(57)【要約】【課題】有用な抗インフルエンザウイルス組成物を提供すること。【解決手段】本発明の抗インフルエンザウイルス組成物は、可変領域が（Ａ）配列番号３もしくは６に示されるアミノ酸配列；または（Ｂ）配列番号３もしくは６に示されるアミノ酸配列において、超可変領域外の１個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加または欠失された、アミノ酸配列からなる抗体軽鎖の二量体を含んでいる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
可変領域が下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列からなる抗体軽鎖の二量体を含んでいることを特徴とする抗インフルエンザウイルス組成物：
（Ａ）配列番号３もしくは６に示されるアミノ酸配列；または
（Ｂ）配列番号３もしくは６に示されるアミノ酸配列において、超可変領域外の１個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加または欠失された、アミノ酸配列。
【請求項２】
上記抗体軽鎖がヒト型の抗体軽鎖であることを特徴とする請求項１に記載の抗インフルエンザウイルス組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗インフルエンザウイルス組成物に関するものであり、特に、抗体軽鎖を含む抗インフルエンザウイルス組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、その抗原性が多様であることから、しばしば広範囲に亘って大流行し、甚大な被害をもたらすことが知られている。そのため、近年、インフルエンザに対する治療法が盛んに研究されている。例えば、非特許文献１には、インフルエンザウイルスに対する中和抗体（Ｃ１７９）が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００６−１９７９３０号公報（２００６年８月３日公開）
【特許文献２】特開２００４−９７２１１号公報（２００４年４月２日公開）
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Okuno, Y. et al（1993） J.Virol. 68, 517-520
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、インフルエンザの流行は依然脅威であり、新たなアプローチに基づく抗インフルエンザウイルス組成物を提供することは非常に有用である。
【０００６】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、新規な抗インフルエンザウイルス組成物を提供することを主たる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、これまで、抗体酵素に関して種々の独創的な研究を行ってきている（例えば、特許文献１を参照のこと）。従来、完全ヒト型配列を有する抗体酵素は、多発性骨髄腫患者から得られるベンスジョーンズタンパク（ＢＪＰ）以外には得ることができなかった。多発性骨髄腫患者の患者数は少なく、また酵素活性を有するＢＪＰも少ないため、ヒト型の抗体酵素を取得することは困難であった。しかし、ヒト型の抗体酵素は、人体に投与した際の副作用が少ないと予想されるために、国内外の製薬会社などは、有用なヒト型の抗体酵素が開発されることを待ち望んでいる。
【０００８】
ところで、狂犬病は、発展途上国で今なお大きな疾病負荷を有する感染症であり、発症すれば死亡率が１００％である致死的な疾患である。狂犬病に対しては、現時点では、狂犬病ウイルス（rabies virus）曝露後における発症予防ワクチンの投与以外に、有効な治療法が無い。そのため、新たな視点からの治療法の開発が求められている。
【０００９】
そこで、本発明者らは、狂犬病に対する新たな視点からの治療法の開発のため、狂犬病ワクチンによって免疫したボランティアから、独自の技術を用いて抗体酵素を取得した。そして、得られた抗体酵素について研究を進めていたところ、驚くべきことに、得られた抗体軽鎖の二量体が、インフルエンザウイルスに対して有効であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明に係る抗インフルエンザウイルス組成物は、可変領域が下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列からなる抗体軽鎖の二量体を含んでいることを特徴としている：（Ａ）配列番号３もしくは６に示されるアミノ酸配列；または（Ｂ）配列番号３もしくは６に示されるアミノ酸配列において、超可変領域外の１個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加または欠失された、アミノ酸配列。なお、配列番号３に示されるアミノ酸配列において、超可変領域とは、第２４〜３９番目（ＣＤＲ１）、第５５〜６０番目（ＣＤＲ２）、および第９４〜１０２番目（ＣＤＲ３）を指す。また、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、超可変領域とは、第２４〜４０番目（ＣＤＲ１）、第５６〜６１番目（ＣＤＲ２）、および第９５〜１０３番目（ＣＤＲ３）を指す。
【００１１】
また、上記抗体軽鎖はヒト型の抗体軽鎖であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、新規な抗インフルエンザウイルス組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】プライマーセットの概略構成を示す模式図である。
【図２】１段階目のＰＣＲ反応後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図３】２段階目のＰＣＲ反応後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図４】２段階のＰＣＲ反応の反応産物を確認するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図５】ヒートショックによって形質転換された大腸菌のコロニー形成を示す図である。
【図６】形質転換した大腸菌において、発現誘導を受けた状態の発現タンパク質を示す図である。
【図７】形質転換した大腸菌において、発現誘導を受けていない状態の発現タンパク質を示す図である。
【図８】形質転換した大腸菌において、菌体の可溶性画分に含まれる発現タンパク質を示す図である。
【図９】形質転換した大腸菌において、菌体の不溶性画分に含まれる発現タンパク質を示す図である。
【図１０】形質転換した大腸菌における発現タンパク質をウエスタンブロッティングによって同定した図である。
【図１１】大腸菌において発現させた目的タンパク質の一次精製時におけるクロマトグラムを示す図である。
【図１２】目的タンパク質を一次精製した後の精製状態を示す図である。
【図１３】大腸菌において発現させた目的タンパク質の二次精製時におけるクロマトグラムを示す図である。
【図１４】目的タンパク質を二次精製した後の精製状態を示す図である。
【図１５】プライマーセットの概略構成を示す模式図である。
【図１６】ＰＣＲ反応後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図１７】ＰＣＲ反応後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図１８】粗精製後の各サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図１９】ｃＤＮＡの設計を説明するための図であり、（ａ）は、単量体のヒト型抗体軽鎖を得るためのｃＤＮＡの設計の概略を示し、（ｂ）は、変異導入前のヒト型抗体軽鎖と変異導入後のヒト型抗体軽鎖との組成の概略を示す。
【図２０】ジスルフィド結合を形成するシステインを置換したヒト抗体κ型軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図２１】ジスルフィド結合を形成するシステインを置換したヒト抗体κ型軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。
【図２２】各クローンのインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を調べた結果を示すグラフである。
【図２３】抗インフルエンザウイルス活性のインビボ試験の概要を示す図である。
【図２４】抗インフルエンザウイルス活性のインビボ試験における体重測定および生死判断の結果を示す図である。
【図２５】抗インフルエンザウイルス活性のインビボ試験における体重測定および生死判断の結果を示す図である。
【図２６】抗インフルエンザウイルス活性のインビボ試験における体毛の観察結果を示す図である。
【図２７】抗インフルエンザウイルス活性のインビボ試験における体毛の観察結果を示す図である。
【図２８】抗インフルエンザウイルス活性のインビボ試験における血中抗体価の測定結果を示す図である。
【図２９】抗インフルエンザウイルス活性のインビトロ試験の結果を示す図である。
【図３０】抗インフルエンザウイルス活性のインビトロ試験の結果を示す図である。
【図３１】クローン２２Ｆ６等の酵素活性を示す図である。
【図３２】クローン＃４等の核酸分解活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、抗インフルエンザウイルス組成物を提供する。本発明に係る抗インフルエンザウイルス組成物は、本発明者らが狂犬病ウイルスのワクチンによってヒトを免疫し、独自の手法を用いて取得した抗体酵素またはその変異体を含んでいることを特徴としている。
【００１５】
