(57)【要約】【課題】サイリウムが本来有する生理活性、特にヒアルロニダーゼ阻害活性を保持している低粘化サイリウム、及びヒアルロニダーゼ阻害活性を保持したままサイリウムを低粘化する方法を提供すること。【解決手段】セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属細菌由来の培養物をサイリウムと接触させることを含む、低粘化サイリウムの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属細菌由来の培養物をサイリウムと接触させることを含む、低粘化サイリウムの製造方法。
【請求項２】
セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属細菌が、セルロシミクロビウムｓｐ．ＳＹ５０２株（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＳＹ５０２）（ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５４）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
サイズ排除クロマトグラムにおいて２つの分子量ピークを有し、高分子量側のピークのピークトップ分子量が１００万以上、低分子側のピークのピークトップ分子量が１０万以下である、低粘化サイリウム。
【請求項４】
セルロシミクロビウムｓｐ．ＳＹ５０２株（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＳＹ５０２）（ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５４）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低粘化サイリウム及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイリウムは、オオバコの一種であるＰｌａｎｔａｇｏ  ｏｖａｔａ  Ｆｏｒｓｋａｌ等の種子外皮から得られるアラビノキシランを主体とした多糖類である。サイリウムは、β−１，４及びβ−１，３結合のキシランを主鎖とし、側鎖の構成糖はβ−Ｄ−キシロース、α−Ｄ−アラビノース、α−Ｌ−ラムノース、α−Ｄ−ガラクツロン酸からなり、ゲル形成による吸水作用、膨潤作用等の物理化学的性質を有する。また、便通改善作用、コレステロール吸収抑制作用、血糖値上昇抑制作用、ヒアルロニダーゼ活性の阻害による抗炎症作用等の生理活性を有することが報告されている（特許文献１）。
【０００３】
サイリウムは、水に溶解すると粘凋性の高いゲルを形成して水飴状となってしまうため、そのままでは液体飲料用途に用いることは困難である。そこで、サイリウムを低粘化する種々の方法が検討されている。
【０００４】
サイリウムの低粘化方法としては、酸やアルカリ、加熱により低粘化する方法のほか、酵素を用いる方法もいくつか提案されている。例えば、特許文献２では、ペクチナーゼ、ヘミセルラーゼを使用し低粘化する方法が記載されている。特許文献３では、キシラナーゼ等により低粘化することが記載されている。また、特許文献４では、プロテアーゼを用いたサイリウムの低粘化方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−１４５７５６号公報
【特許文献２】特開平１１−７５７７６号公報
【特許文献３】ＷＯ９９／６３０５３号パンフレット
【特許文献４】特開２００２−３２０４６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、サイリウムが本来有する生理活性、特にヒアルロニダーゼ阻害活性を保持したまま低粘化することは容易ではない。
【０００７】
酸やアルカリ、加熱による低粘化方法では、サイリウムが低ｐＨや高ｐＨ、高温にさらされることになり、低粘化とともに生理活性も損なわれてしまう可能性が高い。また、工業的生産の観点からも、低ｐＨや高ｐＨ、高温といった厳しい反応条件に耐えうる製造設備が必要となり、コストアップの要因となる。
【０００８】
一方、酵素による低粘化方法は、常温、常圧に近い温和な反応条件で処理するため、設備負担も少なく、生理活性を保持したままサイリウムを低粘化できる可能性がある。
【０００９】
しかしながら、例えば、特許文献２や特許文献３記載のペクチナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ等による低粘化方法では、生理活性として主に便通改善効果に着目しており、その他の多様な生理活性、特にヒアルロニダーゼ阻害活性が保持されているかどうかは不明である。また、特許文献４記載のプロテアーゼを用いたサイリウムの低粘化方法でも、その生理活性への影響については開示されていない。
【００１０】
従って、本発明の主な目的は、サイリウムが本来有する生理活性、特にヒアルロニダーゼ阻害活性を保持している低粘化サイリウム、及びヒアルロニダーゼ阻害活性を保持したままサイリウムを低粘化する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、従来技術の問題点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、特定の微生物由来の培養物をサイリウムに接触させることにより上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、セルロシミクロビウム属細菌由来の培養物をサイリウムと接触させることを含む、低粘化サイリウムの製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
