(57)【要約】【課題】髄膜炎菌感染に対する防御免疫を一貫しておよび確実に誘導するワクチン組成物を提供すること。【解決手段】本発明の組成物は、（ｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞；および（ｉｉ）少なくとも１つのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原性タンパク質を含み、該外膜小胞が、第１のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株に由来し、そして該抗原性タンパク質が、該第１の株とは異なる第２のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株に由来する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞；および（ｉｉ）少なくとも１つのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原性タンパク質を含む組成物であって、該外膜小胞が、第１のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株に由来し、そして該抗原性タンパク質が、該第１の株とは異なる第２のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株に由来する、組成物。
【請求項２】
前記組成物が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なる株由来の複数の抗原性タンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記外膜小胞が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なる株由来の外膜小胞の混合物を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原性タンパク質が、表面抗原、ペリプラズムタンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ、または糖タンパク質より選択される、請求項１から３のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原性タンパク質が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ表面抗原である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗原性タンパク質が、Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ）またはナイセリア表面タンパク質Ａ（ＮｓｐＡ）より選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤがダイマータイプである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかの項に記載の組成物であって、該組成物が、
（ａ）前記少なくとも１つの単離されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原性タンパク質を得る工程；
（ｂ）前記Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞を得る工程；および
（ｃ）該単離されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原性タンパク質と該単離されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞とを組み合わせる工程
を含む方法により得られる、組成物。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかの項に記載の組成物を含む、ワクチン。
【請求項１０】
組成物の製造方法であって、
（ａ）第１のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株の外膜から少なくとも１つのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原性タンパク質を抽出して該抗原性タンパク質の水溶液を調製する工程；
（ｂ）該第１の株とは異なる第２のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株の培養物から外膜小胞を抽出する工程；
（ｃ）薬学的に受容可能なキャリアを得る工程；ならびに
（ｄ）工程（ａ）で調製した溶液、工程（ｂ）で調製した外膜小胞、および工程（ｃ）で得たキャリアを混合する工程
を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記方法の工程（ａ）の代わりに、
（ａ）第１のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株の少なくとも１つの抗原性タンパク質をコードするＤＮＡを細菌において組換え発現し、該細菌の外膜から該抗原性タンパク質を抽出し、該抗原性タンパク質の水溶液を調製する工程
