(57)【要約】      （修正有）【課題】カスガマイシン耐性に関与する新規な遺伝子を単離し、カスガマイシン耐性菌を迅速に、かつ高精度に検出しうる手段を提供する。【解決手段】下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子：（ａ）特定な配列の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ）（ａ）の塩基配列と８０％以上の同一性を有し、かつカスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｃ）（ａ）の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなるＤＮＡであって、カスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、カスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１の塩基配列と８０％以上の同一性を有し、かつカスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなるＤＮＡであって、カスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、カスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子の存在を検出することを含む、カスガマイシン耐性菌の検出方法。
【請求項３】
下記（ｅ）〜（ｈ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド、及び
下記（ｉ）〜（ｌ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド
をプライマーセットとして用いる核酸増幅反応により請求項１に記載の遺伝子の存在を検出する、請求項２に記載の検出方法：
（ｅ）配列番号５の塩基配列、又は配列番号５の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｆ）配列番号７の塩基配列、又は配列番号７の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｇ）配列番号９の塩基配列、又は配列番号９の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｈ）配列番号１１の塩基配列、又は配列番号１１の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉ）配列番号６の塩基配列、又は配列番号６の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｊ）配列番号８の塩基配列、又は配列番号８の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｋ）配列番号１０の塩基配列、又は配列番号１０の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｌ）配列番号１２の塩基配列、又は配列番号１２の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記（ｅ）〜（ｈ）から選ばれるオリゴヌクレオチド、又は前記（ｉ）〜（ｌ）から選ばれるオリゴヌクレオチドからなる、カスガマイシン耐性菌を検出するための核酸増幅用プライマー。
【請求項５】
前記（ｅ）〜（ｈ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド、及び前記（ｉ）〜（ｌ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドよりなる、カスガマイシン耐性菌を検出するための核酸増幅用プライマーセット。
【請求項６】
下記（ｍ）〜（ｏ）のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質：
（ｍ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｎ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつカスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、
（ｏ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、カスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。
【請求項７】
請求項６に記載のタンパク質の存在を検出することを含む、カスガマイシン耐性菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なカスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ及びその検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カスガマイシンは、放線菌の一種であるストレプトマイセス・カスガエンシス（Streptomyces kasugaensis）が産生するアミノ配糖体抗生物質である。カスガマイシンは、α−イノシトール、アミノ糖であるカスガミン及びアミジンカルボン酸から構成され、数あるアミノ配糖体抗生物質の中でも特異な化学構造を有している。
【０００３】
一般に、アミノ配糖体抗生物質は、その化学構造が特定の修飾酵素により修飾されることで不活化されうる。当該修飾酵素として、アミノ基をアセチル化するアセチル基転移酵素（アセチルトランスフェラーゼ）、水酸基をアデニリル化するアデニリル基転移酵酵素（アデニリルトランスフェラーゼ）、水酸基をリン酸化するリン酸基転移酵素（ホスホトランスフェラーゼ）等が知られているが、これらの修飾酵素は基質特異性が比較的低く、類似構造のアミノ配糖体抗生物質全般に作用しうる。したがって、上記修飾酵素を有する微生物は、複数種類のアミノ配糖体抗生物質に対して交差耐性を示しうる（例えば、非特許文献１）。
しかし、特異な化学構造を有するカスガマイシンについては、医療現場で出現した薬剤耐性菌が産生するアミノ配糖体抗生物質の修飾酵素によって不活化された事例は知られていない（非特許文献２）。
【０００４】
カスガマイシン産生菌であるストレプトマイセス・カスガエンシスは、カスガマイシンアセチルトランスフェラーゼを産生してカスガマイシンの２’−位のアミノ基をアセチル化し、これにより自己が産生するカスガマイシンに対する耐性を獲得している（図１、特許文献１、非特許文献３）。
ストレプトマイセス・カスガエンシス由来のカスガマイシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子として、Ｋａｃ２７３及びＫａｃ３３８が報告されている。Ｋａｃ２７３及びＫａｃ３３８は、カスガマイシン生合成遺伝子クラスターに座乗しており、カスガマイシン産生時に同時に産生される仕組みになっている。
特許文献１には、Ｋａｃ２７３を含む組換えプラスミドで大腸菌を形質転換すると、形質転換株はカスガマイシン耐性を獲得する一方、カナマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等の他のアミノ配糖体抗生物質に対しては依然として感受性を有することが記載されており、Ｋａｃ２７３がコードするアセチルトランスフェラーゼのカスガマイシンに対する基質特異性の高さが示されている。
【０００５】
カスガマイシンは、糸状菌が引き起こすイネいもち病に対して卓効を示すことから、水稲の病害を防ぐ目的で使用されている。また、カスガマイシンは、糸状菌に限らず、植物病原細菌に対しても抗菌活性を示すことが知られており、例えば、イネもみ枯細菌病、イネ褐条病、イネ苗立枯細菌病、ウメかいよう病、キウイフルーツかいよう病、キウイフルーツ花腐病、リンゴ火傷病等の細菌性病害に対しても広く使用されている。
一方、カスガマイシンに対する耐性菌の存在も報告されている。カスガマイシン耐性糸状菌の存在は、イネいもち病菌であるマグナポルテ・グリセア（Magnaporthe grisea）やテンサイ褐斑病菌であるセルコスポラ・ベチコラ（Cercospora beticola）において確認されており（非特許文献４、５）、また、カスガマイシン耐性植物病原細菌の存在は、イネ褐条病菌であるアシドボラクス・アベナエ亜種アベナエ（Acidovorax avenae subsp. avenae)やイネもみ枯細菌病菌であるバークホルデリア・グルマエ（Burkholderia glumae）において確認されている（非特許文献６、７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平５−２３１８７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Clinical  Microbiology  Reviews、Vol.16、No.3、pp.430-450、2003年
【非特許文献２】The Japanese  Journal  of  Antibiotics、Vol.52、No.1、pp.57-67、1999年
