(57)【要約】【課題】  優れた抗菌作用を発揮しつつ、副作用が少なく、安全性の高い、複数の生薬の抽出物からなる、ウレアーゼ阻害活性を有する医薬組成物及びその医薬組成物を含有する医薬製剤を提供することを目的とする。【解決手段】  スウェルチアマリン、そのエステル、その生理学的に許容される塩、及びそれらの水和物からなるＡ群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有する、ウレアーゼ活性阻害用組成物及びこの組成物を有効成分として含有する医薬製剤を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スウェルチアマリン、そのエステル、その生理学的に許容される塩、及びそれらの水和物からなるＡ群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有する、胃粘膜保護用組成物。
【請求項２】
ベルベリン、その生理学的に許容される塩、及びそれらの水和物からなるＢ群から選ばれる少なくとも１種以上、並びに、マグノロール、その生理学的に許容される塩、及びそれらの水和物からなるＣ群から選ばれる少なくとも１種以上をさらに含み、Ａ群、Ｂ群及びＣ群から選ばれた化合物の混合比が、モル比で１：（９〜13）：（11〜15）であることを特徴とする、請求項１に記載の胃粘膜保護用組成物。
【請求項３】
オウバク末、ゲンノショウコ末、ビャクジュツ末、センブリ末及びコウボク末からなる群から選ばれる少なくとも２種以上の生薬からの抽出物を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の胃粘膜保護用組成物。
【請求項４】
オウバク末、ゲンノショウコ末、ビャクジュツ末、センブリ末及びコウボク末からの各抽出物を含むことを特徴とする、請求項３に記載の胃粘膜保護用組成物。
【請求項５】
前記組成物中のスウェルチアマリン、その生理学的に許容される塩、及び水和物からなるＡ群から選ばれる少なくとも１種以上と、ベルベリン、それらの生理学的に許容される塩、及びそれらの水和物からなるＢ群から選ばれる少なくとも１種以上と、マグノロールその生理学的に許容される塩、及びそれらの水和物からなるＣ群から選ばれる少なくとも１種以上との混合比が、モル比で１：（９〜13）：（11〜15）であることを特徴とする、請求項４に記載の胃粘膜保護用組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の胃粘膜保護用組成物を含有する医薬製剤。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の胃粘膜保護用組成物を含有する、ウレアーゼ活性阻害用組成物。
【請求項８】
請求項７に記載のウレアーゼ活性阻害用組成物を含有する医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウレアーゼ活性阻害用組成物、その組成物を有効成分とする医薬製剤に関する。より詳細には、スウェルチアマリンを有効成分として含有する、ウレアーゼ活性阻害用組成物、その組成物を有効成分とする医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿素を加水分解して二酸化炭素とアンモニアとに分解する酵素であるウレアーゼは、クレブシェラ・エルギノーザ（Klebsiella aerogenes）、スポロサルシナ・パステューリ（Sporosarcina pasteurii）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）等の菌によって産生される。
これらの中でも、ヘリコバクター・ピロリがウレアーゼによって尿素を分解し、それによって発生するアンモニアで胃酸を中和して胃に棲みつき、胃潰瘍の他、慢性蕁麻疹等の疾患の原因になることが知られている。
【０００３】
日本人は、胃潰瘍や十二指腸潰瘍の罹患率が西欧人に比べて高いが、こうした疾病の発症とヘリコバクター・ピロリへの感染とは相関があると言われている。そして、胃に棲みついたヘリコバクター・ピロリの除菌が胃潰瘍の治療等に有用であることから、現在のところ、オメプラゾールやランソプラゾール等のプロトンポンプ阻害剤（PPI）と後述する２種の構成物質とを組み合わせた３剤併用療法による除菌が行われている。（非特許文献１参照、以下「従来例１」という。）。
【０００４】
一方で、３剤併用による除菌の際に用いられるプロトンポンプ阻害剤（PPI）と抗生物質２種との併用ではなく、生薬を用いたヘリコバクター・ピロリの活性抑制剤等も提案されている（特許文献１：特開2004-115536、以下、「従来例２」という）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2004-115536
【特許文献２】特開2009-263262
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】http://www.takeda.co.jp/press/article_37653.html
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来例１の３剤併用療法は、ヘリコバクター・ピロリの除菌には効果的な方法である。しかし、幾つかの問題点がある。まず、PPIには、胃壁が弱っている場合には胃潰瘍の原因となりかねないことや逆流性食道炎等を起こす場合があるといった副作用があること、及び逆転写酵素阻害剤であるアタザナビル硫酸塩とは併用が禁止されており、テオフィリン、タクロリムス水和物、ジゴキシン、メチルジゴキシン、イトラコナゾール、ゲフィチニブ、フェニトイン、ジアゼパム等とは併用に注意が必要であるとされている。
【０００８】
