(57)【要約】【課題】染色前提の従来の病理診断プロセスを変更せず、同一の試料を用いて、染色画像と分光イメージング画像とを取得し、病理診断の診断精度を向上する。【解決手段】染色された生体試料中に存在する染色色素構造を規定する分光スペクトルを有する第１の分光データセット、生体試料、染色色素およびその他の含有物を含む分光スペクトルである第２の分光データセットを取得するステップＳ２２，Ｓ２３と、データベースから、第１の分光データセットと最も近似する分光スペクトルを有する染色条件を選択するステップＳ２４と、分光データベースから、選択された染色条件に対応する染色色素の分光スペクトルを選択するステップＳ２５と、分光リファレンスを作成するステップＳ２６と、分光リファレンスを用いた数学処理により、第２の分光データセットから染色色素および含有物の分光スペクトルを除去するステップＳ２７とを含むスペクトル抽出方法を提供する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色された生体試料中に存在する染色色素構造を規定する分光スペクトルを有する第１の分光データセットおよび前記生体試料、染色色素およびその他の含有物を含む分光スペクトルである第２の分光データセットを取得するデータ取得ステップと、
前記第１の分光データセットと同一の取得方法で予め取得された前記染色色素自体の分光スペクトルを染色条件毎に記憶する第１の分光データベースから、前記データ取得ステップにおいて取得された前記第１の分光データセットと最も近似する分光スペクトルを有する染色条件を選択する条件選択ステップと、
前記第２の分光データセットと同一の取得方法で予め取得された前記染色色素自体の分光スペクトルを染色条件毎に記憶する第２の分光データベースから、前記条件選択ステップにおいて選択された染色条件に対応する前記染色色素の分光スペクトルを選択する分光スペクトル選択ステップと、
該分光スペクトル選択ステップにおいて選択された前記染色色素の分光スペクトルおよび前記第２の分光データセットと同一の取得方法で予め取得された前記含有物の分光スペクトルから分光リファレンスを作成するリファレンス作成ステップと、
該リファレンス作成ステップにおいて作成された分光リファレンスを用いた数学処理により、前記データ取得ステップにおいて取得された前記第２の分光データセットから前記染色色素および前記含有物の分光スペクトルを除去するスペクトル精製ステップとを含むスペクトル抽出方法。
【請求項２】
前記第１の分光データセットに含まれる前記分光スペクトルが、前記染色色素の吸収波長帯域を含む前記染色色素の吸収スペクトルおよび前記染色色素の吸収波長帯域の励起光による励起ラマンスペクトルの少なくとも１つである請求項１に記載のスペクトル抽出方法。
【請求項３】
前記染色色素が、ヘマテインおよびエオジンであり、前記吸収波長帯域が、４００〜７００ｎｍである請求項２に記載のスペクトル抽出方法。
【請求項４】
前記第２の分光データセットに含まれる前記分光スペクトルが、前記生体試料の近赤外光励起ラマンスペクトル、赤外吸収スペクトル、紫外光励起ラマンスペクトルおよび表面増強ラマンスペクトルの少なくとも１つである請求項１から請求項３のいずれかに記載のスペクトル抽出方法。
【請求項５】
前記染色条件が、染色液のｐＨ、媒染剤の金属イオンの種類および濃度、および染色色素が結合するカウンタ生体分子の種類の少なくとも１つである請求項１から請求項４のいずれかに記載のスペクトル抽出方法。
【請求項６】
前記含有物が、パラフィン、ヨウ素酸イオン、抱水クロラール、グリセリン、エチレングリコールおよびキシレンの少なくとも１つである請求項１から請求項５のいずれかに記載のスペクトル抽出方法。
【請求項７】
