(57)【要約】【課題】人手による作成が困難なフィーダー細胞層の形成方法を提供する。【解決手段】基体上に培養液を配置する工程と、フィーダー細胞を含んだ溶液を吐出器から前記基体に向けて吐出し、前記基体上にフィーダー細胞層を形成する工程と、を含むことを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体上に培養液を配置する工程と、
フィーダー細胞を含んだ溶液を吐出器から前記基体に向けて吐出し、前記基体上にフィーダー細胞層を形成する工程と、
を含むことを特徴とするフィーダー細胞層形成方法。
【請求項２】
前記溶液は、血清を含むことを特徴とする請求項１に記載のフィーダー細胞層形成方法。
【請求項３】
前記培養液は、タンパク質及び血清を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のフィーダー細胞層形成方法。
【請求項４】
前記吐出器における前記フィーダー細胞の運搬経路の表面及び前記吐出器の内側にはポリマーが配置されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のフィーダー細胞層形成方法。
【請求項５】
前記基体が所定の容器内に配置され前記所定の容器内における凸部を形成することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のフィーダー細胞層形成方法。
【請求項６】
所定の容器内の凹部に前記基体が配置されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のフィーダー細胞層形成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たとえば多能性幹細胞の培養方法に関し、フィーダー細胞層の形成に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、多能性幹細胞には様々なものがあるが、再生医療及び医薬品開発の進歩に極めて多大な貢献をすると考えられているものに、ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞がある。ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞を活用するためには、ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞の多能性を維持したまま培養することが必要であり、このための簡便かつ効率的な培養方法が求められている。また、多能性幹細胞は、分化しやすいこと、非常に増殖が早いことなどの特徴を有する。このため、ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞の培養には十分な栄養の補給や度重なる継代が必要となり、その培養状態の変化には特に気を配る必要がある。
【０００３】
細胞の増殖には、フィーダー細胞層が必要となる場合がある。フィーダー細胞層とは、増殖若しくは分化を起こさせる細胞の培養条件を調整するために用いられる支持細胞種であり、細胞の増殖に必要なタンパク質の合成及び分泌を行うと共に分化の足場となるものである。ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞の培養においても、一般的にはフィーダー細胞層が用いられる。培養条件を均一に整えるためには、培養を行う容器内にフィーダー細胞層が均一に形成される必要がある。たとえば、非特許文献１には、手作業によるフィーダー細胞層の形成方法が記載されている。尚、以降の記載において、フィーダー細胞層を形成するための面を有するものを基体と記載する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】PLoS One． ２００９ Dec２；４（２１）e８０６７． Human induced pluripotent stem cells on autologous feeders． Takahashi K， Narita M， Yokura M， Ichisaka T， Yamanaka S．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、基体上に手作業により均一なフィーダー細胞層を形成するのは、長年の経験を有する者でないと難しい。特に直径２０ｍｍ未満の微小基体にフィーダー細胞層を形成する際、縁部分にフィーダー細胞が凝集し、均一なフィーダー細胞層形成は困難である。また、作業者によるバクテリア菌、カビなどによる汚染の可能性も否定できず、多能性幹細胞の培養結果が好ましくないものになることも考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上述した課題の少なくともひとつを解決するためになされたものであり、以下の適用例または実施形態として実現することが可能である。
【０００７】
［適用例１］
本適用例にかかるフィーダー細胞層形成方法は、基体上に培養液を配置する工程と、フィーダー細胞を含んだ溶液を吐出器から前記基体に向けて吐出し、前記基体上にフィーダー細胞層を形成する工程と、を含むことを特徴とする。