抗インフルエンザウイルス組成物とは、抗インフルエンザウイルス活性を有する組成物を意味する。抗インフルエンザウイルス活性とは、インフルエンザウイルスの感染性、増殖能または免疫回避能を低下させる活性を意味する。
【００１６】
インフルエンザウイルスの感染性とは、インフルエンザウイルスが宿主細胞に吸着または侵入する性質を意味する。このときの抗インフルエンザウイルス活性は、例えば、ヒト型抗体酵素の活性によってウイルス粒子の表面タンパク質を、少なくとも部分的に切断または分解して、宿主細胞に対するウイルスの吸着または侵入を抑制する活性を示す。
【００１７】
また、インフルエンザウイルスの増殖能は、宿主細胞におけるウイルス粒子の構成タンパク質の合成能、ウイルス粒子の形成能またはウイルス遺伝子の複製能を意味する。このときの抗ウイルス活性は、例えば、宿主細胞において、あるウイルスタンパク質を分解して成熟したウイルス粒子の形成を抑制する活性を意味する。当該ウイルスタンパク質としては、ウイルスタンパク質の合成を促進するか、もしくは合成に必須なウイルスタンパク質、ウイルス粒子の形成を促進するか、もしくは形成に必須なウイルスタンパク質、またはウイルス遺伝子の複製を促進するか、もしくは複製に必須なウイルスタンパク質が挙げられる。
【００１８】
ウイルスの免疫回避能は、宿主の免疫機構を回避する能力を意味する。このときの抗ウイルス活性は、例えば、ウイルス粒子の表面タンパク質の一部を切断して、抗原として認識可能な形態に変化させる活性、または宿主の免疫機構の一部を妨害するウイルスタンパク質を分解する活性である。
【００１９】
本発明に係る抗インフルエンザウイルス組成物に含まれる抗体酵素またはその変異体は、通常の抗体とは異なり、インフルエンザウイルスに結合すると同時に、インフルエンザウイルスの構成成分を加水分解（破壊）することで、インフルエンザウイルスの感染性、増殖能または免疫回避能を低下させるという新規の機能を有している。
【００２０】
標的とするインフルエンザウイルスの型は特に限定されないが、Ａ型のインフルエンザウイルスを好適に標的とし得る。
【００２１】
本発明に係る抗インフルエンザウイルス組成物に含まれる抗体酵素またはその変異体の詳細については、後述する。
【００２２】
一実施形態において、本発明に係る抗インフルエンザウイルス組成物は、ヒトまたは動物についての使用のために、直接注入により投与され得る。本発明に係る抗ウイルス剤はまた、非経口投与、粘膜投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、眼内投与または経皮的投与のために処方され得る。代表的には、組成物中に含まれるタンパク質は、０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の用量、好ましくは、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与され得る。
【００２３】
本実施形態に係る抗インフルエンザウイルス組成物は、上述した抗体酵素またはその変異体以外に、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤（それらの組み合わせを含む）を含み得る。
【００２４】
本実施形態に係る抗インフルエンザウイルス組成物は、ヒトまたは動物についての使用のためのものであり、そして代表的には、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、または賦形剤の任意の１つ以上を含む。治療的使用のための薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤は、薬学分野で周知であり、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載される。薬学的に需要可能なキャリア、賦形剤または希釈剤の選択は、意図された投与経路および標準的薬学的慣行に従って、当業者によって容易に選択され得る。また、本実施形態に係る抗インフルエンザウイルス組成物は、任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、被覆剤または可溶化剤をさらに含み得る。
【００２５】
異なる送達系に依存して、組成／処方の必要条件は、異なり得る。例示として、本発明に係る抗インフルエンザウイルス組成物は、ミニポンプを使用してまたは粘膜経路により、例えば、吸入のための鼻スプレーまたはエアロゾルとして、あるいは非経口的に送達するために処方され得る（ここで本発明に係る抗ウイルス剤は、例えば、静脈内経路、筋肉内経路もしくは皮下経路による送達のために注射可能形態として処方される）。あるいは、この処方物は、両方の経路により送達されるように設計され得る。
【００２６】
また、本発明に係る抗インフルエンザウイルス組成物を生体内に投与する用途で用いる場合、上述した抗体酵素またはその変異体の生体内における安定性（血中半減期）を向上させるための様々な技術が用いられ得る。例えば、ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦｃＲｎ）がＦｃに結合すると、ＩｇＧなどの抗体の血中半減期が延長することが知られており（例えば、Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ，Ｄ．Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ｖｏｌ．７  ７１５−７２５（２００７）参照）、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖のＣ末端を、ＦｃＲｎとの結合活性を有するように改変することができる。また、本発明に係るヒト抗体κ型軽鎖をダイマー化すること、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を付加することもできる。
【００２７】
本明細書中の記載に基づけば、当業者は、本実施形態に係る抗インフルエンザウイルス組成物の別の形態（例えば、キット）、および本発明に係る抗インフルエンザウイルス組成物を用いて疾患を処理（予防および／または治療）する方法もまた本発明の範囲内であることを、容易に理解する。本発明に係る抗インフルエンザウイルス組成物を用いて疾患を処置する方法において、処置対象となる疾患は、インフルエンザ（インフルエンザウイルス感染症）であり得る。また、本発明に係る抗インフルエンザウイルス組成物を用いて疾患を処置する方法において、被処置対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。
【００２８】
また、他の実施形態において、本発明に係る抗インフルエンザウイルス組成物は、インフルエンザウイルスを除去すべき被処理物からインフルエンザウイルスを除去するために用いられ得る。例えば、本発明に係る抗インフルエンザウイルス組成物は、噴霧剤、塗布剤、浸漬剤等の形態であり得、それぞれ、被処理物に対して噴霧、塗布または被処理物を浸漬するために用いられ得る。本実施形態に係る抗インフルエンザウイルス組成物は、用途に応じて、公知の抗ウイルス剤、界面活性剤、安定剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、保存料、粘張剤、溶媒等をさらに含んでいてもよい。
【００２９】
（抗体酵素およびその変異体）
本発明に係る抗インフルエンザウイルス組成物に含まれる抗体酵素またはその変異体は、本発明者らが狂犬病ウイルスのワクチンによってヒトを免疫し、独自の手法を用いて取得したヒト型の抗体軽鎖（ヒト由来の免疫グロブリンの軽鎖）およびその変異体である。
【００３０】
上記抗体酵素としては、ヒト抗体κ型軽鎖（２２Ｆ６）（後述するクローン２２Ｆ６に対応）の二量体、および、ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）の二量体（後述するクローン＃４に対応）が挙げられる。
【００３１】
ヒト抗体κ型軽鎖（Ｌ２２Ｆ６）の全長の塩基配列は、配列番号２に示される塩基配列であり、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードすることが推定される。なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列において第１〜１１２番目が可変領域であり、そのうち、第２４〜３９番目がＣＤＲ１であり、第５５〜６０番目がＣＤＲ２であり、第９４〜１０２番目がＣＤＲ３である。なお、可変領域のみのアミノ酸配列を配列番号３に示した。
【００３２】
また、ヒト抗体κ型軽鎖（＃４）の全長の塩基配列は、配列番号５に示される塩基配列であり、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードすることが推定される。なお、配列番号４に示されるアミノ酸配列において第１〜１１２番目が可変領域であり、そのうち、第２４〜４０番目がＣＤＲ１であり、第５６〜６１番目がＣＤＲ２であり、第９５〜１０３番目がＣＤＲ３である。なお、可変領域のみのアミノ酸配列を配列番号６に示した。
【００３３】
すなわち、本発明に係る抗インフルエンザウイルス組成物に含まれる抗体酵素またはその変異体は、可変領域が下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列からなる抗体軽鎖の二量体であり得る：
（Ａ）配列番号３もしくは６に示されるアミノ酸配列；または
（Ｂ）配列番号３もしくは６に示されるアミノ酸配列において、超可変領域外の１個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加または欠失された、アミノ酸配列。
【００３４】
なお、抗体酵素またはその変異体の定常領域は、ヒト型の抗体軽鎖の定常領域であることが好ましい。これにより、ヒトに投与したときの副作用を好適に抑えることができる。
【００３５】
なお、上記変異体において、定常領域におけるシステインは、他の抗体軽鎖と結合して二量体となるために必要であるため、保存されていることが好ましい。
