(57)【要約】【課題】データ量を削減することができる画像処理装置、画像処理方法及び画像処理プログラムを提供すること。【解決手段】画像処理装置は、算出部と、補正部とを具備する。前記算出部は、第１のぼやけ画像と、第２のぼやけ画像とに基づき、前記観察領域に含まれるターゲットが染色されて得られる輝点の、前記試料内での前記光軸方向での深さを算出する。前記第１のぼやけ画像は、顕微鏡の対物レンズ及び試料を、前記対物レンズの光軸方向に沿って相対的に移動させて得られる、前記試料の少なくとも一部の観察領域の画像である。前記第２のぼやけ画像は、前記対物レンズ及び前記試料を、前記光軸方向の成分を含み前記光軸方向とは異なる方向に沿って相対的に移動させて得られる前記観察領域の画像である。前記補正部は、前記算出された前記輝点の深さの情報に基づき、前記第１のぼやけ画像を補正する。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡の対物レンズ及び試料を、前記対物レンズの光軸方向に沿って相対的に移動させて得られる、前記試料の少なくとも一部の観察領域の第１のぼやけ画像と、前記対物レンズ及び前記試料を、前記光軸方向の成分を含み前記光軸方向とは異なる方向に沿って相対的に移動させて得られる前記観察領域の第２のぼやけ画像とに基づき、前記観察領域に含まれるターゲットが染色されて得られる輝点の、前記試料内での前記光軸方向での深さを算出する深さ算出部と、
前記算出された前記輝点の深さの情報に基づき、前記第１のぼやけ画像を補正する補正部と
を具備する画像処理装置。
【請求項２】
請求項１に記載の画像処理装置であって、
前記補正部は、前記光軸方向の単位深さごとに設定された深さ補正パラメータを用いて、前記輝点の輝度を補正する
画像処理装置。
【請求項３】
請求項２に記載の画像処理装置であって、
前記輝点の光が有する波長領域を算出する波長算出部をさらに具備し、
前記補正部は、さらに、前記深さ補正パラメータ及び前記算出された波長領域の情報に基づき、前記輝点の輝度を補正する
画像処理装置。
【請求項４】
請求項１に記載の画像処理装置であって、
前記補正部は、前記第１のぼやけ画像の面内において、前記輝点の輝度のピーク値の位置からの距離に応じて設定されたシェーピング補正パラメータを用いて、前記輝点の輝度を補正する
画像処理装置。
【請求項５】
請求項１に記載の画像処理装置であって、
前記補正部により補正された前記輝点の輝度情報と、前記深さ算出部により算出された前記輝点の深さの情報とに基づき、前記ターゲットを含む前記観察領域の３次元画像を生成する３次元画像生成部をさらに具備する画像処理装置。
【請求項６】
請求項１に記載の画像処理装置であって、
前記ターゲットを含み、前記光軸方向で前記ターゲットの厚さより厚く、かつ、前記対物レンズ及び試料の前記光軸方向の相対的な移動範囲のすべてにわたって、前記試料内に連続して存在する、前記第１のぼやけ画像内のターゲットのぼやけ画像を補正する他の補正部をさらに具備する画像処理装置。
【請求項７】
顕微鏡の対物レンズ及び試料を、前記対物レンズの光軸方向に沿って相対的に移動させて得られる、前記試料の少なくとも一部の観察領域の第１のぼやけ画像と、前記対物レンズ及び前記試料を、前記光軸方向の成分を含み前記光軸方向とは異なる方向に沿って相対的に移動させて得られる前記観察領域の第２のぼやけ画像とに基づき、前記観察領域に含まれるターゲットが染色されて得られる輝点の、前記試料内での前記光軸方向での深さを算出し、
前記算出された前記輝点の深さの情報に基づき、前記第１のぼやけ画像を補正する
画像処理方法。
【請求項８】
顕微鏡の対物レンズ及び試料を、前記対物レンズの光軸方向に沿って相対的に移動させて得られる、前記試料の少なくとも一部の観察領域の第１のぼやけ画像と、前記対物レンズ及び前記試料を、前記光軸方向の成分を含み前記光軸方向とは異なる方向に沿って相対的に移動させて得られる前記観察領域の第２のぼやけ画像とに基づき、前記観察領域に含まれるターゲットが染色されて得られる輝点の、前記試料内での前記光軸方向での深さを算出し、
前記算出された前記輝点の深さの情報に基づき、前記第１のぼやけ画像を補正する
ことをコンピュータに実行させる画像処理プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、顕微鏡を用いて得られる画像を処理する画像処理装置、画像処理方法及び画像処理プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
病理診断等の分野において、生物組織の観察に用いられる手法として蛍光染色法がある。蛍光染色法は、予めサンプルに染色剤による染色を施し、それに励起光を照射して励起された染色剤から放射される蛍光を、蛍光顕微鏡を用いて観察する方法である。適切な染色剤を選択することにより、染色剤が化学的特異性を有する特定の組織（例えば細胞内小器官等）を観察することが可能である。染色剤として一種類が用いられる場合もあるが、化学的特異性及び蛍光色が異なる複数種の染色剤を用いることで複数の組織を異なる蛍光色で観察することが可能となる。
【０００３】
例えば細胞核に含まれるＤＮＡやＲＮＡ等の高分子が特定の染色剤によって染色され、これらが、蛍光顕微鏡により取得される画像（蛍光画像）内では、輝点として蛍光を発する。このような輝点の状態（数、位置、大きさ等）が、主に、病理学上の分析対象とされる。
【０００４】
例えば、特許文献１に記載の「微生物計量装置」は、サンプルから放射される蛍光を分光する分光フィルタを備え、モノクロイメージャを用いて所定の色毎に蛍光画像を取得するものである。蛍光画像に含まれる輝点は分光フィルタの透過波長に限定されるため、複数の染色剤を用いた場合であっても色毎に輝点を計数することが可能とされている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−３７２５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来までの、顕微鏡を用いた情報処理システムでは、扱われるデータ量が膨大であった。
【０００７】
以上のような事情に鑑み、本技術の目的は、データ量を削減することができる画像処理装置、画像処理方法及び画像処理プログラムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本技術に係る画像処理装置は、算出部と、補正部とを具備する。
