(57)【要約】      （修正有）【課題】アコヤ貝真珠層のエラスターゼ阻害タンパク質及びそのタンパク質をコードする遺伝子を提供する。【解決手段】アコヤ貝貝殻真珠層から酸可溶性粗タンパク質を抽出し精製することにより、分子量１６ｋDaのエラスターゼ阻害タンパク質が得られる。そのタンパク質のN末端付近のアミノ配列に対応するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、アコヤ貝の外套膜組織から調製されるｃDNAライブラリーより、エラスターゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１〜４の何れかに示すアミノ酸配列を有するアコヤ貝貝殻由来のエラスターゼ阻害タンパク質。
【請求項２】
配列表の配列番号１〜３の何れかに示すアミノ酸配列において、１若しくは４個以下のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有するアコヤ貝貝殻由来のエラスターゼ阻害タンパク質。
【請求項３】
アコヤ貝の貝殻真珠層から得ることができ、SDS-PAGEで測定したときの分子量が１６ｋDaである請求項１又は請求項２のエラスターゼ阻害タンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載のエラスターゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項２に記載のエラスターゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
配列表の配列番号１〜３の何れかに示すCDSにおいて、１若しくは１２個以下の塩基が置換された塩基配列を有する請求項５の遺伝子
【請求項７】
アコヤ貝外套膜組織で発現する請求項４又は請求項５に記載の遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、アコヤ貝（Pinctada fucata）の貝殻真珠層を構成しエラスターゼ阻害作用を有するタンパク質およびそれをコードする遺伝子に関するものである。          
【背景技術】
【０００２】
長崎県の真珠生産量は全国でもトップレベルである。真珠養殖は母貝であるアコヤ貝が用いられており、その数は２，０００万貝を超える。しかしながら、結果として養殖後に排出されるアコヤ貝貝殻は５００トン以上となるが、ほとんど未利用資源として廃棄されており、有効活用が望まれている。
【０００３】
貝殻真珠層の主成分は炭酸カルシウムが９０％以上を占め、タンパク質が約２％含まれている。貝殻外側の稜柱層は方解石（カルサイト）、一方、内面の真珠層はアラレ石（アラゴナイト）という結晶構造をなしており後者は真珠と同様であるため真珠層を用いた研究が主に行われている。このアラゴナイト結晶構造の形成はタンパク質に影響されると考えられている。そのため貝殻真珠層からタンパク質を得る試みが行われており、方法としては粉砕した真珠層をEDTAあるいは酸による脱灰後、水に対する透析が報告されている（特開昭６２−２９８５０７号公報、特開平５−４３４４４号公報）。この時、タンパク質の大部分は不溶性として、一方、可溶性タンパク質は僅かに回収される。これまで真珠や貝殻真珠層のアラゴナイト結晶を作るために不溶性タンパク質が重要な役割を果たすと考えられてきた。そのため、真珠および真珠層の形成機構を解明するための研究がこの不溶性タンパク質で行われ、タンパク質の単離、遺伝子のクローニングが行われているが（特開２０００−１２５８７９、特開２００３−１２６９６）、まだ遺伝情報が少ないなどの課題が残されている。
【０００４】
一方、真珠および真珠層は古くから漢方薬や化粧品の原料として利用されてきたが、その生理作用について科学的には知られていない。当然のことながら、不溶性タンパク質についてもその報告はないが、可溶性タンパク質の中から唯一炭酸カルシウムの生成に働くナクレインと呼ばれる酵素が見出された（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. ９３, pp.９６５７-９６６０, １９９６）。この酵素をはじめ生理機能を示すものは、他にも可溶性タンパク質に存在する可能性が考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６２−２９８５０７号公報
【特許文献２】特開平５−４３４４４号公報
【特許文献３】特開２０００−１２５８７９
【特許文献４】特開２００３−１２６９６
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. ９３, pp.９６５７ -９６６０, １９９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
未利用資源であるアコヤ貝貝殻の真珠層タンパク質の機能と役割を明らかにするため、本発明者は、その前段階として真珠層から酸可溶性粗タンパク質を調製しその活性をスクリーニングすることにより、初めてエラスターゼ阻害活性が存在することを見出した。
【０００８】
ところで、本発明者がアコヤ貝貝殻から初めて見出したエラスターゼ阻害剤はエラスチンの分解を抑制する作用を有し、炎症性疾患の治療薬として使用されている。このような特性を有するエラスターゼ阻害剤は一般的に合成されており、合成品ではなく天然由来で入手しやすく安全性の高いものが望まれていた。
【０００９】
さらに、本発明で初めて見出したエラスターゼ阻害タンパク質が真珠層に含有されていることから、それをコードする遺伝子は真珠層形成の解明に必要と考えられる。
【００１０】