染色された生体試料の各位置において、請求項１から請求項６のいずれかに記載のスペクトル抽出方法により抽出された生体試料由来の分光スペクトルからスペクトル分類を行って分光画像を生成する分光画像生成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料のスペクトル抽出方法および分光画像生成方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、病院の臨床検査の一つに癌などの確定診断を下す病理検査として、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色した組織（または細胞）の明視野観察画像から、組織（または細胞）の形態的な情報に基づいて診断することが一般に行われている。このＨＥ染色は、患者から切り取った病変部の生体組織に対して、顕微鏡での観察に適するように化学的な前処理を施した後に、該組織を切片化したものに対して行われる。しかし、このＨＥ染色した組織（または細胞）の形態的な情報に基づく診断は、その診断精度が診断者の経験や感覚などの主観要素に依存するという問題がある。
【０００３】
そこで、より客観的な生化学情報を診断に利用するために、分光学によって組織に存在する化学物質（分子種、細胞種など）を同定した上で、該物質の分布画像を病理診断に利用する方法（ケミカルイメージング法）が提案されている。ケミカルイメージング法としては、組織（細胞）に含まれる蛋白質や核酸などの生体分子の分子振動に起因する、赤外吸収スペクトルもしくはラマン散乱スペクトルが、分子毎に異なる性質を利用して、試料における化学種の分布をイメージングする振動分光イメージング法が提案されている（特許文献１および非特許文献１参照）。
【０００４】
特許文献１においては、凍結組織から切り出した隣接組織切片の一方をＨＥ染色し、他方について振動分光イメージングを行うこととしている。一方、非特許文献１においては、凍結組織から切り出した組織切片に対して振動分光イメージングを行った後に、同じ組織切片にＨＥ染色を行うこととしている。
【０００５】
ＨＥ染色では、まず患者から採取された生検組織がホルマリン処理され、組織内の蛋白質の構造が安定化されることにより標本の品質保存が図られる。その後、組織はエタノール、キシレンで脱水され、パラフィンを浸透させられた後に薄切化される。さらに切片化された組織に対して、染色色素（ヘマトキシレン、エオジン）による染色処理がなされる。
【０００６】
このように、ＨＥ染色が施された試料においては、生体組織に本来存在する化学物質（生体分子）と染色に伴う化学物質が混在している。したがって、上記のいずれの場合においても、ＨＥ染色の染色色素（ヘマトキシリン由来化学成分である、へマテイン金属錯体とエオジン）および染色に必要な化学処置に伴う残留化学物質が振動分光イメージングに影響を与えないように、ＨＥ染色が施されていない試料に対して分光情報の取得が行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７７０１５７３号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （２００５）  Ｖｏｌ．２３，Ｎｕｍ．４，ｐ４６９−４７４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特許文献１では、隣接組織切片における化学組成（分子分布）はほぼ同一という仮定を前提としているが、切片状態（厚みや部位）によっては、隣接組織の分子分布が必ずしも同一でない場合があり得る。またＨＥ染色による診断とは別に、他の染色手法（例えば免疫化学染色）が隣接組織切片に適用される場合があるが、その場合には分光イメージング像を取得するために隣接組織切片が利用できないという問題が生じる。
【００１０】
また、非特許文献１では、ＨＥ染色画像と分光イメージング画像が取得される試料の化学同一性は担保されるが、ＨＥ染色前に分光イメージングする手数を追加する必要があり、従来のＨＥ染色を前提とした病理診断プロセスを変更しなければならないという不都合がある。また、振動分光イメージングが、その後にＨＥ染色される組織切片の状態に影響を与えないように、測定条件（光源の波長や強度、照射時間等）が制限されるという不都合がある。
