(57)【要約】【課題】均質な三次元癌組織モデルを効率的に構築する方法を提供する。【解決手段】癌細胞を擬微小重力環境下で培養することを特徴とする、三次元癌組織モデルの構築方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞を擬微小重力環境下で培養することを特徴とする、三次元癌組織モデルの構築方法。
【請求項２】
播種される癌細胞が樹立細胞株または初代培養細胞である、請求項１に記載の構築方法。
【請求項３】
癌細胞を複数の均質な細胞足場材料に播種する工程、および擬微小重力環境下で該細胞足場材料に播種された癌細胞を培養する工程、を含む、請求項１または２に記載の構築方法。
【請求項４】
細胞足場材料がコラーゲン、ポリマー、またはそれらの混合物を含む、請求項３に記載の構築方法。
【請求項５】
コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲンおよびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項４に記載の構築方法。
【請求項６】
ポリマーが、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリアルギン酸、およびポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）からなる群より選択される、１種または２種以上の物質を含む、請求項４に記載の構築方法。
【請求項７】
細胞足場材料への癌細胞の播種が、該癌細胞の懸濁液中に該細胞足場材料を浸漬することによって行われる、請求項４〜６のいずれか１項に記載の構築方法。
【請求項８】
癌細胞の懸濁液中に細胞足場材料を浸漬する工程を減圧下にて行う、請求項７に記載の構築方法。
【請求項９】
擬微小重力環境が、時間平均して地球の重力の１／１００〜１／１０に相当する重力を物体に与える環境である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の構築方法。
【請求項１０】
擬微小重力環境が、回転で生じる応力によって地球の重力を相殺することにより、地上で擬微小重力環境を実現する、１軸回転式バイオリアクター、または２軸式回転バイオリアクターを用いて実現される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の構築方法。
【請求項１１】
１軸回転式バイオリアクターがＲＷＶ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ  Ｗａｌｌ  Ｖｅｓｓｅｌ）バイオリアクターである、請求項１０に記載の構築方法。
【請求項１２】
２軸式バイオリアクターがクリノスタットである、請求項１０に記載の構築方法。
【請求項１３】
さらに、擬微小重力環境下で培養することにより得られた三次元癌組織モデルを、単層培養または三次元培養に付す工程を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の構築方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、擬微小重力環境下での三次元癌組織モデルの構築方法に関する。特に、本発明は、癌細胞が播種された多数の細胞足場材料を用いて、多数の三次元癌組織モデルを同時かつ均質に構築する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の癌細胞の薬効スクリーニングは、汎用の単層細胞培養用ディッシュ上に癌細胞を播種・培養した後、効能を調べる薬剤を溶かした培養液を添加し、癌細胞の増殖特性が低下するか、アポトーシスを起こすかなどで評価されてきた。しかし、近年、二次元培養して得られた癌組織モデルがインビボと同様の薬剤応答を示さない可能性が示唆されている。癌細胞の立体的な三次元集合体（すなわち、三次元癌組織モデル）においては、投与された抗癌剤の表面への到達は可能でも物理的空間の問題から内部まで到達するのは難しいとされ、二次元（単層培養）の癌組織モデルと三次元の癌組織モデルでは、投与された薬剤に対する反応性は異なってくると考えられる。
【０００３】
このような背景からよりインビボの状態に近い三次元癌組織モデルを用いた評価が望まれている。その一つの解決法として、凹凸などを持った特殊な表面上に癌細胞を播種・培養しスフェロイドを作製し評価する手法が考案されている（非特許文献１）。
【０００４】
