(57)【要約】      （修正有）【課題】新規生理活性ペプチドの提供する。【解決手段】（１）特定のアミノ酸配列からなるペプチド又はペプチドアミド、（２）特定のアミノ酸配列において、Ｃ末端から３〜１位のＳＲＹ及びＣ末端から７〜６位のＦＦを除く１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、変異前のペプチド（アミド）と同等のショウジョウバエＮｅｐＹｒに対する結合活性を有するペプチド又はペプチドアミド、並びに（３）特定のアミノ酸配列において、Ｃ末端から３〜１位のＳＲＹ及びＣ末端から７〜６位のＦＦを除く１〜５個のアミノ酸残基が置換等されたアミノ酸配列並びに当該ＳＲＹ及びＦＦの１又は２個のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列からなり、変異前のペプチド（アミド）と同等のＮｅｐＹｒに対する結合活性を有するペプチド又はペプチドアミドからなる群より選ばれる、単離されたペプチド又はペプチドアミド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（２）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、Ｃ末端から３〜１位のＳＲＹおよびＣ末端から７〜６位のＦＦを除く１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ（ＮｅｐＹｒ）に対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド、および
（３）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、Ｃ末端から３〜１位のＳＲＹおよびＣ末端から７〜６位のＦＦを除く１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列ならびに当該ＳＲＹおよびＦＦの１または２個のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のＮｅｐＹｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド
からなる群より選ばれる、単離されたペプチドまたはペプチドアミド。
【請求項２】
（１）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（２）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、Ｃ末端から３〜１位のＳＲＹおよびＣ末端から７〜６位のＦＦを除く１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のＮｅｐＹｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド、および
（３）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、Ｃ末端から３〜１位のＳＲＹおよびＣ末端から７〜６位のＦＦを除く１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列ならびに当該ＳＲＹおよびＦＦの１または２個のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のＮｅｐＹｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド
からなる群より選ばれるペプチドまたはペプチドアミドからなる、ＮｅｐＹｒに対するリガンド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する、節足動物の摂食抑制剤。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する、害虫駆除剤。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチドまたはペプチドアミドに結合する抗体。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
ｄＲＹａｍｉｄｅ前駆体ｍＲＮＡの発現を特異的に阻害する物質を含有する、節足動物の成長促進剤。
【請求項８】
配列番号３の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせからなる二本鎖ＲＮＡを含有する、請求項７に記載の成長促進剤。
【請求項９】
ＮｅｐＹｒの発現または機能を阻害する物質を含有する、節足動物の成長促進剤。
【請求項１０】
ＮｅｐＹｒの発現または機能を阻害する物質が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかである、請求項９に記載の成長促進剤：
（ｉ）ＮｅｐＹｒをコードする遺伝子のアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、デコイ核酸またはターゲッティングベクター、
（ｉｉ）ＮｅｐＹｒに対する抗体、当該抗体をコードする核酸、当該ＮｅｐＹｒのドミナントネガティブ変異体または当該変異体をコードする核酸、または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１１】
ＲＮＡｉ誘導性核酸が、配列番号５の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせからなる二本鎖ＲＮＡである、請求項１０に記載の成長促進剤。
【請求項１２】
節足動物が昆虫である、請求項３、７〜１１のいずれか１項に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ショウジョウバエ由来生理活性ペプチドｄＲＹａｍｉｄｅに関し、害虫駆除薬または医薬の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対するリガンド、特に生理活性ペプチドは、幅広い生理現象に関わっていることから医薬品としての応用が進められている。しかし、ショウジョウバエを含む昆虫では未知の生理活性ペプチドの探索はあまり行われていなかった。昆虫における生理活性ペプチドとその受容体に関する最近の知見として、脂質動員ホルモン（ＡＫＨ）の受容体の発見（非特許文献１）、ＧＰＣＲとβ−２−アレスチン２との相互作用に基づく、ショウジョウバエ神経ペプチド受容体の同定（非特許文献２）などが知られている。
【０００３】
オーファンＧＰＣＲに対する内在性リガンドの探索は活発に行われているが、近年、哺乳類での新たな発見に関する報告は減少している。一例として、オーファンＧＰＣＲとして知られていた成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ）の内在性リガンドとして、ラットおよびヒトのグレリン（Ghrelin）が報告された（非特許文献３）。グレリンは、医薬品への応用開発が進められている。本発明者らは、最近、ネコのグレリンを同定した（非特許文献４）。
【０００４】
神経伝達物質であるニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）および消化管ホルモンであるペプチドＹＹ（ＰＹＹ）は、構造的に関連するペプチドであり、哺乳類においてＹ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５およびＹ６が同定され、ヒトにおいてはヒトニューロペプチドＹ受容体Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４およびＹ５が同定されている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】PNAS, 2002, Vol.99, pp.3446-3451
【非特許文献２】Journal of Biological Chemistry, 2003, Vol.278, pp.52172-52178
【非特許文献３】Nature, 1999, Vol.402, pp.656-660
【非特許文献４】Domestic Animal Endocrinology, 2007, Vol.32, pp.93-105
【非特許文献５】Journal of Biological Chemistry, 1992, Vol.267, pp.10935-10938
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
天然に存在する生理活性物質は、これまでに医薬品の有効成分、生活必需品の成分として利用され、人類の健康増進に大いに貢献してきた。したがって、新規生理活性物質の探索は、新規有効成分医薬品ばかりではなく新規効能医薬品の候補を提供するためにも重要であるが、哺乳類での未知の生理活性ペプチドリガンドの発見は減少している。哺乳類ではリガンド未知なオーファン受容体がまだ数多く存在しているにも関わらず、哺乳類新規生理活性ペプチドの発見が減少している理由は、生体内での含量が極端に少ないか、発現する時期が限られている可能性がある。哺乳類オーファン受容体に類似するショウジョウバエオーファン受容体は数多く存在することから、ショウジョウバエで新規生理活性ペプチドを発見すれば、哺乳類でのホモログペプチドの発見につなげていける可能性がある。
一方、ショウジョウバエでの新規生理活性ペプチドの探索は、データベースを利用したものが多いが、ペプチドはアミノ酸配列が短く、予測が困難であった。また、予測したペプチドがどの受容体に作用するかはわからなかった。したがって、本発明の目的は、特定の受容体に結合する新規生理活性ペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、オーファン受容体として、哺乳類ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）受容体に類似しているショウジョウバエＮＰＹ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＰＹ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅとも称する）に着目し、内在性リガンドを探索した。その結果、ショウジョウバエ新規生理活性ペプチドｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２をそれぞれ単離し、当該リガンドと相同なアミノ酸配列を有するペプチドが様々な昆虫においても存在することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、以下のものを提供する。
〔１〕  （１）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（２）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、C末端から３〜１位のＳＲＹおよびC末端から７〜６位のＦＦを除く１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ（ＮｅｐＹｒ）に対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド、および
（３）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、C末端から３〜１位のＳＲＹおよびC末端から７〜６位のＦＦを除く１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列ならびに当該ＳＲＹおよびＦＦの１または２個のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のＮｅｐＹｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド
からなる群より選ばれる、単離されたペプチドまたはペプチドアミド。
〔２〕  （１）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドまたはペプチドアミド、