【００３６】
また、上記変異体のアミノ酸配列における変異は、抗インフルエンザウイルス活性を変化させないものであり、上述したＣＤＲ配列の外に存在するものであることが好ましく、可変領域の外において存在するものであることがより好ましい。また、抗体酵素は、特許文献１に示すように、可変領域に「触媒三つ組残基様構造」と呼ばれる酵素活性をもたらす構造を有しており、これを構成するアミノ酸残基が変異していないことが好ましい。
【００３７】
なお、当業者は、周知技術を使用して抗体軽鎖を構成するアミノ酸残基のうちの１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。
【００３８】
好ましい変異体は、保存性または非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。これらは、上記抗体軽鎖の抗インフルエンザウイルス活性を変化させない。これら、１個もしくは数個のアミノ酸の変異は、定常領域においてなされることが好ましい。
【００３９】
上記抗体酵素またはその変異体は、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、上記抗体酵素またはその変異体は、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、上記抗体酵素またはその変異体はまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００４０】
上記抗体酵素またはその変異体は、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。
【００４１】
また、上記抗体酵素またはその変異体は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００４２】
一実施形態において、上記抗体酵素またはその変異体の生産方法は、上記抗体酵素またはその変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いることを特徴とする。
【００４３】
本実施形態の１つの局面において、上記抗体酵素またはその変異体の生産方法は、上記ベクターが組換え発現系において用いられることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、上記抗体酵素またはその変異体をコードするポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能な宿主に導入し、宿主（形質転換体）内で翻訳されて得られるポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。
【００４４】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。
【００４５】
また、抗体を製造するための細胞株がいくつか知られており、宿主としてはこれらを用いることが好ましい。
【００４６】
上記抗体酵素またはその変異体の生産方法は、上記抗体酵素またはその変異体を含む細胞または組織の抽出液から当該抗体酵素またはその変異体のポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。
【００４７】
本実施形態の他の局面において、上記抗体酵素またはその変異体の生産方法は、上記ベクターが無細胞タンパク質合成系において用いられてもよい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットが用いられ得る。好ましくは、本上記抗体酵素またはその変異体の生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。
【００４８】
無細胞タンパク質合成系は細胞内ｍＲＮＡやクローニングされたｃＤＮＡにコードされているさまざまなタンパク質の同定等に広く用いられる手法であり、無細胞タンパク質合成系（無細胞タンパク質合成法、無細胞タンパク質翻訳系とも呼ぶ）に用いられるのが無細胞タンパク質合成液である。
【００４９】
無細胞タンパク質合成系としては、コムギ胚芽抽出液を用いる系、ウサギ網状赤血球抽出液を用いる系、大腸菌Ｓ３０抽出液を用いる系、および植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液が挙げられる。一般的には、真核生物由来遺伝子の翻訳には真核細胞の系、すなわち、コムギ胚芽抽出液を用いる系またはウサギ網状赤血球抽出液を用いる系のいずれかが選択されるが、翻訳される遺伝子の由来（原核生物／真核生物）や、合成後のタンパク質の使用目的を考慮して、上記合成系から選択されればよい。
【００５０】
なお、種々のウイルス由来遺伝子産物は、その翻訳後に、小胞体、ゴルジ体等の細胞内膜が関与する複雑な生化学反応を経て活性を発現するものが多いので、各種生化学反応を試験管内で再現するためには細胞内膜成分（例えば、ミクロソーム膜）が添加される必要がある。植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液は、細胞内膜成分を保持した無細胞タンパク質合成液として利用し得るのでミクロソーム膜の添加が必要とされないので、好ましい。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「細胞内膜成分」は、細胞質内に存在する脂質膜よりなる細胞小器官（すなわち、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、葉緑体、液胞などの細胞内顆粒全般）が意図される。特に、小胞体およびゴルジ体はタンパク質の翻訳後修飾に重要な役割を果たしており、膜タンパク質および分泌タンパク質の成熟に必須な細胞成分である。
【００５２】
このように、上記抗体酵素またはその変異体の生産方法は、少なくとも、当該ポリペプチドのアミノ酸配列、または当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。
【実施例】
【００５３】
〔１：狂犬病ウイルスワクチンに対するヒト型抗体酵素のクローニング〕
（１−１．プライマーの設計）
図１に示すように、１段階目のＰＣＲ反応のためのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、２段階目のＰＣＲ反応のためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計した。
【００５４】
発明者らは、ペプチドまたは抗原タンパク質を切断または分解する活性を有するヒト由来の抗体酵素を用いて、その性質や構造の特徴を詳細に解析した。その結果、ペプチドまたは抗原タンパク質を切断または分解する活性を有する抗体酵素は、いずれもその立体構造中に、セリン残基、アスパラギン酸残基およびヒスチジン残基が立体構造において近接して存在することを明らかにした。ここで、「立体構造において近接して存在する」とは、セリン残基と、アスパラギン酸残基と、ヒスチジン残基との距離が、少なくとも３〜２０Åの範囲内、好ましくは３〜１０Åの範囲内にあることを意味する。以下において上記３つのアミノ酸残基が立体構造において近接している構造を「触媒三つ組残基様構造」と称する。上記３つのアミノ酸残基間の距離が３〜２０Å、特に３〜１０Åの範囲内であれば、三つ組み残基様構造と基質（ペプチドや抗原タンパク質）とが十分に反応できると考えられる。
【００５５】
抗体は、重鎖（Ｈ鎖：Heavy chain）および軽鎖（Ｌ鎖：Light chain）から構成されている。重鎖および軽鎖は、可変領域（ＶＲ：Variable Region）および定常領域（ＣＲ：Constant Region）から構成されており、可変領域は、超可変領域（ＣＤＲ：Complimentarity Determining Region）を有している。さらに、抗体の軽鎖は、κ型およびλ型に分類される。
【００５６】
抗体遺伝子は、可変領域および定常領域をコードしている。軽鎖の可変領域の構造遺伝子は、Ｖ遺伝子およびＪ遺伝子から構成されている。生殖細胞系列（germline）遺伝子は、それぞれコードするアミノ酸配列が異なるため、抗体遺伝子を構成する可変領域の構造遺伝子によってそれぞれの遺伝子産物である抗体も配列が異なる。これによって、抗体の多様性が生じる。そして、この生殖細胞系列遺伝子は、その塩基配列に基づいて、サブグループに分類される。
【００５７】
発明者らは、ヒト抗体において、サブグループＩＩに属するκ型軽鎖のＶ遺伝子（サブグループＩＩのＶκ遺伝子）にコードされるポリペプチドが上記三つ組様残基構造を高頻度に有していることを明らかにした（例えば、特許文献１を参照のこと）。このことから、抗原との結合部位を構成する可変領域において上記三つ組様残基構造が形成されて、この構造に基づいて酵素活性を獲得した場合に、特に有用なヒト型抗体酵素が得られると考えられる。
【００５８】
しかし、Ｖκ遺伝子の各サブグループ間の配列が非常に類似しているため、ＰＣＲ反応を利用して、サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子を増幅するためのプライマーの設計は非常に困難であった。本発明者らは、試行錯誤の結果、後述するような塩基配列のプライマーを用いた２段階のＰＣＲ反応によれば、効率的にサブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有する抗体軽鎖遺伝子を増幅することを見出した。
【００５９】
（１−２．ヒト末梢血ｃＤＮＡの調製）
狂犬病ウイルスのワクチンを用いて、複数回にわたって過剰免疫されたボランティアから得られた末梢血から、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅを用いてリンパ球を分離した。ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、分離した約３．０×１０７個のリンパ球からトータルＲＮＡを得た。ＴｈｅｒｏｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）をプライマーとして、トータルＲＮＡを逆転写することにより、目的とするｃＤＮＡ（ｃＤＮＡライブラリ−）を調製した。
