(57)【要約】【課題】ＰＣＳＫ９の血液検体における検出を行う意義を明らかにして、臨床的な有用性を確立し、提供すること。【解決手段】各段階のヒトＰＣＳＫ９に結合するモノクローナル抗体を作出し、当該モノクローナル抗体に基づくＰＣＳＫ９の検出系を用いて、血液検体中のＰＣＳＫ９を定量することにより、家族性高コレステロール血症を含めた高コレステロール血症と動脈硬化の検出を行うことが可能であることを見出した。つまり、血液検体中のヒトＰＣＳＫ９を当該成分に対する抗体を用いて定量し、当該定量値に基づいて家族性高コレステロール血症を含めた高コレステロール血症を検出する高コレステロール血症の検出方法を提供し、かつ、同様に血液検体におけるＰＣＳＫ９の定量を行い、当該定量値を指標として動脈硬化を検出する動脈硬化の検出方法を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液検体中のヒトＰＣＳＫ９を当該成分に対する抗体を用いて定量し、当該定量値に基づいて高コレステロール血症を検出する、高コレステロール血症の検出方法。
【請求項２】
ヒトＰＣＳＫ９の定量は、ヘテロダイマーと非ヘテロダイマー双方のヒトＰＣＳＫ９の定量ステップ（１）、ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９の定量ステップ（２）、及び、非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９の定量ステップ（３）、からなる群から選ばれる１種又は２種以上の定量ステップにより行われる、請求項１に記載の高コレステロール血症の検出方法。
【請求項３】
前記のヘテロダイマーと非ヘテロダイマー双方のヒトＰＣＳＫ９の定量ステップ（１）は、固相抗体と検出抗体として、共にヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９と非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９の双方に対して結合するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行われる、請求項２に記載の高コレステロール血症の検出方法。
【請求項４】
前記のヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９の定量ステップ（２）は、（ａ）ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９と非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９の双方に対して結合するモノクローナル抗体、及び、（ｂ）ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９に対して結合するが、非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９に対しては結合しないモノクローナル抗体、のいずれか一方を、相互に異なる固相抗体と検出抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行われる、請求項２に記載の高コレステロール血症の検出方法。
【請求項５】
前記の非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９の定量ステップ（３）は、（ａ）ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９と非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９の双方に対して結合するモノクローナル抗体、及び、（ｂ）非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９に対して結合するが、ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９に対しては結合しないモノクローナル抗体、のいずれか一方を、相互に異なる固相抗体と検出抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行われる、請求項２に記載の高コレステロール血症の検出方法。
【請求項６】
家族性高コレステロール血症検出は、下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、及び、（Ｈ）からなる群から選ばれる１種又は２種以上の指標により行われる、請求項２〜５のいずれかに記載の高コレステロール血症の検出方法。
（Ａ）定量ステップ（１）における定量値が健常人よりも有意に大きい場合を高コレステロール血症として検出する指標である。
（Ｂ）定量ステップ（２）における定量値が健常人よりも有意に大きい場合を高コレステロール血症として検出する指標である。
（Ｃ）定量ステップ（３）における定量値が健常人よりも有意に大きい場合を高コレステロール血症として検出する指標である。
（Ｄ）定量ステップ（１）における定量値／定量ステップ（２）による定量値、であって、当該定量値が健常人よりも有意に大きい場合を高コレステロール血症として検出する指標である。
（Ｅ）定量ステップ（１）における定量値／定量ステップ（３）による定量値、であって、当該定量値が健常人よりも有意に小さい場合を高コレステロール血症として検出する指標である。
（Ｆ）定量ステップ（２）と（３）における定量値の和／定量ステップ（２）における定量値、であって、当該定量値が健常人よりも有意に大きい場合を高コレステロール血症として検出する指標である。
（Ｇ）定量ステップ（２）と（３）における定量値の和／定量ステップ（３）における定量値、であって、当該定量値が健常人よりも有意に小さい場合を高コレステロール血症として検出する指標である。
（Ｈ）定量ステップ（２）における定量値／定量ステップ（３）による定量値、であって、当該定量値が健常人よりも有意に小さい場合を高コレステロール血症として検出する指標である。
【請求項７】
検出対象となる高コレステロール血症が家族性高コレステロール血症である、請求項１〜６のいずれかに記載の高コレステロール血症の検出方法。
【請求項８】
血液検体が血清である、請求項１〜７のいずれかに記載の高コレステロール血症の検出方法。
【請求項９】
血液検体中のヒトＰＣＳＫ９を当該成分に対する抗体を用いて定量し、当該定量値を指標として動脈硬化を検出する、動脈硬化の検出方法。
【請求項１０】
ヒトＰＣＳＫ９の定量は、ヘテロダイマーと非ヘテロダイマー双方のヒトＰＣＳＫ９の定量ステップ（１）、ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９の定量ステップ（２）、及び、非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９の定量ステップ（３）、からなる群から選ばれる１種又は２種以上の定量ステップにより行われる、請求項８に記載の動脈硬化の検出方法。
【請求項１１】
前記のヘテロダイマーと非ヘテロダイマー双方のヒトＰＣＳＫ９の定量ステップ（１）は、固相抗体と検出抗体として、共にヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９と非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９の双方に対して結合するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行われる、請求項９に記載の動脈硬化の検出方法。
【請求項１２】
前記のヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９の定量ステップ（２）は、（ａ）ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９と非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９の双方に対して結合するモノクローナル抗体、及び、（ｂ）ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９に対して結合するが、非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９に対しては結合しないモノクローナル抗体、のいずれか一方を、相互に異なる固相抗体と検出抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行われる、請求項９に記載の動脈硬化の検出方法。
【請求項１３】
前記の非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９の定量ステップ（３）は、（ａ）ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９と非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９の双方に対して結合するモノクローナル抗体、及び、（ｂ）非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９に対して結合するが、ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９に対しては結合しないモノクローナル抗体、のいずれか一方を、相互に異なる固相抗体と検出抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行われる、請求項９に記載の動脈硬化の検出方法。
【請求項１４】
動脈硬化の検出は、下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、及び、（Ｄ）からなる群から選ばれる１種又は２種以上の指標により行われる、請求項１０〜１３のいずれかに記載の検出方法。
（Ａ）定量ステップ（１）における定量値が健常人よりも有意に大きい場合を動脈硬化として検出する指標である。
（Ｂ）定量ステップ（２）における定量値が健常人よりも有意に大きい場合を動脈硬化として検出する指標である。
（Ｃ）定量ステップ（３）における定量値が健常人よりも有意に大きい場合を動脈硬化として検出する指標である。
（Ｄ）定量ステップ（２）と（３）の定量値の和が健常人よりも有意に大きい場合を動脈硬化として検出する指標である。
【請求項１５】
血液検体が血清である、請求項９〜１４のいずれかに記載の動脈硬化の検出方法。
