(57)【要約】【課題】本発明は、実用的なメラノーマ転移抑制剤やメラノーマ転移抑制方法を提供することや、実用的なメラノーマ転移抑制剤調製のための使用を提供することや、メラノーマ転移抑制剤の実用的なスクリーニング方法を提供することを目的とする。【解決手段】メラノーマ転移抑制剤やメラノーマ転移抑制方法やメラノーマ転移抑制剤調製のための使用については、ＳＩＲＴ１阻害作用物質を用いる。また、メラノーマ転移抑制剤のスクリーニング方法については、被検物質の存在下で、ＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性を測定する工程；測定の結果得られたヒストンデアセチラーゼ活性の値を、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値と比較する工程；及び、被検物質の存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値が、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値より低い場合に、その被検物質をメラノーマ転移抑制剤と評価する工程；を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＩＲＴ１阻害作用物質を含有するメラノーマ転移抑制剤。
【請求項２】
ＳＩＲＴ１阻害作用物質が、ニコチンアミド、スプリトマイシン、sirtinol、ＳＩＲＴ１に対するｓｉＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するアンチセンスＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するｍｉＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のメラノーマ転移抑制剤。
【請求項３】
ＳＩＲＴ１阻害作用物質を投与することを特徴とするメラノーマ転移抑制方法。
【請求項４】
ＳＩＲＴ１阻害作用物質が、ニコチンアミド、スプリトマイシン、sirtinol、ＳＩＲＴ１に対するｓｉＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するアンチセンスＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するｍｉＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載のメラノーマ転移抑制方法。
【請求項５】
ＳＩＲＴ１阻害作用物質のメラノーマ転移抑制剤調製のための使用。
【請求項６】
ＳＩＲＴ１阻害作用物質が、ニコチンアミド、スプリトマイシン、sirtinol、ＳＩＲＴ１に対するｓｉＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するアンチセンスＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するｍｉＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
以下の工程を有することを特徴とするメラノーマ転移抑制剤のスクリーニング方法。
被検物質の存在下で、ＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性を測定する工程；
測定の結果得られたヒストンデアセチラーゼ活性の値を、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値と比較する工程；
被検物質の存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値が、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値より低い場合に、その被検物質をメラノーマ転移抑制剤と評価する工程；
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラノーマ転移抑制剤、メラノーマ転移抑制方法、メラノーマ転移抑制剤調製のための使用、メラノーマ転移抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラノーマ（悪性黒色腫）は、メラノサイト（メラニン色素産生細胞）が癌化して生じる悪性腫瘍であり、全身の皮膚、粘膜のほか、目、脊髄、脳等の臓器にも発生する。メラノーマは早期の段階から転移が生じ易く、化学療法や放射線療法にも抵抗性であるため、悪性度の高い腫瘍として知られている（非特許文献１および２）。そのため、メラノーマの治療は基本的には外科的手術に頼らざるを得ないが、転移が生じると外科的手術でも処置し切れなくなる場合が多く、有効な治療法が求められている。
【０００３】
ＳＩＲＴ１は、ＮＡＤを補酵素とするクラスIIIに属するヒストンデアセチラーゼであり、酵母や線虫、ショウジョウバエで過剰発現をおこなうと寿命が延長するＳｉｒ２遺伝子の哺乳類ホモログである。ＳＩＲＴ１は、ヒストンＨ３やＨ４のアセチル化されたリシン残基を脱アセチル化する他、各種の転写因子を調節して細胞の死、分化、代謝などに関与することが近年の研究によりしだいに明らかにされつつある。例えば、ＳＩＲＴ１が、転写因子ｐ５３を脱アセチル化してｐ５３活性を抑制することによりアポトーシスを抑えたり、転写因子ＦＯＸＯｓを脱アセチル化して細胞の酸化ストレスに対する耐性を高める他、核内受容体ＰＰＡＲγの転写を抑えて脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化を抑制したり、転写コアクチベータＰＧＣ−１αを活性化して糖の新生を促進しさらにミトコンドリアでの酸化的リン酸化を促進させたりすることが明らかにされている。
【０００４】
非特許文献３には、ＳＩＲＴ１遺伝子の発現を阻害すると、転写因子ＦＯＸＯ１を介して血管新生が抑制されることが記載されている。また、非特許文献４には、ＳＩＲＴ２が細胞運動に関係することが示唆されている。しかし、ＳＩＲＴ２は、ＳＩＲＴ１と類似のNAD+-dependent ＨＤＡＣドメイン及びＣｄｋリン酸化部位を持つが、他の部分は全く異なる別の遺伝子産物である（非特許文献４の図１Ｄ参照）。
【０００５】
しかし、ＳＩＲＴ１を阻害すると、メラノーマの転移を抑制することについては何ら知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「化学療法の領域」、２００３年、Ｓ−１、第１９巻、ｐ．２２４−２３１
【非特許文献２】Oncogene, 22, p3138-3151 (2003)
【非特許文献３】Genes & Development, 21 p2644-2658 (2007)
【非特許文献４】The Journal of Cell Biology, Vol. 180, No. 5, p915-929 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、実用的なメラノーマ転移抑制剤やメラノーマ転移抑制方法を提供することや、実用的なメラノーマ転移抑制剤調製のための使用を提供することや、メラノーマ転移抑制剤の実用的なスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ニコチンアミド、スプリトマイシン、ＳＩＲＴ１に対するｓｉＲＮＡ等のＳＩＲＴ１阻害作用物質が、メラノーマ細胞の細胞移動を阻害すること、及び、ＳＩＲＴ１阻害作用物質が、in vivoにおいて、メラノーマ細胞の転移を抑制すること等を見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）ＳＩＲＴ１阻害作用物質を含有するメラノーマ転移抑制剤や、（２）ＳＩＲＴ１阻害作用物質が、ニコチンアミド、スプリトマイシン、sirtinol、ＳＩＲＴ１に対するｓｉＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するアンチセンスＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するｍｉＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする上記（１）に記載のメラノーマ転移抑制剤に関する。
