(57)【要約】【課題】簡便かつ実用的であり、倫理的問題の少ない網膜変性疾患モデル動物、その製造方法、及び該網膜変性疾患モデルを用いた網膜変性疾患の病態に作用する化合物の候補物質を同定する方法を提供する。【解決手段】actr1b、dynactin3、又はdynactin4遺伝子の機能が欠損あるいは抑制されていることを特徴とする、網膜変性疾患モデル小型硬骨魚類。また、これらの網膜変性疾患モデル小型硬骨魚類を用いたスクリーニング法。本発明によれば、簡便かつ実用的であり、倫理的問題も少なく、かつ高スループットに網膜の形態評価が可能な網膜変性疾患の病態に作用する化合物の候補部室を同定することが可能となる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
actr1b、dynactin3、又はdynactin4遺伝子の機能が欠損あるいは抑制されていることを特徴とする、網膜変性疾患モデル小型硬骨魚類。
【請求項２】
actr1b、dynactin3、又はdynactin4遺伝子の機能を欠損あるいは抑制することを特徴とする網膜変性疾患モデル小型硬骨魚類の製造方法。
【請求項３】
actr1b、dynactin3、又はdynactin4遺伝子の機能が欠損あるいは抑制されている小型硬骨魚類に化合物を投与する工程、及び該化合物の網膜変性疾患の病態に対する作用を確認する工程を含む、網膜変性疾患の病態に作用を有する化合物のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項１の網膜変性疾患モデル小型硬骨魚類に投与して網膜変性疾患状態をイメージングするためのイメージング用プローブであって、一般式（１）又は（７）で表される化合物を少なくとも１種を有効成分として含むことを特徴とする網膜変性疾患イメージング用プローブ。
【化１】
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（一般式（１）、（５）、（６）中、Ｒ１〜Ｒ２は、各々独立して、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、アラルキル基、又はアリール基を表し、芳香環Ａは、下記一般式（２）〜（４）で表される骨格構造を表し、芳香環ＡとＲ２は結合して、下記一般式（５）〜（６）で表される骨格構造を表す。*は窒素原子との結合部位を示す。また、芳香環Ａ中、点線で示した部分は他の環状化合物と縮合していてもよい。］
【化２】
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【化３】
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（一般式（２）中、Ｒ３は、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、アラルキル基、又はアリール基を表し、
一般式（３）中、Ｒ４は、酸素原子、硫黄原子、又はＮ（Ｒ６）を表し、Ｒ５は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はスルホン酸基を表し、Ｒ６は、水素原子、アルキル基、又はアリール基を表し、
一般式（４）中、Ｒ７は、水素原子、アルキル基、アリール基、又は、ヘテロ環基を表し、
一般式（５）中、Ｒ８は、アルキル基を表し、Ｘ及びＹは水素原子又はアルキル基を表し、Ｚは水素原子又はハロゲン原子を表し、ｎは0又は１の整数を表す。また、ＸとＹは結合して環を形成してもよい。
一般式（６）中、Ｒ９〜Ｒ１０は、アルキル基又はアリール基を表し、Ｒ１１は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、カルボン酸基、又はスルホン酸基を表す。）
【化４】
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（一般式（７）中、Ｒ２１〜Ｒ２４は、各々独立して、水素原子、アルキル基、アミノ基、アルコキシ基、又はハロゲン原子を表し、Ｒ２１とＲ２２、Ｒ２２とＲ２３、Ｒ２３とＲ２４、が互いに結合して環を形成してもよく、Ｒ２５〜Ｒ２８は、各々独立して水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はハロゲン原子を表し、Ｂは酸素原子又はＮＨ基を表し、Ｑは酸素原子、硫黄原子、又はＮ−Ｒ２９基を表す。Ｒ２９は、水素原子又はアルキル基を表す。）
【請求項５】
actr1b、dynactin3、又はdynactin4遺伝子の機能が欠損あるいは抑制されている小型硬骨魚類に被験物質を投与する工程、該小型硬骨魚類に請求項４に記載の網膜変性疾患イメージング用プローブを投与する工程、眼内組織に励起光を照射し、蛍光を観察することにより網膜変性疾患状態をイメージングする工程、及びイメージングされた網膜変性疾患状態に基づき該化合物の網膜変性疾患の病態に対する作用を確認する工程を含む、網膜変性疾患の病態に対する作用を有する化合物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、網膜変性疾患の治療及び予防に関する研究開発に用いるためのモデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢性黄斑変性症や網膜色素変性症などの網膜変性疾患は、先進国における罹患率が２０人に１人であり、中途失明の主要な原因であることから、大きな社会的問題となっている。網膜変性疾患の原因として、遺伝因子や環境因子（医薬品の副作用や、職場における化学物質暴露）などの関与が報告されているが、依然として不明な点が多く残されている。現在、網膜変性疾患に対する治療法として、例えば網膜色素変性症に対するビタミンA投与、遮光療法や、加齢性黄斑変性症に対する光線力学療法などが実施されているが、その治療効果は一定ではない。このことは、網膜変性疾患には様々な分子病態が存在しており、各病態に対して適切な薬物治療を選択する必要性を示唆している。
【０００３】
網膜変性疾患における様々な分子病態を明らかにし、薬物投与による治療法の開発や、発病原因を研究するためには、ヒトと類似した網膜を持った実験動物を用いて、網膜変性疾患状態を再現した網膜変性疾患モデル動物を作出することが重要である。従来、網膜変性疾患の研究には、マウスやラットなどの哺乳類が頻用され、多くの重要な知見が蓄積されてきた。特許文献１にはＶａｖ２遺伝子及び／又はＶａｖ３遺伝子の機能を欠損させた眼疾患モデルマウスが開示されている。
