(57)【要約】【課題】血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤を提供する。【解決手段】ポリグルタミン酸のカルシウム塩を有効成分として含有する血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリグルタミン酸のカルシウム塩を有効成分として含有する血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリグリセリドは中性脂質の一種で、血液中に含まれる中性脂質のほとんどはトリグリセリドである。血液中において、トリグリセリド濃度の高い状態が継続すると高脂血症を引き起こすことが知られている。高脂血症は、動脈硬化症の原因であると考えられており、心疾患や脳血管障害等の疾患を引き起こす最初の引き金となる。
一般に、血中トリグリセリド濃度の変化は、食事の影響を強く受けており、薬物のみで完全にコントロールすることは困難であると言われている。そのため、薬物療法以上に食事として摂取する脂質の質が注目され、例えば、リノール酸、リノレン酸を中心とする高度不飽和脂肪酸を摂取することで、血中トリグリセリド濃度を低下させることが推奨されている。しかし、高度不飽和脂肪酸の摂りすぎは生体内で過酸化脂肪酸の生成を招き、種々の成人病を誘発する可能性が指摘されている。
このような事情から、安全性が高く、日常的に投与あるいは摂取しても副作用が生じない方法で、血中のトリグリセリド濃度上昇を抑制することが望まれている。近年、安全かつ有効に血中トリグリセリドの濃度上昇を抑える物質として、脂質の吸収を抑えるキタンサンガム及びアルギン酸プロピレングリコールエステル（特許文献１参照）、キトサン（特許文献２参照）、加工澱粉（特許文献３参照）が報告されている。
【０００３】
一方、ポリグルタミン酸は、その保水力の高さから保湿剤、吸収剤等として広く使用されており、生分解性ポリマーとして注目されている。また、小腸からのカルシウム吸収促進作用や血圧上昇抑制作用があることが報告されている（特許文献４、５参照）。更に、ポリグルタミン酸に中性脂質の吸収を抑制する効果があり、高中性脂肪血症の治療、改善、発症の抑制に使用できることが報告されている（特許文献６参照）。
【０００４】
しかし、ポリグルタミン酸の特定の塩に関する血中トリグリセリド濃度上昇抑制作用についてはこれまで報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−１８６３５６号公報
【特許文献２】特開平３−２９０１７０号公報
【特許文献３】特開２００４−２６９４５８号公報
【特許文献４】特開平５−９５７６７号公報
【特許文献５】特開２００８−２５５０６３号公報
【特許文献６】特開２００９−１７３６３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、医薬又は食品用途として有用な血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤を提供することを課題とする。具体的には、本発明は、血中のトリグリセリド濃度が上昇することを抑制し、高脂血症や動脈硬化症の予防・改善のための医薬又は食品用途として有用な血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、ポリグルタミン酸の塩に食後の血中トリグリセリド濃度上昇を抑制する効果があることを見い出した。さらに、該ポリグルタミン酸の塩の中でも、カルシウム塩に特に優れた血中トリグリセリド上昇を抑制する効果があることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００８】
本発明は、ポリグルタミン酸のカルシウム塩を有効成分として含有する血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤によれば、血中のトリグリセリド濃度の上昇、特に食後における血中トリグリセリド濃度の上昇を減少させることができる。さらに、本発明の血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤は、血中脂質濃度を正常な範囲に調節し、高脂血症の発症リスクの低下・予防・改善・緩和・処置、さらには動脈硬化症の発症リスクの低下・予防・改善・緩和・処置に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤は、ポリグルタミン酸のカルシウム塩を有効成分として含有する。ポリグルタミン酸は、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基とα位のアミノ基がペプチド結合したもので、その構造式は(-NH-CH(COOH)-CH2-CH2-CO-)nで表されるが、本発明に用いられるポリグルタミン酸のカルシウム塩は、前記構造式におけるカルボキシル基の水素原子の５０％以上がカルシウムに置換されたものである。本発明に用いられるポリグルタミン酸のカルシウム塩は、前記構造式においてカルボキシル基の水素原子の６０％がカルシウムに置換されたものであることが好ましく、さらに上記カルボキシル基の水素原子の７０％以上、さらに８０％以上、さらに９０％以上、さらに９５％以上、殊更９９％以上がカルシウムに置換されたものであることが好ましいが、実質的にすべてのカルボキシル基がカルシウムに置換されたものであることが特に好ましい。また、前記構造式において末端に位置することになるカルボキシル基も、カルシウムで置換されたものであることが好ましい。