（２）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、C末端から３〜１位のＳＲＹおよびC末端から７〜６位のＦＦを除く１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のＮｅｐＹｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド、および
（３）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、C末端から３〜１位のＳＲＹおよびC末端から７〜６位のＦＦを除く１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列ならびに当該ＳＲＹおよびＦＦの１または２個のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであって、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のＮｅｐＹｒに対する結合活性を有するペプチドまたはペプチドアミド
からなる群より選ばれるペプチドまたはペプチドアミドからなる、ＮｅｐＹｒに対するリガンド。
〔３〕  前記〔１〕に記載のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する、節足動物の摂食抑制剤。
〔４〕  前記〔１〕に記載のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する、害虫駆除剤。
〔５〕  前記〔１〕に記載のペプチドまたはペプチドアミドに結合する抗体。
〔６〕  前記〔１〕に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔７〕  ｄＲＹａｍｉｄｅ前駆体ｍＲＮＡの発現を特異的に阻害する物質を含有する、節足動物の成長促進剤。
〔８〕  配列番号３の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせからなる二本鎖ＲＮＡを含有する、前記〔７〕記載の成長促進剤。
〔９〕  ＮｅｐＹｒの発現または機能を阻害する物質を含有する、昆虫の成長促進剤。
〔１０〕  ＮｅｐＹｒの発現または機能を阻害する物質が、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかである、前記〔９〕記載の成長促進剤：
（ｉ）ＮｅｐＹｒをコードする遺伝子のアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、デコイ核酸またはターゲッティングベクター、
（ｉｉ）ＮｅｐＹｒに対する抗体、当該抗体をコードする核酸、当該ＮｅｐＹｒのドミナントネガティブ変異体または当該変異体をコードする核酸、または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の核酸を含む発現ベクター。
〔１１〕  ＲＮＡｉ誘導性核酸が、配列番号５の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせからなる二本鎖ＲＮＡである、前記〔１０〕記載の成長促進剤。
〔１２〕  節足動物が昆虫である、前記〔３〕、〔７〕〜〔１１〕のいずれかに記載の剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の単離されたペプチドまたはペプチドアミドは、ショウジョウバエオーファンＧＰＣＲであるショウジョウバエＮＰＹ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＰＹ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ（ＮｅｐＹｒ））に結合するリガンドであり、ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２ファミリーを構成する。ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２は、多くの昆虫で高度に保存されていた。ｄＲＹａｍｉｄｅ−１またはｄＲＹａｍｉｄｅ−２を投与したクロキンバエは摂食が抑制されたことから、ｄＲＹａｍｉｄｅの前駆体もしくはＮｅｐＹｒの発現抑制またはｄＲＹａｍｉｄｅとＮｅｐＹｒとの結合阻害によって、昆虫の摂食増進作用または成長促進作用が期待できる。以上の点から、ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２は昆虫における摂食抑制ペプチドであり、害虫の発育阻害剤としての利用が期待される。また、ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２が哺乳類ＮＰＹ受容体に対するスーパーアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用を有する場合、肥満、神経性食思不振症の治療などに応用できる可能性がある。さらに、本発明により昆虫の摂食行動を調節できれば、害虫に対する駆虫薬または有用昆虫の効率的育成などを行える可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】マウスニューロペプチドＹ受容体ファミリーに属する遺伝子およびショウジョウバエＧＰＣＲのＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒの系統樹である。
【図２】ショウジョウバエペプチド抽出物のゲル濾過の精製を示すチャートである。
【図３】ショウジョウバエペプチド抽出物のイオン交換クロマトグラフィーの精製を示すチャートである。
【図４】ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒに結合するリガンドｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２の前駆体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。ｄＲＹａｍｉｄｅ−１（配列番号１）およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２（配列番号２）が由来する領域を枠内に示す。
【図５】ｄＲＹａｍｉｄｅ前駆体およびＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒのｍＲＮＡの発現量を比較したグラフである。
【図６】ショウジョウバエＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒのｍＲＮＡの各種組織での発現を比較した図である。
【図７】ラジオイムノアッセイによるｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２のＮ末端側認識抗体の特異性を調べた結果を示す。
【図８】ショウジョウバエにおけるｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２の含量を特異的抗体を用いてラジオイムノアッセイで調べた結果を示すグラフである。
【図９】ｄＲＹａｍｉｄｅ−２  Ｎ末端特異的抗体を用いて免疫染色を行った結果、ショウジョウバエ中腸におけるｄＲＹａｍｉｄｅ−２の分布を示す。
【図１０】ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２ならびにマウス由来のペプチドアミドのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図１１】ショウジョウバエにｄＲＹａｍｉｄｅ−２を投与して吻伸展反射試験を行った結果を示す。
【図１２】ｄＲＹａｍｉｄｅ−１のアミド、ｄＲＹａｍｉｄｅ−２のアミドおよびそれらのＣ末端フリーペプチドとＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとの結合活性を示すグラフである。
【図１３】ｄＲＹａｍｉｄｅ−１のアミド、ｄＲＹａｍｉｄｅ−２のアミドおよびその他のペプチドアミドとＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとの結合活性を示すグラフである。
【図１４】ｄＲＹａｍｉｄｅ−１のアミド、ｄＲＹａｍｉｄｅ−２のアミドおよびその他のペプチドアミドとＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとの結合活性を示すグラフである。
【図１５】ｄＲＹａｍｉｄｅ−１のアミド、ｄＲＹａｍｉｄｅ−２のアミドおよびその他のペプチドアミドとＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとの結合活性を示すグラフである。
【図１６】ｄＲＹａｍｉｄｅ−１のアミドとＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとの結合活性を示すグラフである。
【図１７】ｄＲＹａｍｉｄｅ−２のアミドとＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとの結合活性を示すグラフである。
【図１８】合成したｄＲＹａｍｉｄｅ−１（Ｃ末端フリー体）とＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとの結合活性を示すグラフである。
【図１９】合成したｄＲＹａｍｉｄｅ−２（Ｃ末端フリー体）とＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとの結合活性を示すグラフである。
【図２０】合成ペプチドＦＦＳＲＹのアミド（配列番号４０）とＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとの結合活性を示すグラフである。
【図２１】合成ペプチドＦＦＡＶＳＲＹのアミド（配列番号４１）とＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとの結合活性を示すグラフである。
【図２２】合成ペプチドＦＦＩＡＳＲＹのアミド（配列番号４２）とＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとの結合活性を示すグラフである。
【図２３】合成ペプチドＦＦＶＡＳＲＹのアミド（Ｖ、ＡはＤアミノ酸である）とＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとの結合活性を示すグラフである。
【図２４】合成ペプチドＦＦＶＡＳＲＦのアミド（配列番号４３）とＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとの結合活性を示すグラフである。
【図２５】クルマエビ由来ＳＧＦＹＡＮＲＹのアミド（合成ペプチド、配列番号４４）とＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとの結合活性を示すグラフである。
【図２６】クルマエビ由来ＳＳＲＦＩＧＧＳＲＹのアミド（合成ペプチド、配列番号４５）とＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとの結合活性を示すグラフである。
【図２７】ｄＲＹａｍｉｄｅ−２をクルマエビに投与した場合のクルマエビの摂食量への影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
【００１２】