さらに、一次除菌にはアモキシシリン（AMPC）及びクラシスロマイシン（CAM）が使用されるが、この組み合わせでうまく除菌ができなかった場合に、二次除菌では、クラシスロマイシン（CAM）に代えてメトロニダゾール（MNZ）を使用することにも示されるように、耐性菌の出現という問題があり、耐性菌が出現すると除菌率が低下する。
このため、副作用が少なく、かつ耐性菌の出現しにくい薬剤に対する社会的な要請は強い。
【０００９】
また、従来例２の発明は、抗ヘリコバクター・ピロリ活性剤の発明が開示されている。この発明は、ヘリコバクター・ピロリ（ATCC 43504株）が産生するウレアーゼの活性を、オウゴン、アロエ、シャクヤク、クジン、ケイヒ、ケイヒ、大茴香、ニクズク、リョウキョウ、セキシャク、エンメイソウ、アカメガシワ、ヨウバイヒが阻害することに着目して完成されたものであり、ウレアーゼの阻害活性を有することが開示されている。
しかし、実際に製剤として開示されているのは、アカメガシワとシャクヤクとを有効成分とする錠剤／カプセル剤、エンメイソウとヨウバイヒとを有効成分とする顆粒剤、及びリョウキョウとウバイとを有効成分とする内服液である。
【００１０】
一方、従来例１には、センブリがヘリコバクター・ピロリの増殖阻害効果を有することは記載されているが、ウレアーゼを阻害する活性を有することは記載されていない。また、センブリに含まれているスウェルチアマリンには、インスリン様増殖因子−１（IGF-1）の産生を促進することが知られている（特許文献２：特開2009−263262、以下「従来例３」という）が、ウレアーゼ阻害活性があることは知られていない。
さらに、副作用の面から見れば生薬を候補としてウレアーゼ阻害活性を有するものを探索することが望ましいが、その場合、供給量の点で問題がないものであることも考慮する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、上記のような環境の下で完成されたものである。
すなわち、本発明は、スウェルチアマリン、そのエステル、その生理学的に許容される塩、及びそれらの水和物からなるＡ群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有する、胃粘膜保護用組成物である。
スウェルチアマリンは、下記式（Ｉ）で表わされる化合物である。
【００１２】
【化１】
2012097072.tif 000002
【００１３】
ここで、スウェルチアマリンのエステルとしては、四酢酸エステルであることが好ましく、生理学的に許容される塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、酢酸塩及びアンモニウム塩からなる群から選ばれるいずれかの塩であることが好ましく、水和物としては、一水和物、二水和物、及び六水和物であることが好ましい。
また、上記組成物は、下記式（II）で表わされるベルベリン、その生理学的に許容される塩、及びそれらの水和物からなるＢ群から選ばれる少なくとも１種以上、並びに、下記式（III）で表わされるマグノロール、その生理学的に許容される塩、及びそれらの水和物からなるＣ群から選ばれる少なくとも１種以上をさらに含み、Ａ群、Ｂ群及びＣ群から選ばれた化合物の混合比が、モル比で１：（９〜13）：（11〜15）であることが好ましい。
【００１４】
【化２】
2012097072.tif 000003
【００１５】
【化３】
2012097072.tif 000004
【００１６】
ここで、ベルベリンの生理学的に許容される塩としては、塩酸塩、硫酸塩、二硫酸塩、及びタンニン酸塩からなる群から選ばれるいずれかの塩であることが好ましく、水和物としては、二水和物、三水和物、及び５・１/２水和物からなる群から選ばれるいずれかの水和物であることが好ましい。
また、マグノロールの生理学的に許容される塩としては、塩酸塩、硫酸塩、及びアンモニウム酸塩からなる群から選ばれるいずれかの塩であることが好ましい。
【００１７】
本発明はまた、オウバク末エキス、センブリ末エキス及びコウボク末エキスからなる群から選ばれる少なくとも２種以上の生薬を含むことを特徴とする、ウレアーゼ活性阻害用組成物である。ここで、本発明の組成物は、オウバクエキス、センブリ末エキス及びコウボク末エキスを含み、さらに、ゲンノショウコ末及びビャクジュツ末を含むものであることがさらに好ましい。
そして、これらの抽出物を含む組成物中で、上記のＡ群、Ｂ群及びＣ群から選ばれた化合物の混合比が、モル比で１：（９〜13）：（11〜15）となっていることがさらに好ましい。
また、本発明は、上記のいずれかの胃粘膜保護用組成物を含有する医薬製剤である。
本発明はさらにまた、上述した胃粘膜保護用組成物を含有する、ウレアーゼ活性阻害用組成物である。また、本発明は、前記ウレアーゼ活性阻害用組成物を含有する医薬製剤である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、スウェルチアマリンを有効成分として含有し、強いウレアーゼ活性阻害作用を有する組成物を得ることができる。また、この組成物を有効成分として含有する、医薬製剤を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、各生薬及び百草丸の抽出物によるウレアーゼ活性阻害率を示すグラフである。
【図２】図２は、正常群（陰性対照群）、対照群（陽性対照群）、御岳百草丸投与群、ベルベリン投与群における、スナネズミの胃粘膜の損傷面積を示したグラフである。
【図３】図３は、正常群（陰性対照群）、対照群（陽性対照群）、御岳百草丸投与群、ベルベリン投与群における、スナネズミの胃粘膜の出血面積を示したグラフである。
【図４】図４は、正常群（陰性対照群）、対照群（陽性対照群）、御岳百草丸投与群、ベルベリン投与群における、スナネズミの胃内でのHelicobacter pyloriの生息菌数を示したグラフである。
