(57)【要約】      （修正有）【課題】新たな抗癌剤および新たな抗癌剤のスクリーニング方法の提供。【解決手段】ＴＡＣＣ３タンパク質を発現する癌細胞と候補物質とを接触させる工程、および該物質と接触させた該細胞における、有糸分裂細胞の割合を測定する工程、および該物質と接触させた該細胞におけるＴＡＣＣ３タンパク質の発現または機能を測定する工程、を含む、抗癌剤のスクリーニング方法。特定の配列からなる群から選択される少なくとも１つの配列を標的とするＴＡＣＣ３に対するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含む、リンパ腫、血管肉腫、非小細胞肺癌、乳癌、消化管腫瘍および卵巣癌からなる群から選択される少なくとも１つに対する抗癌剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＡＣＣ３タンパク質を発現する癌細胞と候補物質とを接触させる工程、および
該物質と接触させた該細胞における、有糸分裂細胞の割合を測定する工程、
を含む、抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
ＴＡＣＣ３タンパク質を発現する癌細胞と候補物質とを接触させる工程、および
該物質と接触させた該細胞におけるＴＡＣＣ３タンパク質の発現または機能を測定する工程、
を含む、抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
抗癌剤が、リンパ腫、血管肉腫、非小細胞肺癌、乳癌、消化管腫瘍および卵巣癌からなる群から選択される少なくとも１つの癌に対するものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＴＡＣＣ３タンパク質を発現する癌細胞が、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３株、ＯＶＣＡＲ３株、ヒトバーキットリンパ腫細胞、ヒトＴ細胞急性リンパ性白血病細胞、ｐ５３欠損動物から得られるリンパ腫細胞および血管肉腫細胞、およびＡｐｃ欠損動物から得られる消化管腫瘍細胞からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＴＡＣＣ１タンパク質を発現する癌細胞と候補物質とを接触させる工程、および
該物質と接触させた該細胞における、有糸分裂細胞の割合を測定する工程、
を含む、抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
ＴＡＣＣ１タンパク質を発現する癌細胞と候補物質とを接触させる工程、および
該物質と接触させた該細胞におけるＴＡＣＣ１タンパク質の発現または機能を測定する工程、
を含む、抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
抗癌剤が、卵巣癌に対するものである、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
ＴＡＣＣ１タンパク質を発現する癌細胞が、卵巣癌細胞である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
配列番号３〜５からなる群から選択される少なくとも１つの配列を標的とするＴＡＣＣ３に対するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含む、リンパ腫、血管肉腫、非小細胞肺癌、乳癌、消化管腫瘍および卵巣癌からなる群から選択される少なくとも１つに対する抗癌剤。
【請求項１０】
配列番号１２の配列を標的とするＴＡＣＣ１に対するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含む、卵巣癌に対する抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たな抗癌剤のスクリーニング方法に関する。より詳細には、本発明は、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質を標的とした、抗癌剤のスクリーニング方法に関する。また、本発明は、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質に基づく新規の抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
有糸分裂において、間期細胞中の微小管の広範なネットワークが解体されて、双極紡錘体が再構成される。核膜崩壊に際して、一対の中心体が微小管の放射状配列の核を形成し、そのプラス端は動原体によって捕捉されそして安定化される。このプラス端探索および捕捉のモデルに加えて、紡錘体形成が中心体の非存在下で起こり得、これは無中心体紡錘体と呼ばれる。このモデルにおいて、微小管の核形成は染色体近傍で起こり、そして動原体に結合した微小管（Ｋ線維）は最終的に星状紡錘体に組み込まれる。この微小管の動的形成は、キネシンおよびダイニンモータータンパク質ならびに微小管調節タンパク質を含む様々なクラスのタンパク質の包括的かつ局所的な調節によって協調されている。
【０００３】
腫瘍細胞の紡錘体は癌化学療法の分子標的となっている（非特許文献１）。現在、ビンカアルカロイドやタキサンのような、紡錘体を構成する微小管を標的とした薬物が臨床的に使用されている。これらのうち、ビンカアルカロイドであるビンブラスチンおよびビンクリスチンは微小管を不安定化し、一方、タキサンであるパクリタキセルは微小管を安定化する。腫瘍細胞に対するその抗有糸分裂効果は、微小管の動的不安定性の抑制に起因すると考えられている。しかし、微小管を標的とした薬物は非分裂細胞における微小管機能も阻害し、その結果、末梢神経の軸索輸送の妨害による末梢性ニューロパシーのような重篤な副作用が生じるという問題があった。
【０００４】
この問題を克服するために、非分裂細胞における微小管に影響を及ぼすことなしに紡錘体を阻害する、非紡錘体有糸分裂タンパク質を標的とした新たな薬剤の開発が検討されていた（非特許文献２）。紡錘体の形成は種々の微小管調節タンパク質によって協調されている。機能的に保存された基本的な機構とは対照的に、いくつかの微小管調節タンパク質は、他の細胞における紡錘体形成に影響を及ぼすことなしに特定の体細胞においてのみ中枢的な役割を果たし得る。腫瘍細胞における紡錘体形成に関与し、一方、正常細胞においては機能しないような微小管調節タンパク質を分子標的として利用すれば、腫瘍細胞に特異的または選択的に作用する新たな癌化学療法を開発できる可能性がある。しかし、現在までにそのようなタンパク質は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Jordan, M.A. et al., Nat. Rev. Cancer, 4:253-265 (2004)
【非特許文献２】Wood, K.W. et al., Curr. Opin. Pharmacol., 1:370-377 (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、新たな抗癌剤のスクリーニング方法および抗癌剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、ＴＡＣＣ３および／またはＴＡＣＣ１タンパク質を阻害または枯渇させることにより、腫瘍細胞においては、有糸分裂の際に異常紡錘体が生じ、有糸分裂が停止し、細胞死が生じること、一方、正常細胞においては、影響がないことを見出した。よって、ＴＡＣＣ３および／またはＴＡＣＣ１タンパク質を標的とした抗癌剤は、副作用の無い抗癌剤になり得る。
【０００８】
本発明は、
[１]
ＴＡＣＣ３タンパク質を発現する癌細胞と候補物質とを接触させる工程、および
該物質と接触させた該細胞における、有糸分裂細胞の割合を測定する工程、
を含む、抗癌剤のスクリーニング方法；
[２]
ＴＡＣＣ３タンパク質を発現する癌細胞と候補物質とを接触させる工程、および
該物質と接触させた該細胞におけるＴＡＣＣ３タンパク質の発現または機能を測定する工程、
を含む、抗癌剤のスクリーニング方法；
[３]
抗癌剤が、リンパ腫、血管肉腫、非小細胞肺癌、乳癌、消化管腫瘍および卵巣癌からなる群から選択される少なくとも１つの癌に対するものである、[１]または[２]に記載の方法；
[４]
抗癌剤が、胸腺リンパ腫、血管肉腫、小腸腫瘍、盲腸腫瘍からなる群から選択される少なくとも１つの癌に対するものである、[１]または[２]に記載の方法；
[５]
ＴＡＣＣ３タンパク質を発現する癌細胞が、リンパ腫細胞、血管肉腫細胞、非小細胞肺癌細胞、乳癌細胞、消化管腫瘍細胞および卵巣癌細胞からなる群から選択される少なくとも１つである、[１]〜[４]のいずれか１つに記載の方法；
[６]
ＴＡＣＣ３タンパク質を発現する癌細胞が、ｐ５３欠損動物から得られるリンパ腫細胞、血管肉腫細胞およびＡｐｃ欠損動物から得られる消化管腫瘍細胞からなる群から選択される少なくとも１つである、[１]〜[４]のいずれか１つに記載の方法；
[７]
ＴＡＣＣ３タンパク質を発現する癌細胞が、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３株、ＯＶＣＡＲ３株、ヒトバーキットリンパ腫細胞およびヒトＴ細胞急性リンパ性白血病細胞からなる群から選択される少なくとも１つである、[１]〜[４]のいずれか１つに記載の方法；
[８]
ＴＡＣＣ１タンパク質を発現する癌細胞と候補物質とを接触させる工程、および
該物質と接触させた該細胞における、有糸分裂細胞の割合を測定する工程、
を含む、抗癌剤のスクリーニング方法；
[９]
ＴＡＣＣ１タンパク質を発現する癌細胞と候補物質とを接触させる工程、および
該物質と接触させた該細胞におけるＴＡＣＣ１タンパク質の発現または機能を測定する工程、
を含む、抗癌剤のスクリーニング方法；
[１０]
抗癌剤が、卵巣癌に対するものである、[８]または[９]に記載の方法；
[１１]
ＴＡＣＣ１タンパク質を発現する癌細胞が、卵巣癌細胞である、[８]〜[１０]のいずれか１つに記載の方法；
[１２]
配列番号３〜５からなる群から選択される少なくとも１つの配列を標的とするＴＡＣＣ３に対するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含む、リンパ腫、血管肉腫、非小細胞肺癌、乳癌、消化管腫瘍および卵巣癌からなる群から選択される少なくとも１つに対する抗癌剤。
[１３]
配列番号１２の配列を標的とするＴＡＣＣ１に対するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含む、卵巣癌に対する抗癌剤。
[１４]
ＴＡＣＣ３に対する、配列番号６、配列番号７のｓｈＲＮＡ、配列番号９、１０のｓｉＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１つを含む、リンパ腫、血管肉腫、非小細胞肺癌、乳癌、消化管腫瘍および卵巣癌からなる群から選択される少なくとも１つに対する抗癌剤。
[１５]
ＴＡＣＣ１に対する、配列番号１３のｓｈＲＮＡまたは配列番号１４のｓｉＲＮＡを含む、卵巣癌に対する抗癌剤。
