(57)【要約】【課題】３種以上の塩基配列から、検査対象の塩基配列を判定するための塩基配列判定方法、塩基配列判定システム及び塩基配列判定プログラムを提供する【解決手段】実施形態である塩基配列判定方法は、識別可能な複数の検出用区画と、それらに対応させて各々固定され、区画間で互いに配列が異なる複数の検出用プローブと、何れの検出用プローブの塩基配列とも異なる配列のコントロールDNAが固定化されたコントロール区画を有するチップを用いる。以降の処理により得る結果も最後まで検出用区画に対応し、識別可能である。チップにサンプル核酸を添加した後、各検出用区画からの信号よりコントロール信号を差し引き且つ除算した値を全検出用区画からの各々の信号全てについて行う。得られた結果から１つを選択してＸ座標とし、残りの結果も認識可能な複数のＹ座標とする。各Ｙ座標全てＸ座標と対にされ、対毎のＸおよびＹ座標で定まる点と原点を結ぶ直線と、正のＸ軸とが成す角度を得る。得られた全ての角度が角度判定基準との大小関係の比較から、Ｘ座標とされた結果が対応する検出用区画の検出プローブと、対になったＹ軸の結果に対応する検出用区画の検出用プローブとについて陽性か陰性かを判定する。Ｘ座標については、対となったＹ軸の分の複数の判定結果が出る。これらについては陽性と陰性の優先順位に従い、更に陽性か陰性かを判定し、サンプル核酸について、全検出用プローブが陽性か陰性かを判定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１〜第ｎ検出用区画と、
前記第１〜第ｎ検出用区画に対応してそれぞれ固定され、前記第１〜第ｎ検出用区間で互いに塩基配列が異なる第１〜第ｎプローブと、
前記第１〜第ｎ検出用区画に対応して配置され、前記第１〜第ｎプローブの何れとも塩基配列が異なるコントロールDNAが固定されたコントロール区画と、
を備えるチップに、サンプル核酸を含む薬液を供給する段階と（ここで、前記ｎは３以上の整数である）、
前記第１〜第ｎ検出用電極を介してそれぞれ第１〜第ｎ検出信号を、前記コントロール電極を介してコントロール信号を、それぞれ取得する段階と、
前記第１検出信号から前記コントロール信号を減算し、前記コントロール信号で除算した値をＸ座標とする段階と、
前記第２〜第ｎ検出信号から、前記第２〜第ｎ検出信号それぞれに対応する前記コントロール信号をそれぞれ減算し、前記第２〜第ｎ検出信号それぞれに対応する前記コントロール信号でそれぞれ除算した値を、それぞれ第１〜第ｍY座標とする段階と（ここで、ｍはｎから１を減算した整数である）、
前記第Ｘ座標と、それぞれの前記第１〜第ｍY座標とについて、原点から前記X座標およびそれぞれの第１Y〜第ｍY座標とが定めるそれぞれの点までのそれぞれの直線が正のX軸となす第１〜第ｍ角度をそれぞれ算出する段階と、
前記第１〜第ｍ角度それぞれを、前記第１〜第ｍ角度それぞれに対してそれぞれ予め定められた第１〜第ｍ角度判定基準とそれぞれ比較する段階と、
を含み、
前記第１〜第ｍ角度それぞれと、前記第１〜第ｍ角度に対応する前記第１〜第ｍ角度判定基準それぞれとの大小関係により、それぞれ第１〜第ｍの判定として、前記第２〜第ｎプローブそれぞれと、前記第１プローブとを１対として、第１プローブと、それぞれの第２〜第ｎプローブとのｍ個の対について陽性または陰性を判定することと、
前記ｍ個の対についての第１〜第ｍの判定においてｍ個の判定結果が生じる第１プローブについて、予め定めた陽性と陰性の優先順位に従い、更に陽性または陰性を判定することと、
前記サンプル核酸について、第１〜第ｎプローブそれぞれの陽性または陰性を判定することと、
を特徴とする塩基配列判定方法。
【請求項２】
前記ｍ個の対それぞれにおける、前記Ｘ座標及び前記第１Ｙ〜第ｍＹ座標を、前記ｍ個の対それぞれにおける、前記Ｘ座標及び前記第１Ｙ〜第ｍＹ座標それぞれに対して予め定めた第１Ｘ〜第ｍＸ座標判定基準及び第１Ｙ〜第ｍＹ座標判定基準とそれぞれ比較する段階と、
前記ｍ個の対それぞれにおける、前記Ｘ座標及び前記第１Ｙ〜第ｍＹ座標のそれぞれが、前記判定基準よりも小さい場合には、その座標に該当する前記第１〜第ｎプローブ陰性であると判定することと、
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第1〜ｍ角度判定基準、第１Ｘ〜第ｍＸ座標判定基準及び第１Ｙ〜第ｍＹ座標判定基準が、複数の既知の塩基配列のサンプル核酸の測定データの平均値と標準偏差を用いて定められることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１〜第ｍ角度判定基準それぞれについて、Ｘ座標に該当するプローブの陽性または陰性を判定するための判定基準と、Ｙ座標に該当するプローブの陽性または陰性を判定するための判定基準とが、それぞれ独立に設定されることを特徴とする請求項１〜３の何れか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１Ｘ〜第ｍX座標判定基準と前記第１Ｙ〜第ｍＹ座標判定基準が、それぞれ独立に設定されることを特徴とする請求項１〜４の何れか1項に記載の方法。
【請求項６】
第１〜第ｎ検出用区画と；
前記第１〜第ｎ検出用区画に対応してそれぞれ固定され、前記第１〜第ｎ検出用区画間で互いに塩基配列が異なる第１〜第ｎプローブと；
前記第１〜第ｎ検出用区画に対応して配置され、前記第１〜第ｎプローブの何れとも塩基配列が異なるコントロールDNAが固定されたコントロール区画と；
を備えるチップを装着して使用され、
前記第１〜第ｎ検出用区画を介してそれぞれ第１〜第ｎ検出信号を、前記コントロール電極を介してコントロール信号を、それぞれ取得する測定系と；
前記チップに、薬液を送液する送液系と；
前記測定系及び送液系を制御する制御機構と；
前記第１検出信号から前記コントロール信号を減算し、前記コントロール信号で除算した値をＸ座標とし、
前記第２〜第ｎ検出信号から、前記第２〜第ｎ検出信号それぞれに対応する前記コントロール信号をそれぞれ減算し、前記第２〜第ｎ検出信号それぞれに対応する前記コントロール信号でそれぞれ除算した値を、それぞれ第１〜第ｍY座標とし（ここで、ｍはｎから１を減算した整数である）、
前記第Ｘ座標と、それぞれの前記第１〜第ｍY座標とについて、原点から前記X座標およびそれぞれの第１Y〜第ｍY座標とが定めるそれぞれの点までのそれぞれの直線が正のX軸となす第１〜第ｍ角度をそれぞれ算出し、前記第１〜第ｍ角度それぞれを、前記第１〜第ｍ角度それぞれに対してそれぞれ予め定められた第１〜第ｍ角度判定基準とそれぞれ比較し、前記第１〜第ｍ角度それぞれと、前記第１〜第ｍ角度に対応する前記第１〜第ｍ角度判定基準それぞれとの大小関係により、それぞれ第１〜第ｍの判定として、前記第２〜第ｎプローブそれぞれと、前記第１プローブとを１対として、第１プローブとそれぞれの第２〜第ｎプローブとのｍ個の対について陽性または陰性を判定し、
前記ｍ個の対についての第１〜第ｍの判定においてｍ個の判定結果が生じる第１プローブについて、予め定めた陽性と陰性の優先順位に従い、更に陽性または陰性を判定し、
前記サンプル核酸について、第１〜第ｎプローブそれぞれの陽性または陰性を判定するように構成された型判定モジュールを含むコンピュータと；
を備え、前記第１Ｘ〜第ｍX座標判定基準と前記第１Ｙ〜第ｍＹ座標判定基準が、それぞれ独立に設定されることを特徴とする塩基配列判定システム。
【請求項７】
前記コンピュータが、
前記第１〜第ｎ検出信号及び前記コントロール信号をそれぞれ電流-電圧特性として取得し、当該電流-電圧特性のベースラインの傾きをそれぞれ求め、それぞれのベースラインの傾きにより、それぞれの電流-電圧特性の正常または異常を判断し、異常な検出信号を演算対象外とするように構成された電流波形判定モジュールと、
前記第１〜第ｎ検出信号及び前記コントロール信号に対応するそれぞれの電流-電圧特性から、それぞれのバックグラウンド電流を差し引いて、それぞれの真の検出信号をピーク電流値として取得するように構成されたピーク電流検出モジュールと、
前記ピーク電流検出モジュールが算出した真のピーク電流値のデータ群中から、正常グループを抽出するように構成されたグループ正常判定モジュールと、
抽出された正常データから真のピーク電流値のデータ群を用いて、対象とする核酸塩基が存在するか否かを判定する有無判定モジュールまたはサンプル核酸の一塩基多型を同定するように構成された型判定モジュールと、
を更に備えることを特徴とする請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
第１〜第ｎ検出用電極と、
前記第１〜第ｎ検出用電極に対応してそれぞれ固定され、前記第１〜第ｎ検出用電極間で互いに塩基配列が異なる各々複数の第１〜第ｎプローブと、
前記第１〜第ｎ検出用電極に対応して配置され、前記第１〜第ｎプローブの何れとも塩基配列が異なるコントロールDNAが固定された複数のコントロール電極と、
を備えるチップに、サンプル核酸を含む薬液が供給された後に（ここで、前記ｎは３以上の整数である）、
前記第１〜第ｎ検出用電極を介してそれぞれ第１〜第ｎ検出信号を、前記コントロール電極を介してコントロール信号を、それぞれ取得する手順と、
前記第１検出信号から前記コントロール信号を減算し、前記コントロール信号で除算した値をＸ座標とし、前記第２〜第ｎ検出信号から、前記第２〜第ｎ検出信号それぞれに対応する前記コントロール信号をそれぞれ減算し、前記第２〜第ｎ検出信号それぞれに対応する前記コントロール信号でそれぞれ除算した値を、それぞれ第１〜第ｍY座標とし（ここで、ｍはｎから１を減算した整数である）、更に、前記第Ｘ座標と、それぞれの前記第１〜第ｍY座標とについて、原点から前記X座標およびそれぞれの第１Y〜第ｍY座標とが定めるそれぞれの点までのそれぞれの直線が正のX軸となす第１〜第ｍ角度をそれぞれ算出する手順と、
前記第１〜第ｍ角度それぞれを、前記第１〜第ｍ角度それぞれに対してそれぞれ予め定められた第１〜第ｍ角度判定基準とそれぞれ比較する手順と、
を含む処理をコンピュータに実行させ、
前記第１〜第ｍ角度判定基準が、それぞれ独立に設定され、これにより前記コンピュータに、第１〜第ｎプローブそれぞれの陽性または陰性を判断させ、更に、ｍ個の判定結果が生じる第１プローブについて、予め定めた陽性と陰性の優先順位に従い、第１プローブの陽性または陰性を判断させるための塩基配列判定用プログラム。
【請求項９】
第１プローブが固定された第１検出用電極と、
前記第１プローブとは塩基配列が異なる第２プローブが固定された第２検出用電極と、
前記第1プローブ及び第２プローブとは塩基配列が異なる第３プローブが固定された第３検出用電極と、
前記複数の第１検出用電極及び第２検出用電極及び第３検出用電極に対応して配置され、前記第１プローブ及び前記第２プローブ及び前記第３プローブの何れとも塩基配列が異なるコントロールＤＮＡがそれぞれ固定されたコントロール電極と
を備えるチップに、サンプル核酸を含む薬液を供給する段階と、
前記複数の第１検出用電極を介して第１検出信号を、前記複数の第２検出用電極を介して第２検出信号を、前記複数の第３検出用電極を介して第３検出信号を、前記コントロール電極を介してコントロール信号を、それぞれ取得する段階と、
前記第１検出信号から前記コントロール信号を減算し、前記コントロール信号で除算した値をＸ座標とする段階と、
前記第２検出信号から前記コントロール信号を減算し、前記コントロール信号で除算した値を第１Ｙ座標とする段階と、
前記第３検出信号から前記コントロール信号を減算し、前記コントロール信号で除算した値を第２Ｙ座標とする段階と、
前記第１検出信号と前記第２検出信号について、原点から前記X座標および前記第１Y座標とが定める点までの直線が正のX軸となす第１角度を算出する段階と、
前記第１検出信号と前記第３検出信号について、原点から前記X座標および前記第２Y座標とが定める点までの直線が正のX軸となす第２角度を算出する段階と、
前記第１角度及び前記第２角度を、前記第１角度及び前記第２角度それぞれに対して予め定めた第１角度判定基準及び第２角度判定基準と比較する段階と、
を含み、第１の判定として、前記第１角度と前記第１角度判定基準との大小関係により、第１プローブ及び第２プローブそれぞれについて陽性または陰性を、第２判定として、前記第２角度と前記第２角度判定基準との大小関係により、第１プローブ及び第３プローブそれぞれについて陽性または陰性を判定する段階と、
前記第１判定および第２判定において２パターンの判定結果が生じる第１プローブについて、予め定めた陽性と陰性の優先順位に従い、更に陽性または陰性を判定する段階と、
を含み、前記サンプル核酸について、第１プローブ、第２プローブ及び第３プローブそれぞれの陽性または陰性を判定する段階と、
を特徴とする塩基配列判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
実施形態は、核酸の塩基配列を判定する塩基配列判定方法、この塩基配列判定方法を実現する塩基配列判定システム、及びこの塩基配列判定システムを自動で制御し、測定信号を自動解析される塩基配列判定プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、核酸の塩基配列検出技術が、様々な目的で利用されている。（１）微生物に特異的な塩基配列を検出することにより、それらの存在自体を証明する場合、（２）同一種の微生物の中で分類された型を検出することにより、型に応じた対処を選択する場合、（３）薬剤などの投与により生じる薬剤耐性微生物を検出することにより、微生物の経時的変化を検出する場合、（４）転写されるＲＮＡの量を把握することにより、細胞や組織の状況を把握する、（５）多様性のある塩基配列を複数組み合わせ、個体を特定する、などである。このような目的の中で、検出するものと識別するものが類似している場合には、１塩基または数塩基の僅かな違いを識別する必要がある。
【０００３】
塩基配列を検出する方法は、これまで様々なものが開発されているが、１塩基または数塩基の僅かな違いを識別する場合、どちらか一方を検出する際に他方の非特異信号が見られるため、それぞれの塩基配列に応じた信号から個別に判定することは難しい場合がある。その対応のために、互いの塩基配列に応じた信号同士を相対比較し、判定する方法がある。更に、例えば、ある塩基配列領域の中の１塩基多型部位において、ＡとＧのどちらか一方の塩基が存在する場合、なんらかの検出方法において得られるＡ由来の信号のみから、またはＧ由来の信号のみから、どちらの塩基であるかを判定することが困難な場合がある。その場合には、Ａ由来の信号とＧ由来の信号の比率を算出し、その数値によって、Ａ、Ｇまたは両方の存在を検出する。このように比率から塩基配列を特定する方法について報告があるが、これらは、主に、１塩基置換で且つ２種の塩基を対象としており、そのどちらか一方、またはその両方の有無を検出するものである。
【０００４】
このような技術が報告されてはいるが、上記のような様々な目的における塩基配列の検出対象は、１塩基置換で且つ２種の塩基のみではなく、複数種類の塩基配列を対象とする場合がある。例えば、薬剤耐性微生物を検出する場合、薬剤耐性を示す微生物の特徴は、塩基配列ではなく、アミノ酸配列によって特定される。この薬剤耐性を示すアミノ酸は１種類ではなく、複数種であることもある。その場合には、野生型も含めて、複数の塩基配列の中から、その微生物がもつ配列を特定する必要がある。また、１塩基多型の塩基を調べることにより、個体を特定する場合には、１箇所の１塩基多型による多様性を向上させるため、３塩基、４塩基置換型の１塩基多型部位を使用することも報告されている。この場合、その多型箇所がＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴのいずれかであるかを検出する必要がある。
【０００５】
このような状況において、複数種の塩基配列から、検査対象の塩基配列を特定は、２種の信号の比率を算出するのみでは、不可能である。従って、他の方法の開発が望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２５８７０２号公報
【特許文献２】特許第４５１６１０７号（Ｐ４５１６１０７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、３種以上の塩基配列から、検査対象の塩基配列を判定するための塩基配列判定方法、塩基配列判定システム及び塩基配列判定プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
実施形態の塩基配列判定方法は、識別可能な複数の検出用区画と、それらに対応させて各々固定され、区画間で互いに配列が異なる複数の検出用プローブと、何れの検出用プローブの塩基配列とも異なる配列のコントロールDNAが固定化されたコントロール区画を有するチップを用いる。以降の処理により得る結果も最後まで検出用区画に対応し、識別可能である。チップにサンプル核酸を添加した後、各検出用区画からの信号よりコントロール信号を差し引き且つ除算した値を全検出用区画からの各々の信号全てについて行う。得られた結果から１つを選択してＸ座標とし、残りの結果も認識可能な複数のＹ座標とする。各Ｙ座標全てＸ座標と対にされ、対毎のＸおよびＹ座標で定まる点と原点を結ぶ直線と、正のＸ軸とが成す角度を得る。得られた全ての角度が角度判定基準との大小関係の比較から、Ｘ座標とされた結果が対応する検出用区画の検出プローブと、対になったＹ軸の結果に対応する検出用区画の検出用プローブとについて陽性か陰性かを判定する。Ｘ座標については、対となったＹ軸の分の複数の判定結果が出る。これらについては陽性と陰性の優先順位に従い、更に陽性か陰性かを判定し、サンプル核酸について、全検出用プローブが陽性か陰性かを判定する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施形態に係る塩基配列判定システムを構成する測定系の一例を説明する回路図。
【図２】図１の測定系の一部をなす検出チップの構造を説明する模式的な平面図。
【図３】実施形態の判定基準について示す図。
【図４】実施形態に係る塩基配列判定システムに用いられるチップカートリッジの構造の一例を説明する模式的な組み立て鳥瞰図。
【図５】図４を上下逆にして示す、実施形態に係るチップカートリッジの組み立て鳥瞰図。
【図６】実施形態に係る塩基配列判定システムを構成する送液系に備えられるバルブユニットの全体構成を示す模式図。
【図７】実施形態に係る塩基配列判定システムの一例を説明する概念的なブロック図。
【図８】実施形態に係る塩基配列判定システムを構成するコンピュータの構成の一例を説明する概念的なブロック図。
【図９】第１〜第３の検出用区画に固定化されたプローブＤＮＡと、サンプル核酸との反応状態を示す図。
【図１０】第１〜第３の検出用区画に固定化されたプローブＤＮＡと、サンプル核酸との反応状態を示す図。
【図１１】第１〜第３の検出用区画に固定化されたプローブＤＮＡと、サンプル核酸との反応状態を示す図。
【図１２】第１〜第３の検出用区画に固定化されたプローブＤＮＡと、サンプル核酸との反応状態を示す図。
【図１３】検出用電極に固定化されたプローブＤＮＡとサンプル核酸の結合が、未結合のプローブＤＮＡが固定化された検出用電極よりもピークの大きな電気化学的電流の電流−電圧特性となることを示すグラフ。
【図１４】実施形態に係る塩基配列判定方法の全体としての流れを説明するフローチャート。
【図１５】単純移動平均法による平準化（スムージング）を説明する模式図である。
【図１６】実施形態に係る塩基配列判定方法において、各電極毎に測定された電気化学的電流の電流波形（電流−電圧特性）のそれぞれのベースラインの傾きにより、それぞれの電流波形（電流−電圧特性）の正常・異常を判定する方法の一例を説明するフローチャート。
【図１７】チップカートリッジにおける電気化学的電流の信号の例として、データ１とデータ２の２種類の電流−電圧特性を示す。データ１の電流−電圧特性が示すベースラインの傾きに比して、データ２の電流−電圧特性が示すベースラインの傾きの方が大きい。
