(57)【要約】【課題】異種由来の細胞やタンパク質などを用いなくとも、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の未分化能を十分に維持することができる、フィーダーレスの培養手段を提供する。【解決手段】本発明のいくつかの形態により、以下のものが提供される：アクチビン（好ましくは、アクチビンＡ）を含有する多能性幹細胞培養用組成物；当該組成物を含む多能性幹細胞培養用培地；ｉＰＳ細胞（好ましくは哺乳動物ｉＰＳ細胞、特に好ましくはヒトｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、多能性幹細胞を増殖または樹立するための多能性幹細胞の培養方法であって、培養をアクチビンの存在下で行うことを含む培養方法；および、アクチビンの存在下で未分化状態のｉＰＳ細胞（好ましくは哺乳動物ｉＰＳ細胞、特に好ましくはヒトｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞を培養することを含む、未分化状態の多能性幹細胞クローン集団の調製方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチビンを含有する、多能性幹細胞培養用組成物。
【請求項２】
培地補充物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、多能性幹細胞を増殖させるための、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
アクチビンがアクチビンＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物を含む、多能性幹細胞培養用培地。
【請求項６】
アクチビンを３〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で含有する、請求項５に記載の培地。
【請求項７】
支持細胞および／または血清を含まない、請求項５または６に記載の培地。
【請求項８】
支持細胞および血清を含まない、請求項７に記載の培地。
【請求項９】
細胞培養用最小培地である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１０】
多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、多能性幹細胞を増殖または樹立するための多能性幹細胞の培養方法であって、培養をアクチビンの存在下で行うことを含む、培養方法。
【請求項１１】
培養を請求項５〜９のいずれか１項に記載の培地中で行う、請求項１０に記載の培養方法。
【請求項１２】
前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１０または１１に記載の培養方法。
【請求項１３】
前記多能性幹細胞が哺乳動物由来のものである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項１４】
前記多能性幹細胞がヒト由来のものである、請求項１３に記載の培養方法。
【請求項１５】
アクチビンの存在下で未分化状態の多能性幹細胞を培養することを含む、未分化状態の多能性幹細胞クローン集団の調製方法。
【請求項１６】
生体から未分化状態の多能性幹細胞を単離し、アクチビンの存在下で未分化状態の多能性幹細胞を培養することを含む、未分化状態の多能性幹細胞クローン集団の調製方法。
【請求項１７】
培養を請求項５〜９のいずれか１項に記載の培地中で行う、請求項１５または１６に記載の調製方法。
【請求項１８】
１個の多能性幹細胞を培養してそのクローン集団を得る、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１９】
近接する多能性幹細胞同士の相互作用により当該多能性幹細胞の未分化増殖が誘導されるよりも低密度な播種条件下にある多能性幹細胞を、請求項７または８に記載の培地中で培養してそのクローン集団を得る、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項２０】
１個の多能性幹細胞を請求項７または８に記載の培地中で培養してそのクローン集団を得る、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項２１】
前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項２２】
前記多能性幹細胞が哺乳動物由来のものである、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項２３】
前記多能性幹細胞がヒト由来のものである、請求項２２に記載の調製方法。
【請求項２４】
多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ培養し、多能性幹細胞を増殖または樹立させるための、アクチビンの使用。
【請求項２５】
多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ培養し、多能性幹細胞を増殖または樹立させるための、アクチビンを含有する組成物の使用。
【請求項２６】
アクチビンがアクチビンＡである、請求項２４または２５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞培養用組成物およびその用途に関する。特に本発明は、支持細胞や血清が存在しない培地における多能性幹細胞の培養を可能にする組成物およびこれを含有する培地、並びにそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞は、少なくともそれぞれ１種類ずつの外胚葉、中胚葉、内胚葉に属する分化細胞に分化する能力を有する自己複製可能な幹細胞であり、人工（誘導）多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ：ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ：ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（ａｄｕｌｔ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＡＰＳ細胞）などがある。
【０００３】
これらのうち、ＥＳ細胞は、動物の発生初期段階の胚から作製される幹細胞株であり、生体外において全ての組織に分化できる多能性を維持しつつ、長期間にわたって増殖させることができることから、再生医療への応用が期待されている。しかしながら、ＥＳ細胞の移植には、臓器移植と同様に拒絶反応の問題が伴う。また、ＥＳ細胞の樹立には受精卵または胚盤胞までの段階の初期胚を必要とするため、生命の消失という倫理的な問題もある。
【０００４】
一方、ｉＰＳ細胞は、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞であり、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞として大きな期待を集めている。
【０００５】
このｉＰＳ細胞を、未分化維持能を保持した状態で培養するには、フィーダー細胞と称される支持細胞層上で培養を行うことが必要である。ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を培養するためのフィーダー細胞としては、例えば、マイトマイシン処理によって増殖能が制限されたマウスの新鮮な胎児線維芽細胞などが用いられている。しかしながら、かようなフィーダー細胞の調製には、ロットごとの未分化維持能が異なるため再現性が悪いという問題がある。また、多能性幹細胞から目的の細胞を製造して移植治療に用いる場合、マウス由来胎児線維芽細胞を用いると異種由来のタンパク質が混在する可能性があることから、臨床応用は不可能であるという問題もある。
【０００６】
上述したような問題の解決を図るべく、フィーダー細胞を用いずに多能性幹細胞を培養するための技術が提案されている。例えば、フィーダーレス培地として、株式会社リプロセルより霊長類ＥＳ細胞用フィーダーレス培地（ＲｅｐｒｏＦＦ）が市販されており、同様に、ステムセルテクノロジー社よりヒトＥＳ細胞維持用無血清培地（ｍＴｅＳＲ（登録商標）１）が市販されている。
【０００７】
ところで、アクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）は、哺乳動物の脳下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌を促進するタンパク質として、インヒビンを精製する過程で卵胞液中より発見された因子である。そして、アクチビンはトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βスーパーファミリーに属しており、インヒビンβ鎖（分子量１．４万）がジスルフィド結合で二量化した構造を有している。アクチビンは主として３種類存在し、それぞれアクチビンＡ（βＡβＡ鎖）、アクチビンＢ（βＢβＢ鎖）、およびアクチビンＡＢ（βＡβＢ鎖）の構造からなっている。これらのうち、アクチビンＡについては、未分化胚細胞を中胚葉や内胚葉へと分化させるという報告がある（非特許文献１および２を参照）。実際、ヒトＥＳ細胞でも内胚葉を経由して膵臓のβ細胞への分化誘導に用いられている（非特許文献３を参照）。一方、アクチビンＡがヒトＥＳ細胞の未分化能を維持するという報告もある（非特許文献４を参照）。現在のところ、アクチビンＡはヒトＥＳ細胞を内胚葉へ分化させるのか、逆にその未分化能を維持する方向に作用するのか、結論は出ていない。さらに、ヒトｉＰＳ細胞におけるアクチビンＡの役割に関しては何ら報告が存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Smith JC, Price BM, Van Nimmen K and Huylebroeck D: Identification of a potent Xenopus mesoderm-inducing factor as a homologue of activin A. Nature 345: 729-731, 1990.
