(57)【要約】【課題】プローブの変性を抑制したプローブの固定化方法を提供することを目的とするものである。【解決手段】基板１１にプローブ１４を固定化するためのプローブ１４の固定化方法であって、ＤＮＡ１２が結合された基板１１と、ＤＮＡ結合タンパク質１３が結合したプローブ１４とを準備する工程と、基板１１のＤＮＡ１２を介してプローブ１４を固定化する工程とを含んでいる。このように基板１１にＤＮＡ１２を形成し、このＤＮＡ１２とプローブ１４に結合したＤＮＡ結合タンパク質１３の一部であるＤＮＡ結合ドメインとが結合することによって、プローブ１４を基板に吸着し固定できるため、化学反応におけるｐＨや温度の変化に伴ったプローブ１４の変性を抑制することが可能となる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板にプローブを固定化するためのプローブの固定化方法であって、
ＤＮＡが結合された基板と、ＤＮＡ結合タンパク質が結合したプローブとを準備する工程と、
基板のＤＮＡを介してプローブを固定化する工程とを含むプローブの固定化方法。
【請求項２】
基板とプローブとは、ＤＮＡとＤＮＡ結合タンパク質を介して結合している請求項１に記載のプローブの固定化方法。
【請求項３】
基板とプローブの距離が最も短くなるように、基板に結合したＤＮＡ長をＤＮＡ結合タンパク質が結合できる最短長にする請求項２に記載のプローブの固定化方法。
【請求項４】
ＤＮＡ結合タンパク質として、トポイソメラーゼの全長または一部を用いる請求項２に記載のプローブの固定化方法。
【請求項５】
トポイソメラーゼが変異を有する請求項４に記載のプローブの固定化方法。
【請求項６】
トポイソメラーゼ阻害剤を用いる請求項４に記載のプローブの固定化方法。
【請求項７】
抗がん剤を用いる請求項４に記載のプローブの固定化方法。
【請求項８】
前記抗がん剤として、エトポシドを用いる請求項７に記載のプローブの固定化方法。
【請求項９】
抗生物質を用いる請求項４に記載のプローブの固定化方法。
【請求項１０】
前記抗生物質として、ニューキノロン系抗生物質を用いる請求項９に記載のプローブの固定化方法。
【請求項１１】
ＤＮＡ結合タンパク質として、ジャイレースの全長または一部を用いる請求項２に記載のプローブの固定化方法。
【請求項１２】
前記ジャイレースとして、大腸菌ジャイレースの全長または一部を用いる請求項１１に記載のプローブの固定化方法。
【請求項１３】
ＤＮＡ結合タンパク質として、出芽酵母Ｓｐｏ１１の全長または一部を用いる請求項２に記載のプローブの固定化方法。
【請求項１４】
ＤＮＡ結合タンパク質として、分裂酵母Ｓｐｏ１３の全長または一部を用いる請求項２に記載のプローブの固定化方法。
【請求項１５】
ＤＮＡ結合タンパク質として、真核生物Ｓｐｏ１１ホモログの全長または一部を用いる請求項２に記載のプローブの固定化方法。
【請求項１６】
前記真核生物Ｓｐｏ１１ホモログとして、セキツイ動物Ｓｐｏ１１ホモログの全長または一部を用いる請求項１５に記載のプローブの固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ、糖鎖アレイなどに用いられるアレイ基板に固定されるプローブの固定化方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
各種診断チップやＤＮＡアレイ、プロテインアレイ、糖鎖アレイなどに用いられるアレイ基板に用いられるアレイチップの構築のために、核酸、ペプチド、抗体、レクチンなどのプローブを固定化することが有用視されている。
【０００３】
従来、基板表面に抗体などのプローブを固定化する技術としては、シランカップリング反応が知られている。これは、例えば、固相担体と、例えば、３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物のような、酸無水物官能基を有するシランカップリング剤とを接触させること、前記接触後の固相担体を０℃〜６０℃の温度範囲下に保持しながら、前記酸無水物官能基に対する前記生理活性物質の結合処理を行うこと、を含むことによって、シランカップリング法によってプローブを固定化することができる。
