(57)【要約】【課題】良好な美白効果を有し、且つ安全性が高い皮膚外用剤を提供する。【解決手段】本発明の皮膚外用剤は、グラブリジンが封入されたリポソームを含有する。リポソームを構成するリン脂質をスフィンゴミエリンとすることによって、グラブリジンによる美白効果を向上させ、且つグラブリジンによる細胞毒性を抑制することができる。このリポソームを皮膚外用剤に配合することにより、美白効果に優れ、且つ安全性の高い皮膚外用剤を得ることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラブリジンが封入されたリポソームを含み、該リポソームの構成成分であるリン脂質がスフィンゴミエリンであることを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項２】
グラブリジンの含有量が、皮膚外用剤全体質量に対して０．０００１質量％〜１質量％である請求項１に記載の皮膚外用剤。
【請求項３】
上記リポソームの平均粒径が、５０ｎｍ〜１０００ｎｍである請求項１または２に記載の皮膚外用剤。
【請求項４】
美白用の化粧料であることを特徴とする、請求項１乃至３の何れか１項に記載の皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美白作用を有する皮膚外用剤、特にグラブリジンとスフィンゴミエリンとを含む皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚に対して紫外線が照射されると、メラノサイトにおいてメラニン生成が促進される。このようなメラニン生成が、皮膚の黒化やシミ、ソバカスの原因となることが知られている。皮膚の黒化の予防及びシミ、ソバカスの除去を目的として種々の美白化粧料が提案されている。例えば、ビタミンＣ及びその誘導体、グルタチオン、コウジ酸、ハイドロキノン配糖体（類）、等を美白成分として含有する化粧料の開発がなされている。
【０００３】
しかしながら、ハイドロキノン類を除く従来の美白成分の美白効果は十分なものではなかった。また、ハイドロキノン類には美白効果は認められるものの、安全性の面で十分に満足できるものではなかった。このように、十分な美白効果を有し、且つ安全性が高い皮膚外用剤や美白化粧料は未だ開発されていないというのが現状である。
【０００４】
グラブリジンは、甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａ  Ｌ．等）に含まれるイソフラバンの一種であり、抗菌作用、抗酸化作用、及びメラニン生成抑制作用等を有することが知られている（特許文献１）。しかしながら、グラブリジンは、アルコール等への溶解性が低く、特に水への溶解性が極めて低いために、使用量や使用範囲が限定されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０１−３１１０１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述したように、皮膚外用剤の分野では、良好な美白効果を有し、且つ安全性が高い皮膚外用剤の開発が望まれている。
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、良好な美白効果を有し、且つ安全性が高い皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明に係る皮膚外用剤は、グラブリジンが封入されたリポソームを含み、該リポソームの構成成分であるリン脂質がスフィンゴミエリンであることを特徴とする。
【０００９】
好ましくは、グラブリジンの含有量が、皮膚外用剤全体質量に対して０．０００１質量％〜１質量％である。
【００１０】
好ましくは、上記リポソームの平均粒径が、５０ｎｍ〜１０００ｎｍである。
【００１１】
好ましくは、上記皮膚外用剤は、美白用の化粧料である。
【発明の効果】
【００１２】
