(57)【要約】【課題】プローブの変性を抑制したプローブの固定化方法を提供することを目的とするものである。【解決手段】基板１１にプローブ１２を固定化するためのプローブの固定化方法であって、基板１１とプローブ１２とを準備する工程と、基板１１を処理することで化学反応を伴わずプローブ１２を基板１１に固定化するプローブの固定化方法からなるものである。これにより、プローブ１２が固定化する際に、化学反応を伴うことがなくプローブ１２を自然反応的に基板１１に吸着し固定することができるため、化学反応におけるｐＨや温度の変化に伴ったプローブ１２の変性を抑制することが可能となる。【選択図】図１
2012141140.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板にプローブを固定化するためのプローブの固定化方法であって、
基板とプローブとを準備する工程と、
化学反応を伴わずに基板を処理することでプローブを基板に固定化するプローブの固定化方法。
【請求項２】
前記基板とプローブとを準備する工程の後に
基板をプラズマ処理する工程と、
プラズマ処理した基板にプローブを固定化する工程とを含む請求項１に記載のプローブの固定化方法。
【請求項３】
前記プラズマ処理は、酸素、窒素、水素、笑気ガス、ＮＯｘガス、アンモニア、Ｃ2Ｆ6、ＣＦ4または大気のいずれかあるいはそれらのいずれかの混合ガスによってプラズマ処理される請求項２に記載のプローブの固定化方法。
【請求項４】
前記基板は、シリコン、ガラス、石英、酸化シリコン、窒化シリコン、酸窒化シリコン、のいずれかあるいはそれらのいずれかの混合物よりなる請求項２に記載のプローブの固定化方法。
【請求項５】
前記基板は、ＡＢＳ、ポリカーボネイト、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ビニル、ＣＯＰ、ＣＯＣのいずれかあるいはそれらのいずれかの混合物よりなる請求項２に記載のプローブの固定化方法。
【請求項６】
前記プローブを準備する工程においてアルデヒド基を有するプローブを準備し、
前記プラズマ処理した基板にプローブを固定化する工程において、
前記プラズマ処理された基板と、このアルデヒド基を有したプローブのアルデヒド基とが固定化される工程を含む請求項２に記載のプローブの固定化方法。
【請求項７】
前記アルデヒド基の代わりに、チオール、カルボキシル、活性化カルボキシル、ジスルフィド、活性化ジスルフィド、アルキル、アルケン、アルキン、アルデヒド、ケトン、アジドあるいはそれらの誘導体やアミンからなる反応基をもつ基を有するプローブを準備する請求項６に記載のプローブの固定化方法。
【請求項８】
前記プローブとして糖を準備する工程と、
前記糖の末端を還元し還元糖とする工程と、
前記還元糖をプラズマ処理した基板に固定化する工程とを含む請求項２に記載のプローブの固定化方法。
【請求項９】
糖を準備する工程と、
前記糖の末端を還元し還元糖とする工程と、
前記プローブに還元糖を付加する工程と、
前記還元糖をプラズマ処理した基板に固定化する工程とを含む請求項２に記載のプローブの固定化方法。
【請求項１０】
前記プローブに還元糖を付加する工程として、前記プローブの所定のリジン残基あるいはセリン残基に糖転移酵素によって還元糖を付加する工程を有し、プラズマ処理した基板に還元糖を介してプローブを固定する請求項９に記載のプローブの固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ、糖鎖アレイなどに用いられるアレイ基板に固定されるプローブの固定化方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
各種診断チップやＤＮＡアレイ、プロテインアレイ、糖鎖アレイなどに用いられるアレイ基板に用いられるアレイチップの構築のために、核酸、ペプチド、抗体、レクチンなどのプローブを固定化することが有用視されている。
【０００３】
従来、基板表面に抗体などのプローブを固定化する技術としては、シランカップリング反応が知られている。これは、例えば、固相担体と、例えば、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物のような、酸無水物官能基を有するシランカップリング剤とを接触させること、前記接触後の固相担体を０℃〜６０℃の温度範囲下に保持しながら、前記酸無水物官能基に対する前記生理活性物質の結合処理を行うこと、を含むことによって、シランカップリング法によってプローブを固定化することができる。
【０００４】