【０００４】
しかしながら、哺乳類を用いて確立された網膜変性疾患モデルは、コストや労力、あるいは倫理的観点において課題があるため、簡便かつ実用的であり、倫理的問題の少ないモデル動物としてゼブラフィッシュが注目されている。小型硬骨魚類であるゼブラフィッシュは、昼行性であり色覚に優れており、ヒトと極めて類似した網膜を有していることから、網膜発生の研究に頻用されてきた。ゼブラフィッシュは、飼育にかかるコストが比較的安価で、１ペアの交配により約１００個の受精卵を得ることが可能である。またモルフォリノと呼ばれるアンチセンス核酸を受精卵にマイクロインジェクションすることにより、特定の遺伝子の発現をノックダウンすることが容易に可能である。さらに飼育水に添加された薬物を消化管から体内に吸収するため、薬物スクリーニングにも適したモデル動物である。
【０００５】
このような特徴を有するゼブラフィッシュを用いて、網膜の形態変化を指標としたスクリーニングが実施され、同定された遺伝子や薬物の多くが、ヒトやマウスにおいても網膜変性疾患との関連性が報告されている。このことから、網膜変性疾患研究におけるゼブラフィッシュの有用性が世界的に確立しつつある（非特許文献１）。しかしながら、網膜の形態評価は、網膜切片を用いた免疫染色が主流であり、解析に要する時間と労力の面で課題がある。
【０００６】
また、特許文献２にはゼブラフィッシュ網膜のライブイメージングを可能にする蛍光色素が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０８／０９０７４２号パンフレット
【特許文献２】特開２０１０−１６８３６９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Fadool, J.M., and Dowling, J.E. (2008) Zebrafish: A model system for the study of eye genetics. Prog. Retin. Eye Res.. 27(1):89-110
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
哺乳類を用いて確立された網膜変性疾患モデルは、コストや労力、あるいは倫理的観点において課題がある。本発明が解決しようとする課題の第一は、簡便かつ実用的であり、倫理的問題の少ない網膜変性疾患モデル動物、その製造方法、及び該網膜変性疾患モデルを用いた網膜変性疾患の病態に作用する化合物の候補物質を同定する方法を提供することである。
【００１０】
また、網膜の形態評価は、網膜切片を用いた免疫染色が主流であり、解析に要する時間と労力の面で難点を抱えている。本発明が解決しようとする課題の第二は、生きたまま網膜の層構造を可視化することによって、高スループットに網膜の形態評価が可能な網膜変性疾患の病態に作用する化合物の候補物質を同定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、遺伝子actr1b、 dynactin3、 又はdynactin4のノックダウンにより、ゼブラフィッシュに対して網膜変性障害を惹起し得ることを偶然発見した。またこれらの遺伝子に対するモルフォリノアンチセンス核酸のインジェクション量を制御することにより、網膜変性障害の程度を制御できることを明らかにした。障害の程度の異なる網膜変性疾患モデル動物は、各病態モデル網膜における遺伝子発現を比較解析することや、網膜変性疾患の各モデルを識別できるバイオマーカーを同定すること、さらにはそれぞれの網膜変性モデルにおいて重要な機能を有する遺伝子を同定し、その遺伝子を標的とする治療薬開発の可能性を検討するために有用であることを見出し、本発明に到達した。
【００１２】
すなわち本発明は、
１．  actr1b、 dynactin3、 又はdynactin4遺伝子の機能が欠損あるいは抑制されていることを特徴とする、網膜変性疾患モデル小型硬骨魚類、
２．  actr1b、 dynactin3、 又はdynactin4遺伝子の機能を欠損あるいは抑制することを特徴とする網膜変性疾患モデル小型硬骨魚類の製造方法、
３．  actr1b、 dynactin3、 又はdynactin4遺伝子の機能が欠損あるいは抑制されている小型硬骨魚類に化合物を投与する工程、及び該化合物の網膜変性疾患の病態に対する作用を確認する工程を含む、網膜疾患の病態に作用する化合物のスクリーニング方法、
４．  actr1b、 dynactin3、 又はdynactin4遺伝子の機能が欠損あるいは抑制されている小型硬骨魚類に化合物を投与する工程、該小型硬骨魚類に網膜組織染色用組成物を投与する工程、眼内組織に励起光を照射し、蛍光を観察することにより網膜変性疾患状態をイメージングする工程、及びイメージングされた網膜変性疾患状態に基づき該化合物の網膜変性疾患の病態に対する作用を確認する工程を含む、網膜変性疾患の病態に作用する化合物のスクリーニング方法、
からなる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、網膜変性疾患モデル小型硬骨魚類が提供される。該網膜変性疾患モデル小型硬骨魚類は、簡便かつ実用的であり、倫理的問題の少ない網膜変性疾患モデル動物として、網膜変性疾患の病態に作用する化合物の候補物質を同定するために利用が可能である。
【００１４】
また本発明の網膜変性疾患モデル小型硬骨魚類を用いたスクリーニング方法により、高スループットに網膜の形態評価が可能な網膜変性疾患の病態に作用する化合物の候補物質を同定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】actr1b遺伝子の機能が抑制されている網膜変性疾患モデルゼブラフィッシュの網膜組織のライブイメージング画像である。コントロールはactr1b遺伝子の機能が抑制されていない個体の網膜像を示す。actr1b遺伝子の機能抑制の程度が、弱い、中程度、あるいは強いときのそれぞれの個体の網膜像を示す。GFPの蛍光と蛍光色素による染色像とを重ね合わせて示している。
