(57)【要約】【課題】ＰＣＲ増幅産物のようなＤＮＡ断片を簡便に、挿入方向を制御しながら、さらに目的のＤＮＡ断片のみが挿入されたクローンを容易に選択できるＴＡクローニング用のベクター、当該ベクターを用いるクローニング方法、当該ベクターの製造方法及び当該ベクターを含むキットを提供すること。【解決手段】薬剤耐性遺伝子産物の薬剤耐性の発揮に不可欠なＣ末端部分又はＮ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列が欠失した活性喪失薬剤耐性遺伝子が末端に配置されているベクター、当該ベクターを用いるクローニング方法、当該ベクターの製造方法及び当該ベクターを含むキット。【選択図】図５
2012143226.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
突出する１残基のデオキシチミジン又はウリジンを両３´末端に有する直鎖状の二本鎖ＤＮＡからなるクローニング用ベクターであって、薬剤耐性遺伝子産物の部分配列をコードする核酸を保持し、前記核酸は前記薬剤耐性遺伝子産物の薬剤耐性の発揮に不可欠なＣ末端部分又はＮ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列が欠失した活性喪失薬剤耐性遺伝子であり、さらに前記核酸は前記活性喪失薬剤耐性遺伝子において欠失した核酸配列を末端部分に含む挿入ＤＮＡ断片がベクターに連結した際に欠失のない薬剤耐性遺伝子産物をコードする核酸が構成されるように前記二本鎖ＤＮＡのいずれか一方の末端に配置されていることを特徴とするベクター。
【請求項２】
活性喪失薬剤耐性遺伝子が、薬剤耐性遺伝子産物のＣ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列が欠失した活性喪失薬剤耐性遺伝子である、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
活性喪失薬剤耐性遺伝子が、Ｃ末端アミノ酸が欠失したβ−ラクタマーゼのアミノ酸配列をコードする核酸配列からなる、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
活性喪失薬剤耐性遺伝子が、配列表の配列番号：１７に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列からなる、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
さらに、前記の薬剤耐性遺伝子とは異なる薬剤に対して耐性を示す第２の薬剤耐性遺伝子を有する請求項１に記載のベクター。
【請求項６】
配列表の配列番号：５に記載の核酸配列からなるＤＮＡ、及び配列表の配列番号：１８に記載の核酸配列からなるＤＮＡからなる、請求項１に記載のベクター。
【請求項７】
ＤＮＡをクローニングする方法であって、下記工程（ａ）〜（ｄ）を含む方法：
（ａ）ＤＮＡを鋳型として、第１のプライマー、第１のプライマーに対向する第２のプライマー、及びＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う工程；
（ｂ）工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物と請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクターとを連結し、環状ＤＮＡを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）により得られた環状ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程；及び
（ｄ）欠失のない薬剤耐性遺伝子産物が耐性を示す薬剤による薬剤選択によって、ＰＣＲ産物が所望の方向でベクターに挿入された環状ＤＮＡを有する形質転換体を選択する工程；
ここで第１のプライマーは、３´末端側に前記ＤＮＡに相補的な核酸配列を有し、且つ請求項１〜６に記載のベクターにおける活性喪失薬剤耐性遺伝子が薬剤耐性遺伝子産物のＣ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列が欠損した遺伝子である場合には欠損している核酸配列を５´末端側に、請求項１〜６に記載のベクターにおける活性喪失薬剤耐性遺伝子が薬剤耐性遺伝子産物のＮ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列が欠損した遺伝子である場合には、欠損している核酸配列の相補鎖配列から５´末端のデオキシチミジンを除いた核酸配列を５´末端側に有する。
【請求項８】
工程（ａ）におけるＤＮＡポリメラーゼが、反応産物の３´末端に鋳型非依存的に１塩基のデオキシアデノシンを付加する活性を有する、請求項７のクローニング方法。
【請求項９】
工程（ａ）において、さらに反応産物の３´末端に１塩基のデオキシアデノシンを付加することを含む、請求項７のクローニング方法。
【請求項１０】
ベクターの製造方法であって、配列表の配列番号：１９に記載の核酸配列を有する環状二本鎖ＤＮＡを制限酵素ＰｍａＣＩにより切断する工程、及びターミナルデオキシジルトランスフェラーゼ活性を有する酵素により、切断された二本鎖ＤＮＡの両３´末端に突出する１残基のチミン又はウラシルを付加し、請求項１に記載のベクターを得る工程を含む製造方法。
【請求項１１】
クローニングのためのキットであって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター及びＤＮＡリガーゼを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ産物のクローニングに適したベクター、当該ベクターを用いるクローニング方法、当該ベクターの製造方法及び当該ベクターを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、目的遺伝子の単離方法としてＰＣＲを利用する方法が知られている。この方法ではまず、目的遺伝子を含むＤＮＡもしくはその断片をＰＣＲで増幅し、得られたＰＣＲ産物をクローニング用プラスミドベクターに組み込み、さらにこれを用いて宿主を形質転換させて形質転換体の単コロニーを形成させる。次に、形成された単コロニーからプラスミドを精製し、プラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の確認を行う。こうすることにより、目的遺伝子又はその断片が挿入されているプラスミドを取得することができる。
【０００３】
ＰＣＲ法に用いられる酵素のうち、代表的なＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼには、複製されたＤＮＡ産物の３´末端に鋳型非依存的にデオキシアデニン（ｄＡ）を一残基付加するという副反応の活性があることが知られている。このため、このような副反応の活性があるＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅させた二本鎖ＤＮＡ断片の大部分は、デオキシアデニンが１残基付加した３´端突出構造を有する。
【０００４】
これを利用して、突出する１残基のデオキシチミジン（ｄＴ）を両３´末端に有する開環ベクター（Ｔ−ベクター）を利用するＴＡクローニング法が開発された（非特許文献１）。ＴＡクローニング法を用いることにより、ＰＣＲ産物の制限酵素処理や末端の平滑化処理を行うことなく、ＰＣＲ産物が挿入された組み換えプラスミドを得ることができる。
【０００５】
しかしながら、従来のＴＡクローニング法には欠点がある。ＴＡクローニングにおいて、ＰＣＲ断片が挿入されたプラスミドを含む形質転換体の同定には、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−相補性を利用する、いわゆる青/ 白スクリーニングが汎用されている。しかし、ＰＣＲ断片がβ−ガラクトシダーゼ由来αペプチド遺伝子の塩基配列に対してイン・フレームで挿入された場合には融合タンパク質としてαペプチドの発現が起こることがある。この場合、弱い青色を呈する偽陰性コロニーの生成につながってしまう。
【０００６】
また、通常のＴＡクローニング法では、ベクターに挿入される目的遺伝子の方向性が制御できない。この欠点を解消するために改良型Ｔ−ベクターが作成された。例えば特許文献１には、第一の制限酵素切断部位を生じさせるプライマー対と当該プライマー対を用いてＰＣＲした増幅産物が逆方向に挿入された場合にのみ第２の制限酵素切断部位が出現するようにデザインされたＴ−ベクターとを組み合わせた方法が開示されている。この方法では、第２の制限酵素切断部位を切断する制限酵素を使用して逆方向に挿入されたプラスミドのみを切断することにより、所望の方向にＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを保持した形質転換体のみを得ることができる。しかしながらこの方法では、ライゲーション反応後にさらに制限酵素処理を行う必要があり操作が煩雑になってしまう。
【０００７】
最近、ＴＡクローニングにおける偽陰性コロニーの生成を抑制するために、選択マーカーとして致死遺伝子を利用する方法が報告された（非特許文献２）。しかしながら、この方法では、ベクターに挿入される目的遺伝子の方向性が制御できない。
