(57)【要約】【課題】癌幹細胞の分化誘導を介して癌治療に有効となる、既存の治療法に抵抗性を示す癌幹細胞の分化誘導剤を提供することを課題とする。【解決手段】アセトアミノフェン誘導体を有効成分とする癌幹細胞の分化誘導剤であり、また、抗癌剤と併用することにより抗癌剤の抗癌活性を増強する、アセトアミノフェン誘導体を有効成分とする抗癌活性増強剤であって、特にアセトアミノフェン誘導体が、アセトアミノフェン（ｐ−ヒドロキシアセタミド）またはｏ−ヒドロキシアセタミドである癌幹細胞の分化誘導剤、並びに抗癌活性増強剤である。【選択図】図１
2012031076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセトアミノフェン誘導体を有効成分とする癌幹細胞の分化誘導剤。
【請求項２】
抗癌剤と併用することにより抗癌剤の抗癌活性を増強する、アセトアミノフェン誘導体を有効成分とする抗癌活性増強剤。
【請求項３】
アセトアミノフェン誘導体が、アセトアミノフェン（ｐ−ヒドロキシアセタミド）またはｏ−ヒドロキシアセタミドである請求項１に記載の癌幹細胞の分化誘導剤。
【請求項４】
アセトアミノフェン誘導体が、アセトアミノフェン（ｐ−ヒドロキシアセタミド）またはｏ−ヒドロキシアセタミドである請求項２に記載の抗癌活性増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、既存の抗癌剤療法に抵抗性を示す癌幹細胞の分化誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代の医学の中で癌の治療はきわめて進歩が大きい分野であり、その治療法は多岐に亘っている。しかしながら、日本での癌による死亡者数は年々増加し続けており（厚生労働省、人口動態調査による）、世界保健機構（ＷＨＯ）は今後も世界の癌による死亡者は増加すると予想している。これは、既存の治療法に抵抗性を示す癌細胞の存在が一因になっており、このような癌細胞の一つとして癌幹細胞が注目を集めている。
【０００３】
癌細胞は遺伝的な変異の蓄積や、細胞の周りの環境変化等によって生じ、高い増殖能や細胞の不死化、周辺組織への浸潤や体内の離れた部位への転移という特徴を持つようになる。しかしながら、癌を構成している癌細胞の全てがこれらの特徴を一様に兼ね備えているわけではなく、これらの特徴を併せ持ち、癌を発生、進行させる能力が高いものは全体のごく一部であることが解ってきた。これら一部の癌細胞は、自らと全く同じ細胞を作り出す自己複製能と、多種類の細胞に分化し得る多分化能という幹細胞に共通してみられる二つの特徴を持っていることから、癌幹細胞と呼ばれている。そして、これまで急性骨髄性白血病や乳癌、脳腫瘍、前立腺癌、大腸癌、膵臓癌など様々な組織における癌でその存在が確認されている。
【０００４】
近年、癌幹細胞は既存の治療法に対して抵抗性を示すことが明らかになってきた。例えば、白血病では癌幹細胞が幹細胞ニッチと呼ばれる微小環境にとどまり、細胞周期がＧ0期に停止することで、細胞周期の進行を標的とする抗癌剤に対して耐性となる。また、固形癌での多くの癌幹細胞は、薬剤を細胞外に排出する薬剤排出ポンプ（Ｐ糖タンパク質など）の活性が高いため抗癌剤に対して耐性を示す。このことは、正常な細胞や癌組織中に存在する薬剤排出活性の高い細胞集団（Side population）が幹細胞の同定に寄与してきたことからも解る。また、癌化学療法後の癌組織では組織中に存在している癌幹細胞の比率が化学療法前と比べて上昇していることも解っている。
【０００５】
このように、癌幹細胞は既存の治療法に対して高い抵抗性をもっていることが解っており、治療後に癌が再発する一つの原因となっている可能性がある。したがって、癌幹細胞を標的にした治療法の開発は、癌を根治するために非常に重要であると考えられる。
実際に、癌幹細胞を標的とする治療法は、癌の進行を抑制し、既存の癌化学療法の治療効果を高めることが報告されている。しかしながら、現在臨床現場で癌幹細胞を標的とした治療法は確立されておらず、その開発が待たれているのが現状である。そこで本発明者は、臨床的に応用が可能な、癌幹細胞を標的とした新規治療法の開発を目的に検討を行った。
【０００６】
癌幹細胞は、多くの細胞内情報伝達経路によって未分化状態が維持され、癌を形成、維持する能力が保たれている。例えば、ヒト乳腺上皮癌由来の癌幹細胞では、Ｗｎｔ／β−カテニン経路やＴＧＦ−βシグナル経路よって未分化状態が維持されており、これらのシグナル経路を阻害する化合物は癌幹細胞の分化を導くことで癌の進行を抑制することが解っている。したがって、これらの癌幹細胞の未分化状態を維持する細胞内情報伝達経路は、癌幹細胞を標的とした新規癌化学療法のターゲットになりうる。しかしながら、このような細胞内情報伝達経路は正常な幹細胞でもその未分化能の維持に寄与しているため、これらの経路をターゲットとした治療法は、正常な幹細胞の機能まで抑制してしまう危険性があり、臨床では思わぬ副作用を引き起こす可能性がある。
【０００７】
そこで本発明者は、既に安全性か確立している医薬品の中から、癌幹細胞の未分化状態の維持を抑制する医薬品、すなわち癌幹細胞を分化誘導する医薬品を検索することにより、安全性の高い、新規な癌化学療法を開発できるのではないかと考えた。
【０００８】
現在、本発明者の手元には約６００種類の医薬品ライブラリーを有しており、臨床現場で有効な治療法が少ない疾患に対して薬効を示す医薬品の検索をおこなっている。これらの医薬品は、新規化合物と比べて臨床的な知見が多く、また既にその安全性が認められているため、医薬品の開発において非常に有利であると考えられる。
【０００９】
癌幹細胞を分化誘導する薬剤をスクリーニングするにあたり、癌幹細胞の調製が大きな問題となる。前述したように、癌幹細胞は癌細胞の中でごく一部の細胞集団であることから、このようなスクリーニングには不向きである。
そこで本発明者は、癌幹細胞の性質（細胞膜抗原の発現パターン（ＣＤ４４high/ＣＤ２４Low）や細胞の形態、コロニー形成能）を持つ細胞がその細胞集団の大多数を占めることが最近明らかにされた乳腺上皮癌由来のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いてスクリーニングを行おうと考えた。
【００１０】
本発明では、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にＪＡＭ−Ａを過剰発現させるとこの細胞が分化することを細胞の形態変化、細胞膜抗原の発現変化（ＣＤ４４high/ＣＤ２４Lowの発現パターンを示す細胞の出現）、分化依存的に発現が変化する遺伝子の発現変化、細胞間接着の形成、及び細胞の浸潤活性の変化から明らかにした。これらの結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が分化能を持つことを示しており、この細胞が癌幹細胞のモデル細胞として有用であることを示している。
そして、この細胞を分化誘導する医薬品を検索した結果、アセトアミノフェン（以下、ＡＡＰと記載する場合もある）がこの細胞を分化誘導することを上記の指標をもとに明らかにした。
【００１１】
以下にその検討過程を説明しながら、本発明を詳細に説明していく。
癌は、モノクローナル起源ではあるが、増殖、分化および腫瘍形成の異なる性質を有する細胞の異種集団で構成されている。これを説明するために、癌幹細胞（Cancer Stem Cell：ＣＳＣ）の仮説が提案されている。すなわち、所定の腫瘍内には、幹細胞のように挙動する能力、言い換えれば、自己再生および多能性の両能力を有するため、異種の腫瘍表現型を生じる細胞の小集団が存在する。
ＣＳＣの存在は、最初に急性骨髄性白血病に関して証明され、その後、乳房、脳、前立腺、結腸および膵臓の癌で立証された。このような研究では、各々の組織および器官において、ＣＳＣに特有の細胞表面マーカーの発現プロファイルも同定した。例えば、多量の分化クラスター（ＣＤ）−４４および少量または検知不能量のＣＤ２４を発現する（ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ）乳癌細胞は、ＣＳＣの性質を有することが報告されている（非特許文献１）。
【００１２】
癌の検出および治療法が進歩したにも関わらず、こうした疾患による死亡率は、化学および放射線療法に対する癌の耐性、転移および再発のために依然として高いものである。現在では、ＣＳＣがこうした事象で重要な役割を演じていると考えられている。例えば、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ乳癌細胞は、相対的に分化した細胞型（ＣＤ４４−／ｌｏｗ／ＣＤ２４＋）と比較して、高いｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍形成および転移活性、ならびに浸潤、移動、増殖および足場（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）非依存性コロニー形成の高い活性を有している（例えば、非特許文献１）。ＣＳＣは、化学および放射線療法に対しても耐性も示すことが知られている（例えば、非特許文献２）。例えば、細胞内抗癌剤を排出する多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）および多剤耐性−１などのＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体の高度発現が、各種のＣＳＣで観察されており、このことが、化学療法に対して耐性を示すその表現型の原因となっている（非特許文献３）。
