(57)【要約】【課題】標的物質の分離、分析等に際して粒子への標的物質の結合量が大きく、かつ、磁気分離速度も速い粒子を提供すること。【解決手段】標的物質が結合できる磁性粒子であって、磁性を帯びたコア粒子、および、そのコア粒子の表面に粗面コーティングされたポリマーシェル部を有して成るポリマーコート層を備えた磁性粒子。かかる磁性粒子では、ポリマーシェル部の有する表面粗さによって粒子表面が粗面化されており、磁性粒子の比表面積の値（ｍ２／ｇ）が、コア粒子を平滑な完全球体とみなした場合におけるコア粒子の比表面積の値（ｍ２／ｇ）の１．５倍〜５００倍となっている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質が結合できる磁性粒子であって、
磁性を帯びたコア粒子および該コア粒子の表面に粗面コーティングされたポリマーシェル部を有して成るポリマーコート層を有して成り、
前記磁性粒子が前記ポリマーシェル部の有する表面粗さによって粗面化されて成り、該磁性粒子の比表面積の値（ｍ２／ｇ）が、前記コア粒子を平滑な完全球体とみなした場合の該コア粒子の比表面積の値（ｍ２／ｇ）の１．５倍〜５００倍となっており、
前記標的物質を結合させることが可能な物質または官能基が、前記コア粒子および／または前記ポリマーコート層に固定化されていることを特徴とする、磁性粒子。
【請求項２】
前記ポリマーシェル部は、前記コア粒子との化学的結合に起因して該コア粒子の表面に設けられており、該ポリマーシェル部が該コア粒子の表面の少なくとも一部を連続的に被覆していることを特徴とする、請求項１に記載の磁性粒子。
【請求項３】
前記ポリマーシェル部は、芳香族ビニル骨格を含んで成ることを特徴とする、請求項１または２に記載の磁性粒子。
【請求項４】
前記芳香族ビニル骨格が、ジビニルベンゼン骨格および／またはジビニルベンゼン誘導体骨格であることを特徴とする、請求項３に記載の磁性粒子。
【請求項５】
前記ポリマーコート層が親水ポリマーコート部を更に有して成ることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項６】
前記ポリマーコート層では、前記ポリマーシェル部の外側に前記親水ポリマーコート部が形成されていることを特徴とする、請求項５に記載の磁性粒子。
【請求項７】
前記コア粒子が５ｎｍ〜３μｍの粒径を有していることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項８】
前記コア粒子の長短半径比が１．０〜１．３の範囲となった球形状を有していることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項９】
前記球形状の前記コア粒子につき、粒径分布を示すＣＶ値が１８％以下であることを特徴とする、請求項８に記載の磁性粒子。
【請求項１０】
前記磁性粒子の飽和磁化が２Ａ・ｍ2／ｋｇ〜１００Ａ・ｍ2／ｋｇであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項１１】
前記磁性粒子の保磁力が０．３ｋＡ／ｍ〜１５．９３ｋＡ／ｍであることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項１２】
前記標的物質を結合させることが可能な物質が、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、プロテインＡおよびプロテインＧから成る群から選択される少なくとも１種以上の物質であり、ならびに／または
前記標的物質を結合させることが可能な官能基が、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基、トシル基、スクシンイミド基、マレイミド基、チオール基、チオエーテル基、ジスルフィド基、アルデヒド基、アジド基、ヒドラジド基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、カルボキシル基のハロゲン置換体、および、二重結合から成る群から選択される少なくとも１種以上の官能基であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の磁性粒子。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の標的物質が結合できる磁性粒子を製造する方法であって、
前記磁性粒子のコア粒子となる前駆体粒子と、モノマーと、溶媒とを混ぜ合わせ、それによって、該モノマーから得られるポリマー成分を前記前駆体粒子に化学的に結合させる工程を含んでなり、
前記工程においては、前記化学的に結合した前記ポリマー成分から構成される前記磁性粒子のポリマーシェル部を前記コア粒子の表面の少なくとも一部に連続的に形成し、該ポリマーシェル部の有する表面粗さによって該磁性粒子を粗面化することを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記モノマーとして芳香族ビニルモノマーを用い、それによって、芳香族ビニル骨格を含んで成る前記ポリマーシェル部を形成することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項５に従属する請求項６〜１２のいずれかに記載の標的物質が結合できる磁性粒子を製造する方法であって、
（ｉ）前記磁性粒子のコア粒子となる前駆体粒子に対して粗面ポリマーコーティング処理を施し、該前駆体粒子の表面にポリマーシェル部を形成する工程、および
（ｉｉ）前記粗面ポリマーコーティング処理が施された前記前駆体粒子に対して親水ポリマーコーティング処理を施し、該前駆体粒子に親水ポリマーコート部を形成する工程
を含んで成り、
前記工程（ｉ）と前記工程（ｉｉ）との間で前記前駆体粒子を物理的分散処理に付すことを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記物理的分散処理に際しては、前記前駆体粒子に剪断力を与えることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記物理的分散処理に際しては、加圧下にて前記前駆体粒子をスリット部に通過させることを特徴とする、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程（ｉ）では、前記前駆体粒子と、モノマーと、溶媒とを混ぜ合わせ、それによって、該モノマーから得られるポリマー成分を前記前駆体粒子に化学的に結合させる処理を行い、
前記処理においては、前記化学的に結合した前記ポリマー成分から構成される前記ポリマーシェル部を前記コア粒子の表面の少なくとも一部に連続的に形成し、該ポリマーシェル部の有する表面粗さによって前記磁性粒子を粗面化することを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質の分離、固定化、分析、抽出、精製、反応などに適した機能性粒子に関する。特に、本発明は、粗面ポリマーコーティングが施された磁性を帯びた機能性粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞、蛋白質、核酸または化学物質等の標的物質の定量、分離、精製および分析等の生化学用途に利用される機能材として、特定の標的物質と特異的に結合または反応する複合粒子が従来より知られている（特許文献１および２参照）。かかる複合粒子は、磁性を帯びており、例えば非磁性のビーズ中に磁性体材料を含ませることによって形成される。標的物質の分離に際しては、まず、標的物質が含まれる試料中に複合粒子を供し、複合粒子の表面に標的物質を結合させる。次いで、磁場の印加により複合粒子を移動させて集合・凝集させ、その後、集合・凝集した複合粒子を回収することによって、複合粒子に結合した標的物質を回収している。このような磁場または磁気を用いた手法（以下では「磁気分離法」または単に「磁気分離」とも呼ぶ）は、遠心分離法、カラム分離法または電気泳動法などの手法に比べて、少量の試料に対しても実施でき、また、標的物質を変性させずに短時間で実施できる特徴を有している。
【０００３】
特に標的物質の分析を目的とする粒子について言えば、ラテックス凝集免疫比濁法に用いられるポリマー粒子が存在している。
【０００４】
そのような生化学用途に用いられる磁性粒子（特許文献１）は、通常、ナノメートルからマイクロメートルの範囲の粒子径を持ち、粒子構造が多孔質ポリマー粒子内に数ｎｍ〜数十ｎｍの超常磁性粒子を析出させた構造となっている。多孔質ポリマーを用いているため、粒子の比表面積が大きく標的物質の結合量は大きいものの、ポリマー中に含まれる磁性体の割合が小さいので磁気分離の速度が遅くなる場合があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表昭５９−５００６９１号公報
【特許文献２】特表平０４−５０１９５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みて為されたものである。つまり、本発明の課題の１つは、標的物質の分離、分析等に際して粒子への標的物質の結合量が大きく、かつ、磁気分離速度も速い粒子を提供することである。本発明の別の課題は、特に、水中での分散性が高く、かつ、粒径がサブミクロンと小さいながら、磁気分離速度も速い粒子を提供することである。更に別の本発明の課題は、水系媒体中にて粒径分布の均一性が高く、それぞれの粒子において標的物質の反応性がより均質化した磁性粒子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明では、標的物質が結合できる磁性粒子であって、
磁性を帯びたコア粒子、および、そのコア粒子の表面に粗面コーティングされたポリマーシェル部（即ち、粗面ポリマーコート部）を有して成るポリマーコート層を有して成り、
磁性粒子がポリマーシェル部の有する表面粗さによって粗面化されて成り、磁性粒子の比表面積の値（ｍ２／ｇ）が、コア粒子を平滑な完全球体とみなした場合におけるコア粒子の比表面積の値（ｍ２／ｇ）の１．５倍〜５００倍となっており、
「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」がコア粒子および／またはポリマーコート層に固定化されていることを特徴とする磁性粒子が提供される。
【０００８】
本発明の粒子は、磁性粒子であって、ポリマー粗面化により構成されていることを特徴としている。特に、本発明の磁性粒子は、コア部分が磁性を帯びた粒子を成し、その表面がポリマーの粗面コーティングによって凹凸状を成したコアシェル構造を有することを特徴としている。
【０００９】
本発明のある好ましい態様では、ポリマーシェル部は、コア粒子との化学的結合に起因してコア粒子表面に設けられており、それゆえ、ポリマーシェル部がコア粒子の表面の少なくとも一部を連続的に被覆している。即ち、連続的な形態を有するポリマーシェル部がコア粒子表面の全部または一部に設けられている。本明細書において「連続的」とは、コア粒子表面の一部または全部に設けられたポリマーシェル部が途中で部分的に途切れることなく形成されている態様、即ち、ポリマーシェル部のボディーが空隙部（特にコア粒子表面を露出させる空隙部）を有することなく形成されている態様を実質的に意味している。
【００１０】
別の本発明のある好ましい態様では、ポリマーシェル部はコア粒子の表面を露出させないようにコア粒子を全体的に包囲している。つまり、凹凸状のポリマーシェル部がコア粒子の表面を露出させない厚みでコア粒子を全体的に包囲している。
【００１１】
本明細書において「粗面化」とは、コア粒子表面にコーティングされた被着ポリマーの有する面粗さによって粒子全体の表面積が増加している態様を実質的に意味している。それゆえ、本明細書において「粗面コーティング」とは、形成されるポリマー部の有する面粗さによって対象粒子の表面積が増加するようにポリマーをコーティングするといった態様を実質的に意味している。
【００１２】
本発明の磁性粒子は、“被着ポリマーの面粗さによる粗面化”に起因して、磁性粒子の比表面積の値（ｍ２／ｇ）が、コア粒子を平滑な完全球体とみなした場合におけるコア粒子の比表面積の値（ｍ２／ｇ）の１．５倍〜５００倍となっている。ここで、“平滑な完全球体”とは、幾何学的な形状が真球となった球体のことを実質的に意味している。「真球」とは、中心を通る球直径が実質的に全て同一となっている球のことである。従って、『磁性粒子の比表面積の値（ｍ２／ｇ）が、コア粒子を“平滑な完全球体”とみなした場合におけるコア粒子の比表面積の値（ｍ２／ｇ）の１．５倍〜５００倍』とは、本発明の磁性粒子の比表面積の値（ｍ２／ｇ）が、コア粒子と同一の粒径および密度を有する真球粒子の表面の比表面積の１．５倍〜５００倍となっていることを実質的に意味している。例えば、「コア粒子を“平滑な完全球体”とみなした場合におけるコア粒子の比表面積」は、コア粒子の電子顕微鏡写真または光学顕微鏡写真に基づいて、ピクセル個数等から求めた該コア粒子の面積と等しい面積を有する真円の直径から算出してよい。但し、比表面積は多数個の粒子の平均値として通常求められるため、上記のような写真に基づいて例えば３００個の粒子の粒径を測定し、その数平均として算出した平均粒径を用いるのが適している場合が多い。以上のような写真からの（平均）粒径の測定には、画像処理ソフトウェア（例えば「Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Inc.製)」）等を用いることができる。以上に鑑みて纏めると、本明細書における「コア粒子を“平滑な完全球体”とみなした場合におけるコア粒子の比表面積の値（ｍ２／ｇ）」とは、コア粒子写真の面積と同一面積の真円の直径の平均値Ｌに相当する直径Ｄを有する真球（かかる真球の密度はコア粒子の密度と同一）の比表面積の値（ｍ２／ｇ）を実質的に意味している。
【００１３】
本発明の磁性粒子は、その表面に「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」が固定化されている。換言すれば、「標的物質と結合する物質または官能基」がポリマーコート層および／またはコア粒子に固定化されている。従って、標的物質と本発明の磁性粒子とを共存させると、標的物質が磁性粒子に結合することができるので、標的物質の分離、精製または抽出などの種々の用途に対して本発明の磁性粒子を用いることができるだけでなく、更にはテーラーメード医療技術の用途に対しても本発明の磁性粒子を好適に用いることができる。ここで、「標的物質」とは、分離のみならず、抽出、定量、精製または分析などの種々の対象になり得る物質を実質的に意味しており、粒子に直接的または間接的に結合できるものであれば、いずれの種類の物質であってもかまわない。具体的な標的物質として例えば、核酸、蛋白質（例えばアビジンおよびビオチン化ＨＲＰなども含む）、糖、脂質、ペプチド、細胞、真菌、細菌、酵母、ウィルス、糖脂質、糖蛋白質、錯体、無機物、ベクター、低分子化合物、高分子化合物、抗体または抗原等を挙げることができる。本発明の粒子は、このように種々の標的物質の分離、精製、抽出もしくは分析などに用いることができる点で、種々の機能を奏するものといえる。従って、本発明の粒子は「機能性粒子」と呼ぶこともできる。
【００１４】
ある好適な態様では、ポリマーシェル部が芳香族ビニル骨格を含んで成る。特にかかる芳香族ビニル骨格は、ジビニルベンゼン骨格および／またはジビニルベンゼン誘導体骨格であることが好ましい。更なる好適な態様では、ポリマーシェル部は、その分子にジビニルベンゼン骨格、ジビニルベンゼン誘導体骨格、カルボキシル基、ポリエチレングリコール基、スチレン、スチレン誘導体骨格、スルホン酸基、硫酸エステル基、コリンのリン酸エステル基、および、アミノ基を含む骨格ならびに官能基から成る群から選択される少なくとも１種以上の骨格または官能基を有している。
【００１５】
ある好適な態様では、コア粒子が５ｎｍ〜３μｍの粒径を有している。つまり、本発明の磁性粒子のコアとなる磁性部分が５ｎｍ〜３μｍの粒径を有し得る。
【００１６】
別のある好適な態様では、ポリマーコート層が、ポリマーシェル部に加えて、親水ポリマーコート部（親水ポリマー部）を更に有して成る。かかる場合、ポリマーコート層では、例えば、粗面ポリマーシェル部の外側に親水ポリマーコート部（親水ポリマー部）が設けられている。
【００１７】
更に別のある好適な態様では、コア粒子が球形状を有している。特に、コア粒子の長短半径比が１．０〜１．３の範囲となった球形状を有している。球形状のコア粒子の場合、そのコア粒子の粒径分布を示すＣＶ値は好ましくは１８％以下となっている。ここでＣＶ値とは、変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）のことを指している。より具体的には、本明細書における「ＣＶ値」は、粒子サイズ測定（特にコア粒子のサイズ測定）により得られた全データを統計処理して算出される係数であって、以下の式１により定義される。
［式１］
2012178539.tif 000002
【００１８】
好ましくは、本発明の磁性粒子の飽和磁化は２Ａ・ｍ2／ｋｇ〜１００Ａ・ｍ2／ｋｇとなっている。例えば、飽和磁化が２０Ａ・ｍ2／ｋｇ〜１００Ａ・ｍ2／ｋｇとなっている。また、好ましくは、本発明の磁性粒子の保磁力は０．３ｋＡ／ｍ〜１５．９３ｋＡ／ｍ（３．８〜２００エルステッド）となっている。例えば保磁力が０．７９ｋＡ／ｍ〜１５．９３ｋＡ／ｍ（１０〜２００エルステッド）となっていたり、あるいは特に球形コア粒子から成る場合では、磁性粒子の保磁力が０．３ｋＡ／ｍ〜６．５ｋＡ／ｍ（３．８〜８１．７エルステッド）となっていたり、更には０．３９９ｋＡ／ｍ〜６．３８ｋＡ／ｍ（５〜８０エルステッド）となっていたりする。
