(57)【要約】【課題】試料が生細胞である場合においても試料にダメージを与えることなく、面的なスペクトルイメージを高速に取得することができ、複数のバンドのイメージを同時に取得することができる多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡を提供する。【解決手段】レーザ光源１と、レーザ光源１からの励起光をマトリクス状に分割して集光させるマイクロレンズアレイ２と、各光束を集光点において通過させるピンホールアレイ６と、ピンホールアレイ６を経た光束を試料に集光させる対物レンズ９と、試料からのラマン散乱光を集光させる共焦点光学系１０と、共焦点光学系１０により集光された光束のそれぞれが入射端より入射され出射端が一列に配列された複数の光ファイバからなるファイババンドル１１と、ファイババンドル１１の出射端からの光束が入射される分光手段及び受光手段１２とを備える。【選択図】図１
2012237647.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光を発するレーザ光源と、
前記レーザ光源からの励起光を複数の細い光束にマトリクス状に分割してそれぞれを集光させるマイクロレンズアレイと、
前記マイクロレンズアレイを経て、リレーレンズを経た複数の光束を反射するエッジフィルタと、
前記エッジフィルタを経た複数の光束のそれぞれを集光点において通過させる複数のピンホールを有するピンホールアレイと、
前記ピンホールアレイを経た複数の光束のがリレーレンズを経て入射され、これら複数の光束のそれぞれを試料に集光させる対物レンズと、
前記試料からの励起光の反射光及びラマン散乱光が、前記対物レンズ、前記リレーレンズ及び前記ピンホールアレイを経て前記エッジフィルタに戻り、このエッジフィルタを透過したラマン散乱光のそれぞれを集光させる共焦点光学系と、
前記共焦点光学系により集光された複数のラマン散乱光の光束のそれぞれが入射端より入射され、出射端が一列に配列された複数の光ファイバからなるファイババンドルと、
前記ファイババンドルをなす複数の光ファイバの出射端からの光束が入射される分光手段と、
前記分光手段を経た光束を受光する受光手段と
を備えたことを特徴とする多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ観察光学系を用いて試料からのラマン散乱光を観察する多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、特許文献１に記載されているように、ラマン散乱光や蛍光などの散乱光と、試料の光学像（共焦点光学顕微鏡像）とを同時に測定することができる共焦点ラマン分光顕微鏡が提案されている。
【０００３】
この共焦点ラマン分光顕微鏡は、試料にレーザ光を照射し、試料からの反射光と散乱光とをノッチフィルタにより分離させ、反射光の光量を光検出器により測定するとともに、ラマン散乱光または蛍光スペクトルを光電子増倍管またはＣＣＤにより同時に測定するものである。
【０００４】
このような共焦点ラマン分光顕微鏡は、試料の一箇所のスペクトルを測定するものであるので、生細胞などに対して使用する場合には、試料内での物質の移動、変化が生ずるため、測定が困難であった。しかし、測定時間の短縮のために一箇所に照射するレーザ光の強度を増強すると、特に試料が生細胞である場合等には、試料のダメージが大きくなってしまう。
【０００５】
このような場合には、試料の一箇所のみのスペクトルではなく、面的なスペクトルイメージを高速に取得する必要がある。従来の共焦点ラマン分光顕微鏡においては、イメージ取得には長時間を要するため、イメージングの高速化が要請される。
【０００６】
ここで、面照射を用いた直接ラマンイメージング法が提案されている。これは、試料に対して面照射を行い、数１０μｍ２の領域を同時にラマン励起し、フィルター（誘電体膜によるフィルターやＡＯＴＦ）により、イメージをそのまま分光し、望むラマンバンドのラマンイメージを得るものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−１２１４７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、上述のような直接ラマンイメージング法においては、フィルターの透過波長を走査すればスペクトルを得ることができるが、複数のバンドのイメージを同時に取得することは不可能である。また、試料からの弱いラマン散乱光に対して、培地や試料を担持するガラスからの発光が背景光として検出されてしまい、コントラストの大幅な低下が生ずる。
【０００９】
そこで、本発明は、上述の実情に鑑みて提案されるものであって、試料が生細胞である場合においても、試料にダメージを与えることなく、面的なスペクトルイメージを高速に取得することができ、また、複数のバンドのイメージを同時に取得することができる多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述の課題を解決するため、本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡は、回折限界程度の大きさで多焦点照射を行い、かつ、共焦点効果を用いることにより、空間分解能を向上させ、また、背景光を除去して、多点からのスペクトルの同時取得を可能とし、背景光からの分離及びスペクトル処理を可能とし、コントラストを大幅に向上させるものである。
【００１１】
