(57)【要約】【課題】免疫細胞を効率良く確実に活性化させる。【解決手段】末梢血から抽出された有核細胞３とβリン酸三カルシウム３とが混合されてなる免疫細胞活性化剤１を提供する。本発明によれば、予めβリン酸三カルシウム３と混合された有核細胞３に含まれる十分な数の破骨細胞によってもβリン酸三カルシウム３が貪食されることにより、十分な量のカテプシンＫを移植後迅速に発現させ、該カテプシンＫによって免疫細胞を活性化させることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血から抽出された有核細胞とβリン酸三カルシウムとが混合されてなる免疫細胞活性化剤。
【請求項２】
前記βリン酸三カルシウムが、多孔体である請求項１に記載の免疫細胞活性化剤。
【請求項３】
前記βリン酸三カルシウムからなり７５μｍ以下の粒径を有する顆粒を備え、
前記有核細胞が、前記顆粒と混合されている請求項１または請求項２に記載の免疫細胞活性化剤。
【請求項４】
βリン酸三カルシウムの多孔体からなりその表面に凹部を有するブロック体を備え、
前記顆粒および前記有核細胞の混合物が、前記凹部内に充填されている請求項３に記載の免疫細胞活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫細胞活性化剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、βリン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）によって破骨細胞の貪食能が活性化され、それによって免疫細胞が活性化されることを利用した癌細胞抑制剤が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−１２６４３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の場合、体内に移植後に免疫細胞の活性化による治療効果が発揮されるためには周辺組織からマクロファージが移植部位に集まってくるのを待たなければならず、また、十分な細胞数のマクロファージが集まってくるとは限らない。すなわち、移植後に免疫細胞を効率良く確実に活性化させることが難しいという問題がある。
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、免疫細胞を効率良く確実に活性化させることができる免疫細胞活性化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、末梢血から抽出された有核細胞とβ−ＴＣＰとが混合されてなる免疫細胞活性化剤を提供する。
本発明によれば、体内に移植されたβ−ＴＣＰが、周辺組織から集まってきたマクロファージによって貪食されることにより、同じく周辺組織から患部集まってきたリンパ球などの免疫細胞を活性化させることができる。
【０００６】
この場合に、免疫細胞は、マクロファージの１種である破骨細胞がβ−ＴＣＰを貪食するときに発現するカテプシンＫによって活性化される。ここで、予めβ−ＴＣＰと混合された有核細胞に含まれる十分な数の破骨細胞によってもβ−ＴＣＰが貪食されることにより十分な量のカテプシンＫが移植後迅速に発現させられる。これにより、免疫細胞を効率良く確実に活性化させることができる。
【０００７】
上記発明においては、前記β−ＴＣＰが、多孔体であることが好ましい。
このようにすることで、破骨細胞とβ−ＴＣＰとの接触面積を拡大して破骨細胞によるβ−ＴＣＰの貪食を促進させることによりカテプシンＫの発現量をさらに増大させることができる。
【０００８】
また、上記発明においては、前記β−ＴＣＰからなり７５μｍ以下の粒径を有する顆粒を備え、前記有核細胞が、前記顆粒と混合されていることが好ましい。
このようにすることで、破骨細胞によるβ−ＴＣＰの貪食をさらに促進することができる。
