(57)【要約】【課題】苦味受容体Ｔ２Ｒに対してアンタゴニスト活性を有する新規な抗体を提供する。【解決手段】苦味受容体（Ｔ２Ｒ）タンパクを抗原として、鳥類又は哺乳類に免疫して得られる抗体であって、該苦味受容体に対するアンタゴニスト活性を有することを特徴とする抗体。前記抗原は、ヒト苦味受容体であるｈＴ２Ｒ１６タンパクであることが好ましく、前記抗原を鶏に免疫して得られる卵から調製された抗体であることがより好ましい。当該抗体は、苦味受容体の研究や機能性食品の原料などとして利用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
苦味受容体（Ｔ２Ｒ）タンパクを抗原として、鳥類又は哺乳類に免疫して得られる抗体であって、該苦味受容体に対するアンタゴニスト活性を有することを特徴とする抗体。
【請求項２】
前記抗原は、ヒト苦味受容体であるｈＴ２Ｒ１６タンパクである請求項１記載の抗体。
【請求項３】
前記抗原は、ｈＴ２Ｒ１６タンパクのＣ末端側に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び／又はタンパク質タグを付加したものである請求項２記載の抗体。
【請求項４】
前記抗原を鶏に免疫して得られる卵から調製されたものである請求項１から３のいずれか一つに記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、苦味受容体Ｔ２Ｒに対してアンタゴニスト活性を有する抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  哺乳動物は、少なくとも５つの基本的味覚、すなわち、甘味、苦味、酸味、塩味、及び旨味を持つと考えられている。苦味、甘味、及び旨味の感知は、舌の表面にある味覚受容体細胞で発現するＧタンパク共役受容体（ＧＰＣＲ）を介して行なわれ、酸味、塩味の感知は、イオンチャネルを介して行なわれると考えられている。【０００３】  味覚は、生物にとって食物の種類や質に関する情報を得るための重要な役割を持っている。例えば、甘味（糖のシグナル）、旨味（タンパク質や核酸のシグナル）、塩味（ミネラルのシグナル）は、生きていくために必要な栄養素を含む食物であることを知らせ、酸味（腐敗物のシグナル）や苦味（毒物のシグナル）は、有毒な物質や有害な物質を含むことを知らせる。【０００４】  しかし、ヒトにとって苦味や酸味はその強さの程度によってはおいしさの重要な要素となり得るものである。特に嗜好性の強い食品においては苦味や酸味は重要な要素となっている。【０００５】  苦味物質は味蕾の味細胞膜上に特異的に発現する苦味受容体Ｔ２Ｒによって受容される。Ｔ２Ｒは細胞膜を貫通する領域を７つ持った「７回膜貫通型タンパク質」と呼ばれる膜タンパク質であり、細胞内に位置する部分でＧタンパク質と共役して苦味刺激を伝達する。ヒトでは約３０種類存在していることが知られているが、各Ｔ２Ｒはそれぞれ異なるリガンド特異性を持っており、多くのＴ２Ｒのリガンドは未だ不明のままである。【０００６】  これまで、味覚受容体の機能を研究するためにアゴニストやアンタゴニストの検索が行なわれているが、その多くはペプチドや化合物であり、アゴニスト活性やアンタゴニスト活性を有する抗体は報告されていない（特許文献１〜５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００３−５３００９８号公報
【特許文献２】特開２００５−５０１５１９号公報
【特許文献３】特表２００６−５１５１５７号公報
【特許文献４】特開２００９−１４５３４９号公報
【特許文献５】特開２０１０−１１５２０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  本発明は、苦味受容体Ｔ２Ｒに対してアンタゴニスト活性を有する新規な抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］苦味受容体（Ｔ２Ｒ）タンパクを抗原として、鳥類又は哺乳類に免疫して得られる抗体であって、該苦味受容体に対するアンタゴニスト活性を有することを特徴とする抗体。
［２］前記抗原は、ヒト苦味受容体であるｈＴ２Ｒ１６タンパクである［１］記載の抗体。
［３］前記抗原は、ｈＴ２Ｒ１６タンパクのＣ末端側に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び／又はタンパク質タグを付加したものである前記［３］に記載の抗体。
［４］前記抗原を鶏に免疫して得られる卵から調製されたものである前記［１］〜［３］のいずれか一つに記載の抗体。
【発明の効果】
【００１０】  本発明によれば、苦味受容体Ｔ２Ｒに対してアンタゴニスト活性を有する抗体を提供することができる。この抗体は、苦味受容体の研究や機能性食品の原料などとして利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ｈＴ２ｒ１６遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を示す図である。
