(57)【要約】【課題】  発酵茶由来の高分子ポリフェノールを高含量で含む抽出物を、酢酸エチルやブタノールやアセトンといった有機溶媒を用いずに簡便に調製する方法を提供すること。【解決手段】  発酵茶葉の水溶出液と親水性ビニルポリマーを材質とする吸着剤を混合した後、吸着剤の非吸着成分を除去してから、水を含んでいてもよいエタノールを用いて吸着剤の吸着成分を溶出させることを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物の調製方法であって、発酵茶葉の水溶出液と親水性ビニルポリマーを材質とする吸着剤を混合した後、吸着剤の非吸着成分を除去してから、水を含んでいてもよいエタノールを用いて吸着剤の吸着成分を溶出させることを特徴とする調製方法。
【請求項２】
プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを７．５重量％以上含み、かつ、カフェインの含量が１重量％以下であることを特徴とする発酵茶抽出物。
【請求項３】
請求項２記載の発酵茶抽出物を用いて調製されてなることを特徴とする医薬品または飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪肝の予防剤や治療剤などとして有用な高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールが、紅茶やウーロン茶などの発酵茶に含まれていることが知られている。この発酵茶由来の高分子ポリフェノールは、肝臓における脂肪の蓄積の抑制作用をはじめとする種々の生理活性作用を有しており、例えば脂肪肝の予防剤や治療剤などとしての利用が期待されている（特許文献１）。
【０００３】
発酵茶からのこの高分子ポリフェノールの取得は、現在のところ、特許文献１に記載されている方法、即ち、発酵茶葉中の水溶出成分（水、沸騰水、熱水、水蒸気などで抽出することで溶出する成分）を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製する方法や、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されなかったブタノール非溶出成分を酸性化した後に再びブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製する方法などを用いて行われている。しかしながら、これらの方法は、発酵茶由来の高分子ポリフェノールを高純度で取得することができる点において優れているものの、工程数が多いので時間と労力を要するという問題がある。また、有機溶媒として酢酸エチルやブタノールやアセトンを用いていることから、この高分子ポリフェノールを医薬品の有効成分や飲食品素材などとして利用する際、これらの有機溶媒の残存が問題になる可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−３２０９５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、発酵茶由来の高分子ポリフェノールを高含量で含む抽出物を、酢酸エチルやブタノールやアセトンといった有機溶媒を用いずに簡便に調製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、発酵茶由来の高分子ポリフェノールが親水性ビニルポリマーを材質とする吸着剤に吸着される性質を利用し、この高分子ポリフェノールを高含量で含む抽出物を水とエタノールだけを用いて簡易に調製することができることを知見した。
【０００７】
上記の知見に基づいてなされた本発明のプロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物の調製方法は、請求項１記載の通り、発酵茶葉の水溶出液と親水性ビニルポリマーを材質とする吸着剤を混合した後、吸着剤の非吸着成分を除去してから、水を含んでいてもよいエタノールを用いて吸着剤の吸着成分を溶出させることを特徴とする。
また、本発明の発酵茶抽出物は、請求項２記載の通り、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを７．５重量％以上含み、かつ、カフェインの含量が１重量％以下であることを特徴とする。
また、本発明の医薬品または飲食品は、請求項３記載の通り、請求項２記載の発酵茶抽出物を用いて調製されてなることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、発酵茶由来の高分子ポリフェノールを高含量で含む抽出物を、酢酸エチルやブタノールやアセトンといった有機溶媒を用いずに簡便に調製する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例の試験例１における肝臓組織切片の染色結果を示す写真である。