【非特許文献３】The  Journal  of  Antibiotics、vol.51、3、pp.341-352、1998年
【非特許文献４】日本植物病理学会報、第39巻、第3号、pp.239-240、1973年発行、
【非特許文献５】日本植物病理学会報、第51巻、第1号、pp.112、1985年発行
【非特許文献６】日本植物病理学会報、第57巻、第1号、pp.117-118、1991年発行
【非特許文献７】日本植物病理学会報、第73巻、第3号、pp.278、2007年発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
植物病原細菌により引き起こされる上記のイネ褐条病やイネもみ枯細菌病は、水稲の種子伝染性病害である。種子流通によるカスガマイシン耐性菌の拡散を防止するためには、カスガマイシン耐性菌に感染した種籾をいち早く特定し、代替手段により防除や感染種籾の除去を施すことが重要である。
しかし、これまでイネ褐条病菌やイネもみ枯細菌病菌等におけるカスガマイシン耐性獲得機構についての知見はなく、生化学的な手法によりカスガマイシン耐性菌を高精度かつ迅速に検出・同定する手段は知られていない。
【０００９】
本発明は、カスガマイシン耐性に関与する新規な遺伝子を単離し、カスガマイシン耐性菌を迅速に、かつ高精度に検出しうる手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、カスガマイシンに対する耐性を有するイネ褐条病菌及びイネもみ枯細菌病菌から、カスガマイシンの２’−位のアミノ基をアセチル化する活性を有する、新規なアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の単離に成功した。また、本発明者らは、このアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を検出することで、カスガマイシン耐性菌の検出を迅速かつ高精度に行えることを見い出した。本発明は、これらの知見に基づき完成するに至ったものである。
【００１１】
本発明の課題は下記の手段により達成された。
＜１＞下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１の塩基配列と８０％以上の同一性を有し、かつカスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号１の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなるＤＮＡであって、カスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、カスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜２＞＜１＞に記載の遺伝子の存在を検出することを含む、カスガマイシン耐性菌の検出方法。
＜３＞下記（ｅ）〜（ｈ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド、及び
下記（ｉ）〜（ｌ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド
をプライマーセットとして用いる核酸増幅反応により＜１＞に記載の遺伝子の存在を検出する、＜２＞に記載の検出方法：
（ｅ）配列番号５の塩基配列、又は配列番号５の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｆ）配列番号７の塩基配列、又は配列番号７の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｇ）配列番号９の塩基配列、又は配列番号９の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｈ）配列番号１１の塩基配列、又は配列番号１１の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉ）配列番号６の塩基配列、又は配列番号６の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｊ）配列番号８の塩基配列、又は配列番号８の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｋ）配列番号１０の塩基配列、又は配列番号１０の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｌ）配列番号１２の塩基配列、又は配列番号１２の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
＜４＞前記（ｅ）〜（ｈ）から選ばれるオリゴヌクレオチド、又は前記（ｉ）〜（ｌ）から選ばれるオリゴヌクレオチドからなる、カスガマイシン耐性菌を検出するための核酸増幅用プライマー。
＜５＞前記（ｅ）〜（ｈ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド、及び前記（ｉ）〜（ｌ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドよりなる、カスガマイシン耐性菌を検出するための核酸増幅用プライマーセット。
＜６＞下記（ｍ）〜（ｏ）のいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質：
（ｍ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｎ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつカスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列、
（ｏ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であって、カスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。
＜７＞＜６＞に記載のタンパク質の存在を検出することを含む、カスガマイシン耐性菌の検出方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の遺伝子は、カスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードしており、この遺伝子を発現させることで、カスガマイシンをアセチル化し、これによりカスガマイシンを不活化することができる。また、本発明の遺伝子は、生化学的手法によりカスガマイシン耐性菌を検出するためのマーカーとすることができる。
本発明のカスガマイシン耐性菌の検出方法によれば、生化学的手法により、カスガマイシン耐性菌を迅速かつ高精度に検出することができる。
本発明のカスガマイシン耐性菌検出用プライマー及びプライマーセットは、生化学的手法によるカスガマイシン耐性菌の迅速かつ高精度な検出に寄与する。
本発明のタンパク質は、カスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有し、カスガマイシンをアセチルし、これによりカスガマイシンを不活化することができる。また、本発明のタンパク質は、生化学的手法によりカスガマイシン耐性菌を検出するためのマーカーとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】カスガマイシンアセチルトランスフェラーゼによるカスガマイシンのアセチル化機構を示す図である。
【図２】ＢｇＫａｃの塩基配列と、既知のアセチルトランスフェラーゼとの塩基配列の同一性を示すアラインメントである。
【図３】ＢｇＫａｃタンパク質のアミノ酸配列と、既知のアセチルトランスフェラーゼとのアミノ酸配列の同一性を示すアラインメントである。
【図４】ＢｇＫａｃタンパク質が、アセチルＣｏＡをアセチル基供与体として、カスガマイシンの２’−アミノ基にアセチル基を転移する活性を有することを示すＨＰＬＣの溶出プロファイルである。図４中、ＩはＢｇＫａｃタンパク質液とカスガマイシン塩酸塩とアセチルＣｏＡ・トリリチウム塩との混合液を、IIはＢｇＫａｃを有さない大腸菌ＤＨ５αのタンパク質液とカスガマイシン塩酸塩とアセチルＣｏＡ・トリリチウム塩との混合液を、IIIはカスガマイシン塩酸塩とアセチルＣｏＡ・トリリチウム塩との混合液を、IVはＢｇＫａｃタンパク質液とカスガマイシン塩酸塩との混合液を、３０℃で１時間反応させた反応液の溶出プロファイルを示す。また、図４中、Ａはアセチル化カスガマイシンのピークを示し、Ｂはカスガマイシンのピークを示す。
【図５】カスガマイシン感受性菌株又は耐性菌株を試料とし、配列番号５及び６の塩基配列からなる２種類のプライマーを用いて、ＰＣＲによりＢｇＫａｃをコードするＤＮＡを増幅し、これをアガロース電気泳動後に染色した結果を示す写真である。図５中、（Ｉ）はイネもみ枯細菌病菌の結果を示し、レーン１〜３がカスガマイシン感受性菌株、レーン４〜２１がカスガマイシン耐性菌株の結果を示す。また、図５中、（II）はイネ褐条病菌の結果を示し、レーン１がカスガマイシン感受性菌株、レーン２〜１０がカスガマイシン耐性菌株の結果を示す。図５中Ｍは分子量マーカーを示し、Ｃは陽性コントロールの結果を示す。