を含む、方法。
【請求項１２】
前記Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原性タンパク質が、表面抗原、ペリプラズムタンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ、または糖タンパク質より選択される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原性タンパク質が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ表面抗原である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原性タンパク質が、Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ）またはナイセリア表面タンパク質Ａ（ＮｓｐＡ）より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤがダイマータイプである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
髄膜炎菌疾患に対するワクチン接種のための医薬品の製造のための、請求項１から８のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１７】
前記髄膜炎菌疾患がＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染である、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多成分ワクチン、およびグラム陰性病原体による広いスペクトルの感染に対して防御免疫を与える多成分ワクチンを調製するための方法に関する。特に、本発明は、髄膜炎菌疾患に対する受動および能動の両方の防御免疫を提供する多成分ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
髄膜炎菌性髄膜炎は、世界的に主要な問題であり、そして多くの国で感染の発生が増加している。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、この疾患の原因因子であり、そしてまた、髄膜炎菌性敗血症の原因であり、これは急速な発症および高い死亡率に関連し、症例の約２２％が致命的である。
【０００３】
現在、髄膜炎菌疾患に対する防御免疫を提供するワクチンは、限られた防御を提供するにすぎないが、これはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに多くの異なる株があるためである。血清群抗原である莢膜多糖類に基づくワクチンは、感染に対して短命の防御を与えるのみであり、そして北アメリカおよびヨーロッパで通常見られる多くの株に対して防御しない。これらのワクチンのさらなる欠点は、通常最も感染しやすい脆弱な群の１つである２歳以下の子供に低レベルの防御しか与えないことである。
【０００４】
髄膜炎菌トランスフェリンレセプターは、２つのタイプの構成タンパク質鎖である、トランスフェリン結合タンパク質Ａ（ＴｂｐＡ）およびＴｂｐＢからなる。レセプター複合体は、単一のＴｂｐＢと会合するＴｂｐＡのダイマーから形成されると考えられる（Boultonら(1998)）。ＴｂｐＡに存在するエピトープは、タンパク質の内部にマスクされていることが知られている（Ala'Aldeen (1996)）。単独の株に由来するＴｂｐＢに基づく髄膜炎菌性髄膜炎に対するワクチンは、いくつかの交差反応性を示し、そしてＴｂｐＢ単独で免疫したウサギにおいて交差反応性免疫応答の証拠がある（Feirrerosら(1998)）。
【０００５】
Gomezら（Vaccine Vol.16 (1998) No.17 pp.1633-1639）は、ＴｂｐＡ＋ＴｂｐＢ複合体を含むワクチンにおいて多くの異なるアジュバント組成物の効果についての研究を記載している。髄膜炎菌チャレンジに対する免疫率は、ＴｂｐＡ＋ＴｂｐＢおよびＲＡＳアジュバントを含む組成物で最高であった。
【０００６】
Ala'Aldeen（J. Med. Microbiol. Vol. 44 (1996) pp.237-243）は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＴｂｐおよびその候補ワクチン抗原としてのその使用の可能性の総説を提供している。Ala'Aldeenは、交差反応性および広いスペクトルの防御が、主としてＴｂｐＢサブユニットに関連することを示唆している（240ページ、第３段落）。
【０００７】
Gorringeら（Vaccine Vol.13 (1995) No.13 pp.1207-1212）は、Ｔｂｐに対するヒト抗体応答を記載し、そして抗Ｔｂｐ抗体についてヒト血清をテストすることによってワクチン抗原としての価値を評価している。Gorringeらは、このようなワクチンのどの成分も記載していないが、精製したＴｂｐＡおよびＴｂｐＢサブユニットとＴｂｐＡ＋Ｂ複合体との間の抗体交差反応性のレベルを研究している。
【０００８】
Boultonら（Biochem. J. (1998) 334 pp.269-273）は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＴｂｐＢの単離および特徴づけを記載し、そしてＴｂｐＡダイマー＋ＴｂｐＢモノマーとしてのインビボでのＴｂｐ複合体の形成も仮定する。
