(57)【要約】【課題】試薬ボトルとフローセルの間のデッドボリュームが小さく、試薬ボトルとフローセルの間にバルブを用いない核酸分析装置を提供する。【解決手段】本発明の核酸分析装置は、溶液を注入する注入口，反応領域，注入口と反応領域とを繋ぐ流路、及び溶液を排出する排出口を有するフローセル２と、フローセル２に溶液を注入するノズル７と、ノズル７を駆動させるノズル搬送ユニット８と、フローセル２内の試料を検出する検出ユニット９と、を備えている。【選択図】  図１
2012024000.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液を注入する注入口，反応領域，注入口と反応領域とを繋ぐ流路、及び溶液を排出する排出口を有するフローセルと、
フローセルに溶液を注入するノズルと、
ノズルを駆動させるノズル駆動部と、
フローセル内の試料を検出する検出部と、を備えたことを特徴とする核酸分析装置。
【請求項２】
流路は、反応領域よりも幅が狭いことを特徴とする請求項１に記載の核酸分析装置。
【請求項３】
流路と、反応領域とは別々の温度調整を行うことを特徴とする請求項１に記載の核酸分析装置。
【請求項４】
流路を吸熱する吸熱プレートが配置されていることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析装置。
【請求項５】
吸熱プレートとフローセルは、互いに固定されていることを特徴とする請求項４に記載の核酸分析装置。
【請求項６】
反応領域を温度調整する温度調整部が設けられていることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析装置。
【請求項７】
温度調整部は、ヒートプレート及び温調素子を備えて構成されていることを特徴とする請求項６に記載の核酸分析装置。
【請求項８】
温度調整部とフローセルは、互いに固定されていることを特徴とする請求項６に記載の核酸分析装置。
【請求項９】
フローセルは、フローセルホルダに固定されていることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析装置。
【請求項１０】
溶液はフローセルホルダに設けられた開口部より注入され、上記注入口を介してフローセル内へ入ることを特徴とする請求項９に記載の核酸分析装置。
【請求項１１】
フローセルは、複数の流路を有し、これら流路毎に、注入口，反応領域、及び排出口を有することを特徴とする請求項１に記載の核酸分析装置。
【請求項１２】
検出部が行う検出は、蛍光検出であることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析装置。
【請求項１３】
フローセルを駆動させる駆動部を備え、フローセルを駆動させて検出部が検出する反応領域中の検出領域を切り替えることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析装置。
【請求項１４】
フローセルは、光透過性のある材質からなる部材と、熱伝導性が高い部材とを重ねて構成されることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。
【０００３】
現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
【０００４】
これに対し、近年、基板に試料となるＤＮＡ断片を数多く固定して、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が提案されている。
【０００５】
ＤＮＡ断片を担時する担体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行うという技術が知られている。その後、微粒子のサイズに穴径を合わせた数多くの穴を設けたプレートに、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を担持した微粒子を入れてパイロシーケンス方式で読み出している。
【０００６】
また、ＤＮＡ断片を担持する担体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行うという技術が既に知られている。その後、微粒子をガラス基板上にばら撒いて固定し、ガラス基板上で酵素反応（ライゲーション）を行い、蛍光色素付き基質を取り込ませて蛍光検出を行うことにより各断片の配列情報を得ている。
【０００７】
さらに、基板上に、同一配列を有する多数のＤＮＡプローブを固定するという技術が知られている。また、ＤＮＡ試料を切断後、ＤＮＡプローブ配列と相補鎖のアダプター配列を各ＤＮＡ試料断片の端に付加させる。これらを基板上でハイブリダイゼーションさせることにより、基板上にランダムに一分子ずつ試料ＤＮＡ断片を固定化させている。この場合、基板上でＤＮＡ伸長反応を起こない、蛍光色素付き基質を取り込ませた後、未反応基質の洗浄，蛍光検出を行い、試料ＤＮＡの配列情報を得ている。
【０００８】
以上のように、基板上に、核酸断片試料を数多く固定することにより、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が開発され、実用化されつつある。
