(57)【要約】【課題】酸性ムコ多糖類を有効成分とする免疫賦活剤の提供。【解決手段】糖構成分が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトロン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−ガラクトース、ピルビン酸、Ｄ−アラニンからなり、ゲルろ過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万である酸性ムコ多糖類又はその生理学的に許容される塩若しくは誘導体を有効成分として含む免疫賦活剤。一酸化窒素（ＮＯ）産生誘導活性、ＴＮＦ-α産生誘導活性、ＩＬ−１２産生誘導活性、及びＩＮＦ-γ産生誘導活性を有する。【選択図】    図１
2012031089.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖構成成分が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトロン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−ガラクトース、ピルビン酸、Ｄ−アラニンからなり、ゲルろ過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万である酸性ムコ多糖類又はその生理学的に許容される塩若しくは誘導体を有効成分として含むことを特徴とする免疫賦活剤。
【請求項２】
上記酸性ムコ多糖類又はその生理学的に許容される塩若しくは誘導体の糖構成成分のモル比が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：Ｄ−ガラクトロン酸：Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：Ｄ−ガラクトース：ピルビン酸：Ｄ−アラニン＝（１．０〜１．２）：（１．６〜１．８）：（２．４〜２．６）：１：（１．２〜１．４）：（１．１〜１．３）であることを特徴とする請求項１に記載の免疫賦活剤。
【請求項３】
上記酸性ムコ多糖類が、コベティア属微生物由来の多糖類であることを特徴とする請求項１又は２に記載の免疫賦活剤。
【請求項４】
上記コベティア属微生物が、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２９５の微生物であることを特徴とする請求項３記載の免疫賦活剤。
【請求項５】
一酸化窒素（ＮＯ）産生誘導活性、ＴＮＦ-α産生誘導活性、ＩＬ−１２産生誘導活性、及びＩＮＦ-γ産生誘導活性から選ばれた少なくともいずれかの作用を有することを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の免疫賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海洋細菌の産生する酸性ムコ多糖類を有効成分として含む免疫賦活剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫機構には多くの種類の細胞が関与しているが、特に白血球の役割は大きく、中でもマクロファージは免疫応答の初期段階での働きを含め、あらゆる段階に関与している重要な白血球の一種である。近年、白血球の働きが物質レベルで解明されてきており、白血球の機能や細胞間相互作用は、白血球が分泌する微量タンパク質（サイトカイン）によって担われることが分かってきている。
【０００３】
マクロファージは元来貪食旺盛な細胞と定義されているが、単なる原始的食細胞にとどまらず、活性化することによりがん細胞に対する傷害性の獲得や各種サイトカイン類の放出によるリンパ球の活性化に関与する等深く免疫系に関与していることが明らかになってきた。マクロファージは一酸化窒素(ＮＯ)を産生する。一酸化窒素(ＮＯ)は、免疫系に重要な働きを担っており、ＮＯはヘルパーＴ細胞の賦活化や、サイトカインの合成促進などの作用を介して免疫力を増加させる方向に働く。したがって、ＮＯの産生促進は、免疫賦活の指標の一つとされており、従来より核酸、生薬抽出物、リポポリサッカライド、その他の多糖類等様々なマクロファージを活性化する物質が提案されている。例えば、核酸組成物(特許文献１)、海藻抽出物由来組成物(特許文献２)、乳酸菌製剤(特許文献３)、多糖類(特許文献４)などがあげられる。
【０００４】
サイトカインには多くの種類があり、中でも、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）に代表される炎症性サイトカインは、主にマクロファージから放出される。ＴＮＦ−αの産生促進は免疫賦活の指標の一つとされており、腫瘍に対する免疫作用の強化や、直接的な抗腫瘍効果、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞とのバランス改善によるとされるアレルギー性疾患の改善効果や免疫賦活作用などが知られている（特許文献５）。
【０００５】
