(57)【要約】【課題】ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を用いた皮膚外用剤であって、優れた持続性を持って皮膚水分を好適に保つとともに皮膚の掻痒を抑え、かつ皮膚の再生を効果的に助ける皮膚外用剤組成物を提供することを目的とする。【解決手段】（１）ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩、（２）スクワラン、スクワレン、オリーブオイル、セサミオイル、椿油の1種又は２種以上の油成分、（３）尿素及び尿素付加体の混合物を含むことを特徴とする皮膚外用剤組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩、（２）スクワラン、スクワレン、オリーブオイル、セサミオイル、椿油の1種又は２種以上の油成分、（３）尿素及び尿素付加体の混合物を含むことを特徴とする皮膚外用剤組成物。
【請求項２】
ポリ−γ−L−グルタミン酸が、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸分子同士の架橋構造を有することを特徴とするポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項３】
ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が１００万以上であることを特徴とする請求項１または２に記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項４】
ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が２００万以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項５】
ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が３５０万以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の皮膚外用剤組成物組成物。
【請求項６】
ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の吸水倍率が１０倍以上５０００倍以下であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項７】
（１）ポリ−γ−L−グルタミン酸および／またはその塩０．０１質量％〜１５質量％、（２）スクワラン、スクワレン、オリーブオイル、セサミオイル、椿油から選択した1種又は２種以上０．０５質量％〜５質量％、（３）尿素及び1種以上の尿素付加体の混合物０．２質量％〜２０質量％を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項８】
尿素付加体が、1種以上の高分子尿素付加体、1種以上の低分子尿素付加体又は側鎖のカルボキシル基の一部がカルシウム塩であるポリ-γ-グルタミン酸から成る高分子尿素付加体のいずれかであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項９】
油成分がスクワラン、高分子尿素付加体がポリ-γ-グルタミン酸・尿素付加体であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項１０】
油成分がスクワラン、低分子尿素付加体がグルタミン酸・尿素付加体からなることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項１１】
油成分がオリーブオイル、高分子尿素付加体がポリ-γ-グルタミン酸・尿素付加体であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の皮膚外用剤組成物。
【請求項１２】
油成分がセサミオイル、高分子尿素付加体がポリ-γ-グルタミン酸・尿素付加体であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の皮膚外用剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚外用剤組成物、特に皮膚水分を好適に保つとともに皮膚の掻痒を抑えることができる皮膚外用剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
人の皮膚は、角質層によって覆われており、乾燥した大気中においても水分を失うことなく生命活動を維持できるのは、外界と接しているこの角質層が存在しているからであることはよく知られている。角質層は薄く柔軟で且つ体内の水分を保ち、健常な皮膚状態を維持するように調節している。
【０００３】
しかしながら、我々は環境要因等（例えば、温度変化、湿度変化、光、水との接触、洗剤の使用等）により、しばしば表皮に何らかの損傷をきたすことがある。ダメージを受けた皮膚は、硬く、弾力性も失われ、カサカサとした肌荒れ状態となる。こうした肌荒れ皮膚は、近年、急増傾向にあるアトピー性皮膚炎との関連性も指摘されており、深刻なスキントラブルを招く恐れもある。
【０００４】