そこで本発明は、アコヤ貝真珠層に存在するエラスターゼ阻害タンパク質及びそのタンパク質をコードする遺伝子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
請求項１の発明は、配列表の配列番号１〜４の何れかに示すアミノ酸配列を有するアコヤ貝貝殻由来のエラスターゼ阻害タンパク質に関する。
【００１２】
更に請求項２の発明は、配列表の配列番号１〜３の何れかに示すアミノ酸配列において、１若しくは４個以下のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有するアコヤ貝貝殻由来のエラスターゼ阻害タンパク質に関する。
【００１３】
更に請求項３の発明は、請求項１又は請求項２において、アコヤ貝の貝殻真珠層から得ることができ、SDS-PAGEで測定したときの分子量が１６ｋDaであるエラスターゼ阻害タンパク質に関する。
【００１４】
更に請求項４の発明は、請求項１に記載のエラスターゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子に関する。
【００１５】
更に請求項５の発明は、請求項２に記載のエラスターゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子に関する。
【００１６】
更に請求項６の発明は、請求項５の発明において、配列表の配列番号１〜３の何れかに示すCDSにおいて１若しくは１２個以下の塩基が置換された塩基配列を有する遺伝子に関する。
【００１７】
更に請求項７の発明は、請求項４又は請求項５に記載の発明において、アコヤ貝外套膜組織で発現する遺伝子に関する。
【発明の効果】
【００１８】
エラスターゼに対する阻害作用を示すことで種々の疾患に対する予防剤、治療剤、抗皮膚老化剤としても有望であることは知られているが、このように効能のある天然タンパク質を未利用資源であるアコヤ貝貝殻真珠層から初めて、且つ、容易に精製することを可能にした。
【００１９】
さらに、真珠層を構成するタンパク質をコードする遺伝子の単離は、その遺伝子の発現を調べることにより真珠層形成機構の解明に貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明で得られるエラスターゼ阻害タンパク質（Elastase inhibitory protein）Eip-１及びEip-２のSDS-PAGEの写真である。
【図２】図２は、精製したEip-１及びEip-２のエラスターゼ阻害活性を示す図である。黒丸がEip-１、黒四角がEip-２を指す。
【図３】図３は、真珠層微粉末のエラスターゼ阻害活性を示す図である。
【図４】図４は、本発明で得られる４種類のタンパク質（Eip-１、 Eip-１A、Eip-１BおよびEip-２）のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。それぞれ配列表の配列番号１〜４のアミノ酸配列を指す。
【図５】図５は、Eip-１遺伝子の RT-PCR産物をアガロースゲル電気泳動した写真である。
【図６】図６は、Eip-１A遺伝子の RT-PCR産物をアガロースゲル電気泳動した写真である。
【図７】図７は、Eip-２遺伝子のRT-PCR産物をアガロースゲル電気泳動した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
１．本発明のエラスターゼ阻害タンパク質の抽出及び精製
本発明のエラスターゼ阻害タンパク質は、以下に示すような方法により貝殻真珠層から抽出及び精製できる。アコヤ貝貝殻から真珠層のみを分離し、粉砕する。その粉末からタンパク質を酸で抽出するが、脱灰に用いる酸は特に限定されるものではない。また、EDTAなどのキレート剤を用いても良いが、後に酵素反応などを行う場合には該試薬は除去するほうが好ましい。この操作は、タンパク質の安定性を考え、低温で短時間に行うことが望ましい。脱塩のための透析は希酸に対し４℃で行うが、これは酸によるタンパク質の分解、また、温度によるタンパク質の変性を抑えるためである。外液は酸以外に水でも可能であるが可溶性タンパク質の収量を増やすには希酸で行う方が良い。さらに、酵素反応などを行う場合には、ｐHに影響を与えない程度の希酸が望ましい。透析中に酸可溶性及び酸不溶性粗タンパク質に分かれるので遠心操作で酸可溶性粗タンパク質を得ることができる。
【００２２】
酸可溶性粗タンパク質画分は希釈されているので、限外ろ過で濃縮して精製を行う。サンプルが酸性溶液に溶けていることから逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）が好ましいが、使用するカラムの選択はこれに限定しているものではない。また、使用する溶媒は、水系あるいは有機溶媒系などあるが、凍結乾燥が可能で、酵素反応に支障なないものが望ましい。溶出液を分画しながら、そのエラスターゼ阻害活性を測定して精製することができる。なお、精製過程のタンパク質は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で調べることによりバンドとして確認することができる。
【００２３】
２．本発明のタンパク質のエラスターゼ阻害活性の測定
本発明のタンパク質のエラスターゼ阻害活性の測定は、以下のようにして行うことができる。エラスターゼ酵素と、蛍光又は発色基質を含む反応液に、コントロール又はテスト検体を添加して反応させ、反応後に遊離する蛍光又は発色物を定量することによりエラスターゼ阻害活性を調べることができる。詳しくは実施例２に記載しているが、この方法で真珠層酸可溶性粗タンパク質を調べたところ、エラスターゼ阻害活性を見出した。
【００２４】
