(57)【要約】【課題】可溶性の、分泌された腫瘍壊死因子レセプターポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および関係する組成物および方法が開示される。【解決手段】ポリペプチドは、他の腫瘍壊死因子レセプター、例えば、トランスメンブランアクチベーターおよびCAML−インターラクター（TACI）に対して相同的である、１つのシステインに富んだ反復を含んでなる。ポリペプチドは、リガンド、アゴニストおよびアンタゴニストを検出するために使用することができる。ポリペプチドは、また、Ｂ細胞の活性化をモジュレートするために使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物におけるztnf4活性を阻害する方法において、
ａ）  BR43ｘ２の細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；
ｂ）  TACIの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；
ｃ）  BCMAの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；
ｄ）  配列番号10の配列を含んでなるポリペプチド；
ｅ）  配列番号２のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
ｆ）  配列番号４のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
ｇ）  配列番号６のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
ｈ）  配列番号８のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
ｉ）  配列番号10のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
ｋ）  配列番号４のポリペプチド；
ｌ）  配列番号６のアミノ酸残基１〜166のアミノ酸残基；および
ｍ）  配列番号８のアミノ酸残基１〜150のアミノ酸残基；
から成る群から選択されるある量の化合物を哺乳動物に投与することを含んでなる方法。
【請求項２】
前記化合物がペプチド結合により結合された第１部分と第２部分とから成る融合タンパク質であり、前記第１部分が
ａ）  配列番号８の配列を含んでなるポリペプチド；
ｂ）  配列番号２のアミノ酸残基25〜58を含んでなるポリペプチド；
ｃ）  配列番号６のアミノ酸残基34〜66を含んでなるポリペプチド；
ｄ）  配列番号６のアミノ酸残基71〜104を含んでなるポリペプチド；
ｅ）  配列番号６のアミノ酸残基25〜104を含んでなるポリペプチド；
ｆ）  配列番号８のアミノ酸残基８〜37を含んでなるポリペプチド；
ｇ）  配列番号８のアミノ酸残基41〜88を含んでなるポリペプチド；
ｈ）  配列番号８のアミノ酸残基８〜88を含んでなるポリペプチド；
から成る群から選択されるポリペプチドを含んでなり、そして
前記第２部分が他のポリペプチドを含んでなる、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１部分が、
ａ）  配列番号２のアミノ酸残基59〜120；
ｂ）  配列番号６のアミノ酸残基105〜166；および
ｃ）  配列番号８のアミノ酸残基89〜150；
から成る群から選択されるポリペプチドをさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１部分が、
ａ）  BR43x2の細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；
ｂ）  TACIの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；および
ｃ）  BCMAの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；
から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１部分が、
ａ）  配列番号４のポリペプチド；
ｂ）  配列番号６のアミノ酸残基１〜154；および
ｃ）  配列番号８のアミノ酸残基１〜48；
から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記第２部分が免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体または抗体フラグメントが、
ａ）  ポリクローナル抗体；
ｂ）  ネズミモノクローナル抗体；
ｃ）  上記ｂ）に由来するヒト化抗体；および
ｄ）  ヒトモノクローナル抗体；
から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体フラグメントが、F(ab’)、F(ab)、Fab’、Fab、Fv、scFv、および最小認識ユニットから成る群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物が霊長類である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ztnf4活性がＢリンパ球に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ztnf4活性が活性化Ｂリンパ球に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ztnf4活性が休止Ｂリンパ球に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ztnf4活性が抗体産生に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体産生が自己免疫疾患に関連する、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、多発性硬化症、または慢性関節リウマチである、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記ztnf4活性がぜん息、気管支炎または気腫に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ztnf4活性が末期腎不全に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ztnf4活性が腎臓病に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記腎臓病が糸球体腎炎、脈管炎、腎炎または腎盂腎炎である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記腎臓病が腎臓新形成、多発性骨髄腫、リンパ腫、軽鎖神経疾患またはアミロイドーシスに関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ztnf4活性がエフェクターＴ細胞に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ztnf4活性が免疫応答の緩和に関連する、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記ztnf4活性が免疫抑制に関連する、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫抑制が移植片拒絶、移植片対宿主病または炎症に関連する、請求項21に記載の方法。
【請求項２５】
前記活性が自己免疫疾患に関連する、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記自己免疫疾患がインスリン依存性真性糖尿病または膠原病である、請求項２5に記載の方法。
【請求項２７】
前記ztnf4活性が炎症に関連する、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記炎症が関節の疼痛、腫脹、貧血、または敗血症性ショックである、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンド結合を阻害する方法において、
ａ）  BR43x2の細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；
ｂ）  TACIの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；
ｃ）  BCMAの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；
ｄ）  配列番号10の配列を含んでなるポリペプチド；
ｅ）  配列番号２のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
ｆ）  配列番号４のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
ｇ）  配列番号６のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
ｈ）  配列番号８のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
ｉ）  配列番号10のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
ｊ）  配列番号18のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
ｋ）  配列番号20のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
ｋ）  配列番号４のポリペプチド；
ｌ）  配列番号６のアミノ酸残基１〜166のアミノ酸残基；および
ｍ）  配列番号８のアミノ酸残基１〜150のアミノ酸残基；
から成る群から選択されるある量の化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項３０】
前記化合物がペプチド結合により結合された第１部分と第２部分とから成る融合タンパク質であり、前記第１部分が
ａ）  配列番号８の配列を含んでなるポリペプチド；
ｂ）  配列番号２のアミノ酸残基25〜58を含んでなるポリペプチド；
ｃ）  配列番号６のアミノ酸残基34〜66を含んでなるポリペプチド；
ｄ）  配列番号６のアミノ酸残基71〜104を含んでなるポリペプチド；
ｄ）  配列番号６のアミノ酸残基25〜104を含んでなるポリペプチド；
ｆ）  配列番号８のアミノ酸残基８〜37を含んでなるポリペプチド；
ｇ）  配列番号８のアミノ酸残基41〜88を含んでなるポリペプチド；
ｈ）  配列番号８のアミノ酸残基８〜88を含んでなるポリペプチド；
から成る群から選択されるポリペプチドを含んでなり、そして
前記第２部分が他のポリペプチドを含んでなる、
請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１部分が、
ａ）  配列番号２のアミノ酸残基59〜120；
ｂ）  配列番号６のアミノ酸残基105〜166；および
ｃ）  配列番号８のアミノ酸残基89〜150；
から成る群から選択されるポリペプチドをさらに含んでなる、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１部分が、
ａ）  BR43x2の細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；
ｂ）  TACIの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；および
ｃ）  BCMAの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；
から成る群から選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１部分が、
ａ）  配列番号４のポリペプチド；
ｂ）  配列番号６のアミノ酸残基１〜154；および
ｃ）  配列番号８のアミノ酸残基１〜48;
から成る群から選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２部分が免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体または抗体フラグメントが、
ａ）  ポリクローナル抗体；
ｂ）  ネズミモノクローナル抗体；
ｃ）  上記ｂ）に由来するヒト化抗体；および
ｄ）  ヒトモノクローナル抗体；
から成る群から選択される、請求項29に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体フラグメントが、F(ab’)、F(ab)、Fab’、Fab、Fv、scFv、および最小認識ユニットから成る群から選択される、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンド結合がＢリンパ球に関連する、請求項29に記載の方法。
【請求項３８】
前記BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンド結合が活性化Ｂリンパ球に関連する、請求項29に記載の方法。
【請求項３９】
前記BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンド結合が休止Ｂリンパ球に関連する、請求項29に記載の方法。
【請求項４０】
前記BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンド結合が抗体産生に関連する、請求項29に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体産生が自己免疫疾患に関連する、請求項29に記載の方法。
【請求項４２】
前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、多発性硬化症、または慢性関節リウマチである、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結合がぜん息、気管支炎または気腫に関連する、請求項29に記載の方法。
【請求項４４】
前記BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンド結合が末期腎不全に関連する、請求項29に記載の方法。
【請求項４５】
前記BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンド結合が腎臓病に関連する、請求項29に記載の方法。
【請求項４６】
前記腎臓病が糸球体腎炎、脈管炎、腎炎または腎盂腎炎である、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
前記レセプター−リガンド結合が腎臓新形成、多発性骨髄腫、リンパ腫、軽鎖神経疾患またはアミロイドーシスに関連する、請求項29に記載の方法。
【請求項４８】
前記BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンド結合がエフェクターＴ細胞に関連する、請求項29に記載の方法。
【請求項４９】
前記BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンド結合が免疫応答の緩和に関連する、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
前記レセプター−リガンド結合が免疫抑制に関連する、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
前記免疫抑制が移植片拒絶、移植片対宿主病または炎症に関連する、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
前記活性が自己免疫疾患に関連する、請求項50に記載の方法。
【請求項５３】
前記自己免疫疾患がインスリン依存性真性糖尿病または膠原病である、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
前記BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンド結合が炎症に関連する、請求項50に記載の方法。
【請求項５５】
前記炎症が関節の疼痛、腫脹、貧血、または敗血症性ショックである、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
配列番号２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５７】
配列番号１の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５８】
下記の作用可能に連鎖された因子： 
転写プロモーター；
請求項56に記載のポリヌクレオチド分子；および
転写ターミネーター；
を含んでなる発現ベクター。
【請求項５９】
前記ポリヌクレオチド分子に作用可能に連鎖された分泌レセプター−リガンドの結合配列をさらに含んでなる、請求項58に記載の発現ベクター。
【請求項６０】
前記培養された細胞が前記ポリヌクレオチドセグメントによりコードされる前記ポリペプチドを発現する、請求項58に記載の発現ベクターが導入された培養された細胞。
【請求項６１】
ポリペプチドを産生する方法において、
請求項58に記載の発現ベクターが導入された細胞を培養し；
これにより前記細胞は前記ポリヌクレオチド分子によりコードされる前記ポリペプチドを発現し；そして
前記発現されたポリペプチドを回収する；
ことを含んでなる方法。
【請求項６２】
配列番号２の配列を有する単離されたポリペプチド。
【請求項６３】
薬学上許容されるビヒクルと組み合わせた、請求項６２に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可溶性エフェクターBR43x2およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫応答間に起こる細胞相互作用は、腫瘍壊死因子レセプター（TNFR）ファミリーを包含する、細胞表面レセプターのいくつかのファミリーのメンバーにより調節される。TNFRファミリーは多数の一体的膜糖タンパク質レセプターから成り、それらの多くは、それらのそれぞれのリガンドと組み合わせて、異なる造血細胞系列間の相互作用を調節する（Smith他、The TNF Recepotr Superfamily of Cellular and Viral Proteins：Activation，Costimulation and Death、76：959-62、1994；Cosman、Stem Cells 12：440-55、1994）。
【０００３】
1つのこのようなレセプターはTACI、トランスメンブランアクチベーターおよびCAML−インターラクターである（von BuelowおよびBram、Science 228：138−41、1997およびWIPO公開WO 98／39361）。TACIは膜結合レセプターであり、2つのシステインに富んだ擬反復を含有する細胞外ドメイン、トランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインを有し、この細胞質ドメインはJurkat細胞において過剰発現されるときNF−AT活性化のコインデュサーである細胞内小胞に位置する一体的膜タンパク質である、CAML（カルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド）と相互作用する。TACIはB細胞に関連し、そして細胞のサブセットに関連する。von BuelowおよびBram（前掲）は、TACIのリガンドが未知であることを報告している。
【０００４】
本発明のポリペプチド、ただ1つのシステインに富んだ擬反復を有するTACIイソ型（BR43x2）、TACIおよび関係するB細胞タンパク質、BCMA（Gras他、Int. Immunol. 17：1093-106、1995）は、TNFリガンド、ztnf4、現在ニュートロカインα（WIPO公開WO 98/39361）として知られている、BLyS（Moore他、Science 285：260-3、1999）、BAFF（Schneider他、J. Exp. Med. 189：1747-56、1999）、TALL-1（Shu他、J. Leukoc. Biol. 65：680-3、1999）またはTHANK（Mukhopadhyay他、J. Biol. Chem. 274：15978−81、1999）に結合することが見出された。それら自体、BR43x2、TACIおよびBCMAはztnf4の活性化、特にB細胞の活性化の調節に有効であろう。
この目的に向かって、本発明は、ztnf4または他のBR43x2、TACIまたはBCMAの活性をモジュレートするタンパク質治療剤、関係する組成物および方法ならびに本明細書における技術から当業者にとって明らかな他の使用を提供する。
【発明の概要】
【０００５】
発明の要約
1つの面において、本発明は、ある量の化合物を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるztnf4活性を阻害する方法を提供し、前記化合物は、
a）BR43x2の細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；
b）TACIの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；
c）BCMAの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；
d）配列番号10の配列を含んでなるポリペプチド；
e）配列番号2のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
f）配列番号4のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
g）配列番号6のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
h）配列番号8のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
i）配列番号10のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
k）配列番号4のポリペプチド；
l）配列番号6のアミノ酸残基1〜166のアミノ酸残基；および
m）配列番号8のアミノ酸残基1〜150のアミノ酸残基；
から成る群から選択される。
【０００６】
1つの態様において、化合物はペプチド結合により結合された第1部分と第2部分とから成る融合タンパク質であり、前記第1部分は、
a）配列番号8の配列を含んでなるポリペプチド；
b）配列番号2のアミノ酸残基25〜58を含んでなるポリペプチド；
c）配列番号6のアミノ酸残基34〜66を含んでなるポリペプチド；
d）配列番号6のアミノ酸残基71〜104を含んでなるポリペプチド；
e）配列番号6のアミノ酸残基25〜104を含んでなるポリペプチド；
f）配列番号8のアミノ酸残基8〜37を含んでなるポリペプチド；
g）配列番号8のアミノ酸残基41〜88を含んでなるポリペプチド；
h）配列番号8のアミノ酸残基8〜88を含んでなるポリペプチド；
から成る群から選択されるポリペプチドを含んでなり、そして前記第2部分は他のポリペプチドを含んでなる。
【０００７】
他の態様において、前記第1部分は、
a）配列番号2のアミノ酸残基59〜120；
b）配列番号6のアミノ酸残基105〜166；および
c）配列番号8のアミノ酸残基89〜150；
から成る群から選択されるポリペプチドをさらに含んでなる。
【０００８】
他の態様において、第1部分は、
a）BR43x2の細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；
b）TACIの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；および
c）BCMAの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；
から成る群から選択される。
関係する態様において、第1部分は、
a）配列番号4のポリペプチド；
b）配列番号6のアミノ酸残基1〜154；および
c）配列番号8のアミノ酸残基1〜48；
から成る群から選択される。他の関係する態様において、第2部分は免疫グロブリン重鎖定常領域である。
【０００９】
他の態様において、抗体または抗体フラグメントは、
a）ポリクローナル抗体；
b）ネズミモノクローナル抗体；
c）上記b）に由来するヒト化抗体；および
d）ヒトモノクローナル抗体；から成る群から選択される。関係する態様において、抗体フラグメントは、F(ab')、F(ab)、Fab'、Fab、Fv、scFv、および最小認識ユニットから成る群から選択される。他の態様において、哺乳動物は霊長類である。
【００１０】
他の態様において、ztnf4活性はBリンパ球に関連する。他の関係する態様において、ztnf4活性は活性化Bリンパ球に関連する。なお他の態様において、ztnf4活性は休止Bリンパ球に関連する。他の態様において、ztnf4活性は抗体産生に関連する。関係する態様において、抗体産生は自己免疫疾患に関連する。関係する態様において、前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、多発性硬化症、または慢性関節リウマチである。他の態様において、ztnf4活性はぜん息、気管支炎または気腫に関連する。なお他の態様において、ztnf4活性は末期腎不全に関連する。
【００１１】
さらに他の態様において、ztnf4活性は腎臓病に関連する、関係する態様において、腎臓病は糸球体腎炎、脈管炎、腎炎または腎盂腎炎である。なお他の態様において、腎臓病は腎臓新形成、多発性骨髄腫、リンパ腫、軽鎖神経疾患またはアミロイドーシスに関連する。他の態様において、ztnf4活性はエフェクターT細胞に関連する。関係する態様において、ztnf4活性は免疫応答の緩和に関連する。なお他の態様において、ztnf4活性は免疫抑制に関連する。なお他の態様において、免疫抑制は移植片拒絶、移植片対宿主の疾患または炎症に関連する。他の態様において、活性は自己免疫疾患に関連する。
【００１２】
関係する態様において、自己免疫疾患はインスリン依存性真性糖尿病または膠原病である。他の態様において、ztnf4活性は炎症に関連する。関係する態様において、炎症は関節の疼痛、腫脹、貧血、または敗血症性ショックである。他の面において、本発明は、ある量の前記化合物物を投与することを含んでなる、BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結合を阻害する方法を提供する。他の態様において、BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結合はBリンパ球に関連する。他の関係する態様において、BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結合は活性化Bリンパ球に関連する。
【００１３】
なお他の態様において、BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結合は休止Bリンパ球に関連する。他の態様において、BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結合は抗体産生に関連する。関係する態様において、抗体産生は自己免疫疾患に関連する。関係する態様において、前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、多発性硬化症、または慢性関節リウマチである。他の態様において、BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結合はぜん息、気管支炎または気腫に関連する。なお他の態様において、BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結合は末期腎不全に関連する。
【００１４】
なお他の態様において、BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結合は腎臓病に関連する。関係する態様において、腎臓病は糸球体腎炎、脈管炎、腎炎または腎盂腎炎である。なお他の態様において、腎臓病は腎臓新形成、多発性骨髄腫、リンパ腫、軽鎖神経疾患またはアミロイドーシスに関連する。他の態様において、BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結合はエフェクターT細胞に関連する。関係する態様において、BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結合は免疫応答の緩和に関連する。
【００１５】
なお他の態様において、活性は免疫抑制に関連する。なお他の態様において、免疫抑制は移植片拒絶、移植片対宿主の疾患または炎症に関連する。他の態様において、活性は自己免疫疾患に関連する。関係する態様において、自己免疫疾患はインスリン依存性真性糖尿病または膠原病である。他の態様において、BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結合は炎症に関連する。関係する態様において、炎症は関節の疼痛、腫脹、貧血、または敗血症性ショックである。
【００１６】
他の態様において、本発明は、配列番号2のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。また、配列番号1の単離されたポリヌクレオチド分子が提供される。関係する態様において、下記の作用可能に連鎖された因子を含んでなる発現ベクターが提供される：転写プロモーター；前述のポリヌクレオチド分子；および転写ターミネーター。他の態様において、発現ベクターはポリヌクレオチド分子に作用可能に連鎖された分泌レセプター−リガンドの結合配列をさらに含んでなる。
【００１７】
また、前記ポリヌクレオチドセグメントによりコードされる前記ポリペプチドを発現する、前述の発現ベクターは導入された培養された細胞が提供される。さらに、本発明は、前述の発現ベクターが導入された細胞を培養し；これにより前記細胞は前記ポリヌクレオチド分子によりコードされる前記ポリペプチドを発現し；そして前記発現されたポリペプチドを回収することを含んでなるポリペプチドを産生する方法が提供される。本発明は、また、配列番号2の配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。関係する態様において、ポリペプチドを薬学上許容されるビヒクルと組み合わせる。
本発明のこれらの面および他の面は、本発明の下記の詳細な説明および添付図面を参照すると、明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図1は、BR43x2、TACI（von BuelowおよびBram、前掲）（配列番号6）、BCMA（Gras他、前掲）（配列番号6）およびBR43x1（配列番号7）の間の多重アミノ酸配列整列を示す。システインに富んだ擬反復およびトランスメンブランドメインが記載されている。
【図２】図2は、安定なBHKトランスフェクタントにより発現されたTACIおよびBCMAに結合する可溶性I１２５−ztnf4のスキャッチャードプロット分析を示す。
【００１９】
【図３Ａ】図3Aは、免疫グロブリンを増殖させかつ分泌するztnf4共活性化ヒトBリンパ球を示す。
【図３Ｂ】図3Bは、9日の培養後にIL4またはIL4＋IL5の存在下に可溶性ztnf4で刺激したB細胞から得られた上清中で測定したIgMおよびIgGのレベルを示す。
【００２０】
【図４】図4は、in  vitroにおいて5日間IL−4の存在下に可溶性ztnf4または対照タンパク質（ユビクイチン）で刺激したヒト末梢血B細胞で刺激した。精製したTACI−Ig、BCMA−Igおよび対照Fcをztnf4特異的増殖の阻害について試験した。
【図５Ａ】図5Aは、SLEの特性を発生させたztnf4トランスジェニック動物からの結果で刺激した。
【００２１】
【図５Ｂ】図5Bは、CD5、CD4およびCD8に対する抗体で染色したztnf4トランスジェニック動物からのリンパ節、脾臓および胸腺細胞で刺激した。
【図５Ｃ】図5Cは、6〜23週齢の範囲のトランスジェニックztnf4動物からの血清中の全IgM、IgGおよびIgEで刺激した。
【００２２】
【図５Ｄ】図5Dは、ztnf4トランスジェニック動物からの腎臓切片において同定された糸球体のアミロイドの沈着および厚くなった糸球体間質で刺激した。
【図５Ｅ】図5Eは、ztnf4トランスジェニックマウスにおけるエフェクターT細胞を示す。
【００２３】
【図６Ａ】図6Aは、SLEの発生と相関するZNBWF1マウスおよびMRL／lpr／lprマウスから得られた血清中の増加したztnf4レベルを示す。
【図６Ｂ】図6Bは、SLEの発生と相関するZNBWF1マウスおよびMRL／lpr／lprマウスから得られた血清中の増加したztnf4レベルを示す。
【００２４】
【図７】図7は、研究の過程にわたってタンパク尿を発生するNZBWF1マウスの百分率を示す。
【図８】図8は、ZNBWF1およびMRL／lpr／lprマウスからの血清と比較したztnf4トランスジェニックマウスおよび対照同腹子からのELISAによる抗dsDNAレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、下記の用語を定義することはその理解の助けとなるであろう：
親和標識：は、本明細書において、第2ポリペプチドの精製または検出を提供するか、あるいは基質への第2ポリペプチドの結合部位を提供するために、第2ポリペプチドに結合させることができるポリペプチドのセグメントを表すために使用される。原理的には、抗体または他の特異的な結合因子が利用可能な任意のペプチドまたはタンパク質を親和標識として使用することができる。
【００２６】
親和標識は下記のものを包含する：ポリヒスチジントラクト、プロテインA（Nilsson他、EMBO J. 4：1075、1985；Nilsson他、Methods Enzymol. 198：3、1991）、グルタチオンSトランスフェラーゼ（SmithおよびJohnson、Gene 67：31、1988）、Glu-Glu親和標識（Grussenmeyer他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82：7952-4、1985）、サブスタンスP、FlagＴＭペプチド（Hopp他、Biotechnology 6：1204-10、1988）、ストレプチアビジン結合ペプチド、または他の抗原性エピトープまたは結合ドメイン。一般に、Ford他、Protein Expression and Purification 2：95-107、1991、参照。親和標識をコードするDNAは、商業的供給会社から入手可能である（例えば、Pharmacia Biotech、ニュージャージイ州ピスカタウェイ）。
【００２７】
