(57)【要約】      （修正有）【課題】土壌病害防除剤、及びこの防除剤を用いた土壌病害防除方法を提供する。【解決手段】菌由来の糖質結合モジュール（CBM）を含有する土壌病害防除剤によって達成される。また、この土壌病害防除剤を含有する水溶液を、対象とする植物体の茎・葉に噴霧することによって、土壌病害を防除できる。このとき、植物体は、ホウレンソウ、トマト、イチゴ、ナス、トウガラシ、ピーマン、タバコから選択される少なくとも一つのものであることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌由来の糖質結合モジュール（CBM）を含有することを特徴とする土壌病害防除剤。
【請求項２】
前記糖質結合モジュール（CBM）が、セルロース分解性微生物Clostridium属、Ruminococcus属、Cellulomonas属、Streptomyces属、Bacillus属、Trichoderma属、Aspergillus属、Penicillium属から調製されたもの、又は、これらの微生物からCBMをコードする遺伝子を取得し、異種発現系で発現させ調製したもの、又は、環境中のメタゲノム遺伝子から調製されたものから選択されることを特徴とする請求項１に記載の土壌病害防除剤。
【請求項３】
前記糖質結合モジュール（CBM）が、CBM 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 17, 22, 28, 30, 37, 44, 46, 49, 63 からなる群から選択される１または２以上のものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の土壌病害防除剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一つに記載の土壌病害防除剤であって、対象とする植物体が、ホウレンソウ、トマト、イチゴ、ナス、トウガラシ、ピーマン、タバコ、バナナ、ショウガ、メロンからなる群から選択される少なくとも一つのものであることを特徴とする土壌病害防除剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一つに記載の土壌病害防除剤を含有する水溶液を、対象とする植物体の茎・葉に噴霧することを特徴とする土壌病害防除方法。
【請求項６】
前記植物体は、ホウレンソウ、トマト、イチゴ、ナス、トウガラシ、ピーマン、タバコ、バナナ、ショウガ、メロンからなる群から選択される少なくとも一つのものであることを特徴とする請求項５に記載の土壌病害防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、土壌病害防除剤、及びこの防除剤を用いた土壌病害防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物に対する病原菌は、農作物の減収や収穫物の品質低下等の被害を生じるため、農業生産上、その防除は最大の課題の一つとなっている。現在の農作物の生産現場では、多量の肥料を用いて、広大な面積に単一の農作物を栽培するために、病害発生時の被害は特に大きくなる。この被害を回避するために、病害防除剤の使用は必須の技術となっている。植物の茎・葉に発生する病害は、上記病害防除剤によって比較的容易に防除可能である一方、土壌伝染性の地下部病害（以下、「土壌病害」という）の防除は従来の病害防除剤によっては極めて困難である。土壌病害対策としては、太陽熱・土壌燻蒸剤・熱水を用いた土壌消毒、抵抗性品種の育成、及び抵抗性台木の利用が主たる対策となっている。
上記対策のうち、太陽熱消毒は天候に左右されるため、安定的な効果が得られにくい。土壌燻蒸剤は、毒性が高いため環境面や安全面での問題がある。また、熱水土壌消毒は、土壌の浸透性や圃場の勾配によって影響を受けるために汎用性が低いことに加え、水や燃料コストが掛かるため普及が進んでいない。抵抗性品種の開発、抵抗性台木の効果は、未だに十分とは言えず、抵抗性を打ち破る病原菌の発生が問題となる。
【０００３】
上記問題点を解決するために、病原菌の植物病理を解明し、その原理に基づいて、植物の感染・発症を特異的に阻害する病害防除剤の開発がある。一般に、高等植物は、病原菌と接触すると抵抗性反応を示し、反応部位の周囲の組織に病原菌に対し抗菌性を示す物質を産生することが知られている。植物体中に、このような抵抗性物質を産生、誘導する物質はエリシターと称されており、これまでに多くのエリシターが植物病原菌から分離されている。代表的なエリシターとしては、多糖物質としてPhytophthora megasperma f. sp. glycinea から分離されたhepta-β-D-グルコピラノシド、蛋白物質としてMonilinia fructicolaから分離されたモニコリンA、脂質としてPhytophthora infestansから分離されたエイコサペンタエン酸などがある。
