(57)【要約】【課題】  体組織の細胞増殖と再生を促進し、加工性に優れる生体親和性の再生医療用樹脂組成物を提供することを目的とする。【解決手段】  ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）と生体親和性樹脂を含有してなる樹脂組成物であって、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を０．１〜５０重量％含むことを特徴とする再生医療用樹脂組成物である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）と生体親和性樹脂を含有してなる樹脂組成物であって、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を０．１〜５０重量％含むことを特徴とする再生医療用樹脂組成物。
【請求項２】
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を構成する３−ヒドロキシアルカン酸ユニットにおける３−ヒドロキシブタン酸ユニットのモル分率が１０モル％以下である請求項１に記載の再生医療用樹脂組成物。
【請求項３】
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）の重量平均分子量が１万以上である請求項１または請求項２に記載の再生医療用樹脂組成物。
【請求項４】
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）のガラス転移温度が−２０℃以下である請求項１〜３のいずれかに記載の再生医療用樹脂組成物。
【請求項５】
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）が二重結合を有するモノマユニットを０．１モル％以上含有する請求項１〜４のいずれかに記載の再生医療用樹脂組成物。
【請求項６】
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）が、微生物により生産されたものである請求項１〜５のいずれかに記載の再生医療用樹脂組成物。
【請求項７】
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）が、シュードモナス（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物により生産されたものである請求項６に記載の再生医療用樹脂組成物。
【請求項８】
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）が、シュードモナス  プチダ（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）かＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＧ４５０２（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−５７８）から選ばれる少なくとも１種により生産されたものである請求項７記載の再生医療用樹脂組成物。
【請求項９】
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＧ４５０２（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−５７８）のポリヒドロキシアルカノエート重合酵素遺伝子を導入した遺伝子組み替え体により生産されたものである請求項１〜５のいずれかに記載の再生医療用樹脂組成物。
【請求項１０】
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＧ４５０２（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−５７８）由来のポリヒドロキシアルカノエート重合酵素を用いて生産されたものである請求項１〜５のいずれかに記載の再生医療用樹脂組成物。
【請求項１１】
生体親和性樹脂がポリ乳酸である請求項１〜１０のいずれかに記載の再生医療用樹脂組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の再生医療用樹脂組成物を用いて形成される再生医療用多孔体。
【請求項１３】
気孔率が２０から９５％であり、気孔径の範囲が１μｍから５００μｍである請求項１２に記載の再生医療用多孔体。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれかに記載の再生医療用樹脂組成物を用いて形成される再生医療用フィルム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体適合性に優れた樹脂組成物および製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
外傷や病気により生じた身体欠損部の治療法として、患者自身の身体から採取した組織を用いる自己移植、他人の身体から採取した組織を用いる他家移植、人工組織の補填などが用いられている。これらの治療法は有効であるが、自己移植では身体の健全な部位から組織を採取するため肉体的・精神的な負担が大きく、採取量や回数に制限が生じる。また、他家移植では感染症やドナー不足等の問題がある。人工組織では、金属材料等を用いた場合永久に体内に残ることになり、炎症を起こす可能性がある。そのため、身体への負担が少ない新しい再生医療材料が求められている。
【０００３】