【００６０】
（１−３．１段階目のＰＣＲ反応）
１段階目のＰＣＲ反応では、１−２．で調製したヒト末梢血ｃＤＮＡを鋳型として使用した。フォワードプライマーとしては、塩基配列が、ａｇｔｔＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＡＡＴＧ（配列番号７）であるオリゴヌクレオチドを用いた。なお、５〜１０番目（ＣＣＡＴＧＧ）は、制限酵素サイトである。リバースプライマーとしては、塩基配列が、ｃｃｇｔＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧ（配列番号８）であるオリゴヌクレオチドを用いた。なお、５〜１０番目（ＣＴＣＧＡＧ）は、制限酵素サイトである。プライマーの詳細を表１にまとめた。
【００６１】
【表１】
2012171959.tif 000002
【００６２】
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲチューブの中で、総量２０．０μｌの反応液により行った。反応液は、上記ヒト末梢血ｃＤＮＡ：０．５μｌ、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦバッファー：４．０μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ：０．４μｌ、１０μＭリバースプライマー：０．８μｌ、１０μＭフォワードプライマー：０．８μｌ、滅菌ミリＱ水：１３．３μｌを混合したものに、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ：０．２μｌを加えることにより調製した。
【００６３】
サーマルサイクルの反応時間は、９８℃：３０秒→（１）９８℃：１０秒→（２）６０℃：３０秒→（３）７２℃：３０秒→（１）〜（３）の繰り返し（２９サイクル）→７２℃：５分→４℃で維持、とした。
【００６４】
ＰＣＲ反応後の反応液を、２％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース）で電気泳動した。電気泳動後のゲルをＥｔＢｒ染色し、ＵＶ照射したところ、約７５０ｂｐ付近に、目的遺伝子の増幅を示すバンドが観察された（図２）。
【００６５】
上記ゲルから、フェノールクロロホルム法を用いてＰＣＲ産物を精製した。
【００６６】
（１−４．２段階目のＰＣＲ反応）
２段階目のＰＣＲ反応では、１−３．で得た一段階目のＰＣＲ産物を鋳型として使用した。フォワードプライマーとしては、塩基配列が、ａｇｔｔＣＣＡＴＧＧＡＴＲＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＹＣＡＧ（配列番号９）であるオリゴヌクレオチドを用いた。なお、５〜１０番目（ＣＣＡＴＧＧ）は、制限酵素サイトである。リバースプライマーとしては、塩基配列が、ｃｃｇｔＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧ（配列番号８）であるオリゴヌクレオチドを用いた。なお、５〜１０番目（ＣＴＣＧＡＧ）は、制限酵素サイトである。プライマーの詳細を表２にまとめた。
【００６７】
【表２】
2012171959.tif 000003
【００６８】
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲチューブの中で、総量２０．０μｌの反応液により行った。反応液は、１−３．で得た一段階目のＰＣＲ産物（１／１０または１／１００に希釈）：０．５μｌ、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦバッファー：４．０μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ：０．４μｌ、１０μＭリバースプライマー：０．８μｌ、１０μＭフォワードプライマー：０．８μｌ、滅菌ミリＱ水：１３．３μｌを混合したものに、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ：０．２μｌを加えることにより調製した。
【００６９】
サーマルサイクルの反応時間は、９８℃：３０秒→（１）９８℃：１０秒→（２）６０℃：３０秒→（３）７２℃：３０秒→（１）〜（３）の繰り返し（２９サイクル）→７２℃：５分→４℃で維持、とした。
【００７０】
増幅後のＰＣＲ産物は、１−３．と同様に、２％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ Ａｇａｒｏｓｅ）電気泳動により検出した。図３に示す様に、７５０ｂｐ付近に目的遺伝子の増幅を示すバンドが観察された。なお、図に示すように、２段階目のＰＣＲ産物（１／１０希釈の鋳型を使用）および２段階目のＰＣＲ産物（１／１００希釈の鋳型を使用）は、１段階目のＰＣＲ産物よりもやや短くなっていることが判る。
【００７１】
上記ゲルから、フェノールクロロホルム法を用いて２段階目のＰＣＲ産物を精製した。
【００７２】
（１−５．ベクターへの組み込み）
１−４．における二段階のＰＣＲ反応により得られた約７５０ｂｐのＰＣＲ産物（サブグループＩＩに属するκ型軽鎖遺伝子）をｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯベクターへ組み込んだ。上記ＰＣＲ産物（約７５０ｂｐ）：０．５μｌ、食塩水：０．５μｌ、ミリＱ水：１．５μｌ、およびＴＯＰＯベクター：０．５μｌから、総量２．５μｌの反応液を調製し、２３℃で５分間反応させた。
【００７３】
（１−６．大腸菌の形質転換）
３３．３μｌのコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）に、サブグループＩＩに属するκ型軽鎖遺伝子をクローニングしたＴＯＰＯベクターを２μｌ加え、氷中に１０分間静置した。次に、４２℃のウォーターバスで４５秒間ヒートショックを行い、直ちに氷中に戻して２分間静置した。その後、クリーンベンチ内において、３００ｍｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間、震とう培養した（復活培養）。
【００７４】
復活培養の終了した培養液を、暖めておいた２×ＹＴ（Ｋｍ＋）固形培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
【００７５】
（１−７．インサートの確認）
２０個のコロニー（コロニー＃１〜＃２０）について、インサートを確認した。まず、定法を用いて菌体からプラスミドを回収した。回収したプラスミド：１．０μｌ、１０×Ｈバッファー：１．５μｌ、Ｅｃｏ  ＲＩ：０．３μｌ、および滅菌ミリＱ水：１２．２μｌからなる総量１５．０μｌの反応液を調製して、３７℃で一晩制限酵素反応を行った。その後、２％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース）を用いて電気泳動を行った。図４に示すように、コロニー＃１〜＃１６、＃１８、＃１９について、目的遺伝子の挿入を確認した。以降、これらをクローン＃１〜＃１６、＃１８、＃１９と称する。
【００７６】
（１−８．シーケンス解析および生殖細胞系列遺伝子（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｇｅｎｅ）の特定）
クローン＃１〜１６、＃１８および＃１９についてシーケンス解析を行い、相同性検索により、それぞれの生殖細胞系列遺伝子におけるＶκ遺伝子を判定した。結果を表３に示す。得られた１８クローンすべてがサブグループＩＩに属していた。
【００７７】
【表３】
2012171959.tif 000004
【００７８】
（１−９．ヒートショックによる形質転換）
クローン＃１、クローン＃１６、クローン＃７、およびクローン＃１１をそれぞれ、Ｈｉｓタグ配列サイトを有するプラスミドに導入した。濃度５ｎｇ／μＬに調製した上記プラスミドＤＮＡ１μｌを、氷上にて融解させた５０μＬのＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに加え、５分間にわたって氷上に静置した。その後、４２℃のウォーターバスにて３０秒間インキュベーションした後、２分以上氷上に静置した。クリーンベンチ内において、さらに、３７℃に温めておいた２５０μＬのＳＯＣ培地を加え、ラウンドチューブに移し替えて、３７℃、２００ｒｐｍにて１時間振とう培養（復活培養）した。復活培養の後、プレートに５０μＬまたは１０μＬの培養液を播いて、３７℃で一晩インキュベーションした後、プレート上に形成されたコロニーの個数をカウントした。
【００７９】
図５（ａ）は、５０μＬの培養液を播いたプレートを示す図であり、図５（ｂ）は、５０μＬの培養液を播いたプレートを示す図である。示すように、５０μＬの培養液を播いたプレートには５個のコロニーが形成され、形質転換効率は７．２×１０３ｐｆｕ／ｇＤＮＡであった。１００μＬの培養液を播いたプレートには３５個のコロニーが形成され、形質転換効率は２．１×１０４ｐｆｕ／ｇＤＮＡであった。
【００８０】
（１−１０．エレクトロポレーションによる形質転換）
１−９．におけるヒートショックによる形質転換とは別に、エレクトロポレーションによる形質転換についても実施した。５０μＬのコンピテントセルに５μＬの上記プラスミドを加えた後に、これをキュベットに素早く移して、１分間氷上に放置した。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定し、キュベットをエレクトロポレーターに配置してパルスを印加した。直後に４５０μＬのＳＯＣ培地を加え、転倒混和し、２ｍＬのチューブに移して、３７℃で１時間振とう培養した。