【０００４】
なお、この出願の発明に関連する先行技術文献としては、例えば、特許文献１が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２２９３１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記従来のプローブの固定化方法においては、化学反応を伴うことによって、プローブの機能を最大限に活用できない場合があった。
【０００７】
すなわち、シランカップリング反応は手順が煩雑であり、プローブを保持していた溶媒をシランカップリング用の試薬に置換する必要があり、ｐＨ、塩濃度、温度の変化や界面活性剤の影響によりプローブが変性してしまうことも考えられる。このように化学反応により官能基を基板に付加するため、工程が煩雑になり手間がかかると共に、固定化基板ロット毎のばらつきを生むという問題を有していた。
【０００８】
さらに、シランカップリング反応を用いた場合、基板と結合するプローブ面を特定することができないので、上記反応方法ではプローブが基板に固定化される向きを制御することは難しい。すなわち、化学反応によく用いられるシランカップリング法は、基板と結合するプローブ面を特定できない上に、プローブと基板の間に長いリンカーを有することになるので、プローブの配向が困難となる。
【０００９】
そこで本発明は、プローブの変性を抑制することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために本発明は、基板にプローブを固定化するためのプローブの固定化方法であって、ＤＮＡが結合された基板と、ＤＮＡ結合タンパク質が結合したプローブとを準備する工程と、ＤＮＡ結合タンパク質とプローブとのキメラタンパク質と基板に結合したＤＮＡを反応させることで、自然反応的ないし酵素反応的にプローブを基板に固定化する工程とを含んでいる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のプローブの固定化方法によって、基板に結合されたＤＮＡとプローブに結合したＤＮＡ結合タンパク質の一部であるＤＮＡ結合ドメインとが結合することによって、プローブを基板に吸着し固定できるため、化学反応におけるｐＨや温度の変化に伴ったプローブの変性を抑制することが可能となる。さらに、化学反応を伴わないため工程数の軽減、測定時における固定化基板ロット毎のばらつきを軽減することができる。さらに、プローブと基板間の距離をごく短くすることを可能とし、プローブの配向を可能にするという効果を奏するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１におけるプローブの固定化基板の断面模式図
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（実施例１）
以下、本実施例におけるプローブの固定化方法について説明する。
【００１４】
図１に本実施例のプローブの固定化方法において固定化された基板の断面模式図を示す。
【００１５】
固定化基板１０は、基板１１と、この基板１１の表面に形成されているＤＮＡ１２と、ＤＮＡ結合タンパク質１３とプローブ１４とのキメラタンパク質１５とからなり、基板１１表面のＤＮＡ１２とキメラタンパク質１５のＤＮＡ結合ドメインが結合することによりプローブ１４が固定化されている。
【００１６】
次に、本実施例におけるプローブの固定化方法を示す。
【００１７】