３．本発明のエラスターゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニングは以下に述べる方法によって行うことができる。
（１）DNAプローブの合成
以下に記載するｃDNAライブラリーから、本発明のタンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングするためのDNAプローブを作製する。本発明のタンパク質のN末端付近のアミノ酸配列に基づいてプローブは作製することができる。すなわち、アミノ酸のコドンに対応したDNA配列を用いる。例えば、Met（ATG）やTrp （TGG）のようにコドンの数が少ないものが望ましいが、混合塩基やイノシンを含むプローブでも可能である。プローブは、ジゴキシゲニン（DIG）、３２P-ATPなど、酵素を用いてラベルし検出が出来るようにする。
（２）ｃDNAライブラリーの作製
アコヤ貝外套膜から、真珠層を作るピース部組織（Mantle piece）を採取する。チオシアン酸グアニジン液存在下でホモジナイズし全RNAを単離し、オリゴｄTセルロースカラムを通しポリ(A) ｍRNAを調製する。これを用いて２本鎖のｃDNAを合成し、その両末端に制限酵素認識部位を有するアダプターを付与する。そのｃDNAをファージベクターに連結し、in vitro でパッケージングしてｃDNAライブラリーを作製する。
（３）プラークハイブリダイゼーション
ｃDNAを持つファージを大腸菌に感染させ、プレートに播きプラークを形成させる。ナイロン膜にプラークを移し、ファージDNAを１本鎖に変性させて膜に固定する。これに、ラベルしたプローブを加えハイブリダイゼーションを行い陽性プラークの検出を行う。さらに、プラークを希釈してハイブリダイゼーションを繰り返し行い、単一の陽性プラークを得る。
（４）シーケンシング
ファージから直接シークエンシングすることは難しいため、得られた陽性プラークからファージDNAを調製し、制限酵素によりｃDNAを切り出し、プラスミドベクター（例えばpUC19 等）にサブクローンする。大腸菌からプラスミドを調製し、ダイデオキシターミネーター法などで反応を行い、DNAシーケンサーで解析する。
【００２５】
４．本発明のエラスターゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のアコヤ貝組織での発現
本発明のエラスターゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子の発現は以下のRT-PCR(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)法で調べることができる。アコヤ貝の組織を採取し、変成剤の存在下でホモジナイズして全 RNA を調製する。そのRNAにForward及びReverse プライマー、逆転写酵素、Taq DNA ポリメラーゼ及びｄNTP等を加えた反応液をサーマルサイクラーにセットする。まず、逆転写酵素によりmRNAから一本鎖DNAを合成させ、次にTaq DNA ポリメラーゼによるDNA増幅（PCR）を行い、反応物をアガロースゲル電気泳動に供する。増幅されたDNAはmRNAの量に比例するため、DNAのバンドの濃淡で遺伝子発現のレベルを調べることができる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例によって更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
実施例１
１．本発明のエラスターゼ阻害タンパク質の抽出及び精製
（１）真珠層から酸可溶性粗タンパク質の抽出
アコヤ貝貝殻の外側の稜柱層部分を研磨することにより除去し、光沢のある真珠層を分離した。この真珠層を平均１０μm程度まで粉砕し、その粉末からタンパク質の抽出を透析膜中で行った。使用した膜はスペクトラムラボラトリー製、Cut off ３，５００で、真珠層粉末約１２．５gずつを４つ（合計５０g）透析膜に入れ、３N塩酸５mlを少しずつ加えた。この際、炭酸ガスが出てくるので間をとりながら、氷の中で冷やして粉末が溶解するまで手早く続けた。次に、０．０１N塩酸に対し４℃で透析を行った。透析外液は真珠層粉末５０gに対し、１０リッターの０．０１N塩酸を1日当たり２回交換した。４℃で４日間透析を行うと、大部分が沈殿となり透析膜の下に生じてくるので、８，０００rpm、４℃、２０分遠心し上清を得た。これを酸可溶性粗タンパク質と呼ぶが、複数のタンパク質の混合物である。なお、水に対して透析した場合と比較して回収量が４倍多いことがわかった。また透析中、この酸可溶性粗タンパク質液は貝殻粉末５０g当たり６００ml以上と容量が増えるため、限外ろ過（アミコン社製）で１０mg/ml程度に濃縮した。この時、低分子タンパク質をロスしないように膜はミリポア社のCut off ３，５００を使用した。得られた濃縮タンパク質のエラスターゼ阻害活性を調べた結果、その阻害活性があることが判明した。
【００２７】
（２）真珠層のエラスターゼ阻害タンパク質の精製
そこで、濃縮したタンパク質混合物から精製を行った。その酸可溶性粗タンパク質液を試料として逆相C１８カラム（X Bridge, Waters製）を用いたHPLCに供し、０．１％トリフルオロ酢酸（TFA）を含むアセトニトリルのリニアーグラジエントで１１フラクションに溶出した。それらを凍結乾燥し、１mg/ml濃度になるよう０．０２５％TFAを含む１０％アセトニトリルに再溶解して各フラクションのエラスターゼ阻害活性を反応液当たり５μgで調べた。高いエラスターゼ阻害活性を示すタンパク質の精製を試みた結果、最終的に２種類のタンパク質（以下、エラスターゼ阻害タンパク質Elastase inhibitory protein を Eipと略し、各々のタンパク質をEip-１及びEip-２と呼ぶ）のピークが隣り合って得られ、これらのピークを再度HPLCに供し単一ピークに分離した。この精製した２つのタンパク質（Eip-１及びEip-２）は水に可溶であり、さらにSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で調べた結果を図１のレーン２及び３に示すが、各々分子量１６ｋDaの位置に単一バンドとして検出できた(レーン１と４はサイズマーカーを示す)。