【図２】dynactin3遺伝子の機能が抑制されている網膜変性疾患モデルゼブラフィッシュの網膜組織のライブイメージング画像である。コントロールはdynactin3遺伝子の機能が抑制されていない個体の網膜像を示す。dynactin3遺伝子の機能抑制の程度が、弱い、中程度、あるいは強いときのそれぞれの個体の網膜像を示す。GFPの蛍光と蛍光色素による染色像とを重ね合わせて示している。
【図３】dynactin4遺伝子の機能が抑制されている網膜変性疾患モデルゼブラフィッシュの網膜組織のライブイメージング画像である。コントロールはdynactin4遺伝子の機能が抑制されていない個体の網膜像を示す。Dynactin4遺伝子の機能抑制の程度が、弱い、中程度、あるいは強いときのそれぞれの個体の網膜像を示す。GFPの蛍光と蛍光色素による染色像とを重ね合わせて示している。
【図４】actr1b遺伝子の機能が抑制されている網膜変性疾患モデルゼブラフィッシュの網膜組織のライブイメージング画像である。コントロールはactr1b遺伝子の機能が抑制されていない個体の網膜像を示す。図１とは異なるイメージング用プローブを用いて網膜組織を可視化している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、actr1b、dynactin3、又はdynactin4遺伝子の機能が欠損あるいは抑制されていることを特徴とする、網膜変性疾患モデル小型硬骨魚類である。
【００１７】
小型硬骨魚類としては、フグ、メダカ、金魚、ゼブラフィッシュ、ジャイアント・レリオ等が挙げられる。特に、ゼブラフィッシュはゲノムの解読がほぼ完了しており、また飼育及び繁殖が容易で流通価格も安く、受精後４８〜７２時間で主要臓器・組織の基本構造が出来上がるため、好ましい。眼は多くの脊椎動物の間で解剖学的、組織学的、生化学的に非常によく保存されており、発生についても同様である。ゼブラフィッシュの網膜は、現存の脊椎動物の多くと同様に７種類の主要な細胞種から構成され（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７，８９−１１０頁（２００８年））、ヒトとゼブラフィッシュの網膜組織切片像の比較ではスケールは異なるものの、非常に高い共通性を有している（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４，５０４−５１２（２００４年））。ゼブラフィッシュを用いることで、マウスなどに較べて飼育コストが低く、用いる化合物の量も少量で済むなどの利点が高い。また、形態だけではなく、視物質のひとつであるロドプシンの塩基配列上のヒトとの共通性はマウスよりも若干高く、分子レベルでヒトとも高い相同性を持つことが示されている。また、齧歯類が夜行性なのに対して、ゼブラフィッシュは昼行性であり、網膜には桿体細胞に加えて多様な錐体細胞を有していることからもヒトとゼブラフィッシュは組織学的、機能的に相同性が高い。以上のことから、ゼブラフィッシュは本発明の網膜変性疾患モデル小型硬骨魚類として好ましい。
【００１８】
ゼブラフィッシュactr1b、 dynactin3、及びdynactin4遺伝子と、それらの塩基配列は、Genbank にそれぞれaccession No. NC_007121、NC_007127、及びNC_007125として公知である。
【００１９】
これらの遺伝子の機能は、当業者に公知の技術により欠損させることができる。このような遺伝子の機能の欠損は、公知のノックアウト動物の作製方法、例えばジーンターゲッティング法により達成することができる。
【００２０】
また、これらの遺伝子の機能は、当業者に公知の技術により抑制することができる。このような遺伝子の機能の抑制は、公知のノックダウン動物の作製方法、例えばモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（MO）やsiRNAを用いて該遺伝子の発現を抑制することにより達成することができる。
【００２１】
ゼブラフィッシュactr1b遺伝子に対するモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、具体的には、ゼブラフィッシュactr1b遺伝子mRNAのAUG翻訳開始部位に対する特異的MO（配列番号１）、該遺伝子のスプライスドナー部位及びアクセプター部位に対する特異的MOを例示できる。
【００２２】
ゼブラフィッシュactr1b遺伝子mRNAのAUG翻訳開始部位に対するMO：
5’ GGCTATAATATCATACGACTCCATG 3’  （配列番号１）
【００２３】
ゼブラフィッシュdynactin3遺伝子に対するモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、具体的には、ゼブラフィッシュdynactin3遺伝子mRNAのAUG翻訳開始部位に対する特異的MO（配列番号２）、該遺伝子のスプライスドナー部位及びアクセプター部位に対する特異的MOを例示できる。
【００２４】
ゼブラフィッシュdynactin3遺伝子mRNAのAUG翻訳開始部位に対するMO：
5’ CTTCCAGATTGCTTTTCTCTTCCAT 3’  （配列番号２）
【００２５】
ゼブラフィッシュdynactin4遺伝子に対するモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、具体的には、ゼブラフィッシュdynactin4遺伝子mRNAのAUG翻訳開始部位に対する特異的MO（配列番号３）、該遺伝子のスプライスドナー部位及びアクセプター部位に対する特異的MOを例示できる。
【００２６】
ゼブラフィッシュdynactin4遺伝子mRNAのAUG翻訳開始部位に対するMO：
5’ GCGTCGCCATTTCTCTCCGAGTTTT 3’  （配列番号３）
【００２７】
このような外来遺伝子を個体へ導入する方法には、ベクターを用いずにクローニングしたDNAをそのまま初期胚に注射してランダムに起きるゲノム中への取り込みを利用する方法や、ベクターとしてトランスポゾンやレトロウイルスを用いる方法等が知られている。ゼブラフィッシュ網膜変性疾患モデルの作製は、具体的にはゼブラフィッシュactr1b遺伝子に対するMOをゼブラフィッシュ胚に公知方法でインジェクションすることにより実施できる（実施例１参照）。ゼブラフィッシュ胚へのMOのインジェクションは１から４細胞期に実施することが好ましい。