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質を標的とした、抗癌剤のスクリーニング方法が提供される。また、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質に基づく新たな抗癌剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１ａ】図１は、ＴＡＣＣ３の破壊がインビボにおいて胸腺リンパ腫の退縮を導くことを示す図である。図１ａは、ｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｗ；ＣｒｅＥＲＴ２マウス（ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｗ）およびｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ；ＣｒｅＥＲＴ２マウス（ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ）の４ＯＨＴ投与のスケジュール（上）、胸腺リンパ腫組織のＭＲＩ画像（中央）および腫瘍量（下）を示す。図１ａ中央の図において、胸腺リンパ腫をアスタリスク（＊）で示す。図１ａ下のグラフにおいて、灰色棒および黒色棒はそれぞれｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｗ；ＣｒｅＥＲＴ２マウス（ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｗ）およびｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ；ＣｒｅＥＲＴ２マウス（ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ）における腫瘍量の変化を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、ｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ；ＣｒｅＥＲＴ２マウスの４ＯＨＴ投与のスケジュール（上）、胸腺リンパ腫組織のＭＲＩ画像（中央）および腫瘍量（下）を示す。図１ｂ中央の図において、胸腺リンパ腫をアスタリスク（＊）で示す。
【図１ｃ】図１ｃは、腫瘍量の応答のまとめを示す。図１ｃにおいて、黒色棒および灰色棒はそれぞれ、４ＯＨＴ処置ｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ；ＣｒｅＥＲＴ２（ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ ４ＯＨＴ（＋））、および４ＯＨＴ未処置ｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ；ＣｒｅＥＲＴ２（ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ ４ＯＨＴ（−））または４ＯＨＴ処置ｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｗ；ＣｒｅＥＲＴ２（ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｗ ４ＯＨＴ（＋））マウスにおける腫瘍量の変化を示す。
【図２ａ】図２は、ＴＡＣＣ３の枯渇が、異常な紡錘体および有糸分裂停止、それに続くアポトーシスの迅速な誘導を導くことを示す図である。図２ａは、ｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｗ；ＣｒｅＥＲＴ２（ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｗ）およびｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ；ＣｒｅＥＲＴ２（ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ）マウス由来の胸腺リンパ腫細胞を４ＯＨＴで処理するか（４ＯＨＴ（＋））または未処理のままにし（４ＯＨＴ（−））、そしてＴＡＣＣ３タンパク質の発現をイムノブロットによって経時的に分析した結果を示す。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をローディングコントロールとして示す。
【図２ｂ】図２ｂは、細胞増殖アッセイの結果を示す。表示するアレル（ＴＡＣＣ３Ｓ／ＷまたはＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ）を有するリンパ腫細胞を４ＯＨＴで処理するか（４ＯＨＴ（＋））または未処理のままにし（４ＯＨＴ（−））、そして生存細胞を計数した。
【図２ｃ】図２ｃは、ＦＡＣＳ分析の結果を示す。細胞を図２ｂに関して記載したように処理し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。
【図２ｄ】図２ｄは、有糸分裂指数の増加を示す。細胞を図２ｂに関して記載したように処理し、固定し、そして有糸分裂細胞を抗ＭＰＭ−２抗体で免疫染色することによって同定した。ＴＡＣＣ３陰性細胞および陽性細胞をそれぞれ黒色棒および灰色棒で示す。
【図２ｅ】図２ｅは、ＴＡＣＣ３枯渇リンパ腫細胞における多極紡錘体の誘導を示す。ｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ；ＣｒｅＥＲＴ２マウス由来の細胞を４ＯＨＴで処理するか（４ＯＨＴ（＋））または未処理のままにし（４ＯＨＴ（−））、固定し、そして染色した（図２ｅ）。
【図２ｆ】図２ｆは、ＴＡＣＣ３枯渇リンパ腫細胞における多極紡錘体の誘導を示す。ｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｗ；ＣｒｅＥＲＴ２マウス（ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｗ）またはｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ；ＣｒｅＥＲＴ２マウス（ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ）由来の細胞を４ＯＨＴで処理するか（４ＯＨＴ（＋））または未処理のままにし（４ＯＨＴ（−））、固定し、そして染色した。正常な双極紡錘体（濃灰色棒および斜線棒）および多極紡錘体（黒色棒および淡灰色棒）を含む細胞の百分率を３回の独立した実験において少なくとも５０個の有糸分裂細胞を計数することによって決定した。ＴＡＣＣ３陽性および陰性細胞をそれぞれ、濃灰色棒および黒色棒、ならびに斜線棒および淡灰色棒で示す。
【図２ｇ】図２ｇは、ＴＡＣＣ３枯渇リンパ腫細胞の細胞運命分析を示す。有糸分裂の間の細胞の染色体挙動をＨ２Ｂ−ＧＦＰ発現細胞の低速度撮影によって検討した。核膜崩壊の時点を０：００として定義する。
【図２ｈ】図２ｈは、ＴＡＣＣ３枯渇リンパ腫細胞の細胞運命分析を示す。正常有糸分裂を濃灰色菱形で示す。有糸分裂および有糸分裂スリッページ（mitotic slippage）後の死滅をそれぞれ白色三角および黒色丸で示す（図２ｈ）。
【図３ａ】図３は、ＴＡＣＣ３の枯渇がヒトリンパ腫細胞におけるアポトーシスを導くことを示す図である。図３ａは、ヒトリンパ腫におけるＴＡＣＣ３タンパク質の発現を示す。ＴＡＣＣ３の免疫組織化学をヒトリンパ腫組織アレイを使用して行った。表示する腫瘍組織の代表的な図を示す。挿入図は、より低い倍率での結果を示す。
【図３ｂ】図３ｂは、ＴＡＣＣ３の枯渇を示す。１つのコントロール（Ｃ）および２つのＴＡＣＣ３ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１（配列番号７）およびｓｈ２（配列番号８）を表示する細胞に導入し、そしてＴＡＣＣ３の発現をイムノブロット分析によって検討した。ＮＡＤＰＨをローディングコントロールとして示す。
【図３ｃ】図３ｃは、アポトーシスの誘導を示す。コントロール（配列番号１８）またはＴＡＣＣ３ ｓｈＲＮＡ（ｓｈ１、ｓｈ２）形質導入細胞のアポトーシスをアネキシンＶ染色およびそれに続くＦＡＣＳ分析によって検討した。
【図３ｄ】図３ｄは、ＴＡＣＣ３枯渇ヒトリンパ腫細胞の生存率を示す。ＴＡＣＣ３枯渇後の相対的細胞生存率をＭＴＴアッセイによって決定した。コントロールｓｈＲＮＡ形質導入細胞の生存率を１．０として定義した。
【図３ｅ】図３ｅは、有糸分裂指数の増加を示す。有糸分裂指数を抗ＭＰＭ−２抗体での免疫染色によって決定した。
【図３ｆ】図３ｆは、多極紡錘体の誘導を示す細胞を表示する。ｓｈＲＮＡを用いて形質導入し、固定し、そして免疫蛍光によって分析した。Ｊｕｒｋａｔ細胞の代表的な図を示す。
【図３ｇ】図３ｇは、多極紡錘体の誘導を示す細胞を表示する。ｓｈＲＮＡを用いて形質導入し、固定し、そして免疫蛍光によって分析した。多極紡錘体を含む細胞の百分率を３回の独立した実験において少なくとも５０個の有糸分裂細胞を計数することによって決定した。
【図４】図４ａは、ＴＡＣＣ３ｓｉＲＮＡ（配列番号９）で処理した子宮頸がん細胞（Ｈｅｌａ）および卵巣がん細胞（ＳＫＯＶ３およびＯＶＣＡＲ３）におけるＴＡＣＣ３タンパク質のイムノブロットを示す。（＋）はＴＡＣＣ３ｓｉＲＮＡ処理を示し、（−）はコントロールのｓｉＲＮＡ（配列番号１９）での処理を示す。Anti-TACC3は、第一抗体として抗ＴＡＣＣ３抗体を用いたことを示し、anti-GAPDHは、第一抗体として抗ＧＡＰＤＨ抗体（コントロール）を用いたことを示す。図４ｂは、ＴＡＣＣ３ｓｉＲＮＡで処理した子宮頸がん細胞（Ｈｅｌａ）および卵巣がん細胞（ＳＫＯＶ３およびＯＶＣＡＲ３）における有糸分裂指数を示す。有糸分裂指数は、少なくとも５０個の細胞中の有糸分裂細胞の割合を３回の独立した実験において計数することによって決定した。図４ｃは、ＴＡＣＣ３ｓｉＲＮＡで処理した細胞の紡錘体の形態（Normal、bipolar-misalinged、multipolar、monopolar）を示す写真である。図４ｄは、ＴＡＣＣ３ｓｉＲＮＡで処理した卵巣がん細胞（ＳＫＯＶ３およびＯＶＣＡＲ３）の紡錘体異常のまとめである。Controlは、コントロールｓｉＲＮＡで処理したＳＫＯＶ３およびＯＶＣＡＲ３を示し、ＴＡＣＣ３は、ＴＡＣＣ３ｓｉＲＮＡで処理したＳＫＯＶ３およびＯＶＣＡＲ３を示す。紡錘体形態（％）は、少なくとも５０個の有糸分裂を示す細胞中の、Normal、bipolar-misalinged、multipolarまたはmonopolar形態の紡錘体を有する細胞の割合を３回の独立した実験において計数することによって決定した。