【図１８】実施形態に係る塩基配列判定方法において、各電極毎に測定された電気化学的電流の電流波形（電流−電圧特性）から、それぞれのバックグラウンド電流を差し引いて、真の検出信号のピーク値（ピーク電流値）を求める方法の一例を説明するフローチャート。
【図１９】図１８に示したフローチャートの手順に引き続き、各電極毎に測定された電流波形（電流−電圧特性）から、真の検出信号のピーク値（ピーク電流値）を求める方法の手順の流れを説明するためのフローチャート。
【図２０】実施形態に係る塩基配列判定方法において、各電極毎に測定された電気化学的電流の電流波形（電流−電圧特性）から、ピーク位置を決定するために、電気化学的電流の微分値（ｄｉ／ｄｖ）が「ゼロクロス」する点を求める方法を説明する模式図。
【図２１】実施形態に係る塩基配列判定方法において、各電極毎に測定された電気化学的電流の電流波形（電流−電圧特性）から、それぞれのバックグラウンド電流を近似するための基準点を算出する手順を説明する模式図。
【図２２】図２１の拡大図。
【図２３】実施形態に係る塩基配列判定方法において、ゼロクロス電圧におけるピーク電流から、対応するバックグラウンド電流を差し引いて、真の検出信号（ピーク電流値）を求める方法を説明する模式図。
【図２４】図２３に示す方法で求めた真の検出信号（ピーク電流値）を、複数のコントロール電極毎、複数の第２検出用電極（塩基="Ｔ"検出用電極）毎、複数の第１検出用電極（塩基="Ｇ"検出用電極）毎に整理した棒グラフである。図２４（ａ）に示したモードＡは、第２検出用電極で歯抜けが発生しているモードであり、図２４（ｂ）に示したモードＢは、第２検出用電極からの信号にバラつきが大きい場合を示したモードであり、図２４（ｃ）は、ネガティブ・コントロール電流値の平均値が、ネガティブ・コントロールの上限値ＮＣＵＬを超えてしまった場合を概念的に示す図。
【図２５】実施形態に係る塩基配列判定方法において、各電極毎にそれぞれ算出された一群のピーク電流値のデータに対して、グループ正常判定を行う方法の一例を説明するフローチャート。
【図２６】実施形態に係る塩基配列判定方法において、ある核酸が存在するかどうかを判定する有無判定アルゴリズムのフローに進むのか、ＳＮＰの型が、２種の内のどちらであるか、それがホモ型であるか、ヘテロ型であるかを判定するＳＮＰ型判定アルゴリズムのフローに進むのかを決定する方法の一例を説明するフローチャート。
【図２７】実施形態に係る塩基配列判定方法において、ある核酸が存在するかどうかを判定する有無判定アルゴリズムの一例を説明するフローチャート。
【図２８】実施形態に係る塩基配列判定方法において、検出データとＸ座標およびＹ座標との対応について説明する図。
【図２９】実施形態に係る塩基配列判定方法において、検査有効性を判定するアルゴリズムの一例を説明するフローチャート。
【図３０】実施形態に係る塩基配列判定方法において、検査有効性判定を行う方法の一例を示すフローチャート。
【図３１】実施形態に係る塩基配列判定方法において、判定に関する基準となる種々の設定パラメータを示す概念イメージ図。
【図３２】実施形態に係る塩基配列判定方法において、判定に関する基準となる種々の設定パラメータを示す概念イメージ図。
【図３３】実施形態に係る塩基配列判定方法において、核酸の有無を判定する例について、種々の設定パラメータを示す概念イメージ図。
【図３４】実施形態に係る塩基配列判定方法において、判定に関する基準となる種々の設定パラメータを示す概念イメージ図。
【図３５】実施形態に係る塩基配列判定方法において、判定に関する基準となる種々の設定パラメータを示す概念イメージ図。
【図３６】実施形態に係る塩基配列判定方法において、判定に関する基準となる種々の設定パラメータを示す概念イメージ図。
【図３７】実施形態に係る塩基配列判定方法において、判定に関する基準となる種々の設定パラメータを示す概念イメージ図。
【図３８】実施形態に係る塩基配列判定方法において、判定に関する基準となる種々の設定パラメータを示す概念イメージ図。
【図３９】実施形態に係る塩基配列判定方法において、判定に関する基準となる種々の設定パラメータを示す概念イメージ図。
【図４０】実施形態に係る塩基配列判定方法において、判定に関する基準となる種々の設定パラメータを示す概念イメージ図。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．塩基配列判定方法
実施形態の塩基配列判定方法は、識別可能な複数の検出用区画と、それらに対応させて各々固定され、区画間で互いに配列が異なる複数の検出用プローブと、何れの検出用プローブの塩基配列とも異なる配列のコントロールDNAが固定化されたコントロール区画を有するチップを用いる。以降の処理により得る結果も最後まで検出用区画に対応し、識別可能である。チップにサンプル核酸を添加した後、各検出用区画からの信号よりコントロール信号を差し引き且つ除算した値を全検出用区画からの各々の信号全てについて行う。得られた結果から１つを選択してＸ座標とし、残りの結果も認識可能な複数のＹ座標とする。各Ｙ座標全てＸ座標と対にされ、対毎のＸおよびＹ座標で定まる点と原点を結ぶ直線と、正のＸ軸とが成す角度を得る。得られた全ての角度が角度判定基準との大小関係の比較から、Ｘ座標とされた結果が対応する検出用区画の検出プローブと、対になったＹ軸の結果に対応する検出用区画の検出用プローブとについて陽性か陰性かを判定する。Ｘ座標については、対となったＹ軸の分の複数の判定結果が出る。これらについては陽性と陰性の優先順位に従い、更に陽性か陰性かを判定し、サンプル核酸について、全検出用プローブが陽性か陰性かを判定する。
【００１１】
検出用区画は、１つのチップに複数配置される。複数配置された検出区画に検出用プローブが固定化される。検出用区画は、１つの検出点として１つの検出用プローブとそれにマッチする核酸とのハイブリダイズ信号を検出信号として得られるように構成される。検出信号は、ハイブリダイズ信号を反映する信号であればよく、電気的、物理的、化学的、電気化学的、電気物理的、およびそれらを組み合わせた形態での信号であればよい。従って、それらの信号を得ることが可能な区画の構成とすればよい。例えば、電気化学的な信号として検出信号を得る場合には電極が使用される。
【００１２】
複数配置された検出区画は、それぞれの検出区画から得られる信号が、その後の処理において何れの検出区画からの信号であるか識別されるように対応付けられ維持される。それにより、何れの検出区画の検出用プローブが陽性であり、また何れの検出区画の検出用プローブが陰性であるかが判定される。その結果、サンプル核酸の塩基配列が判定される。
【００１３】
例えば、複数の検出用区画は、例えば、それぞれ第１の検出用区画から第ｎの検出用区画として認識される。ここで「ｎ」は３以上の整数である。ここにおいて、「第１〜第ｎ検出用区画」と記載された場合、第１の検出用区画、第２の検出用区画、第３の検出用区画、第４の検出用区画………第ｎの検出用区画が存在することを意味する。
【００１４】
コントロール区画は、コントロールDNA、言い換えるとコントロールプローブが固定化されるための区画である。従って、コントロール区画からの信号は、コントロール信号として使用される。コントロール区画の構成は、コントロールDNAが固定化されること以外は、基本的に検出用区画と同じ構成である。
【００１５】
コントロール区画は、各検出用区画に対応して配置される。即ち、例えば、検出用区画が３つ、即ち、第１の検出用区画、第２の検出用区画および第３の検出用区画から構成される場合には、それに対して第１のコントロール区画、第２のコントロール区画および第３のコントロール区画が配置される。例えば、第１のコントロール区画は、第１の検出用区画に対応して使用され、第２のコントロール区画は、第２の検出用区画に対応して使用され、第３のコントロール区画は、第３の検出用区画に対応して使用されればよい。
【００１６】
複数からの検出用区画からそれぞれ得られた検出信号群から１つの信号を選択し、その選択された１つの信号からＸ座標を得る。即ち、検出用区画が「第１〜第ｎ検出用区画」ある場合、第１検出用区画からＸ座標を算出する。
【００１７】
Ｘ座標の算出は、第１検出用区画から得られた検出信号を、第１検出用区画に対応付されたコントロール区画からのコントロール信号で減算し、更に当該コントロール区画からのコントロール信号で除算し得る。
【００１８】
第２検出用区画の信号は、第２検出用区画に対応付されたれたコントロール区画からのコントロール信号で減算し、更に当該コントロール区画からのコントロール信号で除算し、Ｙ座標とされる。
【００１９】
同様に第ｎ検出用区画についてＹ座標が算出される。第２〜第ｎ検出用区画からそれぞれ算出されたＹ座標は、各区画と座標が対応付られ最終結果を得るまでその対応は維持さえる。例えば、第２〜第ｎ検出用区画からのそれぞれのＹ座標は、第１Ｙ座標から第ｍＹ座標までの複数が得られる。ここで、「ｍ」は「ｎ」から「１」を差し引いた整数である。
【００２０】
次にＸ座標と各Ｙ座標から、この２つの座標により定められる点と原点とを結ぶ直線を得て、この直線と正側のＸ軸とで作られる角度θを得る。例えば、図２８（ａ）は、各検出用区画から得られた検出信号を、対応するコントロール区画からのコントロール信号で減算し、当該コントロール区画からのコントロール信号で除算して得た値を、各検出区画毎に示したグラフである。グラフの最も左側のバーは第１検出用区画から得られた値であり、これはＸ座標である。その右隣のバーは第２検出用区画から得られた値でありＹ座標である。これらの座標に基づいてグラフ上にプロットした図を図２８（ｃ）に示す。まず、この点と原点とを結ぶ直線を引く。この直線と、正のＸ軸とによりなされる角度がθである。このような角度を全てのＹ軸について、Ｘ座標を使用して求める。得られる角度は、第１〜第ｎ検出用区画それぞれに対応する第１〜第ｍ角度である。「ｍ」は上述した通り、ｍ＝ｎ−１を満たす整数である。
【００２１】
得られた全ての角度、即ち、第１〜第ｍ角度を、予め定めた第１〜第ｍ角度判定基準とそれぞれ比較する。即ち、第１角度と第１角度判定基準を、第２角度と第２角度判定基準…第ｍ角度と第ｍ角度判定基準を比較する。
【００２２】
この比較は、角度、即ち、θの値と、角度判定基準の値と間の大小関係を比較する。この大小関係により陽性か陰性化を判定する。ここにおける角度は、何れも第１検出用区画からの値と、他の何れかの検出用区画との関係を示すものである。即ち、この判定は、何れも第１検出用区画の第１検出用プローブと、他の何れかの検出用区画、例えば、第ｎ検出用区画の第ｎ検出用プローブとが１対として行われる。従って、判定は、第１〜第ｍ判定まで行われる。
【００２３】
また、第１〜第ｍ判定の何れの判定も、第１検出用区画からの値がＸ座標のために常に使用されるため、Ｘ座標の基となった検出用区画、即ち、検出用プローブについての判定は、行った判定の数だけ得られてしまう。この同じ検出用プローブについて得られた複数の判定から、真の判定を得る必要がある。そのために、予め定められた陽性と陰性の優先順位に従って、更に判定を行い、問題となる検出用プローブについても陽性か陰性かの判定を行う。
【００２４】
更に、各検出区画およびコントロール区画のそれぞれを複数配置してもよい。その場合、１つの検出区画内には塩基配列の互いに同じ検出用プローブが固定化される。且つ異なる検出区画間では互いに塩基配列が異なる検出用プローブが固定される。更に、コントロール区画には、何れの検出用プローブとも塩基配列が異なるコントロール核酸、例えば、コントロールDNAが固定化される。
【００２５】
その場合使用されるチップは、例えば、
各々複数の電極からなる第１〜第ｎ検出用電極と、
前記第１〜第ｎ検出用電極に対応してそれぞれ固定され、前記第１〜第ｎ検出用電極毎に同じ塩基配列で、且つ前記第１〜第ｎ検出用電極間では互いに塩基配列が異なる各々の第１〜第ｎプローブと、
前記第１〜第ｎ検出用電極に対応して配置され、前記第１〜第ｎプローブの何れとも塩基配列が異なるコントロールDNAがそれぞれ固定された複数のコントロール電極と、
を備えればよい。この場合、各検出区画毎に検出信号について平均値が算出され、この平均値が対応する検出区画の検出信号として使用される。コントロール区画についても同様に、平均値が算出され、この平均値がコントロール区画のコントロール信号として使用される。
【００２６】
このような処理により、判定しようとする対象が、３種類以上の候補、即ち、３種類以上の塩基または塩基配列である可能性がある場合であっても、その対象が、その３種対以上の候補の何れのであるか、即ち、３種類以上の塩基または塩基配列の何れであるのかを判定することが可能となる。
【００２７】
角度判定基準の概念を表Ａに示す。
【表Ａ】
2012202899.tif 000002
【００２８】
判定基準には４成分が含まれる。上記の実施形態においては、角度判定基準を用いて判定している。角度判定基準は２つの成分、即ち、（１）角度（Ｘ軸側）と（２）角度（Ｙ軸側）の２つの基準が含まれる。表中左側の（１）を付したの斜めの線がＸ軸側の第1基準であり、（２）を付した斜めの線がＸ軸側の第２基準である。この基準よりも外側、即ち、第１基準よりもＸ軸側の領域に含まれるか、第２基準よりもＹ軸側に含まれるか、この何れかの場合陰性と判定される。（１）および（２）の２つの基準に挟まれた領域が陽性の領域である。これらの角度判定基準は角度として処理過程において数値として扱うことが可能である。
【００２９】
これらの角度判定基準との比較に加えて、更なる判定基準、即ち、Ｘ軸に平行する直線と、Ｙ軸に平行する直線により定められる座標判定基準との比較を、更に行ってもよい。これにより更により正確に判定が行われる。判定においては、Ｘ軸についてのＸ座標判定基準は「Ｘの値（即ち、Ｘ値）」として示され、Ｙ軸についてのＹ座標判定基準は「Ｙの値（即ち、Ｙ値）」として示され、処理過程においては数値として圧且つことが可能である。
【００３０】
また、座標判定基準は、例えば、ｍ個の対について判定が行われる場合には、ｍ個の対それぞれのＸ座標について、ここにＸ座標判定基準を定める。また、Ｙ軸座標についても判定の対象となるＹ座標についてそれぞれここにＹ座標評定基準を定める。
【００３１】
従って、座標判定基準と、各座標との比較は、ｍ個の対のそれぞれにおけるＸ座標及び第１Ｙ〜第ｍＹ座標を、ｍ個の対それぞれにおいて、Ｘ座標及び第１Ｙ〜第ｍＹ座標それぞれに対して予め定めた第１Ｘ〜第ｍX座標判定基準と第１Ｙ〜第ｍＹ座標判定基準とそれぞれ比較する。即ち、実施形態の方法において得られた各座標全てが、各々のために予め定められた座標判定基準と比較される。判定は、各対毎にＸ座標とＹ座標とについて各々得られた判定結果を総合して、対毎に行われる。
【００３２】
即ち、１つの対、例えば、Ｘ座標と第１Ｙ座標について、判定を行う場合には、Ｘ座標が第１Ｘ座標判定基準と比較され、且つ第１Ｙ座標が第１Ｙ座標判定基準と比較され、その何れかが座標判定基準よりも小さい場合には、この対は陰性であると判定される。
【００３３】
例えば、判定は、ｍ個の対それぞれにおいて、Ｘ座標と第１Ｙ〜第ｍＹ座標のそれぞれが、前記判定基準よりも小さい場合には、その座標に該当する前記第１〜第ｎプローブが陰性であると判定すればよい。
【００３４】
なお、角度判定基準および座標判定基準の両方と、比較対象との比較を行う場合は、角度判定を先に行い、座標判定を続いて行ってもよく、同時に行ってもよく、座標判定に続いて角度判定を行ってもよい。
【００３５】
実施形態において使用される角度判定基準および座標半的基準は、例えば、複数の既知の塩基配列のサンプル核酸の測定データの平均値と標準偏差を用いて定めればよい。
【００３６】
例えば、以下に判定基準の決定は次の工程を含む方法により行われる。
【００３７】
（１）先ず表Ｂのように既知の判定基準値を決定するためのデータをプロットする：
【表Ｂ】
2012202899.tif 000003
【００３８】
（１−１）Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１０の各ターゲットは、各々７０〜９０個のデータをプロットする。例えば、判定基準決定用に使用するＤＮＡチップは、８００チップ程度であってよいが、これに限定されない；
（１−２）Ｎｏ．１１〜Ｎｏ．２０は１０％マイナータイプを含む混合鋳型から増幅した核酸であり、この各ターゲットについて１０〜２０個のデータをプロットする。全て標準条件で取得したデータであることが好ましい；
上記の手続（１−２）におけるデータの取得は同じ条件で行えばよく、全て標準条件で取得したデータであることが好ましい。
【００３９】
（２）次に判定基準を設定する。
【００４０】
（２−１）Ｘ軸側の第１の角度判定基準を決定する；
【表Ｃ】
2012202899.tif 000004
【００４１】
（２−１−１）１０％マイナータイプを含むターゲットＮｏ．１５，１６，１７から、最も角度の小さい領域に分布するターゲットＮｏ．１６を選択する：
（２−１−２）ターゲットＮｏ．１６のについて次式；
ＳＡＸ＝（角度の平均値）−１．６５×（標準偏差）
を算出し、この値を角度（Ｘ軸側）の判定基準値（ＳＸ）とする。ここで、「１．６４５」は、正解率９５％の場合の数値である；
（２−１−３）プローブセット１が陽性、プローブセット３が陰性となるべきターゲットＮｏ．１，８から、最も角度の大きい領域に分布するターゲットＮｏ．８を選択する；
（２−１−４）ターゲットＮｏ．８のについて次式
Ａ＝（角度の平均値）＋１．６４５×（標準偏差）
を算出し、この値が、（２−１−２）で決めた判定基準値より小さいことを確認する。これにより、ターゲットＮｏ．８の正解率が９５％を超えていることが確認される。
【００４２】
（２−２）Ｙ軸側の第２の角度判定基準を決定する；
【表Ｄ】
2012202899.tif 000005
【００４３】
（２−２−１）プローブセット１が陰性、プローブセット３が陰性ターゲットＮｏ．５，７，９から、最も角度の小さい領域に分布するターゲットＮｏ．７を選択する。
【００４４】
（２−２−２）ターゲットＮｏ．７について次式；
ＳＡＹ＝（角度の平均値）−７×（標準偏差）
を算出し、この値を角度（Ｙ軸側）の判定基準値（ＳＹ）とする。ここで、「７」は、正解率９５％の場合の数値である。更に、Ｙ軸と同様に正解率についての確認を行ってもよい。
【００４５】
（２−３）Ｘ座標基準値を設定する；
【表Ｅ】
2012202899.tif 000006
【００４６】
（２−３−１）プローブセット１が陽性、プローブセット３が陰性となるべきターゲットＮｏ．１，８から、プローブセット１の値が最も小さい領域に分布するターゲットＮｏ．１を選択する；
（２−３−２）プローブセット１、３共に陰性となるべきターゲットＮｏ．２，３，４，６，１０から、他の２次元プロットにおいてプローブセット１が陽性となる可能性があるものを選択する；
（２−３−２−１）上記の選択において、選択されるべきターゲットが存在する場合には、その中からプローブセット１の値が最も大きい領域に分布する番号のターゲット（ターゲットＮｏ．Ａ）を選択して次式； 
ＳＣＸ＝｛（Ｎｏ．１の値の平均値）−（Ｎｏ．Ａの値の平均値）｝／｛（Ｎｏ．１の値の標準偏差）＋（Ｎｏ．Ａの値の標準偏差）｝×（Ｎｏ．Ａの値の標準偏差）＋（Ｎｏ．Ａの値の平均値）
からＸの値の判定基準値（ＳＣＸ）を算出する；
（２−３−２−２）そのようなターゲットが存在しない場合には、プローブセット１の値が最も小さい領域に分布するターゲットを選択する。例えば、表Ｅの例では、そのようなターゲットが存在しない。従って、Ｎｏ．２，３，４，６，１０からプローブセット１の値が最も小さい領域に分布するターゲットＮｏ．６を選択し、次式によりＸの値の判定基準値を算出する;
ＳＣＸ＝｛（Ｎｏ．１の値の平均値）−（Ｎｏ．６の値の平均値）｝／｛（Ｎｏ．１の値の標準偏差）＋（Ｎｏ．６の値の標準偏差）｝×（Ｎｏ．６の値の標準偏差）＋（Ｎｏ．６の値の平均値）
