(57)【要約】      （修正有）【課題】多様な口蹄疫ウィルスを迅速かつ高感度な検出が可能な口蹄疫ウィルスの検出方法、特に，東アジアおよび東南アジアで発生があり日本への侵入が危惧される，O型，A型，C型，Asia-1型の４タイプを少なくとも検出可能な口蹄疫ウィルスの検出方法の提供。【解決手段】O型，A型，C型，Asia-1型の４タイプの口蹄疫ウィルスを迅速かつ高感度で検出しうるオリゴヌクレオチドプライマー、および該プライマーを用いて口蹄疫ウィルスの遺伝子を増幅させることにより，口蹄疫ウィルスの検出が可能とする方法。さらに，該プライマーを単独もしくは組み合わせてLAMP法に用いることにより，口蹄疫ウィルスを迅速かつ高感度で検出することが可能となるオリゴヌクレオチドプライマーセット。【選択図】図１
2012143185.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記プライマーセットのいずれか又は複数を含む口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであって，
プライマーセット１は，
5'-ACA AGT CCT CCT CAA GCG ACG ATT CGC CTA GTT TTG CCC GT-3'（配列番号１０）又は5'-GTC CCA TTT CTC CTG AAA ACG GGA TGA ACC TTC ACC CGG AAG-3'（配列番号１１）のいずれか又は両方と，
5'-CAA CCA CAA GAA TTG CCT TC-3'（配列番号６）と，
5'-GAC TTG TAC AAA CAC GAT CTA CTC AGG CAC CCC TCT AGA CCT GGA A-3'（配列番号１２）と，
5'-GTG GAG TCA AGC ACA GTA CA-3'（配列番号９）とからなり，
プライマーセット２は，
5'-GCC ACG GAG ATC AAC TTC TCC TCT TGA GGC TAT CCT CTC CTT-3'（配列番号２４）と，
5'-GTG ATG GCC TCA AAG ACC-3'（配列番号２０）と，
5'-GAC GAG TAC CGG CGT CTC TTC GCA GGT AAA GTG ATC TGT-3'（配列番号２５）と，
5'-ATT ATG CGT CAC CAC ACA C-3'（配列番号２３）とからなり，
プライマーセット３は，
5'-GTC ACG TGC TTT GAG TTG TTT CTC CGC CTC GAG TTT CTT CCG-3'（配列番号３６）と，
5'-ATT CTG TTG GCC GGG TTG-3'（配列番号３２）と，
5'-TCA AGA ACG GCG AGT GGC TTC TCT TCT GAG GCG ATC CA-3'（配列番号３７）と，
5'-GGT CTG TCA TGG TGA CAA AC-3'（配列番号３５）とからなり，
プライマーセット４は，
5'-ACA GGT TTG TAA AAC CCA GTT CCA CAC TCC ATT GCC GAT GTC AC-3'（配列番号４７）と，
5'-TGA CAA AAG CGA CAA AGG TT-3'（配列番号４３）と，
5'-ATG GCT TCG AAG ACC CTC GAA CGG AGA TCA ACT TCT CCT GTA-3'（配列番号４８）と，
5'-TGG ACT GCG AGT CCT GC-3'（配列番号４６）とからなる，
ことを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
下記プライマーセットのいずれか又は複数を含む口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであって，
プライマーセット１は，
5'-ACA AGT CCT CCT CAA GCG ACG ATT CGC CTA GTT TTG CCC GT-3'（配列番号１０）又は5'-GTC CCA TTT CTC CTG AAA ACG GGA TGA ACC TTC ACC CGG AAG-3'（配列番号１１）のいずれか又は両方と，
5'-CAA CCA CAA GAA TTG CCT TC-3'（配列番号６）と，
5'-GAC TTG TAC AAA CAC GAT CTA CTC AGG CAC CCC TCT AGA CCT GGA A-3'（配列番号１２）と，
5'-GTG GAG TCA AGC ACA GTA CA-3'（配列番号９）とを含み，
さらに，5'-TTT CGT GCG CAG ACG TCC C-3'（配列番号１３），5'-ACT AGG CGA ATT TGC CGT TTT A-3'（配列番号１４），5'-GCA ACT TGA AAC TCC GCC T-3'（配列番号１５），5'-CCG ACA CAA ACC GTG CAA-3'（配列番号１６）のいずれか又は複数を含み，
プライマーセット２は，
5'-GCC ACG GAG ATC AAC TTC TCC TCT TGA GGC TAT CCT CTC CTT-3'（配列番号２４）と，
5'-GTG ATG GCC TCA AAG ACC-3'（配列番号２０）と，
5'-GAC GAG TAC CGG CGT CTC TTC GCA GGT AAA GTG ATC TGT-3'（配列番号２５）と，
5'-ATT ATG CGT CAC CAC ACA C-3'（配列番号２３）とからなり，
さらに，5'-CCA CGG CGT GCA AAG GA-3'（配列番号２６），5'-GAG CCC TTC CAG GGC CTC TT-3'（配列番号２７），5'-GCC TCT TTG AGA TCC CAA GCT-3'（配列番号２８）のいずれか又は複数を含み，
プライマーセット３は，
5'-GTC ACG TGC TTT GAG TTG TTT CTC CGC CTC GAG TTT CTT CCG-3'（配列番号３６）と，
5'-ATT CTG TTG GCC GGG TTG-3'（配列番号３２）と，
5'-TCA AGA ACG GCG AGT GGC TTC TCT TCT GAG GCG ATC CA-3'（配列番号３７）と，
5'-GGT CTG TCA TGG TGA CAA AC-3'（配列番号３５）とからなり，
さらに，5'-GCT CTC TCA AGG TCT TCG GG-3'（配列番号３８），5'-CTT GCC ATC CGC GAC TGG A-3'（配列番号３９）のいずれか又はすべてを含み，
プライマーセット４は，
5'-ACA GGT TTG TAA AAC CCA GTT CCA CAC TCC ATT GCC GAT GTC AC-3'（配列番号４７）と，
5'-TGA CAA AAG CGA CAA AGG TT-3'（配列番号４３）と，
5'-ATG GCT TCG AAG ACC CTC GAA CGG AGA TCA ACT TCT CCT GTA-3'（配列番号４８）と，
5'-TGG ACT GCG AGT CCT GC-3'（配列番号４６）とからなり，
さらに，5'-GGA AGT GTC TTT TGA GGA A-3'（配列番号４９），5'-TTT GCA CGC CGT GGG AC-3'（配列番号５０）のいずれか又はすべてを含む
ことを特徴とするプライマーセット。
【請求項３】
配列番号１で示される口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列の，１２１番〜３５１番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列，又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項４】
口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列を基に設計された配列番号２〜１２で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた，少なくとも連続する１５塩基を含む請求項３に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項５】
口蹄疫ウィルスの標的核酸上の３'末端側からF3c，F2c，F1cという塩基配列領域を，５'末端側からB3，B2，B1という塩基配列領域を選択し，それぞれの相補的塩基配列をF3，F2，F1，そしてB3c，B2c，B1cとしたときに，以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた少なくとも１種の塩基配列からなることを特徴とする請求項３又は４に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のF2領域を３'末端側に有し，５'末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のF3領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のB2領域を３'末端側に有し，５'末端側に標的核酸のB1c領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のB3領域を有する塩基配列。
【請求項６】
口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき，５'末端から３'末端に向かい以下の（ｅ）〜（ｇ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項３ないし５に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ｅ）5'-（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号３の塩基配列）-3'
（ｆ）5'-（配列番号４の塩基配列に相補的な塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号５の塩基配列）-3'
（ｇ）5'-（配列番号７の塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号８の塩基配列に相補的な塩基配列）-3'
【請求項７】
配列番号１７で示される口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列の，７８８３番〜８０９２番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列，又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項８】
口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列を基に設計された配列番号１８〜２５で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた，少なくとも連続する１５塩基を含む請求項７に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項９】
口蹄疫ウィルスの標的核酸上の３'末端側からF3c，F2c，F1cという塩基配列領域を，５'末端側からB3，B2，B1という塩基配列領域を選択し，それぞれの相補的塩基配列をF3，F2，F1，そしてB3c，B2c，B1cとしたときに，以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた少なくとも１種の塩基配列からなることを特徴とする請求項７又は８に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のF2領域を３'末端側に有し，５'末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のF3領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のB2領域を３'末端側に有し，５'末端側に標的核酸のB1c領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のB3領域を有する塩基配列。
【請求項１０】
口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき，５'末端から３'末端に向かい以下の（ｅ）〜（ｆ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項７ないし９に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ｅ）5'-（配列番号１８の塩基配列に相補的な塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号１９の塩基配列）-3'
（ｆ）5'-（配列番号２１の塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号２２の塩基配列に相補的な塩基配列）-3'
【請求項１１】
配列番号２９で示される口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列の，４３２６番〜４５４２番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列，又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１２】