【００１９】
本発明の磁性粒子では、「標的物質を結合させることが可能な物質」が、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、プロテインＡおよびプロテインＧから成る群から選択される少なくとも１種以上の物質であってよい。同様に、「標的物質を結合させることが可能な官能基」は、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基、トシル基、スクシンイミド基、マレイミド基、チオール基、チオエーテル基、ジスルフィド基、アルデヒド基、アジド基、ヒドラジド基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、カルボキシル基のハロゲン置換体、および、二重結合から成る群から選択される少なくとも１種以上の官能基であってよい。
【００２０】
本発明においては、「ポリマーコート層がポリマーシェル部を有して成る磁性粒子」の製造方法も提供される。かかる製造方法は、標的物質が結合できる磁性粒子を製造する方法であって、
磁性粒子のコア粒子となる前駆体粒子と、モノマーと、溶媒とを混ぜ合わせ、それによって、そのモノマーから得られるポリマー成分を前駆体粒子に化学的に結合させる工程を含んでなり得る。かかる工程においては、化学的に結合したポリマー成分から構成される“磁性粒子のポリマーシェル部”をコア粒子の表面の少なくとも一部に連続的に形成し、そのポリマーシェル部の有する表面粗さによって磁性粒子を粗面化する。
【００２１】
本明細書において「化学的結合（または“化学的に結合”）」とは、いわゆる一般的な技術的意味の“化学結合”のことを意味しており、例えば「化学大事典２」（共立出版株式会社、化学大事典編委員会、第２９９頁）に記載されているような化学結合のことである。特に本発明でいう「化学的結合」は“物理的吸着”や“磁気的吸着”に相反する態様を指すものとして使用している。
【００２２】
ある好適な態様では、モノマーとして芳香族ビニルモノマーを用い、それによって、芳香族ビニル骨格（例えばジビニルベンゼン骨格および／またはジビニルベンゼン誘導体骨格）を含んで成るポリマーシェル部をコア粒子の表面に形成する。
【００２３】
また、本発明においては、特に「ポリマーコート層がポリマーシェル部および親水ポリマーコート部を有して成る磁性粒子」についての製造方法も提供される。かかる製造方法は、
標的物質が結合できる磁性粒子を製造する方法であって、
（ｉ）磁性粒子のコア粒子となる前駆体粒子に対して粗面ポリマーコーティング処理を施し、前駆体の表面にポリマーシェル部を形成する工程（即ち、前駆体粒子を粗面化させる工程）、および
（ｉｉ）粗面ポリマーコーティング処理が施された前駆体粒子（即ち、粗面化された前駆体粒子）に対して親水ポリマーコーティング処理を施し、その前駆体粒子に親水ポリマーコート部を形成する工程
を含んで成り、
「工程（ｉ）の粗面ポリマーコーティング処理」と「工程（ｉｉ）の親水ポリマーコーティング処理」との間で前駆体粒子を物理的分散処理に付すことを特徴としている。
【００２４】
本明細書において「物理的分散処理」とは、前駆体粒子に対して外力を加える操作のことを意味しており、特に、凝集状態にある前駆体粒子に対して外力を与えてその凝集状態を減じる操作のことを実質的に意味している。ここで「物理的分散処理」にいう「物理的・・処理」という用語は、“粗面ポリマーコーティング処理”や“親水ポリマーコーティング処理”などの「化学的処理」に相反する態様を指すものとして使用している。
【００２５】
ある好適な態様では、物理的分散処理に際して前駆体粒子に剪断力を作用させる。特に、媒体中で凝集状態にある前駆体粒子に対して外力を加えて、それによって前駆体粒子に剪断作用を及ぼし、その凝集状態を減じる。例えば、前駆体粒子（特に複数の前駆体粒子を含有した液体物）がスリット部を通過するように、加圧下において前駆体粒子を当該スリット部へと供することによって、前駆体粒子の凝集状態を減じてよい。
【００２６】
かかる本発明の製造方法における工程（ｉ）は、上述した態様で実施してもよい。つまり、粗面ポリマーコーティングに際して、前駆体粒子と、モノマーと、溶媒とを混ぜ合わせ、それによって、原料モノマー由来のポリマー成分を前駆体粒子に化学的に結合させる処理を行う。そして、特にその処理においては、“化学的に結合したポリマー成分”から構成されるポリマーシェル部をコア粒子の表面の少なくとも一部に連続的に形成し、ポリマーシェル部の有する表面粗さによって磁性粒子を粗面化する。
【００２７】
本発明の製造方法は、「標的物質と結合することが可能な物質または官能基」を粒子に固定化する処理を更に含んで成る。つまり、「標的物質と結合することが可能な物質または官能基」をポリマーコート層および／またはコア粒子に固定化する処理を含んでいる。
【００２８】
尚、球形のコア磁性粒子についていえば、以下の工程（Ｉ）および（ＩＩ）を含んで成る方法によって調製することができる：
（Ｉ）鉄イオンを含んで成る溶液とアルカリ溶液とを混合し、得られる混合溶液中で「鉄元素を含んで成る水酸化物」を析出させる工程、および
（ＩＩ）混合溶液を加熱処理に付し、水酸化物から磁性粒子を形成する工程。
【００２９】
コア磁性粒子の調製のある好適な態様では、工程（ＩＩ）において、水とグリセリンとを含んで成る混合溶液中で水酸化物をソルボサーマル反応に付す。また、別のある好適な態様では、工程（ＩＩ）において、加熱処理に際して、混合溶液にマイクロ波を照射する。即ち、加熱源としてマイクロ波を用いる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の磁性粒子は、磁性を帯びたコア粒子の表面にポリマーシェル部が設けられており、かかるポリマーシェル部自体が有する面粗さによって磁性粒子の表面積が増加している（以下では「ポリマーシェル部」のことを「粗面ポリマーシェル部」とも称する）。これは、本発明の磁性粒子は、コア粒子自体の凹凸により粗面化されているのではなく、そのコア粒子の表面に設けられたポリマーシェル部が有する凹凸によって粗面化されていることを意味している。特に、本発明の磁性粒子では、ポリマーシェル部がコア粒子の表面の全部または一部を連続的に被覆しており、そのポリマーシェル部の外表領域が凹凸を成している。従って、ポリマーコート層に凹凸がない滑面ポリマーコートの粒子と比べて、１粒子あたりの比表面積が大きくなっている。その結果、本発明の磁性粒子は、その表面に「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」をより多く固定化させることができ、１粒子あたりに結合できる標的物質の量を多くすることができる。１粒子あたりに結合できる標的物質の量が多くなると、標的物質の分離回収の効率が高くなると共に、標的物質を検出する際の粒子体積あたりの検出感度が高くなる。
【００３１】
また、本発明の磁性粒子は、粒子の大部分を占めるコア部分が磁性を帯びている。つまり、「従来の多孔質ポリマー粒子内に数ｎｍ〜数十ｎｍの超常磁性粒子を析出させた構造を持つ磁性粒子」と比べた場合、本発明では、粒子表面の粗面ポリマーシェル部に起因して粒子の全体積に占める磁性材料の割合が大きくなっている。つまり、磁化を持たないポリマー部分による磁化低下が低減されており、粒子全体として磁化量が比較的大きくなっている。従って、本発明の磁性粒子を用いると、磁気分離速度を速くすることができ、短時間で標的物質の結合、分離や精製、定量などを実施できる。特に本発明においては、粒子表面の粗面ポリマーシェル部の厚さを調整することによって粒子全体積を占める磁性材料の割合を適宜調整することができる（例えば、粗面ポリマーシェル部の厚さを薄くすることによって粒子全体積を占める磁性材料の割合を大きくすることができる）といった点でも有利な効果が奏され得る。
【００３２】
ポリマーコート層が親水ポリマーコート部を付加的に有して成る場合、本発明の磁性粒子は、その磁気特性・粒子サイズがメディカルサイエンスやバイオサイエンスの分野での磁性粒子として用いるのに好適であるだけでなく、界面活性剤を用いなくても緩衝液や超純水等の水系媒体中で優れた分散性および分散安定性を呈するものとなっている。かかる優れた分散性および分散安定性は、磁性粒子製造に際して、粗面ポリマーコーティング処理後に再分散処理して親水ポリマーコーティング処理を行うことに起因している。このように分散安定性が高いと、その用途において、磁性粒子と標的物質との反応速度の向上や磁性粒子が沈降しにくいため、標的物質との安定的な反応時間の確保という効果が奏され得る。
【００３３】
更に、球形状のコア粒子から構成される本発明の磁性粒子では、構造磁気異方性が低下し、保磁力が低下し得る。従って、このような本発明の磁性粒子は、磁気捕集後の再分散性が優れ、同一用途または別の用途において再度使用することが可能となり、その再使用において生体物質への結合能が大きく低下しない、といった効果が奏され得る。特に狭い粒径分布を有する球形コア粒子から成る場合では、バルク粒子中のそれぞれの粒子の分散性および沈降性などが均一となり、その結果、バルク粒子中のいずれの部分の粒子を用いても、それぞれの粒子が標的物質に対して同等の反応性ないしは結合性を有し得る。
【００３４】
以上のように、本発明の磁性粒子は、その粒子の使用態様のみならず、その調製などにおいても好適な機能性粒子となっている。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、実施例１における「被着ポリマー粗面化された磁性粒子Ｐ１」の電顕写真である。
【図２】図２は、実施例１および比較例１におけるコア粒子ｒ１の電顕写真である。
【図３】図３は、比較例１における「ポリマー被着化された磁性粒子Ｒ１」の電顕写真である。
【図４】図４は、磁気捕集性の評価試験の測定結果である。
【図５】図５は、粒子Ｐ１’の粒子表面のＳＥＭ画像である。
【図６】図６は、粒子Ｐ２’の粒子表面のＳＥＭ画像である。
【図７】図７は、粒子ｒ１’の粒子表面のＳＥＭ画像である。
【図８】図８は、粒子ｒ２’の粒子表面のＳＥＭ画像である。
【図９】図９は、粒子Ｒ２’の粒子表面のＳＥＭ画像である。
【図１０】本発明に係る磁性粒子のＴＥＭ写真である。
【図１１】図１１は、磁気捕集性の評価試験の測定結果である。
【図１２】図１２は、分散安定性の評価試験の結果を表す写真図である（左：磁性粒子Ｐ２’、右：磁性粒子Ｐ１’）。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下にて、本発明の磁性粒子を詳細に説明する。
【００３７】
（本発明の磁性粒子の構成）
本発明の磁性粒子は、「磁性を帯びたコア粒子」および「コア粒子の表面に粗面コーティングされたポリマーシェル部を有して成るポリマーコート層」を有して成る。換言すれば、本発明の粒子は、コア部分が磁性の微粒子を成し、その微粒子表面がポリマーで粗面コーティングされて成る凹凸状のコアシェル構造を有している（特に好ましくは、微粒子表面を全体的にポリマーが覆っており、そのように覆っているポリマー層の表面が連続的な房状の凹凸面を成している）。
【００３８】
粗面コーティングに起因して、本発明の磁性粒子の比表面積は大きなものとなっている。つまり、コア粒子の表面に設けられたポリマーシェル部の有する凹凸によって粗面化が実現されているので、本発明の磁性粒子の比表面積は大きなものとなっている。具体的には、磁性粒子の比表面積の測定値（ｍ２／ｇ）が、そのコア粒子部分を“平滑な完全球体”とみなした場合の該完全球体の比表面積の計算値（ｍ２／ｇ）の１．５倍〜５００倍となっている。つまり、ポリマーコーティング後の磁性粒子の比表面積の測定値（ｍ２／ｇ）が、ポリマーコーティング前のコア部分の粒子の平均直径の測定値をもとにコア部分の粒子が平滑な完全球体として算出した比表面積の計算値（ｍ２／ｇ）の１．５倍〜５００倍の値となっている。
【００３９】
即ち、本発明の磁性粒子は、ポリマーコート層（特にポリマーシェル部）によって粗面化されており、粒子の比表面積が、コア粒子と同一の粒径および密度を有する真球粒子の平滑表面の比表面積の１．５倍〜５００倍となっている。これは、粒径ａのコア粒子部分を有する本発明の粒子の各々の比表面積が、粒径ａを有する真球粒子（コア粒子と同一の密度を有する真球粒子）の比表面積の１．５倍〜５００倍となっていることを意味しているか、あるいは、平均粒径ａのコア粒子部分を有する複数の本発明の磁性粒子（即ち、複数個の粒子から成る粉末状の粒子群）の比表面積の平均値が、粒径ａを有する真球粒子（コア粒子と同一の密度を有する真球粒子）の比表面積の１．５倍〜５００倍となっていることを意味している。
【００４０】
つまり、本発明の粒子の比表面積の値をＳＰ粒子（ｍ２／ｇ）とし、コア粒子と同一の粒径および密度を有する真球粒子の比表面積の値をＳＰコア真球（ｍ２／ｇ）とすると、ＳＰ粒子＝１．５×ＳＰコア真球〜５００×ＳＰコア真球となっている。ここで、ＳＰ粒子＜１．５×ＳＰコア真球となると、１粒子あたりに結合できる標的物質の量が減少し、標的物質の全体的な検出量が減少してしまう一方、ＳＰ粒子＞５００×ＳＰコア真球となると、標的物質以外の物質が粒子本体に結合する「非特異結合」が必要以上に増加し得るので実用上好ましくない。尚、ＳＰ粒子の下限値は、好ましくは１．６×ＳＰコア真球、より好ましくは１．７×ＳＰコア真球、更に好ましくは１．８×ＳＰコア真球である。一方、ＳＰ粒子の上限値は、好ましくは１００×ＳＰコア真球、より好ましくは２０×ＳＰコア真球、更に好ましくは１０×ＳＰコア真球である。尚、粗面コーティングの処理条件および／またはポリマーシェル部やコア粒子の材質などの諸条件によっては、ＳＰ粒子の下限値が「１．５×ＳＰコア真球」未満となったり、ＳＰ粒子の上限値が「５００×ＳＰコア真球」よりも大きくなったりする場合もあり得る。
【００４１】
ここで、ポリマーコート層が、ポリマーシェル部に加えて、親水ポリマーコート部を有する場合があるが、これについて説明しておく。親水ポリマーコート部を有する場合、本発明の磁性粒子は、「磁性を帯びたコア粒子」および「コア粒子の表面に粗面コーティング処理して得られる第１層目の粗面ポリマーシェル部」および「粗面ポリマーシェル部を備えたコア粒子に親水コーティング処理して得られる第２層目の親水ポリマーコート部」を有して成る。特に、第１層目の粗面ポリマーシェル部は、磁性粒子において厚みを持ったシェル部を構成しており、かかるポリマーシェル部によって表面粗面化が実現されている。換言すれば、本発明の粒子は、コア部分が磁性の微粒子本体を成し、その微粒子本体の表面がポリマーで粗面コーティングされて成る凹凸状のコアシェル構造を有しており、第２層目を成す親水ポリマーコート層が設けられているといえども第１層目の粗面ポリマーシェル部に起因する凹凸の粗面化構造を保っている。
【００４２】
親水ポリマーコート部が設けられている場合であっても、本発明の磁性粒子の比表面積は大きなものとなっている。つまり、第１層目の粗面ポリマーシェル部に起因して、第２層目に親水ポリマーコート部を備えた本発明の磁性粒子の比表面積は大きなものとなっている。具体的には、磁性粒子の比表面積の測定値（ｍ２／ｇ）が、そのコア粒子部分を“平滑な完全球体”とみなした場合の該完全球体の比表面積の計算値（ｍ２／ｇ）の１．５倍〜５００倍となっている。つまり、親水ポリマーコーティング後の磁性粒子の比表面積の測定値（ｍ２／ｇ）が、粗面ポリマーコーティング前のコア部分の粒子の平均直径の測定値をもとにコア部分の粒子が平滑な完全球体として算出した比表面積の計算値（ｍ２／ｇ）の１．５倍〜５００倍の値となっている。
【００４３】
即ち、本発明の磁性粒子は、第１層目の粗面ポリマーコート層によって粗面化されており、第２層目として親水ポリマーコート層を備えている場合であっても、粒子の比表面積が、コア粒子と同一の粒径および密度を有する真球粒子の平滑表面の比表面積の１．５倍〜５００倍となっている。これは、粒径ａのコア粒子部分を有する本発明の粒子の各々の比表面積が、粒径ａを有する真球粒子（コア粒子と同一の密度を有する真球粒子）の比表面積の１．５倍〜５００倍となっていることを意味しているか、あるいは、平均粒径ａのコア粒子部分を有する複数の本発明の磁性粒子（即ち、複数個の粒子から成る粉末状の粒子群）の比表面積の平均値が、粒径ａを有する真球粒子（コア粒子と同一の密度を有する真球粒子）の比表面積の１．５倍〜５００倍となっていることを意味している。つまり、コア粒子上に粗面ポリマーシェル部および親水ポリマーコート部を備えた本発明の磁性粒子の比表面積の値をＳＰ粒子（ｍ２／ｇ）とし、コア粒子と同一の粒径および密度を有する真球粒子の比表面積の値をＳＰコア真球（ｍ２／ｇ）とすると、ＳＰ粒子＝１．５×ＳＰコア真球〜５００×ＳＰコア真球となっている。ここで、上述したように、ＳＰ粒子＜１．５×ＳＰコア真球となると、１粒子あたりに結合できる標的物質の量が減少し、標的物質の全体的な検出量が減少してしまう一方、ＳＰ粒子＞５００×ＳＰコア真球となると、標的物質以外の物質が粒子本体に結合する「非特異結合」が必要以上に増加し得るので実用上好ましくない。尚、ＳＰ粒子の下限値は、好ましくは１．６×ＳＰコア真球、より好ましくは１．７×ＳＰコア真球、更に好ましくは１．８×ＳＰコア真球である。一方、ＳＰ粒子の上限値は、好ましくは１００×ＳＰコア真球、より好ましくは２０×ＳＰコア真球、更に好ましくは１０×ＳＰコア真球である。尚、粗面ポリマーコーティングの処理条件、親水ポリマーコーティングの処理条件、および／またはそれらポリマーコート層やコア粒子の材質などの諸条件によっては、ＳＰ粒子の下限値が「１．５×ＳＰコア真球」未満となったり、ＳＰ粒子の上限値が「５００×ＳＰコア真球」よりも大きくなったりする場合もあり得る。