セルロシミクロビウム属細菌、特に、セルロシミクロビウムｓｐ．ＳＹ５０２株由来の培養物をサイリウムと接触させることにより、生理活性、特に、ヒアルロニダーゼ阻害活性を保持している低粘化サイリウムを製造することができる。
【００１４】
本発明によって得られる低粘化サイリウムは、水等の溶媒に溶解した際の溶液の粘度が低いため、液体飲料として容易に摂取することができ、サイリウムが有する生理活性を保持した機能性食品素材として、広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＳＹ５０２株培養液上清処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムを示す図である。
【図２】図２は、蒸留水処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムを示す図である。
【図３】図３は、塩酸処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明では、セルロシミクロビウム属細菌由来の培養物をサイリウムと接触させることによって、サイリウムを低粘化させる。
【００１７】
（１）セルロシミクロビウム属細菌由来の培養物
（１−１）セルロシミクロビウム属細菌
本発明において、サイリウムの低粘化に用いられる細菌は、セルロシミクロビウム（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属に属する細菌である。セルロシミクロビウム属は、２００１年にＳｃｈｕｍａｎｎらによって提唱された新属である（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｅｖｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００１，５０，９９３−９９６）。
【００１８】
本発明において用いられる細菌は、セルロシミクロビウム属に分類される細菌であればいかなる細菌でもよいが、特に好適なものとして、セルロシミクロビウムｓｐ．ＳＹ５０２株（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＳＹ５０２）が挙げられる。セルロシミクロビウム  ｓｐ．  ＳＹ５０２株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１０５４として寄託されている。
【００１９】
（１−２）細菌の培養
培養条件としては、セルロシミクロビウム属に属する細菌が好適に生育する条件であれば特段限定されるものではない。
【００２０】
培養温度は、例えば、２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃、さらに好ましくは３０℃〜３７℃で行うことができ、また、必要に応じて、培養中に温度を変更してもよい。
【００２１】
培養時間も特には限定されず、例えば、５〜１００時間、好ましくは１０〜９０時間、さらに好ましくは２０〜８０時間程度行えばよい。
【００２２】
培養前又は培養中の培地のｐＨは、セルロシミクロビウム属に属する細菌の生育に適した値であればよく、例えば５〜９、好ましくは６〜８のｐＨで培養することができ、必要に応じてｐＨの調整を行いながら培養することができる。ｐＨ調整剤としては無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いることができる。
【００２３】
培養方法としては、固体培養、液体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養等が挙げられる。これらの中でも液体培養法によって培養するのが好ましく、特に振盪培養又は通気攪拌培養による培養が好ましい。
【００２４】
培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硝酸ナトリウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄若しくは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに、糖質原料、ビタミン、抗生物質、誘導剤等を添加したものが用いられる。
【００２５】
また、サイリウム低粘化酵素活性を誘導するために、培地にサイリウムを添加することが好ましい。添加するサイリウムの濃度は特段限定されず、例えば、０．００１〜１０質量％、好ましくは０．０１〜５質量％とすることができる。
【００２６】
（１−３）培養物
本発明において、培養物とは、培養液、培養液上清、菌体、菌体懸濁液、菌体破砕液、粗酵素液及びこれらの処理物など、セルロシミクロビウム属に属する細菌を培養することによって得られるもの及びそれらに起因するものいずれをも含む。本発明において特に好ましく用いられる培養物は、培養液及び培養液上清である。
【００２７】
