(57)【要約】      （修正有）【課題】１次元目電気泳動の分離用ゲルと２次元目電気泳動の分離用ゲルとが一体化した構造のゲル２次元電気泳動用支持体を大量に効率よく製造できる作製方法の提供。【解決手段】以下の数種類の方法を用いて、パターン化されたゲルを基板上に形成し、２次元電気泳動用支持体を作製する。（１）孔版印刷法を応用したゲルパターンの作製方法。（２）パターン化された撥水処理層を設け、選択的にゲル作製用原料液１２２を付着・塗布するゲルパターンの作製方法。（３）「型抜き」によるゲルパターンの作製方法。（４）流し込み型を用いたゲルパターンの作製方法。【選択図】図１
2012141312.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに電気的に絶縁している複数本の２次元目電気泳動用支持体と前記複数本の２次元目電気泳動用支持体に交差して一体化・連通する１次元目電気泳動用支持体とからなるゲルで構成された２次元電気泳動用支持体であって、
ゲル作製用原料液をインクとし、前記の２次元電気泳動用支持体の平面形状に見合うパターンを孔版印刷法により基板上に印刷した後、これをゲル化させることにより作製することを特徴とする２次元電気泳動用支持体の作製方法。
【請求項２】
互いに電気的に絶縁している複数本の２次元目電気泳動用支持体と前記複数本の２次元目電気泳動用支持体に交差して一体化・連通する１次元目電気泳動用支持体とからなるゲルで構成された２次元電気泳動用支持体であって、
前記２次元電気泳動用支持体の平面形状に見合う反転パターンを有する撥水処理層を基板上に設け、ゲル作製用原料液を前記パターン化された撥水層以外の基板領域上に塗布・被着させた後、これをゲル化させることにより作製することを特徴とする２次元電気泳動用支持体の作製方法。
【請求項３】
互いに電気的に絶縁している複数本の２次元目電気泳動用支持体と前記複数本の２次元目電気泳動用支持体に交差して一体化・連通する１次元目電気泳動用支持体とからなるゲルで構成された２次元電気泳動用支持体であって、
前記２次元電気泳動用支持体の平面形状に見合うパターンを有する「打ち抜き型」を用い、あらかじめ作製した平板ゲルを型抜きすることにより作製することを特徴とする２次元電気泳動用支持体の作製方法。
【請求項４】
互いに電気的に絶縁している複数本の２次元目電気泳動用支持体と前記複数本の２次元目電気泳動用支持体に交差して一体化・連通する１次元目電気泳動用支持体とからなるゲルで構成された２次元電気泳動用支持体であって、
前記２次元電気泳動用支持体の平面形状に見合うパターンを有する「流し込み型」にゲル作製用原料液を流し込んだ後、これをゲル化させることにより作製することを特徴とする２次元電気泳動用支持体の作製方法。
【請求項５】
電気泳動用支持体たるゲルを、ポリアクリルアミドに代表される合成高分子ゲルで形成することを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載した２次元電気泳動用支持体の作製方法。
【請求項６】
電気泳動用支持体たるゲルを、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、寒天ゲル、デンプンゲル、マンナンゲル、若しくはカラギーナンゲルの何れかで形成することを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載した２次元電気泳動用支持体の作製方法。
【請求項７】
電気泳動用支持体たるゲルに緩衝液が含まれる場合であって、前記緩衝液が両性電解質を使用する広領域緩衝液であることを特徴とする請求項５又は請求項６に記載の２次元電気泳動用支持体の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たんぱく質の分離分析を行う電気泳動用支持体の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリアクリルアミドゲルを電気泳動用支持体として用いるゲル電気泳動法は生命科学、医療、環境、食品の分野でたんぱく質、ペプチド、神経伝達物質、ホルモン、核酸などの分離分析手段として広く用いられている。特に、たんぱく質を等電点と分子量という二つの異なる分離モードで分離するポリアクリルアミドゲル２次元電気泳動法は、分離能の優れた分析法として知られている。
【０００３】
上記の従来方法の一例を説明すれば、チューブゲルを用いた１次元目の電気泳動分離と、スラブ（平板）ゲルを用いた２次元目の電気泳動分離を組み合わせた２次元電気泳動においては、１次元目の分離が終了したのちにゲルをチューブから取り出して、これを２次元目分離用のスラブゲルの上に密着させてから、２次元目の電気泳動を行う必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１５５５６０
