(57)【要約】【課題】安価で信頼性が高く、また操作性の良い単一核酸分子の塩基配列を解読する方法・装置を提供する。【解決手段】第１のアクセプタで標識された１〜３種類の塩基及び第２のアクセプタで標識されたそれ以外の塩基を混合した基質溶液と、アクセプタを共鳴励起するための１種類のドナーにより標識されたＤＮＡポリメラーゼ或いは鋳型ＤＮＡとを用いて、核酸増幅の塩基配列伸長反応を行う。ドナーの発光波長帯の信号強度の時間変化情報と、少なくとも１種類のアクセプタの発光波長帯の信号強度の時間変化情報を検出する。検出されるドナーの発光強度の低下と、検出されるアクセプタの発光強度の上昇から、任意の塩基が取り込まれたことを判定する。【選択図】図１
2012023988.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一核酸分子の塩基配列を、蛍光共鳴エネルギー移動を利用して解析する核酸解析方法であって、
ドナーにより励起される第１のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ及び前記第１のアクセプタと種類の異なる第２のアクセプタによって標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第１のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＣＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第２のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＧＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第３のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＴＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰのヌクレオチドからなる第４のヌクレオチドセットと、
ＤＮＡポリメラーゼ，鋳型ＤＮＡ及びプライマと、
アクセプタ励起用として、前記ＤＮＡポリメラーゼ，鋳型ＤＮＡ及びプライマのいずれか一つに標識されている前記ドナーと、を用いて、
前記第１〜第４のヌクレオチドセットのセットごとに順次、前記鋳型ＤＮＡ或いはその相補鎖及びプライマを介してポリメラーゼ反応によるヌクレオチドの捕捉，伸長を行い、
前記鋳型ＤＮＡ或いは前記相補鎖に捕捉される最新に捕捉されるヌクレオチドの近傍に位置する前記ドナーを励起して、このドナーと前記最新捕捉ヌクレオチドの第１のアクセプタ或いは第２のアクセプタとの間で生じる蛍光共鳴エネルギー移動により、前記取り込まれたヌクレオチドの第１のアクセプタ或いは第２のアクセプタを励起し、
前記ドナーの信号強度変化及び前記第１，第２のアクセプタからの信号をリアルタイムにモニタリングし、前記第１〜第４のヌクレオチドセットを使用して得られたこれらのモニタリングデータから、前記鋳型ＤＮＡ或いは前記相補鎖に取り込まれた前記ヌクレオチドの種類とその位置を特定することを特徴とする核酸解析方法。
【請求項２】
前記第１のアクセプタは、前記ドナーにより励起されて蛍光する特性を有し、前記第２のアクセプタは、前記第ドナーにより励起されるが、光を生じない或いは前記第１のアクセプタに対して識別できる発光強度差を有する或いは前記第１のアクセプタと蛍光波長の異なる特性を有している請求項１記載の核酸解析方法。
【請求項３】
前記第１のアクセプタは、前記ドナーにより励起されて蛍光する或いは励起されるが光を生じない特性を有し、前記第２のアクセプタは、前記ドナーにより励起されて前記第１のアクセプタに対して識別できる発光強度差を有する或いは前記第１のアクセプタと蛍光波長の異なる特性を有している請求項１記載の核酸解析方法。
【請求項４】
前記第１のアクセプタは、前記ドナーにより励起されて蛍光する蛍光色素よりなり、前記第２のアクセプタは、前記ドナーにより励起されるが光を生じない無蛍光ダーククエンチャよりなる請求項１又は２記載の核酸解析方法。
【請求項５】
前記第１のアクセプタは、前記ドナーにより励起されるが光を生じない無蛍光ダーククエンチャよりなり、前記第２のアクセプタは、前記ドナーにより励起されて蛍光する蛍光色素よりなる請求項１又は３記載の核酸解析方法。
【請求項６】
前記第１および第２のアクセプタは、前記ドナーを励起するための光源によって励起されない請求項１ないし５のいずれか１項記載の核酸増幅の塩基配列解析方法。
【請求項７】
前記第１のアクセプタもしくは前記第２のアクセプタにより標識されたヌクレオチドが前記鋳型ＤＮＡに捕捉される際に、最新捕捉ヌクレオチドの前記第１又は第２のアクセプタと前記ドナーとの距離が１ｎｍ〜１０ｎｍである請求項１ないし６のいずれか１項記載の核酸解析方法。
【請求項８】
前記ドナーが、量子ドットの蛍光色素である請求項１ないし７のいずれか１項記載の核酸解析方法。
【請求項９】
前記ポリメラーゼ反応によるヌクレオチド伸長反応は、固相上に固定された直鎖状の鋳型ＤＮＡ、もしくはその相補鎖に対して行われる請求項１ないし８のいずれか１項記載の核酸解析方法。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼ反応によるヌクレオチド伸長反応は、固相上に固定された環状の鋳型ＤＮＡ、もしくはその相補鎖に対して行われる請求項１ないし８のいずれか１項記載の核酸解析方法。
【請求項１１】
前記ポリメラーゼ反応によるヌクレオチド伸長反応は、固相上に固定されたポリメラーゼと環状の鋳型ＤＮＡを用いて行われる請求項１ないし８のいずれか１項記載の核酸解析方法。
【請求項１２】
伸長反応に用いる前記プライマは、３’末端にヌクレオチド伸長を阻害するための保護基を有する請求項１ないし１１のいずれか１項記載の核酸解析方法。
【請求項１３】
ヌクレオチド伸長反応の際、反応を停止するために、各ヌクレオチドセットは、３’末端に伸長を阻害するための保護基を有するヌクレオチド溶液を用いる請求項１ないし１１のいずれか１項記載の核酸解析方法。
【請求項１４】
蛍光共鳴エネルギー移動を利用して、ドナーにより励起される第１のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ及び前記第１のアクセプタと種類の異なる第２のアクセプタによって標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第１のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＣＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第２のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＧＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第３のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＴＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰのヌクレオチドからなる第４のヌクレオチドセットと、
アクセプタ励起用の蛍光物質よりなるドナーが標識されているＤＮＡポリメラーゼ，鋳型ＤＮＡ或いはプライマと、を有することを特徴とする核酸解析用試薬セット。
【請求項１５】
前記第１のアクセプタは、前記ドナーにより励起されて蛍光する特性を有し、前記第２のアクセプタは、前記第ドナーにより励起されるが、光を生じない或いは前記第１のアクセプタに対して識別できる発光強度差を有する或いは前記第１のアクセプタと波長の異なる特性を有している請求項１４記載の核酸解析用試薬セット。
【請求項１６】
前記第１のアクセプタは、前記ドナーにより励起されて蛍光する或いは励起されるが光を生じない特性を有し、前記第２のアクセプタは、前記ドナーにより励起されて前記第１のアクセプタに対して識別できる発光強度差を有する或いは前記第１のアクセプタと波長の異なる特性を有している請求項１４記載の核酸解析用試薬セット。
【請求項１７】
前記第１のアクセプタは、前記ドナーにより励起されて蛍光する蛍光色素よりなり、前記第２のアクセプタは、前記ドナーにより励起されるが光を生じない無蛍光ダーククエンチャよりなる請求項１４又は１５記載の核酸解析用試薬セット。
【請求項１８】
前記第１のアクセプタは、前記ドナーにより励起されるが光を生じない無蛍光ダーククエンチャよりなり、前記第２のアクセプタは、前記ドナーにより励起されて蛍光する蛍光色素よりなる請求項１４又は１６記載の核酸解析用試薬セット。
【請求項１９】
単一核酸分子の塩基配列を、蛍光共鳴エネルギー移動を利用して解析する核酸解析方法であって、
第１のアクセプタで標識された１〜３種類の塩基及び前記第１のアクセプタと種類の異なる第２のアクセプタで標識されたそれ以外の塩基を混合した基質溶液と、前記アクセプタを共鳴励起するための１種類のドナーにより標識されたＤＮＡポリメラーゼ或いは前記鋳型ＤＮＡとを用いて、核酸増幅の塩基配列伸長反応を行い、
前記ドナーの発光波長帯の信号強度の時間変化情報と、少なくとも１種類のアクセプタの発光波長帯の信号強度の時間変化情報を検出し、
検出される前記ドナーの発光強度の低下と、検出される前記アクセプタの発光強度の上昇から、任意の塩基が取り込まれたことを判定することを特徴とする核酸解析方法。
【請求項２０】
前記基質溶液は、４種類の塩基を有する第１の基質溶液と、同じく４種類の塩基を有する第２の基質溶液とからなり、前記第１，第２の基質溶液における塩基に標識される前記第１，第２のアクセプタの組み合わせは、４種の塩基のうち、前記第１，第２の基質溶液間で同一の１種については前記第１のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のもう１種については前記第２のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のさらにもう１種については第１の基質溶液のものが第１のアクセプタで標識され第２基質溶液のものが第２のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のさらにもう１種については第１の基質溶液のものが第２のアクセプタで標識され第２基質溶液のものが第１のアクセプタで標識されている請求項１９記載の核酸解析方法。
【請求項２１】
前記第１のアクセプタは、照射光源からの照射光により励起されて蛍光する蛍光色素であり、前記第２のアクセプタは、前記第１のアクセプタからの蛍光共鳴エネルギーにより励起され、且つ励起されるが光を生じない或いは前記第１のアクセプタに対して識別できる発光強度差を有する或いは前記第１のアクセプタと波長の異なる特性を有している請求項１９又は２０記載の核酸解析方法。
【請求項２２】
前記第１のアクセプタの発光強度は、第２のアクセプタの発光強度の１０倍以上である請求項１９ないし２１のいずれか１項記載の核酸解析方法。
【請求項２３】
４種類の塩基を有する第１の基質溶液と、同じく４種類の塩基を有する第２の基質溶液とを備え、前記第１，第２の基質溶液における塩基は、蛍光共鳴エネルギー移動に用いる種類の異なる第１，第２のアクセプタのいずれかにより標識され、このアクセプタの組み合わせは、４種の塩基のうち、前記第１，第２の基質溶液間で同一の１種については前記第１のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のもう１種については前記第２のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のさらにもう１種については第１の基質溶液のものが第１のアクセプタで標識され第２基質溶液のものが第２のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のさらにもう１種については第１の基質溶液のものが第２のアクセプタで標識され第２基質溶液のものが第１のアクセプタで標識されていることを特徴とする核酸解析用試薬セット。
【請求項２４】
単一核酸分子の塩基配列を、蛍光共鳴エネルギー移動を利用して解析する核酸解析装置であって、
ドナーにより励起される第１のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ及び前記第１のアクセプタと種類の異なる第２のアクセプタによって標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第１のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＣＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第２のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＧＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第３のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＴＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰのヌクレオチドからなる第４のヌクレオチドセットと、
