(57)【要約】      （修正有）【課題】目的の分子、特に生体分子、最も好ましくは核酸分子に対して高い結合能力を示す高多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を提供する。【解決手段】酸化鉄又は顔料上に沈殿又は吸着したシリカガラスを含む多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子であって、シリカガラス粒子の細孔が、１０ｎｍより大きいか、又は小さい直径を有する細孔を含み、かつ１０ｎｍより大きい直径を有する細孔の累積細孔面積が４ｍ２／ｇより大きい粒子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化鉄粒子又は顔料上に沈殿又は吸着したシリカガラスを含む多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子であって、シリカガラス粒子の細孔が、１０ｎｍより大きいか、又は小さい直径を有する細孔を含み、かつ１０ｎｍより大きい直径を有する細孔の累積細孔面積が４ｍ2／ｇより大きい粒子。
【請求項２】
５〜２５μｍの直径を有する請求項１に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【請求項３】
６〜１５μｍの直径を有する請求項１に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【請求項４】
７〜１０μｍの直径を有する請求項１に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【請求項５】
粒子の総ＢＥＴ表面積が１９０ｍ2／ｇより大きい請求項１に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【請求項６】
粒子の総ＢＥＴ表面積が、１９０〜２７０ｍ2／ｇの範囲である請求項１に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【請求項７】
１０ｎｍより大きい直径を有する細孔の累積細孔面積が、約４〜８ｍ2／ｇの範囲である請求項１に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【請求項８】
酸化鉄粒子又は顔料がフェライトである請求項１に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【請求項９】
酸化鉄粒子又は顔料が磁鉄鉱である請求項１に記載の強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【請求項１０】
酸化鉄粒子又は顔料がフェライトと磁鉄鉱との混合物である請求項１に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【請求項１１】
酸化鉄粒子又は顔料がフェリ磁性磁鉄鉱である請求項１に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【請求項１２】
粒子が３０〜５０重量％のＳｉＯ2及び５０〜７０重量％のＦｅ3Ｏ4である請求項１に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【請求項１３】
粒子が３５〜４０重量％のＳｉＯ2及び５５〜６５重量％のＦｅ3Ｏ4である請求項１２に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【請求項１４】
酸化鉄粒子又は顔料が、７５〜３００ｎｍの範囲の平均直径を有する請求項１に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【請求項１５】
酸化鉄粒子又は顔料の８０％が、７５〜３００ｎｍの範囲の直径を有する請求項１に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【請求項１６】
酸化鉄粒子又は顔料の９０％が、７５〜３００ｎｍの範囲の直径を有する請求項１に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を含む、混合物から目的の分子を分離、単離、又は検出するためのキット。
【請求項１８】
目的の分子が、核酸、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、脂質、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
目的の分子が核酸分子である請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
カオトロピック剤を更に含む請求項１７、１８、又は１９に記載のキット。
【請求項２１】
カオトロピック剤が、過塩素酸ナトリウム、塩酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化カリウム、チオシアン酸カリウム、塩化ナトリウム、イソチオシアン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、ヨウ化ナトリウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
目的の分子を含む混合物を供給し；
請求項１〜１６のいずれか１項の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子と混合物を接触させ；
混合物中の目的の分子を多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子に付着させ；
外部磁場をかけることにより、付着した目的の分子を含む多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を回収し；かつ 付着した目的の分子とともに多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を、混合物の結合していない成分から除去することを含む、目的の分子を混合物から単離する方法。
【請求項２３】
付着した目的の分子を、多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子から溶出する段階を更に含む請求項２２に記載の目的の分子を混合物から単離する方法。
【請求項２４】
目的の分子が、核酸、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、脂質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項２２又は２３に記載の目的の分子を混合物から単離する方法。
【請求項２５】
目的の分子が核酸分子である請求項２４に記載の目的の分子を混合物から単離する方法。
【請求項２６】
核酸が、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ ＤＮＡ、線状ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、及び化学的に合成された核酸からなる群から選択される請求項２５に記載の核酸の単離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な分子の精製、分離、及びアッセイを促進するために、様々な組成及び性質の磁性粒子を利用することができるようになってきている。粒子を含む容器に外部磁場をかけることにより、目的の（ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）分子と結合する磁性粒子又はビーズを収集又は回収することができる。結合していない分子又は上清液を、粒子から分離するか、又は廃棄することができ、かつ、粒子に結合した分子を、豊富な状態で（ｉｎ ａｎ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｓｔａｔｅ）溶出することができる。従って、磁性粒子は、目的の分子を、液相又は他の分子との混合物から精製又は分離するための、比較的迅速、容易、かつ簡便な手段の可能性をもたらす。更に、特異的分子と結合する磁性粒子は、数百又は数千もの試料から、目的の分子を迅速かつ自動に分析又は同定するために、自動マルチウェル又は複合試料アッセイ若しくはスクリーニングシステムと組み合わされ得る（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）。そのようなシステムは、核酸や蛋白質のような生体分子の精製又は単離において、ますます多くの用途が見出されている。従って、分析及び調製（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）工程を含む様々な分離又は単離用途において、並びに、特定の分子又は目的の分子種のために、数百又は数千もの試料のアッセイを自動的にスクリーニングするように設計された機械的（ｍｅｃｈａｎｉｚｅｄ）システムにおいて、目的の分子、特に生体分子を結合及び単離する高い（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）能力を有する磁性粒子は、価値ある道具として役立ち得る。
【０００３】
本発明は、目的の分子、特に生体分子、最も好ましくは核酸分子に対して高い結合能力を示す高多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス（シリカ）粒子を提供する。本発明の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子は、混合物中の分子、特に核酸分子と結合することができ、その後、混合物及び磁性粒子を含む容器側へ外部磁場をかけるか、又は容器内へ磁性プローブを挿入することにより、結合した分子を保持したまま、収集又は回収され得る。次いで、結合した粒子は、より純度の高い状態で、かつ目的の分子に対する本発明の磁性粒子の高い結合能力に基づく有用な量で、磁性粒子から溶出され得る。