【００２８】
実施例２  
２．エラスターゼ阻害活性の測定
（１）本発明のタンパク質のエラスターゼ阻害活性の測定
ナカライテスク社のブタ膵臓由来エラスターゼを５０mM HEPES-buffer、 pH７．５ で１９units/mlに溶解して用いた。反応は、コントロール（Cと略す）又はテスト検体（Tと略す）を含む２００μlスケールで以下のように行った。８０μlの５０mM HEPES-buffer、 pH７．５と酵素液２０μlを混合し、Cに８０μlの超純水、Tに８０μlの超純水に溶解したEip-１又はEip-２を加え３７℃で５分間プレインキュベートした。その後、５０μMのSuc-Ala-Ala-Ala-MCA基質溶液２０μlを加え３７℃で１０分間反応した。これにメタノール：ブタノール：超純水＝７：６：７混合液を３００μl加え、反応を停止した。また、ブランク（B）は８０μlのHEPES-buffer、酵素液２０μl、８０μlの超純水を混合し３７℃で１０分間インキュベートし、反応停止液を３００μl加え、反応を停止した後、基質溶液２０μlを加えた。その後、反応液を全て１４，０００rpm、２分間遠心して上清を回収し遊離した蛍光物質アミノメチルクマリン（AMC）をマイクロプレートリーダー（励起波長３８０nm、蛍光波長４７０nm）で測定した。エラスターゼ阻害活性は以下のように相対活性として算出した。コントロール（C）とテスト（T）の値からブランク（B）値を差し引いたコントロール（C１）とテスト（T１）値を得る。
エラスターゼ阻害活性（％）＝｛（C１−T１） / C１｝× １００となる。
【００２９】
その結果を図２に示しているが、Eip-１及びEip-２は共に濃度依存的にエラスターゼ阻害作用を有し、５０％阻害率がEip-１では１．６μg、一方のEip-２では２μgであり僅かにEip-１の活性が高いことが分かった。  
【００３０】
（２）本発明のタンパク質の真珠層での役割
真珠層でのエラスターゼ阻害タンパク質の役割及び存在意義は不明である。そのため、そのタンパク質を含有する真珠層自身にエラスターゼ阻害活性があるかを調べた。粉末の表面積を増やすために真珠層をナノジェットマイザー（アイシンナノテクノロジーズ社、NJ５０）により平均１μmの微粉末とし、超純水で２０％に懸濁したものをテスト検体としてエラスターゼ阻害活性を調べた。その検体の分注はボルテックスしながら必要量をピペットマンで吸引して反応液に移して行い、それ以外の方法は前述の実施例２の（１）の要領で行った。
【００３１】
その結果を図３に示すが、真珠層微粉末だけでも濃度依存的にエラスターゼ阻害活性があることが分かった。一方、貝殻の主成分である炭酸カルシウム単独の懸濁液で調べた場合には、阻害活性は認められなかった。さらに、粒子サイズが平均１０μmと大きめの真珠層粉末を用いた場合でもエラスターゼ阻害活性が認められることから、真珠層自身にも活性が存在すると推定された。これらの結果から、貝殻真珠層に含まれるNei-１及びNei-２は、例えば外敵となる生物等の分泌するエラスターゼに対して、その活性を阻害し真珠層タンパク質を保護することで貝殻ならびに個体自身を守るという役割を担っている可能性が考えられる。
【００３２】
実施例３
３．本発明のエラスターゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニング
（１）精製タンパク質のN末端アミノ酸配列の解析
真珠層酸可溶性粗タンパク質から精製したEip-１及びEip-２中のアミノ酸配列を調べた。なお、システインは通常検出できないため、各タンパク質をピリジルエチル化した。方法は、各々３００pmolを１００μlの６M塩酸グアニジン、４mM  EDTA、５００mM  Tris塩酸緩衝液（ｐH８．５）に溶解し、１０％メルカプトエタノールを２．５μｌ加え窒素ガス置換を行い室温で２時間反応した。その後、４−ビニルピリジンを２μｌ加え、再び窒素ガス置換を行い室温で２時間反応させピリジルエチル化を行った。脱塩と試薬の除去は脱塩カラム（HiTrap Desalting、ファルマシア社）を用いて、溶離液として０．２Mアンモニア水を用いて脱塩し、凍結乾燥した。２０％アセトニトリル、０．０５％TFA溶液に再溶解し、各々のタンパク質についてN末端からのアミノ酸配列をアプライドバイオシステムズ社のプロテインシケンサーで調べた。その結果、Eip-１はN末端より２９残基（配列表の配列番号９）、一方のEip-２はN末端より３０残基（配列表の配列番号１０）まで決定した。なお、配列番号９のEip-１のアミノ酸配列番号１４のメインはValであるがIleも僅かに検出された。
Eip-１のN末端アミノ酸（配列番号９）;   IKHYDCSKPYCPAVYAPVCGLDGKTYGND
Eip-２のN末端アミノ酸（配列番号１０）; SNPHGCV---CPAIYDPVCGLDGKTYPNKCVLD
【００３３】
配列番号９のEip-１のアミノ酸配列番号１１〜２６と配列番号１０のEip-２のアミノ酸配列番号８〜２３（途中Eip-２の７番目の後に３アミノ酸のギャップを入れる）の配列は２残基を除いて（Eip-１の１４及び１６番目）同一配列であることが判明した。
【００３４】
（２）DNAプローブの合成及びラベル化