【図２】同、内臓脂肪重量の測定結果を示すグラフである。
【図３】同、体重の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のプロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールを含有する発酵茶抽出物の調製方法は、発酵茶葉の水溶出液と親水性ビニルポリマーを材質とする吸着剤を混合した後、吸着剤の非吸着成分を除去してから、水を含んでいてもよいエタノールを用いて吸着剤の吸着成分を溶出させることを特徴とするものである。
【００１１】
本発明において取得対象とする、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００である高分子ポリフェノールは、紅茶やウーロン茶などの発酵茶（茶葉の発酵を進行させてなる茶）の製造過程（発酵や熟成など）で、カテキン類（Ｃ６−Ｃ３−Ｃ６骨格にフェノール系水酸基を複数個有するフラバン−３−オール骨格を持つ化合物群。具体的には、カテキン、および、カテキンガレート、エピカテキン、エピカテキンガレート、ガロカテキン、ガロカテキンガレート、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレートなどのカテキン誘導体）が高度に重合することで生成すると考えられるものであることは特許文献１に記載の通りである。なお、カテキンの化学構造は下記に示す通りである。
【００１２】
【化１】
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【００１３】
プロシアニジン構造とは、カテキン類のＣ環と他のカテキン類のＡ環が結合した構造である。本発明において取得対象とする発酵茶由来の高分子ポリフェノールは、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造の他に、カテキン類のＢ環と他のカテキン類のＡ環が結合した構造などを含んでいてもよい。発酵茶由来の高分子ポリフェノールが有する部分構造の具体例としては以下に示すものが挙げられる。なお、以下に示す部分構造はあくまで例示に過ぎず、発酵茶由来の高分子ポリフェノールは、ベンゾトロポロン、ベンゾキノン、ナフトキノンなどを含む部分構造をはじめとする多種多様の部分構造を有するものと考えられる。
【００１４】
【化２】
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【００１５】
本発明の発酵茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物の調製方法は、この高分子ポリフェノールが親水性ビニルポリマーを材質とする吸着剤に吸着される性質を利用したものであり、発酵茶葉の水溶出液と親水性ビニルポリマーを材質とする吸着剤を混合する工程と、吸着剤の非吸着成分を除去する工程と、水を含んでいてもよいエタノールを用いて吸着剤の吸着成分を溶出させる工程からなる。以下にそれぞれの工程の詳細を説明する。
【００１６】
（１）発酵茶葉の水溶出液と親水性ビニルポリマーを材質とする吸着剤を混合する工程
この工程は、発酵茶葉の水溶出液に含まれる高分子ポリフェノールを吸着剤に吸着させることを目的としたものである。発酵茶葉の水溶出液は、例えば５０℃以上の温水ないし熱水、または沸騰水に発酵茶葉を投入することで得られる、発酵茶葉に含まれる高分子ポリフェノールをはじめとする水溶性成分を含む水溶液であることが望ましい。親水性ビニルポリマーを材質とする吸着剤は、例えばゲル濾過クロマトグラフィーに用いられる粒子径が１０μｍ〜５００μｍの多孔質で球状の市販のものであってよく、その具体例としては、東ソー株式会社のトヨパール（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ：製品名）などが挙げられる。この工程は、例えば、発酵茶葉の水溶出液を満たした容器に吸着剤を添加して攪拌する態様（攪拌時間は例えば５秒間〜１時間とすればよい）で行ってもよいし、吸着剤を充填したカラムに発酵茶葉の水溶出液をアプライする態様で行ってもよい。なお、発酵茶葉の水溶出液と吸着剤との混合割合は、例えば１：０．１〜１：５（容積比）とすればよい。
【００１７】
（２）吸着剤の非吸着成分を除去する工程