本明細書において「ポリヌクレオチド」または「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡならびにＲＮＡを包含する趣旨で用いられる。また、その長さによって特に制限されるものではない。したがって、本明細書においてポリヌクレオチドとは、特に言及しない限り、ゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）および該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、ならびにこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該「ポリヌクレオチド」には、特定の塩基配列（配列番号：３または５）で示される「ポリヌクレオチド」だけでなく、これらによりコードされるポリ（ペプチド）と生物学的機能が同等であるポリ（ペプチド）（例えば同族体（ホモログやスプライスバリアントなど）、変異体および誘導体）をコードする「ポリヌクレオチド」が包含される。かかる同族体、変異体または誘導体をコードする「ポリヌクレオチド」としては、具体的には、ストリンジェントな条件下で、前記の配列番号：３または５で示されるいずれかの特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列からなる「ポリヌクレオチド」を挙げることができる。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。
【００１３】
例えばショウジョウバエ由来のポリ（ペプチド）のホモログをコードするポリヌクレオチドとしては、当該ポリ（ペプチド）をコードするショウジョウバエ遺伝子に対応する蚊、カイコ、ハチなどの昆虫類、エビ、カニなどの甲殻類、クモ類、ムカデ類からなる節足動物などの他生物種の遺伝子が例示でき、これらの遺伝子（ホモログ）は、HomoloGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）により同定することができる。具体的には、特定のショウジョウバエの塩基配列をBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）にかけて一致する（Scoreが最も高く、E-valueが０でかつIdentityが１００％を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をUniGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/）に入力して得られたUniGene Cluster ID（Hs.で示す番号）をHomoloGeneに入力する。結果として得られた他の生物種の遺伝子とショウジョウバエ遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるショウジョウバエ遺伝子に対応する遺伝子（ホモログ）として他の生物種の遺伝子を選抜することができる。
なお、ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソンまたはイントロンを含むことができる。
【００１４】
単離された本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、本発明者らにより見出された下記（i）ｄＲＹａｍｉｄｅ−１（配列番号１）および（ii）ｄＲＹａｍｉｄｅ−２（配列番号２）（これらは、ショウジョウバエに由来するものである）、ならびにそれらと同等の活性を有する変異ペプチドまたは変異ペプチドアミド（iii）および（iv）から構成されるペプチド群である。本発明においては、ペプチドまたはペプチドアミドのいずれも本発明の目的に使用することができるが、生理活性の強さの観点から、ペプチドアミドを使用することが好ましい。
【００１５】
（i）ｄＲＹａｍｉｄｅ−１：ＰＶＦＦＶＡＳＲＹ−ＮＨ２（配列番号１）
上記アミノ酸配列のＣ末端はアミド化されていてもいなくてもよい。以下、ｄＲＹａｍｉｄｅ−１ファミリーを代表して、配列番号１で表されるペプチドアミドをｄＲＹａｍｉｄｅ−１と称する場合がある。
【００１６】
（ii）ｄＲＹａｍｉｄｅ−２：ＮＥＨＦＦＬＧＳＲＹ−ＮＨ２（配列番号２）
上記アミノ酸配列のＣ末端はアミド化されていてもいなくてもよい。以下、ｄＲＹａｍｉｄｅ−２ファミリーを代表して、配列番号２で表されるペプチドアミドをｄＲＹａｍｉｄｅ−２と称する場合がある。
【００１７】
（iii）ｄＲＹａｍｉｄｅ−１の変異ペプチドまたは変異ペプチドアミド
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｃ末端から３〜１位のＳＲＹおよびＣ末端から７〜６位のＦＦを除く１〜５個（好ましくは１〜３個）のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであっても、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ（ＮｅｐＹｒ）に対する結合活性を有する限り本発明のペプチドまたはペプチドアミドに含まれる。
あるいは、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｃ末端から３〜１位のＳＲＹおよびＣ末端から７〜６位のＦＦを除く１〜５個（好ましくは１〜３個）のアミノ酸残基が置換、欠失または付加され、さらに当該ＳＲＹおよびＦＦの１または２個のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであっても、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のＮｅｐＹｒに対する結合活性を有する限り本発明のペプチドまたはペプチドアミドに含まれる。
ここで「同等のＮｅｐＹｒに対する結合活性を有する」とは、実施例７および図４、１３に示す受容体結合試験において、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等の結合親和性を有することをいう。同等の結合親和性としては、ＥＣ５０が１０−１２〜１０−６Ｍ程度の結合親和性が例示される。
【００１８】
「アミノ酸残基の置換」としては、例えば保存的アミノ酸置換があげられる。保存的アミノ酸置換とは、特定のアミノ酸を、そのアミノ酸の側鎖と同様の性質の側鎖を有するアミノ酸で置換することをいう。具体的には、保存的アミノ酸置換では、特定のアミノ酸は、そのアミノ酸と同じグループに属する他のアミノ酸により置換される。同様の性質の側鎖を有するアミノ酸のグループは、当該分野で公知である。例えば、このようなアミノ酸のグループとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）があげられる。また、中性側鎖を有するアミノ酸は、さらに、極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン）、および非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）に分類することもできる。また、他のグループとして、例えば、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、水酸基（アルコール性水酸基、フェノール性水酸基）を含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、チロシン）などもあげることができる。また、ヒスチジンとメチオニンとの置換、グルタミン酸とセリンとの置換などもあげられる。
【００１９】
前記ＳＲＹおよびＦＦの１または２個のアミノ酸残基の置換としては、「ＳＲＹ」から「ＧＲＹ」、「ＳＲＦ」または「ＮＲＹ」への置換および「ＦＦ」から「ＹＶ」、「ＦＶ」、「ＧＦ」または「ＦＩ」への置換があげられるが、これらに限定されない。
【００２０】
「アミノ酸残基の欠失」としては、例えば、各配列番号で表されるアミノ酸配列の中から、Ｃ末端から３〜１位のＳＲＹおよびＣ末端から７〜６位のＦＦを除く１〜５個（好ましくは１〜３個）の任意のアミノ酸残基を選択して欠失させることがあげられる。
【００２１】
「アミノ酸残基の付加」としては、各配列番号で表されるアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端側（好ましくはＮ末端側）に、１〜５個のアミノ酸残基を付加させることがあげられる。
【００２２】
ｄＲＹａｍｉｄｅ−１の変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドの好適な具体例は、表１および表４にリストされている。
【００２３】
（iv）ｄＲＹａｍｉｄｅ−２の変異ペプチドまたは変異ペプチドアミド
配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｃ末端から３〜１位のＳＲＹおよびＣ末端から７〜６位のＦＦを除く１〜５個（好ましくは１〜３個）のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであっても、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のショウジョウバエｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＹ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ（ＮｅｐＹｒ）に対する結合活性を有する限り本発明のペプチドまたはペプチドアミドに含まれる。
あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｃ末端から３〜１位のＳＲＹおよびＣ末端から７〜６位のＦＦを除く１〜５個（好ましくは１〜３個）のアミノ酸残基が置換、欠失または付加され、さらに当該ＳＲＹおよびＦＦの１または２個のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドであっても、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等のＮｅｐＹｒに対する結合活性を有する限り本発明のペプチドまたはペプチドアミドに含まれる。
ここで「同等のＮｅｐＹｒに対する結合活性を有する」とは、実施例７および図４、１３に示す受容体結合試験において、変異前のペプチドまたはペプチドアミドと同等の結合親和性を有することをいう。同等の結合親和性としては、ＥＣ５０が１０−１２〜１０−６Ｍ程度の結合親和性が例示される。
【００２４】
「アミノ酸残基の置換」、「アミノ酸残基の欠失」および「アミノ酸残基の付加」は、上記（iii）で説明した通りである。
【００２５】
ｄＲＹａｍｉｄｅ−２の変異ペプチドまたは変異ペプチドアミドの好適な具体例は、表１および表４にリストされている。
【００２６】
上記アミノ酸はＬ体、Ｄ体およびＤＬ体を包含するものであるが、通常、Ｌ体であることが好ましい。Ｄ体のアミノ酸を含む好適な例として、表４に記載されている「ＦＦＶＡＳＲＹ−ＮＨ２」（下線部のアミノ酸残基はＤ体である）があげられる。本発明のペプチドは、通常のペプチド合成法によって合成され本発明に供することができるが、製造方法、合成方法、調達方法等については、特に限定されない。本発明のペプチドは、通常のペプチド合成装置を用いることにより、当業者であれば容易に合成することができる。また、本発明のペプチドアミドも常法によりペプチドのＣ末端をアミド化することにより、当業者であれば容易に合成することができる。
【００２７】
本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、上述したような結合親和性を有することより、ＮｅｐＹｒ（GenBank Accession No. NM_079801）に対するリガンドとして有用である。
【００２８】
摂食抑制剤
本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、ＮｅｐＹｒに対するリガンドであり、当該受容体に結合することによって、昆虫を始めとする節足動物の摂食行動を抑制することができる。本発明は、本発明のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する節足動物（例、昆虫）の摂食抑制剤を提供する。摂食抑制剤は、ペプチドまたはペプチドアミドのいずれか１種であっても２種以上であってもよい。２種以上含有する場合、その種類は特に限定されない。ペプチドまたはペプチドアミドの配合量は、適宜設定すればよいが、通常、摂食抑制剤中、０．０１〜９９．５重量％である。
【００２９】
本発明における節足動物には、昆虫類、甲殻類、クモ類およびムカデ類が含まれる。