【０００９】
また、上記発明においては、β−ＴＣＰの多孔体からなりその表面に凹部を有するブロック体を備え、前記顆粒および前記有核細胞の混合物が、前記凹部内に充填されていてもよい。
このようにすることで、予め混合された破骨細胞および移植後に集まってきた破骨細胞が凹部内の顆粒から外側のブロック体へと貪食を進めることにより、これらの破骨細胞をβ−ＴＣＰの場所に留めてカテプシンＫの発現をより長期間にわたって持続させることができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、免疫細胞を効率良く確実に活性化させることができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施形態に係る免疫細胞活性化剤の全体構成図である。
【図２】図１の免疫細胞活性化剤の変形例を示す図である。
【図３】図１の免疫細胞活性化剤のもう１つの変形例を示す図である。
【図４】β−ＴＣＰの顆粒を貪食している破骨細胞を撮影した走査型電子顕微鏡写真である。
【図５】実施例２の測定結果を示すグラフであり、（ａ）粒径７５〜１２５μｍの顆粒および（ｂ）粒径２５〜７５μｍの顆粒を用いたときの破骨細胞の貪食能を示している。
【図６】実施例３に係る免疫細胞活性化剤Ｉを８週間移植した後の凹部におけるＨＥ染色画像である。
【図７】実施例３に係る免疫細胞活性化剤Ｉを８週間移植した後の凹部におけるカテプシンＫ染色画像である。
【図８】実施例３に係る免疫細胞活性化剤Ｉを８週間移植した後のブロック体におけるカテプシンＫ染色画像である。
【図９】実施例３に係る免疫細胞活性化剤ＩＩを８週間移植した後の凹部におけるカテプシンＫ染色画像である。
【図１０】比較例の移植材を８週間移植した後の移植部位におけるカテプシンＫ染色画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明の一実施形態に係る免疫細胞活性化剤１について図１〜図３を参照して説明する。
本実施形態に係る免疫細胞活性化剤１は、図１に示されるように、凹部２ａを有するβ−ＴＣＰ多孔体からなるブロック体２と、凹部２ａ内に充填された、有核細胞とβ−ＴＣＰ多孔体の顆粒との混合物３とを備えている。
【００１３】
ブロック体２は、移植される部位の形状に応じた形状に形成される。凹部２ａは、ブロック体２の外面に形成された窪みや溝などであり、ブロック体２の外側に開口している。図１に示されるブロック体２は円柱状であり、一方の端面に円柱状の凹部２ａが形成されている。ブロック体２は、図２に示されるように、円筒状に形成され、その中空部分が凹部２ａであってもよく、図３に示されるように、一方の平面が波状に形成された平板状であって、一方の平面の谷の部分が凹部２ａであってもよい。ブロック体２は、有核細胞がその内部を容易に移動できるように、数百μｍの孔径の連通孔が形成されており、約７０％以上の気効率を有している。
【００１４】
顆粒は、破骨細胞の大きさと略同等またはそれより小さい粒径を有しており、２５〜７５μｍの粒径を有していることが好ましい。
【００１５】
有核細胞は、末梢血から液体成分、赤血球および血小板を除去して得られた細胞、すなわち、白血球であり、単球、リンパ球、顆粒球およびマクロファージなどの免疫細胞を含んでいる。有核細胞は、例えば、免疫細胞活性化剤１が移植される患者から採取された末梢血からフィルタや遠心分離などによって抽出される。抽出された有核細胞は、抽出後迅速に顆粒と混合されて凹部２ａに充填されてもよく、培養してから顆粒と混合されてもよい。また、有核細胞のうち単球は、マクロファージまたは樹状細胞に分化させた後に顆粒と混合されてもよい。
【００１６】
次に、このように構成された免疫細胞活性化剤１の作用について説明する。
