(57)【要約】【課題】ポリマー混合物および活性化合物からなる徐放用医薬製剤を提供する。【解決手段】水素結合部位を含む構造を有すると共に、相補的な水素結合部位を含む構造を有する第１のポリマーおよび分解すると分解生成物を形成し前記第１のポリマーからの前記活性化合物の放出を促進する第２のポリマーと混合された生物活性化合物を含む製剤。【選択図】  図２０
2012025772.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水素結合部位を含む化学構造を有する生物活性化合物と、
水素結合部位を含み、チロシン誘導ジフェノールモノマーユニットを備え、生体適合性加水分解ポリカーボネートである第１のポリマーと、
前記第１のポリマーより疎水性が低い生体適合性の第２のポリマーとを含み、
前記第２のポリマーは加水分解して前記活性化合物の放出を促進する酸性分解産物を形成する、製剤。
【請求項２】
前記生物活性化合物は薬剤として活性がある、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記薬剤として活性な化合物はペプチドである、請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
前記ペプチドは環状ペプチドである、請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
前記ペプチドは血小板凝集阻害（ＰＡＩ）ペプチドである、請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
前記ＰＡＩペプチドは糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａの合成環状ヘプタペプチである拮抗薬である請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
前記第１ポリマーの前記ポリカーボネートはポリ（アルキレンオキシド）とランダムブロック共重合される、請求項１に記載の製剤。
【請求項８】
前記チロシン由来ジフェノールモノマーはデスアミノチロシルチロシンエステルからなる、請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
前記エステルはエチルエステルまたはヘキシルエステルである、請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
前記第２のポリマーは、チロシン誘導ジフェノールモノマーユニットを備えた第２のポリカーボネート、ポリ（グリコール酸）、ポリ乳酸、ポリ（グリコール酸−ｃｏ−乳酸）（ＰＧＬＡ）、ポリカプロラクトン、およびポリ（ヒドロキシアルカン酸）から選択される、請求項１または７に記載の製剤。
【請求項１１】
前記第２のポリマーはＰＧＬＡである、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１２】
水素結合部位を含む化学構造を有する生物活性化合物と、
水素結合部位を含み、チロシン誘導ジフェノールモノマーユニットを備え、ポリ（アルキレンオキシド）とランダムブロック共重合される生体適合性加水分解ポリカーボネートである第１のポリマーと、
前記第１のポリマーより疎水性が低い生体適合性の第２のポリマーとを含み、
前記第２のポリマーは加水分解して前記活性化合物の放出を促進する酸性分解産物を形成する、製剤。
【請求項１３】
前記ペプチドは環状ペプチドである、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１４】
前記チロシン誘導ジフェノールモノマーはデスアミノチロシルチロシンエステルからなる、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１５】
前記第２のポリマーは、チロシン誘導ジフェノールモノマーユニットを備えた第２のポリカーボネート、ポリ（グリコール酸）、ポリ乳酸、ポリ（グリコール酸−ｃｏ−乳酸）（
ＰＧＬＡ）、ポリカプロラクトン、およびポリ（ヒドロキシアルカン酸）から選択される、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１６】
活性化合物を非ヒト患者にパルス送達する方法であって、
製剤を非ヒト患者に投与することからなり、該製剤が、
水素結合部位を含む化学構造を有する生物活性化合物と、
水素結合部位を含み、チロシン誘導ジフェノールモノマーユニットを備え、生体適合性加水分解ポリカーボネートである第１のポリマーと、
前記第１のポリマーより疎水性が低い生体適合性の第２のポリマーとを含み、
前記第２のポリマーは加水分解して前記活性化合物の放出を促進する酸性分解産物を形成する、方法。
【請求項１７】
前記ペプチドは環状ペプチドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１ポリマーの前記ポリカーボネートはポリ（アルキレンオキシド）とランダムブロック共重合される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
文献には、ポリマー材料を用いた活性薬剤の遅延放出またはパルス（pulsed）放出の例が多くある。しかしながら、そのシステムを２種類の基本的カテゴリーに分けることができる。すなわち、ポリマーマトリクスからの活性薬剤放出を誘発する環境刺激に依存するもの、ならびに特定の時間間隔が経過した後に薬剤を放出するよう設計されたものである。用いられてきた環境刺激の例としては、電気的衝撃、ｐＨ変化もしくは温度変化、磁場の印加または超音波がある。
【背景技術】
【０００２】
徐放を行う系はさらに、一定の時間間隔後に、分解もしくは溶解するよう設計された活性薬剤周囲に設けられた障壁技術を利用するもの、ならびにポリマー自体の分解を利用して活性薬剤の放出を誘発するものに分けることができる。
【０００３】
一つの手法は、誘導体化デキストランから構成されるポリマーヒドロゲルを製造し、ヒドロゲルに、ヒドロゲルを分解する酵素である内因性デキストラナーゼとともにモデルタンパク質であるＩｇＧを組み込むというものであった。その酵素を用いないと、タンパク質放出が非常に遅いことが認められている。しかしながら、その酵素を製剤に含有させた場合、放出速度は酵素濃度によって決まっていた。高濃度では、放出は迅速かつ完全であり、低濃度では放出が遅れていた。
【０００４】
ポリマーの加水分解に関連する遅延放出についても研究が行われている。ヘラー（Heller）のいわゆる「第３世代」ポリ（オルトエステル）は、室温で粘稠性のある軟膏であり、モデルタンパク質であるリソチームと混合すると、遅延放出プロファイルを示した。遅延時間の長さは、ポリマーの分子量およびそのポリマーのアルキル置換基に相関していることが認められた。
【０００５】
動物薬用の水不溶性の駆虫剤であるイベルメクチンをＰＬＧＡ（５０：５０）ミクロスフェアにカプセル封入したところ、この薬剤のインビボでのその後のパルス放出は、ポリマーマトリクスの分解速度によって決まることが明らかになっている。ＰＬＧＡミクロスフェアからの活性薬剤のパルス放出および遅延放出については、クレランド（Cleland\~
）らが最も精力的に研究している。高動粘度のポリマー溶液および高ポリマー比の水溶液を用いて、ＰＬＡまたはＰＬＧＡミクロスフェアを処理している。それによって、薬剤放出にはかなり多量のポリマー侵食を必要とする高密度ミクロスフェアが製造された。その条件によって、低装填量（通常１重量％）、中等度のバーストおよび薬剤の大量溶脱が起こる遅延時間を有するミクロスフェアが得られる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
（発明の開示）
本開示に記載の技術は、先行技術からの逸脱を表すものである。この系では、ポリマーと活性化合物の間の結合相互作用を用いて、活性化合物をポリマーマトリクス中に封じ込める。いくつかの異なる種類の相互作用（吸着、π−結合、イオン結合）を想到することができるが、水素結合相互作用が最も好適であるように思われる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、本発明の１態様によれば、生理活性化合物を含む製剤であって、相補的水素結
