(57)【要約】【課題】  試料溶液中のタンパク質除去などの前処理を適正な圧力条件下で行いつつ，分析のスループットも向上させる。【解決手段】  カラムスイッチング法を用いて，前処理は低圧のポンプを用いて目詰まり等起こさない最適な圧力下で行い，その処理状況は紫外線検出器を用いてモニターする。前処理され精製された後の試料のみを高耐圧ポンプを用いて高速に分析し，システム寿命を延ばしつつスループットも向上させる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の低分子物質を分析する液体クロマトグラフ分析装置において、第一の送液ポンプと、第二の送液ポンプと、試料溶液中の物質を選択的に吸着・溶離できる第一のカラム、第二のカラム、および第三のカラムと、これらへ繋がる流路を切替えるバルブとを有し、
前記第一の送液ポンプからの送液により前記第一のカラムに前記生体試料を導入して当該生体試料中の分子量の大きな物質を先に排出させた後に、前記バルブを切替えて前記第二のカラムに分析対象である前記排出されなかった前記生体試料中の低分子量の物質を流し込んで吸着させ、さらにそのあと流路を切替えて、前記第二の送液ポンプから送液される溶液で前記第二のカラムに吸着された前記低分子物質をカラムから解離させ、当該低分子物質を第三のカラムに流し込み、当該第三のカラムにて分離して検出器に流し込む液体クロマトグラフ装置であって、前記第一の送液ポンプは前記第二の送液ポンプの圧力よりも低圧で送液し、第二の送液ポンプは前記第一の送液ポンプの圧力よりも高圧で送液することを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項２】
請求項１の液体クロマトグラフ装置において、前記第一の送液ポンプの耐圧範囲が５０メガパスカル（ＭＰａ）以下であり、前記第二の送液ポンプの耐圧範囲が６０メガパスカル（ＭＰａ）以上である液体クロマトグラフ装置。
【請求項３】
請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、前記検出器として質量分析装置を用いる液体クロマトグラフ装置。
【請求項４】
生体試料中の低分子物質を分析する液体クロマトグラフ分析装置において、第一の送液ポンプと、第二の送液ポンプと、試料溶液中の物質を選択的に吸着・溶離できる第一のカラム、第二のカラム、および第三のカラムと、これらへ繋がる流路を切替えるバルブとを有する液体クロマトグラフ分析装置を用いた試料分析方法において、
前前記第一の送液ポンプからの送液により前記第一のカラムに前記生体試料を導入して分子量の大きな物質を先に排出させた後に、前記バルブを切替えて前記第二のカラムに分析対象である低分子量の物質を流し込んで吸着させ、さらにそのあと流路を切替えて、前記第二の送液ポンプから送液される溶液で前記第二のカラムに吸着された低分子物質をカラムから解離させ、されを前記第三のカラムに流し込み、前記第三のカラムにて分離して検出器導入し、前記第一の送液ポンプは前記第二の送液ポンプの圧力よりも低圧で送液し、第二の送液ポンプは前記第一の送液ポンプの圧力よりも高圧で送液することを特徴とする試料分析方法。
【請求項５】
請求項４の試料分析方法おいて、前記第一の送液ポンプの耐圧範囲が５０メガパスカル（ＭＰａ）以下であり、前記第二の送液ポンプの動作耐圧が６０メガパスカル（ＭＰａ）以上である試料分析方法。
【請求項６】
請求項４記載の試料分析方法において、前記検出器として質量分析装置を用いる試料分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学分析等に用いられる液体クロマトグラフ装置及び分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料など様々な物質が含まれる混合液の化学分析に、液体クロマトグラフ装置が広く用いられている。試料となる生体液には、測りたい対象物質以外に測定の妨害となる物質も多く含まれるため、液体クロマトグラフ装置では分離カラムを用いて、例えば妨害の要因であるタンパク質を除去したり、測定対象物をいったんカラムに吸着させて、他の妨害物質や、塩のように前処理段階で試料溶液に添加された物質を除去したりする工程が必要である。このように測定対象物質を精製した後、分析用の分離カラムに流し込み、対象物質の性質により分離し、質量分析装置や紫外線検出器などで検出し分析する。
【０００３】
また、精製と分析では、分離のために送液される分離用液体（バッファ溶液）の組成や、送液される溶液の流量や送液ポンプの性質など、最適な条件が異なる場合もある。