【００１３】
したがって、化学療法により多量の腫瘍細胞は死滅する一方、ＣＳＣに対してはそれほど有効なものではなく、ＣＳＣは生き残って、ある潜伏期間の後、新たな腫瘍を再生（再発）する。この概念を支持して、原発性乳癌患者の化学療法により、癌中心部生検のＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ細胞量が増加すると最近報告された（非特許文献４）。
乳癌患者の乳房腫瘍中のＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ細胞量は、化学および放射線療法の効力と良好に相関することも報告された（非特許文献５）。したがって、ＣＳＣを特異的に有効に死滅させる薬物があれば、癌の治療に有益であると思われ、このような化合物が最近になって報告されている（非特許文献５）。あるいは、ＣＳＣの分化を誘導する薬物も、このような薬物が、ＣＳＣの化学療法に対する感受性を高め、転移活性を低下させるような変化を起こすと思われるので、治療上重要になり得るものと考えられる。骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）が、グリア芽腫の分化誘導により、その腫瘍形成性を減少させることが最近報告されたが、ＣＳＣの分化を誘導する化学物質は、未だ報告されていないのが現状である。
【００１４】
ＣＳＣの幹細胞様性質を調節するためには、このような性質を維持する分子機構の理解が重要である。最近の研究によれば、ＣＳＣは正常幹細胞とこのような機構を共有していることが示唆された。乳癌ＣＳＣおよび乳腺幹細胞では、Ｗｎｔ／β−カテニン古典的経路および形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）経路などの多様なシグナル伝達経路が、幹細胞様性質の維持に重要な役割を果たしている。Ｗｎｔ／β−カテニン古典的シグナル伝達経路では、Ｗｎｔリガンドの受容体への結合が、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を誘導する多タンパク質複合体の活性を阻害する。この複合体は、β−カテニンをリン酸化して、ユビキチン化およびタンパク質分解の標的にする。
【００１５】
したがって、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化状態では、β−カテニンがサイトゾル中に蓄積し、このタンパク質の一部は核に転位する。核においては、β−カテニンは、Ｔ細胞因子／リンパ球エンハンサー因子１（Ｔｃｆ／Ｌｅｆ１）ファミリーのタンパク質に結合して、特異遺伝子の転写を、幹細胞様性質の維持に重要なもの（ｓｎａｉｌなど）も含めて調節する。
他方で、Ｗｎｔ／β−カテニン古典的経路の異常活性化は、ヒト癌細胞で知られている最も高頻度のシグナル伝達異常の１つであり、β−カテニンは、乳癌の５０％超において異常に安定化されていることも報告されている。
【００１６】
こうしたデータは、Ｗｎｔ／β−カテニン古典的経路が、乳癌ＣＳＣの幹細胞様性質の維持に重要な役割を果たしていることを示唆している。実際のところ、乳癌ＣＳＣまたは乳腺幹細胞におけるＷｎｔ／β−カテニン古典的経路の活性化または阻害は、自己再生および多能性の能力維持にとって正または負に作用することが、最近報告されている（非特許文献６）。したがって、この経路を阻害する化合物は、癌の化学療法に有益なものと考えられる。
【００１７】
アセトアミノフェン（ＡＡＰ）は、世界的に最も汎用されている市販の抗炎症解熱鎮痛薬の１つである。この薬物の利点は、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）などの他の抗炎症薬より低い胃腸毒性である。他方、この薬物の欠点は、小葉中心性肝壊死を誘発する肝毒性である。
ＡＡＰは１００年以上前に発見され、長期間広範に使用されてきた薬物ではあるが、抗炎症解熱鎮痛効果に対するその作用様式は未だ不明確である。一般に、ＮＳＡＩＤの抗炎症作用は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）活性、および強い炎症誘発能を有するプロスタグランジン（ＰＧ）の合成に対する阻害効果に媒介される。ＡＡＰの抗炎症解熱鎮痛作用はＮＳＡＩＤの作用に類似するが、この薬物は、中枢に作用し、ＣＯＸの弱い阻害剤であると考えられた。しかし、この発想は、その後の研究では支持されなかった。ＣＯＸのこの弱い阻害が、その抗炎症効果を担っていることが最近示唆された。ＣＯＸの阻害およびＰＧ量の減少が、ＡＡＰの抗炎症解熱鎮痛効果においてある程度の役割を果たしているようである。
【００１８】
本発明では、ＣＳＣの分化を誘導する化合物のスクリーニングを行った。一般に、薬物スクリーニングの情報提供因子（ｉｎｆｏｒｍａｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）は、スクリーニング用のアッセイ系および化学ライブラリーである。
本発明者は、主に（約８０％）ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ細胞（癌幹細胞様細胞）を含有すると最近報告されたヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（非特許文献７及び８）を使用してスクリーニングを行った。
【００１９】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ亜集団は、そのＣＤ４４−／ｌｏｗ／ＣＤ２４＋亜集団より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖、足場非依存性コロニー形成、接着、移動および浸潤、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍形成に対して高い活性を有することが報告されている（非特許文献７）。
スクリーニング用の化学ライブラリーに関しては、既に臨床的に使用されている約２５０種の薬剤を含んだ化学ライブラリーを始めに調製した。その理由は、このような薬物の安全性および薬力学が、人間において既に示されていたからである。
他方、候補薬物としての新規分子の開発は、臨床試験の段階で、人間において予想される副作用および低質な薬力学に直面する恐れがある。
【００２０】
本発明者は、ＡＡＰが、Ｗｎｔ／β−カテニン古典的シグナル伝達経路の阻害を介して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導することを見出した。
特に、ＡＡＰによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの処理により、ヌードマウスにおけるその細胞の腫瘍形成能が喪失し、更に、ＡＡＰの投与によって、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の腫瘍異種移植片の増殖が、ドキソルビシンを同時投与した場合としない場合の双方で阻害されることも見出した。
【００２１】
以上の結果は、ＡＡＰがＣＳＣの分化誘導を介して乳癌療法に有効であることを示していることに他ならない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 100:3983-3988 (2003)
【非特許文献２】Cell, 118:149-161 (2004)
【非特許文献３】Anticancer Res., 25:4173-4178 (2005)
【非特許文献４】Cell, 131:1109-1123 (2007)
【非特許文献５】J. Natl. Cancer Inst., 100:672-679 (2008)
【非特許文献６】J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 9:119-131 (2004)
【非特許文献７】J. Cell Mol. Med., 13:2236-2252 (2009)
【非特許文献８】Breast Cancer Res., 8:R59 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
したがって、本発明は、癌幹細胞の分化誘導を介して癌治療に有効となる、既存の治療法に抵抗性を示す癌幹細胞の分化誘導剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
かかる課題を解決するための本発明は、具体的には、
（１）アセトアミノフェン誘導体を有効成分とする癌幹細胞の分化誘導剤、
（２）抗癌剤と併用することにより抗癌剤の抗癌活性を増強する、アセトアミノフェン誘導体を有効成分とする抗癌活性増強剤、
（３）アセトアミノフェン誘導体が、アセトアミノフェン（ｐ−ヒドロキシアセタミド）またはｏ−ヒドロキシアセタミドである癌幹細胞の分化誘導剤、
（４）アセトアミノフェン誘導体が、アセトアミノフェン（ｐ−ヒドロキシアセタミド）またはｏ−ヒドロキシアセタミドである抗癌活性増強剤、
である。
【発明の効果】
【００２５】
癌細胞の一部を占めている癌幹細胞は、抗癌剤に対して抵抗性を示すので既存の抗癌剤が有効に作用しないため、抗癌剤の効果を増強させるためには癌幹細胞の分化を誘導する必要がある。
この癌幹細胞の分化誘導は、癌細胞の悪性度を低下させ（抗癌作用を発揮し）、抗癌剤の感受性を上げ効果を増強させる（抗癌剤の増強作用）こととなる。