【請求項１６】
非ヘテロダイマー型のヒトＰＣＳＫ９に対して結合し、ヘテロダイマー型のヒトＰＣＳＫ９には結合しない、モノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高コレステロール血症と動脈硬化に対する特定成分の存在量を指標とする検出方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
日本人における死因の第一位は悪性新生物（３０．３％）、第二位は心疾患（１５．８％）、第三位は脳血管障害（１１．５％）である。心疾患及び脳血管障害は、脂質異常症や糖尿病などの生活習慣病を基盤とする動脈硬化症が主要な原因となっている。脂質異常症の管理は動脈硬化の最も有効な予防と治療手段の一つと考えられている。したがって、脂質異常症を早期に診断し、適切な治療を施すことは心疾患及び脳血管障害を予防する方法と考えられる。
【０００３】
脂質異常症の原因は様々であるが、病因・病態の解明は著しく深まっている。脂質異常症のなかでII型高脂血症は、血中低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）の上昇を特徴とする疾患である。なかでも家族性高コレステロール血症（familial hypercholesterolemia:FH）は、GoldsteinとBrownによりＬＤＬ受容体の遺伝的異常に起因することが明らかにされた（Goldstein JL, Brown MS. Annu Rev Genet, 1979;13:259-289）。その後単一遺伝子異常に起因するII型高脂血症の原因が確立され、アポリポタンパク質B-100の異常に起因する家族性アポリポタンパク質B-100異常症(familial defective apolipoprotein B-100: FDB) (Schaefer JR, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1997;17:348-353)、ATP-binding cassette (ABC) transporter G5/ABCG8の異常に起因する高植物ステロール血症を特徴とするシトステロール血症(Berge KE, et al. Science, 2000;290:1771-1775)、ＡＲＨ遺伝子の異常によるautosomal recessive hypercholesterolemia (ARH)(Garcia CK, et al. Science, 2001;292:1394-1398)、及びproprotein convertase subtilin/kexin type 9 (ＰＣＳＫ９)遺伝子による常染色体優性高コレステロール血症 (Abifadel M, et al. Nat Genet, 2003;34:154-156)が明らかにされている。
【０００４】
家族性高コレステロール血症（ＦＨ）の診断は、１）ＬＤＬコレステロール値が２００mg/dl以上、２）若年性冠動脈疾患（男性＜５５歳、女性＜６５歳）及び二親等までの家族の若年性冠動脈疾患の履歴、３）腱黄色腫又は皮膚結節性黄色腫の存在、４）角膜輪の存在、によって診断される。これら１）〜４）の診断基準とは別に、ＬＤＬ受容体遺伝子異常が確認された場合は１）〜４）の診断基準の有無にかかわらず確定診断できる（厚労省労働者特定疾患原発性高脂血症調査研究班、http://www.nanbyou.or.jp/top.html）。
【０００５】
ＬＤＬ受容体の異常によるFH発現頻度は、一方の親から異常遺伝子を受け継いだ者（ヘテロ接合体）が約５００人に１人、両親から異常遺伝子を受け継いだ者（ホモ接合体）が１００万人に１人である。日本人では、ヘテロ接合体が約２４万人、ホモ接合体が約１２０名存在することになる。最近、馬渕らは、日本人におけるＦＨホモ接合体の頻度は１／１７１，１６７人、ＦＨヘテロ接合体の頻度は１／２０８人であると報告している（Mabuchi H, et al. Atherosclerosis, 2011;214:404-407）。シトステロール血症、ＦＤＢやＡＲＨは日本人では極めて稀であるが、ＰＣＳＫ９の頻度は、馬渕らの報告からＦＨの１〜２割と推定される。
【０００６】
ＰＣＳＫ９（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9：プロ蛋白転換酵素サブチリシン/ケキシン9型）は、ＮＡＲＣ−１（Neural apoptosis-regulated convertase 1：神経アポトーシス調節転換酵素1型）とも呼ばれ、サブチリシン様セリンプロテアーゼのケキシンに属するプロ蛋白転換酵素ファミリーの9番目の酵素である。ＰＣＳＫ９は主に肝臓、腎臓、及び小腸で発現している６９２アミノ酸からなる分泌蛋白質である（非特許文献１：Seidah NG,et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003;100:928-933.）。
【０００７】
肝細胞膜表面上のＬＤＬ受容体はリガンドであるＬＤＬを結合した後、細胞内に取り込まれる（エンドサイトーシス）。エンドサイトーシス後、ＬＤＬ受容体はＬＤＬを細胞内に供給後、再び細胞膜表面上に局在する（リサイクリング）。この工程を繰り返して血中のコレステロール量を調節している。しかしながら、ＰＣＳＫ９が結合したＬＤＬ受容体は、エンドサイトーシス後、リソソームへ移行した後分解され、ＬＤＬ受容体のリサイクリング機構が働らなくなる。その結果、肝細胞膜上に発現するＬＤＬ受容体の量的異常がおこり、延いては血中ＬＤＬの取り込みが減少し、血中ＬＤＬコレステロールが上昇する。すなわち、ＰＣＳＫ９はＬＤＬ受容体の分解を促してＬＤＬコレステロール代謝に関与することが明らかにされている（非特許文献２：Lagace TA, et al. J Clin Invest, 2006;116:2995-3005、非特許文献３：Qian YW, et al., J Lipid Res, 2007;48:1488-1498、非特許文献４：Li J, et al. Biochem J, 2007;406:203-207、非特許文献５：Grefhorst A, et al. J Lipid Res, 2008;49:1303-1311）。
【０００８】
ヒトＰＣＳＫ９は全長６９２アミノ酸から成り、アミノ酸１−３０がｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（分泌シグナル）、３１−１５２がｐｒｏ  ｄｏｍａｉｎ（プロ蛋白質ドメイン）、１５３−４５２がｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ（プロテアーゼ触媒ドメイン）、４５３−６９２がＣ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ（Ｃ末端ドメイン）を形成している。
【０００９】
ＰＣＳＫ９は約７４ｋＤａのｐｒｏＰＣＳＫ９（前駆体ＰＣＳＫ９）として合成された後、小胞体内にてＰＣＳＫ９自身のセリンプロテアーゼ活性によりアミノ酸配列１５２番目のグルタミンと１５３番目のセリンの間で自己分解を引き起こし、Ｎ末端側約１４ｋＤａのｐｒｏ  ｓｅｇｍｅｎｔ（プロ蛋白質断片）とＣ末端側約６０ｋＤａでプロテアーゼ触媒ドメインを含むｍａｔｕｒｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ（成熟蛋白質断片）に変換される。これら２種の断片はｐｒｏ  ｓｅｇｍｅｎｔがｍａｔｕｒｅ  ｓｅｇｍｅｎｔの活性中心を塞ぐように複合体（ヘテロダイマー構造）を形成した後、当該複合体としてゴルジ体へ移行し、細胞外へ分泌される（非特許文献６：Seidah NG, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003;100:928-933、非特許文献７：Naureckiene S, et al. Arch Biochem Biophys, 2003;420:55-67、非特許文献８：Benjannet S, et al. J Biol Chem, 2004;279:48865-48875）。
【００１０】
血中に分泌されたヘテロダイマー型構造のＰＣＳＫ９は、ＬＤＬ受容体のＥＧＦ−Ａに結合し上述のごとく当該受容体を分解へと誘導する。ＰＣＳＫ９によるＬＤＬ受容体の分解促進はＰＣＳＫ９自身のプロテアーゼ活性（セリンプロテアーゼ活性）とは独立した現象であり、ＰＣＳＫ９の分子シャペロン的作用によりＬＤＬ受容体のリサイクリングを阻害する、すなわちリソソームへ誘導するとも考えられているが、未だ結論に至っていない（非特許文献９：McNutt MC, et al. J Biol Chem, 2007;282:20799-20803）。
【００１１】
また、ＰＣＳＫ９はゴルジ体から細胞外へ分泌される過程において一部のＰＣＳＫ９が更に分解を受けることが報告されている。すなわち、プロ蛋白転換酵素Ｆｕｒｉｎ等の作用によりアミノ酸配列２１８番目のアルギニンと２１９番目のグルタミンの間で切断される。この作用により６０ｋＤａのｍａｔｕｒｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ部分がＮ末端側約７ｋＤａとＣ末端側約５３ｋＤａ（ΔＮ２１８  ｓｅｇｍｅｎｔ）とに分解され、ｐｒｏ  ｓｅｇｍｅｎｔとｍａｔｕｒｅ  ｓｅｇｍｅｎｔとのヘテロダイマー構造が崩壊する。分解後の断片（７ｋＤａと５３ｋＤａ）も細胞外へ分泌される。Ｆｕｒｉｎによる分解を受けていないＰＣＳＫ９（ヘテロダイマー型）はＬＤＬ受容体に結合して上記のリサイクリングを阻害して、ＬＤＬ受容体を分解に導く働きがあるのに対し、Ｆｕｒｉｎによる分解を受けたＰＣＳＫ９（非ヘテロダイマー型）には、そのような働きがない（非特許文献１０：Benjannet S, et al. J Biol Chem, 2006;281:30561-30572）。
【００１２】
２００３年Abifadelらにより、ＰＣＳＫ９遺伝子が常染色体優性家族性高コレステロール血症（ＦＨ）の第３の原因遺伝子であることが見出された  (非特許文献１１：Abifadel M, et al. Nat Genet, 2003;34:154-156)。
【００１３】
ＰＣＳＫ９遺伝子の異常は、これまでに１００以上の変異が報告されており（http://www.ucl.ac.uk/ldlr/Current/）、遺伝子異常によりＰＣＳＫ９の機能が亢進する、すなわちＬＤＬ受容体を分解促進する機能増強型変異（gain-of-function）と機能が喪失する、すなわちＬＤＬ受容体を分解できない機能喪失型変異（loss-of-function）の２通りが見つかっており、それぞれ高コレステロール血症と低コレステロール血症を呈することが明らかになっている。