この値をＸの値の判定基準値（ＳＣＸ）とする。これにより、偽陰性、偽陽性のリスクを均等に分配する。
【００４７】
（２−４）Ｙ座標基準値を設定する；
【表Ｆ】
2012202899.tif 000007
【００４８】
（２−４−１）プローブセット１が陰性、プローブセット３が陽性となるべきターゲットＮｏ．５，７，９から、プローブセット３の値が最も小さい領域に分布するターゲットＮｏ．５を選択する；
（２−４−２）プローブセット１、３共に陰性となるべきターゲットＮｏ．２，３，４，６，１０から、他の２次元プロットにおいてプローブセット３が陽性となる可能性があるものを選択する。
【００４９】
（２−４−２−１）上記の選択において、選択されるべきターゲットが存在する場合には、その中からプローブセット３の値が最も大きい領域に分布するターゲット（ターゲットＮｏ．Ｂ）を選択して次式からＹの値の判定基準値（ＳＣＹ）を算出する。例Ｆの場合には、そのようなターゲットが存在している。即ち、Ｎｏ．４，１０からプローブセット３の値が最も大きい領域に分布するターゲットＮｏ．１０を選択し、次式；
ＳＣＹ＝｛（Ｎｏ．１の値の平均値）−（Ｎｏ．１０の値の平均値）｝／｛（Ｎｏ．１の値の標準偏差）＋（Ｎｏ．１０の値の標準偏差）｝×（Ｎｏ．１０の値の標準偏差＋Ｎｏ．１０の値の平均値）
によりＹの値の判定基準値（ＳＣＹ）を算出する；
（２−４−２−２）上記の選択において、選択されるべきターゲットが存在しない場合には、Ｎｏ．２，３，４，６，１０からプローブセット１の値が最も小さい領域に分布するターゲットＮｏ．Ｂを選択する。ターゲットＮｏ．Ｂについて次式；
ＳＣＹ＝｛（Ｎｏ．１の値の平均値）−（Ｎｏ．Ｂの値の平均値）｝／｛（Ｎｏ．１の値の標準偏差）＋（Ｎｏ．Ｂの値の標準偏差）｝×Ｎｏ．Ｂの値の標準偏差＋Ｎｏ．Ｂの値の平均値
を算出し、この値をＹの値の判定基準値とする。これにより、偽陰性、偽陽性のリスクを均等に分配する。
【００５０】
２．塩基配列判定システム
もう１つの実施態様は、上記の塩基配列判定方法を行うためのシステムである。このシステムでは、上記チップにおいて得られた信号を次のように処理するための各系を有する。
【００５１】
（１）第１〜第ｎ検出用区画を介してそれぞれ第１〜第ｎ検出信号を、コントロール電極を介してコントロール信号を、それぞれ取得する測定系；
（２）チップに、薬液を送液する送液系；
（３）前記測定系及び送液系を制御する制御機構；
（４）前記第１検出信号から前記コントロール信号を減算し、前記コントロール信号で除算した値をＸ座標とし、前記第２〜第ｎ検出信号から、前記第２〜第ｎ検出信号それぞれに対応する前記コントロール信号をそれぞれ減算し、前記第２〜第ｎ検出信号それぞれに対応する前記コントロール信号でそれぞれ除算した値を、それぞれ第１〜第ｍY座標とし（ここで、ｍはｎから１を減算した整数である）、前記第Ｘ座標と、それぞれの前記第１〜第ｍY座標とについて、原点から前記X座標およびそれぞれの第１Y〜第ｍY座標とが定めるそれぞれの点までのそれぞれの直線が正のX軸となす第１〜第ｍ角度をそれぞれ算出し、前記第１〜第ｍ角度それぞれを、前記第１〜第ｍ角度それぞれに対してそれぞれ予め定められた第１〜第ｍ角度判定基準とそれぞれ比較し、前記第１〜第ｍ角度それぞれと、前記第１〜第ｍ角度に対応する前記第１〜第ｍ角度判定基準それぞれとの大小関係により、それぞれ第１〜第ｍの判定として、前記第２〜第ｎプローブそれぞれと、前記第１プローブとを１対として、第１プローブとそれぞれの第２〜第ｎプローブとのｍ個の対について陽性または陰性を判定し、前記ｍ個の対についての第１〜第ｍの判定においてｍ個の判定結果が生じる第１プローブについて、予め定めた陽性と陰性の優先順位に従い、更に陽性または陰性を判定し、前記サンプル核酸について、第１〜第ｎプローブそれぞれの陽性または陰性を判定するように構成された型判定モジュールを含むコンピュータ。
【００５２】
また、このシステムにおいては、第１Ｘ〜第ｍX座標判定基準と第１Ｙ〜第ｍＹ座標判定基準が、それぞれ独立に設定されてもよい。
【００５３】
また実施形態では、このようなシステムにおいて、コンピュータが次のモジュールを含んでもよい；
（１）第１〜第ｎ検出信号及び前記コントロール信号をそれぞれ電流−電圧特性として取得し、当該電流−電圧特性のベースラインの傾きをそれぞれ求め、それぞれのベースラインの傾きにより、それぞれの電流−電圧特性の正常または異常を判断し、異常な検出信号を演算対象外とするように構成された電流波形判定モジュール；
（２）前記第１〜第ｎ検出信号及び前記コントロール信号に対応するそれぞれの電流−電圧特性から、それぞれのバックグラウンド電流を差し引いて、それぞれの真の検出信号をピーク電流値として取得するように構成されたピーク電流検出モジュール；
（３）前記ピーク電流検出モジュールが算出した真のピーク電流値のデータ群中から、正常グループを抽出するように構成されたグループ正常判定モジュールと；
（３）抽出された正常データから真のピーク電流値のデータ群を用いて、対象とする核酸塩基が存在するか否かを判定する有無判定モジュールまたはサンプル核酸の一塩基多型を同定するように構成された型判定モジュール。
【００５４】
３．塩基配列判定用プログラム
更なる実施形態により、上記の塩基配列判定を行うためのプログラムが提供される。実施形態の塩基配列判定用プログラムは、
（１）第１〜第ｎ検出用電極を介してそれぞれ第１〜第ｎ検出信号を、コントロール電極を介してコントロール信号を、それぞれ取得する手順；
（２）前記第１検出信号から前記コントロール信号を減算し、前記コントロール信号で除算した値をＸ座標とし、前記第２〜第ｎ検出信号から、前記第２〜第ｎ検出信号それぞれに対応する前記コントロール信号をそれぞれ減算し、前記第２〜第ｎ検出信号それぞれに対応する前記コントロール信号でそれぞれ除算した値を、それぞれ第１〜第ｍY座標とし（ここで、ｍはｎから１を減算した整数である）、更に、前記第Ｘ座標と、それぞれの前記第１〜第ｍY座標とについて、原点から前記X座標およびそれぞれの第１Y〜第ｍY座標とが定めるそれぞれの点までのそれぞれの直線が正のX軸となす第１〜第ｍ角度をそれぞれ算出する手順；および
前記第１〜第ｍ角度それぞれを、前記第１〜第ｍ角度それぞれに対してそれぞれ予め定められた第１〜第ｍ角度判定基準とそれぞれ比較する手順；
を含む処理をコンピュータに実行させ、
前記第１〜第ｍ角度判定基準が、それぞれ独立に設定され、これにより前記コンピュータに、第１〜第ｎプローブそれぞれの陽性または陰性を判断させ、更に、ｍ個の判定結果が生じる第１プローブについて、予め定めた陽性と陰性の優先順位に従い、第１プローブの陽性または陰性を判断させる。
【００５５】
次に、図面を参照して、実施形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号を付している。ただし、図面は模式的なものであり、厚みと平面寸法との関係、各層の厚みの比率等は現実のものとは異なることに留意すべきである。したがって、具体的な厚みや寸法は以下の説明を参酌して判断すべきものである。又、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。又、以下に示す実施形態は、技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、本発明の技術的思想は、構成部品の材質、形状、構造、配置等を下記のものに特定するものでない。本発明の技術的思想は、特許請求の範囲に記載された技術的範囲内において、種々の変更を加えることができる。
【００５６】
（塩基配列判定システム）
実施形態に係る塩基配列判定システムは、図７に示すように、チップカートリッジ１１と、このチップカートリッジ１１と電気的に接続される測定系１２、チップカートリッジ１１に設けられた流路とインタフェース部を介して物理的に接続される送液系１３及びチップカートリッジ１１の温度制御を行う温度制御機構１４等を備える。図７の測定系１２は、図１に示すように、対極５０２の入力に対して参照極５６１，５６２の電圧をフィードバック（負帰還）させることにより、セル内の電極や溶液などの各種条件の変動によらずに溶液中に所望の電圧を印加する３電極方式のポテンシオ・スタットであり、検出チップ２１の端子Ｃ，Ｒ，Ｗに接続されている。図１の検出チップ２１は、図７のチップカートリッジ１１に備えられている。
【００５７】
検出チップ２１は、図２に示すように、第１検出用電極である作用極５５１，第２検出用電極である作用極５５２，第３検出用電極である作用極５５４、コントロール電極である作用極５５３と、これらの作用極５５１，５５２，５５３，５５４に対する参照極５６１，５６２及び対極５０２が検出チップ上に配列された電極ユニットを用いている。即ち、測定系１２は、作用極５５１，５５２，５５３，５５４に対する参照極５６１，５６２の電圧を、ある所定の特性に設定されるように対極５０２の電圧を変化させ、挿入剤の電気化学的反応による電流（以下において「電気化学的電流」と言う。）を電気化学的に測定する。
【００５８】
実施形態に係る塩基配列判定方法は、先ず、塩基配列判定の目的とされる標的塩基配列（サンプルＤＮＡ）５８１，５８２，５８４（図９〜１１参照。）と相補的な塩基配列を有するプローブＤＮＡ５７１，５７２，５７４について、それぞれ作用極５５１，５５２，５５４に固定化させる。即ち、作用極５５１は、図９に示した塩基配列を有する標的塩基配列（サンプルＤＮＡ）５８１とは相補的な塩基配列を有するプローブＤＮＡ５７１が固定化される電極である。なお、本実施形態では、サンプルＤＮＡ，プローブＤＮＡと記載しているが、ＤＮＡ以外にＰＮＡ，ＲＮＡ等、他の核酸をサンプルもしくはプローブとして用いても良い。又、作用極５５２は、図１０に示した塩基配列を有する標的塩基配列（サンプルＤＮＡ）５８２とは相補的な塩基配列を有するプローブＤＮＡ５７２が固定化される電極である。更に、作用極５５４は、図１１に示した塩基配列を有する標的塩基配列（サンプルＤＮＡ）５８４とは相補的な塩基配列を有するプローブＤＮＡ５７４が固定化される電極である。
【００５９】
一方、作用極５５３は、標的塩基配列（サンプルＤＮＡ）５８１，５８２、５８４とは相補的関係のない塩基配列を有するプローブＤＮＡ（コントロールＤＮＡ）５７３が固定化されるコントロール電極である。これらの作用極５５１，５５２，５５３，５５４は、セル内の反応電流を検出する電極として機能する。なお、作用極５５１，５５２，５５３，５５４に固定化されるプローブＤＮＡ５７１，５７２，５７３，５７４の種類は 例示に過ぎないが、作用極５５１，５５２，５５３，５５４に固定化されるプローブＤＮＡの種類は、それぞれ異なる塩基配列を有するサンプルＤＮＡを検出するように設計されていれば良く、それぞれの作用極に固定化されるプローブの種類は単一である必要はない。
【００６０】
対極５０２は、作用極５５１，５５２，５５３，５５４との間に所定の電圧を印加してセル内に電流を供給する電極である。参照極５６１，５６２は、参照極５６１，５６２と作用極５５１，５５２，５５３，５５４との間の電圧を所定の電圧特性に制御すべく、その電極電圧を対極５０２にフィードバックさせる電極であり、これにより対極５０２による電圧が制御され、セル内の各種検出条件に左右されない精度の高い電気化学的電流の検出が行える。
【００６１】
図１に示すように、実施形態に係る塩基配列判定システムの測定系１２は、電極間を流れる電流を検出するための電圧パターンを発生させる電圧パターン発生回路５１０を備え、この電圧パターン発生回路５１０は、配線５１２ｂを介して参照極５６１，５６２の参照電圧制御用の反転増幅器５１２（ＯＰｃ）の反転入力端子に接続されている。電圧パターン発生回路５１０は、図７に示す制御機構１５から入力されるデジタル信号をアナログ信号に変換して電圧パターンを発生させる回路であり、ＤＡ変換器を備える。配線５１２ｂには抵抗Ｒｓが接続されている。反転増幅器５１２の非反転入力端子は接地され、出力端子には配線５０２ａが接続されている。反転増幅器５１２の反転入力端子側の配線５１２ｂと出力端子側の配線５０２ａは配線５１２ａで接続されている。この配線５１２ａには、フィードバック抵抗Ｒff及びスイッチＳＷfからなる保護回路５００が設けられている。線５０２ａは検出チップ２１の端子Ｃに接続されている。端子Ｃは、検出チップ２１上の対極５０２に接続されている。対極５０２が複数設けられている場合には、各々に対して並列に端子Ｃが接続される。これにより、１つの電圧パターンにより複数の対極５０２に同時に電圧を印加することができる。線５０２ａには、端子Ｃへの電圧印加のオンオフ制御を行うスイッチＳＷ０が設けられている。
【００６２】
反転増幅器５１２に設けられた保護回路５００により、対極５０２に過剰な電圧がかからないような構成となっている。したがって、測定時に過剰な電圧が印加され、溶液が電気分解されてしまうことにより、所望の挿入剤の電気化学的電流の検出に影響を及ぼすことがなく、安定した測定が可能となる。
【００６３】
検出チップ２１の端子Ｒは、配線５０３ａにより電圧フォロア増幅器（ＯＰr）５１３の非反転入力端子に接続されている。電圧フォロア増幅器５１３の反転入力端子は、その出力端子に接続された配線５１３ｂと配線５１３ａにより短絡している。配線５１３ｂには抵抗Ｒfが設けられており、配線５１２ｂの抵抗と、配線５１２ａと配線５１２ｂの交点との間に接続されている。これにより、電圧パターン発生回路５１０により生成される電圧パターンに、参照極５６１，５６２の電圧をフィードバックさせた電圧を反転増幅器５１２に入力させ、そのような電圧を反転増幅した出力に基づき対極５０２の電圧を制御する。
【００６４】
検出チップ２１の端子Ｗは、配線５０１ａによりトランス・インピーダンス増幅器（ＯＰw）５１１の反転入力端子に接続されている。トランス・インピーダンス増幅器５１１の非反転入力端子は接地され、その出力端子に接続された配線５１１ｂと配線５０１ａとは配線５１１ａにより接続されている。配線５１１ａには抵抗Ｒwが設けられている。このトランス・インピーダンス増幅器５１１の出力側の端子Ｏの電圧をＶw、電流をＩwとすると：
Ｖw＝Ｉw・Ｒw ……（１）
となる。この端子Ｏから得られる電気化学信号は、図７に示す制御機構１５に出力される。作用極５５１，５５２，５５３，５５４は複数あるため、端子Ｗ及び端子Ｏは、作用極５５１，５５２，５５３，５５４のそれぞれに対応して複数設けられる。複数の端子Ｏからの出力は後述する信号切替部により切り替えられ、ＡＤ変換されることにより各作用極５５１，５５２，５５３，５５４からの電気化学信号をデジタル値としてほぼ同時に取得することができる。なお、端子Ｗ及び端子Ｏの間のトランス・インピーダンス増幅器５１１などの回路は、複数の作用極５５１，５５２，５５３，５５４で共有しても良い。この場合、配線５０１ａに複数の端子Ｗからの配線を切り替えるための信号切替部を備えれば良い。 
図７の塩基配列判定システムを構成するチップカートリッジ１１は、図４及び５に示すように、カセット上蓋７１１、カセット下蓋７１２、パッキン７１３（シール部材）及び基板７１４からなるカセットを構成している。カセット上蓋７１１及びカセット下蓋７１２の内表面同士を対向させ、かつこれらカセット上蓋７１１及びカセット下蓋７１２の間にパッキン７１３及び基板７１４を狭んだ状態で固定している。カセット上蓋７１１の外表面から内表面にかけて、断面が略円形のノズル差込孔７２２及び７２３が貫通して形成されている。このノズル差込孔７２２及び７２３の内径は、送入及び送出ポート７５２，７５３、及び図６のバルブユニット７０５のノズル７０７，７０８、の外径よりも若干大きく設定されており、例えば３．２ｍｍ程度である。図４に示すように、カセット上蓋７１１の外表面から内表面にかけて断面が略長方形の電気コネクタ用ポート７２４及び７２５が貫通して形成されている。この電気コネクタ用ポート７２４及び７２５の各々には、後述する電気コネクタが挿着され使用される。更に、外表面には内表面にかけてシール検出孔７２６が貫通して形成されている。このシール検出孔７２６は、シールの有無の検出に用いられる。即ち、カセット（検出チップ）２１の外表面のシール検出孔７２６の表面から電気コネクタ用ポート７２４及び７２５の表面にかけてシールが貼付された状態で、カセット（検出チップ）２１へ薬液（試料）を注入し、カセット（検出チップ）２１に薬液（試料）を注入した後にシールが剥がすが、そのシールの有無の検出する。カセット（検出チップ）２１に、シールが貼付された状態で、薬液（試料）を注入することにより、たとえ薬液（試料）溶液が誤って電気コネクタポート７２４若しくは７２５上に滴下しても、シールで被覆されているため、実際のポート７２４若しくは７２５内には液が侵入することがなく、電気的に短絡してしまう等の不具合を発生させる心配を生じないようにしている。 
図５に示すように、カセット上蓋７１１の内表面側には、所定の深さでかつ基板７１４の断面形状とほぼ同じ断面形状を有する基板位置決め溝が設けられており、この基板位置決め溝の周囲は内表面で囲まれている。基板位置決め溝はノズル差込孔７２２及び７２３、電気コネクタ用ポート７２４及び７２５にオーバーラップして形成されている。基板位置決め溝にあわせて基板７１４をはめ込むことにより、基板７１４をカセット上蓋７１１に位置決め配置することができる。基板位置決め溝の深さは基板７１４の厚さとほぼ同じになるように形成されている。
【００６５】
図５に示すように、カセット上蓋７１１の内表面側で基板位置決め溝にオーバーラップして、基板位置決め溝よりも更に深いパッキン位置決め溝が設けられており、このパッキン位置決め溝の周囲は基板位置決め溝で囲まれている。パッキン位置決め溝はノズル差込孔７２２及び７２３にオーバーラップして形成されている。パッキン位置決め溝にあわせてパッキン７１３をはめ込むことにより、パッキン７１３をカセット上蓋７１１に位置決め配置することができる。パッキン位置決め溝の基板位置決め溝に対する深さは後述するパッキン７１３の厚さとほぼ同じになるように形成されている。したがって、パッキン位置決め溝の内表面に対する深さは、パッキン７１３の厚さに基板７１４の厚さを加算した厚さとほぼ同じになるように形成されている。
【００６６】
カセット上蓋７１１の内表面の周縁部には４つのねじ孔７２７ａ、７２７ｂ、７２７ｃ及び７２７ｄが設けられている。これらねじ孔７２７ａ〜７２７ｄにより、カセット上蓋７１１とカセット下蓋７１２をねじ止めできる。カセット上蓋７１１の内表面の周縁部には２つのカセット位置決め孔７２８ａ及び７２８ｂが設けられている。このカセット位置決め孔７２８ａ及び７２８ｂを、スライドステージの上に設けられた２つの位置決め用ピンにあわせてカセット（検出チップ）２１を配置することにより、スライドステージに対してカセット（検出チップ）２１を位置決め配置することができる。
【００６７】
又、外表面にはシール検出孔７４６が貫通して形成されている。又、カセット下蓋７１２のシール検出孔７４６は、カセット上蓋７１１とカセット下蓋７１２が止着された状態で、カセット上蓋７１１のシール検出孔７２６と通じる位置に形成されている。これにより、カセット上蓋７１１とカセット下蓋７１２が止着された際に、カセット上蓋７１１からカセット下蓋７１２にかけて貫通したシール検出孔７２６が設けられ、このシール検出孔７２６に対して検出光を照射することにより、シールの有無を判別できる。
【００６８】