ＩＬ−１２はナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)を活性化する作用を有するサイトカインとして発見され、細胞性免疫活性の増加、マクロファージの活性化、ＩｇＥ産生抑制などの活性が確認されている(非特許文献１)。このためアレルギー、がん、ウイルス病等の治療薬としての応用が期待されている。また、ＩＬ−１２はＮＫ細胞やＮＫＴ細胞などの活性化による抗腫瘍性の発現に重要であり、がんを攻撃するキラーＴ細胞を強力に活性化し、細胞性免疫力を増強するＩＮＦ-γの産生や働きを活性化する。一方、ＩＬ−１２は生体の免疫バランス（Ｔｈ１／Ｔｈ２）をＴｈ１側に誘導する作用を有することでアレルギーや自己免疫疾患の発症を抑制する効果があると期待されている。このようなＩＬ−１２産生促進作用を有するものとしては、従来、例えば、酸性ムコ多糖類（特許文献４）、マクロファージ活性化及びインターロイキン１２の産生を誘導するコンドロシン（特許文献６）が知られている。
【０００６】
インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）は活性化されたＴ細胞で産生され、免疫系に対して調節作用を有するサイトカインである。ＩＦＮ−γは、また、マクロファージを刺激して細菌を貪食殺菌させる作用がある。ＩＦＮ−γの産生促進は、免疫賦活の指標の一つとされており、このようなＩＦＮ−γ産生促進作用を有するものとしては、従来、例えば、乳酸菌産生多糖（特許文献７）等が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−３１４１７２号公報
【特許文献２】特開２００２−１９３８２８号公報
【特許文献３】特開平１０−１６７９７２号公報
【特許文献４】特開２００６−１６３３６号公報
【特許文献５】特開２００７−１３１５６８号公報
【特許文献６】特開２００６−５２１８８号公報
【特許文献７】特開２００９−２５６３１２号公報
【特許文献８】特開２００９−３４０９４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Allergy Clin. Immunol.107, 9-18, 2001
【非特許文献２】オカザキ(K.Okazaki)ら：香川大学農学部学術報告, 61，39-45(2009)
【非特許文献３】VALIDATION LIST No 88.Int.J.Syst.Evol.Microbiol., 52, 1915-1916, 2002
【非特許文献４】DR. Arahalら： System.Appl. Microbiol., 25, 207-211, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前記した以外にも、多くの天然物について免疫賦活作用が研究され、効果が認められたいくつかの素材や抽出物が、健康食品等の原料として既に実用化されている。しかしながら、これらの中には  例えば、特許文献１にかかる発明にあっては、成分の種類や配合比率などが特定されておらず、また特許文献２にかかる発明にあっては、ネオアガロオリゴ糖とその脱硫化された中性糖を主体とし、それ以外にもより重合度の高い不消化物性多糖類、レクチン、核酸、灰分等を含有するものであった。さらに特許文献３にかかる発明にあっては、乳酸菌の菌体又はその処理物から成っていた。また、特許文献５に係る発明にあってはコショウ科植物成分を含有する免疫賦活性飲食物であり、特許文献７に係る発明にあっては、乳酸菌から産生された多糖類からなる免疫調節用組成物であった。すなわち、これらの文献にかかるいずれの発明も活性本体の特定がなされておらず、このままでは安全性や効力の面での検討が不十分であり実際上食品や医薬品としての応用が困難であった。そのため安全性と効力を兼ね備える免疫賦活剤の提供は、未だ求められているのが現状である。
また、特許文献４及び６に係る発明にあっては、特定の糖構造を有する糖鎖による免疫賦活剤ではあるが、免疫賦活活性作用が限定されていたので、さらに広範囲に有用で、安全な免疫賦活剤が求められていた。本発明はこれらの要望を満足する酸性ムコ多糖類からなる免疫賦活剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、特定の種類の糖からなる酸性ムコ糖類を有効成分とする免疫賦活剤からなり、海洋細菌が産生する酸性ムコ多糖類又はその生理学的に許容される塩もしくは誘導体を有効成分として含有する以下に記載の免疫賦活剤に関する。
【００１１】
（１）糖構成分が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトロン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−ガラクトース、ピルビン酸、Ｄ−アラニンからなり、ゲルろ過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万である酸性ムコ多糖類又はその生理学的に許容される塩若しくは誘導体を有効成分として含むことを特徴とする免疫賦活剤。