【非特許文献２】Thomsen G, Woolf T, Whitman M, et al.: Activins are expressed early in Xenopus embryogenesis and can induce axial mesoderm and anterior structures. Cell 63: 485-493, 1990.
【非特許文献３】D'Amour KA, Agulnick AD, Eliazer S, Kelly OG, Kroon E and Baetge EE: Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol 23: 1534-1541, 2005.
【非特許文献４】Xiao L, Yuan X and Sharkis SJ: Activin A maintains self-renewal and regulates fibroblast growth factor, Wnt, and bone morphogenic protein pathways in human embryonic stem cells. Stem Cells 24: 1476-1486, 2006.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、フィーダー細胞を用いることなくｉＰＳ細胞を培養するための培地がいくつか市販されているのが現状である。しかしながら、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１を用いてｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を培養すると、分化した細胞群が出現する場合があり、多能性幹細胞の未分化能の維持には不十分であるという問題がある。また、ＲｅｐｒｏＦＦを用いて同様に多能性幹細胞を培養すると、マウス由来胎児線維芽細胞をフィーダー細胞として培養した細胞と比べて細胞の形態が異なるなど、真に未分化能を維持しているかどうかについて十分には検証されていない。このように、従来技術により提供される培地を用いてｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を培養すると、未分化能を十分に維持することができないのが現状である。
【００１０】
そこで本発明は、異種由来の細胞やタンパク質などを用いなくとも、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の未分化能を十分に維持することができる、フィーダーレスの培養手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、研究を行う過程で、アクチビンＡを含む培地中で懸滴培養（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ）法によりｉＰＳ細胞から胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ；ＥＢ）を形成し、内胚葉を経由して幹細胞へと分化させることを試みた。ところが、驚くべきことに、胚様体は内胚葉へ分化せず、長期間培養しても未分化能を保持したｉＰＳ細胞の状態のまま維持されることを見いだした。つまり、ヒトｉＰＳ細胞の未分化能を維持する因子は現在のところ不明であったが、本発明者らによって、アクチビンＡがヒトｉＰＳ細胞を未分化な状態に維持する主要な因子であることが明確に示されたのである。この知見に基づき、本発明者らは、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明の一形態によれば、アクチビン（好ましくは、アクチビンＡ）を含有する多能性幹細胞培養用組成物が提供される。当該組成物は、培地補充物でありうる。また、当該組成物は、ｉＰＳ細胞（好ましくは哺乳動物ｉＰＳ細胞、特に好ましくはヒトｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、多能性幹細胞を増殖させるために用いられうる。
【００１３】
本発明の他の形態によれば、上述した組成物を含む多能性幹細胞培養用培地が提供される。当該培地は、アクチビンを３〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度で含有することが好ましい。また、当該培地は、支持細胞および／または血清を含まないものであることが好ましく、より好ましくは支持細胞および血清を含まないものである。さらに、当該培地は、細胞培養用最小培地でありうる。
【００１４】
本発明のさらに他の形態によれば、ｉＰＳ細胞（好ましくは哺乳動物ｉＰＳ細胞、特に好ましくはヒトｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、多能性幹細胞を増殖または樹立するための多能性幹細胞の培養方法であって、培養をアクチビンの存在下で行うことを含む培養方法が提供される。当該培養方法は、例えば、培養を上述した培地中で行うものである。
【００１５】
本発明のさらに他の形態によれば、アクチビンの存在下で未分化状態のｉＰＳ細胞（好ましくは哺乳動物ｉＰＳ細胞、特に好ましくはヒトｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞を培養することを含む、未分化状態の多能性幹細胞クローン集団の調製方法が提供される。同様に、生体から未分化状態の多能性幹細胞を単離し、アクチビンの存在下で未分化状態の多能性幹細胞を培養することを含む、未分化状態の多能性幹細胞クローン集団の調製方法もまた、提供される。これらの調製方法は、例えば、培養を上述した培地中で行うものである。また、これらの調製方法は、例えば、１個の多能性幹細胞を培養してそのクローン集団を得るものであってもよい。さらに、これらの調製方法は、近接する多能性幹細胞同士の相互作用により当該多能性幹細胞の未分化増殖が誘導されるよりも低密度な播種条件下にある多能性幹細胞を、上述した支持細胞および／または血清（好ましくは、支持細胞および血清）を含まない培地中で培養してそのクローン集団を得るものでありうる。
【００１６】