口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列を基に設計された配列番号３０〜３７で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた，少なくとも連続する１５塩基を含む請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１３】
口蹄疫ウィルスの標的核酸上の３'末端側からF3c，F2c，F1cという塩基配列領域を，５'末端側からB3，B2，B1という塩基配列領域を選択し，それぞれの相補的塩基配列をF3，F2，F1，そしてB3c，B2c，B1cとしたときに，以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた少なくとも１種の塩基配列からなることを特徴とする請求項１１又は１２に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のF2領域を３'末端側に有し，５'末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のF3領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のB2領域を３'末端側に有し，５'末端側に標的核酸のB1c領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のB3領域を有する塩基配列。
【請求項１４】
口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき，５'末端から３'末端に向かい以下の（ｅ）〜（ｆ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項１１ないし１３に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ｅ）5'-（配列番号３０の塩基配列に相補的な塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号３１の塩基配列）-3'
（ｆ）5'-（配列番号３３の塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号３４の塩基配列に相補的な塩基配列）-3'
【請求項１５】
配列番号４０で示される口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列の，７７６７番〜７９６４番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列，又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１６】
口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列を基に設計された配列番号４１〜４８で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた，少なくとも連続する１５塩基を含む請求項１５に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１７】
口蹄疫ウィルスの標的核酸上の３'末端側からF3c，F2c，F1cという塩基配列領域を，５'末端側からB3，B2，B1という塩基配列領域を選択し，それぞれの相補的塩基配列をF3，F2，F1，そしてB3c，B2c，B1cとしたときに，以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた少なくとも１種の塩基配列からなることを特徴とする請求項１５又は１６に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のF2領域を３'末端側に有し，５'末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のF3領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のB2領域を３'末端側に有し，５'末端側に標的核酸のB1c領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のB3領域を有する塩基配列。
【請求項１８】
口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき，５'末端から３'末端に向かい以下の（ｅ）〜（ｈ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする請求項１５ないし１７に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ｅ）5'-（配列番号４１の塩基配列に相補的な塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号４２の塩基配列）-3'
（ｆ）5'-（配列番号４４の塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号４５の塩基配列に相補的な塩基配列）-3'
【請求項１９】
請求項１又は２に記載のプライマーセットを用いて，口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする口蹄疫ウィルスの検出方法。
【請求項２０】
請求項３ないし１８に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて，口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする口蹄疫ウィルスの検出方法。
【請求項２１】
請求項３ないし１８に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせて１本，２本あるいは３本の反応チューブ内で用いて，４タイプの口蹄疫ウィルス遺伝子の標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする包括的な口蹄疫ウィルスの検出方法。
【請求項２２】
口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅反応がLAMP法であることを特徴とする請求項１９ないし２１に記載の口蹄疫ウィルスの検出方法。
【請求項２３】
請求項１ないし２に記載のプライマーセットを用いて，口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより，口蹄疫ウィルス感染の有無を診断することを特徴とする口蹄疫ウィルス感染症の診断方法。
【請求項２４】
請求項３ないし１８に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより，口蹄疫ウィルス感染の有無を診断することを特徴とする口蹄疫ウィルス感染症の診断方法。
【請求項２５】
請求項３ないし１８に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせて１本，２本あるいは３本の反応チューブ内で用いて，４タイプの口蹄疫ウィルス遺伝子の標的核酸領域の増幅を検出することにより，口蹄疫ウィルス感染の有無を診断することを特徴とする口蹄疫ウィルス感染症の診断方法。
【請求項２６】
口蹄疫ウィルス検出もしくは口蹄疫診断のためのキットであって，請求項１又は２のプライマーセットを含むことを特徴とするキット。
【請求項２７】
口蹄疫ウィルス検出もしくは口蹄疫診断のためのキットであって，請求項３ないし１８に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，口蹄疫ウィルスの包括的検出方法に関する。さらに詳しくは，口蹄疫ウィルスを検出するためのプライマー，プライマーセット，それらを用いた口蹄疫ウィルスの包括的検出方法および口蹄疫の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
口蹄疫ウィルス（foot-and-mouth disease virus）は，ピコルナウィルス科（Picornaviridae）アフトウィルス属（Aphtovirus）に属する１本鎖RNAウィルスである。口蹄疫ウィルスは，O型，A型，C型，Asia-1型，SAT-1型，SAT-2型，SAT-3型の7タイプに分類され，口蹄疫の原因ウィルスとして知られている。
【０００３】
口蹄疫は，牛や豚などの偶蹄類動物に高い伝播性を持つ家畜の伝染病である。口蹄疫の主な臨床症状は，発熱，元気消失，多量のよだれ，舌や口中，蹄の付け根などの水疱形成であり，その結果，罹患した動物の生産性の低下や幼獣での高い致死率を引き起こしてしまう。そのため，日本をはじめとする口蹄疫清浄国において口蹄疫の感染が確認された場合，感染していない家畜への感染拡大を防ぐために，罹患した家畜（患畜）は，発見され次第殺処分される。これら殺処分などを含め，口蹄疫被害にかかる経済的損失は甚大なものとなってしまう。これらの事情を背景として，日本において口蹄疫は，家畜伝染病予防法により法定伝染病に指定されており，口蹄疫ウィルスの防疫や海外からの侵入時の迅速診断ならびに摘発淘汰は最重要課題となっている。
【０００４】
口蹄疫の診断方法としては，口蹄疫の感染個体の血液・糞便・口腔内拭い液などの検体試料を用いて，抗体測定法，培養細胞を用いたウィルス分離法，分子生物学的試験法であるPCR法による診断が行われている。しかしながら，抗体測定法では，感染した個体内で口蹄疫ウィルスに対する抗体が形成される必要があり，抗体形成前や抗体形成量が少ない感染初期の個体を摘発することは出来ない。また，ウィルス分離法では，診断可能となる量のウィルスを培養するまで，通常，数日を要するため，迅速に診断ができないという問題を有する。
一方，PCR法は，抗体測定法やウィルス分離法と比較すると迅速に結果を得ることが出来る利点を有することから，口蹄疫において主たる診断法として用いられている。しかしながら，PCR法であっても検体試料入手から診断まで約５時間を必要としてしまう。さらには，検出感度を下回るウィルス量しか有さない検体試料の場合，偽陰性を示すことが問題となっている。実際，口蹄疫の被害拡大を抑制するためには，口蹄疫特有の臨床症状を示す前の感染初期の個体を迅速かつ高感度で診断し，摘発淘汰することが重要であるが，PCR法では，必ずしも迅速かつ高感度な診断が出来ているとはいえないのが現状といえる。事実，２０１０年に宮崎県において発生した口蹄疫では，口蹄疫にみられる典型的な症状を示さない個体が見られ，これら個体についてもPCR法による診断が行われてきた。しかしながら感染拡大を十分に防ぐことはできず，結果として，約２９万頭にも及ぶ家畜の殺処分という大規模なものとなってしまった。
このことからも分かるように，現在用いられている口蹄疫の診断方法は，迅速性および感度の点において必ずしも十分なものとは言えないため，新たな診断法の開発が望まれている。
【０００５】
口蹄疫の新たな診断法として，LAMP法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）を用いた口蹄疫の診断法が注目されている。LAMP法は，PCR法と同様，遺伝子などの核酸を増幅して診断する方法ではあるが，PCR法で不可欠とされる温度制御が不要な新しい核酸増幅法である（特許文献１）。そのため，LAMP法は，PCR法よりも簡易迅速かつ高感度な検査法といえる。
現在，LAMP法を用いて，様々な病原体を検出するプライマーセットが多数論文報告されており（非特許文献１から７），口蹄疫ウィルスを検出するためのLAMP法についても，いくつかの報告がなされている（非特許文献８から１０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第００／２８０８２号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yamazaki, W., M.Taguchi and N. Misawa. 2010. Development of a loop-mediated isothermalamplification and PCR assays for rapid and simple identification of Campylobacter fetus subsp. venerealis. Microbiol Immunol.54:398-404
【非特許文献２】Yamazaki, W., Y.Kumeda, N. Misawa, Y. Nakaguchi and M. Nishibuchi. 2010. Development of aloop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detectionof the tdh and trh genes of Vibrioparahaemolyticus and related Vibriospecies. Appl Environ Microbiol 76:820-828.
【非特許文献３】Yamazaki, W., M.Taguchi, T. Kawai, K. Kawatsu, J. Sakata, K. Inoue and N. Misawa. 2009.Comparison of loop-mediated isothermal amplification assay and conventionalculture methods for detection of Campylobacterjejuni and Campylobacter coli innaturally contaminated chicken meat samples. Appl Environ Microbiol75:1597-1603.