【０００４】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（４１）を提供する。
（１）酸化鉄粒子又は顔料上に沈殿又は吸着したシリカガラスを含む多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子であって、シリカガラス粒子の細孔が、１０ｎｍより大きいか、又は小さい直径を有する細孔を含み、かつ１０ｎｍより大きい直径を有する細孔の累積細孔面積が４ｍ2／ｇより大きい粒子。
（２） 約５〜２５μｍの直径を有する（１）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
（３） 約６〜１５μｍの直径を有する（１）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
（４） 約７〜１０μｍの直径を有する（１）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
（５） 粒子の総ＢＥＴ表面積が１９０ｍ2／ｇより大きい（１）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【０００５】
（６）粒子の総ＢＥＴ表面積が、約１９０〜２７０ｍ2／ｇの範囲である（１）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
（７）１０ｎｍより大きい直径を有する細孔の累積細孔面積が、約４〜８ｍ2／ｇの範囲である（１）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
（８） 酸化鉄粒子又は顔料がフェライトである（１）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
（９） 酸化鉄粒子又は顔料が磁鉄鉱である（１）に記載の強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
（１０）酸化鉄粒子又は顔料がフェライトと磁鉄鉱との混合物である（１）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【０００６】
（１１） 酸化鉄粒子又は顔料がフェリ磁性磁鉄鉱である（１）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
（１２） 粒子が約３０〜５０重量％のＳｉＯ2及び約５０〜７０重量％のＦｅ3Ｏ4である（１）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
（１３） 粒子が約３５〜４０重量％のＳｉＯ2及び約５５〜６５重量％のＦｅ3Ｏ4である（１２）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
（１４） 酸化鉄粒子又は顔料が、約７５〜３００ｎｍの範囲の平均直径を有する（１）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
（１５） 酸化鉄粒子又は顔料の８０％が、約７５〜３００ｎｍの範囲の直径を有する（１）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
【０００７】
（１６） 酸化鉄粒子又は顔料の９０％が、約７５〜３００ｎｍの範囲の直径を有する（１）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子。
（１７）（１）〜（１６）のいずれか１項に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を含む、混合物から目的の分子を分離、単離、又は検出するためのキット。
（１８） 目的の分子が、核酸、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、脂質、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる（１７）に記載のキット。
（１９） 目的の分子が核酸分子である（１８）に記載のキット。
（２０） カオトロピック剤を更に含む（１７）、（１８）、又は（１９）に記載のキット。
（２１） カオトロピック剤が、過塩素酸ナトリウム、塩酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化カリウム、チオシアン酸カリウム、塩化ナトリウム、イソチオシアン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、ヨウ化ナトリウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる（２０）に記載のキット。
【０００８】
（２２） ａ） 強磁性又はフェリ磁性酸化鉄粒子の懸濁液を供給し、ｂ） ６〜８の間のｐＨで、強磁性又はフェリ磁性酸化鉄粒子の懸濁液へ、テトラアルコキシシランを添加し、ｃ） テトラアルコキシシランを加水分解し、６未満又は８を超えるｐＨを有するバッファーを懸濁液へ添加することによって強磁性又はフェリ磁性酸化鉄粒子上へシリカガラスを沈殿させ、強磁性又はフェリ磁性の多孔性ガラス粒子を形成し、ｄ） 得られた多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を懸濁液から分離し、ｅ） 分離された多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を無水アルコールで洗浄し、かつｆ） キュリー温度より低い温度で多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を乾燥させること：を含む、多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子の作製方法。
【０００９】
（２３） 強磁性又はフェリ磁性酸化鉄粒子が、グリセロール又はグリコールの懸濁液中へ供給される（２２）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子の作製方法。
（２４） 懸濁液中の酸化鉄粒子の大きさが約７５ｎｍ〜３００ｎｍの範囲である（２２）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子の作製方法。
（２５） テトラアルコキシシランが、一般式Ｓｉ（ＯＣnＨ2n+1）4に相当する（ここで、ｎは１、２、３、４、又は５である）（２２）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子の作製方法。
（２６） テトラアルコキシシランがテトラエトキシシランである（２２）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子の作製方法。
（２７） テトラアルコキシシランが、テトラエトキシシラン（３０％）及び脂肪族Ｃ1−Ｃ4−アルコール（７０％）の溶液として、強磁性又はフェリ磁性酸化鉄粒子へ添加される、（２２）に記載の強磁性又はフェリ磁性の多孔性ガラス粒子の作製方法。
【００１０】
（２８） テトラアルコキシシランが、約７のｐＨにおいて強磁性又はフェリ磁性酸化鉄粒子の懸濁液へ添加される（２２）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子の作製方法。
（２９） テトラアルコキシシランが、約１０分以内で強磁性又はフェリ磁性酸化鉄粒子の懸濁液へ添加される（２２）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子の作製方法。
（３０） ６未満のｐＨを有するバッファーが、約５のｐＨを有する酢酸塩バッファーである（２２）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子の作製方法。
（３１） ９を超えるｐＨを有するバッファーが、約１１のｐＨを有するアンモニア／アンモニウム塩バッファーである（２２）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子の作製方法。
（３２） 粒子の洗浄に使用される無水アルコールが無水エタノールである（２２）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子の作製方法。
（３３） 粒子を乾燥させる温度が約３００℃である（２２）に記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子の作製方法。
【００１１】
（３４） ａ） ５以下のｐＨ又は９以上のｐＨを有するグリセロール溶液中の強磁性又はフェリ磁性酸化鉄粒子の懸濁液を供給し、ｂ） 強磁性又はフェリ磁性酸化鉄粒子の懸濁液へテトラエトキシシランを攪拌しながら滴下して１０分以内に添加し、ｃ） 混合物を熟成させて強磁性又はフェリ磁性の多孔性ガラス粒子を凝固させて安定化し、ｄ） 外部磁場をかけることにより、得られた多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を液体から分離し、ｅ） 分離した多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を無水アルコールで洗浄し、かつｆ） 約３００〜５００℃の温度で多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を乾燥させること：を含む多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子の作製方法。
【００１２】
