(57)【要約】【課題】  既知のＶＬＲＡやＶＬＲＢによって認識されない抗原を認識する新規抗原結合分子（ＶＬＲ）、およびこれを用いて標的抗原結合ファージをスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】  ロイシンリッチリピートＮ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＮＴ）と、ロイシンリッチリピートＣ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＣＴ）と、前記ＬＲＲＮＴと前記ＬＲＲＣＴとの間に一または複数のロイシンリッチリピート配列（ＬＲＲ）とを有するＶＬＲであって、前記ＬＲＲＣＴが以下の（ａ）および（ｂ）の少なくともいずれかのアミノ酸配列からなるモチーフを有している。（ａ）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ１−Ｖａｌ−Ａｓｎ−（Ｘ８）−Ｃｙｓ（ｂ）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ１−Ｖａｌ−Ｘ１−Ｔｈｒ−（Ｘ７）−Ｃｙｓ｛式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘｎ（ｎは自然数）はｎ残基の同じまたは異なる任意のアミノ酸Ｘからなるアミノ酸配列を示す。｝【選択図】  図４
2012031066.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイシンリッチリピートＮ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＮＴ）と、ロイシンリッチリピートＣ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＣＴ）と、前記ＬＲＲＮＴと前記ＬＲＲＣＴとの間に一または複数のロイシンリッチリピート配列（ＬＲＲ）とを有する抗原結合分子（ＶＬＲ）であって、前記ＬＲＲＣＴが以下の（ａ）および（ｂ）の少なくともいずれかのアミノ酸配列からなるモチーフを有するＶＬＲ。
（ａ）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ１−Ｖａｌ−Ａｓｎ−（Ｘ８）−Ｃｙｓ
（ｂ）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ１−Ｖａｌ−Ｘ１−Ｔｈｒ−（Ｘ７）−Ｃｙｓ
｛式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘｎ（ｎは自然数）はｎ残基の同じまたは異なる任意のアミノ酸Ｘからなるアミノ酸配列を示す。｝
【請求項２】
前記ＬＲＲＮＴが
Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｃｙｓ−（Ｘ１２）−Ｃｙｓ
｛式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘｎ（ｎは自然数）はｎ残基の同じまたは異なる任意のアミノ酸Ｘからなるアミノ酸配列を示す。｝
のアミノ酸配列からなるモチーフを有する請求項１に記載のＶＬＲ。
【請求項３】
ロイシンリッチリピートＮ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＮＴ）と、ロイシンリッチリピートＣ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＣＴ）と、前記ＬＲＲＮＴと前記ＬＲＲＣＴとの間に一または複数のロイシンリッチリピート配列（ＬＲＲ）とを有する抗原結合分子（ＶＬＲ）であって、前記ＬＲＲＣＴが以下の（ａ）および（ｂ）の少なくともいずれかのアミノ酸配列からなるモチーフを有するＶＬＲをファージディスプレイ法によりファージ表面に提示させて抗原結合ファージライブラリを作製する第一の行程と、
前記抗原結合ファージライブラリと標的抗原とを反応させて、前記抗原結合ファージライブラリのうち前記標的抗原と結合しない抗原結合ファージを除去する第二の行程と、
前記抗原結合ファージライブラリのうち前記標的抗原と結合した抗原結合ファージを大腸菌に感染させて増殖させる第三の行程と
を有する標的抗原結合ファージをスクリーニングする方法。
（ａ）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ１−Ｖａｌ−Ａｓｎ−（Ｘ８）−Ｃｙｓ
（ｂ）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ１−Ｖａｌ−Ｘ１−Ｔｈｒ−（Ｘ７）−Ｃｙｓ
｛式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘｎ（ｎは自然数）はｎ残基の同じまたは異なる任意のアミノ酸Ｘからなるアミノ酸配列を示す。｝
【請求項４】
前記ＬＲＲＮＴが
Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｃｙｓ−（Ｘ１２）−Ｃｙｓ
｛式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘｎ（ｎは自然数）はｎ残基の同じまたは異なる任意のアミノ酸Ｘからなるアミノ酸配列を示す。｝
のアミノ酸配列からなるモチーフを有する請求項３に記載の標的抗原結合ファージをスクリーニングする方法。
【請求項５】
ロイシンリッチリピートＮ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＮＴ）と、ロイシンリッチリピートＣ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＣＴ）と、前記ＬＲＲＮＴと前記ＬＲＲＣＴとの間に一または複数のロイシンリッチリピート配列（ＬＲＲ）とを有する抗原結合分子（ＶＬＲ）であって、前記ＬＲＲＣＴが以下の（ａ）および（ｂ）の少なくともいずれかのアミノ酸配列からなるモチーフを有するＶＬＲをファージディスプレイ法によりファージ表面に提示させて抗原結合ファージライブラリを作製する第一の行程と、
前記抗原結合ファージライブラリと標的抗原とを反応させて、前記抗原結合ファージライブラリのうち前記標的抗原と結合しない抗原結合ファージを除去する第二の行程と、
前記抗原結合ファージライブラリのうち前記標的抗原と結合した抗原結合ファージを大腸菌に感染させて増殖させる第三の行程と、
前記標的抗原と結合した抗原結合ファージに含まれるＶＬＲをコードする遺伝子を組み換えてＶＬＲを組み換え生産する第四の工程と
を有する任意の標的抗原に対するＶＬＲのインビトロ製造方法。
（ａ）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ１−Ｖａｌ−Ａｓｎ−（Ｘ８）−Ｃｙｓ
（ｂ）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ１−Ｖａｌ−Ｘ１−Ｔｈｒ−（Ｘ７）−Ｃｙｓ
｛式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘｎ（ｎは自然数）はｎ残基の同じまたは異なる任意のアミノ酸Ｘからなるアミノ酸配列を示す。｝
【請求項６】
前記ＬＲＲＮＴが
Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｃｙｓ−（Ｘ１２）−Ｃｙｓ
｛式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘｎ（ｎは自然数）はｎ残基の同じまたは異なる任意のアミノ酸Ｘからなるアミノ酸配列を示す。｝