【非特許文献４】Yamazaki, W., M.Taguchi, M. Ishibashi, M. Nukina, N. Misawa and K. Inoue. 2009. Development ofa loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapiddetection of Campylobacter fetus. VetMicrobiol 136:393-396.
【非特許文献５】Yamazaki, W., M.Taguchi, M. Ishibashi, M. Kitazato, M. Nukina, N. Misawa and K. Inoue. 2008. Developmentand evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid andsimple detection of Campylobacter jejuni andCampylobacter coli. J Med Microbiol57:444-451.
【非特許文献６】Yamazaki, W., K. Seto,M. Taguchi, M. Ishibashi and K. Inoue. 2008. Sensitive and rapid detection ofcholera toxin-producing Vibrio choleraeusing a loop-mediated isothermal amplification. BMC Microbiol 8:94 (1-7).
【非特許文献７】Yamazaki, W., M.Ishibashi, R. Kawahara and K. Inoue. 2008. Development of a loop-mediatedisothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Vibrio parahaemolyticus. BMC Microbiol8:163 (1-7).
【非特許文献８】Jun-Jun Shao, Hui-YunChang, Guang-Qing Zhou, Guo-Zheng Cong, Jun-Zheng Du, Tong Lin, Shan-Dian Gao,Ji-Jun He, Xiang-Tao Liu, Ji-Xing Liu and Jin-Liang Gao. 2010. Rapid detectionof foot-and-mouth disease virus by reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification (RT- LAMP). Intern J Appl Res Vet Med. 8:133-142.
【非特許文献９】Dukes, J.P., King,D.P. and Alexandersen, S. 2006. Novel reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification for rapid detection of foot-and-mouth disease virus.Arch Virol 151:1093-1106.
【非特許文献１０】Li, J., Chen, Q.,Xiong, W. and Fang, X.E. 2009. Establishment of RT- LAMP for rapid detection offoot-and-mouth disease virus. Bing Du Xue Bao 25:137-142.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献８から１０では，LAMP法を用いた口蹄疫の診断方法が開示されている。
しかしながら非特許文献８では，中国国内で限定された期間に収集された５９検体のうち，２%にあたる１検体は検出が出来ず，偽陰性を示している。また，非特許文献９では，世界各国で分離された口蹄疫ウィルス９３株のうち，１８%にあたる１７株は検出が出来ず偽陰性を示している。
【０００９】
発明者らは，これら非特許文献８から１０に開示された技術の検証実験を行った。すなわち，発明者らは，特に東アジアおよび東南アジアで発生があり日本への侵入も危惧される，O型，A型，C型，Asia-1型の４タイプの口蹄疫ウィルスに着目し，非特許文献８から１０の技術が，これら４タイプの口蹄疫ウィルスを十分に検出が可能かどうかについて検討を行った。これら４タイプの口蹄疫ウィルスは，サブタイプを含めて２１７検体が既存の塩基配列情報として知られている。これら２１７検体に対する非特許文献８から１０記載のLAMP法プライマーの特異性を検証したところ，LAMP法において発明者らが重要な領域と考える核酸増幅反応で用いられる各プライマーの反応拠点側から５塩基の領域（以下，「反応重要領域」という）ならびにそれ以外の領域に極めて多くのミスマッチを有することを発明者らは見出した。加えて，発明者らは，非特許文献８および１０記載のLAMP法プライマーは，中国国内の限定された期間に入手可能であった検体を使用して設計されたものであり，それを用いて口蹄疫の特異性を検証しているにすぎず，そのため，非特許文献８および１０記載のLAMP法プライマーは，口蹄疫ウィルスの極めて多様な塩基配列に対応しきれていないことにも着目した。検証実験の結果，これら非特許文献８から１０に見られるLAMP法プライマーでは，多様な口蹄疫ウィルスを十分に検出が可能とはいえないことを発明者らは確認した。
【００１０】
上記事情を背景として，本発明では，多様な口蹄疫ウィルスを迅速かつ高感度に検出することが可能な口蹄疫ウィルスの検出方法の開発を課題とする。特に，東アジアおよび東南アジアで発生があり日本への侵入が危惧される，O型，A型，C型，Asia-1型の少なくとも４タイプの検出を目的とした口蹄疫ウィルスの検出方法の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らは，鋭意研究の結果，O型，A型，C型，Asia-1型の４タイプの口蹄疫ウィルスを迅速かつ高感度で検出しうるオリゴヌクレオチドプライマーを見出した。すなわち，それらのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて口蹄疫ウィルスの遺伝子を増幅させることにより，口蹄疫ウィルスの検出が可能となる。加えて，発明者らは，オリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせたプライマーセットをも見出し，それらプライマーセットを単独もしくは組み合わせてLAMP法に用いることにより，口蹄疫ウィルスを迅速かつ高感度で検出することが可能となり，本発明を完成させた。
【００１２】
本発明は以下の構成からなる。
（１）下記プライマーセットのいずれか又は複数を含む口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであって，
プライマーセット１は，
O-IPF-1：5'-ACA AGT CCT CCT CAA GCG ACG ATT CGC CTA GTT TTG CCC GT-3'（配列番号１０）
又はO-IPF-2：5'-GTC CCA TTT CTC CTG AAA ACG GGA TGA ACC TTC ACC CGG AAG-3'（配列番号１１）のいずれか又は両方と，
O-OPF：5'-CAA CCA CAA GAA TTG CCT TC-3'（配列番号６）と，
O-IPB：5'-GAC TTG TAC AAA CAC GAT CTA CTC AGG CAC CCC TCT AGA CCT GGA A-3'（配列番号１２）と，
O-OPB：5'-GTG GAG TCA AGC ACA GTA CA-3'（配列番号９）とからなり，
プライマーセット２は，
A-IPF：5'-GCC ACG GAG ATC AAC TTC TCC TCT TGA GGC TAT CCT CTC CTT-3'（配列番号２４）と，
A-OPF：5'-GTG ATG GCC TCA AAG ACC-3'（配列番号２０）と，
A-IPB：5'-GAC GAG TAC CGG CGT CTC TTC GCA GGT AAA GTG ATC TGT-3'（配列番号２５）と，
A-OPB：5'-ATT ATG CGT CAC CAC ACA C-3'（配列番号２３）とからなり，
プライマーセット３は，
C-IPF：5'-GTC ACG TGC TTT GAG TTG TTT CTC CGC CTC GAG TTT CTT CCG-3'（配列番号３６）と，
C-OPF：5'-ATT CTG TTG GCC GGG TTG-3'（配列番号３２）と，
C-IPB：5'-TCA AGA ACG GCG AGT GGC TTC TCT TCT GAG GCG ATC CA-3'（配列番号３７）と，
C-OPB：5'-GGT CTG TCA TGG TGA CAA AC-3'（配列番号３５）とからなり，
プライマーセット４は，
Asia-1-IPF：5'-ACA GGT TTG TAA AAC CCA GTT CCA CAC TCC ATT GCC GAT GTC AC-3'（配列番号４７）と，
Asia-1-OPF：5'-TGA CAA AAG CGA CAA AGG TT-3'（配列番号４３）と，
Asia-1-IPB：5'-ATG GCT TCG AAG ACC CTC GAA CGG AGA TCA ACT TCT CCT GTA-3'（配列番号４８）と，
Asia-1-OPB：5'-TGG ACT GCG AGT CCT GC-3'（配列番号４６）とからなる，
ことを特徴とするプライマーセット。
（２）下記プライマーセットのいずれか又は複数を含む口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであって，
プライマーセット１は，
O-IPF-1：5'-ACA AGT CCT CCT CAA GCG ACG ATT CGC CTA GTT TTG CCC GT-3'（配列番号１０）
又はO-IPF-2：5'-GTC CCA TTT CTC CTG AAA ACG GGA TGA ACC TTC ACC CGG AAG-3'（配列番号１１）のいずれか又は両方と，
O-OPF：5'-CAA CCA CAA GAA TTG CCT TC-3'（配列番号６）と，
O-IPB：5'-GAC TTG TAC AAA CAC GAT CTA CTC AGG CAC CCC TCT AGA CCT GGA A-3'（配列番号１２）と，
O-OPB：5'-GTG GAG TCA AGC ACA GTA CA-3'（配列番号９）とを含み，
さらに，O-LPF-1：5'-TTT CGT GCG CAG ACG TCC C-3'（配列番号１３），
O-LPF-2：5'-ACT AGG CGA ATT TGC CGT TTT A-3'（配列番号１４），
O-LPB-1：5'-GCA ACT TGA AAC TCC GCC T-3'（配列番号１５），
O-LPB-2：5'-CCG ACA CAA ACC GTG CAA-3'（配列番号１６）のいずれか又は複数を含み，
プライマーセット２は，