【００１０】
また本発明は、（３）ＳＩＲＴ１阻害作用物質を投与することを特徴とするメラノーマ転移抑制方法や、（４）ＳＩＲＴ１阻害作用物質が、ニコチンアミド、スプリトマイシン、sirtinol、ＳＩＲＴ１に対するｓｉＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するアンチセンスＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するｍｉＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする上記（３）に記載のメラノーマ転移抑制方法に関する。
【００１１】
さらに本発明は、（５）ＳＩＲＴ１阻害作用物質のメラノーマ転移抑制剤調製のための使用や、（６）ＳＩＲＴ１阻害作用物質が、ニコチンアミド、スプリトマイシン、sirtinol、ＳＩＲＴ１に対するｓｉＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するアンチセンスＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するｍｉＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする上記（５）に記載の使用に関する。
【００１２】
また本発明は、（７）以下の工程を有することを特徴とするメラノーマ転移抑制剤のスクリーニング方法；被検物質の存在下で、ＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性を測定する工程；測定の結果得られたヒストンデアセチラーゼ活性の値を、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値と比較する工程；被検物質の存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値が、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値より低い場合に、その被検物質をメラノーマ転移抑制剤と評価する工程；に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のメラノーマ転移抑制剤やメラノーマ転移抑制方法は、メラノーマの転移を効果的に抑制することができる。そのメラノーマ転移抑制効果は、in vivoにおいても実証されているため、非常に実用性が高い。本発明のメラノーマ転移抑制剤やメラノーマ転移抑制方法を用いてメラノーマの転移を抑制すると、メラノーマ除去手術後の再発率を低減させたり、メラノーマの悪化を抑制・遅延させたりすることができるため、メラノーマの治療の可能性を顕著に向上させることが可能となる。また、本発明のメラノーマ転移抑制剤のスクリーニング方法は、実用性の高いメラノーマ転移抑制剤を効率良くスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】メラノーマ細胞及びメラノブラストの細胞質におけるＳＩＲＴ１の発現を示す図である。図１Ａ：ＭＭ４１８細胞、Ｂ１６Ｆ１細胞及びＢ１６Ｆ１０細胞において、ＳＩＲＴ１に関するＲＴ−ＰＣＲを行なった結果を示す図である。図１Ｂ：Ｂ１６Ｆ１細胞、Ｂ１６Ｆ１０細胞及びＣＯＳ  ＳＩＲＴ１細胞において、ＳＩＲＴ１等に関するウエスタンブロットを行なった結果を示す図である。図１Ｃ：Ｂ１６Ｆ１細胞、ＭＭ４１８細胞及びメラノブラスト細胞における蛍光免疫染色の結果を示す図である。図１Ｄ：Ｂ１６Ｆ１細胞の核画分、細胞質画分及びミトコンドリア画分のそれぞれに対して、ＳＩＲＴ１等に関するウエスタンブロットを行なった結果を示す図である。
【図２】Ｂ１６Ｆ１メラノーマ細胞群におけるWound healingに対する、ニコチンアミド（ＮＡ）及びニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）の影響を示す図である。図２左：スクラッチ直後（０ｈ）及び２４時間後（２４ｈ）のwounded areaの観察結果を示す図である。図２右：０ｈ時点のwounded areaの面積を１００％としたときの、２４ｈ時点でのwounded areaの面積の割合（％）の平均値を示す図である。
【図３】Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞群におけるWound healingに対する、ニコチンアミド（ＮＡ）の影響を示す図である。図３左：スクラッチ直後（０ｈ）及び２４時間後（１０ｈ）のwounded areaの観察結果を示す図である。図３右：０ｈ時点のwounded areaの面積を１００％としたときの、１０ｈ時点でのwounded areaの面積の割合（％）の平均値を示す図である。
【図４】ＳＩＲＴファミリー阻害物質が、Ｂ１６Ｆ１メラノーマ細胞の細胞移動を阻害することを示す図である。図４左：ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を示す図である。図４右：電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を各サンプル薬剤についてグラフ化した結果を示す図である。
【図５】ＳＩＲＴファミリー活性化物質が、Ｂ１６Ｆ１メラノーマ細胞の細胞移動を促進することを示す図である。図５左：ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を示す図である。図５右：電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を各サンプル薬剤についてグラフ化した結果を示す図である。
【図６】ＳＩＲＴファミリー調節物質（ＳＩＲＴファミリー活性化物質及び阻害物質）が、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞の細胞移動に影響することを示す図である。図６左：ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を示す図である。図６右：電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を各サンプル薬剤についてグラフ化した結果を示す図である。
【図７】ＳＩＲＴファミリー調節物質（ＳＩＲＴファミリー活性化物質及び阻害物質）が、ＭＭ４１８ヒトメラノーマ細胞の細胞移動に影響することを示す図である。図７左：ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を示す図である。図７右：電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を各サンプル薬剤についてグラフ化した結果を示す図である。
【図８】Ｂ１６Ｆ１細胞に関するCell Proliferation Assayの結果を示す図である。
【図９】ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡが、Ｂ１６Ｆ１メラノーマ細胞の細胞移動を阻害することを示す図である。図９左上：ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ｓｉ−１）、レンチウイルスベクター導入Ｂ１６Ｆ１細胞（Ｃ４）、及び、Ｂ１６Ｆ１細胞（Ｃ）において、ＳＩＲＴ１に関するＲＴ−ＰＣＲを行なった結果を示す図である。図９左下：スクラッチ直後（０ｈ）及び２４時間後（２４ｈ）のwounded areaの観察結果を示す図である。図９右：０ｈ時点のwounded areaの面積を１００％としたときの、２４ｈ時点でのwounded areaの面積の割合（％）の平均値を示す図である。
