(57)【要約】【課題】小胞体ストレスに対する細胞保護作用を有する新規な細胞保護剤を提供する。【解決手段】下記一般式（Ｉ）で示されるビキシン誘導体を含有する細胞保護剤。2012097003.tif 000013 （式中、Ｒ１は、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で示されるビキシン誘導体を含有する細胞保護剤。
【化１】
2012097003.tif 000010
（式中、Ｒ１は、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。）
【請求項２】
前記Ｒ１は、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、前記Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ただし、Ｒ１が水素原子かつＲ２がメチル基である場合、並びに、Ｒ１及びＲ２が共に水素原子である場合は除かれる請求項１記載の細胞保護剤。
【請求項３】
前記式中Ｒ２がメチル基である請求項１又は請求項２記載の細胞保護剤。
【請求項４】
前記アルキル基が、炭素数１〜３のアルコキシ基を置換基として有する請求項１〜請求項３のいずれか１項記載の細胞保護剤。
【請求項５】
前記ビキシン誘導体が、下記のいずれかである請求項１記載の細胞保護剤。
【化２】
2012097003.tif 000011
【請求項６】
下記一般式（Ｉ）で示されるビキシン誘導体。
【化３】
2012097003.tif 000012
（式中、Ｒ１は、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。
ただし、Ｒ１が水素原子かつＲ２がメチル基である場合、並びに、Ｒ１及びＲ２が共に水素原子である場合を除く。）
【請求項７】
前記式中Ｒ２がメチル基である請求項６記載のビキシン誘導体。
【請求項８】
前記アルキル基が、炭素数１〜３のアルコキシ基を置換基として有する請求項６又は請求項７記載のビキシン誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞保護剤及びこれに用いられる新規なビキシン誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
小胞体ストレスとは蛋白質の成熟の場である小胞体に何らかのストレスが負荷され、折りたたみの不完全な蛋白質が蓄積した状態であると考えられている。小胞体には、分子シャペロンなどを増加して蓄積されたタンパク質を保護し、又は分解すること等によって、小胞体の機能障害を回避するしくみを有しているが、強い小胞体ストレスの状態が継続すると、細胞がストレスに対抗しきれなくなって、アポトーシスが引き起こされる場合がある。これまでにアルツハイマー病やパーキンソン病、さらに緑内障などの神経変性疾患と小胞体ストレスとの関連が示唆されている。
【０００３】
このため、小胞体ストレスを抑制可能な化合物があれば、アルツハイマー病やパーキンソン病、緑内障などの神経変性疾患に対する治療効果が期待できるため、種々の化合物が探索され、又は開発されている。
例えば、特許文献１には、カルバゾール誘導体を有効成分とする小胞体ストレス又は酸化ストレス由来細胞死抑制剤が開示されている。特許文献２には、リグノフェノール系誘導体を含有する哺乳動物細胞保護剤が開示されている。特許文献３には、リグニン誘導体を用いた眼疾患の予防・治療剤が開示されている。
【０００４】
一方、アナトーはベニノキ科ベニノキの種子から抽出される色素であり、油脂、溶剤、水またはアルカリ水溶液により抽出され、黄色〜赤色の食品用（食品添加物）または化粧品用（口紅など）色素として用いられている（例えば、特許文献４）。主成分としてカロテノイド類であるビキシンやノルビキシンを含有している。ビキシンの主な作用として抗酸化作用が知られており、その他にもペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）γ（peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) gamma）活性化作用（非特許文献１）や抗変異原性作用などが報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２３９５３８号公報
【特許文献２】特開２００４−２４４３６７号公報
【特許文献３】特開２００８−１３４４８号公報
【特許文献４】特開２００５−８２５６１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Biochem Biophys Res Commun 390 (4), 1372 (2009)
【非特許文献２】Environ Mol Mutagen 50 (9), 808 (2009).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、小胞体ストレスに対する細胞保護作用の機構は未だ充分に解明されているわけではなく、有効な細胞保護作用を発揮可能な新規な薬剤に対する期待は依然として存在している。
