(57)【要約】【課題】  形質転換体からの脱落を抑制可能なポリヌクレオチドを含むベクター、および前記ベクターを利用して宿主を形質転換して得られた形質転換体により組換えタンパク質を生産する方法を提供すること。【解決手段】  バチルス属細菌の染色体中に見出された特定の配列を含むポリヌクレオチドおよび目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体、および前記形質転換体を用いて目的タンパク質を生産する方法により、前記課題を解決する。これにより、例えば、抗生物質を含まない培養液を用いた組換えタンパク質の生産も可能となる。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列、または（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において一つ以上の塩基が欠失、付加および／もしくは置換された塩基配列からなり形質転換体からのベクターの脱落を抑制可能であるポリヌクレオチドと、
目的タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、を含むベクター。
【請求項２】
前記（Ｂ）の塩基配列が、前記（Ａ）の塩基配列と８０％以上の同一性を有している塩基配列である請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記（Ａ）の塩基配列または前記（Ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドの上流にさらに当該ポリヌクレオチドを発現させるプロモータ領域を含む、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
前記目的タンパク質がヒト受容体タンパク質である、請求項１から３のいずれか１つに記載のベクター。
【請求項５】
前記ヒト受容体タンパク質が、ヒトＦｃ受容体またはヒトエリスロポエチン受容体である、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１つに記載のベクターを導入することにより宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【請求項７】
前記宿主がバチルス属細菌である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６または７に記載の形質転換体を培養し、当該形質転換体により産生される前記目的タンパク質を回収することを含む、組換えタンパク質の製造方法。
【請求項９】
（ア）配列番号１に記載の塩基配列、または配列番号１に記載の塩基配列において一つ以上の塩基が欠失、付加および／もしくは置換された塩基配列からなり形質転換体からのベクターの脱落を抑制可能であるポリヌクレオチドを含むベクターに目的タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを挿入する工程、および
（イ）前記（ア）の工程により得られたベクターを宿主に導入する工程、を含む形質転換方法。
【請求項１０】
配列番号１に記載の塩基配列、または配列番号１に記載の塩基配列において一つ以上の塩基が欠失、付加および／もしくは置換された塩基配列からなり形質転換体からのベクターの脱落を抑制可能であるポリヌクレオチドを含む、形質転換体からのベクターの脱落抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学的手法を用いて組換えタンパク質を生産するのに有用な新規ベクター、およびそれを用いた組換えタンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学的手法により得られた、遺伝子組換えタンパク質（単に組換えタンパク質とも称される）が医薬、農薬または研究試薬などの分野で数多く利用されている。
遺伝子組換えタンパク質の生産は、動物細胞、酵母、細菌などを宿主として用い生産している。なかでも、形質転換の容易さから、細菌を宿主として用いた生産技術が数多く開発されている。異種遺伝子を用いた宿主細胞の形質転換に際しては、ベクター（発現ベクターとも称される）に挿入された抗生物質を分解や修飾する酵素遺伝子、又は抗生物質を宿主外へ排出するトランスポーター遺伝子をマーカーとして利用し、抗生物質を含む培地により行なわれることが多い（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−１９３７６０号公報
【特許文献２】特開２００８−２４５５８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように作製した形質転換体を用いて組換えタンパク質を生産する際は、組換えタンパク質を効率よく生産させるため、導入したベクターが脱落していない形質転換体の割合をより高くした状態で培養が行われることが好ましい。そのため、前記形質転換体を常に適切な抗生物質の存在下で培養し、ベクターの脱落が確認されたものを培養液から除いてベクターが脱落していない形質転換体の割合を高めることにより組換えタンパク質が生産されていた。しかしながら、大量の抗生物質を含む培養液の管理等のための手間や生産コストの増加などを招くこともあり、ベクターが脱落していない形質転換体の割合を高くした状態で培養を行うことができる新たな方法が望まれている。
【０００５】