【０００８】
このように、ＰＣＲ増幅産物のようなＤＮＡ断片を簡便に、挿入方向を制御しながら、さらに目的のＤＮＡ断片のみが挿入されたクローンを容易に選択できるクローニングベクターはないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００５／０２１７４７号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】バイオテクニークス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１９９５年、第１９巻、第１号、第３４頁〜３５頁
【非特許文献２】モレキュラー  バイオロジー  レポーツ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ）、２００９年、第３６巻、第７号、第１７９３頁〜１７９８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、上記の欠点が克服されたＴＡクローニング用のベクター、当該ベクターを用いるクローニング方法、当該ベクターの製造方法及び当該ベクターを含むキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、薬剤耐性遺伝子産物の薬剤耐性の発揮に不可欠なＣ末端部分又はＮ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列が欠失した活性喪失薬剤耐性遺伝子が末端に配置されているベクターにより、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、
［１］突出する１残基のデオキシチミジン又はウリジンを両３´末端に有する直鎖状の二本鎖ＤＮＡからなるクローニング用ベクターであって、薬剤耐性遺伝子産物の部分配列をコードする核酸を保持し、前記核酸は前記薬剤耐性遺伝子産物の薬剤耐性の発揮に不可欠なＣ末端部分又はＮ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列が欠失した活性喪失薬剤耐性遺伝子であり、さらに前記核酸は前記活性喪失薬剤耐性遺伝子において欠失した核酸配列を末端部分に含む挿入ＤＮＡ断片がベクターに連結した際に欠失のない薬剤耐性遺伝子産物をコードする核酸が構成されるように前記二本鎖ＤＮＡのいずれか一方の末端に配置されていることを特徴とするベクター、
［２］活性喪失薬剤耐性遺伝子が、薬剤耐性遺伝子産物のＣ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列が欠失した活性喪失薬剤耐性遺伝子である、［１］に記載のベクター、
［３］活性喪失薬剤耐性遺伝子が、Ｃ末端アミノ酸が欠失したβ−ラクタマーゼのアミノ酸配列をコードする核酸配列からなる、［２］に記載のベクター、
［４］活性喪失薬剤耐性遺伝子が、配列表の配列番号：１７に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列からなる、［３］に記載のベクター、
［５］さらに、前記の薬剤耐性遺伝子とは異なる薬剤に対して耐性を示す第２の薬剤耐性遺伝子を有する［１］に記載のベクター、
［６］配列表の配列番号：５に記載の核酸配列からなるＤＮＡ、及び配列表の配列番号：１８に記載の核酸配列からなるＤＮＡからなる、［１］に記載のベクター、
［７］ＤＮＡをクローニングする方法であって、下記工程（ａ）〜（ｄ）を含む方法：
（ａ）ＤＮＡを鋳型として、第１のプライマー、第１のプライマーに対向する第２のプライマー、及びＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う工程、（ｂ）工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物と［１］〜［６］のいずれか一項に記載のベクターとを連結し、環状ＤＮＡを得る工程、（ｃ）工程（ｂ）により得られた環状ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程、及び（ｄ）欠失のない薬剤耐性遺伝子産物が耐性を示す薬剤による薬剤選択によって、ＰＣＲ産物が所望の方向でベクターに挿入された環状ＤＮＡを有する形質転換体を選択する工程、ここで第１のプライマーは、３´末端側に前記ＤＮＡに相補的な核酸配列を有し、且つ［１］〜［６］に記載のベクターにおける活性喪失薬剤耐性遺伝子が薬剤耐性遺伝子産物のＣ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列が欠損した遺伝子である場合には欠損している核酸配列を５´末端側に、［１］〜［６］に記載のベクターにおける活性喪失薬剤耐性遺伝子が薬剤耐性遺伝子産物のＮ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列が欠損した遺伝子である場合には、欠損している核酸配列の相補鎖配列から５´末端のデオキシチミジンを除いた核酸配列を５´末端側に有する、
［８］工程（ａ）におけるＤＮＡポリメラーゼが、反応産物の３´末端に鋳型非依存的に１塩基のデオキシアデノシンを付加する活性を有する、［７］のクローニング方法、
［９］工程（ａ）において、さらに反応産物の３´末端に１塩基のデオキシアデノシンを付加することを含む、［７］のクローニング方法、
［１０］ベクターの製造方法であって、配列表の配列番号：１９に記載の核酸配列を有する環状二本鎖ＤＮＡを制限酵素ＰｍａＣＩにより切断する工程、及びターミナルデオキシジルトランスフェラーゼ活性を有する酵素により、切断された二本鎖ＤＮＡの両３´末端に突出する１残基のチミン又はウラシルを付加し、［１］に記載のベクターを得る工程を含む製造方法、並びに
［１１］クローニングのためのキットであって、［１］〜［６］のいずれか一に記載のベクター及びＤＮＡリガーゼを含むキット、
に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、簡便な操作で目的の遺伝子が所望の方向で挿入されたクローンのみを選択可能なベクターが提供される。また、本発明により、目的遺伝子が挿入されたプラスミドを含む形質転換体の同定にＸ−ＧａｌやＩＰＴＧ等が不要となり、準備操作が簡略化される。さらに、本発明のベクターは、ＡＴリッチなＤＮＡ断片のクローニングにも威力を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例２（１）における、本発明のベクターを用いたＴＡクローニングを経て得られた形質転換体についてのコロニーＰＣＲの結果を示す図である。
【図２】実施例２（１）における、従来のＴ−ベクターを用いたＴＡクローニングを経て得られた形質転換体についてのコロニーＰＣＲの結果を示す図である。
【図３】実施例２（３）における、本発明のベクターを用いたＴＡクローニングを経て得られた形質転換体についてのコロニーＰＣＲの結果を示す図である。
【図４】実施例２（３）における、従来のＴ−ベクターを用いたＴＡクローニングを経て得られた形質転換体についてのコロニーＰＣＲの結果を示す図である。
【図５】ｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡの構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（１）本発明のクローニングベクター
本発明のクローニングベクターは、突出する１残基のデオキシチミジン又はウリジンを両３´末端に有する直鎖状の二本鎖ＤＮＡからなり、薬剤耐性遺伝子産物の部分配列をコードする核酸を保持し、前記核酸は前記薬剤耐性遺伝子産物の薬剤耐性の発揮に不可欠なＣ末端部分又はＮ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列が欠失した活性喪失薬剤耐性遺伝子であり、さらに前記核酸は前記活性喪失薬剤耐性遺伝子において欠失した核酸配列を末端部分に含む挿入ＤＮＡ断片がベクターに連結した際に欠失のない薬剤耐性遺伝子産物をコードする核酸が構成されるように前記二本鎖ＤＮＡのいずれか一方の末端に配置されている。ここで前記の「欠失」とは、前記の直鎖状の二本鎖ＤＮＡの末端に配置された薬剤耐性遺伝子において、薬剤耐性の発揮に不可欠な部分を除く領域をコードする核酸配列のみが保持されていることを意味する。
【００１７】
「前記核酸が前記活性喪失薬剤耐性遺伝子において欠失した核酸配列を末端部分に含む挿入ＤＮＡ断片がベクターに連結した際に欠失のない薬剤耐性遺伝子産物をコードする核酸が構成されるように前記二本鎖ＤＮＡのいずれか一方の末端に配置されている」とは、前記活性喪失薬剤耐性遺伝子の核酸配列が欠失した側の末端が、前記二本鎖ＤＮＡのいずれか一方の末端となるように、前記核酸が配置されているということである。ただし、前記活性喪失薬剤耐性遺伝子側の二本鎖ＤＮＡの末端における３´末端の突出する１残基のデオキシチミジン又はウリジンが、前記活性喪失薬剤耐性遺伝子又はその相補鎖の一部を構成するように配置される。本発明のクローニング用ベクターに、前記活性喪失薬剤耐性遺伝子において欠失した核酸配列の部分配列を末端部分に含むＤＮＡ断片が連結することにより、欠失のない薬剤耐性遺伝子産物をコードする核酸が構成されるようになる。
【００１８】
