(57)【要約】【課題】濁度物質及び蛍光物質の何れも検出可能な核酸増幅反応装置を提供すること。【解決手段】蛍光物質を励起する光を出射する第一の光源と、蛍光物質から生じる蛍光の波長域に重複する波長域の光を出射する第二の光源と、第一の光源と第二の光源とを切り換えて発光させる制御部とを有し、前記第一の光源からの光及び前記第二の光源からの光が、重複する光路上を通過して核酸の増幅反応の反応場となる反応領域に照射され、増幅反応の進行に伴って生じる濁度物質による光量と、増幅反応の進行に伴って光により励起された蛍光物質から生じる蛍光の強度とを検出できる核酸増幅反応装置。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光物質を励起する光を出射する第一の光源と、
蛍光物質から生じる蛍光の波長域に一致する波長域の光を出射する第二の光源と、
第一の光源と第二の光源とを切り換えて発光させる制御部とを有し、
前記第一の光源からの光及び前記第二の光源からの光が、導光部材にて重複する光学系路上を通過して核酸の増幅反応の反応場となる反応領域に照射され、
増幅反応の進行に伴って生じる濁度物質による光量と、増幅反応の進行に伴って光により励起された蛍光物質から生じる蛍光の強度とを検出できる核酸増幅反応装置。
【請求項２】
前記第一の光源及び前記第二の光源と前記反応領域との間の光学系路上に、これらの光源からの光を同一光学系路上に導光する導光部材が配設され、
前記反応領域と光検出器との間の光学系路上に蛍光フィルタが配設される請求項１記載の核酸増幅反応装置。
【請求項３】
前記第一の光源及び前記第二の光源と前記反応領域との間の光学系路上に、前記第二の光源からの光を前記第一の光源の光学系路上に導光する導光部材が配設され、
前記反応領域と光検出器との間に光学系路上に蛍光フィルタが配設される請求項１記載の核酸増幅反応装置。
【請求項４】
前記第一の光源が、レーザー光源である、請求項２記載の核酸増幅反応装置。
【請求項５】
前記第一の光源と前記反応領域との間の光学系路上に、前記第一の光源からの光が透過する励起フィルタ及び該励起フィルタからの光が通過する前記導光部材を配設する、請求項３記載の核酸増幅反応装置。
【請求項６】
前記第一の光源からの光で蛍光物質を励起し、
前記第二の光源からの光で濁度を検出する請求項４又は５記載の核酸増幅反応装置。
【請求項７】
前記核酸の増幅反応が、ＰＣＲ法又はＬＡＭＰ法によるものである請求項６項記載の核酸増幅反応装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅反応装置に関する。より詳細には、遺伝子発現解析、感染症検査、またＳＮＰ解析等の遺伝子解析に供される核酸増幅反応装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＰＣＲ法（Polymerase Chain Reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）やＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）等による遺伝子増幅反応を行って検証することが微量核酸の定量分析の標準的手法となっている。このような手法によって、遺伝子発現解析、遺伝的疾患、癌化、微生物やウイルス等の感染症の検査、またＳＮＰ解析等の遺伝子解析が進められている。
ここで、核酸の増幅産物を検出する方法において、インターカレーター法や蛍光標識プローブ法等のように蛍光物質を用いる蛍光検出方法、また増幅過程での副産物のピロリン酸にマグネシウムイオン等の金属イオンで水に不溶又は難溶性の塩を形成した濁度物質を用いる濁度検出法等が主として用いられている（特許文献１〜３）。
上述のような蛍光物質や濁度物質を検出するための蛍光検出装置や濁度検出装置は広く市販されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−２３７２０７号公報
【特許文献２】国際公開第０１／８３８１７号パンフレット
【特許文献３】特許４１３３４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来の核酸増幅蛍光検出装置では、励起光に比べ微弱な蛍光成分を検出するため、励起系に蛍光材料の吸収スペクトルに配慮した所望の透過域を有する励起光用波長フィルタ（以下、「励起フィルタ」ともいう）を配置している。しかし、この方式では、核酸増幅反応で生じる増幅副産物による内部散乱に起因するサンプル透過光の光量変化を検出する濁度検出を、蛍光検出と同じ系で実現することはできない。
