(57)【要約】【課題】  子宮体がん組織を高い感度と特異性で検出することができる、子宮体がんの検査方法を提供すること。【解決手段】  ヒトから分離された生体試料における、ＣＲＥＬＤ１遺伝子、ＧＲＫ５遺伝子、及びＳＬＣ２５Ａ２７遺伝子からなる群から選択される少なくとも一の遺伝子の発現を検出することにより、高い感度と特異性で、子宮体がんの検査を行うことができることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトから分離された生体試料における、ＣＲＥＬＤ１遺伝子、ＧＲＫ５遺伝子、及びＳＬＣ２５Ａ２７遺伝子からなる群から選択される少なくとも一の遺伝子の発現を検出することを特徴とする子宮体がんの検査方法。
【請求項２】
ヒトから分離された生体試料における、ＣＲＥＬＤ１遺伝子、ＧＲＫ５遺伝子、及びＳＬＣ２５Ａ２７遺伝子からなる群から選択される少なくとも一の遺伝子と、ＭＳＨ２遺伝子及びＳＴＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも一の遺伝子の発現を検出することを特徴とする子宮体がんの検査方法。
【請求項３】
ヒトから分離された生体試料における、ＣＲＥＬＤ１遺伝子、ＧＲＫ５遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ２７遺伝子、ＭＳＨ２遺伝子、及びＳＴＣ２遺伝子の発現を検出することを特徴とする子宮体がんの検査方法。
【請求項４】
遺伝子の発現を蛋白質レベルで検出することを特徴とする請求項１から３のうちのいずれか一項に記載の検査方法。
【請求項５】
抗体を用いて検出することを特徴とする請求項４に記載の検査方法。
【請求項６】
下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれかを有効成分とすることを特徴とする子宮体がんの検査薬
（ａ）ＣＲＥＬＤ１蛋白質に結合する抗体、ＧＲＫ５蛋白質に結合する抗体、及びＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質に結合する抗体からなる群から選択される少なくとも一の抗体
（ｂ）ＣＲＥＬＤ１蛋白質に結合する抗体、ＧＲＫ５蛋白質に結合する抗体、及びＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質に結合する抗体からなる群から選択される少なくとも一の抗体と、ＭＳＨ２蛋白質に結合する抗体及びＳＴＣ２蛋白質に結合する抗体からなる群から選択される少なくとも一の抗体との組み合わせ
（ｃ）ＣＲＥＬＤ１蛋白質に結合する抗体、ＧＲＫ５蛋白質に結合する抗体、ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質に結合する抗体、ＭＳＨ２蛋白質に結合する抗体、及びＳＴＣ２蛋白質に結合する抗体の組み合わせ。
【請求項７】
下記（ａ）〜（ｄ）のうちのいずれかに記載の抗体
（ａ）配列番号：１〜３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＣＲＥＬＤ１蛋白質に結合する抗体
（ｂ）配列番号：７〜９に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＧＲＫ５蛋白質に結合する抗体
（ｃ）配列番号：１３〜１５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質に結合する抗体
（ｄ）配列番号：１９〜２１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２２〜２４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＳＴＣ２蛋白質に結合する抗体。
【請求項８】
下記（ａ）〜（ｄ）のうちのいずれかに記載の抗体
（ａ）配列番号：２６に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２８に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＣＲＥＬＤ１蛋白質に結合する抗体
（ｂ）配列番号：３０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３２に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＧＲＫ５蛋白質に結合する抗体
（ｃ）配列番号：３４に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３６に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質に結合する抗体
（ｄ）配列番号：３８に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＳＴＣ２蛋白質に結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮体がんの検査方法、子宮体がんの検査薬、並びに子宮体がん抗原に対する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮体がんは世界的に女性の生殖管によく見られる悪性腫瘍の一つであり、２００４年においては１９９０００の新規発症例と５５０００人の死亡例が報告されている（非特許文献１）。また、日本においても子宮体がんの発症率及び死亡率は年々増加している。かかる発症率と死亡率を減少すべく、子宮体がんの検査方法の開発は必要とされているにも関わらず、有効な子宮体がんの検査方法は未だ確立されていない（非特許文献２）。
【０００３】
子宮体がんにおける一般的な症状として不正子宮出血が挙げられる。不正子宮出血を起こした女性に対する子宮体がんの検査方法としては、子宮内容除去術（子宮頸管拡張及び子宮内掻爬術）が標準的な方法として長年用いられており、最近では、例えば、経膣超音波検査、子宮体細胞診、吸引による子宮体掻爬、子宮体サンプリングといった不正子宮出血を起こした女性に対する検査方法が多々報告されている（非特許文献３〜５）。しかしながら、不正子宮出血に基づいて子宮体がんと診断されるのはたった１０％の女性に過ぎず（非特許文献６、７）、６０〜７０％の女性においては器質的な異常は認められていない（非特許文献８）。このように、これら検査方法には、感度および特異性に問題があった。
【０００４】
一方、子宮体がんにおいては、ＳＴＣ２（ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ  ２）、ＭＳＨ２（ｍｕｔＳ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ２）、ＭＵＣ１（ｍｕｃｉｎ１）のような、沢山の種類の生体分子が高発現していることが報告されており（特許文献１〜５、非特許文献９〜２０）、これらをバイオマーカーとして用いて、子宮体がんを検査することが試みられている。しかしながら、この方法においても、子宮体がん組織と正常な子宮体とを明確に区別することが困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００７−５１５９５７号公報
【特許文献２】特表２００３−５１５５３５号公報
【特許文献３】特表平９−５０６５０９号公報
【特許文献４】特表平１１−５０６９４０号公報
【特許文献５】特表平９−５０９８２２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ：２００４ｕｐｄａｔｅ、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、２００８
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ  ２００９、Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００９
【非特許文献３】Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．，Ｃｏｋｋｉｎｉｄｅｓ，Ｖ．＆Ｂｒａｗｌｅｙ，Ｏ．Ｗ．、「ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ」、２００９、５９、２７−４１
【非特許文献４】Ｈｏｌｓｔ，Ｊ．，Ｋｏｓｋｅｌａ，Ｏ．＆ｖｏｎＳｃｈｏｕｌｔｚ，Ｂ．、「Ａｎｎ  Ｃｈｉｒ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ」、１９８３、７２、２７４−２７７
【非特許文献５】Ｇｒｅｄｍａｒｋ，Ｔ．，Ｋｖｉｎｔ，Ｓ．，Ｈａｖｅｌ，Ｇ．＆Ｍａｔｔｓｓｏｎ，Ｌ．Ａ．、「Ｂｒ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ」、１９９５、１０２、１３３−１３６
【非特許文献６】Ｃｈｏｏ，Ｙ．Ｃ．，Ｍａｋ，Ｋ．Ｃ．，Ｈｓｕ，Ｃ．，Ｗｏｎｇ，Ｔ．Ｓ．＆Ｍａ，Ｈ．Ｋ．、「Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ」、１９８５、６６、２２５−２２８
【非特許文献７】Ｇｕｌｌ，Ｂ．，Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｍｉｌｓｏｍ，Ｉ．＆Ｇｒａｎｂｅｒｇ，Ｓ．、「Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ」、２００３、１８８、４０１−４０８
【非特許文献８】Ｋｏｎｄｏ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．、「Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ」、２００８、１９、２８−３３
【非特許文献９】Ｋｉｐｐ，Ｂ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．「Ｃａｎｃｅｒ」、２００８、１１４、２２８−２３５
【非特許文献１０】Ｃｈｅｕｎｇ，Ａ．Ｎ．，Ｃｈｉｕ，Ｐ．Ｍ．＆Ｋｈｏｏ，Ｕ．Ｓ．、「Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ」、１９９７、２８、９１−９４
【非特許文献１１】Ｔｏｒｅｎｂｅｅｋ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．、「Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ」、１９９８、３２、２０−２７
【非特許文献１２】Ｓｈｉｈ，Ｈ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．、「Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ」、２００３、３４、４７１−４７８
【非特許文献１３】Ｃｈｕ，Ｐ．Ｇ．，Ａｒｂｅｒ，Ｄ．Ａ．＆Ｗｅｉｓｓ，Ｌ．Ｍ．、「Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ」、２００３、１２０、６４−７０
