(57)【要約】【課題】本発明は、コンタミネーションの生じにくい環境下にて、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、並びにα−ケトグルタル酸及び／またはグルタミン酸、及びポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）の製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】以下の工程を含む、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸の製造方法：（１）ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で培養する工程１、（２）工程１にて得られる培養液からα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸を回収する工程２。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸の製造方法：
（１）ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で培養する工程１、
（２）工程１にて得られる培養液からα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸を回収する工程２。
【請求項２】
以下の工程を含む、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、及びポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）の製造方法：
（１）ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で培養する工程１、
（２）工程１にて得られる培養液からα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸を回収し、且つ培養して得られる好塩菌体内からＰＨＡｓを回収する工程２。
【請求項３】
工程２にて得られる培養液１Ｌ当り、１０ｇ以上のα−ケトグルタル酸が含まれることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程２にて得られる培養液１Ｌ当り、０．１ｇ以上のグルタミン酸が含まれることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程２にて得られる好塩菌から、該好塩菌の乾燥重量に対して３０重量%以上、又は培地１Ｌ当り３．５ｇ以上のＰＨＡｓが回収される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＰＨＡｓがポリヒドロキシブチレート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ：ＰＨＢ）である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
有機炭素源が廃グリセロールである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
アラビノースを含有する有機炭素源である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記好塩菌がハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９９５）である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸の製造方法に関する。更に、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、及びポリヒドロキシアルカノエート(ＰＨＡｓ)の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年ピークオイルが叫ばれ、エネルギーのみならずケミカル・リファイナリーのバイオベース化、工業用原料の石油からバイオマスへの転換等が、喫緊の課題となっている。
【０００３】
α−ケトグルタル酸は、グルタミン酸、ビタミンＣ等の原料、医薬品等の原料として使用されている。また、α−ケトグルタル酸そのものの用途として、例えば、肉体疲労改善剤としての用途が知られており、サプリメント等の商品としての用いることが可能である（特許文献１）。
【０００４】
また、非特許文献１の「バイオリファイナリーの出発中間体として期待しうる３２化合物」には、α−ケトグルタル酸、及びグルタミン酸が、バイオリファイナリーの出発中間体の有望な化合物として挙げられており、将来的には利用が拡大されることが大いに見込まれている。
【０００５】
α-ケトグルタル酸の製造方法として、例えば、アラビノースを原料にして生産する手法が特許文献２に記載される方法が知られている。他の製造方法として、大腸菌群細菌等の細菌、キャンディタ属等の酵母等を用い、ブドウ糖、ｎ−パラフィン等を原料にしたα-ケトグルタル酸の製造方法が知られている。
【０００６】
グルタミン酸は、コリネバクテリウム属の細菌で生産されることが知られ、世界で２００万トン以上生産されている重要なアミノ酸である。また、腸内細菌科に属する微生物においても遺伝子改変すること等で生産が可能であることが知られている(特許文献３)。しかしながら、自然の菌体においてはコリネバクテリウム属以外の菌体がグルタミン酸等を分泌発現することは、ほぼ知られていない。
【０００７】