グラブリジンをスフィンゴミエリンリポソームに封入することにより、良好な美白効果を有し、且つ安全性が高い皮膚外用剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例において、各評価用製剤で処理したヒト培養表皮のメラニン産生率を示す図である。
【図２】実施例において、各評価用製剤で処理したヒト培養表皮の生細胞率を示す図である。
【図３】実施例において、各評価用製剤で処理したヒト培養表皮のメラニン産生率を示す図である。
【図４】実施例において、各評価用製剤で処理したヒト培養表皮の生細胞率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、スフィンゴミエリンを主要なリン脂質成分とするリポソームを含有し、このリポソーム中にグラブリジンが封入された皮膚外用剤を提供するものである。
【００１６】
グラブリジンは、甘草の根等から一般的な抽出法により抽出される。具体的には、甘草の根部をエタノール、クロロホルム等の有機溶媒に浸漬し、常温で静置する。得られた抽出物から溶媒を留去することによって、約５〜１０％のグラブリジンを含有した抽出物が得られる。さらに、この抽出物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィ及び逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィにより処理し、アセトンなどを用いて再結晶化することにより精製することができる。本発明の皮膚外用剤においては、甘草抽出物、甘草抽出物からの精製品、又は合成品を用いることができる。グラブリジンは、例えば、上海奥利実業有限公司からＧｌａｂｒｉｄｉｎ−９０として入手することができる。
【００１７】
本発明の皮膚外用剤において、リポソームを構成するリン脂質は、主にスフィンゴミエリンである。以下、スフィンゴミエリンを主要なリン脂質成分とするリポソームを「スフィンゴミエリンリポソーム」という。具体的には、リポソームを構成するリン脂質中のスフィンゴミエリンの含有量が９０質量％以上であることが好ましい。より好ましくは９５質量％以上、更に好ましくは９８質量％以上である。
【００１８】
本発明の皮膚外用剤に用いられるスフィンゴミエリンとして、高純度のものを用いることが好ましい。純度９８％以上の高純度スフィンゴミエリンは、例えば、日油株式会社（商品名「ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＮＭ−１０」及び「ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＮＭ−７０」）及び株式会社シャローム（商品名「スフィンゴミエリンナチューレ」）から入手できる。
【００１９】
本発明における皮膚外用剤中の好ましいグラブリジンの含有量は、皮膚外用剤の種類、美白効果の程度によっても異なるが、０．０００１〜１質量％である。好ましくは、０．０００３〜０．０５質量％である。さらに好ましくは、０．０００５〜０．００５質量％である。含有量が０．０００１質量％より少ないと美白効果が十分でない。また、含有量が１質量％より多いと、皮膚外用剤の調製が困難となる。
【００２０】
また、皮膚外用剤中のグラブリジン濃度が増すと、グラブリジンによる細胞毒性が発現する。特に、本発明の皮膚外用剤のようにグラブリジンを高濃度で含有する場合、グラブリジンの細胞毒性が問題となる可能性がある。後述する実施例に示すように、例えば、０．００５質量％の濃度でグラブリジンを含むグラブリジン分散液を細胞に適用すると、３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）を用いたＭＴＴ試験によって細胞毒性が認められる。このような細胞毒性は、皮膚の白化及びかんぱん等の原因になりやすく、皮膚外用剤においては好ましくない。これに対し、グラブリジンをスフィンゴミエリンリポソーム中に封入すると、グラブリジンを０．００５質量％の濃度で細胞に適用しても、細胞毒性が認められない。