【０００８】
本適用例によれば、基体上に培養液を配置する工程と、フィーダー細胞を含んだ溶液を吐出器から基体に向けて吐出してフィーダー細胞層を形成する工程と、を含むことで、基体上に均一なフィーダー細胞層を形成することができる。また、上述したフィーダー細胞層形成方法は、人手によりフィーダー細胞層を形成するものでないことから、作業者によるバクテリア菌、カビなどによる汚染を防ぐことができる。
【０００９】
［適用例２］
上記適用例にかかるフィーダー細胞層形成方法において、前記溶液は、血清を含むことを特徴とする。前記溶液はフィーダー細胞と血清を含む培地から構成されることが好ましい。
【００１０】
本適用例によれば、前記溶液がフィーダー細胞と血清を含む培地から構成されていることにより、フィーダー細胞に栄養を供給することができる。
【００１１】
［適用例３］
上記適用例にかかるフィーダー細胞層形成方法において、前記培養液は、タンパク質及び血清を含むことを特徴とする。前記培養液は、タンパク質及び血清を含む培地から構成されることが好ましい。
【００１２】
本適用例によれば、前記培養液がタンパク質及び血清を含む培地から構成されていることにより、増殖される細胞、例えばｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞に栄養を供給し増殖を促進することができる。
【００１３】
［適用例４］
上記適用例にかかるフィーダー細胞層形成方法において、前記吐出器における前記フィーダー細胞の運搬経路の表面及び前記吐出器の内側は、生体適合性材料が塗布されており、前記生体適合性材料は、ポリマー、例えばＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）ポリマーであることが好ましい。
【００１４】
本適用例によれば、吐出器におけるフィーダー細胞の運搬経路の表面及び吐出部の内側に生体適合性材料としてポリマー、例えばＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）ポリマーが塗布されていることにより、該運搬経路及び吐出部の内側へのフィーダー細胞の付着を防ぐことができる。
【００１５】
［適用例５］
上記適用例にかかるフィーダー細胞層形成方法において、前記基体が所定の容器内に配置され前記所定の容器内における凸部を形成し、前記フィーダー細胞層が前記基体上に形成されることが好ましい。
【００１６】
本適用例によれば、所定の容器内に配置され凸部を形成する基体上に均一なフィーダー細胞層を形成することができる。人手により均一なフィーダー細胞層を凸部に作成することは難しい。しかし、上述した方法を用いることにより、凸部に均一なフィーダー細胞層を形成することが容易となる。また、これにより、所定の容器内に複数の基体を配置することで、異なる多能性幹細胞の成長をひとつの容器内で並行して行うことができる。
【００１７】
［適用例６］
上記適用例にかかるフィーダー細胞層形成方法において、所定の容器内の凹部に前記基体が配置され、前記フィーダー細胞層が前記基体上に形成されることが好ましい。
【００１８】
本適用例によれば、所定の容器内の凹部にある基体上に均一なフィーダー細胞層を形成することができる。また、これにより、所定の容器内に複数の凹部を配置することで、異なる多能性幹細胞の成長をひとつの容器内で並行して行うことができる。
【００１９】
更に、本発明にかかるフィーダー細胞層形成方法には以下の適用例がある。
【００２０】
上記適用例にかかるフィーダー細胞層形成方法において、前記吐出器の吐出部は、静電駆動式のインクジェットヘッドであることが好ましい。
【００２１】
本適用例によれば、吐出器の吐出部が静電駆動式のインクジェットヘッドであることにより、吐出部内の熱の発生を抑えることができることから、吐出物の変性を抑えることができる。
【００２２】
基体上に培養液を配置する工程に用いられる方法には、基体を培養液に浸漬させる方法も含まれる。上記適用例にかかるフィーダー細胞層形成方法において、前記基体は、培養液に浸されていることが好ましい。
【００２３】
本適用例によれば、基体が培養液に浸されていることによって、フィーダー細胞が吐出後すぐに培養液に浸されることになり、フィーダー細胞の損傷を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】第１実施形態におけるフィーダー細胞層の形成の様子を示した概略図。
【図２】第１実施形態におけるフィーダー細胞層形成装置の概略ブロック図。
【図３】第１実施形態におけるフィーダー細胞層の形成領域を示した概略図。
【図４】第２実施形態におけるフィーダー細胞層の形成の様子を示した概略図。
【図５】第３実施形態におけるフィーダー細胞層の形成の様子と領域区分基板の概略図。