本発明はこのような事情に基づきなされたものであり、導入されたベクターの形質転換体からの脱落を抑制可能なベクター、および前記ベクターを利用して宿主を形質転換して得られた形質転換体により組換えタンパク質を生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、細菌の染色体中に存在するポリヌクレオチドの中に、形質転換体からのベクターの脱落を抑制可能である機能を有するポリヌクレオチドを見出した。当該ポリヌクレオチドはさらに、形質転換効率を向上させる機能をも有していた。しかも、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの複製、分配、コンピテンシー等に関わる遺伝子群や、その周辺領域とは一切関係なく、前記ポリヌクレオチドが前述した機能を有していることは予測をはるかに超えるものであった。
【０００７】
すなわち、本願発明は以下の発明を包含する。
（１）（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列、または（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において一つ以上の塩基が欠失、付加および／もしくは置換された配列からなり、形質転換体からのベクターの脱落を抑制可能であるポリヌクレオチドと、目的タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含むベクター。
（２）前記（Ｂ）の塩基配列が、前記（Ａ）の塩基配列と８０％以上の同一性を有している塩基配列である（１）に記載のベクター。
（３）前記（Ａ）の塩基配列または前記（Ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドの上流にさらに当該ポリヌクレオチドを発現させるプロモータ領域を有する、（１）または（２）に記載のベクター。
（４）前記目的タンパク質がヒト受容体タンパク質である、（１）から（３）のいずれか１つに記載のベクター。
（５）前記ヒト受容体タンパク質が、ヒトＦｃ受容体またはヒトエリスロポエチン受容体である、（４）に記載のベクター。
（６）（１）から（５）のいずれか１つに記載のベクターを導入することにより宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
（７）前記宿主がバチルス属細菌である、（６）に記載の形質転換体。
（８）（６）または（７）に記載の形質転換体を培養し、当該形質転換体により産生される前記目的タンパク質を回収することを含む、組換えタンパク質の生産方法。
（９）（ア）配列番号１に記載の塩基配列、または配列番号１に記載の塩基配列において一つ以上の塩基が欠失、付加および／もしくは置換された塩基配列からなり、形質転換体からのベクターの脱落を抑制可能なポリヌクレオチドを含むベクターに目的タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを挿入する工程、および（イ）前記（ア）の工程により得られたベクターを宿主に導入する工程、を含む形質転換方法。
（１０）配列番号１に記載の塩基配列、または配列番号１に記載の塩基配列において一つ以上の塩基が欠失、付加および／もしくは置換された塩基配列からなり、形質転換体からのベクターの脱落を抑制可能であるポリヌクレオチドを含む、形質転換体からのベクターの脱落抑制剤。
【０００８】
なお、本明細書において、ベクター（発現ベクター）とは、細菌などの宿主に当該宿主とは異なる由来の外来遺伝子を導入できる核酸分子（例えば、プラスミドＤＮＡ）をいう。また、ベクターの脱落とは、導入したベクターが例えば排出されるなどして宿主内から消失することをいう。ベクターの脱落が抑制されているか否かは、後述する方法により算出される導入遺伝子保持率（％）を基に理解することができる。
本明細書において、形質転換体とは、細菌などの宿主内にベクターなどによって宿主とは異なる由来の外来遺伝子が導入された結果、その性質が転換されたものをいう。
本明細書において、組換えタンパク質とは、宿主とは異なる由来の外来遺伝子の発現に基づき形質転換体において産生されるタンパク質をいう。さらに、本明細書において、目的タンパク質とは、組換えタンパク質のうち、形質転換体によって大量に生産されることが望まれる任意のタンパク質をいう。
本明細書において、プロモータ（プロモータ領域）とは、ベクターにおいて所定の遺伝子を発現させる遺伝子発現制御領域をいう。
本明細書において、ヒト受容体タンパク質とは、ヒトにおける外界や体内からの刺激を受け取る（例えば抗体やホルモンなどに結合する）タンパク質をいう。また、ヒトＦｃ受容体とは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群のタンパク質をいう。ヒトＦｃ受容体については複数のサブタイプが報告されており、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対するサブタイプとしては、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている。
本明細書において、ヒトエリスロポエチン受容体とは、ヒト受容体タンパク質のうち、赤血球の産生を促進するホルモンであるエリスロポエチンに結合するタンパク質をいう。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、形質転換体からの脱落を抑制可能なベクター、および当該ベクターを利用して組換えタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが導入された形質転換体により組換えタンパク質を生産する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】配列番号１のポリヌクレオチド配列および前記配列より翻訳して得られるポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図２】ベクターｐＥＤＭＳ１の構造を示す図である。ｅｄｍＳは本実施形態に係るポリヌクレオチドを、ｏｒｉは自立複製領域を、ｔｅｔはテトラサイクリン耐性遺伝子を、ＰｘｙｌＡはキシロースプロモータを、それぞれ示す。