合部位を有する構造を有する第１のポリマーおよび分解することでその第１のポリマーからの活性化合物の放出を促進する分解産物を形成する第２のポリマーと混合した、水素結合部位を有する構造を持った製剤が提供される。
【０００８】
従って、この製剤は３種類の成分、すなわち２種類のポリマーおよび生理活性化合物からなり、それら全てが混合されている。そこで本発明は、徐放的に薬理活性化合物もしくは生理活性化合物を放出することで、放出前の遅延時間の設計、パルス放出の設計、ならびに「バースト」（例：非常に短い初期使用期間内でのかなりの量の装填薬剤の即時かつ未制御の放出）に対して抵抗性である高装填の系の設計を可能とする新たな移植可能または注射可能な薬剤放出系を提供するものである。
【０００９】
本発明は、一方のポリマーの分解産物を利用して、他方のポリマーからの活性化合物の放出を誘発するものである。さらに、活性化合物の遅延放出を、複雑かつ細かな製剤技術が必要な障壁系を使用することなく行うことができる。さらに本発明は、活性化合物と遅延分解性疎水性マトリクスポリマーとの間の水素結合形成に依存するものである。その特徴により、バースト（上記で定義）を起こすことなく、系に水溶性活性化合物を予想外に高い装填量で組み込むことが可能になる。一般に使用されるポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）またはポリジオキサノンなどのα−ヒドロキシ酸に基づくポリマーに水溶性ペプチドを組み込んだ場合に認められる挙動とは異なり、本発明の系においては、ポリマーマトリクスと活性化合物との間の水素結合介在相互作用の形成によって、極めて高い装填量であってもバーストが防止される。
【００１０】
連続放出の形とは対照的に、パルス様式で患者に投与した場合により有効な薬剤が多くある。例えば、現在その種の投与系に関して非常に興味深い分野は単発免疫法である。免疫は、抗原のパルス投与によって最も良好に誘発されることから、追加免疫投与が必要である。破傷風トキソイドまたはｇｐ１２０（ＡＤＩＳワクチン用に現在開発中）などの抗原用の投与系を患者に１回埋め込み、予めプログラムされた時間間隔で追加免疫用量を放出できるのであれば、特に第３世界諸国において、それが経済的かつ有効であると考えられることが提案されている。
【００１１】
従って本発明は、本発明の製剤を患者に投与することで、処置を必要とする患者に対して生理活性化合物をパルス投与する方法をも含むものである。
この種の薬剤投与は、ホルモンに基づく薬剤投与においても重要である。動物およびヒトの両方における妊娠および避妊薬物療法は連続的ではなく、それらの療法が月経周期および相当するホルモン増減と相乗的に働くことから、むしろ性質的には周期的である。それは、活性化合物の遅延および／またはパルス放出が適用可能と考えられる薬剤投与における別の方向性である。
【００１２】
肥料、殺草剤および他の活性薬剤の持続性投与が必要な農業的利用分野が、本発明が重要であると考えられる別の領域である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】チロシン由来ポリアリレートの化学構造の図であり、図中において矢印はポリマーにおいて変化させる部位を指す。
【図２】インテグリリン（商標）（ＩＮＴＥＧＲＩＬＩＮＴＭ）のアミノ酸配列を示す図。
【図３】ペプチド３０重量％を含むポリ（ＤＴＨアジペート）フィルムからのインテグリリン放出を示す図。
【図４】等価なＤ，Ｌ−ＰＬＡフィルムおよびポリ（Ｅ−カプロラクトン）フィルムからのインテグリリン放出を示す図。
【図５】インテグリリン３０重量％を含むポリ（ＤＴＨアジペート）サンプルの質量保持パーセントを示す図。
【図６】Ｄ，Ｌ−ＰＬＡフィルムからの質量保持パーセントを示す図。
【図７】インテグリリン３０重量％を含むＰＣＬフィルムおよびＰＬＡフィルムの吸水パーセントを示す図。
【図８】等価なポリ（ＤＴＨアジペート）フィルムに関する吸水パーセントを示す図。
【図９】純ポリ（ＤＴＨアジペート）およびインテグリリン３０重量％を含むポリ（ＤＴＨアジペート）の分子量保持パーセントを示す図。
【図１０】ポリ（ＤＴＨアジペート）フィルムからのインテグリリン（３０重量％）の放出に対するイオン強度の効果を示す図。
【図１１】電解質を加えない場合の、ｐＨ２．２でのポリ（ＤＴＨアジペート）フィルムからの３０重量％のインテグリリン放出を示す図。
【図１２】電解質を加えない場合の、ｐＨ２．２での３０重量％インテグリリンポリ（ＤＴＨアジペート）フィルムにおける水取り込みを示す図。
【図１３】ポリ（ＤＴＨジオキサオクタンジオエート）の構造を示す図。
【図１４】ポリ（ＤＴＨジオキサオクタンジオエート）フィルムからのインテグリリンの放出を示す図。
【図１５】ポリ（ＤＴＥカーボネート）の構造を示す図。
【図１６】ポリ（ＤＴＥｃｏＰＥＧ）からの１０重量％インテグリリン放出を示す図。
【図１７】ポリ（ＤＴＥカーボネート）からの１５重量％インテグリリンの放出を示す図。
【図１８】Ｄ，Ｌ−ＰＬＡ／ポリ（ＤＴＨアジペート）フィルムからのＰＢＳ中（ｐＨ＝７．４、３７℃）３０重量％インテグリリンのインビトロでの放出を示す図。
【図１９】ＰＬＧＡの化学構造を示す図。
【図２０】ポリ（ＤＴＨアジペート）とＰＬＧＡの５０：５０混合物からの１５重量％インテグリリンの累積放出を示す図。
【図２１】インテグリリン含有ＰＬＧＡ／ポリ（ＤＴＨアジペート）混合物フィルムのＮＭＲスペクトルを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
前記混合物における第１の第１のポリマーは、遅延分解性で比較的疎水性の生体適合性ポリマーである。生理活性化合物との水素結合相互作用形成を促進するため、第１のポリマーとして高官能性ポリマー系を選択することも必要である。最も広い実施形態においては、遅延分解性の疎水性生体適合性ポリマーは、化学構造の一部として水素結合部位を有するようないかなるポリマーであっても良い。最も好ましい実施形態では、その遅延分解性かつ疎水性のポリマーは、米国特許第５，２１６，１１５号およびＷＯ第９９／５２９６２号（これらのいずれの開示内容も、引用により本明細書に組み込まれる）に開示のチロシン由来ポリアリレートに関するライブラリーから選択される。このライブラリーのものはいずれも、同じ高官能性構造基本形を共有するが、小さい構造的変化によって互いに区別される。主要基本形の官能基が、相互作用のための部位を提供する。その部位は、それの芳香環とペプチドの芳香環とのｐｉスタッキングまたはα−アミノカルボキシレート領域のペプチドにおける相当する基との水素結合である。構成員間の小さい構造的変化によって、これらの相互作用を微細に調整して、特定のタンパク質またはペプチドに適合させることができる。
【００１５】
米国特許第５，５８７，５０７号のチロシン由来ジフェノール化合物およびＷＯ第９８／３６０１３号のチロシン由来ジヒドロキシモノマー類から誘導することができるポリマ
ーも好ましい（これらいずれの文献の開示内容も、引用により本明細書に組み込まれる）。上記で引用のポリアリレート類以外の例として、米国特許第５，０９９，０６０号のポリカーボネート類、米国特許第４，９８０，４４９号のポリイミノカーボネート類、米国特許第５，９１２，２２５号のポリホスファゼン類およびポリホスホネート類、米国特許第５，２４２，９９７号のポリウレタン類などのポリウレタン類、米国特許第５，６５８，９９５号のランダムポリ（アルキレンオキサイド）ブロックコポリマー類、ならびに上記のチロシン由来ジフェノール化合物、チロシン由来ジヒドロキシ化合物および同様のペプチド類から誘導することができる広範囲の他のポリマー類などがある。上記の特許公開はいずれも、参照によって本明細書に組み込まれる。特に、チロシン由来ジヒドロキシ化合物の相当するポリマーは、チロシン由来ジフェノール化合物のポリマーを開示する上記のいずれかの特許のいずれかの方法によって製造することができる。
【００１６】