【００１１】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、染色を前提とした従来の病理診断プロセスを変更することなく、同一の試料を用いて、染色画像と分光イメージング画像とを取得し、病理診断の診断精度を向上することができる生体試料のスペクトル生成方法および分光画像生成方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、染色された生体試料中に存在する染色色素の分子構造を規定する分光スペクトルを有する第１の分光データセットおよび前記生体試料、染色色素およびその他の含有物を含む分光スペクトルである第２の分光データセットを取得するデータ取得ステップと、前記第１の分光データセットと同一の取得方法で予め取得された前記染色色素自体の分光スペクトルを染色条件毎に記憶する第１の分光データベースから、前記データ取得ステップにおいて取得された前記第１の分光データセットと最も近似する分光スペクトルを有する染色条件を選択する条件選択ステップと、前記第２の分光データセットと同一の取得方法で予め取得された前記染色色素自体の分光スペクトルを染色条件毎に記憶する第２の分光データベースから、前記条件選択ステップにおいて選択された染色条件に対応する前記染色色素の分光スペクトルを選択する分光スペクトル選択ステップと、該分光スペクトル選択ステップにおいて選択された前記染色色素の分光スペクトルおよび前記第２の分光データセットと同一の取得方法で予め取得された前記含有物の分光スペクトルから分光リファレンスを作成するリファレンス作成ステップと、該リファレンス作成ステップにおいて作成された分光リファレンスを用いた数学処理により、前記データ取得ステップにおいて取得された前記第２の分光データセットから前記染色色素および前記含有物の分光スペクトルを除去するスペクトル精製ステップとを含むスペクトル抽出方法を提供する。
【００１３】
本発明によれば、データ取得ステップにより第１の分光データセットと第２の分光データセットとが取得され、条件選択ステップにおいて第１の分光データベース内の分光スペクトルと第１の分光データセット内の分光スペクトルとが対比され、分光スペクトルどうしが最も近似する分光スペクトルを有する染色条件が選択される。第２の分光データベースには、染色条件毎に第２の分光データセットと同一の取得方法で取得された染色色素自体の分光スペクトルが記憶されているので、分光スペクトル選択ステップにおいて、第２の分光データベース内から、選択された染色条件に対応する染色色素の分光スペクトルが選択される。
【００１４】
そして、リファレンス作成ステップにおいて、選択された染色色素の分光スペクトルおよびその他の含有物の分光スペクトルから分光リファレンスが作成されるので、スペクトル精製ステップにおいて、分光リファレンスを用いた数学処理が行われることにより、染色を施された生体組織の分光スペクトルである第２の分光データセットから、染色色素および染色化学処理にともなう夾雑物質の分光スペクトルが除去され、病理分析を行いたい生体試料のみの分光スペクトルを抽出することができる。
【００１５】
すなわち、本発明によれば、組織切片等の生体試料を染色して形態的な情報に基づく診断を行った後の染色後の生体試料から、生体試料内に染色色素や組織切片を作成するための含有物が存在していても、生体試料のみの分光スペクトルを抽出することができる。
その結果、染色を前提とした従来の病理診断プロセスを変更することなく、同一の試料を用いて、染色画像と分光イメージング画像とを取得し、染色画像に基づく形態情報と分光イメージング画像に基づく生化学情報を取得することで、病理診断の診断精度を向上することができる。
【００１６】
上記発明においては、前記第１の分光データセットに含まれる前記分光スペクトルが、前記染色色素の吸収波長帯域を含む前記染色色素の吸収スペクトルおよび前記染色色素の吸収波長帯域の励起光による励起ラマンスペクトルの少なくとも１つであってもよい。
また、上記発明においては、前記染色色素が、ヘマトキシリン酸化物であるヘマテインおよびエオジンであり、前記吸収波長帯域が、４００〜７００ｎｍであってもよい。
【００１７】
また、上記発明においては、前記第２の分光データセットに含まれる前記分光スペクトルが、前記生体試料の近赤外光励起ラマンスペクトル、赤外吸収スペクトル、紫外光励起ラマンスペクトルおよび表面増強ラマンスペクトルの少なくとも１つであってもよい。