A-IPF：5'-GCC ACG GAG ATC AAC TTC TCC TCT TGA GGC TAT CCT CTC CTT-3'（配列番号２４）と，
A-OPF：5'-GTG ATG GCC TCA AAG ACC-3'（配列番号２０）と，
A-IPB：5'-GAC GAG TAC CGG CGT CTC TTC GCA GGT AAA GTG ATC TGT-3'（配列番号２５）と，
A-OPB：5'-ATT ATG CGT CAC CAC ACA C-3'（配列番号２３）とからなり，
さらに，A-LPF：5'-CCA CGG CGT GCA AAG GA-3'（配列番号２６），
A-LPB-1：5'-GAG CCC TTC CAG GGC CTC TT-3'（配列番号２７），
A-LPB-2：5'-GCC TCT TTG AGA TCC CAA GCT-3'（配列番号２８）のいずれか又は複数を含み，
プライマーセット３は，
C-IPF：5'-GTC ACG TGC TTT GAG TTG TTT CTC CGC CTC GAG TTT CTT CCG-3'（配列番号３６）と，
C-OPF：5'-ATT CTG TTG GCC GGG TTG-3'（配列番号３２）と，
C-IPB：5'-TCA AGA ACG GCG AGT GGC TTC TCT TCT GAG GCG ATC CA-3'（配列番号３７）と，
C-OPB：5'-GGT CTG TCA TGG TGA CAA AC-3'（配列番号３５）とからなり，
さらに，C-LPF：5'-GCT CTC TCA AGG TCT TCG GG-3'（配列番号３８），
C-LPB：5'-CTT GCC ATC CGC GAC TGG A-3'（配列番号３９）のいずれか又はすべてを含み，
プライマーセット４は，
Asia-1-IPF：5'-ACA GGT TTG TAA AAC CCA GTT CCA CAC TCC ATT GCC GAT GTC AC-3'（配列番号４７）と，
Asia-1-OPF：5'-TGA CAA AAG CGA CAA AGG TT-3'（配列番号４３）と，
Asia-1-IPB：5'-ATG GCT TCG AAG ACC CTC GAA CGG AGA TCA ACT TCT CCT GTA-3'（配列番号４８）と，
Asia-1-OPB：5'-TGG ACT GCG AGT CCT GC-3'（配列番号４６）とからなり，
さらに，Asia-1-LPF：5'-GGA AGT GTC TTT TGA GGA A-3'（配列番号４９），
Asia-1-LPB：5'-TTT GCA CGC CGT GGG AC-3'（配列番号５０）のいずれか又はすべてを含む，
ことを特徴とするプライマーセット。
【００１３】
（３）配列番号１で示される口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列（GenBank accession No. AB079061）の，１２１番〜３５１番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列，又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（４）口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列を基に設計された配列番号２〜１２で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた，少なくとも連続する１５塩基を含む（３）に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（５）口蹄疫ウィルスの標的核酸上の３'末端側からF3c，F2c，F1cという塩基配列領域を，５'末端側からB3，B2，B1という塩基配列領域を選択し，それぞれの相補的塩基配列をF3，F2，F1，そしてB3c，B2c，B1cとしたときに，以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた少なくとも１種の塩基配列からなることを特徴とする（３）又は（４）に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のF2領域を３'末端側に有し，５'末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のF3領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のB2領域を３'末端側に有し，５'末端側に標的核酸のB1c領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のB3領域を有する塩基配列。
（６）口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき，５'末端から３'末端に向かい以下の（ｅ）〜（ｇ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（３）〜（５）に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ｅ）5'-（配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号３の塩基配列）-3'
（ｆ）5'-（配列番号４の塩基配列に相補的な塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号５の塩基配列）-3'
（ｇ）5'-（配列番号７の塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号８の塩基配列に相補的な塩基配列）-3'
【００１４】
（７）配列番号１７で示される口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列（GenBank accession No. AY593802）の，７８８３番〜８０９２番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列，又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（８）口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列を基に設計された配列番号１８〜２５で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた，少なくとも連続する１５塩基を含む（７）に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（９）口蹄疫ウィルスの標的核酸上の３'末端側からF3c，F2c，F1cという塩基配列領域を，５'末端側からB3，B2，B1という塩基配列領域を選択し，それぞれの相補的塩基配列をF3，F2，F1，そしてB3c，B2c，B1cとしたときに，以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた少なくとも１種の塩基配列からなることを特徴とする（７）又は（８）に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のF2領域を３'末端側に有し，５'末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のF3領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のB2領域を３'末端側に有し，５'末端側に標的核酸のB1c領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のB3領域を有する塩基配列。
（１０）口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき，５'末端から３'末端に向かい以下の（ｅ）〜（ｆ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（７）〜（９）に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ｅ）5'-（配列番号１８の塩基配列に相補的な塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号１９の塩基配列）-3'
（ｆ）5'-（配列番号２１の塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号２２の塩基配列に相補的な塩基配列）-3'
【００１５】
（１１）配列番号２９で示される口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列（GenBank accession No. AY593809）の，４３２６番〜４５４２番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列，又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（１２）口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列を基に設計された配列番号３０〜３７で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた，少なくとも連続する１５塩基を含む（１１）に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（１３）口蹄疫ウィルスの標的核酸上の３'末端側からF3c，F2c，F1cという塩基配列領域を，５'末端側からB3，B2，B1という塩基配列領域を選択し，それぞれの相補的塩基配列をF3，F2，F1，そしてB3c，B2c，B1cとしたときに，以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた少なくとも１種の塩基配列からなることを特徴とする（１１）又は（１２）に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のF2領域を３'末端側に有し，５'末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のF3領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のB2領域を３'末端側に有し，５'末端側に標的核酸のB1c領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のB3領域を有する塩基配列。
（１４）口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき，５'末端から３'末端に向かい以下の（ｅ）〜（ｆ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１１）〜（１３）に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ｅ）5'-（配列番号３０の塩基配列に相補的な塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号３１の塩基配列）-3'
