(57)【要約】      （修正有）【課題】結腸直腸癌のリスクがある患者又は結腸直腸癌と診断された患者を治療する方法を提供する。【解決手段】前記患者の結腸直腸癌細胞であることが疑われる細胞におけるＭＳＨ３総発現を測定し、前記患者を治療するための遺伝毒性を有する抗腫瘍剤を用いる治療の有効性を予測する方法である。患者細胞のＭＳＨ３総発現が、正常な結腸直腸細胞のＭＳＨ３発現と比べて減少している場合、遺伝毒性のある抗腫瘍剤を用いる療法に対する応答素因が示される。遺伝毒性のある抗腫瘍剤を用いる療法は、有効量の遺伝毒性のある抗腫瘍剤を患者に投与することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は２以上の腺癌のリスクを有する患者或いは１又は２以上の腺癌と診断された患者における治療レジメンの有効性を予測する方法において、
前記患者から得、腺癌細胞であることが疑われる細胞におけるＭＳＨ３総発現を測定するステップ、及び
前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現の測定に基づき、前記患者を治療するための抗腫瘍剤を用いる前記治療レジメンの有効性を予測するステップであって、正常細胞におけるＭＳＨ３発現に比べて前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現が減少しているときに抗腫瘍剤療法に対する応答素因が示され、前記療法が前記患者に有効量の前記抗腫瘍剤を投与することを含むステップを含む、方法。
【請求項２】
腺癌が、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、肺癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、精巣癌、膀胱癌、膣癌、乳癌、食道癌、膵臓癌、及び胃癌からなる群から選択される固形腫瘍を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腺癌がＣＲＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、腺癌細胞であることが疑われる細胞を、ＭＳＨ３タンパク質の発現、ＭＳＨ３核酸の発現又はその両方について分析することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
個体から得たＭＳＨ３核酸又はＭＳＨ３核酸の一部からのＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、質量分析、ローリングサークル増幅、免疫組織化学分析、対立遺伝子特異的プローブ又は抗体プローブを用いるハイブリダイゼーション、或いはそれらの組合せ又は改変法を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗腫瘍剤が、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロフォスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、テモゾロミド、トポテカン、及び電離放射線からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗腫瘍剤が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、フロクマリン、及びソラレンからなる群から選択される鎖間架橋剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抗腫瘍剤が、オラパリブ、イソインドリノン誘導体、ベリパリブ、イニパリブ、及び４−メトキシ−カルバゾール誘導体からなる群から選択されるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
結腸直腸癌のリスクがある患者又は結腸直腸癌と診断された患者を治療する方法において、
前記患者から得、結腸直腸癌細胞であることが疑われる細胞におけるＭＳＨ３総発現を測定するステップ、及び
前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現の測定に基づいて前記患者を治療するための抗腫瘍剤を用いる治療レジメンの有効性を予測するステップであって、
正常結腸直腸細胞におけるＭＳＨ３発現に比べて前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現が減少しているときに抗腫瘍剤療法に対する応答素因が示され、
前記療法が前記患者に有効量の前記抗腫瘍剤療法を投与することを含むステップを含む、方法。
【請求項１０】
ＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、腺癌細胞であることが疑われる細胞を、ＭＳＨ３タンパク質の発現、ＭＳＨ３核酸の発現又はその両方について分析することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
個体から得たＭＳＨ３核酸又はＭＳＨ３核酸の一部からのＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、質量分析、ローリングサークル増幅、免疫組織化学分析、対立遺伝子特異的プローブ又は抗体プローブを用いるハイブリダイゼーション、或いはそれらの組合せ又は改変法を行うことを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
抗腫瘍剤が、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロフォスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、テモゾロミド、トポテカン、及び電離放射線からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
抗腫瘍剤が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、フロクマリン、及びソラレンからなる群から選択される鎖間架橋剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
抗腫瘍剤が、オラパリブ、イソインドリノン誘導体、ベリパリブ、イニパリブ、及び４−メトキシ−カルバゾール誘導体からなる群から選択されるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
結腸直腸癌のリスクがある患者又は結腸直腸癌と診断された患者に対する癌治療法を選択する方法において、
前記患者のＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップ、及び抗腫瘍剤を用いて前記患者を治療するための抗腫瘍剤治療の有効性を予測するステップであって、前記ＭＳＨ３総発現レベルが減少しているときにＤＮＡ架橋剤が前記患者にとって適切な療法であることが示されるステップを含む、方法。
【請求項１６】
ＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、腺癌細胞であることが疑われる細胞を、ＭＳＨ３タンパク質の発現、ＭＳＨ３核酸の発現又はその両方について分析することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
個体から得たＭＳＨ３核酸又はＭＳＨ３核酸の一部からのＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、質量分析、ローリングサークル増幅、免疫組織化学分析、対立遺伝子特異的プローブ又は抗体プローブを用いるハイブリダイゼーション、或いはそれらの組合せ又は改変法を行うことを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
抗腫瘍剤が、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロフォスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、テモゾロミド、トポテカン、及び電離放射線からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
抗腫瘍剤が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、フロクマリン、及びソラレンからなる群から選択される鎖間架橋剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
抗腫瘍剤が、オラパリブ、イソインドリノン誘導体、ベリパリブ、イニパリブ、及び４−メトキシ−カルバゾール誘導体からなる群から選択されるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
患者を癌治療法の臨床試験用のサブグループに分類する方法において、
前記患者から得、癌細胞であることが疑われる細胞におけるＭＳＨ３総発現を測定するステップ、及び
前記患者を治療するための候補薬剤を用いる療法の有効性を予測するステップであって、
正常細胞におけるＭＳＨ３発現に比べて前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現が減少しているときに候補薬剤を用いる療法に対する応答素因が示され、
前記療法が患者に有効量の前記候補薬剤を投与することを含み、ＭＳＨ３発現レベルにより前記患者を臨床試験用のサブグループに分類できるステップを含む、方法。
【請求項２２】
癌細胞が、固形腫瘍に存在し、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、肺癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、精巣癌、膀胱癌、膣癌、乳癌、食道癌、膵臓癌、及び胃癌からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
癌細胞が結腸直腸癌細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、腺癌細胞であることが疑われる細胞を、ＭＳＨ３タンパク質の発現、ＭＳＨ３核酸の発現又はその両方について分析することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
個体から得たＭＳＨ３核酸又はＭＳＨ３核酸の一部からのＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、質量分析、ローリングサークル増幅、免疫組織化学分析、対立遺伝子特異的プローブ又は抗体プローブを用いるハイブリダイゼーション、或いはそれらの組合せ又は改変法を行うことを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
候補薬剤が遺伝毒性剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
候補薬剤がポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
患者を結腸直腸癌のサブグループに分類する方法において、
前記患者から得、結腸直腸癌細胞であることが疑われる細胞におけるＭＳＨ３総発現を測定するステップ、及び
正常結腸直腸細胞におけるＭＳＨ３発現と比べたときの前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現の変化に基づいて結腸直腸癌のステージを予測するステップを含む、方法。
【請求項２９】
結腸直腸癌のリスクがある患者又は結腸直腸癌と診断された患者を治療する方法において、
前記患者から得、結腸直腸癌細胞であることが疑われる細胞におけるＭＳＨ３総発現を測定するステップであって、ＭＳＨ３総発現が変化しているときに、１又は２以上のＤＮＡ架橋剤を用いる療法に対する応答素因が示されるステップ、
結腸直腸癌細胞におけるＭＳＨ３発現を減少させるのに十分な量の治療有効量のＤＮＡ架橋剤を投与するステップ、及び
前記患者におけるＭＳＨ３総発現の継続的減少を測定するステップを含む、方法。
【請求項３０】
ＭＳＨ３遺伝子発現を伴う疾患状態の治療に有用であると考えられる候補薬剤を評価するための臨床試験を行う方法において、以下のステップを含む方法。
ａ）患者グループから得た結腸直腸癌を有することが疑われる組織におけるＭＳＨ３発現レベルを測定するステップ；
ｂ）患者の第１サブグループに候補薬剤を投与し、患者の第２サブグループに偽薬を投与するステップ；
ｃ）前記候補薬剤又は前記偽薬を投与した後にステップａ）を繰り返すステップ；及び
ｄ）前記候補薬剤により、ＭＳＨ３発現減少を示す結腸直腸細胞の数が、前記患者の第２サブグループで生じる低減と比べて統計的に有意に低減されるか否かを測定するステップであって、統計的に有意に低減していることによって前記候補薬剤が前記疾患状態を治療するのに有用であることが示されるステップ
【請求項３１】
哺乳動物の結腸直腸癌が、結腸直腸癌の治療のためのＤＮＡ損傷剤に対して耐性又は応答性である可能性を測定する方法において、
前記癌から得た生体試料におけるＭＳＨ３総発現の減少を調べるステップ、及び
前記結腸直腸癌が前記ＤＮＡ損傷剤に対して応答性を示す又は増強された感受性を有すると同定するステップであって、前記生体試料におけるＭＳＨ３の発現又は活性の減少が前記ＤＮＡ損傷剤に対する応答性の指標となるステップ
を含む方法。
【請求項３２】
結腸直腸癌の疾患進行のバイオマーカーにおいて、前記バイオマーカーがＭＳＨ３であり、患者から得た結腸直腸癌細胞におけるＭＳＨ３総発現が、正常結腸直腸癌細胞又は同じ患者からより早い時期に得た結腸直腸癌細胞におけるＭＳＨ３発現と比べて減少していることが結腸直腸癌の疾患進行の指標となる、バイオマーカー。
【請求項３３】
ＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、腺癌細胞であることが疑われる細胞を、ＭＳＨ３タンパク質の発現、ＭＳＨ３核酸の発現又はその両方について分析することを含む、請求項３２に記載のバイオマーカー。
【請求項３４】
個体から得たＭＳＨ３核酸又はＭＳＨ３核酸の一部からのＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、質量分析、ローリングサークル増幅、免疫組織化学分析、対立遺伝子特異的プローブ又は抗体プローブを用いるハイブリダイゼーション、或いはそれらの組合せ又は改変法を行うことを含む、請求項３２に記載のバイオマーカー。
【請求項３５】
ＭＳＨ３の差次的発現レベルを測定するためのバイオマーカー検出試薬と、結腸直腸癌のリスクの診断における使用のためのインストラクションとを含む結腸直腸癌診断用のキット。
【請求項３６】
結腸直腸のリスクを有する患者から得た試料におけるＭＳＨ３ ｍＲＮＡ及びＭＳＨ３タンパク質の両方の発現レベルが正常対象に比べて有意に減少している、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
ヒト対象における結腸直腸癌進行を診断又は検出する方法において、
結腸直腸癌に罹患していることが疑われるヒト対象を同定するステップ、
前記対象から１又は２以上の生体試料を得るステップであって、前記生体試料が、組織試料、糞便試料、細胞ホモジネート、及び  を含む１又は２以上の生体液からなる群から選択されるステップ、
前記対象の前記生体試料から得た１又は２以上の細胞におけるＭＳＨ３総発現パターンを測定するステップ、並びに
結腸直腸癌に罹患していることが疑われる前記対象の前記生体試料からのＭＳＨ３の総発現パターンと、正常対象の生体試料からのＭＳＨ３の総発現パターンとを比較するステップであって、前記正常対象が結腸直腸癌に罹患していない健常な対象であり、前記対象の前記生体試料におけるＭＳＨ３総発現パターンの減少が、結腸直腸癌の存在、発症リスク、又はその両方の指標となるステップ
を含む方法。
【請求項３８】
ＭＳＨ３の総発現レベルを測定するステップが、腺癌細胞であることが疑われる細胞を、ＭＳＨ３タンパク質の発現、ＭＳＨ３ ｍＲＮＡ核酸の発現又はその両方について分析することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＭＳＨ３ ｍＲＮＡ、ＭＳＨ３タンパク質、又はその両方の発現レベルの有意な減少が、湿潤性結腸直腸癌の存在、発症リスク、又はその両方の指標となる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
個体から得たＭＳＨ３核酸又はＭＳＨ３核酸の一部からのＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、質量分析、ローリングサークル増幅、免疫組織化学分析、対立遺伝子特異的プローブ又は抗体プローブを用いるハイブリダイゼーション、或いはそれらの組合せ又は改変法を行うことを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
結腸直腸癌のリスクを有する又は結腸直腸癌に罹患している患者を治療すること、結腸直腸癌のリスクを有する又は結腸直腸癌に罹患している患者のためにＤＮＡ架橋剤療法を選択すること、患者を結腸直腸癌のサブグループ又は結腸直腸癌治療法の臨床試験用のサブグループに分類すること、結腸直腸癌治療レジメンに対する耐性又は応答性を測定すること、結腸直腸癌の診断用キットを開発すること、或いはそれらの組合せのために用いる、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に癌の検出、予後及び治療の分野に関し、より具体的にはＤＮＡ損傷剤に対する結腸直腸癌細胞の感受性を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定することなく、結腸癌及び消化器癌の検出用バイオマーカーとの関連で以下に本発明の背景を記載する。
【０００３】