【図３】比較例である市販ベクターｐＷＨ１５２０または実施例であるベクターｐＥＤＭＳ１を用いて形質転換したときの形質転換効率を示す図である。
【図４】比較例である市販ベクターｐＷＨ１５２０または実施例であるベクターｐＥＤＭＳ１を用いて得られた形質転換体の導入遺伝子保持率を示す図である。
【図５】Ｆｃ受容体発現ベクターｐＮＣＭＯ２ＦｃＲの作製方法を示す図である。
【図６】Ｆｃ受容体発現ベクターｐＥＤＭＳｘｙｌＦｃＲおよびｐＥＤＭＳｕｎｉＦｃＲの作製方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施形態の１つについて詳細に説明する。
本実施形態に係るポリヌクレオチドは、形質転換体からのベクターの脱落を抑制する機能を有している。また、本実施形態に係るポリヌクレオチドはさらに、形質転換効率を向上させる機能およびベクターに挿入したポリヌクレオチドから翻訳されるタンパク質を効率的に発現する機能を有している。本実施形態に係るポリヌクレオチドは、例えば、バチルス属細菌の染色体中に見出された、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｚ９２９５４の２７０９から２８７６番目の塩基に相当）に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。
【００１２】
なお、本実施形態に係るポリヌクレオチドの塩基配列は、形質転換体からのベクターの脱落を抑制する機能を有する限り、配列番号１に記載の塩基配列において一つ以上の塩基が欠失、付加および／または置換されていてもよい。さらに、配列番号１に記載の塩基配列において一つ以上の塩基が欠失および／または置換、および／または付加されることで、配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドと比較して、発現した目的タンパク質の活性や安定性などが向上していてもよい。欠失、置換または付加される塩基の数には制限ないが、好ましくは１から１０塩基、より好ましくは１から５塩基、さらに好ましくは１から２塩基である。配列番号１に記載の塩基配列において一つ以上の塩基が欠失、付加および／または置換された配列と配列番号１に記載の塩基配列との同一性は８０％以上であると好ましく、９０％以上であるとより好ましく、９５％以上であるとさらに好ましい。なお、同一性は、ＢＬＡＳＴなど当業者の周知のソフトウェアにより、簡便に確認することができる。
【００１３】
本実施形態に係るポリヌクレオチドは、染色体ＤＮＡを抽出後、これを鋳型としたＰＣＲ法により作製してもよいし、直接化学合成により作製してもよい。
【００１４】
本実施形態に係るポリヌクレオチドは、宿主への形質転換を促進するために用いることができる。例えば、本実施形態に係るポリヌクレオチドおよび目的タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（以下、単に目的タンパク質のポリヌクレオチドとも称す）を挿入したベクターを用いて宿主を形質転換する際、形質転換体内で本実施形態に係るポリヌクレオチドの機能が発揮されると、形質転換体から目的タンパク質のポリヌクレオチドを含むベクターの脱落が抑制される。これにより、目的タンパク質のポリヌクレオチドの発現が安定に維持され、目的タンパク質の生産を高めることができる。
【００１５】
本実施形態のベクターは、本実施形態に係るポリヌクレオチドと目的タンパク質の塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含んでいる。目的タンパク質に特に限定はなく、例えばアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、コレステロールオキシダーゼ等の酵素、インシュリン、インターフェロン、インターロイキン、抗体、エリスロポエチン、成長ホルモン、およびそれらの受容体タンパク質等のヒトタンパク質、ポリ−γ−グルタミン酸、ポリ−ε−リジン、シアノファイシン、ポリヒドロキシアルカン酸等のバイオ素材を例示できる。本実施形態のベクターを用いることにより、例えば、形質転換体による、医農薬中間体等の有用合成低分子化合物の合成を触媒する酵素の生産量を高めることで、当該低分子化合物の生産を向上させることもできる。また、特に本実施形態のベクターはヒト受容体タンパク質の生産に好ましく、とりわけヒトＦｃ受容体またはヒトエリスロポエチン受容体の生産に好ましい。ヒトＦｃ受容体の一例としては、ヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩＩが例示できる。ヒトＦｃ受容体のさらに具体的な一例として、配列番号１４に記載の天然型ＦｃγＲＩアミノ酸配列のうち少なくとも２２番目のアラニンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質や、配列番号１４に記載の天然型ＦｃγＲＩアミノ酸配列のうち少なくとも２２番目のアラニンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸において当該アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されており、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対する結合能を有するタンパク質（より好ましくは配列番号１４に記載の天然型ＦｃγＲＩアミノ酸配列のうち少なくとも２２番目のアラニンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸と７０％以上の同一性を有するアミノ酸を含むタンパク質）があげられる。目的タンパク質のポリヌクレオチドは、当該目的タンパク質のポリヌクレオチドを有する細胞から、染色体ＤＮＡや染色体外ＤＮＡを抽出後、これを鋳型としたＰＣＲ法により作製してもよいし、直接化学合成により作製してもよい。なお、目的タンパク質のポリヌクレオチドを作製する際は、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を考慮するのが好ましい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。
