(57)【要約】【課題】糖化率を向上させ、効率よく多糖類から分解糖を製造することのできる方法の提供。【解決手段】次の工程（１）〜（３）：（１）多糖類に圧縮せん断応力を加えて粉砕し、多糖類の粉砕物を得る工程、（２）多糖類の粉砕物を水の存在下、１８５〜２３０℃で加熱処理する工程、（３）加熱処理後の反応物から固液分離により固体部を得、これに加水分解酵素を作用させる工程、を包含する、単糖類、二糖類、及び／又はオリゴ糖の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程（１）〜（３）：
（１）多糖類に圧縮せん断応力を加えて粉砕し、多糖類の粉砕物を得る工程、
（２）多糖類の粉砕物を水の存在下、１８５〜２３０℃で加熱処理する工程、
（３）加熱処理後の反応物から固液分離により固体部を得、これに加水分解酵素を作用させる工程、
を包含する、単糖類、二糖類、及び／又はオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
１８５〜２３０℃で加熱処理する時間が１０分〜９０分である、請求項１記載の単糖類、二糖類、及び／又はオリゴ糖の製造方法。
【請求項３】
振動ロッドミルを用いて多糖類に圧縮せん断応力を加えるものである、請求項１又は２記載の単糖類、二糖類、及び／又はオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
加熱処理を水の飽和蒸気圧以上の圧力で行う、請求項１〜３のいずれか１記載の単糖類、二糖類、及び／又はオリゴ糖の製造方法。
【請求項５】
多糖類としてセルロース含有バイオマスを用いる、請求項１〜４のいずれか１項記載の単糖類、二糖類、及び／又はオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖類、特にバイオマスから単糖類、二糖類、及び／又はオリゴ糖（以下、総称して「分解糖」ともいう）を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石資源に代えてセルロース系、デンプン系、或いは糖質系のバイオマスからエタノールや乳酸等の有用物質を製造する技術の開発が望まれている。とりわけ、非食糧資源であるセルロース系バイオマスを有効利用する技術への関心が高まっている。
バイオマスからのエタノール等の製造は、バイオマスを糖化工程においてグルコース等の糖に分解した後、これを発酵工程においてエタノール等に変換することにより行うことができる。糖化は、硫酸等を用いる酸糖化と酵素糖化に大別される。
酵素糖化は、酸糖化に比して緩和な条件で加水分解できる等の利点があるが、特にセルロース系バイオマスを利用する場合、反応速度が非常に遅く、糖化率の向上が大きな課題になっている。
【０００３】
糖化率向上のための技術として、糖化工程に先立って予めバイオマスを前処理する方法が検討されている。前処理方法としては、例えば、硫酸法、有機溶媒法、水熱処理法、機械的破砕等が知られている。
また、これらの方法を組み合わせてエタノール原料を効率的に製造する方法も検討され、例えば、リグノセルロースを含有する原料を粗粉砕する粗粉砕工程、粗粉砕物を微粉砕する微粉砕工程、微粉砕物を水熱処理する水熱処理工程、及び水熱処理物を脱水する脱水工程を包含する方法（特許文献１）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−１２４９７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記特許文献１には、微粉砕工程で得た微粉砕物を水熱処理する際、糖の過分解を抑えるため、約０．９８ＭＰａ（飽和水蒸気として約１８０℃以下）以下が好ましい旨の記載がある。しかしながら、前記特許文献１には水熱処理の実施について開示がなく、本発明者が特許文献１記載の方法に従ってセルロース系バイオマスの粉砕工程、水熱処理工程を行い、次いで実際に酵素糖化工程を行ったところ、水熱処理工程後のセルロース収率は高いものの、酵素糖化工程で反応が進みにくく、全体として分解糖の生成量が少なくなる場合があることが判明した。一方、セルロース系バイオマスを単に機械的破砕した後に酵素糖化に供しても、経時的に反応速度が低下し、十分な糖化率が得られない場合がある。