【図５】図５ａは、卵巣がん細胞SKOV3をNOD-scidマウスに移植後の腫瘍サイズの変化を示す。#1 ctrl、#2 ctrlおよび#3 ctrlは、コントロールｓｈＲＮＡ（配列番号１８）を含むベクターで処理した卵巣がん細胞SKOV3を移植したマウス（コントロール）を示し、#1 exp、#2 expおよび#3 expは、shRNA（配列番号７）を有するベクターで処理した卵巣がん細胞SKOV3を移植したマウスを示す。卵巣がん細胞SKOV3を移植した日を１日目とする。図５（b-1）は、111日目の#1 ctrlのマウスの移植部位の写真である。図（b-2）は、111日目の#1 ctrlのマウスの移植部位から取り出した腫瘍の写真である。腫瘍量は4878.4ｍ３であった。図５（c-1）は、70日目の#2 ctrlのマウスの移植部位の写真である。70日目の#2 ctrlのマウスの移植部位から取り出した腫瘍量は389.8ｍ３であった。図（d-1）は、111日目の#3 ctrlのマウスの移植部位の写真である。図（d-2）は、111日目の#3 ctrlのマウスの移植部位から取り出した腫瘍の写真である。腫瘍量は4854.4ｍ３であった。
【図６】図６ａは、ＴＡＣＣ３、ＴＡＣＣ１またはＴＡＣＣ２のｓｉＲＮＡで処理した卵巣がん細胞ＳＫＯＶ３における有糸分裂停止を示す。有糸分裂指数は、少なくとも５０個の細胞中の有糸分裂細胞の割合を示す（ｎ＝３）。Controlは、コントロールｓｉＲＮＡ、ＴＡＣＣ１は、配列番号１４のｓｉＲＮＡ、ＴＡＣＣ２は、配列番号１２のｓｉＲＮＡ、ＴＡＣＣ３は配列番号９のｓｉＲＮＡで処理したことを示す。図６ｂは、ＴＡＣＣ３、ＴＡＣＣ１またはＴＡＣＣ２のｓｉＲＮＡで処理した卵巣がん細胞ＳＫ−ＯＶ３の紡錘体形態のまとめである。Normal、bipolar-misalingedまたはMultipola-Aはそれぞれ、少なくとも５０個の有糸分裂を示す細胞中、Normal、bipolar-misalingedまたはmultipolar-A形態の紡錘体を有する細胞の割合を示す（ｎ＝３）。Multipolar-Aは、多数の紡錘体極のうち２極のみに中心体がある形態を指す。
【図７】図７は、Apc580SマウスにおいてＴＡＣＣ３の枯渇がインビボにおいて腫瘍数の減少を導くことを示す図である。Ｗ／Ｗは、Tacc3W/W、ApcS/W、Villin-Cre(+)のマウスを示し、Ｓ／Ｄは、Tacc3S/D、ApcS/W、Villin-Cre(+)のマウスを示す。１匹のマウスあたりの小腸および大腸癌数の合計の平均数として示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
「ＴＡＣＣ３」（「Ｔａｃｃ３」とも記載する）および「ＴＡＣＣ１」（「Ｔａｃｃ１」とも記載する）は、ＴＡＣＣ（transforming acidic coiled-coil containing）ファミリーに属するタンパク質の１種である。哺乳動物においては、ＴＡＣＣ１、ＴＡＣＣ２、ＴＡＣＣ３の３種のＴＡＣＣファミリーに属するタンパク質が同定されている。本明細書において使用する用語「ＴＡＣＣ３」および「ＴＡＣＣ１」は、哺乳動物のＴＡＣＣ３およびＴＡＣＣ１タンパク質を指す。哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ヒトなど任意の哺乳動物であり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。ＴＡＣＣ３、ＴＡＣＣ１をコードする遺伝子のヌクレオチド配列およびＴＡＣＣ３、ＴＡＣＣ１タンパク質のアミノ酸配列はデータベースから入手可能である（それぞれGenBankアクセッション番号NM_006342.1（配列番号１）、NM_006283（配列番号２）、UniProtアクセッション番号Q9Y6A5、O75410-1の配列が好ましい）。
【００１２】
本発明は、ＴＡＣＣ３および／またはＴＡＣＣ１タンパク質を標的とした抗癌剤のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法によって同定される物質を抗癌剤として使用して処置される癌は、任意の癌である。下記のように、ＴＡＣＣ３は種々のヒト癌において異常発現されていることが示されていたが、ＴＡＣＣ３の阻害または枯渇によって腫瘍が退縮され得ることをインビボで示したのは本発明者らが最初である。１つの実施態様において、前記癌は、リンパ腫または肉腫から選択される。「リンパ腫」は、リンパ系組織の任意の腫瘍をいい、「肉腫」は、結合組織の任意の腫瘍をいう。１つの実施態様において、リンパ腫は、リンパ系組織の１つである胸腺から発生する腫瘍である胸腺リンパ腫である。別の実施態様において、肉腫は、血管由来の腫瘍である血管肉腫である。ＴＡＣＣ３は、ＭｏＭｕＬＶ−ｔｓ１レトロウイルスの挿入によって生じるマウスのリンパ腫において発現が亢進した遺伝子の１つとして報告されているが（Chakraborty, J. et al., Virology, 377:100-109 (2008)）、この報告はＴＡＣＣ３タンパク質を標的としてリンパ腫が処置され得ることを示唆するものではない。ＴＡＣＣ３と肉腫との関連について記載された例はない。
【００１３】
卵巣癌は、卵巣に発生する癌を意味し、限定されないが、好ましくは、胚細胞腫瘍（好ましくは、未熟奇形腫、卵黄嚢腫瘍、絨毛がん、未分化胚細胞腫）、性索間質腫瘍（好ましくは、セルトリ・間質細胞腫瘍、線維肉腫、顆粒膜細胞腫）、表層上皮性・間質性腫瘍（好ましくは、漿液性腺がん、類内膜腫瘍、明細胞がん）である。
【００１４】
消化管腫瘍は、消化管に発生する腫瘍を指し、好ましくは大腸癌、小腸癌である。大腸癌は、盲腸、結腸、直腸に発生する、盲腸癌、結腸癌、直腸癌を意味する。小腸癌は、十二指腸球部から回盲弁までの間に発生する、十二指腸腫瘍、空腸・回腸腫瘍を意味する。
【００１５】
乳癌は乳房組織に発生する癌を意味する。限定されないが、好ましくは、腺癌である。非小細胞肺癌は、形態が小細胞ではない肺組織に発生する癌を意味する。限定されないが、好ましくは、腺癌、大細胞癌、扁平上皮癌である。
【００１６】
本発明おいて、癌と腫瘍は交換可能に用いられる。
【００１７】
本発明の抗癌剤のスクリーニング方法は、ＴＡＣＣ３および／またはＴＡＣＣ１タンパク質を発現する細胞と候補物質とを接触させる工程を含む。ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質を発現する細胞としては、候補物質の作用によりＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１遺伝子、または、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質の発現または機能が低下するかまたは失われた結果生じる影響を観察することができる任意の細胞を使用することができる。１つの実施態様において、ＴＡＣＣ３タンパク質を発現する細胞は、ｐ５３欠損動物から得られるリンパ腫細胞または肉腫細胞である。別の実施態様において、ＴＡＣＣ３タンパク質を発現する細胞は、ヒトバーキットリンパ腫細胞またはヒトＴ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）細胞である。別の実施態様において、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質を発現する細胞として、卵巣癌細胞、腸腫瘍細胞、乳癌細胞、非小細胞肺癌細胞、乳癌細胞を使用することもできる。
【００１８】
例えば、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１遺伝子またはＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質に対する候補物質の影響を、候補物質と接触させた細胞における多極紡錘体などの異常な紡錘体の形成の観察によって、あるいは、有糸分裂細胞の割合、有糸分裂期間の長さ、細胞死の程度などを測定することによって観察することができる。
【００１９】
従来、細胞を用いた抗癌剤のスクリーニングを行う場合、一般に、候補物質と接触させた後の細胞の生存率を指標として用いていた。本発明者らは、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質の枯渇が、異常な紡錘体の形態（多極紡錘体など）を生じさせ、細胞運命に影響を及ぼすことを見出した。従って、これらを抗癌剤のスクリーニングに際して指標として使用することができる。例えば、α−チューブリンとレポーター遺伝子産物（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））との融合タンパク質の発現ベクターを標的細胞に導入して微小管を可視化し、候補物質と接触させた細胞を固定標本の蛍光染色、低速度撮影等により観察し、有糸分裂停止後に有糸分裂スリッページまたは有糸分裂において細胞が死滅するという細胞運命が示されることを指標として、抗癌剤を選択することができる。
【００２０】
よって、１つの実施態様において、本発明の抗癌剤のスクリーニング方法（Ａ）は、
癌細胞と候補物質とを接触させる工程；
有糸分裂細胞を計数する工程；および
該物質と接触させていない該細胞における有糸分裂細胞の割合と比較して、有糸分裂細胞の割合を増加させた該物質を選択する工程；
を含む方法であることができる。
【００２１】
抗癌剤とは、癌を退縮させるまたは癌の増殖を遅延もしくは抑制する剤を意味する。
【００２２】
候補物質は、限定されないが、好ましくは低分子化合物、核酸、タンパク質などである。候補物質は、天然由来であっても、人工合成物であっても良い。
【００２３】
癌細胞は、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１を発現している癌細胞であれば限定されない。好ましくは、リンパ腫瘍細胞、血管肉瘍細胞、卵巣癌細胞、腸腫瘍細胞、非小細胞肺癌細胞、乳癌細胞などである。癌細胞は、チューブリンなどの紡錘体に関係するタンパク質とレポーター遺伝子産物（例えば、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄなどの蛍光タンパク質遺伝子、ルシフェラーゼなどの発光タンパク質遺伝子、ガラクトシダーゼなどの酵素遺伝子等）との融合遺伝子を導入し、発現している細胞でも良い。
【００２４】
癌細胞と候補物質とを接触させるとは、細胞に候補物質を添加し、候補物質を癌細胞中のＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質と接触させることを意味する。
【００２５】
癌細胞と候補物質との接触（インキュベーション）時間は、限定されないが、２４時間〜７２時間、好ましくは３６時間〜６０時間である。細胞は、限定されないが、マイクロチップ、マイクロプレートに播種されることが好ましい。細胞数は、スクリーニングの実施に適した数であれば限定されなくともよい。
【００２６】
有糸分裂細胞の決定方法は、当業者に周知であり、限定されないが、細胞を固定後に顕微鏡で紡錘体の有無を観察することが好ましい。
【００２７】
細胞の固定方法は、当業者に周知であり、限定されないが、有機溶媒、好ましくはメタノール、グルタルアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを用いることができる。
【００２８】
紡錘体の観察方法は、当業者に周知であり、限定されないが、抗チューブリン抗体などの紡錘体に関係するタンパク質に対する抗体を用いた免疫染色を用いることが好ましい。
【００２９】