【００１６】
本実施形態のベクターは、例えば、公知のベクターに、本実施形態に係るポリヌクレオチドおよび目的タンパク質のポリヌクレオチドを挿入して作製することができる。当該公知のベクターは目的タンパク質のポリヌクレオチドを挿入するためのクローニング部位を有し、かつ、クローニング部位が特定の制限酵素により切断される箇所に目的タンパク質のポリヌクレオチドを挿入可能な部位を有していれば、特に制限はなく、使用する細胞に合わせて適宜選択すればよい。具体的には、プラスミドベクター、ウイルスベクター、アグロバクテリウムシステムが例示できる。より具体的には、バチルス属細菌用ベクターとしてｐＷＨ１５２０、ｐＡＭα１、ｐＵＢ１１０等が、大腸菌用ベクターとしてｐＵＣ、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＥＴ等が例示できる。本実施形態のベクターは、例えば、常法に従い作製すればよい。すなわち、公知のベクターを適切な制限酵素で切断後、本実施形態に係るポリヌクレオチドおよび目的タンパク質のポリヌクレオチドをＤＮＡリガーゼにより、制限酵素で切断した箇所にライゲーションすればよい。
【００１７】
なお、本実施形態のベクターを作製する際、本実施形態に係るポリヌクレオチドの上流に、本実施形態に係るポリヌクレオチドを発現させるプロモータ領域を有するように作製すると、当該プロモータにより本実施形態に係るポリヌクレオチドの発現を活性化させることができる点で、さらに好ましい。当該プロモータは、本実施形態に係るヌクレオチドの上流において当該ヌクレオチドに作動可能に連結（プロモータと発現される配列とが遺伝子発現を可能とするように結合される連結）されていればよい。また、プロモータは、本実施形態のベクターを用いて形質転換する宿主内で本実施形態に係るポリヌクレオチドの発現を活性化できるプロモータであればよく、構成的プロモータであってもよいし、誘導型プロモータであってもよい。
【００１８】
本実施形態の形質転換体は、本実施形態のベクターを用いて宿主を形質転換することで作製することができる。当該宿主は、使用する本実施形態のベクターに感受性を有し、かつ挿入した目的タンパク質のポリヌクレオチドの発現に基づき目的タンパク質を産生可能なものであれば特に限定はなく、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、納豆菌、大腸菌、緑膿菌、ビブリオ菌等の細菌、酵母等の真核細胞、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞等が例示できる。その中でも、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、納豆菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓなどのバチルス属細菌が、本実施形態の形質転換体を作製する際に使用する宿主として好ましい。なお、酵母のような真核生物の細胞を、本実施形態の形質転換体を作製する際に使用する宿主として利用する場合には、本実施形態のベクター内にある、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの下流にポリ（Ａ）シグナル配列をさらに付加すると好ましい。ポリ（Ａ）シグナル配列は、ｍＲＮＡの下流にアデニンを付加することにより、ｍＲＮＡの安定性と発現効率を向上させる機能を有する。
【００１９】
本実施形態のベクターを用いて宿主を形質転換するには、使用する細胞やベクターに応じた常法に従えばよい。例えば、宿主を予備的に培養して得られる培養液に本実施形態のベクターを添加後、ヒートショック法やエレクトロポレーション法などにより細胞を刺激して本実施形態のベクターを宿主内に導入する方法があげられる。また、宿主として真核細胞を用いる場合は、カルシウム法によりコンピテントセルを作製後、本実施形態のベクターを導入する方法や、プロトプラスト−ＰＥＧ法等があげられる。宿主を形質転換させるときの温度は、使用する宿主の生育に適する温度とすればよい。また、本実施形態のベクターを導入するのに要する時間は、使用したベクターや宿主、ＤＮＡ導入促進試薬の使用の有無などにもよるが、通常は１時間から１０日間程度である。
【００２０】
本実施形態の形質転換体の培養における培養温度は、使用する形質転換体の生育に適する温度、または形質転換体に導入した本実施形態のベクターにより発現される目的タンパク質の安定性や発現量に適する温度で行なえばよい。また培養時間も、適宜、培地中や形質転換体内における目的タンパク質の産生量をモニターすることで決定すればよい。
【００２１】
本実施形態の形質転換体に導入した本実施形態のベクターが、本実施形態に係るポリヌクレオチドの上流にプロモータ領域を有するベクターである場合、導入したプロモータを活性化または抑制する物質を培養液中に添加することで制御しながら目的タンパク質のポリヌクレオチドを発現させると好ましい。
【００２２】