本発明のさらに他の形態によれば、多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ培養し、多能性幹細胞を増殖または樹立させるための、アクチビン（好ましくは、アクチビンＡ）（またはこれを含有する組成物）の使用が提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、異種由来の細胞やタンパク質などを用いなくとも、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の未分化能を十分に維持することができる、フィーダーレスの培養手段が提供されうる。より具体的には、従来技術のようにマウス由来胎児線維芽細胞を扱う必要がないため、ヒトｉＰＳ細胞の培養が簡便・容易になる。本発明は、今後のヒトｉＰＳ細胞の培養技術の開発に応用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例において、アクチビンＡの添加がｉＰＳ細胞の分化に及ぼす影響を調べる目的で、アクチビンＡ存在下で培養した２０１Ｂ７細胞から懸滴培養法により形成した胚様体を顕微鏡的に観察した結果を示す写真である。
【図２】実施例において、異なる濃度のアクチビンＡ存在下で培養した２０１Ｂ７細胞の増殖能を、ＭＴＳアッセイにより評価した結果を示すグラフである。
【図３】実施例において、アクチビンＡ存在下で培養した２０１Ｂ７細胞が未分化能を維持していることを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色によって確認した結果を示す写真である。
【図４】実施例において、各種の薬剤をｉＰＳｍ（−）に添加して継代を行った際の、各種薬剤の添加形態による継代数の変化についての結果を示すグラフである。
【図５】実施例において、各種の薬剤をｉＰＳｍ（−）に添加して継代を行った後の細胞を、位相差顕微鏡により観察した観察像（１２継代時）（図５の左側）、および、当該細胞をアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色したものを観察した観察像（図５の右側）を示す写真である。なお、図５において、「Ａ」はアクチビンＡ単独を表し、「ＡＣ」はアクチビンＡ＋ＣＨＩＲ９９０２１の組み合わせを表し、「ＡＣＬ」はアクチビンＡ＋ＣＨＩＲ９９０２１＋ＬＩＦの組み合わせを表す。
【図６】実施例において、各種の薬剤をｉＰＳｍ（−）に添加して継代を行った後の細胞を、いくつかの抗体を用いて免疫染色した後に観察した観察像を示す写真である。なお、図５において、「Ａ」はアクチビンＡ単独を表し、「ＡＣ」はアクチビンＡ＋ＣＨＩＲ９９０２１の組み合わせを表し、「ＡＣＬ」はアクチビンＡ＋ＣＨＩＲ９９０２１＋ＬＩＦの組み合わせを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書において、「多能性」とは、外胚葉、中胚葉、内胚葉に属するいずれの分化細胞にも分化しうる能力、および、外胚葉、中胚葉、内胚葉に属する少なくともそれぞれ１種の分化細胞に分化する能力を意味し、生殖細胞への分化能も、この概念に包含される。
【００２０】
「多能性幹細胞」とは、外胚葉、中胚葉、内胚葉に属するいずれの分化細胞にも分化し得る能力、または、外胚葉、中胚葉、内胚葉に属する少なくともそれぞれ１種類ずつの分化細胞に分化する能力（多分化能）を有する自己複製可能な幹細胞を意味し、具体的には、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、ＥＣ細胞、ＭＡＰ細胞、ＡＰＳ細胞などが挙げられる。その代表例である「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」は、多分化能を有し、他の胚盤胞中に注入されると、生殖細胞をも含む種々の細胞に分化しうる。
【００２１】
「支持細胞」とは、フィーダー細胞とも称され、それ自体は増殖できないが、代謝活性を有しており、種々の代謝物質を産生することにより、その上に植えられた他の細胞の増殖を助ける細胞をいう。例えば、ｉＰＳ細胞の場合、不活性化して増殖を停止させた胎児性初代培養繊維芽細胞やＳＴＯ細胞が支持細胞として用いられうる。
【００２２】
「支持細胞非依存性多能性幹細胞」とは、血清の存在下、支持細胞を含まない培養条件で増殖しうる多能性幹細胞を意味する。多能性幹細胞は、本来、そのような培養条件では未分化能を維持したまま培養により増殖させることが困難なものであるが、継代培養を続けることにより、支持細胞非依存性を取得するようになる。
【００２３】
本発明の一形態により提供される多能性幹細胞培養用組成物は、アクチビンを含有する点に特徴がある。アクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）は、濾胞刺激ホルモン分泌促進タンパク質とも称され、分子量約２７，０００のペプチド性ホルモンである。アクチビンには、インヒビンＡのβ鎖のホモ二量体（βＡβＡ）であるアクチビンＡ、インヒビンＢのβ鎖のホモ二量体（βＢβＢ）であるアクチビンＢ、および、これらのヘテロ二量体（βＡβＢ）であるアクチビンＡＢの３種類がある。アクチビンの各単量体には９つのシステイン残基が非常によく保存されており、ＴＧＦ-βのスーパーファミリーに属している。脊椎動物におけるアクチビンのアミノ酸配列は非常に相同性が高く、例えば、アフリカツメガエルとヒトとの間で、アクチビンＡの相同性は８７％、アクチビンＢの相同性は９５％である。アクチビンの生体における機能は数多く知られているが、フィーダーレスの培養条件下で多能性幹細胞の未分化能を維持することができるという機能については、未だ知られていない。
【００２４】
アクチビンのアミノ酸配列等は公知であり、例えば、ヒト由来のアクチビンは以下のＩＤ番号に基づき各公的機関のデータベースを参照することができる：ＮＭ＿００２１９２（ＮＣＢＩ）  Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ  ｉｎｈｉｂｉｎ，  ｂｅｔａ  Ａ  （ＩＮＨＢＡ），  ｍＲＮＡ。
【００２５】
さらに、アクチビンとして、
（ａ）天然のアクチビンのアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アクチビンの生物学的活性を有するタンパク質；または
（ｂ）天然のアクチビンのアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、アクチビンの生物学的活性を有するタンパク質、
も同様に、本発明において用いられうる。これらのアクチビンは、当業者に公知の任意の遺伝子工学的手法で作製されうる。
【００２６】