【００８１】
（１−１１．タンパク質発現誘導（前培養および本培養）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）
３ｍＬのＬＢ培地および６μＬのアンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を試験管に入れ、形質転換した菌のグリセロールストックから竹串を用いて菌の一部を試験管に移し、３７℃にて一晩前培養した。前培養の後、５ｍＬのＬＢ培地および５μＬのアンピシリン（最終濃度５ｎｇ／ｍＬ）を試験管に入れ、前培養した培養液をＬＢ培地の１／１００量（５０μＬ）だけ当該試験管に移し、２５℃にて本培養を開始した。本培養は、Ｏ．Ｄ．６６０が約０．６〜０．８になるまで続けた。Ｏ．Ｄ．６６０が約０．６〜０．８に達した後、０．１ＭのＩＰＴＧ５０μＬを試験管内に加え、３７℃にて６時間培養した。６時間後に５ｍＬチューブに培養液を入れ、４℃、１８０００×ｇにて１０分間遠心した。培地（上清）をデカンテーションによってファルコンチューブに移した。また、菌体（ペレット）に１×ＰＢＳを加え、菌体をピペットによって懸濁し、別のファルコンチューブに移した。培地および菌体の各々を凍結して保存した。
【００８２】
ＩＰＴＧによる誘導あり（＋）および誘導なし（−）の条件下において上記培地をサンプルとして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって目的のタンパク質の発現を確認した。その結果を図６および図７に示す。図６は、ＩＰＴＧ添加あり（＋）の菌体懸濁液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。図７は、ＩＰＴＧ添加なし（−）の菌体懸濁液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。なお、抗体のκ型軽鎖の理論分子量は約２４ｋＤａであるが、還元条件においてＳ−Ｓ結合が切断されるので、約３１ｋＤａの位置にバンドが現れる。図では、抗体のκ型軽鎖のバンドが現れる位置を矢印によって示している。
【００８３】
図６に示すように、ＩＰＴＧによる誘導あり（＋）の場合に、所望のタンパク質の発現を確認した。各サンプルにおける目的のタンパク質のバンドの濃度は、９レーンのＢＳＡ（濃度１００μｇ／ｍｌ、１０μｌ）のバンドの濃度と同程度であるので、サンプルの濃度は１μｇ／１ｍｌと推定される。なお、図７に示すように、ＩＰＴＧによる誘導なしの場合は、所望のタンパク質の発現は確認されなかった。
【００８４】
（１−１２．菌体の可溶性画分および不溶性画分の回収ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）
また、１−１１．において得られた菌体（ペレット）の懸濁液を、粘性がなくなるまで液体窒素を用いて繰り返し凍結融解させた後、１４０００ｒｐｍ、４℃にて２５分間遠心した。得られたペレットを不溶性画分とし、上清を可溶性画分としてそれぞれ回収した。不溶性画分には、サンプバッファーを加えてペレットを溶解させた。
【００８５】
ＩＰＴＧによる誘導あり（＋）およびＩＰＴＧによる誘導なし（−）の可溶性画分および不溶性画分をサンプルとして用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって、目的のタンパク質の発現を確認した。その結果を図８および図９に示す。図８は、菌体可溶性画分におけるタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。示すように、目的のタンパク質（矢印によって示した約３１ｋＤａのバンド）は、ＩＰＴＧによる誘導あり（＋）のレーン２においてわずかに検出された。図９は、菌体不溶性画分におけるタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。示すように、ＩＰＴＧによる誘導あり（＋）のレーン１〜６において目的のタンパク質が若干検出された。
【００８６】
（１−１３．ウエスタンブロッティングによる発現タンパク質の同定）
タンパク質の発現を確認することができたため、続いて、発現されたタンパク質が抗体軽鎖であるか否かを同定するために、抗ヒト型（Ｆａｂ’）２抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。まず、ＩＰＴＧによる誘導あり（＋）およびＩＰＴＧによる誘導なし（−）の各々の培地を、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿により濃縮し、電気泳動用ゲルの各レーンに流して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。続いて、電極を用いてメンブレンへの転写を行い、当該メンブレンをブロッキングした後、抗ヒト型（Ｆａｂ’）２抗体と免疫反応させた。その後、発色基質液を加え、メンブレンを観察した。結果を図１０に示す。図１０は、目的タンパク質のバンドを可視化したメンブレンを示す写真である。示すように、図６、図８および図９においてバンドが確認された３１ｋＤａ付近に、強いバンドが検出された。これにより、大腸菌において発現したタンパク質がヒト型抗体軽鎖であることを同定することができた。
【００８７】
（１−１４．発現タンパク質の精製）
発現タンパク質（ヒト型抗体軽鎖）を、一次精製および二次精製した。
【００８８】
一次精製としては、抗体カラムを用いたアフィニティー精製を行った。アフィニティー精製におけるクロマトグラムを図１１に示す。また、得られた各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）で分析した結果を図１２に示す。図１２（ａ）は、サンプルとして、還元していない発現タンパク質をアプライしたときの結果を示し、図１２（ｂ）は、サンプルとして、還元していない発現タンパク質をアプライしたときの結果を示す。示すように、フラクション２（Ｆｒ．２）以降においてかなり綺麗に精製されていた。非還元下（図１２（ａ））では、約２６ｋＤａ付近、還元下（図１２（ｂ））では、約３１ｋＤａ付近に目的のヒト型抗体軽鎖の単量体が検出された。また、非還元下（図１２（ａ））では、約５０ｋＤａ付近に、２量体が検出された。なお、約４０ｋＤａ付近の薄いバンドは不純物である。フラクション１〜３（Ｆｒ．１、Ｆｒ．２、およびＦｒ．３）をまとめて二次精製を行った。
【００８９】
二次精製としては、Ｈｉｓタグを用いた精製を行った。Ｈｉｓタグ精製におけるクロマトグラムを図１３に示す。また、得られた各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）で分析した結果を図１４に示す。図１４（ａ）は、サンプルとして、還元していない発現タンパク質をアプライしたときの結果を示し、図１４（ｂ）は、サンプルとして、還元していない発現タンパク質をアプライしたときの結果を示す。示すように、二次精製後では、全フラクションにおいて綺麗に精製されていた。非還元下（図１４（ａ））では、約２６ｋＤａ付近、還元下（図１４（ｂ））では、約３１ｋＤａ付近に目的のヒト型抗体軽鎖の単量体が検出された。また、非還元下（図１４（ａ））では、約５０ｋＤａ付近に、２量体が検出された。このように、銀染色の結果、ヒト抗体軽鎖以外のバンドが検出されたいことから、二次精製により高純度に精製されたと考えられる。
【００９０】
（１−１５．改変タンパク質の製造）
また、多くの抗体酵素は、単量体の状態で強い触媒活性を示す場合がある。そこで、各クローンについて、Ｓ−Ｓ結合を介して二量体の形成に必須と考えられる２２０番目のシステインに変異を導入して、単量体のヒト型抗体酵素のみが形成されるように、ｃＤＮＡを設計した。この設計の詳細を図１９に示す。図１９（ａ）に示すように、全長のヒト型抗体酵素の遺伝子における２２０番目のシステインをコードするＴＧＴを、ＧＣＴに置換した。これによって、図１９（ｂ）に示すように、元のアミノ酸配列では２２０番目がシステインであるために、単量体および二量体が混在していたが、置換後のアミノ酸では２２０番目がアラニンであるために、Ｓ−Ｓ結合が形成されず、単量体のみが得られた。このようにして得られたｃＤＮＡを用いて、１−９．〜１−１４．と同様にタンパク質の調製および精製を行った（Ｃ２２０Ａ改変体）。
【００９１】
次に、１−１．〜１−１５．とは異なる手法により、さらに抗体酵素クローンを取得した。
【００９２】
（１−１６．ヒト末梢血ｃＤＮＡの調製）
狂犬病ウイルスのワクチンを用いて、複数回にわたって被験者を過剰免疫し、血清の中和活性を測定した。血清の中和活性が最も高かった（７．２ＩＵ）被験者をドナーとして末梢血を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅを用いて当該末梢血からリンパ球を分離した。ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、分離した約３．０×１０７個のリンパ球からトータルＲＮＡを得た。ＴｈｅｒｏｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）をプライマーとして、トータルＲＮＡを逆転写することにより、後述するＰＣＲ反応において鋳型とするｃＤＮＡを調製した。
【００９３】
（１−１７．ＬＣＡライブラリの構築）
まず、図１５に示すようなプライマーを設計した。詳しくは、ＮＣＢＩのＩｇＢＬＡＳＴ（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）に登録されているヒト抗体軽鎖遺伝子の配列情報に基づき、これらのヒト抗体軽鎖遺伝子を網羅的に増幅するためのプライマーセットとして、５’（フォワード）プライマー２０種類と、３’（リバース）プライマー１種類とからなる計２０ペアのプライマーセットを設計した。５’プライマーは、ヒト抗体軽鎖のＶ領域のＮ末端領域に対応する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとし、３’プライマーは、ヒト抗体軽鎖の定常（Ｃ）領域のＣ末端領域に対応する塩基配列に対する相補配列を有するオリゴヌクレオチドとした。なお、５’プライマーには、大腸菌発現ベクターｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（登録商標、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入するための４塩基（ＣＡＣＣ）を付加した。