【０００９】
それにもかかわらず、より広いスペクトルのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株からの感染に対してより広い範囲の防御免疫を与えるワクチンを提供することは、有益である。幼児および成人に対して防御免疫を与え、そしてその防御が長期であるワクチンを提供することは、さらに有益である。無症状感染に対して防御するワクチンを提供することも有益である。すなわち、無症状感染は、髄膜炎菌感染の徴候がすぐに出現せず、感染した個体が病原体のキャリアの働きをし得るからである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、Ｔｂｐを含む組成物、およびそれに基づくワクチンを提供することであり、それによって当該技術分野の不利点に対処するまたは少なくとも改善する。特に、本発明の目的は、髄膜炎菌感染に対する防御免疫を一貫しておよび確実に誘導するワクチン組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、（ｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞；および（ｉｉ）少なくとも１つのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原性タンパク質を含む組成物を提供し、上記外膜小胞は、第１のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株に由来し、そして上記抗原性タンパク質が、上記第１の株とは異なる第２のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株に由来する。
【００１２】
１つの実施態様では、上記組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なる株由来の複数の抗原性タンパク質を含む。
【００１３】
１つの実施態様では、上記外膜小胞は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なる株由来の外膜小胞の混合物を含む。
【００１４】
１つの実施態様では、上記組成物において、上記Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原性タンパク質は、表面抗原、ペリプラズムタンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ、または糖タンパク質より選択される。
【００１５】
さらなる実施態様では、上記少なくとも１つのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原性タンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ表面抗原である。
【００１６】
さらなる実施態様では、上記抗原性タンパク質は、Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ）またはナイセリア表面タンパク質Ａ（ＮｓｐＡ）より選択される。
【００１７】
よりさらなる実施態様では、上記Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤはダイマータイプである。
【００１８】
１つの実施態様では、上記組成物は、
（ａ）上記少なくとも１つの単離されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原性タンパク質を得る工程；
（ｂ）上記Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞を得る工程；および
（ｃ）上記単離されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原性タンパク質と上記単離されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞とを組み合わせる工程
を含む方法により得られる。
【００１９】
本発明はまた、上記組成物を含むワクチンを提供する。
【００２０】
本発明はさらに、上記組成物の製造方法を提供し、上記方法は、
（ａ）第１のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株の外膜から少なくとも１つのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原性タンパク質を抽出して該抗原性タンパク質の水溶液を調製する工程；
（ｂ）上記第１の株とは異なる第２のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株の培養物から外膜小胞を抽出する工程；
（ｃ）薬学的に受容可能なキャリアを得る工程；ならびに
（ｄ）工程（ａ）で調製した溶液、工程（ｂ）で調製した外膜小胞、および工程（ｃ）で得たキャリアを混合する工程
を含む。
【００２１】
１つの実施態様では、上記方法は、上記工程（ａ）の代わりに、