また、病原菌であるエキビョウ菌（phytophthora parasitica nicotianae）の細胞壁から抽出されたセルロース結合ドメイン（CBD）は、エリシターであることが知られている（非特許文献１）。但し、このエリシターは、病原菌自体から抽出されたものであり、さらに直接に植物体の内部に注射しなければ、その効果を発揮できなかった。したがって、時間的にも作業としても非常に煩雑になり、植物体にとってもストレスとなることから、簡便な手法で大量の植物体を扱うことができ、且つ、高安全性・低環境負荷を有する防除剤及び防除方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Elodie Gaulin, et al., Cellulose Binding Domains of a Phytophthora Cell Wall Protein Are Novel Pathogen-Associated Molecular Patterns; The Plant Cell, Vol.18, 1766-1777 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、毒性（残留薬剤を含む）や薬剤耐性菌出現を生じさせない土壌病害防除剤、及びこの防除剤を用いた土壌病害防除方法、特に、病原菌由来ではなく、植物や微生物由来の土壌病害防除剤、及びこの防除剤を用いた土壌病害防除方法を提供することである。また、植物体内への直接的な投与（例えば注射など）を行うことなく、植物体外から噴霧することにより効果を発揮できる土壌病害防除剤、及びこの防除剤を用いた土壌病害防除方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討の結果、微生物から得られる糖質結合モジュールタンパク質を植物体に噴霧することによって、土壌病害の発生を予防できることを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
こうして、上記課題を解決するための発明に係る土壌病害防除剤は、菌由来の糖質結合モジュール（CBM）を含有することを特徴とする。
糖質結合モジュール（「セルロース結合モジュール」、「Carbohydrate-binding module (CBM)」、「Cellulose-binding module (CBM)」とも称する。また、「モジュール」は「ドメイン」とも称される。）とは、セルラーゼ中に存在するモジュール（ドメイン）の一つであり、糖質（セルロース）への結合活性を有している。セルロースはグルコースのユニットから構成されているので、CBMには、糖−蛋白質の相互作用が必要とされる。CBMは、アミノ酸配列の相同性に基づき、50を超えるファミリーに分類されている。タンパク質構造的には、β-バレル構造が多く、糖との結合には、芳香族アミノ酸（トリプトファンやチロシンなど）が関与していると言われている（糖との疎水性によるスタッキング効果）。結晶性のセルロースに結合するモジュールは、結合面がフラットな構造になり、そこに芳香族アミノ酸が並んでいるという特徴がある（CBM1など）。一方、非結晶性セルロースやキシランに結合するモジュールでは、結合面はややくぼんだクレフト（溝）を形成しており、そこに、芳香族アミノ酸が露出している（CBM6など）。また、糖鎖の端に結合するモジュールでは、クレフトが突き当たりになっており、そこを二つの芳香族アミノ酸で挟むという構造になっている（CBM9など）。これらのCBMを組換え蛋白質のタグとして精製に利用したり、酵素や菌体のセルロースへの固定化など応用面でも注目されている。
【０００７】
本発明に用いるCBMとしては、特に限定はされないが、菌類（真菌および細菌を含む。具体的には、例えばセルロース分解性微生物Clostridium属、Ruminococcus属、Cellulomonas属、Streptomyces属、Bacillus属、Trichoderma属、Aspergillus属、Penicillium属など）から調製されたもの、又は、これらの微生物からCBMをコードする遺伝子を取得し、異種発現系で発現させ調製したもの、又は、環境中のメタゲノム遺伝子から調製されたものを用いることができる。CBMの調製は、従来公知の文献に開示されている方法（例えば、Araki, et al., Characterization of family 17 and family 28 carbohydrate-binding modules from Clostridium josui. Biosci. Biotechnol. Biochem., 73: 1028-1032 (2009)）に従って行える。また、本発明に用いるCBMのファミリーとしては、特に限定はされないが、CBM 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 17, 22, 28, 30, 37, 44, 46, 49, 63 を用いることができる。