【図６】第４実施形態におけるフィーダー細胞層の形成の様子を示した概略図。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。また、以降に説明する実施形態のすべてにおいて、フィーダー細胞はマウス胎児由来の細胞を、培養液はタンパク質及び血清を含む培地を、生体適合性材料にはＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）ポリマーを用いた。また、タンパク質としては、サイトカインであるＬＩＦ（leukemia inhibitory factor）を用いた。尚、図面は分かりやすくするために便宜上描いており、各層や各部材の尺度などは実際のものとは異なる場合がある。
【００２６】
（第１実施形態）
図１−（ａ）及び図１−（ｂ）は、本実施形態におけるフィーダー細胞層の形成の様子（フィーダー細胞層形成方法）を示した概略図である。図１−（ａ）及び図１−（ｂ）に示したのは、吐出器１０、容器２０、基体３０、フィーダー細胞４０、フィーダー細胞層４１及び培養液５０である。図１−（ｂ）は、容器２０を平面視したときの図であり、図１−（ａ）は、図１−（ｂ）のＡ−Ｂにおける断面図である。まず、培養液５０が入った容器２０内に基体３０を配置し、基体３０を培養液５０に浸す。言い換えると、基体３０上に培養液５０を配置する。そして、フィーダー細胞が、容器２０内の培養液５０に浸された基体３０上の所定の領域に吐出器１０により吐出され、フィーダー細胞層４１が形成される。
【００２７】
図２に、フィーダー細胞形成装置１００の概略ブロック図を示す。上述した吐出器１０は、フィーダー細胞形成装置１００の構成要素のひとつであり、フィーダー細胞形成装置１００においては、吐出器１１０として示している。図２に示すように、フィーダー細胞形成装置１００は、吐出器１１０、操作部１２０、制御部１３０及び駆動部１４０を含む。また、吐出器１１０は、吐出部１１１及び位置検出部１１２を含む。駆動部１４０は、吐出器１１０の移動制御及びフィーダー細胞４０の吐出制御を行う部位である。また、フィーダー細胞形成装置１００におけるフィーダー細胞４０の運搬経路には生体適合性材料が塗布されている。これにより、フィーダー細胞形成装置１００内でフィーダー細胞が付着することで運搬経路を塞ぐことを防ぐことができる。
【００２８】
操作部１２０は、フィーダー細胞層形成のための指示をフィーダー細胞形成装置１００に対して行う部分であり、操作者により操作される部分である。また、操作部１２０は、フィーダー細胞形成装置１００の実行状態をモニタリングする機能を有し、制御部１３０から送られてくる状態信号１３６に従い所定の情報を操作者に対して提示する。所定の情報には、吐出器１１０の実行状態及びフィーダー細胞層４１の形成状態を示す画像などが含まれる。
【００２９】
制御部１３０は、操作部１２０からの指示とフィーダー細胞形成装置１００の内部状態を示す情報とを基にしてフィーダー細胞形成装置１００内の制御を行う部分である。操作部１２０からの指示は、指示信号１２６を介して制御部１３０に伝達される。フィーダー細胞形成装置１００の内部状態を示す情報として図２に示したのは、吐出器１１０から出力される位置検出信号１１６及び駆動部１４０から出力される状態信号１４６である。制御部１３０は、これらの情報から吐出器１１０を動かすための制御情報を算出し、位置制御信号１３７を生成する。位置制御信号１３７は駆動部１４０の入力信号となり、駆動部１４０は位置制御信号１３７に従った動作を行う。位置制御信号１３７には、吐出器１１０を移動させるための移動制御信号及びフィーダー細胞を吐出させるための吐出制御信号などが含まれる。尚、制御部１３０に予めフィーダー細胞の特性を入力しておき、この特性値が移動制御情報及び吐出制御情報の算出に反映されるようにすることが好ましい。
【００３０】
駆動部１４０は、位置制御信号１３７の情報に従い、吐出器１１０の移動制御及びフィーダー細胞の吐出制御を行う部分であり、吐出器１１０に対する制御情報１４７を出力すると共に駆動部１４０における吐出器１１０に対しての制御状態を状態信号１４６として制御部１３０に対して出力する。駆動部１４０の制御により、吐出器１１０は位置移動を行い、フィーダー細胞４０を吐出する。これにより容器２０の中の培養液５０に浸された基体３０上の所定の領域にフィーダー細胞層４１が形成される。
【００３１】
フィーダー細胞層４１が形成される所定の領域の指定は、次のように行うことができる。操作部１２０は、情報などの表示及び操作のためのインターフェイスを提供するためにモニターを有している。図３−（ａ）及び図３−（ｂ）に示したのは、モニターに映し出された、容器２０を平面視したときの画像である。図３中の符号７０は、モニターの枠若しくはモニター内に映し出された表示領域の境界を示している。操作者は、平面視した容器２０内における基体３０上の画像上にフィーダー細胞層４１を形成したい領域を描くことで、フィーダー細胞層４１を形成する所定の領域を指定することができる。尚、容器２０内のすべての領域に基体３０が存在しない場合も考えられる。このため、所定の領域の指定は、容器２０内の領域ではなく、基体３０上に指定できるようにしておくことが好ましい。
【００３２】
図３−（ａ）は、基体３０上に円形状の領域６０を所定の領域として指定したときの図である。図３−（ｂ）は、基体３０上に長円形状の領域１６０を所定の領域として指定したときの図である。操作者が描いた図形どおりのフィーダー細胞層４１が、制御部１３０の制御の基での駆動部１４０及び吐出器１１０の動作により形成される。