【図５】図５は、正常群（陰性対照群）、対照群（陽性対照群）、御岳百草丸投与群、ベルベリン投与群における、スナネズミの胃粘膜のミエロペルオキシダーゼ（MPO）の活性を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に本発明を更に詳細に説明する。
本発明のウレアーゼ活性阻害用組成物は、スウェルチアマリン（C16H22O10,分子量  374.34）、そのエステル、その生理学的に許容される塩、及び水和物からなるＡ群から選ばれる少なくとも１種以上を有効成分として含有するものである。スウェルチアマリンは、上記式（Ｉ）で表わされる通りの配糖体であり、後述するセンブリに含有される化合物である。
また、本発明のウレアーゼ活性阻害用組成物は、ベルベリン（[C20H18NO4]+、式量336.37）、その生理学的に許容される塩、及び水和物からなるＢ群から選ばれる少なくとも１種以上、並びにマグノロール（C18H18O2,分子量266.34）その生理学的に許容される塩、及び水和物からなるＣ群から選ばれる少なくとも１種以上をさらに含むものであることが、ウレアーゼ阻害活性が高いことから好ましい。
【００２１】
ベルベリンは、上記式（II）で表わされるアルカロイドであり、後述するオウバクに含有される化合物である。また、マグノロールは、上記式（III）で表わされる化合物であり、後述するコウボクに含有されるものである。
これらのエステル、生理学的に許容される塩、及びそれらの水和物については、上述した通りである。
さらに、上記のＡ群、Ｂ群及びＣ群から選ばれた化合物の混合比が、モル比で１：（９〜13）：（11〜15）であることが、ウレアーゼ阻害活性が高いことから好ましく、１：11：13のときに、最も活性が高い。
本発明のウレアーゼ活性阻害用組成物は、市販されているナタマメ由来のウレアーゼ、ATCC43504その他のヘリコバクター・ピロリから得られるウレアーゼのみならず、ヘリコバクター・ピロリ菌の臨床分離株から得られるものに対しても阻害作用を有するものである。
本発明はまた、オウバク末エキス、センブリ末エキス及びコウボク末エキスからなる群から選ばれる少なくとも２種以上の生薬を含む、ウレアーゼ活性阻害用組成物である。
【００２２】
（生薬エキスの調製）
ここで、オウバクはキハダ（Phellodendron Bark）又はその他同属植物（Phellodendron）の周皮を除いた樹皮から得られる生薬であり（日本薬局方）、粉末にしたものをオウバク末（日本薬局方）という。オウバク末に、所定の溶媒を加えて所定の条件で抽出することにより、有効成分ベルベリンを含有する抽出液が得られる。所定の溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル及び水等を挙げることができ、メタノール又は水を使用することが、有効成分の抽出効率が高いことから好ましい。溶媒の添加量としては、３〜７（ｗ/ｖ）とすることが有効成分の抽出効率の点から好ましく、４〜６（ｗ/ｖ）とすることがさらに好ましい。
抽出の条件としては、振蘯、ソックスレー抽出、超音波抽出等を挙げることができ、抽出効率の点から超音波抽出を行うことが好ましい。抽出時間は約１５分〜約６０分とすることが抽出効率の点から好ましく、約３０分とすることがさらに好ましい。また、抽出温度は、２０℃〜４０℃とすることが抽出効率の点から好ましい。
【００２３】
ゲンノショウコは、ゲンノショウコ（Geranin thunbergii Siebold et Zuccarini (Geraniaceae)）の地上部（日本薬局方）から得られる生薬であり、粉末としたものをゲンノショウコ末という（日本薬局方）。ゲンノショウコ末からも、上述したオウバク末と同様の条件で抽出液を得ることができる。
ビャクジュツは、オケラ（Atractylodes japonica Koidzumi ex Kitamura）の根茎（ワビャクジュツ）又はオオバナオケラ（Atractylodes ovate De Candlle (Compositae)）の根茎（カラビャクジュツ）から得られる生薬であり、粉末としたものをビャクジュツ末（日本薬局方）という。ビャクジュツ末からも、上述したオウバク末と同様の条件で抽出液を得ることができる。
【００２４】
センブリは、センブリ（Swertia japonica Makino(Gentianaceae))の開花期の全草であり、これを粉末としたものをセンブリ末という（日本薬局方）。センブリ末からも、上述したオウバク末と同様の条件で有効成分を含有する抽出液を得ることができる。この抽出液には、主成分の１つとして下記式（Ｉ）で表わされる配糖体、スウェルチアマリンが含有されている。
コウボクは、ホウノキ（Magnolia obovata Thunberg, Magnolia officibalis Rehder et al Wilson又はMagnolia officinalis Rehder et Wilson var. biloba Rehder et Wilson (Magnoliaceae)）の樹皮から得られる生薬であり（日本薬局方）、粉末にしたものをコウボク末という（日本薬局方）。コウボク末からも、上述したオウバク末と同様の条件で抽出液を得ることができる。この抽出液には、主成分の１つとして、下記式（III）で表わされるマグノロールが含有されている。
【００２５】
【化４】
2012097072.tif 000005
【００２６】
上述したスウェルチアマリン、ベルベリン、及びマグノロール、これらのエステル、これらの生理学的に許容される塩、及びそれらの水和物は、常法に従って精製して得ることもでき、市販品を購入して使用することもできる。
また、これらの抽出物の混合物として、上述した生薬の抽出液を所定の割合で混合してもよく、またこれらの抽出液を含有する生薬製剤を所定の溶媒で抽出し、これを使用することもできる。
