(57)【要約】【課題】比較的により感度が高く、かつH5ウイルスに特異的な、H5ウイルスを検出するためのキットを設計すること。【解決手段】H5ウイルスの複製のための2種類の特別に設計されたプライマーAとB、並びに増幅されたウイルスRNAを固定化するための特異的な捕獲プローブを利用する検出キット。病原性H5ウイルスの検出のために、さらにプライマーCが設計されもする。前記検出キットによるH5ウイルスの検出は、所望であれば1日以内に完了する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプル中の非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットであって、以下の：
−  上記生体サンプルからH5ウイルスのRNA分子を単離するための単離作用物質；
−  ターゲット分子を複製するための核酸複製作用物質であって、以下の：
・H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的な核酸配列；及び
・検出分子に結合するための核酸配列；
を含むもの；並びに
−  上記ターゲット分子を検出するための核酸検出作用物質であって上記検出分子を含むもの、
を含む上記検出キット。
【請求項２】
前記検出キットが、前記生体サンプル中の核酸を安定化させるための溶解作用物質をさらに含む、請求項1に記載の非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キット。
【請求項３】
前記ターゲット分子がRNA分子である、請求項1に記載の非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キット。
【請求項４】
前記核酸複製作用物質が以下の：
−  H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に結合するための第1のDNA配列；及び
−  RNAポリメラーゼのプロモーターDNA配列をコードする第2のDNA配列、
を含む最初の精製・単離されたDNA分子を含み、
上記最初の精製・単離されたDNA分子が、H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に結合するとき、上記最初の精製・単離されたDNA分子を、酵素及びDNAヌクレオチドの存在下で伸長させて、以下の：
−  H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的なDNA配列；及び
−  RNAポリメラーゼのプロモーターDNA配列をコードするDNA配列、
を含むDNA配列を作製する、請求項1に記載の非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キット。
【請求項５】
前記第1のDNA配列が、配列番号1、2、又は3に示すDNA配列のいずれか1つをコードする、請求項4に記載の非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キット。
【請求項６】
前記RNAポリメラーゼが、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼであり、かつ、前記第2のDNA配列が、配列番号4に示すDNA配列をコードする、請求項4又は5に記載の非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キット。
【請求項７】
前記核酸複製作用物質が、以下の
−  非病原性又は病原性H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードする第1のDNA配列；及び
−  検出分子に結合するためのDNA配列をコードする第2のDNA配列、
を含む2番目の精製・単離されたDNA分子を含み、
上記2番目の精製・単離されたDNA分子が、非病原性又は病原性H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的なDNA配列を含むDNA分子に結合するとき、上記2番目の精製・単離されたDNA分子を、酵素とDNAヌクレオチドの存在下で伸長させて、以下の：
−  非病原性又は病原性H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードするDNA配列；及び
−  検出分子に結合するためのDNA配列をコードするDNA配列、
を含むDNA配列を作製する、請求項4に記載の非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キット。
【請求項８】
−  前記H5ウイルスが非病原性であり、かつ
−  前記第1のDNA配列が、配列番号5、6、又は7に示すDNA配列のいずれか1つをコードする、
請求項7に記載の非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キット。
【請求項９】
−  前記H5ウイルスが病原性であり、かつ
−  前記第1のDNA配列が、配列番号9、10、又は11に示すDNA配列のいずれか1つをコードする、
請求項7に記載の非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キット。
【請求項１０】
前記第2のDNA配列が、配列番号8に示すDNA配列をコードする、請求項7〜9のいずれか1項に記載の非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キット。
【請求項１１】
前記核酸複製作用物質が、配列番号5、6、7、9、10、又は11に示すDNA配列のいずれか1つをコードする第1のDNA配列から成る、2番目の精製・単離されたDNA分子を含む、請求項4に記載の非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キット。
【請求項１２】
前記核酸検出作用物質が、以下の：
・  ターゲット分子に結合するための、H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードする第1のDNA配列；及び
・  固定化物質、
を含む精製・単離されたDNA分子をさらに含み、
上記精製・単離されたDNA分子に結合するとき、上記ターゲット分子が固定化される、請求項1に記載の非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キット。
【請求項１３】
前記第1のDNA配列が、配列番号12、13、又は14に示すDNA配列のいずれか1つをコードする、請求項12に記載の非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キット。
【請求項１４】
前記検出分子が、以下の
・  ターゲット分子に結合するための、H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードする第1のDNA配列；及び
・  シグナル生成物質、
を含み、
上記検出分子と前記精製・単離されたDNA分子が、上記ターゲット分子の異なる部分に結合する、請求項12に記載の非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キット。
【請求項１５】
以下の：
−  インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に結合するための第1のDNA配列；及び
−  RNAポリメラーゼのプロモーターDNA配列をコードする第2のDNA配列、
を含む精製・単離されたDNA分子、又は相補的なDNA分子であって、
上記最初の精製・単離されたDNA分子が、H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に結合するとき、上記精製・単離されたDNA分子を、酵素及びDNAヌクレオチドの存在下で伸長させて、以下の：
−  H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的なDNA配列；及び