前記算出部は、第１のぼやけ画像と、第２のぼやけ画像とに基づき、前記観察領域に含まれるターゲットが染色されて得られる輝点の、前記試料内での前記光軸方向での深さを算出する。前記第１のぼやけ画像は、顕微鏡の対物レンズ及び試料を、前記対物レンズの光軸方向に沿って相対的に移動させて得られる、前記試料の少なくとも一部の観察領域の画像である。前記第２のぼやけ画像は、前記対物レンズ及び前記試料を、前記光軸方向の成分を含み前記光軸方向とは異なる方向に沿って相対的に移動させて得られる前記観察領域の画像である。
前記補正部は、前記算出された前記輝点の深さの情報に基づき、前記第１のぼやけ画像を補正する。
【０００９】
深さ算出部は、第１及び第２のぼやけ画像に基づき、試料の観察領域内の輝点の深さを算出するので、データ量を削減することができる。
【００１０】
顕微鏡で得られる画像内の輝点のぼやけ度は、その輝点が位置する、試料内の光軸方向の深さ、つまり焦点深度に応じて変わるが、補正部は、試料内での算出された輝点の深さの情報に基づき、第１のぼやけ画像を補正する。これにより、輝点の輝度の定量化を図ることができる。
【００１１】
前記補正部は、前記光軸方向の単位深さごとに設定された深さ補正パラメータを用いて、前記輝点の輝度を補正してもよい。補正部は、深さ補正パラメータを用いることにより、容易に輝度の補正演算を実行することができる。
【００１２】
前記画像処理装置は、前記輝点の光が有する波長領域を算出する波長算出部をさらに具備してもよい。その場合、前記補正部は、さらに、前記深さ補正パラメータ及び前記算出された波長領域の情報に基づき、前記輝点の輝度を補正する。これにより、輝点の色（波長）によって対物レンズの焦点深度が異なることを補償することができる。
【００１３】
例えば、前記補正部は、前記第１のぼやけ画像の面内において、前記輝点の輝度のピーク値の位置からの距離に応じて設定されたシェーピング補正パラメータを用いて、前記輝点の輝度を補正してもよい。これにより、第１のぼやけ画像内の輝点のぼやけを補正することができる。
【００１４】
前記画像処理装置は、前記補正部により補正された前記輝点の輝度情報と、前記深さ算出部により算出された前記輝点の深さの情報とに基づき、前記ターゲットを含む前記観察領域の３次元画像を生成する３次元画像生成部をさらに具備してもよい。これにより、観察領域の３次元表示が可能となる。
【００１５】
前記画像処理装置は、前記第１のぼやけ画像内の、前記ターゲットを含む他のターゲットのぼやけ画像を補正する他の補正部をさらに具備してもよい。他のターゲットは、前記光軸方向で前記ターゲットの厚さより厚く、かつ、前記対物レンズ及び試料の前記光軸方向の相対的な移動範囲のすべてにわたって、前記試料内に連続して存在する。
【００１６】
本技術に係る画像処理方法は、第１のぼやけ画像と、２のぼやけ画像とに基づき、前記観察領域に含まれるターゲットが染色されて得られる輝点の、前記試料内での前記光軸方向での深さを算出することを含む。
【００１７】
前記第１のぼやけ画像は、顕微鏡の対物レンズ及び試料を、前記対物レンズの光軸方向に沿って相対的に移動させて得られる、前記試料の少なくとも一部の観察領域の画像である。前記第２のぼやけ画像は、前記対物レンズ及び前記試料を、前記光軸方向の成分を含み前記光軸方向とは異なる方向に沿って相対的に移動させて得られる前記観察領域の画像である。
そして、前記算出された前記輝点の深さの情報に基づき、前記第１のぼやけ画像が補正される。
【００１８】
本技術に係る画像処理プログラムは、上記の画像処理方法の各要素をコンピュータに実行させる。
【発明の効果】
【００１９】
以上、本技術によれば、データ量を削減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本技術の一実施形態に係る画像処理システムを示す図である。
【図２】図２は、ステージに載置される試料をステージの側面方向から示す図である。
【図３】図３は、画像処理装置の構成を示すブロック図である。
【図４】図４は、各染色剤による発光スペクトルの一例を示す図である。
【図５】図５は、エミッションフィルタの透過スペクトルの一例を示す図である。
【図６】図６は、各色の発光スペクトルごとのＲＧＢの輝度値のデータである。
【図７】図７は、画像処理装置の処理を示すフローチャートである。
【図８】図８は、Ｚ方向への焦点のスキャンの様子を示す図である。
【図９】図９は、焦点がＺ方向へ移動されながら露光処理が行われることで取得された試料の画像（第１の画像）を示す図である。
【図１０】図１０は、Ｚ方向及びＸ方向への焦点のスキャンの様子を示した図である。
【図１１】図１１は、焦点がＺ方向及びＸ方向へスキャンされながら露光処理が行われることで取得された試料の画像（第２の画像）を示す図である。
【図１２】図１２は、第１及び第２の画像とが合成された合成画像を示す図である。
【図１３】図１３は、図１２の合成画像を用いたターゲットの深さ位置の算出処理を示す図である。
【図１４】図１４は、単位深さごとに輝点の輝度が異なることを説明するための図である。
【図１５】図１５Ａは、輝度補正係数及びシェーピング補正係数を含む補正プロファイル（図１５Ｂ）を用いて、黒点で示したグラフの各マーカの輝点のぼやけが補正された結果を示す図である。
【図１６】図１６は、合焦点画像のリストデータの一例を示す。
【図１７】図１７は、３次元画像データの生成方法を説明するための図である。
【図１８】図１８は、他の実施形態に係るターゲットのぼやけ画像の補正処理を示すフローチャートである。
【図１９】図１９は、図１８に示した補正処理を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、図面を参照しながら、本技術の実施形態を説明する。
【００２２】
［画像処理システムの構成］
図１は、本技術の一実施形態に係る画像処理システムを示す図である。同図に示すように、本実施形態における画像処理システム１は、顕微鏡（蛍光顕微鏡）１０と、当該顕微鏡１０に接続された画像処理装置２０とを有する。
【００２３】
顕微鏡１０は、ステージ１１、光学系１２、明視野撮影用照明灯１３、光源１４及び撮像素子３０を有する。
【００２４】