【００２８】
また本発明は、actr1b、dynactin3、又はdynactin4遺伝子の機能を欠損あるいは抑制することを特徴とする網膜変性疾患モデル小型硬骨魚類の製造方法である。
【００２９】
これらの遺伝子の機能は、当業者に公知の技術により欠損させることができる。このような遺伝子の機能の欠損は、公知のノックアウト動物の作製方法、例えばジーンターゲッティング法により達成することができる。
【００３０】
また、これらの遺伝子の機能は、当業者に公知の技術により抑制することができる。このような遺伝子の機能の抑制は、公知のノックダウン動物の作製方法、例えばモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（MO）やsiRNAを用いて該遺伝子の発現を抑制することにより達成することができる。
【００３１】
本発明の網膜変性疾患モデル小型硬骨魚類の製造方法において、MOのゼブラフィッシュ胚へのインジェクション量を制御することにより、網膜変性障害の程度を制御することが可能となる。網膜変性障害を惹起するMOのインジェクション量は、ゼブラフィッシュ胚あたり、0.01から10ピコモルであり、好ましくは0.1から1ピコモルであり、より好ましくは0.1から0.3ピコモルである。
【００３２】
本発明にしたがえば、簡便な方法により安定した形質を示す網膜変性疾患モデル動物を大量に得ることができる。
【００３３】
さらに本発明は、actr1b、dynactin3、又はdynactin4遺伝子の機能が欠損あるいは抑制されている小型硬骨魚類に化合物（被験物質）を投与する工程、及び該化合物の網膜変性疾患の病態に対する作用を確認する工程を含む、網膜変性疾患の病態に作用する化合物のスクリーニング方法である。
【００３４】
本発明の方法により得られる網膜変性疾患モデルゼブラフィッシュは、網膜変性疾患の病態に作用する化合物を同定するために用いることができる。ゼブラフィッシュは透明であるため、ゼブラフィッシュの網膜の形態、層構造は、特殊な装置を用いることなく、肉眼又は実体顕微鏡で容易に観察することができる。生体画像での解析には倍率４０倍程度の実体顕微鏡が望ましい。顕微鏡に付属のデジタルカメラで網膜を撮影し、Adobe PhotoshopやScion Imageなどの一般的な画像解析ソフトにて、網膜層構造の厚みを測定し、数値化する。本発明の網膜変性疾患モデルゼブラフィッシュは正常個体と比較し、明らかに網膜視細胞層及び内網状層の欠損・菲薄化・構造の乱れが認められ、これらはヒトの網膜変性疾患の症状と一致する。網膜の機能としては、電気生理学的手法を用い、ゼブラフィッシュの網膜を体表から挟み込むような形で電極を置くことで、光刺激により誘導された網膜電図を測定、評価することができる。
【００３５】
網膜変性疾患モデルゼブラフィッシュでは透明な体を通して眼底への血流が認められる。
血管系の循環状態の確認には血管造影法を用いることも可能である。血管造影法を用いる場合は、腹側の心臓よりやや尾部側あるいは尾部の静脈から、ガラスキャピラリーで蛍光色素・蛍光色素を結合させたマイクロビーズ（FITC-コンジュゲート化マイクロビーズやCy3等）あるいは色素（Rose Bengal等）を微量注入する。ゼブラフィッシュは体が透明であるため、血流をリアルタイムで観察することが可能である。
【００３６】
組織学的検討には、パラフィン切片標本あるいは凍結切片標本を用い、HE染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）などの一般的な染色法を行うことができる。
【００３７】
また、網膜変性疾患に特異的な遺伝子の発現を調べるためには、ISH（in situ hybridization）法やISP（in situ PCR）法、レーザーマイクロダイセクション法による網膜の各種細胞の抽出、RNA増幅法などを用いることができる。その後のアプリケーションとしてはDNAチップ、ディファレンシャルスクリーニング法を始めとする様々な遺伝子発現解析が可能である。網膜変性疾患に特異的なタンパク質の発現を調べるためには、免疫染色法（抗体）やプロテインチップ、二次元電気泳動、LC-MASS/TOF-MASS法、プロテインシーケンサーによる実験を行うことができる。
【００３８】
網膜変性疾患状態に対する作用を有する化合物かどうかは、試験物質を本発明の方法により製造された網膜変性疾患を呈するゼブラフィッシュと接触させ，前記試験物質がゼブラフィッシュの網膜変性疾患症状を変化させるか否かを測定することにより同定することができる。この方法は、特に、網膜変性疾患症状を軽減させる、又は治癒する作用を有する化合物の同定を目的とした検討に好適に用いられる。化合物が網膜変性疾患症状を呈する本発明のゼブラフィッシュに及ぼす効果を調べるためには、本発明の方法により得られたゼブラフィッシュに候補化合物を投与し、網膜層構造の形態を観察する。試験化合物を投与する方法としては、候補化合物が水溶性である場合には飼育水中に溶解すればよく、水不溶性である場合には適当な界面活性剤との複合体又はエマルジョンの形で飼育水中に懸濁すればよい。あるいは、ゼブラフィッシュの餌に混ぜて経口投与してもよく、注射などにより非経口投与してもよい。基本的に、飼育水は毎日交換するのが望ましいが、候補化合物によっては一定期間をあけて交換することも可能である。ハイスループット化には、化合物の投与や飼育水の交換をバイオメックなどのロボティクスを用いて行うことが好ましい。
【００３９】