前記の薬剤耐性遺伝子は特定の薬剤への耐性に寄与するものに限定されるものではなく、宿主の生育を抑制する薬剤に対する耐性を宿主に付与できるタンパク質をコードするものであればよい。例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン等への耐性に寄与する遺伝子を本発明に使用することができる。好適には、本発明にはアンピシリン耐性遺伝子（β−ラクタマーゼ遺伝子）が使用される。
【００１９】
前記の活性喪失薬剤耐性遺伝子において欠失した薬剤耐性遺伝子産物の薬剤耐性の発揮に不可欠なＣ末端部分又はＮ末端部分のアミノ酸としては、好適には薬剤耐性遺伝子産物の薬剤耐性の発揮に不可欠なＣ末端又はＮ末端から１〜５アミノ酸残基が、より好適にはＣ末端又はＮ末端から１〜３アミノ酸残基が、さらにより好適にはＣ末端又はＮ末端のアミノ酸残基が例示される。なお、本明細書では、活性喪失薬剤耐性遺伝子において欠失した薬剤耐性遺伝子産物の薬剤耐性の発揮に不可欠なＣ末端部分又はＮ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列とは、このようなアミノ酸をコードするコドンを全て含むものに限定されず、その欠損によって薬剤耐性遺伝子産物の薬剤耐性が喪失する限りにおいて、上記アミノ酸のうち１つのアミノ酸についてはこれをコードするコドンの一部の核酸配列を欠くものであってもよい。例えば、活性喪失薬剤耐性遺伝子において欠失した薬剤耐性遺伝子産物の薬剤耐性の発揮に不可欠なＣ末端部分又はＮ末端部分のアミノ酸がＣ末端のフェニルアラニンであり、これをコードするコドンが５´−ＴＴＣ−３´であるとき、このうち５´−ＴＣ−３´も活性喪失薬剤耐性遺伝子において欠失した薬剤耐性遺伝子産物の薬剤耐性の発揮に不可欠なＣ末端部分又はＮ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列である場合もある。
【００２０】
前記の活性喪失薬剤耐性遺伝子において欠失した薬剤耐性遺伝子産物の薬剤耐性の発揮に不可欠なＣ末端部分又はＮ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列としては、本発明を特に限定するものではないが、薬剤耐性遺伝子産物のＣ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列であることが好ましい。このような核酸配列が欠失した活性喪失薬剤耐性遺伝子としては、例えば配列表の配列番号：１７に示される核酸配列のような、Ｃ末端アミノ酸が欠損したβ−ラクタマーゼのアミノ酸配列をコードする核酸配列が例示される。
【００２１】
配列表の配列番号：１７に示される核酸配列を含むベクターは、例えば以下の方法で作製できる。β−ラクタマーゼのＣ末端である２９０番目のアミノ酸残基（トリプトファン残基、以下、Ｗ２９０と記すことがある）とその前の２８９番目のアミノ酸残基（ヒスチジン残基、以下、Ｈ２８９と記すことがある）をコードする核酸配列である５´−ＣＡＴＴＧＧ−３´をＰｍａＣＩの制限酵素切断部位である５´−ＣＡＣＧＴＧ−３´に改変する。こうして作製される改変β−ラクタマーゼ遺伝子にコードされるポリペプチドはβ−ラクタム系抗生物質、例えばアンピシリンを分解できない。この改変β−ラクタマーゼ遺伝子を挿入された、前記遺伝子以外の領域にＰｍａＣＩ切断部位を有しないベクターをＰｍａＣＩで切断すると、Ｗ２９０をコードする配列を欠くβ−ラクタマーゼ遺伝子が末端に位置する直鎖状の二本鎖ＤＮＡが生成する。さらに、こうして得られた二本鎖ＤＮＡの両３´末端に公知の方法で１残基のデオキシチミジン（もしくはウリジン）を付加することにより、３´末端に１残基のデオキシアデノシンを有するＰＣＲ産物の連結に適した直鎖状ベクターを調製することができる。ここでは配列表の配列番号：１７に示される核酸配列を用いて説明したが、本発明の直鎖状ベクターは上記の具体例に限定されず、薬剤耐性遺伝子のＣ末端部分やＮ末端部分のアミノ酸配列を考慮し、公知の制限酵素を適宜選択し使用することにより、同様の方法で調整することができる。
【００２２】
本発明のベクターとして、本発明を特に限定するものではないが、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクターを使用することができる。プラスミドベクターとしては使用する宿主において機能する複製起点（大腸菌の場合にはｐＵＣ  ｏｒｉ、ｐＡＣＹＣ  ｏｒｉ等）を保持するものを使用すればよい。本発明のベクターには、搭載される薬剤耐性遺伝子の発現のためのプロモーター配列の他、例えばクローニングされるＤＮＡ断片上の遺伝子の発現を制御するためのプロモーター及びオペレーター配列等が含まれていてもよい。また、前記の薬剤耐性遺伝子とは異なる薬剤に対して耐性を示す第２の薬剤耐性遺伝子をさらに有していてもよい。前記の薬剤耐性遺伝子として例えばアンピシリン耐性遺伝子を使用する場合、第２の薬剤耐性遺伝子としては、本発明を特に限定するものではないが、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン等への耐性に寄与する遺伝子が例示され、このうちカナマイシン耐性遺伝子が好適に例示される。本発明のベクターの好適な例としては、図５に示す構造を有するものが挙げられる。本発明のベクターのさらに具体的な例としては、配列表の配列番号：５に記載の核酸配列からなるＤＮＡ、及び配列表の配列番号：１８に記載の核酸配列からなるＤＮＡからなるベクターが挙げられる。
【００２３】
本発明のベクターを後述の本発明のクローニング方法に用いることにより、形質転換体取得の際の偽陽性クローンの出現が抑えられ、陽性クローン取得効率を向上させることができる。本明細書において「陽性クローン取得効率」とは、ＴＡクローニングにより得られた環状ＤＮＡにより形質転換された形質転換体の中からＴＡクローニングに使用したベクターに応じたスクリーニング方法（青/ 白スクリーニングや薬剤選択等）によって選択された所望の挿入断片が挿入された環状ＤＮＡを保持することが期待されるクローンのうち、実際に所望の挿入断片が挿入された環状ＤＮＡを保持するクローンが含まれる割合のことをいう。陽性クローン取得効率の測定方法は、本願実施例２〜４に記載の方法に準じて測定することができる。
【００２４】
さらには、本発明のベクターを後述の本発明のクローニング方法に用いることにより、挿入断片が任意の方向でのみ挿入された環状ＤＮＡを取得することができる。
【００２５】
（２）本発明のクローニング方法
本発明のクローニング方法は、（ａ）ＤＮＡを鋳型として、第１のプライマー、第１のプライマーに対向する第２のプライマー、及びＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う工程、（ｂ）工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物と本発明のベクターとを連結し、環状ＤＮＡを得る工程、（ｃ）工程（ｂ）により得られた環状ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程、及び（ｄ）欠失のない薬剤耐性遺伝子産物が耐性を示す薬剤による薬剤選択によって、ＰＣＲ産物が所望の方向でベクターに挿入された環状ＤＮＡを有する形質転換体を選択する工程を含む。ここで第１のプライマーは、３´末端側に前記ＤＮＡに相補的な核酸配列を有し、且つ本発明のベクターにおける活性喪失薬剤耐性遺伝子が薬剤耐性遺伝子産物のＣ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列が欠損した遺伝子である場合には欠損している核酸配列を５´末端側に、本発明のベクターにおける活性喪失薬剤耐性遺伝子が薬剤耐性遺伝子産物のＮ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列が欠損した遺伝子である場合には、欠損している核酸配列の相補鎖配列から５´末端のデオキシチミジンを除いた核酸配列を５´末端側に有する。
【００２６】
前記の第１のプライマーの、活性喪失薬剤耐性遺伝子において欠失している薬剤耐性の発揮に不可欠なＣ末端部分又はＮ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列又はその相補鎖配列は、当該プライマーを用いたＰＣＲによって得られる増幅産物を本発明のクローニングベクターと連結した際に、欠失のない薬剤耐性遺伝子産物をコードする配列が生じるよう設計されていればよい。例えば配列表の配列番号：５に記載の核酸配列のＤＮＡ及び配列表の配列番号：１８に記載の核酸配列のＤＮＡからなるベクターを用いる場合、５´−ＧＧＴＡＡ−３´を５´末端に含む核酸配列のプライマーを用いることができる。前記の欠失のない薬剤耐性遺伝子産物のアミノ酸配列やそれをコードする核酸配列は、遺伝子産物が薬剤耐性を発揮するものであれば、天然型の配列と異なるものであってもよい。本願発明者らは、β−ラクタマーゼの２９０番目のアミノ酸がフェニルアラニンに置換した変異体（Ｗ２９０Ｆ）が野生型のβ−ラクタマーゼと同様にアンピシリンに対する薬剤耐性を発揮することを見出した。この知見に基づいて、例えばベクターとして配列表の配列番号：５に記載の核酸配列のＤＮＡ及び配列表の配列番号：１８に記載の核酸配列のＤＮＡからなるベクターを用いる場合、５´−ＴＴＴＡＡ−３´あるいは５´−ＴＣＴＡＡ−３´を５´末端に含む核酸配列のプライマーを用いることができる。また、第１のプライマーの３´末端側の配列は、鋳型ＤＮＡに相補的な、ＰＣＲのプライマーとして十分な長さの核酸配列を有していればよい。
