(57)【要約】【課題】ＤＮＡ鎖（例、プライマー、ＤＮＡ標品）の安定化方法の開発。【解決手段】水中において、１以上のＤＮＡ鎖、および式（Ｉ）：【化１】2012005436.tif 000029〔式中、Ｒｎ−１およびＲｎ−２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、アミノ基または炭素数１〜６のアルキル基を示すか、またはＲｎ−１およびＲｎ−２は、互いに一緒になってオキソ基を示し、  ｎは、１〜３の任意の整数を示す。〕で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有する、ＤＮＡ鎖の保存溶液、ならびにその製造方法など。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中において、１以上のＤＮＡ鎖、および式（Ｉ）：
【化１】
2012005436.tif 000017
〔式中、Ｒｎ−１およびＲｎ−２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基または炭素数１〜６のアルキル基を示すか、またはＲｎ−１およびＲｎ−２は、互いに一緒になってオキソ基を示し、
ｎは、１〜３の任意の整数を示す。〕
で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有する、ＤＮＡ鎖の保存溶液。
【請求項２】
前記ＤＮＡ鎖がプライマーである、請求項１記載の保存溶液。
【請求項３】
前記プライマーが、目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用のプライマーである、請求項２記載の保存溶液。
【請求項４】
前記ＤＮＡ鎖がＤＮＡ標品である、請求項１記載の保存溶液。
【請求項５】
前記式（Ｉ）で表される多価カルボン酸化合物が、式（Ｉ−１）：
【化２】
2012005436.tif 000018
〔式中、Ｒ１−１およびＲ１−２は、それぞれ独立して、水素原子またはヒドロキシル基を示す。〕、
（Ｉ−２）：
【化３】
2012005436.tif 000019
〔式中、Ｒ１−１、Ｒ１−２、Ｒ２−１およびＲ２−２は、それぞれ独立して、水素原子またはヒドロキシル基を示す。〕、あるいは
（Ｉ−３）：
【化４】
2012005436.tif 000020
〔式中、Ｒ１−１、Ｒ１−２、Ｒ２−１、Ｒ２−２、Ｒ３−１およびＲ３−２は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を示す。〕
で表される多価カルボン酸化合物である、請求項１〜４のいずれか１つに記載の保存溶液。
【請求項６】
前記式（Ｉ−１）、（Ｉ−２）あるいは（Ｉ−３）で表される多価カルボン酸化合物が、マロン酸、コハク酸あるいはクエン酸である、請求項５記載の保存溶液。
【請求項７】
ＤＮＡ鎖の保存溶液の保存方法であって、
ＤＮＡ鎖の保存溶液を液体状態で保存することを含み、
ＤＮＡ鎖の保存溶液が、水中において、１以上のＤＮＡ鎖、および式（Ｉ）：
【化５】
2012005436.tif 000021
〔式中、Ｒｎ−１およびＲｎ−２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基または炭素数１〜６のアルキル基を示すか、またはＲｎ−１およびＲｎ−２は、互いに一緒になってオキソ基を示し、
ｎは、１〜３の任意の整数を示す。〕
で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有するＤＮＡ鎖の保存溶液である、方法。
【請求項８】
１以上のＤＮＡ鎖、および式（Ｉ）：
【化６】
2012005436.tif 000022
〔式中、Ｒｎ−１およびＲｎ−２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基または炭素数１〜６のアルキル基を示すか、またはＲｎ−１およびＲｎ−２は、互いに一緒になってオキソ基を示し、
ｎは、１〜３の任意の整数を示す。〕
で表される多価カルボン酸化合物の塩を、水中に共存させることにより、１以上のＤＮＡ鎖、および式（Ｉ）で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有するＤＮＡ鎖の保存溶液を得ることを含む、ＤＮＡ鎖の保存溶液の製造方法。
【請求項９】
１以上のＤＮＡ鎖、および式（Ｉ）：
【化７】
2012005436.tif 000023
〔式中、Ｒｎ−１およびＲｎ−２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基または炭素数１〜６のアルキル基を示すか、またはＲｎ−１およびＲｎ−２は、互いに一緒になってオキソ基を示し、
ｎは、１〜３の任意の整数を示す。〕
で表される多価カルボン酸化合物の塩を、水中に共存させることにより、１以上のＤＮＡ鎖を安定化させることを含む、ＤＮＡ鎖の安定化方法。
【請求項１０】
以下（ａ）、（ｂ）を含む、キット：
（ａ）水中において、１以上のＤＮＡ鎖、および式（Ｉ）：
【化８】
2012005436.tif 000024
〔式中、Ｒｎ−１およびＲｎ−２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基または炭素数１〜６のアルキル基を示すか、またはＲｎ−１およびＲｎ−２は、互いに一緒になってオキソ基を示し、
ｎは、１〜３の任意の整数を示す。〕
で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有する、ＤＮＡ鎖の保存溶液；ならびに
（ｂ）目的ＤＮＡ鎖の合成反応用の構成要素。
【請求項１１】
目的ＤＮＡ鎖の合成反応用の構成要素が、目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の構成要素、ＲＮＡ鎖の逆転写反応用の構成要素、または逆転写反応−目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の構成要素である、請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の構成要素が、ＰＣＲ用の試薬、またはＲＴ−ＰＣＲ用の試薬である、請求項１０記載のキット。
【請求項１３】
目的ＤＮＡ鎖の製造方法であって、
１以上のプライマーを用いてテンプレートから目的ＤＮＡ鎖を合成することを含み、
（ｉ）該プライマーが、水中において、１以上のプライマー、および式（Ｉ）：
【化９】
2012005436.tif 000025
〔式中、Ｒｎ−１およびＲｎ−２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基または炭素数１〜６のアルキル基を示すか、またはＲｎ−１およびＲｎ−２は、互いに一緒になってオキソ基を示し、
ｎは、１〜３の任意の整数を示す。〕
で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有するプライマーの保存溶液中の１以上のプライマーであるか、あるいは／ならびに
（ｉｉ）該テンプレートが、水中において、ＤＮＡ標品、および式（Ｉ）：
【化１０】
2012005436.tif 000026
〔式中、Ｒｎ−１およびＲｎ−２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基または炭素数１〜６のアルキル基を示すか、またはＲｎ−１およびＲｎ−２は、互いに一緒になってオキソ基を示し、
ｎは、１〜３の任意の整数を示す。〕
で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有するＤＮＡ標品の保存溶液中のＤＮＡ標品である、方法。
【請求項１４】
ＲＮＡ発現量の測定方法であって、
ＲＮＡ鎖を、ＲＮＡ鎖の逆転写反応および目的ＤＮＡ鎖の増幅反応に供することを含み、
（ｉ’）ＲＮＡ鎖の逆転写反応または／および目的ＤＮＡ鎖の増幅反応において、プライマーが用いられ、
該プライマーが、水中において、１以上のプライマー、および式（Ｉ）：
【化１１】
2012005436.tif 000027
〔式中、Ｒｎ−１およびＲｎ−２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基または炭素数１〜６のアルキル基を示すか、またはＲｎ−１およびＲｎ−２は、互いに一緒になってオキソ基を示し、
ｎは、１〜３の任意の整数を示す。〕
で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有するプライマーの保存溶液中の１以上のプライマーであるか、あるいは／ならびに
（ｉｉ’）目的ＤＮＡ鎖の増幅反応において、ＤＮＡ標品が用いられ、
該ＤＮＡ標品が、水中において、ＤＮＡ標品、および式（Ｉ）：
【化１２】
2012005436.tif 000028
〔式中、Ｒｎ−１およびＲｎ−２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基または炭素数１〜６のアルキル基を示すか、またはＲｎ−１およびＲｎ−２は、互いに一緒になってオキソ基を示し、
ｎは、１〜３の任意の整数を示す。〕