このように、本発明の皮膚外用剤は、グラブリジンをスフィンゴミエリンリポソーム中に封入することによって、グラブリジンによる細胞毒性が顕著に抑制されるという優れた効果を有している。
【００２１】
さらに、後述する実施例に示すように、グラブリジンをスフィンゴミエリンリポソーム中に封入することによって、同じ濃度のグラブリジン分散液を細胞に適用する場合と比べてメラニン産生が顕著に抑制されるという驚くべき効果が得られる。
このように、本発明の皮膚外用剤は、グラブリジンをスフィンゴミエリンリポソーム中に封入することによって、グラブリジンによる美白効果が顕著に向上するという優れた効果を有している。
【００２２】
また上述したように、グラブリジンは、アルコールや水への溶解性が極めて低い。そのため、水溶性の皮膚外用剤にリポソームに封入することなくグラブリジンを配合する場合、配合できるグラブリジン濃度の上限は、０．０００３質量％である。しかしながら、グラブリジンによる美白効果をより高めるためには、より高濃度でグラブリジンを含有することが好ましい。これに対し、本発明においては、スフィンゴミエリンリポソーム中にグラブリジンを封入することによって、水溶性の皮膚外用剤中に高濃度にグラブリジンを含有させることができる。そのため、水溶性の皮膚外用剤においても良好な美白効果を有し得る。
【００２３】
本発明の皮膚外用剤において、リポソーム中のグラブリジンの含有量は、通常０．０００１〜０．５質量％である。好ましくは、０．００１〜０．２％である。さらに好ましくは、０．０１〜０．１質量％である。含有量が０．０００１質量％より少ないと皮膚外用剤の美白効果が十分でなく、０．５質量％より多いとリポソームの調製が困難となる。
【００２４】
本発明の皮膚外用剤に含有されるリポソームは、一層のリン脂質の二分子膜からなる球状の小胞体であってもよく、多重層のリン脂質の二分子膜からなる球状の小胞体であってもよい。グラブリジンはこの小胞体中に取り込まれている。本実施形態において、リポソームは、安定性の観点から多重層の膜であることが好ましい。
【００２５】
スフィンゴミエリンリポソームの平均粒径は極めて小さいことが好ましい。好ましい平均粒径は、５０ｎｍ〜１０００ｎｍであり、より好ましくは、７０〜２００ｎｍである。粒径が５０ｎｍより小さいとリポソームの調製が困難とある。また、粒径が１０００ｎｍより大きいと皮膚への浸透性が低下する。
なお、リポソームの粒径は、一般的な方法によって測定することができる。例えば、粒度分布測定器Ｎｉｃｏｍｐ３８０ＺＬＳ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏ．、光散乱光度計）を用いることができる。
【００２６】
グラブリジンを封入したスフィンゴミエリンリポソーム分散液は、エタノール注入法、水和法、エーテル注入法、逆相蒸発法、薄膜法、超音波処理法、界面活性剤法、凍結・融解法などの公知のリポソーム製造方法によって調製することができるが、これに限定されるものではない。
【００２７】
エタノール注入法では、脂質をエタノールに溶解させ、その後、グラブリジンを添加する。次に、この溶液を高温に暖めた水中にシリンジあるいはノズル等より、加圧下、一定速度で注入する。この注入とともにエタノールが留去又は希釈されることによって脂質二重層が形成され、グラブリジンを含有するリポソーム分散液が調製される。
また、水和法では、スフィンゴミエリンおよびグラブリジンを適当な有機溶媒に溶解させ、減圧下にてこれら溶媒を留去して、脂質膜を形成する。その後、この脂質膜に水を添加して水和させ、超音波処理等を行うことにより、グラブリジンを含有するリポソーム分散液を調整することができる。
【００２８】
また、次のような方法によってスフィンゴミエリンリポソーム分散液を調製してもよい。まず、スフィンゴミエリンをエタノール等に添加し６５℃に加温混合して、スフィンゴミエリンを溶解する。その後、グラブリジンを添加し、例えば６５℃に加温して、撹拌混合することにより乳化する。乳化工程は、ホモミキサー、ホモジナイザー、超音波分散乳化装置又は高圧乳化装置等を用いて実施することができる。このような工程により、グラブリジン含有スフィンゴミエリンリポソーム分散液を得ることができる。
