(57)【要約】【課題】農薬・医薬品中間体として有用な、Ｌ−ホモセリンを極めて安価な出発原料から簡便、効率的に製造する。【解決手段】ＤＬ−ホモセリンラクトンを出発原料とし、アシル化した後、Ｎ-アシルホモセリンラクトナーゼによるラクトン環開環反応を行うとともに、該ラクトン環開裂反応により生成したＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンに対しＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼによる立体選択的脱アシル化反応を行うことによりＬ-ホモセリンを得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンからＬ−ホモセリンを製造する方法であって、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンに対するＮ-アシルホモセリンラクトナーゼによるラクトン環開環反応を行うとともに、該ラクトン環開裂反応により生成したＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンに対しＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼによる立体選択的脱アシル化反応を行うことを特徴とする、Ｌ−ホモセリンの製造方法。
【請求項２】
上記ラクトン環の開環反応と立体選択的脱アシル化反応を同時に進行させることを特徴とする、請求項１の製造方法。
【請求項３】
ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンがＤＬ−ホモセリンラクトンのアシル化により得られたものであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼ及びＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼの酵素形態が、精製酵素、粗酵素、菌体処理物、あるいは培養処理物の形態であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼが、エルウニア属微生物由来の酵素であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
エルウニア属微生物がエルウニア・サイプリペデイに属する微生物であることを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼが、エルウニア属、バルクホルデリア属、ペニシリウム属に属する微生物由来の酵素であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼ及びＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼがともに、エルウニア属に属する同一微生物由来の酵素であることを特徴とする、請求項１〜５又は７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
微生物がエルウニア・サイプリペデイに属する微生物であることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
以下の酵素学的性質を有することを特徴とする、Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼ。
（ａ）作用：Ｎ−ホルミルホモセリンラクトンをＮ−ホルミルホモセリンに加水分解する。
（ｂ）基質特異性：Ｎ−ホルミルホモセリンラクトンの他、ホモセリンラクトンにも作用する。
（ｃ）至適温度：４５〜５５℃
（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ６〜７
（ｅ）温度安定性：〜４０℃
（ｆ）ｐＨ安定性：ｐＨ６から９
（ｇ）分子量: ベックマン・ウルトラスフェロゲル ＳＥＣ３０００（７．５ｍｍ×３０ｃｍ）カラムを用いたゲルパーミエイションクロマトグラフィーにて約９７，０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて２９，０００
【請求項１１】
エルウニア属に属する微生物を培地に培養し、菌体若しくは培養物からＮ−アシルホモセリンラクトナーゼを採取することを特徴とする、請求項１０に記載のＮ−アシルホモセリンラクトナーゼの製造方法。
【請求項１２】
エルウニア属に属する微生物が、エルウニア・サイプリペデイに属する微生物であることを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンに請求項１０に記載の酵素あるいは該酵素含有物を接触させることを特徴とする、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンの製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか記載の製造法において、さらにＬ−ホモセリンを脱水環化することを特徴とする、Ｌ−ホモセリンラクトンの製造法。
【請求項１５】
Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼを含有することを特徴とする、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンのラクトン環開環剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農薬・医薬品中間体として有用な光学活性なＬ−ホモセリン又はその等価体であるＬ−ホモセリンラクトンの新規な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−ホモセリンは、ラジカルスカベンジャーであるＬ−Ｏ−カフェオイルホモセリン等の薬剤の構成要素であり、これら薬剤を量産する際の原料として使用される。また、Ｌ−ホモセリンはアミノ酸であり、アミノ酸製剤等の成分として、製薬・健康分野において大量かつ安価な供給が望まれている。