で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有するＤＮＡ標品の保存溶液中のＤＮＡ標品である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ鎖の保存溶液およびその製造方法、プライマーの安定化方法、ＤＮＡ鎖の保存溶液を含むキット、ＤＮＡ鎖の保存溶液の使用方法などに関する。
に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分子（例、ＲＮＡ、プローブ等のＤＮＡ）を溶解するための溶液としては、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）緩衝液が汎用されている。これは、ＴＥ緩衝液が核酸分子の溶解能に優れることに加え、核酸分子の安定化作用を有するためである。また、ＴＥ緩衝液の他に、水溶液中の核酸分子を安定化する成分が、幾つか知られている。例えば、非特許文献１は、クエン酸ナトリウムが、ＲＮＡの塩基の加水分解を抑えるキレート剤として、ＴＥ緩衝液中で使用できることを記載している。
【０００３】
ところで、ＴＥ緩衝液は、プライマーを溶解するために用いられていない。この理由は、ＴＥ緩衝液中の成分であるＥＤＴＡがＤＮＡ鎖の合成反応（例、ＰＣＲ等の増幅反応）を阻害し得るためである（非特許文献２を参照）。したがって、水がプライマーを溶解するために用いられているが、水は、ＴＥ緩衝液に比し、ＤＮＡ鎖の安定化作用に劣る。
【０００４】
また、プライマーは、長期保存される場合、凍結乾燥された形態、または凍結溶液として冷凍保存される。例えば、プライマー合成を所定の機関に依頼した場合、依頼先の機関は、凍結乾燥プライマーを納品する。凍結乾燥プライマーを納品する理由は、凍結乾燥状態で輸送される場合にプライマーが最も安定なためである。納品された凍結乾燥プライマーは、凍結乾燥状態のまま保存され、アッセイに使用する際に滅菌蒸留水中に溶解される。余ったプライマー溶液は、幾つかのチューブに分注され、チューブ中の各プライマー溶液は、使用されるまで−２０℃または−８０℃で冷凍庫中に保存される。プライマーがアッセイに再度使用される場合、必要な分だけチューブが冷凍庫から取り出され、プライマー溶液が解凍される。このように、プライマー溶液を分注し、使用する際に必要な分だけ解凍する理由は、溶液の凍結−融解のプロセスにおいてプライマーの分解が促進され得ることから、当該プロセスの回数を可能な限り減らすためである。
【０００５】
以上に述べた経緯より、プライマーは、水中に溶解された後、すぐに使用する予定がない場合には、分注により小分けされた様式において凍結状態で保存されているのが実情である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のホームページ、製品名「ＲＮＡ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」の項目「Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」、２０１０年４月５日検索、インターネット＜ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ａｂ／ｅｎ／ＵＳ／ａｄｉｒｅｃｔ／ａｂ？ｃｍｄ＝ｃａｔＮａｖｉｇａｔｅ２＆ｃａｔＩＤ＝６０３２７２＆ｔａｂ＝ＤｅｔａｉｌＩｎｆｏ＞
【非特許文献２】Ａｆｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．６（３），ｐｐ．１８４−１８７，５  Ｆｅｂｒｕａｒｙ，２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、分注により小分けし、使用する際に必要な分だけ解凍するという上述した手法を利用した場合であっても、水溶液の凍結−融解のプロセスを少なくとも一回行う必要がある。このようなプロセスは、プライマー分解の抑制という観点からは、好ましくない。また、分注により小分けし、使用する際に必要な分だけ解凍した場合、余ったプライマーは通常廃棄されるが、このような廃棄は、より多くのプライマーの有効利用という観点からは、好ましくない。以上の欠点に配慮した、プライマーの安定化方法の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上述した課題を解決するため、鋭意検討した結果、プライマーの保存に関する上述した従来の技術常識とは異なり、プライマー溶液を常温で保存することを着想した。また、プライマー溶液を常温で保存するために、水中のプライマーの安定化作用を有する物質を鋭意探索した結果、優れた安定化作用を有する物質を見出すことに成功し、さらに安定化作用を有する物質がＤＮＡ鎖の増幅反応の検出感度を向上させることをも見出した。さらに、本発明者らは、このような物質がプライマー以外のＤＮＡ鎖（例、ＤＮＡ鎖の増幅反応に用いられるＤＮＡ標品）の常温保存にも利用できることを着想し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
従来技術は、ＤＮＡ鎖と多価カルボン酸化合物の塩とを、組み合わせて使用すること、特に、ＤＮＡ鎖（例、ＤＮＡ鎖の増幅反応に用いられるプライマーまたは／およびＤＮＡ標品）の保存、および／またはＤＮＡ鎖の増幅反応における検出感度の向上のために組み合わせて使用することを記載も示唆もしていない。従来技術はそもそも、ＤＮＡ鎖を常温で保存するという発想、特に水中で保存するという発想を記載も示唆もしていない。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕水中において、１以上のＤＮＡ鎖、および式（Ｉ）：
【化１】
2012005436.tif 000002
〔式中、Ｒｎ−１およびＲｎ−２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基または炭素数１〜６のアルキル基を示すか、またはＲｎ−１およびＲｎ−２は、互いに一緒になってオキソ基を示し、
ｎは、１〜３の任意の整数を示す。〕
で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有する、ＤＮＡ鎖の保存溶液。
〔２〕前記ＤＮＡ鎖がプライマーである、〔１〕の保存溶液。
〔３〕前記プライマーが、目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用のプライマーである、〔２〕の保存溶液。
〔４〕前記ＤＮＡ鎖がＤＮＡ標品である、〔１〕の保存溶液。
〔５〕前記式（Ｉ）で表される多価カルボン酸化合物が、式（Ｉ−１）：
【化２】
2012005436.tif 000003
〔式中、Ｒ１−１およびＲ１−２は、それぞれ独立して、水素原子またはヒドロキシル基を示す。〕、
（Ｉ−２）：
【化３】
2012005436.tif 000004
〔式中、Ｒ１−１、Ｒ１−２、Ｒ２−１およびＲ２−２は、それぞれ独立して、水素原子またはヒドロキシル基を示す。〕、あるいは
（Ｉ−３）：
【化４】
2012005436.tif 000005
〔式中、Ｒ１−１、Ｒ１−２、Ｒ２−１、Ｒ２−２、Ｒ３−１およびＲ３−２は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を示す。〕
で表される多価カルボン酸化合物である、〔１〕〜〔４〕のいずれか１つに記載の保存溶液。
〔６〕前記式（Ｉ−１）、（Ｉ−２）あるいは（Ｉ−３）で表される多価カルボン酸化合物が、マロン酸、コハク酸あるいはクエン酸である、〔５〕の保存溶液。
〔７〕ＤＮＡ鎖の保存溶液の保存方法であって、
ＤＮＡ鎖の保存溶液を液体状態で保存することを含み、
ＤＮＡ鎖の保存溶液が、水中において、１以上のＤＮＡ鎖、および前記式（Ｉ）で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有するＤＮＡ鎖の保存溶液である、方法。
〔８〕１以上のＤＮＡ鎖、および前記式（Ｉ）で表される多価カルボン酸化合物の塩を、水中に共存させることにより、１以上のＤＮＡ鎖、および式（Ｉ）で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有するＤＮＡ鎖の保存溶液を得ることを含む、ＤＮＡ鎖の保存溶液の製造方法。
〔９〕１以上のＤＮＡ鎖、および前記式（Ｉ）で表される多価カルボン酸化合物の塩を、水中に共存させることにより、１以上のＤＮＡ鎖を安定化させることを含む、ＤＮＡ鎖の安定化方法。
〔１０〕以下（ａ）、（ｂ）を含む、キット：
（ａ）水中において、１以上のＤＮＡ鎖、および前記式（Ｉ）で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有する、ＤＮＡ鎖の保存溶液；ならびに
（ｂ）目的ＤＮＡ鎖の合成反応用の構成要素。
〔１１〕目的ＤＮＡ鎖の合成反応用の構成要素が、目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の構成要素、ＲＮＡ鎖の逆転写反応用の構成要素、または逆転写反応−目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の構成要素である、〔１０〕のキット。