【００２９】
さらに、得られたリポソーム分散液を一定加圧下のもとにフィルター等で処理することにより、目的の粒径を有するリポソーム分散液を調製することができる。
【００３０】
スフィンゴミエリンリポソームをより安定化するために、リポソームを調製する際、コレステロールなどをスフィンゴミエリンと共に混合し、リポソームの構成成分の一つとすることができる。
【００３１】
本発明においては、調製されたリポソーム分散液をそのまま皮膚外用剤とすることができる。また、調製されたリポソーム又はリポソーム分散液を皮膚外用剤用の基材及び他の添加剤と混合して皮膚外用剤を調製してもよい。例えば油分、界面活性剤、香料及び防腐剤等と混合してもよい。
【００３２】
さらに、スフィンゴミエリンリポソームに、グラブリジンに加えて他の成分が封入されていてもよい。具体的には、グラブリジン以外の他の美白成分、例えば、ビタミンＣ及びその誘導体、グルタチオン、コウジ酸及びその塩、エラグ酸及びその塩、トラネキサム酸及びその塩、ルシノール、カミツレエキス、リノール酸並びにプラセンタエキス、ハイドロキノン配糖体（類）、等を封入することができる。また、他の植物抽出物及びｈ−ＥＧＦなどの有効成分を封入することができる。
【００３３】
本発明の皮膚外用剤の形態としては、例えば、乳液、クリーム、化粧水、パック等が挙げられる。また、剤型としては、例えば、液状、ゲル状、ペースト状、クリーム状、ジェル状、分散液状等が挙げられる。
【００３４】
本発明の皮膚外用剤は、化粧料、医薬部外品、医薬品等に適用することができる。
【００３５】
本発明の化粧料としては、具体的には、例えば、おしろい、フェースパウダー、紙おしろい、クリームおしろい、固形おしろい、粉おしろい、練りおしろい、水おしろい皮膚用化粧品、スキンローション、化粧水、化粧液、保湿液、美容液、クリーム、油性クリーム、中油性クリーム、弱油性クリーム、クレンジングクリーム、コールドクリーム、ハイゼニッククリーム、バニシングスリーム、ハンドクリーム、ひげそり用クリーム、漂白クリーム、ファンデーションクリーム、薬用クリーム、リップクリーム、乳液、ミルクローション、スキンミルク、日焼け止めクリーム、日焼け止め用化粧品、仕上げ用化粧品、ファンデーション、フェースカラー、コンシーラー、化粧下地、メークアップベース、プレメークアップ、紅、口紅、リップスティック、リップルージュ、リップカラー、リップペンシル、リップグロス、リップライナー、アイメークアップ、アイシャドウ、アイカラー、アイライナー、眉墨、アイブローペンシル、アイブローブラッシュ、マスカラ、まつげ化粧料、練紅、頬化粧料、頬紅、チークカラー、チークルージュ、ボディメークアップ、ボディパウダー、タルカムパウダー、バスパウダー、パフュームパウダー、ベビーパウダー、天爪粉、浴用化粧料、バスオイル、バスソルト、バブルバス、フォームバス、パック用化粧料等が挙げられる。
【００３６】
上記のような構成により、本発明の皮膚外用剤では、良好な美白効果が認められ、且つグラブリジンの細胞毒性が抑制される。このような効果は、リン脂質としてレシチンを主に含有するリポソームを用いた皮膚外用剤では認められない。また、グラブリジンとスフィンゴミエリンリポソームとを別々に皮膚外用剤に配合した場合においても、グラブリジンの美白効果の向上及び細胞毒性の抑制効果は認められない。従って、本発明における皮膚外用剤は、グラブリジンが封入されたスフィンゴミエリンリポソームを含有することによって、グラブリジンの美白効果が向上し且つグラブリジンによる細胞毒性が抑制されるという優れた効果を有する。
【００３７】
本発明における皮膚外用剤がこのような優れた効果を有する理由は明らかではないが、平均粒径の小さいスフィンゴミエリンリポソームを含む皮膚外用剤を皮膚に塗布すると、スフィンゴミエリンやグラブリジンが角層内に効果的に到達すると考えられる。従って、高濃度のグラブリジンが角層から顆粒層や有棘層に放出されることによって、優れた美白効果がもたらされるものと推察される。一方、高濃度のグラブリジンを分散させただけでは、皮膚に塗布したグラブリジンの一部しか角層内に到達することができず、十分な美白効果を得ることができないものと考えられる。