特に好ましい第１のポリマーは、図１のポリ（アジピン酸デスアミノチロシルチロシンヘキシルエステル（ポリ（ＤＴＨアジペート））（ｙ＝４；Ｒ＝ヘキシル）である。重量平均分子量が約８０，０００〜約２００，０００ダルトンであるポリ（ＤＴＨアジペート）が特に好ましい。
【００１７】
ポリマー混合物内で物理的に分散させることができる水素結合部位を有する生理活性部位を、放出用の生理活性化合物として用いることができる。水素結合部位の例としては、１級および２級アミン類、水酸基、カルボン酸基およびカルボキシレート基、カルボニル（カルボキシル）基などがある。天然および合成抗生物質、細胞毒性薬およびオリゴヌクレオチドなどの水素結合部位を有する活性化合物に本発明を適用することができるが、ペプチドおよびタンパク質などのアミノ酸由来薬剤が、この技術には最も適しているように思われる。本発明の組成物は、バーストおよび／または遅延効果を起こすことなく再現性の良い放出プロファイルを示す徐放デバイスを得るための従来の試みにおいて遭遇していた問題の一部を克服するものである。最も好ましい実施形態において活性化合物は、温和な酸性条件下で安定なペプチドである。
【００１８】
本発明の組成物を含む製剤に好適なペプチド薬には、天然および合成のペプチド類、オリゴペプチド類、環状ペプチド類、ライブラリーで得られたオリゴペプチド類、ポリペプチド類およびタンパク質類、ならびにペプチド様作用物質および部分ペプチド類などがある。特に興味深いペプチド薬には、細胞表面糖タンパク質Ｉｉｂ／ＩＩＩａの拮抗薬であることから、血小板凝集を防止し、最終的に血塊形成を防止する血小板凝集阻害（ＰＡＩ）ペプチド類などがある。好ましいＰＡＩペプチド類には、ＷＯ第９０／１５６２０号（この開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる）に開示のＰＡＩペプチド類などがあり、特には医薬的に有用である環状ＰＡＩヘプタペプチドであるインテグリリン（商標）（図２）である。
【００１９】
ペプチド薬の場合、そのペプチドと第１のポリマーの間の相互作用によって、ペプチドの放出が阻害される。それらの相互作用は、水素結合と疎水性力から成る。これらの相互作用は、低ｐＨ条件下では弱まって、ペプチド放出を生じ得ることが発見されている。従って、それを行う一つの方法は、分解して酸性副生成物となる第２のポリマーを例えばポリ（グリコール酸−ｃｏ−乳酸）（ＰＧＬＡ）などのマトリクスに混合するというものである。ＰＧＬＡ分解産物によってマトリクスのｐＨが低下することで、相互作用の中断およびその後のペプチド放出が生じる。放出の時期の制御は、この急速分解性ポリマーの初期分子量の選択、ＰＧＬＡポリマー中での乳酸とグリコール酸のコポリマー比、ならびにコポリマーのキャッピングの選択によって容易に行うことができる。これらの要素全てが分解の速度論を決定することから、これらの要素を用いて、前記デバイスからの活性薬剤放出を制御することもできる。ｐＨ低下性（酸性）分解産物を生じる他の有用なポリマーには、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸）、ポリカプロラクトン、ポリ（ヒドロキシ酪
酸）およびポリ（ヒドロキシ吉草酸）のようなポリ（ヒドロキシアルカン酸類）などがある。
【００２０】
留意すべき重要な点として、本発明は、第１のポリマーより相対的に親水性の高い第２のポリマーの選択に基づくものである。そこで、第１のポリマーの疎水性が高い場合、他の場合において通常であればやはり疎水性であると考えられるものであっても、相対的に疎水性の低いポリマーを第２のポリマーとして用いることができる。同様に、第２のポリマーの親水性が高い場合、他の場合において通常であればやはり親水性であると考えられるものであっても、相対的に親水性の低いポリマーを第１のポリマーとして用いることができる。従って、第１のポリマーが活性化合物と水素結合を形成し、第２のポリマーが第１のポリマーより親水性であって、分解して第１のポリマーからの生理活性化合物の放出を促進する分解産物を形成するのであれば、本明細書で挙げた２種類のポリマーを第１のポリマーとして用い、あるいは本明細書で挙げた２種類のポリマーを第２のポリマーとして用いて好適な組成物を製造することができる。通常の技術を有する者であれば、第１のポリマーの一方が第２のポリマーとして機能する組合せおよびその逆があることも理解できよう。
【００２１】
本発明の組成物は、局所薬剤投与が望ましい用途、ならびに全身投与が望ましい状況で好適である。治療上有効な用量は、インビボまたはインビトロの方法によって決定することができる。本発明の特定化合物それぞれについて、個別の決定を行って、必要な至適用量を決定することができる。治療上有効な用量の範囲は当然のことながら、投与経路、治療目的および患者の状態によって影響される。各種の好適な投与経路に関しては、薬理学において公知の方法により、各薬剤について個別に吸収効率を求めなければならない。従って、至適な治療効果を得る上での必要に応じて、治療担当者が用量の力価測定を行い、投与経路を変更することが必要となる場合がある。有効用量レベル、すなわち所望の結果を達成するのに必要な用量レベルの決定は、当業者の裁量の範囲内である。代表的には化合物の投与は、相対的に比較的低いレベルから開始し、所望の効果が達成されるまで用量レベルを上昇させる。本発明の製剤からの薬剤の放出速度も、当業界における通常の技術の範囲内で変動させて、治療すべき治療状態に応じて有利なプロファイルを確認する。
【００２２】
一般的な用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲となると考えられる。有利には、本発明の化合物は１日数回投与することができ、他の投与法も有用な場合がある。
【００２３】
その組成物は、坐剤、埋込ペレット剤もしくは小シリンダ剤、エアロゾル、経口製剤ならびに軟膏、滴剤および経皮貼付剤などの局所製剤のような各種製剤を用いて、皮下投与、筋肉投与、結腸投与、直腸投与、経鼻投与、経口投与または腹腔内投与することができる。小単ラメラ小胞、大単ラメラ小胞および多ラメラ小胞などのリポソーム投与系も使用可能である。
【００２４】
以下に記載の実施例は、本発明のある種の態様を説明するものであるが、本発明はこれらに限定されるものではない。注記しない限り、部およびパーセント表示はいずれも重量基準であり、温度はいずれも摂氏単位である。ＰＡＩペプチドは、シー・オー・アール・セラピューティックス社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州所在（COR Therapeutics of S outh San Francisco, California）から入手した。ポリ（ＤＴＨアジペート）は、米国特許第５２１６１１５号の実施例２に記載の手順に従って製造した。使用したポリマーは、８０〜１２０ｋＤａの範囲の分子量を有していた。ＰＥＧは、アルドリッチ・ケミカルズ社、ウィスコンシン州ミルウォーキー所在（Aldrich Chemicals of Milwaukee, Wis）から入手した。Ｄ，Ｌ−ＰＬＡおよびポリ（ｓ−カプロラクトン）は、それぞ
れメディソルブ（Medisorb）およびアルドリッチから購入した。いずれも分子量は１００ｋＤａであった。薬剤およびポリマーは、それ以上の精製を行わずに使用した。溶媒は「ＨＰＬＣ用」であり、フィッシャー・サイエンティフィック社、ペンシルバニア州ピッツバーグ所在（Fisher Scientific of Pittsburgh, Pa ）から入手した。
【００２５】
実施例
インテグリリン（抗血栓薬注射剤）をモデルペプチドとして選択して、前記材料の薬物投与について調べた（図２）。この化合物は、非常に強力な糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗薬である、水に容易に可溶である合成環状ヘプタペプチドである。この化合物は、インビボで良好に抗血栓挙動を示しており、この特性を有するポリマーマトリクスにこのペプチドを組み込むことで製造されるデバイスは、多くの有用な心血管用途を有する。さらにこのポリマーはＲＧＤ配列を有することから、このペプチドを含むデバイスは、組織再生の足場における構成要素として利用可能である。
【００２６】