【図２】ｈＴ２ｒ１６遺伝子を組み込んだ発現ベクター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ用）の模式図である。
【図３】ｈＴ２ｒ１６遺伝子を組み込んだ発現ベクター（Ｐ．ｐａｓｔｒｉｓ用）の模式図である。
【図４】形質転換体におけるｈＴ２Ｒ１６融合タンパク質の発現量を調べた結果を示す図である。
【図５】精製したｈＴ２Ｒ１６融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図６】精製したｈＴ２Ｒ１６融合タンパク質のゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図７】精製したｈＴ２Ｒ１６融合タンパク質のＣＤスペクトル（円偏光２色性）測定の結果を示した図である。
【図８】単離したｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓ融合タンパク質のリガンド結合能をＣＤスペクトルによって測定した結果を示す図である。
【図９】ｈＴ２Ｒ１６を基質としたＥＬＩＳＡによる血中の抗体量の推移を調べた結果を示す図である。
【図１０】ｈＴ２Ｒ１６発現ＨＥＫ２９３株の作製方法を示した図である。
【図１１】ｈＴ２Ｒ１６発現ＨＥＫ２９３細胞を用いて、ｈＴ２Ｒ１６抗体添加後の細胞内カルシウム濃度の推移を調べた結果を示す図である。
【図１２】サリシン及びｈＴ２Ｒ１６抗体を用いた官能評価の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】［抗原の調製］
抗原として用いられるＴ２Ｒタンパクは、７回膜貫通型タンパク質と呼ばれる膜タンパク質であり、Ｇタンパク質と共役することから、「Ｇタンパク質共役受容体」という受容体のグループに属している。Ｔ２Ｒファミリーには多くの種類があり、ヒトでは２５種類（ｈＴ２Ｒ１、ｈＴ２Ｒ３、ｈＴ２Ｒ４、ｈＴ２Ｒ５、ｈＴ２Ｒ７、ｈＴ２Ｒ８、ｈＴ２Ｒ９、ｈＴ２Ｒ１０、ｈＴ２Ｒ１３、ｈＴ２Ｒ１４、ｈＴ２Ｒ１６、ｈＴ２Ｒ３８、ｈＴ２Ｒ３９、ｈＴ２Ｒ４０、ｈＴ２Ｒ４１、ｈＴ２Ｒ４２、ｈＴ２Ｒ４３、ｈＴ２Ｒ４４、ｈＴ２Ｒ４５、ｈＴ２Ｒ４６、ｈＴ２Ｒ４７、ｈＴ２Ｒ４８、ｈＴ２Ｒ４９、ｈＴ２Ｒ５０、ｈＴ２Ｒ６０）が存在し、マウスでは３５種類（Ｔ２Ｒ３、Ｔ２Ｒ４、Ｔ２Ｒ９、Ｔ２Ｒ１０、Ｔ２Ｒ１１、Ｔ２Ｒ１２、Ｔ２Ｒ１３、Ｔ２Ｒ１４、Ｔ２Ｒ１５、Ｔ２Ｒ１６、Ｔ２Ｒ１７、Ｔ２Ｒ１８、Ｔ２Ｒ２０、Ｔ２Ｒ２１、Ｔ２Ｒ２２、Ｔ２Ｒ２３、Ｔ２Ｒ２４、Ｔ２Ｒ２６、Ｔ２Ｒ２７、Ｔ２Ｒ２９、Ｔ２Ｒ３０、Ｔ２Ｒ３１、Ｔ２Ｒ３４、Ｔ２Ｒ３５、Ｔ２Ｒ３６、Ｔ２Ｒ３７、Ｔ２Ｒ３８、Ｔ２Ｒ４０、Ｔ２Ｒ４３，Ｔ２Ｒ１０４、Ｔ２Ｒ１０６、Ｔ２Ｒ１０８、Ｔ２Ｒ１０９、Ｔ２Ｒ１１９、Ｔ２Ｒ１２２、Ｔ２Ｒ１３９）が存在する（Ｃｈａｎｄｒａｓｈｅｋａｒ  Ｊ．，Ｈｏｏｎ  Ｍ．Ａ．  Ｒｙｂａ  Ｎ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ：Ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｓｔｅ．Ｎａｔｕｒｅ，２００６；４４４；２８８−２９４）。
【００１３】  本発明において抗原として用いるＴ２Ｒタンパクは、得られる抗体のアゴニスト・アンタゴニスト活性を調べる必要があるため、リガンドが判明しているものが好ましい。このようなＴ２Ｒタンパクとしては、Ｔ２Ｒ４，４４（リガンド：デナトニウム）、マウスＴ２Ｒ５（リガンド：シクロヘキシミド）、Ｔ２Ｒ１０（リガンド：ストリキニーネ）、Ｔ２Ｒ１６（リガンド：サリシン）、Ｔ２Ｒ３８（リガンド：フェニルチオカルバミド）、Ｔ２Ｒ４３，４４（リガンド：サッカリン）が例示できる。本発明においては、ｈＴ２Ｒ１６タンパク（図１）が好ましく例示できる。
【００１４】  上記Ｔ２Ｒタンパクは、公知の方法でＴ２Ｒ遺伝子をクローニングして、種々の発現系において発現させることで得ることができる。その際、マーカーペプチド（例えば、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）など）、タグ配列（例えば、ポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグなど）、マウスロドプシンなどのアミノ酸配列を付加し、融合タンパク質として発現させてもよい。例えば、マーカーペプチドを付加した場合、形質転換体のスクリーニングが容易になり、タグ配列を付加した場合、目的タンパクの精製が容易になり、マウスロドプシンを付加した場合、目的タンパクの局在性の改善効果が期待できる。