アレレ変異型：同一染色体遺伝子座を占有する遺伝子の2またはそれ以上のオールタネイト形態の任意のもの。アレレの変動は突然変異により自然に起こり、そして集団内に表現型の多形性を生じさせることがある。遺伝子の突然変異はサイレント（コードされたポリペプチドの非変化）であるか、あるいは変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。アレレ変異型という用語は、また、本明細書において遺伝子のアレレ変異型によりコードされるタンパク質を表すために使用される。また、アレレの変動のために参照アミノ酸配列と異なる同一種からの同一タンパク質が包含される。
【００２８】
アミノ末端およびカルボキシル末端：は、本明細書において、ポリペプチド内の位置を表すために使用される。この関係が許す場合、これらの用語は近接性または相対的位置を表すためにポリペプチドの特定の配列または部分を参照して使用される。例えば、ペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端に位置するある種の配列は、参照配列のカルボキシル末端に対して近接して位置するが、完全なポリペプチドのカルボキシル末端に必ずしも存在しない。
【００２９】
相補体／抗相補体の対：は、適当な条件下に非共有結合的にアソシエートした安定な対を形成する、非同一部分を表す。例えば、ビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）は、相補体／抗相補体の対のプロトタイプのメンバーである。他の典型的な相補体／抗相補体の対は、レセプター／リガンドの対、抗体／抗原（またはハプテンまたはエピトープ）の対、センス／アンチセンスポリヌクレオチドの対、およびその他を包含する。相補体／抗相補体の対の引き続く解離を望む場合、補体／抗補体の対は好ましくは＜10９／Mの結合アフィニティーを有する。
【００３０】
コンティグ（contig）：は、他のポリヌクレオチドに対して同一であるか、あるいは相補的な配列の隣接するストレッチを有するポリヌクレオチドを表す。隣接する配列は、それらの全体においてあるいはポリヌクレオチドの部分的ストレッチに沿って、ポリヌクレオチド配列の所定のストレッチを「オーバーラップ」させると言われる。例えば、ポリヌクレオチド配列5'-ATGGTTAGCTT-3'に対する代表的なcontigは5'-TAGCTTgagtct-3'および3'-gtcgacTACCGA-3'である。
【００３１】
ポリヌクレオチド分子の相補体：は、相補的塩基配列を有しかつ参照配列に比較して逆の向きを有するポリヌクレオチド分子である。例えば、配列5' ATGCACGGG 3'は5' CCCGTGCAT 3'に対して相補的である。
【００３２】
縮重ヌクレオチド配列または縮重配列：は、1またはそれ以上の縮重コドンを含むヌクレオチド配列（ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子に比較して）を表す。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含有するが、同一アミノ酸残基をコードする（すなわち、GAUおよびGACのトリプレットの各々はAspをコードする）。
【００３３】
発現ベクター：その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連鎖された、問題のポリペプチドをコードするセグメントからなる、線状または円形のDNA分子。このような追加のセグメントは、プロモーターおよびターミネーターの配列を包含し、そして、また、1またはそれ以上の複製起点、1またはそれ以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、およびその他を包含することができる。発現ベクターは、一般に、プラスミドまたはウイルスDNAから誘導されるか、あるいは双方の因子を含有することができる。
【００３４】
イソ型：は、異なる遺伝子からまたは同一遺伝子からオールタネイトスプライシングにより製造できるタンパク質の異なる型を意味する。ある場合において、イソ型はそれらの輸送活性、発生されており発現時間、組織分布、細胞中の位置またはこれらの特性の組合わせにおいて異なる。
【００３５】
単離されたポリヌクレオチドオチド：は、ポリヌクレオチドがその自然の遺伝的環境から取出され、こうして、他の余分または望ましくないコーディング配列を含まず、そして遺伝子操作されたタンパク質の産生系内で使用するために適当な形態であることを表す。このような単離された分子は、それらの自然環境から分離されたものであり、そしてcDNAおよびゲノムのクローンを包含する。本発明の単離されたDNA分子は、それらが通常アソシエートされる他の遺伝子を含まないが、天然に存在する5'および3'の非翻訳領域、例えば、プロモーターおよびターミネーター、およびその他を包含することができる。アソシエートされた領域の同定は、当業者にとって明らかであろう（例えば、DynanおよびTijan、Nature 316：774-78、1985、参照）。
【００３６】
単離されたポリペプチドまたはタンパク質：は、その自然環境、例えば、血液および動物の組織、以外の条件において見出されるポリペプチドまたはタンパク質である。好ましい形態において、単離されたポリペプチドは他のポリペプチド、特に動物由来の他のポリペプチドを実質的に含まない。高度に精製された形態、すなわち、95％より大きい純度、より好ましくは99％より大きい純度のポリペプチドを提供することが好ましい。この関係において使用するとき、用語「単離された」は別の物理的形態、例えば、二量体、あるいはグリコシル化または誘導化された形態の同一のポリペプチドの存在を排除しない。
【００３７】
作用可能に連鎖された：は、DNAセグメントについて言及するとき、セグメントがそれらの意図する目的のために調和して機能するように、例えば、転写がプロモーターにおいて開始し、コーディングセグメントを通してターミネーターに進行するように、セグメントが配置されていることを示す。
オーソログ：は、異なる種からのポリペプチドまたはタンパク質の機能的対応物である、1つの種から得られたポリペプチドまたはタンパク質を表す。オーソログ間の配列の差は種形成の結果である。
【００３８】
ポリヌクレオチド：は、5'→3'末端の方向に読んだ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖のポリマーである。ポリヌクレオチドはRNAおよびDNAを包含し、天然源から単離され、in  vitroで合成されるか、あるいは天然の分子と合成の分子との組合わせから製造することができる。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対（略号「bp」）、ヌクレオチド（「nt」）、またはキロ塩基（「kb」）として表される。
【００３９】
この関係が許す場合、後者の2つの用語は一本鎖または二本鎖であるポリヌクレオチドを記載することができる。この用語を二本鎖の分子に適用するとき、それは全体の長さを表すために使用され、そして用語「塩基対」に等しいと理解されるであろう。当業者は認識するように、二本鎖ポリヌクレオチドの2つの鎖はわずかに長さが異なることがあり、そして酵素の切断の結果その末端は食い違うことがある；こうして、二本鎖ポリヌクレオチド内のすべてのヌクレオチドは対合していなことがある。このような不対末端は一般に20ヌクレオチド長さを超えないであろう。
【００４０】
ポリペプチド：は、自然にまたは合成的に生産された、ペプチド結合により結合されたアミノ酸残基のポリマーである。約10アミノ酸残基より小さいポリペプチドは普通に「ペプチド」と呼ばれる。
プロモーター：は、RNAポリメラーゼの結合を提供しかつ転写を開始させるDNA配列を含有する遺伝子の部分を表す。プロモーター配列は普通に、しかし常にではないが、遺伝子の5'非コーディング領域の中に見出される。
【００４１】
タンパク質：は、1または2以上のポリペプチド鎖を含んでなる高分子である。タンパク質は、また、非ペプチド成分、例えば、炭水化物基を含んでなることができる。炭水化物および他の非ペプチド置換基を細胞によりタンパク質に付加することができ、細胞においてタンパク質は産生され、そして細胞の型とともに変化するであろう。タンパク質はアミノ酸主鎖構造により本明細書において定義される；置換基、例えば、炭水化物基は一般に特定されないが、それにもかかわらず、存在することができる。
【００４２】
レセプター：は、生物活性分子（すなわち、リガンド）に結合し、細胞上のリガンドの作用を伝達する、細胞関連タンパク質を表す。レセプターへのリガンドの結合は、エフェクタードメインと、細胞中の1またはそれ以上の他の分子との間の相互作用を引き起こす、レセプターにおけるコンフォメーションの変化を生ずる。この相互作用は、引き続いて、細胞の代謝の変更に導く。レセプター−リガンドの相互作用に関係する代謝の事象は、遺伝子の転写、リン酸化、脱リン酸化、細胞増殖、サイクル的AMP産生の増加、細胞のカルシウムの移動化、膜脂質の移動化、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、およびリン脂質の加水分解を包含する。BR43x2は、本明細書においていっそう詳細に説明するように、TNFレセプターの特性を有する。
【００４３】
分泌シグナル配列：は、ポリペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするDNA配列を表し、それは、より大きいポリペプチドの1成分として、より大きいポリペプチドが合成される細胞の分泌経路を通してそのポリペプチドを向ける。通常、より大きいポリペプチドは、分泌経路を通る移行の間に切断されて、分泌ペプチドを除去する。
【００４４】
可溶性レセプター：細胞膜に結合しないレセプターポリペプチド。最も普通には、可溶性のレセプターはトランスメンブランおよび細胞質ドメインを欠如するリガンド結合性レセプターのポリペプチドである。可溶性レセプターは、追加のアミノ酸残基、例えば、ポリペプチドの精製を提供するまたは基質へのポリペプチドの結合部位を提供する親和標識を含んでなることができる。多数の細胞表面のレセプターは、タンパク質分解により産生されるか、あるいは選択的にスプライスされたmRNAから翻訳される、天然に存在する、可溶性対応物を有する。レセプターのポリペプチドは、それぞれ、膜の定着またはシグナルトランスダクションを提供する、これらのセグメントの十分な部分を欠如するとき、トランスメンブランおよび細胞内ポリペプチドのセグメントを実質的に含まないと言われる。
【００４５】
不正確な分析法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されたポリマーの分子量および長さは、近似値であると理解されるであろう。このような値を「約」Xまたは「ほぼ」Xとして表すとき、Xの記載する値は±10％の正確さであると理解されるであろう。
本明細書において引用するすべての参考文献の教示は、それらの全体において引用することによって本明細書の一部とされる。
【００４６】
本発明は、1192bpのDNA配列（配列番号1）およびレセプターTACIのイソ型である対応するポリペプチド配列（配列番号2の発見に一部分に基づく。イソ型はBR43x2と表示された。BR43x2の可溶性形態は配列番号4に開示され、可溶性レセプターをコードするポリヌクレオチドは配列番号3に開示される。本明細書においていっそう詳しく説明されるように、本発明のBR43x2レセプターをコードするポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒトRPMI  1788ライブラリーおよびNまたはC末端的に標識化された、ビオチン−またはFITC標識化腫瘍壊死因子リガンドztnf4、現在ニュートロカインα（WIPO公開WO  98／39361）として知られている、BLyS（Moore他、前掲）、BAFF（Schneider他、前掲）、TALL−1（Shu他、前掲）またはTHANK（Mukhopadhyay他、前掲）を使用するシグナルトラップクローニングにより、最初に同定された。
【００４７】
陽性プールはリガンド結合により同定され、単一クローンに破壊され、cDNA単離され、配列決定された。BR43x2の推定されたアミノ酸配列（配列番号2に表示されている）を既知の腫瘍壊死因子レセプターと比較すると、BR43x2はTACIのイソ型であり、単一の、低度に保存された、システインに富んだ擬反復を有することが示された。
【００４８】
構造的には、TNFレセプターファミリーは、歴史的に「システインに富んだ擬反復」と呼ばれる、いくつかのモジュールから構成された細胞外部分により特徴づけられる。プロトタイプのTNFRファミリーメンバーは4つのこれらの擬反復を有し、各々は交互に約29〜43の残基長さを有する。典型的な擬反復は6システイン残基を有する。それらは共通のモジュールに由来するように思われ、正確に反復しないので、擬反復と呼ばれる：擬反復＃1、＃2、＃3および＃4は互いに区別する特徴ある配列を有する。p55  TNFレセプターの結晶構造は、各擬反復が1つのフォルディングドメインに対応し、すべての4つの擬反復が同一第3構造的の折りたたまれ、ジサルファイド結合により内部に一緒に保持されることを示した。
【００４９】
TACIは2つのシステインに富んだ擬反復を有する（von  BuelowおよびBram、前掲）を含有し、第1はTNFレセプターファミリーの他のメンバーとともに構造の中に保存され、第2は低度に保存される。本発明のBR43x2イソ型は第1のTACIシステインに富んだ擬反復を欠如し、第2の、低度に保存された反復のみを保持する。
【００５０】
配列番号2に表示されるようなBR43x2の推定されたアミノ酸配列の配列の解析は、細胞外ドメイン（配列番号2の残基1〜120）を有する成熟タンパク質の存在を示し、このタンパク質は1つのシステインに富んだ擬反復（pseudo-repeat)（配列番号2の残基25〜58）、トランスメンブランドメイン（配列番号2の残基121〜133）および細胞質ドメイン（配列番号2の残基134〜247）を含有する。BR43x2のシステインに富んだ擬反復は6つのシステイン残基（配列番号2の残基25、40、43、47、54および58）、保存されたアスパラギン酸残基（配列番号2の残基34）および2つのロイシン残基（配列番号2の残基36および37）を有し、TACIの第1システインに富んだ擬反復（配列番号6）と46％の同一性およびBCMAのシステインに富んだ擬反復（配列番号8）と35％の同一性を共有する（図1）。
【００５１】
システインに富んだ擬反復は下記のモチーフにより表すことができる：
CX［QEK］［QEKNRDHS］［QE］X｛0−2｝［YFW］［YFW］DXLLX｛2｝C［IMLV］XCX｛3｝CX｛6−8｝CX｛2｝［YF］C（配列番号10）、
ここでCはアミノ酸残基システインを表し、Qはグルタミンを表し、Eはグルタミン酸を表し、Kはリシンを表し、Nはアスパラギンを表し、Rはアルギニンを表し、Dはアスパラギン酸を表し、Hはヒスチジンを表し、Sはセリンを表し、Yはチロシンを表し、Fはフェニルアラニンを表し、Wはトリプトファンを表し、Lはロイシンを表し、Iはイソロイシンを表し、Vはバリンを表し、そしてXはシステイン以外の任意の天然に存在するアミノ酸残基を表す。正方形の括弧中のアミノ酸残基“［］”は、その位置において許容されたアミノ酸残基の変動を示す。中括弧“｛｝”は、その位置において許容されたアミノ酸残基の数を示す。
【００５２】
本発明は、また、配列番号10により提供されるような32〜40アミノ酸残基長さの可溶性ポリペプチドを提供する。
可溶性BR43x2レセプターは、配列番号4の残基1〜120により表され、1つのシステインに富んだ擬反復（配列番号4の残基25〜58）を含有し、配列番号2に記載されているようなBR43x2のトランスメンブランおよび細胞質ドメインを欠如する。
当業者は認識するように、これらのドメイン境界は近似であり、既知のタンパク質との整列およびタンパク質フォルディングの予測に基づく。これらの特徴は、配列番号1および3のDNA配列によりコードされるレセプターはTNFレセプターファミリーの1メンバーであることを示す。
【００５３】
BR43x2発現を検出するために予測されるBR43x1に対するヌクレオチドプローブに対応するmRNAの組織分布のノザンブロット分析およびドットブロット分析は、脾臓、リンパ節、CD19＋細胞における発現、混合リンパ球反応細胞、DaudiおよびRaji細胞における弱い発現を示した。TACIについて報告されたように（von BuelowおよびBram、前掲）、逆転写酵素PCRを使用して、BR43x1はB細胞のみにおいて検出され、そして活性化されたT細胞において検出されなかった。対応するTACI配列と100％オーバーラップするBR43x2プローブを使用して、TACIおよびBR43x2は脾臓、リンパ節および小腸、胃、唾液腺、虫垂、肺、骨髄、胎児脾臓、CD19＋細胞、およびRaji細胞において検出された。
【００５４】
ノザンブロット分析を使用して、BCMAは小腸、脾臓、胃、結腸、虫垂、リンパ節、気管、および精巣において検出された。BCMAはまた腺リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および副甲状腺腫瘍において検出され、CD8+、CD19+、MLR細胞、Daudi細胞、RajiおよびHut78細胞においてかすかに検出された。
また、ネズミztnf4（配列番号19）および同様なヒトTACI、BCMA、およびBR43x2を使用してノザンブロット分析を実施し、ネズミztnf4の発現は主として脾臓および胸腺において検出された。ネズミztnf4はまた肺において発現され、そしてかすかな発現は皮膚および心臓において検出された。
【００５５】
本発明は、また、本明細書に開示するBR43x2ポリペプチドをコードする、DNAおよびRNA分子を包含する、ポリヌクレオチド分子を提供する。当業者は容易に認識するように、遺伝暗号のデジェネラシーにかんがみて、かなりの配列変動はこれらのポリヌクレオチド分子の間で可能である。配列番号11は、配列番号4の可溶性BR43x2ポリペプチドをコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配列である。同様に、配列番号12は、配列番号2のBR43x2ポリペプチドをコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配列である。
【００５６】
当業者は認識するように、配列番号12の縮重配列は、また、UをTと置換することによって配列番号4をコードするすべてを含むRNA配列を提供する。こうして、BR43x2ポリペプチドをコードする配列番号11のヌクレオチド1〜ヌクレオチド360、配列番号12のヌクレオチド1〜741を含んでなるポリヌクレオチドおよびそれらのRNA同等物は、本発明に包含される。縮重ヌクレオチド位置を表すために配列番号11および12内で使用した1文字コードを表1に記載する。「分解能」はコード文字により表されるヌクレオチドである。「補体」は1またはそれ以上の相補的ヌクレオチドのコードである。例えば、コードYはCまたはTを表し、そしてその補体RはAまたはGを表し、AはTに対して相補的であり、そしてGはCに対して相補的である。
【００５７】
【表１】
2012001550.tif 000002
所定のアミノ酸についてすべての可能なコドンを包含する、配列番号11および12において使用する縮重コドンを、表2に記載する。
【００５８】
【表２】
2012001550.tif 000003
【００５９】
当業者は認識するように、各アミノ酸をコードするすべての可能なコドンを代表する縮重コドンを決定するとき、多少の不明確さが導入される。例えば、セリンの縮重コドン（WSN）は、ある環境において、アルギニン（AGR）をコードすることができ、そしてアルギニンの縮重コドン（MGN）は、ある環境において、セリン（AGY）をコードすることができる。同様な関係はフェニルアラニンおよびロイシンをコードするコドンの間に存在する。したがって、縮重配列に包含される、いくつかのポリヌクレオチドは変異型アミノ酸配列をコードすることができるが、当業者は、配列番号2および4のアミノ酸配列を参照することによって、このような変異型配列を容易に同定することができる。変異型配列は、本明細書において記載するように、機能性について容易に試験することができる。
【００６０】
また、当業者は認識するように、異なる種は「優先的コドンの使用」を示すことができる。一般に、下記の文献を参照のこと：Grantham他、Nucl. Acids Res. 8：1893-912、1980；Haas他、Curr. Biol. 6：315-24、1996；Wain-Hobson他、Gene 13：355-64、1981；GrosjeanおよびFiers、Gene 18：199-209、1982；Holm、Nucl. Acids Res. 14：3075-87、1986；Ikemura、J. Mol. Biol. 158：573-97、1982。本発明において使用するとき、用語「優先的コドンの使用」または「優先的コドン」は、ある種の細胞において最も頻繁に使用され、こうして各アミノ酸をコードする可能なコドンの1つまたはわずかの代表的なものに好んで使用される、タンパク質翻訳コドンを言及する、この分野の用語である（表2参照）。
【００６１】
例えば、アミノ酸のスレオニン（Thr）はACA、ACC、ACG、またはACTによりコードされることができるが、哺乳動物細胞において、ACCは最も普通に使用されるコドンである；他の種、例えば、昆虫細胞、酵母、ウイルスまたは細菌において、異なるThrコドンは優先的であることができる。特定の種の優先的コドンを、この分野において知られている種々の技術により、本発明のポリヌクレオチドの中に導入することができる。組換えDNAの中への優先的コドンの導入は、例えば、特定の細胞の型または種内のタンパク質の翻訳を効率よくすることによって、タンパク質の産生を増強することができる。
【００６２】
したがって、配列番号11に開示されている縮重コドンの配列は、この分野において普通に使用されかつ本明細書において開示する、種々の細胞の型および種におけるポリヌクレオチドの発現を最適化するための鋳型として働く。優先的コドンを、本明細書において開示するように、種々の種における発現について試験し、発現のために最適化し、そして機能性について試験することができる。
【００６３】
BR43x2のシステインに富んだ擬反復の中に高度に保存されたアミノ酸を、新しいファミリーメンバーを同定するツールとして使用することができる。例えば、種々の組織源または細胞系統から得られたRNAからの、前述の、細胞外リガンド結合性ドメインをコードする配列を増幅するために、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）を使用することができる。特に、BR43x2配列から設計された高度に保存されたプライマーはこの目的に有用である。
【００６４】
本発明の好ましい態様の範囲内において、単離されたポリヌクレオチドは、ストリンジェント条件下に、配列番号3の同様なサイズの領域またはそれ対して相補的配列に対してハイブリダイゼーションするであろう。一般に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度およびpHにおいて、特定の配列の熱的融点（Tm）よりも約5℃低いように選択される。Tmはターゲット配列の50％が完全に合致するプローブにハイブリダイゼーションする温度（規定されたイオン強度およびpHにおいて）である。典型的にはストリンジェント条件は、pH7において塩濃度が約0.03Mまででありかつ温度が少なくとも約60℃である条件である。
【００６５】
前述したように、本発明の単離されたポリヌクレオチドはDNAおよびRNAを包含する。DNAおよびRNAを製造する方法はこの分野においてよく知られている。一般にRPMI  1788細胞、PBMNC、B細胞または扁桃腺組織からRNAを単離することが好ましいが、また、DNAは他の組織からのRNAを使用して製造することができるか、あるいはゲノムDNAとして単離することができる。全RNAはグアジニウムイソチオシアネート抽出および引き続くCsCl勾配の遠心により製造することができる（Chirgwin他、Biochemistry 18：52-94、1979）。ポリ（A）+RNAは全RNAからAvivおよびLederの方法（Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA 69：1408-12、1972）により製造される。相補的DNA（cDNA）はポリ（A）＋RNAから既知の方法により製造される。次いでBR43x2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、例えば、ハイブリダイゼーションまたはPCRにより、同定し、単離する。
【００６６】
当業者は認識するように、配列番号1および3に開示する配列はヒト遺伝子の単一アレレ表し、そしてアレレの変動およびオールタネイティブスプライシングが起こることが期待される。配列番号1および3に示すDNA配列のアレレ変異型は、サイレント突然変異を含有するものおよび突然変異がアミノ酸配列の変化を生ずるものを包含し、本発明の範囲内に入り、そして配列番号2および4のアレレ変異型であるタンパク質もまた本発明の範囲内に入る。この分野において知られている標準的手順に従い異なる個体または組織からのcDNAまたはゲノムライブラリーをプロービングすることによって、アレレ変異型およびこれらの配列のスプライス変異型をクローニングすることができる。
【００６７】
本発明は、また、配列番号2および4のポリペプチドおよびそれらの種オーソログに対して実質的に類似する、単離されたBR43x2ポリペプチドを提供する。用語「実質的に類似する」は、本明細書において、配列番号2および4に示す配列またはそれらのオーソログに対して50％、好ましくは60％、より好ましくは少なくとも80％の配列の同一性を有するポリペプチドを表すために使用される。このようなポリペプチドは配列番号2に示す配列またはそれらのオーソログに対して好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％配列の同一性を有する。
【００６８】
配列の同一性の百分率は慣用法により決定される。例えば、下記の文献を参照のこと：Altschul他、Bull. Math. Bio. 48：603-66、1986およびHenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915-9、1992。簡単に述べると、表3（アミノ酸は標準的1文字コードにより示されている）に示すように10のギャップオープニングペナルティー、1のギャップエクステンションペナルティー、およびHenikoffおよびHenikoff（前掲）の「ブロサム（blosum）62」スコアリングマトリックスを使用して、2つのアミノ酸配列を整列させて整列スコアを最適化する。
【００６９】
【数１】
2012001550.tif 000004
【００７０】
【表３】
2012001550.tif 000005
【００７１】
ポリヌクレオチド分子の配列の同一性は、上に開示した比を使用する同様な方法により決定される。
【００７２】
実質的に相同性のタンパク質およびポリペプチドは、1またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するとして特性決定される。これらの変化は好ましくは小さい特質を有する、すなわち、保存的アミノ酸置換（表4参照）およびタンパク質またはポリペプチドのフォルディングまたは活性に影響を実質的に与えない他の置換；小さい欠失、典型的には1〜約30アミノ酸の欠失；およびアミノ末端およびカルボキシル末端のエクステンション、例えば、アミノ末端のメチオニン残基、約20〜25残基までの小さいリンカーペプチド、または親和標識を有する。親和標識を含んでなるポリペプチドは、さらに、BR43x2ポリペプチドと親和標識との間にタンパク質分解切断部位を含むことができる。好ましいこのような部位は、トロンビン切断部位および因子Xa切断部位を包含する。
【００７３】
【表４】
2012001550.tif 000006
20の標準的アミノ酸に加えて、非標準的アミノ酸（例えば、4−ヒドロキシプロリン、6−N−メチルリシン、2−アミノイソ酪酸、イソバリンおよびα−メチルセリン）を本発明のBR43x2ポリペプチドのアミノ酸残基と置換することができる。制限された数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸、および非天然アミノ酸をBR43x2ポリペプチドのアミノ酸残基と置換することができる。また、本発明のタンパク質は、天然に存在しないアミノ酸残基を含んでなることができる。
【００７４】
天然に存在しないアミノ酸は、限定されずに、下記のものを包含する：トランス−3−メチルプロリン、2,4−メタノプロリン、シス−4−ヒドロキシプロリン、トランス−4−ヒドロキシプロリン、N−メチルグリシン、アロ−スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3−および4−メチルプロリン、3,3−ジメチルプロリン、tert−ロイシン、ノルバリン、2−アザフェニルアラニン、3−アザフェニルアラニン、4−アザフェニルアラニン、および4−フルオロフェニルアラニン。
【００７５】
天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質の中に組込む、いくつかの方法はこの分野において知られている。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを使用してナンセンス突然変異を抑制する、in  vitro系を使用することができる。アミノ酸を合成し、tRNAをアミノアシル化する方法はこの分野において知られている。大腸菌（E.coli）S30抽出物および商業的に入手可能な酵素および他の試薬を含んでなる、無細胞系において、ナンセンス突然変異を含有するプラスミドの転写および翻訳は実施される。タンパク質をクロマトグラフィーにより精製する。
【００７６】
例えば、下記の文献を参照のこと：Robertson他、J. Am. Chem. Soc. 113：2722、1991；Ellman他、Methods Enzymol. 202：301、1991；Chung他、Science 259：806−809、1993；およびChung他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：10145-10149、1993）。第2の方法において、突然変異したmRNAおよび化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAのマイクロインジェクションにより、キセノプス・オオサイト（Xenopus oocytes）中で翻訳を実施する（Turcatti他、J. Biol. Chem. 271：19991−8、1996）。
【００７７】
第3の方法において、置換すべき天然アミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の非存在においてかつ所望の天然に存在しない1またはそれ以上のアミノ酸（例えば、2−アザフェニルアラニン、3−アザフェニルアラニン、4−アザフェニルアラニンまたは4−フルオロフェニルアラニン）の存在において、大腸菌（E.coli）細胞を培養する。天然に存在しないアミノ酸をその天然対応物の代わりにタンパク質の中に組込む。Koide他、Biochem.  33：7470−6、1994、参照。in vitro化学的修飾により、天然に存在するアミノ酸残基を天然に存在しない種に変換することができる。化学的修飾を部位特異的突然変異誘発と組合わせて、置換の範囲をさらに拡張することができる（WynnおよびRichards、Protein Sci. 2：395−403、1993）。
【００７８】
制限された数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、および非天然のアミノ酸をBR43x2アミノ酸残基と置換することができる。
【００７９】
本発明のBR43x2ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、この分野において知られている手順、例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発に従い同定することができる（CunninghamおよびWells、Science 244：1081-5、1989；Bass他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：4498−502、1991）。後者の技術において、単一のアラニンの突然変異を分子中のすべての残基において導入し、そして、後述するように、生ずる突然変異体分子を生物学的活性について試験して、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定する。また、下記の文献を参照のこと：Hilton他、J. Biol. Chem. 271：4699-708、1996。
【００８０】
また、リガンド−レセプターまたは他の生物学的相互作用の部位は、構造の物理的解析により決定することができ、例えば、核磁気共鳴、結晶学、電子回折またはフォトアフィニティー標識化のような技術と、推定上の接触部位のアミノ酸の突然変異との組合わせにより決定することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：de Vos他、Science 255：306-12、1992；Smith他、J. Mol. Biol. 224：899-904、1992；Wlodaver他、FEBS Lett. 309：59-64、1992。必須アミノ酸の同定は、また、関係するポリペプチドとの相同性から推定することができる。
【００８１】
保存されたシステイン、アスパラギン酸およびロイシン残基が混乱されないかぎり、BR43x2のシステインに富んだ擬反復内で追加のアミノ酸置換を行うことができる。他のシステインに富んだ擬反復の配列を参照することによって、BR43x2のシステインに富んだ擬反復内で追加のアミノ酸置換を行うことが好ましい。配列番号10は、このような整列に基づく許容可能なアミノ酸配列を示す、一般化されたシステインに富んだ擬反復である。このドメイン内の置換は本明細書において記載する限定に付される。
【００８２】
既知の突然変異誘発およびスクリーニングの方法、例えば、下記の文献に記載されている方法を使用して、多重アミノ酸置換を行い、試験することができる：Reidhaar-OlsonおよびSauer、Science 241：53-7、1988またはBowieおよびSauer、Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA 86：2152-6、1989。簡単に述べると、これらの著者らはポリペプチド中の2またはそれ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドについて選択し、次いで突然変異化ポリペプチドを配列決定して、各位置における許容可能な置換のスペクトルを決定する方法を開示している。使用できる他の方法は下記の方法を包含する：ファージディスプレイ（例えば、Lowman他、Biochem. 30：10832-7、1991；Ladner他、米国特許第5,223,409号；Huse、WIPO公開WO 92/06204）および領域特異的突然変異誘発（Derbyshire他、Gene 46：145、1986；Ner他、DNA 7：127、1988）。