光学活性なＬ−ホモセリンの製造手段としては発酵法が報告されているが（非特許文献１）、実用化には至っていない。一方、本発明者は、ラセミ体Ｎ−アシルホモセリンをＬ−アシラーゼにより立体選択的に脱アシルすることによりＬ−ホモセリンを製造する方法について出願している（特願２０１０−０２６３９６）。この光学分割法の原料であるＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンは、ＤＬ−ホモセリンのアシル化により得られる。しかし、ＤＬ−ホモセリンはＬ−ホモセリンよりは安価であるが、工業原料としては割高である。また、ホモセリンのアシル化はＯ−アシルホモセリンやＮ，Ｏ−ジアシルホモセリンを副生し、その除去が必要となるなど、原料供給に改良の余地がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】鮫島広年、奈良高、藤田忠三、木下祝郎、農芸化学会誌、第34巻第  750〜754頁、1960年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明の目的は、上記した本発明者の方法をさらに一歩進めて、極めて安価な原料から簡便、効率的ににＬ−ホモセリンを製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決すべく種々検討した結果、Ｏ−アシルホモセリンやＮ，Ｏ−ジアシルホモセリンを副生することなくＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンを得るには、ＤＬ−ホモセリンラクトンを出発原料とし、アシル化した後、開環および立体選択的脱アシル化によりＬ-ホモセリンを得るプロセスを採用し、これらプロセス中、上記開環脱アシル化は酵素法で行うのが最善であるという結論を得た。この理由は、まず、ホモセリンラクトンにおける水酸基は分子内のラクトン結合により保護されており、Ｏ−アシル化を受けないことに加え、ＤＬ−ホモセリンラクトンは、極めて安価であるという点にある。さらに、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンの開環法には、アルカリ加水分解法、ラクトナーゼによる酵素分解法があるが、アルカリ加水分解法は、脱アシル反応に移行する際に、中和、脱塩が必要であるのに対し、酵素分解法は温和な条件下で進行し、Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼによる上記したような立体選択的な脱アシル反応と同時進行させれば、より安価な原料を用いて、一段階でＬ−ホモセリンの製造が可能となり、プロセスの簡略化も期待できる点にある。
【０００６】
しかし、アシル化とそれに続く立体選択的脱アシル化を利用したアミノ酸の光学分割では、ホルミル基やアセチル基などの短鎖のアシル基がアシル化に用いられるが、このような短鎖のＮ−アシルホモセリンラクトンに作用するラクトナーゼは知られていない。また、既知のラクトナーゼについても、短鎖Ｎ−アシルホモセリンラクトンに対する活性は報告されていない。
このような実情に鑑み、本発明者は、短鎖Ｎ−アシルホモセリンラクトンをＮ−アシルホモセリンに加水分解するラクトナーゼを生産する微生物を探索した結果、エルウニア属に属する微生物の中にそのようなラクトナーゼを生産する微生物を見出し、それを用いることにより、Ｎ−アシルホモセリンラクトンから光学活性なＬ−ホモセリンを安価にかつ効率的に取得し得ることに成功した。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【０００７】
（１）ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンからＬ−ホモセリンを製造する方法であって、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンに対するＮ-アシルホモセリンラクトナーゼによるラクトン環開環反応を行うとともに、該ラクトン環開裂反応により生成したＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンに対しＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼによる立体選択的脱アシル化反応を行うことを特徴とする、Ｌ−ホモセリンの製造方法。
（２）上記ラクトン環の開環反応と立体選択的脱アシル化反応を同時に進行させることを特徴とする、上記（１）の製造方法。
（３）ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンがＤＬ−ホモセリンラクトンのアシル化により得られたものであることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼ及びＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼの酵素形態が、精製酵素、粗酵素、菌体処理物、あるいは培養処理物の形態であることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼが、エルウニア属微生物由来の酵素であることを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）エルウニア属微生物がエルウニア・サイプリペデイに属する微生物であることを特徴とする上記（５）に記載の製造方法。
（７）Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼが、エルウニア属、バルクホルデリア属、ペニシリウム属に属する微生物由来の酵素であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の製造方法。
（８）Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼ及びＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼがともに、エルウニア属に属する同一微生物由来の酵素であることを特徴とする、上記（１）〜（５）又は（７）のいずれかに記載の製造方法。