【００１４】
ＰＣＳＫ９は、コレステロールや中性脂肪生合成に関わる遺伝子の発現を調節している転写因子ＳＲＥＢＰｓ（Sterol Regulatory Element-Binding Proteins：ステロール調節エレメント結合性タンパク質）の活性化により転写促進されることが報告されている（非特許文献１２：Maxwell KN, et al. J Lipid Res, 2003;44:2109-2019）。
【００１５】
すなわち、高コレステロール血症治療薬であるスタチン系薬剤はＳＲＥＢＰｓの活性化を介してＬＤＬ受容体の発現を誘導するが、同様の経路でＰＣＳＫ９も発現誘導される。このことから、ＰＣＳＫ９はスタチンのコレステロール低下作用に対して拮抗的に働くと考えられる（非特許文献１３：Dubuc G, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004;24:1454-1459）。すなわち、ＰＣＳＫ９はＦＨの病因となっているばかりでなく、高コレステロール血症治療における薬剤効果を減弱する作用がある。また、ＰＣＳＫ９の作用を阻害することによる高コレステロール血症治療薬のターゲット分子として阻害薬の開発も行われている（特許文献１〜５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特表２０１０−５３６３８４号公報
【特許文献２】特表２０１０−５２３１３５号公報
【特許文献３】特表２０１０−５０８８１７号公報
【特許文献４】特表２０１０−５０１９５２号公報
【特許文献５】米国公開２０１０／１６６７６８号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Seidah NG,et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003;100:928-933
【非特許文献２】Lagace TA, et al. J Clin Invest, 2006;116:2995-3005
【非特許文献３】Qian YW, et al.,J Lipid Res, 2007;48:1488-1498
【非特許文献４】Li J, et al. Biochem J, 2007;406:203-207
【非特許文献５】Grefhorst A, et al. J Lipid Res, 2008;49:1303-1311
【非特許文献６】Seidah NG, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003;100:928-933
【非特許文献７】Naureckiene S, et al. Arch Biochem Biophys, 2003;420:55-67
【非特許文献８】Benjannet S, et al. J Biol Chem, 2004;279:48865-48875
【非特許文献９】McNutt MC,et al. J Biol Chem,2007;282;20799-20803
【非特許文献１０】Benjannet S, et al. J Biol Chem, 2006;281:30561-30572
【非特許文献１１】Abifadel M, et al. Nat Genet, 2003;34:154-156
【非特許文献１２】Maxwell KN, et al. J Lipid Res, 2003;44:2109-2019
【非特許文献１３】Dubuc G, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004;24:1454-1459
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
以上のことより、ＰＣＳＫ９はＬＤＬコレステロール代謝に関与する重要な因子であり、その発現量が生体内での脂質合成を制御するＳＲＥＢＰｓの活性を反映することから、血中のＰＣＳＫ９濃度を測定することは、臨床的に有用と期待される。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者は、今般各段階のＰＣＳＫ９に結合するモノクローナル抗体を作出し、当該モノクローナル抗体に基づくＰＣＳＫ９の検出系を用いて、血液検体中のＰＣＳＫ９を定量することにより、家族性高コレステロール血症を含めた高コレステロール血症と動脈硬化の検出を行うことが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００２０】
すなわち、本発明は、血液検体中のＰＣＳＫ９を当該成分に対する抗体を用いて定量し、当該定量値に基づいて家族性高コレステロール血症を含めた高コレステロール血症を検出する、高コレステロール血症の検出方法（以下、本ＦＨ検出方法ともいう）を提供し、かつ、同様に血液検体におけるＰＣＳＫ９の定量を行い、当該定量値を指標として動脈硬化を検出する、動脈硬化の検出方法（以下、本動脈硬化検出方法ともいう）を提供する発明である。なお、本ＦＨ検出方法と本動脈硬化検出方法を併せて、本検出方法ともいう。また、本明細書と図面において「ＰＣＳＫ９」と記載した場合には、特に断りのない限りはヒトＰＣＳＫ９を意味することとする。
【００２１】
本ＦＨ検出方法において、ＰＣＳＫ９の定量は、ヘテロダイマーと非ヘテロダイマー双方のＰＣＳＫ９の定量ステップ（１）、ヘテロダイマーのＰＣＳＫ９の定量ステップ（２）、及び、非ヘテロダイマーのＰＣＳＫ９の定量ステップ（３）、からなる群から選ばれる１種又は２種以上の定量ステップにより行うことができる。
【００２２】
本ＦＨ検出方法の主題である家族性高コレステロール血症検出は、下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、及び、（Ｈ）からなる群から選ばれる１種又は２種以上の指標により行うことができる。
（Ａ）定量ステップ（１）における定量値が健常人よりも有意に大きい場合を、家族性高コレステロール血症を含めた高コレステロール血症として検出する指標。
（Ｂ）定量ステップ（２）における定量値が健常人よりも有意に大きい場合を、家族性高コレステロール血症を含めた高コレステロール血症として検出する指標。
（Ｃ）定量ステップ（３）における定量値が健常人よりも有意に大きい場合を、家族性高コレステロール血症を含めた高コレステロール血症として検出する指標。
（Ｄ）定量ステップ（１）における定量値／定量ステップ（２）による定量値、であって、当該定量値が健常人よりも有意に大きい場合を、家族性高コレステロール血症を含めた高コレステロール血症として検出する指標。
（Ｅ）定量ステップ（１）における定量値／定量ステップ（３）による定量値、であって、当該定量値が健常人よりも有意に小さい場合を、家族性高コレステロール血症を含めた高コレステロール血症として検出する指標。
（Ｆ）定量ステップ（２）と（３）における定量値の和／定量ステップ（２）における定量値、であって、当該定量値が健常人よりも有意に大きい場合を、家族性高コレステロール血症を含めた高コレステロール血症として検出する指標。
（Ｇ）定量ステップ（２）と（３）における定量値の和／定量ステップ（３）における定量値、であって、当該定量値が健常人よりも有意に小さい場合を、家族性高コレステロール血症を含めた高コレステロール血症として検出する指標。
（Ｈ）定量ステップ（２）における定量値／定量ステップ（３）による定量値、であって、当該定量値が健常人よりも有意に小さい場合を、家族性高コレステロール血症を含めた高コレステロール血症として検出する指標。
【００２３】
本動脈硬化検出方法においても、ＰＣＳＫ９の定量は、ヘテロダイマーと非ヘテロダイマー双方のＰＣＳＫ９の定量ステップ（１）、ヘテロダイマーのＰＣＳＫ９の定量ステップ（２）、及び、非ヘテロダイマーのＰＣＳＫ９の定量ステップ（３）、からなる群から選ばれる１種又は２種以上の定量ステップにより行うことができる。
【００２４】
また、本動脈硬化検出方法の主題である動脈硬化の検出は、下記（Ａ’）、（Ｂ’）、（Ｃ’）、及び、（Ｄ’）からなる群から選ばれる１種又は２種以上の指標により行うことができる。
（Ａ’）定量ステップ（１）における定量値が健常人よりも有意に大きい場合を動脈硬化として検出する指標。
（Ｂ’）定量ステップ（２）における定量値が健常人よりも有意に大きい場合を動脈硬化として検出する指標。
（Ｃ’）定量ステップ（３）における定量値が健常人よりも有意に大きい場合を動脈硬化として検出する指標。
（Ｄ’）定量ステップ（２）と（３）の定量値の和が健常人よりも有意に大きい場合を動脈硬化として検出する指標。
【００２５】
本検出方法において、血液検体とは、例えば、血清、血漿、又は、全血が例示されるが、血清又は血漿が好適であり、血清が特に好適である。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、血液検体中のＰＣＳＫ９を指標とする家族性高コレステロール血症と動脈硬化の検出方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＰＣＳＫ９の構造模式図である。
【図２】精製リコンビナントＰＣＳＫ９のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動像を示した図面である。
【図３】ウェスタンブロット法によるｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性を検討した結果を示す図面である。
【図４】ウェスタンブロット法によるｒｈＰＣＳＫ９のＦｕｒｉｎ処理による切断の内容を検討した結果を示す図面である。
【図５】ウェスタンブロット法による、取得された各モノクローナル抗体のＦｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性を検討した結果を示す図面である。
【図６】本検出方法を、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＰＣＳＫ９分子形態特異的蛋白質量測定系とした実施例の説明図である。
【図７】上記サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＰＣＳＫ９分子形態特異的蛋白質量測定系による組換えＰＣＳＫ９に対する検量線を示した図面である。