なお、この出願の発明に関連する先行技術文献としては、例えば、特許文献１が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２２９３１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記従来のプローブの固定化方法においては、化学反応を伴うことによって、プローブの機能を最大限に活用できない場合があった。
【０００７】
すなわち、シランカップリング反応は手順が煩雑であり、プローブを保持していた溶媒をシランカップリング用の試薬に置換する必要があり、ｐＨ、塩濃度、温度の変化や界面活性剤の影響によりプローブが変性してしまうことも考えられる。このように化学反応により官能基を基板に付加するため、工程が煩雑になり手間がかかると共に、固定化基板ロット毎のばらつきを生むという問題を有していた。
【０００８】
さらに、シランカップリング反応を用いた場合、基板と結合するプローブ面を特定することができないので、上記反応方法ではプローブが基板に固定化される向きを制御することは難しい。すなわち、化学反応によく用いられるシランカップリング法は、基板と結合するプローブ面を特定できない上に、プローブと基板の間に長いリンカーを有することになるので、プローブの配向が困難となる。
【０００９】
そこで本発明は、プローブの変性を抑制することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために本発明のプローブの固定化方法は、特に化学反応を伴わず、自然反応的あるいは物理的に基板を処理することでプローブを基板に吸着、固定化する工程を有する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の基板を物理的に処理することにより、プローブを自然反応的に基板に吸着し固定することができるため、化学反応におけるｐＨや温度の変化に伴ったプローブの変性を抑制することが可能となる。さらに、化学反応を伴わないため工程数の軽減、測定時における固定化基板ロット毎のばらつきを軽減することができる。さらに、プローブと基板間の距離をごく短くすることを可能とし、プローブの配向を可能にするという効果を奏するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１におけるプローブの固定化基板の断面模式図
【図２】（ａ）、（ｂ）実施例１におけるプローブの固定化方法を示すための断面図
【図３】（ａ）、（ｂ）実施例１におけるプローブの固定化方法を示すための断面図
【図４】実施例１におけるプローブの固定化基板の断面模式図
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（実施例１）
以下、本実施例におけるプローブの固定化方法について説明する。
【００１４】
図１に本実施例のプローブの固定化方法において固定化された固定化基板の断面模式図を示す。
【００１５】
固定化基板１０には、基板１１の表面にある表面分子とプローブ１２のアルデヒド基とが共有結合することでプローブ１２が固定化されている。
【００１６】
次に、図２及び図３を用いて本実施例におけるプローブの固定化方法を示す。
【００１７】
まず、基板１１と、固定化するためのプローブ１２とを準備し、準備した基板１１にプラズマ処理をすることで、ラジカル化した官能基（基板の官能基１３）を基板１１に付加する。例えば、図２（ａ）に示すように、シリコン、ガラス、石英、酸化シリコン、酸窒化シリコン、のいずれからなるか、あるいは、これらのうちのいずれかの混合物よりなる基板１１を、酸素プラズマによって処理するとラジカル化された水酸基（−ＯＨ）（基板の官能基１３）が多数形成される。もしくは、図３（ａ）に示すように、窒化シリコン、酸窒化シリコンあるいはこれらの混合物よりなる基板１１を、笑気ガスプラズマ、もしくはＮＯｘプラズマ、もしくは窒素と水素の混合プラズマによって処理するとラジカル化されたアミン基（−ＮＨ2）（基板の官能基１３）が多数形成される。あるいは、基板１１に酸素プラズマ処理によってラジカル化された水酸基（−ＯＨ）を形成し、その後窒素プラズマ処理によってラジカル化された−ＯＮ基を形成させてもよい。なお、プラズマは、チャンバー内に不活性気体ガスや反応性ガス圧力を一定の減圧状態に保ち、電極間に印加した直流電圧や高周波電圧、あるいはマイクロ波などによる電界によって加速された電子とガス分子との衝突電離を利用して生成することができる。このようなプラズマ処理によって形成される基板の官能基１３の数および密度は、プラズマ発生の際の電力・ガスの分圧、真空度によって厳密に制御することができる。
【００１８】