【０００９】
これらの方式では、基板上でシーケンス反応を行うため、数多くの種類の溶液を基板上に供給するとともに、基板上での温度の上げ下げが必要である。例えば、最初にアンカープライマーを含む溶液を供給した後、基板を昇温・冷却した後、基板上に洗浄液を供給し、基板上の未反応アンカープライマーを洗浄するという技術が知られている。その後、ライゲーション反応のための溶液，アンカープライマーと蛍光プライマーの複合体を分解するための溶液を供給する。これらの溶液供給の間にも、温度の上げ下げと洗浄液での洗浄が必要である。
【００１０】
これらの分析を行うための装置として、特許文献１，３には、容器に保管されている試薬溶液をチューブを介して反応場であるフローセルに供給する装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００９−５３２０３１号公報
【特許文献２】特表２００８−５０６９６９号公報
【特許文献３】特開２００８−１５１７７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、上記のようなチューブを介した装置では、試薬容器からフローセル間のチューブ内容量がデッドボリュームとなり、１回の解析に必要な試薬量が増えるため、解析のランニングコストが高くなる問題がある。
【００１３】
特許文献２では、試薬ボトルとフローセルの間にバルブを用いる方法も開示されているが、バルブの開け閉め機構を実現するために、装置構成が複雑になる問題がある。
【００１４】
本発明は、試薬ボトルとフローセルの間のデッドボリュームが小さく、試薬ボトルとフローセルの間にバルブを用いない核酸分析装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の核酸分析装置は、溶液を注入する注入口，反応領域，注入口と反応領域とを繋ぐ流路、及び溶液を排出する排出口を有するフローセルと、フローセルに溶液を注入するノズルと、ノズルを駆動させるノズル駆動部と、フローセル内の試料を検出する検出部と、を備えている。
【発明の効果】
【００１６】
試薬ボトルとフローセルの間のデッドボリュームが小さく、試薬ボトルとフローセルの間にバルブを用いない核酸分析装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の核酸分析装置の構成の一例を説明するための図である。
【図２】本発明のフローセルの構成の一例を説明するための図である。
【図３】本発明のホルダユニットの構成の一例を説明するための図である。
【図４】本発明のホルダユニットの構成の一例を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。
ここでは、本発明を理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。また、各構成は適宜組み合せることが可能であり、当該組み合せ形態についても本明細書は開示している。
【００１９】
図１に本発明による核酸分析装置の例を示す。核酸分析装置１は、流路が形成されたフローセル２，フローセル２を固定し、なおかつフローセル２を温度調整するホルダユニット３，フローセル２・ホルダユニット３を移動させるステージユニット４，複数の試薬や洗浄水が収容された試薬容器５，試薬容器５に収容された試薬を吸引しフローセル２に注入する駆動源である送液ユニット６，試薬の吸引・吐出の際、実際に試薬容器５やフローセル２にアクセスするノズル７，ノズル７を搬送させるノズル搬送ユニット８，フローセル２に固定された試料を観察するための検出ユニット９，フローセル２からの廃液を収容する廃液容器１０を有する。
【００２０】
核酸分析装置１の動作について図１を用いて説明する。まず、測定対象のＤＮＡを保持したフローセル２をホルダユニット３に設置する。次に、ノズル７が試薬容器５にアクセスし、試薬を送液ユニット６により吸引する。ノズル７は、ノズル搬送ユニット８によりフローセル２上面に搬送され、フローセル２に注入ポート１１から試薬を注入する。そして、ホルダユニット３にて、フローセル２内に含まれたＤＮＡ断片と試薬を温度調整することで反応が起こる。
【００２１】
反応したＤＮＡ断片を観察するために、フローセル２をステージユニット４にて観察したい検出領域が検出ユニット９で観察できるように移動させ、励起光を当てて検出領域内にある複数のＤＮＡ断片の蛍光を検出する。検出後、フローセル２を微小に動かし同様の方法で検出、という動作を複数回繰り返す。全ての検出領域で観察が終了したら、試薬容器５に収容された洗浄水を送液ユニット６により吸引し、フローセル２へ注入することで、フローセル２の流路内を洗浄する。また、別の試薬を注入し検出、という動作を複数回繰り返すことで、ＤＮＡ配列を読み取ることができる。なお、核酸分析では４種類の塩基を同定することが必要である。４種類以上にラベル化された色素を検出する方法が広く公知である。
【００２２】
本実施の形態では、ノズル７を介して分注を行うため、試薬容器５から注入ポート（後述）１１までのデッドボリュームを低減することができる。
【００２３】