【００４４】
ここで、本発明の「磁性粒子の比表面積の測定値」（即ち、粗面ポリマーシェル部のみを備えた磁性粒子または付加的に親水ポリマーコート部を備えた磁性粒子の比表面積の測定値）とは、比表面積細孔分布測定装置ＢＥＬＳＯＲＰ−Ｍｉｎｉ（日本ベル社製）を用いて測定された値（特にＢＥＴ法により測定された値）のことを指している。より厳密にいえば、「磁性粒子の比表面積の測定値」は、「標的物質を結合させることが可能な物質」または「標的物質を結合させることが可能な官能基」を固定化処理する前の状態の被着ポリマー粗面化された磁性粒子を上記ＢＥＬＳＯＲＰ−Ｍｉｎｉを用いて測定された値であるものの、便宜的に、上記固定化処理後の磁性粒子を上記ＢＥＬＳＯＲＰ−Ｍｉｎｉを用いて測定した値であってもかまわない。
【００４５】
本発明の磁性粒子（粗面ポリマーシェル部のみを備えた磁性粒子または付加的に親水ポリマーコート部を備えた磁性粒子）は、バイオテクノロジー分野またはライフサイエンス分野の磁気分離用粒子または磁気プローブとして好適な磁気特性を有している。具体的には、ポリマーコート層を含む本発明の磁性粒子の飽和磁化は好ましくは２Ａ・ｍ2／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）〜１００Ａ・ｍ2／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）であり、より好ましくは２０Ａ・ｍ2／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）〜１００Ａ・ｍ2／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）であり、更に好ましくは４０Ａ・ｍ２／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）〜９０Ａ・ｍ２／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）となっている（球形状コア粒子から構成された磁性粒子についてのみいえば、飽和磁化は好ましくは４Ａ・ｍ2／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）〜９０Ａ・ｍ2／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）程度となっている）。磁性粒子の飽和磁化が上記の下限値を下回ると、粒子の磁界に対する感応性が低くなり、磁気応答性が低下してしまう傾向にある。その一方で、磁性粒子の飽和磁化が上記の上限値を上回ると、粒子が磁気的に必要以上に凝集して、その分散性が低下し得る。尚、本明細書における飽和磁化の数値は、例えば振動試料型磁力計（東英工業（株）製）を用いて、７９６．５ｋＡ／ｍ（１０キロエルステッド）の磁界を印加したときの磁化量を測定することにより得られる数値である。
【００４６】
一方、ポリマーコート層を含む本発明の磁性粒子（粗面ポリマーシェル部のみを備えた磁性粒子または付加的に親水ポリマーコート部を備えた磁性粒子）の保磁力は、好ましくは０．３ｋＡ／ｍ〜１５．９３ｋＡ／ｍ（３．８〜２００エルステッド）であり、より好ましくは０．７９ｋＡ／ｍ〜１５．９３ｋＡ／ｍ（１０〜２００エルステッド）であり、更に好ましくは１．５９ｋＡ／ｍ〜１１．９４ｋＡ／ｍ（２０〜１５０エルステッド）である。尚、球形状コア粒子から構成された磁性粒子についてのみいえば、保磁力は、好ましくは０．３９９ｋＡ／ｍ〜６．３８ｋＡ／ｍ（５〜８０エルステッド）であり、より好ましくは０．３９９ｋＡ／ｍ〜４．７９ｋＡ／ｍ（５〜６０エルステッド）である。磁性粒子は、捕集するときに印加された磁界・磁場によってある程度磁化され得るが、保磁力が上記の上限値を上回ると粒子間の凝集力が必要以上に大きくなり、その分散性が低下し得る。その一方で、上記の下限値を下回る保磁力を得る場合では、使用するコア粒子の種類や、さらにはコア粒子の合成方法までもが制約を受けることになってしまう。尚、本明細書における保磁力の数値は、例えば振動試料型磁力計（東英工業（株）製）を用いて、７９６．５ｋＡ／ｍ（１０キロエルステッド）の磁界を印加して飽和磁化させた後、磁界をゼロに戻し、さらに逆方向に磁界を徐々に増加させながら印加して、磁化の値がゼロになる印加磁界の強さから得られる数値である。
【００４７】
上記のような磁気特性が供される限り、本発明の磁性粒子における“コア粒子”はいずれの粒子であってもよい。例えば、コア粒子は、超常磁性粒子でなく強磁性粒子となっていることが好ましく、例えば強磁性酸化物粒子となっている。ここでいう「強磁性」とは、磁場に応答して実質的に永久磁化され得るものを意味している。また、「強磁性酸化物粒子」は、金属酸化物粒子であって、磁気応答性（磁界に対する感応性）を有する粒状物を指している（「磁気応答性を有する」とは、磁石等による外部磁界・外部磁場が存在するとき、磁界・磁場により磁化する、あるいは磁石に吸着するなど、磁界・磁場に対して感応性を示すことを意味している）。具体的な強磁性酸化物としては、特に制限はなく、鉄、コバルト、ニッケルなどの公知の金属、ならびにそれらの合金および酸化物が挙げられる。特に磁界・磁場に対する感応性に優れることから、強磁性酸化物粒子は強磁性酸化鉄であることが好ましい。かかる粒子の強磁性酸化鉄としては、公知の種々の強磁性酸化鉄を使用することができる。特に、化学的安定性に優れることから、強磁性酸化鉄は、マグヘマイト（γ−Ｆ ｅ２Ｏ３）、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、ニッケル亜鉛フェライト（Ｎｉ1−ＸＺｎＸＦｅ２Ｏ４）およびマンガン亜鉛フェライト（Ｍｎ1−ｘＺｎＸＦｅ２Ｏ４）から成る群から選択される少なくとも１種のフェライトであることが好ましい。これらの中でも大きな磁化量を有しており、磁界・磁場に対する感応性に優れるマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）が特に好ましい。尚、用途や表面処理によっては、鉄やニッケル等の磁性金属または合金も使用することが可能である。
【００４８】
ちなみに、バイオなどの技術分野でよく用いられる磁性粒子は超常磁性を持つものが極めて多い。“超常磁性”が多い理由は、超常磁性粒子では残留磁化、保磁力が極めて小さいため、特段の処理をしなくても、磁気捕集後の再分散に影響を及ぼさないからである。一方、保磁力のある強磁性を持つ粒子を用いると、特段の処理を施さなければ、磁気凝集の問題が発生し、使いにくいものとなる。一般にマグネタイトなどの酸化鉄が超常磁性を示す一次粒径は２０ｎｍよりも小さいとされ、それ以上の粒径では、強磁性を示すことになる。
【００４９】
本発明の磁性粒子におけるコア粒子の粒径（または平均粒径）は、好ましくは約５ｎｍ〜約３μｍ、より好ましくは約５ｎｍ〜約１μｍ、更に好ましくは約２０ｎｍ〜約５００ｎｍ、例えば約２０ｎｍ〜約４００ｎｍ程度となっている。コア粒子の粒径が上記の下限値を下回ると所望の磁気特性を保持できなくなってしまう一方、粒径が上記の上限値を上回ると、水や緩衝溶液に分散させた際に高い分散安定性を確保できなくなってしまう。尚、本明細書にいう「粒径」とは、粒子画像の重心を通る径の測定値の平均（例えば最小値と最大値との平均）を実質的に意味している。そして、本明細書でいう「平均粒径」とは、粒子の透過型電子顕微鏡写真または光学顕微鏡写真に基づいて例えば３００個の粒子の粒径サイズを測定し、その数平均として算出した粒子サイズを実質的に意味している。
【００５０】
ある好適な態様では、本発明の磁性粒子のコア粒子の形状は、球状となっている。即ち、磁性粒子の全体形状が球形状をなしており、粒子の重心を通る種々の方向で測定した場合の重心から外周までの最長の長さ(長半径)と最小の長さ(短半径)との比である長短半径比が１．０〜１．３の範囲、好ましくは１．０〜１．２５の範囲、より好ましくは１．０〜１．２の範囲となっている。このような長短半径比を有していることによって、粒子形状に起因する構造磁気異方性が低下し、保磁力の低い磁性粒子が実現される。換言すれば、かかる本発明の磁性粒子では、構造磁気異方性に起因して、実用上十分な分散性と磁気捕集性とを兼ね備えた粒子が実現され得る。なお、実際には上記長短径比は立体として測定することは困難なため、撮影した電子顕微鏡写真より計測する。長短半径比を簡単に求めることができる解析ソフトウェアとして、Image-Pro Plus（日本ローパー社）があり、「半径比」として求められる値が上記長短半径比に相当する。
【００５１】
球形状のコア粒子の場合、その粒径に関してのＣＶ値（変動係数）は、０．０１％〜１９％であり、好ましくは０．１％〜１８％であり、更に好ましくは０．１％〜１７％である（例えば、ある場合では、ＣＶ値は１０％〜１８％ないしは１０％〜１７％となる）。この値が大きいと、粒径のばらつきは大きくなり、標的物質分析用として使用した際の結果のばらつきの原因となるため、好ましくない。粒子の透過型電子顕微鏡写真または光学顕微鏡写真に基づいて例えば３００個の粒子のサイズを測定し、それの統計処理を行うことで粒径に関しての変動係数を求めることができる。
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【００５２】
ちなみに、小さな粒径分布を持った球形のコア粒子から成る磁性粒子では、バルク粒子中のそれぞれの粒子の分散性および沈降性が均一化することになる。その結果、バルク粒子中のいずれの部分の粒子を用いても、それぞれの粒子が標的物質に対して同等の反応性または結合性を有し得る。また、保磁力の原因として、磁気異方性があるが、球形のコア粒子から成る磁性粒子においては、構造磁気異方性が低下し得るので、保磁力が低下し、生化学用途のポリマーコート磁性粒子に特に必要な特性の一つである磁気捕集後の再分散性の向上に寄与しうる。
【００５３】
本発明では、コア粒子の表面にポリマーが被着または結合している。即ち、本発明の磁性粒子では、コアとなる磁性粒子部分の表面にポリマーコート層（即ち、「ポリマーシェル部を有するポリマーコート層」又は「ポリマーシェル部と親水ポリマーコート部とを有するポリマーコート層」）が存在している。かかるポリマーコート層は、コア粒子との化学的結合を通じてコア粒子表面に設けられている。ポリマーコート層（特にポリマーシェル部）とコア粒子との相互の“化学的な結合”に起因して、ポリマーコート層は、コア粒子の表面の少なくとも一部を連続的に被覆している。つまり、コア粒子上に設けられたポリマーコート層（特にポリマーシェル部）自体が、“コア粒子表面を露出させる空隙”を有することなく、連続的に設けられている。換言すれば、本発明においては、コア粒子表面に他の物質が物理的結合（例えば物理的吸着や磁気的吸着）した場合に得られるような空隙部（コア粒子表面を局所的に露出させる空隙部）は存在していないといえる。特に好ましくは、ポリマーコート層はコア粒子を内包するようにコア粒子表面全体に存在している。
【００５４】
好ましい態様では、ポリマーコート層とコア粒子との“化学的結合”に起因して、磁性粒子におけるポリマーの被着量は比較的減じられている。具体的にいえば、磁性粒子における粗面ポリマーシェル部のポリマー被着量・含有量は、使用されるポリマー原料の種類などに依存し得るものの、好ましくは磁性粒子の全重量基準で、０．５〜５０重量％であり、好ましくは１〜４０重量％、より好ましくは２〜３０重量％程度、更に好ましくは３〜２５重量％程度、例えば５〜２０重量％程度である。粗面ポリマー被着量・含有量が上記の上限値を上回ると、１つのコア粒子表面だけでなく、複数のコア粒子が一塊となるようにポリマーが存在し得る傾向が大きくなる一方、粗面ポリマーの被着量・含有量が上記の下限値を下回ると、ポリマーに起因する分散能が低下することになり、複数のコア粒子同士が凝集する傾向が大きくなる。このようなポリマー被着量・含有量は、水や緩衝溶液中における分散性および分散安定性に有効に寄与し得るものである。
【００５５】
本発明では、ポリマーコート層のポリマーシェル部に起因して、磁性粒子（特に磁性粒子の表面領域）が粗面化されている。つまり、本発明の磁性粒子は、その表面のシェル部のポリマー自体が有する面粗さに起因して（即ち、粗面コーティングされたポリマーに起因して）凹凸状のコアシェル構造を有している。あくまでも本発明は“被着ポリマーによる粗面化”であって、コア粒子自体が粗面化された粒子となっているものではない点に留意されたい。
【００５６】
本発明においては、“粗面化の程度”を示すために、コア粒子の比表面積（特にそのコア粒子を平滑な完全球体とみなした場合の比表面積）の値を尺度基準として用いている。具体的には、コア粒子を“平滑な完全球体”とみなした場合におけるコア粒子の比表面積の値（ｍ２／ｇ）と比べることによって、本発明の磁性粒子の“粗面化の程度”を表している。このような尺度基準に基づいて評価すると、本発明に係る磁性粒子の比表面積の測定値（ｍ２／ｇ）は、コア粒子を平滑な完全球体とみなした場合のコア粒子の比表面積の値（ｍ２／ｇ）の１．５倍〜５００倍となっており、例えば１．６倍〜１００倍、場合によっては１．７倍〜２０倍となっている。１つ例示すると、ポリマーコート層がポリマーシェル部のみを有する場合では、磁性粒子の比表面積の測定値（ｍ２／ｇ）は、コア粒子を平滑な完全球体とみなした場合のコア粒子の比表面積の値（ｍ２／ｇ）の１．７倍〜７倍程度となっている。また、同様に１つ例示すると、ポリマーコート層がポリマーシェル部および親水ポリマー部を有する場合では、磁性粒子の比表面積の測定値（ｍ２／ｇ）は、コア粒子を平滑な完全球体とみなした場合のコア粒子の比表面積の値（ｍ２／ｇ）の１．７倍〜４倍程度となっている。
【００５７】
本発明の磁性粒子においては、ポリマーコート層の分子構造中、特に、ポリマーシェル部の分子構造中に芳香族ビニル骨格が含まれ得る。これは、後述するポリマーコート処理の原料、即ち、粗面コーティング処理の原料として“芳香族ビニルモノマー”が用いられることに起因している。特定の理論に拘束されるわけではないが、ポリマーシェル部の分子構造中に芳香族ビニル骨格が含まれているものであるからこそ、ポリマーシェル部によって磁性粒子の表面の粗面化が好適に実現されていると考えられる。芳香族ビニル骨格としては、例えば、ジビニルベンゼン骨格および／またはジビニルベンゼン誘導体骨格を挙げることができる。
【００５８】
特に好ましくは、ポリマーシェル部はコア粒子の表面を全体的に覆っており（即ちコア粒子の外表面の露出はなく）、そのように覆っているポリマー層の表面が凹凸面を成している。これは、ポリマーシェル部がコア粒子の表面を露出させない厚みでコア粒子を包囲していることを意味している。尚、ポリマー層の表面の凹凸面は、例えば房形状（好ましくは連続的な房形状）の形態を有している（後述の［実施例］において説明する図１も併せて参照のこと）。場合によっては、コア粒子表面にて連鎖体や網目状またはスポンジ状の集まりの形態を有するようにポリマーシェル部が全体として分布している。
【００５９】
ポリマーコート層が親水ポリマーコート部を有する場合、かかる親水ポリマーコート部には、カルボキシル基、スルホン酸基、硫酸エステル基、水酸基、エーテル基、アミノ基、ベタイン基およびホスホリルコリン基から成る群から選択される少なくとも１種以上の親水基が含まれていることが好ましい。このように親水基が含まれていると、磁性粒子に親水性が付与されることになる。磁性粒子における親水ポリマーコート部のポリマー被着量・含有量は、ポリマー原料の種類などに依存し得るものの、好ましくは磁性粒子の全重量基準で、０．１〜１５重量％であり、好ましくは０．２〜１０重量％、より好ましくは０．５〜５重量％程度である。このように親水ポリマーの含有量は、粗面ポリマーの含有量に比べて極めて少なくなっているので、ポリマーコート層が実質的にポリマーシェル部から構成され、そのポリマーシェル部によって磁性粒子が粗面化されている。
【００６０】
本発明の磁性粒子は、上述したように、凹凸状のコアシェル構造を有しているが、凹凸を成すポリマーコート層（特にポリマーシェル部）の厚さＴpolmerは、平均すると（凹凸を平均して考えると）、好ましくは約２ｎｍ〜約５００ｎｍの厚さ、より好ましくは約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの厚さを有している。即ち、本発明の磁性粒子では、ポリマーコート層（特にポリマーシェル部）が好ましくは約２ｎｍ〜約５００ｎｍの平均厚さ、より好ましくは約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの平均厚さでもってコア粒子を連続的に包囲しているといえる。ちなみに、コア粒子の粒径Ｄコア粒子（平均粒径）が好ましくは約５ｎｍ〜約３μｍ、より好ましくは約５ｎｍ〜約１μｍ、更に好ましくは約２０ｎｍ〜約５００ｎｍ程度であることに鑑みると、ポリマーコート層を含んだ本発明の磁性粒子の粒径Ｄ磁性粒子（平均粒径）は、好ましくは約９ｎｍ〜約４μｍ、より好ましくは約２０ｎｍ〜約１．２μｍ、更に好ましくは約４０ｎｍ〜約８００ｎｍ程度となる。
【００６１】