のアミノ酸配列からなるモチーフを有する請求項５に記載の任意の標的抗原に対するＶＬＲのインビトロ製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロイシンリッチリピートＮ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＮＴ）と、ロイシンリッチリピートＣ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＣＴ）と、前記ＬＲＲＮＴと前記ＬＲＲＣＴとの間にロイシンリッチリピート配列（ＬＲＲ）とを有する新規な抗原結合分子（ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＶＬＲ）、これを用いて標的抗原結合ファージをスクリーニングする方法、および任意の標的抗原に対するＶＬＲの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高等動物の免疫系においては、多様な病原体を認識して排除するため、リンパ球の一種であるＢ細胞ゲノムのＶ（Ｄ）Ｊ領域が再構成することにより、多様な抗原結合領域が形成される。一方、最も下等な脊椎動物である円口類においては、Ｖ（Ｄ）Ｊ領域の再構成は見られないものの、遺伝子再構成による獲得免疫を持つことが知られている。近年、円口類において、抗原結合分子（ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＶＬＲ）が発見され（非特許文献１）、これまで、ＶＬＲＡとＶＬＲＢとの２つのアイソタイプが同定されている（非特許文献２）。
【０００３】
ＶＬＲは、そのアミノ酸配列の多様性により、特定のタンパク質その他の分子である標的抗原と特異的に結合ないし認識することが知られている（非特許文献３または４）。例えば、ＶＬＲＢについては、炭疽菌胞子殻ＢｃｌＡタンパク質に特異的なモノクロナール抗体ＶＬＲＢが作製されている（非特許文献５）。また、これらＶＬＲは反復エピトープの認識に優れていることが知られており、哺乳動物の抗体である免疫グロブリンによっては認識されにくい脂質や糖鎖抗原等をよく認識することが示唆されている（非特許文献６）。
【０００４】
一方、任意のアミノ酸配列を有する様々なタンパク質を提供する方法の一つとして、ファージディスプレイ法が提案されている。ファージディスプレイ法は、ファージのコートタンパク質をコードする遺伝子中に任意の配列からなる外来ＤＮＡを挿入し、その外来ＤＮＡにコードされているタンパク質をコートタンパク質との融合タンパク質としてファージ粒子表面に提示（ディスプレイ）させる方法である。ランダムな合成ＤＮＡを外来遺伝子として用いることにより、ファージ粒子表面に様々なポリペプチドが提示されたファージ群からなるポリペプチドライブラリを得ることができる。この技術を応用し、標的抗原を用いてポリペプチドライブラリをスクリーニングすることにより、標的抗原と結合するポリペプチドを提示するファージ粒子を回収することができる（非特許文献７）。
【０００５】
【非特許文献１】Pancer, Z. et al. Nature 430, 174-180（2004）
【非特許文献２】Pancer, Z. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(26), 9224-9229（2005）
【非特許文献３】Kobe, B et al., Biochem, Sci. 19, 415-421（1994）
【非特許文献４】Kajava, A. V., J. Mol. Biol., Vol.277, 519-527,（1998）
【非特許文献５】Herrin, B. R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(6), 2040-2045（2008）
【非特許文献６】Matthew N. A. et al. Nature Immunol. 9, 319-327（2008）
【非特許文献７】Smith G.P. et al. Methods Enzymol. 217, 228-257（1993）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＶＬＲの抗原結合特異性を規定するＬＲＲの組み換え単位の配列は、ＶＬＲアイソタイプによって異なると考えられ、既知のＶＬＲＡやＶＬＲＢによって認識されないエピトープが存在する可能性があり、新たなＶＬＲアイソタイプが求められている。また、新たなＶＬＲアイソタイプのＬＲＲ領域を発現するファージディスプレイライブラリを作製し、標的抗原と特異的に結合するＬＲＲを提示するファージ粒子を選別することによって、既知のＶＬＲＡやＶＬＲＢによって認識されないエピトープを認識する新規ＶＬＲの作製が期待されている。
【０００７】
本発明は、前記課題を解決するためになされたものであって、既知のＶＬＲＡやＶＬＲＢによって認識されない抗原を認識する新規ＶＬＲ、標的抗原結合ファージをスクリーニングする方法、および任意の標的抗原に対するＶＬＲの製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る抗原結合分子（ＶＬＲ）は、ロイシンリッチリピートＮ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＮＴ）と、ロイシンリッチリピートＣ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＣＴ）と、前記ＬＲＲＮＴと前記ＬＲＲＣＴとの間に一または複数のＬＲＲとを有するＶＬＲであって、前記ＬＲＲＣＴが以下の（ａ）および（ｂ）の少なくともいずれかのアミノ酸配列からなるモチーフを有している。
（ａ）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ１−Ｖａｌ−Ａｓｎ−（Ｘ８）−Ｃｙｓ（配列番号１）
（ｂ）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ１−Ｖａｌ−Ｘ１−Ｔｈｒ−（Ｘ７）−Ｃｙｓ（配列番号２）
｛式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘｎ（ｎは自然数）はｎ残基の同じまたは異なる任意のアミノ酸Ｘからなるアミノ酸配列を示す。｝
【０００９】
また、本発明において、前記ＬＲＲＮＴが
Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｃｙｓ−（Ｘ１２）−Ｃｙｓ（配列番号３）
｛式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘｎ（ｎは自然数）はｎ残基の同じまたは異なる任意のアミノ酸Ｘからなるアミノ酸配列を示す。｝
のアミノ酸配列からなるモチーフを有してもよい。
【００１０】
また、本発明に係る標的抗原結合ファージをスクリーニングする方法は、ロイシンリッチリピートＮ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＮＴ）と、ロイシンリッチリピートＣ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＣＴ）と、前記ＬＲＲＮＴと前記ＬＲＲＣＴとの間に一または複数のＬＲＲとを有する抗原結合分子（ＶＬＲ）であって、前記ＬＲＲＣＴが以下の（ａ）および（ｂ）の少なくともいずれかのアミノ酸配列からなるモチーフを有するＶＬＲを、ファージディスプレイ法によりファージ表面に提示させて抗原結合ファージライブラリを作製する第一の行程と、前記抗原結合ファージライブラリと標的抗原とを反応させて、前記抗原結合ファージライブラリのうち前記標的抗原と結合しない抗原結合ファージを除去する第二の行程と、前記抗原結合ファージライブラリのうち前記標的抗原と結合した抗原結合ファージを大腸菌に感染させて増殖させる第三の行程とを有している。
