(57)【要約】【課題】本発明は、ＴＧＦβの発現を抑制するのに有効なＴＧＦβ阻害剤を発現する遺伝的構築物を含む遺伝的に改変された細胞を、治療上有効量含む組成物（ここで遺伝的に改変された細胞は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）または小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）である）、およびその関連方法に関する。【解決手段】ＴＧＦβの発現を低減するのに有効なＴＧＦβ阻害剤を発現する遺伝的構築物を含む、治療上有効な量の遺伝的に改変された細胞を含む組成物であって、前記ＴＧＦβ阻害剤はアンチセンス又はリボザイムであり、前記遺伝的に改変された細胞は自己細胞及び／又は同種異系細胞である肺癌細胞である組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦβの発現を低減するのに有効なＴＧＦβ阻害剤を発現する遺伝的構築物を含む、治療上有効な量の遺伝的に改変された細胞を含む組成物であって、前記ＴＧＦβ阻害剤はアンチセンス又はリボザイムであり、前記遺伝的に改変された細胞は自己細胞及び／又は同種異系細胞である肺癌細胞である組成物。
【請求項２】
前記ＴＧＦβ阻害剤は、アンチセンスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＴＧＦβは、ＴＧＦβ−１である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＴＧＦβは、ＴＧＦβ−２である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
前記遺伝的に改変された細胞は、自己細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記遺伝的に改変された細胞は、同種異系細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記遺伝的に改変された細胞は、自己細胞および同種異系細胞の混合物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記遺伝的に改変された細胞は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記遺伝的に改変された細胞は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記遺伝的に改変された細胞は、免疫賦活性効果を有する１つまたはそれ以上のサイトカインをさらに発現する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記１つまたはそれ以上のサイトカインは、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１５、インターフェロン−α、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−α、トランスフォーミング成長因子−β、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、及び顆粒球コロニー刺激因子からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野 本発明は、ＴＧＦβの発現を抑制するのに有効なＴＧＦβ阻害剤を発現する遺伝的構築物を含む遺伝的に改変された細胞を、治療上有効な量を含む組成物（ここで、遺伝的に改変された組成物は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）または小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞である）、およびその関連方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明 肺癌は、依然として西洋の世界で最も一般的な癌であり、癌に関連する死亡原因の３０％を占める(Ramanathan and Belani, 1997)。肺癌を伴う患者の現時点での予後は低い。全体の治癒率は、１３％程度と低いものと推定される。１９９９年のアメリカ合衆国では、約１８０，０００人の新たな肺癌患者が予測される。これらの患者の大部分はその疾患により死亡し、１９９９年に全国的に肺癌による死亡者は１６０，０００人になると予測される。
【０００３】
肺癌の２つの主要な細分、すなわち１）非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および２）小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）が存在する。これらの２つの疾患においては、治療アプローチおよび自然史が異なる。アメリカ合衆国における肺癌の症例の大部分（８０％）は、ＮＳＣＬＣである。ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣの両方に関する重要な臨床的および予後的な要素が、過去２０年間で理解されてきたが、治療上の結果においてはわずかな改善しかされてこなかった。ＮＳＣＬＣを伴う患者のための唯一の治療的オプションは、腫瘍がまだ局在化している初期段階疾患（段階Ｉ＆ＩＩ）を有する患者における局所治療（外科的切除または局所照射）である。しかしながら、診断で、ＮＳＣＬＣを有する患者の大部分は、進行性疾患があり、外科手術だけでは治癒することはできない。進行段階の疾患において、全身性化学療法および／または照射は、目的とする応答および症状の一時的な緩和をもたらすことができるが、それらによっては、生存期間および生存率の改善は限られている。切除できない疾患を有する患者の生存中央値は、６〜１２ヶ月である。段階ＩＩＩＢおよびＩＶのＮＳＣＬＣに関する２年生存率は、それぞれ１０．８％および５．４％である。同様に、５年生存率は、３．９％および１．３％である。近年、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、トポテカン、イリノテカン、ビノレルビン、およびゲムシタビンを含む幾つかの新規薬剤が、ＮＳＣＬＣの治療のために利用可能となってきた。これらの薬剤は、従来の化学療法剤（エトポシド、シスプラチンおよびカルボプラチン）の改良物ではあるが、全体の治癒率は依然として低いままである。
【０００４】
ＳＣＬＣは、初期段階に、多くの場合に転移する非常に攻撃的な癌であり、それは、診断からの生存中間値がたった２〜４ヶ月である。外科的切除または放射線療法のような局部的な治療によっては、この癌の遠位の転移性のために、生存期間が長期になるのはまれである。化学療法を用いることにより、療法を施されていない患者と比較して少なくとも４〜５倍の生存中間値に生存を延ばすことができるが、５年目の全体の生存率は、依然としてたった５〜１０％である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
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【非特許文献４６】Swisher SG; Roth JA; Nemunaitis J; Lawrence DD; Kemp BL; Carrasco CH; Connors DG; El-Naggar AK; Fossella F; Glisson BS; Hong WK; Khuri FR; Kurie JM; Lee JJ; Lee JS; Mack M; Merritt JA; Nguyen DM; Nesbitt JC; Perez-Soler R; Pisters KM; Putnam JB Jr; Richli WR; Savin M; Waugh MK; et al. Adenovirus-mediated p53 gene transfer in advanced non-small-cell lung cancer. J. Natl. Cancer Inst. 5;91 (9):763-71, 1999
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在の治療方法によっては、ＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣ患者の段階にて、平均余命が有意に延長できないため、これらの患者のための新規治療的アプローチを探究することは当然である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
種々の組織源の腫瘍を有する患者は、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦβ）のレベルが上昇している。ＴＧＦβは、免疫抑制と関連した成長因子である。患者の免疫系が抑制されると、まず、腫瘍を認識および破壊する能力がなくなる。さらに、患者の免疫性の抑制により、患者は頻繁に感染しやすくなる。ＴＧＦβの産生を阻止するように遺伝子的に操作した腫瘍細胞を注射すると、遺伝子改変細胞が強力なワクチンとなり、それがその腫瘍に対する免疫系により認識され、かつその免疫系を活性化することができる。続いて免疫系の活性化は、宿主生体において変更されていない親腫瘍の認識および抑制を引き起こす。この現象は、動物腫瘍モデルにて、およびヒトの臨床試験にて適用される。したがって、本発明者等は、非小細胞肺癌段階および小細胞肺癌段階を有する患者においてこのアプローチを使用することを提案する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
肺癌は、アメリカ合衆国において癌に起因するすべての死亡原因のうちの３０％を占める(Ramanathan and Belani, 1997)。肺癌の全体の治癒率は、１３％であり、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を有する患者の現時での予後は、依然として低いままである。
【０００９】
進行性の腫瘍成長を伴う患者は免疫機能が弱まっているということが立証されている(Jakowlew et al. 1995, Ransohoff et al 1991; Holladay et al. 1992a; Holladay et al. 1992b)。この機能障害は、一般的に顕著な免疫の応答性の低下を特徴とし、それは腫瘍に特異的な免疫性だけでなく、むしろ免疫系全体にわたって観察されることが多い。この機能障害は、特に細胞性およびＴ細胞分画（コンパートメント）にて明らかであり、Ｔ細胞リンパ球の減少、ならびに腫瘍特異的刺激および非腫瘍特異的刺激の両方に対するＴ細胞の応答性が低下することを特徴とする(Ransohoff et al. 1991)。腫瘍が免疫監視機構を逃れ得る１つの方法は、ＭＨＣクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の発現をより低レベルにすることによるものである。さらに腫瘍は、ＴＧＦβのような免疫抑制剤分子の発現を増加することにより免疫監視機構を逃れ得る。これらの機構の組合せを利用する腫瘍は一般的に知られている。
【００１０】
遺伝子治療は、近年かなりの注目を集めている。腫瘍抗原提示を増大させ、特定の抗腫瘍免疫性を誘発するように設計した腫瘍細胞をワクチン接種をすることは、期待されたにもかかわらず、限られた結果しかもたらさなかった(Holladay et al. 1992)。癌生物学およびベクター技術における開発について本発明者等が理解を進展させたことにより、腫瘍ワクチンアプローチが治療に用いられる可能性を前進させている。特定の腫瘍抑制剤遺伝子、免疫モジュレーター、薬剤感受性遺伝子およびアンチセンス遺伝子切片を発現するように、ワクチン接種用の腫瘍細胞を遺伝的に改変することは今や可能である(Huber et al. 1991; Culver et al. 1992; Trojan et al. 1992; Dranoff et al. 1993; Ram et al. 1993; Trojan et al. 1993; Swisher et al. 1999)。特に、前臨床および臨床研究は、肺癌の治療における遺伝子治療アプローチの可能性を実証する。前臨床肺癌モデルでは、サイトカインＧＭ−ＣＳＦおよび薬剤感受性遺伝子を発現するように遺伝的に改変された同種異系肺癌系である、同系の骨髄由来の樹状細胞が混入する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼを用いて、樹立腫瘍の後退および免疫原性の増大が示された(Miller et al. 1998)。レトロウイルス遺伝子治療を用いた患者における第Ｉ相臨床試験の予備的結果は、遺伝子治療が十分に耐容性であり、毒性がないことを示す(Swisher et al. 1998)。
【００１１】
トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）は、多くの正常細胞型および腫瘍性細胞型の成長ならびに機能を調節する多機能タンパク質の一科である(Sporn et al. 1986; Massague 1987; Border and Rouslahti 1992; Jachimczak et al. 1993)。ＴＧＦβは、様々な細胞型に対して広範な効果を発揮し、細胞成長を刺激または抑制し、アポトーシスを誘導し、血管新生を増加させることがわかっている(Merzak et al. 1994; Jennings et al. 1994; Ashley et al. 1998a; Ashley et al. 1998b; Jennings et al. 1998)。これらの効果は、シグナルの形質導入段階で伝達される。ＴＧＦβシグナル伝達は、２０種以上の遺伝子の発現に影響を及ぼすことが見出されている(Baker and Harland 1997; Heldin et al. 1997; Stiles 1997; Yingling et al. 1997)。
【００１２】
ＴＧＦβは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３として知られる３つのイソ体で存在する。それらのアミノ酸配列は、７０〜８０％程度の相同性を示す。ヒトＴＧＦβタンパク質およびそれらをコードしている遺伝子は、当該技術分野で既知である。具体的には、ヒト供給源由来のＴＧＦβ１ ｍＲＮＡ（GenBank アクセッション番号第ＸＭ ００８９１２号および第ＮＭ０００６６０号）、ＴＧＦβ２ ｍＲＮＡ（GenBank アクセッション番号第ＸＭ００１７５４号および第ＮＭ ００３２３８号）、およびＴＧＦβ３ ｍＲＮＡ（GenBank アクセッション番号第ＸＭ ００７４１７号）が立証されている。
【００１３】
ＴＧＦβ受容体タンパク質は、Ｉ型（５５ｋＤａ）またはＩＩ型（７０ｋＤａ）であり得る。ＴＧＦβ受容体タンパク質およびそれらをコードしている遺伝子もまた、当該技術分野で既知である。ヒトＴＧＦβ受容体Ｉ型 ｍＲＮＡ（GenBank アクセッション番号第ＸＭ ００５５９１号）およびヒトＴＧＦβ受容体ＩＩ型 ｍＲＮＡ(GenBank アクセッション番号第ＸＭ ００３０９４号）は、当該技術分野で文献公知である。
【００１４】
ＴＧＦβスーパーファミリーのサイトカインは、特定セリン／トレオニンキナーゼ受容体に結合し、Ｓｍａｄタンパク質を通じて細胞内シグナルを伝達する。リガンドを刺激すると、Ｓｍａｄは、核へと移動し、転写複合体の構成成分として機能する。ＴＧＦβシグナル伝達は、様々な機構により正および負に調節される。正の調節は、生物活性に十分なレベルにシグナルを増幅する。負の調節は、細胞外レベル、膜レベル、細胞質レベルおよび核レベルにて生じる。
【００１５】
ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣを含む多くの腫瘍は、活性ＴＧＦβの産生が高レベルである(Constam et al. 1992; Eastham et al. 1995; Friedman et al. 1995; Jakowlew et al.