本発明は、小胞体ストレスに対する細胞保護作用を有する新規な細胞保護剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下のとおりである。
［１］  下記一般式（Ｉ）で示されるビキシン誘導体を含有する細胞保護剤。式中、Ｒ１は、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。
【０００９】
【化１】
2012097003.tif 000002
【００１０】
［２］  前記Ｒ１は、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、前記Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、ただし、Ｒ１が水素原子かつＲ２がメチル基である場合、並びに、Ｒ１及びＲ２が共に水素原子である場合は除かれる［１］に記載の細胞保護剤。
［３］  前記式中Ｒ２がメチル基である［１］又は［２］に記載の細胞保護剤。
［４］  前記アルキル基が、炭素数１〜３のアルコキシ基を置換基として有する［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞保護剤。
［５］  前記ビキシン誘導体が、下記のいずれかである［１］に記載の細胞保護剤。
【００１１】
【化２】
2012097003.tif 000003
【００１２】
［６］  上記一般式（Ｉ）で示されるビキシン誘導体。式中、Ｒ１は、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。ただし、Ｒ１が水素原子かつＲ２がメチル基である場合、並びに、Ｒ１及びＲ２が共に水素原子である場合を除く。
［７］  前記式中Ｒ２がメチル基である［６］に記載のビキシン誘導体。
［８］  前記アルキル基が、炭素数１〜３のアルコキシ基を置換基として有する［６］又は［７］に記載のビキシン誘導体。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、小胞体ストレスに対する細胞保護作用を有する新規な細胞保護剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施例１にかかる過酸化水素による細胞ストレスに対するアナトーの細胞保護効果を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例１にかかる過酸化水素による細胞ストレスに対するビキシン及びメチルビキシンの細胞保護効果を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例１にかかるツニカマイシンによる細胞ストレスに対するアナトーの細胞保護効果を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例１にかかるツニカマイシンによる細胞ストレスに対するビキシン及びメチルビキシンの細胞保護効果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例２にかかるIn vivoにおけるアナトー、ビキシンおよびメチルビキシンの細胞保護効果を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例３にかかるツニカマイシンによる細胞ストレスに対する各種ビキシン誘導体の細胞保護効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のビキシン誘導体は、下記一般式（Ｉ）で示されるものである。式中、Ｒ１は、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。
また本発明の細胞保護剤は、下記一般式（Ｉ）で示される化合物を含有するものである。式中、Ｒ１は、水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。
本発明のビキシン誘導体であれば、小胞体ストレスによる細胞傷害から細胞を保護する作用を有するので、細胞保護剤として有効である。
【００１６】
【化３】
2012097003.tif 000004
【００１７】
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
なお、本発明において「ビキシン誘導体」との表現には、特に断らない限り、ビキシンも含まれる。
以下、本発明について説明する。
【００１８】
上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１で表されるアルキル基としては、炭素数１〜６のアルキル基であればよく、直鎖、分岐鎖又は環状のアルキル基であってもよい。このようなアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、シクロプロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基等を挙げることができる。中でも、炭素数１〜４であることが確実な細胞保護作用を奏する観点から好ましい。