ポリグルタミン酸のカルシウム塩は、ポリグルタミン酸や他のポリグルタミン酸の塩に比べて血中のトリグリセリド濃度の上昇を顕著に抑制する作用を有する。従って、当該ポリグルタミン酸のカルシウム塩は、血中のトリグリセリド濃度上昇抑制剤として使用することができ、また、当該トリグリセリド濃度上昇抑制剤を製造するために使用することができる。ポリグルタミン酸のカルシウム塩が血液中におけるトリグリセリド濃度の上昇を抑制する作用があることは今まで知られていなかった。また、ポリグルタミン酸のカルシウム塩に高脂血症や動脈硬化症の予防・改善効果があることも知られていない。ポリグルタミン酸のカルシウム塩は、後述の実施例で示すように、血中トリグリセリド濃度の上昇、特に食後（通常の糖質・脂質・蛋白質等を含む食品、飲料などを摂取した後）の血中トリグリセリド濃度の上昇を効率的に抑制しうる。
【００１１】
ポリグルタミン酸のカルシウム塩は、その分子量に関わらず全般的に血中トリグリセリド濃度上昇抑制効果を有しうる。
本発明において用いられるポリグルタミン酸のカルシウム塩は、重量平均分子量が約５００以上であることが好ましく、１，０００以上であることがより好ましく、２,０００以上であることがさらに好ましく、４,０００以上であることがさらに好ましく、６，０００以上であることがさらに好ましく、８，０００以上であることが特に好ましい。
使用されるポリグルタミン酸のカルシウム塩の重量平均分子量の上限は約５，０００，０００であるのが好ましいが、製造面、及び本発明の血中インスリン濃度上昇抑制剤を経口用液体製剤としたときの喉ごし、ぬるつき、嚥下のしやすさなどの観点から、その粘度が比較的低い方が好ましく、使用されるポリグルタミン酸のカルシウム塩の重量平均分子量は１，０００,０００以下であることがより好ましく、５００,０００以下であることがさらに好ましく、１００，０００以下であることがさらに好ましく、５０，０００以下であることが特に好ましく、３０，０００以下であることが殊更好ましい。
より具体的には、本発明に用いるポリグルタミン酸のカルシウム塩の重量平均分子量は５００〜５，０００，０００であることが好ましく、１，０００〜１，０００,０００であることがより好ましく、２，０００〜５００,０００であることがさらに好ましく、４，０００〜１００,０００であることがさらに好ましく、６，０００〜５０,０００であることが特に好ましく、８，０００〜３０,０００、さらに８，０００〜２０，０００であることが殊更好ましい。
重量平均分子量の測定は、例えば、ゲルろ過カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより行うことができる。
【００１２】
本発明に用いられるポリグルタミン酸のカルシウム塩は、化学的合成や微生物によって生産したポリグルタミン酸又はその塩、あるいは市販されているポリグルタミン酸又はその塩を、後述する実施例に記載されているように水酸化カルシウム水溶液を用いて中和することで得ることができる。また、カルシウムを含有する混合培地で培養した微生物によって生産することもできる。ポリグルタミン酸のカルシウム塩を構成するグルタミン酸の光学活性はＤ体でもＬ体でもよく、それらの混合物でもよい。天然のポリグルタミン酸は、グルタミン酸がγ位で結合した重合体であり、野生型でポリグルタミン酸を生産する微生物としては、例えば、納豆菌を含む一部のバチルス（Bacillus）属細菌とその近縁種（Bacillus subtilis  var．chungkookjang、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、Bacillus halodurans）や、Natrialba aegyptiaca、Hydra等を挙げることができる［Ashiuchi，M.，et  al.:Appl．Microbiol．Biotechnol.，59，pp.9-14(2002)］。また、遺伝子組換え技術を用いたポリグルタミン酸の生産例としては、プラスミドにて遺伝子導入された組換え枯草菌（Bacillus subtilis  ISW1214株）において約9g/L/5日［Ashiuchi，M.，et  al.:Biosci．Biotechnol．Biochem.，70，pp.1794-1797(2006)］、プラスミドにて遺伝子導入された組換え大腸菌において約4g/L/1.5日[Jiang，H.，et  al.:Biotechnol．Lett.，28，pp.1241-1246(2006)]の生産性が得られることが知られている。或いは、ポリグルタミン酸は、食品添加物、化粧品素材及び増粘剤等として商業的に生産されており、国内及び海外のポリグルタミン酸メーカーが供給するポリグルタミン酸を購入することもできる（例えば、国内メーカー：日本ポリグル、一丸ファルコス、明治フードマテリア等、海外メーカー：バイオリーダース等）。