（２）上記酸性ムコ多糖類又はその生理学的に許容される塩若しくは誘導体の糖構成成分のモル比が、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：Ｄ−ガラクトロン酸：Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：Ｄ−ガラクトース：ピルビン酸：Ｄ−アラニン＝（１．０〜１．２）：（１．６〜１．８）：（２．４〜２．６）：１：（１．２〜１．４）：（１．１〜１．３）であることを特徴とする上記（１）に記載の免疫賦活剤。
（３）上記酸性ムコ多糖類が、コベティア属微生物由来の多糖類であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の免疫賦活剤。
（４）上記コベティア属微生物が、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２９５の微生物であることを特徴とする上記（３）記載の免疫賦活剤。
（５）一酸化窒素（ＮＯ）産生誘導活性、ＴＮＦ-α産生誘導活性、ＩＬ−１２産生誘導活性、及びＩＮＦ-γ産生誘導活性から選ばれた少なくともいずれかの作用を有することを特徴とする上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の免疫賦活剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、安全性と効力を兼ね備える免疫賦活剤が提供される。
また、ＮＯの産生、ＴＮＦ−αの産生、ＩＬ−１２の産生及びＩＦＮ−γの産生、を誘導する新たな手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の免疫賦活剤によるマクロファージのＮＯ産生誘導促進効果を示す図である。
【図２】本発明の免疫賦活剤によるマクロファージのＴＮＦ−α産生誘導促進効果を示す図である。
【図３】本発明の免疫賦活剤によるマクロファージのＩＬ−１２産生誘導促進効果を示す図である。
【図４】本発明の免疫賦活剤による脾臓細胞のＩＬ−１２産生誘導促進効果を示す図である。
【図５】本発明の免疫賦活剤による脾臓細胞のＩＮＦ−γ産生誘導促進効果を示す図である。
【図６】本発明の免疫賦活剤による脾臓細胞のＴＮＦ−α産生誘導促進効果を示す図である
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
［免疫賦活化剤］
本発明者等は、優れた免疫賦活効果を有する物質を見出すべく、マウス由来マクロファージ様細胞株及びマウス脾臓細胞を用いて検索した。その結果、海洋細菌が産生する酸性ムコ多糖類が、マクロファージ及び脾臓細胞の免疫機能性促進作用を有することを知見した。また、上記酸性ムコ多糖類は、細胞毒性が極めて弱く、免疫賦活化剤として極めて有効であることを見出した。即ち、本発明は、上記知見に基づいて完成されたものであり、海洋細菌が産生する酸性ムコ多糖類を有効成分として含有する免疫賦活剤に関する。
【００１５】
かかる酸性ムコ多糖類としては、海洋細菌コベチア・エスピー  P-21295(Cobetia  sp. P-21295)菌株又はその変異株の培養物より分離精製された酸性ムコ多糖類を用いることが好ましい（非特許文献２）。本酸性ムコ多糖類は、すでに公知の物質であり（非特許文献２、特許文献８参照）。また、本酸性ムコ多糖類は、メラニン培養細胞のメラニン生成抑制効果を有することが知られているが、これをＮＯ及びサイトカイン類の誘導活性剤等の免疫賦活剤として使用したという報告は、現在までに全く知られていないものである。
【００１６】
本酸性ムコ多糖類は、ＮＯ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、及びＩＦＮ−γ、の産生の誘導を促進することができることから、免疫賦活効果が期待される医薬分野、健康食品分野及び化粧品分野に有用な素材を提供することができる。特に花粉症やアトピー性皮膚炎などのアレルギーやリウマチなどの自己免疫疾患及びがんの予防又は治療に有効である。また、本酸性ムコ多糖類は、免疫賦活活性として、例えばマクロファージ活性化作用に伴う腫瘍壊死因子(ＴＮＦ-α)の誘導能を有する。この活性は、本酸性ムコ多糖類が免疫系を介して抗腫瘍性を有することを示唆するものである。
【００１７】
［免疫賦活組成物］
上記多糖類を免疫賦活組成物として用いる場合、有効成分である本酸性ムコ多糖類と医薬品又は食品に一般に用いられている各種成分、例えば、油分、保湿剤、防腐剤、殺菌剤、色剤、粉末、香料、増粘剤、緩衝剤などを、その剤形にあわせ、本発明の効果を損なわない範囲で適宜配合することにより調製される。また、上記免疫賦活組成物に、本酸性ムコ多糖類を配合するに当たっては、これら化合物のＩＮＦ−γ誘導作用及びＩＬ−１２産生誘導作用等を考慮することが好ましく、一般にはこれら化合物を有効成分として少なくとも０．００１重量％以上、好ましくは０.０１〜２０．０重量％程度添加すればよい。必ずしも有効成分を単離して使用する必要はなく、必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、本発明の化合物を含む粗精製物を使用することができる。免疫賦活組成物の剤型は任意であり、例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒剤、ドリンク剤等の可溶化系、乳液又はクリーム等の乳化系、あるいは軟膏又は分散液などの剤型をとることができる。