【図８】上記サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＰＣＳＫ９分子形態特異的蛋白質量測定系による血清サンプルに対する検量線を示した図面である。
【図９】健常者間においてＰＣＳＫ９検出サンドイッチＥＬＩＳＡの各測定系間における関係を示した図面である。
【図１０】ＦＨ患者間においてＰＣＳＫ９検出サンドイッチＥＬＩＳＡの各測定系間における関係を示した図面である。
【図１１】ヒト血清中のＰＣＳＫ９の免疫沈降を行った結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
１．ＰＣＳＫ９
本検出方法における検出対象となるＰＣＳＫ９（ヒトＰＣＳＫ９）は、上述したようにその遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列（preproPCSK9、アミノ酸１−６９２）は公知であり（NCBI リファレンス配列：NM_174936及びNP_777596：配列番号１及び２）、本検出方法の対象となるのはその生体内蛋白質の全部又は一部である。上述したように、ＰＣＳＫ９はいくつかの形態で生体内に存在する生体内蛋白質である。図１は、ＰＣＳＫ９の構造模式図である。
【００２９】
上述したようにＰＣＳＫ９は、ｐｒｅｐｒｏＰＣＳＫ９を経て約７４ｋＤａのｐｒｏＰＣＳＫ９（前駆体ＰＣＳＫ９）として生体内合成された後、小胞体内にてＰＣＳＫ９自身のセリンプロテアーゼ活性によりアミノ酸配列１５２番目のグルタミンと１５３番目のセリンの間で自己分解を引き起こし、Ｎ末端側約１４ｋＤａのｐｒｏ  ｓｅｇｍｅｎｔ（プロ蛋白質断片）とＣ末端側約６０ｋＤａでプロテアーゼ触媒ドメインを含むｍａｔｕｒｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ（成熟蛋白質断片）に変換され、これら２種の断片はｐｒｏ  ｓｅｇｍｅｎｔがｍａｔｕｒｅ  ｓｅｇｍｅｎｔの活性中心を塞ぐように複合体（ヘテロダイマー構造）を形成した後、当該複合体としてゴルジ体へ移行し、細胞外へ分泌される。ＰＣＳＫ９のｐｒｏ  ｓｅｇｍｅｎｔはプロテアーゼ活性の阻害因子としての働きがあり、ヘテロダイマー構造は蛋白質分解酵素（セリンプロテアーゼ）としては不活性型である。また、ＰＣＳＫ９はゴルジ体から細胞外へ分泌される過程において、一部のＰＣＳＫ９が更に分解を受けることが報告されている。すなわち、プロ蛋白転換酵素Ｆｕｒｉｎ等の作用によりアミノ酸配列２１８番目のアルギニンと２１９番目のグルタミンの間で切断される。この作用によりｍａｔｕｒｅ  ｓｅｇｍｅｎｔがＮ末端側約７ｋＤａとＣ末端側約５３ｋＤａ（ΔＮ２１８  ｓｅｇｍｅｎｔ）とに分解され、ｐｒｏ  ｓｅｇｍｅｎｔとｍａｔｕｒｅ  ｓｅｇｍｅｎｔとのヘテロダイマー構造が崩壊し、分解後の断片（７ｋＤａと５３ｋＤａ）も細胞外へ分泌される。
【００３０】
ＰＣＳＫ９の検出は、ＰＣＳＫ９に対する抗体を用いて、それと血液検体中のＰＣＳＫ９との抗原抗体反応を利用する検出手段を用いて行うことが好適である。具体的には、例えば、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、免疫クロマトグラフィー法、ラテックス凝集比濁法、免疫沈降法、等を利用した解析法、ウェスタンブロット法を主体とした解析法等を例示することができる。これらの検出手段の中でも、その定量性と検出感度、安全性、簡便性、さらには、正確性ゆえに、ＥＬＩＳＡ法、特にサンドイッチＥＬＩＳＡ法を選択することが好適である。また、近年、蛍光や化学発光、等を検出に利用した免疫測定（FEIA,CLIA,CLEIA,ECLIA）法等も好適である。
【００３１】
２．検出に用いる抗体
このような検出手段を行う前提として、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体：以下、ＰＣＳＫ９に対する抗体ともいう）が必要である。
【００３２】
ＰＣＳＫ９に対する抗体の製造方法は、常法に従って行うことが可能であるが、抗原としてのＰＣＳＫ９の全部又は一部が必要である。ＰＣＳＫ９の入手法は、生体材料からの天然蛋白質や細胞株が自然発現している蛋白質を用いることも可能であるが、実質的には遺伝子工学的手法を用いてＰＣＳＫ９の組換え（リコンビナント）蛋白質を製造することにより入手することができる。当該組み換え蛋白質は、上述したＰＣＳＫ９遺伝子の塩基配列を参考にして、遺伝子増幅用プライマーを調製し、これを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行うことにより、ＰＣＳＫ９遺伝子を遺伝子増幅産物として得ることができる。そして、これを組み込んだ発現ベクターを細胞等に導入することにより得た強制発現細胞より産生されるＰＣＳＫ９組み換え蛋白質を、上述した通常公知の精製法により精製することにより、ＰＣＳＫ９に対する抗体を製造するための抗原として用いることが可能な、ＰＣＳＫ９組み換え蛋白質とすることができる。また、上記のＰＣＳＫ９遺伝子の塩基配列を一部改変した、ＰＣＳＫ９一部改変遺伝子がコードする改変組み換え蛋白質も、ＰＣＳＫ９に対する抗原としての性質を失わない限り可能である。また、ここで使用される抗原としてのＰＣＳＫ９は、必ずしもＰＣＳＫ９の全部である必要はなく、その一部の断片ペプチドであってもよい。特に、上述したようにＰＣＳＫ９はいくつかの特徴的な形態を採ることが知られており、各々の形態のＰＣＳＫ９を必要に応じて選択することが、所望の性質の抗体を得るためには好適である。
【００３３】
なおＰＣＳＫ９の一部の断片ペプチドは、ＰＣＳＫ９遺伝子の一部断片を発現させたＰＣＳＫ９断片や、ＰＣＳＫ９のプロテアーゼ処理物、ホスファイト−トリエステル法(Ikehara,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,5956(1984)) 等を用いた固相法や液相法による化学合成ペプチド等を抗原として用いることができる。
【００３４】
このようにして得られるＰＣＳＫ９において、特に、免疫抗原として用いるＰＣＳＫ９が小分子の一部ペプチドである場合には、抗原の免疫原性を向上させるために、ハプテンを結合させることができる。ハプテンとしては、通常はハプテンとして用いられ得る物質を任意に選択することが可能であり、例えば、傘貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ニワトリ卵アルブミン（ＯＶＡ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等をハプテンとして選択することができる。
【００３５】
所望のＰＣＳＫ９に対する抗体が、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であるにかかわらず、免疫は一般的方法により、例えば、上記免疫抗原を、免疫の対象とする動物に静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内等で投与することにより行うことができる。
【００３６】
ＰＣＳＫ９に対するポリクローナル抗体は、ＰＣＳＫ９分子の全部又は一部を免疫抗原として、免疫した動物に由来する免疫血清から製造することができる。
【００３７】
ＰＣＳＫ９に対するモノクローナル抗体は、上記のポリクローナル抗体と同様の方法で、免疫した動物の免疫細胞と動物の骨髄腫細胞とのハイブリドーマを作出し、これによりＰＣＳＫ９分子を認識する抗体を産生するクローンを選択し、このクローンを培養することにより製造することができる。
【００３８】
上述したポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、公知技術、例えば、Nature 1992 Mar12;356, p152-154やJ.Immunol Methods Mar 1;249, p147-154を参考に、遺伝子免疫によっても調製が可能である。具体的にはＰＣＳＫ９分子の全部又は一部をコードする遺伝子を発現するベクターを直接動物に免疫する事によって製造することができる。
【００３９】
また、免疫される動物も特に限定されるものではなく、マウス，ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ等を広く用いることができるが、モノクローナル抗体を製造する場合には、細胞融合に用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択することが望ましい。
【００４０】
より具体的には、上記免疫抗原を所望により通常のアジュバントと併用して、免疫の対象とする動物に７〜２１日毎を目安に上記手段により数回投与し、ポリクローナル抗体製造のための免疫血清又はモノクローナル抗体製造のための免疫細胞、例えば免疫後の脾臓細胞を得ることができる。
【００４１】
モノクローナル抗体を作製する場合、公知のモノクローナル抗体作製方法、例えば、安藤民衛、千葉  丈、共著、「単クローン抗体実験操作入門」講談社（１９９１年）や、EdHarlow and David Lane,“Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に従い作製することができる。
【００４２】
このようにして得られるポリクローナル抗体ないしモノクローナル抗体は、ＰＣＳＫ９に特異反応性を有する抗体である。なお、本発明においては、ＰＣＳＫ９に対する抗体の市販品を用いることも可能である。
【００４３】
さらに、ＰＣＳＫ９に対する抗体に、必要に応じて標識処理、すなわち、酵素標識処理、蛍光標識処理、アイソトープ標識処理等を、常法に従い行うことができる。
【００４４】
血液検体中のＰＣＳＫ９を捕捉し得る抗体は、固相に固定化された固定化抗体として用いられるのが、好適な態様の一つである。
【００４５】
固相としては、例えば、マイクロプレートやビーズ（アガロースゲルやセファロースゲル、ラテックス粒子、磁性粒子など）、等が挙げられる。
【００４６】
固定化方法は、固相の種類に応じた抗体の固定化方法における常法に従い行うことができる。
【００４７】
例えば、マイクロプレートに対しては、常法に従った物理的な非特異的吸着法を行うことにより、抗体の固定化を行うことができる。また、ビーズに対しても、常法に従って固定化を行うことができる。例えば、化学的な架橋剤を用いた固定化や、ビオチン−アビジンのような他の物質間の親和性を利用して、予め化合物で抗体を標識し、その化合物に親和性のある固定化された蛋白質等を用いた固定化法、固定化された抗イムノグロブリン抗体やプロテインＡ等の抗体に親和性のある蛋白質を用いた固定化法等を行うことにより、抗体の固定化を行うことができる。