このような背景から、医療用足場材の構築が注目されている。医療用足場材は、損傷部への細胞の接着・増殖を補助することで組織の再生を促進する。そのため、早急な病気や怪我の治療が可能となる。足場材料としては、特許文献１に示すようなポリ乳酸とその共重合体であるポリ乳酸系高分子が最も多く研究、使用されてきた。ポリ乳酸は、生体吸収性があり、力学的強度が高く成形が容易で、構成成分である乳酸が体内代謝物であることから安全性に優れている。また、特許文献２に示すポリグリコール酸や特許文献３に示すポリカプロラクトン等の合成樹脂も足場材として用いられてきた。これらの生体吸収性合成樹脂は、早くから生体分解性医療用材料として利用が検討されており、ねじやプレートなどの骨固定材、縫合糸などとして実用化されている。しかし、これらの合成樹脂は細胞接着性等の生体親和性が悪く、硬くて柔軟性に欠けるため軟組織に用いられないといった欠点がある。
【０００４】
合成樹脂の欠点改善のため、特許文献４に示すようなコラーゲンやゼラチンなどの天然樹脂も再生医療用材料として用いられる。天然樹脂は、柔軟性があり細胞親和性等の生体親和性が高い利点がある。しかし強度が弱く加工性に劣り、動物由来の天然樹脂では肝炎やＨＩＶ、クロイツフェルトヤコブ病などの感染源に汚染される恐れがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２４２７２８号公報
【特許文献２】特開２００４−１６２２１５号公報
【特許文献３】特開２００５−５２２２４号公報
【特許文献４】特開２００６−２５７０１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、体組織の細胞増殖と再生を促進し、加工性に優れる生体親和性の再生医療用樹脂組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の通りである。
（１）  ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）と生体親和性樹脂を含有してなる樹脂組成物であって、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を０．１〜５０％含むことを特徴とする再生医療用樹脂組成物。
（２）  ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）中の３−ヒドロキシブタン酸ユニットのモル分率が１０モル％以下である再生医療用樹脂組成物。
（３）  ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）の重量平均分子量が１万以上である再生医療用樹脂組成物。
（４）  ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）のガラス転移温度が−２０℃以下である再生医療用樹脂組成物。
（５）  ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）が二重結合を有するモノマユニットを０．１モル％以上含有する再生医療用樹脂組成物。
（６）  ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）が、微生物により生産されたものである再生医療用樹脂組成物。
（７）  ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）が、シュードモナス（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物により生産されたものである再生医療用樹脂組成物。
（８）  ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）が、シュードモナス  プチダ（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）かＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＧ４５０２（受託番号：ＮＩＴＥＰ−５７８）から選ばれる少なくとも１種により生産されたものである再生医療用樹脂組成物。
（９）  ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＧ４５０２（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−５７８）のポリヒドロキシアルカノエート重合酵素遺伝子を導入した遺伝子組み替え体により生産されたものである再生医療用樹脂組成物。
（１０）  ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＧ４５０２（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−５７８）由来のポリヒドロキシアルカノエート重合酵素を用いて生産されたものである再生医療用樹脂組成物。
（１１）  生体親和性樹脂がポリ乳酸である再生医療用樹脂組成物。
（１２）  上記いずれかに記載の再生医療用樹脂組成物を用いて形成される再生医療用多孔体。
（１３）  気孔率が２０から９９％であり、気孔径の範囲が１ｎｍから１ｍｍである上記いずれかに記載の再生医療用多孔体。
（１４）  上記いずれかに記載の再生医療用樹脂組成物を用いて形成される再生医療用フィルム。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を用いるため、天然樹脂のメリットである生体親和性を持ちながら、微生物由来樹脂であるため人獣共通感染症の心配がない。さらには、細胞増殖を促進する作用を持つため医療用足場材料として好ましい性質を持つ。
【０００９】
本発明によれば、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を含有した再生医療用樹脂組成物を提供でき、細胞増殖性を促進させることによって病気や怪我を早急に治療できる再生医療用樹脂組成物を提供することが可能となる。
【００１０】