【００９４】
表４に各プライマーの塩基配列を示す。表４には、各５’プライマーを用いて増幅されるヒト抗体軽鎖遺伝子のＶκ遺伝子のサブグループを併せて示した。
【００９５】
【表４】
2012171959.tif 000005
【００９６】
次に、上述したｃＤＮＡおよび２０ペアのプライマーセットを用い、各ペア毎にＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ反応では、初めに９５℃で５分間インキュベートした後、９５℃で１５秒間、５４℃で５０秒間、および７２℃で９０秒間のサイクルを３５サイクル繰り返し、さらに７２℃で１０分間保持した後、４℃で保存した。ポリメラーゼとしてはＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従い使用した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、ゲルから目的の６６０ｂｐ付近のバンドを切り出し、精製した。
【００９７】
図１６に、ＰＣＲ産物の電気泳動結果の一部を示す。ＭＭは、マーカー（１ｋｂ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を示し、（１）は、５’プライマーとしてＶｋ３ｂＴＯＰＯを用いたＰＣＲ反応の産物を示し、（２）は、５’プライマーとしてＶｋ４ａＴＯＰＯを用いたＰＣＲ反応の産物を示す。図１６に示すように、目的の６６０ｂｐ付近に主要なバンドが観察され、ヒト抗体軽鎖遺伝子が効率よく増幅されたことが示された。なお、他の５’プライマーを用いたＰＣＲ反応の産物についても同様の結果が得られた。
【００９８】
続いて、精製した各ＰＣＲ産物を、製造者の指示に従い、大腸菌発現ベクターｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（登録商標、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ＬＣＡライブラリを構築した。ＬＣＡライブラリのサイズは、１．３５×１０5ＣＦＵであり、十分な多様性を有していた。
【００９９】
（１−１８．ＬＣ２ライブラリの構築）
サブグループＩＩに属するＶκ遺伝子を有するヒト抗体軽鎖遺伝子のみを増幅するために、５’プライマーとして、サブグループＩＩに対応するプライマー（表４に示すＶｋ２ａＴＯＰＯ、Ｖｋ２ｂＡＴＯＰＯ、Ｖｋ２ｂＧＴＯＰＯおよびＶｋ２ｃＴＯＰＯの４種類）を用い、３’プライマーとして、ＶＣＲ２８６２を用いて、１−１７．と同様の手順でＰＣＲ反応を実施した。
【０１００】
図１７に、ＰＣＲ産物の電気泳動結果の一部を示す。ＭＭは、マーカー（１ｋｂ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を示し、（１）は、５’プライマーとしてＶｋ２ａＴＯＰＯを用いたＰＣＲ反応の産物を示し、（２）は、５’プライマーとしてＶｋ２ｂＡＴＯＰＯを用いたＰＣＲ反応の産物を示し、（３）は、５’プライマーとしてＶｋ２ｂＧＴＯＰＯを用いたＰＣＲ反応の産物を示し、（４）は、５’プライマーとしてＶｋ２ｃＴＯＰＯを用いたＰＣＲ反応の産物を示す。図１７に示すように、目的の６６０ｂｐ付近に主要なバンドが観察され、ヒト抗体軽鎖遺伝子が効率よく増幅されたことが示された。
【０１０１】
続いて、１−１７．と同様に、精製した各ＰＣＲ産物を、製造者の指示に従い、大腸菌発現ベクターｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（登録商標、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ＬＣ２ライブラリを構築した。ＬＣ２ライブラリのサイズは、２．５８×１０4ＣＦＵであり、十分な多様性を有していた。
【０１０２】
なお、本発明者らは、ヒト抗体において、サブグループＩＩに属するκ型軽鎖のＶ遺伝子（サブグループＩＩのＶκ遺伝子）にコードされるポリペプチドが上記三つ組様残基構造を高頻度に有していることを明らかにしている（特許文献１を参照のこと）。そのため、ＬＣ２ライブラリに含まれるクローンがコードするヒト抗体軽鎖は、触媒三つ組様アミノ酸残基を有し、酵素活性を有する可能性が高いと考えられる。
【０１０３】
（１−１９．大腸菌の形質転換）
構築した２つのライブラリ（ＬＣＡライブラリ、ＬＣ２ライブラリ）のそれぞれについて、大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換した。ＴＯＰ１０内で、プラスミドを十分に増幅させた後、菌体を破壊してプラスミドを回収した。回収したプラスミドを精製した後、抗体軽鎖の効率のよい発現系である大腸菌ＢＬ２１の形質転換に供した。得られた形質転換体から、ライブラリ毎に３８４クローンをランダムに選び（計７６８クローン）、以下のスクリーニングに供した。
【０１０４】
（１−２０．第１および第２スクリーニング）
以下のように第１スクリーニングを実施した。具体的には、各大腸菌クローンを１５０μｌのＬＢ培地において培養し、その上清について、ＥＬＩＳＡ法により、抗体軽鎖の発現および狂犬病ウイルス抗原２種類に対する結合活性を測定した。測定結果に基づき、ＬＣＡライブラリから２０クローン、ＬＣライブラリから２３クローン、計４３クローンを、狂犬病ウイルス抗原２種類に対する結合活性がみられるクローンとして選択した。
【０１０５】
さらに、第１スクリーニングにおいて選択されたクローンについて、ＬＢ培地による培養のスケールを１０ｍｌとし、第１スクリーニングと同様の手順で、第２スクリーニングを実施した。第２スクリーニングの際、各大腸菌クローンからプラスミドを回収し、回収効率のよいものを選択した。
【０１０６】
また、得られたプラスミドについて、シーケンスを実施した。得られたシーケンスに基づき、Ｖκ領域のＮ末端の塩基配列を決定し、対応する抗体軽鎖のサブグループおよび由来する生殖細胞系列遺伝子（ジャームライン遺伝子）を推定するとともに、セリン、ヒスチジン、およびアスパラギン酸からなる触媒三つ組様残基を有すクローンを４つ、ＬＣ２ライブラリから見出した（ＬＣ２２Ｆ６、ＬＣ２２Ｇ２、ＬＣ２３Ｄ４およびＬＣ２３Ｆ１）。
【０１０７】
以上の結果を表５に示す。この結果に基づき、ＬＣ２ライブラリから上記４クローンを選択し、ＬＣＡライブラリから３クローン（ＬＣＡ１Ｂ８、ＬＣＡ２Ｃ２およびＬＣＡ２Ｈ９）を選択し、第３スクリーニングに供した。
【０１０８】
【表５】
2012171959.tif 000006
【０１０９】
（１−２１．粗精製）
上記７クローンについて、１００ｍｌの培養系で培養を行った。抗体軽鎖を発現させた菌体を、凍結融解を繰り返して破砕し、遠心分離して上清を回収した。回収した上清を、抗体軽鎖を含むサンプルとして、発現ベクター由来のＨｉｓタグを利用して抗体軽鎖を粗精製した。精製は、オープンカラムに担体（Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＴＭ６  ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）を充填し、緩衝液を自然落下させることにより実施した。カラムの平衡化、バインディング、およびサンプルアプライ後のウォッシュのための緩衝液の組成としては、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、および２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．４）を用いた。溶出のための緩衝液の組成としては、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、および５００ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．４）を用いた。溶出後、タンパク質溶出画分を、ＰＢＳ（−）によって一晩透析した後、分画分子量１００００の限外ろ過膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて遠心操作により濃縮して粗精製品とした。粗製製品について、ＳＤＳ電気泳動およびクーマシーブリリアントブルー染色によって確認した（図１８）。図１８中、四角枠で示したバンドは、低分子量側が抗体軽鎖のモノマーを、高分子量側が抗体軽鎖のダイマーを示すと考えられる。なお、抗体軽鎖モノマーの分子量は、タグ等が付加されているため、約２７ｋＤａとなった。
【０１１０】
（１−２２．第３スクリーニング）
得られた粗精製品のうち、精製の際に沈殿を形成しなかったものについて、ＥＬＩＳＡプレートに固定した狂犬病ウイルス抗原（狂犬病ウイルス標品（αＣＶＳ）および精製ニワトリ胚細胞狂犬病ワクチン（αＰＥＣＥ））との親和性（ｋｄ）を測定した。
【０１１１】
また、２２Ｄ４および２２Ｆ６について、酵素活性試験を行った。抗体軽鎖精製は全ての過程を低温下（４℃）、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在下で行った。抗体軽鎖発現細胞の培養上清を濃縮した後、３倍量の移動層（ＰＢＳ＋２０％グリセロール＋１ｍＭＤＴＴ）で希釈してサンプルとした。公知の方法に基づき、アフィニティー精製およびゲルろ過を行った。ウェスタンブロットおよび銀染色によって精製純度を確認した。
【０１１２】