【００８３】
開示したBR43x2のDNAおよびポリペプチド配列の変異型は、下記の文献に開示されているように、DNAシャフリングにより発生させることができる：Stemmer、Nature 370：389-91、1994、Stemmer、Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA 91：10747-51、1994およびWIPO公開WO 90/20078。簡単に述べると、親DNAをランダムフラグメント化し、次いでPCRを使用してリアセンブリーして、ランダムに導入された点突然変異を生じさせることによって、in vitro相同的組換えにより変異型DNAを発生させる。
【００８４】
親DNAのファミリー、例えば、アレレ変異型または異なる種からのDNAを使用して、追加の可変性をプロセスの中に導入することによって、この技術を修飾することができる。所望の活性について選択またはスクリーニングし、次いで突然変異誘発およびアッセイをさらに反復して、所望の突然変異を選択すると同時に有害な変化に対して選択することによって、配列を急速に「進化」させる。
【００８５】
本明細書に開示する突然変異誘発法を大きい処理量の自動化スクリーニング法と組合わせて、宿主細胞においてクローニングされ、突然変異化ポリペプチドの活性を検出することができる。活性ポリペプチド（例えば、免疫応答間のB細胞の応答を減少させ、自己抗体の産生を阻害または減少させる）をコードする突然変異化DNA分子を宿主細胞から回収し、現代的装置を使用して急速に配列決定することができる。これらの方法は、問題のポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能とし、未知構造のポリペプチドに適用することができる。
【００８６】
前述の方法を使用して、配列番号2の残基1〜120に対して実質的に相同的である種々のポリペプチドまたはそれらのアレレ変異型を同定しおよび／または製造することができ、そして野生型タンパク質のB細胞の抑制特性を保持することができる。このようなポリペプチドは腫瘍壊死因子レセプターのスーパーファミリーの他のメンバー、親和標識またはその他からの追加のアミノ酸およびドメイン包むことができる。TNFRのスーパーファミリーの他のメンバーの機能的ドメインを含有する、BR43x2ポリペプチドまたは融合構築物は、修飾されたB細胞抑制能力を示すハイブリッド腫瘍壊死因子レセプターを構築する。
【００８７】
さらに、本発明は、他の種からの対応物のレセプターおよびポリヌクレオチド（オーソログ）を提供する。これらの種は下記のものを包含するが、これらに限定されない：哺乳動物、トリ、両生類、爬虫類、魚類、昆虫および他の脊椎動物および無脊椎動物の種。他の哺乳動物種からのBR43x2レセプター、例えば、ネズミ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ウマ、および他の霊長類のレセプターは特に重要である。本発明により提供される情報および組成物を慣用クローニング技術と組み合わせて使用することによって、ヒトBR43x2レセプターのオーソログをクローニングすることができる。
【００８８】
例えば、レセプターを発現する組織または細胞型から得られたmRNAを使用して、cDNAをクローニングすることができる。本明細書に開示する配列から設計されたプローブを使用するノザンブロットをプロービングすることによって、mRNAの適当な源を同定することができる。次いで陽性の組織または細胞系統のmRNAから、ライブラリーを調製する。次いで種々の方法、例えば、完全なまたは部分的ヒトcDNAを使用するか、あるいは開示された配列をベースとする縮重プローブの1またはそれ以上の組を使用してプロービングする方法により、レセプターをコードするcDNAを単離することができる。
【００８９】
また、本明細書に開示する配列から設計されたプローブを使用するPCRにより、cDNAをクローニングすることができる。追加の方法において、cDNAライブラリーを使用して宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができ、そして問題のcDNAの発現をレセプターに対する抗体で検出することができる。また、同様な技術をゲノムクローンの単離に適用することができる。
【００９０】
全長のレセプターポリペプチド、可溶性レセプターポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、および融合ポリペプチドを包含する、本発明のレセプターポリペプチドを、慣用技術に従い、遺伝子操作された宿主細胞において製造することができる。適当な宿主細胞は、外因的DNAで形質転換またはトランスフェクトし、培養において増殖させることができる細胞の型であり、そして細菌、真菌細胞、および培養された高等真核細胞を包含する。
【００９１】
真核細胞、特に多細胞微生物の培養された細胞は好ましい。クローニングされたDNA分子を操作し、外因的DNAを種々の宿主細胞の中に導入する技術は、下記の文献に記載されている：Sambrook他、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989、およびAusubel他編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons，Inc.、NY、1987。
【００９２】
一般に、BR43x2ポリペプチドをコードするDNA配列は、発現ベクター内に一般に転写プロモーターおよびターミネーターを含む、その発現に必要な他の遺伝因子に作用可能に連鎖される。ベクターは、また、1またはそれ以上の選択可能なマーカーおよび1またはそれ以上の複製起点を普通に含有するが、当業者は認識するように、ある種の系内で選択可能なマーカーを別々のベクター上に提供し、そして宿主細胞のゲノムの中への組込みにより外因的DNAの複製を得ることができる。プロモーター、ターミネーター、選択可能なマーカー、ベクターおよび他の因子の選択は、当業者のレベル内の日常的設計事項である。多数のこのような因子は文献に記載されており、そして商業的供給会社から入手可能である。
【００９３】
BR43x2ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路の中に向けるために、分泌シグナル配列（また、リーダー配列、プレプロ配列または前配列として知られている）を発現ベクターの中に準備する。分泌シグナル配列はBR43x2ポリペプチドのそれであることができるか、あるいは他の分泌されたタンパク質（例えば、t−PA）から誘導するか、あるいは新規に合成することができる。分泌シグナル配列をBR43x2  DNA配列に作用可能に連鎖して、すなわち、2つの配列を正しいリーディングフレームで結合して、新しく合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路の中に向けるように位置させる。分泌シグナル配列は普通に問題のポリペプチドをコードするDNA配列に対して5'に配置されるが、ある種の分泌シグナル配列は問題のDNA配列の中のどこかに位置決定することができる（例えば、Welch他、米国特許第5,037,743号；Holland他、米国特許第5,143,830号、参照）。
【００９４】
培養された哺乳動物細胞は本発明において適当な宿主である。外因的DNAを哺乳動物の宿主細胞の中に導入する方法は下記の方法を包含する：リン酸カルシウム仲介トランスフェクション（Wigler他、Cell 14：725、1978；CorsaroおよびPearson、Somatic Cell Genetics 7：603、1981；GrahamおよびVan der Eb、Virology 52：456、1973）、エレクトロポレーション（Neumann他、EMBO J. 1：841-5、1982）、DEAE−デキストリン仲介トランスフェクション（Ausubel他、前掲）、およびリポソーム仲介トランスフェクション（Hawley−Nelson他、Focus 15：73、1993；Ciccarone他、Focus 15：80、1993）、およびウイルスベクター（MillerおよびRosman、BioTechniques 7：980-90、1989；WangおよびFiner、Nature Med. 2：714-6、1996）。
【００９５】
培養された哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの産生は、例えば、下記の特許文献に記載されている：Levinson他、米国特許第4,713,339号；Hagen他、米国特許第4,784,950号；Palmiter他、米国特許第4,579,821号；およびRingold、米国特許第4,656,134号。適当な培養された哺乳動物細胞は下記のものを包含する：
【００９６】
COS-1（ATCC No. CRL 1650）、COS-7（ATCC No. CRL 1651）、BHK（ATCC No. CRL 1632）、BHK570（ATCC No. CRL 10314）、293（ATCC No. CRL 1573；Graham他、J. Gen. Virol. 36：59−72、1977）；Jurkat（ATCC No. CRL-8129）、BaF3（ネズミ骨髄に由来するインターロイキン−3依存的前リンパ系細胞系統、下記の文献を参照のこと：PalaciosおよびSteinmetz、Cell 41：727-34、1985；Mathey-Prevot他、Mol. Cell. Biol. 6：4135-5、1986）およびチャイニーズハムスター卵巣（例えば、CHO-K1；ATCC No. CRL 61）細胞系統。追加の適当な細胞系統はこの分野において知られており、そして公衆の寄託機関、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）バージニア州マンナッサス、から入手可能である。
【００９７】
一般に、強い転写プロモーター、例えば、SV−40またはサイトメガロウイルスからのプロモーターは好ましい。例えば、米国特許第4,956,288号参照。他の適当なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター（米国特許第4,579,821号および米国特許第4,601,978号）およびアデノウイルスの主要な後期プロモーターを包含する。薬剤選択を一般に使用して、外来DNAが挿入された、培養された哺乳動物細胞について選択する。このような細胞は普通に「トランスフェクタント」と呼ばれる。例えば、選択因子の存在において培養され、問題の遺伝子をそれらの子孫に移行させることができる細胞は、「安定なトランスフェクタント」と呼ばれる。
【００９８】
好ましい選択可能なマーカーは、抗生物質のネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択はネオマイシン型薬剤、例えば、G−418またはその他の存在において実施される。また、選択系を使用して、問題の遺伝子の発現レベルを増加することができる、「増幅」と呼ぶ方法。低いレベルの選択因子の存在においてトランスフェクタントを培養し、次いで選択因子の量を増加して、導入された遺伝子の産物を高いレベルで産生する細胞について選択することによって、増幅は実施される。好ましい増幅可能な選択可能なマーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与する、ジヒドロフォレートリダクターゼである。
【００９９】
他の薬剤耐性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、多薬剤耐性、プロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）を使用することもできる。因子によるトランスフェクションのセットに加えて、変更された表現型を導入するオールタネイティブマーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質、または細胞表面のタンパク質、例えば、CD4、CD8、クラスIのMHC、胎盤アルカリ性ホスファターゼを使用して、FACSソーティングまたは磁気ビーズ分離技術により、トランスフェクトされない細胞からトランスフェクトされた細胞をソーティングすることができる。
【０１００】
植物細胞、昆虫細胞およびトリの細胞を包含する、他の高等真核細胞を宿主細胞として使用することもできる。植物細胞中で遺伝子を発現するのためのベクターとしてアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を使用することは、Sinkar他、J.  Biosci.（Bangalore）11：47-58、1987、において概観されている。昆虫細胞の形質転換およびその中の外来ポリペプチドの産生は、Guarino他、米国特許第5,162,222号およびWIPO公開WO 94/06463に開示されている。オートグラファト・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（AcNPV）から普通に誘導される、組換えバキュロウイルスで、昆虫細胞を感染させることができる。
【０１０１】
下記の文献を参照のこと：King、L. A. およびPossee、R. D. The Baculovirus Expression System：A Laboratory Guide、London、Chapman & Hall、O'Reilly、D. R. 他、Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual、New York、Oxford University Press、1994；およびRichardson、C. D. 編、Baculovirus Expression Protocols、Methods in Molecular Biology、Totowa、NJ、Humana Press、1995。組換えバキュロウイルスを作る第2の方法は、Luckowが記載するトランスポゾンをベースとする系を利用する（Luckow、V. A.、他、J. Virol. 67：4566-79、1993）。
【０１０２】
この系はBac-to-Bacキット（Life Technologies、マリイランド州ロックビレ）で販売されている。この系は転移ベクター、pFastBac1（商標）（Life Technologies）を利用し、ここでpFastBac1（商標）は「バクミド（bacmid）」と呼ばれる大きいプラスミドとして大腸菌（E. coli）の中に維持されたバキュロウイルスのゲノムの中にBR43x2ポリペプチドをコードするDNAを動かすために、Tn7トランスポゾンを含有する。下記の文献を参照のこと：Hill-Perkins、M. S. およびPossee、R. D.、J. Gen. Virol. 71：971-6、1990；Bonning、B. C.、他、J. Gen. Virol. 75：1551-6、1994；および、Chazenbalk、G. D.、およびRapoport、B.、J. Biol. Chem. 270：1543-9、1995。
【０１０３】
さらに、転移ベクターは、発現されたBR43x2ポリペプチドのC末端またはN末端におけるエピトープ標識、例えば、Glu-Gluエピトープ標識をコードするDNAとのインフレーム融合物を含むことができる（Grussenmeyer、T.、他、Proc. Natl. Acad. Sci. 82：7952-4、1985）。この分野において知られている技術を使用して、BR43x2を含有する転移ベクターを大腸菌（E.coli）の中に形質転換し、そして組換えバキュロウイルスを示す中断されたlacZ遺伝子を含有するバクミドについてスクリーニングする。組換えバキュロウイルスのゲノムを含有するバクミドDNAを普通の技術に従い単離し、そしてスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞、例えば、Sf9細胞をトランスフェクトする。BR43x2を発現する組換えベクターを引き続いて生成させる。この分野において普通に使用されている方法により、組換えウイルスの系統を作る。
【０１０４】
宿主細胞、典型的にはヨトウガ、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera  frugiperda）から誘導された細胞系統を感染させるために、組換えウイルスを使用する。一般に、下記の文献を参照のこと：GlickおよびPasternak、Molecular Biotechnology：Principle and Applications of Recombinant DNA、ASM Press、Washington、D. C.、1994。他の適当な細胞系統は、トリコデルマ・ニ（Trichoderma ni）に由来するHigh FiveO（商標）細胞系統（Invitrogen）である（米国特許第5,300,435号）。商業的に入手可能な無血清培地を使用して、細胞を増殖させかつ維持する。
【０１０５】
適当な培地はSf9細胞についてSf900 II（商標）（Life Technologies）またはESF 921（商標）（Expression System）；およびトリコデルマ・ニ（T.ni）細胞についてEx-cellO450（商標）（JRH Bioscience、カンサス州レネクサ）またはExpress FiveO（商標）（Life Technologies）である。細胞をほぼ2〜5×105細胞の接種密度から1〜2×106細胞の密度に増殖させ、この時組換えウイルスの系統を0.1〜10、より典型的には約3付近の感染の多重度で添加する。使用する手順は一般に入手可能な実験室のマニュアルに記載されている（King、L. A. およびPossee、R. D.、前掲；O'Reilly、D. R.、他、前掲；Richardson、C. D.、前掲）。本明細書に記載する方法に従い、上清からのBR43x2ポリペプチドの引き続く精製を実施することができる。
【０１０６】
酵母細胞を包含する真菌細胞を本発明において使用することもできる。これに関して特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、およびピキア・メタノリカ（Pichia  metanolica）を包含する。外因的DNAでサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）を形質転換し、それから組換えポリペプチドを生産する方法は、例えば、下記の特許文献に記載されている：Kawasaki、米国特許第4,599,311号；Kawasaki他、米国特許第4,931,373号；Brake、米国特許第4,870,008号；Welch他、米国特許第5,037,743号；およびMurry他、米国特許第4,845,075号。
【０１０７】
選択可能なマーカーにより決定された表現型、普通の薬剤耐性または特定の栄養（例えば、ロイシン）の非存在において増殖する能力により、形質転換された細胞を選択する。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において使用するために好ましいベクター系は、Kawasaki他（米国特許第4,931,373号）により開示されているPOT1ベクター系であり、これによりグルコースを含有する培地中の増殖により形質転換細胞を選択することができる。酵母において使用するために適当なプロモーターおよびターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号；Ingsman他、米国特許第4,615,974号；およびBitter、米国特許第4,977,092号、参照）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。
【０１０８】
また、米国特許第4,990,446号；米国特許第5,063,154号；米国特許第5,139,936号および米国特許第4,661,454号、参照。ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカラロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・フラギリス（Kluyveromyces frgilis）、ウスチラゴ・マイディス（Ustilago maydis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノリカ（Pichia metanolica）、ピキア・グイレルモンディイ（Pichia guillermondii）およびカンジダ・マルトサ（Candida maltosa）を包含する、他の酵母のための形質転換系はこの分野において知られている。
【０１０９】
例えば、Gleeson他、J. Gen. Microbiol. 132：3459-3465、1986およびCregg、米国特許第4,882,279号、参照。McKnight他、米国特許第4,935,349号の方法に従い、アスペルギルス（Aspergillus）細胞を利用することができる。アクレモニウム・クリソゲヌム（Acremonium chrysogenum）は、Sumino他、米国特許第5,162,228号に開示されている。ニューロスポラ（Neurospora）を形質転換する方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号に開示されている。
【０１１０】
例えば、組換えタンパク質の生産のための宿主としてピキア・メタノリカ（Pichia  metanolica）を使用することは、WIPO公開WO 97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536、およびWO 98/02565に開示されている。ピキア・メタノリカ（P. metanolica）の形質転換において使用するDNA分子は二本鎖、円形のプラスミドとして普通に製造され、これらは好ましくは形質転換の前に線状化される。ピキア・メタノリカ（P. metanolica）におけるタンパク質の生産のために、プラスミド中のプロモーターおよびターミネーターはピキア・メタノリカ（P. metanolica）の遺伝子、例えば、ピキア・メタノリカ（P. metanolica）のアルコール利用遺伝子（AUG1またはAUG2）のそれであることが好ましい。
【０１１１】
他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（DHAS）、ホルメートデヒドロゲナーゼ（FMD）、およびカタラーゼ（CAT）遺伝子のプロモーターを包含する。宿主染色体の中へのDNAの組込みを促進するために、宿主DNA配列により双方の末端においてフランクされたプラスミドの全体の発現セグメントを有することが好ましい。ピキア・メタノリカ（Pichia metanolica）において使用するために好ましい選択可能なマーカーはピキア・メタノリカ（P. metanolica）のADE2遺伝子であり、これはホスホリボシル−5−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（AIRC；EC4.1.1.21）をコードし、これはアデニンの非存在においてade2宿主細胞を増殖させる。
【０１１２】
メタノールの使用を最小としようとする、大規模の工業的方法のために、双方のメタノール利用遺伝子（AUG1およびAUG2）が欠失されている、宿主細胞を使用することが好ましい。分泌されたタンパク質の生産のために、液胞プロテアーゼ遺伝子（PEP4およびPRB1）を欠如する宿主細胞は好ましい。問題のポリペプチドをコードするDNAを含有するプラスミドをピキア・メタノリカ（P. metanolica）細胞の中に導入することを促進するために、エレクトロポレーションを使用する。2.5〜4.5kV／cm、好ましくは約3.75kV／cmの電界強度を有する、指数的に減衰する、パルス電界、および1〜40ミリセカント、最も好ましくは約20ミリセカントの時間定数（t）を使用する、エレクトロポレーションにより、ピキア・メタノリカ（P. metanolica）細胞を形質転換することが好ましい。
【０１１３】
細菌大腸菌（Escherichia coli）、バシラス（Bacillus）および他の属の株を包含する、原核宿主細胞は、また、本発明において有用である。これらの宿主を発現させ、その中でクローニングされた外来DNA配列を発現する技術はこの分野においてよく知られている（例えば、Sambrook他、前掲参照）。大腸菌（E. coli）のような細菌においてBR43x2ポリペプチドを発現させるとき、ポリペプチドを、典型的には不溶性粒子として、細胞質の中に保持させることができるか、あるいは細菌の分泌配列によりペリプラスミック空間の中に向けることができる。
【０１１４】
前者の場合において、細胞を溶解し、粒子を回収し、例えば、グアニジンイソチオシアネートまたは尿素を使用して、変性する。次いで変性されたポリペプチドをリフォルディングさせ、変性物の希釈により、例えば、尿素の溶液および還元されたグルタチオンおよび酸化されたグルタチオンとの組合わせに対する透析、および引き続く緩衝化生理食塩水に対する透析により、二量体化させることができる。後者の場合において、細胞を崩壊させて（例えば、超音波処理または浸透圧ショックにより）ペリプラスミック空間の内容物を解放し、これにより変性およびリフォルディングの必要性を排除することによって、ポリペプチドをペリプラスミック空間から可溶性の、機能的形態で回収することができる。
【０１１５】
形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、慣用手順に従い、栄養素および選択した宿主細胞の成長に必要な他の成分を含有する培地中で培養する。規定された培地および複合培地を包含する、種々の適当な培地は、この分野において知られており、そして一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよび無機質を含む。培地は、また、必要に応じて、成長因子または血清のような成分を含有することができる。一般に、外因的に添加されたDNAを含有する細胞について成長培地を選択する。この選択は、例えば、薬剤選択または必須栄養素の欠如により実施され、必須栄養素は発現ベクター上に担体されるか、あるいは宿主細胞の中に共トランスフェクトされた選択可能なマーカーにより補足される。
【０１１６】
炭素、窒素および微量栄養素の適切な源を含む培地中で約25℃〜35℃の温度において、ピキア・メタノリカ（P. metanolica）細胞を培養する。慣用の手段、例えば、小さいフラスコの震盪または発酵槽のスパージにより、液体培地を十分にエアレーションする。ピキア・メタノリカ（P. metanolica）のために好ましい培地は、YEPD（2％のD−グルコース、2％のBacto（商標）ペプトン（Difco Laboratories、ミシガン州デトロイト）、1％のBacto（商標）酵母エキス（Difco Laboratories）、0.004％のアデニンおよび0.006％のL−ロイシン）である。
【０１１７】
分画および／または慣用の精製方法および培地を使用して、発現された組換えBR43x2ポリペプチド（またはキメラBR43x2ポリペプチド）を精製することができる。試料の分画のために、硫酸アンモニウム沈降および酸またはカオトロープ抽出を使用することができる。典型的な精製工程は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLCおよび逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含することができる。適当なアニオン交換媒質は、誘導化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特製シリカ、およびその他を包含する。PEI、DEAE、QAEおよびQ誘導体は好ましく、DEAE高速流れセファローズ（Pharmacia、ニュージャージイ州ピスカタウェイ）は特に好ましい。
【０１１８】
典型的なクロマトグラフィー媒質は、フェニル、ブチル、またはオクチル基で誘導化された媒質、例えば、フェニル−セファローズFF（Pharmacia）、トヨパールブチル650（Toso Haas、ペンシルベニア州モントゴメリヴィレ）、オクチル−セファローズ（Pharmacia）およびその他；またはポリアクリル樹脂、例えば、Amberchrom CG 71（Toso Haas）およびその他を包含する。適当な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカをベースとする樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂、およびその他を包含し、これらはこれらを使用する条件下に不溶性である。
【０１１９】
これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基および／または炭水化物部分によるタンパク質の結合を可能とする反応性基で修飾することができる。化学的カップリングの例は、臭化シアン活性化、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、およびカーボジイミドの化学的カップリングのためのカルボキシルおよびアミノ誘導体を包含する。これらおよび他の固体の媒質はこの分野においてよく知られており、かつ広く使用されており、そして商業的供給会社から入手可能である。
【０１２０】
レセプターのポリペプチドを固体の媒質に結合する方法は、この分野においてよく知られている。特定の方法の選択は日常的設計事項であり、そして一部分選択した支持体の性質により決定される。例えば、下記の文献を参照のこと：Affinity Chromatography：Principle & Methods、Pharmacia LKB Biotechnology、スイス国ウップサラ、1988；およびscopes、R.（編）Protein Purification：Principles and practice、Springer-Verlag、New York、1987。
【０１２１】
本発明のポリペプチドは、それらの物理的性質を利用することによって、単離することができる。例えば、固定化金属イオン吸着（IMAC）クロマトグラフィーを使用して、ポリヒスチジン標識からなるものを包含する、ヒスチジンに富んだタンパク質を精製することができる。簡単に述べると、ゲルにまず2価の金属イオンを負荷してキレート化剤を形成する（Sulkowski、Trends in Biochem. 3：1-7、1985）。ヒスチジンに富んだタンパク質は、使用する金属イオンに依存して、異なるアフィニティーでこのマトリックスに吸着され、競合的溶離、pHの低下、または強いキレート剤の使用により溶離されるであろう。
【０１２２】
他の精製法は、レクチンアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製を包含する（Methods in Enzymol.、Vol. 182、″Guide to Protein Purification″、M. Deutscher（編）、Academic Press、サンディエゴ、1990、pp. 529-39）。本発明の追加の態様の範囲内において、問題のポリペプチドと親和標識（例えば、マルトース結合性タンパク質、FLAG−タグ（Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys（配列番号13））、Glu-Gluタグ（Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu（配列番号14））免疫グロブリンドメイン）との融合物を構築して、精製を促進することができる。
【０１２３】
タンパク質の再フォルディング（および必要に応じて再酸化）手法を好都合に使用することができる。汚染する高分子、特に他のタンパク質および核酸に関して＞80％の純度、より好ましくは＞90％、なおより好ましくは99.9％より大きい純度にタンパク質を精製すること、そしてタンパク質は感染因子および発熱因子を含有しないことが好ましい。好ましくは、精製されたタンパク質は他のタンパク質、特に動物由来の他のタンパク質を実質的に含まない。
【０１２４】
BR43x2ポリペプチドまたはそのフラグメントは、また、化学的合成により製造することができる。BR43x2ポリペプチドはモノマーまたはマルチマーであることができ、グリコシル化されているか、あるいはされていないことができ、ペギル化されているか、あるいはされていないことができ、そして初期のメチオニンアミノ酸残基を含むか、あるいは含まないことができる。典型的なBR43x2ポリペプチドは下記のモチーフに相当するアミノ酸配列を有しかつ本明細書に記載する限定に付される、32〜40残基長さのポリペプチドを包含する：XXCX［QEK］［QEKNRDHS］［QE］X｛0−2｝［YFW］［YFW］DXLLX｛2｝C［IMLV］XCX｛3｝CX｛6−8｝CX｛2｝［YF］C（配列番号10）。
【０１２５】
BR43x2ポリペプチドは、独占的固相合成、部分的固相法、フラグメント縮合または古典的溶液合成により合成することができる。ポリペプチドは好ましくは、例えば、Merrifield、J. Am. Chem. Soc. 85：2149、1963、に記載されているように、固相ペプチド合成により製造される。アルファ−アミノ末端が保護されたアミノ酸を使用して、この合成は実施される。不安定性側鎖を有する3官能性アミノ酸を、また、適当な基で保護して、ポリペプチドの組立ての間に望ましくない化学的反応が起こるのを防止する。アルファ−アミノ保護基を選択的に除去して、引き続いてアミノ末端において反応が起こるようにする。アルファ−アミノ保護基を除去する条件は、側鎖の保護基を除去しない。
【０１２６】
アルファ−アミノ保護基は、段階的ポリペプチド合成の分野において有用であることが知られている基である。アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリフルオロアセチル、アセチル）、アリール型保護基（例えば、ビオチニル）、芳香族ウレタン型保護基［例えば、ベンジルオキシカルボニル（Cbz）、置換ベンジルオキシカルボニルおよび9−フルオレニルメチルオキシ−カルボニル（Fmoc）］、脂肪族ウレタン保護基［例えば、t−ブトキシカルボニル（tBco）、イソプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル］およびアルキル型保護基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチル）が包含される。好ましい保護基はtBocおよびFmocである。
【０１２７】
選択される側鎖の保護基はカップリングの間に無傷に止まらなくてはならず、そしてアミノ末端の保護基の脱保護の間に、またはカップリング条件の間に除去されてはならない。側鎖の保護基は、また、合成の完結後に、仕上げられたポリペプチドを変更しなであろう反応条件を使用して除去されなくてはならない。tBoc化学において、3官能性アミノ酸のための側鎖の保護基は大部分ベンジルに基づく。Fmoc化学において、側鎖の保護基は大部分ブチルまたはトリチルに基づく。
【０１２８】