本実施形態に係る免疫細胞活性化剤１は、凹部２ａが形成されている方の端面が、腫瘍などが形成された患部に接触するように、すなわち、混合物３が患部と直接接触するように患者の体内に移植される。移植後、予め凹部２ａ内に充填された有核細胞のうちマクロファージの１種である破骨細胞が顆粒を貪食する。一方、患部の周辺組織からも破骨細胞が免疫細胞活性化剤１へ遊走してきて顆粒を貪食する。顆粒を貪食したこれらの破骨細胞は引き続き凹部２ａの外側に配置されたブロック体２を貪食する。
【００１７】
このときに、β−ＴＣＰからなる顆粒およびブロック体２を貪食している破骨細胞が発現するカテプシンＫにより、顆粒と混合されたリンパ球などの免疫細胞および周辺組織から患部に集まってきた免疫細胞が活性させられ、該免疫細胞によって患部の治癒を図ることができる。
【００１８】
この場合に、本実施形態によれば、予め凹部２ａに免疫細胞が顆粒と混合された状態で充填されているので、移植後迅速に十分な量のカテプシンＫを発現させて、該カテプシンＫによって、周辺に存在する十分な数の免疫細胞を効率良く確実に活性化させることができるという利点がある。また、これにより、移植部位の周辺組織から集まってきた免疫細胞のみを利用して患部の治癒を図る場合と比べて、治癒効果を向上することができるという利点がある。
【００１９】
また、顆粒の周辺にブロック体２が存在することにより、顆粒を貪食した破骨細胞は、その場から移動して細胞数が減少したり貪食を止めたりすることなくβ−ＴＣＰの貪食を続け、カテプシンＫを発現し続ける。これにより、免疫細胞が比較的長い期間にわたって活性化させられた状態に維持されるので、治癒効果を一層向上することができるという利点がある。
【実施例】
【００２０】
次に、上述した本発明に係る一実施形態の実施例１〜３について、図４〜図１０を参照して説明する。
［実施例１］
本発明の実施例１に係るβ−ＴＣＰのブロック体および顆粒を以下の方法により製造した。
まず、β−ＴＣＰの粉末１２０ｇ、気泡安定剤としてポリアクリル酸アンモニウム系剤料（中京油脂製セルナー３０５）５４ｍｌおよび純水４５ｍｌを混合することにより均一なスラリを生成した。
【００２１】
生成されたスラリに発泡剤としてポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル１０ｍｌを加えて混合することにより発泡体を生成した。生成された発泡体を室温で約１日乾燥させた後、３０〜３５℃でさらに約１日乾燥させた。十分に乾燥した発泡体を電気炉によって３００℃で３時間焼成し、さらに１００℃／時間で昇温して１０５０℃で１時間焼成した後、電気炉内で放冷した。
【００２２】
これにより、７５％の気孔率を有するβ−ＴＣＰ多孔体の塊が得られた。得られた塊を切削することにより、一方の端面に直径１．３ｍｍ、深さ８ｍｍの円柱状の凹部を有する、直径３．７ｍｍ、高さ１０ｍｍの円柱状の、本実施例に係るブロック体を製造した。また、塊を粉砕し、得られた粉をふるいにかけることにより、β−ＴＣＰ多孔体からなる粒径２５〜７５μｍの本実施例に係る顆粒を製造した。
【００２３】
［実施例２］
次に、β−ＴＣＰの顆粒の粒径と破骨細胞の貪食能との関係を調べた。
まず、末梢血から抽出した有核細胞から、ＣＤ１４  Ｃｅｌｌ−Ａｄｅｍｂｅａｄｓ  Ｋｉｔ（ＡＤＥＭＴＥＣＨ社製）を利用してＣＤ１４陽性細胞、すなわち、単球を分離した。分離したＣＤ１４陽性細胞を緩衝液で懸濁して細胞懸濁液を作成した。
【００２４】
次に、各培養容器に、作成した細胞懸濁液と実施例１に係る粒径２５〜７５μｍの顆粒とを収容し、ルミノールを添加し、３７℃で培養した。ここで、顆粒は、β−ＴＣＰの最終濃度が０、０．０１、０．１、０．５および１ｍｇ／ｍｌになるように、各容器に収容した。また、本実施例に対する比較例として、実施例１と同じ方法で製造した７５〜１２５μｍの粒径の顆粒を用いて同じ実験を行った。
【００２５】
そして、培養中に、マイクロプレートリーダを用いてルミノールからの発光を経時的に測定した。破骨細胞がβ−ＴＣＰを貧食することにより活性酸素が産生され、該活性酸素とルミノールが反応することによりルミノールが発光する。すなわち、ルミノールの発光強度は、破骨細胞の貪食能に比例する。