カセット下蓋７１２の外表面の周縁部には４つのねじ孔７４７ａ、７４７ｂ、７４７ｃ及び７４７ｄが設けられている。これらねじ孔７４７ａ〜７４７ｄとカセット上蓋７１１に設けられた対応するねじ孔７２７ａ〜７２７ｄの各々をねじ止めすることにより、カセット下蓋７１２をカセット上蓋７１１に止着することができる。カセット下蓋７１２の外表面の周縁部には、２つのカセット位置決め孔７４８ａ及び７４８ｂが設けられている。このカセット位置決め孔７４８ａ及び７４８ｂには、カセット上蓋７１１のカセット位置決め孔７２８ａ及び７２８ｂがそれぞれ貫通する。スライドステージに対するカセット（検出チップ）２１の位置決めは、スライドステージの上に設けられた２つの位置決め用ピンと、カセット下蓋７１２のカセット位置決め孔７４８ａ及び７４８ｂを貫通しているカセット上蓋７１１の２つの位置決め孔７２８ａ及び７２８ｂによって規定される構成になっている。カセット下蓋７１２には、更にカセット種類判別用孔７４９が設けられ、このカセット種類判別用孔７４９の有無により、カセット（検出チップ）２１の種類を判別できる。なお、種類判別は、カセット種類判別用ピン（図示省略）の押し下げの有無により自動で行うことができる。カセット種類判別用ピン（図示省略）のピンの押し下げ状態は、制御機構１５で検知される。
【００６９】
なお、カセット種類判別用孔７４９が設けられていないカセット（検出チップ）２１を用いても、判別されるカセット（検出チップ）２１の種類が異なるのみで同様の測定が可能である。若しくは、カセット（検出チップ）２１の種類が異なることを表示部（図示省略）に制御機構１５が表示させて警告して、測定段階に進まないように設計しておくこともできる。或いは、カセット種類判別用ピン（図示省略）は固定された固定ピンを用いて、カセット種類判別用孔７４９が設けられていないカセット（検出チップ）２１は装着できないようにすることにより、誤ったカセット（検出チップ）２１をセットしないようにすることもできる。 パッキン７１３は、ほぼ長方形で所定の厚さを有し、その４隅が切欠いて形成された板状部分と、この板状部分の主面上であって長辺の両端近傍に位置し、かつ短辺の中央近傍に設けられた円筒形状の送入ポート７５２及び送出ポート７５３からなる。送入ポート７５２及び送出ポート７５３の先端には開口部が設けられている。この開口部から板状部分にかけて、送入ポート７５２及び送出ポート７５３の軸心には、板状部分の主面に対して垂直な方向に流路が設けられている。板状部分の裏面には、図５に示すように、送入ポート７５２の形成位置から送出ポート７５３の形成位置にかけて折れ曲がり形状の溝が形成されている。溝は、流路を構成している。溝は、複数回交互に進行するように形成され、溝の折り返し地点を所定の曲率のカーブとすることにより、折り返し地点のコーナーなどが設けられた場合に発生する薬液やエアの滞留を抑制できる。
【００７０】
図４に示すように、基板７１４の主面には、電極ユニット７６１、パッド７６２及び７６３が形成されている。電極ユニット７６１は、図２に示すように、対極５０２、作用極５５１，５５２，５５３，５５４及び参照極５６１，５６２の組合せからなる３電極系のユニットである。電極ユニット７６１の作用極５５１，５５２，５５３，５５４にはプローブＤＮＡ５７１，５７２，５７３，５７４が固定化される。電極ユニット７６１とパッド７６２、電極ユニット７６１とパッド７６３は、図示しない配線により接続されている。図４では、基板７１４に対して、プローブＤＮＡが固定されている電極ユニット７６１と、パッド７６２及び７６３が同一面上に形成させている場合を例示しているが、パッド７６２及び７６３が、基板７１４の電極ユニット７６１が形成された面に対して反対側の面に形成されている場合には、バルブユニット７０５はカセット（検出チップ）２１に対して上側に、そしてプローブユニット７１０は下側に設置されることになる。その場合には、必然的に、バルブユニット７０５とプローブユニット７１０は一体的に形成される訳ではなくなる。
【００７１】
電極ユニット７６１の配列は、パッキン配置位置でかつ折れ曲がり形状の流路形成位置にあわせて形成されている。これにより、パッキン７１３と基板７１４がカセット上蓋７１１及びカセット下蓋７１２に位置決めされた状態で狭着固定された際には、折れ曲がり形状の溝と基板７１４表面により折れ曲がり形状の流路が形成され、かつその流路表面には電極ユニット７６１が露出した構成となる。即ち、電極ユニット７６１上は、折れ曲がり形状の溝により間隙が設けられ、この間隙により折れ曲がり形状の流路が形成される。又、この状態では、パッキン７１３と基板７１４とはシールが保持される。 
先ず、カセット上蓋７１１の内表面のパッキン位置決め溝にあわせて、かつノズル差込孔７２２及び７２３に送入ポート７５２及び送出ポート７５３が挿通するように、パッキン７１３をパッキン位置決め溝に嵌挿する。次に、基板７１４を、その主面、即ち電極ユニット７６１、パッド７６２及び７６３が形成された面がカセット上蓋７１１側に向くように、基板位置決め溝に位置決め配置する。次に、カセット下蓋７１２を、その内表面７４２がカセット上蓋７１１側に向くように、又ねじ孔７４７ａ〜７４７ｄ及びねじ孔７２７ａ〜７２７ｄの位置が対応するようにカセット上蓋７１１上に載置する。そして、ねじ孔７４７ａ〜７４７ｄ及びねじ孔７２７ａ〜７２７ｄにねじ７７０ａ〜７７０ｄを螺挿する。これにより、カセット上蓋７１１及びカセット下蓋７１２が螺着され、かつカセット上蓋７１１及びカセット下蓋７１２間にはパッキン７１３及び基板７１４が狭着固定され、カセット（検出チップ）２１が完成する。この完成した状態では、ノズル差込孔７２２からノズル差込孔７２３にかけて、折れ曲がり形状の流路が形成される。
【００７２】
図４及び５では、ねじ止めによりカセット上蓋７１１及びカセット下蓋７１２を固定する例を示したが、これに限定されない。例えば凹凸の部材を用いた係着手法を用いても良い。図６は、実施形態に係る塩基配列判定システムを構成する送液系１３に備えられバルブユニット７０５の全体構成を示す図である。なお、図６では、プローブユニットの構成は省略して記載してあるが、バルブユニット７０５にはプローブユニットが一体的に形成され、バルブユニット・プローブユニット駆動機構によりこれらバルブユニット及びプローブユニットが同時に駆動される。例えばガラスエポキシ基板などからなるプローブユニットに、２つの電気コネクタが所定の間隔をおいて配置される。電気コネクタの先端には、複数の凸状電極が基板７１４上のパッドと同じ配列によりマトリクス状に配置されており、これら各凸状電極が図４に示した基板７１４上のパッド７６２，７６３と接触することにより、基板７１４とプローブユニットとの電気的接続が確保される。又、電気コネクタ内には配線が設けられており、各凸状電極と制御機構１５がこの配線により電気的に接続される。
【００７３】
バルブユニット・プローブユニット駆動機構は制御機構１５からの指示により駆動する。バルブユニット・プローブユニット駆動機構は、昇降方向の駆動方向を有する。これにより、スライドステージ側のカセット（検出チップ）２１の上部に対してノズル７０７、７０８及び電気コネクタ７０３が降下することにより、図６に示すように、ノズル７０７及び７０８がノズル差込孔７２２及び７２３に位置決めされ、かつ電気コネクタ７０３が電気コネクタ用ポート７２４及び７２５に位置決めされる。これにより、送液系とカセット（検出チップ）２１内の流路が連通する。又、電気コネクタがカセット（検出チップ）２１のパッドに位置決めされ、パッドと電気コネクタが電気的に接続される。
【００７４】
バルブユニット７０５は、バルブボディ７８１が連結固定して用いられる。バルブボディ７８１には２方電磁弁４０３、３方電磁弁４１３、４２３及び４３３が設けられており、又バルブボディ７８２には３方電磁弁４４１及び４４５が設けられている。バルブボディ７８１は、例えばＰＥＥＫ樹脂により作製される。なお、バルブボディ７８１が別個に作製され、その両者をつなぎ合わせる場合には、その継ぎ目部分には例えばＰＴＦＥをパッキンとして使用する。したがって、バルブボディ７８１の両者では、薬液に接する部分の材質はＰＥＥＫ及びＰＴＦＥからなる。又、バルブボディ７８１にはほぼ一定の断面形状の空洞が設けられている。この空洞は、後述する各電磁弁の間やパッキン７１３等との間を接続する配管として機能する。又、バルブボディ７８２に設けられた空洞には、ノズル７０７及びノズル７０８が連通している。これらノズル７０７及びノズル７０８はＰＥＥＫ樹脂からなる。
【００７５】
３方電磁弁４１３は、エアと純水を切り換えて下流側の３方電磁弁４２３に供給する。３方電磁弁４２３は、バッファと３方電磁弁４１３からのエア又は純水を切り換えて下流側の３方電磁弁４３３に供給する。３方電磁弁４３３は挿入剤と３方電磁弁４２３からのエア、純水又はバッファを切り換えて下流側のバルブボディ７８２に供給する。３方電磁弁４４１は、バルブボディ７８１からのエア又は薬液のノズル７０７への供給又はバイパス配管を介した３方電磁弁４４５への供給を切り換える。３方電磁弁４４５は、３方電磁弁４４１からのエア又は薬液の供給又はカセット（検出チップ）２１からのノズル７０８を介した薬液又はエアの送出を切り換える。
【００７６】
図６に示すバルブユニット７０５において、カセット（検出チップ）２１内にバッファを送液するためには、３方電磁弁４２３、４４１、４４５、及び送液ポンプ４５４をＯＮにすれば良い。これにより、バッファが吸い上げられ、薬液はノズル７０７側に切り替わり、ノズル７０７からカセット（検出チップ）２１へ、更にカセット（検出チップ）２１からノズル７０８に吸い出され、３方電磁弁４４５を経由して廃液することができる。カセット（検出チップ）２１内に純水を送液するためには、３方電磁弁４２３にかえて３方電磁弁４１３をＯＮにすれば良い。カセット（検出チップ）２１内に挿入剤を送液するためには、３方電磁弁４２３にかえて３方電磁弁４３３をＯＮにすれば良い。カセット（検出チップ）２１内にエアを供給するためには、３方電磁弁４０３をＯＮにし、３方電磁弁４１３，４２３及び４３３のいずれもＯＦＦにすれば良い。バルブユニット７０５のバルブボディ７８１内に設けられた空洞部分の配管の内部容量は、バルブ内容量を含めても１００μＬ程度である。本実施形態とは異なり各３方弁をチューブで接続して同じフローを構成する場合には、５００μＬ程度の内部容量が必要であるが、これと比較すると大幅に試薬量を節減することができる。更に、バルブユニット７０５とカセット（検出チップ）２１間の内部容量も、本実施形態とは異なる例では１００μＬ以上あるが、本実施形態では１０μＬと大幅に低減できる。この様な構造により、試薬切換え後に、更に不本意にカセット（検出チップ）２１内を流れる溶液若しくは空気の量を大幅に減らすことができる。その結果、反応及び測定のバラつきを低減し、結果の再現性も大幅に向上する。
【００７７】
又、図示していない、薬液揺動装置を備えており、チップカセット内の薬液揺動を行うことができる。薬液の揺動は、（１）サンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーション工程、（２）洗浄工程、（３）挿入剤供給工程などで行うのが有効である。（１）のハイブリダイゼーション工程でサンプルＤＮＡを揺動させることにより、ハイブリダイゼーション効率を向上させ、ハイブリダイゼーション時間を短縮させることができる。又、（２）洗浄工程でバッファ液を揺動させることにより、非特異吸着ＤＮＡを引き剥がす効率を向上させることにより、洗浄時間を短縮させることができる。又、（３）挿入剤供給工程で挿入剤を揺動させることにより、挿入剤の濃度の均一性を向上させ、又挿入剤の吸着均一性も向上させることにより、信号のバラつき、Ｓ／Ｎ比を改善することができる。これら（１）〜（３）のすべての工程に薬液揺動工程を適用しても、一部の工程に適用しても、薬液揺動の効果が得られる。 
冒頭で、一部言及したが、実施形態に係る塩基配列判定システムは、図７に示すように、測定ユニット１０と、測定ユニット１０に接続された制御機構１５と、制御機構１５に接続されたコンピュータ１６とを備える。測定ユニット１０は、チップカートリッジ１１と、このチップカートリッジ１１と電気的に接続される測定系１２、チップカートリッジ１１に設けられた流路とインタフェース部を介して物理的に接続される送液系１３及びチップカートリッジ１１の温度制御を行う温度制御機構１４等を備える。
【００７８】
図７に示したコンピュータ１６は、図８に示すように、操作者からのデータや命令などの入力を受け付ける入力装置３０４と、各プローブの陽性または陰性を判定する中央処理装置（ＣＰＵ）３００と、判定結果を出力する出力装置３０５及び表示装置３０６と、塩基配列の判定に必要な所定のデータなどを格納したデータ記憶部（図示省略）と、塩基配列判定プログラムなどを格納したプログラム記憶部（図示省略）とを備える。 
ＣＰＵ３００は、ノイズ除去モジュール３０１，電流波形判定モジュール３０２，ピーク電流検出モジュール３１０，グループ正常判定モジュール３２０，検査有効性判定モジュール３２５、有無判定モジュール３３０及び型判定モジュール３４０を備える。
【００７９】
ノイズ除去モジュール３０１は、図２に示した第１検出用電極５５１，第２検出用電極５５２，第３検出用電極５５４，コントロール電極５５３を介して測定される電流から、「単純移動平均法」を用いて平準化（スムージング）により、ノイズを除去する。スムージングは、例えば、図１５に示すような、単純移動平均法を用いれば良い。「単純移動平均法」は文字通り、いくつかの実績値を単純平均するものであり、図１５（ａ）に示すような時系列データを、その規則性に着目して平均するものである。図１５では、移動平均値の区間をｍ＝５として、それぞれのデータの後５点のデータを５で割った数値：
y[n]=(x[n]+x[n+1]+x[n+2]+x[n+3]+x[n+4])/5 ……（２）
が、図１５（ｂ）に示す移動平均値となる。移動平均により、図１５（ａ）に示すような変動が図１５（ｂ）に示すように平準化（スムージング）され、全体的な傾向を分析するが容易になる。 
電流波形判定モジュール３０２は、図１６のフローチャートに示した手順に従って、図２に示した第１検出用電極５５１，第２検出用電極５５２，第３検出用電極５５４，コントロール電極５５３を介してそれぞれ測定された電流波形（電流−電圧特性）のベースラインの傾きをそれぞれ求め、それぞれのベースラインの傾きにより、それぞれの検出信号（電流波形）の正常・異常を判定し、異常な検出信号を演算対象外とする。 
ピーク電流検出モジュール３１０は、電圧値算出部３１１，ベースライン近似部３１２，ピーク電流値演算部３１３を備え、図１８及び図１９のフローチャートに示した手順に従い、第１検出用電極５５１，第２検出用電極５５２，第３検出用電極５５４，コントロール電極５５３を介して測定される電流（検出信号）から、バックグラウンド電流を差し引いて、挿入剤５９１に起因する真の電気化学的電流（真の検出信号）のピーク値（ピーク電流値）を求める。
【００８０】
電圧値算出部３１１は、図１８のステップＳ２２１〜Ｓ２２３に示す手順に従い、チップカートリッジ１１で測定された電気化学的電流の電流（ｉ）−電圧（ｖ）特性の波形を電圧値（ｖ）に対して微分演算し、予め定めた下限値Ｖ１〜上限値Ｖ２の範囲において、微分値（ｄｉ／ｄｖ）が「ゼロクロス」する点の電圧値Ｖpk1と電流値Ｉpk1を、各電極ユニット７６１のそれぞれの電流−電圧特性に対して算出する（図２０参照。）。「ゼロクロス」する点とは、電気化学的電流の微分値（ｄｉ／ｄｖ）が正値から負値に変化する点、又は負値から正値に変化する点であり、電流ピークを与える電圧値Ｖpk1及び電流値Ｉpk1に対応する。図２０には、電圧値の増大に伴い、微分値（ｄｉ／ｄｖ）が負値から正値に変化する点の電圧値Ｖpk1と電流値Ｉpk1が示されている。「ゼロクロス点」は、ノイズによる影響やピーク検出範囲（下限値Ｖ１〜上限値Ｖ２）設定による悪影響を受けないために、負値から正値に転じて連続３点が正値を保持している場合の最初に正値となった点の電圧値を、電圧値Ｖpk1として採用するのが好ましい。
【００８１】
ベースライン近似部３１２は、図１８のステップＳ２２４〜図１９のＳ２２８に示す手順に従い、電気化学的電流の電流−電圧特性のベースライン（バックグラウンド）を、各電極ユニット７６１のそれぞれの電流−電圧特性に対して近似する（図２１及び図２２参照。）。ピーク電流値演算部３１３は、図１９に示すステップＳ２２９〜Ｓ２３０の手順に従い、電気化学的電流の電流−電圧特性曲線における真のピーク電流値Ｉpk2を、電圧値算出部３１１が算出したゼロクロス電流値Ｉpk1からベースライン近似部３１２が算出したバックグラウンド（ベースライン）の電流値Ｉbgを差し引いて求める。
【００８２】
グループ正常判定モジュール３２０は、図２５のフローチャートに示す一連の手順を用いて、ピーク電流検出モジュール３１０が算出した真の電気化学的電流（真の検出信号）のピーク値（ピーク電流値）のデータ群中から、異常データを除外し、データ群がその後の型判定を行うに相応しいデータ群であるかどうかを判定する。即ち、グループ正常判定モジュール３２０は、図４に示す基板７１４上に複数配列される電極ユニット７６１にそれぞれ含まれる複数の第１検出用電極５５１，第２検出用電極５５２，第３検出用電極５５４，コントロール電極５５３からそれぞれ得られる一群の電流値Ｉpk2のデータから、所定の基準を満たさないデータを異常値として排除し（歯抜け異常判定Ｓ３１）、又グループ単位で所定の基準を満たさない場合にはそのグループを異常として、その後の判定モジュールでの演算対象外とする（バラツキ異常判定Ｓ３２）。 
検査有効性判定モジュール３２５は、図３２に示すフローチャートに示す一連の手順に従い、検査が有効であるかどうかを判定する。即ち、図４に示す基板７１４上に複数配列される電極ユニット７６１にそれぞれ含まれる複数のポジティブ・コントロール用電極（作用極）から検出されるポジティブ・コントロール電流と、ネガティブ・コントロール用電極（作用極）から検出されるネガティブ・コントロール電流とを所定の基準値と大小関係比較を行い、ネガティブ・コントロール電流が所定の基準よりも小さく、ポジティブ・コントロール電流が所定の基準よりも大きい場合に、当該検査が有効である、との判断を行い、その後の判定モジュールでの演算に移行する。
【００８３】
型判定モジュール３４０は、作用極５５１、５５２、５５４から得られる信号が陽性であるか陰性であるかを判定する。詳細は、後述する。
【００８４】
図８に示したように、ＣＰＵ３００には、バス３０３を介して、波形判定用電圧範囲記憶部３５１，傾き許容範囲記憶部３５２，ピーク探索電圧値範囲記憶部３５３，ゼロクロス値記憶部３５４，変曲点記憶部３５５，交点電圧記憶部３５６，オフセット電圧記憶部３５７，ベースライン電流値記憶部３５８，平均値・標準偏差記憶部３６０，グループ正常判定記憶部３６１，ＳＬＬ記憶部３６２，ＥＳＬＬ記憶部３６３，ＭＩＲ記憶部３６４，規格化座標記憶部３６５、直線長記憶部３６６、角度記憶部３６７、角度パラメータ記憶部３６８，及び分類結果記憶部３６９が接続されている。
【００８５】
波形判定用電圧範囲記憶部３５１は、電流波形判定モジュール３０２が、第１検出用電極５５１，第２検出用電極５５２，第３検出用電極５５４，コントロール電極５５３を介して測定される電流（検出信号）のベースラインの傾きを計算する範囲としての「範囲下限電圧ＶＬｏ」と「範囲上限電圧ＶＨｉ（ＶＬｏ ＜ ＶＨｉ）」を記憶する。傾き許容範囲記憶部３５２は、電流波形判定モジュール３０２が、検出信号のベースラインの傾きの許容範囲を規定するパラメータとしての「傾き下限値（Coef Lo）」と「傾き上限値（Coef Hi）」を記憶する。
【００８６】
ピーク探索電圧値範囲記憶部３５３は、予め決定されたピーク探索電圧値範囲［Ｖ１，Ｖ２］を設定パラメータとして格納しておき、電圧値算出部３１１がピーク探索電圧値範囲［Ｖ１，Ｖ２］を読み出し可能にしている。電気化学的電流の電流−電圧特性が示す電流ピークは、測定条件を固定すればほぼ一定の電圧範囲に現れるので、ピーク探索電圧値範囲［Ｖ１，Ｖ２］を設定パラメータとして決めておくのである。ゼロクロス値記憶部３５４は、電圧値算出部３１１が算出した「ゼロクロス値（ゼロクロス電圧値Ｖpk1，ゼロクロス電流値Ｉpk1）」を、図４に示した基板７１４上の、すべての電極ユニット７６１毎に整理して格納する。
【００８７】