CBMをコードする遺伝子をクローニングし、宿主内で高度に発現させることにより、CBM溶液を作成することができる。
具体的には、CBMをコードする遺伝子をPCR法により増幅し、これを発現ベクターに挿入後、発現を行う宿主（大腸菌、または酵母）に導入する。CBM遺伝子をもった組換え体微生物を培養する。大腸菌の場合では、生育した菌体を遠心分離により回収し、超音波などをあてることにより、菌体を破壊し、菌体内に発現したCBMタンパク質を回収する。CBMタンパク質は、タグを用いたアフィニティクロマトグラフィを使用して精製することができる。また、酵母に導入した場合、菌体外発現することができるので、この場合には、培養液そのものをCBM溶液として使用することができる。
また、本発明に係る土壌病害防除方法は、前記土壌病害防除剤を含有する水溶液を、対象とする植物体の茎・葉に噴霧することを特徴とする。
投与時のCBM濃度としては、特に限定されないが、1μM〜100μM（好ましくは5μM〜80μM、更に好ましくは10μM〜50μM）が好ましい。
【０００８】
なお、投与時のCBM濃度が低ければ、対象とする植物体に多量の防除剤を噴霧すれば良く、CBM濃度が高ければ、植物体に少量の防除剤を噴霧すれば良い。但し、CBM濃度が非常に低い場合には、噴霧量が多くなりすぎて多量の水を必要とするし、CBM濃度が非常に高い場合には、CBMが大量に必要となり、コスト高となる。このため、投与時のCBM濃度としては、上記程度の範囲であることが好ましい。
また、対象とする植物体としては、特に限定されないが、例えば、穀類、野菜、果樹等の農作物、観葉植物等が挙げられる。具体的には、ホウレンソウ、トマト、イチゴ、ナス、トウガラシ、ピーマン、タバコ、バナナ、ショウガ、メロン等を例示できる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来には対処する方法がなかった土壌病害に対する防除剤、及びこの防除剤を用いた土壌病害防除方法を提供できる。また、本発明では、病原菌由来ではなく、植物や微生物由来のCBMを用いるので、毒性（残留薬剤を含む）や薬剤耐性菌出現を生じさせにくい。更に、本発明によれば、防除剤を植物体に直接に導入する注射のように手間の掛かるものではなく、防除剤を含有する水溶液を噴霧すれば済むので、非常に容易な防除方法となる。例えば、糖質結合モジュールの一種であるCBMを植物体に噴霧することで、フザリウム菌により引き起こされるホウレンソウ萎凋病やトマト青枯病の発病を顕著に抑制できる。糖質結合モジュールは、人体に無害な微生物由来のタンパク質であり、従来の土壌燻蒸剤に比べて安全性が高く、環境への負荷も非常に少ない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】CBM噴霧によるトマト（桃太郎）青枯病抑制の様子を示した写真図である。BSA（A、B）、TrCBM1-CFP（C、D）の噴霧効果を示した。
【図２】トマト（桃太郎）茎内で増殖した病原菌の密度を示すグラフである。
【図３】CBM噴霧によるトマト（マイクロトム）青枯病抑制の様子を示した写真図である。CFP（A、B）、TrCBM1-CFP（C、D）、CjCBM3（E、F）の噴霧効果を示した。移植時（A、C、E）とCBM２回目噴霧４日後（B、D、F）のトマト外観を示した。
【図４】青枯病発病後のトマト（マイクロトム）地上部の乾燥重量を示すグラフである。CBM２回目噴霧後11日目の地上部乾燥重量を示した。
【図５】CBM噴霧によるホウレンソウ萎凋病抑制の様子を示す写真図である。緩衝液のみ（A、B）、CjCBM3（C、D）の噴霧効果を示した。２回目CBM噴霧時（A、C）と２回目CBM噴霧から5日後（B、D）のホウレンソウ外観を示した。
【図６】トマト（桃太郎）葉組織の遺伝子発現解析を行った結果を示すグラフである。CBM噴霧後２４時間地点で葉からRNAを抽出し、DNAマイクロアレイ解析を行った。横軸にCFP処理株での遺伝子発現量、縦軸にTrCBM1-CFP処理株での遺伝子発現量を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶ。