この手法は、三次元癌組織モデルを構築できる点で有利であるが、構築されるスフェロイド組織の形状や大きさを一定にすることが困難である。そのため薬効スクリーニングにおいて当該三次元癌組織モデルを用いた場合、データのばらつきを回避できず、多数のドラッグライブラリーから効能のある薬剤を選択することは非常に困難である。
【０００５】
単層培養、スフェロイド培養による癌細胞の薬効評価は上記の問題点を有しており、均質な三次元組織モデルを効率的に構築できる技術が、当該分野において求められている。
【０００６】
擬微小重力環境は、宇宙空間における微小重力環境を模して人工的に作り出された微小重力（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｔｙ）環境を意味する。今日、擬微小重力環境を生じる様々なバイオリアクターが開発されており（例えば、ＲＷＶ（Ｒａｔａｔｉｎｇ−Ｗａｌｌ  Ｖｅｓｓｅｌ：特許文献１）、ＲＣＣＳ（Ｒｏｔａｒｙ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＳｙｓｔｅｍＴＭ：Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、３Ｄクリノスタット）、細胞の三次元培養に用いられている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，００２，８９０号
【特許文献２】ＷＯ２００５／０５６０７２
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ３Ｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  ２００８  Ｊａｎ；１２８（１）：３７−４４．  Ｒｅｖｉｅｗ．  Ｊａｐａｎｅｓｅ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、均質な三次元癌組織モデルを効率的に、同時にまた多数構築する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、擬微小重力環境下での三次元組織培養により均質な三次元癌組織モデルを構築できることを見出した。さらに、多数の足場材料に同数の癌細胞を播種して、擬微小重力環境下にて同時に回転培養することにより、多数の均質な三次元癌組織モデルを構築できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づく。
【００１１】
本発明は以下の特徴を有する。
［１］  癌細胞を擬微小重力環境下で培養することを特徴とする、三次元癌組織モデルの構築方法。
［２］  播種される癌細胞が樹立細胞株または初代培養細胞である、［１］の構築方法。
［３］  癌細胞を複数の均質な細胞足場材料に播種する工程、および擬微小重力環境下で該細胞足場材料に播種された癌細胞を培養する工程、を含む、［１］または［２］の構築方法。
［４］  細胞足場材料がコラーゲン、ポリマー、またはそれらの混合物を含む、［３］の構築方法。
［５］  コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲンおよびそれらの混合物からなる群より選択される、［４］の構築方法。
［６］  ポリマーが、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリアルギン酸、およびポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）からなる群より選択される、１種または２種以上の物質を含む、［４］の構築方法。
［７］  細胞足場材料への癌細胞の播種が、該癌細胞の懸濁液中に該細胞足場材料を浸漬することによって行われる、［４］〜［６］のいずれかの構築方法。
［８］  癌細胞の懸濁液中に細胞足場材料を浸漬する工程を減圧下にて行う、［７］の構築方法。
［９］  擬微小重力環境が、時間平均して地球の重力の１／１００〜１／１０に相当する重力を物体に与える環境である、［１］〜［８］のいずれかの構築方法。
［１０］  擬微小重力環境が、回転で生じる応力によって地球の重力を相殺することにより、地上で擬微小重力環境を実現する、１軸回転式バイオリアクター、または２軸式回転バイオリアクターを用いて実現される、［１］〜［９］のいずれかの構築方法。
［１１］  １軸回転式バイオリアクターがＲＷＶ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ  Ｗａｌｌ  Ｖｅｓｓｅｌ）バイオリアクターである、［１０］の構築方法。
［１２］  ２軸式バイオリアクターがクリノスタットである、［１０］の構築方法。