【図６】カスガマイシン感受性菌株又は耐性菌株を試料とし、配列番号７及び８の塩基配列からなる２種類のプライマーを用いて、ＰＣＲによりＢｇＫａｃの部分配列からなるＤＮＡを増幅し、これをアガロース電気泳動後に染色した結果を示す写真である。図６中、（Ｉ）はイネもみ枯細菌病菌の結果を示し、レーン１〜３がカスガマイシン感受性菌株、レーン４〜１２がカスガマイシン耐性菌株の結果を示す。また、図６中、（II）はイネ褐条病菌の結果を示し、レーン１〜３がカスガマイシン感受性菌株、レーン４〜１０がカスガマイシン耐性菌株の結果を示す。図６中Ｍは分子量マーカーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について、その好ましい実施態様に基づき詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１５】
［本発明の遺伝子］
本発明の遺伝子は、カスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する特定のタンパク質をコードするＤＮＡからなる。このカスガマイシンアセチルトランスフェラーゼは、図１に示すように、アセチル基供与体から、受容体であるカスガマイシンの２’−位のアミノ基にアセチル基を転移する活性を有する。上記アセチル基供与体としては、通常、アセチルＣｏＡが利用される。
カスガマイシンは、２’−位のアミノ基がアセチル化されると、抗菌活性を失って不活化される。
【００１６】
本発明の遺伝子は、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡより構成される。
本明細書において塩基配列の同一性とは、比較する２つの塩基配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大の塩基配列の同一性（％）をいう。塩基配列の同一性を決定する目的のためのアラインメントは、通常の方法を用いて行うことができ、例えばＢＬＡＳＴのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアや、ＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング社）並びにＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社）等の市販のソフトウェアを使用することもできる。
【００１７】
また、本発明の遺伝子は、配列番号１の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなるＤＮＡより構成されてもよい。
本明細書中、配列番号１の塩基配列において、「１又は数個」とは、好ましくは１〜１００の整数、より好ましくは１〜５０の整数、さらに好ましくは１〜３０の整数、特に好ましくは１〜２０の整数、殊更好ましくは１〜１０の整数である。
【００１８】
また、本発明の遺伝子は、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡより構成されてもよい。
本明細書において、「配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」の「ストリンジェントな条件」とは、塩基配列の同一性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の同一性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する温度及び塩濃度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。上記ハイブリダイゼーションは、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法等、通常の方法で行うことができる。
【００１９】
本発明の遺伝子には、ゲノムＤＮＡ中に存在するＤＮＡからなる遺伝子、ゲノムＤＮＡから単離されたＤＮＡからなる遺伝子及びｃＤＮＡ等の人工的に合成したＤＮＡからなる遺伝子が包含される。
また、本発明の遺伝子には、上述したＤＮＡの１本鎖から構成されるもの、及び上述したＤＮＡと当該ＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとの２本鎖から構成されるものの両者が含まれる。
【００２０】
本発明の遺伝子は、配列番号１の塩基配列に基づき通常の方法で作製したプライマー対を用いて、イネ褐条病菌やイネもみ枯細菌病菌等におけるカスガマイシン耐性菌のｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型として通常の方法でＰＣＲを行うことにより得ることができる。カスガマイシン耐性のイネ褐条病菌やイネもみ枯細菌病菌は、農業試験場等の公的機関から入手することができる。
また、本発明の遺伝子は、通常の方法により化学合成して得ることもできる。さらに、本発明の遺伝子は、配列番号１の塩基配列を断片化し、各断片の塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡを化学合成し、これらを順次連結することで得ることもできる。
さらに、上記のようにして得られたＤＮＡに部位特異的変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を導入することで、該ＤＮＡの特定のバリアント、すなわち、該ＤＮＡと特定の塩基配列同一性を有するＤＮＡを得ることができ、このような特定のバリアントも本発明の遺伝子に含まれうる。
【００２１】
上記配列番号１の塩基配列は、後述する実施例で示すように、カスガマイシン耐性のイネもみ枯細菌病菌より得られた新規なカスガマイシンアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列（７８３塩基長）である。
【００２２】
また、配列番号３の塩基配列は、本発明の遺伝子の塩基配列に包含されるものであり、カスガマイシン耐性イネ褐条病菌より得られた新規なカスガマイシンアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列（７８３塩基長）である。配列番号３の塩基配列は、配列番号１の塩基配列における第２３４番目の塩基シトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）に、第２５８番目の塩基チミン（Ｔ）がグアニン（Ｇ）に、第４３６番目の塩基チミン（Ｔ）がアデニン（Ａ）に置換された配列である。
【００２３】
アミノ配糖体抗生物質に耐性を付与するアセチルトランスフェラーゼは、アミノ配糖体に対する作用部位及び基質特異性の違いによって、４種類のグループに大別される（ＡＡＣ（１）、ＡＡＣ（３）、ＡＡＣ（２’）及びＡＡＣ（６’）、Clinical  Microbiology  Reviews、Vol.16、No.3、pp.430-450、2003年  参照）。しかし、配列番号１及び３の塩基配列は、既知のアミノ配糖体抗生物質に対するアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列とは配列同一性が低く（７０％以下）、配列番号１及び３の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるアセチルトランスフェラーゼは、上記４つのグループのいずれにも分類することができなかった。
【００２４】
［本発明のタンパク質］
本発明のタンパク質は、上述した本発明の遺伝子にコードされる、カスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質である。
【００２５】
本発明のタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である。
本明細書において、アミノ酸配列の同一性とは、比較する２つのアミノ酸配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大のアミノ酸配列の同一性（％）をいう。アミノ酸配列の同一性を決定する目的のためのアラインメントは、通常の方法を用いて行うことができ、例えばＢＬＡＳＴのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアや、ＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング社）並びにＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社）等の市販のソフトウェアを使用することもできる。
【００２６】
また、本発明のタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなってもよい。
本明細書中、配列番号２のアミノ酸配列において、「１又は数個」とは、好ましくは１〜５０の整数、より好ましくは１〜３０の整数、さらに好ましくは１〜２０の整数、特に好ましくは１〜１０の整数、殊更好ましくは１〜５の整数である。
【００２７】