【非特許文献１４】Ｌａｕ，Ｓ．Ｋ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｌ．Ｍ．＆Ｃｈｕ，Ｐ．Ｇ．、「Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ」、２００４、１２２、６１−６９
【非特許文献１５】Ｈｏｎｇ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．、「Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ  Ｒｅｓ」、２００６、３２、３７９−３８６
【非特許文献１６】Ｋｏｂｅｌ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．、「Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ」、２００６、１９、５８１−５８７
【非特許文献１７】Ｇａｌｇａｎｏ，Ｍ．Ｔ．，Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｇ．Ｍ．＆Ｆｒｉｅｒｓｏｎ，Ｈ．Ｆ．，Ｊｒ．、「Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ」、２００６、１９、８４７−８５３
【非特許文献１８】Ｍｏｄｉｃａ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．、「Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ」、２００７、３１、７４４−７５１
【非特許文献１９】Ｔａｎａｂｅ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ」、２００８、９９、１１２５−１１３０
【非特許文献２０】Ｚｈｅｎｇ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．、「Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ」、２００８、３２、３０４−３１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、子宮体がん組織を高い感度と特異性で検出することができる、子宮体がんの検査方法並びに子宮体がんの検査薬を提供することにある。さらなる本発明の目的は、このような検査に有用な、子宮体がん抗原に対する抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、まず、シグナルシークエンストラップ法（ＳＳＴ−ＲＥＸ法）により、細胞表面に発現あるいは細胞から分泌される蛋白質をコードするｃＤＮＡを選抜した。次いで、選抜したｃＤＮＡがコードする蛋白質に対するモノクローナル抗体を作製して、公知の抗体も含め、子宮体がんに対する特異性を検討した。その結果、ＣＲＥＬＤ１蛋白質、ＧＲＫ５蛋白質、ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質、ＭＳＨ２蛋白質、及びＳＴＣ２蛋白質は、子宮体がんにおいて高発現している一方で、正常な子宮体で発現しておらず、これら蛋白質に対する抗体を用いることにより、子宮体がん組織を高い感度と特異性で検出しうることを見出した。さらに、本発明者らは、ＣＲＥＬＤ１蛋白質、ＧＲＫ５蛋白質、ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質、及びＳＴＣ２蛋白質に対する各々のモノクローナル抗体について、軽鎖及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列を決定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、子宮体がん組織に特異的に発現する分子を標的とした子宮体がんの検査方法、子宮体がんの検査薬、並びにこれら検査に有用な抗体に関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）  ヒトから分離された生体試料における、ＣＲＥＬＤ１遺伝子、ＧＲＫ５遺伝子、及びＳＬＣ２５Ａ２７遺伝子からなる群から選択される少なくとも一の遺伝子の発現を検出することを特徴とする子宮体がんの検査方法、
（２）  ヒトから分離された生体試料における、ＣＲＥＬＤ１遺伝子、ＧＲＫ５遺伝子、及びＳＬＣ２５Ａ２７遺伝子からなる群から選択される少なくとも一の遺伝子と、ＭＳＨ２遺伝子及びＳＴＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも一の遺伝子の発現を検出することを特徴とする子宮体がんの検査方法、
（３）  ヒトから分離された生体試料における、ＣＲＥＬＤ１遺伝子、ＧＲＫ５遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ２７遺伝子、ＭＳＨ２遺伝子、及びＳＴＣ２遺伝子の発現を検出することを特徴とする子宮体がんの検査方法、
（４）  遺伝子の発現を蛋白質レベルで検出することを特徴とする（１）〜（３）のうちのいずれかに記載の検査方法、
（５）  抗体を用いて検出することを特徴とする（４）に記載の検査方法、
（６）  下記（ａ）〜（ｃ）のうちのいずれかを有効成分とすることを特徴とする子宮体がんの検査薬、
（ａ）ＣＲＥＬＤ１蛋白質に結合する抗体、ＧＲＫ５蛋白質に結合する抗体、及びＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質に結合する抗体からなる群から選択される少なくとも一の抗体
（ｂ）ＣＲＥＬＤ１蛋白質に結合する抗体、ＧＲＫ５蛋白質に結合する抗体、及びＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質に結合する抗体からなる群から選択される少なくとも一の抗体と、ＭＳＨ２蛋白質に結合する抗体及びＳＴＣ２蛋白質に結合する抗体からなる群から選択される少なくとも一の抗体との組み合わせ
（ｃ）ＣＲＥＬＤ１蛋白質に結合する抗体、ＧＲＫ５蛋白質に結合する抗体、ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質に結合する抗体、ＭＳＨ２蛋白質に結合する抗体、及びＳＴＣ２蛋白質に結合する抗体の組み合わせ。
（７）  下記（ａ）〜（ｄ）のうちのいずれかに記載の抗体
（ａ）配列番号：１〜３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＣＲＥＬＤ１蛋白質に結合する抗体
（ｂ）配列番号：７〜９に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＧＲＫ５蛋白質に結合する抗体
（ｃ）配列番号：１３〜１５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質に結合する抗体
（ｄ）配列番号：１９〜２１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２２〜２４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＳＴＣ２蛋白質に結合する抗体、
および
（８）  下記（ａ）〜（ｄ）のうちのいずれかに記載の抗体
（ａ）配列番号：２６に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２８に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＣＲＥＬＤ１蛋白質に結合する抗体
（ｂ）配列番号：３０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３２に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＧＲＫ５蛋白質に結合する抗体
（ｃ）配列番号：３４に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３６に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質に結合する抗体
（ｄ）配列番号：３８に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＳＴＣ２蛋白質に結合する抗体。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の検査方法によれば、子宮体がん組織を高い感度と特異性で検出することができる。ＣＲＥＬＤ１遺伝子、ＧＲＫ５遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ２７遺伝子、ＭＳＨ２遺伝子、およびＳＴＣ２遺伝子がコードする蛋白質に対する抗体は、優れた子宮体がんの検査薬となる。これら抗体を組み合わせで用いることにより、子宮体がんの検査の感度を飛躍的に高めることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】抗ＡＣＴ０３８−６１７抗体（２Ｄ１Ｅ１２Ｉ抗体、抗ＣＲＥＬＤ１モノクローナル抗体）と子宮体がんとの反応性を免疫組織化学的染色法で解析した結果を示す光学顕微鏡観察写真である。
【図２】抗ＡＣＴ０３８−６１７抗体（２Ｄ１Ｅ１２Ｉ抗体、抗ＣＲＥＬＤ１モノクローナル抗体）と正常な子宮体との反応性を免疫組織化学的染色法で解析した結果を示す光学顕微鏡観察写真である。
【図３】抗ＡＣＴ０４３−０１１３抗体（２Ｆ１１Ｃ３抗体、抗ＧＲＫ５モノクローナル抗体）と子宮体がんとの反応性を免疫組織化学的染色法で解析した結果を示す光学顕微鏡観察写真である。
【図４】抗ＡＣＴ０４３−０１１３抗体（２Ｆ１１Ｃ３抗体、抗ＧＲＫ５モノクローナル抗体）と正常な子宮体との反応性を免疫組織化学的染色法で解析した結果を示す光学顕微鏡観察写真である。
【図５】抗ＭＳＨ２モノクローナル抗体と子宮体がんとの反応性を免疫組織化学的染色法で解析した結果を示す光学顕微鏡観察写真である。
【図６】抗ＭＳＨ２モノクローナル抗体と正常な子宮体との反応性を免疫組織化学的染色法で解析した結果を示す光学顕微鏡観察写真である。
【図７】抗ＡＣＴ０６７−０１１６抗体（３Ａ８Ｂ１４抗体、抗ＳＬＣ２５Ａ２７モノクローナル抗体）と子宮体がんとの反応性を免疫組織化学的染色法で解析した結果を示す光学顕微鏡観察写真である。
【図８】抗ＡＣＴ０６７−０１１６抗体（３Ａ８Ｂ１４抗体、抗ＳＬＣ２５Ａ２７モノクローナル抗体）と正常な子宮体との反応性を免疫組織化学的染色法で解析した結果を示す光学顕微鏡観察写真である。
【図９】抗ＡＣＴ００４−２６２抗体（２Ｄ４Ｃ４抗体、抗ＳＴＣ２モノクローナル抗体）と子宮体がんとの反応性を免疫組織化学的染色法で解析した結果を示す光学顕微鏡観察写真である。
【図１０】抗ＡＣＴ００４−２６２抗体（２Ｄ４Ｃ４抗体、抗ＳＴＣ２モノクローナル抗体）と正常な子宮体との反応性を免疫組織化学的染色法で解析した結果を示す光学顕微鏡観察写真である。
【図１１】抗ＡＣＴ０３８−６１７抗体（２Ｄ１Ｅ１２Ｉ抗体）と、ＣＲＥＬＤ１遺伝子を発現するＢａ／Ｆ３細胞との反応性をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。