Pant et al.に発行された米国特許第７２５２９５５号（２００７年）は、結腸癌スクリーニング用の免疫アッセイ及びキットを開示している。各試料から糞便糖タンパク質を免疫原性が保持されるようにして抽出する。精製された糞便糖タンパク質を結腸−卵巣腫瘍抗原（ＣＯＴＡ）に対する抗体と反応させる。このムチン抗原ＣＯＴＡは結腸直腸癌細胞に特異的に存在し、正常結腸には存在しない。糞便試料中のＣＯＴＡ量を測定し、結腸癌の存在を示すことに用いる。
【０００４】
Lin et al.に発行された米国特許第７５７５９２８号は、結腸直腸癌を診断するための遺伝子を開示している。簡潔に述べるとこの特許は、以下のようにして遺伝子配列を検索することにより結腸直腸癌を診断するための遺伝子を提供する。（１）正常腸、腸ポリープ及び結腸直腸癌組織から上皮細胞を得る；（２）抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）により高度に差次的な遺伝子発現を示す遺伝子を回収し、ライブラリーを構築する；（３）癌組織から、比較的高いシグナル強度を有するコロニーを得る；（４）ノーザンハイブリダイゼーションで癌組織をより臨床的に回収し、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と生物情報分析を併用して差次的遺伝子発現の変動を確認する；並びに（５）前記ライブラリーから最適な遺伝子を選択し、その遺伝子配列を試薬として使用することにより、早期診断、特異性、高感受性及び安全性における効果が得られる。
【０００５】
Robbins et al.に発行された米国特許第７０２２４７２号は、結腸直腸癌の診断に有用なヒトＭＬＨ１遺伝子及びヒトＭＳＨ２遺伝子の変異（mutation）を開示している。簡単に述べると、ヒトＭＬＨ１遺伝子及びヒトＭＳＨ２遺伝子のバリアントを用いて遺伝性非ポリープ性結腸直腸癌（ＨＮＰＣＣ）が診断でき、及び／又は患者におけるＨＮＰＣＣの発症感受性も測定できることが見い出された。ＭＬＨ１遺伝子又はＭＳＨ２遺伝子の新規バリアントを同定するための方法及び組成物も提供されている。さらに、かかるバリアント遺伝子を含む遺伝性非ポリープ性結腸直腸癌の実験モデルが提供された。  
【０００６】
最後に、Baker et al.が出願した米国特許出願公開公報第２００９０３０５２７７号は、ヒト患者が癌と診断される可能性を予測する方法であって、以下の遺伝子群、ＡＵＲＫＢ、Ａｘｉｎ２、Ｂ１Ｋ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ２、ＢＵＢ１、Ｃ２０ｏｒｆ１、Ｃ２０ＯＲＦ１２６、ＣＡＳＰ９、ＣＣＮＥ２バリアント１、ＣＤＣ２、ＣＤＣ４、ＣＥＮＰＡ、ＣＥＮＰＦ、ＣＬＩＣ１、ＣＹＲ６１、Ｃｄｘ２、Ｃｈｋ１、ＤＬＣ１、ＤＵＳＰ１、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＲ３、Ｅ１２４、ＥＳＰＬ１、ＦＢＸＯ５、ＦＧＦ２、ＦＯＳ、ＦＵＴ６、ＧＳＫ３Ｂ、Ｇｒｂ１０、ＨＥＳ６、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＮＲＰＡＢ、ＨＯＸＢ１３、ＨＳＰＥ１、ＫＩＦ２２、ＫＩＦＣ１、ＫＬＲＫ１、Ｋｉ−６７、ＬＡＴ、ＬＭＹＣ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＮＲ４Ａ１、ＰＤＧＦＡ、ＰＲＤＸ２、ＲＡＢ３２、ＲＡＤ５４Ｌ、ＲＡＮＢＰ２、ＲＣＣ１、ＲＯＣＫ２、ＲｈｏＢ、Ｓ１００Ｐ、ＳＡＴ、ＳＯＤ１、ＳＯＳ１、ＳＴＫ１５、ＴＣＦ−１、ＴＯＰ２Ａ、ＴＰ５３ＢＰ１、ＵＢＥ２Ｃ、ＶＣＰ、及びｃＭＹＣから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの測定に基づく、又はこれらに対応する発現に基づく方法を記載しており、これらの遺伝子のうち１又は２以上の遺伝子における発現亢進が、化学療法に対する正の応答性の可能性が高くなることと正の相関を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７２５２９５５号
【特許文献２】米国特許第７５７５９２８号
【特許文献３】米国特許第７０２２４７２号
【特許文献４】米国特許出願公開公報第２００９０３０５２７７号
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、結腸直腸癌の予後の評価及び／又は化学療法に対する癌の応答性を予測する上でのＭＳＨ３発現レベルに関して従来の知見を超える有意義かつ新規な知見をここに明らかにする。
【０００９】
本発明の一実施形態では、１又は２以上の腺癌のリスクを有する患者或いは１又は２以上の腺癌と診断された患者を治療する方法において、前記患者から得、腺癌細胞であることが疑われる細胞におけるＭＳＨ３総発現を測定するステップ、及び前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現の測定に基づき、前記患者を治療するための抗腫瘍剤を用いる前記治療の有効性を予測するステップであって、正常細胞におけるＭＳＨ３発現に比べて前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現が減少しているときに抗腫瘍剤療法に対する応答素因（predisposition to responsiveness）が示され、前記療法が患者に有効量の前記抗腫瘍剤を投与することを含むステップを含む方法を提供する。前記腺癌は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、肺癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、精巣癌、膀胱癌、膣癌、乳癌、食道癌、膵臓癌、及び胃癌からなる群から選択される。より具体的な態様では腺癌はＣＲＣであり、固形腫瘍を含む。
【００１０】
別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、腺癌細胞であることが疑われる細胞を、ＭＳＨ３タンパク質の発現、ＭＳＨ３核酸の発現又はその両方について分析することを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、個体から得たＭＳＨ３核酸の質量分析を行うことを含む。さらに別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、個体から得たＭＳＨ３核酸の一部についてローリングサークル増幅を行うことを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、対立遺伝子特異的プローブ、抗体プローブ又はその両方を用いるハイブリダイゼーションを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、免疫組織化学法を含む。
【００１１】
関連する態様において抗腫瘍剤は、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア、ブスルファン（busulfan）、カルムスチン（carmustine）、クロラムブシル（chlorambucil）、シクロフォスファミド（cyclophosphamide）、ダカルバジン（dacarbazine）、ダウノルビシン（daunorubicin）、ドキソルビシン（doxorubicin）、エピルビシン（epirubicin）、エトポシド（etoposide）、イダルビシン（idarubicin）、イフォスファミド（ifosfamide）、イリノテカン（irinotecan）、ロムスチン（lomustine）、メクロレタミン（mechlorethamine）、メルファラン（melphalan）、マイトマイシンＣ（mitomycin C）、ミトキサントロン（mitoxantrone）、テモゾロミド（temozolomide）、トポテカン（topotecan）、及び電離放射線からなる群から選択される。一態様において抗腫瘍剤は鎖間架橋剤である。別の態様において抗腫瘍剤は、シスプラチン（cisplatin）、カルボプラチン（carboplatin）、オキサリプラチン（oxaliplatin）、フロクマリン（furocoumarins）、及びソラレン（psoralen）からなる群から選択される鎖間架橋剤である。さらに別の態様において抗腫瘍剤は、オラパリブ（olaparib）、イソインドリノン（isoindolinone）誘導体、ベリパリブ（veliparib）、イニパリブ（iniparib）、及び４−メトキシ−カルバゾール誘導体からなる群から選択されるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤である。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、腺癌のリスクがある患者又は腺癌と診断された患者を治療する方法において、（ｉ）前記患者から得、腺癌細胞であることが疑われる細胞におけるＭＳＨ３総発現を測定するステップ、及び（ii）前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現の測定に基づいて前記患者を治療するための抗腫瘍剤を用いる治療の有効性を予測するステップであって、
正常細胞におけるＭＳＨ３発現に比べて前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現が減少しているときに抗腫瘍剤療法に対する応答素因が示され、前記療法が前記患者に有効量の前記抗腫瘍剤を投与することを含むステップを含む方法を提供する。一態様において腺癌は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、肺癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、精巣癌、膀胱癌、膣癌、乳癌、食道癌、膵臓癌、及び胃癌からなる群から選択される。別の態様において腺癌はＣＲＣである。さらに別の態様において腺癌は、固形腫瘍である。
【００１３】
上述したＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、腺癌細胞であることが疑われる細胞を、ＭＳＨ３タンパク質の発現、ＭＳＨ３核酸の発現又はその両方について分析することを含む。一態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、個体から得たＭＳＨ３核酸の質量分析を行うことを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、個体から得たＭＳＨ３核酸の一部についてローリングサークル増幅を行うことを含む。さらに別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、対立遺伝子特異的プローブ、抗体プローブ又はその両方を用いるハイブリダイゼーションを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、免疫組織化学法を含む。
【００１４】
一態様において抗腫瘍剤は、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロフォスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、テモゾロミド、トポテカン、及び電離放射線からなる群から選択される。別の態様において抗腫瘍剤は鎖間架橋剤である。別の態様において抗腫瘍剤は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、フロクマリン、及びソラレンからなる群から選択される鎖間架橋剤である。さらに別の態様において抗腫瘍剤は、オラパリブ、イソインドリノン誘導体、ベリパリブ、イニパリブ、及び４−メトキシ−カルバゾール誘導体からなる群から選択されるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤である。
【００１５】
さらに別の実施形態において本発明は、結腸直腸癌のリスクがある患者又は結腸直腸癌と診断された患者を治療する方法において、前記患者から得、結腸直腸癌細胞であることが疑われる細胞におけるＭＳＨ３総発現を測定するステップ、及び抗腫瘍剤を用いて前記患者を治療するための抗腫瘍剤治療の有効性を予測するステップであって、正常な結腸直腸細胞におけるＭＳＨ３総発現に比べて前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現が減少しているときに抗腫瘍剤療法に対する応答素因が示され、前記療法が前記患者に有効量の前記抗腫瘍剤療法を投与することを含むステップを含む方法を開示する。
【００１６】
一態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、結腸直腸癌であることが疑われる組織試料をＭＳＨ３タンパク質の発現について分析することを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、結腸直腸癌であることが疑われる組織試料をＭＳＨ３核酸の発現について分析することを含む。更に別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、個体から得たＭＳＨ３核酸の質量分析を行うことを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、個体から得たＭＳＨ３核酸の一部についてローリングサークル増幅を行うことを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、対立遺伝子特異的プローブ、抗体プローブ又はその両方を用いるハイブリダイゼーションを含む。さらに別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、免疫組織化学法を含む。
【００１７】
一態様において抗腫瘍剤は、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロフォスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、テモゾロミド、トポテカン、及び電離放射線からなる群から選択される。特定の態様において抗腫瘍剤は鎖間架橋剤である。別の態様において抗腫瘍剤は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、フロクマリン、及びソラレンからなる群から選択される鎖間架橋剤である。さらに別の態様において抗腫瘍剤は、オラパリブ、イソインドリノン誘導体、ベリパリブ、イニパリブ、及び４−メトキシ−カルバゾール誘導体からなる群から選択されるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤である。
【００１８】
本発明はさらに、結腸直腸癌のリスクがある患者又は結腸直腸癌と診断された患者に対する癌治療法を選択する方法において、前記患者のＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップ、及び抗腫瘍剤を用いて前記患者を治療するための抗腫瘍剤治療の有効性を予測するステップであって、前記ＭＳＨ３総発現レベルが減少しているときにＤＮＡ架橋剤が前記患者にとって適切な療法であることが示されるステップを含む方法を提供する。一態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、結腸直腸癌であることが疑われる組織試料をＭＳＨ３タンパク質の発現について分析することを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、結腸直腸癌であることが疑われる組織試料をＭＳＨ３核酸の発現について分析することを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、個体から得たＭＳＨ３核酸の質量分析を行うことを含む。本明細書に記載のさらに別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、個体から得たＭＳＨ３核酸の一部についてローリングサークル増幅を行うことを含む。この方法に関連する態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、対立遺伝子特異的プローブ及び抗体プローブを用いるハイブリダイゼーション、並びに免疫組織化学法を含む。この方法の特定の態様において、抗腫瘍剤は鎖間架橋剤である。別の態様において抗腫瘍剤は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、フロクマリン、及びソラレンからなる群から選択される。別の態様において抗腫瘍剤は、オラパリブ、イソインドリノン誘導体、ベリパリブ、イニパリブ、及び４−メトキシ−カルバゾール誘導体からなる群から選択されるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤である。
【００１９】
本明細書に開示される別の実施形態は、患者を癌治療法の臨床試験用のサブグループに分類する方法において、前記患者から得、癌細胞であることが疑われる細胞におけるＭＳＨ３総発現を測定するステップ、及び前記患者を治療するための候補薬剤を用いる療法の有効性を予測するステップであって、正常細胞におけるＭＳＨ３発現に比べて前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現が減少しているときに候補薬剤を用いる療法に対する応答素因が示され、前記療法が前記患者に有効量の前記候補薬剤を投与することを含み、ＭＳＨ３発現レベルにより前記患者を臨床試験用のサブグループに分類できるステップを含む方法に関する。一態様において癌細胞は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、肺癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、精巣癌、膀胱癌、膣癌、乳癌、食道癌、膵臓癌、及び胃癌からなる群から選択される。特定の態様において、癌細胞は結腸直腸癌細胞であり、固形腫瘍に存在する癌細胞である。