「培養液」とは、細菌を、生育に好適な成分を含有する培地中に接種し、適当な培養条件下で増殖させた後に得られる溶液である。「培養液上清」とは、培養後に遠心分離やろ過などの手段によって、培養液から菌体を除去して得られる画分である。「菌体」とは、細菌そのものを意味し、完全に乾燥されたもののみならず、少量の水、緩衝液、培養液、その他液体を含有しているものも含む。「菌体懸濁液」とは、菌体を水や緩衝液、その他液体に懸濁したもの溶液を言う。「菌体破砕液」とは、細菌の菌体を、超音波処理、高圧処理、磨砕処理、衝撃破砕処理、酵素処理、凍結融解処理、低張液処理等によって、破砕して得られる菌体破砕物を含有する溶液を言う。「粗酵素液」とは、遠心分離やろ過などの手段によって、菌体破砕液から不溶物を除去して得られる画分を言う。「処理物」とは、上記の培養液、培養液上清、菌体、菌体懸濁液、菌体破砕液、粗酵素液に対して、物理的・化学的処理を施したものを言う。例えば、菌体を担体に固定化して得られる固定化菌体や、培養液上清や粗酵素液から硫安沈殿や各種クロマトグラフィーなどの操作によって得られる画分なども含まれる。
【００２８】
（２）サイリウム
サイリウムは、オオバコの一種Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｏｖａｔａの種子から得られる天然多糖である。一般には、サイリウムハスク、サイリウムシードガムとして市販されている。
【００２９】
本発明においては、いかなる粒度、グレードのものを用いることができるが、ごみ等共雑物の少ないものが好ましい。本発明では、公知の方法（例えば、特開平０１−１９７５０１号公報に記載の方法）により製造することもできるし、市販されているものを使用することもできる。市販されているサイリウムとしては、例えば、ソアリュームＰＧ２００、ソアリュームＰＧ０２０ＭＲ（共にＭＲＣポリサッカライド社製）などがある。
【００３０】
（３）サイリウムの低粘化
本発明において、培養物をサイリウムと接触させるとは、サイリウム溶液とセルロシミクロビウム属細菌由来の培養物を混合し、一定時間反応させることをいう。本発明では、サイリウムを含むサイリウム溶液に微生物の培養物を添加しても良く、逆に微生物の培養物にサイリウム又はサイリウム溶液を添加しても良い。ここでは、代表して前者の方法について述べる。
【００３１】
サイリウム溶液中のサイリウム濃度はサイリウムが低粘化されれば限定されず、例えば、０．００１〜１０質量％、好ましくは０．０１〜５質量％、さらに好ましくは０．１〜１質量％とすることができる。
【００３２】
サイリウム溶液の溶媒としては水が例示できるが、低粘化が妨げられない限り、エタノール等の有機溶媒を加えたり、緩衝作用を有する無機・有機塩類等を添加したりすることも可能である。
【００３３】
用いられる緩衝液は特段限定されるものではなく、例えば、緩衝液成分濃度５〜５００ｍＭ、好ましくは５〜１５０ｍＭ程度、ｐＨとしては５〜９程度のものが挙げられる。緩衝作用を有する無機・有機塩類等としては、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、リン酸ナトリウム又はカリウム塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。
【００３４】
反応条件は、サイリウムの低粘化を達成できる条件であれば如何なる条件でもよい。反応温度は、１０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃、より好ましくは３０〜４０℃とすることができる。ｐＨは、４〜１０、好ましくは５〜９、より好ましくは６〜８とすればよい。
【００３５】
必要に応じて、反応液を撹拌することができる。反応を効率的に進行させることができるからである。回転速度は、例えば、５〜５００ｒｐｍ（回転／分）、好ましくは１０〜２００ｒｐｍ、より好ましくは２０〜１００ｒｐｍとすることができる。
【００３６】
接触させるセルロシミクロビウム属細菌由来の培養物の量は、低粘化が達成できる量であれば限定されず、培養物中に含まれる低粘化活性その他の反応条件を考慮して任意に設定できる。例えば、培養液の上清を直接用いる場合、サイリウム溶液の０．００１倍〜１０倍の質量、好ましくは０．０１倍〜５倍の質量、より好ましくは０．１倍〜２倍の質量とすることができる。
【００３７】
低粘化反応を行った後は、反応を停止するために培養物に含まれる低粘化活性を消失させるための失活処理を行うことができる。失活処理は、低粘化活性を消失することができ、且つ、サイリウムの過剰な低粘化や分解が生じない処理であれば如何なる処理でもよい。例えば、加熱処理などが挙げられる。加熱処理としては、例えば５０〜１００℃、好ましくは６０〜１００℃、より好ましくは７０〜１００℃とすることができる。
【００３８】
また、必要に応じて、低粘化反応により得られた低粘化サイリウムを精製することができる。精製方法としては、所望の低粘化サイリウム溶液を得ることができる方法であれば如何なる方法でもよい。例えば、遠心分離やろ過、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿などの方法が挙げられる。
【００３９】
遠心分離の条件は、不要不純物などが沈殿し、低粘化サイリウム含む上清を回収できる条件であれば如何なる条件でもよいが、例えば、１，０００〜５０，０００×ｇ、好ましくは５，０００〜２０，０００×ｇとすることができる。
【００４０】
ろ過は、ろ紙やろ布、膜などを用いて行うことができる。ろ紙としては、精製した綿繊維（セルロース）を主体としたもの又はガラス繊維ろ紙等が挙げられ、例えば、ＪＩＳ  Ｐ３８０１の規定による定性分析用及び定量分析用等のろ紙を用いることができる。
