(57)【要約】【課題】ＲＪに含まれている胆汁酸結合能や高コレステロール血症改善能を備える特定の成分を有効成分とする胆汁酸結合剤、及び当該特定成分を用いて血清コレステロール量を低下させる方法の提供。【解決手段】ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２、及びＭＲＪＰ３からなる群より選択される１種以上を有効成分とすることを特徴とする、胆汁酸結合剤；ＭＲＪＰ１を有効成分とすることを特徴とする、血清コレステロール量低下剤；ＭＲＪＰ１を有効成分とすることを特徴とする、コレステロールミセルの溶解性低下剤；ＭＲＪＰ１を経口摂取することを特徴とする、血清コレステロール量を低下させる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２、及びＭＲＪＰ３からなる群より選択される１種以上を有効成分とすることを特徴とする、胆汁酸結合剤。
【請求項２】
ＭＲＪＰ１を有効成分とすることを特徴とする、血清コレステロール量低下剤。
【請求項３】
ＭＲＪＰ１を有効成分とすることを特徴とする、コレステロールミセルの溶解抑制剤。
【請求項４】
ＭＲＪＰ１を経口摂取することを特徴とする、血清コレステロール量を低下させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胆汁酸結合能を有するローヤルゼリー由来のタンパク質を有効成分とする胆汁酸結合剤及び血清コレステロール量低減剤、並びに、当該タンパク質を用いた血清コレステロール量を低下させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関（ＷＨＯ）の統計では、世界の死因の第１位は、動脈硬化症等の心臓血管疾患である。血液中のＬＤＬ−コレステロール濃度が過剰に高いことが動脈硬化症の主因と考えられており、コレステロール代謝を改善するためのより効果的な医薬品や機能性食品の開発が強く求められている。
【０００３】
近年、ローヤルゼリーの摂取により、高コレステロール血症が改善されるという報告がなされている（例えば、非特許文献１〜４参照。）。また、ローヤルゼリーには、一般成分として粗タンパク質が１２〜１５％含まれているほかに、特殊成分として１０−ヒドロキシデセン酸とロイヤリシンが含まれているが、この１０−ヒドロキシデセン酸は、高脂血症ラットの血液中のトリグリセリド、総コレステロールを減少させるという報告がなされている（例えば、非特許文献５参照。）。
【０００４】
一方で、コール酸を結合させた担体を充填させたカラムを胆汁酸結合アフィニティーカラム（胆汁酸結合能を有する成分に対するアフィニティーカラム）として用い、血清アルブミンを単離する方法（例えば、非特許文献６参照。）や、胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いて、大豆タンパク質の中から胆汁酸結合能を有するタンパク質を単離・同定する方法（例えば、非特許文献７及び８参照。）等が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ナカジン（Nakajin）、他４名、生薬学雑誌、１９８２年、第３６巻、第６５〜６９ページ。
【非特許文献２】ヴィテック（Vittek）、エクスペリエンチア（Experientia）、１９９５年、第５１巻、第９２７〜９３５ページ。
【非特許文献３】グオ（Guo）、他６名、ジャーナル・オブ・ニュートリショナル・サイエンス・アンド・ビタミノロジー（Journal of Nutritional Science and Vitaminology）、２００７年、第５３巻、第３４５〜３４８ページ。
【非特許文献４】カマクラ（Kamakura）、他２名、ジャーナル・オブ・ファーマシー・アンド・ファーマコロジー（Journal of pharmacy and pharmacology）、２００６年、第５８巻、第１６８３〜１６８９ページ。
【非特許文献５】ク（Xu）、他２名、ジョン・ヤオ・カイ（Zhong Yao Cai）（英文誌名：ジャーナル・オブ・チャイニーズ・メディシナル・マテリアルズ（Journal of chinese medicinal materials））、２００２年、第２５巻、第３４６〜３４７ページ。
【非特許文献６】パッチンソン（Pattinson）、他２名、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Journal of Chromatography）、１９８０年、第１８７巻、第４０９〜４１２ページ。
【非特許文献７】マキノ（Makino）、他４名、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry）、１９８８年、第５２巻、第８０３〜８０９ページ。
【非特許文献８】ミナミ（Minami）、他３名、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry）、１９９０年、第５４巻、第５１１〜５１７ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
また、ローヤルゼリー（以下、ＲＪ）は、働き蜂が下咽頭腺と大腮腺から分泌する乳白色ゼリー状の栄養物質である。ローヤルゼリーは女王蜂幼虫の唯一の食糧であり、様々なビタミン類、ミネラル、糖質、アミノ酸、タンパク質成分を含み、非常に栄養価が高い。また、科学的に立証されてはいないものの、昔から、疲労回復作用、抗アレルギー作用、抗癌作用、免疫増強作用等の多くの薬理作用を有すると考えられており、栄養補助食品や医薬品原料として広く用いられている。このため、ＲＪ由来の成分を有効成分とすることにより、安全な新しい高コレステロール血症予防・改善のための食品や医薬品を開発し得ることが期待される。
【０００７】
ＲＪ中には様々な成分が含まれているため、新規の医薬品や機能性食品を開発するためには、ＲＪ中の有効成分の特定が不可欠である。しかしながら、非特許文献１〜４では、ＲＪ自身には、高コレステロール血症改善効果があることは明らかにされているものの、その有効成分については全く解明されておらず、その作用機序も未解明である。