また、Ｒ１で表されるアルキル基は、置換基を有していてもよい。Ｒ１で表されるアルキル基が有しうる置換基としては、アルコキシ基を挙げることができ、メトキシ基、エトキシ基、ブトキシ基等を挙げることができる。これらの置換基としては炭素数１〜３のアルコキシ基であることが、確実な細胞保護作用を奏する観点から好ましい。
【００１９】
一般式（Ｉ）のおけるＲ１としては、確実な細胞保護作用を奏する観点から、好ましくは、メチル基、エチル基、イソブチル基及びメトキシエチル基を挙げることができる。
【００２０】
上記一般式（Ｉ）中、Ｒ２で表されるアルキル基としては、炭素数１〜４のアルキル基であればよく、メチル基、エチル基などを挙げることができる。一般式（Ｉ）のおけるＲ２としては、確実な細胞保護作用を奏する観点から、好ましくは、メチル基である。
【００２１】
本発明にかかるビキシン誘導体としては、例えば、下記の化合物を例示することができる。なお、化合物（Ｉ−１）はビキシン及び化合物（Ｉ−６）はノルビキシンとして公知の化合物である。
【００２２】
【化４】
2012097003.tif 000005
【００２３】
本発明におけるビキシン誘導体は、天然由来の成分として、又は化学合成品として入手可能である。
特に、化合物（Ｉ−１）はビキシン及び化合物（Ｉ−６）はノルビキシンとして公知の化合物であり、それぞれアナトーとして、ベニノキ科ベニノキの種子から、油脂、溶剤、水またはアルカリ水溶液により抽出したものであってもよく、市販品をそのまま使用してもよい。
例えば、ビキシンの場合には、ベニノキの種子を、例えば、熱した状態で油脂もしくはプロピレングリコールで抽出すること、室温状態でヘキサンもしくはアセトンで抽出し溶媒を除去すること、または熱した状態でアルカリ性水溶液で抽出し、加水分解して中和することによって、得ることができる。
【００２４】
またその他の化合物は、例えば、ビキシンまたはノルビキシンを、通常用いられるエステル化反応に供することで合成することができる。前記エステル化反応は特に制限されず、例えば、アルコールと酸触媒（好ましくは、濃硫酸等の強酸）とを用いる方法、アルコールとカルボジイミド類等の縮合剤とを用いる方法、ビキシンまたはノルビキシンをハロゲン化剤を用いて酸ハロゲン化物とした後、これとアルコールとを反応させる方法、ハロゲン化アルキルと塩基とを用いる方法等を挙げることができる。
またエステル化反応によって得られた反応生成物を必要に応じて精製処理してもよい。精製処理としては通常行なわれる精製方法を特に制限なく適用でき、例えばシリカゲルカラムクロマト処理等を行うことができる。
例えば、化合物（Ｉ−２）（メチルビキシン）の場合、ビキシンを過剰量のメタノール中で濃硫酸の存在下にエステル化反応させて、精製処理することで得ることができる。
【００２５】
本発明の細胞保護剤は、上述したビキシン誘導体を有効成分として含むものである。本発明において「細胞保護剤」とは、小胞体ストレスよる細胞傷害を緩和又は抑制する作用を有する薬剤を意味する。
【００２６】
ビキシン誘導体の細胞保護作用は、例えば、各種の条件で誘導された視神経細胞死の細胞死抑制活性を測定することにより確認することができる。こうした視神経細胞の細胞死誘導条件としては、例えば、酸素及び／又はグルコース欠乏による視神経細胞死条件、ツニカマイシンによる小胞体ストレス誘導による視神経細胞死条件及びＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）などによる小胞体ストレス誘導及び／又は細胞内Ｃａ２＋濃度上昇による視神経細胞死誘導条件などを用いることができる。
したがって、本発明におけるビキシン誘導体は、こうした視神経細胞の細胞死に対する細胞保護剤の他、このような視神経細胞死が原因となりうる眼疾患の予防・治療剤として用いることができる。
【００２７】
本発明におけるビキシン誘導体による細胞傷害抑制効果が有効な視神経細胞としては、網膜神経節細胞、アマクリン細胞（無軸索細胞）、双極細胞、水平細胞、視細胞（光受容細胞）、インタープレキシフィルム細胞及びミューラー細胞（網膜グリア細胞）などを挙げることができる。また、本発明におけるビキシン誘導体は、ヒトを含む動物に有効であるが、特に、ヒトを含む哺乳類に有効である。
【００２８】
本発明におけるビキシン誘導体が対象とする眼疾患は、ヒトを含む哺乳類の眼疾患であることが好ましい。本発明におけるビキシン誘導体が有効な眼疾患としては、網膜血管閉塞症、糖尿病網膜症、虚血性視神経症、黄斑変性症、網膜色素変性症、レーベル病等に代表される網膜疾患や緑内障などの視神経障害を伴う眼疾患が挙げられる。
【００２９】