【図１２】抗ＡＣＴ０４３−０１１３抗体（２Ｆ１１Ｃ３抗体）と、ＧＲＫ５遺伝子を発現するＢａ／Ｆ３細胞との反応性をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。
【図１３】抗ＡＣＴ０６７−０１１６抗体（３Ａ８Ｂ１４抗体）と、ＳＬＣ２５Ａ２７遺伝子を発現するＢａ／Ｆ３細胞との反応性をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。
【図１４】抗ＡＣＴ００４−２６２抗体（２Ｄ４Ｃ４抗体）と、ＳＴＣ２遺伝子を発現するＢａ／Ｆ３細胞との反応性をフローサイトメーターで解析した結果を示す図である。
【図１５】抗ＡＣＴ０３８−６１７抗体（２Ｄ１Ｅ１２Ｉ抗体）の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ予測の結果を示す図である。
【図１６】抗ＡＣＴ０４３−０１１３抗体（２Ｆ１１Ｃ３抗体）の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ予測の結果を示す図である。
【図１７】抗ＡＣＴ０６７−０１１６抗体（３Ａ８Ｂ１４抗体）の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ予測の結果を示す図である。
【図１８】抗ＡＣＴ００４−２６２抗体（２Ｄ４Ｃ４抗体）の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ予測の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、ヒトから分離された生体試料における、
（１）  ＣＲＥＬＤ１遺伝子、ＧＲＫ５遺伝子、及びＳＬＣ２５Ａ２７遺伝子からなる群から選択される少なくとも一の遺伝子の発現、
（２）  ＣＲＥＬＤ１遺伝子、ＧＲＫ５遺伝子、及びＳＬＣ２５Ａ２７遺伝子からなる群から選択される少なくとも一の遺伝子と、ＭＳＨ２遺伝子及びＳＴＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも一の遺伝子の発現、
又は
（３）  ＣＲＥＬＤ１遺伝子、ＧＲＫ５遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ２７遺伝子、ＭＳＨ２遺伝子、及びＳＴＣ２遺伝子の発現、
を検出することを特徴とする子宮体がんの検査方法を提供する。
【００１３】
本発明において「生体試料」とは、ＣＲＥＬＤ１遺伝子等の発現を検出する際の対象となる生体由来の細胞、組織、体液等であり、「ヒトから分離された」とは、ヒトの生体から細胞、組織、体液等を摘出することによって、当該細胞、組織、体液等が、その由来の生体と完全に隔離されている状態をいう。生体試料の摘出の方法は特に限定されることなく、公知の方法を用いることができる。例えば、子宮内容除去術（子宮頸管拡張及び子宮内掻爬術）、吸引による子宮体掻爬、膣内へのタンポン挿入が挙げられる。これらの方法の中では、子宮体がん等から剥離した細胞等を生体を侵襲することなく摘出できるという観点から、膣内へのタンポン挿入が好ましい。また、細胞、組織、体液等を摘出する「生体」としては、子宮体がんの患者に限らず、健常者（子宮体がんのおそれがある者を含む）を対象とすることもできる。
【００１４】
本発明において、発現を検出する「ＣＲＥＬＤ１遺伝子」は、典型的には、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＭ＿０１５５１３で特定されるＤＮＡ配列からなる遺伝子であり、「ＧＲＫ５遺伝子」は、典型的には、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＭ＿００５３０８．２で特定されるＤＮＡ配列からなる遺伝子であり、「ＳＬＣ２５Ａ２７遺伝子」は、典型的には、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＭ＿００４２７７で特定されるＤＮＡ配列からなる遺伝子であり、「ＭＳＨ２遺伝子」は、典型的には、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿０００２５１．１で特定されるＤＮＡ配列からなる遺伝子であり、「ＳＴＣ２遺伝子」は、典型的には、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＭ＿００３７１４．２で特定されるＤＮＡ配列からなる遺伝子である。しかしながら、遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異などにより、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。従って、本発明においては、このような天然の変異体も、検出対象となりうる。
【００１５】
また、本発明における子宮体がんの検査方法は、前述の通り、ＣＲＥＬＤ１遺伝子、ＧＲＫ５遺伝子、及びＳＬＣ２５Ａ２７遺伝子からなる群から選択される少なくとも一の遺伝子の発現を検出するものであり、これら遺伝子群の中から一もしくは二の遺伝子の発現を検出してもよく、三種の遺伝子全てを検出してもよいが、子宮体がんに対する感度が高いという観点から、三種の遺伝子全てを検出することが好ましい。また、一の遺伝子の発現を検出して子宮体がんの検査を行う場合は、子宮体がんに対する感度が高いという観点から、ＣＲＥＬＤ１遺伝子を標的とすることが好ましい。
【００１６】
本発明における子宮体がんの検査方法においては、ＣＲＥＬＤ１遺伝子、ＧＲＫ５遺伝子、及びＳＬＣ２５Ａ２７遺伝子からなる群から選択される少なくとも一の遺伝子の発現の検出と、既に子宮体がんとの関連が知られている遺伝子（ＭＳＨ２遺伝子及びＳＴＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも一の遺伝子）の発現の検出とを組み合わせることができる。本発明においては、ＣＲＥＬＤ１遺伝子、ＧＲＫ５遺伝子、及びＳＬＣ２５Ａ２７遺伝子、ＭＳＨ２遺伝子、及びＳＴＣ２遺伝子の全ての遺伝子の発現を検出することにより、最も高い感度をもって、子宮体がんの検査を行うことができる（表４参照のこと）。
【００１７】
また、本発明における子宮体がんの検査方法においては、ＣＲＥＬＤ１遺伝子、ＧＲＫ５遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ２７遺伝子、ＭＳＨ２遺伝子、及びＳＴＣ２遺伝子からなる群より選択されるいずれの一の遺伝子の発現を検出した場合でも、極めて高い特異性で子宮体がんの検査を行うことができる（表４参照のこと）。
【００１８】
本発明において「遺伝子の発現を検出する」とは、遺伝子の発現の有無の検出、および発現の程度の検出の双方を含む意である。遺伝子の発現量は、絶対量としてまたは相対量として把握することができる。相対量を把握する場合には、例えば、用意した標準試料の遺伝子の発現量と比較して判断することができる。「標準試料」は、標的遺伝子を発現しているか否かが事前に特定されている試料である。例えば、既に子宮体がんの存在している部位が特定されている病理組織を、本発明の標準試料とすることができる。また、子宮体がんに罹患していない組織（正常組織）も、本発明の標準試料とすることができる。
【００１９】
さらに、本発明において「遺伝子の発現」とは、遺伝子の転写および翻訳の双方を含む意である。従って、本発明における「遺伝子の発現の検出」には、ｍＲＮＡレベルおよび蛋白質レベルでの検出の双方が含まれる。
【００２０】
本発明における遺伝子の発現の検出には、公知の手法を用いることができる。ｍＲＮＡレベルで検出する方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ノーザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法が挙げられる。また、蛋白質レベルで検出する方法としては、例えば、免疫組織化学的染色法、イメージングサイトメトリー、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、イムノブロッティング、抗体アレイ、等の抗体を用いて検出する方法（免疫学的手法）が挙げられる。本発明においては、簡便性の観点から、蛋白質レベルで検出する方法が好ましく、特に抗体を用いて検出する方法（免疫学的手法）が好ましい。
【００２１】
本発明における抗体を用いて検出する方法（免疫学的手法）では、ＣＲＥＬＤ１蛋白質に結合する抗体（抗ＣＲＥＬＤ１蛋白質抗体）、ＧＲＫ５蛋白質に結合する抗体（抗ＧＲＫ５蛋白質抗体）、ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質に結合する抗体（抗ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質抗体）、ＭＳＨ２蛋白質に結合する抗体（抗ＭＳＨ２蛋白質抗体）、およびＳＴＣ２蛋白質に結合する抗体（抗ＳＴＣ２蛋白質抗体）が使用され、当該抗体を各々の抗体が結合する蛋白質に接触させ、当該抗体の各蛋白質への結合性（結合量）を指標として、ＣＲＥＬＤ１蛋白質等が検出される。ここで「接触」とは、抗体が標的蛋白質を認識できうる生理条件下に、当該抗体と当該蛋白質をおくことを意味する。例えば、当該抗体を用いて、細胞表面上の当該蛋白質の染色を行う場合には、当該抗体を含有した溶液に、ヒトの生体（被検体）から分離した細胞、組織、体液等を浸す、あるいは、当該細胞、組織、体液等に、当該抗体を含有した溶液を十分に滴下もしくは噴霧し、当該抗体が当該細胞、組織、体液等に存在する当該蛋白質を認識できうる生理条件下におくことを意味する。
【００２２】
本発明の抗体の標的となる「ＣＲＥＬＤ１蛋白質」は、典型的には、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿０５６３２８で特定されるアミノ配列からなる蛋白質であり、「ＧＲＫ５蛋白質」は、典型的には、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿００５２９９で特定されるアミノ配列からなる蛋白質であり、「ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質」は、典型的には、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿００４２６８．１で特定されるアミノ酸配列からなる蛋白質であり、「ＭＳＨ２蛋白質」は、典型的にはＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００２４２．１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質であり、「ＳＴＣ２蛋白質」は、典型的には、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＮＰ＿００３７０５で特定されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。蛋白質は、このような典型的なアミノ酸配列を有するもの以外に、天然においてアミノ酸が変異したものも存在しうる。従って、本発明の抗体の標的となる「蛋白質」には、このような天然の変異体が含まれる。天然の変異体は、通常、上記典型的なアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなる。アミノ酸配列の置換、欠失、挿入もしくは付加は、一般的には、１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内、３アミノ酸以内、１アミノ酸）である。