（ｆ）5'-（配列番号３３の塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号３４の塩基配列に相補的な塩基配列）-3'
【００１６】
（１５）配列番号４０で示される口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列（GenBank accession No. AY593795）の，７７６７番〜７９６４番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列，又はそれらと相補的な塩基配列を基に設計されたオリゴヌクレオチドプライマー。
（１６）口蹄疫ウィルス遺伝子の塩基配列を基に設計された配列番号４１〜４８で示される塩基配列又はそれらと相補的な塩基配列から選ばれた，少なくとも連続する１５塩基を含む（１５）に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（１７）口蹄疫ウィルスの標的核酸上の３'末端側からF3c，F2c，F1cという塩基配列領域を，５'末端側からB3，B2，B1という塩基配列領域を選択し，それぞれの相補的塩基配列をF3，F2，F1，そしてB3c，B2c，B1cとしたときに，以下の（ａ）〜（ｄ）から選ばれた少なくとも１種の塩基配列からなることを特徴とする（１５）又は（１６）に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ａ）標的核酸のF2領域を３'末端側に有し，５'末端側に標的核酸のF1c領域を有する塩基配列。
（ｂ）標的核酸のF3領域を有する塩基配列。
（ｃ）標的核酸のB2領域を３'末端側に有し，５'末端側に標的核酸のB1c領域を有する塩基配列。
（ｄ）標的核酸のB3領域を有する塩基配列。
（１８）口蹄疫ウィルスに特異的な塩基配列を増幅でき，５'末端から３'末端に向かい以下の（ｅ）〜（ｈ）から選ばれた塩基配列から成ることを特徴とする（１５）〜（１７）に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（ｅ）5'-（配列番号４１の塩基配列に相補的な塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号４２の塩基配列）-3'
（ｆ）5'-（配列番号４４の塩基配列）-（塩基数０〜５０の任意の塩基配列）-（配列番号４５の塩基配列に相補的な塩基配列）-3'
【００１７】
（１９）（１）又は（２）に記載のプライマーセットを用いて，口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする口蹄疫ウィルスの検出方法。
（２０）（３）〜（１８）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて，口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする口蹄疫ウィルスの検出方法。
（２１）（３）〜（１８）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせて１本，２本あるいは３本の反応チューブ内で用いて，４タイプの口蹄疫ウィルス遺伝子の標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする包括的な口蹄疫ウィルスの検出方法。
（２２）口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅反応がLAMP法であることを特徴とする（１９）〜（２１）に記載の口蹄疫ウィルスの検出方法。
（２３）（１）又は（２）に記載のプライマーセットを用いて，口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより，口蹄疫ウィルス感染の有無を診断することを特徴とする口蹄疫ウィルス感染症の診断方法。
（２４）（３）〜（１８）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて口蹄疫ウィルスの標的核酸領域の増幅を検出することにより，口蹄疫ウィルス感染の有無を診断することを特徴とする口蹄疫ウィルス感染症の診断方法。
（２５）（３）〜（１８）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせて１本，２本あるいは３本の反応チューブ内で用いて，４タイプの口蹄疫ウィルス遺伝子の標的核酸領域の増幅を検出することにより，口蹄疫ウィルス感染の有無を診断することを特徴とする口蹄疫ウィルス感染症の診断方法。
（２６）口蹄疫ウィルス検出もしくは口蹄疫診断のためのキットであって，（１）又は（２）のプライマーセットを含むことを特徴とするキット。
（２７）口蹄疫ウィルス検出もしくは口蹄疫診断のためのキットであって，（３）〜（１８）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことを特徴とするキット。
【００１８】
本明細書において，プライマーとは，特に限定しない限り，複数の塩基配列を有する核酸断片をいい，DNAポリメラーゼによるDNA合成の際用いることができるものをいう。
また，プライマーセットとは，複数個のプライマーの組合せのみならず，そのようなプライマーの組合せを複数個含むものも合わせてプライマーセットというものとする。
さらに，LAMP法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）とは，鋳型となるヌクレオチドに自身の３'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに，このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより，等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法として定義される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により，従来法よりも高感度で迅速かつ簡易に口蹄疫ウィルスを検出することが可能となった。特に，日本への侵入が危惧される４タイプの口蹄疫ウィルスを，特異的，高感度かつ迅速に検出することが可能となり，日本を含めたアジア地域での口蹄疫ウィルスに対する防疫に貢献することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】配列番号５１の人工塩基配列とプライマーセット１を用いてLAMP法を行った場合の，反応溶液中の濁度の経時変化を示した図
【図２】配列番号５２の人工塩基配列とプライマーセット２を用いてLAMP法を行った場合の，反応溶液中の濁度の経時変化を示した図
【図３】配列番号５３の人工塩基配列とプライマーセット３を用いてLAMP法を行った場合の，反応溶液中の濁度の経時変化を示した図
【図４】配列番号５４の人工塩基配列とプライマーセット４を用いてLAMP法を行った場合の，反応溶液中の濁度の経時変化を示した図
【図５】配列番号５１の人工塩基配列とプライマーセット１，プライマーセット２を混合してLAMP法を行った場合の，反応溶液中の濁度の経時変化を示した図
【図６】配列番号５２の人工塩基配列とプライマーセット１，プライマーセット２を混合してLAMP法を行った場合の，反応溶液中の濁度の経時変化を示した図
【図７】配列番号５３の人工塩基配列とプライマーセット３，プライマーセット４を混合してLAMP法を行った場合の，反応溶液中の濁度の経時変化を示した図
【図８】配列番号５４の人工塩基配列とプライマーセット３，プライマーセット４を混合してLAMP法を行った場合の，反応溶液中の濁度の経時変化を示した図
【図９】配列番号５１の人工塩基配列とプライマーセット１，プライマーセット２，プライマーセット３，プライマーセット４を混合してLAMP法を行った場合の，反応溶液中の濁度の経時変化を示した図
【図１０】配列番号５２の人工塩基配列とプライマーセット１，プライマーセット２，プライマーセット３，プライマーセット４を混合してLAMP法を行った場合の，反応溶液中の濁度の経時変化を示した図
【図１１】配列番号５３の人工塩基配列とプライマーセット１，プライマーセット２，プライマーセット３，プライマーセット４を混合してLAMP法を行った場合の，反応溶液中の濁度の経時変化を示した図
【図１２】配列番号５４の人工塩基配列とプライマーセット１，プライマーセット２，プライマーセット３，プライマーセット４を混合してLAMP法を行った場合の，反応溶液中の濁度の経時変化を示した図
【図１３】電気泳動法によるPCR法の検出感度を示した図
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下，下記のプライマーセットを用いたLAMP法による口蹄疫ウィルス検出法を一例として説明する。これら１から４に例示するプライマーセットは，プライマーセット１がO型，プライマーセット２がA型，プライマーセット３がC型，プライマーセット４がAsia-1型の口蹄疫ウィルスを主な検出対象とするプライマーのセットである。これらプライマーセットは，主な検出対象である口蹄疫ウィルスのタイプを高率で検出することが可能であるが，主な検出対象の型の口蹄疫ウィルスのみの検出に限定する意図ではなく，その他の型の口蹄疫ウィルスの検出に用いてもかまわない。例えば，プライマーセット１を用いて，A型やC型の口蹄疫ウィルスを検出するなどである。通常，口蹄疫ウィルスを検出する場合，対象となる型が分からないことも多い。その場合などには種々のプライマーセットを複合的に用いることにより，より正確な口蹄疫ウィルス検出や診断が可能となることが期待できるからである。
なお，詳細は後述するが，IPFはインナープライマーF，OPFはアウタープライマーF，IPBがインナープライマーB，OPBがアウタープライマーB，LPFがループプライマーF，LPBがループプライマーBの略である。
１．プライマーセット１
O-IPF-1：5'-ACA AGT CCT CCT CAA GCG ACG ATT CGC CTA GTT TTG CCC GT-3'（配列番号１０）
O-IPF-2：5'-GTC CCA TTT CTC CTG AAA ACG GGA TGA ACC TTC ACC CGG AAG-3'（配列番号１１）
O-OPF：5'-CAA CCA CAA GAA TTG CCT TC-3'（配列番号６）
O-IPB：5'-GAC TTG TAC AAA CAC GAT CTA CTC AGG CAC CCC TCT AGA CCT GGA A-3'（配列番号１２）
O-OPB：5'-GTG GAG TCA AGC ACA GTA CA-3'（配列番号９）
O-LPF-1：5'-TTT CGT GCG CAG ACG TCC C-3'（配列番号１３）
O-LPF-2：5'-ACT AGG CGA ATT TGC CGT TTT A-3'（配列番号１４）
O-LPB-1：5'-GCA ACT TGA AAC TCC GCC T-3'（配列番号１５）
O-LPB-2：5'-CCG ACA CAA ACC GTG CAA-3'（配列番号１６）
２．プライマーセット２