スフィンゴミエリンには細胞の働きを活性化する作用があることが分かっており、この働きにより細胞毒性が抑制されるものと推察される。
【００３８】
また、グラブリジンをスフィンゴミエリンリポソーム中に封入することによって、グラブリジンを化粧水、美容液等の水性の皮膚外用剤に容易に混合することができる。これにより、本発明は、様々な種類の皮膚外用剤へのグラブリジンの適用を可能にする。さらに、本発明の皮膚外用剤を皮膚に適用すると、スフィンゴミエリンが角層下の顆粒層や有棘層に達してセラミドを生成する。このため本発明の皮膚外用剤は、優れた保湿効果も有する。
【実施例】
【００３９】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。言うまでもなく本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、また、特にことわらない限り「％」は質量％を示す。
【００４０】
（実施例１．グラブリジン含有スフィンゴミエリンリポソームの調製）
グラブリジンを含有するスフィンゴミエリンリポソーム（ＳＰＭＬＧ）を以下のように調製した。まず、スフィンゴミエリン（商品名「スフィンゴミエリンナチューレ（商標）」、株式会社シャローム）及びグラブリジン（商品名「Ｇｌａｂｒｉｄｉｎ−９０」、上海奥利実業有限公司）をエタノールに添加し、６５℃で加熱溶解した。この溶液に、パラベンを溶解した注射用水を加えて、ホモミキサーを用いて、６５℃、回転数８，５００ｒｐｍで、１５分間処理し、乳化した。次に、ｐＨ７付近になるように水酸化ナトリウムを添加した。その後、全量が１００質量％になるように注射用水を加えて、リポソーム粗分散液を得た。このリポソーム粗分散液を、２枚重ねした孔径０．２μｍのメンブランフィルターを用いて、６５℃、０．８〜１．０Ｍｐａの高圧下で濾過した。この濾過工程を３回行い、濾液としてグラブリジン含有スフィンゴミエリンリポソーム（ＳＰＭＬＧ）分散液を得た。なお、ＳＰＭＬＧ分散液の組成は次の通りである。
（ＳＰＭＬＧ分散液の組成）
スフィンゴミエリン  １．０質量％
グラブリジン      ０．０５質量％
エタノール          ５．０質量％
パラベン          ０．１５質量％
水酸化ナトリウム          適量
注射用水                  残部
【００４１】
上記の方法で得られたスフィンゴミエリンリポソームの平均粒径は、１４９ｎｍであった。なお、スフィンゴミエリンリポソームの平均粒径は、粒度分布測定器Ｎｉｃｏｍｐ３８０ＺＬＳを用いて測定した。
【００４２】
（比較例１．グラブリジン懸濁液の調製）
必要量のグラブリジンを秤取し、リポソームの分散媒（エタノール及びパラベン）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に懸濁して、グラブリジン懸濁液（ＧＳ懸濁液）を調整した。なお、ＧＳ懸濁液の組成は次の通りである。
（ＧＳ懸濁液組成）
グラブリジン      ０．０５質量％
エタノール          ５．０質量％
パラベン          ０．１５質量％
ＰＢＳ                    残部
【００４３】
（比較例２．スフィンゴミエリンとグラブリジンとの懸濁液の調製）
必要量のスフィンゴミエリンおよびグラブリジンを秤取し，リポソームの分散媒を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に懸濁して、スフィンゴミエリンおよびグラブリジンをリポソーム化せずに含有するスフィンゴミエリンとグラブリジンとの懸濁液（Ｇ−ＳＰＭ懸濁液）を調整した。なお、Ｇ−ＳＰＭ懸濁液の組成は次の通りである。
（Ｇ−ＳＰＭ懸濁液の組成）
スフィンゴミエリン  １．０質量％
グラブリジン      ０．０５質量％