【図１０】ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡが、Ｂ１６Ｆ１メラノーマ細胞の細胞移動を阻害することを示す図である。図１０左：ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を示す図である。図１０右：電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を各サンプル薬剤についてグラフ化した結果を示す図である。
【図１１】ＳＩＲＴ２〜７のｓｉＲＮＡが、Ｂ１６Ｆ１メラノーマ細胞の細胞移動に影響しないことを示す図である。図１１左：ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を示す図である。図１１右：電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を各サンプル薬剤についてグラフ化した結果を示す図である。
【図１２】in vivoにおける、Ｂ１６Ｆ１細胞の移植アッセイの方法の概略を示す図である。
【図１３】ＮＡ投与群及びコントロール群のマウスにおける腫瘍径の推移及び生存マウス数の推移の結果を示す図である。図１３の上段：ＮＡ投与群及びコントロール群のマウスにおける腫瘍径の平均の推移を示す図である。図１３の下段：ＮＡ投与群及びコントロール群のマウスにおける生存数の推移を示す図である。
【図１４】移植アッセイにおいて、メラノーマ細胞の腹腔内浸潤又はリンパ節転移の存在が確認されたマウスのみについて、その累積生存率をコントロール群（Ｃ）とＮＡ投与群（Ｎ）に分けて比較した結果を示す図である。
【図１５】移植アッセイにおいて、正常組織へのメラノーマ細胞の浸潤が確認されたマウス（Invasion（＋）のマウス）の割合（％）を両群について算出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のメラノーマ転移抑制剤としては、ＳＩＲＴ１阻害作用物質を含有している限り特に制限されず、また本発明のメラノーマ転移抑制方法としては、ＳＩＲＴ１阻害作用物質を投与する方法であれば特に制限されず、そしてまた、本発明の使用としては、ＳＩＲＴ１阻害作用物質をメラノーマ転移抑制剤の調製のために使用する方法であれば特に制限されない。後述の実施例の結果から明らかなように、ＳＩＲＴ１を阻害すれば、メラノーマ転移を抑制し得るからである。本発明におけるＳＩＲＴ１阻害作用物質としては、いずれかの哺乳動物のＳＩＲＴ１の活性（好ましくはヒストンデアセチラーゼ活性）を阻害する物質である限り特に制限されないが、例えばニコチンアミド、スプリトマイシン、sirtinol、ＳＩＲＴ１に対するｓｉＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するアンチセンスＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するｍｉＲＮＡを好適に例示することができ、中でもニコチンアミド、スプリトマイシン、ＳＩＲＴ１に対するｓｉＲＮＡをより好適に例示することができ、安全性や入手の容易性や投与の容易性の観点から、ニコチンアミド、スプリトマイシンをさらに好適に例示することができる。上記のニコチンアミド、スプリトマイシン、sirtinolは、市販のものを使用することができる。また、上記のＳＩＲＴ１に対するｓｉＲＮＡ、ＳＩＲＴ１に対するアンチセンスＲＮＡは、ＳＩＲＴ１の配列情報に基づいて、適宜設計し、そのメラノーマ細胞転移抑制効果を確認することにより、得ることができる。
【００１６】
本発明のメラノーマ転写抑制剤では、２種類以上のＳＩＲＴ１阻害作用物質を併用してもよい。また、上記の哺乳動物としては、特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。
【００１７】
ある被検物質が、ＳＩＲＴ１阻害作用物質であるかどうかは、被検物質の存在下で、ＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性を測定する工程；測定の結果得られたヒストンデアセチラーゼ活性の値を、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値と比較する工程；被検物質の存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値が、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値より低い場合に、その被検物質をＳＩＲＴ１阻害作用物質と評価する工程；を有する方法により、容易に確認することができる。上記のＳＩＲＴ１タンパク質は、公知のＳＩＲＴ１の配列情報に基づいて、所望の哺乳動物からＳＩＲＴ１遺伝子を単離し、該遺伝子を適当な発現ベクターにインテグレイトして発現させた後、そのＳＩＲＴ１を単離することによって容易に入手することができる。ＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性は、ＳＩＲＴ１の基質であるアセチル化されたｐ５３の３８２番目のリシン又は３２０番目のリシンを含む蛍光標識ペプチド（Biomol社製）等を用いて測定することができる。
【００１８】
本発明におけるＳＩＲＴ１阻害作用物質のメラノーマ転移抑制効果を確認する方法としては、特に制限されないが、メラノーマ細胞をコンフルエントになるまで培養し、メラノーマ細胞の層を形成させる工程；メラノーマ細胞の層に被検物質を添加する工程；被検物質の添加から一定時間経過後に、メラノーマ細胞の層をスクラッチする工程；スクラッチした部分（スクラッチ部分）を、スクラッチから一定時間経過後に観察して、メラノーマ細胞のスクラッチ部分への移動の程度を測定する工程；メラノーマ細胞のスクラッチ部分への移動の程度を、被検物質非添加の場合の程度と比較する工程；メラノーマ細胞のスクラッチ部分への移動の程度が、被検物質非添加の場合の程度と比較して低い場合に、その被検物質をメラノーマ転移抑制剤と評価する工程；を有する方法（Wound Healing Assay）や、メラノーマ細胞が浸潤し得る組成物の表面にメラノーマ細胞を接触させ、被検物質存在下でのメラノーマ細胞の浸潤の程度を測定する工程；メラノーマ細胞の浸潤の程度を、被検物質非存在下の場合の程度と比較する工程；メラノーマ細胞の浸潤の程度が、被検物質非存在下の場合の程度と比較して低い場合に、その被検物質をメラノーマ転移抑制剤と評価する工程；を有する方法（Invasion Assay）を好適に例示することができる。上記のWound Healing Assayにおける「スクラッチ部分への移動の程度」としては、スクラッチ直後におけるスクラッチ部分の面積と比較したときの、スクラッチから一定時間経過後のスクラッチ部分の面積の低下の程度を好適に用いることができ、上記のInvasion Assayにおける「メラノーマ細胞が浸潤し得る組成物」としては、マトリジェルを好適に用いることができる。上記のWound Healing Assay及びInvasion Assayとして、より具体的には、後述の実施例２に記載の方法、及び、実施例３に記載の方法をそれぞれ好適に例示することができる。
【００１９】