tBoc化学において、好ましい側鎖の保護基はアルギニンについてトシル、アスパラギン酸についてシクロヘキシル、システインについて4−メチルベンジル（およびアセトアミドメチル）、グルタミン酸、セリンおよびスレオニンについてベンジル、ヒスチジンについてベンジルオキシメチル（およびジニトロフェニル）、リシンについて2−Cl−ベンジルオキシカルボニル、トリプトファンについてホルミルそしてチロシンホルミル2−ブロモベンジルである。Fmoc化学において、好ましい側鎖の保護基は、アルギニンについて2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホニル（Pmc）または2,2,4,6,7−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−5−スルホニル（Pbf）、アスパラギン、システイン、グルタミンおよびヒスチジンについてトリチル、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニンおよびチロシンについてt−ブチル、リシンおよびトリプトファンについてtBocである。
【０１２９】
ホスホペプチドの合成のために、ホスフェート基の直接的または組立て後の組込みを使用する。直接的組込みの戦略において、セリン、スレオニンまたはチロシン上のホスフェート基は、Fmoc化学においてメチル、ベンジル、またはｔ−ブチルにより保護するか、あるいはtBoc化学においてメチル、ベンジルまたはフェニルにより保護することができる。ホスフェート保護なしのホスホチロシンの直接的組込みをFmoc化学において使用することができる。組立て後の組込みの戦略において、セリン、スレオニンまたはチロシンの非保護のヒドロキシル基を固相上でジ−t−ブチル−、ジベンジル−またはジメチル−N,N'−ジイソプロピル−ホスホアミダイトで誘導化し、次いでt−ブチルヒドロ−ペルオキシドで酸化する。
【０１３０】
固相合成は、通常、アルファ−アミノ保護（側鎖保護）アミノ酸を適当な固体の支持体にカップリングさせることによってカルボキシル末端から実施される。クロロメチル、クロロトリチルまたはヒドロキシメチル樹脂に結合させるとき、エステル結合が形成し、そして生ずるポリペプチドはＣ末端に遊離のカルボキシル基を有するであろう。あるいは、アミド樹脂、例えば、ベンズヒドリルアミンまたはｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（tBoc化学について）およびリンク（Rink）アミドまたはPAL樹脂（Fmoc化学について）を使用するとき、アミド結合が形成し、そして生ずるポリペプチドはＣ末端にカルボキシアミド基を有するであろう。
【０１３１】
これらの樹脂は、ハンドルまたはリンカーを含むか、あるいは含まない、結合した第1アミノ酸を含むか、あるいは含まない、ポリスチレン−またはポリアミド−をベースとするか、あるいはポリエチレングリコール−グラフト化されているかどうかにかかわらず、商業的に入手可能であり、そしてそれらの製造は下記の文献に記載されている：Stewart、他、″Solid Phase Peptide Synthesis″（第2版）、（Pierce Chemical Co.、イリノイ州ロックフォード、1984）およびBayerおよびRapp、Chem. Pept. Prot. 3：3、1986；およびAtherton、他、Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach、IRL Press、Oxford、1989。
【０１３２】
必要に応じて側鎖において、およびアルファ−アミノ基において保護された、C末端のアミノ酸を、種々の活性化剤、例えば、ジシクロヘキシルカーボジイミド（DCC）、N,N'−ジイソプロピルカーボジイミド（DIPCDI）およびカルボニルジイミダゾール（CDI）を使用して、ヒドロキシメチル樹脂に結合させる。それはクロロメチルまたはクロロトリチル樹脂に直接的にそのセシウムテトラメチルアンモニウム塩の形態で、あるいはトリエチルアミン（TEA）またはジイソプロピルエチルアミン（DIEA）の存在において結合させることができる。アミド樹脂への第１アミノ酸の結合は、カップリング反応の間のアミド結合の形成と同一である。
【０１３３】
樹脂の支持体への結合後、保護化学（例えば、tBoc、Fmoc）に依存して種々のの試薬を使用して、アルファ−アミノ保護基を除去する。Fmoc除去の程度は、300〜320nmにおいて、あるいは導電性セルによりモニターすることができる。アルファ−アミノ保護基を除去した後、残りの保護されたアミノ酸を要求される順序で段階的にカップリングして、所望の配列を得る。
【０１３４】
種々の活性化剤、例えば、下記のものをカップリング反応に使用することができる：DCC、DIPCDI、2−クロロ−1,3−ジメチルイミジウムヘキサフルオロホスフェート（CIP）、ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（BOP）およびそのピロリジン類似体（PyBOP）、ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（PyBrOP）、O−（ベンゾトリアゾール−1−イル）−1,1,3,3−テトラメチル−ウロニムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）およびそのテトラフルオロボレート類似体（TBTU）またはそのピロリジン類似体（HBPyU）、O−（7−アザベンゾトリアゾール−1−イル）−1,1,3,3−テトラメチル−ウロニムヘキサフルオロホスフェート（HATU）およびそのテトラフルオロボレート類似体（TATU）またはそのピロリジン類似体（HAPyU）。
【０１３５】
カップリング反応において使用する最も普通の触媒添加剤は、4−ジメチルアミノピリジン（DMAP）、3−ヒドロキシ−3,4−ジヒドロ−4−オキソ−1,2,3−ベンゾトリアジン（HODhbt）、N−ヒドロキシベンゾトリアゾール（BOBt）および1−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール（HOAt）を包含する。各保護されたアミノ酸は過剰量（＞2.0当量）で使用し、そしてカップリングは通常N−メチルピロリドン（NMP）中で、あるいはDMF、CH2Cl2またはそれらの混合物中で実施する。各段階において、例えば、Kaiser、他、Anal.  Biochem.  34：595、1970、に記載されているように、ニンヒドリン反応により、カップリング反応の完結の程度をモニターすることができる。
【０１３６】
所望のペプチドが完全に組立てられた後、適切な掃去剤とともに試薬を使用してペプチド−樹脂を切り放す。掃去剤（例えば、H2O、エタンジチオール、フェノールおよびチオアニソール）とともにTFAにより、Fmocペプチドは通常切り放し、脱保護される。tBocペプチドは通常液状ＨＦで1〜2時間−5〜0℃において切り放し、脱保護され、これはポリペプチドを樹脂から切り放し、側鎖の保護基の大部分を除去する。掃去剤、例えば、アニソール、ジメチルサルファイドおよびｐ−チオクレゾールを通常液状HFとともに使用して、切り放しの間にポリペプチドの中に存在するアミノ酸残基のアルキル化およびアシル化からカチオンが形成するのを防止する。
【０１３７】
トリプトファンのホルミル基およびヒスチジンのジニトロフェニル基を、HFの切り放し前にDMF中で、それぞれ、ピペリジンおよびチオフェニルにより、除去することが必要である。システインのアセトアミドメチル基は、酢酸水銀（II）により除去するか、あるいはヨウ素、トリフルオロ酢酸タリウム（III）またはテトラフルオロホウ酸銀（これは同時にシステインをシスチンに酸化する）により除去することができる。tBocペプチドの切り放しおよび脱保護のために使用される他の強酸は、トリフルオロメタンスルホン酸（TFMSA）およびトリメチルシリルトリフルオロアセテート（TMSOTf）を包含する。
【０１３８】
本発明は、さらに、種々の他のポリペプチド融合物および1またはそれ以上のポリペプチド融合物を含んでなる関係するマルチマータンパク質を提供する。可溶性BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドは、2つの定常領域ドメインを含有しかつ可変領域を欠如する、免疫グロブリン重鎖定常領域、典型的にはFcフラグメントとの融合物として発現させることができる。このような融合物を製造する方法は、米国特許第5,155,027号および米国特許第5,567,584号に開示されている。このような融合物は典型的にはマルチマー分子として分泌され、ここでFc部分は互いにジサルファイド結合されておりそして2つの非Igポリペプチドは互いに密接して配列されている。
【０１３９】
免疫グロブリン−BR43x2（TACIまたはBCMA）ポリペプチド融合物を遺伝子操作された細胞において発現させて、種々のマルチマーBR43x2アナローグを産生することができる。補助的ドメインをBR43x2（TACIまたはBCMA）ポリペプチドに融合させて、それらのドメインを特異的細胞、組織、または高分子にターゲットすることができる。また、本明細書において記載するようにトキシンを使用して、融合物をつくることができる。このようにして、ポリペプチドおよびタンパク質を療法および診断の目的でターゲットすることができる。BR43x2ポリペプチドを2またはそれ以上の分子、例えば、精製のために親和標識およびターゲッティングドメインに融合することができる。
【０１４０】
また、ポリペプチド融合物は、特にドメイン間の、1またはそれ以上の切断部位を含んでなることができる。下記の文献を参照のこと：Tuan他、Connect. Tiss. Res. 34：1-9、1996。例えば、in vitroアッセイツールとして、溶液から同種リガンドをアフィニティー精製するために、細胞表面上にリガンドを結合するために、あるいはリガンドの刺激をブロックするために投与することによってin vivoにおけるBR43x2アンタゴニストとして、この型の融合物を使用することができる。アッセイにおいて使用するために、融合タンパク質を支持体にFc領域を介して結合し、そしてELISAフォーマットにおいて使用することができる。
【０１４１】
また、本発明は、親和標識または標識との融合タンパク質を形成するために使用する、可溶性BR43x2レセプターを提供する。可溶性BR43x2親和標識融合タンパク質は、例えば、BR43x2リガンド、ならびに自然リガンドのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するために使用される。標識化された、可溶性BR43x2を使用して、リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストを発現する細胞を蛍光免疫サイトメトリーまたは免疫組織化学により同定する。組織または特定の細胞系統上のリガンドの分布を研究し、レセプター／リガンドの生物学の洞察を提供するために、可溶性融合タンパク質は有用である。
【０１４２】
リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストを精製するために、レセプター−リガンドの結合を促進する条件（典型的には生理学的温度、pH、およびイオン強度）下にリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストを含有する試料に、BR43x2−Ig融合タンパク質を添加する。次いで固体支持体（例えば、不溶性樹脂ビーズ）上に固定化された、プロテインAを使用する混合物により、レセプター−リガンド複合体を分離する。次いで慣用化学技術、例えば、塩またはpH勾配を使用して、リガンド、アゴニスト、アンタゴニストを溶離する。別法において、融合タンパク質それ自体を固体支持体に結合することができ、結合および溶離は前述したように実施する。
【０１４３】
使用条件下に安定である固体支持体、例えば、アガロース、架橋したアガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカをベースとする樹脂、ポリスチレン、架橋したポリアクリルアミド、または同様な物質のビーズにレセプターポリペプチドを固定化する方法はこの分野において知られている。固体支持体にポリペプチドを結合させる方法はこの分野において知られており、そしてアミン化学、臭化シアン活性化、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、およびヒドラジン活性化を包含する。生ずる媒質は一般にカラムの形態であり、そしてリガンドを含有する流体をカラムに1またはそれ以上の回数通過させて、リガンドをレセプターポリペプチドに結合させる。次いでリガンド−レセプターの結合を崩壊させるために塩濃度、カオトロープ因子（MgCl2）、またはpHの変化を使用して、リガンドを溶離する。
【０１４４】
宿主細胞からの可溶性レセプターの輸送を向けるために、分泌ペプチド、例えば、t−PA分泌ペプチドをコードする第2DNAセグメントに、可溶性レセプターDNAを結合する。分泌されたレセプタードメインの精製を促進するために、抗体または他の特異的結合因子を利用できる、NまたはC末端のエクステンション、例えば、親和標識または他のポリペプチドまたはタンパク質をレセプターポリペプチドに融合することができる。
【０１４５】
本発明の機能的可溶性、膜結合レセプターを発現する細胞をスクリーニングアッセイにおいて使用する。種々の適当なアッセイはこの分野において知られている。これらのアッセイはターゲット細胞における生物学的応答の検出に基づく。対照値に比較した代謝変化は、BR43x2仲介代謝をモジュレートする被検化合物を示す。1つのこのようなアッセイは細胞増殖アッセイである。細胞を被検化合物の存在または非存在下に培養し、そして、例えば、トリチウム化チミジンの組込みの測定または3−（4,5−ジメチルチアゾル−2−イル）−2,5−ジフェニルテトラゾリウムヌロミド（MTT）の代謝的破壊に基づく比色アッセイにより、細胞増殖を検出する（Mosman、J. Immunol. Meth. 65：55−63）。
【０１４６】
他のアッセイのフォーマットにおいて、リポーター遺伝子を発現するようにさらに操作される細胞を使用する。レセプター結合経路に対して応答性であるプロモーター因子にリポーター遺伝子を結合させ、アッセイにおいて、リポーター遺伝子の転写の活性化を検出する。細胞抽出物について容易にアッセイされる多数のリポーター遺伝子、例えば、大腸菌（E. coli）lacZ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）および血清応答因子（SRE）はこの分野において知られている（例えば、Shaw他、Cell 56：563-72、1989参照）。
【０１４７】
好ましいこのようなリポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である（de Wet他、Mol. Cell. Biol. 7：725、1987）。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、この分野において知られている方法を使用するルミネセンスにより検出される（例えば、Baumgartner他、J. Biol. Chem. 269：29094-101、1994；SchenbornおよびGoiffin、Promega Notes 41：11、1993）。ルシフェラーゼ活性アッセイキットは、例えば、Promega Corp.、ウイスコンシン州マディソンから商業的に入手可能である。
【０１４８】
この型のターゲット細胞系統を使用して、化学物質、コンディショニングした培地、菌類ブロス、土壌試料、水試料、およびその他のライブラリーをスクリーニングことができる。例えば、1連の細胞コンディショニング培地の試料をターゲット細胞についてアッセイして、リガンドを産生する細胞を同定する。次いで陽性細胞を使用して、哺乳動物発現ベクターにおいてcDNAライブラリーを産生し、これをプールに分割し、宿主細胞の中にトランスフェクトし、発現させる。次いでトランスフェクトされた細胞からの培地試料をアッセイし、引き続いてプールに分割し、再トランスフェクトし、継代培養し、陽性細胞を再アッセイして、リガンドをコードするクローニングされたcDNAを単離する。
【０１４９】
リガンド結合性レセプター（または抗体、補体／抗補体の対の一方のメンバー）またはその結合性フラグメント、および商業的に入手可能なバイオセンサー計器（BIAcore（商標）、Pharmacia Biosensor、ニュージャージイ州ピスカタウェイ）を使用してアッセイシステムを好都合に使用することができる。このようなレセプター、抗体、補体／抗補体の対のメンバーまたはフラグメントをレセプターのチップの表面上に固定化する。この計器の使用は、Karlsson、J. Immunol. Methods 145：229-40、1991およびCunninghamおよびWells、J. Mol. Biol. 234：554-63、1993、に開示されている。
【０１５０】
例えば、アミンまたはスルフヒドリルの化学を使用して、BR43x2ポリペプチド、フラグメント、抗体または補体／抗補体のメンバーを、フローセル内の金薄膜に結合させたデキストラン繊維に共有結合させる。被験試料をセルに通過させる。リガンド、エピトープ、または補体／抗補体の反対のメンバーが試料の中に存在する場合、それは、それぞれ、固定化されたレセプター、抗体またはメンバーに結合し、媒質の屈折率を変化させ、これは金薄膜の表面のプラズモンの共鳴の変化として検出される。
【０１５１】
このシステムは、オンおよびオフの割合の測定（これから結合アフィニティーを計算することができる）および結合の化学量論的評価を可能とする。リガンド結合性ポリペプチドを、また、この分野において知られている他のアッセイシステムにおいて使用することができる。このようなシステムは、結合アフィニティーを測定するスキャッチャード分析（Scatchard、Ann. NY Acad. Sci. 51：660-72、1949、参照）および比色アッセイ（Cunningham他、Science 253：545-48、1991；Cunningham他、Science 245：821-25、1991、参照）を包含する。
TACIおよびBCMAに対する可溶性I125−ztnf4についてのスキャッチャードプロット分析を図2に示し、表5におけるTNFRファミリーの他のメンバーの結合定数と比較する。
【０１５２】
【表５】
2012001550.tif 000007
【０１５３】
レセプターとして、BR43x2ポリペプチドの活性化はシリコンをベースとするバイオセンサーミクロフィジオメーターにより測定することができる。このミクロフィジオメーターは、レセプター結合に関連する細胞外酸性化速度またはプロトン外分泌および引き続く生理学的細胞応答を測定する。典型的な装置は、Cytosensor（商標）Microphysiometer（製造会社：Molcular Divices、カリフォルニア州サニイヴァイル）である。種々の細胞応答、例えば、細胞増殖、イオン輸送、エネルギー産生、炎症性応答、調節およびレセプターの活性化、およびその他をこの方法により測定することができる。
【０１５４】
例えば、下記の文献を参照のこと：McConnell他、Science 257：1906-12、1992；Pitchford他、Meth. Enzymol. 228：84-108、1997；Arimilli他、J. Immunol. Meth. 212：49-59、1998；Van Lifde他、Eur. J. Pharmacol. 346：87-95、1998。付着性または非付着性真核または原核細胞をアッセイするために、ミクロフィジオメーターを使用することができる。
【０１５５】
細胞培地の細胞外酸性化の経時的変化を測定することによって、ミクロフィジオメーターは、種々の刺激、例えば、BR43x2ポリペプチドのアゴニスト、リガンドまたはアンタゴニストに対する細胞の応答を直接測定する。好ましくは、BR43x2ポリペプチドを発現しない対照真核細胞に比較して、BR43x2を発現する真核細胞の応答を測定するためにミクロフィジオメーターを使用する。BR43x2を発現する真核細胞は、本明細書において記載するように、BR43x2がトランスフェクトされ、BR43x2刺激性刺激に対して応答性である細胞をつくる、細胞；またはBR43x2を自然に発現する細胞、例えば、脾臓組織に由来するBR43x2を発現する細胞を含んでなる。
【０１５６】
対照に関する、細胞外酸性化の変化、例えば、BR43x2を発現する細胞の応答の増加または減少により測定された差は、BR43x2モジュレート細胞応答の直接的測定である。そのうえ、このようなBR43x2モジュレート応答を種々の刺激下にアッセイすることができる。また、ミクロフィジオメーターを使用して、BR43x2ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法が提供される。この方法は、BR43x2ポリペプチドを発現する細胞を準備し、細胞の第1部分を被検化合物の非存在下に培養し、細胞の第2部分を被検化合物の存在下に培養し、そして、例えば、細胞の第1部分に比較した細胞の第2部分の細胞応答の増加または減少を検出することを含んでなる。細胞外酸性化速度の測定可能な変化として、細胞応答の変化は示される。この方法を使用して、BR43x2ポリペプチドのアンタゴニストおよびアゴニストを急速に同定することができる。
【０１５７】
組織または特異的細胞系統に対するリガンドの分布を研究するとき、そしてレセプター／リガンドの生物学の洞察を提供するために、可溶性BR43x2は有用である。リガンドを支持するターゲット細胞を破壊するメカニズムとして、それらのリガンドに対するTNFレセプターの特異性を利用することができる。例えば、毒性化合物をBR43x2可溶性レセプターまたはBR43x2融合物にカップリングすることができる。毒性化合物の例は、ターゲット細胞を不活性化する放射性薬品；化学療法剤、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メトトレキセート、およびシトキサン；トキシン、例えば、リシン、ジフテリア、シュードモナスエキソトキシンAおよびアブリン；および細胞障害性T細胞表面分子に対する抗体を包含するであろう。
【０１５８】
FACS分析（Flow Cytometry and Sorting、Melamed他、編、Wiley−Liss、1990およびImmunofluorescnce and Cell Sorting、Current Protocols in Immunology、Vol. 1、Coligann他、編、John Wiley & Sons、1997）により、ztnf4（5ng／ml）はBR43x2（配列番号2）、TACI（配列番号6）、BCMA（配列番号8）およびBR43x1（配列番号9）に結合することが見出された。FITC標識化可溶性ztnf4は、また、FACS分析を使用して、なかでも、下記のものに特異的に結合することが示された：PBMNC、扁桃腺細胞中のBリンパ球、B細胞リンパ腫細胞（Raji、バーキットヒトリンパ腫、ATCC CCL86）、Ramos（バーキットヒトリンパ腫細胞系統、ATCC CRL-1596）、Daudi（バーキットヒトリンパ腫、ATCC CCL213）およびRPMI 1788（Bリンパ球細胞系統、ATCC CCL-156）。HL-60（ATCC前骨髄細胞系統、ATCC CCL-240）との結合は見られなかった。
【０１５９】
PBMNCおよび扁桃腺細胞からのB細胞に対する結合の特異性は、CD19、IgD、IgM、およびCD20を包含するB細胞特異的分子に対する抗体との共染色により確証された。CD40Lに対するztnf4の類似性は、より広い組織分布が見られることを示唆した。例えば、サイトカイン増殖およびT細胞増殖を使用して、単球、樹枝状細胞、および精製されたT細胞に対するztnf4のアフィニティーを試験し、そしてztnf4のアフィニティーは試験した他の型の細胞に対するztnf4の結合または生物学的作用を検出することができなかった。したがって、リガンドおよびレセプターによるB細胞に対する特異性は、自己免疫、B細胞癌、免疫調節、IBDおよび抗体仲介病理学、例えば、ITCP、重症筋無力症およびその他、腎疾患、間接的T細胞免疫応答、移植片拒絶反応、移植片対宿主疾患の研究および治療のために、リガンドおよびレセプターが有用であることを示唆する。
【０１６０】
ztnf4はB細胞を活動性し、B細胞を増殖させ、抗体を産生させ、in  vitroにおいて活動性マーカーをアップレギュレートすることが示された（下記実施例参照）。これらの作用は、IL−4または他のサイトカインを介する共刺激あるいはB細胞抗原レセプターまたはB細胞を活性化する他の細胞表面レセプター、すなわち、CD40による刺激に必要である。他の腫瘍壊死因子のリガンド、例えば、gp39およびTNFβはまたB細胞増殖を刺激する。こうして、本発明のポリペプチドをターゲッティングしてB細胞の応答を特異的に調節し、他の細胞集団に影響を与えないで免疫応答の間に、活性化されたB細胞を阻害することができ、これは疾患の治療において好都合である。
【０１６１】
さらに、本発明のポリペプチドはB細胞の発生、他の細胞の発生、抗体産生およびサイトカイン産生をモジュレートするために使用することができる。また、BR43x2ポリペプチドはアポトーシスおよび／または細胞内のアネルギーを誘導するとき使用することができる。本発明のポリペプチドは、また、ztnf4の増殖作用を中和することによってT細胞およびB細胞をモジュレートすることができる。可溶性BR43x2、TACIおよび／またはBCMAの存在下にztnf4に対する細胞の応答を測定するために、バイオアッセイおよびELISAを利用することができる。
【０１６２】
他のアッセイは、細胞応答の測度としてサイトカイン産生の変化を測定するアッセイを包含する（例えば、下記の文献を参照のこと：Current Protocols in Imunology、John E. Coligan他、編、NIH、1996）。他の細胞応答、例えば、抗体イソ型、単球の活性化、NK細胞の形成、抗原提示細胞の機能、アポトーシスを測定するアッセイ。
【０１６３】
本発明のBR43x2ポリペプチドは、ztnf4の作用を中和して、前B細胞またはB細胞白血病、例えば、形質細胞白血病、慢性または急性リンパ球白血病、骨髄腫、例えば、多発性骨髄腫、プラスマ細胞腫、内皮骨髄腫および巨細胞骨髄腫；およびリンパ腫、例えば、非ホジキンリンパ腫（ztnf4ポリペプチドの増加が関連づけられる）の治療に有効であろう。可溶性BR43x2は腫瘍の進行および生き残りを阻害するための療法的養生法において有用な成分であろう。
【０１６４】
ノザンブロット分析において、ztnf4はCD8+細胞、単球、樹枝状細胞、活性化単球において発現されることが示された。これが示唆するように、ある自己免疫疾患において、細胞障害性T細胞はztnf4の過剰産生を通してB細胞の産生を刺激する。Bリンパ球の作用を選択的にブロックする免疫抑制タンパク質は、疾患の治療において使用される。自己抗体の産生はいくつかの自己免疫疾患に対して普通であり、疾患の組織分布および悪化に寄与する。また、自己抗体は免疫複合沈着合併症に導き、腎不全、神経痛性症候および死を包含する、全身性エリテマトーデスの多数の症候に導く。細胞応答に対して独立である抗体のモジュレーションは、また、多数の疾患の状態において有益であろう。
【０１６５】
また、B細胞は慢性関節リウマチにおける関節炎発生性免疫グロブリンの分泌においてある役割を演ずる（Korganow他、Immunity 10：451-61、1999）。それ自体、ztnf4抗体産生の阻害は自己免疫疾患、例えば、重症筋無力症および慢性関節リウマチの治療において有益であろう。免疫抑制治療剤、例えば、Bリンパ球の活性を選択的にブロックまたは中和する可溶性BR43x2はこのような目的に有効であろう。本発明のBR43x2可溶性レセプターポリペプチドにおけるこれらの能力を確認するために、このようなBR43x2ポリペプチドはこの分野において知られておりかつ本明細書に記載するアッセイを使用して評価される。
【０１６６】
本発明は、自己免疫疾患に関連するか、あるいは関連しない、末期腎疾患に関連するB細胞の作用を選択的にブロックまたは中和するために、BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチド、融合物、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストを使用する方法を提供する。このような方法は、また、免疫学的腎疾患の治療のために有用である。このような方法は、下記のような疾患に関連する糸球体腎炎の治療に有用であろう：膜性腎症、IgA腎症またはベルガー病、IgM腎症、グッドパスチャー病、感染後糸球体腎炎、脈管増殖性疾患、微少変化ネフローゼ症候群。
【０１６７】
このような方法は、また、狼瘡、多発性関節炎、ヘノッホ・シェーンライン、硬皮症、HIV関係疾患、アミロイドーシスまたは溶血尿毒症症候群のような疾患に関連する二次的糸球体腎炎または脈管炎を治療するための療法上の応用として働くであろう。本発明の方法は、また、慢性腎盂腎炎、鎮痛剤乱用、腎石灰症、他の薬剤により引き起こされる腎症、腎石症、または慢性もしくは急性間質性腎炎に関連する間質性腎炎または腎盂腎炎を治療する療法的応用の一部分として有用であろう。
【０１６８】
本発明の方法は、また、腎臓動脈狭窄または閉塞およびコレステロール性塞栓症または腎臓塞栓症を包含する、高血圧性または大きい血管の疾患の治療におけるBR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチド、融合物、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストの使用を包含する。
本発明は、また、腎臓または泌尿器科の新形成、多発性骨髄腫、リンパ腫、軽鎖神経疾患またはアミロイドーシスを診断または治療する方法を提供する。
本発明は、また、ぜん息および他の慢性気道疾患、例えば、気管支炎および気腫を治療するためにBR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチド、融合物、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストを使用して活性化B細胞をブロックまたは阻害する方法を提供する。
【０１６９】
また、免疫抑制において使用するために、特に移植片対宿主疾患および移植片拒絶反応のために療法的に使用するために、BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチド、融合物、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストを使用してエフェクターT細胞の応答を阻害または中和する方法が提供される。追加の使用は、免疫応答、特にリンパ球の活性化または調節において見出されるであろう。
【０１７０】
BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチド、融合物、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストは、免疫欠損症を治療する療法において有用であろう。BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチド、融合物、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストは、インスリン依存性真性糖尿病（IDDM）および膠原病のような自己免疫疾患を治療する療法的プロトコルにおいて有用であろう。本発明の方法は、慢性炎症性疾患の治療、特に関節痛、腫脹、貧血および他の関連する症候を軽減するためにならびに敗血性ショックを治療するために追加の療法上の価値を有するであろう。
【０１７１】
抗原で免疫化した動物に本発明のポリペプチドを投与し、次いでztnf4を注射し、この分野において知られている方法に従い遅延型過敏性およびin  vitro増殖およびサイトカイン産生を包含する、抗体アイソタイプの産生およびB細胞およびT細胞の応答を測定することによって、免疫応答に対する可溶性BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドの作用を測定することができる。
【０１７２】
したがって、本発明は、ある量の化合物を哺乳動物に投与することを含んでなる哺乳動物におけるztnf4活性を阻害する方法を提供し、前記化合物は
a）配列番号4のポリペプチド；
b）配列番号8のポリペプチド；
c）融合タンパク質；
d）配列番号6のアミノ酸残基1〜残基166のポリペプチド；
e）配列番号8のアミノ酸残基1〜残基150のポリペプチド；
f）配列番号4のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；および
g）配列番号10のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；
から成る群から選択される。
【０１７３】
融合タンパク質の例は、可溶性BR43x2（配列番号4）、TACI（配列番号6のアミノ酸残基1〜残基166）またはBCMA（配列番号8のアミノ酸残基1〜残基150）と他のポリペプチド、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域Fcフラグメントとの融合物を包含する。本発明は、BR43x2、TACIまたはBCMAレセプター−リガンドの結合を阻害する方法を提供する。
【０１７４】
このような方法は、ztnf4活性が活性化Bリンパ球に関連する場合、前B細胞またはB細胞の癌を治療するために特に有用であろう。このような方法は、また、ztnf4活性が抗体産生、特に、自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症または慢性関節リウマチに関連する抗体産生に関連する場合において有用であろう。
【０１７５】
本発明は、また、BR43x2のアゴニストおよびアンタゴニストを提供する。BR43x2アゴニストとして同定される化合物は、in  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖoにおけるターゲット細胞の増殖および発生を変更するために有用である。例えば、アゴニスト化合物は、単独でまたは他のサイトカインおよびホルモンと組み合わせて、規定された細胞培地の化合物として有用である。こうして、培養におけるBR43x2を支持するBリンパ球細胞の成長および／または発生を特異的に変更するとき、アゴニストは有用である。アゴニストおよびアンタゴニストは、また、Bリンパ球のエフェクター機能、特にBリンパ球の活性化および分化の研究において有用であることを証明することができる。アンタゴニストはリガンド−レセプターの相互作用のための研究試薬として有用である。
【０１７６】
BR43x2アンタゴニストとして同定された化合物は、また、体液性免疫応答を促進するために有用である。B細胞の応答は、細菌、ウイルス、原生動物および寄生生物の感染を包含する感染症を戦うとき重要である。感染性微生物に対する抗体は、抗原に結合させ、次いで補体仲介溶解または細胞仲介攻撃により病原体を固定化することができる。BR43x2アンタゴニストは体液性応答を増強する働きをし、そして感染症の危険にある個体のために有効な治療剤であるか、あるいはワクチン接種に対する補助物質として有効であろう。
【０１７７】
