(57)【要約】【課題】細胞懸濁液から異物を除去するとともに、細胞の配列及び観察を行うことにより効率的に細胞懸濁液に含まれる循環腫瘍細胞の検出を行う。【解決手段】細胞が含まれる細胞懸濁液が上層に、前記細胞懸濁液及び前記細胞よりも比重の大きい第２液体が下層となるように貯留槽に注ぎ、  前記貯留槽の上方から、前記細胞懸濁液と前記第２液体の界面を撮影し、  前記撮影により得られた画像から前記細胞に含まれる稀少細胞の有無又は個数の検出を行うことを特徴とする細胞検出方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が含まれる細胞懸濁液が上層に、前記細胞懸濁液及び前記細胞よりも比重の大きい第２液体が下層となるように貯留槽に注ぎ、
前記貯留槽の上方から、前記細胞懸濁液と前記第２液体の界面を撮影し、
前記撮影により得られた画像から前記細胞に含まれる稀少細胞の有無又は個数の検出を行うことを特徴とする細胞検出方法。
【請求項２】
前記貯留槽には、前記第２液体を最初に注ぎ、注がれた前記第２液体の上方に細胞懸濁液を注ぐことを特徴とする請求項１に記載の細胞検出方法。
【請求項３】
前記貯留槽には底部に注入口を備えており、細胞懸濁液を最初に注ぎ、前記注入口により前記細胞懸濁液の下方から前記第２液体を注入することを特徴とする請求項１に記載の細胞検出方法。
【請求項４】
細胞が含まれる細胞懸濁液が注入された貯留槽において、前記細胞が浮かぶ方向の電界を形成し、
前記細胞懸濁液の上面に浮上した前記細胞を撮影し、
前記撮影により得られた画像から前記細胞に含まれる稀少細胞の有無又は個数の検出を行うことを特徴とする細胞検出方法。
【請求項５】
前記細胞は、負に帯電しており、前記電界は上方が正となる方向に形成されていることを特徴とする請求項４に記載の細胞検出方法。
【請求項６】
上方に設けられた透明電極板と、下方に設けられた下電極板と、を有する貯留槽と、
前記透明電極板と前記下電極板との間に電界を形成する電源と、
前記透明電極板の上方に設けられた撮影部と、
前記撮影部から得られた画像を解析する解析部と、
を有し、
前記貯留槽に注入された細胞が含まれる細胞懸濁液に前記電源により電界を形成し、形成した電界により前記細胞を浮上させ、浮上させた前記細胞を前記撮影部により撮影し、撮影し得られた画像を前記解析部により解析することにより前記細胞に含まれる稀少細胞の有無又は個数の検出を行うことを特徴とする細胞検出装置。
【請求項７】
前記細胞は、負に帯電しており、前記電源により上方が正となる方向の電界を形成することを特徴とする請求項６に記載の細胞検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、血液中における細胞、特に循環腫瘍細胞（ＣＴＣ：Circulating tumor cell）を検出するために、細胞を配列し配列した細胞の中から稀少細胞を検出する細胞検出方法及び細胞検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌患者の血液中においては循環腫瘍細胞が存在する。循環する血液中の循環腫瘍細胞の有無を検出することにより、癌に罹っているか否かあるいは、癌患者に対する治療の効果を判断することができる。
【０００３】
循環腫瘍細胞の濃度は非常に低く、１０７〜１０８個の細胞中にわずか数個の低濃度で存在する。例えば血液１０ｍｌのサンプルに対して含まれる循環腫瘍細胞は数個程度である。
【０００４】
特許文献１では、細胞から循環腫瘍細胞を分離するために、チキソトロープ物質を含む複数種類の密度の異なる物質を容器にいれて遠心分離を実施、チキソトロープ物質よりも上の物質を取り出すことにより、循環腫瘍細胞その他のチキソトロープ物質よりも比重が小さい物質を分離する手段が開示されている。
【０００５】
特許文献２では、細胞自体がマイナスに荷電していることを利用し、細胞が接着した接着部をマイナスに荷電することにより、細胞を損傷させずに剥離する手段が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００８−５２９５４１号公報
