(57)【要約】【課題】本発明は、ＡＭＰＫ活性化剤、血糖上昇抑制剤、生活習慣病及びこれに関連する疾患を予防又は治療するための組成物並びに糖尿病予防用組成物を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、ナリンゲニンカルコン又はその誘導体を含有する、ＡＭＰＫ活性化剤及び血糖上昇抑制剤に関する。本発明はまた、ナリンゲニンカルコン又はその誘導体を含有する、生活習慣病及び生活習慣病に関連する疾患の予防又は治療用組成物並びに糖尿病予防用組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナリンゲニンカルコン又はその誘導体を含有するＡＭＰＫ活性化剤。
【請求項２】
ナリンゲニンカルコン又はその誘導体を含有する血糖上昇抑制剤。
【請求項３】
ナリンゲニンカルコン又はその誘導体を含有する、生活習慣病及び生活習慣病に関連する疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項４】
前記ナリンゲニンカルコン又はその誘導体の含有量が、０．００１〜１０重量％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の剤又は組成物。
【請求項５】
トマト加工飲食品である、請求項４に記載の剤又は組成物。
【請求項６】
前記ナリンゲニンカルコン又はその誘導体がγ−サイクロデキストリンで包接されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の剤又は組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トマト果皮由来ポリフェノールであるナリンゲニンカルコン又はその誘導体を含有する、ＡＭＰＫ活性化剤及び血糖上昇抑制剤並びに生活習慣病及びこれに関連する疾患の予防又は治療用組成物及び糖尿病予防用組成物、並びにそれらの製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の運動不足、過剰な脂質摂取等にみられる生活習慣の急速な変化に伴い、内臓脂肪の蓄積を伴う肥満、高血糖、高脂血症等の生活習慣病の患者数は、増加の一途をたどっている。
【０００３】
一方で、最近の研究により、ＡＭＰＫ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）がエネルギー代謝調節に極めて重要な役割を担っていることが明らかとなりつつある。ＡＭＰＫは、骨格筋運動のように細胞内ＡＭＰ／ＡＴＰ比が上昇するような状況下においてリン酸化されることにより活性化され、糖、脂質の代謝を促進する。
【０００４】
ＡＭＰＫが活性化されると、ＡＣＣ（Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）をリン酸化することにより不活性化し、ＡＣＣの代謝により生じるマロニルＣｏＡレベルが低下する。マロニルＣｏＡの低下により、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼを介した脂肪酸のミトコンドリアへの取り込みが増加し、ベータ酸化が亢進することが知られている（例えば、非特許文献１参照）。また、ＡＭＰＫの活性化により、糖取り込みの亢進が起こることも知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
さらに近年、ＡＭＰＫをＰＰＡＲδ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｅｒ  ｄｅｌｔａ）の活性化と組み合わせることにより、運動持久力増大をはじめとした、運動時と同様の生体応答が認められることが報告された（例えば、非特許文献２参照）。
【０００６】
これまでにＡＭＰＫを活性化する化合物として、糖尿病治療薬のメトホルミンやＡＩＣＡＲ（５−ａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ−４−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）等が知られている。また、天然由来の化合物として数種のポリフェノールがＡＭＰＫを活性化することが知られている（例えば、特許文献１及び非特許文献３参照）。
【０００７】
一方、トマトは、野菜の中で最も多く栽培されており、世界中で広く食され、人々の健康増進に高く貢献している野菜である。トマトには多くの種類の機能的な栄養成分が含まれ、長年にわたってその研究が進められてきた。
【０００８】
トマト果皮に存在するポリフェノールの一種であるナリンゲニンカルコンは、アレルギーを抑制するという報告がある（例えば、非特許文献４参照）。また、ナリンゲニンカルコンは、肥満・糖尿病患者において低値を示すアディポネクチンの分泌を、分肥満・糖尿病モデル動物において亢進させることが知られている（例えば、特許文献２参照）。