従って、本発明の課題は、糖化率を向上させ、効率よく多糖類から分解糖を製造することのできる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討したところ、多糖類を特定の方法で粉砕した後に、水の存在下、１８５〜２３０℃で加熱処理すれば、特許文献１のような低い温度で加熱処理した場合より加熱処理後のセルロース収率は低いにもかかわらず、その後の酵素糖化工程では全く意外にも糖化率が顕著に向上し、最終的に分解糖の収率が高くなることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の工程（１）〜（３）：
（１）多糖類に圧縮せん断応力を加えて粉砕し、多糖類の粉砕物を得る工程、
（２）多糖類の粉砕物を水の存在下、１８５〜２３０℃で加熱処理する工程、
（３）加熱処理後の反応物から固液分離により固体部を得、これに加水分解酵素を作用させる工程、
を包含する、単糖類、二糖類、及び／又はオリゴ糖の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、糖化率を向上させることができ、分解糖を効率よく製造することができる。本発明方法は、セルロース系のバイオマスにも適用可能であり、バイオマスからのエタノ−ル等有用物質の製造を高効率化する技術として期待できる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
工程（１）は、多糖類に圧縮せん断応力を加えて粉砕して、多糖類の粉砕物を得る工程である。
本発明で用いられる多糖類としては、例えば、セルロース、ヘミセルロース、キシログルカン、ペクチン、澱粉、マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、キチン、キトサン、イヌリン、アルギン酸、寒天、フコイダン、ラミナリン、β−グルカン、プルラン等の天然多糖又はこれらの誘導体が挙げられる。これらは単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。なかでも、安価かつ分解後の発酵生産により有用物質に変換可能である点から、セルロース、ヘミセルロース、キチン、キトサンが好ましく、特にセルロース、ヘミセルロースが好ましい。本発明で用いられる多糖類の分子量は、特に限定されないが、一般的には１，０００以上５，０００，０００以下であることが好ましい。
【００１０】
また、本発明における多糖類として、前記多糖類を含む原料、例えば、バイオマスを用いることもできる。バイオマスとは、生物由来の有機資源で、化石資源を除いたものである。バイオマスとしては、セルロース系、デンプン系、或いは糖質系のバイオマスが挙げられ、これらは単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
なかでも、資源の有効活用の点から、セルロースを含有するセルロース系バイオマスを用いることが好ましい。
【００１１】
セルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを主成分とするものであり、例えば、綿、木材系パルプ、ケナフ、麻、小径木、間伐材、おが屑、木屑、古紙、新聞紙、包装紙、ティッシュペーパー、トイレットペーパー、ダンボール等の木質系；バガス、スイッチグラス、エレファントグラス、稲ワラ、ムギワラ等の草木系のバイオマスが挙げられる。また、デンプン系バイオマスとしては、例えば、米、麦、トウモロコシ、イモ等が挙げられ、糖質系バイオマスとしては、サトウキビ、テンサイ、海藻、エビ殻、カニ殻等の糖質系バイオマスが挙げられる。
【００１２】
多糖類に圧縮せん断応力を加えて粉砕するには、圧縮せん断式粉砕機を用いることができる。圧縮せん断式粉砕機は、圧縮応力とせん断応力の両方を付加できる機械で、例えば、振動ロッドミル、振動ボールミル等が挙げられる。なかでも、糖化率及び生産効率の点から、振動ロッドミルが好ましい。ロッドは、特に制限されないが、外径が０．１〜１００ｍｍ、さらに０．５〜５０ｍｍのものが好ましい。また、ロッドの充填率（振動ミルの攪拌部の容積に対するロッドの見かけの体積）は、機種により異なるが、１０〜９７％が好ましく、１５〜９５％がより好ましい。
粉砕時間、粉砕機の回転数等の粉砕条件は、所望の粉砕物を形成するために適宜設定すればよい。
【００１３】