1995; Kong et al. 1995; Yamada et al. 1995; Eder et al. 1996)。ＴＧＦβレベルの上昇はまた、免疫抑制と関連していた(Sporn et al. 1986; Massague 1987; Bodmer et al. 1989; Border and Rouslahti 1992; Chen et al. 1997)。ＴＧＦβは、抗原刺激に応答してＴ細胞が活性化するのを抑制する。さらに、ＴＧＦβは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ならびにリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞の誘発および増殖に対する拮抗的効果を有する(Rook et al. 1986; Kasid et al. 1988; Tsunawaki et al. 1988; Hirte et al. 1991; Ruffini et al. 1993; Naganuma et al. 1996)。これを支持して、ＴＧＦβレベルと生存間の相関関係が結腸癌にて実証された(Friedman et al. 1995)。再発率は、腫瘍のＴＧＦβの産生が低レベルである患者に比べて、腫瘍のＴＧＦβの産生が高レベルである患者において１８倍も高かった。この相関関係は、原発性の腫瘍の結節状態および分化の度合いとは無関係であった。
【００１６】
免疫抑制というＴＧＦβの役割を考慮して、本発明者等は、ＮＳＣＬＣ腫瘍ワクチン接種によるＴＧＦβ抑制の効果を評価することを試みた。ＴＧＦβ阻害剤アプローチを用いて、本発明者等は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３、ならびにそれらの混合物から選択されるＴＧＦβアンチセンスで多数のＮＳＣＬＣ細胞をトランスフェクトした。ＴＧＦβ２アンチセンスは、ＴＧＦβ１アンチセンス、またはＴＧＦβ１アンチセンスおよびＴＧＦβ２アンチセンスの組合せと比べて、ＴＧＦβ発現をダウンレギュレートする点で優れていることが実証されていることから選択された。次にこれらの遺伝的に改変されたＮＳＣＬＣ細胞は増殖を防止するために照射され、多数の異なる動物腫瘍被験体に注射された。本発明者等は、ワクチンの構成成分としてこれまで無効だったＮＳＣＬＣ細胞をかかる遺伝的改変により有効にさせることができることを見いだした。ＴＧＦβ発現の阻止は、これらの動物の免疫原性を増加させた。さらに、かかるワクチン接種は、これまでに内植した腫瘍を根絶させ、腫瘍攻撃から動物を保護した。
【００１７】
免疫抑制におけるＴＧＦβの役割を考慮して、本発明者等は、ＳＣＬＣ腫瘍ワクチン接種によるＴＧＦβ抑制の効果を評価することを企図する。ＴＧＦβ阻害剤アプローチを用いて、本発明者等は、ＴＧＦβ１アンチセンス、ＴＧＦβ２アンチセンスおよびＴＧＦβ３アンチセンス、ならびにそれらの混合物から選択されるＴＧＦβアンチセンスで多数のＳＣＬＣ細胞をトランスフェクトすることを企図する。次にこれらの遺伝的に改変されたＳＣＬＣ細胞は増殖を防止するために照射され、多数の異なる動物腫瘍被験体に注射された。本発明者等は、ワクチンの構成成分としてこれまで無効だったＳＣＬＣ細胞をかかる遺伝的改変により有効にさせることができることを見いだすことを企図する。ＴＧＦβ発現の阻止は、これらの動物の免疫原性を増加させるものと企図される。さらに、かかるワ
クチン接種は、これまでに内植した腫瘍を根絶させ、腫瘍攻撃から動物を保護するものと企図される。
【００１８】
本発明者等は、ＮＳＣＬＣ腫瘍モデルにおいてこのアプローチの有効性を示した。ＫＬＮ−２０５ ＮＳＣＬＣ腫瘍モデルにおいて、５×１０5個の照射ＴＧＦβ２アンチセンス遺伝子で改変された自己ＮＳＣＬＣ細胞を、２回の注射で、ＤＢ２マウスにワクチン接種した。これにより、接種後の１０6個の未改変ＫＬＮ−２０５ ＮＳＣＬＣ細胞による腹腔内（ｉ．ｐ．）腫瘍攻撃に対して、動物を保護することが可能であった。この肺癌腫瘍モデルにおける腫瘍根絶実験では、１週齢の腫瘍を有する動物に、ＴＧＦβ２アンチセンス遺伝子改変細胞のワクチンの接種をすると、顕著な腫瘍後退を生じ、ワクチンの接種をしなかった対照群と比較して、腫瘍が発生することなく生存期間が延長した。
【００１９】
Fakhrai et al. 1996は、ラットの神経膠腫瘍においてこのアプローチの有効性を実証した。９Ｌ神経膠肉腫腫瘍モデルにおいて、Fisher-344ラットに、わずか３００個程度と少ない数の腫瘍細胞を頭蓋内移植したところ、６週後に９９％を超える致死率をもたらした。Fakhrai et al. 1996は、ラットの脳に５×１０3個の腫瘍細胞を移植し、腫瘍ワクチン接種を施した。ＴＧＦβ２アンチセンス改変９Ｌ細胞またはＩＬ−２を分泌するように遺伝的に改変されたＴＧＦβ２アンチセンス改変９Ｌ細胞で免疫化された動物は、研究の継続期間、腫瘍が発生しない状態のままであった（２４匹のうちの２４匹、すなわち腫瘍が発生することなく生存した率は１００％）。対照的に、空のベクターを含む細胞で免疫化した対照群の大部分（１５匹のうちの２匹以外）は、腫瘍の発達が見られ、５週以内に安楽死させなくてはならなかった（腫瘍が発生することなく生存した率は１３％、ｐ＜０．０１）。
【００２０】
Liau et al. 1998は、ラットＣ−６神経膠腫腫瘍モデルにおいてＴＧＦβ２アンチセンス遺伝子治療の同様の有効性を実証した。Dorigo et al. 1998は、マウス卵巣奇形腫（ＭＯＴ）腫瘍モデルにおいてこのアプローチの有効性を示した。しかしながら、ＴＧＦβアンチセンスおよびＩＬ−２遺伝子改変細胞を接種した群のみが、続く腫瘍細胞攻撃から有意に保護され、したがって、このアプローチの経験論が確立された。他のグループにおいても、培養細胞および動物腫瘍モデルにおいてＴＧＦβ遺伝子治療の同様の抗腫瘍効果を実証した(Kim et al. 1997)。
【００２１】
遺伝子治療は、近年かなりの注目を集めている。腫瘍抗原提示を増大させ、特定の抗腫瘍免疫性を誘発するように設計した腫瘍細胞のワクチンの接種は、期待できるが、限られた結果しかもたらさなかった。癌生物学およびベクター技術開発について本発明者等が理解を進展させたため、腫瘍ワクチンの治療的可能性を前進させている。特定の腫瘍抑制剤遺伝子、免疫モジュレーター、薬剤感受性遺伝子およびアンチセンス遺伝子断片を発現するように、ワクチン接種用の腫瘍細胞を遺伝的に改変することは今や可能である(Huber et al. 1991; Culver et al. 1992; Trojan et al. 1992; Dranoff et al. 1993; Ram et al. 1993; Trojan et al. 1993)。
【００２２】
多くの臨床研究においては、脳癌、皮膚癌、結腸癌および乳癌のための免疫療法的治療の主要構成成分として、遺伝的に改変された同種異系細胞が評価されてきた。ワクチン療法は、安全であり、体液性および細胞性抗ワクチン免疫応答を発生させることがわかった。ＮＳＣＬＣを有する患者において遺伝子治療を用いた幾つかの第Ｉ相臨床試験からの予備結果からも、このＮＳＣＬＣ患者集団(Dubinett, 1998; Roth, 1998; Swisher et al. 1998)、ならびにＳＣＬＣ患者集団についての遺伝子治療アプローチの安全性が実証された。
【００２３】
複数のグループが、多数の動物腫瘍モデルおよび臨床の両方で、遺伝子治療の領域の経
験則を実証した（例えば、Fakhrai et al. 1995; Sobol et al. 1999)。ＦＤＡ（連邦食品薬品管理局）は、癌を有する患者における遺伝子改変ワクチン接種の研究について、申請された少なくとも４つの以下のＩＮＤをこれまでに承認した：
・Sobol et al., BB-IND # 5812: 「インターロイキン−２（ＩＬ−２）を分泌するように遺伝的に改変され、照射された自己腫瘍細胞および線維芽細胞を結腸癌腫患者に注射すること。第Ｉ相研究(Injection of colon carcinoma patients with autologous irradiated tumor cells and fibroblasts genetically modified to secrete interleukin-2 (IL-2). A Phase I study)」
・Sobol et al., BB-IND #4840: 「インターロイキン−２（ＩＬ−２）を分泌するように遺伝的に改変された腫瘍細胞または線維芽細胞を用いた神経膠芽細胞の活性免疫療法(Active immunotherapy of glioblastoma with tumor cells or fibroblasts genetically modified to secrete interleukin-2 (IL-2)」
・Sobol et al., BB-IND #7483: 「結腸直腸癌腫を有する患者について、インターロイキン−２を分泌するように遺伝的に改変された同種異系線維芽細胞と混合し、Ｂ７．１を発現するように遺伝的に改変された同種異系腫瘍細胞（ＣＤ８０）の第Ｉ相研究(A Phase I
Study of Allogeneic Tumor Cell Genetically Modified to Express B7.1 (CD80) Mixed with Allogeneic Fibroblasts Genetically Modified to Secrete IL-2 in Patients with Colorectal Carcinoma)」
・Fakhrai et al. BB-IND #6658: 「第Ｉ相臨床試験のための提案：照射されたＴＧＦβ２アンチセンス遺伝子改変自己腫瘍細胞を悪性神経膠腫患者へ注射することの安全性の第Ｉ相研究(Proposal for a Phase I Clinical Trial: A Phase I Study of the Safety of
Injecting Malignant Glioma Patients with Irradiated TGFβ2 Antisense Gene-Modified Autologous Tumor Cells)」
【００２４】
BB-IND #6658では、ＦＤＡは、重度な神経膠腫を有する患者においてＴＧＦβ２アンチセンス遺伝子治療を評価する第Ｉ相ＩＮＤを承認した。患者に、ＴＧＦβ２アンチセンスプラスミドで遺伝的に改変された自己神経膠腫腫瘍細胞をワクチン接種して、ＴＧＦβ２の発現を阻止した。治療は、最初の４ヶ月は３週毎に、それ以降は１〜２ヶ月毎に５×１０6、１×１０7または２×１０7個の細胞を皮内注射することにより構成された。現在までに、５人の患者を治療してきた。同じＩＮＤのもとで、ＦＤＡは、小児神経膠腫を有する患者において、同じＴＧＦβ２アンチセンスベクターで遺伝子改変され、部分的にハプロタイプが適合した同種異系神経膠腫細胞系の使用を特別に承認した。
【００２５】
治療全体は、十分に耐容性であり、きわめて低度の一過性の毒性だけが報告された。完全血球算定、血清化学に関して、および尿検査のモニタリング時における、免疫化部位における有意の副作用も、治療に関連した異常性も観察されなかった。幾つかの場合では、ＴＧＦβ２アンチセンス遺伝子改変自己腫瘍細胞の第２回目および第３回目の皮下注射後に、注射部位にて一過性の穏やかな紅斑が観察された。
【００２６】
増加したレベルのＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋エフェクター細胞が、注射部位で浸潤していることが、二次腫瘍生体組織検査にて観察された。注射部位における生検材料、および続く作用で得られる腫瘍について免疫組織検査したところ、遺伝子治療の開始前に採取した生検材料と比べて、有意に多量の免疫が浸潤していることを実証した。
【００２７】
治療した５人の患者のうち、１人の患者が臨床的応答を示し、２人の患者が免疫応答の増加を示し、１人の患者が腫瘍進行を示したが、５人目の患者はなお治療を受けている。臨床的応答を示した患者においては、全腫瘍サイズの適度の変化が見られる治療開始後の三ヶ月の間、約６週間隔で全体のＭＲＩスキャンを実施した。デカドロンにおける変化に関連して、腫瘍周囲の浮腫が一進一退している様子を観察することができた。しかしながら、応答の３ヶ月後に、さらなる改善をして、７ヶ月までには腫瘍後退していることが、
ＭＲＩスキャンによって明らかになった。
【００２８】
したがって、第Ｉ相臨床試験により、５×１０6、１×１０7、または２×１０7のＴＧＦβ２アンチセンス遺伝子改変自己腫瘍細胞またはハプロタイプ適合腫瘍細胞を患者に注射することは安全性のあることが実証された。さらに、このワクチン接種療法により見られる免疫原性の増加および予備臨床的応答の認識が進んでいる。本発明者等は、ＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣを有する患者におけるこの遺伝子治療アプローチの適用を企図する。
【００２９】