【０００８】
本発明は、ＲＪに含まれている胆汁酸結合能や高コレステロール血症改善能を備える特定の成分を有効成分とする胆汁酸結合剤、及び当該特定成分を用いて血清コレステロール量を低下させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いてＲＪから胆汁酸結合能を有する複数の成分を特定し、これらの成分の胆汁酸結合能や血清コレステロールに対する影響を調べることにより、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）  ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２、及びＭＲＪＰ３からなる群より選択される１種以上を有効成分とすることを特徴とする、胆汁酸結合剤、
（２）  ＭＲＪＰ１を有効成分とすることを特徴とする、血清コレステロール量低下剤、
（３）  ＭＲＪＰ１を有効成分とすることを特徴とする、コレステロールミセルの溶解抑制剤、
（４）  ＭＲＪＰ１を経口摂取することを特徴とする、血清コレステロール量を低下させる方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の胆汁酸結合剤や血清コレステロール量を低下させる方法においては、ＲＪ由来の胆汁酸結合剤を経口服用することにより、血清コレステロール量を安全に低下させることができる。したがって、本発明の胆汁酸結合剤等は、特に高コレステロール血症や動脈硬化症等の、血清中のコレステロール量の増大に起因する疾患に対する治療や予防効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】参考例１において、胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって、ＢＳＡ溶液及びＯｖａｌｂｕｍｉｎ溶液を分画し、各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を示したチャート図である。
【図２】実施例１において、胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって、ＲＪタンパク質溶液を分画し、各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を示したチャート図である。
【図３】実施例１において、胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いたカラムクロマトグラフィーによって、ＲＪタンパク質溶液を分画し、得られた分画物を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果、得られたＣＢＢ染色像を示した図である。
【図４】実施例２において、ゲル濾過クロマトグラフィーによってＲＪタンパク質溶液を分画し、各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を示したチャート図である。
【図５】実施例２において、スタンダードの移動度と分子量から得た検量線を示した図である。
【図６】実施例２において、分子量約２９０ｋＤａの画分を１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果、得られたＣＢＢ染色像を示した図である。
【図７】実施例２において、分子量約５１ｋＤａの画分を１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果、得られたＣＢＢ染色像を示した図である。
【図８】実施例２において、陰イオンクロマトグラフィーによって分子量約５１ｋＤａの画分を分画し、各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を示したチャート図である。
【図９】実施例２において、陰イオンクロマトグラフィーによって得られたピーク１〜４を１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果、得られたＣＢＢ染色像を示した図である。
【図１０】実施例２において、胆汁酸結合能試験により算出された各分子と結合した胆汁酸の割合を示した図である。
【図１１】実施例３において、ミセルへのコレステロールの溶解割合を示した図である。
【図１２】実施例４において、ラットへのＭＲＪＰ１の経口投与実験の概要を示した図である。
【図１３】実施例４において、ラットへのＭＲＪＰ１の経口投与実験における各ラット群の体重の変化を示した図である。
【図１４】実施例４において、ラットへのＭＲＪＰ１の経口投与実験における各ラット群の１日当たりの食餌摂取量を示した図である。
【図１５】実施例４において、ラットへのＭＲＪＰ１の経口投与実験における各ラット群の肝臓重量を示した図である。
【図１６】実施例４において、ラットへのＭＲＪＰ１の経口投与実験における各ラット群の血清総コレステロール量を示した図である。
【図１７】実施例５において、ラットへのＭＲＪＰ１の経口投与実験における各ラット群の体重の変化を示した図である。
【図１８】実施例５において、ラットへのＭＲＪＰ１の経口投与実験における各ラット群の１日当たりの食餌摂取量を示した図である。
【図１９】実施例５において、ラットへのＭＲＪＰ１の経口投与実験における各ラット群の肝臓重量を示した図である。