本発明に用いるＳＩＲＴ１阻害作用物質における、好ましいメラノーマ転移抑制効果としては、後述の実施例２に記載のWound Healing Assayと同様の方法において、スクラッチから２４時間後のスクラッチ部分（wounded area）の面積が、コントロールの場合のその面積に対して、１．１倍以上であることが好ましく、１．２倍以上であることがより好ましい。また、後述の実施例３に記載のInvasion Assayと同様においては、４８時間インキュベートした後の浸潤細胞数が、コントロールの場合と比較して、２分の１以下であることが好ましく、３分の１以下であることがより好ましい。また、後述の実施例６に記載のin vivo移植アッセイと同様の方法においては、投与群の総マウス数に対するInvasion（＋）のマウス（転移を生じているマウス）数の割合が、コントロール群におけるその割合の２分の１以下であることが好ましく、３分の１以下であることがより好ましい。
【００２０】
本発明のメラノーマ転移抑制剤は、所望のメラノーマ転移抑制効果が得られる限り、前述のＳＩＲＴ１阻害作用物質の他に、他のメラノーマ転移抑制剤や抗がん剤等の任意成分をふくんでいてもよい。
【００２１】
本発明のメラノーマ転移抑制剤に含有されるＳＩＲＴ１阻害作用物質は、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいが、優れたメラノーマ転移抑制効果を得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤とすることが好ましい。前述の液剤の製造方法としては、例えばＳＩＲＴ１阻害作用物質を溶剤と混合する方法や、さらに懸濁化剤や乳化剤を混合する方法を好適に例示することができる。以上のように、本発明におけるＳＩＲＴ１阻害作用物質を製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、吸着剤、甘味剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。
【００２２】
本発明のメラノーマ転移抑制剤の投与方法としては、所望のメラノーマ転移抑制剤が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等を例示することができる。また、本発明のメラノーマ転移抑制剤の投与量や投与回数や投与濃度は、投与対象のメラノーマ状態や投与対象の体重等に応じて、適宜調節することができる。なお、本発明のメラノーマ転移抑制剤を抗がん剤と併用すると、メラノーマの治療の可能性を顕著に向上させることが可能となるため好ましい。
【００２３】
本発明のメラノーマ転移抑制剤の転移抑制対象となるメラノーマ（悪性黒色腫）の種類としては、特に制限されないが、悪性黒子型、末端黒子型、結節型、表在拡大型のいずれであってもよい。また、本発明のメラノーマ転移抑制剤の投与対象となる哺乳動物としては、特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を好適に例示することができ、中でもヒトをより好適に例示することができる。また、本発明のメラノーマ転移抑制剤に含有されるＳＩＲＴ１阻害作用物質が阻害作用を発揮するＳＩＲＴ１の由来である哺乳動物の種類は、該メラノーマ転移抑制剤の投与対象となる哺乳動物の種類と一致していることが、より安定して優れたメラノーマ転移抑制効果を得る観点から、好ましい。
【００２４】
本発明のメラノーマ転移抑制方法におけるＳＩＲＴ１阻害作用物質やその投与方法については、メラノーマ転移抑制剤について前述したのと同様である。また、本発明のメラノーマ転移抑制剤調製のための使用におけるＳＩＲＴ１阻害作用物質やそれをメラノーマ転移抑制剤に調製する方法も、メラノーマ転移抑制剤について前述したのと同様である。
【００２５】
本発明のメラノーマ転移抑制剤のスクリーニング方法としては、被検物質の存在下で、ＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性を測定する工程；測定の結果得られたヒストンデアセチラーゼ活性の値を、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値と比較する工程；及び、被検物質の存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値が、被検物質の非存在下におけるＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性の値より低い場合に、その被検物質をメラノーマ転移抑制剤と評価する工程；を有している限り特に制限されない。このような本発明のメラノーマ転移抑制剤のスクリーニング方法によれば、ＳＩＲＴ１阻害作用物質を効率良くスクリーニングすることができ、すなわち、実用性の高いメラノーマ転移抑制剤を効率良くスクリーニングすることができる。
【００２６】
上記の、被検物質の存在下で、ＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性を測定する工程としては、特に制限されないが、ＳＩＲＴ１の基質であるアセチル化されたｐ５３の３８２番目のリシン又は３２０番目のリシンを含む蛍光標識ペプチド（Biomol社製）等を被検物質の存在下で用いることによって、ＳＩＲＴ１のヒストンデアセチラーゼ活性を測定することを好適に例示することができる。
【００２７】
この他、本発明には、メラノーマの転移抑制における、ＳＩＲＴ１阻害作用物質の使用も含まれる。この使用におけるＳＩＲＴ１阻害物質の使用方法については、メラノーマ転移抑制剤について前述したのと同様である。
【００２８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
［メラノーマ細胞におけるＳＩＲＴ１の局在］
通常の培養細胞においては、ＳＩＲＴ１は核で発現していることが知られている。メラノーマ細胞におけるＳＩＲＴ１の局在を調べるために、ＭＭ４１８細胞（ヒトメラノーマ細胞株）、Ｂ１６Ｆ１細胞（マウスメラノーマ細胞株；低転移性）、Ｂ１６Ｆ１０細胞（マウスメラノーマ細胞；高転移性）を用意して、以下の実験を行なった。なお、上記の３種類の細胞は、札幌医科大学皮膚科学講座から入手した。札幌医科大学皮膚科学講座は、ＭＭ４１８細胞をQueensland Institute of Medical Research, Brisbane, Australiaから譲り受け、Ｂ１６Ｆ１細胞及びＢ１６Ｆ１０細胞をAmerican Type Culture Collectionから購入した。
【００３０】
１．ＲＴ−ＰＣＲ
ＭＭ４１８細胞、Ｂ１６Ｆ１細胞及びＢ１６Ｆ１０細胞のそれぞれから、常法にしたがってトータルＲＮＡを抽出した。ＳＩＲＴ１を増幅し得るプライマーセットを用いて、常法にしたがって、前述のトータルＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行なった。その結果を、図１Ａに示す。図１Ａから分かるように、いずれのメラノーマ細胞においても、ＳＩＲＴ１に相当する位置にバンドが確認された。
【００３１】
２．トータルタンパク質に対するウエスタンブロット
Ｂ１６Ｆ１細胞、Ｂ１６Ｆ１０細胞及びＣＯＳ  ＳＩＲＴ１細胞（ＣＯＳ細胞に、ＳＩＲＴ１を発現する発現ベクターを導入した細胞）のそれぞれから、常法にしたがってトータルタンパク質を抽出した。得られたトータルタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動して分離した後、分離したタンパク質をメンブレンにトランスファーした。このメンブレンをブロッキングバッファーにてブロッキングした後、洗浄バッファーにて洗浄を行なった。洗浄したメンブレンに、ＳＩＲＴ１特異的な１次抗体を添加してインキュベートしてから洗浄し、次いで、ＨＲＰで標識した２次抗体を添加してインキュベートを行なった後、洗浄した。洗浄したメンブレンに、ＨＲＰの発色基質を添加した。メンブレン上の発色の様子を観察した結果を図１Ｂに示す。図１Ｂに示されているように、Ｂ１６Ｆ１細胞及びＢ１６Ｆ１０細胞のいずれの場合も、ポジティブコントロールであるＣＯＳ  ＳＩＲＴ１細胞の場合と同様の位置に、ＳＩＲＴ１のバンドが検出された。なお、内部標準として、ＧＡＰＤＨの検出を行うことによって、各レーンのトータルタンパク質量が同等であることを確認した。以上の結果より、Ｂ１６Ｆ１細胞及びＢ１６Ｆ１０細胞において、ＳＩＲＴ１が実際に発現していることが確認できた。