【００２３】
本発明の検査方法に用いる「抗体」は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、また、抗体の機能的断片であってもよい。また、「抗体」には、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラスが含まれる。「ポリクローナル抗体」は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物である。また、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味する。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、自然環境の成分から分離され、および／または回収された（即ち、単離された）抗体である。本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、標的蛋白質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、およびこれらの重合体などが挙げられる。
【００２４】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（標的蛋白質、その部分ペプチド、またはこれらを発現する細胞など）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
【００２５】
ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラーおよびミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原（標的蛋白質、その部分ペプチド、またはこれらを発現する細胞など）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球などである。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞またはリンパ球などに対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞およびミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、標的蛋白質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。標的蛋白質に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
【００２６】
組換えＤＮＡ法は、上記本発明の抗体またはペプチドをコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｄｅａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ  Ａ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９２：７６７−７７５（１９９０））。本発明の抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報参照）。本発明の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内または培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタなど）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
【００２７】
本発明の検査方法に用いる抗体は、好ましくは、本実施例に記載の、抗ＡＣＴ０３８−６１７抗体（２Ｄ１Ｅ１２Ｉ抗体）、抗ＡＣＴ０４３−０１１３抗体（２Ｆ１１Ｃ３抗体）、抗ＡＣＴ０６７−０１１６抗体（３Ａ８Ｂ１４抗体）、抗ＡＣＴ００４−２６２抗体（２Ｄ４Ｃ４抗体）（以下、単に「本実施例に記載の抗体」と称することがある）の軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を保持する抗体あるいはそれらのアミノ酸配列変異体である。具体的には、以下の抗体である。
＜抗ＣＲＥＬＤ１蛋白質抗体＞
（ａ）配列番号：１〜３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＣＲＥＬＤ１蛋白質に結合する抗体
＜抗ＧＲＫ５蛋白質抗体＞
（ｂ）配列番号：７〜９に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＧＲＫ５蛋白質に結合する抗体
＜抗ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質抗体＞
（ｃ）配列番号：１３〜１５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質に結合する抗体
＜抗ＳＴＣ２蛋白質抗体＞
（ｄ）配列番号：１９〜２１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２２〜２４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＳＴＣ２蛋白質に結合する抗体。
【００２８】
本発明の検査方法に用いる抗体は、特に好ましくは、本実施例に記載の抗体の軽鎖可変領域と、重鎖可変領域を保持する抗体あるいはそのアミノ酸配列変異体である。具体的には、以下の抗体である。
＜抗ＣＲＥＬＤ１蛋白質抗体＞
（ａ）配列番号：２６に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２８に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＣＲＥＬＤ１蛋白質に結合する抗体
＜抗ＧＲＫ５蛋白質抗体＞
（ｂ）配列番号：３０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３２に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＧＲＫ５蛋白質に結合する抗体
＜抗ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質抗体＞
（ｃ）配列番号：３４に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３６に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質に結合する抗体
＜抗ＳＴＣ２蛋白質抗体＞
（ｄ）配列番号：３８に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＳＴＣ２蛋白質に結合する抗体
抗ＭＳＨ２蛋白質抗体は、例えば、本実施例において用いた市販の抗体あるいはそのアミノ酸配列変異体を用いることもできる。
【００２９】
本発明の抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域およびＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，  １０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ２１：３４５−３５１（２００８））。
【００３０】
改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。アミノ酸配列変異体は、抗原への結合活性が対象抗体（代表的には、本実施例に記載の抗体）と同等であることが好ましい。抗原への結合活性は、例えば、抗原を発現するＢａ／Ｆ３細胞を作製し、抗体サンプルとの反応性をフローサイトメーターで解析することにより評価することができる（後述の実施例３参照）。また、抗原への結合活性は、上記した通り、例えば、後述の実施例４に記載の子宮体がん組織の免疫染色により評価することができる。
【００３１】
一旦、本実施例に記載の抗体が得られた場合、当業者であれば、その抗体が認識する蛋白質上のペプチド領域（エピトープ）を特定して、その領域に結合する種々の抗体を作製することができる。抗体のエピトープは、標的となる蛋白質のアミノ酸配列から得られたオーバーラップする合成オリゴペプチドへの結合を調べるなどの周知の方法によって決定することができる（例えば、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，、米国特許４７０８８７１号）。ファージディスプレイによるペプチドライブラリーをエピトープマッピングに用いることもできる。二つの抗体が同一または立体的に重なり合ったエピトープと結合するかどうかは、競合アッセイ法により決定することができる。
【００３２】
また、本発明の検査方法に用いる抗体としては、標識物質を結合させた抗体を使用することができる。当該標識を検出することにより、標的蛋白質に結合した抗体量を直接測定することが可能である。標識物質としては、抗体に結合することができ、化学的又は光学的方法に検出できるものであれば特に制限されることはなく、例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、アルカリホスファターゼ、ビオチン、及び放射性物質などが挙げられる。
【００３３】
さらに、標識物質を結合させた抗体を用いて標的蛋白質に結合した抗体量を直接測定する方法以外に、標識物質を結合させた二次抗体を利用する方法や二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用する方法などの間接的検出方法を利用することもできる。ここで「二次抗体」とは、上記本発明の抗体に特異的な結合性を示す抗体である。例えば、上記本発明の抗体をウサギ抗体として調製した場合には、二次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体を使用することができる。ウサギ、ヤギ、マウスなどの様々な生物種に由来する抗体に対して、使用可能な標識二次抗体が市販されており、本発明の抗体の由来する生物種に応じて、適切な二次抗体を選択し、本発明において使用することができる。二次抗体に代えて、標識物質を結合させたプロテインＧやプロテインＡなどを用いることも可能である。
【００３４】
本発明の免疫組織化学的染色法によれば、子宮体がんの罹患の有無、子宮体がんの存在している部位や状況（転移部位や転移の状況、新たな組織に浸潤していく子宮体がん由来の細胞の存在様式などを含む）を視覚的にとらえることができるため、目視では正常と区別しにくい子宮体がんの検出、特に早期の子宮体がんの検出に有用である。さらに、イメージングサイトメトリー及びフローサイトメトリーにおいては、本発明の抗体によって染色された子宮体がん由来の細胞の定量的な評価を自動的に行うことができる点で有用である。