【０００９】
しかし、現在までに、ナリンゲニンカルコンのＡＭＰＫに対する作用、あるいは健常人の糖代謝に及ぼす作用は、知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−３１４４４６号公報
【特許文献２】特開２００８−１１５１６３号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，ｖｏｌ．９１，ｐ１０１７−１０２８，２００１
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１３４，ｐ４０５−４１５，２００８
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．ｖｏｌ．３８８，ｐ３７７−３８２，２００９
【非特許文献４】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．６８，ｐ１７０６−１７１１，２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ＡＭＰＫ活性化剤及び血糖上昇抑制剤を提供することを目的とする。本発明は、また、生活習慣病及びこれに関連する疾患の予防又は治療用組成物並びに糖尿病予防用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の課題を解決するために、本発明者は鋭意研究を重ね、トマト果皮から分離したナリンゲニンカルコンがＡＭＰＫを活性化する作用を有することを発見した。また、健常マウスにおいて、ナリンゲニンカルコンが顕著な血糖値の上昇抑制作用を有することを発見した。さらに、ナリンゲニンカルコンをγ−サイクロデキストリンで包接することにより、組成物中のナリンゲニンカルコンの安定性が高まることも発見した。
【００１４】
本発明者による前記の知見に基づく本発明は、以下の通りである。
〔１〕
ナリンゲニンカルコン又はその誘導体を含有するＡＭＰＫ活性化剤。
〔２〕
ナリンゲニンカルコン又はその誘導体を含有する血糖上昇抑制剤。
〔３〕
ナリンゲニンカルコン又はその誘導体を含有する、生活習慣病及び生活習慣病に関連する疾患の予防又は治療用組成物。
〔４〕
前記ナリンゲニンカルコン又はその誘導体の含有量が、０．００１〜１０重量％である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の剤又は組成物。
〔５〕
トマト加工飲食品である、〔４〕に記載の剤又は組成物。
〔６〕
前記ナリンゲニンカルコン又はその誘導体がγ−サイクロデキストリンで包接されている、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の剤又は組成物。
〔７〕
ナリンゲニンカルコン又はその誘導体を含有する、糖尿病予防用組成物。
〔８〕
脂質代謝促進剤、糖質代謝促進剤、脂肪蓄積抑制剤又は運動代替剤である、〔１〕に記載の活性化剤。
〔９〕
ナリンゲニンカルコン又はその誘導体をγ−サイクロデキストリンで包接する工程を含む、〔６〕に記載の剤又は組成物の製造方法。
〔１０〕
ナリンゲニンカルコン又はその誘導体をγ−サイクロデキストリンで包接する工程を含む、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の剤又は組成物中のナリンゲニンカルコンの安定化方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ＡＭＰＫ活性化剤、血糖上昇抑制剤並びに生活習慣病及びこれに関連する疾患の予防又は治療用組成物並びに糖尿病予防用組成物を提供することができる。本発明の活性化剤及び組成物の有効成分は、トマト果皮から得ることができる成分であり、安全に摂取することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ナリンゲニンカルコンによる、ＨｅｐＧ２細胞（肝細胞）におけるリン酸化されたＡＭＰＫ（ｐ−ＡＭＰＫ、活性化型）の亢進を示す（実施例２）。
【図２】ナリンゲニンカルコンによる、Ｌ６細胞（骨格筋細胞）におけるリン酸化されたＡＭＰＫ（ｐ−ＡＭＰＫ、活性化型）の亢進を示す（実施例３）。
【図３】ナリンゲニンカルコンによる、ＩＣＲマウスにおける血糖上昇抑制作用を示す（実施例４）。
【図４】実施例５で得た飲料（γ−ＣＤ有）と実施例６で得た飲料（γ−ＣＤ無）中のナリンゲニンカルコンの安定性を示す（実施例７）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を具体的に説明する。本発明の組成物、活性化剤及び抑制剤（以下、単に「本発明の組成物」ともいう）は、ナリンゲニンカルコン又はその誘導体を有効成分とする。ナリンゲニンカルコン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ  ｃｈａｌｃｏｎｅ，ｔｒａｎｓ−２’４’６’４−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ  ｃｈａｌｃｏｎｅ）は、以下の構造を有する化合物である。