（３５） ａ） アルコール、好ましくはエタノール中の強磁性又はフェリ磁性酸化鉄粒子の懸濁液を供給し、ｂ） ６未満のｐＨで、強磁性又はフェリ磁性酸化鉄粒子の懸濁液へ、シリカナノ粒子を添加し、ｃ） 連続的に攪拌することにより、混合物を熟成させ、ｄ） 得られた多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を液体から分離し、ｅ） 得られた多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を洗浄し、かつｆ） 約２００℃の温度で多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を乾燥すること：を含む多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子の作製方法。
【００１３】
（３６） ａ） パラフィン油中の強磁性又はフェリ磁性酸化鉄粒子の懸濁液を供給し、ｂ） ６未満のｐＨで、強磁性又はフェリ磁性酸化鉄粒子の懸濁液を、珪酸ナトリウム水溶液、好ましくは２７％ＳｉＯ2を含有する水へ添加し、ｃ） 連続的に攪拌することにより、混合物を熟成させ、ｄ） 得られた多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を液体から分離し、ｅ） 分離された多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を洗浄し、かつｆ） 約２００℃の温度で多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を乾燥させること：を含む多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子の作製方法。
【００１４】
（３７） 目的の分子を含む混合物を供給し；
（１）〜（１６）のいずれか１項の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子と混合物を接触させ；
混合物中の目的の分子を多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子に付着させ；
外部磁場をかけることにより、付着した目的の分子を含む多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を回収し；かつ 付着した目的の分子とともに多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を、混合物の結合していない成分から除去することを含む、目的の分子を混合物から単離する方法。
【００１５】
（３８） 付着した目的の分子を、多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子から溶出する段階を更に含む（３７）に記載の目的の分子を混合物から単離する方法。
（３９） 目的の分子が、核酸、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、脂質、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される（３７）又は（３８）に記載の目的の分子を混合物から単離する方法。
（４０） 目的の分子が核酸分子である（３９）に記載の目的の分子を混合物から単離する方法。
（４１） 核酸が、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ ＤＮＡ、線状ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、アプタマー、及び化学的に合成された核酸からなる群から選択される（４０）に記載の核酸の単離方法。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子は、二酸化珪素（ＳｉＯ2）及び酸化鉄粒子又は顔料を含む。酸化鉄粒子又は顔料は、例えば、Ｆｅ2Ｏ3（ヘマタイト）、Ｆｅ3Ｏ4（磁鉄鉱）、又はそれらの組み合わせであり得る。好ましくは、酸化鉄は、フェリ磁性磁鉄鉱である。
【００１７】
本発明の別の態様では、本発明の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子は、約３０〜５０（重量）％のＦｅ3Ｏ4及び約５０〜７０（重量）％のＳｉＯ2という組成を有する。より好ましくは、ここに記載の多孔性磁性ガラス粒子の組成は、約３５〜４５（重量）％のＦｅ3Ｏ4及び約５５〜６５（重量）％のＳｉＯ2である。
【００１８】
更に別の態様では、一種以上の他の金属又は遷移金属の酸化物も、本発明の多孔性磁性ガラス粒子中に存在し得る。そのような更なる金属酸化物は、多孔性磁性ガラス粒子へ、更なる望ましい性質をもたらし得る。好ましくは、更なる金属酸化物は、チタン、ホウ素、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、鉛、及びそれらの組み合わせの酸化物からなる群から選ばれる。
【００１９】
本発明の多孔性磁性ガラス粒子は、酸化鉄又は鉄担持（ｂｅａｒｉｎｇ）顔料の存在により、強磁性又はフェリ磁性を示す。外部磁場をかけると、それらは磁化され、外部磁場を取り除いたとしても磁化されたままであるが（残留磁気）、この残留磁気は、粒子を塊にするか（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｅ）、又は凝集させるには弱すぎる。
【００２０】
本発明の別の態様において、ここに記載の多孔性磁性ガラス粒子は、直径が約５〜２５μｍ、好ましくは約６〜１５μｍ、特に好ましくは約７〜１０μｍの平均サイズ範囲を有する。窒素ブルナウワー・エメット・テラー（Ｂｒｕｎａｕｒ Ｅｍｍｅｔ Ｔｅｌｌｅｒ）（ＢＥＴ）法により測定した場合の本発明の多孔性磁性ガラス粒子の総表面積は、好ましくは１９０ｍ2／ｇ以上であり、より好ましくは約１９０〜２７０ｍ2／ｇの範囲である。本発明の多孔性磁性ガラス粒子は、水銀（Ｈｇ）−多孔度計（ｐｏｒｏｓｉｍｅｔｒｙ）法で測定した場合の、直径が１０ｎｍを超える細孔の累積細孔面積（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｐｏｒｅ ａｒｅａ）が、約４〜８ｍ2／ｇの範囲であることが好ましい。
【００２１】
本発明の別の態様では、核酸分子、又は他の生体分子に対して高い結合能力を有する多孔性磁性ガラス粒子の製造方法が提供される。本発明の好ましい製造プロセスは、直径で７５〜３００ｎｍの平均サイズを有する磁性酸化鉄粒子又は顔料の懸濁液の供給を含む。より好ましくは、８０％以上、より好ましくは９０％以上の酸化鉄粒子の直径は７５〜３００ｎｍである。好ましくは、酸化鉄粒子を、グリセロール又はグリコール中に懸濁させ、かつ好ましくは６〜８のｐＨ、より好ましくはｐＨ７でシリカ（ガラス）の供給源と組み合わせる。次いで、酸化鉄粒子の表面上へシリカを沈殿させるか、又は吸着させるために、酸性又はアルカリ性バッファーによって、シリカの供給源を加水分解することにより、酸化鉄粒子の存在下でシリカを合成する。シリカ被覆酸化鉄粒子は、凝集してより大きな多孔性ガラス粒子を形成し得る。次いで、初期の多孔性磁性ガラス粒子を、キュリー温度より低い温度でオーブンを用いて乾燥させる。乾燥温度は、約１００℃〜約５００℃、例えば２００℃又は３００℃であることがより好ましい。乾燥温度は、約３００℃〜約５００℃であることが更に好ましい。
【００２２】
本発明の製造方法の別の態様において、シリカの供給源は、テトラアルコキシシラン、多官能アルコールのシリルエステル、珪酸ナトリウムのような珪酸塩、シリカナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｓ）、又はそれらの組み合わせである。シリカの供給源は、テトラアルコキシシランであることがより好ましく、テトラアルコキシシランがテトラエトキシシランであることが最も好ましい。
【００２３】
本発明の製造プロセスの更に別の態様において、製造プロセスにおいて、５以下の酸性ｐＨを有するバッファー又は９以上のアルカリ性ｐＨを有するバッファーを用いて、シリカの供給源を加水分解する。好ましくは、加水分解バッファーは、９〜１１のｐＨを有するアンモニア／アンモニウム塩バッファーである。
【００２４】
好ましい態様において、本発明の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子は、粒子１ｍｇ当たり１μｇを超える核酸分子、より好ましくは粒子１ｍｇ当たり約１．３ｍｇの核酸分子、最も好ましくは粒子１ｍｇ当たり１．３μｇを超える核酸分子と結合する。
【００２５】
別の態様において、本発明の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を用いて単離された核酸分子の収率は、８０％以上である。
【００２６】
本発明の別の態様は、 目的の分子を含む混合物を供給し；
本発明の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を混合物と接触させ；
混合物中の目的の分子を多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子へ結合又は付着させ；
外部磁場をかけることにより、付着した目的の分子を含む多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を回収し；かつ 混合物の結合していない成分から、付着した目的の分子を含む多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を分離することを含む、目的の分子を混合物から単離するための方法である。
任意に、適当な溶出バッファーを用いることにより、結合した目的の分子を、本発明の粒子から溶出することができる。
【００２７】