A-IPF：5'-GCC ACG GAG ATC AAC TTC TCC TCT TGA GGC TAT CCT CTC CTT-3'（配列番号２４）
A-OPF：5'-GTG ATG GCC TCA AAG ACC-3'（配列番号２０）
A-IPB：5'-GAC GAG TAC CGG CGT CTC TTC GCA GGT AAA GTG ATC TGT-3'（配列番号２５）
A-OPB：5'-ATT ATG CGT CAC CAC ACA C-3'（配列番号２３）
A-LPF：5'-CCA CGG CGT GCA AAG GA-3'（配列番号２６）
A-LPB-1：5'-GAG CCC TTC CAG GGC CTC TT-3'（配列番号２７）
A-LPB-2：5'-GCC TCT TTG AGA TCC CAA GCT-3'（配列番号２８）
３．プライマーセット３
C-IPF：5'-GTC ACG TGC TTT GAG TTG TTT CTC CGC CTC GAG TTT CTT CCG-3'（配列番号３６）
C-OPF：5'-ATT CTG TTG GCC GGG TTG-3'（配列番号３２）
C-IPB：5'-TCA AGA ACG GCG AGT GGC TTC TCT TCT GAG GCG ATC CA-3'（配列番号３７）
C-OPB：5'-GGT CTG TCA TGG TGA CAA AC-3'（配列番号３５）
C-LPF：5'-GCT CTC TCA AGG TCT TCG GG-3'（配列番号３８）
C-LPB：5'-CTT GCC ATC CGC GAC TGG A-3'（配列番号３９）
４．プライマーセット４
Asia-1-IPF：5'-ACA GGT TTG TAA AAC CCA GTT CCA CAC TCC ATT GCC GAT GTC AC-3'（配列番号４７）
Asia-1-OPF：5'-TGA CAA AAG CGA CAA AGG TT-3'（配列番号４３）
Asia-1-IPB：5'-ATG GCT TCG AAG ACC CTC GAA CGG AGA TCA ACT TCT CCT GTA-3'（配列番号４８）
Asia-1-OPB：5'-TGG ACT GCG AGT CCT GC-3'（配列番号４６）
Asia-1-LPF：5'-GGA AGT GTC TTT TGA GGA A-3'（配列番号４９）
Asia-1-LPB：5'-TTT GCA CGC CGT GGG AC-3'（配列番号５０）
【００２２】
まず，本明細書におけるLAMP法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）について説明する。本明細書においてLAMP法とは，鋳型となるヌクレオチドに自身の３'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに，このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより，等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法として定義される。LAMP法では，プライマーの３'末端が常に試料に由来する領域に対してアニールするために，塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能する。この結果として，LAMP法は，高感度かつ特異性の高い核酸増幅反応が可能であるという特徴を有する。
【００２３】
LAMP法の核酸増幅で用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは，鋳型核酸の塩基配列の計６領域，すなわち３’末端側からF3c，F2c，F1cという領域と，５’末端側からB3，B2，B1という領域の塩基配列を認識する少なくとも４種類のプライマーであって，各々インナープライマーF及びＢ，アウタープライマーF及びＢと呼ばれる。また，F1c，F2c，F3cの相補的な塩基配列はF1，F2，F3と，B1，B2，B3の相補的な塩基配列はB1c，B2c，B3cとそれぞれ呼ばれる。
【００２４】
本明細書においてインナープライマーとは，標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し，かつ合成起点を与える塩基配列を３’末端に有し，同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’末端に有するオリゴヌクレオチドとして定義される。ここで，「F2より選ばれた塩基配列」及び「F1cより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーF（IPF），そして「B2より選ばれた塩基配列」と「B1cより選ばれた塩基配列」を含むプライマーをインナープライマーB（IPB）と呼ぶ。インナープライマーは，「F2より選ばれた塩基配列」と「F1cより選ばれた塩基配列」の間，あるいは「B2より選ばれた塩基配列」と「B1cより選ばれた塩基配列」の間に，塩基数０〜５０の任意の塩基配列を持っても良い。
【００２５】
一方，本明細書においてアウタープライマーとは，標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域の３’末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域」を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとして定義される。ここで，「F3より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーF（以下OPF），「B3より選ばれた塩基配列」を含むプライマーをアウタープライマーB（以下OPB）と呼ぶ。
【００２６】
ここで，各プライマーにおけるＦとは，標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し，合成起点を提供するプライマー表示であり，一方Ｂとは，標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し，合成起点を提供するプライマー表示である。ここで，プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは，１０塩基以上，好ましくは１５塩基以上で，化学合成あるいは天然のどちらでも良く，各プライマーは単一のオリゴヌクレオチドであってもよく，複数のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。また，各プライマーは１種類でも２種類でも良い。
【００２７】
このようにLAMP法の核酸増幅においては，それぞれＦとＢに対応するインナープライマーとアウタープライマーの少なくとも４種類が必須の構成プライマーとなる。前述のプライマーセットでいうと，プライマーセット１では，IPFとして配列番号１０ないし１１，IPBとして配列番号１２，OPFとして配列番号６，OPBとして配列番号９のプライマーが役割を果たすこととなる。同様に，プライマーセット２では，IPFとして配列番号２４，IPBとして配列番号２５，OPFとして配列番号２０，OPBとして配列番号２３，プライマーセット３では，IPFとして配列番号３６，IPBとして配列番号３７，OPFとして配列番号３２，OPBとして配列番号３５，プライマーセット４では，IPFとして配列番号４７，IPBとして配列番号４８，OPFとして配列番号４３，OPBとして配列番号４６のプライマーがそれぞれ役割を果たすこととなる。
【００２８】
続いてLAMP法の一連の流れについて説明を行う。
LAMP法による口蹄疫ウィルス検出のためには，検体試料が必要である。この検体試料としては，通常用いられるあらゆる検体試料を用いることが可能であり，例えば，ウィルス，ウィルスを含む培養細胞ならびに培養液，牛などの家畜由来の検体などが挙げられる。この場合，家畜由来の検体を検体試料として用いることがより好ましく，例えば血液，血清，体液，組織抽出液，あるいは組織拭い液ならびに組織拭き取り検体を検体試料として用いることができる。これにより，迅速な口蹄疫ウィルス検出が可能となるという効果を有する。
口蹄疫ウィルス検出のための検体試料については，通常用いられる前処理を行い後述するLAMP法に用いる際の試料とすることができる。例えば，タンパク質分解酵素等による組織細胞由来タンパク質を分解後，フェノール及びクロロホルムを用いて核酸抽出や精製を行ったり，市販されている抽出キット（例えばキアゲン社のRNeasy Mini Kit）を用いて得られた核酸を抽出したりするなどである。
【００２９】
検体試料の準備ができたら，前述のプライマーセットを用いて，核酸増幅のための操作を行う。この核酸増幅の際の操作として，例えば，反応Buffer中，少なくとも４種類のプライマー（IPF，IPB，OPF，OPB），鋳型依存性核酸合成酵素，デオキシヌクレオチド3リン酸などの基質を，６０から６５℃で１５分から1時間程度インキュベートすればよい。この場合，口蹄疫ウィルスはRNAウィルスであるため，鋳型がDNAの場合の反応液に逆転写酵素を添加する事で，同様に核酸増幅反応を進めることができる（RT-LAMP法）。また，上述の通り，ループプライマーをさらに用いることもできる。
【００３０】
鋳型依存性核酸合成酵素は，通常用いられるあらゆる鋳型依存性核酸合成酵素を用いることができる。このような酵素として，例えば，Bst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント），Bca(exo-)DNAポリメラーゼ，大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ，好ましくはBst DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。
RT-LAMP法に用いる逆転写酵素としては，通常用いられるあらゆる逆転写酵素を用いることができる。このような酵素として，例えばAMVやMMLVの逆転写酵素，SuperscriptII，ReverTraAce，Thermoscriptなどが挙げられ，より好ましくは，AMV逆転写酵素が挙げられる。またBca DNAポリメラーゼのように，逆転写酵素活性とDNAポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素があり，このような酵素を用いると，RT-LAMP反応を１つの酵素で行う事ができるという利点を有する。
【００３１】
プライマーセットは，単独のプライマーセットを用いて核酸増幅操作を行うこともできるし，複数を組み合わせて核酸増幅操作を行うこともできる。複数のプライマーセットを組み合わせて核酸増幅操作を行うことにより，少ないサンプルで同時に複数のタイプの口蹄疫ウィルス検出が可能となるため，簡便性と迅速性の観点から有用である。加えてプライマーセットは，口蹄疫ウィルスの多様性に対応するため，１種類のプライマーに対して複数用いることも可能である。１つのプライマーセットでIPFを複数用いるなどがこれに該当し，例えば，前述のプライマーセット１で，配列番号１０と１１の二つのIPFを用いていることがこれに該当する。さらに，プライマーセットでは，感度を向上させるために，ループプライマーを用いることができ，このループプライマーについても同種のものを複数用いることが可能である。例えば，前述のプライマーセット１で，配列番号１３と１４のＬＢＦを用いていることがこれに該当する。