昆虫類としては、カブトムシ、カイコ、ゴミムシ、チョウ、ガ、ハエ、カ、アブ、ハチ、アリ、セミ、カメムシ、バッタ、コオロギ、トンボ、ならびに後述する害虫および益虫として記載されたあらゆる昆虫があげられる。
甲殻類としては、エビ、カニ、オキアミ、フジツボ、ミジンコなどがあげられる。
クモ類としては、アシナガグモ、オナガグモ、コガネグモ、コモリグモ、ジョロウグモ、セアカゴケグモ、セスジアカムネグモ、センショウグモ、タランチュラ（オオツチグモ科）、ドヨウオニグモなど；さらには、イエダニ、マダニ、ツツガムシ、ヒメダニ、ヒゼンダニ、チリダニ、コナダニなどのダニ類があげられる。
ムカデ類としては、ムカデ、ゲジなどがあげられる。
【００３０】
本発明の摂食抑制剤は、昆虫を始めとする節足動物を誘引するための誘引剤を含んでいてもよい。前記誘引剤としては、特に制限されないが、例えば、ビール酵母、蛹粉、酒かす、オキアミパウダー、卵黄、キャベツパウダー、キャロットパウダー、チキンエキスパウダー、シーズニングオイル、ストロベリーパウダー、ピーチパウダー、マッシュルームエキス、魚粉、牛（豚）肉粉等が挙げられる。誘引剤は、１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。誘引剤の配合量は、適宜設定すればよいが、通常、摂食抑制剤中、０．０１〜５０重量％である。
【００３１】
本発明の摂食抑制剤には、本発明の効果を損なわない範囲で、さらに必要に応じて、上記以外の成分を配合することができる。例えば、フェニル−β−ナフリルアミン、α−ナフリルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ−第三ブチル−ｐ−フェニレンジアミン、２，６−ジ−第三ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）、２，６−第三ブチル−フェノール、２，４−ジ−メチル−６−第三ブチルフェノール、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等の酸化防止剤；黄色２号、黄色４号、赤色２号、赤色３号、赤色１０２号、青色１号、青色２号、緑色２０１号、緑色２０２号等の色素；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カラギーナン、キサンタンガム、デンプン類等の粘度調整剤；リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調整剤；水、エタノール、トウモロコシ油、ゴマ油等の溶剤；香料；などを配合することができる。
【００３２】
害虫駆除剤
本発明は、本発明のペプチドまたはペプチドアミドを少なくとも１種含有する害虫駆除剤を提供する。害虫駆除剤は、ペプチドまたはペプチドアミドのいずれか１種であっても２種以上であってもよい。２種以上含有する場合、その種類は特に限定されない。ペプチドまたはペプチドアミドの配合量は、適宜設定すればよいが、通常、害虫駆除剤中、０．０１〜９９．５重量％である。
【００３３】
本発明の害虫駆除剤は、昆虫を始めとする節足動物を誘引するための誘引剤を含んでいてもよい。前記誘引剤としては、特に制限されないが、例えば、ビール酵母、蛹粉、酒かす、オキアミパウダー、卵黄、キャベツパウダー、キャロットパウダー、チキンエキスパウダー、シーズニングオイル、ストロベリーパウダー、ピーチパウダー、マッシュルームエキス、魚粉、牛（豚）肉粉等が挙げられる。誘引剤は、１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。誘引剤の配合量は、適宜設定すればよいが、通常、害虫駆除剤中、０．０１〜５０重量％である。
【００３４】
本発明の害虫駆除剤には、本発明の効果を損なわない範囲で、さらに必要に応じて、上記以外の成分を配合することができる。例えば、フェニル−β−ナフリルアミン、α−ナフリルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ−第三ブチル−ｐ−フェニレンジアミン、２，６−ジ−第三ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）、２，６−第三ブチル−フェノール、２，４−ジ−メチル−６−第三ブチルフェノール、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等の酸化防止剤；黄色２号、黄色４号、赤色２号、赤色３号、赤色１０２号、青色１号、青色２号、緑色２０１号、緑色２０２号等の色素；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カラギーナン、キサンタンガム、デンプン類等の粘度調整剤；安息香酸デナトニウム、トウガラシ粉末等の誤食防止剤；リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調整剤；水、エタノール、トウモロコシ油、ゴマ油等の溶剤；香料；などを配合することができる。
【００３５】
本発明の摂食抑制剤または害虫駆除剤は、単独で、または節足動物（例、昆虫）の餌と混合し、節足動物（例、昆虫）の生態系を考慮して、節足動物（例、昆虫）がアクセス可能な態様で節足動物（例、昆虫）に与えることができる。あるいは、害虫駆除剤は、積極的に節足動物（例、昆虫）の体内に導入することも好ましい。
【００３６】
抗体
本発明は、本発明のペプチドまたはペプチドアミドに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、本発明のペプチドまたはペプチドアミドの検出手段、本発明のペプチドまたはペプチドアミドの阻害作用を通じて節足動物（例、昆虫）の食欲の増進作用が期待される。本発明の「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはＦａｂフラグメントやＦａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する前記抗体の一部が包含される。
【００３７】
前記抗体は、自体公知の方法により製造することができる。以下、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を例にとって、説明する。
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、例えば免疫原（本発明のペプチドまたはペプチドアミド）を、必要に応じてフロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）と共に、哺乳動物、例えばポリクローナル抗体の場合、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマまたはウシなど、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギに免疫する。モノクローナル抗体の場合は、同様の方法で、マウス、ラット、ハムスターなどに免疫する。
【００３８】
本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、そのまま免疫原として用いることも可能であるが、分子量１万以上の高分子化合物との複合体として免疫することが望ましい。従って、免疫原として使用するとき、本発明のペプチドは、自体公知の方法により高分子化合物（例、タンパク質（以下、キャリアタンパク質と記載する場合がある）など）との複合体としてもよい。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを上記記載の方法に従って合成し、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン（ＴＧ）、免疫グロブリン等のキャリアタンパク質との複合体を形成させる。当該複合体は、その後好ましい免疫原として用いることができる。
【００３９】
前記ペプチドとキャリアタンパク質との複合体を形成させるなどの目的で、本発明のペプチドには１〜２個、好ましくは１個のアミノ酸を付加することができる。付加されるアミノ酸の位置はペプチドのいずれの位置でもよく、特に限定されないが、ペプチドのＮ末端またはＣ末端が好ましく、Ｃ末端がより好ましい。
【００４０】
複合体の形成においては、本発明のペプチドの抗原性を維持することができる限り、限定なく公知の方法を適用することができる。例えば、本発明のペプチドにシステイン残基を導入し、当該システインの側鎖であるＳＨ基を介して前記高分子化合物（キャリアタンパク質）のアミノ基と結合させることもできる（ＭＢＳ法）。また、タンパク質のリジン残基のεアミノ基や、αアミノ基などのアミノ基同士を結合させることもできる（グルタルアルデヒド法）。
【００４１】
ポリクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。すなわち、免疫原をマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギ、好ましくはヤギ、ウマまたはウサギ、より好ましくはウサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１〜数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜５回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物から血清を取得する。
【００４２】
血清そのものをポリクローナル抗体として用いることも可能であるが、限外ろ過、硫安分画、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムもしくはプロテインＡ／Ｇカラム、免疫原を架橋させたカラム等を用いたアフィニティカラムクロマトグラフィーにより、該抗体を単離および／または精製し、得られた精製抗体を用いることも可能である。
【００４３】
モノクローナル抗体の製造方法としては、例えば下記の方法が挙げられる。まず上記免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化する。すなわち、ハイブリドーマの培養上清を検体として、免疫学的手法により、哺乳動物の免疫に用いた本発明のペプチドに対する特異的親和性を示しかつキャリアタンパク質と交差反応性を示さないモノクローナル抗体を産生するクローンを選択する。次いで、当該ハイブリドーマの培養上清などから、自体公知の方法によって抗体を製造することができる。
【００４４】
具体的には、下記のようにしてモノクローナル抗体を製造することができる。すなわち、免疫原を、マウス、ラットまたはハムスターの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内もしくは腹腔内に１〜数回注射するか、または移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜４回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物の脾臓などから抗体産生細胞を取得する。
【００４５】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（融合細胞）の調製は、ケーラーおよびミルシュタインらの方法（Nature,Vol.256,495-497,1975）ならびにそれらに準じる修飾方法に従って行うことができる。すなわち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄または扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等の哺乳動物、より好ましくはマウスまたはラット由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合により、ハイブリドーマを得る。