〔１２〕目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の構成要素が、ＰＣＲ用の試薬、またはＲＴ−ＰＣＲ用の試薬である、〔１０〕のキット。
〔１３〕目的ＤＮＡ鎖の製造方法であって、
１以上のプライマーを用いてテンプレートから目的ＤＮＡ鎖を合成することを含み、
（ｉ）該プライマーが、水中において、１以上のプライマー、および前記式（Ｉ）で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有するプライマーの保存溶液中の１以上のプライマーであるか、あるいは／ならびに
（ｉｉ）該テンプレートが、水中において、ＤＮＡ標品、および前記式（Ｉ）で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有するＤＮＡ標品の保存溶液中のＤＮＡ標品である、方法。
〔１４〕ＲＮＡ発現量の測定方法であって、
ＲＮＡ鎖を、ＲＮＡ鎖の逆転写反応および目的ＤＮＡ鎖の増幅反応に供することを含み、
（ｉ’）ＲＮＡ鎖の逆転写反応または／および目的ＤＮＡ鎖の増幅反応において、プライマーが用いられ、
該プライマーが、水中において、１以上のプライマー、および前記式（Ｉ）で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有するプライマーの保存溶液中の１以上のプライマーであるか、あるいは／ならびに
（ｉｉ’）目的ＤＮＡ鎖の増幅反応において、ＤＮＡ標品が用いられ、
該ＤＮＡ標品が、水中において、ＤＮＡ標品、および前記式（Ｉ）で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有するＤＮＡ標品の保存溶液中のＤＮＡ標品である、方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の保存溶液は、プライマー等のＤＮＡ鎖を安定化し得るので、ＤＮＡ鎖の保存（特に、常温での保存）に有用である。本発明の保存溶液はまた、目的ＤＮＡ鎖の増幅反応の検出感度を向上させ得るので、目的ＤＮＡ鎖の増幅反応に有用である。
また、本発明の保存溶液は、安定化されたＤＮＡ鎖を、凍結乾燥ではなく水溶液の状態で供給できる点で優れている。例えば、プライマー等のＤＮＡ鎖を臨床検査等の検査目的で使用する場合、ＤＮＡ鎖を凍結乾燥ではなく水溶液の状態で供給することができれば、ＤＮＡ鎖を水溶液中に溶解する工程を省略することができるので、検査を簡便に行うことができる。また、かかる工程を省略することにより、かかる工程について、不注意による人為的な操作ミス（例、ＤＮＡ鎖を溶解するための溶液の取り違え、および溶液の添加量のバラツキに基づくＤＮＡ鎖濃度の誤差）を確実に排除できる。かかる工程の省略は、製品が世界的に供給され、分子生物学的手法に不慣れな者が製品を使用する場合（例、発展途上国における製品の使用）、精度管理の観点から、特に利点がある。
さらに、本発明の保存溶液は、水溶液の状態で安定化されたＤＮＡ鎖を世界中に供給することを実現できる。これは、（ｉ）本発明の保存溶液が長期にわたりＤＮＡ鎖を安定化し得るため、輸送期間が長い場合であってもＤＮＡ鎖が分解されないため、（ｉｉ）本発明の保存溶液が比較的高温でもＤＮＡ鎖を安定化し得ることから、冷凍設備（例、輸送中の冷凍設備、または輸送後の保管用の冷凍設備）を備えていない地域にＤＮＡ鎖を供給できるため、（ｉｉｉ）本発明の保存溶液は、振盪条件下でもＤＮＡ鎖を安定化し得るため、振盪状態で輸送される場合（例、道路が未整備の地域に輸送される場合）にも、ＤＮＡ鎖の分解を抑制できるためである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、異なる濃度〔添加なし（０ｍＭ）、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ〕のクエン酸ナトリウムの存在下における、ＰＣＲサイクルと蛍光強度との間の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ＤＮＡ鎖の保存溶液（またはＤＮＡ鎖の溶液。以下同様。）を提供する。本発明の保存溶液は、保存対象物である１以上のＤＮＡ鎖を含有する。ＤＮＡ鎖としては、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡが挙げられる。具体的には、ＤＮＡ鎖としては、プライマー、ＤＮＡ標品、プローブ（例、蛍光標識プローブ）、ベクター、アンチセンスＤＮＡ、天然物から抽出されたＤＮＡなどが挙げられる。
【００１４】
保存対象のＤＮＡ鎖は、ＤＮＡ鎖の構成成分であるデオキシリボヌクレオチドから構成される。保存対象のＤＮＡ鎖の構成成分であるデオキシリボヌクレオチドとしては、例えば、主要核酸塩基である、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）を有するデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。また、他の代表的なデオキシリボヌクレオチドとしては、例えば、イノシン、ウリジンが挙げられる。
【００１５】
保存対象のＤＮＡ鎖の構成成分であるデオキシリボヌクレオチドは、修飾されていてもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチド」とは、未修飾のデオキシリボヌクレオチド、あるいは核酸塩基部分、糖部分およびリン酸結合部分のうちの少なくとも１つの部分が修飾されたデオキシリボヌクレオチドをいう。具体的には、修飾されたデオキシリボヌクレオチドとしては、置換基または蛍光物質で置換された核酸塩基部分を含むリボヌクレオチド、置換基または蛍光物質で置換された糖部分を含むリボヌクレオチド、リン酸結合が他の結合と交換されたリボヌクレオチド、およびこれらの修飾の組合せを含むリボヌクレオチドが挙げられる。
【００１６】
置換基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、アミノ基、ハロゲン原子（例、フッ素原子、臭素原子、塩素原子、ヨウ素原子）、ヒドロキシル基、カルボキシル基、オキソ基（＝Ｏ）、チオ基（＝Ｓ）、ニトロ基、リン酸基、チオール基、ビオチンなどが挙げられる。核酸塩基部分または糖部分に結合し得る置換基の数は、１〜３個であり得るが、１または２個が好ましく、１個がより好ましい。リン酸結合部分が他の結合と交換される場合、このような他の結合としては、例えば、ホスホロチオエート結合、アミド結合、メチルホスホネート結合、メチルホスホトリエステル結合が挙げられる。蛍光物質としては、例えば、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）５などが挙げられる。
【００１７】
アルキル基としては、直鎖状または分枝状の炭素数１〜１２のアルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどのＣ１〜Ｃ１０アルキルが挙げられるが、Ｃ１〜Ｃ６アルキルが好ましい。
【００１８】
アルケニル基としては、直鎖状または分枝状の炭素数２〜１２のアルケニル、例えば、アリル、クロチル、２−ペンテニル、３−ヘキセニルなどのＣ２〜Ｃ１０アルケニルが挙げられるが、Ｃ２〜Ｃ６アルケニルが好ましい。
【００１９】
アルキニル基としては、直鎖状または分枝状の炭素数２〜１２のアルキニル、例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ペンチニル、３−ヘキシニルなどのＣ２〜Ｃ１０アルキニルが挙げられるが、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルが好ましい。
【００２０】
シクロアルキル基としては、環状の炭素数３〜１２のシクロアルキル、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルが挙げられる。
【００２１】
アリール基としては、炭素数６〜１０のアリール、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチルが挙げられる。
【００２２】
アラルキル基としては、炭素数７〜１２のアラルキル、例えば、フェニル−Ｃ１〜Ｃ４アルキル（例、ベンジル、フェネチル）が挙げられる。
【００２３】
アシル基としては、炭素数２〜１２のアシル、例えば、炭素数２〜４のアルカノイル（例、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル）、あるいは炭素数６から１０のアロイル（例、ベンゾイル、トルオイルなど）が挙げられる。
【００２４】
アミノ基としては、上記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキルおよびアシルからなる群より選ばれる置換基でモノ置換またはジ置換されていてもよいアミノ、例えば、アミノ（−ＮＨ２）、メチルアミノ、ジメチルアミノが挙げられる。
【００２５】