（９）微生物がエルウニア・サイプリペデイに属する微生物であることを特徴とする、上記（８）に記載の製造法法。
（１０）以下の酵素学的性質を有することを特徴とする、Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼ。
（ａ）作用：Ｎ−ホルミルホモセリンラクトンをＮ−ホルミルホモセリンに加水分解する。
（ｂ）基質特異性：Ｎ−ホルミルホモセリンラクトンの他、ホモセリンラクトンにも作用する。
（ｃ）至適温度：４５〜５５℃
（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ６〜７
（ｅ）温度安定性：〜４０℃
（ｆ）ｐＨ安定性：ｐＨ６から９
（ｇ）分子量：ベックマン・ウルトラスフェロゲル ＳＥＣ３０００ （７．５ｍｍ×３０ｃｍ）カラムを用いたゲルパーミエイションクロマトグラフィーにて約９７，０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて２９，０００
（１１）エルウニア属に属する微生物を培地に培養し、菌体若しくは培養物からＮ−アシルホモセリンラクトナーゼを採取することを特徴とする、上記（１０）に記載のＮ−アシルホモセリンラクトナーゼの製造方法。
（１２）エルウニア属に属する微生物が、エルウニア・サイプリペデイに属する微生物であることを特徴とする、上記（１１）に記載の製造方法。
（１３）ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンに上記（１０）に記載の酵素あるいは該酵素含有物を接触させることを特徴とする、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンの製造方法。
（１４）上記（１）〜（９）のいずれか記載の製造法において、さらにＬ−ホモセリンを脱水環化することを特徴とする、Ｌ−ホモセリンラクトンの製造法。
（１５）Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼを含有することを特徴とする、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンのラクトン環開環剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、医薬品又は化学薬品の製造原料として有用なＬ−ホモセリンあるいはＬ−ホモセリンラクトンを、極めて安価なＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンから簡便、かつ効率的に製造することが可能となる。特に本発明の菌株であるエルウニア・サイプリペデイ３１４Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５）株は、上記ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンからＬ−ホモセリン製造に関与するＮ−アシルホモセリンラクトナーゼとＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼをともに保有しているので、該菌株の菌体あるいは培養処理物の使用により、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンからＬ−ホモセリンへの変換は、さらに簡便、効率的になり、Ｌ−ホモセリンの生産性向上に大いに寄与する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】エルウニア・サイプリペデイ３１４Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５）から調製した粗酵素液をＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリンラクトンに作用させた場合における、Ｌ−ホモセリン濃度の経時変化を測定した結果を示すグラフである。
【図２】Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼに本発明のＮ−アシルホモセリンラクトナーゼを組み合わせて、ＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリンラクトンに作用させた場合における、Ｌ−ホモセリン濃度の経時変化を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明におけるＬ−ホモセリンの製造法は、図１にその概要が示され、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンに本発明のＮ−アシルホモセリンラクトナーゼ及びＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼを作用させて、Ｌ−ホモセリンを製造するものである。上記Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼ及びＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼは、Ｎ−アシルホモセリンラクトンに同時に接触させてもよいし、また、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンにＮ−アシルホモセリンラクトナーゼを作用させ、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンに変換後、生成物を単離あるいは単離しないでさらにＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼを作用させてもよい。
【００１１】