【００４６】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマＰ３／Ｘ６３−ＡＧ８．６５３（６５３；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５８０）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／０、Ｓｐ２）、ＰＡＩ、Ｆ０またはＢＷ５１４７、ラット由来ミエローマ２１０ＲＣＹ３−Ａｇ．２．３．が挙げられる。
【００４７】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、得られたハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート内で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の、前述の免疫感作で用いた本発明のペプチドに対する反応性および前記上清のキャリアタンパク質に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の免疫測定法によって測定し、比較することによって行うことができる。
【００４８】
スクリーニングによりクローン化されたハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養される。そして、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、該ハイブリドーマを、該ハイブリドーマに由来する動物の腹腔に注入することにより、動物に腹水を生成させ、該動物から得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。モノクローナル抗体は、上述のポリクローナル抗体と同様の方法で、単離および／または精製されることが好ましい。
【００４９】
ポリヌクレオチド
本発明は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドそのものであってもよく、ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２の前駆体をコードする配列番号３で表される塩基配列全長からなるものであってもよい。また、ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２が翻訳される限りにおいては、配列番号３で表される塩基配列の一部からなるものであってもよい。ショウジョウバエｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２は、同一の前駆体（ｄＲＹａｍｉｄｅ前駆体と称する。ＣＧ４０７３３、GenBank Accession No. NM_001110912には、ｄＲＹａｍｉｄｅ前駆体の部分塩基配列および部分アミノ酸配列が開示されている）から２つのペプチドが切り出されて生じるものであることがわかった。ｄＲＹａｍｉｄｅ前駆体の全塩基配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）は、図４にも記載されている。
本発明のポリヌクレオチドは、発現ベクターに組み込まれていてもよい。発現ベクターとしては、発現させる宿主に応じて、種々の発明ベクターの中から当業者であれば適宜選択して用いることができる。また、本発明で好適に使用される発明ベクターについては、後述する。
【００５０】
成長促進剤
ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２は、摂食抑制作用を有する生理活性ペプチドであり、生体内でのｄＲＹａｍｉｄｅ−１および／またはｄＲＹａｍｉｄｅ−２の発現を特異的に阻害する物質は、節足動物（例、昆虫）の食欲を増進し、成長を促進させる作用を有することが期待される。本発明は、ｄＲＹａｍｉｄｅ−１および／またはｄＲＹａｍｉｄｅ−２の発現を特異的に阻害する物質を含有する、節足動物（例、昆虫）の成長促進剤を提供する。
【００５１】
本発明の成長促進剤に有効成分として含まれるｄＲＹａｍｉｄｅ−１および／またはｄＲＹａｍｉｄｅ−２の発現を特異的に阻害する物質は、ｄＲＹａｍｉｄｅ前駆体（例えば、配列番号３）の転写過程に作用してその発現を特異的に阻害する物質であれば特に限定されるものではない。かかる阻害物質としては、ＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸もしくはリボザイムまたはそれらの発現ベクターが挙げられる。
【００５２】
前記ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡ干渉を誘導し得るポリヌクレオチドをいい、好ましくはＲＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡのキメラ分子である。ＲＮＡ干渉とは、ｍＲＮＡと同一の塩基配列（またはその部分配列）を含む２本鎖構造のＲＮＡが、当該ｍＲＮＡの発現を抑制する効果をいう。このＲＮＡｉ効果を得るには、例えば、少なくとも１９の連続する標的ｍＲＮＡと同一の塩基配列（またはその部分配列）を有する２本鎖構造のＲＮＡを用いることが好ましい。ただし、ｄＲＹａｍｉｄｅ−１またはｄＲＹａｍｉｄｅ−２の発現阻害作用を有していれば数塩基置換されているものであってもよく、１９塩基長よりも短いＲＮＡであってもよい。２本鎖構造は、センス鎖とアンチセンス鎖の異なるストランドで構成されていてもよいし、一つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる２本鎖（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどが挙げられる。
【００５３】
ＲＮＡｉ誘導性核酸は、転写抑制活性が強いという観点から、ｓｉＲＮＡが好ましい。ｄＲＹａｍｉｄｅ−１またはｄＲＹａｍｉｄｅ−２に対するｓｉＲＮＡは、ｄＲＹａｍｉｄｅ前駆体のｍＲＮＡの任意の部分を標的とすることができる。ｄＲＹａｍｉｄｅ−１またはｄＲＹａｍｉｄｅ−２に対するｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉ効果を誘導できる限り特に制限されないが、例えば１９〜２７塩基長、好ましくは２１〜２５塩基長である。ｄＲＹａｍｉｄｅ−１またはｄＲＹａｍｉｄｅ−２に対するｓｉＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二重鎖である。具体的には、ｄＲＹａｍｉｄｅ−１またはｄＲＹａｍｉｄｅ−２に対するｓｉＲＮＡは、配列番号３の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである。ｄＲＹａｍｉｄｅ−１またはｄＲＹａｍｉｄｅ−２に対するｓｉＲＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖の一方または双方の５’末端または３’末端においてオーバーハング（overhang）を有していてもよい。オーバーハングは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の末端における１〜数個（例、１、２または３個）の塩基の付加により形成されるものである。ｓｉＲＮＡの設計方法は、当業者に公知であり、ｓｉＲＮＡの様々な設計ソフトウエアまたはアルゴリズムを用いて、上記塩基配列から適切なｓｉＲＮＡの塩基配列を選択することができる。
【００５４】
ＲＮＡｉ誘導性核酸は、ＲＮＡを構成する天然のヌクレオチドから構成されていてもよいが、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化、相補鎖核酸とのアフィニティーの向上または細胞透過性を高めるために、ヌクレオチドに修飾を施したヌクレオチド誘導体を一部含んでいてもよい。ヌクレオチド誘導体としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド、ならびに糖部、リン酸ジエステル結合および塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等があげられる。
【００５５】
ｄＲＹａｍｉｄｅ−１またはｄＲＹａｍｉｄｅ−２に対するアンチセンス核酸は、ｄＲＹａｍｉｄｅ前駆体の転写産物（ｍＲＮＡまたは初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該転写産物とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該転写産物にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得るポリヌクレオチドをいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。アンチセンス核酸は、天然型のリン酸ジエステル結合を有するものであっても、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’−Ｏ−メチル型等の修飾ヌクレオチドであってもよい。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性および細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。アンチセンス核酸の長さは、ｄＲＹａｍｉｄｅ前駆体の転写産物（例、配列番号３の塩基配列に対応するｍＲＮＡ）と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約１５塩基程度、長いもので転写産物の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、例えば約１５塩基以上、好ましくは約１５〜約３０塩基、より好ましくは約１８塩基〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。さらに、アンチセンス核酸は、ｄＲＹａｍｉｄｅ−１またはｄＲＹａｍｉｄｅ−２の転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。
【００５６】
本明細書において、「相補的である」とは、塩基配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相補性を有することをいう。本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
【００５７】
前記「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いる。具体的には、リボザイムは、ｄＲＹａｍｉｄｅ−１またはｄＲＹａｍｉｄｅ−２をコードするｍＲＮＡまたは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得る。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる（Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)）。
【００５８】
ｄＲＹａｍｉｄｅ−１またはｄＲＹａｍｉｄｅ−２特異的阻害物質は、発現ベクターとしても提供され得る。かかる発現ベクターは、ｄＲＹａｍｉｄｅ−１またはｄＲＹａｍｉｄｅ−２特異的阻害物質をコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含む。
【００５９】
前記プロモーターは、その制御下にある発現対象の核酸の種類により適宜選択され得るが、基本的には節足動物細胞（例、昆虫細胞）で機能するプロモーターであれば限定なく使用することができ、例えば、ショウジョウバエ熱ショックタンパク質プロモーター、前記熱ショックタンパク質プロモーターと酵母ＧＡＬ４−ＵＡＳシステムとを組み合わせたプロモーター、ショウジョウバエアクチンプロモーター等が挙げられる。
【００６０】
好適には、本発明の節足動物（例、昆虫）の成長促進剤は、配列番号３の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせからなる二本鎖ＲＮＡを含む。
【００６１】
本発明の成長促進剤は、含まれる成分および目的に応じて配合量を適宜設定することができる。通常、成長促進剤中、０．０１〜９９．５重量％である。
【００６２】