まず、基板１１表面にＤＮＡ１２を有する基板１１を準備する。この時ＤＮＡ１２は、二本鎖ＤＮＡ１２であることが後のプローブ１４固定化の際に安定性が良く好ましい。このようにＤＮＡ１２が結合した基板１１表面に、ＤＮＡ１２を介してＤＮＡ結合タンパク質１３を有するプローブ１４を固定化することによって、プローブ１４の固定化基板１０を作成することができる。
【００１８】
ＤＮＡ結合タンパク質１３を有するプローブ１４は、プローブ１４とＤＮＡ結合タンパク質１３とのキメラタンパク質１５を発現するプラスミドＤＮＡもしくはウイルスを大腸菌・出芽酵母・昆虫細胞ＳＦ９などのホスト生物に形質転換し、キメラタンパク質１５をホスト生物中で強制発現させることによって作成することができる。前述のプラスミドＤＮＡないしウイルス上では、開始コドンに始まりプローブタンパク質がエンコードされ、そのまま連続してＤＮＡ結合タンパク質１３がエンコードされ、終始コドンで転写が終わる。もしくは開始コドン直後にＤＮＡ結合タンパク質１３がエンコードされ、そのまま連続してプローブタンパク質（プローブ１４）がエンコードされ、終始コドンで転写が終わる。プローブタンパク質（プローブ１４）の機能が損なわれないように、必要に応じて数アミノ酸で構成されるリンカーアミノ酸がプローブ１４とＤＮＡ結合タンパク質１３の間にデザインされる。ホスト生物中で強制発現されたキメラタンパク質１５は任意の方法で精製することができる。
【００１９】
このように精製されたキメラタンパク質１５すなわちＤＮＡ結合タンパク質１３を有するプローブ１４を基板１１に付加させると、キメラタンパク質１５のＤＮＡ結合タンパク質１３の一部であるＤＮＡ結合ドメインの酵素活性により基板１１表面にあるＤＮＡ１２と共有結合し、もしくはＤＮＡ結合ドメインと基板１１表面にあるＤＮＡ１２とが水素結合することによって、ＤＮＡ結合タンパク質１３部分とＤＮＡ１２とを介してプローブ１４と基板１１とが固定され固定化基板１０を形成することができるのである。
【００２０】
さらに、この時、キメラタンパク質１５のＤＮＡ結合ドメイン側が基板１１側を、プローブ１４側が基板１１と反対側（つまり基板１１と離れた方向）を向くようにデザインすることができる。なお、ＤＮＡ１２との結合に必要な最小限のＤＮＡ結合タンパク質１３の塩基対数が基板１１表面に結合しているＤＮＡ１２の長さとして望ましい。すなわち、基板１１とプローブ１４との距離が最も短くなるように、基板１１に結合したＤＮＡ１２の長さは、ＤＮＡ結合タンパク質１３が結合できる最短長にすることが望ましい。ここで最短長とは、ＤＮＡ結合タンパク質１３ごとに決まっており、ゲルシフト実験法などにより容易に決定することができる。
【００２１】
なお、ＤＮＡ結合タンパク質１３としてヒストン、ＳＳＢ、ＲＰＡ、ＯＲＣ、転写因子、ＤｎａＡなどを用いることができる。前述のタンパク質のうちヒストン、ＯＲＣ、転写因子は二本鎖ＤＮＡ１２の外側であってメジャーグルーブやマイナーグルーブと呼ばれる溝部分と水素結合により相互作用する。ＳＳＢ、ＲＰＡは１本鎖ＤＮＡと水素結合により相互作用することが知られているので、基板１１に結合しておくＤＮＡは一本鎖ＤＮＡが望ましい。
【００２２】
なお、ＤＮＡ結合タンパク質１３として、トポイソメラーゼの全長あるいは少なくとも一部を用いることができる。
【００２３】
通常、ＤＮＡ結合タンパク質はＤＮＡ二重鎖と水素結合により相互作用することが知られているが、ＤＮＡに一過的に共有結合するタンパク質としてトポイソメラーゼが知られている。トポイソメラーゼはＤＮＡのトポロジーを緩和する、もしくは、増加させる酵素である。トポイソメラーゼはまずＤＮＡ二重鎖の片方ないし両方を切断し、一過的にＤＮＡに共有結合する。そしてトポロジーを緩和もしくは増加させ、その後ＤＮＡとの共有結合を解消、ＤＮＡから解離し、一旦切断していたＤＮＡを再度結合させることができる。
【００２４】
トポイソメラーゼの変異のうち、ＤＮＡに共有結合したままを保持する変異があり、ＤＮＡ結合タンパク質１３として、このような変異を有するトポイソメラーゼを用いることにより、プローブ１４の固定化保持を特に安定的に行うことができる。