この配列（Eip-１のアミノ酸配列番号１５〜２６）を基に両方のプローブとして利用できる配列表の配列番号１１のDNA（３５mer）を合成した。その際、コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために混合塩基あるいはイノシンを使用した。
プローブ（配列番号１１）; ５’-TAIGTYTTICCRTCIARICCRCAIACIGGIKCRTA-３’
【００３５】
配列番号１１のプローブのラベルは、ベーリンガー・マンハイム社のジゴキシゲニン（DIG）オリゴヌクレオチド３’末端標識キットを用いた。２００pmolのプローブと１mMのDIG標識ダイデオキシウリジン三リン酸をターミナルトランスフェラーゼで３７℃、２０分間反応した。反応停止後、エタノール沈殿を行い０．１倍TE(１０mMトリス塩酸塩、１mM EDTA、ｐH８．０)に溶解した。
【００３６】
（３）ｃDNAライブラリーの作製
２０個体のアコヤ貝外套膜のピース組織（Mantle piece）を採取後、ファルマシア社のRNA Extraction kitのチオシアン酸グアニジン液でホモジナイズし、サンプルをセシウムトリフロロアセテート溶液に重層してスイング型ローターを用いた超遠心分離機で２７，０００rpm、１５℃、１６時間遠心した。遠心チューブの底に付着した全RNA７５０μgを回収し、プロメガ社のPolyATract  mRNA isolation systemを用いてpoly (A) mRNAを１０μg調製した。２μgのmRNAを用いて以下の方法でｃDNAを合成した（Universal Riboclone cDNAsynthesis system、プロメガ社）。オリゴ（ｄT）プライマーと逆転写酵素を用いて１本鎖DNA合成を行い、RNaseHによるRNA鎖の消化とDNAポリメラーゼによる２本鎖DNAの合成を行った。次に、T４DNAポリメラーゼを用いて平滑末端とし、Sephacryl S-400を用いたスピンカラムでｃDNAを溶出した。T４DNAライゲースによりEcoRI- NotIアダプター（ファルマシア社）を両末端に付与した後、T４キナーゼでアダプターをリン酸化して再度Sephacryl S-400を用いたスピンカラムでｃDNAを溶出した。このｃDNAに１μgのλgt１０ファージDNAのEcoRI部位に連結してｃDNAライブラリーを作製し、in vitro のパーケージング（Packagene Lamda DNA Packaging System、プロメガ社）を行った。パーケージング液の一部を希釈して、その３０μlを大腸菌C６００hflと混合して、３７℃で３０分感染させた。３mlのソフトアガロース（あらかじめ５０℃に温めておいた０．７％アガロース）を加えLBプレート上に播き、３７℃で８時間培養して直径１mm程度のプラークをカウントした結果、２．１X１０６のライブラリーが作製できた。
【００３７】
（４）遺伝子のクローニング
大腸菌C６００hflにパーケージングしたファージを感染させた後、シャーレに播いてプラーク（１２０，０００プラーク／１６枚シャーレ）を形成させた。プラークにアマシャム社のHybond N+ ナイロン膜を置くことによりファージを付着させ、ろ紙に湿らしたアルカリ溶液（０．５M NaOH/１．５M NaCl）上で１分、中和液（０．５M Tris-HCｌ/１．５M NaCl）上で５分、次に２X SSCで２分間膜を洗浄した後、８０℃、２時間ベーキングしDNAをナイロン膜へ固定した。プレハイブリダイゼーションは、５X SSC、１％ブロッキング溶液、０．１％ SLS、０．０２％ SDS、１００μg/ml変性サケDNA溶液中で４８℃、２時間行った。ハイブリダイゼーションは配列番号１１のDIGラベルのプローブ１５pmol/ml、４８℃、１４時間行い、同社のDIG標識核酸キットを用いてPositive plaqueの検出を行った。方法は、ナイロン膜を２X SSC、０．１％ SDS溶液で３回洗浄し、次に０．１X SSC、０．１％ SDS溶液で３回洗浄した。膜をマレイン酸緩衝液−０．３％ Tween２０に２分浸けて、マレイン酸緩衝液−１％ブロッキング液中で２８℃、２時間処理した。次に抗体による検出を行うため、ナイロン膜と５，０００倍に希釈した抗DIG抗体−アルカリ性ホスファターゼ（ALP）複合体を２８℃、３０分反応させ、マレイン酸緩衝液で２回洗浄、さらに発色液で１回洗浄した。ALPの発色基質NBT/BCIPを加え、室温で１時間発色させた。純水、EDTAを加え反応を止め発色プラークを調べた結果、８個発色していることが判った。ナイロン膜をサランラップで覆い、それをOHPでコピーし８個の陽性プラークと合わせ、各々パスツールピペットの大きい穴で突き刺して５００μlのSM溶液に懸濁し一次スクリーニングの保存液とした。二次スクリーニングは、この８個の保存液をプレート当たり１００程度のプラークを形成するよう希釈して一次スクリーニングで行った要領で行った。二次スクリーニングで６個のシングルプラークを分離した。λgt１０から挿入DNAを制限酵素EcoRI切り出しｐUC１９のEcoRIサイトへ挿入し大腸菌JM１０９を形質転換した。その大腸菌よりプラスミドDNAを調製し、BigDye Terminator Cycleシーケンスキットを用いて反応を行い、ｃDNAをシーケンスした（アプライドバイオシステムズ社、Genetic analyzer３１０）。その結果、Eip-１及びEip-２の部分配列をコードするクローンが各々１つ得られたが完全長のものはなかった。
【００３８】
そこで、今回判明した部分配列を基にEip-１をコードするAプローブの３５mer（配列表の配列番号１２）とEip-２をコードするBプローブの４１mer（配列表の配列番号１３）を合成し、DIGでラベルした。再度６４，０００プラークを播き２枚ずつナイロン膜にファージを付着させた後DNAを固定し、AおよびBプローブを用いて濃度１０pmol/ml、４５℃で別々にハイブリダイゼーションを行った。以降の操作は前述の要領で行った。