【００４８】
３．本検出方法
上記のように、ＰＣＳＫ９に対する抗体を用いて、検出手段に応じた要素を用いることによって、本検出方法を行うことができる。
【００４９】
検出手段がＥＬＩＳＡ法である場合には、例えば、マイクロプレートに固定化したＰＣＳＫ９に対する抗体に、血液検体を接触させて、検体中の可溶性ＰＣＳＫ９を固定化抗体に結合させ、この固相に結合した可溶性ＰＣＳＫ９を、酵素標識した別のＰＣＳＫ９に対する抗体等を用いて検出することにより、本発明の判定方法を行うことができる。また、固定化抗体と血液検体及び酵素標識抗体を同時に反応させて検出することも可能である。
【００５０】
また、検出手段として、免疫沈降法を利用する場合には、例えば、ビーズに固定化したＰＣＳＫ９に対する抗体に、血液検体を接触させてＰＣＳＫ９を固定化抗体に結合させ、この固相に結合したＰＣＳＫ９を分離して、この分離物からＰＣＳＫ９を検出することにより、本検出方法を行うことができる。このＰＣＳＫ９の免疫沈降法による検出は、例えば、前記の分離物に対して電気泳動を行って、この電気泳動パターンの転写物に、ＰＣＳＫ９に対する標識抗体を作用させて、可溶性ＰＣＳＫ９のバンドを検出する、ウェスタンブロット法を挙げることができる。
【００５１】
また、検出手段を、ウェスタンブロット法を主体とした方法とすることも可能である。例えば、血液検体から細胞を除いた細胞除外検体を、直接、電気泳動により分離し、その転写物に、ＰＣＳＫ９に対する標識抗体を作用させて、バンドを検出することにより、血液検体中のＰＣＳＫ９を検出することができる。
【００５２】
さらには、検出手段として、ラテックス凝集比濁法を用いることも可能である。例えば、ラテックス粒子に結合させたＰＣＳＫ９に対する抗体に、血液検体を接触させて、液相中で抗原抗体反応による免疫複合体の凝集塊を形成させ、その濁度の変化を測定することにより、本検出方法を行うことができる。
【００５３】
上述した通りに本検出方法におけるＰＣＳＫ９の定量は、ヘテロダイマーと非ヘテロダイマー双方のＰＣＳＫ９の定量ステップ（１）、ヘテロダイマーのＰＣＳＫ９の定量ステップ（２）、及び、非ヘテロダイマーのＰＣＳＫ９の定量ステップ（３）、からなる群から選ばれる１種又は２種以上の定量ステップにより行うことができる。
【００５４】
本検出方法を行う場合の好適な検出手段の一つであるサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いる場合、前記のヘテロダイマーと非ヘテロダイマー双方のＰＣＳＫ９の定量ステップ（１）は、固相抗体と検出抗体として、共にヘテロダイマーのＰＣＳＫ９と非ヘテロダイマーのＰＣＳＫ９の双方に対して結合するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行うことができる。また、同定量ステップ（２）は、（ａ）ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９と非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９の双方に対して結合するモノクローナル抗体、及び、（ｂ）ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９に対して結合するが、非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９に対しては結合しないモノクローナル抗体、のいずれか一方を、相互に異なる固相抗体と検出抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行うことができる。さらに、同定量ステップ（３）は、（ａ）ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９と非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９の双方に対して結合するモノクローナル抗体、及び、（ｂ）非ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９に対して結合するが、ヘテロダイマーのヒトＰＣＳＫ９に対しては結合しないモノクローナル抗体、のいずれか一方を、相互に異なる固相抗体と検出抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行うことができる。
【００５５】
上述した通りに本ＦＨ検出方法では、上記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、及び、（Ｈ）からなる群から選ばれる１種又は２種以上の指標により行うことが可能である。また、本動脈硬化検出方法では上記（Ａ’）、（Ｂ’）、（Ｃ’）、及び、（Ｄ’）からなる群から選ばれる１種又は２種以上の指標により行うことが可能である。これらについては、後述する実施例において具体的に開示する。
【００５６】
このようにして、血液検体中のＰＣＳＫ９を定量検出することにより、当該定量値を指標として、検体提供者における家族性高コレステロール血症を含んだコレステロール血症と動脈硬化を検出することができる。動脈硬化性疾患としては、例えば、心筋梗塞や狭心症等の冠動脈性心疾患、脳梗塞、脳血栓などの脳血管障害が例示される。本ＦＨ検出方法により、血液検体中のＰＣＳＫ９の定量値により高コレステロール血症であることが明らかになった場合、本動脈硬化検出方法により動脈硬化の疑いを確認することが可能である。すなわち本検出方法を行うことにより、高コレステロール血症、特に家族性高コレステロール血症患者をして好発する動脈硬化性疾患の可能性をチェックすることが可能となる。
【００５７】
本発明は、本検出方法を行うためのキットを提供する。すなわち、本発明は、上記の検出を行うための要素を含むキット（以下、本検出用キットともいう）を提供する発明でもある。
【００５８】
本検出用キットには、最低限、ＰＣＳＫ９に対する抗体が要素として含まれる。
【００５９】
例えば、検出手段が、ＥＬＩＳＡ法の場合には、固相に固定化された又は固定化するためのＰＣＳＫ９に対する第１抗体、及び／又は、この固定化第１抗体が認識するエピトープとは別のＰＣＳＫ９分子内エピトープを認識する検出用の第２抗体が、ＥＬＩＳＡ法の本判定用キットに要素として含まれることが好適である。また、第２抗体を検出するための検出試薬、ブロッキング液、希釈液、ＰＣＳＫ９標準品等を、ＥＬＩＳＡ法の本判定用キットの要素として含めることも好適である。
【００６０】
また、検出手段が、免疫沈降法を利用した解析法において、上記の例のように、ウェスタンブロット法を検出手段として組み合わせる場合には、血液検体におけるＰＣＳＫ９を捕捉するためのＰＣＳＫ９に対する抗体、固定化された又は固定化するためのＰＣＳＫ９に対する抗体、及び／又は、電気泳動のバンドとして分離される可溶性ＰＣＳＫ９を検出するための、ＰＣＳＫ９に対する検出抗体を、ウェスタンブロット法の本検出用キットの要素として含めることが好適である。また、ＰＣＳＫ９に対する検出抗体を検出するための試薬、ブロッキング液、希釈液、転写膜等を、ウェスタンブロット法の本検出用キットの要素として含めることも好適である。
【００６１】
さらに、検出手段が、ラテックス凝集反応を利用した解析法では、ラテックス粒子に結合させたＰＣＳＫ９に対する抗体が、本検出用キットに要素として含まれることが好適である。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例により、具体的に説明するが、この実施例により、本発明の技術的範囲は限定されない。なお、後述する４種類のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマについては、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにおいて寄託を行っている。すなわち、モノクローナル抗体「１ＦＢ」を産生するハイブリドーマ「Mouse-Mouse hybridoma PCSK9-1FBは受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１０９として、モノクローナル抗体「Ｂ１Ｇ」を産生するハイブリドーマ「Mouse-Mouse hybridoma PCSK9-B1Gは受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１１０として、モノクローナル抗体「Ｂ１２Ｅ」を産生するハイブリドーマ「Mouse-Mouse hybridoma PCSK9-B12E」は受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１１１として、及び、モノクローナル抗体「Ｇ１２Ｄ」を産生するハイブリドーマ「Mouse-Mouse hybridoma PCSK9-G12D」は受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１１２として、上記寄託機関において受領されている。
【００６３】
１．リコンビナントＰＣＳＫ９の作製
（１）リコンビナントヒト全長ＰＣＳＫ９の調製
ＨｅｐＧ２細胞由来の全ＲＮＡより、ヒトＰＣＳＫ９全長（アミノ酸番号１−６９２）に相当する相補鎖ＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、pEF321ベクター (Kim DW, Gene. 1990 Jul 16;91(2):217-23)に組み込み、発現ベクターpEF/PCSK9を作製した。なお、上記ＰＣＲは、金属アフィニティー精製のために蛋白質のC末端にヒスチジン6残基が融合する形で発現するようプライマー配列を設定した（下記）。当該ＰＣＲの熱サイクルは、95℃ 5分の変性処理を行った後、「94℃ 1分 → 65℃ 2分 → 72℃ 5分 → 65℃ 1分」を35サイクル行い、最後に65℃ 7分の反応を行った。
【００６４】
増幅用プライマーとしては、
「gacgaattccagcgacgtcgaggcgctcatggttg」（フォワードプライマー：配列番号３）、
「gacgaattctcagtgatggtgatggtgatgctggagctcctgggaggcctgcgcc」（リバースプライマー：配列番号４）を用いた。
【００６５】
発現ベクターpEF/PCSK9、及びネオマイシン耐性遺伝子発現ベクターpSV2Neo（クローンテック社製）を哺乳類動物細胞株CHO-K1（理研）に共導入し、ゲネティシン（シグマ社製）による選別を繰り返し行い、安定的にリコンビナントヒトＰＣＳＫ９（ｒｈＰＣＳＫ９）を発現するクローンCHO-K1/PCSK9細胞を作製した。