また、従来の核酸増幅濁度検出装置でも、蛍光検出するための励起フィルタを配設すると濁度検出ができなくなるため、蛍光検出を同じ光学系で実現することができなかった。
そこで、本発明は、同一の系で蛍光検出及び濁度検出が可能な核酸増幅反応装置を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題解決のため、本発明は、前記蛍光物質を励起する光を出射する第一の光源と、蛍光物質から生じる蛍光の波長域に一致する波長域の光を出射する第二の光源と、第一の光源と第二の光源とを切り換えて発光させる制御部とを有し、前記第一の光源からの光及び前記第二の光源からの光が、導光部材にて重複する光学系路上を通過して核酸の増幅反応の反応場となる反応領域に照射され、増幅反応の進行に伴って生じる濁度物質による光量と、増幅反応の進行に伴って光により励起された蛍光物質から生じる蛍光の強度とを検出できる核酸増幅反応装置を提供する。
【０００６】
また、前記第一の光源及び前記第二の光源と前記反応領域との間の光学系路上に、これらの光源からの光を同一光学系路上に導光する導光部材が配設され、前記反応領域と光検出器との間の光学系路上に蛍光フィルタが配設されるのが好適である。
前記第一の光源が、レーザー光源であるのが好適である。
【０００７】
また、前記第一の光源及び前記第二の光源と前記反応領域との間の光学系路上に、前記第二の光源からの光を前記第一の光源の光学系路上に導光する導光部材が配設され、前記反応領域と光検出器との間に光学系路上に蛍光フィルタが配設されるのが好適である。
前記第一の光源と前記反応領域との間の光学系路上に、前記第一の光源からの光が透過する励起フィルタ及び該励起フィルタからの光が通過する前記導光部材を配設するのが好適である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係わる核酸増幅検出装置は、光源を切り替えることにより、同一の光学系で蛍光検出及び濁度検出が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明に係わる核酸増幅反応装置における第一実施形態を側面視した概念図を示す。
【図２】本発明に係わる核酸増幅反応装置における第二実施形態を側面視した概念図を示す。
【図３】第一実施形態（ａ）及び第二実施形態（ｂ）の蛍光検出のための特定の励起光の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１１】
１．核酸増幅反応装置
（１）第一の光源
（２）第二の光源
（３）制御部
（４）導光部材
（５）蛍光フィルタ及び光検出器
（６）反応領域
（ａ）核酸増幅反応
（ｂ）核酸増幅の検出方法
２．本発明に係わる核酸増幅反応装置の第一実施形態
（１）第一の実施形態の構成
（２）第一の実施形態の動作
（ａ）蛍光検出
（ａ−１）ＲＴ−ＰＣＲ装置の動作
（ｂ）濁度検出
（ｂ−１）ＬＡＭＰ装置の動作
３．本発明に係わる核酸増幅反応装置の第二実施形態
（１）第二の実施形態の構成
（２）第二の実施形態の動作
（ａ）蛍光検出
（ｂ）濁度検出
【００１２】
＜１．核酸増幅反応装置＞
図１及び２は、本発明に係わる核酸増幅反応装置の第１実施形態及び第２実施形態を側面視した概念図である。
なお、以下に説明する図面では、説明の便宜上、装置の構成等を簡略化して示している。
【００１３】
本発明に係わる核酸増幅反応装置の大まかな構成を、以下に説明する。
本発明に係わる核酸増幅反応装置は、反応領域に照射する光を出射する第一の光源及び第二の光源、これら光源の切り換えを行う制御部、導光部材、蛍光フィルタ、並びに光検出器を備えている。当該反応領域は、脱着可能であり、当該反応領域が核酸の増幅反応の反応場となる。そして、本発明の核酸増幅反応装置は、増幅反応に伴って生じる濁度物質による光量と、増幅反応の進行により励起された蛍光物質から生じる蛍光の強度とを検出することが可能である。
【００１４】
（１）第一の光源
前記第一の光源は、蛍光物質を励起する光を出射するものである。
当該励起光は、所望の蛍光物質の吸収スペクトルに対応した特定の波長域を有するものであり、当該蛍光物質から生じる蛍光の波長域と重複しない波長域のものである。
当該励起光は、反応領域に到達し、反応領域内での増幅反応の進行に伴って生成される蛍光物質を励起する。そして、当該蛍光物質から生じる蛍光の強度を蛍光フィルタを介して光検出器にて検出する。
【００１５】
（２）第二の光源
前記第二の光源は、蛍光物質から生じる蛍光の発光波長域及び蛍光フィルタの透過波長域に発光波長を有する光に一致する波長域の光を出射するものである。