【図２０】実施例５において、ラットへのＭＲＪＰ１の経口投与実験における各ラット群の血清総コレステロール量を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の胆汁酸結合剤は、ＭＲＪＰ１（Ｍａｊｏｒ  ｒｏｙａｌ  ｊｅｌｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）、ＭＲＪＰ２、及びＭＲＪＰ３からなる群より選択される１種以上を有効成分とすることを特徴とする。ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２、及びＭＲＪＰ３は、後記実施例において示すように、胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いて、ＲＪから初めて単離・同定された胆汁酸結合タンパク質である。胆汁酸結合アフィニティークロマトグラフィーを使用した胆汁酸結合タンパク質の単離・同定法は、本発明者らにより初めて、ＲＪに対して適用された。
【００１４】
ＭＲＪＰ１はＲＪに含まれているタンパク質全体の約３９．４％を占めるタンパク質であり、ＭＲＪＰ２はＲＪに含まれているタンパク質全体の約２１．５％を占めるタンパク質であり、ＭＲＪＰ３はＲＪに含まれているタンパク質全体の約２１．２％を占めるタンパク質である（泉宏樹、米倉政実著。「ローヤルゼリータンパク質のプロテオーム解析」、社団法人全国ローヤルゼリー公正取引協議会、平成２０年度報告書（２００８年）、第２１ページ。）。ＭＲＪＰ１は、４３２アミノ酸からなるタンパク質であり、一般的にはＳＤＳ−ＰＡＧＥでは約５５ｋＤａの分子量として知られている（J.Schmitozova et. al, Cell.Mol.Life Sci., vol.54, p1020-1030 (1998)）。また、ＭＲＪＰ１は、アメリカ合衆国のＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター）の配列データベースに、アクセッション番号ＮＰ＿００１０１１５７９として登録されている。ＭＲＪＰ２は、４５２アミノ酸からなるタンパク質であり、一般的にはＳＤＳ−ＰＡＧＥでは約４９ｋＤａの分子量として知られている（J.Schmitozova et. al, Cell.Mol.Life Sci., vol.54, p1020-1030 (1998)）。また、ＭＲＪＰ２のＮＣＢＩのアクセッション番号はＮＰ＿００１０１１５８０である。ＭＲＪＰ３は、５４４アミノ酸からなるタンパク質であり、一般的にＳＤＳ−ＰＡＧＥでは６０〜７０ｋＤａの分子量である（J.Schmitozova et. al, Cell.Mol.Life Sci., vol.54, p1020-1030 (1998)）。また、ＭＲＪＰ３のＮＣＢＩのアクセッション番号はＮＰ＿００１０１１６０１である。
以下、これらのタンパク質を、「本発明のＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質」と総称することがある。
【００１５】
さらに、本発明においては、ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２、又はＭＲＪＰ３が有する胆汁酸結合能を損なわない限り、ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２、又はＭＲＪＰ３中の１〜数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加させてもよい。このようなアミノ酸を付加等させたタンパク質も、本発明の胆汁酸結合剤の有効成分とすることができる。例えば、ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２、又はＭＲＪＰ３のＮ末端やＣ末端にそれぞれ、１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸を付加することができる。本発明のＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質のＮ末端やＣ末端に付加させるアミノ酸配列としては、例えば、Ｈｉｓタグ等の通常、リコンビナントタンパク質の生成に用いられるタグ配列等が挙げられる。
【００１６】
本発明のＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質のうち、ＭＲＪＰ１は、胆汁酸結合能に加えて、コレステロールミセルの溶解低下作用と、血清コレステロール量低下作用とを有する。すなわち、本発明のＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質は、コレステロールミセルの溶解抑制剤及び血清コレステロール量低下剤の有効成分として好適である。なお、ＭＲＪＰ１の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつコレステロールミセルの溶解抑制能や血清コレステロール量低下能を有するタンパク質も、ＭＲＪＰ１と同様にコレステロールミセルの溶解抑制剤及び血清コレステロール量低下剤の有効成分として好適である。
【００１７】
食事由来のコレステロールは、レシチン、脂肪酸、胆汁酸等とミセルを形成し、水溶性となり、非撹拌水層（ＵＷＬ）を通過し、小腸から吸収される。このような小腸におけるコレステロール吸収メカニズムから、本発明のＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質は、小腸内において、胆汁酸と結合することにより、コレステロールのミセル形成を抑制する結果、コレステロールの吸収を抑制すると推察される。
【００１８】
本発明の胆汁酸結合剤、コレステロールミセルの溶解抑制剤、及び血清コレステロール量低下剤（以下、胆汁酸結合剤等）の有効成分であるＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質は、ＲＪから精製されたものであってもよく、遺伝子組換え技術を用いた公知の発現系により合成されたリコンビナントタンパク質であってもよく、ペプチド合成により得られた合成品であってもよい。例えば、ＲＪタンパク質溶液を胆汁酸結合アフィニティークロマトグラフィーによって分画し、ＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質を含有する画分を回収する。この回収された画分を、本発明の胆汁酸結合剤等の有効成分とすることができる。また、ＲＪタンパク質溶液をゲル濾過クロマトグラフィーによって分画し、ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２、又はＭＲＪＰ３を含有する画分を回収する。これらの回収された画分を、本発明の胆汁酸結合剤等の有効成分とすることもできる。