インテグリリンおよびポリ（ＤＴＨアジペート）の混合物は、米国特許第５，８７７，２２４号に記載されている。その特許では、共沈溶融−加圧法を用いてこれらの成分からフィルムを形成することで、ＰＢＳ中３７℃でインキュベートした際にごく微量のペプチドしか放出しない試料が得られたと記載されている。ペプチドは容易に水に溶けることから、これは予想外であった。
【００２７】
放出デバイスの作製
３０重量％のペプチドおよび７０重量％のポリマーを含む共沈物から、圧縮成型フィルムを作製した。この共沈物は、ペプチド０．１５ｇをメタノール（ＨＰＬＣ用）５ｍＬに溶かし、ポリマー０．３５ｇを塩化メチレン（ＨＰＬＣ用）５ｍＬに溶かし、それら２種類の溶液を混合して透明溶液を形成することで得た。そうして得られた溶液を、−７８℃に維持した撹拌エチルエーテル１００ｍＬに滴下した。白色のスポンジ状沈殿が生成し、焼結ガラスフィルターを用いてそれを濾過し、真空乾燥した。乾燥後、共沈物を約３４．５ＭＰａ（５０００ｐｓｉ）下に９０℃で圧縮成型した。厚さ０．１ｍｍ（±０．０２ｍｍ）のフィルムが得られた。
【００２８】
デバイスの特性決定  １０ｍＬメスフラスコ中、フィルム１０．０ｍｇをＴＨＦ（ＨＰＬＣ用）（１．０ｍＬ）に溶かし、１０ｍＬの線までＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を加えることで、ペプチド装填量を求めた。混合物を最低６時間撹拌し、次に水系媒体中の薬剤含有量をＨＰＬＣによって分析した。ＰＬＡまたはポリ（ｓ−カプロラクトン）からなるサンプルの特性決定を行う場合には、ＴＨＦに不溶であるため、ＴＨＦに代えて塩化メチレンを用いた。
【００２９】
ペプチド放出試験
フィルムをカットして、複数の０．５ｃｍ２正方形とした。サンプルの平均重量は２１ｍｇ（±５）であった。各試料を個別に、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４、３７℃）１０ｍＬの入った２０ｍＬ容量のガラス製シンチレーションバイアルに入れた。使用した標準ＰＢＳ溶液は、１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水１３８ｍＭ  ＮａＣｌおよび２．７ｍＭ  ＫＣｌからなるものであった。各時点で緩衝液を変え、ＨＰＬＣによってペプチド放出を分析した。各時点につき最低３個のサンプルとし、各サンプルは異なるフィルムから得たものとした。ＨＰＬＣ法では、３ｃｍのＣ−１８パーキンエルマー（Perkin\~Elmer
）カートリッジカラムを用い、移動相には、流量１ｍＬ／分で８０％水／２０％アセトニトリルから開始して、５分間で最終的に７５％水とする勾配を設けた。アセトニトリルと水のいずれにも、０．１体積％のトリフルオロ酢酸を含有させた。カラムは、ＰＢＳに溶かした既知濃度のペプチドを用いて較正して較正曲線を得て、各サンプルの緩衝液に含まれるインテグリリンを、その曲線を用いて定量した。使用したＨＰＬＣポンプは、パーキ
ンエルマーの４１０ＬＣポンプシリーズであり、使用した検出器は、２８０ｎｍに設定されたＰＥＬＣ−２３５ダイオードアレイＵＶ−ＶＩＳ検出器であった。収集データは、ＰＥネルソン（PE Nelson）３０００シリーズクロマトグラフィーデータシステムを用いて
解析した。
【００３０】
指定された時点でサンプルを取り出し、脱イオン水で洗浄し、キムワイプ（Kimwipe）
ティッシュで拭き取り、質量保持試験および分子量保持試験での真空乾燥用にバイアルに入れるか、あるいは熱重量分析（ＴＧＡ）水取り込み試験に用いた。ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）またはＴＧＡ試験に必要なかったデバイスは、乾燥後に有機溶媒に溶かし、ペプチド含有物を抽出して、全ての装填ペプチドが計算されるようにした。
【００３１】
熱重量分析（ＴＧＡ）を用いた含水量測定
インキュベートしたサンプルによって吸収された水分量を、ＴＧＡ９５１（ＴＡインスツルーメント社（TA\~Instruments,\~Inc.））を用いて測定した。サンプルを緩衝液から取り出し、脱イオン水で洗浄して緩衝剤塩を除去し、キムワイプティッシュで拭き取って乾燥させた。試料から少量のサンプル（１０ｍｇ）を切り取り、アルミニウム製のＴＧＡ皿に乗せた。サンプルを、窒素気流下に室温から２２５℃まで１０℃／分の速度で加熱した。サンプルを室温から１５０℃まで加熱しながら、サンプルの重量損失によって水分取り込みを測定した。
【００３２】
微量天秤を用いた含水量測定
所定の時点で、サンプルを緩衝液から取り出し、脱イオン水で洗浄し、拭き取って乾燥させた。電子天秤を用いて、直ちにサンプルの湿重量（Ｗｗ）を測定した。サンプルを少なくとも２週間真空乾燥して恒量とした後、乾燥重量（Ｗｄ）を測定した。水分取り込み量を、下記式
水分取り込み％＝［（Ｗｗ−Ｗｄ）／Ｗｄ］×１００
から計算した。
【００３３】
ペプチドの融点およびポリマーフィルムでの溶融転移を測定するための示差走査熱量測定分析（ＤＳＣ）
ＤＳＣを用いて、ペプチドの融点を測定した。ペプチド約２ｍｇのサンプルを秤取し、波形のアルミニウム製ＤＳＣ皿に入れて密封した。サンプルを窒素気流下に室温から２００℃まで１２℃／分で加熱した。ＤＳＣを用いて、３０重量％のペプチドを含むポリマーフィルムに関連する溶融転移があるか否かも確認した。フィルム６ｍｇという量のサンプルを波形ＤＳＣ皿に入れて密封し、窒素気流下に２００℃まで１２℃／分で加熱した。融解の急峻な吸熱が起こった温度によって、サンプルの融点を求めた。データはいずれも、初回測定の温度記録図を用いて解析した。各実験では、空のアルミニウム皿を基準として用いた。使用した特定の装置は、ＤＳＣ９１０（ＴＡインスツルメンツ）であり、装置は使用前にインジウム（融点＝１５６．６１℃）で較正した。
【００３４】
質量保持パーセント試験
サンプルの質量保持パーセントを、次のようにして計算した。サンプルをＰＢＳインキュベーション媒体から取り出し、脱イオン水で洗浄し、キムワイプティッシュで拭き取った。それを新品のバイアルに入れ、２週間真空乾燥した。その乾燥期間後、それを秤量した（Ｗｄ）。インキュベーションおよび乾燥後の重量を、初期重量（Ｗ０）と比較した。質量保持パーセントの計算式は
質量損失％＝［（Ｗ０−Ｗｄ／Ｗ０］×１００
である。
【００３５】
ＧＰＣを用いたポリマーの分子量測定
フィルムサンプルをＴＨＦに溶かして濃度５ｍｇ／ｍＬとし、２５μｍガラス繊維フィルターで前濾過してから、０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターで濾過して、ＧＰＣへの注入に供した。ポリ（ＤＴＨアジペート）サンプルの分子量を、１セットの単分散ポリスチレン標準（ポリマー・ラボラトリーズ社、チャーチステーション、英国所在（Polymer Laboratories, Ltd. Church Station, U.K.）に対して計算し、それ以上の補正は行わなか
った。ＧＰＣクロマトグラフィーシステムは、ウォーターズ（Waters）５１０ＨＰＬＣポンプ、ウォーターズ４１０示差屈折計検出器およびデータ処理用のデジタルベンチュリ（Digital Venturi）の４６６ＰＣラニングミレニアム（PC running Millenium）（ウォー
ターズ社）ソフトウェアから成るものであった。長さ３０ｃｍの２本のＰＬ−ゲルカラム（孔径１０３および１０５Å；英国ポリマー・ラボラトリーズ社）をＴＨＦ  １ｍＬ／分の流量で直列で動作させた。ＰＬＡまたはＰＣＬからなるサンプルをＴＨＦではなく塩化メチレンに溶かし、それ以外についてはポリ（ＤＴＨアジペート）サンプルの場合と同様にして分析を行った。
【００３６】
ポリ（ＤＴＨアジペート）／ＰＬＡ混合物フィルムの作製
Ｄ，Ｌ−ＰＬＡおよびポリ（ＤＴＨアジペート）混合物からなる放出デバイスは、３０重量％のペプチドを含有していた。５０／５０Ｄ，Ｌ−ＰＬＡ／ポリ（ＤＴＨアジペート）の場合、インテグリリン０．１５ｇをメタノール５ｍＬに溶かし、ＰＬＡ  ０．１７５ｇおよびポリ（ＤＴＨアジペート）０．１７５ｇをそれぞれ塩化メチレン２．５ｍＬに溶かした。溶液を全て混合して、透明溶液を形成した。この時点からは、ポリ（ＤＴＨアジペート）デバイスの作製における手順に従った。
【００３７】