荒れ肌には、角質細胞の剥離によるものと、乾燥により皮膚の健康状態が悪化して表皮の硬化や損傷に至るものがある。前者の荒れ肌はコレステロール、セラミド、脂肪酸等の角質細胞間脂質の溶出、および紫外線、洗剤等に起因する角質細胞の変性や表皮細胞の増殖・角化バランスの崩壊による角層透過バリアの形成不全等によって発生する。この荒れ肌を予防または治癒する目的で、角質細胞間脂質成分又はそれに類似する合成の角質細胞間脂質を供給するなどの検討が行われている。この角層細胞間脂質は、有棘層と顆粒層の細胞で生合成された層板顆粒が、角層直下で細胞間に放出され、伸展し、層板（ラメラ）構造をとり、細胞間に広がったものである。層板顆粒はグルコシルセラミド、コレステロール、セラミド、リン脂質等から構成されるが、角層細胞間脂質にはグルコシルセラミドは殆ど含まれていない。すなわち、層板顆粒中のグルコシルセラミドは、β−グルコセレブロシダーゼによって加水分解を受け、セラミドに変換され、このセラミドがラメラ構造をとる結果、角層細胞間脂質として角層透過バリアの形成を改善し、荒れ肌防御のバリアの働きを持つと考えられる。洗浄剤による肌荒れはセラミドの補充が有効であり、肌荒れの改善に高い効果を示すことが報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
一方、後者の荒れ肌には、皮膚外用剤には皮膚の恒常性維持の他、皮膚からの水分揮散を防止し、皮膚を構成する表皮、角質層に水分を保持させ皮膚に保湿性、柔軟性を保たせみずみずしい肌を保持する等の目的で保湿剤が配合されている。従来より用いられてきた保湿剤としては、オリーブ油、等の植物油やラノリンのような動物由来の脂質に代表される親油性の保湿剤の他に親水性の保湿剤としては、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ソルビトール等の水溶性多価アルコール、ヒアルロン酸及びキサンタンガムのような多糖類、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子、ピロリドンカルボン酸塩及びアミノ酸に代表される低分子量の天然保湿因子、植物抽出エキス等が知られている。
【０００６】
このように様々な種類の親水性、親油性の保湿剤が存在するが、安全性を重要視する風潮などから、昨今では動物由来のものや化学合成品は避けられる傾向にあり、好ましくは天然物や微生物による発酵生産物で、さらには生体のみならず環境にも負荷の少ない生分解性の素材が期待され注目を浴びている。
【０００７】
一方で、微生物が生産するバイオポリマーが有望視されている。バイオポリマーの中でも、アミノ酸が縮重合して構成されるポリアミノ酸と呼ばれる一群のバイオポリマーには、様々な機能が見出されており、その潜在能力に注目が集まっている。従来、ポリアミノ酸として、ポリ−γ−グルタミン酸（以下、「ＰＧＡ」と表記することがある）、ポリ−ε−リジンおよびシアノファイシンの３種類が同定されている。
【０００８】
ＰＧＡは、グルタミン酸のα−アミノ基とγ−カルボキシル基とがアミド結合したポリアミノ酸である。ＰＧＡは、古くから日本人に親しまれている納豆の糸引きの主体物質として知られる、吸水性のポリアミノ酸であるが、このように親しまれてきた背景として、その魅力的な機能性によるところが大きい。ＰＧＡの魅力的な機能としては、生分解性及び高吸水性を兼ね備えている点が知られている。これらの機能を利用して、上述した皮膚外用剤をはじめ、医療品、食品等、種々の分野、用途で用いられることが期待されている。
【０００９】
最近、ポリアミノ酸の構造的特徴（構成アミノ酸の光学活性や種類、分子サイズ、結合様式など）がその機能性に強く反映されていることが分かってきた。よく知られているところでは、生分解性と高吸水性を兼ね備えている点が挙げられる。それらの機能を利用し、食品、化粧品、医療品などの多くの分野で、種々の用途があるものと期待されている。しかし、現在、製品化されているＰＧＡは、化学的にヘテロなＤＬ−ＰＧＡである。具体的には、ＰＧＡは、納豆菌やその類縁菌から生産され、Ｄ−グルタミン酸及びＬ−グルタミン酸が不規則に結合しており、その含有比率や、配列は生産菌の培養毎に変動する。一般に、ポリアミノ酸の構造的特徴（構成するアミノ酸の光学活性や種類、分子サイズ、結合様式など）は、その機能に強く影響を与える。上記ＤＬ−ＰＧＡは、分子毎に構造が異なるため、その性質も分子毎に異なる。これでは、所望の品質を有するＤＬ−ＰＧＡを安定して製造することが困難である。
【００１０】
ホモポリ−γ−グルタミン酸を生産する菌も報告されている。例えば、炭疸菌Bacillus anthracisはＤ−グルタミン酸のみからなるポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸（以下、Ｄ−ＰＧＡと記載することもある）を生産する事が報告されている（非特許文献２）。しかし、本菌は強い病原性を有する細菌であるため、工業的なＰＧＡ生産菌としては不適切であり、生産されるＤ−ＰＧＡの分子量も小さい。また、好アルカリ性細菌Bacillus haloduransは、Ｌ−グルタミン酸のみからなるポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩（以下Ｌ−ＰＧＡと記載することもある）を生産する事も報告されている（非特許文献３）。しかし、本菌の生産するＬ−ＰＧＡは分子量が極めて小さく、実用的な性能を得るには不十分である。
【００１１】