本発明は、治療上有効な量の、ＴＧＦβの発現を低減するのに有効なＴＧＦβ阻害剤を発現する遺伝的構築物を含む遺伝的に改変された細胞を被験体に投与することを含む、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）または小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を有する被験体の生存を延ばすための方法および組成物を含み、ここで遺伝的に改変される細胞は、ＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣ細胞である。ＴＧＦβを無効にするか、またはＴＧＦβ遺伝子の発現（転写または翻訳）を抑制するいかなる方法をも、被験体の生存を達成するのに使用することができる。かかるアプローチは、治療用途のために、すなわちＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣを治療するのに有用であり得る。
【００３０】
一実施形態では、生存治療様式は、例えば、ＴＧＦβ ｍＲＮＡ転写物の翻訳を低減もしくは抑制するためのアンチセンスまたはリボザイムアプローチを用いて、ＴＧＦβ遺伝子の転写を抑制する三重らせんアプローチを用いて、あるいはＴＧＦβ遺伝子もしくはその内因性プロモーターを不活性化または「ノックアウト」するための標的相同組換えを用いて、内因性ＴＧＦβ遺伝子発現レベルを低減するように設計され得る。
【００３１】
アンチセンスアプローチには、ＴＧＦβ ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の設計が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的ＴＧＦβ ｍＲＮＡ転写物に結合し、翻訳を防止するであろう。絶対的な相補性が好ましいが、必須ではない。本明細書で称する場合、ＲＮＡの一部に対する配列「相補性」とは、そのＲＮＡとハイブリダイズすることが可能であるのに十分な相補性を有する配列であって、安定な二重鎖を形成することのできる配列を意味する。したがって、二重鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が試験されてもよく、または三重鎖形成がアッセイされてもよい。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性および長さの両方に依存するであろう。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、ＲＮＡとの誤った塩基対合を多く含有する可能性があるものの、安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を形成しうる。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融解温度を確定するための標準的手法を用いて、塩基対合の誤りの許容度を確認することができる。
【００３２】
メッセージの５’末端、例えばＡＵＧ開始コドンまでを含んでいる５’非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を抑制する際に最も有効に作用すべきである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列も同様に、ｍＲＮＡの翻訳の抑制時に有効であることがわかっている。概して、Wagner, R., 1994, Nature 372:333-335を参照されたい。したがって、ＴＧＦβの５’または３’非翻訳の非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性ＴＧＦβ ｍＲＮＡの翻訳を抑制するために、アンチセンスアプローチにて使用することができる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖はまた、本発明により使用することができる。ＴＧＦβ ｍＲＮＡの５’−、３’−またはコード領域のいずれにハイブリダイズするように設計されていようと、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、好ましくは６〜約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオドである。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
【００３３】
標的配列の選択に関係なく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、遺伝子発現を抑制する能力を定量するために、まずインビトロでの研究がなされることが好ましい。これらの研究は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス遺伝子抑制と、非特異的生物学的効果とを区別するための対照を利用することが好ましい。これらの研究は、標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルを、内部対照ＲＮＡまたはタンパク質のレベルと比較することもまた好ましい。さらに、アンチセンスアリゴヌクレオチドを用いて得られる結果は、対照オリゴヌクレオチドを用いて得られる結果と比較することが企図される。対照オリゴヌクレオチドは、試験するオリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであることが好ましく、その対照オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的配列に対して特異的にハイブリダイズすることがない程度に、アンチセンス配列と異なることが好ましい。
【００３４】
オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはそれらのキメラ混合物または誘導体または修飾体であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸バックボーンを修飾され得る。オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付属基（例えば、宿主細胞受容体を標的化するため）、または細胞膜を通過する輸送を容易にする作用物質を含んでもよい（例えば、Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556、Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652、ＰＣＴ国際公開第８８／０９８１０号（１９９８年１２月１５日に公開）を参照）。
【００３５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含むが、これらに限定されない群から選択され、少なくとも１つの修飾塩基部分を含んでもよい。
【００３６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含むが、これらに限定されない群から選択される、少なくとも１つの修飾糖部分を含んでもよい。
【００３７】
さらなる別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール、またはそれらの類縁体からなる群から選択され、少なくとも１つのリン酸バックボーンを含む。
【００３８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機（例えば、Biosearch, Applied Biosystems等から市販されている）を用いて、当該技術分野で周知の標準的な方法
により合成され得る。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Stein等の方法により合成されてもよく(1988, Nucl. Acids Res. 16:3209)、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御孔グラスポリマー支持体(Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451)等を用いて調製することができる。
【００３９】
しかしながら、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度を達成するのは多くの場合困難である。したがって、利便性のよいアプローチとして、アンチセンス配列が強力なプロモーターの制御下に置かれている組換えＤＮＡ構築物を利用する方法がある。標的細胞をトランスフェクトするためにかかる構築物を使用すると、内因性ＴＧＦβ転写物に相補的な塩基対を形成し、それによりＴＧＦβ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するであろう一本鎖ＲＮＡの転写を十分に生じる結果となろう。例えば、細胞に取り込まれ、アンチセンスＲＮＡの転写を誘導するようなベクターが導入され得る。かかるベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを産生するように転写され得る限り、エピゾームとしてとどまるか、あるいは染色体に組み込まれ得る。かかるベクターは、当該技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技法により構築することができる。ベクターは、哺乳動物細胞における複製および発現のために使用されるプラスミド、ウイルスまたは当該技術分野で既知の他のものであり得る。アンチセンスＲＮＡをコードする配列を発現させるプロモーターは、哺乳動物、好ましくはヒト細胞において作用することが当該技術分野で既知であるいかなるプロモーターによるものであり得る。かかるプロモーターは、誘導性であっても構成的であってもよい。かかるプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310)、ラウス肉腫ウイルスの３’長い末端反復配列（ＬＴＲ）に含入されるプロモーター(Yamamoto et al., 19ｋ80, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
ＴＧＦβ ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように分子設計されたリボザイムもまた、ＴＧＦβ ｍＲＮＡの翻訳およびＴＧＦβの発現を防止するのに使用することができる（例えば、１９９０年１０月４日に公開されたＰＣＴ国際公開第９０／１１３６４号; Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225を参照）。特異的認識配列の部位でｍＲＮＡを切断するリボザイムは、ＴＧＦβ ｍＲＮＡを破壊するのに使用することができるが、ハンマーヘッドリボザイムを使用することが好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成するフランキング領域により指示される位置にてｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの塩基配列、すなわち５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築および産生は、当該技術分野で既知であり、Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591により完全に記載されている。ＴＧＦβ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列内には、数百もの潜在的なハンマーヘッドリボザイムによって切断され得る部位が存在する。好ましくは、リボザイムは、切断認識部位がＴＧＦβ ｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように、すなわち効率的に増加して、非機能性ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最低限に押さえるように操作される。
【００４１】
本発明のリボザイムはまた、テトラヒメナ(Tetrahymena Thermophila)にて天然に存在し（ＩＶＳまたはＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして知られる）、Thomas Cechおよび共同研究者により広範に記載される(Zaug, et al., 1984, Science, 224:574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231:470-475; Zaug, et al., 1986, Nature, 324:429-433; University Patentsによる国際特許出願国際公開第８８／０４３００号;Been and Cech, 1986, Cell, 47:207-216)もののようなＲＮＡエンドヌクレアーゼ（これ以降、「Cech型リボザイム」）を含む。Cech型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする８塩基対の活性部位を有し、ハイブリダイズした後、標的ＲＮＡの切断が起こる。本発明は、ＴＧＦβに存在する８塩基対の活性部位配列を標的とするCech型リボザイムを含む。
【００４２】