【００１５】  上記各Ｔ２Ｒ遺伝子の塩基配列は公知であり、例えば、ｈＴ２Ｒの場合、ｈＴ２Ｒ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ７２４８１２）、ｈＴ２Ｒ３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ７２４９６１）、ｈＴ２Ｒ４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ７２４９５８）、ｈＴ２Ｒ１６  （ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＣ０９５５２４）である。その塩基配列に基づいてＰＣＲプライマーを作製し、常法に従ってクローニングすることができる。
【００１６】  クローニングしたＴ２Ｒ遺伝子を導入する発現ベクターは、宿主により適宜選択すればよく、例えば、宿主が哺乳動物細胞等の場合はｐＭＥ１８ＳＦＬ３（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＡＢ００９８６４）等、大腸菌の場合はｐＥＴ３、ｐＥＴ１１（ストラタジーン社製）、ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等、酵母の場合はｐＥＳＰ−Ｉエクスプレッションベクター（ストラタジーン社製）、ｐＲＳ４２６（Ａｄｄｇｅｎｅ社製）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等、昆虫細胞の場合はＢａｃＰＡＫ６（クロンテック社製）等が用いられる。
【００１７】  本発明においては、宿主は特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞（例えば、大腸菌等の細菌、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、及びＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）など）を用いることができるが、中でも酵母が好ましく用いられる。
【００１８】  上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法を用いることができる。
【００１９】  得られた形質転換体は、培養・発現誘導した後、培養物などから、濾過、遠心分離、破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの慣用的な手法を組み合わせて、Ｔ２Ｒタンパクを回収、精製することができる。
【００２０】［抗体の調製］
上記で得られたＴ２Ｒタンパクを抗原として、鳥類又は哺乳類に免疫することによって本発明の抗体を得ることができる。鳥類としては、家禽（鶏、鶉、アヒル等）の他、ダチョウが挙げられるが、鶏（特に産卵種）を用いるのが好ましい。一方、哺乳類としては、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等が挙げられるが、好ましくは畜産に適する産乳動物（特に乳牛）を用いるのが好ましい。本発明においては、抗体の量産性などの点から、鳥類に免疫して、その卵から抗体を調製することが好ましい。
【００２１】  鳥類又は哺乳類への免疫は、抗原を免疫増強剤（アジュバント）と共に接種（皮下注射、筋肉注射など）することにより行うことが好ましい。アジュバントとしては、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン、ペペス、カルボキシビニルポリマーなどの沈降性アジュバンドや、流動パラフィン、ラノリン、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）、ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）などの油性アジュバントが例示できる。
【００２２】  抗原の接種量は、目的とする抗体が体内に適当量形成され、かつ動物に対して過度の毒性が発揮されないように適宜決定すればよい。また、抗原の接種は数回に分けて行い、高力価が持続するように追加接種することが好ましい。
【００２３】  例えば、鳥類への免疫は、Ｍａｋｏｔｏ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６（２）：２７０−２７４，１９９２に記載された方法、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｅｎ’ｓ  Ｅｇｇ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５（８）．２１４１−２１４３．１９９１）に記載された方法等が挙げられる。