この工程は、発酵茶葉の水溶出液に含まれる吸着剤に吸着しない不要成分を除去することを目的としたものである。この工程は、（１）の工程を発酵茶葉の水溶出液を満たした容器に吸着剤を添加して攪拌する態様で行った場合、例えば吸着剤を濾紙上に濾取した後、十分量の水を用いて吸着剤を洗浄することで行えばよい。また、（１）の工程を吸着剤を充填したカラムに発酵茶葉の水溶出液をアプライする態様で行った場合、十分量の水をカラムに流してカラム内の吸着剤を洗浄することで行えばよい。
【００１８】
（３）水を含んでいてもよいエタノールを用いて吸着剤の吸着成分を溶出させる工程
この工程は、吸着剤に吸着させた高分子ポリフェノールを溶出させることを目的としたものである。溶出溶媒として含水エタノールを用いる場合、そのエタノール濃度は３０％以上が望ましい。エタノール濃度が低すぎると高分子ポリフェノールが効果的に溶出されない恐れがあるからである。高分子ポリフェノールの溶出性とコストなどを合わせ考えれば、エタノール濃度が７０％〜９０％の含水エタノールを溶出溶媒として用いることが望ましい。なお、この工程は、（１）の工程を発酵茶葉の水溶出液を満たした容器に吸着剤を添加して攪拌する態様で行った場合、（２）の工程で洗浄した吸着剤に対して溶出溶媒を添加することで行えばよい。また、（１）の工程を吸着剤を充填したカラムに発酵茶葉の水溶出液をアプライする態様で行った場合、（２）の工程で洗浄したカラムに溶出溶媒を流すことで行えばよい。
【００１９】
以上の工程により、本発明の発酵茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物を吸着剤の吸着成分の溶出液として得ることができる。なお、この吸着剤の吸着成分の溶出液からエタノールを例えば減圧濃縮を行って除去した後、凍結乾燥や噴霧乾燥を行えば、発酵茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物を粉末状物として得ることができる（粉砕操作は要しない）。また、凍結乾燥や噴霧乾燥のかわりに減圧濃縮を行えば、発酵茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物を液状濃縮物として得ることができる。その高分子ポリフェノールの含量は概ね７．５重量％以上であり（上限は概ね３０重量％）、それ以外の成分としてはフラボノイド系化合物が主体を占め（５０重量％以上）、その他にカテキン類やテアフラビン類が含まれる。こうして得られた発酵茶抽出物は、医薬品の有効成分や飲食品素材などとして各種の形態に加工して服用したり飲食したりすることができる。特筆すべきは、この発酵茶抽出物にはカフェインがほとんど含まれていないので（１重量％以下）、カフェインの副作用が無く、老若男女に受け入れられやすい利用が可能であることである。
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００２１】
実施例１：紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物の調製（その１）
市販の紅茶（デイリークラブ：三井農林の商品名）３０ｇを弱く沸騰させた水１Ｌに投入し、約１分間そのままの状態を保ち、さらに時々攪拌しながら１０分間保つことで、紅茶に含まれる水溶性成分の抽出を行った。その後、ブフナーロートにＮｏ．２濾紙（アドバンテック）２枚を敷いて吸引濾過を行って濾液（紅茶の水溶出液）を得た。この濾液に、親水性ビニルポリマーを材質とする吸着剤として水で予め洗浄した東ソー株式会社のトヨパールＨＷ−４０Ｆ（製品名、粒子径：３０μｍ〜６０μｍ）２５０ｍＬを加えて１分間攪拌した後、ブフナーロートにＮｏ．２濾紙（アドバンテック）１枚を敷いて吸引濾過を行い、濾紙上に吸着剤を濾取し、濾紙上の吸着剤を１回につき水１５０ｍＬを用いて１０回洗浄した。次に、濾紙上の吸着剤に対して１５０ｍＬのエタノール濃度が８０％の含水エタノールを添加して吸着剤の吸着成分を溶出させる操作を１２回行った。１２回分の吸着剤の吸着成分の溶出液を５０℃で減圧濃縮を行ってエタノールを除去した後、凍結乾燥を行うことで、紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物２．９６ｇを茶褐色粉末として得た。この紅茶由来の抽出物に含まれる成分の含量を以下の方法によって定量した。
【００２２】
（１）高分子ポリフェノールおよびフラボノイド系化合物
（Ａ）分析方法
（ア）分析装置：中圧ポンプ（ＳＰ１１、東京理化器械）２台、中圧液体クロマト用カラム（φ１×３０ｃｍ、東京理化器械）、試料注入器（Ｉｎｊｅｃｔｏｒ  ＶＩ、東京理化器械）、フラクションコレクター（ＣＨＦ１６１ＲＡ、アドバンテック）を用い、溶媒の直線的濃度勾配が可能な装置を組み立てた。