（１）唾液中のメラトニン分析を目的とし、同型の送液ポンプ２台を用い、メラトニンの精製、分離分析に最適化した液体クロマトグラフ装置が特開２００５―３００３５８号公報に記載されている。
（２）タンパク質の分析を目的とし、シリンジポンプを送液手段に用い、脱塩部と分離部を持ち、分離部はタンパク質の分離に適した低流量であるタンパク質分析用二次元液体クロマトグラフ装置が特開２００３―１４９２１８号公報に記載されている。
（３）タンパク質の分析を目的とし、脱塩部と分離部を持ち、脱塩状態をモニターして脱塩部から分離部への試料導入にフィードバックし、分離部はタンパク質分離に適した極低流量の送液ポンプを用いる液体クロマトグラフ装置が特開２００６―２６６８９９号公報に記載されている。
（４）分離カラムに充填されている分離用微粒子の直径を１〜3ミクロンと細かくし、分離性能を高めた液体クロマトグラフ装置用カラムが特開２００９―２６４８５９号公報に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５―３００３５８号公報
【特許文献２】特開２００３―１４９２１８号公報
【特許文献３】特開２００６―２６６８９９号公報
【特許文献４】特開２００９―２６４８５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述した液体クロマトグラフ装置には、以下のような課題が存在する。
分離のために良い条件と、精製に良い条件が相反する場合がある。例えば、近年通常より細かい粒子が充てんされたカラムに概ね６０ＭＰａ程度の高圧力のポンプでバッファを流し込むことで分離性能を高め、短時間で分析が可能な超高速型の液体クロマトグラフが開発されている。短時間で分析ができれば、大量の試料の分析にも対応可能となり、臨床検査などに液体クロマトグラフを使用しやすくなる。
【０００６】
しかし、タンパク質など測定を妨害する物質が試料溶液に含まれている場合は、もともとカラム内の圧力が高まりやすい。それを細かい粒子のカラムと高圧力のポンプで分析すると、圧力が高まり過ぎて流路のつなぎ目から液漏れがおきたり、破損が発生する危険性があった。また、破損まで行かない場合でも、充填されている粒子が細かいカラムはタンパク質を流し込むと目詰まりを起こしやすい。目詰まりを起こすと分離性能が落ちる上にカラムの寿命が短くなるという問題点があった。
【０００７】
本発明は、このような問題を解決するためになされたものであり、適した条件下で除タンパク等の前処理を行い、さらに分離速度も速い液体クロマトグラフ質量分析装置及び分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
生体試料中の低分子物質を分析する液体クロマトグラフ分析装置において、第一の送液ポンプと、第二の送液ポンプと、試料溶液中の物質を選択的に吸着・溶離できる第一のカラム、第二のカラム、および第三のカラムと、これらへ繋がる流路を切替えるバルブとを有し、前記第一の送液ポンプからの送液により前記第一のカラムに前記生体試料を導入して当該生体試料中の分子量の大きな物質を先に排出させた後に、前記バルブを切替えて前記第二のカラムに分析対象である前記排出されなかった前記生体試料中の低分子量の物質を流し込んで吸着させ、さらにそのあと流路を切替えて、前記第二の送液ポンプから送液される溶液で前記第二のカラムに吸着された前記低分子物質をカラムから解離させ、当該低分子物質を第三のカラムに流し込み、当該第三のカラムにて分離して検出器に流し込む液体クロマトグラフ装置であって、前記第一の送液ポンプは前記第二の送液ポンプの圧力よりも低圧で送液し、第二の送液ポンプは前記第一の送液ポンプの圧力よりも高圧で送液することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、カラムが詰まったり圧力が高まったりしやすい前処理（除タンパク）は、それに適した低圧ポンプで処理を行いながら、タンパクを除いて精製した後は高圧ポンプで高速な分析を行え、システムの寿命を延ばし且つスループットも高い安定なシステムを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施例になる液体クロマトグラフ装置および質量分析装置の構成図。
【図２】本発明の一実施例になる液体クロマトグラフ装置の、カラムスイッチングを構成する六方バルブと第一、第二、及び第三のカラムと、それらを接続する流路の構成図、及び試料溶液の流れる方向を示す図。