本発明の成長促進剤は、節足動物（例、昆虫）を誘引するための誘引剤を含んでいてもよい。前記誘引剤としては、特に制限されないが、例えば、ビール酵母、蛹粉、酒かす、オキアミパウダー、卵黄、キャベツパウダー、キャロットパウダー、チキンエキスパウダー、シーズニングオイル、ストロベリーパウダー、ピーチパウダー、マッシュルームエキス、魚粉、牛（豚）肉粉等が挙げられる。誘引剤は、１種のみであってもよいし、２種以上であってもよい。誘引剤の配合量は、適宜設定すればよいが、通常、成長促進剤中、０．０１〜５０重量％である。
【００６３】
本発明の成長促進剤には、本発明の効果を損なわない範囲で、さらに必要に応じて、上記以外の成分を配合することができる。例えば、フェニル−β−ナフリルアミン、α−ナフリルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ−第三ブチル−ｐ−フェニレンジアミン、２，６−ジ−第三ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）、２，６−第三ブチル−フェノール、２，４−ジ−メチル−６−第三ブチルフェノール、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等の酸化防止剤；黄色２号、黄色４号、赤色２号、赤色３号、赤色１０２号、青色１号、青色２号、緑色２０１号、緑色２０２号等の色素；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カラギーナン、キサンタンガム、デンプン類等の粘度調整剤；リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等のｐＨ調整剤；水、エタノール、トウモロコシ油、ゴマ油等の溶剤；香料；などを配合することができる。
【００６４】
本発明の成長促進剤は、単独で、または節足動物（例、昆虫）の餌と混合し、節足動物（例、昆虫）の生態系を考慮して、節足動物（例、昆虫）がアクセス可能な態様で節足動物（例、昆虫）に与えることができる。
【００６５】
生体内でのｄＲＹａｍｉｄｅ−１および／またはｄＲＹａｍｉｄｅ−２の作用は、それらの受容体への結合を介して発揮されるものであるから、該受容体の発現または機能を特異的に阻害する物質も、節足動物（例、昆虫）の食欲を増進し、成長を促進させる作用を有することが期待される。本発明は、ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒの発現または機能を阻害する物質を含有する、節足動物（例、昆虫）の成長促進剤を提供する。
【００６６】
ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒは、その塩基配列およびアミノ酸配列は、公知である。例えば、ショウショウバエ由来のＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｅｐＹｒ）の塩基配列およびアミノ酸配列はGenBank Accession No. NM_079801.2として登録され、それぞれ配列番号５および配列番号６で示す。上述したように、ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒは、ホモログなどを含む概念であり、ショウショウバエ由来のＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒに対するホモログは、Homologeneにより同定することができる。
【００６７】
ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒの発現または機能を阻害する物質は、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかであることが好ましい。
（ｉ）ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子のアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、デコイ核酸またはターゲッティングベクター、
（ｉｉ）ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒに対する抗体、当該抗体をコードする核酸、当該ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒのドミナントネガティブ変異体または当該変異体をコードする核酸、または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の核酸を含む発現ベクター。
【００６８】
ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒの発現を阻害する物質がアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、デコイ核酸などの核酸分子である場合、本発明の成長促進剤は、当該核酸分子をコードする発現ベクターを有効成分とすることもできる。当該発現ベクターは、通常、上記の核酸分子をコードするオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが、投与対象である昆虫細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されている。アンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸、デコイ核酸およびその発現ベクターについては、ｄＲＹａｍｉｄｅの発現を阻害する物質において説明した通りである。
【００６９】
ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒの発現を阻害する物質の別の態様は、ターゲティングベクターである。本発明で用いられるターゲティングベクターは、当該ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子の相同組換えを誘導し得る遺伝子に相同な第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチド、並びに選択マーカーを含む。第一および第二のポリヌクレオチドは、当該ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする遺伝子を含むゲノムＤＮＡに対して、相同組換えを生じるのに十分な程度の配列同一性および長さを有するポリヌクレオチドである。第一および第二のポリヌクレオチドは、当該遺伝子を含むゲノムＤＮＡにおいて、第一および第二のポリヌクレオチドに対して相同な２つの領域の間に存在するゲノムＤＮＡ部分領域が欠失すると、当該遺伝子の機能的欠損がもたらされるように選択される。選択マーカーとしては、ポジティブ選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＢＰＨ）遺伝子、ブラスティシジンＳデアミナーゼ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子）、ネガティブ選択マーカー（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴＡ）遺伝子）などが挙げられる。ターゲティングベクターは、ポジティブ選択マーカー、ネガティブ選択マーカーのいずれか一方、または両方を含むことができる。ターゲティングベクターはまた、２以上のリコンビナーゼ標的配列（例えば、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムで用いられるｌｏｘＰ配列、酵母由来のＦＬＰ／ＦＲＴシステムで用いられるＦＲＴ配列）を含んでいてもよい。
【００７０】
ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒの機能を阻害する物質の一態様は、当該ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒに対する抗体、当該抗体をコードする核酸（プロモーター活性を有する核酸に機能可能に連結されたもの）、または当該核酸を含む発現ベクターである。当該抗体は、当該ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒを認識するものであれば特に制限されず、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。また、当該抗体は、抗体のフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）、組換え抗体（例えば、単鎖抗体）であってもよい。
【００７１】
ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒの機能を阻害する物質の別の一態様は、当該ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒのドミナントネガティブ変異体、当該変異体をコードする核酸（プロモーター活性を有する核酸に機能可能に連結されたもの）、当該核酸を含む発現ベクター、低分子有機化合物などが例示される。
【００７２】
ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒのドミナントネガティブ変異体とは、当該ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒに対する変異の導入によりその活性が低減したものをいう。当該ドミナントネガティブ変異体は、天然のＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒと競合することで間接的にその活性を阻害することができる。当該ドミナントネガティブ変異体は、当該ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒをコードする核酸に変異を導入することによって作製することができる。その変異としては、例えば、ミリストイル化部位、ＤＮＡ結合部位並びにこれらの部位以外の部位における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異（例えば、１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加）が挙げられる。当該変異は、ＰＣＲや公知のキットを用いる自体公知の方法により導入することができる。
【００７３】
好適には、本発明の節足動物（例、昆虫）の成長促進剤の有効成分はＲＮＡｉ誘導性核酸であり、配列番号５の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１９〜２５個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖の組み合わせからなる二本鎖ＲＮＡを含む。
【００７４】
本発明の摂食抑制剤もしくは害虫駆除剤または成長促進剤は、目的に応じて節足動物（例、昆虫）を適宜選択して投与することができる。摂食抑制剤は、害虫を対象とすることが好ましく、成長促進剤は、益虫を対象とすることが好ましい。
【００７５】
本発明が対象とする害虫として、鱗翅目害虫、例えばアオムシ、ハスモンヨトウ、アワノメイガ、コナガ、ニカメイチュウ、コブノメイガ、ドクガ等；半翅目害虫、例えば、ツマグロヨコバイ、トビイロウンカ、ヒメトビウンカ、ヤノネカイガラムシ、モモアカアブラムシ、ワタアブラムシ、ニセダイコンアブラムシ、アオカメムシ、オンシツコナジラミ、シラミ、トコジラミ、コロモジラミ、サシガメ等；鞘翅目害虫、例えば、アズキゾウムシ、コクゾウムシ、ニジュウヤホシテントウ、ヒメコガネ、コロラドポテトビートル、イネミズゾウムシ、マツノゴマダラカミキリ、キクイムシ、ハネカクシ等；直翅目害虫、例えば、チャバネゴキブリ、クロゴキブリ、ワモンゴキブリ、ケラ、バッタ、ヤマトシロアリ、イエシロアリ等；双翅目害虫、例えば、イエバエ、キンバエ、クロバエ、サシバエ、サシチョウバエ、メルラアブ、ツェツェバエ、アブ、ブユ、ヌカカ、ネッタイシマカ、ヒトスジシマカ、アカイエカ、シナハマダラカ、コガタアカイエカ、イエカ、ヤブカ、ヌマカ等；毒グモ、例えば、セアカゴケグモ、タランチュラ等；ダニ類、例えば、イエダニ、マダニ、ツツガムシ、ヒメダニ、ヒゼンダニ、チリダニ、コナダニ等をあげることができる。