上記免疫賦活剤は、優れた免疫賦活効果を示すと共に、安定性及び高い安全性を併せ持つ。例えば、がん、ウイルス病、アトピー性皮膚炎等の発生を防ぐことができる。また、既に発症しているがん、ウイルス病、アトピー性皮膚炎等の治療に使用できる。
【００１８】
［有効成分］
本発明で用いられる酸性ムコ多糖類は、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。本酸性ムコ多糖類の調製方法としては、各種の方法が知られている。例えば、海洋微生物を炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを含有する海水又は人工海水で調製した培地で培養して多糖類を生産し、採取、精製して得ることができる（非特許文献２）。より具体的には、例えば、炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを含有する多糖類生産用海水培地においてコベチア・エスピー  P-21295(Cobetia  sp. P-21295)菌株又はその変異株を培養し、培養液中から本酸性ムコ多糖類を分離、精製して得ることができる。前記した培地と微生物を用いて従来法を用いて微生物を培養することにより、本発明の有効成分である本多糖が効率的に生産されることとなる。
【００１９】
本発明の免疫賦活剤として用いられる多糖類は、構成糖のモル比がＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：Ｄ−ガラクトロン酸：Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：Ｄ−ガラクトース：ピルビン酸：Ｄ−アラニン＝（１．０〜１．２）：（１．６〜１．８）：（２．４〜２．６）：１：（１．２〜１．４）：（１．１〜１．３)の範囲にあり、ゲルろ過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万であることが好ましい。構成成分の分析には、セルロースアセテート膜電気泳動、高速液体クロマトグラフィー又はアミノ酸自動分析装置を用いることができる。この構成成分の分析には、多糖類を２Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、又は４Ｎ−ＨＣｌで１００℃、１２時間加水分解し、ロータリーエバポレイターでＴＦＡ又はＨＣｌを除いたものを検体とし、各種標品との比較によって中性糖、ウロン酸、有機酸、アミノ糖又はアミノ酸の分析を行う。構成有機酸の分析にはこの他に酵素法又はNMR分析装置を用いて解析することができる。
【００２０】
本多糖類の分子量の測定は、ゲルろ過クロマトグラフィー法を用いることができる。具体的には、Ａｓａｈｉｐａｋ  ＧＦＡ−７Ｍ（昭和電工製）をカラムとする高速液体クロマトグラフィー（島津製）を使用し、０．１Ｍ−ＮａＣｌを移動相とし、分子量既知のプルラン（Shodex STANDARD KIT P-82、昭和電工製）を標準サンプルとして作成した分子量保持時間標準曲線を使用して測定することができる。
【００２１】
本多糖類はカルバゾール硫酸法で陽性を示し、ウロン酸の存在が推測される。また上記の条件で加水分解した検体はエルソン−モルガン法で陽性を示すことからヘキソサミンが含まれていると判断できる。また塩の存在下において第４級アンモニウム塩により沈殿を生じることからも、本発明の多糖類は酸性多糖であると認められる。
【００２２】
［酸性ムコ多糖類産生菌］
本酸性ムコ多糖類産生菌は、瀬戸内海で採取した海水をスクリーニング源として窒素源、炭素源および海水で調製し、寒天で固めた寒天平板培地で、２２〜２８℃にて２日〜７日間培養し、生育した粘稠性を示すコロニーを釣菌して純粋分離して得た。この菌株を上記と同じ組成の液体培地で振とう培養し、多糖類を産生することを確認して選別した。多糖類の免疫賦活作用を調べ、本菌株（FERM P-21295）がその目的に適った性質を有することを知見し、選別した。
得られた本菌株の16S rDNA塩基配列、さらには培養学的および生化学的特性を調べることにより、該菌株の同定を試み、コベティア(Cobetia)属に属する微生物であることを明らかにした。次いで本規菌株の培養物を分析し、本酸性ムコ多糖類が産生されていることを確認した。前記した培地と微生物を用いて従来法を用いて微生物を培養することにより本多糖が効率的に生産される。
【００２３】
［微生物の菌学的性質］
コベティア（Cobetia）属に属し寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２９５として寄託されている微生物株は、本多糖類を産生する能力があり、瀬戸内海の海水より本発明者らによって純粋分離されたものである。
次にこの微生物株の菌学的性質について述べる。本微生物は、コベティア（Cobetia）属に属し、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２９５として寄託されている微生物であり、以下の菌学的性質を有する。