【００２４】  抗原を免疫された鶏が生産した卵から抗体を調製する方法は、公知の方法で行なうことができる。例えば、免疫した鶏の卵中に抗体が適当量生成したことを確認した後、卵を採取し、卵から卵黄液を分離し、得られた卵黄液を粉末化した後、その粉末をエタノール等を用いて脱脂した粉末中から緩衝液を用いて抽出方法、カラギーナンを使用した方法（Ｈ．Ｈａｔｔａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．，５４（１０），２５３１−２５３５，１９９０）などによって抗体を調製することができる。
【００２５】  上記で得られた抗体は、適宜、塩析やカラムを用いた方法などにより更に精製することもできる。
【００２６】  一方、乳牛への免疫は、特開昭５７−１８８５２３号公報等に記載された方法が挙げられる。抗原を免疫された乳牛が産生する乳から抗体を調製する方法は、公知の方法で行なうことができる。例えば、免疫した哺乳類の乳中に抗体が適当量生成したことを確認した後、乳を採取し、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ポリエチレングリコールなどを用いる方法により脂質成分を除去した後、適宜、塩析などの方法により抗体を精製することができる。
【実施例】
【００２７】  以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００２８】〔実施例１：抗原の調製〕
（１）ヒトＴ２Ｒ１６（ｈＴ２Ｒ１６）遺伝子のクローニング
ｈＴ２Ｒ１６遺伝子は、ヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型に用いて表１に示すＦ１及びＲ１プライマーを用いてＰＣＲ法により増幅しクローニングした。図１にｈＴ２Ｒ１６遺伝子の塩基配列、ｈＴ２Ｒ１６タンパク質のアミノ酸配列を示す。【００２９】  マウス・ロドプシンのＮ末端３８残基配列遺伝子（ｍＲｈｏ）は、Ｄｒ．ＬｉｑｕａｎＨｕａｎｇ（モネル研究所、ＵＳＡ）から供与された遺伝子を鋳型にして表１のＦ２及びＲ２プライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した。表１のＦ３及びＲ３プライマーを用いて再度ＰＣＲ法により増幅したｈＴ２Ｒ１６とｍＲｈｏを混合し、これを鋳型として表１のＦ２及びＲ３プライマーを用いてＰＣＲ法にてｍＲｈｏ−ｈＴ２Ｒ１６融合遺伝子を増幅した後、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。【００３０】
【表１】
2012051867.tif 000002
【００３１】（２）ｈＴ２Ｒ１６とＧＦＰ及び／又はＨｉｓタグ融合遺伝子の増幅
ｐｃＤＮＡ３．５／ｍＲｈｏ−ｈＴＡＳ２Ｒ１６と表１に示す各プライマーを用いてＰＣＲ法により、ｈＴ２Ｒ１６とＧＦＰ及び／又はＨｉｓタグ融合遺伝子の増幅を行なった。【００３２】  なお、各プライマーは３０ｂｐの組み換え配列（下線部）と３０ｂｐの苦味受容体遺伝子と同じ配列を持つように設計した（表２）。【００３３】
【表２】
2012051867.tif 000003
【００３４】  得られた各ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル電気泳動を行い、目的のバンドを確認した。【００３５】（３）形質転換（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の作製
ＹＰＤ培地で前日から培養しておいた酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を、ＹＰＤ培地３０ｍＬでＯ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．４になるように調製し、３０℃で４時間培養した。培養後、培養液を遠心して菌体を回収し、１Ｍソルビトールで３回洗浄後、１Ｍソルビトール：５００μＬに再懸濁した。【００３６】  ｐＲＳ４２６  ＧＡＬ１  ＧＦＰ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，１０４（３５），１３９３６−１３９４１（２００７）記載の方法で調製）をＳｍａＩで処理（３０℃で数時間反応させた後、６０℃で３０分反応）し、直線化した。【００３７】  酵母培養液：１００μＬ、ＰＣＲ産物：１μＬ、ＳｍａＩ処理したｐＲＳ４２６  ＧＡＬ１  ＧＦＰ：１μＬをキュベット電極（エレクトロポレーションキュベット：ネッパジーン社）に分注し、エレクトロポレーション（エレクトロポレーション条件：１．５ｋボルト、２００〜７００Ω、２５μファラデー）を行った。【００３８】  その後、ＳＣ−Ｕプレートに撒布し、約３日後まで３０℃でインキュベートし、コロニーが複数できていることを確認した。【００３９】  なお、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、ＹＰＨ４９９株、ＢＪ５４６４株、ＢＪ２１６８株、ＦＧＹ２１７株（酵母遺伝資源センターより分譲）を用い、それぞれの株で形質転換体を作製した。【００４０】（４）酵母からのプラスミド抽出