なお、「相同性」（または、「同一性」）とは、ポリペプチドのアミノ酸配列における２本の鎖の間で当該鎖を構成している各アミノ酸残基どうしの互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものである。この相同性は容易に算出されうる。２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、「相同性」なる用語は、当業者には周知である (例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994);von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press,New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991) 等)。２つの配列の相同性を測定するのに用いる一般的な方法には、Martin, J. Bishop (Ed.), Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego, (1994);Carillo, H. & Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) 等に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
なお、本発明において、用いられるアクチビンは、後に培養対象となる多能性幹細胞と同じ生物種または異なる生物種由来のもののいずれでもよいが、可能な限り互いに近縁な種であることが好ましく、特に、同じ生物種由来であることが好ましい。
【００２８】
本発明の一形態により提供される多能性幹細胞培養用組成物におけるアクチビンの含有量については、本発明の作用効果を奏する限り特に制限はなく、当業者によって適宜決定されうる。上記組成物におけるアクチビンの含有量を決定する際には、後述するように当該組成物が培地として用いられる場合における培地中の好ましいアクチビン濃度が参考になる。
【００２９】
多能性幹細胞培養用組成物は、アクチビンを１種のみ含んでもよいし、２種以上のアクチビンをいかなる組み合わせで含んでもよい。ただし、多能性幹細胞培養用組成物は、好ましくはアクチビンＡを少なくとも含むものである。
【００３０】
本発明の他の形態によれば、上述した多能性幹細胞培養用組成物を含む、多能性幹細胞培養用培地が提供される。当該培地中には、支持細胞や血清が存在しても多能性幹細胞の培養に支障をきたすものではない。ただし、好ましくは、当該培地は支持細胞および／または血清を含まないものであり、より好ましくは、当該培地は支持細胞および血清を含まないものである。
【００３１】
すなわち、本発明の一形態により提供される多能性幹細胞培養用培地は、好ましくは細胞培養用最小培地（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｉｎｉｍｕｍ ｍｅｄｉｕｍ：ＣＣＭＭ）を基礎培地とし、これに分化抑制因子、血清代替添加物、抗酸化剤（例えば、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、ジチオスレイトール、アスコルビン酸）および上述した多能性幹細胞培養用組成物（すなわち、アクチビンを含む組成物）を含有させたものであって、支持細胞および血清を含有しないものである。上記のＣＣＭＭ、分化抑制因子、血清代替添加物、抗酸化剤および本発明に係る多能性幹細胞培養用組成物は、以下に説明するように、いずれも人為的に調製することの可能な既知物質である。このため、これらの成分から構成される上記培地は、生体成分の使用に起因する未知病原体による汚染を回避することができるという点でも好ましい。
【００３２】
基礎培地として使用する「細胞培養用最小培地（ＣＣＭＭ）」は、これに分化抑制因子、血清代替添加物、抗酸化剤および本発明に係る多能性幹細胞培養用組成物を含有させた場合に、多能性幹細胞の未分化増殖を可能にするものであれば、その他の具体的な形態について特に制限はない。
【００３３】
ＣＣＭＭには、通常、標準無機塩（亜鉛、鉄、マグネシウム、カルシウム、カリウムなど）、ビタミン、グルコース、緩衝系、必須アミノ酸などを添加する。その具体例としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、αＭｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ）、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）などが挙げられ、市販のものが使用されてもよい。
【００３４】
ＣＣＭＭには、０．１ｍＭ非必須アミノ酸及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを加えてもよい。非必須アミノ酸は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−プロリン、およびＬ−セリンの混合物で、例えばＭＥＭ ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １０ｍＭ ｌｉｑｕｉｄ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）として市販されているものが用いられうる。ピルビン酸ナトリウムとしては、例えばＭＥＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １００ｍＭ ｌｉｑｕｉｄ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）として市販されているものが用いられうる。
【００３５】
分化抑制因子は、支持細胞および多能性幹細胞自身が放出する液性因子であり、未分化細胞の分化を抑制する。代表的な分化抑制因子としては、白血病阻害因子（ＬＩＦ）が挙げられる。分化抑制因子は、元来、生体に存在する物質であるため、生体からの採取も不可能ではないが、病原体の汚染を避けるためにも、また、経済的にも、人為的に合成されたものを用いることが好ましい。例えば、ＬＩＦのようなタンパク質性の分化抑制因子の場合、遺伝子操作によって製造された組換え分化抑制因子タンパク質を使用することが好ましい。また、他の分化抑制因子として、選択的なＧＳＫ−３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１も挙げられる。後述する実施例に示すように、本発明に係る多能性幹細胞培養用組成物の好ましい実施形態においては、アクチビン（例えば、アクチビンＡ）が、ＣＨＩＲ９９０２１と組み合わせて用いられる。また、アクチビン（例えば、アクチビンＡ）が、ＣＨＩＲ９９０２１およびＬＩＦと組み合わせて用いられることもまた、他の好ましい実施形態である。
【００３６】