本発明者らは、商業的な屋外培養を行っても、コンタミがほとんどないことが知られている微細藻類スピルリナの効率的な培養方法を検討していたところ、ある条件下では、特定の好塩菌が唯一のコンタミ菌として生育することを認めた。
【０００８】
当該好塩菌そのものは、通常はｐＨ５〜１２程度の条件下の、高濃度のナトリウムを含む培地中でも良好に生育するため、好気発酵下であっても他のバクテリア等のコンタミが極めて起こりにくいことが推定された。そこで、当該好塩菌の各種の炭素源の資化性を検討していたところ、当該好塩菌の菌体内に著量のポリヒドロキシアルカノエート(ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ：ＰＨＡｓ)が蓄積していることが明らかとなった(特許文献４)。さらに、特許文献４では当該好塩菌のＰＨＡｓの産生について特化した調査が記載されている。
【０００９】
近年、地球に優しい燃料として利用が進んでいるバイオディーゼルフュエル(ＢＤＦ)の生産において、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等のアルカリ触媒を用いて、植物、動物油脂から脂肪酸メチルエステル(ＢＤＦの主体)を作製する方法が主流である。そのため、この手法による副生物であるアルカリを多く含んだ廃グリセロールの処理が問題となっている。特許文献４には、これらの廃グリセロールからメタノール除去を行えば、当該好塩菌が廃グリセロールを炭素源として、ＰＨＡｓを生産できることが記載されている。
【００１０】
以上のように、当該好塩菌を用いたＰＨＡｓの製造について数多くの研究がなされてきたところ、当該好塩菌が乳酸、酢酸等といった特定の物質の産生に関与することも知られている（特許文献５）。しかしながら、上述のようなα−ケトグルタル酸、グルタミン酸等を、好塩菌を用いて産生する方法についての報告は何ら認められない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平１０−１７５８５５号公報
【特許文献２】特開２００９−０１１１６１号公報
【特許文献３】特開２００９−２０７４８３号公報
【特許文献４】国際公開第２００９／０４１５３１号パンフレット
【特許文献５】特開２０１０−２７３５８２号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】第１５回地球環境産業技術動向調査報告会資料−持続可能な発展を求めて−バイオリファイナリー産業の早期構築へ向けて（財）地球環境産業技術研究機構（ＲＩＴＥ）微生物研究グループ  湯川英明  平成１８年１月３１日
【非特許文献２】Ｍｏｎｔｅｉｌ−Ｒｉｖｅｒａ  Ｆら．２００７  Ｊｕｎ  ２２；１１５４（１−２）：３４−４１
【非特許文献３】三重保環研年報  第９号（通巻第５２号），２７−３２頁（２００７）「三重県における日間生産量１００ＬクラスのＢＤＦ製造施設の現状と課題」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、コンタミネーションの生じにくい環境下にて、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、又はα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、及びポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、特許文献４に記載された好塩菌の培養条件を検討していたところ、過剰の炭素源が存在する培地中にて当該菌体の濃度が上昇した際に、培地のｐＨの低下が見られることを認めた。そして、この培養液を分析したところ、培地中に著量の乳酸、及び酢酸が蓄積していることを見出した(特許文献５)。
【００１５】
さらに、培養を続けると、上記の乳酸、酢酸の蓄積が減少することを認めた。引き続いて、上記好塩菌の代謝物をメタボローム解析に供したところ、著量のα−ケトグルタル酸、並びにグルタミン酸が培養液中に分泌されていることを認め、それと同時に該菌体内において著量のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）が蓄積されていることを認めた。
【００１６】
本願発明者は、特定の属に属する好塩菌を、無機塩と単一又は複数の有機炭素源を基質として含む培地を用いて培養すれば、培養液中にα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸を産生されるという知見を得た。そして該菌体内にはＰＨＡｓを産生させることができるという知見も得た。
【００１７】
また、上記のα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、又はα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、及びＰＨＡｓを製造するための培養は、ＢＤＦ廃液等を用いた培養、光合成できる微細藻類スピルリナ等との混合培養、及び他のバクテリアのコンタミが起こりにくい環境での培養が可能であることも見出した。
【００１８】
さらに、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、又はα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、及びＰＨＡｓの製造は、特定の属に属する好塩菌体の一連の増殖と共に行われるため、一段階の培養での製造が可能であることも明らかにした。
【００１９】