また、本発明におけるビキシン誘導体は、視神経細胞の細胞死に対する細胞保護作用の他、パーキンソン病又はアルツハイマー病などの神経変性疾患を惹起する細胞傷害に対しても保護作用を有する。従って、本発明におけるビキシン誘導体は、これらの神経変性疾患に対する予防・治療剤としても用いることができる。
【００３０】
本発明におけるビキシン誘導体は、必要に応じて、医薬として許容される添加剤を加え、単独製剤または配合製剤として汎用されている技術を用いて製剤化することができる。      
【００３１】
本発明の眼疾患の予防・治療剤及び細胞保護剤は、非経口でも、経口でも投与することができる。非経口投与の剤型としては、点眼剤、注射剤、点鼻剤などが、経口投与の剤型としては、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、散剤などが挙げられ、汎用される技術を用いて製剤化することができる。
【００３２】
例えば、点眼剤であれば、添加物として、等張化剤、緩衝剤、ｐ Ｈ 調節剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、保存剤等を適宜配合することができる。また、ｐＨ調節剤、増粘剤、分散剤などを添加することにより、薬物を懸濁化させて、安定な点眼剤を得ることもできる。等張化剤としては、例えばグリセリン、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ソルビトール、マンニトール等を挙げることができる。緩衝剤としては例えば、リン酸、リン酸塩、クエン酸、酢酸、ε -アミノカプロン酸等を挙げることができる。ｐＨ調節剤としては、例えば塩酸、クエン酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ホウ酸、ホウ砂、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等を挙げることができる。可溶化剤としては、例えばポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、マクロゴール４０００等を挙げることができる。増粘剤、分散剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース系高分子、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等を、また、安定化剤としては、例えばエデト酸、エデト酸ナトリウム等を挙げることができる。保存剤（防腐剤）としては、例えば汎用のソルビン酸、ソルビン酸カリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール等が挙げられ、これらの保存剤を組み合わせて使用することもできる。
【００３３】
点眼剤のｐＨは眼科製剤に許容される範囲内にあればよいが、４．０〜８．５の範囲が好ましく、また、浸透圧比を１．０付近に設定することが望ましい。また、注射剤には、溶液、懸濁液、乳濁液および用時液中に溶解または懸濁して用いる固形の注射剤が包含され、例えば薬物を液中に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。
また、注射剤は、滅菌精製水及び等張化のための塩化ナトリウムなどを用いて調製することができる。
【００３４】
また、錠剤は、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、無水リン酸水素カルシウム、デンプン、ショ糖等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポピドン、デンプン、部分アルファー化デンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等の崩壊剤； ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、デンプン、部分アルファー化デンプン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の結合剤； ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、含水二酸化ケイ素、硬化油等の滑沢剤；精製白糖、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン等のコーティング剤；クエン酸、アスパルテーム、アスコルビン酸、メントール等の矯味剤などを適宜選択して用い製剤化することができる。
【００３５】
投与量は症状、年令、剤型等によって適宜選択できるが、点眼剤であれば０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）のものを１日１回〜数回点眼すればよく、注射剤であれば通常１日０．１ｍｇ〜２５０ｍｇを１回または数回に分けて投与すればよい。また、経口剤であれば通常１日当り２５０ｍｇ〜２．５ｇを１回または数回に分けて投与することができる。必要により上記範囲外の量を用いることができる。
【００３６】