本発明の磁性粒子は、コア粒子および／またはポリマーコート層の表面に「標的物質結合性物質」および／または「標的物質結合性官能基」が固定化されて成るものである。「標的物質結合性物質」は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、プロテインＡおよびプロテインＧから成る群から選択される少なくとも１種以上の物質であることが好ましい。また、「標的物質結合性官能基」は、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基、トシル基、スルホン酸基、硫酸エステル基、スクシンイミド基、マレイミド基、チオール基、チオエーテル基およびジスルフィド基などの硫化物官能基、アルデヒド基、アジド基、ヒドラジド基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、カルボキシル基のハロゲン置換体、ならびに、二重結合から成る群から選択される少なくとも１種以上の官能基であることが好ましい（これらの官能基の誘導体であってもかまわない）。例えば、「標的物質結合性物質」および／または「標的物質結合性官能基」はポリマーコート層のカルボキシル基やアミノ基を介して、表面に付加的に形成され得るものであってもよい。
【００６２】
ここで、上記における「固定化」とは、一般的に、コア粒子および／またはポリマーコート層の表面付近に「標的物質結合性物質」または「標的物質結合性官能基」が存在している態様を実質的に意味しており、必ずしも「標的物質結合性物質」または「標的物質結合性官能基」がコア粒子および／またはポリマーコート層の表面に直接取り付けられている態様のみを意味するものではない。また、「固定化」とは、それらの表面の少なくとも一部に「標的物質結合性の物質または官能基」が固定化されている態様を実質的に意味しており、「標的物質結合性の物質または官能基」が必ずしも表面全体にわたって固定化されていなくてもよい。
【００６３】
本発明の粒子には「標的物質結合性の物質または官能基」が固定化されているので、かかる物質または官能基を介して標的物質（即ち、目的とする対象物質）が粒子に結合することができる。つまり、本発明の粒子は磁気分離用粒子または磁気プローブとして好適に用いることができる。尚、本明細書において「標的物質が結合」という用語は、粒子に対して標的物質が「化学吸着」した態様のみならず、「物理吸着」または「吸収」される態様をも包含している。
【００６４】
好ましくは、本発明の粒子は、標的物質の分離などに好適な密度を有している。即ち、ヒト又は動物の尿、血液、血清、血漿、精液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液；ヒト又は動物の臓器、毛髪、皮膚、粘膜、爪、骨、筋肉又は神経組織等の懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；便懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；培養細胞又は培養組織の懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；ウィルスの懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；菌体の懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；土壌懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；植物の懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；食品・加工食品懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；排水等の試料に粒子を分散させた際に粒子の沈降速度が比較的大きくなるような密度を粒子は有している。具体的には、本発明の磁性粒子の密度（ポリマーコート層を含む）は、好ましくは１〜９ｇ／ｃｍ３であり、より好ましくは１〜６ｇ／ｃｍ３である。粒子の密度が１ｇ／ｃｍ３よりも小さくなると、自然沈降のみによる粒子の移動速度が実用上好ましくない一方、粒子の密度が９ｇ／ｃｍ３よりも大きくなると、標的物質を結合させる際に行う攪拌にとって好ましくない。従って、本発明の粒子の密度は、１ｇ／ｃｍ３〜９ｇ／ｃｍ３であり、より好ましくは１ｇ／ｃｍ３〜６ｇ／ｃｍ３であり、更に好ましくは３．５ｇ／ｃｍ３〜７．０ｇ／ｃｍ３（例えば、１．５ｇ／ｃｍ３〜６ｇ／ｃｍ３）である。ここで、本明細書にいう「密度」とは、物質自身が占める体積だけを密度算定用の体積とする真密度を意味しており、真密度測定装置ウルトラピクノメーター１０００（ユアサアイオニクス社製）を使用することによって求めることができる値である。
【００６５】
（本発明の磁性粒子の製造方法）
次に、本発明の磁性粒子の製造方法について説明する。
【００６６】
（ポリマーコート層がポリマーシェル部のみを有する磁性粒子の製造方法）
本発明の製造方法は、磁性粒子のコア粒子となる前駆体粒子と、モノマーと、溶媒とを混ぜ合わせ、それによって、原料モノマー由来のポリマー成分を前駆体粒子に化学的に結合させる工程を好ましくは含んでいる。特に、かかる工程においては、“化学的に結合したポリマー成分”から構成される磁性粒子のポリマーシェル部をコア粒子の表面の少なくとも一部に連続的に形成し、ポリマーシェル部の有する表面粗さによって磁性粒子を粗面化する。具体的な処理法について説明すると次のようになる。
【００６７】
本発明の磁性粒子を製造するに際して、“磁性を帯びたコア粒子”として市販の粒子を用いることができる。例えば、戸田工業製マグネタイトＴＭ−０２３（一次粒径：約２３０ｎｍ）を用いることができる。
【００６８】
まず、コア粒子表面においてポリマーシェル部の形成が助力されることになるように、コア粒子に対してシランカップリング剤処理を行うことが好ましい。シランカップリング剤処理を行うことによって、ポリマーをコア粒子表面に好適に結合させることができ、「二重結合などの重合可能な反応基」をコア粒子に設けることができるからである。用いるシランカップリング剤としては、アクリル基やメタクリル基を末端に有するシランカップリング剤を挙げることができる。また、シランカップリング剤処理に用いる溶媒についていえば、コア粒子が分散し、シランカップリング剤が溶解するものであれば、特に制限はない。しかしながら、シランカップリング剤を加水分解させる必要があり、その点で水が微量ながら必要である。従って、その観点でいえばシランカップリング剤処理に用いる溶媒として、水が溶けやすい溶媒が好ましいといえる。具体的にはメタノール、エタノール、テトラヒドロフランおよび水から成る群から選択される少なくとも１種以上を溶媒として用いることが好ましい。更には、シランカップリング剤の加水分解をより進行させるために、酸もしくはアルカリを触媒として加えてもよい。触媒としての酸は例えば酢酸であってよく、触媒としてのアルカリは例えばアンモニア水であってよい。シランカップリング剤とコア粒子との反応を行う際の温度は、用いる溶剤の融点以下かつ沸点以上でなければ、任意に設定することが可能である。反応時間も、任意に設定可能であり、反応温度との兼ね合いで選択することが好ましい。
【００６９】
シランカップリング剤処理の後、好ましくは、洗浄を実施することによって未反応のシランカップリング剤を除去する。かかる洗浄方法も特に制限はないが、遠心分離法を用いる手法が簡易であるので適当である。洗浄後は、コア粒子を乾燥に付してもよい。乾燥に付すことによって、コア粒子表面とシランカップリング剤との間に化学結合が生じやすくなる。かかる乾燥方法も特に制限はなく、任意の温度で乾燥を行ってもよい。しかしながら、乾燥時の粒子凝集を防ぐ点でいえば凍結乾燥を行うことが好ましい。乾燥を実施した場合、再分散させる必要があるが、かかる再分散に関しても特に制限はない。
【００７０】
次いで、シランカップリング剤処理が施されたコア粒子表面に対してポリマーコート処理、即ち、粗面コーティング処理を実施する。具体的な処理操作としては、コア粒子、モノマー、溶媒および必要に応じて用いられる重合開始剤を混ぜ合わせる。このような処理を行うことによって、コア粒子の表面にポリマーシェル部を形成することができる（好ましくは、コア粒子との化学的結合を通じてコア粒子表面にポリマーシェル部を連続的に設けることができる）。モノマーとしては、少なくとも「２個以上の重合性二重結合を有する低分子モノマー」及び「被覆を形成することが可能なモノマー」を用いることが好ましい。必要に応じて、「両末端または片末端に重合可能な部位を有するポリエチレングリコール鎖の化合物（例えば、共栄社化学より市販されているライトアクリレート）」および／または「スルホン酸基または硫酸エステル基と末端に重合可能な部位とを有する化合物（例えば、スチレンスルホン酸または２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸のモノマー）」などを併せて用いてもよい。
【００７１】
特定の理論に拘束されるわけではないが、ポリマーシェル部の形成に用いるモノマーとして「２個以上の重合性二重結合を有する低分子モノマー」が含まれていることに起因して、ポリマー粗面化が好適に実現されることになると考えられる。かかる「２個以上の重合性二重結合を有する低分子モノマー」としては、芳香族ビニルモノマーが好ましく、例えばジビニルベンゼンおよび／またはジビニルベンゼン誘導体のモノマーを挙げることができる。一方、「被覆を形成することが可能なモノマー」としては、例えばスチレン、（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸アミド、酢酸ビニル、アクリロニトリル、ビニルエーテル、ビニルピリジン、ビニルイミダゾール、ビニルピロリドン、標的物質結合性の官能基を有するモノマー等を挙げることができる。
【００７２】
ポリマー化に用いる溶媒は、特に制限はないが、例えば、水、メタノール、エタノールおよびテトラヒドロフランから成る群から選択される少なくとも１種を用いることができる。更に、必要に応じて用いられる重合開始剤は、用いる溶媒の種類に合わせて適宜選択することができ、溶媒が水またはアルコール系の場合、例えば、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、２,２'-アゾビス(２-メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩および／または水溶性アゾ重合開始剤（和光純薬製のＶＡ−０４４またはＶＡ−０６１）などを用いることができる。その他の開始剤については、使用する溶媒の親水性、疎水性などの条件を考慮し、アゾビスイソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル、過酸化ジオクタノイル等の熱開始剤を適宜使用すればよく、また、光開始剤を用いてもかまわない。
【００７３】
粗面コーティング処理は、酸素ができる限り存在しない条件下で行うことが好ましい。従って、各種原料などが仕込まれた反応容器内に窒素やアルゴンガスなどを満たして粗面コーティング処理を実施することが好ましい。また、粗面コーティング処理を行う際の温度（反応温度）は用いる反応開始剤の分解速度によって適宜設定してよい。粗面コーティング処理を実施する時間（反応時間）も特に制限はない。
【００７４】
このような粗面コーティング処理によって、コア粒子表面にポリマーが被着した磁性粒子を得ることができ、好ましくは、連続的に形成されたポリマーシェル部がコア粒子の表面の少なくとも一部を被覆し、ポリマーシェル部の有する表面粗さによって粗面化されて成る磁性粒子を得ることができる。
【００７５】
粗面コーティング処理後においては、洗浄を行い、未反応の原料モノマーや粒子に結合しなかったポリマーを除去する。かかる洗浄方法も特に制限はないが、簡易であるので遠心分離法や磁気分離を用いた洗浄が好ましい。
【００７６】
ポリマーシェル部および／またはコア粒子の表面に対して「標的物質結合性物質」または「標的物質結合性官能基」を固定化させる処理は、粗面コーティングの前、粗面コーティングに際して又は粗面コーティングの後のいずれで行ってもよい。
【００７７】
例えば、粗面コーティングの後に「標的物質結合性官能基」を固定化させる場合では、磁性粒子を溶媒中に分散させ、加温状態で、反応触媒と「固定化すべき官能基を持つ化合物」とを添加し、数時間反応させる。かかる反応によって、「標的物質結合性官能基」がポリマーシェル部および／またはコア粒子の表面に固定化されることになる。
【００７８】
また、「標的物質結合性官能基」の固定化を粗面コーティングに際して実施する場合では、粗面コーティング時に「標的物質結合性官能基」を有するモノマーを重合または共重合させてよい。かかる場合、「標的物質が結合可能な官能基」を有するモノマーとしては、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリロイロキシアルキルコハク酸、（メタ）アクリロイロキシアルキルヘキサヒドロフタル酸、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキル、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノアルキル、（メタ）アクリル酸イソシアナートアルキル、ｐ−スチレンスルホン酸（塩）、ジメチロールプロパン酸、Ｎ−アルキルジエタノールアミン、（アミノエチルアミノ）エタノールまたはリジン等を用いることができる。
【００７９】
ちなみに、「標的物質結合性物質」を固定化させる場合についていえば、「標的物質結合性物質」と結合性を有する官能基を粒子本体表面または被着ポリマー表面に予め導入することによって、その官能基を介して「標的物質が結合可能な物質」を粒子に固定化させることができる。
【００８０】
（ポリマーコート層がポリマーシェル部および親水ポリマーコート部を有する磁性粒子の製造方法）
「ポリマーコート層がポリマーシェル部および親水ポリマーコート部を有する磁性粒子」を製造するに際しては、まず、本発明の製造方法の工程（ｉ）を実施する。つまり、製造されることになる磁性粒子のコア粒子となる前駆体粒子に対して粗面ポリマーコーティング処理を施し、それによって、前駆体粒子の表面にポリマーシェル部を形成して粒子の粗面化を行う。「粗面ポリマーコーティング処理」とは、ポリマーを用いて粒子にコーティングを施し、そのコーティングされるポリマーの有する表面粗さによって粒子を粗面化させる処理のことを実質的に意味しており、上記「ポリマーコート層がポリマーシェル部のみを有する磁性粒子の製造方法」で説明した処理である。
【００８１】
粗面ポリマーコーティング処理において用いられるモノマーであるジビニルベンゼン等の芳香族ビニルモノマーは疎水性を有するため、粗面化コーティング処理後の粒子は水溶液中で凝集性が高くなる。また、１つのコア粒子表面だけでなく、複数のコア粒子が一塊となるようにポリマーによって化学結合した粒子となり、粒子径が大きくなり、水溶液中で沈降しやすい粒子が形成されうる。また、分散性を向上させるために、親水性のモノマーをジビニルベンゼン等の芳香族ビニルモノマーと併せて用いた場合には、水溶液中である一定の分散性は得られるが限界が生じる。親水性のモノマーの投入比率を増化させると、粗面性が生じにくくなるというトレードオフの関係になる。
【００８２】
そこで、粒子の粗面性を保ちつつ、親水性を効果的に粒子へと付与するために、工程（ｉ）の粗面ポリマーコーティング処理後に粒子の再分散処理、特に物理的分散処理を行う。かかる物理的分散処理では、「コア粒子が破壊されない程度であって、かつ、粗面ポリマーシェル部が多く剥がれない程度の外力」を粒子に対して付与することが好ましい。かかる外力は、機械的剪断力（例えば高速剪断力）、摩擦力、圧縮力、超音波および／または衝撃波などに起因した外力であることが好ましい。
【００８３】
第１層目の粗面ポリマーコーティング処理後の粒子の単分散性が促進されれば、いずれの物理的分散処理法を用いてもかまわない。例えば、物理的分散処理は、ジルコニアビーズ等の硬質ビーズとのメカニカルスターラーによる共撹拌処理を挙げることができる他、バス型超音波、プローブ型超音波、ホモジナイザー、ジェットミル、ペイントシェイカー、ピコミル、遊星ボールミル等を用いた処理を挙げることができる。ここでいう「ホモジナイザー」は、化学工学辞典（編者：社団法人化学工学会、発行者：鈴木信夫、発行所：丸善株式会社、改訂３版）の第５２５頁に定義されるようなホモジナイザー（homogenizer）のことである。即ち、本明細書で用いる「ホモジナイザー」という用語は、狭い間隙を高圧で流体を流し、そのときに働く剪断力を利用して粒子の分散処理手段のことを意味しているだけでなく（例えば、高速の回転による衝撃と渦流による剪断作用を利用する手段であってもよい）、常套的な粉砕機（コロイドミル、振動ボールミル、攪拌ミル）などの機械的分散手段をも意味するものとして用いている。ちなみに、上記例示した手段に鑑みると、本発明にいう「物理的分散処理」は、“物理的解砕処理”とも称すことができるものである（即ち、砕力に相当する外力を粒子に対して及ぼしつつ、その凝集状態を解き離す処理態様も含んでいる）。
【００８４】