本発明の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を用いて、目的の分子を混合物から単離又は分離する方法の好ましい態様において、目的の分子は、核酸、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、脂質、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。より好ましくは、目的の分子は、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ポリメラーゼ・チェーン反応によって生成されたＤＮＡ（ＰＣＲ ＤＮＡ）、線状ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、及び化学的に合成された核酸分子を含む何らかの核酸分子であり得る核酸分子である。
【００２８】
別の態様において、本発明は、本発明の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を含む、目的の分子、好ましくは目的の核酸分子を単離又は分離するためのキットを提供する。本発明のキットは、本発明の多孔性磁性ガラス粒子を懸濁させて使用するための、一種以上のバッファー、又は濃縮貯蔵液を更に含み得る。本発明のキット中のバッファーは、イソチオシアン酸グアニジニウムのような一種以上のカオトロピック剤も含み得る。
【００２９】
ここに記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス（シリカ）粒子は、様々な分子、特に核酸分子に対して、比較的高い結合能力を有するので、それら粒子は、混合物から有効な収率で分子を単離又は分離する場合に有用である。それら粒子は、分析並びに調製スケールの両方の工程において使用され得る。本発明により、様々な合成反応パラメーターを選択的に変化させることにより、特定の多孔度、結合能力、及び結合特異性を有する粒子が得られる。
【００３０】
本発明をより完全に理解するために、以下の用語を定義する。
ここで理解され、かつ使用される“細孔”とは、粒子の外側表面にある何らかの入り口、くぼみ、又は凹部を表し、くぼみ、又は凹部の深さは、粒子の表面で測定される入り口、くぼみ、又は凹部の半径の長さよりも伸びている。粒子の外側表面における半径よりも深く伸びていない入り口、くぼみ、又は凹部は、細孔ではない。
【００３１】
ここで理解され、かつ使用される“微小孔”とは、２ｎｍ未満の平均直径を有する何らかの細孔を表す。
【００３２】
ここで理解され、かつ使用される“中間孔（Ｍｅｓｏｐｏｒｅ）”とは、２ｎｍ〜２００ｎｍの平均直径を有する何らかの細孔を表す。
【００３３】
ここで理解され、かつ使用される“巨大孔（Ｍａｃｒｏｐｏｒｅ）”とは、２００ｎｍを超える平均直径を有する何らかのポート（ｐｏｒｔ）を表す。
【００３４】
ここで理解され、かつ使用される“細孔の直径”とは、各細孔の最も狭い点での細孔の直径を表す。
【００３５】
ここで理解され、かつ使用される“粒子の大きさ”とは、粒子の直径を表す。球状粒子の場合は、大きさは、その直径に相当する。より一般的には、規則的な、又は不規則な形の粒子の大きさは、安定な位置にある粒子のものと同じ面積を有する円の直径によって表される、粒子の直径の推定された（ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ）範囲を表す。
【００３６】
ここで理解され、かつ使用される“累積細孔面積”とは、ある直径（大きさ）を有する細孔について算出された細孔壁の総細孔面積を表す。
【００３７】
ここで理解され、かつ使用される“表面積”とは、多孔性粒子の表面積を表し、それは、その内側及び外側の表面積の合計と等しい。
【００３８】
ここで理解され、かつ使用される粒子の“外側表面”とは、そこからその点と直交する線が、粒子の別の部分と交差せずに外へ向かって延び得る、粒子のそれぞれすべての点を表す。
【００３９】
ここで理解され、かつ使用される多孔性粒子の“内側表面”とは、細孔壁から始まる表面を表す。
【００４０】
ここで理解され、かつ使用される“常磁性”物質は、印加磁場の存在下でのみ弱い磁性を示す。印加磁場が存在しないと、スピン及び軌道モーメントは整列せず（ｕｎａｌｉｇｎｅｄ）、無秩序な方向を向き、お互いに打ち消し合う。しかし、外部印加磁場の存在下では、スピン及び軌道モーメントは、場の方向へ回転する傾向がある。しかし、常磁性物質の原子の熱振動は、全ての磁気モーメントが整列する傾向を妨害する。その結果、印加磁場の方向へ、モーメントの一部のみが整列する。磁場をかける間、その物質は、正味の（ｎｅｔ）、しかし比較的弱い磁場を示す。外部磁場を取り除くと、部分的な整列が損なわれ、磁場は物質中に残存しない。
【００４１】
常磁性物質のように、ここで理解され、かつ使用される“超常磁性”物質も、外部印加磁場の存在下で誘発された一時的な磁場を示す。真の超常磁性物質では、物質の個々の原子の磁気モーメントは、整列し、常磁性物質で生じ得るものよりはるかに強い誘発磁気を形成することになる（例えば、ビーン（Ｂｅａｎ）及びリビングストーン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ）， Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｃｓ， ３０： １２０Ｓ−１２９Ｓ（１９５９）参照）。従って、超常磁性物質の誘発された磁場は、古典的に“常磁性”と定義される物質において生じる場より、はるかに強い（数倍の大きさ（ｂｙ ｓｅｖｅｒａｌ ｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ））。約３００オングストローム（３０ｎｍ）未満の直径の酸化鉄結晶は、そのような超常磁性挙動を示し得る。
【００４２】
ここで理解され、かつ使用される“フェリ磁性”物質、例えば、ヘマタイト（Ｆｅ2Ｏ3）、Ｆｅ金属、Ｎｉ、Ｃｏは、印加磁場が存在しなくても磁場を示し得る物質である。フェリ磁性物質では、物質の領域又は範囲は、磁気モーメントを同じ方向に整列させることができ、その結果、磁場が生じる。フェリ磁性物質に外部磁場をかけると、物質の様々な範囲が、同じ方向に整列するようになることができ、フェリ磁性物質に、非常に強い磁場が生じる。外部磁場を取り除いても、フェリ磁性物質の範囲は、同じ方向に整列したままでいる傾向があるので、物質は全体として、固有の熱振動によって本質的に乱されない（ｕｎｐｅｒｔｕｒｂｅｄ）強い磁場を保つ。しかし、強磁性物質を十分高い温度に加熱することにより、熱エネルギーは、磁気エネルギーを超えることができるので、磁気モーメントの整列は損なわれ、無秩序になる。そのような温度で、物質は、外部発生印加磁場の存在下で、常磁性挙動を示し得る。強磁性物質が常磁性になる温度は、“キュリー温度”又は“キュリー点”として知られている。
【００４３】
ここで理解され、かつ使用される“フェリ磁性”物質は、強磁性物質と同様に、外部印加磁場にさらされた後に残留する磁場（残留磁気）を示す。フェリ磁性は、１つのカチオンが、遷移金属、例えば、Ｆｅ2+、Ｍｎ2+、Ｚｎ2+、Ｃｏ2+等の群からの二価イオン（Ｍ2+）であり、三価カチオンがＦｅ3+である混合酸化物（Ｍ2+Ｏ）（Ｆｅ2Ｏ3）である、例えば、磁鉄鉱（Ｆｅ3Ｏ4）である、フェライトでのみ見られる磁性である。フェライトの結晶構造は、２つの重なり合う結晶からなる。１つの格子位置の原子のスピンは、特定の方位に整列し、別の位置での原子のスピンは、反対の方位に整列し、磁場が残留する（残留磁気）。従って、フェリ磁性物質は、結晶性の鉄の（ｆｅｒｒｉｃ）酸化物化合物であり、外部印加磁場の存在なしに磁場を保持するそれらの能力の点で、強磁性物質と似ている。
【００４４】
本発明の多孔性磁性シリカ粒子は、強磁性又はフェリ磁性挙動を示し、外部磁場がなくても磁化されたままであるが、この残留磁気は、粒子を塊にするか凝集させるには弱すぎる。
【００４５】
別に断らない限り、ここで理解され、かつ使用される“シリカ”、“シリカガラス”、及び“ガラス”という語は、本発明の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を作製するために使用される、酸化鉄粒子又は顔料の全部又は一部を被覆する非晶質、結晶形状のＳｉＯ2を表す。
【００４６】
本発明の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子は、何らかの混合物又は試料から、核酸分離を単離又は分離するために有用である。ここで理解され、かつ使用される“混合物”又は“試料”は、目的の分子を含む何らかの混合物又は調製物を含む。混合物は、人工のものであっても、細胞、組織、若しくはウイルスのような天然又は生物学的供給源に由来するものであってもよい。混合物又は試料は、例えば、目的の分子の他に多くの成分を含む複雑なものであることができ、又は、目的の分子の水溶液のような、比較的単純なものであることもできる。混合物は、それらに限定されないが、核酸の処理若しくは合成に用いられるか、又はポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）、核酸配列決定反応、制限エンドヌクレアーゼ若しくは他のヌクレアーゼ消化反応、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ混合物、蛋白質−核酸結合アッセイ混合物、抗体−核酸アッセイ混合物、並びにインビトロ転写及び／若しくは翻訳アッセイ混合物のような核酸を含む何らかの様々なインビトロ反応混合物を含む。混合物又は試料中に存在し得る生物学的材料は、それらに限定されないが、血漿、リンパ、乳、尿、精液、又は他の生物学的体液、全細胞、細胞の抽出液、ウイルス粒子、毛髪、及び組織ホモジェネート（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ）を含む。
【００４７】
多孔性磁性ガラス粒子の組成及び製造方法