（ａ）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ１−Ｖａｌ−Ａｓｎ−（Ｘ８）−Ｃｙｓ（配列番号１）
（ｂ）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ１−Ｖａｌ−Ｘ１−Ｔｈｒ−（Ｘ７）−Ｃｙｓ（配列番号２）
｛式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘｎ（ｎは自然数）はｎ残基の同じまたは異なる任意のアミノ酸Ｘからなるアミノ酸配列を示す。｝
【００１１】
また、本発明において、前記ＬＲＲＮＴが
Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｃｙｓ−（Ｘ１２）−Ｃｙｓ（配列番号３）
｛式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘｎ（ｎは自然数）はｎ残基の同じまたは異なる任意のアミノ酸Ｘからなるアミノ酸配列を示す。｝
のアミノ酸配列からなるモチーフを有してもよい。
【００１２】
さらに、本発明に係る任意の標的抗原に対する抗原結合分子（ＶＬＲ）のインビトロ製造方法は、ロイシンリッチリピートＮ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＮＴ）と、ロイシンリッチリピートＣ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＣＴ）と、前記ＬＲＲＮＴと前記ＬＲＲＣＴとの間に一または複数のロイシンリッチリピート配列（ＬＲＲ）とを有するＶＬＲであって、前記ＬＲＲＣＴが以下の（ａ）および（ｂ）の少なくともいずれかのアミノ酸配列からなるモチーフを有するＶＬＲをファージディスプレイ法によりファージ表面に提示させて抗原結合ファージライブラリを作製する第一の行程と、
前記抗原結合ファージライブラリと標的抗原とを反応させて、前記抗原結合ファージライブラリのうち前記標的抗原と結合しない抗原結合ファージを除去する第二の行程と、
前記抗原結合ファージライブラリのうち前記標的抗原と結合した抗原結合ファージを大腸菌に感染させて増殖させる第三の行程と、
前記標的抗原と結合した抗原結合ファージに含まれるＶＬＲをコードする遺伝子を組み換えてＶＬＲを組み換え生産する第四の工程と
を有している。
（ａ）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ１−Ｖａｌ−Ａｓｎ−（Ｘ８）−Ｃｙｓ
（ｂ）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｘ１−Ｖａｌ−Ｘ１−Ｔｈｒ−（Ｘ７）−Ｃｙｓ
｛式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘｎ（ｎは自然数）はｎ残基の同じまたは異なる任意のアミノ酸Ｘからなるアミノ酸配列を示す。｝
【００１３】
また、本発明において、前記ＬＲＲＮＴが
Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｃｙｓ−（Ｘ１２）−Ｃｙｓ（配列番号３）
｛式中、Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘｎ（ｎは自然数）はｎ残基の同じまたは異なる任意のアミノ酸Ｘからなるアミノ酸配列を示す。｝
のアミノ酸配列からなるモチーフを有してもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、既知のＶＬＲＡやＶＬＲＢによって認識されない抗原を認識する新規ＶＬＲを提供することができ、これにより新たな臨床検査試薬、実験試薬、生体反応を特異的に阻害する阻害剤、および任意の標的抗原に対するＶＬＲ等、或いはこの新規ＶＬＲを用いた標的抗原結合ファージをスクリーニングするためのキットおよび装置等を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明に係るＶＬＲをｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクターへ組み込んで用いた場合の実施形態を示す図である。
【図２】実施例１において得られたＥＳＴのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図３】実施例２（３）におけるＲＡＣＥ法を用いて決定された完全長配列のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。なお、下記記載のＬＲＲＶについては、Ｃ末端側に存在するもののみを示している。
【図４】実施例２（４）で得られた推定アミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図５】実施例２（４）で得られた推定アミノ酸配列の近隣結合系統樹を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明に係る抗原結合分子、標的抗原結合ファージをスクリーニングする方法、および任意の標的抗原に対する抗原結合分子の製造方法の実施形態について詳細に説明する。
【００１７】
本発明に係る抗原結合分子（variable lymphocyte receptor；ＶＬＲ）は、アミノ酸配列の多様性を表現するロイシンリッチリピート配列（ＬＲＲ）を有しており、ＬＲＲはＮ末端側キャップユニットであるロイシンリッチリピートＮ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＮＴ）、およびＣ末端側キャップユニットであるロイシンリッチリピートＣ−ターミナル隣接領域（ＬＲＲＣＴ）とフランキングする。ここで、「抗原」とは、本発明においては、本発明に係るＶＬＲと結合するタンパク質、脂質、糖鎖抗原等の分子をいい、「結合」には、「認識」や「特異的な相互作用」という概念が含まれる。すなわち、抗原に対し免疫原性の存否は問われず、抗原にはハプテンが含まれる。
【００１８】
また、本発明において「抗原結合分子」は、「抗原認識分子」、「抗体」、「抗原受容体」、或いは「リンパ球受容体」と交換可能に用いられる。ここで、「抗体」とは、一般には、リンパ球Ｂ細胞の産生する糖タンパク分子であって、抗原を認識して結合するものをいうが、本発明においては、リンパ球Ｂ細胞により産生される糖タンパク分子を意味するのではなく、単に抗原と結合する分子をいう。
【００１９】
また、ＬＲＲとは、一般にはロイシンリッチリピートを意味するが、本発明においてはロイシンリッチリピートを含むアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列からなるドメインないしタンパク質の部分構造をいう。一般に、ＬＲＲはロイシン残基を骨格とし、βストランド構造を含む。それらが多数繰り返され、全体として「馬蹄構造」と呼ばれるタンパク質立体構造が形成される。ＶＬＲでは、馬蹄構造の凹面に存在するアミノ酸配列の多様性により、様々な標的抗原と特異的に結合ないし認識すると考えられている。
【００２０】
次に、ＬＲＲＣＴとは、ＬＲＲにＣ末端側でフランキングする、ＬＲＲのシャッフリングの際の不変部分であるシステイン残基に富んだＣ末端側キャップユニットをいう。これらシステイン残基においてジスルフィド結合が形成されて、ＶＬＲのＣ末端側の構造が安定となる。本発明に係るＶＬＲのＬＲＲＣＴとしては、アミノ酸配列ＶＫＸＶＮＸＸＸＸＸＸＸＸＣ（Ｖはバリン、Ｋはリシン、Ｎはアスパラギン、Ｃはシステイン、Ｘは同じまたは異なる任意のアミノ酸を示す）、およびＶＫＸＶＸＴＸＸＸＸＸＸＸＣ（Ｖはバリン、Ｋはリシン、Ｔはトレオニン、Ｃはシステイン、Ｘは同じまたは異なるアミノ酸を示す）の少なくともいずれかをモチーフとして有している。
【００２１】