本発明のタンパク質は、本発明の遺伝子を発現させることで得ることができる。本発明の遺伝子の発現は通常の方法で行うことができ、例えば、本発明の遺伝子をコードするＤＮＡを所望のプロモーターの下流に連結した発現ベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して発現させることで、宿主細胞中に本発明のタンパク質を得ることができる。宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。原核細胞としては、大腸菌、枯草菌、放線菌等が挙げられる。また、真核細胞としては、酵母、カビ、植物細胞などが挙げられる。宿主細胞中に得られた本発明のタンパク質は、イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、ヒドロキシアパタイトカラム、疎水性カラム等を適宜組合わせて用いて通常の方法により精製又は部分精製することもできる。また、ヒスチジンタグ等のタグペプチドとの融合体として発現させることで、該タグペプチドに対するアフィニティーカラムを用いて精製することもできる。
【００２８】
また、本発明のタンパク質は、カスガマイシン耐性を獲得したイネ褐条病菌やイネもみ枯細菌病菌等の植物病原細菌から単離・精製することで得ることもできる。当該単離・精製は通常の方法で行うことができ、例えば、イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、ヒドロキシアパタイトカラム、疎水性カラム等の複数のカラムを組み合わせたカラムクロマトグラフィーにより行うことができる。
【００２９】
上述した精製工程で得られる画分のカスガマイシンアセチルトランスフェラーゼの活性は、カスガマイシンを基質として、カスガマイシンのアミノ基へのアセチル基転移活性を指標に測定することができる。アミノ基がアセチル化されたカスガマイシンはＨＰＬＣを用いて常法により定量することができる。
【００３０】
上記配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質は、上述した配列番号１の塩基配列にコードされるタンパク質であり、少なくとも特定のカスガマイシン耐性イネもみ枯細菌病菌が有するカスガマイシンアセチルトランスフェラーゼである。
【００３１】
また、配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質は、上述した配列番号３の塩基配列にコードされるタンパク質であり、少なくとも特定のカスガマイシン耐性イネ褐条病菌が有するカスガマイシンアセチルトランスフェラーゼである。
配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列における第１４６番目のアミノ酸セリン（Ｓ）がスレオニン（Ｔ）に置換された配列である。
【００３２】
［本発明のカスガマイシン耐性菌の検出方法］
本発明のカスガマイシン耐性菌の検出方法（以下、単に、本発明の検出方法と呼ぶことがある。）は、本発明の遺伝子、又は本発明のタンパク質の存在の有無を検出する方法である。試料中から当該遺伝子又はタンパク質の存在を検出したときには、試料中にカスガマイシン耐性菌が存在し、又は存在していたと判断することができる。また、試料中から当該遺伝子又はタンパク質の存在が検出できない場合には、試料中にカスガマイシン耐性菌が存在しない、存在する可能性が低い、又は存在数が所定数より少ないと判断することができる。
【００３３】
（本発明の遺伝子の検出方法）
本発明の遺伝子の存在は、シークエンス法、ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法）等の遺伝子工学的手法により検出することができる。上記遺伝子工学的手法は通常の方法を採用することができる。
ここで、「本発明の遺伝子の存在の検出する」とは、本発明の遺伝子の全部を検出すること、及び本発明の遺伝子の一部を検出することの双方を含む概念である。
本発明の遺伝子の存在の検出は、本発明の遺伝子を特徴づける塩基配列、すなわち、本発明の遺伝子に特異的な塩基配列の存在を検出することが好ましい。本発明の遺伝子に特異的な塩基配列は、例えば、既知のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする塩基配列とのアラインメントにより特定することができる。
【００３４】
本発明の遺伝子の存在の検出には、本発明の遺伝子を含むゲノムＤＮＡ領域に存在する特異的な塩基配列又はこの塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、検出用オリゴヌクレオチドと呼ぶことがある。）を好適に用いることができる。ここで、本発明の遺伝子を含むゲノムＤＮＡ領域とは、本発明の遺伝子をコードする領域のみならず、該領域に連続的につながって存在する非翻訳領域を併せた領域をも含む概念である。
上記検出用オリゴヌクレオチドとして、例えば、配列番号５、７、９及び１１の塩基配列、又は該塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらのオリゴヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、又は、カスガマイシン耐性菌のゲノムＤＮＡ中に存在しうる、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡと、当該ＤＮＡの５’側に連続的につながる非翻訳領域との連結部分を含む領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ（例えば、配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ）に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうることが好ましい。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１の塩基配列と８０％以上の同一性を有し、かつカスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなるＤＮＡであって、カスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、カスガマイシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００３５】
また、上記検出用オリゴヌクレオチドとして、配列番号６、８、１０及び１２の塩基配列又は該塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドも例示することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡ、又は、カスガマイシン耐性菌のゲノムＤＮＡ中に存在しうる、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡと、当該ＤＮＡの３’側に連続的につながる非翻訳領域との連結部分を含む領域の塩基配列からなるＤＮＡ（例えば、配列番号６の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ）に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうることが好ましい。
【００３６】
本明細書において、配列番号５〜１２の塩基配列において「１もしくは数個」とは、５’側に塩基が付加される場合においては１〜１０の整数であることが好ましく、１〜５の整数であることがより好ましく、１〜３の整数であることがさらに好ましく、１又は２であることが特に好ましい。また、３’側に塩基が付加される場合並びに塩基の欠失、置換及び／又は挿入の場合においては、１〜５の整数であることが好ましく、１〜３の整数であることがより好ましく、１又は２であることがさらに好ましい。
【００３７】
また、上記検出用オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにおけるストリンジェントな条件とは、５０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは５５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する温度及び塩濃度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。上記ハイブリダイゼーションは、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法等、通常の方法で行うことができる。
【００３８】
上記の配列番号５〜１２の各塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／もしくは付加された塩基配列を有する各オリゴヌクレオチドは、それぞれ、配列番号５〜１２の各塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡに、上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであることが好ましい。
【００３９】
上記検出用オリゴヌクレオチドは目的に応じて、放射性物質、酵素、蛍光物質、発光物質等で標識して用いることもできる。
【００４０】
本発明の遺伝子の存在の検出に用いうるハイブリダイゼーション法においては、上記検出用オリゴヌクレオチドを、カスガマイシン耐性菌のゲノムＤＮＡを含みうる試料溶液に添加して、該ゲノムＤＮＡと標識した上記検出用オリゴヌクレオチドとをストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせることができる。