具体的には、御岳百草丸（登録商標、長野県製薬（株））に、所定の溶媒、例えば、メタノールを１０〜２０倍（ｗ/ｖ）加えて抽出し、この抽出液を使用することができる。抽出は上述した方法を使用することができるが、ソックスレー抽出を行うことが、ベルベリン抽出効率が良いという理由から好ましい。
得られた抽出液（以下、「百草丸抽出液」という。）を、約４０〜６０°Ｃの湯浴を使用しながら減圧濃縮することによって、試料（百草丸エキス）とすることができる。使用の際には、減圧濃縮した百草丸エキスを、所望の溶媒で適宜希釈して使用する。
【００２７】
以下に、スウェルチアマリンを含有する抽出液を得る場合を例に挙げて説明する。上述したセンブリを乾燥させてこれを粉末とするか、市販のセンブリ末を所定量秤量し、これに３〜７倍（ｗ/ｖ）、好ましくは４〜６（ｗ/ｖ）倍の溶媒、例えば、メタノールを加えて、２０〜３０℃にて、１５〜３０分間、例えば、超音波抽出を行う。
得られた抽出液を濾過し、例えば、ロータリーエバポレータで濃縮した後に、常法に従って凍結乾燥する。以上のようにして、スウェルチアマリンを含有する抽出液を得ることができる。
ベルベリン又はマグノロールを含有する抽出液についても、同様にして得ることができる。これらを保存試料として、以下に記載するウレアーゼの阻害活性試験、抗菌試験及びin vivoでの胃粘膜保護試験に供する。
【００２８】
（ウレアーゼの阻害試験）
所定の培地を調整し、ウレアーゼの産生菌を植菌し、所定の条件下で培養する。例えば、コロンビアＨＰ培地を調整し、ここにヘリコバクター・ピロリを植菌して、微好気性条件下に、３５〜３９°Ｃで培養する。ここで、微好気性条件とは、炭酸ガス濃度の範囲が５〜８％の範囲にあることをいう。培養温度は、３７°Ｃとすることが、生体内での増殖条件に近いことから好適である。
菌の増殖を確認した後に、適当な培地、例えば、５〜１５％の仔ウシ血清を添加したブレインハートインフージョン培地に掻き取った菌を懸濁し、これを処理して菌の産生する酵素を含有する溶液を調製する。
具体的には、上記の懸濁液を、約(１５，０００ｒｐｍ又は１２６ｘｇ)で遠心し、上清を除く。得られた沈渣に適当な還元剤とキレーター、例えば、０．５〜２ｍＭのメルカプトエタノールと０．５〜２ｍＭのＥＤＴＡ−２Ｎａとを添加したリン酸緩衝液（以下、「ＰＢ」ということがある。）を加え、氷冷下に、例えば、超音波処理を行って菌を破砕する。遠心によって、破砕物を沈殿させ、上清を濾別してＰＢで所定倍、例えば、１０〜２０倍に希釈して酵素液を調製する。
【００２９】
このようして得られた試験用酵素液に上述したようにして得られた各試料からの抽出液を加えて所定の条件下に静置し、ウレアーゼの基質溶液を加えて混合する。その後、所定の条件の下で一定時間反応させる。具体的には、例えば、酵素液２５〜２００μＬに上記の抽出液を１０〜５０μＬ加え、約３７°Ｃのウォーターバス中に１０〜２０分間置き、次いで２００〜６００ｍＭの尿素を含有するＰＢを添加する。ＰＢの添加後、ただちに振とうし、再度、約３７℃のウォーターバス中に１０〜２０分間置き、その後、０．５〜２Ｎの硫酸を加えて反応を停止させる。
反応を停止させた溶液をインドフェノール法に従って処理し、ウレアーゼの阻害率を６３０ｎｍの吸光度から求める。以上のようにして、ウレアーゼ阻害効果を確認することができる。
【００３０】
（抗菌試験）
凍結保存してある所定のHelicobacter pylori株を、所定の培地に白金耳で植菌し、所定の条件下で培養して菌苔を形成させる。この菌苔を掻き取って懸濁液とし、濁度を、測定し、所望の菌数となるように調整する。この懸濁液を所定の寒天培地上に塗布して、所定の条件下に培養し、所定の濃度の薬液を浸み込ませたディスクを置き、阻止円の形成による抗菌作用を測定することができる。
例えば、−８０°Ｃで凍結保存しておいたH. pyloriの臨床株を、コロンビアＨＰ寒天培地に白金耳で植菌し、微好気条件下に約３７°Ｃで２〜４日間培養して菌苔を形成させ、その一部を掻き取って懸濁液とする。この懸濁液の濁度を、例えば、ＯＤ600で測定し、菌数が０．５〜２ｘ１０6個/１００μＬとなるように調製し、コロンビアＨＰ寒天培地に塗布し、薬液５０μLを浸み込ませたディスクをこの寒天培地上に置き、約３７℃で３日間、微好気条件下に培養する。このときに形成された阻止円の大きさから、５０％阻止濃度を求めることにより、抗菌作用の強さを評価することができる。
【００３１】
また、阻止円内のH. pyloriのコロニー形成能を、阻止円内を白金耳で触れ、HI-FBS-TTC培地に線を引き、画線培養することによって調べることができる。画線培養は、例えば、約３７°Ｃで２〜４日間、微好気条件下に行うことができる。
さらに、例えば、0.1％（w/v）デオキシコール酸含有培地等を用いて、菌のコロニー形成能を調べることもできる。例えば、上記のH. pyloriをＨＰ寒天培地に塗り広げ、微好気条件下で、約３７°Ｃにて２〜４日間培養し、次いで、培養した菌を白金耳にとり、HI-FBS-DCA培地に線を引き、微好気条件下にて、さらに約３７℃で２〜４日間培養して、形成されたコロニー数を計数することによって、こうした培地でのコロニー形成能を調べることができる。
【００３２】
また、H. pyloriを所望の数、例えば、２ｘ１０8 CFU/0.5mL/マウスで経口接種し、その後、所望の量の御岳百草丸溶液又はベルベリン溶液を所望の期間、経口投与して、胃粘膜の損傷の程度、胃内でのH. pyloriの生息数、及びミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）等の酵素活性を測定し、in vivoでの胃粘膜に対する効果を検討することができる。胃粘膜の損傷の程度は、例えば、実体顕微鏡下に目視によって確認して評価することができる。また、胃内でのH. pyloriの生息数は、例えば、ブルセラ寒天培地に、５〜１５％の馬脱繊維血、１〜５μg/mLのアンホテリシンＢ、７〜１１μg/mLのバンコマイシン、０．１〜０．６４μg/mLのポリミキシンＢ、１〜１０μg/mLのトリメトプリム、１０〜１００μg/mLのl, 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chlorideを加えたH. pylori 選択プレートを用いて、形成されたコロニー数をカウントし、定量することができる。市販のH. pylori選択培養プレートを使用してもよい。