本発明の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子は、酸化鉄及びシリカガラスを含む。好ましくは、それら粒子は、３０〜５０（重量）％のＦｅ3Ｏ4及び５０〜７０（重量）％のＳｉＯ2という、比較的簡単な組成を有する。より好ましくは、本発明の粒子は、３５〜４５（重量）％のＦｅ3Ｏ4及び５５〜６５（重量）％のＳｉＯ2である。しかし、特定のプロトコルにより適した性質を有する粒子を得るために、反応混合物中に他の化合物を導入することもできる。従って、本発明の粒子は、酸化鉄の他に、他の金属、特に遷移金属の酸化物を含むこともでき、チタン、ホウ素、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、及び鉛の酸化物を制限なく含むことができる。本発明の粒子中で、酸化鉄が、重量で最も多い（ｐｒｅｖａｌｅｎｔ）金属酸化物であることが好ましい。
【００４８】
製造プロセスで用いられる酸化鉄粒子又は顔料の大きさは、最終的な粒子生成物の大きさ及び特性に影響を及ぼす。このため、成分酸化鉄粒子又は顔料は、直径で約７５〜３００ｎｍの平均サイズを有することが好ましい。少なくとも８０％の酸化鉄粒子が、直径で約７５〜３００ｎｍの平均サイズを有することがより好ましい。少なくとも９０％の酸化鉄粒子が、直径で約７５ｎｍ〜３００ｎｍの平均サイズを有することが更に好ましく、本発明の多孔性磁性ガラス粒子を作製するために使用される酸化鉄粒子の少なくとも９５％が、この範囲の大きさであることが最も好ましい。
【００４９】
ここに記載の多孔性磁性ガラス粒子の細孔は、粒子の外側表面での細孔の直径によって決定される幅広い範囲の大きさで存在する。好ましくは直径が約５〜２５μｍであり、より好ましくは直径が約６〜１５μｍであり、最も好ましくは直径が約７〜１０μｍである本発明の粒子が、１９０ｍ2／ｇ以上、好ましくは１９０〜２７０ｍ2／ｇの比較的高い値のＢＥＴ比表面積も有するという事実により、本発明の粒子の細孔含有量が高いこともわかり（ａｐｐｒｅｃｉａｔｅｄ）、この大きさの粒子が高い細孔表面積を有することが示される。従って、微小孔、中間孔、及び巨大孔として分類される細孔はすべて、本発明によって調製された各粒子上に表され得る。注目すべきことに、ここに記載の粒子中に存在する細孔は、１０ｎｍ超及び１０ｎｍ未満の直径を有する細孔を含む。直径が１０ｎｍを超える細孔について、標準水銀多孔度計によって測定された粒子の累積細孔面積が、典型的には４ｍ2／ｇ超であり、好ましくは約４〜８ｍ2／ｇであるという事実により、本発明の多孔性磁性ガラス粒子の多孔度が高いこともわかる。
【００５０】
酸化鉄粒子又は顔料は、本発明の多孔性磁性ガラス粒子の基本的な磁性核を構成する。製造プロセス中に、シリカが酸化鉄粒子上に堆積又は沈殿すると、酸化鉄粒子は凝集し始め、上記のように、大きな表面積を有する、より大きな本発明の多孔性磁性ガラス粒子を形成する。直径で約７５〜３００ｎｍの範囲の好ましい平均サイズにおいて、既に利用可能でなければ、酸化鉄粒子又は顔料は、製造プロセスを行う前に、好ましいサイズに縮小されなければならないこともある。酸化鉄粒子又は顔料は、従来技術において知られていた様々な方法のいずれかを用いて、約７５ｎｍ〜約３００ｎｍのサイズの好ましい平均サイズに加工され得る。例えば、酸化鉄粒子又は顔料は、ＰＭ４００遊星運動（ｐｌａｎｅｔａｒｙ）ボールミル（レッチェ（Ｒｅｔｓｃｈ）、ハーン（Ｈａａｎ）、ドイツ）のようなボールミルを用いて、適当なサイズに粉砕され得る。例えば、市販の実験室使用用攪拌器を用いることにより、迅速に攪拌することによって、酸化鉄粒子を粉砕することがより好ましい。酸化鉄粒子又は顔料は、脂肪族Ｃ1−Ｃ6−アルコール、より好ましくは、イソプロパノール、エタノール、グリコール、又はグリセロールのような脂肪族Ｃ1−Ｃ4−アルコール中に懸濁させるべきである。粘度が高いことにより、より小さな酸化鉄粒子を調製することができるので、グリセロールを用いることが好ましい。酸化鉄粒子をグリセロールの溶液（例えば４３％グリセロール）中で迅速に攪拌することにより、約７５ｎｍ〜約３００ｎｍの範囲の平均サイズに粉砕することが最も好ましい。
【００５１】
ここに記載の多孔性磁性ガラス粒子のシリカ成分は、製造工程中に、好ましくは式Ｓｉ（ＯＣnＨ2n+1）4（ここでｎは１〜５の整数である）を有するテトラアルコキシシランから生成される。このシリカ合成段階は、グリセロールやグリコールのような多官能アルコールのシリルエステルを使用することもできる。本発明の別の態様では、シリカ供給源は、珪酸塩であることができ、より好ましくは、珪酸ナトリウム又はシリカナノ粒子である。又は、シリカの供給源は、少なくとも一種のテトラアルコキシシランと少なくとも一種の多官能アルコールのシリルエステルとの組み合わせであることができる。本発明の多孔性磁性ガラス粒子のためのシリカの供給源は、テトラエトキシシランであることが最も好ましい。
【００５２】
製造工程の好ましい態様において、テトラアルコキシシランは、６〜８のｐＨ、より好ましくはｐＨ７で、テトラエトキシシラン含有（３０％）脂肪族Ｃ1−Ｃ6−アルコール、より好ましくは脂肪族Ｃ1−Ｃ4−アルコール（７０％）の溶液として、強磁性又はフェリ磁性酸化鉄粒子の懸濁液へ添加される。
【００５３】
本発明の多孔性磁性ガラス粒子の製造プロセス中に、反応混合物のｐＨを、酸性ｐＨ、例えば６以下のｐＨ、又はアルカリ性ｐＨ、例えば９以上のｐＨに変化させることによって、テトラアルコキシシラン、多官能アルコールのシリルエステル、又はそれらの組み合わせを加水分解してシリカを放出させる。テトラアルコキシシランを加水分解するために使用され得る酸性バッファーは、それらに限定されないが、ｐＨ５を有する酢酸塩バッファーを含む。本発明の方法において、テトラアルコキシシランを加水分解するために使用され得るアルカリ性バッファーは、それらに限定されないが、９〜１１の範囲のｐＨを有するアンモニア／アンモニウム塩バッファー（例えば、アンモニア／塩化アンモニウムバッファー）を含む。テトラアルコキシシランを加水分解してシリカを放出するために、アルカリ性バッファーを用いてシリカを合成することが好ましい。９〜１１のｐＨにおいて、アンモニア／アンモニウム塩バッファーを用いてシリカを合成することがより好ましい。
【００５４】
本発明の多孔性磁性ガラス粒子の製造プロセスの別の態様において、反応混合物のｐＨを、酸性ｐＨ、例えば６以下のｐＨへ変化させることにより、珪酸塩又はシリカナノ粒子を加水分解してシリカを放出させる。酢酸を用いてシリカを合成することがより好ましい。
【００５５】
テトラアルコキシシラン又は他のシリカ供給源の加水分解において放出されたシリカは、酸化鉄粒子又は顔料の表面上へ沈殿、堆積、又は吸着し、その後、凝集して、より大きな本発明の多孔性磁性ガラス粒子を形成する。
【００５６】
シリカ合成段階を行うために、酸化鉄粒子又は顔料は、まずシリカ供給源と、次いで、添加された酸性若しくはアルカリ性ｐＨの加水分解バッファーと混合されることができ、又は、酸化鉄粒子は、まず加水分解バッファーと、その後添加されたシリカ供給源と混合されることができる。しかし、好ましい工程では、まず酸化鉄粒子をシリカ供給源と混合し、その後、加水分解バッファーを添加する。また、酸化鉄粒子の表面へより効率的に堆積又は沈殿し得る小さなシリカ粒子の製造を促進するに足る粘性を有する最終反応溶液中で、シリカ合成段階が行われることが好ましい。好ましい態様において、アンモニア／塩化アンモニウムバッファー（５Ｍ、ｐＨ１０．５）は、グリセロール（４３％）、エタノール（４３％）、及びテトラエトキシシランの溶液中に分散させた酸化鉄粒子へ、２０００ｒｐｍで混合物を攪拌しながら、１０分間にわたり滴下して添加される。１０分より短い時間でバッファーを添加すると、非磁性粒子が生成される傾向があるのに対し、より長い時間でバッファーを添加すると、非常に密で、試料から核酸分子を単離又は分離するための最適値より小さい低い（ｒｅｄｕｃｅｄ）多孔度を有する粒子が生成される傾向がある。シリカ合成中、５００ｒｐｍのようなより遅い速度で攪拌すると、核酸に対する結合能力がより低い多孔性磁性ガラス粒子が得られる。
【００５７】
テトラアルコキシシラン又は他のシリルエステル化合物の加水分解によってシリカを合成すると、それは、酸化鉄粒子の表面上へ沈殿又は吸着する。次いで、シリカ含有酸化鉄粒子は凝集し、より大きな多孔性ガラス（シリカ）粒子を形成するであろう。新たに形成された粒子を、凝固又は安定化し得るように、更にインキュベート（“熟成（ａｇｅ）”）させることが推奨される。効果的な熟成段階は、更に８〜２４時間攪拌しながら、新たに形成された粒子をシリカ合成混合物中でインキュベートさせ続けることのみを含み得る。
【００５８】
安定化された新たに形成された粒子は、濾過によって反応混合物から分離され、次いで、溶媒溶液、通常はアルコール溶液によって洗浄される。洗浄溶液は、アルコールの他に、またはアルコールに代えて、アセトン及び／またはカオトロピック剤（類）を含む他の溶媒及び試薬を含み得る。しかし、一般に、新たに形成された粒子の洗浄のためには、無水アルコール、特に、無水（ａｂｓｏｌｕｔｅ）エタノールのみが好ましい。無水エタノールのような無水アルコールは、新たに形成された粒子が塊になることを防ぐ際に、及び核酸分子に対する高い結合能力を有するか、又は保持する粒子の生成において非常に有効である。
【００５９】
濾過及び洗浄後、新たに形成された多孔性磁性ガラス粒子は乾燥され得る。最適乾燥温度は、キュリー温度より常に低く、かつ約１００℃程度と低いか、又は約５００℃と高くあり得る。その温度は、約３００℃〜５００℃の範囲、例えば２００℃であることが好ましい。循環空気乾燥オーブン中で約３００℃において、新たに形成された粒子を乾燥させることによって、最適な結果が得られることがより好ましい。最終的な多孔性磁性ガラス粒子の平均サイズは、直径で約５〜２５μｍであることが好ましく、約６〜１５μｍであることがより好ましく、約７〜１０μｍであることが最も好ましい。乾燥させた粒子は、熟成の徴候、即ち、粒子の何らかの性質の劣化を示さずに、室温で数ヶ月間、密閉容器中に保存され得る。
【００６０】