【００２０】
かかる方法の一態様において、ＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、結腸直腸癌であることが疑われる組織試料をＭＳＨ３タンパク質の発現、ＭＳＨ３核酸の発現、又はその両方について分析することを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、個体から得たＭＳＨ３核酸の質量分析を行うことを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、個体から得たＭＳＨ３核酸の一部についてローリングサークル増幅を行うことを含む。さらに別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、対立遺伝子特異的プローブ又は抗体プローブを用いるハイブリダイゼーションを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、免疫組織化学法を含む。関連する態様において候補薬剤は、遺伝毒性剤又はポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤である。
【００２１】
さらに別の態様において本発明は、患者から得、結腸直腸癌細胞であることが疑われる細胞におけるＭＳＨ３総発現を測定すること、及び正常結腸直腸細胞におけるＭＳＨ３発現と比べて前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現が減少することを指標に結腸直腸癌疾患進行のステージを予測すること、のステップからなる方法により、患者を結腸直腸癌のサブグループに分類するステップを記載している。前記に開示した分類方法の一態様では、疾患の進行及びＭＳＨ３発現の減少が、抗腫瘍剤療法に対する結腸直腸癌素因を示す。
【００２２】
本発明はさらに、結腸直腸癌のリスクがある患者又は結腸直腸癌と診断された患者を治療する方法において、（ｉ）前記患者から得、結腸直腸癌細胞であることが疑われる細胞におけるＭＳＨ３総発現を測定するステップであって、１又は２以上のＤＮＡ架橋剤を用いる療法に対する応答素因を示すステップ、（ii）前記患者におけるＭＳＨ３総発現の継続的減少を測定するステップ、及び（iii）ＭＳＨ３発現を減少させ、結腸直腸癌細胞を除去するのに十分な量の治療有効量のＤＮＡ架橋剤を投与するステップを含む方法を開示する。
【００２３】
一実施形態において本発明は、ＭＳＨ３遺伝子発現に伴う疾患状態の治療に有用であると考えられる候補薬剤を評価するための臨床試験を行う方法において、ａ）患者グループから得た結腸直腸癌を有することが疑われる組織におけるＭＳＨ３発現レベルを測定するステップ；ｂ）患者の第１サブグループに候補薬剤を投与し、患者の第２サブグループに偽薬を投与するステップ；ｃ）前記候補薬剤又は前記偽薬を投与した後にステップａ）を繰り返すステップ；及びｄ）前記候補薬剤により、ＭＳＨ３発現減少を示す結腸直腸細胞の数が、前記患者の第２サブグループで生じる低減と比べて統計的に有意に低減されるか否かを測定するステップであって、統計的に有意に低減していることによって前記候補薬剤が前記疾患状態を治療するのに有用であることが示されるステップを含む方法に関する。
【００２４】
別の実施形態において本発明は、哺乳動物の結腸直腸癌が、結腸直腸癌の治療のためのＤＮＡ損傷剤に対して耐性又は応答性である可能性を測定する方法において、前記癌から得た生体試料におけるＭＳＨ３総発現の減少を調べるステップと、前記ＤＮＡ阻害剤に対して応答性を有する癌において、同じバイオマーカーの発現レベル又は活性レベルに対してＭＳＨ３の発現又は活性が減少している場合、前記結腸直腸癌が前記ＤＮＡ損傷剤に対して応答性を示す又は増強された感受性を有すると同定するステップとを含む方法を提供する。
【００２５】
さらに別の実施形態において本発明は、結腸直腸癌の疾患進行のバイオマーカーにおいて、前記バイオマーカーがＭＳＨ３であり、患者から得た結腸直腸癌細胞におけるＭＳＨ３総発現が、正常結腸直腸癌細胞又は同じ患者からより早い時期に得た結腸直腸癌細胞におけるＭＳＨ３発現と比べて減少していることが結腸直腸癌の疾患進行の指標となる、バイオマーカーを開示する。一態様においてＭＳＨ３総発現レベルは、結腸直腸癌であることが疑われる組織試料をＭＳＨ３タンパク質の発現について分析することを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルは、結腸直腸癌であることが疑われる組織試料をＭＳＨ３核酸の発現について分析することを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルは、個体から得たＭＳＨ３核酸の質量分析を行うことを含む。さらに別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルは、個体から得たＭＳＨ３核酸の一部についてローリングサークル増幅を行うことを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルは、対立遺伝子特異的プローブ及び抗体プローブを用いるハイブリダイゼーション、又は免疫組織化学法を含む。
【００２６】
本発明はさらに、ＭＳＨ３の差次的発現レベルを測定するためのバイオマーカー検出試薬と、結腸直腸癌のリスクの診断における使用のためのインストラクションとを含む結腸直腸癌診断用のキットについて記載している。一態様において、結腸直腸癌のリスクを有する患者から得た試料におけるＭＳＨ３ ｍＲＮＡ及びＭＳＨ３タンパク質の両方の発現レベルは、正常対象に比べて著しく減少している。別の態様では、結腸直腸癌のリスクを有する患者のＭＳＨ３ｍＲＮＡの発現レベルは、正常対象と比べて減少している。さらに別の態様では、結腸直腸癌のリスクを有する患者のＭＳＨ３タンパク質の発現レベルは、正常対象と比べて減少している。
【００２７】
最後に、本発明は、ヒト対象における結腸直腸癌の進行を診断又は検出する方法において、（ｉ）結腸直腸癌に罹患していることが疑われるヒト対象を同定するステップ、（ii）前記対象から１又は２以上の生体試料を得るステップであって、前記生体試料が、組織試料、糞便試料、細胞ホモジネート、及び  １又は２以上の生体液からなる群から選択されるステップ、（iii）前記対象の前記生体試料から得た１又は２以上の細胞におけるＭＳＨ３総発現パターンを測定するステップ、並びに（iv）結腸直腸癌に罹患していることが疑われる前記対象の前記生体試料からのＭＳＨ３の総発現パターンと、正常対象の生体試料からのＭＳＨ３の総発現パターンとを比較するステップであって、前記正常対象が結腸直腸癌に罹患していない健常な対象であり、前記対象の前記生体試料におけるＭＳＨ３総発現パターンの減少が、結腸直腸癌の存在、発症リスク、又はその両方の指標となるステップを含む方法を提供する。
【００２８】
上記に開示した診断方法の一態様において、ＭＳＨ３ ｍＲＮＡ、ＭＳＨ３タンパク質、又はその両方の発現レベルの著しい減少が、湿潤性結腸直腸癌の存在、発症リスク、又はその両方の指標となる。別の態様では、ＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、生体試料からの１又は２以上の細胞についてＭＳＨ３核酸の発現を分析することを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、対象から得たＭＳＨ３核酸の質量分析を行うことを含む。さらに別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、対象から得たＭＳＨ３核酸の一部についてローリングサークル増幅を行うことを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、対立遺伝子特異的プローブ又は抗体プローブを用いるハイブリダイゼーションを含む。別の態様においてＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップは、免疫組織化学法を含む。さらに別の態様において、かかる方法は、結腸直腸癌のリスクを有する又は結腸直腸癌に罹患している患者を治療すること、結腸直腸癌のリスクを有する又は結腸直腸癌に罹患している患者のためにＤＮＡ架橋剤療法を選択すること、患者を結腸直腸癌のサブグループ又は結腸直腸癌治療法の臨床試験用のサブグループに分類すること、結腸直腸癌治療レジメンに対する耐性又は応答性を測定すること、結腸直腸癌の診断用キットを開発すること、或いはそれらの組合せのために用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
本発明の特徴及び利点のより完全な理解のため、添付の図面と共に、発明の詳細な記載を参照する。図面は以下のとおりである。
【図１】ＭＳＨ３ｓｈＲＮＡを安定的にトランスフェクトしたＨＣＴ１１６＋３＋５由来クローンのＭＳＨ３発現に対するtet-offシステムによる制御を示す図である。（１Ａ）ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１１６＋３、ＨＣＴ１１６＋３＋５、並びにＨＣＴ１１６＋３＋５由来クローン３種、Ｇ１、Ｇ２及びＧ５の各細胞におけるＭＳＨ３、ＭＬＨ１及びβ−アクチンのウエスタンブロット分析である。（１Ｂ）１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンの存在下又は不在下の培地で培養したＨＣＴ１１６＋３＋５、Ｇ１、Ｇ２及びＧ５の各細胞におけるＭＳＨ３及びβ−アクチンのウエスタンブロット分析である。ＭＳＨ３の相対的発現をデンシトメトリーにより計算し、個別に３回以上行った試験に基づいて結果を得た。
【図２】ＭＳＨ３プロフィシェント細胞（MSH3-proficient cells）と比べ、ＭＳＨ３欠損細胞のほうがシスプラチン及びオキサリプラチンに対する感受性が高いことを示す図である。（２Ａ）シスプラチン処理したＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１１６＋３、ＨＣＴ１１６＋３＋５及びＧ５の各細胞のクローン原性生存率（clonogenic survival fraction）である。（２Ｂ）シスプラチン処理し、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンの存在下及び不在下で培養したＧ５細胞のクローン原性生存率である。（２Ｃ）オキサリプラチン処理したＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１１６＋３、ＨＣＴ１１６＋３＋５及びＧ５の各細胞のクローン原性生存率である。（２Ｄ）１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンの存在下及び不在下で培養し、オキサリプラチンによる処理も施したＧ１、Ｇ２及びＧ５細胞のクローン原性生存率である。（２Ｅ）Ｓ期集団で減少がみられ、（２Ｆ）ＨＣＴ１１６＋３＋５細胞及びＧ１細胞のサブＧ１期集団で増加がみられ、（２Ｇ）無処理コントロールと比べＢｒｄＵの相対的取込みが減少し、（２Ｈ）ＨＣＴ１１６＋３＋５細胞及びＧ５細胞の免疫蛍光において、抗活性カスパーゼ−３陽性細胞の増加がみられる。データは、個別に３回以上行った試験から得た平均値±平均値の標準誤差（ＳＥ）で示す。統計的差異は、両側スチューデントｔ検定により測定した。アスタリスク「＊」、「＊＊」及び「＊＊＊」は、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１を表す。ＮＳはｐ＝０．０５以上を示す。３種類のＭＳＨ３欠損クローンの１種から得た代表データをこの図に示す。
【図３】ｓｉＲＮＡによりＭＳＨ３が一時的に枯渇することによっても、ＨＣＴ１１６＋３＋５細胞がシスプラチン及びオキサリプラチンに対して感作されることを示す図である。（３Ａ）ｓｉＲＮＡを一時的にトランスフェクトしたことによりＭＳＨ３が枯渇したＨＣＴ１１６＋３＋５細胞におけるＭＳＨ３及びβ−アクチンのウエスタンブロット分析である。非標的化（コントロール）ｓｉＲＮＡ及びＭＳＨ３ｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトした後に、（３Ｂ）シスプラチン処理した、及び（３Ｃ）オキサリプラチン処理したＨＣＴ１１６＋３＋５細胞株におけるクローン原性生存率を比較した。（３Ｄ）非標的化ｓｉＲＮＡ及びＭＳＨ３ｓｉＲＮＡで処理したＨＴ２９細胞におけるＭＳＨ３及びβ−アクチンのウエスタンブロット分析である。ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションの７２時間後に細胞を抽出した。コントロールｓｉＲＮＡ及びＭＳＨ３ｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトした後に、（３Ｅ）シスプラチン処理した、及び（３Ｆ）オキサリプラチン処理したＨＴ２９細胞のクローン原性生存率を比較した。データは、個別に５回行った実験の平均値±ＳＥで表す。統計的差異は、両側スチューデントｔ検定により測定した。アスタリスク「＊」及び「＊＊」は、それぞれｐ＜０．０５、及びｐ＜０．０１を表す。ＮＳはｐ≧０．０５を表す。
【図４】ｓｉＲＮＡによりＭＬＨ１を一時的に枯渇させても、シスプラチン及びオキサリプラチンに対するＭＳＨ３プロフィシェント細胞及びＭＳＨ３欠損細胞の耐性には影響しなかったことを示す図である。（４Ａ）ｓｉＲＮＡを一時的にトランスフェクトした後、ＭＬＨ１が枯渇したＨＣＴ１１６＋３＋５細胞及びＧ５細胞におけるＭＬＨ１及びβ−１アクチンのウエスタンブロット分析である。（４Ｂ）コントロールｓｉＲＮＡ又はＭＬＨ１ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした後、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで処理したＨＣＴ１１６＋３＋５細胞及びＧ５細胞におけるクローン原性生存率である。（４Ｃ）シスプラチン処理した、及び（４Ｄ）オキサリプラチン処理したＭＬＨ１が枯渇したＨＣＴ１１６＋３＋５細胞及びＧ５細胞におけるクローン原性生存率の比較である。データは、個別に４回以上行った実験の平均値±ＳＥで表す。統計的差異は、両側スチューデントｔ検定により測定した。アスタリスク「＊」及び「＊＊」は、それぞれｐ＜０．０５、及びｐ＜０．０１を表す。ＮＳはｐ≧０．０５を表す。
【図５】ＭＳＨ３欠損細胞では、ＤＮＡ二本鎖切断修復の効率が低下していることを示す図である。（５Ａ）ドキシサイクリン処理したＨＣＴ１１６＋３＋５細胞及びＧ５細胞と、ドキシサイクリン未処理のＧ５細胞とを免疫蛍光染色し、ｐＨ２ＡＸ増殖巣の形成を調べた。５μＭのオキサリプラチンで細胞を６時間処理し、所定時間後に免疫蛍光法で分析した。上パネル；ＤＡＰＩ、下パネル：ｐＨ２ＡＸ、（５Ｂ）ＭＳＨ３欠損細胞におけるｐＨ２ＡＸ陽性細胞の減少効率は低かった。（５Ｃ）ドキシサイクリン処理Ｇ５細胞及びドキシサイクリン未処理Ｇ５細胞を免疫蛍光し、５３ＢＰＩ増殖巣の形成を調べた。５μＭのオキサリプラチンで細胞を６時間処理し、４８時間後に免疫蛍光法で分析した。（５Ｄ）各スライドについて少なくとも１００個の細胞をカウントした。データは、個別に３回又は４回行った実験から得た平均値±ＳＥを示す。ＭＳＨ３欠損Ｇ５細胞とＭＳＨ３プロフィシェントＧ５細胞との間の統計的差異は、両側スチューデントｔ検定により測定した。アスタリスク「＊」及び「＊＊＊」は、それぞれｐ＜０．０５、及びｐ＜０．００１を表す。
【図６】ＭＳＨ３欠損細胞が、ＰＡＲＰ阻害剤であるオラパリブ、及びそのオキサリプラチンとの組合せに対して感受性を有することを示す図である。（６Ａ）２μＭのオキサリプラチン、２μＭのオラパリブ、及びこれら２種の薬剤の組合せでそれぞれ処理した、ドキシサイクリン未処理のＨＣＴ１１６＋３＋５細胞及びＧ５細胞と、ドキシサイクリン処理Ｇ５細胞のクローン原性生存率である。（６Ｂ）１μＭのオキサリプラチン、２μＭのオラパリブ、及びこれら２種の薬剤の組合せでそれぞれ処理したＨＴ２９細胞のクローン原性生存率である。データは、個別に３回以上行った実験から得た平均値±ＳＥを示す。統計的差異は、両側スチューデントｔ検定により測定した。アスタリスク「＊」、「＊＊」及び「＊＊＊」は、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の様々な実施形態の作製及び使用を以下で詳細に説明するが、本発明は、広範な特定状況下で具現化され得る多くの適用可能な発明概念を提供することを認識されたい。本明細書に記載される特定の実施形態は、単に本発明を作製及び使用するための特定の手法の例示であり、本発明の範囲を定めるものではない。
【００３１】
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。本明細書中で定義される用語は、本発明に関する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「この（ｔｈｅ）」などの用語は、単一の存在物のみを称することを意図するものではなく、説明のために具体例を使用する場合の一般的な種類を含む。本明細書中の専門用語は、本発明の具体的な実施形態を記述するために使用されるが、これらの用語の使用は、特許請求の範囲に概説されている場合を除き本発明の範囲を定めるものではない。
【００３２】
本明細書で使用する省略形としては、ＭＭＲ、ミスマッチ修復；ＭＳＩ、マイクロサテライト不安定性；ＣＲＣ、結腸直腸癌；ＭｅＧ、Ｏ６−メチルグアニン；ＩＣＬｓ、鎖間架橋；ＮＥＲ、ヌクレオチド除去修復；ＨＲ、相同組換え；ＲＡＲＰ、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ；ＥＭＡＳＴ、テトラヌクレオチド反復におけるマイクロサテライトの変化の増加；ＤＳＢ、二本鎖切断；ＢｒｄＵ、ブロモデオキシウリジン；ｐＨ２ＡＸ、リン酸化Ｈ２ＡＸなどがある。