また、ＬＲＲＮＴとは、ＬＲＲにＮ末端側でフランキングする、ＬＲＲのシャッフリングの際の不変部分であるシステイン残基に富んだＮ末端側キャップユニットをいい、ＬＲＲＣＴと同様、これらシステイン残基においてジスルフィド結合が形成されて、ＶＬＲのＮ末端側の構造が安定となる。本発明に係るＶＬＲのＬＲＲＮＴとしては、例えば、ＶＬＲＡのＬＲＲＮＴのひとつであるアミノ酸配列ＣＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＣ（Ｃはシステイン、Ｘは同じまたは異なる任意のアミノ酸を示す）をモチーフとして有しているものや、ＶＬＲＢのＬＲＲＮＴのひとつであるアミノ酸配列ＣＸＸＸＣＸＣ（Ｃはシステイン、Ｘは同じまたは異なる任意のアミノ酸を示す）をモチーフとして有しているもの、アミノ酸配列ＣＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ（Ｃはシステイン、Ｘは同じまたは異なる任意のアミノ酸を示す）をモチーフとして有しているものを挙げることができるが、アミノ酸配列ＣＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣをモチーフとして有しているものが好ましい。
【００２２】
以下、特に前記ＬＲＲＣＴの少なくともいずれかのモチーフと前記ＬＲＲＮＴのモチーフとを有する新規ＶＬＲを、ＶＬＲＣと称する。
【００２３】
なお、ＬＲＲＣＴとＬＲＲＮＴとは、ＬＲＲに含まれる場合があるが、本発明においては、ＬＲＲと区別する。すなわち、ＬＲＲＣＴとＬＲＲとを分ける部位は、ＬＲＲＣＴが少なくとも前記いずれかのモチーフを含みさえすれば、任意に定めることができ、ＬＲＲＮＴとＬＲＲとを分ける部位は、例えば、ＬＲＲＮＴが前記モチーフを含むようにして任意に定めることができる。また、ＬＲＲには、第１ユニットであるＬＲＲ１、複数のメインユニットであるＬＲＲＶ、およびＬＲＲのシャッフリング後に現れるコネクティングペプチド（ＣＰ）やＬＲＲＶ−ｅｎｄ（ＬＲＲＶｅ）が含まれ、これらは単にＬＲＲと表現される場合がある。
【００２４】
以下、本発明に係るＶＬＲの作製方法について、さらに詳細に説明する。本発明に係るＶＬＲの作製方法は、主に、
（１）本発明に係るＶＬＲ遺伝子を同定するための相同性検索をする行程
（２）本発明に係るＶＬＲ遺伝子をクローニングする行程
（３）本発明に係るＶＬＲ遺伝子のアミノ酸解析をする行程
の以上３つの行程を有している。
【００２５】
（１）本発明に係るＶＬＲ遺伝子を同定するための相同性検索をする行程
主に、公的データベースから既知のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）塩基配列を複数抽出し、既知のＶＬＲの任意に選択した塩基配列との相同性検索を行い、新規ＶＬＲのＥＳＴ塩基配列を決定する行程である。ＥＳＴ塩基配列とは、遺伝子転写産物の一部に相当する短い配列であり、転写産物の目印とされている。ＶＬＲはアミノ酸配列に多様性を有していることから、ＥＳＴ塩基配列を得ることにより新規ＶＬＲ遺伝子を同定することが好ましい。
【００２６】
公知のデータベースとしては、例えば、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）、DNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）、Ｅｎｓｅｍｂｌ、ＦＡＮＴＯＭ３等のウェブサイトを挙げることができる。また、ＥＳＴデータベースの構築には、公知のデータベース構築ソフトを用いることができ、例えば、Ｖａｒｉａｎｔ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（ＡＢＩ社）、ＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフト社）、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ社）、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＰＤＢ（ゼネティックス社）等を挙げることができる。さらに、相同性検索は、それらソフト内に内蔵されている周知のアルゴリズムまたはプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、或いはＪＡＬＶＩＥＷソフトウェア等により可能である。なお、当業者であれば、必要な任意のアルゴリズムを含む配列を測定するために、適切なパラメータを決定することができる。
【００２７】
（２）本発明に係るＶＬＲ遺伝子をクローニングする行程
主に、常法によりターゲットｃＤＮＡを合成した後、（１）の行程で得られたＥＳＴ塩基配列を基に、常法により遺伝子特異的プライマーを設計して目的遺伝子断片を増幅し、クローニングを行う行程である。以下、本発明において、ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡの抽出 および精製、ＲＴ−ＰＣＲによるｃＤＮＡの作製、ＰＣＲ、ベクター中へのライゲーション、ＤＮＡの塩基配列決定、プライマーの設計および合成等の分子生物学的実験法や生化学的実験法は、基本的には、通常の実験書の記載に従って行うことができる。そのような実験書として、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2001, Eds., Sambrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Pressを挙げることができる。
【００２８】
前記ターゲットは、新規ＶＬＲ遺伝子を有する可能性があれば、特に限定されないが、獲得免疫を持つ下等動物である円口類の白血球から抽出されたＲＮＡが好ましい。また、ＲＮＡの抽出には、例えば、QIAamp RNA kit（Ｑｉａｇｅｎ社）、Concert Plant RNA Regent（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、QuickPrep Total RNA Extraction Kit（ＧＥヘルスケア社）、RNeasy Mini Kit（Ｑｉａｇｅｎ社）等を用いることができる。また、ＲＴ−ＰＣＲ法（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）には、例えば、Expand High FidelityPLUS PCR System (Ｒｏｃｈｅ社)、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ (タカラバイオ社)、ThermoScript RT-PCR System 、PLATIUM taq DNA Polymerase High fidelity (いずれもＧｉｂｃｏ社)、ABI Prism 7000、同7900（いずれもＡＢＩ社）、Superscript III First Strand Synthesis System（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いることができる。
【００２９】