ステージ１１は、例えば組織切片、細胞、染色体等の生体高分子等の試料（サンプル）ＳＰＬを載置可能な載置面を有し、当該載置面に対してその平行方向及び垂直方向（ＸＹＺ軸方向）へ移動可能とされている。
【００２５】
図２は、上記ステージ１１に載置される試料ＳＰＬをステージ１１の側面方向から示した図である。
【００２６】
同図に示すように、試料ＳＰＬは、Ｚ方向に約４〜８μmの厚さ（深さ）を有し、スライドガラスＳＧ及びカバーガラスＣＧに挟まれて所定の固定手法により固定され、必要に応じて、試料ＳＰＬ内の観察の対象物が染色される。染色剤は、同一の光源１４から照射される励起光によって、異なる蛍光を発する複数の染色剤から選択される。図４は、各染色剤による発光スペクトルの一例である。蛍光染色は、例えば試料ＳＰＬ中の特定のターゲットをマーキングするために行われる。蛍光染色されたターゲットは、同図では、蛍光マーカＭ（Ｍ１、Ｍ２）として表され、当該蛍光マーカＭは、顕微鏡で取得された像では、輝点として表れる。
【００２７】
図１に戻り、光学系１２は、ステージ１１の上方に設けられ、対物レンズ１２Ａ、結像レンズ１２Ｂ、ダイクロイックミラー１２Ｃ、エミッションフィルタ１２Ｄ及び励起フィルタ１２Ｅを有する。
【００２８】
対物レンズ１２Ａ及び結像レンズ１２Ｂは、上記明視野撮影用照明灯１３により得られた試料ＳＰＬの像を所定の倍率に拡大し、当該拡大像を撮像素子３０の撮像面に結像させる。この拡大像が、試料内の少なくとも一部の領域の画像であり、顕微鏡１０による観察領域の画像である。なお、明視野撮影用照明灯１３を用いて資料ＳＰＬの像の観察を行う場合には、ダイクロイックミラー１２Ｃ、エミッションフィルタ１２Ｄを光路より除くことにより、より忠実な色情報を持った画像観察を行うことができる。
【００２９】
励起フィルタ１２Ｅは、光源１４から出射された光のうち、蛍光色素を励起する励起波長の光のみを透過させることで励起光を生成する。ダイクロイックミラー１２Ｃは、当該励起フィルタで透過されて入射する励起光を反射させて対物レンズ１２Ａへ導く。対物レンズ１２Ａは、当該励起光を試料ＳＰＬへ集光する。
【００３０】
スライドガラスＳＧに固定された試料ＳＰＬに蛍光染色が施されている場合、上記励起光により蛍光色素が発光する。この発光により得られた光（発色光）は、対物レンズ１２Ａを介してダイクロイックミラー１２Ｃを透過し、エミッションフィルタ１２Ｄを介して結像レンズ１２Ｂへ到達する。
【００３１】
エミッションフィルタ１２Ｄは、上記対物レンズ１２Ａによって拡大された発色光以外の光（外光）を吸収する。エミッションフィルタ１２Ｄによって外光が喪失された発色光の像は、上述のとおり、結像レンズ１２Ｂにより拡大され、撮像素子３０上に結像される。
【００３２】
図５は、エミッションフィルタ１２Ｄの透過スペクトルの一例である。図４に示した、蛍光染色による各色の発光スペクトルは、このエミッションフィルタ１２Ｄによりフィルタリングされ、後述する撮像素子３０のＲＧＢ（Red、Green、Blue）カラーフィルタにより、さらにフィルタリングされる。
【００３３】
図６は、そうして生成された各色の発光スペクトルごとのＲＧＢの輝度値のデータ、すなわち蛍光色素が発光する光が撮像素子３０のＲＧＢカラーフィルタによりそれぞれ吸収されカラー信号を形成した場合のＲＧＢの輝度値の比率を示すデータである。ＲＧＢ輝度値データは、この画像処理装置２０（またはこれにインストールされるソフトウェア）の工場出荷時に、予め記憶されている。しかし、画像処理装置２０は、ＲＧＢ輝度値のデータを作成するプログラムを有していてもよい。
【００３４】
明視野撮影用照明灯１３は、ステージ１１の下方に設けられ、ステージ１１に設けられた開口（図示せず）を介して、上記載置面に載置された試料ＳＰＬへ照明光を照射する。
【００３５】
撮像素子３０としては、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device）やＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）等が用いられる。撮像素子３０は、上記のようにＲＧＢカラーフィルタを有する素子であり、入射光をカラー画像として出力するカラーイメージャである。撮像素子３０は、顕微鏡１０と一体的に設けられていてもよいし、顕微鏡１０に接続可能な撮像装置（デジタルカメラ等）内に設けられていてもよい。
【００３６】
画像処理装置２０は、例えばＰＣ（Personal Computer）により構成され、撮像素子３０により生成された試料ＳＰＬの像を、例えばＪＰＥＧ（Joint Photographic Experts Group）等の所定形式のデジタル画像データ（バーチャルスライド）として保存する。
【００３７】
［画像処理装置の構成］
図３は、上記画像処理装置２０の構成を示したブロック図である。
【００３８】
同図に示すように画像処理装置２０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）２１、ＲＯＭ（Read Only Memory）２２、ＲＡＭ（Random Access Memory）２３、操作入力部２４、インターフェイス部２５、表示部２６及び記憶部２７を有し、これら各ブロックがバス２８を介して接続されている。
【００３９】
ＲＯＭ２２は、各種の処理を実行するためのファームウェア等の複数のプログラムやデータを固定的に記憶する。ＲＡＭ２３は、ＣＰＵ２１の作業用領域として用いられ、ＯＳ（Operating System）、実行中の各種アプリケーション、処理中の各種データを一時的に保持する。
【００４０】
記憶部２７は、例えばＨＤＤ（Hard Disk Drive）や、フラッシュメモリ、その他の固体メモリ等の不揮発性メモリである。当該記憶部２７には、ＯＳや各種アプリケーション、各種データが記憶される。特に本実施形態では、記憶部２７には、顕微鏡１０から取り込まれた画像データや、当該画像データを処理して試料ＳＰＬにおけるターゲットの輝点の深さ（Ｚ軸方向（対物レンズ１２Ａの光軸方向）での高さ）を算出するための画像処理アプリケーションも記憶される。
【００４１】
インターフェイス部２５は、当該画像処理装置２０を、上記顕微鏡１０のステージ１１、光源１４及び撮像素子３０とそれぞれ接続し、所定の通信規格により顕微鏡１０との間で信号をやり取りする。