アクセプタ励起用の蛍光物質よりなるドナーが標識されているＤＮＡポリメラーゼ，鋳型ＤＮＡ或いはプライマと、
前記第１〜第４のヌクレオチドセットの各々ごとに、前記鋳型ＤＮＡ及びプライマを介してポリメラーゼ反応により行われる核酸増幅にて、前記鋳型ＤＮＡもしくはその相補鎖に捕捉されていくヌクレオチドのうち最新捕捉のヌクレオチドを標識しているアクセプタを励起する光照射系と、
蛍光共鳴エネルギーにより、前記ドナーの蛍光で前記最新捕捉のヌクレオチドを標識しているアクセプタを励起して、前記ドナーによる信号強度変化及び前記第１，第２アクセプタからの信号をリアルタイムにモニタリングする光検出系と、
前記第１〜第４のヌクレオチドセットを使用して得られたこれらのモニタリングデータから、前記鋳型ＤＮＡ或いは前記相補鎖に取り込まれた前記ヌクレオチドの塩基配列を解析するデータ演算処理部と、を有することを特徴とする核酸増幅の塩基配列解析装置。
【請求項２５】
単一核酸分子の塩基配列を、蛍光共鳴エネルギー移動を利用して解析する核酸解析装置であって、
４種類の塩基を有する第１の基質溶液と、同じく４種類の塩基を有する第２の基質溶液とを備え、前記第１，第２の基質溶液における塩基は、蛍光共鳴エネルギー移動に用いる種類の異なる第１，第２のアクセプタのいずれかにより標識され、このアクセプタの組み合わせは、４種の塩基のうち、前記第１，第２の基質溶液間で同一の１種については前記第１のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のもう１種については前記第２のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のさらにもう１種については第１の基質溶液のものが第１のアクセプタで標識され第２基質溶液のものが第２のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のさらにもう１種については第１の基質溶液のものが第２のアクセプタで標識され第２基質溶液のものが第１のアクセプタで標識されており、
さらに、前記核酸解析装置は、
アクセプタ励起用の蛍光物質よりなるドナーが標識されているＤＮＡポリメラーゼ，鋳型ＤＮＡ或いはプライマと、
前記第１，第２の基質溶液ごとに、前記鋳型ＤＮＡ及びプライマを介してポリメラーゼ反応により行われる核酸増幅にて、前記鋳型ＤＮＡもしくはその相補鎖に捕捉されていく塩基のうち最新の捕捉塩基を標識しているアクセプタを励起する光照射系と、
蛍光共鳴エネルギーにより、前記ドナーの蛍光で前記最新の捕捉塩基を標識しているアクセプタを励起して、前記ドナーによる信号強度変化及び前記第１，第２アクセプタからの信号をリアルタイムにモニタリングする光検出系と、
前記第１，第２の基質溶液を使用して得られたこれらのモニタリングデータから、前記鋳型ＤＮＡ或いは前記相補鎖に取り込まれた前記ヌクレオチドの塩基配列を解析するデータ演算処理部と、を有することを特徴とする核酸増幅の塩基配列解析装置。
【請求項２６】
前記第１のアクセプタは、前記ドナーにより励起されて蛍光する特性を有し、前記第２のアクセプタは、前記第ドナーにより励起されるが、光を生じない或いは前記第１のアクセプタに対して識別できる発光強度差を有する或いは前記第１のアクセプタと波長の異なる特性を有している請求項２４又は２５記載の核酸増幅の塩基配列解析装置。
【請求項２７】
前記第１のアクセプタは、前記ドナーにより励起されて蛍光する或いは励起されるが光を生じない特性を有し、前記第２のアクセプタは、前記ドナーにより励起されて前記第１のアクセプタに対して識別できる発光強度差を有する或いは前記第１のアクセプタと波長の異なる特性を有している請求項２４又は２５記載の核酸増幅の塩基配列解析装置。
【請求項２８】
単一核酸分子の塩基配列を解析するために用いる核酸解析用の蛍光検出装置であって、
ポリメラーゼ反応により前記核酸分子を捕捉，伸長させるためのスポットが複数設けられた基板と、
前記スポットに向けて照射される全反射エバネッセント照射方式の光励起用の照射光源と、
前記スポット位置で、捕捉された核酸分子に修飾された蛍光色素から発せられる蛍光を集光するための蛍光集光系と、
前記蛍光集光系で集光した光を指定の波長ごとに分割するための分離部と、
前記分離部で分割された光を検出器に結像する結像光学系と、
分割され結像される各々の光の時間変化を、同時に検出するための複数の検出画素を備えた検出器と、
検出された光強度の時間変化から核酸の種類を判定するデータ処理部と、を具備する核酸解析用蛍光検出装置。
【請求項２９】
前記スポットは、光学的に透明であり、規則的に配置されており、且つ前記基板は、前記スポットでのＤＮＡ変性、ハイブリダイゼーション、伸長反応を行うための温調機構を備える請求項２７記載の核酸解析用蛍光検出装置。
【請求項３０】
前記照射光源は、１種類の単一波長光源である請求項２７記載の核酸解析用蛍光検出装置。
【請求項３１】
前記照射光源は、蛍光色素を励起するための１種類の単一波長光源と、反応を制御するためのＵＶ光源である請求項２７記載の核酸解析用蛍光検出装置
【請求項３２】
前記分離部は、波長ごとに透過率の異なるダイクロイックミラーである請求項２７記載の核酸解析用蛍光検出装置。
【請求項３３】
前記分離部は、波長ごとに進行角度が異なるプリズム分光素子である請求項２７記載の核酸解析用蛍光検出装置
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鋳型ＤＮＡ或いはその相補鎖に取り込まれる単一核酸分子である塩基（ヌクレオチド：ｄＮＴＰ）の種類や部位の特定、或いは塩基配列を解析するのに適した塩基解析方法、その方法を実施する装置、及び核酸解析用試薬セットに関する。特にＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した、核酸解析方法、その方法を実施する装置、及び核酸解析用試薬セットに関する。
【背景技術】
【０００２】
（１）近年、非特許文献１にあるように、基板に固定した鋳型ＤＮＡ或いはその相補鎖に単一核酸分子であるヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を順次、捕捉伸長させて、その塩基配列を決定することが提案されている。すなわち基板表面にランダムに分析すべき試料ＤＮＡ断片（単一核酸分子）を１分子ずつ捕捉し伸長させて、その結果を蛍光計測より検出することにより塩基配列を決定するものである。
【０００３】
具体的には、ＤＮＡポリメラーゼの基質として、鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができ、且つ検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体（ＭｄＮＴＰ）を、ＤＮＡポリメラーゼ反応により相補的に順次取り込む工程、次いで取り込まれたＭｄＮＴＰを、蛍光等で検出する工程、及びＭｄＮＴＰを伸長可能な状態に戻す工程を１サイクルとし、それを繰り返すことにより試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。本技術では、ＤＮＡ断片を１分子ずつ配列決定することができるため、同時に数多くの断片を解析することができ、解析スループットを大きくすることができる。また、本方式では、全反射エバネッセント照射検出方式により、単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列が決定できる可能性があるため、従来技術の問題であったクローニングやＰＣＲ等での試料ＤＮＡを精製、増幅が不要にできる可能性があり、ゲノム解析や遺伝子診断の迅速化が期待できる。
【０００４】
（２）一方、非特許文献２および特許文献１では、全反射エバネッセント照射検出方式よりも励起光照射体積の一層の低減が可能となるナノ開口エバネッセント照射検出方式によって、核酸増幅の塩素配列の蛍光検出の感度を更に向上させている。
【０００５】
具体的には、２枚のガラス基板であるガラス基板Ａとガラス基板Ｂを平行に対向配置し、ガラス基板Ａのガラス基板Ｂと対面する側の表面に、径５０ｎｍのナノ開口を有する膜厚約１００ｎｍの平面状のアルミニウム薄膜を積層する。アルミニウム薄膜は遮光性能を有している必要がある。２枚のガラス基板の中間に前記ナノ開口により反応槽を構成し、反応槽に溶液を充填することによって、２枚のガラス基板の間に溶液層の反応槽を形成する。反応槽には溶液の注入口と排出口があり、注入口から溶液を注入し、排出口から溶液を排出させることで、溶液をガラス基板およびアルミニウム薄膜と平行方向にフローさせることができる。これにより、溶液層の溶液を任意の組成に交換することが可能である。Ａｒイオンレーザから発振した波長４８８ｎｍの励起光を、ガラス基板Ｂと反対方向より、ガラス基板Ａに対して垂直に、対物レンズで絞って照射すると、ナノ開口内部の底平面近傍の溶液層に励起光のエバネッセント場が形成され、それ以上先の溶液層内部に励起光が伝播することはない。一方、蛍光発光は、前記対物レンズを用いて２次元ＣＣＤ上に結像することによって検出される。エバネッセント場では、励起光強度がナノ開口底平面から離れるに従って指数関数的に減衰し、ナノ開口底平面から３０ｎｍ程度の距離で励起光強度が１／１０となる。更に、ナノ開口エバネッセント照射検出方式では、全反射エバネッセント照射検出法と異なり、ガラス基板と平行方向の励起光照射幅が開口径すなわち５０ｎｍに限定されるため、励起光照射体積が一層低減される。このため、遊離の蛍光体の蛍光発光や水のラマン散乱を始めとする背景光を飛躍的に低減することが可能となる。その結果、より高濃度の遊離の蛍光体存在下で、対象とする生体分子に標識された蛍光体だけを選択的に検出することが可能となり、非常に高感度な蛍光検出を実現できる。本文献では、以上の蛍光検出方式をＤＮＡ分子の伸長反応によるｄＮＴＰの取り込み計測に応用している。
【０００６】
（３）特許文献２では、核酸増幅された塩基配列解析にＦＲＥＴ方式を採用して、蛍光標識（ドナー）で修飾されたポリメラーゼ（蛍光標識ポリメラーゼ又は蛍光修飾ポリメラーゼと称せられる）と蛍光標識（アクセプタ）で修飾されたヌクレオチド（蛍光標識ヌクレオチド又は蛍光修飾ヌクレオチドと称せられる）との相互作用により、鋳型鎖（鋳型ＤＮＡ）上での１核酸分子ずつのヌクレオチド捕捉，伸長を、光源により励起されるドナーの蛍光により共鳴励起されるアクセプタの蛍光を検出して、核酸配列（ヌクレオチド配列）をリアルタイムに決定する技術が提案されている。ヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を修飾する蛍光標識（アクセプタ）として、４種類のｄＮＴＰ（ＡＴＣＧ）に応じた４種類の蛍光色素を使用する。本技術は、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応（ヌクレオチド捕捉伸長反応）を１核酸分子（ヌクレオチド）レベルで観察する方法で、ポリメラーゼと捕捉されるヌクレオチドの間の蛍光標識（ドナー、アクセプタ）による蛍光共鳴励起エネルギーの転移(ＦＲＥＴ) を逐次検出することにより配列を読み取るというものである。具体的には、ドナーとしての蛍光色素に標識されたＤＮＡポリメラーゼがスライドガラス上にガラス面から一定の距離を置いて固定され、別の蛍光標識（アクセプタ）を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体（ＭｄＮＴＰ）をＤＮＡポリメラーゼ反応により鋳型ＤＮＡ鎖上で相補的に捕捉し伸長させる。このとき、ＤＮＡポリメラーゼに標識された蛍光色素（ドナー）の蛍光波長は、ＭｄＮＴＰに標識された蛍光色素（アクセプタ）を励起可能である。ポリメラーゼに標識された蛍光色素（ドナー）を励起すると、捕捉したＭｄＮＴの取り込みが行われた際、ポリメラーゼとＭｄＮＴＰが相互作用し、ポリメラーゼからＭｄＮＴＰに励起エネルギーが転移（ＦＲＥＴ）し、ＭｄＮＴＰ（アクセプタ）の蛍光色素が励起され蛍光を発する。こうして生じたＭｄＮＴＰからの種類別の蛍光を検出することで塩基種ＡＴＣＧの配列を決定する。一般的にＦＲＥＴ は、ドナーとアクセプタ間の距離が1〜10 ｎｍ の範囲で起こることが知られている。またＦＲＥＴの強度は両分子間の距離の6乗の関数として、距離とともに急速に減少する。すなわちｄＮＴＰを標識する蛍光色素（アクセプタ）は、ポリメラーゼを標識する蛍光色素（ドナー）の近傍においてのみ発光するため、実質的に限られた空間のみが励起されている状態となる。その結果、浮遊ＭｄＮＴＰの蛍光発光や水のラマン散乱を始めとする背景光を飛躍的に低減し、非常に高感度な蛍光観察が可能となる。本技術は背景光低減に有効な手段であるが、ドナー色素を常に励起し続ける必要があるため、退色が課題であった。この問題を解決する手段として、量子ドット（Quantum Dot、 Ｑｄｏｔ）の利用が挙げられる。Ｑｄｏｔは通常の蛍光色素と比較して光安定性が強く、長時間露光しても退色が遅いという特徴がある。このためＦＲＥＴのドナー色素として非常に有効である。加えてＱｄｏｔの蛍光強度は極めて強いため、ＱｄｏｔをＦＲＥＴのドナーとして用いる場合、アクセプタ側の蛍光色素の組み合わせによっては、１種類のＱｄｏｔで４種類以上のアクセプタ色素を励起できる可能性がある。即ち、Ｑｄｏｔを励起するた��の１種類の光源で４色の蛍光色素を励起できるため、他の従来法と比較して操作性、コストの面で有利である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６９１７７２６号公報