【００３５】
本発明の免疫学的手法においては、複数種の抗体を、各々異なる蛍光色素等で標識して併用することにより、ヒトから分離された生体試料を多重に染色して解析することができる。
【００３６】
子宮体がんの患者以外の者、すなわち、子宮体がんが認定されていない者を対象として、上記方法を実施して得られた情報は、子宮体がんの罹患の有無の判定評価等に利用できる。本発明の方法に基づけば、染色性という客観性に優れた指標を基に子宮体がんの診断を行うことができる。
【００３７】
一方、子宮体がんの患者を対象として、上記方法を実施して得られた情報は、当該患者の病態の評価ないし把握、治療効果の評価などに利用できる。例えば、子宮体がんの治療と並行して本発明の方法を実施すれば、結果として得られる情報を基に治療効果を評価することができる。具体的には、薬剤投与後に本発明の方法を実施することで病理組織における染色性の変化を調べ、染色部位の増減の推移から治療効果を判定することができる。このように本発明の方法を治療効果のモニターに利用してもよい。
【００３８】
被検体における子宮体がんの診断は、通常、医師（医師の指示を受けた者も含む。以下同じ。）によって行われるが、本発明の方法によって得られる、病理組織におけるＣＲＥＬＤ１遺伝子等の発現量に関するデータは、医師による診断に役立つものである。よって、本発明の方法は、医師による診断に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。
【００３９】
また、本発明は、上記本発明の抗体又はそれらの組み合わせを有効成分とすることを特徴とする子宮体がんの検査薬を提供する。本発明の検査薬に用いる抗体は、上記した通り、標識したものであってもよい。本発明の検査薬は、抗体成分の他、組成物として許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩、標識化合物、二次抗体などが挙げられる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
【００４０】
また、上記本発明の検査薬の他、標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、あるいは試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を組み合わせることができ、子宮体がんの検出用キットとすることもできる。また、標識されていない抗体を抗体標品とした場合には、当該抗体に結合する物質（例えば、二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡなど）を標識化したものを組み合わせることができる。さらに、かかる子宮体がんの検出用キットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。
【００４１】
さらに、本発明は、本実施例に記載の抗体の軽鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、重鎖ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を保持する抗体あるいはそれらのアミノ酸配列変異体をも提供する。具体的には、以下の抗体である。
＜抗ＣＲＥＬＤ１蛋白質抗体＞
（ａ）配列番号：１〜３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４〜６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＣＲＥＬＤ１蛋白質に結合する抗体
＜抗ＧＲＫ５蛋白質抗体＞
（ｂ）配列番号：７〜９に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１０〜１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＧＲＫ５蛋白質に結合する抗体
＜抗ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質抗体＞
（ｃ）配列番号：１３〜１５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：１６〜１８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質に結合する抗体
＜抗ＳＴＣ２蛋白質抗体＞
（ｄ）配列番号：１９〜２１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２２〜２４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＳＴＣ２蛋白質に結合する抗体。
【００４２】
さらに、本発明は、本実施例に記載の抗体の軽鎖可変領域と、重鎖可変領域を保持する抗体あるいはそのアミノ酸配列変異体をも提供するものである。具体的には、以下の抗体である。
＜抗ＣＲＥＬＤ１蛋白質抗体＞
（ａ）配列番号：２６に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：２８に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＣＲＥＬＤ１蛋白質に結合する抗体
なお、配列番号：２６に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号：２５に示し、配列番号：２８に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号：２７に示す。
＜抗ＧＲＫ５蛋白質抗体＞
（ｂ）配列番号：３０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３２に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＧＲＫ５蛋白質に結合する抗体
なお、配列番号：３０に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号：２９に示し、配列番号：３２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号：３１に示す。
＜抗ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質抗体＞
（ｃ）配列番号：３４に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：３６に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＳＬＣ２５Ａ２７蛋白質に結合する抗体
なお、配列番号：３４に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号：３３に示し、配列番号：３６に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号：３５に示す。
＜抗ＳＴＣ２蛋白質抗体＞
（ｄ）配列番号：３８に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列若しくは該アミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の少なくともいずれかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを保持し、ＳＴＣ２蛋白質に結合する抗体
なお、配列番号：３８に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号：３７に示し、配列番号：４０に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号：３９に示す。
【００４３】
これら抗体は、上記の本発明の子宮体がんの検査方法に用いることができるが、その他、標的となる蛋白質を検出するための研究目的や子宮体がんの治療目的に用いることも考えられる。ヒトの治療目的に用いる場合には、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体であることが好ましい。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４５】
［実施例１］  ＳＳＴ−ＲＥＸの実施
細胞表面に発現している膜あるいは分泌遺伝子情報を網羅的に得るために各種ヒト細胞からＳＳＴ−ＲＥＸを実施した。
【００４６】
（１）ｃＤＮＡの作製
ヒト由来のがん細胞２×１０７個をＴｒｉｚｏｌ（Ｒ）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１５５９６−０２６）１ｍｌに懸濁して５分放置し、クロロフォルムを２００μｌ添加して１５秒間懸濁後、１２，０００×ｇで１５分間遠心した。この遠心後の上清と５００μｌのイソプロパノールを混ぜ合わせた後、１２，０００×ｇで１０分間遠心した。得られたペレットを８０％エタノールで洗浄し、全ＲＮＡ２００μｇ以上を得て、以後の実験に供した。
【００４７】
得られた全ＲＮＡすべてを１００μｌの水に溶かし、ＦａｓｔＴｒａｃｋ２．０  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：Ｋ１５９３−０２）を用いて、ｍＲＮＡ  ３μｇを得た。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製、カタログ番号：１８０９０−０１９）を用いて、得られたｍＲＮＡから２本鎖ｃＤＮＡの作製を行った。
【００４８】
（２）ｐＭＸ−ＳＳＴベクターへのｃＤＮＡ配列の組み込み（キメラ化）
レトロウイルスベクターｐＭＸ−ＳＳＴに得られたｃＤＮＡを組み込むためにｐＭＸ−ＳＳＴベクター（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：４８７−４９０（１９９９）  参照）５μｇを制限酵素ＢｓｔＸＩを用いて、１００μｌの反応系で４５℃で４時間切断処理した。反応液すべてを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ベクター部位に相当する約５０００塩基の長さのＤＮＡ断片を切り出した。さらにＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｍｅｇａ社製、カタログ番号：Ａ９２８２）を用いて、約５０００塩基の長さのＤＮＡ断片を精製した。このようにして得られたＤＮＡ断片をｐＭＸ−ＳＳＴベクターをＢｓｔＸＩで制限酵素処理したものとし、これを１μｌ当たり５０ナノグラム含む水溶液となるよう調製した。
【００４９】