【００４２】
ＣＰＵ２１は、ＲＯＭ２２や記憶部２７に格納された複数のプログラムのうち、操作入力部２４から与えられる命令に対応するプログラムをＲＡＭ２３に展開し、当該展開されたプログラムにしたがって、表示部２６及び記憶部２７を適宜制御する。特に本実施形態においては、ＣＰＵ２１は、上記画像処理アプリケーションにより、上記試料ＳＰＬにおけるターゲットの深さの算出処理を実行する。この際、ＣＰＵ２１は、上記インターフェイス部２５を介して、ステージ１１、光源１４及び撮像素子３０を適宜制御する。
【００４３】
ＣＰＵ２１の代わりとして、ＦＰＧＡ（Field Programmable Gate Array）等のＰＬＤ(Programmable Logic Device)、その他ＡＳＩＣ（Application Specific Integrated Circuit）等のデバイスにより実現されてもよい。
【００４４】
操作入力部２４は、例えばマウス等のポインティングデバイス、キーボード、タッチパネル、その他の操作装置である。
【００４５】
表示部２６は、画像処理装置２０に一体的に設けられていてもよいし、画像処理装置２０に外部接続されていてもよい。
【００４６】
［画像処理システムの動作］
以上のように構成された顕微鏡の動作及び画像処理装置２０の処理について説明する。図７は、画像処理装置２０の処理を示すフローチャートである。画像処理装置２０の処理は、記憶デバイス（ＲＯＭ２２や記憶部２７等）に記憶されたソフトウェアプログラムと、ＣＰＵ２１等のハードウェア資源との協働により実現される。以下では、便宜的に、処理の主体をＣＰＵ（ＣＰＵ２１）として説明する。
【００４７】
蛍光染色された例えば図２に示したような試料ＳＰＬが、ユーザにより顕微鏡１０のステージ１１に載置される。ＣＰＵは、その試料ＳＰＬ内の輝点として現れる蛍光マーカＭの色を検出し(ステップ１０１)、その波長を特定する(ステップ１０２)。この場合、ＣＰＵは、波長算出部として機能する。
【００４８】
ステップ１０１及び１０２では、実際には、ＣＰＵは、撮像素子３０で得られる画素値（輝度値）のデータを取得し、図６に示したテーブルを参照することにより、その画素値がどの蛍光色（波長領域）に属するかを求めることができる。この場合、ＣＰＵは、蛍光色の各波長領域をそれぞれ代表する１つの波長を選択してもよい。
【００４９】
ＣＰＵは、図６に示したテーブルを用いずに、その画素値に基づき所定のアルゴリズムによる演算によって、波長を算出してもよい。
【００５０】
一方、ＣＰＵは、蛍光マーカＭ１、Ｍ２の光軸方向（Ｚ軸方向）の深さを算出する(ステップ１０３)。この場合、主にＣＰＵは深さ算出部として機能する。以下、この深さの算出方法について説明する。
【００５１】
＜輝点の深さの算出＞
試料ＳＰＬがステージ１１に載置された後、ＣＰＵは、ステージ１１の垂直方向（Ｚ軸方向）における初期位置を設定する。
【００５２】
図８に示すように、当該初期位置ＤＰ（Default Position）は、対物レンズ１２Ａの焦点面ＦＰの位置が、深さ方向において、試料ＳＰＬが存在する範囲の外（上方または下方）となるように、すなわち、撮像素子３０の露光工程において、焦点の移動範囲（スキャン範囲）が試料ＳＰＬの全ての面に亘るような位置に設定される。
【００５３】
続いてＣＰＵは、図８に矢印で示すように、ステージ１１（すなわち焦点）を、上記初期位置ＤＰから垂直方向（Ｚ軸方向）へ所定速度で等速移動させながら撮像素子３０を露光させることで、試料ＳＰＬを撮影する。ここでＣＰＵは、スキャン範囲が試料ＳＰＬの全ての面に亘るような位置を当該移動の終了位置ＥＰ（End Point）として設定する。すなわち、初期位置ＤＰから終了位置ＥＰまでの範囲に試料ＳＰＬが全て収まるように（試料ＳＰＬの厚さよりもスキャン範囲が長くなるように）初期位置ＤＰ及び終了位置ＥＰが設定される。
【００５４】
図９は、上記のように焦点がスキャンされながら露光処理が行われることで取得された試料ＳＰＬの画像（第１のぼやけ画像）を示した図である。同図に示すように、第１のぼやけ画像６０においては、上記蛍光マーカＭ１が輝点Ａの像として表れ、上記蛍光マーカＭ２が輝点Ｂの像として表れる。
【００５５】
ここで、第１のぼやけ画像６０は、試料ＳＰＬのＺ軸方向への焦点のスキャンを伴いながら露光され撮影された画像であるため、蛍光マーカＭ１及びＭ２に焦点が合っている焦点面ＦＰにおける像とそうでない像とが重なった画像となる。したがって輝点Ａ及びＢの像は、周囲が多少ぼやけた画像となるが、それらの位置は明確に把握可能な程度に表れる。
【００５６】
ＣＰＵは、上記第１のぼやけ画像６０を撮像素子３０から上記インターフェイス部２５を介して取得し、ＲＡＭ２３に一旦保存する。
【００５７】
続いてＣＰＵは、ステージ１１のＺ軸方向の位置を上記初期位置ＤＰに戻す。
【００５８】
図１０は、次に行われるＺ及びＸ軸方向への焦点のスキャンの様子を示した図である。
【００５９】
ＣＰＵは、図１０に示すように、ステージ１１（焦点）を、上記初期位置ＤＰから上記終了位置ＥＰまで、Ｚ軸方向へ上記第１の速度（Vz）で等速移動させるとともにＸ軸方向へ第２の速度（Vx）で等速移動させながら、撮像素子３０を露光させることで、試料ＳＰＬを撮影する。すなわち、今回は、ステージ１１は、光軸方向の成分を含み光軸方向とは異なる方向に沿って移動する。
【００６０】
図１１は、上記のように焦点がＺ軸方向及びＸ軸方向へスキャンされながら露光処理が行われることで取得された試料ＳＰＬの画像（第２のぼやけ画像）を示した図である。同図に示すように、第２のぼやけ画像８０においては、試料ＳＰＬにおける焦点位置の変化毎の像の軌跡が１枚の画像中に表れる。すなわち、蛍光マーカＭ１及びＭ２を表す輝点Ａ及び輝点Ｂの像はそれぞれ、上記Ｘ軸方向への焦点のスキャンに伴い、ぼやけた大きな状態から、焦点が合いはっきりとした小さな状態へと変化していき、その後またぼやけた状態へと変化するように表れる。
【００６１】
ＣＰＵは、上記第２のぼやけ画像８０を撮像素子３０から上記インターフェイス部２５を介して取得し、ＲＡＭ２３に一旦保存する。
【００６２】
続いてＣＰＵは、上記第１のぼやけ画像６０と、第２のぼやけ画像８０とを合成して合成画像を生成する。
【００６３】