−  RNAポリメラーゼのプロモーターDNA配列をコードするDNA配列、
を含むDNA配列を作製する、上記精製・単離されたDNA分子又は相補的なDNA分子。
【請求項１６】
前記第1のDNA配列が、配列番号1、2、又は3に示すDNA配列のいずれか1つをコードする、請求項15に記載の精製・単離されたDNA分子又は相補的なDNA分子。
【請求項１７】
前記RNAポリメラーゼが、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼであり、かつ、前記第2のDNA配列が、配列番号4に示すDNA配列をコードする、請求項15に記載の精製・単離されたDNA分子又は相補的なDNA分子。
【請求項１８】
以下の：
−  非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードする第1のDNA配列；及び
−  検出分子に結合するためのDNA配列をコードする第2のDNA配列、
を含む精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子であって、
上記精製・単離されたDNA分子が、非病原性又は病原性H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的なDNA配列を含むDNA分子に結合するとき、上記精製・単離されたDNA分子を、酵素とDNAヌクレオチドの存在下で伸長させて、以下の：
−  非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードするDNA配列；及び
−  検出分子に結合するためのDNA配列をコードするDNA配列、
を含むDNA配列を作製する、上記精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子。
【請求項１９】
−  前記H5ウイルスが非病原性であり、かつ
−  前記第1のDNA配列が、配列番号5、6、又は7に示すDNA配列のいずれか1つをコードする、
請求項18に記載の精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子。
【請求項２０】
−  前記H5ウイルスが病原性であり、かつ
−  前記第1のDNA配列が、配列番号9、10、又は11に示すDNA配列のいずれか1つをコードする、
請求項18に記載の精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子。
【請求項２１】
前記第2のDNA配列が、配列番号8に示すDNA配列をコードする、請求項18〜20のいずれか1項に記載の精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子。
【請求項２２】
配列番号5、6、7、9、10、又は11に示すDNA配列のいずれか1つをコードする第1のDNA配列から成る精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子。
【請求項２３】
以下の：
−  ターゲット分子に結合するための、インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードする第1のDNA配列、ここで、上記ターゲット分子が、インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的な核酸配列を含む；及び
−  固定化物質、
を含む精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子であって、
上記精製・単離されたDNA分子に結合するとき、上記ターゲット分子が固定化される、上記精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子。
【請求項２４】
前記第1のDNA配列が、配列番号12、13、又は14に示すDNA配列のいずれか1つをコードする、請求項23に記載の精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子。
【請求項２５】
以下の：
−  ターゲット分子に結合するための、インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードする第1のDNA配列、ここで、上記ターゲット分子は、インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的な核酸配列を含む；及び
−  シグナル生成物質
を含む精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子であって、
上記ターゲット分子が、上記精製・単離されたDNA分子に結合するとき、シグナルがターゲット分子から生み出される、上記精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子。
【請求項２６】
−  H5ウイルスのRNA分子を、単離作用物質により生体サンプルから単離し；
−  以下の：
・H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的な核酸配列；及び
・検出分子に結合するための核酸配列、
を含むターゲット分子を、最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子を含む核酸複製作用物質により複製し；そして
−  上記ターゲット分子を、検出分子を含む核酸検出作用物質により検出する、
生体サンプル中のインフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットの製造における最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子の使用。
【請求項２７】
前記核酸を安定化させるための溶解作用物質を、H5ウイルスのRNA分子を単離する前に生体サンプルに適用する、請求項26に記載の生体サンプル中のインフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットの製造における最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子の使用。
【請求項２８】
前記ターゲット分子が、RNA分子である、請求項26に記載の生体サンプル中のインフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットの製造における最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子の使用。
【請求項２９】
前記最初の精製・単離されたDNA分子が、以下の：
−  H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に結合するための第1のDNA配列；及び
−  RNAポリメラーゼのプロモーターDNA配列をコードする第2のDNA配列、
を含み、
上記最初の精製・単離されたDNA分子が、H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に結合するとき、上記最初の精製・単離されたDNA分子を、酵素及びDNAヌクレオチドの存在下で伸長させて、以下の：
−  H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的なDNA配列；及び
−  RNAポリメラーゼのプロモーターDNA配列をコードするDNA配列、
を含むDNA配列を作製する、請求項26に記載の生体サンプル中のインフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットの製造における最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子の使用。
【請求項３０】
