(57)【要約】【課題】標本に対して精度よく焦点合わせする。【解決手段】カバーガラス５付きの標本Ａに照射される照明光をライン状に集光する照明光学系１１と、ライン状に集光された照明光を標本Ａに照射し、カバーガラス５からの反射光を集光する対物レンズ１３と、対物レンズ１３により集光された反射光の光軸に対して傾斜して配置された撮像面３６を有し、反射光を撮影して画像情報を検出する検出部１５と、検出部１５により検出された画像情報における光強度の最も高い位置が反射光の光軸上に位置するように、対物レンズ１３とカバーガラス５付きの標本とを光軸方向に相対移動させる合焦調節部１７とを備える自動合焦機構１０を提供する。【選択図】図１
2012141452.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カバーガラス付きの標本に照射される照明光をライン状に集光する照明光学系と、
前記ライン状に集光された照明光を前記標本に照射し、前記カバーガラスからの反射光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された前記反射光の光軸に対して傾斜して配置された撮像面を有し、前記反射光を撮影して画像情報を検出する検出部と、
該検出部により検出された前記画像情報における光強度の最も高い位置が前記光軸上に位置するように、前記対物レンズと前記カバーガラス付きの標本とを前記光軸方向に相対移動させる合焦調節部とを備える自動合焦機構。
【請求項２】
カバーガラス付きの標本に照射される照明光をライン状に集光する照明光学系と、
前記ライン状に集光された照明光を前記標本に照射し、前記カバーガラスからの反射光を集光する対物レンズと、
該対物レンズにより集光された前記反射光の光軸に対して傾斜して配置された撮像面を有し、前記反射光を撮影して画像情報を検出する検出部と、
該検出部により検出された前記画像情報における光強度の最も高い位置が前記光軸上から所定の距離だけ離れるように、前記対物レンズと前記カバーガラス付きの標本とを前記光軸方向に相対移動させる合焦調節部とを備える自動合焦機構。
【請求項３】
前記検出部の撮像面が前記反射光の光束の短軸回りに傾斜している請求項１または請求項２に記載の自動合焦機構。
【請求項４】
前記反射光の光軸に対する前記撮像面の傾きが以下の式を満たす請求項１から請求項３のいずれかに記載の自動合焦機構。
｛（ｐ×ｔａｎθ）／β２｝＜｛（１．２×λ）／ＮＡ２｝
ここで、ｐ：撮像面を構成する受光素子の長さ（μｍ）
θ：反射光の光軸に対する撮像面の傾き（ｒａｄ）
β：装置全体の撮像倍率（倍）
ＮＡ：対物レンズの開口数
λ：光源の波長（μｍ）
【請求項５】
前記合焦調節部が、以下の式により前記対物レンズと前記標本との相対移動量を設定する請求項１から請求項４のいずれかに記載の自動合焦機構。
（ａ×ｐ×ｔａｎθ）／β２
ここで、ａ：撮像面に入射される反射光の光束の中心から撮像面における中心の画素までの画素数
【請求項６】
前記カバーガラス付きの標本に対する前記撮像面の傾きが一定の角度となるように、前記カバーガラス付きの標本の傾きを調節する傾き調節部を備える請求項１から請求項５のいずれかに記載の自動合焦機構。
【請求項７】
請求項１から請求項６のいずれかに記載の自動合焦機構と、
前記標本を載置し、前記光軸方向に移動可能なステージと、
前記検出部により取得された前記画像情報に基づいて前記標本の画像を取得する画像取得部とを備える顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自動合焦機構および顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、標本のデジタル画像を取得し、モニタ上にその倍率や観察位置を変えて表示することにより、模擬的に顕微鏡観察を行うバーチャルスライド顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。バーチャルスライド顕微鏡装置によれば、対物レンズの光軸に対して直交する方向にステージを移動させながら複数の画像を取得し、これらの画像を繋ぎ合せることにより、スライドガラスのように顕微鏡装置の観察範囲より大きい標本を観察することができるが、顕微鏡周辺の環境変化によるフォーカスドリフトや、標本自身の傾き等により、対物レンズの焦点位置がずれ画質が劣化するという問題がある。特許文献１に記載の顕微鏡装置は、対物レンズの光軸に対して傾けて配置したカメラにより標本の画像の取得し、この画像の解析結果に基づいて対物レンズの焦点位置を制御することとしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００５／１１４２９３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の顕微鏡装置は、画像処理により標本の画像のコントラストが高い位置を対物レンズの焦点位置として検出するため、透明な標本や標本から外れた部分では対物レンズの焦点位置を検出することができないという問題がある。