本発明が提供するアセトアミノフェン（ＡＡＰ）誘導体は、この癌幹細胞の分化を誘導し、抗癌作用を発揮すると共に、抗癌剤の抗癌作用を増強させるものである。
特に既存の抗癌剤、例えばドキソルビシンと併用することにより、その治療効果を高め、抗癌活性を増強させる点で、極めて特異的なものである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導する薬物としてのＡＡＰの特定の結果を示す図であり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＡＡＰ誘導分化を示した図である。
【図２】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導する薬物としてのＡＡＰの特定の結果を示す別の図であり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＡＡＰ誘導分化の特異性を示した図である。
【図３】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化のＡＡＰ依存性誘導に対する分子機構の結果を示す図であり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化誘導に対するＡＡＰの構造−機能相関を示した図である。
【図４】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化のＡＡＰ依存性誘導に対する分子機構の結果を示す別の図であり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＡＡＰ誘導分化におけるＷｎｔ／β−カテニン古典的シグナル伝達経路の関与を示した図である。
【図５】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の抗癌薬に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感受性のＡＡＰ誘導増加の結果を示す図であり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の抗癌薬に対する感受性のＡＡＰ誘導増加を示した図である。
【図６】ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の増殖に対するＡＡＰの効果の結果を示す図である。
【図７】ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の増殖に対するＡＡＰの効果の結果を示す別の図であり、ＡＡＰとｏ−アセトアミドフェノールとの肝毒性および抗癌作用の比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下に、本発明の具体的試験検討内容を記載しながら、本発明をより詳細に説明していく。
【００２８】
＜材料および方法＞
［試薬および動物］
【００２９】
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、日水製薬（東京、日本）から入手した。
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｇ４１８、ＬＹ３６４９４７、臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）、および６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）は、シグマ社（St. Luois, MO）から購入し、リポフェクタミン（ＴＭ２０００）およびｐｃＤＮＡ３．１（−）は、Invitrogen（Carlsbad, CA）から入手した。
ＲＮｅａｓｙキットは、Quiagen（Valencia, CA）から取得し、第１鎖ｃＤＮＡ合成キットは、タカラバイオ（大津、日本）から入手し、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘは、Bio-Rad（Hercules, CA）から入手した。
【００３０】
カルセインアセトキシメチルエステル（カルセインＡＭ）は、同仁堂（熊本、日本）から入手した。ＭａｔｒｉｇｅｌはＢＤ  Ｂiosciences（San Jose, CA）から、２４−ウェルトランスウェルはCostar（Lowell, MA）から入手した。トランスアミナーゼＣ  ＩＩ−ｔｅｓｔＷａｋｏは、和光純薬工業社（東京、日本）から入手した。ＰＧＥ２用ＥＩＡキットは、Cayman（Ann Arbor, MI）から入手した。クラウディン−１に対する抗体は、Zymed（San Francisco, CA）から、アクチンに対する抗体は、Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA）から入手した。フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗ＣＤ４４（クローンＧ４４−２６）抗体、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ＣＤ２４抗体（クローンＭＬ５）、およびβ−カテニンに対する抗体は、BD Biosciences（San Jose, CA）から入手した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４ヤギ抗マウスＩｇＧは、Invitrogen（Carlsbad, ＣＡ）から取得した。免疫組織化学分析用の封入剤（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ）はVector Laboratories（Burlingame, CA）から入手した。
【００３１】
雌性ＩＣＲ野生型マウスおよびヌードマウス（Ｃｒｌｊ：ＣＤ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕマウス）（６〜８週齢）は、チャールス リバー社（神奈川、日本）から購入した。
【００３２】
なお、本発明における実験および手順は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により採用され、推奨されているような実験動物の管理と使用に関する指針に従って実施し、本発明者が所属する熊本大学の動物管理委員会により認可されたものである。
【００３３】
＜細胞の培養およびプラスミドの構築＞
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ−７（乳癌細胞系）細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。細胞は、５％ＣＯ２含有９５％空気の加湿雰囲気中、３７℃で、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。
培地中のＰＧＥ２量の決定は、ＥＩＡで行った。生存細胞数のモニターには、ＭＴＴアッセイを使用した。
その詳細を記載すると、細胞を、最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液と２時間インキュベートした。イソプロパノールおよび塩酸を、それぞれ最終濃度５０％および２０ｍＭで培地に添加した。各試料の５７０ｎｍにおける光学密度を、基準波長６３０ｎｍを用いた分光光度法で決定した。
【００３４】
全長ヒトｊａｍ−ａ  ｃＤＮＡを、ＰＣＲで調製し、ｐｃＤＮＡ３．１（−）中にクローニングして、結合部接着分子Ａ（ＪＡＭ−Ａ）を過剰発現させるプラスミドを創製した。このプラスミドのＭＤＡ−ＭＢ−２３１へのトランスフェクションは、指定の手順に従ってリポフェクタミン（ＴＭ２０００）を用いて実施した。ＪＡＭ−Ａを過剰発現する安定なトランスフェクタントを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析で選定した。陽性クローンを４００μｇ／ｍＬのＧ４１８の存在下で維持した。
【００３５】
＜リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析＞
総ＲＮＡは、手順に従ってＲＮｅａｓｙキットを用いて抽出した。各試料（１μｇＲＮＡ）を、手順に従って第１鎖ｃＤＮＡ合成キットを用いて逆転写した。合成したｃＤＮＡは、ｉＱ  ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘを用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｃｈｒｏｍｏ４装置；Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）実験に用い、手順に従ってＯｐｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅで分析した。特異性は、反応生成物の電気泳動分析、および鋳型または逆転写酵素を含まない対照を入れることにより確認した。各反応に存在する総ＲＮＡ量を規格化するために、アクチンのｃＤＮＡを内部標準として使用した。プライマー配列は、必要なときに利用可能である。
【００３６】
＜免疫ブロット分析＞
全細胞抽出物を、Biol. Pharm. Bull., 32:825-831 (2009) に記載の方法に従って調製した。試料のタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により決定した（Anal. Biochem., 72:248-254 (1976)）。試料を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する１０％ポリアクリルアミドゲルに付け、電気泳動に掛けた後、タンパク質を各抗体で免疫ブロットした。