【００３２】
これらプライマーセットは，少なくとも４種類のプライマーから構成される。
O型を検出するプライマーセットの場合，配列番号１（GenBank accession No. AB079061）で示される，１２１番から３５１番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列，もしくはそれらと相補的な塩基配列を基に設計することができる。同様に，A型を検出するプライマーセットの場合は配列番号１７（GenBank accession No. AY593802）で示される７８８３番〜８０９２番，C型を検出するプライマーセットの場合は配列番号２９（GenBank accession No. AY593809）で示される４３２６番〜４５４２番，Asia-1型を検出するプライマーセットの場合は配列番号４０（GenBank accession No. AY593795）で示される７７６７番〜７９６４番の塩基配列から選ばれた任意の塩基配列，もしくはそれらと相補的な塩基配列を基に設計することができる。これにより，反応重要領域においてミスマッチの少ないプライマーの設計が可能となり，LAMP法における感度，特異度を高めることが可能となる。この場合の塩基配列の長さとしては，核酸増幅効率の観点から，少なくとも１０，好ましくは１５以上の塩基配列を有することが好ましい。加えて，IPFとしてのプライマーを選択する場合は４０塩基程度，IPBとしてのプライマーを選択する場合は４０塩基程度，OPFとしてのプライマーを選択する場合は２０塩基程度，OPBとしてのプライマーを選択する場合は２０塩基程度を有することが好ましい。
【００３３】
このようにプライマー設計に必要とされる反応重要領域でのミスマッチを少なくすることによりLAMP法における感度，特異度を高めるという観点に加え，一定のGC含量を有しプライマーとしての安定性を高め，かつ，口蹄疫ウィルスの多様な塩基配列に対応できるインナープライマー部分として，配列番号１の塩基配列を基に配列番号２から５，７と８を用いることができる。これらのプライマー部分は，主にO型の口蹄疫ウィルスを検出する目的で，配列番号２がIPFのプライマーの一部，配列番号３がIPFのプライマーの一部，配列番号４がIPFのプライマーの一部，配列番号５がIPFのプライマーの一部，配列番号７がIPBのプライマーの一部，配列番号８がIPBのプライマーの一部として用いることができる。これらのプライマー部分もしくはプライマー部分と相補的な塩基配列を組み合わせて用いることにより，適切なインナープライマー設計を行うことができる。例えば，配列番号２は，5'-cgt cgc ttg agg agg act tgt-3'，配列番号３は5'-att cgc cta gtt ttg ccc gt-3'の塩基配列を有するが，配列番号２と相補的な塩基配列5'-aca agt cct cct caa gcg acg-3'と配列番号３を組み合わせることにより，5'- aca agt cct cct caa gcg acg att cgc cta gtt ttg ccc gt-3'（配列番号１０）とすることができる。この場合，核酸増幅機能を損なわないことから，配列番号２に相補的な塩基配列と配列番号３の間に０から５０の塩基配列を挿入しても構わない。同様に，配列番号４と相補的な塩基配列と配列番号５により配列番号１１の塩基配列，配列番号７と配列番号８と相補的な塩基配列で配列番号１２の塩基配列とすることができ，それぞれの塩基配列の間に０から５０の塩基配列を挿入しても構わない。
また，同様のプライマー設計コンセプトにより，アウタープライマーとして配列番号６（ＯＰＦ），配列番号９（ＯＰＢ）の塩基配列とすることができる。
【００３４】
その他，A型やC型，Asia-1型の口蹄疫ウィルスに関するプライマーについても，O型と同様のプライマー設計コンセプトを用いることができる。この場合，主にA型の口蹄疫ウィルスを検出する目的で，配列番号１８がIPFのプライマーの一部，配列番号１９がIPFのプライマーの一部，配列番号２０がOPF，配列番号２１がIPBのプライマーの一部，配列番号２２がIPBのプライマーの一部，配列番号２３がOPB，配列番号２４がIPF（配列番号１８に相補的な塩基配列と，配列番号１９の組合せ），配列番号２５がIPB（配列番号２１と，配列番号２２に相補的な塩基配列の組合せ）のプライマーとして用いることができる。加えて，主にC型の口蹄疫ウィルスを検出する目的で，配列番号３０がIPFのプライマーの一部，配列番号３１がIPFのプライマーの一部，配列番号３２がOPF，配列番号３３がIPBのプライマーの一部，配列番号３４がIPBのプライマーの一部，配列番号３５がOPB，配列番号３６がIPF（配列番号３０に相補的な塩基配列と，配列番号３１の組合せ），配列番号３７がIPB（配列番号３３と，配列番号３４に相補的な塩基配列の組合せ）のプライマーとして用いることができる。さらに，主にAsia-1型の口蹄疫ウィルスを検出する目的で，配列番号４１がIPFのプライマーの一部，配列番号４２がIPFのプライマーの一部，配列番号４３がOPF，配列番号４４がIPBのプライマーの一部，配列番号４５がIPBのプライマーの一部，配列番号４６がOPB，配列番号４７がIPF（配列番号４１に相補的な塩基配列と配列番号４２の組合せ），配列番号４８がIPB（配列番号４４と，配列番号４５に相補的な塩基配列の組合せ）のプライマーとして用いることができる。
【００３５】
核酸増幅反応操作が終了したら，核酸増幅産物の検出を行う。核酸増幅産物の検出には，通常用いられるあらゆる検出方法を用いることができる。例えば，増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドを用いた検出や蛍光性インターカレーター法，アガロースゲル電気泳動法による検出などである。アガロースゲル電気泳動法においてLAMP増幅産物は，塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。
加えて，LAMP法では目視による検出ができる場合があり，迅速な口蹄疫ウィルス検出が必要な場合に好ましい。すなわち，LAMP法では，核酸の合成により基質が大量に消費され，副産物であるピロリン酸が，共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり，反応液が肉眼で確認できる程度に白濁することから口蹄疫ウィルスの検出が可能である。この場合，反応中の濁度上昇経過や反応終了後の濁度を光学的に観察できる分光光度計等の測定機器を用いて，口蹄疫ウィルスの検出を確認することも可能である。
【００３６】
本発明のプライマーやプライマーセットを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は，あらかじめパッケージングしてキット化することができる。例えば，本発明のプライマーあるいはループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド，核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰ，鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素，逆転写活性を持つ酵素，酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類，酵素や鋳型を安定化する保護剤，さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして提供される。
【実施例】
【００３７】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが，本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００３８】
＜＜実験１，検出感度の確認＞＞
本発明におけるプライマーを用いた場合のLAMP法による検出感度について，PCR法と比較として実験を行った。
【００３９】
＜陽性コントロール試料の調製＞
ファスマック社製の人工塩基配列（配列番号５１〜５４）をＴＥ緩衝液で溶解し，１０倍ずつＴＥ緩衝液で段階的に希釈を行い，コピー数を算出した上で，鋳型DNAとして用いた。
なお，配列番号５１が口蹄疫ウィルスO型，配列番号５２が口蹄疫ウィルスA型，配列番号５３が口蹄疫ウィルスC型，配列番号５４が口蹄疫ウィルスAsia-1型の陽性コントロールとして用いた。
【００４０】
＜実施例，LAMP法に使用したプライマー＞
下記のプライマーセットを用いた。
（実施例１）プライマーセット１
O-IPF-1：5'-ACA AGT CCT CCT CAA GCG ACG ATT CGC CTA GTT TTG CCC GT-3'（配列番号１０）
O-IPF-2：5'-GTC CCA TTT CTC CTG AAA ACG GGA TGA ACC TTC ACC CGG AAG-3'（配列番号１１）
O-OPF：5'-CAA CCA CAA GAA TTG CCT TC-3'（配列番号６）
O-IPB：5'-GAC TTG TAC AAA CAC GAT CTA CTC AGG CAC CCC TCT AGA CCT GGA A-3'（配列番号１２）
O-OPB：5'-GTG GAG TCA AGC ACA GTA CA-3'（配列番号９）
O-LPF-1：5'-TTT CGT GCG CAG ACG TCC C-3'（配列番号１３）
O-LPF-2：5'-ACT AGG CGA ATT TGC CGT TTT A-3'（配列番号１４）
O-LPB-1：5'-GCA ACT TGA AAC TCC GCC T-3'（配列番号１５）
O-LPB-2：5'-CCG ACA CAA ACC GTG CAA-3'（配列番号１６）
（実施例２）プライマーセット２
A-IPF：5'-GCC ACG GAG ATC AAC TTC TCC TCT TGA GGC TAT CCT CTC CTT-3'（配列番号２４）
A-OPF：5'-GTG ATG GCC TCA AAG ACC-3'（配列番号２０）
A-IPB：5'-GAC GAG TAC CGG CGT CTC TTC GCA GGT AAA GTG ATC TGT-3'（配列番号２５）
A-OPB：5'-ATT ATG CGT CAC CAC ACA C-3'（配列番号２３）
A-LPF：5'-CCA CGG CGT GCA AAG GA-3'（配列番号２６）
A-LPB-1：5'-GAG CCC TTC CAG GGC CTC TT-3'（配列番号２７）
A-LPB-2：5'-GCC TCT TTG AGA TCC CAA GCT-3'（配列番号２８）
（実施例３）プライマーセット３
C-IPF：5'-GTC ACG TGC TTT GAG TTG TTT CTC CGC CTC GAG TTT CTT CCG-3'（配列番号３６）
C-OPF：5'-ATT CTG TTG GCC GGG TTG-3'（配列番号３２）
C-IPB：5'-TCA AGA ACG GCG AGT GGC TTC TCT TCT GAG GCG ATC CA-3'（配列番号３７）
C-OPB：5'-GGT CTG TCA TGG TGA CAA AC-3'（配列番号３５）