好ましい実施形態では、ＤＮＡ鎖は、プライマーである。プライマーは、ＤＮＡ鎖の伸長に用いられる一本鎖ＤＮＡである。プライマーの構成成分としては、例えば、主要核酸塩基である、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）を有するデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。プライマーはまた、プライマー合成において汎用されるデオキシリボヌクレオチド代替物（例、イノシン、ウリジン）、あるいは糖鎖修飾を、構成成分として有していてもよい。プライマーはまた、置換基、あるいは蛍光物質で修飾されていてもよい。置換基としては、例えば、上述したものが挙げられるが、アミノ基、アミノアルキル基（例、６−アミノヘキシル基等の、アミノ基で置換された炭素数１〜１２（好ましくは炭素数１〜６）のアルキル基）、リン酸基、チオール基、ビオチンなどであってもよい。蛍光物質としては、上述したものが挙げられる。なお、プライマーは、３’末端に水酸基を有し得る。これは、３’末端の水酸基が鎖の伸長反応に必要であり得るためである。したがって、プライマーの場合、置換基または蛍光物質による修飾部位は、３’末端の水酸基以外の部分であり得、例えば、５’末端の水酸基部分、核酸塩基部分が挙げられる。
【００２６】
プライマーは、目的ＤＮＡ鎖の合成反応、例えば、目的ＤＮＡ鎖の増幅反応、またはＲＮＡ鎖の逆転写反応に用いられ得る。プライマーが目的ＤＮＡ鎖の増幅反応に用いられる場合、目的ＤＮＡ鎖の増幅反応は、プライマーを使用する増幅反応である限り特に限定されず、定性的または定量的アッセイ等のために用いられ得る。具体的には、目的ＤＮＡ鎖の増幅反応としては、ＰＣＲ（例、リアルタイムＰＣＲ、多重化ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（例、国際公開第００／２８０８２号参照）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）（例、国際公開第００／５６８７７号参照）、ＳＭＡＰ（ＳＭａｒｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）が挙げられる。
【００２７】
一方、プライマーがＲＮＡ鎖の逆転写反応に用いられる場合、逆転写反応に供されるＲＮＡ鎖としては、天然に由来するＲＮＡ鎖、および人工的に合成されたＲＮＡ鎖が挙げられる。天然に由来するＲＮＡ鎖としては、例えば、天然の供給源（例、哺乳動物等の動物、植物、昆虫、微生物、ウイルス）から調製され得る天然ＲＮＡ鎖が挙げられる。また、天然に由来するＲＮＡ鎖は、トータルＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であってもよい。人工的に合成されたＲＮＡ鎖としては、例えば、ＲＮＡベクターが挙げられる。
【００２８】
プライマー中のデオキシリボヌクレオチドの個数は、標的核酸中の所定の部位にアニーリングして、ＤＮＡ鎖の伸長の起点として使用できる限り特に限定されない。例えば、プライマーが目的ＤＮＡ鎖の増幅反応に用いられる場合、プライマー中のデオキシリボヌクレオチドの個数は、１６個以上、１８個以上、２０個以上、または２２個以上であってもよい。この場合、デオキリボヌクレオチドの個数はまた、例えば、６０個以下、５０個以下、または４０個以下であってもよい。プライマーは、標的ＤＮＡ鎖に相補的な部分に加えて、制限酵素認識部位等の部分を有していてもよい。一方、プライマーがＲＮＡ鎖の逆転写反応に用いられる場合、典型的なプライマーとしては、ランダムプライマー（例、ランダムヘキサマー）、オリゴｄＴプライマーが挙げられる。プライマーがＲＮＡ鎖の逆転写反応に用いられる場合、プライマー中のデオキシリボヌクレオチドの個数は、６個以上、８個以上、１０個以上であってもよい。ＲＮＡ鎖の逆転写反応に用いられるプライマー中のデオキシリボヌクレオチドの個数はまた、目的ＤＮＡ鎖の増幅反応に用いられるプライマー中のデオキシリボヌクレオチドの個数と同じであってもよい。
【００２９】
保存溶液中に含まれるプライマーの種類の数は、１以上である限り特に限定されず、１個または複数（例、２個、３個、４個、５個または６個以上）であってもよい。例えば、プライマーがＤＮＡ鎖の増幅反応に用いられ、ＤＮＡ鎖の増幅方法としてＰＣＲが利用される場合、標準的なプライマーの種類の数は２個であり、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーが使用される。したがって、標的ＤＮＡ鎖が決定されている場合、本発明の保存溶液は、標的ＤＮＡ鎖に対する２個のプライマーを含有していてもよい。多重化ＰＣＲ等の方法が利用される場合、３以上のプライマーが使用され得る。したがって、１以上の標的ＤＮＡ鎖が決定されている場合、本発明の保存溶液は、１以上の標的ＤＮＡ鎖に対する３以上のプライマーを含有していてもよい。一方、プライマーがＲＮＡ鎖の逆転写反応に用いられる場合、例えば、１種類のオリゴｄＴプライマー、または複数のプライマー（例、ランダムプライマーの場合）が使用される。
【００３０】
保存溶液中に含まれるプライマーの濃度は、ＤＮＡ鎖の増幅反応液またはＲＮＡ鎖の逆転写反応液を適切に調製できる濃度である限り特に限定されない。例えば、プライマーがＤＮＡ鎖の増幅反応に用いられる場合、保存溶液中のプライマーの濃度は、０．５〜１０００μＭ、１〜１００μＭ、または５〜５０μＭであってもよい。一方、プライマーがＲＮＡ鎖の逆転写反応に用いられる場合、保存溶液中のプライマーの濃度は、０．１〜５０００μＭ、１〜２５００μＭ、または１０〜１０００μＭであってもよい。
【００３１】
別の好ましい実施形態では、ＤＮＡ鎖は、ＤＮＡ標品である。ＤＮＡ標品としては、ＤＮＡ鎖の合成反応（例、ＤＮＡ鎖の増幅反応）におけるＤＮＡ標品（例、コントロール用テンプレート）が好ましい。ＤＮＡ標品中のデオキシリボヌクレオチドの個数は、特に限定されない。例えば、ＤＮＡ標品がＤＮＡ鎖の増幅反応に用いられる場合、ＤＮＡ標品中のデオキシリボヌクレオチドの個数は、５０個以上、８０個以上、１２０個以上、または１４０個以上であってもよい。この場合、デオキリボヌクレオチドの個数はまた、例えば、１００００個以下、５０００個以下、または１０００個以下であってもよい。保存溶液中に含まれるＤＮＡ標品の種類の数は、１以上である限り特に限定されず、１個または複数（例、２個、３個以上）であってもよいが、通常、ＤＮＡ標品の種類の数は１個である。保存溶液中に含まれるＤＮＡ標品の濃度は、例えば、標品としての目的を果たし得る濃度である限り特に限定されない。例えば、ＤＮＡ標品がＤＮＡ鎖の増幅反応に用いられる場合、保存溶液中のＤＮＡ標品の濃度は、１×１０−１６〜１００００μＭ、１×１０−１４〜１０００μＭ、または１×１０−１２〜２００μＭであってもよい。
【００３２】
また、本発明の保存溶液は、１以上のＤＮＡ鎖の安定化成分である、式（Ｉ）：
【化５】
2012005436.tif 000006
〔式中、Ｒｎ−１およびＲｎ−２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基または炭素数１〜６のアルキル基を示すか、またはＲｎ−１およびＲｎ−２は、互いに一緒になってオキソ基（＝Ｏ）を示し、
ｎは、１〜３の任意の整数を示す。〕
で表される多価カルボン酸化合物（以下、必要に応じて、「多価カルボン酸化合物」と省略）の塩を含有する。
【００３３】
上記式（Ｉ）で表される多価カルボン酸化合物において、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、およびヨウ素原子が挙げられる。
【００３４】
炭素数１〜６のアルキル基は、直鎖または分岐鎖であり、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ヘキシル、イソヘキシルが挙げられる。
【００３５】
炭素数１〜６のアルコキシ基は、上述したような炭素数１〜６のアルキル基で置換されたヒドロキシル基（即ち、炭素数１〜６のアルキル−オキシ基）であり、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ基が挙げられる。
【００３６】
生体に安全であり、かつ環境への負荷が少ない化合物の塩を、多価カルボン酸化合物の塩として提供するという観点からは、Ｒｎ−１およびＲｎ−２は、生体内または細胞中に見出される、クエン酸サイクル（トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルとも呼ばれる）に関与する化合物に対応する基であってもよい。このような場合、Ｒｎ−１およびＲｎ−２（または後述するＲ１−１、Ｒ１−２、Ｒ２−１、Ｒ２−２、Ｒ３−１およびＲ３−２）は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を示すか、またはＲｎ−１およびＲｎ−２は、互いに一緒になってオキソ基（＝Ｏ）を示していてもよい。
【００３７】
一実施形態では、式（Ｉ）で表される多価カルボン酸化合物は、ｎ＝１の場合、式（Ｉ−１）：
【化６】
2012005436.tif 000007
〔式中、Ｒｎ−１およびＲｎ−２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基または炭素数１〜６のアルキル基を示すか、またはＲｎ−１およびＲｎ−２は、互いに一緒になってオキソ基（＝Ｏ）を示す。〕