【００３７】
＜蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）による細胞表面マーカーの発現分析＞
細胞（５×１０５個）を、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ４４抗体およびＰＥコンジュゲート抗ＣＤ２４抗体と共にインキュベートした。試料は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）で分析した。イベントの収集は、３００００回で停止した。
【００３８】
＜カルセインＡＭ蓄積アッセイ＞
薬物排出活性は、カルセインＡＭ蓄積アッセイ（Cancer Res., 66:4804-4815 (2006)）により、幾つかの点を修正して推定した。トリプシンで処理した細胞（１×１０６個）を、２％ＦＢＳ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓおよび１μＭカルセインＡＭを含有するＤＭＥＭ中に懸濁し、３７℃で１０分間インキュベートした。遠心分離し、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した後、各試料の緑色蛍光強度を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いて測定した。イベントの収集は、３００００回で停止した。
【００３９】
＜細胞浸潤アッセイ＞
細胞浸潤活性は、トランスウェルマトリゲル浸潤アッセイ（Biol. Pharm. Bull., 32:825-831 (2009)）に従い、ある程度修正して測定した。５ｍｇ／ｍＬのマトリゲルを含有する無血清ＤＭＥＭを、２４ウェルトランスウェルの上部チャンバーに加え、３７℃で４時間インキュベートした。細胞懸濁液をマトリゲルに加え、下部チャンバーを、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで満たした。そのプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を膜の上面から取り出し、膜の下面を、２５％メタノール中の０．５％クリスタルバイオレットで１０分間染色し、蒸留水で濯ぎ洗い、終夜で風乾した。次いで、クリスタルバイオレットを５０％エタノール中の０．１Ｍクエン酸ナトリウムで抽出し、吸光度を５８５ｎｍで測定した。
【００４０】
＜免疫染色アッセイ＞
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＬａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩチャンバースライド系（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）の中で増殖させた。細胞を１％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中で３０分間ブロッキングした。次いで、試料を各一次抗体と共にインキュベートした。洗浄後、試料を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）とコンジュゲートした各二次抗体と共にインキュベートした。画像は、共焦点レーザー蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ５００，Ｏｌｙｍｐｕｓ、東京、日本）上で取り込んだ。
【００４１】
＜肝傷害の評価＞
肝傷害は、製造業者の説明書に従ってトランスアミナーゼＣ  ＩＩ−ｔｅｓｔＷａｋｏを使用して、血漿中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の触媒活性を測定することにより、評価した。
【００４２】
＜腫瘍異種移植片の増殖アッセイ＞
細胞（１×１０７個、無血清ＤＭＥＭ０．２ｍＬの懸濁液）を、各ヌードマウスの右後肢足蹠の皮下に接種した。腫瘍を、毎週カリパスを用いて測定し、その体積は、次の標準式：幅２×長さ×０．５を用いて計算した。
【００４３】
＜免疫組織化学分析＞
腫瘍異種移植片をＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｃｏ．，東京、日本）中に包埋し、凍結切断した。切片を、３％ヤギ血清で１５分間ブロッキングし、各一次抗体と共に２．５％ＢＳＡの存在下で１２時間インキュベートし、最後にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧと共に３時間インキュベートした。試料をＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤで封入し、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１，Ｏｌｙｍｐｕｓ、東京、日本）を用いて検査した。
【００４４】
＜統計分析＞
全ての数値は、平均値±標準偏差（ＳＤ）または平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表現した。テューキー検定に従った二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、４群以上の間の差異を評価した。差異は、Ｐ＜０．０５の数値について有意であると見なした。
【００４５】
［結果］
【００４６】
＜ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導する薬物としてのＡＡＰの特定＞
最初に、既に臨床的に使用されている約２５０種の薬剤から、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導する薬物をスクリーニングした。未分化（幹細胞様）（ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ）または分化（ＣＤ４４−／ｌｏｗ／ＣＤ２４＋）乳癌細胞は、それぞれ、玉石様の上皮単層構造または分散紡錘状の間葉細胞構造を示すことが報告された（Cancer Cell, 11:259-273 (2007)）。したがって、４日間の処理後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の形態変化を誘導する（間葉細胞構造から玉石様構造へ）薬物を探索し、ＡＡＰが、このような形態変化を明瞭に誘導することを見出した。
【００４７】
この結果を図１Ａに示した。この形態変化は不可逆であった。即ち、細胞形状は、ＡＡＰ非含有培地中での２日間のインキュベーション後も維持されていた（データは示していない）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における密着結合タンパク質ＪＡＭ−Ａの過剰発現は、このような形態変化を誘導し、細胞の浸潤活性を阻害することが報告されており（４４）、この過剰発現が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導することを示唆している。
本発明者らは、ＪＡＭ−Ａの過剰発現が、ＡＡＰによる処理で観察したものと類似の形態変化を誘導することを確認し（図１Ａ）、以下の実験で、ＪＡＭ−Ａを過剰発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を陽性対照として使用した。
【００４８】
上記したように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ細胞の主要亜集団およびＣＤ４４−／ｌｏｗ／ＣＤ２４＋細胞の副次亜集団を含有している（非特許文献７）が、この特徴は、ＣＤ４４およびＣＤ２４の表面発現に対するフローサイトメトリー分析により確認した。
その結果を図１Ｂに示した。更に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＡＡＰによる処理またはＪＡＭ−Ａの過剰発現のいずれも、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ細胞を減少させ、ＣＤ４４−／ｌｏｗ／ＣＤ２４＋細胞を増加させることを見出した（図１Ｂ）。
【００４９】
分化細胞（α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）、クラウディン−１およびＥ−カドヘリン）および幹細胞様細胞（フィブロネクチン、ビメンチン、ジンクフィンガーＥボックス結合ホメオボックス１（ＺＥＢ−１）、ＳｌｕｇおよびＳｎａｉｌ）のマーカーのｍＲＮＡ発現も調べ、以前の報告におけるデータを参照した（Cancer Cell, 11:259-273 (2007)；Cell, 133:704-715 (2008)；Genes Dev., 17:1253-1270 (2003)）。
【００５０】
図１Ｃに示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、ＡＡＰによる処理またはＪＡＭ−Ａの過剰発現のいずれも、分化細胞または幹細胞様細胞のマーカーのｍＲＮＡ発現をそれぞれ上方調節または下方調節した。分化した上皮細胞の細胞間接触部に局在する閉鎖帯−１（ＺＯ−１）は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のサイトゾル中に広く局在しており、ＪＡＭ−Ａの過剰発現が、このタンパク質の細胞間接触部への転位を起こすことが、最近報告された（Cancer Res., 68:2194-2203 (2008)）。
