(57)【要約】【課題】  土壌から線虫を簡便かつ迅速に分離出来る器具を提供する。【解決手段】  ポリチューブ及びメッシュの異なるフィルターを多層化したフィルターから成る線虫の分離器具を発明した。チューブ内で比重液と土壌分散液を用いて土壌を沈降させ、分離した線虫水溶液を取得してフィルターで線虫を取得する場合に於いて、ポリチューブを多層化したフィルターに直結することで、一度の操作で簡便に線虫をサイズ別に回収することが出来る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリチューブ及びメッシュの異なるフィルターを多層化したフィルターを用いて土壌から線虫を分離する器具。
【請求項２】
請求項１においてフィルターがナイロンメッシュである請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、農業及び園芸における土壌線虫の分析に関する。
【背景技術】
【０００２】  作物栽培において線虫を含む土壌微生物の分析は重要な課題である。一般に地上部の病害に比べ土壌病害の防除は非常に困難であり、薫蒸消毒剤をはじめ強力な農薬が多量に土壌に投与されている現状は、人体及び環境への安全性が懸念されている。土壌病原菌の分析が充分には行なわれないため、その対策が土壌丸ごとの殺菌消毒、予防的な農薬処理という単純化した方法に頼らざるを得ないのが現状である。農家が自身で土壌病害の診断を行うことは難しく、専門家に頼らざるを得ないことも原因の一つである。【０００３】  これに対して土壌線虫の密度測定や天敵微生物の寄生度の測定など、より詳細な分析を通して農薬の使用法の削減を図ることや有機質資材および天敵微生物の防除効果を確認することが検討されており、更には土壌中の微生物相を豊かにして特定の病原微生物の占有を防ぎ、化学農薬に頼らない作物の栽培を行なうことも実施され、今日、線虫をはじめ土壌微生物分析法の効率化と精緻化はますます重要な課題となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】  線虫を土壌から分離する方法は、線虫自身の活動性を利用するベルマン法や比重差を利用して物理的に分離する二層遠心浮遊法が一般的に行われている。【０００５】  ベルマン法（図１）は器具も簡便であり最も広く利用されている。水に浸けた土壌中を動く線虫は、自身の重みで段々下に落ち、時間が経つと土の下に敷かれた和紙、ティッシュを通り抜けて水の中にでる。この方法では運動性の低い線虫は集められないが観察の邪魔になる土壌粒子の混入が少ないというメリットがある。
１．土壌２０ｇを、ティッシュペーパーが敷かれた網皿に入れ、水を張ったベルマン漏斗に置く。
２．７２時間後に線虫の集まった管びんを回収する（非特許文献１）。【０００６】  線虫は水より重いので（比重約１．０５）、水の代わりに比重の重い砂糖水などを使うと線虫だけを自ら浮き上がらせることができる。二層遠心浮遊法は１回の遠心処理によって線虫が分離できるため、非常に効率的である（非特許文献２）。しかし高価な遠心分離機と電気設備が必要である。【０００７】分離率はネコブセンチュウ２期幼虫で６０％程度である。活動性の無い線虫や発育ステージの分離に利用できる点もこの方法の利点である（非特許文献３）。しかし供試できる土壌量が少ない。有機物や粘土分の多い土壌では分離率が低下しやすい。大型の線虫の分離率が低い問題点もある（非特許文献４、（図２）：非特許文献１）。【０００８】  １．５０ｍｌの遠沈管に土壌１０ｇと水２０ｍｌを入れてよくかき混ぜる。
２．遠沈管の底までピペットを挿入し、４０％砂糖水１０ｍｌを静かに入れる。
３．１，５００回転で１分間遠心。泥水は底に沈殿し、線虫は水と砂糖水の境界線に集まる。
４．上澄を２０−４０μｍのふるいでこして，ふるいの上に残った線虫を集める。あるいは水と砂糖水の境界線からピペットで線虫を吸い取る（非特許文献１）。
【非特許文献１】「平成２１年度野菜の難防除害虫（Ｂ）研修テキスト」、北海道農業研究センター
【非特許文献２】高木一夫（１９７０）応動昆１４，１０８−１１０
【非特許文献３】Ｍｉｎａｇａｗａ，Ｎ．（１９７９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｔｍｏｌ．Ｚｏｏｌ．１４，４６９−４７７，佐野善一（１９７５）日線虫研誌５，４１−４７
【非特許文献４】「線虫学実験法」日本線虫学会、２００４年３月発行
【０００９】  何れの分離法も土壌の全線虫を分離することは出来ず、常に一定部分を抽出しているに過ぎないが、夫々の特徴を理解して目的に適した方法を使うことで運用されているのが現実である。ベルマン法器具は簡便であるが分離に２−３日と時間のかかる方法である。【００１０】  二層遠心浮遊法は数十分で分離でき、死線虫や卵のうも分離でき分離率も高いことから土壌の線虫相全体を把握することができる優れた方法である。しかし高価な遠心分離機と電気設備を必要とし更に技術の熟練を要することが難点である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】  従来の器具では簡便で迅速に多種類の線虫を土壌から分離することができず、専門的技術及び知識を持たない者が線虫を分離することは困難であった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】  ポリチューブ及びメッシュの異なるフィルターを多層化したフィルターから成る線虫の分離器具を発明した。以下の線虫分離方法（チューブ法と称する）：チューブに比重液と水又は凝集剤溶液を入れて界面を形成しその上から土壌懸濁液を落下させることにより、土壌粒子は比重液底部に沈降し、線虫類を含む土壌微生物が水又は凝集剤溶液と比重液の界面に集まる。次いでチューブを横に静置してチューブから水溶液を押し出す又は絞り出して分離した線虫水溶液を取得する方法：に於いて、ポリチューブを導管を用い多層化したフィルターに直結することで、線虫溶液を押し出す圧力でフィルターを通して線虫を回収することが出来る。一度の操作で簡便に線虫をサイズ別に回収することが出来る。