目的遺伝子断片の増幅は、主に、ＰＣＲ法（Polymerase Chain Reaction）が用いられるが、これに代わりＬＡＭＰ法（Loop-mediated Isothermal Amplification）を用いてもよい。また、クローニングベクターとしては、大腸菌中で自律複製できるものが好適であり、例えば、ZAP Express（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、pBluescript II SK（+）（Nucleic Acids Research）、Lambda ZAP II（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、λｇｔ１０、λｇｔ１１（いずれもDNA Cloning, A Practical Approach）、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３（いずれもＰｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐｃＤ２（H.Okayama and P.Berg）、ｐＭＷ２１８（和光純薬）、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９（いずれもタカラバイオ社）、ｐＥＧ４００（Ｊ． Ｂａｃ．）、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−８０（いずれもＱＩＡＧＥＮ社）、ｐＴＡ２（ＴＯＹＯＢＯ社）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（いずれもＰｒｏｍｅｇａ社）等を挙げることができる。さらに、大腸菌やシュードモナス属菌等の２種以上の宿主微生物で自律的増殖が可能なベクターのほか、各種シャトルベクターを用いることも可能である。この場合、上記制限酵素で切断し、その断片を得ることができる。
【００３０】
また、遺伝子クローニングには、例えば、Current Protocols in Molecular Biologyユニット２・４やDNA Cloning 1（Core Techniques, A PracticalApproach, Second Edition, Oxford University Press（1995））等に記載の方法に従って、或いは市販のキット、例えば、DNeasy Blood & Tissue Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）、The illustra bacteria genomicPrep Mini Spin Kit（ＧＥヘルスケア社）、PrepMan Ultra Reagent（ＡＢＩ社）等を用いることができる。さらに、Rapid Amplification of cDNA ends（ＲＡＣＥ）法を用いて、欠失部分のｃＤＮＡをクローニングすることにより完全長ｃＤＮＡを得ることもできる。ここで、ＲＡＣＥ法とは、近年米国シータス社によって技術化されたＰＣＲ法を利用して欠失部分のｃＤＮＡを修復及び増幅させる方法をいい、例えば、5’-Full RACE Core Set（タカラバイオ社）、3’-Full RACE Core Set（タカラバイオ社）、Cells-to-cDNA Kit FirstChoice RLM-RACE Kit（Ａｍｂｉｏｎ社）、GeneRacer RACE-Ready cDNA kit（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いて行うことができる。
【００３１】
（３）本発明に係るＶＬＲ遺伝子のアミノ酸解析をする行程
得られた完全長ｃＤＮＡの推定アミノ酸配列と既知のＶＬＲアミノ酸配列とのアラインメントと、系統解析法を用いた系統樹の作製とを行う行程である。アラインメントには、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ ｖｅｒ．２．０（いずれもＬａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｔ−ＣＯＦＦＥＥ（ＥＭＢｎｅｔ）、ＤＩＡＬＩＧＮ（Brudno et al., Nuc. Acids. Res. 32: 41-44 （2004））、Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ（Depiereux, E. et al., Prot. Engng. 4（6）:603-613（1991））、ＭＡＰ（Huang, X. On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences（10）, 227-235 （1994））等を用いることができる。また、系統樹の作製に用いる系統解析法は特に限定されないが、例えば、最大節約法、最尤法、ベイズ法、近隣結合法（ＮＪ法；Saito, N. et al., Molecular Biology and Evolution （4）406-425（1987)）を挙げることができる。近隣結合法による系統樹（近隣結合系統樹）の作製には、例えば、ＭＥＧＡ ｐａｃｋａｇｅ（Kumar, S. et al., molecular evolutionary genetics analysis version 4.1. The Pennsylvania State University, University Park. （1993））、microSeq Microbial Identification System（ＡＢＩ）等を用いることができる。
【００３２】
次に、本発明に係る標的抗原結合ファージをスクリーニングする方法について、さらに詳細に説明する。本発明に係る標的抗原結合ファージをスクリーニングする方法は、主に、
（１）本発明に係るＶＬＲをファージ表面に提示させて抗原結合ファージライブラリを作製する行程
（２）抗原結合ファージライブラリと標的抗原とを反応させて、抗原結合ファージライブラリのうち標的抗原と結合しない抗原結合ファージを除去する行程
（３）抗原結合ファージライブラリのうち標的抗原と結合した抗原結合ファージを大腸菌に感染させて増殖させる行程
の以上３つの行程を有している。
【００３３】
（１）本発明に係るＶＬＲをファージ表面に提示させて抗原結合ファージライブラリを作製する行程
本行程は、本発明に係るＶＬＲをコードするＤＮＡを用いて、本発明に係るＶＬＲまたはこれを有するポリペプチドを、ファージディスプレイ法（Smith G.P., Science, 228, 1315-1317（1985）等）、によってファージ粒子表面に提示させて抗原結合ファージライブラリを作製する行程である。すなわち、本発明に係るＶＬＲをコードするＤＮＡ、またはこれに相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ抗原に結合する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ファージのコートタンパク質遺伝子のいずれかに挿入し、これをファージに組み込む。そして、本発明に係るＶＬＲまたはこれを有するポリペプチドとファージのコートタンパク質との融合タンパク質を発現させ、ファージ粒子表面に提示させることにより、抗原結合ファージライブラリを作製することができる。また、このファージを大腸菌等の宿主に感染させることにより、ファージのゲノムDNAを効率よく複製することができる。
【００３４】
ここで、前記「ストリンジェントな条件」とは、特別な場合を除き、６Ｍ尿素，０．４％ＳＤＳ，０．５×ＳＳＣの条件、またはこれと同等のハイブリダイゼーション条件を指し、さらに必要に応じて、よりストリンジェンシーの高い条件を適用してもよく、例えば、６Ｍ尿素，０．４％ ＳＤＳ，０．１×ＳＳＣ、またはこれと同等のハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。それぞれの条件において、温度は約４０℃以上とすることができ、よりストリンジェンシーの高い条件が必要であれば、例えば、約５０℃ないし６５℃としてもよい。また、ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第二版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３５】