すなわち、本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡は、励起光を発するレーザ光源と、レーザ光源からの励起光を複数の細い光束にマトリクス状に分割してそれぞれを集光させるマイクロレンズアレイと、マイクロレンズアレイを経てリレーレンズを経た複数の光束を反射するエッジフィルタと、エッジフィルタを経た複数の光束のそれぞれを集光点において通過させる複数のピンホールを有するピンホールアレイと、ピンホールアレイを経た複数の光束のがリレーレンズを経て入射されこれら複数の光束のそれぞれを試料に集光させる対物レンズと、試料からの励起光の反射光及びラマン散乱光が対物レンズ、リレーレンズ及びピンホールアレイを経てエッジフィルタに戻り、このエッジフィルタを透過したラマン散乱光のそれぞれを集光させる共焦点光学系と、共焦点光学系により集光された複数のラマン散乱光の光束のそれぞれが入射端より入射され出射端が一列に配列された複数の光ファイバからなるファイババンドルと、ファイババンドルをなす複数の光ファイバの出射端からの光束が入射される分光手段と、分光手段を経た光束を受光する受光手段とを備えたことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡においては、回折限界程度の大きさで多焦点照射を行い、かつ、共焦点効果を用いることにより、空間分解能を向上させ、また、背景光を除去して、多点からのスペクトルの同時取得を可能とし、背景光からの分離及びスペクトル処理を可能とし、コントラストを大幅に向上させることができる。多焦点照射は、励起光を分割した光束によって行うので、各焦点ごとにおける試料のダメージを軽減することができる。
【００１３】
すなわち、本発明は、試料が生細胞である場合においても、試料にダメージを与えることなく、面的なスペクトルイメージを高速に取得することができ、また、複数のバンドのイメージを同時に取得することができる多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡を提供することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡の構成を示す平面図及び側面図である。
【図２】本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡により得られたラマン散乱光の強度を示すグラフである。
【図３】本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡により得られたラマン散乱光の強度と受光手段における受光イメージとの関係を示すグラフである。
【図４】本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡により得られるラマン散乱光の情報と被測定面との関係を示すグラフである。
【図５】本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡により得られるラマン散乱光のイメージング画像及びラマン散乱光の３次元イメージング画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。
【００１６】
〔本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡の構成〕
本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡は、試料に対して複数に分割した励起光をそれぞれ集光して照射することにより、励起光が照射された試料の複数箇所を同時に測定する装置である。
【００１７】
本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡は、特に、組織、器官、または、細胞の生体及び生体関連物質を試料とする場合に好適に使用することができる。
【００１８】
図１は、本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡の構成を示す平面図及び側面図である。
【００１９】
本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡は、図１に示すように、励起光を発するレーザ光源１と、レーザ光源１からの励起光が入射されるマイクロレンズアレイ２とを備えている。マイクロレンズアレイ２は、励起光を複数の細い光束にマトリクス状に分割して、それぞれを集光させる。
【００２０】
マイクロレンズアレイを経た複数の光束は、リレーレンズ３，４を経て、エッジフィルタ５に入射し、このエッジフィルタ５によって反射される。エッジフィルタ５を経た複数の光束は、それぞれを集光点において、ピンホールアレイ６の複数のピンホールを通過する。ピンホールアレイ６の各ピンホールを経た複数の光束は、リレーレンズ７及びダイクロイックミラー８を経て、対物レンズ９入射される。対物レンズ９は、複数の光束のそれぞれを、図示しない試料に集光させる。
【００２１】
試料における各励起光の集光点は、例えば２μｍ間隔で、マトリクス状（２次元状）に配列された状態となっている。これら集光点のなす平面が、測定対象となる被測定平面となる。そして、試料は、ピエゾステージにより、各集光点の間隔（例えば２μｍ）に亘って光束に直交する２方向に、被測定平面に沿って走査できるようにしてもよい。また、試料をピエゾステージにより光軸方向に移動（走査）させることにより、資料の深さ方向に被測定平面を移動させることができる。
【００２２】
試料からの励起光の反射光及びラマン散乱光は、対物レンズ９、リレーレンズ７及びピンホールアレイ６を経てエッジフィルタ５に戻り、ラマン散乱光がエッジフィルタ５を透過する。
【００２３】
ラマン散乱光のそれぞれは、共焦点光学系１０に入射される。共焦点光学系１０は、第１及び第２のレンズ１０ａ，１０ｂからなる。ピンホールアレイ６の各ピンホールにおいて集光していたラマン散乱光は、これらピンホールから拡散しながらエッジフィルタ５を透過し、第１のレンズ１０ａに入射する。第１のレンズ１０ａは、入射した各光束をそれぞれ集光させる。第１のレンズ１０ａにより集光された各光束は、再び拡散しながら、第２の第２のレンズ１０ｂに入射する。第２のレンズ１０ｂは、入射した各光束をそれぞれ集光させる。第２のレンズ１０ｂによる各光束の集光点は、試料における励起光の集光点及びピンホールアレイ６の各ピンホールにおける集光点と共焦点の関係となっている。