抗酸化剤としては、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、アスコルビン酸などが用いられうるが、通常は２−メルカプトエタノールを用いる。これらの物質は市販されており、容易に入手可能である。
【００３７】
血清代替添加物は、これを無血清培地に添加することにより、多能性幹細胞の増殖を支持しうる物質を意味する。血清代替添加物は、単一物質であってもよいし、混合物であってもよい。具体的には、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン）またはアルブミン代替添加物（例えば、ウシ下垂体抽出物、コメ加水分解物、ウシ胎児アルブミン、卵アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウシ胚抽出物、ＡｌｂｕＭＡＸ Ｉ（登録商標））、アミノ酸（例えば、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン）、ビタミン、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替添加物（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、デフェロキサミンメシレート、ジメルカプトプロパノール、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸のような鉄キレート物、クエン酸第２鉄キレート物、硫酸第１鉄キレート物などの鉄キレート化合物）、抗酸化剤（例えば、還元型グルタチオン、アスコルビン酸−２−一リン酸塩）、インスリンまたはインスリン代替添加物（例えば、塩化亜鉛、硝酸亜鉛、臭化亜鉛、硫酸亜鉛などの亜鉛含有化合物）、コラーゲン前駆体（例えば、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、アスコルビン酸）及び微量元素（例えば、Ａｇ＋、Ａｌ３＋、Ｂａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｒ３＋、Ｇｅ４＋、Ｓｅ４＋、Ｂｒ−、Ｉ−、Ｍｎ２＋、Ｆ−、Ｓｉ４＋、Ｖ５＋、Ｍｏ６＋、Ｎｉ２＋、Ｒｂ＋、Ｓｎ２＋、Ｚｒ４＋）から選択される１種またはそれ以上の成分を含有するものである。
【００３８】
なお、血清代替添加物の一例は、特表２００１−５０８３０２号公報に「無血清真核生物細胞培養培地補充物」として詳記されており、当該公報の記載を参酌して血清代替添加物の組成を適宜決定すればよい。代表的な血清代替添加物は、ノックアウト血清代替添加物（ＫＳＲ）としてライフテクノロジーズジャパン株式会社から販売されており、容易に入手可能である。
【００３９】
上述したＬＩＦ、２−ＭＥおよびＫＳＲは、培地中において、それぞれ通常、１〜１００００ｕｎｉｔ／ｍＬ、１〜１０００μＭ、および０．５〜９０％（ｖ／ｖ）の最終濃度、好ましくは１００〜１０００ｕｎｉｔ／ｍＬ、１０〜１００μＭ、および５〜２０％の最終濃度となるような量で使用する。培地中のアクチビンの濃度（複数のアクチビンが用いられる場合には、その合計濃度）について特に制限はなく、本発明の作用効果を発揮しうる範囲で適宜決定されうるが、好ましくは３〜３０ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは１０〜３０ｎｇ／ｍＬである。培地中のアクチビンの濃度が３ｎｇ／ｍＬ以上であれば、当該培地を用いて多能性幹細胞を培養した際に、当該多能性幹細胞の未分化能が十分に維持されうる。一方、培地中のアクチビンの濃度が３０ｎｇ／ｍＬ以下であれば、当該培地を用いて多能性幹細胞を培養した際に、アクチビンの添加が当該多能性幹細胞の増殖能に及ぼす悪影響が最小限に抑制されうる。
【００４０】
本発明に係る多能性幹細胞培養用組成物および上述の各添加成分は、培地に対して最初から目的の最終濃度となるような量で添加されてもよく、２回またはそれ以上の回数に分けて添加し、最終的に目的の濃度となるような量で使用されてもよい。培地のｐＨは、通常、重炭酸塩により７．０〜８．２、好ましくは７．３〜７．９に調節されうる。
【００４１】
本発明に係る多能性幹細胞培養用組成物および多能性幹細胞培養用培地は、それぞれ溶液形態または乾燥形態で調製されうる。溶液形態の場合、濃縮組成物（例えば１×〜１０００×）として提供されてもよく、使用に際して、適宜に希釈されてもよい。溶液形態または乾燥形態の組成物または培地を希釈または溶解するのに用いられる液体の種類は、水、緩衝水溶液、生理食塩水溶液などがあり、必要に応じて容易に選択されうる。
【００４２】
好ましくは、本発明に係る多能性幹細胞培養用組成物または多能性幹細胞培養用培地は滅菌され、コンタミネーションを防止されたものである。滅菌方法としては、紫外線照射、加熱滅菌、放射線照射および濾過などがある。
【００４３】
本発明に係る技術を利用して多能性幹細胞を培養し、その分化能を保持したまま、未分化増殖培養を行うには、上述した本発明に係る培地、好ましくは細胞培養用最小培地に白血病阻害因子、抗酸化剤、血清代替添加物および本発明に係る多能性幹細胞培養用組成物を含有させてなる培地を使用して、多能性幹細胞を、この分野で採用されている通常の培養条件下で培養すればよい。
【００４４】
多能性幹細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、ヒツジを含む哺乳動物、鳥類、爬虫類などの多様な動物に由来するものが用いられうる。ただし、通常は、哺乳動物に由来するものが用いられる。多能性幹細胞の具体例としては、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、ＥＣ細胞、ＡＰＳ細胞、ＭＡＰ細胞などが挙げられる。培養する多能性幹細胞の数に特に限定はないが、本発明の培養方法は、特に１個の多能性幹細胞を培養して増殖させ、クローン細胞集団を形成させることを可能にする点でも有利である。
【００４５】
培養すべき多能性幹細胞は、それ自体、支持細胞依存性のものでもよいが、支持細胞非依存性であるものが好ましい。支持細胞依存性多能性幹細胞を支持細胞非依存性にするための手法としては、例えば、次のような処理が例示される。すなわち、支持細胞を使用しない培養条件で、数次にわたる継代操作を行い、このような条件に適合した細胞を選択すればよい。
【００４６】