【００４１】
ろ布としては、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアミド（ナイロン）、塩化ビニリデン、ビニロン、綿等の材質のろ布を用いることができる。ろ布の糸の形態としては、例えば、スパン糸（短繊維糸）、マルチフィラメント糸（長繊維糸）、モノフィラメント糸（長単繊維糸）、分割型極細繊維糸等のものを用いることができる。ろ布の組織としては、平織、綾織、二重織、フェルト、朱子織等のものを用いることができる。
【００４２】
ろ紙又はろ布によってろ過を行う際、ろ過助剤を併用して行うこともできる。ろ過助剤としては、例えば、珪藻土、パーライト（真珠岩）のほか、活性炭、セルロース系ろ過助剤等が挙げられる。
【００４３】
膜としては、精密ろ過（ＭＦ）膜や限外ろ過（ＵＦ）膜を用いることができる。ＭＦ膜の材質としては、有機系の高分子膜とアルミナなどの無機系のセラミック膜があり、有機高分子膜としてはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルフォン、ポリフッ化ビニリデンなどが用いられる。ＭＦ膜の孔径としては、例えば０．１〜０．５μｍ程度の孔径のものを用いることができる。ＵＦ膜の材質としては、高分子材料を用いる有機膜とセラミック膜などの無機膜があり、高分子膜としては、酢酸セルロース系、ポリアクリロニトリル系、ポリスルフォン系などが挙げられる。ＵＦ膜は目的に応じた分画分子量の膜を選択して用いることができ、例えば、１，０００〜３００，０００程度のＵＦ膜を使用することができる。
【００４４】
クロマトグラフィーとしては、所望の低粘化サイリウム溶液を得ることができる方法であればよく、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、陰イオンクロマトグラフィー等が挙げられる。
【００４５】
アルコール沈殿に用いるアルコールとしては、エタノールやイソプロパノール等を用いることができる。アルコールの濃度は、低粘化サイリウムの沈殿を取得することができる濃度であれば如何なる濃度でもよいが、例えば、５０〜９９％（Ｖ／Ｖ）、好ましくは６０〜９９％、より好ましくは７０〜９９％の濃度とすればよい。必要に応じて得られたサイリウムの沈殿を同様の濃度のアルコール水溶液でリンスすることができる。得られたサイリウムの沈殿は、真空乾燥、凍結乾燥などにより乾燥することができる。
【００４６】
（４）低粘化サイリウム
（４−１）低粘化
本発明において、低粘化とは、サイリウム溶液の粘度を低下させることを意味する。粘度の測定方法は特には限定されない。例えば、２５℃で水溶液として測定した場合に、低粘化反応を行う前（原料）のサイリウム溶液の粘度と比較して、好ましくは５０％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下に粘度を低下させることを意味する。
【００４７】
サイリウム溶液の粘度は、種々の粘度計を用いて測定することができる。粘度計の種類としては、振動式粘度計、回転式粘度計、細管式粘度計、落体式粘度計、カップ式粘度計などがある。サイリウム溶液の粘度を適切に測定できる粘度計であれば如何なる粘度計を用いてもよいが、本発明においては、回転式粘度計を好適に用いることができる。回転式粘度計には、共軸二重円筒型、単一円筒型回転式粘度計（Ｂ型粘度計）、コーンプレート型（Ｅ型粘度計）等があり、本発明においては、Ｂ型粘度計を好適に用いることができる。
【００４８】
また、本発明において、サイリウムを低粘化させる能力の強さを低粘化活性と言う。本発明における低粘化活性は、被験試料とサイリウム溶液を混合して反応液とし、所定条件下で所定時間接触（反応）させた後の粘度によって測定及び比較することができるものとする。
【００４９】
（４−２）サイズ排除クロマトグラフィー
本発明の低粘化サイリウムは、サイズ排除クロマトグラムにおいて２つの分子量ピークを有する。そのうちの１つは高分子量側のピークのピークトップ分子量が１００万以上であり、もう１つは低分子側のピークのピークトップ分子量が１０万以下である。高分子量側のピークの好ましいピークトップ分子量は１００万〜２００万程度、より好ましくは１２０万〜１５０万程度である。また、低分子量側のピークの好ましいピークトップ分子量は１０００〜１０万程度、より好ましくは５０００〜５万程度である。
【００５０】
本発明において、サイズ排除クロマトグラムとは、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、横軸に保持時間又は溶出容量を、縦軸に溶質濃度を反映する光学的シグナル（吸光度、示唆屈折率、蛍光等）強度や電気化学的シグナル強度をとったものを言う。サイズ排除クロマトグラフィーとは、多孔質充填剤を詰めたカラム中において、充填剤表面の細孔とポリマー（高分子量体）とのサイズ排除機構により物質を分離することができるクロマトグラフィーを言う。
【００５１】
サイズ排除クロマトグラフィーでは、分子サイズの大きい（高分子量の）ポリマーは多孔質充填剤の深部へは到達できないために早く溶出され、分子サイズの小さい（低分子量の）ポリマーは深部へ到達できるために遅く溶出されるため、分子サイズ（分子量）の違いによりポリマーを分離することができる。
【００５２】