本発明は、また、BR43x2ポリペプチドに結合するか、あるいはBR43x2ポリペプチドが結合するリガンドに結合し、これによりBR43x2の機能を阻害または排除する、アンタゴニストを提供する。このようなBR43x2アンタゴニストは、抗体；BR43x2ポリペプチドまたはそのリガンドに結合するオリゴヌクレオチド；レセプターに結合する能力を保持するが、リガンドまたはレセプターのシグナリングを生じない、BR43x2リガンドの天然または合成のアナローグを包含する。このようなアナローグはペプチドまたはペプチド様化合物であることができる。BR43x2ポリペプチドに結合しかつシグナリングを妨害する天然または合成の小さい分子は、また、アンタゴニストとして考えられる。
【０１７８】
それ自体、BR43x2アンタゴニストは、BR43x2レセプターまたはリガンドからのブロッキングシグナルが有益である、ある種の疾患を治療する治療剤として有用であろう。アンタゴニストは、リガンド−レセプターの相互作用を特性決定する研究試薬として有用である。BR43x2は、EBV誘導および自発的バーキットリンパ腫およびいくつかのB細胞骨髄腫を包含する形質転換されたB細胞系統上で発現される。BR43x2機能の阻害は、B細胞リンパ腫または多発性骨髄腫の治療において有用であろう。BR43x2アンタゴニスト、例えば、BR43x2可溶性レセプターまたは抗体は、腫瘍の進行を仲介するために治療的に使用することができるであろう。
【０１７９】
アゴニストおよびアンタゴニストの活性は、レセプター／リガンドの結合の効力を測定する活性アッセイにより測定することができる。NfKB、NFAT−1およびAP−1のためのリポーター遺伝子構築物を高いレベルで共発現する、安定にトランスフェクトされたB細胞系統、例えば、Baf3（ネズミ前B細胞系統、PalaciosおよびSteinmetzy、前掲、およびMathey-Prevot他、前掲）がつくられ、これらはBR43x2を発現する。また、TACIおよびBCMAを発現する細胞系統は、同様な方法により、Jurkatおよび他のBリンパ腫細胞系統において調製された。ztnf4はこれらの構築物においてリポーター遺伝子を通してシグナリングすることが見出された。可溶性BR43x2および抗体を使用して、結合を測定することができる。
【０１８０】
本発明のタンパク質をアッセイするin  vivoアプローチは、ウイルスデリバリー系を包含する。この目的のために典型的なウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノ関連ウイルス（AAV）を包含する。二本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスは、異種核酸のデリバリーのための、現在最良の研究されている遺伝子転移ベクターである（概観については下記の文献を参照のこと：Becker他、Mol. Cell. Biol. 43：161-89、1994；およびDouglasおよびCuriel、Science and Medicine 4：44-53、1997）。
【０１８１】
アデノウイルスはいくつかの利点を提供する：アデノウイルスは（i）比較的大きいインサート収容することができる；（ii）高い力価に成長することができる；（iii）広い範囲の哺乳動物細胞型を感染することができる；そして（iv）多数の異なるプロモーターを含有する入手可能なベクターとともに使用することができる。また、アデノウイルスは血流中で安定であるので、静脈内注射により投与することができる。
【０１８２】
アデノウイルスゲノムの一部分を欠失することによって、異種DNAの大きい（7kbまでの）インサートを収容することができる。これらのインサートは直接的結合によりまたは共トランスフェクトされたプラスミドとの相同的組換えによりウイルスDNAの中に組込むことができる。典型的な系において、必須E1遺伝子をウイルスベクターから欠失されており、そしてE1遺伝子が宿主細胞（ヒト293細胞系統が典型的である）により提供されないかぎり、ウイルスは複製しないであろう。
【０１８３】
無傷の動物に静脈内投与されるとき、アデノウイルスは主として肝臓をターゲットとする。アデノウイルスデリバリー系がE1遺伝子欠失を有する場合、ウイルスは宿主細胞中の複製することができない。しかしながら、宿主組織（例えば、肝臓）は異種タンパク質を発現し、プロセシングする（そして、シグナル配列が存在する場合、分泌する）であろう。分泌されたタンパク質は高度に脈管化した肝臓中の循環の中に入り、そして感染した動物に対する作用を測定することができる。
【０１８４】
また、in vitroタンパク質産生のためにアデノウイルス系を使用することができる。細胞が急速に分裂しない条件下にアデノウイルス感染した非293細胞を培養することによって、細胞は延長時間の間タンパク質を産生することができる。例えば、BHK細胞を細胞ファクトリー中でコンフルエンスに成長させ、次いで問題の分泌されたタンパク質をコードするアデノウイルスベクターに暴露させる。次いで細胞を無血清条件下に成長させ、この条件下に感染した細胞は有意な細胞分裂なしに数週間生存することができる。
【０１８５】
あるいは、アデノウイルスベクターが感染した293S細胞は比較的高い細胞密度において懸濁培養において成長して、有意な量のタンパク質を産生することができる（Garnier他、Cytotechnol. 15：145-55、1994参照）。いずれのプロトコルを使用しても、発現され、分泌された組織学的タンパク質は細胞培養上清から反復して単離することができる。感染した293S細胞産生プロトコルにおいて、分泌しないタンパク質をまた効果的に得ることができる。
【０１８６】
ある種の疾患の状態において本発明の可溶性BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドのin  vivo効能を試験するために、よく確立された動物モデルは入手可能である。特に、多数の自己免疫疾患の動物モデル、例えば、SLE（全身性エリテマトーデス）のモデルとして働くMRL−lpr／lprまたはNZB×NZW F1コンジェニックマウス系統において、可溶性BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントを試験することができる。このような動物モデルはこの分野において知られている、例えば、下記の文献を参照のこと：Autoimmune Disease Models A Guidebook、CohenおよびMiller、編、Academic Press。
【０１８７】
ニュージーランドブラック（NZB）マウスとニュージーランドホワイト（NZW）マウスとの間の交雑の子孫は、ヒトにおけるSLEに密接に類似する自発的形態のSLEを発生する。NZBWとして知られている子孫のマウスは1月齢においてT細胞に対するIgM自己抗体を発生し始め、5〜7月齢までに、Ig抗DNA自己抗体は優性免疫グロブリンである。ポリクローナルB細胞機能亢進は自己抗体の過剰産生に導く。これらの自己抗体、特に一本鎖DNAに対して向けられた自己抗体は、タンパク尿、窒素血症、および腎不全からの死として臨床的に発現する、糸球体腎炎の発生に関係づけられる。
【０１８８】
腎不全は自発的SLEの影響を受けたマウスおよびNZBWにおける死の主要な原因であり、このプロセスは慢性でありかつ遮断性である。この疾患は雄よりも雌においていっそう急速でありかつ重く、平均の生存期間は雄について406日に比較してわずかに245日である。雌マウスの多くは7〜9月齢までに症候性（タンパク尿）であるが、あるものは症候を発生するとき非常に若いか、あるいは老いていることがある。
【０１８９】
NZBWマウスにおいて見れられる致死的免疫腎炎はヒトSLEにおいて見られる糸球体腎炎に非常に類似し、この自発的ネズミモデルを潜在的SLE療法の試験のために非常に魅力的とする（PuttermanおよびNaparstek、Murine Models of Spontaneous Systemic Lupus Erythematousus、Autoimmune Desease Models：A Guidebook、chapter 14、pp. 217-34、1994；Mohan他、J. Immunol. 154：1470-80、1995；およびDaikh他、J. Immunol. 159：3104-08、1997）。症候の改善および疾患の過程の変更に対するTACI、BR43x2またはBCMAの効能を評価するために、これらのマウスに可溶性TACI-IG、BR43x2-Ig、BCMA-Igまたは他の可溶性および融合タンパク質を投与することは実施例の節において後述される。
【０１９０】
実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）のためのマウスモデルは、免疫仲介疾患のメカニズム、および潜在的療法上の関与の両方を研究するために道具として使用されてきている。このモデルはヒト多発性硬化症に類似し、神経タンパク質、例えば、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）またはプロテオリピドタンパク質（PLP）へのT細胞の活性化の結果として脱髄を産生する。抗原の接種はCD4＋、クラスII MHC−制限T細胞（Th1）の誘導に導く。
【０１９１】
EAEのプロトコルの変化は、モデルの急性、慢性−回帰性、または受動−転移変異型を産生することができる（Weihberg他、J. Immunol. 162：1818-26，1999；Mijaba他、Cell Immunol. 186：94-102、1999；およびGlabinski、Meth. Enzym. 288：182-90、1997）。症候の改善および疾患の過程の変更に対するTACI、BR43x2またはBCMAの効能を評価するために、これらのマウスに可溶性TACI−IG、BR43x2−Ig、BCMA−Igまたは他の可溶性および融合タンパク質を投与することは実施例の節において後述される。
【０１９２】
コラーゲン誘導関節炎（CIA）モデルにおいて、マウスはヒト慢性関節リウマチ（RA）に密接に類似する慢性炎症性関節炎を発生する。CIAはRAと同様な免疫学的および病理学的特徴を共有するので、CIAは潜在的ヒト抗炎症化合物をスクリーニングするための理想的モデルである。CIAモデルを使用する他の利点は、病原性のメカニズムが知られていることである。
【０１９３】
II型コラーゲン上のT細胞およびB細胞エピトープが同定され、免疫仲介関節炎に関係する種々の免疫学的（遅延型過敏性および抗コラーゲン抗体）および炎症性（サイトカイン、ケモカイン、およびマトリックス分解酵素）のパラメーターが決定され、モデルにおける被験化合物の効能を評価するために使用することができる（Wooley、Curr. Opin. Rheum. 3：407-20、1999；Williams他、Immunology 89：9784-788、1992；Myers他、Life Sci. 61：1861-78、1997；およびWang他、Immunology 92：8955-959、1995）。症候の改善および疾患の過程の変更に対するTACI、BR43x2またはBCMAの効能を評価するために、これらのマウスに可溶性TACI-IG、BR43x2-Ig、BCMA-Igまたは他の可溶性および融合タンパク質を投与することは実施例の節において後述される。
【０１９４】
マウスにオバルブミンを注射し、そしてぜん息に類似する気管支におけるぜん息性応答を産生する抗原でマウス経鼻的で再刺激するとき、気管支の感染、例えば、ぜん息のためにモデルをつくることができる。症候の改善および疾患の過程の変更に対するTACI、BR43x2またはBCMAの効能を評価するために、これらのマウスに可溶性TACI-IG、BR43x2-Ig、BCMA-Igまたは他の可溶性および融合タンパク質を投与することは実施例の節において後述される。
in vivoモデルについての他の使用は、動物に対する抗原チャレンジのデリバリーおよび引き続く可溶性BR43x2（TACI）またはそのリガンドの投与およびT細胞およびB細胞の応答の測定を包含する。
【０１９５】
T細胞依存的およびT細胞独立的免疫応答は、Perez−Melgosa他、J. Immunol. 163：1123-7、1999に記載されているように、測定することができる。
正規の抗原チャレンジ（例えば、オバルブミンまたはコラーゲン）に対して暴露される動物における免疫応答および引き続くBR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドまたは可溶性Ig−融合物の投与を実施して、B細胞の応答に対する作用を測定することができる。
【０１９６】
薬物速度論の研究を放射能標識化、可溶性BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドまたは融合物に関連して使用して、このようなポリペプチドのin vivoの分布および半減期を測定することができる。さらに、in vivoにおける腫瘍および腫瘍発生に対する可溶性BR43x2、TACIまたはBCMAの作用を測定するために、動物モデルを使用することができる。
また、自己免疫疾患、腎疾患、B細胞およびT細胞の疾患のための代理マーカーとしてBR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドを使用することが提供される。このような患者から採血し、血液中のBR43x2、TACIまたはBCMA可溶性レセプターおよびそれらのリガンドを検出することができる。
【０１９７】
本発明は、また、抗体を提供する。例えば、問題のポリペプチド、または天然源から単離されたポリペプチドを含有する発現ベクターの産物を抗原として使用して、BR43x2または配列番号8のアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体を得ることができる。特に有効な抗体は、BR43x2または配列番号10のアミノ酸配列を有するペプチドに「特異的に結合する」。抗体が106／Mまたはそれより大きい、好ましくは107／Mまたはそれより大きい、より好ましくは108／Mまたはそれより大きい、最も好ましくは109／Mまたはそれより大きい結合アフィニティー（Ka）でBR43x2ポリペプチドまたは配列番号8のポリペプチド、ペプチドまたはエピトープに結合する場合、抗体はBR43x2または配列番号10のアミノ酸配列を有するペプチドに「特異的に結合する」。
【０１９８】
抗体の結合アフィニティーは、例えば、スキャッチャード分析（Scatchard、Ann. NY Acad. Sci. 51：660、1949）により、容易に決定することができる。適当な抗体は、BR43x2、特にBR43x2の細胞外ドメイン（配列番号2のアミノ酸残基1〜120）に結合する抗体および配列番号10のアミノ酸配列を有するペプチドに結合する抗体を包含する。
【０１９９】
抗原性BR43x2エピトープ支持ペプチドおよびポリペプチドを使用して、抗BR43x2抗体を製造することができる。本発明の抗原性エピトープ支持ペプチドおよびポリペプチドは、配列番号2内の少なくとも9、好ましくは15〜約30アミノ酸の配列を含有する。しかしながら、本発明のアミノ酸配列のより大きい部分を含んでなり、30〜50アミノ酸、または本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の全体までの任意の長さのアミノ酸を含有する、ペプチドまたはポリペプチドは、また、BR43x2に結合する抗体を誘導するために有効である。
【０２００】
水性溶媒中の実質的な溶解度を提供するようにエピトープ支持ペプチドのアミノ酸配列を選択することが望ましい（すなわち、配列は比較的親水性の残基を含むが、疎水性残基を回避することが好ましい）。親水性ペプチドは疎水性プロットから予測することができる、例えば、下記の文献を参照のこと：HoppおよびWoods、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78：3824-8、1981およびKyteおよびDoolittle、J. Mol. Biol. 157：105-142、1982。そのうえ、プロリン残基を含有するアミノ酸配列は、また、抗体産生に望ましいことがある。
【０２０１】
組換えBR43x2タンパク質または天然源から単離されたBR43x2に対するポリクローナル抗体は、この分野においてよく知られている方法を使用して製造することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Green他、“Production of Polyclonal Antsera，”in Immunochemical Protocols（Manson、編）、pp. 1-5（Humana Press 1992）、およびWilliams他、“Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies，”in DNA Cloning 2：Expression Systems、第2版、Glover他（編）、p. 15（Oxford University Press 1995）。
【０２０２】
アジュバント、例えば、明礬（水酸化アルミニウム）またはフロインド完全アジュバントまたはフロインド不完全アジュバントを使用して、BR43x2ポリペプチドの免疫原性を増加することができる。免疫化に有効なポリペプチドは、また、融合ポリペプチド、例えば、BR43x2またはその一部分と免疫グロブリンまたはマルトース結合性タンパク質との融合物を包含する。ポリペプチド免疫原は全長の分子またはその一部分であることができる。ポリペプチドの一部分が「ハプテン様」である場合、このような一部分は免疫化のために好都合には高分子担体（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）または破傷風トキソイド）に結合または連鎖することができる。
【０２０３】
ポリクローナル抗体は典型的には動物、例えば、ウマ、雌牛、イヌ、ニワトリ、割合、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット、ヤギまたはヒツジ中で発生させるが、本発明の抗BR43x2抗体は類人猿の抗体に由来することができる。ヒヒにおいて診断的、療法的に有効な抗体を発生させる一般的技術は、例えば、下記の文献に記載されている：Goldenberg、国際特許公開No.WO 91/11465、およびLosman他、Int. J. Cancer 46：310、1990。また、抗体はトランスジェニック動物、例えば、トランスジェニックヒツジ、雌牛、ヤギまたはブタにおいて発生させることができ、そして酵母および真菌中の修飾された形態でならびに哺乳動物細胞および昆虫細胞中で発現させることができる。
【０２０４】
あるいは、モノクローナル抗BR43x2抗体を発生させることができる。特異的抗原に対する齧歯類モノクローナル抗体は、この分野において知られている方法により得ることができる（例えば、下記の文献を参照のこと：Kohler他、Nature 256：495、1975；Coligan他（編）、Current Protocols in Imunology、Vol. 1、pp. 2.5.1-2,6,7（John Wiley & Sons 1991）；Picksley他、“Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli，”in DNA Cloning:Expression Systems、第2版、Glover他（編）、p. 63（Oxford University Press 1995））。
【０２０５】
簡単に述べると、モノクローナル抗体は次のようにして得ることができる。BR43x2遺伝子産物を含んでなる組成物をマウスに注射し、血清試料を取出すことによって抗体産生を確認し、脾臓を取出してBリンパ球を獲得し、Bリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを産生し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、そしてハイブリドーマ培養物から抗体を単離する。
【０２０６】
さらに、本発明の抗BR43x2抗体はヒトモノクローナル抗体に由来することができる。抗原チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスから、ヒトモノクローナル抗体は得られる。この技術において、内因的重鎖および軽鎖遺伝子座のターゲッテッド崩壊を含有する胚幹細胞系統に由来したマウスの中に、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の因子を導入する。トランスジェニックマウスはヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、そしてこのマウスを使用してヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、例えば、下記の文献に記載されている：Green他、Nat. Genet. 7：13、1994；Lonberg他、Nature 368：856、1994；およびTaylor他、Int. Immun. 6：579、1994。
【０２０７】
種々のよく確立された技術により、モノクローナル抗体をハイブリドーマ培養物から単離し、精製することができる。このような単離技術は、プロテインAセファローズを使用するアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを包含する（例えば、下記の文献を参照のこと：Coligen、pp. 2.7.1-2.7.12およびpp. 2.9.1-2.9.3；Baines他、“Purification of Immunoglobulin G（IgG），”in Methods in Molecular Biology、Vol. 10、pp. 79-104（The Humana Press,Inc. 1992））。
【０２０８】
特定の用途に、抗BR43x2抗体のフラグメントを製造することが望ましい。このような抗体フラグメントは、例えば、抗体のタンパク質分解的加水分解により、得ることができる。抗体フラグメントは、慣用法に従い全抗体のペプシンまたはパパイン消化により得ることができる。例示として、抗体をペプシンで酵素的に消化してF（ab）'2と表示する5Sフラグメントを形成することによって、抗体フラグメントを製造することができる。チオール還元剤を使用して、このフラグメントをさらに切断して、3.5SFab'1価フラグメントを産生することができる。
【０２０９】
必要に応じて、ジサルファイド結合の切断から生ずるスルフヒドリル基のブロッキング基を使用して、切断反応を実施することができる。別法として、ペプシンを使用する酵素的切断は2つの1価FabフラグメントおよびFcフラグメントを直接的に産生する。これらの方法は、例えば、下記の文献に記載されている：Goldenberg、米国特許第4,331,647号；Nisonoff他、Arch. Biochem. Biophys. 89：230、1960；Porter、Biochem. J. 73：119、1959；Edelman他、in Methods in Enzymology、Vol. 1、p. 422（Academic Press 1967）；およびColigan、前掲。
【０２１０】
フラグメントが無傷の抗体により認識される抗原に結合するかぎり、抗体を切断する他の方法、例えば、重鎖を分離して1価の軽−重鎖フラグメントを形成する方法、フラグメントをさらに切断する方法、または他の酵素的、化学的または遺伝学的技術を使用することもできる。
例えば、FvフラグメントはVHおよびVL鎖のアソシエーションを含んでなる。下記の文献に記載されているように、このアソシエーションは非共有結合であることができる：Inbar他、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69：2659、1972。あるいは、可変鎖は細胞間ジサルファイド結合により結合するか、あるいは化学物質、例えば、グルタルアルデヒドにより架橋することができる（例えば、下記の文献を参照のこと：Sandhu、Crit. Rev. Biotch. 12：437、1992）。
【０２１１】
Fvフラグメントは、ペプチドリンカーにより接続されたVHおよびVL鎖を含んでなることができる。オリゴヌクレオチドにより接続されたVHおよびVLドメインをコードするDNA配列を含んでなる構造的遺伝子を構築することによって、これらの一本鎖抗原結合性タンパク質（scFv）は製造される。構造遺伝子を発現ベクターの中に挿入し、次いで発現ベクターを宿主細胞、例えば、大腸菌（E. coli）の中に導入する。これらの組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。scFvを産生する方法は、例えば、下記の文献に記載されている：Whitlow他、Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：97、1991；また、Bird他、Science 242：423、1988；Ladner他、米国特許第4,946,778号；Pack他、Bio/Technology 11：1271、1993；およびSandhu、前掲。
【０２１２】
例示として、リンパ球をin vitroにおいてBR43x2ポリペプチドに暴露し、ファージまたは同様なベクター中の抗体表示ライブラリーを選択することによって、scFvを得ることができる（例えば、固定化または標識化BR43x2タンパク質またはペプチドを使用する）。潜在的BR43x2ポリペプチド結合性ドメインを有するペプチドをコードする遺伝子は、ファージ上で（ファージ表示）または細菌、例えば、大腸菌（E. coli）上で表示されたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。
【０２１３】
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多数の方法、例えば、ランダム突然変異誘発およびランダムポリヌクレオチド合成により得ることができる。これらのランダムペプチド表示ライブラリーを使用して、既知のターゲットと相互作用するペプチドについてスクリーニングすることができる。このターゲットはタンパク質またはポリペプチド、例えば、リガンドまたはレセプター、生物学的または合成的高分子、または有機または無機の物質であることができる。
【０２１４】
このようなランダムペプチド表示ライブラリーをつくりかつスクリーニングする技術はこの分野において知られている（Ladner他、米国特許第5,223,409号、Ladner他、米国特許第4,946,778号、Ladner他、米国特許第5,403,484号、Ladner他、米国特許第5,571,698号、およびKay他、Phage Display of Peptides and Poteins（Academic Press，Inc. 1996）そしてランダムペプチド表示ライブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするキットは、例えば、Clontech（カリフォルニア州パロアルト）、Invitrogen  Inc.（カリフォルニア州サンディエゴ）、New England Biolabs，Inc.（マサチュセッツ州ベバーリイ）、およびPharmacia LKB Biotechnology  Inc.（ニュージャージイ州ピスカタウェイ）から商業的に入手可能である。本明細書に開示するBR43x2配列を使用して、ランダムペプチド表示ライブラリーをスクリーニングして、BR43x2に結合するタンパク質を同定することができる。
【０２１５】
抗体フラグメントの他の形態は、単一の相補性決定領域（CDR）をコードするペプチドである。問題の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって、CDRペプチド（「最小認識単位」）を得ることができる。このような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成するPCRにより製造される（例えば、下記の文献を参照のこと：Larrick他、Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：106、1991）；Courtenay-Luck、“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies，”in Monoclonal Antibodies：Production，Engineering and Clinical Application、Ritter他、（編）、p. 166（Cambridge University Press 1995）；およびWard他、“Genetic Manipulation and Expression of Antibodies，”in Monoclonal Antibodies：Principles and Applications、Birch他、（編）、p. 137（Wiley-Liss，Inc. 1995））。
【０２１６】
あるいは、抗BR43x2抗体は「ヒト化」モノクローナル抗体から誘導することができる。マウス相補的決定領域をマウス免疫グロブリンの重および軽可変鎖からヒト可変ドメインの中に転移することによって、ヒト化モノクローナル抗体を産生する。次いでヒト抗体の典型的な残基を、ネズミ対応物のフレームワーク領域において置換する。ヒトモノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用は、ネズミ定常領域の免疫原性に関連する潜在的問題を排除する。
【０２１７】
ネズミ免疫グロブリン可変領域をクローニングする一般的技術は、例えば、下記の文献に記載されている：Orlandi他、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86：3833、1989。ヒト化モノクローナル抗体を産生する技術は、例えば、下記の文献に記載されている：Jones他、Nature 321：522、1986；Carter他、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89：4285、1992；Sandhu、Crit. Rev. Biotch. 12：437、1992；Singer他、J. Immun. 150：2844、1993；Sudhir（編）、Antibody Engineering Protocols（Humana Press，Inc. 1995）；Kelley、“Engineering Therapeutic Antibodies，”in Protein Engineering:Principles and Practice、Cleland他（編）、pp. 399-434（John Wiley & Sons，Inc. 1996）；およびQueen他、米国特許第5,693,762号（1997）．xxx。
【０２１８】
ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、動物を抗BR43x2抗体または抗体フラグメントで標準的技術に従い免疫化することによって製造することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Green他、“Production of Polyclonal Antisera，”in Methods In Molecular Biology：Immunochemical Protocols、Manson（編）、pp. 1-12（Humana Press 1992）。また、Coligan、前掲、pp. 2.4.1-2.4.7参照。
【０２１９】
あるいは、モノクローナル抗イディオタイプ抗体は、前述の技術に従い、免疫原として抗BR43x2抗体または抗体フラグメントを使用して製造することができる。別法として、ヒト化抗イディオタイプ抗体または類人猿抗イディオタイプ抗体は前述の技術に従い製造することができる。抗イディオタイプ抗体を製造する方法は、例えば、下記の文献に記載されている：Irie、米国特許第5,208,146号、Greene他、米国特許第5,637,677号、およびVarthakaviおよびMinocha、J. Gen. Virol. 77：1875、1996。
【０２２０】
本発明における抗体またはポリペプチドは、また、薬剤、トキシン、放射性核種およびその他と直接的または間接的に複合化することができ、そしてこれらの複合体はin  vivoの診断または療法の応用において使用することができる。例えば、対応する抗相補的分子（例えば、それぞれ、レセプターまたは抗原）を発現する組織または器官を同定または処置するために、本発明のポリペプチドまたは抗体を使用することができる。さらに詳しくは、BR43x2ポリペプチドまたは抗BR43x2抗体、またはそれらの生物活性フラグメントまたは部分を検出可能なまたは細胞障害性分子にカップリングさせ、そして抗相補的分子を発現する細胞、組織または器官を有する哺乳動物に送達することができる。
【０２２１】
適当な検出可能な分子をポリペプチドまたは抗体に直接的または間接的に結合させることができ、そしてこのような分子は放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子、およびその他を包含する。適当な細胞障害分子をポリペプチドまたは抗体に直接的または間接的に結合させることができ、そしてこのような分子は細菌または植物のトキシン（例えば、ジフテリアトキシン、シュードモナス・エキソトキシン（Pseudomonas exotoxin）、リシン、アブリンおよびその他）、ならびに治療用放射性核種、例えば、ヨウ素−131、レニウム−188またはイットリウム−90（ポリペプチドまたは抗体に直接的に結合されているか、あるいは、例えば、キレート化部分の手段により間接的に結合されている）を包含する。
【０２２２】
また、ポリペプチドまたは抗体を細胞障害性薬剤、例えば、アドリアマイシンに結合させることができる。検出可能なまたは細胞障害性分子の間接的結合のために、検出可能なまたは細胞障害性分子を補体／抗補体の対の1メンバーに結合することができ、ここで他方のメンバーをポリペプチドまたは抗体の部分に結合させる。これらの目的に対して、ビオチン／ストレプトアビジンは典型的な補体／抗補体の対である。
【０２２３】
可溶性BR43x2ポリペプチドまたは抗体を薬剤、放射性核種およびその他に直接的または間接的に複合化することができ、そしてこれらの複合体をin  vivoの診断または療法的応用に使用することができる。例えば、対応する抗相補的分子（例えば、それぞれ、レセプターまたは抗原）を発現する組織または器官を同定または処置するために、本発明のポリペプチドまたは抗体を使用することができる。さらに詳しくは、BR43x2ポリペプチドまたは抗BR43x2抗体、またはそれらの生物活性フラグメントまたは部分を検出可能なまたは細胞障害性分子にカップリングさせ、そして抗相補的分子を発現する細胞、組織または器官を有する哺乳動物に送達することができる。
【０２２４】
適当な検出可能な分子をポリペプチドまたは抗体に直接的または間接的に結合させることができ、そしてこのような分子は放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子、およびその他を包含する。適当な細胞障害分子をポリペプチドまたは抗体に直接的または間接的に結合させることができ、そしてこのような分子は細菌または植物のトキシン（例えば、ジフテリアトキシン、シュードモナス・エキソトキシン（Pseudomonas exotoxin）、リシン、アブリンおよびその他）、ならびに治療用放射性核種、例えば、ヨウ素−131、レニウム−188またはイットリウム−90（ポリペプチドまたは抗体に直接的に結合されているか、あるいは、例えば、キレート化部分の手段により間接的に結合されている）を包含する。