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】O’Farrell, J.Biol. Chem.,250, 4007-4021, 1975
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ポリアクリルアミドゲルに代表されるゲルを支持体に用いる２次元電気泳動法は、分離能に優れた分析方法であるが、上述のゲルを用いる２次元電気泳動方法には下記のような課題がある。
（１）１次元目の分離が終了したのちのゲルをチューブから取り出して、これを２次元目分離用のスラブゲルの上に移し替えるという、複雑で熟練を要する操作が必要である。
（２）上記の理由により、装置の自動化が容易ではない。
【０００７】
これを解決するために、図２に示すような１次元目電気泳動の分離用ゲルと２次元目電気泳動の分離用ゲルとが一体化した構造を持つ「２次元電気泳動用支持体」が考えられている。上記構造を持つゲル２次元電気泳動用支持体を実用に供するには、これを大量に効率よく製造できることが重要であり、これに見合う適切な製造技術が要望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は上記の課題を解決するために、上記の２次元電気泳動用支持体を大量に効率良く作製する方法を提供するものである。図２は、、本発明による作製方法を用いて作製する２次元電気泳動用支持体の模式構造を示す斜視図である。１次元目分離用のストライプゲルを２次元目分離用のスラブゲルに単純に接続・一体化しただけでは、１次元目電気泳動時、電圧印加による泳動電流は２次元目分離用のスラブゲルの領域にも流れてしまい、１次元目の分離精度が損なわれる。
【０００９】
図２に示す２次元電気泳動用支持体２００の構造においては、２次元目電気泳動用スラブゲルの領域に泳動方向に沿ってスリット２３０を設けることにより、上記不都合を解消している。本発明により作製した２次元電気泳動用支持体２００は、ストライプ状の１次元目電気泳動用支持体２１１に、複数本のストライプ状の２次元目電気泳動用支持体２１２および２２２が交差して一体化している。すなわち、２次元目展開用のスラブゲルに２次元目の電気泳動方向に沿ってスリット２３０が入っている。
【００１０】
本発明では、以下に示す数種類の方法を用いて、パターン化されたゲルを基板２１０上に形成して、２次元電気泳動用支持体を作製する。
（１）孔版印刷法を応用したゲルパターンの作製方法
（２）パターン化された撥水処理層を設け、選択的にゲル作製用原料液を付着・塗布するゲルパターンの作製方法
（３）「型抜き」によるゲルパターンの作製方法
（４）流し込み型を用いたゲルパターンの作製方法
【００１１】
上記のゲルの材質には、ポリアクリルアミドに代表される合成高分子ゲルが主として用いられるが、その他にアガロース、寒天ゲル、デンプン、マンナン、カラギーナンなども使用可能である。さらに、上記のゲルの中に両性電解質を使用する広領域緩衝液を予め混合・添加しておくことも可能である。これにより、１次元目の電気泳動を等電点電気泳動法で行うことができる。
【００１２】
本発明による作製方法を用いて製作されたゲル２次元電気泳動用支持体を応用した電気泳動法においては、１次元目の電気泳動終了後、直ちに２次元目の電気泳動を開始することが出来る。従来の方式で必要とされた１次元目電気泳動終了後に、試料を含む泳動用支持体を２次元目電気泳動用支持体上に移す煩雑な操作が不要になり、電気泳動時間が短縮されると同時に工程が簡素化されるため、装置の自動化が容易になる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、種々の利点を有する「ゲル２次元電気泳動用支持体」を、大量に効率よく製造することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（Ａ）実施例１における孔版印刷用型板を示す平面図（Ｂ）実施例１における印刷途中の電気泳動用支持体などの部分断面図
【図２】本発明の製法により作製する２次元電気泳動用支持体の斜視図
【図３】（Ａ）実施例２における撥水パターン層作製用フォトマスクの平面図（Ｂ）実施例２における２次元電気泳動用支持体の部分断面図
【図４】（Ａ）１次元目電気泳動用電極システムを示す斜視図（Ｂ）２次元目電気泳動用電極システムを示す斜視図