変曲点記憶部３５５は、ベースライン近似部３１２の演算に必要な変曲点電圧Ｖifpを記憶する。「変曲点電圧Ｖifp」は、図２１に示すように、電流ピークを与えるゼロクロス電圧値Ｖpk1から電圧を負の方向に遡って（電圧を減少させて）微分値が最小となる電圧である。交点電圧記憶部３５６は、交点電圧Ｖcrsを記憶する。「交点電圧Ｖcrs」とは、図２２に示すように、電気化学的電流の電流−電圧特性曲線とこの電流−電圧特性曲線の接線との交点が与える電圧である。オフセット電圧記憶部３５７は、図２２のように、交点電圧Ｖcrsを起点として、設定パラメータとして規定されるオフセット値だけ電圧を負の方向に遡った（電圧を減少させた）オフセット電圧Ｖofsを記憶する。
【００８８】
ベースライン電流値記憶部３５８は、ピーク電流値演算部３１３の演算に必要なバックグラウンド（ベースライン）の電流値Ｉbgを記憶する。「バックグラウンド（ベースライン）の電流値Ｉbg」とは、図２２に示すように、ベースライン近似部３１２が算出したベースラインの近似一次式に、電圧値算出部３１１が算出したゼロクロス電圧値Ｖpk1を代入して得られる電流値である。
【００８９】
平均値・標準偏差記憶部３６０は、グループ正常判定モジュール３２０、検査有効性判定モジュール３２５、有無判定モジュール３３０、及び型判定モジュール３４０が、それぞれ算出した算出したポジティブ・コントロール電極５４の電流値の平均値Ｘｐ、ネガティブ・コントロール電極５５の電流値の平均値Ｘｎ、有無検出用電極５５０の電流値の平均値Ｘ、有無検出用電極５５０に対応するコントロール電極（Ｃ）５５３の電流の平均値Ｘｃ、第１検出用電極５５１の電流の平均値Ｘ1，第２検出用電極５５１に対応するコントロール電極（Ｃ１）５５３の電流の平均値Ｘc1，第２検出用電極５５２の電流の平均値Ｘ2，第２検出用電極５５２に対応するコントロール（Ｃ２）電極５５３の電流の平均値Ｘc2、第３検出用電極５５４の電流の平均値Ｘ3，第３検出用電極５５４に対応するコントロール電極（Ｃ１）５５３の電流の平均値Ｘc3，ポジティブ・コントロール電極５４の電流値の標準偏差σｐ、ネガティブ・コントロール電極５５の電流値の標準偏差σｎ、有無検出用電極５５０からのピーク電流値の標準偏差σ、対応するコントロール電極５３からのピーク電流値の標準偏差σc、第1検出用電極５５１からのピーク電流値の標準偏差σ1、対応するコントロール電極５５３からのピーク電流値の標準偏差σc１、第２検出用電極５５２からのピーク電流値の標準偏差σ2、第３検出用電極５５４からのピーク電流値の標準偏差σ3、対応するコントロール電極５５３からのピーク電流値の標準偏差σc２、等を記憶する。これらの平均値Ｘ、Ｘｐ，Ｘｎ、Ｘ1，Ｘc1，Ｘ2，Ｘc2，Ｘ3，Ｘc3や標準偏差σ、σp、σn、σ1，σc１，σ2，σc２等は、グループ正常判定モジュール３２０、検査有効性判定モジュール３２５、有無判定モジュール３３０、及び型判定モジュール３４０の演算の要請に応じて随時読み出される。
【００９０】
グループ正常判定記憶部３６１は、グループ正常判定モジュール３２０において演算された歯抜けデータ数Ｎｒ、ＣＶ値ＣＶ及び、グループ正常判定モジュール３２０の演算に必要な歯抜け電流基準値ＭＳ(Minimum Signal)、歯抜け許容割合Ｐ、基準ＣＶ値ＣＶ０（％）等を記憶する。「ＣＶ（変動係数）値」とは、対象とする一群のデータの標準偏差を対応する平均値で除した値を１００倍して百分率表示したものである。分散や変動は標本の単位を持っているので、複数の標本群間のバラツキの程度を比較できないので、それぞれの平均値で割って無名数としたものである。ＳＬＬ記憶部３６２は、検査有効性判定モジュール３２５の演算に必要なネガティブ・コントロール基準値ＮＣＬＬ(Negative Control Lower Limit)，ＮＣＵＬ(Negative Control Upper Limit)，ポジティブ・コントロール基準値ＰＣＬＬ(Positive Control Lower Limit)、有無判定モジュール３３０の演算に必要な信号増加量判定基準ＳＬ（＋）、ＳＬ（−）を記憶している。信号判定基準ＳＬＬ(Signal Limit Level)記憶部３６２に記憶されている各パラメータは、信号の絶対値若しくは、コントロール電極５５３に対する信号増加量の判定アルゴリズムの判定基準を与える設定パラメータである。ＥＳＬＬ記憶部３６３は、検査有効性判定モジュール３２５の演算に必要なポジティブ・コントロール実効変動係数ＰＥＳＬ、有無判定モジュール３３０の演算に必要な実効変動係数ＥＳＬＬを記憶している。ポジティブ・コントロール実効変動係数ＰＥＳＬ(Positive Control Effective Signal Lower Limit)及び実効変動係数ＥＳＬＬ(Effective Signal Lower Limit)は、信号増加量が標準偏差σに対して何倍あるかの判定の下限を与える設定パラメータである。即ち、信号増加の信頼性を表す指標となる。
【００９１】
ＭＩＲ記憶部３６４は、型判定モジュール３４０の演算に必要な電流増加割合基準値ＭＩＲを記憶している。電流増加割合基準値ＭＩＲ(Minimum Increase Ratio)は型判定で必要な電流増加量のコントロール電流値に対する比の下限を与える設定パラメータである。図３１に示した判定基準となる種々の設定パラメータを示す概念イメージにおいては、原点からの距離としてＭＩＲが記載されている。これは、第１検出用電極５５１の電流の平均値Ｘ1の第１検出用電極５５１に対応するコントロール電極（Ｃ１）５５３の電流の平均値Ｘc1からの増加量、第２検出用電極５５２の電流の平均値Ｘ2の第２検出用電極５５２に対応するコントロール（Ｃ２）電極５５３の電流の平均値Ｘc2、及び第３検出用電極５５４の電流の平均値Ｘ3の第３検出用電極５５４に対応するコントロール（Ｃ３）電極５５４の電流の平均値Ｘc2、からの増加量が、小さい場合（Ｘの値、Ｙの値が共に基準値よりも小さい場合）には、システムとして期待される電流値が得られておらず、型判定を行うに値しない（判定不能）、ということを意味している。
【００９２】
角度パラメータ記憶部３６８は、型判定モジュール３４０の演算に必要な角度判定基準および座標判定基準を記憶している。図３の判定基準となる種々の設定パラメータを示す概念イメージにおいて、網かけ部分の領域に検出用プローブ信号が含まれる場合には、陽性と判断され、それ以外の部分の領域に検出用プローブ信号が含まれる場合には、陰性と判断される。
【００９３】
分類結果記憶部３６９は、有無判定モジュール３３０及び型判定モジュール３４０が分類した種々の分類結果を記憶している。
【００９４】
図示を省略しているが、ＣＰＵ３００には、バス３０３を介してとインタフェースが接続され、このインタフェースを介してローカルバス（図示省略）を通じて図７に示す制御機構１５との間でデータの送受信を行うことができる。
【００９５】
図８において、入力装置３０４はキーボード、マウス、ライトペン又はフレキシブルディスク装置などで構成される。入力装置３０４より塩基配列判定実行者は、入出力データを指定したり、設定パラメータや許容誤差の値及び誤差の程度を設定できる。更に、入力装置３０４より出力データの形態等を設定することも可能で、又、演算の実行や中止等の指示の入力も可能である。又、出力装置３０５及び表示装置３０６は、例えば、それぞれプリンタ装置及びディスプレイ装置等により構成されることが可能である。表示装置３０６は入出力データや判定結果や判定パラメータ等を表示する。データ記憶部（図示省略）は入出力データや判定パラメータ及びその履歴や演算途中のデータ等を記憶する。
【００９６】
以上説明したように、実施形態に係る塩基配列システムによれば、核酸の存在の有無判定、塩基配列の判定および塩基配列の判定結果と対応するコドンとに基づいくアミノ酸判定を、高い精度で、実態に即してできる。
【００９７】
（塩基配列判定方法）
図１４に示すフローチャートを用いて、実施形態に係る塩基配列判定方法を説明する。なお、以下に述べる塩基配列判定方法は、一例であり、この変形例を含めて、これ以外の種々の塩基配列判定方法により、実現可能であることは勿論であるが、いずれにせよ、図３に示すようなプローブＤＮＡ５７１，５７２，５７３，５７４が固定化されたチップカートリッジ１１にサンプルＤＮＡ５８１，５８２，５８３，５８４を含む薬液（試料）を注入してハイブリダイゼーション反応などを生じさせ、バッファによる洗浄、挿入剤の導入による電気化学反応を経て測定系１２を用いて図１３に示すような電気化学的電流の電流−電圧特性を求めることが基礎となる。電気化学的電流の電流−電圧特性から、各プローブＤＮＡ５７１，５７２，５７３，５７４のハイブリダイゼーション反応に定量的に対応するピーク電流値を算出する。そして算出されたピーク電流値を統計的にデータ処理し、これにより核酸の存在の有無を判定し、或いは塩基配列の判定および塩基配列の判定結果と対応するコドンとに基づいくアミノ酸判定をする。
【００９８】
図９〜図１１を用いて、プローブＤＮＡとサンプルＤＮＡとのハイブリダイゼーションについて説明する。ハイブリダイゼーション工程は、図４及び図５に示したチップカートリッジ１１を用いれば良い。
【００９９】
図９では、サンプルＤＮＡ５８１が標的塩基配列である場合を示す。図９（ａ）に示すように、プローブＤＮＡ５７１が固定化された作用極（第１検出用電極）５５１は、標的塩基配列５８１と配列が完全にマッチングしているので２本鎖を形成する。しかし、１塩基でも配列が異なると２本鎖を形成しないので、図９（ｂ）に示すように、プローブＤＮＡ５７２が固定化された作用極（第２検出用電極）５５２は、標的塩基配列５８１とは、２本鎖を形成できない。更に、図９（ｄ）に示すように、プローブ５７４が固定化された作用極（第３検出用電極）５５４は、標的塩基配列５８１と２本鎖を形成できない。又、完全に配列が異なれば、当然に２本鎖を形成できないので、図９（ｃ）に示すように、プローブＤＮＡ（コントロールＤＮＡ）５７３が固定化された作用極（コントロール電極）５５３は、標的塩基配列５８１とは、２本鎖を形成できない。
【０１００】
図１０では、サンプルＤＮＡ５８２が標的塩基配列である場合を示す。同様に、チップカートリッジ１１によるハイブリダイゼーション工程により、図１０（ｂ）に示すように、プローブＤＮＡ５７２が固定化された作用極（第２検出用電極）５５２は、標的塩基配列５８２と配列が完全にマッチングしているので２本鎖を形成する。しかし、１塩基でも配列が異なると２本鎖を形成しないので、図１０（ａ）に示すように、プローブＤＮＡ５７１が固定化された作用極（第１検出用電極）５５１は、標的塩基配列５８２とは、２本鎖を形成できない。更に、図１０（ｄ）に示すように、プローブ５７４が固定化された作用極（第３検出用電極）５５４は、標的塩基配列５８１と２本鎖を形成できない。又、完全に配列が異なれば、当然に２本鎖を形成できないので、図１０（ｃ）に示すように、塩基配列ＣＡＧＴＧ……を有するプローブＤＮＡ（コントロールＤＮＡ）５７３が固定化された作用極（コントロール電極）５５３は、標的塩基配列５８２とは、２本鎖を形成できない。
【０１０１】
図１１では、第１の検出用核酸と第２の検出用核酸に対して、サンプルＤＮＡ５８３がハイブリダイズする場合を示す。
【０１０２】
図４及び図５に示した構成とは異なる場合、即ち基板（チップ）上に平面状のパッキンを搭載し、カセット（チップカートリッジ）内に流路を形成する構成をとる場合には、カセット（検出チップ）２１内の流路が長くなり、不必要な試薬量が多くなる。又、カセット（検出チップ）２１に薬液（試料）を注入する場合には、流路が基板上のみならずカセット（検出チップ）２１内にも長く存在するため、基板以外の不要な部分に薬液（試料）が流れ込み、無駄となってしまう。又、パッキンに対するカセット（検出チップ）２１の密着性が難しく、パッキンとカセット（検出チップ）２１との間でリークが生じてしまい、送液の不具合が発生することが多い。本実施形態のような構成により、不必要な試薬量が少なくなり、又パッキン、基板及びカセット（検出チップ）２１の密着性が高くなり、送液の安定性が増す。
【０１０３】
図１２は、前述の図９と同様に、標的塩基配列（サンプルＤＮＡ）５８１を用いて、ハイブリダイゼーションした各作用極５５１，５５２，５５３、５５４に、挿入剤５９１を導入した状態を示す。図１２（ａ）に示すように、プローブＤＮＡ５７１が固定化された作用極（第１検出用電極）５５１は、標的塩基配列（サンプルＤＮＡ）５８１と配列が完全にマッチングし、２本鎖を形成しているので、２本鎖ＤＮＡに挿入剤５９１が結合する。しかし、図１２（ｂ）および（ｄ）に示すように、プローブＤＮＡ５７２が固定化された作用極（第２検出用電極）５５２およびは、プローブＤＮＡ５７４が固定化された作用極（第３検出用電極）５５４は、標的塩基配列（サンプルＤＮＡ）５８１と２本鎖を形成できないので、挿入剤５９１が結合できない。又、図１２（ｃ）に示すように、プローブＤＮＡ（コントロールＤＮＡ）５７３が固定化された作用極（コントロール電極）５５３には、標的塩基配列（サンプルＤＮＡ）５８１とは、２本鎖を形成できないので、挿入剤５９１が結合できない。
【０１０４】
図１３は、各作用極５５１，５５２，５５３上に固定化されたプローブＤＮＡ５７１，５７２，５７３，５７４にハイブリダイゼーションした２本鎖ＤＮＡに結合した挿入剤５９１からの電気化学的電流、又は２本鎖ＤＮＡに挿入剤５９１が結合できなかった場合の電流と電圧との関係を示す図である。図１３の曲線（ａ）は、図１２（ａ）に対応する。即ち、曲線（ａ）は、プローブＤＮＡ５７１と標的塩基配列（サンプルＤＮＡ）５８１と配列が完全にマッチングし、２本鎖を形成し、この２本鎖ＤＮＡに挿入剤５９１が結合した場合の電気化学的電流の電流−電圧特性であり、大きな電流値のピークを示す。しかし、図１２の曲線（ｂ）は、図１２（ｂ）に対応し、プローブＤＮＡ５７２と標的塩基配列（サンプルＤＮＡ）５８１とが２本鎖を形成できず、挿入剤５９１が結合できない場合の電流−電圧特性であり、曲線（ａ）に比して小さな電流値のピークを示す。又、図１３の曲線（ｃ）は、図１２（ｃ）に対応し、コントロールＤＮＡ５７３と標的塩基配列（サンプルＤＮＡ）５８１とが２本鎖を形成できず、挿入剤５９１が結合できない場合の電流−電圧特性であり、曲線（ｂ）に比して、更に小さな電流値のピークを示す。図１３（ｂ）、（ｃ）で見られる小さな電流値ピークは、図１２（ｂ）、（ｃ）で示したように、電極５５２、５５３表面にわずかに吸着した挿入剤５９１起因の電流である。電極５５４も電極５５２、５５３表面にわずかに吸着した挿入剤５９１起因の電流を生じる。
【０１０５】
前置きが長くなったが、図１４に示すフローチャートを用いて、実施形態に係る塩基配列判定方法を説明する：
（イ）先ず、チップカートリッジ１１にサンプルＤＮＡを含む薬液（試料）を注入してハイブリダイゼーション反応などを生じさせ、挿入剤の導入による電気化学反応による電流−電圧特性を測定系１２を用いて、各電極毎に測定する。図４に基板７１４上に多数の電極ユニット７６１を模式的に示したが、この多数の電極ユニット７６１に対応して、プローブＤＮＡ５７１，５７２，５７３がそれぞれ固定化される第１検出用電極５５１，第2検出用電極５５２，コントロール電極５５３は、等価な電極として多数存在し、それに対応して多数のデータが取得される。ステップＳ１０１において、ノイズ除去モジュール３０１が、プローブＤＮＡ５７１，５７２，５７３が固定化された各電極毎に、測定された一群のデータのそれぞれを、平準化（スムージング）により、ノイズを除去する。スムージングは、既に説明したように、図１５に示すような、単純移動平均法を用いれば良い。 以降の処理は、すべて平準化処理後のデータに対して演算を行う。
【０１０６】
（ロ）次に、ステップＳ１０２において、電流波形判定モジュール３０２が、各電極毎に測定された電流波形（電流−電圧特性）のベースラインの傾きをそれぞれ求め、それぞれのベースラインの傾きにより、それぞれの検出信号（電流波形）の正常・異常を判定し、異常な検出信号を演算対象外とする。ステップＳ１０２における電流波形判定モジュール３０２の処理の詳細は、図１６のフローチャートを用いて後述する。
【０１０７】
（ハ）次に、ステップＳ１０３において、ピーク電流検出モジュール３１０が、各電極毎に測定された検出信号のピーク値（ピーク電流値）をそれぞれ検出する。ステップＳ１０３におけるピーク電流検出モジュール３１０の処理の詳細は、図１８及び図１９のフローチャートを用いて後述するが、ステップＳ１０３における処理で、図１２に示したような挿入剤５９１からの電気化学的電流から、これ以外のバックグラウンド電流を差し引いて、真の検出信号のピーク値（ピーク電流値）が、等価な各電極毎に、それぞれ一群のデータとして求められる。
【０１０８】
（ニ）ステップＳ１０３でのバックグラウンド電流成分の除去後、一群のデータのそれぞれに、ステップＳ１０４における信号処理がなされる。即ち、ステップＳ１０４において、グループ正常判定モジュール３２０が、一群のデータが正常であるか否かを判定する。ステップＳ１０４におけるグループ正常判定モジュール３２０の処理の詳細は、図２５のフローチャートを用いて後述する。
【０１０９】
（ホ）その後、ステップＳ１０５において、検査有効性判定モジュール３２５が、検査が有効であるか無効であるかを判定する。検査有効性判定モジュール３２５の処理の詳細は、図３２のフローチャートを用いて後述する。
【０１１０】
（ヘ）次に、ステップＳ１０６において、有無判定モジュール３３０が、核酸の存在の有無を判定、又は型判定モジュール３４０が、核酸の一塩基多型（ＳＮＰ）の型判定を行う。ステップＳ１０６における有無判定モジュール３３０及び型判定モジュール３４０のそれぞれ処理の詳細は、図２６〜図２８のフローチャートを用いて後述する。
【０１１１】
図１４に示すフローチャートに示す実施形態に係る塩基配列判定方法によれば、チップカートリッジ１１や測定系１２に異常があった場合や、データにバラつきがあった場合等でも、それらの異常なデータを除外して、正確にある核酸が存在するかどうか、ＳＮＰの型が、どの型であるか、又、それがホモ型であるか、ヘテロ型であるか、を判断できる。以下具体的に、図１４に示すフローチャートの各ステップを説明する。
【０１１２】
［ステップＳ１０２：電流波形の正常・異常の判定］
図１の測定系１２が測定したチップカートリッジ１１における電気化学的電流の信号（電流波形）は、特徴的に、図１７に示したような電流−電圧特性の波形をとる。電気信を発生する物質（挿入剤）に特有の電圧において、図１７に示したようなピーク形状を有する電流−電圧特性の波形を持っている。図１７では、データ１とデータ２の２種類の電流−電圧特性を示しているが、データ１の電流−電圧特性が示すベースラインの傾きに比して、データ２の電流−電圧特性が示すベースラインの傾きの方が大きく、データ２の電流−電圧特性では、ピーク形状が不明確で肩（ショルダー）的な変化を示している。
【０１１３】
理想的には、電気化学的電流の電流−電圧特性は、ピーク電流を発生する電圧以下ではほぼ「零」の電流値となる。ところが、基板７１４に何らかの不具合が生じた場合には、しばしば、データ２のように、ベースラインが傾いた電流−電圧特性となる。データ２のような場合には、ピーク電流値を正しく検出することができないため、図１４のステップＳ１０２において、「異常」として排除する必要がある。
【０１１４】
ステップＳ１０２における電流波形判定モジュール３０２の処理の詳細は、図１６のフローチャートに示す通りであり：
(ａ)先ず、ステップＳ２０１において、各電極毎に測定された電流波形（電流−電圧特性）のベースラインの傾きを計算する範囲を抽出し、設定する。この範囲の抽出では、設定パラメータとして、範囲下限電圧ＶＬｏと範囲上限電圧ＶＨｉ（ＶＬｏ ＜ ＶＨｉ）を入力装置３０４を用いて設定し、波形判定用電圧範囲記憶部３５１に格納する。更に、ベースラインの傾きの許容範囲を規定するパラメータとして「傾き下限値（Coef Lo）」と「傾き上限値（Coef Hi）」を設定し、傾き許容範囲記憶部３５２に格納する。
【０１１５】