先に調製した２本鎖ｃＤＮＡは、平滑末端であり、ＢｓｔＸＩで制限酵素処理したｐＭＸ−ＳＳＴと直接結合させることはできない。そこで、２本鎖ｃＤＮＡの両端にＢｓｔＸＩの制限酵素切断後のＤＮＡ配列を持たせるための作業を行った。ＢｓｔＸＩ  Ａｄａｐｔｅｒ（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製、カタログ番号：Ｎ４０８−１８）９μｇを１０μｌの水に溶かしたＢｓｔＸＩ  Ａｄａｐｔｅｒ水溶液に２本鎖ｃＤＮＡを溶かした。これにＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製、コード番号：ＬＧＫ−２０１）を５μｌ添加し、懸濁して、１６℃で１６時間反応させて、ＢｓｔＸＩ  Ａｄａｐｔｅｒと２本鎖ｃＤＮＡとを結合させた。その後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製、カタログ番号：１８０９０−０１９）に添付のサイズ分画カラムを用いて、鎖長が約４００塩基以下のＤＮＡ断片を除去した。その後、得られた容量の１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５倍量のエタノールを添加し、転倒混和した後、２０，４００×ｇで３０分遠心した。遠心後の上清を除去して得た沈殿を１５μｌの水に溶かし、１．５％のアガロースゲルにて電気泳動した。その後、約５００塩基から約４０００塩基の長さを持った２本鎖ｃＤＮＡ断片とＢｓｔＸＩ  Ａｄａｐｔｅｒとの結合体を含んだゲルを切り出し、Ｗｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｍｅｇａ社製、カタログ番号：Ａ９２８２）を用いて、２本鎖ｃＤＮＡとＢｓｔＸＩ  Ａｄａｐｔｅｒとの結合体を精製した。
【００５０】
ＢｓｔＸＩで制限酵素処理したｐＭＸ−ＳＳＴベクター５０ｎｇ、取得した２本鎖ｃＤＮＡとＢｓｔＸＩ  Ａｄａｐｔｅｒとの結合体の全量、およびＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅを、２０μｌの反応系にて室温で３時間処理し、ｐＭＸ−ＳＳＴベクターをＢｓｔＸＩで制限酵素処理したものと上記結合体とを結合させた。反応液の組成は能書にしたがって調整した。
【００５１】
（３）ｃＤＮＡライブラリの増幅
ｐＭＸ−ＳＳＴベクターを用いて構築したｃＤＮＡライブラリを大腸菌に導入して増幅を行った。ｃＤＮＡライブラリに、５μｇのｔＲＮＡ、１２．５μｌの７．５Ｍ酢酸ナトリウム、および７０μｌのエタノールを加え、転倒混和した後、２０，４００×ｇで３０分遠心し、上清を捨て沈殿を得た。得られた沈殿に５００μｌの７０％エタノールを加え、２０，４００×ｇで５分遠心し、上清を捨て得られた沈殿を１０μｌの水に溶かした。ｃＤＮＡを大腸菌内で増幅させるために、そのうちの２μｌを、コンピテントセル（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１８９２０−０１５）２３μｌと混ぜ、１．８ｋＶの条件でエレクトロポレーションを行い、１ｍｌのＳＯＣ培地に全量を懸濁した。この作業を２回行い、大腸菌を懸濁したＳＯＣ培地を３７℃で９０分間、振とう培養した。その後、この培養溶液全量を、培地１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを含むＬＢ培地５００ｍｌに投入し、３７℃で１６時間、振とう培養した。
【００５２】
ｃＤＮＡライブラリの大腸菌への導入数、およびｐＭＸ−ＳＳＴベクターと結合したｃＤＮＡの鎖長を確認するために、培養液５μｌを取り出し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングした。
【００５３】
その結果、５μｌをプレーティングしたＬＢ寒天培地に１５０個のコロニーの生育が見られた。これにより培養液５００ｍｌ中に１．５×１０７個の独立したｃＤＮＡライブラリがあると考えられた。また、コロニーのうち任意の１６個についてプラスミドを抽出し、制限酵素ＢｓｔＸＩで制限酵素処理し、処理物を１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、ｐＭＸ−ＳＳＴベクター上のｃＤＮＡの長さを計測した。その結果、平均値は約１０００塩基であった。
【００５４】
残りの培養液から集菌し、１０  ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（Ｒ）  ＡＸ  ５００  ｃｏｌｕｍｎｓ（日本ジェネティクス社製、カタログ番号：７４０５７４）を用いてプラスミドを精製し、増幅されたｃＤＮＡライブラリ系を確立した。
【００５５】
（４）ｃＤＮＡライブラリのパッケージングおよびＳＳＴ−ＲＥＸ法の実施
ｃＤＮＡライブラリ由来遺伝子が組み込まれたｐＭＸ−ＳＳＴレトロウイルスベクターＲＮＡを含むレトロウイルスを産生させるため、ウイルスパッケイジング細胞Ｐｌａｔ−Ｅ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７（１２）：１０６３−６（２０００）Ｊｕｎ）２×１０６個を、４ｍｌのＤＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ社製、コード番号：０４４−２９７６５）を含む６ｃｍディッシュに懸濁し、３７℃で５％ＣＯ２の条件で２４時間培養した。一方、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製、製品番号：３１９８５０７０）と９μｌのＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ社製、製品コード：１８１４４４３）を混ぜ、５分室温で放置後、３μｇのｃＤＮＡライブラリを添加し、１５分室温で放置した。ｃＤＮＡライブラリを含む溶液を、培養後のＰｌａｔ−Ｅ細胞に滴下し、２４時間後に上清を入れ替えて同一条件で培養を続けた。さらに２４時間後の上清を０．４５μｍのフィルターを通してろ過した。
【００５６】
この取得したろ過上清０．５ｍｌを、４×１０６個のＢａ／Ｆ３細胞を含むＲＰＭＩ−１６４０（コージンバイオ株式会社製）培地９．５ｍｌが入れられた１０ｃｍディッシュ中に加えた。
【００５７】
さらに１０μｌのポリブレン（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製、カタログ番号：ＴＲ−１００３−Ｇ）と１０ｎｇのＩＬ−３を添加し、２４時間培養した。その後、細胞を３回ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄し、新しいＲＰＭＩ−１６４０培地２００ｍｌに懸濁して９６ウェルプレート２０枚に均等分量になるようにまき、Ｂａ／Ｆ３細胞の自律増殖能に基づくセレクションおよびクローニングを試みた。１０日後から２０日後までに増殖が見られた細胞をＳＳＴ−ＲＥＸに基づいて選抜されたものとし、該細胞が各ウェルいっぱいに増殖するまでさらに培養を続けた。
【００５８】
（５）ＳＳＴ−ＲＥＸで得られた遺伝子産物の解析
各ウェルから得られた細胞の半分量は拡大培養して、ストック細胞とした。さらに、ストック細胞を培養して、組み込まれたｃＤＮＡ由来のペプチド分子を細胞外に発現するトランスフェクタントＢａ／Ｆ３細胞（以下、「ＳＳＴクローン細胞」とも言う）を、抗体作製のための免疫原細胞として、また、スクリーニング対象の細胞として用いた。各ウェルから得られた細胞の残り半分からはゲノムを抽出してシークエンスを行い、導入されたｃＤＮＡ由来の遺伝子を解析した。シークエンスにおいては、得られたゲノムに対して、ＬＡ  ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製、製品番号：＃ＲＲ００２）またはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製、製品番号：＃Ｒ０４５Ａ）を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマーには、以下の配列を用いた。
ＳＳＴ３’側−Ｔ７  ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＴＡＡＡＣＧＧＴＡＧ−３’（配列番号：４１）
ＳＳＴ５’側−Ｔ３  ５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡ−３’（配列番号：４２）
ＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｍｅｇａ社製、製品番号：Ａ９２８２）などを用いて精製した。
【００５９】
その後、精製したＰＣＲ産物について、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＡＢＩ社製、カタログ番号：４３３７４５６）およびＤＮＡシークエンサーＡＢＩ３１００ＸＬを用いて、シークエンスを行った。シークエンスのプライマーには以下のものを用いた。
ＳＳＴ５’側−Ｔ３  ５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡ−３’（配列番号：４２）
得られたシークエンスデータは、ＢＬＡＳＴ検索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）とＳｉｇｎａｌＰ  ３．０  Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を利用して解析した。
【００６０】
［実施例２］  モノクローナル抗体の作製
免疫動物はマウスＢＡＬＢ／ｃを使用し、まず、免疫賦活剤として、ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、カタログ番号：ＡＬＸ−５１０−００２−Ｌ０１０）を等量のＰＢＳと混和して乳化したもの５０μｌを投与した。翌日、ＳＳＴクローン細胞を免疫原細胞として５×１０６個投与し、さらに免疫原細胞を２日おきに４回注入した。最初の免疫から約２週間後、摘出した二次リンパ組織をすりつぶし、抗体産生細胞を含む細胞集団を得た。それらの細胞と融合パートナー細胞を混合し、ポリエチレングリコール（ＭＥＲＣＫ社製、カタログ番号：１．０９７２７．０１００）を用いた細胞融合によりハイブリドーマ］を作製した。融合パートナー細胞としては、マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１）を用いた。
【００６１】
ハイブリドーマは、ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、製品番号：、Ｈ０２６２）、５％  ＢＭ−ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ社製、カタログ番号：６６３５７３）、１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトイマイシン溶液（ＧＩＢＣＯ社製、カタログ番号：１５１４０−１２２、製品名：Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ（以降「Ｐ／Ｓ」と略す））を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｗａｋｏ社製）選択培地で１０〜１４日間培養した。次に、実施例３に示すフローサイトメトリーにより免疫原細胞に反応し、免疫原細胞に抗原遺伝子を含まないＢａ／Ｆ３細胞（陰性対照細胞）に反応しないハイブリドーマを選択した。限界希釈によりモノクローン化し、免疫原細胞が発現するＳＳＴ−ＲＥＸ由来の遺伝子に対する抗体を産生するハイブリドーマクローンを得た。
【００６２】