エタノール          ５．０質量％
パラベン          ０．１５質量％
ＰＢＳ                    残部
【００４４】
（比較例３．グラブリジン含有水添レシチンリポソームの調製）
グラブリジンを含有する水添レシチンリポソームを次のような方法によって調製した。まず、水添レシチン（ＳＬＰ−ＰＣ９２Ｈ、辻製油株式会社）及びグラブリジンをエタノールに添加し、６５℃で加熱溶解した。この溶液に、パラベンを溶解した注射用水を加えて、ホモミキサーを用いて、６５℃、８,５００ｒｐｍで１５分間処理し、乳化した。次に、ｐＨ７付近になるように水酸化ナトリウムを添加した。その後、全量が１００質量％になるように注射用水を加えて、リポソーム粗分散液を得た。このリポソーム粗分散液を、２枚重ねした孔径０．２μｍのメンブランフィルターを用いて、６５℃、０．８〜１．０Ｍｐａの高圧下で濾過した。この濾過工程を３回行い、濾液としてグラブリジン含有水添レシチンリポソーム（ｈＳＰＣＬＧ）分散液を得た。なお、ｈＳＰＣＬＧ分散液の組成は次の通りである。
（ｈＳＰＣＬＧ分散液の組成）
水添レシチン      １．０質量％
グラブリジン    ０．０５質量％
エタノール        ５．０質量％
パラベン        ０．１５質量％
水酸化ナトリウム          適量
注射用水                  残部
【００４５】
上記の調製方法にて得られた水添レシチンリポソームの平均粒径は、１２４ｎｍであった。
【００４６】
（ヒト培養表皮の培養）
上記調製方法にて得られたグラブリジン含有スフィンゴミエリンリポソーム等の美白効果及び細胞毒性を評価するため、メラノサイト含有ヒト３次元培養表皮モデル（商品名「ＬａｂＣｙｔｅ  ＭＥＬＡＮＯ  ＭＯＤＥＬ」，Ｊ−ＴＥＣ社）を、添付のプロトコールに従い、以下のように培養した。なお、「ＬａｂＣｙｔｅ  ＭＥＬＡＮＯ  ＭＯＤＥＬ」には、改良メラニン産生促進培地、ヒト培養表皮の入った培養カップ、及び１２ウェルアッセイプレート等が付属されている。
【００４７】
まず、１２ウェルアッセイプレートに、３７℃に温めた改良メラニン産生促進培地を１．５ｍＬずつ分注した。各ウェルにヒト培養表皮の入った培養カップを移し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内に、１時間以上静置した。その後、アッセイプレートを取り出し、ヒト培養表皮表面にそれぞれ評価用製剤を５０μＬずつ添加した。評価用製剤はそれぞれ、上記の調製方法によって調整した各分散剤及び懸濁液を用いて作成した。各評価用製剤の組成は、表１および表２に記載したとおりである。表１および表２は各成分の割合を質量％で示し、同じ名称の評価用製剤は同じ組成を有する。なお、表１に記載した評価用製剤は、メラニン産生率の評価に用いた。また、表２に記載した評価用製剤は、ＭＴＴ試験に用いた。
【００４８】
【表１】
2012097001.tif 000003
【００４９】
【表２】
2012097001.tif 000004
【００５０】
評価用製剤ＳＰＭＬＧ１は、０．０５％のグラブリジン包含スフィンゴミエリンリポソーム（ＳＰＭＬＧ）分散液１質量％及び１０×リポソーム分散媒９質量％を適量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に添加し、攪拌し混合した。その後、総量が１００質量％になるようにＰＢＳを添加し、再度攪拌、混合して調製した。評価用製剤ＳＰＭＬＧ１中のグラブリジン濃度は、０．０００５％であり、スフィンゴミエリン濃度は、０．０１％である。他の評価用製剤についても同様に調製した。なお、全ての評価用製剤には、リポソーム分散媒を１０％含有するように、１０×リポソーム分散媒を添加した。１０×リポソーム分散媒は、注射用水約９０質量％にエタノール５質量％及びパラベン０．１５質量％を添加して混合した後、ｐＨ７．１２になるように水酸化ナトリウムを添加し、全量が１００質量％となるように注射用水を加えて調製した。各評価用製剤中のグラブリジン及びリン脂質の濃度は、表３および表４に示すとおりである。なお、表３に記載した評価用製剤は、メラニン産生率の評価に用いた。また、表４に記載した評価用製剤は、ＭＴＴ試験に用いた。