コロニーをピックアップして、一晩液体培養した酵母培養液２〜１０ｍｌを１．５ｍＬエッペンに移し、８０００ｒｐｍで１分間遠心（２回）し、上清を綺麗に除いた。次いで、３．５０ｍＭ  ＥＤＴＡ：２９３μＬと「ｚｙｍｏｌｙａｓｅ  １００Ｔ（３ｍｇ／ｍＬ）」（生化学バイオビジネス社製）７．５μＬを加え３７℃で１時間反応させた後、８０００ｒｐｍで１分間遠心（２回）し、上清を綺麗に除いた。そして、「ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ」（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミド抽出を行った。【００４１】（５）コンピテントセルを使ってのプラスミド増幅
Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５α株）をＳＯＢ培地１０ｍｌでＯ．Ｄ．６１０ｎｍ＝０．５になるまで培養した後、１０分間冷却し、４℃で冷却しながら集菌した。集菌した菌は氷冷したＴＢ３．２ｍＬに再懸濁し、１０分間冷却し、４℃で冷却しながら集菌した。その後、氷冷したＴＢ０．８ｍＬに再懸濁し、ＤＭＳＯ：０．０６ｍＬを加え、１０分間冷却してから、５０μＬずつ分注し、液体窒素で急冷し、コンピテントセルを調製した。コンピテントセルは−８０℃で保存した。【００４２】  コンピテントセルを氷上で溶解し、上記（４）で得られたプラスミド０．０１μｇ加えて１時間氷冷した後、４２℃でヒートショックを３０秒与え、すぐに氷冷を２分間行った。【００４３】  その後、ＳＯＣ培地２ｍＬに懸濁し、３７℃で培養し、集菌後、ＬＢ培地２００μｌに懸濁し、プレーティングした。その際、滅菌したコンラージ棒でプレートに均等に伸ばした。【００４４】  ３７℃で１日培養し、出てきたコロニーを１つ取り、ＬＢ培地にて３７℃で１２〜１８時間培養した後、「Ｓｉｇｍａ  ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ」（シグマ社製）を用いて、プラスミドを精製した。得られた各プラスミドは、以下の通りである。【００４５】
【表３】
2012051867.tif 000004
【００４６】  ｐＲＳ４２６  ｍＲｈｏ−ｈＴ２Ｒ１６−ＧＦＰ−Ｈｉｓタグ、ｐＲＳ４２６  ｈＴ２Ｒ１６−ＧＦＰ−Ｈｉｓタグの模式図を図２に示す。【００４７】（６）形質転換体（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓ）の作製
Ｐ．ｐａｓｔｒｉｓ（ＫＭ７１株、ＧＳ１１５株、ＳＭＤ１１６３株（酵母遺伝資源センターより分譲）を用いた。【００４８】  上記（５）で得られたｐＲＳ４２６  ｍＲｈｏ−ｈＴ２Ｒ１６又はｐＲＳ４２６  ｈＴ２Ｒ１６と、ｐＰＩＣ３．５Ｋ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩを用いて処理（３７℃で３時間）し、直線化した。【００４９】  直線化したｐＲＳ４２６  ｍＲｈｏ−ｈＴ２Ｒ１６又はｐＲＳ４２６  ｈＴ２Ｒ１６とｐＰＩＣ３．５Ｋの各４７μＬにＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ：１５３μＬを加えてそれぞれ合計２００μＬにした。これにフェノール・クロロホルム溶液：２００μＬを加えて、ボルテックスをかけて撹拌した後、１４０００ｒｐｍで５分遠心し、上清だけ１９５μＬ取り除き、４Ｍ  ＮａＣｌ：１０μＬとエタノール４００μＬを混ぜ合わせ、−２０℃で１時間冷やした。そして、１４０００ｒｐｍで２０分遠心し、上清を捨て乾かした後、７０％エタノールを加え、１４０００ｒｐｍで１０分遠心した。上清を捨て、デシケーターで低圧にし、乾燥させた。なお、酵素処理したｐＰＩＣ３．５Ｋのみ常法に従ってＣＩＡＰ処理を行い、フェノール抽出・エタノール沈殿した後、ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ：１２μＬに溶解させた。【００５０】目的配列のＤＮＡと直線化したｐＰＩＣ３．５Ｋを、「Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２」（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてライゲーションした後、上記（５）と同様の方法にてライゲーションしたプラスミドを増幅した。【００５１】  得られたプラスミド（ｐＰＩＣ３．５Ｋ  ｍＲｈｏ−ｈＴ２Ｒ１６、ｐＰＩＣ３．５ＫｈＴ２Ｒ１６）の模式図を図３に示す。【００５２】  ＳａｌＩ処理したｐＰＩＣ３．５Ｋ  ｍＲｈｏ−ｈＴ２Ｒ１６及びｐＰＩＣ３．５Ｋ  ｈＴ２Ｒ１６を用いて、上記（３）と同様にエレクトロポレーション法を用により形質転換を行ない、形質転換体を作製した。【００５３】（７）得られた形質転換体の培養条件、誘導条件の検討