【０２２５】
また、ポリペプチドまたは抗体を細胞障害性薬剤、例えば、アドリアマイシンに結合させることができる。検出可能なまたは細胞障害性分子の間接的結合のために、検出可能なまたは細胞障害性分子を補体／抗補体の対の1メンバーに結合することができ、ここで他方のメンバーをポリペプチドまたは抗体の部分に結合させる。これらの目的に対して、ビオチン／ストレプトアビジンは典型的な補体／抗補体の対である。
【０２２６】
このようなポリペプチド−トキシン融合タンパク質または抗体／フラグメント−トキシン融合タンパク質は、ターゲッテッド細胞を組織の阻害または離解のために使用することができる（例えば、癌細胞または組織を処理するために）。あるいは、ポリペプチドが多重機能のドメイン（すなわち、活性化ドメインまたはリガンド結合性ドメイン、＋ターゲッティングドメイン）を有する場合、ターゲッティングドメインのみを含む融合タンパク質は検出可能分子、細胞障害性分子または相補的分子を問題の細胞または組織の型に向けるために適当であることがある。
【０２２７】
ドメインの融合タンパク質のみが相補的分子を含む場合、抗相補的分子を検出可能なまたは細胞障害性分子に複合化することができる。こうして、このようなドメイン−相補的分子の融合タンパク質は、一般的抗相補的−検出可能／細胞障害性分子の複合体の細胞／組織−特異的デリバリーのための一般的ターゲッティングベヒクルを表す。本明細書に記載する生物活性ポリペプチドまたは抗体複合体は静脈内、動脈内または管内に送出すことができるか、あるいは意図する作用部位に局所的に導入することができる。
【０２２８】
HisまたはFLAG（商標）標識化されている、可溶性BR43x2ポリペプチドに対して、抗体をつくることができる。また、大腸菌（E. coli）産生MBP−融合タンパク質に対して、抗体を製造することができる。あるいは、このようなポリペプチドはヒトIgとの融合タンパク質を包含することができるであろう。特に、His標識化、またはFLAG（商標）標識化可溶性BR43x2に対するポリペプチド抗体を含有する抗血清を、ヒトまたは霊長類組織上の免疫組織化学によるBR43x2の組織分布の分析において使用することができる。また、これらの可溶性BR43x2ポリペプチドを使用してマウスを免疫化して、可溶性ヒトBR43x2ポリペプチドに対してモノクローナル抗体を産生することができる。
【０２２９】
可溶性ヒトBR43x2ポリペプチドに対するモノクローナル抗体をまた使用して、リガンド／レセプターのカップリングを模擬して、リガンド／レセプター対を活性化または不活性化することができる。例えば、架橋性抗可溶性CD40モノクローナル抗体は、抗IgMまたはLPSで次善的に活性化されたB細胞系統に対する刺激シグナルを提供し、増殖および免疫グロブリンの産生を生ずることが証明された。これらの同一モノクローナル抗体は、溶液中で使用するとき、レセプターの活性化をブロックすることによって、アンタゴニストとして作用する。BR43x2に対するモノクローナル抗体を使用して、組織分布の研究により同定された特異的細胞系統上の分布、調節および生物学的相互作用を決定することができる。
【０２３０】
本発明は、また、単離され、精製されたBR43x2、TACIおよびBCMAポリヌクレオチドのプローブまたはプライマーを提供する。このようなポリヌクレオチドのプローブはRNAまたはDNAであることができる。DNAはcDNAまたはゲノムDNAであることができる。ポリヌクレオチドのプローブは一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNA、一般に合成オリゴヌクレオチドであるが、クローニングしたcDNAまたはゲノム配列から発生させることができ、一般に少なくとも16ヌクレオチド、よりしばしば17ヌクレオチド〜25またはそれより多いヌクレオチド、時には40〜60ヌクレオチド、ある場合においてBR43x2遺伝子またはcDNAの実質的な部分、ドメインまたはさらに全体を含んでなるであろう。
【０２３１】
プローブおよびプライマーは一般に合成オリゴヌクレオチドであるが、クローニングされたcDNAまたはゲノム配列またはその補体から発生させることができる。分析用プローブは一般に少なくとも20ヌクレオチド長さであるが、多少短いプローブ（14〜17ヌクレオチド）を使用することができる。PCRプライマーは少なくとも5ヌクレオチド長さ、好ましくは15またはそれより多いヌクレオチド、より好ましくは20〜30ヌクレオチドである。遺伝子を小さい領域を分析のためにターゲッティングするとき、短いポリヌクレオチドを使用することができる。遺伝子全体の分析のために、ポリヌクレオチドのプローブは全体のエクソンまたはそれより多くを含んでなることができる。
【０２３２】
この分野においてよく知られている技術を使用して、プローブを、例えば、酵素、ビオチン、放射性核種、蛍光体、化学発光体、常磁性プロトコルおよびその他標識化して検出可能なシグナルを提供することができ、これらは多数の源、例えば、Molecular Probes，Inc.、Eugene、OR、およびAmersham Corp.、イリノイ州アーリントンハイツ、から商業的に入手可能である。プローブを構築するために好ましい領域は、リガンド結合性領域、システインに富んだ擬反復、シグナル配列、およびその他を包含する。ポリヌクレオチドのプローブを発生させる技術およびハイブリダイゼーション技術はこの分野において知られており、例えば、下記の文献を参照のこと：Ausubel他、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons，Inc.、NY、1991。
【０２３３】
BR43x2、TACIおよびBCMAポリペプチドおよび抗体を、診断系において使用して、BR43x2、TACIおよびBCMAおよびBR43x2、TACIおよびBCMAリガンドポリペプチド、例えば、ztnf4の存在を検出することができる。このような検出法から誘導される情報は種々の疾患におけるBR43x2ポリペプチドの意味の洞察を提供し、BR43x2レベルの変更が有意である疾患の診断ツールとして働くであろう。BR43x2、TACIおよびBCMAレセプターポリペプチドのレベルの変更は、癌、自己免疫疾患および感染症を包含する病理学的状態を示すことができる。
【０２３４】
基本的アッセイにおいて、一本鎖プローブ分子を生物学的試料から単離されたRNAと、プローブとターゲットBR43x2  TACIまたはBCMA  RNA種との間の塩基対合を促進する温度およびイオン強度の条件下に、インキュベートする。非結合プローブをハイブリダイゼーションした分子から分離した後、ハイブリッドの量を検出する。
【０２３５】
RNA検出のよく確立されたハイブリダイゼーション法は、ノザン分析およびドット／スロットブロットハイブリダイゼーションを包含する（例えば、下記の文献を参照のこと：Ausbel前掲およびWu他（編）、″Analysis of Gene Expression at the RNA Level″、Methods in Gene Biotechnology、pp. 225-239（CRC Press，Inc.、1997））。核酸プローブを放射性同位元素、例えば、32Pおよび35Sで直接標識化することができる。あるいは、BR43x2  RNAを非放射線的ハイブリダイゼーション法で検出することができる（例えば、下記の文献を参照のこと：Isaac（編）、Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes、Humana Press，Inc.、1993）。典型的には、非放射線的検出は、色素形成または化学発光基質の酵素的変換により達成される。例示的非放射性成分はビオチン、フルオレセイン、およびジゴキシゲニンを包含する。
【０２３６】
BR43x2、TACI、およびBCMAオリゴヌクレオチドプローブは、また、in  vivo診断に有用である。例示として、18F標識化オリゴヌクレオチドを被検体に投与し、陽電子放射断層撮影法により可視化することができる（Tavitian他、Nature Medicine 4：467、1998）。
【０２３７】
多数の診断手順は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用して検出方法の感度を増加する。PCRを実施する標準技術はよく知られている（一般に、下記の文献を参照のこと：Mathew（編）、Protocols in human Molecular Genetics（Humana Press，Inc.、1991）、White（編）、PCR Protocols：Current Methods and Applications（Humana Press，Inc.、1993）、Cotter（編）、Molecular Diagnosis of Cancer（Humana Press，Inc.、1996）、HanausekおよびWalaszek（編）、Tumor Marker Protocols（Humana Press，Inc.、1998）、Lo（編）、Clinical Applications of PCR（Humana Press，Inc.、1998）、およびMeltzer（編）、PCR in Bioanalysis（Humana Press，Inc.、1998））。特定のBR43x2ドメインまたはモチーフ、例えば、BR43x2、TACIまたはBCMAシステインに富んだ擬反復をコードする配列を増幅するために、PCRを設計することができる。
【０２３８】
診断アッセイのためのPCRの1つの変法は逆転写PCR（RT−PCR）である。RT−PCR技術において、RNAを生物学的試料から単離し、cDNAに逆転写し、そしてcDNAをBR43x2プライマーとインキュベートする（例えば、下記の文献を参照のこと：Wu他（編）、″Rapid Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR″、Methods in Gene Biotechnology、pp. 15-28（CRC Press，Inc.、1997）。次いでPCRを実行し、産物を標準技術により分析する。
【０２３９】
例示として、RNAを生物学的試料から、例えば、前述のグアニジニウム−チオシアネート細胞溶解手順により単離する。あるいは、固相技術を使用して細胞ライゼイトからmRNAを単離することができる。ランダムオリゴヌクレオチド、dTの短いホモポリマー、またはBR43x2、TACIまたはBCMAアンチセンスオリゴマーを使用して、逆転写反応を単離されたRNAでプライムすることができる。オリゴ−dTプライマーは、対照ターゲット配列を提供できる、種々のmRNAヌクレオチド配列が増幅されるという利点を提供する。典型的には20塩基長さである、2つのフランキングオリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応により、BR43x2、TACIまたはBCMA配列を増幅する。
【０２４０】
種々のアプローチを使用して、PCR増幅生成物を検出することができる。例えば、PCR生成物ゲル電気泳動により分画し、臭化エチジウム染色により可視化することができる。あるいは、分画したPCR生成物を膜に移し、検出可能に標識化されたBR43x2プローブとハイブリダイゼーションさせ、オートラジオグラフィーにより検査することができる。追加の別のアプローチは、ジゴキシゲニン標識化デオキシリボ核酸トリホスフェートを使用して化学発光を検出する方法、およびC−TRAK比色アッセイを包含する。
【０２４１】
他のアプローチは実時間定量的PCRである（Perkin-Elmer Cetus、コネチカット州ノーウォーク）。結合したリポーターおよびクエンチャー色素の両方を有するオリゴヌクレオチドから成る、蛍光発生プローブは、特異的に前方向プライマーと逆方向プライマーとの間をアニールする。TaqDNAポリメラーゼの5'エンドヌクレアーゼ活性を使用して、リポーター色素をクエンチャー色素から分離し、配列特異的シグナルを発生させ、このシグナルは増幅が増加するにつれて増加する。PCR反応の間に、蛍光強度を連続的にモニターし、定量する。
【０２４２】
BR43x2、TACIまたはBCMAの発現を検出する他のアプローチはサイクリングプローブ技術（CPT）であり、ここで一本鎖DNAターゲットは過剰のDNA−RNA−DNAキメラプローブと結合して複合体を形成し、RNA部分をRNアーゼHで切断し、そして切断されたキメラプローブの存在を検出する（例えば、下記の文献を参照のこと：Beggs他、J. Clin. Microbiol. 34：2985、1996、Bekkaoui他、Biotechniques 20：240、1996）。BR43x2、TACIまたはBCMA配列を検出する別の方法は、核酸配列をベースとする増幅（NASBA）、交差ハイブリダイゼーションにより鋳型の共同増幅（CATCH）、およびリガーゼ連鎖反応（LCR）のようなアプローチを利用することができる（例えば、下記の文献を参照のこと：Mrshall他、米国特許第5,686,272号（1997）、Dyer他、J. Virol. Methods 60：161、1996；Ehricht他、Eur. J. Biochem. 243：358、1997およびChadwick他、J. Virol. Methods 70：59、1998）。他の標準的方法はこの分野において知られている。
【０２４３】
また、BR43x2、TACIまたはBCMAプローブおよびプライマーを使用して、組織試料におけるBR43x2、TACIまたはBCMA遺伝子の発現を検出し、位置決定することができる。このようなin  situハイブリダイゼーションの方法は、この分野においてよく知られている（例えば、下記の文献を参照のこと：Choo（編）、In Situ Hybridization Protocols、Humana Press，Inc.、1994、Wu他（編）、″Analysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In Situ Hybridization（RISH）″、Methods in Gene Biotechnology、CRC Press，Inc.、pp. 259-278、1997、およびWu他（編）、″Localization of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization（RISH）″、Methods in Gene Biotechnology、CRC Press，Inc.、pp. 279-289、1997）。
【０２４４】
種々の追加の診断アプローチは当業者によく知られている（例えば、下記の文献を参照のこと：Mathew（編）、Protocols in Human Molecular Genetics、Humana Press，Inc.、1991；ColemanおよびTsongalis、Molecular Diagnostics、Humana Press，Inc.、1996およびElles、Molecular Diagnosis of Genetic Diseases、Humana Press，Inc.、1996）。
【０２４５】
さらに、個々の染色体上の対応配列にハイブリダイゼーションさせるために、このようなポリヌクレオチドのプローブを使用することできるであろう。染色体の同定および／またはBR43x2遺伝子のマッピングは、遺伝子の機能および疾患の関連についての有用な情報を提供することができるであろう。多数のマッピング技術、例えば、体細胞ハイブリッドのマッピング、および蛍光in  situハイブリダイゼーション（FISH）は当業者に入手可能である。好ましい方法は放射線ハイブリッドマッピングである。放射線ハイブリッドマッピングは、哺乳動物染色体の高い分解能の、連続的マップを構成するために開発された体細胞遺伝学的技術である（Cox他、Science 250：245-50、1990）。
【０２４６】
遺伝子の配列の部分的または完全な知識は、染色体放射線ハイブリッドマッピングパネルとともに使用するために適当なPCRプライマーの設計を可能とする。ヒトゲノム全体をカバーする、商業的に入手可能な放射線ハイブリッドマッピングパネル、例えば、Stanford G3 RH PanelおよびGeneBridge 4 RH Panel（Research Genetics，Inc.、アラバマ州ハンツヴィレ）が入手可能である。これらのパネルは、急速な、PCRをベースとする、染色体の位置決定および問題の領域内の遺伝子、配列タッグド部位（STS）、および他の非多形性および多形性マーカーの排列を可能とする。これは、問題の新しく発見された遺伝子と以前にマッピングされたマーカーとの間の比例的物理的距離を直接的に確立することを包含する。
【０２４７】
遺伝子の位置についての正確な知識は、下記の方法を包含する多数の方法において有効であることがある：1）配列が現存するcontigの一部分であるかどうかを決定し、そして種々の形態の追加の取り囲む遺伝学的配列、例えば、YAC−、BAC−またはcDNAクローンを得ること、2）sma染色体領域に対する結合を示す遺伝可能な疾患について可能な候補を提供すること、および3）特定の遺伝子がどんな機能を有することができるかの決定を促進するために有益である相互参照モデル生物、例えば、マウスのため。
【０２４８】
また、染色体の位置決定はSTSを使用して実施することができる。STSはヒトゲノムにおいてユニークであるDNA配列であり、そして特定の染色体または染色体の領域のための参照点として使用することができる。すべての他のゲノム配列の存在下にこの部位を特異的に検出するために、PCRにおいて使用することができる、1対のオリゴヌクレオチドのプライマーにより、STSを定めることができる。STSはもっぱらDNA配列に基づくので、STSはデータベース、例えば、Database of Sequence Tagged Sites（dbSTS）、GeneBank（National Center for Biological Information、National Institutes of Health、マリイランド州ベセスダ、http://www.ncbi.nlm.nih.fov）内に完全に記載することができ、問題の遺伝子配列を使用して、これらの短いゲノムランドマークSTS配列内に含有されるマッピングデータについて検索することができる。
【０２４９】
本発明は、また、診断用途において使用する試薬を提供する。例えば、BR43x2遺伝子、BR43x2  DNAまたはRNAを含んでなるプローブ、またはそれらのサブ配列を使用して、BR43x2遺伝子が特定の染色体上に存在するかどうか、あるいは突然変異が起こったかどうかを決定することができる。BR43x2遺伝子座における検出可能な染色体異常は下記のものを包含するが、これらに限定されない：異数性、遺伝子コピー数の変化、挿入、欠失、制限部位の変化および再配列。これらの異常はコーディング配列内、イントロン内、またはフランキング配列内で起こることができ、上流のプロモーターおよび調節領域を包含し、そしてコーディング配列内の物理的変更または遺伝子発現レベルの変化として発現されることがある。
【０２５０】
一般に、これらの診断方法は下記の工程を含んでなる：（a）  患者から遺伝的試料を取り；（b）  ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションして第1反応産物を産生する条件下に、遺伝的試料をポリヌクレオチドのプローブまたはプライマーとインキュベートし、そして（iii）  第1反応産物を対照反応産物と比較する。第1反応産物と対照反応産物との間の差は患者における遺伝的異常性を示す。本発明において使用する遺伝的試料は、ゲノムDNA、cDNA、およびRNAを包含する。ポリヌクレオチドのプローブまたはプライマーはRNAまたはDNAであることができ、そして配列番号3の一部分、配列番号1の相補体、またはそれらのRNA同等物を含んでなるであろう。
【０２５１】
これに関して適当なアッセイ方法は、この分野において知られている分子遺伝的技術、例えば、制限フラグメント長さの多形性（RFLP）の解析、PCR技術を使用する短い縦列反復（STR）の解析、結合連鎖反応（Barany、PCR Methods and Applications 1：5−16、1991）、リボヌクレアーゼ光受容体アッセイ、およびこの分野において知られている他の遺伝的既知解析（Sambrook他、ibid. ;Ausubel他、ibid. ;Marian、Chest、108：255−65、1995）。
【０２５２】
リボヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、Ausubel他、ibid.、ch. 4参照）は患者のRNA試料に対するRNAプローブのハイブリダイゼーションを含んでなり、その後反応産物（RNA−RNAハイブリッド）をRNアーゼに暴露させる。RNAのハイブリダイゼーションした領域は消化から保護される。PCRアッセイにおいて、患者の遺伝的試料を1対のポリヌクレオチドのプライマーとインキュベートし、そしてプライマーの間の領域を増幅し、回収する。回収された産物のサイズまたは量の変化は、患者における突然変異体を示す。技術使用できる他のPCRをベースとする技術は、一本鎖コンフォメーション多形性（SSCP）解析である（Hayashi、PCR Methods and Applications 1：34−8、1991）。
【０２５３】
アンチセンス方法を使用してBR43x2、TACIまたはBCMA遺伝子の転写を阻害することができ、例えば、B細胞系統の発生および他の細胞との相互作用を阻害することができる。BR43x2、TACIまたはBCMAをコードするmRNAに結合しかつこのようなRNAの翻訳を阻害するように、BR43x2、TACIまたはBCMAをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号3に記載されているようなポリヌクレオチド）のセグメントに対して相補的であるポリヌクレオチドを設計する。細胞培養物または被検体におけるBR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害するために、このようなアンチセンスポリヌクレオチドを使用する。
【０２５４】
BR43x2、TACIまたはBCMAを発現する操作されたマウス（「トランスジェニックマウス」と呼ぶ）およびBR43x2、TACIまたはBCMAの機能の完全な非存在を示すマウス（「ノックアウトマウス」と呼ぶ）を、また、発生させることができる（Snouwaert他、Science 257：1083、1992；Lowell他、Nature 366：740−42、1993；Capecchi、Science 244：1288−92、1989；Palmiter他、Annu. Rev. Genet. 20：465−99、1986）。例えば、偏在的にまたは組織特異的または組織制限的プロモーター下にBR43x2、TACIまたはBCMAを過剰に発現するトランスジェニックマウスを使用して、過剰発現が表現型を引き起こすかどうかを決定することができる。
【０２５５】
例えば、野生型BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチド、ポリペプチドフラグメントまたはその突然変異体の過剰発現は正常細胞のプロセスを変更し、表現型を生ずることができ、この表現型はBR43x2、TACIまたはBCMAの発現が機能的に関係する組織を同定し、そしてBR43x2、TACI、BCMAまたはそれらのアゴニストまたはアンタゴニストの療法上のターゲットを示すことができる。例えば、操作するために好ましいトランスジェニックマウスは、可溶性BR43x2、TACIまたはBCMAを過剰に発現するマウスである。そのうえ、このような過剰発現はヒト疾患とに類似性を示す表現型を生ずることがある。
【０２５６】
同様に、ノックアウトBR43x2、TACIまたはBCMAマウスを使用して、BR43x2がin vivoにおいて絶対的に要求されるかどうかを決定することができる。ノックアウトマウスの表現型は、BR43x2、TACIまたはBCMAアンタゴニスト、例えば、本明細書に記載するアンタゴニストが有することができるin vivo作用を予測させる。ヒトBR43x2、TACIまたはBCMA cDNAを使用して、ネズミBR43x2、TACIまたはBCMA mRNA、cDNAおよびゲノムDNAを単離し、これらを引き続いてノックアウトマウスの発生に使用する。
【０２５７】
BR43x2、TACIまたはBCMA遺伝子およびそれによりコードされるタンパク質をin  vivo系において研究するために、これらのマウスを使用することができ、そして対応するヒト疾患のためのin vivoモデルとして、これらのマウスを使用することができる。そのうえ、本明細書に記載するBR43x2、TACIまたはBCMAに対して向けられたBR43x2、TACIまたはBCMAアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムのトランスジェニック発現を、前述のトランスジェニックマウスと同様に使用することができる。
【０２５８】
薬学的に有効量の本発明のBR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドは、慣用法に従い、非経口的、経口的、経鼻的、経直腸的、局所的、経皮的投与またはその他のために薬学上許容される担体を使用して処方することができる。処方物はさらに1種または2種以上の希釈剤、充填剤、乳化剤、保存剤、緩衝剤、賦形剤、およびその他を含むことができ、そして例えば、液体、粉末、乳濁液、坐剤、リポソーム、経皮パッチおよび錠剤のような形態で提供することができる。多数のバイオポリマー（生物学をベースとする系）の任意のものを含む、遅延または延長放出性デリバリー系、リポソームを使用する合成、およびポリマーのデリバリー系を、また、本明細書に記載する組成物とともに、利用してBR43x2ポリペプチドまたはアンタゴニストの連続的または長期間の源を提供することができる。
【０２５９】
このような遅延放出系は、例えば、経口的、局所的および非経口的使用のための処方物に適用可能である。用語「薬学上許容される担体」は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せずかつ宿主または患者に対して無毒である、担体媒質を意味する。当業者は、下記の文献に記載されているように、本発明の化合物を適当な方法で、許容される実施に従い処方することができる：Remington：The Science and Practice of Pharmacy、Gennaro、編、Mack Publishing Company、ペンシルベニア州イーストン、第19版、1995。
【０２６０】
本明細書において使用するとき、BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストの「薬学的に有効量」は所望の生物学的結果を誘導するために十分な量である。この結果は疾患の徴候、症候、または原因の軽減、あるいは生物学的系の任意の他の所望の変更であることができる。例えば、BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドの有効量は、臨床医または他の適格とされた観察者により認められた症候の主観的軽減または客観的同定可能な改善を提供する量である。例えば、このような有効量のBR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドまたは可溶性融合物は、免疫応答間のB細胞応答の減少、自己抗体産生の阻害または減少、SLE、MGまたはRAに関連する症候の阻害または減少を提供するであろう。
【０２６１】
有効量のBR43x2、TACIまたはBCMAは末梢血中のB細胞の百分率を減少させるであろう。BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドの有効量は、治療すべき疾患または症候に依存して広く変化させることができる。投与すべきポリペプチドの量および処方物中のその濃度は、選択したベヒクル、投与経路、特定のポリペプチドの効力、患者の臨床的症状、処方物中の化合物の副作用および安定性に依存する。したがって、臨床医は、問題の患者または同様に患者を使用する臨床的経験に依存して、処方物の中に適当な濃度を含有する適当な調製物、ならびに処方物の投与量を使用するであろう。
【０２６２】
このような量は、一部分、治療すべき特定の症状、年齢、体重、および患者の一般的健康、および当業者にとって明らかな他の因子に依存するであろう。典型的には、投与量は0.1〜100mg／被検体kgの範囲であろう。特定の化合物の投与量は、実験動物についての研究と組合わせたin vitroまたはex vivo研究から決定することができる。in vitroまたはex vivoにおいて有効であることが見出された化合物の濃度は動物の研究のために手引きを提供し、ここで投与量は作用部位において同様な濃度を提供するように計算される。
下記の非限定的実施例により、本発明をさらに例示する。
【実施例】
【０２６３】
実施例１．BR43x2の同定
分泌トラップアプローチを使用してRPMIアレイから、TACIイソ型をクローニングした。20の96ウェルのプレートを使用して、RPMI 1788（活性化B細胞系統）ライブラリーをアレイした。各ウェルは約100の大腸菌（E. coli）コロニーを含有し、各コロニーは1つのcDNAクローンを含有した。TomTech Quadra 9600を使用して96ウェルのフォーマットで、DNAミニプレプを調製した。次いで単離されたDNAを120プールにプールし、各プールは1600コロニーを表した。これらのプールをCos−7細胞の中にトランスフェクトし、12ウェルのプレートの中にプレートした。
【０２６４】
12μlのプールDNAおよび5μlのLipofectAMINEを92μlの無血清DMEM培地（500mlのDMEM中の55mgのピルビン酸ナトリウム、146mgのL−グルタミン、5mgのトランスフェリン、2.5mgのインスリン、1μgのセレンおよび5mgのフェツイン）中で混合し、室温において30分間インキュベートし、次いで400μlの無血清DMEM培地を添加した。12ウェルの組織培養プレート上にプレートした220,000のCos−7細胞／ウェル上にDNA−LipofectAMINE混合物を添加し、37℃において5時間インキュベートした。インキュベーション後、500μlの20％PBS  DMEM培地（500mlのDMEM中の100mlのFBS、55mgのピルビン酸ナトリウムおよび146mgのL−グルタミン）を各ウェルに添加し、細胞を一夜インキュベートした。
【０２６５】
ビオチニル化、FLAGタッグドztnf4を使用して、分泌トラップスクリーンを実施した。細胞をPBSでリンスし、PBS中の1.8％ホルムアルデヒドで15分間固定した。次いで細胞をTNT（H2O中の0.1MのTris−HCl、0.15MのNaCl、および0.05％のTween−20）で洗浄した。細胞をPBS中の0.1％Triton−Xで浸透させ、次いでTNT中で洗浄した。製造業者のインストラクションに従いNEN Renaissance（商標）TSA-Direct Kit（NEN、マサチュセッツ州ボストン）を使用して、TNB（0.1MのTris−HCl、0.15MのNaClおよび0.5％Blocking Reagent）で細胞を1時間ブロックした。
【０２６６】
細胞をTNTで洗浄し、15分間アビジンで、次いでビオチン（Vector Labs Cat# SP-2001）ブロックし、それらの間においてTNTで洗浄した。細胞をTNB中の1μg／mlのztnf4／Flag／Biotinと1時間インキュベートし、次いでTNT中で洗浄した。次いで細胞をTNB中のストレプトアビジン−HRP（NEN）の1：300希釈物と1時間インキュベートし、TNTで洗浄した。希釈緩衝液（NEN）中で1：50に希釈したフルオレセインチラミド試薬でハイブリダイゼーションを検出し、4.4分間インキュベートし、TNTで洗浄した。細胞をTNT中で1：5に希釈したVectashield Mounting Media（Vector Labs、カリフォルニア州バーリンゲイム）で保存した。
【０２６７】
FITCフィルターを使用して蛍光顕微鏡により、細胞を可視化した。12プールはztnf4結合について陽性であった。プールD8（1600クローンを表す）を破壊し、ztnf4結合について陽性の単一クローン（D8−1）を単離した。配列決定分析はクローンD8−1を明らかにし、このクローンはTACIのイソ型をコードするポリペプチド配列を含有し、ここでTACIのPhe21−Arg67第1システインに富んだ擬反復は単一アミノ酸残基、トリプトファンで置換されていた。このイソ型をBR43x2と表示し、そのポリヌクレオチド配列を配列番号1に表す。
【０２６８】
実施例２．リンパ球および単球中のBR43x1の位置決定
逆転写PCRを使用して、TおよびB細胞および単球におけるBR43x1発現を位置決定した。オリゴヌクレオチドプライマーZC19980（配列番号15）およびZC199810（配列番号165）を使用して、CD19+、CD3+および単球cDNAをBR43についてスクリーニングした。逆転写酵素反応を94℃において3分間実施し、次いで30サイクルで94℃において30秒間、68℃において2分間、そして72℃において1分間実施し、次いで72℃において7分のエクステンションを実施した。抗体を使用するTACIについて報告されたように（von  BuelowおよびBram、前掲）、期待したサイズの720bpのバンドはB細胞中でのみ検出され、活性化T細胞中で検出されなかった。
【０２６９】
実施例３．BR43リガンドztnf4を使用してB細胞の増殖アッセイ
1×108凍結、アフェレスド（apheresed）末梢血単核細胞（PBMC）を含有するバイアルを37℃の水浴中で急速融解し、50mlの管中の25mlのB細胞培地（Iscove's Modified Dulbecco's Medium、10％熱不活性化胎仔ウシ血清、５％L−グルタミン、5％Pen／Strep）の中に再懸濁させた。トリパンブルー（GIBCO BRL、マリイランド州ガイサースバーグ）を使用して、細胞を生活能力について試験した。
【０２７０】
10mlのFicoll/Hypaque Plus（Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.、ニュージャージイ州ピスカタウェイ）を細胞懸濁液の下に層状にし、1800rpmにおいて30分間回転し、ブレーキをオフにして停止させた。次いで相間層を除去し、新しい50mlの管に移し、PBSで40mlの最終体積し、ブレーキをオンにして1200rpmにおいて10分間回転させた。単離されたB細胞の生活能力をトリパンブルーで試験した。B細胞をB細胞培地の中に1×106細胞／mlの最終濃度に再懸濁させ、96ウェルのU字形底のプレート（Falcon、VWR、ワシントン州シアトル）の中に180μl／ウェルでプレートした。
【０２７１】
細胞に下記の刺激因子の1つを添加して、最終体積を200ml／ウェルにした：