【０００５】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、標本に対して精度よく焦点合わせすることができる自動合焦機構および顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、カバーガラス付きの標本に照射される照明光をライン状に集光する照明光学系と、前記ライン状に集光された照明光を前記標本に照射し、前記カバーガラスからの反射光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された前記反射光の光軸に対して傾斜して配置された撮像面を有し、前記反射光を撮影して画像情報を検出する検出部と、該検出部により検出された前記画像情報における光強度の最も高い位置が前記光軸上に位置するように、前記対物レンズと前記カバーガラス付きの標本とを前記光軸方向に相対移動させる合焦調節部とを備える自動合焦機構を提供する。
【０００７】
本発明によれば、対物レンズにより照明光がカバーガラス付きの標本に照射されると、検出部の撮像面によりカバーガラスからの反射光が撮影される。この場合において、ライン状の照明光が照射されたカバーガラスからの反射光の光軸に対し、撮像面を傾斜して配置することで、撮像面に入射される反射光の分布は撮像面の傾きに沿って変化することとなる。
【０００８】
すなわち、合焦状態においては、反射光の光束における光軸上の集光位置が撮像面に一致し、光軸から離れるに従い集光位置からずれて撮像面に入射される。したがって、画像情報における光強度が反射光の光軸上で最も高くなり、光軸から離れるに従いその光強度は低くなる。また、対物レンズの焦点位置が光軸方向に変動すると、反射光の光束における光軸から離れた集光位置が撮像面に一致する。したがって、画像情報における光強度の最も高い位置が反射光の光軸からずれる。
【０００９】
本発明は、合焦調節部により、画像情報における光強度の最も高い位置が反射光の光軸上に一致するように、対物レンズとカバーガラス付きの標本とを光軸方向に相対移動させることで、標本に対して精度よく焦点合わせすることができる。
【００１０】
本発明は、カバーガラス付きの標本に照射される照明光をライン状に集光する照明光学系と、前記ライン状に集光された照明光を前記標本に照射し、前記カバーガラスからの反射光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された前記反射光の光軸に対して傾斜して配置された撮像面を有し、前記反射光を撮影して画像情報を検出する検出部と、該検出部により検出された前記画像情報における光強度の最も高い位置が前記光軸上から所定の距離だけ離れるように、前記対物レンズと前記カバーガラス付きの標本とを前記光軸方向に相対移動させる合焦調節部とを備える自動合焦機構を提供する。
【００１１】
本発明によれば、合焦調節部の作動により、敢えて画像情報における光強度の最も高い位置が光軸上から所定の距離だけ離れるように、対物レンズとカバーガラス付きの標本とを光軸方向に相対移動させることで、標本の深部等、カバーガラスから光軸方向に離れた位置にある標本の部位に合焦位置を合わせることができる。
【００１２】
上記発明においては、前記検出部の撮像面が前記反射光の光束の短軸回りに傾斜していることとしてもよい。
【００１３】
このように構成することで、検出部の撮像面に入射される反射光の光路長が光束のライン方向に沿って異なるため、対物レンズの焦点位置が光軸方向に変動すると、画像情報における光強度の最も高い位置が反射光の光束のライン方向に移動する。したがって、画像情報における光強度の最も高い位置と反射光の光軸とをそのライン方向に一致させるだけで、標本に対して容易に焦点合わせすることができる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記反射光の光軸に対する前記撮像面の傾きが以下の式を満たすこととしてもよい。
｛（ｐ×ｔａｎθ）／β２｝＜｛（１．２×λ）／ＮＡ２｝
ここで、ｐ：撮像面を構成する受光素子の長さ（μｍ）
θ：反射光の光軸に対する撮像面の傾き（ｒａｄ）
β：装置全体の撮像倍率（倍）
ＮＡ：対物レンズの開口数
λ：光源の波長（μｍ）
【００１５】
検出部における反射光の光軸方向の分解能（（ｐ×ｔａｎθ）／β２（μｍ））を対物レンズの焦点深度（（１．２×λ）／ＮＡ２）よりも小さくすることで、対物レンズの焦点位置を精度よく調節することができる。
【００１６】
また、上記発明においては、前記合焦調節部が、以下の式により前記対物レンズと前記標本との相対移動量を設定することとしてもよい。
（ａ×ｐ×ｔａｎθ）／β２
ここで、ａ：撮像面に入射される反射光の光束の中心から撮像面における中心の画素までの画素数
【００１７】
カバーガラス付きの標本上での実際の焦点位置のずれ量は、撮像面上での反射光の光軸方向のピントずれ量（ａ×ｐ×ｔａｎθ）を装置全体の撮像倍率（β）の２乗で除算した値となる。したがって、このように構成することで、少ない調節回数により標本に対して焦点合わせすることができる。
【００１８】