本発明のフローセル２について図２を用いて説明する。フローセル上面には、溶液を注入，排出するための穴である、注入ポート１１と排出ポート１２が設けられている。フローセル２は、溶液を通すための中空構造となっており、中空構造は加熱防止のための流路部１３と検出部（反応領域）１４からなる。図２に示すとおり、上方から見たとき流路部１３は検出部１４よりも幅が狭くなっている。
【００２４】
流路部１３の体積を小さくすることで、試薬溶液のデッドボリュームを小さくする。検出部１４の面積を大きくすることで、測定対象のＤＮＡを持つビーズ固定数を増やすことができ、一度に解析できるＤＮＡ断片数を増やすことができる。
【００２５】
フローセル２の上面部の材質は、蛍光検出のために、光透過性が高い材料が良い。この様な材料としては、ガラス，サファイアなどの無機材料やポリメタクリル酸メチル樹脂，ポリカーボネート樹脂，シクロオレフィン樹脂などの樹脂材料が挙げられる。フローセル２の下面部の材質は、熱伝導性が高い材料が望ましい。この様な材料としては、シリコン，ガラスなどの無機材料や、ＳＵＳなどの金属材料，カーボンファイバや無機フィーラを配合した高熱伝導性の樹脂材料が挙げられる。なお、図２では、注入ポート１１，流路部１３，検出部１４、及び排出ポート１２の組を２つ配置させているが、これに限らず、１つでも、３つ以上でもよい。但し、複数組、注入ポート１１，流路部１３，検出部１４、及び排出ポート１２を設けることにより、１つの検出部を検出している時に同時に他の検出部に液を注入することができる。また、検出と検出のための反応を同時に行うことができ、スループットを高めることができる。
【００２６】
本発明のホルダユニット３について図３を用いて説明する。ホルダユニット３は、温調を可能とする温調素子１６と、これと接触するヒートプレート１５と、吸熱プレート１７と、クランプ１８からなる。図３に示すとおり、ヒートプレート１５の下側に温調素子１６が設けられている。このような構成により、複数回の温度上げ下げが必要な基板上でのシーケンス反応を実現することができる。
【００２７】
具体的には、フローセル２の検出部１４の下側の一部がヒートプレート１５と接し、フローセル２の流路部１３の下側の一部が吸熱プレート１７と接する。シーケンス反応のための加熱時、流路部１３内の熱は吸熱プレート１７を介して、外部に放熱されるため、流路部１３内の温度上昇を抑えることができ、注入ポート１１からの蒸発を防止することができる。
【００２８】
クランプ１８は吸熱プレート１７とフローセル２の下部との密着性を高めるために、断面コ字状のクランプ１８が設けられている。クランプ１８により、フローセル２の下部から吸熱プレート１７への伝熱量を増やすことができる。吸熱プレート１７の材料としては、熱伝導性が高く、クランプ時の寸法変化が小さく、耐久性が高い金属材料が望ましく、この様な材料として、アルミニウムや銅などが挙げられる。フローセル２と吸熱プレート１７の密着性を高めるために、フローセル２と吸熱プレート１７の間に熱伝導性が高いシリコンシートなどを用いても良い。このようなクランプ１８を設けることにより、密着界面からの液漏れを防止することができる。
【００２９】
また、図３とは異なる形態として、本発明のホルダユニットについて図４を用いて説明する。図３との違いは、フローセル２がホルダ１９に格納されてセルホルダユニットに組み込まれている点である。この形態では、ノズル７からの液の注入は、ホルダ１９にあるインジェクションポート２０より行われる。図３の形態では、フローセル上面部の厚さが薄い場合、ノズルとフローセル上面部の接触面積が小さくなるので液漏れしやすくなるが、図４の形態では、ノズルと注入ポートの接触面積は、フローセル上面部の厚さによらないので、フローセルの上面部の厚さを薄くできる。なお、図３，図４では、注入ポート１１，流路部１３，検出部１４、及び排出ポート１２の組を２つ配置させているが、これに限らず、１つでも、３つ以上でもよい。
【００３０】
本発明の核酸分析装置を用いた核酸分析方法を説明する。測定対象のＤＮＡを断片化，増幅した後、エマルジョンＰＣＲ法を用いて測定対象のＤＮＡ断片が固定化されたビーズを作製する。続いて、アクリルゲルを用いて本発明のフローセル内にビーズを固定化する。次に、ビーズが固定化された反応デバイスを図１に示した核酸分析装置に設置する。最後に、
（ａ）アンカープライマーのハイブリダイゼーション
（ｂ）蛍光プライマーのライゲーション
（ｃ）蛍光検出
（ｄ）アンカープライマーと蛍光プライマーの除去
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の繰り返し
を行い、塩基配列を決定する。
【符号の説明】
【００３１】
１  核酸分析装置
２  フローセル
３  ホルダユニット
４  ステージユニット
５  試薬容器
６  送液ユニット
７  ノズル
８  ノズル搬送ユニット
９  検出ユニット
１０  廃液容器
１１  注入ポート
１２  排出ポート
１３  流路部
１４  検出部
１５  ヒートプレート
１６  温調素子
１７  吸熱プレート
１８  クランプ
１９  ホルダ
２０  インジェクションポート
【図１】
2012024000.tif 000003
【図２】
2012024000.tif 000004
【図３】
2012024000.tif 000005
【図４】
2012024000.tif 000006