本実施形態の形質転換体を培養することで、本実施形態のベクターに挿入されたポリヌクレオチドから翻訳された目的タンパク質を生産することができる。生産された目的タンパク質を回収する方法については特に限定されない。例えば、形質転換体内に目的タンパク質が生産される場合は、超音波法等の方法を用いて細胞を破砕することで目的タンパク質の抽出液を調製することができる。また、形質転換体培養液中に目的タンパク質が分泌生産される場合は、遠心分離操作等によって形質転換体を分離することで、目的タンパク質の抽出液を調製することができる。当該抽出液から目的タンパク質を精製するには、イオン交換、疎水性相互作用、ゲルろ過、アフィニティなどのカラムクロマトグラフィーを適宜組み合わせて使用することで、純度の高い目的タンパク質を調製することができる。
【００２３】
以上説明したように、本実施形態に係るポリヌクレオチドは、ベクターに挿入することで、当該ベクターを用いて形質転換された形質転換体におけるベクターの脱落を抑制する機能を有している。よって、本実施形態に係るポリヌクレオチドを含むベクターを形質転換処理に用いることで、ベクターの脱落が発生する形質転換体の割合を少なくすることができる。
このようにベクターの脱落が発生する形質転換体の割合を小さくすることができる結果、例えば、抗生物質が添加されていない培地で形質転換体を培養しての目的タンパク質の生産も可能となるので、抗生物質を含む培地の管理に要していた手間やコストの削減も可能となる。
さらに、本実施形態に係るポリヌクレオチドは、形質転換処理における形質転換効率を向上させる機能、およびベクターに挿入したポリヌクレオチドから翻訳されるタンパク質を効率的に発現する機能を有している。したがって、本実施形態に係るポリペプチドを含むベクターを用いて形質転換処理を行うことにより、より効率的な形質転換および目的タンパク質の生産が可能となる。
加えて、本実施形態に係るポリヌクレオチドによれば、形質転換体からのベクターの脱落抑制剤を提供することができる。当該脱落抑制剤の具体的な態様としては、例えば、本実施形態に係るポリヌクレオチド単体、本実施形態に係るポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡ、および当該ポリヌクレオチド単体またはプラスミドＤＮＡを含む遺伝子組換えキットなどが挙げられる。遺伝子組換えキットは、プラスミドＤＮＡのほかに、例えば培地や宿主細胞などにより構成される。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２５】
実施例１  ベクターの調製
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で発現させるためのベクターを下記に示す方法で調製した。
【００２６】
（１）以下に示す方法で、配列番号１に記載の配列（図１）を含むポリヌクレオチドを調製した。
（１−１）滅菌蒸留水（５０μＬ）に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ株の染色体ＤＮＡ（約１μｇ）、ＬＡ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）（０．２５μＬ）、ＬＡ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼキット添付のＰＣＲバッファー（タカラバイオ社製）（５μＬ）、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー（ＰＥＤＭＳ−ＮＦ）（終濃度で５ｐｍｏｌ）、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー（ＰＥＤＭＳ−ＣＦ）（終濃度で５ｐｍｏｌ）、をそれぞれ添加することで、ＰＣＲ反応液を調製した。なお、配列番号２に記載の塩基配列のうち、１０番目から１５番目までのヌクレオチドはＳｐｅＩサイトであり、２９番目から４２番目までのヌクレオチドは配列番号１の１番目から１４番目までのヌクレオチドと同一である。また、配列番号３に記載の塩基配列のうち、８番目から１３番目までのヌクレオチドはＢａｍＨＩサイトであり、１４番目から４０番目までのヌクレオチドは配列番号１の１３２番目から１６８番目までのヌクレオチドの相補鎖と同一である。
（１−２）ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（タカラバイオ社製）を用いて、（１−１）のＰＣＲ反応液を９４℃で９分間加熱処理した後、９４℃で１分間／５７℃で１分間／６４℃で１０分間の反応サイクルを３０サイクル行ない
、最後に７２℃で１０分間反応することで、配列番号１に記載の配列からなるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を増幅し調製した。
【００２７】
（２）（１）で調製したＤＮＡ断片をイソプロパノールで沈殿させ単離した。
【００２８】
（３）単離したＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で処理後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈキット（東洋紡社製）を用いて、あらかじめ制限酵素ＳｐｅＩとＢａｍＨＩで処理したｐＷＨ１５２０ベクター（ＭｏＢｉＴｅｃ社製）と連結させた。
調製したベクターをベクターｐＥＤＭＳ１と命名するとともに、その構造を図２に示す。ｐＥＤＭＳ１に導入された遺伝子配列をＤＮＡシークエンサー（遺伝子解析装置）で解析し、配列番号１と同一であることを確認した。
【００２９】
実施例２  形質転換効率試験
配列番号１に記載の配列を含むポリヌクレオチドをベクターに導入したことによる、枯草菌への形質転換効率の変化を確認した。
【００３０】