酵素活性の測定に用いる基質（ＭＣＡ標識ペプチド）としては、Ｂｚ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＭＣＡ、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＭＣＡ（いずれもペプチド研究所、ＤＭＳＯにより１０ｍＭに調整）を用いた。バッファーとしては、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、１００ｍＭグリシン、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．０２％ＮａＮ3からなるバッファー２を用いた。
【０１１３】
６０μｌずつ各基質のおよび１２６０μｌのバッファー２を混合して、１５００μｌの反応液を調製した。反応液１００μｌに、各サンプル１００μｌを加えて３７℃においてインキュベートし、各時間における蛍光を測定した。なお、ネガティブコントロールとしては、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）１００ｍＭグリシンおよび０．０２％ＮａＮ3からなるバッファー１を用いた。ポジティブコントロールとしては、１ｍｇ／ｍｌ（４２μＭ）トリプシン１．６ｍｇおよび１ｍＭ  ＨＣｌ１．６ｍｌを、バッファー１により４０ｐＭに希釈したものを用いた。また、１０ｍＭ  ＡＭＣをバッファー１を用いて４００ｍＭとなるように希釈したものについても、反応液に加え、蛍光を測定した。結果、図３１に示すように、２２Ｄ４および２２Ｆ６ともに、酵素活性を有していた。また、同様に２３Ｆ１についても酵素活性を測定した。
【０１１４】
以上の結果を表６にまとめた。この結果に基づき、Ｌ２２Ｆ６、ＬＣ２３Ｄ４およびＬＣ２３Ｆ１を、抗ウイルス活性を有する抗体酵素の候補とした。なお、表６には、Ｌ２２Ｆ６およびＬＣ２３Ｄ４の分子量を併せて示す。
【０１１５】
【表６】
2012171959.tif 000007
【０１１６】
Ｌ２２Ｆ６、ＬＣ２３Ｄ４およびＬＣ２３Ｆ１の３つのクローンについて、全塩基配列を決定し、決定した塩基配列に基づき、解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＩＸ  Ｖｅｒ．８）を用いて、アミノ酸配列ならびに軽鎖の可変領域および定常領域を推定した。ＬＣ２３Ｄ４のＶκ部位（生殖細胞系列遺伝子におけるＶκ遺伝子）は、生殖細胞系列遺伝子Ａ１９／Ａ３と、１００％の相同性を有し、ＬＣ２２Ｆ６のＶκ部位（生殖細胞系列遺伝子におけるＶκ遺伝子）は、生殖細胞系列遺伝子Ａ１９／Ａ３と、９７．７％の相同性を有していた。
【０１１７】
（１−２３．改変タンパク質の製造）
Ｌ２２Ｆ６、ＬＣ２３Ｄ４およびＬＣ２３Ｆ１の３つのクローンについても、１−１５．と同様に、Ｓ−Ｓ結合を介して二量体の形成に必須と考えられる２２０番目のシステインに変異を導入して、単量体のヒト型抗体酵素のみが形成されるようにｃＤＮＡを設計し、タンパク質の調製および精製を行った（Ｃ２２０Ａ改変体）。
【０１１８】
（１−２４．得られた各クローンの配列）
以上、得られた各クローンについてのシーケンスの結果から推定されるアミノ酸配列は図２０および図２１を参照のこと。なお、図２０および図２１に示すアミノ酸配列は、１−１５．および１−２４．において説明した改変タンパク質のアミノ酸配列であり、先頭にメチオニンが存在し、末尾のシステインがアラニンに置換され、さらにロイシンおよびヒスチジンが付加されている。しかし、当業者であれば、図２０および図２１の先頭からメチオニンを取り、末尾のＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号１０）をＣに置換することにより、改変前の抗体軽鎖のアミノ酸配列を取得し得ることを容易に理解する。なお、図２０および図２１には、可変領域、定常領域およびＣＤＲ１〜３の位置が示されている。
【０１１９】
例えば、クローンＬ２２Ｆ６の全長の塩基配列は、配列番号２に示される塩基配列であり、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードすることが推定される。なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列において第１〜１１２番目が可変領域であり、そのうち、第２４〜３９番目がＣＤＲ１であり、第５５〜６０番目がＣＤＲ２であり、第９４〜１０２番目がＣＤＲ３である。なお、可変領域のみのアミノ酸配列を配列番号３に示した。
【０１２０】
例えば、クローン＃４の全長の塩基配列は、配列番号５に示される塩基配列であり、配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードすることが推定される。なお、配列番号４に示されるアミノ酸配列において第１〜１１２番目が可変領域であり、そのうち、第２４〜４０番目がＣＤＲ１であり、第５６〜６１番目がＣＤＲ２であり、第９５〜１０３番目がＣＤＲ３である。なお、可変領域のみのアミノ酸配列を配列番号６に示した。
【０１２１】
〔３：抗インフルエンザウイルス活性の評価〕
（３−１．インビトロ試験１）
続いて、得られた抗体酵素クローンが、インフルエンザウイルスに対して感染抑制能を有するか否かを試験した。インフルエンザウイルスとしては、Ａ／広島／７１／２００１（Ｈ３Ｎ２）株を用いた。ウイルスは、孵化後１１日目のニワトリ卵の尿膜腔において培養され、感染性の尿膜腔液として、使用時まで−８０℃にて保管した。感染させる細胞としては、１０％の牛血清が加えられたＥａｇｌｅ’ｓ最小培地（ＭＥＭ）中で培養されたＭＤＣＫ細胞を用いた。
【０１２２】
各クローンのサンプルは、ＰＢＳによって２０μｇ／ｍｌの濃度に希釈して使用した。インフルエンザウイルスは、Ｅａｇｌｅ’ｓ最小培地によって、約５×１０２または５×１０３ＰＦＵ／０．２ｍｌに希釈した。サンプルと、ウイルスとを等量（各０．２５ｍｌ）混合し、２０℃で４８時間インキュベートした。インキュベート後、ウイルスの感染価をプラーク法により算定した。具体的には、サンプル−ウイルス混合物は、組織培養トレイ上の単層のＭＤＣＫ細胞に予備接種し、３７℃において６０分間吸着させた。その後、接種材料を除去し、ＰＢＳで洗浄した。そして、ＭＤＣＫ細胞を、１．０％のアガロースＭＥおよび２０ｍｇ／ｍｌのトリプシンを含むＭＥＭ培地（第１被覆培地）によって被覆し、３７℃において加湿された５％ＣＯ2インキュベータ内で、４日間インキュベートした。その後、細胞を、第１被覆培地に０．００５％ニュートラルレッドを加えた第２被覆培地で被覆した。プラーク数は次の日に計測した。
【０１２３】
結果を図２２（ａ）および（ｂ）に示す。なお、図２２では、感染価をコントロールに対するパーセンテージで示している。また、「ｄｉｍｅｒ」は、サンプルが、二量体（モノマー）であることを示し、「Ｃ２２０Ａ」は、サンプルが、ジスルフィド結合がされないようにアミノ酸配列を改変して得られた単量体（モノマー）であることを示す。
【０１２４】
図２２に示すように、＃１クローン、＃４クローン、＃１１クローン、＃１８クローン、および２２Ｆ６クローンにおいて、インフルエンザウイルスの感染抑制効果が確認された。
【０１２５】
（３−２．インビボ試験）
インビボ試験により、ヒト型抗体酵素クローンのインフルエンザウイルスに対する効果をさらに確認した。図２３は、インビボ試験の概要を示す図である。図２３に示すように、（ｉ）インフルエンザウイルスと抗体酵素クローンとを混合し、２５℃、４８時間の条件で反応させ、（ｉｉ）反応後のウイルス液をマウスに経鼻接種し、（ｉｉｉ）体重、体毛、血中抗体価の変化を観察した。
【０１２６】
インフルエンザウイルスとしては、Ｈ１Ｎ１型のＡ型インフルエンザウイルスであるＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４を用いた。インフルエンザウイルス溶液はＰＢＳ（−）で希釈し、２０００ｐｆｕ／５０μＬに調製した。各抗体酵素は１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）で１００μｇ／ｍＬに希釈した。ウイルス液と抗体酵素を等量で混合し（混合後のウイルス終濃度１０００ｐｆｕ／５０μＬ、抗体終濃度５０μｇ／ｍＬ）、２５℃で４８時間静置し反応させた。また、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳとウイルス液を等量で混合し同様の処理を行い、抗体酵素非添加の陽性対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）群とした。
【０１２７】
マウスへのウイルスの接種は、まず、Ｂａｌｂ／ｃマウスをエーテルで麻酔し、ＰＢＳ（−）で適宜希釈した反応後のウイルス液をマウス一匹あたり２５μＬ、経鼻接種した。また、陰性対照（ｍｏｃｋ）群に対しては、ＰＢＳ（−）をマウス一匹あたり２５μＬ経鼻接種した。なお、２５℃、４８時間の反応によってウイルス力価が半減すると仮定すると、マウス接種時のウイルス力価は、２５０ｐｆｕ／マウス程度となる。
【０１２８】
接種時点を「０日」とし、以降毎日、体重測定を行った。また、マウスの体毛の変化を観察した。また、１週間おきに尾の先端約１ｍｍ程度をハサミで切り落とし、滴下する血液を回収した。回収した血液から、血清成分を分離して、血中抗体価測定に供した。血中抗体価測定は、まず、インフルエンザウイルスを感染させたＭＤＣＫ細胞をスライドガラスに固定し、ＰＢＳ（−）で希釈したマウス血清を添加し、室温で１時間静置した。その後、スライドガラスをＰＢＳ（−）で洗浄し、蛍光標識した抗マウスＩｇＧ抗体を反応させた。そして、蛍光を呈した細胞の有無から、マウスの血清ウイルス抗体価を測定した。
【０１２９】
