(57)【要約】【課題】光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミドを効率良く得る方法を提供する。【解決手段】アミノ酸アミドを、アミダーゼ活性を有する酵素と接触させることにより、光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミドを製造する方法において、反応液中に精製するアンモニアを低減又は除去させながら反応を行うことを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
2012044931.tif 000006
（一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基及びアリール基を示す。Ｒ２は水素原子又はＣ１〜２０のアルコキシカルボニル基を示す。）
で示されるアミノ酸アミドを、アミダーゼ活性を有する酵素と接触させることにより、光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミドを製造する方法において、反応液中に生成するアンモニアを低減又は除去しながら反応を行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
アンモニアを低減又は除去する方法が、（イ）酸の添加、（ロ）反応液への気体の供給及び（ハ）減圧下での反応からなる群から選ばれる少なくとも１つの工程を含む、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミドは医薬品等の合成中間体として有用な化合物である。
【０００３】
生体触媒を用いた光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミドの製造方法としては、例えば、アミダーゼ活性を有する生体触媒を用いた光学分割による製造方法が知られている（特許文献１〜５）。アミダーゼ活性を有する生体触媒としては、アミダーゼを産生する微生物が、菌体そのまま又は菌体処理物（洗浄菌体、乾燥菌体、菌体破砕物、菌体抽出物、粗酵素、精製酵素、及びこれらの固定化物）として反応に使用されている（特許文献５等）。
【０００４】
菌体そのままを反応に使用する場合、反応後の菌体の分離に時間を要するという問題がある。従って、菌体から取り出した酵素を反応に使用すれば、より効率よく光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミドを製造することができると考えられ、様々な研究がなされている。
【０００５】
しかしながら、酵素を反応に使用すると、反応が進むにつれて反応速度が低下する、反応が途中で止まるなどの問題が生じていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭５９−１５９７８９号公報
【特許文献２】特開昭６１−２９３３９４号公報
【特許文献３】特開平１−１８６８５０号公報
【特許文献４】特開２００１−３２８９７０号公報
【特許文献５】特開２００８−１２５３６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明の目的は、光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミドを効率良く製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、従来技術の問題点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、アミダーゼ活性を有する酵素を用いてアミノ酸アミドの立体選択的加水分解を行う際に、反応液中からアンモニアを低減又は除去しながら反応を行うことにより上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記一般式（１）
【００１０】
【化１】
2012044931.tif 000002
【００１１】
（一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基及びアリール基を示す。Ｒ２は水素原子又はＣ１〜２０のアルコキシカルボニル基を示す。）
で示されるアミノ酸アミドを、アミダーゼ活性を有する酵素と接触させることにより、光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミドを製造する方法において、反応液中に生成するアンモニアを低減又は除去しながら反応を行うことを特徴とする方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、簡便な操作により、高収率で（効率良く）光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミドを製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（１）アミノ酸アミド
本発明におけるアミノ酸アミドは、下記一般式（１）で示されるアミノ酸アミドである。
【００１４】
【化２】
2012044931.tif 000003
【００１５】
