(57)【要約】【課題】本発明は、必須アミノ酸のシステイン、メチオニンおよび二次代謝物の同定、移動、代謝速度などを精緻な解明を容易にする事を目指し、硫黄の安定同位体を使用する肥料組成物、該組成物を使用した生育方法およびそこから得られる生物を提供することにある。【解決手段】上記目的を達成するために、従来の炭素、窒素を主にした標識でなく、硫黄元素に着目した安定同位体を使用した標識により上記課題を解決するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫黄の安定同位体を硫酸塩、硫化物、アミノ酸の一種ないし二種以上として含有する事を特徴とする肥料組成物。
【請求項２】
請求項１において、硫黄の安定同位体が３４Ｓである事を特徴とする肥料組成物。
【請求項３】
請求項１において、硫黄の安定同位体が３３Ｓである事を特徴とする肥料組成物。
【請求項４】
請求項１ないし３において、硫黄の安定同位体化合物が水に易溶性であることを特徴とする肥料組成物。
【請求項５】
請求項１ないし４において、硫黄の安定同位体化合物が硫酸塩であり、そのカウンターカチオンがナトリウムでないことを特徴とする肥料組成物。
【請求項６】
植物を育成する際に請求項１ないし５に記載の肥料組成物を使用することを特徴とする方法。
【請求項７】
藻類を育成する際に請求項１ないし５に記載の肥料組成物を使用することを特徴とする方法。
【請求項８】
酵母、菌類を育成する際に請求項１ないし５に記載の肥料組成物を使用することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項６ないし８により生育させた硫黄の安定同位体を天然存在率より高めた事を特徴とする植物、藻類および酵母、菌類
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、肥料に関し、特に、硫黄の安定同位体濃度を高めた肥料およびそれを使用する方法並びにそれを使用して得られる生物に関する。
【背景技術】
【０００２】  近年、創薬に関する分野で植物、動物などの二次代謝物が重要な役割を果たしている。二次代謝物を同定する上で、安定同位体で標識された物質は、特に、高性能な処理能力で効率的な質量分析装置（ＭＳ）により重要性が増している。この技術は、分子質量に関していかなる制限を課すことなく多くの様々な潜在的被検体に対して使用することができるが、個々の物質の検出において、分解スペクトルおよび個々の分子ピークの両方を適宜特定しなければならないという問題が生じる可能性がある。信頼性のあるＬＣ−ＭＳの利用および方法を確実にするために、いわゆる内部標準物質がますます重要になってきた。内部標準は、標的被検体そのものに極めて似ている、すなわち、特に、同じ分子構造を有する可能性があるが、分子量は異なる物質である。それゆえ、標的被検体の同位体標識した分子、すなわち、分子内の１個または数個の原子がこれらの同位体に置き換えられている分子は、理想的な内部標準であることがわかった。現在、このような物質は、例えば、炭素または窒素を対応するより重い同位体で置換する有機合成によって生成されている。また、該当する生物の代謝物を標識して標準化することも行われてきた。【０００３】  そのため、炭素、窒素の元素の安定同位体化合物が使用され、以下の特許文献に見られるように一定の成果を挙げてきたが、全解析を行うには未だ充分とは言えない状況にある。【０００４】  また、生体を活用して得られる生成物を標識する為にも、安定同位体を含有する培地の記載があるが、その使用法がバイオポリマー等に限定的であり、生物が生産する二次代謝物を深く究明するものになっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−５３０９９