上記ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンは、安価なホモセリンラクトンを原料として化学合成法によりアシル化することにより、大量かつ安価に製造でき、しかも、上記ホモセリンラクトンにおいては、ホモセリンの水酸基が分子内ラクトン環の形成により保護されているので、ＤＬ-ホモセリンを原料とした場合のように、Ｏ−アシル化反応が起こらないため、Ｏ−アシル化ホモセリンの除去等の操作の必要性はなくなる。したがって、このようなＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンを使用する酵素反応系により、Ｌ−ホモセリンを効率的かつ安価に製造できる。
本発明において用いるＮ−アシルホモセリンラクトナーゼは新規酵素であり、アシル基がホルミル基のような短鎖のＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンを基質として、ラクトン環を加水分解により開環し、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンに変換する酵素である。
【００１２】
本発明のＮ−アシルホモセリンラクトナーゼは、エルウニア属に属する微生物由来のものである。該微生物をより具体的に示すと、例えば、エルウニア・サイプリペデイに属する微生物が挙げられ、代表的な該酵素産生菌株としては、エルウニア・サイプリペデイ３１４Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５）が挙げられる。
エルウニア・サイプリペデイ３１４Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５）は、短鎖ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンに作用するＮ−アシルホモセリンラクトナーゼ生産菌の探索中、保存菌株に見出されたものである。本菌株の菌学的性質は、特許公報（特許第３９２８０４６号）に記載されており、本発明に係る微生物は、この菌学的性質を指標として、土壌、河川水、湖沼水、汚泥などから、Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼ活性に基づき、平板分離法や集積培養法などのスクリーニングを行うことにより得ることができる。
【００１３】
本発明におけるＮ−アシルホモセリンラクトナーゼ生産菌としては、上記エルウニア・サイプリペデイ３１４Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５）が好ましいが、これらの誘導株も同様に好ましい。「誘導株」とは、上記菌株から天然に又は化学的若しくは物理的処理によって誘導される菌株であって、依然としてＮ−アシルホモセリンラクトナーゼを生産する能力を保持あるいは向上した菌株を指す。微生物は、その培養条件（例えば培地組成、温度など）や、化学的若しくは物理的処理（例えばガンマ線照射など）によって変異が誘発されることが知られている。本発明においては、Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼを生産する能力を保持する限り、そのような誘導株も好ましく用いることができる。
【００１４】
ある菌株がＮ−アシルホモセリンラクトナーゼを生産する能力は、例えば後記する実施例１に記載のように、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンに菌体抽出物あるいはパーミアブル菌体を作用させ、反応液中のＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンの濃度を測定することにより簡便に確認することができる。
一方、本発明においては、上記したように、Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼの作用により生成したＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンは、Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼの立体選択的脱アシル化作用により、Ｌ−アシルホモセリンのみが脱アシル化され、これによりＬ−ホモセリンが得られる。
【００１５】
本発明で使用するＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼは、例えば、バルクホルデリア属、ペニシリウム属あるいはエルウニア属由来の酵素であって、より具体的には、バルクホルデリアデリア・テラ３０８Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８７１）株、エルウニア・サイプリペデイ３１４Ｂ（ＦＥＲＭ−Ｐ１９１９５）株、ペニシリウム・シンプリシマム２０３Ｆ（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８６９）株、あるいはペニシリウム・グラブラム４６３Ｆ（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８７０）の産生酵素が好ましく、これらについては、本発明者の先の出願明細書（特願２０１０−０２６３９６）に記載されている。
【００１６】