また、上記発明においては、前記カバーガラス付きの標本に対する前記撮像面の傾きが一定の角度となるように、前記カバーガラス付きの標本の傾きを調節する傾き調節部を備えることとしてもよい。
【００１９】
検出部の撮像面に対するカバーガラス付きの標本の傾きが小さくなると、撮像面に入射される反射光の分布の変化が小さくなる。すなわち、画像情報における光強度の差が低減する。一方、撮像面に対するカバーガラス付きの標本の傾きが大きくなると、像面に入射される反射光の分布の変化が大きくなる。すなわち、画像情報における光強度の差が増大する。したがって、このように構成することで、傾き調節部の作動により、所望の反射光分布の画像情報を取得することができる。
【００２０】
本発明は、上記いずれかの自動合焦機構と、前記標本を載置し、前記光軸方向に移動可能なステージと、前記検出部により取得された前記画像情報に基づいて前記標本の画像を取得する画像取得部とを備える顕微鏡装置を提供する。
【００２１】
本発明によれば、精度よく焦点合わせされた状態で、標本の画像を取得することができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係る自動合焦機構によれば、標本に対して精度よく焦点合わせすることができるという効果を奏する。また、本発明に係る顕微鏡装置によれば、精度よく焦点合わせされた状態で標本の画像を取得することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】（ａ）は本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置の一部を示す図であり、（ｂ）は（ａ）含む顕微鏡装置をシリンドリカルレンズのパワーがある方向から見た図である。
【図２】（ａ）合焦時に反射光の光束におけるライン方向の中心が撮像面に入射される様子を示し、（ｂ）は反射光の光束におけるライン方向の一端側が撮像面に入射される様子を示し、（ｃ）は反射光の光束におけるライン方向の他端側が撮像面に入射される様子を示す図である。
【図３】合焦時の撮像面上の反射光分布を示す図である。
【図４】（ａ）はカバーガラスの手前側で照明光が集光する様子を示し、（ｂ）は（ａ）のときのカバーガラスから反射光が反射される様子を示している。
【図５】照明光の焦点位置がカバーガラスの手前にある場合の撮像面上の反射光分布を示す図である。
【図６】（ａ）対物レンズの焦点位置がカバーガラスよりも手前側にある場合に反射光の光束におけるライン方向の中心が撮像面に入射される様子を示し、（ｂ）は同じく反射光の光束におけるライン方向の一端側が撮像面に入射される様子を示し、（ｃ）は同じく反射光の光束におけるライン方向の他端側が撮像面に入射される様子を示す図である。
【図７】（ａ）はカバーガラスの奥行き側で照明光が集光する様子を示し、（ｂ）は（ａ）のときのカバーガラスから反射光が反射される様子を示している。
【図８】照明光の焦点位置がカバーガラスの奥行き側にある場合の撮像面上の反射光分布を示す図である。
【図９】（ａ）は対物レンズの焦点位置がカバーガラスよりも奥行き側にある場合に反射光の光束におけるライン方向の中心が撮像面に入射される様子を示し、（ｂ）は同じく反射光の光束におけるライン方向の一端側が撮像面に入射される様子を示し、（ｃ）は同じく反射光の光束におけるライン方向の他端側が撮像面に入射される様子を示す図である。
【図１０】本発明の一実施形態に係る自動合焦機構により標本に焦点合わせする工程を示すフローチャートである。
【図１１】反射光のライン方向に並んで配置される２つの受光素子により構成される撮像面を示す図である。
【図１２】（ａ）はカバーガラスの奥行き側で照明光を集光させる様子を示し、（ｂ）は（ａ）の場合の撮像面上の反射光分布を示す図である。
【図１３】（ａ）はカバーガラスの表面で照明光を集光させる様子を示し、（ｂ）は（ａ）の場合の撮像面上の反射光分布を示す図である。
【図１４】本発明の一実施形態の第１の変形例に係る顕微鏡装置のカバーガラスに対する撮像面の傾きが小さいときの撮像面上の反射光分布を示す図である。
【図１５】本発明の一実施形態の第１の変形例に係る顕微鏡装置のカバーガラスに対する撮像面の傾きが大きいときの撮像面上の反射光分布を示す図である。
【図１６】（ａ）は本発明の一実施形態の第２の変形例に係る顕微鏡装置の一部を示す図であり、（ｂ）は（ａ）を含む顕微鏡装置をシリンドリカルレンズのパワーがある方向から見た図である。
【図１７】図１６の顕微鏡装置による合焦時における撮像面上の反射光分布を示す図である。
【図１８】（ａ）は合焦時の反射光の光束におけるライン方向の中心が撮像面に入射される様子を示し、（ｂ）は同じく反射光の光束におけるライン方向の一端側が撮像面に入射される様子を示し、（ｃ）は同じく反射光の光束におけるライン方向の他端側撮像面に入射される様子を示す図である。
【図１９】（ａ）は対物レンズの焦点位置がカバーガラスよりも手前側にある場合に反射光の光束におけるライン方向の中心が撮像面に入射される様子を示し、（ｂ）は（ａ）のときの撮像面上の反射光分布を示す図である。