７５／２５ＰＬＡ／ポリ（ＤＴＨアジペート）からなるデバイスは、インテグリリン０．１５ｇをメタノール５ｍＬに溶かし、Ｄ，Ｌ−ＰＬＡ  ０．２６ｇを塩化メチレン４ｍＬに溶かし、ポリ（ＤＴＨアジペート）０．０９ｇを塩化メチレン２ｍＬに溶かし、その３種類の溶液を混合することで作製した。その時点からは、ポリ（ＤＴＨアジペート）デバイスの作製に関する手順に従った。
【００３８】
フィルムの作製および酸性条件下でのインキュベーション
これらのフィルムについては、ｐＨ計で測定したｐＨが６．８から２に降下するまで、撹拌ペプチド／メタノール溶液に濃ＨＣｌ（１２Ｍ）を滴下した以外、上記のものと同じ作製プロトコールに従った。
【００３９】
ｐＨ２で行ったインビトロインキュベーション試験における酸性媒体は、次のようにして調製した。標準ＰＢＳ溶液を用い、所望のｐＨが得られたことをｐＨ計が示すまで、ＰＢＳに１２Ｍ  ＨＣｌを滴下した。
【００４０】
イオン強度条件を変化させながらのフィルムのインキュベーション
３セットのフィルムを上記の標準法で製造し、１セットをＨＰＬＣ水中でインキュベートし、そのまま用いた。もう１セットは標準ＰＢＳ緩衝液中でインキュベートした。最後の１セットは、２倍濃度のＰＢＳ溶液であるＰＢＳ緩衝液中でインキュベートした。
【００４１】
ポリ（ＤＴＨアジペート）のガラス転移温度に対するペプチドの効果
数セットのフィルムのガラス転移温度を、動的機械分析（ＤＭＡ）を用いて測定した。測定は、撓み曲げ変形モードの応力で、ＴＡインスツルーメンツ社からのＤＭＡ９８３で行った。各組のフィルムには、ペプチド０重量％〜３０重量％の範囲の異なる重量パーセントのペプチドを含有させた。大きさ約５×１０×１ｍｍのサンプルをフィルムから切り出し、軽量クランプを有する装置の較正を行った後に、軽量クランプを用いて装置に載置した。液体窒素冷却補助器具を用いて、サンプルを−３０℃まで冷却し、４℃／分の速度で７０℃まで加熱した。周波数を１Ｈｚに固定し、振幅を１ｍｍとした。ガラス転移をＥ
″ピークの最大値から読み取った。
【００４２】
インテグリリン／ＰＬＧＡ／ポリ（ＤＴＨアジペート）混合物フィルムの形成
ペプチド０．０７５ｇをメタノール２ｍＬに溶かし、ＰＬＧＡ  ０．２１ｇを塩化メチレン３ｍＬに溶かし、ポリ（ＤＴＨアジペート）０．２１ｇを塩化メチレン３ｍＬに溶かすことで、インテグリリン／ＰＬＧＡ／ポリ（ＤＴＨアジペート）からなるデバイスを製造した。ＰＬＧＡ溶液をポリ（ＤＴＨアジペート）溶液にピペットで加えた。インテグリリン溶液を、混合ポリマー溶液にピペットで加えた。得られた透明溶液を、冷ジエチルエーテル（−７８℃）に滴下した。それ以降の手順は、上記のものと同様である。
【００４３】
混合フィルムの特性決定
ポリマーマトリクスを溶解させるのにＴＨＦに代えて塩化メチレンを用いて、上記の方法と同様にしてフィルムのペプチド装填量を測定した。
【００４４】
ポリマー混合フィルム中のＰＬＧＡ／ポリ（ＤＴＨアジペート）比について、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用いて特性決定した（図２１）。各フィルムについて、ＰＧＡメチレンプロトンの積分のＰＬＡメチンプロトンの積分に対する比を、理論値と比較した。実験比と理論比が互いに１０％以内であることを確認した。次に、ＰＧＡメチレンプロトン（４．８ｐｐｍ）の積分値を、４．１ｐｐｍのポリ（ＤＴＨアジペート）のメチレンプロトンの積分値と比較した。この４．１ｐｐｍのピークは、懸垂鎖におけるエステルの酸素に隣接するメチレン基のプロトンに関連するものである。ポリ（ＤＴＨアジペート）の上記プロトンに対するこれらＰＧＡプロトンの理論比は３．８６である。全てのフィルムについて、このように特性決定を行い、いずれの場合においても、ＰＧＡ／ポリ（ＤＴＨアジペート）の比の誤差は、ＰＧＡ／ＰＬＡの比の誤差の範囲内であった。
【００４５】
ＮＭＲ分析については、フィルム２０ｍｇを重クロロホルム０．７５ｍＬに溶かした。その溶媒を選択したのは、ペプチドがそれに不溶であるために、ＮＭＲでは検出されないことで、スペクトルが不必要に複雑になることが防止されると考えられたからである。サンプルは、バリアン（Varian）２００ＭＨｚ装置を用いて分析した。積分は、２５６回の測定後におけるスペクトルについて行った。サンプルについての積分を３回繰り返して正確さを確保し、積分値の平均を３回の値の平均から得た。
【００４６】
ＳＥＭを用いたフィルム表面の特性決定
洗浄および真空乾燥後に、サンプルをＳＥＭのスタブに取り付け、７リムの金パラジウムを用いて、バルツァーズ（Baltzers）ＳＣＤ００４スパッタコータでスパッタコーティングした。それを、２０ｋＶ、倍率＝９０倍のアムレー（Amray）１８３０１ＳＥＭで観
察した。
【００４７】
ＤＳＣを用いたポリマー混合物の混和性測定
ＤＳＣ９１０（ＴＡインスツルーメンツ、ＤＥ）を搭載したサーモアナリシス（Thermo
Analysis ）２１００システムを用い、使用前にインジウム（融点１５６．６１℃）で較正した。重量既知の（約４ｍｇ）ポリマーを、２個の波形アルミニウム製皿の間に密封した。そのサンプルについて、２連続加熱走査を行って、全サンプルについて同じ熱履歴となるようにした。最初の走査では、サンプルを１０℃／分の速度で１１０℃まで加熱した。温度を１０分間等温に維持した後、液体窒素を用いてサンプルを−２０℃まで冷却した。この段階によって、サンプルの熱履歴が消去される。２回目の走査は、その後直ちに、１０℃／分の速度で行った。２回目の走査で、ガラス転移に関連する吸熱段階転移の中点として、ガラス転移温度を測定した。
【００４８】
ポリ（ＤＴＨアジペート）を用いたインテグリリンの製剤
５、１０、１５、２０および３０重量％の装填量のペプチドを含むポリ（ＤＴＨアジペート）からなるフィルムを製造した。最も高い装填量を含むフィルムであっても、透明かつ可撓性であった。それとは対照的に、同じペプチド装填量を含むＤ，Ｌ−ＰＬＡまたはポリ（Ｅ−カプロラクトン）（ＰＣＬ）のいずれかからなるフィルムは不透明で脆かった。ペプチド／ポリアリレートフィルムの透明さは、ペプチドおよびポリ（ＤＴＨアジペート）の場合の相分離が十分に低下して、分離したポリマー領域とペプチド領域が非常に小さいために光の散乱が起こらないことを示していた。それは、Ｄ，Ｌ−ＰＬＡおよびペプチドまたはＰＣＬおよびペプチドの混合物と比較して、ペプチドおよびチロシン由来ポリマーの適合性が高くなっていることを示すものであった。
【００４９】
ペプチドといずれかの脂肪族ポリエステルからなるフィルムと比較した、ペプチドを含むポリアリレートフィルムの可撓性は、ＰＬＡ（５２℃）と比較して低いポリアリレートのガラス転移温度（３７℃）およびＰＣＬと比較したポリアリレートの非晶質性によって説明することができる。
【００５０】
３７℃およびｐＨ＝７．４でインキュベートしたフィルムからのペプチドの放出
この実験では、シミュレーションした生理条件下での各種ポリマーマトリクスからのペプチドのインビトロ放出挙動を観察した。予想に反して、両方の脂肪族ポリマーが、３時間以内にペプチドを完全に放出した。それとは対照的に、ポリ（ＤＴＨアジペート）は、同一条件下において７日間の期間でごく微量の放出しか示さなかった（図３および４）。
【００５１】
インキュベートしたサンプルの質量保持パーセント
３０重量％のペプチドを含むポリ（ＤＴＨアジペート）サンプルは、７日間のインキュベーション期間で平均５％の重量を失った（図５）。それとは対照的に、ポリ（ＤＴＨアジペート）サンプルと同じ方法で形成したＤ，Ｌ−ＰＬＡサンプルは、２時間以内でその重量の約３０％を失った（図６）。従って、これらの実験の結果は、ＨＰＬＣから得られたデータと一致していた。３０重量％のペプチドを含むポリ（ＤＴＨアジペート）フィルムの場合、ＨＰＬＣデータは、これらのフィルムが装填ペプチドの１０％未満を放出したことを示している（図３）。これは、７７日間の期間で、サンプル全体の質量損失が約３％であることを意味している。これは、これらのサンプルについて認められた平均５％の質量損失と一致している。
【００５２】