［１３］さらに、擬微小重力環境下で培養することにより得られた三次元癌組織モデルを、単層培養または三次元培養に付す工程を含む、［１］〜［１２］のいずれかの構築方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、均質な三次元癌組織モデルを効率的に構築することができる。本発明によれば、足場材料を用いることによって、多数の均質な三次元癌組織モデルを効率的に構築することができる。多数の均質な三次元癌組織モデルを利用することによって、抗癌剤など薬効スクリーニングおよび薬効評価を精度高く行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、足場材料を用いずにＲＷＶ回転培養により作製したＭＧ６３三次元癌組織モデルのヘマトキシリン・エオジン染色像を示す写真図である。
【図２】図２は、ＲＷＶ回転培養により作製したＭＧ６３三次元癌組織モデルのドキソルビシン曝露により生じるＤＮＡ量の経時的変化を示すグラフ図である。
【図３】図３は、平面培養により作製したＭＧ６３癌組織モデルのドキソルビシン曝露により生じるＤＮＡ量の経時的変化を示すグラフ図である。
【図４】図４は、平面培養（Ｆｌａｔ）またはＲＷＶ回転培養（３Ｄ）により作製したＭＧ６３の癌組織モデルのドキソルビシン曝露により生じるＤＮＡ量の比較（左２４時間、右４８時間）を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、癌細胞を、擬微小重力環境で培養することを特徴とした、三次元癌組織モデルの構築方法に関する。
【００１５】
本発明の方法により作製される三次元癌組織モデルは、抗癌剤などの薬効スクリーニングおよび薬効評価に用いることができる。
【００１６】
「三次元癌組織モデル」とは、癌細胞を三次元培養することによって得られる癌細胞の立体的な集合体（三次元集合体）を意味する。当該三次元集合体において、癌細胞は三次元的に増殖することが可能であり、細胞が細胞培養用プレートなどの上に張り付くように二次元的に延伸する細胞培養（二次元細胞培養）によって得られる組織モデルと比べて、より生体内に近い培養環境を実現することができる。
【００１７】
本発明において「癌細胞」は、特に限定されることなく様々なものを利用することができる。好ましくは、固形癌由来の癌細胞である。固形癌とは、血液の癌（白血病など）を除く癌を意味し例えば、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、骨髄癌、腎細胞癌、尿管癌、肝癌、胆管癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、頭蓋咽頭癌、喉頭癌、舌癌、繊維肉腫、粘膜肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、ウィルムス腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、骨髄芽種、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫などが挙げられるが、これらに限定されない。癌細胞は、樹立細胞株であっても、初代培養細胞であっても良い。
【００１８】
癌細胞は、細胞足場材料（スキャホールド）に播種されたものであっても良い。
細胞足場材料を用いることによって、同一条件下にて複数の三次元癌組織モデルを同時に構築することが可能であり、均質な複数の三次元癌組織モデルを製造することが可能である。これに対して、細胞足場材料を用いない場合においては、培地中に播種された細胞は、下記に詳細に記載される回転培養において、一つに凝集し、細胞足場材料を用いた場合と比べて大型の三次元癌組織モデルを製造することが可能である。
【００１９】
ここで「均質」とは、構築される各三次元癌組織モデルの間で性質的に違いがほとんどないか、極めてわずかであることを意味し、例えば、同一条件下において同一に与えられる刺激に対して、個々の三次元癌組織モデルが同一の反応を示すことを意味する。
【００２０】