で表される化合物である。好ましくは、式（Ｉ−１）におけるＲ１−１およびＲ１−２は、それぞれ独立して、水素原子またはヒドロキシル基を示す。特に好ましくは、式（Ｉ−１）で表される多価カルボン酸化合物は、式（Ｉ−１’）で表されるマロン酸である。
【００３８】
【化７】
2012005436.tif 000008
【００３９】
別の実施形態では、式（Ｉ）で表される多価カルボン酸化合物は、ｎ＝２の場合、式（Ｉ−２）：
【化８】
2012005436.tif 000009
〔式中、Ｒｎ−１およびＲｎ−２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基または炭素数１〜６のアルキル基を示すか、またはＲｎ−１およびＲｎ−２は、互いに一緒になってオキソ基（＝Ｏ）を示す。〕
で表される化合物である。好ましくは、式（Ｉ−２）におけるＲ１−１、Ｒ１−２、Ｒ２−１およびＲ２−２は、それぞれ独立して、水素原子またはヒドロキシル基を示す。特に好ましくは、式（Ｉ−２）で表される多価カルボン酸化合物は、式（Ｉ−２’）で表されるコハク酸である。
【００４０】
【化９】
2012005436.tif 000010
【００４１】
さらに別の実施形態では、式（Ｉ）で表される多価カルボン酸化合物は、ｎ＝３の場合、上記式（Ｉ−３）：
【化１０】
2012005436.tif 000011
〔式中、Ｒｎ−１およびＲｎ−２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、カルボキシル基、アミノ基または炭素数１〜６のアルキル基を示すか、またはＲｎ−１およびＲｎ−２は、互いに一緒になってオキソ基（＝Ｏ）を示す。〕
で表される化合物である。好ましくは、式（Ｉ−３）におけるＲ１−１、Ｒ１−２、Ｒ２−１、Ｒ２−２、Ｒ３−１およびＲ３−２は、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を示す。より好ましくは、式（Ｉ−３）におけるＲ２−１およびＲ２−２の一方は、カルボキシル基を示し、Ｒ２−１およびＲ２−２の他方、ならびにＲ１−１、Ｒ１−２、Ｒ３−１およびＲ３−２は、それぞれ独立して、水素原子またはヒドロキシル基を表す。特に好ましくは、式（Ｉ−３）で表される多価カルボン酸化合物は、式（Ｉ−３’）で表されるクエン酸である。
【００４２】
【化１１】
2012005436.tif 000012
【００４３】
多価カルボン酸化合物の塩としては、金属塩、無機塩、有機塩が挙げられる。金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等の一価の金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の二価の金属塩が挙げられる。無機塩としては、例えば、アンモニウム塩が挙げられる。有機塩としては、例えば、アルキル基で置換されたアンモニウム塩が挙げられる。アルキル基で置換されたアンモニウム塩としては、モノアルキルアンモニウム塩、ジアルキルアンモニウム塩、トリアルキルアンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩が挙げられる。アルキル基で置換されたアンモニウム塩におけるアルキル基は、その炭素数が特に限定されないが、例えば、上述したような炭素数１〜６のアルキル基であってもよい。
【００４４】
保存溶液中に含まれる、多価カルボン酸化合物の塩は、単一（即ち、一種類）の物質であっても、複数（例、２種、３種）の物質であってもよい。複数の物質としては、（ｉ）化合物の種類が異なり、かつ塩の種類が同一である物質の組合せ、（ｉｉ）化合物の種類が同一であり、かつ塩の種類が異なる物質の組合せ、（ｉｉｉ）化合物の種類、および塩の種類が異なる物質の組合せが挙げられる。含有成分の簡素化および保存溶液の調製の簡便化という観点からは、多価カルボン酸化合物の塩は、単一の物質であってもよい。
【００４５】
本発明の保存溶液は、多価カルボン酸化合物の塩を、保存対象物である１以上のＤＮＡ鎖の分解を抑制し得るのに十分な濃度で含有し得る。このような濃度は、用いられる多価カルボン酸化合物の塩の種類、後述する別の安定化剤の有無、およびＤＮＡ鎖の合成反応液の総量に対するＤＮＡ鎖の保存溶液の添加量等によっても変動し得るが、当業者は、このような濃度を適宜決定することができる。
【００４６】
例えば、ＤＮＡ鎖がプライマーである場合、本発明の保存溶液中における多価カルボン酸化合物の塩の濃度は、１以上のプライマーを安定化し得る限り特に限定されないが、例えば０．１〜５００ｍＭ、好ましくは０．５〜２００ｍＭ、より好ましくは１〜１００ｍＭ、さらにより好ましくは２〜５０ｍＭ、最も好ましくは５〜２０ｍＭである。多価カルボン酸化合物の塩が複数用いられる場合、その濃度の合計が、上記濃度の範囲内にあってもよい。ＤＮＡ鎖の増幅反応液（例、ＰＣＲ用の反応液）の総量に対するプライマー溶液の添加総量がしばしば１／１０（例、フォワードプライマー溶液量１／２０＋リバースプライマー溶液量１／２０）であること、および反応溶液中において１．０ｍＭを超える濃度の多価カルボン酸化合物の塩（例、クエン酸ナトリウム）がＤＮＡ鎖の増幅反応を阻害する傾向があることを考慮すると、本発明の保存溶液中における多価カルボン酸化合物の塩の濃度が１０ｍＭ以下であることもまた、好ましい。
【００４７】
また、ＤＮＡ鎖がＤＮＡ標品である場合、本発明の保存溶液中における多価カルボン酸化合物の塩の濃度は、ＤＮＡ標品を安定化し得る限り特に限定されないが、例えば０．１〜５００ｍＭ、好ましくは０．５〜２００ｍＭ、より好ましくは１〜１００ｍＭ、さらにより好ましくは２〜５０ｍＭ、最も好ましくは５〜２０ｍＭである。ＤＮＡ鎖の増幅反応液（例、ＰＣＲ用の反応液）の調製の容易さの観点からは、ＤＮＡ標品を含有する本発明の保存溶液中における多価カルボン酸化合物の塩の濃度は、０．１〜１００ｍＭ、好ましくは０．２〜５０ｍＭ、より好ましくは０．５〜１０ｍＭであってもよい。多価カルボン酸化合物の塩が複数用いられる場合、その濃度の合計が、上記濃度の範囲内にあってもよい。ＤＮＡ鎖の増幅反応液（例、ＰＣＲ用の反応液）の総量に対するＤＮＡ標品溶液の添加量がしばしば１／４であること、および反応溶液中において１．０ｍＭを超える濃度の多価カルボン酸化合物の塩（例、クエン酸ナトリウム）がＤＮＡ鎖の増幅反応を阻害する傾向があることを考慮すると、本発明の保存溶液中における多価カルボン酸化合物の塩の濃度が４．０ｍＭ以下であることもまた、好ましい。
【００４８】
さらに、ＤＮＡ標品およびプライマーを含有する本発明の保存溶液が提供される場合、本発明の保存溶液中における多価カルボン酸化合物の塩の濃度は、ＤＮＡ鎖がプライマーまたはＤＮＡ標品のいずれかである場合の上述した濃度であってもよい。具体的には、本発明の保存溶液中における多価カルボン酸化合物の塩の濃度は、ＤＮＡ鎖の増幅反応液（例、ＰＣＲ用の反応液）の総量に対する、ＤＮＡ標品およびプライマーを含有する本発明の保存溶液の添加量に応じて適宜決定され得る。
【００４９】
本発明の保存溶液のｐＨは、例えばｐＨ６．５〜８．５であり、好ましくはｐＨ６．８〜８．４であり、より好ましくはｐＨ７．０〜８．２である。
【００５０】
本発明の保存溶液は、多価カルボン酸化合物の塩に加えて、別の安定化剤をさらに含有していてもよい。別の安定化剤としては、例えば、ＭｇＣｌ２、硫酸アンモニウムなどが挙げられる。別の安定化剤が塩である場合、塩としては、上述したような、金属塩、無機塩および有機塩が挙げられる。
【００５１】
本発明の保存溶液では、多価カルボン酸化合物の塩が溶解される溶媒は、緩衝液ではなく、水である。緩衝液は、通常、酸および塩が共存した水溶液である。一方、本発明の保存溶液は、多価カルボン酸化合物の塩を含有するものの、緩衝液ではないため、酸を含有しない。したがって、本発明の保存溶液は、酸を用いて調製されないという点で、酸を用いて調製される緩衝液と異なる。水としては、例えば、蒸留水、滅菌水、滅菌蒸留水が挙げられるが、滅菌蒸留水が好ましい。
【００５２】
本発明はまた、本発明の保存溶液の保存方法を提供する。本発明の保存方法は、本発明の保存溶液を液体状態で保存することを含む。液体状態での保存は、常温で保存することにより達成されてもよい。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「常温」とは、２〜５０℃の温度をいう。ところで、日本工業規格（ＪＩＳ）では、常温とは、２０℃±１５℃（５〜３５℃）の温度として定められている。一方、日本薬局方では、常温とは、１５〜２５℃の温度として定められている。したがって、本発明の保存溶液は、２〜５０℃の温度で保存されてもよいが、５〜３５℃または１５〜２５℃の温度で保存されてもよい。
【００５４】