【図３】本発明の別の一実施例になる液体クロマトグラフ装置および質量分析装置の構成図。
【図４】本発明の一実施例になる液体クロマトグラフ装置において、各グラジェントポンプの流量及び溶液組成、バルブの切り替えのタイミングを示す流れ図。
【図５】本発明の一実施例になる液体クロマトグラフ装置と質量分析装置と、従来型の液体クロマトグラフ装置と質量分析装置とで測定したイブプロフェンのマスクトマトグラム図。
【図６】本発明の一実施例になる液体クロマトグラフ装置及び質量分析装置を用いて測定した、バルブロ酸ナトリウムのマスクロマトグラム図。
【図７】本発明の一実施例になる液体クロマトグラフ装置及び質量分析装置を用いて測定した、バルブロ酸ナトリウムの検量線を示した図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
上記の目的を達成する構成例としては、例えば２台の送液ポンプと流路切替用の六方バルブを持つ液体クロマトグラフ装置であり、前処理用カラムに送液する送液ポンプには、概ね４０ＭＰａ以下の圧力で送液が可能な通常型のポンプを用い（所謂セミミクロＬＣ、または汎用ＬＣ用）、カラム内圧力が上がり過ぎないように前処理を行う。タンパク質などの妨害物質が除去されて前処理が終わったかどうかは、紫外線検出器でモニターする。前処理が終わったら六方バルブで流路を切り替え、概ね６０ＭＰａ以上の圧力で送液が可能な高耐圧型の送液ポンプを用いて、目的物質を高分離性能カラムに流し込み、高い圧力をもって高速な分離を行い、質量分析装置や紫外線検出器で即時検出する。なお、このように流路を切り替えて複数のカラムで分析する手法を一般に「カラムスイッチング」と呼んでいる。
【００１２】
このようにして、前処理をそれに適した安定な条件で行え、高速分析も可能な液体クロマトグラフ装置及び分離方法を提供できる。
【００１３】
以下に、本発明の代表的な具体構成例について図面を参照して詳述する。
図１は、本発明の一実施例になる液体クロマトグラフ装置と、検出器として質量分析装置を結合したシステムの構成図である。高耐圧のポンプを持つ所謂「超高速」液体クロマトグラフシステム１０１には、高耐圧グラジェントポンプ１０２、オートサンプラー１０３、紫外線検出器１０５が含まれる。低圧グラジェントポンプ１１０は、流路１１３によりオートサンプラに接続されている。バッファ溶液１１１ａおよび１１１ｂは流路１１２ａ、１１２ｂを経由して低圧グラジェントポンプ１１０により吸い上げられ、混合比率を変えて（グラジェントをかけて）低圧グラジェントポンプ１１０より送液される。
低圧グラジェントポンプは通常４０ＭＰａ程度以下の圧力で動作するが、送液流量を２ｍＬ／ｍｉｎ以上にするなど通常より高めねばならない場合や、複数のカラムを直列に連結して使用する場合などそれ以上の圧力になる場合もある。送液されたバッファ溶液は、流路１１３を通ってオートサンプラー１０３に送られ、オートサンプラー内部にセットされている複数の試料容器のうちの一つから吸い上げた一定量の試料溶液を流路２０１に流し込む。流路２０１に流し込まれた試料溶液は、比較的低圧で送液され、フィルター１１５で細かな固形物を除去し、第一のカラム１１６に流れ込む。カラム１１６は、タンパク質のような分子量が数万以上の大きな物質は早く排出されるが、薬剤やホルモンなどの分子量が数百の小さな物質はカラム内に吸着されやすく、ゆっくりと排出される。
この時点では、切り替え用六方バルブ１１４は、流路２０１と２０２を接続するために図２（ｂ）のポジション２の位置になっている。タンパク質など分子量が数万以上の大きな物質は、溶液の流れ３０３のように流れ、紫外線検出器１０４に流れ込み、モニターされる。
タンパク質等の分析妨害物が排出されたかどうかは、紫外線検出器１０４の紫外線吸光度の値が下がったかどうかで判断する。
【００１４】
タンパク質等の分子量の大きな物質が排出されたら、六方バルブ１１４を、流路２０１と２０４を接続するために図２（ａ）のポジション１の位置に切り替える。第一のカラム１１６からゆっくり排出される低分子の目的物質は、ポンプ１１０からの送液により第二のカラム１１７に流れ込む。ポンプ１１０から送液されるバッファ溶液は図２（ａ）の溶液の流れ３０１のように流れて紫外線検出器１０４を経由して排出され、目的物質はカラム１１７に吸着して蓄積され、濃縮される。
【００１５】