【００５１】
【表３】
2012097001.tif 000005
【００５２】
【表４】
2012097001.tif 000006
【００５３】
評価用製剤の添加後、２〜３日に一度、培地交換及び評価用製剤の再添加を行った。具体的には、評価用製剤および改良メラニン産生培地を除去し、３７℃に温めたＰＢＳで３回洗浄した。その後、３７℃に温めた改良メラニン産生促進培地１．５ｍＬを各ウェルに添加し、さらに各評価用製剤５０μＬをヒト培養表皮表面に添加した。２週間培養した後、メラニン産生率の評価またはＭＴＴ試験を行った。
【００５４】
（グラブリジン含有スフィンゴミエリンリポソーム添加によるメラニン産生率の評価）
まず、グラブリジンをスフィンゴミエリンリポソームに封入することによるメラニン産生率への影響を評価した。
具体的には、ヒト培養表皮を２週間培養した後、各培養カップ内の評価用製剤を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した。次に、各ウェルのヒト培養表皮をマイクロチューブに入れ、溶液Ａ（１％ＳＤＳ、０．０５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を１５０μＬ添加した。さらに５ｍｇ／ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ溶液を３μＬ加え、よく混合し、４５℃のウォーターバスで一晩温めて、皮膚を溶解させた。その後、５００ｍＭ炭酸ナトリウム溶液を２５μＬ、３０％過酸化水素水を５μＬ添加し、よく混合した後、８０℃のウォーターバスで３０分間温めた。続いて、室温で放置して冷ました後、クロロホルム：メタノール（２：１）溶液を２０μＬ加え混合し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心して不純物を取り除いた。遠心分離後の上清について４０５ｎｍの吸光度を測定した。
メラニン量を算出するため、既知の各濃度のメラニン溶液を調整し、同様の操作により検量線を作成した。この検量線に基づいてメラニン量を算出し、対照のメラニン量を基準（１００％）としてメラニン産生率を求めた。
【００５５】
その結果、図１に示すように、グラブリジン含有スフィンゴミエリンリポソームとして、０．０００５％および０．００５％のグラブリジンを含有する評価用製剤ＳＰＭＬＧ１およびＳＰＭＬＧ１０を添加したヒト培養表皮では、同濃度でグラブリジンを含有するグラブリジン分散液ＧＳ１およびＧＳ１０に比べてメラニン生産率が大幅に低下した。また、ＧＳ１よりも低濃度でグラブリジンを含有するＳＰＭＬＧ０．５を添加した場合、ＧＳ１よりもメラニン産生率が低下する傾向が認められた。これらの結果より、スフィンゴミエリンリポソーム中にグラブリジンを封入することにより、グラブリジンを分散させた場合と比べて、美白効果が顕著に向上することが明らかとなった。
【００５６】
（グラブリジン含有スフィンゴミエリンリポソーム添加によるＭＴＴ試験）
次に、ＭＴＴ試験を行うことにより、グラブリジンをスフィンゴミエリンリポソームに封入することによる細胞毒性への影響について評価した。
評価用製剤の添加後、上記と同様に２週間培養した。その後、各培養カップ内の評価物質分散液を除去しＰＢＳで３回洗浄した。次に、培養カップ外側の改良メラニン生産促進培地を除去し、各ウェルの培養カップの外側に温めたＭＴＴ培地を１ｍＬずつ分注し、ＣＯ２インキュベーター内で３時間静置した。なお、ＭＴＴ培地は、終濃度０．５ｍｇ／ｍＬになるようにＭＴＴ試薬（Ｊ−ＴＥＣ社）をＤＭＥＭ培地に溶解することによって調整した。その後、各ヒト培養表皮片をマイクロチューブに入れ、さらに２００μＬのイソプロパノールを添加した。このマイクロチューブを室温、暗所にて時々振とうしながら２時間静置することにより色素を抽出した。抽出終了後、色素抽出液について５７０ｎｍの吸光度を測定し、対象の吸光度からブランクの吸光度を引いた値を１００％として評価物質の生細胞率を計算した。なお、ブランクの吸光度はイソプロパノールを用いて測定した。