一方、高分子量のホモポリ−γ−グルタミン酸の生産菌として、好塩性古細菌Natrialba aegyptiacaが分子量１０万〜１００万程度のＬ−ＰＧＡを生産することが報告されている。しかし、本菌は液体培養条件下では分子量が１０万程度と小さい、かつ殆どポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩を生産しないため、工業的な生産菌として問題があった（非特許文献４、特許文献１）。
【００１２】
上記以外に、Ｌ−ＰＧＡを生産する生物としては、ヒドラ等が挙げられるが、ヒドラの場合も同様に分子量が極めて小さいという問題がある（非特許文献３）。
【００１３】
一方本発明者らは、均一な光学純度でかつ高分子量のポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩を液体培養などで大量に調製することを可能とした。より具体的には、数平均分子量が１３０万以上で、かつ均一な光学純度のポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩を、培養液１Ｌあたり４．９９ｇ以上の高い生産性で取得している（特許文献２）。
【００１４】
また、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の架橋方法と架橋体（特許文献３）、並びにポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸及びポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体のうち少なくとも一方を含むことを特徴とする皮膚外用剤（特許文献４）の報告がある。
【００１５】
皮膚は一般に表皮（角質層、顆粒層、有棘層、基底層）、真皮、皮下組織と呼ばれる組織から成る。特に角質層は外部環境から人体を保護する重要な防御層として働くが、その機能を発現するには適度の水分と脂質が必要であると考えられている。また、皮膚は組織全体として滑らかさ、弾力性、柔軟さ等を具えており、そのためには皮膚組織全体にわたって適度の水分と脂質が必要であると考えられている。通常皮膚組織に存在する水分は組織と結合した結合水と結合していない自由水とから成ると考えられ、全体として皮膚内の水分バランスはコントロールされている。すなわち、自由水は表皮の微細孔を通って外部へ放散され、結合水は表皮内の自然保湿因子（アミノ酸、ピロリドンカルボン酸、尿素、乳酸塩等）と強い相互作用によって保持され、全体として水分バランスがコントロールされている。
【００１６】
これに対し、例えば（１）乾燥、低温等の厳しい外部環境条件、（２）あるいは過度の洗浄、入浴、（３）あるいは加齢、病気、投薬、人工透析に見られるような強制的脱水操作等によって自然保湿因子の減少や結合水の減少等が起こると、水分の動的バランスが失われ、皮膚は柔軟さを消失し、表面は荒れ、防御機能は低下する。このように皮膚の保湿及び水分調節は皮膚組織を正常に保つための必須の要件であり、正常な状態が失われた場合には症状の回復あるいは緩和が極めて重要である。従来から保湿効果、皮膜形成能の付与を目的として多くの物質を利用することや各種の対症療法的処置が提案されている（特許文献５〜７参照）。特許文献５ではスクワランを油性化粧料あるいは外用剤の成分として使用することが開示されている。特許文献６ではポリ-γ-グルタミン酸に多糖類を加えて保湿性を高めることが開示されている。特許文献７ではポリ-γ-グルタミン酸が化粧料として使用することが開示されている。特許文献８には化粧料としての尿素化合物誘導体の性質が開示されている。しかしながら、従来の化粧料では上記（１）〜（３）に対して十分な効果は得られていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特表２００２−５１７２０４号公報
【特許文献２】特開２００７−３１４４３４号公報
【特許文献３】特開２００８−１２０９１０号公報
【特許文献４】特開２００８−１２０７２５号公報
【特許文献５】特開２００５−２０６５７３号公報
【特許文献６】特開２００５−１２００３２号公報
【特許文献７】特開２００４−１４９４６７号公報
【特許文献８】特開２００５−１０４８７９号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】ジャーナル  オブ  バイオサイエンス  アンド  バイオエンジニアリング、９４，１８７（２００２）
【非特許文献２】Handy, W. E., and H.N. Rydon,Biochem J., 40, 297-309 (1946)
【非特許文献３】生物と化学 Vol.40, No.4, p212-214 (2002)
【非特許文献４】Hezayen, F. F., B. H. A. Rehm, B. J. Tindall and A. Steinbuchel, Int. J. Syst. E., 51, 1133-1142(2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、優れた持続性を持って皮膚水分を好適に保つとともに皮膚の掻痒を抑え、かつ皮膚の再生を効果的に助ける皮膚外用剤組成物を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