一方、超高速液体クロマトグラフシステム１０１の中の高耐圧ポンプ１０２は、タンパク質を排出している図２（ｂ）のポジション２になっている間は送液を止めておき、低分子を第二のカラム１１７に流し込み始めた図２（ａ）のポジション１に戻ったら送液を開始し、高耐圧用の第三のカラム１１８を平衡化（コンディショニング）しておく。
目的物質が第二のカラム１１７に十分蓄積され濃縮されたら、六方バルブ１１４を図２（ｂ）のポジション２に切り替え、高圧グラジェントポンプ１０２は、バッファ溶液１０５ａと１０５ｂを溶液の流れ３０４のように流路２０４を経由して第二のカラム１１７に流し込み、目的物質を一気に排出させ、第三のカラム１１８に流し込む。
【００１６】
第三のカラム１１８には、通常よりサイズの小さい直径１〜３ミクロン程度の粒子が使われているため、分離能力が高く、かつ素早く分離されるので分析時間も短くできるが、カラム内圧が通常より高くなる。抵抗が大きいため，圧力が弱いと設定通りの流量で送液することができず，流量が設定値に達しない危険がある。設定値通りの流量にならなければ，十分な分離ができないうえ，流量が不安定になるので再現性も得られなくなる。そのため、カラムの抵抗に負けない６０ＭＰａ程度以上の圧力をかけることが可能な高耐圧ポンプを使用する必要がある。
なお、検出器である質量分析装置の最適条件に合わせて送液の流量を下げる場合や，長さが１―２センチ以下と短く内圧が上がらないカラムを使用する場合などは、６０ＭＰａ以下で使用しても問題はない。カラム１１８に流れ込んだ目的物質は、ポンプ１０２から高圧で送液されるバッファ溶液で分離される。
分離された目的物質は、質量分析装置１２０に導入され、検出される。なお、質量分析装置の代わりに、別の紫外線検出器を用いて検出しても良い。さらに、電気化学検出など、また別の検出器を用いても良い。
【００１７】
図２は、図１に示した実施例の、六方バルブ１１４の切り替えポジションと、そのときの溶液の流れを説明した図である。試料溶液の流れや切り替えタイミングは、図１の説明中に記載した内容と同一である。
【００１８】
図３は、本発明の別の実施例になる液体クロマトグラフ装置と、検出器として質量分析装置を結合したシステムの構成図である。低圧のポンプを持つ液体クロマトグラフシステム１０７には、低圧グラジェントポンプ１１０、オートサンプラ‐１０８、紫外線検出器１０９が含まれる。液体クロマトグラフシステム１０７以外に、単体の高耐圧グラジェントポンプ１０２を使用した構成である。オートサンプラ‐１０８と紫外線検出器１０９が低圧用である以外は、分析と動作の手順は、図１と同様である。なお、第三のカラム１１８の前に、第三のカラム１１８を保護するフィルター１１９を設置しても良い。図１に示した実施例においても、第三のカラム１１８の前にフィルター１１９を設置しても問題はない。
【００１９】
図４は、バルブロ酸ナトリウムという薬剤を服用した被験者の唾液を試料溶液とし、バルブロ酸を測定対象物質として、第一の実施例を用いて分析する場合のポンプ１０２（ＬＣＵポンプ）とポンプ１１０（Ｌ−７１００ポンプ）の流量及び各２つのバッファ溶液の混合比、六方バルブ１１４の切替のタイムシーケンスである。右半分は、第一のカラム１１６（プレカラム）、第二のカラム１１７（トラッピングカラム）、第三のカラム１１８（分析カラム）の動作の様子を示している。時刻０から０．４分まではバルブ１１４はポジション２の位置になっており、第一のカラム１１６はタンパク質を排出（除タンパク）している。高耐圧ポンプ１０２の送液は止まった状態で、ポンプ１０２のバッファ溶液１０５ａ、ｂが第二のカラム１１７に流れ込まないようにしている。０．４分から５分までは、バルブ１１４はポジション１になっており、第二のカラム１１７はバルブロ酸を吸着し、第三のカラム１１８には高耐圧グラジェントポンプ１０２からバッファ溶液が０．２ｍＬ/ｍｉｎで送り込まれて平衡化（コンディショニング）されている。５分から５．７分まではバルブ１１４の位置はポジション２になり、第二のカラム１１７に高耐圧グラジェントポンプ１０２から溶液が流れ込み、第二のカラムに吸着したバルブロ酸を一気に排出して、第三のカラム１１８に流し込む。バルブロ酸が第三のカラム１１８に導入されたら時刻5.7分にバルブ１１４をポジション１に戻す。その後カラム１１８にはポンプ１０２から高圧で送液された溶液を流し込み、約２分で分離し、質量分析装置１２０に導入して検出する。その後は、同じ溶液をポンプ１０２からカラム１１８に流し平衡化し、次の試料分析に備える。一方、第一のカラム１１６と第二のカラム１１７には、５分から７分までポンプ１１０からバッファ１０５ｂ（Ａ−２液）を流してカラムに残った目的物質以外の物質を洗い流し（クリーンナップ）、７分以降はバッファ溶液１０５ａ（Ａ−１溶液）で平衡化する。