前記第1のDNA配列が、配列番号1、2、又は3に示すDNA配列のいずれか1つをコードする、請求項29に記載の生体サンプル中のインフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットの製造における最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子の使用。
【請求項３１】
前記RNAポリメラーゼが、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼであり、かつ、前記第2のDNA配列が、配列番号4に示すDNA配列をコードする、請求項29又は30に記載の生体サンプル中のインフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットの製造における最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子の使用。
【請求項３２】
前記核酸複製作用物質が、以下の
−  非病原性又は病原性H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードする第1のDNA配列；及び
−  検出分子に結合するためのDNA配列をコードする第2のDNA配列、
を含む2番目の精製・単離されたDNA分子を含み、
上記2番目の精製・単離されたDNA分子が、非病原性又は病原性H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的なDNA配列を含むDNA分子に結合するとき、上記2番目の精製・単離されたDNA分子を、酵素とDNAヌクレオチドの存在下で伸長させて、以下の：
−  非病原性又は病原性H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードするDNA配列；及び
−  検出分子に結合するためのDNA配列をコードするDNA配列、
を含むDNA配列を作製する、請求項26に記載の生体サンプル中のインフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットの製造における最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子の使用。
【請求項３３】
−  前記H5ウイルスが非病原性であり、かつ
−  前記第1のDNA配列が、配列番号5、6、又は7に示すDNA配列のいずれか1つをコードする、
請求項32に記載の生体サンプル中のインフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットの製造における最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子の使用。
【請求項３４】
−  前記H5ウイルスが病原性であり、かつ
−  前記第1のDNA配列が、配列番号9、10、又は11に示すDNA配列のいずれか1つをコードする、
請求項32に記載の生体サンプル中のインフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットの製造における最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子の使用。
【請求項３５】
前記第2のDNA配列が、配列番号8に示すDNA配列をコードする、請求項32〜34のいずれか1項に記載の生体サンプル中のインフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットの製造における最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子の使用。
【請求項３６】
前記核酸複製作用物質が、配列番号5、6、7、9、10、又は11に示すDNA配列のいずれか1つをコードする第1のDNA配列から成る2番目の精製・単離されたDNA分子を含む、請求項26に記載の生体サンプル中のインフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットの製造における最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子の使用。
【請求項３７】
前記核酸検出作用物質が、以下の：
・  ターゲット分子に結合するための、H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードする第1のDNA配列；及び
・  固定化物質、
を含む精製・単離されたDNA分子をさらに含み、
上記精製・単離されたDNA分子に結合するとき、上記ターゲット分子が固定化される、請求項26に記載の生体サンプル中のインフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットの製造における最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子の使用。
【請求項３８】
前記第1のDNA配列が、配列番号12、13、又は14に示すDNA配列のいずれか1つをコードする、請求項37に記載の生体サンプル中のインフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットの製造における最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子の使用。
【請求項３９】
前記検出分子が、以下の
・  ターゲット分子に結合するための、H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードする第1のDNA配列；及び
・  シグナル生成物質、
を含み、
上記検出分子と上記精製・単離されたDNA分子が、上記ターゲット分子の異なる部分に結合する、請求項26に記載の生体サンプル中のインフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットの製造における最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子の使用。
【請求項４０】
前記ターゲット分子が、請求項34に記載の2番目の精製・単離されたDNA分子を含む核酸複製作用物質により複製される前に、請求項33に記載の2番目の精製・単離されたDNA分子を含む核酸複製作用物質により複製される、請求項36に記載の生体サンプル中のインフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットの製造における最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本願発明は、インフルエンザAサブタイプH5ウイルスを検出するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
鳥類のインフルエンザ(インフルエンザA)ウイルスは、ヒト、豚、馬、海洋哺乳動物、及び鳥を含む種々の動物に感染する。最近のインフルエンザAウイルスの系統発生の研究が、ウイルス遺伝子の種特異系統を明らかにし、そして種間の伝染の罹患率が動物種に依存することを証明した。彼らは、水鳥が他の種の全てのインフルエンザ・ウイルスの起源であることをも明らかにした。
【０００３】
ヒトの「新しい」インフルエンザAウイルスの出現は、可能である。血清学とウイルス学の証拠は、1889以来、ある期間ヒトの母集団には存在しなかったHAサブタイプを伴うインフルエンザ・ウイルスの出現の6つの例が存在することを示唆する。HAについての3種類のヒト・サブタイプが、周期的に現われた−1889年にサブタイプH2、1900年にH3、1918年にH1、1957年に再びH2、1968年に再びH3、そして1977年に再びH1。鳥類のインフルエンザAサブタイプH5N1のヒトへの最初の感染が、1997年に報告され、3歳の少年の死をもたらした。この最初の報告は、ウイルスの広がりを止めるための、動物、特にニワトリのH5ウイルスに関する日常的なスクリーニングの必要性をもたらす。
【０００４】