また、ミエロパーオキシダーゼ（ＭＰＯ）等の酵素活性は、所定の期間、薬物を投与し、薬物投与の終了後所望の期間、通常は約２４時間、絶食させた動物をエーテル麻酔下に開腹して胃を摘出する。薬物としては、例えば、御岳百草丸とベルベリンを、それぞれ、０．５〜２粒／ｋｇ／日又は０．１〜０．６ｍｇ／ｋｇ／日となるよう調製して、使用することができる。
【００３３】
胃粘としては、摘出した胃の所望の部位、例えば、胃体部及び幽門部の境界領域をコルクボーラー等を用いてパンチアウトして試験片とし、重量を測定する。こうして調製した試験片５０ｍｇに対して、所望の緩衝液、例えば、0.5% hexadecyltrimethylammonium bromideを含有する50 mMのリン酸緩衝液（pH6.0、以下「PBH」ということがある）を所定の量、例えば、1.0mL加え、ポリトロン等にて破砕後、この破砕液を２〜５回凍結融解し、例えば、2,000ｘｇで10分間、４°Ｃにて遠心分離し、この上清を測定用試料とする。
このようにして、得た測定用試料から、２〜１０μLを取って、所望の濃度、例えば、0.167mg/mlのo-dianisidine dihydrochlorideおよび0.0001〜0.001%のH2O2を含む５〜２０ｍＭのPBH（pH 6.0）140〜148μLを加えて混和する。この混液を、例えば、吸光度450nmで測定し、ＭＰＯ活性を測定することができる。
【００３４】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
［試料抽出液の調製］
日局オウバク末（ベルベリン濃度1.21％）は堀江生薬（株）から、日局コウボク末（マグのロール濃度2.10％）、日局センブリ末（スウェルチアマリン濃度3.13％）、日局ゲンノショウコ末、日局ビャクジュツ末は、長野県生薬（株）より、それぞれ購入した。
日局オウバク末、日局コウボク末、日局センブリ末は、別々の容器にそれぞれ10.0gを秤量し、50ｍLのメタノールを加えて30分間超音波抽出を行った。
日局ゲンノショウコ末は1.675gを秤量し、50ｍLのメタノールを加えて30分間超音波抽出を行った。日局ビャクジュツ末は0.50gを秤量し、50ｍLのメタノールを加えて30分間超音波抽出を行った。
【００３６】
百草丸を粉末にし、日本薬局方24号篩を通した後、40gを秤量し、円筒濾紙（Whatman、GEヘルスケア・ジャパン（株）製）にとった。800ｍLのメタノール（和光純薬工業（株）製）を加えて、80°Ｃのウォーターバス中で20時間、ソックスレー抽出器を用いて抽出を行った。
得られた抽出液を濾紙（No.4、Whatman）で濾過し、ロータリーエバポレータにて、50℃で減圧濃縮し、百草丸抽出液とした。百草丸抽出液を以下の条件で高速液体クロマトグラフィーに供し、ベルベリン、マグノロール及びスウェルチアマリンの含有量を測定した。
ベルベリン、マグノロール及びスウェルチアマリンの標準品は、和光純薬工業（株）より購入した。
【００３７】
＜HPLC条件＞
装  置：高速液体クロマトグラフ（（株）日立製作所）
システムコントローラ：D-7000
インジェクタ：L-7200
ポンプ：L-7100
検出機：L-7405
溶離液：0〜12分、12分〜25分、25分〜30分で移動相の組成を変えて溶出させた。12分〜25分で使用した移動相を除き、９mMのリン酸二水素カリウム及び９mMの１−オクタンスルホン酸ナトリウムを含む水／アセトニトリル混液（16:9)を使用した。12分〜25分では、19.7mMのリン酸二水素カリウム及び４mMの１−オクタンスルホン酸ナトリウムを含む水／アセトニトリル混液（56:69)を使用した。
カラム：内径4.6mm×長さ150mm  粒子径5μm（ODS）
流  速：1.0mL/min
カラム温度：40  ℃
得られた各抽出液は、下記表１〜６に示す量にメタノール（和光純薬工業（株）製）で希釈し、ウレアーゼ阻害試験に使用した。
【実施例２】
【００３８】
［ウレアーゼ活性阻害試験］
（１）酵素溶液の調製
コロンビアＨＰ培地（日本ベクトン・ディッキンソン（株）製）を用いて、ヘリコバクター・ピロリ（東京大学医科学研究所より供与を受けた臨床分離菌株）を、５日間微好気性条件下（アネロパウチ・キャンピロ，三菱ガス化学（株）製）で培養し、増殖させた。
次いで、コロンビアＨＰ培地上で増殖したピロリ菌のコロニーを掻き取り、ここに２〜３mLの10％子牛血清（Gemini. Bio. Products社製）含有ブレインハートインフュージョン培地を加えて攪拌し、この菌液を2,000rpmで遠心分離した。
沈渣に１mMのメルカプトエタノールと１mMのEDTA-2Naとを添加したリン酸バッファー２〜３mLを加え、５分間、氷冷下で超音波処理をした。次いで、これを15,000rpmで遠心分離し、上清を濾別した。濾別した上清を20mMのリン酸バッファーで15倍に希釈し、酵素溶液（ストック溶液）とした。
【００３９】
（２）ウレアーゼ活性の測定
ウレアーゼの活性はインドフェノール法で測定した。まず、フェノール5.0g、ニトロプルシドナトリウム25mgを秤量して500mLの水に溶解させ、フェノール・ニトロプルシッドナトリウム溶液（以下、「溶液A」という。）を調製した。また、2.2gのリン酸水素ナトリウム及び2.5gの水酸化ナトリウムを約300mLの水に溶解し、ここに、3.0mLの有効塩素濃度10％以上の次亜塩素酸ナトリウムを添加し、水を加えて500mLとした溶液（以下、「溶液B」という。）を調製した。
【００４０】