Aプローブ（配列番号１２）；５’-GGAATATCGTCTTTTAGTTATCATTGCTGCCTCTG-３’
Bプローブ（配列番号１３）；５’-GGATATGTCGAAGCAAGCAATCCTCACGGCTGCGTTTGCCC-３’
【００３９】
一次及び二次スクリーニング後、最終的には、Aプローブから３クローン、一方のBプローブから２クローンが得られた。それらをｐUC１９にサブクローニングしシーケンスを全て調べ、その塩基配列を基に遺伝情報処理ソフトウェア（GENETYX）によって解析した。その結果、Aプローブからの３クローンは、各々１６７アミノ酸から成る３種のタンパク質（Eip-１、 Eip-１A、及びEip-１Bと呼ぶ）をコードする遺伝子が存在することが明らかとなった（以下、各々Eip-１遺伝子、Eip-１A遺伝子、及びEip-１B遺伝子と呼ぶ）。それぞれの遺伝子は各々配列表の配列番号１〜３に、またタンパク質のアミノ酸配列は、各々配列表の配列番号５〜７に示す。
【００４０】
一方、Bプローブから得られた２クローンはどちらも同一で、１６４アミノ酸から成るEip-２（配列表の配列番号８）をコードする配列表の配列番号４のEip-２遺伝子であることが判明した。
【００４１】
配列表の配列番号１のEip-1のCDS（Coding Sequence）を基に他の２種類（配列表の配列番号２、３のEip-１A及びEip-１B）のCDS配列と比較した。まず、Eip-1A遺伝子では、配列番号１のEip-1遺伝子の塩基配列番号７４番のｇがｔ、８８番のｇがc、１０４番のcがｔ、１１９番のcがt、１２９番のgがa、１６４番のｔがa、２２４番のcがt、２３２番のgがa、２８１番のtがc、４６１番のtがc、４８８番のｇがaと１１塩基異なっていた。これらの塩基の置換によりアミノ酸レベルでは３残基（配列番号１のアミノ酸配列番号２１のGlyがAla、３５番のValがIle、６９番のSerがAsn）異なっていた。次に、Eip-１B遺伝子との比較では、配列番号１のEip-１遺伝子の塩基配列番号２６４番のcがｔに１塩基だけ異なっていた。その塩基の置換によりアミノ酸レベルでは１残基（配列番号１のアミノ酸配列番号８０番のProがSer）異なった。また、Eip-１AとEip-１Bの比較では、前述のものを合計した１２塩基の置換に伴い４アミノ酸異なることが明らかとなった。
【００４２】
（５）本発明の遺伝子から予想されるタンパク質の性質
Eip-１、 Eip-１AおよびEip-１Bの３つのタンパク質のホモロジーを比較したところ９８％以上と非常に高いことがわかった。同様に、Eip-１およびEip-２の比較では、Eip-２の配列番号４のアミノ酸番号２９〜３１に３つのギャップを入れた場合、７７％のホモロジーがあることが判明した。これら４つのタンパク質のアミノ酸配列のアライメントは図４に示す。
【００４３】
さらに、表１のように４つのタンパク質の物理化学的性質も明らかになった。これらのタンパク質は２１アミノ酸のシグナルペプチドを有する分泌性のタンパク質であり、成熟タンパク質の等電点はEip-１、 Eip-１AおよびEip-１Bの３つが共に７．７０、一方のEip-２は７．８２と少し異なることがわかった。また成熟タンパク質の分子量はいずれも約１６kDaで、実験例１のSDS-PAGEで調べた結果と一致することも判明した。
【表１】
2012187057.tif 000002
【００４４】
実施例４
本発明のEip-１遺伝子、Eip-１A遺伝子及びEip-２遺伝子のアコヤ貝組織での発現
（１）アコヤ貝組織から全RNA の調製
同一個体のアコヤ貝を用いて、外套膜は真珠層を作るピース部組織（Mantle piece）と稜柱層を作る膜縁部組織（Mantle edge）に分けて、それ以外の組織としてエラ、心臓および肝臓組織を採取しプロメガ社のSV Total RNA Isolation System を用いて全RNAを調製した。方法は、各組織約６０mgに対し３５０μlのLysis Buffer を加えホモジナイズし、その１７５μlを別のチューブに移した後、３５０μlのLysis Buffer を加えて混ぜた。７０℃で３分間加熱し、１４，０００rpmで１０分遠心した上清を回収した。遠心は３回行いその上清に２００μlの９５％エタノールを加えピペッテングしてよく混ぜた。それをキットのスピンバスケット−アッセンブリに入れ１４，０００rpmで１分遠心し、さらに６００μlの洗浄液を加え遠心した。スピンバスケットの膜上で、DNAse 処理を室温で１５分行い、２００μlの反応停止液を加え遠心後、洗浄操作を２回行い、最終的に１００μlのキット中の純水でRNAを溶出した。
【００４５】
（２）RT-PCRによる遺伝子発現の確認
キアゲン社のOne Step RT-PCR キットを用いて、各プライマー濃度０．３μM（配列表の配列番号１４〜１８）、５０ng RNA濃度で２５μlの反応液とした。サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社、モデル９７００）の条件は、逆転写酵素反応５０℃、３０分、PCR activation スッテプ９５℃、１５分反応し、次に、変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５８℃、４５秒）、伸長（７２℃、１分）の３反応を３５サイクル行い、最後に７２℃、１０分の伸長反応後、４℃で保存するプログラムで行った。
【００４６】
使用したプライマーは以下の通りで、配列表の配列番号１のEip-１遺伝子の発現は配列番号１４と１５プライマーを用いると、５０２bpの増幅DNAが期待できる。