本発明において上記Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼ産生微生物あるいはＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ産生微生物の培養法、培地組成等には一切の制限がなく、該酵素が効率的に生産されるものであれば、何れでも用いることができる。例えば、培地として、炭素源、窒素源、無機塩類を含有する培地を用いて、各種培養条件を用いて培養を行うことができる。炭素源としては、澱粉又はその組成画分、焙焼デキストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びアルファ澱粉等の炭水化物などを用いることができる。具体例としては、例えば、可溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘薯澱粉、デキストリン、アミロペクチン、アミロース等が挙げられる。窒素源としては、ポリペプトン、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー又は大豆若しくは大豆粕等の抽出物等の有機窒素源物質、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物を用いることができる。そして、無機塩類としては、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄等の鉄イオン含有化合物、リン酸カリウム塩、リン酸ナトリウム塩等のリン酸塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム塩、塩化ナトリウム等のナトリウム塩を用いることができる。また培地は、固体培地及び液体培地のいずれも使用することができる。
【００１７】
培養方法も特に限定されるものではなく、振盪培養、通気撹拌培養、静置培養などの公知の培養方法を用いることができる。また、温度、ｐＨ、培養期間等のその他の培養条件も、該微生物が生育し、該酵素活性を生産し得る条件であれば適宜選択されて培養が行われることが好ましい。例えば、培養は、振盪培養若しくは通気撹拌培養等の好気的条件下において、培地をｐＨ３〜９の範囲、好ましくはｐＨ５〜８に調整し、温度１０〜５０℃の範囲、好ましくは２０〜３０℃で実施し、通常１〜１５日間培養するのが望ましい。
また、本発明において使用するＮ−アシルホモセリンラクトナーゼ及びＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼの酵素形態は、精製酵素の形態でもよいが、菌体破砕物等の菌体処理物、あるいは培養物、培養処理物の形態でもよく、酵素として作用しうる形態であれば、何ら制限がない。
【００１８】
例えば微生物の菌体そのままの形態、これらの菌体あるいはその破砕物を適当な溶媒中に溶解若しくは懸濁した形態、あるいは微生物の菌体を保存可能なように凍結又は乾燥した形態で用いてもよく、さらに培養物を濾過、遠心分離して若しくは脱水して得た菌体にパーミアブル化等の処理を行って使用してもよいし、培養物を水等で希釈して使用してもよい。また、微生物の菌体あるいは培養物から粗酵素の形態で使用してもよいし、さらに精製したものを使用してもよい。Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼあるいはＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼの精製法それ自体公知の酵素精製法を用いることが可能であり、例えば、菌体破砕物から菌体を除去後、硫安分画法等を用いて酵素濃縮後、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等を適宜組み合わせて行うことができるが、微生物の菌体あるいはその培養物からのＮ−アシルホモセリンラクトナーゼあるいはＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼの抽出法や精製法等の形態には、何ら限定されない。
【００１９】
また、Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼあるいはＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ、又はこれら酵素を含有する菌体を不溶性の担体に固定化して用いても良い。このような形態は、当技術分野で公知の方法に従って適宜調整することができる。また、使用する微生物の菌体又はそれから抽出したＮ−アシルホモセリンラクトナーゼの量、及び共存させるＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼの量は、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンの存在量などを考慮して、望ましい結果が得られるように決定することもできる。
さらに、Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼによるＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンの加水分解とそれに続くＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼによるＬ−Ｎ−アシルホモセリンの立体選択的脱アシル化をさらに効率的に行うために、他の追加成分を使用してもよく、そのような追加成分としては、限定するものではないが、硫酸コバルトや塩化亜鉛等の塩類が挙げられる。
【００２０】
本発明においては、Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼによるＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンのラクトン環開環とそれに続くＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼによるＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンの立体選択的脱アシル化を別工程として２段階に分けて行ってもよいが、本発明においては、Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼとＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼを同一反応容器中に共存させて、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンに上記両酵素を接触させ、そのラクトン環の開裂とそれに続くＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンの立体選択的脱アシル化反応を同時に進行させて、一段階でＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンからＬ−ホモセリンを製造することが可能となり、大幅な効率アップが図れる。