本発明によって強磁性又はフェリ磁性粒子を作製する別の方法は、アルコール、好ましくはエタノール中へ強磁性又はフェリ磁性酸化鉄粒子を供給する段階、６未満のｐＨで強磁性又はフェリ磁性酸化鉄粒子の懸濁液へシリカナノ粒子を添加する段階、連続的に攪拌することにより、混合物を熟成する段階、得られた多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を液体から、例えば磁気的に分離する段階、分離された多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を洗浄する段階、及び約２００℃の温度で多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を乾燥させる段階を含む。
【００６１】
核酸分子に対して高い結合能力を示す高多孔性磁性ガラス粒子を生成するために、以下のガイドラインが推奨される。本発明の多孔性磁性ガラス粒子の製造において使用される酸化鉄粒子又は顔料は、フェリ磁性磁鉄鉱（Ｆｅ3Ｏ4）粒子であることが好ましい。酸化鉄粒子又は顔料は、直径で７５ｎｍ〜３００ｎｍの平均サイズを有するべきである。粉砕することにより、酸化鉄粒子又は顔料の大きさを、この推奨範囲に縮小することが必要とされることもある。酸化鉄粒子又は顔料を推奨される大きさの範囲に粉砕するためには、ボールミルが使用され得るが、粉砕段階は、グリセロール溶液のような粘性溶液中で、２０００ｒｐｍのような迅速な攪拌によって行われることが好ましい。テトラアルコキシシラン、シリルエステル、又は珪酸塩の加水分解によって、又は酸性若しくはアルカリ性ｐＨを用いてシリカナノ粒子を沈殿させることによって、シリカが合成される。テトラアルコキシシランは、本発明の粒子を合成するために好ましいシリカ供給源である。酸化鉄粒子又は顔料の表面上をより効率的に被覆するか、又は沈殿し得る小さなシリカ粒子の合成を促進するために、シリカ合成は、粘性溶液、例えば、グリセロールを含む溶液中で行われるべきである。粘性テトラアルコキシシラン又はシリルエステル化合物混合物中に懸濁させた酸化鉄粒子へ、加水分解バッファーを添加することが好ましい。更に、シリカ供給源は、特に、供給源がテトラエトキシシランの場合は、１０分間で添加されるべきである。無水アルコール、特に無水エタノールは、新たに形成された多孔性磁性ガラス粒子を洗浄するために好ましい溶媒である。新たに形成された多孔性磁性ガラス粒子は、それらを安定化するために熟成されるべきである。最終的に、１００℃〜５００℃、好ましくは３００℃〜５００℃、より好ましくは３００℃のオーブン中で、比較的高温であるが、キュリー温度よりも低温で、新たに形成された粒子を乾燥させるべきである。
【００６２】
本発明の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子は、核酸、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、脂質、及びそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない、混合物中の様々な目的の分子のいずれかを分離、検出、又は単離するためのキットへ提供されることもできる。本発明のキットは、混合物中の目的の核酸分子又はヌクレオチドを含む分子を分離、検出、又は単離するために、ここに記載の多孔性強磁性又はフェリ磁性ガラス粒子を含むことが好ましい。本発明のキットは、多孔性磁性ガラス粒子を懸濁させるために、及び／又は核酸若しくは他の目的の分子のための単離若しくは生成工程中のその後の段階のために有用な、一種以上のバッファーを含むこともできる。本発明のキットに含まれ得る一種以上のバッファーは、一種以上のカオトロピック剤又は物質を含み得る。本発明によれば、好ましいカオトロピック剤は、トリクロロアセテート、チオシアネート（イソチオシアン酸グアニジニウム（又は“グアニジン”を含む）、過塩素酸塩（例えば過塩素酸ナトリウム）、ヨウ化物（例えばヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム）、塩酸グアニジニウム、及び尿素を制限なく含む。カオトロピック剤は、１〜８Ｍの水溶液で用いられることが好ましく、より好ましくは２〜５Ｍの水溶液で、最も好ましくは２〜４Ｍの水溶液で用いられる。本発明のキットのバッファー中のカオトロピック剤は、イソチオシアン酸グアニジニウムであることが最も好ましい。
【００６３】
核酸及び他の生体分子の単離における使用
ここに記載の多孔性磁性ガラス粒子は、核酸と結合する高い能力を有し、それにより、様々な試料及び混合物から核酸分子を単離又は分離するために特に有用な本発明の粒子が作製される。炭水化物、ポリペプチド、ペプチド、脂質、及び、糖蛋白質及び核酸／蛋白質の組み合わせ又は集合のような、そのような分子の組み合わせをも含むが、それらに限定されない他の分子の単離又は分離のために、それら粒子を使用することもできる。目的の分子がここに記載の多孔性磁性ガラス粒子に結合するか、又はそこから溶出するバッファー条件を調節することにより、１つの分子が別のものから選択的に単離又は分離され得る。本発明の多孔性磁性ガラス粒子の磁性により、従来技術で利用可能であった様々な磁気回収システムのいずれかを用いて外部磁場をかけることにより、試料又は混合物から、それら粒子を容易かつ迅速に回収することができる。
【００６４】
例えば、本発明の多孔性磁性ガラス粒子は、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ反応生成物、プラスミド、ゲノム核酸、核酸プライマー、様々な種のＲＮＡ、リボザイム、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒｓ）、合成によって生成されたヌクレオチドを含む核酸分子、化学的に合成された核酸、核酸−蛋白質複合体、ハイブリダイズされた核酸分子、インビトロ転写及び／又は翻訳アッセイ、ＥＬＩＳＡや放射線免疫アッセイのような免疫アッセイ（そのような工程は、核酸成分を含む）における核酸分子を含むが、それらに限定されない様々な核酸分子のいずれかを単離又は分離するために用いられ得る。合成によって生成されたヌクレオチドは、一部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）、即ち、糖、窒素含有複素環塩基（プリン又はピリミジン）、及びリン酸塩バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を構成し、現実に（ｉｎ ｎａｔｕｒｅ）見られるヌクレオチド、並びに現実には見られない基によって修飾又は置換された構成部分を有するヌクレオチド化合物を含む。例えば、本発明の粒子は、チオール基が一種以上のりん酸塩基を置換し、修飾されたプリン若しくはピリミジンが、自然に発生したプリン若しくはピリミジンを置換し、又は異なる分子が、リボース若しくは２−デオキシリボース糖部を置換する合成ヌクレオチドを含む核酸分子を単離するために用いられ得る。ここに記載の粒子は、反応からの核酸を結合及び分離することによって、核酸分子の存在に依存する反応を、効率的に停止させるためにも用いられ得る。また、ここに記載の粒子は、例えば、法廷用（ｆｏｒｅｎｓｉｃ）試料、考古学試料、封じ込め（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ）容器中の偶然の流出及び裂け目（ｂｒｅａｃｈｅｓ）の場合のように、価値があるか、又は危険な核酸分子を回収するか、又は取り出すために使用され得る。
【００６５】
本発明の多孔性磁性ガラス粒子は、単離工程において段階を調整することにより、他の核酸分子から、特定の種類又は大きさの核酸分子を優先的に分離するために使用され得る（下記実施例６及び７を参照）。核酸分子を磁性粒子へ結合させるための基本的なプロトコルが説明されている（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９５／０１３５９参照；本明細書に開示として援用される）。例えば、核酸は、核酸の粒子への結合を促進する高濃度の塩の存在下で、本発明の多孔性磁性ガラス粒子によって単離され得る。過塩素酸ナトリウム、塩酸グアニジニウム、イソチオシアン酸グアニジニウム、ヨウ化カリウム、チオシアン酸カリウム、塩化ナトリウム、イソチオシアン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、又はヨウ化ナトリウムのような、（上記のような）カオトロピック剤が一種以上存在することも好ましい。カオトロピック剤がイソチオシアン酸グアニジニウムであることがより好ましい。カオトロピック剤は、好ましくは１〜８Ｍ；より好ましくは２〜５Ｍ、最も好ましくは２〜４Ｍの濃度で使用される。更に、１〜８０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の濃度のメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、又はそれらの組み合わせのような、Ｃ1−Ｃ5脂肪族アルコールも、カオトロピック剤の溶液へ添加され得る。イソプロパノールを使用することが特に好ましい。
【００６６】
塩及び／又はアルコールの濃度は、核酸分子が磁性粒子へ選択的に結合するように調整され得る。更に、カオトロピック剤及び／又はアルコールの濃度を調整することにより、長さの異なる核酸をお互いに分離することができる。目的の核酸分子を本発明の多孔性磁性ガラス粒子へ結合させ、かつ溶出させるための様々なバッファー条件の例を、以下に記載する（実施例参照）。
【００６７】
目的の特定の核酸分子が結合又は吸着する磁性粒子は、混合物から磁気的に回収又は分離され得る。例えば、それら粒子は、外部磁場をかけることにより、それらを含む容器の壁に付着させることができ、次いで、粒子に結合していない内容物は、例えば、ピペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）、デカンテーション、又は吸引濾過によって除去され得る。代わりの工程において、磁石を混合物に浸すことにより、結合した核酸分子を含む磁性粒子を、混合物の結合していない成分から分離することができ、結合した核酸分子を含む粒子を回収し、磁石上の粒子を別の容器に移し、必要により、粒子を磁石から容器内へ拭き取るか洗い流し、回収した粒子を取り去った磁石を除去することができる。