【００３３】
本明細書中、「結腸直腸癌」という用語には、結腸直腸癌を、小腸下方の腸管（すなわち、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ状結腸及び直腸を含む大腸（結腸））の細胞の癌により特徴付けられる病状であると定義する、広く認められた医学的定義が含まれる。さらに、本明細書で用いる「結腸直腸癌」という用語にはさらに、十二指腸及び小腸（空腸及び回腸）の細胞の癌により特徴付けられる病状も含まれる。
【００３４】
「組織試料」（用語「組織」は「組織試料」と同じ意味で使用される）という用語には、個別の細胞、又はマトリックスと複合する若しくは化学物質と会合する細胞のいずれであってもよいが、１又は２以上の細胞で構成される任意の物質が含まれると理解すべきである。この定義には、任意の生物学的物質又は有機物質、並びに任意の細胞サブポーション、それらの産物又は副産物が含まれるものとする。「組織試料」という定義には、精子、卵子、胚及び血液成分を限定されることなく含まれると理解すべきである。また、本発明の趣旨における「組織」という定義には、細胞起源であるが、もはや「細胞」とは特徴付けられない皮膚の皮層などの定義された無細胞構造体も含まれる。本明細書中で用いる「便（stool）」という用語は、ヒトが排泄する糞便に関する臨床用語である。
【００３５】
本明細書中、「遺伝子」という用語は、機能性のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードする単位のことを指す。当業者には理解されるが、かかる機能用語には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、又はそれらの断片若しくは組合せ、並びに人為的に改変されたものも含む遺伝子産物が含まれる。これらのものが、通常みられる少なくとも１つの夾雑核酸若しくは夾雑タンパク質から同定又は分離された場合に、精製された遺伝子、核酸、タンパク質等の用語を使用する。  「対立遺伝子（allele）」又は「対立遺伝子形態（allelic form）」という用語は、同じ機能性タンパク質をコードするが、同じ遺伝子の別の形態に対するヌクレオチド配列に違いがある遺伝子の改変型のことを指す。
【００３６】
本明細書中、「核酸」又は「核酸分子」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）若しくはリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作製された断片、並びに連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより作製された断片などのポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然ヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡ等）の単量体、天然ヌクレオチドのアナログ（例：天然ヌクレオチドのα−鏡像異性体）、又は両者の組合せから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分に、及び／又はピリミジン塩基若しくはプリン塩基部分に改変を有し得る。糖修飾には、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミン、及びアジド基による１又は２以上のヒドロキシル基の置換が含まれ、或いはエーテル又はエステルとして糖に官能性をもたせることができる。さらに、糖部分全体を、アザ糖および炭素環式糖類似体などの、立体的および電子的に類似の構造体と置換することができる。塩基部分の修飾の例には、アルキル化プリン及びアルキル化ピリミジン、アシル化プリン若しくはアシル化ピリミジン、或いはその他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合、またはそのような結合の類似結合によって結合され得る。ホスホジエステル結合の類似結合には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート（phosphoroselenoate）、ホスホロジセレノエート（phosphorodiselenoate）、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）、ホスホラニリデート（phosphoranilidate）、ホスホロアミダートなどが含まれる。「核酸分子」という用語には、ポリアミド骨格に結合した天然または修飾核酸塩基を含む、いわゆる「ペプチド核酸」もまた含まれる。核酸は一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。
【００３７】
本明細書中、「ハイブリダイゼーション」という用語は、２つの１本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合的に結合して、安定な二本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスをいう。三本鎖ハイブリダイゼーションも理論上可能である。生じる（通常）二本鎖ポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」である。安定なハイブリッドを形成するポリヌクレオチド集団の割合は、本明細書において「ハイブリダイゼーションの程度」といわれる。通常、ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下、例えば、塩濃度が１Ｍ以下及び温度が最低２５℃という条件下で行われる。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）及び温度２５〜３０℃の条件が、対立遺伝子特異的なプローブハイブリダイゼーションに適している。ストリンジェントな条件については、例えば、その全文を本明細書に参照として組み込むSambrook, Fritscheand Maniatis. “Molecular Cloning A laboratory Manual” 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)を参照されたい。
【００３８】
本明細書中、「ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）」という用語は、元々の環状ＤＮＡの配列と相補的な配列の１又は２以上のコピーを含む核酸の鎖を得るためのＤＮＡ複製及び増幅方法のことをいう。この増幅（相補的複製の作製）方法には、オリゴヌクレオチドプライマーを標的環状ＤＮＡとハイブリダイズさせることと、等温サイクリングを行う（例えば、リガーゼ及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で）こととが含まれる。ＲＣＡを用いる増幅法を１ラウンド行うことにより環状標的の配列が多数増幅され、核酸の一本鎖上に所望のオリゴヌクレオチドが高濃度で得られる。混合物中、所望の核酸配列が優勢配列となるので（濃度において）、「ＲＣＡ増幅」であるといわれる。ＲＣＡを用いると、特定の核酸配列の１個のコピーをいくつかの異なる方法（例えば、標識プローブを用いるハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーを取り込み、アビジン酵素コンジュゲートで検出する方法；ｄＣＴＰ又はｄＡＴＰ等の３２Ｐ標識化デオキシヌクレオチド三リン酸を増幅セグメントに取り込む方法）で検出できる程度にまで増幅させることが可能である。
【００３９】
本明細書中、「抗体プローブ」という用語は、標的抗原に特異的で、標的抗原に結合する抗体を指す。かかる標的抗原は、ペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体が特異的に結合するその他の生体高分子であり得る。
【００４０】
本明細書中、数々の実施形態で使用される「バイオマーカー」という用語は、疾患の進行又は治療の効果の診断及び測定に有用となるような特別の分子特徴を備える特定の体内生化学物質を指す。例えば、ヒト呼気中の一般的な代謝産物若しくはバイオマーカー、及びかかる代謝産物を提供するヒトのそれぞれの診断状態としては、アセトアルデヒド（起源：エタノール、Ｘ−トレオニン；診断：中毒症）、アセトン（起源：アセトアセテート、診断：食事／糖尿病）、アンモニア（起源：アミノ酸の脱アミノ化、診断：尿毒症及び肝疾患）、ＣＯ（一酸化炭素）（起源：ＣＨ２Ｃｌ２、ＣＯＨｂ割合の増加、診断：室内空気汚染）、クロロホルム（起源：ハロゲン化化合物）、ジクロロベンゼン（起源：ハロゲン化化合物）、ジエチルアミン（起源：コリン、診断：腸管細菌の過増殖）、Ｈ（水素）（起源：腸、診断：乳糖不耐症）、イソプレン（起源：脂肪酸、診断：代謝ストレス）、メタンチオール（起源：メチオニン、診断：腸管細菌の過増殖）、メチルエチルケトン（起源：脂肪酸、診断：室内空気汚染／食事）、Ｏ−トルイジン（起源：癌腫代謝物、診断：気管支原性癌腫）、ペンタンスルフィド及びスルフィド（起源：脂質過酸化、診断：心筋梗塞）、Ｈ２Ｓ（起源：代謝、診断：歯周病／排卵）、ＭｅＳ（起源：代謝、診断：肝硬変）、Ｍｅ２Ｓ（起源：感染症、診断：塹壕口内炎）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００４１】
本明細書中、「免疫組織化学（ＩＨＣ：immunohistochemistry）」という用語は、細胞に適用する場合は「免疫細胞化学（ＩＣＣ：immunocytochemistry）」としても知られ、診断病理学のツールを指し、モノクローナル抗体のパネルを未分化腫瘍の鑑別診断に用い（例えば、リンパ腫、細胞腫（carcinoma）及び肉腫を識別する）、特定の腫瘍型及び他の疾患に特異的なマーカーを突き止め、悪性リンパ腫の診断及び表現型分類を行い、ウイルス抗原、腫瘍性タンパク質、ホルモン受容体及び増殖関連核タンパク質の存在を明らかにする。
【００４２】
本明細書中、「臨床試験（clinical trial）」という用語には、特定の治療に対しする応答性に関する臨床データを収集することを目的とする調査研究が含まれ、第Ｉ相臨床試験、第II相臨床試験、及び第III相臨床試験が含まれるが、これらに限定されない。患者集団を定義し、被験者を登録するのは標準的な方法によって行う。
【００４３】
研究するグループ間における「統計的に有意な」違いという用語は、適切な統計分析法（例：カイ二乗検定（Chi-square test）、ｔ−検定）を用いたときに、グループ間で同じ確率（probability）となるのが５％未満、すなわちｐ＜０．０５である状態に関するものである。言い換えれば、完全にランダムな状況において同じ結果を得る確率が、１００回試行して５回未満であるということである。
【００４４】
本明細書中、「候補薬剤」という用語は、本発明の方法により、ＭＳＨ３発現が低下した結腸直腸細胞の数を減少させる活性のスクリーニングに適したあらゆる起源の化合物を指す。
【００４５】
本明細書中、「遺伝毒性剤（genotoxicagent）」という用語の定義には、ヒトのＤＮＡ又は遺伝子を損傷させる能力を有する化学的作用物質（agent）及び物理的作用物質の両方が含まれる。発癌物質及び変異原は、化学的遺伝毒性剤の一般的な例であり、紫外線（ＵＶ）照射、γ線、Ｘ線などは、ＤＮＡ酸化産物を産み出す場合に物理的遺伝毒性剤の一般例となる。
【００４６】
本明細書中、「抗腫瘍剤」という用語は、ヒト等の哺乳動物において新生物（neoplasm）の発生又は進行を阻害するという機能的特徴を有する作用物質を指し、転移又は転移能を阻害することも指す。
【００４７】
本明細書中、「キット」又は「試験キット」という用語は、分析に必要な試薬とアジュバントとの組合せを意味する。殆どの場合、試験キットはいくつかのユニットで構成されるが、１種類の分析エレメント（one-piece analysis element）としても可能であり、それも同様に試験キットとみなされる。
【００４８】
ＭＳＨ３遺伝子（アクセッション番号Ｐ２０５８５）は、ＭＭＲ欠損癌でしばしば生じる体細胞変異を受けたＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子の１種である。ＭＳＨ３は、ＭＳＨ２と一緒になってＭｕtＳβヘテロ二本鎖を形成し、シスプラチン及びソラレン等の薬剤に誘導された鎖間架橋（ＩＣＬ）と相互作用する。しかし、ＩＣＬ誘導剤の細胞毒性効果を仲介するにあたってのＭＳＨ３の正確な役割は依然としてよく理解されていない。本発明らは本明細書において、ＭＳＨ３欠損が、シスプラチン及び別のＩＣＬ誘導性プラチナ薬剤であるオキサリプラチンがもたらす細胞毒性に対するＭＳＨ３欠損による効果を示す。
【００４９】
ｓｈＲＮＡ発現によってＭＳＨ３発現が制御されている同系ＨＣＴ１１６由来クローンをtet-offシステムで使用したところ、ＭＳＨ３が欠損することによって臨床関連用量のシスプラチン及びオキサリプラチンの両方に対して細胞が感作されたことが見いだされた。興味深いことに、かかる薬剤のＭＳＨ３依存性毒性は、ｓｉＲＮＡに誘導されたＭＬＨ１タンパク質のダウンレギュレーションの影響を受けなかったことから、この方法は基準ＭＭＲ経路の関与を必要としないことが示唆される。
【００５０】
さらに、ＭＳＨ３欠損細胞では、ＭＳＨ３プロフィシェント細胞に比べ、オキサリプラチンによる処理後もリン酸化Ｈ２ＡＸ及びリン酸化５３ＢＰ１が高レベルで維持され、ＭＳＨ３が、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復に重要な役割を果たしていることが示唆される。かかるＭＳＨ３の役割は、ＭＳＨ３欠損細胞がポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ阻害剤であるオラパリブに対して感受性を有するという本明細書における知見により更に裏付けられた。また、オキサリプラチンとオラパリブを組み合わせると、それぞれ単独による処理の場合に比べ、相乗効果が得られた。以上の結果から、ＭＳＨ３の欠損が、ＤＳＢの修復欠損をとおしてプラチナ薬剤の細胞毒性に貢献していることが示される。これらのデータから、ＭＳＨ３欠損を伴う癌の効果的な予測及び治療が可能になる。
【００５１】
本発明の知見は、予後の評価及び／又は化学療法に対する癌の応答性の予測に有用な遺伝子（ＭＳＨ３を含む）及び遺伝子セットに関する従来の知見からの顕著、かつ、新規な発展を表すものである。Baker et al.が出願した米国特許出願公開公報第２００９０３０５２７７号は、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの測定に基づいてヒト患者が癌と診断される可能性を予測する方法を記載しているが、これは本発明とは逆で、ＭＳＨ３を含む特定の遺伝子の発現の亢進が化学療法に正の応答性を示す可能性の増加と正に相関していることを示すというものである。しかし、Baker et al.の出願には細胞又は組織に関するデータは皆無であり、むしろ、一般的な遺伝子マイニングアプローチを採用してその結論に到達している。
【００５２】
ＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）系は、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＳＨ３、ＰＭＳ２等のいくつかのタンパク質で構成され、複製エラーを除去し、ゲノム安定性を維持する。ＭＳＨ２／ＭＳＨ６へテロ二量体ＭｕｔＳαは、単独の塩基ミスマッチを認識するが、ＭＳＨ２／ＭＳＨ３へテロ二量体ＭｕｔＳβは、２〜４ｂｐの挿入−欠失ループを主として認識する（Kunkel, T. A., and Erie, D. A. (2005) Annu. Rev. Biochem. 74, 681-710；Jiricny, J. (2006) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 335-346）。ＭｕｔＬ複合体、主にＭＬＨ１／ＰＭＳ２へテロ二量体ＭｕｔＬαは、複製時にＤＮＡミスマッチと結合するＭｕｔＳへテロ二量体との三重複合体を形成し、他のタンパク質を動員してＤＮＡＭＭＲのプロセスを完成させる。ＭＭＲ遺伝子に生殖細胞変異が生じると、結腸、子宮内膜、卵巣及び尿路においてマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を伴う癌に対する遺伝的素因により特徴付けられるリンチ症候群が生じる（Hendriks, Y. M., de Jong, A. E., Morreau, H., Tops, C. M., Vasen, H. F., Wijnen, J. T., Breuning, M. H., and Brocker-Vriends, A. H. (2006) CA Cancer J. Clin. 56, 213-225；Boland, C. R., and Goel, A. (2010) Gastroenterology 138, 2073-2087 e2073）。他方、ＭＬＨ１プロモーターのメチル化に起因するＭＭＲ欠損により、結腸直腸癌（ＣＲＣ）（〜１５％）、子宮内膜癌（２０〜２５％）及び卵巣癌（〜１２％）を含む孤発性ＭＳＩ腫瘍が生じる（Boland, C. R., and Goel, A. (2010) Gastroenterology 138, 2073-2087 e2073；Black, D., Soslow, R. A., Levine, D. A., Tornos, C., Chen, S. C., Hummer, A. J., Bogomolniy, F., Olvera, N., Barakat, R. R., and Boyd, J. (2006) J. Clin. Oncol. 24, 1745-1753；Pal, T., Permuth-Wey, J., Kumar, A., and Sellers, T. A. (2008) Clin. Cancer Res. 14, 6847-6854）。