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）と生体親和性樹脂を含有する樹脂組成物を多孔体とすることで、表面積が増えて細胞が接着しやすくなる。また栄養と酸素の供給がしやすくなる。この効果により、骨や歯でより高い治療効果を発揮する再生医療用樹脂組成物を提供できる。
【００１１】
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）と生体親和性樹脂を含有する樹脂組成物をフィルムとすることで、傷表面を覆ったり傷を塞いだりすることができる。この効果により、傷治療や角膜再生の際により高い治療効果を発揮する再生医療用樹脂組成物を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の再生医療用樹脂組成物は、微生物が合成可能であり生体適合性に優れるポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を含有したものである。
【００１３】
前記ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）は、どのような方法で得られたものでも使用できるものであるが、特に、微生物により生産されたポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）であることが好ましく、微生物としては、シュードモナス（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物であることが好ましく、さらに、シュードモナス  プチダ（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）か、あるいはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＧ４５０２（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−５７８）から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。また、本発明のポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＧ４５０２（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−５７８）のポリヒドロキシアルカノエート重合酵素遺伝子を導入した遺伝子組み替え体により生産されたものであってもよく、また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＧ４５０２（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−５７８）由来のポリヒドロキシアルカノエート重合酵素を用いて生産されたものであってもよい。
【００１４】
本発明で使用するポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）は生体親和性樹脂に柔軟性を付与するため、柔軟性を有することが好ましい。そのため、高い結晶性を発現する３−ヒドロキシブタン酸ユニットを含む場合、そのポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）中のモル分率は１０モル％以下が好ましく、５％以下がより好ましく、２％以下が特に好ましい。３−ヒドロキシブタン酸モノマユニット量が多すぎると、結晶性が増大し柔軟性が得にくくなるからである。
【００１５】
本発明で使用するポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）の重量平均分子量は１０，０００以上が好ましく、５０，０００以上がより好ましく、１００，０００以上が特に好ましい。上限は特に制限されないが、通常１００万以下とされる。分子量が低すぎると、再生医療用多孔体や再生医療用フィルムを成形する際に強度が弱すぎるといった問題がある。また、分子量が大きすぎると溶媒への溶解性が低下するとともに溶液粘度が大きくなり取り扱いが困難になるので好ましくない。なお、重量平均分子量は、ゲルパーミエ−ションクロマトグラフィー法により測定し、標準ポリスチレン検量線を用いて算出することができる。
【００１６】
本発明のポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）のガラス転移温度は−２０℃以下が好ましく、−３０℃以下がより好ましく、−３５℃以下が特に好ましい。下限は特にないが通常−１００℃以上とされる。ガラス転移温度が高すぎるとガラス状態となり、柔軟性を保持できなくなってしまう問題がある。なお、ガラス転移温度は、示差走査熱量計（ＤＳＣ）により測定することができる。
【００１７】
本発明のポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）はモノマユニットの側鎖に二重結合を導入したものも好ましく使用できる。このようなモノマユニットの側鎖に二重結合が導入されたポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）をそのまま用いても差し支えないが、例えば、分子量不足のため粘着剤の凝集力に問題がある場合に、架橋剤や熱または光重合開始剤の存在下で熱または光を用いて架橋または鎖延長を行っても良く、粘度や強度の改善ができる。用いる架橋剤や開始剤に制限はないが、架橋剤としては、複数のアクリロイル基やメタクリロイル基をもつモノマ、ビスマレイミド等が使用できる。また、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）中の二重結合を有するモノマユニットの含有量は、少なすぎると架橋または鎖延長が困難になるため、最小含有量は０．１モル％以上が好ましく、１％以上が好ましく、５％以上が特に好ましい。また、多すぎると均一な架橋反応物を得がたいため、最大含有量は３０モル％以下が好ましく、２５モル％以下がより好ましく、２０モル％以下が特に好ましいが、このような架橋処理をしないのであれば、二重結合を有するモノマユニットの含有量が３０モル％を超えても何ら差し支えない。