（ａ）第１のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株の少なくとも１つの抗原性タンパク質をコードするＤＮＡを細菌において組換え発現し、上記細菌の外膜から上記抗原性タンパク質を抽出し、上記抗原性タンパク質の水溶液を調製する工程
を含む。
【００２２】
１つの実施態様では、上記方法において、上記Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原性タンパク質は、表面抗原、ペリプラズムタンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ、または糖タンパク質より選択される。
【００２３】
さらなる実施態様では、上記Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原性タンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ表面抗原である。
【００２４】
さらなる実施態様では、上記抗原性タンパク質は、Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ）またはナイセリア表面タンパク質Ａ（ＮｓｐＡ）より選択される。
【００２５】
よりさらなる実施態様では、上記Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤはダイマータイプである。
【００２６】
本発明はさらに、髄膜炎菌疾患に対するワクチン接種のための医薬品の製造のための、上記組成物の使用を提供する。
【００２７】
１つの実施態様では、上記髄膜炎菌疾患はＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＴｂｐＡ＋Ｂおよび外膜小胞でのマウスの免疫処置を示すグラフである。
【図２】ＴｂｐＡ＋Ｂでのマウスの免疫処置を示すグラフである。
【図３】ＴｂｐＡ＋Ｂ、単離したＴｂｐＡ、または単離したＴｂｐＢで免疫処置した後の、ＩＰ感染に対するマウスの防御を示すグラフである。
【図４】ナイセリアＴｂｐＡ＋Ｂ、ＴｂｐＢまたはＴｂｐＡ（ｎＴｂｐ）のいずれかで免疫処置した後の、髄膜炎菌感染に対するマウスの防御を示すグラフである。
【図５】ナイセリアＴｂｐＡ＋Ｂ、ＴｂｐＢまたはＴｂｐＡ（ｎＴｂｐ）、あるいは組換えＴｂｐ（ｒＴｂｐ）のいずれかで免疫処置した後の、髄膜炎菌感染に対するマウスの防御を示すグラフである。
【図６】組換えＴｂｐＡ＋Ｂ、ＴｂｐＢまたはＴｂｐＡで免疫処置した後の、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｋ４５４株のそれぞれ１０６生物／マウスのチャレンジに対するマウスの防御を示すグラフである。
【図７】組換えＴｂｐＡ＋Ｂ、ＴｂｐＢまたはＴｂｐＡで免疫処置した後の、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｋ４５４株のそれぞれ１０７生物／マウスのチャレンジに対するマウスの防御を示すグラフである。
【図８】異種血清群でのチャレンジに対する防御を示すグラフである。
【図９】Ｂ１６Ｂ６でのチャレンジに対する防御を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
したがって、本発明の第１の局面は、両方のトランスフェリン結合タンパク質Ａ（ＴｂｐＡ）およびＢ（ＴｂｐＢ）を、適切には約２：１（ＴｂｐＡ：ＴｂｐＢ）のモル比で含む組成物を提供する。本発明の好ましい実施態様では、ＴｂｐＡ対ＴｂｐＢのモル比は２：１である。
【００３０】
この組成物は、髄膜炎菌疾患の治療のための薬学的組成物を製造するために、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わされ得る。このようなキャリアとしては、例えば、アジュバントミョウバンが挙げられるが、経口、静脈内、皮下、腹腔内、または任意の他の投与経路に適した任意のキャリアが適切である。
【００３１】
本発明は、したがって、両方のＴｂｐＡ＋Ｂタンパク質を、好ましくは１．８分子と２．２分子との間のＴｂｐＡ対１分子のＴｂｐＢのモル比で、より好ましくは２分子のＴｂｐＡ対１分子のＴｂｐＢのモル比で含むワクチンを提供する。成分のこの特定の組み合わせは、驚くべきことに、ＴｂｐＢ単独でのワクチン接種と比較して、髄膜炎菌感染に対するより高い防御免疫を提供し得る。以下により詳細に記載する本発明の特定の実施態様では、Ａ：Ｂの１：１の組み合わせは、Ｂ単独よりもチャレンジに対してより防御性である。これは、ＴｂｐＡがこれまで非防御性であると考えられていたので、驚くべきことである。本発明の結果はこの確立された見解とは異なるが、これはワクチンとして投与した場合、ＴｂｐＡもまた髄膜炎菌感染に対する防御免疫を提供し得ることを示すいくつかの実験（以下でより詳細に記載）によって示される。しかし、本発明の結果が最も顕著に証明するのは、ＴｂｐＡまたはＢを単独で含むワクチンと比較した場合、ＴｂｐＡおよびＢの両方を含むワクチンの一貫した性能である。これは、組成物と、ＴｂｐＡ＋Ｂでのワクチン接種に対する応答で誘発される感染に対する一貫した高レベルの防御との間には、変動性がないことであり、これによって、本発明の組成物が、従来のワクチンよりも著しく有利であることが証明される。
【００３２】