【００２０】
この実施例の場合の１０５ａ（Ａ−１溶液）は１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液、１０５ｂ（Ａ−２溶液）はアセトニトリル、１１１ａ（Ｂ−１溶液）は１０ｍＭギ酸アンモニウム（水／メタノール＝３０／７０％、ｖ／ｖ）で、今回は１１１ｂ（Ｂ−２溶液）は使用しなかった。
【００２１】
図５は、低圧ポンプを使用する液体クロマトグラフー質量分析装置と、高耐圧ポンプを使用する液体クロマトグラフー質量分析装置で、イブプロフェンという薬剤を分析した結果を比較したものである。横軸が試料導入後の時間（分）、縦軸が質量分析装置で検出した信号強度である。この場合、純品の薬剤を分析しているので、第三のカラムに相当する分析カラムのみを使用している。
【００２２】
図５（ａ）は低圧ポンプを使用する液体クロマトグラフー質量分析装置（セミミクロ液体クロマトグラフー質量分析装置）で分析した結果で、試料導入から約６分後にイブプロフェンが検出されている。このときの溶液流量は１５０ｕＬ/ｍｉｎである。図５（ｂ）（ｃ）は高耐圧ポンプを使用する液体クロマトグラフー質量分析装置（超高速液体クロマトグラフー質量分析装置）で分析した結果で、図５（ｂ）は（ａ）と同じ溶液流量１５０ｕＬ/ｍｉｎで分析し、（ｃ）はそれよりも高速の溶液流量２００ｕＬ/ｍｉｎである。同じ流量で分析しても、高耐圧ポンプと粒子が細かい高耐圧カラムを用いると、分析時間が３分以下と分析時間が約２分の１に短縮できる。流量２００ｕＬ/ｍｉｎと流量を高めると、約２分で検出と３分の１の分析時間になる。このように、分子量数百の低分子を測定する場合、高耐圧ポンプの使用は分析時間を短縮し、スループットを向上させる。ただし、分子量数万のタンパク質が試料溶液に入っていると、高耐圧カラムは目詰まりを起こしたり、立つ力が上がり過ぎて流路の接続部などで液漏れが起きたり、破損したりする危険がある。
【００２３】
図６は、本発明の一実施例になる図１のシステムを用いて測定した、唾液中に含まれるバルプロ酸ナトリウムという薬剤の分析結果である。横軸が試料導入後の時間（分）、縦軸が質量分析装置で検出した信号強度である。分析のタイムシーケンスは図４記載の通りである。０分でオートサンプラー１０３から試料溶液が導入され、５分で第二のカラム１１７からバルブロ酸が排出される。排出後約２分にあたる７分後にバルブロ酸が検出されている。
【００２４】
図７は、様々な濃度のバルブロ酸ナトリウムを分析し、図６に示した分析結果のバルブロ酸が検出されているピーク部分の面積（ピーク面積）とその時導入したバルブロ酸濃度を比較した検量線である、横軸が濃度、縦軸がピーク面積である。なおバルブロ酸ナトリウムは、溶液中ではナトリウムとバルブロ酸に解離しており、バルブロ酸が薬効を持つので通常バルブロ酸を分析する。濃度とピーク面積は良好な直線性を示しているので、本発明による液体クロマトグラフ装置及び分析方法は、生体液中の低分子の分析装置および方法として有効である。
【符号の説明】
【００２５】
１０１：超高速液体クロマトグラフシステム、１０２：超高速液体クロマトグラフシステム用高耐圧グラジェントポンプ、１０３：超高速液体クロマトグラフシステム用オートサンプラ‐、１０４：超高速液体クロマトグラフシステム用紫外線検出器、１０５ａ：バッファ溶液Ｂ−１、１０５ｂ：バッファ溶液Ｂ−２、１０６ａ：流路、１０６ｂ：流路、１０７：従来型液体クロマトグラフシステム、１０８：従来型液体クロマトグラフシステム用オートサンプラー、１０９：従来型液体クロマトグラフシステム用紫外線検出器、１１０：従来型液体クロマトグラフシステム用低圧グラジェントポンプ、１１１ａ：バッファ溶液Ａ−１、１１１ｂ：バッファ溶液Ａ−２、１１２ａ：流路、１１２ｂ：流路、１１３：流路、１１４：六方バルブ、１１５：ラインフィルター、１１６：第一のカラム（プレカラム；除タンパク）、１１７：第二のカラム（トラッピングカラム；濃縮）、１１８：第三のカラム（分析カラム；分離）、１１９：ラインフィルター、１２０：質量分析装置、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５：流路、３０１、３０２、３０３、３０４：溶液の流れ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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