あくまでも例示にすぎないが、粗面ポリマーコーティング処理後の粒子を含んだ流体（媒体としては、例えば水、超純水や緩衝液等の水系媒体）を狭い間隙（スリット部）に高圧で流し、そのときに働く剪断力によって粒子の分散処理を行ってよい。かかるスリット部（細い間隙）は、「流路に設けられた狭窄部」や「流路途中に設けられたディスクに形成された微小開口部」などであってよい。このようなスリット部の寸法（間隙寸法）は、ミクロンオーダーであることが好ましく、例えば、好ましくは１μｍ〜２ｍｍの範囲、より好ましくは２０μｍ〜６００μｍの範囲、更に好ましくは３０μｍ〜４００μｍの範囲であってよい。また、「高圧」は、粒子を含んだ流体がスリット部を通ることを可能にする圧力であってよく、例えば大気圧（約０．１ＭＰａ）〜２５０ＭＰａの範囲（より好ましくは１００ＭＰａ〜２３０ＭＰａの範囲）である。例えば、プランジャーポンプなどのポンプを用いて粒子含有流体を圧送すると、高圧・加圧条件を形成することができる。スリット部に流す際の流速は、例えば、５０ｍ／ｓ〜４００ｍ／ｓの範囲（より好ましくは１００ｍ／ｓ〜２００ｍ／ｓの範囲）であってよい。必要に応じて、処理すべき粒子含有流体を分割し、その分割したサブ流体同士をスリット部内において相互に衝突させてもよい。
【００８５】
物理的分散処理に引き続いて、工程（ｉｉ）を実施する。つまり、粗面ポリマーコーティング処理が施された前駆体粒子に対して親水ポリマーコーティング処理を施し、その前駆体粒子において親水ポリマーコート部を形成する。
【００８６】
「親水ポリマーコーティング処理」とは、ポリマーを用いて粒子にコーティングを施し、そのコーティングされるポリマーによって粒子を親水化させる処理のことを実質的に意味している。
【００８７】
具体的な処理操作としては、「粗面ポリマーシェル部を備えたコア粒子」、親水化モノマー、溶媒および必要に応じて用いられる重合開始剤を混ぜ合わせる。このような原料を用いることによって、粒子を親水化することができる。親水化モノマーとしては、ホスホリルコリン基を有するモノマー、メタクリロイルオキシエチルカルボキシベタイン等のベタインモノマー、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリロイロキシアルキルコハク酸、（メタ）アクリロイロキシアルキルヘキサヒドロフタル酸、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキル、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノアルキル、（メタ）アクリル酸イソシアナートアルキル、ｐ−スチレンスルホン酸（塩）、ジメチロールプロパン酸、Ｎ−アルキルジエタノールアミン、（アミノエチルアミノ）エタノールまたはリジン、「両末端または片末端に重合可能な部位を有するポリエチレングリコール鎖の化合物（例えば、共栄社化学より市販されているライトアクリレート）」および／または「スルホン酸基または硫酸エステル基と末端に重合可能な部位とを有する化合物（例えば、スチレンスルホン酸または２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸のモノマー）等を単独または複数組み合わせて用いても良い。
【００８８】
親水ポリマーコーティング処理に用いる溶媒は、特に制限はないが、例えば、水、メタノール、エタノールおよびテトラヒドロフランから成る群から選択される少なくとも１種を用いることができる。更に、必要に応じて用いられる重合開始剤は、用いる溶媒の種類に合わせて適宜選択することができ、溶媒が水またはアルコール系の場合、例えば、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、２,２'-アゾビス(２-メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩および／または水溶性アゾ重合開始剤（和光純薬製のＶＡ−０４４またはＶＡ−０６１）などを用いることができる。その他の開始剤については、アゾビスイソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル、過酸化ジオクタノイル等の熱開始剤を適宜使用してもよく、また、光開始剤を用いてもかまわない。
【００８９】
本発明の製造方法は、「標的物質と結合することが可能な物質または官能基」を粒子に固定化する処理を含んでいる。かかる固定化処理は、粗面コーティングの前、粗面コーティングに際して、粗面コーティングの後、親水コーティングの前、親水コーティングに際して、親水コーティングの後のいずれかで行ってよい。
【００９０】
例えば、親水コーティング処理の後に「標的物質結合性官能基」を固定化させる場合では、磁性粒子を溶媒中に分散させ、加温状態で、反応触媒と「固定化すべき官能基を持つ化合物」とを添加し、数時間反応させる。かかる反応によって、「標的物質結合性官能基」がポリマーコート層および／またはコア粒子の表面に固定化されることになる。
【００９１】
また、「標的物質結合性官能基」の固定化を親水コーティングに際して実施する場合では、親水コーティング時に「標的物質結合性官能基」を有するモノマーを重合または共重合させてよい。かかる場合、「標的物質が結合可能な官能基」を有するモノマーとしては、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリロイロキシアルキルコハク酸、（メタ）アクリロイロキシアルキルヘキサヒドロフタル酸、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキル、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノアルキル、（メタ）アクリル酸イソシアナートアルキル、ｐ−スチレンスルホン酸（塩）、ジメチロールプロパン酸、Ｎ−アルキルジエタノールアミン、（アミノエチルアミノ）エタノールまたはリジン等を用いることができる。
【００９２】
次に、球形状のコア粒子の製造方法について説明しておく。まず、工程（Ｉ）として、鉄イオンを含んで成る溶液とアルカリ溶液とを混合し、得られる混合溶液中で鉄元素を含んで成る水酸化物を析出させる。例えば、鉄イオンを含んで成る溶液に対してアルカリ溶液を加える。これにより、鉄イオンとアルカリイオンとが相互に反応し、鉄元素を含んで成る水酸化物が混合溶液中に析出してくる（析出物は「沈殿物」または「共沈物」とも称すことができる）。
【００９３】
工程（Ｉ）で用いる「鉄イオンを含んで成る溶液」は、例えば、塩化鉄、硫酸鉄、アセチルアセトナト鉄などの鉄化合物を鉄化合物が可溶な溶媒に溶解させることによって得られる溶液である。この場合、鉄イオンは、溶液中に一般に存在することになる。塩化鉄としては塩化第一鉄（ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）および塩化第二鉄（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）を挙げることができ、硫酸鉄としては硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を挙げることができ、また、アセチルアセトナト鉄としてはアセチルアセトナト鉄（ＩＩ）（Ｆｅ（ＣＨ３ＣＯＣＨ＝Ｃ（Ｏ）ＣＨ３）２を挙げることができる。これらをそれらが可溶な溶媒に溶解させることによって、鉄イオンを生じさせる。一度溶解しやすい溶媒に溶解させた上で、溶解しにくい溶媒と混合させて反応に用いることも可能である。たとえば、硫酸鉄を少量の水に溶解させた上で、グリセリンなどの多価アルコール溶媒と混合させるということも可能である。グリセリンを含めることによって、結晶成長が等方的に進む（結晶形状が球状化する）という効果が奏され得る。溶液中の鉄イオンの濃度は、好ましくは０．０３〜６ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．０６〜３ｍｏｌ／ｌである。所望の磁気特性を得るべく、コバルトイオン、白金イオンおよび／またはマグネシウムイオンを必要に応じて含ませてもよい。
【００９４】
一方、工程（Ｉ）で用いるアルカリ溶液は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ３やテトラメチルアンモニウムヒドロキシド（Ｎ（ＣＨ３）４ＯＨ）等のアルカリをそれらが可溶な溶媒に溶解させることによって得られる溶液である。従って、アルカリ溶液中では、アルカリはイオンの形態で一般に存在する。アルカリ溶液のアルカリ濃度は、好ましくは０．０３〜２０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．０６〜１０ｍｏｌ／ｌである。ここで、アルカリ水溶液には、鉄のイオン価数に応じた量のアルカリイオンが含まれていることが好ましく、鉄イオンの価数以上のアルカリイオンが存在していることが特に好ましい。尚、アルカリ溶液中にアルカリイオンが必要以上に多く存在すると、得られる強磁性粒子の水洗回数が多くなり水洗処理が非効率となってしまう。
【００９５】
鉄イオンを含んで成る溶液とアルカリ溶液とを混合する際の温度条件は、特に制限はなく、好ましくは１０〜９０℃程度（例えば常温）であってよい。また、好気下、嫌気下どちらの条件でも行うことができる。好気下のほうが、簡便性の点から好ましい。さらに、混合する際の圧力条件も特に制限はなく、大気圧下で行うことができる。マグネティックスターラーやスリーワンモータなどの攪拌機を用いて「鉄イオンを含んで成る溶液」を攪拌しながら、その水溶液に対して、等速滴下が可能な滴下ポンプ等でアルカリ溶液を滴下供給し、「鉄イオンを含んで成る溶液」と「アルカリ溶液」とを混合することが好ましい。
【００９６】
工程（Ｉ）の別法として、次の方法も可能である。「鉄イオンを含んで成る溶液」を水溶液とし、球状化をもたらす添加剤として、グリセリンでなく、ポリビニルアルコールおよび／またはmyo−イノシトールなどのＯＨ基を多く持つ化合物を加える。その後、アルカリ溶液を加え、さらに酸化剤であるＮａＮＯ３を添加したのち、加熱を行う。このような手法によっても、“球状化”を好適に促進させることができる。尚、かかる場合、「鉄イオンを含んで成る溶液」およびアルカリ溶液については前述の通りである。ＯＨ基を多く持つ化合物の濃度は、好ましくは０．０３〜６ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．０６〜３ｍｏｌ／ｌである。また、酸化剤についていえば、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３など酸化能を持つものであれば、いずれの種類の酸化剤を使用してもよい。酸化剤の濃度は好ましくは０．０３〜４ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．０６〜１ｍｏｌ／ｌである。
【００９７】
工程（Ｉ）に引き続いて工程（ＩＩ）を実施する。工程（ＩＩ）では、工程（Ｉ）で得られた混合水溶液を加熱処理に付す。必要に応じてエアーポンプなどを用いて混合水溶液に空気を吹き込みながら加熱処理を行ってよい。加熱温度は、７０〜３００℃であることが好ましい。加熱処理の圧力条件は、特に制限はなく、大気圧下で行ってよいし、水熱反応（ソルボサーマル反応）と呼ばれる、圧力容器中で溶媒の沸点以上に加熱した高圧反応も可能である。加熱時間も、特に制限はなく、例えば５時間〜３０時間程度である（好ましくは、加熱時間は８時間〜２５時間程度である）。また、加熱の方法も、特に制限もなく、オイルバス、マントルヒーター、乾燥機といったものや、マイクロ波を用いた加熱装置を用いることも可能である。マイクロ波に関しては、マイクロ波の照射により加熱できる溶媒は制限されるが、溶媒自体が加熱されるため、内部から均一に加熱できるという特徴がある。このような、マイクロ波を用いた加熱装置としては、マイルストーンゼネラル社製MicroSYNTHをあげることができる。
【００９８】
工程（ＩＩ）の加熱処理が行われることによって、水酸化物が溶解して好ましくはスピネル型構造の強磁性酸化鉄粒子が形成される。スピネル型構造の酸化鉄粒子としては、特に限定されるものではないが、マグネタイト（Ｆｅ３ Ｏ４ ）、マグヘマイト（γ−Ｆｅ２ Ｏ３ ）粒子、マグネタイト−マグヘマイト中間体を挙げることができる。また、加熱処理に付す混合溶液に含まれているイオンによっては、上記酸化鉄にコバルト（Ｃｏ）、白金（Ｐｔ）、マグネシウム（Ｍｇ）、亜鉛（Ｚｎ）および／またはニッケル（Ｎｉ）などが更に含まれた粒子を得ることができる（コバルト、白金、マグネシウム、亜鉛またはニッケルなどは、保磁力を調整するために有効である）。マグネタイト粒子への“コバルト添加”は保磁力を増大させるために有効であり、“マグネシウム添加”は保磁力を低減させるために有効である。
【００９９】
工程（ＩＩ）で形成または合成されたコア粒子は、洗浄、濾過および乾燥に付すことが好ましい。得られたコア粒子を洗浄することによって、粒子表面から不純物を除去できる。洗浄は、水を用いた水洗が好ましいものの、水以外にもエタノール、メタノールといったアルコール系をはじめとする水に可溶な溶媒を用いてコア粒子を洗浄してもよい。濾過は、洗浄に際して行ってよく、洗浄液などをコア粒子から除去できる。コア粒子の乾燥は必須ではなく、必要に応じて有無を選択できる。乾燥する場合は、好ましくは１０〜１５０℃、より好ましくは４０〜９０℃の温度条件下で行うことが好ましい。乾燥機を用いてコア粒子を乾燥させてよいものの、自然乾燥によりコア粒子を乾燥させてもかまわない。
【０１００】
尚、工程（Ｉ）、（ＩＩ）ともに、嫌気下、好気下条件のいずれでも実施可能である。嫌気下条件で反応する場合は、工程で用いる溶媒や工程での容器中を嫌気性ガスで置換する必要がある。嫌気性ガスとしては、酸素以外の不活性ガスであれば、窒素、アルゴンなど各種ガスが使用可能である。好気下条件で反応させる場合は、大気下で反応を行えばよい。
【０１０１】
以上のような製造プロセスを通じて、球形状の磁性を帯びた粒子を得ることができる。より具体的にいえば、アルカリ濃度が球形形成に一番寄与するので、この条件を最適化することで、球形状のコア粒子を好適に得ることができる。このように、上記プロセスを経ることによって球状粒子が得られることになるので、それを、本発明の磁性粒子の製造に好適に用いることができる。
【０１０２】
（磁気捕集性）
次に、本発明の磁性粒子の特徴の１つである「水中における優れた磁気捕集性」について説明する。
【０１０３】
水中に含まれる磁性粒子の磁気捕集性は、“粒子の水分散液の吸光度の変化”を指標にすることができる。これは、粒子の水分散液に対して分光光度計による吸光度測定を行って磁気捕集性を把握するものである。かかる指標に基づく磁気捕集性について詳述する。
【０１０４】
本発明の磁性粒子が含まれた水分散液では、水中に磁性粒子が分散しており、磁性粒子の色がついた分散液となっている。この分散液に対して外側から磁石を用いて磁性粒子を捕集すると、磁石の近傍に磁性体が集まることになるので、分散液が全体的に無色透明となる。従って、分光光度計による吸光度測定を行うと、分散状態である初期状態では、吸光度は高いものの、磁気捕集が進行するにつれ、徐々に吸光度が下がっていくことになる。このような吸光度が低下する割合から、磁性粒子の磁気捕集性を把握することができる。
【０１０５】
ここで、本発明の磁性粒子は、十分な磁気捕集性を呈し得るが、それを定量的に説明すれば次のようになる。ポリマーシェル部のみを有する本発明の磁性粒子を含んで成る水分散液（磁性粒子の濃度は例えば約０．１〜０．２ｍｇ/ｍＬである）について０．３６Ｔの磁場の影響下において緩衝溶液中の磁性粒子を磁気捕集すると、緩衝溶液の相対吸光度が約０．１〜０．２（磁気捕集操作前の初期値は１）になるまでの時間が約６０秒以内となる。これにつき一例を挙げると、磁性粒子の濃度が例えば約０．２ｍｇ/ｍＬである水分散液に対して０．３６Ｔの磁場を作用させる場合では、磁気捕集を開始してから約６０秒程度で水分散液の相対吸光度（約５５０ｎｍの光の吸光度）が初期の“１”から約０．０４にまで低下し得る。また、ポリマーシェル部および親水ポリマーコート部を有する磁性粒子を含んで成る水分散液（磁性粒子の濃度は例えば約０．１〜０．２ｍｇ/ｍＬである）について０．３６Ｔの磁場の影響下において緩衝溶液中の磁性粒子を磁気捕集すると、緩衝溶液の相対吸光度が約０．１〜０．２（磁気捕集操作前の初期値は１）になるまでの時間は約３分以内となる。これにつき一例を挙げると、磁性粒子（球形コア粒子）の濃度が例えば約０．２ｍｇ/ｍＬである緩衝溶液分散液に対して０．３６Ｔの磁場を作用させる場合では、磁気捕集を開始してから約２分程度で緩衝溶液分散液の相対吸光度（約５５０ｎｍの光の吸光度）が初期の“１”から約０．０７にまで低下し得る。
【０１０６】
尚、本明細書において「緩衝溶液」とは、酸または塩基が加えられた際にｐＨの変化を打ち消そうとする緩衝作用を有する流体を意味しており、特には、メディカルサイエンスやバイオサイエンスの分野において用いられる「ｐＨが略一定に保たれる液体」を指している（例えば緩衝溶液はリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２である）。
【０１０７】
本発明における吸光度の値は、例えば、日立ハイテクノロジー社製のバイオ光度計Ｕ−００８０Ｄを用いて得られものである。また、磁気捕集時の磁場を供するものとしては、磁石を用いてよく、フェライト磁石、サマリウムコバルト磁石、ネオジム磁石、アルニコ磁石など磁石であればどれでも使用できる。更に、本発明における磁場の値“０．３６Ｔ”は、例えば、マイテック（株）製の「ハンディテスラメータ  エルル  ＤＴＭ６１００」を用いて測定した値である。かかる装置を用いて磁場の強さを測定する際、測定セルに磁石を貼り付けたのち、測定セル内壁部側面に接触させるようにセンサー部を配置する。また、センサー部の先端はセル内壁下部に接触させておく。このようにして、分散液に供される磁場の値を測定することができる。