保存期間は、本発明の保存溶液中において、１以上のＤＮＡ鎖の一部が未分解状態で残存し得る期間である限り特に限定されない。１以上のＤＮＡ鎖の残存の程度は、保存期間によっても異なるため特に限定されないが、例えば、１以上のＤＮＡ鎖は、本発明の保存溶液中において、１以上のＤＮＡ鎖の初期量に対して、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、８０％以上または９０％以上の量において未分解状態で残存し得る。本発明の保存溶液中における１以上のＤＮＡ鎖の残存の程度は、当該技術分野で周知の方法により決定することができる（例、ＴＯＦ／ＭＳ検出によるメインピークの残存率の決定）。このような保存期間としては、例えば、１週間以上、２週間以上、３週間以上、１ヶ月以上、２ヶ月以上、３ヶ月以上、４ヶ月以上、５ヶ月以上、６ヶ月以上、８ヶ月以上、１０ヶ月以上または１年以上の期間が挙げられる。また、保存期間は、３年以下、２年以下、１年半以下または１年以下の期間であってもよい。
【００５５】
本発明は、本発明の保存溶液の製造方法を提供する。本発明の製造方法は、１以上のＤＮＡ鎖、および多価カルボン酸化合物の塩を、水中に共存させる工程を含む。本工程は、例えば、工程（１）１以上のＤＮＡ鎖を含有する水中に、多価カルボン酸化合物の塩を添加すること、工程（２）多価カルボン酸化合物の塩を含有する水中に、１以上のＤＮＡ鎖を添加すること、ならびに工程（３）水中に、１以上のＤＮＡ鎖、および多価カルボン酸化合物の塩を同時に添加することにより行われ得る。
【００５６】
工程（１）の場合、１以上のＤＮＡ鎖を含有する水は、予め調製されたものを用いてもよいが、改めて調製してもよい。したがって、改めて調製される場合、工程（１）は、１以上のＤＮＡ鎖を水中に添加して、１以上のＤＮＡ鎖を含有する水を調製し、次いで、調製された水中に、多価カルボン酸化合物の塩を添加することにより行われる。
【００５７】
工程（２）の場合、多価カルボン酸化合物の塩を含有する水は、予め調製されたものを用いてもよいが、改めて調製してもよい。したがって、改めて調製される場合、工程（２）は、多価カルボン酸化合物の塩を水中に添加して、多価カルボン酸化合物の塩を含有する水を調製し、次いで、調製された水中に、１以上のＤＮＡ鎖を添加することにより行われる。
【００５８】
工程（３）の場合、同時添加は、１以上のＤＮＡ鎖、および多価カルボン酸化合物の塩の混合物を、水中に添加することにより、または１以上のＤＮＡ鎖、および多価カルボン酸化合物の塩を、水中に同時に別々に添加することにより、達成される。本発明の保存溶液の製造に際して、１以上のＤＮＡ鎖、および多価カルボン酸化合物の塩の混合物が用いられる場合、本発明の製造方法は、１以上のＤＮＡ鎖、および多価カルボン酸化合物の塩を混合することを含んでいてもよい。
【００５９】
本発明の製造方法において用いられる水は、本発明の保存溶液において上述した水と同様である。１以上のＤＮＡ鎖、および多価カルボン酸化合物の塩を水中に共存させる工程は、本発明の保存溶液において上述したような濃度等が達成されるように行われ得る。
【００６０】
本発明の製造方法は、１以上のＤＮＡ鎖、および多価カルボン酸化合物の塩に加えて、他の成分（例、別の安定化剤）を水中に添加することを含んでいてもよい。他の成分の水中への添加は、上述した工程（１）〜（３）と同様の方法論により行われ得る。
【００６１】
本発明は、ＤＮＡ鎖の安定化方法を提供する。本発明の安定化方法は、１以上のＤＮＡ鎖、および多価カルボン酸化合物の塩を水中に共存させることにより、１以上のＤＮＡ鎖を安定化させることを含む。１以上のＤＮＡ鎖、および多価カルボン酸化合物の塩を水中に共存させることは、例えば、上記工程（１）〜（３）と同様に行われ得る。
【００６２】
本発明の安定化方法において用いられる水は、本発明の保存溶液において上述した水と同様である。共存は、本発明の保存溶液において上述したような濃度が達成されるように行われ得る。本発明の安定化方法はまた、１以上のＤＮＡ鎖、および多価カルボン酸化合物の塩に加えて、他の成分（例、別の安定化剤）を水中に添加することを含んでいてもよい。他の成分の水中への添加は、上述した工程（１）〜（３）と同様の方法論により行われ得る。
【００６３】
本発明はまた、本発明の保存溶液を含むキットを提供する。本発明のキットは、以下（ａ）、（ｂ）を含む：
（ａ）水中において、１以上のＤＮＡ鎖、および式（Ｉ）で表される多価カルボン酸化合物の塩を含有する、ＤＮＡ鎖の保存溶液；ならびに
（ｂ）目的ＤＮＡ鎖の合成反応用の構成要素。
【００６４】
キットに含まれる構成要素（ａ）および（ｂ）は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器（例、チューブ）に格納された形態で提供され得る。本発明のキット中の構成要素（ａ）は、本発明の保存溶液と同様である。本発明のキットは、構成要素（ａ）および（ｂ）に加えて、構成要素（ｃ）ＤＮＡまたはＲＮＡの抽出試薬をさらに含んでいてもよい。
【００６５】
構成要素（ｂ）について、目的ＤＮＡ鎖の合成反応用の構成要素としては、例えば、目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の構成要素、ＲＮＡ鎖の逆転写反応用の構成要素、逆転写反応−目的ＤＮＡ鎖の増幅反応（本明細書中、必要に応じて、「逆転写（ＲＴ）−増幅反応」と省略）用の構成要素が挙げられる。
【００６６】
したがって、一実施形態では、本発明のキットは、目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用のキットであり、以下（ａ１）、（ｂ１）を含む：
（ａ１）ＤＮＡ鎖として１以上のプライマーを含有する本発明の保存溶液；ならびに
（ｂ１）目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の構成要素。
【００６７】
この場合、本発明のキットは、検出、定量あるいはクローニング等の目的のために利用され得る。目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の構成要素としては、このような反応に用いられる試薬および容器が挙げられる。具体的には、このような構成要素としては、ポリメラーゼ（例、耐熱性ポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ混合物、反応緩衝液、ＤＮＡ標品（コントロール用テンプレート）、反応容器が挙げられる。
【００６８】
この場合、本発明のキットは、ＲＮＡ鎖の逆転写反応用の構成要素（後述）をさらに含むことにより、逆転写（ＲＴ）−増幅反応用のキットであってもよい。
【００６９】
別の実施形態では、本発明のキットは、目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用のキットであり、以下（ａ２）、（ｂ２）を含む：
（ａ２）ＤＮＡ鎖としてＤＮＡ標品を含有する本発明の保存溶液；ならびに
（ｂ２）目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の構成要素。
【００７０】
この場合、本発明のキットは、検出または定量等の目的のために利用され得る。目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の構成要素としては、このような反応に用いられる試薬および容器が挙げられる。具体的には、このような構成要素としては、ポリメラーゼ（例、耐熱性ポリメラーゼ）、１以上のプライマー、ｄＮＴＰ混合物、反応緩衝液、反応容器が挙げられる。１以上のプライマーは、本発明の保存溶液中に含有されていてもよい。
【００７１】
さらに別の実施形態では、本発明のキットは、ＲＮＡ鎖の逆転写反応用のキットであり、以下（ａ３）、（ｂ３）を含む：
（ａ３）ＲＮＡ鎖の逆転写反応用のプライマーを含有する本発明の保存溶液；ならびに
（ｂ３）ＲＮＡ鎖の逆転写反応用の構成要素。
【００７２】
この場合、本発明のキットは、目的ＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ鎖）の合成のために利用され得る。ＲＮＡ鎖の逆転写反応用の構成要素としては、このような反応に用いられる試薬および容器が挙げられる。具体的には、このような構成要素としては、逆転写酵素、ｄＮＴＰ混合物、反応緩衝液、ＲＮＡ標品（コントロール用テンプレート）、反応容器が挙げられる。
【００７３】
この場合、本発明のキットは、ＤＮＡ鎖の増幅反応用の上述した構成要素（例、１以上のプライマーを含有する本発明の保存溶液、ＤＮＡ標品を含有する本発明の保存溶液）をさらに含むことにより、逆転写（ＲＴ）−増幅反応用のキットであってもよい。
【００７４】
本発明のキットが、逆転写（ＲＴ）−増幅反応用のキットである場合、逆転写（ＲＴ）反応および増幅反応は、別々に行われてもよいが、同時に行われてもよい。逆転写（ＲＴ）−増幅反応が同時に行われる場合、ＲＮＡ鎖の逆転写反応用のプライマー、およびＤＮＡ鎖の増幅反応用のプライマーは、異なっていてもよいが、共通していてもよい。この場合、本発明のキットは、例えば、以下（ａ４）、（ｂ４）を含む：
（ａ４）ＲＮＡ鎖の逆転写反応および目的ＤＮＡ鎖の増幅反応用の共通プライマーを含有する本発明の保存溶液；ならびに
（ｂ４）ＲＴ−増幅反応用の構成要素。
【００７５】
上述したまたは後述する構成要素（ｂ）（あるいは構成要素（ｂ１）〜（ｂ４））の構成成分は、１以上であれば特に限定されず、１個であっても、複数（例、２、３、４、５、６以上）であってもよい。各構成成分は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器（例、チューブ）に格納された形態で提供されてもよいが、予め混合された形態（例、ＰｒｅＭｉｘ）等で提供されてもよい。