【００６６】
このCHO-K1/PCSK9細胞を無血清・低蛋白質培地CHO-S-SFM II（インビトロジェン社製）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、培養上清を回収した。さらに、培養上清５００mLはTALON Resin（クローンテック社製）６mLと混合し、４℃で一晩反応させた。TALON Resinをカラムに充填し、５０mLの５００mM塩化ナトリウム含有２５mM リン酸緩衝液 (pH ８．０)、続いて１０mLの２０mM リン酸緩衝液 (pH ８．０)で洗浄し、２０mLの２００mM イミダゾール含有２０mM リン酸緩衝液 (pH ８．０)で溶出した。次いで、この溶出液を予め２０mMリン酸緩衝液(pH ８．０)で平衡化したDEAE‐Sepharose CL-6B（０．６mL、GEヘルスケア社）カラムにアプライし、５mLの２０mMリン酸緩衝液(pH ８．０)、次いで１．５mLの１００mM 塩化ナトリウム含有２０mM リン酸緩衝液(pH ８．０)で洗浄した後、３mLの２００mM 塩化ナトリウム含有２０mM リン酸緩衝液(pH ８．０)で溶出した。この溶出画分を精製リコンビナントヒト全長ＰＣＳＫ９（ｒｈＰＣＳＫ９）とした。
【００６７】
精製リコンビナントＰＣＳＫ９（ｒｈＰＣＳＫ９）はＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行い、ゲルを銀染色によりバンドの検出し、精製の純度を確認した（図２）。その結果ｒｈＰＣＳＫ９は、還元条件下であっても、非還元条件下であってもpro segmentは外れた形で存在し、還元条件下の電気泳動によりなるmature segmentは、非還元条件下の電気泳動によりなるmature segmentよりも若干分子量が大きい（約６０kDa）ことが判明した。
【００６８】
（２）リコンビナントΔＮ２１８  ＰＣＳＫ９（５３ＫＤａ）の調製
ΔＮ２１８  ＰＣＳＫ９（アミノ酸番号２１９−６９２）に相当する相補鎖ＤＮＡをpEF/PCSK9を鋳型としたＰＣＲによって増幅し、pEF321ベクター (Kim DW, Gene. 1990 Jul 16;91(2):217-23)に組み込み、発現ベクターpEF/ΔN218 PCSK9を作製した。当該PCRの熱サイクルは、94℃ 30秒の変性処理を行った後、「98℃ 10秒 → 60℃ 5秒 → 72℃ 1.5分」を23サイクル行い、最後に72℃ 2分の反応を行った。
【００６９】
増幅用プライマーとしては、
「agtcaagcttcaggccagcaagtgtgacagtcat」（フォワードプライマー：配列番号５）、
「agtagtcgacctggagctcctgggaggcctg」（リバースプライマー：配列番号６）を用いた。
【００７０】
発現ベクターpEF/ΔN218 PCSK9を上述と同様に、哺乳類動物細胞株CHO-K1に導入し、リコンビナントΔN218 PCSK9を安定的に発現するクローンCHO-K1/ΔN218 PCSK9細胞を作製した。
【００７１】
この細胞は１５ｃｍφディッシュで培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Gibco社製）処理
にて細胞を回収し、遠心操作によりＰＢＳにて洗浄した。洗浄後、細胞は1x Complete mini EDTA-free（ロシュ社製）及び１% Nonidet P40含有トリス緩衝液（ＴＢＳ； 150 mM NaCl含有50 mM Tris-HCl, pH 7.5）に懸濁し、氷中で３０分冷却した。次いで、細胞懸濁
液を遠心（１５０００rpm、４℃、２０分）し、上清を回収した。この上清画分をリコン
ビナントΔN218 PCSK9（rhΔN218 PCSK9）含有細胞ライセートとした。
【００７２】
２．抗ヒトＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の作製
（１）抗ヒトＰＣＳＫ９モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
精製ｒｈＰＣＳＫ９を抗原とした蛋白免疫あるいは発現ベクターpEF/PCSK9を免疫源とした遺伝子免疫にてマウスを免疫した。
【００７３】
蛋白免疫は、１回あたり精製ｒｈＰＣＳＫ９  ３μgをアジュバントAbisco-100（ISCONOVA社）１２μgと混合し、Balb/cマウス（８週齢、雌）の背部皮下に投与した（初回免疫）。追加免疫は２週間ごとに合計３回初回免疫同様の操作を行った。
【００７４】
遺伝子免疫は、１回あたりＰＢＳに溶解した発現ベクターpEF/PCSK9  ５０μgをBalb/cマウス（８週齢、雌）尾部皮下に投与した（初回免疫）。追加免疫は２週間ごとに合計４回初回免疫同様の操作を行った。
【００７５】
蛋白免疫、遺伝子免疫ともに最終投与から２週間後に、２０μgの精製ｒｈＰＣＳＫ９
をマウス腹腔内に投与した。腹腔内投与から３日後にマウス脾臓を摘出し、脾細胞を回収した。脾細胞はポリエチレングリコール1500溶液（ベーリンガーマンハイム社製）にてマウス骨髄腫細胞(SP2/0-Ag14)と融合させた。融合した細胞（ハイブリドーマ）は３％ハイブリドーマクローニングファクター（HCF、エアブラウン社製）、１X HAT（シグマ社製）および１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ、ニチレイ社製）含有RPMI培地で選択した。抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体の産生細胞は、精製ｒｈＰＣＳＫ９を固相したマイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法によって選別した。すなわち、各ウェル当たり２５ｎｇの精製ｒｈＰＣＳＫ９を固相化（４℃、一晩）し、各ウェルを１％ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ、シグマ社製）含有ＰＢＳでブロッキングした。各ウェルを洗浄後、１００μＬの各ハイブリドーマの培養上清を添加し、室温下で２時間反応した。反応後、各ウェルを洗浄液（０．１％ Tween20含有PBS）で洗浄し、５０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社）を加えて、室温下で１時間反応した。反応後、洗浄液にてウェルを５回洗浄し、１００μＬの発色溶液［０．０１２％過酸化水素、０．４mg/mL OPD(o-phenulenediamine dihydrochloride、シグマアルドリッチ社製）含有クエン酸リン酸緩衝液、pH５．０］を添加し、室温下で３０分間反応させた。反応後、２Ｎ硫酸を添加し、反応を停止し、波長４９２nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。ハイブリドーマ培養上清の吸光度が１．０以上を示すウェルを陽性として選別した。抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体産生ハイブリドーマはさらに限界希釈法によりクローニングし、細胞株を樹立した。
【００７６】
さらに、陽性ハイブリドーマ細胞の選別は、ハイブリドーマ細胞培養上清を用いてウェスタンブロット法によるｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性、あるいは免疫沈降法によるヒト血清ＰＣＳＫ９に対する反応性をそれぞれ確認し、両方法にて特異性が認められたクローンを最終的に選別した。
【００７７】
ウェスタンブロット法は、ゲル１枚あたり１μgの精製ｒｈＰＣＳＫ９を非還元にてＳＤＳ−ＰＡＧＥし、次いでＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写した膜は、５％スキムミルクを含むＰＢＳにて４℃、一晩静置した。０．１％ Tween20含有ＰＢＳ（洗浄液）にて２回洗浄後、各ハイブリドーマ培養上清を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、１００００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（BioSource社）を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、化学発光試薬（パーキンエルマー社製）を用い、Ｘ線フィルム（コダック社製）に感光させ、特異バンドを検出した。
【００７８】
免疫沈降法は、１．０×１０７個のDynabeads M-280 抗マウスＩｇＧ（ベリタス社製）に各ハイブリドーマ培養上清を２００μL加え、室温2時間、転倒混和しながら抗体をビーズに結合させた。０．１% Tween20含有ＰＢＳでビーズを３回洗浄した後、ヒト血清１００μLを添加し転倒混和しながら４℃、１６時間反応させた。０．１% Tween20含有ＰＢＳで３回洗浄後、非還元ＳＤＳサンプル液に懸濁してSDS-PAGEし、次いでＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写した膜は、５％スキムミルクを含むＰＢＳにて４℃、一晩静置した。０．１％ Tween20含有ＰＢＳ（洗浄液）にて２回洗浄後、０．１μg/mLのペルオキシダーゼ標識抗ＰＣＳＫ９抗体MAB38881（R&D社製）を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、化学発光試薬（パーキンエルマー社製）を用い、Ｘ線フィルム（コダック社製）に感光させ、特異バンドを検出した。
【００７９】
最終的に、精製ｒｈＰＣＳＫ９固相化マイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法による精製ｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性、免疫沈降法によるヒト血清ＰＣＳＫ９に対する反応性により選別し、ヒトＰＣＳＫ９に対して反応するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ２５クローンを作製した。
【００８０】
（２）ハイブリドーマからのモノクローナル抗体調製