【００５７】
その結果、図２に示すように、ＧＳ１０を添加したヒト培養表皮の細胞生存率が約１０％であるのに対し、ＳＰＭＬＧ１０を添加したヒト培養表皮の生細胞率は約１００％であった。この結果から、グラブリジンをスフィンゴミエリンリポソーム中に封入することにより、グラブリジンの細胞毒性が大幅に抑制されることが明らかとなった。また、０．０００３％のグラブリジンを含むＳＰＭＬＧ０．６及びＧＳ０．６を添加した場合には、いずれも生細胞率の低下は認められなかった。
【００５８】
（スフィンゴミエリンとグラブリジンとの懸濁液の評価）
スフィンゴミエリンをリポソーム化せずに、スフィンゴミエリンとグラブリジンとを懸濁することによって得られたＧ−ＳＰＭ懸濁液を用いた場合に、上記のような効果が認められるかどうかを検討するため、Ｇ−ＳＰＭ懸濁液を含有する評価用製剤を用いてメラニン産生率の評価およびＭＴＴ試験を行った。
メラニン産生率の評価およびＭＴＴ試験は、上記のＳＰＭＬＧ添加によるメラニン産生率の評価およびＭＴＴ試験に記載の方法に従った。
その結果、０．０００５％のグラブリジンを含有するＧ−ＳＰＭ１を添加した場合、メラニン産生率は、図３に示すように対照と同程度であり、有意な美白効果は認められなかった。また、細胞毒性については、図４に示すようにＧ−ＳＰＭ１を添加した場合の生細胞率は対照と同程度であった。
【００５９】
このように、グラブリジン含有スフィンゴミエリンリポソームによる上記の優れた効果は、単にグラブリジンとスフィンゴミエリンとを含有する懸濁液では認められなかった。従って、グラブリジンをスフィンゴミエリンリポソームに封入することによって、グラブリジンの美白効果が向上するという驚くべき優れた効果が得られることが明らかとなった。
【００６０】
（グラブリジン含有水添レシチンリポソームの評価）
次に、スフィンゴミエリン以外の他のリン脂質からなるリポソームを用いた場合に上記の美白効果および細胞毒性抑制効果が認められるかどうかを検討するため、グラブリジン含有水添レシチンリポソーム（ｈＳＰＣＬＧ）を含む評価用製剤を用いてメラニン産生率の評価およびＭＴＴ試験を行った。
メラニン産生率の評価およびＭＴＴ試験は、上記のＳＰＭＬＧ添加によるメラニン産生率の評価およびＭＴＴ試験に記載の方法に従った。
その結果、グラブリジン含有水添レシチンリポソームとして０．０００５％のグラブリジンを含有するｈＳＰＣＬＧ１を添加した場合、図３に示すように、メラニン産生率が対照に比べて有意に低下することが分かった（多重検定、ｐ＜０．０１）。なお、ＳＰＭＬＧ１を添加したほうが、ｈＳＰＣＬＧ１よりもメラニン産生率が低下しており、ＳＰＭＬＧ１による美白効果の方が高いことが明らかとなった。
一方、細胞毒性については、図４に示すようにｈＳＰＣＬＧ１を添加した場合には生細胞率が低下しており、細胞毒性を示すことが分かった。
【００６１】
このように、グラブリジン含有スフィンゴミエリンリポソームによる上記の優れた効果は、水添レシチンから構成されるリポソームにグラブリジンを封入しても認められなかった。従って、スフィンゴミエリンから構成されるリポソームにグラブリジンを封入することによってグラブリジンによる細胞毒性を抑制できるという驚くべき優れた効果が得られることが明らかとなった。
【００６２】
以上の結果から、グラブリジンをスフィンゴミエリンリポソーム内に封入することによって、良好な美白効果を有し、且つグラブリジンの細胞毒性を軽減できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の皮膚外用剤は、化粧料、医薬部外品、医薬品等に適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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