【００２７】
前記の第２のプライマーは、第１のプライマーの伸長鎖にアニーリング可能なプライマーであれば特に限定はなく、周知技術により適宜設計することができる。ＰＣＲ断片が特定の一方向で挿入された環状ＤＮＡのみを取得する場合には、特に限定されるものではないが、例えば第１のプライマーの伸長鎖の一部に相補的な核酸配列からなるプライマーを第２のプライマーとして設計すればよい。ＰＣＲ産物がそれぞれ異なる方向で挿入された２種類の環状ＤＮＡを取得する場合には、第１のプライマーと同様に、活性喪失薬剤耐性遺伝子において欠失している薬剤耐性の発揮に不可欠なＣ末端部分又はＮ末端部分のアミノ酸をコードする核酸配列又はその相補鎖配列が含まれるように、第２のプライマーを設計すればよい。
【００２８】
前記のＤＮＡポリメラーゼとしては、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼ、又はこれを含む混合型ＤＮＡポリメラーゼが例示される。なお、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼとともに汎用されているα型ＤＮＡポリメラーゼによってＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片は、当該ＤＮＡポリメラーゼが有する３´エキソヌクレアーゼ活性のために、３´末端にｄＡ突出を持たないものが多数を占めることが知られているが、ＰＣＲ反応後にＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼ等により３´末端にｄＡの突出を付加する処理を行うことで、ＴＡクローニング法によるクローニングは可能となる。α型ＤＮＡポリメラーゼによりＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片の３´末端にｄＡ突出を作製する方法としては、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、あるいはターミナルデオキシトランスフェラーゼのような核酸配列の３´末端へ塩基を付加する活性を有する酵素で処理する方法が挙げられる。このような処理を経て得られたＤＮＡ断片と本発明のベクターを用いるクローニング方法も、本発明の態様の一つである。
【００２９】
本発明のクローニング方法におけるＰＣＲ反応は、上記のプライマー対及びＤＮＡポリメラーゼを使用して実施する。鋳型ＤＮＡ、プライマー、Ｍｇイオン、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及びＤＮＡポリメラーゼの使用量、並びに熱変性／アニーリング／伸長反応の各プロセスの温度及び時間、これらのプロセスのサイクル数等は、例えばＢａｒｔｌｅｔｔ  ＪＭＳ及びＳｔｉｒｌｉｎｇ  Ｄ編「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、第２版、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００３年等を参考に、任意に設定することができる。
【００３０】
前記工程（ｂ）におけるＰＣＲ産物と本発明のクローニングベクターとの連結には、ＤＮＡリガーゼや市販のライゲーションキットが利用できる。本発明を特に限定するものではないが、ＤＮＡリガーゼとしてはＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼが例示され、ライゲーションキットとしてはＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（タカラバイオ社製）、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）、及びＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）が例示される。また、本発明のクローニングベクターとの連結に際して、ＰＣＲ産物は精製しても良いし、ＰＣＲ後の反応液を精製を経ずにそのまま本発明のクローニングベクターとの連結に使用することもできる。
【００３１】
前記工程（ｃ）における宿主細胞としては、本発明を特に限定するものではないが、大腸菌、枯草菌、酵母、及び昆虫細胞が例示され、このうち大腸菌がより好適に例示される。前記工程（ｃ）の形質転換には一般的な方法を使用すればよく、例えばケミカルコンピテントセルを用いる方法や電気穿孔法を利用することができる。
【００３２】
前記工程（ｄ）の薬剤選択に使用する選択薬剤は、欠失のない薬剤耐性遺伝子産物が耐性を示す薬剤を用いればよい。例えば、欠失のない薬剤耐性遺伝子産物がβ−ラクタマーゼである場合には、選択薬剤としてアンピシリンを用いることができる。また、本発明のクローニングベクターが第２の薬剤耐性遺伝子を有する場合には、第２の薬剤耐性遺伝子の遺伝子産物が耐性を示す薬剤を併用してもよい。
【００３３】
ここで、以下に本発明のクローニング方法の一態様を示す。ここではβ−ラクタマーゼ遺伝子を用いて説明するが、本発明のクローニング方法は以下の具体例に限定されず、用いる薬剤耐性遺伝子の核酸配列に基づき適宜プライマー対を設計して用いることにより、以下の方法と同様の方法や、当業者にとって自明な方法で行うことができる。
【００３４】
まず、クローニングの目的となる遺伝子を増幅するためのプライマー対を用意する。当該プライマーのうち、一方のプライマーの５´末端側にはβ−ラクタマーゼ遺伝子のＣ末アミノ酸Ｔｒｐ（Ｗ２９０）をコードする核酸配列とその下流のストップコドンとを生じさせるような塩基配列ＧＧＴＡＡを付加しておく。あるいはアミノ酸Ｐｈｅ（Ｆ２９０）とその下流のストップコドンとを生じさせるような塩基配列ＴＴＴＡＡあるいはＴＣＴＡＡを付加してもよい。当該プライマーとこれに対向するもう一方のプライマーとを用いてＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼによりＰＣＲを行う。こうすることによって、当該増幅断片の任意の一方の末端にＧＧＴＡＡ、ＴＴＴＡＡあるいはＴＣＴＡＡという配列が付加し、さらに両３´末端に突出するデオキシアデニンが付加したＤＮＡ断片が取得できる。このようにして取得されたＤＮＡ断片を本発明のベクターとのライゲーションに供することにより、所望の方向でのみＤＮＡ断片が挿入された環状ＤＮＡを取得することができる。
【００３５】
本発明においては、上記付加配列を５´末端側に含む２つの対向するプライマーを用いてＰＣＲを実施してもよい。この場合、両５´末端にＧＧＴＡＡ、ＴＴＴＡＡあるいはＴＣＴＡＡという配列が付加し、さらに両３´末端に突出するデオキシアデニンが付加したＤＮＡ断片が取得できる。このようにして取得されたＤＮＡ断片を本発明のベクターとのライゲーションに供することにより、ＤＮＡ断片がそれぞれ異なる方向で挿入された２種類の環状ＤＮＡを取得することができる。
【００３６】
前記ＤＮＡ断片を、Ｗ２９０を欠失したβ−ラクタマーゼ遺伝子を保持する本発明のベクターとのライゲーションに供し、連結して環状化されたベクターを作製する。本発明のベクターとのライゲーション反応には、上記ＤＮＡ断片を精製することなく用いてもよいしスピンカラム等を用いて精製したものを用いてもよい。このようにして得られた環状化ベクターで宿主を形質転換し、アンピシリン耐性を獲得した形質転換体を選抜するだけで、所望の方向に核酸断片が挿入されたクローンを得ることができる。
【００３７】
本発明のクローニング方法は、所望の方向でのみＤＮＡ断片が挿入された環状ＤＮＡを取得できることから、特定の部分のみのシークエンス解析に有用である。例えば、細菌の同定や分類を目的として１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子の５´側数百塩基をシークエンス解析する場合、ＤＮＡ断片の方向性が制御できない場合には解析の必要がない３´側領域がシークエンスされるクローンもシークエンス解析に供してしまうこととなる。しかしながら本発明のベクターを使うことによって、この問題が解消される。このため、前記のような判別においては迅速かつ安価な解析が可能になる。また、エピジェネティクス分野で多用されるバイサルフファイト処理されたＤＮＡはＡＴリッチな核酸配列を有するが、本発明のクローニング方法は、このようなＡＴリッチなＤＮＡ断片のクローニングにおいても有用である。
【００３８】
本発明のクローニング方法は、高い陽性クローン取得効率でＴＡクローニングを行うことができ、かつ挿入されるＤＮＡ断片の方向性を制御することが可能であるため、挿入断片のシークエンス解析を目的としたクローニングの場合においても正体不明のクローンを塩基配列解析することを防止でき、塩基配列解析にかかるコストを下げることができる。
【００３９】
本発明のベクターによりクローニングできるＤＮＡ（核酸断片）は特に限定はない。ポリペプチドコードする遺伝子、機能的ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）をコードする遺伝子やその断片の他、例えば、シス作用性塩基配列要素（プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子発現制御配列或いはその候補）であってもよい。また、機能が不明な核酸配列を標的核酸配列としてクローニングし、塩基配列解析することもできる。