結果を、図２４〜２７に示す。なお、図中において、＃１は、抗体酵素として、クローン＃４のＣ２２０Ａ改変体の単量体を用いた場合を示し、＃２は、抗体酵素として、クローン＃４の非改変体の二量体を用いた場合を示し、＃４は、抗体酵素として、クローン２２Ｆ６のＣ２２０Ａ改変体の単量体を用いた場合を示し、＃５は、抗体酵素として、クローン２２Ｆ６の非改変体の二量体を用いた場合を示し、＃６は、抗体酵素として、クローン２３Ｄ４のＣ２２０Ａ改変体の単量体を用いた場合を示し、＃７は、抗体酵素として、クローン＃１１の非改変体の二量体を用いた場合を示し、＃８〜＃１０は、抗体酵素として、クローン＃１８の非改変体の二量体を用いた場合を示す。
【０１３０】
図２４（ａ）および図２５（ａ）は、体重測定の結果を示す図であり、図２４（ｂ）および図２５（ｂ）は、生死判断の結果を示す図である。
【０１３１】
示すように、＃２群（クローン＃４二量体処理群）および＃５群（クローン２２Ｆ６二量体処理群）については、ウイルス感染に伴う顕著な体重減少が認められず、ウイルス非感染群（ｍｏｃｋ）と同様の挙動を示した。それ以外の抗体については、抗体酵素未処理群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比して、顕著な差は認められなかった。但し、致死率で見ると、＃１０群（クローン＃１８）では、試験に供した4匹のマウスのいずれも実験終了時（接種２１日目）まで生存し、死亡は一匹も認められなかった。
【０１３２】
また、インフルエンザウイルスの感染に伴いマウスの体毛は逆立ちを呈することが知られている。図２６（ａ）〜（ｆ）および図２７（ａ）〜（ｇ）は、感染後７日目におけるマウスの体毛を示す写真である。示すように、ウイルス非感染群（ｍｏｃｋ）では、体毛が滑らかで特に変化は認められないが、抗体酵素未処理群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）では、顕著な体毛の逆立ちが認められる。そして、＃２群（クローン＃４二量体処理群）および＃５群（クローン２２Ｆ６二量体処理群）では、顕著な体毛の逆立ちは認められず、ウイルス非感染群と同様の滑らかな体毛を呈していた。それ以外の抗体については、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と同様にウイルス感染時特有の体毛の逆立ちが認められた。この結果は体重減少の試験結果と明確に相関を示した。
【０１３３】
図２８は、血中ウイルス抗体価の経時変化を示す図であり、（ａ）は、感染後７日目、（ｂ）は、感染後１４日目、（ｃ）は、感染後２１日目の血中ウイルス抗体価を示す。示すように、＃２群（クローン＃４二量体処理群）および＃５群（クローン２２Ｆ６二量体処理群）では、その他の群（ウイルス非感染群（ｍｏｃｋ）を除く）よりも血中抗体価が低くなっていた。このように、ウイルス接種による血中ウイルス抗体価の変動も体重減少や体毛変化との相関を示した。
【０１３４】
以上のように、インビボ試験において、クローン＃４の二量体およびクローン２２Ｆ６の二量体の抗インフルエンザウイルス活性が確認された。
【０１３５】
（３−３．インビトロ試験２）
また、３−２のインビボ試験と同等の条件で、ウイルス液と各抗体酵素とを反応させ、３−１．と同様の手法によって、各抗体酵素の感染抑制効果を調べた。
【０１３６】
対象となる抗体酵素としては、クローン＃４の二量体、クローン＃４  Ｃ２２０Ａ改変体の単量体、クローン＃１１の二量体、クローン２２Ｆ６の二量体およびクローン＃２２Ｆ６  Ｃ２２０Ａ改変体の単量体とした。また、対照として、公知の中和抗体Ｃ１７９（非特許文献１参照）およびＰＢＳを用いた。
【０１３７】
各抗体酵素は、５０μｇ／ｍＬの濃度とし、インフルエンザウイルス液と等量混合した。中和抗体Ｃ１７９については、２０μｇ／ｍＬの濃度とした。これらを５倍に希釈して、ＭＤＣＫ細胞に加え、プラーク法によりウイルスの感染価を測定した。その他の条件については、３−１．３−２．と同等の条件を用いた。表７および図２９に結果を示す。
【０１３８】
【表７】
2012171959.tif 000008
【０１３９】
示すように３−２のインビボ試験と同様、クローン＃４の二量体およびクローン２２Ｆ６の二量体において顕著な感染抑制効果が観察された。なお、クローン＃１１、クローン２２Ｆ６  Ｃ２２０Ａ改変体においても、若干の感染抑制効果が観察された。
【０１４０】
（３−４．インビトロ試験３）
続いて、クローン２２Ｆ６の二量体をＭＤＣＫ細胞と混合し、２時間静置した後に、よく洗浄してからインフルエンザウイルス液をＭＤＣＫ細胞に加え、プラークの形成数を数えることにより、クローン２２Ｆ６の二量体の感染抑制効果を調べた。対照として、公知の中和抗体Ｃ１７９（非特許文献１参照）およびＰＢＳを用いた。
【０１４１】
ＭＤＣＫ細胞に対し、クローン２２Ｆ６の二量体は、１μｇ、１０μｇおよび１００μｇをそれぞれ加えた。また、中和抗体Ｃ１７９は、ＭＤＣＫ細胞に対し、１μｇ加えた。ＭＤＣＫ細胞の培地としては、ＤＭＥＭ培地を用いた。その他の条件については、３−１．３−２．と同等の条件を用いた。表８および図３０に結果を示す。
【０１４２】
【表８】
2012171959.tif 000009
【０１４３】
示すように、Ｃ１９７は、感染抑制効果を示さなかった。これは、Ｃ１９７が通常の抗体である（抗体酵素でない）ため、洗浄によって反応系から排除されたためと考えられる。一方、クローン２２Ｆ６は、洗浄を行ったにも拘わらず、濃度依存的に感染抑制効果を示した。これは、クローン２２Ｆ６が、ＭＳＣＫ細胞の表面に強く結合しているか、または、細胞内に入り込んでいることが推測される。このように、クローン２２Ｆ６は、Ｃ１９７が有していない独自の特性を有していることが示された。
【０１４４】
〔４：核酸分解活性試験〕
得られたヒト抗体軽鎖クローンの核酸分解活性を試験した。各サンプルは、Ｈｉｓ−Ｔａｇ精製の後、陽イオンカラムクロマトグラフィーにより精製したものを用いた。各サンプルの濃度は、後述の表９に示す。基質となる核酸としては、プラスミドＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）を用いた。ネガティブコントロールとしては、反応させていない基質（ＭａｓｔｅｒＭｉｘ）を用いた。ポジティブコントロールとしては、ＤＮａｓｅ１を反応させたものを用いた。各サンプルについては、３７℃のサーマルサイクラーにおいて、２４時間または４８時間反応させた。ポジティブコントロールについては、ＤＮａｓｅ１を３０分間反応させた。ネガティブコントロールについては、サーマルサイクラーにおいて、０時間、２４時間または４８時間インキュベートした。そして、反応後のサンプルに、１０×ローディングバッファおよびミリＱ水を加え、−３０℃で凍結した。その後、アガロースゲル電気泳動を行った。結果の一部を図３２（ａ）に示す。
【０１４５】
図３２（ａ）において、３０００ｂｐ近くの濃いバンドは、スーパーコイル形態のＤＮＡを示し、４０００〜６０００ｂｐのバンドは、ほどけた形態のＤＮＡを示す。図３２（ｂ）は、核酸分解活性の強さの段階と、バンドの状態との対応を示す図であり、最も右（１）は、全く活性が無い状態を示し、左に進むにつれ活性が高まり（２〜４）、最も左（５）が最も高い活性を示す。例えば、図３２（ａ）に示すように、＃４クローンでは、ＤＮＡのバンドが消失しており、＃４クローンが高いＤＮＡ分解活性（図３２（ｂ）における「５」）を有していることがわかった。これを各クローンの結果について当てはめたものを、表９にまとめた。
【０１４６】
【表９】
2012171959.tif 000010
【０１４７】
表９に示すように、＃４クローンの他、＃１８クローン、＃１クローン、２３Ｄ４クローンおよび＃１１クローンが確かな核酸分解活性を有していることがわかった。
【０１４８】
核酸分解活性を有する抗体酵素は、自己免疫疾患患者の血清中の抗体酵素によく見られることから、＃４クローンなどのクローンは、自己免疫疾患に関連する働きを有しているのかもしれない。また、＃４クローンなどのクローンは、ウイルスのＤＮＡを破壊する能力を有している可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
本発明は、製薬業、衛生用品の製造業等において好適に利用することができる。
【図１】
2012171959.tif 000011
【図１５】
2012171959.tif 000012
【図１９】
2012171959.tif 000013
【図２０】
2012171959.tif 000014
【図２１】
2012171959.tif 000015
【図２２】
2012171959.tif 000016
【図２３】
2012171959.tif 000017
【図２４】
2012171959.tif 000018
【図２５】
2012171959.tif 000019
【図２８】
2012171959.tif 000020
【図２９】
2012171959.tif 000021
【図３０】
2012171959.tif 000022
【図３１】
2012171959.tif 000023
【図２】
2012171959.tif 000024
【図３】
2012171959.tif 000025
【図４】
2012171959.tif 000026
【図５】
2012171959.tif 000027
【図６】
2012171959.tif 000028
【図７】
2012171959.tif 000029
【図８】
2012171959.tif 000030
【図９】
2012171959.tif 000031
【図１０】
2012171959.tif 000032
【図１１】
2012171959.tif 000033
【図１２】
2012171959.tif 000034
【図１３】
2012171959.tif 000035
【図１４】
2012171959.tif 000036
【図１６】
2012171959.tif 000037
【図１７】
2012171959.tif 000038
【図１８】
2012171959.tif 000039
【図２６】
2012171959.tif 000040
【図２７】
2012171959.tif 000041
【図３２】
2012171959.tif 000042
【配列表】
2012171959000001.app