細胞培養、赤血球凝集抑制、蛍光抗体、及び酵素免疫測定法、及び逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を含む多くの方法が、現在、ウイルスの同定に使用されている。しかし、これらの方法の全てが同じ問題を共有している−それらは、比較的に低い感度と低い特異性を有している。さらに、日常的な検出目的のためには検出時間が長すぎ、しかも前述の方法は、利用されるには比較的に難しい。
【０００５】
インフルエンザAサブタイプH5ウイルスの検出に適用されている現在の方法は、免疫診断アッセイとウイルス培養を含む。免疫診断アッセイの例は、赤血球凝集素抑制アッセイと免疫アッセイを含む。しかし、免疫診断アッセイは、低い感度の問題点を持つ。さらに、免疫診断アッセイのターゲットは、通常特定のタンパク質なので、ターゲットを構成する遺伝子の性質は直接的には得ることができない。さらに、抗体の最初の誘導は、免疫宿主動物におけるタンパク質解析の抗原性に結果的に依存しているので、交差感受性が生じるかもしれない。
【０００６】
ウイルス培養は、正確で、低コストの検出方法であるが、比較的に労働集約的であり、インキュベーションのためのたくさんのスペースを必要とする。この培養工程は遅く、毎日の検査の需要を満たすことができない。さらに、ウイルス培養は、直接的に検出結果を提供することができず、非常に高価な他の検出方法によるさらなる確認によって返答しなくてはならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的
従って、感度及び特異性が改善されうるようなH5ウイルスを検出するための使いやすい診断キットを設計することが本願発明の目的である。
検出時間及び検出のための費用を軽減しうるようなインフルエンザAサブタイプH5ウイルスの検出のためのキットを設計することが本願発明の他の目的である。
H5ウイルスの病原性を直接的に検出しうるようなインフルエンザAサブタイプH5ウイルスの検出のためのキットを設計することが本願発明のさらに他の目的である。
少なくとも、一般大衆に有用な選択肢を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の概要
従って、本願発明は、生体サンプル中の非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットを提供し、上記キットは以下の：
−  上記生体サンプルからH5ウイルスのRNA分子を単離するための単離作用物質(isolating agent)；
−  ターゲット分子を複製するための核酸複製作用物質であって、以下の：
・H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的な核酸配列；及び
・検出分子に結合するための核酸配列
を含むもの；並びに
−  上記ターゲット分子を検出するための核酸検出作用物質であって上記検出分子を含むもの、
を含む。
【０００９】
以下の：
−  インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に結合するための第1のDNA配列；及び
−  RNAポリメラーゼのプロモーターDNA配列をコードする第2のDNA配列、
を含む精製・単離されたDNA分子、又は相補的なDNA分子を提供することが本願発明の他の側面であり、
上記最初の精製・単離されたDNA分子が、H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に結合するとき、上記精製・単離されたDNA分子を、酵素及びDNAヌクレオチドの存在下で伸長させて、以下の：
−  H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的なDNA配列；及び
−  RNAポリメラーゼのプロモーターDNA配列をコードするDNA配列、
を含むDNA配列を作製する。
【００１０】
以下の：
−  非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードする第1のDNA配列；及び
−  検出分子に結合するためのDNA配列をコードする第2のDNA配列、
を含む精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子を提供することが本願発明のさらに他の側面であり、
上記精製・単離されたDNA分子が、非病原性又は病原性H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的なDNA配列を含むDNA分子に結合するとき、上記精製・単離されたDNA分子を、酵素とDNAヌクレオチドの存在下で伸長させて、以下の：
−  非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードするDNA配列；及び
−  検出分子の結合ためのDNA配列をコードするDNA配列、
を含むDNA配列を作製する。
【００１１】
本願発明は、配列番号5、6、7、9、10、又は11に示すDNA配列のいずれか1つをコードする第1のDNA配列から成る精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子をも提供する。
以下の：
−  ターゲット分子に結合するための、インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードする第1のDNA配列、ここで、上記ターゲット分子が、インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的な核酸配列を含む；及び
−  固定化物質(immobilizer)、
を含む精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子を提供することが本願発明のさらに他の側面であり、
上記精製・単離されたDNA分子に結合するとき、上記ターゲット分子が固定化される。
【００１２】
以下の：
−  ターゲット分子に結合するための、インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードする第1のDNA配列、ここで、上記ターゲット分子は、インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的な核酸配列を含む；及び
−  シグナル生成物質
を含む精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子を提供することが本願発明の他の目的であり、
上記ターゲット分子が、上記精製・単離されたDNA分子に結合するとき、シグナルがターゲット分子から生み出される。
【００１３】
本願発明は、生体サンプル中のインフルエンザAサブタイプH5ウイルスの検出のためのキットの製造における最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子の使用をも提供し、ここで：
−  H5ウイルスのRNA分子を、単離作用物質により上記生体サンプルから単離し；
−  ターゲット分子を、上記最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子を含む核酸複製作用物質により複製し、ここで、上記ターゲット分子は、以下の：
・H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的な核酸配列；及び
・検出分子に結合するための核酸配列、
を含む；
−  上記ターゲット分子を、核酸検出作用物質により検出する、ここで、上記核酸検出作用物質は、検出分子を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本願発明のキットによるインフルエンザAサブタイプH5ウイルスの検出の全体的な手順のフローチャートを示す。
【図２】本願発明の検出キットによるインフルエンザAサブタイプH5ウイルスの検出に関する詳細な手順を示す。
【図３】生体サンプルからのウイルスRNA分子の単離を示す。
【図４】2種類のDNA分子、プライマーA及びBによるインフルエンザAサブタイプH5ウイルスRNA分子の一部の増幅を示す。
【図５】検出プローブに結合した間の増幅されたRNA分子の固定化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