Eip-１ Forward Primer（配列番号１４）；５’-TATAGAGGGAATCAAACATTACGAC-３’
Eip-１ Reverse Primer（配列番号１５）；５’-AGCATTCTACTTTGATGCCGAGAAG-３’
【００４７】
配列表の配列番号２のEip-１A遺伝子の発現は配列番号１５と１６プライマーを用いると、４７８bpの増幅DNAが期待できる。なお、Eip-１とEip-１AのReverse Primer は同じ配列であり、Eip-１A遺伝子では配列番号２の塩基配列番号の５４６〜５７０のAntisenseに相当する。
Eip-１A  Forward Primer（配列番号１６）；５’-TTGTAGTAAACCATATTGTCCTGCTA-３’
Eip-１   Reverse Primer（配列番号１５）；５’-AGCATTCTACTTTGATGCCGAGAAG-３’
【００４８】
配列表の配列番号４のEip-２遺伝子の発現は配列番号１７と１８プライマーを用いると、４７５bpの増幅DNAのが期待できる。
Eip-２ Forward Primer（配列番号１７）; ５’-GTCGAAGCAAGCAATCCTCACGGCT-３’
Eip-２ Reverse Primer（配列番号１８）;５’-CTGAGAAGCACATATTCTGATAGTC-３’
【００４９】
反応終了後、左レーン（M）に５７４bpと２４１bpのサイズマーカー、レーン１にピース組織、レーン２に膜縁部組織、レーン３にエラ、レーン４に心臓、レーン５に肝臓由来の反応物８μlを２％アガロースに供し電気泳動を行った。
【００５０】
図５にEip-１遺伝子、図６にEip-１A遺伝子、及び図７にEip-２遺伝子のRT-PCRの結果を示すが、いずれも真珠層を作る外套膜のピース組織では濃いバンドとして、稜柱層を作る外套膜の膜縁部組織では薄いバンドとして確認できた。一方、エラ、心臓、肝臓においてバンドは見られなかった。以上のことから、エラスターゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子はエラ、心臓、肝臓では発現されず、貝殻を作る外套膜組織で発現することが明らかとなった。
【図１】
2012187057.tif 000003
【図２】
2012187057.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2012187057000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年1月27日(2012.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号５〜８の何れかに示すアミノ酸配列を有するアコヤ貝貝殻由来のエラスターゼ阻害タンパク質。
【請求項２】
配列表の配列番号５〜７の何れかに示すアミノ酸配列において、１若しくは４個以下のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有するアコヤ貝貝殻由来のエラスターゼ阻害タンパク質。
【請求項３】
アコヤ貝の貝殻真珠層から得ることができ、SDS-PAGEで測定したときの分子量が１６ｋDaである請求項１又は請求項２のエラスターゼ阻害タンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載のエラスターゼ阻害タンパク質をコードする配列表の配列番号１〜４の何れかに示す塩基配列を有する遺伝子。
【請求項５】
請求項２に記載のエラスターゼ阻害タンパク質をコードする配列表の配列番号１〜３の何れかに示す塩基配列を有する遺伝子。
【請求項６】
配列表の配列番号１〜３の何れかに示すCDSにおいて、１若しくは１２個以下の塩基が置換された塩基配列を有する請求項５の遺伝子。
【請求項７】
アコヤ貝外套膜組織で発現する請求項４又は請求項５に記載の遺伝子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
請求項１の発明は、配列表の配列番号５〜８の何れかに示すアミノ酸配列を有するアコヤ貝貝殻由来のエラスターゼ阻害タンパク質に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
更に請求項２の発明は、配列表の配列番号５〜７の何れかに示すアミノ酸配列において、１若しくは４個以下のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有するアコヤ貝貝殻由来のエラスターゼ阻害タンパク質に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
更に請求項４の発明は、請求項１に記載のエラスターゼ阻害タンパク質をコードする配列表の配列番号１〜４の何れかに示す塩基配列を有する遺伝子に関する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
更に請求項５の発明は、請求項２に記載のエラスターゼ阻害タンパク質をコードする配列表の配列番号１〜３の何れかに示す塩基配列を有する遺伝子に関する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
【図１】図１は、本発明で得られるエラスターゼ阻害タンパク質（Elastase inhibitory protein）Eip-１及びEip-２のSDS-PAGEの写真である。
【図２】図２は、精製したEip-１及びEip-２のエラスターゼ阻害活性を示す図である。黒丸がEip-１、黒四角がEip-２を指す。
