(57)【要約】【課題】 食品中の微生物種を迅速かつ高精度で同定分析するために、食品から微生物を増殖させることなく直接分離した微生物濃縮物を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法に供する方法を提供すること。【解決手段】 液状の食品試料を遠心分離して得た沈殿物、その沈殿物の懸濁液を微細孔膜に通し分離したろ液または液状もしくは液体に分散させた食品試料を微細孔膜に通し分離したろ液、あるいは食品由来のタンパク質成分を等電点沈殿させたのち、微細孔膜を通過させたろ液部を遠心分離法により分離した沈殿物を、微生物濃縮物としてマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法の同定分析に供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法を用いて食品中の微生物種を同定する場合において、食品より分離して得た微生物濃縮物を試料検体として微生物種の同定をする方法。
【請求項２】
微生物濃縮物を食品中より分離する方法が、液状食品または液体に分散もしくは溶解させた食品から遠心分離法により沈殿として分離する請求項1に記載の方法。
【請求項３】
微生物濃縮物を食品中より分離する方法が、請求項２記載の沈殿の懸濁液、液状食品、または液体に分散もしくは溶解させた食品を微細孔膜を通して、ろ液として分離する請求項1に記載の方法。
【請求項４】
微生物濃縮物を食品中より分離する方法が、微生物濃縮物を食品中より分離する前に予め食品由来のタンパク質成分を等電点沈殿させてから微細孔膜を通してろ液として分離し、さらに得られた該ろ液から遠心分離法により沈殿として分離する請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法を用いて、食品試料より分離された微生物濃縮物から微生物種を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品、医薬品及び環境などの管理において、微生物試験及び検出された微生物の分類・同定を行うことは、衛生管理、汚染原因の究明、二次汚染防止及び殺菌処理方法の対応策設定を行ううえで重要なことである。
【０００３】
かかる微生物の分類・同定は迅速に行う必要があり、すでに病原菌の迅速測定法として非特許文献１のようなキット化された迅速測定法が実用化されている。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）やイムノクロマト法などの免疫学的検出法とＰＣＲ法などの遺伝子検出法などである。これらの方法は迅速法と言われているものの、いずれも培養時間込みで２〜３日間を要する測定法であり、更なる迅速な測定法が要望されていた。
【０００４】
また、非特許文献２記載のように、微生物の属レベルの同定にはキノン分子種やGC含量、種レベルでは細胞壁組成、脂肪酸分析、16SrRNA塩基配列、DNA-DNA hybridization、PCR-RFLPなどがある。一般的には方法が確立していて、最も手軽でデータベースも充実している16SrRNA塩基配列の解析で、97％以下の相同性であれば別種と判定するのが普通である。ただ多くの細菌で16SrRNAのゲノム中のコピー数はばらついており、配列の異なるものも含まれる。また属によっては相同性が高すぎて、97％という閾値で種を分類できないという問題点もある。すなわち、従来の同定法では菌種、菌株の正確な同定は困難という問題もあった。
【０００５】
一方でマトリックス支援レーザー・脱離イオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF/MS、以下MALDI）を用いて菌体を構成する総タンパク質の質量を分析し、得られたマススペクトルパターンを微生物データベースと比較することによって微生物の分類・同定を行う手法がある（特許文献1及び特許文献2及び非特許文献３及び非特許文献４及び非特許文献５）。該方法によると、微生物の細胞構成成分のMALDIマススペクトルのパターンを指紋判定することにより、菌種の同定や菌株の識別が可能と言われている。
【０００６】
上記のMALDI法の測定原理は以下のとおりである。微生物を含む試料とマトリックス（レーザー光によってイオン化されやすい物質で、シナピン酸、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、フェルラ酸、ゲンチシン酸、３−ヒドロキシピコリン酸などが代表的なものである。）を予め混合しておき、この混合物に窒素レーザー（波長３７０nm）のパルスを当てると、マトリックスは瞬時に励起され、受け取った余剰エネルギーを熱エネルギーとして放出する。その結果、試料とマトリックスの混合物のごく一部が気化され、同時に試料とマトリックス間でプロトンの授受が起こって試料がイオン化する。生成したイオンは加速電圧（２０〜２５KV前後）を印加されて運動エネルギーを生じ、イオン検出器まで飛行して行く。このときの飛行速度は、イオン質量が大きいと低速で、逆にイオン質量が小さいと高速で飛行する。この飛行速度の差異に由来する検出器に到達する時間差から、試料の質量や質量分布（マススペクトル）を測定することができる。