【００４０】
（３）本発明のベクターの製造方法
本発明のベクターを製造する方法は、本発明のベクターの構造を構築できる製造方法であれば特に限定はない。突出する１残基のｄＴを両３´末端に有するベクターの作製方法にも特に限定はなく、ＸｃｍＩ、ＭｂｏＩＩ、ＨｐｈＩ、ＭｎｌＩ、ＡｈｄＩ、Ｅａｍ１１０５Ｉなどの３´末端に１塩基突出末端作製可能な制限酵素を用いて３´ｄＴ突出末端を作製する方法や、ＡｌｕＩ、ＤｐｎＩ、ＲｓａＩ、ＡｆｅＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨａｅＩＩＩ、ＰｍａＣＩなどの平滑末端を作製可能な制限酵素で処理した後、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、あるいはターミナルデオキシトランスフェラーゼのようなＤＮＡ断片の３´末端へ塩基を付加する活性を有する酵素を用いて、３´ｄＴ突出末端を作製する方法を利用できる。前記の制限酵素は、ベクターに搭載される薬剤耐性遺伝子をコードする核酸の配列に応じて選択すればよいが、適切な制限酵素が見出されない場合には、本発明のベクターの機能が失われない範囲で（例えばアミノ酸配列を変化させることなく）前記核酸の塩基配列を改変し、制限酵素切断部位を創成してもよい。
【００４１】
本発明を特に限定するものではないが、本発明のベクターの製造方法としては、配列表の配列番号：１９に記載の核酸配列を有する環状二本鎖ＤＮＡを制限酵素ＰｍａＣＩにより切断する工程、及びターミナルデオキシジルトランスフェラーゼ活性を有する酵素により、切断された二本鎖ＤＮＡの両３´末端に突出する１残基のデオキシチミジン又はウリジンを付加し、本発明のベクターを得る工程を含む製造方法が例示される。
【００４２】
ここで、以下にアンピシリン存在下で核酸断片が挿入されたクローンを選択的に取得できる本発明のベクターの製造方法の一態様を示す。
まず、予めβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有するベクターにβ−ラクタマーゼ遺伝子以外の薬剤耐性遺伝子（第二の薬剤耐性遺伝子）を導入する。導入には、制限酵素サイトを利用しても良いし、ＰＣＲのような核酸増幅方法を利用しても良い。次に導入後のベクターに存在するβ−ラクタマーゼ遺伝子のＣ末端Ｔｒｐ及びストップコドンに対応する部分を欠損させる。欠損方法としては、ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲ法が好適に利用できる。特に限定はされないが、前記ＰＣＲにおいてその５´末端側に制限酵素ＰｍａＣＩ認識部位が付加されたプライマー対を用いる方法が好適である。この増幅断片を制限酵素ＰｍａＣＩにより切断し、次いでライゲーションによる自己環化を行った後、宿主を形質転換し、前記の第二の薬剤耐性遺伝子をマーカーとして形質転換体を選択する。得られた形質転換体よりＣ末端のＴｒｐを欠損したβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有するベクターを保持するものを選択する。この形質転換体より調製したベクターを制限酵素ＰｍａＣＩにより再消化し、さらにＤＮＡポリメラーゼやターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによって両３´末端にｄＴを１残基突出付加させる。このようにして本発明のベクターを調製することができる。
【００４３】
（４）本発明のキット
本発明のキットは、本発明のベクター及びＤＮＡリガーゼを含む。前記のＤＮＡリガーゼとしては、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼが例示される。本発明のキットには、ＤＮＡリガーゼによる連結反応（ライゲーション反応）に適した組成の緩衝液がさらに含まれていてもよい。さらに、本発明のキットには、α型ＤＮＡポリメラーゼによってＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片の３´末端にｄＡを付加するための試薬類（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、あるいはターミナルデオキシトランスフェラーゼなど）が含まれていてもよい。
【００４４】
特に限定はされないが、好ましくは本発明のベクターと市販されているＤＮＡライゲーションキットを組合わせたキット、例えばＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（タカラバイオ社製）、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）、又はＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）などと組合わせたキットが例示される。
【００４５】
本発明のキットを用いることにより、最小限の労力と時間で、多数の未知遺伝子がクローニング可能である。特にバイサルファイト処理された核酸断片のようなＡＴリッチな核酸断片のクローニングキットとして有用である。
【実施例】
【００４６】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００４７】
また、本明細書に記載の操作のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本的な操作については２００１年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、Ｊ．サムブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編集、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．）に記載の方法によった。
【００４８】
実施例１  
（１）ベクターの構築
本発明のベクターは、以下の方法で構築した。まず、ｐＵＣ１９ベクター（タカラバイオ社製）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＰｖｕＩＩ（いずれもタカラバイオ社製）で消化した。続いて平滑末端化、及びＢＡＰ処理を行った。こうして得られたＤＮＡ断片は、常法により精製した。次に配列表の配列番号：５に記載の核酸配列のうち９９９番目の塩基から２１３番目の塩基までの核酸配列を有する二本鎖ＤＮＡを合成した。続いて、この二本鎖ＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩ及び制限酵素ＰｖｕＩＩで切断したｐＵＣ１９ＤＮＡに挿入した。こうして構築したプラスミドＤＮＡをｐＵＣ１９−Ｋａｎａ  ＤＮＡと命名した。
【００４９】
上記ｐＵＣ１９−Ｋａｎａ  ＤＮＡを鋳型としてｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行った。まず、配列表の配列番号：３、４に記載の塩基配列をそれぞれ有するＡＭＰ−Ｆプライマー、ＡＭＰ−Ｒプライマーを合成した。これらのプライマーは、その５´末端側に制限酵素ＰｍａＣＩサイトが生じるようにデザインされている。当該プライマー対を用いたＰＣＲは、以下の反応液組成で行った。即ち、２×ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  Ｍａｘ  プレミックスを５０μＬ、上記プライマーを２０ｐｍｏｌずつ、及び鋳型ＤＮＡを２ｎｇ含む計１００μＬである。また、ＰＣＲ条件は、９８℃  １０秒、（９８℃  １０秒、５５℃  ５秒、７２℃  ４０秒）を１サイクルとする３０サイクル反応とした。ＰＣＲ終了後、増幅産物を制限酵素ＤｐｎＩ（宝生物工程（大連）有限公司社製）で消化した。その後、制限酵素ＰｍａＣＩ（タカラバイオ社製）消化し、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてセルフライゲーションを行った。反応終了後、得られた環状ＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９（タカラバイオ社製）を形質転換した。得られた形質転換体を培養後、常法によりプラスミドを調製し、当該プラスミドをｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０と命名した。当該プラスミドは、Ｃ末端のトリプトファン（Ｎ末端から２９０番目のアミノ酸、対応する塩基配列はＴＣＧ）が欠損したβ−ラクタマーゼをコードする核酸配列を有する。当該Ｃ末端欠損β−ラクタマーゼは、β−ラクタマーゼ活性を実質的に有さない。
【００５０】
（２）アンピシリン感受性の確認