アンチセンスアプローチにおける場合と同様に、リボザイムは、修飾されたオリゴヌクレオチドから構成され（例えば、安定性、ターゲティング等の改良のために）、ＴＧＦβを発現する標的細胞に送達される必要があり得る。送達のための利便性の高い方法は、トランスフェクトされた細胞が内因性ＴＧＦβメッセージを破壊し、翻訳を抑制するのに十分な量のリボザイムを産生するように、強力なプロモーターの制御下にてリボザイムをコードするＤＮＡ構築物を用いることを含む。アンチセンス分子と異なってリボザイムは触媒性であるので、効果を発現する細胞内濃度はアンチセンス分子の場合より低濃度でよい。
【００４３】
内因性ＴＧＦβ遺伝子発現はまた、標的化した相同的組換えすることにより、ＴＧＦβ遺伝子またはそのプロモーターを不活性化あるいは「ノックアウト」することにより低減され得る（例えば、Smithies et al, 1985, Nature 317:230-234; Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51:503-512; Thompson et al., 1989 Cell 5:313-321を参照）。例えば、内因性ＴＧＦβ遺伝子（ＴＧＦβ遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）に相同的であるＤＮＡに隣接する（ｆｌａｎｋｅｄ）突然変異体の非機能性ＴＧＦβ（または完全に関連のないＤＮＡ配列）は、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーとともに使用して、またはそれらを用いることなく使用して、ＴＧＦβを発現する標的細胞をトランスフェクトすることができる。標的化した相同的組換えによるＤＮＡ構築物の挿入は、ＴＧＦβ遺伝子の不活性化を生じる。
【００４４】
あるいは、内因性ＴＧＦβ遺伝子発現は、ＴＧＦβ遺伝子の調節領域（すなわち、ＴＧＦβプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列をターゲティングして、標的細胞におけるＴＧＦβ遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成することにより低減され得る（一般に、Helene, C. 1991, Anticancer Drug Des., 6(6):569-84; Helene, C., et al., 1992, Ann, N.Y. Accad. Sci., 660:27-36; およびMaher , L.J., 1992. Bioassays 14(12): 807-15を参照）。
【００４５】
本発明のさらなる別の実施形態では、ＴＧＦβの活性を、「優性ネガティブ」アプローチを用いて低減し、被験体の生存という目的を達成しうる。この目的のために、欠損ＴＧＦβをコードする遺伝的構築物を用いて、隣接細胞におけるＴＧＦβの活性を減少させることができる。例えば、ドメインが欠失しているＴＧＦβ、またはドメインが突然変異しているＴＧＦβの発現を誘導するヌクレオチド配列を、標的細胞に導入することができる。あるいは、標的相同組換えを利用して、標的細胞の内因性ＴＧＦβ遺伝子に、かかる欠失または突然変異をさせることができる。操作した細胞は、非機能性サイトカイン（すなわち、その天然の受容体に結合することは可能であるが、シグナル伝達は不可能なサイトカイン）を発現するであろう。かかる細胞の操作をすることにより、隣接細胞において内因性ＴＧＦβリガンドに対する応答性が減少し、よって被験体の生存をもたらすはずである。
【００４６】
代替的実施形態では、細胞内ＴＧＦβに結合し、それを「無効にする」可溶性ペプチド、タンパク質、融合タンパク質または抗体をコードする遺伝的構築物を投与することにより、被験体の生存を達成する。この目的のために、ＴＧＦβ受容体のドメイン、ＴＧＦβ受容体の欠失突然変異体、あるいはこれらのＴＧＦβ受容体ドメインまたは突然変異体のいずれかに相当し、別のポリペプチド（例えば、ＩｇＦｃポリペプチド）との融合ペプチドをコードする遺伝的構築物を利用することができる。あるいは、ＴＧＦβ受容体を模倣し、ＴＧＦβを無効にする抗イディオタイプ抗体または抗イディオタイプ抗体の抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）をコードする遺伝的構築物を使用することができる。これらのＴＧＦβ受容体ペプチド、タンパク質、融合タンパク質、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）をコードするかかる遺伝的構築物は、ＴＧＦβを無効に
し、被験体の生存を達成するために投与される。
【００４７】
１つまたはそれ以上のＴＧＦβのエピトープ、またはＴＧＦβの保存変異体のエピトープ、あるいはＴＧＦβのペプチド断片を特異的に認識する抗体をコードする遺伝的構築物もまた本発明に含まれる。かかる抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される断片、および上記のいずれかのエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。かかる抗体をコードする遺伝的構築物は、ＴＧＦβ活性の抑制および被験体の生存の達成のための方法として使用されてもよい。
【００４８】
抗体の産生のために、様々な宿主動物が、ＴＧＦβ、ＴＧＦβペプチド、切断型ＴＧＦβ、ＴＧＦβの機能的等価体またはＴＧＦの突然変異体を注射することにより免疫化され得る。かかる宿主動物としては、数種であるが例を挙げるとウサギ、マウスおよびラットが挙げられるが、これらに限定されない。ポリクローナル抗体は、免疫化動物の血清から得られる抗体分子の異種集団である。
【００４９】
モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する抗体の同種集団であるが、それは培養における連続細胞系による抗体分子を産生する任意の技法により得られ得る。これらの方法としては、Kohler and Milsteinのハイブリドーマ技法(1975, Nature 256: 495-497, および米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法(Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030)、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96)が挙げられるが、これらに限定されない。かかる抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む任意の免疫グロブリンクラスおよびそれらのサブクラスであってもよい。
【００５０】
さらに、適切な生物活性を有するヒト抗体分子に由来する遺伝子とともに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることにより、「キメラ抗体」を産生するために開発された技法(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454)を使用することができる。キメラ抗体は、マウスｍＡｂから得られる可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもののような、異なる動物種から得られる種々の部位からなる分子である。
【００５１】
あるいは、一本鎖抗体の産生に関して記載される技法（米国特許第４，９４６，７７８号; Bird, 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; およびWard et al., 1989, Nature 334:544-546）は、ＴＧＦβ遺伝子産物に対する一本鎖抗体を産生するのに用いられ得る。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋によりＦｖ領域の重鎖断片および軽鎖断片を連結することにより形成され、一本鎖ポリペプチドを生じる。
【００５２】
特定のエピトープを認識する抗体断片は、既知の技法により生成され得る。例えば、Ｆａｂ発現ライブラリーは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ簡易に同定するために構築され得る(Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281)。
【００５３】
さらに、ＴＧＦβの活性化を阻止するために、ＴＧＦβ前駆体を切断し、活性イソ型に変化させる酵素を抑制してもよい。ＴＧＦβがその生物学的効果を示すためには活性化されなくてはならず、酵素は、前駆体タンパク質を切断する必要がある。これらの酵素を、前駆体タンパク質との相互作用が妨げられるように遺伝的に改変し、前駆体タンパク質が
活性化された成熟形態へ切断されるのを防止してもよい。これらの酵素の転写または翻訳が、当該技術分野で既知の手段により阻止されてもよい。あるいはこれらの酵素が、当業者に既知の任意の手段により抑制されてもよい。
【００５４】
ＴＧＦβは、セリン／トレオニンキナーゼ受容体に結合し、Ｓｍａｄタンパク質により細胞内シグナルを伝達する。ＴＧＦβにより開始されるシグナルを抑制するために、シグナル伝達を妨害してもよい。シグナル伝達を崩壊することにより、ＴＧＦβの免疫抑制効果を防止することができる。このことは、当該技術分野において既知の任意の手段であって、ＴＧＦβ受容体およびＳｍａｄタンパク質相互作用を拮抗するか、または妨げる手段により達成され得る。その手段は、ＴＧＦβ受容体およびＳｍａｄタンパク質間の相互作用を妨げるか、または拮抗するタンパク質を発現するように遺伝的に改変された細胞を投与することを含む。あるいは、シグナル伝達経路に沿ったシグナル伝達を防止するために、ＴＧＦβ受容体またはＳｍａｄタンパク質の転写あるいは翻訳が、当該技術分野で既知の任意の手段により改変されてもよい。
【００５５】
ＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣを有する患者に、免疫原としてＴＧＦβを阻害する種を発現するように遺伝的に操作された標的細胞が投与されると、それらは抗腫瘍免疫応答を高めるように作用し、それにより腫瘍保有被験体の生存が延びるであろう。かかる細胞は、患者自身から得られてもよく（自己由来）、またはドナーから得られてもよい（同種異系または異種）。ＮＳＣＬＣを有する患者に関しては、遺伝的に操作された細胞は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞により構成され、それは、ＮＳＣＬＣから得た細胞であるか、またはＮＳＣＬＣを模倣した細胞である（すなわち、原発性のＮＳＣＬＣと共有している共通腫瘍抗原またはエプトープを有する）。あるいは、ＳＣＬＣを有する患者に関しては、遺伝的に操作された細胞は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞により構成され、それはＳＣＬＣから得た細胞であるか、またはＳＣＬＣを模倣した細胞である（すなわち、原発性ＳＣＬＣと共有している共通腫瘍抗原またはエピトープを有する）。
【００５６】
自己細胞とは、同一個体から得られる細胞である。同種異系細胞は、種は同一であるが別の個体から得られる細胞であり、したがって細胞が種内遺伝的差異を有する。異種細胞は、異なる種の個体から得られる細胞であり、したがって細胞が種間の抗原差異を有する。
【００５７】
一実施形態では、同種異系（または異種）ＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣ腫瘍細胞系が、免疫原として選択される。肺癌細胞系は、原発腫瘍と共有したエピトープを有することが示されている(Takenoyama et al. 1988)。これらの研究者等は、ヒト肺腺癌細胞系に対して生成されたＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬは、別の腫瘍細胞系に対して明白な細胞障害作用を有することを示した。これらの実験における交差反応性は、抗ＭＨＣクラスＩおよび抗ＣＤ８モノクローナル抗体により阻止され、共有される共通の腫瘍抗原が肺癌細胞間に存在することを示唆している。
【００５８】
別の実施形態では、同種異系（または異種）細胞カクテルが、ＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣを有する患者における免疫原として使用される。これは、腫瘍抗原提示の総数を増加させるという意味よりはむしろ、２個、３個、４個またはそれ以上の細胞系を使用することができるという意味である。
【００５９】
さらに、標的細胞は、ＴＧＦβ２阻害剤をコードする遺伝的構築物によりトランスフェクトされることにより、ＴＧＦβ発現性が低下するであろう。腫瘍細胞によりＴＧＦβ発現が抑制されると、まずワクチン注射部位で免疫抑制作用の主要原因が除去されるであろう。そして注射した腫瘍細胞に対して誘動される局所免疫応答が、患者の自然腫瘍に対する全身性免疫応答を誘発するであろう。
【００６０】