多数の候補化合物をスクリーニングする場合は、上述の測定方法をマイクロタイタープレート又はマイクロアレイのフォーマットで行うことができる。具体的な例として、候補化合物を飼育水中に溶解する方法を説明する。まず網膜変性疾患モデルゼブラフィッシュの飼育及び化合物投与には９６ウェルスクエアプレートに、候補化合物ライブラリーは別の９６ウェルマイクロプレートに用意する。そしてロボティクスにより、化合物ライブラリーが分注されている９６ウェルマイクロプレートから希望の候補化合物をゼブラフィッシュを飼育している各ウェルに添加する。この方法がスループット性能及び正確性、コンビネーションの豊富さなどの点でもっとも望ましい。詳細な方法としては、まず９６ウェルスクエアプレート１ウェルあたり２００μlの飼育水にゼブラフィッシュの受精卵を入れ、次に、候補化合物を溶解した飼育水１００μlを加える。これらの化合物を加える際の濃度は、最終濃度を調整するように設定する。候補化合物の投与及び飼育水の交換にはロボティクスを用いることが望ましいが、飼育水吸引の際、ゼブラフィッシュの吸い上げ及び損傷を避けるため、吸入スピードを下げる、ピペットの先端部９６スクエアプレートの底辺より、５mm以上上の位置にする、数回のピペッティングで飼育水を交換するなどの工夫が必要である。ちなみに９６ウェルスクエアプレートは各ウェル約５００μlの液量が保持できる。３種類以上の化合物を同時に投与する場合は、たとえば前述の液量を１００μlから５０μlに減らすなど、適宜変更すればよい。
【００４０】
さらにまた本発明は、actr1b、dynactin3、又はdynactin4遺伝子の機能が欠損あるいは抑制されている小型硬骨魚類に化合物を投与する工程、該小型硬骨魚類に網膜組織染色用組成物を投与する工程、眼内組織に励起光を照射し、蛍光を観察することにより網膜疾患状態をイメージングする工程、及びイメージングされた網膜疾患状態に基づき該化合物の網膜疾患に対する作用を確認する工程を含む、網膜疾患の病態に対する作用を有する化合物のスクリーニング方法である。
【００４１】
網膜変性疾患状態をイメージングするためには、特許文献２に開示された蛍光色素などを用いることができる。特に好ましくは、本発明の一般式（１）又は（７）で表される化合物を少なくとも１種を有効成分として含むことを特徴とする網膜変性疾患イメージング用プローブが用いられる。
【化１】
2012165715.tif 000003
【００４２】
ここで、一般式（１）、（５）、（６）中、Ｒ１〜Ｒ２は、各々独立して、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、アラルキル基、又はアリール基を表す。また、芳香環Ａは、下記一般式（２）〜（４）で表される骨格構造を表し、芳香環ＡとＲ２は結合して、下記一般式（５）〜（６）で表される骨格構造を表してもよい。*は窒素原子との結合部位を示す。また、芳香環Ａ中、点線で示した部分は他の環状化合物と縮合していてもよい。
【化２】
2012165715.tif 000004
【化３】
2012165715.tif 000005
【００４３】
ここで、一般式（２）中、Ｒ３は、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、アラルキル基、又はアリール基を表す。一般式（３）中、Ｒ４は、酸素原子、硫黄原子、又はＮ（Ｒ６）を表し、Ｒ５は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はスルホン酸基を表し、Ｒ６は、水素原子、アルキル基、又はアリール基を表す。一般式（４）中、Ｒ７は、水素原子、アルキル基、アリール基、又はヘテロ環基を表す。一般式（５）中、Ｒ８は、アルキル基を表し、Ｘ及びＹは水素原子又はアルキル基を表し、Ｚは水素原子又はハロゲン原子を表し、ｎは0又は１の整数を表す。また、ＸとＹは結合して環を形成してもよい。一般式（６）中、Ｒ９〜Ｒ１０は、アルキル基又はアリール基を表し、Ｒ１１は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、カルボン酸基、又はスルホン酸基を表す。
【００４４】
前記一般式（１）、（５）、（６）中のＲ１〜Ｒ２におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、及び３−ヘキシル基等が挙げられる。さらに、該基は、色素化合物の保存安定性を著しく阻害するものでなければさらに置換基を有していてもよい。
【００４５】
前記一般式（１）、（５）、（６）中のＲ１〜Ｒ２におけるシクロアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、シクロヘキシル基等が挙げられる。さらに、該基は、色素化合物の保存安定性を著しく阻害するものでなければさらに置換基を有していてもよい。
【００４６】
Ｒ１〜Ｒ２におけるアラルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、ベンジル基及びフェネチル基等が挙げられる。また、Ｒ１〜Ｒ２におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基及びナフチル基などが挙げられる。
【００４７】
前記一般式（２）中のＲ３におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基及びブチル基等が挙げられる。
【００４８】
前記一般式（２）中のＲ３におけるシクロアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、シクロヘキシル基等が挙げられる。
【００４９】
前記一般式（１）及び（２）で表される化合物中、特に、Ｒ１又はＲ２の一方が水素原子、もう一方が、アルキル基又はアラルキル基である場合、蛍光性が強く好ましい。Ｒ３はメチル基、ブチル基及びシクロヘキシル基が合成の容易さから好ましい。 
【００５０】
前記一般式（３）中のＲ５〜Ｒ６におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、及びブチル基等が挙げられる。
Ｒ５におけるアルコキシ基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、及びブトキシ基等が挙げられる。
Ｒ６におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基などが挙げられる。
【００５１】
前記一般式（４）中のＲ７におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、及びブチル基等が挙げられる。
Ｒ７におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、例えば、フェニル基などが挙げられる。さらに、該基には、色素化合物の保存安定性を著しく阻害するものでなければさらに置換基を有していてもよい。