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、以下に示すα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、又はα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、及びＰＨＡｓの製造方法を提供するものである。
【００２０】
項１  以下の工程を含む、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸の製造方法：
（１）ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で培養する工程１、
（２）工程１にて得られる培養液からα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸を回収する工程２。
【００２１】
項２  以下の工程を含む、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、及びポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）の製造方法：
（１）ハロモナス属に属する好塩菌を無機塩と、単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地で培養する工程１、
（２）工程１にて得られる培養液からα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸を回収し、且つ培養して得られる好塩菌体内からＰＨＡｓを回収する工程２。
【００２２】
項３  工程２にて得られる培養液１Ｌ当り、１０ｇ以上のα−ケトグルタル酸が含まれることを特徴とする上記項１又は２に記載の方法。
【００２３】
項４  工程２にて得られる培養液１Ｌ当り、０．１ｇ以上のグルタミン酸が含まれることを特徴とする上記項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【００２４】
項５  工程２にて得られる好塩菌から、該好塩菌の乾燥重量に対して３０重量%以上、又は培地１Ｌ当り３．５ｇ以上のＰＨＡｓが回収される、上記項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【００２５】
項６  ＰＨＡｓがポリヒドロキシブチレート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ：ＰＨＢ）である、上記項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【００２６】
項７  有機炭素源が廃グリセロールである上記項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【００２７】
項８  アラビノースを含む有機炭素源である上記項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【００２８】
項９  前記好塩菌がハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９９５）である、上記項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の製造方法は、単一、若しくは複数の有機炭素源と、無機窒素、無機リン等の無機塩を加えた培地を用いることにより、一段階の培養で、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、又はα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸及びポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）を、培地中、又は菌体中を蓄積させることができる。さらにこのような培養は、他のバクテリアのコンタミが起こりにくい環境で行うことができるので有意な製造方法である。
【００３０】
本発明の製造方法において用いる好塩菌は、例えば、安価な無機塩に加え、バイオディーゼル生産に副生する廃グリセロール、エタノール発酵等の過程で生産される木材糖化液等を有機炭素源として単独で、又は他の有機炭素源と組み合わせて用いることが可能である。さらに、酵母細胞を用いたエタノール発酵において得られ、利用が難しいとされる五炭糖のキシロース、アラビノース等を有機炭素源として有効に利用することも可能である。
【００３１】
これらのことから、例えば現状の遺伝子組換えをしていない酵母細胞を用いた木材糖化液のエタノール発酵後の残渣（主にキシロールやアラビノースを含む）を有機炭素源として利用して、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、又はα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、及びＰＨＡｓの生産を行うことが可能である。
【００３２】
そして、本発明の製造方法によって得られるα−ケトグルタル酸、及びグルタミン酸は、化粧品、医薬品、機能性食品等の原料に有用であり、ＰＨＡｓはプラスチックのバイオベース化において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株を、グリセロール、廃グリセロールを用い３３℃にて培養したときの菌体濁度ＯＤ６００（縦軸）と培養時間（横軸：ｈ）を調べたグラフである。凡例に示す「％」はすべて、「ｗ／ｖ％」を示す(図２〜７においても同じ)。