当該光は、所望の蛍光物質から生じる蛍光の発光波長域及び蛍光フィルタの透過波長域に発光波長を有する光に一致する波長域の光を有するものであり、例えば、通常の光源から出射されるような様々な波長が混合されている光などが挙げられる。尚、当該一致する波長域とは、長波長域であるが、例えば４５０ｎｍ以上、特に４５０〜７８０ｎｍが挙げられる。
当該光は反応領域に到達し、反応領域内での増幅反応の進行に伴って生成される濁度物質によって反射される或いは吸収される。そして、当該濁度物質による光の散乱光量又は透過光量を光検出器にて検出する。
【００１６】
（３）制御部
前記第一の光源及び前記第二の光源の切り換えは、前記制御部によって制御されている。例えば、当該制御部は、核酸増幅に際して、蛍光や濁度によって検出するのに適した光成分を出射する光源を考慮し、一方の光源からの光を照射させると共に、他方の光源からの光を照射させないように制御する。また、当該制御部は、光源から出射する光の量を制御してもよい。
尚、当該制御部は、光源を制御する以外に、本発明の装置に関しての各種動作（例えば、核酸増幅反応、検出光量算出やモニタリング等）を制御してもよい。
【００１７】
（４）導光部材
前記導光部材には、光入射端部が設けられており、当該光入射端部に、前記第一の光源及び／又は前記第二の光源の単数又は複数から出射された光が入射される。前記導光部材内部には、入射された光が反応領域の方向に向かわせるような部材（例えばプリズム、反射板や凹凸等）が設けられている。この導光部材を用いることにより、光源の数を減らすことができ、均一な照射と低消費電力化が可能となる。更に、装置全体の小型化、特に薄型化が可能となる。
【００１８】
（５）蛍光フィルタ及び光検出器
前記蛍光フィルタは、反応領域からの蛍光、散乱光及び透過光を良好に透過させるものが好適である。具体的には、核酸の増幅反応で利用する蛍光物質、濁度物質に応じて、これら波長帯域を効率よく透過させつつ、それ以外の波長域を遮断するものを適宜選択すればよい。例えば、ロングパスフィルター（LRF: Long Pass Filter）が挙げられる。また、当該波長帯域とは、長波長領域が好適であり、この具体的な波長帯域としては４５０ｎｍ以上、より具体的には４５０〜７８０ｎｍが挙げられる。
また、前記光検出器としては、少なくとも蛍光及び濁度を検出することが可能であれば特に限定されず、例えば、ＣＣＤやＣＭＯＳ素子等のエリア撮像素子、ＰＭＴ（光電子倍増管）、フォトダイオード等が挙げられる。
尚、集光レンズは、上述した各構成の間に適宜配設すればよい。
【００１９】
（６）反応領域
前記反応領域は、核酸の増幅反応の反応場となるエリアであり、例えば、核酸増幅反応用マイクロチップ等の反応容器内に形成されている。
前記反応領域は、単数又は複数の反応基板により形成される。当該反応基板は、ガラス製基板層のウェットエッチングやドライエッチングによって、又はプラスチック製基板層のナノインプリントや射出形成、切削加工によって形成することができる。このときに、前記反応領域の形状を適宜設定することができ、例えばウェル状や細管状にしてもよい。
当該反応基板の材料は、特に限定されず、検出方法や加工容易性、耐久性等を考慮して適宜選択するのが好適である。当該材料としては、光透過性のある素材で所望の検出方法に応じて適宜選択すればよく、例えば、ガラスや各種プラスチック（ポリプロピレン、ポリカーボネイト、シクロオレフィンポリマー、ポリジメチルシロキサン等）が挙げられる。
また、反応容器を形成する際に、反応領域内に、適宜、核酸増幅反応に必要な試薬類を充填していてもよい。
【００２０】
（ａ）核酸増幅反応
本発明において、「核酸増幅反応」には、温度サイクルを実施する従来のＰＣＲ（polymerase chain reaction）法や、温度サイクルを伴わない各種等温増幅法が含まれる。等温増幅法としては、例えば、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法やＳＭＡＰ（SMartAmplification Process）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（登録商標）、ＴＲＣ（transcription-reverse transcription concerted）法、ＳＤＡ（strand displacement amplification）法、ＴＭＡ（transcription-mediated amplification）法、ＲＣＡ（rolling circle amplification）法等が挙げられる。
この他、「核酸増幅反応」には、核酸の増幅を目的とする変温あるいは等温による核酸増幅反応が広く包含されるものとする。また、これらの核酸増幅反応には、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法やＲＴ−ＲＡＭＰ法などの増幅核酸鎖の定量を伴う反応も包含される。