【化１】
2012236793.tif 000002
【００１８】
ナリンゲニンカルコンは、ポリフェノールの一種であり、トマト果皮に特徴的に多く含まれることが知られる公知の化合物である。
【００１９】
本発明の組成物における有効成分であるナリンゲニンカルコンは、所望の作用（ＡＭＰＫ活性化作用、血糖上昇抑制作用等）を有する限り、上記の構造の一部が改変又は修飾された誘導体であっても良い。ナリンゲニンカルコンの誘導体としては、例えば、生理学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグ等が挙げられる。
【００２０】
ナリンゲニンカルコンの誘導体のうち、生理学的に許容される塩としては、特に限定されないが、例えば、アルカリ金属（ナトリウム、カリウム等）、アルカリ土類金属（マグネシウム、カルシウム等）、これらの水酸化物又は炭酸塩、アルカリ金属アルコキサイド（ナトリウムメトキサイド、カリウムｔ−プトキサイド等）との塩が挙げられる。また、無機酸（塩酸、硫酸、リン酸等）や有機酸（マレイン酸、クエン酸、フマル酸等）を付加した酸付加塩、さらにはアミンの付加塩、アミノ酸の付加塩等が挙げられる。なお、上記の塩の水和物もここでいう塩に含まれる。
【００２１】
ナリンゲニンカルコンの誘導体のうち、エステルは、アルコール又はカルボン酸とのエステル化反応で生じるエステルであれば特に限定されない。アルコールとしてはメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール等が例示され、またはカルボン酸としてはギ酸、酢酸、乳酸等が例示される。
【００２２】
ナリンゲニンカルコンの誘導体のうち、プロドラッグとは、生体に投与された後にナリンゲニンカルコンに変化して、所望の作用（ＡＭＰＫ活性化作用、血糖上昇抑制作用等）を発現する化合物を意味する。安定性や吸収性の改善、副作用の低減等を目的としてプロドラッグ化されたナリンゲニンカルコンも、ここでいう誘導体に含まれる。
【００２３】
ナリンゲニンカルコン又はその誘導体としては、市販品を用いてもよいし、化学的に合成したものを用いてもよいが、より簡便には、トマト果皮を含むトマト果実由来物からナリンゲニンカルコンを抽出することができる。
【００２４】
例えば、トマト果皮を含むトマト果実由来物に、１０〜１５倍量の５０〜９０％エタノール（例えば７０％エタノール）を加え、４０〜８０℃（例えば５０℃程度）で１〜５時間（例えば２時間程度）抽出を行うことで、ナリンゲニンカルコンを含む抽出物（粗精製物）を得ることができる。これを、酢酸エチル、ｎ‐ヘキサン等の有機溶剤を溶出液としたシリカゲルによる精製や、水‐アセトニトリル溶剤を溶出液としたＯＤＳ逆相系樹脂による精製に供することにより、ナリンゲニンカルコンを精製することができる。得られた精製物等にナリンゲニンカルコンが含まれているかは、例えば、標準品を用いたＨＰＬＣ等、常法により確認することができる。なお、本発明の組成物は、このように精製されたナリンゲニンカルコンのみを含むものに限定されず、ナリンゲニンカルコンの粗精製物を含むものであっても良い。得られた精製物や粗精製物は、そのまま本発明の組成物としてもよいし、下記の医薬品、飲食品、化粧品等に添加してもよい。
【００２５】
原料となるトマト果実由来物は、トマト果皮を含むものであれば特に限定されない。トマト果実の搾汁液を得る過程において得られる搾汁粕は、一般的に廃棄されるか、家畜飼料となるが、この搾汁粕を用いれば、廃棄原料を有効利用でき、しかも高濃度のナリンゲニンカルコンを含む組成物を容易に効率よく得ることができるため好ましい。トマトジュース、トマトピューレ、トマトペースト等に用いるトマト果実の搾汁液は、常法により、トマト果実を洗浄し、破砕したのち予備加熱を行い、次いで、これを搾汁して得られる。この搾汁の過程において、果実の約１〜５％が搾汁粕として発生する。搾汁粕は、主として果皮と種子から構成されており、この中には水溶性食物繊維であるペクチンや不溶性食物繊維であるセルロース、ヘミセルロース等の繊維質が豊富に含まれるだけでなく、ポリフェノール類も残存している。
【００２６】
ナリンゲニンカルコンは、後述の実施例に記載の通り、ＡＭＰＫ活性化作用及び血糖上昇抑制作用を有する。したがって、ナリンゲニンカルコン又はその誘導体を含有する組成物は、ＡＭＰＫ活性化剤及び血糖上昇抑制剤として用いることができる。
【００２７】
ナリンゲニンカルコン又はその誘導体のＡＭＰＫ活性化作用は、例えば後述の実施例２及び３に記載の方法を参照して確認することができる。また、血糖値上昇抑制作用は、例えば後述の実施例４に記載の方法を参照して確認することができる。特に血糖上昇抑制作用は、従来血糖上昇抑制作用が知られるナリンゲニンと比較しても顕著に高いことを本発明者は確認している。