（１）枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のうち最も形質転換効率が優れていると報告されているＩＳＷ１２１４株、および形質転換され難い納豆菌の中でも比較的形質転換されやすいと報告されている野生株ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ株の菌懸濁液（５μＬ）をそれぞれＬＢ液体培地（５ｍＬ）に植菌後、３０℃で一晩振とう（１００ｒｐｍ）培養した。
【００３１】
（２）得られた培養液を再度ＬＢ培地に植菌し、６００ｎｍの吸光度が０．６の培養液を調製した。
【００３２】
（３）（２）の培養液（５０μＬ）を表１に示す組成の形質転換培地（５ｍＬ）に植菌し、３７℃で４時間、振とう培養した。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
（４）実施例１で調製したベクターｐＥＤＭＳ１（図２）を滅菌蒸留水（５０μＬ）に懸濁させることで、ＤＮＡ濃度０．０００１５ｗ／ｖ％の懸濁液を調製した。なお、ＤＮＡ濃度は、分光光度計を用いて測定した２６０ｎｍの吸光度から算出しており、吸光度測定値が０．０２の時、濃度は０．０００１ｗ／ｖ％となる。
【００３５】
（５）得られた培養液を１．５ｍＬ容チューブに１００μＬずつ分注後、さらに１００ｍＭ塩化マグネシウム水溶液（５μＬ）、および（４）の懸濁液（５μＬ）を添加し、３７℃で１時間振とう培養した。
【００３６】
（６）その後、４２℃のヒートショックを５分間加え、さらに１時間、培養を継続した。
【００３７】
（７）並行して、ＬＢ液体培地に１．５ｗ／ｖ％の寒天末を加えてオートクレーブし、５０℃まで温度が低下した時点で０．００１２５ｗ／ｖ％のテトラサイクリンを混和後、直ちに直径９ｃｍのシャーレに２０ｍＬずつ分注して室温まで冷却することにより、テトラサイクリン含有ＬＢプレートを作製した。
【００３８】
（８）（６）で得られた形質転換処理菌体（２０μＬ）を（７）のテトラサイクリン含有ＬＢプレートに塗布し、３７℃で１日間静置培養した。
【００３９】
（９）生育したコロニー数を目視でカウントし、下記に示す式１から形質転換効率、すなわち、添加したＤＮＡあたりのテトラサイクリン耐性遺伝子が発現した菌のコロニー数を算出した。また、比較のために、配列番号１に記載の配列からなるポリヌクレオチドを挿入する前の市販ベクターｐＷＨ１５２０についても同様に試験した。なお、ｐＷＨ１５２０ベクターには遺伝子が導入されているか否かを確認するためのマーカーとしてテトラサイクリン耐性遺伝子を有しており、本実験では当該遺伝子を導入遺伝子として位置付けている。
【００４０】
形質転換効率（ｃｆｕ）
＝テトラサイクリン含有ＬＢ培地上に生育したコロニー数（ｃｆｕ）
÷添加したＤＮＡ重量（μｇ）    ・・・・・式１
【００４１】
上述の試験を独立して４回行ない、その形質転換効率の平均値を図３に示した。図３に示すように、ＩＳＷ株では、配列番号１に記載の配列からなるポリヌクレオチドを含む本実施形態のベクターを使用することにより、ＤＮＡ重量当たりの形質転換効率は１０倍以上向上した（図３（１））。また、形質転換効率が低いとされるｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ株では、形質転換効率は約１００倍まで向上した（図３（２））。従って、本実施形態のベクターは、目的遺伝子の導入効率や発現効率を顕著に高めることが実証できた。
【００４２】
実施例３  ベクターの脱落試験
（１）実施例２と同様な方法で、実施例１で作製したベクターｐＥＤＭＳ１（図２）、または市販ベクターｐＷＨ１５２０を用いてＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ株を形質転換した。
【００４３】
（２）得られた形質転換体の懸濁液（５μＬ）を、表２に示す組成のＬＢ液体培地（５ｍＬ）に植菌した後、３７℃で２４時間振とう培養した（１００ｒｐｍ）。
【００４４】
【表２】
2012170331.tif 000004
【００４５】
（３）（２）の菌体培養液を生理食塩水にて約２５万倍希釈した後、実施例２で用いたＬＢプレート（ただしテトラサイクリンは除いている）に塗布し、室温で一晩静置培養した。また、上述のＬＢプレートにキシロースを添加したプレートにも塗布し、同様に静置培養した。各プレートでの一晩培養後のコロニー数を目視で計測し、そのコロニー数を脱落試験回数が０という意味でＲ０とした。
【００４６】
（４）表２に示すＬＢ液体培地（５ｍＬ）に（２）の培養液（５μＬ）を植菌後、３７℃で２４時間振とう培養した（１００ｒｐｍ）。
【００４７】
（５）得られた菌体培養液を、（３）で使用したテトラサイクリンを除いたＬＢプレート、および実施例２で用いたテトラサイクリン含有ＬＢプレートで培養し、各プレートでのコロニー数を目視で計測し、下記に示す式２により導入遺伝子保持率（％）を算出した。得られた値は、脱落試験回数が１という意味でＲ１とする。
【００４８】
導入遺伝子保持率（％）
＝［テトラサイクリン含有ＬＢ培地上に生育したコロニー数（ｃｆｕ）
÷テトラサイクリン不含有ＬＢ培地上に生育したコロニー数（ｃｆｕ）］
×１００    ・・・・・式２
【００４９】
（６）（４）から（５）の操作を繰り返し、ｎ回目の脱落試験Ｒｎにおける導入遺伝子保持率（％）を同様に求めた。
【００５０】