粉砕物の平均粒径は、０．００２〜０．３ｍｍ、さらに０．００５〜０．２ｍｍ、特に０．０１〜０．０５ｍｍであることが糖化率及び生産効率の点から好ましい。なお、本明細書において平均粒径とは、レーザー回折散乱法により体積基準に従って求められる平均値をいう。
【００１４】
また、多糖類は、圧縮せん断応力を加えて粉砕する前に、予め粗粉砕しておいてもよい。粗粉砕する方法は特に制限されず、例えば、粉砕機として、グラインダー・ロールカッター等のカッター式粉砕機、ハンマーミル等の衝撃式粉砕機、コロイドミル等の摩砕式粉砕機等を用いることができる。
粗粉砕は、多糖類の平均粒径が、１〜１５ｃｍ、特に３〜５ｃｍとなるように行うのが好ましい。
【００１５】
工程（２）は、工程（１）より得られた粉砕物を水の存在下、１８５〜２３０℃で加熱処理する工程である。加熱処理方法としては、特に制限されず、公知の方法を適用できる。バッチ攪拌式でも連続流通式でもよい。加熱処理の際に用いる水は、例えば、水道水、蒸留水、イオン交換水、精製水等が例示される。
粉砕物はスラリー状にして用いるのが好ましく、スラリー中の多糖類の含有量は、流動性の点から、１〜４００ｇ／Ｌ、更に５〜３００ｇ／Ｌ、特に８〜２００ｇ／Ｌとするのが好ましい。スラリーとしては、水、各種緩衝液等が挙げられる。
【００１６】
加熱処理の温度は、１８５℃〜２３０℃の範囲であるが、さらに１８５〜２２０℃、特に１９０〜２１０℃であるのが糖化率及び生産効率の点から好ましい。加熱の手段は、例えば、水蒸気、電気が挙げられる。
【００１７】
１８５℃〜２３０℃の範囲で加熱処理する時間は、反応方法や多糖類の種類によって異なるが、分解率及び生産効率の点から、１０〜９０分が好ましく、更に１５〜８５分、特に２０〜８０分が好ましい。なお、加熱処理する時間とは、規定されている温度範囲に含まれる状態の時間の合計を意味し、温度が当該範囲に含まれている限り、温度が変化しても構わない。従って、昇温及び降温の時間も、当該温度範囲に含まれる限り加熱処理する時間に含むものとする。また、温度が変化した結果、断続的に当該温度範囲に含まれる場合は、当該温度範囲に含まれる時間の総計をもって当該時間とする。
【００１８】
また、加熱処理時の圧力は、水の飽和蒸気圧又はそれ以上に設定するのが好ましく、更に１．１〜１０．０ＭＰａ、特に１．２〜８．０ＭＰａ、殊更１．３〜６．０ＭＰａが好ましい。加圧する場合はガスを用いてもよく、用いられるガスは、例えば、不活性ガス、水蒸気、窒素ガス、ヘリウムガス等が挙げられる。連続流通式の場合はバルブなどで出口流路を絞ることにより圧力を設定してもよい。
【００１９】
工程（３）は、加熱処理後の反応物から固液分離により固体部を得、これに加水分解酵素を作用させる工程である。反応物から液体部を除去することで、過分解物を除去することができ、後の発酵工程で糖過分解物による発酵阻害を防ぐことができる。
加熱処理後の反応物から固液分離により固体部を得る方法としては、特に制限されず、必要に応じ冷却しながら、ろ過、遠心分離、沈降分離により行うことができる。冷却温度は、１００℃以下、好ましくは８０℃以下が好ましい。
【００２０】
本発明で用いられる加水分解酵素としては、多糖類に対して加水分解活性を有する酵素であれば特に制限はないが、例えば、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、グルカナーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、アガラーゼ、ラクトーゼ、ムタナーゼ、キチナーゼ、キトサナーゼ等が挙げられる。
加水分解酵素は、その起源に限定はなく、さらに、遺伝子組み換え技術、部分加水分解等による人工酵素であってもよい。
また、加水分解酵素の形態は特に限定されず、酵素蛋白質の乾燥物、酵素蛋白質を含む粒子、及び酵素蛋白質を含む液体等を用いることができる。
【００２１】
加水分解酵素の使用量は、加水分解反応の条件、多糖類の種類等によって異なるが、例えば、セルラーゼの場合、固体部１ｇあたり１〜２００ＦＰＵが好ましく、特に５〜５０ＦＰＵが好ましい。ここでＦＰＵ活性は以下に示すＩＵＰＡＣ法により測定される。まず、濾紙（ワットマンＮｏ．１）５０ｍｇを基質とし、これに酵素液０．５ｍＬと０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）１．０ｍＬを加え、５０℃で１．０時間酵素反応を行った後、ジニトロサリチル酸試薬３．０ｍＬを加え、１００℃で５．０分間加熱し発色させる。冷却後、これにイオン交換水２０ｍＬを加え５４０ｎｍの波長で比色定量する。１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１ユニット（ＦＰＵ）とする。