【００１８】
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）は、微生物による合成法、酵素などを用いる生化学的合成法、化学合成法による合成が可能である。化学合成法としては、例えば、（Ｒ）−β−ブチロラクトン、ε−カプロラクトン、δ−バレロラクトン等の脂肪酸ラクトンを、触媒下で開環重合する方法により合成する方法があげられる。生体適合性に優れる点からは、微生物による合成法や生化学的合成法を用いることが好ましく、以下に微生物による合成法を説明する。
【００１９】
微生物によりポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を合成するには、微生物に対し、炭素源を過剰に与え、窒素、リン等をある程度制限した条件下で培養することに行うことができる。培養装置としては温度、ｐＨ、溶存酸素量などを制御可能なジャーファーメンターを用いることができる。培養に先立ち、炭素源や他の栄養分を含む培地を予め加熱滅菌することで、目的外の微生物によるコンタミネーションを防ぐことができる。
【００２０】
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を合成する微生物としては、シュードモナス  プチダ（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス  オレオボランス（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス  チコリ（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｉｃｈｏｒｉｉ）、シュードモナス  レジノボランス（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）等のシュードモナス属、アルカリゲネス  ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）、アルカリゲネス  フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、アルカリゲネス  ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｏｒｏｐｈｕｓ）等のアルカリゲネス属の微生物等が知られているが、中でもシュードモナス属の微生物が好ましく、特にシュードモナス  プチダ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＧ４５０２（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−５７８）を好適に使用することができる。
【００２１】
培養に際して、使用される炭素源に特に制限はないが、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、アクリル酸、クロトン酸、２−ペンテン酸、２−ヘキセン酸、２−ヘプテン酸、２−オクテン酸、２−ノネン酸、２−デセン酸等の有機酸や油脂、グリセリン、アルコール類、グルコース、フルクトース、スクロース、廃糖蜜等の糖類、または、バイオディーゼル燃料副産物（ＢＤＦＢ）やこの中和品が好ましく使用される。なお、このなかでも、バイオディーゼル燃料副産物（ＢＤＦＢ）の中和品は後述するように、得られるポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）に二重結合を有するモノマユニットを導入できる点で好ましいものである。
【００２２】
生成されるポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）のモノマユニットとしては、使用する炭素源によって調整し得るが、例えば、グリコール酸、乳酸、３−ヒドロキシブタン酸、４−ヒドロキシブタン酸、リンゴ酸、３−ヒドロキシ吉草酸、クエン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、６−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸などのモノマユニットがあげられ、また、その一部のモノマユニットを、３−ヒドロキシヘキセン酸、３−ヒドロキシヘプテン酸、３−ヒドロキシオクテン酸、３−ヒドロキシノネン酸、３−ヒドロキシデセン酸、３−ヒドロキシドデセン酸、３−ヒドロキシウンデセン酸等のような側鎖に炭素−炭素二重結合を有する形となるモノマユニットとすることもできる。得られるポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）は、このようなモノマユニットを１種または２種以上の共重合体となっている。
【００２３】
培養する際の培地としては、完全培地または合成培地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地などを用い、ｐＨ７〜９、３０〜５０℃で、好気的に４〜４８時間程度培養することによりポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を菌体内に蓄積させる。次いで、このポリヒドロキシアルカン酸を回収する。
【００２４】