【特許文献２】特開２００９−１１８８４７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、 ｖｏｌ．１００、 ｐｐ．３９６０、 ２００３
【非特許文献２】ＳＣＩＥＮＣＥ ２００３、 Ｖｏｌ．２９９、 ｐｐ． ６８２−６８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記した背景技術の（１）及び（２）の項で述べた手法は、ＦＲＥＴを使わない所謂、通常の蛍光色素を使用するものである。一方、背景技術の（３）の項で述べた手法は、ＦＲＥＴを採用しているものである。前者、すなわち通常の蛍光色素の場合には、蛍光色素を励起する励起波長と、それにより蛍光したときの蛍光波長とが近いために、励起光の影響が大きい。また、消光までの時間が短い。一方、後者、すなわちＦＲＥＴの場合には、特にＱｄｏｔをドナーとして使用する場合には、ドナーの励起波長とアクセプタの蛍光波長が遠いために、励起光の影響が小さい、また消光までの時間が長いといった特長を有している。
【００１０】
ただし、ＱｄｏｔをドナーとしてＦＲＥＴを利用して４種類のＭｄＮＴＰを励起する場合、４種類の波長の異なる蛍光標識（蛍光色素）のうち、ドナーの励起光を基準にして長波長側に遠くなる波長を有する蛍光色素へのＦＲＥＴ効率が低くなるという傾向がある。ドナーとしてのＱｄｏｔの蛍光波長は、少なくともｄＮＴＰを標識する４種類の蛍光色素（アクセプタ）の蛍光波長よりも短い必要があるが、Ｑｄｏｔの蛍光も分布を持っているため、ＦＲＥＴ効果はアクセプタ側の蛍光色素の励起波長が長くなるほど効果が低くなる。また一般的な蛍光色素の励起光の波長は、およそ４５０ｎｍ〜８００ｎｍの領域であるが、４種類のｄＮＴＰを標識するため、その範囲内で４種類の蛍光色素を選択しようとすると、蛍光色素同士の蛍光スペクトルが一部重なり、隣接する蛍光波長のピークを有する蛍光色素同士が、互いの信号に影響を及ぼすという、いわゆるクロストークが生じる。また４種類の蛍光色素を波長成分ごとに抽出して観察するために、フィルタやミラーなどの光学素子の点数が多く使用せねばならず、それに伴い信号強度が損失する。このため、特に長波長領域におけるアクセプタ側の蛍光色素のS/Nが低く、十分な検出感度を得られない傾向がある。
【００１１】
本発明の目的は、ＦＲＥＴを採用した場合でも、上記したような課題を解消し、しかも、安価で信頼性が高く、また操作性の良い単一核酸分子の塩基配列を解読する方法・装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、上記目的を達成するために、基本的には、次のような核酸解読方法及び装置を提案する。
（１）一つは、単一核酸分子の塩基配列を、蛍光共鳴エネルギー移動を利用して解析する核酸解析方法であって、
ドナーにより励起される第１のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ及び前記第１のアクセプタと種類の異なる第２のアクセプタによって標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第１のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＣＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第２のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＧＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第３のヌクレオチドセットと、
前記同様の第１のアクセプタによって標識されたｄＴＴＰ、及び前記同様の第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰのヌクレオチドからなる第４のヌクレオチドセットと、
ＤＮＡポリメラーゼ，鋳型ＤＮＡ及びプライマと、
アクセプタ励起用として、前記ＤＮＡポリメラーゼ，鋳型ＤＮＡ及びプライマのいずれか一つに標識されている前記ドナーと、を用いて、
前記第１〜第４のヌクレオチドセットのセットごとに順次、前記鋳型ＤＮＡ或いはその相補鎖及びプライマを介してポリメラーゼ反応によるヌクレオチドの捕捉，伸長を行い、
前記鋳型ＤＮＡ或いは前記相補鎖に取り込まれていくヌクレオチドの近傍に位置する前記ドナーを励起して、このドナーと前記取り込まれたヌクレオチドの第１のアクセプタ或いは第２のアクセプタとの間で生じる蛍光共鳴エネルギー移動により、前記取り込まれたヌクレオチドの第１のアクセプタ或いは第２のアクセプタを励起し、
前記ドナーの信号強度変化及び前記第１，第２のアクセプタからの信号をリアルタイムにモニタリングし、前記第１〜第４のヌクレオチドセットを使用して得られたこれらのモニタリングデータから、前記鋳型ＤＮＡ或いは前記相補鎖に取り込まれた前記ヌクレオチドの種類とその位置を特定することを特徴とする。
【００１３】
例えば、第１のアクセプタは、ドナーにより励起されて蛍光する特性を有し、第２のアクセプタは、第ドナーにより励起されるが、光を生じない或いは第１のアクセプタに対して識別できる発光強度差を有する或いは第１のアクセプタと波長の異なる特性を有している。
【００１４】
或いは、第１のアクセプタは、前記ドナーにより励起されて蛍光する或いは励起されるが光を生じない特性を有し、前記第２のアクセプタは、前記ドナーにより励起されて前記第１のアクセプタに対して識別できる発光強度差を有する或いは前記第１のアクセプタと蛍光波長の異なる特性を有している。
（２）さらに、前記核酸解析方法のために使用する核酸解析用試薬セットとして、前記第１〜第４のヌクレオチドセットを有するものを提案する。
（３）本発明に係る核酸解析方法のもう一つは、単一核酸分子の塩基配列を、蛍光共鳴エネルギー移動を利用して解析する核酸解析方法であって、
第１のアクセプタで標識された１〜３種類の塩基及び前記第１のアクセプタと種類の異なる第２のアクセプタで標識されたそれ以外の塩基を混合した基質溶液と、前記アクセプタを共鳴励起するための１種類のドナーにより標識されたＤＮＡポリメラーゼ或いは前記鋳型ＤＮＡとを用いて、核酸増幅の塩基配列伸長反応を行い、
前記ドナーの発光波長帯の信号強度の時間変化情報と、少なくとも１種類のアクセプタの発光波長帯の信号強度の時間変化情報を検出し、
検出される前記ドナーの発光強度の低下と、検出される前記アクセプタの発光強度の上昇から、任意の塩基が取り込まれたことを判定することを特徴とする。
【００１５】
例えば、４種類の塩基を有する第１の基質溶液と、同じく４種類の塩基を有する第２の基質溶液とからなり、前記第１，第２の基質溶液における塩基に標識される前記第１，第２のアクセプタの組み合わせは、４種の塩基のうち、前記第１，第２の基質溶液間で同一の１種については前記第１のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のもう１種については前記第２のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のさらにもう１種については第１の基質溶液のものが第１のアクセプタで標識され第２基質溶液のものが第２のアクセプタで標識され、前記基質溶液間で同一のさらにもう１種については第１の基質溶液のものが第２のアクセプタで標識され第２基質溶液のものが第１のアクセプタで標識されている。ここで、第１、第２のアクセプタの特性は、前記（１）の方法と同様である。
（４）さらに、上記（３）の方法を実施するために、例えば、上記（３）の互いにアクセプタの組み合わせが異なる４種の塩基を内容とする前記第１、第２の基質溶液を有する核酸解析用試薬セットを提案する。
（５）また、上記（１）、（２）の方法を実施するために、前記第１〜第４のヌクレオチドセットを有する核酸解析用試薬セットと、
アクセプタ励起用の蛍光物質よりなるドナーが標識されているＤＮＡポリメラーゼ，鋳型ＤＮＡ或いはプライマと、
前記第１〜第４のヌクレオチドセットの各々ごとに、前記鋳型ＤＮＡ及びプライマを介してポリメラーゼ反応により行われる核酸増幅にて、前記鋳型ＤＮＡもしくはその相補鎖に捕捉されていくヌクレオチドのうち最新捕捉のヌクレオチドを標識しているアクセプタを励起する光照射系と、
蛍光共鳴エネルギーにより、前記ドナーの蛍光で前記最新捕捉のヌクレオチドを標識しているアクセプタを励起して、前記ドナーによる信号強度変化及び前記第１，第２アクセプタからの信号をリアルタイムにモニタリングする光検出系と、
前記第１〜第４のヌクレオチドセットを使用して得られたこれらのモニタリングデータから、前記鋳型ＤＮＡ或いは前記相補鎖に取り込まれた前記ヌクレオチドの塩基配列を解析するデータ演算処理部と、を有することを特徴とする核酸増幅の塩基配列解析装置を提案する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、核酸増幅解析にＦＲＥＴ方式を採用した場合であっても、ＤＮＡポリメラーゼ反応により核酸増幅される４種の塩基配列を検出する場合に、捕捉される核酸分子（ヌクレオチド）を標識するアクセプタは、第１、第２のアクセプタの２種類だけで済むので、従来課題とされていたヌクレオチド側の４種類の蛍光色素同士のクロストークの影響を排除でき、それにより、ノイズ成分が抑制され、各蛍光色素のS/Nが向上する。
【００１７】
またS/Nの向上に伴い、従来方法で必要とされていた高性能センサや光学部品、高出力光源を安価な部品に置き換えることが可能であるため、コスト削減に繋がる。
【００１８】
また、色素識別のための複雑な計算が不要となるため、観察後のデータ処理が簡便となり、操作性が向上する。結果として、塩基配列解読の信頼性が向上する
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の第１の実施例の蛍光分析方法に使用される蛍光検出装置の構成図
【図２（Ａ）】本発明の各実施例に用いられる基板の構造を示す斜視図。
【図２（Ｂ）】本発明の各実施例に用いられる基板とプリズムの組み合わせを示す縦断面図。
【図２（Ｃ）】本発明の各実施例に用いられる基板上に載せられるチャンバを裏返してみた斜視図。
【図３（Ａ）】第１の実施例に用いるフィルタ、ミラーの特性図。
【図３（Ｂ）】第１の実施例に用いるフィルタ、ミラーの特性図。
【図３（Ｃ）】第１の実施例に用いるフィルタ、ミラーの特性図。
【図４】第１の実施例での反応フロー図。
【図５（Ａ）】第１の実施例での第１ヌクレオチドセットにおける蛍光観察結果の模式図。
【図５（Ｂ）】第１の実施例での第２ヌクレオチドセットにおける蛍光観察結果の模式図。
【図５（Ｃ）】第１の実施例での第３ヌクレオチドセットにおける蛍光観察結果の模式図。
【図５（Ｄ）】第１の実施例での第４ヌクレオチドセットにおける蛍光観察結果の模式図。
【図６】第２の実施例での反応フロー図
【図７】第３の実施例での反応フロー図
【図８】第５の実施例での反応フロー図
【図９】上記各実施例に用いる蛍光集光系の一例を示す図。
【図１０】上記各実施例に用いる蛍光集光系の他の例を示す図。
【図１１】ドナーとして用いるＱｄｏｔ５２５と蛍光アクセプタとして用いるＡｌｅｘａの波長特性を示す説明図。
【図１２】第１０の実施例に用いる第１、第２の基質溶液（ヌクレオチドセット）のアクセプタの組み合わせを示す説明図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を実施の形態について下記の示す実施例により説明する。
【実施例１】
【００２１】
基板表面に分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子ずつ捕捉し、伸長させて、取り込まれたDNA断片（ヌクレオチド：ｄNTP）に修飾された蛍光標識を検出して塩基配列を決定する装置、方法について説明する。
【００２２】
本実施例では、ＤＮＡポリメラーゼの基質として、４つの塩基種（ＡＴＣＧ）のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの総称）を鋳型ＤＮＡ或いはその相補鎖に一分子ずつ捕捉し、且つ取り込まれるｄＮＴＰの標識（アクセプタ）を、ＦＥＲＴを利用して励起する蛍光色素（ドナー）を有する。また、４つの塩基種について、一核酸分子（ヌクレオチド）ごとに取り込まれるｄＮＴＰを修飾する標識については、１種類の蛍光色素（第１のアクセプタ）と１種類の無蛍光物質（第２のアクセプタ）、すなわちトータルで２種類のアクセプタを使用する。ここで、アクセプタとして機能する無蛍光物質としては、例えば消光色素（クエンチャ）が例示される。４種類のｄＮＴＰは、第１のアクセプタ（１種類の蛍光色素）と第２のアクセプタ（クエンチャ）の組み合わせであり、次のようなアクセプタ組み合わせを４つのヌクレオチドセットを使用する。