酵母を培養、誘導する際の温度条件（２０℃と３０℃）、日数（２日もしくは３日）、培地（ＳＣ−Ｕ、ＳＤ−ＣＡＡ、ＹＰＤ）を組み合わせた。誘導後、蛍光分光光度計「ＦＰ−６５００」（日本分光社）を用いて、ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌスペクトル波長測定（励起光：４７０ｎｍ、測定スペクトル：４８０ｎｍ〜６００ｎｍ）を行った。【００５４】  その結果、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換体においては、２％ガラクトース添加ＳＤ−ＣＡＡ培地で２０℃４８時間誘導することにした。【００５５】  また、Ｐ．ｐａｓｔｒｉｓの形質転換体においては、２％ガラクトース添加ＳＤ−ＣＡＡ培地で３０℃、２４時間後、２０℃にして２４時間誘導した。【００５６】（８）ｈＴ２Ｒ１６融合タンパク質の発現の確認
８−１．  走査型共焦点レーザー顕微鏡による局在性確認
上記（７）の条件にて誘導をかけた各酵母の培養液３μＬをスライドガラスにのせてカバーガラスを被せた後、走査型共焦点レーザー顕微鏡「Ｆｌｕｏｖｉｒｅ  ＦＶ３００」（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）にて、４８８ｎｍの励起光を当て、ＧＦＰを発光させて、細胞内の局在性を確認したところ、ｍＲｈｏ（マウスロドプシン）の有無による局在性の改善は見られなかった。そのため、酵母の発現系ではマウスロドプシンを付加する必要がないことが分かった。【００５７】８−２．  蛍光分光光度計によるＧＦＰの蛍光測定
ＧＦＰ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１２Ｍソルビトール、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を調製した。酵母の培地をＧＦＰｂｕｆｆｅｒに交換して実験に供した。【００５８】  蛍光分光光度計「ＦＰ−６５００」（日本分光社製）を用いて、スペクトル波長測定（励起光４７０ｎｍ、測定スペクトル：４８０ｎｍ〜６００ｎｍ）を行った（図４）。図４から、ＢＪ２１６８株を用いた形質転換体の発現量が最も多いことが分かった。【００５９】  以上の結果から、ＢＪ２１６８株（ｐＲＳ４２６  ｈＴ２Ｒ１６−ＧＦＰ−Ｈｉｓタグ）、ＢＪ２１６８株（ｐＲＳ４２６  ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓタグ）を抗原調製に用いることに決定した。【００６０】（９）ｈＴ２Ｒ１６融合タンパクの調製
９−１．形質転換体の培養
ＢＪ２１６８株（ｐＲＳ４２６  ｈＴ２Ｒ１６−ＧＦＰ−Ｈｉｓタグ）を２％グルコース添加ＳＤ−ＣＡＡ培地４００ｍＬで３０度４８時間培養したのち、２％ガラクトース添加ＳＤ−ＣＡＡ培地に交換し、２０℃４８時間誘導をかけた。【００６１】９−２．膜画分の調製・ｈＴ２Ｒ１６融合タンパクの精製
得られた培養液を遠心（６００ｒｐｍ、１０分で２回）し、上清を除いて酵母を回収し、４０ｍＬのｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ７．５）、０．６Ｍ  Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）に懸濁した。【００６２】  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒと等量のｇｌａｓｓ  ｂｅａｄｓをコーニングに入れ、「ＦａｓｔＰｒｅｐ  ＦＰ１００Ａ」（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）もしくは「ＦａｓｔＰｒｅｐ  ２４  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ」（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）で破砕した後、遠心（６４００ｒｐｍ、１０分）し、上清を超遠心管に入れた。また、ｇｌａｓｓ  ｂｅａｄｓをｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ２０ｍＬで洗浄、遠心（６４００ｒｐｍ、１０分）して得られた上清を同じく超遠心管に入れた。これらの上清を、遠心（３００００ｒｐｍ、４℃、１時時間）した。遠心後、上清を捨て、沈殿物（膜画分）を４ｍＬのｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）に再懸濁し、ＢＣＡ法によりタンパク濃度を測定した。【００６３】  膜画分タンパク質濃度が３．５ｍｇ／ｍＬになるように、ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）で希釈してから、１０倍濃度のｄｅｔｅｒｇｅｎｔ（１％Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ、０．