【発明の効果】
【００１３】  簡便な用具であり、１０分程度で迅速に土壌微生物を分離することができ、機械装置や電源は不要である。農家自身が有害線虫の診断を行うことを可能にする技術である。植木・盆栽の輸出産業にとって検疫上重要な有害線虫であるＸｉｐｈｉｎｅｍａ属のオオハリセンチュウの分離にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】チューブ法器具の概要を示した図である。
【図２】チューブ法器具使用法の概要を示した図である。
【図３】ベルマン法器具の概要を示した図である。
【図４】二層遠心浮遊法器具の概要を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】  透明又は半透明のポリチューブを用いる。チューブの材質は例えばポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ビニル、テフロン等のポリマーであるが、チューブ内に水を入れ圧迫して水を押し出す動作に耐えられる材質であれば材料の種類を問わない。又、チューブの出口の栓及び導管も、ゴム、プラスティック、ＰＰ，ＰＥ，テフロン等を用いることが出来る。フィルターにはプラスティックメッシュ好適にはナイロンメッシュを目開き１０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２５０μｍの様に用いることが出来る。多層化したフィルターはプラスティックホルダーを積層して組み立てることが出来、容易にばらすことが出来る。
【００１６】  チューブのサイズは被検土壌の量に応じて使い分けることが出来る。好適には直径３ｃｍ、長さ１ｍ、厚さ３０μｍ以上を用いる。直径と長さの比率を変えることも出来る。厚さは水の圧力に耐えられる材質であれば変えることが出来る。
【００１７】  図２の様に器具を組み立てる。多層化フィルターは容器中の水に沈めて置くことが肝要である。チューブ及び導管中に水圧を加えることで、チューブ内の溶液系が安定し乱れることなくフィルターに押し出すことが出来る。
【００１８】  以下、チューブ法に従って操作する。底部をシールしたポリチューブに比重液を注入しピンチコック１を付ける。比重液の調整には通常ショ糖水溶液を使用するが、食塩、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、塩化カルシウム等も使用できる。線虫の比重は約１．０５であり比重液の比重は１．０５以上から１．３程度が使用できる。より好適には２０％から４０％のショ糖水溶液が使用できる。次に水又は土壌凝集剤の水溶液を注入しピンチコック２を付ける。凝集剤を使用する場合は有機系無機系を問わず土壌粒子が沈降可能な物であれば使用できる。比重液及び水又は凝集剤液の量は好適には１００ｍｌから３００ｍｌ程度である。
【００１９】  被検土壌２０ｇから１００ｇを水１００ｍｌから４００ｍｌ程度に懸濁した液を注入する。ピンチコックを順にはずすと、土壌懸濁液から土壌粒子が沈降し水又は凝集剤溶液を通過してショ糖液に移行し底部に沈降する。比重液と水又は希釈された凝集剤溶液は界面を形成する。チューブを横に静置して土壌を沈降させ、出口に導管を付けて端からチューブを押し出す、絞り出す又は巻き取ることで凝集剤溶液及び比重液を流出させると線虫溶液が得られる。土壌はチューブ内に残す。取得した線虫溶液は残り全量である。線虫溶液は１０μｍから３００μｍ程度のナイロンメッシュを多層化したパッケージに直結することで、線虫溶液を押し出す圧力でフィルターを通して線虫を回収することが出来る。多層化フィルターをばらして夫々少量の水でサンプル皿にとり生物顕微鏡で数えた。異なるメッシュのフィルターから種類の異なる線虫を夫々回収することが出来る。
【実施例】
【００２０】  発明の実施の形態を実施例に基づき説明する。本発明はこの形態に限定されるものではない。線虫汚染土壌を用意し、本発明の器具を用いてチューブ法及び二層遠心浮遊法で夫々４反復で分析し比較した（表１）。
【実施例１】
【００２１】チューブ法
底部をシールしたポリエチレンチューブ（直径３０ｍｍ  長さ１０００ｍｍ  厚さ５０μｍ）に２５％ショ糖水溶液２００ｍｌを注入しピンチコック１をする。次いで水２００ｍｌを注入しピンチコック２をする。被検土壌５０ｇを水２００ｍｌに懸濁して液を注入する。（図１）。ピンチコックを１、２の順にはずすと、土壌懸濁液から土壌粒子が沈降し水層を通過してショ糖液に移行し底部に沈降する。ショ糖液と水層は界面を形成する。チューブを横に静置して土壌を沈降させ、出口に導管を付けて端からチューブを巻き取ると水層及びショ糖液が流出し、土壌は巻き取ったチューブ内に残る。残渣土壌はポリエチレンチューブを含めて８０ｇであった。線虫溶液を５０μｍ、１００μｍ及び２５０μｍのナイロンメッシュ多層化フィルターに通して線虫を回収した。少量の水でサンプル皿にとり生物顕微鏡で数えた。【００２２】（比較例１）二層遠心法
被検土壌２５ｇを２％ヘキサメタリン酸ナトリウム液１００ｍｌに分散した。分散液は５分間超音波処理した後、２５０ｍｌ遠心管に入れた５０％ショ糖液８５ｍｌの上に加えて、遠心分離機を用いて１分間、５００ｒｐｍで２層遠心分離を行なった。上水を２０ミクロンナイロンメッシュで線虫を回収した。回収した線虫を生物顕微鏡で数え、土壌５０ｇ当りに換算した。【００２３】  上記の結果を表１に記載した。本発明の器具は簡便、迅速に、二層遠心法と同等の線虫分離を行うことが出来た。【００２４】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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