【００２３】
すなわち、（i）蛍光共鳴エネルギー移動の励起により光を生じる第１のアクセプタ（蛍光色素）によって標識されたｄＡＴＰ及び第２のアクセプタ（クエンチャ）によって標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第１のヌクレオチドセットと、上記同様に（ii）第１のアクセプタによって標識されたｄＣＴＰ、及び第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰからなる第２のヌクレオチド              セットと、（iii）第１のアクセプタによって標識されたｄＧＴＰ、及び第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰからなる第３のヌクレオチドセットと、(iv)第１のアクセプタによって標識されたｄＴＴＰ、及び第２のアクセプタによって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰのヌクレオチドからなる第４のヌクレオチドセットである。
【００２４】
第１〜第４のヌクレオチドセットごとに順次、ＤＮＡポリメラーゼ反応によるｄＮＴＰの捕捉、伸長を行い、取り込まれるｄＮＴＰの第１の蛍光色素（第１のアクセプタ）或いはクエンチャ（第２のアクセプタ）とその近傍に位置する第２の標識（ドナー）との間の蛍光共鳴による励起エネルギーの移動（ＦＲＥＴ）を利用した蛍光及び無蛍光の測定データ（リアルタイムモニタリングデータ）を用いることで、塩基配列の解読を行う。
【００２５】
より具体的には、第１〜第４のヌクレオチドセットのセットごとに、ターゲット鋳型ＤＮＡ、プライマ及びポリメラーゼを用いて、順次、ｄＮＴＰの捕捉，伸長を行う（ＦＲＥＴによるリアルタイム蛍光検出を伴う）。この場合、セットごとのｄＮＴＰの捕捉，伸長が完了する度に、鋳型DNA上で合成された伸長鎖を熱変性で分離し，洗浄により除去が行われる。したがって、ヌクレオチドセットごとのｄＮＴＰの捕捉，伸長，熱変性，洗浄を１サイクルとする。
【００２６】
本実施例によれば、ドナーのＦＲＥＴによる信号変化と第１、第２のアクセプタの信号から、第1のヌクレオチドセットでは、捕捉された塩基配列のうちｄＡＴＰの位置を特定でき、第２のヌクレオチドセットでは、捕捉された塩基配列のうちｄＣＴＰの位置を特定でき、第３のヌクレオチドセットでは、捕捉された塩基配列のうちｄＧＴＰの位置を特定でき、第４のヌクレオチドセットでは、捕捉された塩基配列のうちｄＴＴＰの位置を特定できる。したがって、第１から第４のヌクレオチドセットのデータを組み合わせることで、4種の全体的な塩基配列を解読することができる。
【００２７】
以上のように、本実施例では、ＦＲＥＴ利用の核酸解析、すなわち試料ＤＮＡの塩基配列の決定を、１種類のドナー、１種類の蛍光アクセプタ（第１アクセプタ）、及び１種類の無蛍光アクセプタ（第２のアクセプタ：クエンチャ）を用いて、４サイクルにより行う。具体的な装置や核酸解析のための準備及び反応工程については、以下に詳述する。なお、本操作は単分子蛍光検出を行うため、測定はＨＥＰＡフィルタなどを介したクリーンルーム様の環境にて行うのが望ましい。
（装置構成）
図１は、本発明の核酸解析方法（蛍光分析方法）に用いるＤＮＡ検査装置（核酸解析装置）の構成図である。基板８にＤＮＡ分子を順次捕捉してヌクレオチド伸長状態をＦＲＥＴ方式により蛍光検出するものである。
【００２８】
ここで、図１の装置全体を説明するに先立ち、図２により基板８の構造について説明する。
【００２９】
図２（Ａ）は、基板（固相）８の斜視図であり、図２（Ｂ）は、基板８と、基板８の下面側に配置したプリズム７と、基板８の上面側に配置したフローチャンバ９とからなる積層体の縦断面図を示す。図２（Ｃ）は、フローチャンバ９を、裏面すなわち基板８に対向する面側からみた斜視図である。図２（Ｃ）のＡ−Ａ線で断面したものが、図２（Ｂ）のフローチャンバ９の断面に相当する。
【００３０】
基板８は少なくとも反応領域８ａが透明材質でできており、材質としては合成石英などが用いられる。反応領域８ａは、フローチャンバ９によって形成される液槽９ａに導入される試薬、試料などが接触する。フローチャンバ９については、後述する。
【００３１】
反応領域８ａ内に検出対象となるＤＮＡ分子（核酸分子：ヌクレオチド）を捕捉するためのスポット８ｉｊが複数形成されている。スポット８ｉｊの個々の大きさは直径１００ｎｍ以下である。各スポット８ｉｊには、ＤＮＡを捕捉するための表面処理が施されている。
【００３２】
その表面処理は、例えば、変性により得られた一本鎖化されたターゲットである鋳型ＤＮＡをチオール化（図４の符号５０に示すような５’末端のチオール化）によりスポット８ｉｊ上に捕捉（固定）し、その３’末端にポリＡ配列（例えば、図４の符号３０で示す）を付加する。すなわち、スポット８ｉｊに、図４に示すように、金構造体上にポリＡ付加鋳型ＤＮＡ３３を固定する。ポリＡ配列３０は、ポリＴプライマ３４をハイブリダイズにより捕捉するものである。或いは、その表面処理は、ポリＴのオリゴヌクレオチド（例えば図６のポリＴプライマ３４）を捕捉しておき、また、ＤＮＡ断片（例えば図６のターゲットである鋳型ＤＮＡ３３）の一端をポリＡ化処理して、この標的ＤＮＡ断片をハイブリダイゼーション反応にて捕捉する。その際、ＤＮＡ断片濃度を適当に調製することで、個々のスポット８ｉｊに鋳型ＤＮＡに相補的に取り込まれるべきヌクレオチド（ｄＮＴＰ）のみが入るようにすることができる。なお、スポット８ｉｊをより小さくしていくことで、スポット内に捕捉できる分子が１個になるようにすることができる。このような基板では、すべてのスポット８ｉｊに単一分子のｄＮＴＰが捕捉されている場合と、スポット８ｉｊのうち一部のスポットのみｄＮＴＰが捕捉されている場合がある。スポット８ｉｊのうち、一部のスポットのみｄＮＴＰが捕捉されている場合は、残りのスポットには捕捉されておらず、空きの状態となる。なお、一例として、スポット８ｉｊ同士の間隔ｄｘは２マイクロメータ、間隔ｄｙは２マイクロメータとする。
【００３３】
スポット８ｉｊは基板表面上にランダムに存在していても構わないが、観察時の効率を考慮して規則的に配置されていることが望ましい。例えば図２（Ａ）のように、格子配列構造（２次元の格子構造）を形成し、その格子点の位置にスポット８ｉｊが配置される。このような、均等間隔の基板の作成法としては、例えば、特開２００２−２１４１４２号公報に記載の手法（金属ナノウェルを用いた蛍光分析用素子の製造方法）などがある。なお、ｄｘ、ｄｙは、スポット８ｉｊの個々の径の大きさより大きく、０.２〜１０マイクロメータ以下、さらには０.５〜６マイクロメータ程度が好ましい。なお、スポット８ｉｊの格子配列構造は正方格子構造、長方格子構造、三角格子構造などにしてもよい。基板の反応スポット８ａは、例えば１ｍｍ×１ｍｍの大きさとする。反応スポット８ａの大きさは、それより大きくても可であるし、０.５ｍｍ×０.５ｍｍの大きさのものを一定間隔で、１次元または２次元に複数個並べたようなものでもよいし、長方形、丸型、三角形、六角形の形状などでもよい。
【００３４】
なお、スポット８ｉｊには金属構造体を配置してもよい。金属構造体は半導体プロセスにて作成でき、また、電子線描画、光リソグラフィー、ドライエッチング、ウェットエッチングなどの手法によっても作製できる。金属構造体は、金、銀、アルミ、クロム、チタン、タングステン、白金等で、励起光の波長以下の大きさを有する形状であり、直方体、円錐、円柱、三角柱、一部が突起状のものを有する構造、あるいは、これらを２個または複数個近接して並べた構造など、また金属微粒子なども使用可能である。たとえば、直径１０ｎｍから１００ｎｍ程度の大きさの金の膜状のドットを上記ｄｘ、ｄｙの間隔、たとえば、１×１、１×２、１×３、２×３、２×４、３×５、３×６（マイクロメータ×マイクロメータ）などの間隔の格子状に構築できる。直径２０ｎｍ程度のドットに、大きさ２０ｎｍ程度の蛋白や蛍光物質、リンカーをその上部に捕捉すれば、確率的にその大きさからドットあたり１分子を捕捉し、格子状に単一分子を配置することが可能になる。また、周知の手法でドットに選択的なリンカーを結合させ、それにオリゴヌクレオチド、たんぱく質などを捕捉することで、ドットに目的の分子を捕捉することが可能であり、これを使うことができる。以後このような状態の基板８を用いて核酸増幅を行い蛍光計測する。
【００３５】
ｄＮＴＰおよびポリメラーゼに加える蛍光標識として、種々の蛍光体を使うことができる。Ａｌｅｘａ系やＣｙ系などの一般的な蛍光化合物のほか、量子ドットであるＱｄｏｔなどを使うことができる。ただし、冒頭で述べたとおり、両者の間にはＦＲＥＴにおけるドナーとアクセプタの関係が成立する組み合わせでなければならない。例えばポリメラーゼへの蛍光標識（ドナー）はＱｄｏｔ５２５、前述した第１〜第４のヌクレオチドセットにおける、それぞれ1種の塩基（ヌクレオチドセット毎に異なる）の蛍光標識（蛍光アクセプタ：第１のアクセプタ）はＡｌｅｘａ５５５、残り３種への標識（無蛍光アクセプタ：第２のアクセプタ）についてはクエンチャ（消光色素）など種々の物質を使うことができる。ここで、クエンチャは、Ａｌｅｘａ５５５と同様にアクセプタ（ただしこの場合には無蛍光アクセプタ）として機能するので、蛍光共鳴エネルギー移動により、ドナーは発光強度低下する。第２のアクセプタについては、Ｑｄｏｔ（ドナー）や第１のアクセプタ（Ａｌｅｘａ５５５）との検出信号の明瞭な識別化を図るために、励起によって蛍光を生じない無蛍光ダーククエンチャを用いることが望ましい。クエンチャは、例えばＢＨＱ−１などである。なおｄＮＴＰへの標識は、ヌクレオチド3リン酸のγリン酸に付加することが望ましい。これは標識物質が伸長鎖に残らないようにするためである。
【００３６】
ここで、図１に戻り、蛍光測定装置全体について説明する。
【００３７】
Ｑｄｏｔ５２５励起用のレーザ装置１（例えば、ＬＤレーザ、４０５ｎｍ）からのレーザ光をλ／４波長板２を通して円偏光とする。なおレーザは上記に特定されず、ドナーを励起できるものなら種類は問わない。例えば今回のようにＱｄｏｔ５２５を励起する際、Ｈｅ−Ｃｄレーザ（４４２ｎｍ）などを使用しても良い。レーザ光を、レンズを介して全反射照明用の石英製プリズム７に図のように入射面に垂直に入射し、ＤＮＡ分子を捕捉する基板８の裏側から照射する。石英製プリズム７と基板８はマッチングオイル（無蛍光グリセリン等）を介して接触させており、レーザ光はその界面で反射することなく、基板８に導入される。基板８の反応領域８ａ表面は反応液（水）で覆われており、その界面にてレーザ光は全反射し、エバネッセント照明となる。これにより、高いＳ／Ｎで蛍光測定が可能になる。
【００３８】
なお、基板８の近傍には、温調器が配置されているが、図では省略した。また、通常観察のため、プリズム下部よりハロゲン照明、ＬＥＤ照明ができる構造としているが、図ではこれを省略している。
【００３９】
基板８の上部には、試薬などを流し、反応させるためのフローチャンバ９が構成されている。図２（Ｃ）に示すように、フローチャンバ９のうち、基板８の反応領域８ａと対向する領域が、既述した液槽９ａとなるために、液槽となる長方形（形状は問わない）で窪みを有しており、その窪みの両端に液体導入孔９ｂと液体排出孔９ｃが設けられている。フローチャンバ９は、石英材などの透明材質より形成されている。また、図１に示すように、フローチャンバ９の上面には、試薬導入口１２が設けてあり、分注ノズル２６を有する分注ユニット２５、試薬保管ユニット２７、チップボックス２８に収容された分注チップを用いて、目的の試薬液の注入などを行う。
【００４０】
具体的には、試薬保管ユニット２７には、試料液容器２７ａ、４種類（第１〜第４）のヌクレオチドセット溶液容器２７ｂ、２７ｃ、２７ｄ、２７ｅ及び洗浄液容器２７ｆ等が用意される。チップボックス２８内の分注チップを分注ノズル２６に取り付け、適当な試薬液を吸引し、試薬導入口１２から基板の反応領域に導入し、反応させる。廃液は廃液チューブ１０を介して廃液容器１１に排出される。これらは制御ユニット（ＰＣ）２１により自動的に行われる。
【００４１】