標的細胞は、例えばプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、エレクトロポレーション、リポソーム等の使用を含むがこれらに限定されない形質導入（ウイルスベクターを用いた）またはトランスフェクション手法により、遺伝的構築物を細胞に導入するために、組換えＤＮＡ技法を用いてインビトロで遺伝的に操作される。操作された細胞は、例えば、血液循環にて、腹腔内にて、皮内にて、皮下に、肺葉にて、患者に導入され得る。あるいは、細胞は、マトリックス内に組み込まれ、組織移植片の一部として体内に移植され得る。
【００６１】
別の実施形態では、標的細胞は、１つまたはそれ以上のサイトカインのコード配列を発現するように操作される。１つの代替法では、１つまたはそれ以上のサイトカインを一重でコードする発現ベクターが標的細胞に導入される。別の代替法では、１つまたはそれ以上のサイトカインおよびＴＧＦβ阻害剤を二重でコードする発現ベクターが標的細胞に導入される。さらなる別の代替法では、いくつかの標的細胞のうちの一部は、１つまたはそれ以上のサイトカインのコード配列を発現するように操作され、その他の標的細胞は、ＴＧＦβ阻害剤を発現するように遺伝的に改変される。免疫抑制ＴＧＦβを阻害することに加えて、免疫促進剤を同時投与することは、腫瘍細胞に対する被験体の免疫応答を改善し得る。本発明の実施に有用なサイトカインの例としては、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１５、インターフェロン−α、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−α、トランスフォーミング成長因子−β、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、および顆粒球コロニー刺激因子が挙げられる。サイトカイン発現レベルは、抗腫瘍免疫性が被験体において有意な全身毒性をもたらすことのない範囲で上昇することができるように調節されるべきである。
【００６２】
投与されるべき標的細胞が非自己細胞である場合、それらは、導入する細胞に対して宿主免疫応答が発生するのを妨げる既知の技法を用いて投与され得る。例えば、導入する細胞を被包化して導入してもよく、それによりすぐ隣接する細胞外環境との構成成分の交換が可能になる一方で、導入細胞を宿主免疫系が認識するのを不可能にする。
【００６３】
ＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣ細胞の毒性および治療効率は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養液または実験動物における標準的な薬学的手法により決定することができる。毒性と治療効果間の用量比は、治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示すＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣ細胞が好ましい。
【００６４】
細胞培養液アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトに使用するための投与量範囲を決定するのに使用され得る。ヒトに投与する量は、毒性が少ないかまたは全くなしで、ＥＤ５０に含まれる濃度であるのが好ましい。本発明において使用されるＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣ細胞の任意の用量に関して、治療上有効な用量は、細胞培養液アッセイから初期に推定することができる。治療上有効な用量が、細胞培養液で決定される場合のＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半分の抑制を達成する試験物質濃度）に含まれる濃度にするために、動物モデルにて決定されうる。かかる情報を用いて、ヒトにおける有効な用量をより正確に決定することができる。
【００６５】
本発明に従って使用するための薬学的組成物は、１つまたはそれ以上の生理学的に許容なキャリアまたは賦形剤を用いて、従来法にて決定され得る。ＱＳ−２１、Ｄｅｔｏｘ−ＰＣ、ＭＰＬ−ＳＥ、ＭｏＧＭ−ＣＳＦ、ＴｉｔｅｒＭａｘ−Ｇ、ＣＲＬ−１００５、Ｇ
ＥＲＢＵ、ＴＥＲａｍｉｄｅ、ＰＳＣ９７Ｂ、Ａｄｊｕｍｅｒ、ＰＧ−０２６、ＧＳＫ−１、ＧｃＭＡＦ、Ｂ−アレチン、ＭＰＣ−０２６、Ａｄｊｕｖａｘ、ＣｐＧ ＯＤＮ、ベータフェクチン、ミョウバン、およびＭＦ５９を含む様々な抗原性補強剤（アジュバント）を使用して、免疫学的応答を増加させ得る（Kim et al. Vaccine 2000, 18:597 およびその中の参照文献を参照）。注射用配合物は、単位投薬形態で、例えばアンプル中または複数用量容器にて提供され得る。
【００６６】
本発明はさらに、ＴＧＦβ阻害剤を発現するように遺伝的に改変された細胞、および治療上許容なキャリアを含む治療用組成物を提供する。本明細書で使用する場合、治療上許容なキャリアは、宿主に対して無毒性の水、分散媒、細胞培地からの培養液、等張剤等を含む任意およびすべての溶媒を含む。適しているのは、約７．０のｐＨを有する等張緩衝水溶液である。治療用組成物においてかかる媒質または薬剤を使用するのは、当業者に既知である。治療用組成物におけるかかる任意の従来型媒質または薬剤が本発明の遺伝的に改変された細胞に非相容性である場合を除いて、治療用組成物におけるかかる従来型媒質または薬剤使用が意図される。補足の有効成分もまた、組成物に組み込むことができる。
【００６７】
本発明の治療用組成物は、それを必要とする動物に投与され得る。したがって、本発明は、免疫応答の必要な動物において免疫応答を誘発する方法を提供し、その方法は、遺伝的に改変されており、免疫学的に有効な量の細胞を動物に投与することを含む。本発明はまた、動物において腫瘍を防止または治療する方法を提供し、その方法は、遺伝的に改変されており、抗腫瘍に有効な量の細胞を動物に投与することを含む。
【００６８】
本明細書で使用する「動物」という用語は、ヒトを含むすべての哺乳動物を含む。好ましくは、本発明の動物はヒト被験体である。
【００６９】
遺伝的に改変された細胞を投与することによって、動物において誘発される免疫応答は、腫瘍細胞を死滅させることが可能な細胞障害性Ｔ細胞により主に媒介される細胞性免疫応答、ならびにＢ細胞を活性化することが可能であり、したがって抗体の産生を引き起こすヘルパーＴ細胞により主に媒介される体液性免疫応答を含んでもよい。遺伝的に改変された細胞により誘発される免疫応答型を分析するために、様々な技法を使用してもよく、それらは、当該技術にて十分に記載されている（例えばColigan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc. (1994)）。
【００７０】
本明細書で使用する「腫瘍を防止する」という用語は、腫瘍の発生が防止されるか、または腫瘍の発症が有意に遅延されることを意味する。本明細書で使用する「腫瘍を治療する」という用語は、腫瘍成長が有意に抑制されることを意味し、それは例えば腫瘍体積により反映される。腫瘍体積は、様々な既知の手法、例えば、ダイヤルキャリパーを用いて二次元的測定をすることにより決定され得る。
【００７１】
「免疫学的に有効な量」、「抗腫瘍に有効な量」または「腫瘍抑制に有効な量」が示される場合、投与されるべき遺伝的に改変された細胞の正確な量は、患者の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染の程度または転移の程度、および症状における個々の差異を考慮して、医師により決定され得る。通常、遺伝的に改変された対象の細胞を含む治療組成物は、１回の用量につき少なくとも約１×１０3細胞〜約５×１０9の細胞を含み、適した方法で投与されるといえる。
【００７２】
対象の治療用組成物の投与は、エーロゾル吸入、注射、摂取、輸血、埋没または移植を含む任意の従来型様式で実行されてもよい。適当であれば、本発明の遺伝的に改変された細胞は、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内（ｉ．ａ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により患者に投与される。治療上許容なキャリアは、当業者に既知の技法により
殺菌されるべきである。
【００７３】
本発明は、以下の具体例によりさらに説明されるが、それはいかなる場合においても本発明の範囲を限定することを意図しない。本発明者等は、以下の実施例において、ＴＧＦβ２をＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３で置換することを企図する。さらに、本発明者等は、以下の実施例において、ＮＳＣＬＣ細胞をＳＣＬＣ細胞で置換することを企図する。
【実施例】
【００７４】
臨床試験において、本発明者等は、組織培養研究所にてこれまでに樹立した４つのヒト非小細胞肺癌細胞系を使用する。本発明者等は、これら腫瘍細胞を、それらのＴＧＦβ分泌が阻止されるように、研究所にて遺伝子改変する。次に本発明者等は、非小肺癌を有する患者において、ワクチンとして遺伝子的に操作した細胞を使用する。月１回の間隔で４回、ＴＧＦβアンチセンス遺伝子改変された４種の非自己（同種異系）腫瘍細胞で構成される遺伝子改変ワクチンカクテルを患者に注射する。他のヒトの腫瘍細胞を使用する本発明者等の理論的根拠は、異なるヒトに属する肺腫瘍細胞系が非自己免疫系により認識されるという共通の特性を共有することを示していることにある。治療した患者を、彼等が治療に入った４ヶ月後に評価する。治療の効果がある患者には、彼等の治療効果が増幅され得るかどうかを評価するために、さらに４回〜１２回の注射を行う。
【００７５】
患者は、３つの別個の群のうちの１つに無作為に割り当てる。ワクチンカクテルは、等数の、４種の照射ＴＧＦβアンチセンス遺伝子改変ＮＳＣＬＣ細胞系のそれぞれから構成される。３つの群において注射した細胞数は、それぞれ１．２５×１０7、２．５×１０7、および５×１０7細胞である。
【００７６】
応答、腫瘍進行までの時間、および腫瘍を持たない生存を、患者についてモニターし、履歴的対照患者および他の形態の治療を受けた患者と比較する。応答なし、安定な疾患、部分的応答、および完全な応答という分類で、標準的評価基準に従って、患者をモニタリングおよび評価する。この研究の結果を用いて、ＴＧＦβアンチセンス遺伝子改変腫瘍細胞を単独で用いる、およびＩＬ−２（または他のサイトカイン）遺伝子改変腫瘍細胞との組み合わせを用いる治療の、さらなる臨床試験の実現可能性を評価する。
【００７７】
主要な目的
臨床試験の主要な目的は、遺伝子改変腫瘍細胞ワクチンの用量を増加させることによって、ＮＳＣＬＣを有する患者の腫瘍応答を誘発する能力を評価することである。
【００７８】
研究設計
この研究は、ＮＳＣＬＣを有する患者において、同種異系腫瘍細胞ワクチンの用量が増加することによる免疫化の効果の変化が評価できるように設計される。患者は臨床的応答、免疫抗原性、安全性について観察される。
【００７９】
適切な患者に、等数の、４種類の照射同種異系ＴＧＦβ２アンチセンス遺伝子改変ＮＳＣＬＣ細胞系から構成される細胞カクテルを、１月ごとに４回皮内注射する。患者は３つの研究群の１つから任意に抽出する。患者には、それぞれ１．２５×１０7、２．５×１０7、または５×１０7遺伝子改変細胞を与える。
【００８０】
入手可能である場合、臨床において指示された手術時に、研究対象の患者から得られる腫瘍試料を使用して、各患者の細胞系を樹立する。次に患者の腫瘍細胞を、遺伝子治療接種法に対する患者の免疫応答をモニタリングする前駆物質分析または細胞障害性アッセイにて使用する。
【００８１】
ワクチン投与
０、１、２、３および４ヶ月目に、腫瘍細胞ワクチンの皮内注射を患者に行う。これらは、外来患者の設定で投与される。注射する部位は、上肢と下肢で交替にする。ワクチン接種後２時間、患者を病院で観察する。この観察時間中、生命徴候を３０分毎に測定する。治療により副作用をほとんど受けない患者は、ワクチン接種の２時間後に解放する。
【００８２】
研究手法の概要
以下の表に概要したスケジュールに従って患者にワクチン接種する。他の抗癌治療による介入を必要とするような、手におえないほどの毒性または臨床的に相当な疾患進行が明らかにされない限りは、１ヶ月に１度、４ヶ月間、患者に初期治療する。腫瘍の病期分類（ｓｔａｇｉｎｇ）（総合ＣＴ／ＭＲＩスキャンによって）を、治療の前に、ならびに治療後８、１６および２８週目、その後は３ヶ月毎に実施する。２８週目までは４週毎に、その後は１２週毎に、患者に対して免疫応答（体液性応答およびＴ細胞応答）の連続モニタリングを行う。患者は、研究の間、毒性に関して綿密にモニタリングされる。治療によって有益な効果がみられる患者に、さらに、４〜８週間毎に１２回のワクチン接種をする（全１６回のワクチン接種）。
【００８３】
停止規則
ワクチン接種した後の腫瘍応答が初期の腫瘍進行期間に続く可能性がある場合であって、８週目に非臨床的に相当な腫瘍進行があっても患者に研究を続けることが可能である。かかる患者は、１６週目に、さらなる腫瘍進行を示してはならない（８週目と比較して１６週目にて最大２５％増加）。１６週目に依然として進行性疾患を示す（８週目と比較して）患者は、研究から外される。
【００８４】
【表１】
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【００８５】