本発明に係る多能性幹細胞の培養方法における具体的な操作は、培養条件を含め、当該技術分野で常套の操作および条件に従って、これを行うことができる。例えば、中辻憲夫編：実験医学別冊・ポストゲノム時代の実験講座４「幹細胞・クローン研究プロトコール」、羊土社（２００１年）、Ｈｏｇａｎ，Ｇ．ら編：マウス胚の操作：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（１９９４）、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．編：奇形ガン及び胚性幹細胞、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ（１９８７）などの記載を参酌して適宜決定されうる。
【００４７】
代表的な継代操作および培養条件を挙げれば、以下のとおりである。すなわち、ｉＰＳ細胞を継代するには、まず成育したｉＰＳ細胞のコロニーをリン酸緩衝化生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）で１〜２回リンスし、その後十分量のトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．２５％トリプシン−１ｍＭＥＤＴＡ、ＰＢＳ中）を細胞層を覆うように添加して５分間放置する。その後、トリプシン阻害剤を含むＰＢＳまたは血清を含むｉＰＳ細胞培養用基礎培養液（ＣＣＭＭ＋ＬＩＦ＋２−ＭＥ）を添加し、ピペッティングにより細胞塊を分離する。この細胞懸濁液から、通常遠心分離により細胞を沈殿させる。上清を除去後、沈殿した細胞を血清または血清代替添加物を含むｉＰＳ細胞培養用基礎培養液に再懸濁し、この一部を支持細胞層またはゼラチン化したプラスチックプレート内に播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養する。
【００４８】
本発明に係る培養方法の一つの実施形態では、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン溶液で処理してゼラチン化したプラスチックプレート内に３７℃に温めた本発明に係る培地を入れ、そこにプレート面積１ｃｍ２あたり１０〜１０００個の多能性幹細胞を播く。プレートをＣＯ２インキュベーター内に置き、３７℃、５％ＣＯ２下で培養する。コロニーが成育したら、新しい培地に播き直し、継代する。継代に際しては、トリプシン阻害剤を含むＰＢＳを使用することが好ましい。
【００４９】
近接する多能性幹細胞どうしの相互作用により当該多能性幹細胞の未分化増殖が誘導されるよりも低密度な播種条件とは、具体的には、細胞１個／ｍｍ２以下の播種条件などが好適なものとして例示される。均一な多能性幹細胞系統の樹立や、遺伝子操作を行った多能性幹細胞の増殖に際し、１つの多能性幹細胞からそのクローン細胞集団を得る工程などは、もちろんこの条件に該当する。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態においては支持細胞や血清が使用されないため、通常の培養方法で行われる血清のロットのスクリーニング、支持細胞の選択および培養を省くことができる。また、本発明に係る培地を使用した場合、ゼラチンコートプレート上で低密度播種条件下に単一の支持細胞非依存性多能性幹細胞を未分化状態で増殖させることが可能である。
【００５１】
本発明に係る培養方法によれば、１個の多能性幹細胞を培養して増殖させ、クローン細胞集団を形成させることができる。このことは、ゲノムを改変した多能性幹細胞の集団が必要な場合、例えばトランスジェニック動物を作成する場合に、有利である。
【００５２】
本発明のさらに他の形態では、アクチビンを含有する、多能性幹細胞培養用組成物が、培地補充物として提供される。また、本発明のさらに他の形態では、当該培地補充物を含む、多能性幹細胞培養用培地が提供される。好ましくは、当該培地は、支持細胞および／または血清を含まず、より好ましくは、当該培地は、支持細胞および血清を含まない。当該培地は、細胞培養用最小培地を基礎培地とすることができる。そして、当該培地は、分化抑制因子、血清代替添加物および抗酸化剤をさらに含んでもよい。
【００５３】
本発明のさらに他の形態では、多能性幹細胞を培養して未分化多能性幹細胞を増殖させるにあたり、当該培養をアクチビンの存在下で行うことを特徴とする、多能性幹細胞の培養方法が提供される。当該培養方法では、当該培養を上記の培地で行うことができる。また、当該培養方法では、１個の多能性幹細胞を培養してそのクローン細胞集団を得ることができ、また、支持細胞および／または血清が存在せず、かつ、上述した培地補充物が存在しない条件下では未分化増殖を起こさない多能性幹細胞を、上述した培地で培養してそのクローン集団を得ることができる。好ましくは、上記培養方法では１個の多能性幹細胞を上記培地で培養してそのクローン集団を得る。そして、当該培養方法では、多能性幹細胞はｉＰＳ細胞であることが好ましく、また、多能性幹細胞は哺乳動物由来のものであることが好ましく、さらに、多能性幹細胞はヒト由来のものであることが好ましい。なお、本発明のさらに他の形態によれば、上記の培養方法で増殖させた、多能性を保持する未分化多能性幹細胞が提供される。
【００５４】
本発明のさらに他の形態によれば、多能性幹細胞を培養して未分化多能性幹細胞を樹立させるにあたり、当該培養をアクチビンの存在下で行うことを特徴とする、多能性幹細胞の培養方法が提供される。当該培養方法では、当該培養を上記の培地で行うことができる。そして、当該培養方法では、多能性幹細胞はｉＰＳ細胞であることが好ましく、また、多能性幹細胞は哺乳動物由来のものであることが好ましく、さらに、多能性幹細胞はヒト由来のものであることが好ましい。本発明のさらに他の形態によれば、上記の培養方法で樹立させた、多能性を保持する未分化多能性幹細胞が提供される。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５６】
≪細胞培養≫