【００２２】
多糖類と加水分解酵素との反応は、使用する酵素の特性に合わせて温度やｐＨを選択することが可能であるが、例えば、セルラーゼを用いる場合、ｐＨ３〜８、特にｐＨ４〜７とすることが好ましく、温度は１０〜８０℃、特に２０〜６０℃とすることが好ましい。
【００２３】
反応時間は、多糖類の種類等によって異なるが、糖化率及び生産効率の点から、例えば、１〜２４０時間が好ましく、更に２〜２００時間、特に３〜１４０時間が好ましい。
【００２４】
かくして、加水分解反応により得られる単糖類としては、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース等が挙げられる。また、二糖類としては、セロビオース、マルトース、ジ−Ｎ−アセチルキトビオース等が挙げられ、オリゴ糖としては３〜１０の単糖単位を有するものをいい、例えば、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、セロヘキサオース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、トリ−Ｎ−アセチルキトトリオース、テトラ−Ｎ−アセチルキトテトラオース、ペンタ−Ｎ−アセチルキトペンタオース、ヘキサ−Ｎ−アセチルキトヘキサオース等が挙げられる。
【００２５】
本発明方法によれば、６０〜１００％、更に７０〜１００％、特に８０〜１００％の糖化率で多糖類から分解糖を製造することができる。なお、糖化率とは、加水分解反応により生成した水溶性糖（グルコースに代表される単糖類及び二糖類）の合計質量を、加水分解反応に供した原料に含まれる多糖類の質量で割った値を云う。
また、全工程を通した分解糖の収率（歩留まり）は６０％以上、更に６５％以上、特に７０％以上であることが製造効率の点から好ましい。
なお、前述したように、多糖類にはセルロースをはじめとして多くのものが例示され、さらにセルロースには結晶性の高いα-セルロースのほかに、ヘミセルロースとして分類される変性したβ-セルロースとγ-セルロースもある。本願では、多糖類の収率、糖化率、及び分解糖収率について、一般的にバイオマス中のセルロース純度として用いられるα-セルロースを基準とする。α-セルロース量の測定方法は実施例に記載した。
【００２６】
得られる分解糖は、これら分解糖を糖源として、微生物発酵を行ったり、化学変換したりすることにより、エタノール、ポリ乳酸、アミノ酸、キシリトールやエリスリトール等の有用物質を製造することができる。
【実施例】
【００２７】
＜α−セルロース量の測定＞
ソッスレー抽出により得られる脱脂品約２．５ｇに蒸留水１５０ｍＬ、亜塩素酸ナトリウム１．０ｇ、酢酸０．２ｍＬを加え、８０℃の湯浴上で加熱する。亜塩素酸ナトリウム、酢酸の添加と添加後の１時間加熱を、さらに２回行った。内容物をろ過し、ろ過残渣は水、アセトンで洗浄後、乾燥させた。得られた乾燥品１ｇを１７．５％水酸化ナトリウム水溶液２５ｍＬに加え、３０分間放置した。３０分後、水２５ｍＬを加え、１分間攪拌後、５分間静置した。内容物をろ過し、ろ過残渣を１０％酢酸水および煮沸水で洗浄後、乾燥させた。得られた乾燥残渣の重量をα−セルロース量とした。
【００２８】
＜水溶性糖濃度（グルコース濃度、セロビオース濃度）の測定＞
日立製作所製高速液体クロマトグラフを用い、昭和電工製カラムＡｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ  （４．５ｍｍφ×２５０ｍ）を装着し、カラム温度２０℃でグラジエント法により行った。移動相Ａ液はアセトニトリル、Ｂ液は３０％メタノール水とし、１．００ｍＬ／分で送液した。グラジエント条件は以下のとおりである。
時間（分）    Ａ液（％）      Ｂ液（％）
０            ２０          ８０
４５            ５０          ５０
４５．１        ２０          ８０
５５            ２０          ８０
試料注入量は５μＬ、検出はＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製コロナＣＡＤ検出器を用いた。