種々のサイズ排除クロマトグラフィー用充填剤（カラム）が市販されており、本発明においては、サイリウムの分子量を適切に測定できるカラムであれば如何なるカラムをも用いることができる。例えば、Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０６Ｍ  ＨＱ（昭和電工株式会社）などを好適に用いることができる。
【００５３】
サイズ排除クロマトグラフィーにおいては、分子量既知のポリマー（標準ポリマー）を用い、保持時間又は溶出容量と分子量の較正曲線を予め求めておくことで、被験ポリマーであるサイリウムの分子量を求めることができる。標準ポリマーは、被験ポリマーであるサイリウムの分子量を適切に算出できるポリマーであれば特段限定されず、特にプルラン（例えば、ＳＴＤ  Ｐ−８２、ＳＴＤ  Ｐ−２５０、昭和電工株式会社）を好適に用いることができる。
【００５４】
サイズ排除クロマトグラフィーによって、数平均分子量（Ｍｎ）、重量平均分子量（Ｍｗ）、ｚ平均分子量（Ｍｚ）、ピークトップ分子量（Ｍｐ）などの平均分子量を求めることができる。本発明における低粘化サイリウムは、ピークトップ分子量によって特定することができる。
【００５５】
ピークトップ分子量は、サイズ排除クロマトグラムにおける分子量ピーク（以下、単にピークとも呼ぶ）の頂点（ピークトップ）に相当する分子量として求められる。ピークトップは、サイズ排除クロマトグラム上の「山」の頂点に相当する部分であり、ピーク領域内における出力値の１階微分値が０であり２階微分値がマイナスであるデータ点ということができる。クロマトグラムにおけるピークの検出方法は任意であるが、例えば、クロマトグラムの微分値を求め、該微分値が＋、−の所定レベルを超えた時点をピークの始点、終点として、始点と終点の間の部分をピークとする方法が挙げられる。
【００５６】
なお、本発明において低粘化サイリウムを特定するためのピーク及びピークトップ分子量は、本質的にサイリウムに由来するピーク及びそのピークトップ分子量が対象であり、クロマトグラム上に出現するサイリウム以外の不純物等に由来するピーク及びそのピークトップ分子量は対象ではない。ピークがサイリウムに由来するものであるか否かは、被験試料であるサイリウム溶液のクロマトグラムと、サイリウム以外の成分が被験試料と同じ溶液のクロマトグラムとを比較することによって容易に判断することができる。
【００５７】
（４−３）ヒアルロニダーゼ阻害活性
本発明においてヒアルロニダーゼ阻害活性とは、ヒアルロン酸を分解する酵素であるヒアルロニダーゼの活性を阻害する活性を言う。ヒアルロン酸は、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとβ−Ｄ−グルクロン酸が交互に結合してできた直鎖状の高分子多糖であり、哺乳動物の結合組織に多量に分布するほか、ニワトリの鶏冠や連鎖球菌の夾膜などにも存在する。
【００５８】
ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を解重合する酵素の総称であり、高等動物の精液や蛇毒・肺炎菌・連鎖球菌中などに存在する。哺乳動物においては、受精の際、卵細胞表面をおおうヒアルロン酸を含む粘性ゲルを取り除いて精子の侵入を助けたり、病原菌の侵入を容易にしたりすると考えられている。また、炎症時に活性化され、結合組織のマトッリクスを破壊し、炎症系組織への浸潤や血管の透過性亢進、Ｉ型アレルギーにおける肥満細胞からのヒスタミン遊離過程に介在することが知られている。
【００５９】
ヒアルロニダーゼ阻害活性を有する物質としては、クロモグリク酸ナトリウム、トラニラストのような抗アレルギー剤、アスピリン、インドメタシンのような抗炎症薬等が知られている。
【００６０】
ヒアルロニダーゼ阻害活性は、ヒアルロニダーゼ活性測定系に被験物質を共存させた場合に、被験物質を共存させない場合と比較してヒアルロニダーゼ活性がどの程度阻害されるかを調べることによって求めることができる。ヒアルロニダーゼ活性は、例えば、ヒアルロニダーゼによってヒアルロン酸から遊離したＮ−アセチルグルコサミン量を、Ｍｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５５，２１７，９５９−９６６）によって定量することにより測定できる。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００６２】
［実施例１：セルロシミクロビウム属細菌由来培養物の調製とサイリウム低粘化活性の確認］
セルロシミクロビウムｓｐ．ＳＹ５０２株（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＳＹ５０２；以下、「ＳＹ５０２株」という。）を次のように培養した。
【００６３】
−８０℃で保存していたＳＹ５０２株のグリセロールストック０．２ｍＬを、５００ｍＬ容三角フラスコ中に調製した１００ｍＬの前培養培地（培地１Ｌあたり、硝酸ナトリウム１ｇ、リン酸水素二カリウム０．１ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５ｇ、塩化カリウム０．５ｇ、硫酸第二鉄七水和物０．０１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、ポリペプトン細粒２ｇ、サイリウム（ソアリューム；ＭＲＣポリサッカライド株式会社製）０．５ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に調製した後、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）したもの）に植菌し、温度３０℃、回転数２００ｒｐｍで７２時間振とう培養を行った。