２％Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を加え、４℃で１時間反応させた。【００６４】  ３００００ｒｐｍで４℃１時時間遠心し、上清を回収し、これにＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ社）を加え、２時間吸着させた後、ｈＴ２Ｒ１６が吸着したＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ樹脂を混和し、液ごとミニカラム容器にアプライし、カラムの下から出てくるｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈフラクションを分取した。【００６５】  次にＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０３％ＤＤＭ）をミニカラムにアプライし、カラムから出てくる溶出フラクションを分取した。【００６６】  その後、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０３％  ＤＤＭ）をミニカラムにアプライし、溶出フラクションを５ｍＬずつ同じく６本の試験管に分取した。【００６７】  得られた各フラクションは、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＦＳＥＣ）を行い、ｈＴ２Ｒ１６−ＧＦＰ−Ｈｉｓタグタンパクの精製を行なった。【００６８】  あらかじめゲル濾過ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３％ＤＤＭ）で平衡化しておいた「ｓｕｐｅｒｒｏｓｅ１２（１．０×３０ｃｍ）」カラム（ファルマシア社製）にサンプルをアプライしてフラクションを分取し、ＵＶ波長測定器と蛍光波長測定器（島津社製）により測定してｈＴ２Ｒ１６−ＧＦＰ−Ｈｉｓタグタンパク質を回収した。【００６９】  上記と同様の方法で、ＢＪ２１６８株（ｐＲＳ４２６  ｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓタグ）を培養し、膜画分からｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓタグタンパク質を精製した。【００７０】  なお、ＧＰＣＲは発現量が少ないことが問題となっているが、上記形質転換体を用いることで、Ｔ２Ｒ１６−ＧＦＰ−Ｈｉｓタグ融合タンパク質は２〜３ｍｇ／１Ｌ培養液、Ｔ２Ｒ１６−Ｈｉｓタグ融合タンパク質は０．５ｍｇ／１Ｌ培養液のタンパク質を精製することができることが分かった。【００７１】９−３．精製した各ｈＴ２Ｒ１６融合タンパク質の確認
回収した各ｈＴ２Ｒ１６融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、単一バンドであることを確認した（図５）。【００７２】  また、目的タンパク質がＤｅｔｅｒｇｅｎｔ処理や精製の過程で重合をおこしていないか調べるために、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った（図６）。図６から、Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ処理後又は精製後のｈＴ２Ｒ１６融合タンパク質は単一のピークであることが確認でき、Ｄｅｔｅｒｄｅｎｔによって可溶化しても、精製の過程を経ても単量体のまま存在しているものが多いことが分かった。【００７３】  さらに、ＣＤスペクトル（円偏光２色性）測定（円二色性分散計「Ｊ−８２０」、日本分光社製）を行なった（図７）。図７から、精製したタンパク質は２０８ｎｍ及び２２２ｎｍに負のピークを示しており、α−ヘリックス含量が約６４％と推定することができた。この値は、ｈＴ２Ｒ１６アミノ酸配列からの二次構造予測の値に近く、精製したタンパク質が目的のタンパク質であることが示唆された。【００７４】  次に、単離したｈＴ２Ｒ１６−Ｈｉｓタグ融合タンパク質のリガンド結合能を調べるために、ＣＤスペクトルによる温度変化測定を行った。温度を３０〜９０℃まで変化させ、α−ヘリックスのピークである２２０ｎｍのモル平均楕円率を測定した（図８）。その結果、ｈＴ２Ｒ１６の変性温度が約６７℃であることが分かった。【００７５】  また、ｈＴ２Ｒ１６のリガンドであるサリシンを加え、再度ＣＤスペクトル測定を行ったところ、α−ヘリックスの減少がサリシン濃度に依存して抑制された（図８中、１０００倍というのは、モル濃度でｈＴ２Ｒ１６の１０００倍ということを表す。）。【００７６】  この結果から、単離したｈＴ２Ｒ１６はリガンドに対して結合能を持つことが示唆され、結合定数と解離定数を計算すると、解離定数がＫｄ＝１．２×１０−３〜１．４５×１０−３Ｍ、結合定数がＫｂ＝０．６９×１０３〜０．８３×１０３Ｍとなった。【００７７】〔実施例２：抗体の調製〕