斯かる実情において、本発明者らは鋭意研究を行ったところ、（１）ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸と（２）スクワラン、スクワレン、オリーブオイル、セサミオイル、椿油の1種又は２種以上の油成分、（３）尿素及び尿素付加体の混合物を含むことによって、この目的が達成できることを見出し、本発明を完成した。
【００２１】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩、（２）スクワラン、スクワレン、オリーブオイル、セサミオイル、椿油の1種又は２種以上の油成分、（３）尿素及び尿素付加体の混合物を含むことを特徴とする皮膚外用剤組成物。
（２） ポリ−γ−L−グルタミン酸が、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸分子同士の架橋構造を有することを特徴とするポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体であることを特徴とする（１）の皮膚外用剤組成物。
（３）ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が１００万以上であることを特徴とする（１）または（２）の皮膚外用剤組成物。
（４）ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が２００万以上であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかの皮膚外用剤組成物。
（５）ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が３５０万以上であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかの皮膚外用剤組成物。
（６）ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の吸水倍率が１０倍以上５０００倍以下であることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかの皮膚外用剤組成物。
（７）（１）ポリ−γ−L−グルタミン酸および／またはその塩０．０１質量％〜１５質量％、（２）スクワラン、スクワレン、オリーブオイル、セサミオイル、椿油から選択した1種又は２種以上０．０５質量％〜５質量％、（３）尿素及び1種以上の尿素付加体の混合物０．２質量％〜２０質量％を含むことを特徴とする（１）〜（６）のいずれかの皮膚外用剤組成物。
（８）尿素付加体が、1種以上の高分子尿素付加体、1種以上の低分子尿素付加体又は側鎖のカルボキシル基の一部がカルシウム塩であるポリ-γ-グルタミン酸から成る高分子尿素付加体のいずれかであることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかの皮膚外用剤組成物。
（９）油成分がスクワラン、高分子尿素付加体がポリ-γ-グルタミン酸・尿素付加体であることを特徴とする（１）〜（８）のいずれかの皮膚外用剤組成物。
（１０）油成分がスクワラン、低分子尿素付加体がグルタミン酸・尿素付加体からなることを特徴とする（１）〜（９）のいずれかの皮膚外用剤組成物。
（１１）油成分がオリーブオイル、高分子尿素付加体がポリ-γ-グルタミン酸・尿素付加体であることを特徴とする（１）〜（１０）のいずれかの皮膚外用剤組成物。
（１２）油成分がセサミオイル、高分子尿素付加体がポリ-γ-グルタミン酸・尿素付加体であることを特徴とする（１）〜（１１）のいずれかの皮膚外用剤組成物。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の皮膚外用剤組成物は、すぐれた持続性を持って皮膚水分を好適に保つとともに皮膚の掻痒を抑える、特に表皮角質層の水分補給と水分平衡を改善し、皮膚の荒れを抑制あるいは改善するとともに掻痒を抑え、かつ皮膚の再生を効果的に助けることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の「ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸」とは、Ｌ−グルタミン酸のみからなるホモポリマ−である。その構造は式（Ｉ）にて示される構造である。α−ＣＯＯＨの水素は水素であっても良いし他の金属対イオンでも良い。例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、カルシウム、亜鉛及び鉄等一般的なものあれば限定する必要はない。そのなかでも好ましくはナトリウムである。
【００２４】
【化１】
2012001506.tif 000002
【００２５】
本発明の「分子量」とはプルラン標準物質の分子量換算にて算出した数平均分子量（Ｍｎ）のことを指す。
【００２６】
本発明のポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸は、既存の方法で得ることができる。たとえば、特許文献２（特開２００７−３１４４３４号公報）に記載された方法で、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を得ることができる。以下に、一例として、特許文献２を参考にしたポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の製造方法を述べるがこれに限定されるものではない。
【００２７】