トランスフェリン結合タンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのような多くのグラム陰性細菌の外膜上に位置することが知られている。本発明の組成物と従来のキャリアまたはアジュバントとの処方物は、これらの細菌による感染の治療のための組成物を提供する。
【００３３】
本発明の組成物の投与後に、抗体が、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ由来の並列の配列からなるエピトープに対して惹起され得ることは有利である。したがって、このような組成物を使用して得られ得る免疫応答は、Ｔｂｐ複合体の１つの成分のみを含み、そして潜在的なＴｂｐエピトープの全範囲が利用可能ではない従来技術のワクチン組成物からの免疫応答と比較して、改善され得る。ＴｂｐＡ＋Ｂ複合体の１つのＴｂｐサブユニット成分が、第１のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株に由来し、そしてもう１つの成分が、第１とは異なる第２の株に由来することは、本発明においてさらなる選択肢である。例えば、ＴｂｐＡダイマーは、第１の株に由来し、そしてＴｂｐＢは第２の株に由来する。ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢタンパク質は、独立して、Ｋ４５４株、Ｈ４４／７６株、およびＢ１６Ｂ６株から選択され得る。本発明のすべての局面において、Ｔｂｐは、細菌ソースから直接単離され得るか、または当業者に通常知られている組換え方法によって産生され得る。他の株からのタンパク質の組み合わせも予測され、そして種々の株の細菌由来の成分を組み合わせることは、髄膜炎菌感染に対するより広いスペクトルの防御を個体に提供するための可能性を提供する。本発明の組成物またはワクチンが、種々の株由来のＡタンパク質の混合物または種々の株由来のＢタンパク質の混合物を含むことは、さらなる選択肢であり、本発明によって与えられる防御の潜在的なスペクトルを広げる。よりさらなる選択肢は、Ｔｂｐが、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓを含む他の細菌から得られるまたはこれらに由来することである。
【００３４】
本発明において、用語「トランスフェリン結合タンパク質」または「Ｔｂｐ」とは、単独でトランスフェリンに結合するか、またはトランスフェリンと結合するタンパク質の複合体の一部であり得るいずれかのタンパク質をいう。この用語はまた、このようなタンパク質のフラグメント、改変体、または誘導体に対して惹起された抗体が、このタンパク質と結合する場合、このようなタンパク質のフラグメント、改変体、および誘導体を含む。したがって、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢは、解離した状態または会合した複合体の状態のいずれかのＴｂｐであると考えられる。さらに、ＴｂｐＡまたはＢのいずれかの変異体、融合タンパク質、またはフラグメント、あるいは共通の抗原的同一性を有するＴｂｐＡ＋Ｂ複合体の他の誘導体も、本発明において用語Ｔｂｐによって表されると考えられる。
【００３５】
本発明の第２の局面は、２つのＴｂｐＡおよび１つのＴｂｐＢの複合体を含む組成物を提供する。したがって、タンパク質は、天然のレセプターで見られる比率で一緒に保持される。個々のタンパク質は、例えば、水素結合または共有結合によって結合され得る。後者の場合、各ＴｂｐＡは、直接的または間接的のいずれかでＴｂｐＡに共有結合される。好ましい実施態様では、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢの複合体は、天然の構造を有すると考えられる。
【００３６】
天然のＴｂｐＡ＋Ｂ複合体は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから単離され精製され得る。あるいは、本発明はまた、組換えＴｂｐタンパク質の合成、次いでインビトロでのＴｂｐＡ＋Ｂ複合体のアセンブリを提供する。ＴｂｐＡ＋Ｂ複合体は、混合によって形成され得、または当該技術分野で公知の物理的（例えば、ＵＶ照射）または化学的方法によって架橋され得、一緒に残りそして互いに解離し得ないＴｂｐの組み合わせを生じる。さらなる例では、２つのＴｂｐＡ配列を好ましくはＴｂｐＡダイマーの形態で含む一本鎖組換えタンパク質は、次いで、ＴｂｐＢタンパク質と共有結合され、インビトロで完全なＴｂｐＡ＋Ｂ複合体を形成する。使用における本発明のもう１つの例は、ＴｂｐＡおよびＢが、ＴｂｐＡとＴｂｐＢサブユニットとの間のジスルフィド結合の形成を容易にするシステイン残基を導入するように変異され、共有結合複合体を得る。
【００３７】
組換えタンパク質の調製において、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ遺伝子を短縮して、タンパク質の抗原性に寄与することが知られているドメインのみが、Ｔｂｐ複合体に組み込まれるようにもし得る。
【００３８】
本発明のいくつかの組成物において、ＴｂｐＡ＋Ｂ複合体は、トランスフェリンレセプターとして作用し得、そしてヒトトランスフェリンに結合する。本発明の他の組成物では、ＴｂｐＡ＋Ｂ複合体は、トランスフェリンを結合しない意味で非機能的であるが、それにもかかわらず、適切な免疫応答を誘起する抗原性成分を提供する。