【００７６】
好ましい実施形態では、本発明のキットは、リアルタイム増幅反応（例、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムＬＡＭＰ）用のキットである。この場合、本発明のキットは、構成要素（ｂ）がリアルタイム増幅反応用の構成要素であり得る。リアルタイム増幅反応としては、例えば、インターカレーター法、蛍光物質標識プローブ法が挙げられる。したがって、リアルタイム増幅反応用の構成要素（ｂ）は、構成成分として、このような方法を行うための蛍光物質または蛍光物質標識プローブをさらに含んでいてもよい。蛍光物質としては、例えば、インターカレーター法に用いられる蛍光物質（例、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）が挙げられる。蛍光物質標識プローブとしては、例えば、５’末端または３’末端の一方に蛍光物質が結合し、かつ５’末端または３’末端の他方にクエンチャーが結合しているプローブ（例、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）が挙げられる。リアルタイム増幅反応は、逆転写反応と組み合わせて用いられてもよい。したがって、本キットは、リアルタイムＲＴ−増幅反応用のキットであってもよい。なお、蛍光物質または蛍光標識プローブは、構成要素（ｂ）ではなく、構成要素（ａ）（すなわち、本発明の保存溶液）中に含まれていてもよい。
【００７７】
特に好ましい実施形態では、本発明のキットは、リアルタイムＰＣＲ用のキットである。この場合、本発明のキットは、構成要素（ｂ）がリアルタイムＰＣＲ用の構成要素であり得る。具体的には、構成要素（ｂ）の構成成分としては、耐熱性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物、反応緩衝液、上述したような蛍光物質、ＲＮＡまたはＤＮＡ標品（コントロール用テンプレート）、反応容器が挙げられる。リアルタイムＰＣＲは、逆転写反応と組み合わせて用いられてもよい。したがって、本キットは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用のキットであってもよく、逆転写酵素等をさらに含んでいてもよい。なお、蛍光物質または蛍光標識プローブは、構成要素（ｂ）ではなく、構成要素（ａ）（すなわち、本発明の保存溶液）中に含まれていてもよい。
【００７８】
本発明はまた、ＤＮＡ鎖の製造方法（またはＤＮＡ鎖の合成方法）を提供する。本発明の製造方法は、プライマーを用いてＤＮＡ鎖を合成することを含む。プライマーとしては、上述したプライマー保存溶液中のプライマーが用いられる。
【００７９】
ＤＮＡ鎖の製造反応としては、ＤＮＡ鎖の増幅反応、ＲＮＡ鎖の逆転写（ＲＴ）反応、またはＲＴ−増幅反応が挙げられる。本方法は、上述した本発明のキットにより行われてもよい。
【００８０】
本発明はまた、ＲＮＡ発現量の測定方法を提供する。本発明の測定方法は、本発明の保存溶液中に含有されるＲＮＡ鎖を、ＲＮＡ発現量の測定のためのＲＮＡ標品（即ち、コントロール）として使用することを含む。
【００８１】
ＲＮＡ発現量の測定で用いられるＲＮＡサンプルとしては、例えば、哺乳動物由来のＲＮＡサンプルが挙げられる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギが挙げられる。臨床応用という観点から、哺乳動物種は、好ましくはヒトである。ＲＮＡサンプルとしてはまた、上述したような天然に由来するＲＮＡ鎖（例、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を含むサンプル（例、細胞または組織からの抽出液）が挙げられる。
【００８２】
本発明の測定方法では、ＲＴ−増幅反応が利用され得る。したがって、本発明の測定方法は、例えば、（ａ１’）ＲＮＡサンプルを、ＲＴ−増幅反応に供する工程、（ｂ１’）本発明の保存溶液中に含有されるＲＮＡ鎖を、ＲＴ−増幅反応に供する工程、および（ｃ１’）工程（ｂ１’）の結果に基づき、工程（ａ１’）のＲＴ−増幅反応を検証する工程、または工程（ｂ１’）の結果に基づき、ＲＮＡサンプル中の標的ＲＮＡの発現量を決定する工程を含んでいてもよい。工程（ａ１’）および（ｂ１’）は、別々に行われてもよいが、一緒に行うこともできる。この場合、本発明の測定方法は、例えば、（ａ２’）ＲＮＡサンプル、および本発明の保存溶液中に含有されるＲＮＡ鎖を合わせる工程、（ｂ２’）ＲＮＡサンプル、および本発明の保存溶液中に含有されるＲＮＡ鎖を、ＲＴ−増幅反応に供する工程、および（ｃ２’）ＲＮＡ鎖の反応結果に基づき、工程（ｂ２’）のＲＴ−増幅反応を検証する工程、またはＲＮＡ鎖の反応結果に基づき、ＲＮＡサンプル中の標的ＲＮＡの発現量を決定する工程を含んでいてもよい。本発明の測定方法は、上述した本発明のキットにより行われてもよい。好ましくは、本発明の測定方法は、リアルタイムＲＴ−増幅反応（例、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）による方法である。また、ＲＴ−増幅反応は、ＲＴ反応および増幅反応を別々に行う２ステップＲＴ−増幅反応（例、２ステップＲＴ−ＰＣＲ）であってもよいが、ＲＴ反応および増幅反応を同時に行う１ステップＲＴ−増幅反応（例、１ステップＲＴ−ＰＣＲ）であってもよい。
【００８３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８４】
実施例１：カルボン酸塩を含有する水溶液中のプライマーの安定性（２５℃）
使用したプライマー（５’−ＧＣＡＡＡＧＡＣＣＴＧＴＡＣＧＣＣＡＡＣ−３’：配列番号１）は、ＤＮＡ自動合成機「３９００  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ」（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、一般的なホスホアミダイト法により２００ｎｍｏｌｅスケールでＴｒｉｔｙｌ−ＯＮ（５’末端のヒドロキシル基がジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基で保護された状態）として合成した。合成担体（支持体）からの切り出しは、一般的方法により３０％濃アンモニア水５００μＬで行った。プライマーの保護基の脱保護は、一般的方法に従い、切り出し後の濃アンモニア水溶液のまま耐圧バイアルにて、６０℃で１５０分間行った。
その後、プライマーを、精製簡易カートリッジＯｌｉｇｏ  Ｒ３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により一般的方法に従い精製し（この工程で酸の処理によってＤＭＴ基を除去）、遠心エバポレーターによって減圧乾燥した。乾燥されたプライマーを滅菌水で溶解し、飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＭＳ）Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により純度確認を行った。分光光度計ＤＵ（登録商標）５３０（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を用いて測定した吸光度とランベルト・ベールの法則からプライマー濃度を決定した。
【００８５】
純度確認・濃度決定を終えたプライマーを滅菌蒸留水中に溶解して、１０μＭの濃度となるように以下の８種の溶液を調製した。
（１）マロン酸ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．１８）
（２）コハク酸ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．１５）
（３）クエン酸ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ８．０４）
（４）マレイン酸ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．５３）
（５）酢酸ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ６．６８）
（６）フマル酸ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ６．５４）
（７）シュウ酸ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ６．４９）
（８）滅菌蒸留水（Ｈ２Ｏ）（ｐＨ６．３４）
水溶液中の各塩の濃度は、１０ｍＭであった。
【００８６】
プライマーを含有する上記の水溶液を、スクリューキャップチューブへ分注して密閉し、室温（２５℃）で保存した。各保存チューブから水溶液を定期的に採取し、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＭＳによる分子量観測によって、水溶液中のプライマーの経時的な分解の度合いを調査した。
【００８７】