たとえば、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ−に、ナトリアルバ  エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）０８３０−８２株（受託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ−、受託日：平成１８年４月４日、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２０８７２）、ナトリアルバ  エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）０８３０−２４３株（受託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ−、受託日：平成１８年４月４日、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２０８７３）、またはナトリアルバ  エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）０８３１−２６４株（受託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ−、受託日：平成１８年４月４日、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２０８７４）として寄託されている菌株をもちいてポリ−γ−L−グルタミン酸を得る場合、液体培養によりポリ−γ−L−グルタミン酸を得ることができる。または、特許文献２（特開２００７−３１４４３４号公報）に記載された方法で微生物を変異処理し、液体培養によりポリ−γ−L−グルタミン酸を生産できる微生物を作製し、ポリ−γ−L−グルタミン酸を生産することもできる。また、ナトリアルバ  エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）を常法により固相培養し、ポリ−γ−L−グルタミン酸を生産することもできる。
【００２８】
液体培養する場合には、振とう培養、通気攪拌培養など好気条件などで行うことが望ましい。その際の培養温度は、３０〜５０℃、好ましくは３５〜４５℃が適当である。また、培地のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、塩酸、硫酸またそれらの水溶液などによって調整できるが、ｐＨ調整できれば限定されない。培養ｐＨ５．０−９．０、好ましくはｐＨ６．０−８．５で培養するのが望ましい。また、培養期間は、通常２〜７日間程度でよい。また、培養時のＮａＣｌ濃度は１０〜３０％、好ましくは１５〜２５％で培養するのが望ましい。また、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ濃度は０．１〜１０％、好ましくは０．５〜５．０％濃度で培養するのが望ましい。また、固体培養の場合においても前期液体培養の場合と応用に、培養温度は３０〜５０℃、好ましくは３５〜４５℃、培養時のｐＨは５．０−９．０、好ましくはｐＨ６．０−８．５、培養時のＮａＣｌ濃度は１０−３０％、好ましくは１５〜２５％、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ濃度は０．１−１０％、好ましくは０．５−５％濃度が採用される。このようにして培養すると、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸は、主として菌体外に蓄積されて前記した培養物中に含まれる。特に限定はされないが、ＰＧＡ生産液体培地−１（２２．５％  ＮａＣｌ、２％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％  ＫＣｌ、３％  Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ、１％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．７５％  Ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）を使用してもよく、各添加量は菌株にあわせて適宜調整すればよい。
【００２９】
培養液中のポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の定量方法としては、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を含む試料から、硫酸銅やエタノ−ルを用いて沈澱させ、その沈殿物の重量測定およびＫｉｊｅｒｄｅｒ法による総窒素の測定を行なうもの（Ｍ．Ｂｏｖａｒｎｉｃｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１４５巻、４１５ペ−ジ、１９４２年）、塩酸加水分解後のグルタミン酸量を測定する方法（Ｒ．Ｄ．Ｈｏｕｓｅｗｒｉｇｔ，Ｃ．Ｂ．Ｔｈｏｒｎｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，６０巻、８９ペ−ジ、１９５０年）及び、塩基性色素との定量的な結合を利用した比色法（Ｍ．Ｂｏｖａｒｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０７巻、５９３ペ−ジ、１９５４年）が知られているが好ましくは、塩基性色素との定量的な結合を利用した比色法である。