また、上記発明においては、前記染色条件が、染色液のｐＨ、媒染剤における金属イオンの種類もしくは濃度、および染色色素が結合するカウンタ生体分子の種類の少なくとも１つであってもよい。
【００１８】
また、上記発明においては、前記含有物が、パラフィン、ヨウ素酸イオン、抱水クロラール、グリセロール、エチレングリコールおよびキシレンの少なくとも１つであってもよい。
このようにすることで、生体試料を切片化する際に供給されるパラフィンが残存していたり、ＨＥ染色由来の夾雑物であるヨウ素酸イオン、抱水クロラールおよびキシレンが残存していても、これらの影響を除去して生体組織自体の分光スペクトルを取得することができる。
【００１９】
また、本発明は、染色された生体試料の各位置において、上記いずれかのスペクトル抽出方法により抽出された生体試料由来の分光スペクトルからスペクトル分類を行って分光画像を生成する分光画像生成方法を提供する。
本発明によれば、従来の染色による生体組織の形態的な情報に基づく診断に加えて、分光学によって組織に存在する化学物質を同定した分光画像により、さらに精度の高い病理診断を行うことが可能となる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、染色を前提とした従来の病理診断プロセスを変更することなく、同一の試料を用いて、染色画像と分光イメージング画像とを取得し、病理診断の診断精度を向上することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施形態に係る分光画像生成方法を説明するフローチャートである。
【図２】図１の分光画像生成方法における染色画像取得処理を説明するフローチャートである。
【図３】図１の分光画像生成方法における分光画像取得処理を説明するフローチャートである。
【図４】図３の区画ステップを説明する図である。
【図５】図３の第１のデータセット取得ステップにより取得される第１のデータセットの一例を示す図である。
【図６】図３の第２のデータセット取得ステップにより取得される第１のデータセットの一例を示す図である。
【図７】図３の条件選択ステップにおいて使用される分光データベースの一例を示す図である。
【図８】図３のリファレンス作成ステップにより作成される分光リファレンスの一例を示す図である。
【図９】図１の分光画像生成方法により取得された分光画像の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の第１の実施形態に係る生体試料のスペクトル抽出方法および分光画像生成方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体試料のスペクトル抽出方法は、図１に示されるように、生体試料としての組織切片のＨＥ染色画像を取得する染色画像取得処理Ｓ１の後に行われる分光画像取得処理Ｓ２において実施されるものである。
【００２３】
染色画像取得処理Ｓ１は、図２に示されるように、病理標本作成ステップＳ１１と、染色ステップＳ１２と、撮影ステップＳ１３と、基準設定ステップＳ１４とを含んでいる。
病理標本作成ステップＳ１１は、患者から採取した生検組織をホルマリンやエタノールで固定化し、エタノールおよびキシレンで脱水し、パラフィンを包埋した後に切片化し、生成された組織切片に対してキシレン洗浄することにより脱パラフィン化し、最後にエタノール洗浄するようになっている。
【００２４】
染色ステップＳ１２は、病理標本作成ステップＳ１１において生成された組織切片をスライド上に載置した状態で、ヘマトキシリン染色液で染色し、流水洗浄した後、エオジン染色するようになっている。
ヘマトキシリン染色液は一般に、染色色素となるヘマトキシリンとアルカリ金属の水和物を含むミョウバン（媒染剤）と、酸化剤であるヨウ素酸ナトリウム、その他にクロラールの混合溶液である。
【００２５】
染色時においてヘマトキシリンはヘマテインへと酸化され、媒染材の金属イオンとヘマテイン金属錯体を形成し、さらに細胞核（核酸）のリン酸基と結合して核を染色する。また、エオジン染色液は、エオジンとエタノールもしくは酢酸の混合溶液であり、エオジンは蛋白質中の正荷電したアミノ酸残基と結合して細胞質や間質（蛋白質）を染色する。