【００２１】
さらに、上記したことから明らかなように、本発明のＮ−アシルホモセリンラクトナーゼを産生するエルウニア属微生物は、Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼも産生する。したがって、本発明において、このエルウニア・サイプリペデイ３１４Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５）株の上記両酵素を含有する粗酵素、菌体処理物、あるいは培養物、培養処理物等をＮ−アシルホモセリンラクトンを作用させることにより、一段階でＬ−ホモセリンを生産することが可能となる。この一段階法に用いる酵素の形態にも何ら制限がなく、上記で例示した酵素形態は、精製酵素の形態を除き、いずれも用いることができる。
【００２２】
以上の酵素反応により、Ｌ−ホモセリンとＤ−Ｎ−アシルホモセリンを含む懸濁液が得られるので、通常の単離・精製方法、例えば遠心分離や濾過、タンパク質又は核酸分解試薬を使用して、微生物菌体及びそれに由来する成分を取り除く。続いて、生成したＬ−ホモセリンとＤ−Ｎ−アシルホモセリンは、イオン交換クロマトグラフィー等により容易に分離できる。更に必要に応じて、再結晶、再沈殿、クロマトグラフィー等の当技術分野で公知の任意の方法を単独で又は組み合わせて用いることによりＬ−ホモセリンを精製することができる。
【００２３】
このようにして製造されるＬ−ホモセリンは、光学純度（鏡像体過剰率）が高い。例えば、Ｌ−ホモセリンの鏡像体過剰率は、約７０％ｅ．ｅ．以上、好ましくは約８０％ｅ．ｅ．以上、より好ましく約９０％ｅ．ｅ．以上、最も好ましくは９５％〜１００％ｅ．ｅ．である。
また、ホモセリンとホモセリンラクトンは平衡混合物として存在し、この平衡は、酸性条件下ではホモセリンラクトン方向に、そしてアルカリ性条件ではホモセリンの方向に傾くことが知られている。したがって、上述のようにして得られたＬ−ホモセリンを酸性条件下での還流などの公知の方法で脱水環化することによって、Ｌ−ホモセリンラクトンを製造することができる。例えば、２規定濃度の塩酸で、２時間の煮沸処理を行うことによりＬ−ホモセリンはＬ−ホモセリンラクトンに変換することができる。
【００２４】
しかしながら、本製造方法においては、Ｌ−ホモセリンからＬ−ホモセリンラクトンを製造する公知の方法であれば特に限定されるものではない。
以上のようにして、本発明に係る微生物又はそれから抽出したＮ−アシルホモセリンラクトナーゼを用いることにより、簡便かつ効率的にＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンよりＬ−ホモセリン及びＬ−ホモセリンラクトンを製造できる。
また、本発明のＮ−アシルホモセリンラクトナーゼ及びその含有物は、ＤＬ−Ｎ−アシルホモセリンラクトンのラクトン環の開環剤として有用である。
【００２５】
本開環剤の形態は特に限定されず、微生物の菌体そのままの形態、菌体破砕物、これらを溶媒中に溶解若しくは懸濁した形態、あるいは微生物の菌体を保存可能なように凍結又は乾燥した形態、透過性を増すために微生物菌体を有機溶剤等で処理した形態、更にはこれらを不溶性担体に固定化した形態など、任意の形態をとることができる。また、該菌体を含む培養物、及び抽出あるいはさらに精製したＮ−アシルホモセリンラクトナーゼについても、同様に任意の形態をとりうる。このような形態は、当技術分野で公知の方法に従って適宜調整することができる。
また、本開環剤は、他の成分を含んでもよい。他の成分は、微生物の菌体又はそれから抽出したＮ−アシルホモセリンラクトナーゼの分解能を損なわないものであれば特に限定されるものではなく、例えば、リン酸塩などのｐＨ調整剤、酵母エキスやビオチンなどの賦活剤、カルボキシメチルセルロースや乳糖などの賦形剤等が挙げられる。
以下、本説明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
実施例１
保存菌株を下記の培地に接種し、３０℃で震盪培養した。菌体を集め、ガラスビーズ法で菌体を破砕し、無細胞抽出物を得、粗酵素液とし、Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼ活性を測定した。
培地：コハク酸  ２０．０、ＫＨ２ＰＯ４  ３．０、硫酸アンモニウム  ２．０、酵母エキス  １．０、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．３、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．１、ＮａＣｌ  ０．１ｇ／ｌ，ｐＨ５．０
［活性測定法］１００ｍＭのＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリンラクトンを含む１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液
（ｐＨ６．５）２００μｌを３７℃で３分間加温した後、酵素液５０μｌを加え、反応を開始した。３７℃で３０分間反応後、沸騰水浴上に１分間置き、反応を停止した。遠心により不溶物を除いた後、生成したＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリンをＧＬサイエンス社製イナートシルＯＤＳ−３カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで定量した。酵素１Ｕは、上記の反応条件下で、１分間に１μｍｏｌｅのＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリンを遊離する酵素量とした。
供試した保存菌株のうち、エルウニア・サイプリペデイ３１４Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５）が、０．９２Ｕ／ｍｌ，０．２９Ｕ／ｍｇ蛋白の活性を示した。