上述の試験を独立して５回行ない、その導入遺伝子保持率の平均値と標準偏差を図４に示す。市販ベクターｐＷＨ１５２０を用いて形質転換を行なった場合（図４（１））、キシロースによりｐＷＨ１５２０が有するキシロースプロモータを活性化させても、繰り返し培養をする毎に導入遺伝子保持率（すなわちテトラサイクリン耐性遺伝子発現率）が半減しており、導入したベクターが形質転換体から脱落していることがわかる。一方、ベクターｐＥＤＭＳ１を用いて形質転換を行なった場合（図４（２））、繰り返し培養を７回（Ｒ７）行なっても（脱落試験回数７回目であっても）、導入遺伝子保持率（すなわちテトラサイクリン耐性遺伝子発現率）は５０％以上（キシロースによるキシロースプロモータの活性化なし）、または８０％以上（キシロースによるキシロースプロモータの活性化あり）を維持していた。なお、キシロースプロモータを挿入したベクターを用いた発現系の場合、培地にキシロースを添加しなければ、その下流に存在する遺伝子（すなわちテトラサイクリン耐性遺伝子）は発現しないと考えられるが、実際にはキシロースを添加しなくても（キシロースプロモータを活性化させなくても）、その下流に存在する遺伝子は半分程度発現する。すなわち、図４（２）の結果は、繰り返し培養によってもベクターは脱落し難く、効率良く発現していることを示す。
【００５１】
以上をまとめると、配列番号１に記載の配列を含む本実施形態のポリヌクレオチドを挿入した本実施形態のベクターは、少なくとも繰り返し培養を７回行なっても、形質転換体からのベクターの脱落が生じないため、遺伝子工学的手法を用いた物質生産をする際に好ましいベクターといえる。
【００５２】
実施例４  ヒトＦｃ受容体の発現ベクターの構築
（１）特開２００８−２４５５８０号公報（特許文献２）により開示された方法により、ヒトＦｃ受容体を発現可能なベクターｐＥＣＦｃＲを作製した。前記ベクターは、大腸菌宿主での発現量を高めるためコドンユーセジ（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を大腸菌用に変換した、ヒトＦｃ受容体の細胞外領域（配列番号１４に記載のアミノ酸配列のうち２２番目のアラニンから２８９番目のバリンまでの領域、以下「ＦｃＲ」と略記）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４）が挿入されている。
【００５３】
（２）鋳型としてｐＥＣＦｃＲベクターを、プライマーとして配列番号５（５’―ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡＣＧＣＴＧＣＡＡＣＣ―３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６（５’―ＴＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＧＴＴＧＡＡＧ―３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表３に示す組成からなる反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応は、９４℃で５分間の熱処理後、９４℃で３０秒間／６２℃で３０秒間／７２℃で１分間の反応サイクルを２５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間反応することで実施した。
【００５４】
【表３】
2012170331.tif 000005
【００５５】
（３）ＰＣＲ反応終了後、１％のアガロース電気泳動で確認したところ、設計通りのサイズのＤＮＡバンドを確認することができた。
【００５６】
（４）目的バンドを抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ：キアゲン社）後、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理を行い、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＮＣＭＯ２プラスミドベクター（タカラバイオ社製）に挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を形質転換し調製した。これをｐＮＣＭＯ２ＦｃＲとした。当該ベクターの構造を図５に示す。
【００５７】
（５）（４）で調製したｐＮＣＭＯ２ＦｃＲを鋳型として、配列番号７（５’―ＴＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＧＧＧＧＧＡＡＡＴＧＡＣＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＧＴＣＧ―３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをセンス側プライマーとして、また、配列番号８（５’―ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＧＴＴＧＡＡＧ―３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをアンチセンス側プライマーとしてそれぞれ用いて表４に示す組成からなる反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行なうことで、キシロースプロモータのＲＢＳ配列（ＡＡＧＧＧＧＧ）およびシグナルペプチドを含むＦｃＲのＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲ反応は、９８℃で５分間の熱処理後、９８℃で１０秒間／５５℃で５秒間／７２℃で１分間の反応サイクルを２５サイクル行ない、最後に７２℃で５分間反応することで実施した。
【００５８】
【表４】
2012170331.tif 000006
【００５９】
（６）ＰＣＲ反応終了後、１％のアガロース電気泳動を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて目的サイズのＤＮＡバンドを抽出した。
【００６０】