【００２６】
撮影ステップＳ１３は、染色ステップＳ１２においてスライド上に得られた染色された組織切片に可視光を照射して組織切片の明視野画像を取得する。これにより、組織切片の形態的な特徴により病理診断を行うことができるようになっている。
【００２７】
基準設定ステップＳ１４は、撮影ステップＳ１３において取得された明視野画像において、位置の基準となる基準点Ｐを設定する。これにより、明視野画像と、後に取得される分光画像とを空間的に対応づけることができる。
【００２８】
分光画像取得処理Ｓ２は、図３に示されるように、データを取得する区画を設定する区画設定ステップＳ２１と、第１の分光データセットを取得する第１のデータ取得ステップＳ２２と、第２の分光データセットを取得する第２のデータ取得ステップＳ２３と、取得された第１の分光データセットから染色条件を選択する条件選択ステップＳ２４と、選択された染色条件と第２の分光データセットとから染色色素の分光スペクトルを選択する分光スペクトル選択ステップＳ２５と、分光リファレンスを作成するリファレンス作成ステップＳ２６と、作成された分光リファレンスを用いた数学処理により、組織切片の分光スペクトルを抽出するスペクトル精製ステップＳ２７とを含んでいる。
【００２９】
区画設定ステップＳ２１は、図４に示されるように、基準設定ステップＳ１４において設定された基準点Ｐを基準として、組織切片Ａ上の領域を、升目状に区画された複数の小領域Ａ１，Ａ２…に区画するようになっている。
【００３０】
第１のデータ取得ステップＳ２２は、図５に示されるように、区画設定ステップＳ２１において区画された各小領域Ａ１，Ａ２…について、４００〜７００ｎｍの波長帯域を含む組織切片Ａの電子吸収スペクトル、または、４００〜７００ｎｍの波長帯域の励起光を照射して得られる組織切片Ａのラマンスペクトルの少なくとも一方の分光データ（第１の分光データセット）を取得するようになっている。
【００３１】
ここで、第１の分光データセットとして取得される、組織切片Ａの吸収スペクトルもしくはラマンスペクトルの特徴を以下に述べる。組織に含まれる生体由来物質のほとんどは、可視光領域に吸収を示さないか、もしくは非常に弱い吸収を示すだけであり、該領域に吸収を示す生体由来物質は、主として血液として残留するヘモグロビンである。
【００３２】
また、色素の吸収帯に波長を同調させてラマンスペクトルを励起すると、共鳴ラマン効果によって、そのような色素のみのラマンスペクトル強度が著しく強められる。染色された組織切片における物質濃度においては、ヘモグロビンに対して染色物質であるヘマテインとエオジン成分濃度が支配的である。
【００３３】
したがって、第１の分光データセットとして取得される吸収スペクトルもしくはラマンスペクトルは、組織切片Ａ中に存在するヘマテイン(ヘマテイン金属錯体)およびエオジン様の吸収スペクトルもしくはラマンスペクトルとほぼ同一である見なすことができる。この第１の分光データセットを取得することで、組織切片中の各小領域において存在する、へマテイン(ヘマテイン金属錯体)およびエオジンの分子構造を特徴付けることができる。
【００３４】
第２のデータ取得ステップＳ２３は、図６に示されるように、区画設定ステップＳ２１において区画された各小領域Ａ１，Ａ２…について、染色色素その他の夾雑物質を含む組織切片Ａの近赤外光励起ラマンスペクトル、赤外吸収スペクトル、紫外光励起ラマンスペクトルおよび表面増強ラマンスペクトルの少なくとも１つの分光データ（第２の分光データセット）を取得するようになっている。
【００３５】
ここで第２の分光データセットとして取得される、組織切片Ａのラマンスペクトルもしくは赤外吸収スペクトルの特徴を以下に述べる。これらのスペクトルにおいては、組織に含まれる生体由来物質、染色色素、およびＨＥ染色における化学処理にともなう夾雑物質のそれぞれが吸収もしくはラマン散乱を生じる性質を有し、それらの存在濃度に応じてスペクトル強度に寄与する。したがって第２の分光データセットにおける振動スペクトルは、生体由来分子と、染色色素とその他夾雑物からの振動スペクトルが重畳されたものである。
【００３６】