【００１３】
本発明に用いられるポリグルタミン酸のカルシウム塩は、糖質、脂質及び／又は蛋白質を摂取した後の血中トリグリセリド濃度の上昇を抑制することができる。しかもその抑制効果は、ポリグルタミン酸や他のポリグルタミン酸塩と比較して顕著に優れている。
【００１４】
本発明の血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤は、前記ポリグルタミン酸のカルシウム塩そのものであってもよい。また、本発明の血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤は、ポリグルタミン酸のカルシウム塩の他に、例えば酸化チタン、炭酸カルシウム、蒸留水、乳糖、デンプン等の適当な液体または固体の賦形剤または増量剤を含んでもよい。この場合、ポリグルタミン酸のカルシウム塩の配合量は特に制限されないが、血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤中０．０１〜１００質量％含まれるのが好ましく、０．１〜９５質量％含まれるのがより好ましく、１〜９０質量％含まれるのが更に好ましく、１０〜８５質量％含まれるのがより更に好ましい。
【００１５】
本発明の血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤を食品や医薬品等の用途に用いる場合、ポリグルタミン酸を単体でヒト及び動物に、消化管内投与、腹腔内投与、血管内投与、皮内投与、皮下投与等により投与できる他、各種食品、医薬品、ペットフード等に配合して摂取することができる。食品としては、一般食品のほか、血中のトリグリセリド濃度の上昇抑制、高脂血症や動脈硬化症の発症リスクの低下・予防・改善・緩和・処置をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した美容食品、病者用食品、特定保健用食品等の食品に応用できる。医薬品として使用する場合は、例えば、錠剤、顆粒剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤とすることができる。
【００１６】
なお、経口用固形製剤を調製する場合には、ポリグルタミン酸のカルシウム塩に、賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。また、経口用液体製剤を調製する場合は、矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯味剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。
【００１７】
上記各食品や製剤中のポリグルタミン酸のカルシウム塩の配合量は特に制限されないが、０．０１〜１００質量％含まれるのが好ましく、０．０３〜９０質量％含まれるのがより好ましく、０．１〜８０質量％含まれるのがさらに好ましく、０．３〜７０質量％含まれるのが特に好ましく、１〜６０質量％含まれるのが殊更好ましい。
上記各食品や製剤中の有効投与（摂取）量は、ポリグルタミン酸のカルシウム塩として、１日当たり０．０１ｇ／ｋｇ体重〜１．０ｇ／ｋｇ体重とするのが好ましく、０．００３ｇ／ｋｇ体重〜０．５ｇ／ｋｇ体重とするのがより好ましく、０．０１ｇ／ｋｇ体重〜０．２ｇ／ｋｇ体重とするのがさらに好ましい。また、本発明の血中トリグリセリド濃度上昇抑制剤は、食前・食中・食後に用いると効果的であり、特に食前又は食中に用いることが好ましく、食前１時間から食中に用いることがより好ましい。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１９】
〔分析方法〕
ポリグルタミン酸のカルシウム塩の定量法及び重量平均分子量測定法：
ポリグルタミン酸のカルシウム塩の重量平均分子量測定は、Ｄ−６０００（日立ハイテクノロジーズ社製）ＨＰＬＣシステムを用いてゲルろ過法にて実施した。分析条件は、分析カラムにＴＳＫＧｅｌ  Ｇ３０００ＰＷＸＬゲルろ過カラム（商品名、東ソー社製）を用い、溶離液に０．１Ｍ硫酸ナトリウムを使用し、流速０．８ｍＬ／分、カラム温度５０℃とし、ＵＶ検出波長を２１０ｎｍとした。重量平均分子量は、プルラン（商品名：Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２、昭和電工社製）を用いて予め重量平均分子量を求めたポリグルタミン酸（明治フードマテリア社製、分子量９ｋ）、ポリーヒドロキシプロリン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、分子量４ｋ）を標準品として用い測定した。