一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又は置換基を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基及びアリール基を示す。好ましくは、Ｃ１〜C２０のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ２０のアルケニル基、Ｃ６〜Ｃ２０のシクロアルキル基及びＣ６〜Ｃ２０のアリール基である。より好ましくは、Ｃ１〜C１０のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ１０のアルケニル基、Ｃ６〜Ｃ１５のシクロアルキル基及びＣ６〜Ｃ１５のアリール基である。
【００１６】
Ｒ２は水素原子又はＣ１〜２０のアルコキシカルボニル基を示す。Ｃ１〜２０のアルコキシカルボニル基としては、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、ｉ−プロポキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｉ−ブトキシカルボニル基、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ｎ−ペンチロキシカルボニル基、ｎ−ヘキシロキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等が挙げられる。好ましくは、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基である。
【００１７】
一般式（１）で示されるアミノ酸アミドとしては、アラニンアミド、バリンアミド、ノルバリンアミド、ロイシンアミド、イソロイシンアミド、ノルロイシンアミド、ｔ−ロイシンアミド、メチオニンアミド、トリプトファンアミド、フェニルアラニンアミド、セリンアミド、システインアミド、チロシンアミド、リジンアミド、シクロヘキシルアラニンアミド、２−アミノ酪酸アミド、フェニルグリシンアミド、及びそのアルコキシ誘導体などが挙げられる。好ましくは、アラニンアミド、バリンアミド、ロイシンアミド、ｔ−ロイシンアミド、フェニルアラニンアミドである。
【００１８】
本発明においては、アミノ酸アミドとして、ラセミ体のアミノ酸アミド、Ｓ体の方が多く含まれるアミノ酸アミド、Ｒ体の方が多く含まれるアミノ酸アミドのいずれも基質として使用することができる。
【００１９】
（２）光学活性アミノ酸
本発明の方法で得られる光学活性アミノ酸は、下記一般式（２）で示される光学活性体である。
【００２０】
【化３】
2012044931.tif 000004
【００２１】
一般式（２）中、R１及びR２は、前記一般式（１）と同じである。
【００２２】
一般式（２）で示されるアミノ酸としては、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ｔ−ロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、システイン、チロシン、リジン、シクロヘキシルアラニン、２−アミノ酪酸、フェニルグリシン、及びそのアルコキシ誘導体などが挙げられる。好ましくは、アラニン、バリン、ロイシン、ｔ−ロイシン、フェニルアラニンである。
【００２３】
（３）光学活性アミノ酸アミド
本発明の方法で得られる光学活性アミノ酸アミドは、下記一般式（３）で示される光学活性体である。
【００２４】
【化４】
2012044931.tif 000005
【００２５】
一般式（３）中、R１及びR２は、前記一般式（１）と同じである。
【００２６】
一般式（３）で示されるアミノ酸アミドとしては、アラニンアミド、バリンアミド、ノルバリンアミド、ロイシンアミド、イソロイシンアミド、ノルロイシンアミド、ｔ−ロイシンアミド、メチオニンアミド、トリプトファンアミド、フェニルアラニンアミド、セリンアミド、システインアミド、チロシンアミド、リジンアミド、シクロヘキシルアラニンアミド、２−アミノ酪酸アミド、フェニルグリシンアミド、及びそのアルコキシ誘導体などが挙げられる。好ましくは、アラニンアミド、バリンアミド、ロイシンアミド、ｔ−ロイシンアミド、フェニルアラニンアミドである。
【００２７】
（４）加水分解反応
本発明は、光学活性の無いアミノ酸アミドを立体選択的に加水分解する酵素（アミダーゼ活性を有する酵素）を用いて加水分解することにより、光学活性アミノ酸及び光学活性アミノ酸アミドを得る方法に関する。
【００２８】
アミダーゼ活性を有する酵素を用いたアミノ酸アミドの立体選択的加水分解は、アミノ酸アミド水溶液にアミダーゼ活性を有する酵素を加え、アミノ酸アミドに該触媒を作用させて行う。
【００２９】
（４−１）酵素
立体選択的加水分解に使用するアミダーゼ活性を有する酵素としては、アミノ酸アミドに立体選択的に作用し、光学活性アミノ酸と対応する光学活性アミノ酸アミドを生成させるものであれば、特に限定なく使用することができる。
【００３０】
例えば、以下に例示する微生物が産生するアミダーゼが好適に使用される。
・エンテロバクター・クロアッセイ  Ｎ−７９０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８７３）
・バチルス・ステアロサーモフィラス  ＮＣＩＭＢ８９２３
・サーマス・アクアチカ  ＮＣＩＭＢ１１２４３