非常に小さい質量損失を示したポリ（ＤＴＨアジペート）サンプルとは対照的に、ＰＬＡサンプルはかなりの質量損失を示した。これらのフィルムサンプルも、３０重量％のペプチドを含有していた。ＨＰＬＣデータは、これらのサンプルが、それに含まれていたペプチドを全て放出したことを示しており、それは３時間のインキュベーション期間で３０％の重量損失を意味する。その結果得られた質量保持パーセントデータは、これらのサンプルについては約７０％であることから、ＨＰＬＣ結果と一致している。さらに、ＰＬＡマトリクスおよびＰＣＬマトリクスによってペプチドは非常に急速に放出されたことから、そのペプチドはポリマー鎖を通り抜けて容易に拡散するほど小さいものであり、フィルム内の深部に存在するペプチド分子を放出させるのに、多孔質構造および相互連絡通路を形成する必要はないと言うことができる。従って、ポリアリレートからのペプチドの放出における障壁は小さいはずである。
【００５３】
インキュベーション時のポリマーフィルムによる吸水の測定
３０重量％のペプチドを含むポリ（ＤＴＨアジペート）の試料は、最初の日で約１０重量％の水を吸収し、全インキュベーション期間にわたりその膨潤レベルを維持した。さらに、ペプチドが存在することで、ポリマーの吸水量が約３重量％から約１０重量％まで増加した（図８）。ポリ（ＤＴＨアジペート）に対するペプチドの含有装填量が同じであるＰＬＡおよびＰＣＬのサンプルも、それらをインキュベートした２〜３時間で、その範囲
内の水を吸収した（図７）。
【００５４】
前記ペプチドを用いた同じ方法で形成した場合の、上記３種類のポリマー間の水取り込みが類似していることは、吸水がペプチド放出における決定因子ではないことを示している。
ポリマーの分子量に対するペプチドの影響
ペプチド上のアミノ酸残基の１つはアスパラギン酸である。アスパラギン酸はポリマーをペプチドと混合した時にポリマーに酸に導入することのできる部分である。従って、ポリマーの分子量分解について調べ、純ポリ（ＤＴＨアジペート）（図９）の分解速度と比較した。
【００５５】
他の対照標準として、１０重量％のＰＥＧと９０重量％のポリ（ＤＴＨアジペート）からなるサンプルもこの試験で使用した。これらのサンプルはＴＧＡで測定すると２０重量％の水を吸収するからである。これは３０重量％ペプチドを含むポリマーサンプルが吸収する水の量よりも多く、このため、このサンプルはポリマーの分子量分解への添加水の効果に対する対照標準とすることができる。ペプチドを含むサンプルの分解はペプチドを含まないサンプルよりも速いという結果が得られた。２ヶ月後、３０重量％ペプチドを含むポリ（ＤＴＨアジペート）は４０％、分子量が減少した。対照的に、ペプチドを含まないサンプルではこの期間中ほとんど分子量が減少しなかった。
【００５６】
さらに、ポリマーマトリクス中の水の量が増加しても分子量減少速度には全く影響しなかった。ＰＥＧを含むポリ（ＤＴＨアジペート）サンプルと純サンプルとの間には分子量減少速度に有意の差はあるとは考えられない。そのため、ポリマーの分解に対し触媒効果を有するのはペプチドの存在であると結論づけることができる。しかしながら、分解速度の増加はペプチドの放出に影響するほど大きくはなかった。
ペプチドの放出に対する媒体のイオン強度の影響
３０重量％ペプチドを含むポリ（ＤＴＨアジペート）膜を標準的な方法で調製した。インキュベーション媒体のｐＨは約７に維持したが、放出媒体のイオン強度は変化させた。ＨＰＬＣ水中、標準ＰＢＳ溶液（１０ｍＭの燐酸緩衝生理食塩水、１３８ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ）中、および２倍濃度で調製したＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭの燐酸緩衝生理食塩水、２７６ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ）中で、ペプチドのインビトロ放出を測定し、比較した（図１０）。ＨＰＬＣ水中でのペプチドの放出速度は燐酸緩衝液中での放出速度の４倍であった。これらの結果からペプチドとポリマー間の疎水性相互作用、例えばペプチドのトリプトファン環のポリマーのフェノール環とのｐｉスタッキングが証明された。
イオン強度の低い酸性条件における３０重量％ペプチドを含むポリ（ＤＴＨアジペート）膜のインキュベーション
３０重量％ペプチドを含むサンプルを標準条件下で調製し、０．１％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸を含むｐＨが２．２のＨＰＬＣ水中でインキュベートした。ペプチドの放出速度は、インキュベーション媒体のｐＨとイオン強度の両方を減少させた方が、一方の因子だけを減少させた場合よりも大きくなった（図１１）。ｐＨのみを低くすると、３日間で１２％の装填ペプチドが放出された。イオン強度のみを減少させると、３日間で８％の装填ペプチドが放出された。両方のパラメータを同時に減少させると、この期間内に２０％の装填ペプチドが放出された。これらの条件では放出が向上したが、ペプチドはＤ．Ｌ−ＰＬＡの場合のように「どっと放出される（ｄｕｐｍｐｅｄ  ｏｕｔ）」ことはなく、ペプチドはポリ（ＤＴＨアジペート）マトリクスから連続して拡散された。
【００５７】
しかしながら、これらの条件下での水の吸収は予想外であった（図１２）。インキュベーション第１日目のうちに、これらのサンプルは標準ＰＢＳ溶液中でインキュベートしたサンプルの３倍膨らみ、第７日目までにはこれらのサンプルは７倍膨れた。図９から、純
粋なポリマーそれ自体は標準ＰＢＳ溶液中でインキュベートされても、最初の７日間に水の吸収は増加しなかったと判定することができる。さらに、このポリマーはかなり疎水性であるので、インキュベーション条件を変えても純粋ポリマーが取り込みする水のパーセンテージを増大させることはないと予測される。このため、このように多くの水を取り込みできるのはマトリクス内のペプチドによると推論することができる。
【００５８】
そのため、標準ＰＢＳ溶液中でのインキュベーションはペプチドと水との相互作用に比べポリ（ＤＴＨ−アジペート）との相互作用に有利である。このように、これらの条件で何週もインキュベーションしても最初の１０％を超える膨張の増大はなかった。しかしながら、ペプチド−ポリマー相互作用が弱められる条件では、インキュベーション媒体のｐＨおよびイオン強度の両方共が低くされ、ペプチドが水と相互作用する駆動力がより大きくなり、その結果より多くのペプチド分子が水に暴露され水と相互作用するため膜の膨潤が着実に増大した。
【００５９】
酸性度を増大させイオン強度を低下させるこれらの条件下では、膜サンプルはまた直ちに不透明になった。ポリ（ＤＴＨアジペート）膜からのペプチドの放出が増大した状況下でのみ見られるこの不透明さは膜サンプルの水吸収能力の増大と関連すると考えられる。ペプチド−ポリマー相互作用の強さが弱くなると水の吸収能力が増大し、不透明になるがこれはポリマーマトリクス内の自由体積を占める水により起こるものである。
【００６０】
脂肪族ポリマー類の場合、ペプチドの放出を完了するには１０重量％の水の吸収で十分であった。しかしながら、マトリクスがＰＬＡの代わりにポリ（ＤＴＨアジペート）からなるサンプルは７０重量％の水を吸収し、まだＰＬＡおよびＰＣＬマトリクスが１０重量％の水の吸収で放出したのと同じ「放出（ダンピング：ｄｕｍｐｉｎｇ）」様式ではペプチドを放出しなかった。
【００６１】
ペプチドとチロシン由来ポリアリレートの相互作用は、各繰り返しユニットのアミド結合が同じユニット内の垂下エステルに近接するポリマーの独特の構造から生じる。この領域全体は１つの官能基、α−アミドカルボキシル基と考えられ、ペプチド上の様々な官能基の水素結合用のポケットとして機能することができる。
他のチロシン由来ポリマー類を用いたペプチド−ポリマー相互作用
ペプチドの拡散のためにいくつかの他のポリマーのスクリーニングを行った。これらのスクリーニング実験において使用したペプチドの装填量はポリ（ＤＴＨアジペート）と共に使用する場合よりも低かったが、妨げる相互作用が無ければ容易に水に溶けるペプチドの放出を期待するには十分であった。
【００６２】
ポリ（ＤＴＨジオキサオクタンジオエート）は調べた最初の代替物であるが、構造的に関連するポリマーであった。このポリマーはＤＴＨ繰り返しユニットを含み、このためポリ（ＤＴＨアジペート）と類似している。しかしながら、このポリマーはアジピン酸の代わりにジオキサオクン二酸（図１３）とＤＴＨとを重合させることにより合成される。