独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター細胞バンク（Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）より入手した、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）であるＨＰＳ０００１ ２０１Ｂ７株を用いて細胞培養を行った。細胞培養は、培地としてノックアウト血清代替添加物（ＫＳＲ；Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；ライフテクノロジーズジャパン株式会社（最終濃度２０％）、１００倍濃縮最小必須アミノ酸（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ；ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を１００分の１希釈、Ｌ−グルタミン（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）２ｍＭ、２−メルカプトエタノール（シグマアルドリッチジャパン株式会社）０．１ｍＭ、および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；和光純薬工業株式会社）５ｎｇ／ｍＬが添加されたダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）−Ｆ１２培地（シグマアルドリッチジャパン株式会社）を用い、５％ＣＯ２条件下、３７℃にて加湿チャンバ内で行った。この際、マイトマイシンＣ（シグマアルドリッチジャパン株式会社）で処理されゼラチン（シグマアルドリッチジャパン株式会社）コートされた培養皿（ＡＧＣテクノグラス株式会社）で増殖させたマウス由来胎児線維芽細胞であるＳＮＬ７６／７株上で２０１Ｂ７細胞株を共培養することで、２０１Ｂ７細胞株を増殖させ、維持した。また、継代時にはＣＴＫ溶液を用いて細胞を回収した。
【００５７】
後述の実験用に、マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン社）コートされた培養皿で、培地として霊長類ＥＳ細胞用フィーダーレス培地（ＲｅｐｒｏＦＦ；株式会社リプロセル）を用いて２０１Ｂ７細胞を培養した。そして、後述の実験の直前に、アキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ；イノベーティブ セル テクノロジーズ社）を用いて細胞を回収した。
【００５８】
≪懸滴培養法による胚様体の形成≫
解離した２０１Ｂ７細胞を、懸滴培養（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ）法により、培地３０μＬあたり１０００個の細胞密度で培養して、２０１Ｂ７細胞株の継代および維持を行った（文献：Tomozawa M, Toyama Y, Ito C, et al.: Hepatoblast-like cells enriched from mouse embryonic stem cells in medium without glucose, pyruvate, arginine, and tyrosine. Cell Tissue Res 333: 17-27, 2008を参照）。この際、コントロールとしては上述したのと同様のＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（ｂＦＧＦを含有）を用いて培養を行ったのに対し、実施例ではｂＦＧＦに代えてアクチビンＡを１００ｎｇ／ｍＬの濃度となるように添加して培養を行った。
【００５９】
≪アクチビンＡの添加がｉＰＳ細胞の分化に及ぼす影響≫
上述した懸滴培養を４日間行った後、得られた胚様体を、マトリゲルコートされたプラスチック製培養皿に移した。その後、培養開始１日後、４日後、および１４日後にそれぞれ倒立型培養顕微鏡（ＩＭＴ−２）を用いて細胞を観察した。結果を図１に示す。
【００６０】
図１に示すように、アクチビンＡを添加しなかった系（０ｎｇ／ｍＬ）では分化した細胞が出現した。これに対し、アクチビンＡを培地に添加した系（１００ｎｇ／ｍＬ）では、胚様体は培養開始から少なくとも１４日後まで形態学的に未分化な状態が維持された。
【００６１】
≪ＭＴＳアッセイによる細胞増殖能の評価≫
アクチビンＡ存在下で培養した２０１Ｂ７細胞の増殖能を、ＭＴＳアッセイにより評価した。結果を図２に示す。
【００６２】
図２に示すように、３〜３０ｎｇ／ｍＬのアクチビン添加濃度で、２０１Ｂ７細胞は増殖能を有することがわかる。
【００６３】
≪２０１Ｂ７細胞が未分化能を維持していることの確認≫
アクチビンＡ存在下で培養した２０１Ｂ７細胞が未分化能を維持していることを、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色によって確認した。結果を図３に示す。なお、図３の左側は位相差顕微鏡による観察像であり、右側がＡＬＰ染色後の観察像である。
【００６４】
まず、アクチビンＡを培地に添加しなかった系（０ｎｇ／ｍＬ）では、分化した細胞が出現したことにより、ＡＬＰ染色にて陰性を示した。すなわち、もはや未分化能を有していないことが確認された。一方、アクチビンＡを１ｎｇ／ｍＬの濃度で添加した系では、２０１Ｂ７の形態がやや線維芽細胞様であり、ＡＬＰ染色陽性ではあるものの、完全には未分化能を維持していない可能性が示唆された。そして、アクチビンＡを１０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加した系では、細胞の形態は未分化な状態を維持しており、ＡＬＰ染色も陽性である。したがって、アクチビンＡの添加濃度１０〜１００ｎｇ／ｍＬでは、ｉＰＳ細胞が未分化能を維持できるものと考えられる。
【００６５】
以上のことから、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を、その未分化能を維持したまま培養する手法として、増殖能の維持の観点からも、３〜３０ｎｇ／ｍＬの濃度でアクチビンＡを添加することが特に好ましいことが結論づけられる。
【００６６】
≪継代≫
以下の各種の薬剤をｉＰＳｍ（−）に添加して継代を行った。
【００６７】
SU5402（ＦＧＦＲ１阻害剤；和光純薬工業株式会社）：２μＭ
ＳＣ−１（ＲａｓＧＡＰ、ＥＲＫ１阻害剤；和光純薬工業株式会社）：１μＭ
アクチビンＡ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ）：１０ｎｇ／ｍＬ
ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ−３β阻害剤；和光純薬工業株式会社）：２μＭ
ヒト白血病阻害因子（ＬＩＦ；Ｓｉｇｍａ）：１０００Ｕ／ｍＬ
塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；和光純薬工業株式会社）：５ｎｇ／ｍＬ。
【００６８】
２０１Ｂ７細胞をマトリゲルコーティングした６孔プレートに播き、ｉＰＳｍ（−）に上記薬剤を単独、または同時に添加し、７０％コンフルエントに達した時点でＡｃｃｕｔａｓｅにて回収し、新しくマトリゲルコーティングした６孔プレートに播いた。培地は４８時間ごとに交換した。位相差顕微鏡にて形態を観察し、分化した細胞が認められる、または細胞が増殖しなくなった時点で継代を終了した。また１２継代にて終了した。