図１２は、上記合成画像を示した図である。同図に示すように、合成画像９０においては、上記取得された第１のぼやけ画像６０に表れた輝点Ａ及び輝点Ｂ（輝点Ａ１及び輝点Ｂ１）の像と、上記取得された第２のぼやけ画像８０に表れた輝点Ａ及び輝点Ｂ（輝点Ａ２及び輝点Ｂ２）の像とが１枚の画像内で、それぞれ同一直線上に表れている。
【００６４】
続いてＣＰＵは、上記合成画像９０から、上記第１のぼやけ画像６０における輝点Ａ１及びＢ１の各位置座標（Ａ１:(XA1,YA)、Ｂ１:(XB1,YB)）と、上記第２のぼやけ画像８０における輝点Ａ２及びＢ２の各位置座標（Ａ２:(XA2,YA)、Ｂ２:(XB2,YB)）を検出する。ここで、各輝点の検出は、ＣＰＵが、例えば、所定閾値以上の輝度値（蛍光強度）を有する複数の画素のまとまりを抽出し、そのうち最も輝度が高い画素の位置を検出することで行われる。ターゲットに応じて異なる色の蛍光染色が施されている場合には、ＣＰＵは、当該異なる色毎に輝度を検出する。
【００６５】
続いてＣＰＵは、上記検出した第１及び第２のぼやけ画像におけるそれぞれの輝点間の距離D:(DA, DB)を算出する。すなわち、図１２において、ＣＰＵは、輝点Ａ１:(XA1,YA)と輝点Ａ２:(XA2,YA)との間の距離DA:(XA1-XA2)、及び、輝点Ｂ１:(XB1,YB)と輝点Ｂ２:(XB2,YB)との間の距離DB:(XB1-XB2)とをそれぞれ算出する。
【００６６】
そして、ＣＰＵは、上記距離Dと、上記Ｚ軸方向への焦点の移動速度である上記第１の速度Vzと、Ｘ軸方向への焦点のスキャン速度である上記第２の速度Vxとを基に、上記各蛍光マーカＭの試料ＳＰＬ中における深さhを算出する。
【００６７】
図１３は、図１２の合成画像９０を用いた蛍光マーカＭの高さの算出処理を示した図である。ここで、ステージ１１が移動し始めてから輝点Ａに焦点が合うまでの時間tAは、tA＝hA／Vzにより算出される（hAは試料ＳＰＬにおける輝点Ａの高さ）。
【００６８】
そして、上記距離DA及び距離DBは、以下の式によっても表される。
DA=tA・Vx=Vx・hA/Vz=hA・Vx/Vz
DB=hB・Vx/Vz
【００６９】
これを変形すると、輝点Ａ及びＢの各深さhA及びhBは、以下の式により算出できることになる。
hA=DA・Vz/Vx
hB=DB・Vz/Vx
【００７０】
ＣＰＵは、当該各式に基づいて輝点Ａ及びＢの各深さhA及びhBを算出し、当該算出により得られる情報を輝点毎に例えば表示部２６へ出力する。各輝点の深さが算出されることで、例えば輝点Ａにより表される蛍光マーカＭ１と、輝点Ｂにより表される蛍光マーカＭ２とが同一組織（細胞）内に存在するのか否かが判別可能となる。また、当該蛍光マーカＭ１と蛍光マーカＭ２との３次元距離も検出可能となる。上記画像処理システムのオペレータは、当該算出結果を、例えば各種の病理診断材料や新薬研究等に利用することができる。
【００７１】
ここで、上記第２の速度Vxは、上記第１の速度Vzよりも大きく設定される。これは、合成画像９０において、第２のぼやけ画像８０由来の輝点Ａの像及び輝点Ｂの像からそれぞれ焦点が合った位置の座標（Ａ２及びＢ２）を特定する際に、ぼやけた像の重複範囲が大きいと、各像の分離が困難になり、上記座標（Ａ２及びＢ２）の特定が容易ではなくなるからである。
【００７２】
また、図１３に示すように、輝点Ａ及びＢの各深さhA及びhBは、焦点の初期位置ＤＰから輝点までの距離として算出される。したがって、試料ＳＰＬ内のみを基準にした正確な高さを算出するには、当該初期位置ＤＰから、スライドガラスＳＧと試料ＳＰＬとの境界線までの距離に相当する長さを、上記算出された各深さhA及びhBから減じればよい。
【００７３】
なお、ＣＰＵは、得られた各画素の輝度値が、予め設定された閾値を超えるか否かによって、第１のぼやけ画像６０内のぼやけた輝点の画像を構成する画素群を特定することができる。つまり、これによりＣＰＵは、第１のぼやけ画像６０内のこの画素群の画像が１つのぼやけた輝点の画像である、と認識することができる。
【００７４】
以上のステップ１０１〜１０３の処理の順序はこの順序に限られず、例えばステップ１０３がステップ１０１または１０２より先に実行されてもよい。
【００７５】
＜ぼやけ画像の補正＞
図７を参照して、ＣＰＵは、算出された輝点ごとの深さの情報に基づき、Ｚ軸方向の焦点のスキャンにより得られた第１のぼやけ画像６０のぼやけを補正する(ステップ１０４〜１０８)。この場合、主にＣＰＵは補正部として機能する。
【００７６】
ＣＰＵは、単位深さごとの深さ補正係数（深さ補正パラメータ）を算出する(ステップ１０４)。一例としては、深さ方向の中心位置が0、それより±1μmの深さ方向で離れた位置では+1、それより±2μmの深さ方向で離れた位置では+2、・・・などというように、深さ補正係数が予め単位深さごとに所定の値に設定される。単位深さは1μmに限られない。
【００７７】
図１４は、単位深さごとに輝点の輝度が異なることを説明するための図である。
【００７８】
図１４に示すように、例えば焦点のスキャン範囲が5μmである場合において、そのスキャン範囲の中心位置にマーカ（蛍光マーカ）３が存在し、その中心位置から±1μmずつ深さ方向に離れた位置にあるマーカ１、２、４、５が存在するとする。この場合、図１５Ａに示すように、ＣＰＵは、マーカ１〜５の輝点について各画素の輝度分布（黒点を結ぶ示すグラフ）を得ることができる。ここで、マーカ１〜５の発光色はすべて同じであるとする。図１５Ａにおいて、横軸は第１のぼやけ画像のX位置（またはY位置）（画素位置）であり、縦軸は輝度（輝度ピーク値を２００とした規格値）である。
【００７９】
図１５Ａの黒点のグラフに示すように、マーカ２、３、４の輝点が最も高い輝度ピーク値を有し、このマーカ３のスキャン範囲内での存在位置である中心位置から離れるにしたがって、それらのマーカの輝点の輝度ピーク値は低くなっていく。なお、この例では、マーカ２の輝度ピーク値と、マーカ３及び４の輝度ピーク値とが同じであるが、マーカ２の輝度ピーク値の方がマーカ３及び４のそれよりも高い場合もある。
【００８０】
このように第１のぼやけ画像６０において、輝点が存在する深さの違いにより、その輝度値が異なるのは、次のような理由による。
【００８１】