また、本発明で用いられるファージは特に限定されないが、例えば、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージ、λファージ、繊維状ファージを挙げることができ、繊維状ファージが好ましい。さらに、繊維状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）としては、例えば、ｆ１、ｆｄ、Ｍ１３等を挙げることができるが、環状一本鎖ゲノムＤＮＡを持ち、かつｇｅｎｅ ３ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｇ３ｐ，以下同様），ｇ６ｐ，ｇ７ｐ，ｇ８ｐ，ｇ９ｐの５つのコートタンパクがアセンブリされた、桿状のＭ１３ファージがより好ましい。
【００３６】
なお、Ｍ１３ファージを用いる場合、本発明に係るＶＬＲまたはこれを有するポリペプチドのファージ粒子表面への提示は、これをコードするＤＮＡ、またはこれに相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ抗原に結合する能力を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ｇ３ｐ，ｇ６ｐ，ｇ７ｐ，ｇ８ｐ，ｇ９ｐのいずれかのコートタンパク質遺伝子に挿入することにより可能となるが、Ｍ１３ファージ粒子の最終的パッケージングを破壊せずに融合タンパク質を提示させることができる観点から、ｇ３ｐまたはｇ８ｐと融合させ、提示させることが好ましく、ｇ３ｐと融合させ、融合タンパク質としてファージ粒子表面に提示させることがより好ましい。
【００３７】
また、本発明で用いられるベクターは、ファージの一本鎖ゲノムを改良してベクターとして用いてもよく、外来プラスミドベクターを用いてもよい。外来プラスミドベクターとしては、例えば、ファージへのパッケージングシグナルを含むファージミドベクターを挙げることができる。ファージミドベクターを用いる場合は、一本鎖ＤＮＡとしてファージ粒子中にパッケージングさせるために、ヘルパーファージを感染させる必要があり、これにより培養上清から一本鎖ＤＮＡを得ることができる。なお、好ましいファージミドベクターとして、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅを挙げることができ、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクターを用いる場合は、図１に示すように、制限酵素サイトＳｆｉIおよびＮｏｔIを利用することができる。
【００３８】
また、形質転換させた宿主は、当業者によって適宜選択可能な培地を用いて培養することができ、これにより高濃度の抗原結合ファージ溶液を得ることができる。
【００３９】
ここで、本発明に係るＶＬＲまたはこれを有するポリペプチドのファージ粒子表面への提示には、ＬＲＲをコードするポリヌクレオチドを任意に選択して用いてもよく、或いは、Ｓｔｕｍｐｐ Ｍ．Ｔ．らの方法（Stumpp M. T. et al., J. Mol. Biol. 332（2）471-87（2003））に従い、前記得られた完全長ｃＤＮＡから縮重ポリヌクレオチドを合成して用いてもよい。
【００４０】
なお、前記選択或いは縮重合成されたＬＲＲポリヌクレオチドは、ＬＲＲＮＴ、ＬＲＲＣＴ、および他のＬＲＲポリヌクレオチドとライゲーションさせて、ＶＬＲとして用いることができる。この場合、例えば、免疫染色、フローサイトメトリー、免疫沈降法等を用いて、作製したＶＬＲの有用性を検討することもできる。
【００４１】
（２）抗原結合ファージライブラリと標的抗原とを反応させて、抗原結合ファージライブラリのうち標的抗原と結合しない抗原結合ファージを除去する行程
本行程は、行程（１）において作製した抗原結合ファージライブラリと標的抗原とを反応させた後、標的抗原と結合しない抗原結合ファージを除去して標的抗原と結合した抗原結合ファージを得る行程である。
【００４２】
例えば、標的抗原を固相基板、フィルム、テープ、ビーズ等の固相担体に固定して本行程を行う場合、この固相担体表面に抗原結合ファージライブラリを含む溶液を接触させてインキュベートした後、この固相担体表面を洗浄し、標的抗原に親和性を有しないポリペプチドを提示しているファージ粒子を除去することにより、標的抗原とポリペプチドとの相互作用によって固相担体表面に捕捉されたファージ粒子を回収する等の行程を挙げることができる。さらに、例えば、標的抗原をビオチン化し、固定化されたストレプトアビジンを介して固定化することで、標的抗原の性質に関係なく、またその構造に影響を与えずに固定することができ、標的抗原に特異的な抗原結合ファージを濃縮することができる。
【００４３】
また、例えば、液相に含まれる標的抗原について本行程を行う場合、液相に抗原結合ファージライブラリを含む溶液を加えてインキュベートした後、遠心分離によって標的抗原に親和性を有しないポリペプチドを提示するファージ粒子を除去し、さらに標的抗原に親和性を有するポリペプチドを提示するファージ粒子を加えた後に、遠心分離により沈殿を回収する等の行程を挙げることができる。さらに、標的抗原に親和性を有するポリペプチドを提示するファージ粒子にセファロースビーズ等の担体を結合させることで、標的抗原に特異的な抗原結合ファージを濃縮することができる。
【００４４】
（３）抗原結合ファージライブラリのうち標的抗原と結合した抗原結合ファージを大腸菌に感染させて増殖させる行程
本行程は、行程（２）によって濃縮された、標的抗原と結合した抗原結合ファージを宿主大腸菌に感染させて増幅させる行程である。例えば、酸処理等によって回収した抗原結合ファージを宿主大腸菌に感染させて増幅させれば、行程（２）〜（３）の一連の操作により、標的抗原に親和性を有するリガンドを提示する、標的抗原と結合した抗原結合ファージがさらに濃縮され、標的抗原に対して高い親和性を有する抗原結合ファージ粒子群を得ることができる。なお、行程（２）〜（３）を複数回行う方法（バイオパニング法；Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）により、より濃縮された、標的抗原と結合した抗原結合ファージ粒子群を得ることができる。
【００４５】
次に、本発明に係る任意の標的抗原に対するＶＬＲのインビトロ製造方法について、さらに詳細に説明する。本発明に係る標的抗原結合ファージをスクリーニングする方法は、主に、
（１）本発明に係るＶＬＲをファージ表面に提示させて抗原結合ファージライブラリを作製する行程
（２）抗原結合ファージライブラリと標的抗原とを反応させて、抗原結合ファージライブラリのうち標的抗原と結合しない抗原結合ファージを除去する行程
（３）抗原結合ファージライブラリのうち標的抗原と結合した抗原結合ファージを大腸菌に感染させて増殖させる行程
（４）標的抗原と結合した抗原結合ファージに含まれるＶＬＲをコードする遺伝子を組み換えてＶＬＲを組み換え生産する工程
の以上４つの行程を有している。なお、本発明の構成のうち、前述した標的抗原結合ファージをスクリーニングする方法と同一または相当する構成については再度の説明を省略する。
【００４６】
（４）標的抗原と結合した抗原結合ファージに含まれるＶＬＲをコードする遺伝子を組み換えてＶＬＲを組み換え生産する工程
本行程は、行程（３）により濃縮された、標的抗原と結合した抗原結合ファージ粒子が提示するＶＬＲをコードする遺伝子から、ＶＬＲを組み換え生産する行程である。このＶＬＲの組み換え生産は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2001, Eds., Sambrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Press等、当業者に広く知られている各種実験マニュアルに記載されている方法を利用することができる。
【００４７】