【００５１】
免疫染色分析により、ＺＯ−１だけでなくβ−カテニンも、ＪＡＭ−Ａの過剰発現によって細胞間接触部に転位することを見出し、同様な転位が、ＡＡＰで処理した細胞にも観察されることを見出した（図１Ｄ）。
【００５２】
更に、トランスウェルマトリゲル浸潤アッセイで判定したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤活性は、ＡＡＰによる処理またはＪＡＭ−Ａの過剰発現により有意に抑制された（図１Ｅ）。
【００５３】
ＨＰＬＣ分析を使用して、培地中のＡＡＰは、４日間のインキュベーション後に、その９８．９±３．７４％が代謝も分解もされていないことが確認された。したがって、これら図１の結果は、ＡＡＰによる処理がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導することを強く示唆している。この結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＪＡＭ−Ａの過剰発現も、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導することも示唆している。
【００５４】
次いで、分化した乳癌細胞系のＭＣＦ−７細胞に対するＡＡＰの効果を調べた（非特許文献７）。ＡＡＰで処理しない場合、既述のように、ＭＣＦ−７細胞は玉石様構造を示し、その大部分はＣＤ４４−／ｌｏｗ／ＣＤ２４＋細胞であった（図２ＡおよびＢ）。
ＡＡＰによる処理は、ＭＣＦ−７細胞のこうした表現型に影響しなかった（図２ＡおよびＢ）。
更に、この処理は、分化した幹細胞様細胞に対しては（図２Ｃ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で見られた（図１Ｃ）ほどは、明瞭にマーカーのｍＲＮＡ発現に影響しなかった。
以上の結果は、ＡＡＰが、細胞形態、表面マーカーの発現、および特異的に未分化（幹細胞様）乳癌細胞における分化関連遺伝子の発現に影響することを示唆し、ＡＡＰが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導するという概念を支持している。
【００５５】
ＣＳＣの分化誘導の別の特性は、細胞増殖の阻害であり、ＡＡＰによる処理がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖を抑制することを示した（図２Ｄ）。
細胞の４％エタノールによる処理も、同様にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖を抑制した（図２Ｄ）が、この処理は、ＡＡＰ処理で見られた（図１Ａ〜Ｃ）ほど、明瞭に細胞形態、ＣＤ４４およびＣＤ２４の発現プロファイル、ならびに分化関連遺伝子のｍＲＮＡ発現に影響しておらず（図２Ｅ〜Ｇ）、こうした表現型のＡＡＰ依存性変化が、細胞増殖の阻害の結果でないことを示唆している。
【００５６】
＜ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化のＡＡＰ依存性誘導に対する分子機構＞
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＡＡＰ誘導分化に対する構造−機能相関および分子機構を特定するために、各種ＡＡＰ誘導体（図３Ａ）のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化に対する効果を調べた。図３ＢおよびＣに示すように、こうしたＡＡＰ誘導体の中でも、化合物ｅ（ｏ−アセトアミドフェノール）は、全細胞に対するＣＤ４４−／ｌｏｗ／ＣＤ２４＋細胞の比率を増加させ、ＡＡＰで観察された場合と類似の程度までクラウディン−１の発現を誘導したので、ｏ−アセトアミドフェノールはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導することが示唆される。各ＡＡＰ誘導体の細胞増殖に対する効果を調べた結果、ＡＡＰおよびｏ−アセトアミドフェノールだけでなく、他の幾つかの誘導体（化合物ｇなど）も、増殖を阻害する（図３Ｄ）ことが判明し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化誘導が、細胞増殖の阻害の結果でないことが確認された。
【００５７】
これらのＡＡＰ誘導体を用いて、ＡＡＰの抗炎症活性と分化誘導活性との相関性を次に調査する。各ＡＡＰ誘導体の抗炎症活性は、培地中のＰＧＥ２量を減少させる能力によって推定した。図３Ｅに示すように、ＡＡＰ１ｍＭで細胞を処理すると、インドメタシン０．１ｍＭで見られた場合と類似の程度までＰＧＥ２量が減少する。更に、同様量の減少は、ｏ−アセトアミドフェノール１ｍＭでも観察されたが、他のＡＡＰ誘導体では観察されず（図３Ｅ）、ＡＡＰの抗炎症活性と分化誘導活性との間には密接な相関性があることを示唆している。
【００５８】
前述したように、各種のシグナル伝達経路が、乳癌ＣＳＣおよび乳腺幹細胞の幹細胞様性質の維持に寄与することが報告されている（Cancer Cell, 11:259-273 (2007)）。そのため、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の幹細胞様性質の維持、およびＡＡＰ依存性分化誘導に関与するシグナル伝達経路を同定することを試みた。ＴＧＦ−β１は、各種のＣＳＣおよび正常幹細胞における幹細胞様性質の維持にとって重要なサイトカインであり、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の阻害は、幾つかのＣＳＣの分化を誘導すると報告された（Cancer Cell, 11:259-273 (2007)）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりｔｇｆ−β１ｍＲＮＡの発現を測定した結果、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＡＡＰで処理した後では、その発現は減少することが判明した（図４Ａ）。しかし、ＴＧＦ−βＩ型受容体の阻害剤（ＬＹ３６４９４７）は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の幹細胞様細胞形態に影響しなかった（図４Ｂ）ので、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、幹細胞様性質の維持、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＡＡＰ依存性分化誘導に寄与していないようである。
【００５９】
次に、Ｗｎｔ／β−カテニン古典的シグナル伝達経路の寄与を調べた。
図４Ｃに示すように、β−カテニン量は、ＡＡＰで処理した細胞では明瞭に減少しており、この減少は、ＧＳＫ３βの特異的阻害剤ＢＩＯによる同時処理で抑制されており、したがってＷｎｔ／β−カテニン古典的シグナル伝達経路は、ＡＡＰによる処理で阻害されることを示唆している。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＡＡＰ誘導分化に対するこの阻害の寄与を調べるために、分化に関連する表現型のＡＡＰ依存性変化に対するＢＩＯの効果を調べた。
ＢＩＯによる細胞の同時処理は、ＡＡＰ依存性形態変化、ＺＯ−１およびβ−カテニンの細胞間接触部への転位、ならびに分化細胞マーカーのｍＲＮＡの上方調節を抑制した（図４Ｄ〜Ｆ）。
【００６０】
免疫染色のために共焦点レーザー顕微鏡を使用したので、免疫ブロット実験で認められたβ−カテニン発現量のＡＡＰ誘導減少（図４Ｃ）は、観察されなかった（図４Ｅ）。以上の結果は、ＡＡＰが、Ｗｎｔ／β−カテニン古典的シグナル伝達経路の活性化を介して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導することを示唆している。
【００６１】
＜ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の抗癌薬に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感受性のＡＡＰ誘導増加＞
前述したように、ＣＳＣは抗癌薬に耐性を示すが、この現象では、ＭＲＰなどのＡＢＣ型薬物排出ポンプの過剰発現が、重要な役割を演じている。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＭＲＰの過剰発現、および細胞の多剤耐性に対するその寄与が報告されている。したがって、上記の結果は、ＡＡＰによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の処理が、抗癌薬に対する該細胞の感受性を高めることを示唆している。