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に、実施例に基づき本発明の実施の形態を説明する。
【実施例１】
【００１６】
本発明の第１の実施例を図１及び図２を用いて以下に説明する。図１は、厚膜孔版印刷法を応用したゲルパターンの作製方法を示す模式図、図２は、厚膜孔版印刷法を用いて基板上に作製した２次元電気泳動用支持体（パターン化されたゲル）２００の模式構造を示す斜視図である。図２に示すように、基板２１０上に作製したゲルパターンは、１本の１次元目電気泳動用支持体２１１と、これと交差する複数本の２次元目電気泳動用支持体２１２とで構成されている。２次元目電気泳動用支持体２１２の本数は、例えば１００本であり、図面では間引いて描画している。また、１次元目電気泳動用支持体２１１の両端には１次元目電気泳動用電極受け部２１３が設けられている。
【００１７】
次に、孔版印刷法を応用したゲルパターンの作製方法を図１を用いて説明する。図１（Ａ）は孔版印刷用の型板１００を示す平面図である。型基板１４０の板厚は約１００μｍであり、１次元目電気泳動用支持体２１１に対応するパターン孔１３１、上記ゲルの両端に設ける電極受け部に対応するパターン孔１３３、複数本の２次元目電気泳動用支持体２１２に対応する複数個のパターン孔１３２が設けられている。基板１１０上に上記の型板１００をセットし、適度の粘度に調整したゲル作製用原料液をスキージにより刷り込む。この状態を図１（Ｂ）に示す。この図は、基板１１０上にセットされた型板（ステンシル）１００にあるパターン孔１３２の中に刷り込まれたゲル作製用原料液１２２を示す模式断面図であり、図２のＡ−Ａ部分に相当する箇所の部分断面を示す。１３０は型基板１４０に形成されている仕切り壁を示す。流動性がなくなる程度にまで溶液１２２が固ったら、型板（ステンシル）をとりはずし、溶液１２２を完全にゲル化させれば、図２に示すゲルパターン（２次元電気泳動用支持体）が完成する。
【００１８】
ゲル作製用原料液の主成分は、例えば、アクリルアミドモノマー４％、架橋剤として用いるBis（N,N’−ビスアクリルアミド）０.２％、ゲル重合反応を促進する薬品としてTEMED（N,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミン）、過硫酸アンモニウム、そして緩衝液などであり、光照射で重合させる場合は、リボフラビンなどの光重合触媒などを混合しておく。
また、１次元目を等電点電気泳動とする場合には、上記の緩衝液として両性電解質を使用する広領域緩衝液を用いる。ゲル作製用原料液を基板上に塗布（印刷）した後、加温（例えば３５℃位）するか、あるいは紫外線照射などによりゲル化（重合）させる。このため、作製プロセスの温度制御、光の管理などが要求されると同時に、重合反応を阻害する酸素の脱気、雰囲気制御、使用する基板材質の選択などにも注意を払う必要がある。
【００１９】
ゲルパターンの寸法の一例を挙げれば、ゲル層の厚さ：約１００μｍ、１次元目電気泳動用支持体２１１の幅：約１５０μｍ、２次元目電気泳動用支持体２２２の幅：約１２０μｍ、２次元目電気泳動用支持体２１２の間隔（スリット２３０の幅）：約５０μｍ、２次元目分離用ゲルの全長：約２５ｍｍである。２次元目分離用ゲルの本数は、１００本である（図面では、描画の都合上、本数を間引いて示している）。
【００２０】
以下に、上記の図２に示す２次元電気泳動用支持体２００を用いた電気泳動の一例を示す。例えば、図４（Ａ）、図４（Ｂ）に示すような電極システムを用いて電気泳動を行う。今、２次元電気泳動用支持体２００には予め両性電解質を使用する広領域電解質などの泳動液が含浸されているとすれば、まず、1次元目等電点電気泳動用支持体２１１上の目的に適った位置に試料を供給した後、一対の１次元目電気泳動用電極システム４１０を１次元目電気泳動用電極受け部２１３に接触させ、電圧を印加する。電極システム４１０のキャピラリー４１３の中には電極液４１１として０.０１Ｍリン酸（陽極用）および０.０４Ｍ水酸化ナトリウム（陰極用）が充填されており、毛細管作用により一定量が保持されている。電極液中には電極線４１２が設けられている。以上の１次元目電気泳動分離は１次元目電気泳動用支持体２１１の領域で進行し、これと交差・一体化している複数本の２次元目電気泳動用支持体２１２，２２２の影響をほとんど受けることなしに、１次元目の電気泳動が行われる。
【００２１】