【図２】好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株を、グリセロール、廃グリセロールを用い３３℃にて培養したときに蓄積された乾燥菌体重量（縦軸：ｍｇ／ｍｌ）と培養時間（横軸：ｈ）を示したグラフである。
【図３】好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株を、グリセロール、廃グリセロールを用い３３℃にて培養したときに蓄積されたＰＨＢの割合（縦軸：ＰＨＢ／乾燥菌体（％））と培養時間（横軸：ｈ）を示したグラフである。
【図４】好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株を、グリセロール、廃グリセロールを用い３３℃にて培養したときに蓄積されたＰＨＢの総量（縦軸：ｇ（ＰＨＢ）／Ｌ（培養液））と培養時間（横軸：ｈ）を示したグラフである。
【図５】好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株を、グリセロール、廃グリセロールを用い３３℃にて培養したときに、上清中に蓄積されたα-ケトグルタル酸の上清中の割合（縦軸：α-ケトグルタル酸重量（ｇ）／培養上清（Ｌ）を%に換算、即ち、１%とは培養上清１Ｌあたり、１０ｇのα-ケトグルタル酸が含まれていることに相当する。）と培養時間（横軸：ｈ）を調べたグラフである。
【図６】好塩菌ハロモナス・エスピーＫＭ−１株を、グリセロール、廃グリセロールを用い３３℃にて培養したときに、上清中に蓄積されたグルタミン酸の上清中の割合（縦軸：グルタミン酸重量（ｍｇ）／培養上清（Ｌ）と培養時間（横軸：ｈ）を調べたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の方法は、ハロモナス属に属する好塩菌を用いたα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸を製造する方法、又はα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、及びポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）を製造する方法である。
【００３５】
（ａ）好塩菌
本発明の製造方法にて用いる好塩菌は、下記の（１）〜（３）のいずれかによって示される好塩菌である。
（１）無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源を含む培地にて増殖し、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸を生産して培地中に分泌させることを特徴とするハロモナス属に属する好塩菌。
（２）前記条件の培地で増殖し、ＰＨＡｓを生産して自らの菌体内にて蓄積させることを特徴とするハロモナス属に属する好塩菌。
（３）前記条件の培地で増殖し、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸を生産して培地中に分泌させ、且つＰＨＡｓを生産して自らの菌体内にて蓄積させることを特徴とするハロモナス属に属する好塩菌。
【００３６】
上記の無機塩、及び有機炭素源については、培地の欄にて後述するものが適用される。
【００３７】
ハロモナス属に属する好塩菌は、０．１〜１．０Ｍの塩濃度を適とする好塩性を有し、時には塩を含まない培地においても生育する細菌である。ハロモナス属に属する好塩菌は、通常はｐＨ５〜１２程度の培地にて生育する。
【００３８】
このようなハロモナス属に属する好塩菌としては、例えば、ハロモナス・エスピー（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＫＭ−１株が挙げられる。ハロモナス・エスピーＫＭ−１株は、平成１９年７月１０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３１６として寄託されている。また、この菌株は、現在国際寄託に移管されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９９５である。当該ハロモナス・エスピーＫＭ−１株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、ＤＤＢＪにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ４７７０１５として登録されている。
【００３９】
本発明の製造方法において用いられる、ハロモナス・エスピーＫＭ−１株以外のハロモナス属に属する好塩菌の具体例として、例えば、１６ＳリボゾームＲＮＡ配列による分析から、ハロモナス・ニトリトフィルス、ハロモナス・アリメンタリア等が挙げられる。
【００４０】
さらに、上述した性質と同様の性質を有するハロモナス属に属する好塩菌であれば、ハロモナス・ニトリトフィルス、ハロモナス・エスピーＫＭ−１等に限らず、本発明のα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、又はα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、及びＰＨＡｓの製造方法が適用できる。
【００４１】