【００２７】
実施例２
実施例１で調製したエルウニア・サイプリペデイ３１４Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５）の粗酵素液のＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ活性を測定したところ、０．５０Ｕ／ｍｌ，０．１５Ｕ／ｍｇ蛋白の活性が検出された。また、生成したＬ−ホモセリンの光学純度（鏡像体過剰率）は、９９％ｅ．ｅ．以上であった。なお、Ｎ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ活性の測定は、下記の方法に拠った。
［活性測定法］２５ｍＭのＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリンを含む１２５ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）２００μｌと５ｍＭ  ＣｏＳＯ４  ５μｌを混じ、３７℃で３分間加温した後、酵素液４５μｌを加え、反応を開始した。３７℃で３０分間反応後、沸騰水浴上に１分間置き、反応を停止した。遠心により不溶物を除いた後、生成したホモセリンのＤ−体とＬ−体それぞれを光学分割カラム［ダイセル化学工業社製、ＣｒｏｗｎＰａｋ  ＣＲ  （＋）］を用いた高速液体クロマトグラフィーで定量した。酵素１Ｕは、上記の反応条件下で、１分間に１μｍｏｌｅのＬ−ホモセリンを遊離する酵素量とした。
【００２８】
実施例３
実施例１の培地を用いてエルウニア・サイプリペデイ３１４Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５）を３０℃で１５時間、振盪培養した。菌体を遠心により集め、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で二回洗浄した後、Ｂｒａｕｎ社製ＭＳＫセルホモゼェナイザーで破砕、遠心後の上清を粗酵素液とした。この粗酵素液から以下の操作によりＮ−アシルホモセリンラクトナーゼを精製した。先ず、粗酵素液に対し硫安を３０％飽和となるように加え夾雑物を沈殿させ、遠心により除去した。上清液に対して更に硫安を６０％飽和となるように加えた。沈殿した酵素を遠心により集め、１．２Ｍの硫安を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）に再溶解し、同じ緩衝液で平衡化したブチルトヨパールカラムに供した。吸着された活性画分を、移動相中の硫安濃度を直線的に低下させることにより溶離した。得られた活性画分を１０％のエチレングリコールを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した後、同じ緩衝液で平衡化したフラクトゲルＥＭＤ  ＤＥＡＥカラムに吸着させ、次いで移動相中にＮａＣｌを直線的に加えることにより溶出させた。得られた活性画分を１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラムを通過させ夾雑蛋白質を除いた後、１０％のエチレングリコールを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ  ＭｅｍＳｅｐ１０００カラムに吸着させ、移動相中にＮａＣｌを直線的に加えることにより、目的酵素を溶出させた。このようにして得られた酵素標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを与えた。この一連の精製操作によりＮ−アシルホモセリンラクトナーゼは、３３０倍に精製された。
【００２９】
得られたＮ−アシルホモセリンラクトナーゼの酵素学的性質は以下に示される。
（ａ）Ｎ−ホルミルホモセリンラクトンに対するＫｍ値は１７．６ｍＭ、Ｖｍａｘ値は３６９  Ｕ／ｍｇ。
（ｂ）基質特異性：Ｎ−ホルミルホモセリンラクトンの他、ホモセリンラクトンにも作用する。ホモセリンラクトンに対するＫｍ値は３３．６ｍＭ、Ｖｍａｘ値は８８７Ｕ／ｍｇ。（Ｓ）−５−オキソ−２−テトラヒドロフランカルボン酸、（Ｒ）−５−オキソ−２−テトラヒドロフランカルボン酸、２−オキソテトラヒドロフラン−４，５−ジカルボン酸に作用しない。
（ｃ）至適温度：４５〜５５℃
（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ６〜７
（ｅ）温度安定性：ｐＨ７において４０℃までの温度に１０分間保っても、９５％以上の活性が残存。
（ｆ）ｐＨ安定性：４℃においてｐＨ６から９に２４時間保っても９５％以上の活性が残存。
（ｇ）分子量:ベックマン・ウルトラスフェロゲル  ＳＥＣ３０００（７．５ｍｍ×３０ｃｍ）カラムを用いたゲルパーミエイションクロマトグラフィーにて約９７，０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて２９，０００。
（ｈ）阻害剤・賦活剤など：Ｏ-フェナンスロリン、２，２’−ビピリジル、ＥＤＴＡにより弱程度（＜２０％）、ＡｇＮＯ３、Ｎ−ブロモスクシンイミドにより強程度（＞９０％）の阻害を受ける。ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオライド）、ヒドロキシアミン、ＣｏＳＯ４、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＮｉＳＯ４、ＺｎＣｌ２で阻害・賦活されない。
上記の通り、本酵素は特許公報（特許第３９２８０４６号）記載のラクトナーゼと基質特異性、分子量などの諸性質を異にし、別の酵素であることが明かである。
【００３０】
実施例４
実施例３と同様にエルウニア・サイプリペデイ３１４Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５）から粗酵素液を調製した。この粗酵素液を０．１ｍＭのＣｏＳＯ４を含む１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において３７℃で１００ｍＭのＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリンラクトンに作用させた。経時的に反応液を採取し、Ｌ−ホモセリンを定量した。図１に示す通り、Ｎ−ホルミルホモセリンラクトンからＬ−ホモセリンが生成した。