【００３２】
３．蛍光免疫染色
メラノーマ細胞におけるＳＩＲＴ１の局在を調べるために、以下の方法で免疫蛍光染色を行なった。
【００３３】
Ｂ１６Ｆ１細胞及びＭＭ４１８細胞を用意した。また、メラニン細胞の前駆細胞であるメラノブラストも用意した。メラノブラストは、生後１日のマウスの皮膚から単離培養して得た。得られた細胞がメラノブラストであることの確認は、そのマーカーであるＴＲＰ１の発現を確認することによって行なった。前述のＢ１６Ｆ１細胞、ＭＭ４１８細胞、メラノブラストの３種類の細胞のそれぞれについて、ＳＡＲＴ１特異的抗体及び赤色蛍光標識したその２次抗体；チロジナーゼ（tyrosinase）特異的抗体及び緑色蛍光標識したその２次抗体；又は、Ｈｏｅｃｈｉｓｔ；を用いて染色を行なった。その結果を図１Ｃに示す。なお、「Ｍｅｒｇｅ」とは、「ＳＩＲＴ１」、「チロジナーゼ」、「Ｈｏｅｃｈｉｓｔ」にて染色した結果を重ね合わせたものを示す。図１Ｃの結果から分かるように、Ｈｏｅｃｈｉｓｔにて染色された核の周囲の細胞質において、ＳＩＲＴ１やチロジナーゼが発現していることが示された。また、メラノーマ細胞と同様に、メラノブラストにおいても、ＳＩＲＴ１は細胞質で優位に発現していることが示された。
【００３４】
４．核画分、細胞質画分及びミトコンドリア画分に対するウエスタンブロット
メラノーマ細胞におけるＳＩＲＴ１の局在を調べるために、Ｂ１６Ｆ１細胞の核画分、細胞質画分及びミトコンドリア画分のそれぞれに対して、ウエスタンブロットを試みた。具体的には以下のような方法で行なった。
【００３５】
Ｂ１６Ｆ１細胞を破砕した後、遠心分離法によって、核画分、細胞質画分、及び、ミトコンドリア画分を得た。それぞれの画分について、実施例１の２．と同様の方法でウエスタンブロットを行なった。その結果を図１Ｄに示す。図１Ｄから分かるように、ＳＩＲＴ１は、細胞質画分において特に検出された。なお、各画分が、核画分、細胞質画分、ミトコンドリア画分であることを確認するために、核マーカータンパク質であるＬａｍｉｎ  Ａ／Ｃ、細胞質マーカータンパク質であるｃ−ＡＳＴ、ミトコンドリアマーカータンパク質であるｍ−ＡＳＴの発現の検出も行った。以上の結果より、Ｂ１６Ｆ１細胞において、ＳＩＲＴ１は細胞質にて発現していることが示された。
【実施例２】
【００３６】
［Wound Healing Assay］
ＳＩＲＴ１が、メラノーマ細胞の細胞移動に関与しているかどうかを調べるために、以下のような方法でWound Healing Assayを行なった。
【００３７】
サンプル薬剤として、ＳＩＲＴ１等のＳＩＲＴファミリーの阻害物質であるニコチンアミド（ＮＡ）を５ｍＭ含む溶液；ＳＩＲＴ１の活性化物質であるニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）を１ｍＭ含む溶液；蒸留水（コントロール：control）；の３種類を用意した。２４ウェルプレートの各ウェルに、Ｂ１６Ｆ１細胞を同量ずつ播種した。５％ＦＢＳを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥ）を各ウェルに添加して、コンフルエントになるまで約一晩培養し、その後、前述と同様の培地を用いて各ウェルの培地を交換した。次いで、サンプル薬剤をウェルに投与して、Ｂ１６Ｆ１細胞をサンプル薬剤に暴露し、２４時間後にイエローチップで細胞の層をスクラッチした。スクラッチした部分（wounded area）を、スクラッチしてから０ｈ、４ｈ、６ｈ、１０ｈ、１２ｈ及び２４ｈ後に顕微鏡で観察し、０ｈ時点でのwounded areaの面積を１００％としたときの、各時点でのwounded areaの面積の割合（％）を測定した。スクラッチした部分についてのこの測定は、各サンプルの１本のwoundについて、それぞれ３〜５個所ずつ行なった。スクラッチ直後（０ｈ）及び２４時間後（２４ｈ）のwounded areaの観察結果を図２左に示す。また、０ｈ時点のwounded areaの面積を１００％としたときの、２４ｈ時点でのwounded areaの面積の割合（％）の平均値を図２右に示す。図２左及び右の結果から分かるように、ＳＩＲＴ１阻害物質であるＮＡを添加した場合は、２４ｈ時点でもwounded areaの面積は０ｈ時点とほとんど変わらなかったが、コントロールの場合は、２４ｈ時点でのwounded areaの面積が０ｈ時点のそれと比較して有意に（約３０％弱）低下し、ＳＩＲＴ１活性化物質であるＮＡＤを添加した場合は、２４ｈ時点のwounded areaの面積が０ｈ時点のそれと比較して顕著に（約５０％）低下した。すなわち、ＳＩＲＴ１活性を活性化すると、スクラッチ後のwounded areaの面積の低下が促進され、ＳＩＲＴ１活性を阻害すると、スクラッチ後のwounded areaの面積の低下が抑制されることが示された。なお、同様の実験を計３回繰り返したところ、同様の結果を得た。
【００３８】
Ｂ１６Ｆ１細胞に代えて、Ｂ１６Ｆ１０細胞を用いたこと、サンプル薬剤として、前述の５ｍＭのＮＡ溶液及びコントロール液を用いたこと、及び、wounded areaを比較する時点を０ｈと１０ｈとしたこと以外は、上記の方法と同じ方法でWound Healing Assayを行なった。スクラッチ直後（０ｈ）及び１０時間後（１０ｈ）のwounded areaの観察結果を図３左に示す。また、０ｈ時点のwounded areaの面積を１００％としたときの、１０ｈ時点でのwounded areaの面積の割合（％）の平均値を図３右に示す。図３左及び右の結果から分かるように、ＳＩＲＴ１阻害物質であるＮＡを添加した場合は、１０ｈ時点のwounded areaの面積が０ｈ時点のそれと比較してわずかに（約１０％）低下しただけであったが、コントロールの場合は、１０ｈ時点でのwounded areaの面積が、０ｈ時点のそれと比較して顕著に（約５５％）低下した。すなわち、Ｂ１６Ｆ１０細胞を用いた場合も、Ｂ１６Ｆ１細胞を用いた場合と同様に、ＳＩＲＴ１活性を阻害すると、スクラッチ後のwounded areaの面積の低下が抑制されることが示された。なお、同様の実験を計３回繰り返したところ、同様の結果を得た。
【００３９】
以上のWound Healing Assayの結果は、ＳＩＲＴ１活性の程度が低くなるにつれて、メラノーマ細胞株の細胞移動（cell migration）が阻害されること、及び、ＳＩＲＴ１の活性の程度が高くなるにつれて、メラノーマ細胞株の細胞移動が促進されることを表すものであり、ＳＩＲＴ１がメラノーマ細胞株の細胞移動に関与していることが明らかとなった。
【実施例３】
【００４０】
［Invasion Assay（Matrigel Assay）］
メラノーマ細胞の細胞移動を、浸潤性の観点から評価するために、以下のような方法でInvasion Assayを行なった。
【００４１】