該ゲノムＤＮＡ中に本発明の遺伝子が存在する場合には、標識された上記検出用オリゴヌクレオチドが、本発明の遺伝子を構成するＤＮＡ中に存在する特異的な配列部分とハイブリダイズするため、ハイブリダイズした上記検出用オリゴヌクレオチドの標識を検出することで、カスガマイシン耐性菌を検出することができる。かかる標識の検出手段としては、例えば検出用オリゴヌクレオチドが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フイルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。上記ハイブリダイゼーション反応は、試料中のゲノムＤＮＡを固相担体に固定化させた状態で実施することが好ましい。これにより未反応のオリゴヌクレオチドを洗浄により除去することができ、正確な検出が可能になる。
【００４１】
別のハイブリダイゼーション反応の形態として、上記検出用オリゴヌクレオチドを固相に固定化された捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、該捕捉プローブと、検出対象である本発明の遺伝子又はその一部を構成するＤＮＡの塩基配列のうち、該捕捉プローブの結合部位とは異なる部位に結合する標識核酸プローブとの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、ゲノムＤＮＡ自体を標識して捕捉プローブに捕捉された標的核酸を検出することもできる。
【００４２】
上記検出用オリゴヌクレオチドは、シークエンス法、核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼによる複製開始点を提供するプライマーとしても好適に用いることができる。
【００４３】
上記シークエンス法は通常の方法で行うことができる。すなわち、カスガマイシン耐性菌のゲノムＤＮＡを含みうる試料溶液をサンプルとして、上記検出用オリゴヌクレオチドのうちいずれか一種をプライマーとし、塩基としてｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物の存在下で常法によりＰＣＲ反応を行わせた産物をシークエンサーで解析する。上記ゲノムＤＮＡ中に本発明の遺伝子が存在する場合には、本発明の遺伝子が有する塩基配列を確認することができ、これによりカスガマイシン耐性菌を検出することができる。
【００４４】
核酸増幅法においては、通常には、ペアとなって標的核酸を増幅するために、少なくとも２種類のプライマーをプライマーセットとして用いる。ＰＣＲ法においては、好ましくは、下記（ｅ）〜（ｈ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと、下記（ｉ）〜（ｌ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドとをプライマーセットとして用いる。
（ｅ）配列番号５の塩基配列、又は配列番号５の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｆ）配列番号７の塩基配列、又は配列番号７の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｇ）配列番号９の塩基配列、又は配列番号９の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｈ）配列番号１１の塩基配列、又は配列番号１１の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉ）配列番号６の塩基配列、又は配列番号６の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｊ）配列番号８の塩基配列、又は配列番号８の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｋ）配列番号１０の塩基配列、又は配列番号１０の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｌ）配列番号１２の塩基配列、又は配列番号１２の塩基配列において１もしくは数個の塩基が置換、欠失、挿入及び／もしくは付加された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
【００４５】
上記（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドは、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、又は、カスガマイシン耐性菌のゲノムＤＮＡ中に存在しうる、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡと、当該ＤＮＡの５’側に連続的につながる非翻訳領域との連結部分を含む領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ（例えば、配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ）に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうることが好ましい。
また、上記（ｉ）〜（ｌ）のオリゴヌクレオチドは、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡ、又は、カスガマイシン耐性菌のゲノムＤＮＡ中に存在しうる、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡと、当該ＤＮＡの３’側に連続的につながる非翻訳領域との連結部分を含む領域の塩基配列からなるＤＮＡ（例えば、配列番号６の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ）に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうることが好ましい。
【００４６】
本明細書において、上記（ｅ）〜（ｌ）のオリゴヌクレオチド（塩基配列５〜１２の塩基配列又は該塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／もしくは付加された塩基配列を有する各オリゴヌクレオチド）をハイブリダイズさせる際のストリンジェントな条件とは、５０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは５５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する温度及び塩濃度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。上記ハイブリダイゼーションは、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法等、通常の方法で行うことができる。
【００４７】
上記（ｅ）、（ｉ）、（ｆ）、（ｊ）、（ｇ）、（ｋ）、（ｈ）及び（ｌ）の各塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドは、それぞれ、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１及び１２の各塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであることが好ましい。
【００４８】
核酸増幅法は、通常には、下記（i）〜（iii）の工程を少なくとも含む。
（i）カスガマイシン耐性菌を含みうる試料（例えば、カスガマイシン耐性菌でありうる菌株、種子、種子を浸した浸種液、羅病苗、羅病株、環境水等）又はそのＤＮＡ抽出物と、ｄＮＴＰと、ＤＮＡポリメラーゼと、上記プライマーセットとを混合して核酸増幅用反応液を調製する工程、
（ii）上記核酸増幅用反応液を核酸増幅反応に付する工程、
（iii）増幅された核酸を検出する工程。
【００４９】
ＰＣＲ法の条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。例えば、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９０℃〜９８℃程度で１０〜６０秒間程行い、プライマーを１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５０〜６５℃程度で数秒〜数分間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を６５〜７５℃程度で数秒〜数分間行い、これらを１サイクルとしたものを３０〜４０サイクル程度行うことができる。また、リアルタイムＰＣＲ法を用いれば、標的ＤＮＡを精度よく定量することもでき、これにより検出対象である微生物の数を測定することも可能になる。ＰＣＲはサーマルサイクラーを用いて行う。
一方、ＬＡＭＰ法等の等温増幅反応では、６０℃付近の等温で増幅反応が進行するので、サーマルサイクラーを要せず、恒温槽で反応を進行させることができる。ＬＡＭＰ法においては、通常は４種類のオリゴヌクレオチドプライマーが必要になるが、このようなプライマーの設計は専用のソフトウェアを用いて行うことができる。