【００３０】
塩基性色素としてはクリスタルバイオレット、アニリンブル−、サフラニンオ−、メチレンブル−、メチルバイオレット、トルイジネブル−、コンゴレッド、アゾカルマイン、チオニン、ヘマトキシリンなどがあげられるが、サフラニンオ−が好ましい。
【００３１】
この培養物からポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を分離、採取するには、硫酸銅やエタノ−ルを用いて沈澱させるなどの前記の公知の方法を用いればよい。一例を挙げると、例えば、培養液を遠心分離し、菌体を取り除く。続いて、得られた上清液に３倍量の水を加え希釈した後、ｐＨを３．０に調整する。ｐＨ調整後、５時間  室温で攪拌した。その後、３倍量のエタノ−ルを加え、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を沈殿物として回収した。沈殿物を０．１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させ、低分子物質を透析により除去する。透析後、得られた液を核酸除去のため、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ処理を行っても良いし、次いでタンパク質除去のために、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ処理を行っても良い。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ処理後、透析により低分子物質を除去しても良い。透析後、凍結乾燥等により、乾燥ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を得ればよい。また、必要により陰イオン交換樹脂を用いた精製を行うことができるが、一般的な条件で精製可能である。
【００３２】
本発明に使用するポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の分子量は、特に限定されないが、好ましくは５０万以上、より好ましくは８０万以上、さらに好ましくは１００万以上、特に好ましくは１３０万以上である。
【００３３】
Ｌ−ＰＧＡの分子量の上限値は特に限定されるものではないが、前述のＬ−ＰＧＡの製造方法によれば、例えば、６００万、最大で１５００万のＬ−ＰＧＡを得ることができる。
【００３４】
このポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩は、古細菌によって生産されるために、納豆菌によって生産されるポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩と比べて特有の臭気が軽減することで、化粧品、医薬部外品、医療用品、衛生用品または医薬品の用途に利用しても品質を損なうことがない。
【００３５】
スクワランは動物性、植物性のいずれでもよく、分散安定には含有水分が可能な限り少ないことが望ましい。オリーブオイル、椿油、スクワレンの分散安定にはできる限り不純物（特に金属イオン）や含有水分が少ないことが望ましい。セサミオイルは水分の少ないセサミ種子を金属イオン等の不純物含まない状態で低温搾油・ろ過して得られた発酵に対する抵抗性が高いものが望ましい。
【００３６】
本発明において、保湿、自然保湿因子の改善のために尿素及び尿素付加体を用いる。尿素に保湿作用があることは知られているが、本発明は尿素付加体にも同様の効果があることを見出した。特に尿素と尿素付加体を混合使用すると両成分の相互作用によって保湿効果及び持続性が向上することが見出された。添加量は尿素成分として０．２質量％〜２０質量％以下を含む、特に１質量％〜１０質量％を含むことが望ましい。尿素と尿素付加体の混合率には特に制限はないが、両者の混合比率として尿素付加体が５％以上９５％以下であれば尿素付加体の効果が発揮される。尿素付加体としては、例えば天然、半合成、合成高分子やオリゴマーの高分子尿素付加体としてポリ−γ−グルタミン酸、ポリ−β−アスパラギン酸、ポリ−ε−リジン、シルク（粉末）、セリシン、オリゴペプチド、カゼイン、ペクチン、グルテン、ポリアミド、ポリ−N−ビニルピロリドン等の尿素付加体が上げられるが、対応する高分子の分子量には特に制限は無い。また低分子尿素付加体としてはアミノ酸やカルボン酸の尿素付加体、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、グリシン、セリン、ピロリドンカルボン酸、乳酸、酪酸、酒石酸、リンゴ酸等の尿素付加体がある。また側鎖にカルボキシル基を持つ高分子の尿素付加体ではカルボキシル基の一部をＣａ、Ａｌ、Ｚｎ、Ｍｇ、Ｆｅ塩にすることによって溶解性を制御することができる。
【００３７】
また、上記の本発明の効果を阻害しない範囲で他の成分、例えばヒアルロン酸、フラクタン、アミロペクチン、キトサン、カラギーナン、グルカン、アラビアゴム、ミクロファイバーセルロース、カルボキシメチルセルロース等の多糖類及びその誘導体、各種香料、ジフェンヒドラミンのような抗ヒスタミン剤、塩酸プロカインの様な医薬品、EDTA、ジシアンジアミジンのような各種キレート剤、各種酸化防止剤、その他の通常化粧料や外用剤に添加される成分を加えることは何等差し支えない。