【００５３】
ＭＭＲ系は、アルキル化剤及び６−チオグアニン等のＤＮＡ損傷剤によって産生する特定のＤＮＡ付加物の修復にも関与している。アルキル化剤によって産生される主な細胞障害性領域は、Ｏ６−メチルグアニン（ＭｅＧ）であり、これにより、ＭｅＧ−Ｃ又はＭｅＧ−Ｔミスペアが生じる（Duckett, D. R., Drummond, J. T., Murchie, A. I., Reardon, J. T., Sancar, A., Lilley, D. M., and Modrich, P. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 6443-6447）。ＭｕｔＳαは、これらのミスペアを認識し、その後の修復反応のためにＭｕｔＬαを動員する（de Wind, N., Dekker, M., Claij, N., Jansen, L., van Klink, Y., Radman, M., Riggins, G., van der Valk, M., van'tWout, K., and te Riele, H. (1999) Nat. Genet. 23, 359-362；Abuin, A., Zhang, H., and Bradley, A. (2000) Mol. Cell. Biol. 20, 149-157）。ＭｕｔＳα又はＭｕｔＬαが欠損すると、前記薬剤の細胞毒性効果に対して細胞が寛容性をもつことになり、前記２種類の複合体もまた、細胞増殖停止又は細胞死をもたらすシグナル誘導経路と関連していることが示唆される（Koi, M., Umar, A., Chauhan, D. P., Cherian, S. P., Carethers, J. M., Kunkel, T. A., and Boland, C. R. (1994) Cancer Res. 54, 4308-4312；Hawn, M. T., Umar, A., Carethers, J. M., Marra, G., Kunkel, T. A., Boland, C. R., and Koi, M. (1995) Cancer Res. 55, 3721-3725）。
【００５４】
他方、ＭｕｔＳβは、ソラレン及びシスプラチン等のＤＮＡ架橋剤によって産生する鎖間架橋（ＩＣＬ）を認識する。ＭｕｔＳβは、哺乳動物細胞抽出物におけるソラレン誘導ＩＣＬの認識及び脱共役に関与している（Zhang, N., Lu, X., Zhang, X., Peterson, C. A., and Legerski, R. J. (2002) Mol. Cell. Biol. 22, 2388-2397）。最近、ＭｕｔＳβが、いずれもヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）に関与するＸＰＡ−ＲＰＡ又はＸＰＣ−ＲＡＤ２３ＢとソラレンＩＣＬ認識において相互作用し、ＮＥＲプロセスを促進することが示された（Zhao, J., Jain, A., Iyer, R. R., Modrich, P. L., and Vasquez, K. M. (2009) Nucleic Acids Res. 37, 4420-4429；Vasquez, K. M. (2010) Environ. Mol. Mutagen 51, 527-539）。ＩＣＬを修復する相同組換え（ＨＲ）の程度もまた、ＭｕｔＳα又はＭＬＨ１にではなく、ＭｕｔＳβに依存する。これらの結果から、ＭｕｔＳβが、ソラレン誘導ＩＣＬの修復においてＮＥＲタンパク質、ＨＲタンパク質及びファンコニ貧血タンパク質と協同することが示唆される（Zhang, N., Liu, X., Li, L., and Legerski, R. (2007) DNA Repair (Amst) 6, 1670-1678）。また、ＭｕｔＳβは、ＰＡＲＰ−１、ＤＮＡリガーゼIII、ＸＲＣＣ−１、Ｋｕ８０及びＫｕ７０と共にシスプラチン誘導ＩＣＬにも結合し、ＭｕｔＳβが、他の修復経路とも協同して、プラチナ薬剤誘導ＩＣＬを認識し、修復することが示唆される（Zhu, G., and Lippard, S. J. (2009) Biochemistry 48, 4916-4925）。
【００５５】
第三世代のプラチナ薬剤であるオキサリプラチンは、ＣＲＣ患者の治療に現在使用されている重要薬剤（key drug）の１つである。シスプラチン同様、オキサリプラチンもまた鎖間架橋及びＩＣＬを形成する（Chaney, S. G., Campbell, S. L., Bassett, E., and Wu, Y. (2005) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 53, 3-11）。しかし、オキサリプラチン誘導付加物、特にＩＣＬの修復及び細胞毒性効果に関与する詳細な分子機構は未だ幅広く調査されていない。
【００５６】
ＭｕｔＳβ複合体がＩＣＬ修復に役割を担っている点を考慮し、本発明者らは、ＭＳＨ３欠損が、プラチナ薬剤に誘導されるＩＣＬの修復を中断させ、癌患者におけるこれら薬剤の細胞毒性が強化することを認識した。さらに、ＭＳＨ３欠損によりＨＲが抑制され（Zhang, N., Liu, X., Li, L., and Legerski, R. (2007) DNA Repair (Amst) 6, 1670-1678）、ＨＲ欠損細胞がポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤に高感受性であることから（Bryant, H. E., Schultz, N., Thomas, H. D., Parker, K. M., Flower, D., Lopez, E., Kyle, S., Meuth, M., Curtin, N. J., and Helleday, T. (2005) Nature 434, 913-917；Farmer, H., McCabe, N., Lord, C. J., Tutt, A. N., Johnson, D. A., Richardson, T. B., Santarosa, M., Dillon, K. J., Hickson, I., Knights, C., Martin, N. M., Jackson, S. P., Smith, G. C., and Ashworth, A. (2005) Nature 434, 917-921）、本発明者らはさらに、ＭＳＨ３が欠損すると、細胞がＰＡＲＰ阻害剤に対して感作されることを認識した。ＭＳＩＣＲＣにおいては、ＭＳＨ３のエクソン７におけるモノヌクレオチド［Ａ］８リピート内でフレームシフト変異が頻繁に生じる（２０〜５０％）結果、ＭＳＨ３の欠失又は減少が生じる（Plaschke, J., Kruger, S., Jeske, B., Theissig, F., Kreuz, F. R., Pistorius, S., Saeger, H. D., Iaccarino, I., Marra, G., and Schackert, H. K. (2004) Cancer Res. 64, 864-870；Miquel, C., Jacob, S., Grandjouan, S., Aime, A., Viguier, J., Sabourin, J. C., Sarasin, A., Duval, A., and Praz, F. (2007) Oncogene 26, 5919-5926；Hewish, M., Lord, C. J., Martin, S. A., Cunningham, D., and Ashworth, A. (2010) Nat. Rev. Clin. Oncol. 7, 197-208）。本発明者らは最近、低レベルのＭＳＩ及び／又はテトラヌクレオチド反復（ＥＭＡＳＴ）におけるマイクロサテライトの変化の増加を呈する孤発性ＣＲＣ組織に、ＭＳＨ３陰性癌細胞集団が存在していることを見いだした（Haugen, A. C., Goel, A., Yamada, K., Marra, G., Nguyen, T. P., Nagasaka, T., Kanazawa, S., Koike, J., Kikuchi, Y., Zhong, X., Arita, M., Shibuya, K., Oshimura, M., Hemmi, H., Boland, C. R., and Koi, M. (2008) Cancer Res. 68, 8465-8472）。もしもＭＳＨ３欠損が、臨床現場においてプラチナ薬剤及びＰＡＲＰ阻害剤の毒性に影響を与えるのであれば、ＭＳＨ３の状態を、ＭＳＨ３欠損癌の患者における化学療法の成果に対する予測マーカーとして使用することができる。ＭＳＨ３欠損癌の患者における化学療法の成果に対する予測マーカーとしてＭＳＨ３の状態を使用できることを示すため、本発明者らは、ｓｈＲＮＡの発現を介してＭＳＨ３タンパク質の発現を調節できる同系細胞株をtet-offシステムで使用し、２種類のプラチナ薬剤及び周知のＰＡＲＰ阻害剤に対する細胞の感受性に及ぼすＭＳＨ３欠損の効果を調べた。これらの研究により、ＣＲＣ細胞株におけるＭＳＨ３欠損が、特に、二本鎖切断（ＤＳＢ）修復機能が低下する結果として、プラチナ薬剤の毒性に寄与するという新たな分子的証拠が明らかにされた。
【００５７】
試薬−  シスプラチン、オキサリプラチン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）及びヨウ化プロピジウムは、Sigma-Aldrich社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。ＰＡＲＰ阻害剤のオラパリブは、Selleck Chemicals社（テキサス州ヒューストン）から購入した。
【００５８】
細胞株及び細胞培養−  ヒト結腸癌細胞株のＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１１６＋ｃｈ．３（ＨＣＴ１１６＋３）、ＨＣＴ１１６＋ｃｈ．３＋ｃｈ．５（ＨＣＴ１１６＋３＋５）については文献に記載されている（Koi, M., Umar, A., Chauhan, D. P., Cherian, S. P., Carethers, J. M., Kunkel, T. A., and Boland, C. R. (1994) Cancer Res. 54, 4308-4312；Haugen, A. C., Goel, A., Yamada, K., Marra, G., Nguyen, T. P., Nagasaka, T., Kanazawa, S., Koike, J., Kikuchi, Y., Zhong, X., Arita, M., Shibuya, K., Oshimura, M., Hemmi, H., Boland, C. R., and Koi, M. (2008) Cancer Res. 68, 8465-8472）。ＭＳＨ３に対するｓｈＲＮＡをコードするテトラサイクリン調節型レトロウイルスベクターであるＴＭＰ（Open Biosystems社，アラバマ州ハンツビル）を、ＨＣＴ１１６＋３＋５細胞に安定的にトランスフェクトさせた。安定的なＭＳＨ３欠損クローンＧ１、Ｇ２及びＧ５を単離した（結果及びHaugen, A. C., Goel, A., Yamada, K., Marra, G., Nguyen, T. P., Nagasaka, T., Kanazawa, S., Koike, J., Kikuchi, Y., Zhong, X., Arita, M., Shibuya, K., Oshimura, M., Hemmi, H., Boland, C. R., and Koi, M. (2008) Cancer Res. 68, 8465-8472を参照のこと）。１０％ウシ胎仔血清を添加したＩＭＤＭ（Invitrogen社、メリーランド州ロックビル）中でＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１１６＋３、ＨＣＴ１１６＋３＋５細胞を培養した。１０％ウシ胎仔血清及び０．６μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加したＩＭＤＭ中でＧ１、Ｇ２及びＧ５細胞を維持した。１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを培養培地に加えることにより、ＭＳＨ３ ｓｈＲＮＡの発現を停止させた。
【００５９】
ウエスタンブロット分析−  文献記載の手法により（Vaisman, A., Varchenko, M., Umar, A., Kunkel, T. A., Risinger, J. I., Barrett, J. C., Hamilton, T. C., and Chaney, S. G. (1998) Cancer Res. 58, 3579-3585）、細胞溶解物からタンパク質を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。特異的タンパク質を検出するための一次抗体として、抗ｈＭＳＨ３マウスモノクローナル抗体（希釈倍率；１：２５０、クローン５２、BD Pharmingen社、カリフォルニア州サンノゼ）、抗ｈＭＬＨ１マウスモノクローナル抗体（１：２００、Ｇ１６８−７２８、BD Pharmingen社）、及び抗β−アクチン抗体（１：１００００、クローンＡＣ−１５、Sigma-Aldrich社）を用いた。二次抗体として、ヤギ抗マウス抗体（１：３０００、ｓｃ−２００５、Santa Cruz Biotechnology社、カリフォルニア州サンタクルーズ）を用いた。シグナルの増幅及び検出は、前記膜をＥＣＬ試薬（GE Healthcare社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に暴露し、Stormイメージングシステム（Amersham社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で視覚化することにより行った。
【００６０】
クローン原性生存率−  ６ウエルプレートの各ウエルに２００個の細胞を播種した。シスプラチン又はオキサリプラチンにより生じた細胞毒性を測定するため、プレートに細胞が付着した後に前記薬剤で２４時間細胞を処理した。オラパリブによる細胞毒性の測定には、この薬剤で細胞を実験の間中、継続的に処理した。８〜１０日後、コロニー（５０個を超える（＞５０）細胞を有するコロニー）の数を数え、無処理細胞に対する薬剤処理細胞のクローン原性生存率の相対的変化を求めた。
【００６１】
細胞周期分析−  １０ｃｍプレートに１００万個の細胞を播種した。細胞が付着した後に、この細胞株をオキサリプラチンで２４時間処理した。それから更に４８時間経過後、冷温ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、一晩又は数日間、７０％冷エタノールに−２０℃で固定した。次にエタノールで固定した細胞（２×１０６）をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ３００μｌ及び０．１５％ＲＮaseＡの共存下において１５分間３７℃でインキュベーションした。これらの細胞を７５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで３０分間染色し、FACSCantoIIフローサイトメトリー（BD Bioscineces社、カリフォルニア州サンノゼ）を用いてＤＮＡ含有量について分析した。Flowjoソフトウエアを用いて細胞周期データを分析した（Tree Star社、オレゴン州アッシュランド）。
【００６２】
増殖アッセイ−  ２４時間にわたる最初のシスプラチン又はオキサリプラチン処理の４８時間後に、ＨＣＴ１１６＋３＋５細胞及びＧ５細胞へのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取込量に基づいて増殖指数を測定した（Cell Proliferation ELISA, BrdU, Roche Diagnositics、インディアナ州インディアナポリス）。実験は３回行い、個別に行った３回又は４回の実験からデータを得た。
【００６３】
ｓｉＲＮＡ処理−  ＭＬＨ１ ｓｉＲＮＡ、ＭＳＨ３ｓｉＲＮＡ及び非標的化ｓｉＲＮＡは、Dharmacon社（コロラド州ラファイエット）から購入した。２４ウエルプレートに２００,０００個の細胞を播種した。一晩インキュベーションした後、リポフェクタミン２０００（Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバッド）を製造者指示書に基づいて使用し、これらの細胞に８３ｎＭの標的化ｓｉＲＮＡ又は非標的化ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を回収し、クローン原性生存アッセイに供するために再プレーティングした。
【００６４】
免疫蛍光染色−  １２ウエルプレート中、カバーガラス上で１０,０００個の細胞を培養した。細胞は、ＰＢＳ中、４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．５）で１５分間固定し、０．３％トリトンＸ−１００で５分間、透過処理し、１０％ヤギ血清（Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバッド）で１時間ブロッキングした。次に、これら細胞を、抗活性カスパーゼ３抗体（１：５００、Ｇ７４８、Promega社、ウイスコンシン州マディソン）、抗リン酸化Ｈ２ＡＸ（ｐＨ２ＡＸ）抗体（１：５０００、ＪＢＷ３０１、Millipore Corporation社、マサチューセッツ州ビレリカ）、又は抗５３ＢＰ１抗体（１：６００、ａｂ２１０８３、Abcam社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）の共存下で１時間インキュベーションし、次いで二次抗体（１：８００、Alexa Fluor 555ヤギ抗マウス抗体又は抗ウサギ抗体、Invitrogen社）の共存下で４０分間インキュベーションした。ＤＡＰＩ（Invitrogen社）を含むProlong Goldを培地にマウントした。画像は、AxioVisionソフトウエア（Carl Zeiss社、ニューヨーク州ソーンウッド）を備えたAxioSkop2マルチチャンネル落射蛍光顕微鏡を用いて得た。