（イ）展開溶媒：Ａ溶媒としてアセトン濃度が２０％の含水アセトン９０ｍＬ、Ｂ溶媒としてアセトン濃度が５０％の含水アセトン９０ｍＬを用い、流速を１．５ｇ／４分とし、Ａ溶媒とＢ溶媒の割合を１００：０から０：１００に直線的に変化させた。
（ウ）試料注入：サンプル４０ｍｇをアセトン濃度が２０％の含水アセトン２ｍＬに溶解して行った。
（エ）分画：溶出液をフラクションコレクターで１．５ｇずつ分取した（フラクション総数：１１５）。溶出液の３５０ｎｍの吸光度の測定結果をもとに溶出曲線を描き、これに従って分画した。各画分を５０℃で減圧濃縮してアセトンを除去した後、凍結乾燥を行ってから秤量し、その重さから画分を構成する成分のサンプル中の割合を求めた。
（Ｂ）分析結果
目的とする紅茶由来の高分子ポリフェノールは、フラクションＮｏ．７５〜１１０の画分として得られ、サンプルに含まれるその含量は２５．６重量％であった。なお、この画分が目的とする紅茶由来の高分子ポリフェノールであることは、特許文献１に記載の方法による平均分子量の測定結果（数平均分子量：１．３６×１０４、重量平均分子量：１．５９×１０４）と構造解析の結果に基づいて確認した（以下に示す部分構造を有する）。フラボノイド系化合物は、フラクションＮｏ．２０〜７４の画分として得られ、サンプルに含まれるその含量は６０．６重量％であった。
【００２３】
【化３】
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【００２４】
（２）その他の成分
サンプルを精密に秤量し、アセトニトリル濃度が１０％の含水アセトニトリルの一定量に溶解して調製した分析試料を用いて分析を行った。
（ア）分析装置：島津製作所のＬＣ−１０Ａシステム（ポンプＬＣ−１０ＡＤ、カラムオープンＣＴＯ−１０Ａ、検出器ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ）を用いた。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３、φ４．６×２５０ｍｍ、粒子径５μｍ（ジーエルサイエンス）を用いた。
（イ）分析条件：分析試料の注入量は４．０μＬとし、流速は０．７ｍＬ／分とした。カラム温度は４０℃とした。
（ウ）展開溶媒：Ａ溶媒としてアセトニトリル濃度が５％の含水アセトニトリル（０．０２％ＴＦＡ含有）、Ｂ溶媒としてアセトニトリル濃度が４０％の含水アセトニトリル（０．０２％ＴＦＡ含有）を用い、Ａ溶媒とＢ溶媒の割合を７０分間で１００：０から０：１００に直線的に変化させた。
（エ）検出：２８０ｎｍと３７５ｎｍを検出波長とし、標準物質のエリア数と分析試料のエリア数から、サンプルに含まれる成分のサンプル中の割合を求めた。
（オ）結果：サンプルには、カテキン類（エピガロカテキン：３．５重量％、エピガロカテキンガレート：３．８重量％）やテアフラビン類（テアフラビン１：１．１重量％、テアフラビン２ａｂ：１．２重量％、テアフラビン３：３．８重量％）が含まれていることがわかった。サンプルに含まれるカフェインの含量は０．３８重量％であった。
【００２５】
（３）まとめ
以上の結果から、実施例１で得られた紅茶由来の抽出物は、その約１／４が高分子ポリフェノールから構成されていることがわかった。また、この抽出物のカフェインの含量は１重量％以下であったことから、実施例１の方法は、紅茶由来の高分子ポリフェノールを高含量で含み、しかも脱カフェイン化された抽出物を、水とエタノールだけを用いて簡易に調製することができる方法であることがわかった。
【００２６】
実施例２：紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物の調製（その２）
実施例１におけるエタノール濃度が８０％の含水エタノールのかわりにエタノール濃度が４０％の含水エタノールを用いること以外は実施例１と同様の操作を行うことで、紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物を得た。
【００２７】
実施例３：ウーロン茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物の調製
実施例１における紅茶のかわりにウーロン茶を用いること以外は実施例１と同様の操作を行うことで、ウーロン茶由来の高分子ポリフェノールを７．９重量％含む抽出物を得た。
【００２８】
応用例１：紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物を配合した緑茶飲料の製造