免疫染色は、当業者に周知であり、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３などの蛍光標識、ルシフェラーゼなどの発光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素、放射性物質で標識された抗体を用いることが好ましい。蛍光標識の場合、直接蛍光を観察できるので好ましい。発光標識の場合、対応する基質と反応後、発光により観察することができる。酵素標識の場合、対応する基質と反応後、発色により観察することができる。また、標識されていない抗体を用いても良い。標識されていない抗体を第１抗体として用いた場合は、標識された第２抗体を用いて、上記のように標識に対応した方法で観察することができる。
【００３０】
癌細胞が、チューブリンなどの紡錘体に関係するタンパク質とレポーター遺伝子産物（例えば、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄなどの蛍光タンパク質遺伝子、ルシフェラーゼなどの発光タンパク質遺伝子、ガラクトシダーゼなどの酵素遺伝子等）との融合遺伝子の導入された細胞の場合、レポーター遺伝子産物を検出することで紡錘体を観察することができる。
【００３１】
染色された紡錘体および細胞は、標識に対応した検出装置、画像取り込み装置を備えた顕微鏡を用いて観察することが好ましい。有糸分裂細胞の決定およびその計数は、目視で行っても、画像処理ソフトを用いて行っても良い。
【００３２】
有糸分裂細胞の割合は、所定の細胞数（好ましくは５０以上、より好ましくは５０〜１００）中の、紡錘体を有する細胞の百分率（％）を意味する。有糸分裂細胞の割合の増加とは、候補物質と接触させていない癌細胞における有糸分裂細胞の割合と比較して、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍の増加を意味する。
【００３３】
さらに、有糸分裂細胞の正常紡錘体および異常紡錘体（bipolar-misalinged、multipolarまたはmonopolar）の割合を測定しても良い。異常紡錘体とは、紡錘体が双極を有し整列している状態（normal）ではない状態を意味し、双極であるが整列していない状態（bipolar-misalinged）、多極（multipolar）または単極（monopolar）などがある。正常及び異常紡錘体の決定およびその計数は、目視で行っても、画像処理ソフトを用いて行っても良い。
【００３４】
異常紡錘体の割合は、所定の有糸分裂細胞数（好ましくは５０以上、より好ましくは５０〜１００）中の異常紡錘体の百分率（％）を意味する。異常紡錘体の割合の増加とは、候補物質と接触させていない癌細胞における異常紡錘体の割合と比較して、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍の増加を意味する。
【００３５】
候補物質がＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１遺伝子、または、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質の発現または機能に影響することは、例えば、インビトロでの候補物質とＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質との結合、細胞中のＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１遺伝子転写物、または、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質の量（例えば、ノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質とレポーター遺伝子産物との融合タンパク質の産生の検出）、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質の細胞内局在などを任意の公知の方法を使用して調べることによって確認することができる。
【００３６】
よって、１つの実施態様において、本発明の抗癌剤のスクリーニング方法（Ｂ）は、
癌細胞と候補物質とを接触させる工程；
該細胞中のＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質の発現または機能を測定する工程；および
該物質と接触させていない癌細胞におけるＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質の発現または機能と比較して、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質の発現または機能を減少させた該物質を選択する工程；
を含む方法であることができる。
【００３７】
ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質の発現の減少は、候補物質と接触させていない癌細胞におけるＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質の発現と比較して、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質の発現が、少なくとも１／２以下、好ましくは少なくとも１／１０以下、より好ましくは検出できないレベルに減少していることを意味する。また、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質の機能の減少は、候補物質と接触させていない癌細胞におけるＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質の細胞内局在性の変化であっても良い。
【００３８】
上記（Ａ）および（Ｂ）のスクリーニング方法を組み合わせても用いてもよい。さらに、従来の細胞生存率を指標とする抗癌剤のスクリーニング方法を、本発明の方法に加えても良い。
【００３９】
本発明者らは、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質が、非紡錘体有糸分裂タンパク質として、癌化学療法の標的となり得ることを最初に示した。ビンカアルカロイドやタキサンのような、紡錘体を構成する微小管を標的とした薬物による副作用を回避する目的で、Ｅｇ５、ポロ様キナーゼ、オーロラキナーゼなどの非紡錘体有糸分裂タンパク質が、癌化学療法の標的の潜在的な候補として期待されていた。しかし、これらを標的として癌が退縮された例はなかった。
【００４０】
本発明者らは、ＴＡＣＣ３の阻害または枯渇によって腫瘍が退縮され得ることをインビボで最初に示した。さらに、正常組織（ＴＡＣＣ３タンパク質を発現する胸腺を含む）において明らかな異常は観察されなかった。また、腫瘍細胞においてＴＡＣＣ３と同じ紡錘体の異常がＴＡＣＣ１の枯渇によって生じることを見出した。従って、ＴＡＣＣ３および／またはＴＡＣＣ１タンパク質を癌化学療法のための標的とする本発明のスクリーニング方法によって、正常組織に対する副作用を示さず、癌細胞に選択的または特異的に作用する抗癌剤を得ることができる。
【００４１】
本発明者らは、ｐ５３欠損マウスにおいて、ＴＡＣＣ３タンパク質の枯渇は胸腺リンパ腫などのリンパ腫および血管肉腫などの肉腫の退縮を導くが、横紋筋肉腫細胞において異常はほとんど観察されないことを見出し、ＴＡＣＣ３の機能は「細胞種依存性（cell context-dependent）」であることを示した。下記のように、本発明以前にはＴＡＣＣ３の機能は明らかではなかった。ＴＡＣＣ３の有する細胞種依存性の機能は、その理由を説明すると考えられる。
【００４２】
ツメガエル（Xenopus）のＴＡＣＣホモログであるＭａｓｋｉｎは紡錘体形成において重要であり、ショウジョウバエ（Drosophila）のＴＡＣＣファミリーメンバーであるＤ−ＴＡＣＣは中心体微小管の安定性に影響を及ぼし、線虫（Caenorhabditis elegans）のＴＡＣＣホモログであるＴＡＣ−１は初期胚形成における効果を有する。このように、ＴＡＣＣファミリーのタンパク質は広範な生物に存在し、有糸分裂における保存された役割を果たしていることが知られていた。
【００４３】
一方、ヒトＴＡＣＣ３遺伝子は、多発性骨髄腫における転座切断点付近の４ｐ１６にマッピングされる癌関連遺伝子として元来単離され（Still, I.H. et al., Genomics, 58:165-170 (1999)）、その後、卵巣癌、非小細胞肺癌、乳癌などの種々のヒト癌において異常発現されていることが示され、腫瘍細胞においてＴＡＣＣ３タンパク質が重要な機能を有する可能性が示唆されていた（Lauffart, B. et al., BMC Women's Health, 5:8 (2005)；Jung, C.K. et al., Pathol. Int., 56:503-509 (2006)；Ma, X-.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:5974-5979 (2003)；Jacquemier, J. et al., Cancer Res., 65:767-779 (2005)）。
【００４４】
ＨｅＬａ細胞において、ＴＡＣＣ３枯渇細胞は正しく構成された双極紡錘体を構築することが報告されている（Gergely, F. et al., Genes Dev., 17:336-341 (2003)）。一方、本発明者らは以前に、ＴＡＣＣ３タンパク質の枯渇により、卵巣癌細胞株において異常な紡錘体が形成され、有糸分裂停止が誘導され、有糸分裂スリッページまたは有糸分裂における細胞死が導かれることを見出して、ＴＡＣＣ３タンパク質が卵巣癌細胞株の紡錘体形成における重要な役割を有することを示している（日本癌学会第６８回学術総会（2009要旨集、第２５２頁、演題番号Ｏ−６４１）。また、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において、ＴＡＣＣ３タンパク質の枯渇は有糸分裂進行を損なわないが、有糸分裂後ｐ５３−ｐ２１ＷＡＦ経路を誘発し、可逆的な細胞周期停止を導くことが報告されている（Schneider, L. et al., Oncogene, 27:116-125 (2008)）。
【００４５】
本発明者らは、リンパ腫においてＴＡＣＣ３タンパク質を枯渇させると、紡錘体形成異常（多極紡錘体の形成）により紡錘体形成チェックポイント（ＳＡＣ）が活性化され、有糸分裂停止が導かれ、その後腫瘍は、有糸分裂においてまたは有糸分裂スリッページの後にアポトーシスによる細胞死を受けることを示した。有糸分裂停止後の細胞運命は、２つの拮抗するネットワーク（一方はカスパーゼの活性化が関与するアポトーシスによる細胞死の経路であり、他方はサイクリンＢ１の分解からの保護である）によって左右されることが提唱されている（Gascoigne, K.E. et al., Cancer Cell, 14:111-122 (2008)）。有糸分裂停止後の迅速なアポトーシスは、細胞中に強い内在性の細胞死シグナルが存在することを示唆する。有糸分裂スリッページ後の細胞死も同様に説明され得、有糸分裂停止の間に細胞がアポトーシスに拘束されており、そして細胞周期の進行後すぐに細胞死に至るものと考えられる。このことから、ＴＡＣＣ３タンパク質のような非紡錘体有糸分裂タンパク質を標的とした癌化学療法の効力は、ＳＡＣに対する細胞応答によって細胞種依存性に決定されることが示唆される。