【００３９】
本発明の第３の局面は、ＴｂｐおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞を含む組成物を提供する。この組成物の有利点は、ワクチン接種を受けた人または患者に投与した場合、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原、および特に生きた感染生物の膜上に実質的に存在するような形態である抗原、の異なる組み合わせを示すことである。この組み合わせは、感染に対するより有効な防御または現存するワクチンよりも広いスペクトルの防御の可能性を提供する。デスオキシコール酸処理によるような外膜小胞単離の公知の方法は、本発明の組成物の調製に適切である。種々の好ましい実施態様では、Ｔｂｐは、ＴｂｐＡ、ＴｂｐＢ、または天然のままの複合体もしくは解離した形態のいずれかのＴｂｐＡ＋Ｂである。
【００４０】
外膜小胞はさらに、小胞膜にＴｂｐを富化するようにインビトロにてＴｂｐで前処理され得る。「富化」および類似の用語は、小胞中のＴｂｐの濃度または密度を上昇させるようにＴｂｐが添加されている外膜小胞をいう。好ましくは、富化により、膜に位置するトランスフェリンレセプターの数が増加した外膜小胞を生じる。これは、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢを小胞へ添加することにより、これらの濃度が上昇し会合してレセプターまたはレセプター様構造をとるためである。本発明のこのような実施態様の特定の有利点は、ワクチンの重要な抗原性成分とみなされるＴｂｐが、高度に抗原性の環境に提示されることであるが、この環境は、トランスフェリンレセプターが生きた感染細菌上に提示される環境に非常によく似ている。
【００４１】
既述のように、組成物のＴｂｐ成分は、野生型Ｔｂｐである必要はない。これらは、組換え法で作成され得、そしてそのようにして配列改変が導入され得る。本発明の１つの代表的な例では、組換えＴｂｐＢは、膜結合ドメインを含むように改変される。好ましい膜スパニングドメインは、ＴｂｐＢタンパク質のＮまたはＣ末端のいずれかに付加された疎水性αヘリカル領域である。しかし、膜アンカリング領域は、αへリックスだけが必要であるのではなく、脂肪酸または脂質鎖の付加も膜アンカリングを容易にする。実際に、野生型ＴｂｐＢは、このような脂質鎖アンカーを介して細菌の外膜にアンカリングされると考えられている。使用における本発明のさらなる例では、外膜小胞（ＯＭＶ）を、インビトロにて膜結合組換えＴｂｐＢで前処理し、小胞膜にＴｂｐＢを富化する。Ｔｂｐが富化されたＯＭＶは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓでの高レベルのＴｂｐ発現を誘発し、次いで既述の方法の１つによってＯＭＶを単離することによって、さらに生成される。この後者の方法は、代表的には、選択したＴｂｐをコードする遺伝子が挿入されている適切な発現ベクターで、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを形質転換することによって達成される。ナイセリア種で使用される適切な発現ベクターとしては、プラスミドｐＭＧＣ１０（Nassifら(1991)）が挙げられる。
【００４２】
本発明の組成物は、外膜小胞およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのある範囲の異なる株から単離されたＴｂｐＡ＋Ｂ複合体を含むことが好ましい。本発明の他の好ましい組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの他のタンパク質、例えば、表面抗原、ペリプラズムタンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ、および糖タンパク質を含む。
【００４３】
本発明の第３の局面の組成物は、外膜小胞の代わりにまたはそれに加えて、１つ以上のリポソームを含み得、各リポソームは、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢを含み、好ましくは、レセプターまたはレセプター様複合体に会合したＴｂｐＡおよびＴｂｐＢを含む。したがって、トランスフェリンレセプター抗原を提示するさらなる手段が提供される。
【００４４】
本発明の第３の局面のさらなる実施態様では、組成物は、外膜小胞と同様にまたはその代わりに２２ｋＤ抗原（ナイセリア表面タンパク質Ａ（ＮｓｐＡ））を含む。ＮｓｐＡおよびその調製物は、Martinら, 1997に記載されている。
【００４５】
本発明の第４の局面は、上記のような本発明の組成物を含むワクチンを提供する。本発明のワクチンはまた、Ｔｂｐに対する抗体を含み得、したがって細菌感染に対するあるレベルの受動免疫を提供する。
【００４６】
本発明の第５の局面は、ＴｂｐＡ、ＴｂｐＢ、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞と、薬学的に受容可能なキャリアとを組み合わせる工程を包含する、組成物の製造方法を提供する。ＴｂｐＡ対ＴｂｐＢのモル比が約２：１であることが好ましい。外膜小胞は、天然のＴｂｐＡ＋Ｂでインビトロにて前処理され得、それによって小胞膜にＴｂｐ複合体が富化され得る。しかし、外膜小胞はまた、他のタンパク質成分で前処理され得、それによってこれらの抗原性成分も富化され得る。外膜小胞はまた、いくつかの異なる株のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来する抗原性タンパク質およびプロテオグリカンで前処理され得る。