上述したハロモナス属に属する好塩菌には、遺伝子が導入されていてもよい。導入される遺伝子は、本発明の製造方法において、生産効率等を向上させる機能を発現させるものであれば特に限定されない。例えば、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸を該好塩菌体外に分泌され易くする機能を発現させる遺伝子、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸の発現量を増大させる遺伝子、ＰＨＡｓの該菌体内への蓄積を上昇させる機能を発現させる遺伝子等が挙げられる。
【００４２】
これらの遺伝子の導入は、導入する遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換することにより行なわれる。例えば宿主菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に該遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを利用するのが好ましい。かくして得られる所望の組換えＤＮＡの宿主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。
【００４３】
（ｂ）培地
本発明の製造方法にて用いる培地は、無機塩と単一若しくは複数の有機炭素源に追加した培地である。培地のｐＨは特に限定されないが、上述した好塩菌の生育条件を満たすｐＨであることが好ましく、具体的にはｐＨ５〜１２程度にすればよい。より好ましくはｐＨ８．８〜１２の培地である。アルカリ性の培地を用いることによって、他の菌のコンタミネーションをより効果的に防止ことができるので好ましい。
【００４４】
無機塩は、特に限定されることは無く、例えばリン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、硫酸塩、及びナトリウム、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、コバルト等の金属塩が挙げられる。例えば、ナトリウムを含む培地成分として、ＮａＣｌ、ＮａＮＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ2ＣＯ３等が挙げられる。本発明の製造方法おいては、無機塩として上述の好塩菌にとって窒素源やリン源となるような化合物を用いることが好ましい。これらの無機塩は単一で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４５】
上述の窒素源としては、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム塩等が挙げられる。より具体的には、ＮａＮＯ3、ＮａＮＯ２、ＮＨ４Ｃｌ等の化合物が挙げられる。
【００４６】
窒素源の使用量は、菌体の生育に影響を及ぼすことなく、本発明の培地、又は乾燥菌体あたりにおける、それぞれα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、又はＰＨＡｓの生産目的が達成される範囲において適宜設定すればよい。具体的には、培地１００ｍＬあたり通常であれば５００ｍｇ程度以上とすればよく、より好ましくは１０００ｍｇ程度以上、更に好ましくは１２５０ｍｇ程度以上である。
【００４７】
また、上述のリン源としては、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩等が挙げられる。より具体的には、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ2ＰＯ４等の化合物が挙げられる。
【００４８】
リン源の使用量も、上記窒素源の使用量と同様の観点から、上述の好塩菌の生育に影響を及ぼすことなく、本発明の培地、又は乾燥菌体あたりにおける、それぞれα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、又はＰＨＡｓの生産目的が達成される範囲において、適宜設定すればよい。具体的には、培地１００ｍＬあたり通常は５０〜４００ｍｇ程度とすればよく、より好ましくは１００〜２００ｍｇ程度である。
【００４９】
その他の化合物等も含めた無機塩は、総量で通常は０．1〜２．５Ｍ程度となる濃度で用いればよく、好ましくは０．２〜１．０Ｍ程度、より好ましくは０．２〜０．５Ｍ程度である。
【００５０】
有機炭素源としては、トリプトン、イーストエキストラクト等の一般的に発酵に用いられる有機炭素源；可溶性デンプン、六炭糖（グルコース、フラクトース）、五炭糖（キシロース、アラビノース）、二糖（スクロース）、糖アルコール（マンニトール、ソルビトール）等の糖類；エタノール、ｎ−プロパノール等の炭素数１〜６の低級アルコール；酢酸、酢酸ナトリウム、プロピオン酸等のカルボン酸又はその誘導体；グリセロール等の多価アルコール等が挙げられる。なお、グリセロールには、下記に示すような廃グリセロールも含まれる。また、アラビノースを含む木材糖化液、若しくはその残渣も、有機炭素源として用いることができる。
【００５１】
中でも、製造方法にかかるコストを低減する観点から、廃グリセロール、木材糖化液等が有機炭素源として好ましく用いられる。これらの有機炭素源は、単一で使用してもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５２】
本発明の廃グリセロールとは、植物、動物等に由来する油脂に、メタノール等のアルコールと、ＫＯＨ、ＮａＯＨ等のアルカリ触媒を添加し、６５℃程度の温度にて反応させて得られる、脂肪酸メチルエステルを主体とするバイオディーゼルの製造時に、副産物として得られるものである。
【００５３】