回収は、まず、培養終了後の培養液を遠心分離機等での固液分離を行い、菌体成分を回収する。微生物内からのポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）の回収方法としては、リゾチーム処理や次亜塩素酸処理による菌体成分の溶解によるポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）の分離や、ソックスレー抽出器を用いたクロロホルムまたは塩化メチレン等の溶媒抽出が使用できる。こうして得られたポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）は再沈処理等によって精製することができる。
【００２５】
なお、本発明で用いるポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）は、上記した微生物に産生させる方法以外に、例えば、「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＧ４５０２」から単離した、ＰＨＡ重合酵素（このＰＨＡ重合酵素は、Ｃ３〜６程度の短鎖長のヒドロキシアシルＣｏＡに基質特異性を示すＰＨＡ重合酵素Ｉと、Ｃ６〜１２程度の中鎖長のヒドロキシアシルＣｏＡに基質特異性を示すＰＨＡ重合酵素ＩＩとして分類されるものである）の遺伝子を他の微生物に導入した遺伝子組み替え体により、産生させることもでき、また、単離した酵素を用いて生化学的に合成することもできる。生化学的合成は、例えば、上記の単離したＰＨＡ重合酵素の存在下、ＣｏＡ、アシルＣｏＡシンセターゼやヒドラターゼなどとともに基質となる炭素源を反応させることにより得ることができる。なお、ＰＨＡ重合酵素をコードする遺伝子を単離し、他の微生物への導入などの一連の操作は公知の手段に従い達成できる。
【００２６】
本願発明の生体医療用樹脂組成物は、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）に加えて、その他の生体親和性樹脂を含む。その他の生体親和性樹脂としては、以下の例には限定されないが、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、カルシウム欠損型アパタイト、非晶質リン酸カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸八カルシウム  、フッ素化アパタイト、炭酸アパタイト、炭酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、モネタイト、及びコラーゲン、ゼラチン、キチン、キトサン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、フィブリン、アルギン酸、フィブロイン、デンプン、ペクチン、ペクチン酸、アガロース並びにこれらの部分分解物、酸化物、アルキレンオキシド付加物、及びポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリメタクリル酸メチル、メタクリル酸エステル系ポリマ、シリコーン樹脂、ポリグリコール酸、ポリ（ε−カプロラクトン）などが挙げられる。好ましくは、適度な強度を持つポリ乳酸である。
【００２７】
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）単体では加工性や強度が劣り、疎水性が強すぎて細胞接着性に劣るため、他の生体親和性合成樹脂に混合して使用する。さらに、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）の混合により生体親和性合成樹脂の表面自由エネルギーを変化させることができ、それにより細胞接着および細胞増殖しやすい基材表面にすることができる。混合する際、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）が多すぎると強度や細胞接着性の低下が起き、またポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）が少なすぎると細胞接着性が向上しない。そのため、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を生体親和性合成樹脂に混合する割合は、０．１〜５０重量％であり、０．１〜３０重量％が好ましく、０．１〜２０重量％がより好ましい。
【００２８】
本発明の樹脂組成物には、必要に応じて、粘着付与剤（タッキファイヤ）、可塑剤、充填剤を配合して使用しても良い。粘着付与剤としてはロジン、ロジン誘導体、クマロン・インデン樹脂、ポリテルペン樹脂、フェノール樹脂、石油系炭化水素樹脂等が使用できる。また、可塑剤としてはミネラルオイル、液状ポリブテン、液状ポリアクリレート、ラノリン、ジブチルフタレート等のフタル酸エステル等を使用できる。充填剤としては酸化亜鉛、水酸化アルミニウム、酸化チタン、炭酸カルシウム、クレイ等が使用できる。これらの成分を使用する場合は、配合の制限はないが、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）の生体親和性合成樹脂に混合する割合が０．１〜５０重量％となる範囲内で配合する。
【００２９】
本発明の再生医療用樹脂組成物を、再生医療用多孔体としてもよい。多孔体の気孔率は２０〜９５％であるのが好ましく、４０〜８５％がより好ましく、６０〜８０％が特に好ましい。また、多孔体の気孔径の範囲は１μｍから５００μｍであることが好ましく、１０μｍから３００μｍがより好ましく、２０μｍから２００μｍが特に好ましい。多孔体が前記範囲の気孔率を有すると、生体材料を例えば骨欠損部又は歯欠損部等に補填した時、気孔内により多量の生体物質が速やかに侵入、定着及び成長しやすく、生体内での代謝及び骨形成がより一層速やかになる。