【００３８】
ここに提示したポリ-γ-グルタミン酸の水分保持、保湿作用、スクワランの脂質成分としての作用、尿素の保湿作用は個々には公知である。しかしながら、これら三成分が混合された時の相乗効果は極めて大きく、個々の成分を単独で使用した時に予想される効果を遥かに超えている。特に尿素付加体を混在させると相乗効果は一層顕著である。
【００３９】
以下、本発明を実施例に基づき、より詳細に説明する。なお、本発明は、特に実施例に限定されるものではない。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、以下の実施例に示す「％」は全て「重量％」である。
【００４０】
〔製造例１；ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の製造〕
Natrialba aegyptica（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４９）のＬ乾燥アンプルに、０．４ｍｌのＰＧＡ生産用液体培地（２２．５％  ＮａＣｌ、２％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％  ＫＣｌ、３％  Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ、１％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．７５％  Ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）を加えて懸濁液を得た。０．２ｍｌの当該懸濁液を、ＰＧＡ寒天培地（１０％  ＮａＣｌ、２％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％  ＫＣｌ、３％  Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ、１％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．７５％  Ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、２％  Ａｇａｒ）に接種し、３７℃で３日間培養して、シングルコロニーを得た。
【００４１】
次に、５本の１８ｍｌ容試験管に、それぞれ、３ｍｌのＰＧＡ生産液体培地（２２．５％  ＮａＣｌ、２％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％  ＫＣｌ、３％  Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ、１％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．７５％  Ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、ｐＨ７．２）を入れ、さらに、上記シングルコロニーを白金耳で１白金耳掻き取り植菌した。植菌後の試験管を、３７℃、３００ｒｐｍで３日間培養して、さらに、得られた培養液０．５ｍｌを、５０ｍｌ  ＰＧＡ生産液体培地を入れた５００ｍｌ容坂口フラスコ１０本にそれぞれ植菌し、３７℃で５日間培養した。培養後、得られた培養液を遠心し、菌体を取り除いて上清を回収した。
【００４２】
次に、回収した上清に３倍量の水を加え希釈した後、１Ｎ硫酸でｐＨを３．０に調整した。ｐＨを調整した後、室温で５時間攪拌した。その後、３倍量のエタノールを加えて遠心分離を行い、沈殿物を回収した。この沈殿物がＬ−ＰＧＡである。
【００４３】
回収したＬ−ＰＧＡを０．１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して、これを、低分子物質等の不純物を除去するために透析した。次に、透析後の液体に含まれる核酸を除去するために、当該液体に、ＭｇＣｌ２が１ｍＭ、ＤＮａｓｅＩ（ＴＡＫＡＲＡ社製）が１０Ｕ／ｍｌ、ＲＮａｓｅＩ（ニッポンジーン製）が２０μｇ／ｍｌとなるように加えて、３７℃で２時間インキュベートした。次いでタンパク質を除去するために、核酸を除去した後の液体にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（タカラバイオ製）を３Ｕ／ｍｌとなるように添加して、３７℃で５時間インキュベートしてＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ処理を行なった。
【００４４】
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ処理の後、超純水で透析し、低分子物質を除去した。次に、Ｌ−ＰＧＡを陰イオン交換樹脂（Ｑ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＧＥ  ヘルスケア  バイオサイエンス社製）に吸着させ、０．５ＭのＮａＣｌ水溶液で洗浄した後、１ＭのＮａＣｌ水溶液で溶出した。得られた溶液を、さらに超純水で透析し、透析後の溶液を凍結乾燥することにより、Ｌ−ＰＧＡのナトリウム塩（以下、「Ｌ−ＰＧＡ・Ｎａ塩」と表記する）を得た。なお、超純水は、ＭｉｌｌｉＱ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製の純水製造装置）で作製した。