「細胞足場材料」とは、癌細胞が当該材料と接することによって、細胞の接着、増殖、分化、活性化、移動、遊走、形態変化など様々な細胞機能が発現、促進される材料を意味する。そのような材料としては、例えばハイドロキシアパタイトやβ−ＴＣＰ（リン酸三カルシウム）、α−ＴＣＰ等のセラミックス、コラーゲン、ポリマー等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、細胞足場材料は、コラーゲン、ポリマー、又はそれらの混合物を含んでなる。ここで、「コラーゲン」とは、Ｉ型〜ＶＩＩ型コラーゲンのいずれか、またはそれらの混合物である。使用するコラーゲンは、市販のものでもよいし、動物組織から抽出・精製したものでもよいし、または組み換え的に発現させた後、精製したものでもよい。また、「ポリマー」とは、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリアルギン酸、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）のうち１種または２種以上を含む。上記の材料の列挙は例示であって、限定的なものではない。
【００２１】
細胞足場材料は、上記物質のいずれか一種からなるものであっても良いし、複数種を含む複合体からなるものであっても良い。
【００２２】
細胞足場材料の形態は特に限定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形物などの形態を有することができるが、細胞の均一な播種が可能となるよう、多孔性であることが好ましい。「多孔性」とは、数μｍ〜数１００μｍ程度の無数の孔（空隙）が存在する構造であり、本発明においては、空隙率（細胞足場材料の全体積に比した空隙部分の体積の割合）は４０〜９０％、より好ましくは６０〜９０％である。空隙率が低すぎると、細胞の侵入が不十分になり、空隙率が高すぎると、構造の強度を保つことができない。
【００２３】
細胞足場材料の形状は、特に限定されず、球状、ディスク状、粒子状、ブロック状など任意の形状を用いることができる。細胞足場材料の大きさは、特に限定されず、例えば最長部の長さ（直径など）を、０．２ｍｍ〜１０ｍｍの範囲より適宜選択することができる。
【００２４】
細胞足場材料は、市販のもの（特に限定されないが、テルダーミス（オリンパステルモバイオマテリアル株式会社）など）を利用することができる。
【００２５】
培養に用いられる細胞足場材料は、構築される三次元癌組織モデルの均質性を確保すべく、材料や大きさなどすべて同一であることが好ましい。
【００２６】
培養に用いられる細胞足場材料の個数は、用いるバイオリアクターの容積や、所望される三次元癌組織モデルの数等に応じて適宜調整することが好ましい。通常、癌細胞が播種された細胞足場材料一つから、一つの三次元癌組織モデルが構築される。
【００２７】
癌細胞の細胞足場材料への播種は、公知の手法を用いて行うことができ、緩衝液、生理食塩水、培養液、またはコラーゲン溶液等の液体に癌細胞を懸濁して得られた懸濁液に細胞足場材料を浸漬する、あるいは当該懸濁液を細胞足場材料へ注入することによって行うことができる。また、必要に応じて、引圧または加圧条件下で播種してもよい。播種する細胞の数（播種密度）は、懸濁液の細胞濃度や注入量によって調整することが可能であり、用いる細胞の種類の特性や足場材料に応じて適宜調整することが好ましい。
【００２８】
癌細胞が播種された細胞足場材料は、擬微小重力環境下で培養する前に、１時間〜２４時間の静置培養に供し、癌細胞を細胞足場材料に接着させることが好ましい。
【００２９】
本発明において「擬微小重力環境」とは、宇宙空間における微小重力環境を模して人工的に作り出された微小重力（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｔｙ）環境を意味する。こうした擬微小重力環境は、例えば、回転で生じる応力によって地球の重力を相殺することにより実現される。すなわち、回転している物体は、地球の重力と応力とのベクトル和で表される力を受けるため、その大きさと方向は時間により変化する。したがって、時間平均すると物体には地球の重力（ｇ）よりもはるかに小さな重力しか作用しないこととなり、宇宙空間によく似た「擬微小重力環境」が実現される。
【００３０】
「擬微小重力環境」は、細胞が沈降することなく均一に分散した状態で増殖分化し、三次元的に凝集して、組織塊を形成できるような環境であることが必要である。言い換えれば、播種細胞の沈降速度に同調するように回転速度を調節して、細胞に対する地球の重力の影響を最小化することが望まれる。具体的には、培養細胞にかかる微小重力は、時間平均して地球の重力（ｇ）の１／１００〜１／１０倍程度であることが望ましい。
【００３１】
本発明では、擬微小重力環境を実現するために、好ましくは、回転式のバイオリアクターを使用する。そのようなバイオリアクターとしては、例えば、ＲＷＶ（Ｒａｔａｔｉｎｇ−Ｗａｌｌ  Ｖｅｓｓｅｌ：米国特許第５，００２，８９０号）、ＲＣＣＳ（Ｒｏｔａｒｙ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＳｙｓｔｅｍＴＭ：Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、３Ｄクリノスタット、並びに特開平８−１７３１４３号、特開平９−３７７６７号、及び特開２００２−４５１７３号に記載されているものなどを用いることができる。なかでも、ＲＷＶ及びＲＣＣＳはガス交換機能を備えているという点で優れている。