実際、ＡＡＰによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の前処理により、ドキソルビシンまたは５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に対する該細胞の感受性は、増加した（図５Ａ）。ＪＡＭ−Ａの過剰発現により、こうした抗癌薬に対するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の感受性が、増加することも見出した。他方で、ＡＡＰによるＭＣＦ−７細胞の前処理では、こうした抗癌薬に対する感受性が影響されなかった（図５Ｃ）ため、ＡＡＰは、分化の誘導を介して、抗癌薬に対するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の感受性を高めることが示唆される。
【００６２】
次に、ＡＡＰによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の処理が、薬物排出活性に及ぼす効果をカルセインＡＭ蓄積アッセイで調べた。疎水性のため、カルセインＡＭは、非特異的に細胞質膜を通って細胞内に取り込まれ、細胞内で蛍光分子のカルセインに変換されるので、細胞内カルセイン量が多いほど、細胞の薬物排出活性が低くなることを意味する。図５Ｄに示すように、ＡＡＰで処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞では、対照細胞より多量のカルセインＡＭの蓄積が観察されており、薬物排出活性が、ＡＡＰによる処理で抑制されることが示唆される。図５Ｅに示すように、ｍｒｐ２〜５のｍＲＮＡ発現は、ＡＡＰによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の処理で抑制されており、発現のこの下方調節が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における、薬物排出活性のＡＡＰ誘導阻害および抗癌薬に対する感受性の増加に関与していることが示唆される。
【００６３】
＜ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の増殖に対するＡＡＰの効果＞
次に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＡＡＰ依存性分化誘導が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍形成活性に影響しているか否かを試験した。ＡＡＰ処理または非処理ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を各ヌードマウスの皮下に接種し、腫瘍異種移植片の増殖をモニターした。図６Ａに示すように、対照細胞を接種したマウスでは、腫瘍異種移植片が良好に増殖したが、ＡＡＰ処理細胞を接種したマウスでは、このような増殖が観察されておらず、ＡＡＰによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞処理は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の腫瘍形成活性を抑制することが示された。
【００６４】
次いで、ＡＡＰの毎日の皮下投与が、ドキソルビシンを同時に毎週皮下投与したヌードマウスおよびそれをしなかったヌードマウスにおいて、腫瘍異種移植片の増殖に及ぼす効果を調べた。図６Ｂに示すように、ＡＡＰまたはドキソルビシンいずれかの投与は、腫瘍異種移植片の増殖を有意に抑制した。３５日目に、腫瘍異種移植片を取り除き、ＣＤ４４、ＣＤ２４およびβ−カテニンの発現を免疫組織化学分析で調べた。図６ＣおよびＤに示すように、ドキソルビシンの投与ではなく、ＡＡＰの投与は、これらのタンパク質の発現に明らかに影響する。即ち、ＡＡＰ投与マウスの腫瘍異種移植片では、対照またはドキソルビシン投与マウスの移植片より、それぞれ高いまたは低い発現量のＣＤ２４またはＣＤ４４およびβ−カテニンが観察されており、ＡＡＰが、ｉｎ  ｖｉｖｏでＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導することが示唆される。興味深いことには、ＡＡＰ投与およびドキソルビシン投与双方の組合せは、腫瘍異種移植片の増殖をより明瞭に抑制した。
【００６５】
次いで、ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の増殖に及ぼす効果をＡＡＰとｏ−アセトアミドフェノールとの間で比較した。図７Ａに示すように、ｏ−アセトアミドフェノールの投与は、ＡＡＰで観察された場合と同程度まで腫瘍異種移植片の増殖を低下させた。ＡＡＰの臨床使用に伴う最も深刻な問題は、肝毒性であり、それが、抗癌剤としてのその使用に対する障害になりかねない。我々は、ＡＡＰとｏ−アセトアミドフェノールとの毒性を、野生型ＩＣＲマウスにおいて比較している。図７Ｂに示すように、ＡＡＰと異なり、ｏ−アセトアミドフェノールは、１２００ｍｇ／ｋｇ未満の用量でマウスの死亡を起こさなかった。
【００６６】
更に、肝傷害の指標であるＡＳＴおよびＡＬＴの血漿濃度は、ＡＡＰ投与マウスの方が、ｏ−アセトアミドフェノール投与マウスより高かった（図７Ｃ）ので、ｏ−アセトアミドフェノールは、肝臓に対してＡＡＰより安全であることが示唆される。以上の結果に基づいて、我々は、ｏ−アセトアミドフェノールが、分化誘導活性および低い肝毒性のために、乳癌の治療に有益になり得ると考えている。
【００６７】
＜考察＞
ＣＳＣが、化学または放射線療法後の腫瘍の増殖、転移および再発において重要な役割を果たしていることを示唆する証拠が蓄積されつつあるので、多くの研究でＣＳＣを特異的に死滅させる薬物の特定が試みられている。ＣＳＣに注目した癌療法に対する代替戦略として、本発明ではＣＳＣの分化を誘導する薬物を探索した。このために、主に幹細胞様細胞（ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ）を含有すると報告された乳癌細胞系、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と、既に臨床的に使用されている薬物からなる元の化学ライブラリーとを使用した。保温発明者らは、ＡＡＰ（１ｍＭ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導することを見出し、その判定は、細胞形態の変化、細胞表面マーカーの発現プロファイルの変化（ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗからＣＤ４４−／ｌｏｗ／ＣＤ２４＋へ）、分化細胞または幹細胞様細胞のマーカー発現のそれぞれ上方調節または下方調節、細胞の増殖および浸潤の阻害、ならびに細胞間接触部におけるＺＯ−１およびβ−カテニンの局在化によって下した。これは、臨床的に使用されている薬物が、癌幹細胞様細胞の分化を誘導するという最初の知見である。
【００６８】
細胞増殖の抑制は、ＣＳＣ分化の表現型の１つであるが、他の分化関連表現型が、細胞増殖の抑制によって起こるという可能性もある。しかし、本発明者らは、表現型の変化が、細胞増殖の抑制の結果ではないと結論した。その理由は、細胞の４％エタノールによる処理は、ＡＡＰ１ｍＭで観察された場合と同程度まで細胞増殖を阻害したが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導しなかったこと、ＡＡＰは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化と共に、トリパンブルー排除試験で判定して細胞死を誘導することはなかった（データは示していない）こと、細胞増殖の阻害活性は、ＡＡＰの各種誘導体を用いた実験において、分化誘導の活性と相関していなかったことである。ＡＡＰ誘導体を用いた分析の結果、ＰＧＥ２合成に対する阻害効果で判定したＡＡＰの抗炎症活性は、分化誘導活性と良好に相関していることも判明した。しかし、インドメタシン０．１ｍＭによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の処理は、ＡＡＰ１ｍＭで観察された場合と同程度までＰＧＥ２合成の阻害を起こしたが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化は誘導しない（データは示していない）ことが見出された。
【００６９】
したがって、ＡＡＰの抗炎症活性は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化誘導に関与してはいるが、それで十分とは言えないようである。ＰＧＥ２は、造血幹細胞における恒常性の維持に寄与すると最近報告されており（Nature, 447:1007-1011 (2007)）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＡＡＰ誘導分化においても、同様な機構が関与することもあり得る。
【００７０】