フローチャンバ９は、光軸方向に透明な材質で形成される。フローチャンバ内の蛍光標識ポリメラーゼのドナーの蛍光及びそれに共鳴励起される蛍光標識ヌクレオチドのアクセプタの蛍光は、符号１３に示すようにフローチャンバ９を透過して、自動ピント合わせ装置２９で制御される集光レンズ（対物レンズ）１４で集められ、フィルタユニット１５で必要な波長の蛍光を取り出され、不必要な波長の光が除去される。フィルタユニット１５を透過する蛍光は、ダイクロイックミラー３２により、波長ごとに分割された光束に分離される。分離された光束は、それぞれ補助フィルタ１７ａ、１７ｂを介して、結像レンズ１８ａ、１８ｂにより、それぞれ、２次元センサカメラ１９ａ、１９ｂ（高感度冷却２次元ＣＣＤカメラ）に結像させられ、検出される。カメラの露光時間の設定、蛍光画像の取り込みタイミングなどの制御は、２次元センサカメラコントローラ２０ａ、２０ｂを介して制御ＰＣ２１が行う。結果はモニタ２２に表示される。なお、フィルタユニット１５には、レーザ光除去用のロングパスフィルタ（４０５ｎｍ）、検出する波長帯を透過させるバンドパスフィルタ（透過帯域：４４０−６８０ｎｍ）を組み合わせて用いる。レーザ光除去用のハイパスフィルタの概略特性を図３（Ａ）に、バンドパスフィルタを図３（Ｂ）に、ダイクロイックミラー３２を図３（Ｃ）に示す。
【００４２】
なお、装置は、調整などのため、透過光観察用鏡筒１６とＴＶカメラ２３とモニタ２４を備えており、ハロゲン照明などで基板８の状態をリアルタイムで観察できるようになっている。
【００４３】
図２（Ａ）に示すように、基板８には位置決めマーカ８０、８１が刻印されている。マーカ８０、８１は、スポット８ｉｊの並びと平行に配置され、その間隔が規定されている。そこで、透過照明での観測でマーカ８０，８１を検出することで、スポット８ｉｊの位置を計算することができる。
【００４４】
本実施例で使用する２次元センサカメラ１９ａ，１９ｂとして、ＣＣＤエリアセンサを使用する。種々の画素サイズ、画素数のＣＣＤエリアセンサを使うことができる。たとえば、画素サイズが７．４×７．４マイクロメータで、画素数２０４８×２０４８画素の冷却ＣＣＤカメラを使用する。なお、２次元センサカメラとしては、ＣＣＤエリアセンサの他、Ｃ−ＭＯＳエリアセンサなどの撮像カメラなどを一般に使うことができる。ＣＣＤエリアセンサにも、構造によって、背面照射型、正面照射型があり、どちらも使用できる。また、素子内部に信号の増倍機能を有する電子増倍型ＣＣＤカメラなども高感度化を図る上で有効である。また、センサは冷却型が望ましく、−２０℃程度以下にすることで、センサの持つダークノイズを低減でき、測定の精度を高めることができる。
【００４５】
反応領域８ａからの蛍光像を一度に検出してもいいし、分割することもできる。この場合、基板の位置を移動させるためのＸ−Ｙ移動機構部をステージ下部に配置し、制御ＰＣで照射位置への移動、光照射、蛍光像検出を制御する。本例ではＸ−Ｙ移動機構部は図示していない。
（反応の工程）
図４に本実施例の反応フローを示す。基板８のＤＮＡ捕捉スポット８ｉｊの表面に、金を材質とした構造体が配置されている場合を例として説明する。
＜準備工程＞
ターゲットである鋳型ＤＮＡ３３を変性等によって一本鎖化し、その鋳型ＤＮＡ３３の５’末端をチオール化し（符号５０で示す）、３’末端にポリＡ配列３０を付加する。例えば、試薬バッファを導入口１２よりフローチャンバ９の液槽９ａに導入することにより、金−チオール結合を利用して、金構造体上にポリＡ付加鋳型ＤＮＡ３３を固定する。ポリＴプライマ３４をチャンバに導入し、ポリＡ付加鋳型ＤＮＡ３３にハイブリダイズさせる。余剰な鋳型ＤＮＡ３３およびプライマ３４を洗浄用バッファにてチャンバより洗い流す。
＜伸長反応工程１＞
次に、Ａｌｅｘａ５５５（第１のアクセプタ：蛍光アクセプタ）で標識されたｄＡＴＰ及びＢＨＱ−１（第２のアクセプタ：無蛍光アクセプタ：クエンチャ）で標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰからなる第１のヌクレオチドセットと、Ｑｄｏｔ５２５（ドナー）で標識されたＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅポリメラーゼ３５とを加えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファを導入口１２よりフローチャンバ９ａへ導入し、伸長反応を開始する。反応中は、ＬＤレーザを連続的に照射し、常にＱｄｏｔ５２５を励起し続け、レーザ光により励起されて蛍光するＱｄｏｔ５２５およびそのＱｄｏｔ５２５からの蛍光波長によりＦＲＥＴにより励起されるＡｌｅｘａ５５５の蛍光強度の変化をモニタリングし続ける。照射方法はエバネッセント照射であり、反応領域８ａ表面近傍のみが励起光照射領域となるため、それ以外の領域に存在するＱｄｏｔ５２５ポリメラーゼ３５は励起されず、背景光の少ない測定ができる。
【００４６】
Ｑｄｏｔ５２５とＡｌｅｘａ５５５の蛍光はダイクロイックミラー３２で波長ごとに分けられ、補助フィルタ１７ａ，１７ｂおよびレンズ１８ａ，１８ｂを介してそれぞれ２台のＣＣＤカメラ１９ａ，１９ｂに結像される。第１のＣＣＤカメラ１９ａでは、Ｑｄｏｔ５２５の蛍光が、第２のＣＣＤカメラ１９ｂではＡｌｅｘａ５５５の蛍光がそれぞれ常時モニタリングされる。伸長反応においてヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の取り込みが生じた際、Ｑｄｏｔ５２５とＡｌｅｘａ５５５またはＢＨＱ−１の距離は十分に近くなり、両者の間にはＦＲＥＴにおけるドナー・アクセプタの関係が成立する。すなわち、ドナーであるＱｄｏｔ５２５の蛍光強度が低下した場合、アクセプタ或いはクエンチャが近傍に存在しｄＮＴＰの取り込みが生じたことになる。同時にＡｌｅｘａ５５５の蛍光強度が観察された場合は、取り込まれたｄＮＴＰの種類がＡｌｅｘａ５５５によって標識されたｄＮＴＰであると特定できる。例えば上記第１のヌクレオチドセットを用いて伸長反応を行った際、Ｑｄｏｔ５２５の信号が低下すると同時にＡｌｅｘａ５５５の信号が観察された場合、そのｄＮＴＰの種類は塩基種Ａである。一方、Ｑｄｏｔ５２５の信号が低下したが、Ａｌｅｘａ５５５の蛍光強度が観察されない場合には、クエンチャ（消光色素）であるＢＨＱ−１に標識されたｄＮＴＰ（ここでは、Ｃ、Ｇ、Ｔのうちいずれか一つ）が取り込まれたことになる。Ｑｄｏｔ５２５の蛍光強度低下のイベント数は、また、取り込まれたｄＮＴＰの数に等しいため、上記第１のヌクレオチドセットを用いた場合、上記したＡｌｅｘａ５５５の蛍光信号とＢＨＱ−１の消光信号の配列により、伸長鎖（ヌクレオチド配列）３６中の何塩基の間隔で塩基種Ａ（ｄＡＴＰ）が存在しているかという情報を得ることができる。例えば、Ｑｄｏｔ５２５の信号強度低下が１０回観察され、Ａｌｅｘａ５５５の信号強度の変化が、（０＝信号なし、１＝信号あり）として、［００１００００１００］というデータを得た場合、鋳型ＤＮＡ３３は10ｂｐであり、その３番目と８番目は塩基種Ａであるので、これに相補的なターゲット鋳型ＤＮＡの塩基種は、Ｔであることが特定できる。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３６を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程２＞
前記洗浄バッファによる伸長鎖除去後に、残存する前記ターゲット鋳型ＤＮＡ（ポリＡ付加鋳型ＤＮＡ）３３及び新たに導入したプライマ３４を用い、且つＡｌｅｘａ５５５で標識されたｄＣＴＰと、ＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰとからなる第２のヌクレオチドセットを用いて、反応工程１と同様の手順で反応・観察を行う。本工程によって、ターゲット鋳型ＤＮＡ３３に取り込まれる伸長鎖（ヌクレオチド配列）３６中の塩基種Ｃ（ｄＣＰＴ）については、ＦＲＥＴによりＡｌｅｘａ５５５が蛍光する。したがって、これと相補的なターゲット鋳型ＤＮＡの塩基種Ｇの位置が特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３６を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程３＞
前記洗浄バッファによる伸長鎖除去後に、前記ターゲット鋳型ＤＮＡ（ポリＡ付加鋳型ＤＮＡ）３３及び新たに導入したプライマ３４を用い、且つＡｌｅｘａ５５５で標識されたｄＧＴＰと、ＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰとからなる第３のヌクレオチドセットを用いて、反応工程１、２と同様の手順で反応・観察を行う。本工程によって、ターゲット鋳型ＤＮＡ３３に取り込まれる伸長鎖（ヌクレオチド配列中）３６の塩基種ＧについてはＦＲＥＴによりＡｌｅｘａ５５５が蛍光するので、Ｇに相補的なターゲット鋳型ＤＮＡのＣの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３６を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程４＞
前記洗浄バッファによる伸長鎖除去後に、前記ターゲット鋳型ＤＮＡ（ポリＡ付加鋳型ＤＮＡ）３３及び新たに導入したプライマ３４を用い、且つＡｌｅｘａ５５５で標識されたｄＴＴＰと、ＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰからなる第４のヌクレオチドセットを用いて、反応工程１と同様の手順で反応・観察を行う。本工程によって、ターゲット鋳型ＤＮＡ３３に取り込まれる塩基種（ヌクレオチド配列中）３６の塩基種ＴについてはＦＲＥＴによりＡｌｅｘａ５５５が蛍光するので、Ｔに相補的なターゲット鋳型ＤＮＡのＡの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３６を洗浄バッファによって除去する。
【００４７】
以上の１〜４の反応工程（４サイクル）で得られた蛍光強度信号のモニタリング（検出）データを総合して、鋳型ＤＮＡ３３の配列を決定する。サンプルとして10ｂｐの未知配列をシーケンシングした際の、第１のヌクレオチドセットによって得られるデータの模式図を図５（Ａ）に、第２のヌクレオチドセットによって得られるデータの模式図を図５（Ｂ）に、第３のヌクレオチドセットによって得られるデータの模式図を図５（Ｃ）に、第４のヌクレオチドセットによって得られるデータの模式図を図５（Ｄ）に示す。図５（Ａ）〜図５（Ｄ）は、Ｑｄｏｔ５２５およびＡｌｅｘａ５５５の信号強度の時間変化を表し、上側の信号が第１のＣＣＤ１９ａで検出されるＱｄｏｔ５２５（ドナー蛍光）由来の信号、下側の信号が第２のＣＣＤ１９ｂで検出されるＡｌｅｘａ５５５（第１のアクセプタ：蛍光アクセプタ）由来およびクエンチャ（第２のアクセプタ：無蛍光アクセプタ）由来の信号である。
【００４８】
本実施例では、第１のヌクレオチドセットによって得られるｄＮＴＰ配列情報は、ＢＢＡＢＢＢＡＢＢＢ（Ｂ＝Ｃ、Ｇ、Ｔのいずれか）、第２のヌクレオチドセットによって得られるｄＮＴＰ配列情報は、ＤＤＤＤＤＣＤＤＣＤ（Ｄ＝Ａ、Ｇ、Ｔのいずれか）、第３のヌクレオチドセットによって得られるｄＮＴＰ配列情報はＧＨＨＨＨＨＨＧＨＨ（Ｈ＝Ａ、Ｃ、Ｔのいずれか）、第４のヌクレオチドセットによって得られるｄＮＴＰ配列情報はＶＴＶＴＴＶＶＶＶＴ（Ｖ＝Ａ、Ｃ、Ｇのいずれか）となる。以上の結果より、鋳型ＤＮＡ３３に取り込まれたヌクレオチドは順にＧＴＡＴＴＣＡＧＣＴであると特定できる。それにより、相補的なターゲット鋳型ＤＮＡの塩基配列は、ＣＡＴＡＡＧＴＣＧＡと解読される。
【００４９】
かような核酸解析（本実施例では塩基配列）は、演算装置（制御ユニット）２１が、ｄＮＴＰの捕捉，伸長が確認されたスポット８ｉｊの位置データ（二次元センサカメラ１９ａ，１９ｂの座標データ）と、その位置における蛍光検出データ（二次元センサカメラセンサ１９ａ，１９ｂの光測定強度）を取り込み、これらのデータに基づき上記の配列情報を演算することで行われる。
【００５０】
なお本システムでは、反応領域８ａの複数のスポット８ｉｊからの発光を同時計測できるため、スポット８ｉｊにそれぞれ異なる鋳型ＤＮＡを設置する場合には、前記複数の異なる鋳型ＤＮＡ−プライマ複合体に取り込まれたｄＮＴＰの塩基種を、つまり複数の鋳型ＤＮＡの配列を上記の位置データおよび蛍光検出データにより同時に決定することができる。
【００５１】
また、使用できる蛍光体（ドナー、アクセプタ）は本実施例に示すものに限らず、所定の励起光を使い、異なる蛍光特性を有する蛍光体の組み合わせであれば同様に使用できる。一般には、蛍光極大波長が各々異なる種類の組み合わせであればよい。本実施例では、ドナーとしてのＱｄｏｔ５２５は、４０５ｎｍ励起、５２５ｎｍ蛍光であり、アクセプタとしてのＡｌｅｘａ５５５は、５２５ｎｍ励起、５７０ｎｍ蛍光であり、図１１の蛍光波長特性に示すように両者の蛍光波長特性が十分に離れているので、両者の蛍光識別の精度が高められる。
【００５２】
さらに、本実施例では、第１のアクセプタをドナー励起により発光する蛍光物質により構成し、第２のアクセプタとして、無蛍光アクセプタを用いるが、第２のアクセプタについては、第１のアクセプタに対して識別できる程度の弱い光（例えば、第１のアクセプタの１／１０程度の光）、換言すれば識別可能な発光強度を有する蛍光物質であってもよい（後述の他の実施例でも同様である）。換言すれば、第１のアクセプタの発光強度は、第２のアクセプタの発光強度の１０倍以上である。また、第１のアクセプタと第２のアクセプタとして、互いの波長が顕著に離れている蛍光色素を使用してもよい。
【００５３】