【００２０】
〔調製例〕ポリグルタミン酸カルシウム塩の調製
重量平均分子量９，０００のポリグルタミン酸のナトリウム塩（明治フードマテリア社製）を初発材料として、２０％（ｗ／ｗ）水溶液を１２５ｍＬ作製し、氷冷下にて塩酸を用いてｐＨ２以下に調整した。続いて、生成した酸沈殿物を８，０００ｒｐｍ、５分の遠心分離（商品名：ｈｉｍａｃＣＲ２１ＧＩＩＩ、日立工機社製）にて回収し、得られた沈殿物を同量の蒸留水を用いて洗浄し、再度遠心分離に供した。この洗浄操作を２回繰り返し行なった後、得られた沈殿物を３００ｍLの蒸留水に懸濁し、これをｐＨ７以上となるように水酸化カルシウムを用いてそれぞれ中和した。この上記酸処理および水酸化カルシウムによる中和処理を再度実施し、得られた中和試料に対して２．５倍量のエタノールを添加し、氷冷下にて一晩放置した。このエタノール添加により生成した沈殿物を１４，０００ｒｐｍ、５分の遠心分離（同上）にて回収し、回収試料を減圧乾燥に供して、カルシウム塩として１９．０ｇの固形物を得た。また、この試料の重量平均分子量は前述の分析方法により、１１,０００と算出された。
【００２１】
〔試験例〕ポリグルタミン酸のカルシウム塩の血中トリグリセリド濃度上昇抑制作用
重量平均分子量１１，０００（調製例１で調製）のポリグルタミン酸のカルシウム塩と、重量平均分子量９，０００（明治フードマテリア社製）のポリグルタミン酸のナトリウム塩（明治フードマテリア社製）を用いて下記のように経口投与サンプルを調製した。
また、８週齢の雄性マウス（C57BL/6J  Jcl：日本クレア社製）を各群７匹ずつ用いて下記のように経口投与試験を行った。
【００２２】
経口投与サンプルの調製：
グルコース（関東化学社製）とトリオレイン（Glyceryl  trioleate：Sigma社製）をレシチン（卵製、和光純薬社製）とアルブミン(ウシ血清由来、Sigma社製)を用いて乳化し、乳液を調製した。この乳液に、ポリグルタミン酸塩試料を添加し、最終濃度がポリグルタミン酸塩試料５（ｗ/ｗ）％、グルコース５（ｗ/ｗ）％、トリオレイン５（ｗ/ｗ）％、乳化剤（レシチン０．２（ｗ/ｗ）％、アルブミン１．０（ｗ/ｗ）％となるよう、経口投与サンプルを調製した。なお、コントロールサンプルとして、ポリグルタミン酸塩の代わりに水を添加したサンプルを調製した。
【００２３】
経口投与試験：
一晩絶食させたマウスをエ−テル麻酔下、眼窩静脈よりヘパリン処理ヘマトクリット毛細管（VITREX社製）を用い、初期採血を行った。その後、経口投与サンプルを経口ゾンデ針にて経口投与し、１０分、３０分、１時間、２時間後にエーテル麻酔下、眼窩静脈より採血を行った。マウスに対する経口投与量を下記の表１に示す。
【００２４】
【表１】
2012144487.tif 000002
【００２５】
ヘパリン処理ヘマトクリット毛細管で採取した血液は血漿分離まで氷冷下で保存後、１１０００ｒｐｍにて５分間遠心し、血漿を得た。得られた血漿から、トリグリセライドＥ−テストワコー（和光純薬社製、GPO・DAOS法)を用いて血中トリグリセリド濃度を測定した。
サンプル経口投与後から２時間後までの血中トリグリセリド濃度の各測定結果をもとに、血中トリグリセリド濃度の最大値と初期値（初期採血時）の差（Δ値）を最大トリグリセリド濃度上昇と定義し、コントロール群を１００としたときの値を表２に示した。
【００２６】
得られた最大トリグリセリド濃度上昇の値をもとに、群間の統計学的有意差についても検討し、その結果も表２に示した。分散分析によって有意性（Ｐ＜０．０５）が認められた場合、多重比較検定（Bonferroni／Dunn法）により、コントロール群と各ポリグルタミン酸塩投与群との間、及びナトリウム塩投与群とカルシウム塩投与群との間での検定を行い、得られた結果から、Ｐ＜０．０５を有意な差として有意性を判断した。
【００２７】
【表２】
2012144487.tif 000003
【００２８】
表２の結果から、ポリグルタミン酸塩を投与したいずれのケースでも最大トリグリセリド濃度上昇を効果的に抑制できることがわかった。
また、ポリグルタミン酸のカルシウム塩の投与群では、ポリグルタミン酸のナトリウム塩の投与群と比較しても、最大トリグリセリド濃度上昇が顕著に抑制されていた。
【００２９】
前述のように、血中トリグリセリド濃度の上昇は、高脂血症ひいては動脈硬化症を引き起こすことが知られている。したがって、前記ポリグルタミン酸のカルシウム塩は、血中のトリグリセリド濃度の上昇を効果的に抑制することで、高脂血症や動脈硬化症の予防・改善に好適に用いることができる。