【００６４】
得られた前培養液２５ｍＬを、３Ｌ容ミニジャーファーメンター中に調製した３系列の２．５Ｌの本培養培地（培地１Ｌあたり、硝酸ナトリウム１ｇ、リン酸水素二カリウム０．１ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５ｇ、塩化カリウム０．５ｇ、硫酸第二鉄七水和物０．０１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、ポリペプトン細粒２ｇ、サイリウム１５ｇ、プルロニックＬ−６１（株式会社ＡＤＥＫＡ製）０．２ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６、７、８にそれぞれ調製した後、オートクレーブ滅菌（１２１℃、２０分間）したもの）に植菌し、温度３０℃、回転数２００ｒｐｍ、ｐＨ制御値６、７又は８（１２．５質量％水酸化ナトリウム水溶液及び１２質量％硫酸水溶液で制御）、通気量１．２５Ｌ／分（２６時間後０．６Ｌ／分に変更）、圧力は大気圧にて通気撹拌培養を行った。
【００６５】
培養４８時間後又は７２時間後に、菌濃度を反映するＯＤ６６０値（波長６６０ｎｍにおける濁度）を測定した。また、培養液の一部（４０ｍＬ）を遠心分離（７，５００×ｇ、２０分間）に供し、得られた上清を「培養液上清」とした。
【００６６】
得られた各培養液上清を用いて、次のように低粘化活性を測定した。サイリウム溶液（サイリウム１．２ｇを２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ８）に加え、オートクレーブ（１２１℃、２０分間）により溶解したもの）３０ｍＬと、各培養液上清３０ｍＬ又は対照として蒸留水３０ｍＬを混合し、温度３７℃、回転数１６０ｒｐｍで２４時間（蒸留水の場合は９６時間）は反応した後、Ｂ型粘度計により粘度を測定した。粘度は、Ｂ型粘度計（東京計器株式会社）を用い、温度２５℃において測定した。測定したＯＤ６６０値及び反応液粘度を表１に示す。
【００６７】
本培養時のｐＨがｐＨ６、７及び８のいずれであってもＳＹ５０２株は良好に生育した。また、いずれの培養液上清を用いた場合でも、対象である蒸留水を用いた場合と比較して、反応液の粘度は大きく低下した。従って、これらの培養液上清にサイリウム低粘化活性が含まれることが確認された。
【００６８】
【表１】
2012191875.tif 000002
［実施例２：ＳＹ５０２株培養液上清による低粘化反応］
実施例１で得られたＳＹ５０２株培養液上清（本培養時ｐＨ７）をサイリウム溶液と接触させて低粘化反応を行った。
【００６９】
サイリウム溶液（サイリウム１０ｇを２５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７）５００ｍＬに加え、オートクレーブ（１２１℃、２０分間）したもの）５００ｍＬと、ＳＹ５０２株培養液上清（本培養時ｐＨ７）５００ｍＬを混合し、温度３７℃、ｐＨ制御値７（１２．５質量％水酸化ナトリウム水溶液及び１２質量％硫酸水溶液で制御）、回転数１００ｒｐｍで２日間反応させ、反応液（＝「ＳＹ５０２株培養液上清処理サイリウム」）の粘度を測定した。
【００７０】
結果を表２に示す。粘度は４０ｍＰａ・ｓであり、反応液の粘度が大きく低下していることが確認された。
【００７１】
［比較例１：蒸留水による低粘化反応］
サイリウム溶液（サイリウム１ｇを蒸留水５０ｍＬに加え、オートクレーブ（１２１℃、２０分間）したもの）５０ｍＬと、蒸留水５０ｍＬを混合し、温度３７℃で４日間反応させ、反応液（＝「蒸留水処理サイリウム」）の粘度を測定した。
【００７２】
結果を表２に併せて示す。蒸留水処理サイリウムの粘度は５７００ｍＰａ・ｓであり、前述したＳＹ５０２株培養液上清処理サイリウム反応液と比較すると、非常に高い粘度であることが確認された。
【００７３】
［比較例２：塩酸による低粘化反応］
サイリウム溶液（サイリウム１ｇ、を蒸留水１００ｍＬに加え、オートクレーブ（１２１℃、２０分間）したもの）１００ｍＬに、２Ｎ塩酸０．２５ｍＬを添加し（添加後ｐＨ約２．７）、温度８０℃で３０分間反応させた後、反応液（＝「塩酸処理サイリウム」）の粘度を測定した。
【００７４】
結果を表２に併せて示す。塩酸処理サイリウムの粘度は８ｍＰａ・ｓであり、反応液の粘度が大きく低下していることが確認された。
【００７５】
［比較例３：Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８による低粘化反応］
サイリウム溶液（サイリウム１０ｇを２５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液１０００ｍＬに加え、オートクレーブ（１２１℃、２０分間）１０００ｍＬに、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８（ノボザイム社製）溶液５ｍＬを添加し、温度４０℃、ｐＨ制御値７（１２．５質量％水酸化ナトリウム水溶液及び１２質量％硫酸水溶液で制御）、回転数１００ｒｐｍで７日間反応させ、反応液（＝「Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８処理サイリウム」）の粘度を測定した。
【００７６】