上記（１）で調製したプラスミドｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０について、アンピシリン感受性を確認した。即ち、５０μｇ／ｍＬ濃度のカナマイシンとそれぞれ０、２０、４０、６０、８０、１００μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリンとを含む計６種類のアガロースＬＢプレートを作成した。これらのプレートにプラスミドｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０で形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を播種し、３７℃で終夜培養後、コロニー数をカウントした。その結果、アンピシリン濃度が４０μｇ／ｍＬ以上になるとコロニー生育が認められなかった。このことから、プラスミドｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０で形質転換した大腸菌はアンピシリン感受性であることを確認した。
【００５１】
（３）プラスミドｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０のＴ−ベクター化
上記（２）でアンピシリン感受性を確認したプラスミドｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０についてＴ−ベクター化を行った。まず、プラスミドｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０を制限酵素ＰｍａＣＩで消化した後、アガロースゲル抜きによる精製を行った。次に、精製したＤＮＡ断片にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＴＴＰを加え、両３´末端に１塩基のデオキシチミジンを付加させた。こうして得られた直鎖状の二本鎖ＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡと命名した。当該二本鎖ＤＮＡは、配列表の配列番号：５に記載の核酸配列からなるＤＮＡ及び配列表の配列番号：１８に記載の核酸配列からなるＤＮＡにより構成される。
【００５２】
実施例２  実施例１で調製したｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡについて、いろいろな鎖長のＰＣＲ断片をＴＡクローニング法により挿入し、陽性クローン取得効率を検討した。
（１）５００ｂｐＰＣＲ断片の陽性クローン取得効率検討
配列表の配列番号：６、７に記載の塩基配列をそれぞれ有する５００ｂｐ−Ｆプライマー、５００ｂｐ−Ｒプライマーを合成した。次に、大腸菌ＪＭ１０９ゲノムＤＮＡを鋳型として、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、以下の反応液組成で行った。即ち、２×Ｅｘ  Ｔａｑ  プレミックス（タカラバイオ社製）を２５μＬ、上記プライマーを２０ｐｍｏｌずつ、及び鋳型ＤＮＡを５０ｎｇ含む計５０μＬである。また、ＰＣＲ条件は、９４℃  １分、（９８℃  １５秒、５９℃  ３０秒、７２℃  ３０秒）を１サイクルとする３０サイクルの反応の後、７２℃で５分保持する条件とした。反応後の増幅断片は、アガロースゲル抜きにより精製した。
【００５３】
精製後の増幅断片を５０ｎｇ、ｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡを５０ｎｇ、及びＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（タカラバイオ社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを５μＬ含む計１０μＬの反応液を１６℃で１時間保持した。対照として、ｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡの代わりにｐＭＤ１９−Ｔベクター（宝生物工程（大連）有限公司社製）を用いる以外は上記と同様の反応を実施した。次に、反応終了後の各反応液を用いて大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリンを含むＡＩＸプレートに播種した後、３７℃で一晩培養した。その結果形成したコロニーの一部について、配列表の配列番号：８に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号：９に記載の塩基配列からなるプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供した結果を図１及び図２に示す。
【００５４】
図１に示すように、本発明のベクターを用いた場合は３２クローン中３２クローン（陽性クローン取得効率１００％）に目的の挿入断片が確認された。一方図２に示すように、従来技術のＴ−ベクターを用いた場合は、３２クローン中２６クローン（陽性クローン取得効率８１％）に目的の挿入断片が確認された。このことから、本発明のベクターの陽性クローン取得効率が非常に高いことが実証された。
【００５５】
（２）１ｋｂｐＰＣＲ断片の陽性クローン取得効率検討
配列表の配列番号１０、１１に記載の塩基配列をそれぞれ有する１Ｋ−Ｆプライマー、１Ｋ−Ｒプライマーを合成した。大腸菌ＪＭ１０９ゲノムＤＮＡを鋳型として、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液組成およびＰＣＲ条件は、上記（１）と同様にして行った。反応後の増幅断片は、アガロースゲル抜きにより精製した。
【００５６】
精製後の増幅断片を５０ｎｇ、ｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡを５０ｎｇ及びＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（タカラバイオ社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを５μＬ含む計１０μＬの反応液を１６℃で１時間保持した。対照として、ｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡの代わりにｐＭＤ１９−Ｔベクターを用いる以外は上記と同様の反応を実施した。反応終了後、当該反応液を用いて大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体は、ＡＩＸプレートに播種後、３７℃で一晩培養した。生育した白色クローンについて配列表の配列番号：８に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号：９に記載の塩基配列からなるプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行った。その結果、本発明のベクターの陽性クローン取得効率１００％に対し、従来技術のＴ−ベクターでは、陽性クローン取得効率９０％であった。このことから、挿入断片が１ｋｂｐの場合でも本発明のベクターの陽性クローン取得効率が非常に高いことが実証された。
【００５７】
（３）２ｋｂｐＰＣＲ断片の陽性クローン取得効率検討
配列表の配列番号：１２、１３に記載の塩基配列をそれぞれ有する２Ｋ−Ｆプライマー、２Ｋ−Ｒプライマーを合成した。大腸菌ＪＭ１０９ゲノムＤＮＡを鋳型として、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液組成およびＰＣＲ条件は、上記（１）と同様にして行った。反応後増幅断片は、アガロースゲル抜きにより精製した。
【００５８】
精製後の増幅断片を２００ｎｇ、ｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡを５０ｎｇ及びＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（タカラバイオ社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを５μＬ含む計１０μＬの反応液を１６℃で１時間保持した。対照として、ｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡの代わりにｐＭＤ１９−Ｔベクターを用いる以外は上記と同様の反応を実施した。反応終了後、当該反応液を用いて大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体は、ＡＩＸプレートに播種後、３７℃で一晩培養した。生育した白色クローンについて配列表の配列番号：８に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号：９に記載の塩基配列からなるプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行った。その結果を図３及び図４に示す。
【００５９】
図３に示すように、本発明のベクターは１５クローン中１３クローン（陽性クローン取得効率８７％）に目的の挿入断片が確認された。一方図４に示すように、従来技術のＴ−ベクターでは、１５クローン中１０クローン（陽性クローン取得効率６７％）に目的の挿入断片が確認された。このことから、挿入断片が２ｋｂｐの場合でもやはり本発明のベクターの陽性クローン取得効率が非常に高いことが実証された。
【００６０】
実施例３