上記（１）で得られた各抽出液50μLを試験管に取り（ｎ＝３）、ここに上記酵素液50μLを加えてよく混合し、37°Ｃで15分間インキュベートし、400 mMの尿素を添加した100mMリン酸緩衝液を基質溶液として300μL添加した。この混合液を直ちに振とうし、37°Ｃで15分間インキュベートした後に、100μLの１Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。
得られた反応液に、上記の溶液Ａ及び溶液Ｂを溶解し、有効塩素10％以上の次亜塩素酸ナトリウム3.0 mlを添加し、水で500 mlとした溶液2.5 mlを加え、65°Ｃのウォーターバス中で20分間インキュベートした。吸光光度計にて、波長630nmで測定し、下記の式に従ってウレアーゼの阻害率を求めた。
ウレアーゼ活性値（Ｕ）＝Ｅｓ−Ｅｂ
【００４１】
Ｅｓ：酵素液を使用して測定した吸光度
Ｅｂ：酵素液の代わりに緩衝液を使用して測定した吸光度
ウレアーゼ阻害率（％）＝｛（Ｕｂ−Ｕｓ）／Ｕｂ｝×100
Ｕｂ：抽出液の代わりに水を使用して測定したウレアーゼ活性値
Ｕｓ：抽出液を使用して測定したウレアーゼ活性値
各試料のウレアーゼ阻害活性を、表１〜表６に示す。
【００４２】
【表１】
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*反応液が黄色となり、吸光度は−で振り切れたため、100とした。
【００４３】
【表２】
2012097072.tif 000007
【００４４】
【表３】
2012097072.tif 000008
【００４５】
【表４】
2012097072.tif 000009
【００４６】
【表５】
2012097072.tif 000010
【００４７】
【表６】
2012097072.tif 000011
【００４８】
上記表６より、ゲンノショウコに高いウレアーゼ阻害活性が見られた。これに対し、センブリ及びビャクジュツには中程度のウレアーゼ阻害活性他見られた（表４及び表５）が、オウバクのウレアーゼ阻害活性は弱く（表２）、コウボクにはウレアーゼ阻害活性は見られなかった（表３）。
これに対し、百草丸の抽出物は非常に高いウレアーゼ阻害活性を示した（表１）。このため、実施例１で得た抽出液中のスウェルチアマリン、ベルベリン及びマグノロールの含有量を測定した。結果を下記表７に示す。
【００４９】
【表７】
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以上より、上記の各生薬からの抽出物を、それらに含まれるスウェルチアマリン、ベルベリン及びマグノロールの量比が、上記表７に示す割合となるように混合することによって、これらの抽出物単独では得られない、相乗的な高いウレアーゼ阻害活性を示すことが明らかになった。
【実施例３】
【００５０】
［抗菌作用の検討］
（１）試料等
通常、胃腸薬として市販されている製品で、抗菌作用のある中医・和漢生薬を複数含有する製剤（百草丸、長野県製薬（株））を用いて、その製剤及び含有する生薬のHelicobacter pyloriに対する抗菌作用を調べた。
コロンビアHP寒天培地は、日本ベクトン・ディッキンソン（株）より購入して使用した。ハートインフュージョン（HI）、トリプティケースソイブロス（TBS）培地、及びミューラーヒントン培地は、栄研化学（株）より購入したものを用いた。血清を含むHI培地は、牛胎児血清（FBS、Gemini. Bio. Products社製）を10％（v/v）加えて調製した。
必要に応じて、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC、東京化成工業（株）製）を５ｘ10-4％（v/v）、またはデオキシコール酸（DCA、和光純薬（株）製）を0.1％（w/v）加えた。LB培地は、0.5ｇのNaCl、0.5ｇのイーストエキストラクト、１ｇのトリプトンに100mLの蒸留水を加えて調製した。
【００５１】
百草丸５ｇに、メタノール100mLを加えて抽出を行い、そのメタノール抽出液（ベルベリン4.13％、マグノロール3.77％、スウェルチアマリン0.33％含有）を試験に供した。
和漢生薬として、オウバクエキス（ベルベリン8.8％含有、日本粉末（株）製）の原液と、コウボク乾燥エキス（マグノロール0.695％含有、日本粉末（株）製）を用いた。これらは、それぞれ５ｇを水50mLに溶かして100mg/mLに調整し、原液とした。
【００５２】
また、センブリ末エキス（スウェルチアマリン9.86％含有、日本粉末（株）製）は、66％センブリエキス（170mg/mL）の水溶液を調整し、原液とした。ゲンノショウコ末エキスは、66％ゲンノショウコエキスを用いて33.5mg/mLの水溶液を調整し、ゲンノショウコ原液とした。ビャクジュツ末エキス（日本粉末（株）製）は、73.6％ビャクジュツエキスを用いて82mg/mLの水溶液に調整し、原液とした。
生薬の有効成分の標準品として、市販のベルベリン、マグノロール、スウェルチアマリン（いずれも、和光純薬（株）製）を使用した。塩化ベルベリンは10mg/mL、マグノロールとスウェルチアマリンはそれぞれ１mg/mLのメタノール溶液に調整し、これらを原液とした。なお、クラリスロマイシン（和光純薬(株)製）は、２mg/mLのメタノール溶液に調整し、原液とした。
ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）は、東大医科研より１株、理研より２株（株名なし、JCM12095）を入手し、使用した。
【００５３】
（２）抗菌効果の測定
抗菌効果の測定はディスク法で行い、阻止円の直径を測定して評価した。
菌液の調整は、以下のように行った。−80°Ｃで凍結保存してあるHelicobacter pyloriのHI-FBS凍結凝塊を、コロンビアHP寒天培地に白金耳で全面に植菌し、微好気ガスパック（三菱ガス化学（株））を用いて、37°Ｃで３日間培養した。次いで、この培地上にHI-FBSを２mL加えて菌苔を掻き取り懸濁液とした。