【００１９】
本発明の胆汁酸結合剤等は、医薬品やサプリメント等の飲食品として単独で摂取されてもよく、他の飲食用組成物や医薬用組成物と同様に、飲食品や医薬品への添加剤として用いることもできる。
【００２０】
本発明の胆汁酸結合剤等の剤型は、特に限定されるものではない。例えば、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤等であってもよい。培養細胞等へ用いられる場合には、乾燥粉末や、水や緩衝液等の適当な溶液に溶解させた液剤であることが好ましい。一方、生物個体へ用いられる場合には、経口投与に適した剤型であることが好ましく、腸溶剤であることがより好ましい。
【００２１】
本発明の胆汁酸結合剤等に含まれるＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質は、１種類のみであってもよく、２種類以上を組み合わせてもよい。また、これらの胆汁酸結合剤等に含まれるＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の量は、該ＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の胆汁酸結合能、コレステロールミセル溶解抑制能、又は血清コレステロール低下能が発揮され得る量であれば、特に限定されるものではなく、ＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の種類や、剤型等を考慮して、適宜決定することができる。
【００２２】
本発明の胆汁酸結合剤等は、本発明のＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質のみからなるものであってもよく、その他の成分を含有するものであってもよい。その他の成分としては、本発明のＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の活性を損なわない限り、どのような成分であってもよく、例えば、本発明のＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質以外のＲＪ由来の成分を含有していてもよく、胆汁酸結合能や血清コレステロール低下能を有する機能性ペプチドを含有していてもよい。その他にも、本発明の胆汁酸結合剤等は、例えば、賦型剤、結合剤、界面活性剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、滑沢剤、防腐剤、殺菌剤、着色剤、矯味矯臭剤等の、医薬品や飲食品に添加される成分を含有することができる。
【００２３】
本発明の胆汁酸結合剤等の製造方法は、含有される本発明のＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の活性を損なわない方法であれば特に限定されるものではなく、通常、機能性タンパク質を含有する飲食用組成物又は医薬用組成物を製造する場合に使用される方法を用いて製造することができる。
【００２４】
本発明の胆汁酸結合剤等の投与量は、ＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の胆汁酸結合等の活性が発揮され得る量であれば、特に限定されるものではなく、ＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の種類、対象とする細胞の種類や状態、剤形、投与方法等を考慮して適宜決定することができる。例えば、培養細胞等の生物個体外の細胞へ用いる場合には、本発明の胆汁酸結合剤又はコレステロールミセル溶解抑制剤を、培養液中のＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の含有量が１０ｍｇ〜１００mｇ／ｍＬとなるように培養液へ添加することができる。
【００２５】
生物個体に摂取させる場合には、本発明の胆汁酸結合剤等の摂取量は、該ＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の胆汁酸結合等の活性が発揮され得る量であれば、特に限定されるものではなく、摂取する人や動物の体重、年齢、性別、剤型等により適宜決定することができる。例えば、ＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の一日当たりの摂取量が３００ｍｇ〜１ｇ／ｋｇとなるように、１度に又は数回に分けて摂取させることが好ましい。
【００２６】
本発明の胆汁酸結合剤等は、経口摂取することにより、生体内において、胆汁酸と結合し、さらに、食事として摂取されたコレステロールのミセルの溶解性を低下させる結果、血清コレステロール量を低減させる。このため、本発明の胆汁酸結合剤等は、高コレステロール血症や動脈硬化症等の、血清中のコレステロール量が過剰となることに起因する疾患の治療や予防に好適である。
【００２７】
本発明の血清コレステロール量を低下させる方法（以下、血清コレステロール量低下方法）は、ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２、及びＭＲＪＰ３からなる群より選択される１種以上を経口摂取することを特徴とする。ＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質を経口摂取させる生物は、小腸や胆管等の組織を有する動物であれば特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ウシ等のヒト以外の動物であってもよい。