【００５０】
配列番号５〜１２の各塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのうち２種をプライマーセットとして用いて本発明の遺伝子を検出する際において、プライマーセットを構成しうるプライマーの組み合わせの例を下記表１に示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５１】
【表１】
2012187008.tif 000002
【００５２】
核酸増幅反応により増幅したＤＮＡ断片の確認は通常の方法で行うことができる。例えば核酸増幅反応時に蛍光物質や放射性物質などで標識されたヌクレオチドを取り込ませる方法、増幅産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、増幅産物の塩基配列を解読する方法、増幅産物である２本鎖ＤＮＡに蛍光物質を入り込ませて発光させる方法、増幅産物による反応液の濁度を検出する方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。
【００５３】
ＰＣＲ法で使用するＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ等の高温耐性のＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。また、等温増幅反応においてはＡａｃＤＮＡポリメラーゼやＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ等の鎖置換型のＤＮＡポリメラーゼを用いる。
核酸増幅用反応液には試料、プライマー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ等の他、プライマーと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションや使用するＤＮＡポリメラーゼに適した緩衝液等の他の成分を含ませてもよい。また、リアルタイムＰＣＲ法では、目的に応じて、さらに蛍光標識等がなされた標識プローブを含ませてもよい。
【００５４】
ＰＣＲ法において、２種類のプライマー（１種類のプライマーペア）からなるプライマーセットを用いると、増幅される塩基配列は実質的に１種類であり、３種類以上のプライマー（２種類以上のプライマーペア）からなるプライマーセットを用いると、増幅される塩基配列は実質的に２種類以上となる。また、２種類以上の該部分塩基配列は一部重複していてもよい。２種類以上の該部分塩基配列が一部重複しているケースとしては、１つのプライマーに対して、対になるプライマーが２種類以上含まれる場合が挙げられる。
【００５５】
検出対象となる本発明の遺伝子の塩基配列が、配列番号１及び３で示されるように、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位（ＡＡＧＣＴＴ）が一箇所存在するものである場合には、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法により正確に目的遺伝子を確認することも可能である。
【００５６】
（本発明のタンパク質の検出方法）
本発明のタンパク質の存在は、本発明のタンパク質に特異的に結合する分子を用いて行うことが好ましい。本発明のタンパク質に特異的に結合する分子としては、本発明のタンパク質に対する抗体やアプタマー等が挙げられるが、本発明のタンパク質に対する抗体を用いることが好ましい。上記抗体やアプタマーは、目的に応じて、放射性物質、酵素、蛍光物質、発光物質等で標識して用いることができる。
抗体を用いた検出手段としては、イムノアッセイの分野において通常用いられる手段を採用することができ、例えば、ラテックス凝集法、ウエスタンブロット法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、イムノクロマト法などにより本発明のタンパク質を検出することができる。
【００５７】
本発明のタンパク質の検出に用いる抗体は、本発明のタンパク質に結合能を有する抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また、抗体をペプシンやパパインのようなタンパク質分解酵素で分解し、抗原に対する結合性を維持した、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂフラグメントや、２本のＨ鎖同士を結びつけているジスルフィド結合を還元して乖離させて、１本のＨ鎖と１本のＬ鎖からなるフラグメントとしたものも含まれる。また、本発明における抗体には、単鎖抗体やその２量体（ダイアボディー）もしくは３量体（トリアボディー）、又はミニボディーも含まれる。本発明に使用する抗体として、一般的に用いられているマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、トリ由来のもの等が使用できるがこれらに限定されず、本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体であれば何れも使用できる。
【００５８】
本発明のタンパク質の検出に用いる抗体は、通常の方法で取得することができる。例えば、本発明の遺伝子の全部又は一部を発現させて得たタンパク質を免疫原として用い、動物に免疫して、該動物から本発明のタンパク質に選択的に反応する抗体を取得することができる。また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列から本発明のタンパク質に特徴的なアミノ酸配列を選択し、該アミノ酸配列からなるペプチドを化学的に合成して、これを動物に免疫して、該動物から本発明のタンパク質に選択的に反応する抗体を取得することができる。
動物を免疫する方法は通常の手法が適用でき、それに必要な免疫プロトコールは当業者にとって容易に決定し得る。例えば、アジュバントと混合した免疫原を適当な宿主動物（マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマまたはその他の哺乳類）に注射することにより、動物を免疫することができる。免疫原の注射は、適当な力価の抗血清が得られるまで続けられる。
【００５９】
また、本発明のタンパク質の検出に用いるモノクローナル抗体は、免疫された動物から得た細胞と不死化細胞とを融合することによって得られる融合細胞（ハイブリドーマ）から得ることができる。免疫された動物がマウスであれば、マウスに免疫原を免疫した後、当該マウスから回収した脾臓細胞とマウスミエローマ細胞を用いてケーラーとミルシュタインの方法（ネイチャー２５６巻４９５頁１９７５年）により目的のハイブリドーマを得ることが可能である。目的とする抗体を産生するハイブリドーマは、ハイブリドーマの培養液の抗体価を調べることで選択することができる。
抗体は、アフィニティークロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー等の通常の方法により精製することができる。
【００６０】
本発明のタンパク質の検出は、本発明のタンパク質におけるエピトープの異なる２種類の抗体を用いて、サンドイッチイムノアッセイの原理により行うことが好ましい。この場合において、一方の抗体は捕捉抗体として固相に固定化され、もう一方の抗体は、標識され、検出用抗体として機能する。
【００６１】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法では、本発明のタンパク質に対する抗体が固定化されたウェルを用意し、非特異的な吸着を防ぐために、ＢＳＡやカゼイン等により当該ウェルをブロッキングしておく。ここにカスガマイシン耐性菌を含みうる試料から調製したタンパク質溶液を入れ、抗体が失活しにくい温度（例えば４〜４０℃）で数分〜数日インキュベートする。続いてタンパク質溶液を捨て、リン酸緩衝液等でウェルを洗浄後、固定化抗体が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する標識された抗体を加え、再び数分〜数日インキュベートし、ウェルを洗浄後、ウェル内に存在する標識を検出する。上記タンパク質溶液中に本発明のタンパク質が存在する場合には、標識のシグナルが高くなるため、これにより、試料中のカスガマイシン耐性菌の存在の有無を判別することができる。
【００６２】
また、イムノクロマト法においては、上記サンドイッチＥＬＩＳＡにおける固定化抗体をメンブレンのテストライン上に固定化しておき、上記サンドイッチＥＬＩＳＡにおける標識抗体をコンジュゲートパッドに保持した状態のテストストリップを調製する。カスガマイシン耐性菌を含みうる試料から調製したタンパク質溶液をコンジュゲートパッドに直接又は間接的に添加すると、毛細管現象により、当該溶液が標識抗体と液相中で反応しながらコンジュゲートパッドからメンブレンへと進んでいく。タンパク質溶液中に本発明のタンパク質が存在する場合には、メンブレンのテストライン上に標識抗体と本発明のタンパク質とからなる複合体がトラップされる。したがって、テストライン上に存在する標識を検出することにより、試料中のカスガマイシン耐性菌の存在の有無を判別することができる。
【００６３】