可溶性、FLAGタッグドztnf−4sCFまたはztnf−4sNFを1mg〜１ng／mlの10倍希釈で単独で、NaH2CO3、pH9.5中で希釈した10μg／mlの抗IgM（ヤギ抗ヒトIgM）（Southern Biotechnology Associates，Inc.、アラバマ州バーリンガム）とともに；または10μg／mlの抗IgM、および10ng／mlの組換えヒトIL4（PBSおよび0.1％BSA中で希釈下）。さらに、他のサイトカイン、例えば、IL−3およびIL−6ならびに可溶性CD40（sCD40）抗体（Pharmngen、カリフォルニア州サンディエゴ）をその上試験した。対照として、細胞を0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）およびPBS、10μg／mlの抗IgMまたは10μg／mlの抗IgMおよび10ng／mlのIL4（または他のサイトカイン）。
【０２７２】
次いで細胞を37℃において加湿インキュベーター中で72時間インキュベートした。収集前16時間に、1μCiの3H−チミジンをすべてのウェルに添加した。細胞を96ウェルのフィルタープレート（UniFlter GF/C、Packard、コネチカット州ベリデン）の中に収集し、ここで細胞収集器（Packard）で細胞を収集し、製造業者のインストラクションに従い収集した。プレートを55℃において20〜30分間乾燥し、ウェルの底を不透明プレートシーラーでシールした。各ウェルに0.25mlのシンチレーション流体（Microscint-O、Packard）を添加し、トップカウント・マイクロプレート・シンチレーション・カウンター（TopCount Microplate Scintillation Counter）（Packard）を使用してプレートを読んだ。
【０２７３】
精製したB細胞を刺激した後、種々のB細胞マイトジェンに応答したIgG産生の誘導を測定するために、細胞を記載されているように製造し、9日間インキュベートした。IgG産生を測定するために、細胞上清を収集した。
精製したB細胞を刺激した後、種々のB細胞マイトジェンに応答した細胞表面のマーカー活性化を測定するために、細胞を記載されているように製造したが、48時間だけインキュベートした。FACS分析により、細胞表面のマーカーを測定した。
種々のB細胞マイトジェンで刺激したヒト精製B細胞の増殖を表6に要約する。
【０２７４】
【表６】
2012001550.tif 000008
【０２７５】
IL4、IL3（10μg／ml）およびIL6とのztnf4の相乗作用はB細胞増殖について見られた。CD40を使用するとき、B細胞のシグナリングの2倍の増加が見られた。
精製したB細胞を刺激した後、種々のB細胞マイトジェンに応答したIgG産生（ng／ml）の誘導を表7に要約する。
【０２７６】
【表７】
2012001550.tif 000009
【０２７７】
精製したB細胞をztnf4単独、または抗IgMまたは抗IgM＋IL−4で刺激した後、細胞表面活性化マーカーの増加が見られた。最適または次善のT細胞マイトジェンの存在下にPBMNCの増殖に対する作用は存在しなかった。また、LPS刺激に応答した精製単球においてTNFα産生に対する作用は見られなかった。
【０２７８】
増殖しかつ免疫グロブリンを分泌するヒトBリンパ球の可溶性ztnf4共活性化を第3図に示す。5日間培養後、可溶性ztnf4（25ng／ml）でIL-4の存在下に、そしてIL4および抗IgM、抗CD40、または抗CD19を使用する刺激に応答する、精製したヒト末梢血B細胞増殖を第3A図に示す。9日間培養後、IL-4またはIL-4＋IL-5の存在下に可溶性ztnf4で刺激したヒトB細胞から得られた上清中で測定されたIgMおよびIgGのレベルを第3B図に示す。
【０２７９】
これらの結果が示唆するように、可溶性ztnf4は他のB細胞刺激と共同して作用しかつそれ自体で弱く作用するB細胞活性化分子である。可溶性ztnf4はB細胞増殖およびIgG産生を促進する。接着分子、共同刺激分子および活性化レセプターのアップレギュレーションは、B細胞のAPC機能を促進する役割を示唆する。
in vitroにおいて5日間における10ng／mlのIL-4の存在下に可溶性ztnf4（25ng／ml）または対照タンパク質（ユビクイチン）を使用する、ヒト末梢血B細胞の刺激を第4図に示す。可溶性ztnf4特異的増殖の阻害について、精製TACI-Ig、BCMA-Ig、または対照Fcを試験した。
【０２８０】
実施例４．ztnf4結合を使用するTACIおよびBCMA形質転換BHK細胞の選択
トランスフェクタントのプールの希釈クローニングにより、高いレベルのTACIタンパク質を発現するBHK細胞を選択した。トランスフェクタント細胞（2×105）を、結合緩衝液（PBS、2％BSA、0.02％NaN3）中で1μg／mlのビオチニル化ztnf4と、氷上で30分間インキュベートした。細胞を結合緩衝液で2×洗浄し、次いでSA−PE（Caltag）（結合緩衝液中の1：1000希釈）と氷上で30分間インキュベートした。次いで細胞を結合緩衝液中で2×洗浄し、結合緩衝液の中に再懸濁させ、FACS（FACS  Vantage、Becton Dickinson）により読んだ。TNF4の最高の結合を有するクローンを選択する。
【０２８１】
BCMAを発現するトランスフェクタントプールをビオチニル化ztnf4で表面標識化することによって、BCMAタンパク質を高いレベルで発現するBHK細胞を選択した。次いでストレプトアビジン−フィコ−エリトリン（SA−PE  Caltag  Burlingame、カリフォルニア州）およびFACS Vantage（Becton Dickinson）上のFL2中の輝いた細胞の無菌ソーティングを実施した。次いで単一コロニーをztnf4結合についてスクリーニングした。
【０２８２】
実施例５．組織分布
ヒト多重組織ノザンブロット（MTN I、MTN IIおよびMTN III：Clontech）をプロービングして、ヒトBR43x2およびTACIの発現の組織分布を決定した。鋳型としてBR43x2（配列番号1）およびプライマーとしてオリゴヌクレオチドZC20061（配列番号22）およびZC20062（配列番号23）を使用して、ほぼ500bpのPCR由来プローブ（配列番号21）を増幅した。この配列はTACIの相同的領域と同一である。
【０２８３】
増幅を次のようにして実施した：1サイクルの94℃において1.0分間、30サイクルの94℃において30秒間、60℃において30秒間および72℃において30秒間、次いで1サイクルの72℃において10分間。PCR生成物をアガロースゲル電気泳動により可視化し、Gel Extraction Kit（Qiagen、カリフォルニア州チャツワース）を製造業者のインストラクションに従い使用して500bpのPCR生成物を精製した。MULTIPRIME DNA標識化キット（Amersham、イリノイ州アーリントンハイツ）を製造業者のインストラクションに従い使用して、プローブを放射能標識化した。NUCTRAPプッシュカラム（Stratagene）を使用して、プローブを精製した。
【０２８４】
EXPRESSHYB（Clontech）溶液をハイブリダイゼーションのためにかつノザンブロットのハイブリダイゼーション溶液として使用した。106cpm／mlの標識化プローブを使用して65℃において、ハイブリダイゼーションを一夜実施した。次いでブロットを室温において2×SSCおよび0.1％SDS中で洗浄し、次いで50℃において0.1×SSCおよび0.1％SDS中で2回洗浄した。ほぼ1.5kbの転写物が脾臓、リンパ節および小腸において検出された。
【０２８５】
ヒト多重組織ノザンブロット（MTN I、MTN IIおよびMTN III：Clontech）をプロービングして、ヒトTACIの発現の組織分布を決定した。鋳型としてDaudi細胞cDNAおよびプライマーとしてオリゴヌクレオチドZC21065（配列番号25）およびZC21067（配列番号26）を使用して、ほぼ257bpのPCR由来プローブ（配列番号24）を増幅した。増幅を次のようにして実施した：1サイクルの94℃において1.0分間、35サイクルの94℃において30秒間、60℃において30秒間および72℃において30秒間、次いで1サイクルの72℃において10分間。PCR生成物をアガロースゲル電気泳動により可視化し、Gel Extraction Kit（Qiagen、カリフォルニア州チャツワース）を製造業者のインストラクションに従い使用して257bpのPCR生成物を精製した。
【０２８６】
MULTIPRIME DNA標識化キット（Amersham、イリノイ州アーリントンハイツ）を製造業者のインストラクションに従い使用して、プローブを放射能標識化した。NUCTRAPプッシュカラム（Stratagene）を使用して、プローブを精製した。EXPRESSHYB（Clontech）溶液をハイブリダイゼーションのためにかつノザンブロットのハイブリダイゼーション溶液として使用した。106cpm／mlの標識化プローブを使用して65℃において、ハイブリダイゼーションを一夜実施した。次いでブロットを室温において2×SSCおよび0.1％SDS中で洗浄し、次いで50℃において0.1×SSCおよび0.1％SDS中で2回洗浄した。ほぼ1.2kbの転写物が胃、小腸、リンパ節、気管、脾臓および精巣において検出された。
【０２８７】
8ハウスキーピング遺伝子に正規化した種々の組織からのRNAを含有するRNA Master Dot Blots（Clontech）を、また、TACIプローブ（配列番号21）またはBCMAプローブ（配列番号24）でプロービングし、前述したようにハイブリダイゼーションした。BR43x2/TACIの発現は脾臓、リンパ節、小腸、胃、唾液腺、虫垂、肺、骨髄および胎児脾臓イン見られた。
【０２８８】
ヒト腫瘍パネルブロットV（Invitrogen Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ）およびヒトリンパ腫ブロット（Invitrogen）を、前述したように、BR43x2/TACIプローブ（配列番号21）またはBCMAプローブ（配列番号24）でプロービングした。TACIに対応する1.5kbの転写物が非ホジキンリンパ腫および耳下腺腫瘍において見出された。BCMAに対応する1.2kbの転写物が腺リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および耳下腺腫瘍において見出された。
【０２８９】
グアニジンイソチオシアネート（Chirgwin他、Biochemistry 18：52−94、1979）、次いでCsCl遠心工程を使用して、CD4＋、CD8＋、CD19＋および混合反応細胞（CellPro、ワシントン州ボセル）からの全RNAを調製した。オリゴd（T）セルロースクロマトグラフィー（AvivおよびLeder、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69：1408−12、1972）を使用して、ポリ（A）＋RNAを単離した。次いでノザンブロット分析を次のようにして実施した。
【０２９０】
約２mgの各ポリA＋RNAを2.2Mのホルムアルデヒド／リン酸塩緩衝液（50mMのNa2HPO4、50mMのNaH2PO4、50mMのNaOAc、1mMのEDTAおよび2.2Mのホルムアルデヒド）中で変性し、ホルムアルデヒド／リン酸塩緩衝液中の1.5％のアガロースミニゲル（Stratagene Cloning  Systems、カリフォルニア州ラジョラ）電気泳動により分離した。RNAをニトランフィルター（Schleicher & Schuell、ニューハンプシャイヤー州ケーネ）上に一夜ブロットし、フィルターをSTRATLALINKERue紫外線架橋装置（Stratagene Cloning Systems）中で紫外線架橋し（1,200ミリジュール）、次いで80℃において1時間ベーキングした。
【０２９１】
ブロットをTACI（配列番号21）またはBCMA（配列番号24）プローブでプロービングした。TACIを表す1.5kbのバンドはCD19+細胞においてのみ検出された。BCMAを表す1.2kbの転写物がCD8+、CD19+およびMLR細胞においてわずかに検出された。前述したように、K−562細胞（赤血球系、ATCC CCL 243）、HUT78細胞（T細胞、ATCC TIB-161）、Jurkat細胞（T細胞）、DAUDI（バーキットヒトリンパ腫、Clontech、カリフォルニア州パロアルト）、RAJI（バーキットヒトリンパ腫、Clontech）およびHL60（単球）からのポリ（A）RNAを使用して作ったブロット上で、追加のノザンブロット分析を実施した。TACIに対応する1.5kbの転写物がRaji細胞において検出された。BCMAに対応する1.2kbの転写物がDauji、RajiおよびHut78細胞において検出された。
【０２９２】
PCRをベースとするスクリーンを使用して、ヒトまたはネズミTACIおよびヒトBCMAを発現する組織を同定した。ヒトおよびネズミRapid−Scan（商標）遺伝子発現パネル（OriGene Technologies，Inc.、マリイランド州ロックビレ）を製造業者のインストラクションに従いスクリーニングした。エクソン連結をスパンし、かつネズミTACIに対応する272bpのフラグメントを産生するように、オリゴヌクレオチドプライマーZC24200（配列番号27）およびZC24201（配列番号28）を設計した。発現は脾臓、胸腺、肺、乳房、心臓、筋肉、皮膚、副腎、胃、小腸、脳、卵、前立腺および胚において検出された。約500および800bpの追加のバンドが多数の組織において検出された。
【０２９３】
エクソン連結をスパンし、かつヒトTACIに対応する204bpのフラグメントを産生するように、オリゴヌクレオチドプライマーZC24198（配列番号29）およびZC24199（配列番号30）を設計した。発現は脾臓、脳、心臓、肝臓、結腸、肺、小腸、筋肉、胃、精巣、胎盤、唾液腺、副腎、膵臓、末梢血リンパ球および骨髄において検出された。
【０２９４】
エクソン連結をスパンし、かつヒトBCMAに対応する329bpのフラグメントを産生するように、オリゴヌクレオチドプライマーZC24271（配列番号31）およびZC24272（配列番号32）を設計した。発現は脳、脾臓、結腸、肺、小腸、胃、卵、精巣、唾液腺、副腎、前立腺、末梢血リンパ球、骨髄および胎児肝臓において検出された。
エクソン連結をスパンし、かつネズミBCMAに対応する436bpのフラグメントを産生するように、オリゴヌクレオチドプライマーZC24495（配列番号33）およびZC24496（配列番号34）を設計した。発現は肝臓において検出された。
【０２９５】
実施例６．TACI-IgおよびBCMA-Ig融合ベクターの製造
Igガンマ1Fc4フラグメントの構築
TACI-Ig融合タンパク質を製造するために、ヒトIgG1のFc領域（ヒンジ領域およびCH2およびCH3ドメイン）を修飾してFcレセプター（FcgRI）および補体（C1g）結合機能を除去した。ヒトIgG1 Fcのこの修飾されたバージョンをFc4と呼んだ。オリゴプライマーZC10,134（配列番号43）およびZC10,135（配列番号44）を使用するPCRにより、ヒト胎児肝臓ライブラリー（Clontech）からFc領域を単離した。PCRを使用してFc領域内に突然変異を導入してFcgRI結合を減少させた。
【０２９６】
FcgRI結合部位（Leu-Leu-Gly-Gly）をBaum他、（EMBO J. 13：3992-4001、1994）に従いAla-Glu-Gly-Ala（配列番号45のアミノ酸残基38〜41）突然変異させて、FcgRI結合を減少させた（Duncan他、Nature 332：563-4、1988）。オリゴヌクレオチドプライマーZC15,345（配列番号46）およびZC15,347（配列番号47）を使用して突然変異を導入した。50μlの最終体積に、570ngのIgFc鋳型、5μlの10×Pfu反応緩衝液（Stratagene）、8μlの1.25mMのdNTPs、31μlのdH2O、2μlの20mMのZC15,345（配列番号46）およびZC15,347（配列番号47）を添加した。等しい体積の鉱油を添加し、反応を94℃に1分間加熱した。
【０２９７】
Pfuポリメラーゼ（2.5単位、Stratagene）を添加し、次いで25サイクルの94℃において30秒間、55℃において30秒間、72℃において1分間、および引き続いて72℃において7分間エクステンションを実施した。反応生成物を電気泳動させ、約676bpの予測されたサイズに対応するバンドが検出された。バンドをゲルから切除し、QIAGEN QIAquickTMゲル抽出キット（Qiagen）を製造業者のインストラクションに従い使用して回収した。
【０２９８】
また、PCRを使用してAla→Ser（配列番号45のアミノ酸残基134）およびPro→Ser（配列番号45のアミノ酸残基135）の突然変異を導入して、補体C1g結合および／または補体固定（DuncanおよびWinter、Nature 332：788、1988）および停止コドンTAAを減少させた。鋳型としてFcγRI結合側突然変異IgFc配列を使用して、2回の第1ラウンドの反応を実施した。50μlの最終体積に、1μlのFcγRI結合側突然変異IgFc鋳型、5μlの10×Pfu反応緩衝液（Stratagene）、8μlの1.25mMのdNTPs、31μlのdH2O、２μlの20mMのZC15,517（配列番号48）、配列番号45のヌクレオチド26において開始する5'プライマーおよび2μlの20mMのZC15,530（配列番号49）、配列番号45のヌクレオチド405において開始する3'プライマーを添加した。
【０２９９】
第２反応は２μlの各20mMのストックのオリゴヌクレオチドプライマーZC15,518（配列番号50）、配列番号45のヌクレオチド388において開始する5'プライマーおよびZC15,347（配列番号47）、3'プライマーを含有して、Ala→Ser突然変異、XbaI制限部位および停止コドンを導入した。等しい体積の鉱油を添加し、反応を94℃に1分間加熱した。Pfuポリメラーゼ（2.5単位、Stratagene）を添加し、次いで25サイクルの94℃において30秒間、55℃において30秒間、72℃において1分間、および引き続いて72℃において7分間エクステンションを実施した。反応生成物を電気泳動させ、それぞれ、約370および約395bpの予測されたサイズに対応するバンドが検出された。
【０３００】
バンドをゲルから切除し、QIAGEN QIAquickTMゲル抽出キット（Qiagen）を製造業者のインストラクションに従い使用して回収した。第2ラウンドの反応を実施して上記フラグメントを結合し、5'BamHI制限部位を付加した。50μlの最終体積に、30μlのdH2O、8μlの1.25mMのdNTPs、5μlの10×Pfuポリメラーゼ反応緩衝液（Stratagene）および1μlの2回の第1の2つのPCR生成物の各々を添加した。等しい体積の鉱油を添加し、反応を94℃に1分間加熱した。
【０３０１】
Pfuポリメラーゼ（2.5単位、Stratagene）を添加し、次いで5サイクルの94℃において30秒間、55℃において30秒間、および72℃において2分間を実施した。温度を再び94℃にし、2μlの各20mMのストックのZC15,516（配列番号51）、配列番号45のヌクレオチド1において開始する5'プライマーおよびZC15,347（配列番号47）を添加し、次いで25サイクルの94℃において30秒間、55℃において30秒間および72℃において1分間、および引き続いて72℃において最後の7分間エクステンションを実施した。反応生成物をゲル電気泳動により可視化した。予測されたサイズに対応する789bpのバンドが検出された。
【０３０２】
TACI-Fc4およびBCMA-Fc4発現ベクターの構築
酵母中の相同的組換えにより、TACI-Fc4およびBCMA-Fc4融合タンパク質を含有する発現プラスミドを構築した。配列番号5のヌクレオチド15〜ヌクレオチド475のポリヌクレオチド配列を含むTACI cDNAのフラグメントをPCRにより単離した。TACIフラグメントの製造に使用した２つのプライマーは次の通りであった：（1）40bpsの5'ベクターフランキング配列およびTACIフラグメントのアミノ末端に対応する17bpsを含有するプライマー（配列番号52）；（2）40bpsのフランキングFc4配列に対応する3'末端およびTACIフラグメントのカルボキシル末端に対応する17bpを含有するプライマー（配列番号53）。
【０３０３】
100μlの最終体積に、10ngのTACI鋳型、10μlの10×Taqポリメラーゼ反応緩衝液（Perkin  Elmer）、8μlの2.5nMのdNTPs、78μlのdH2O、2μlの各20mMのストックのオリゴヌクレオチドプライマー配列番号52および配列番号53、およびtaqポリメラーゼ（2.5単位、Life  Technology）を添加した。等しい体積の鉱油を添加し、反応を94℃に2分間加熱し、次いで25サイクルの94℃において30秒間、65℃において30秒間、65℃において30秒間、72℃において1分間、および引き続いて72℃において5分のエクステンションを実施した。
【０３０４】
配列番号７のヌクレオチド219〜ヌクレオチド362のポリヌクレオチド配列を含むBCMA  cDNAのフラグメントをPCRにより単離した。BCMAフラグメントの製造に使用した2つのプライマーは次の通りであった：40bpsの5'ベクターフランキング配列およびBCMAフラグメントのアミノ末端に対応する17bpsを含有するプライマー（配列番号54）；および40bpsのフランキングFc4配列に対応する3'末端およびBCMAフラグメントのカルボキシル末端に対応する17bpを含有するプライマー（配列番号55）。
【０３０５】
100μlの最終体積に、10ngのBCMA鋳型、10μlの10×Taqポリメラーゼ反応緩衝液（Perkin  Elmer）、8μlの2.5nMのdNTPs、78μlのdH2O、2μlの各20mMのストックのオリゴヌクレオチドプライマー配列番号54および配列番号55を添加した。等しい体積の鉱油を添加し、反応を94℃に2分間加熱し、次いで25サイクルの94℃において30秒間、65℃において30秒間、72℃において1分間、および引き続いて72℃において5分のエクステンションを実施した。
【０３０６】
TACIおよびBCMA融合タンパク質の各々について1つの、Fc4フラグメントをコードするcDNAを含有するフラグメントを同様な方法において構築した。TACIについて、Fc4フラグメントの製造において使用した2つのプライマーは次の通りであった（上流および下流）：40bpsの5'TACIフランキング配列およびFc4のアミノ末端に対応する17bpsを含有するオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号56）；および40bpsのフランキングベクター配列に対応する3'末端およびFc4フラグメントのカルボキシル末端に対応する17bpsを含有するオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号57）。BCMAについて、Fc4フラグメントの製造において使用した上流プライマーは、40bpsの5'BCMAフランキング配列およびFc4のアミノ末端に対応する17bpsを含有するオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号58）。BCMA構築物についてFc4フラグメントの下流プライマーは、TACI−Fc4について前述のものと同一であった（配列番号57）。
【０３０７】
100μlの最終体積に、10ngの前述のFc4鋳型、10μlの10×Taqポリメラーゼ反応緩衝液（Perkin Elmer）、8μlの2.5nMのdNTPs、78μlのdH2O、2μlの各20mMのストックのTACIについてオリゴヌクレオチド配列番号56および配列番号57およびBCMAについてオリゴヌクレオチド配列番号58および配列番号57、およびtaqポリメラーゼ（2.5単位、Life Technology）を添加した。等しい体積の鉱油を添加し、反応を94℃に2分間加熱し、次いで25サイクルの94℃において30秒間、65℃において30秒間、72℃において1分間、および引き続いて72℃において5分のエクステンションを実施した。
【０３０８】
分析のために0.8％のLMPアガロースゲル（Seaplaque GTG）上に1×TBE緩衝液とともに、前述の100μlのPCR反応の各々の10μlを展開させた。5μlの１M NaClおよび250μlの無水エタノールの添加により、各PCR反応の残りの90μlを沈降させた。プラスミドpZMP6をSmaIで切断して、それをポリリンカーとして線状化した。プラスミドpZMP6をプラスミドpCZR199（American Type Culture Collection、バージニア州マンナッサス、ATCC＃ 98668）から誘導され、そしてCMV即時型プロモーター、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の可変領域からのコンセンサスイントロン、コーディング配列の挿入のための多重制限部位およびヒト成長ホルモンターミネーターを含有する哺乳動物発現ベクターである。
【０３０９】
また、このプラスミドは大腸菌（E. coli）複製起点、sCD40プロモーター、エンハンサーおよび複製起点を有する哺乳動物選択可能なマーカー発現単位、DHFR遺伝子およびsCD40ターミネーターを有する。メタロチオネインプロモーターをCMV即時型プロモーター、およびオープンリーディングフレームの5'末端におけるKozac配列で置換することによって、ベクターpZMP6をpCZR199から構築した。
【０３１０】
100μlのコンピテント酵母細胞（S. cerevisiae）を、ほぼ1μgのTACIまたはBCMA細胞外ドメインおよび各々との組換えに適当なFc4 PCRフラグメントの各々、および100ngのSmaI消化pZMP6ベクターを含有する10μlと組合わせ、0.2cmのエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母／DNA混合物を0.75kV（5kV／cm）、∞オーム、25μFにおいてエレクトロパルスした。各キュベットに、600μlの1.2Mのソルビトールを添加し、酵母を2×300μlのアリコートでURA−Dプレート上にプレートし、30℃においてインキュベートした。
【０３１１】
約48時間後、単一プレートからのUra＋酵母形質転換体を1μlのH2Oの中に再懸濁させ、短時間回転して酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを1mlの溶解緩衝液（2％トリトンX−100、1％SDS、100mM NaCl、10mM Tris、pH8.0、1mM EDTA）の中に再懸濁させた。300μlの酸洗浄ガラスビーズおよび200μlのフェノール−クロロホルムを含有するエッペンドルフ管に、500μlの溶解混合物を添加し、1分の間隔で2または3回渦形成し、次いでエッペンドルフ遠心機中で最大速度で5分間回転した。300μlの水性相を新しい管に移し、DNAを600μlのエタノール（EtOH）で沈降させ、次いで4℃において10分間遠心した。DNAペレットを100μlのH2Oの中に再懸濁させた。
【０３１２】
0.5〜2mlの酵母DNAプレプおよび40μlのDH10B細胞を使用して、エレクトロコンピテント大腸菌（E. coli）細胞（DH10B、GibcoBRL）の形質転換を実施した。細胞を2.0kV、25mFおよび400オームにおいてエレクトロパルスした。エレクトロポレーション後、1mlのSOC（2％のバクトトリプトン（Difco、ミシガン州デトロイト）、0.5％の酵母エキス（Difco）、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコース）を4×LB  AMPプレート（LBブロス（Lennox）、1.8％のバクト寒天（Difco）、100mg／lのアンピシリン）上に250μlのアリコートでプレートした。
【０３１３】
TACI-Fc4またはBCMA-Fc4について正しい発現構築物を収容する個々のクローンを制限消化により同定して、インサートの存在を確認し、種々のDNA配列が互いに対して正しく結合されていることを確証した。陽性クローンのインサートを配列分析した。Qiagen  Maxi  Kit（Qiagen）を製造業者のインストラクションに従い使用して、より大きい規模のプラスミドDNAを単離する。
【０３１４】
実施例7．TACI-Fc4およびBCMA-Fc4の哺乳動物発現
BHK570細胞（ATCC No. CRL-10314）を10cmの培養皿の中にプレートし、DMEM／PBS培地（DMEM、Gibco／BRL、高グルコース（Gibco BRL、マリイランド州ガイサースバーグ）、5％胎仔ウシ血清（Hyclone、ユタ州ローガン）、１mM L−グルタミン（JRH Biosciences、カンサス州レネクサ）、１mM ピルビン酸ナトリウム（Gibco BRL））中で37℃、5％CO2においてほぼ50〜70％のコンフルエンシーに成長させた。
【０３１５】
次いで細胞をLipofectamine（商標）（Gibco BRL）を使用して無血清（SF）培地処方物（DMEM、10mg／mlのトランスフェリン、5mg／mlのインスリン、2mg／mlのフェツイン、1％のL−グルタミンおよび1％のピルビン酸ナトリウム）中でプラスミドTACI−Fc4／pZMP6またはBCMA-Fc4／pZMP6でトランスフェクトした。TACI-Fc4／pZMP6またはBCMA−Fc4／pZMP6を15mlの管の中にSF培地で640μlの全最終体積に希釈した。35μlのLipofectamine（商標）（Gibco BRL）を605μlのSF培地と混合した。Lipofectamine（商標）混合物をDNA混合物に添加し、室温においてほぼ30分間インキュベートした。5mlのSF培地をDNA：Lipofectamine（商標）混合物に添加した。
【０３１６】
細胞を1回5mlのSF培地でリンスし、吸引し、DNA：Lipofectamine（商標）混合物に添加した。細胞を37℃において5時間インキュベートし、次いで6.4mlのDMEM／10％FBS、1％PSN培地を各プレートに添加した。プレートを37℃において一夜インキュベートし、DNA：Lipofectamine（商標）混合物を次の日に新鮮な5％ FBS／DMEM培地と置換した。トランスフェクション後5日に、細胞を選択培地（DMEM／5％FBS、1％L−グルタミン、1％ピルビン酸ナトリウム）中でT−162フラスコの中に分割した。トランスフェクション後ほぼ10日に、各トランスフェクションからの2×150mmの培養皿のメトトレキセート耐性コロニーをトリプシン処理し、細胞をプールし、T−162フラスコの中にプレートし、大規模培養に移した。
【０３１７】
実施例９．ztnf4のトランスジェニック発現
成体の生殖能力のある雄（B6C3f1）、青春期直前の生殖能力のある雌（B6C3f1）、精管切除雄（B6D2f1）、および成体生殖能力のある雌（B6D2f1）（すべてはRaconic Farms、ニューヨーク州ジャマンウン、から）を使用して、ztnf4遺伝子を発現するトランスジェニック動物を作った。Pregnannt Mare's Serumコナドトロピン（Sigma、ミゾリー州セントルイス）およびヒトChorionic Gonadotrpin（hCG（Sigma））を使用して、青春期直前の生殖能力のある雌を過剰排卵させた。引き続いて過剰排卵させた雌を成体の生殖能力のある雄と交配させ、膣栓の存在により交尾を確認した。
【０３１８】
受精卵を外科用スコープ（Leica MZ12 Stereo Microscope、Leica、ドイツ国ウェッツラー）下に収集した。次いでヒアウロニダーゼおよび5％CO2、5％O2、および90％N2と37℃においてインキュベートしたウィッテンW640培地（表8；すべての試薬はSigma Chemical Co.から入手可能である）中で卵を洗浄した。マイクロインジェクションまで、卵を37℃／5％CO2において貯蔵した。
【０３１９】
【表８】
2012001550.tif 000010
【０３２０】
配列番号36および配列番号37のオリゴヌクレオチドのプライマーを使用して最適化開始コドンおよびフランキング5'PmeIおよび3'AscI部位を導入するようにPCRにより、全長のヒトTACIリガンドBlys（配列番号35）をコードする858bpのオープンリーディングフレームを増幅した。このPmeI／AscIフラグメントをpKFO24、B細胞および／またはT細胞制限トランスジェニックベクター［Ig  Emエンハンサー（pEmSRからの690bpのNotI／XbaI；（Bodrug他、EMBO J. 13：2124−30，1994）、Ig Vhプロモーター（pJH1X（−）からの５３６bpのHincII／XhoIフラグメント；Hu他、J. Exp. Med. 177：1681−90、1993）、SV40 16Sイントロン（pEmSRからの171bpのXhoI／HindIIIフラグメント）、PmeI／AscIポリリンカー、およびヒト成長ホルモン遺伝子ポリアデニル化シグナル（627bpのSmaI／EcoRIフラグメント；Seeburg、DNA 1：239−49、1982）を含有する］の中にサブクローニングした。
【０３２１】
トランスジーンインサートをプラスミドバックボーンからNotI消化およびアガロースゲル精製により分離し、前述のB6C3F1Tacマウスの交配からの受精卵を本質的に以前に記載されているように擬妊娠雌の中にマイクロインジェクトし、移植した（Malik他、Mol. Cell. Biol. 15：2349−58、1995）。
レシピエントを対でカゴに戻し、19〜21日間妊娠させた。出産後、分娩後19〜21日経過させた後、雌雄鑑別および離乳させ、0.5cmのバイオプシー（遺伝子型別のために使用する）をきれいなハサミで尾から切り取る。
【０３２２】
商業的に入手可能なキット（DNeasy 96 Tissue Kit；Qiagen、カリフォルニア州バレンシア）を製造業者のインストラクションに従い使用して、尾の切り取り物からゲノムDNAを調製した。トランスジェニックベクターのヒト成長ホルモン（hGH）3'UTR部分に対して設計されたプライマーを使用するPCRにより、ゲノムDNAを分析した。プライマーZC17251（配列番号38）およびZC17252（配列番号39）をhGHの368塩基対のフラグメントを増幅する。
【０３２３】
ヒト配列に対してユニークな領域（ヒトおよびマウス成長ホルモン3'UTR  DNA配列の整列から同定された）を使用して、PCR反応がマウス配列を増幅しないことを保証した。さらに、プライマーZC17156（配列番号40）およびZC17157（配列番号41）は、ベクター配列に対してハイブリダイゼーションしかつcDNAインサートを増幅し、hGHプライマーと一緒に使用することができる。これらの実験において、トランスジーンについて陽性の動物からのDNAを2つのバンド、すなわち、hGH3'UTRフラグメントに対応する368塩基対のバンドおよびcDNAインサートに対応する可変サイズのバンドを発生させた。
【０３２４】
いったん動物がトランスジェニック（TG）であると確証されたとき、TG雌を野生型マウスと一緒に、またはTG雄を1つまたは2匹の野生型雌と一緒に配置することによって、動物を同系交配系統の中に戻し交雑させる。子供が生まれ、これらを離乳させ、雌雄で分離し、それらの尾を遺伝子型別のために切り取った。
生きている動物におけるトランスジーンの発現をチェックするために、生存バイオプシーを実施する。RNA溶液ハイブリダイゼーションアッセイを使用するか、あるいはABI Prism 7700（PE Applied Biosystems，Inc.、フォスターシティー、カリフォルニア州）上で製造業者のインストラクションに従い実時間PCRを実施することによって、各トランスジーンのmRNA発現レベルの分析を実施した。