【００４６】
さらに、本発明者らは、ｐ５３欠損マウスおよびｐ５３野生型マウスにおいて、ＴＡＣＣ３タンパク質の枯渇は胸腺リンパ腫のアポトーシスを誘導するが、正常胸腺はＴＡＣＣ３タンパク質の枯渇に際してアポトーシスの増加を示さないことを見出し、ＴＡＣＣ３タンパク質の役割が「細胞系譜依存性」ではないことを示した。この特徴は、たとえ同じ細胞系譜の細胞であっても、正常細胞に対する副作用なしに、癌細胞を選択的または特異的に処置できる抗癌剤が開発できることを示す。
また、本発明者らは、Ａｐｃ欠損マウスおよびＡｐｃ野生型マウスにおいて、ＴＡＣＣ３タンパク質の枯渇が、消化管腫瘍発生を減少させ、正常細胞に対する副作用を生じないことを見出した。
【００４７】
本発明の方法によって得られた抗癌剤は、リンパ腫および肉腫を含めて、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質の枯渇によって退縮または死滅させられる任意の癌に有効である可能性がある。広範な腫瘍型の中からＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質の枯渇に感受性のものを同定すれば、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質を標的とした処置が有効であるさらなる癌を同定することができる。ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質の枯渇は、本発明のスクリーニング方法によって得られた抗癌剤、トランスジェニック動物におけるＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１遺伝子の欠損、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１に対するｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＤＮＡなど任意の公知の手段を使用することによって達成され得る。特に、本発明者らにより得られた、ＴＡＣＣ３コンディショナルノックアウト動物は、ＴＡＣＣ３の機能解析、ＴＡＣＣ３枯渇に感受性の癌の研究等に有用である。なお、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１に対するｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＤＮＡなどの核酸を抗癌剤として医薬組成物に使用することも可能である。
【００４８】
ＴＡＣＣ３に対するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、ＴＡＣＣ３をサイレンシングするものであれば限定されないが、ＴＡＣＣ３遺伝子（NM_006342.1）中の位置2000〜2024の配列：5'GACCTATAGTGGACCTGCTCCAGTA 3（配列番号３）、位置1905〜1925の配列：5'GCTTGTGGAGTTCGATTTCTT 3'（配列番号４）、または位置589〜609の配列：5'CCAGGAAGTTCTGAGAACCAA 3'（配列番号５）を標的配列とするものが好ましい。
【００４９】
配列番号３の配列を標的とするｓｈＲＮＡには、限定されないが、配列番号６：5'CCGGGACCUAUAGUGGACCUGCUCCAGUACUCGAGUACUGGAGCAGGUCCACUAUAGGUCUUUUUG 3'の配列を有するものが好ましい。
【００５０】
配列番号４の配列を標的とするｓｈＲＮＡには、限定されないが、配列番号７（TRCN0000062026）：5'CCGGGCUUGUGGAGUUCGAUUUCUUCUCGAGAAGAAAUCGAACUCCACAAGCUUUUUG 3'の配列を有するものが好ましい。
【００５１】
配列番号５の配列を標的とするｓｈＲＮＡには、限定されないが、配列番号８（TRCN0000062027）：5'CCGGCCAGGAAGUUCUGAGAACCAACUCGAGUUGGUUCUCAGAACUUCCUGGUUUUUG 3'の配列を有するものが好ましい。
【００５２】
配列番号３の配列を標的とするｓｉＲＮＡには、限定されないが、配列番号９（TACC3-HSS116027）：5' UACUGGAGCAGGUCCACUAUAGGUC 3'の配列を有するものが好ましい。
【００５３】
配列番号４の配列を標的とするｓｉＲＮＡには、限定されないが、配列番号１０：5'AAGAAAUCGAACUCCACAAGC 3'の配列を有するものが好ましい。
【００５４】
配列番号５の配列を標的とするｓｉＲＮＡには、限定されないが、配列番号１１：5' UUGGUUCUCAGAACUUCCUGG 3'の配列を有するものが好ましい。
【００５５】
ＴＡＣＣ１に対するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、ＴＡＣＣ１をサイレンシングするものであれば限定されないが、ＴＡＣＣ１遺伝子（NM_006283）中の位置2448〜2522の配列：5’AAGAATGAAGAAGCCTTGAAGAAAT 3’（配列番号１２）の相補配列を標的するものが好ましい。
【００５６】
配列番号１２の配列を標的とするｓｈＲＮＡには、限定されないが、配列番号１３：5'CCGGAAGAAUGAAGAAGCCUUGAAGAAAUCUCGAGAUUUCUUCAAGGCUUCUUCAGCAACUUUUUUG3'の配列を有するものが好ましい。
【００５７】
配列番号１２の配列を標的とするｓｉＲＮＡには、限定されないが、配列番号１４（TACC1-HSS186179）：5’AUUUCUUCAAGGCUUCUUCAGCAACU 3’の配列を有するものが好ましい。
【００５８】
ｓｉＲＮＡの場合、さらに各鎖の３’末端に２塩基のオーバーハングを有していることが好ましい。より好ましいオーバーハングは、ＴＴである。
【００５９】
ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、ＤＮＡに基づいて細胞内で合成されてもよい。
【００６０】
ＤＮＡに基づくｓｈＲＮＡ合成は、ヘアピン配列を介して連結したセンス鎖とアンチセンス鎖を発現（転写）するベクターを細胞内に導入し、細胞内でヘアピン配列を介して連結したセンス鎖とアンチセンス鎖の１本鎖ＲＮＡを生産させ、センス鎖とアンチセンス鎖をヘアピンを介して自然に対形成させることによってできる。
【００６１】
配列番号７で示される配列のｓｈＲＮＡは、プロモーターに連結した配列番号７（但し、配列中のＵをＴに置き換える）のＤＮＡを有する発現ベクターから合成できる。同様にして、配列番号６、８または１３で示される配列のｓｈＲＮＡも発現ベクターから合成できる。
【００６２】
ＤＮＡに基づくｓｉＲＮＡ合成は、センス鎖とアンチセンス鎖のそれぞれを発現（転写）するベクターを細胞内に導入し、細胞内でセンス鎖およびアンチセンス鎖の２つを個別に産生させ、センス鎖とアンチセンス鎖の対を自然に形成させることによってできる。
【００６３】
配列番号１０で示される配列のｓｉＲＮＡは、第１プロモーターに連結した配列番号１０（但し、配列中のＵをＴに置き換える）および第２プロモーターに連結した配列番号１０の相補配列（配列中のＵをＴに置き換える）のＤＮＡを有する発現ベクターを細胞に導入することによって合成することができる。同様にして、配列番号９、１１または１４で示される配列のｓｉＲＮＡも発現ベクターから合成できる。
【００６４】
プロモーター、発現ベクターは、細胞においてＲＮＡ合成を可能とするものであれば限定されない。
【００６５】
本発明者らは、ｐ５３欠損マウスにおいてＴＡＣＣ３タンパク質を枯渇させることによって、リンパ腫等のｐ５３非依存的な細胞死が引き起こされることを示した。この知見は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において観察された、ＴＡＣＣ３タンパク質の枯渇が有糸分裂後ｐ５３−ｐ２１ＷＡＦ経路を誘発し、細胞周期停止を導いた（すなわち、ＴＡＣＣ３タンパク質の枯渇により細胞死が抑制された）という以前の知見とは対照的である（Schneider, L. et al., Oncogene, 27:116-125 (2008)）。従って、限定するものではないが、本発明のスクリーニング方法によって得られた抗癌剤は、ｐ５３遺伝子の変異が関与する広範な癌に特に有効である可能性がある。
【００６６】
また、本発明者らはＡｐｃ欠損マウスにおいてＴＡＣＣ３タンパク質を枯渇させることによって、消化管腫瘍発生が抑制されることを示した。従って、本発明のスクリーニング方法によって得られた抗癌剤は、Ａｐｃ遺伝子の変異が関与する癌に特に有効である可能性がある。
【００６７】
１つの実施態様において、本発明は、抗癌剤の製造のための本発明の核酸、特にｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの使用を含むことができる。また、本発明の抗癌剤の有効量を癌患者に投与する治療方法を含むことができる。
【００６８】
本発明の抗癌剤は、発現ベクターの形態を含む。発現ベクターは、本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを発現できるものであれば、限定されないが、ウイルスベクターまたはプラスミドが好ましい。また、裸のＤＮＡとして導入してもよい。
【００６９】
本発明の抗癌剤は、対象者への投与に適した生理的に許容されるビヒクル、賦形剤、担体、もしくは希釈剤と共に、またはその組合せを含むことが好ましい。
本発明の抗癌剤は、限定されないが、好ましくは腫瘍部位の局所に、１日に１回または数回投与できる。投与期間は、年齢、症状に応じて任意に定めることができる。例えば、数日間の規則的な間隔で、２〜１０日間で投与できる。また全身投与してもよい。製剤の例としては、注射剤、点滴剤等を挙げることができる。
【００７０】
本発明の抗癌剤の有効量または投与量は、特に制限されないが、投与形態、年齢、体重、症状に応じて適宜選択すればよい。局所投与の場合、局所１回当り約１〜約１０００μｇ、好ましくは約１０〜約５００μｇのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含むことができる。発現ベクターの形態の場合、約０．０５〜約１０μｇ、好ましくは約０．１〜約１μｇの発現ベクターを含むことができる。全身投与の場合には、成人１回当り１〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２から２５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含むことができる。発現ベクターの形態の場合、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１〜約１ｍｇ／ｋｇの発現ベクターを含むことができる。
【００７１】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７２】
材料および方法
抗体およびＴＵＮＥＬアッセイ