実施例１で得た紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物を市販の緑茶（キリンビバレッジの商品名：生茶）に０．０８％添加することで、紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物を配合した緑茶飲料を製造した。
【００２９】
応用例２：紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物を封入したカプセル製剤の製造
実施例１で得た紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物を２号の硬カプセルに封入することで製剤化してサプリメントとした。
【００３０】
試験例１：紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物を配合した緑茶飲料の脂肪蓄積抑制作用と体重増加抑制作用
応用例１において製造した紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物を配合した緑茶飲料の脂肪蓄積抑制作用と体重増加抑制作用を以下の方法で調べた。
（実験方法）
雄の６週齢の２型糖尿病モデルマウス（ＢＫＳ．Ｃｇ−  ＋Ｌｅｐｒｄｂ／＋Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊｃｌ＊：日本クレア）をＡ群〜Ｃ群の３群に分け（それぞれｎ＝８）、１週間（０週）の予備飼育を行った後、１０週間（１〜１０週）の飼育実験を行った。予備飼育期間中は各群とも蒸留水を自由飲水で与え、飼育実験期間中はＡ群には蒸留水を、Ｂ群には緑茶飲料を、Ｃ群には紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物を配合した緑茶飲料をそれぞれ自由飲水で与えた。飼料としては全飼育期間においてＣＥ−２（日本クレア）を給餌した。１０週間の飼育実験終了後、各個体を解剖し、特許文献１に記載の方法に従って肝臓組織切片のヘマトキシリン・エオシン染色を行った。また、内臓にまとわりついている脂肪組織（内臓脂肪）を取り出してその重量の測定を行った。
（実験結果）
各群の肝臓組織切片の染色結果を図１に示す（ＡおよびＢにおける「＊」は血管を示す。スケールバー：１００μｍ）。また、各群の内臓脂肪重量の測定結果を図２に示す（図中の「０．０８％Ｅ８０茶」は紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物を配合した緑茶飲料投与群を、「緑茶」は緑茶飲料投与群を、「ＤＷ」は蒸留水投与群をそれぞれ示す。＊＝Ｐ＜０．０５：ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔ）。さらに、全飼育期間中において１週間ごとに測定した各群の体重の測定結果を図３に示す（図中の「０．０８％Ｅ８０茶」「緑茶」「ＤＷ」は図２と同じ。＊＝Ｐ＜０．０５：ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔ）。図１から明らかなように、紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物を配合した緑茶飲料投与群の肝臓組織に含まれる脂肪（白抜きの部分）は、蒸留水投与群と緑茶飲料投与群よりも格段に少なかった。また、図２から明らかなように、紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物を配合した緑茶飲料投与群の内臓脂肪重量は、蒸留水投与群と緑茶飲料投与群よりも有意に少なかった。さらに、図３から明らかなように、紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物を配合した緑茶飲料投与群の体重の増加の程度は、蒸留水投与群と緑茶飲料投与群よりも低く、１０週目において有意差があった。以上の結果から、応用例１において製造した紅茶由来の高分子ポリフェノールを含有する抽出物を配合した緑茶飲料は、優れた脂肪蓄積抑制作用と体重増加抑制作用を有することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、発酵茶由来の高分子ポリフェノールを高含量で含む抽出物を、酢酸エチルやブタノールやアセトンといった有機溶媒を用いずに簡便に調製する方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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