(ｂ)次に、ステップＳ２０２において、電流波形判定モジュール３０２は、波形判定用電圧範囲記憶部３５１に格納された範囲下限電圧ＶＬｏ及び範囲上限電圧ＶＨｉとを読み出し、この設定範囲で、ベースラインの傾きの近似式を導出する。範囲下限電圧ＶＬｏ及び範囲上限電圧ＶＨｉは、ベースラインの傾きを算出するための領域を規定するパラメータであり、範囲下限電圧ＶＬｏと範囲上限電圧ＶＨｉとの間の電圧値で、各電極毎に測定された電流−電圧特性の波形に対して最小二乗近似によって、直線（ベースライン）を近似する。
【０１１６】
(ｃ)次に、ステップＳ２０３において、電流波形判定モジュール３０２は、各電極毎に測定された電流波形（電流−電圧特性）のそれぞれについて、範囲下限電圧ＶＬｏ及び範囲上限電圧ＶＨｉを読み出し、それぞれ開始点及び終了点とし、これらの開始点及び終了点を、ステップＳ２０２において導出した近似式に代入し、各電極毎に測定された電流波形（電流−電圧特性）のベースラインの傾き（ｂ）を算出する。
【０１１７】
(ｄ)次に、ステップＳ２０４において、電流波形判定モジュール３０２は、傾き許容範囲記憶部３５２から、「傾き下限値（Coef Lo）」と「傾き上限値（Coef Hi）」を読み出し、ステップＳ２０３において、各電極毎に算出したベースラインの傾き（ｂ）が、「傾き下限値（Coef Lo）」と「傾き上限値（Coef Hi）」の間に存在するか、それぞれ判定する。
【０１１８】
(e)ステップＳ２０４において、特定の電極で測定された電流波形（電流−電圧特性）のベースラインの傾き（ｂ）が、「傾き下限値（Coef Lo）」と「傾き上限値（Coef Hi）」の間に存在すれば、「正常波形」と判断して、図１４のステップＳ１０３に進む。ステップＳ２０４において、特定の電極で測定された電流波形（電流−電圧特性）が、「傾き下限値（Coef Lo）」と「傾き上限値（Coef Hi）」の範囲外であると判断された場合には、その電極で測定された電流波形（電流−電圧特性）は、「異常波形」であると判断して、ステップＳ２０５において、電流波形判定モジュール３０２は、その電極で測定された電流波形（電流−電圧特性）に対し「エラー判定」を下し、適宜、表示装置３０６及び出力装置３０５に出力させる。
【０１１９】
図１４に示したステップＳ１０３の手順は、図４に示した基板７１４上の、すべての電極ユニット７６１について実施される。
【０１２０】
［ステップＳ１０３：ピーク電流値の検出］
ステップＳ１０３におけるピーク電流検出モジュール３１０の処理の詳細を、図１８及び図１９のフローチャートを用いて説明する。ステップＳ１０３において、測定系１２が測定したそれぞれの電極ユニット７６１による電流−電圧特性の波形から、それぞれの正味のピーク電流値を検出する段階（ステップ）は、ステップＳ２２１〜Ｓ２２３における電流ピークを与える電圧値を算出する段階（図２０参照。）；ステップＳ２２４〜Ｓ２２８におけるベースラインを近似する段階（図２１及び図２２参照。）；及びステップＳ２２９〜Ｓ２３０におけるピーク電流値を算出する段階（図２３参照。）を、各電極ユニット７６１のそれぞれの電流−電圧特性に対して実行する手順からなる：
（ａ）チップカートリッジ１１で測定された電気化学的電流の電流−電圧特性が示す電流ピークは、ほぼ一定の電圧範囲に現れる。このため、ステップＳ２２１においては、図８に示した入力装置３０４を用い、予め、ピーク探索電圧値範囲［Ｖ１，Ｖ２］を設定パラメータとしてピーク探索電圧値範囲記憶部３５３に格納しておく。即ち、図２０に示すように、電気化学的電流のピーク電流探索は、下限値Ｖ１〜上限値Ｖ２の範囲で行う。先ず、ステップＳ２２２において、ピーク電流検出モジュール３１０の電圧値算出部３１１は、電気化学的電流の電流（ｉ）−電圧（ｖ）特性の波形を電圧値（ｖ）に対して微分演算する。そして、ステップＳ２２３において、電圧値算出部３１１は、下限値Ｖ１〜上限値Ｖ２の範囲において、電気化学的電流の微分値（ｄｉ／ｄｖ）が「ゼロクロス」する点の電圧値Ｖpk1と電流値Ｉpk1を算出する（図２０参照。）。「ゼロクロス」する点とは、電気化学的電流の微分値（ｄｉ／ｄｖ）が正値から負値に変化する点、又は負値から正値に変化する点であり、電流ピークを与える電圧値Ｖpk1及び電流値Ｉpk1に対応する。図２０には、電圧値の増大に伴い、微分値（ｄｉ／ｄｖ）が負値から正値に変化する点の電圧値Ｖpk1と電流値Ｉpk1が示されている。「ゼロクロス値」は、ノイズによる影響やピーク検出範囲（下限値Ｖ１〜上限値Ｖ２）設定による悪影響を受けないために、負値から正値に転じて連続３点が正値を保持している場合の最初に正値となった点の電圧値を、電圧値Ｖpk1として採用する。ステップＳ２２３において算出された「ゼロクロス値（ゼロクロス電圧値Ｖpk1，ゼロクロス電流値Ｉpk1）」は、ゼロクロス値記憶部３５４に、図４に示した基板７１４上の、すべての電極ユニット７６１毎に整理して、格納する。
【０１２１】
（ｂ）ステップＳ２２４において、ピーク電流検出モジュール３１０のベースライン近似部３１２は、電流ピークを与えるゼロクロス電圧値Ｖpk1から電圧を負の方向に遡って（電圧を減少させて）、図２１に示すように、微分値が最小となる電圧を変曲点電圧Ｖifpとする。変曲点電圧Ｖifpは、変曲点記憶部３５５に格納する。そして、ベースライン近似部３１２は、ゼロクロス電圧値Ｖpk1と変曲点電圧Ｖifpをゼロクロス値記憶部３５４及び変曲点記憶部３５５からそれぞれ読み出し、ステップＳ２２５において、電流−電圧特性曲線への接線の起点を求めるための一次式：
y = ax+b ……（３）
を、ゼロクロス電圧値Ｖpk1と変曲点電圧Ｖifpの間で求める。例えば、ゼロクロス電圧値Ｖpk1と変曲点電圧Ｖifpの間における電流−電圧特性の波形データを、最小二乗法により式（３）のように直線近似する。図２１に示す例では、一次式の係数ａ＝-1.397×10-10、定数b=3.396×10-8と求められ、図２２に示す例では、一次式の係数ａ＝-2.899×10-11、定数b=4.504×10-9と求められる。更に、ベースライン近似部３１２はステップＳ２２６において、電流−電圧特性の波形と式（３）の近似直線との交点を与える交点電圧Ｖcrsを図２２に示すように求め、この交点電圧Ｖcrsを交点電圧記憶部３５６に格納する。そして、ベースライン近似部３１２はステップＳ２２７において、交点電圧Ｖcrsを起点として、設定パラメータとして規定しているオフセット値だけ電圧を負の方向に遡った（電圧を減少させた）オフセット電圧Ｖofsを、図２２のように求める。求められたオフセット電圧Ｖofsは、オフセット電圧記憶部３５７に格納する。更に、ベースライン近似部３１２は、オフセット電圧Ｖofsをオフセット電圧記憶部３５７から、交点電圧Ｖcrsを交点電圧記憶部３５６からそれぞれ読み出し、ステップＳ２２８において、オフセット電圧Ｖofsと交点電圧Ｖcrsの間の電流−電圧特性の波形データのバックグラウンドの接線（ベースライン）となる近似一次式を最小二乗法により、図２３に示すように求める。この近似一次式は、式（３）と同様な形式で表現可能で、図２３に示す直線近似では、一次式の係数ａ＝-6.072×10-12、定数b=-5.902×10-9と求められる。
【０１２２】
（ｃ）この後、ピーク電流検出モジュール３１０のピーク電流値演算部３１３は、ゼロクロス電圧値Ｖpk1をゼロクロス値記憶部３５４から読み出す。そして、ステップＳ２２９において、ピーク電流値演算部３１３は、ステップＳ２２８で求めたベースラインの近似一次式に、ゼロクロス電圧値Ｖpk1を代入し、バックグラウンド（ベースライン）の電流値Ｉbgを求める。バックグラウンド（ベースライン）の電流値Ｉbgは、ベースライン電流値記憶部３５８に格納する。更に、ピーク電流値演算部３１３は、電流−電圧特性の波形のピークを示すゼロクロス電流値Ｉpk1を、ゼロクロス値記憶部３５４から読み出し、ステップＳ２３０において、ゼロクロス電流値Ｉpk1から、バックグラウンド（ベースライン）の電流値Ｉbgを、式（４）に示すように差し引く：
Ｉpk2 =abs(Ｉpk1−Ｉbg) ……（４）
式（４）を各電極ユニット７６１のそれぞれの第１検出用電極（ＳＮＰ="Ｇ"検出用電極）５５１，第2検出用電極（ＳＮＰ="Ｔ"検出用電極）５５２，コントロール電極５５３のそれぞれの電流−電圧特性に対して適用することにより、各電極ユニット７６１のそれぞれの電極５５１，５５２，５５３から、それぞれ真の電流値Ｉpk2が算出される。
【０１２３】
［ステップＳ１０４：グループ正常判定］
以上説明したように、図１４のステップＳ１０３では、ピーク電流検出モジュール３１０が、測定系１２が測定した各電極ユニット７６１によるそれぞれの電流−電圧特性のピークを示すゼロクロス電流値Ｉpk1から、バックグラウンド（ベースライン）の電流値Ｉbgを差し引いて、各電極ユニット７６１のそれぞれの第１検出用電極（ＳＮＰ="Ｇ"検出用電極）５５１，第2検出用電極（ＳＮＰ="Ｔ"検出用電極）５５２，コントロール電極５５３毎に、それぞれの正味の電流値Ｉpk2が、種々の判定モードで算出され、分類される。
【０１２４】
しかし、例えば、複数の同等の検出用電極５５１の内１電極だけ、異常に大きい値、若しくは小さい値の場合、複数の同等の第２検出用電極５５２の内１電極だけ、異常に大きい値、若しくは小さい値を示す場合は、それら異常値を除外しないと、判定アルゴリズムに混乱を生じさせる。即ち、図４に示すように、基板７１４上に複数配列した同等の電極ユニット７６１から得られるピーク電流値Ｉpk2をそのまま、すべて用いて、図１４のステップＳ１０６の処理、つまり、塩基配列判定する場合に、問題が生じてしまう場合がある。
【０１２５】
そこで、図１４のステップＳ１０４では、ステップＳ１０５に進む前に、グループ正常判定モジュール３２０が、図４に示す基板７１４上に複数配列される電極ユニット７６１によって定義されるすべての電極から得られる電流値Ｉpk2に対し、図２５に示すフローチャートの手順をグループ単位で実施する。図２５に示すフローチャートでは、ステップＳ３１において、図２４（ａ）に示すような歯抜け異常を判定し、その後ステップＳ３２において、図２４（ｂ）に示すようなバラツキ異常を判定する。ステップＳ３１における歯抜け異常の判定、及びステップＳ３２におけるバラツキ異常の判定は、以下に示すような所定の基準で、グループ単位でその後の判定処理に値するかどうかの有効性を判断する：
（ａ）ステップＳ３０１では、グループ正常判定モジュール３２０において、ステップＳ３１における歯抜け判定を行うかどうかの選択を行う。歯抜け判定を行う場合には、ステップＳ３１のステップＳ３０２に進む。歯抜け判定を行わない場合には、バラツキ異常を判定するステップＳ３２のステップＳ３０５に進む。
【０１２６】
（ｂ）ステップＳ３０２において、歯抜けデータ数をカウントするため、歯抜けデータ数Ｎｒの初期値として「０」をセットして、次のステップＳ３０３に進む。
【０１２７】
（ｃ）ステップＳ３０３において、グループ正常判定記憶部３６１に格納されている歯抜け電流基準値ＭＳを読み出し、各電流値Ｉpk2に対して、歯抜け電流基準値ＭＳとの大小関係を比較する。歯抜け電流基準値ＭＳ以上であれば、歯抜けではないと判断して、次のステップＳ３０４に進む。歯抜け電流基準値ＭＳよりも小さい場合には、当該データは歯抜けデータと判断し、ステップＳ３１１において、「判定対象外」とするエラーセットとする。更に、ステップＳ３１２において、歯抜けデータ数Ｎｒをカウントアップし、ステップＳ３０３に戻る。グループ内のすべてのデータに対して、このルーチンを繰り返し、最終的なグループ内の歯抜けデータ数をカウントする。ステップＳ３０３において、歯抜けでないと判断されたデータは判定対象データとする。
【０１２８】
（ｄ）ステップＳ３０４では、グループ正常判定記憶部３６１に格納されている歯抜け許容割合Ｐを読み出し、積算された歯抜けデータ数Ｎｒと、グループに割り当てられている電極数Ｎ０をＰで除算して値との大小関係を比較する。歯抜けデータ数Ｎｒが、Ｎ０／Ｐよりも小さければ、バラツキ異常を判定するステップＳ３２のステップＳ３０５に進む。歯抜けデータ数Ｎｒが、Ｎ０／Ｐ以上である場合には、当該グループは、「歯抜け多数」につき、型判定には値しないと判断し、「グループ異常」と判定する。
【０１２９】
（ｅ）ステップＳ３０５において、判定対象データグループの電流値Ｉpk2の平均値が「零」でないか否かの判定を行い、「零」の場合には、ステップＳ３１４において、「グループ異常」と判定する。ここで、歯抜け判定を行っている場合には、平均値が「零」になることはないはずであるが、ステップＳ３０１において、歯抜け判定を行わない場合には、ステップＳ３０５において、「グループ異常」と判定される場合が生じる。「零」でない場合には、次のステップＳ３０６に進む。
【０１３０】
（ｆ）ステップＳ３０６では、判定対象データの電流値Ｉpk2の平均値及び標準偏差を算出し、標準偏差を平均値で除算して、ＣＶ値を求め、次のステップＳ３０７に進む。
【０１３１】
（ｇ）ステップＳ３０７で、グループ正常判定記憶部３６１から設定パラメータとして規定した基準ＣＶ値ＣＶ０と比較し、基準ＣＶ値ＣＶ０よりも小さい場合には、次のステップＳ３０８で当該グループは正常であると判定し、更に、図１４のフローチャートのステップＳ１０５の検査有効性判定へと進む。基準ＣＶ値ＣＶ０以上の場合には、図２５のフローチャートのステップＳ３１５において、当該グループは、「グループ異常」と判定する。
【０１３２】
以上のルーチンをすべてのグループについて繰り返すことにより、グループが正常かどうかの判定を行う。
【０１３３】
グループ正常判定モジュール３２０は、電極から得られる電流値Ｉpk2に対し演算対象外の際に「グループ異常判定」を下し、適宜、表示装置３０６及び出力装置３０５に出力させる。これ以降のステップにおいては、すべて、真の電流値Ｉpk2に対する演算であるため、特に断らない限り、「真の電流値Ｉpk2」を単に「電流値」として記述することにする。又、基本的には、判定対象データのみを、今後の演算対象とする（歯抜けデータは除いて処理する）。
【０１３４】
［ステップＳ１０５：検査有効性判定］
ステップＳ１０５における検査有効性判定モジュール３２５の処理の詳細を、図３２のフローチャートを用いて説明する。ここでは、図４に示す基板７１４上に複数配列される電極ユニット７６１にそれぞれ含まれる複数のポジティブ・コントロール用電極５４，ネガティブ・コントロール用電極５５からそれぞれ得られる一群の電流値Ｉpk2のデータについて判定を行う。
【０１３５】
（ａ）ステップＳ４０１では、先ず、検査有効性判定において、ネガティブ・コントロールでの判定を行うかどうかの選択を行う。ネガティブ・コントロールでの判定を行わない場合には、ステップＳ４３５において、検査有効性判定は「有効」として、本処理を終了する。ネガティブ・コントロールでの判定を行う場合には、次のステップＳ４０２に進む。
【０１３６】
（ｂ）ステップＳ４０２では、ネガティブ・コントロール用電極５５からそれぞれ得られる一群の電流値Ｉpk2のデータが、図１４のフローチャートのステップＳ１０４におけるグループ正常判定において、「正常」と判定されていた場合には、次のステップＳ４４３に進む。図１４のフローチャートのステップＳ１０４におけるグループ正常判定において、「グループ異常」と判定された場合には、ステップＳ４４１において、「判定不能(N.D.５２)」を、表示装置３０６及び出力装置３０５に出力させる。
【０１３７】
（ｃ）ステップＳ４４３では、ネガティブ・コントロール用電極５５からそれぞれ得られる一群の電流値Ｉpk2の平均値Ｘｎ、及び標準偏差σｎをそれぞれ計算し、平均値・標準偏差記憶部３６０に格納する。
【０１３８】
（ｄ）ステップＳ４０３では、ＳＬＬ記憶部３６２から格納されている設定パラメータネガティブ・コントロール判定上限値ＮＣＵＬ、ネガティブ・コントロール判定下限値ＮＣＬＬを、平均値・標準偏差記憶部３６０からは、ステップＳ４４３で算出したネガティブ・コントロール電流の平均値Ｘｎを読み出し、設定パラメータネガティブ・コントロール判定上限値ＮＣＵＬ、ネガティブ・コントロール判定下限値ＮＣＬＬとネガティブ・コントロール電流値の平均値Ｘｎとの大小関係を比較する。ネガティブ・コントロール電流値の平均値Ｘｎが、判定下限値ＮＣＬＬ以上、判定上限値ＮＣＵＬ以下である場合には、ステップＳ４０４において、ネガティブ・コントロールは妥当とみなして、次のステップＳ４０５に進む。ネガティブ・コントロール電流値の平均値Ｘｎが、判定下限値ＮＣＬＬと判定上限値ＮＣＵＬの範囲から逸脱している場合には、ステップＳ４２１において、ネガティブ・コントロール異常として、ステップＳ４２２に進む（図２４（ｃ）は、ネガティブ・コントロール電流値の平均値が、上限値ＮＣＵＬを超えてしまった場合を概念的に示している。）。
【０１３９】
（ｅ）ステップＳ４０５では、ポジティブ・コントロール判定を行うかどうか選択を行う。ポジティブ・コントロールでの判定を行わない場合には、ステップＳ４１２において、検査有効性判定は「検査有効」として、本処理を終了する。ポジティブ・コントロールでの判定を行う場合には、次のステップＳ４０６に進む。
【０１４０】
（ｆ）ステップＳ４０６では、ネガティブ・コントロールに対して、ステップＳ４０２において行ったと同様に、ポジティブ・コントロールに対して行う。図１４のフローチャートのステップＳ１０４におけるグループ正常判定において、「正常」と判定されていた場合には、次のステップＳ４４４に進む。図１４のフローチャートのステップＳ１０４におけるグループ正常判定において、「グループ異常」と判定された場合には、ステップＳ４４２において「判定不能(N.D.５１)」とし、分類結果記憶部３６９に判定結果を分類して格納し、表示装置３０６及び出力装置３０５に出力させる。
【０１４１】
（ｇ）ステップＳ４４４では、ポジティブ・コントロール用電極５４からそれぞれ得られる一群の電流値Ｉpk2の平均値Ｘｐ、及び標準偏差σｐをそれぞれ計算し、平均値・標準偏差記憶部３６０に格納する。
【０１４２】
（ｈ）ステップＳ４０７では、ＳＬＬ記憶部３６２から格納されている設定パラメータポジティブ・コントロール判定下限値ＰＣＬＬ及びポジティブ・コントロール実効変動係数ＰＥＳＬを、平均値・標準偏差記憶部３６０からは、ステップＳ４４３で算出したネガティブ・コントロール電流の平均値Ｘｎ及び標準偏差σｎ、ステップＳ４４４で算出したポジティブ・コントロール電流の平均値Ｘｐ及び標準偏差σｐを読み出す。ポジティブ・コントロール電流値の平均値Ｘｐからネガティブ・コントロール電流値の平均値Ｘｎを減算した値とポジティブ・コントロール判定下限値ＰＣＬＬと大小関係を比較する。更に、ポジティブ・コントロール電流値平均値Ｘｐから、ポジティブ・コントロール電流の標準偏差σｐにポジティブ・コントロール実効変動係数ＰＥＳＬを乗算した値を減算した値と、ネガティブ・コントロール電流値平均値Ｘｎに、ネガティブ・コントロール電流の標準偏差σｎにポジティブ・コントロール実効変動係数ＰＥＳＬを乗算した値を加算した値を比較する。ポジティブ・コントロール電流値の平均値Ｘｐからネガティブ・コントロール電流値の平均値Ｘｎを減算した値が、ポジティブ・コントロール判定下限値ＰＣＬＬ以上でかつ、ポジティブ・コントロール電流値平均値Ｘｐから、ポジティブ・コントロール電流の標準偏差σｐにポジティブ・コントロール実効変動係数ＰＥＳＬを乗算した値を減算した値がネガティブ・コントロール電流値平均値Ｘｎに、ネガティブ・コントロール電流の標準偏差σｎにポジティブ・コントロール実効変動係数ＰＥＳＬを乗算した値を加算した値以上である場合（ステップＳ４０８）には、ステップＳ４０９において、「検査有効」と判定し、処理を終了する。いずれか一方でも満たさない場合（ステップＳ４１０）には、ステップＳ４１１において、「検査無効」と判断する。
【０１４３】
（ｉ）ステップＳ４０３で、ネガティブ・コントロール電流値の平均値が、図２４（ｃ）に示すように、判定下限値ＮＣＬＬと判定上限値ＮＣＵＬの範囲から逸脱している場合には、ステップＳ４２１でネガティブ・コントロール異常として、ステップＳ４２２に進む。ステップＳ４２２では、ステップＳ４０６と同様にポジティブ・コントロール判定を行うかどうか選択を行う。ポジティブ・コントロールでの判定を行わない場合には、ステップＳ４３４において検査有効性判定は「検査無効」として、本処理を終了する。ポジティブ・コントロールでの判定を行う場合には、次のステップＳ４２３に進む。