プリステン（０．５ml/匹、シグマ社製）を予め腹腔内に投与したBalb/cマウス（８週齢、雄）に一匹あたりハイブリドーマ細胞１０６〜１０７個／０．５ｍＬを腹腔内に注入した。注入１０日後、マウスを開腹し、腹水を採取した。得られた腹水は、遠心にて細胞成分を取り除き、上清に等量の氷冷した飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて混和し、氷冷し２時間放置した。次いで、１００００×ｇで１０分間遠心後、上清を捨て、沈殿を結合溶液（３Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン溶液、pH 8.9）に溶解し、Protein Ａセファロース（GEヘルスケア社製）と混和し、４℃で一晩転倒混和した。結合させたProtein Ａセファロースをカラムに充填し、６倍量の結合溶液にて洗浄後、溶出溶液（０．１Ｍクエン酸溶液、pH ４．０）で１ｍＬずつ溶出した。溶出された画分は、０．１ｍＬの２Ｍトリス溶液（pH１０．０）で中和した。各溶出画分の吸光度(２８０nm)を測定し、モノクローナル抗体の溶出画分を回収した。回収したモノクローナル画分はＰＢＳにて透析（４℃、一晩）し、精製モノクローナル抗体を得た。
【００８１】
得られたモノクローナル抗体のアイソタイプは、マウスモノクロナール抗体アイソタイプ決定用キット（べーリンガー社製）を用い、キット添付の操作手順に準じて測定した。ヒトPCSK9に対するモノクローナルは、IgG1（17クローン）、IgG2a（2クローン）、ＩｇＧ２ｂ（６クローン）であった。これらのうち、ハイブリドーマ１ＦＢ、Ｂ１２Ｅ、Ｇ１２Ｄ、Ｂ１Ｇに由来するモノクローナル抗体［抗体１ＦＢ（ＩｇＧ１）、Ｂ１２Ｅ（ＩｇＧ１）、Ｇ１２Ｄ（ＩｇＧ１）、Ｂ１Ｇ（ＩｇＧ１）］について、下記のように抗体の特異性を確認した。
【００８２】
（３）モノクローナル抗体特異性の確認
モノクローナル抗体の特異性は、ウェスタンブロット法によるｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性、免疫沈降法によるＦｕｒｉｎ切断、ｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性を検討し、確認した。
【００８３】
（４）ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体の作製
抗体１ＦＢ、Ｂ１２Ｅ、Ｇ１２Ｄ、Ｂ１Ｇ、及び市販抗ヒトＰＣＳＫ９抗体MAB38881（R&D社）、抗ヒスチジンタグ抗体（Tetra-His Antibody、キアゲン社）はPeroxidase Labeling Kit - SH（同仁化学研究所）を用いて各抗体のペルオキシダーゼ標識抗体を作製した。抗体の標識はキット説明書に従い行った。
【００８４】
（５）ウェスタンブロット法によるｒｈＰＣＳＫ９に対する抗体の特異性検討
ゲル１枚あたり１μgの精製ｒｈＰＣＳＫ９を非還元及び還元条件下にてSDS-PAGEし、次いでＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写した膜は、５％スキムミルクを含むＰＢＳにて４℃、一晩静置した。洗浄液（０．１% Tween20含有ＰＢＳ）にて２回洗浄後、各ペルオキシダーゼ標識抗体１０ ng/mLを室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、化学発光試薬（パーキンエルマー社製）を用い、Ｘ線フィルム（コダック社製）に感光させ、特異バンドを検出した（図３）。
【００８５】
ウェスタンブロット法によるｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性の結果より、抗体１ＦＢ、Ｂ１２Ｅ、Ｂ１ＧはＰＣＳＫ９mature segmentに反応し、この反応性は抗原の還元処理により失われることが明らかとなった。抗体Ｇ１２ＤはＰＣＳＫ９pro segmentのみに反応し、この反応性は抗原の還元処理に影響されないことが明らかとなった。
【００８６】
（６）ｒｈＰＣＳＫ９のＦｕｒｉｎ処理による切断
２mM CaCl2及び０．５% Triton X-100含有２５mM Tris-HCl (pH９．０)液中で精製ｒｈＰＣＳＫ９  １μgとリコンビナントヒトＦｕｒｉｎ（R&D社）を混合し、３７℃で６時間反応させた。その後、１μLの０．５M ＥＤＴＡを加え、反応を停止した。この反応液をＦｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９溶液とした。
【００８７】
Ｆｕｒｉｎ処理によるｒｈＰＣＳＫ９の切断は、以下のように、SDS-PAGE及びウェスタンブロット法により確認した。Ｆｕｒｉｎ未処理ｒｈＰＣＳＫ９及びＦｕｒｉｎ処理ｒｈＰＣＳＫ９(２０ng）をそれぞれ還元条件下にてSDS-PAGEし、次いでＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写した膜は、５％スキムミルクを含むＰＢＳにて４℃、一晩静置した。洗浄液（０．１% Tween20含有ＰＢＳ）にて２回洗浄後、１０ng/mLペルオキシダーゼ標識抗ヒトＰＣＳＫ９抗体MAB38881（R&D社製）を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、化学発光試薬（パーキンエルマー社製）を用い、Ｘ線フィルム（コダック社製）に感光させ、特異バンドを検出した(図４)。
【００８８】
その結果、Ｆｕｒｉｎ未処理ｒｈＰＣＳＫ９は分子量約６０kDaのmature segmentのバンド（前出図２の還元処理におけるmature segmentに相当する）が検出されるのに対し、Ｆｕｒｉｎ処理ｒｈＰＣＳＫ９はそのほとんどが分子量５３ｋDaのバンドが検出された。
【００８９】
（７）モノクローナル抗体のＦｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９に対する反応性
抗ＰＣＳＫ９抗体１ＦＢ、Ｂ１２Ｅ、Ｂ１Ｇ、Ｇ１２Ｄ、及び、コントロール抗体１６Ｇ５について、０．１Ｍホウ酸緩衝液(pH９．５)で洗浄したDynabeads M-280 Tosyl-activated（ベリタス社製）を３Ｍ硫酸アンモニウム含有０．１Ｍホウ酸緩衝液(pH ９．５)に懸濁し、１．０×１０８個のビーズあたり抗体を１０μg加え、４℃で２０時間、転倒混和しながらビーズに各抗体を結合させた。反応後上清液を捨て、０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ（pH７．４) を加え、緩やかに攪拌しながら、室温で２時間反応させビーズを不活化した後、０．１％  ＢＳＡ含有ＰＢＳ（pH７．４）で洗浄し、抗体結合ビーズを作製した。抗体結合ビーズ１．０×１０７個に対しｒｈＰＣＳＫ９  ２０μg、もしくはＦｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９  ２０μgを添加し、転倒混和しながら４℃で１６時間反応させた。０．１％ Tween20含有ＰＢＳで３回洗浄後、非還元ＳＤＳサンプル液に懸濁してSDS-PAGEし、次いでＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写した膜は、５％スキムミルク含有ＰＢＳにて４℃、一晩静置した。洗浄液（０．１%Tween 20含有ＰＢＳ）にて２回洗浄後、０．１μg/mLのペルオキシダーゼ標識抗ヒトＰＣＳＫ９抗体MAB38881（R&D社）を室温下、２時間反応させた。反応後、洗浄液にて５回洗浄した後、化学発光試薬（パーキンエルマー社製）を用い、Ｘ線フィルム（コダック社製）に感光させ、特異バンドを検出した（図５）。
【００９０】
前記のようにウェスタンブロット法によりPro segmentに対する抗体であることが確認されたＧ１２Ｄは、Ｆｕｒｉｎ未処理ｒｈＰＣＳＫ９ではmature segment（６０kDa）が免疫沈降するのに対し、Ｆｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９ではmature segment（５３kDa）が免疫沈降しない。このことから、Ｆｕｒｉｎ未処理ｒｈＰＣＳＫ９はヘテロダイマーを形成しているのに対し、Ｆｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９はヘテロダイマーを形成していない（非ヘテロダイマー）ことが確認された。
【００９１】
Mature segmentに対する抗体１ＦＢ、Ｂ１２ＥはＦｕｒｉｎ未処理ｒｈＰＣＳＫ９（ヘテロダイマー）及びＦｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９（非ヘテロダイマー）の両者を免疫沈降することから、ＰＣＳＫ９の６０kDa mature segment、及び５３kDa cleaved mature segmentのいずれにも反応することが確認された。抗体Ｂ１ＧはＦｕｒｉｎ未処理ｒｈＰＣＳＫ９（ヘテロダイマー）では６０kDa mature segmentを免疫沈降しないのに対し、Ｆｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９（非ヘテロダイマー）では５３kDa cleaved mature segmentを免疫沈降することから、非ヘテロダイマーのmature segment特異的に反応することが確認された。
【００９２】
３．サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＰＣＳＫ９分子形態特異的蛋白質量測定系の構築
（１）抗体の組合せ
上述のごとく作製したモノクローナル抗体を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡが可能な抗体の組合せを検討し、最終的に、固相抗体１ＦＢと検出抗体ペルオキシダーゼ標識Ｂ１２Ｅの組合せによる全ＰＣＳＫ９測定系（Ａ系）、固相抗体Ｂ１２Ｅと検出抗体ペルオキシダーゼ標識Ｇ１２Ｄの組合せによるヘテロダイマーＰＣＳＫ９測定系（Ｂ系）、固相抗体Ｂ１Ｇと検出抗体ペルオキシダーゼ標識Ｂ１２Ｅの組合せによる非ヘテロダイマーＰＣＳＫ９測定系（Ｃ系）をそれぞれ構築した（図６）。
【００９３】
（２）サンドイッチＥＬＩＳＡの構築
イムノプレート（Nunc社）にＰＢＳで希釈した各固相抗体（A系：1FB 1μg/mL、B系：B12E 0.3μg/mL、C系：B1G 1μg/mL）を１００μl/wellで添加し、４℃で一晩静置した。