上記の廃グリセロールの組成は、バイオディーゼルの製造設備や、原料として用いる油脂の組成により異なり、特に限定されるものではない。例えば、非特許文献３に示されるように、グリセロール濃度がおよそ３０〜６５%程度で、上記のアルカリ触媒をおよそ４〜７％程度含有し、ｐＨは１０〜１２程度の廃グリセロールが挙げられる。また、上記の廃グリセロールには、得られるバイオディーゼルを洗浄する際に用いられる水が含まれている。
【００５４】
有機炭素源の使用量は、使用する有機炭素源の種類により異なるが、通常は培地に対して終濃度が、通常1〜２０％ｗ／ｖ程度で使用すればよい。
【００５５】
中でも、有機炭素源として廃グリセロールを用いる場合、その使用量は、培地に対して終濃度が通常1〜２０ｗ／ｖ％程度とすればよく、好ましくは１０〜１５ｗ／ｖ％程度である。
【００５６】
また、有機炭素源としてアラビノースを用いる場合、その使用量は、培地に対して終濃度が通常1〜５ｗ／ｖ％程度とすればよく、好ましくは２〜３ｗ／ｖ％程度である。
【００５７】
本発明の製造方法では、塩濃度が比較的高い条件の培地で、好塩菌を培養するため、他のバクテリアのコンタミネーションの恐れがほとんどない。そして、コンタミネーションの恐れが低いことから、培地に対して滅菌処理等を行う必要も無く、簡便な設備で培養することも可能である。
【００５８】
（ｃ）培養方法
本発明の製造方法における上述の好塩菌の培養方法としては、上述のように培地中にα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸を産生し、培養液中に分泌させる方法、又はα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸を培養液中に分泌産生させつつ、且つ前記の好塩菌体内でＰＨＡｓを生産させる方法であれば特に制限されないが、培養の例を以下に挙げる。
【００５９】
上述の本発明の好塩菌の培養環境は好気条件下が望ましい。例えば、５ｍｌ程度の培地に当該好塩菌植菌し、通常３０〜３７℃程度、攪拌速度１２０〜１８０ｒｐｍで１晩振盪前培養を行う。続いて前培養して得られた菌体を、三角フラスコ、発酵槽、ジャーファーメンター等に入った培地中に１００倍程度に希釈し本培養する。通常であれば、本培養は２０〜４５℃程度で可能であるが、３０〜３７℃で行うことが好ましい。
【００６０】
本発明の培養方法は、特に限定されず、回分培養、半回分培養、連続培養等の培養方法が挙げられる。特に、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸を効率よく製造するには、本発明の方法によって用いる好塩菌がコンタミネーションの可能性が極めて低いことを考慮すれば、半回分培養又は連続培養が好ましい。
【００６１】
本発明の製造方法では、上述の好塩菌の生育速度が低下するにつれて、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸を効率的に培養液中に分泌産生する傾向にある。
【００６２】
従って、上述の好塩菌を生育の旺盛にする有機炭素源（例えば、グルコース等）を含む培地を用いて培養して当該菌体を生育させた後に、生育が制限される有機炭素源（例えば廃グリセロール、アラビノース等）を含む培地に変更して培養することによって、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸をより効率的に産生することができる。
【００６３】
一方、本発明においてα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸と同時に産生されるＰＨＡｓは、上記好塩菌体内に蓄積されるため、効率よくＰＨＡｓを産生させるには、当該菌体をグルコースなどの生育効率のよい有機炭素源を含む培地にて生育し続けることが好ましい。
【００６４】
培養時間は、培地に用いる無機塩、有機炭素源などといった培地の条件により異なるが、後述するような所望の量のα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、又はＰＨＡｓが回収できるのに十分な時間の培養時間とすればよい。
【００６５】
（ｄ）α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸の回収
本発明の製造方法において、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸は、上述の方法によって培養して得られる培養液中から回収される。ここでの回収とは、培養液中にα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸が存在している時に上述の培養を停止し、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸培養液と、上記好塩菌体を分離することである。
【００６６】
分離の手法は、遠心操作、濾過等の公知の固液分離の操作を採用すればよい。また、培養の停止方法も特に限定はされず、例えば、上記好塩菌を加熱、酸処理等の方法によって殺菌する方法、遠心操作、濾過等の公知の固液分離方法を用いて培養液と上記好塩菌体を分離する方法等が挙げられる。
【００６７】
培養液中にα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸が含まれたまま培養をし続けていると、培養液中に分泌されたα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸が、当該好塩菌体内に再度取り込まれて利用されるために、結果として培養液中のα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸が減少し、ひいては培養液から消失してしまうためにてしまうために、培養液中にα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸が存在しているときに、上記培養を停止する必要がある。