Ｒ７におけるヘテロ環基としては、特に限定されるものではないが、ピリジル基、ピラジル基、及びモルホリニル基等が挙げられる。
【００５２】
前記一般式（５）中のＲ８、Ｘ、Ｙにおけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、及びブチル基等が挙げられる。さらに、該基には、色素化合物の保存安定性を著しく阻害するものでなければさらに置換基を有していてもよい。
前記一般式（５）中の、Ｚにおけるハロゲン原子としては、特に限定されるものではないが、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、及びヨウ素原子等が挙げられる。
前記一般式（５）中のＸとＹが結合して形成する環としては、特に限定されるものではないが、シクロペンタン環及びベンゼン環が挙げられる。
【００５３】
前記一般式（６）中のＲ９〜Ｒ１０におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、及びブチル基等が挙げられる。
Ｒ９〜Ｒ１０におけるアリール基としては、特に限定されるものではないが、例えば、フェニル基などが挙げられる。さらに、該基には、色素化合物の保存安定性を著しく阻害するものでなければさらに置換基を有していてもよい。
【００５４】
Ｒ１１におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、及びブチル基等が挙げられる。
Ｒ１１におけるアルコキシ基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、及びブトキシ基等が挙げられる。
【００５５】
本発明にかかる一般式（１）〜（６）で表される色素化合物は、市販されており入手可能であるが、公知の方法によって合成することも可能である。
一般式（１）〜（６）で表わされる色素化合物の好ましい具体例（化合物（８）から化合物（１４）、及び化合物（２９）から化合物（４４））を次に示す。ただし、本発明は以下のものに限定されるわけではない。
【化４】
2012165715.tif 000006
【化５】
2012165715.tif 000007
【００５６】
次に、一般式（７）について説明する。
【化６】
2012165715.tif 000008
【００５７】
一般式（７）中、Ｒ２１〜Ｒ２４は、各々独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基又はハロゲン原子を表す。Ｒ２１とＲ２２、Ｒ２２とＲ２３、又はＲ２３とＲ２４が互いに結合して環を形成しても良い。Ｒ２５〜Ｒ２８は、各々独立して水素原子、アルキル基、アルコキシ基、又はハロゲン原子を表す。Ｂは酸素原子又はＮＨ基を表す。Ｑは酸素原子、硫黄原子、Ｎ−Ｒ２９基を表す。Ｒ２９は、水素原子、又はアルキル基を表す。
【００５８】
前記一般式（７）中のＲ２１〜Ｒ２９におけるアルキル基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、及びブチル基等が挙げられる。Ｒ２１〜Ｒ２８におけるアルコキシ基としては、特に限定されるものではないが、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、及びブトキシ基等が挙げられる。
Ｒ２１〜Ｒ２４におけるアミノ基としては、特に限定されるものではないが、例えば、無置換アミノ基；Ｎ−メチルアミノ基及びＮ−エチルアミノ基等のモノ置換アミノ基；並びにＮ，Ｎ−ジメチルアミノ基、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ基、及びＮ，Ｎ−メチルプロピルアミノ基等のジ置換アミノ基が挙げられる。
【００５９】
Ｒ２１〜Ｒ２８におけるハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、及びヨウ素原子等が挙げられる。
Ｒ２１とＲ２２、Ｒ２２とＲ２３、又はＲ２３とＲ２４が互いに結合して形成する環としては、特に限定されるものではないが、例えば、ベンゼン環等の芳香環、シクロヘキサン環等の飽和環、シクロペンテン環等の部分飽和環及びピペリジン環等のヘテロ環が挙げられる。該環には、色素化合物の保存安定性を著しく阻害するものでなければさらに置換基を有していてもよい。
【００６０】
前記一般式（７）中、特にＲ２２がアミノ基又はアルコキシ基等の電子供与性置換基の場合は蛍光強度が増すので好ましく、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ基等のジ置換アミノ基の場合は蛍光強度が強く、最も好ましい。
Ｑは酸素原子、硫黄原子が標識性の観点から好ましく、特に酸素原子の場合が蛍光強度も強く、特定の部位を効果的に標識することが出来るためより好ましい。
Ｒ２６がメチル等のアルキル基、クロロ原子等のハロゲン原子を有する時は蛍光強度も強く、特定の部位を効果的に標識することが出来るため好ましい。
【００６１】
本発明にかかる一般式（７）で表される色素化合物は、市販されており入手可能であるが、公知の方法（例えば、Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  ｐｉｇｍｅｎｔｓ，Ｖｏｌ．４７（Ｉｓｓｕｅｓ１−２），７９−８９頁（２０００）等）によって合成する事も可能である。
一般式（７）で表わされる色素化合物の好ましい具体例（化合物（１５）から化合物（２８））を次に示す。ただし、本発明は以下のものに限定されるわけではない。
【化７】
2012165715.tif 000009
【００６２】
本発明の網膜変性疾患イメージング用プローブに含まれる一般式（１）又は（７）で表される化合物は、標識の対象となる中枢神経系組織へ移行させることから、低分子化合物であることが好ましく、分子量が２，０００以下であるものが選択される。好ましくは分子量が１，０００以下の化合物、特に分子量が６００以下の化合物であることが好ましい。
【００６３】
また、本発明の網膜変性疾患イメージング用プローブに含まれる化合物は蛍光性を有する蛍光性化合物であることが好ましい。蛍光性の化合物であれば感度が高いため、低濃度で標識することができ、必要とする化合物の量を相対的に減らすことができる。また、標識部位が異なり、蛍光スペクトルの異なる化合物等の組み合わせを選択すれば、多重標識が可能になるため、一度の観察から得られる情報が増えるため、有用性が高い。