【特許文献２】特表２００２−５２３０７３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  前項の課題を解決する為に、従来の炭素、窒素を主にした標識でなく、硫黄元素に着目し、必須アミノ酸のシステイン、メチオニンおよび二次代謝物の同定、移動、代謝速度などを精緻な解明を容易にする事を目指した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  硫黄の安定同位体使用することを特徴とする肥料組成物により、生物を育成し、必須アミノ酸のメチオニン、システインおよび二次代謝物の分かり易い解析を行う事が期待される。【０００８】  分析手段としては、生物を抽出、酸による分解処理により脂質も抽出後、アミノ酸および二次代謝物に注目して質量分析計により解析する。【０００９】  硫黄の安定同位体として、３４Ｓおよび３３Ｓが存在する。天然存在比は、３４Ｓが約４．２％、３３Ｓが約０．７５％で存在する。上記、質量分析計での解析は、ＬＣ−ＭＳで両方の安定同位体化合物について可能であるが、工業的な観点から、３４Ｓが価格の面で対応がし易い。【００１０】  最近では、赤外またはラマン分光法で存在を求める事も可能であり、有効な解析が可能となる。【００１１】  一方、３３Ｓは核スピン３／２を有し、ＮＭＲ解析で有効である為、重水やクロロホルムなどの有機溶媒などで３３Ｓを使用して育成した生物を抽出、酸による分解処理により脂質も抽出後、アミノ酸および二次代謝物を処理により得られた成分をＮＭＲを用いて解析を行う事ができる。【００１２】  肥料の成分としての化合物は、３３Ｓもしくは３４Ｓの硫酸塩、硫化物、アミノ酸を使用することができる。該化合物の中で、易溶性の物が好ましい。易溶性とは水への溶解度が少なくとも１ｇ／１００ｍＬのものを言う。【００１３】  前記化合物において、硫酸塩は好ましいのであるが、その際に使用する、カウンターカチオンは、一価、二価、三価のカチオン種を用いる事ができるが、使用する一価のカチオン種としてはナトリウム、カリウムイオン、アンモニウムイオン、二価のカチオン種としては、マグネシウム、カルシウム、三価のカチオン種には。アルミニウムを例示できるが、好ましくは、アンモニウム、カリウム、マグネシウムである。また、植物のナトリウム−カリウムポンプの為か明快ではないが、ナトリウムイオンを使用しないことが好ましい。【００１４】  具体的な、肥料組成は対象とする生物により異なるが、多量要素のＮ、Ｐ、Ｋ、Ｓおよび微量要素Ｆｅ、Ｂ、Ｚｎ、Ｍｏを使用する。【００１５】  このようにして得る肥料組成物は標識生物を育成、飼育する為に、水耕液としても培養液としても応用できるものである。【００１６】  本出願の肥料組成物を使用する対象を例示すれば、一般的な植物、野菜、果実を示す事ができる。具体的には、シロイヌナズナ、バジル、ブロッコリー、サクラソウ、ホレンソウ、トウモロコシ、タマネギ、セイジ、トマト、小麦、赤カブ、チコリー、ポテト、ナス、キウリ、米、イチゴ、リンゴ、モモ、メロンなどを挙げることができる。【００１７】  特に水耕では、クロレラ、スピルリナ、ドナリエラ、フォルフィリディウム、ヘマトコッカス等の微細藻類を対象として、組成を組み立てる事もできる。【００１８】  また、酵母、大腸菌などの菌類を対象として、組成を組み立てる事もできる。前述の生物とは、ここまでに示した植物、微細藻類、酵母、菌類を言う。【００１９】  特に、食性が可能なものについては、動物、昆虫等に食させ、標識を図ることも可能である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】  以下、本発明を実施するための形態（以下、「実施形態」という）を説明する。
【実施例】
【００２１】  実施例１