＜形態＞
細胞の形態：桿菌
運動性：無し
胞子形成：無し
＜生育状態＞
コロニーの形態：円形
コロニーの色調：クリーム色
コロニーの表面：スムーズ
生育温度：１０℃、３７℃及び４５℃で生育する。
生育ｐＨ：５.５〜９.５（至適生育ｐＨ：６．５〜７．５）
酸素要求性：好気性
【００２４】
＜生理学的性質＞
グラム染色性：陰性
カタラーゼ反応：陽性
オキシダーゼ反応：陰性
O／Fテスト(酸化／発酵) ：陰性／陰性
β−ガラクトシダーゼ活性：陰性
インドール産生：陰性
硝酸塩還元：陰性
でんぷん加水分解：陰性
ゼラチン加水分解：陰性
エスクリン加水分解：陰性
ウレアーゼ：陰性
アルギニンジヒドロラーゼ：陰性
資化性 （Ｄ-グルコース、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、こはく酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、Ｌ-アラニン）：有り
資化性 （Ｌ-アラビノース、マルトース、ラクトース、サッカロース、D-マンノース、D-マンニトール、Ｎ-アセチル-D-グルコサミン、ｎ-カプリン酸、アジピン酸、ｄｌ-リンゴ酸、酢酸フェニル、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-セリン）：無し
本微生物は、16S rDNA塩基配列がCobetia marina DSM 4741のそれと99.4%の相同率を有し、かつ100%は一致しない塩基配列を有する。
【００２５】
本微生物は、コベティア(Cobetia)属微生物に適した培養条件での培養にて培養物を得、次に培養物から多糖を分離することにより回収可能なコベティア(Cobetia)属微生物である。より詳細には、Cobetia marina DSM 4741(非特許文献３、４)と99.4%の相同な16S rDNA塩基配列を有し、かつ、100%の相同率は有しない微生物であり免疫賦活作用を有する本多糖類を産生する微生物である。
【００２６】
なお、Cobetia marina DSM4741株は、Cobetia marina の標準株として位置付けられている。寄託番号と公の寄託先は、下記のとおりである。
１． ATCC253741(American Type Culture Collection, Manassas, VA. USA)
２．DSM4741(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Braunschweig, Germany)
３．  NCIMB1877(National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, UK)
コベティア(Cobetia)属の微生物は、海洋微生物であり海洋資源開発の進展の中で興味が持たれているものの一つであり、DSM4741株は、Arahalら(非特許文献４)によって命名され、承認されているものである(非特許文献３)。
本微生物は、コベティア(Cobetia)属に属することが、16S rDNA塩基配列分析などの分類学的調査を通じて決定されたことより、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター(〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６)に寄託し、平成１9年5月2日、寄託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２９５として受託された。
【００２７】
（酸性ムコ多糖類の製造方法）
酸性ムコ多糖類の製造方には、（ア）コベティア（Cobetia）属に属し寄託番号FERM P-21295として寄託されている微生物を培地中で培養し多糖類を産生させて培養物を得る工程と、（イ）培養物から多糖類を単離する工程と、を含む。以下詳細に説明する。
【００２８】
（ア）微生物を培養し多糖類を産生する工程
多糖類を得るためには、本微生物（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２９５）又はその変異株を用いる。微生物として本菌株又はその変異株を用いることで、多糖類を効率的に生産することができる。液体培養は静置、振とう(攪拌)、通気培養法、および固形培養には寒天平板法を用いることができる。
基本培地としては、多糖類を産生しうる微生物が生育できるものであって、少なくとも炭素源と、窒素源と、各種無機塩とおよび微量元素とを適量含有するものが用いられる。さらに好ましくは、上記基本培地として、コベティア(Cobetia)属に属する微生物が生育できるものが用いられる。炭素源としては、グルコース等の糖、あるいは糖蜜や廃糖蜜が挙げられる。炭素源として１種又は２種以上を単独で又は組み合わせて用いることができる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩等の化合物やペプトン、酵母エキス、アミノ酸などの天然物が挙げられる。窒素源として１種又は２種以上を単独で又は組み合わせて用いることができる。無機塩としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩等が挙げられる。無機塩として１種又は２種以上を単独で又は組み合わせて用いることができる。固体培地の場合は寒天を用いる。