【図２０】（ａ）は対物レンズの焦点位置がカバーガラスよりも奥行き側にある場合に反射光の光束におけるライン方向の中心が撮像面に入射される様子を示し、（ｂ）は（ａ）のときの撮像面上の反射光分布を示す図である。
【図２１】反射光のライン方向に直交する方向に並んで配置される２つの受光素子により構成される撮像面を示す図である。
【図２２】（ａ）は照明光の光軸に対してカバーガラスが傾いている様子を示し、（ｂ）は（ａ）のときの撮像面上の反射光分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の一実施形態に係る自動合焦機構および顕微鏡装置について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１００は、図１（ａ），（ｂ）に示されるように、標本Ａを載置するステージ１と、照明光を発する光源３と、標本Ａの合焦調節を行う自動合焦機構１０と、標本Ａの画像を取得する観察光学系５０とを備えている。
図１（ａ）は、図１（ｂ）の一部をシリンドリカルレンズ２３のパワーがない方向から見た図である。
【００２５】
標本Ａは、ステージ１上に載置し、薄板状のカバーガラス５により覆うこととする。
ステージ１は、ステージ駆動部２により、照明光の光軸方向および照明光に直交する方向に移動可能となっている。
光源３は、例えば、水銀ランプ、ハロゲンランプ、タングステンランプ、レーザ光源、ＬＥＤ、または、ＬＤ等を用いることができる。
【００２６】
自動合焦機構１０は、光源３から発せられた照明光をライン状に集光する照明光学系１１と、ライン状に集光された照明光を標本Ａに照射し、カバーガラス５からの反射光を集光する対物レンズ１３と、対物レンズ１３により集光された反射光を撮影し画像情報を検出する検出部１５と、検出部１５により検出された画像情報に基づいて対物レンズ１３の焦点位置を調節する合焦調節部１７とを備えている。
【００２７】
照明光学系１１は、光源３から射出された照明光を略平行光にするコリメートレンズ２１と、略平行光となった照明光をライン状に集光するシリンドリカルレンズ（線状集光素子）２３と、シリンドリカルレンズ２３の集光位置に配置されたスリット２５と、スリット２５と標本Ａ面が共役関係になるように、スリット２５を通過した照明光を対物レンズ１３の入射瞳位置に平行に投影するリレーレンズ２７と、所定の波長帯域の光のみを透過させる励起フィルタ２９と、励起フィルタ２９を通過した照明光および対物レンズ１３により集光された反射光を反射するダイクロイックミラー３１とを備えている。
【００２８】
スリット２５は、標本Ａおよびカバーガラス５から戻る戻り光に対しては、カバーガラス５からの反射光のみ通過させるようになっている。これにより、回折光等による測定に不要な光の影響を低減し、対物レンズ１３の焦点位置を精度よく調節することができる。
【００２９】
検出部１５は、光源３から発せられコリメートレンズ２１を通過した照明光を反射する一方、カバーガラス５からダイクロイックミラー３１を介して光路を逆方向に戻る反射光を透過させるビームスプリッタ３３と、ビームスプリッタ３３を透過した反射光を集光するシリンドリカルレンズ３５と、シリンドリカルレンズ３５により集光された反射光を撮影することにより画像情報を検出するＣＣＤカメラやＣＭＯＳカメラ等のような光検出器３７とを備えている。
【００３０】
光検出器３７は標本Ａと共役な位置に配置されている。この光検出器３７は、複数（３以上）の受光素子からなる撮像面３６（図３参照）を備えており、検出した画像情報に基づいて２次元的な反射光画像を取得するようになっている。撮像面３６には、標本Ａ上にライン状に集光される照明光に対応して、略ライン状の反射光が入射されることとなる。この撮像面３６は、反射光の光軸に対してその光束の短軸回りに傾斜して配置されている。
【００３１】
例えば、反射光の光軸に対する撮像面３６の傾きは、以下の式（１）を満たすようになっている。
｛（ｐ×ｔａｎθ）／β２｝＜｛（１．２×λ）／ＮＡ２｝・・・（１）
好ましくは、｛（ｐ×ｔａｎθ）／β２｝＜｛（１．２×λ）／ＮＡ２／５｝
ここで、ｐ：撮像面３６を構成する受光素子の長さ（μｍ）
θ：反射光の光軸に対する撮像面３６の傾き（ｒａｄ）
β：自動合焦機構１０全体の撮像倍率（倍）
ＮＡ：対物レンズ１３の開口数
λ：光源３の波長（μｍ）
撮像面３６の傾きが上記式（１）を満たすことで、すなわち、光検出部１５における反射光の光軸方向の分解能｛（ｐ×ｔａｎθ）／β２｝を対物レンズ１３の焦点深度｛（１．２×λ）／ＮＡ２｝よりも小さくすることで、対物レンズ１３の焦点位置を精度よく調節することができる。
【００３２】
合焦調節部１７は、対物レンズ１３を光軸方向に移動させるピエゾアクチュエータ４１と、光検出器３７により取得された反射光画像に基づいて、対物レンズ１３の焦点位置が標本Ａに一致しているか否かを判別する合焦判別部４３と、合焦判別部４３により一致していないと判別された場合に、ピエゾアクチュエータ４１を駆動制御して対物レンズ１３の光軸方向の位置を調節するピエゾ駆動部４５とを備えている。
【００３３】