【０００７】
本MALDI法は、菌が分離されていればマススペクトルを得るまで数分で完了し、数百のサンプルでも1日で解析可能なほど迅速であること、寒天培地に形成されるほどの菌体量があれば分析可能で、操作も簡便で低コストであるなどのメリットのある方法である。
【０００８】
しかし、ＭＡＬＤＩ法においても、分析に必要な菌体量を得るために、最低でも1日以上の平板培地による培養が必須とされており、更なる迅速な微生物の分類・同定法が求められていた。また、損傷を受けた菌や生命力を保持しているが通常の培養では発育出来ないviable but non- culturable（VNC）の状態になった菌は、培養によっても必要とされる菌体量が得られないため、ＭＡＬＤＩ法によって検出できないという問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開2001-502164号公報
【特許文献２】特開2010-515915号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】分析技術最前線  SCAS NEWS 2005−II  ７−１０頁
【非特許文献２】化学と生物  Vol.48,No.9,2010 598−601頁
【非特許文献３】Rapid Commun.Mass Spectrom.,10,1227,1996
【非特許文献４】Rapid Commun.Mass Spectrom.,10,1992,1996
【非特許文献５】Nature Biotechnol.,25,1334,1996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
食品中の微生物種を迅速かつ高精度で同定分析するために、食品から微生物を増殖させることなく直接分離して得た微生物濃縮物を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析に供する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するために、本発明者は鋭意検討をおこなった。その結果、従来は必須とされていた最低でも1日以上の平板培地による培養による食品中の微生物の増殖を行うことなく、迅速に簡易な方法でＭＡＬＤＩ法で分析可能な試料検体を得る方法として、液状の食品試料を遠心分離または微細孔膜を通して菌体を回収する方法、あるいは食品由来のタンパク質成分を等電点沈殿により除去したのち、微細孔膜を通過させ、遠心分離法により沈殿として回収する方法が有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
（１）マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法を用いて食品中の微生物種を同定する場合において、食品より分離して得た微生物濃縮物を試料検体として微生物種の同定をする方法。
（２）微生物濃縮物を食品中より分離する方法が、液状食品または液体に分散もしくは溶解させた食品から遠心分離法により沈殿として分離する（１）に記載の方法。
（３）微生物濃縮物を食品中より分離する方法が、（２）記載の沈殿の懸濁液、液状食品または液体に分散もしくは溶解させた食品を、微細孔膜を通してろ液として分離する（１）に記載の方法。
（４）微生物濃縮物を食品中より分離する方法が、微生物濃縮物を食品中より分離する前に予め食品由来のタンパク質成分を等電点沈殿させてから微細孔膜を通してろ液として分離し、さらに得られた該ろ液から遠心分離法により沈殿として分離する（１）に記載の方法。
である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、食品中の微生物種を食品から微生物を増殖させることなく同定できるため、微生物の同定・分類を数時間以内と極めて短時間で同定することが可能となった。また、損傷を受けた菌や生命力を保持しているが通常の培養では発育出来ないVNCの状態になった菌の同定をすることも可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、食品に対し好適に利用できる。菌数は、一般的に用いられる平板培地で集落を形成する生菌数濃度、colony forming unit （CFU）の単位であらわすことができる。食品試料中の菌数は単位ｇ当り、10の５乗CFU以上、好ましくは10の６乗CFU以上、さらに望ましくは10の７乗CFU以上が好ましい。菌数が下限未満であると、本発明の方法で得られる微生物濃縮物中の菌数が少ないため、MALDI法により正確なマススペクトルが得られなくなり、好ましくない。微生物濃縮物中の菌数は、10の６乗CFU以上、好ましくは10の７乗CFU以上、最も好ましくは10の８乗CFU以上、さらに望ましくは10の９乗CFU以上であるのが好ましい。