得られたハイブリドーマは、必要量ＨＴ（製品名：ＨＴ  ｍｅｄｉａ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０Ｘ）Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ  、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、製品番号：Ｈ０１３７）、１５％  ＦＢＳ、１％  Ｐ／Ｓ溶液を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、維持した。
【００６３】
モノクローン化されたハイブリドーマから精製された抗体の取得は、次のように行った。ハイブリドーマを無血清培地（製品名：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ社製、カタログ番号：１２０４５−０７６）に馴化して拡大培養後、一定期間培養して培養上清を得た。次いで、この培養上清に含まれるＩｇＧ画分をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  セファロース（ＧＥヘルスケア社製、コード番号：１７−１２７９−０３）、ＭＡＰＳ−ＩＩ結合バッファー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、カタログ番号：１５３−６１６１）、ＭＡＰＳ−ＩＩ溶出バッファー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、カタログ番号：１５３−６１６２）を用いて精製した。溶出されたＩｇＧをＰＢＳで透析し、精製抗体画分を得た。
【００６４】
［実施例３］  フローサイトメトリーを用いた抗体スクリーニング
得られた抗体と、各種細胞（目的遺伝子を発現するＢａ／Ｆ３細胞、目的遺伝子を発現していないＢａ／Ｆ３細胞など）との反応性を、フローサイトメトリーを用いて解析した。
【００６５】
本実施例においては、細胞懸濁バッファーおよび以降の洗浄バッファーには、０．５％  ＢＳＡと２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳを用いた。抗体と反応させる各種細胞（対象細胞）を、９６穴プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製、カタログ番号：３５３９１１）に、細胞懸濁液が１ウェルあたり５×１０４個の細胞を含み１００μｌに成るよう調整し、分注した。
【００６６】
細胞懸濁液の各サンプルに、ハイブリドーマ培養上清あるいは２μｇ／ｍｌの精製抗体（以降、「抗体溶液」と称する）５０μｌを添加し、抗体と細胞とを反応させた。抗体溶液のアイソタイプ対照としては、ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、カタログ番号：４００４１２）、ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、カタログ番号：４００２２４）、ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、カタログ番号：４００３２４）をそれぞれ２μｇ／ｍｌづつ含む洗浄バッファーを用いた。ハイブリドーマの培養上清と対象細胞を室温で３０分反応後、７００×ｇで２分間の遠心を行って培養上清を除去し、さらに洗浄バッファーを１００μｌ加え、再度７００×ｇで２分間の遠心を行って上清を除去し、細胞を洗浄した。
【００６７】
次に、洗浄後の細胞ペレットに、検出用２次抗体として、Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，  Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＩＭ０８５５）を洗浄バッファーで２００倍に希釈したものを５０μｌ添加し、暗所において室温で３０分反応させた。反応後、７００×ｇで２分間の遠心を行って上清を除去し、さらに洗浄バッファーを１００μｌ加え、再度７００×ｇで２分間の遠心を行って上清を除去し、細胞を洗浄した。その後、適当量の洗浄バッファーで細胞を懸濁し、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、製品番号：ＦＣ５００ＭＰＬ）により、抗体と細胞の反応性について解析した。
【００６８】
反応性の測定では、前方散乱と側方散乱の測定値より生細胞を選択するようにゲートをかけた。選択された生細胞に対して抗体との反応性に基づくＰＥの蛍光強度を測定し、アイソタイプ対照の反応強度を基準として、免疫原細胞に対して有意に反応性が認められるが、陰性対照細胞に対して反応性が認められない培養上清を産生するハイブリドーマ細胞を候補クローンとして選択した。
【００６９】
［実施例４］  子宮体がんを検出するためのモノクローナル抗体セットの確立
前記スクリーニングによって得られたハイブリドーマ培養上清（モノクローナル抗体）及び後述の市販抗体（子宮体がんにおいて高発現しているとして報告されている抗原を認識する抗体）の中から、子宮体がんに対する特異性の高い抗体を選抜するために、免疫組織化学的染色のよるスクリーニングを行った。
【００７０】
なお、免疫組織化学的染色は以下の通りに行った。
（免疫組織化学的染色）
ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテック株式会社製）で包埋した凍結組織から厚さ５μｍの凍結切片を得た。なお、用いた組織は国立がん研究センターの倫理委員会を通した、手術後のがん組織、及びその周辺の正常組織である。得られた凍結切片を４％パラホルムアルデヒド溶液中に４℃で１０分間浸漬し、凍結切片中の組織等を固定し、超純水ですすいだ。３％過酸化水素水／メタノール溶液に３０分間浸漬し、内在性ぺルオキシダーゼの活性を阻害し、ＰＢＳで５分間２回すすいだ。室温下で３０分間５％スキムミルク／ＰＢＳに浸漬し、非特異的蛋白質の吸着を阻害した。スキムミルク／ＰＢＳを除去した後に、以下のものを添加し、室温下で１時間インキュベートした。
・前記スクリーニングによって得られたハイブリドーマの培養上清（１：２５０）
・市販のマウス由来のモノクローナル抗体
抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ社製、１：４０）、抗ＣＡ１５−３モノクローナル抗体（コスモバイオ社製、１：６２５、抗ＣＤ４４ｖ６モノクローナル［ＣＤ４４  ｖａｒｉａｎｔ  ６］抗体（ミリポア社製、１：２５０）、抗ＣＤ６４モノクローナル抗体、抗Ｃｄｋ２［ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ２］モノクローナル抗体、抗Ｅｚｒｉｎモノクローナル抗体、抗ＭＳＨ２モノクローナル抗体、抗ＭＵＣ１モノクローナル抗体、及び、抗Ｓｙｎｄｅｃａｎ１モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製、１：５０）、抗ＥｐＣＡＭ１モノクローナル抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社製、１：２５０）、抗ＦｃγＲＩ［Ｆｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ＩｇＧ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ］モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製、１：２５０）、抗ｐａｎＣＥＡＣＡＭ［ｐａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ］モノクローナル抗体（Ａｌｅｘｉｓ社製、１：２５０）
・市販のヤギ由来のポリクロ―ナル抗体
抗ＨＥ４［ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４］ポリクロ―ナル抗体、抗ＨＰ１γ［ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １γ］ポリクロ―ナル抗体、抗ＩＭＰ３［ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２  ｍＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３］ポリクロ―ナル抗体、及び、抗ＸＴＲＰ３［Ｘ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３］ポリクロ―ナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製、１：５０）
・市販のウサギ由来のポリクロ―ナル抗体
抗Ｍｉｄｋｉｎｅポリクロ―ナル抗体（ａｂｃａｍ社製、１：２５０）、及び、抗Ｃａｌｐａｉｎ１３ポリクロ―ナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製、１：５０）
なお、ハイブリドーマの培養上清及び抗体に関する記載において括弧内の数値は各々の抗体等を使用した際の希釈率を示すものである。また、抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体は、子宮体がん組織及び正常子宮体の上皮を強く染色することができるので、ポジテチィブコントロールとしてを用いた。
【００７１】
以上の抗体等でインキュベートした後、ＰＢＳで５分間、２回すすぎ、切片をＨＲＰ標識２次抗体で室温下で３０分間インキュベートした。そして、ＰＢＳで５分間、さらに２回すすいだ後、ＤＡＢ＋（３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド）基質キット（Ｄａｋｏ社製）で５分間インキュベートした。最後に切片をリンスし、へマトキシリン溶液で対比染色し、光学顕微鏡で１０倍に拡大し観察した。
【００７２】
免疫組織化学的染色の評価は、患者の予後に関する情報を知らされていない婦人科医学の専門家が行った。また、染色強度は下記基準に基づき評価した
（−）染色されていないか、弱く染色されている
（＋）適度に染色されている
（２＋）強く染色されている。
【００７３】
前記免疫組織化学的染色の方法を用い、先ず、第一段階のスクリーニングとして、ハイブリドーマの培養上清１０４種を用いた子宮体がん組織の凍結切片（Ｎ＝１）及び正常子宮体の凍結切片（Ｎ＝３）の免疫組織化学的染色を行った。得られた結果は表１に示す。なお、表１〜３において、「ＥＣ」は「子宮体がん組織」を、「Ｎ」は「正常な子宮体」を示し、影が付された項目は各スクリーニングにおいて選択された培養上清又は抗体であることを示す。第一段階のスクリーニングの結果、子宮体がんの検出が可能なモノクローナル抗体の候補として、正常子宮体では発現しておらず、子宮体がんにしか発現していない抗原を認識できるものとして、３２種のハイブリドーマ上清に含有される３６種のモノクローナル抗体を選択した。なお、ハイブリドーマ上清とモノクローナル抗体の数が一致しないのは、いくつかのハイブリドーマ上清においては２種以上のモノクローナル抗体が含有されているからである。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