【特許文献２】特許第３４９４５３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１では、循環腫瘍細胞を分離させることを目的とするものである。また特許文献２では、同極性による静電気的な反発力を利用して細胞を剥離させることを目的とするものである。これらはいずれも複数種類の細胞が混在した細胞懸濁液から対象となる循環腫瘍細胞等の細胞を分離するものであるが、分離の手間がかかるということと、そもそも分離が不十分になる虞がある。また全細胞を移動させるとともに配列、観察を行うものではない。
【０００８】
本願発明は分離工程の一部を省略して細胞懸濁液に含まれる全細胞（特に白血球及び循環腫瘍細胞）の移動と同時に顕微鏡観察に適切な平面状態を作り出すことを目的とするとともに、細胞懸濁液から異物を除去して、全細胞の配列及び観察を行うことにより効率良く細胞懸濁液に含まれる循環腫瘍細胞の検出を行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的は、下記に記載する発明により達成される。
【００１０】
１．細胞が含まれる細胞懸濁液が上層に、前記細胞懸濁液及び前記細胞よりも比重の大きい第２液体が下層となるように貯留槽に注ぎ、
前記貯留槽の上方から、前記細胞懸濁液と前記第２液体の界面を撮影し、
前記撮影により得られた画像から前記細胞に含まれる稀少細胞の有無又は個数の検出を行うことを特徴とする細胞検出方法。
【００１１】
２．前記貯留槽には、前記第２液体を最初に注ぎ、注がれた前記第２液体の上方に細胞懸濁液を注ぐことを特徴とする前記１に記載の細胞検出方法。
【００１２】
３．前記貯留槽には底部に注入口を備えており、細胞懸濁液を最初に注ぎ、前記注入口により前記細胞懸濁液の下方から前記第２液体を注入することを特徴とする前記１に記載の細胞検出方法。
【００１３】
４．細胞が含まれる細胞懸濁液が注入された貯留槽において、前記細胞が浮かぶ方向の電界を形成し、
前記細胞懸濁液の上面に浮上した前記細胞を撮影し、
前記撮影により得られた画像から前記細胞に含まれる稀少細胞の有無又は個数の検出を行うことを特徴とする細胞検出方法。
【００１４】
５．前記細胞は、負に帯電しており、前記電界は上方が正となる方向に形成されていることを特徴とする前記４に記載の細胞検出方法。
【００１５】
６．上方に設けられた透明電極板と、下方に設けられた下電極板と、を有する貯留槽と、
前記透明電極板と前記下電極板との間に電界を形成する電源と、
前記透明電極板の上方に設けられた撮影部と、
前記撮影部から得られた画像を解析する解析部と、
を有し、
前記貯留槽に注入された細胞が含まれる細胞懸濁液に前記電源により電界を形成し、形成した電界により前記細胞を浮上させ、浮上させた前記細胞を前記撮影部により撮影し、撮影し得られた画像を前記解析部により解析することにより前記細胞に含まれる稀少細胞の有無又は個数の検出を行うことを特徴とする細胞検出装置。
【００１６】
７．前記細胞は、負に帯電しており、前記電源により上方が正となる方向の電界を形成することを特徴とする前記６に記載の細胞検出装置。
【発明の効果】
【００１７】
本願発明によれば、細胞懸濁液に含まれる細胞を同一高さに浮上させることにより、異物の除去と、細胞の配列及び観察を行うことが可能となり、ひいては効率よく細胞懸濁液に含まれる循環腫瘍細胞の検出を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施形態に係る細胞検出方法に用いられる細胞検出装置の概略構成を示す図である。
【図２】貯留槽１０の拡大断面図である。
【図３】送液手順を説明する模式図である。
【図４】第２の実施形態の細胞検出方法に用いる細胞検出装置の概略構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明を実施の形態に基づいて説明するが、本発明は該実施の形態に限られない。
【００２０】
図１は、実施形態に係る細胞検出方法に用いられる細胞検出装置の概略構成を示す図である。
【００２１】
図１に示す細胞検出装置は、撮影部２５、画像解析部２０、送液ポンプｐ１、供給槽１６、上流側流路ｒ１、貯留槽１０、下流側流路ｒ２、排出槽１７、経路中に配置されたバルブｂ１、ｂ２を備える。
【００２２】