この懸濁液の濁度をＯＤ600で測定し、菌数が106個/100μＬとなるように調製した。この菌液100μLをコロンビアHP寒天培地に塗布し、薬液50μLを浸み込ませたディスク（ペーパーディスク抗生物質検定用、直径８mm（ADVANTEC東洋（株）製））をこの寒天培地上に置き、37°Ｃで３日間、微好気条件下に培養した。
陰性対照として、10倍希釈した菌液をコロンビアHP寒天培地に塗布した別プレートを作成し、同時に同じ条件下で培養して、コロニー数を計数した。
１検体について、同じ条件で３回以上実験を行い、各回の阻止円を測定して平均値と偏差とを求めた。
【００５４】
陽性対象として、Escherichia coliとStaphylococcus aureus H209Pを用い、同様の実験を行い、抗菌効果を測定した。E. coliはLB培地で、S. aureusはTSB培地で、それぞれ培養し、各菌液の濁度をＯＤ600で測定し、Helicobacter pyloriのときと同様に、106個/100μLに調製し、ミューラーヒントン培地に塗布してディスクを置き、37°Ｃで一昼夜培養し、阻止円の直径を測定した。結果を表８に示す。
【００５５】
【表８】
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【００５６】
オウバク末エキス、コウボク末エキス、ゲンノショウコ末エキスは、いずれも、S. aureus、２株のHelicobacter pyloriに対する阻止円が形成され、これらの菌に対して抗菌作用を示した。オウバク及びコウボクでは、標準品とエキスとで阻止円の大きさに違いがあり、エキスの阻止円の方が大きくなっていた。
センブリ末エキスの場合、E. coli、S. aureus及び２株のH. pyloriに対する阻止円が形成されたが、スウェルチアマリンの標準品では、いずれの濃度でも、阻止円の形成は見られなかった。また、ビャクジュツ末エキスでは、使用したいずれの菌に対しても阻止円を形成しなかった。一方、製剤では、H. pyloriの２株に対し、阻止円の形成が見られた。製剤とほぼ同量のベルベリンを含有するオウバク末エキスでは、製剤より大きな阻止円の形成が観察された。S. aureusでは、製剤を用いたときには阻止円が形成されなかった。
これに対し、Helicobacter pyloriでは、エキスを使用した場合に形成される阻止円よりも小さかったが、製剤でも阻止円が形成され、抗菌作用があることが確認された。
【００５７】
（３）阻止円内のHelicobacter pyloriのコロニー形成能の検討
また、抗菌効果の測定方法の手順に従って、Helicobacter pyloriの培養を行い、クラリスロマイシン、ベルベリン、オウバクエキスのディスクを置いて阻止円を形成させた。その後、阻止円内を白金耳で触れ、HI-FBS-TTC培地に線を引き、画線培養した。対照として阻止円外の菌苔についても、同様の操作を行った。以上のようにして調製したプレートを、37°Ｃで３日間、微好気条件下に培養した。
また、各プレートに上記の薬液に浸漬したディスクを置いて、同様の条件下に培養を行い、１〜４日目まで、経時的に阻止円内外の菌のコロニー形成能の有無を検討した。結果を表９に示す。
【００５８】
【表９】
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【００５９】
阻止円内のH. pyloriのコロニー形成能を確認した結果、阻止円の菌苔から、画線培養した菌は生育した。しかし、クラリスロマイシン、ベルベリン、オウバク末エキスを含浸させたディスクによって形成された阻止円内から採取し画線培養した菌は、いずれも、生育しなかった。
H. pyloriは、周囲の環境がその生存に適さなくなると、球状体cocoid formに変化することが知られていることから、この実験において、阻止円内から得た菌を画線培養しても生育しなかったことが、抗菌薬の抗菌作用によるものであるのか否かは判定できなかった。
【００６０】
（４）0.1％（w/v）デオキシコール酸含有培地における菌のコロニー形成能
E. coli、S. aureus及びH. pyloriを用いた実験で使用した各薬剤の抗菌スペクトルを見ると、Helicobacter pyloriは同じグラム陰性菌のE. coliではなく、グラム陽性菌であるS. aureusに類似した抗菌スペクトルを示した。これより、グラム陽性菌の発育を抑制するデオキシコール酸含有培地におけるHelicobacter pyloriの生育の有無を検討した。
−80°Ｃで凍結保存してあるHelicobacter pyloriをHP寒天培地に塗り広げ、微好気条件下で、37°Ｃにて３日間培養した。次いで、培養した菌を白金耳にとり、HI-FBS-DCA培地に線を引き、微好気条件下にて、37°Ｃで３日間培養した。E. coli及びS. aureusは、LB寒天培地上野コロニーを白金耳で釣菌し、HI-FBS-DCA培地に画線し、37°Ｃで一昼夜培養を行った。
また、対象として、HI-FBS培地でも、同様に培養を行った。結果を表１０に示す。
【００６１】
【表１０】
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【００６２】
表１０に示されるように、デオキシコール酸含有培地において、E. coliは発育できたが、S. aureus、Helicobacter pyloriは発育しなかった。これに対し、対照であるデオキシコール酸を含んでいない培地では、すべての菌が生育した。このことから、同じグラム陰性菌であっても、Helicobacter pyloriとE. coliとでは、外膜の透過性に違いがある可能性が示唆された。
【００６３】