＜実施例１．タンパク質溶液調製＞
真菌由来の糖質結合モジュール（Carbohydrate-binding module: CBM） (TrCBM1-CFP)と細菌由来のCBM（CjCBM3）を調製した。また、対照試料としてトマト（桃太郎）の場合は牛血清アルブミン（BSA）を、トマト（マイクロトム）の場合はシアン色蛍光タンパク質（CFP）を、ホウレンソウの場合は20mMリン酸カリウム緩衝液を使用した。各溶液は20mMリン酸カリウム緩衝液で透析し、25μMの濃度に設定し、試験に用いた。
TrCBM1-CFP: Trichoderma reesei NBRC31329株のゲノムDNAを鋳型として、セルラーゼCel7AのもつCBM1をコードする領域をPCR法で増幅した。PCRに使用したプライマー配列として、5'-GGATCCCCTACCCAGTCTCACTACGG-3'（配列番号１）と5'-GAATTCGGGGGAGGTCAGGCACTGAGAGTAGTAAGG-3'（配列番号２）のオリゴヌクレオチドを合成して使用した。この配列は、Shoemarker et al., Nature Biotechnology 1: 691-696 (1983) に発表されている塩基配列に基づいて、設計した。PCR反応は、市販のrTaq DNAポリメラーゼを使用した。この増幅した遺伝子を、発現ベクターpRSET-CFPのBamHI-EcoRIサイトに導入し、大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。IPTGによる誘導下、形質転換体を培養し、回収した菌体を超音波で破壊し、CBMを含む無細胞抽出液を得た。この抽出液にNi-NTAアガロース樹脂を添加し、CBMを吸着させ、洗浄の後、イミダゾール溶液によりCBMを遊離した。これを透析することにより、CBM1-CFPタンパク質を含む溶液を作成した。
CjCBM3： Clostridium josui FERM P-9684株のゲノムDNAを鋳型として、スキャホールディンタンパク質CipAのもつCBM3をコードする領域をPCR法で増幅した。PCRに使用したプライマー配列として、5'-AAGGATCCGCAGCTGATACTGGCG-3'（配列番号３）と5'-AAGCTTTCAACCATTAGGTGTTGAACCA-3'（配列番号４）のオリゴヌクレオチドを合成して使用した。この配列は、Kakiuchi et al., Journal of Bacteriology 180: 4303-4308 (1998) に発表されている塩基配列に基づき設計した。この増幅した遺伝子を、発現ベクターpQE30のBamHI-HindIIIサイトに導入し、大腸菌JM109株を形質転換した。IPTGによる誘導下、形質転換体を培養し、回収した菌体を超音波で破壊し、CBMを含む無細胞抽出液を得た。この抽出液にNi-NTAアガロース樹脂を添加し、CBMを吸着させ、洗浄の後、イミダゾール溶液によりCBMを遊離した。これを透析することにより、CjCBM３タンパク質を含む溶液を作成した。
【００１２】
＜実施例２．トマト（桃太郎）の栽培と病害防除試験法＞
培土を詰めたセルトレイにトマト種子（桃太郎）を播種し、ガラス温室内で育苗した。なお、1区7株とした。草丈が約10cmに生長した苗にCBM溶液3mLを噴霧した。噴霧処理から7日後、苗を青枯病菌（Ralstonia solanacearum）汚染土（106 cfu/g）を詰めたポットへ移植し、同温室内で栽培を続けた。移植から3日後にCBM溶液3mLを再度噴霧した。2回目噴霧から4日後に発病を調査した。さらに、茎内で増殖した病原菌の密度（cfu/g）を測定した。
CBM噴霧処理後の遺伝子発現状況を解析した。上記と同様、セルトレイ中で草丈約10cmまで育苗し、1mLのタンパク溶液を噴霧した。噴霧処理から24時間後、葉を採取し、そこからRNAを抽出し試料とした。試料はDNAマイクロアレイにて解析した。
【００１３】
＜実施例３．トマト（マイクロトム）の栽培と病害防除試験法＞
バーミキュライトを詰めたセルトレイにトマト種子（マイクロトム）を播種し、液体肥料を与えながら人工気象器内で30℃に管理し、育苗した。なお、1区6株とした。草丈が約2cmに生長した苗にCBM溶液3mLを噴霧した。噴霧処理から3日後、苗を青枯病菌汚染土（106cfu/g）を詰めたポットへ移植し、同気象器内で栽培を続けた。移植から3日後にCBM溶液3mLを再度噴霧した。2回目噴霧から4日から11日後までの間、病徴の進行を調査し、以下の6段階の発病指数に分類した。発病指数（０：萎れた葉の割合が0％、１：1〜25％、２：26〜50％、３：51〜75％、４：76〜99％、５：100％）。また、発病指数を用いて防除価を以下の式にて算出した。