好ましい態様の詳細な説明
本願発明の好ましい態様を、図面を参照してここで説明する。一覧表1は、図面中の参照数字を容易に参照しうる部品リストである。
生体サンプル、例えばニワトリ血液中のインフルエンザAサブタイプH5の濃度は、H5ウイルスRNAの存在の検出が、生体サンプルで直接実施しえないくらい非常に低いかもしれない。検出目的のために十分な量までウイルスRNA分子の数を増やすために、好適な増幅技術を必要とする。核酸配列ベースの増幅(NASBA)は、RNAの増幅のために特別な用途を有する柔軟な技術であることが知られている。次に、増幅されたRNA分子を好適な技術により検出しうる。NASBAは、インフルエンザ・ウイルス・サブタイプH5の検出のための迅速で、高感度で、高度に特異的な方法である。結果を、1日位の短期間で得ることがでる。さらに、それは直接的に病原性と非病原性H5菌株を区別することができる。
【００１６】
インフルエンザ・ウイルスは、ウイルス性のリボ核酸(RNA)の1本鎖の形態でその遺伝物質を含んでいる。インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNAは、その増殖に必要な遺伝子を含んでいて、必須遺伝子の1つは赤血球凝集素と呼ばれる。この遺伝子は、約1756ヌクレオチドの長さで、そしてこのヌクレオチドは分子の5末端から番号を付されている。
【００１７】
図1は、検出キットによるH5ウイルスの検出に関する全体的な手順を示す。図1で示されるように、RNA分子の1本鎖の形態のターゲットH5ウイルス核酸分子は、まず生体サンプルから抽出される。適合する生体サンプルの種類は、血、血清/血漿、末梢血単核細胞/末梢血リンパ球(PBMC/PBL)、痰、尿、糞便、咽喉スワブ、真皮病変スワブ、脳脊髄液、子宮頸管スミア、膿サンプル、食物基質、並びに脳、脾臓、及び肝臓を含む身体の様々な部分からの組織を含む。列挙されていない他のサンプルが、適用されもする。本願発明の検出キットの核酸抽出過程は、単離作用物質により達成される。
【００１８】
ターゲットH5ウイルスRNA分子を生体サンプルから抽出した後、サンプル中のRNA分子の量は検出に十分でないかもしれない。従って、H5ウイルス性のRNA分子の一部を、適切な増幅技術、例えばNASBAによりターゲット核酸分子に複製する。次に、このターゲット核酸分子を好適な方法により検出する。
本発明の検出キットの全体的な手順を説明した後に、各々の手順の詳細を本明細書中で議論する。
【００１９】
H5ウイルスRNA分子は、好適な単離作用物質を生体サンプルに適用することにより生体サンプルから単離されうる。好ましくは、溶解作用物質が、単離作用物質の前に用いられうる。溶解作用物質、例えば溶解バッファーは、それらの物質がサンプルからより容易に取り除かれうるような、タンパク質及び脂質の溶解、及び生体サンプル中のタンパク質の変性を担う。さらに、溶解作用物質は、長期保存目的のためにRNA分子を安定化するためのバッファーとして働くかもしれない。図2に示されるように、RNA分子は、溶解バッファー中、室温で48時間まで安定しており、そして-70℃で無期限に保存される。そのようにする利点は、そのような方法の実行にふさわしくないサンプル採取場での解析を実施する必要をなくすことである。
【００２０】
好適な溶解バッファーの例は、5Mのグアニジンチオシアネート及びTris/HClを含む。溶解バッファーは、この検出キットの発明を形成せず、そしてその目的に好適な組成物は本技術分野に周知である。従って、溶解バッファーの詳細な組成を、ここで議論しない。依然としてタンパク質及び脂質の溶解、タンパク質の変性、並びにRNA分子の安定化の目的を達成することができる異なる組成物を持つ溶解作用物質を、本願発明の検出キットで利用しうる。
【００２１】
溶解作用物質を生体サンプルに適用した後、次のステップは、単離作用物質の使用によるサンプルからの核酸分子の単離である。図3は、前記検出キットにおける全体的な単離手順を表す。溶解作用物質を生体サンプルに適用した後に、核酸(10)は、他の不必要な成分と一緒に溶液の形態で存在する。次に、核酸(10)を吸着するために吸着剤、例えばシリカ(12)をこの溶液中に添加し、核酸/シリカ混合物(14)を得る。その後、溶液中のタンパク質及び脂質、並びに他の不必要な物質を、好適な溶離剤、例えば5Mのグアニジンチオシアネート及びTris/HCl溶液、Tris/HCL溶液、70%のエタノール、又はアセトン、あるいはそれらの組み合わせ物により洗浄されうる。混合物(14)を、十分な量の溶離剤で洗浄した後、次にシリカ(12)中の核酸(10)を、遠心分離により単離する。
【００２２】
サンプル中に含まれる核酸(12)を単離した後、H5ウイルスRNA分子が検出目的、例えばNASBA技術のために複製されるように、次に増幅作用物質を核酸の混合物に適用する。3種類の精製・単離されたDNA分子が、増幅目的のために設計され、これらはプライマーA〜Cと呼ばれる。
図4は、本願発明におけるNASBAによるH5ウイルスRNAの増幅に関する模式図を示す。図面に示されるように、増幅プロセスは、プライマーA(22)の、1本鎖RNA分子であるターゲットH5ウイルスRNA(20)へのアニーリングにより開始される。プライマーA(22)は、ターゲットRNA分子に結合できるように、そしてさらにRNAポリメラーゼ、好ましくはバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼのためのプロモーターをコードするDNA配列を含むように設計されている。結合の正確な位置は、検査されたウイルスの種類に依存する。結合部位は、ある期間の後に変化するかもしれない。プライマーAの重要な技術的特徴は、なおも、それがH5ウイルスの一部に結合することができる状態にあることである。
【００２３】
従って、プライマー(22)は、H5ウイルスRNA(20)の少なくとも一部に相補的なDNA配列をコードする結合配列を含んでいる。本願発明の目的のために、H5ウイルスRNA(20)への結合に好適な部位が、結合機能のための最小限の数のヌクレオチドを含むことが発見されているH5ウイルスの赤血球凝集素遺伝子のヌクレオチド1107〜1132の部位であることが分かっている。従って、プライマーAの結合配列は、図6の配列番号1に記載される、H5ウイルスの赤血球凝集素遺伝子のヌクレオチド1107〜1132の部位に相補的なDNA配列を好ましくは含んでいる。配列番号1が、5'-3'方向に形式的に書かれることに留意すべきである。結果として、ウイルス遺伝子に対する結合の方向は、「後方」から「前方」の形態である。
【００２４】
選択肢として、H5ウイルスの赤血球凝集素遺伝子のヌクレオチド1060〜1140 (配列番号2、図7)、又はヌクレオチド1040〜1160 (配列番号3、図8)が、プライマーA(22)の結合目的のために使用されうる。
明細書中でより詳細に記載される増幅目的のために、プライマー(22)は、RNAポリメラーゼ、例えばバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼのプロモーターをコードするDNA配列をさらに含んでいる。好適なプロモーターDNA配列は、配列番号4 (図9)に記載されている。プライマーAがH5ウイルスRNAに結合した時に、結合配列が3'末端で伸長するように、プロモーター配列は、好ましくは結合配列の5'末端に付着される。他のRNAポリメラーゼが利用される場合、前記プロモーター配列は、当然変更されなくてはならない。
【００２５】
H5ウイルスRNAにプライマーAが結合した後、このプライマーAを、プライマーAの3'末端で、好適なヌクレオチドの存在下、好適な逆転写酵素、例えば鳥類の筋芽細胞症ウイルス-逆転写酵素(AMV-RT)の作用によりを伸長される。従って、以下の配列を含めた伸長されたプライマーA (24)が得られる：
(a)  H5ウイルスRNAの一部に相補的なDNA配列；及び
(b)  RNAポリメラーゼのためのプロモーターをコードするDNA配列。
【００２６】