【００２１】
また、「試薬」には、上記の核酸増幅反応において、増幅核酸鎖を得るために必要な試
薬であって、具体的には、標的核酸鎖に相補的な塩基配列とされたオリゴヌクレオチドプ
ライマー、核酸モノマー（ｄＮＴＰ）、酵素、反応緩衝液（バッファー）溶質などが含ま
れる。
【００２２】
前記ＰＣＲ法は、「熱変性（約９５℃）→プライマーのアニーリング（約５５〜６０℃）→伸長反応（約７２℃）」という増幅サイクルを連続的に行う。
また、前記ＬＡＭＰ法とは、ＤＮＡのループ形成を利用して、一定温度でＤＮＡやＲＮＡからｄｓＤＮＡを増幅産物として得る方法である。一例として、成分（i）、（ii）（iii）を加え、インナープライマーが鋳型核酸上の相補的配列に対して安定的な塩基対結合を形成することができ、かつ鎖置換型ポリメラーゼが酵素活性を維持しうる温度でインキュベートすることにより進行する。このときのインキュベート温度は５０〜７０℃、時間は１分〜１０時間程度が好適である。
成分（i）インナープラマー２種、又は更にアウタープライマー２種、又は更にループプライマー２種；成分（ii）鎖置換型ポリメラーゼ；成分（iii）基質ヌクレオチド。
【００２３】
（ｂ）核酸増幅（産物）の検出方法
前記核酸増幅の検出方法としては、特に限定されず、例えば、蛍光物質や濁度物質、化学発光物質等を用いる方法が挙げられる。
【００２４】
前記蛍光物質や化学発光物質を用いる方法としては、例えば、二本鎖核酸に特異的に挿入されて蛍光を発する蛍光色素（誘導体）を用いるインターカレート方法、増幅する核酸配列に特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブを用いる標識プローブ方法等が挙げられる。
前記標識プローブ法としては、例えばハイブリダイゼーション（Hyb）プローブ法、加水分解（TaqMan）プローブ法等が挙げられる。
前記Hybプローブ法は、予め２種のプローブが近接するようにデザインされたドナー色素でラベルされたプローブとアクセプター色素でラベルされたプローブという２種のプローブを用いる方法である。そして、当該２種のプローブが標的核酸にハイブリダイズするとドナー色素により励起されたアクセプター色素が蛍光を発する。
また、前記TaqManプローブ法は、レポーター色素とクエンチャー色素の２つが近接するようにラベルされているプローブを用いる方法である。そして、当該プローブが核酸伸長の際に加水分解され、このときクエンチャー色素とレポーター色素とが離れ、レポーター色素が励起されると蛍光を発する。
【００２５】
前記蛍光物質を用いる方法に使用する蛍光色素（誘導体）としては、SYBR（登録商標） Green I、SYBR（登録商標） Green II、SYBR（登録商標）Gold、YO (Oxazole Yellow)、TO (Thiazole Orange)、PG (Pico（登録商標）Green)、臭化エチジウム等が挙げられる。
前記化学発光物質を用いる方法に使用する有機化合物としては、ルミノール、ロフィン、ルシゲニン、シュウ酸エステル等が挙げられる。
【００２６】
また、前記濁度物質を用いる方法としては、例えば核酸増幅反応の結果生じるピロリン酸とこれに結合可能な金属イオンにより生じた濁度物質を用いる方法等が挙げられる。当該金属イオンは、一価又は二価の金属イオンであり、ピロリン酸と結合すると水に不溶又は難溶性の塩を形成して濁度物質となる。
当該金属イオンとしては、具体的には、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン及び二価遷移金属イオン等が挙げられる。このうち、例えば、マグネシウム（II）、カルシウム（II）及びバリウム（II）等のアルカリ土類金属イオン；亜鉛（II）、鉛（II）、マンガン（II）、ニッケル（II）及び鉄（II）等の二価遷移金属イオン等から選ばれる１種又は２以上が好ましい。更に好ましくは、マグネシウム（II）、マンガン（II）、ニッケル（II）及び鉄（II）である。
当該金属イオンを添加するときの濃度は、０．０１〜１００ｍＭの範囲であれば好適である。検出波長は、３００〜８００ｎｍとするのが好適である。
【００２７】
尚、本発明に係わる核酸増幅反応装置には、前記反応領域を加熱する温度制御手段（図示せず）を設けるのが好適である。当該温度制御手段は、反応領域への光及び反応領域からの光が通過するように設置する。当該温度制御手段の配置としては、反応領域の上部、下部及び／又は側部とするのが好ましい。また、当該温度制御手段としては、例えば、ペルチェ等のヒータや光透過性のあるＩＴＯヒータ等が挙げられる。これにより、核酸増幅の反応温度や反応時間等を制御できるので、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法等の核酸増幅反応を良好に行うことができる。