【００６８】
結合段階後、それら粒子はまた、必要により、溶媒による洗浄段階及びその後の磁気分離によって、不純物から分離され得る。洗浄溶液は、アルコール、アセトンのような他の高揮発性有機溶媒、更に一種以上のカオトロピック剤を含み得る。
【００６９】
分離した核酸分子の更なる利用に適しているならば、核酸分子は、磁性粒子から、溶出バッファーによって溶出され得る。溶出バッファーは、例えば、脱イオン水、低塩濃度の水性溶液、トリス−［ヒドロキシメチル］アミノメタン（トリス）バッファー、及び／又はエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）を含み得る。
【実施例】
【００７０】
本発明のより完全な理解、択一的な（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）明らかな態様、及びそれらの利点は、以下の非限定的な（ｎｏｎ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）実施例からも得られ得る。
実施例１．合成Ｉ：テトラエトキシシランのアルカリ加水分解を用いる多孔性磁性ガラス粒子の合成
酸化鉄（ＩＩ、ＩＩＩ）粒子（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、スタインハイム（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ）、ドイツ、カタログ番号３１，００６−９）を、ＰＭ４００遊星運動ボールミル（レッチェ（Ｒｅｔｓｃｈ）、ハーン（Ｈａａｎ）、ドイツ）のようなボールミルに入れ、５０ｍｌのイソプロパノール又はエタノール中で懸濁させた。ミルジャー（ｊａｒ）に、直径３ｍｍの酸化イットリウムボールを充填し、ミルを、最大強度で３時間運転させた。粉砕された粒子を除去し、酸化イットリウム粒子を製造者の手順に従って分離し、粉砕された酸化鉄４ｇを、還流濃縮器及び攪拌器を備えた５００ｍｌの三角フラスコ（メルク社（Ｍｅｒｃｋ ＧｍｂＨ）、ケルン（Ｋｏｅｌｎ）、ドイツ；カタログ番号９．１９７２１５）に移した。１５０ｍｌの無水エタノール及び４５ｍｌの５Ｍアンモニア／塩化アンモニウムバッファー（ｐＨ１１）を、フラスコ中の粉砕した粒子へ添加し、５００ｒｐｍで攪拌することによって混合した。１００ｍｌのテトラエトキシシラン溶液（テトラエトキシシラン３０ｍｌ：エタノール７０ｍｌ）を、扇動（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ）ポンプによって、室温で３時間にわたり滴下して添加し、更に２４時間、連続的に攪拌することにより、反応混合物をインキュベート（熟成）させた。次いで、多孔度３のガラスフリットを通して混合物を吸引濾過し、得られた粒子を回収した。１００ｍｌの脱イオン水によって２回、１００ｍｌの無水エタノールによって２回、かつ脱イオン水によって更に２回、回収した粒子を洗浄した。次いで、循環空気乾燥オーブン中で、１２０℃で粒子を乾燥させた。
【００７１】
実施例２．合成ＩＩ：テトラエトキシシランの酸加水分解を用いる多孔性磁性ガラス粒子の合成
１０ｇのマグネチック・ピグメント（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐｉｇｍｅｎｔ）３４５（ＢＡＳＦ、ルードヴィスハーフェン（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ）、ドイツ）をプラスチック容器に入れ、１００ｍｌの無水エタノールと混合した。均質化攪拌器（ウェラボ（Ｗｅｌａｂｏ）、デュッセルドルフ（Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ）、ドイツ；カタログ番号３３３６１１３１２）を、プラスチック容器へ導入し、プラスチック容器を氷浴で低温に保ちながら、約１０００ｒｐｍで３時間、混合物を攪拌した。混合した懸濁液及びプラスチック容器のエタノールリンス１００ｍｌを、２リットルの三口フラスコへ移し、更に２００ｍｌのエタノールを添加した。次いで、２Ｍ酢酸／酢酸塩バッファー（ｐＨ４．０）１００ｍｌをフラスコへ添加した。１０００ｒｐｍで混合物を攪拌しながら、１００ｍｌのテトラエトキシシラン溶液（テトラエトキシシラン５０ｍｌ：エタノール５０ｍｌ）を、滴下漏斗によって１０分間にわたって滴下して添加した。連続的に攪拌して、混合物を一晩（約８〜１２時間）熟成させ、次いで、多孔度３のガラスフリットを通して吸引によって濾過し、得られた粒子を回収した。１００ｍｌの脱イオン水によって２回、１００ｍｌの無水エタノールによって２回、かつ１００ｍｌの脱イオン水によって再度２回、得られた粒子を洗浄した。循環空気乾燥オーブン中で、１２０℃で８時間、粒子を乾燥させた。得られた粒子は、１０μｍの平均直径を有していた。
【００７２】
実施例３．合成ＩＩＩ：磁鉄鉱及び珪酸ナトリウムからの多孔性磁性ガラス粒子の合成
１０ｇのマグネチック・ピグメント（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐｉｇｍｅｎｔ）３４５（ＢＡＳＦ、ルードヴィスハーフェン（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ）、ドイツ）を、プラスチック容器中で１００ｍｌのパラフィン油中に懸濁させ、プラスチック容器を氷浴で低温に保ちながら、均質化攪拌器によって１０００ｒｐｍで３時間攪拌した。次いで、１００ｍｌのパラフィン油をプラスチック容器へ添加し、混合物を均質になるまで再度攪拌した。混合物を、２リットルの三口（ｔｈｒｅｅ−ｎａｃｋｅｄ）へ移した。更に２００ｍｌのパラフィン油を添加した後、２００ｍｌの１−ヘキサノール（フルカ（Ｆｌｕｋａ）、カタログ番号５２８４０）、及び６０ｍｌの珪酸ナトリウム水溶液（水中に２７％ＳｉＯ2、フルカ（Ｆｌｕｋａ）、カタログ番号７１９５７）を添加した。次いで、混合物を２０００ｒｐｍで攪拌しながら、濃縮した酢酸６０ｍｌを５分間にわたって滴下して添加した。次いで、混合物を更に６０分間攪拌した。次いで、新たに形成された粒子を含む混合物を、遠心分離管へ注ぎ、管を１時間遠心分離して粒子を回収した。上清液をデカンテーションし、メタノール溶液（５０％）中に粒子を懸濁させる。粒子の懸濁液を多孔度３のガラスフリットを通して吸引濾過した。その後、１００ｍｌの無水エタノールで２回、次いで１００ｍｌの脱イオン水で２回、回収した粒子を洗浄する。次いで、循環空気乾燥オーブン中で、２００℃で粒子を乾燥させた。得られた多孔性磁性ガラス粒子は、２５μｍの平均直径を有していた。
【００７３】
実施例４．合成ＩＶ：多孔性フェリ磁性シリカ粒子の合成
５００ｍｌプラスチック容器中へ、２００ｍｌの無水グリセロールを添加し、攪拌器の下に容器を調整した。２４ｇの磁鉄鉱（バイオキシド（Ｂａｙｏｘｉｄｅ）８７１３Ｈ、バイエル（Ｂａｙｅｒ）ＡＧ製、レーヴァクーゼン（Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ）、ドイツ）を、ゆっくり攪拌しながらグリセロールへゆっくり添加し、２，０００ｒｐｍで２時間攪拌し続けて、塊を破壊した。次いで、攪拌速度を下げて、２５０ｍｌのグリセロールを懸濁液へ添加した。５分後、攪拌器（実施例１参照）及び滴下漏斗を有する４リットルのフラスコへ、反応混合物を移した。４５０ｍｌのグリセロール、９００ｍｌのエタノール、及び１２０ｍｌのテトラエトキシシランを添加し、攪拌速度を２０００ｒｐｍに調整した。１０分以内に、ｐＨ１０．５の７Ｍ塩化アンモニウムバッファー３００ｍｌを添加し、攪拌速度を１２分間維持した。次いで、反応混合物を濾過し、脱イオン水で２回、及びエタノールで２回洗浄し、３００℃で７時間乾燥させた。粒子は、５〜１０μｍの粒子サイズを有していた。
【００７４】
実施例５．合成Ｖ：磁鉄鉱及びシリカナノ粒子からの多孔性磁性ガラス粒子の合成
１０ｇのマグネチック・ピグメント（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｐｉｇｍｅｎｔ）３４５（ＢＡＳＦ、ルードヴィスハーフェン（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ）、ドイツ）及び１００ｍｌの無水エタノールをプラスチック容器に入れ、均質化攪拌器で２時間、１０００ｒｐｍで攪拌した。更に１００ｍｌのエタノールを添加し、混合物を更に５分間攪拌した。容器の内容物を１リットルの三口フラスコへ移した。３０ｍｌのルドックス（ＬＵＤＯＸ）ＡＳ４０（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ダイゼンホフェン（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）、ドイツ、カタログ番号４２，０８４−０）及び４００ｍｌの脱イオン水も、フラスコへ添加した。フラスコ中の混合物を、１０００ｒｐｍで５分間攪拌した。次いで、５０ｍｌの濃縮酢酸を、５分間にわたり、連続的に攪拌しながら滴下して添加した。混合物を、更に３０分間１０００ｒｐｍで、次いで、更に６０分間５００ｒｐｍで攪拌した。新たに形成された粒子を含む混合物を、多孔度３のガラスフリットを通して吸引濾過し、粒子を回収した。１００ｍｌの脱イオン水で２回、１００ｍｌの無水エタノールで２回、かつ１００ｍｌの脱イオン水で更に２回、回収した粒子を洗浄した。洗浄された粒子が乾燥するまで吸引を続けた。循環空気乾燥オーブン中で、２００℃で７時間、粒子を更に乾燥させた。この工程によって生成された多孔性磁性ガラス粒子は、２５μｍの平均直径を有していた。
【００７５】