・サーマス属  Ｏ−３−１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１３９）
・オクロバクテリウム・アントロピ ＮＣＩＢ４０３２１
・クレブシェラ属 ＮＣＩＢ４０３２２株
・Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＬＡ２０５（ ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３２）
・Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＭ５０１ＫＮ
本発明においては、酵素反応が菌体外で起こるようにする。すなわち、これらの微生物を破砕した菌体破砕物、菌体を破砕し菌体残渣をろ過した粗酵素又はそれを精製した精製酵素を、アミダーゼ活性を有する酵素として反応に使用することができる。
【００３１】
（４−２）反応条件
基質として使用するアミノ酸アミド水溶液中のアミノ酸アミド濃度は、１〜７０質量％であることが好ましく、５〜６０質量％であることがより好ましい。７０質量％以下とすることにより、効率よく加水分解反応が進み、原料であるアミノ酸アミドをできるだけ残存させなくすることができる。一方、１質量％以上とすることにより、反応後に濃縮する水の量が少なくできるため、製造効率が良くなる。
【００３２】
アミダーゼ活性を有する酵素の使用量は、その活性や基質濃度等の条件に応じて適宜選択することができる。例えば、アミノ酸アミドに対して１／１００００〜１質量であることが好ましく、１／１０００〜１／１０質量であることがより好ましい。使用量を１質量以下とすることにより、粗酵素等と共に混入した菌体残渣を反応後に除去することが容易となる。使用量を１／１００００質量以上とすることにより、反応速度を速くすることができ、製造に要する時間を短くすることができる。
【００３３】
加水分解反応を行う際の水溶液のｐＨは、３５〜４５℃の範囲において６〜９であることが好ましい。ｐＨを９以下とすることにより、アミダーゼ活性を有する酵素の活性が低下しにくくなり、反応効率の低下が起こりにくくなる。一方、ｐＨを６以上とすることにより、原料であるアミノ酸アミドが析出しにくくなり、反応が進行しやすくなる。
【００３４】
反応温度は、１０〜６０℃であることが好ましく、２０〜５０℃であることがより好ましい。温度が１０〜６０℃の場合は、アミダーゼ活性を有する酵素の活性が十分に発揮され、収率の低下や反応時間の増加を防止できるという点で好ましい。
反応時間は、アミダーゼ活性を有する酵素の使用量や基質であるアミノ酸アミドの種類・濃度に応じて適宜選択できるが、通常は５〜６０時間であることが好ましい。反応時間を５時間以上とすることにより、十分な反応収率が得られやすい。一方、反応時間を６０時間以下とすることにより、製造効率の面からも好ましくなる。
【００３５】
（４−３）アンモニアの除去
アミノ酸アミドの加水分解反応においては、反応の進行とともにアンモニアが発生する。そのため、反応が進むにつれ、反応速度が低下する、反応が途中で止まるなどの問題が生じる。本発明では、このような問題を回避するために、反応液中からアンモニアを低減又は除去しながら反応を行う。
【００３６】
反応液中からアンモニアを低減又は除去する方法としては、例えば、反応液に酸を添加することでアンモニウム塩を形成させる方法が挙げられる。また、生成する成分が揮発性のアンモニアであることから、気体を供給することも効果的である。また、反応液中のアンモニアは、低圧、高温下で揮発しやすくなることから、減圧下での反応も効果的である。これらの方法は単独で行ってもよく、２種以上を組み合わせて行ってもよい。
【００３７】
（イ）酸の添加
反応液に酸を添加することでアンモニウム塩を形成させることにより、反応液中からアンモニアを低減又は除去することができる。反応液に添加する酸は、アンモニアを中和させたり、固定化できたりするものであればよく、限定はされない。
【００３８】
例えば、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸等の無機酸；ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸等の有機酸；陽イオン交換樹脂、高酸価ビーズ等の酸性の樹脂を使用することができる。これらは１種を単独で使用することもできるし、２種以上を組み合わせて使用することもできる。
【００３９】
（ロ）気体の供給
（a）気体の種類
反応液に気体を供給することにより、反応液中からアンモニアを低減又は除去することができる。反応液に供給する気体の種類は、加水分解に悪影響を及ぼさず、効率良く加水分解反応を進行させることができるものであれば限定はされない。例えば、窒素、ヘリウム、アルゴン、二酸化炭素等の不活性ガス、水蒸気、空気を使用することができる。なかでも、酸化が起こらない不活性ガスが好ましい。これらの気体は１種を単独で使用することもできるし、２種以上を混合して使用することもできる。
【００４０】
（b）供給方法
反応液に気体を供給する方法は、効率良く加水分解反応を進行させることができれば特に限定はされない。
【００４１】