C-LPF：5'-GCT CTC TCA AGG TCT TCG GG-3'（配列番号３８）
C-LPB：5'-CTT GCC ATC CGC GAC TGG A-3'（配列番号３９）
（実施例４）プライマーセット４
Asia-1-IPF：5'-ACA GGT TTG TAA AAC CCA GTT CCA CAC TCC ATT GCC GAT GTC AC-3'（配列番号４７）
Asia-1-OPF：5'-TGA CAA AAG CGA CAA AGG TT-3'（配列番号４３）
Asia-1-IPB：5'-ATG GCT TCG AAG ACC CTC GAA CGG AGA TCA ACT TCT CCT GTA-3'（配列番号４８）
Asia-1-OPB：5'-TGG ACT GCG AGT CCT GC-3'（配列番号４６）
Asia-1-LPF：5'-GGA AGT GTC TTT TGA GGA A-3'（配列番号４９）
Asia-1-LPB：5'-TTT GCA CGC CGT GGG AC-3'（配列番号５０）
【００４１】
＜比較法，PCR法に使用したプライマー＞
PCR法で使用するプライマーとして，Reidらの報告（Reid, S.M., Ferris, N.P., Hutchings, G.H.,Samuel, A.R. and Knowles, N.J. 2000. Primary diagnosis of foot-and-mouth disease by reverse transcription polymerase chain reaction. J Virol Methods 89:167-176.）に記載の5‘UTR流域を認識するプライマー1F（GCCTGGTCTTTCCAGGTCT）とプライマー1R（CCAGTCCCCTTCTCAGATC）の組み合わせ，A-OPF（配列番号２０）とA-OPB（配列番号２３）の組み合わせ，C-OPF（配列番号３２）とC-OPB（配列番号３５）の組み合わせならびにAsia-1-OPF（配列番号４３）とAsia-1-OPB（配列番号４６）の組み合わせをそれぞれ用いた。
【００４２】
＜核酸増幅法による反応＞
１．LAMP法による反応
LAMP法による増幅のため，最終反応溶液２５μL中の各試薬濃度が下記になるよう調製した。なお，プライマーの合成は北海道システムサイエンス社に依頼し，簡易カラム精製したものを使用した。
(1)  反応溶液組成
20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KCl
8mM MgSO4
1.4mM dNTPs（GE Healthcare社製）
10mM(NH4)2SO4
0.8M Betaine（和光純薬社製）
0.1% Tween20
1.6μM IPF
1.6μM IPB
0.4μM OPF
0.4μM OPB
0.8μM LPF
0.8μM LPB
8U Bst DNA polymerase（New England Biolabs社製）
(2)  方法
LAMP反応は上記試薬２４μLに，各濃度の試料溶液１μLを加え，最終反応溶液２５μLとして，０．２ｍＬの専用チューブ内で６３℃６０分間，リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００（栄研化学）を用いて，リアルタイムに反応を検出した。４組のプライマーセットを組み合わせて１本のチューブ内で反応させた場合の反応条件のみ６３℃９０分間とした。リアルタイム濁度測定装置ＬＡ−２００に接続したパーソナルコンピュータ画面上のグラフで反応結果をリアルタイムに視認した。所定時間内に濁度が０．１を超えた検体を陽性と判定した。
【００４３】
２．PCR法による反応
PCR反応は，以下の方法により行った。鋳型DNAは人工合成塩基配列（ファスマック社製）を使用した。
(1)  PCRの反応溶液組成及び反応条件
１反応あたり各試薬が下記になるよう調製した。
・PCR  buffer ×10  （Qiagen社製）  2.5μL
・2mM dNTPs（Qiagen社製）2μL
・dDW（滅菌超純水） 20.98μL
・100pmol/μL OPF（前述のＲｅｉｄらの報告によるプライマー1F，配列番号２０，配列番号３２もしくは配列番号４３） ０．１６μL
・100pmol/μL OPB（前述のＲｅｉｄらの報告によるプライマー1R，配列番号２３，配列番号３５，もしくは配列番号４６） ０．１６μL
・5U/μL Taq Polymerase（Qiagen社製）0.1μL
(2)  方法
反応溶液に各希釈段階の鋳型DNA１．０μLを加え，最終反応液量２５．０μLとして各PCR反応を行った。PCR反応の温度サイクル条件は，９４℃５分静置後，熱変性９４℃１分，アニーリング５５℃１分，ポリメラーゼ伸長反応７２℃２分を１サイクルとして計３０サイクル行い，最後に７２℃７分間静置後，反応を終了した。所要時間は約３時間であった。
反応終了後の反応溶液３μLを２％アガロースゲルで電気泳動を行い，エチジウムブロマイド染色した。
【００４４】
３．実験結果
(1)  実験結果のまとめを下記の表１に示す。
【００４５】
【表１】
2012143185.tif 000003
【００４６】
(2)  図１から図１３にそれぞれの実験結果を示す。図中，横軸は核酸増幅反応を行った時間（分）を示し，縦軸は濁度（Abs）を示す。核酸が増幅されればされるほど反応溶液中の濁度が上昇することとなり，結果，対象となるウィルスの存在を検出することが可能となる。
また，図中グレーで示した枠内は，単位チューブあたりの人工塩基配列のコピー数を示す。すなわち，コピー数が多いほど，核酸増幅反応数が容易に進むとともに濁度の上昇が早く検出できる。逆にコピー数が少ないほど，核酸増幅反応は進みにくくなるため濁度の上昇が遅くなり，検出に時間がかかることとなる。
(3)  図１から図４においてそれぞれのプライマーセット単独で行った場合，プライマーセット１が２０コピー，プライマーセット２が２０コピー，プライマーセット３が５０コピー，プライマーセット４が７００コピーまでの検出が可能であった。それぞれPCR法の検出感度と比較すると，プライマーセット１が10倍，プライマーセット２が10倍，プライマーセット３が100倍，プライマーセット４が10倍の感度であった。
(4)  図５から図８において2組のプライマーセットを組み合わせて用いた場合，プライマーセット単独での検出感度と比較して変化はなかった。また，濁度の上昇時間を比較しても，大きな変化はなく，2組のプライマーセットの組合せは，検出感度および検出時間の点で大きな影響を与えないことが分かった。
(5)  図９から図１２において4組のプライマーセットを組み合わせて用いた場合，プライマーセット単独での検出感度と比較して，配列番号５１を除き，約10倍の検出感度の低下にとどまった。この場合であっても，PCRと同等以上の検出感度を有していることが確認された。
(6)  図１３に示すように，PCR法では，LAMP反応チューブあたり７，０００〜２００ｃｏｐｙまで希釈したものまで検出可能であった。
(7)  以上をまとめると，４組のプライマーセットをそれぞれ単独で使用した場合と２組のプライマーセットを組み合わせて1本のチューブ内で反応を実施した場合の検出感度は，いずれもLAMP法がPCR法よりも１０倍優れていた。４組のプライマーセットを組み合わせて1本のチューブ内で反応を実施した際の検出感度は，LAMP法がPCR法よりも１０倍優れているか，あるいは同等であった。反応所要時間はPCR法では約３時間の増幅反応と約３０分の電気泳動分析を必要としたのに対し，LAMP法では６０分から９０分であり，LAMP法のほうが迅速であった。
【００４７】
＜＜実験２，プライマーセットの定性確認＞＞
実験１で用いた人工塩基配列とは異なる塩基配列（配列番号５５から５８）を用いて，各プライマーセットがこれらの塩基配列を検出できるかについて定性的に調べた。なお，各配列番号については口蹄疫ウィルスの一部を抜き出した形で陽性コントロールとして用いており，配列番号５５が口蹄疫ウィルスO型（GenBank accession No. AY593812），配列番号５６が口蹄疫ウィルスO型（GenBank accession No. AY593821），配列番号５７が口蹄疫ウィルスO型（GenBank accession No. AY593830），配列番号５８が口蹄疫ウィルスA型（GenBank accession No. AY593782）の陽性コントロールである。
１．使用したプライマーセット
プライマーセット１，プライマーセット２，プライマーセット１と２の混合したものを用いた。
２．実験方法
実験１のＬＡＭＰ法の手法により行った。なお，各人工塩基配列のコピー数は，１チューブあたり約10,000,000コピーで行った。
【００４８】
３．結果
結果を表２に示す。検出が可能だった場合を”陽性”と，検出ができなかった場合を”陰性”として示す。検出が可能であった場合は，検出にかかった時間も合わせて表に示す。
【００４９】
【表２】
2012143185.tif 000004
【００５０】
(1)  プライマーセット１は，O型の陽性コントロール配列である配列番号５５，５６，５７のいずれも検出が可能であった。
(2)  プライマーセット２は，A型の陽性コントロール配列である配列番号５８の検出が可能であった。
(3)  プライマーセット１と２を組み合わせた場合であっても，いずれの配列番号についても検出が可能であった。また，検出までの時間についても大きな変化はなかった。
(4)  以上のことから，プライマーセット１がO型の口蹄疫ウィルスについて，プライマーセット２がA型の口蹄疫ウィルスについて検出が可能であることが確認された。加えて，プライマーセットを組み合わせて検出を行った場合であっても，検出が可能であり，検出時間についても大きな影響を及ぼさないことが確認できた。
【符号の説明】
【００５１】
レーンＭ：DNAサイズマーカー
レーン１：２，０００ｃｏｐｙ
レーン２：２００ｃｏｐｙ
レーン３：２０ｃｏｐｙ
レーン４：２，０００ｃｏｐｙ
レーン５：２００ｃｏｐｙ
レーン６：２０ｃｏｐｙ
レーン７：５，０００ｃｏｐｙ
レーン８：５００ｃｏｐｙ
レーン９：５０ｃｏｐｙ
レーン１０：７，０００ｃｏｐｙ
レーン１１：７００ｃｏｐｙ
レーン１２：７０ｃｏｐｙ
ｂｐ： ｂａｓｅ  ｐａｉｒ（塩基対）
レーン１〜３は配列番号５１の人工合成塩基配列と主にO型を検出するプライマーセットを使用。
レーン４〜６は配列番号５２の人工合成塩基配列と主にＡ型を検出するプライマーセットを使用。
レーン７〜９は配列番号５３の人工合成塩基配列と主にＣ型を検出するプライマーセットを使用。
レーン１０〜１２は配列番号５４の人工合成塩基配列と主にＡｓｉａ−１型を検出するプライマーセットを使用。
【図１】
2012143185.tif 000005
【図２】
2012143185.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2012143185.tif 000015
【図１２】
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【図１３】
2012143185.tif 000017
【配列表】
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