焦点がスキャンされている間、つまり撮像素子３０が露光されている間、マーカ１〜５のうち、焦点が合っている（合焦点）及びそれに近い状態にある合計時間が最長であるマーカは、中央位置にあるマーカ３である。その合計時間が長いほど、輝点の輝度ピーク値は高くなる。中央位置から離れるほど、合焦点及びそれに近い状態にある合計時間が短いので、その輝度ピーク値は低くなる。したがって、スキャンにより得られた第１のぼやけ画像６０の輝度分布は、図１５Ａの黒点のグラフのようになる。
【００８２】
なお、図１５Ａに示した例では、２次元的に輝度分布を得ているが、実際には撮像素子３０はX-Yの２次元で配列された画素を持つので、ＣＰＵは３次元の輝度分布を得ることができる。理解を容易にするため、図１５Ａのように輝度分布を２次元（ここではX-Z）で表している。
【００８３】
このように、輝点が存在する深さの違いによって輝度ピーク値が異なるので、ＣＰＵはこの輝度ピーク値を定量化するため、上記のように深さ補正係数を生成する。
【００８４】
深さ補正係数はこのように予め設定されている場合に限られない。例えばＣＰＵは、第１のぼやけ画像６０内で、複数の輝点の輝度ピーク値のうち、最も高い輝度ピーク値と、最も低い輝度ピーク値との差を算出し、その差に基づく、単位深さごとの深さ補正係数を算出してもよい。
【００８５】
続いてＣＰＵは、輝度補正係数を算出する（ステップ１０５）。
【００８６】
ＣＰＵは、ステップ１０２及び１０４でそれぞれ得られた輝点の波長（波長係数）及び深さ補正係数、また、対物レンズ１２ＡのNA（Numerical Aperture）に基づき、第１のぼやけ画像６０内の輝点Ａ１及びＡ２の各輝度を補正するための輝度補正係数（輝度補正パラメータ）を算出する。輝度補正係数の算出には、算出された波長のデータが用いられる。
【００８７】
輝点の波長のデータを用いる理由は、輝点の波長によって対物レンズ１２Ａの焦点深度が異なり、それにより輝点のぼやけ度、すなわち輝度が異なるからである。焦点深度dは、d=λ/NA2である。λは波長である。例えば同じ深さに波長の異なる２つの輝点が存在する仮定した場合、それらの輝点のうち一方に焦点が合っていても、他方には焦点が合わずにぼやけるので、その分輝度が異なる。したがって、ＣＰＵは波長に依存する波長係数を選択する。
【００８８】
一例として、光の全波長領域のうち500〜550nmの中心の波長の波長係数を0とする場合に、その中心波長領域から、単位波長領域分（例えば50nm）離れるごとに所定の値増える、といったように波長係数が設定される。波長係数は、単位波長ごとに予め所定の値に設定されていればよい。
【００８９】
そして、ＣＰＵは、深さ補正係数及び波長係数に基づいて、輝度補正係数を算出する。例えば、ＣＰＵは、深さ補正係数に波長係数を乗算したり、深さ補正パラメータ及び波長補正のためのパラメータを用いて所定のアルゴリズムにより演算したりすることにより、第１のぼやけ画像６０の輝点Ａ１及びＡ２の輝度値を定量化するための輝度補正係数を算出する。すなわち、ＣＰＵは、実質的に同じ深さに存在する同じ波長領域を有する輝点の輝度ピーク値が実質的に一致するように、輝度補正係数を算出する。
【００９０】
続いてＣＰＵは、シェーピング補正係数（シェーピング補正パラメータ）を算出する（ステップ１０６）。
【００９１】
シェーピング補正係数は、第１のぼやけ画像６０の面内において、輝点の輝度ピーク値が存在する位置からの距離に応じて設定される。すなわち、輝点の輝度のピーク値が存在する位置（以下、ピーク位置という。）は、第１のぼやけ画像６０内で、ぼやけが発生している輝点の中心位置と実質的に一致する。
【００９２】
シェーピング補正係数は、ピーク位置からの距離に応じて、予め設定されていてもよい。その場合、単位深さごとにシェーピング補正係数が設定されていてもよい。また、その場合、実質的に同じ深さに存在する同じ波長領域を有する輝点の輝度分布が実質的に一致するような、シェーピング補正係数が設定される。
【００９３】
あるいは、第１のぼやけ画像６０内の１つの輝点のうち、ピーク位置からの距離が遠いほど、輝度が小さくなるので、ＣＰＵは、そのピーク位置から輝度の変化率に応じてシェーピング補正係数を算出してもよい。
【００９４】
なお、ステップ１０７において、ピーク位置の算出方法としては、第１のぼやけ画像６０内の画素内で、予め設定された閾値を超えた輝度値を持つ画素のうち、最大輝度値を持つ画素が、ピーク位置として抽出されればよい。上記閾値は、第１のぼやけ画像６０内で、最大輝度値と最小輝度値との差を算出し、その差に基づいて算出されてもよい。
【００９５】
続いてＣＰＵは、上記算出された輝度補正係数及びシェーピング補正係数を用いて、第１のぼやけ画像６０の輝点Ａ１及びＡ２のぼやけを補正する（ステップ１０７）。これにより、輝点Ａ１及びＡ２の合焦点画像が得られる。例えばＣＰＵは、繰り返し減算による画像フィッティングを行うことにより、合焦点画像を得ることができる。
【００９６】
図１５Ａは、輝度補正係数及びシェーピング補正係数を含む補正プロファイル（図１５Ｂ）を用いて、黒点で示したグラフのマーカ１〜５の輝点のぼやけが補正された結果を示す図である。図１５Ｂにおいて、横軸は図１５Ａに対応する、第１のぼやけ画像のX位置（またはY位置）（画素位置）であり、縦軸は補正係数である。
【００９７】
図１５Ａに示すように、黒点で示されたぼやけ画像の輝度分布が、図１５Ｂに示した補正係数（輝度補正係数及びシェーピング補正係数）で加工（ここでは乗算）されることにより、図１５Ａにおいて白点で示された合焦点画像（ぼやけが抑制された画像）が生成される。
【００９８】
続いてＣＰＵは、第１のぼやけ画像６０内のぼやけた輝点Ａ１及びＡ２の画像を、上記ぼやけ補正により得られた輝点Ａ１及びＡ２の合焦点画像に部分的に置き換える（ステップ１０８）。これにより第１のぼやけ画像６０に対応する、ぼやけが補正された、つまり合焦点時の輝点Ａ１及びＡ２を含む画像が生成される。
【００９９】
以上のように、本実施形態では、第１のぼやけ画像６０及び第２のぼやけ画像８０に基づき、試料の観察領域内の輝点の深さが算出されるので、データ量を削減することができる。具体的には、光軸方向にステージ１１をステップ送りで移動させながら、そのステップ送りごとに画像を何枚も撮影して記憶しておく形態に比べ、本実施形態では、第１のぼやけ画像６０及び第２のぼやけ画像８０の２つの画像を記憶しておくだけで、輝点の深さを算出できる。これにより、データ量を削減することができる。
【０１００】