その結果、（１）〜（７）の水溶液において、プライマーが安定であった（表１を参照）。なお、ＭＳスペクトルのピークを解析したところ、（８）の滅菌水では、リボース部分と核酸塩基との間の結合の分解に起因するプライマー分解物、およびリボース間の３’−５’ホスフェート結合の分解に起因するプライマー分解物、ならびにリボース部分と核酸塩基との間の結合およびリボース間の３’−５’ホスフェート結合の分解に起因するプライマー分解物が生じていることが確認されたが、（１）〜（７）の水溶液では、これらのプライマー分解物が生じていなかった。したがって、（１）〜（７）の水溶液は、リボース部分と核酸塩基との間の結合、およびリボース間の３’−５’ホスフェート結合の分解を抑制することにより、プライマーを安定化すると考えられた。
【００８８】
【表１】
2012005436.tif 000013
【００８９】
実施例２：カルボン酸塩を含有する水溶液中のプライマーの安定性（３７℃）
プライマー（配列番号１）を、実施例１と同様の方法により調製した。実施例１と同様の方法により純度確認・濃度決定を終えたプライマーを滅菌蒸留水中に溶解して、１０μＭの濃度となるように以下の１０種の溶液を調製した。
（１）マロン酸ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．１８）
（２）コハク酸ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．１５）
（３）クエン酸ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ８．０４）
（４）マレイン酸ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．５３）
（５）酢酸ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ６．６８）
（６）フマル酸ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ６．５４）
（７）シュウ酸ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ６．４９）
（８）滅菌蒸留水（Ｈ２Ｏ）（ｐＨ６．３４）
（９）塩化ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．３７）
（１０）塩化マグネシウムを含有する水溶液（ｐＨ６．９９）
水溶液中の各塩の濃度は、１０ｍＭであった。（９）の水溶液は、ナトリウム塩についてのコントロールとして用いた。（１０）の水溶液は、塩化マグネシウムがＰＣＲ反応の添加剤としてしばしば使用されていることを考慮し、比較のために用いた。
【００９０】
プライマーを含有する上記の水溶液を、スクリューキャップチューブへ分注して密閉し、３７℃で保存した。保存は、非振盪条件下、または振盪条件（振盪方式：旋回、振盪数：８００ｒｐｍ、回転振幅：約３ｍｍ）下で行った。各保存チューブから水溶液を定期的に採取し、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＭＳによる分子量観測によって、水溶液中のプライマーの経時的な分解の度合いを調査した。非振盪条件下の保存試験の結果を、表２に示す。
【００９１】
その結果、非振盪条件下の保存試験では、カルボン酸塩を含有する各滅菌水溶液のうち、（１）マロン酸ナトリウム、（２）コハク酸ナトリウム、および（３）クエン酸ナトリウムを含有する滅菌水溶液において、プライマーが特に安定であった（表２を参照）。なお、振盪条件下の保存試験の結果は、非振盪条件下の保存試験の結果と同様であり、振盪の有無は、プライマーの安定性に影響を及ぼさないようであった。
【００９２】
【表２】
2012005436.tif 000014
【００９３】
また、水溶液中の各塩の濃度を１ｍＭに変更した条件下で、上記と同様の実験を行ったところ、同様の結果が得られたが、安定性に対する各塩の効果は、１０ｍＭの濃度条件が、１ｍＭの濃度条件に比し、優れていた。
【００９４】
実施例３：カルボン酸塩を含有する水溶液中のプライマーの安定性（６０℃）
プライマー（配列番号１）を、実施例１と同様の方法により調製した。実施例１と同様の方法により純度確認・濃度決定を終えたプライマーを滅菌蒸留水中に溶解して、１０μＭの濃度となるように以下の３種の溶液を調製した。
（１）マロン酸ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．１８）
（９）塩化ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．３７）
（１０）塩化マグネシウムを含有する水溶液（ｐＨ６．９９）
水溶液中の各塩の濃度は、１０ｍＭであった。（９）および（１０）の水溶液を用いた理由は、実施例２と同様である。
【００９５】
プライマーを含有する上記の水溶液を、スクリューキャップチューブへ分注して密閉し、６０℃で保存した。各保存チューブから水溶液を定期的に採取し、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＭＳによる分子量観測によって、水溶液中のプライマーの経時的な分解の度合いを調査した。６０℃で本試験を行った理由は、ＤＮＡ鎖の分解を促進する高温条件（加速条件）下で保存試験を行うことにより、ＤＮＡ鎖の安定性に対する多価カルボン酸化合物塩の効果を、より短期間で評価するためである。
【００９６】
その結果、６０℃では、（１）マロン酸ナトリウムを含有する滅菌水溶液において、プライマーが特に安定であった（表３を参照）。
【００９７】
【表３】
2012005436.tif 000015
【００９８】
実施例４：ＤＮＡ鎖の増幅反応における蛍光強度に対する、クエン酸ナトリウム濃度の影響
以下のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを、実施例１と同様の方法により、調製し、純度確認・濃度決定をした。
フォワードプライマー：５’−ＧＣＡＴＴＣＣＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＴＡ−３’（配列番号２）
リバースプライマー：５’−ＴＣＡＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＡＧＣ−３’（配列番号３）
また、ＰＣＲのテンプレートとして、培養細胞Ｋ５６２由来のトータルＲＮＡから逆転写して得られたｃＤＮＡを調製した。
【００９９】
上記のフォワードプライマー、リバースプライマー、およびテンプレートを用いて、反応液中のクエン酸ナトリウムの終濃度が異なる条件（０ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ）下で、一般的なインターカレーター法（蛍光物質としてはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用）によるリアルタイムＰＣＲ反応を行った。なお、最も高い終濃度として１．０ｍＭを採用した理由は、１．０ｍＭを超える濃度のクエン酸ナトリウムは、ＤＮＡ鎖（テンプレート）の増幅反応を阻害する傾向があったためである。
【０１００】
その結果、クエン酸ナトリウムの終濃度が高い場合、最終到達の蛍光強度が上昇することが確認された（図１）。
【０１０１】
試験例１：ＰＣＲに対するＴＥ緩衝液の影響
ＴＥ緩衝液中のＥＤＴＡがＰＣＲに影響を及ぼし得るどうかを調べた。一般的な組成のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０））を、ＰＣＲの反応溶液の総量に対して１/１０量加えた。コントロールとして、ＴＥ緩衝液の代わりに、滅菌蒸留水を用いた。ＰＣＲは、基本的に、上記実施例４と同様にして行った。ＰＣＲにおけるＤＮＡ鎖の増幅効率を評価するためのＤＮＡ標品（テンプレート）としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のＤＮＡを用いた。ＴＥ緩衝液または滅菌蒸留水を加えた反応溶液を用いたＰＣＲについてのＣｐ値を、表４に示す。Ｃｐ（Ｃｒｏｓｓｉｎｇ  Ｐｏｉｎｔ）値は、用いた装置の蛍光強度計の閾値（指数関数的に強度が増加している範囲に通常設定される。）に達するのに必要なＰＣＲサイクル数を示す値である。Ｃｐ値が相対的に大きい場合、ＰＣＲが阻害されていることを示す。一方、Ｃｐ値が相対的に小さい場合、ＰＣＲが阻害されていないことを示す。その結果、ＴＥ緩衝液を使用した場合のＣｐ値は、滅菌蒸留水を使用した場合のＣｐ値に比し、大きい値を示した（表４）。したがって、ＴＥ緩衝液は、ＰＣＲを阻害することが確認された。
【０１０２】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明は、ＤＮＡ鎖（例、プライマー、ＤＮＡ標品）の安定化に有用である。したがって、本発明は、ＤＮＡ鎖を利用する方法、例えば、ＤＮＡ鎖の合成反応（例、ＰＣＲ、逆転写反応）において、またはＤＮＡ鎖の合成反応の試薬およびキットとして有用である。
【図１】
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【配列表】
2012005436000001.app