【００１５】
本発明に用いる試料は、液状、固体状のいずれでも適用することができる。固体状の試料の場合は、殺菌処理した蒸留水などの液体に溶解または分散させたものを用いる。その場合、試料が蒸留水中で分散すれば問題ないが、1〜20重量%となるように蒸留水を添加するのが好ましい。
【００１６】
続いて上記の液状または蒸留水などの液体に分散もしくは溶解させた試料を遠心分離し、微生物濃縮物を沈殿として回収する。遠心gは微生物濃縮物が回収できれば問題はないが、1000〜8000×gが好ましい。
【００１７】
また、上記の上記の液状または蒸留水などの液体に分散もしくは溶解させた試料を微細孔膜を通してろ液として分離して、ろ液部を微生物濃縮物として得ることができる。更に、上記の遠心分離により得られた微生物濃縮物の沈殿に蒸留水を添加して、懸濁液としてから微細孔膜を通して、ろ液として微生物がさらに濃縮された濃縮物を得ることもできる。微細孔膜は食品中の複合成分から微生物をろ過して、微生物濃縮物をろ液として得られるものであればよいが、孔径は１μｍ〜20μｍ、好ましくは1μｍ〜10μｍ、最も望ましくは2μｍ〜8μｍが好ましい。1μｍ未満であると、微生物菌体が微細孔膜を通過できない場合もあり、ろ液側に効率的に微生物濃縮物を得ることができない。逆に、20μｍ以上になると、ろ液中に食品中の複合成分の一部が混入して、やはりろ液側に微生物を効率的に濃縮することができない。該微細孔膜の材質は特に制限はないが、市販のトラックエッチドメンブレンフィルタなどを好適に用いることができる。
【００１８】
本発明においては、微生物濃縮物を食品中より分離する前に、予め食品由来のタンパク質を等電点沈殿させることもできる。等電点沈殿をするpHは食品中のタンパク質の等電点±0.4、好ましくは等電点の±0.2、さらに望ましくは等電点付近が好ましい。等電点から大きく離れると、MALDI法で分析する際に食品由来のタンパク質の混入が多くなり、正確なマススペクトルが得られなくなり、好ましくない。等電点沈殿によりタンパク質を沈殿させた食品を、微細孔膜によりろ過して得られたろ液を得て、さらに該ろ液を遠心分離することにより、沈殿として分離した微生物濃縮物を得ることができる。
【００１９】
上記によって得られた微生物濃縮物の菌体試料、またはギ酸等を用いて微生物濃縮物のタンパク質を抽出した溶液とマトリックス試薬をMALDIプレート上に添加する。続いてMALDI測定を行い、取得したマススペクトルを解析ソフトに登録されているスペクトルデータベースと照合することで微生物の分類・同定を行う。
【００２０】
上記のマトリックス試薬としては、微生物の分類・同定用としては、中〜高分子量の試料分析に適するα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（CHCA）などが好適に利用できる。また、MALDI測定機器は、市販の測定機器が利用できるが、Autoflex-II（ブルカー・ダルトニクス株式会社製）やAXIMA微生物同定システム（株式会社島津製作所製）などが好適に利用できる。スペクトルデータベースは、MALDI測定機器メーカーから提供されるものを利用することができる。
【実施例】
【００２１】
次に実施例をあげて本発明の実施様態を具体的に説明する。
実施例1
大豆ペプチド（不二製油株式会社製）を人為的に汚染させたものを試料とした。この試料10gを水90mlに分散または溶解し、標準寒天培地にて一般生菌数を測定したところ10の７乗CFUであった。次に汚染の原因となった微生物を同定した。すなわち当該試料2gを水38mlに分散または溶解し、遠心分離して微生物濃縮物を沈殿として回収し、滅菌水にて洗浄した。次に微生物濃縮物を滅菌水300μlに懸濁し、900μlのエタノールを添加した。遠心分離後に上清を捨て、70％ギ酸10μlを添加した。さらにアセトニトリル10μlを添加し、遠心分離後の上清を分析試料とした。分析試料1μlをMALDIプレートのスポットにアプライして常温で風乾した。その上にマトリックス溶液（ＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を使用））1μlを重ね同様に風乾し、MALDI（Autoflex-II（ブルカー・ダルトニクス株式会社製）にて正イオン・リニアモードにて分析した。得られたスペクトルから微生物同定ソフトウエアMALDI Biotyper 2.0 （ブルカー・ダルトニクス株式会社製）にて菌種の同定を行った。その結果、当該溶液中の菌はEscherichia coliと同定された。
【００２２】
比較参考例１
実施例１の標準寒天培地上に生育したコロニーから定法に従ってＤＮＡを抽出し、16SrRNAの塩基配列法にて当該試料中の微生物を同定したところ、同じくEscherichia coliと同定された。
【００２３】
実施例2