【００２８】
また、ナリンゲニンカルコンは、健常マウスに糖負荷を行った場合（健康な人が食事をした時に相当）に、血糖上昇抑制作用を有し、こうした食後血糖上昇の抑制を積み重ねることで糖尿病の発症、進展が遅延するとの報告があることから、ナリンゲニンカルコンは、健康な人の糖尿病発症を予防する効果を有すると考えられる。したがって、ナリンゲニンカルコン又はその誘導体を含有する組成物は、糖尿病予防用組成物とすることができる。なお、本明細書中において、「糖尿病予防用組成物」とは、健康な人の糖尿病発症を予防するための組成物をいう。
【００２９】
ＡＭＰＫは、セリン／スレオニンキナーゼに属し、その１７２番目のスレオニンがリン酸化されることによって活性化されることが知られている。活性化されたＡＭＰＫは糖代謝や脂質代謝系の主要な酵素群をリン酸化し、脂肪酸のベータ酸化や糖取り込み等を促進する。また、筋肉組織では、ＡＭＰＫの活性化により糖輸送担体であるＧＬＵＴ−４の膜移行が促進され、脂肪酸のベータ酸化や糖取り込み等を促進する。従って、本発明の組成物は、ＡＭＰＫを活性化することにより、肥満、高血糖、高脂血症、糖尿病、動脈硬化症等の生活習慣病並びにこれらに関連する疾患及び状態の、予防及び／又は治療のために用いることができる。また、脂質代謝促進剤、糖質代謝促進剤、脂肪蓄積抑制剤、運動代替剤等としても用いることができる。本発明の組成物は、例えば医薬品、飲食品又は化粧品とすることができる。
【００３０】
上記の作用を有する本発明の組成物を、例えば、ＡＭＰＫ活性化作用、血糖上昇抑制作用、脂質代謝促進作用、糖質代謝促進作用、生活習慣病（肥満、高血糖、高脂血症、糖尿病、動脈硬化症等）及びこれらに関連する疾患及び状態の予防及び／又は治療作用が知られている他の食品や有効成分と併用して投与することにより、相加効果又は相乗効果を得ることもできる。このような食品や有効成分としては、例えば、各種ポリフェノール等が挙げられる。
【００３１】
また、ＡＭＰＫ活性化とＰＰＡＲδ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｅｒ  ｄｅｌｔａ）の活性化とを組み合わせることにより、運動持久力向上作用をはじめとした、運動時と同様の生体応答が得られるため、ナリンゲニンカルコン又はその誘導体とＰＰＡＲδ活性化剤をともに含有する組成物は、運動持久力向上剤、運動代替剤として用いることができる。
【００３２】
本発明の組成物は、有効成分であるナリンゲニンカルコン又はその誘導体を、乾燥重量で好ましくは０．００１〜１０重量％、より好ましくは０．００５〜８重量％、特に好ましくは０．０１〜５重量％程度含有する。なお、トマト果皮を多く含むドライトマト等を含む食品中においては、ナリンゲニンカルコンは分解され、一般的な食品はナリンゲニンカルコンを含有しない。
【００３３】
本発明の組成物の有効成分であるナリンゲニンカルコン又はその誘導体をサイクロデキストリンに包接させることで、組成物中のナリンゲニンカルコン又はその誘導体に十分な安定性を付与することができる。
【００３４】
サイクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）は、数分子のＤ−グルコースがα（１→４）グルコシド結合によって結合し、環状構造をとった環状オリゴ糖の一種であり、代表的なものとして、α−サイクロデキストリン（６分子のグルコースが結合）、β−サイクロデキストリン（７分子のグルコースが結合）及びγ−サイクロデキストリン（８分子のグルコースが結合）が知られる。これらの中でも、特に、包接後のナリンゲニンカルコンの安定性が高いという観点から、ナリンゲニンカルコン又はその誘導体をγ−サイクロデキストリンに包接させることが望ましい。
【００３５】
サイクロデキストリンは、通常、難水溶性物質の可溶化に用いられるが、サイクロデキストリンは親水性物質であるナリンゲニンカルコンの安定性にも寄与する。また、サイクロデキストリンのうち、特にγ−サイクロデキストリンは、ナリンゲニンカルコンの包接分子サイズと適合し、包接分子サイズの小さいα−サイクロデキストリンやβ−サイクロデキストリンよりも安定性への効果が大きい。
【００３６】
サイクロデキストリンとしては、簡便には市販品を用いることができる。デンプンにサイクロデキストリン・グルコシルトランスフェラーゼを作用させる等の工程を経て得られるものを用いることもできる。
【００３７】
γ−サイクロデキストリンにナリンゲニンカルコン又はその誘導体を包接させる方法は、一般にサイクロデキストリンに化合物を包接させる方法と同様の方法を用いることができる。具体例を挙げると、ナリンゲニンカルコンとγ−サイクロデキストリンを、５０〜８０℃の温度（例えば７０℃程度）で、数十分〜数時間程度（例えば４０分程度）水溶液中で攪拌することにより、γ−サイクロデキストリンのナリンゲニンカルコン包接物を得ることができる。
【００３８】