本発明のカスガマイシン耐性菌の検出方法により、カスガマイシンに耐性を示す植物病原細菌、例えばカスガマイシンに耐性を示すイネもみ枯細菌病菌およびイネ褐条病菌、あるいはイネ苗立枯細菌病菌、ウメかいよう病菌、キウイフルーツかいよう病菌、キウイフルーツ花腐細菌病菌、リンゴ火傷病菌、キュウリ斑点細菌病菌、トマト斑点細菌病菌、トマトかいよう病菌、トマト軟腐病菌、ピーマン斑点細菌病菌、トウガラシ類斑点細菌病菌、タマネギ軟腐病菌、ネギ軟腐病菌、レタス腐敗病菌(非結球レタスを含む)、レタス斑点細菌病菌(非結球レタスを含む)、キャベツ黒腐病菌、キャベツ軟腐病菌、ブロッコリー黒腐病菌、スイカ褐斑細菌病菌、スイカ果実汚斑細菌病菌、ナタネ黒腐病菌、セルリー軟腐病菌、ダイコン軟腐病菌、ダイコン黒斑細菌病菌、ゴボウ黒斑細菌病菌、ニンジン軟腐病菌、インゲンかさ枯病菌、アズキ褐斑細菌病菌、アズキ茎腐細菌病菌、オクラ葉枯細菌病菌、ジャガイモ軟腐病菌、テンサイ斑点細菌病菌、ニンニク春腐病菌、カンキツかいよう病菌、モモせん孔細菌病菌、ホオズキ軟腐病菌、ホオズキ斑点細菌病菌、ユリ軟腐病菌等を検出することができる。すなわち、本発明のカスガマイシン耐性菌の検出方法により、カスガマイシンに対する耐性を獲得したイネもみ枯細菌病菌やイネ褐条病菌のみならず、本発明に係る遺伝子が他の細菌へ菌種を越えて伝播されることにより耐性を獲得した細菌を検出することも可能である。
【００６４】
［本発明の核酸増幅用プライマー］
本発明の核酸増幅用プライマーは、前記（ｅ）〜（ｈ）から選ばれるオリゴヌクレオチド、又は、前記（ｉ）〜（ｌ）から選ばれるオリゴヌクレオチドからなり、核酸増幅法又はシークエンス法等によるカスガマイシン耐性菌の検出に用いられる。核酸増幅法は好ましくはＰＣＲ法である。
【００６５】
上記（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドは、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、又は、カスガマイシン耐性菌のゲノムＤＮＡ中に存在しうる、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡと、当該ＤＮＡの５’側に連続的につながる非翻訳領域との連結部分を含む領域の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ（例えば、配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ）に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうることが好ましい。
また、上記（ｉ）〜（ｌ）のオリゴヌクレオチドは、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡ、又は、カスガマイシン耐性菌のゲノムＤＮＡ中に存在しうる、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡと、当該ＤＮＡの３’側に連続的につながる非翻訳領域との連結部分を含む領域の塩基配列からなるＤＮＡ（例えば、配列番号６の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ）に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうることが好ましい。
【００６６】
上記（ｅ）、（ｉ）、（ｆ）、（ｊ）、（ｇ）、（ｋ）、（ｈ）及び（ｌ）の各塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドは、それぞれ、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１及び１２の各塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであることが好ましい。
【００６７】
本発明のプライマーには、上記オリゴヌクレオチドが標識されたものが含まれる。当該標識としては、例えば、放射性物質、酵素、蛍光物質、発光物質等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
また、本発明のプライマーを構成する上記オリゴヌクレオチドには、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等やこれらのキメラ核酸の他、ＤＮＡやＲＮＡにおけるホスホジエステル結合の一部又は全部をホスホロチオエート結合等の他の結合に置き換えた核酸が含まれる。
本発明のプライマーは、通常の方法で化学合成することができるし、試薬メーカーから購入することもできる。
【００６９】
［本発明の核酸増幅用プライマーセット］
本発明の核酸増幅用プライマーセットは、前記（ｅ）〜（ｈ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド、及び、前記（ｉ）〜（ｌ）から選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチドよりなり、核酸増幅法、好ましくはＰＣＲ法によるカスガマイシン耐性菌の検出に用いられる。
【００７０】
上記（ｅ）〜（ｈ）のオリゴヌクレオチドは、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、又は、カスガマイシン耐性菌のゲノムＤＮＡ中に存在しうる、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡと、当該ＤＮＡの５’側に連続的につながる非翻訳領域との連結部分を含む塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ（例えば、配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ）に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうることが好ましい。
また、上記（ｉ）〜（ｌ）のオリゴヌクレオチドは、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡ、又は、カスガマイシン耐性菌のゲノムＤＮＡ中に存在しうる、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡと、当該ＤＮＡの３’側に連続的につながる非翻訳領域との連結部分を含む領域の塩基配列からなるＤＮＡ（例えば、配列番号６の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ）に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうることが好ましい。
【００７１】
上記（ｅ）、（ｉ）、（ｆ）、（ｊ）、（ｇ）、（ｋ）、（ｈ）及び（ｌ）の各塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドは、それぞれ、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１及び１２の各塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであることが好ましい。
【００７２】
上記プライマーセットを構成するプライマーは、標識されていてもよい。当該標識としては、例えば、放射性物質、酵素、蛍光物質、発光物質等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、上記プライマーセットを構成するプライマーには、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等やこれらのキメラ核酸の他、ＤＮＡやＲＮＡにおけるホスホジエステル結合の一部又は全部をホスホロチオエート結合等の他の結合に置き換えた核酸が含まれる。
【００７３】
本発明のプライマーセットは、該プライマーセットを構成するプライマーが混合された状態のものであってもよいし、別々により分けられた状態であってもよい。また、乾燥状態であっても、緩衝液等の水溶液に溶解した状態であってもよい。また、無機塩、有機塩、防腐剤、安定化剤等と共存させた状態であってもよい。
【００７４】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００７５】
［調製例１］  イネもみ枯細菌病菌からのカスガマイシン耐性に係る遺伝子の単離
本発明者らは、カスガマイシンに感受性を示す大腸菌ＤＨ５αを宿主として用い、クローニングベクターとしてｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔII  ＳＫ＋を用いる系を利用して、カスガマイシン耐性イネもみ枯細菌病菌の総ＤＮＡからカスガマイシン耐性に係る遺伝子をショットガン法によりクローニングすることを試みた。
具体的には、カスガマイシン耐性イネもみ枯細菌病菌の総ＤＮＡおよびクローニングベクターを制限酵素ＥｃｏＲ１で処理した後連結し、これを用いてヒートショック法により大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。この形質転換体を、アンピシリンを５０μｇ／ｍＬ、及びカスガマイシンを２００μｇ／ｍＬ添加した培地に培養したところ、カスガマイシン耐性のコロニーが得られた。