【００２８】
以下に、本発明に係わる核酸増幅反応装置を、より具体的に説明する。上述した構成については省略する。
【００２９】
＜２．本発明に係わる核酸増幅反応装置の第一の実施形態＞
（１）第一の実施形態の構成
図１を参照して、第一の実施形態を説明する。尚、一つの光学系路について説明するが、これに限定されず、複数存在していても良い。
本発明に係わる核酸増幅検出装置１における第一の実施形態は、第一の光源２と、第二の光源３と、導光部材４と、蛍光フィルタ９，１１と、光検出器（以下、「光学検出器」ともいう）１３と、第一の光源２と第二の光源３とを切り換えて発光させる制御部（図示せず）とを有する。
【００３０】
前記第一の光源２は、蛍光物質を励起する光を出射する光源であればよく、例えば、レーザー光源が好適であり、線幅の狭いレーザー光を出射するレーザー光源がより好適である。当該レーザー光源としては、レーザー光の種類によっては特に限定されないが、アルゴンイオン（Ar）レーザー、ヘリウム−ネオン（He-Ne）レーザー、ダイ（dye）レーザー、クリプトン（Cr）レーザー等を出射する光源であればよい。当該レーザー光源は、１種又は２種以上、自由に組み合わせて用いることができる。当該励起光により、増幅反応の進行に伴って生じる蛍光物質が励起され、蛍光強度が増加する。
尚、前記第一の光源２は、単数又は複数の何れでもよい。
これにより、励起フィルタを用いる必要がなくなるので（図３（a）参照）、後述する第二の光源３にて濁度の検出が可能となる。また、励起フィルタに関連する部材を減らすことができ、装置全体の小型化、特に薄型化が可能となる。
【００３１】
前記第二の光源３は、蛍光物質から生じる蛍光の波長域に重複する波長域の光を出射する光源であればよく、例えば、白色又は単色の発光ダイオード（ＬＥＤ）、水銀灯、タングステンランプ等が好適であり、このうちＬＥＤが好ましい。当該光は、濁度物質の表面で反射するものと吸収されるものとになる。これにより、光の散乱光量は増加し、また光軸方向の透過光量は減少する。
尚、前記第二の光源３は、単数又は複数の何れでもよい。
【００３２】
前記導光部材４は、前記第一の光源２及び前記第二の光源３と前記反応領域Ａ１との間の光学系路上に、これらの光源からの光を同一光学系路上に導光するものである。当該導光部材４には、光入射端部４１が設けられており、この光入射端部４１に沿って、前記第一の光源２及び前記第二の光源３とが配置されている。そして、当該光入射端部４１から入射される光を反応領域Ａ１の方向に向かわせるプリズムや反射板等の部材が設けられている。このプリズム等の部材は、これらの光源からの光が、反応領域Ａ１（例えば反応基板７の面）に略垂直に照射するように配置されているのが好適である。
これにより、第一の光源及び第二の光源の各光源数を減らしても、均一な照射が得られ、低消費電力化も可能となる。また、当該導光部材４は光源を支持するための支持体としても利用できるので、装置内の光源を支持するための部材を減らすことができる。よって、装置全体の小型化、特に薄型化も可能となる。
尚、前記導光部材４と前記反応領域Ａ１との間には、集光レンズ５及び絞り６が配置されるのが好適である。これらを介して当該導入部材４からの光が、前記反応領域Ａ１に照射される。
【００３３】
前記反応領域Ａ１は、ウェル状であり、反応基板７によって形成されたものである。
当該反応基板７は、前記導光部材４からの光Ｌ１，Ｌ２を通過させるもの及び反応領域Ａ１を透過した光Ｌ１１，Ｌ２１を通過させるものである。
更に、当該反応基板７の下部には、前記反応領域Ａ１をセットするための測定基板８が設けられているのが好適である。当該測定基板８における基板については、前記反応領域Ａ１からの光を透過させるものであれば特に限定されないが、例えば基板に孔を設けたり、透明性の基板を用いればよい。また、当該測定基板８に、上述のような温度制御手段を備えてもよい。
【００３４】
前記蛍光フィルタ９，１１は、前記反応領域Ａ１と光検出器１３との間の光学系路上に配設されるのが好適である。当該蛍光フィルタは、適宜単数にしてもよく、また更に加えてもよい。
更に、蛍光フィルタ９と蛍光フィルタ１１との間及び／又は蛍光フィルタ１１と光学検出器１３との間には、集光レンズが単数又は複数配設されていてもよい。例えば、集光レンズ１０，１２のように配設されていてもよい。
前記光学検出器１３は、支持体１４によって支持され、少なくとも所望の蛍光及び濁度が検出できるものが好適である。