手法の定義電話連絡：研究看護士による電話により患者と連絡して、炎症、疼痛または局所注射部位でのかゆみの度合いを評価する
各分画におけるＣＢＣ：ＷＢＣ、ＨＣＴ、ＨＧＢ、血小板計数、好中球％、白血球％、単球％
電解質パネル：ナトリウム、カリウム、塩化物、二酸化炭素、ＢＵＮ、クレアチニン、グルコース
代謝パネル：カルシウム、リン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ、ビリルビン、尿酸、アルブミン、タンパク質
腫瘍病期分類：物理的検査、Ｘ線、適切な場合にはＣＴ／ＭＲＩ。
すべての病期分類は、基準にて使用された方法と同じ方法で腫瘍を評価するべきである接種部位の生体組織検査：炎症性ワクチン接種部位の周辺にて、または炎症がない場合には、ワクチン接種部位を含めて行われるパンチ皮膚生体組織検査
体液性免疫：血清抗腫瘍力価細胞性免疫：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２０、およびＣＤ６８を含む末梢血Ｂ細胞およびＴ細胞サブセット（十分な細胞が入手可能である場合）の免疫表現型タイピング
定量的（半定量的）なＮＫ活性（非特異的殺傷）、ＬＡＫ活性（アロ殺傷）によるＰＢＣサイトカインプロフィールを測定
【００８６】
臨床試験対象基準
・インフォームドコンセントに署名したもの
・１８歳以上
・測定可能な疾患および推定体積１２５ｃｃを有する治癒不可能なＮＳＣＬＣを組織学的
に確認されたもの
・一般状態（ＥＣＯＧ） ２以下
・絶対顆粒球数 １，５００／ｍｍ3
・血小板数 １００，０００／ｍｍ3
・総ビリルビン ２ｍｇ／ｄＬ以下
・ＡＳＴおよびＡＬＴ 正常の上限の２倍以下
・クレアチニン １．５ｍｇ／ｄＬ以下
【００８７】
臨床試験対象除外基準
・同時全身ステロイド １日当たりのプレドニゾンが２０ｍｇより多い
・事前脾摘出
・手術、化学療法、放射線療法、ステロイド療法または免疫療法 研究に入る４週間未満
・治療して、２ヶ月間安定である場合を除いて、脳転移または髄膜リンパ腫症・既知のＨＩＶ陽性・研究者の考えによるとプロトコルの対象を傷つけるであろう重篤な非悪性疾患（例えば、うっ血性心不全、または活性非制御細菌、ウイルスまたは真菌感染）、あるいは他の症状・２年間以上寛解状態にある場合を除いて、事前悪性疾患（皮膚の非黒色腫癌腫を除く）
・研究に入る前の３０日以内に治験薬で治療・プロトコルを遵守することを妨害するであろう精神医学的障害の履歴
・妊婦または育児をしている女性、あるいは生殖能力を有する場合、避妊を実施することへの拒絶
【００８８】
研究の遂行
本研究は、臨床試験実施に関する基準であるヘルシンキ宣言および米国２１ＣＦＲパート５０・ヒト被験者の保護、およびパート５６・施設内治験審査委員会に従って遂行される。研究に関して書面による日付付きのインフォームドコンセントを、プロトコルに明記した手法を実施する前に、すべての患者から得る。署名後、患者のインフォームドコンセントのコピーを患者に付与する。患者をこの研究に登録する前に、適切な施設内治験審査委員会からこの研究の承認を得る。同意の書式は、患者予定者が完全に理解できる言語で行う。同意したことは、患者自身の日付付き署名により、あるいは患者の同意を記録する個々の立会人の署名により証明される。
【００８９】
腫瘍応答
患者は、ＣＴ／ＭＲＩおよび物理的検査により評価される。臨床試験に関する標準的な結果の基準（完全な応答（ＣＲ）、部分的応答（ＰＲ）、安定した疾患（ＳＤ）および進行性疾患（ＰＤ））を用いて応答を記録する。治療に対して応答（ＰＲまたはＣＲ）があった場合は、いかなる場合も、少なくとも４週間を隔てて、２つの確証的病期分類をしなければならない。
完全な応答
・少なくとも４週間、すべての測定可能な疾患の解消
・少なくとも４週間、すべての評価可能な疾患の解消・新たな病巣なし（測定可能または評価可能）
部分的応答
・少なくとも４週間、すべての測定可能な病巣の産物の総計のうち、少なくとも５０％が減少
・少なくとも４週間、評価可能な疾患の自覚的改善
・新たな病巣なし（測定可能または評価可能）
安定した疾患
・すべての測定可能な病巣の産物の総計のうち、５０％未満が減少、かつ２５％未満が増加
・新たな病巣なし（測定可能または評価可能なもの）
進行性疾患
・すべての測定可能な病巣の産物の総計のうち、２５％超が増加、または新たな病巣（測定可能または評価可能なもの）
【００９０】
免疫応答の評価
体液性免疫応答の評価
体液性抗腫瘍免疫応答は、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、ワクチン接種する細胞系に対する反応性に関して、治療前および治療後の血清の力価を比較することにより評価される。簡潔に述べると、１０5個の標的細胞を、９６ウェルインキュベーターチャンバー(V and P Enterprises, La Jolla, CA)の濾紙ディスク上に固定化し、続いて試験血清とともに３０分間インキュベートする。プレートを洗浄し、続いて酵素結合抗ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）とともにインキュベートする。プレートを再び洗浄し、酵素基質を添加し、ＥＬＩＳＡ測定器で各ウェルの吸光度を測定することにより、結合を定量化する。
【００９１】
細胞性免疫応答の評価
免疫表現型タイピング 標準的な免疫蛍光フローサイトメトリーアッセイを行い、患者の治療前および治療後の免役エフェクター細胞プロフィールを評価する。Ｔ細胞（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）、ナチュラルキラー細胞（ＣＤ１６）、およびＢ細胞（ＣＤ２０）に対するモノクローナル抗体と反応するエフェクター細胞の亜集団のパーセントを、治療前および治療後の末梢血リンパ球群にて測定し、他の基準により測定した患者の応答と相関させる。簡潔に述べると、フィコール・ハイパークの精製単核細胞を、一次抗体とともに室温にて１時間インキュベートし、洗浄し、続いて蛍光色素結合二次抗体とともにインキュベートする。細胞を洗浄し、固定して、陽性細胞のパーセントを、フローサイトメーターを用いて決定する。一次抗体の代わりにイソ型とインキュベートした対照抗体との細胞のインキュベーションは、陰性対照として役立つ。
【００９２】
ナチュラルキラー（ＮＫ）活性
ＮＫ活性は、標的としてＮＫ感受性細胞系Ｋ５６２を用いた標準的クロム遊離試験を用いて分析される。簡潔に述べると、Ｋ５６２細胞を、51Ｃｒと３７℃にて４５分間インキュベートすることにより標識する。標的細胞を広範囲に洗浄した後、エフェクター細胞：標的細胞の比を１００：１〜３：１の範囲として、５×１０3個のＫ５６２を、治療前および治療後ＰＢＭＣとともに、３７℃にて４時間インキュベートする。次に、細胞を遠心分離し、γカウンターを用いて51Ｃｒ遊離量を測定する。特定細胞溶解パーセントは、以下の式：（実験（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）ｃｐｍ−背景（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）ｃｐｍ）／（全（ｔｏｔａｌ）ｃｐｍ−背景（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）ｃｐｍ）×１００を用いて決定される。
【００９３】
ＬＡＫ活性
ＬＡＫ活性は、標的としてＬＡＫ感受性細胞系ＤＡＵＤＩを用いて、上述のようにクロム遊離アッセイにより決定される。
【００９４】
治療前および治療後のリンパ球のサイトカインプロフィール
患者のＰＢＭＣのサイトカインプロフィールは、半定量的ＰＣＲアッセイにより確定される。患者の治療前および治療後の精製単核細胞からＲＮＡを抽出し、それを用いて、製造業者の推奨に従ってInvitrogen(サンディエゴ, カリフォルニア)のｃＤＮＡサイクルキットにより、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。次に、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、γ−ＩＮＦ、ＴＮＦ−α等の検出のために、種々のプライマーセットを用いたＰＣＲアッセイにて、第１鎖ｃＤＮＡを鋳型として使用する。定量
化を達成するために、ポリメラーゼ連鎖反応は、１５〜１８サイクルに制限される。内部対照として、かつ産物の定量化を促進するために、既知濃度の対照ＲＮＡをｃＤＮＡ合成開始前に各試料に添加する。次に、対照配列に関する特定のプライマーをポリメラーゼ連鎖反応に添加する。患者試料のサイトカインプロフィールは、患者のＰＣＲ産物を定量化し、それらを対照ＰＣＲ産物と比較することにより確定される。
【００９５】
免疫化部位の皮膚生体組織検査
標準的なヘマトキシリンおよびエオシン染色、ならびに造血細胞サブセットに対するモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的方法を用いて、免疫化部位における皮膚生体組織検査にて観察される免疫浸潤物を解析する。Ｔ細胞（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）、ナチュラルキラー細胞（ＣＤ１６）およびＢ細胞（ＣＤ２０）に対するモノクローナル抗体をこれらの研究のために利用する。簡潔に述べると、免疫組織化学的研究のために、凍結切片を冷アセトン中で固定した後、一次抗体とともに室温にて一時間インキュベートする。切片を洗浄し、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体とともにインキュベートした後に、適切な色素原基質で切片を染色し、光学顕微鏡法により検査する。一次抗体の代わりにイソ型の対照抗体との切片のインキュベーションは、陰性対照として役立つ。
【００９６】
薬物情報
臨床的処方
ワクチンは、バイアル１本あたり少なくとも２０×１０8細胞を含有する凍結バイアルにて提供される。
薬剤師指示書
非希釈物質
バイアル容量： １ｍｌ
外観： 濁り液
保管： −１７６℃（液体窒素）
危険： 凍結バイアルは、破壊されないのであれば危険とみなされない。バイアルは、１０％ジメチルスルホキシドおよび５０％ウシ胎児血清を含有する混合物中にて、凍結された細胞を含有する。
取り扱い： 凍結バイアルは、破壊されないのであれば安全性を害するものとみなされない。破壊されたバイアルは、細胞障害性薬剤に関するバイオハザード処置に従って破棄されるべきである。
希釈物質
調製： 患者に注射する前に、凍結バイアルをバイオセーフティフードにて解凍し、血清含有媒質で２回、乳酸加リンガー液で４回洗浄する。次に細胞を計数し、２５０〜４００μｌの容量で、１回の注射当たりの適切な細胞数に調節する。細胞懸濁液をキャップ付きの１ｍＬ注射器に用意する。
薬剤濃度： ２５０〜４００μｌの容量中に、１回の注射当たり１．２５×１０7、２．５×１０7、または５×１０7細胞 
希釈液： 乳酸加リンガー液
投与経路： 皮内注射保管 凍結した未開封のバイアル中で、−１７６℃（液体窒素）で保管する。
【００９７】
データ評価
統計学および推定試料サイズ ２７〜７５人の総数の患者を登録する。この研究は２段階で成る。３つの治療手段それぞれにまず９人の患者を収集する。最初の９人の患者に応答が見られない場合、その治療手段には、それ以上の患者を収集しない。最初の９人の患者の中で少なくとも１人に応答が観察される場合、さらに１６人の患者をその治療手段に収集し、１つの治療手段当たり総計２５人の患者とする。
【００９８】
患者は、少なくとも２回のワクチン接種を受け、８週目に２回目の腫瘍病期分類を受けた場合、腫瘍応答に関して評価対象であるとみなされる。
【００９９】
患者は、少なくとも１回のワクチン接種を受け、４週目に免疫分析を受けた場合、免疫応答に関して評価対象であるとみなされる。
【０１００】
１回目のワクチン接種後に、患者が毒性に関して適格であることを確認する。
【０１０１】
結果の報告
応答の割合は、評価可能であると決定された患者における記述統計、ならびにＣＲ、ＰＲ、ＳＤおよびＰＤの報告の割合を用いて報告される。初期治療後における腫瘍進行の時間は、ＣＲまたはＰＲのいずれかを受けている患者に関して決定される。
【０１０２】
二次的項目としては、免疫応答、応答の持続期間、および安全性が挙げられる。これらの割合もまた、記述統計を用いて報告される。安全性は、所定の有害事象を受けている患者のパーセントとして報告される。応答が観察される集団に関しては、腫瘍進行の平均時間が、カプラン・メイアー統計学を用いて報告される。
【０１０３】
非改変ＮＳＣＬＣ細胞系
このワクチンの生産に使用される８個のＮＳＣＬＣ細胞系のうち７個は、American Tissue Cell Culture (ATTC)から購入される樹立細胞系である。ヒト扁平上皮ＮＳＣＬＣ細胞系であるＲｈ−２は、Lee et al., J. Immunology 152:3222, 1994; Huang et al., Cancer Research 55:3847, 1995; Huang et al., J, Immunology 157:5512, 1996; およびHuang et al., Cancer Research 58: 1208, 1998に従って、１９９４年にＵＣＬＡにあるDr. Steven Dubinettの研究室にて外科的切除検体から樹立されており、公的に入手可能である。