【００２９】
培養条件は使用する培地、培地のｐＨ、培地への添加物、培養温度などは通常微生物の培養の際に用いられている条件をそのまま用いることができる。培養時のｐＨは微生物が生育し、かつ多糖類を生産する範囲（ｐＨ５.５〜９.５）であれば制限されないが、通常は６．５から７．５の範囲のｐＨが好ましい。培養温度については微生物が生育し、かつ多糖類を産生する範囲であれば制限されないが、２２℃から２８℃の範囲が多糖類の産生には良好である。培養期間は培養のｐＨや温度により変化するが、通常２日から７日が適切である。
【００３０】
コベティア（Cobetia）属に属し寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２９５として寄託されている微生物を、炭素源、窒素源および鉱物塩を含む培養培地で静置、振とう(又は撹拌)、又は通気条件で２２℃から２８℃の範囲で２日から７日間培養することが好ましい。
【００３１】
上記した培地と本微生物を用いて微生物を培養することにより、目的とする多糖類が効率的に産生されることとなる。上記により得られた多糖画分は、糖分析反応(フェノール硫酸法、カルバゾール硫酸法など)および加水分解後HPLC分析によりアミノ糖、アミノ酸又は有機酸を分析することができる。さらに、以下に説明する抽出・回収工程を経ることにより高純度の多糖類を高収率で得ることが可能となる。
【００３２】
（イ）産生された多糖類を分離・回収する工程
上記製造方法で得られた培養物から多糖類を抽出する方法としては、多糖類の分離回収に用いられる種々の方法を用いることができる。例えば、液体培養の場合は培養物をそのまま、あるいは高温で殺菌した後で、遠心分離により菌体を除去し、これをそのまま、あるいは濃縮してから、２〜３倍量のエタノール、イソプロパノール、あるいはアセトン等を加え、沈殿を生じさせる。この沈殿物を再度、水あるいは１〜１５重量％塩化ナトリウム溶液に溶解させた後で、アルコール等による沈殿を２〜３回繰り返し、水で透析を行い、噴霧乾燥や凍結乾燥機等を用いて乾燥させることにより、多糖類を得る。これ以外にも電気透析法や限外濾過法も利用することができる。さらに精製するためには、イオン交換、ゲル濾過等の各種クロマトグラフィーや塩析および活性炭処理法などを用いることができる。
【００３３】
以上の工程により多糖類が産生および回収される。本実施形態により得られる多糖類は特に制限なく種々の用途に使用されうるものであるが、本多糖類には本明細書に記載のとおり免疫賦活効果のあることから、健康食品分野および医薬分野、及び化粧品分野に有用な素材を提供することができる。
【００３４】
多糖類の調製方法としては、各種の方法が使用され得るが、用途の制限を受けないという観点からは、医薬として使用できる程度に精製し得るものが好ましい。例えば、本菌株を炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを含有する海水又は人工海水を寒天で固めた培地又は寒天を加えない液体培地で培養して多糖類を生産し、採取、精製して得ることができる。より具体的には、例えば、液体培養では、炭素源として蔗糖、窒素源としてペプトン、酵母エキスを含有する多糖類産生用海水培地において本菌株又はその変異株を培養し、培養液から多糖類を分離、精製して得ることができる。
【００３５】
［製造例１］
ペプトン０．５％、酵母エキス０．１％、蔗糖３％の組成を有し海水で調製した培地を、温度１２１℃としたオートクレーブ中で１５分間滅菌し、本菌株(FERM P-21295)の斜面培養から、1白金耳を試験管中の上記滅菌培地(１０ｍｌ)に接種し、２５℃の温度で２４時間静置培養を行い、次いでこの前培養液を５００ｍｌ容の三角フラスコ中に上記組成の培地２００ｍｌ(１２１℃、１５分間滅菌)に接種し、２５℃の温度で３日間の静置培養を行った。培養後培養液を遠心分離した後濾過助剤(ラジオライト#500)を用いて濾過し、菌体を除いた上澄液にエタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後再度エタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後透析し、活性炭処理し、凍結乾燥により多糖画分を得た。
尚、実用的な精製レベルとしては、培養濾過液から分子量５万カットの中空糸ＵＦ膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を短時間のうちに濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。膜濾過装置は東洋紡エンジニアリング社製SYLS-SB04型を用いた。
【００３６】