【００６３】
これらの膜からはペプチドは放出されなかった（図１４）。これによりポリマーの親水性を増大させてもペプチドの放出には影響がないことが示された。膜の水取り込みもまた測定すると、１０重量％のペプチドを含む膜では５重量％、２０重量％のペプチドを含む膜では１０重量％であることがわかった。これにより、ペプチドの装填量はこれらの試料では低かったが、３０重量％のペプチドを含むポリ（ＤＴＨアジペート）試料では２０重量％のペプチドを含むポリ（ＤＴＨジオキサオクタンジオエート）とバルクで同じ量の水が存在することが示される。さらに、このポリマーの構造は、フレキシブルなバックボーンユニットの構造の点においてのみポリ（ＤＴＨアジペート）とは異なる。このポリマーの放出挙動はポリ（ＤＴＨアジペート）の放出挙動と類似しており、２つのポリマー間の
構造的な違いはバックボーンユニットの構造にのみ存在しているので、ＤＴＨユニットはペプチド−ポリマー相互作用において最も不可欠なものであると結論することができる。
【００６４】
他のポリマー構造、ポリ（ＤＴＥ０．９５−ｃｏ−ＰＥＧ（１０００）０．０５カーボネート）をポリ（ＤＴＨアジペート）の代わりとした。このポリマーはデアミノチロシルチロシンエチルエステル（ＤＴＥ）とポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）とのランダムコポリマー（図１５）であり、基本のデアミノチロシルチロシンアルキルエステル繰り返しユニットをポリ（ＤＴＨアジペート）と共有するが、バックボーンには炭酸結合を含むがエステルは含まず、二酸成分を含まない。二酸成分が無いこと、チロシン由来繰り返しユニットが類似性することによりさらに、ペプチドがこのポリマーから拡散できない場合、これらの相互作用において関係するのはチロシン由来成分であって二酸ではないことが確認された。１０重量％のペプチドを含む膜を調製した。
【００６５】
これらのポリマーからのペプチドの放出はまた最小であった（図１６）。これらのサンプルの水の取り込みについても測定した。インキュベーションの期間中、膜サンプルは１０重量％の水を吸収した。また、これはＰＬＡ、ＰＣＬおよびポリ（ＤＴＨアジペート）サンプルが吸収した水の量と同じである。これらの膜中のペプチド装填量は低いが、水の取り込み量はこれらの他のポリマー系のサンプルと同じくらい多いことは驚きに値しない。というのは、ＰＥＧはこれのサンプルの親水性を増大させるからである。これらのデータからＤＴＲユニットを含むポリマー類からのペプチドの放出が最小であるのは、チロシン由来の繰り返しユニットがポリマーからペプチドが拡散しない原因となる構造であることによることが証明される。
【００６６】
ポリ（ＤＴＥカーボネート）もまた１５重量％のペプチドを用いて調合した。このポリマー構造は炭酸結合を有するデアミノチロシルチロシンエチルエステルのみを含みＰＥＧを含まない。これらの膜もまたチロシン由来ポリアリレート類と同じ挙動を示した（図１７）。これらの膜の水取り込みもまた測定すると、インキュベーション期間中に６重量％であることがわかった。
ポリ（ＤＴＨアジペート）／Ｄ，Ｌ−ＰＬＡ混合物からのペプチドのインビトロ放出
ポリ（ＤＴＨアジペート）からのペプチドのインビトロ放出試験では、約５％の装填ペプチドの放出が得られた。同じ条件下でのＤ，Ｌ−ＰＬＡマトリクスからのペプチドの放出では３時間以内に装填ペプチドが完全に放出された。Ｄ，Ｌ−ＰＬＡ／ポリ（ＤＴＨアジペート）混合物膜からのペプチドのインビトロ放出試験では、Ｄ，Ｌ−ＰＬＡからの放出に対しペプチドの放出は中程度のバーストで、延長された。ポリ（ＤＴＨアジペート）：Ｄ，Ｌ−ＰＬＡの比が１：１のサンプルでは５日以内に全ペプチド装填量の１８％が放出された。Ｄ，Ｌ−ＰＬＡ：ポリ（ＤＴＨアジペート）の比が３：１のサンプルでは５日以内にペプチド装填量の４０％が放出された。どちらの製剤でも、最初のペプチドのバーストはＤ，Ｌ−ＰＬＡ膜からのバーストに比べ減少した。さらに、放出はＤ，Ｌ−ＰＬＡマトリクスの場合の元々の３時間から延長された。
モデル水溶性ペプチドのパルス送達：
ペプチド、ＰＬＧＡ、およびポリ（ＤＴＨアジペート）から成るフィルムの調製
【表１】
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【００６７】
ＰＬＧＡはポリ乳酸とポリ（グリコール酸）から成る再吸収可能なコポリマーであり、分解プロセス中に酸性化合物を放出することが知られている（図１９）。３セットの混合物膜を調製した。膜は全て、１５重量％（±２）のペプチドと、４２重量％のアンキャップドＰＬＧＡと、４３％のポリ（ＤＴＨアジペート）とを含んでいた。違いは含まれるＰＬＧＡの分子量のみであった（表１）。
混合物膜の視覚検査
ペプチド／ポリ（ＤＴＨアジペート）膜の透明な性質とは対照的に、これらの膜は均一に不透明であり、前述したペプチド、Ｄ，Ｌ−ＰＬＡおよびポリ（ＤＴＨアジペート）から成る混合物と非常に類似し、ペプチド／ポリ（ＤＴＨアジペート）膜に比べペプチド／ＰＬＧＡ／ポリ（ＤＴＨアジペート）の相分離が増大することが示唆された。さらに、これらの膜はＰＬＧＡ無しで作製された膜に比べ可撓性が低かった。予測された通り、脆性はＰＬＧＡの分子量の減少に伴い増加した。
混合物膜の示差走査熱量測定分析
ＰＬＧＡとポリ（ＤＴＨアジペート）混合物を含む膜全ての温度記録図で２つのガラス転移温度が明らかになり、これらの混合物膜に存在する相分離が確認された。約３４℃で生じる低いＴｇはポリ（ＤＴＨアジペート）ドメインと関連する。４９℃のより高いＴｇはＰＬＧＡドメインに対応する。２つのガラス転移の出現により、２つのポリマーは混和できず、そのため膜中にＰＬＧＡとポリ（ＤＴＨアジペート）の別個のドメインが存在することが示される。
【００６８】
２００℃まで加熱したサンプルでは対応する温度記録図において純粋ペプチドの特徴を示す吸熱はないことに注目すべきであり、これらのマトリクスでもペプチドは別個の結晶ドメインには存在しないことが示される。
ポリ（ＤＴＨアジペート）／ＰＬＧＡ混合物膜マトリクスからのペプチドの放出
ＰＬＧＡおよびポリ（ＤＴＨアジペート）混合物の膜サンプルを３７℃、ＰＢＳ中でインキュベートした（図２０）。予測通り、小さなバーストがあった。このババーストのサイズはＰＬＧＡの分子量と関連すると考えられる。一般に最も低い分子量のＰＬＧＡを含むサンプルは最も高い分子量のＰＬＧＡを含むサンプル（装填ペプチドの６％）より大きなバースト（装填ペプチドの１１％−１８％）を示した。しかしながら、この様式では２０重量％を超える装填ペプチドを放出したサンプルはなかった。分子量の減少とバーストとの間のこの相関の原因はおそらく、分子量の低いポリマー中に存在する末端基の数が分子量の高いポリマーに比べ多いため、分子量の低いポリマーは分子量の高いポリマーより
も親水性が高いことであろう。そのため、分子量の低いポリマーはペプチドに対しより高い親和性を有する。分子量が増加するに伴い、親水性は減少し、最初の放出がより小さくなる。
【００６９】
放出期間の間の遅滞時間はまたＰＬＧＡの最初の分子量との直接の関係を明らかにした。最も低い分子量のＰＬＧＡを含む膜に関連する遅滞時間は５日未満であった。さらに、遅滞時間後のペプチドの放出はかなり急速であった。装填ペプチドは全て１２日で放出され、その大部分が約４日以内に放出された。
【００７０】
２５ｋＤの分子量のＰＬＧＡを含むサンプルは１８日から２６日まで変動する遅滞時間を示した（サンプルのほとんどが約１８日の遅滞時間を示し、１つのサンプルのみが２６日の遅滞時間を示した）。遅滞期後のペプチドの放出はまたかなり迅速でペプチドの全装填量が約５日以内に放出された。
【００７１】
最も高い分子量のＰＬＧＡ（６３ｋＤａ）を含むサンプルは２７から３４日までの遅滞時間を示した。サンプルのほとんどが２７日の印の周りに集中した。遅滞時間後放出は迅速になったが、分子量の低いＰＬＧＡを有するサンプルほど迅速ではなかった。これらのサンプルは約１０日の期間で装填ペプチドを放出した。
【００７２】