上述した１次元目の電気泳動終了後、直ちに２次元目の分子量分離電気泳動に移行できる。これには、図４（B）に示す２次元目電気泳動用電極システム４２０を一対用いる。２次元目電気泳動用の電極システム４２０の構成も１次元目用と類似しており、電極液容器４２３の中に電極液４２１が充填されており、毛細管作用により一定量が保持されている。電極液には陽極、陰極共、例えば０.０５Ｍトリス（Tris(hydroxyl)aminomethane）−０.３８Ｍグリシン緩衝液を用いる。電極液中には電極線４２２が設けられている。上記の電極システムを２次元目電気泳動用支持体２１２・２２２の両端の電極受け領域２１４に接触させてから電圧を印加して、２次元目の電気泳動を行う。
【００２２】
上述のように、１次元目の電気泳動終了後、直ちに２次元目の電気泳動を開始することが出来る。従来の方式で必要とされた１次元目電気泳動終了後に、試料を含む泳動用支持体を２次元目電気泳動用支持体上に移す煩雑な操作が不要になり、電気泳動時間が短縮されると同時に工程が簡素化されるため、電気泳動装置の自動化が容易になる。
【００２３】
本実施例では、孔版印刷用の型板としてメッシュスクリーンを持たない型板（ステンシル）を用いてゲルパターンを作製する例を示した。一方、基板上に刷り込んだ直後に型板を取り外したときに、ゲル作製用原料液がもはやそれ以上の濡れ広がりを起こすことがなく、ゲル化するまでの間、所定のパターン形状を保持できるような条件下であれば、スクリーン印刷手法、すなわち、メッシュスクリーンに乳化剤による所定パターンを設けた印刷用マスク（印刷原版）を用いる印刷手法によりゲルパターンを作製することも可能である。
【００２４】
また、ゲルパターンの下地となる基板２１０は、例えば、ガラス基板、プラスチック基板、プラスチックシートなどである。これらの基板には、必要に応じて、アクリルアミドモノマーと基板の結合剤となるシランカップリング剤などで前処理を施す。好ましくは、上記基板材質が電気泳動像の観察のための照明光や蛍光標識体を発光させるための励起光に対して透明であることが望ましい。また、パターン化されたゲルで構成される支持体を１個づつ印刷するのではなく、複数個を同時に印刷できる原版を用いた、複数個同時印刷手法を採用することも可能である。
【実施例２】
【００２５】
本発明の第２の実施例を図３により説明する。本実施例では、先の図２に示したようなパターン化されたゲルにより構成された２次元電気泳動用支持体を、半導体デバイス製造プロセスで多用されているフォトリソグラフィー技術とオフセット印刷に類似する手法を応用して作製している。図３（Ａ）は、ゲルパターンを作製する基板（例えばベースシート）面にパターン化した撥水処理層を設けるために使用するフォトマスク３５０の平面図である。フォトマスクガラス基板３３０上には、図２と同様のパターンが描かれている。ハッチングを施してあるパターン領域には、紫外線を遮光するクロム（Ｃｒ）膜３３５が被着されている。一方、１次元目や２次元目分離用ゲルパターンに対応する部分（３３１、３３２）にはクロム膜が存在せず、ガラス基板を通して紫外線が透過可能になっている。
【００２６】
本例でのパターン化された電気泳動用支持体を作製するには、まず、ゲルパターンを作製する基板（ベースシート）３１０面に撥水処理剤（有機珪素系撥水剤）を塗布又はスプレーして撥水処理層を設ける。次に、撥水処理を施された上記のベースシート３１０面に図３（Ａ）に示すフォトマスク３５０を載置し、紫外線を数分間照射する。これにより、紫外線が照射された部分、すなわちゲルパターンを形成したい部分のベースシート表面では撥水性が解消され、ゲル作製用原料液の濡れ性が復活する。また、紫外線の照射を受けなかった部分（図３（Ａ）の３３５に相当する領域）では撥水処理層が残っており、撥水性が維持されている。
【００２７】
以上の処理により部分的に撥水処理層が形成された上記のベースシート面に、ゲル作製用原料液を掛け流すことにより、ゲルパターン形成部分のみにゲル作製用原料液を選択的に付着させることができる。この選択的な付着をさせるためには、ゲル作製用原料液をベースシート面上にスプレーした後、ベースシートを傾斜させて撥水処理層上の液を流し落としてもよい。さらには、部分的に撥水処理層をもつベースシートをゲル作製用原料液中に浸漬したのち引き上げ、ベースシートを傾斜させるなどして余分な液を流し落とすなどしてもよい。
【００２８】
上記のゲル作製用原料液の選択付着が終了したのちは、加温（例えば３５℃）することによってゲル化させる。図３（Ｂ）は、完成した２次元電気泳動用支持体３００の模式断面図であり、図３（Ａ）Ｐ−Ｐに相当する位置での部分断面を示す。ベースシート３１０上には選択的に撥水処理層３４０が設けられている。この部分にはゲル作製用原料液が濡れることはないので、選択的にゲル層３２２を形成することが出来る。
【００２９】