（１）免疫
実施例１で調製したｈＴ２Ｒ１６−ＧＦＰ−Ｈｉｓタグ融合タンパク質を抗原として用い、以下の条件で産卵鶏（２羽）のももの筋肉に注射して免疫を行なった。
・１回目免疫
ｈＴ２Ｒ１６−ＧＦＰ−Ｈｉｓタグ融合タンパク質：０．２ｍｇ／羽
アジュバント：ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）
・２回目免疫（９週間後）
ｈＴ２Ｒ１６−ＧＦＰ−Ｈｉｓタグ融合タンパク質：０．５ｍｇ／羽
アジュバント：ＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）【００７８】  なお、免疫期間中は、鶏が抗原抗体反応を示しているかを確認するため、Ｔ２Ｒ１６を基質としたＥＬＩＳＡを行い、血中の抗体量の推移を調べ、血中の抗体濃度が上昇していることを確認した（図９）。【００７９】（２）鶏卵からの抗体精製
２回目免疫後、十分に抗体濃度が上昇した１０日目の卵から卵黄を分離した。得られた卵黄を均質化した後、この卵黄液１００ｇを用い、等量の水（１００ｇ）を加え、均質になるよう撹拌した。更に、０．１５％のλ−カラギーナン水溶液４００ｍＬを加え、撹拌後、３０分間静置した。静置後、遠心機を用い、８，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、その上清を回収した。回収した上清液に、硫酸アンモニウムを加え、塩析を行った。塩析を３回実施し、純度が９０％以上の抗体を得た。【００８０】（３）抗体の評価
作製したｈＴ２Ｒ１６抗体が、ｈＴ２Ｒ１６に対して活性を持っているか否かをＧ蛋白質の１種であるＧα１５とｈＴ２Ｒ１６を発現したＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎細胞由来の培養細胞）を用いたカルシウムイメージングとヒトによる官能検査によって評価した。【００８１】３−１．カルシウムイメージング法による評価
カルシウムイメージング法とは細胞にカルシウム感受性の試薬を負荷し、細胞内のカルシウムイオン濃度を測定する方法であり、味溶液によって苦味受容体が活性化すると細胞内のカルシウムイオン濃度が上昇する。【００８２】  まず、Ｇα１５とｈＴ２Ｒ１６を発現したＨＥＫ２９３細胞を、図１０に示す方法で作製した。作製したｈＴ２Ｒ安定発現細胞株は、ＲＴ−ＰＣＲと免疫染色により細胞表面にｈＴ２Ｒ１６が発現しているか確認した。【００８３】  ｈＴ２Ｒ１６を発現したＨＥＫ２９３細胞を用いて、ｈＴ２Ｒ１６抗体添加後の細胞内カルシウム濃度の推移を調べた結果を図１１に示す。図１１（ａ）はｈＴ２Ｒ１６抗体溶液に対する応答を示した結果で、イソプロテノールハイドロクロライドはコントロールである。コントロールに対しては反応するものの、ｈＴ２Ｒ１６抗体溶液に対しては細胞内のカルシウム濃度は全く変化しないことが分かる。この結果から、ｈＴ２Ｒ１６抗体はｈＴ２Ｒ１６を活性化させないことが分かった。【００８４】  一方、図１１（ｂ）はｈＴ２Ｒ１６抗体とＴ２Ｒ１６に対するリガンドであるサリシンの混合溶液に対する応答を示した結果である。ｈＴ２Ｒ１６抗体の濃度依存的にサリシンに対する細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇が抑制される傾向があることが分かる。【００８５】  以上の結果から、精製したｈＴ２Ｒ１６抗体は、ｈＴ２Ｒ１６を活性化しなかったが、サリシンの苦味を抑制する傾向があることが分かった。なお、ＨＥＫ２９３と、Ｇα１５のみを発現したＨＥＫ２９３は全てのサンプルに応答しなかった【００８６】３−２．官能評価
味刺激であるサリシン（０．５、１、３ｍＭ）溶液、ｈＴ２Ｒ１６抗体溶液（２５０μｇ／ｍＬ）、ｈＴ２Ｒ１６抗体（２５０μｇ／ｍＬ）とサリシン（０．５、１、３ｍＭ）の混合溶液を、被験者である１３名の成人男女（２８．４±２．３才）に呈示した。なお、各溶液の濃度は予備実験を行い、最も効果が大きいと考えられる濃度を選んだ。【００８７】  被験者に、感じた味強度をＬＭＳ（ラベルドマグニチュードスケール）にチェックしてもらい、スケール下端からのチェックまでの距離を測り、被験者間の相乗平均を求め、平均呈味強度とした。また、各溶液の味質も回答してもらった。その結果を図１２に示す。【００８８】  図１２から、精製したｈＴ２Ｒ１６抗体は無味であったが、サリシンの苦味を抑制する傾向があることが分かった。【００８９】  以上の結果から、ｈＴ２Ｒ１６抗体はｈＴ２Ｒ１６に対するアゴニスト活性はなかったものの、アンタゴニスト活性を有していることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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