マウスＴＡＣＣ３に対する抗体を以前に記載のように生成した（Yao, R. et al., Cancer Sci., 98:555-562 (2007)）。ヒトＴＡＣＣ３に対する抗体を、ヒトＴＡＣＣ３のアミノ酸２１３〜２２４に対応するペプチドでウサギを免疫することによって生成し、そしてこれをペプチド結合免疫親和性カラムを使用して精製した。抗ＰＣＮＡ抗体（CBL407）および抗ＧＡＤＰＨ抗体（sc-25778）をそれぞれChemiconおよびSanta Cruzから購入した。α−チューブリンに対する抗体（DM1A）およびγ−チューブリンに対する抗体（GTU-88）をSigmaから入手した。図２に示す三重染色のために、ＦＩＴＣ結合抗α−チューブリン（Sigma）抗体およびＣｙ３結合抗γ−チューブリン抗体（Sigma）を、Alexa Flour 647（Molecula Probe）で標識した抗ヒトＴＡＣＣ３抗体とともに使用した。抗ホスホ−ヒストンＨ３（ser10）抗体および抗ＭＰＭ−２抗体をそれぞれCell SignalingおよびNovusから購入した。ＴＵＮＥＬアッセイを、ApoTag PLUS Fluorescein In Situ Apoptosis Detection kit（Chemicon）を製造業者の説明書に従って使用して行った。
【００７３】
マウス腫瘍細胞
胸腺リンパ腫および横紋筋肉腫からマウス細胞株を生成するために、腫瘍をカミソリで細かく切断し、７０μｍフィルターを通して濾過し、そしてＧＩＴ培地（胸腺リンパ腫細胞）または１０％仔ウシ血清を補充したＤＭＥ培地（横紋筋肉腫細胞）中にプレーティングした。ＤＮＡ含量を決定するために、細胞を氷冷メタノール中で固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、そしてFACS caliber（Becton Dickinson）を用いて分析した。
【００７４】
ヒトリンパ腫細胞のＴＡＣＣ３ノックダウンおよび細胞生存能アッセイ
細胞を、TRC shRNA LibraryからのｐＬＫＯ．１ｐｕｒｏレンチウイルスｓｈＲＮＡベクターを用いて形質導入した（TRC0000062023-27、Open Biosystems）。レンチウイルス粒子を、lipofectamine 2000（Invitrogen）を使用したｐＬＫＯ．１構築物（Open Biosystems）ならびにｐＭＤ２．Ｇ（Open biosystems）およびｐｓＰＡＸ２（Open biosystems）プラスミドを用いる２９３Ｔ細胞の同時トランスフェクションによって産生し、そして上清をトランスフェクションの４８時間後および７２時間後に回収した。細胞を６μｇ／ｍｌポリブレン（Sigma）の存在下で２４時間レンチウイルス上清とともにインキュベートし、そして感染細胞を２μｇ／ｍｌ（Ｄａｕｄｉ、ＪｕｒｋａｔおよびＣＣＲＦ−ＣＥＭ）または４μｇ／ｍｌ（Ｒａｊｉ）のピューロマイシンを用いて選択した。イムノブロット分析を感染の４８時間後に行った。生存細胞数を４日連続でＭＴＴアッセイ（Roche）を用いて決定した。アネキシンＶ染色を感染の７２時間後にAnnexin-V-FLUOS staining kit（Roche）を製造業者の説明書に従って使用して行った。
【００７５】
イムノブロット
全細胞溶解物を１％ＮＰ−４０緩衝液（１％ＮＰ−４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０％グリセロール）中で調製した。等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてニトロセルロースにトランスファーした。ブロットを一次抗体とともにインキュベートし、続いてペルオキシダーゼ結合二次抗体とともにインキュベートし、そしてECL detection system（GE Healthcare）を使用して可視化した。定量のために、ブロットをスキャンし、そして全ピクセル強度をImageJ1.42aソフトウェアを使用して計数した。
【００７６】
免疫蛍光
細胞を３．７％ＰＦＡ中で固定し、ＰＢＳ中０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中で透過処理し、そして一次抗体とともにインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いでＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧおよび／またはＣｙ３結合ウサギＩｇＧ（Chemicon）とともにインキュベートした。ＤＮＡを４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を使用して検出した。画像処理を×100/1.40-0.70 PlanApo対物レンズおよびZ-projectionｓを装備したLeica DM6000B顕微鏡を使用して行った。
【００７７】
低速度撮影
マウスリンパ腫細胞を６０ｍｍガラス底プレート（Iwaki）上にプレーティングし、蛍光画像を毎分Leica AF6000および×40/1.40-0.70 PlanApo対物レンズを使用して得た。細胞運命決定のために、画像を１０分毎に集め、そして細胞運命をImageJ1.42aソフトウェアを使用して手動で決定した。
【００７８】
組織アレイ
２つのホルマリン固定ヒトリンパ腫組織アレイ（NHL401（BioMax）およびA224（AccuMax））を、製造業者のプロトコルに従って脱パラフィン処理し、水和した。０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でマイクロ波を使用して抗原を賦活化した後、切片を４℃で一晩ヒトＴＡＣＣ３抗体（×５００）とともにインキュベートした。比色検出を、ヒストンシンプルステインMAX-PO(R)（ニチレイ）およびperoxidase substrate kit（Vector）を使用して行った。
【００７９】
実施例１
腫瘍組織におけるＴＡＣＣ３の機能を探求するために、最初に、ｐ５３欠損マウスにおいて発症した種々のマウス腫瘍におけるＴＡＣＣ３タンパク質の発現を検討し、ＴＡＣＣ３が種々の腫瘍において発現されていることを見出した。とりわけ、胸腺リンパ腫細胞がＴＡＣＣ３タンパク質の高発現を示した。
【００８０】
インビボにおけるＴＡＣＣ３の機能をさらに研究するために、ＴＡＣＣ３コンディショナルノックアウトマウスを利用した（Yao, R. et al., Cancer Sci., 98:555-562 (2007)）。このマウスをｐ５３欠損マウス（Jacks, T. et al., Curr. Biol., 4:1-7 (1994)）およびＲ２６−ＣｒｅＥＲＴ２マウス（Ventura, A. et al., Nature, 445:661-665 (2007)；Tyler Jacks博士より入手した）と交配して、ＴＡＣＣ３サイレント／ヌルおよびＣｒｅＥＲＴ２アレルを保有するｐ５３ホモ接合型変異マウス（ｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ；ＣｒｅＥＲＴ２）およびコントロールとしてのＴＡＣＣ３サイレント／野生型およびＣｒｅＥＲＴ２アレルを保有するｐ５３ホモ接合型変異マウス（ｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｗ；ＣｒｅＥＲＴ２）を生成した。これらは１２９Ｓｖ／ＪおよびＣ５７／Ｂ６の混合遺伝的背景を有する。ＴＡＣＣ３の機能的な遺伝子を欠いたノックアウトマウスは妊娠中後期で死亡することが本発明者らの以前の研究によって示されていた。４−ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨＴ）をこれらのマウスに投与してＣｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系を誘導することによって、ｐ５３欠損腫瘍においてＴＡＣＣ３のサイレント（Ｓ）アレルを欠失させることができる。皮下（ＳＣ）注射が、腹腔内（ＩＰ）注射よりも効率的に組換えを誘導することが見出されたので、４ＯＨＴの投与をＳＣ注射によって行った（トウモロコシ油中１０ｍｇ／ｍｌの溶液１００μｌ）。
【００８１】
これらの動物を定期的に磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に供し、腫瘍を保有するマウスを４ＯＨＴで処置し、次いで様々な時点で再び調べた。４ＯＨＴで処置したｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｗ；ＣｒｅＥＲＴ２マウスにおける胸腺リンパ腫の腫瘍量は３日で１５６％、１０日で３６８％に増加し（図１ａ）、これは以前の報告と一致した（Ventura, A. et al., Nature, 445:661-665 (2007)）。対照的に、４ＯＨＴでの同じ処置は、ｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ；ＣｒｅＥＲＴ２マウスにおいて胸腺リンパ腫の退縮を引き起こした。腫瘍量は３日および１０日でそれぞれ元の量の９６％および２６％へ減少した。
【００８２】
上記の結果が腫瘍の個体差に起因する可能性を排除するために、４ＯＨＴ処置なしで腫瘍量を検討し、次いで同一の腫瘍を４ＯＨＴで処置した（図１ｂ）。処置なしでは、腫瘍量は７日で６００％に増加し、４ＯＨＴ処置によりその５７％への退縮が同一の腫瘍において誘導された。全体で、４匹のコントロールマウス（４ＯＨＴで処置した２匹のｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｗ；ＣｒｅＥＲＴ２マウスおよび４ＯＨＴ処置なしの２匹のｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ；ＣｒｅＥＲＴ２マウス）はその腫瘍量を１８９％〜６０７％の範囲で増加させた。一方、４ＯＨＴで処置した４匹のｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ；ＣｒｅＥＲＴ２マウスは９６％から２６％の範囲の胸腺リンパ腫の退縮を示した（図１ｃ）。これらの結果は、ＴＡＣＣ３がｐ５３欠損マウスの胸腺リンパ腫の進行および維持における重要な役割を果たしており、そしてその破壊が迅速な退縮を引き起こすことを明らかに実証する。
【００８３】
実施例２
次に、正常組織におけるＴＡＣＣ３の役割を検討した。ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）での染色により、ｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ；ＣｒｅＥＲＴ２マウスへの４ＯＨＴの投与が正常組織において肉眼的な変化を引き起こさないことが示された。４ＯＨＴで処置したＴＡＣＣ３Ｓ／ＷまたはＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ遺伝子型を有するマウスの胸腺リンパ腫に対する、抗ＴＡＣＣ３抗体、ＴＵＮＥＬおよび４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いる免疫蛍光研究により、ＴＡＣＣ３の破壊によって引き起こされる胸腺リンパ腫の退縮が大量のアポトーシスを伴うことが示された。