結果を表２に併せて示す。Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８処理サイリウムの粘度は１１ｍＰａ・ｓであり、反応液の粘度が大きく低下していることが確認された。
【００７７】
【表２】
2012191875.tif 000003
［実施例３：ＳＹ５０２株培養液上清処理サイリウムの分子量測定］
実施例２の反応液を８０℃で４０分加熱処理を行い、低粘化活性を消失させた。遠心分離（７，５００×ｇ、２０分間）を行い、得られた上清の一部を用いて、ＳＹ５０２株培養液上清処理サイリウムの分子量をサイズ排除クロマトグラフィーにより測定した。プルラン（ＳＴＤ  Ｐ−８２及びＳＴＤ  Ｐ−２５０；昭和電工株式会社製）を標準ポリマーに用いて較正曲線を作成した。分析条件を以下に示す。
【００７８】
分析カラム  ：Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０６Ｍ  ＨＱ  ８ｍｍ×３００ｍｍ（昭和電工株式会社）
ガードカラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨｐａｋ  ＳＢ−Ｇ  ４．６ｍｍ×１００ｍｍ（昭和電工株式会社）
流速        ：１ｍＬ／分
移動相      ：５０ｍＭ硫酸ナトリウム水溶液
検出        ：示唆屈折率
カラム温度  ：４０℃
サンプル濃度：約０．２５ｍｇ／ｍＬ
注入量      ：２０μＬ。
【００７９】
ＳＹ５０２株培養液上清処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムを図１に、算出されたピークトップ分子量を表３に示す。
【００８０】
後述する蒸留水処理サイリウム（比較例４；図２）及び塩酸処理（比較例５；図３）のクロマトグラムとは異なり、ＳＹ５０２株培養液上清処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムは、明確に分離された２つの分子量ピークを示した。高分子量側のピークのピークトップ分子量は約１４０万、低分子側のピークのピークトップ分子量は約７５００であった。
【００８１】
【表３】
2012191875.tif 000004
［比較例４：  蒸留水処理サイリウムの分子量測定］
比較例１で得られた反応液の一部を用いて、蒸留水処理サイリウムの分子量を実施例３と同様の分析条件により測定した。蒸留水処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムを図２に、算出されたピークトップ分子量を表３に併せて示す。
【００８２】
実施例３のＳＹ５０２株培養液上清処理サイリウムのクロマトグラムとは異なり、蒸留水処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムは、近接した２つの分子量ピークを示した。高分子量側のピークのピークトップ分子量は約１６０万、低分子側のピークのピークトップ分子量は約２０万であった。
【００８３】
［比較例５：  塩酸処理サイリウムの分子量測定］
比較例２の反応液を水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ６に調整した後、その一部を用いて、塩酸処理サイリウムの分子量を実施例３と同様の分析条件により測定した。塩酸処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムを図３に、算出されたピークトップ分子量を表３に併せて示す。
【００８４】
実施例３のＳＹ５０２株培養液上清処理サイリウムのクロマトグラムとは異なり、また、比較例４の蒸留水処理サイリウムのクロマトグラムと同様に、塩酸処理サイリウムのサイズ排除クロマトグラムも、近接した２つの分子量ピークを示した。高分子量側のピークのピークトップ分子量は約９０万、低分子側のピークのピークトップ分子量は約１３万であった。
【００８５】
［実施例４：ＳＹ５０２株培養液上清処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性測定］
実施例３の遠心上清をメンブレンフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ、孔径０．４５μｍ、材質セルロースアセテート）を用いて０．２ＭＰａにて加圧ろ過を行った。得られたろ液を限外ろ過膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、分画分子量１万、材質再生セルロース）を用いて０．１５ＭＰａにて加圧ろ過を行い、限外ろ過膜上に濃縮された溶液を回収した。
【００８６】
回収した溶液１０ｍＬにイオン交換樹脂（ＡＧ５０１−８Ｘ、バイオラッド・ラボラトリーズ株式会社）０．５ｇを添加し、２５℃で一晩振とうし、脱塩を行った。得られた溶液を凍結させた後、凍結乾燥を行った。
【００８７】
得られた乾燥品を用いて、ＳＹ５０２株培養液上清処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性を、以下のようにして測定した。凍結乾燥したＳＹ５０２株培養液上清処理サイリウムを０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ３．５、以下、酢酸バッファーという）に終濃度０．０８〜０．３ｇ／Ｌとなるよう溶解し、サイリウム溶液とした。
【００８８】