培養中に、破骨細胞Ａがβ−ＴＣＰの顆粒に付着して貪食している様子を撮影した走査型電子顕微鏡写真を図４に示す。図中、黒く表れている比較的小さな点は、β−ＴＣＰの微粉である。
【００２６】
また、比較例の測定結果を図５（ａ）に、本実施例の測定結果を図５（ｂ）に示す。図５（ａ），（ｂ）は、横軸が培養（インキュベート）時間を示し、縦軸がルミノールの発光強度を相対光単位で示している。
図５（ａ），（ｂ）から、顆粒の量の増加とともに破骨細胞の貪食能が増加することが確認された。また、粒径が７５〜１２５μｍの顆粒よりも、粒径が２５〜７５μｍの顆粒を使用した方が効率良く破骨細胞によるβ−ＴＣＰの貪食が進むことが確認された。これにより、本発明において、２５〜７５μｍの粒径の顆粒を使用することにより、破骨細胞によってカテプシンＫを効率的に発現させることができることが示唆された。
【００２７】
［実施例３］
次に、実施例１に係るβ−ＴＣＰ多孔体のブロック体および顆粒を用いて免疫細胞活性化剤を製造し、製造された免疫細胞活性化剤を生体内に移植し、カテプシンＫの発生に対する効果を評価した。
【００２８】
まず、ハイブリット犬から血液５０ｍｌを採取し、採取した血液からフィルタによって有核細胞を分離した。分離した有核細胞と実施例１の顆粒とを、有核細胞の細胞数が顆粒１ｍｇに対して５×１０５以上になるように混合して混合物を生成した。そして、生成した混合物をブロック体の凹部に充填することにより、本実施例に係る免疫細胞活性化剤Ｉを製造した。
また、実施例１の顆粒と有核細胞との混合物からなる本実施例に係る免疫細胞活性化剤ＩＩを製造した。
【００２９】
製造された免疫細胞活性化剤Ｉ，ＩＩを、ハイブリット犬の顎骨に形成した骨欠損部に移植した。移植から８週間経過後に顎骨から移植部位の組織を採取し、採取した組織の病理切片を作成してカテプシンＫを免疫染色し、光学顕微鏡により観察した。
本実施例に対する比較例として、実施例１の顆粒のみからなる移植材を移植した場合についても、同様にして移植部位の病理切片を作成してカテプシンＫを染色し観察した。
【００３０】
図６は、本実施例に係る免疫細胞活性化剤Ｉの凹部のＨＥ染色画像である。全体にわたって有核細胞（黒い小さな点状のもの）の分布が確認された。画像中の比較的大きな球状のものが、顆粒である。図７は、図６と略同一部分のカテプシンＫ染色画像である。全体にわたってカテプシンＫ（図中、矢印参照。）の分布が確認された。図８は、免疫細胞活性化剤Ｉのブロック体のカテプシンＫ染色画像である。凹部に比べてカテプシンＫが多く分布しており、凹部において顆粒を貪食した破骨細胞がブロック体に移動してさらにβ−ＴＣＰを貪食し続けることが確認された。
【００３１】
図９は、本実施例に係る免疫細胞活性化剤ＩＩの移植部位におけるカテプシンＫ染色画像である。顆粒の位置にカテプシンＫの発現が多く確認されたが、その発現量は免疫細胞活性化剤Ｉの場合と比べると５〜６割程度に留まっていた。
図１０は、比較例の移植材の移植部位におけるカテプシン染色画像である。カテプシンＫの発現がわずかに確認されたが、本実施例に係る免疫細胞活性化剤Ｉ，ＩＩと比べると優位に少なかった。
【００３２】
以上の観察の結果から、有核細胞と顆粒とを混合して移植することにより移植後のカテプシンＫの発現量が増大すること、さらに、有核細胞と顆粒との混合物の周辺にブロック体が存在することによりカテプシンＫの発現量が一層増大することが確認された。
【符号の説明】
【００３３】
１  免疫細胞活性化剤
２  ブロック体
２ａ  凹部
３  混合物（β−ＴＣＰ、顆粒、有核細胞）
Ａ  破骨細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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