【０１４４】
（ｊ）ステップＳ４２３では、ステップＳ４０６において行ったと同様に、ポジティブ・コントロールに対して、図１４のフローチャートのステップＳ１０４におけるグループ正常判定において、「正常」と判定されていた場合には、次のステップＳ４４５に進む。図１４のフローチャートのステップＳ１０４におけるグループ正常判定において、「グループ異常」と判定された場合には、ステップＳ４３１において「検査有効性判定」は「検査無効」として、本処理を終了する。
【０１４５】
（ｋ）ステップＳ４４５では、ステップＳ４４４と同様の処理を行う。即ち、ポジティブ・コントロール用電極５４からそれぞれ得られる一群の電流値Ｉpk2の平均値Ｘｐ、及び標準偏差σｐをそれぞれ計算し、平均値・標準偏差記憶部３６０に格納する。
【０１４６】
（ｌ）ステップＳ４２４では、ＳＬＬ記憶部３６２から格納されている設定パラメータポジティブ・コントロール判定下限値ＰＣＬＬ及びポジティブ・コントロール実効変動係数ＰＥＳＬを、平均値・標準偏差記憶部３６０からは、ステップＳ４４３で算出したネガティブ・コントロール電流の平均値Ｘｎ及び標準偏差σｎ、ステップＳ４４５で算出したポジティブ・コントロール電流の平均値Ｘｐ及び標準偏差σｐを読み出す。ポジティブ・コントロール電流値の平均値Ｘｐからネガティブ・コントロール電流値の平均値Ｘｎを減算した値とポジティブ・コントロール判定下限値ＰＣＬＬと大小関係を比較する。更に、ポジティブ・コントロール電流値平均値Ｘｐから、ポジティブ・コントロール電流の標準偏差σｐにポジティブ・コントロール実効変動係数ＰＥＳＬを乗算した値を減算した値と、ネガティブ・コントロール電流値平均値Ｘｎに、ネガティブ・コントロール電流の標準偏差σｎにポジティブ・コントロール実効変動係数ＰＥＳＬを乗算した値を加算した値を比較する。ポジティブ・コントロール電流値の平均値Ｘｐからネガティブ・コントロール電流値の平均値Ｘｎを減算した値が、ポジティブ・コントロール判定下限値ＰＣＬＬ以上でかつ、ポジティブ・コントロール電流値平均値Ｘｐから、ポジティブ・コントロール電流の標準偏差σｐにポジティブ・コントロール実効変動係数ＰＥＳＬを乗算した値を減算した値がネガティブ・コントロール電流値平均値Ｘｎに、ネガティブ・コントロール電流の標準偏差σｎにポジティブ・コントロール実効変動係数ＰＥＳＬを乗算した値を加算した値以上である場合（ステップＳ４２５）は、ステップＳ４２６において「検査無効」と判断し、本処理を終了する。ステップＳ４２４で、上記条件のいずれか一方でも満たさない場合（ステップＳ４３２）も、ステップＳ４３３において「検査無効」と判断し、本処理を終了する。
【０１４７】
［２種類のアルゴリズムから選択］
図１４のステップＳ１０６は、図２６に示すようにステップＳ３３２における検査有効性の判定において検査が有効であると判定された場合は、ステップＳ３３３に進み、２種類のアルゴリズムの選択を行う。ステップＳ３３２における検査有効性の判定において検査が有効でないと判定された場合は、ステップＳ３３４において「検査無効」として、分類結果記憶部３６９に判定結果を分類して格納し、表示装置３０６及び出力装置３０５に出力させ、信号処理を終了する。ステップＳ３３３においては、ある核酸が存在するかどうかを判定する有無判定アルゴリズムのフローに進むのか、ＳＮＰ型判定や変異型判定など塩基配列の判定アルゴリズムのフローに進むのかを決定する。Ｓ１０６にはＳＮＰ型判定に進む例を示したが、Ｓ１０６は塩基配列判定であってもよい。
【０１４８】
［ステップＳ１０６その１：核酸の存在の有無判定］
図２６のステップＳ３３３において、ある核酸が存在するかどうかを判定するアルゴリズムのフローに進むと決定された場合は、図２７に示すフローチャートの手順で有無判定モジュール３３０が処理を行う。
【０１４９】
図２において、第1検出用電極５５１，第２検出用電極５５２，第３検出用電極５５４，コントロール電極５５３、参照極５６１，５６２及び対極５０２が検出チップ上に配列された電極ユニットを示したが、ある核酸が存在するかどうかを判定するアルゴリズムの場合は、第１検出用電極５５１，第２検出用電極５５２および第３検出用電極５５４のいずれか１であっても良い。即ち、図４に示す基板７１４上には、第１検出用電極５５１，第２検出用電極５５２および第３検出用電極のいずれか１を検出用電極（作用極）として備える電極ユニット７６１が複数配列されている。ここでは、図２に示した第１検出用電極５５１を、対象核酸を検出する有無検出用電極（作用極）５５０であると仮定して説明する。
【０１５０】
（ａ）図２７に示すフローチャートのステップＳ３４１では、有無判定モジュール３３０は、コントロール電極５５３からの電流値がグループ正常判定モジュール３２０での処理の結果が「グループ正常」であるか否かを判定する。ステップＳ３４１で、「グループ正常」であると判定された場合には、次のステップS３４２に進む。グループ正常判定モジュール３２０での処理の結果、「グループ異常」であると判定された場合には、「判定不能(N.D.２１)」として、分類結果記憶部３６９に判定結果を分類して格納し、ステップＳ３４８において「判定不能(N.D.２１)」を表示装置３０６及び出力装置３０５に出力させる。
【０１５１】
（ｂ）更に、ステップＳ３４２において、有無判定モジュール３３０は、判定対象となる複数の有無検出用電極（作用極）５５０からの電流値がグループ正常判定モジュール３２０での処理の結果、「グループ正常」であるか否かを判定する。ステップＳ３４２において、「グループ正常」であると判定された場合には、次のステップS３４３に進む。グループ正常判定モジュール３２０での処理の結果、「グループ異常」であると判定された場合には、「判定不能(N.D.２２)」として、分類結果記憶部３６９に判定結果を分類して格納し、ステップＳ３４９において「判定不能(N.D.２２)を表示装置３０６及び出力装置３０５に出力させる。
【０１５２】
（ｃ）次に、ステップＳ３４３において判定対象となる複数の有無検出用電極（作用極）５５０からの電流値の平均値（Ｘ）、標準偏差（σ）、対応するコントロール電極５５３からの電流値の平均値（Ｘc）及び標準偏差（σc）を算出し、平均値・標準偏差記憶部３６０に格納する。
【０１５３】
（ｄ）ステップＳ３４４において、有無判定モジュール３３０は、有無検出用電極（作用極）５５０からの電流値の平均値（Ｘ）と対応するコントロール電極５５３からの電流値の平均値（Ｘc）を平均値・標準偏差記憶部３６０から読み出し、平均値の差（Ｘ−Ｘｃ）を演算する。更に、「−」判定信号増加量上限基準ＳＬ（−）をＳＬＬ記憶部３６２から読み出す。そして、ステップＳ３４４において、平均値の差（Ｘ−Ｘc）と、「−」判定信号増加量上限基準ＳＬ（−）との大小関係を比較する。ステップＳ３４４で「−」判定信号増加量上限基準ＳＬ（−）以下と判断された場合には、有無検出用電極（作用極）５５０からは対象とする核酸の電気化学的電流の電流値が観測されなかったと判断し、分類結果記憶部３６９に判定結果を分類して格納し、ステップＳ３５０において、表示装置３０６に「−（検出感度以下）」の判定を表示させる。一方、ステップＳ３４４において、「−」判定信号増加量上限基準ＳＬ（−）よりも大きい場合には、ステップＳ３４５に進む。
【０１５４】
（ｅ）ステップＳ３４５では、有無判定モジュール３３０は、有無検出用電極（作用極）５５０からの電流値の平均値（Ｘ）と対応するコントロール電極５５３からの電流値の平均値（Ｘc）を平均値・標準偏差記憶部３６０から読み出し、平均値の差（Ｘ−Ｘｃ）を演算する。更に、「＋」判定信号増加量下限基準ＳＬ（＋）をＳＬＬ記憶部３６２から読み出す。そして、平均値の差（Ｘ−Ｘc）と、「＋」判定信号増加量下限基準ＳＬ（＋）との大小関係を比較する。ステップＳ３４５で「＋」判定信号増加量下限基準ＳＬ（＋）より小さいと判断された場合には、「判定不能(N.D.０１)」として、分類結果記憶部３６９に判定結果を分類して格納し、ステップＳ３５１において、「判定不能(N.D.０１)」を表示装置３０６及び出力装置３０５に出力させる。これは、有無検出用電極（作用極）５５０からの電気化学的信号の増加量（コントロール電極からの電気化学的信号との差分）が、「＋」判定とするには充分でなく、又、「−」判定とするには小さくない、という中途半端な値を示しており、＋／−判定を決することができない状態を表している。一方、ステップＳ３４５において、「＋」判定信号増加量下限基準ＳＬ（＋）以上の場合には、ステップＳ３４６に進む。
【０１５５】
（ｆ）ステップＳ３４６では、有無判定モジュール３３０は、有無検出用電極（作用極）５５０からの電流値の平均値（Ｘ）、標準偏差（σ）、対応するコントロール電極５５３からの電流値の平均値（Ｘc）及び標準偏差（σｃ）を平均値・標準偏差記憶部３６０から、更には実効変動係数ＥＳＬＬをＳＬＬ記憶部３６２から読み出す。有無検出用電極５５０からの電流の平均値Ｘに対して、標準偏差σの実効変動係数倍小さい値（Ｘ−ＥＳＬＬ＊σ）と、コントロール電極からの電流平均値Ｘｃに対して、標準偏差σｃの実効変動係数倍大きい値（Ｘｃ＋ＥＳＬＬ＊σｃ）との大小関係を比較する。有無検出用電極５５０からの電流平均値Ｘに対して、標準偏差σの実効変動係数倍小さい値（Ｘ−ＥＳＬＬ＊σ）が、コントロール電極からの電流平均値Ｘｃに対して、標準偏差σｃの実効変動係数倍大きい値（Ｘｃ＋ＥＳＬＬ＊σｃ）以上の場合、即ち、Ｘ−ＥＳＬＬ＊σ≧Ｘｃ＋ＥＳＬＬ＊σｃの不等式が成立する場合には、充分な信号増加量が得られているとして、「＋」の判定を行い、分類結果記憶部３６９に判定結果を分類して格納し、ステップＳ３４７において、「＋」を表示装置３０６及び出力装置３０５に出力させる。一方、Ｘ−ＥＳＬＬ＊σ≧Ｘｃ＋ＥＳＬＬ＊σｃの不等式を満足しない場合には、信号バラつきに対して、信号増加量が充分でないと判断し、「判定不能(N.D.０２)」として、分類結果記憶部３６９に判定結果を分類して格納し、ステップＳ３５２において、「判定不能(N.D.０２)」を表示装置３０６及び出力装置３０５に出力させる。
【０１５６】
即ち、ステップＳ３４５において、平均値の差（Ｘ−Ｘc）が「＋」判定信号増加量下限基準ＳＬ（＋）以上の場合でも、直ちに「＋」と表示せず、ステップＳ３４６において、電流増加量がバラツキに比べて充分であるか否かを判断する訳である。ここで、「＋」判定信号増加量下限基準ＳＬ（＋）及び「−」判定信号増加量上限基準ＳＬ（−）については、複数のサンプルに関して測定を行い、上述の手順で、信号増加量を算出し、「＋」のサンプル及び「−」のサンプルに対して、それぞれ統計的な値から算出して決定するのが好ましい。より好ましくは、「＋」サンプル、「−」サンプルそれぞれの信号増加量の平均値と標準偏差から、定めるのが好ましい。更により好ましくは、「＋」判定信号増加量下限基準ＳＬ（＋）は、「＋」サンプルの「平均値−３×標準偏差」とし、「−」判定信号増加量上限基準ＳＬ（−）は「−」サンプルの「平均値＋３×標準偏差」と定めるのが良い。なお、基準値を決定するのに用いるサンプル数は、それぞれ３０サンプル以上であることが望ましい。
【０１５７】
電流増加割合下限基準値ＭＩＲについても、同様に複数のサンプルに関するデータから、統計的に算出して決めるのが好ましい。ＭＩＲについても、角度判定基準値と同様に、複数のサンプルに関する測定から求めた直線長の平均値と標準偏差を用いて決定するのが好ましい。ＭＩＲは、「平均値−３×標準偏差」と定めるのがより好ましい。なお、基準値を決定するのに用いるサンプル数は、３０サンプル以上であることが望ましい。
【０１５８】
［ステップＳ１０６その２：塩基配列判定］
塩基配列判定方法の手順を末尾に記す表Ｉにおいて示す。
【０１５９】
図２６のステップＳ３３３において、ある核酸が存在するかどうかを判定するアルゴリズムのフローに進むと決定された場合は、表Ｉに示すフローチャートの手順で塩基配列判定モジュール９００が処理を行う。
【０１６０】
（ａ）まず、塩基配列判定モジュール９００は、ステップＳ３６２では、型判定モジュール３４０は、第１検出用電極５５１に対応するコントロール電極（Ｃ１）５５３、第2検出用電極５５２に対応するコントロール電極（Ｃ２）５５６及び第３検出用電極５５４に対応するコントロール電極（Ｃ１）５５３からの電流値がグループ正常判定モジュール３２０での処理の結果、いずれも「グループ正常」であると判定された場合には、次のステップＳ３６３に進む。グループ正常判定モジュール３２０での処理の結果、いずれかが「グループ異常」であると判定された場合には、「判定不能(Ｎ．Ｄ．３１)」として、分類結果記憶部３６９に判定結果を分類して格納し、ステップＳ３８２において、「判定不能(Ｎ．Ｄ．３１)」を表示装置３０６及び出力装置３０５に出力させる。
【０１６１】
（ｂ）更に、ステップＳ３６３において、塩基配列判定モジュール９００は、判定対象となる第１検出用電極５５１、第2検出用電極５５２及び第３検出用電極５５４からの電流値がグループ正常判定モジュール３２０での処理の結果、いずれも「グループ正常」であると判定された場合には、次のステップＳ３６４に進む。グループ正常判定モジュール３２０での処理の結果、いずれかが「グループ異常」であると判定された場合には、「判定不能(Ｎ．Ｄ．３２)」として、分類結果記憶部３６９に判定結果を分類して格納し、ステップＳ３８３において、「判定不能(Ｎ．Ｄ．３２)」を表示装置３０６及び出力装置３０５に出力させる。
【０１６２】
（ｃ）次に、ステップＳ３６４では、塩基配列判定モジュール９００は、第１検出用電極５５１の電流値の平均値Ｘ1，第１検出用電極５５１に対応するコントロール電極（Ｃ１）５５３の電流値の平均値Ｘc1，第2検出用電極（ＳＮＰ="Ｔ"検出用電極）５５２の電流値の平均値Ｘ2，第2検出用電極５５２に対応するコントロール（Ｃ２）電極５５６の電流値の平均値Ｘc2および第３検出用電極５５４の電流値の平均値Ｘ３，第３検出用電極５５４に対応するコントロール電極（Ｃ１）５５７の電流値の平均値Ｘc３を算出する。図２では、第１検出用電極５５１と第2検出用電極に対応する共通のコントロール電極５５３を示したが、第１検出用電極５５１に対応するコントロール電極（Ｃ１）と第2検出用電極５５２に対応するコントロール（Ｃ２）とを別個に設けても構わず、且つ第３検出用電極５５４についても同様である。算出した第１検出用電極５５１の電流値の平均値Ｘ1，第１検出用電極５５１に対応するコントロール電極（Ｃ１）５５３の電流値の平均値Ｘc1，第2検出用電極５５２の電流値の平均値Ｘ2，第2検出用電極５５２に対応するコントロール（Ｃ２）電極５５６の電流値の平均値Ｘc2及び第３検出用電極５５４の電流値の平均値Ｘ３，第３検出用電極５５４に対応するコントロール電極（Ｃ１）５５７の電流値の平均値Ｘc３は、平均値・標準偏差記憶部３６０に格納する。
【０１６３】
（ｄ）次に、ステップＳ３６５では、塩基配列判定モジュール９００は、第１検出用電極５５１の電流値の平均値Ｘ1と対応するコントロール電極（Ｃ１）５５３の電流値の平均値Ｘc1を平均値・標準偏差記憶部３６０から読み出し、第１検出用電極５５１の電流値の平均値Ｘ1とコントロール電極（Ｃ１）５５３の電流値の平均値Ｘc1との差（Ｘ1−Ｘc1）をコントロール電極（Ｃ１）５５３の電流値の平均値Ｘc1で除算した値Ｚ１を算出する：
Ｚ１＝（Ｘ１−Ｘｃ１）／Ｘｃ１ ……（５）
同様に、第2検出用電極５５２の電流値の平均値Ｘ２と対応するコントロール電極（Ｃ２）５５４の電流値の平均値Ｘc２を平均値・標準偏差記憶部３６０から読み出し、第2検出用電極５５２の電流値の平均値Ｘ２とコントロール電極（Ｃ２）５５６の電流値の平均値Ｘc２との差（Ｘ２−Ｘc２）をコントロール電極（Ｃ２）５５６の電流値の平均値Ｘc２で除算した値Ｚ２を算出する：
Ｚ２＝（Ｘ２−Ｘｃ２）／Ｘｃ２ ……（６）
同様に、第３検出用電極５５４の電流値の平均値Ｘ３と対応するコントロール電極（Ｃ３）５５３の電流値の平均値Ｘc２を平均値・標準偏差記憶部３６０から読み出し、第３検出用電極５５４の電流値の平均値Ｘ３とコントロール電極（Ｃ３）５５６の電流値の平均値Ｘc３との差（Ｘ３−Ｘc３）をコントロール電極（Ｃ３）５５６の電流値の平均値Ｘc２で除算した値Ｚ３を算出する：
Ｚ２＝（Ｘ２−Ｘｃ２）／Ｘｃ２ ……（７）
そして、算出したＺ１、Ｚ２およびＺ３を、規格化座標記憶部３６５に格納し、ステップＳ３６６に進む。
【０１６４】
（ｅ）ステップＳ３６６において、塩基配列判定モジュール９００は、規格化座標記憶部３６５から、規格化された第１電流増加量Ｚ１及び規格化された第2電流増加量Ｚ２を読み出す。塩基配列判定モジュール９００は、規格化座標記憶部３６５から、規格化された第１電流増加量Ｚ１及び規格化された第2電流増加量Ｚ２を読み出す。ステップＳ３６７では、更に、規格化された第１電流増加量Ｚ１をＸ座標とし、規格化された第2電流増加量Ｚ２をＹ座標として定まる点の座標（Ｚ１，Ｚ２）を、極座標（Ｒ，Ａ）に変換する。即ち、表Ａに示すように、Ｘ座標Ｚ１がＹ座標Ｚ２で定まる点Ｐに対して、Ｒは、原点から、点Ｐ（Ｚ１，Ｚ２）までの直線を示し、Ａは、正のＸ軸と、原点から点Ｐ（Ｚ１，Ｚ２）への直線のなす角度を示す。ここで、ステップＳ３６６においてＸ軸について角度の比較が行われる。
【０１６５】
（ｇ）ステップＳ３６７においては、塩基配列判定モジュール９００は、規格化座標記憶部３６５から、規格化された第１電流増加量Ｚ１及び規格化された第３電流増加量Ｚ３を読み出す。塩基配列判定モジュール９００は、規格化座標記憶部３６５から、規格化された第１電流増加量Ｚ１及び規格化された第３電流増加量Ｚ３を読み出す。ステップＳ３６７では、更に、規格化された第１電流増加量Ｚ１をＸ座標とし、規格化された第３電流増加量Ｚ３をＹ座標として定まる点の座標（Ｚ１，Ｚ３）を、極座標（Ｒ，Ａ）に変換する。即ち、表Ａに示すように、Ｘ座標Ｚ１がＹ座標Ｚ３で定まる点Ｐに対して、Ｒは、原点から、点Ｐ（Ｚ１，Ｚ３）までの直線を示し、Ａは、正のＸ軸と、原点から点Ｐ（Ｚ１，Ｚ３）への直線のなす角度を示す。ここで、ステップＳ３６７においてＸ軸について角度の比較が行われる。
【０１６６】
（ｈ）Ｓ３６６、３６７およびＳ３８４からの比較結果を受け取り、分類結果記憶部３６９に判定結果を分類して格納し、Ｓ３８５では「プローブ１（＋）およびプロープ２（−）」、Ｓ３３８６では「プローブ１（＋）およびプロープ２（−）」、Ｓ３８７では「プローブ１（−）およびプロープ２（＋）」、Ｓ８８では「プローブ１（−）およびプロープ２（−）」とのを表示装置３０６及び出力装置３０５に出力させる。
【０１６７】
以上の説明で理解できるように、実施形態に係る塩基配列方法によれば、チップカートリッジ１１や測定系１２に異常があった場合や、データにバラつきがあった場合等でも、それらの異常なデータを除外して、正確にある核酸が存在するかどうかを高い精度で判定できる。又、実施形態に係る塩基配列方法によれば、初期設定にエラーがあれば「設定エラー」と判定し，チップ若しくは試料（バイオサンプル）に異常があれば「判定不能（サンプル・エラー）」と判定し、装置（ハードウェア）に不具合があれば「判定不能（ハードウェア・エラー）」と判定する等の処理をして、それらの異常なデータを除外できる。更に、信号のバラつきにより判定できない場合や信号強度が弱い場合等についてもその状況に応じた判定が可能である。このため、実施形態に係る塩基配列方法によれば、種々の測定環境や状況（実状）に適格に応じながら、塩基配列を高い精度で判断できる。ここで、塩基配列については、具体的に塩基名を用いて”Ａ”、”Ｔ”、”Ｇ”、”Ｃ”等の表示を行ってもよいし、更にアミノ酸配列までを判断するためには、決定された塩基配列と対応するコドンに基づいてアミノ酸配列を判断すればよい。従って、判断の結果は、アミノ酸の名称の表示、１文字表記、３文字表記、「耐性型」若しくは「非耐性型」または「薬剤耐性型」若しくは「薬剤非耐性型」などの表示を行ってよい。このようにアミノ酸配列に対応させる場合や、薬剤耐性などのアミノ酸配列に由来する特徴を表示する場合には、それらを対応させるテーブルを記憶モジュールに記憶し、塩基配列判定モジュールがその対応を読み出して、検出結果、算出値および判定などの判定結果とそれらのテーブルを対応付け、その結果を表示部に表示させるように構成すればよい。