試験管中にサイリウム溶液を０．２ｍＬ取り、ヒアルロンニダーゼ溶液（酢酸バッファー中に０．７ｇ／Ｌの濃度でヒアルロニダーゼ（ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｔｅｓｔｉｓ；タイプＩＶ−Ｓ、シグマ社製）を含有）０．１ｍＬを添加して、３７℃で２０分間インキュベートした。Ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０溶液（酢酸バッファー中に０．１ｇ／Ｌの濃度でＣｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０（シグマ社製）を含有）０．２ｍＬを添加し、さらに３７℃で２０分間インキュベートした。
【００８９】
ヒアルロン酸カリウム溶液（ヒアルロン酸カリウム（和光純薬工業（株）製）を酢酸バッファーに溶解し、最終濃度を０．４ｍｇ／ｍＬに調製したもの）０．５ｍＬを添加し、３７℃で４０分間反応させた。０．４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を０．２ｍＬ添加して反応を停止させた後、氷冷し、ホウ酸溶液（ホウ酸４．９５ｇに水５０ｍＬを加え、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ＝９．１にし、水を加えて１００ｍＬに調製したもの）０．２ｍＬを添加した。沸騰水中で３分間加熱した後、ＤＭＡＢ溶液（１０Ｎ塩酸１２．５ｍＬと酢酸８７．５ｍＬの混液にｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（和光純薬工業（株）製）を１０ｇ溶解し、使用直前に酢酸で１０倍に希釈したもの）０．２ｍＬを添加し、３７℃で２０分間インキュベートした後、波長５８５ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ５８５）を測定した。
【００９０】
被験試料を添加した系におけるＡｂｓ５８５をＡｂｓ５８５（Ｔ）、被験試料の変わりに酢酸バッファーを添加した系におけるＡｂｓ５８５値をＡｂｓ５８５（Ｃ）とし、次の式によりヒアルロニダーゼ活性阻害率ＩＲ（％）を算出した。
ＩＲ（％）＝｛Ａｂｓ５８５（Ｃ）−Ａｂｓ５８５（Ｔ）／Ａｂｓ５８５（Ｃ）｝×１００。
【００９１】
反応系中の被験試料濃度（％）を横軸に、ＩＲ（％）を縦軸にとり、ＩＲ＝５０（％）となるような被験試料濃度をＩＣ５０（％）とし、ヒアルロニダーゼ阻害活性の指標とした。ＩＣ５０（％）値を表４に示す。
【００９２】
ＳＹ５０２株培養液上清処理サイリウムのＩＣ５０（％）値は０．００５８２であり、後述する蒸留水処理サイリウム、塩酸処理サイリウム、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８処理サイリウムと比較して、明らかに高いヒアルロニダーゼ阻害活性を有していることが確認された。
【００９３】
【表４】
2012191875.tif 000005
［比較例６：蒸留水処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性測定］
比較例１の反応液を凍結乾燥し、得られた乾燥品を用いて、蒸留水処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性を、実施例４と同様の方法により測定した。ＩＣ５０（％）値を表４に併せて示す。
【００９４】
蒸留水処理サイリウムのＩＣ５０（％）値は０．００９２０であり、ＳＹ５０２株培養液上清処理サイリウムと比較すると、ヒアルロニダーゼ阻害活性は低いことが確認された。
【００９５】
［比較例７：塩酸処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性測定］
比較例５で得られた中和反応液について、実施例４と同様に分画、精製及び乾燥を行った。得られた乾燥品を用いて、塩酸処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性を、実施例４と同様の方法により測定した。ＩＣ５０（％）値を表４に併せて示す。
【００９６】
塩酸処理サイリウムのＩＣ５０（％）値は０．００９８２であり、ＳＹ５０２株培養液上清処理サイリウムと比較すると、ヒアルロニダーゼ阻害活性は低いことが確認された。
【００９７】
［比較例８：Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性測定］
比較例３で得られた反応液について、実施例３と同様に、加熱処理及び遠心分離を行った後、実施例４と同様に分画、精製及び乾燥を行った。得られた乾燥品を用いて、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８処理サイリウムのヒアルロニダーゼ阻害活性を、実施例４と同様の方法により測定した。ＩＣ５０（％）値を表４に併せて示す。
【００９８】
Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８処理サイリウムのＩＣ５０（％）値は０．００９１２であり、ＳＹ５０２株培養液上清処理サイリウムと比較すると、ヒアルロニダーゼ阻害活性は低いことが確認された。
【図１】
2012191875.tif 000006
【図２】
2012191875.tif 000007
【図３】
2012191875.tif 000008