【００３３】
以下に第２実施形態〜第４実施形態について説明する。以降の実施形態の説明にあたっては、上述した実施形態と同様の構成については同じ符号を付し、その説明を省略する。
（第２実施形態）
本実施形態は、容器内に基体が敷き詰められていない場合の例を示すものである。図４−（ｂ）に容器２１を平面視したときの図を、図４−（ａ）に図４−（ｂ）で示したＣ−Ｄにおける断面図を示す。本実施形態においては、複数の基体３１が水玉模様状に配置され、培養液５０に浸されている。吐出器１０により、フィーダー細胞４０が基体３１の部分に吐出され、フィーダー細胞層７１が形成される。フィーダー細胞層７１を形成する所定の領域の指定は、第１実施形態に示した動作と同様の操作をすることでよい。本実施形態の場合、所定の領域を指定するためにモニターに映し出される基体３１の画像は、図４−（ｂ）に示した配置とすることでよい。
【００３４】
（第３実施形態）
本実施形態は、第２実施形態で説明したフィーダー細胞層の形成方法において領域区分基板２３を用いる例である。領域区分基板２３は、複数の基体３１の間の領域を埋めるようにして、複数の基体３１間を仕切る基板である。領域区分基板２３を取り付けたときの容器２１を図５−（ａ）に、領域区分基板２３を平面視したときの図を図５−（ｂ）に示す。領域区分基板２３は、容器２１に装着されたときに基体３１が存在する部分に穴が開けられている。図５−（ａ）の図は、図５−（ｂ）で示した領域区分基板２３のＥ−Ｆにおける断面図である。領域区分基板２３は、複数の基体３１の周囲を取り囲み、複数の基体３１の間に障壁を設けるように装着される。
【００３５】
本実施形態においては、容器２１に複数の基体３１及び領域区分基板２３が装着された状態で基体３１上にフィーダー細胞が吐出される。これにより、容器２１若しくはフィーダー細胞形成装置１００に予期しない振動が加えられたときなどの場合や、フィーダー細胞形成装置１００における吐出器１１０の位置制御が正確になされないような場合でも基体３１上にフィーダー細胞層を形成することが容易となる。尚、本実施形態において、基体３１及び領域区分基板２３を別々の構成物として説明したが、これらの形状が一体形成された基体を用いることでもよい。
【００３６】
（第４実施形態）
本実施形態は、フィーダー細胞と培養液５０とを吐出器から吐出する例である。フィーダー細胞形成装置１００は、上述した実施形態における装置を流用することでよい。また、フィーダー細胞層形成に用いる容器及び該容器内に配置するフィーダー細胞層の土台となる基体には特に制限はない。培養液５０は、フィーダー細胞と共に吐出されても、培養液単独で吐出されてもよい。
【００３７】
図６に、本実施形態におけるひとつの実施例の断面図を示す。図６に示されている番号記号は第３実施形態と同様である。領域区分基板２３で複数の基体３１が区切られているため、個々の基体ごとに独立した培養液５０の中にフィーダー細胞層を形成することができる。更に、これにより、異なる培養液５１を用いたフィーダー細胞層をひとつの容器２１内で形成することができる。
【００３８】
以上、本発明にかかる実施形態を述べてきたが、本発明を実施することにより、フィーダー細胞層形成の経験を有さない者でも基体上に均一なフィーダー細胞層を形成することができる。また、人が直接ふれることがないことから、作業者によるバクテリア菌、カビなどによる汚染の可能性を防ぐことができる。尚、本発明の実施はこれら上述した実施形態に限定されるものではない。たとえば、上述した第１実施形態〜第３実施形態において、フィーダー細胞が、培養液若しくは細胞の培養に悪影響を与えない液体と共に吐出器から吐出されることでもよい。また、容器２０若しくは容器２１の形状も円形のものに限られる訳ではなく、同様に基体３０若しくは基体３１の形状も円形に限られるものではない。本発明を用いることで、これらがどのような形状であっても容易にフィーダー細胞層を形成することができる。たとえば、上述した実施形態では基体３１を複数用いているが、一枚の基体に複数の凸部を設け、該複数の凸部上にフィーダー細胞層を形成することでもよい。これにより基体の取り扱いが容易となる。
【００３９】
上記の本発明は上記の実施形態に限定されるものでなく、本発明の主旨を逸脱しない範囲で広く適用可能である。
【符号の説明】
【００４０】
１０…吐出器、２０…容器、２１…容器、２３…領域区分基板、３０…基体、３１…基体、４０…フィーダー細胞、４１…フィーダー細胞層、５０…培養液、５１…培養液、６０…円形状の領域、７１…フィーダー細胞層、１００…フィーダー細胞形成装置、１１０…吐出器、１１１…吐出部、１１２…位置検出部、１１６…位置検出信号、１２０…操作部、１２６…指示信号、１３０…制御部、１３６…状態信号、１３７…位置制御信号、１４０…駆動部、１４６…状態信号、１４７…制御情報、１６０…長円形状の領域。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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