【００４７】
本発明のさらなる局面は、ＴｂｐおよびＣｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ）を含む組成物を提供する。
【００４８】
Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ）は、多くの原核生物および真核生物にみられる金属酵素である。この酵素は、スーパーオキシドラジカルアニオンＯ２−の過酸化水素および分子状酸素への還元を触媒し、そのため細胞傷害性フリーラジカルの生物からの除去に重要な役割を果たす。細菌において、Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを含む多くのグラム陰性種のペリプラズムにおいて同定されている。酵素は、ダイマーまたはモノマーとして存在し得、したがって本発明の好ましい実施態様では、ＴｂｐおよびダイマータイプのＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤを含む組成物が提供される。
【００４９】
用語「Ｔｂｐ」の使用に関して既述のように、本発明のＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤはまた、そのフラグメント、改変体、または誘導体に対して惹起された抗体が野生型Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤと結合する場合、このようなタンパク質のフラグメント、改変体、および誘導体を含む。
【００５０】
本発明の使用例では、Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤと、ＴｂｐＡ、ＴｂｐＢ、またはＴｂｐＡ＋Ｂ複合体のいずれかとを含む組成物が提供される。後者の例では、ＴｂｐＡ対ＴｂｐＢのモル比が１．８と２．２との間であることが好ましく、最も適切な組成物は、２：１（ＴｂｐＡ：ＴｂｐＢ）の比を有する。本発明のさらなる組成物では、Ｔｂｐは、Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤが由来する株とは異なる株のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来し、そのため髄膜炎菌感染に対するより広いスペクトルの免疫応答の形成を容易にする。
【００５１】
本発明はまた、ＴｂｐおよびＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤが、異なる細菌種、代表的には異なるグラム陰性種に由来する組成物を提供する。このような組成物は、それによって、ワクチンとして投与された場合に誘起される免疫応答のスペクトルをさらに広くする。代表的な組成物は、ナイセリアＴｂｐＡ＋Ｂ複合体、ならびにモノマーＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに由来）および任意にさらなるダイマーＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ（例えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに由来）を含む。
【００５２】
本発明の他の局面は、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢが共有結合した複合体を、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞およびＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤのいずれかまたは両方と、薬学的に受容可能なキャリアとを合わせる工程を包含する、グラム陰性細菌感染に対する防御免疫を提供する組成物の製造方法を提供する。
【００５３】
本発明のさらなる局面は、Ｔｂｐおよび外膜小胞を含む組成物を提供し、ここで外膜小胞は、異なる株のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来する。同様に、本発明はまた、ＴｂｐおよびＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤを含む組成物を提供し、ここでＴｂｐは、異なる株のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来する。
【００５４】
さらなる局面は、ヒトワクチン接種のための医薬品の製造におけるＴｂｐＡおよびＢの使用を提供する。このような医薬品は、髄膜炎菌感染に対するワクチン接種に適切であるが、本発明のいくつかの組成物は、より広範囲の細菌性病原体からの感染に対して広いスペクトルの防御を提供することが好ましい。
【００５５】
本発明の実施態様は、以下に記載の実施例によってより詳細に説明される。実施例に示される結果は、添付の図面によって例示される。