次に、第二段階のスクリーニングとして、子宮体がんにおいて高発現しているとして報告されている抗原を認識する１８種の抗体を前記３６種のモノクローナル抗体に加えた、計５４種の抗体による、子宮体がん組織の凍結切片（Ｎ＝１３）及び正常子宮体の凍結切片（Ｎ＝１０）の免疫組織化学的染色を行った。得られら結果は表２に示す。第ニ段階のスクリーニングの結果、正常子宮体には決して反応せず、いくつかの子宮体がんに対して反応した、計２１種の抗体を選択した。
【００７６】
【表２】
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【００７７】
最後に、第三段階のスクリーニングとして、第二段階のスクリーニングに用いた凍結切片に更に子宮体がん組織の凍結切片（Ｎ＝１５）及び正常子宮体の凍結切片（Ｎ＝１２）を追加し、子宮体がん組織の凍結切片（Ｎ＝２８）及び正常子宮体の凍結切片（Ｎ＝２２）の免疫染色を前記２１種の抗体を用いて行い、正常子宮体では決して発現しておらず、子宮体がんにしか発現していない抗原を認識でき、更にがんの間質部位ではなく、がん細胞を染色することができる、子宮体がんの検出が可能な抗体を選択した。結果は図１〜１０及び表３に示す。なお、図１〜１０中のスケールバーは２００μｍを示し、表３において、アスタリスク（＊）が付された抗体はがんの間質部位を強く染色する抗体を示し、ダブルアスタリスク（＊＊）が付された抗体はがんの間質部位を弱く染色する抗体を示す。以上の結果、５種のモノクローナル抗体を、正常子宮体には反応せず、子宮体がんのみを検出することのできるモノクローナル抗体として選択した。
【００７８】
【表３】
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【００７９】
前記、免疫組織化学的染色によるスクリーニングでのこった抗体のうち４種については、得られた抗体の抗原としたＳＳＴクローン細胞は以下の通りである
（１）ＡＣＴ０３８−６１７＿２Ｄ１Ｅ１２Ｉ：  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｗｉｔｈ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  １  （ＣＲＥＬＤ１），  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  ２，  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０１５５１３）
（２）ＡＣＴ０４３−１１３＿２Ｆ１１Ｃ３：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅ  ５  （ＧＲＫ５），  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００５３０８）
（３）ＡＣＴ０６７−１１６＿３Ａ８Ｂ１４：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ２５，  ｍｅｍｂｅｒ  ２７  （ＳＬＣ２５Ａ２７），  ｎｕｃｌｅａｒ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００４２７７）
（４）ＡＣＴ００４−２６２＿２Ｄ４Ｃ４：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ  ２  （ＳＴＣ２），  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００３７１４．２）。
【００８０】
さらに前記４種のモノクローナル抗体については、抗原として用いた各ＳＳＴクローン細胞との反応性をフローサイトメーターで検証した。得られた結果は図１１〜１４に示す。これらの結果から明らかなように、各モノクローナル抗体はそれぞれの抗原に反応することが確認された。
【００８１】
また、産生抗体のアイソタイプを、アイソストリップキット（Ｒｏｃｈｅ社製、製品番号：１４９３０２７）を用いて決定した結果、抗ＡＣＴ０６７−１１６モノクローナル抗体はＩｇＭ／ｋであり、他３種類はすべてＩｇＧ２ａ／ｋであった。そして、前記５種のモノクローナル抗体を用いて、２８の子宮体がん組織の免疫組織化学的染色を行った。得られた結果は表４に示す。
【００８２】
【表４】
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【００８３】
ＣＲＥＬＤ１（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｗｉｔｈ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  １）、ＧＲＫ５（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅ  ５）、ＭＳＨ２、ＳＬＣ２５Ａ２７（ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ２５，  ｍｅｍｂｅｒ  ２７）、ＳＴＣ２（ｓｔａｎｎｉｍｏｃａｌｃｉｎ  ２）を各々特異的に認識する、本発明のモノクローナル抗体を用いた子宮体がん組織の免疫組織化学的染色における陽性率は、各々６０．７％（１７／２８）、３２．１％（９／２８）、３５．７％（１０／２８）、２１．４％（６／２８）、３５．７％（１０／２８）であった。また、これらモノクローナル抗体の全てを併用した場合、子宮体がん組織の免疫組織化学的染色における陽性率は８５．７％（２４／２８）であった。一方、２２の正常子宮体の免疫染色を行った結果、前記５種全てのモノクローナル抗体において、正常子宮体の免疫染色における陰性率は、１００％（２２／２２）であった。これらの結果から明らかなように、本発明の抗体は、子宮体がんと正常な子宮体とを明確に区別することが可能な優れた抗体であり、またこれらの抗体を組み合わせて用いることによって、子宮体がんに対する特異性（感度）の高い子宮体がんの検査薬又は検査方法を提供することができる。
【００８４】
［実施例５］  抗体可変領域決定方法
前記４種モノクローナル抗体の可変領域の遺伝子配列を明らかにするため、得られた抗体産生細胞ハイブリドーマ細胞２×１０６個をＴｒｉｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１５５９６−０２６）１ｍｌに懸濁し５分放置し、クロロフォルムを２００μｌ添加して、１５秒間懸濁後、１２，０００×ｇで１５分間遠心し、上清を得た。この上清と５００μｌのイソプロパノールを混合した後、１２，０００×ｇで１０分間遠心した。得られたペレットを８０％エタノールで洗浄し、全ＲＮＡ４０μｇを得た。その全量を２０μｌの水で溶かした。そのうち、全ＲＮＡ５μｇ分の溶液を使用して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製、カタログ番号：１８０９０−０１９）を用いて、全ＲＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを作製した。得られた２本鎖ｃＤＮＡをエタノール沈殿後、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製、コード番号：ＬＧＫ−２０１）を用いて２本鎖ｃＤＮＡの５’末端と３’末端を結合させ、そのうち１μｌを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーとしては、重鎖と軽鎖の定常領域に対して設計したものを使用した。プライマーの配列は、次の通りである。
【００８５】
すなわち、前記  抗ＡＣＴ０３８−６１７抗体、抗ＡＣＴ０４３−１１３抗体、及び抗ＡＣＴ００４−２６２抗体（ＩｇＧ２ａ／ｋ）の重鎖の配列決定には
重鎖５’側ｇｔｃｃａｃｇａｇｇｔｇｃｔｇｃａｃａａｔ（配列番号：４３）
重鎖３’側ａｇｇｔｃａａｇｇｔｃａｃｔｇｇｃｔｃａｇｇｇ（配列番号：４４）
を使用した
また、前記  抗ＡＣＴ０６７−１１６抗体（ＩｇＭ／ｋ）の重鎖の配列決定には
重鎖５’側ｃｔｃｔｃａｇｃａｔｇｇａａｇｇａｃａｇ（配列番号：４５）
重鎖３’側ｇａｔａｃｃｃｔｇｇａｔｇａｃｔｔｃａｇ（配列番号：４６）
を使用した
さらに、前記４種モノクローナル抗体の軽鎖の配列決定には
軽鎖５’側ａａｇａｔｇｇａｔａｃａｇｔｔｇｇｔｇｃ（配列番号：４７）
軽鎖３’側ｔｇｔｃａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇａ（配列番号：４８）
を使用した。
【００８６】
ＰＣＲ産物を１．５％ゲルにて電気泳動を行った後、切り出して精製を行った。精製したＤＮＡを用いてシークエンスを行った。軽鎖については、精製したＤＮＡをクローニングした後、シークエンスを行った。決定された軽鎖の可変領域の塩基配列を配列番号：２５、２９、３３、３７に、アミノ酸配列を配列番号：２６、３０、３４、３８に、重鎖の可変領域の塩基配列を配列番号：２７、３１、３５、３９に、アミノ酸配列を配列番号：２８、３２、３６、４０に示す。
【００８７】
また、これら可変領域のアミノ酸配列について、ＵＣＬの「Ａｎｄｒｅｗ  Ｃ．Ｒ．  Ｍａｒｔｉｎ’ｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ」のサイトにおける配列分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／ｔｏｏｌｓ／ａｎａｌｙｚｅ．ｃｇｉ）を利用してナンバリングし、「Ｔａｂｌｅ  ｏｆ  ＣＤＲ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ」に記載の基準（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／＃ｋａｂａｔｎｕｍ）に従ってＣＤＲ領域を同定した。ＣＤＲ予測の結果と軽鎖および重鎖のシグナル配列は図１５〜１８に示す。また、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号：１〜３、７〜９、１３〜１５、１９〜２１に、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号：４〜６、１０〜１２、１６〜１８、２２〜２４に示す。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
以上説明したように、本発明の子宮体がんの検査方法によれば、子宮体がん組織を高い感度と特異性で検出することができる。本発明の抗体は、このような検査のための優れた薬剤となる。本発明の子宮体がんの検査方法においては、子宮体がんから剥離した細胞を検体として用いることにより、生体を侵襲することなく簡便に検査を行うことができる。このように子宮体がんの検査方法および検査薬は、医療上極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2012021943.tif 000021
【図１７】
2012021943.tif 000022
【図１８】
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【配列表】
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