再生医療用多孔体は、その製造方法としては特に制限はなく、公知の種々の方法が使用できる。例えば、組成物中にあらかじめ物質（例えば、ＮａＣｌ）を配合して成形した後、物質を溶媒に溶出させて気孔を得る方法がある。組成物中に配合する物質の粒子の大きさが大きくなるほど多孔体の気孔径も大きくなり、１〜５００μｍとすることで、気孔径の大きさを１〜５００μｍに制御することができる。また、配合する粒子の量を変化させることで気孔率を２０〜９５％まで変化させることができる。その他、組成物中にあらかじめ溶媒を混合し、加熱して溶融した後、樹脂が結晶化する温度で冷却して気孔を得る方法等が挙げられる。
【００３０】
本発明の再生医療用樹脂組成物は再生医療用フィルムとしてもよい。再生医療用フィルムは、前記再生医療用樹脂組成物から成り、フィルム基材上に形成することにより得ることができる。その製造方法としては特に制限はなく、公知の種々の方法が使用できる。再生医療用フィルムは、多孔体であってもよい。
【００３１】
基材としても特に制限はなく、ポリ塩化ビニルフィルム、ポリエチレンフィルム、ポリエステルフィルム、ポリプロピレンフィルム、エチレン―プロピレン共重合体フィルム、エチレン―酢酸ビニル共重合体フィルム等、種々のものを使用することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、次に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
（ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）の調製）
まず、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を、培養法により次のようにして調製した。培養に使用するＮＲ培地およびＭＳ培地は次のとおりのものである。
【００３３】
（ＮＲ培地の組成）                    培地１Ｌ中
バクトイーストエクストラクト              ３ｇ
バクトペプトン                            １０ｇ
エルリッヒカツオエキス                  １０ｇ
（ＭＳ培地の組成）                    培地１Ｌ中
リン酸水素二ナトリウム                ３．６ｇ
リン酸二水素カリウム                  １．５ｇ
塩化アンモニウム                      ０．５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物        ０．０１０４ｇ
トレースエレメント水溶液            ０．０５ｍＬ
「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＳＧ４５０２」を、ＮＲ培地２ｍＬに植菌し、４５℃で８時間培養した後、その培養液を新しいＮＲ培地に１００ｍＬに植菌し、一晩振盪培養した。この培養液６０ｍＬを、ＭＳ培地１．２Ｌを含む三角フラスコ（イワキ製）に添加して、４５℃で振盪培養した。培養開始時と１２、２４、３６時間経過時に炭素源を１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ずつ加えた。炭素源としては、グリセリンを用いた。４８時間培養後、４℃、８０００×ｇにて１５分間遠心して菌体を回収し、２０％エタノール水溶液、１００％エタノール水溶液、蒸留水の順に用いてこの菌体を洗浄後、凍結乾燥して乾燥菌体１．５００ｇ／Ｌを得た。
【００３４】
上記にて得られた乾燥菌体を、クロロホルムを溶媒としてソックスレー抽出機（柴田製）を用いてポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を抽出した後、エバポレーターにて溶媒を除去し、減圧乾燥させて生成物（ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸））を得た。得られたポリヒドロキシアルカン酸の生成量は０．６０９ｇ／Ｌであった。
【００３５】
次いで、上記にて得られたポリヒドロキシアルカン酸の分子構造を核磁気共鳴法（ＮＭＲ）を用いた１Ｈ−ＮＭＲによって確認した。ＮＭＲ測定は、ＭＳＬ４００分光器（Ｂｒｕｋｅｒ製）を用い、１Ｈに対し周波数４００ＭＨｚにて２５℃で行った。得られたポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルによれば、得られたポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）は、二重結合を有しないモノマユニットと二重結合を有するモノマユニットとで構成されるポリマであることがわかった。二重結合を有するモノマユニットの含有量は、１２モル％であった。
【００３６】
また、得られたポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）について、分子量を測定した。分子量は、ゲルパミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定し、測定は、ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＨＺＭ−Ｈカラム（６．０ｎｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ；東ソー製）を２本直列に接続し、移動相としてクロロホルムを用い、４０℃、流速０．３ｍＬ／分にて測定した。純正のポリスチレンを用いて検量線を作成し、数平均分子量（Ｍｎ）、重量平均分子量（Ｍｗ）および分子量分布（Ｍｎ／Ｍｗ）を算出した。その結果、Ｍｎは３６，０００であり、Ｍｗは６９，０００であった。
【００３７】