【００７６】
本発明が対象とする益虫として、ミツバチ、カイコ、カブトムシなどをあげることができる。
【実施例】
【００７７】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されるものではない。
【００７８】
実施例１：細胞培養、トランスフェクション、ＮＰＹ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ発現細胞株の調製
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ＣＨＯ培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したＭＥＭ−alpha、これらの試薬は、Gibco製のものを使用した）中で維持した。
【００７９】
哺乳動物ＮＰＹ ｒｅｃｅｐｔｏｒファミリー（図１を参照）に類似するショウジョウバエＮＰＹ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮｅｐＹｒ）のｃＤＮＡクローニングは、reverse transcriptase（ＲＴ−）ＰＣＲ法を用いて行った。ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の成虫の全長ｃＤＮＡを、以下のプライマーセット：
5’-caccttctaccattgacgcgcttg-3’（Ｓ：配列番号３６）
5’-cggtgcttcttatgtttgcttc-3’（ＡＳ：配列番号３７）
を用いて増幅した。ＰＣＲの条件は、以下の通りであった：
ＰＣＲ反応液(Takara)
10xPyrobest buffer II  ５μｌ
dNTP mix               ４μｌ
primer S (１μＭ)      ５μｌ
AS (１μＭ)      ５μｌ
Pyrobest         ０．２５μｌ
H２O           ２９．７５μｌ
cDNA                   １μｌ
全量                 ５０μｌ
温度条件
94℃  2minを1 cycleの後、
98℃10sec、55℃30sec、および72℃ 2minを30 cyclesし、
72℃3minを1 cycleし、4℃に冷却した。
得られた増幅産物をpcDNA3.2/V5/GW/D-TOPO発現ベクター（Invitrogen）にクローニングし、シークエンシングにより配列を確認した。
【００８０】
発現ベクターD,CG5811-7-pcDNA3.2/V5/GW/D-TOPOのＣＨＯ細胞へのトランスフェクションは、トランスフェクション試薬としてＦｕｇｅｎｅ６（Boehringer Mannheim）を用いて、販売業者の指示書に従って行った。抗生物質による選択（１ｍｇ/ｍｌ  Ｇ４１８）およびクローン選択の後、ＮＰＹ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ発現ＣＨＯ細胞株を得た。
【００８１】
実施例２：ショウジョウバエｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２の精製
ショウジョウバエの成虫（３５０ｇ）を１０倍容量の脱イオン水を加えて１０分間煮沸し、０℃まで冷却した。酢酸を添加し（最終ｐＨ３．０）、Kinematica polytronでホモジナイズした後、ホモジネートを遠心分離し、上清を分離してエバポレーターにて３分の１量まで濃縮した。次に２倍量のアセトンを加え、一晩４℃にて攪拌後、遠心し上清をグラスフィルターにて濾過した。エバポレーターにてアセトン除去後、SepPak C18カートリッジ（Waters）を用いて脱塩、濃縮し、０．１％トリフルオロ酢酸でリンスした後、０．１％トリフルオロ酢酸中６０％アセトニトリルで各カートリッジから溶出した。溶出液を凍結乾燥させ、出発材料として用いた。前記凍結乾燥物を１Ｍ酢酸に溶解し、ＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５（Ｈ＋型）カラムに吸着させ、１Ｍ酢酸で平衡化した。１Ｍ酢酸、２Ｍピリジンおよび２Ｍピリジン−酢酸（ｐＨ５．０）での連続溶出により、ＳＰ−Ｉ、ＳＰ−IIおよびＳＰ−IIIの各フラクションを得た。
【００８２】
次に、凍結乾燥した塩基性ペプチドフラクションＳＰ−IIIを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０ゲルろ過カラムにかけ、分画した。各フラクションのリガンド活性を以下のように調べた。
ＣＨＯ−ＮＰＹ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒは、各細胞表面にＧＰＣＲであるＮＰＹ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒが発現し、当該受容体にリガンドが結合すると、細胞内カルシウム濃度が上昇することが期待されるので、細胞内カルシウム濃度の変化を測定することによって、各受容体に結合するリガンド活性を追跡した。
ＣＨＯ−ＮＰＹ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒをＣＨＯ培地中で維持し、上記で分画したフラクションの一部を各培地に添加し、当該細胞における細胞内カルシウムイオン濃度（[Ｃａ２＋]ｉ）の変化を、蛍光イメージングプレートリーダー（FLEX）システム（Molecular Devices）を用いて既報（Nature, 1999; 402: pp.656-660）に準じて測定した。すなわち、アッセイの１２〜１５時間前にＣＨＯ−ＮＰＹ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ細胞（５×１０４細胞）を９６ウェルの黒壁マイクロプレート（Corning）に播種した。細胞をFLEX Calcium 4 Assay Kit（Molecular Devices）１００μｌとともに１時間インキュベートした後、蛍光イメージングプレートリーダー（FLEX）に供し、サンプル（フラクション）が蛍光の変化を誘導するか否かを測定した。最大[Ｃａ２＋]ｉの変化を三連で決定した。結果を図２に示す。カルシウムイオン濃度の上昇したフラクションを活性フラクションとしてさらなる精製に供した。
【００８３】
プールした活性フラクションを、TSK−GEL CM−25Wカラム（Tosoh）を用いるカルボキシメチル（ＣＭ）イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供した。ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。
溶離液：１０％アセトニトリル中、ギ酸アンモニウム１０ｍＭ−０．６Ｍの直線勾配
溶出速度：１ｍｌ／分（１６−１３６分）
各フラクションについて上述のようにFLEXシステムで細胞内カルシウムイオン濃度の変化を測定し（図３）、活性フラクションをプールし、さらに以下の精製に供した。
【００８４】
プールした活性フラクションを、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅＣ１８カラム（Waters）を用いる逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。
溶離液：０．１％トリフルオロ酢酸中（ＴＦＡ）、１０−６０％アセトニトリルの直線勾配
溶出速度：１ｍｌ／分（８０分）
【００８５】
さらに、活性フラクションをＣｈｅｍｃｏｓｏｒｂ ３ＯＤＳ−Ｈカラム（Chemco）を用いるＲＰ−ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。
溶離液：０．１％トリフルオロ酢酸中（ＴＦＡ）、１０−６０％アセトニトリルの直線勾配
溶出速度：０．２ｍｌ／分（８０分）
吸収ピークに相当するフラクションを集め、各フラクションの一部をFLEXシステムにより測定した。約２０ｐｍｏｌの主要活性フラクションの最終精製ペプチドを、プロテインシークエンサー（モデル４９４、Applied Biosystems）で解析した。また、約１ｐｍｏｌの各活性フラクションを用いて、マトリックス支援レーザー脱着−イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計およびＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＰＲＯ instrument（Applied Biosystems）により分子量を決定した。
【００８６】
その結果、ＮＰＹ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒに結合するリガンドとしてｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２を単離し、精製することに成功した。得られたペプチドリガンドの配列を以下に示す。また、得られたペプチドリガンド（アミド体およびＣ末端フリー体）について、上記受容体結合試験の結果を図４に示す。ペプチドリガンド（アミド体およびＣ末端フリー体）のＥＣ５０は、アミド体が１０−１１Ｍ程度でＣ末端フリー体が１０−６〜１０−８Ｍ程度であった。
【００８７】
ｄＲＹａｍｉｄｅ−１：
PVFFVASRY-NH2（配列番号１、図４の上段枠で示す領域、分子量1084.22）
ｄＲＹａｍｉｄｅ−２：
NEHFFLGSRY-NH2（配列番号２、図４の下段枠で示す領域、分子量1268.33）
【００８８】
得られたｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２のアミノ酸配列に基づいて、他の昆虫のゲノムデータベースを探索し、他の昆虫種に存在するｄＲＹａｍｉｄｅ−１様ペプチドおよびｄＲＹａｍｉｄｅ−２様ペプチドをアラインした。結果を表１に示す。ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２は、各昆虫でよく保存されていることがわかった。
【００８９】
【表１】
2012223187.tif 000002
【００９０】
実施例３：ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２の前駆体のクローニング
ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２の前駆体の部分配列は、既にデータベース上で公開されており：
ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２前駆体ＣＧ４０７３３（NM_00111912.2）、
公開されている塩基配列に基づいて下記プライマー：
5’-cttcgtccccttgttattattgtct-3’（Ｓ：配列番号３８）
5’-agtaattggcattcatgtcagagtc-3’（ＡＳ：配列番号３９）
を設計し、ＰＣＲで増幅し、クローニングした。
ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２は、１つの前駆体から２つのペプチドが切り出されることがわかった。前駆体の塩基配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３および４に示し、さらに前駆体とペプチドとの関係を図４に示す。
【００９１】
実施例４：リアルタイムＰＣＲによるショウジョウバエのｄＲＹａｍｉｄｅ前駆体およびＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒのｍＲＮＡの発現量の解析
リアルタイムＰＣＲによるショウジョウバエ（オス、メス）の頭部と身体におけるｄＲＹａｍｉｄｅ前駆体およびＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒのｍＲＮＡの発現量の解析結果を図５に示す。その結果、ｄＲＹａｍｉｄｅ前駆体ｍＲＮＡは、オスで高く発現していることがわかった。また、ショウジョウバエの成虫および幼虫の各組織における発現を図６に示す。ＮＰＹ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒは、成虫の後腸で高く発現しているので、腸管に関する生理作用に関与している可能性がある。