【実施例】
【００２８】
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２９】
［参考例１］
＜胆汁酸結合アフィニティーカラムの作製＞
胆汁酸結合アフィニティーカラムは、カルボジイミドをスペーサーとして、コール酸をカラム担体であるＥＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂに結合させることにより作製した。胆汁酸結合アフィニティーカラムの調製方法は、Ｐａｔｔｉｎｓｏｎらの方法（非特許文献６）に準じて行った。
具体的には、まず、ＥＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ担体５０ｍＬ容量に対し、６２５ｍＬの胆汁酸溶液（スペーサーとして３３．４ｍＭ  １−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ＨＣｌと３．７ｍＭのコール酸を含む５０％エタノール溶液）をｐＨ６．４で１６時間反応させ、担体にコール酸を結合させた。その後、カラムに非吸着の過剰なコール酸溶液を０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む５０％エタノールで洗浄したものを充填することにより、胆汁酸結合アフィニティーカラム（カラムのベッド容量：５０ｍＬ）を作製した。なお、カラムは使用前に０．０２％ＮａＮ３溶液にて平衡化した。
【００３０】
＜胆汁酸結合アフィニティーカラムによる分画＞
次いで、作製されたカラムが、実際に胆汁酸結合能を有する化合物に対するアフィニティーを備えているかどうかを、ＢＳＡとＯｖａｌｂｕｍｉｎをアプライすることにより、確認した。カラムからの溶出条件は、マキノらの方法（非特許文献７）に準じて行った。
まず、作製された胆汁酸結合アフィニティーカラムに、１．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液又はＯｖａｌｂｕｍｉｎ溶液をアプライした。次に、当該カラムに第１次洗浄液（０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を通し、当該カラム中の担体に吸着していなかった物質を洗浄除去した。次いで、当該カラムに、溶出液（０．５％Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を通し、コール酸と結合したタンパク質、すなわち胆汁酸結合能を有するタンパク質を溶出した。最後に、当該カラムに、第２次洗浄液（８Ｍ  ｕｒｅａ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を通し、当該カラムに非特異的に結合した物質を溶出した。
【００３１】
各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を図１に示す。図１中、「（１）」が第１次洗浄液の画分であり、「（２）」が溶出液の画分であり、「（３）」が第２次洗浄液の画分である。この結果、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎは第１次洗浄液の画分に溶出されており、ＢＳＡは溶出液の画分に溶出されていた。これらの結果から、作製された胆汁酸結合アフィニティーカラムは、非特許文献７に記載されている胆汁酸結合アフィニティーカラム同様に、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎは吸着せず、ＢＳＡを吸着することが確認された。
【００３２】
［実施例１］
＜胆汁酸結合アフィニティーカラムによるＲＪタンパク質の分画＞
参考例１で作製された胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いて、ＲＪタンパク質の分画を行い、胆汁酸結合能を有するタンパク質を単離・精製した。この胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いたＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の単離精製は、これまで報告が無く、非常に効率的な精製法である。
まず、ＲＪタンパク質溶液を調製した。具体的には、ＲＪ（中国産）に純水を加えて懸濁したものを、孔径１０ｋＤａの透析膜を用いて、純水にて７２時間透析した。透析膜内液を回収し、凍結乾燥した後、再びＮａＮ３含有トリス緩衝液（０．２％ＮａＮ３、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に懸濁し、１１７ｍｇ／２５ｍＬのＲＪタンパク質溶液（１０ｋＤａ  ｃｕｔ  ｏｆｆ  ＲＪ）を調製した。
【００３３】
次いで、参考例１で作製された胆汁酸結合アフィニティーカラムに、ＲＪタンパク質溶液をアプライした後、参考例１と同様にして、第１次洗浄液、溶出液、第２次洗浄液を順次当該カラムにアプライした。各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を図２に示す。図２中、「（１）」、「（２）」、及び「（３）」は図１と同じである。
さらに、溶出液により溶出された画分（図２中の「Ａ」、以下、「画分Ａ」）を回収した。
【００３４】
＜胆汁酸結合アフィニティーカラムにより単離・精製されたＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の同定＞
胆汁酸結合アフィニティーカラムにより単離・精製されたＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の同定を行った。
まず、画分Ａを孔径１０ｋＤａの透析膜を用いて、純水にて４℃、７２時間透析・脱塩した。透析膜内液を回収し、凍結乾燥することにより、脱塩画分Ａを調製した。