本多糖を２Ｍのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、又は４Ｎ−ＨＣｌで１００℃、１２時間加水分解し、ロータリーエバポレイターでＴＦＡ又はＨＣｌを除いたものを検体とし、構成成分の分析を行った。その結果、本多糖類は、セルロースアセテート膜電気泳動、高速液体クロマトグラフィー又はアミノ酸自動分析法でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトロン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、D−ガラクトース、ピルビン酸、Ｄ−アラニンが構成成分として認められ、それらのモル比がＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：Ｄ−ガラクトロン酸：Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：Ｄ−ガラクトース：ピルビン酸：Ｄ−アラニンが（１．０〜１．２）：（１．６〜１．８）：（２．４〜２．６）：１：（１．２〜１．４）：（１．１〜１．３)の範囲にあり、ピルビン酸は酵素法においても同様な結果が得られた。またＧＦＡ−７Ｍ（昭和電工製）をカラムによるゲルろ過クロマトグラフィーで測定した平均分子量がプルランを標準として１００万〜１５０万であることが認められた。この結果から本多糖類は公知の酸性ムコ多糖類であると同定された。
【００３７】
［製造例２］
前培養までは製造例１と同様に処理し、次いでこの前培養液を５００ｍｌ容の三角フラスコ中に上記組成を有する海水から調製した滅菌培地２００ml(１２１℃、１５分間)に接種し、２５℃の温度で３日間振とう培養を行った。次いで培養液を遠心分離した後濾過助剤(ラジオライト#500)を用いて濾過し、上澄液にエタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後再度エタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後透析し、活性炭処理し、凍結乾燥により多糖画分を得た。尚、実用的な精製レベルとしては、培養濾液から分子量５万カットの中空糸ＵＦ膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を短時間のうちに濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。膜濾過装置は東洋紡エンジニアリング社製SYLS-SB04型を用いた。このようにして得られた多糖類については、製造例１と同様に処理しセルロースアセテート膜電気泳動法を用いて均一性を確認すると共に、化学分析、核磁気共鳴分析により、製造例１に記載の糖構成及び平均分子量の範囲内にあるムコ糖類が製造されていることを確認した。
【００３８】
［製造例３］
前培養までは製造例１と同様に処理し、上記製造例１で述べた培地に寒天を１．５％添加した寒天平板培地２５０ｍｌを平板(１８×２６ｃｍ)に広げて前培養液を塗沫し、２５℃の温度で４日間培養を行った後、寒天平板の表面に生じた粘質物をかきとり、１％フエノール液に懸濁させ、遠心分離した後濾過助剤(ラジオライト#500)で菌体を濾過により除いて得られた上澄液にエタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後再度エタノールを加えて沈殿する画分を集め、水に溶解後透析し、活性炭処理し、凍結乾燥により多糖画分を得た。尚、実用的な精製レベルとしては、培養濾過液から分子量５万カットの中空糸ＵＦ膜モジュール(Spectrum社製)を備えた膜濾過装置により得られる高分子画分を短時間のうちに濃縮、脱塩回収し、活性炭処理し、凍結乾燥により粉末化した。このようにして得られた多糖類については、製造例１と同様に処理しセルロースアセテート膜電気泳動法を用いて均一性を確認すると共に、化学分析、核磁気共鳴分析により、製造例１に記載の糖構成及び平均分子量の範囲内にあるムコ糖類が製造されていることを確認した。
【００３９】
［免疫機能性の検討］
製造例で得られた酸性ムコ多糖類を使用して、マウス由来マクロファージ様細胞株(J774.1)のＮＯ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２産生誘導作用を検討した。また、マウス脾臓細胞を用いて酸性ムコ多糖類のＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α産生誘導作用を調べそれぞれ免疫機能性を検討した。
【実施例１】
【００４０】
(マクロファージの産生するＮＯ及びＴＮＦ−α)
製造例１で得られた酸性ムコ多糖類を使用した。培養液には、１０%(V/V)ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地(コージンバイオ社製)を用いた。マウス由来マクロファージ様細胞株J774.1(Riken Cell Bank)を所定の濃度となるように含む上記培養液を９６穴プレートに播種し(1.5×105個/well)、マクロファージ細胞に分化誘導した。上記培養液に溶解し０．２μｍのフイルターで予め滅菌した試料を所定の濃度となるように添加して３７℃、５%ＣＯ２下で培養した。２４時間培養後、培養上清を回収し、酸化窒素（ＮＯ）が培地中で酸化されることによって生ずる亜硝酸イオン濃度をグリース試薬法で、又、ＴＮＦ−αの濃度をサイトカイン測定キット(BioSource International, Inc.)を用いてＥＬＩＳＡ法でそれぞれ測定した。なお、ＮＯ産生量は、陽性コントロールであるＬＰＳ（１０μg/ml）添加時のＮＯ産生量を測定し、比活性（ＬＰＳのＮＯ産生量に対するサンプルのNO産生量、単位：%）をＮＯ産生能とした。これらの結果を図１及び図２にそれぞれ示す。