【００８４】
対照的に、ＴＡＣＣ３タンパク質の高発現および活発な増殖にかかわらず、正常胸腺はアポトーシスの有意な増加を示さず、そして細胞増殖はＴＡＣＣ３の枯渇による影響を受けなかった。これはｐ５３野生型マウスについても同様であった。このことはアポトーシスの欠如が単にｐ５３機能の喪失に起因するのではないことを示す。これらの結果は、胸腺リンパ腫細胞の増殖におけるＴＡＣＣ３機能の要求が細胞系譜依存性ではないことを示す。
【００８５】
高レベルのＴＡＣＣ３タンパク質を発現する２つのさらなる正常組織も検討した。ＴＡＣＣ３は腸のＴＡ（transit amplifying）細胞において高発現されており、４ＯＨＴ処置はこれらの細胞における組換えを効果的に可能にした。しかし、これらの細胞はアポトーシスの誘導も細胞増殖の阻害も示さなかった。同様に、毛包のマトリックス細胞は高レベルのＴＡＣＣ３タンパク質を発現していたが、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系によるＴＡＣＣ３遺伝子座の欠失によって、２年より長い間明らかな変化は示されず、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）染色により示されるこれらの細胞の増殖は影響されなかった。これらの結果は、ＴＡＣＣ３がリンパ腫細胞においては重要な機能を有するが、リンパ球、腸ＴＡ細胞および毛包マトリックス細胞を含む正常細胞では重要な機能を有しないことを実証する。
【００８６】
実施例３
胸腺リンパ腫の退縮を担う機構を研究するために、４つの細胞株（ｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｗ；ＣｒｅＥＲＴ２マウス由来の２株およびｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ；ＣｒｅＥＲＴ２マウス由来の２株）を樹立した。マウスリンパ腫細胞株をペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＧＩＴ培地（日本製薬）中で培養した。４ＯＨＴ（Sigma）をエタノール中で２５ｍＭの濃度に希釈し、最終濃度１μＭで使用した。同一の遺伝子型を有する各々の細胞株が本質的に同じ結果を示したので、各々の遺伝子型由来の１つの細胞株のデータを提示した。
【００８７】
ＴＡＣＣ３タンパク質の有意な低下が４ＯＨＴ処理の２日後からＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ細胞において観察され、これらの細胞の細胞増殖は同時に抑制された（図２ａおよびｂ、ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ  ４ＯＨＴ（＋））。ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｗ細胞において４ＯＨＴ処理後に増殖の変化は検出されなかった。さらに、ＦＡＣＳ分析により、４ＯＨＴの投与がサブＧ１細胞集団の有意な増加を導くことが示された（図２ｃ）。
【００８８】
以前の報告と同様に（Gergely, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:14352-14357 (2000)；Piekorz, R.P. et al., EMBO J., 21:653-664 (2002)）、ＴＡＣＣ３は有糸分裂期に蓄積され、マウスリンパ腫細胞において紡錘体および中心体に局在化しており、このことは、ＴＡＣＣ３が有糸分裂における役割を果たしていることを示唆する。この考えに一致して、４ＯＨＴ処理によるＴＡＣＣ３の破壊は有糸分裂指数の増加を導いた（図２ｄ）。
【００８９】
ＴＡＣＣ３の破壊によって誘導される有糸分裂欠陥を理解するために、免疫蛍光分析によって有糸分裂細胞を検討し、そしてＴＡＣＣ３欠失細胞が多極紡錘体を含むことを見出した（図２ｅ）。４ＯＨＴ投与の３日後に、細胞の９０．９％においてＴＡＣＣ３の発現は失われており、そしてその５７．９％が多極紡錘体を含んでいた（図２ｆ）。これらの結果は、ＨｅＬａ細胞やＮＩＨ３Ｔ３細胞とは異なり、胸腺リンパ腫細胞においてＴＡＣＣ３が適正な双極紡錘体の形成に必要とされることを実証する。紡錘体欠陥は紡錘体形成チェックポイント（ＳＡＣ）を活性化し、有糸分裂停止を導く。長期の停止の後、細胞は有糸分裂において死滅するかまたは有糸分裂から退避する（この現象は有糸分裂スリッページと呼ばれる）。ＦＡＣＳ分析により、ＴＡＣＣ３の破壊は、アポトーシス細胞集団の顕著な増加を導くが、四倍体細胞集団の変化はほとんど観察されないことが示された（図２ｃ）。この結果は、リンパ腫細胞が有糸分裂細胞死を受けることを示唆する。あるいは、これらの細胞は、有糸分裂スリッページの後迅速にアポトーシスを受ける。
【００９０】
これらの可能性を単細胞ベースのアッセイによって試験した（図２ｇおよびｈ）。ヒストンＨ２Ｂ−ＧＦＰを発現する胸腺リンパ腫細胞を樹立し、そして有糸分裂の間の染色体の挙動を低速度撮影によって検討した。Ｈ２Ｂ−ＧＦＰを発現する安定クローンをｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴベクター（Invitrogen）を使用したレンチウイルス形質導入によって得、感染細胞をピューロマイシンおよびそれに続くFACSAria（Becton Dickinson）を使用するＦＡＣＳソーティングによって選択した。核膜崩壊（ＮＥＢ）の後、ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｗ細胞は有糸分裂を完了して、４ＯＨＴの非存在下および存在下でそれぞれ５３．８±８．９分および６０．０±１３．１９分で娘細胞を生成した。同様に、ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ細胞は４ＯＨＴの非存在下で５９．６±１５．３分で有糸分裂を完了した。対照的に、４ＯＨＴの投与によって大部分の細胞は死滅した。ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ細胞の１７．６％は有糸分裂において死滅し、そして細胞の７０．６％は有糸分裂スリッページを受け、その後の間期において細胞死した。細胞死を誘導するために必要とされた時間は、以前に報告された肺癌および結腸癌（有糸分裂において死滅した細胞およびその後の間期において死滅した細胞について１１６．７±１６．１分および１５５．４±３９．６分）に比較して短い（Gascoigne, K.E. et al., Cancer Cell, 14:111-122 (2008)）。これらの結果は、リンパ腫細胞において、ＴＡＣＣ３機能の喪失が異常な紡錘体を導き、これが有糸分裂停止およびそれに続く迅速な細胞死を引き起こすことを実証する。
【００９１】
実施例４
胸腺リンパ腫に加えて、ｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ；ＣｒｅＥＲＴ２マウス由来の３つの肉腫を分析した。４ＯＨＴ処置は、２つの肉腫の退縮を引き起こし、そして免疫組織化学分析によってこれらが血管肉腫であることが示された。これらの一方は迅速に退縮し（１０日で８０．５％）、他方は比較的ゆっくりと破裂したが（７日で１４．３％、１４日で３７．０％）、残存する組織は壊死組織の大きな塊を含んでおり、このことはこれらの腫瘍が進行および維持のためにＴＡＣＣ３を必要とすることを示唆する。
【００９２】
対照的に、４ＯＨＴの投与にかかわらず、第３の肉腫は腫瘍量を７日で２４７％、１４日で３５０％増加させた。この進行はＴＡＣＣ３遺伝子座の組換えの失敗に起因するのではない。なぜなら、サザンブロット分析により約２５％のＴＡＣＣ３ＳアレルがＴＡＣＣ３Ｄアレルに変換されたことが実証されたからである。免疫組織化学分析により、この肉腫はデスミンを発現していることが示され、そしてこれは横紋筋肉腫であると同定された。胸腺リンパ腫とは対照的に、ＴＡＣＣ３の枯渇はこの腫瘍において広範な大量のアポトーシスを誘導しなかった。
【００９３】
横紋筋肉腫におけるＴＡＣＣ３の役割を検討するために、横紋筋肉腫細胞株をｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ；ＣｒｅＥＲＴ２（＋）マウスおよびｐ５３−／−；ＴＡＣＣ３Ｓ／Ｄ；ＣｒｅＥＲＴ２（−）マウスから樹立した。胸腺リンパ腫細胞と同様に、ＴＡＣＣ３は横紋筋肉腫細胞において紡錘体および中心体に局在化した。しかし、効率的な組換えにかからわず、細胞増殖のわずかな抑制が４ＯＨＴ処理に応答して観察され、そして有糸分裂指数の有意な増加は観察されなかった。
【００９４】
免疫蛍光分析により紡錘極数の増加は示されなかった。しかし、細胞の５３．１％は中期において非整列染色体を含んでおり、そして間期細胞において多くの微小核が検出された。このことは細胞増殖の弱い抑制を説明し得る。従って、ＴＡＣＣ３の破壊は横紋筋肉腫細胞において紡錘体形成を妨害しなかったが、ＴＡＣＣ３は染色体整列に必要とされるようである。これらの観察は、横紋筋肉腫の腫瘍退縮には、ＴＡＣＣ３の長期の阻害またはＴＡＣＣ３機能の異常が、他の化学療法剤とともに必要とされ得る可能性を提起する。
【００９５】
実施例５
上記の結果は、ＴＡＣＣ３がマウスリンパ腫細胞の増殖のために必要とされることを実証するので、次にヒトリンパ腫細胞におけるＴＡＣＣ３の役割を検討した。ヒトタンパク質アトラスデータベース（http://www.proteinatlas.org）は悪性リンパ腫がＴＡＣＣ３タンパク質を最も高発現している癌組織の１つであることを示した。ヒトリンパ腫組織におけるＴＡＣＣ３タンパク質の発現をさらに探求するために、組織アレイ中の２５個のＴ細胞リンパ腫、３５個のＢ細胞リンパ腫、５個の骨髄腫および６個の未分化大細胞ならびに９個の非腫瘍組織を検討した（図３ａ）。ＴＡＣＣ３は非腫瘍組織を含む全ての組織において発現されていた。Ｔリンパ腫、Ｂリンパ腫、骨髄腫、未分化大細胞および正常組織においてそれぞれ組織の７６．０％、８５．７％、６０．０％、８５．７％および７５．０％がＴＡＣＣ３タンパク質を高い割合で（７５％超の陽性）発現していた。
【００９６】
次に、ヒトリンパ腫細胞におけるＴＡＣＣ３の役割を検討するために、２つのバーキットリンパ腫細胞株（ＤａｕｄｉおよびＲａｊｉ）ならびに２つのＴ細胞性急性リンパ腫白血病（Ｔ−ＡＬＬ）細胞株（ＪｕｒｋａｔおよびＣＣＲＦ−ＣＥＭ）において、レンチウイルス媒介ｓｈＲＮＡ感染を使用してＴＡＣＣ３タンパク質を枯渇させた。ヒトリンパ腫細胞株を１０％仔ウシ血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco）中で培養した。ＴＡＣＣ３を枯渇させるために、human pLKO.1 lentivirus shRNA target gene setを使用し、そして２つのクローンTRCN0000062026（図３中ｓｈ１、配列番号７）およびTRCN0000062027（図３中ｓｈ２、配列番号８）をそれらの効率的な枯渇の故に使用した（それぞれのクローンについての詳細な情報はThe RNAi Consortiumのウェブサイト（http://www.broadinstitute.org/rnai/public/）から入手可能である）。