まず、サンプル薬剤として、ＮＡを５ｍＭ含む溶液；ＮＡＤを１ｍＭ含む溶液；ＳＩＲＴ１等のＳＩＲＴファミリーの阻害物質であるスプリトマイシン（ＳＰ）を１００μＭ含む溶液；ＳＩＲＴ１の活性化物質であるレスベラトロール（ＲＥＳ）を１０ｎＭ含む溶液；蒸留水（コントロール：control）；の５種類を用意した。次に、１２ウェルプレートのウェル内にセルカルチャーインサート（cell culture insert）を置いた。市販のものを５０倍希釈したマトリジェルを、１ウェルあたり５０μｌずつ添加して、セルカルチャーインサートをコーティングした。次いで、その１２ウェルプレートをクリーンベンチ内で２時間乾燥し、ウェル内に残った液体は吸引して除去した。セルカルチャーインサートを、いずれかのサンプル薬剤を添加した浸潤アッセイ用培地（ＦＢＳ（−）ＤＥＭ）に３７℃で２時間浸してインキュベートして、マトリジェルを再膨化させた。そのセルカルチャーインサート上に、１ウェルあたり５００００個のメラノーマ細胞を播種した後、セルカルチャーインサートの下層の培地をＦＢＳ（＋）ＤＥＭに変換して、３７℃で４８時間インキュベートした。セルカルチャーインサートに付着した細胞をメタノールで固定してギムザ染色を行い、セルカルチャーインサートの下面（細胞を播種した面の逆側の面）に浸潤した細胞（以下、「浸潤細胞」ともいう。）を顕微鏡にて顕微鏡撮影し、その顕微鏡写真の浸潤細胞数を目視により計測した。この計測は、各サンプルにつき、顕微鏡写真５〜６枚ずつを用いて行なった。
【００４２】
細胞として、Ｂ１６Ｆ１細胞を用い、サンプル薬剤として、ＮＡを５ｍＭ含む溶液；ＳＰを１００μＭ含む溶液；蒸留水（コントロール：control）；を用いたInvasion Assayの結果を図４に示す。図４左の３つのパネルは、ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を表し、図４右には電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を各サンプル薬剤についてグラフ化した結果を表す。図４から分かるように、ＳＩＲＴ１の阻害物質であるＮＡやＳＰを添加した場合は、コントロールの場合と比較して浸潤細胞の数が有意に低下することが示された。なお、同様の実験を計３回繰り返したところ、同様の結果を得た。
【００４３】
また、細胞として、Ｂ１６Ｆ１細胞を用い、サンプル薬剤として、ＮＡを５ｍＭ含む溶液；ＮＡＤを１ｍＭ含む溶液；ＲＥＳを１０ｎＭ含む溶液；蒸留水（コントロール：control）；を用いたInvasion Assayの結果を図５に示す。図５左の４つのパネルは、ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を表し、図５右には電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を各サンプル薬剤についてグラフ化した結果を表す。図５から分かるように、ＳＩＲＴ１の阻害物質であるＮＡを添加した場合は、コントロールの場合と比較して浸潤細胞の数が有意に低下し、ＳＩＲＴ１の活性化物質であるＮＡＤやＲＥＳを添加した場合は、コントロールの場合と比較して浸潤細胞の数が有意に増加することが示された。なお、同様の実験を計３回繰り返したところ、同様の結果を得た。
【００４４】
さらに、細胞として、Ｂ１６Ｆ１０細胞を用い、サンプル薬剤として、ＮＡを５ｍＭ含む溶液；ＳＰを１μＭ含む溶液；ＮＡＤを１ｍＭ含む溶液；蒸留水（コントロール：control）；を用いたInvasion Assayの結果を図６に示す。図６左の４つのパネルは、ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を表し、図６右には電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を各サンプル薬剤についてグラフ化した結果を表す。図６から分かるように、ＳＩＲＴ１の阻害物質であるＮＡやＳＰを添加した場合は、コントロールの場合と比較して浸潤細胞の数が有意に低下し、ＳＩＲＴ１の活性化物質であるＮＡＤを添加した場合は、コントロールの場合と比較して浸潤細胞の数が有意に増加することが示された。なお、同様の実験を計３回繰り返したところ、同様の結果を得た。
【００４５】
また、細胞として、ＭＭ４１８細胞を用い、サンプル薬剤として、ＮＡを５ｍＭ含む溶液；ＳＰを１μＭ含む溶液；蒸留水（コントロール：control）；を用いたInvasion Assayの結果を図７に示す。図７左の３つのパネルは、ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を表し、図７右には電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を各サンプル薬剤についてグラフ化した結果を表す。図７から分かるように、ＳＩＲＴ１の阻害物質であるＮＡやＳＰを添加した場合は、コントロールの場合と比較して浸潤細胞の数が有意に低下することが示された。なお、同様の実験を計３回繰り返したところ、同様の結果を得た。
【００４６】
以上のInvasion Assayの結果は、ＳＩＲＴ１活性の程度が低くなるにつれて、メラノーマ細胞株の浸潤が阻害されること、及び、ＳＩＲＴ１の活性の程度が高くなるにつれて、メラノーマ細胞株の浸潤が促進されることを表している。これにより、ＳＩＲＴ１がメラノーマ細胞株の細胞移動に関与していることが、浸潤の面からも確認された。
【実施例４】
【００４７】
［MTT Assay（Cell Proliferation Assay）］
上記実施例２のWound Healing Assayや上記実施例３のInvasion Assayの結果が、コントロール以外のサンプル薬剤の細胞毒性によるものでないことを確認するために、以下のような方法でMTT Assayを行なった。
【００４８】
まず、サンプル薬剤として、ＮＡを５ｍＭ含む溶液；ＳＰを１００μＭ含む溶液；ＮＡＤを１ｍＭ含む溶液；ＲＥＳを１０ｎＭ含む溶液；蒸留水（コントロール：control）；の５種類を用意した。次に、９６ウェルプレートの各ウェルに、Ｂ１６Ｆ１細胞を１×１０３ｃｅｌｌずつ播種し、さらに、各ウェルにいずれか１種類のサンプル薬剤を添加して２４時間インキュベートした。それから、各ウェルの培養液を、サンプル薬剤を含まない通常の培養液に交換した後、ＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中にＭＴＴを５ｍｇ／ｍｌで含む溶液）を各ウェルに２０μｌずつ添加して、３時間インキュベートした。各ウェルから培養液を除去してから、各ウェルにＤＭＳを１００μｌずつ添加して、ウェルプレートを１０分間程度振とうした。次いで、５７０ｎｍの波長にて各ウェルの溶液の吸光度を測定した。吸光度の測定は、各サンプルについて３〜６ウェルずつに対して行なった。
【００４９】
コントロールにおける吸光度を１００％としたときの、各サンプル薬剤における吸光度の値（平均）を、図８に示す。図８から分かるように、いずれのサンプル薬剤の場合も、コントロールの場合と有意差は見られなかった。なお、同様の実験を計３回繰り返したところ、同様の結果を得た。これにより、上記実施例２のWound Healing Assayや上記実施例３のInvasion Assayの結果が、コントロール以外のサンプル薬剤の細胞毒性によるものでないことが示された。
【実施例５】
【００５０】
［Sirt1-siRNA Assay］
ＳＩＲＴ１が実際に細胞移動に関与しているかどうかを調べるために、ＳＩＲＴ１のｓｉＲＮＡ（以下、「ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ」ともいう）を用いて、Sirt1-siRNA Assayを試みることとした。そこで、Sirt1-siRNA Assayに先立って、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡを細胞内で発現する細胞株を作製した。
【００５１】
１．ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞の作製