【００２５】
もしくはトポイソメラーゼはエトポシドなどの抗がん剤により、ＤＮＡ結合後の再解離が阻害されるが、このような抗がん剤をキメラタンパク質の基板への反応時に添加することで、プローブ１４の固定化保持を特に安定的に行うことができる。
【００２６】
また、ＤＮＡ結合タンパク質１３として原核生物のトポロジーを変える酵素であるジャイレースの全長あるいは一部を用いることができる。
【００２７】
プローブとジャイレースのキメラタンパク質にもＤＮＡを介した基板への結合が期待されるためである。ジャイレースとしては、例えば大腸菌ジャイレースを用いることができる。ジャイレースのＤＮＡからの再解離を抑えるような化合物としては抗生物質のひとつ、ニューキノロン系抗生物質があり、このような抗生物質を付加することにより、プローブ１４の固定化保持を特に安定的に行うことができる。
【００２８】
また、ＤＮＡ結合タンパク質１３として、出芽酵母Ｓｐｏ１１の全長あるいは一部を用いることができる。
【００２９】
これらのタンパク質は減数分裂期に相同組み換えを引き起こすためにＤＮＡ二重鎖を切断する酵素であり、切断後、ＤＮＡ末端に共有結合したままになることが知られている。これらタンパク質とプローブのキメラタンパク質はＤＮＡを介して基板に結合できる。出芽酵母Ｓｐｏ１１の相同因子はヒト、セキツイ動物、昆虫、植物、菌類などの真核生物に広く存在しており、これら真核生物Ｓｐｏ１１を（ＤＮＡ結合タンパク質１３の一部であるＤＮＡ結合ドメイン）として利用しても、前述と同様の効果を奏することができる。なお、分裂酵母のＳｐｏ１１相同因子として分裂酵母Ｓｐｏ１３が知られており、同様の効果を奏することができる。
【００３０】
なお、ＤＮＡ１２を利用した基板１１へのプローブ１４の固定化方法としては、プローブ１４に一本鎖ＤＮＡを結合させ、それと相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡ１２を基板１１側に固定させておき、これらＤＮＡをハイブリダイゼーション法により水素結合させ二本鎖ＤＮＡにする方法も考えられる。しかしながら、プローブ１４に一本鎖ＤＮＡを結合させるステップで化学反応が必要となり、プローブ１４の変性、作業の煩雑さ、など既存の方法との優位性が得られなくなる。
【００３１】
本実施例におけるプローブの固定化方法による効果を示す。
【００３２】
本発明におけるプローブの固定化方法は、従来のシランカップリング法のように、プローブの末端を特定の反応基に置換する必要がないので、プローブを薬品処理などの化学処理を施す必要がない。すなわち、プローブそのものを化学処理による化学反応により処理することなく、基板に結合したＤＮＡと、ＤＮＡ結合タンパク質１３とプローブ１４とのキメラタンパク質１５のＤＮＡ結合ドメインとが結合することによりプローブ１４が固定化されている。その結果、プローブの溶液を化学反応をするために必要な溶液に置換する必要がなく、どのようなｐＨや温度の溶液を用いた場合でもプローブを固定化することができるため、プローブに対して好ましくないｐＨや温度の溶液に置換することによるプローブの変性を避けることができる。さらに、従来のような化学反応を伴わないため工程数の軽減、測定時における固定化基板ロッド毎のばらつきを軽減することができる。さらに、プローブと基板の間に長いリンカーを有する必要がないのでプローブの配向制御が容易となる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明はＤＮＡアレイ、プロテインアレイ、糖鎖アレイなどに用いられるアレイ基板に固定されるプローブの固定化方法として有用である。
【符号の説明】
【００３４】
１０  固定化基板
１１  基板
１２  ＤＮＡ
１３  ＤＮＡ結合タンパク質
１４  プローブ
１５  キメラタンパク質
【図１】
2012141142.tif 000003