【００３５】
前記制御部は、所望の蛍光又は濁度を検出するのに応じて、第一の光源２と第二の光源３とを切り換えて発光させる。例えば、当該制御部は、蛍光を検出する際には、第一の光源２から励起光を出射させる一方で、第二の光源３からの光を出射させないようにする。一方、濁度を検出する際には、第二の光源３からの光を出射させる一方で、第一の光源２からの励起光を出射させないようにする。
このとき、当該制御部は、核酸増幅反応の進行に伴って生じる濁度物質による光の散乱光量や透過光量から、また、核酸増幅反応の進行に伴って生じる蛍光物質が光により励起されて生じる蛍光強度から、それぞれ核酸量を算出することも可能である。
また、当該制御部には、核酸増幅をリアルタイムに検出するため各核酸増幅反応（温度や時間）を制御することも可能である。
【００３６】
（２）第一の実施形態の動作
本発明の第一の実施形態の光学系路を図１に示す。
【００３７】
（ａ）蛍光検出
反応領域Ａ１中の核酸増幅反応で蛍光検出を選択した場合を以下に説明する。このとき、制御部は、第二の光源３からの光を出射させないように制御している。
第一の光源２から、検出する蛍光物質を励起する光Ｌ１（特定の励起光）が出射される。当該光Ｌ１は、光学入射端部４１から導光部材４に入射される。入射された光Ｌ１は、導光部材４内部のプリズム等の部材によって、反応領域Ａ１に到達するように照射される。照射された光Ｌ１は、集光レンズ５次いで絞り６を通過し、反応基板７上面を通過して、反応領域Ａ１の核酸増幅反応の進行に伴って生じている蛍光物質に照射される。この照射された光Ｌ１により励起された蛍光物質から生じる光Ｌ１１（蛍光）は、蛍光フィルタ９を透過して光Ｌ１２となる。当該光Ｌ１２は、集光レンズ１０を通過し、更に蛍光フィルタ１１を透過して、所望の蛍光成分の光Ｌ１３（特定の蛍光成分）となる。当該光Ｌ１３は、集光レンズ１２を通過して光学検出器１３にて検出される。これにより、反応領域Ａ１からの所望の蛍光量を測定できる。
【００３８】
（ａ−１）ＲＴ−ＰＣＲ装置の動作
ここで、本発明の第一の実施形態を、ＲＴ―ＰＣＲ装置として用い、蛍光物質にて核酸（例えばＤＮＡ）を定量する場合について、以下にステップＳｐ１（熱変性）、ステップＳｐ２（プライマーのアニーリング）、ステップＳｐ３（ＤＮＡ伸長）の手順で説明する。
熱変性ステップ（ステップＳｐ１）では、ウェルＡ１内が９５℃になるように前記温度制御手段にて制御し、二本鎖ＤＮＡを変性させ一本鎖ＤＮＡとする。
続くアニーリングステップ（ステップＳｐ２）では、ウェルＡ１内が５５℃となるように設定することで、プライマーが当該一本鎖ＤＮＡと相補的な塩基配列と結合させる。
次のＤＮＡ伸長ステップ（ステップＳｐ３）では、ウェルＡ１内が７２℃となるように制御することで、プライマーをＤＮＡ合成の開始点として、ポリメラーゼ反応を進行させてｃＤＮＡを伸長させる。
このようなステップＳｐ１〜Ｓｐ３の温度サイクルを繰り返すことによって、各ウェル内のＤＮＡは増幅されてゆく。
ＤＮＡ複製反応の際に生成されたｄｓ（double-standed）−ＤＮＡには、例えばＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等の蛍光色素がインターカレートする。インターカレートしたｄｓ−ＤＮＡに励起光（光Ｌ１）が照射されることで励起して蛍光（光Ｌ１１）を発する（励起光４９７ｎｍ：発光波長５２０ｎｍ）。蛍光フィルタ９，１１で所望の蛍光成分にし、この蛍光（光Ｌ１３）の発光量を前記温度サイクルごとに蛍光検出部１３で測定し、定量化する。そして、温度サイクル数とこれに対応する蛍光量との相関関係に基づいて遺伝子発現量として初期のｃＤＮＡ量を求めることもできる。
尚、ＰＣＲ法については、濁度物質を用いても核酸を定量することが可能であるので、この場合には、後述の（ｂ）濁度検出に従って、濁度を検出すればよい。
【００３９】
（ｂ）濁度検出
反応領域Ａ１中の核酸増幅反応で濁度検出を選択した場合を以下に説明する。このとき、制御部は、第一の光源２からの光を出射させないように制御している。
第二の光源３から、検出する濁度物質に照射される光Ｌ２が出射される。当該光Ｌ２は、光学入射端部４１から導光部材４に入射される。入射された光Ｌ２は、導光部材４内部のプリズム等の部材によって、反応領域Ａ１に到達するように照射される。照射された光Ｌ２は、集光レンズ５次いで絞り６を通過し、反応基板７上面を通過して、反応領域Ａ１の核酸増幅反応の進行に伴って生じる濁度物質に照射される。この照射された光Ｌ２は、濁度物質の表面で反射されるか或いは吸収され、光Ｌ２１（散乱光及び透過光）となる。この光Ｌ２１は、蛍光フィルタ９を透過して光Ｌ２２となる。当該光Ｌ２２は、集光レンズ１０を通過し、更に蛍光フィルタ１１を透過して、所望の光Ｌ２３（散乱光成分或いは透過光成分）となる。所望の光成分となった光Ｌ２３は、集光レンズ１２を通過して光学検出器１３にて検出される。これにより、反応領域Ａ１での散乱光量や透過光量を測定できる。