０．１% Tween20含有ＰＢＳ（洗浄液）で２回洗浄後、１％ＢＳＡ及び１０% Sucrose含有ＰＢＳを２００μl/wellで添加し、室温２時間ブロッキングした。各ウェルの液を除去後、０．３％ＢＳＡ及び０．１％Tween20含有ＰＢＳで希釈したスタンダード溶液（A系及びB系はｒｈＰＣＳＫ９、Ｃ系はｒｈΔＮ２１８  ＰＣＳＫ９）、あるいはヒト血清を１００μl/wellで添加し、室温で２時間静置した（表１）。
【００９４】
【表１】
2012237752.tif 000002
【００９５】
反応後洗浄液で４回洗浄し、１０% StabilZyme（SurModics社）、０．３% ＢＳＡ及び０．１％ Tween20含有ＰＢＳで希釈した各検出抗体（Ａ系：ペルオキシダーゼ標識Ｂ１２Ｅ  １０ng/mL、Ｂ系：ペルオキシダーゼ標識Ｇ１２Ｄ  ２５ng/mL、C系：ペルオキシダーゼ標識Ｂ１２Ｅ  ３５ng/mL）を１００μl/wellで添加し、室温１時間静置した。反応後洗浄液で４回洗浄し、酵素基質液ＴＭＢ＋（Dako社）を１００μl/well添加し、室温３０分間発色させた後、０．５M硫酸１００μl/wellを添加して酵素反応を停止し、Multiskan Ascent (Thermo Labsystems社製)にて各ウェルの吸光度を波長４５０nm（バックグラウンド５６０nm）で測定した。
【００９６】
各ＥＬＩＳＡ測定系における検量線は図７のとおりである。Ａ系及びＢ系は、０〜２０ng/ml、C系は０〜４ng/mlの範囲で良好な検量線を示した。
【００９７】
図８は、血清サンプルの希釈直線性試験の結果を示している。いずれの系、サンプルについても直線性が示されており、各ＥＬＩＳＡ系の正確度が確認された。
【００９８】
４．ヒト血清中ＰＣＳＫ９の測定
（１）健常者及び家族性高コレステロール血症（FH）患者におけるＰＣＳＫ９の定量
健常者１０８名及び家族性高コレステロール血症（FH）患者１９４名の血清におけるＰＣＳＫ９濃度を測定した。その結果、健常者における血清ＰＣＳＫ９濃度は、Ａ系測定系が２６２．７±８０．２（平均±SD） ng/mL、Ｂ系測定系が２５２．５±７９．１ng/mL、C系測定系が２８．９±１０．６ng/mLであった。また、ＦＨ患者における血清ＰＣＳＫ９濃度は、Ａ系測定系が３８２．９±１３２．６ ng/mL、Ｂ系測定系が３１０．３±１４６．６ ng/mL、C系測定系が８９．７±９０．６ng/mLであった。いずれの系においても、ＦＨ患者の方が健常者よりも有意に高い値であった（Ａ系及びＣ系測定系、ｐ＜０．０００１；Ｂ系測定系、ｐ＝０．００１６）。
【００９９】
（２）ＰＣＳＫ９検出サンドイッチＥＬＩＳＡの各測定系間における関係
健常者おいては、Ａ系測定系とＢ系測定系との相関はy=0.957x + 1.114、 R2=0.940、A系測定系とC系測定系との相関はy=0.115x - 1.449、R2=0.768、Ａ系測定系と（Ｂ系測定系＋Ｃ系測定系）との相関はy=1.072x - 0.335、 R2=0.961であった。この結果より、PCSK9 Ａ系測定系は（ＰＣＳＫ９  Ｂ系測定系＋ＰＣＳＫ９  Ｃ系測定系）にほぼ一致することが示された。すなわち、血清中ＰＣＳＫ９は、そのほとんどがヘテロダイマー型で存在しており、一部約1割が非へテロダイマー型として存在していることが示された（図９）。
【０１００】
ＦＨ患者においては、Ａ系測定系とＢ系測定系との相関がy=0.768x + 20.598、R2=0.515、Ａ系測定系とＣ系測定系との相関がy=0.283x - 20.745、R2=0.207、Ａ系測定系と（Ｂ系測定系＋Ｃ系測定系）との相関がy=1.051x - 0.147、R2=0.942であった。ＦＨ患者においては、Ａ系測定系と（Ｂ系測定系＋Ｃ系測定系）との相関は健常者と同様であるが、Ａ系測定系とＢ系測定系あるいはＣ系測定系との相関が健常者とは異なり、相関が悪いことが示された。つまりＦＨ患者においては、血清総ＰＣＳＫ９量は健常者より高く、またＢ系測定系あるいはＣ系測定系の比率が大きく異なることによることが大きい、すなわちヘテロダイマー型ＰＣＳＫ９が減少し、逆に非へテロダイマー型が増加していることによることが示された。
【０１０１】
また、ヘテロダイマーと非ヘテロダイマーの存在比にばらつきがあるもののＡ系とＢ系＋Ｃ系は良い正相関を示すことから、Ｂ系、Ｃ系がそれぞれ血清中のヘテロダイマー、非ヘテロダイマーを正しく定量していることが示された（図１０）。
【０１０２】
さらに、Ａ系測定系とＢ系測定系との比（Ａ系／Ｂ系比）は健常者が1.05 ± 0.08、FH患者が1.88 ± 3.88で、同様に（Ｂ系測定系＋Ｃ系測定系）とＢ系測定系との比（（Ｂ系＋Ｃ系）／Ｂ系比）は健常者が1.12 ± 0.02、FH患者が1.84 ± 3.39であり、両者ともＦＨ患者は健常者に比して有意に（P < 0.0001）高値であることが示された。また、Ａ系測定系とＣ系測定系との比（Ａ系／Ｃ系比）は健常者が9.39 ± 1.55、ＦＨ患者が6.73 ± 3.21で、同様に（Ｂ系測定系＋Ｃ系測定系）とＣ系測定系との比（（Ｂ系＋Ｃ系）／Ｃ系比）は健常者が10.08 ± 1.93、ＦＨ患者が7.18 ± 3.62であり、両者ともＦＨ患者は健常者に比して有意に（P < 0.0001）低値であることが示された。Ｂ系／Ｃ系比は健常者が9.08 ± 1.93、ＦＨ患者が6.18 ± 3.65であり、ＦＨ患者は健常者に比して有意に（P < 0.0001）低値であることが示された（表２）。
【０１０３】
これらの結果は、ＦＨ患者においてはＢ系測定系によるＰＣＳＫ９（へテロダイマー型ＰＣＳＫ９）量が健常者より高く、Ｃ系測定系によるＰＣＳＫ９（非へテロダイマー型ＰＣＳＫ９）量が高く、かつヘテロダイマー型ＰＣＳＫ９が低いことを示しており、これらの比によりＦＨを鑑別可能であることが示された。
【０１０４】
【表２】
2012237752.tif 000003
【０１０５】
（３）ヒト血清中ＰＣＳＫ９の免疫沈降
非ヘテロダイマー型ＰＣＳＫ９特異的な抗ＰＣＳＫ９抗体Ｂ１Ｇを用いて血清ＰＣＳＫ９分子を免疫沈降により検討した。上述のごとく、ＦＨ患者血清１００μLに対して抗ＰＣＳＫ９抗体Ｂ１Ｇを反応し、免疫沈降を行った。
【０１０６】
その結果、非ヘテロダイマー型ＰＣＳＫ９量が高い血清サンプル（サンプル番号１〜４）において、Ｆｕｒｉｎ切断ｒｈＰＣＳＫ９と同様に５３kDaのバンドが検出された。
【０１０７】
５．ＰＣＳＫ９と動脈硬化症との関連
血清ＰＣＳＫ９量と動脈硬化症との関連を１４８名のＦＨ患者について、血清脂質パラメーター［総コレステロール（ＴＣ）、中性脂肪（ＴＧ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬＣ）、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬＣ）、レムナントコレステロール（ＲＬＰ−Ｃ）、Ｌｐ（ａ）、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（Ａｐｏ  Ａ−Ｉ）、アポリポタンパク質Ｂ（Ａｐｏ  Ｂ）、アポリポタンパク質Ｅ（Ａｐｏ  Ｅ）］、空腹時血糖（ＦＢＳ）、空腹時インスリン、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、高感度ＣＲＰ（ｈｓＣＲＰ）、頚動脈肥厚度（ＩＭＴ）ｍａｘ−ＩＭＴＲ・ｍａｘ−ＩＭＴＬ・ｍｅａｎ−ＩＭＴＲ・ｍｅａｎ−ＩＭＴＬ、アキレス腱黄色腫（Ａｃｈ  Ｒ、Ａｃｈ  Ｌ）、肝・腎機能（ＡＬＴ、ＡＳＴ、γ−ＧＴＰ、ＣＰＫ、Ｃｒ）、拡張期血圧（ＳＢＰ）、収縮期血圧（ＤＢＰ）、及び脈拍数との相関を検討した。
【０１０８】
その結果、ＰＣＳＫ９  Ａ系測定系（へテロダイマー型ＰＣＳＫ９と非へテロダイマー型ＰＣＳＫ９との総和）は、ＴＧ（r=0.201、p=0.0332）、Ｌｐ（ａ）(r=0.253、p=0.0087)、ｍａｘ−ＩＭＴＲ(r=0.234、p=0.0339）、ｍａｘ−ＩＭＴＬ(r=0.327、p=0.0029）、ｍｅａｎ−ＩＭＴＲ(r=0.325、p=0.0033）、アキレス腱黄色腫Ｒ（r=0.300、p=0.0070）、アキレス腱黄色腫Ｌ（r=0.250、p=0.0242）、ＡＬＴ(r=0.286、p=0.0025）、ＡＳＴ(r=0.214、p=0.0235）と有意に正相関を、ＰＣＳＫ９（Ａ系測定系＋Ｂ系測定系）（へテロダイマー型ＰＣＳＫ９と非へテロダイマー型ＰＣＳＫ９との総和）は、ＴＧ（r=0.200、p=0.0341）、ｍａｘ−ＩＭＴＬ(r=0.305、p=0.0055）、ｍｅａｎ−ＩＭＴＲ(r=0.316、p=0.0042）、アキレス腱黄色腫Ｒ（r=0.282、p=0.0113）、アキレス腱黄色腫Ｌ（r=0.236、p=0.0340）、ＡＬＴ(r=0.308、p=0.0011）、ＡＳＴ(r=0.239、p=0.0116）と有意に正相関を、ＰＣＳＫ９  Ｂ系測定系（へテロダイマー型ＰＣＳＫ９量）は、ｍｅａｎ−ＩＭＴＲ(r=0.268、p=0.0161）、アキレス腱黄色腫Ｒ（r=0.300、p=0.0070）、アキレス腱黄色腫Ｌ（r=0.250、p=0.0242）、ＡＬＴ(r=0.212、p=0.0246）と有意に正相関を、ＰＣＳＫ９  Ｃ系測定系（非へテロダイマー型ＰＣＳＫ９量）は、ｍａｘ−ＩＭＴＬ(r=0.255、p=0.0200）、ｍｅａｎ−ＩＭＴＲ(r=0.421、p=0.0001）、ＣＰＫ(r=0.200、p=0.0340）と有意に正相関を、ＨＤＬＣ(r=-213、p=0.0242)と有意に逆相関することが示された。すなわち、ＰＣＳＫ９量を測定することにより、ＦＨの診断のみでなく、動脈硬化症との関連性を示すことが明らかとなった（表３）。
【０１０９】
【表３】
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【０１１０】
以上より、本測定系（サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＰＣＳＫ９分子形態特異的蛋白質量測定系）がヒト血中のＰＣＳＫ９全量、ヘテロダイマー量、非ヘテロダイマー量、それぞれを定量出来ることが明らかになった。特に、健常者では非ヘテロダイマーが全ＰＣＳＫ９の約１割程度であるのに対し、ＦＨ患者では非ヘテロダイマーの割合が高くなるケースがあること、高値の非ヘテロダイマーが５３kDa segmentに由来することが示され、本測定系がＦＨや動脈硬化の診断に有用であることが明らかとなった。
【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１１】
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【配列表】
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