【図３】図３は、真珠層微粉末のエラスターゼ阻害活性を示す図である。
【図４】図４は、本発明で得られる４種類のタンパク質（Eip-１、 Eip-１A、Eip-１BおよびEip-２）のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。それぞれ配列表の配列番号５〜８のアミノ酸配列を指す。
【図５】図５は、Eip-１遺伝子の RT-PCR産物をアガロースゲル電気泳動した写真である。
【図６】図６は、Eip-１A遺伝子の RT-PCR産物をアガロースゲル電気泳動した写真である。
【図７】図７は、Eip-２遺伝子のRT-PCR産物をアガロースゲル電気泳動した写真である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
（４）遺伝子のクローニング
大腸菌C６００hflにパーケージングしたファージを感染させた後、シャーレに播いてプラーク（１２０，０００プラーク／１６枚シャーレ）を形成させた。プラークにアマシャム社のHybond
N+ ナイロン膜を置くことによりファージを付着させ、ろ紙に湿らしたアルカリ溶液（０．５M NaOH/１．５M NaCl）上で１分、中和液（０．５M
Tris-HCｌ/１．５M NaCl）上で５分、次に２X SSCで２分間膜を洗浄した後、８０℃、２時間ベーキングしDNAをナイロン膜へ固定した。プレハイブリダイゼーションは、５X
SSC、１％ブロッキング溶液、０．１％ SLS、０．０２％ SDS、１００μg/ml変性サケDNA溶液中で４８℃、２時間行った。ハイブリダイゼーションは配列番号１１のDIGラベルのプローブ１５pmol/ml、４８℃、１４時間行い、同社のDIG標識核酸キットを用いてPositive
plaqueの検出を行った。方法は、ナイロン膜を２X SSC、０．１％ SDS溶液で３回洗浄し、次に０．１X SSC、０．１％ SDS溶液で３回洗浄した。膜をマレイン酸緩衝液−０．３％
Tween２０に２分浸けて、マレイン酸緩衝液−１％ブロッキング液中で２８℃、２時間処理した。次に抗体による検出を行うため、ナイロン膜と５，０００倍に希釈した抗DIG抗体−アルカリ性ホスファターゼ（ALP）複合体を２８℃、３０分反応させ、マレイン酸緩衝液で２回洗浄、さらに発色液で１回洗浄した。ALPの発色基質NBT/BCIPを加え、室温で１時間発色させた。純水、EDTAを加え反応を止め発色プラークを調べた結果、８個発色していることが判った。ナイロン膜をサランラップ（登録商標）で覆い、それをOHPでコピーし８個の陽性プラークと合わせ、各々パスツールピペットの大きい穴で突き刺して５００μlのSM溶液に懸濁し一次スクリーニングの保存液とした。二次スクリーニングは、この８個の保存液をプレート当たり１００程度のプラークを形成するよう希釈して一次スクリーニングで行った要領で行った。二次スクリーニングで６個のシングルプラークを分離した。λgt１０から挿入DNAを制限酵素EcoRI切り出しｐUC１９のEcoRIサイトへ挿入し大腸菌JM１０９を形質転換した。その大腸菌よりプラスミドDNAを調製し、BigDye
Terminator Cycleシーケンスキットを用いて反応を行い、ｃDNAをシーケンスした（アプライドバイオシステムズ社、Genetic analyzer３１０）。その結果、Eip-１及びEip-２の部分配列をコードするクローンが各々１つ得られたが完全長のものはなかった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
配列表の配列番号１のEip-1のCDS（Coding
Sequence）を基に他の２種類（配列表の配列番号２、３のEip-１A及びEip-１B）のCDS配列と比較した。まず、Eip-1A遺伝子では、配列番号１のEip-1遺伝子の塩基配列番号７４番のｇがｔ、８８番のｇがc、１０４番のcがｔ、１１９番のcがt、１２９番のgがa、１６４番のｔがa、２２４番のcがt、２３２番のgがa、２８１番のtがc、４６１番のtがc、４８８番のｇがaと１１塩基異なっていた。これらの塩基の置換によりアミノ酸レベルでは３残基（配列番号５のアミノ酸配列番号２１のGlyがAla、３５番のValがIle、６９番のSerがAsn）異なっていた。次に、Eip-１B遺伝子との比較では、配列番号１のEip-１遺伝子の塩基配列番号２６４番のcがｔに１塩基だけ異なっていた。その塩基の置換によりアミノ酸レベルでは１残基（配列番号５のアミノ酸配列番号８０番のProがSer）異なった。また、Eip-１AとEip-１Bの比較では、前述のものを合計した１２塩基の置換に伴い４アミノ酸異なることが明らかとなった。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
Eip-１、 Eip-１AおよびEip-１Bの３つのタンパク質のホモロジーを比較したところ９８％以上と非常に高いことがわかった。同様に、Eip-１およびEip-２の比較では、Eip-２の配列番号８のアミノ酸番号２９〜３１に３つのギャップを入れた場合、７７％のホモロジーがあることが判明した。これら４つのタンパク質のアミノ酸配列のアライメントは図４に示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
さらに、表１のように４つのタンパク質の物理化学的性質も明らかになった。これらのタンパク質は２１アミノ酸のシグナルペプチドを有する分泌性のタンパク質であり、成熟タンパク質の等電点はEip-１、 Eip-１AおよびEip-１Bの３つが共に７．７０、一方のEip-２は７．８２と少し異なることがわかった。また成熟タンパク質の分子量はいずれも約１６kDaで、実施例１のSDS-PAGEで調べた結果と一致することも判明した。