ＴＧＦ−βシグナル伝達経路およびＷｎｔ／β−カテニン古典的シグナル伝達経路の双方は、乳癌ＣＳＣおよび乳腺幹細胞の未分化性の維持に重要な役割を果たしている。しかし、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、この経路の阻害剤がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導しなかったので、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の未分化性の維持に寄与していないようである。他方で、本発明者らは、Ｗｎｔ／β−カテニン古典的シグナル伝達経路が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＡＡＰ依存性分化誘導に関与していると結論したが、それは以下の知見：ＡＡＰによる細胞の処理は、細胞のβ−カテニン量を減少させ、この減少は、ＧＳＫ３βの阻害剤により抑制され、この阻害剤は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＡＡＰ誘導分化を抑制したことに基づいている。現在のところ、ＡＡＰがＷｎｔ／β−カテニン古典的シグナル伝達経路を阻害する機構は不明である。Ｗｎｔ／β−カテニン古典的シグナル伝達経路は、自己再生および多能性の活性維持に、乳腺幹細胞だけでなく脳および腸の幹細胞においても重要な役割を果たしていると、最近報告された（例えば、Cell Res.,18:523-527 82008））。ＣＳＣは、正常な幹細胞と幹細胞様性質の維持機構を共有するので、この研究における結果は、ＡＡＰが、脳および腸のＣＳＣの分化を誘導し、これらの癌の化学療法にも有効であることを示唆している。
【００７１】
抗癌薬に対する耐性は、ＣＳＣの表現型の１つであり、不十分な化学療法および化学療法後の癌再発の原因である。本発明での検討では、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＡＡＰによる前処理が、細胞の抗癌薬（ドキソルビシンおよび５−ＦＵ）に対する感受性を高めることを示した。感受性の同様な増加は、ＪＡＭ−Ａの過剰発現で分化したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にも観察され、しかしＡＡＰ処理ＭＣＦ−７細胞（分化性を有する乳癌細胞系）では観察されなかったので、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の抗癌薬に対する感受性のＡＡＰ誘導増加は、分化により媒介されていると思われる。我々は、ＡＡＰが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の薬物排出活性を低下させ、ＭＲＰの発現を抑制することも示唆している。
【００７２】
ドキソルビシンまたは５−ＦＵは、それぞれＭＲＰ２およびＭＲＰ５の基質であることが報告された。したがって、本発明の結果は、ＡＡＰが、ＭＲＰ発現の分化媒介抑制およびその結果の薬物排出活性の阻害を通じて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の抗癌薬に対する感受性を高めることを示唆している。
【００７３】
ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の増殖をモニターすることにより、ＡＡＰの抗腫瘍薬としての活性もｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＡＡＰによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの前処理は、その腫瘍形成活性を減少させることを示した。以前の報告では、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ亜集団は、ＣＤ４４−／ｌｏｗ／ＣＤ２４＋細胞より高い腫瘍形成活性を有することが示唆されているので、腫瘍形成活性のＡＡＰ誘導抑制は、分化の誘導に媒介されているようである。ＡＡＰのマウスへの皮下投与が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の腫瘍異種移植片の増殖を阻害することも示した。ＡＡＰのマウスへの投与は、腫瘍異種移植片においてＣＤ２４またはＣＤ４４およびβ−カテニンの発現量のそれぞれ増加または減少を起こしており、それは、投与ＡＡＰが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで見られるようなＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導することを示唆している。この概念を支持して、ＡＡＰの皮下投与（６００ｍｇ／ｋｇ）後のＡＡＰのピーク血漿濃度は、約２ｍＭ（投与から１時間後、データは示していない）であり、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化誘導に必要な濃度より高いことが判明した。
【００７４】
ＡＡＰの投与が、腫瘍異種移植片の増殖のドキソルビシン依存性削除（ｓｕｐｅｒｓｅｓｓｉｏｎ）を強化することも示した。この強化の機構については、ＡＡＰが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで見られるような分化の誘導により、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のドキソルビシンに対する感受性を高めるという興味深い発想がある。しかし、上記したように、ＡＡＰ単独の投与も腫瘍異種移植片の増殖を抑制したので、これは、腫瘍異種移植片の増殖に対するＡＡＰおよびドキソルビシンの相加効果であることも可能である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＣＤ４４＋／ＣＤ２４−／ｌｏｗ亜集団は、ＣＤ４４−／ｌｏｗ／ＣＤ２４＋亜集団より高い転移活性を有することが、最近報告された（非特許文献７）。転移は、原発部位からの腫瘍細胞の脱出、移動、続発部位での接着および滲出、ならびに増殖および血管形成の開始を伴う多段過程であるので、ＣＳＣは、転移において重要な役割を果たし得る。
したがって、本発明の結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＡＰによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の処理、またはｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＡＰの投与が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の転移活性を抑制することを示唆している。
【００７５】
上市される薬物数は、年毎に減少してきた。これは、可能性ある薬物の意外な副作用および低質な薬物動態が、臨床試験の段階で明らかになってきているためである。したがって、本発明者らは、既に臨床的に使用されている薬物の新たな薬理作用を特定し、こうした薬物を他の疾患用に開発するためにその作用を使用する、新たな戦略を検討している。
【００７６】
したがって、本発明では、既に臨床的に使用されている薬物からＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導する化学物質を探索した。本発明者らは、抗腫瘍薬、または他の抗腫瘍薬の効力を増強する薬物を目指してＡＡＰを開発することは、人におけるその安全性および薬物動態が既に確認されているので、高い確率で成功し得ると考えている。しかし、この発想に対する主要な障害はＡＡＰの用量である。抗炎症解熱鎮痛作用に対するＡＡＰの臨床用量は、１５００ｍｇ／人／日（２５ｍｇ／ｋｇ／日）であり、動物の抗炎症解熱鎮痛作用に対して必要な用量は、１５０ｍｇ／ｋｇであり、本発明で使用された用量（６００ｍｇ／ｋｇ）より遥かに高い。臨床用にＡＡＰ用量を増加させることは、肝副作用を起こすと思われるので適当ではない。そのため、抗腫瘍効果の実現に必要なＡＡＰ用量を減少させる方法として、腫瘍に対する特異的なその薬物送達などが重要である。あるいは、ＡＡＰの肝毒性を低下させるＮ−アセチルシステインなどの薬物の同時投与も、考えることができる。
【００７７】
代替戦略は、ＡＡＰより、抗腫瘍活性または肝臓に対する安全性が高いＡＡＰ誘導体の特定であるが、この戦略は、既に臨床的に使用されている薬物の使用という長所を減少させる。本発明では、ＡＡＰの異性体であるｏ−アセトアミドフェノールが、ＡＡＰで観察された場合と同様の程度まで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化を誘導し、ｉｎ  ｖｉｖｏでＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の腫瘍異種移植片の増殖を減少させることを見出した。更に、ｏ−アセトアミドフェノールの方が、恐らくは肝毒性が低いために、マウスに対する毒性が低いことも見出した。ＡＡＰは、肝臓中のシトクロームＰ４５０酵素により代謝変換されて、反応性の求電子代謝産物であるｎ−アセチル−ｐ−ベンゾキノンイミンとなるが、これは、グルタチオンを減失させ、各種のタンパク質に共有結合する結果、肝毒性を起こす。ｏ−アセトアミドフェノールがＡＡＰより肝毒性が低いのは、ｏ−アセトアミドフェノールが、シトクロームＰ４５０酵素の基質ではないこと、またはｏ−アセトアミドフェノールの代謝産物が、肝臓に対してｎ−アセチル−ｐ−ベンゾキノンイミンほど毒性がないことが原因になり得る。ｏ−アセトアミドフェノールは、ＣＳＣに対する分化誘導活性および低毒性のために、乳癌の治療に有益になり得ると考えられる。
【００７８】
結論として、本発明者らは、ＡＡＰおよびｏ−アセトアミドフェノールが、ＣＳＣの分化を誘導する新型の抗腫瘍薬になると提案する。この種の薬物は、他の化学療法剤と併用した癌療法に有益である。その理由は、該薬物が、現行の癌療法の障害、即ち化学療法に対する耐性、転移および再発を与えることができると思われるからである。
【００７９】
＜図の更なる詳細な説明＞
【００８０】