また、上記包接方法において、水の代わりに、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類等の有機溶媒を用いることも可能である。水を含めたこれらの溶媒は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。本発明の組成物を飲食品とする場合、上記の溶媒は飲食可能な溶媒であることが好ましい。
【００３９】
ナリンゲニンカルコン又はその誘導体をγ−サイクロデキストリンに包接させる際のナリンゲニンカルコン又はその誘導体とγ−サイクロデキストリンとの混合比は、モル比で１：１０〜１：１０００００の範囲であることが好ましく、モル比で１：１５〜１：１０００の範囲であることがさらに好ましい。ナリンゲニンカルコン又はその誘導体に対するγ−サイクロデキストリンの量が少ないとナリンゲニンカルコン又はその誘導体を十分に包接できないことがあり、また、多量のγ−サイクロデキストリンを用いると、得られるγ−サイクロデキストリン包接物の水に対する溶解性に問題が生じることがある。
【００４０】
上記の手法により、本発明の組成物中のナリンゲニンカルコン又はその誘導体の安定性が高まる。したがって、本発明は、ナリンゲニンカルコン又はその誘導体をγ−サイクロデキストリンで包接する工程を含む、本発明の組成物の製造方法並びに本発明の組成物中のナリンゲニンカルコン又はその誘導体の安定化方法にも関する。
【００４１】
ナリンゲニンカルコン又はその誘導体及びナリンゲニンカルコン又はその誘導体の包接物の、溶液中における安定性は、例えば、後述の実施例７を参照してナリンゲニンカルコン又はその誘導体を測定することにより、判断することができる。
【００４２】
本発明の組成物を医薬品とする場合、常法により、薬学的に許容可能な賦形剤を添加して医薬製剤とすることができる。医薬製剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、チュアブル、トローチ等の経口剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、貼付剤等の外用剤、注射剤、舌下剤、吸入剤、点眼剤、坐剤等の剤型であることができる。好ましい剤型は、経口剤である。
【００４３】
本発明の組成物の投与量は、対象疾患及び状態、疾患の程度、対象者の年齢、体重等に応じて適宜設定することができるが、通常成人一日当たりナリンゲニンカルコン又はその誘導体を乾燥物換算で０．１〜２，０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは２〜３００ｍｇ／ｋｇ体重程度投与することができる。投与は単回投与でも数回に分けた投与でもよい。
【００４４】
本発明の組成物の投与経路は、特に限定されず、経口投与でも非経口投与でも投与可能であるが、簡便には経口投与により投与することができる。
【００４５】
摂取容易性の観点から、好ましくは本発明の組成物を飲食品とすることができる。飲食品としては、サプリメント、特定保健用食品、栄養機能食品、健康食品、機能性食品、健康補助食品、通常の飲食品が挙げられる。形状としては、ジュース、清涼飲料、ドリンク剤、茶等の液状、ビスケット、タブレット、顆粒粉末、粉末、カプセル等の固形、ペースト、ゼリー、スープ、調味料、ドレッシング等の半流動状が例示される。これらの飲食品は、いずれも当業者に公知の手法を用いて、ナリンゲニンカルコン又はその誘導体を添加して製造することができる。
【００４６】
上記の飲食品は、生活習慣病（例えば肥満、高血糖、高脂血症、糖尿病、動脈硬化症等）予防作用、生活習慣病改善作用、脂質代謝促進作用、糖質代謝促進作用、脂肪蓄積抑制作用、運動持久力向上作用、運動代替作用等の作用を有する旨の表示を付した飲食品であってもよい。
【００４７】
上記の飲食品の摂取量は、用途に応じて適宜調整することができるが、例えば、ナリンゲニンカルコン又はその誘導体を乾燥物換算で０．１〜２，０００ｍｇ／日、好ましくは２〜３００ｍｇ／日摂取することができる。摂取回数は特に制限されないが、好ましくは１日１〜３回であり、必要に応じて摂取回数を増減してもよい。
【００４８】
本発明の組成物は、好ましくはトマト加工飲食品である。通常の飲食品にナリンゲニンカルコンを添加した場合、特有の赤みを帯び、特有の粉っぽさが生る。一方、トマト加工飲食品にナリンゲニンカルコンを添加した場合、トマト加工飲食品の色、香り、味覚等官能面に影響を与えることがない。トマト加工飲食品の例としては、トマトジュース、トマトミックスジュース、トマトケチャップ、トマトソース、チリソース、トマト果汁飲料、固形トマト、トマトピューレ、トマトペースト、トマトスープ等が挙げられる。これらのトマト加工飲食品は、通常のトマト加工飲食品の製造法（レシピ等）に従い、ナリンゲニンカルコンを添加してそれぞれ通常の製法に従って調製される。
【００４９】