例えば、アミノ酸及びアミノ酸アミドを含む溶液に、散気装置を用いて気体をバブリングすることができる。散気装置は、気体を供給することによってアミノ酸及びアミノ酸アミドを含む溶液中で気泡を発生させるものであれば、その形態は特に限定されない。また、空気透過膜を通して気体を供給することもできる。このとき使用する空気透過膜の形態や種類も限定されない。
【００４２】
気体の供給速度と供給時間は、効率良く加水分解反応を進行させることができるものであれば特に限定はされず、アミノ酸及びアミノ酸アミドの濃度の条件等に応じて適宜選択することができる。例えば、アミノ酸及びアミノ酸アミドを含む溶液１０００ｍＬに対して、０．５〜３０ｍＬ／ｍｉｎとするのが好ましい。１．０〜３．０ｍＬ／ｍｉｎがより好ましく、１．５〜２．０ｍＬ／ｍｉｎが更に好ましい。０．５ｍＬ／ｍｉｎ以上とすることにより、効率良く加水分解反応を進行させることができる。３０ｍＬ／ｍｉｎ以下とすることにより、発泡による反応液のエントレイメントを抑制することができる。供給時間については、反応中継続することが好ましいが、部分的に通気しても問題はない。
【００４３】
気体を供給する際の環境は、密閉下であっても開放下であってもよい。また、常圧、減圧、いずれの状態で行ってもよい。また、気体を供給する場合に、攪拌下に行うことが好ましい。気体を供給する効果（効率の良い加水分解）がより良く得られるからである。
【００４４】
（ハ）減圧下での反応
減圧下での反応を行うことにより、反応液中からアンモニアを低減又は除去することができる。減圧下で反応を行う場合の圧力は、反応温度にもよるが、１０００ｈＰａ以下とするのが好ましい。さらに、９００ｈＰａ以下であることが好ましく、８００ｈＰａ以下であることがさらに好ましい。下限値としては、反応温度にもよるが、溶媒の気化熱による温度低下を抑制する観点から、６００ｈＰａ以上であることが好ましい。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を製造例、実施例及び比較例により具体的に説明する。
【００４６】
なお、実施例及び比較例中の化合物の分析は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて行った。
〈分析条件〉
カラム  Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３Ｖ（ＧＬサイエンス社製）
溶離液  ０．１％リン酸水溶液
流速    １．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出    ＵＶ  ２１０ｎｍ
［製造例］
アミダーゼ活性を有する酵素の調製
ＷＯ２０００／０６３３５４号記載の方法に従い、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＬＡ２０５（ ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３２）の培養を行った。１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０２％ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ、０．００２％ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００２％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏからなる培地（ｐＨ ７．２）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに入れてオートクレーブ滅菌した後、アンピシリンナトリウム（５０μｇ／ｍｌ）を添加し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＬＡ２０５を植菌して、３７℃にて１９時間振盪培養した。培養液５００ｍｌを遠心分離し、次いで湿潤菌体を蒸留水に懸濁した。さらに菌体懸濁液を破砕した後に、遠心分離し、粗酵素溶液２０ｇを調製した。
［実施例１］
攪拌機及び温度計を付した１０００ｍｌ三口フラスコに、ｔ−ロイシンアミド２００．０ｇ（１．５４ｍｏｌ）を秤量し、純水６００ｍｌを加えて溶解した。この水溶液に９８％硫酸を２５．３ｇ添加して、ｐＨを１１．３から８．０（４０℃）に調整した。この溶液に製造例で調製した粗酵素溶液２０ｇを添加した。反応温度を３８〜４２℃で制御するとともに、発生したアンモニアを９８％硫酸で中和しながら反応を行った。中和に要した９８％硫酸は３８．５ｇであった。２４時間後のＬ−ｔ−ロイシンアミドの転化率は９９％以上であり、Ｌ−ｔ−ロイシン１０１．０ｇ（０．７７ｍｏｌ）が生成した。
［実施例２］
硫酸の添加の代わりに２．０ｍＬ／ｍｉｎの通気をした以外は、実施例１と同様の方法で行った。２４時間後のＬ−ｔ−ロイシンアミドの転化率は９９％以上であり、Ｌ−ｔ−ロイシン１０１．０ｇ（０．７７ｍｏｌ）が生成した。
［比較例１］
硫酸の添加を実施しなかった以外は、実施例１と同様の方法で行った。２４時間後のＬ−ｔ−ロイシンアミドの転化率は７２％で反応が停止した。
［参考例］
製造例で破砕処理を実施しなかった菌体懸濁液を使用し、硫酸の添加を実施しなかった以外は、実施例１と同様の方法で行った。３６時間後のＬ−ｔ−ロイシンアミドの転化率は９９％以上であり、Ｌ−ｔ−ロイシン１０１．０ｇ（０．７７ｍｏｌ）が生成した。しかし反応後の菌体の分離に時間を要した。