顕微鏡１０で得られる蛍光画像内の輝点のぼやけ度は、その輝点が位置する、試料内の光軸方向の深さ、つまり焦点深度に応じて変わるが、本実施形態では、試料内での算出された輝点の深さの情報に基づき、第１のぼやけ画像６０が補正される。これにより、輝点の輝度の定量化を図ることができる。
【０１０１】
本実施形態では、ＣＰＵは、深さ補正係数を用いて輝度を補正することにより、容易に輝度の補正演算を実行することができる。
【０１０２】
本実施形態において、輝度補正係数及びシェーピング補正係数がそれぞれ予め設定されている場合、図１５Ｂに示したような、単位深さごと（及び波長領域ごと）の補正プロファイルが予め記憶デバイスに記憶される。そして、ＣＰＵは、算出した輝点の波長及び深さに基づき、ルックアップテーブル方式で適宜これらの補正プロファイルから１つの補正プロファイルを選択して、第１のぼやけ画像６０内の輝点のぼやけを補正すればよい。
【０１０３】
[合焦点画像のリストデータ]
図１６は、上記ステップ１０８で生成された合焦点画像のリストデータの一例を示す。
・この例では、２つの輝点（輝点ナンバー1,2）のリストを示す。
・輝点のX,Y位置は、輝点中心（輝点のうち最大輝度の）画素位置を示す。
・補正前後の色（ＲＧＢ輝度値）は、輝点の輝度ピーク値を示す。
・蛍光マーカ分類とは、上記ステップ１０１での色検出の結果、その色であることが、最も可能性の高いと考えられる蛍光マーカの種類である。
・蛍光強度とは、すなわち、中心位置の深さに存在する輝点の輝度（標準輝度）を1.00とした場合に、その中心位置から離れた深さに存在する輝点の輝度は、その標準輝度の何倍か、を示す。したがって、この例では、２つの輝点の補正後のＲＧＢ輝度値が、補正前のＲＧＢ輝度値の1.2倍、0.9倍になっている。
【０１０４】
[３次元画像データの作成方法]
ＣＰＵは、上記の第１のぼやけ画像６０の補正後に、３次元画像を生成することも可能である。この場合、主にＣＰＵは３次元画像生成部として機能する。
【０１０５】
図１７は、３次元画像データの生成方法を説明するための図である。ＣＰＵは、上記したようにステップ１０７及び１０８で第１のぼやけ画像６０の輝点のぼやけを補正することにより、合焦点画像６１を得る。なお、上記の説明では、観察領域内には２つの輝点Ａ１及びＡ２が存在していたが、ここでの説明では、深さが-3μm、0μm（スキャン範囲の中心位置）、+2μmの３つの輝点Ａ〜Ｃが観察領域内に存在するものとする。
【０１０６】
ＣＰＵは、左及び右目用の画像の生成のため、合焦点画像６１をコピーし、左目用画像６２及び右目用画像６３を生成する。
【０１０７】
基準の輝点Ａ（深さ0μm）と比較して、対物レンズ１２Ａに遠い輝点Ｂ（-3μm）については、次のように補正される。すなわち、ＣＰＵは、輝点Ｂの合焦点画像を、その基準からの深さ（-3μm）に応じて、左目用画像については左にシフトさせ、右目用画像については右にシフトさせる。
【０１０８】
一方、基準の輝点Ａと比較して、対物レンズ１２Ａに近い輝点Ｃ（+2μm）については、次のように補正される。すなわち、ＣＰＵは、輝点Ｃの合焦点画像を、その基準からの深さ（+2μm）に応じて、左目用画像については右にシフトさせ、右目用画像については左にシフトさせる。
【０１０９】
輝点Ｂ、Ｃの合焦点画像のシフト量については、次のように設定することができる。例えば、単位深さ（例えば1μm）当りの横方向へのシフト量を10ピクセルなどとすると、輝点Ｂの合焦点画像のシフト量は30ピクセル、輝点Ｃの合焦点画像のシフト量は20ピクセルというように設定することができる。なお、輝点Ａの位置は、そのままである。
【０１１０】
[他の実施形態に係る、ターゲットのぼやけ画像の補正]
図１８は、他の実施形態に係るターゲットのぼやけ画像の補正処理を示すフローチャートである。
【０１１１】
上記実施形態では、蛍光染色された場合、比較的高い輝度を発生する、例えばＤＮＡやＲＮＡ等の高分子がターゲットであった。本実施形態では、蛍光染色された場合に、ステージ１１のスキャン範囲のすべてにわたって、試料ＳＰＬ内に連続して存在するターゲットのぼやけ画像の補正を説明する。ここでのターゲットは、典型的には、そのＤＮＡやＲＮＡ等の高分子のターゲットを含む「細胞核」である。すなわち、典型的には、この場合の染色は対比染色を意味する。
【０１１２】
図１９は、この補正処理を説明するための図である。
【０１１３】
一般に、細胞核ＣＬの光軸方向の厚さは、あるいは、上記ＤＮＡやＲＮＡ等の高分子のターゲットＴの光軸方向の厚さに比べ、十分に厚い。したがって、細胞核ＣＬに対比染色が行われることにより、顕微鏡１０は、ステージ１１を光軸方向でスキャンさせた場合に、そのスキャン範囲のすべてにわたって、その細胞核ＣＬの周囲６０ａの輝度よりも高い輝度で、その細胞核ＣＬの画像を得ることができる。
【０１１４】
しかしながら、ＤＮＡやＲＮＡ等の高分子のターゲットＴを観察する時の倍率（高倍率）で、その細胞核ＣＬが観察される場合、スキャン範囲内では対物レンズ１２Ａの焦点がその細胞核ＣＬに合わない。したがって、図１９の上図に示すように、例えば第１のぼやけ画像６０内で得られる細胞核ＣＬの画像は、その細胞核ＣＬの周囲６０ａの輝度より高い一様（近似的に一様）な輝度で、うっすらとぼやけた状態で取得される。しかし、この細胞核ＣＬの染色として現れる一様な輝度は、ＤＮＡやＲＮＡ等の高分子のターゲットＴの輝点の輝度より低くなる。
【０１１５】
ＣＰＵは、例えば第１のぼやけ画像６０に基づき、このような細胞核ＣＬが存在する領域を検出する。この場合、ＣＰＵは他の補正部として機能する。
【０１１６】
図１８に示すように、ＣＰＵは、対比染色された蛍光色を検出する（ステップ２０１）。この処理は、上記ステップ１０１（図７参照）と同様の処理である。
【０１１７】
続いてＣＰＵは、細胞核ＣＬとその周囲６０ａとの境界を検出する（ステップ２０２）。この領域検出は、エッジ検出技術が用いられてもよい。エッジ検出では、第１のぼやけ画像６０内で、細胞核ＣＬの一様な輝度を持つ画素位置から、徐々にその輝度が低く変化する、あるいは別の輝度へ変化するような画素領域（その輝度変化率が閾値以上の画素領域）が検出される。
【０１１８】
続いてＣＰＵは、その画素領域をシェーピング処理により補正する（ステップ２０３）。シェーピング処理により、その画素領域に対応する画像が、その細胞核ＣＬの輪郭が強調された画像６１に置き換えられる。