【００２４】
共焦点光学系１０により集光された複数のラマン散乱光の光束のそれぞれは、ファイババンドル１１をなす複数の光ファイバの入射端に入射される。このファイババンドル１１をなす複数の光ファイバは、出射端が一列に配列されている。
【００２５】
ファイババンドル１１をなす複数の光ファイバの出射端から出射された光束は、グレーティングなどの分光手段に入射して分光され、ＣＣＤカメラなどの受光手段１２により受光される。
【００２６】
〔本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡の動作〕
この多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡においては、試料に対して、回折限界程度の大きさで多焦点照射を行い、かつ、共焦点効果を用いることによって、空間分解能を向上させ、多点からのスペクトルの同時取得が可能である。多焦点照射は、励起光を分割した光束によって行うので、各焦点ごとにおける試料のダメージを軽減することができる。したがって、試料が生細胞である場合においても、試料にダメージを与えることなく、面的なスペクトルイメージを高速に取得することができ、また、複数のバンドのイメージを同時に取得することができる。コントラストを大幅に向上させることができる。
【００２７】
図２は、本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡により得られたラマン散乱光の強度を示すグラフである。
【００２８】
この多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡により、試料をφ５４８ｎｍのポリスチレン（polystyrene）球として、１６０３ｃｍ−１のラマン散乱光を測定した。図２（ａ）に示すように、被測定面内（Ｘ軸方向）及び、図２（ｂ）に示すように、光軸方向（Ｚ軸方向）について、それぞれ良好な測定を行うことができた。
【００２９】
図３は、本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡により得られたラマン散乱光の強度と受光手段における受光イメージとの関係を示すグラフである。
【００３０】
この多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡においては、図３に示すように、被測定面内の複数箇所（例えば４８点）におけるラマンスペクトルを同時に測定することができる。受光手段の受光素子（ＣＣＤ）においては、被測定面上の一点からのスペクトルが一本の線状に領域に受光される。図３においては、ファイババンドル１１をなす複数の光ファイバの出射端が縦に並んでおり（１〜４８）、これら出射端からの光束がそれぞれ分光されて横方向にスペクトルとして広がって撮像される。
【００３１】
図４は、本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡により得られるラマン散乱光の情報と被測定面との関係を示すグラフである。
【００３２】
この多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡においては、図４に示すように、被測定面（図４中のＸ−Ｙ平面）上の複数の点について、それぞれからスペクトル情報が得られるので、３次元的な情報を得ている。この３次元的な情報が、ファイババンドル１１をなす複数の光ファイバの出射端が一列に並んでいることにより、受光手段の受光素子においては、２次元的な情報として取得される。
【００３３】
受光手段の受光素子において取得された情報を、ファイババンドル１１をなす複数の光ファイバの入射端の位置、すなわち、被測定面上の位置に応じて並べ替えることにより、元の３次元的な情報を再現することができる。このようにして、被測定面上の複数の点についてのスペクトル情報を、被測定面上の位置に応じて再現すれば、イメージングを行うことができる。
【００３４】
図５は、本発明に係る多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡により得られるラマン散乱光のイメージング画像及びラマン散乱光の３次元イメージング画像である。
【００３５】
この多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡においては、図５（ａ）に示すように、被測定面上の複数の点についてのスペクトル情報を、被測定面上の位置に応じて再現したイメージング画像を、極めて高速に取得することができる。さらに、図５（ｂ）に示すように、資料の奥行方向（光軸方向）の情報を加えて処理することにより、資料の３次元的なスペクトル情報を画像化することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、レーザ観察光学系を用いて試料からのラマン散乱光を観察する多焦点共焦点ラマン分光顕微鏡に適用される。
【符号の説明】
【００３７】
１  レーザ光源
２  マイクロレンズアレイ
５  エッジフィルタ
６  ピンホールアレイ
９  対物レンズ
１０  共焦点光学系
１１  ファイババンドル
１２  受光手段
【図１】
2012237647.tif 000003
【図２】
2012237647.tif 000004
【図４】
2012237647.tif 000005
【図３】
2012237647.tif 000006
【図５】
2012237647.tif 000007