３４Ｓ（純度９８％：ＳＩサイエンス社調達）３．１ｇを磁性坩堝に秤量し、該坩堝を３Ｌの三口セパラブルフラスコに入れた。一つの口から室温下で酸素を７００ｍＬ／分で導入し、もう一つの口から硫黄の酸化ガスを排出ガスとして取り出した。残る口は系内の温度を測定する為に使用した。酸化ガスは、３０％濃度の過酸化水素水４．５ｍＬを５００ｍＬの水に溶解させた８００ｍＬの吸収ビン３本をシリーズで繋いだ中に導入する事で捕捉した。その後、吸収ビンで捕捉した水溶液を５０℃にてエバポレーターを用いて濃縮、乾燥し、７．５ｇの３４Ｓ−硫酸を得た（以下、［表３］では「硫酸」という）。収率は８４．５％であった。
ここで得た３４Ｓ−硫酸５．０ｇを水２００ｍＬに溶解させた硫酸水溶液を攪拌しながら、３Ｎ水酸化カリウムをゆっくり滴下し３４Ｓ−硫酸カリウムを製造した。上記と同様に、濃縮、乾燥して３４Ｓ−硫酸カリウム８．５ｇ得た（９５％収率）（以下、［表３］では「硫酸塩」という）。
該３４Ｓ−硫酸カリウムを含む［表１］記載の化合物を用いて、４０Ｌの液体肥料組成物（以下、「組成物」という）を調製した。
【表１】
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３４Ｓは［表１］記載の組成物中の全硫黄に対して、１００モル％であった。
上記の組成物を使用して、シロイヌナズナを以下の条件にて生育させた。純水に充分水を吸わせて水に浮かせたスポンジ上に、シロイヌナズナを播種し、２２℃の無菌箱にて１週間生育させたのち、充分に洗浄したバーミュキュライトを詰めた直径６０ｍｍのポリポットに移植して、本組成物を施し、２２℃、１６時間照明、８時間消灯のサイクルで８週間育成した（以下、「生物」という）。
育成後、充分に水洗し、該生物から完全にバーミュキュライトを取り除いた。その後、凍結乾燥、粉砕し粉末にした。該シロイヌナズナ中の３４Ｓの安定同位体純度を求める為に、該シロイヌナズナ１．０ｍｇと標識硫黄成分を使用しない以外は同一条件化で育成、凍結乾燥後粉末にしたシロイヌナズナ９．２ｍｇとを充分に混合し全量を錫箔（Ｌｕｄｉ社製）に包み、質量分析計の前処理装置である元素分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＥＡ１１１０）にフィードし、燃焼温度１，０２０℃、ＰｏｒａｐａｋＱＳの分離カラムでＳＯ２を分離し、質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＤＥＬＴＡ  ｐｌｕｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ）にて測定した。同様にして、該シロイヌナズナ２．０ｍｇと標識硫黄成分を使用しない以外は同一条件化で育成、凍結乾燥後粉末にしたシロイヌナズナ９．２ｍｇとを充分に混合し全量を錫箔（Ｌｕｄｉ社製）に包み、質量分析計の前処理装置である元素分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＥＡ１１１０）にフィードし、燃焼温度１，０２０℃、ＰｏｒａｐａｋＱＳの分離カラムでＳＯ２を分離し、質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＤＥＬＴＡ  ｐｌｕｓ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ）にて測定した。元素分析計で測定した両者のシロイヌナズナの硫黄含有量は共に０．７９重量％であった。
また、該生物中の３４Ｓの存在量は９８％であった（ＳＩサイエンス株式会社、分析センター測定）。シロイヌナズナの成長は良好であった。【００２２】  比較例１
［表１］における３４Ｓ−硫酸カリウムに代えて、和光純薬製の非標識の硫酸カリウムを使用した以外は同様にして肥料組成物を得た。
該組成物を使用して、実施例１に示したと同一の手法、条件にてシロイヌナズナを生育した。また、同様にして、硫酸バリウムを得て、該生物を実施例１に記載の質量分析手法により測定を行い、該生物中の主となる硫黄の存在量を分析した。それらの結果は、［表３］にまとめて記す。また、シロイヌナズナの成長は良好であった。【００２３】  実施例２