例えば、ドナーがQdot 525の場合には、第１のアクセプタとしては、Alexa555のほかにCｙ３があり、第２のアクセプタとして消光させるタイプのものにはBHQ-1のほかに、BHQ-2、DABCYL、Eclipse dark quencher、Iowa black FQ等がある。また、第１のアクセプタとして、上記同様にAlexa555或いはCｙ３とした場合、第２のアクセプタとして蛍光強度・波長特性の異なるタイプのものには、TAMRA、Cy3.5などがある。
【００５４】
本実施例ではまた、石英製プリズム７に対してレーザ光をその入射面に垂直つまり入射角度０度で入射している。これにより、基板８とプリズム７を一体化して移動させても、対物レンズ１４の観察視野からレーザ照射位置がずれないため、基板とプリズムを一体化することができ、プリズムと基板とのカップリング方式を種々選ぶことが可能になる。オイルカップリングのほか、光学接着も可能になり、装置構成を容易に選ぶことができる。
【００５５】
本実施例では、基板８の各８ｉｊの反応領域に結合しているドナー蛍光分子が１分子であり、複数の異なる蛍光分子が同じ位置にいないため、本発明のような装置及び方法で効率よく蛍光体種つまりは塩基種が識別でき、しかも高密度な基板に対応できる。
【００５６】
なお、本実施例では、検出する波長帯域が４８０−６８０ｎｍであるが、これに制限されることはない。使用する蛍光体の波長帯域に応じて、任意に対応できる。
【００５７】
実施例では、オリゴヌクレオチド等の生体関連分子が捕捉される基板８に、蛍光測定用の励起光を照射し、それにより生じるドナー蛍光及びＦＲＥＴによるアクセプタ蛍光を集光し、２次元検出器に結像させ、２次元検出器にて蛍光検出する。基板は実質的に透明な基板であり、分子が捕捉されうるスポットが複数設けられ、それらが格子配列構造の格子点位置（スポット８ｉｊ）に配置されている。該基板上で必要な試薬や試料などを反応させ、全反射照明のための光励起用の光源と、照射光学系により該基板上の蛍光体を励起し、発する蛍光を蛍光集光系で集光し、その光束を指定の波長範囲において実質的に各々の波長で異なる比率で分割する分光部により分割し、結像光学系で各々検出器に結像し、複数の検出画素を備えた検出器により検出する。これにより、簡便に多種の蛍光体種を識別検出することができる。
【００５８】
実施例では、基板に金属構造物を形成している。この場合、構造物の光ルミネセンス、光散乱を検出することで、構造物の空間位置を検出することができ、位置の基準マーカとして活用でき、効果的である。
【００５９】
格子点位置の領域（スポット、格子点の領域）の大きさは１００ｎｍ径以下にする。少なくとも、隣接する最短の格子点の間隔の１／３以下が好ましい。これにより、光学的に解像しやすくなり、識別が容易になる。格子点位置の捕捉のための領域を１０ｎｍ〜３０ｎｍ程度にすれば、単一分子の捕捉に有効である。
【００６０】
また、本例では、一定間隔の格子状に捕捉スポットを配置する基板を使用する。格子状に配置することで、透過像と反射像内の相対応する輝点の識別が容易になる。格子状に捕捉スポットを配置する基板を使わない場合にも対応する。分子をランダムに分散させて捕捉する場合など、捕捉位置が、ランダムに分散する場合は、両方の画像を比較し、パターン解析し、または基準マーカを参照して、相対応する輝点を判定すればよい、これによっても同様の効果が得られる。
【実施例２】
【００６１】
本実施例は、図６の反応フローに示すように、基板８表面のｄＮＴＰ捕捉スポットに、プライマ３４を固定配置し、これにターゲットとなる鋳型ＤＮＡ３３をハイブリダイズさせ、伸長反応によって鋳型ＤＮＡ３３に相補鎖な伸長鎖３６を合成し、その伸長鎖３６にさらに相補的に捕捉される伸長鎖３８の配列を解読することで、ターゲット鋳型ＤＮＡ３３の配列を決定する。この場合、伸長鎖３８の配列は、ターゲット鋳型ＤＮＡ３３の配列そのものとなる。
（装置構成）
実施例１と同様の構成である
（反応の工程）
＜準備工程＞
前準備として、ターゲットである鋳型ＤＮＡ３３を変性等によって一本鎖化し、その鋳型ＤＮＡ３３の３’末端にポリＡ配列３０を付加してポリＡ付加鋳型ＤＮＡ３３を作成しておく。そして、図６の上段に示すように、基板８表面のｄＮＴＰ捕捉スポット８ｉｊには、ポリＴプライマ３４を固定する。固定方法は、例えばポリＴプライマ３４の５’末端をチオール化し（符号５０で示す）、ｄＮＴＰ捕捉スポット８ｉｊ（測定スポット）に配置した金構造体に対し、金−チオール結合を利用する。そして、ターゲット鋳型ＤＮＡ３３をチャンバに導入し、ポリＴプライマ３４とハイブリダイズさせる。任意のヌクレオチドセット（第１〜第４のヌクレオチドセットのいずれか）およびＱｄｏｔ５２５で標識されたＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅポリメラーゼ３５を加えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファを導入口１２よりチャンバへ導入し、ポリメラーゼ反応により、ｄＮＴＰの捕捉・伸長反応を開始する。伸長反応完了後、熱変性を行い、遊離した鋳型ＤＮＡ３３を洗浄によって除去する。基板８（スポット８ｉｊ）に残った伸長鎖３６の３’末端に、プライマ認識部位として、ターミナルトランスフェラーゼ等によりポリＡ配列３７を付加する。なおプライマ認識配列としては、既知の配列を付加しても構わない。
＜伸長反応工程１＞
上記準備工程後に、図６の下段に示すように、新たなポリＴプライマ３４をフローチャンバ９に導入し、鋳型ＤＮＡ３３に相補的な伸長鎖３６の末端３’に付加したポリＡ配列３７とハイブリダイズさせる。そして、Ａｌｅｘａ５５５（蛍光アクセプタ：第１アクセプタ）で標識されたｄＡＴＰと、ＢＨＱ−１（無蛍光アクセプタ：第２アクセプタ）で標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰとからなる第１のヌクレオチドセット、および、Ｑｄｏｔ５２５（ドナー）で標識されたＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅポリメラーゼ３５を加えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファを、導入口１２よりフローチャンバへ導入し、伸長反応を開始する。伸長鎖（鋳型３３に対する相補鎖）３６にとり取り込まれる一分子ずつのｄＮＴＰの伸長により相補的な伸長鎖３８が形成される過程で、実施例１と同様の手順で観察を行う。本工程によってターゲット鋳型ＤＮＡ３３中の塩基種Ａの位置を伸長鎖３８から特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行って伸長鎖３８を遊離させ、遊離した伸長鎖３８を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程２＞
前記洗浄バッファによる伸長鎖３８の除去後に、図６の下段に示すように、新たに導入したポリＡ３７及びプライマ３４を用い、且つＡｌｅｘａ５５５で標識されたｄＣＴＰと、ＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰとからなる第２のヌクレオチドセットを用いて、反応工程１と同様の手順（反応）で新たに伸長鎖３８を形成し、観察を行う。本工程によって、鋳型ＤＮＡ３３中のＣの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３８を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程３＞
前記洗浄バッファによる伸長鎖３８の除去後に、再度、新たに導入したポリＡ３７及びプライマ３４を用い、且つＡｌｅｘａ５５５で標識されたｄＧＴＰと、ＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰからなる第２のヌクレオチドセットを用いて、反応工程１と同様の手順で新たに伸長鎖を形成し、観察を行う。本工程によって、鋳型ＤＮＡ３３中のＧの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３８を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程４＞
前記洗浄バッファによる伸長鎖３８の除去後に、再度、新たに導入したポリＡ３７及びプライマ３４を用い、且つＡｌｅｘａ５５５で標識されたｄＴＴＰと、ＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰからなる第２のヌクレオチドセットを用いて、反応工程１と同様の手順で新たな伸長鎖を形成し、観察を行う。本工程によって、鋳型ＤＮＡ３３中のＴの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３８を洗浄バッファによって除去する。
【００６２】
以上１〜４の反応工程で得られたデータを総合して、実施例１同様にターゲットである鋳型ＤＮＡ３３の配列を決定する。
【実施例３】
【００６３】
本実施例では、図７に反応フローに示すように、基板表面に配置したプライマ３４に対し、ターゲットとなる鋳型ＤＮＡ３３を環状化してハイブリダイズさせ、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）反応によってターゲット鋳型ＤＮＡ３３に取り込まれたヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の種類を決定することで、鋳型ＤＮＡ３３の配列を決定する。ＲＣＡ法とは、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて、鋳型となる環状ＤＮＡから相補鎖を連続して合成する手法である。使用するポリメラーゼは、例えばバクテリオファージ由来のｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼやＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）などである。
（装置構成）
実施例１と同様の構成である。
（反応の工程）
＜準備工程＞
前準備として、ターゲットである鋳型ＤＮＡ３３を変性等によって一本鎖化し、その鋳型ＤＮＡ３３の３’末端にポリＡ配列７０を付加して、鋳型ＤＮＡを環状化しておく。そして、図７に示すように、基板表面のｄＮＴＰ捕捉スポット８ｉｊには、ポリＴプライマ３４を固定する。固定方法は例えばポリＴプライマ３４の５’末端をチオール化（５０）し、ｄＮＴＰ捕捉スポット８ｉｊ（測定スポット）に配置した金構造体に対し、金−チオール結合を利用する。そして、上記環状鋳型ＤＮＡ３３をフローチャンバに導入し、ポリＡ配列７０に、ポリＴプライマ３４とハイブリダイズさせる。
＜伸長反応工程１＞
上記準備工程後に、Ａｌｅｘａ５５５（蛍光アクセプタ：第１アクセプタ）で標識されたｄＡＴＰ及びＢＨＱ−１（無蛍光アクセプタ：第２アクセプタ）で標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰからなる第１のヌクレオチドセットと、Ｑｄｏｔ５２５（ドナー）で標識されたｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ３５とを加えた反応バッファを、導入口１２よりフローチャンバへ導入し、ＲＣＡ反応を開始する。実施例１と同様の手順で観察を行う。本工程によって鋳型ＤＮＡ３３と相補のｄＮＴＰが順次捕捉され伸長して伸長鎖７１ａ(総称としては、７１で示す)が得られ、その伸長鎖７１ａ中の塩基Ａ（ｄＡＴＰ）の位置を実施例１、２同様のＦＲＥＴを利用して特定する。ちなみに、伸長が続くと、伸長鎖の５’末端で鋳型ＤＮＡのポリＡ配列７０の部分との置換が始まり（新たなプライマ合成）鋳型ＤＮＡ一周分の合成が終了する。伸長鎖７１ａの合成が終了した時点からポリＡ配列７０での置換が終了する時点（新たなプライマ合成が終了する時点）間の任意の時点で、２−ニトロベンジル基が結合するケージドｄＮＴＰをチャンバに導入して伸長反応を停止させる。フローチャンバ９内を洗浄し、遊離ｄＮＴＰを除去する。
＜伸長反応工程２＞
次いで、Ａｌｅｘａ５５５で標識されたｄＣＴＰ及びＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰからなる第２のヌクレオチドセットをフローチャンバ内に導入する。３６０ｎｍ以下の紫外線を照射し、ケージド物質（２−ニトロベンジル基）を遊離させ、伸長鎖７１の伸長反応を再開することにより新たなプライマを拠点として伸長鎖７１ｂを得る。この場合の伸長反応の工程および観察は、伸長反応１の工程と同様の手順である。本工程によって、伸長鎖７１ｂ中の塩基Ｃ（ｄＣＴＰ）の位置を特定する。伸長鎖７１ｂの合成終了時点後、反応工程１同様にタイミングで、２−ニトロベンジル基が結合するケージドｄＮＴＰをチャンバに導入して伸長反応を停止する。チャンバ内を洗浄し、遊離ｄＮＴＰを除去する。
＜伸長反応工程３＞