なお、上記の例では部分的に撥水処理層を設ける方法として、全面に設けた撥水処理層のうち、ゲルパターンを設ける部分にのみ紫外線を照射してその撥水性を解消する方法を用いているが、この方法に限定されるものではない。パターンサイズと整合が採れれば、例えば、図３（Ａ）に示すパターンの逆パターン―――すなわち、図の白抜きの部分をマスクするようなスクリーン印刷用原版を用いて、これをベースシート上に載置したのち撥水処理剤（フッ素樹脂系撥水剤や、有機珪素系撥水剤）をスプレーし、その後乾燥させて撥水パタン層を部分的に形成することも出来る。あるいはまた、図３（Ａ）に示すパターン形状と同様のスタンプを製作し、３３５に相当する部分に撥水処理剤を含浸させておき、これをベースシート上にスタンプして部分的に撥水処理層を設けることも可能である。
なお、本例で用いたゲル作製用原料液やゲル化させるときの条件などは、実施例１に類似しているので、記述を省略する。
【００３０】
なお、本例では原料液をゲル化させて２次元電気泳動用支持体を構成しているが、別の原料液と本例の手法により、ゲルではなく液体の２次元電気泳動用パターン流路を作製することも可能である。別の原料液とは、例えば、水溶性直鎖ポリマー若しくは分岐構造を含む水溶性直鎖ポリマーのいずれか一以上と両性電解質を使用する広領域緩衝液を混合したものである。水溶性直鎖ポリマーは、例えば、直鎖状ポリアクリルアミド、セルロース、などであり、ゲル同様の分子篩効果を有する支持体となる。
【実施例３】
【００３１】
以下では、実施例１〜３で述べたものとは別の方法によってパターン化されたゲルを作製する実施例について説明する。
（１）流し込み型を使用する方法
まず、例えば図２に示すようなパターン化されたゲルの形状に対応した「雌型」を作製する。これには、例えば半導体デバイス作製プロセスで多用されているドライエッチング技術を利用してシリコン基板上に所定形状の溝を形成し、次いで溝内面を含む表面全面に厚さ約１μｍの酸化膜（ＳｉＯ２膜）を設け、「雌型」を完成させる。さらに必要に応じ、表面・型溝内面に撥水処理を施してもよい。
【００３２】
次に、ゲル作製用原料液としては、実施例１にならい、これを上記「雌型」の溝内部に流し込む。この流し込み作業にはディスペンサーを用いてもよい。あるいは又、「雌型」の表面全面にゲル作製用原料液を掛け流して溝内を埋めた後に、「雌型」表面にある余分な原料液をスキージなどで除去する手法を採ってもよい。以上の「雌型」への流し込みが終了した後は実施例１と同様にしてゲル化を完了させ、型から取り外せばパターン化された２次元電気泳動用支持体が得られる。
【００３３】
（２）型抜きによる方法
基板に固定された平板ゲルを、打ち抜き型を用いてプレスにより基板ごと型抜きすることにより、パターン化された２次元電気泳動用支持体を得ることも可能である。詳細を以下に述べる。まず、既存の方法で基板上に平板ゲルを作製する。次に、例えば図２に示すようなパターン化されたゲルの形状に相当する「プレス打ち抜き型」を準備し、これを用いて上記平板ゲルをプレス打ち抜きすれば、所定形状の２次元電気泳動用支持体を作製することが出来る。この方法は、比較的サイズの大きいゲルの作製に好適であるが、電鋳法などを応用した精密なプレス型を準備すれば、マイクロチップに見合う小型支持体を作製することも可能である。
【００３４】
なお、以上の実施例１〜３においては、ゲルの材質としてポリアクリルアミドを例にして説明したが、これに限定されるものではなく、広く合成高分子ゲルや、アガロース、デンプン、寒天ゲル、マンナン、カラギーナン等も使用可能である。
【００３５】
なお、以上の各実施例において、撥水処理層が存在しなければ紫外線照射によるゲル化促進も可能である。また、必要に応じ、カバープレート（例えば、ガラス薄板など）で支持体の必要箇所を覆う構造とすることも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の活用例としては、医療、食品、環境分析、又はその品質管理など広い分野に適用可能である。
【符号の説明】
【００３７】
１００―――孔版印刷用型板
１２２、２１２―――２次元目電気泳動用支持体
２００，３００―――２次元電気泳動用支持体
２１０―――基板
２１１―――１次元目電気泳動用支持体
２１３―――１次元目電気泳動用電極受け部
２１４―――２次元目電気泳動用電極受け領域
２３０―――スリット
４１０―――１次元目電気泳動用電極システム
４１１，４２１―――電極液
４１２，４２２―――電極線
４２０――２次元目電気泳動用電極システム
【図１】
2012141312.tif 000003
【図２】
2012141312.tif 000004
【図３】
2012141312.tif 000005
【図４】
2012141312.tif 000006