【００３２】
これらのバイオリアクターの中には、１軸回転式のものと２軸以上の多軸回転式のものがあるが、本発明では１軸回転式のバイオリアクターを用いることが好ましい。多軸回転式（例えば、２軸式クリノスタット等）では、ずり応力（シェアストレス）を最小化することができず、またサンプル自体も回転するため、１軸式バイオリアクターのようにベッセル内にサンプルがふわふわと浮かんだ状態を再現することができないからである。このふわふわと浮かんだ状態が、特別な足場材料がない場合でも大きな三次元組織塊を得るために重要である。
【００３３】
本発明の実施例で用いられているＲＷＶは、アメリカ航空宇宙局（ＮＡＳＡ）によって開発されたガス交換機能を備えた１軸式の回転式バイオリアクターである。ＲＷＶは、横向き円筒形バイオリアクター内に培養液を満たし、細胞を播種した後、その円筒の水平軸方向に沿って回転しながら培養を行う。バイオリアクター内には、回転による応力のため、実質的に地球の重力よりもはるかに小さい「微小重力環境」が実現される。この擬微小重力環境下において、細胞は培養液内に均一に懸濁され、最小のずり応力下で必要時間にわたって培養され、凝集して組織塊を形成する。足場材料を用いる培養の場合、細胞は足場材料全体に均一に広がり、良好に増殖する。
【００３４】
回転式バイオリアクターの回転速度は、バイオリアクター内の細胞塊または組織塊が、回転することなく、ほぼ一定の位置にふわふわと浮かんだ状態となるように適宜調整する。上記状態を維持すべく、回転式バイオリアクターの回転速度は、培養期間中、経時的に適宜変更することができる。
【００３５】
ＲＷＶを用いた場合の好ましい回転速度は、ベッセルの直径および組織塊の大きさや質量に応じて適宜設定され、例えば直径１０ｃｍのベッセルを用いた場合であれば、足場材料を用いない場合において８〜２４ｒｐｍ程度、足場材料を用いる場合において１２〜１５ｒｐｍ程度であることが望ましい。このような回転速度で培養を行うとき、ベッセル内の細胞に作用する重力は実質的に地上の重力（１ｇ）の１／１０〜１／１００程度となる。
【００３６】
培地はＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等、癌細胞の培養に通常用いられる培地を、細胞の特性に合わせて適宜選んで用いることができる。また、これらの培地には、ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製）やＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）等の抗生物質等を添加しても良い。
【００３７】
細胞の培養は、３〜１０％ＣＯ２、３０〜４０℃、特に５％ＣＯ２、３７℃の条件下で行うことが望ましい。培養期間は、特に限定されないが、少なくとも４日、好ましくは６〜２８日である。
【００３８】
本発明方法によれば、均質な三次元癌組織モデルを同時に多数構築することができる。当該三次元癌組織モデルは、均質であるが故に、同一の化合物に対する反応性のばらつきを低減または回避することができ、多数のドラッグライブラリーから抗癌作用などの効能を有する化合物をスクリーニングするに際して極めて有用であるといえる。
【００３９】
当該三次元癌組織モデルを用いた化合物のスクリーニングおよび薬効評価は、従来公知の一般的な手法を用いて行うことができる。例えば、三次元癌組織モデルと候補化合物とを接触させ、三次元癌組織モデルが所望の反応を示す化合物を選択・同定することによって行うことができる。例えば、抗癌作用を有する化合物をスクリーニングする場合においては、三次元癌組織モデルと候補化合物とを接触させ、当該三次元癌組織モデルにおいて増殖抑制および／またはアポトーシスを生じる化合物を選択・同定する。増殖抑制および／またはアポトーシスの検出は、従来公知の一般的な手法を用いて行うことができる。
【００４０】