本発明の組成物は、化粧品であってもよい。化粧品としては、特に限定されないが、例えば、化粧水、化粧クリーム、乳液、ファンデーション、口紅、整髪料、ヘアトニック、育毛料、歯磨き、洗口料、シャンプー、リンス等が挙げられる。化粧品を調製する場合には、植物油等の油脂類、ラノリンやミツロウ等のロウ類、炭化水素類、脂肪酸、高級アルコール類、種々の界面活性剤、色素、香料、ビタミン類、植物・動物抽出成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、保存剤等、通常の化粧品原料として使用されているものを適宜配合して常法により製造することができる。
【実施例】
【００５０】
以下に実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何ら制限されるものではない。
【００５１】
［実施例１］
（トマト果皮からのナリンゲニンカルコンの抽出）
乾燥トマト果皮２０ｋｇを２４０Ｌの水で５０℃、２時間洗浄し、夾雑物を抽出除去した。ついで、抽出滓を回収し、溶剤として７０％エタノール２４０Ｌを加えて、７０℃で加熱しながら２時間抽出した。得られた抽出溶液を濾別したのちに、濾液を減圧濃縮し、減圧濃縮物を得た。その減圧濃縮物について、酢酸エチル、ｎ−ヘキサンといった有機溶剤を溶出液としたシリカゲルによる精製、及び水−アセトニトリル溶剤を溶出液としたＯＤＳの逆相系樹脂による精製を行い、ナリンゲニンカルコンを得た。
【００５２】
［実施例２］
（ナリンゲニンカルコンによる肝細胞におけるＡＭＰＫ活性化作用の評価）
肝細胞株ＨｅｐＧ２を用いてナリンゲニンカルコンによるＡＭＰＫの活性化作用の評価を行った。ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣより入手）を１００ｍｍディッシュに播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養した。サブコンフルエント時にＦＢＳを含まないＤＭＥＭに培地交換し、１８時間さらに培養を行った。培地を除去した後、実施例１で得たナリンゲニンカルコン１００μＭ（試験サンプル）又はメトホルミン（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）２ｍＭ（ポジティブコントロール）を含む培地を添加し、それぞれ３０分間培養した。サンプル溶媒のＤＭＳＯのみを添加したものをコントロールとし、同様に培養した。
【００５３】
培養液を除去後、氷冷したＰＢＳにて細胞を洗浄し、細胞を回収した。２，０００×ｇ、４℃で２分間遠心して得られたペレットにｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（１×ＰＢＳ、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、０．２５％  デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｓｉｇｍａ社製）を２００μＬ添加して懸濁した。氷上で３０分間インキュベートした後、１６，０００×ｇ、４℃で５分間遠心して得られた上清を細胞溶解サンプルとした。
【００５４】
このサンプルのタンパク質濃度をＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）により測定し、各サンプルのタンパク質量が１５μｇになるようにして１０％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質を膜に転写後、１次抗体（ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏＡＭＰＫ又はａｎｔｉ−ＡＭＰＫ、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、２次抗体（ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＨＲＰ  ｃｏｕｊｕｇａｔｅｄ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）、及び検出試薬（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、リン酸化されたＡＭＰＫ（ｐ−ＡＭＰＫ）又はＡＭＰＫを検出した。結果を図１に示す。ナリンゲニンカルコンによりＡＭＰＫはリン酸化され、活性化されることがわかった。
【００５５】
[実施例３]
（ナリンゲニンカルコンによる骨格筋細胞におけるＡＭＰＫ活性化作用の評価）
骨格筋細胞株Ｌ６を用いてナリンゲニンカルコンによるＡＭＰＫの活性化作用の評価を行った。Ｌ６細胞（ＡＴＣＣより入手）を１００ｍｍディッシュに播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養した。細胞がコンフルエントに到達した後、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに培地交換した。以後２日ごとに同様に培地交換して培養を続け、筋管が形成されてきたことを確認した後、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭに培地交換し、１８時間さらに培養を行った。