【実施例】
【００５６】
マウス防御データ
マウス（ＣＡＭＲ−ＮＩＨ）を、Ｔｂｐおよび／または外膜小胞で免疫し、そして同種または異種のいずれかの髄膜炎菌株でチャレンジした。Ｋ４５４株由来のＴｂｐおよび外膜小胞で免疫したマウスの、Ｋ４５４株によるチャレンジ後の群当たりの生存動物を、図１に示す。Ｔｂｐと比較して、外膜小胞ワクチンは、防御が低下していたが、これは、異なる群Ｂ株（Ｈ４４／７６）から産生されるためであり得る。Ｋ４５４株から単離されたＴｂｐＡ＋Ｂで免疫した動物も、他の血清群Ｂ生物でのチャレンジに対して防御され（図１）、そして同種株および類似の分子量を有するＴｂｐＢを発現する株で、より大きな防御が見られた。非常に異なる分子量を有するＴｂｐＢを有する髄膜炎菌（Ｂ１６Ｂ６株）でのチャレンジに対しては、ほとんどまたは全く防御が観察されなかった。異種チャレンジ株では、Ｔｂｐ＋外膜小胞の組み合わせでワクチン接種した群において、わずかに多数の生存動物がいる。しかし、含まれる数は小さく、そして明確な結果には達し得ない。Ｋ４５４株由来のＴｂｐＡ＋Ｂで免疫したマウスもまた、血清群Ｃでの感染に対して防御されるが、血清群Ａ株では防御されないことが観察されたことは、興味深い（図２）。
【００５７】
一緒に精製したＴｂｐＡ＋Ｂならびに単離されたＴｂｐＡおよびＴｂｐＢで免疫したマウスでの、Ｋ４５４株でのチャレンジに対する防御を、図３に示す。ＴｂｐＢが、防御の原因である重要な抗原であり、ＴｂｐＡ単独ではほとんど防御は与えられなかった。
【００５８】
組換えＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｋ４５４株由来のＴｂｐＡおよびＴｂｐＢをクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉで過剰発現させた。これらのタンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、そしてこれを用いて髄膜炎菌疾患のマウスモデルにおいてそれらの防御力価を決定した。組換えＴｂｐは、鉄ストレスを与えたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから単離されたＴｂｐによって提供される防御と等価の防御を示した（図４および５）。これらの組換えＴｂｐもまた、２つのさらに大きいＩＰチャレンジ実験に利用した（図６および７）。
【００５９】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓでのマウスＩ．Ｐ．感染に対する強力なおよび一貫した防御力価は、おそらくそれらのワクチン可能性についての最も強力な証拠である。
【００６０】
興味深いことに、図５、６、および７に示す結果は、類似の設計の実験から生じるが、ＴｂｐＡまたはＴｂｐＢのいずれか単独のみに依存するワクチン組成物と関連した驚くべき変動性を示す。図５では、組換えＴｂｐＡ組成物は、ＴｂｐＢまたはＴｂｐＡ＋Ｂと比較して低いレベルの防御を示した。しかし、図６および７では、ＴｂｐＡ＋Ｂ複合体およびＴｂｐＢ単独組成物に匹敵する高レベルの防御を示した組換えＴｂｐＡワクチン組成物は、感染に対してほとんど防御を示さなかった。この後者の結果は、従来技術の教示とは全く反対である。
【００６１】
回復期血清におけるＴｂｐＡおよびＴｂｐＢに対するヒト免疫応答
発明者らは、髄膜炎菌疾患後のＴｂｐＡおよびＴｂｐＢに対するヒトの抗体応答を見る多くの研究を行った。一般的な結論は、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢの両方とも、髄膜炎菌疾患中に発現されそして免疫応答はそれらに対して惹起されることである。この応答は、機能的（オプソニン性）であり、そしてＴｂｐでの動物の免疫処置によって誘導される応答よりも、異なる髄膜炎菌株間でより交差反応性である。ＴｂｐＡの免疫応答は、ＴｂｐＢに対するよりも強力かつ交差反応性のようであり、ＴｂｐＡのワクチン可能性の重要性を確認する。
【００６２】
トランスフェリンレセプターからのＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ
発明者らの構造研究は、髄膜炎菌表面上のトランスフェリンレセプターが、一緒に作用する２つのＴｂｐＡ分子および１つのＴｂｐＢ分子からなることを示す。
【００６３】
Ａ＋Ｂ  Ｔｂｐを含むワクチンの効果
発明者らは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｌ９１  ７０５株およびＢ１６Ｂ６株からのチャレンジに対するワクチン処方物を含む組換えＴｂｐＢ対組換えＴｂｐＡ＋Ｂの有効性のさらなるテストを行い、その結果を、それぞれ図８および９に示す。両方の場合とも、Ｂ単独と比較してＡ＋Ｂによっていくらか改善された防御が与えられた。
【００６４】
参考文献
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Nassifら (1991) J Bacteriol, vol. 173 no. 7 pp2147-54。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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