【００３１】
実施例５
１）実施例１に示す培地でペニシリウム・シンプリシシマム２０３Ｆを培養した。菌体を濾過により集め、５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で二回洗浄した後、Ｂｒａｕｎ社製ＭＳＫセルホモゼェナイザーで破砕、遠心後の上清を粗酵素液とした。この粗酵素液に対し硫安を１．７Ｍとなるように加えた。沈殿した夾雑物を遠心により除いた後、１．７Ｍの硫安を含む５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したブチルトヨパールカラムに供した。吸着された活性画分を、移動相中の硫安濃度を直線的に低下させることにより溶離した。得られた活性画分を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した後、同じ緩衝液で平衡化したフラクトゲルＥＭＤ  ＤＥＡＥカラムに吸着させ、次いで移動相中にＮａＣｌを直線的に加えることにより溶出させた。得られた活性画分を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した後、同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ  ＭｅｍＳｅｐ１０００カラムに吸着させ、移動相中にＮａＣｌを直線的に加えることにより溶出させた。得られた活性画分を１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラムに吸着させ、移動相中のリン酸濃度を直線的に上げることにより、目的酵素を溶出させた。この一連の精製操作によりＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼは、４５０倍に精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを与えた。本アシラーゼの性質を以下に示す。
【００３２】
（ａ）Ｎ−ホルミルホモセリン対するＫｍ値は７９．８ｍＭ、Ｖｍａｘ値は３６８Ｕ／ｍｇ。
（ｂ）基質特異性：  Ｎ−アセチルホモセリン（２９％）、Ｎ−アセチルアラニン（１３％）、Ｎ−アセチルグルタミン酸（１１％）にも弱く作用する。尚、（）内の数字は、Ｎ−ホルミルホモセリンに対する活性を１００％とした場合の相対活性である。Ｎ−アセチルフェニルアラニンやＮ−アセチルペニシラミンには作用しない。
（ｃ）至適温度：５５〜６５℃
（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ８〜９
（ｅ）温度安定性：ｐＨ７において５０℃までの温度に１０分間保っても、９５％以上の活性が残存。
（ｆ）ｐＨ安定性：４℃においてｐＨ６．５から８．５に２４時間保っても９５％以上の活性が残存。
（ｇ）分子量:ベックマン・ウルトラスフェロゲル  ＳＥＣ３０００（７．５ｍｍ×３０ｃｍ）カラムを用いたゲルパーミエイションクロマトグラフィーにて約８４，０００、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて３７，０００。
（ｈ）阻害剤・賦活剤など：  ＮｉＳＯ４、２，２”−ビピリジルにより弱程度（＜２０％）、ＭｎＣｌ２、ＡｇＮＯ３、ＥＤＴＡ、Ｎ−ブロモスクシンイミドにより強程度（＞９０％）の阻害を受ける。ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオライド）、ヒドロキシアミンで阻害・賦活されない。ＣｏＳＯ４、ＺｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２により、それぞれ、１．９、１．４、１．１倍に賦活される。
【００３３】
２）１００ｍＭのＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリンラクトンと０．１ｍＭのＣｏＳＯ４を含む１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に、上記１）で精製したＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼおよび上記実施例３で得たＮ−アシルホモセリンラクトナーゼをそれぞれ０．２Ｕ／ｍｌおよび１．２Ｕ／ｍｌとなるように加え、３７℃でインキュベートした。経時的に反応液を採取し、Ｌ−ホモセリンを定量した。その結果を図２に示す。図２よりＮ−アシルホモセリン−Ｌ−アシラーゼ活性は０．２Ｕ／ｍｌと算出され、ＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリンラクトンからのＤＬ−Ｎ−ホルミルホモセリンの供給が律速になっていないこと、即ち、Ｎ−アシルホモセリンラクトナーゼの効果が実証された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明により、Ｌ−ホモセリンの簡便な製造法が提供される。この方法を利用して健康補助食品、医薬品又は化学薬品の製造原料として有用なＬ−ホモセリン及びＬ−ホモセリンラクトンを簡便かつ効率的に製造することができる。
【受託番号】
【００３５】
ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８６９
ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８７０
ＦＥＲＭ  Ｐ−２１８７１
ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１９５
【図１】
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【図２】
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