このようなラジカル化された基板の官能基１３は、図２（ｂ）あるいは図３（ｂ）に示すように、準備されていたプローブ１２の官能基１４と容易に反応し、共有結合を形成することにより、プローブ１２が基板１１に吸着し固定される。ここでいうプローブの官能基１４とは、アルデヒド基、チオール基、カルボキシル基、活性化カルボキシル基、ジスルフィド基、活性化ジスルフィド基、アルキル基、アルケン基、アルキン基、アルデヒド基、ケトン基、アジド基、アミンあるいはそれらの誘導体からなる。
【００１９】
本実施例におけるプローブの固定化方法による効果を示す。
【００２０】
本発明におけるプローブの固定化方法は、従来のシランカップリング法のように、プローブの末端を特定の反応基に置換する必要がないので、プローブに薬品処理などの化学処理を施す必要がない。すなわち、プローブそのものを化学処理による化学反応により処理することなく、基板１１をプラズマ処理してラジカル化した基板の官能基１３を発生させることにより、プローブ１２に存在するアルデヒド基などのプローブの官能基１４をそのまま用いて基板１１に吸着、固定化させることができる。従って、プローブ１２を固定化する際に、プローブ１２の混ざった溶液を化学反応させるために必要な溶液に置換する必要がなく、どのようなｐＨや温度の溶液を用いた場合でもプローブ１２を固定化することができる。その結果、プローブ１２に対して好ましくないｐＨ、塩濃度、温度もしくは界面活性剤を含んだ溶液に置換することによるプローブ１２の変性を避けることができる。さらに、従来のような化学反応を伴わないため工程数の軽減、測定時における固定化基板１０ロット毎のばらつきを軽減することができる。さらに、プローブ１２と基板１１の間に長いリンカーを有する必要がないのでプローブ１２の配向制御が容易となる。
【００２１】
なお、プラズマに用いるガスとして、酸素ガス、笑気ガス、ＮＯｘについて説明したが、プラズマ化としては、他に、窒素、水素、アンモニア、Ｃ2Ｆ6、ＣＦ4、大気などのガスのいずれかあるいはそれらのいずれかの混合ガスを利用しても良い。
【００２２】
なお、基板１１として、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネイト、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ビニル、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、ＣＯＣ（環状オレフィン・コポリマー）のような、樹脂基板を前記のプラズマガスで処理しても同様の効果を得ることができる。
【００２３】
なお、プローブ１２として糖を用いた場合に、プローブ１２に特別に官能基を付加する必要性がないので、より工程数を軽減させることができる。この場合は、プローブ１２である糖の末端を還元し還元糖にすることでアルデヒド基が露出することができる。そしてこの還元糖をプラズマ処理しラジカル化された官能基１３を有する基板１１に固定化させることによって、還元糖を末端に含む糖であるプローブ１２を吸着、固定化することができる。
【００２４】
なお、プローブ１２である糖を還元糖とする工程では、酵素反応を用いることができるので、薬品処理などの化学処理を施す必要がなく、プローブの変性を抑制することができる。
【００２５】
また図４に示すように、プローブ１２に官能基がない場合は、官能基を持ったエピトープ１５をプローブ１２に付加することでラジカル化された基板１１にプローブを固定できる。例えば、プローブ１２がタンパク質１２ａである場合、エピトープ１５として糖１５ａの末端を還元した還元糖を糖転移酵素によってプローブ１２であるタンパク質１２ａのリジン残基ないしセリン残基に付加し、還元糖のアルデヒド基を介してプローブ１２を基板１１に吸着、固定化することができる。リンカーとして還元糖を用いることにより、リンカーを短くすることができ、従来に比べプローブ１２の配向制御を容易とすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明はＤＮＡアレイ、プロテインアレイ、糖鎖アレイなどに用いられるアレイ基板に固定されるプローブの固定化方法として有用である。
【符号の説明】
【００２７】
１０  固定化基板
１１  基板
１２  プローブ
１２ａ  タンパク質
１３  基板の官能基
１４  プローブの官能基
１５  エピトープ
１５ａ  糖
【図１】
2012141140.tif 000003
【図２】
2012141140.tif 000004
【図３】
2012141140.tif 000005
【図４】
2012141140.tif 000006