【０３２５】
細胞増殖およびフローサイトメトリー
基本系統のマウスを種々の週齢において分析した。リンパ系組織のフローサイトメトリー（FACS）分析のために、乳鉢および乳棒を使用してリン酸塩緩衝液（PBS）中で注意して崩壊することによって、骨髄（BM）細胞を大腿および脛骨から単離した。細胞を再懸濁させ、受動的沈降により骨断片を分離し、1000×gにおいてペレット化した。ガラススライドの間で無傷の組織を破砕することによって、脾細胞、胸腺細胞、またはリンパ節細胞を獲得し、次いで再懸濁させ、BMについてのように細胞をペレット化した。細胞をFACS洗浄緩衝液（FACS  WB）（ハンク均衡塩溶液、1％BSA、10mMのHepes、pH7.4）の中に20×106細胞／mlの濃度に再懸濁させた後染色した。
【０３２６】
染色するために、1×106細胞を5mlの管に移し、1mlのFACS WBで洗浄し、次いで1000×gにおいてペレット化した。次いで細胞を氷上で飽和量の適当なFITC−、PE−および／またはTriColor（TC）−結合モノクローナル抗体の存在下にFACS WB中の全体積100mlで20分間インキュベートした。細胞を1.5mlのWBで洗浄し、ペレット化し、次いで400mlのWBの中に再懸濁させ、CellQuestソフトウェア（Becton Dickinson、カリフォルニア州マウンテンビュー）を使用してFACSCaliburフローサイトメーター上で分析した。前方向（FSC）および側面（SSC）光散乱装置の検出器を線形目盛り上に設定したが、これに対して対数検出器をすべての3つの蛍光チャンネル（FL−1、FL−2、およびFL−3）について使用した。
【０３２７】
単一色で染色された細胞集団を使用する各実験のために、FLチャンネルの間でオーバーラップするスペクトルを使用した。すべての細胞を収集し、ディスクにアンゲート（ungate）し、CellQuestソフトウェアを使用してデータを分析した。FSC対SSCプロファイルに基づいて電子的にゲーティングしたデータにより、RBCおよび死んだ細胞を排除した。
【０３２８】
フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗CD8モノクローナル抗体（mAb）（クローン53−6.7）およびフィコエリトリン（PE）結合抗CD4（クローンRM4−5）、抗CD5（クローン53−7.3）。抗CD19（クローン1D3）、および抗シンデカン（クローン281−2）モノクローナル抗体をPharMingen（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。TriColor（TC）結合抗CD45R／B220モノクローナル抗体（クローンRA3−6B2）をCaltagから購入した。
【０３２９】
リンパ系区画においてztnf4を過剰に発現するトランスジェニックマウスは、増加した数の末梢B細胞、増加した形質細胞および増加したレベルの血清免疫グロブリンを発生させる。これらのトランスジェニック動物は、脾臓、リンパ節および胸腺において増加した数のB200＋細胞を有する。増加した数の脾B細胞は、慣用B−2細胞および通常稀な集団のB−1細胞の両方を包含する。一般に、B−1細胞は大部分腹膜および他の体腔に制限され、低いアフィニティーの自己反応性抗体を産生し、しばしば自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデスSLEの発生に関係づけられてきている。
【０３３０】
高齢のトランスジェニック動物は、自己抗体を産生し、全身性エリテマトーデスの特徴を示すタンパク尿および硬化性糸球体を発生する。
第5A図は、後述するように調製し、抗B220−TCで染色し、フローサイトメトリーにより分析した脾臓（上部パネル）、腸間膜リンパ節（中央パネル）、および骨髄（下部パネル）の単細胞懸濁液を示す。B220＋細胞の百分率に血球計で計数した生きている（トリパンブルー排除）細胞の総数を掛けることによって、各組織におけるB220＋の数を計算した。各バーは個々のztnf4トランスジェニックマウス（Tg、陰影をつけたバー）または非Tg同腹子対照マウス（白抜きバー）を表す。
【０３３１】
第5B図は、示した分子（DC5、CD4およびCD8）に対するモノクローナル抗体で染色し、次いでフローサイトメトリーにより分析した、ztnf4  TG（右側パネル）または非TG同腹子（左側列）、脾臓（中央列）、および胸腺（下部列）から単離された細胞を示す。示されたデータはゲーティングして死亡した細胞およびRBCは排除されている。
第5C図は、6〜23週齢の範囲のztnf4トランスジェニックマウスからの血清中の全IgG、IgM、およびIgEのレベルを示す。
【０３３２】
第5D図は、対照同腹子からの正常の糸球体に比較して、ztnf4トランスジェニックマウスからのH&E染色腎臓切片において同定された糸球体のアミロイド沈着および厚くなった糸球体間質を示す。
第5E図は、Mckay他（J. Exp. Med. 190：1697-1710、1999）の報告に類似する、ztnf4トランスジェニックマウスにおけるエフェクターT細胞の増加を示す。  ztnf4を過剰発現するトランスジェニック動物の中に、可溶性TACI（BR43x2）またはBCMA−Ig融合物を注射した（IP、IMまたはIV）、リンパ球系組織のフローサイトメトリー（FACS）分析を使用して、脾臓、リンパ節および胸腺におけるB220＋細胞の数の変化を同定する。
【０３３３】
実施例10．直接的結合性ELISA
in vitroにおけるztnf4の生物学的活性に結合しかつそれを阻害する可溶性TACI-Igまたは可溶性BCMA-Igの能力を特性決定するために、直接的結合性ELISAを開発した。
96ウェルのプレートを1μg／mlのヤギ抗ヒトIgG（Jackson Labs、マサチュセッツ州バールハーバー）でELISA A緩衝液（0.1MのNa2HCO3、pH9.6、0.02％のNaN3）中の被覆し、4℃において一夜インキュベートした。TACI、BCMA、および対照として無関係のTNFレセプター、例えば、ztnfr10（配列番号42）を10μg／mlから320ng／ml＋ゼロに5倍希釈することによって力価決定し、2.5、0.5または0.1μg／mlのビオチニル化ztnf4または陰性対照としてオバルブミンと共インキュベートし、室温において1時間インキュベートした。
【０３３４】
次いで共インキュベートしたレセプター−ビオチニル化リガンド混合物を、ヤギ抗ヒトIgG被覆した96ウェルのプレートに添加した。次いでプレートを洗浄し（ELISA C、500μlのTween 20（Sigma Chemical Co.、ミゾリー州セントルイス）、200mgのNaN3、PBSで1リットルの最終体積にした）、Superblock（Pierce、イリノイ州ロックフォード）でブロックした。次いでプレートを37℃において2時間インキュベートした。
【０３３５】
プレートを再びELISA Cで洗浄し、次いで100μl／ウェルのnetr-avidin-HRPをELISA B（それぞれ、1％または2％について5または10μgのBSA（Sigma）、250μlのTween 20（Sigma）、100mgのNaN3、リン酸塩緩衝液pH7.2（PBS、Sigma）で500mlの最終体積にした。あるいは、緩衝液はELISA C緩衝液中で1％または2％のBSAとして構成した）中で1：10,000に添加した。次いでプレートを室温において10分間OPDで展開し、492において読んだ。
【０３３６】
実施例11．生物学的活性のアッセイ
ヒトB細胞の可溶性TACI−FC阻害、可溶性ztnf4の刺激を測定するために、生物学的活性のアッセイを展開した。CD19磁気ビーズおよびVarioMacs磁気分離システム（Miltenyi  Biotec  Auburn、カリフォルニア州）を製造業者のインストラクションに従いを使用して、B細胞を末梢血単核細胞（PBMNC）から単離した。精製したB細胞を可溶性ztnf4（25ng／ml）および組換えヒトIL−4（10ng／ml、Pharmingen）と混合し、丸底96ウェルのプレート上に1×105細胞／ウェルにおいてプレートした（トリプリケート）。
【０３３７】
可溶性TACI−FCを5μg／mlから6ng／mlに希釈し、B細胞と5日間インキュベートし、第4日に1μCiの3H−チミジン（Amersham）／ウェルで一夜パルスした。対照として、可溶性TACI−FCをまたB細胞およびIL−4とztnf4の非存在下にインキュベートした。
プレートをPackardプレート収集器で収集し、Packardリーダーにより計数した。TACI−Ig可溶性レセプターは、投与量従属的方法でin vitroにおいてB細胞増殖を刺激する可溶性ztnf4の能力を阻害した。10倍モル過剰のTACI-Igは、IL-4の存在下に可溶性ztnf4に応答してヒトB細胞の増殖を完全に阻害する。
【０３３８】
実施例12．ORIGINアッセイ
正常個体に関する疾患の症状（例えば、SLE、慢性関節リウマチ）を有する個体におけるztnf4のレベルを、電気化学的ルミネセンスアッセイにより測定した。10ng／ml、1ng／ml、0.1ng／ml、0.01ng／mlおよび0ng／mlにおいて可溶性ヒトztnf4から作成した標準曲線をORIGIN緩衝液（Igen、マリイランド州ガイサースバーグ）中で調製した。血清試料をORIGIN緩衝液中で希釈した。オリジンアッセイ緩衝液（IGEN）中で1μg／mlに希釈したビオチニル化ウサギ抗ヒトztnf4−NF BV抗体およびオリジンアッセイ緩衝液（IGEN）中で1μg／mlに希釈したルテニル化ウサギ抗ヒトztnf4−NF BVポリクローナル抗体と、標準および試料を室温において２時間インキュベートした。
【０３３９】
インキュベーション後、試料を渦形成し、0.4mg／mlのストレプトアビジンDynabeads（Dynal、ノールウェイ国オスロ）を標準および試料の各々に50μl／管で添加し、室温において30分間インキュベートした。次いで試料を渦形成し、試料をOrigin分析装置（Igen）で製造業者のインストラクションに従い読んだ。Originアッセイは電気化学的ルミネセンスに基づき、これは何であるか、これはどのように働くか、そしてこれは何を語るかのECLのリードアウトを生成する。
糸球体腎炎および自己免疫疾患の進行した段階に進行した、NZBWF1／JおよびMRL／Mpj−Faslp（商標）マウスからの血清試料において、増大したレベルのztnf4が検出された。
【０３４０】
実施例13．SLEの自発的モデルにおける可溶性TACI−Ig
NZBWマウスはほぼ7〜9月齢において自発的SLEについて症候性となる。平均、B細胞自己抗体産生がNZBWマウスにおいて高いと考えられるとき、TACI-FcをNZBWマウスに投与して、5週にわたってB細胞に対するその抑制作用をモニターした。
【０３４１】
100匹の、8週齢マウス（NZB×NZW）F1マウス（Jackson  Labs）を15匹のマウスの6グループに分割した。処置前に、マウスを尿タンパク質について1回／月モニターし、血液をCBCおよび血清バンキングのために抜き出した。血清を自己抗体についてスクリーニングする。タンパク尿は糸球体腎炎の特徴あるサインであるので、尿タンパク質レベルをディップスティックにより規則的間隔で研究過程にわたってモニターした。処置前に、動物を秤量した。マウスがほぼ5月齢のとき投与を開始した。マウスにベヒクルのみ（PBS）またはヒトIgG−FC（対照タンパク質）を3回／週で5週間腹腔内注射した。
【０３４２】
【表９】
2012001550.tif 000011
血液を投与の間に2回収集し、投与後少なくとも2回収集する。タンパク尿についての尿ディップスティック値および体重を投与開始後2週毎に取った。血液、尿のディップスティック値および体重を安楽死時に収集した。脾臓、胸腺、胆嚢を有する肝臓、左腎臓および脳の重量を測定した。脾臓および胸腺をFACSおよび組織学のために分割した。顎下唾液腺、腸間膜リンパ節鎖、胆嚢を有する肝臓小葉、大脳皮質膜および大腸、胃、小腸、膵臓、右腎臓、副腎、気管および食道を有する舌、心臓および肺をまた組織学のために収集する。
【０３４３】
図6は、SLEの発生と相関するNZBWF1およびMRL／lpr／lprマウスからの血清中のztnf4のレベルの増加を示す。第6A図の上のパネルは、ztnf4血清レベルと週齢、10〜40週齢範囲の68匹のNZBWF1マウス、および10週齢および30週齢のNZB／B対照マウスとの相関を示す。中央パネルは、対照NZB／Bマウスに比較して、NZBWF1マウスにおける3つの範囲、すなわち、微量〜20mg／dl（T−30）、100〜300ng／dlおよび2000mg／dlのタンパク尿の相関を示す。下のパネルは、対照NZB／Bマウスに比較して、NZBWF1マウスにおける抗dsDNA抗体の種々の力価とztnf4レベルとを示す。
【０３４４】
図6Bは、18〜24週齢範囲の23匹のMRL／lpr／lprマウスおよび10匹の11週齢のMRL／MpJマウスに対して行った同一相関を示す。
図7は尿分析の結果を示す。ディップスティックの読みが＞100mg／dlである場合、マウスはタンパク尿を有すると考えた。（A）PBS、（B）ヒトIgG  FC、100mg、（C）ヒトIgG  FC、20mg、（D）ヒトTACI−IgG、100mg、および（E）ヒトTACI−IgG、20mg。可溶性TACI−IgG融合物で処置したマウスはタンパク尿の減少を示した。
【０３４５】
処置した動物からの末梢血の分析において、FC（20および100mg）およびPBS処置マウスに比較したとき、処置開始後2週において、白血球およびリンパ球の計数はTACI−FC（20および100mg）処置マウスにおいて減少することが明らかにされた。処置後6週に抜き出した末梢血のFAC分析（リンパ球ゲート）は試料の中に存在するB細胞の百分率の減少を示し始め（最後の処置を投与した後2週）そして百分率の劇的な減少を示した。最後の処置を投与した後5週にB細胞レベルはなお減少したが、劇的ではなかった。表10は各処置グループ（表10）におけるマウスについて平均（および標準偏差）を提供する。末梢血中のB細胞レベルの百分率の減少は、また、処置の2週に入って観測された。
【０３４６】
【表１０】
2012001550.tif 000012
【０３４７】
実施例14．正常マウスにおける可溶性TACI−Ig
TACI−FCをBalb/Cマウスに投与して、正常マウスに対するその作用をモニターした。60匹の8週齢の雌Balb/Cマウス（HSD）を5匹の12グループに分割した。処置前に、マウスを秤量し、血液をCBCおよび血清バンキングのために抜き出した。グループ1〜9にベヒクルのみ（PBS）またはヒトIgG−FC（対照タンパク質）またはTACI−FC4（被験タンパク質）を毎日12日間腹腔内注射（IP）し、第14日に殺した。グループ10および11に、3回／週2週間腹腔内注射し、第14日に殺した。
【０３４８】
【表１１】
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【０３４９】
血液を第7日および第12日に収集した。血液および体重を安楽死時に収集した。脾臓、胸腺、および脳の重量を測定した。脾臓および胸腺をFACSおよび組織学のために分割した。皮膚、脾臓、腸間膜LN鎖、顎下唾液腺、卵巣、子宮、頸、膀胱、腸間膜リンパ節鎖、胆嚢を有する肝臓小葉、大脳皮質膜および大腸、胃、小腸、膵臓、右腎臓、副腎、気管および食道を有する舌、心臓、胸腺、大腿筋肉、左および右大腿骨、脳を、また、組織学のために収集する。
【０３５０】
実施例13において前述したように、FC4またはPBS単独で処置しかつCBCによりFACSにより分析したものに比較して、すべてのTACI−FC4処置試料から採った末梢血細胞において第7日（CBCによる）および第12日（FACSを使用する）に、B細胞百分率の有意な減少が見られた。さらに、第14日にFC4処置したマウスからのものに比較して、TACI−FC4で処置した動物から採った脾臓中のB細胞は50％減少した。
【０３５１】
実施例15．抗dsDNA ELISA
自己免疫性は高いレベルの抗二本鎖DNA抗体により特性決定される。ztnf4を過剰に発現するマウスおよびNZBWマウスの両方における抗dsDNA抗体のレベルを測定するために、ELISAアッセイを開発した。96ウェルのマイクロタイタープレート（Nunc）をポリ−L−リシン（Sigma）（0.1MのTris緩衝液pH7.3中の20μl／ml）で75μl／ウェルにおいて被覆し、室温において一夜インキュベートした。次いでプレートをdH2O中で洗浄し、ポリdAdT（Sigma）（0.1MのTris緩衝液pH7.3中の20μl／ml）で75μl／ウェルにおいて被覆し、室温において60分間インキュベートした。次いでプレートをdH2O中で洗浄し、Tris緩衝液中の2％BSA（Sigma）で室温において30分間ブロックし、次いでdH2O中で最後に洗浄した。
【０３５２】
実施例10に記載するztnf4トランスジェニックマウスおよび実施例11に記載するNZBWマウスから、血清試料を採った。血清試料をTris緩衝液中の１％BSA／2％BGG（Calbiochem）中で1：50に希釈した。次いで希釈試料を被覆したプレートの中に1：50、1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200および1：6400（50μl／ウェル）で滴定し、室温において90分間インキュベートした。
【０３５３】
次いでプレートをdH2O中で洗浄し、そして1％BSA／2％BGG中で1：1000に希釈したヤギ抗マウスIgG-Fc-HRP（Cappel）を50μl／ウェルにおいて添加した。プレートを室温において60分間インキュベートした。プレートをdH2O中で5×洗浄し、OPD、1タブレット／10mlのDnovo Dで現像し、100μl／ウェルでプレートした。現像剤を1N H2SO4、100μl／ウェルで停止させ、ODを492nmにおいて読んだ。
図８は、NZBWF1（32週齢）およびMRL／lpr／lpr（19週齢）マウスからの血清中で検出されたレベルに比較して、２匹のztnf4トランスジェニックマウス（23週齢）、2匹の非トランスジェニック同腹交配体における抗dsDNAレベルを示す。
【０３５４】
実施例16．ELEの自発的モデルにおける可溶性TACI-Ig
25匹の雌PLxSJL F1マウス（12週齢、Jackson Labs）に、完全フロインドアジュバント中で処方した125μg／マウスの抗原（ミエリンプロテオリピドタンパク質、PLP、残基139〜151）を皮下注射した。マウスを5匹のマウスの5グループに分割する。百日咳トキシン（400ng）を第0日および第2日に腹腔内注射する。グループに1×、10×、または100×投与量のTACI、BCMAまたはBR43x2を与え、1つのグループにベヒクルのみを与え、そして1つのグループを処置しない。
【０３５５】
予防的処置は第0日に開始し、関与的処置は第7日に、あるいは臨床的徴候の発現において開始する。疾患の徴候、体重喪失、および麻痺はほぼ10〜14日に発現し、約1週連続する。体重を収集し、それらの症状の程度に対応する臨床的スコアを割当てることによって、動物を評価する。EAEの臨床的徴候は接種の10〜14日以内に出現し、ほぼ1週間持続する。研究の終わりにおいて、すべての動物をガスの過剰投与により安楽死させ、剖検する。脳および脊髄を組織学のために収集するか、あるいはmRNA分析のために凍結させる。体重および臨床的スコアのデータを個体およびグループによりプロットする。
【０３５６】
臨床的スコア
0    正常
0.5  弱い、尾の緊張が減少するが、非存在ではない。
1    力のない尾（マウスを尾の基部で持ち上げるとき直立しない）。
2    力のない、弱い脚（尾を持ち上げることができない、後ろ脚で直立するが、脚は不安定である）。
3    麻痺（体重下に脚で座ることができず、脚でこいで後方に歩くことができない）。
4    麻痺（後ろ脚を後方に動かすことができない、歩こうとしたとき、脚を引きずる）。
5    四肢麻痺（前脚の麻痺または円形パターンの歩き、頭を傾けることができる）。
6    瀕死（完全に麻痺、食物または水に到達することができない、動物を殺す）。
実施例17．慢性関節リウマチのTACI-FCおよびCIAモデル
8週齢の雄DBA／1Jマウス（Jackson Labs）を5マウス／移植片拒絶反応のグループに分割し、3週の間隔で50〜100μlの1mg／mlのコラーゲン（ヒヨコまたはウシ由来）を2回皮下注射する。1匹の対照にコラーゲンを注射しない。第1注射を完全フロインドアジュバント中で処方し、第2注射を不完全フロインドアジュバント中で処方する。第2注射時にまたはその前に、あるいは動物が少なくとも24時間持続する2またはそれより大きい臨床的スコアを発生した後、TACI-FCを予防的に投与する。
【０３５７】
第2コラーゲン注射後、通常2〜3週以内に、動物は関節炎の症候を示し始める。足の厚さをキャリパーで測定し、各足に対する臨床的スコア（0〜3）を評価することによって、疾患の程度を各足において評価する。臨床的スコア、0  正常、1  足指の炎症、2  軽度の足の炎症、3  中程度の足の炎症、および4  重度の足の炎症。1組の期間、使用7日間に確立された疾患を有するようになった後、動物を安楽死させる。足を組織学またはmRNA分析のために収集し、そして血清を免疫グロブリンおよびサイトカインのアッセイのために収集する。
【０３５８】
実施例18．中和性TACI抗体
2匹の雌ニュージーランド白ウサギをペプチド、huztnf4-1  SAGIAKLEEGPELQLAIPRE（配列番号59）またはhuztnf4-2  SFKRGSALEEKENKELVKET（配列番号60）で免疫化することによって、ポリクローナル抗ペプチド抗体を調製した。Applied Biosystems 431A型ペプチド合成装置（Applied Biosystems，Inc.、フォスターシティー、カリフォルニア州）を製造業者のインストラクションに従い使用して、ペプチドを合成した。
【０３５９】
次いでペプチドを担体タンパク質キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）にマレイミド活性化により複合化した。ウサギの各々に完全フロインドアジュバント中の200μgのペプチドを初期腹腔内（ip）注射を与え、次いで3週毎に不完全フロインドアジュバント中の100μgのペプチドをブースターip注射した。第2ブースター注射（3回の全注射）の投与後7〜10日に、動物を放血させ、血清を収集した。次いで動物にブースター投与し、3週毎に放血させた。
【０３６０】
抗体ターゲットとして抗体（配列番号59および60）をつくるために使用した1μg／mlのペプチドを使用するELISA力価チェックにより、ztnf4ペプチド特異的ウサギ血清を特性決定した。huztnf4−1ペプチド（配列番号59）に対する2つのウサギ血清は、1：1E5（1：100000）の希釈でそれらの特異的ペプチドに対する力価を有する。huztnf4−2ペプチド（配列番号60）に対する2つのウサギ血清は、1：1E5の希釈でそれらの特異的ペプチドに対して、そして組換え全長のタンパク質（バキュロウイルス（huztnf4s-NF-Bv）においてつくられたN末端のFLAGタッグドztnf4およびBHK細胞においてつくられたC末端のFLAGタッグドztnf4）に対して力価を有した。
【０３６１】
10mgの特異的ペプチド（配列番号59または60）／gのCNBr-SEPHAROSEを使用して調製されたCNBr-SEPHAROSE  4Bタンパク質カラム（Pharmacia LKB）を使用してウサギ血清から、ztnf4ペプチド特異的ポリクローナル抗体をアフィニティー精製し、次いでPBS中の一夜20×透析した。抗体ターゲットとして1μg／mlの適当なペプチド抗原または組換え全長のタンパク質（huztnf4s-NF-Bv）を使用するELISA力価チェックにより、ztnf4特異的抗体を特性決定した。
【０３６２】
その特異的抗原（huztnf4−1ペプチド、配列番号59）に対するウサギ抗huztnf4−1アフィニティー精製した抗体のより低い検出限界（LLD）は、5ng／mlの希釈である。その特異的抗原（huztnf4−2ペプチド、配列番号60）に対するウサギ抗huztnf4−2アフィニティー精製した抗体のより低い検出限界（LLD）は、0.5ng／mlの希釈である。組換えタンパク質huztnf4s−NF−Bvに対するウサギ抗huztnf4−2アフィニティー精製した抗体のより低い検出限界（LLD）は、5ng／mlの希釈である。
【０３６３】
マウスモノクローナル抗体をまた発生させ、ビオチン標識化可溶性ztnf4の阻害の阻害のために選択した。TACIモノクローナル抗体（248.14、248.23、248.24、または246.3）のいずれもBCMAに対するztnf4の結合をブロックしない。モノクローナル248.23は、コンディショニングした培地を1：243に希釈したとき、10ng／mlのztnf4−ビオチンの結合を約50％に減少させ、そして未希釈測定中で約2×に結合を減少させる。モノクローナル246.3はコンディショニングした培地の1：243および1：181の希釈においてztnf4−ビオチンの結合を約50％減に少させ、そして未希釈測定中で約5×に結合を減少させる。
【０３６４】
以上から、理解されるように、本発明の特定の態様を例示の目的で本明細書に記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱しないで種々の変更が可能である。したがって、本発明は添付された特許請求の範囲による以外制限されない。
【図１】
2012001550.tif 000014
【図２】
2012001550.tif 000015
【図３Ａ】
2012001550.tif 000016
【図３Ｂ】
2012001550.tif 000017
【図４】
2012001550.tif 000018
【図５Ａ】
2012001550.tif 000019
【図５Ｂ】
2012001550.tif 000020
【図５Ｃ】
2012001550.tif 000021
【図５Ｅ】
2012001550.tif 000022
【図６Ａ】
2012001550.tif 000023
【図６Ｂ】
2012001550.tif 000024
【図７】
2012001550.tif 000025
【図８】
2012001550.tif 000026
【配列表】
2012001550000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月2日(2011.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：18のポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体断片を含んで成る、哺乳類においてBR43x2、TACI又はBCMA受容体とztnf４との結合を阻害することにより全身性エリテマトーデスに関連する抗体の産生を阻害するための医薬組成物。
【請求項２】
配列番号：２のポリペプチドをコードする単離されたポリプクレオチド分子。
【請求項３】
配列番号：１の単離されたポリプクレオチド分子。
【請求項４】
作用可能に連結された下記の要素：
転写プロモーター；
請求項２に記載のポリヌクレオチド分子；及び
転写ターミネーター；
を含んで成る発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターが導入されており、前記ポリヌクレオチド分子によりコードされているポリペプチドを発現する、培養された細胞。
【請求項６】
ポリペプチドの製造方法において、
請求項４に記載の発現ベクターが導入されており、前記ポリヌクレオチド分子によりコードされているポリペプチドを発現する細胞を培養し；そして
上記の発現されたポリペプチドを回収する；
ことを含んで成る方法。
【請求項７】
配列番号：２のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。
【請求項８】
医薬として許容される担体と組み合わされた請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
下記のポリペプチド：
ａ）BR43x2（配列番号：２）の細胞外ドメインを含んで成るポリペプチド；及び
ｂ）配列番号：10の配列を含んで成るポリペプチド；
から成る群から選択される化合物を含んでなる、
ぜん息、気管支炎、気腫、末期腎不全、軽鎖神経疾患、アミロイドーシス、炎症、膜ネフロパシー、IgAネフロパシー、バーガー病、IgMネフロパシー、グッドパスチャー病、感染後糸球体腎炎、メサンギウム増殖疾患、最小変化腎症候群、二次糸球体腎炎又は狼瘡関連脈管炎の治療のため、或いは自己免疫疾患に関連する抗体の産生の阻害のための医薬組成物。
【請求項１０】
前記化合物が融合タンパク質であり、当該融合タンパク質がペプチド結合により連結された第１の部分と第２の部分とから成り、当該第１の部分が配列番号：２のアミノ酸残基25−58を含んで成るポリペプチドを含み、そして当該第２の部分が他のポリペプチドを含んでなる、ことを特徴とする請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記第１の部分が、配列番号：２のアミノ酸残基59−120から成るポリペプチドを更に含んでなる、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記第１の部分が、BR43x2（配列番号：２）の細胞外ドメインを含んで成るポリペプチドである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記第２の部分が免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項10〜12のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域が、IgG1のヒト免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
当該医薬が融合タンパク質のマルチマーを含んで成る、請求項10〜15のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
当該医薬が、２個の定常領域を含み且つ可変ドメインを欠く免疫グロブリン重鎖定常領域を含んで成る、請求項16に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記抗体の産生が、全身性エリテマトーデス、筋無力症、多発性硬化症又は関節リウマチから選択される自己免疫疾患に関連する、請求項９〜17のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記抗体の産生が、インシュリン依存性糖尿病又はクローン病から選択される自己免疫疾患に関連する、請求項９〜17のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記腎疾患が、糸球体腎炎、脈管炎、腎炎又は腎盂腎症である、請求項９〜17のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記炎症が、関節痛、腫脹又は敗血性ショックに関連する、請求項９〜17のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
下記のアミノ酸残基：
配列番号：８のアミノ酸残基１−48；
配列番号：８のアミノ酸残基８−37；
配列番号：８のアミノ酸残基41−88；
配列番号：８のアミノ酸残基８−88；又は
配列番号：８のアミノ酸残基１−150；
から成る群から選択されるアミノ酸配列から成るポリペプチド。
【請求項２３】
請求項22に記載のポリペプチドを含んで成る、哺乳類における、ぜん息、気管支炎、気腫、腎疾患、末期腎不全、腎新生物、多発性骨髄腫、リンパ腫、軽鎖神経疾患、アミロイドーシス又は炎症の治療のため、或いは自己免疫疾患に関連する抗体の産生を阻害するため又はエフェクターＴ細胞を阻害するための医薬組成物であって、当該阻害がさらに、移植片拒絶、移植片対宿主病、自己免疫疾患又は炎症に関連する免疫抑制を含む、前記医薬組成物。
【請求項２４】
ペプチド結合により連結された第１の部分と第２の部分とから成る融合タンパク質において
当該第１の部分が請求項22に記載のポリペプチドから成り；そして
当該第２の部分が、免疫グロブリン重鎖定常領域、又は２個の定常領域を含み且つ可変ドメインを欠く免疫グロブリン重鎖定常領域Fcフラグメントである；
ことを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２５】
前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項24に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
前記ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域が、IgG1のヒト免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項25に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
前記FcフラグメントがヒトIgG1に由来する、請求項24に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
前記Fcフラグメントが、Fc受容体結合機能又は補体（C1q）結合機能を除去するように修飾されている、請求項24又は27に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
融合タンパク質のマルチマーの形態である、請求項24〜28のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
哺乳類における、ぜん息、気管支炎、気腫、腎疾患、末期腎不全、腎新生物、多発性骨髄腫、リンパ腫、軽鎖神経疾患、アミロイドーシス又は炎症の治療のため、或いは自己免疫疾患に関連する抗体の産生を阻害するため又はエフェクターＴ細胞を阻害するための医薬であって、当該阻害がさに、移植片拒絶、移植片対宿主病、自己免疫疾患又は炎症に関連する免疫抑制を含む、当該医薬の製造のための、請求項24〜29のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含んで成る医薬組成物。
【請求項３１】
前記抗体の産生が、全身性エリテマトーデス、筋無力症、多発性硬化症又は関節リウマチから選択される自己免疫疾患に関連する、請求項30に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記抗体の産生が、インシュリン依存性糖尿病又はクローン病から選択される自己免疫疾患に関連する、請求項31に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記腎疾患が、糸球体腎炎、脈管炎、腎炎又は腎盂腎症である、請求項30に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記炎症が、関節痛、腫脹又は敗血性ショックに関連する、請求項30に記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
2012001550000001.pdf