より具体的には、例えば、ＶＬＲをコードする遺伝子またはこの遺伝子を含むベクターで形質転換された宿主細胞を、適当な条件下で培養して培養混合物を回収し、ＶＬＲを回収して、必要に応じて精製することができる。この精製方法は、当業者により適宜選択することができるが、例えば、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィー、および逆相クロマトグラフィー等を挙げることができる。また、必要に応じてＨＰＬＣ等を使用することもできる。
【００４８】
以下、本発明に係るＶＬＲの作製方法を、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例１】
【００４９】
＜新規ＶＬＲ遺伝子を同定するための相同性検索＞
新規ＶＬＲ遺伝子を同定するため、ウミヤツメ（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ ｍａｒｉｎｕｓ）由来のｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ（ＥＳＴ）データベースを構築し、既知のＶＬＲ遺伝子をクエリーとして相同性検索を行った。
【００５０】
公的データベースであるＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）の trace archives homepage（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/trace.cgi）から、ウミヤツメ由来のＥＳＴ塩基配列を抽出し、データベース構築ソフトウェアであるＧＥＮＥＴＹＸ−ＰＤＢ Ｖｅｒ．５（ゼネティックス社）を用いてウミヤツメＥＳＴデータベースを構築した。ＮＣＢＩに登録されているヤツメウナギ類（Ｌａｍｐｒｅｙ）とメクラウナギ類（Ｈａｇｆｉｓｈ）のＶＬＲＡ遺伝子およびＶＬＲＢ遺伝子のアミノ酸配列から任意に選択した配列をクエリーとして相同性検索を行った。この相同性検索は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＰＤＢ Ｖｅｒ．５に内蔵されているＴＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて行った。
【００５１】
その結果、図２に示すように、既知のＶＬＲＡおよびＶＬＲＢとは異なる配列を有するＥＳＴ塩基配列が得られた。その塩基配列を配列番号４に示す。これにより新規ＶＬＲ遺伝子の存在の可能性が確認され、これをＶＬＲＣと命名した。
【実施例２】
【００５２】
＜ＶＬＲＣ遺伝子のクローニング＞
実施例１で得られたＥＳＴ塩基配列を基に、以下の方法にてＶＬＲＣ遺伝子のクローニングを試みた。
【００５３】
（１）ｃＤＮＡの合成
カワヤツメ（Ｌｅｔｈｅｎｔｅｒｏｎ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）を１００ｍｇ/Ｌのトリカイン・メタンスルフォネート（ＴＭＳ，ＭＳ２２２；Ｓｉｇｍａ社）で麻酔した後、尾部切断によってその血液を採取した。この血液をＨｉｓｔｏｐａｃｋ １０７７（Ｓｉｇｍａ社）上に重層し、４℃、１５００ｒｐｍの条件下、３０分間遠心することにより白血球を採取した後、RNeasy Mini Kit（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて白血球由来ＲＮＡを抽出した。続いて、Superscript III First Strand Synthesis System（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、１μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
【００５４】
（２）ＶＬＲＣ遺伝子を含む完全長ｃＤＮＡの取得
実施例１で得られたＥＳＴ配列を基に、２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。その配列は、
５’−ｃａａｃｔｇｃａｇａ ｇｔｇｔｔｃｃｔｇａ ｃｇｇ−３’（配列番号５）
５’−ｃａｔｃｃｇｔｇｔｇ ｃｔｃａｔｇｇｇｔｔ ｇｃ−３’（配列番号６）
で表される。
【００５５】
前記配列番号５および配列番号６の各オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰＣＲを以下の条件で行った。
−反応試薬−
バイオ実験イラストレイテッド第三巻（秀潤社）掲載のプロトコルに従って反応液を調製した。反応にはＤＮＡポリメラーゼとしてＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（ＡＢＩ社）を用い、この酵素に付属の溶液を使用した。本実施例（１）で得られたｃＤＮＡ ５ｎｇ相当を鋳型として用いた。
−反応条件−
９５℃で１０分の反応の後、９５℃で１５秒、３７℃で１分、７２℃で３０秒の各反応を１サイクルとして３サイクル行い、その後、９５℃で１５秒、５７℃で１分、７２℃で３０秒の各反応を１サイクルとして４０サイクル行い、さらに７２℃で７分の反応を行った。その結果、約３００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が確認された。
【００５６】
続いて、pGEM T-Easy Vector Systems I（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、この増幅されたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＧＥＭ−Ｔ ＥａｓｙにＴＡクローニングした。操作は付属のマニュアルに従って行った。形質転換液を、アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩静置培養した。生じたコロニーをＬＢ培地２ｍＬに植菌し、３７℃で一晩培養した後にpGEM-T Easy- LjVLRC_c2プラスミドを調製した。その塩基配列を配列番号７に示す。
【００５７】
次に、完全長ＶＬＲＣ ｃＤＮＡの配列情報を得るため、Rapid Amplification of cDNA ends（ＲＡＣＥ）法を行った。具体的には、GeneRacer RACE-Ready cDNA kit（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、付属のマニュアルに従って操作し、欠失部分のｃＤＮＡをクローニングした。
【００５８】
まず、遺伝子の５’末端を増幅するため、最初の反応と二回目の反応とに用いる２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。その配列は、
５’−ｇａｇａｃａａａａｇ ｇｃａｔｇｔｔａｃａ ｃａｃａ−３’（配列番号８）
５’−ａｔｇｔａｇｃａｇｇ ｇｇｔｇｇｇａｇａｃ ｇａｔｇｃ−３’（配列番号９）
で表される。
【００５９】
次に、遺伝子の３’末端を増幅するため、最初の反応と二回目の反応とに用いる２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。その配列は、
５’−ｇｃａｔｃｇｔｃｔｃ ｃｃａｃｃｃｃｔｇｃ ｔａｃａｔ−３’（配列番号１０）
５’−ｔｇｔｇｔｇｔａａｃ ａｔｇｃｃｔｔｔｔｇ ｔｃｔｃ−３’（配列番号１１）
で表される。
【００６０】