【００６５】
ＭＳＨ３欠損クローンにおいて、ＭＳＨ３の発現はドキシサイクリンによって制御されている。本発明者らは、まず、ＨＣＴ１１６ＣＲＣ細胞のＧ１、Ｇ２及びＧ５細胞クローンにおけるＭＳＨ３発現がドキシサイクリンに制御されているか否かを調べた。ＨＣＴ１１６細胞及びＨＣＴ１１６＋３細胞をＭＳＨ３発現に関するネガティブコントロールとして、また、ＨＣＴ１１６＋３＋５細胞をポジティブコントロールとして用いた。ＨＣＴ１１６細胞及びＨＣＴ１１６＋３細胞ではＭＳＨ３タンパク質の検出可能な発現が示されなかったが（図１Ａ）、これは、ＭＳＨ３のエクソン７のモノヌクレオチド反復におけるホモ接合型フレームシフト変異を有するＨＣＴ１１６細胞の場合と一致している（Haugen, A. C., Goel, A., Yamada, K., Marra, G., Nguyen, T. P., Nagasaka, T., Kanazawa, S., Koike, J., Kikuchi, Y., Zhong, X., Arita, M., Shibuya, K., Oshimura, M., Hemmi, H., Boland, C. R., and Koi, M. (2008) Cancer Res. 68, 8465-8472）。
【００６６】
ＭＳＨ３欠損ＨＣＴ１１６＋３の５番染色体のコピーを移動させることにより作製したＨＣＴ１１６＋３＋５ではＭＳＨ３が発現していた。ドキシサイクリン不在下ではＧ１、Ｇ２及びＧ５クローンにおいてＭＳＨ３は検出されなかったものの、ドキシサイクリンの添加により、これらクローンの全てにおいて、親ＨＣＴ１１６＋３＋５の約４０〜６０％程度のレベルのＭＳＨ３発現が復活した（図１Ａ及び１Ｂ）。これらの細胞株においてＭＳＨ３ ｓｈＲＮＡの産生を完全に阻止しようとすることは、ドキシサイクリン存在下であっても技術的に困難かもしれないが、Ｇ５細胞におけるＭＳＨ３の前記レベルは、ＥＭＡＳＴ表現型に関するＭＳＨ３の機能をインビトロで回復させるには十分であることから、これらの結果におけるタンパク質レベルは、本研究での薬剤感受性に対するＭＳＨ３の効果を分析するには十分なものであった（Haugen, A. C., Goel, A., Yamada, K., Marra, G., Nguyen, T. P., Nagasaka, T., Kanazawa, S., Koike, J., Kikuchi, Y., Zhong, X., Arita, M., Shibuya, K., Oshimura, M., Hemmi, H., Boland, C. R., and Koi, M. (2008) Cancer Res. 68, 8465-8472）。
【００６７】
ＭＳＨ３欠損細胞は、シスプラチン及びオキサリプラチンに対し、ＭＳＨ３プロフィシェント細胞よりも強い感受性を示す。かかる二種類のプラチナ薬剤に対する細胞感受性がＭＳＨ３の状況によって左右されるかどうかを調べるため、シスプラチン処理細胞におけるＨＣＴ１１６細胞株及びＨＣＴ１１６由来細胞株のクローン原性生存率を調べた。ＭＬＨ１とＭＳＨ３とを欠損するＨＣＴ１１６細胞株と、ＭＬＨ１だけが欠損しているＨＣＴ１１６＋３細胞株との間にはシスプラチン感受性の有意な差は観察されなかったが、ＭＳＨ３発現（proficient）ＨＣＴ１１６＋３＋５細胞株ではより高い抵抗性が観察された（図２Ａ）。種々の細胞株の中で、ＭＳＨ３欠損Ｇ５クローンが、その親ＨＣＴ１１６＋３＋５より感受性が高かった（図２Ａ）。ＭＳＨ３の存在が、シスプラチンに誘導される細胞毒性に影響を及ぼしたことをさらに確認するため、ドキシサイクリンの存在下及び不在下におけるＧ５細胞のクローン原性生存率を比較した。ＭＳＨ３発現が回復すると、細胞がシスプラチンに対して脱感作されたことが見いだされた（５μＭ；図２Ｂ）。これらの結果から、ＭＳＨ３が枯渇すると、細胞がシスプラチンに対して感作されることが示される。その他のクローン、Ｇ１及びＧ２のクローン原性生存率も分析し、これらのクローンがＧ５と同様の挙動を示したことがわかった（データは示さず）。これにより、シスプラチンが引き起こす細胞毒性に対するＭＳＨ３の考えられる役割がさらに補強された。次に、ＭＳＨ３欠損が、オキサリプラチンに対する細胞感受性にも影響を及ぼしたか否かを調べた。驚くべきことに、ＭＳＨ３を欠損するＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１１６＋３及びＧ５の各クローンは、シスプラチンの場合と同様に、その親ＨＣＴ１１６＋３＋５よりもオキサリプラチンに対する感受性が著しく強かった（図２Ｃ）。さらに、ＭＳＨ３欠損細胞におけるＭＳＨ３の回復により、オキサリプラチンへの非感受性が回復されたことが観察された（図２Ｄ）。次に、オキサリプラチン処理後のＭＳＨ３発現細胞とＭＳＨ３欠損細胞との増殖阻害率及びアポトーシスレベルを比較した。本発明者らは、細胞増殖阻害の程度（図２Ｅ）とアポトーシスのレベルが、ＭＳＨ３発現細胞よりもＭＳＨ３欠損細胞において著しく高かった（図２Ｆ）ことをフローサイトメトリーによって見いだした。オキサリプラチン処理したＭＳＨ３欠損細胞では、細胞増殖が低下してアポトーシス画分が増加していることも、それぞれＢｒｄＵアッセイ及び免疫蛍光法で確認された。図２Ｇは、無処理のコントロールと比べ、相対的なＢｒｄＵ取込みが減少していることを示し、図２Ｈは、ＨＣＴ１１６＋３＋５細胞及びＧ５細胞において抗活性カスパーゼ３陽性細胞が増加していることを免疫蛍光法で示す。これらの結果は、クローンアッセイ（clonogenic assay）で得た増殖阻害に関する結果に関して本明細書で示す知見と一致している。
【００６８】
ｓｉＲＮＡトランスフェクションによりＭＳＨ３を枯渇させることによっても、細胞はシスプラチン及びオキサリプラチンに対して感作される。シスプラチン及びオキサリプラチンに対するＭＳＨ３関連感作の役割をさらに確認するため、ＭＳＨ３ｓｉＲＮＡと非標的化ｓｉＲＮＡとを一時的にトランスフェクトした細胞のクローン原性生存頻度を調べた。かかる研究から、ＨＣＴ１１６＋３＋５細胞においてＭＳＨ３タンパク質の発現が、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの７２時間後に著しく減少したことが（無処理細胞に比べて９８％のＭＳＨ３発現阻害）示される（図３Ａ）。ＭＳＨ３ｓｉＲＮＡをＨＣＴ１１６＋３＋５細胞にトランスフェクトし、かかる細胞をトランスフェクションの４８時間後にシスプラチン（５μＭ及び１０μＭ）又はオキサリプラチン（２μＭ及び５μＭ）に暴露した。図３Ｂ及び３Ｃに示すように、ＭＳＨ３ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨＣＴ１１６＋３＋５細胞は、非標的化ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞株と比べ、シスプラチン及びオキサリプラチンの両方に対してより高い感受性を示した。ＭＳＨ３枯渇細胞におけるプラチナ薬剤に対する感受性の亢進をさらに確認するため、別の結腸癌細胞株ＨＴ２９にＭＳＨ３ｓｉＲＮＡ又は非標的化ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ＨＴ２９細胞ではＭＳＨ３がほぼ完全に抑制され（図３Ｄ）、ＭＳＨ３ｓｉＲＮＡで処理したＨＴ２９細胞は、シスプラチン及びオキサリプラチンの両方に対して感受性がさらに亢進していたことが確認された（図３Ｅ及び３Ｆ）。これらの結果により、ＭＳＨ３欠損によってシスプラチン及びオキサリプラチンの両方に対して細胞が感作されるという知見がさらに補強される。
【００６９】
ＭＳＨ３プロフィシェント細胞及びＭＳＨ３欠損細胞におけるシスプラチン感受性又はオキサリプラチン感受性は、結腸癌細胞におけるＭＬＨ１の状況とは無関係に生じる。臨床的見地からすると、ＭＳＨ３の状況が、ＭＬＨ１も欠損している癌患者のシスプラチン及びオキサリプラチンへの感受性に影響するか否かを調べることが重要である。この課題に対処するため、ｓｉＲＮＡに介されるＭＬＨ１発現のダウンレギュレーションを誘導することによる、シスプラチン及びオキサリプラチンに対するＭＳＨ３欠損Ｇ５細胞とＭＳＨ３プロフィシェント細胞の感受性を比較した（図４Ａ）。ＭＬＨ１ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨＣＴ１１６＋３＋５細胞とＧ５細胞の両方においてＭＬＨ１がダウンレギュレーションされた場合、いずれの細胞株も、無処理のコントロール細胞株に比べ、ＭＮＮＧに対する耐性が強くなっており（図４Ｂ）、かかる条件下でのＭＬＨ１の機能抑制が確認された（Koi, M., Umar, A., Chauhan, D. P., Cherian, S. P., Carethers, J. M., Kunkel, T. A., and Boland, C. R. (1994) Cancer Res. 54, 4308-4312；Hawn, M. T., Umar, A., Carethers, J. M., Marra, G., Kunkel, T. A., Boland, C. R., and Koi, M. (1995) Cancer Res. 55, 3721-3725）。興味深いことに、この状況では、ＨＣＴ１１６＋３＋５よりもＧ５細胞の方が、シスプラチン及びオキサリプラチン（２μＭ及び５μＭ）に対する感受性が強かったことが観察された（図４Ｃ及び４Ｄ）。これらの結果は、シスプラチン及びオキサリプラチンに対するＭＳＨ３依存性感受性がＭＬＨ１の状況とは無関係に生じることを示している。
【００７０】
ＭＳＨ３欠損細胞では、オキサリプラチン処理後にｐＨ２ＡＸ及び５３ＢＰ１レベルが持続している。プラチナ薬剤は、ＤＮＡ鎖間架橋及びＩＣＬを誘導し、病巣の一部では、恐らく複製フォークが崩壊したために最終的に二次的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が生じる（Hinz, J. M. (2010) Environ. Mol. Mutagen 51, 582-603）。ＭＳＨ３がＤＳＢの修復に関与しているか否かを調べるため、ＤＮＡ二本鎖切断の代理マーカーである核内ｐＨ２ＡＸレベルの経時変化を免疫蛍光染色法により分析した。ＭＳＨ３発現細胞株及びＭＳＨ３欠損細胞株では、オキサリプラチン処理の前後でｐＨ２ＡＸ巣陽性細胞数に違いはないことがわかった。他方、オキサリプラチン処理の４８〜７２時間後におけるＭＳＨ３欠損Ｇ５細胞におけるｐＨ２ＡＸ巣陽性細胞数の減少率が、ＭＳＨ３が復活したＧ５細胞及びＨＣＴ１１６＋３＋５細胞株のいずれと比較しても低いことが観察され（図５Ａ及び図５Ｂ）、ＤＳＢ修復が、ＭＳＨ３欠損細胞株においてのみ損なわれることが示される。かかるＤＳＢ修復の非効率性をさらに確認するため、ＤＮＡ二本鎖切断の別の検出マーカーである抗５３ＢＰ１抗体を用いて免疫蛍光アッセイを行った。オキサリプラチン処理後にＭＳＨ３欠損Ｇ５細胞において５３ＢＰ１のレベルが維持されていることが確認された（図５Ｃ及び図５Ｄ）。以上の結果から、処理によって誘導されるＤＮＡ損傷負荷の量的差異よりむしろ、ＤＮＡ二本鎖切断修復の効率性の低下が、ＭＳＨ３欠損細胞におけるオキサリプラチン高感受性の原因の一部であることが示される。
【００７１】
ＭＳＨ３欠損細胞もまた、ＰＡＲＰ阻害剤であるオラパリブに感受性である。ＰＡＲＰ阻害剤は、一本鎖切断数を増やし、最終的にＤＮＡ二本鎖切断が生じるが、これはＨＲシステムで修復される。ＨＲ欠損細胞はかかる二本鎖切断を修復できないため、ＰＡＲＰ阻害剤に超感受性である（Bryant, H. E., Schultz, N., Thomas, H. D., Parker, K. M., Flower, D., Lopez, E., Kyle, S., Meuth, M., Curtin, N. J., and Helleday, T. (2005) Nature 434, 913-917；Farmer, H., McCabe, N., Lord, C. J., Tutt, A. N., Johnson, D. A., Richardson, T. B., Santarosa, M., Dillon, K. J., Hickson, I., Knights, C., Martin, N. M., Jackson, S. P., Smith, G. C., and Ashworth, A. (2005) Nature 434, 917-921）。前記結果（図５Ａ〜５Ｄ）から明らかとなったＤＳＢ修復に果たすＭＳＨ３の考えられる役割により、ＭＳＨ３欠損細胞がＰＡＲＰ阻害剤に対しても感受性を有するか否かに関するさらなる検討が促進された。図６Ａに示すとおり、ＭＳＨ３欠損Ｇ５細胞はＭＳＨ３が回復したＧ５細胞株よりも、オラパリブに対する感受性が高かった。これらのデータは、ＣＲＣ細胞におけるＤＳＢ修復へのＭＳＨ３の役割を明らかに裏付けている。さらに、オキサリプラチンとオラパリブを組み合わせると、親ＨＣＴ１１６＋３＋５細胞に比べ、ＭＳＨ３欠損Ｇ５細胞における細胞毒性に相乗効果がもたらされた。この効果は、別の結腸癌細胞株２種、ＨＴ２９（図６Ｂ）及びＳＷ４８０（データは示さず）、について、ＭＳＨ３ｓｉＲＮＡを用いる一時的ノックダウンシステムにおいて確認された。これらの結果から、ＭＳＨ３欠損癌に対するプラチナ薬剤とＰＲＰ阻害剤との併用療法が示される。
【００７２】
本研究は、ＭＳＨ３が消失することにより、プラチナ薬剤に起因する細胞感受性が影響を受けることを解明した。この観察結果は、ＭＳＨ３欠損腫瘍患者に対する化学療法の成果に関する予想マーカーとしてＭＳＨ３の状況を用いる診断及び治療戦略を確立するために用いることができる。簡潔に述べると、ＭＳＨ３発現がtet-offシステムによって調節されている同系結腸癌細胞株を用い、結腸癌細胞におけるＭＳＨ３発現を枯渇させると、かかる結腸癌細胞がシスプラチンだけでなくオキサリプラチン及びＰＡＲＰ阻害剤に対しても感作されることを明らかにした。かかる効果は、前記薬剤による処理後にみられるＭＳＨ３欠損細胞のＤＳＢ修復能減少によって最もよく説明できるだろうことが前記データから示唆されるが、ＭＳＨ３がＤＮＡ二本鎖切断修復に関与する正確な機構については更なる解明がまたれる。ＭＳＨ３を選択的に阻害することにより、プラチナ薬剤及びＰＡＲＰ阻害剤に対する細胞感受性が亢進することを明らかにしたのは本発明が始めてである。さらに前記結果は、シスプラチン及びオキサリプラチンに対する感受性のＭＳＨ３依存的亢進が、ＭＬＨ１のダウンレギュレーションの影響によるものではなく、恐らく基準ミスマッチ修復システムからも独立していることを明らかにしている。
【００７３】
ＩＣＬの修復におけるＭｕｔＳ及びＭｕｔＬホモログの役割は、ソラレンＩＣＬを用いて数多く研究されてきた（Zhang, N., Lu, X., Zhang, X., Peterson, C. A., and Legerski, R. J. (2002) Mol. Cell. Biol. 22, 2388-2397；Zhao, J., Jain, A., Iyer, R. R., Modrich, P. L., and Vasquez, K. M. (2009) Nucleic Acids Res. 37, 4420-4429；Vasquez, K. M. (2010) Environ. Mol. Mutagen 51, 527-539；Zhang, N., Liu, X., Li, L., and Legerski, R. (2007) DNA Repair (Amst) 6, 1670-1678；Wu, Q., and Vasquez, K. M. (2008) PLoS Genet. 4, e1000189）。これらのデータからは、ＭｕｔＳβが、ＮＥＲタンパク質及びＨＲタンパク質など他のタンパク質と協同していくつかのタイプのＩＣＬの認識及びプロセッシングの双方に関与していること、並びにＭｕｔＳβがＭＭＲにおけるその主な役割とは無関係にＩＣＬ修復にも機能していることが示唆される。ここに示す知見は、ＭＳＨ３枯渇細胞がシスプラチン及びオキサリプラチンに感受性を有することを示し、このことがＭＬＨ１の機能とは無関係に生じる点が、ソラレンＩＣＬを用いる知見と一致している。
【００７４】