得られたDNA：RNAハイブリッドのH5 RNA部分(26)は、RNaseHの作用により除去される。これが、プライマーB (28)に、プライマーA(22)のアニール部位の上流の位置での伸長したプライマーA (24)へのアニールを可能にする。従って、プライマーB (28)に関して伸長したプライマーA (24)に結合するために、プライマーB (28)は、H5ウイルス赤血球凝集素遺伝子配列の一部をコードする第1の結合DNA配列を含んでいる。好ましくは、プライマーB(28)のこの第1のDNA配列は、H5ウイルスの赤血球凝集素遺伝子のヌクレオチド914〜940をコードする(配列番号5、図10)。選択肢として、H5ウイルス赤血球凝集素遺伝子のヌクレオチド866〜961(配列番号6、図11)、又はヌクレオチド846〜981 (配列番号7、図12)を利用しうる。
【００２７】
検出目的を果たすために、プライマーB(28)は、検出分子の核酸配列に相補的な第2のDNA配列をさらに含んでいる。増幅されたRNA分子に結合するように、H5ウイルスのRNA配列の一部をコードするDNA配列を含むようにこの検出分子がある程度設計されれば、プライマーBが第2のDNA配列を含む必要がないかもしれない。このケースにおいて、プライマーBは、単なる第1のDNA配列から成る。
【００２８】
選択肢として、配列番号8(図13)の示されるDNA配列をコードする第2のDNA配列が、プライマーBに含まれる。好ましくは、第2のDNA配列は、プライマーBの結合配列の5'末端に付着する。他の検出核酸配列が使用される場合、配列番号8が、変更の対象となる。
伸長したプライマーA (24)へのプライマーB(28)のアニーリング後に、プライマーB (28)を、プライマーA (24)の末端で、AMV-RTの作用によりT7 RNA ポリメラーゼ・プロモーターを通じて下流に伸長する。結果として、一方の末端に完全なT7 RNAポリメラーゼ・プロモーターを、そしてもう一方の末端にH5ウイルスRNA配列の一部をコードする、元のH5ウイルスRNAターゲット配列の2本鎖DNAコピー(30)を生じる。次に、このプロモーターをT7 RNAポリメラーゼにより認識させ、元のH5ウイルスRNA配列の一部に相補的なRNA配列を含む、大量のターゲットRNA分子(32)の製造をもたらす。
【００２９】
プライマーBは、インフルエンザAサブタイプH5ウイルスの非病原性菌株を決定するために使用される。病原性H5ウイルスの検出のために、プライマーBの代わりにプライマーCが使用される。同様に、プライマーCは、以下のDNA配列：
−  病原性H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードする第1のDNA配列；及び
−  検出DNA配列に相補的なDNA配列をコードする第2のDNA配列、
を含む精製・単離されたDNA分子である。プライマーBの場合のように、この第2のDNA配列は、単に任意の成分であるかもしれない。
【００３０】
ターゲットが病原性H5ウイルスである以外、プライマーCの機能及び働きはプライマーBと同じものである。
好ましくは、プライマーCの第1のDNA配列は、H5ウイルスの赤血球凝集素遺伝子のヌクレオチド1017〜1042をコードする(配列番号9、図14)。選択肢として、H5ウイルス赤血球凝集素遺伝子のヌクレオチド970〜1063 (配列番号10、図15)、又はヌクレオチド950〜1083 (配列番号11、図16)が、利用されうる。
【００３１】
プライマーCは、プライマーA (22)によりサンプルから新しく単離された核酸からH5ウイルスRNAターゲットを効率よく複製しないことが分かる。従って、プライマーA (22)及びB (28)を使用してH5ウイルスに関して検査で陽性を示したサンプルからの増幅したRNAにプライマーCを適用することが好ましい。
増幅工程の産物は、以下のRNA配列：
(a)  元のH5ウイルスRNA(病原性又は非病原性)の一部に相補的なRNA配列；及び
(b)  プライマーB又はCが対応する第2のDNA配列を含んでいれば、検出分子の核酸配列に相補的なRNA配列、
を各々含む、大量のターゲットRNA分子(32)である。
【００３２】
この特定の態様のターゲットRNA分子(32)は、T7 RNAポリメラーゼによる増幅工程中に自動的に含まれている、T7 RNAポリメラーゼのためのプロモーターをコードするRNA配列をさらに含んでいる。しかし、RNA配列のこのセグメントは、検出ステップに機能を持っていない。
ターゲットRNA分子(32)の検出を、図5で説明する。ターゲットRNA分子(32)は、シグナルを生じることができる検出分子、例えば検出プローブ(40)に結合することにより検出されうる。シグナルは、検出プローブ(40)に付されたシグナル生成物質(41)から生じる。図5示されるように、この特に好ましい態様において、シグナル生成物質(41)は、ルテニウム-ビピリジン複合体[Ru(bpy)3]2+である。選択肢として、シグナル生成物質(41)は、放射性(例えば、32P)、化学発光性(例えば、ルシフェリン/ルシフェラーゼ)、蛍光性(例えば、フルオレセイン)、酸素(例えば、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ)、又は他の電気化学発光分子である。
【００３３】
プライマーB又はCが検出DNA配列に相補的である対応の第2のDNA配列を含む場合、前記ターゲットRNA分子(32)は、検出分子の核酸配列に相補的なRNA配列を含む。そのようなデザインを利用する利点は、商業的に入手可能な検出分子を使用しうることである。
プライマーB又はCが単にH5ウイルスの赤血球凝集素遺伝子配列の一部をコードする第1のDNA配列から成る場合、新しい検出分子が必要とされる。この場合、前記検出分子は、以下の：
・  ターゲットRNA分子(32)にコードされているものに相補的なH5ウイルスRNA配列の一部をコードする核酸配列；及び
・  シグナル生成物質、
を含むかもしれない。
【００３４】
ターゲットRNA分子(32)は、元のサンプル中に含まれる増幅されていない核酸、プライマーA、B、及びC、反応しなかったヌクレオチド、並びに最も重要なことに、結合しなかった検出分子を含めた他の望ましくない成分と一緒に混合物中に含まれている。従って、望ましくない成分を洗浄しうるように、ターゲットRNA分子(32)を捕獲分子、例えば捕獲プローブ(42)で固定化する。捕獲プローブ(42)は、ターゲットRNA分子(32)に結合することができる。これは、ターゲットRNA分子(32)にコードされているものに相補的なH5ウイルスRNA配列の一部をコードする核酸配列を含むことにより達成される。この捕獲プローブ(42)は、さらに固定化物質(44)に付着する。他の望ましくない成分を洗浄しうるように、前記固定化物質はターゲットDNA分子(32)を固定化する。図5で示される固定化物質(44)は、作用電極に引き付けられうる磁性粒子である。他の固定化物質、例えばその上に付着した相当数の捕獲プローブ(42)を有する重合体の小片が利用されもする。
【００３５】
検出プローブの配列は、その末端がプライマーAとB、又はプライマーAとCにより確定される増幅されたRNA産物のいずれかの部位に相補的である。しかし、これが捕獲プローブと増幅されたRNA、その逆もまた同様、の相互作用に影響するので、この検出プローブ配列は、捕獲プローブのそれに重複させることができない。
【００３６】
図5で示されるように、ターゲットDNA分子は、検出プローブ(40)と一緒に固定化される。従って、混合物への捕獲プローブ(42)の添加のタイミングに対する制限はない。捕獲プローブが洗浄ステップの前に添加される限り、捕獲プローブ(42)は、検出プローブ(40)の添加後、又はその前に添加される。
プライマーA、B、及びC、並びに捕獲プローブの核酸配列が、ここで既知の場合、対応する相補的DNA分子の合成は、当業者にとって明白である。そのような相補的DNA分子は、プライマーA、B、及びC、並びに捕獲プローブの合成の鋳型として使用されうる。
【００３７】
本発明を、制限することのない以下の実施例によりここで説明する。様々な変更と修飾が、本発明の範囲から逸脱することなく以下の実施例及び方法に適用されうることに留意すべきである。従って、以下の実施例が、説明のみとして解釈され、そしてあらゆる意味においても制限することがないことに留意すべきである。
【実施例】
【００３８】