【０１０８】
ちなみに、実際の用途において磁気捕集を行う場合では、磁気捕集速度を速めて測定する用途に対しては強力磁石であるネオジム磁石、サマリウムコバルト磁石などを用いてよい。その一方、磁気捕集速度を遅くして測定する用途に対してはフェライト磁石などを使用してもよい。また、別の考え方では素材ではなく、磁石の表面磁束密度を目安にすることも可能である。この場合は、表面磁束密度の値が大きい程、磁気捕集速度は速くなり、逆に表面磁束密度の値が低ければ、磁気捕集速度が遅くなる。このような値は、使用者が用途に応じて自由に決めることが可能である。尚、実用上では、測定セル内部の磁場の強さを実測するほうが分かりやすい。これについても同様に、磁場が強いと磁気捕集速度は速くなり、磁場が弱いと磁気捕集速度は遅くなるので、使用者が用途に応じて自由に決めることができる。
【０１０９】
（分散性・沈降速度について）
ポリマーコート層がポリマーシェル部および親水ポリマーコート部を有する場合の磁性粒子の分散性・沈降速度について説明しておく。第２層形成の親水ポリマーコーティング後と第１層形成の粗面ポリマーコーティング後の分散性の比較は、例えば、独国Ｌ．Ｕ．Ｍ．ＧｍｂＨ社製の分散安定性評価装置ＬＵＭｉＦｕｇｅを用いて行うことができる。これを例示すると、測定は１ｍｇ／ｍｌの粒子分散体０．５ｍｌを用いて所望の回転速度で行い、水中やＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ リン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）等の水溶液中で行う。また、サンプルチューブ中で静置することによる目視での評価も、もちろん可能である。本発明では、第２層形成の親水ポリマーコーティング後の粒子は第１層形成の粗粗面ポリマーコーティング後の粒子に比べて、明らかに分散性が優れ、沈降速度が遅くなる。
【実施例】
【０１１０】
以下では、『ポリマーコート層がポリマーシェル部のみを有する磁性粒子に特化したケースＡ』、『ポリマーコート層がポリマーシェル部および親水ポリマー部を有する磁性粒子に特化したケースＢ』および『球形状のコア粒子から構成された磁性粒子に特化したケースＣ』に分けて説明する。まず、『ポリマーコート層がポリマーシェル部のみを有する磁性粒子に特化したケースＡ』について先に説明し、その後、『ポリマーコート層がポリマーシェル部および親水ポリマー部を有する磁性粒子に特化したケースＢ』、そして、『球形状のコア粒子から構成された磁性粒子に特化したケースＣ』について説明する。
【０１１１】
『ポリマーコート層がポリマーシェル部のみを有する磁性粒子に特化したケースＡ』
《粒子の調製》
実施例１および比較例１において磁性粒子を以下のように調製した。
【０１１２】
実施例１
（シランカップリング剤処理）
磁性を帯びたコア粒子ｒ１として戸田工業製マグネタイトＴＭ−０２３（一次粒径：２３０ｎｍ）を用いた。かかるコア粒子ｒ１の１．７ｇをメタノール４７５ｍｌ中に分散させた。得られた分散液に対して３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（ＬＳ−３３６０、信越化学製）２５．５ｍｌを加えて、４０℃で４時間撹拌した。攪拌後、遠心分離に付して洗浄を行った後、溶媒を水に置換することによって、シランカップリング剤を固定化した磁性粒子を得た。
【０１１３】
（被着ポリマー粗面化）
水３８ｍｌに対して「シランカップリング剤を固定化した磁性粒子の溶液（４０ｍｇ／ｍｌ）」を１０ｍｌ加えた。得られた分散液を撹拌しながら、窒素ガスを流し、窒素雰囲気下にした。その後、ジビニルベンゼン（和光純薬製）２ｍｌ、スチレン（和光純薬製）０．５ｍｌ、ＨＯＡ−ＭＳ（２−アクリロイロキシエチルコハク酸、共栄社化学製）の０．２５ｍｇ／ｍｌの水懸濁液１．６ｍｌ（和光純薬製）、および、メタノール２ｍｌを加えた。しばらく撹拌した後、４０ｍｇの過硫酸カリウムを加え、８０℃の窒素雰囲気下で５時間反応を進行させた。その後、磁気分離法によって洗浄を行い、被着ポリマー粗面化された磁性粒子Ｐ１を得た。
【０１１４】
比較例１
実施例１で得られた「シランカップリング剤を固定化した４０ｍｇ／ｍｌの磁性粒子の溶液」の５ｍｌを水４３ｍｌに対して分散させた。得られた溶液を撹拌しながら、窒素ガスを流し、窒素雰囲気下にした。その後、アクリル酸（和光純薬製）０．７ｍｌ、および、ライトアクリレート９ＥＧ−Ａ（共栄社化学製）３５μｌを加えた。しばらく撹拌した後、１．４ｍｇの２,２'−アゾビス(２-メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩（和光純薬製）を加え、７０℃の窒素雰囲気下で５時間反応させた。その後、遠心分離法によって洗浄を行った。これにより、ポリマー被着化された磁性粒子Ｒ１を得た。
【０１１５】
《比表面積の測定》
比表面積細孔分布測定装置ＢＥＬＳＯＲＰ−Ｍｉｎｉ（日本ベル社製）を用いてＢＥＴ法により実施例１のＰ１の比表面積を測定した。かかる測定の結果、実施例１の磁性粒子Ｐ１の比表面積は１８．８ｍ２／ｇであることが分かった。その一方、同じくＢＥＴ法により比較例１の磁性粒子Ｒ１の比表面積を測定したところ、その比表面積は６．０ｍ２／ｇであった。
【０１１６】
ＢＥＴ法で測定したコア粒子ｒ１（戸田工業製マグネタイトＴＭ−０２３）の比表面積が７．４ｍ２／ｇであったことに鑑みると、本発明の実施例１においては被着ポリマー粗面化によって比表面積が「７．４→１８．８ｍ２／ｇ」と増加しており、ポリマーコート層によって確実に粗面化した粒子が得られていることが分かった（これに対して、比較例１では比表面積の増加は見られなかった）。つまり、実施例１のようにジビニルベンゼンを用いた被着ポリマー化を実施すると、コア粒子表面にコーティングされたポリマーシェル部によって粒子全体における表面積が効果的に増加することが把握できた。
【０１１７】
ここで、コア粒子ｒ１を粒径２３０ｎｍの平滑な完全球体と仮定して、その比表面積を計算すると５．２ｍ２／ｇとなる。従って、実施例１のポリマー粗面化された磁性粒子Ｐ１の比表面積１８．８ｍ２／ｇは、かかる５．２ｍ２／ｇの“３．６倍”となっている（これに対して、比較例１の磁性粒子Ｒ１の比表面積６．０ｍ２／ｇは、５．２ｍ２／ｇの“１．２倍”にすぎなかった）。
【０１１８】
《ＳＥＭ観察》
実施例１の磁性粒子Ｐ１、コア粒子ｒ１および比較例１の磁性粒子Ｒ１の表面観察を行った。具体的には、走査型電子顕微鏡を用いて磁性粒子Ｐ１、コア粒子ｒ１および磁性粒子Ｒ１の表面を観察した。Ｐ１、ｒ１およびＲ１の粒子表面のＳＥＭ画像をそれぞれ図１、図２および図３に示す。
【０１１９】
図１〜図３を参照すると分かるように、被着ポリマー粗面化された磁性粒子Ｐ１の粒子表面状態（図１）は、コア粒子ｒ１の粒子表面状態（図２）およびポリマー被着化された磁性粒子Ｒ１の粒子表面状態（図３）とは明らかに異なり、粒子表面に連続的房形状の粗面コーティングが見られた。
【０１２０】
《熱重量の測定》
被着ポリマー粗面化された磁性粒子Ｐ１およびポリマー被着化された磁性粒子Ｒ１に対して熱重量測定（Ｔｈｅｒｍｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｙ、ＴＧ）を実施した。その結果、実施例１の磁性粒子Ｐ１のポリマー含率は１５．４重量％（粒子の全重量基準）であって、比較例１の磁性粒子Ｒ１のポリマー含率は２重量％（粒子の全重量基準）であった。
【０１２１】
以上の《比表面積の測定》、《ＳＥＭ観察》および《熱重量の測定》の結果を参酌すると、実施例１の磁性粒子Ｐ１においては、粒子表面にコーティングされたポリマーシェル部によって房形状に粗面化が施され、その結果、粒子の比表面積が増大していることが理解できるであろう。
【０１２２】
《生体物質結合性物質の固定化試験》
被着ポリマー粗面化された磁性粒子Ｐ１およびポリマー被着化された磁性粒子Ｒ１に対してストレプトアビジンを固定化した。磁性粒子Ｐ１およびＲ１にはそれぞれ同様の処理を行った。磁性粒子Ｐ１を例に挙げて説明する。
【０１２３】
まず、磁性粒子Ｐ１（２ｍｇ）を１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌに溶かして磁性粒子液１ｍｌを得た。次いで、かかる磁性粒子液に対して、５ｍｇのＤＭＴ−ＭＭ（カップリング剤、和光純薬製）を１ｍｌの１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶かした溶液１ｍｌを加え、２ｍｌとし、超音波を５分間加えた後、さらに２５分間、１０００ｒｐｍで撹拌を行った。磁気分離後、上澄みを除き、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌ加えてピペッティング後、１分間超音波洗浄し、磁気分離で上澄みを除いた。このような超音波洗浄、磁気分離をもう一度繰り返した後、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて、１ｍｌに調製し、カルボキシル基活性化磁性粒子液を得た。
【０１２４】
次いで、１ｍｇストレプトアビジン(和光純薬製)を０．５ｍｌの１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶かし、カルボキシル基活性化磁性粒子液０．５ｍｌを加えて、１時間超音波を加えた。その後、一晩、ローテーターで撹拌し、カルボキシル基へのストレプトアビジンの結合反応を促進させた。反応終了後、磁気分離を実施して上澄みを除き、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌ加えてピペッティング後、１分間超音波洗浄し、磁気分離で上澄みを除いた。そして、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを１ｍｌ加え、超音波を１分間加えた後、ローテーターで２時間撹拌することによって、未反応の活性化カルボキシル基のヒドロキシル化を行った。反応終了後、磁気分離し、上澄みを除き、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌ加えてピペッティング後、１分間超音波洗浄し、磁気分離で上澄みを除いた、このような洗浄操作をさらに２回繰り返した後、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて１ｍｌに調製することによって、最終的にストレプトアビジンが固定化された磁性粒子液を得ることができた。
【０１２５】
《特異結合能の評価試験》
ストレプトアビジン固定化磁性粒子とビオチンとの特異結合能を評価するため、ビオチン化ＨＲＰを用いて、ストレプトアビジン固定化磁性粒子のビオチン結合量を評価した。上記の《生体物質結合性物質の固定化試験》と同様、磁性粒子Ｐ１およびＲ１にはそれぞれ同様の処理を行った。磁性粒子Ｐ１を例に挙げて説明する。
【０１２６】
まず、ストレプトアビジン固定化磁性粒子Ｐ１の０．０５ｍｇ／ｍｌに対してＰＢＳ緩衝液で希釈すべく、１．５ｍｌチューブにＰＢＳ緩衝液０．２５ｍｌ加えた。磁気分離で上澄みを除き、濃度１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＨＲＰを１００μｌ加え、ボルテックスミキサーで３０分間攪拌し、ビオチン化ＨＲＰをストレプトアビジン固定化磁性粒子Ｐ１に結合させた。１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）４００μｌを用いてチューブ内の粒子を洗浄して磁気分離した。このような洗浄操作を計４回行った。その後、ＰＢＳ緩衝液を除去した後、粒子が含まれるチューブに２００μｌのＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を加えて３０分間静置させることによって、粒子溶液を発色させた。次いで、１Ｎ硫酸を２００μｌ加えて、反応を停止させた。この反応停止液を１Ｎ硫酸で５倍希釈し、１００μｌをウェルプレートへと分注した。ＴＥＣＡＮ社製プレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ２００で吸光度（４５０ｎｍ）を測定し、チューブに仕込まれた粒子の発色量を求めた。結果を表１に示す。
【０１２７】
【表１】
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【０１２８】
表１に示す結果から、実施例１の磁性粒子Ｐ１は比較例１の磁性粒子Ｒ１と比べて、単位重量あたりでより多くのビオチン結合能を有することを確認することができた。
【０１２９】
以上の結果に鑑みると、被着ポリマー粗面化された磁性粒子Ｐ１は、標的物質をより多く結合させることができ、バイオテクノロジー分野またはライフサイエンス分野で用いる磁性粒子として好適に利用できるものであることが理解できるであろう。
【０１３０】
《磁気捕集性の評価》
実施例１の磁性粒子Ｐ１および比較例２として用いたInvirogen社製ダイナビーズ（ＭｙＯｎｅ  Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）Ｒ２に対して水中で磁気捕集速度の測定を行った。磁性粒子Ｐ１およびＲ２にはそれぞれ同様の処理を行った。磁性粒子Ｐ１を例に挙げて説明する。尚、実施例１における磁性粒子Ｐ１の飽和磁化は７０．８Ａ・ｍ2／ｋｇであって、その保磁力は５．０ｋＡ／ｍであった。
【０１３１】
磁気捕集性評価の測定装置としては日立ハイテクノロジー社製バイオ光度計Ｕ−００８０Ｄを用いた。具体的な測定としては、０．２ｍｇ/ｍＬの磁性粒子分散液を１ｃｍ角の分光セルに仕込んで分光光度計にセットし、ピペッティングにより十分に粒子を分散させた後、二六製作所製ネオジム磁石ＮＫ０３７（大きさ：４０ｍｍ×２０ｍｍ×１ｍｍ、表面磁束密度：１３４ｍＴ）をセル外部に近接させ、５５０ｎｍの光の吸光度の時間変化を測定した。この際のセル内部の磁場は前述した方法で測定すると０．３６Ｔであった。
【０１３２】
図４に測定結果のグラフを示す。図４のグラフから分かるように、磁性粒子Ｐ１は吸光度が短時間で低下している。具体的には、磁場を作用させてから約６０秒程度で緩衝溶液の相対吸光度が初期の“１”から約０．０４にまで低下した。これに対して、Invirogen社製ダイナビーズＲ２は同様の相対吸光度の低下に際して約３分要した。
【０１３３】
図４の結果に鑑みると、被着ポリマー粗面化された磁性粒子Ｐ１を含んだ水分散液では、より短い時間で効果的に粒子を磁気捕集できることが理解できるであろう。
【０１３４】
『ポリマーコート層がポリマーシェル部および親水ポリマー部を有する磁性粒子に特化したケースＢ』
《粒子の調製》
実施例１’および比較例１’、２’において磁性粒子を以下のように調製した。
【０１３５】
実施例１’
本実施例１’においては、コア粒子上に粗面ポリマーコート層および親水ポリマーコート層を備えた磁性粒子を調製した。
（シランカップリング剤処理）
磁性を帯びたコア粒子ｒ１’として戸田工業製マグネタイトＨＭ−３０５（一次粒径：２１０ｎｍ）を用いた。かかるコア粒子ｒ１’の１０ｇ／１００ｍｌのメタノール分散ストック溶液を予備分散した後、このストック溶液１８ｍｌ（コア粒子１．８ｇ分）にメタノールを加えて４２７ｍｌとし、さらに予備分散を行った。得られた分散液に対して３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（ＬＳ−３３６０、信越化学製）２２．９５ｍｌを加えて、４０℃で４時間撹拌した。攪拌後、遠心分離に付して洗浄を行った後、溶媒を水に置換することによって、シランカップリング剤を固定化した磁性粒子を得た。
【０１３６】
（粗面化ポリマーコーティング処理）
水２９０ｍｌに対して「予備分散したシランカップリング剤を固定化した磁性粒子の溶液（４６．７ｍｇ／ｍｌ）」を５９．９６ｍｌ（「予備分散したシランカップリング剤を固定化した磁性粒子」２．８ｇ分）加えた。得られた分散液を撹拌しながら、窒素ガスを流し、窒素雰囲気下にした。その後、ジビニルベンゼン（和光純薬製）５．２５ｍｌ、スチレン（和光純薬製）１．７５ｍｌ、ライトアクリレート４ＥＧ−Ａ（共栄社化学製）１．７５ｍｌ、さらには、ＨＯＡ−ＭＳ（２−アクリロイロキシエチルコハク酸、共栄社化学製）の０．２５ｇ／ｍｌの水懸濁液５ｍｌ（和光純薬製）、および、メタノール１４ｍｌを加えた。しばらく撹拌した後、過硫酸カリウム１４２ｍｇを水７ｍｌに溶かして加え、８０℃の窒素雰囲気下で５時間反応を進行させた。その後、磁気分離法によって洗浄を行うことによって、粗面化ポリマーコートされた磁性粒子Ｐ１’を得た。
【０１３７】
（物理的分散処理および親水ポリマーコーティング処理）