合焦判別部４３は、画像情報における光強度の最も高い位置が反射光の光軸上にある場合、例えば、反射光画像において反射光の集光点がその光軸上にある場合は、対物レンズ１３の焦点位置が標本Ａに一致していると判別し、画像情報における光強度の最も高い位置が反射光の光軸からずれている場合、例えば、反射光画像において反射光の集光点がその光軸からずれている場合は、対物レンズ１３の焦点位置が標本Ａに一致していないと判別するようになっている。
【００３４】
ピエゾ駆動部４５は、例えば、以下の式（２）により、対物レンズ１３の光軸方向の移動量Ｌを設定するようになっている。
Ｌ＝（ａ×ｐ×ｔａｎθ）／β２・・・（２）
ここで、ａ：撮像面３６に入射される反射光の光束の中心（すなわち、反射光画像における反射光の集光位置）から撮像面３６における中心の受光素子までの画素数
標本位置での実際のピントずれ量は、撮像面３６上での光軸方向のピントずれ量（ａ×ｐ×ｔａｎθ）を自動合焦機構１０全体の撮像倍率（β）の２乗で除算した値となる。したがって、対物レンズ１３の光軸方向の移動量Ｌを上記式（２）により設定することで、少ない調節回数で標本Ａに対して焦点合わせすることができる。
【００３５】
観察光学系５０は、対物レンズ１３およびダイクロイックミラー３１を自動合焦機構１０と共用するようになっている。対物レンズ１３は、照明光が標本Ａに照射されて蛍光物質が励起されることにより発生する蛍光を集光するようになっている。また、ダイクロイックミラー３１は、対物レンズ１３により集光された蛍光を透過させるようになっている。
【００３６】
また、観察光学系５０は、ダイクロイックミラー３１を透過した蛍光を集光して結像させる結像レンズ５１と、結像レンズ５１により結像された蛍光を撮影し、標本Ａの蛍光画像を取得するＣＣＤ等の撮像装置（画像取得部）５３と、撮像装置５３による画像取得を制御する画像取得制御部（図示略）とを備えている。
【００３７】
撮像装置５３においては、標本Ａ上にライン状に集光される照明光に対応した略ライン状の蛍光画像が取得される。
画像取得制御部は、ステージ駆動部２を作動させ、照明光のライン方向に直交する方向にステージ１を移動させるようになっている。これにより、標本Ａ上において照明光が２次元的に走査される。撮像装置５３は、２次元的に走査された照明光の各集光位置において取得したライン状の蛍光画像をステージ１の位置と対応づけて蓄積するようになっている。これにより、標本Ａの２次元的な蛍光画像が取得される。
【００３８】
次に、このように構成された自動合焦機構１０および顕微鏡装置１００の作用について以下に説明する。
まず、対物レンズ１３の焦点合わせについて説明する。
ステージ１に標本Ａを載置し、カバーガラス５により標本Ａを覆い、光源３から照明光を発生させる。
【００３９】
光源３から発せられた照明光は、コリメートレンズ２１により略平行光にされビームスプリッタ３３により反射された後、シリンドリカルレンズ２３によりライン状に集光される。ライン状に集光された照明光は、スリット２５を通過しリレーレンズ２７、励起フィルタ２９、および、ダイクロイックミラー３１を介して対物レンズ１３の入射瞳位置に平行にリレーされ、対物レンズ１３により標本Ａに照射される。
【００４０】
カバーガラス５において反射された反射光は、対物レンズ１３により集光されダイクロイックミラー３１により反射された後、励起フィルタ２９、リレーレンズ２７、スリット２５、シリンドリカルレンズ２３を介してビームスプリッタ３３を透過し、シリンドリカルレンズ３５により集光されて光検出器３７により撮影される。
【００４１】
この場合において、略ライン状に集光される反射光の光軸に対して撮像面３６がその光束の短軸回りに傾斜して配置されているので、撮像面３６に入射される反射光の光路長が光束のライン方向に沿って異なることとなる。すなわち、撮像面３６上の反射光分布が撮像面３６の傾きに沿って変化することとなる。
【００４２】
例えば、対物レンズ１３の焦点位置がカバーガラス５上にある場合は、図２（ａ）に示されるように、反射光の光束におけるライン方向の中心Ｃでは、集光位置が撮像面３６に一致する。これに対し、図２（ｂ）に示されるように、反射光の光束におけるライン方向の一端Ｌ側では、集光位置よりも手前側が撮像面３６に入射される。また、図２（ｃ）に示されるように、反射光の光束におけるライン方向の他端Ｒ側では、集光位置よりも奥行き側が撮像面３６に入射される。
【００４３】
したがって、図３に示すように、撮像面３６上の反射光分布は、ライン方向の略中央付近で最も絞られ、中方付近からライン方向に沿って両側に離れるに従い次第に広がる形状となる。すなわち、反射光画像においては反射光の光軸上で光強度が最も高くなり、光軸から離れるに従い光強度は次第に低くなる。図３において、ハッチング部分が反射光の分布を示している。以下、図５、図８、図１２（ｂ）、図１３（ｂ）、図１４、図１５、図１７、図１９（ｂ）、図２０（ｂ）および図２２（ｂ）において同様である。また、図３において、符合Ｃは図２（ａ）の符号Ｃに対応する位置を示し、符合Ｌは図２（ｂ）の符号Ｌに対応する位置を示し、符合Ｒは図２（ｃ）の符号Ｒに対応する位置を示している。