【００６４】
以下、本説明を実施例によりさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６５】
リサミン(赤色蛍光物質)でラベルしたコントロールMO（標的遺伝子なし）
フェノールレッド (pH indicator)に、
ゼブラフィッシュactr1b遺伝子mRNAのAUG翻訳開始部位に対するMO：
5’ GGCTATAATATCATACGACTCCATG 3’  （ACTR1B_tr1、配列番号１）
又は、コントロールとして、
ACTR1B_tr1の５塩基ミスマッチMO：
5’ GGCaAaAATATgATACcAgTCCATG 3’  （ACTR1B_tr1mm2、配列番号４）
を各種濃度で加えて、0.3から0.1mMとした。
これらのモルフォリノ溶液を、桿体視細胞にGFPを発現するゼブラフィッシュTg(zfRh1-3.7B:EGFP)の受精卵（1-4細胞期）にマイクロインジェクションした。翌日、リサミンの蛍光量を用いて、ゼブラフィッシュ受精卵を選別するとともに、インジェクションされたMOの量を推定した。
【００６６】
受精後5日目（5 dpf）に、ゼブラフィッシュを網膜組織用標識組成物：
【化８】
2012165715.tif 000010
で染色して、共焦点レーザー顕微鏡にて網膜の層構造をライブイメージング解析するとともに、GFPの蛍光に基づいて視細胞層を可視化した。化合物（１１）による染色操作は次のようにして行った。
化合物（１１）の濃度が１ｍＭであるＤＭＳＯ溶液に蒸留水を加えて、前記化合物（１１）の濃度が１μＭである染色液１を調製した。６穴マルチプレートの任意のウェル中に、４ｍＬの染色液１とゼブラフィッシュ胚の稚魚を入れ、１時間放置した。次に、ウェル中の染色液１を除去し、蒸留水１ｍＬで置換する操作を３回行った。次に、ウェルから稚魚を取り出し、スライドガラス上で５％低温融解アガロースゲルに埋没させて動きを制限し、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製  Ｐａｓｃａｌ  Ｅｘｃｉｔｅｒ）を用いて網膜組織の観察を行った。化合物（１１）の蛍光特性は励起波長554nm、蛍光波長580 nmであり、これらの波長に適合するようにして観察を行った。
【００６７】
異なるACTR1B_tr1のインジェクション量によりノックダウンされた程度が強いと認められる個体、中程度の個体、及び程度が低いと認められる個体のそれぞれと、コントロールから選ばれた個体の網膜画像を図１に示す。ACTR1B_tr1mm2をインジェクションしたコントロールのゼブラフィッシュに比較して、ACTR1B_tr1をインジェクションしたゼブラフィッシュでは、内網状層の不整、内顆粒層網状構造消失、外網状層の形成不全、視細胞層の形成不全が認められた。ACTR1B_tr1のインジェクション量が増大するに従って、内網状層の不整、内顆粒層網状構造消失、外網状層の形成不全、視細胞層の形成不全の程度は増大した。これらの網膜組織構造の状態は化合物（１１）を含有する網膜変性疾患イメージング用プローブによって、生きたままイメージングすることが出来た。
【実施例２】
【００６８】
ゼブラフィッシュdynactin3遺伝子mRNAのAUG翻訳開始部位に対するMO：
5’ CTTCCAGATTGCTTTTCTCTTCCAT 3’  （dctn3_1、配列番号２）
又は、コントロールとして、
dctn3_1の５塩基ミスマッチMO：
5’ CTTCgAcATTcCTTTTgTgTTCCAT 3’  （dctn3_1mm1、配列番号５）
を各種濃度で加えて、0.3から0.1mMとした以外は実施例１と同様にして、モルフォリノ溶液を調製した。
【００６９】
これらのモルフォリノ溶液を、桿体視細胞にGFPを発現するゼブラフィッシュTg(zfRh1-3.7B:EGFP)の受精卵（1-4細胞期）にマイクロインジェクションした。翌日、リサミンの蛍光量を用いて、ゼブラフィッシュ受精卵を選別するとともに、インジェクションされたMOの量を推定した。
【００７０】
受精後5日目（5 dpf）に、ゼブラフィッシュを網膜組織用標識組成物：
【化９】
2012165715.tif 000011
で染色して、共焦点レーザー顕微鏡にて網膜の層構造をライブイメージング解析するとともに、GFPの蛍光に基づいて視細胞層を可視化した。化合物（１１）による染色操作は実施例１と同様にして行った。
【００７１】
異なるdctn3_1のインジェクション量によりノックダウンされた程度が強いと認められる個体、中程度の個体、及び程度が低いと認められる個体のそれぞれと、コントロールから選ばれた個体の網膜画像のライブイメージング画像を図２に示す。dctn3_1mm1をインジェクションしたコントロールのゼブラフィッシュに比較して、dctn3_1をインジェクションしたゼブラフィッシュでは、内網状層の不整、内顆粒層網状構造消失、外網状層の形成不全、視細胞層の形成不全が認められた。dctn3_1のインジェクション量が増大するに従って、内網状層の不整、内顆粒層網状構造消失、外網状層の形成不全、視細胞層の形成不全の程度は増大した。これらの網膜組織構造の状態は化合物（１１）を含有する網膜変性疾患イメージング用プローブによって、生きたままイメージングすることが出来た。
【実施例３】
【００７２】
ゼブラフィッシュdynactin4遺伝子mRNAのAUG翻訳開始部位に対するMO：
5’ GCGTCGCCATTTCTCTCCGAGTTTT 3’  （dctn4_1、配列番号３）
又は、コントロールとして、
dctn4_1の５塩基ミスマッチMO：
5’ GgGaCGCCATTTgTCTCgGAcTTTT 3’  （dctn4_1mm2、配列番号６）
を各種濃度で加えて、0.3から0.1mMとした以外は実施例１と同様にして、モルフォリノ溶液を調製した。
【００７３】
これらのモルフォリノ溶液を、桿体視細胞にGFPを発現するゼブラフィッシュTg(zfRh1-3.7B:EGFP)の受精卵（1-4細胞期）にマイクロインジェクションした。翌日、リサミンの蛍光量を用いて、ゼブラフィッシュ受精卵を選別するとともに、インジェクションされたMOの量を推定した。