【００６９】
上記薬剤の添加形態による継代数の変化について、結果を図４に示す。なお、図４において、「Ａ」はアクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）を表し、「Ｃ」はＣＨＩＲ９９０２１（２μＭ）を表し、「Ｌ」はＬＩＦ（１０００Ｕ／ｍＬ）を表し、「Ｆ」は塩基性線維芽細胞増殖因子（５ｎｇ／ｍＬ）を表す。また、位相差顕微鏡による観察像（１２継代時）を図５の左側に示す。なお、図５において、「Ａ」はアクチビンＡ単独を表し、「ＡＣ」はアクチビンＡ＋ＣＨＩＲ９９０２１の組み合わせを表し、「ＡＣＬ」はアクチビンＡ＋ＣＨＩＲ９９０２１＋ＬＩＦの組み合わせを表す。
【００７０】
図４に示すように、アクチビンＡが添加されている系では、添加されていない系に比べて継代数が多かった。特にアクチビンＡ単独、アクチビンＡ＋ＣＨＩＲ９９０２１の組み合わせ、およびアクチビンＡ＋ＣＨＩＲ９９０２１＋ＬＩＦの組み合わせは１２継代を超えた。
【００７１】
以上のことから、本発明に係る多能性幹細胞培養用組成物を含む培地を用いて培養を行うことで、継代培養を繰り返すことが可能であることが示される。
【００７２】
≪アルカリホスファターゼ染色≫
上記で継代した細胞のうち、アクチビンＡ単独（Ａ）、アクチビンＡ＋ＣＨＩＲ９９０２１の組み合わせ（ＡＣ）、およびアクチビンＡ＋ＣＨＩＲ９９０２１＋ＬＩＦの組み合わせ（ＡＣＬ）について、１２継代時に上述したのと同様にしてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色を行った。結果を図５の左側に示す。
【００７３】
図に示すように、アクチビンＡ単独（Ａ）、アクチビンＡ＋ＣＨＩＲ９９０２１の組み合わせ（ＡＣ）、およびアクチビンＡ＋ＣＨＩＲ９９０２１＋ＬＩＦの組み合わせ（ＡＣＬ）のいずれも、ＡＬＰ染色に対して陽性を示した。ただし、ＡＣＬについては、やや染色が弱かった。多能性を有する細胞はＡＬＰ染色に対して陽性を示すことが知られており（Goldstein DJ et al. Expression of alkaline phosphatase loci in mammalian tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(5): 2857- 2860, 1980.）、したがって、上記でＡＬＰ染色に対して陽性を示した細胞は、多能性を維持したまま継代培養を繰り返すことができたものであると考えられる。
【００７４】
≪免疫染色≫
１１継代時の各細胞を、マトリゲルコーティングした４孔スライドグラスに播き、継代培養を続けた。７０％コンフルエントに到達後、培地を除去してＰＢＳにて一回洗浄した。４％パラホルムアルデヒドで固定した後、ＰＢＳにて３回洗浄した。なお、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇにて染色する場合はＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ溶液（０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＰＢＳ溶液））を添加して室温にて１５分静置した。続いて、Ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２％ＦＢＳ（ＰＢＳ溶液））にて５分間３回洗浄した。
【００７５】
その後、Ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで希釈した一次抗体を添加し、４℃にて一晩静置した。なお、各一次抗体の種類および希釈率は以下の通りである。
【００７６】
マウス抗−Ｏｃｔ３/４抗体（ＢＤ Ｔｒａｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）：２００倍
（一次抗体）
ウサギ抗−Ｎａｎｏｇ抗体（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ）：１０００倍
マウス抗−ＳＳＥＡ４抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）：２００倍
マウス抗−ＴＲＡ−１−６０抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）：２００倍
続いて、Ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて５分間３回希釈した後、Ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで希釈した二次抗体を添加し、４℃にて一時間静置した。なお、各二次抗体の種類および希釈率は以下の通りである。
【００７７】
（二次抗体）
ＨＲＰ抗−マウス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）：５００倍
ＨＲＰ抗−ウサギ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）：５００倍
その後、Ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて５分間３回洗浄し、Ｌｉｑｕｉｄ ＤＡＢ＋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ）を用いて発色させた。そして、マイヤー・ヘマトキシリン（武藤化学）にて１０秒間染色した後、３０分間水洗後封入した。結果を図６に示す。
【００７８】
図６に示すように、抗−Ｏｃｔ３/４抗体ではＡ、ＡＣ、およびＡＣＬのいずれにおいても、核が陽性であった。また、抗−Nanog抗体ではＡＣが最も強く核が陽性であった。さらに、抗−ＳＳＥＡ４抗体および抗−ＴＲＡ−１−６０抗体では、ともにＡＣが最も強く細胞質が陽性であった。これらの抗体は、一般的に多能性の指標として用いられることが知られており（Takahashi et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell (2007) 131, 861-872）、したがって、上記各種の抗体による免疫染色において陽性を示した細胞は、多能性を維持したまま継代培養を繰り返すことができたものであると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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