防除価＝｛１−（処理区の平均発病指数／対照区の平均発病指数）｝×100。
【００１４】
＜実施例４．ホウレンソウ（おかめ）の栽培と病害防除試験法＞
培土を詰めたセルトレイにホウレンソウ種子（おかめ）を播種し、人工気象器内で26℃に管理し、育苗した。なお、1区13株とした。播種から4日後に苗にCBM溶液3mLを噴霧した。噴霧処理から3日後、萎凋病菌（Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae GF960）（104 cfu/g）を接種した。接種から3日後にCBM溶液3mLを再度噴霧した。2回目噴霧から5日後、病徴の進行を調査し、以下の5段階の発病指数に分類した。発病指数（0：健全、1：地上部は健全だが根部表面が褐変、２：地上部は健全だが根部導管が褐変、３：地上部が萎凋、４：枯死）。さらに発病指数を用いて防除価を算出した。
【００１５】
＜結果＞
トマト（桃太郎）における青枯病抑制効果
対照区では86％のトマト株が青枯病を発病し、枯死した。一方、TrCBM1-CFPを噴霧したトマト株の枯死率は29％にとどまり、高い発病抑制効果が認められた（図１）。また、茎内の病原菌を比較したところ、TrCBM1-CFP処理区では対照区の約１／３に減少していた（図２）。以上の結果から、TrCBM1-CFP噴霧処理によりトマト株が青枯病に耐病性化し、トマト体内への病原菌の感染および増殖が抑制されることが明らかとなった。
【００１６】
トマト（マイクロトム）における青枯病抑制効果
対照区では、２回目CBM噴霧から4日後には100％のトマト株が枯死した（図３）。一方、TrCBM1-CFP処理区では発病が抑制され、２回目噴霧4日後の発病指数は1.3（防除価74）、２回目噴霧11日後の発病指数は3.3（同34）であった（図３、表１）。さらに、CjCBM3処理区では、２回目噴霧4日後には発病株は全く現れず（防除価100）、２回目噴霧11日後でも発病指数が0.8（防除価84）にとどまった（図３、表１）。また、CBM処理区では対照区と比較して、２回目噴霧11日後の乾燥重量が有意に大きかった（図４）。このように、両タンパク質の処理は、難防除の土壌伝染性の細菌病害である青枯病に高い防除効果を示すことが明らかとなった。
【００１７】
【表１】
2012246227.tif 000002
【００１８】
ホウレンソウ萎凋病に対する防除効果
CjCBM3噴霧はホウレンソウ萎凋病の発病を顕著に抑制した（図５）。表２に示すように、無処理区の発病指数は2.2であったが、CjCBM3処理区は1.0（防除価55）であった。この結果から、CjCBM3の葉面噴霧は土壌伝染性の糸状菌病害にも有効であることが明らかとなった。
【００１９】
【表２】
2012246227.tif 000003
【００２０】
遺伝子発現解析
TrCBM1-CFP噴霧したトマト（桃太郎）株における遺伝子発現をマイクロアレイ解析した結果、エチレン応答性遺伝子等の防御関連遺伝子やストレス応答性遺伝子の発現が顕著に誘導されていることが明らかとなった(表３、図６)。この結果は、TrCBM1-CFPを植物葉に噴霧するだけで、植物体全身に病害やストレスに対する抵抗性が誘導されることを示唆している。
下表３には、TrCBM1-CFP噴霧後24時間地点で葉を採取し、RNAを抽出後にDNAマイクロアレイ解析を行い、発現量に2倍以上の変化があることが明らかとなった遺伝子の一例を示した。
【００２１】
【表３】
2012246227.tif 000004
このように、本実施形態によれば、従来には有効に対処する方法が少なかった土壌病害である青枯病や萎凋病に対する防除剤、及びこの防除剤を用いた土壌病害防除方法を提供できた。また、本実施形態では、病原菌由来ではなく、植物や微生物由来のCBMを用いたので、毒性（残留薬剤を含む）や薬剤耐性菌出現を生じさせにくい。更に、本実施形態では、植物体への注射のように手間の掛かるものではなく、防除剤を噴霧すれば良いので、容易な防除方法を提供できた。例えば、糖質結合モジュールの一種であるCBMを植物体に噴霧することで、フザリウム菌により引き起こされるホウレンソウ萎凋病やトマト青枯病の発病を顕著に抑制できた。CBMは、人体に無害な微生物由来のタンパク質であり、従来の土壌燻蒸剤に比べて安全性が高く、環境への負荷も非常に少ない土壌病害防除剤を提供できた。
【図１】
2012246227.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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