【００４４】
一方、対物レンズ１３の焦点位置が光軸方向に変動すると、撮像面３６上の反射光分布の最も絞られた位置が反射光の光束のライン方向に沿って変化する。
例えば、図４（ａ）に示すように、対物レンズ１３の焦点位置がカバーガラス５よりも手前側にある場合は、図５に示すように、撮像面３６上の反射光分布は、反射光の光軸からライン方向に若干ずれた位置（図５においては符合Ｌ側。）で最も絞られた形状となる。図４（ｂ）はカバーガラス５から反射される反射光の光束を示している。
【００４５】
例えば、図６（ａ）に示されるように、反射光の光束におけるライン方向の中心Ｃでは、集光位置よりも若干奥行き側が撮像面３６に入射される。したがって、若干広がりのある反射光分布となる。図６（ｂ）に示されるように、反射光の光束におけるライン方向の一端Ｌ側では、集光位置よりも若干手前側が撮像面３６に入射される。したがって、若干広がりのある反射光分布となる。図６（ｃ）に示されるように、反射光の光束におけるライン方向の他端Ｒ側では、集光位置よりもさらに奥行き側が撮像面３６に入射される。したがって、さらに広がりのある反射光分布となる。図５において、符合Ｃは図６（ａ）の符号Ｃに対応する位置を示し、符合Ｌは図６（ｂ）の符号Ｌに対応する位置を示し、符合Ｒは図６（ｃ）の符号Ｒに対応する位置を示している。
【００４６】
また、図７（ａ）に示すように、対物レンズ１３の焦点位置がカバーガラス５よりも奥行き側にある場合は、図８に示すように、撮像面３６上の反射光分布は、対物レンズ１３の焦点位置がカバーガラス５よりも手前側にある場合とは逆方向にずれた位置（図８においては符合Ｒ側。）で最も絞られた形状となる。図７（ｂ）はカバーガラス５から反射される反射光の光束を示している。
【００４７】
例えば、図９（ａ）に示されるように、反射光の光束におけるライン方向の中心Ｃでは、集光位置よりも若干手前側が撮像面３６に入射される。したがって、若干広がりのある反射光分布となる。図９（ｂ）に示されるように、反射光の光束におけるライン方向の一端Ｌ側では、集光位置よりもさらに手前側が撮像面３６に入射される。したがって、さらに広がりのある反射光分布となる。図９（ｃ）に示されるように、反射光の光束におけるライン方向の他端Ｒ側では、集光位置よりも若干奥行き側が撮像面３６に入射される。したがって、若干広がりのある反射光分布となる。図８において、符合Ｃは図９（ａ）の符号Ｃに対応する位置を示し、符合Ｌは図９（ｂ）の符号Ｌに対応する位置を示し、符合Ｒは図９（ｃ）の符号Ｒに対応する位置を示している。
【００４８】
このように、対物レンズ１３の焦点位置のずれ量に応じて、撮像面３６における反射光分布の最も絞られた位置、すなわち、反射光画像における光強度の最も高い位置が反射光の光束のライン方向に変化する。
【００４９】
自動合焦機構１０においては、図１０のフローチャートに示す手順で合焦調節が行われる。
まず、検出部１５により、カバーガラス５からの反射光に基づいて反射光画像が取得されると（ステップＳ１）、合焦判別部４３により、その反射光画像における反射光の集光点（光強度が最も高い点）の位置が検出される（ステップＳ２）。
【００５０】
合焦判別部４３により、反射光画像において反射光の集光点が光軸よりも左側にあると判断されると（ステップＳ３「ＹＥＳ」）、ピエゾ駆動部４５により、例えば、対物レンズ１３をステージ１に近接させる方向に移動させるようにピエゾアクチュエータ４１が制御される。これにより、反射光画像における反射光の集光点が光軸に近接させられる。
【００５１】
続いて、ステップＳ１〜Ｓ３が繰り返され、合焦判別部４３により、反射光の集光点が光軸よりも左側ではなく右側にあると判断されると（ステップＳ４「ＹＥＳ」）、ピエゾ駆動部４５により、例えば、対物レンズ１３をステージ１から遠ざける方向に移動させるようにピエゾアクチュエータ４１が制御される。これにより、反射光画像における反射光の集光点が光軸に近接させられる。
【００５２】
ステップＳ１〜Ｓ４が繰り返され、合焦判別部４３により、反射光画像における反射光の集光点が光軸よりも左側にも右側にも無いと判断されると（ステップＳ４「ＮＯ」）、対物レンズ１３の焦点位置が標本Ａに一致していることとなり合焦調節が終了する。
【００５３】
次に、標本Ａの蛍光画像を取得する場合について説明する。
自動合焦機構１０により対物レンズ１３の焦点位置が標本Ａに一致させられた状態で、ステージ駆動部２の作動により、照明光のライン方向に直交する方向にステージ１が移動させられ、標本Ａ上において照明光が２次元的に走査される。
【００５４】
撮像装置５３により、２次元的に走査された照明光の各集光位置においてライン状の蛍光画像が取得され、取得された蛍光画像とステージ１の位置とが対応づけて蓄積される。これにより、標本Ａの２次元的な蛍光画像が取得される。
【００５５】
以上説明したように、本実施形態に係る自動合焦機構１０および顕微鏡装置１００によれば、ライン状に集光される反射光の光軸に対して光検出器３７の撮像面３６を傾斜して配置し、合焦調節部１７により、反射光画像における反射光の集光点の位置が反射光の光軸上に一致するように対物レンズ１３の光軸方向の位置を調節することで、標本Ａに対して精度よく焦点合わせすることができる。また、精度よく焦点合わせされた状態で、標本Ａの画像を取得することができる。