実施例６．より小さな核酸分離からプラスミドＤＮＡを精製するための多孔性磁性ガラス粒子の使用
この実施例は、３つの異なる磁性粒子の、より短いＤＮＡ分子の混合物からプラスミドＤＮＡを精製する能力を比較する。この実施例では、３つの異なる供給源からの磁性粒子は、ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）オリゴヌクレオチドプライマーの混合物から、３ｋｂのプラスミドベクターを分離するために使用される。ロシュ・ダイアグノスティクス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）（ｍＲＮＡ単離キット、カタログ番号１９３４３３３、ロシュ・ダイアグノスティクス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）、及びプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（ウィザード・ピュア・フェクション（ＷＩＺＡＲＤ ＰＵＲＥ ＦＥＣＴＩＯＮ）（登録商標）プラスミドＤＮＡ精製システム、カタログ番号Ａ２１５０、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ＷＩ）から、本発明の多孔性磁性ガラス粒子の実施例として、実施例４の工程によって、それら磁性粒子が得られた。
【００７６】
２．９６ｋｂ（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＧｍｂＨ）、ハイデルベルグ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、ドイツ）、及び５０μｌ当たり１μｇのオリゴマー濃度で、２０ヌクレオチド（２０量体）、４５ヌクレオチド（４５量体）、５６ヌクレオチド（５６量体）、及び７５ヌクレオチド（７５量体）のヌクレオチド長を有する一連の市販のオリゴマーＰＣＲプライマー（ＴＩＢモルビオル（Ｍｏｌｂｉｏｌ）、ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ）、ドイツ）であるファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）ｐブルースクリプト（ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ）ＩＩを含む核酸分子の溶液が調製された。
【００７７】
磁気分離によって、実施例４で得られた磁性粒子の３つの調製物からバッファー汚染物質を除き（ｆｒｅｅｄ）、水で２回、無水エタノールで２回洗浄し、真空乾燥させた。次いで、粒子を、２３．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、バッファーＰＢ、カオトロピック剤を含む溶液（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＵＳＡ、カタログ番号１９０６６）中に懸濁させた。５００μｌのＰＣＲエッペンドルフ管中で、各粒子の懸濁液１００μｌを、核酸分子溶液の５０μｌアリコートと混合した。次いで、粒子と核酸分子とを、ＩＫＡミニシェーカー（Ｍｉｎｉｓｈａｋｅｒ）（ＩＫＡ、スタウフェン（Ｓｔａｕｆｅｎ）、ドイツ）上で１分間混合した。次いで、ＰＣＲ管をダイナル（Ｄｙｎａｌ）ＭＰＣ−Ｐ−１２磁気分離機中に入れ、液体から磁性粒子を回収して分離した後、上清液を捨てた。次いで、バッファーＰＥ（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＵＳＡ、カタログ番号１９０６５）中で４回、再懸濁させることによって粒子を洗浄した。
【００７８】
洗浄した粒子を、３７℃で加熱ブロック中で１５分間乾燥させ、残留エタノールを除去した。粒子から核酸分子を溶出するために、３０μｌの溶出バッファー（１０ｍＭのトリスＨＣｌ（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン）、ｐＨ８．５）を、ＰＣＲ管中の粒子へ添加した後、ＩＫＡミニシェーカー（Ｍｉｎｉｓｈａｋｅｒ）上で、管を１分間混合した。次いで、ＰＣＲ管を磁気分離機中に入れ、粒子を磁気的に分離した。次いで、２５μｌの溶出液を管からピペットで取り出した。核酸分子の収率を分析するために、溶出液の試料１５μｌを、標準２％ＴＡＥ（トリス、酢酸塩、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート））臭化エチジウム含有アガロースゲル上で操作した。下記表１は、３種の磁性粒子によって精製された様々な核酸分子の収率を示す。
【００７９】
【表１】
2012106241.tif 000002
【００８０】
表１の核酸分子の収率から、実施例４の工程によって生成された多孔性磁性ガラス粒子が、より小さな核酸分子からプラスミドＤＮＡを精製する際に、どちらかの市販の磁性粒子の調製物より、より有効であることが明らかに示される。
【００８１】
実施例７．全血液からゲノムＤＮＡを精製するための多孔性磁性ガラス粒子の使用
この実施例は、ヒトの血液細胞からゲノムＤＮＡを精製するための、本発明の多孔性磁性ガラス粒子の使用を示す。
多孔性磁性ガラス粒子は、実施例４の工程によって合成した。０．０４％のナトリウムアジドを含む、ヌクレアーゼを含まない水に、１１０ｍｇのキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）プロテアーゼ（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＵＳＡ、カタログ番号１９１５７）を溶解することにより、プロテアーゼ溶液を調製した。このプロテアーゼ溶液を、２〜８℃で貯蔵して、少なくとも２ヶ月間静置した。１２５ｍｌの無水エタノール（フルカ（Ｆｌｕｋａ）ＡＧ、バックス（Ｂｕｃｈｓ）、スイス）を９５ｍｌのＡＷ１濃縮バッファー貯蔵液（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＵＳＡ、カタログ番号１９０８１）と混合することにより、ＡＷ１バッファーを調製した。１６０ｍｌの無水エタノールを６６ｍｌのＡＷ２濃縮バッファー貯蔵液（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＵＳＡ、カタログ番号１９０７２）と混合することにより、ＡＷ２バッファーを調製した。多孔性磁性ガラス粒子（１８０ｍｇ）を、１ｍｌのカオトロピックＡＬバッファー（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＵＳＡ、カタログ番号１９０７５）中に懸濁させ、懸濁液を使用直前にホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）（ＩＫＡ ミニシェーカー（Ｍｉｎｉｓｈａｋｅｒ））で混合した。
【００８２】
本発明の多孔性磁性ガラス粒子は、以下の血液スピンプロトコルを用いて血液細胞からゲノムＤＮＡを単離するために使用された。
２０μｌのプロテアーゼ溶液をミクロ遠心分離管の底へ移し、１５秒間のパルスボルテックス（ｐｕｌｓｅ−ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）によって、遠心分離で２００μｌのバッファーＡＬ及び２００μｌの全ヒト血液と混合し、均質な混合物（細胞抽出物）を得た。ＡＬバッファー中の磁性粒子の均質な懸濁液２０μｌを添加した後、ミクロ分離（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）管に１５秒間パルスボルテックスを行った。次いで、磁性粒子と細胞抽出物との混合物を５６℃で１０分間インキュベートした。２５０μｌのイソプロパノールを混合物へ添加し、ミクロ分離管に直ちにパルスボルテックスを１５秒間行った。
【００８３】
磁性粒子及び細胞抽出物を含むミクロ分離管を磁気分離機（ダイナル（Ｄｙｎａｌ）ＡＳ、上記参照）へ入れ、上清液から磁性粒子を分離した後、上清液は廃棄した。５００μｌのバッファーＡＷで２回、粒子を洗浄し、粒子をバッファー中に再懸濁させ、簡単にボルテックスミキサーで混合することにより（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）、完全に懸濁させた。それぞれのボルテックスミキサーによる混合の後に、磁気分離機を用いて粒子を回収した、その後、同じように、５００μｌのバッファーＡＷ２によって２回、粒子を洗浄した。この一連の洗浄の後に、最後の洗浄バッファーを除去し、室温で１５分間、管を磁気分離機中にセットし、粒子を乾燥させ、蒸発によって残留エタノールを除去した。
【００８４】
この乾燥期間後、磁性粒子に結合したＤＮＡを、１００μｌのバッファーＡＥ（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＵＳＡ、カタログ番号１９０７７）中に粒子を懸濁させ、ボルテックスミキサーで簡単に攪拌して粒子を懸濁させ、かつ懸濁液を１分間室温でインキュベートすることによって溶出させた。次いで、磁気分離機を用いて溶出液から磁性粒子を回収して分離した。上清溶出液を、別のミクロ分離管へ移した。この溶出段階を繰り返した。
【００８５】
臭化エチジウムを含む標準１％ＴＡＥアガロースゲル上で溶出したＤＮＡの試料を操作することによって、この工程によって得られたゲノムＤＮＡの長さ及び純度を決定した。分光光度計における２６０ｎｍでの吸光度（Ａ260）と２８０ｎｍでの吸光度（Ａ280）との比によって、収率及び純度を評価した。典型的には、この工程により、ミクロ分離管（全血液２００μｌ）当たり、１．６〜１．８５のＡ260／Ａ280の平均比を有する精製されたゲノムＤＮＡが４〜８μｇ得られた。
【００８６】
ここに記載の本発明の他の変形及び態様は、本発明の精神又は以下の請求項の範囲から逸脱することなく、当業者に直ちに明らかであろう。上記の全ての特許、出願、及び公報は、本明細書に開示として援用される。