実施例
この実施例の検出キットの詳細な構成要素を以下の通り列挙する：
A．溶解バッファー
・50×0.9 mlの溶解バッファー(5M グアニジンチオシアネート、トリトンX-100、Tris/HCl)
B．核酸単離成分
・5×22 mlの洗浄バッファー(5M グアニジンチオシアネート、Tris/HCl)
・5×0.8 mlのシリカ(塩酸により活性的にされた二酸化ケイ素粒子)
・5×1.5 mlの溶離バッファー(Tris/HCl)
【００３９】
C．核酸増幅成分
・5×60μlの酵素溶液(鳥類の筋芽細胞症ウイルス-逆転写酵素 (AMV-RT)、RNase-H、牛血清アルブミンにより安定化したT7 RNAポリメラーゼ
・5×10 mgの試薬玉(ヌクレオチド、ジチオスレイトール、及びMgCl2を凍結乾燥した球)。シリカゲル乾燥剤とホイール包装の状態で含んだ
・1×0.6 mlの試薬玉希釈液(Tris-HCl、45% DMSO)
・1×1.6mlのKCl溶液
・1×70 μlのH5−プライマー混合物
【００４０】
D．核酸検出成分
・1×0.9mlの、ノーブランドのECL検出プローブ(ルテニウム・ラベルしたDNAオリゴヌクレオチド、保存剤：5 g/L 2-クロロアセトアミド)
・1×0.7 mlのH5捕獲プローブ(ビオチニル化オリゴヌクレオチド、保存剤：5 g/L 2-クロロアセトアミド)
・2×1.7 mlの装置標準液(ルテニウム・ラベルした常磁性ビーズ)
先に列挙した材料は、50回の試験反応のために使用することを意図している。
試験反応に使用される、検出キットに含まれていないすぐに利用可能な材料を以下のとおり列挙する：
【００４１】
【表１】
2012191943.tif 000002
【００４２】
試薬の調製
A．溶解バッファー
・溶解バッファーを、この放出手順を始める前に37℃で30分間、前もって温める。
・全ての結晶が完全に溶解していることを確実にするためにインキュベーションの間、上記溶解バッファー・バイアルを10分ごとに混合する。
・上記溶解バッファーを室温まで冷ます。
・過度の熱又は光から上記溶解バッファーを保護する。
【００４３】
B．核酸単離試薬
・全ての試薬を使用前に室温にする。
・試薬の再利用：10点未満のサンプルをアッセイする場合、単離試薬の余りは、-20℃で2週間まで保存しうる。
1．洗浄バッファー
・洗浄バッファーを、単離手順を始める前に37℃で30分間、前もって温める。
・全ての結晶が完全に溶解していることを確実にするためにインキュベーションの間、上記溶解バッファー・バイアルを10分ごとに混合する。
・上記溶解バッファーを室温まで冷ます。
・過度の熱又は光から上記溶解バッファーを保護する。
【００４４】
C．核酸増幅作用物質
・全ての試薬を使用前に室温にする。
・試薬の再利用：もどした試薬玉及び未使用の酵素溶液は、それらを-70℃で保存した場合、2週間以内は再利用することができる。未使用の部分を-20℃で保存した場合、全ての他の増幅試薬の再使用が可能である。
【００４５】
1．試薬玉/KCl溶液の調製
・80 μlの試薬玉希釈液を凍結乾燥した試薬玉に添加し、そしてすぐによくボルテックスする。遠心分離はしないこと。
・希釈した球に30 μlのKCl溶液を添加し、そしてボルテックスする。
2．ターゲットRNA特異的プライマーの溶液の調製
・110 μlの試薬玉/KCl溶液を、新しい試験管に移し、10 μlのH5プライマー混合物を添加する。ボルテックスすることによりよく混合する。遠心分離はしないこと。
【００４６】
3．酵素溶液
・室温で酵素溶液を解凍し、指で試験管を軽くはじいて優しく混合する。酵素を含むあらゆる溶液はボルテックスしないこと。使用前に試験管の内容物を遠心分離する。
D．核酸検出試薬
・未使用の試薬が2〜8℃に保存されている場合、検出試薬の再利用が可能である。
【００４７】
1．捕獲及び検出プローブ
・特定のRNA単位複製配列の検出を、前もって常磁性ビーズ結合したH5捕獲プローブと組み合わせて、このキットのノーブランドの検出プローブを用いて実行する。
2．H5 RNAハイブリダイゼーション溶液
・不透明な溶液を形成するまでH5捕獲ビーズをボルテックスする。
・N個のH5 RNA特異的反応のために：
新しい試験管に(N+2)×10 μlのH5 RNA特異的捕獲ビーズを添加し、
(N+2)×10 μlのノーブランドのECLプローブを添加する。
・使用前にハイブリダイゼーション溶液をボルテックスする。
【００４８】
インビトロにおけるRNA増幅
A．核酸の放出と単離
1．核酸放出を始める前に、一様に前もって溶解バッファーの試験管を30分間温め、そしてボルテックスする。
2．溶解バッファーの試験管を10,000×gで30秒間遠心分離しする。
【００４９】
3．100 μlのターゲットRNAを溶解バッファーの試験管に添加し、そしてボルテックスする。溶解バッファー中、試料は：
-70℃で無期限に、
2〜8℃で14日まで、
25℃で48時間まで、
保存することができる。
【００５０】
4．シリカ懸濁液をボルテックスし、そして各々のサンプルRNA/溶解バッファー試験管に50 μlを添加する。
5．RNA/溶解バッファー/シリカの試験管を、室温で10分間インキュベートする(シリカが底に堆積するのを防ぐために2分ごとに試験管をボルテックスする)。
6．RNA/溶解バッファー/シリカの試験管を10,000×gで30秒間、遠心分離する。
【００５１】
7．慎重に上清を取り除いて(ペレットを乱さないこと)、各々の試験管に1 mlの洗浄バッファーを添加する。
8．ペレットが完全に再懸濁するまで試験管をボルテックスする。
9．試験管を10,000×gで30秒間、遠心分離する。
10．ステップ(7)〜(9)を、
・  洗浄バッファーにより1回、
・  70%のエタノールにより2回、
・  アセトンにより1回繰り返す。
【００５２】
11．最後の洗浄ステップの後、100 μlピペットを用いて全ての残留アセトンを慎重に取り除く。
12．加熱ブロック上の56℃で10分間、開口した試験管中、シリカ・ペレットを乾燥させる。
13．乾燥した時点で、各々の試験管に50 μlの溶離バッファーを添加する。
【００５３】
14．ペレットを完全に懸濁するまで剤まで試験管をボルテックスする。
15．再懸濁したシリカを56℃で10分間インキュベートし、核酸を溶離する(5分後、試験管をボルテックスする)。
16．試験管を、10,000×gで2分間遠心分離する。
17．5 μlの各々の核酸上清を、新しい試験管に移し、そして1時間以内に増幅反応を始める。
【００５４】
B．核酸の増幅
1．各々のH5 RNA反応物について、5 μlの核酸抽出物を新しい試験管中にピペットで移す。
2．10 μlのH5 RNA特異的増幅溶液を添加する。上記増幅溶液は、非病原性H5ウイルスの検出のためのプライマーA及びBを含む。
【００５５】
3．加熱ブロックにより65℃で5分間、試験管をインキュベートする。
4．加熱ブロックにより41℃で5分間、試験管を冷却する。
5．5 μlの酵素溶液を添加し、そして指で試験管をはじいてよく混成する。
6．試験管を、直ちに41℃で10分間に戻す。
7．上記試験管を軽く遠心分離し、そして水浴中、41℃で90分間それらをインキュベートする。
【００５６】
8．増幅産物の検出をここで実施する。選択肢として、この増幅産物を-20℃で1ヶ月まで保存しうる。
9．非病原性H5ウイルスの存在に関する検出結果が陽性の場合、病原性H5ウイルスの検出のためのプライマーA及びCを含む増幅溶液を、ステップ2〜8を繰り返すことにより上記増幅産物にここで適用する。
【００５７】
C.核酸の検出
1．不透明になるまでハイブリダイゼーション溶液をボルテックスする。20 μlのターゲットRNAハイブリダイゼーションを、各々のハイブリダイゼーション試験管に添加する。
2．増幅反応のために：
・  5 μlのH5 RNA増幅反応物を添加し、
・  粘着テープを用いてハイブリダイゼーション試験管を覆い、
・  不透明な溶液を形成するまでハイブリダイゼーション試験管を混合する。
【００５８】
3．ハイブリダイゼーション試験管を覆うために粘着テープを使用する。これは、蒸発と汚染を防ぐ。
4．41℃で30分間、ハイブリダイゼーション試験管をインキュベートする。