２１．３２ｍｇ／ｍｌの粗面化ポリマーコートされた磁性粒子Ｐ１’の分散液１７．８ｍｌ（粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ１’として３８０ｍｇ分）を水７５ｍｌに加えて物理的分散処理に付した。より具体的には、「水が加えられた分散液」を加圧下にてスリット部（細い隙間）に通過させ、それによって、磁性粒子に剪断力を与えて分散させた。次いで、得られた溶液を撹拌しながら、窒素ガスを流し、窒素雰囲気下にした。その後、アクリル酸（和光純薬製）１．２３５ｍｌ、ライトアクリレート９ＥＧ−Ａ（共栄社化学製）６６．５μｌを加え、さらに、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸６６．５ｍｇを水５ｍｌに溶かして加えた。しばらく撹拌した後、２．６６ｍｇの２,２'−アゾビス(２-メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩（和光純薬製）を水５ｍｌに溶かして加え、７０℃の窒素雰囲気下で５時間反応させた。その後、磁気分離法によって洗浄を行った。これにより、親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ２’を得た。即ち、コア粒子上に粗面ポリマーコート層および親水ポリマーコート層を備えた粒子Ｐ２’を得た。
【０１３８】
比較例１’
本比較例１’においては、コア粒子上に粗面ポリマーコート層を備えた磁性粒子を調製した。即ち、粗面ポリマーコーティング処理が施されているものの、親水ポリマーコーティング処理が施されていない磁性粒子を調製した。
【０１３９】
（シランカップリング剤処理）
磁性を帯びたコア粒子ｒ２’として戸田工業製マグネタイトＴＭ−０２３（一次粒径：２３０ｎｍ）を用いた。かかるコア粒子ｒ２’の１．７ｇをメタノール４７５ｍｌ中に分散させた。得られた分散液に対して３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（ＬＳ−３３６０、信越化学製）２５．５ｍｌを加えて、４０℃で４時間撹拌した。攪拌後、遠心分離に付して洗浄を行った後、溶媒を水に置換することによって、シランカップリング剤を固定化した磁性粒子を得た。
【０１４０】
（粗面化ポリマーコーティング処理）
水３８ｍｌに対して「シランカップリング剤を固定化した磁性粒子の溶液（４０ｍｇ／ｍｌ）」を１０ｍｌ加えた。得られた分散液を撹拌しながら、窒素ガスを流し、窒素雰囲気下にした。その後、ジビニルベンゼン（和光純薬製）２ｍｌ、スチレン（和光純薬製）０．５ｍｌ、ＨＯＡ−ＭＳ（２−アクリロイロキシエチルコハク酸、共栄社化学製）の０．２５ｍｇ／ｍｌの水懸濁液１．６ｍｌ（和光純薬製）、および、メタノール２ｍｌを加えた。しばらく撹拌した後、４０ｍｇの過硫酸カリウムを加え、８０℃の窒素雰囲気下で５時間反応を進行させた。その後、磁気分離法によって洗浄を行い、粗面化ポリマーコートされた磁性粒子Ｒ１’を得た。即ち、粗面ポリマーコート層を有するものの親水ポリマーコート層を有していない磁性粒子Ｒ１’を得た。
【０１４１】
比較例２’
本比較例２’においては、コア粒子上に親水ポリマーコート層を備えた磁性粒子を調製した。即ち、親水コーティング処理が施されているものの、粗面ポリマーコーティング処理が施されていない磁性粒子を調製した。
【０１４２】
（親水ポリマーコーティング処理）
上記比較例１’で得られた「シランカップリング剤を固定化した４０ｍｇ／ｍｌの磁性粒子の溶液」の５ｍｌを水４３ｍｌに対して分散させた。得られた溶液を撹拌しながら、窒素ガスを流し、窒素雰囲気下にした。その後、アクリル酸（和光純薬製）０．７ｍｌ、および、ライトアクリレート９ＥＧ−Ａ（共栄社化学製）３５μｌを加えた。しばらく撹拌した後、１．４ｍｇの２,２'−アゾビス(２-メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩（和光純薬製）を加え、７０℃の窒素雰囲気下で５時間反応させた。その後、遠心分離法によって洗浄を行った。これにより、親水ポリマーコートされた磁性粒子Ｒ２’を得た。即ち、親水ポリマーコート層を有するものの粗面ポリマーコート層を有していない磁性粒子Ｒ２’を得た。
【０１４３】
《比表面積の測定》
比表面積細孔分布測定装置ＢＥＬＳＯＲＰ−Ｍｉｎｉ（日本ベル社製）を用いてＢＥＴ法により実施例１’のＰ１’、Ｐ２’の比表面積を測定した。かかる測定の結果、実施例１’の磁性粒子Ｐ１’、Ｐ２’の比表面積はそれぞれ、２８．７ｍ２／ｇ、１５．９ｍ２／ｇであることが分かった。その一方、同じくＢＥＴ法により比較例２’の磁性粒子Ｒ２’の比表面積を測定したところ、その比表面積は６．０ｍ２／ｇであった。なお、ｒ１’、ｒ２’、Ｒ１’の比表面積はそれぞれ、５．６ｍ２／ｇ、７．４ｍ２／ｇ、１８．８ｍ２／ｇであった。
【０１４４】
ＢＥＴ法で測定したコア粒子ｒ１’（戸田工業製マグネタイトＨＭ−３０５）の比表面積が５．６ｍ２／ｇであったことに鑑みると、本発明の実施例１’においては粗面化ポリマーコートによって比表面積が「５．６→２８．７ｍ２／ｇ」と増加しており、ポリマーコート層によって確実に粗面化した粒子が得られていることが分かった
【０１４５】
親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ２’の比表面積は１５．９ｍ２／ｇであった。比表面積はＰ１’の２８．７ｍ２／ｇからＰ２’の１５．９ｍ２／ｇに減少している。この減少は粗面化ポリマーコート層の剥がれに起因していると考えられる。しかし、比表面積はコア粒子ｒ１’の５．６ｍ２／ｇより大きいので、剥がれは一部にとどまっており、表面の粗面性は実質的に維持されている。
【０１４６】
ここで、コア粒子ｒ１’を粒径２１０ｎｍの平滑な完全球体と仮定して、その比表面積を計算すると５．７ｍ２／ｇとなる。従って、実施例１’の親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ２’の比表面積１５．９ｍ２／ｇは、かかる５．７ｍ２／ｇの“２．８倍”となっている（これに対して、比較例２’のポリマーコートされた磁性粒子Ｒ２’の比表面積６．０ｍ２／ｇは、コア粒子ｒ２’の５．２ｍ２／ｇの“１．２倍”にすぎなかった）。
【０１４７】
《ＳＥＭ観察》
実施例１’の磁性粒子Ｐ１’、Ｐ２’、コア粒子ｒ１’、比較例１’のコア粒子ｒ２’および比較例２’の磁性粒子Ｒ２’の表面観察を行った。具体的には、走査型電子顕微鏡を用いて磁性粒子Ｐ１’、Ｐ２’、コア粒子ｒ１’、ｒ２’および磁性粒子Ｒ２’の表面を観察した。Ｐ１’、Ｐ２’、ｒ１’、ｒ２’およびＲ２’の粒子表面のＳＥＭ画像をそれぞれ図５、図６、図７、図８および図９に示す。
【０１４８】
図５〜図９を参照すると分かるように、粗面化ポリマーコートされた磁性粒子Ｐ１’の粒子表面状態（図５）は、コア粒子ｒ１’の粒子表面状態（図７）および比較例２’のポリマーコートされた磁性粒子Ｒ２’の粒子表面状態（図９）とは明らかに異なり、粒子表面に房形状の粗面コーティングが見られた。さらに、親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子でも粒子表面は粗面性を有することが分かった（図６）。
【０１４９】
《ＴＥＭ観察》
実施例１’と同様に調製して得られた磁性粒子のＴＥＭ写真を図１０（ａ）および（ｂ）に示す。かかるＴＥＭ写真から理解できるように、本発明の磁性粒子では、ポリマーコート層（特にポリマーシェル部）が、コア粒子の表面の少なくとも一部を連続的に被覆していることが分かった。つまり、コア粒子上に設けられたポリマーコート層（特にポリマーシェル部）自体が、“コア粒子表面を局所的に露出させるような空隙”を有することなく、連続的に設けられていることが分かった。これは、特定の理論に拘束されるわけではないが、ポリマーコート層（特にポリマーシェル部）がコア粒子との化学的結合に起因してその表面に設けられていることが要因として考えられる。
【０１５０】
《熱重量の測定》
粗面化ポリマーコートされた磁性粒子Ｐ１’，親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ２’およびポリマーコートされた磁性粒子Ｒ１’、Ｒ２’に対して熱重量測定（Ｔｈｅｒｍｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｙ、ＴＧ）を実施した。その結果、実施例１’の磁性粒子Ｐ１’、Ｐ２’のポリマー含率は４４．２重量％、１７．６重量％（粒子の全重量基準）であって、比較例１’の磁性粒子Ｒ１’のポリマー含率は１５．４重量％（粒子の全重量基準）、比較例２’の磁性粒子Ｒ２’のポリマー含率は２重量％（粒子の全重量基準）であった。
【０１５１】
以上の《比表面積の測定》、《ＳＥＭ観察》、《熱重量の測定》および《ＴＥＭ観察》の結果を参酌すると、実施例１’の磁性粒子Ｐ１’および比較例１’の磁性粒子Ｒ１’においては、粒子表面にコーティングされたポリマーシェル部（特に連続的な形態を有するポリマーシェル部）によって房形状に粗面化が施され、その結果、粒子の比表面積が増大していることが理解できるであろう。さらに、実施例１’の磁性粒子Ｐ２’においては、粗面化ポリマーコートした磁性粒子をさらに親水化ポリマーコートした磁性粒子が同様にポリマーシェル部に房形状の粗面性を保持し、その結果、粒子の比表面積は磁性コア粒子に比べて、増大したまま維持されていることが理解できるであろう。
【０１５２】
《生体物質結合性物質の固定化試験》
粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ１’、親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ２’およびポリマーコートされた磁性粒子Ｒ２’に対してストレプトアビジンを固定化した。磁性粒子Ｐ１’、Ｐ２’およびＲ２’にはそれぞれ同様の処理を行った。磁性粒子Ｐ１’を例に挙げて説明する。
【０１５３】
まず、磁性粒子Ｐ１’（２ｍｇ）を１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌに溶かして磁性粒子液１ｍｌを得た。次いで、かかる磁性粒子液に対して、５ｍｇのＤＭＴ−ＭＭ（カップリング剤、和光純薬製）を１ｍｌの１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶かした溶液１ｍｌを加え、２ｍｌとし、超音波を５分間加えた後、さらに２５分間、１０００ｒｐｍで撹拌を行った。磁気分離後、上澄みを除き、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌ加えてピペッティング後、１分間超音波洗浄し、磁気分離で上澄みを除いた。このような超音波洗浄、磁気分離をもう一度繰り返した後、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて、１ｍｌに調製し、カルボキシル基活性化磁性粒子液を得た。
【０１５４】
次いで、１ｍｇストレプトアビジン(和光純薬製)を０．５ｍｌの１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶かし、カルボキシル基活性化磁性粒子液０．５ｍｌを加えて、１時間超音波を加えた。その後、一晩、ローテーターで撹拌し、カルボキシル基へのストレプトアビジンの結合反応を促進させた。反応終了後、磁気分離を実施して上澄みを除き、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌ加えてピペッティング後、１分間超音波洗浄し、磁気分離で上澄みを除いた。そして、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを１ｍｌ加え、超音波を１分間加えた後、ローテーターで２時間撹拌することによって、未反応の活性化カルボキシル基のヒドロキシル化を行った。反応終了後、磁気分離し、上澄みを除き、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌ加えてピペッティング後、１分間超音波洗浄し、磁気分離で上澄みを除いた、このような洗浄操作をさらに２回繰り返した後、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて１ｍｌに調製することによって、最終的にストレプトアビジンが固定化された磁性粒子液を得ることができた。
【０１５５】
《特異結合能の評価試験》
ストレプトアビジン固定化磁性粒子とビオチンとの特異結合能を評価するため、ビオチン化ＨＲＰを用いて、ストレプトアビジン固定化磁性粒子のビオチン結合量を評価した。上記の《生体物質結合性物質の固定化試験》と同様、磁性粒子Ｐ１’、Ｐ２’およびＲ２’にはそれぞれ同様の処理を行った。磁性粒子Ｐ１’を例に挙げて説明する。
【０１５６】
まず、ストレプトアビジン固定化磁性粒子Ｐ１’の０．０５ｍｇ／ｍｌに対してＰＢＳ緩衝液で希釈すべく、１．５ｍｌチューブにＰＢＳ緩衝液０．２５ｍｌ加えた。磁気分離で上澄みを除き、濃度１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＨＲＰを１００μｌ加え、ボルテックスミキサーで３０分間攪拌し、ビオチン化ＨＲＰをストレプトアビジン固定化磁性粒子Ｐ１’に結合させた。１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）４００μｌを用いてチューブ内の粒子を洗浄して磁気分離した。このような洗浄操作を計４回行った。その後、ＰＢＳ緩衝液を除去した後、粒子が含まれるチューブに２００μｌのＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を加えて３０分間静置させることによって、粒子溶液を発色させた。次いで、１Ｎ硫酸を２００μｌ加えて、反応を停止させた。この反応停止液を１Ｎ硫酸で５倍希釈し、１００μｌをウェルプレートへと分注した。ＴＥＣＡＮ社製プレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ２００で吸光度（４５０ｎｍ）を測定し、チューブに仕込まれた粒子の発色量を求めた。結果を表２に示す。なお、吸光度の値については、標準粒子をもとに規格化した。
【０１５７】
【表２】
2012178539.tif 000005
【０１５８】
表２に示す結果から、実施例１’の磁性粒子Ｐ２’は比較例２’の磁性粒子Ｒ２’と比べて、単位重量あたりでより多くのビオチン結合能を有することを確認することができた。
【０１５９】
以上の結果に鑑みると、親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ２’は、標的物質をより多く結合させることができ、バイオテクノロジー分野またはライフサイエンス分野で用いる磁性粒子として好適に利用できるものであることが理解できるであろう。
【０１６０】
《磁気捕集性の評価》
実施例１’の磁性粒子Ｐ２’および比較例３’として用いたInvirogen社製ダイナビーズ（ＭｙＯｎｅ  Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）Ｒ３’に対して水中で磁気捕集速度の測定を行った。磁性粒子Ｐ２’およびＲ３’にはそれぞれ同様の処理を行った。磁性粒子Ｐ２’を例に挙げて説明する。尚、実施例１’における磁性粒子Ｐ２’の飽和磁化は６９．５Ａ・ｍ2／ｋｇであって、その保磁力は５．０ｋＡ／ｍであった。
【０１６１】
磁気捕集性評価の測定装置としては日立ハイテクノロジー社製バイオ光度計Ｕ−００８０Ｄを用いた。具体的な測定としては、０．２ｍｇ/ｍＬの磁性粒子分散液を１ｃｍ角の分光セルに仕込んで分光光度計にセットし、ピペッティングにより十分に粒子を分散させた後、二六製作所製ネオジム磁石ＮＫ０３７（大きさ：４０ｍｍ×２０ｍｍ×１ｍｍ、表面磁束密度：１３４ｍＴ）をセル外部に近接させ、５５０ｎｍの光の吸光度の時間変化を測定した。この際のセル内部の磁場は前述した方法で測定すると０．３６Ｔであった。
【０１６２】
図１１に測定結果のグラフを示す。図１１のグラフから分かるように、親水化された粗面コート磁性粒子Ｐ２’に磁場を作用させてから約２分程度で緩衝溶液の相対吸光度が初期の“１”から約０．０７にまで低下した。これに対して、Invirogen社製ダイナビーズＲ３’も、同様の速度で低下した。
【０１６３】
図１１の結果に鑑みると、磁性粒子の水分散液中での磁気分離速度は分散粒径が小さくなるほど、遅くなる傾向にあるが、本磁性粒子のコア粒子径は２１０ｎｍで、ＤＬＳ測定での分散粒径も約５００ｎｍと小粒径であるにも拘わらず、磁気分離能を維持していることが理解できるであろう。
【０１６４】
《分散安定性の評価》
粗面化ポリマーコートされた磁性粒子Ｐ１’と親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ２’の水中での分散性を比較した。それぞれの粒子の１ｍｇ／ｍｌの水分散体１ｍｌを調製し、自然沈降の速さを目視で確認した。図１２に示すように例えば、１時間後では粗面化ポリマーコートされた磁性粒子Ｐ１’（右側）は粒子がほとんど沈降しているのに対し、親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ２’（左側）は沈降がほとんど見られなかった。このことから、親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ２’は粗面性を有し、優れた磁気分離を維持しながらも、高い分散性を有した粒子で、バイオテクノロジー分野またはライフサイエンス分野で用いる磁性粒子として好適に利用できるものであることが理解できるであろう。
【０１６５】
『球形状のコア粒子から構成された磁性粒子に特化したケースＣ』
《粒子の調製》
実施例１”において球形のコア磁性体を有する親水性の粗面化磁性粒子、比較例１”において球形ではないコア磁性体を有する親水性の粗面化磁性粒子、比較例２”において親水ポリマーコート層を有するものの粗面ポリマーコート層を有していない球形コアの磁性粒子を以下のように調製した。