次いで、Ａｌｅｘａ５５５で標識されたｄＧＴＰ及びＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰからなる第３のヌクレオチドセットをフローチャンバ内に導入する。上記伸長反応２の工程同様に、３６０ｎｍ以下の紫外線を照射し、ケージド物質（２−ニトロベンジル基）を遊離させ、伸長鎖７１の伸長反応を再開することにより、伸長鎖７１ｃを得る。この場合の伸長反応の工程および観察は、伸長反応１、２の工程と同様の手順である。本工程によって、伸長鎖７１ｃ中の塩基Ｇ（ｄＧＰＴ）の位置を特定する。一定時間伸長反応後、２−ニトロベンジル基が結合するケージドｄＮＴＰをチャンバに導入して伸長反応を停止する。チャンバ内を洗浄し、遊離ｄＮＴＰを除去する。
＜伸長反応工程４＞
次いで、Ａｌｅｘａ５５５で標識されたｄＴＴＰ及びＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰからなる第４のヌクレオチドセットをチャンバ内に導入する。３６０ｎｍ以下の紫外線を照射し、ケージド物質（２−ニトロベンジル基）を遊離させ、伸長反応を再開し、伸長鎖７１ｄを得る。この場合、伸長反応工程１〜３と同様の手順で反応・観察を行う。本工程によって、伸長鎖７１ｄ中の塩基Ｔ（ｄＴＰＴ）の位置を特定する。一定時間伸長反応後、２−ニトロベンジル基が結合するケージドｄＮＴＰをチャンバに導入して伸長反応を停止する。チャンバ内を洗浄し、遊離ｄＮＴＰを除去する。
【００６４】
伸長鎖７１ａ〜７１ｄの塩基配列パターンは、いずれも同一であるので、１〜４の伸長反応工程で得られたＦＲＥＴ（Ｑｄｏｔ５２５、Ａｌｅｘａ５５５、ＢＨＱ−１）の蛍光検出データを総合して、ターゲットである鋳型ＤＮＡ３３の配列を決定する。本例によれば、熱変性が不要であるため、操作が簡便となる。本実施例では最初のヌクレオチドセットで鋳型鎖１周分のシーケンシングを完了した時点で反応を停止し、次のヌクレオチドセットを導入しているが、複数周分のシーケンスを行うことも可能である。この場合、配列を複数回読むことで精度が向上するとい
うメリットがある。
【００６５】
ＤＮＡポリメラーゼ３５の基質としては、鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができ、かつ検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体であり、なんらかの手段により該ｄＮＴＰ誘導体を伸長可能な状態に戻す（再開する）ことのできるものである。このような伸長可能な状態に戻す試薬として、本例では、蛍光標識ケージドｄＮＴＰを使用するが、蛍光体とヌクレオチドをジスルフィド結合により結合するｄＮＴＰの誘導体などでも同様に実施可能である。この場合、蛍光体の存在で、伸長が停止し、Ｔｒｉｓ［２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ］ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ試薬などでジスルフィド結合を化学的に解離させて伸長可能な状態に戻すことが可能である。
【００６６】
なお本実施例では、使用者の利便性を考慮し、ヌクレオチドセット交換時に反応を停止するような試薬および機能を追加したが、これらの工程が無くともシーケンシングは成立する。
【実施例４】
【００６７】
実施例３では、ターゲットとなる鋳型ＤＮＡ３３を環状化し、プライマ３４を介して基板表面に結合させているが、別方式として、ドナーであるＱｄｏｔ５２５−ポリメラーゼ複合体３５を基板表面に配置して（図示省略）、環状の鋳型ＤＮＡ３３を上記複合体と結合させ伸長反応を行い、取り込まれたｄＮＴＰの種類を決定してもよい。装置構成および反応工程は実施例３と同様である。
【実施例５】
【００６８】
本実施例の反応フローを図８に示す。本実施例では、実施例３同様の反応手順により、基板表面に配置したプライマ３４に対し、ターゲットとなる鋳型ＤＮＡ３３を環状化してハイブリダイズさせ、ＲＣＡ反応によって鋳型ＤＮＡ３３に相補鎖な配列を連続して持つ伸長鎖７１を、前記した第１〜第４のヌクレオチドセットごとに順次合成する（すなわち伸長鎖７１ａ〜７１ｄを順次合成する）。さらに、熱変性、洗浄により環状ＤＮＡ鋳型３３及びポリメラーゼ３５を洗浄除去した後に、ポリＧ配列７２を伸長鎖７１の末端３’に付加し、このポリＧ７２にプライマ７３をハイブリダイズする。この状態で、再度、第１〜第４のヌクレオチドセットを順次、標識ポリメラーゼと共に加えることで、伸長鎖７１ａ〜７１ｄに相補のｄＮＴＰ伸長鎖７４ａ〜７４ｄを合成する。この伸長鎖７４ａ〜７４ｄのＦＲＥＴによる蛍光検出データの配列を解読することで、ターゲット鋳型ＤＮＡ３３の配列を決定することが可能になる。
（装置構成）
実施例１と同様の構成である
（反応の工程）
＜準備工程＞
前準備として、ターゲットである鋳型ＤＮＡ３３を変性等によって一本鎖化し、その鋳型ＤＮＡ３３の３’末端にポリＡ配列７０を付加して、鋳型ＤＮＡを環状化しておく。そして、図８に示すように、基板表面のｄＮＴＰ捕捉スポット８ｉｊには、ポリＴプライマ３４を固定する。固定方法は例えばポリＴプライマ３４の５’末端をチオール化（５０）し、ｄＮＴＰ捕捉スポット８ｉｊ（測定スポット）に配置した金構造体に対し、金−チオール結合を利用する。そして、上記環状鋳型ＤＮＡ３３をフローチャンバに導入し、ポリＡ配列７０を、ポリＴプライマ３４にハイブリダイズさせる。さらに、既述した第１〜第４のヌクレオチドセットを順次、Ｑｄｏｔ５２５で標識された鎖置換活性を有するポリメラーゼ３５と共に反応バッファとして導入口１２よりフローチャンバへ導入し、実施例３同様のＲＣＡ反応工程により伸長鎖７１（７１ａ〜７１ｄ）を合成する。ここまでは、図７の一連の反応工程と同様であるが、本実施例では、ここまでが前準備工程であるので、蛍光検出は行われない。伸長鎖７１の合成後、熱変性を行い、鋳型ＤＮＡ３３を遊離し且つそれを洗浄によって除去する。残った伸長鎖７１の３’末端に、プライマ認識部位として、ターミナルトランスフェラーゼ等によりポリＧ配列７２を付加する。なおプライマ認識配列としては、既知の配列を付加しても構わない。
＜伸長反応工程１＞
次いで、ポリＣプライマ７３をフローチャンバに導入し、鋳型ＤＮＡ３３に伸長鎖７１（７１ａ〜７１ｄ）のポリＧ配列７２にハイブリダイズさせる。この状態で、Ａｌｅｘａ５５５（第１のアクセプタ）で標識されたｄＡＴＰ及びＢＨＱ−１（第２のアクセプタ）で標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰからなる第１のヌクレオチドセットと、Ｑｄｏｔ５２５（ドナー）で標識されたｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ３５とを加えた反応バッファを、導入口１２よりフローチャンバ９へ導入し、ＲＣＡ反応を開始する。本工程で伸長鎖７１（７１ａ〜７１ｄ）に相補な伸長鎖７４（７４ａ〜７４ｄ）を得る。本工程によって伸長鎖７４（７４ａ〜７４ｄ）のうち塩基Ａの蛍光検出データ（前述の実施例同様のＦＲＥＴによる蛍光検出データ）が得られ、このデータを下に鋳型ＤＮＡ３３中の塩基Ａの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖７４及びプライマ７３を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程２＞
次いで、新たにポリＣプライマ７３をチャンバに導入し、反応工程１同様に、残存する伸長鎖７１のポリＧ配列７２とハイブリダイズさせる。この状態で、Ａｌｅｘａ５５５で標識されたｄＣＴＰ及びＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰからなる第２のヌクレオチドセットと、Ｑｄｏｔ５２５で標識されたｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ３５とを加えた反応バッファをフローチャンバ９へ導入する。これにより、反応工程１同様にして、伸長鎖７１に相補な伸長鎖７４を得る。本工程によって伸長鎖７４のうち塩基Ｃの蛍光検出データが得られ、このデータを下に鋳型ＤＮＡ３３中の塩基Ｃの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３８を洗浄バッファによって除去する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖７４及びプライマ７３を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程３＞
次いで、新たなポリＣプライマ３４をチャンバに導入し、反応工程１、２同様に、残存する伸長鎖７１のポリＧ配列７２とハイブリダイズさせる。この状態で、Ａｌｅｘａ５５５で標識されたｄＧＴＰ及びＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰからなる第３のヌクレオチドセットと、Ｑｄｏｔ５２５で標識されたｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ３５とを加えた反応バッファをフローチャンバ９へ導入する。これにより、反応工程１、２同様にして、伸長鎖７１に相補な伸長鎖７４を得る。本工程によって伸長鎖７４のうち塩基Ｇの蛍光検出データが得られ、このデータを下に鋳型ＤＮＡ３３中の塩基Ｇの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３８を洗浄バッファによって除去する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖７４及びプライマ７３を洗浄バッファによって除去する。
＜伸長反応工程４＞
次いで、新たなポリＣプライマ３４をチャンバに導入し、反応工程１、２、３同様に、残存する伸長鎖７１のポリＧ配列７２とハイブリダイズさせる。この状態で、Ａｌｅｘａ５５５で標識されたｄＴＴＰ及びＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰからなる第４のヌクレオチドセットと、Ｑｄｏｔ５２５で標識されたｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ３５とを加えた反応バッファをフローチャンバ９へ導入する。これにより、反応工程１、２、３同様にして、伸長鎖７１に相補な伸長鎖７４を得る。本工程によって伸長鎖７４のうち塩基Ｔの蛍光検出データが得られ、このデータを下に鋳型ＤＮＡ３３中の塩基Ｔの位置を特定する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖３８を洗浄バッファによって除去する。伸長反応終了後、熱変性等を行い、遊離した伸長鎖７４及びプライマ７３を洗浄バッファによって除去する。
【００６９】
以上１〜４の反応工程で得られたデータを総合して、ターゲットである鋳型ＤＮＡ３３の配列を決定する。本実施例によれば、塩基配列を、塩基種ごとに、いずれも伸長鎖７４ａ〜７４ｂから読むので、複数回（本実施例では、４回）読むことで精度が向上する。
【実施例６】
【００７０】
上記実施例１から３の変形例として、Ｑｄｏｔ５２５（ドナー）を、ポリメラーゼに代えて鋳型ＤＮＡ３３に標識し、すなわち基板上に鋳型ＤＮＡ３３を介してＱｄｏｔ５２５を固定し、前記第１〜第４のヌクレオチドセットと蛍光標識無しのポリメラーゼとを前記実施例同様に用いてｄＮＴＰ伸長反応を行うことも可能である。鋳型ＤＮＡ上のＱｄｏｔ５２５の位置は、ＦＲＥＴに必要なドナー・アクセプタ間の距離がおおよそ１０ｎｍに制限される関係上、伸長鎖として取り込まれるｄＮＴＰの位置に対して常にＦＲＥＴ反応が可能な距離（例えば１０ｎｍ）内を保てる箇所に設定する必要がある。このような条件の下で、実施例１〜３同様の蛍光検出をヌクレオチドセットごとのｄＮＴＰ伸長反応工程で行えば、鋳型ＤＮＡの配列解析が可能になる。本実施例は、短鎖ＤＮＡの塩基配列の解析に適している。本実施例によれば、ポリメラーゼ反応によりに蛍光標識を行わずに済むため、構造変化や立体障害に伴うポリメラーゼの酵素活性が損なわれる可能性がなくなる。
【実施例７】
【００７１】
さらに、上記実施例１、２、５等の変形例として、これまた、ポリメラーゼに代えて、プライマ３４にＱｄｏｔ５２５（ドナー）を標識し、上記実施例同様のｄＮＴＰ伸長反応を行い、鋳型ＤＮＡ３３の配列を解読しても良い。本例もまた実施例６同様、ポリメラーゼに蛍光標識を行わずに済むため、構造変化や立体障害に伴うポリメラーゼの酵素活性が損なわれる可能背がなくなる。同じく本例は、ＦＲＥＴに必要なドナー・アクセプタ間の距離がおおよそ１０ｎｍに制限される関係上、短鎖ＤＮＡの解析に適している。
【実施例８】
【００７２】
上記各実施例の変形例として、プライマ３４の３’末端を２−ニトロベンジル化することで、伸長反応開始のタイミングを制御することができる。この場合、装置に３６０ｎｍ以下のＵＶ光源を追加する。プライマ３４を鋳型ＤＮＡ３３にハイブリダイズ後、ヌクレオチドセットを導入した状態でＵＶを照射することで、保護基が遊離し、伸長反応が開始する。伸長反応の開始を制御することで、より信頼性の高い配列データを得ることが可能となる。