図１：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＡＡＰ誘導分化。４日間、ＡＡＰ１ｍＭで、およびＡＡＰなしで（対照）処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、またはＪＡＭ−Ａ用発現プラスミド（ＪＡＭ−Ａ）もしくはベクター（ベクター）で安定にトランスフェクトした細胞を分析した（図１Ａ〜Ｅ）。細胞形態は、位相差顕微鏡による観察で調べた（図１Ａ）。ＣＤ２４およびＣＤ４４の細胞表面発現は、材料および方法の項に記載したようにＦＡＣＳで分析した（図１Ｂ）。総ＲＮＡを抽出し、各遺伝子に対する特定のプライマーセットを用いて、該ＲＮＡに対してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った（Ｄｉｆｆ：分化細胞のマーカー、Ｓｔｅｍ：幹細胞のマーカー）。数値は、対照に比して発現したアクチン遺伝子に対して規格化した（図１Ｃ）。ＺＯ−１およびβ−カテニンの発現を免疫染色アッセイでモニターした（図１Ｄ）。細胞浸潤活性は、材料および方法の項に記載したように、マトリゲル被覆トランスウェル上で測定し、対照に比して表した（図１Ｅ）。示した数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝３〜７）である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【００８１】
図２：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＡＡＰ誘導分化の特異性。ＭＣＦ−７（図２Ａ〜Ｃ）またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図２Ｄ〜Ｇ）細胞を、４日間、ＡＡＰ１ｍＭで、もしくはＡＡＰなしで（対照）（図２Ａ〜Ｄ）、または４％ＥｔＯＨで（図２Ｄ〜Ｇ）処理した。細胞形態（図２Ａ、Ｅ）、ＣＤ２４およびＣＤ４４の細胞表面発現（図２Ｂ、Ｆ）、ならびにｍＲＮＡ発現（図２Ｃ、Ｇ）は、図１の見出しに記載したように調べた。生存細胞数は、細胞の直接計数でモニターした（図２Ｄ）。示した数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝３〜４）である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【００８２】
図３：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の分化誘導に対するＡＡＰの構造−機能相関。ＡＡＰおよびその誘導体（化合物ａ〜ｉ）の化学構造を示した（図３Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＡＡＰおよびその誘導体の１ｍＭ（図３Ｂ、Ｃ、Ｅ）もしくは指示濃度（図３Ｄ）で、もしくは前記のものなしで（対照）、またはインドメタシン０．１ｍＭ（Ｉｎｄｏ）（図３Ｅ）で、４日間（図３Ｂ〜Ｄ）または４時間（図３Ｅ）処理した。ＣＤ２４およびＣＤ４４の細胞表面発現は、図１の見出しに記載したように調べ、分化細胞（ＣＤ４４−／ｌｏｗ／ＣＤ２４＋）の全細胞に対する比率（％）を決定した（図３Ｂ）。全細胞抽出物は、クラウディン−１またはアクチンに対する抗体で免疫ブロットすることにより分析した（図３Ｃ）。生存細胞数は、ＭＴＴ法により決定した（図３Ｄ）。細胞を更に、アラキドン酸５０μＭと共に２０分間インキュベートし、培地中のＰＧＥ２量をＥＩＡで決定した（図３Ｅ）。数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【００８３】
図４：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＡＡＰ誘導分化におけるＷｎｔ／β−カテニン古典的シグナル伝達経路の関与。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、４日間、ＢＩＯ１μＭの存在下または非存在下、ＡＡＰ１ｍＭで、またはＡＡＰなしで（対照）処理した（図４Ａ、Ｃ〜Ｆ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、４日間、ＬＹ３６４９４７の指示濃度で処理した（図４Ｂ）。各遺伝子のｍＲＮＡ発現を調べ、図１の見出しに記載したように表した（図４Ａ、Ｆ）。細胞形態ならびにＺＯ−１およびβ−カテニンの発現は、図１の見出しに記載したように調べた（図４Ｂ、Ｄ、Ｅ）。β−カテニン量は、図３の見出しに記載したように免疫ブロットでモニターした（図４Ｃ）。示した数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝３〜７）である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．は有意性なし。
【００８４】
図５：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の抗癌薬に対する感受性のＡＡＰ誘導増加。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図５Ａ、Ｄ、Ｅ）またはＭＣＦ−７（図５Ｃ）細胞を、４日間、ＡＡＰ１ｍＭで、またはＡＡＰなしで（対照）処理した。ＪＡＭ−Ａ用発現プラスミド（ＪＡＭ−Ａ）またはベクター（ベクター）で安定にトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、４日間培養した（図５Ｂ）。ＡＡＰを除去した後、細胞を、指示濃度のドキソルビシンと３日間、または５−ＦＵと５日間更にインキュベートし、細胞生存率をＭＴＴ法で決定した（図５Ａ〜Ｃ）。細胞をカルセインＡＭと共にインキュベートし、細胞内カルセイン量を、材料および方法の項に記載したように、ＦＡＣＳ分析でモニターした。各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を調べ、図１の見出しに記載したように表した（図５Ｅ）。示した数値は、平均値±ＳＤ（ｎ＝３〜４）である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．は有意性なし。
【００８５】
図６：ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の増殖に対するＡＡＰの効果。４日間、ＡＡＰ１ｍＭで、およびＡＡＰなしで（対照）処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、各ヌードマウスの右後肢足蹠の皮下に０日目に接種した（１×１０７細胞／マウス）（図６Ａ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、各ヌードマウスの右後肢足蹠の皮下に接種した（１×１０７細胞／マウス）。２週後（０日目）、ＡＡＰ（６００ｍｇ／ｋｇ）もしくはＰＢＳの左後肢足蹠への毎日の皮下投与、および／またはドキソルビシン（４ｍｇ／ｋｇ、ＤＸＲ）もしくはＰＢＳの尾静脈への毎週の静脈内投与を開始した（図６Ｂ〜Ｄ）。腫瘍サイズを毎週測定し、その体積を計算した（図６Ａ、Ｂ）。３５日目に、腫瘍異種移植片を取り除き、ＣＤ４４、ＣＤ２４およびβ−カテニンに対する抗体で免疫組織化学分析に掛けた（図６Ｃ、Ｄ）。数値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝６〜８）である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．は有意性なし。
【００８６】
図７：ＡＡＰとｏ−アセトアミドフェノールとの肝毒性および抗癌作用の比較。ｏ−アセトアミドフェノール（ｏ−ＡＡＰ）またはＡＡＰ（ｐ−ＡＡＰ）がヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の増殖に及ぼす効果を、図６の見出しに記載したように調べた（図７Ａ）。ＩＣＲ野生型マウスに、指示用量のｏ−ＡＡＰまたはｐ−ＡＡＰを経口投与した。８時間後、マウスの生存率（図７Ｂ）、ならびに血漿中のＡＳＴおよびＡＬＴの活性（図７Ｃ）を、材料および方法の項に記載したように決定した。数値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４〜８）である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．は有意性なし。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
以上記載のように、癌細胞の一部を占めている癌幹細胞は、抗癌剤に対して抵抗性を示すので既存の抗癌剤が有効に作用しないため、抗癌剤の効果を増強させるためには癌幹細胞の分化を誘導する必要がある。
本発明が提供するアセトアミノフェン（ＡＡＰ）誘導体は、この癌幹細胞の分化を誘導し、癌細胞の悪性度を低下させ（抗癌作用を発揮し）、抗癌剤の感受性を上げ効果を増強させる（抗癌剤の増強作用）。
特に、既存の抗癌剤、例えばドキソルビシンと併用することにより、その治療効果を高め、抗癌活性を増強させる点で、極めて特異的なものである。
【図１】
2012031076.tif 000003
【図２】
2012031076.tif 000004
【図３】
2012031076.tif 000005
【図４】
2012031076.tif 000006
【図５】
2012031076.tif 000007
【図６】
2012031076.tif 000008
【図７】
2012031076.tif 000009