以上の結果から、ＩＣＬ付加物に誘導される毒性ＤＳＢの修復にＭｕｔＳβが関与していることが示される。第一に、レーザーにより（Hong, Z., Jiang, J., Hashiguchi, K., Hoshi, M., Lan, L., and Yasui, A. (2008) J. Cell Sci. 121, 3146-3154）、及びクロミウム（VI）等の発癌物質により（Reynolds, M. F., Peterson-Roth, E. C., Bespalov, I. A., Johnston, T., Gurel, V. M., Menard, H. L., and Zhitkovich, A. (2009) Cancer Res. 69, 1071-1079）誘導されたＤＳＢ病巣にＭＳＨ３が共局在するようになるという既存の証拠がある。第二に、本発明者らは、オキサリプラチン処理後、ＭＳＨ３欠損細胞においてＤＳＢと共局在するｐＨ２ＡＸ及び５３ＢＰ１のレベルがＭＳＨ３発現細胞と比べて維持されていたことを認識した。第三に、ＭＳＨ３欠損細胞は、ＤＳＢを誘導するＰＡＲＰ阻害剤に感受性を有する。よって、これらの結果から、ＭＳＨ３欠損に起因する未修復ＤＳＢが細胞死の直接の原因であることが示される。しかし、最近行われた研究では、ＭＳＨ２ヌルマウスで生じる腫瘍が、ＭＳＨ２Ｇ６７４Ｄ変異を有するマウスの腫瘍よりも、シスプラチンと、５−ＦＵ＋オキサリプラチンの組合せとに対して高い耐性を有することが示された（Kucherlapati, M. H., Lee, K., Nguyen, A. A., Clark, A. B., Hou, H., Jr., Rosulek, A., Li, H., Yang, K., Fan, K., Lipkin, M., Bronson, R. T., Jelicks, L., Kunkel, T. A., Kucherlapati, R., and Edelmann, W. (2010) Gastroenterology 138, 993-1002 e1001）。興味深いことに、かかるミスセンス変異の結果、ＭＭＲ活性が失われても、ＤＮＡ損傷に対する感受性は依然として保たれている。これらの結果は、ＭＳＨ２がＭＭＲ活性及び化学感受性に独特の機能を有することを示している（Kucherlapati, M. H., Lee, K., Nguyen, A. A., Clark, A. B., Hou, H., Jr., Rosulek, A., Li, H., Yang, K., Fan, K., Lipkin, M., Bronson, R. T., Jelicks, L., Kunkel, T. A., Kucherlapati, R., and Edelmann, W. (2010) Gastroenterology 138, 993-1002 e1001）。ＭＳＨ２及びＭＬＨ１は、シスプラチン処理後にＪＮＫ及びｃ−Ａｂ１等のアポトーシス経路に関与する種々のタンパク質の活性化に必要であることが示されている（Nehme, A., Baskaran, R., Nebel, S., Fink, D., Howell, S. B., Wang, J. Y., and Christen, R. D. (1999) Br. J. Cancer 79, 1104-1110）。しかし、シスプラチン又はオキサリプラチンに引き起こされるシグナル経路に、ＭｕｔＳα又はＭｕｔＳβ又はその両方が関与しているかどうかは不明である。しかし、これらの結果から、ＭＳＨ３の消失により、シスプラチン及びオキサリプラチンへの感受性が亢進することが示されているので、ＭｕｔＳβは主としてＤＮＡ損傷修復に関与し、ＭｕｔＳαはかかる修復と細胞死をもたらすシグナル経路の両方に関与している可能性が高い。今後の研究により、ＤＮＡ損傷修復に、及びこれらの薬剤によって生じる損傷シグナルに果たすＭｕｔＳα又はＭｕｔＳβの正確な役割が解明されるであろう。
【００７５】
シスプラチン及びオキサリプラチンにたいするＭＳＨ３欠損細胞の感受性に関する結果は、Vaisman et al.が以前報告した内容（Vaisman, A., Varchenko, M., Umar, A., Kunkel, T. A., Risinger, J. I., Barrett, J. C., Hamilton, T. C., and Chaney, S. G. (1998) Cancer Res. 58, 3579-3585）と矛盾している。このVaisman et al.の研究は、ＭＳＨ３欠損ＨＨＵＡ細胞と５番染色体を追加されたＭＳＨ３発現ＨＨＵＡとの間で、上記各薬剤に対する感受性に違いがなかったことを報告した（Vaisman, A., Varchenko, M., Umar, A., Kunkel, T. A., Risinger, J. I., Barrett, J. C., Hamilton, T. C., and Chaney, S. G. (1998) Cancer Res. 58, 3579-3585）。かかる研究では５番染色体の数百個にも及ぶ他の遺伝子の影響を排除することができないため、ＭＳＨ３発現が必要に応じて選択的に調節されたＨＣＴ１１６結腸癌細胞の同系クローンが使用されている本明細書に記載のデータがより正確なものである。
【００７６】
臨床的観点からすると、オキサリプラチンによる治療レジメン、ＰＡＲＰ阻害剤、又は特にこれら２つの併用が多数のＭＳＩＣＲＣ患者にとって有効である可能性が本明細書に示される結果から明らかにされる。ＣＲＣに関しては数多くの最近の研究が、ステージIIIのＭＳＩ癌患者には５−ＦＵアジュバント化学療法が有効ではないことを示している（Ribic, C. M., Sargent, D. J., Moore, M. J., Thibodeau, S. N., French, A. J., Goldberg, R. M., Hamilton, S. R., Laurent-Puig, P., Gryfe, R., Shepherd, L. E., Tu, D., Redston, M., and Gallinger, S. (2003) N. Engl. J. Med. 349, 247-257；Popat, S., Hubner, R., and Houlston, R. S. (2005) J. Clin. Oncol. 23, 609-618；Sargent, D. J., Marsoni, S., Monges, G., Thibodeau, S. N., Labianca, R., Hamilton, S. R., French, A. J., Kabat, B., Foster, N. R., Torri, V., Ribic, C., Grothey, A., Moore, M., Zaniboni, A., Seitz, J. F., Sinicrope, F., and Gallinger, S. (2010) J. Clin. Oncol. 28, 3219-3226）。さらに、Bertagnolli et alは、ステージIIIのＭＳＩ−ＣＲＣ患者にとり、５−ＦＵ及びイリノテカンを含むアジュバント化学療法が有効であると報告したが（Bertagnolli, M. M., Niedzwiecki, D., Compton, C. C., Hahn, H. P., Hall, M., Damas, B., Jewell, S. D., Mayer, R. J., Goldberg, R. M., Saltz, L. B., Warren, R. S., and Redston, M. (2009) J. Clin. Oncol. 27, 1814-1821）、別の研究では、かかるアジュバント治療がステージIIIのＭＳＩ−ＣＲＣ患者に有効ではなかったと報告されている（Tejpar, S., Bosman, F., Delorenzi, M., Fiocca, R., Yan, P., Klingbiel, D., Dietrich, D., Van Cutsem, E., Labianca, R., and Roth, A. (2009) J. Clin. Oncol. 27, 4001）。このように矛盾する結果は、ＭＳＩ ＣＲＣでは、異なる化学感受性を有する患者のサブグループが存在する可能性を示している。例えば、これらの結果から、ＭＳＨ３プロフィシェントＣＲＣとＭＳＨ３欠損ＣＲＣという少なくとも２つのサブ集団のＭＬＨ１欠損ＣＲＣが存在し、それらがそのＭＳＨ３の状況に応じ、オキサリプラチン、ＰＡＲＰ阻害剤又はそれらの併用に対して異なる応答をすることが示される。
【００７７】
ＭＳＨ３の他にも、いくつかの別のＤＮＡ修復リペア遺伝子がＭＳＩ癌において変異する。その産物がＤＳＢ修復複合体ＭＲＥ１１Ａ−ｈＲＡＤ５０−ＮＢＳ１中で形成されるＭＲＥ１１Ａ及びＲＡＤ５０は、ＭＳＩ癌において最も頻繁に変異する遺伝子の一種である（Hewish, M., Lord, C. J., Martin, S. A., Cunningham, D., and Ashworth, A. (2010) Nat. Rev. Clin. Oncol. 7, 197-208）。培養細胞において、ＭＲＥ１１Ａ及びＲＡＤ５０における変異がイリノテカン感受性を亢進させることが示されており、それにより培養細胞における二次的ＤＳＢが誘導される（Vilar, E., Scaltriti, M., Balmana, J., Saura, C., Guzman, M., Arribas, J., Baselga, J., and Tabernero, J. (2008) Br. J. Cancer 99, 1607-1612；Rodriguez, R., Hansen, L. T., Phear, G., Scorah, J., Spang-Thomsen, M., Cox, A., Helleday, T., and Meuth, M. (2008) Clin. Cancer Res. 14, 5476-5483）。これらの結果から、ＭＳＨ３欠損により、イリノテカンの活性代謝物であるＳＮ−３８に対して細胞が感作されたことが示される（データは示さず）。さらに、ＭＳＩ癌においてしばしば変異する別の遺伝子であるホスファターゼ及びテンシンホモログが消失すると、ＨＲ修復の非効率性によりＰＡＲＰ阻害剤に対して細胞が感作されることが示されている（Mendes-Pereira, A. M., Martin, S. A., Brough, R., McCarthy, A., Taylor, J. R., Kim, J. S., Waldman, T., Lord, C. J., and Ashworth, A. (2009) EMBO Mol. Med. 1, 315-322；McEllin, B., Camacho, C. V., Mukherjee, B., Hahm, B., Tomimatsu, N., Bachoo, R. M., and Burma, S. (2010) Cancer Res. 70, 5457-5464）。よって、ＤＳＢ修復に関与するこれらの遺伝子又はタンパク質を分析することが、ＭＳＩ癌患者に対する治療成果を予測することに役立つ可能性がある。ＭＳＩ癌における薬剤療法の予測マーカーを実証する臨床研究が必要とされる。
【００７８】
本発明者らは既に、ＭＳＨ３発現の消失によりＥＭＡＳＴ及びＭＳＩが低レベルの表現型が生じ、ＭＳＨ３発現の局所的消失が散発性ＣＲＣ組織におけるＥＭＡＳＴと関連していたことを明らかにした（Haugen, A. C., Goel, A., Yamada, K., Marra, G., Nguyen, T. P., Nagasaka, T., Kanazawa, S., Koike, J., Kikuchi, Y., Zhong, X., Arita, M., Shibuya, K., Oshimura, M., Hemmi, H., Boland, C. R., and Koi, M. (2008) Cancer Res. 68, 8465-8472）。さらに、ＭＳＩが低レベルのＣＲＣの殆どとＭＳＳ腫瘍の一部とがＥＭＡＳＴを示したが、これは、かかる組織においてＭＳＨ３欠損が起きたことを示唆している（Haugen, A. C., Goel, A., Yamada, K., Marra, G., Nguyen, T. P., Nagasaka, T., Kanazawa, S., Koike, J., Kikuchi, Y., Zhong, X., Arita, M., Shibuya, K., Oshimura, M., Hemmi, H., Boland, C. R., and Koi, M. (2008) Cancer Res. 68, 8465-8472）。ＭＳＨ３欠損は、ＭＬＨ１欠損ＣＲＣの疾患進行と関連している可能性があり（Plaschke, J., Kruger, S., Jeske, B., Theissig, F., Kreuz, F. R., Pistorius, S., Saeger, H. D., Iaccarino, I., Marra, G., and Schackert, H. K. (2004) Cancer Res. 64, 864-870）、ＭＳＩが低レベルのＣＲＣでは予後不良であり（Kohonen-Corish, M. R., Daniel, J. J., Chan, C., Lin, B. P., Kwun, S. Y., Dent, O. F., Dhillon, V. S., Trent, R. J., Chapuis, P. H., and Bokey, E. L. (2005) J. Clin. Oncol. 23, 2318-2324；Wright, C. M., Dent, O. F., Newland, R. C., Barker, M., Chapuis, P. H., Bokey, E. L., Young, J. P., Leggett, B. A., Jass, J. R., and Macdonald, G. A. (2005) Gut 54, 103-108）、ＭＳＨ３の消失がＣＲＣの転移又は再発の促進と関連している可能性が示される。このシナリオでは、ＭＳＨ３陰性癌細胞集団を有する散発性ＣＲＣをプラチナ薬剤若しくはＰＡＲＰ阻害剤、又はそれら両方を用いて治療することにより、疾患進行が抑制される可能性がある。
【００７９】
以上より、恐らくＤＮＡ二本鎖切断の修復が低減する結果、ＭＳＨ３欠損細胞がシスプラチン、オキサリプラチン及びＰＡＲＰ阻害剤に感受性を有することが本発明で明らかにされた。これらの知見は、ＤＮＡ修復及び薬剤感受性におけるＭＳＨ３の役割をより良く理解すること、並びにＭＳＨ３欠損癌患者に対する治療成果の予測及び改良に貢献する。
【００８０】
本明細書において説明されるいかなる実施形態も、任意の方法、キット、試薬、又は本発明の組成物に対して実施することができ、またその逆も成り立つと考えられる。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用することができる。
【００８１】
本明細書に記載の特定の実施形態は、本発明の限定としてではなく、例示として示されていることが理解されよう。本発明の主な特徴は、本発明の範囲から逸脱せずに、様々な実施形態において使用することができる。当業者は、本明細書に記載された特定の手順の数々の均等物を認識し、又は慣例的にすぎない実験を用いて確認することができる。そのような同等物は、本発明の範囲内であるとみなされ、特許請求の範囲に包含される。
【００８２】
本明細書中で言及される刊行物及び特許出願は全て、本発明が関連する技術分野における当業者の技術のレベルを示すものである。刊行物及び特許出願は全て、それぞれ個々の刊行物又は特許出願が、参照により具体的及び個別に組み込まれることが示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８３】
「a」又は「an」という単語の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書において「含む（comprising）」という用語と併せて使用される場合、「１つ」を意味し得るが、「１又は２以上」、「少なくとも１つ」、及び「１又は２つ以上」の意味とも一致する。特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、選択肢（alternatives）のみを指すように、又は選択肢が相互排他的であることが明示的に指定されない限り、「及び／又は」を意味するように使用されるが、本開示は、選択肢のみ、並びに「及び／又は」を指す定義に対応する。本出願全体にわたり、値が、デバイス、その値を決定するために使用されている方法、又は試験対象間に存在する変動に固有の誤差の変動を含むことを示すために、「約」という用語が使用される。
【００８４】
本明細書及び特許請求の範囲において、「含む（comprising）」（並びにその任意の形、例えば「comprise」及び「comprises」）、「有する（having）」（並びにその任意の形、例えば「have」及び「has」）、「含む（including）」（並びにその任意の形、例えば「includes」及び「include」）、又は「含有する（containing）」（並びにその任意の形、例えば「contains」及び「contain」）という単語は、包含的又は非制限的であり、列挙されていない追加の要素又は方法ステップを除外しない。
【００８５】
本明細書中、「又はそれらの組合せ」という用語は、その用語に先行する列挙された項目の全ての順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣのうちの少なくとも１つを含むことを意図し、具体的な文脈において順番が重要である場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢもまた含むことを意図する。引き続きこの例において、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢ等の、１又は２以上の項目又は用語の反復を含有する組合せが、明示的に含まれる。典型的には、文脈から別の意味が明らかでない限り、任意の組合せにおける項目又は用語の数に制限はないことが、当業者に理解される。
【００８６】
本明細書中、近似値を表す語句、限定されないが例えば「約」、「実質的」又は「実質的に」という語句は、そのように修飾した場合、必ずしも絶対又は完全ではない状態であると理解されるが、かかる状態が存在していると当業者が保証するには十分近いとみなされる。記載の変動範囲は、変化がどの程度大きいかにより左右され、かかる語句で修飾されていない特徴に要求される特徴及び能力が依然として修飾された特徴にも備わっていると当業者が認識するものでなければならない。前述の議論によるものの、一般に、本明細書における数値を「約」などの近似値を示す語句で修飾する場合、記載の数値より少なくとも±１、２、３、４、５、６、７、１０、１２又は１５％変動する。
【００８７】
本明細書で開示され、請求される組成物及び／又は方法のすべては、本開示に照らして、過度の実験をせずに作成及び実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態について記載されているが、当業者にとっては、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物及び／又は方法、並びに方法のステップ又は一連のステップを変化させ得ることは明らかであろう。当業者にとって明らかなかかる類似の代替物及び変更はすべて添付の特許請求の範囲で定義される本発明の精神、範囲及び概念に含まれる。
【００８８】
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【図１】
2012165736.tif 000002
【図２】
2012165736.tif 000003
【図３】
2012165736.tif 000004
【図４】
2012165736.tif 000005
【図５】