遅滞期間中に、装填ペプチドの２％未満が混合物膜から浸出した。これにより、製剤は真のバリヤを含んでいないが、遅滞期間中のペプチドの放出を防ぐのにペプチド−ポリマー相互作用のみをあてにしており、このシステムはバリヤ技術と同じようによく機能することが示される。対照標準として、１５重量％のペプチドを含むがＰＬＧＡを含まないポリ（ＤＴＨアジペート）のサンプルを調合した。これらのサンプルはインキュベーション期間中ほとんどペプチドを放出しなかった。
【００７３】
ＰＬＧＡが酸性副産物を形成するのに十分なほど分解するのに必要な時間により遅滞時間の長さが制御される。最初の分子量が低いＰＬＧＡを含むサンプルでは臨界分解期間に到達するのに必要な時間が短い。そのため、分子量が最も低いＰＬＧＡを含むサンプルは最も短い遅滞時間を有し、最初の分子量が最も大きなサンプルでは放出前の遅滞時間が最も長かった。最初の分子量が最も大きなＰＬＧＡを含むサンプルはまた遅滞時間後の放出速度が最も遅かった。ペプチドを放出するのに十分な濃度の酸性副産物がポリマーマトリクス中に存在するが、その濃度は最初の分子量の低いポリマーを含むサンプルと同じレベルには到達しなかった。そのため、相互作用を弱める効果が弱く、ペプチドの放出が遅くなる。
インキュベーション媒体のｐＨのモニタリング  インビトロペプチド放出実験中に、緩衝液交換中の各時間点でインキュベーション媒体のｐＨをモニタした。対照標準として、１５重量％のインテグリリン（ＩＮＴＥＧＲＩＲＬＩＮ、登録商標）を含むポリ（ＤＴＨアジペート）膜を同様にインキュベートし、ｐＨを測定した。
【００７４】
ＰＬＧＡ１２，０００のサンプルを９日間ｐＨ７．４に維持した。この期間後、これらのサンプルの緩衝液のｐＨは徐々に減少し、インキュベーション期間の終わりには緩衝液のｐＨは７．０に到達した。ｐＨの最も鋭い低下は正確にペプチドの放出の最も鋭い増加を反映した。
【００７５】
ＰＬＧＡ２５，０００のサンプルの緩衝液のｐＨはインキュベーションの最初の１５日間は７．４であった。この期間後、緩衝液のｐＨは７．２となりこのｐＨが２１日まで続き、その時に最も低いｐＨ６．９となった。インキュベーション期間の残りの間、緩衝液のｐＨは７．０と７．２との間で揺れ動いた。
【００７６】
最も高い分子量のＰＬＧＡを含むサンプルの緩衝液のｐＨは３２日目まで生理学的なｐＨに維持された。この点でｐＨは７．０まで降下し、インキュベーション期間の残りの間、緩衝液のｐＨは７．０と７．３との間で揺れ動いた。
【００７７】
緩衝液のｐＨの降下とペプチドの放出は一致して起きた。というのはサンプルのインキュベーション中、膜中のＰＬＧＡ相では分子量分解プロセスが始まり、酸性分解生成物がマトリクスのバルク内に蓄積したからである。結局臨界酸濃度に到達すると、ペプチド−ポリマー相互作用は弱まり、ペプチドが放出された。しかしながら、水溶性分解生成物もまたマトリクスから拡散し、ペプチドと酸性分解生成物とが共に拡散（同時拡散）する。この同時拡散効果のため、緩衝液のｐＨの降下はペプチドの放出と一致する、あるいはペプチドの放出が開始して後短い時間内で起こる。
混合物膜の質量保持パーセント  ペプチド、ＰＬＧＡとポリ（ＤＴＨアジペート）混合物から成るサンプルをインキュベーション後に水洗し、乾燥させ、その後に計量した。これらのサンプルの質量保持パーセントはすべて６０から７０％の間（表２）であった。ペプチドのみが放出された場合、質量保持パーセントは約８５％であろう。質量損失が１５％を超えるという事実からいくらかの分解が起こっていることが示唆される。ペプチドとポリ（ＤＴＨアジペート）のみを含む膜は有意の質量損失を示さなかったので、これらの混合物から失われた成分はＰＬＧＡであり、これは分解して水溶性オリゴマーとなった。
混合物膜の質量保持パーセント
【００７８】
【表２】
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【００７９】
これらの混合物サンプル中のポリ（ＤＴＨアジペート）の分子量もまた調べた。乾燥後、分子量を求めるためにＧＰＣを用いて膜サンプルを分析した。対照標準として、１５重量％のペプチドを含むポリ（ＤＴＨアジペート）膜もＰＢＳ中でインキュベートし、分子量保持パーセントをＰＬＧＡを含むサンプルと比較した。分子量保持パーセントを計算するために、インキュベーション後の膜の分子量を、膜を調製するのに使用した初使用のポリ（ＤＴＨアジペート）（１００ｋＤａ）の分子量に対し正規化した。初使用のポリマーを使用し、通常行うインキュベーション前の膜の分子量を使用しなかった。というのは混合されたＰＬＧＡでは人為的に低分子量部分の比率を増大させることにより、ポリ（ＤＴ
Ｈアジペート）の分子量に対する真の値が著しく変動することがあるからである。その影響は膜をインキュベートする前の方がその後よりも大きかった。というのはインキュベーション中にＰＬＧＡは分解してオリゴマーとなり、インキュベーション後の膜のＧＰＣトレースの主ピークにより表される分子量データは、大体はインキュベーション前と比べ、ＰＬＧＡの分子量を含まないか、あるいはＰＬＧＡの分解部分を含むからである。その結果、データを初使用ポリマーに対し正規化することにより、インキュベーション中のポリ（ＤＴＨアジペート）の分子量の変化が追跡されるが、ＰＬＧＡ混合物の分子量の変化は追跡されない（表３）。
【００８０】
【表３】
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【００８１】
混合物膜の分子量保持パーセントとペプチドの放出との間には何の相関も見られなかった（表３）。ＰＬＧＡの２つの分子量の低いポリマーを含むサンプルセットはＰＬＧＡを含まない対照標準膜と同じ程度まで分解した。しかしながら、ＰＬＧＡを含む膜はペプチドを放出し対照標準は放出しなかった。そのため、ポリ（ＤＴＨアジペート）の大規模な分解は起こらなかった。これはペプチドの放出の原因となる機構ではない。
インキュベーション後の混合物膜表面の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察
１５重量％のペプチドを含むポリ（ＤＴＨアジペート）／ＰＬＧＡ１２０００膜のインキュベーション中の表面形態の変化をＳＥＭを用いて調べた。インキュベーション前後の表面形態の比較から、表面は元々比較的平滑であるが、かなり多孔性であることが示された。１６日のインキュベーション期間後、表面はずっと粗くなりインキュベーション前に見られた平滑さとは似つかなくなった。さらに、多くの亀裂および穴が現れた。これらの細孔、穴および亀裂は、ＰＬＧＡの分解およびその後の水溶性分解生成物の溶解により空になっているＰＬＧＡ豊富なドメインである。これらのドメインはペプチド豊富なドメインを表していない。というのは、そのような相分離ではペプチドが即座に迅速に放出され、この遅滞応答とはならないからである。
【００８２】
対照的に、１５重量％のペプチドと８５重量％のポリ（ＤＴＨアジペート）から成る対照標準の表面は同じ１６日間のインキュベーション期間で大きくは変化しなかった。これによりさらに、これらのサンプルがＰＬＧＡを含むサンプルが受けた変化と同じ劇的な変化を受けなかったことが確認される。
【００８３】
このように、この発明のポリマー混合物により製剤において生物活性化合物の拍動的な放出が達成される。この製剤では活性化合物はかなり疎水性のポリマーマトリクス中に水素結合により「ロック」されており、ある時間が経過すると混合物の疎水性の低いポリマーが分解してより疎水性の高いポリマーからの活性化合物の放出を促進する。遅滞の長さおよび遅滞後の送達速度は材料の選択、使用量により再現性よく制御することができる。
【００８４】
好ましい実施の形態の前述の例および記述は、特許請求の範囲により定義される本発明を例示するものであり、限定するものではないと考えるべきである。特許請求の範囲に記載された本発明の範囲内であれば、前述した特徴に関する多くの変更および組合せを使用することができることは容易に理解されるであろう。そのような変更は本発明の趣旨および範囲内にあり、そのような改変はすべて特許請求の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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