さらに、上記にて得られたポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を構成するモノマユニットの組成をガスクロマトグラフ法によって分析した。測定方法と条件とは以下に示すとおりである。まず、上記ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を１５重量％濃度の硫酸メタノール溶液２ｍＬとクロロホルム２ｍＬとの混合液に溶解し、１００℃で１４０分間処理しアルコリシスした。冷却後、超純水を１ｍＬ加えよく混合し静置し２層に分離させ、この下層を回収しフィルター濾過により不溶物を除去した。このうち０．５ｍＬと、０．１ｖｏｌ％カプリル酸メチルを含むクロロホルム溶液０．５ｍＬとを混合し、ＦＩＤを備えたキャピラリーガスクロマトグラフＧＣ−２０１０（島津製作所製製）にて昇温分析し、モノマユニットのメチルエステル化物の同定を行った。カラムは、ヒューズド・シリカ・キャピラリーカラムＤＢ−５（カラム内径０．２５ｍｍ、液層膜厚０．２５μｍ、カラム長３０ｍ；島津製作所製）を使用した。初発温度９０℃で５分、昇温速度５℃／分、および最終温度２５０℃で２分の分析条件にて行った。その結果、３−ヒドロキシブタン酸（Ｃ４）０．８モル％、３−ヒドロキシヘキサン酸（Ｃ６）５．７モル％、３−ヒドロキシオクタン酸（Ｃ８）２５．１モル％、３−ヒドロキシデカン酸（Ｃ１０）５９．８モル％、および３−ヒドロキシドデカン酸（Ｃ１２）８．６モル％であった。
【００３８】
また、上記ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）のガラス転移温度を示差走査熱量計（２００℃溶融後、昇温速度２０℃／ｍｉｎで再スキャン）で測定したところ、−４５℃であった。
【００３９】
（多孔体の調製）
上記で得られたポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）１ｇとポリ乳酸（大神薬化株式会社製、ＲＥＶＯＤＥ）９ｇをそれぞれ秤量し、クロロホルム９０ｇに完全に溶解させた。この溶液に粒子径１８０〜２５０μｍのＮａＣｌ粒を加え溶液中に分散した。溶液をφ６０ｍｍシリコンディッシュに注ぎ乾燥させた後、蒸留水３００ｍＬに浸漬して攪拌しＮａＣｌ粒を溶出した。洗浄後乾燥し、多孔体を得た。作製した多孔体は、多孔率６０％、気孔径は１８０〜２５０μｍであった。
【００４０】
（多孔体の細胞増殖試験）
作成した多孔体をφ１４ｍｍに繰りぬき、細胞培養用マルチプレートのウェルに入れた。エタノール１ｍＬで滅菌し、リン酸緩衝生理食塩水１ｍＬで２回洗浄した後、ウェルにＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）１ｍＬを入れた。１時間静置した後、ＤＭＥＭ培地を除去し、ここにＤＭＥＭ培地に濃度１０，０００  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように懸濁させた正常ヒト歯周靱帯線維芽細胞ＨＰｄＬＦ（タカラバイオ社）を入れ、７日間培養した。培地は２日ごとに交換した。培養後、細胞増殖率はＭＴＴアッセイ（フナコシ社製）にて測定した。その結果、この多孔体における生細胞数は比較例１と比較して２２５％増加した（表１）。
【００４１】
＜実施例２＞
（多孔体の調製）
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を２．５ｇ、ポリ乳酸を７．５ｇを秤量し、クロロホルム９０ｇに溶解させた以外は、実施例１と同様の方法で、実施例１と同じ多孔率及び気孔径を有する多孔体を得た。
【００４２】
（多孔体の細胞増殖試験）
上記で得られた多孔体を用い、実施例１と同様の方法で細胞増殖試験を行った。その結果、生細胞数の増加率は比較例１と比較して１８０%増加した（表１）。
【００４３】
＜実施例３＞
（多孔体の調製）
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を４．５ｇ、ポリ乳酸を５．５ｇを秤量し、クロロホルム９０ｇに溶解させた以外は、実施例１と同様の方法で、実施例１と同じ多孔率及び気孔径を有する多孔体を得た。
【００４４】
（多孔体の細胞増殖試験）
上記で得られた多孔体を用い、実施例１と同様の方法で細胞増殖試験を行った。その結果、生細胞数の増加率は比較例１と比較して１５０%増加した（表１）。
【００４５】
＜実施例４＞
（多孔体の調製）
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を０．１ｇ、ポリ乳酸を９．９ｇを秤量し、クロロホルム９０ｇに溶解させた以外は、実施例１と同様の方法で、実施例１と同じ多孔率及び気孔径を有する多孔体を得た。
【００４６】
（多孔体の細胞増殖試験）
上記で得られた多孔体を用い、実施例１と同様の方法で細胞増殖試験を行った。その結果、生細胞数の増加率は比較例１と比較して２４０%増加した（表１）。
【００４７】
＜比較例１＞
（多孔体の調製）
ポリ乳酸１０ｇを秤量し、クロロホルム９０ｇに溶解させた以外は、実施例１と同様の方法で、実施例１と同じ多孔率及び気孔径を有する多孔体を得た。
【００４８】
（多孔体の細胞増殖試験）
上記で得られた多孔体を用い、実施例１と同様の方法で細胞増殖試験を行った。その結果、生細胞数の増加率は実施例１と比較して低かった（表１）。
【００４９】
＜比較例２＞
（多孔体の調製）
ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を７ｇ、ポリ乳酸を３ｇを秤量し、クロロホルム９０ｇに溶解させた以外は、実施例１と同様の方法で、実施例１と同じ多孔率及び気孔径を有する多孔体を得た。
【００５０】
（多孔体の細胞増殖試験）
上記で作製した多孔体は、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）含有量が過大であったため、強度に劣り多孔体を作製できなかったため、細胞増殖試験は行えなかった（表１）。
【表１】
2012034825.tif 000002
【００５１】