上記配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１の各オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰＣＲを前述と同様の条件で行い、５’末端については約７００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が、３’末端については約５００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が、各々確認された。増幅された５’末端と３’末端とのＤＮＡ断片は、前述と同様の手法によりＴＡクローニングした。形質転換液を、アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩静置培養した。生じたコロニーをＬＢ培地２ｍＬに植菌し、３７℃で一晩培養することによりpGEM-T Easy- LjVLRC_5RACE_A5T9002プラスミドおよびpGEM-T Easy- LjVLRC_3RACE_A3c4プラスミドを調製した。それらの塩基配列を配列番号１２および配列番号１３に示す。
【００６１】
続いて、前記pGEM-T Easy- LjVLRC_c2プラスミド、pGEM-T Easy- LjVLRC_5RACE_A5T9002プラスミド、およびpGEM-T Easy- LjVLRC_3RACE_A3c4プラスミドをテンプレートとして、各々のＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。この塩基配列の決定は種々の合成ＤＮＡをプライマーとして、CEQ2000XL DNA Analysis System（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いて、常法に従ってジデオキシ法により行った。
【００６２】
（３）完全長ＶＬＲＣ ｃＤＮＡ配列の決定
前記pGEM-T Easy- LjVLRC_c2プラスミド、pGEM-T Easy- LjVLRC_5RACE_A5T9002プラスミド、およびpGEM-T Easy- LjVLRC_3RACE_A3c4プラスミドの配列解析の結果から、完全長ＶＬＲＣ ｃＤＮＡは１３９９塩基で構成されることが確認された。その塩基配列を配列番号１４に示す。また、図３に示すように、ＶＬＲＡおよびＶＬＲＢのアミノ酸配列とのアラインメントを、無償提供されているＣｌｕｓｔａｌ Ｘ ｖｅｒ．２．０（http://www.clustal.org/download/current/, Larkin et al., Bioinformatics 23: 2947-2948（2007））を用いて行った。なお，配列番号１４の塩基配列は３つのＬＲＲＶを含んでいるが，図３ではＣ末端側に存在するＬＲＲＶのみを示している。
【００６３】
（４）ＶＬＲＣの多様性領域の単離
本実施例（２）で得られた決定した完全長ｃＤＮＡ配列を基に、２種類のオリゴヌクレオチドを合成した。その配列は、
５’−ａｇｔｇｔｔｇｇｔｃ ｃｃｇｔｇｃｇａｇｃ−３’（配列番号１５）
５’−ｇｇｔｇｇｇａｇａｃ ｇａｔｇｃｔｇｔａａ−３’（配列番号１６）
で表される。
【００６４】
上記配列番号１５および配列番号１６の各オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰＣＲを以下の条件で行った。
−反応試薬−
Expanded High Fidelity PCR System（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ 社）の付属のマニュアルに従って反応液を調製した。反応には本実施例（１）で作成したｃＤＮＡ １５ｎｇを鋳型として用いた。
−反応条件−
９４℃で２分の反応を１サイクル行い、その後、９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分の各反応を１サイクルとして３５サイクル行い、さらに７２℃で７分の反応を行った。
【００６５】
この増幅されたＤＮＡ断片を、TOPO TA Cloning kit（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）または前記pGEM T-Easy Vector Systems I（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、プラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）またはプラスミドベクターｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にＴＡクローニングした。操作は付属のマニュアルに従って行った。形質転換液を、アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。生じたコロニーをＬＢ培地２ｍＬに植菌し、３７℃で一晩培養した後に複数のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００６６】
続いて、プラスミドＤＮＡをテンプレートとして、ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定は種々の合成ＤＮＡをプライマーとして、CEQ2000XL DNA Analysis System（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いて、常法に従って行った。ＴＡクローニングされた挿入ＤＮＡを、種々の合成ＤＮＡをプライマーとして用いて、ジデオキシ法により複数のプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定した。それらの塩基配列を配列番号１７〜３５に示す。これにより、１９のＶＬＲＣ遺伝子をクローニングすることに成功した。
【実施例３】
【００６７】
＜ＶＬＲＣのアミノ酸配列解析＞
実施例２（４）で得られた配列番号１７〜３５から推定アミノ酸配列を決定した。それらのアミノ酸配列を配列番号３６〜５４に示す。それらアミノ酸配列について、前記Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘを用いてアラインメントを行った。その結果を図４に示す。また、そのアミノ酸配列を用いて近隣結合系統樹の構築を行った。系統樹構築はMEGA ver 4.1 Beta program（http://www.megasoftware.net/）を用いて行った。これを図５に示す。既に報告のあるＶＬＲＢ抗体は、図１で示すような多様性に富んだ可変領域を有し、かつこの可変領域が抗原と結合することが知られている。したがって、ＶＬＲＣもＶＬＲＢと同様に、その可変領域を介して抗原に結合する能力を有することが強く示唆された。
【００６８】
以上のような本実施例によれば、既知のＶＬＲＡやＶＬＲＢによって認識されない抗原を認識する新規ＶＬＲを提供することができ、これにより、新たな臨床検査試薬、実験試薬、および生体反応を特異的に阻害する阻害剤等、或いはこの新規ＶＬＲを用いた標的抗原結合ファージをスクリーニングするためのキットおよび装置等を製造することができる。
【００６９】
なお、本発明に係るＶＬＲ、標的抗原結合ファージをスクリーニングする方法、および任意の標的抗原に対するＶＬＲの製造方法は、前述した実施例に限定されるものではなく、適宜変更することができる。例えば、本発明に係るＶＬＲが抗体として機能するのではなく、エピトープペプチド、阻害ペプチド、或いはアンタゴニスト（アゴニスト）ペプチドとして機能してもよい。また、ファージディスプレイ法に代えて、例えば、ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法、ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法、ｉｎ ｖｉｔｒｏウイルス法等を用いてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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