【００９２】
実施例５：ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２のＮ末端側認識特異抗体
ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２のＮ末端側を抗原としてウサギを免疫してポリクローナル抗体を作製し、抗体価および特異性を検討した。ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２のＮ末端側認識特異抗体を得た（図７）。
【００９３】
次に、前記抗体を用いて、ラジオイムノアッセイによるｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２のショウジョウバエ（オス、メス）における含量を調べた。結果を図８に示す。ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２の含量は、オス、メスで差がなかった。
【００９４】
実施例６：ｄＲＹａｍｉｄｅ−２のＮ末端側認識特異抗体を用いた免疫染色
ショウジョウバエの幼虫の組織をPBS中で解剖し、４％ホルムアルデヒドのPBS溶液中で、室温で３０分間固定した。固定した組織をPBT（Triton-Xを含有するPBS（中枢神経系に対しては０．３％、腸に対しては０．２％、その他の組織に対しては０．１％））で３回リンスし、次いで、PBTで２０分間の洗浄を３回繰り返した。洗浄後の組織を、室温で１時間以上ブロッキング溶液（1% BSAのPBT溶液）とともにインキュベートした後、４℃で一晩一次抗体とともにインキュベートした。
次の日、組織をPBTで３回リンスし、PBTで２０分間の洗浄を３回繰り返した後、４℃で一晩、次いで室温で２時間二次抗体（抗ウサギIgG-Cy3：Jackson 711-165-152）とともにインキュベートした。インキュベート後の組織をPBTで３回リンスし、PBTで１０分間の洗浄を２回繰り返した後、Vectashieldマウンティングメディウムでスライドに搭載した。
【００９５】
結果を図９に示す。図９より、幼虫中腸において広範にdRYamide-2が分布していることがわかった。
【００９６】
実施例７：マウスＮＰＹおよびＮＰＦＦの精製
実施例２において、ショウジョウバエの成虫の代わりにマウス１０００匹分の脳を使用したこと以外は実施例２と同様の方法により、マウス由来のペプチドを精製した。
【００９７】
その結果、以下の配列番号１７および１８で表されるペプチドアミドが精製された。ｄＲＹａｍｉｄｅ−１およびｄＲＹａｍｉｄｅ−２とのアラインメントを図１０に示す。
PVFFVASRY-NH2 (配列番号１) dRYamide-1
NEHFFLGSRY-NH2 (配列番号２) dRYamide-2
SPAFLFQPQRF-NH2 (配列番号１７) mouse NPFF
YPSKPDNPGEDAPAEDMARYYSALRHYINLITRQRY-NH2 (配列番号１８) mouse NPY
YPAKPEAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 (配列番号１９) mouse PPY
APLEPMYPGDYATPEQMAQYETQLRRYINTLTRPRY-NH2 (配列番号２０) mouse PP
SRAHQHSMETRTPDINPAWYTGRGIRPVGRF-NH2 (配列番号２１) mouse PrRP
NPAFLFQPQRF-NH2 (配列番号２２) rat NPFF
APLEPMYPGDYATHEQRAQYETQLRRYINTLTRPRY-NH2 (配列番号２３) rat PP
YPAKPEAPGEDASPEELSRYYASLRHYLNLVTRQRY-NH2 (配列番号２４) rat PYY
YPSKPDNPGEDAPAEDMARYYSALRHYINLITRQRY-NH2 (配列番号２５) rat NPY
【００９８】
実施例８：受容体結合試験
ＣＨＯ−ＮＰＹ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒをＣＨＯ培地中で維持し、上記ペプチドアミドもしくはペプチドまたは下記表２に示すペプチドアミドを培地に添加し、当該細胞における細胞内カルシウムイオン濃度（[Ｃａ２＋]ｉ）の変化を、蛍光イメージングプレートリーダー（FLEX）システム（Molecular Devices）を用いて既報（Nature, 1999; 402: pp.656-660）に準じて測定した。すなわち、アッセイの１２〜１５時間前にＣＨＯ−ＮＰＹ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ細胞（５×１０４細胞）を９６ウェルの黒壁マイクロプレート（Corning）に播種した。細胞をFLEX Calcium 4 Assay Kit（Molecular Devices）１００μｌとともに１時間インキュベートした後、蛍光イメージングプレートリーダー（FLEX）に供し、添加したペプチドまたはペプチドアミドが蛍光の変化を誘導するか否かを測定した。ＥＣ５０値は、測定機器であるFLEX stationのソフトウエアを用いて決定した。結果を表３および図１２〜１５に示す。
【００９９】
【表２】
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【０１００】
【表３】
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【０１０１】
実施例９：ｄＲＹａｍｉｄｅ投与による吻伸展反射試験
Journal of Neuroscience, 2005, 25(33): 7507-7516に記載の方法に準じて、吻伸展反射（ＰＥＲ）試験を行った。実験に供したハエは、クロキンバエ（Phormia regina）であり、ハエの背側に10pmolの各種ペプチドアミドを投与し、種々の濃度のショ糖液に対する吻伸展反射を調べ、ＰＥＲ閾値を決定した。
【０１０２】
結果を図１１に示す。クロキンバエの背側にｄＲＹａｍｉｄｅ−２を10pmol投与することによりＰＥＲ閾値が高くなった。このことから、ペプチド投与前と比べて、ショ糖濃度が高くないと吻伸展反射をしなくなることがわかり、ｄＲＹａｍｉｄｅ−２投与により摂食行動が抑制されていることを意味する。
【０１０３】
実施例１０：受容体結合試験
ＣＨＯ−ＮＰＹ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒをＣＨＯ培地中で維持し、下記表４に示すペプチドまたはペプチドアミドを培地に添加し、当該細胞における細胞内カルシウムイオン濃度（[Ｃａ２＋]ｉ）の変化を、蛍光イメージングプレートリーダー（FLEX）システム（Molecular Devices）を用いて既報（Nature, 1999; 402: pp.656-660）に準じて測定した。すなわち、アッセイの１２〜１５時間前にＣＨＯ−ＮＰＹ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ細胞（５×１０４細胞）を９６ウェルの黒壁マイクロプレート（Corning）に播種した。細胞をFLEX Calcium 4 Assay Kit（Molecular Devices）１００μｌとともに１時間インキュベートした後、蛍光イメージングプレートリーダー（FLEX）に供し、添加したペプチドまたはペプチドアミドが蛍光の変化を誘導するか否かを測定した。ＥＣ５０値は、測定機器であるFLEX stationのソフトウエアを用いて決定した。結果を表４および図１６〜２６に示す。
【０１０４】
【表４】
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【０１０５】
dRYamide-1およびdRYamide-2から共通するアミノ酸配列を取り出して最小のアミノ酸配列「FFSRY」を有するペプチドアミド（配列番号４０）を合成して試験したところ、活性を有することがわかった（図２０）。
dRYamide-1およびdRYamide-2の解析から、当該ペプチド（アミド）の活性発現には、「FF」配列と「SRY」配列に挟まれた2アミノ酸残基のN末端側には疎水性アミノ酸（V、L、I等）、C末端側には分子量の小さいアミノ酸（A、G等）を配置することも重要と考えられる。この仮説を実証するためのペプチド（アミド）を配列番号４２および４３で示し、結果を図２２および２４に示す。図２２および２４より、上記仮説が成立することがわかった。
一方、N末端側疎水性アミノ酸とC末端側小分子量アミノ酸とを入れ替えた場合（配列番号４１）でも、ペプチド（アミド）の活性は維持された（図２１）。
さらに、N末端側疎水性アミノ酸とC末端側小分子量アミノ酸をＬ体からＤ体に変えた場合（FFVASRY-NH2：下線部はＤ−アミノ酸を表す）も、ペプチド（アミド）の活性は維持された（図２３）。
以上のことから、「FF」配列と「SRY」配列に挟まれた2アミノ酸残基に配置されるアミノ酸は「VA」に代表される疎水性アミノ酸と小分子量アミノ酸の組合せが好適な例としてあげられるが、かかるアミノ酸の組合せに特に限定されるものではなく、天然に存在するアミノ酸のみならず非天然のアミノ酸であってもよいと考えられる。
【０１０６】
本発明者らは、実施例２に記載の方法に準じて、クルマエビからｄＲＹａｍｉｄｅと同様のペプチド（アミド）を２種分離同定した。前記ペプチドのアミノ酸配列を表４ならびに配列番号４４および４５で示す。クルマエビに由来するペプチドの合成ペプチドアミドを、ショウジョウバエＮＰＹ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ発現ＣＨＯ細胞の培地に添加して受容体結合試験を行ったところ、結合活性を有することがわかった（図２５、２６）。このことから、甲殻類に由来するペプチド（アミド）は、種を超えてショウジョウバエ受容体に対しても活性を有することが示唆された。
【０１０７】
実施例１１：ｄＲＹａｍｉｄｅ投与によるクルマエビ摂食量への影響
砂を敷いた水槽中で飼育中のクルマエビを用いて、クルマエビの摂食量を調べた。実験に供したクルマエビの平均体重は１０ｇであり、給餌量は体重の１％とした。各群５匹ずつ水温１５℃で飼育した。各エビに１ｎｍｏｌ/１００μＬ ＰＢＳ中のｄＲＹａｍｉｄｅ−２を筋肉内注射した。対照として、１００μＬ ＰＢＳを同様に筋肉内注射した。
【０１０８】
結果を図２７に示す。ｄＲＹａｍｉｄｅ−２は投与後３日間、クルマエビの摂食量を減少させることがわかり、ｄＲＹａｍｉｄｅ−２投与により摂食行動が抑制されていることを意味する。ショウジョウバエから分離同定されたｄＲＹａｍｉｄｅ−２は、種を超えて甲殻類にも作用することが示された。
また、ｄＲＹａｍｉｄｅ−２投与群は、対照群に比べて、砂に潜る「潜砂行動」をより頻繁にする傾向があった（データ示さず）。エビの養殖においては、陸上のいけすで稚エビを育てた後、海に放流するが、魚に捕食されることにより養殖率が低下する。潜砂能力が高くなることによってクルマエビが砂に潜る頻度が高くなり、捕食圧が減少するので、結果として養殖率の上昇が期待できる。ｄＲＹａｍｉｄｅ−２のクルマエビへの投与は、養殖業において有利である。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明のペプチドまたはペプチドアミドは、害虫の駆除および益虫の繁殖に貢献することができる。また、哺乳動物の新規医薬成分の候補ともなりうる。
以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正及び変更も、すべて後記の特許請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
【図１】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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