次いで、脱塩画分Ａを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、含まれているタンパク質を分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３に示す。図３中、「ｓｔｄ」は分子量マーカーを、「Ａ」は脱塩画分Ａを意味し、これらをそれぞれアプライしたものである。この結果、「Ａ」レーンには約４９〜７５ｋＤａの範囲内に３本のバンド（図３中、（１）〜（３））が検出された。この結果から、脱塩画分Ａ溶液には、胆汁酸と結合する３種類のＲＪ由来タンパク質が含まれていたことが明らかである。
【００３５】
各バンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから切り出し、還元アルキル化した後、トリプシン処理によりＩｎ−ｇｅｌ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎを行った。その後、ゲルより抽出したペプチド断片を脱塩精製して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにて質量分析を行った。この結果、図３中、バンド（１）はＭＲＪＰ３、バンド（２）はＭＲＪＰ１、バンド（３）はＭＲＪＰ２であると同定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、得られたＣＢＢ染色像を画像解析（Ｉｍａｇｅ  Ｊ分析）したところ、これら３種のタンパク質の割合は、ＭＲＪＰ１が７６％、ＭＲＪＰ２が２２％、ＭＲＪＰ３が２％であった。
【００３６】
［実施例２］
ＲＪから単離精製されたＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ２の胆汁酸結合能を測定した。
【００３７】
＜ＲＪからのＭＲＪＰ１の単離精製＞
まず、ＲＪからゲル濾過クロマトグラフィーを用いてＭＲＪＰ１を精製した。具体的には、まず、実施例１と同様にして調製した２３．５ｍｇ／５ｍＬのＲＪタンパク質溶液（
１０ｋＤａ  ｃｕｔ  ｏｆｆ  ＲＪ）を５ｍＬ、ＨｉＬｏａｄ  ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐ．ｇ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にアプライした。その後、溶出液（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を溶出速度１．５ｍＬ／ｍｉｎで当該カラムに通し、５ｍＬずつを１画分として回収した。各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を図４に示す。また、ＲＪタンパク質溶液と同時に、当該カラムに３６ｍｇ／ｍｌのＧｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ （ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）をアプライし、移動度（溶出開始からの総溶出量）と、当該画分に含まれる分子の大きさとの関係を調べ、検量線を作成した。作成された検量線を図５に示す。
本発明者らは、前記の胆汁酸結合アフィニティーカラムから溶出した複合体の、ゲル解析において量的に一番多かったＭＲＪＰ１画分に着目した。図４に示すゲル濾過クロマトグラフィーのうち、画分Ｂ（Frac.B：図４中、点線で囲まれた画分）は、図５に示すスタンダードの移動度と分子量から得た検量線から、分子量約２９０ｋＤａ付近であることがわかった。この画分を１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、図６に示すように、約５５ｋＤａの位置に単一なバンドとして検出された。また、当該画分に含まれている分子に対してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにて質量分析を行ったところ、ＭＲＪＰ１を含む画分であると判明した。これらの結果から、ＭＲＪＰ１は約５５ｋＤａであり、ＲＪ中では、５〜６量体として存在していることが確認された。以下、当該画分をＭＲＪＰ１画分という。
なお、当該ＭＲＪＰ１画分には、非特許文献５において、高脂血症ラットの血液中のトリグリセリド、総コレステロールを減少させる作用が報告されている１０−デセン酸は含まれていないことが、定量的に明らかにされた。
【００３８】
＜ＲＪからのＭＲＪＰ２の単離精製＞
本発明者らはさらに、前記の胆汁酸結合アフィニティーカラムから溶出した複合体の、ゲル解析において量的に一番多かったＭＲＪＰ１画分に次いで多かったＭＲＪＰ２に着目した。図４に示すゲル濾過クロマトグラフィーのうち、画分Ｅ（Frac.E：図４中、一点鎖線で囲まれた画分）に含まれているタンパク質を調べた。当該画分Ｅは、図５に示すスタンダードの移動度と分子量から得た検量線から、分子量約５１ｋＤａ付近であることがわかった。この画分Ｅを１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、図７に示すように、４６〜６６ｋＤａの位置に２本のバンドとして検出された。
また、この画分Ｅを陰イオンクロマトグラフィーに供し、単一のタンパク質に精製した。具体的には、画分Ｅを結合用溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で１２５ｍｇ／５ｍＬに希釈した上で、５ｍＬをＨｉＰｒｅｐ  Ｑ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にアプライした。その後、溶出液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて、移動相中の塩化ナトリウム濃度を図８中の点線で示すような０〜０．５Ｍにグラジエントをかけることにより、タンパク質を溶出させた。なお、移動相の移動速度は１．５ｍＬ／ｍｉｎとした。