分光画像取得処理Ｓ２に先立って、分光データベースを用意しておく。
分光データベースは、（１）第１のデータベース：染色色素のへマテイン金属錯体（Ｈｍ＋Ｍ）およびエオジン（Ｅ）、（２）第２のデータベース：染色色素以外の複数の夾雑物質（パラフィン、ヨウ素酸イオン、抱水クロラール、グリセリン、エチレングリコールなど）のスペクトル情報を含んでいる。
【００３７】
へマテインの吸収スペクトルは、媒染剤に含まれる金属イオンの種類や濃度、または染色液のpHに依存して変化する。また同様にエオジンも染色液のpHに依存して変化する。またヘマテイン金属錯体およびエオジンへ結合するカウンタ分子(リン酸基を有する核酸や蛋白質中の正荷電したアミノ酸)の種類によっても変化しうる。
【００３８】
吸収スペクトルの変化は物質構造の変化に因るため、吸収帯励起のラマンスペクトルも吸収スペクトル同様に上記条件に依存している。したがって、使用する染色液の種類、すなわち媒染剤の種類やpＨによって、また染色された組織における各小領域の分子組成ごとに、へマテインとエオジンの吸収スペクトルおよびラマンスペクトルは異なっている。また、染色色素以外の夾雑物質は上記条件にほぼ依存しない。
【００３９】
ここで、図７に示されるように、（１）の第１のデータベースに含まれる、染色色素のスペクトルについては、多様な染色条件Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３…（例えば、染色液ｐＨを変化させた場合、媒染剤の金属イオン濃度を変化させた場合、色素が結合する、核酸やアミノ酸などのカウンタ生体分子毎）に対応づけて、第１分光データセットと同一の方法で測定されたスペクトル情報と、第２分光データセットと同一の方法で測定されたスペクトル情報とが記憶されている。
【００４０】
例えば、第１の分光データセットが組織切片の可視光励起のラマンスペクトルとして取得され、第２の分光データセットが近赤外光励起のラマンスペクトルとして取得される場合においては、第１のデータベースは可視光励起のラマンスペクトルデータおよび近赤外光励起のラマンスペクトルデータを必ず含んでいる。また、（２）の第２のデータベースに含まれる、染色色素以外の複数の夾雑物質については、第２分光データセットと同一の方法で測定されたスペクトル情報が記憶されている。
【００４１】
条件選択ステップＳ２４は、区画設定ステップＳ２１において設定された各小領域Ａ１，Ａ２…の位置において、第１のデータ取得ステップＳ２２において取得された第１のデータセットのスペクトルと最良の相関を有するヘマテイン・エオジンのスペクトルを予め用意された分光データベースから検索し、当該ヘマテイン・エオジンのスペクトルに対応づけられている各区画位置における染色条件（例えば、Ｃ３）を選択するようになっている。
【００４２】
上記相関は、例えば、第１の分光データセットのスペクトルと分光データベースのスペクトルについて、測定スペクトルのチャンネルごとのスペクトル強度の差の二乗和を計算し、概算術値の大きさが最小となる場合について、それぞれのスペクトルが最良の相関を有すると判定されればよい。あるいは、１個もしくは複数個の特定の振動バンド（ラマンバンドもしくは赤外吸収バンド）に着目し、バンドの振動数や強度を比較するか、それぞれのバンド強度の相対比によって相関が判定されてもよい。
【００４３】
このようにして、各小領域ごとにスペクトル情報に基づいて組織切片中のへマテイン金属錯体およびエオジンの分子構造が特徴付けられ、該構造を与える化学的条件である染色条件も決定される。
【００４４】
分光スペクトル選択ステップＳ２５は、条件選択ステップＳ２４において選択された染色条件（例えば、Ｃ３）に対応づけて分光データベースに記憶されている第２の分光データセットと同一の方法で測定された染色色素のスペクトル情報を、各小領域Ａ１，Ａ２…の位置に対して選択するようになっている。
リファレンス作成ステップＳ２６は、分光スペクトル選択ステップＳ２５において選択された、第２の分光データセットと同一の方法で測定された染色色素のスペクトル情報と、分光データベースに記憶されている、第２の分光データセットと同一の方法で測定された夾雑物質のスペクトル情報とを含む分光スペクトル群からなる分光リファレンスが作成される（図８参照。）。