マウスＳＩＲＴ１のヌクレオチド配列情報（Genbankアクセッションナンバー；NM_019812）に基づいて、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡを設計した。その配列を配列番号１に示す。このＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡは、ショートヘアピン型のｓｉＲＮＡであり、マウスＳＩＲＴ１ ｃＤＮＡ（Genbankアクセッションナンバー；AY377984）のコード領域の１６４５〜１６６４番目のヌクレオチド配列を標的配列としている。このＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡをレンチウイルスベクターにインテグレイトして、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ／レンチウイルスベクターを作製した。このＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ／レンチウイルスベクターを、Ｂ１６Ｆ１細胞に感染させることにより、細胞内でＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡを発現する細胞（以下、「ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞」という）を得た。また、コントロールとして、レンチウイルスベクターをＢ１６Ｆ１細胞に感染させることにより、Ｂ１６Ｆ１細胞（Ｃ４）を得た。なお、前述のレンチウイルスベクターは、国立神経センターより譲り受けたものであり、Araki T, Sasaki Y, Milbrandt J.  Increased nuclear NAD biosynthesis and SIRT1 activation prevent axonal degeneration.  Science. 2004 Aug 13;305(5686):1010-3.に記載されているレンチウイルスベクターと同じものである。
【００５２】
２．ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞におけるＲＴ−ＰＣＲ
次に、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞において、ＳＩＲＴ１の発現が低下していることを確認するために、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ｓｉ−１）、レンチウイルスベクター導入Ｂ１６Ｆ１細胞（Ｃ４）（コントロール）、及び、Ｂ１６Ｆ１細胞（Ｃ）（コントロール）のそれぞれについて、上記実施例１の１．記載の方法と同様の方法でＳＩＲＴ１に関するＲＴ−ＰＣＲを行なった。その結果を図９の左上に示す。図９の左上から分かるように、レンチウイルスベクター導入Ｂ１６Ｆ１細胞（Ｃ４）（コントロール）やＢ１６Ｆ１細胞（Ｃ）（コントロール）の場合と比較して、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ｓｉ−１）では、ＳＩＲＴ１の発現が低下していることが示された。これにより、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ｓｉ−１）内では、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡが発現しており、ＳＩＲＴ１の発現が低下していることが分かった。
【００５３】
３．ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞におけるWound Healing Assay
次に、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞の細胞移動が低下しているかどうかを調べるために、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ｓｉ−１）、及び、レンチウイルスベクター導入Ｂ１６Ｆ１細胞（Ｃ４）（コントロール）について、上記実施例２記載の方法と同様の方法でWound Healing Assayを行なった。スクラッチした部分（wounded area）を、スクラッチしてから０ｈ及び２４ｈ後に顕微鏡で観察し、０ｈ時点でのwounded areaの面積を１００％としたときの、各時点でのwounded areaの面積の割合（％）を測定した。スクラッチした部分についてのこの測定は、各サンプルの１本のwoundについて、それぞれ３〜５個所ずつ行なった。スクラッチ直後（０ｈ）及び２４時間後（２４ｈ）のwounded areaの観察結果を図９左下に示す。また、０ｈ時点のwounded areaの面積を１００％としたときの、２４ｈ時点でのwounded areaの面積の割合（％）の平均値を図９右に示す。図９の左下及び右から分かるように、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞では、細胞移動が有意に低下していることが示された。なお、同様の実験を計３回繰り返したところ、同様の結果を得た。
【００５４】
４．ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞におけるInvasion Assay
ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞の細胞移動を、浸潤性の観点から評価するために、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ｓｉ−１）及びレンチウイルスベクター導入Ｂ１６Ｆ１細胞（Ｃ４）（コントロール）について、上記実施例３記載の方法と同様の方法でInvasion Assayを行なった。その結果を図１０に示す。図１０左の２つのパネルは、ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を表し、図１０右には電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を細胞の種類ごとにグラフ化した結果を表す。図１０から分かるように、ＳＩＲＴ１−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞においては、コントロールの細胞と比較して、浸潤細胞の数が有意に低下することが示された。
【００５５】
５．ＳＩＲＴ２〜７のｓｉＲＮＡを発現するＢ１６Ｆ１細胞におけるInvasion Assay
Ｂ１６Ｆ１細胞において、ＳＩＲＴ１以外のＳＩＲＴファミリーであるＳＩＲＴ２〜ＳＩＲＴ７の発現を低下させた場合に、浸潤性がどのように変化するかを調べるために、ＳＩＲＴ２〜ＳＩＲＴ７のいずれかのｓｉＲＮＡを細胞内で発現する細胞についてInvasion Assayを試みることとした。そこで、そのInvasion Assayに先立って、ＳＩＲＴ２〜ＳＩＲＴ７のいずれかのｓｉＲＮＡを細胞内で発現する細胞を作製した。
【００５６】
マウスＳＩＲＴ２〜７のそれぞれのヌクレオチド配列情報に基づいて、ＳＩＲＴ２のｓｉＲＮＡ（以下、「ＳＩＲＴ２−ｓｉＲＮＡ」ともいう）、ＳＩＲＴ３のｓｉＲＮＡ（以下、「ＳＩＲＴ３−ｓｉＲＮＡ」ともいう）、ＳＩＲＴ４のｓｉＲＮＡ（以下、「ＳＩＲＴ４−ｓｉＲＮＡ」ともいう）、ＳＩＲＴ５のｓｉＲＮＡ（以下、「ＳＩＲＴ５−ｓｉＲＮＡ」ともいう）、ＳＩＲＴ６のｓｉＲＮＡ（以下、「ＳＩＲＴ６−ｓｉＲＮＡ」ともいう）及びＳＩＲＴ７のｓｉＲＮＡ（以下、「ＳＩＲＴ７−ｓｉＲＮＡ」ともいう）を設計した。これらのＳＩＲＴ２〜７のｓｉＲＮＡを、それぞれ市販のＦＳＰ−ｓｉベクターにインテグレイトして、ＳＩＲＴ２−ｓｉＲＮＡ／ＦＳＰ−ｓｉベクター、ＳＩＲＴ３−ｓｉＲＮＡ／ＦＳＰ−ｓｉベクター、ＳＩＲＴ４−ｓｉＲＮＡ／ＦＳＰ−ｓｉベクター、ＳＩＲＴ５−ｓｉＲＮＡ／ＦＳＰ−ｓｉベクター、ＳＩＲＴ６−ｓｉＲＮＡ／ＦＳＰ−ｓｉベクター、ＳＩＲＴ７−ｓｉＲＮＡ／ＦＳＰ−ｓｉベクターを作製した。