実施例１において、３４Ｓ（純度９８％：ＳＩサイエンス株式会社調達）に代えて、３３Ｓ（純度９８％：ＳＩサイエンス株式会社調達）を３．１ｇ使用した以外は、同様にして３３Ｓ−硫酸を７．７ｇ得た。収率は８９％であった。また、得られた３３Ｓ−硫酸をから、同様に硫酸カリウムを得て、［表２］に記載される肥料組成物を調製した。
【表２】
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該組成物を用いたことを除いて、実施例１と同様にシロイヌナズナを育成した。育成された生物を用いて、実施例１と同様にして、生物中の主となる硫黄成分３３Ｓの存在量を測定した。実施例１と同様に各段階のデータを纏めて［表３］に示した。また、シロイヌナズナの成長は良好であった。【００２４】実施例３
実施例１の肥料組成物を得た条件を基に、改めてスケールアップして、同一の肥料組成物を調製した。該組成物を使用して、ブロッコリーを育成した。実施例１と同様の育成方法で、吸水したスポンジ上に、ブロッコリーを播種し、同一条件で発芽させたものを、無菌、無栄養素のバーミュキュライトに移植して、該肥料組成物を与えて、成長させ、成長に連れて、移植を繰り返した。１０週間後に成長したブロッコリーを凍結乾燥、粉砕を経て、質量分析計を使用して、同様に測定して、全量硫黄含有量は０．５４重量％であった。３４Ｓの存在量および、各段階のデータは纏めて［表３］に示した。また、ブロッコリーの成長は良好であった。【００２５】実施例４
以下の条件にて坂口フラスコを使用して、クロレラ・ブルガリスを生育した。水道水１Ｌに対して、尿素０．６ｇ、第一燐酸カリウム、０．３ｇ、３４Ｓ−硫酸マグネシウム０．３ｇ、ＥＤＴＡ−鉄１５ｍｇ、微量元素Ａ５溶液６ｍＬ（「藻類実験法」田宮博、渡辺篤編集、南江堂９９ページ）にグルコース２０ｇを添加したものを使用し、上記の液体１００ｍＬにクロレラ・ブルガリス５×１０８細胞を加え、３０℃、１２，０００ルクスの空気雰囲気下で生育させた。生育後、遠心分離機で濃縮、水洗後、凍結乾燥し、実施例１に示した方法にてクロレラ・ブルガルス中の３４Ｓの定量を行い、［表３］に示した。【００２６】実施例５
スピルリナを以下の条件にて生育した。すなわち、水道水１Ｌに対して、炭酸水素ナトリウム１６．８ｇ、第二燐酸カリウム０．５ｇ、硝酸ナトリウム２．５ｇ、３４Ｓ−硫酸カリウム１．０ｇ、塩化ナトリウム１．０ｇ、３４Ｓ−硫酸マグネシウム７水和物０．２ｇ、塩化カルシウム２水和物０．０４ｇ、硫酸鉄７水和物０．０１ｇ、ＥＤＴＡ−２ナトリウム０．０８ｇ、Ａ５溶液１ｍＬで構成した液を使用して行った。
生育後、遠心分離機で濃縮、水洗後、凍結乾燥し、実施例１に示した方法にてスピルリナ中の３４Ｓの定量を行い、［表３］に示した。【００２７】実施例６
［表１］に示した肥料成分中、３４Ｓ−硫酸カリウムに代えて３４Ｓ−硫酸アンモニウムを同一重量使用した以外は実施例３に従いトマトを生育した。結果を［表３］に示した。【００２８】実施例７
実施例１において水酸化カリウムを使用したところを水酸化ナトリウムに代えて、３４Ｓ−硫酸ナトリウムを合成した。［表４］にその肥料組成を示し、得られた結果および３４Ｓ−硫酸ナトリウムなどを得る過程の結果を［表３］に示した。
【表４】
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【００２９】以上の結果より、本発明の実施例から肥料の構成、製造法が示され性能について比較例に対して、性能が優れることがわかる。また、安定同位体標識された生物についても示された。
【表３】
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