以上より、胃腸薬として常用されている製剤Ａに、ピロリ菌に対する抗菌作用が見られ、このことから、除菌治療の補助として使用できる可能性が示唆された。また、各エキスを混合した製剤では、S. aureus H209Pに対する抗菌作用は減弱していたが、ピロリ菌に対する特異的な増殖抑制効果は維持されていた。さらに、オウバク末エキス、コウボク末エキスの抗菌作用は各主成分（ベルベリン、マグノロール）の抗菌効果を上回る相乗効果が認められた。
【実施例４】
【００６４】
[in vivoにおけるヘリコバクター・ピロリに対する効果の検討]
（１）動物及び試薬等
６週齢の雄性スナネズミ（日本SLC（株）、６週齢）、体重40〜50gを清水実験材料（株）より購入した。ヘリコバクター・ピロリ菌は、TN2GF4 株（臨床分離株, Vac A およびCag A陽性）を使用した。試料として、御岳百草丸（長野県製薬（株）製）を、また、対照としてベルベリンを使用した。
御岳百草丸は、1粒を、第15改正日本薬局方の溶出試験第１液(pH1.2程度)と同組成の溶媒に溶解して1粒/10mLの溶液とした。また、ベルベリンは、第15改正日本薬局方の溶出試験第１液(pH1.2程度)と同組成の溶媒に溶解して0.03mg/10mLの溶液とした。
【００６５】
（２）試験方法
雄性スナネズミ２０匹は、温度22±1°Ｃ、明暗サイクル12/12時間の条件で、水と飼料を自由に摂取させながら、１週間、馴化飼育した後、１群４〜５匹に分けた。
陰性対照群（図２〜５中、「正常」と示す。）を除いて、ヘリコバクター・ピロリ菌を2 x 108 CFU/0.5mL/動物で経口接種し、その後、御岳百草丸溶液（１粒/kg/日）又はベルベリン（0.3mg/kg/日）を４週間連続投与した。
【００６６】
（２−１）胃粘膜の損傷
薬物投与終了後またはH. pylori 接種28日後に、動物をエーテル致死させて胃を摘出した。摘出した胃を大弯に沿って切開し、コルク板上にピンで固定後、解剖顕微鏡下（×10）にて、損傷程度を観察し、損傷面積及び出血面積（mm2）を測定した。
（２−２）胃内でのヘリコバクター・ピロリの生息数
薬物投与終了後、実施例４の観察を終えた胃を、20mLのPBS（pH 7.0）中に入れ、ポリトロンにて破砕した。この破砕液を原液とし、これをPBS（pH 7.0）にて10倍希釈した。
原液および10倍希釈液を、それぞれ100μLずつ、H. pylori 選択培養プレート（日水製薬（株））に塗布し、微好気性条件下に７〜８日間、37°Ｃで培養した。培養終了後、プレート上のコロニーをH. pyloriとしてコロニー数を計測した。H. pylori胃内生菌数はCFU/胃で表示した。
【００６７】
（２−３）ミエロパーオキシダーゼ（MPO）活性の変化
薬物投与終了後、24時間絶食させた動物をエーテル麻酔下に開腹した。生理食塩水にて全身灌流を行い、その後に胃を摘出し、Krawiszらの方法によりMPO活性を測定した。
すなわち、胃を大弯に沿って切開し、コルク板上にピンで固定後、胃体部および幽門部境界領域をコルクボーラー（内径９mm）にてパンチアウトして試験片とし、各試験片の湿重量（mg）を測定した。
各試験片50 mgに対して、0.5% hexadecyltrimethylammonium bromide（Sigma社製）含有50 mMリン酸緩衝液（pH6.0、以下「PB」ということがある）を1.0 mL加え、ポリトロンにて破砕後、この破砕液を３回凍結融解し、2,000ｘｇで10分間、４℃にて遠心分離し、この上清を測定用試料とした。
【００６８】
各試料から５μLとって、0.167mg/ml o-dianisidine dihydrochloride（Sigma社製）および0.0005%のH2O2を含む10 mMのPB（pH 6.0）145 μLを加えて混和し、450nmにおける吸光度の変化をマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製）を用いて測定した。MPO活性は、μmol H2O2/分/mgタンパクで表示した。
試料のタンパク量は、BCAプロテインアッセイキット（Pierce社製）を使用して測定した。
【００６９】
（３）結果
（３−１）胃粘膜の損傷
損傷面積を図２に、また、出血面積を図３にそれぞれ示す。胃粘膜には、過形成変化、潰瘍及びびらんが認められた。損傷面積はベルベリン投与群でやや低くなる傾向が認められたが、対照群及び御岳百草丸投与群との間に有意差は認められなかった。
また、出血面積は、御岳百草丸投与群で有意な低下が見られた、御岳百草丸がヘリコバクター・ピロリ感染に起因する胃潰瘍の出血を抑制していることが示された。
（３−２）胃内でのヘリコバクター・ピロリの生息数
薬物投与終了後、対照群、御岳百草丸投与群、及びベルベリン投与群のいずれからも、H. pyloriが検出された。菌数は、対照群で約5.0ｘ104 CFU/胃、他の２群では約0.9ｘ102 CFU/胃であり、対照群と比較して有意に少なくなっていた。
以上から、御岳百草丸及びベルベリンはいずれも、ヘリコバクター・ピロリの生息数を減少させることが示された。
【００７０】
（３−３）MPO活性の変化
各群のスナネズミの胃から調製した試料のMPO活性は、御岳百草丸投与群で対照よりやや高く、ベルベリン投与群でやや低い傾向を示したが、いずれの群でも有意差は認められなかった。
以上より、in vivoでは、御岳百草丸は、粘膜の損傷面積を減少させてはいないものの出血面積を大きく減少させていた。また、ヘリコバクター・ピロリの胃内の生息数もベルベリンと同程度に減少させることが示された。
御岳百草丸は、ヘリコバクター・ピロリの感染による胃粘膜障害に対して、保護作用を有することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、医薬の分野において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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