【００４０】
（ｂ−１）ＬＡＭＰ装置の動作
ここで、本発明の第一の実施形態を、ＬＡＭＰ装置として用い、濁度物質にて核酸を定量する場合について、以下にステップＳｌ１の手順で説明する。
温度制御ステップ（ステップＳｌ１）にて、ウェルＡ１内が一定温度（６０〜６５℃）になるように設定することで、各ウェル内の核酸が増幅されてゆく。尚、このＬＡＭＰ法では、一本鎖から二本鎖への熱変性が必要なく、この等温条件下、プライマーのアニーリングと核酸伸長とが繰り返り行われる。
この核酸増幅反応の結果、ピロリン酸が生成され、このピロリン酸に金属イオンが結合して不溶性又は難溶性の塩が形成され、この塩が濁度物質となる（測定波長３００〜８００ｎｍ）。この濁度物質に入射光（光Ｌ２）が照射されることで、散乱光（光Ｌ２１）となる。蛍光フィルタ９，１１を透過して、この散乱光の散乱光量をリアルタイムに蛍光検出器１３で測定し、定量化する。また、透過光量からも定量化することは可能である。
尚、ＬＡＭＰ法については、蛍光物質を用いても核酸を定量することが可能であるので、この場合には、上述の（ａ）蛍光検出に従って、これを検出すればよい。
【００４１】
尚、第一の実施形態は、上述のＲＴ−ＰＣＲ装置やＬＡＭＰ装置等の他、種々の核酸増幅装置として使用可能である。
【００４２】
上述のように、前記第一の光源２及び前記第二の光源３からの各光は、前記導光部材４によって同一の光学系路上となる。より具体的には、第二の光源３からの光が、導光部材４の内部に入射された際には、当該第二の光源３からの光は、導光部材４によって前記第一の光源２の光学系路上に重複するように導光される。
【００４３】
前記第一の実施形態によれば、蛍光検出と濁度検出との各測定が、光源を切り替えることによって可能となる。また、最適な検出方法を選択することが可能となることから、より精度の高い定量分析やリアルタイム検出が可能となる。しかも、励起フィルタが不要であることから、ディバイスとしての小型化がより容易となる。
【００４４】
＜３．本発明に係わる核酸増幅反応装置の第二の実施形態＞
（１）第二の実施形態の構成
図１を参照して、第二の実施形態を説明する。上述した構成については省略する。尚、一つの光学系路について説明するが、これに限定されず、複数存在していても良い。
【００４５】
本発明に係わる核酸増幅反応装置１における第二の実施形態は、第一の光源２１と、励起フィルタ２４と、第二の光源２２と、導光部材２５と、第一の光源２１と第二の光源２２とを切り換えて発光させる制御部とを有する。尚、第二の実施形態は、蛍光フィルタ９，１１と、光学検出器１３とも有するが、上述した第一の実施形態のものと同様であるので省略する。
【００４６】
前記第一の光源２１及び前記第二の光源２２は、上述した前記第二の光源３と同様であればよく、例えばＬＥＤが好適である。
尚、前記第一の光源２１は、支持体２３にて支持されていてもよく、また、第一の実施形態のような前記導光部材４に光を入射させるように配置されていてもよい。前記導光部材４のような構成を採用することが、好適である。
【００４７】
前記励起フィルタ２４は、前記第一の光源２１と前記反応領域Ａ１との間に配設するのが好適である。また、当該励起フィルタ２４は、第一の光源２１から出力される光を所望の蛍光検出が可能な特定波長の励起光にするものが好適である。
これにより、様々な波長が混合されている通常の光源（例えばＬＥＤ等）を利用しても蛍光検出での悪影響を低減することができる（図３（ｂ）参照）。また、上述した第一の光源２がレーザー光源である場合には、蛍光物質によっては有効な発振波長のレーザーが入手できない場合がある。しかし、励起フィルタ方式であれば適宜所望の特定波長の励起光にできるので、幅広い対応が可能となることから、この点で有利である。
【００４８】
前記導光部材２５は、前記第一の光源２１及び前記第二の光源２２と、前記反応領域Ａ１との間の光学系路上に、前記第二の光源２２からの光を前記第一の光源２１の光学系路上に導光するものである。更に、前記導光部材２５は、前記励起フィルタ２４と反応領域Ａ１との間に配設するのが好適である。
当該導光部材２５には、光入射端部２５１が設けられており、この入射光端部２５１に沿って、前記第二の光源２２が配置されている。そして、当該光入射端部２５１から入射される第二の光源２２からの光及び第一の光源２１からの光を反応領域Ａ１の方向に向かわせるプリズムや反射板等の部材が設けられている。