5．300 μlのアッセイ・バッファーをハイブリダイゼーション試験管に添加する。
【００５９】
前記サンプルを、好適な検出装置によりH5ウイルスの存在について検出する準備がこの時できている。この実施例の検出は、光電子増倍管を備えた好適なシステムにより実施される。
H5ウイルス検出の結果を以下の表に列挙する。結果を、Perkin Elmer ABI 310 Genetic Analyzerを使用して、DNA配列決定法により確認する。
【００６０】
【表２】
2012191943.tif 000003
【００６１】
【表３】
2012191943.tif 000004
【００６２】
前述の実施例で示されるように、農場を含む様々な検査場において前記検出キットが都合よく使用されることを実現することができる。さらに、前記検出キットは、既存の方法より使用が比較的に簡単で、そしてより短い時間に検出結果を提供することができるかもしれない−検出結果は、所望であれば1日以内に利用可能であるかもしれない。RNAベースの検出システムであるので、特異性と感度が高められた検出キットは、H5ウイルスに特異的であり、そしてサンプル中のH5ウイルスの濃度は、ウイルスは検出のためのターゲット分子に複製されるのでもはや重要ではないかもしれない。
【００６３】
プライマー、検出プローブ、及び捕獲プローブがRNA分子の形成に有用でもあることは当業者にとって明白である。DNA分子は、安定性の理由のため好ましい。
本願発明の好ましい態様を先の段落で述べたが、本願発明の修飾と代替型は、可能であり、そしてそのような修飾と代替型が、前記請求項に記載する本願発明の範囲内に依然として存在することは当業者にとって明白である。さらに、本願発明の態様は、実施例又は図面のみにより限定的に解釈されないものとする。
【００６４】
【表４】
2012191943.tif 000005
【００６５】
本願発明の好ましい態様を、以下の図面に関してここで説明する：
ここで、図6〜19は、増幅及び検出目的のために検出キットのDNA分子に使用される、本願発明に関する核酸配列の配列番号1〜14のそれぞれを示していた。
【図１】
2012191943.tif 000006
【図２】
2012191943.tif 000007
【図３】
2012191943.tif 000008
【図４】
2012191943.tif 000009
【図５】
2012191943.tif 000010
【配列表】
2012191943000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年7月13日(2012.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプル中の非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットであって、以下の：
−  上記生体サンプルからH5ウイルスのRNA分子を単離するための単離作用物質；
−  ターゲット分子を複製するための核酸複製作用物質であって、以下の：
・H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的な核酸配列；及び
・検出分子に結合するための核酸配列；
を含むもの；並びに
−  上記ターゲット分子を検出するための核酸検出作用物質であって上記検出分子を含むもの、
を含む上記検出キット。
【請求項２】
以下の：
−  インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に結合するための第1のDNA配列；及び
−  RNAポリメラーゼのプロモーターDNA配列をコードする第2のDNA配列、
を含む精製・単離されたDNA分子、又は相補的なDNA分子であって、
上記最初の精製・単離されたDNA分子が、H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に結合するとき、上記精製・単離されたDNA分子を、酵素及びDNAヌクレオチドの存在下で伸長させて、以下の：
−  H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的なDNA配列；及び
−  RNAポリメラーゼのプロモーターDNA配列をコードするDNA配列、
を含むDNA配列を作製する、上記精製・単離されたDNA分子又は相補的なDNA分子。
【請求項３】
以下の：
−  非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードする第1のDNA配列；及び
−  検出分子に結合するためのDNA配列をコードする第2のDNA配列、
を含む精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子であって、
上記精製・単離されたDNA分子が、非病原性又は病原性H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的なDNA配列を含むDNA分子に結合するとき、上記精製・単離されたDNA分子を、酵素とDNAヌクレオチドの存在下で伸長させて、以下の：
−  非病原性又は病原性インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードするDNA配列；及び
−  検出分子に結合するためのDNA配列をコードするDNA配列、
を含むDNA配列を作製する、上記精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子。
【請求項４】
配列番号5、6、7、9、10、又は11に示すDNA配列のいずれか1つをコードする第1のDNA配列から成る精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子。
【請求項５】
以下の：
−  ターゲット分子に結合するための、インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードする第1のDNA配列、ここで、上記ターゲット分子が、インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的な核酸配列を含む；及び
−  固定化物質、
を含む精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子であって、
上記精製・単離されたDNA分子に結合するとき、上記ターゲット分子が固定化される、上記精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子。
【請求項６】
以下の：
−  ターゲット分子に結合するための、インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部をコードする第1のDNA配列、ここで、上記ターゲット分子は、インフルエンザAサブタイプH5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的な核酸配列を含む；及び
−  シグナル生成物質
を含む精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子であって、
上記ターゲット分子が、上記精製・単離されたDNA分子に結合するとき、シグナルがターゲット分子から生み出される、上記精製・単離されたDNA分子又は相補的DNA分子。
【請求項７】
−  H5ウイルスのRNA分子を、単離作用物質により生体サンプルから単離し；
−  以下の：
・H5ウイルスのRNA配列の少なくとも一部に相補的な核酸配列；及び
・検出分子に結合するための核酸配列、
を含むターゲット分子を、最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子を含む核酸複製作用物質により複製し；そして
−  上記ターゲット分子を、検出分子を含む核酸検出作用物質により検出する、
生体サンプル中のインフルエンザAサブタイプH5ウイルス検出キットの製造における最初の精製・単離されたDNA分子及び2番目の精製・単離されたDNA分子の使用。
【外国語明細書】
2012191943000001.pdf