本発明のベクターと挿入断片の関係について検討した。本実施例においては、上記実施例２の（１）及び実施例２の（３）で調製した５００ｂｐのＰＣＲ増幅断片及び２ｋｂｐのＰＣＲ増幅断片を用いた。５００ｂｐ又は２ｋｂｐの増幅断片１００ｎｇに対し本発明のベクターを２５ｎｇ、５０ｎｇ、又は１００ｎｇ、及びＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（タカラバイオ社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを５μＬ含む計１０μＬの反応液を計６種類調製し、これらを１６℃で１時間保持した。形質転換及び培養条件は、実施例２の（１）と同様にして行った。その結果、５００ｂｐのＰＣＲ断片を挿入した場合、ベクター濃度に従って、取得クローン数が向上することが確認できた。一方、２ｋｂｐのＰＣＲ断片を挿入した場合、ベクター量が５０ｎｇの場合に最も取得クローン数が多いことが確認できた。
【００６１】
実施例４
Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理されたＤＮＡ断片は、ＧＣ含量がＡＴリッチに変化する。本実施例では、エピジェネティクスで多用されるＢｉｓｕｌｆｉｔｅ  ＰＣＲ法で得られたＡＴリッチな増幅断片のクローニングについて検討した。
【００６２】
配列表の配列番号：１４に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号：１５記載の塩基配列からなるプライマーを合成した。Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理したヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、以下の反応液組成で行った。即ち、２×Ｔａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  プレミックス（タカラバイオ社製）を５０μＬ、上記プライマーをそれぞれ２０ｐｍｏｌずつ、鋳型ＤＮＡを５０ｎｇ含む１００μＬ容量である。また、ＰＣＲ条件は、９５℃  ３０秒、（９５℃  ３０秒、５３℃  ３０秒、７２℃  ３０秒）を１サイクルとする３０サイクル反応とした。反応後、増幅断片はアガロースゲル抜きにより精製した。なお、当該増幅断片は、３７７ｂｐであり、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理したことによりＧＣ含量は３２％から２９％に低下していた。精製後の増幅断片を１００ｎｇ、ｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡを５０ｎｇ、及びＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（タカラバイオ社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを５μＬ含む計１０μＬの反応液を１６℃で１時間保持した。対照として、ｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡの代わりにｐＭＤ１９−Ｔベクターを用いる以外は上記と同様の反応を実施した。反応終了後、当該反応液を用いて大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体は、ＡＩＸプレートに播種後、３７℃で一晩培養した。生育した白色クローンについて配列表の配列番号：８に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号：９に記載の塩基配列からなるプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行った。その結果、本発明のベクターの陽性クローン取得効率８７．５％に対し、従来技術のＴ−ベクターでは、陽性クローン取得効率１２．５〜１８．７５％であった。このことから、ＡＴリッチな挿入断片の場合にも、本発明のベクターの陽性クローン取得効率が非常に高いことが実証された。
【００６３】
実施例５
配列表の配列番号：１６に記載の塩基配列を有する２ｋ-Ｒ１プライマーを合成した。大腸菌ＪＭ１０９ゲノムＤＮＡを鋳型とし、実施例２の２ｋ-Ｆプライマーと上記の２ｋ-Ｒ１プライマーとをプライマー対として用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液組成、反応条件は、実施例２記載の条件と同様にした。反応後、増幅断片はアガロースゲル抜きにより精製した。当該増幅断片は、２ｋｂｐである。精製後の増幅断片とｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡとを用いて、下記表１に記載の反応液Ｉの組成で１６℃、１時間のライゲーション反応を行った。対照として、ｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡの代わりにｐＭＤ１９−Ｔベクターを用いる以外は上記と同様の反応を実施した。
【００６４】
【表１】
2012143226.tif 000003
【００６５】
反応終了後、当該反応液を用いて大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体は、ＡＩＸプレートに播種後、３７℃で一晩培養した。生育した白色クローンについて常法でプラスミドを調製後、配列表の配列番号：８に記載の核酸配列からなるプライマーをシークエンスプライマーとしてシークエンシングを行った。本発明のベクターを用いた場合と対照の従来のＴ−ベクターを用いた場合についてそれぞれ１０個のコロニーよりプラスミドを取得し、その挿入断片の方向性を確認した。その結果、本発明のベクターを用いた場合には、すべてのプラスミドに所望の方向性でインサートが挿入されていた。これに対して従来技術のＴ−ベクターでは、所望の方向でインサートが挿入されていたプラスミドは、取得した全プラスミドのうち６０％であった。このことから、本発明のベクターは、挿入断片の方向制御性という面においても従来技術に比較して非常に効果が高いことが実証された。
【００６６】
実施例６
本発明のベクターに挿入するＤＮＡ断片の末端配列についてさらに検討した。
ｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡに種々のＤＮＡ断片を挿入してアンピシリン耐性クローンを取得し、得られたクローンが保持するプラスミドをシークエンス解析したところ、２９０番目のアミノ酸がフェニルアラニンとなったβ−ラクタマーゼも２９０番目のアミノ酸がトリプトファンのものと同様にアンピシリンに対する薬剤耐性を発揮することが明らかになった。
【００６７】
そこで、フェニルアラニンをコードする塩基配列を５´末端側に含む挿入断片を用いる方法について検討した。先ず、配列表の配列番号：２０に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号：２１記載の塩基配列からなるプライマーを合成した。同様にトリプトファンをコードする塩基配列を５´末端側に含む配列表の配列番号：２２に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号：２３記載の塩基配列からなるプライマーを合成した。大腸菌ＪＭ１０９株ゲノムＤＮＡを鋳型として、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、以下の反応液組成で行った。即ち、２×Ｅｘ  Ｔａｑ  プレミックス（タカラバイオ社製）を２５μＬ、上記プライマーを２０ｐｍｏｌずつ、及び鋳型ＤＮＡを５０ｎｇ含む計５０μＬである。また、ＰＣＲ条件は、９４℃  １分、（９８℃  １５秒、５９℃  ３０秒、７２℃  ３０秒）を１サイクルとする３０サイクルの反応の後、７２℃で５分保持する条件とした。反応後の増幅断片は、アガロースゲル抜きにより精製した。
【００６８】
精製後の増幅断片を５０ｎｇ、ｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡを５０ｎｇ、及びＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（タカラバイオ社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを５μＬ含む計１０μＬの反応液を１６℃で０．５時間保持した。また、ライゲーションに用いる試薬としてＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１の代わりにＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いた反応も当該製品の標準のプロトコルに従って実施した。さらに対照として、ｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡの代わりにｐＭＤ１９−Ｔベクター（宝生物工程（大連）有限公司社製）を用いる以外は上記と同様の反応を実施した。次に、反応終了後の各反応液を用いて大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリンを含むＡＩＸプレートに播種した後、３７℃で一晩培養した。培養後取得したコロニーの一部について、配列表の配列番号：８に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号：９に記載の塩基配列からなるプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供した。