【００４５】
〔製造例２；ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の分子量分析−１〕
製造例１で得たＬ−ＰＧＡ・Ｎａ塩の平均分子量を、ＧＰＣ分析にて測定した。その結果、Ｍｗ＝７，５２２，０００、Ｍｎ＝３，７０４，０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝２．０３１であることが確認された（プルラン換算）。
【００４６】
なお、ＧＰＣ分析は、以下の条件で行なった。
装置：ＨＬＣ−８２２０ＧＰＣ（東ソー社製）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  α−Ｍ（東ソー社製）
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
溶出液：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液
カラム温度：４０℃
注入量：１０μｌ
検出器：示差屈折計
【００４７】
〔製造例３；ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の分子量分析−２〕
製造例１において、１．０ＭのＮａＣｌ水溶液溶出した後、さらに、１Ｎ  ＨＣｌを用いて、ｐＨを２．０に調製した以外は、製造例１と同様の操作を行なって得たＬ−ＰＧＡ・Ｎａ塩の平均分子量をＧＰＣ分析により測定した。その結果、Ｍｗ＝２，８８８，０００、Ｍｎ＝１，３２７，０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝２．１７６であることが確認された（プルラン換算）。なお、本製造例におけるＧＰＣ分析は、製造例２と同様の操作で行なった。
【００４８】
〔製造例４；ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体の作製〕
製造例１で得たＬ−ＰＧＡ・Ｎａ塩の５％水溶液を作製した。
【００４９】
次に、Ｌ−ＰＧＡ・Ｎａ塩水溶液を、窒素を用いて３分間バブリングした後、蓋付き１０ｍｌサンプル瓶に、２ｍｌ分取して蓋を閉めた。
【００５０】
次に、サンプル瓶に、線源をコバルト６０とするγ線照射装置を用いてγ線を照射した。照射線量は、５ｋＧｙとなるように照射した。γ線照射後に得られた生成物を、サンプル瓶から取り出し、余分な水分を８０メッシュの金網で水切りした後、凍結乾燥することで、Ｌ−ＰＧＡ架橋体粉末を得た。なお、上記余分な水分には、未架橋のＬ−ＰＧＡが含まれており、当該水切りは、未架橋のＬ−ＰＧＡを除去することが主たる目的である。
【００５１】
本発明の組成物の効果を見るため次の検討を行った。
【００５２】
表１に基剤ベースを、表３に比較例、実施例を示す。実施例１尿素付加体のポリ−γ−グルタミン酸の分子量は２６万である。実施例３の尿素付加体のポリ−γ−グルタミン酸の分子量は２１万である。実施例５の尿素付加体のポリ−γ−グルタミン酸の分子量は１８０万である。実施例７の尿素付加体のポリ−γ−グルタミン酸の分子量は２６万である。
【００５３】
尿素・高分子付加体、尿素・低分子付加体は、試薬をジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、蒸留水等に溶解した後５０〜８０℃で２０〜４０分静かに撹拌し、一晩静置後濃縮採取した。得られた試料を示差熱量分析すると尿素の融解ピークが消失し尿素付加体が得られたことが確認された。
【００５４】
乾燥肌、肌荒れに悩む３０〜７０歳の女性１０人、肌の張り、弾力性、艶に悩む３０〜７０歳の女性１０人、肌の小皺に悩む３０〜７０歳の女性１０人に本発明のジェルクリームの効果を試した。テストは、３か月間毎日朝晩２回洗顔後に適量を顔面に塗布して効果を官能評価した。評価は６段階《０：変わらないあるいは悪化する、１：僅かに効果がある、２：少し効果がある、３：効果がある、４:可成り効果がある、５:非常に効果がある》で行った。結果を表３から表５に示す。
【００５５】
乾燥肌、肌荒れの、肌の張り、弾力性、艶、小皺の改善に非常に効果が認められる。テスト者の満足度が非常に高い。さらに特筆すべきことはテスト開始の初期段階（１日目）で顕著な効果が認められるだけでなく使用終了後も効果が持続することである。
【００５６】
【表１】
2012001506.tif 000003
【００５７】
【表２】
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【００５８】
【表３】
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【００５９】
【表４】
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【００６０】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、優れた持続性を持って皮膚水分を好適に保つとともに皮膚の掻痒を抑え、かつ皮膚の再生を効果的に助ける皮膚外用剤組成物を提供することができる。さらに、従来のポリ−γ−L−グルタミン酸よりも、原料コストが安価であり、大量生産可能となり、長期にわたる使用に十分に耐え得ることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。