【０１６６】
実施例１”
本実施例１”においては、球形のコア粒子を合成し、得られた球形のコア粒子上に粗面ポリマーコート層および親水ポリマーコート層を形成することによって磁性粒子の調製を行った。
【０１６７】
＜マグネタイト粒子の合成＞
反応系として嫌気下条件を用いた。溶媒としての水およびグリセリンは、窒素ガスを用いて脱気したものを使用した。また、反応中も容器内を窒素ガスで置換し、酸素を含まない条件にした。窒素ガスの純度は９９．９９８%のものを用いた。
コア粒子となるマグネタイト粒子を、以下の方法により合成した。まず、１.１ｇの硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を４ｃｃの純水に溶解させ、硫酸第一鉄水溶液を調製した。この硫酸第一鉄をグリセリン１２０ｃｃと混合し均一な溶液とした。また、これとは別に、１１２ｇの水酸化ナトリウムを１００ｃｃの純水に溶解させ、水酸化ナトリウム水溶液を調製した。次いで、硫酸第一鉄溶液を攪拌しながら、水酸化ナトリウム水溶液１４．７ｃｃを滴下し、水酸化第一鉄の沈殿物を生成させた。最終的な液量が１４５ｃｃになるように水を滴下した。滴下終了後、攪拌しながら、３０分撹拌した。この溶液を、耐圧容器に入れ、乾燥機で１８０℃、２０時間反応させた。得られた粒子を洗浄し、乾燥させないまま、次の反応に用いた。かかるマグネタイト粒子ｒ１”は、長短半径比が１．１４の球形で、一次粒径が２５０ｎｍであった（マグネタイト粒子の長短半径比と一次粒径は、透過型電子顕微鏡写真上で、画像解析ソフトImage-Pro Plus(日本ローパー製)を用いて、３００個の粒子サイズを測定し、その数平均として求めた）。また、飽和磁化量は７７．６Ａ・ｍ2／ｋｇ（ｅｍｕ／ｇ）、保磁力は３．１０ｋＡ／ｍ（３８．９エルステッド）であった。
【０１６８】
（シランカップリング剤処理）
先の反応で得られたマグネタイト粒子ｒ１”の２００ｍｇをメタノール５０ｍｌ中に分散させた。この溶液に、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（ＬＳ−３３６０、信越化学製）３ｍｌを加えて、４０℃で４時間撹拌した。次いで、遠心分離に付して洗浄を行った後、溶媒を水に置換して、シランカップリング剤を固定化した磁性粒子Ｑ１”を得た。
【０１６９】
（粗面化ポリマーコーティング処理）
シランカップリング剤を固定化した磁性粒子２００ｍｇを水５０ｍｌに分散させた。得られた分散液を撹拌しながら、窒素ガスを流し、窒素雰囲気下にした。その後、ジビニルベンゼン（和光純薬製）０．３７５ｍｌ、スチレン（和光純薬製）０．１２５ｍｌ、ライトアクリレート４ＥＧ−Ａ（共栄社化学製）０．１２５ｍｌ、さらには、ＨＯＡ−ＭＳ（２−アクリロイロキシエチルコハク酸、共栄社化学製）
の０．２５ｇ／ｍｌの水懸濁液０．３５ｍｌ（和光純薬製）、および、メタノール２ｍｌを加えた。しばらく撹拌した後、過硫酸カリウム１０ｍｇを水１ｍｌに溶かして加え、８０℃の窒素雰囲気下で５時間反応を進行させた。その後、磁気分離法によって洗浄を行うことによって、粗面化ポリマーコートされた磁性粒子Ｐ１”を得た。
【０１７０】
（物理的分散処理および親水ポリマーコーティング処理）
２５ｍｇ／ｍｌの粗面化ポリマーコートされた磁性粒子Ｐ１”の分散液１０ｍｌ（粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ１”として２５０ｍｇ分）を物理的分散処理に付した。より具体的には、分散液を加圧下にてスリット部（細い隙間）に通過させ、それによって、磁性粒子に剪断力を与えて分散させた。磁気分離で洗浄後、得られた溶液に水を加えて５０ｍｌとし、撹拌しながら、窒素ガスを流し、窒素雰囲気下にした。その後、アクリル酸（和光純薬製）０．６５ｍｌ、ライトアクリレート９ＥＧ−Ａ（共栄社化学製）３５μｌを加え、さらに、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸３５ｍｇを水１ｍｌに溶かして加えた。しばらく撹拌した後、１．４ｍｇの２,２'−アゾビス(２-メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩（和光純薬製）を水１ｍｌに溶かして加え、７０℃の窒素雰囲気下で５時間反応させた。その後、磁気分離法によって洗浄を行った。これにより、親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ２”を得た。即ち、コア粒子上に粗面ポリマーコート層および親水ポリマーコート層を備えた粒子Ｐ２”を得た。
【０１７１】
比較例１”
本比較例１”においては、球形でないコア粒子上に粗面ポリマーコート層および親水ポリマーコート層を備えた磁性粒子を調製した。
【０１７２】
（シランカップリング剤処理）
磁性を帯びたコア粒子ｒ２”として戸田工業製マグネタイトＨＭ−３０５（一次粒径：２１０ｎｍ）を用いた。かかるコア粒子ｒ２”の１０ｇ／１００ｍｌのメタノール分散ストック溶液を予備分散した後、このストック溶液１８ｍｌ（コア粒子１．８ｇ分）にメタノールを加えて４２７ｍｌとし、さらに予備分散を行った。得られた分散液に対して３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（ＬＳ−３３６０、信越化学製）２２．９５ｍｌを加えて、４０℃で４時間撹拌した。攪拌後、遠心分離に付して洗浄を行った後、溶媒を水に置換することによって、シランカップリング剤を固定化した磁性粒子Ｑ２”を得た。
【０１７３】
水２９０ｍｌに対して「予備分散したシランカップリング剤を固定化した磁性粒子の溶液（４６．７ｍｇ／ｍｌ）」を５９．９６ｍｌ（「予備分散したシランカップリング剤を固定化した磁性粒子」２．８ｇ分）加えた。得られた分散液を撹拌しながら、窒素ガスを流し、窒素雰囲気下にした。その後、ジビニルベンゼン（和光純薬製）５．２５ｍｌ、スチレン（和光純薬製）１．７５ｍｌ、ライトアクリレート４ＥＧ−Ａ（共栄社化学製）１．７５ｍｌ、さらには、ＨＯＡ−ＭＳ（２−アクリロイロキシエチルコハク酸、共栄社化学製）の０．２５ｇ／ｍｌの水懸濁液５ｍｌ（和光純薬製）、および、メタノール１４ｍｌを加えた。しばらく撹拌した後、過硫酸カリウム１４２ｍｇを水７ｍｌに溶かして加え、８０℃の窒素雰囲気下で５時間反応を進行させた。その後、磁気分離法によって洗浄を行うことによって、粗面化ポリマーコートされた磁性粒子Ｒ１”を得た。
【０１７４】
（物理的分散処理および親水ポリマーコーティング処理）
２１．３２ｍｇ／ｍｌの粗面化ポリマーコートされた磁性粒子Ｒ１”の分散液１７．８ｍｌ（粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｒ１”として３８０ｍｇ分）を水７５ｍｌに加えて物理的分散処理に付した。より具体的には、「水が加えられた分散液」を加圧下にてスリット部（細い隙間）に通過させ、それによって、磁性粒子に剪断力を与えて分散させた。次いで、得られた溶液を撹拌しながら、窒素ガスを流し、窒素雰囲気下にした。その後、アクリル酸（和光純薬製）１．２３５ｍｌ、ライトアクリレート９ＥＧ−Ａ（共栄社化学製）６６．５μｌを加え、さらに、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸６６．５ｍｇを水５ｍｌに溶かして加えた。しばらく撹拌した後、２．６６ｍｇの２,２'−アゾビス(２-メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩（和光純薬製）を水５ｍｌに溶かして加え、７０℃の窒素雰囲気下で５時間反応させた。その後、磁気分離法によって洗浄を行った。これにより、親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｒ２”を得た。即ち、コア粒子上に粗面ポリマーコート層および親水ポリマーコート層を備えた粒子Ｒ２”を得た。
【０１７５】
比較例２”
本比較例２”においては、球形のコア粒子上に親水ポリマーコート層を備えた磁性粒子を調製した。即ち、親水コーティング処理が施されているものの、粗面ポリマーコーティング処理が施されていない球形のコア粒子を有する磁性粒子を調製した。
【０１７６】
（親水ポリマーコーティング処理）
上記実施例１”で合成した球形の磁性粒子ｒ１”に「シランカップリング剤を固定化した４０ｍｇ／ｍｌの磁性粒子Ｑ１”の溶液」の５ｍｌを水４３ｍｌに対して分散させた。得られた溶液を撹拌しながら、窒素ガスを流し、窒素雰囲気下にした。その後、アクリル酸（和光純薬製）０．７ｍｌ、および、ライトアクリレート９ＥＧ−Ａ（共栄社化学製）３５μｌを加えた。しばらく撹拌した後、１．４ｍｇの２,２'−アゾビス(２-メチルプロピオンアミジン)二塩酸塩（和光純薬製）を加え、７０℃の窒素雰囲気下で５時間反応させた。その後、遠心分離法によって洗浄を行った。これにより、親水ポリマーコートされた磁性粒子Ｒ３”を得た。即ち、親水ポリマーコート層を有するものの粗面ポリマーコート層を有していない球形コアの磁性粒子Ｒ３”を得た。
【０１７７】
《生体物質結合性物質の固定化試験》
球形のコア磁性粒子を有する親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ２”、球形ではないコア磁性粒子を有する親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｒ２”および、親水ポリマーコート層を有するものの粗面ポリマーコート層を有していない球形コアの磁性粒子Ｒ３”に対してストレプトアビジンを固定化した。磁性粒子Ｐ２”、Ｒ２”およびＲ３”はそれぞれ同様の処理を行った。磁性粒子Ｐ２”を例に挙げて説明する。
【０１７８】
まず、磁性粒子Ｐ２”（２ｍｇ）を１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌに溶かして磁性粒子液１ｍｌを得た。次いで、かかる磁性粒子液に対して、５ｍｇのＤＭＴ−ＭＭ（カップリング剤、和光純薬製）を１ｍｌの１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶かした溶液１ｍｌを加え、２ｍｌとし、超音波を５分間加えた後、さらに２５分間、１０００ｒｐｍで撹拌を行った。磁気分離後、上澄みを除き、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌ加えてピペッティング後、１分間超音波洗浄し、磁気分離で上澄みを除いた。このような超音波洗浄、磁気分離をもう一度繰り返した後、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて、１ｍｌに調製し、カルボキシル基活性化磁性粒子液を得た。
【０１７９】
次いで、１ｍｇストレプトアビジン(和光純薬製)を０．５ｍｌの１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶かし、カルボキシル基活性化磁性粒子液０．５ｍｌを加えて、１時間超音波を加えた。その後、一晩、ローテーターで撹拌し、カルボキシル基へのストレプトアビジンの結合反応を促進させた。反応終了後、磁気分離を実施して上澄みを除き、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌ加えてピペッティング後、１分間超音波洗浄し、磁気分離で上澄みを除いた。そして、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを１ｍｌ加え、超音波を１分間加えた後、ローテーターで２時間撹拌することによって、未反応の活性化カルボキシル基のヒドロキシル化を行った。反応終了後、磁気分離し、上澄みを除き、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌ加えてピペッティング後、１分間超音波洗浄し、磁気分離で上澄みを除いた、このような洗浄操作をさらに２回繰り返した後、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて１ｍｌに調製することによって、最終的にストレプトアビジンが固定化された磁性粒子液を得ることができた。
【０１８０】
《特異結合能の評価試験》
ストレプトアビジン固定化磁性粒子とビオチンとの特異結合能を評価するため、ビオチン化ＨＲＰを用いて、ストレプトアビジン固定化磁性粒子のビオチン結合量を評価した。上記の《生体物質結合性物質の固定化試験》と同様、磁性粒子Ｐ２”、Ｒ２”およびＲ３”にはそれぞれ同様の処理を行った。磁性粒子Ｐ２”を例に挙げて説明する。
【０１８１】
まず、ストレプトアビジン固定化磁性粒子Ｐ２”の０．０５ｍｇ／ｍｌに対してＰＢＳ緩衝液で希釈すべく、１．５ｍｌチューブにＰＢＳ緩衝液０．２５ｍｌ加えた。磁気分離で上澄みを除き、濃度１００ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＨＲＰを１００μｌ加え、ボルテックスミキサーで３０分間攪拌し、ビオチン化ＨＲＰをストレプトアビジン固定化磁性粒子Ｐ１”に結合させた。１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）４００μｌを用いてチューブ内の粒子を洗浄して磁気分離した。このような洗浄操作を計４回行った。その後、ＰＢＳ緩衝液を除去した後、粒子が含まれるチューブに２００μｌのＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を加えて３０分間静置させることによって、粒子溶液を発色させた。次いで、１Ｎ硫酸を２００μｌ加えて、反応を停止させた。この反応停止液を１Ｎ硫酸で５倍希釈し、１００μｌをウェルプレートへと分注した。ＴＥＣＡＮ社製プレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ２００で吸光度（４５０ｎｍ）を測定し、チューブに仕込まれた粒子の発色量を求めた。結果を表３に示す。なお、吸光度の値については、標準粒子をもとに規格化した。
【０１８２】
【表３】
2012178539.tif 000006
【０１８３】
表３に示す結果から、実施例１”の磁性粒子Ｐ２”は、比較例１”の磁性粒子Ｒ２”および比較例２”の磁性粒子Ｒ３”と比べて、単位重量あたりで同等以上のビオチン結合能を有することを確認することができた。
【０１８４】
以上の結果に鑑みると、球形のコア磁性粒子を有する親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ２”は、標的物質をより多く結合させることができ、バイオテクノロジー分野またはライフサイエンス分野で用いる磁性粒子として好適に利用できるものであることが理解できるであろう。
【０１８５】
《分散安定性の評価》
球形のコア磁性粒子を有する親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ２”、球形ではないコア磁性粒子を有する親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｒ２”および親水ポリマーコート層を有するものの粗面ポリマーコート層を有していない球形コアの磁性粒子Ｒ３”の水中での分散性を比較した。それぞれの粒子の１ｍｇ／ｍｌの水分散体１ｍｌを調製し、自然沈降の速さを目視で確認した。２時間後では、球形ではないコア磁性粒子を有する親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｒ２”、親水ポリマーコート層を有するものの粗面ポリマーコート層を有していない球形コアの磁性粒子Ｒ３”には、若干の沈降が見られたのに対して、球形のコア磁性粒子を有する親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ２”にはほとんど沈降が見られなかった。このことから、球形のコア磁性粒子を有する親水化された粗面化ポリマーコート磁性粒子Ｐ２”は粗面性を有し、優れた磁気分離を維持しながらも、高い分散性を有した粒子で、バイオテクノロジー分野またはライフサイエンス分野で用いる磁性粒子として好適に利用できるものであることが理解できるであろう。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
本発明の磁性粒子は、細胞、蛋白質、核酸または化学物質等の標的物質の定量、分離、精製および分析等に利用できる。例えば、本発明の磁性粒子は、ＤＮＡ等の核酸を結合させることができ、結果的にＤＮＡの塩基配列の解析に用いることができるので、テーラーメード医療技術に資するものである。
【０１８７】
また、本発明の磁性粒子は、例えば、ある特定の生体物質と特異的に結合する物質を粒子表面につけると、サンプル溶液と混合して粒子だけを回収することで、必要な生体物質だけを取り出すことができる。従って、本発明の磁性粒子は、体外診断などの検査薬の用途のみならず、医療、研究分野でのＤＮＡやタンパクなど生体物質の回収や検査の用途、また、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）等の用途にも用いることができる。
【図４】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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