チョコレート（不二製油株式会社製）を人為的に汚染させ、５０℃、３０分保持して完全融解したものを試料とした。この試料10gを水90mlに分散または溶解し、標準寒天培地にて一般生菌数を測定したところ10の８乗CFUであった。次に汚染の原因となった微生物をMALDIにて同定した。すなわち当該試料2gを水38mlに分散または溶解し、孔径１０μｍの市販のTEフィルタ（日本ミリポア社製  ISOPORE(R) TSTPフィルタ）に通し、ろ液として微生物濃縮物を回収した。得られた濃縮物300μlに900μlのエタノールを添加し、遠心分離して上清を捨て、70％ギ酸10μlを添加した。さらにアセトニトリル10μlを添加し、遠心分離後の上清を分析試料とした。分析試料1μlをMALDIプレートのスポットにアプライして常温で風乾した。その上に実施例１と同マトリックス溶液1μlを重ね同様に風乾し、MALDI（Autoflex-II（ブルカー・ダルトニクス株式会社製）にて正イオン・リニアモードで分析した。得られたスペクトルから微生物同定ソフトウエアMALDI Biotyper 2.0 （ブルカー・ダルトニクス株式会社製）にて菌種の同定を行った。その結果、当該溶液中の菌はBacillus subtilisと同定された。
【００２４】
比較参考例２
実施例２の標準寒天培地上に生育したコロニーから定法に従ってＤＮＡを抽出し、16SrRNAの塩基配列法にて当該試料中の微生物を同定したところ、同じくBacillus subtilisと同定された。
【００２５】
実施例３
豆乳（不二製油株式会社製）を人為的に汚染させたものを試料とした。標準寒天培地にてこの試料の一般生菌数を測定したところ10の8乗CFUであった。次に汚染の原因となった微生物をMALDIにて同定した。すなわち当該試料120mlをpH4.7に調整し、食品由来のタンパク質成分を沈殿させ、孔径10μｍの市販のTEフィルタ（日本ミリポア社製  ISOPORE(R) TSTPフィルタ）に通した。次にろ液を遠心分離し、微生物濃縮物を回収した。得られた濃縮物300μlに900μlのエタノールを添加し、遠心分離して上清を捨て、70％ギ酸10μlを添加した。さらにアセトニトリル10μlを添加し、遠心分離後の上清を分析試料とした。分析試料1μlをMALDIプレートのスポットにアプライして常温で風乾した。その上に実施例１と同マトリックス溶液1μlを重ね同様に風乾し、MALDI（Autoflex-IIブルカー・ダルトニクス株式会社製）にて正イオン・リニアモードで分析した。得られたスペクトルから微生物同定ソフトウエアMALDI Biotyper 2.0 （ブルカー・ダルトニクス株式会社製）にて菌種の同定を行った。その結果、当該溶液中の菌はCitrobacter freundiiと同定された。
【００２６】
実施例３の標準寒天培地上に生育したコロニーから定法に従ってＤＮＡを抽出し、16SrRNAの塩基配列法にて当該試料中の微生物を同定したところ、同じくCitrobacter freundiiと同定された。
【００２７】
実施例４
市販の漬け物10gを水90mlに溶解し、標準寒天培地にてこの試料の一般生菌数を測定したところ10の8乗CFUであった。次に遠心分離して微生物濃縮物を沈殿として回収し、滅菌水にて洗浄した。得られた濃縮物300μlに900μlのエタノールを添加し、遠心分離して上清を捨て、70％ギ酸10μlを添加した。さらにアセトニトリル10μlを添加し、遠心分離後の上清を分析試料とした。分析試料1μlをMALDIプレートのスポットにアプライして常温で風乾した。その上に実施例１と同マトリックス溶液1μlを重ね同様に風乾し、MALDI（Autoflex-IIブルカー・ダルトニクス株式会社製）にて正イオン・リニアモードで分析した。得られたスペクトルから微生物同定ソフトウエアMALDI Biotyper 2.0 （ブルカー・ダルトニクス株式会社製）にて菌種の同定を行った。その結果、当該溶液中の菌はLeuconostoc mesenteroidesと同定された。
【００２８】
比較参考例４
実施例３の標準寒天培地上に生育したすべてのコロニーから定法に従ってＤＮＡを抽出し、16SrRNAの塩基配列法にて当該試料中の微生物を同定したところ、うち9つはLeuconostoc mesenteroides、うち１つはLactobacillus curvatusと同定された。
【００２９】
実施例１と比較参考例１、実施例２と比較参考例２および実施例３と比較参考例３および実施の対比から明らかなように、汚染試料から微生物を増殖させることなく直接同定した本発明の方法によって、従来の16SrRNAの塩基配列法による方法と同一の同定結果を得ることができた。
さらに実施例４と比較参考例４の対比から明らかなように、本発明の方法によって試料中に複数の菌が存在する場合は、主要な菌を同定することができた。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明により、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法を用いた微生物種の同定において、食品試料から微生物を増殖させることなく、直接同定できるようになり、特に食品業界における微生物の同定の大幅な時間短縮に大きく寄与するものである。