【００５６】
本実施形態においては、通常光観察（明視野、暗視野等）を行うこととしてもよい。この場合は、ビームスプリッタ３３に代えて、ハーフミラーを用いることとすればよい。
また、本実施形態においては、例えば、標本Ａのラマン散乱光観察をすることとしてもよい。この場合は、レーザ波長だけを効率良く透過しその他の波長を透過させないレーザラインフィルタ（図示略）を光源３とビームスプリッタ３３との間に配置するとよい。レーザ光は完全な単色光ではなく、レーザ光には発振波長以外に微弱なノイズが含まれる。そのため、ラマン測定を行う場合において微弱なラマン散乱光を効率良く検出するには、レーザ光の迷光を除去することが効果的である。レーザラインフィルタを用いることにより、レーザの純色性を高め、Ｓ／Ｎの高いラマン散乱光を得ることができる。
【００５７】
本実施形態において、照明光としてレーザ光を用いる場合は、レーザ光および反射光の光路に偏光ビームスプリッタとλ／４波長板を配置することが好ましい。
この場合、ビームスプリッタ３３に代えて偏光ビームスプリッタを配置し、偏光ビームスプリッタ３３と対物レンズ１３との間、例えば、リレーレンズ２７とダイクロイックミラー３１との間にλ／４波長板を配置することとすればよい。
【００５８】
偏光ビームスプリッタにより反射されたレーザ光は直線偏光になるが、１／４波長板を通過すると、対物レンズ１３により円偏光になって標本Ａに焦点を結ぶこととなる。このレーザ光がカバーガラス５において反射されると、その反射光は円偏光の回転方向が反転し、１／４波長板を通過すると入射レーザ光に対して垂直の偏光面を持つことになる。
標本Ａに円偏光のレーザ光を照射することで、標本Ａの偏光特性を抑えて観察することができる。したがって、光検出器３７により検出される検出信号（画像情報）にノイズ成分を排除した高Ｓ／Ｎの信号を得ることができ、対物レンズ１３の焦点位置を精度よく調節することができる。
【００５９】
また、本実施形態においては、撮像面３６が３以上の受光素子により構成されていることとしたが、例えば、図１１に示すように、反射光の光束のライン方向に並べて配置される２つの受光素子Ｓ１，Ｓ２により撮像面３６が構成されることとしてもよい。この場合、合焦調節部１７は、受光素子Ｓ１，Ｓ２の明るさが明るくなるように対物レンズ１３の焦点位置を制御することとしてもよいし、あるいは、受光素子Ａ１の明るさと受光素子Ａ２の明るさが等しくなるように対物レンズ１３の焦点位置を制御することとしてもよい。
【００６０】
また、本実施形態においては、合焦調節部１７が、検出部１５により検出された画像情報における光強度の最も高い位置が光軸上から所定の距離だけ離れるように、すなわち、反射光画像において反射光の集光点がその光軸上から所定の距離だけ離れるように、ピエゾアクチュエータ４１を駆動制御して対物レンズ１３の光軸方向の位置を調節することとしてもよい。
このようにすることで、合焦調節部１７により、標本Ａの深部等、カバーガラス５から光軸方向に離れた位置にある標本Ａの部位に対物レンズ１３の焦点位置を合わせることができる。
【００６１】
例えば、標本Ａ（例えば、細胞）と培養液とからなる観察体（図示略）をスライドガラス（図示略）とカバーガラス５との間に封入し、図１２（ａ），（ｂ）に示すように、標本Ａの内部を深部観察する場合を例示して説明する。観察したい位置とカバーガラス５との距離をオフセットｄ（μｍ）として定義する。この値は観察者が決定する。図１３（ａ），（ｂ）はオフセットｄを設定しない場合の対物レンズ１３の焦点位置を示している。
【００６２】
図１２（ｂ）において、撮像面３６における中心の受光素子をＯ点、撮像面３６における反射光の集光位置をＸ点とし、観察体の屈折率をnとすると、撮像面３６における反射光の集光位置Ｘ点から中心の受光素子Ｏ点までの画素数ａが以下の式（３）を満たすように、対物レンズ１３の光軸方向の位置を調節する。
ａ＝β２×（ｄ／ｎ）／（ｐ×ｔａｎθ）・・・（３）
合焦調節部１７により、撮像面３６における中心の受光素子Ｏ点と反射光の焦点位置Ｘ点とがずれるように対物レンズ１２の位置を調節することにより、対物レンズ１３のピント位置をカバーガラス５の反射位置から離すことができる。したがって、生体試料の深部観察のように、観察したい位置がカバーガラス５から離れている場合でも、標本Ａの画像取得と合焦調節とを同時に行うことができる。
【００６３】
図１２（ａ），（ｂ）においては、カバーガラス５の観察体側の面を基準にオフセットを求めることとしたが、カバーガラス５の厚さ（ｔ）および屈折率（ｎ＿ｇｌａｓｓ）が分かっている場合は、カバーガラス５の対物レンズ１３側の面をオフセットの基準位置としてもよい。
この場合、以下の式（４）を満たすように、対物レンズ１３の光軸方向の位置を調節することとすればよい。
ａ＝β２×（ｄ／ｎ＋ｔ／ｎ＿ｇｌａｓｓ）／（ｐ×ｔａｎθ）・・・（４）