供給槽１６に供給された血液その他の細胞懸濁液は、バルブｂ１を開放してから送液ポンプｐ１を作動させることにより上流側流路ｒ１へ搬送される。上流側流路ｒ１を搬送された細胞懸濁液は、貯留槽１０に供給される。貯留槽１０では後述の方法により細胞を配列し、配列した細胞は上方に設けた撮影部２５により撮影する。撮影により得られた画像データは画像解析部２０により画像解析される。ここでいう配列とは、理想的には全ての細胞が単層かつ高密度で配置されていることであり、各細胞が重ならずに高密度で配置させることができれば、これを撮影することにより全て細胞の形状を確認することができる。画像解析としては例えば得られた画像データに対してコントラスト調整、２値化処理、エッジ抽出、等の処理により細胞の形状を検出する。そしてそれらの形状の特徴から白血球細胞及び循環腫瘍細胞その他の稀少細胞（rare cell）の選別を行って稀少細胞の有無もしくは個数の検出を行う。撮影部２５から撮影される側の貯留槽１０の上方面積（開口面積）としては、血液その他の細胞懸濁液中に含まれる全細胞を平面上に重なることなく展開する際に必要な面積と同等もしくはそれよりも広い面積とすることが好ましく、本実施形態では例えば１００ｍｍ□の０．０１ｍ２である。
【００２３】
貯留槽１０の下流側には下流側流路ｒ２が接続されておりバルブｂ２を開放してから、送液ポンプｐ１を作動させることにより、貯留槽１０の内部の細胞懸濁液は、下流側流路ｒ２を経由して排出槽１７に排出される。
【００２４】
図２は、貯留槽１０の拡大断面図である。貯留槽１０はその底部に上流側流路ｒ１からの注入口１０１が設けられている。図２に示す実施形態では貯留槽１０は密閉されておらずその上方は開放されている。このような構成であることからバルブｂ２を閉じた状態で送液ポンプｐ１を作動させることにより貯留槽１０の内部に液体が供給される。上方の開放状態を避けるのであれば空気抜きの穴を設けた上で撮影部２５により撮影可能なように透明の材料により形成された蓋を被せるようにしても良い。
【００２５】
図２においては貯留槽１０の内部には、上層に細胞懸濁液ｌｑ１が、それよりも下層に第２液体ｌｑ２が注がれている。そして、細胞懸濁液ｌｑ１の底面であって第２液体ｌｑ２との境界には、白血球細胞ｃが配列されている状態を示している。送液手順については後述する。なお、白血球細胞ｃ等の細胞には循環腫瘍細胞が混在している場合があるが、細胞１０７〜１０８個に数個の割合と非常に少ないので、図２及びこれ以降の図では循環腫瘍細胞の表示は省略している。
【００２６】
細胞懸濁液ｌｑ１は、例えばＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に循環腫瘍細胞と白血球細胞ｃを懸濁させたものであり比重としては１．０２〜１．０４である。細胞懸濁液ｌｑ１全体の比重は白血球細胞ｃの比重１．０７〜１．０９及び循環腫瘍細胞の比重１．０４〜１．０７０よりも小さい。第２液体ｌｑ２は、細胞懸濁液ｌｑ１、白血球細胞ｃ及び循環腫瘍細胞よりも比重が大きい液体であり、例えば比重１．１３０のFicoll-Paque PLUS（ＧＥ社製）がある。また想定される異物（不純物）としては磁気ビーズ（ＭＧ２０５：ＪＳＲ社製）であり、第２液体ｌｑ２の比重は、当該異物の比重１．１３０よりも小さいものを使用している。なお、図２においては、下流側流路ｒ２は図示省略している。
【００２７】
図３は、送液手順を説明する模式図である。図３（ａ）から図３（ｄ）は図２に対応する貯留槽１０の断面図であり、図３（ａ）から図３（ｄ）まで時系列的に表示したものである。
【００２８】
図３（ａ）では、上流側流路ｒ１側から細胞懸濁液ｌｑ１を送液する。送液する量としては、貯留槽１０の内部で高さ１．０〜２．０ｍｍとなるように例えば１０ｍｌ〜２０ｍｌの量を送液する。細胞懸濁液ｌｑ１には、白血球細胞ｃとともに、前処理により除去できずに残っている磁性ビーズ等の異物ａｐが僅かながら混じっている可能性がある。
【００２９】
図３（ｂ）は、図３（ａ）に続いて上流側流路ｒ１側から第２液体ｌｑ２を送液する。第２液体ｌｑ２は底部の注入口１０１から細胞懸濁液ｌｑ１の下方から、静かに注ぐことにより、両者は混ざらずに細胞懸濁液ｌｑ１の下方に第２液体ｌｑ２が分離した状態で存在することになる。送液速度としては、好ましくは５ｍｌ／ｍｉｎ〜１ｍｌ／ｍｉｎである。
【００３０】
図３（ｃ）は、図３（ｂ）に引き続き、所定量の第２液体ｌｑ２の送液を終了した状態を示している。送液する所定量としては、貯留槽１０の内部で高さ３〜６ｍｍとなるようにしている、例えば３０ｍｌ〜６０ｍｌである。
【００３１】
図３（ｄ）は、図３（ｃ）の状態から数分間静置させた後の状態を示している。循環腫瘍細胞及び白血球細胞ｃは、細胞懸濁液ｌｑ１よりも比重が大きく、かつ第２液体ｌｑ２よりも比重が小さいので、２つの液体の境界面に浮いた状態で同一高さに整列されることになる。一方、磁気ビーズ等の第２液体ｌｑ２よりも比重が大きい異物ａｐは、貯留槽１０の底面に沈殿することになる。