【００４１】
図１に示されるように、対照ではＮＯ産生誘導は全く認められなかった。しかし、本酸性ムコ多糖類を添加すると濃度依存的にＮＯ産生誘導を促進し、マクロファージ活性化作用のあることが認められた。
また、図２に示されるように、本酸性ムコ多糖類で刺激することにより低い濃度（０．１μg／ml）でＴＮＦ−α産生誘導を促進し、マクロファージ活性化作用のあることが認められた。
【実施例２】
【００４２】
(マクロファージの産生するＩＬ−１２)
製造例１で得られた酸性ムコ多糖類を使用した。培養液には、１０%(V/V)ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地(和光純薬社製)を用いた。マウス由来マクロファージ様細胞株J774.1(Riken  Cell  Bank)を含む上記培養液を４８穴プレートに播種し(4.0×105個/well)た。２４時間培養後、予め０．２μｍのフイルターで滅菌した試料を所定の濃度になるように添加した培養液と交換して３７℃、５%ＣＯ２下で培養した。２４時間培養後、培養上清を回収し、ＩＬ−１２の濃度をサイトカイン測定キット(インビトロジェン社)を用いてＥＬＩＳＡ法で測定した。この結果を図３に示す。
【００４３】
図３に示されるように対照ではＩＬ−１２産生誘導は全く認められなかった。しかし、本酸性ムコ多糖類を添加するとＩＬ−１２産生誘導を促進し、マクロファージ活性化作用のあることが認められた。
【実施例３】
【００４４】
(脾臓細胞の産生するＩＬ−１２、ＩＮＦ−γ、及びＴＮＦ−α)
製造例１で得られた酸性ムコ多糖類を使用した。培養液には、１０%(V/V)ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地(和光純薬社製)を用いた。C3H/HeN及びC57BL/6J Hamマウス（8週齢、メス）の脾臓細胞を採取し、この混合細胞を含む上記培養液を４８穴プレートに播種した(2.0×107個/well)。このウェル中の細胞懸濁液に、予め上記培養液に溶解した試料を所定の濃度になるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。２４時間培養後培養上清を回収し、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの濃度をサイトカイン測定キット(インビトロジェン社)を用いてＥＬＩＳＡ法で測定した。この結果を図４〜６に示す。
【００４５】
図４〜６に示されるように、本酸性ムコ多糖類存在下(10μg/ml)で培養したマウスC3H/HeN系とC57BL/6ＪHam系脾臓細胞では、いずれもＩＬ−１２、ＩＮＦ−γ及びＴＮＦ−αの産生誘導はそれぞれ対照に比べて著しく促進され、リポ多糖ＬＰＳ（0.1μg/ml, シグマ社) と同様なレベルで産生された。免疫賦活作用のあることが認められた。一方、本酸性ムコ多糖類によるＩＬ−１２の産生誘導促進効果は両系統のマウス脾臓細胞ではあまり変わらなかったが、ＩＦＮ-γの産生量はＮＫ活性の低下したC57BL/6ＪHam系がＬＰＳに対する感受性が高いC3H/HeN系の１／５と低くＴｈ１型細胞の活性化が示唆された。 
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は酸性ムコ多糖類を有効成分として含む免疫賦活剤に関するものであり、一酸化窒素（ＮＯ）産生誘導活性、ＴＮＦ-α産生誘導活性、ＩＬ−１２産生誘導活性、及びＩＮＦ-γ産生誘導活性の優れた免疫賦活作用を呈する新しい剤である。一般には、これら糖化合物を有効成分として少なくとも０．００１重量％以上、好ましくは０.０１〜２０．０重量％程度添加した医薬品又は食品類として提供されるが、有効成分は必ずしも単離・精製して使用する必要はなく、必要に応じて免疫誘導効果を損なわない範囲で、本発明の糖化合物を含む粗精製物をも使用することができるため使用する態様が制限されることが少ない。また、有効成分の糖構成や組成比が特定されているため安全性や効力の面で十分な試験・検討が可能となり、食品や医薬品への応用が迅速化されて実用性のある免疫賦活剤として提供される。さらに、本免疫賦活剤は、優れた免疫賦活効果を示すと共に、安定性及び高い安全性を併せ持つため、例えば、がん、ウイルス病、アトピー性皮膚炎等の発生を防ぐことができるとともに、既に発症しているがん、ウイルス病、アトピー性皮膚炎等の治療に使用できる優れた医薬品を提供することを可能とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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