【００２９】
＜体積基準平均粒径の測定＞
レーザー回折式粒度分布計（ベックマン・コールター社製、ＬＳ  １３  ３２０）により測定した。
【００３０】
＜α−セルロース収率の算出＞
α−セルロース収率は次式（ｉ）により算出した。
α−セルロース収率（％）＝｛工程（２）で得られた加熱処理後の反応物を固液分離して得た固体部に含まれるα−セルロースの質量｝／｛工程（２）に供した原料多糖類の粉砕物に含まれるα−セルロースの質量｝×１００      （ｉ）
【００３１】
＜糖化率の算出＞
糖化率は次式（ｉｉ）により算出した。
糖化率（％）＝｛（反応後の水溶性糖質量）−（反応前の水溶性糖質量）｝／α−セルロースの質量×１００      （ｉｉ）
【００３２】
＜分解糖収率の算出＞
上記α−セルロース収率と糖化率を乗じることで分解糖収率（％）を算出した。
【００３３】
実施例１
乾燥した稲ワラ１００ｇをグラインダーで体積基準平均粒径が３〜５ｃｍとなるように予備粉砕した。振動ロッドミル（（株）中央化工機製ＭＢ−１、容器全容積３．５Ｌ）に外径３０ｍｍのロッドを１３本充填し（充填率７４％）、予備粉砕した稲ワラ１００ｇを仕込み、１，２００ｃ／ｍｉｎで１０分間振動することにより、粉砕稲ワラを得た。体積基準平均粒径は０．０４ｍｍであった。
この粉砕稲ワラ（α−セルロース含有量３２質量％）１０ｇと水９０ｇを混合したスラリーを、バッチ式水熱処理装置（日東高圧製Ｓｔａｒｔ２００Ｎｅｗ  Ｑｕｉｃｋ、容積１８０ｍＬ）に入れ、上部空間を窒素置換し、加熱した。昇温速度は３．４℃／分とし、２００℃に到達後、直ちに冷却した。１８５℃〜２３０℃にあった時間は３０分であった。室温まで冷却後、ろ過により固体部（固形分残渣）を得た。残渣の乾燥質量が５質量％になるように分取し、ｐＨ５．０の０．１Ｍクエン酸緩衝溶液を加えて全体を１０ｇにした。これにセルラーゼ（ノボザイムズ製セルクラスト１．５Ｌ）を６２．５μＬ添加して糖化した（残渣の乾燥重量1ｇあたりの添加は８．７５ＦＰＵ）。糖化反応は５０℃の恒温槽中、１１０ｒ／ｍｉｎで振とうしながら４８時間行った。反応終了後、液部を０．２μｍのフィルターでろ過し、水溶性糖濃度を測定した。水溶性糖としては、セロビオース、グルコースが測定された。
【００３４】
実施例２
水熱処理において２００℃に到達後、２００℃で３０分保持した後に冷却した以外は実施例１と同様にして水溶性糖を得た。１８５℃〜２３０℃にあった時間は６５分であった。
【００３５】
実施例３
バッチ式水熱処理装置をあらかじめ窒素ガスで１ＭＰａに加圧した以外は実施例１と同様にして水溶性糖を得た。
【００３６】
比較例１
水熱処理において、１８０℃に到達後、直ちに冷却した以外は実施例１と同様にして水溶性糖を得た。
【００３７】
比較例２
実施例１で得た粉砕稲ワラを、水熱処理せずに酵素糖化した。
【００３８】
比較例３
岩谷産業（株）製グラインダー（ラボミルサー８００ＤＧ、容積２６０ｍＬ）に乾燥した稲ワラ４０ｇを仕込んで２０，０００ｒ／ｍｉｎで１０分間攪拌することにより、粉砕稲ワラを得た。体積基準平均粒径は０．２７ｍｍであった。この粉砕稲ワラ（α−セルロース含有量３２質量％）１０ｇと水９０ｇを混合し、その後実施例２と同様にして加熱処理と酵素糖化処理を行い、水溶性糖を得た。
比較例４
２０，０００ｒ／ｍｉｎで１２０分間攪拌した以外は比較例３と同様にして粉砕稲ワラを得た。体積基準平均粒径は０．０５ｍｍであった。この粉砕稲ワラ（α−セルロース含有量３２質量％）１０ｇと水９０ｇを混合し、その後実施例２と同様にして加熱処理と酵素糖化処理を行い、水溶性糖を得た。
各実施例及び比較例の条件と結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
2012005359.tif 000002
【００４０】
表１から明らかなように、セルロースを振動ロッドミルで粉砕後、１８５〜２３０℃で加熱処理した実施例１〜３では、いずれも糖化率が高く、全工程を通した分解糖の収率は高かった。これに対し、１８０℃未満で加熱処理した比較例１、及び振動ロッドミルの代わりにグラインダーを用いて粉砕した比較例３及び４では、加熱処理後のα−セルロース収率が高いものの、糖化反応後の糖化率が低く、全工程を通した分解糖の収率は低いという結果であった。また、加熱処理をしなかった比較例２は糖化率が低く、分解糖の収率も低いという結果であった。