【０１０４】
ｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２：ＴＧＦβ２アンチセンスプラスミドプラスミドを含有するヒトＴＧＦβ２アンチセンスを構築するために使用されるｐＣＨＥＫベクターは、ｐＣＥＰ４ベクター(Invitrogen, サンディエゴ, カリフォルニア)から得た。それは、遺伝的サブクローニングを促進するためにわずかに改変された。結果的に生じるキャリアベクターはｐＣＨＥＫである。遺伝的サブクローニングを用いて、ＴＧＦβ２アンチセンス遺伝子断片（ＨＢＡ２）をｐＣＨＥＫに挿入した。一定分量のｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２プラスミドを制限酵素分析により検査して、１）ＴＧＦβ２アンチセンスがクローニングされたキャリアベクターの同定、および２）ＴＧＦβ２アンチセンスを挿入することは適切な手段であることを確実にする。
【０１０５】
試験限界：１４個のエンドヌクレアーゼ：ＡｐａＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇＩＩＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＰｓｔＩ、ＳａＩＩ、ＳａｃＩＩ、ＳｃａＩおよびＸｂａＩを用いた一連の制限消化後のＤＮＡ断片と、予想ＤＮＡ断片サイズとの完全な相同性
【０１０６】
結果：これらの制限消化物により得られるＤＮＡ断片を観察したところ、ｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２プラスミドの予想断片サイズに相当した。結論として、サブクローニングに使用されるベクターは、適切であり、ＴＧＦβ２アンチセンス遺伝子断片を挿入することは、適切な手段である。
【０１０７】
これらの制限消化物の予想断片は、以下の通りである：
ＡｐａＩ  ４６０４ｂｐ  ３３０９ｂｐ  １９５７ｂｐ  ８７４ｂｐ  ２１９ｂｐ
ＢａｍＨＩ  １０９６３ｂｐ
ＢｇＩＩＩ  １０２１０ｂｐ  ７５３ｂｐ
ＣｌａＩ  １０９６３ｂｐ
ＥｃｏＲＶ  １０９６３ｂｐ
ＨｉｎｄＩＩＩ  ７４５０ｂｐ  ２７８７ｂｐ  ６３６ｂｐ
ＨｐａＩ  １０２５１ｂｐ  ７１２ｂｐ
ＮｏｔＩ  １０９６３ｂｐ
ＮｒｕＩ  ５７１６ｂｐ  ５２４７ｂｐ
ＰｓｔＩ  ７５７３ｂｐ  １４９４ｂｐ  １２７７ｂｐ  ６１９ｂｐ
ＳａＩＩ  ８７３８ｂｐ  ２２２５ｂｐ
ＳａｃＩＩ  ５３４７ｂｐ  ３３４０ｂｐ  ２２７６ｂｐ
ＳｃａＩ  ８０２１ｂｐ  １９１５ｂｐ  １０２７ｂｐ
ＸｂａＩ  ９５７９ｂｐ  １３８４ｂｐ
【０１０８】
ＴＧＦβ２アンチセンス挿入物
ＴＧＦβ２アンチセンス断片の正確な配列および方向性をさらに確実にするために、ＡＢＩ−３１０遺伝子アナライザー(Perkin Elmer, Foster City,カリフォルニア)を用いた配列分析により、挿入物を試験した。
【０１０９】
試験限界：プラスミド挿入物とＴＧＦβ２アンチセンス間の完全な相同性 
【０１１０】
結果：得られた配列決定の結果から、ｐＣＨＥＫベクターにおけるヒトＴＧＦβ２断片の存在を確認した。これらの結果により、挿入物が適切であることも確認した。ｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２ベクターの構築に使用されるヒトＴＧＦβ２断片の配列、およびベクター中のそのフランキング領域は以下のようである。小文字は、ヒトＴＧＦβ２断片に隣接する２つのベクター配列を表す。
【０１１１】
ｔｇｔｃｔｇｇａｔｃ ｃｇｇｃｃｔｔｇｃｃ ｇｇｃｃｔｃｇａ（配列番号２）−−−挿入物に隣接するベクター配列−−− ヒトＴＧＦβ２の塩基対５
（配列番号１）−−−ヒトＴＧＦβ２の塩基対９３５−−−ａｇｃｔｔｇｃｔ ａｇｃａｇｃｔｇｇｔ ａｃｃｃａｇｃｔ（配列番号３）−−−挿入物に隣接するベクター配列
【０１１２】
遺伝子改変ＮＳＣＬＣ細胞系
トランスフェクトした後、各遺伝子改変細胞系のクローンを、ＰＣＲにより、ｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２ベクターの存在に関して試験した。ｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２に関して陽性の結果を示したクローンのみ、さらなる分析のために選ばれた。
【０１１３】
結果：試験した８個の細胞系のうち７個からのコロニーは、ＴＧＦβ２アンチセンストランスフェクションに関して陽性であった。細胞系ＮＣＩ−Ｈ−２９２は陰性であった。
【０１１４】
ＴＧＦβ２のダウンレギュレーション
トランスフェクトした後、各遺伝子改変細胞系のクローンを、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）によりＴＧＦβ２のダウンレギュレーションに関して試験し、改変されていない親細胞系と比較した。簡潔に述べると、ＴＧＦβ２アンチセンス遺伝子改変細胞培養液の血清を含まない上清を２４時間後に収集し、ＥＬＩＳＡキット(Genzyme, Cambridge, MASS)を用いたＴＧＦβ２分泌レベルに関して、三重反復試験にてアッセイした。製造業者の推奨に従って、ヒトＴＧＦβ２を、抗ヒトＴＧＦβ２モノクローナル抗体により捕獲し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＴＧＦβ２抗血清との反応により定量化した。色素原基質との酵素反応を展開し、マイクロＥＬＩＳＡプレート読取り器上で吸光度を読取ることにより、定量化がなされた。既知濃度のＴＧＦβ２を表す標準ＴＧ
Ｆβ２曲線は、ＴＧＦβ２アンチセンス遺伝子改変細胞が分泌するＴＧＦβ２の定量化を可能した。
【０１１５】
未改変腫瘍細胞に関する試験限界：ＴＧＦβ２の分泌量が２４時間当たりの、かつ１０6細胞当たり、少なくとも２００ｐｇ
【０１１６】
ワクチン用遺伝子改変腫瘍細胞系に関する試験限界：未改変親細胞に対して、ＴＧＦβ２産生を少なくとも３５％低減。この試験限界は、Lee et al., J. Immunology 152:3222, 1994に従って、ワクチン接種療法によって腫瘍細胞の免疫原性が高まることを実証する。
【０１１７】
治療開始の約３〜４日前に、一定分量の各遺伝子改変細胞系を、ＴＧＦβ２抑制に関して再試験する。同じ試験限界が適用される。
【０１１８】
【表２】
2012176994.tif 000003
【０１１９】
選択された４種の細胞系は、ＮＣＩ−Ｈ−４６０、ＮＣＩ−Ｈ−５２０、ＳＫ−ＬＵ−１およびＲｈ−２であった。本発明者等の手法では、ＴＧＦβ２アンチセンス遺伝子改変は、腫瘍細胞における内因性のＴＧＦβ２発現の３７〜９１％を阻止した。これらの細胞におけるＴＧＦβ２発現の抑制は、培養液にて６〜９ケ月の間続いた。
【０１２０】
細胞密度
患者にワクチンを接種する前に、細胞密度を各細胞系に関して評価する。使用される各細胞系の一定分量を、血球計算器を用いて計数して、細胞濃度を確認する。等数の各遺伝子改変細胞系を、この研究にて試験されるべき３つの用量にあわせて混合する（それぞれ１．２５×１０6、２．５×１０6、および５×１０6全細胞）
【０１２１】
細胞生存度
患者にワクチンを接種する前に、細胞生存もまた、各細胞系に関して評価する。免疫化に用いられる細胞の生存度は、トリパンブルー排除法により評価される。トリパンブルー色素は、形質（プラスマ）膜の完全性の尺度である。生存可能な細胞は、形質膜の完全性を維持し、したがって色素を排除する。死滅細胞は、膜の完全性を失っており、色素の取り込みが可能であり、したがって青く見える。一定分量の各細胞系を試験し、血球計算器にて細胞を計数する。生存可能な「青くない」細胞のパーセントが決定される。
【０１２２】
試験限界：治療に使用するＴＧＦβ２アンチセンス遺伝子改変腫瘍細胞の生存度は、５０％よりも高くなくてはならない。
【０１２３】
クローン原性
安全性を確実にするために、患者ワクチン接種に使用されるべき遺伝子改変腫瘍細胞系すべてが、注射前に照射されなくてはならない。これは、腫瘍細胞の成長および複製を防止するためである。細胞は、１０，０００ｃＧｙの線量で、使用前に照射される。この照射線量の選択は、Massachusetts General HospitalにあるRadiation Oncologyの長であるDr. Herman Suitとの論議に基づくものである。これは、遺伝子改変腫瘍細胞の、増殖および腫瘍形成を不可能にするのに十分であって最低の照射線量であった。トランスフェクトした細胞にとって考え得る最低の照射線量を使用して、ＴＧＦβ２アンチセンス転写のレベルおよび持続期間を最適化することが望ましい。さらに、本発明者等は、ヒトＮＳＣＬＣ、神経膠腫、結腸癌、および膵臓癌腫細胞系を含む種々の組織源の培養腫瘍細胞に関して、本発明者等の研究所にてこの照射線量について試験し、種々の組織源の培養腫瘍細胞によるコロニー形成を完全に停止することが可能であることを実証した。
【０１２４】
未改変および遺伝子改変ヒトＮＳＣＬＣ細胞系の試料を、１０，０００ｃＧｙで照射した。次に、照射細胞を、Ｔ−２２５フラスコにて培養し、コロニー形成について観察した。コロニーとは、１６個の成長細胞のクラスターと定義した。以下の表に示すように、４〜６週の観察期間の間、照射細胞の培養液にてコロニーは形成しなかった。対照的に、非照射細胞の対照培養液においてはすべてが、１０〜１４後に集密状態になった。照射細胞の培養液において、観察開始の約２週間後に、細胞死が起こった。
【０１２５】
【表３】
2012176994.tif 000004
【０１２６】
ワクチン接種前に、一定分量の各遺伝子改変細胞系を解凍し、各ロットが患者の注射用に安全であると考えられるまでの４〜６週間、培養液におけるコロニー形成について試験する。
【０１２７】
試験限界：コロニー形成なし
【０１２８】
細胞系の無菌性
細胞の製造業者ＡＴＣＣから購入した各未改変細胞系に関して、無菌性試験を実施した。
【０１２９】
さらに、一定分量の各細胞系をMolecular Diagnostics Associatesに送付し、以下のウイルス剤の存在に関してアッセイした： ＨＩＶ１＆２ ＨＢＶ ＣＭＶ ＨＨ−６ ＨＣＶ 
ＨＴＬＶ ＥＢＶ 外来ウイルス
【０１３０】
結果：８個の未改変マスター細胞系すべてが、細菌、真菌およびウイルスの存在に関して陰性であることがわかった。
【０１３１】
インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での成長および操作中、各細胞系は、細菌、真菌およびマイコプラズマ感染に関してルーチンで試験した。他の細胞による汚染を回避するために、研究室での操作中、培養液は、完全に個別に処理した。最終的に、治療日に、接種試料をグラム染色により再試験する。すべての無菌性試験を通過した細胞のみが治療に使用される。
【０１３２】
試験限界は、細菌、マイコプラズマまたは真菌感染なしである。
【０１３３】
臨床等級のｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２プラスミド ｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２プラスミドの予備解析後、Qiagen Corporationにより最適化された、Birnboim およびDolyのアルカリ溶解法(Birnboim and Doly, 1979)により、細菌培養液からＤＮＡストックを調製し、Qiagen EndoFree Gigaプレップカラムにて精製した。すべての工程は、バイオセーフティフローフード中で、ＡＲＴバリアチップを用いて、無菌条件下にて行った。一定分量のプラスミドＤＮＡを取り出して、無菌性に関して試験した。簡潔に述べると、プラスミドＤＮＡ２０μｌを用いて、それぞれが抗生物質を含まないＬＢ５ｍｌを含有する、４つの培養チューブに接種した。培養液を、３７℃で５日間インキュベートした。
【０１３４】
試験限界：細菌成長なし
【０１３５】
結果：コロニーは観察されず、調製した臨床等級のＤＮＡの無菌性を確認した。
【０１３６】
製造およびパッケージング手法の簡単な概説 ８種の樹立ＮＳＣＬＣ細胞系を、American Tissue Cell Culture(ATCC)または他から購入し、膨張させて、未改変マスター細胞バンク（ｕｎＭＣＢ）として凍結した。各細胞系は、無菌性（細菌およびウイルス汚染）、クローン原性およびＴＧＦβ２発現に関して試験をした。一定分量の各系を解凍し、標準的な技法を用いて、ＴＧＦβ２アンチセンス導入遺伝子を含むベクターであるｐＣＨＥＫ/ＨＢＡ２でトランスフェクトした。遺伝子改変細胞系をハイグロマイシン選択のもと培養液で膨張させ、治療用途および試験に十分な数に成長させた。次に膨張した細胞系を、ＴＧＦβ２発現のダウンレギュレーションおよび無菌性に関してアッセイした。ＴＧＦβ２発現に関して適切なダウンレギュレーションを示し、かつ無菌性を示す４つのＮＳＣＬＣ細胞系：ＮＣＩ−Ｈ−４６０、ＮＣＩ−Ｈ−５２０、ＳＫ−ＬＵ−１およびＲｈ−２ について同定した。これらの細胞系を、（１）遺伝子改変マスター細胞バンク（ｇｍＭＣＢ）および（２）遺伝子改変作業用細胞バンク（ｇｍＷＣＢ）として、一定分量で凍結し、液体窒素中に保管した。使用前に、一定分量のこれらの４つの細胞系を、ｇｍＷＣＢから解凍して、１０，０００Ｇｙで照射し、無菌性、クローン原性およびＴＧＦβ２ダウンレギュレーションに関して再試験した。すべての試験限界を通過した細胞ロットのみが、ワクチン調製に使用することが可能である。次に、注射日に、使用可能のｇｍＷＣＢロットそれぞれから十分な細胞を解凍し、照射して、等数で混合する。患者へのワクチン接種前に、接種試料を、細菌汚染に関して試験する。汚染が検出されない場合、ワクチン接種に取りかかることができる。