【０１１９】
シェーピング処理は、上記ステップ１０６（図７参照）におけるシェーピング補正係数を用いてステップ１０７のぼやけ補正処理を行う方法と同様の方法が用いられる。この場合、細胞核ＣＬの輝度値の基準位置は、第１のぼやけ画像６０内において、細胞核ＣＬ全体の輝度値のうちのピーク値を有する画素位置であってもよいし、上記閾値以上の輝度変化率を有する画素領域内の輝度ピーク値であってもよい。
【０１２０】
これにより、細胞核レベルのサイズを有するターゲットの場合、そのターゲットの深さ情報によらずに、そのぼやけ画像を補正することができる。
【０１２１】
[その他の実施形態]
本技術は、以上説明した実施形態に限定されず、他の種々の実施形態が実現される。
【０１２２】
画像処理装置２０は、第２の画像８０の取得に際し、ステージ１１をＸ（Ｙ）方向に移動させることで焦点を移動させた。しかし、画像処理装置２０は、撮像素子３０をＸ（Ｙ）方向に移動させる機構を設けて、当該機構を用いて、ステージ１１ではなく撮像素子３０の移動により焦点を移動させてもよい。あるいはこれらの両方が移動してもよい。
【０１２３】
上記実施形態においては、蛍光顕微鏡が用いられたが、蛍光顕微鏡以外の顕微鏡が用いられてもよい。この場合、ターゲットは蛍光染色されていなくともよく、何らかのマーキング手法でマーキングされ、輝点として観察可能であればよい。
【０１２４】
上記実施形態においては、顕微鏡及び画像処理装置をそれぞれ別体としたが、これらは１つの装置として一体的に設けられていてもよい。
【０１２５】
撮像素子は、３色のＲＧＢカラーフィルタに限られず、４色、あるいは５色以上のカラーフィルタを備えていてもよい。
【０１２６】
上記実施形態では、深さhA及びhBが算出されたが、距離DA及びDBが深さhA及びhBにそれぞれ比例する値であるので、これらのステップ１０４以降の処理を行う上では、距離DA及びDBが規格化された深さとして取り扱われるようにしてもよい。
【０１２７】
以上説明した各形態の特徴部分のうち、少なくとも２つの特徴部分を組み合わせることも可能である。
本技術は以下のような構成もとることができる。
（１）顕微鏡の対物レンズ及び試料を、前記対物レンズの光軸方向に沿って相対的に移動させて得られる、前記試料の少なくとも一部の観察領域の第１のぼやけ画像と、前記対物レンズ及び前記試料を、前記光軸方向の成分を含み前記光軸方向とは異なる方向に沿って相対的に移動させて得られる前記観察領域の第２のぼやけ画像とに基づき、前記観察領域に含まれるターゲットが染色されて得られる輝点の、前記試料内での前記光軸方向での深さを算出する深さ算出部と、
前記算出された前記輝点の深さの情報に基づき、前記第１のぼやけ画像を補正する補正部と
を具備する画像処理装置。
（２）請求項１に記載の画像処理装置であって、
前記補正部は、前記光軸方向の単位深さごとに設定された深さ補正係数を用いて、前記輝点の輝度を補正する
画像処理装置。
（３）（２）に記載の画像処理装置であって、
前記輝点の光が有する波長領域を算出する波長算出部をさらに具備し、
前記補正部は、さらに、前記深さ補正係数及び前記算出された波長領域の情報に基づき、前記輝点の輝度を補正する
画像処理装置。
（４）（１）から（３）のうちいずれか１つに記載の画像処理装置であって、
前記補正部は、前記第１のぼやけ画像の面内において、前記輝点の輝度のピーク値の位置からの距離に応じて設定されたシェーピング補正係数を用いて、前記輝点の輝度を補正する
画像処理装置。
（５）（１）から（４）のうちいずれか１つに記載の画像処理装置であって、
前記補正部により補正された前記輝点の輝度情報と、前記深さ算出部により算出された前記輝点の深さの情報とに基づき、前記ターゲットを含む前記観察領域の３次元画像を生成する３次元画像生成部をさらに具備する画像処理装置。
（６）（１）から（５）のうちいずれか１つに記載の画像処理装置であって、
前記ターゲットを含み、前記光軸方向で前記ターゲットの厚さより厚く、かつ、前記対物レンズ及び試料の前記光軸方向の相対的な移動範囲のすべてにわたって、前記試料内に連続して存在する、前記第１のぼやけ画像内のターゲットのぼやけ画像を補正する他の補正部をさらに具備する画像処理装置。
（７）顕微鏡の対物レンズ及び試料を、前記対物レンズの光軸方向に沿って相対的に移動させて得られる、前記試料の少なくとも一部の観察領域の第１のぼやけ画像と、前記対物レンズ及び前記試料を、前記光軸方向の成分を含み前記光軸方向とは異なる方向に沿って相対的に移動させて得られる前記観察領域の第２のぼやけ画像とに基づき、前記観察領域に含まれるターゲットが染色されて得られる輝点の、前記試料内での前記光軸方向での深さを算出し、
前記算出された前記輝点の深さの情報に基づき、前記第１のぼやけ画像を補正する
画像処理方法。
（８）顕微鏡の対物レンズ及び試料を、前記対物レンズの光軸方向に沿って相対的に移動させて得られる、前記試料の少なくとも一部の観察領域の第１のぼやけ画像と、前記対物レンズ及び前記試料を、前記光軸方向の成分を含み前記光軸方向とは異なる方向に沿って相対的に移動させて得られる前記観察領域の第２のぼやけ画像とに基づき、前記観察領域に含まれるターゲットが染色されて得られる輝点の、前記試料内での前記光軸方向での深さを算出し、
前記算出された前記輝点の深さの情報に基づき、前記第１のぼやけ画像を補正する
ことを画像処理装置に実行させる画像処理プログラム。
【符号の説明】
【０１２８】
Ａ１、Ａ２…輝点
Ｔ、ＣＬ…ターゲット
１０…顕微鏡
１２Ａ…対物レンズ
２０…画像処理装置
２１…ＣＰＵ
６０…第１のぼやけ画像
８０…第２のぼやけ画像
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２】
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【図８】
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【図１０】
2012237693.tif 000019
【図１３】
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【図１９】
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