【実施例９】
【００７３】
これまで述べてきた各実施例では、第１〜第４のヌクレオチドセットの各セットにおいて、４種類のヌクレオチド（ｄＮＴＰ）のうち、1種の塩基を標識する第１のアクセプタＡｌｅｘａ５５５（蛍光アクセプタ）で標識し、残りの３種類を標識する第２のアクセプタをＢＨＱ−１（無蛍光アクセプタ：クエンチャ）で標識したヌクレオチドセットを使用しているが、他の種々の組み合わせを利用することもできる。
【００７４】
例えば、上記の組み合わせとは逆に、４種類のヌクレオチド（ｄＮＴＰ）のうち、1種の塩基を標識する第１のアクセプタをＢＨＱ−１（無蛍光アクセプタ：クエンチャ）或いは信号強度の弱い蛍光色素で標識し、残りの3種の塩基を標識する第２のアクセプタをＡｌｅｘａ５５５（蛍光アクセプタ）で標識したヌクレオチドセットを使用してもよい。
【００７５】
具体的には、ＢＨＱ−１（第１のアクセプタ）によって標識されたｄＡＴＰ及びＡｌｅｘａ５５５（第２のアクセプタ）によって標識されたｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第１のヌクレオチドセットと、
ＢＨＱ−１によって標識されたｄＣＴＰ、及びＡｌｅｘａ５５５によって標識されたｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第２のヌクレオチドセットと、
ＢＨＱ−１によって標識されたｄＧＴＰ、及びＡｌｅｘａ５５５によって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰのヌクレオチドからなる第３のヌクレオチドセットと、
ＢＨＱ−１によって標識されたｄＴＴＰ、及びＡｌｅｘａ５５５によって標識されたｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰのヌクレオチドからなる第４のヌクレオチドセットと、を用いる。
【００７６】
このようなヌクレオチドセットを用いれば、既述したＦＲＥＴを利用した場合、例えば、第１のヌクレオチドセットによって得られた伸長鎖のうち、Ｑｄｏｔ（ドナー）の信号が低下し、Ａｌｅｘａ５５５（第２のアクセプタ）の信号が上昇した場合、取り込まれた塩基はＣ、Ｇ、Ｔのいずれかである。逆にQdotの信号が低下したが、Ａｌｅｘａ５５５の信号が変化しない（上昇しない）場合、ＢＨＱ−１（第１のアクセプタ）標識のｄＡＴＰが取り込まれ、取り込まれた塩基はＡである。
【００７７】
同様の手順にして、第２〜第４のヌクレオチドセットの場合にも、それぞれの伸長鎖から、塩基の種類Ｃ、Ｇ、Ｔとその位置が特定される。
【実施例１０】
【００７８】
また、上記実施例のヌクレオチドセットに代えて、４種類のヌクレオチドのうち、２種類をＡｌｅｘａ５５５（蛍光アクセプタ：第１のアクセプタ）で標識し、他の２種類をクエンチャ（無蛍光アクセプタ：第２のアクセプタ）で標識した複数のヌクレオチドセットを使用することもできる。図１２（a）〜（ｄ）は、その組み合わせ例を示すものであり、それぞれ、上段が第１のヌクレオチドセット（第１の基質溶液）、下段が第２のヌクレオチドセット（第２の基質溶液）を示す。四角枠が蛍光アクセプタ（第１のアクセプタ）による塩基種であり、○枠が無蛍光アクセプタ（第２のアクセプタ）による塩基種である。
【００７９】
例えば、図１２（a）に示すように、Ａｌｅｘａ５５５（蛍光アクセプタ）で標識されたｄＡＴＰおよびｄＣＴＰと、ＢＨＱ−１（無蛍光アクセプタ：クエンチャ）で標識されたｄＧＴＰおよびｄＴＴＰからなる第１のヌクレオチドセットを用いてｄＮＴＰ伸長反応を行い、合成される伸長鎖について、Ａｌｅｘａ５５５と、Ｑｄｏｔの信号強度変化を観察する。次にＡｌｅｘａ５５５で標識されたｄＣＴＰおよびｄＧＴＰと、ＢＨＱ−１で標識されたｄＡＴＰおよびｄＴＴＰからなる第２のヌクレオチドセットを用いて同様にｄＮＴＰ伸長反応を行い、Ａｌｅｘａ５５５と、Ｑｄｏｔの信号強度変化を観察する。
【００８０】
以上２回の伸長反応において、２回（１回目及び２回目）ともＡｌｅｘａ５５５の信号が上昇した位置はＣ、１回目のみＡｌｅｘａ５５５の信号が上昇した位置はＡ、２回目のみＡｌｅｘａ５５５の信号が上昇した位置はＧ、どちらの結果でもＡｌｅｘａ５５５の信号が変化しなかった位置はＴと推定できる。本例によれば、使用するヌクレオチドセットが２種類で済むため、操作が簡便になる。
【００８１】
第１のヌクレオチドセットと第２のヌクレオチドセットの、セットごとのＡｌｅｘａ５５５（第１のアクセプタ）で標識される２種類のｄＮＴＰと、ＢＨＱ−１（第２のアクセプタ）で標識される２種類のｄＮＴＰは、２回（１回目及び２回目）ともＡｌｅｘａ５５５の信号上昇（１、１）、１回目がＡｌｅｘａ５５５の信号上昇（１、０）、２回目がＡｌｅｘａ５５５の信号上昇（０，１）、いずれもＡｌｅｘａ５５５の信号上昇無し（０，０）の２値信号が成立すればよく、上記の一例に限定されるものではない。例えば、そのほか、図１２（ｂ）〜（ｄ）のような組み合わせが考えられる。
【００８２】
本実施例に用いる第１，第２の基質溶液（ヌクレオチドセット）における塩基は、第１，第２のアクセプタとの関係で、次のように定義される。
【００８３】
４種の塩基のうち、（ｉ）第１，第２の基質溶液間で同一の１種については第１のアクセプタで標識され、(ii)基質溶液間で同一のもう１種については第２のアクセプタで標識され、（iii）基質溶液間で同一のさらにもう１種については第１の基質溶液のものが第１のアクセプタで標識され第２基質溶液のものが第２のアクセプタで標識され、（iv）基質溶液間で同一のさらにもう１種については第１の基質溶液のものが第２のアクセプタで標識され第２基質溶液のものが第１のアクセプタで標識されている。
【００８４】
本例の場合にも、第１のアクセプタは、ドナー励起により蛍光する蛍光色素、第２のアクセプタは、ドナー励起により発光しないクエンチャを使用するが、それに限定されず、両者のアクセプタについて発光強度差を有するもの、波長特性の異なるものを使用しても同様の効果が得られる。
【００８５】
また、Ａｌｅｘａ５５５を標識させるｄＮＴＰの種類の数は、全反応工程で一定である必要は無く、特定したい塩基種の数に応じて、例えば第１のヌクレオチドセットでは、上記同様に２種類のｄＮＴＰをアクセプタで標識し、残り２種類のｄＮＴＰをクエンチャで標識し、第２のヌクレオチドセットでは３種類のヌクレオチドを標識するといったような、種々の組み合わせも可能である。
【実施例１１】
【００８６】
上記の実施例１〜１０に適用可能な蛍光検出装置の一例は、図１に示されているが、その光学系の一部を変形した実施例を図９に示す。
【００８７】
本実施例では、２種類の蛍光をダイクロイックミラー等で分離し、１台のＣＣＤの異なる領域に結像させる、いわゆる分割型結像光学系の例である。
【００８８】
分割型結像光学系では、まず、集光レンズ（対物レンズ）で集められた蛍光１３は、フィルタユニット１５で必要な波長の蛍光を取り出し、分割のためのダイクロイックミラー３２により、波長ごとに透過光と反射光に分割する。分割された光束をそれぞれ、反射光はミラー３９ａで反射し、結像レンズ４０に指定の角度で導く。透過光はミラー３９ｂと３９ｃで折り曲げ、同じ結像レンズ４０に別の指定の角度で導く。両光束は異なる角度で結像レンズ４０に入射することで、２次元センサカメラ４１（高感度冷却２次元ＣＣＤカメラ）に対して、それぞれの画像をずらして結像させる。
【００８９】
フィルタユニット１５には、レーザ光除去用のロングパスフィルタ（４０５ｎｍ）、検出する波長体を透過させるバンドパス干渉フィルタ（透過帯域：４４０-６８０ｎｍ）を用いる。補助フィルタ４２ａ、４２ｂは迷光除去のため、バンドパス干渉フィルタ（透過帯域：４４０−６８０ｎｍ、透過率９５％以上）を使う。場合により、補助フィルタ４２ａｂは使わなくてもよい。なお、分割透過光と分割反射光の光路の長さは、なるべく同じになるようにしているが、必ずしも同じでなくてもかまわない。図では結像倍率は、両光束で同じであるが、異なるようにしてもよい。同じ輝点の分割透過光像と分割反射光像であることが判断されれば解析可能である。
【００９０】
反射光と透過光を異なる角度で結像レンズ４０に入射させることで、それぞれの蛍光像を同じ２次元センサカメラ４１の異なる位置に結像され、デュアル・ビュー状態で蛍光像を検出することができる。本例により、１個の２次元センサカメラで２種の蛍光体を識別することが可能であり、多種類の蛍光体を同時に簡便に識別検出することができる。
【００９１】
本例によれば、抗原、抗体を測定対象にした蛋白チップ、ＤＮＡチップ、抗原検査装置などにも適用できる。同時に２種類のラベルを使うことができるので、２種類の標識抗体などを準備し、同時に反応させ、反応結果を同時に測定でき、各標識抗体ごとの強度を算定することができる。単一分子の測定だけでなく、定量も可能になる。なお、基板に捕捉する抗体、抗原の位置は格子状でなくても良いので、種々のチップに対応することができる。
【００９２】
また、本例を細胞染色、細胞チップ等に適用することもできる。例えば、細胞表面抗原に特異的に結合する抗体を準備し、それぞれ蛍光体で標識する。２種類の標識抗体を同時に反応させ、同時に蛍光測定することで、２種の抗体の分布、濃度などを測定することもできる。表面抗原だけでなく、細胞質内のマーカ、膜マーカ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを同時に検出することができる
【実施例１２】
【００９３】
本実施例も、既述した蛍光検出装置のうち光学系の一部を変えた例である。本実施例では、２種類の蛍光をプリズム等で分散させ、１台のＣＣＤに結像させる、いわゆる分散型結像光学系の例である。図１０に本実施例の検出部分の構成を示す。
【００９４】
分散型結像系ではまず、集光レンズ（対物レンズ）で集められた蛍光１３は、フィルタユニット１５で必要な波長の蛍光を取り出し、不必要な波長の光を除去し、波長分散プリズム４３で分光し、その像を結像レンズ４０で、２次元センサカメラ４１（高感度冷却ＣＣＤカメラ）に結像させ、検出する。フィルタユニット１５には、レーザ光除去用のロングパスフィルタ（４０５ｎｍ）、検出する波長体を透過させるバンドパス干渉フィルタ（透過帯域：４４０−６８０ｎｍ）を用いる。
【００９５】
なお、波長分散プリズム４３により光軸が傾くが、分散の異なるプリズムを複数枚組み合わせ、光軸が傾かないようにすることもできる。
【００９６】
本実施例により、１個の２次元センサカメラで２種の蛍光体を識別することが可能であり、多種類（ドナー，アクセプタ）の蛍光体を同時に簡便に識別検出することができる。なお波長を分散させる角度に指定は無いが、分散した結果生じた波長成分のピークは、隣接するスポットの領域と分離可能な距離を置いて存在することが必要である。
【符号の説明】
【００９７】
１…レーザ装置、２…波長板、７…プリズム、８…基板、８ａ…反応領域、８ｉｊ…ＤＮＡが捕捉されるスポット、９…フローチャンバ、１０…廃液チューブ、１１…廃液容器、
１２…試薬導入口、１３…蛍光、１４…集光レンズ（対物レンズ）、１５…フィルタユニット、１６…透過光観察用鏡筒、１７ａ，１７ｂ，４２ａ，４２ｂ…補助フィルタ、１８ａ，１８ｂ，４０…結像レンズ、１９ａ，１９ｂ，４１…２次元センサカメラ、２０ａ，２０ｂ…２次元センサカメラコントローラ、２１…制御ＰＣ（制御手段、演算手段）、２２，２４…モニタ、２３…ＴＶカメラ、２５…分注ユニット、２６…分注ノズル、２７…試薬保管ユニット、２７ａ…試料液容器、２７ｂ，２７ｃ，２７ｄ，２７ｅ…ヌクレオチドセット溶液容器、２７ｆ…洗浄液容器、２８…チップボックス、２９…自動ピントあわせ装置、
８０，８１…位置決めマーカ、３２…ダイクロイックミラー、３３…鋳型ＤＮＡ、３４…プライマ、３５…標識ポリメラーゼ、３６…鋳型ＤＮＡと相補的な伸長鎖、３７…プライマ認識部位、３８…鋳型ＤＮＡと同じ配列の伸長鎖、３９…ミラー、４３…波長分散プリズム、ｄｘ、ｄｙ…スポット８ｉｊの間隔の寸法
【図１】
2012023988.tif 000003
【図２（Ａ）】
2012023988.tif 000004
【図２（Ｂ）】
2012023988.tif 000005
【図２（Ｃ）】
2012023988.tif 000006
【図３（Ａ）】
2012023988.tif 000007
【図３（Ｂ）】
2012023988.tif 000008
【図３（Ｃ）】
2012023988.tif 000009
【図４】
2012023988.tif 000010
【図５（Ａ）】
2012023988.tif 000011
【図５（Ｂ）】
2012023988.tif 000012
【図５（Ｃ）】
2012023988.tif 000013
【図５（Ｄ）】
2012023988.tif 000014
【図６】
2012023988.tif 000015
【図７】
2012023988.tif 000016
【図８】
2012023988.tif 000017
【図９】
2012023988.tif 000018
【図１０】
2012023988.tif 000019
【図１１】
2012023988.tif 000020
【図１２】
2012023988.tif 000021