【００４５】
スペクトル精製（抽出）ステップＳ２７は、第２のデータ取得ステップＳ２３において取得された、染色色素その他の夾雑物質を含む組織切片のスペクトル情報である第２の分光データセットと、リファレンス作成ステップＳ２６において作成された分光リファレンスとを用いて、例えば、ケモメトリクスのような数学処理を行うことにより、染色色素その他の夾雑物質が除去された組織切片Ａ中の各小領域Ａ１，Ａ２…の位置における生体分子由来のスペクトル情報を抽出するようになっている。
【００４６】
さらに具体的には、スペクトル精製ステップＳ２７においては、（ａ）作成された分光リファレンス中の分光スペクトルを、染色された組織切片についての成分スペクトルとして、ＣＬＳ（Classical least square fitting）解析をおこない、ＣＬＳ解析における残差項（残差のスペクトル）を生体分子由来の分光スペクトル情報とする方法や、（ｂ）生体分子由来の振動バンドに重畳しない領域で、染色色素その他の夾雑物質のバンド強度を参照しながら減算処理を行うことにより生体分子由来の分光スペクトル情報を抽出する方法が行われる。
【００４７】
そして、本実施形態に係る分光画像生成方法においては、スペクトル精製ステップＳ２７において抽出された、染色色素その他の夾雑物質のスペクトル成分が除去された各小領域Ａ１，Ａ２…の位置での生体分子由来の分光スペクトルを利用して、スペクトル分類を行うことにより、図９（ａ）〜（ｃ）に示されるように、同一のスペクトル分類に属する小領域Ａ１，Ａ２…を別々に集めることにより、組織切片の分光画像を取得するようになっている。
【００４８】
スペクトル分類の実施法は、例えば、任意に抽出した２個の小領域の生体分子由来の分光スペクトルに対して、ユークリッド距離（Euclidean distance）もしくは、マハラノビス距離（Mahalanobis distance）を計算し、さらに小領域のスペクトルにおける全ての２個のスペクトルの組み合わせについて該距離を計算した上で、分光スペクトル間の距離データにもとづいてHierarchial clustering法やK-means clustering法などの分類アルゴリズムを用いてスペクトル分類がおこなわれる。
【００４９】
このように、本実施形態に係る生体試料のスペクトル抽出方法および分光画像生成方法によれば、ＨＥ染色された組織切片を用いて、組織切片の作成時や染色時に付加された染色色素その他の夾雑物質のスペクトル成分を除去した生体分子由来の分光情報を抽出できる。したがって、分光イメージング画像の取得前に同一組織切片Ａに対してＨＥ染色による病理診断を行うことができ、染色を前提とした従来の病理診断プロセスを変更せずに済むという利点がある。
【００５０】
また、各小領域Ａ１，Ａ２…の位置は、ＨＥ染色画像において設定した基準点Ｐを基準として設定されているので、各小領域Ａ１，Ａ２…の位置におけるスペクトル情報は、ＨＥ染色画像における同一の小領域Ａ１，Ａ２…における形態的特徴と精度よく対応づけることができ、ＨＥ染色画像と分光イメージング画像の両方に基づいて、高精度の病理診断を行うことができる。
【００５１】
そして、同一の組織切片Ａを用いて、染色画像と分光イメージング画像とを取得するので、組織切片Ａの化学的な同一性を確実に担保し、病理診断の診断精度を向上することができるという利点がある。
【符号の説明】
【００５２】
Ａ  組織切片（生体試料）
Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３  染色条件
Ｓ２２  第１のデータセット取得ステップ（データ取得ステップ）
Ｓ２３  第２のデータセット取得ステップ（データ取得ステップ）
Ｓ２４  条件選択ステップ
Ｓ２５  分光スペクトル選択ステップ
Ｓ２６  リファレンス作成ステップ
Ｓ２７  スペクトル抽出ステップ（スペクトル精製ステップ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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