【００７４】
受精後5日目（5 dpf）に、ゼブラフィッシュを網膜組織用標識組成物：
【化１０】
2012165715.tif 000012
で染色して、共焦点レーザー顕微鏡にて網膜の層構造をライブイメージング解析するとともに、GFPの蛍光に基づいて視細胞層を可視化した。化合物（１１）による染色操作は実施例１と同様にして行った。
【００７５】
異なるdctn4_1のインジェクション量によりノックダウンされた程度が強いと認められる個体、中程度の個体、及び程度が低いと認められる個体のそれぞれと、コントロールから選ばれた個体の網膜画像のライブイメージング画像を図３に示す。dctn4_1mm2をインジェクションしたコントロールのゼブラフィッシュに比較して、dctn4_1をインジェクションしたゼブラフィッシュでは、内網状層の不整、内顆粒層網状構造消失、外網状層の形成不全、視細胞層の形成不全が認められた。dctn4_1のインジェクション量が増大するに従って、内網状層の不整、内顆粒層網状構造消失、外網状層の形成不全、視細胞層の形成不全の程度は増大した。これらの網膜組織構造の状態は化合物（１１）を含有する網膜変性疾患イメージング用プローブによって、生きたままイメージングすることが出来た。
【実施例４】
【００７６】
リサミン(赤色蛍光物質)でラベルしたコントロールMO（標的遺伝子なし）
フェノールレッド (pH indicator)に、
ゼブラフィッシュactr1b遺伝子mRNAのAUG翻訳開始部位に対するMO：
5’ GGCTATAATATCATACGACTCCATG 3’  （ACTR1B_tr1、配列番号１）
又は、コントロールとして、
ACTR1B_tr1の５塩基ミスマッチMO：
5’ GGCaAaAATATgATACcAgTCCATG 3’  （ACTR1B_tr1mm2、配列番号４）
を加えて、0.1mMとした。
【００７７】
これらのモルフォリノ溶液を、桿体視細胞にGFPを発現するゼブラフィッシュTg(zfRh1-3.7B:EGFP)の受精卵（1-4細胞期）にマイクロインジェクションした。受精後4日目（4 dpf）に、稚魚の眼球を摘出し、total RNAを精製した。このtotal RNAを用いたDNAマイクロアレイ解析を行った。DNAマイクロアレイは、Agilent社zebrafish oligoarray ver2（G2519F#19161）を使用した。その結果、ACTR1B_tr1とACTR1B_tr1mm2との間で、有意な発現変化を認める25プローブを同定した。
【実施例５】
【００７８】
リサミン(赤色蛍光物質)でラベルしたコントロールMO（標的遺伝子なし）
フェノールレッド (pH indicator)に、
ゼブラフィッシュactr1b遺伝子mRNAのAUG翻訳開始部位に対するMO：
5’ GGCTATAATATCATACGACTCCATG 3’  （ACTR1B_tr1、配列番号１）
又は、コントロールとして、
ACTR1B_tr1の５塩基ミスマッチMO：
5’ GGCaAaAATATgATACcAgTCCATG 3’  （ACTR1B_tr1mm2、配列番号４）
を加えて、0.3mMとした。
【００７９】
これらのモルフォリノ溶液を、ゼブラフィッシュの受精卵（1-4細胞期）にマイクロインジェクションした。
【００８０】
受精後5日目（5 dpf）に、ゼブラフィッシュを網膜組織用標識組成物：
【化１１】
2012165715.tif 000013
で染色して、共焦点レーザー顕微鏡にて網膜の層構造をライブイメージング解析するとともに、GFPの蛍光に基づいて視細胞層を可視化した。化合物（２３）による染色操作は次のようにして行った。
【００８１】
化合物（２３）の濃度が１ｍＭであるＤＭＳＯ溶液に蒸留水を加えて、前記化合物（２３）の濃度が１μＭである染色液２を調製した。６穴マルチプレートの任意のウェル中に、４ｍＬの染色液２とゼブラフィッシュ胚の稚魚を入れ、１時間放置した。次に、ウェル中の染色液２を除去し、蒸留水１ｍＬで置換する操作を３回行った。次に、ウェルから稚魚を取り出し、スライドガラス上で５％低温融解アガロースゲルに埋没させて動きを制限し、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社製  Ｐａｓｃａｌ  Ｅｘｃｉｔｅｒ）を用いて網膜組織の観察を行った。化合物（２３）の蛍光特性は励起波長422nm、蛍光波長476 nmであり、これらの波長に適合するようにして観察を行った。
【００８２】
ACTR1B_tr12のインジェクションによりノックダウン処理をした個体と、コントロールのライブイメージング画像を図４に示す。ACTR1B_tr1mm2をインジェクションしたコントロールのゼブラフィッシュに比較して、ACTR1B_tr1をインジェクションしたゼブラフィッシュでは、内網状層の不整、内顆粒層網状構造消失、外網状層の形成不全、視細胞層の形成不全が認められ、これらの網膜組織構造の状態を生きたままイメージングすることが出来た。これらの網膜組織構造の状態は化合物（２３）を含有する網膜変性疾患イメージング用プローブによって、生きたままイメージングすることが出来た。
【実施例６】
【００８３】
実施例１と同様にして網膜変性疾患を呈するゼブラフィッシュを作製した。
【００８４】
化合物（１１）の代わりに化合物（８）から（１０）、（１２）から（２２）、及び（２４）から（４４）の１μＭである染色液を用いて網膜組織をin vivoで染色した。これらの化合物の蛍光特性は表１の通りであり、これらの波長に適合するようにして観察を行った。結果、これらの化合物を用いて網膜変性疾患状態を生きたままイメージングすることができた。
【００８５】
【表１】
2012165715.tif 000014
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明の網膜変性疾患状態を示すゼブラフィッシュは、網膜変性疾患の治療及び予防に関する研究開発のためのモデル動物として有用である。
【図１】
2012165715.tif 000019
【図２】
2012165715.tif 000020
【図３】
2012165715.tif 000021
【図４】
2012165715.tif 000022
【配列表】
2012165715000001.app