【００６８】
培養液中のα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸の存在を確認する方法は、菌種、培地成分、培養条件等により変わり得るものであるので、これらの要素を考慮して適宜決定する。例えば、キャピラリー電気泳動等の分析方法を使用して、培養を行いながら培養を停止する時間を決定することもできる。
【００６９】
また、α−ケトグルタル酸及びグルタミン酸は酸性を示す化合物であることから、培養の際の培地のｐＨの低下を基準にして、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸の存在を確認してもよい。
【００７０】
なお回収されるα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸は、培養液中に含まれる無機塩に基づく、ナトリウムやカルシウム等のアルカリ金属陽イオン等と反応したアルカリ金属塩として回収される。したがって、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸を酸の状態にて製造するには、回収した培養液を蒸留等の常法に供すればよい。また、回収した培養液を適切なカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製工程に供してもよい。
【００７１】
本発明の製造方法によって得られるα−ケトグルタル酸は、得られる培地１Ｌに対して通常は、１０ｇ程度以上（１ｗ／ｖ％）であり、より好ましくは３０ｇ程度以上である。
【００７２】
本発明の製造方法によって得られるグルタミン酸は、得られる培地１Ｌに対して通常は、１００ｍｇ程度以上であり、より好ましくは１５０ｍｇ程度以上である。
【００７３】
本発明の方法によって製造されるα-ケトグルタル酸、及びグルタミン酸は、生体内にて通常の光学活性を持った化合物である。特に、本発明の方法によって製造されるグルタミン酸は、Ｌ−グルタミン酸である。
【００７４】
（ｄ）ＰＨＡｓの回収
本発明の製造方法において、ＰＨＡｓは、上述の方法によって培養して得られる培養液中にα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸が存在し、且つ得られる好塩菌体内から回収される。ここでの回収とは、ＰＨＡｓが蓄積している時に上述の培養を停止して、当該菌体を培養液から分離した当該菌体を破砕した後に、トリクロロエチレン等で抽出することである。例えば、好塩菌を分離した後の具体的な方法については、非特許文献２に記載された方法を参照すればよい。
【００７５】
本発明の製造方法によって、α−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸と主に生産されるＰＨＡｓは、ヒドロキシアルカノエート単位からなるポリマーである。ヒドロキシアルカノエートの具体例としては、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート等が挙げられる。
【００７６】
上記の培地に用いる有機炭素源として、グリセロール、グルコース、木材糖化液等をそれぞれ単独で用いれば、産生されるＰＨＡｓが、同一のヒドロキシブチレートをモノマー単位として構成されるホモポリマーとなる傾向となる。
【００７７】
また、ｎ−プロパノール、プロピオン酸、又はこれらの塩等を、上記培地の有機炭素源として用いれば、ヒドロキシブチレートとヒドロキシバレレートからなるＰＨＡｓコポリマーが産生される傾向となる。このようなＰＨＡｓコポリマーに含まれるヒドロキシバレレートの含有量は、通常は０．５〜１３重量％程度であり、好ましくは５〜１３重量％程度である。
【００７８】
本発明の製造方法によって、α−ケトグルタル酸並びに／もしくはグルタミン酸と共に得られるＰＨＡｓは、培地１Ｌに対して通常は、３．５ｇ程度以上であり、得られる乾燥菌体重量に対して、通常は３０重量％以上である。
【００７９】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。なお、本発明が実施例に限定されないことは言うまでも無い。
【００８０】
＜実施例＞
＜α−ケトグルタル酸、及びグルタミン酸の測定＞
培養液に分泌されたα−ケトグルタル酸、及びグルタミン酸を測定するため、非特許文献２に記載されたポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）分析の手法を応用し、以下の実験を行った。
【００８１】
下記の方法で培養して得られた培養液を遠心分離して上清のみ採取し、５０μＬを乾燥させた。この上清乾燥物に、３ｖｏｌ%のＨ２ＳＯ４を含むメタノール０．２５ｍｌを加え１０５℃で１時間加熱した。その後、室温まで冷却した後、クロロホルム０．２５ｍｌ、蒸留水０．１２５ｍｌを加えて、激しく攪拌した。その後、１分間遠心分離したのち、クロロホルム層を１μｌ分取し、ガスクロマトグラフ装置を用いて、α−ケトグルタル酸を分析した。α−ケトグルタル酸の標品を上清乾燥物と同様に処理、分析し、これを基準として培地あたりのα−ケトグルタル酸蓄積率（α−ケトグルタル酸（ｇ）／上清液（Ｌ））を求めた。
【００８２】
またグルタミン酸は、酵素法・食品分析試薬  Ｆ-キット（株式会社J．K．インターナショナル）を用いて測定し、（グルタミン酸（ｇ）／上清液（Ｌ））を求めた。