＜実施例５＞
（フィルムの作成）
実施例１で調製したポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）０．２ｇとポリ乳酸（大神薬化株式会社製、ＲＥＶＯＤＥ）９．８ｇをそれぞれ秤量した。これらを東洋精機製作所製卓上用試験ロール機に投入し、１８５℃で１０分間溶融混練した。溶融混練物を、大橋製作所製の熱圧着機（ＯＨ−１０５−ＡＴＦ）を用いて圧力２３５ｋＰａ、温度１７５℃、３０秒間の条件で熱圧着し、フィルム化した。
【００５２】
（フィルムの細胞増殖試験）
作成したフィルムをφ１４ｍｍに繰りぬき、細胞培養用マルチプレートに入れた。エタノール１ｍＬで滅菌し、リン酸緩衝生理食塩水１ｍＬで２回洗浄した後、ＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）１ｍＬを入れた。１時間静置した後、ＤＭＥＭ培地を除去し、ここにＤＭＥＭ培地に濃度１０，０００  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように懸濁させた正常ヒト歯周靱帯線維芽細胞ＨＰｄＬＦ（タカラバイオ社）を入れ、７日間培養した。培地は２日ごとに交換した。培養後、細胞増殖率はＭＴＴアッセイ（フナコシ社製）にて測定した。その結果、生細胞数は比較例３と比較して１２１％増加した（表２）。
【００５３】
（フィルムの接触角測定）
作成したフィルムを用いて純水に対する接触角を測定した。接触角測定には、協和界面化学（株）社製接触角計Ｄｒｏｐ  Ｍａｓｔｅｒ５００を用いた。試験液体は純水，滴下量１μＬとし，滴下１０ｓｅｃ後の接触角を測定した。その結果、水に対する接触角は９３°であった（表２）。
【００５４】
＜実施例６＞
（フィルムの作成）
使用する材料を、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）２．５ｇ、ポリ乳酸を７．５ｇとした以外は、実施例５と同様の方法でフィルムを得た。
【００５５】
（フィルムの細胞増殖試験）
上記で得られたフィルムを用い、実施例５と同様の方法で細胞増殖試験を行った。その結果、生細胞数の増加率は比較例３と比較して１１９%増加した（表２）。
【００５６】
（フィルムの接触角測定）
上記で得られたフィルムを用い、実施例５と同様の方法で水に対する接触角を測定した。その結果、水に対する接触角は９５°であった（表２）。
【００５７】
＜実施例７＞
（フィルムの作成）
使用する材料を、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）４．５ｇ、ポリ乳酸を５．５ｇとした以外は、実施例５と同様の方法でフィルムを得た。
【００５８】
（フィルムの細胞増殖試験）
上記で得られたフィルムを用い、実施例５と同様の方法で細胞増殖試験を行った。その結果、生細胞数の増加率は比較例３と比較して１１５%増加した（表２）。
【００５９】
（フィルムの接触角測定）
上記で得られたフィルムを用い、実施例５と同様の方法で水に対する接触角を測定した。その結果、水に対する接触角は９８°であった（表２）。
【００６０】
＜比較例３＞
（フィルムの作成）
使用する材料をポリ乳酸１０ｇのみとした以外は、実施例５と同様の方法でフィルムを得た。
【００６１】
（フィルムの細胞増殖試験）
上記で得られたフィルムを用い、実施例５と同様の方法で細胞増殖試験を行った。その結果、生細胞数の増加率は実施例５と比較して低かった（表２）。
【００６２】
（フィルムの接触角測定）
上記で得られたフィルムを用い、実施例５と同様の方法で水に対する接触角を測定した。その結果、水に対する接触角は７２°であった（表２）。
【００６３】
＜比較例４＞
（多孔体の調製）
使用する材料を、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）７ｇ、ポリ乳酸３ｇとした以外は、実施例５と同様の方法でフィルムを得た。
【００６４】
（フィルムの細胞増殖試験）
上記で作製したフィルムは、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）含有量が過大であったため、強度に劣りフィルムを作製できなかったため、細胞増殖試験は行えなかった（表２）。
【００６５】
（フィルムの接触角測定）
上記で作製したフィルムは、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）含有量が過大であったため、強度に劣りフィルムを作製できなかったため、接触角測定は行えなかった（表２）。
【表２】
2012034825.tif 000003
【００６６】
上記の結果、本発明の生体親和性樹脂であるポリ乳酸に対してポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を添加した多孔体において、生細胞の増加率は１５０〜２４０％、またフィルムにおいて生細胞の増加率は１１５〜１２１％に向上した。また、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）を添加したフィルムにおいて、接触角が２１〜２６°増加と大きく変化した。基材への細胞接着性に関わる大きな要因の一つとして表面自由エネルギーがある。細胞接着に必須である接着因子タンパク質は、基材表面の水に対する接触角にみられるような表面自由エネルギーの変化によって基材への接着量が異なり、極端な親水性あるいは疎水性では接着量が減少する。そのため、細胞増殖率増加の要因はポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）により表面構造が変化し、細胞接着に最適な表面エネルギーに近づいたためと考えられる。すなわち本発明は、体組織の細胞増殖と再生を促進し、加工性に優れる生体親和性の再生医療用樹脂組成物になりうることがわかる。