化合物のスクリーニングおよび／または薬効評価において、三次元癌組織モデルの培養は、単層培養で行っても良いし、三次元培養によって行っても良い。この場合において「単層培養」とは、三次元癌組織モデルを構成する一部の細胞が培養皿表面上に接着していれば良く、三次元癌組織モデルはその三次元構造の一部または全体を保持した状態での培養を意味する。また、この場合において「三次元培養」は、クリノスタットを利用して行うことが好ましい。これらの培養方法を用いることによって、化合物のスクリーニング等の操作を簡便にすることができる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかしながら、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４２】
実施例１：細胞足場材料を用いない培養による三次元癌組織モデルの構築
ＭＧ６３（ヒト骨髄腫由来樹立細胞株）を、培養液  （ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）（ＷＡＫＯ）＋１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）＋ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ））で単層培養した後、トリプシンを用いて剥離・回収した。回収した細胞を同じ組成の培養液５０ｃｃに懸濁し（細胞濃度２ｘ１０６細胞／ｍｌ）、ＲＷＶバイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ社製）を用いて回転培養を行った。
【００４３】
ＲＷＶバイオリアクターによる回転培養は直径１０ｃｍ（容量５０ｃｃ）の容器を用い、回転数８〜２４ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３週間行った。回転数は目視で細胞塊が液中に浮いている状態になるように頻繁に調整した。３日に一度培養液の交換と培養ベッセル中にたまった泡抜きを行った。
【００４４】
培養後、得られた細胞塊は、４％パラフォルムアルデヒド、０．１％グルタールアルデヒドを用いてマイクロウエーブ固定を行い、常法に従って脱水しパラフィンに包埋した。５μｍの厚さで切片を作製し、常法に従ってヘマトキシリン・エオジン染色を行い顕微鏡で観察した。
【００４５】
ヘマトキシリン・エオジン染色の結果を図１に示す。図１に示すように大型（直径〜１．５ｃｍ程度）の均質な三次元癌組織モデルを構築することができた。
【００４６】
実施例２：細胞足場材料を用いた、多数の三次元癌組織モデルの構築
細胞足場材料は、コラーゲンスポンジ（テルダーミス（真皮欠損用グラフト：コラーゲン単層タイプ：オリンパステルモバイオマテリアル株式会社））を生検パンチ（３ｍｍφ）でくり抜いたもの（１５０個）を用いた。
【００４７】
ＭＧ６３（ヒト骨髄種由来樹立細胞株）を、培養液（ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）（ＷＡＫＯ）＋１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）＋ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ））で単層培養した後、トリプシンを用いて剥離・回収した。回収した細胞を同培地に懸濁し（細胞濃度１ｘ１０６細胞／ｍｌ）、得られた懸濁液にコラーゲンスポンジ１５０個を浸漬して、減圧下にて当該コラーゲンスポンジに細胞を播種した。その後、５時間静置培養した後、ＲＷＶバイオリアクターの培養ベッセル（２５０ｃｃ用）に足場材料／癌細胞コンポジット１５０個を新鮮な培養液（同組成）とともに注ぎ、回転培養を行った。回転速度は最初１２ｒｐｍからはじめ、足場材料／癌細胞コンポジットが培養液中にふわふわ浮く状態に回転速度を目視で調整した。６日間培養した（回転速度は１２〜１５ｒｐｍの範囲で調整した）後、多数の均質な三次元癌組織モデルを構築することができた（直径１．５ｍｍ程度の大きさ）。
【００４８】
実施例３：三次元癌組織モデルの薬効評価
実施例２で得られた三次元癌組織モデルを、９６穴プレートに移動し、新鮮な培養液（ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）（ＷＡＫＯ）＋１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）＋ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ））で静置培養を２４時間行った。次に、抗ガン剤（ドキソルビシン，Ｓｉｇｍａ）を添加した培地（それぞれ１０μｇ／ｍｌ，１．０μｇ／ｍｌ，０．１μｇ／ｍｌ，０μｇ／ｍｌ）に置換し、２日間培養した。１２時間ごとにサンプリングを行い（各抗ガン剤組成に対してｎ＝６サンプル）、−８０℃にて保存した。比較実験のために、９６穴プレートにＭＧ６３を平面培養（５０００細胞／ｗｅｌｌ）して二次元癌組織モデルを構築し、上と同様にドキソルビシンで処理して、−８０℃にて保存した。