【００５６】
培地を除去した後、実施例１で得たナリンゲニンカルコン１００μＭ（試験サンプル）又はメトホルミン（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）２ｍＭ（ポジティブコントロール）を含む培地を添加し、それぞれ３０分間培養した。サンプル溶媒のＤＭＳＯのみを添加したものをコントロールとし、同様に培養した。培養液を除去後、氷冷したＰＢＳにて細胞を洗浄し、細胞を回収した。２，０００×ｇ、４℃で２分間遠心して得られたペレットにｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（１×ＰＢＳ、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、０．２５％  デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｓｉｇｍａ社製）を２００μＬ添加して懸濁した。氷上で３０分間インキュベートした後、１６，０００×ｇ、４℃で５分間遠心して得られた上清を細胞溶解サンプルとした。
【００５７】
このサンプルのタンパク質濃度をＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）により測定し、各サンプルのタンパク質量が１５μｇになるようにして１０％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質を膜に転写後、１次抗体（ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏＡＭＰＫ又はａｎｔｉ−ＡＭＰＫ、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、２次抗体（ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＨＲＰ  ｃｏｕｊｕｇａｔｅｄ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）、検出試薬（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いてリン酸化されたＡＭＰＫ（ｐ−ＡＭＰＫ）又はＡＭＰＫを検出した。結果を図２に示す。ナリンゲニンカルコンによりＡＭＰＫはリン酸化され、活性化されることがわかった。
【００５８】
[実施例４]
（ナリンゲニンカルコンによる血糖上昇抑制作用の評価）
ＩＣＲマウス（日本クレア社生産）を用いてナリンゲニンカルコンによる血糖上昇抑制作用について確認した。５週齢雄性マウスを１週間ＭＦ飼料（オリエンタル酵母社製）にて予備飼育後、１８時間絶食させ、血糖及び体重に群間で差が生じないように群分けした。１群７匹とし、群分けは以下のように行った。ｃｏｎｔｒｏｌ群（溶媒対照として０．５％  ｃａｒｂｏｘｙ  ｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ナリンゲニン群（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製ナリンゲニン２５０ｍｇ／ｋｇ）、ナリンゲニンカルコン群（実施例１で得たナリンゲニンカルコン２５０ｍｇ／ｋｇ）。マウスに試験サンプルを含む溶液を経口投与し、３０分後さらに１，５００ｍｇ／ｋｇとなるように経口糖質負荷（パインデックス＃１００、松谷化学工業社製）を行った。
【００５９】
負荷３０、６０及び１２０分後に尾静脈より採血を行い、アントセンスIII（堀場社製）を用いて血糖値測定を行った。結果を図３に示す。ナリンゲニンカルコンは、健常マウスにおいて、血糖上昇抑制作用を有することが知られているナリンゲニンと比べても、顕著に高い血糖上昇抑制作用を示し、負荷３０分後の血糖上昇を７０％以上抑制し、負荷６０分後の血糖上昇も４５％程度抑制した。なお、本実施例では健常マウスに糖負荷を行った場合（健康な人が食事をした時に相当）に、ナリンゲニンカルコンによる血糖上昇抑制作用を確認することができた。こうした食後血糖上昇の抑制を積み重ねることで糖尿病の発症、進展が遅延するとの報告があることから、ナリンゲニンカルコンは、健康な人の糖尿病発症を予防する効果を有すると考えられた。
【００６０】
［実施例５］
（γ−サイクロデキストリンで包接されたナリンゲニンカルコンを含有する健康飲料の製造）