【００３２】
このように図３のような手順で、貯留槽１０の内部に液体を送液することにより、細胞懸濁液ｌｑ１に含まれる異物ａｐを除去できるとともに、循環腫瘍細胞と白血球細胞ｃの整列されている高さを揃えることが可能となる。特に２つの液体の境界面に揃えることができるので高さ方向のばらつきが少なく、撮影部２５から撮影する際に焦点深度が浅くても問題なく撮影することが可能となる。
【００３３】
なお、液体を注ぐ手順としては、最初に第２液体ｌｑ２を貯留槽１０に注いでおき、その上方に細胞懸濁液ｌｑ１を注ぐようにしても、図３（ｄ）と同様の状態とすることができる。
【００３４】
［第２の実施形態］
図４は、第２の実施形態の細胞検出方法に用いる細胞検出装置の概略構成を示す図である。図４に示す細胞検出装置は、撮影部２５、画像解析部２０、貯留槽１０ｂ、電源ＰＳを備えている。そして貯留槽１０ｂは、上方には透明電極板１２１、下方には下電極板１２２が設けられている。また貯留槽１０ｂの内部には、白血球細胞ｃが含まれた細胞懸濁液ｌｑ１が注入されている。細胞懸濁液ｌｑ１の液量は、その液面（上面）が透明電極板１２１の底面に触れるような設定にしている。
【００３５】
透明電極板１２１は、例えば、ＩＴＯ基板（ＩＴＯ：Indium-Tin Oxide）であり可視光を透過するので、上方にある撮影部２５により透明電極板１２１の下方にある白血球細胞ｃを撮影することができる。また同図に示す例では、下電極板１２２と透明電極板１２１とは、例えば１００ｍｍ□で面積０．０１ｍ２として、略同一の面積、形状で正対する位置関係となるように配置している。
【００３６】
電源ＰＳにより、下電極板１２２と透明電極板１２１との間に白血球細胞ｃが浮かぶ方向の電界を形成する。白血球細胞ｃは負に帯電しているので、電源ＰＳの陽極側を透明電極側に、負極側を下電極板１２２に接続することにより、白血球細胞ｃが浮かぶ方向の電界を形成するので、当該電界により白血球細胞ｃを浮上させることができる。図４に示すように循環腫瘍細胞と白血球細胞ｃは、細胞懸濁液ｌｑ１の上面に浮上するので透明電極板１２１の底面に白血球細胞ｃが当接した状態となる。透明電極板１２１に当接した白血球細胞ｃを上方にある撮影部２５により撮影し、撮影により得られた画像に対して画像解析部２０より画像解析することにより図１に示した実施形態と同様に、個々の細胞の形状を検出して、白血球細胞及び循環腫瘍細胞その他の稀少細胞（rare cell）の選別を行って稀少細胞の有無もしくは個数の検出を行う。
【００３７】
電源ＰＳの出力電圧としては例えば、陽極側に１０Ｖ、負極側を接地（ゼロＶ）としている。また電源ＰＳの出力としてはＤＣ電圧のみならずこれにＡＣ電圧を重畳させて、下電極板１２２と透明電極板１２１との間にＡＣ電界を重畳させてもよい。このようにすることにより循環腫瘍細胞と白血球細胞ｃに振動を与えて細胞の凝集を低減し細胞を分散させて細胞の単層化配列を促進することが可能となる。
【００３８】
また、下電極板１２２を針状電極のように透明電極板１２１とは異なる形状とすることで両電極間に、高周波の不均一な電界を形成してもよい。当該電界により、循環腫瘍細胞と白血球細胞ｃには、誘電泳動力が作用することになるので、電界の向きや周波数を適正な値とすることにより誘電泳動力により白血球細胞ｃを透明電極板１２１に当接するように浮上させることができる。
【００３９】
本実施形態では、貯留槽１０ｂの内部に浮上させた状態で観察することにより、細胞懸濁液ｌｑ１に含まれる異物の除去と観察とを合わせて行うことが可能となる。
【符号の説明】
【００４０】
１０、１０ｂ  貯留槽
１０１  注入口
１６  供給槽
１７  排出槽
２０  画像解析部
２５  撮影部
ＰＳ  電源
ｐ１  ポンプ
ｒ１  上流側流路
ｒ２  下流側流路
１２１  透明電極板
１２２  下電極板
ｃ  白血球細胞
ａｐ  異物
ｌｑ１  細胞懸濁液
ｌｑ２  第２液体
【図１】
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【図２】
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【図３】
2012021828.tif 000005
【図４】
2012021828.tif 000006