このプリズム等の部材は、前記第二の光源２２からの光を反応領域Ａ１（例えば反応基板７の面）に略垂直に照射させるように、かつ前記第一の光源２１から照射される光を通過させ、反応領域Ａ１に照射させるように、配置されているのが好適である。尚、当該導入部材４からの光を集光レンズ（図示せず）や絞り６を介して前記反応領域Ａ１に照射させてもよい。
【００４９】
前記制御部は、所望の蛍光及び濁度を検出するのに応じて、第一の光源２１と第二の光源２２とを切り換えて発光させる。例えば、当該制御部は、蛍光を検出する際には、第一の光源２１から光を出射させる一方で、第二の光源２２からの光を出射させないようにする。一方、濁度を検出する際には、第二の光源２２からの光を出射させる一方で、第一の光源２１からの励起光を出射させないようにする。
【００５０】
（２）第二の実施形態の動作
本発明の第二の実施形態の光学系路を図２に示す。尚、上述した第一の実施形態と重複する部分については省略する。
【００５１】
（ａ）蛍光検出
反応領域Ａ１中の核酸増幅反応で蛍光検出を選択した場合を以下に説明する。このとき、制御部は、第二の光源２２からの光を出射させないように制御している。
第一の光源２１から、蛍光物質を励起する光Ｌ３が出射される。当該光Ｌ３は、集光レンズ５を通過し、更に励起フィルタ２４を透過して、光Ｌ３１（特定の励起光）になる。当該光Ｌ３１は、導光部材２５、絞り６次いで反応基板７上面を通過して、反応領域Ａ１の核酸増幅反応の進行に伴って生じている蛍光物質に照射される。この照射された光Ｌ３１により励起された蛍光物質から生じる光Ｌ３２（蛍光）は、蛍光フィルタ９を透過して光Ｌ３３となる。当該光Ｌ３３は、集光レンズ１０を通過し、更に蛍光フィルタ１１を透過して、所望の蛍光成分の光Ｌ３４（特定の蛍光成分）となる。当該光Ｌ３４（蛍光）は、集光レンズ１２を通過して光学検出器１３にて検出される。これにより、反応領域Ａ１からの所望の蛍光量を測定できる。
【００５２】
（ｂ）濁度検出
反応領域Ａ１中の核酸増幅反応で濁度検出を選択した場合を以下に説明する。このとき、制御部は、第一の光源２１からの光を出射させないように制御している。
前記第二の光源２２から、検出する濁度物質に照射される光Ｌ４が出射される。当該光Ｌ４は、光学入射端部２５１から導光部材２５に入射される。入射された光Ｌ４は、導光部材２５内部のプリズム等の部材によって、反応領域Ａ１に到達するように照射される。照射された光Ｌ４は、集光レンズ５、絞り６、次いで反応基板７上面を通過して、反応領域Ａ１の核酸増幅反応の進行に伴って生じる濁度物質に照射される。この照射された光Ｌ４は、濁度物質の表面で反射されるか或いは吸収され、光Ｌ４１（散乱光成分及び透過光成分）となる。この光成分Ｌ４１は、蛍光フィルタ９を透過して光Ｌ４２となる。当該光Ｌ４２は、集光レンズ１０を通過し、更に蛍光フィルタ１１を透過して、光Ｌ４３（散乱光成分或いは透過光成分）となる。所望の光成分となった光Ｌ４３は、集光レンズ１２を通過して光学検出器１３にて検出される。これにより、反応領域Ａ１での散乱光量や透過光量を測定できる。
【００５３】
尚、第二の実施形態は、上述の第一の実施形態と同様にＲＴ−ＰＣＲ装置やＬＡＭＰ装置等の種々の核酸増幅装置として使用可能である。
【００５４】
上述のように、前記第二の光源２１からの光は、導光部材２５によって前記第一の光源２２の光学系路上と重複するようになる。より具体的には、前記第二の光源２２からの光が、導光部材２５内部に入射された際には、当該第二の光源２２からの光は、当該導光部材２５を通過した第一の光源２１の光学系路上に重複するように導光される。
【００５５】
前記第二の実施形態によれば、蛍光検出と濁度検出との各測定が光源を切り替えることによって可能となる。また、最適な検出方法を選択することが可能となることから、より精度の高い定量分析やリアルタイム検出が可能となる。しかも、励起フィルタを採用することにより、幅広い蛍光物質を利用することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明に係わる核酸増幅反応装置によれば、蛍光及び濁度や呈色による検出が可能である。そのため、１つの装置で、目的に応じた核酸増幅反応に対応することが可能となる。
【符号の説明】
【００５７】
１  核酸増幅反応装置  ２，２１  第一の光源  ３，２２  第二の光源  ４，２５  導光部材  Ａ１反応領域  ９，１１  蛍光フィルタ  １３  光学検出器  ２４励起フィルタ
【図１】
2012034617.tif 000003
【図２】
2012034617.tif 000004
【図３】
2012034617.tif 000005