【００９７】
２つの独立したｓｈＲＮＡはＴＡＣＣ３発現を有意に低下させた（図３ｂ）。ＴＡＣＣ３の低下はアネキシンＶ染色によって示されるアポトーシスおよび細胞生存率の抑制をＴ−ＡＬＬのみならずバーキットリンパ腫細胞においても誘導した（図３ｃおよびｄ）。さらに、マウスリンパ腫細胞において観察されたのと同様に、これらの細胞は有糸分裂指数の有意な増加を示し（図３ｅ）、そして多極紡錘体を含む細胞の百分率は有意に増加した（図３ｆおよびｇ）。これらの結果は、マウスリンパ腫細胞に加えて、ＴＡＣＣ３がヒトリンパ腫細胞の生存能に不可欠であることを実証する。
【００９８】
一方、配列番号１５（TRCN0000062023）：5' CCGGCCACGGAGCCGCUGUCCCCGCCUCGAGGCGGGGACAGCGGCUCCGUGGUUUUUG 3'、配列番号１６（TRCN0000062024）：5' CCGGGCAGUCCUUAUACCUCAAGUUCUCGAGAACUUGAGGUAUAAGGACUGCUUUUUG 3'、配列番号１７（TRCN0000062025）：5' CCGGCGCACAGGAUUCUAAGUCCUACUCGAGUAGGACUUAGAAUCCUGUGCGUUUUUG 3'、配列番号１８（コントロール）：（5' CCGGACCGGUCCGCAGGUAUGCACGCGUGAAUUCCUCGAGGAAUUCACGCGUGCAUACCUGCGGACCGGUUUUUUG 3'）のshRNAは、TACC3の枯渇、細胞生存率の抑制および有糸分裂指数の増加を示さなかった。
【００９９】
実施例６
卵巣がん細胞および子宮頸がん細胞におけるＴＡＣＣ３による有糸分裂停止の誘導
【０１００】
材料と方法
子宮頸がん細胞（Ｈｅｌａおよび2種の卵巣がん細胞(SKOV3、OVCAR3)を8ウェルチャンバースライドに播種（1x105/mlで100ul/ウェル）し、Invitorgen社のLipofectamineTM RNAiMAXを用い、その指示書に従って配列番号９のTACC3 siRNA (Invitrogen TACC3-HSS116027)、配列番号２０のTACC3 siRNA (Invitrogen TACC3-HSS116026)、配列番号２１のTACC3 siRNA (Invitrogen)をトランスフェクションし、48時間後に、細胞を回収し前記と同様にイムノブロットを行った。また、細胞を3.7%PFAで固定し、ホスホヒストンH3（pH3）抗体（Cell Signaling社)を用いた免疫染色によりＭ期で停止している細胞を目視で同定した。ホスホヒストンH3（pH3）抗体染色後の細胞は、さらに、FITC結合α-tubulin抗体（sigma）を用いて染色し、有糸分裂停止細胞の紡錘体の形態を目視により観察した。
【０１０１】
配列番号２０（TACC3-HSS116026）：5'AUAAGGACUGCUUCCUCAAGGCCGA 3'のTACC3 siRNAは、位置1762〜1786の配列を標的とし、配列番号２１（TACC3-HSS116028）：5'UUUAGUCUUCUGCUCCACUGUCUUC 3'のTACC3 siRNAは位置2541〜2565の配列を標的とする。
【０１０２】
なお、配列番号９、２０、２１のsiRNAは、Invitorgen社に合成を依頼し入手した。
【０１０３】
結果
図４（ａ）に示すとおり、配列番号９のＴＡＣＣ３ｓｉＲＮＡ処理により、子宮頸がん細胞（Ｈｅｌａ）および卵巣がん細胞（ＳＫＯＶ３およびＯＶＣＡＲ３）におけるＴＡＣＣ３タンパク質の枯渇が観察された。
【０１０４】
図４（ｂ）に示すとおり、配列番号９のＴＡＣＣ３ｓｉＲＮＡ処理により、卵巣がん細胞（ＳＫＯＶ３およびおよびＯＶＣＡＲ３）子宮頸がん細胞（Ｈｅｌａ）において、有糸分裂停止の細胞の増加が認められた。驚くべきことに、有糸分裂停止の細胞の増加は、子宮頸がん細胞（Ｈｅｌａ）と比較して卵巣がん細胞（ＳＫ−ＯＶ３およびＯＶＣＡＲ３）において顕著に高いものであった。
【０１０５】
図４（ｄ）に示すとおり、配列番号９のＴＡＣＣ３ｓｉＲＮＡ処理による有糸分裂停止している卵巣腫瘍細胞（ＳＫＯＶ３およびＯＶＣＡＲ３）の紡錘体の形態は、ほとんどが多極紡錘体（ＳＫＯＶ３で約７５％、ＯＶＣＡＲ３で約６０％）であった。
【０１０６】
一方、配列番号２０および２１のsiRNAはこれらの効果を示さなかった（データは示していない）。
【０１０７】
実施例７
腫瘍細胞におけるＴＡＣＣ３の枯渇による効果をin vivoで検討した。
【０１０８】
材料と方法
SKOV3細胞1.0X107個をNOD-scidマウス（日本チャールズリバー）の背側皮下に移植し、腫瘍の長さ（Ｗ）と幅（Ｗ）をノギスで測定し、腫瘍量(TV（tumor volume)＝LxWxW/2)を経時的に計測した。前記のとおり、コントロール群(Ctrl)では、TRCN-control (発現ベクターpShag Magic Version 2.0（pSM2）にコントロール用のshRNA 配列（配列番号１８）を挿入したベクター（open biosystem社製品、(株)フナコシより入手)）を用いて作製した組換えレンチウイルス、実験群(exp)群では配列番号７（open biosystems社製品、(株)フナコシより入手)を用いて作製した組換えレンチウイルスをSKOV3細胞に感染後、puromycinで非感染細胞を除去し、接種した。
【０１０９】
SKOV3細胞でも、リンパ腫瘍の場合と同じく５つの配列（配列番号７、８、１５〜１７）を用いたが、リンパ腫瘍の場合と異なり配列番号７のみがイムノブロットで顕著なTACC3の枯渇を示した（データは示していない）。そのため、in vivo実験には、配列番号７のみを用いた。
【０１１０】
結果
図５ａに示すとおり、3つのコントロール群（#1 ctrl、#2 ctrlおよび#3 ctrl：配列番号１８）ではすべて接種60日頃以降に腫瘍量の顕著な増殖が認められたのに対し、3つの実験群（#1 exp、#2 expおよび#3 exp：配列番号７）では、腫瘍の増殖は認められなかった。これにより、配列番号７のshRNAのin vivoにおける卵巣腫瘍に対する抗がん効果が示された。
【０１１１】
実施例８
ＳＫＯＶ３卵巣がん細胞の有糸分裂に対するＴＡＣＣ３、ＴＡＣＣ１、ＴＡＣＣ２のｓｉＲＮＡの効果を検討した。
【０１１２】
材料と方法
卵巣がん細胞(SKOV3)を8ウェルチャンバースライドに播種（1x105/mlで100ul/ウェル）し、TACC1 siRNA（配列番号１４、Invitorgen)、TACC2（配列番号２０、Invitorgen)もしくはTACC3 siRNA （配列番号９、Invitorgen)をトランスフェクションし、４８時間後にmethanolで固定後、抗MPM2抗体（Novus社）を用いた免疫染色により分裂期の細胞を同定した。続いて、ＦＩＴＣ結合α-tubulin抗体を用いて染色し、紡錘体の形態を観察した。
【０１１３】
siRNAの配列
配列番号１９（Control）：5' GAAUUCACGCGUGCAUACCUGCGGACCGGU 3'
配列番号１４（TACC1-HSS186179）：5’AUUUCUUCAAGGCUUCUUCAGCAACU 3’
配列番号２０(TACC2-HSS116289)：5’UACUCCUGCGCGCACAUCUCUUAACA 3’
これらのsiRNAは、Invitorgen社に合成を依頼し入手した。
【０１１４】
結果
TACC1(p=0.001)およびTACC3(p=0.0009)で有意な有糸分裂指数の上昇（図６ａ）および、紡錘体異常の増加（図６ｂ）を認めた。一方、TACC2のsiRNAは、イムノブロットでTACC2の枯渇が認められた（データは示していない）にもかかわらず、有糸分裂指数に変化はなく、紡錘体異常の増加もほとんど認られなかった（図６ａおよびｂ）。TACC2は、TACC1(p=0.001)およびTACC3と異なり、抗がん作用と関係しないことが示された。
なお、ＴＡＣＣ１については、配列番号１４（TACC1-HSS186179）の他に、異なる領域に対するsiRNA（TACC1-HSS186178およびTACC1-HSS186180）、またＴＡＣＣ２についても、配列番号２０(TACC2-HSS116289)の他に、異なる領域に対するsiRNA（TACC2-HSS116287およびTACC2-HSS116288）を合成し試験したが、効果は認められなかった（データは示していない）。
【０１１５】
実施例９
TACC3およびApcコンディショナルノックアウトマウスApc580SにおけるＴＡＣＣ３の枯渇
【０１１６】
材料と方法
TACC3コンディショナルノックアウトマウス（Yao, R. et al., Cancer Sci., 98:555-562 (2007)）をApcコンディショナルノックアウトマウス（Shibata et al. Science 278:120-3 (1997)）およびVilin-Creマウス（Ventura, A. et al., Nature, 445:661-665 (2007)；Tyler Jacks博士より入手した）と交配して、Tacc3W/W、ApcS/W、Villin-Cre(+)であるApc580Sマウス(W/W)およびTacc3S/D、ApcS/W、Villin-Cre(+)であるApc580Sマウス(S/D)を作製した。
【０１１７】
なお、APCは癌抑制遺伝子であり、Apcコンディショナルノックアウトマウスは、Apcをコンディショナルにノックアウトすることで加齢とともに、小腸、大腸（盲腸を含む）に腫瘍を発生させるマウスである。
【０１１８】
各マウスを飼育し、８週令（8.0W）に２匹のＷ/Ｗマウスおよび４匹のＳ/Ｄマウス、１２週令（12.0W）に３匹のＷ/Ｗマウスおよび３匹のＳ/Ｄマウス、１６週令（16.0W）に３匹のＷ/Ｗマウスおよび４匹のＳ/Ｄマウスを解剖し、小腸、大腸（盲腸を含む）に発生した腫瘍数を目視で計数した。
【０１１９】
結果
図７に示すとおり、Ｗ/Ｗ型のApc580Sマウス（ApcはノックアウトされるがTacc3は機能している）では、加齢と供に発生した腫瘍数は増加した。一方、Ｓ/Ｄ型のApc580Sマウス（ApcおよびTacc3供にノックアウトされる）では、１２週においては、８週齢と比較して腫瘍数は増加したが、１６週においては、１２週齢と比較して減少した。そして、Ｗ/Ｗ型と比較して、腫瘍数ははるかに少ない。これは、ＴＡＣＣ３を枯渇させることにより小腸、大腸および盲腸腫瘍を抑制できることを示しており、ＴＡＣＣ３が、小腸、大腸および盲腸腫瘍に対する抗癌剤開発の標的となりえることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明により、ＴＡＣＣ３タンパク質を標的とした、抗癌剤のスクリーニング方法が提供される。また、ＴＡＣＣ３またはＴＡＣＣ１タンパク質を標的とした、新たな抗癌剤が提供される。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図２ｈ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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