各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を図８に示す。図８中に示す得られたピークのうちの１〜４を、それぞれ１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、図９に示すように、ピーク１から２までは単一なバンドとして検出された。そこで、ピーク１及び２を合わせて回収し、当該画分に含まれている分子に対してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにて質量分析を行ったところ、ＭＲＪＰ２を含む画分であると判明した。以下、当該画分をＭＲＪＰ２画分という。
【００３９】
＜透析法による胆汁酸結合試験＞
上記で精製されたＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ２の胆汁酸結合能の評価を、透析法により行った。ポジティブコントロールとして抗高コレステロール剤であるコレスチラミンを、ネガティブコントロールとしてカゼインをそれぞれ用いた。
具体的には、タウロコール酸含有リン酸緩衝液（５０ｍＭ  タウロコール酸、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）中に、コレスチラミン、カゼイン、ＭＲＪＰ１画分、ＭＲＪＰ２画分、又は生ＲＪを凍結乾燥させたものを、それぞれ１００ｍｇ／ｍＬとなるように添加したものを反応溶液とした。これらの反応溶液を３７℃で２時間インキュベートした後、室温で７２時間透析した。透析膜外液に含まれている総胆汁酸量を測定することにより、透析膜内液に含まれている（すなわち、各分子と結合した）胆汁酸の割合を算出した。
算出された各分子と結合した胆汁酸の割合を図１０に示す。図１０中、「Ｉｎｔａｃｔ  ＲＪ」は、生ＲＪを凍結乾燥させたものを添加した反応溶液の結果である。この結果、胆汁酸結合能はネガティブコントロール群のカゼイン（３３％）と比較し、ＭＲＪＰ１は４６％、ＭＲＪＰ２は３７％であった。すなわち、ＭＲＪＰ１のほうがＭＲＪＰ２よりも高い胆汁酸結合能を示した。
【００４０】
［実施例３］
＜コレステロールミセル溶解性試験＞
ＲＪから単離精製されたＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ２のコレステロールミセル溶解抑制能を測定した。ＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ２は、実施例２において調製したＭＲＪＰ１画分及びＭＲＪＰ２画分をそれぞれ用いた。また、ネガティブコントロールとしてカゼインを用いた。
【００４１】
まず、最終濃度が３．７ｋＢｑ／ｍＬ（２．１Ｇｂｑ／ｍｍｏｌ，ＮＥＮ）となるように［４−１４Ｃ］コレステロール／クロロホルム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を、２μＭとなるようにコレステロール（片山化学工業社製）／クロロホルムを、２０μＭとなるようにＯｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＳＩＧＭＡ社製）／クロロホルムを、５μＭとなるようにＭｏｎｏ  ｏｌｅｏｙｌ−ｒａｃ−Ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＳＩＧＭＡ社製）／クロロホルムを、０．６ｍＭとなるようにＬ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社製）／クロロホルムを２０ｍＬ容量のガラスバイアルに分取し、よく混合した後、窒素ガスを吹き付け乾固させた。その後、得られた乾固物を、６．６ｍＭのＴａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＳＩＧＭＡ社製）及び１３２ｍＭ  ＮａＣｌを含む１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させた。ボルテックミキサーで２分間攪拌した後、超音波処理（２５Ｗ、ｏｕｔｐｕｔ６、３分間）し、その後３７℃で２４時間振とうしながらインキュベートすることにより、［１４Ｃ］−コレステロールミセル溶液を調製した。
【００４２】
コレステロールミセル溶解性試験は、具体的には、［１４Ｃ］−コレステロールミセル溶液に、最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＣａｓｅｉｎ、ＭＲＪＰ１、又はＭＲＪＰ２を添加したものを反応溶液とした。各反応溶液をボルテックミキサーで２分間攪拌した後、超音波処理（２５Ｗ、ｏｕｔｐｕｔ ６、３分間）し、３７℃で１時間インキュベートした後、３８０μＬを３７℃、１００，０００×ｇで1時間遠心分離を行い、上清を回収した。回収された上清５０μＬに、乳化シンチレーターを１０ｍＬ加えて、液体シンチレーションカウンターにより、上清中の［１４Ｃ］−コレステロールを測定した。上清中には、水溶液中に安定して溶解しているコレステロールミセルが存在する。このため、反応溶液に予め添加した［１４Ｃ］−コレステロール量に対する上清中の［１４Ｃ］−コレステロール量の割合から、水溶液中に安定して溶解しているコレステロールミセルの割合が算出できる。
【００４３】
ミセルへのコレステロールの溶解割合を図１１に示す。各試験区は、Ｄｕｎｃａｎ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒａｎｇｅ  ｔｅｓｔによりｐ＜０．０５で統計学的な有意差検定処理した。その結果、ネガティブコントロール群のカゼイン（７９％）と比較し、ＭＲＪＰ１は４６％であり、有意に低下していた。これに対してＭＲＪＰ２は９３％であり、有意な上昇が見られた。すなわち、ＭＲＪＰ１はコレステロールミセル溶解抑制能を有することが明らかである。
【００４４】
［実施例４］
＜ラットへの経口投与試験＞
高コレステロール血症のモデルである１％コレステロール摂取ラットに、ＲＪから単離精製されたＭＲＪＰ１を経口投与し、血清コレステロールに与える影響を調べた。ＭＲＪＰ１は、実施例２において調製したＭＲＪＰ１画分を用いた。また、ネガティブコントロールとしてカゼインを用いた。