【００４９】
ＤＮＡ定量：ピコグリーンアッセイ
各癌組織モデルのＤＮＡ定量には、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｑｕａｎｔｉ−ｉＴＴＭ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ  Ｐ１１４９６，  ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。−８０℃にて保存したサンプルを自然解凍し、それに細胞溶解液（ＳＣＩＶＡＸ  Ｓｐｈｅｒｏｉｄ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ：ＳＬＢ）を培養液の１０％ずつ加え室温でホモジナイズした（キアゲン；ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒＩＩ）。遠心により上澄みを回収後、同量のＴＥ緩衝液を加え、製造元のプロトコールに従いｐｉｃｏｇｒｅｅｎ溶液を調整し、サンプル液に加えて１０分間放置し、その後蛍光測定を行うことによりＤＮＡ量を測定した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ  ＧＥＭＩＮＩ  ＥＭ）。
【００５０】
各癌組織モデルにおけるＤＮＡの定量結果を図２〜４に示す。
図２に示すように、ＲＷＶ回転培養により得られた三次元癌組織モデルのドキソルビシン曝露によるＤＮＡ量の変化はドキソルビシンの濃度依存的であった。しかし、ドキソルビシン濃度が０μｇ／ｍｌ(Ｄｏｘ０)および０．１μｇ／ｍｌである場合、三次元癌組織モデルのＤＮＡ量に与える影響は小さく、ドキソルビシン濃度が１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌである場合、三次元癌組織モデルのＤＮＡ量に与える影響が比較的大きくなることが観察された。
【００５１】
一方、図３に示すように、平面培養により得られた二次元癌組織モデルのドキソルビシン曝露によるＤＮＡ量の変化も、ドキソルビシンの濃度依存的であった。しかしながら、ドキソルビシンの濃度変化とＤＮＡ量との間には、逆比例の関係が見られ、図２の三次元癌組織モデルの結果とは明らかに異なっていた。
【００５２】
図４は、ドキソルビシン曝露後２４時間および４８時間における各癌組織モデルのＤＮＡ量を示す棒グラフ図である。各癌組織モデルのＤＮＡ量は、それぞれドキソルビシン濃度が０μｇ／ｍｌ(Ｄｏｘ０)である場合の発現量を１００とする相対値によって示す。この結果より明らかなように、平面培養により得られた二次元癌組織モデル（Ｆｌａｔ）においてはドキソルビシンの濃度変化とＤＮＡ量との間には、逆比例の関係が見られるのに対して、ＲＷＶ回転培養により得られた三次元癌組織モデル（３Ｄ）においては、１μｇ／ｍｌ以上の濃度のドキソルビシンを用いた場合に、飛躍的に高い効果が得られた。
【００５３】
これらの結果は、二次元培養により得られた癌組織モデルと三次元培養により得られた癌組織モデルでは、同じ薬剤の効能が大きく変わってくることを示す。一般に、抗癌剤の効果は、固形癌において低いことが臨床的報告により示されている。その理由として、癌細胞が三次元の組織構造を有することにより、当該組織の内部まで抗癌剤が浸潤しにくいこと、また当該三次元組織によって、抗癌剤に対する反応性が二次元培養の場合とは異なっていることが挙げられる。上記のとおり三次元培養により得られた癌組織モデルのデータは、二次元培養により得られた癌組織モデルのデータとは明らかに異なっていた。これは、抗癌剤の癌組織モデルの組織内部への浸潤性の違いであり、および／または三次元組織の抗癌剤に対する反応性の変化であると考えられる。
【００５４】
本発明方法により得られた三次元癌組織モデルは、抗癌剤に対する固形癌の反応性を反映していると考えられ、真に癌組織に効能を持つ薬剤のスクリーニングに適している。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明によれば、均質な三次元癌組織モデルを効率的に構築することができる。このため、本発明は抗癌剤など薬効スクリーニングおよび薬効評価を行うのに有用な三次元癌組織モデルを提供することが可能であり、抗癌剤開発の分野における貢献が大いに期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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