【０１３７】
組織獲得 以下の８個の樹立ＮＳＣＬＣ細胞系は、American Type Culture Collection(ATCC)またはその他から得られ、培養液にて膨張させ、未改変マスター細胞バンク（全８個のｕｎＭＣＢ）として凍結した。１０％のＦＢＳ、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２．５μｇ／ｍｌのフンギゾン、５０μ
ｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシン、１０-4Ｍのα−チオ−グリセロールおよび非必須アミノ酸を補充したＩＭＤＭにて、細胞系を培養した。各細胞系は、１バイアルにつき１０8細胞超であって、１００バイアル分を含む１つのロットとして凍結した。各細胞系は、無菌性およびＴＧＦβ２発現に関して試験した。以下の細胞系を使用した：
・ＮＣＩ−Ｈ−２９２
・ＮＣＩ−Ｈ−４６０
・ＮＣＩ−Ｈ−５２０
・ＮＣＩ−Ｈ−５９６
・ＮＣＩ−Ｈ−６６１
・ＳＫ−ＬＵ−１
・ＳＫ−ＭＥＳ−１
・Ｒｈ−２
【０１３８】
ヒトＴＧＦβ２アンチセンス発現プラスミドの構築 ｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２プラスミドの説明 ヒトＴＧＦβ２アンチセンス発現プラスミド（ｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２）を構築するために使用されるｐＣＨＥＫベクターは、ｐＣＥＰ４ベクター(Invitrogen, サンディエゴ, カリフォルニア)から得られるので、癌細胞の遺伝子改変を容易にし、安全性の懸念を排除した。ｐＣＨＥＫベクターは、以下を除くすべての領域でｐＣＥＰ４ベクターと同一である：
・アンピシリン耐性の代わりに、カナマイシン耐性が、ｐＣＨＥＫベクターには組み込まれている。
・ｐＣＨＥＫベクターでは、ＳＶ−４０初期プロモーター、続くイントロンから構成されるＤＮＡカセットユニットが、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現を駆動する。ＳＶ−４０プロモーター／イントロンユニットの組込みは、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現を増加させて、培養液中の遺伝子改変細胞の選択を容易にするためである。
【０１３９】
ｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２プラスミドは、ＣＭＶプロモーターを利用して、アンチセンス方向性で、９３０塩基対ヒトＴＧＦβ２断片の発現を駆動する。ＴＧＦβ２アンチセンス断片は、ＣＭＶプロモーターに隣接してかつその制御下にて逆方向性で連結されるヒトＴＧＦβ２のｃＤＮＡ分子の５’末端の塩基６〜９３５によって構成される。ｐＣＨＥＫベクターはまた、ＳＶ−４０初期プロモーターにより駆動されるハイグロマイシン耐性遺伝子、エプスタイン・バーウイルス複製起点、およびエプスタイン・バーウイルス核関連タンパク質１（ＥＢＮＡ−１）のための遺伝子を含む。さらに、このベクターは、ＤＮＡ製造中のベクターを含む細菌の選択のためのＣｏｌＥ１起点およびカナマイシン耐性遺伝子を含む。
【０１４０】
【表４】
2012176994.tif 000005
【０１４１】
ＴＧＦβ２アンチセンスのｐＣＨＥＫベクターへのサブクローニング ＴＧＦβ２単離 ｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２プラスミドを構築するために、本発明者等はまず、ｐＣＥＰ４／ＨＢＡ２、シャトルベクターを構築した。簡潔に述べると、ヒトＴＧＦβ２遺伝子を含有するプラスミドｐＰＣ２１（Dr.Purchioから公的に入手可能）を、ＥｃｏＲＩで完全に消化させた。ＥｃｏＲＩ末端を、反応条件をそれぞれ２５０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰに調節し、３ユニットのクレノー酵素を添加して、反応を開始することにより平滑末端化した。反応は、３７℃にて３０分間行った。次に、反応容量をＴＥで１００μｌに調節し、フェノール／クロロホルムで抽出をした。ＤＮＡをイソプロパノール沈殿して、７０％エタノールですすいだ。９３０塩基対ＴＧＦβ２断片（ＨＢＡ２）が、ＨｉｎｄＩＩＩ消化によりベクターから放出された。１％アガロースゲルの電気泳動後、９３０ｂｐＴＧＦβ２断片を含有するゲルスライスを切除し、ルーチンな酸化シリカ（ガラス粉末）法によりＤＮＡ断片を抽出した。これにより、ＴＧＦβ２ＤＮＡをｐＣＥＰ４ベクターに連結させる準備ができた。
【０１４２】
ｐＣＥＰ４／ＨＢＡ２シャトルベクター構築 ＸｈｏＩ制限酵素で消化することにより、ｐＣＥＰ４ベクターを調製し、上述のようにクレノー反応により平滑末端にした。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿後、ベクターをＨｉｎｄＩＩＩで消化して、上述のようにアガロールゲル電気泳動／ガラス粉末法により精製した。
【０１４３】
９３０塩基対ヒトＴＧＦβ２断片を、アンチセンス方向性となるようにｐＣＥＰ４ベクターにサブクローニングした。大腸菌の形質転換後、ｐＣＥＰ４／ＨＢＡ２のＤＮＡを、数個のアンピシリン耐性形質転換細菌コロニーから調製した。これらのコロニーからの単離されたＤＮＡは、制限酵素解析を行い、ｐＣＥＰ４／ＨＢＡ２と命名した１つのクローンを選択し、臨床用プラスミドｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２の構築のために使用した。
【０１４４】
ｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２発現プラスミド構築 簡潔に述べると、ｐＣＥＰ４／ＨＢＡ２のＤＮＡを、制限酵素ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化して、９３０ｂｐＴＧＦアンチセンス挿入断片をアガロースゲル電気泳動により精製した。次に、挿入物をＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＣＨＥＫベクターに連結し、細菌を形質転換するのに使用した。一晩の培養のカナマイシン選択後、ｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２のＤＮＡを数個のクローンから単離して、制限酵素解析を行い、同定を行った。ＴＧＦβ２アンチセンス断片の正確な配列および方向性をさらに確認するために、ＡＢＩ−３１０遺伝子アナライザー(Perkin Elme
r, Foster City, CA)を用いた配列分析により、挿入物を試験した。
【０１４５】
臨床等級のｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２プラスミドの製造 予備解析をした後、ｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２プラスミドを含有する１つの細菌コロニーを、１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するLuria-Bertani培地（ＬＢ培地）寒天プレート上で画線培養した。３７℃でインキュベートした後、単一の細菌コロニーを、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢブロス５ｍｌに接種し、振盪細菌インキュベーター中で３７℃にて一晩成長させた。この一晩の培養液を、細菌を含むプラスミドの５０ｍｌ培養液に接種した。５０ｍｌの細菌培養液を一晩インキュベートし、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを加えたＬＢを２リッター含むフラスコに接種した。これを、３７℃にて一晩成長させた。
【０１４６】
Qiagen Corporationにより最適化されるようなBirnboim and Dolyのアルカリ溶解法により、細菌培養液からＤＮＡを調製し(Birnboim and Doly, 1979)、Qiagen EndoFree Gigaプレップカラムにて精製した。すべての工程は、バイオセーフティフローフード中でＡＲＴバリアチップを用いて、無菌条件下で行った。
【０１４７】
一定分量のＤＮＡを、制限分析およびＤＮＡ濃度の決定のために取り出した。プラスミドＤＮＡ濃度を１ｍｇ／ｍｌに調節し、一定分量に分割し、後の使用のために−７０℃で保管した。一定分量のプラスミドＤＮＡを取り出して、無菌性に関して試験した。
【０１４８】
ｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２プラスミドを用いたＮＳＣＬＣ細胞系の遺伝的改変 ４つの一定分量の各ＮＳＣＬＣ細胞系を適切なｕｎＭＣＢから取りだし、培養で成長させた。１週間に２度、新鮮な培地を細胞に供給した。遺伝子改変をする日に、細胞に新鮮な培地を供給した。４時間後、細胞をトリプシン処理し、血清を含む培地で、続いてＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳ３５０μｌ容量にて、細胞密度を１ｍｌ当たり１〜２×１０7細胞に調節し、１５〜２０分間氷上でインキュベートした。ｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２プラスミド５０μｇを添加した。混合物をさらに１０〜１５分間、氷上でインキュベートした。次に細胞懸濁液を予冷したキュベットに移し、氷上でインキュベートした。５分後、キュベットを方形波エレクトロポレーター(Genetronic, San Diego, CA)に入れて、各パルスが７５μｓ持続する３０００ｖ／ｃｍの３つのエレクトロポレーションパルスに曝露した。５０ｍＭのＨｅｐｅｓを含有する新鮮な冷培地１ｍｌを添加して、混合物を室温にて１０分間インキュベートした。次に細胞を２回の分裂周期の間平板培養し、続いて選択を行った（トランスフェクション後７２時間）。ハイグロマイシン２５μｇ／ｌを含有する新鮮な培地を培養液に添加した。遺伝子改変細胞を培養液で膨張させ、１つの細胞系につき総計４つの遺伝子改変マスター細胞バンク（ｇｍＭＣＢ）として凍結させた。遺伝子改変細胞におけるｐＣＨＥＫ／ＨＢＡ２プラスミドの存在が、ＰＣＲにより確認された。さらに、各ｇｍＭＣＢからの５つのバイアル（５％）を取り出し、好気性、嫌気性、マイコプラズマおよび真菌アッセイからなる無菌性試験のために使用した。
【０１４９】
患者へのワクチン接種用細胞系の調製および同定 遺伝的改変後、腫瘍細胞を培養液で膨張させて、治療用途および試験に十分な細胞を成長させた。同一性、強度および安全性試験限界を通過した各細胞系からのクローンを、遺伝子改変マスター細胞バンク（ｇｍＭＣＢ）および遺伝子改変作業用細胞バンク（ｇｍＷＣＢ）の一定分量として、液体窒素中に冷凍保存した。患者へのワクチン接種前に、各ｇｍＷＣＢロットからの一定分量を解凍し、本発明者等がこれらのＮＳＣＬＣ細胞を含む種々の組織源の培養腫瘍細胞によるコロニー形成を完全に停止させることが可能であることを実証した照射線量である１０，０００ｃＧｙの線量で照射した。各ロットのからの一定分量に対して、安全性、強度および同一性試験を行い、細胞操作および凍結中に改変または汚染が起こっていないことを確実に保証した。ロットを、クローン原性、無菌性およびＴＧＦβ２ダウンレギュレーションに関して試験する。
【０１５０】
患者へのワクチン接種の前の細胞の調製および試験 皮下免疫化の前に、４つの選択した細胞系の一定分量を短期間培養液に入れる。遺伝子改変細胞を、培養皿から分離して、洗浄して、培地に再懸濁させ、１０，０００ｃＧｙで照射し、洗浄して、乳酸加リンガー液に再懸濁させた。次にそれらを、無菌性および生存度に関して試験する。試験限界を通過した細胞のみを、患者のワクチン接種に使用する。
【０１５１】
明瞭性および理解の目的で、やや詳細に本発明を説明してきたが、本発明の本来の範囲を逸脱することなく形態および細部の様々な変更がなされ得ることを当業者は理解するであろう。上述に参照したすべての図、表および付録、ならびに特許、出願および刊行物は、参照により本明細書に援用される。
【配列表】
2012176994000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年7月19日(2012.7.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦβの発現を低減するのに有効なＴＧＦβ阻害剤を発現する遺伝的構築物を含む、治療上有効な量の遺伝的に改変された細胞を含む組成物であって、前記ＴＧＦβ阻害剤はアンチセンス又はリボザイムであり、前記遺伝的に改変された細胞は自己細胞及び／又は同種異系細胞である肺癌細胞である組成物。