【００７６】
次に、このコロニーからプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した後、アガロースゲル電気泳動を行ったところ、このプラスミドＤＮＡが約５．６ｋｂのＤＮＡ断片を有する事を確認した。このＤＮＡ断片は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を１カ所有しており、ＨｉｎｄＩＩＩで処理して得た２種類のＤＮＡ断片をそれぞれプラスミドに組み込んで再度大腸菌ＤＨ５αを形質転換したところ、これらの形質転換体はいずれもカスガマイシンに対して感受性を示した。従って、このＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を含む塩基配列からなるＤＮＡ部分がカスガマイシン耐性に係る遺伝子であると判断し、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位の前後の塩基配列を解析し、配列番号１の塩基配列で示されるオープンリーディングフレームを見い出した。配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡをＢｇＫａｃと命名した。
【００７７】
上記５．６ｋｂのＤＮＡ断片を有するプラスミドをテンプレートとして、配列番号５の塩基配列からなるプライマーと配列番号６の塩基配列からなるプライマーとを用いて、ＢｇＫａｃをＰＣＲにより増幅し、制限酵素ＨｉｎｃＩＩで処理したクローニングベクターｐＵＣ１１８に連結し、これを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体について、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。その結果を下記表２に示す。
【００７８】
【表２】
2012187008.tif 000003
【００７９】
ＢｇＫａｃを有する形質転換大腸菌（表２中のｐＵＣ１１８−ＢｇＫａｃ）は、ＢｇＫａｃを有しないｐＵＣ１１８で形質転換体した形質転換大腸菌（表２中のｐＵＣ１１８）と比較して、カスガマイシンに対して顕著に高い耐性を示したが、ネオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシンに対しては、ＢｇＫａｃを有する大腸菌も有さない大腸菌も同等の感受性を示した。
【００８０】
ＢｇＫａｃの塩基配列をＱｕｅｒｙ配列として、ＢＬＡＳＴ（Basic  Local  Alignment  Search  Tool）法を用い、ＢＬＡＳＴＸ(ＤＮＡ配列×アミノ酸配列ＤＢ)プログラムによりホモロジー検索を行った。その結果、ＢｇＫａｃはSinorhizobium meliloti、Burkholderia cenocepacia、及びBurkholderia  sp.  383のＧＣＮ５ファミリー  Ｎ−アセチルトランスフェラーゼと塩基配列でわずか４３.７〜５９．８％の同一性しか示さず、アミノ酸配列でもわずか５５．９〜６５．８％の同一性しか示さなかった（図２及び３）。上記の検索されたＧＣＮ５ファミリー  Ｎ−アセチルトランスフェラーゼによりアセチル化される化合物は不明である。
【００８１】
［試験例１］  ＢｇＫａｃタンパク質のアセチルトランスフェラーゼ活性の評価
アミノ配糖体抗生物質アセチルトランスフェラーゼは、細菌の菌体内においてアミノ配糖体抗生物質をアセチル化し、該アミノ配糖体抗生物質を不活化させることが知られている。そこで、ＢｇＫａｃがコードしているタンパク質が、カスガマイシンをアセチル化することを示すため、カスガマイシンのアセチル化試験を行った。本試験例で用いるＢｇＫａｃタンパク質液（酵素液）の調製は、以下のようにして行った。
【００８２】
調製例１において作製したＢｇＫａｃを有する形質転換大腸菌ＤＨ５αを培養して菌体を集菌した後、氷冷下超音波にて菌体を破砕した。この菌体破砕液を２０,０００Ｇで５分間遠心処理を行った。得られた上清を低温下でゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）にアプライし、緩衝液(５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５)でタンパク質画分を溶出させ、ＢｇＫａｃタンパク質液（総タンパク質濃度；２０ｍｇ／ｍＬ）とした。
【００８３】
基質としてカスガマイシン塩酸塩（和光純薬社製）を１ｍＭ、アセチル基供与体としてアセチルＣｏＡ・トリリチウム塩（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ社製）を２ｍＭ、ＢｇＫａｃタンパク質液を１２.５μl添加した緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を用意し（全容量２００μＬ）、３０℃として１時間反応させることでカスガマイシンのアセチル化反応を行わせ、反応産物をＨＰＬＣにより分析した。検出は２３０ｎｍの波長の吸収により行った。
対照として、アセチルＣｏＡ・トリリチウム塩の代わりに蒸留水を加えたもの、ＢｇＫａｃタンパク質液の代わりに、コントロールプラスミド（ｐＵＣ１１８）で形質転換したＢｇＫａｃを有さない大腸菌ＤＨ５αのタンパク質液を加えたものについても同様の分析を行った。
結果を図４に示す。
【００８４】
図４の結果から、ＢｇＫａｃタンパク質が、アセチルＣｏＡをアセチル基供与体として、カスガマイシンの２’−アミノ基にアセチル基を転移する活性を有することがわかった。
【００８５】
［試験例２］  ＢｇＫａｃタンパク質によるカスガマイシンの不活化
上記ＢｇＫａｃタンパク質液を用いて、カスガマイシン感受性イネもみ枯細菌病菌のカスガマイシンによる生育阻止を指標としたペーパーディスク検定（バイオアッセイ）を行った。その結果、上記ＢｇＫａｃタンパク質液とアセチルＣｏＡとを添加した場合に、カスガマイシンによる検定菌の生育阻止効果の明らかな減少が認められた。
【００８６】
［試験例３］
ＢｇＫａｃの塩基配列のホモロジー検索の結果に基づき、配列番号５から１２の塩基配列からなる各オリゴヌクレオチドをＢｇＫａｃ増幅用のプライマーとして設計した。
配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとしてそれぞれ用い、ＰＣＲによりカスガマイシン耐性菌の検出を試みた。
イネもみ枯細菌病菌については、カスガマイシン感受性菌３菌株及びカスガマイシン耐性菌１８菌株を試験した。
また、イネ褐条菌については、カスガマイシン感受性菌１菌株及びカスガマイシン耐性菌９菌株を試験した。
ＰＣＲは、変性温度を９４℃で４５秒とし、６０℃で４５秒のアニーリング反応及び７２℃で１分の伸長反応からなる増幅サイクルを３０サイクル行った。
ＰＣＲ後の反応液を、アガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイドでＤＮＡを検出した結果を図５に示す。
【００８７】
図５に示すように、イネもみ枯細菌病菌及びイネもみ褐条病菌のいずれにおいても、カスガマイシン感受性菌においては目的の大きさのＤＮＡ断片の増幅を認めなかった。一方、カスガマイシン耐性菌においては、いずれの菌種においても、目的の大きさのＤＮＡ断片の増幅を認めた。
【００８８】
［試験例４］
配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとしてそれぞれ用い、ＰＣＲによりカスガマイシン耐性菌の検出を試みた。
イネもみ枯細菌病菌については、カスガマイシン感受性菌３菌株及びカスガマイシン耐性菌９菌株を試験した。
また、イネ褐条菌については、カスガマイシン感受性菌３菌株及びカスガマイシン耐性菌７菌株を試験した。
ＰＣＲは、変性温度を９８℃で１０秒とし、６３℃で３０秒のアニーリング反応及び６８℃で１分の伸長反応からなる増幅サイクルを３０サイクル行った。
ＰＣＲ後の反応液を、アガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイドでＤＮＡを検出した結果を図６に示す。
【００８９】
図６に示すように、イネもみ枯細菌病菌及びイネもみ褐条病菌のいずれにおいても、カスガマイシン感受性菌においては目的の大きさのＤＮＡ断片の増幅を認めなかった。一方、カスガマイシン耐性菌においては、いずれの菌種においても、目的の大きさのＤＮＡ断片の増幅を認めた。
【００９０】
［試験例５］
試験例３及び４において増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列をシークエンス解析し、該ＤＮＡ断片が、ＢｇＫａｃより増幅されたものであることを確認した。
【００９１】
上記の結果は、本発明の遺伝子又はタンパク質の有無を検出することで、カスガマイシン耐性菌を迅速に、かつ高精度に検出できることを示す。
【図１】
2012187008.tif 000004
【図４】
2012187008.tif 000005
【図２】
2012187008.tif 000006
【図３】
2012187008.tif 000007
【図５】
2012187008.tif 000008
【図６】
2012187008.tif 000009
【配列表】
2012187008000001.app