【００８３】
＜ＰＨＡｓ蓄積率測定＞
菌体内に蓄積されたＰＨＡｓ（例えば、ヒドロキシブチレート：ＰＨＢ）の蓄積量を測定するため、非特許文献２に記載の手法を用い以下の実験を行った。
【００８４】
上記培養した培養液を遠心分離して菌体のみ採取し、蒸留水で数回洗浄したのち乾燥させた。この乾燥菌体１〜３ｍｇに、３ｖｏｌ％のＨ２ＳＯ４を含むメタノール０．５ｍｌを加え１０５℃で２時間加熱した。その後、室温まで冷却した後、クロロホルム０．５ｍｌ、蒸留水０．２５ｍｌを加え、激しく攪拌した。その後、１分間遠心分離したのち、クロロホルム層を１μｌ分取し、ガスクロマトグラフ装置を用いて、ＰＨＡｓを分析した。ＰＨＡｓの標品を乾燥菌体と同様に処理、分析し、これを基準として乾燥菌体あたりのＰＨＡｓ蓄積率（ＰＨＡｓ（ｇ）／乾燥菌体重量（ｇ））を求めた。
【実施例１】
【００８５】
本実施例では、微生物により産生されるα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、又はα−ケトグルタル酸並びに／若しくはグルタミン酸、及びＰＨＢを産生する方法について詳述する。
【００８６】
表１に示すＳＯＴ改５（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ改）を基本にした培地を用いた。この培地は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ（国立環境研究所のＨＰ）であり、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３の量を調整し、窒素源のＮａＮＯ３を５倍に、リン源のＫ２ＨＰＯ４を４倍に増加させて調整した。上記の培地を調整した後のｐＨは９．４±０．１であり、オートクレーブ等の滅菌操作は行わずにそのまま用いた。
【００８７】
培養の際には、上述の培地に対して各種有機炭素源を適宜追加して用いた。具体的な有機炭素源としてそれぞれ培地中での終濃度がそれぞれ１０％、及び１５％となる量でグリセリンを使用した。廃グリセリン（グリセリン含有量約６５％）は、培地中での終濃度が１５％となる量で用い、アラビノースを培地中での終濃度で５％となる量で用いた。
【００８８】
また、表１に示すＮａＮＯ３の量を、通常の１２５０ｍｇにかえて、１０００ｍｇ、又は１５００ｍｇに変化させ、該好塩菌の生育速度、該好塩菌体重量、ＰＨＢの産生量、α−ケトグルタル酸の産生量、及びグルタミン酸の生産量を検討した。
【００８９】
【表１】
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【００９０】
＜ハロモナス・エスピーＫＭ−１株のプレ培養＞
プレート培養より、１６．５ｍｍ径の試験管に５ｍｌの上記ＳＯＴ５改培地（この場合、炭素源として１ｗ／ｖ％グルコース等を含むものを用いた）を加え、３７℃で１晩振盪培養した。
【００９１】
＜ハロモナス・エスピーＫＭ−１株の培養、サンプルの回収等＞
プレ培養した菌体０．２ｍｌを、１００ｍｌ容の三角フラスコに入れた上記ＳＯＴ改５培地２０ｍｌに混合して植菌し、シリコセンをした。これを、３３℃で振盪培養し、２４時間後より、およそ１２時間おきに培養液を０．５ｍｌ回収して、ＯＤ６００、乾燥菌体重量、ＰＨＢ含有量、及び上清中のα-ケトグルタル酸蓄積率を測定した。培養液は、再度シリコセンをし、３３℃で振盪培養を継続し、回分培養した。結果を以下に示す。
【００９２】
図１、２では、３３℃において、グリセリン、廃グリセリンを炭素源に培養した生育の状況が示している。図３、４では、同条件で培養した際のＰＨＢの生産量について示している。図５では、同条件で培養した際のα-ケトグルタル酸の生産量について示している。
【００９３】
炭素源としてグリセリンの影響のみを比較した場合、１０％のグリセリンを含む培地では、菌体の生育抑制がさほど起こらないため、菌体生育、及びＰＨＢの蓄積が盛んである。
【００９４】
一方、１５％のグリセリンでは、初期の生育が抑制される傾向がある。また、１５％においては、培養開始から４８時間後に約１％のα-ケトグルタル酸の蓄積が見られることから、ある程度の菌体の生育の抑制がα-ケトグルタル酸の蓄積に有効であることが推定される。また有機炭素源として廃グリセリンを用いた場合には、培養開始後２４時間から３６時間の間に、菌体の生育抑制が見られたが、培養開始から３６時間以降には、培地中において著量のα-ケトグルタル酸の蓄積が認められ、最大値は８０ｇ/Ｌ（培養液）にも達した。
【００９５】
一方で、窒素源においては、ある程度の濃度範囲であればα−ケトグルタル酸の蓄積にさほどの差はないものと推定する。
【００９６】
さらに終濃度で５％のアラビノースを有機炭素源として含む培地を用いて６０時間培養した場合、培養液１Ｌあたりに１０ｇのα-ケトグルタル酸が含まれていることが明らかになった。
【００９７】
上記結果から、グリセロール、廃グリセロール、アラビノース等を有機炭素源として含む培地を用いれば、ハロモナス・エスピーＫＭ−１株は、α-ケトグルタル酸を収量として培地１Ｌ当り１０ｇ以上、かつＰＨＡｓを収量として培地１Ｌ当り３．５ｇ（乾燥菌体重量に対して３０重量％以上）を産生することができることが明らかとなった。また、α-ケトグルタル酸のみを生産することを目指せば、収量として培地１Ｌ当り５０ｇ以上得ることも可能であることを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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