【００６９】
その結果、フェニルアラニンをコードする塩基配列を５´末端側に含む挿入断片を用いた方法は、トリプトファンをコードする塩基配列を５´末端側に含む挿入断片を用いた場合に比べて、１．５倍多いコロニーを取得することができた。また、本発明のベクター、フェニルアラニンをコードする塩基配列を５´末端側に含む挿入断片及びＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞を組み合わせた場合は、トリプトファンをコードする塩基配列を５´末端側に含む挿入断片を用いた場合に比べて、３倍多いコロニーを得ることができた。なお、ｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡを用いた反応により得られたクローンについて陽性クローン取得効率を調べたところ、いずれの条件においても１００％の陽性クローン取得率であった。一方、対照となるｐＭＤ１９−Ｔベクターを用いた場合は、得られた陽性のコロニー（白色のコロニー）の数は多かったものの、陽性クローン取得効率は３３〜５０％であった。このことから、本発明のベクターにフェニルアラニンをコードする塩基配列を５´末端側に有するＤＮＡ断片を挿入する方法は、本発明の方法の好適な態様の一つであることが分かった。
【００７０】
実施例７
実施例６では、フェニルアラニンをコードする塩基配列を両方の５´末端側に付加させた挿入断片の使用が好適であることが確認できた。本実施例では、片方の５´末端側にフェニルアラニンをコードする塩基配列を付加させた挿入断片について検討した。即ち、フェニルアラニンをコードする塩基配列を５´末端側に含む配列表の配列番号：２０に記載の塩基配列からなるプライマー及び５´末端側に付加配列を有さない配列表の配列番号：２４記載の塩基配列からなるプライマーを合成した。また、トリプトファンをコードする塩基配列を５´末端側に含む配列表の配列番号：２２に記載の塩基配列からなるプライマーを合成した。大腸菌ＪＭ１０９株ゲノムＤＮＡを鋳型として、配列表の配列番号：２０に記載の塩基配列からなるプライマーと配列表の配列番号：２４記載の塩基配列からなるプライマーとを用いたＰＣＲ、及び配列表の配列番号：２３に記載の塩基配列からなるプライマーと配列表の配列番号：２４記載の塩基配列からなるプライマーとを用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、以下の反応液組成で行った。即ち、２×Ｅｘ  Ｔａｑ  プレミックス（タカラバイオ社製）を２５μＬ、上記プライマーを２０ｐｍｏｌずつ、及び鋳型ＤＮＡを５０ｎｇ含む計５０μＬである。また、ＰＣＲ条件は、９４℃  １分、（９８℃  １５秒、５９℃  ３０秒、７２℃  ３０秒）を１サイクルとする３０サイクルの反応の後、７２℃で５分保持する条件とした。反応後の増幅断片は、アガロースゲル抜きにより精製した。
【００７１】
精製後の増幅断片を５０ｎｇ、ｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡを５０ｎｇ、及びＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を５μＬ含む計１０μＬの反応液を１６℃で０．５時間保持した。対照として、ｐＵＣ１９−ｂｌａ  ΔＷ２９０−Ｔ  ＤＮＡの代わりにｐＭＤ１９−Ｔベクター（宝生物工程（大連）有限公司社製）を用いる以外は上記と同様の反応及び培養を実施した。培養後得られたコロニーの一部について、配列表の配列番号：８に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号：９に記載の塩基配列からなるプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供した。
【００７２】
その結果、片方の５´末端側にトリプトファンをコードする塩基配列を有する挿入断片を用いた場合と、片方の５´末端側にフェニルアラニンをコードする塩基配列を有する挿入断片を用いた場合では、得られたコロニー数はほぼ同等で、いずれの場合も１００％の陽性クローン取得率であった。対照となるｐＭＤ１９−Ｔベクターの場合は、得られた陽性のコロニー（白色のコロニー）の数は多かったものの、陽性クローン取得効率は４０％であった。このことから、本発明のベクターにフェニルアラニンをコードする配列を片方の５´末端に有するＤＮＡ断片を挿入する方法は、本発明の方法の好適な態様の一つであることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明のベクターを用いることにより、簡便な操作で目的の遺伝子が所望の方向で挿入されたクローンを選択することが可能となる。従って本発明は、遺伝子工学的分野、応用生命科学的分野、及び医学的分野等において特に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００７４】
SEQ ID NO:1 ; Designed oligonucleotide primer as Kana-F.
SEQ ID NO:2 ; Designed oligonucleotide primer as Kana-R.
SEQ ID NO:3 ; Designed oligonucleotide primer as AMP-F.
SEQ ID NO:4 ; Designed oligonucleotide primer as AMP-R.
SEQ ID NO:5 ; Plus-strand sequence of pUC19-bla deltaW290-T.
SEQ ID NO:6 ; Designed oligonucleotide primer as 500bp-F.
SEQ ID NO:7 ; Designed oligonucleotide primer as 500bp-R.
SEQ ID NO:8 ; Designed oligonucleotide primer for colony PCR.
SEQ ID NO:9 ; Designed oligonucleotide primer for colony PCR.
SEQ ID NO:10 ; Designed oligonucleotide primer as 1k-F.
SEQ ID NO:11 ; Designed oligonucleotide primer as 1k-R.
SEQ ID NO:12 ; Designed oligonucleotide primer as 2k-F.
SEQ ID NO:13 ; Designed oligonucleotide primer as 2k-R.
SEQ ID NO:14 ; Designed oligonucleotide primer to amplify a bisulfite-treated human genomic DNA.
SEQ ID NO:15 ; Designed oligonucleotide primer to amplify a bisulfite-treated human genomic DNA.
SEQ ID NO:16 ; Designed oligonucleotide primer as 2k-R1.
SEQ ID NO:17 ; Gene encoding a inactive mutant of beta-lactamase.
SEQ ID NO:18 ; Minus-strand sequence of pUC19-bla deltaW290-T.
SEQ ID NO:19 ; Nucleic acid sequence of plasmid pUC19-bla deltaW290.
SEQ ID NO:20 ; Designed oligonucleotide primer which contains a DNA sequence encoding phenylalanine in the 5'end region.
SEQ ID NO:21 ; Designed oligonucleotide primer which contains a DNA sequence encoding phenylalanine in the 5'end region.
SEQ ID NO:22 ; Designed oligonucleotide primer which contains a DNA sequence encoding tryptophane in the 5'end region.
SEQ ID NO:23 ; Designed oligonucleotide primer which contains a DNA sequence encoding tryptophane in the 5'end region.
SEQ ID NO:24 ; Designed oligonucleotide primer to amplify a DNA sequence derived from E.coli genomic DNA.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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