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【図６】
2012165736.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成23年12月19日(2011.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は２以上の腺癌のリスクを有する患者或いは１又は２以上の腺癌と診断された患者における治療レジメンの有効性を予測するためのデータを収集する方法において、
前記患者から得られた、腺癌細胞であることが疑われる細胞におけるＭＳＨ３総発現を測定するステップ、及び
前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現の測定に基づき、前記患者を治療するための抗腫瘍剤を用いる前記治療レジメンの有効性を予測するステップであって、正常細胞におけるＭＳＨ３発現に比べて前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現が減少しているときに抗腫瘍剤療法に対する応答素因が示され、前記療法が前記患者に有効量の前記抗腫瘍剤を投与することを含むステップを含む、方法。
【請求項２】
腺癌が、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、肺癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、精巣癌、膀胱癌、膣癌、乳癌、食道癌、膵臓癌、及び胃癌からなる群から選択される固形腫瘍を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腺癌がＣＲＣである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、腺癌細胞であることが疑われる細胞を、ＭＳＨ３タンパク質の発現、ＭＳＨ３核酸の発現又はその両方について分析することを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
個体から得たＭＳＨ３核酸又はＭＳＨ３核酸の一部からのＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、質量分析、ローリングサークル増幅、免疫組織化学分析、対立遺伝子特異的プローブ又は抗体プローブを用いるハイブリダイゼーション、或いはそれらの組合せ又は改変法を行うことを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
抗腫瘍剤が、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロフォスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、テモゾロミド、トポテカン、及び電離放射線からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
抗腫瘍剤が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、フロクマリン、及びソラレンからなる群から選択される鎖間架橋剤である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
抗腫瘍剤が、オラパリブ、イソインドリノン誘導体、ベリパリブ、イニパリブ、及び４−メトキシ−カルバゾール誘導体からなる群から選択されるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
結腸直腸癌のリスクがある患者又は結腸直腸癌と診断された患者の治療成果を予測するために用いられるバイオマーカーであって、前記バイオマーカーが以下のステップを含む方法で用いられるＭＳＨ３であることを特徴とするバイオマーカー。
前記患者から得られた、結腸直腸癌細胞であることが疑われる細胞におけるＭＳＨ３総発現を測定するステップ、及び
前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現の測定に基づいて前記患者を治療するための抗腫瘍剤を用いる治療レジメンの有効性を予測するステップであって、
正常結腸直腸細胞におけるＭＳＨ３発現に比べて前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現が減少しているときに抗腫瘍剤療法に対する応答素因が示され、
前記療法が前記患者に有効量の前記抗腫瘍剤療法を投与することを含むステップ
【請求項１０】
ＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、結腸直腸癌細胞であることが疑われる細胞を、ＭＳＨ３タンパク質の発現、ＭＳＨ３核酸の発現又はその両方について分析することを含む、請求項９に記載のバイオマーカー。
【請求項１１】
個体から得たＭＳＨ３核酸又はＭＳＨ３核酸の一部からのＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、質量分析、ローリングサークル増幅、免疫組織化学分析、対立遺伝子特異的プローブ又は抗体プローブを用いるハイブリダイゼーション、或いはそれらの組合せ又は改変法を行うことを含む、請求項９又は１０に記載のバイオマーカー。
【請求項１２】
抗腫瘍剤が、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロフォスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、テモゾロミド、トポテカン、及び電離放射線からなる群から選択される、請求項９〜１１のいずれかに記載のバイオマーカー。
【請求項１３】
抗腫瘍剤が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、フロクマリン、及びソラレンからなる群から選択される鎖間架橋剤である、請求項９〜１１のいずれかに記載のバイオマーカー。
【請求項１４】
抗腫瘍剤が、オラパリブ、イソインドリノン誘導体、ベリパリブ、イニパリブ、及び４−メトキシ−カルバゾール誘導体からなる群から選択されるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤である、請求項９〜１１のいずれかに記載のバイオマーカー。
【請求項１５】
結腸直腸癌のリスクがある患者又は結腸直腸癌と診断された患者に対する癌治療法を選択する方法において、
前記患者のＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップ、及び抗腫瘍剤を用いて前記患者を治療するための抗腫瘍剤治療の有効性を予測するステップであって、前記ＭＳＨ３総発現レベルが減少しているときにＤＮＡ架橋剤が前記患者にとって適切な療法であることが示されるステップを含む、方法（但し、医師による診断行為は除く。）。
【請求項１６】
ＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、結腸直腸癌細胞であることが疑われる細胞を、ＭＳＨ３タンパク質の発現、ＭＳＨ３核酸の発現又はその両方について分析することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
個体から得たＭＳＨ３核酸又はＭＳＨ３核酸の一部からのＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、質量分析、ローリングサークル増幅、免疫組織化学分析、対立遺伝子特異的プローブ又は抗体プローブを用いるハイブリダイゼーション、或いはそれらの組合せ又は改変法を行うことを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗腫瘍剤が、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロフォスファミド、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、テモゾロミド、トポテカン、及び電離放射線からなる群から選択される、請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
抗腫瘍剤が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、フロクマリン、及びソラレンからなる群から選択される鎖間架橋剤である、請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
抗腫瘍剤が、オラパリブ、イソインドリノン誘導体、ベリパリブ、イニパリブ、及び４−メトキシ−カルバゾール誘導体からなる群から選択されるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤である、請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
患者を癌治療法の臨床試験用のサブグループに分類するためのデータを収集する方法において、
前記患者から得られた、癌細胞であることが疑われる細胞におけるＭＳＨ３総発現を測定するステップ、及び
前記患者を治療するための候補薬剤を用いる療法の有効性を予測するステップであって、
正常細胞におけるＭＳＨ３発現に比べて前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現が減少しているときに候補薬剤を用いる療法に対する応答素因が示され、
前記療法が患者に有効量の前記候補薬剤を投与することを含み、ＭＳＨ３発現レベルにより前記患者を臨床試験用のサブグループに分類できるステップを含む、方法。
【請求項２２】
癌細胞が、固形腫瘍に存在し、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、肺癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、精巣癌、膀胱癌、膣癌、乳癌、食道癌、膵臓癌、及び胃癌からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
癌細胞が結腸直腸癌細胞である、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、腺癌細胞であることが疑われる細胞を、ＭＳＨ３タンパク質の発現、ＭＳＨ３核酸の発現又はその両方について分析することを含む、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
個体から得たＭＳＨ３核酸又はＭＳＨ３核酸の一部からのＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、質量分析、ローリングサークル増幅、免疫組織化学分析、対立遺伝子特異的プローブ又は抗体プローブを用いるハイブリダイゼーション、或いはそれらの組合せ又は改変法を行うことを含む、請求項２１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
候補薬剤が遺伝毒性剤である、請求項２１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
候補薬剤がポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤である、請求項２１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
患者を結腸直腸癌のサブグループに分類するためのデータを収集する方法において、
前記患者から得られた、結腸直腸癌細胞であることが疑われる細胞におけるＭＳＨ３総発現を測定するステップ、及び
正常結腸直腸細胞におけるＭＳＨ３発現と比べたときの前記患者細胞におけるＭＳＨ３総発現の変化に基づいて結腸直腸癌のステージを予測するステップを含む、方法。
【請求項２９】
結腸直腸癌のリスクがある患者又は結腸直腸癌と診断された患者のを治療成果を予測するために用いられるバイオマーカーであって、前記バイオマーカーが以下のステップを含む方法で用いられるＭＳＨ３であることを特徴とするバイオマーカー。
前記患者から得られた、結腸直腸癌細胞であることが疑われる細胞におけるＭＳＨ３総発現を測定するステップであって、ＭＳＨ３総発現が変化しているときに、１又は２以上のＤＮＡ架橋剤を用いる療法に対する応答素因が示されるステップ、
結腸直腸癌細胞におけるＭＳＨ３発現を減少させるのに十分な量の治療有効量のＤＮＡ架橋剤を投与するステップ、及び
前記患者におけるＭＳＨ３総発現の継続的減少を測定するステップ
【請求項３０】
ＭＳＨ３遺伝子発現を伴う疾患状態の治療に有用であると考えられる候補薬剤を評価するための臨床試験に用いられるキットであって、以下のステップを行うためのインストラクションを含むキット。
ａ）患者グループから得た結腸直腸癌を有することが疑われる組織におけるＭＳＨ３発現レベルを測定するステップ；
ｂ）患者の第１サブグループに候補薬剤を投与し、患者の第２サブグループに偽薬を投与するステップ；
ｃ）前記候補薬剤又は前記偽薬を投与した後にステップａ）を繰り返すステップ；及び
ｄ）前記候補薬剤により、ＭＳＨ３発現減少を示す結腸直腸細胞の数が、前記患者の第２サブグループで生じる低減と比べて統計的に有意に低減されるか否かを測定するステップであって、統計的に有意に低減していることによって前記候補薬剤が前記疾患状態を治療するのに有用であることが示されるステップ
【請求項３１】
哺乳動物の結腸直腸癌が、結腸直腸癌の治療のためのＤＮＡ損傷剤に対して耐性又は応答性である可能性を測定する方法において、
前記癌から得た生体試料におけるＭＳＨ３総発現の減少を調べるステップ、及び
前記結腸直腸癌が前記ＤＮＡ損傷剤に対して応答性を示す又は増強された感受性を有すると同定するステップであって、前記生体試料におけるＭＳＨ３の発現又は活性の減少が前記ＤＮＡ損傷剤に対する応答性の指標となるステップ
を含む方法。
【請求項３２】
結腸直腸癌の疾患進行のバイオマーカーにおいて、前記バイオマーカーがＭＳＨ３であり、患者から得た結腸直腸細胞におけるＭＳＨ３総発現が、正常結腸直腸細胞又は同じ患者からより早い時期に得た結腸直腸細胞におけるＭＳＨ３発現と比べて減少していることが結腸直腸癌の疾患進行の指標となる、バイオマーカー。
【請求項３３】
ＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、結腸直腸癌細胞であることが疑われる細胞を、ＭＳＨ３タンパク質の発現、ＭＳＨ３核酸の発現又はその両方について分析することを含む、請求項３２に記載のバイオマーカー。
【請求項３４】
個体から得たＭＳＨ３核酸又はＭＳＨ３核酸の一部からのＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、質量分析、ローリングサークル増幅、免疫組織化学分析、対立遺伝子特異的プローブ又は抗体プローブを用いるハイブリダイゼーション、或いはそれらの組合せ又は改変法を行うことを含む、請求項３２に記載のバイオマーカー。
【請求項３５】
ＭＳＨ３の差次的発現レベルを測定するためのバイオマーカー検出試薬と、結腸直腸癌のリスクの診断における使用のためのインストラクションとを含む結腸直腸癌診断用のキット。
【請求項３６】
結腸直腸癌のリスクを有する患者から得た試料におけるＭＳＨ３ ｍＲＮＡ及びＭＳＨ３タンパク質の両方の発現レベルが正常対象に比べて有意に減少している、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
ヒト対象における結腸直腸癌進行を検出するためのデータを収集する方法において、
結腸直腸癌に罹患していることが疑われるヒト対象を同定するステップ、
前記対象から１又は２以上の生体試料を得るステップであって、前記生体試料が、組織試料、糞便試料、細胞ホモジネート、及び１又は２以上の生体液からなる群から選択されるステップ、
前記対象の前記生体試料から得た１又は２以上の細胞におけるＭＳＨ３総発現パターンを測定するステップ、並びに
結腸直腸癌に罹患していることが疑われる前記対象の前記生体試料からのＭＳＨ３の総発現パターンと、正常対象の生体試料からのＭＳＨ３の総発現パターンとを比較するステップであって、前記正常対象が結腸直腸癌に罹患していない健常な対象であり、前記対象の前記生体試料におけるＭＳＨ３総発現パターンの減少が、結腸直腸癌の存在、発症リスク、又はその両方の指標となるステップ
を含む方法。
【請求項３８】
ＭＳＨ３の総発現レベルを測定するステップが、結腸直腸癌細胞であることが疑われる細胞を、ＭＳＨ３タンパク質の発現、ＭＳＨ３ ｍＲＮＡ核酸の発現又はその両方について分析することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＭＳＨ３ ｍＲＮＡ、ＭＳＨ３タンパク質、又はその両方の発現レベルの有意な減少が、湿潤性結腸直腸癌の存在、発症リスク、又はその両方の指標となる、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
個体から得たＭＳＨ３核酸又はＭＳＨ３核酸の一部からのＭＳＨ３総発現レベルを測定するステップが、質量分析、ローリングサークル増幅、免疫組織化学分析、対立遺伝子特異的プローブ又は抗体プローブを用いるハイブリダイゼーション、或いはそれらの組合せ又は改変法を行うことを含む、請求項３７〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
結腸直腸癌のリスクを有する又は結腸直腸癌に罹患している患者を治療すること、結腸直腸癌のリスクを有する又は結腸直腸癌に罹患している患者のためにＤＮＡ架橋剤療法を選択すること、患者を結腸直腸癌のサブグループ又は結腸直腸癌治療法の臨床試験用のサブグループに分類すること、結腸直腸癌治療レジメンに対する耐性又は応答性を測定すること、結腸直腸癌の診断用キットを開発すること、或いはそれらの組合せのために用いる、請求項３７〜４０のいずれかに記載の方法。
【外国語明細書】
2012165736000001.pdf