７０℃に加温した混合タンク内で、トマト果皮抽出物（ナリンゲニンカルコン  ０．４％含有、実施例１におけるシリカゲル精製前の減圧濃縮物）０．７２ｋｇ、クエン酸０．１３ｋｇ、ショ糖脂肪酸エステル（リョートーシュガーエステル Ｐ−１５７０、三菱化学フーズ社製）０．０３ｋｇ、キサンタンガム（サンエースＮＸＧ−Ｓ、三栄源エフエフアイ社製）０．２ｋｇ、安息香酸Ｎａ０．０６ｋｇ及びγ−サイクロデキストリン（ＣＡＶＡＭＡＸ Ｗ８  ＦＯＯＤ、シクロケム社製）０．２８８ｋｇを、水９８．５７２ｋｇに溶解し、７０℃に保ちながら４０分間混合することで、γ−サイクロデキストリンで包接されたナリンゲニンカルコンを含有する健康飲料を得た。飲料製造に用いたナリンゲニンカルコンとγ−サイクロデキストリンのモル比は、約１：２０であった。
【００６１】
［実施例６］
（ナリンゲニンカルコンを含有する健康飲料の製造）
γ−サイクロデキストリンの代わりに水を０．２８８ｋｇ配合した以外は実施例５と全く同様にして、ナリンゲニンカルコンを含有する健康飲料を得た。
【００６２】
［実施例７］
（ナリンゲニンカルコンの安定性評価）
実施例５及び６で得た各健康飲料について、ナリンゲニンカルコンの安定性を評価した。各健康飲料を５０ｍＬガラス瓶に充填後、４０℃の条件下で保存し、保存開始から１、２、３、６及び１３日後に、ナリンゲニンカルコンの残存量の経時的変化を測定した。ナリンゲニンカルコンの測定は下記の通り行った。
【００６３】
各飲料２００μＬにＤＭＳＯを２００μＬ加え、さらに内部標準として５ｍｇのｐ−アミノ安息香酸ブチルを１００ｍＬのＤＭＳＯに溶解させたものを２００μＬ添加し２分間超音波処理を行った。これにイソプロピルアルコールを４００μＬ加えて混和し、さらに２分間超音波処理を行った。これを１００００ｒｐｍ、１０分間遠心し、得られた上清をＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣ条件は下記の通りである。カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ１２０  （４．６ｍｍφ×１５ｃｍ）、移動相：水：アセトニトリル：トリフルオロ酢酸＝７８．９：２１：０．１、カラム温度：３０℃、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ（内部標準の保持時間は約４４分）。
【００６４】
ナリンゲニンカルコンの測定結果を図４に示す。実施例６のγ−サイクロデキストリンを用いていない飲料では、１３日後にナリンゲニンカルコンの残存量が７０％まで低下していた。一方、実施例５のγ−サイクロデキストリンで包接されたナリンゲニンカルコンを含む飲料では、ほとんどナリンゲニンカルコンの分解が認められず、安定に存在していた。
【００６５】
［実施例８］
（ナリンゲニンカルコンを含有するトマト加工飲食品の製造）
以下にナリンゲニンカルコンを原料の一部として使用するトマト加工飲食品の製造例を示す。なお、以下の製造例において、ナリンゲニンカルコンは好ましくはγ−サイクロデキストリンで包接されている。
【００６６】
１．トマトジュース
シーズンパックトマトジュースの製造方法には、トマト洗浄、選別、破砕、加熱、搾汁、調合、脱気、殺菌、充填、冷却及び箱詰め工程があり、この調合工程で、搾汁したトマトジュースにナリンゲニンカルコンを添加して調合し、有塩の場合のみ食塩が加えられ、窒素ガスを混合して減圧脱気して、溶存酸素濃度を３ｐｐｍ以下とした後、１２１℃、約１分の加熱殺菌をして、９０℃まで冷却され、缶に充填される。また、濃縮還元品の製造法は、開けだし工程で、トマト濃縮物を開けだし、規定の無塩可溶性固形分（４．５以上）に水希釈する。その後、ナリンゲニンカルコンを添加して調合し、脱気、殺菌、充填、冷却及び箱詰め工程を経て製造される。
【表１】
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【００６７】
２．野菜ミックスジュース
搾汁したトマトジュース、あるいは、トマト濃縮物を規定の無塩可溶性固形分（４．５以上）に水希釈して得たトマトジュースに、各種野菜汁及びナリンゲニンカルコンを添加して調合し、脱気、殺菌、充填、冷却及び箱詰め工程を経て製造される。
【表２】
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【００６８】
３．トマトソース
以下の表に示す全原材料を混合して、窒素ガスを混合して減圧脱気して溶存酸素濃度を３ｐｐｍ以下とした後、２号缶に充填し、１１０℃、３０分のレトルト殺菌をする。
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明のナリンゲニンカルコンを有効成分とする組成物は、ＡＭＰＫ活性化剤や血糖上昇抑制剤として利用することができる。また、生活習慣病及びこれに関連する疾患を予防又は治療するため並びに糖尿病を予防するために利用することができる。本発明は、医薬品、飲食品、化粧品等の分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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