作製したこれらのベクターを、Ｂ１６Ｆ１細胞にトランスフェクションすることにより、細胞内でＳＩＲＴ２−ｓｉＲＮＡを発現する細胞（以下、「ＳＩＲＴ２−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞」ともいう）、細胞内でＳＩＲＴ３−ｓｉＲＮＡを発現する細胞（以下、「ＳＩＲＴ３−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞」ともいう）、細胞内でＳＩＲＴ４−ｓｉＲＮＡを発現する細胞（以下、「ＳＩＲＴ４−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞」ともいう）、細胞内でＳＩＲＴ５−ｓｉＲＮＡを発現する細胞（以下、「ＳＩＲＴ５−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞」ともいう）、細胞内でＳＩＲＴ６−ｓｉＲＮＡを発現する細胞（以下、「ＳＩＲＴ６−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞」ともいう）、及び、細胞内でＳＩＲＴ７−ｓｉＲＮＡを発現する細胞（以下、「ＳＩＲＴ７−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞」ともいう）を得た。これらのＳＩＲＴ２−ｓｉＲＮＡを発現する細胞、ＳＩＲＴ３−ｓｉＲＮＡを発現する細胞、ＳＩＲＴ４−ｓｉＲＮＡを発現する細胞、ＳＩＲＴ５−ｓｉＲＮＡを発現する細胞、ＳＩＲＴ６−ｓｉＲＮＡを発現する細胞、及び、ＳＩＲＴ７−ｓｉＲＮＡを発現する細胞を併せて、「ＳＩＲＴ２〜７−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞」ともいう。また、コントロールとして、ＦＳＰ−ｓｉベクターをＢ１６Ｆ１細胞にトランスフェクションすることにより、ＦＳＰ−ｓｉベクター導入Ｂ１６Ｆ１細胞を得た。
【００５７】
ＳＩＲＴ２〜７−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞の細胞移動を、浸潤性の観点から評価するために、ＳＩＲＴ２−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ＳＩＲＴ２−ｓｉ）、ＳＩＲＴ３−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ＳＩＲＴ３−ｓｉ）、ＳＩＲＴ４−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ＳＩＲＴ４−ｓｉ）、ＳＩＲＴ５−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ＳＩＲＴ５−ｓｉ）、ＳＩＲＴ６−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ＳＩＲＴ６−ｓｉ）、ＳＩＲＴ７−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞（ＳＩＲＴ７−ｓｉ）、及び、ＦＳＰ−ｓｉベクター導入Ｂ１６Ｆ１細胞（ＦＳＰ−ｓｉ）（コントロール）について、上記実施例３記載の方法と同様の方法でInvasion Assayを行なった。その結果を図１１に示す。図１１左の９つのパネルは、ギムザ染色したセルカルチャーインサートの下面のマトリジェルを電子顕微鏡で観察した結果を表し、図１１右には電子顕微鏡にて目視により計測した浸潤細胞の数（平均）を細胞の種類ごとにグラフ化した結果を表す。図１１から分かるように、ＳＩＲＴ２〜７−ｓｉＲＮＡ発現Ｂ１６Ｆ１細胞のいずれの場合も、コントロールと比較して、有意な差は見られなかった。
【実施例６】
【００５８】
［in vivoにおける、Ｂ１６Ｆ１細胞の移植アッセイ］
ＳＩＲＴ１阻害作用物質を投与することによって、in vivoにおけるメラノーマ転移が実際に抑制されるかどうかを確認するために、図１２に概略した方法で、Ｂ１６Ｆ１細胞の移植アッセイを行なった。具体的には、以下のような方法で移植アッセイを行なった。
【００５９】
４週齢の雌のＣ５７ＢＬ６マウスを２０〜２４匹用意し、それぞれのＣ５７ＢＬ６マウスの右側腹部を剃毛した。コントロール群として、１０〜１３匹のＣ５７ＢＬ６マウスの腹腔に０．１ｃｃの生理食塩水を投与し、治療群（ＮＡ投与群）として１０〜１２匹のＣ５７ＢＬ６マウスの腹腔に０．１ｃｃのＮＡ（in PBS）を０．５ｍｇ／ｇで投与した。生理食塩水又はＮＡを投与するのと同時に、各マウスの右側腹部に、Ｂ１６Ｆ１細胞（in DME）を０．１ｃｃ／匹（１×１０６個／匹）ずつ皮下注射した。翌日以降は、コントロール群のマウスには、前述したのと同様に０．１ｃｃの生理食塩水を各マウスに腹腔内投与し、治療群のマウスには、前述したのと同様に０．１ｃｃのＮＡ（in PBS）を０．５ｍｇ／ｇで各マウスに腹腔内投与した。Ｂ１６Ｆ１細胞の皮下注射以降、マウスが死亡するまで、各マウスの腫瘍径（tumor size）（ｍｍ３）の計測と、両群中の生存マウス数（The number of survival mouse）の確認とを、毎日行なった。死亡したマウスは、解剖して、メラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ１細胞）の腹腔内浸潤又はリンパ節転移の有無を目視で確認した。以上の移植アッセイを、３回繰り返した。両群のマウスにおける腫瘍径の推移及び生存マウス数の推移の結果を図１３に示す。図１３の上段の３つのパネルは、ＮＡ投与群のマウスにおける腫瘍径の平均の推移と、コントロール群のマウスにおける腫瘍径の平均の推移を示す。図１３の上段の結果から分かるように、１回目と３回目の移植アッセイでは、コントロール群のマウスにおける腫瘍径の方がＮＡ投与群のそれよりも若干上回る傾向を示したが、２回目の移植アッセイでは、ＮＡ投与群のマウスにおける腫瘍径の方がコントロール群のそれよりも若干上回る傾向を示しており、両群の腫瘍径の推移に有意差は見られなかった。また、図１３の下段の３つのパネルは、両群における生存マウス数の推移を示す。図１３の下段の結果から分かるように、ＮＡ群のマウスの生存数の推移と、コントロール群のマウスの生存数の推移にはそれほどの差は見られなかった。
【００６０】
また、上記の移植アッセイにおけるマウスの死因は、腫瘍死よりも、ストレスによると思われる消化管出血、或いは腫瘍からの出血死が多かった。そこで、上記の移植アッセイにおいて、メラノーマ細胞の腹腔内浸潤又はリンパ節転移の存在が確認されたマウスのみについて、その累積生存率をコントロール群（Ｃ）とＮＡ投与群（Ｎ）に分けて比較した結果を図１４に示す。図１４から分かるように、この場合のコントロール群の累積生存日数は、２１日から３６日くらいの間に分布しており、その平均生存日数は２８．３８日であったのに対し、ＮＡ投与群の累積生存日数は１８日から４５日くらいの間に分布しており、その平均生存日数は３７．５５６日であった。すなわち、メラノーマ細胞の腹腔内浸潤又はリンパ節転移の存在が確認されたマウスに関しては、ＮＡ投与群では、コントロール群に対して有意な延命効果が示された。
【００６１】
また、上記の移植アッセイにおいて、正常組織へのメラノーマ細胞の浸潤が確認されたマウス（Invasion（＋）のマウス）の割合（％）を両群について算出した結果を図１５に示す。図１５から分かるように、コントロール群においては、該群の総マウス数に対するInvasion（＋）のマウス（転移を生じているマウス）数の割合が３１．４％であったのに対し、ＮＡ投与群（ＮＡ群）におけるその割合は１１．８％であった。すなわち、ＮＡ投与群におけるInvasion（＋）のマウス数の割合は、コントロール群におけるその割合の約３分の１であった。これにより、ＳＩＲＴ１の阻害物質（ＮＡ）を投与すると、メラノーマ細胞の転移抑制効果が得られることが、in vivoにおいて実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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