【０１６８】
（塩基配列判定プログラム）
図１４，図１６，図１８−１９，図２５−２７および表Ｉ示した一連の判定操作は、図１４，図１６，図１８−１９，図２５−２７および表Ｉと等価なアルゴリズムのプログラムにより、図８に示した塩基配列判定システムを制御して実行できる。このプログラムは、塩基配列判定システムを構成するコンピュータシステムのプログラム記憶装置（図示省略）に記憶させれば良い。又、このプログラムは、コンピュータ読取り可能な記録媒体に保存し、この記録媒体を塩基配列判定システムのプログラム記憶装置に読み込ませることにより、一連の判定操作を実行することができる。ここで、「コンピュータ読取り可能な記録媒体」とは、例えばコンピュータの外部メモリ装置、半導体メモリ、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、磁気テープなどのプログラムを記録することができるような媒体などを意味する。具体的には、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ，ＭＯディスク、カセットテープ、オープンリールテープ、メモリカード、ハードディスク、リムーバブルディスクなどが「コンピュータ読取り可能な記録媒体」に含まれる。
【０１６９】
例えば、塩基配列判定システムの本体は、フレキシブルディスク装置（フレキシブルディスクドライブ）及び光ディスク装置（光ディスクドライブ）を内蔵若しくは外部接続するように構成できる。フレキシブルディスクドライブに対してはフレキシブルディスクを、又光ディスクドライブに対してはＣＤ−ＲＯＭをその挿入口から挿入し、所定の読み出し操作を行うことにより、これらの記録媒体に格納されたプログラムを、塩基配列判定システムを構成するプログラム記憶装置にインストールすることができる。又、所定のドライブ装置を接続することにより、例えばゲームパック等に利用されているメモリ装置としてのＲＯＭや、磁気テープ装置としてのカセットテープを用いることもできる。更に、インターネット等の情報処理ネットワークを介して、このプログラムをプログラム記憶装置に格納することが可能である。
【実施例１】
【０１７０】
実施例１  アミノ酸配列の判定
Hepatitis B virus (HBV)のポリメラーゼを構成するアミノ酸のうち、204番目のアミノ酸(aa204)であるメチオニン(Met), 薬剤投与後、その薬剤に対して耐性を示すアミノ酸イソロイシン(Ile), 及びバリン(Val)の3種のアミノ酸を判定するためのアルゴリズムを以下に示した。
【０１７１】
・HBVaa204アミノ酸判定用センサーの作製
表１に示すように、MetをコードするコドンはATG、IleをコードするコドンはATC、ATT、ATA、Valをコードするコドン４種のうち野生型のMetをコードするコドンATGの最初の塩基のみがGに置換したGTG、以上の5種類のコドンを検出・判定することにより、そのウイルスのaa204のアミノ酸を検出・判定し、そのウイルスがある薬剤に対して耐性を持つかどうかを判定することができる。また、このコドンより上流４塩基目には、高頻度な塩基多型 (T or C)が存在するため、上記5種類のコドンそれぞれに対し、上流4塩基目の塩基がTの場合、Cの場合、計10種類の塩基配列を検出判定する必要がある。これら10種類の塩基配列を含むプローブDNA、及びバックグラウンドを測定するためのプローブDNA、計11種類を準備し、表１に示すように、2種または3種のプローブDNAを組み合わせ、5種のプローブセットを準備した。これら5種のプローブセットを別々の電極に固定し、これをHBVaa204アミノ酸判定用センサーとした。
【表１】
2012202899.tif 000008
【０１７２】
・核酸増幅(LAMP)反応溶液の調製
核酸増幅は、Loop-mediated isothermal amplification (LAMP法)で行った。LAMP反応用プライマーを表２に示した。これらのプライマーを用いてLAMP反応を行うことにより、aa204のコドンとその上流４塩基目を含むLAMP産物が得られる。表３に示した組成にてLAMP反応溶液を調製した。
【表２】
2012202899.tif 000009
【０１７３】
【表３】
2012202899.tif 000010
【０１７４】
・人工合成遺伝子（鋳型）の調製
以下の1000塩基がベクターpUC57に組み込まれた人工合成遺伝子を作製した。aa204をコードする3塩基、及びそれより上流４塩基目の塩基（以下の塩基配列の四角の枠）については、表ＧのプローブNo.1〜10の10種類の組み合わせと同じ塩基となるように塩基置換を行い、計10種類の人工合成遺伝子(T1〜T10)を作製した。それぞれの人工合成遺伝子を1E+03copies/5uLとなるように段階希釈し、鋳型溶液とした。
【表Ｇ】
2012202899.tif 000011
【０１７５】
・核酸増幅(LAMP)反応
各鋳型溶液5uLをLAMP反応液に添加し、混合後、予め63℃に加温した恒温装置にセットし、60分間反応させ、その後、80℃で2分反応させた。
【０１７６】
・HBVaa204アミノ酸判定用センサーによる核酸増幅(LAMP)産物の検出
核酸増幅(LAMP)産物を15uL, 0.1% Tween20 を45uL, 20×SSCを6uLを混合し、検出用ターゲットDNA溶液（計66uL）とした。検出用ターゲット溶液50uLをHBVaa204アミノ酸判定用センサー上に添加し、55℃で5分間反応させ、核酸増幅(LAMP)産物とHBVaa204アミノ酸判定用センサー上に固定されたプローブDNAとをハイブリダイズさせた。その後、検出用ターゲット溶液を2×SSC溶液で置換し、36℃で5分間反応させ洗浄を行った。次に、75uMのヘキスト33258溶液で置換し、25℃で1分間反応させた後、センサー（電極）に電位を挿引し、ヘキスト33258の酸化反応と伴に流れる電流のピーク電流値を検出した。これらの検査は、東芝のDNAチップ、及びGenelyzerを用いて行った（SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. 1, No. 3, pp. 265-270, May 2008）。
【０１７７】
・センサーにより得られた数値とアミノ酸aa204のアミノ酸判定
プローブセットNo.1より得られた信号(I-1)からコントロール用プローブ(I-5)を差し引き、これを(I-5)で割った値をC1、プローブセットNo.2より得られた信号(I-2)からコントロール用プローブ(I-5)を差し引き、これを(I-5)で割った値をC2、同様にして、C3, C4の値を算出した。C1をX、C2をYとし、2次元のXY平面にプロットし、(C1, C2), (C1, C3), (C1, C4)の３つの2次元プロットを作製した。各２次元プロットにおいてプロットと原点を結んだ線とX軸とが形成する角度をA(1-2)とし、同様にA(1-3)、A(1-4)を求めた。
【０１７８】
表４に示すように、3種の2次元プロットそれぞれについて、Xの値、Yの値、角度（大小２種）にそれぞれ判定基準を設け、各判定基準値とプロットを比較することにより、各2次元プロットにおける、X軸側プローブセット、Y軸側プローブセットが陽性または陰性となるかを判定した。2次元プロット(C1, C2)における判定基準、X、Y、角度（大小２種）をそれぞれ、X(1-2). Y(1-2), A1(1-2), A2(1-2)とし、同様に、2次元プロット(C1, C3), (C1, C4)についても、X(1-3). Y(1-3), A1(1-3), A2(1-3), X(1-4). Y(1-4), A1(1-4), A2(1-4)を設定した。判定方法を以下に示す。各2次元プロットにおいて、C1の値が予め決めた基準値(X)よりも大きく、且つ角度Aが予め決めた基準値A2よりも小さい場合、プローブセット1は「陽性」と判定し（図３の上段向かって左側の斜線で示した領域青）、それ以外は「陰性」と判定した。一方、各2次元プロットにおいて、C2, C3, C4の値が予め決めた基準値（Y）よりも大きく、且つ角度A)が予め決めた基準値（A1）よりも大きい場合、プローブセット2, 3, 4は、「陽性」と判定し(図３の上段向かって左側の車線で示した領域)、それ以外は「陰性」と判定した。
【表４】
2012202899.tif 000012
【０１７９】
これらの判定は表５に示した計算式にて実行される。この段階で、各２次元プロットの２つのプローブセットそれぞれについて、「陽性」 または 「陰性」の判定がなされる。
【表５】
2012202899.tif 000013
【０１８０】
判定結果は、表５に従いR12-1, R12-2, R13-1, R13-3, R14-1, R14-4と表記した。次に、3つの2次元プロットそれぞれから結果が得られるプローブセット1について、総合判定を行った。これら3つの結果の中で、少なくとも1つが「陰性」と判定された場合、プローブセット1は、「陰性」と判定した。これは、プローブセット1以外のプローブセットが陽性であった場合、プローブ1において非特異的な弱信号が検出される性質を考慮したものであり、例えば、プローブセット3が陽性、且つプローブセット1が陰性であった場合、プローブセット1に生じる非特異的な弱信号とプローブセット2とを比較する2次元プロット(C1, C2)において、プローブセット1が陽性であった場合でも、これはプローブセット3陽性に伴って生じた非特異信号とみなし、プローブセット1は陰性と判定した（図３０）。この総合判定は、以下の計算式にて実行した。
【０１８１】
IF(OR(R12-1="-",R13-1="-",R14-1="-"),"-",IF(AND(R12-1="+", R13-1="+", R14-1="+"),"+"))
この段階で、プローブセットそれぞれについて、「陽性」or「陰性」が決定した。次に、各プローブセットから、アミノ酸の判定を行った。Metに対応するプローブセットは1のみであるので、プローブセット1が陽性であった場合は、「Met陽性」、プローブセット2が陰性であった場合は、「Met陰性」と判定した。Ileに対応するプローブセットは、プローブセット2と3の2種類あり、これらの結果から、Ileの有無についての総合判定を行した。プローブセット2と3の少なくとも一方が陽性であった場合、「Ile陽性」と判定し、それ以外の場合は、「Ile陰性」と判定する。この総合判定は以下の計算式により実行した。
【０１８２】
IF(OR(R12-2="+",R12-3="+"),"Ile陽性",IF(AND(R12-2="-",R12-3="-")," Ile陰性"))
Valに対応するプローブセットは、4のみであるので、プローブセット4が陽性であった場合は、「Val陽性」、プローブセット4が陰性であった場合は、「Val陰性」と判定した。
【０１８３】
・人工合成遺伝子（鋳型）の検出結果
T1〜T10の人工合成遺伝子（鋳型）を検出し、(C1, C2), (C1, C3), (C1, C4)の2次元プロットを作製した（図３０〜図４０）。上記判定アルゴリズムに従い、各2次元プロットにおける各プローブセットの判定結果、プローブセット１の総合判定結果、アミノ酸の総合判定結果を表６Ａおよび６Ｂに示した。
【表６Ａ】
2012202899.tif 000014
【０１８４】
【表６Ｂ】
2012202899.tif 000015
【実施例２】
【０１８５】
３塩基置換の遺伝子多型の検出
3塩基置換の遺伝子多型を検出・判定するための方法を以下に示した。
【０１８６】
・3塩基置換の遺伝子多型判定用センサーの作製
表7に示す3種類のプローブDNAを準備した。これらのプローブDNAは、構成する塩基配列の中の１箇所において互いに異なる塩基（G, C, または T）を持っている。これら3種のプローブを別々の電極に固定し、これを3塩基置換の遺伝子多型判定用センサーとした。
【０１８７】
・核酸増幅(LAMP)反応溶液の調製
【表７】
2012202899.tif 000016
【０１８８】
核酸増幅は、Loop-mediated isothermal amplification (LAMP法)で行った。LAMP反応用プライマーを表2に示した。これらのプライマーを用いてLAMP反応を行うことにより、表1に示したプローブDNA領域を含むLAMP産物が得られる。表3に示した組成にてLAMP反応溶液を調製した。
【０１８９】
・人工合成遺伝子（鋳型）の調製
以下の1000塩基がベクターpUC57に組み込まれた人工合成遺伝子を作製した。3塩基置換部位（以下の塩基配列の四角の枠）については、G, C, またはTをもつ3種類の人口合成遺伝子 (T21〜T23)を作製した。それぞれの人工合成遺伝子を1E+03copies/5uLとなるように段階希釈し、鋳型溶液とした。使用した鋳型を、本例末尾に表Ｈとして記載する。
【０１９０】
・核酸増幅(LAMP)反応
各鋳型溶液5uLをLAMP反応液に添加し、混合後、予め63℃に加温した恒温装置にセットし、60分間反応させ、その後、80℃で2分反応させた。
【０１９１】
・3塩基置換の遺伝子多型判定用センサーによる核酸増幅(LAMP)産物の検出
核酸増幅(LAMP)産物を15uL, 0.1% Tween20 を45uL, 20×SSC6uLを混合し、検出用ターゲットDNA溶液（計66uL）とした。検出用ターゲット溶液50uLを3塩基置換の遺伝子多型判定用センサー上に添加し、55℃で5分間反応させ、核酸増幅(LAMP)産物と3塩基置換の遺伝子多型判定用センサー上に固定された3種のプローブDNAとをハイブリダイズさせた。その後、検出用ターゲット溶液を2×SSC溶液で置換し、36℃で5分間反応させ洗浄を行った。次に、75uMのヘキスト33258溶液で置換し、25℃で1分間反応させた後、センサー（電極）に電位を挿引し、ヘキスト33258の酸化反応と伴に流れる電流のピーク電流値を検出した。これらの検査は、東芝のDNAチップ、及びGenelyzerを用いて行った（SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. 1, No. 3, pp. 265-270, May 2008）。
【０１９２】
・センサーにより得られた数値と塩基の判定
プローブNo.21より得られた信号(I-21)からコントロール用プローブ(I-24)を差し引き、これを(I-24)で割った値をC21、プローブNo.22より得られた信号(I-22)からコントロール用プローブ(I-24)を差し引き、これを(I-24)で割った値をC22、同様にして、C23の値を算出した。C21をX、C22をYとし、2次元のXY平面にプロットし、(C21, C22), (C21, C23)の2つの2次元プロットを作成した。各2次元プロットにおいてプロットと原点を結んだ線とX軸とが形成する角度をA(21-22)とし、同様にA(21-23)を求めた。
【０１９３】
表8に示すように、2種の2次元プロットそれぞれについて、Xの値、Yの値、角度（大小２種）にそれぞれ判定基準を設け、各判定基準値とプロットを比較することにより、各2次元プロットにおける、X軸側プローブセット、Y軸側プローブセットが陽性または陰性となるかを判定した。
【表８】
2012202899.tif 000017
【０１９４】
2次元プロット(C21, C22)における判定基準、X、Y、角度（大小２種）をそれぞれ、X(21-22). Y(21-22), A1(21-22), A2(21-22)とし、同様に、2次元プロット(C21, C23))についても、X(21-23). Y(21-23), A1(21-23), A2(21-23)を設定した。判定方法を以下に示す。各2次元プロットにおいて、C21の値が予め決めた基準値(X)よりも大きく、且つ角度Aが予め決めた基準値A2よりも小さい場合、プローブ21は「陽性」と判定し、それ以外は「陰性」と判定した。一方、各2次元プロットにおいて、C22, C23の値が予め決めた基準値（Y）よりも大きく、且つ角度Aが予め決めた基準値（A1）よりも大きい場合、プローブセット22, 23は、「陽性」と判定し、それ以外は「陰性」と判定した。これらの判定は表9に示した計算式にて実行される。
【表９】
2012202899.tif 000018
【０１９５】
この段階で、各２次元プロットの２つのプローブセットそれぞれについて、「陽性」 または 「陰性」の判定がなされる。判定結果は、表9に従いR2122-21, R2122-22, R2123-21, R2123-23と表記した。次に、2つの2次元プロットそれぞれから結果が得られるプローブ21について、総合判定を行った。これら2つの結果の中で、少なくとも1つが「陰性」と判定された場合、プローブ21は、「陰性」と判定した。これは、プローブ21以外のプローブセットが陽性であった場合、プローブ21において非特異的な弱信号が検出される性質を考慮したものであり、例えば、プローブ23が陽性、且つプローブ21が陰性であった場合、プローブセット21に生じる非特異的な弱信号とプローブ22とを比較する2次元プロット(C21, C22)において、プローブセット21が陽性と判定された場合でも、これはプローブ23陽性に伴って生じた非特異信号とみなし、プローブ21は陰性と判定した。この総合判定は、以下の計算式にて実行した。
【０１９６】
IF(OR(R2122-21="-",R2123-21="-"),"-",IF(AND(R2122-21="+", R2123-21="+"),"+"))
この計算式により、各プローブの陽性、陰性、つまり、３塩基置換部位の塩基を判定した。
【０１９７】
・人工合成遺伝子（鋳型）の検出結果
T21〜T23の人工合成遺伝子（鋳型）を検出し、(C21, C22), (C21, C23)の 2次元プロットを作成し、上記アルゴリズムにより塩基の判定を行った。その結果、T21はG、T22はC、T23はTと判定された。
【表Ｈ】
2012202899.tif 000019
【０１９８】
これらの結果により、実施形態の塩基配列判定方法に複数の選択される候補を有する対象であっても、塩基配列の判定を行うことが可能であり、また、より正確に塩基配列の判定を行うことが可能である。従って、この方法を実行するための塩基配列判定システムおよび塩基配列判定用プログラムも同様に塩基配列の判定を行うことが可能であり、また、より正確に塩基配列の判定を行うことが可能である。
【０１９９】
例えば、塩基配列決定方法は、以下の表Ｉのフローチャートにより行うことが可能である。
【表Ｉ】
2012202899.tif 000020
【０２００】
本実施形態により、３種以上の塩基配列から、検査対象の塩基配列を判定するための塩基配列判定方法、塩基配列判定システム及び塩基配列判定プログラムを提供される。
【図１】
2012202899.tif 000021
【図２】
2012202899.tif 000022
【図３】
2012202899.tif 000023
【図４】
2012202899.tif 000024
【図５】
2012202899.tif 000025
【図６】
2012202899.tif 000026
【図７】
2012202899.tif 000027
【図８】
2012202899.tif 000028
【図９】
2012202899.tif 000029
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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