図１２に示すように、実験期間の３日間、コレステロールを含む食餌を与えたラットに、１日１回、ＭＲＪＰ１又はカゼインを経口投与した。３回目の投与から２４時間経過後、４時間絶食させた後、心臓採血によりラットを屠殺した。採取された血液を用いて、血清コレステロールを測定した。さらに解剖し、肝臓重量を測定した。その他の具体的な実験条件は以下の通りである。
【００４５】
実験群：４週齢のＷｉｓｔａｒ系雄ラット（７０ｇ）
実験群数：ｎ＝９                                                    
投与開始時間：ＡＭ８：００
試験飼育期間：３日間（予備飼育３日間）
絶食時間：４時間
実験サンプル：カゼインナトリウム（ＣＳ）又はＭＲＪＰ１（ＭＲ）
サンプル投与量：３００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ、又は６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ
食餌組成：２０％カゼイン＋１％コレステロール
【００４６】
血清は、３０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離により調製した。血清コレステロールの定量は酵素法、具体的には市販のキット（コレステロールＥ−テストワコー；和光純薬工業社製））を用いて測定した。同様にして、ＨＤＬ−コレステロールはＨＤＬ−コレステロールＥ−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて測定した。ＬＤＬ＋ＶＬＤＬ−コレステロールは計算により求めた。
【００４７】
各種測定結果などを図１３〜１６に示す。なお、各数値は、１群９匹の平均±標準誤差とし、実験結果の統計的分析には、Ｄｕｎｃａｎ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒａｎｇｅ  ｔｅｓｔとＳｔｕｄｅnｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いた。
各実験群の体重の変化を図１３に、１日当たりの食餌摂取量を図１４に、肝臓重量を図１５に、それぞれ示す。この結果、各群のうち、カゼインナトリウム（ＣＳ）投与群とＭＲＪＰ１（ＭＲ）投与群とでは、いずれも特に差は観察されなかった。
一方、図１６のように、血清総コレステロール量は、３００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙの投与群と６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙの投与群のいずれにおいても、カゼインナトリウム（ＣＳ）投与群よりもＭＲＪＰ１（ＭＲ）投与群のほうが、血清総コレステロール量が低下する傾向が観察された。特に６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙの投与群では、カゼインナトリウム（ＣＳ）投与群よりもＭＲＪＰ１（ＭＲ）投与群のほうが、血清総コレステロール量が有意に（Ｄｕｎｃａｎ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒａｎｇｅ  ｔｅｓｔとＳｔｕｄｅｕｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔの両方でｐ＜０．０５）低下していた。
これらの結果から、単離精製されたＭＲＪＰ１を経口投与することにより、血清総コレステロール量を低下させられることが明らかである。
【００４８】
［実施例５］
＜ラットへの経口投与試験＞
実験群数を１０匹（ｎ＝１０）、試験飼育期間を７日間（予備飼育３日間）、サンプル投与量を６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙとした以外は、実施例４と同様にして、高コレステロール血症のモデルである１％コレステロール摂取ラットに、ＲＪから単離精製されたＭＲＪＰ１を７日間経口投与し、血清コレステロールに与える影響を調べた。
【００４９】
各実験群の体重の変化を図１７に、１日当たりの食餌摂取量を図１８に、肝臓重量を図１９に、血清総コレステロール量を図２０に、それぞれ示す。なお、各数値は、１群１０匹の平均±標準誤差とし、実験結果の統計的分析には、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いた。
この結果、体重の変化、１日当たりの食餌摂取量、及び肝臓重量は、カゼインナトリウム（ＣＳ）投与群とＭＲＪＰ１（ＭＲ）投与群とでは、いずれも有意差は観察されなかった。
一方、血清総コレステロール量は、カゼインナトリウム（ＣＳ）投与群よりもＭＲＪＰ１（ＭＲ）投与群のほうが、血清総コレステロール量が有意に（約２６％）低下した（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔでｐ＜０．０５）。特に、血清ＬＤＬコレステロール及び血清ＶＬＤＬコレステロールの総量が有意に低下した。
これらの結果から、単離精製されたＭＲＪＰ１を７日間経口投与することにより、血清総コレステロール量を低下させられることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の胆汁酸結合剤や血清コレステロール量低下方法は、ＲＪ由来の胆汁酸結合剤を経口服用することにより、血清コレステロール量を安全に低下させることができる。このため、本発明の胆汁酸結合剤等は、特に高コレステロール血症や動脈硬化症の治療や予防のための医薬や機能性食品等の有効成分として利用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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