カバーガラス５と空気との界面は、カバーガラス５と観察体との界面と比較して反射率が高いので、カバーガラス５の対物レンズ１３側の面をオフセットの基準位置とすることで、撮像面３６上の反射光分布のコントラストを高くし、対物レンズ１３の焦点位置を精度よく調節できる。
【００６４】
本実施形態は、以下のように変形することができる。
例えば、第１の変形例としては、標本Ａ上のカバーガラス５に対する撮像面３６の傾きが一定の角度となるように、ステージ駆動部（傾き調節部）２が標本Ａおよびカバーガラス５の傾きを調節することとしてもよい。この場合、ステージ１の傾きを調節することとすればよい。
【００６５】
撮像面３６に対するカバーガラス５の傾きが小さくなると、図１４に示すように、撮像面３６上の反射光分布の変化が低減し、反射光の光束における中央付近からライン方向に離れても広がりが小さくなる。すなわち、反射光画像における光強度の差が低減する。一方、撮像面３６に対するカバーガラス５の傾きが大きくなると、図１５に示すように、撮像面３６上の反射光分布の変化が増大し、反射光の光束における中央付近からライン方向に離れる従い広がりがさらに大きくなる。すなわち、反射光画像における光強度の差が増大する。
【００６６】
したがって、ステージ駆動部２の作動により、カバーガラス５に対する撮像面３６の傾きが一定の角度となるようにステージ１の傾きを調節することで、所望の反射光分布、例えば、撮像面３６の傾きで決まる反射光分布の画像情報を取得することができる。ステージ１の傾きは、例えば、標本Ａを交換する度に調節することとしてもよいし、あるいは、メンテナンス時に調節することとしてもよい。
【００６７】
また、第２の変形例としては、例えば、図１６（ａ），（ｂ）に示すように、シリンドリカルレンズ３５と光検出器３７との間の光軸上に、反射光の光束におけるライン方向の半分を遮断するナイフエッジ５５を配置することとしてもよい。図１６（ａ）は図１６（ｂ）の一部をシリンドリカルレンズ２３のパワーがない方向から見た図である。
【００６８】
このようにした場合、図１７に示すように、撮像面３６上の反射光分布は、ライン方向の一端Ｌ側の広がりと他端Ｒ側の広がりが、ライン方向に直交する方向に沿って互いに逆方向となる。図１８（ａ）は合焦時に反射光の光束におけるライン方向の中心位置が撮像面３６に入射される様子を示し、図１８（ｂ）は同じくライン方向の一端Ｌ側が撮像面３６に入射される様子を示し、図１８（ｃ）は同じくライン方向の一端Ｒ側が撮像面３６に入射される様子を示している。また、図１９（ａ）は、対物レンズ１３の焦点位置がカバーガラス５よりも手前側にある場合の撮像面３６に入射される反射光の光束を示し、図１９（ｂ）はそのときの撮像面３６上の反射光分布を示している。また、図２０（ａ）は、対物レンズ１３の焦点位置がカバーガラス５よりも奥行き側にある場合の撮像面３６に入射される反射光の光束を示し、図２０（ｂ）はそのときの撮像面３６上の反射光分布を示している。
【００６９】
このように、撮像面３６上の反射光分布は、反射光の光束のライン方向に直交する方向に沿ってライン方向の一端Ｌ側と他方Ｒ側とで逆方向に広がることで、例えば、図２１に示す撮像面３６のように、反射光のライン方向に直交する方向に２つの受光素子Ｓ１，Ｓ２を並べて配置しても、対物レンズ１３の焦点位置を調節することができる。
【００７０】
本変形例においては、図２２（ａ）に示すように照明光の光軸に対してカバーガラス５が傾いている場合は、例えば、図２２（ｂ）に示すように、撮像面３６の反射光分布は、反射光の光束におけるライン方向に沿って平行に延びる形状となる。この場合も、変形例１に示すように、ステージ駆動部２により、ステージ１の傾きを調節することとしてもよい。
【００７１】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の一実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。また、例えば、上記実施形態においては、対物レンズ１３を光軸方向に移動させることとしたが、対物レンズ１３と標本Ａとを相対移動させることとすればよく、例えば、ステージ１を光軸方向に移動させることにより標本Ａの位置を調節することとしてもよい。
【符号の説明】
【００７２】
１    ステージ
２    ステージ駆動部（傾き調節部）
５    カバーガラス
１０    自動合焦機構
１１    照明光学系
１３    対物レンズ
１５    検出部
１７    合焦調節部
３６    撮像面
５３    撮像装置（画像取得部）
１００    顕微鏡装置
Ａ    標本
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2012141452.tif 000020
【図１９】
2012141452.tif 000021
【図２０】
2012141452.tif 000022
【図２１】
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【図２２】
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