（７）抽出した目的バンドにあるＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩとＢｇｌＩＩで消化後、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、あらかじめ制限酵素ＳｐｈＩとＢｇｌＩＩで消化したｐＥＤＭＳ１にライゲーションした。
【００６１】
（８）ライゲーションしたベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、１００μｇ／ｍＬの抗生物質（カルベニシリン）を添加したＬＢ寒天培地により選択された形質転換体からベクターを調製した。当該形質転換体から調製したベクターはｐＥＤＭＳｘｙｌＦｃＲと命名した。
【００６２】
（９）センス側プライマーを配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから配列番号９（５’―ＴＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＧＴＣＧ―３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドに変更した他は（５）から（８）と同様な方法により、ベクターｐＥＤＭＳ１に枯草菌に最適なＲＢＳ配列（ＡＡＧＧＡＧＧＡＡ）およびシグナルペプチドを含むＦｃＲのＤＮＡ断片を挿入して得られたベクターｐＥＤＭＳｕｎｉＦｃＲを調製した。
【００６３】
（１０）作製した２種類のベクター（ｐＥＤＭＳｘｙｌＦｃＲ、ｐＥＤＭＳｕｎｉＦｃＲ）について、配列番号１０（５’−ＡＴＡＴＴＴＡＡＡＡＧＴＡＴＣＡＴＡＴＣ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または配列番号１１（５’−ＧＡＧＣＧＡＴＣＣＴＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣ−３’）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて、（遺伝子解析試薬（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ、アプライドバイオシステムズ社製）および遺伝子解析システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ジェネティックアナライザ、アプライドバイオシステムズ社製）にて、挿入されたＦｃＲをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を確認した。
【００６４】
ｐＥＤＭＳｘｙｌＦｃＲおよびｐＥＤＭＳｕｎｉＦｃＲの構造ならびに作製方法を図６に示す。また、ｐＥＤＭＳｘｙｌＦｃＲの塩基配列を配列番号１２に、ｐＥＤＭＳｕｎｉＦｃＲの塩基配列を配列番号１３に、それぞれ示す。
【００６５】
実施例５  ＦｃＲの発現  
（１）実施例４で調製した２種類のベクター（ｐＥＤＭＳｘｙｌＦｃＲ、ｐＥＤＭＳｕｎｉＦｃＲ）を用いて、実施例２に記載の方法によりＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＳＷ１２１４株をそれぞれ形質転換し、形質転換体を得た。
【００６６】
（２）各形質転換体を０．５％キシロース含有ＬＢ培地で２４時間培養後、培養液を遠心分離し、発現したＦｃＲを含む培養上清を分離回収した。
【００６７】
（３）発現したＦｃＲの抗体結合活性を下記に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
（３−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌの濃度で固定した（４℃、１８時間）。
（３−２）固定化終了後、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（商品名）（ＰＩＥＲＣＥ社）によりブロッキングした。
（３−３）洗浄緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、発現したＦｃＲを含む培養上清を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で適宜希釈し、固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃、１時間）。
（３−４）反応終了後、再度洗浄緩衝液で洗浄し、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社）を添加後、３０℃で１時間反応させた。
（３−５）反応終了後、（３−３）と同じ組成の洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社）を添加後、３分間反応させた。
（３−６）１Ｍのリン酸溶液で反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
ＦｃＲ定量のための標準物質として市販のヒトＦｃγＲＩ（Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を使用し、その吸光度との比較からＦｃＲ発現量を定量した。表５に示す通り、実施例４で調製したベクター（ｐＥＤＭＳｘｙｌＦｃＲ、ｐＥＤＭＳｕｎｉＦｃＲ）を用いて枯草菌を形質転換し、得られた形質転換体を抗生物質を含まない培地を用いて培養したところ、培養上清中にＦｃＲを有意に発現できることが確認できた。
【００６８】
【表５】
2012170331.tif 000007
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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