ビキシン誘導体は、また、非生理的細胞死抑制剤及び細胞保護剤などの試薬として使用することができる。例えば、各種培養細胞系へ直接投与することにより、不適切に誘導されるアポトーシスに対して細胞を保護することができる。これらの試薬の形態は特に限定されないが、例えば、粉末などの固形剤、又は有機溶剤若しくは含水有機溶剤に溶解した液体剤などを挙げることができる。通常、上記の化合物を試薬として用いて非生理的細胞死抑制作用及び細胞保護作用を発揮させるための効果的な使用濃度は、１０μＭ〜５０μＭとしてもよく、適切な使用量は培養細胞系の種類や使用目的により異なり当業者が適宜選択可能である。また、動物に投与する場合、血中濃度１０μＭ〜１００μＭであることがこのましい。また、必要により上記範囲外の量を用いることができる。
【００３７】
さらに、本剤は、経口あるいは腸管経由の栄養補助材（食品）としても有用である。食品の形態は、従来公知の各種形態を採ることができる。また、食品添加物としても用いることができる。栄養補助食品として摂取する場合、好ましい摂取量としては、１日あたり２５０ｍｇ〜２．５ｇ程度であり、必要により上記範囲外の量を用いることができる。
【００３８】
また、本発明におけるビキシン誘導体は、リード化合物として、細胞保護活性を指標としてさらに有用な化合物を探索し、得るために用いてもよい。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」は質量基準である。
【００４０】
［調製例１］
アナトーの調製
ベニノキの種子１ｋｇを粉砕後、室温下、２リットルのアセトンを用いる２日間の冷浸を３回行って抽出を行った。得られた１０２ｇのエキスをアナトーとして用いた。
【００４１】
［調製例２］
ビキシンの調製
上記調製例１で得られたアナトーのうち７０ｇについて、アセトンに溶解し、室温にて一晩放置後、吸引濾過したところ、ビキシンの粉末結晶２１ｇが得られた。
【００４２】
【化５】
2012097003.tif 000006
【００４３】
HR-ESI-MS m/z 417.2016 [M+Na]+calcd for C25H30O4 (417.2036).
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 1.96 (6H, s, H-21 and H-24, overlapped signals), 1.99 (3H, s, H-22), 2.01 (3H, s, H-23), 3.79 (3H, s, OCH3), 5.88 (1H, d, J = 16.1 Hz, H-2), 5.91 (1H, d, J = 16.1 Hz, H-19), 6.32 (1H, d, J = 9.7 Hz, H-12), 6.37 (2H, d, J = 11.5 Hz, H-9 and H-16, overlapped signals), 6.41 (1H, d, J = 14.9 Hz, H-14), 6.54 (2H, br d, J = 13.1 Hz, H-5 and H-7, overlapped signals), 6.63 (1H, m, H-6), 6.67 (1H, m, H-10), 6.71 (1H, m, H-11), 6.86 (1H, dd, J = 12.0, 14.3 Hz, H-15), 7.46 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-3), 7.97 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-18). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 12.7 (C-21), 12.8 (C-22), 13.0 (C-23), 20.3 (C-24), 51.6 (OCH3), 115.1 (C-2), 117.5 (C-19), 123.4 (C-15), 124.2 (C-6), 130.7 (C-10), 131.4 (C-11), 131.6 (C-17), 133.3 (C-4), 134.2 (C-12), 135.2 (C-9), 136.6 (C-8), 137.1 (C-13), 138.0 (C-16), 140.4 (C-18), 140.5 (C-5 and C-14), 142.4 (C-7), 151.1 (C-3), 168.0 (C-20), 171.7 (C-1).
【００４４】
［合成例１］
メチルビキシンの合成（Ｂｘ−１：化合物Ｉ−２）
ビキシン３００ｍｇを過剰量のメタノール（１５０ｍＬ）に溶解後、濃硫酸２．０ｍＬを添加し、８０℃にて反応を行った。反応生成物は酢酸エチル−水系にて液液分配を行った。得られた酢酸エチル相の溶媒を留去した後、移動相にヘキサン−酢酸エチル（４：１（体積比））混合溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲルカラム：silica gel 60 (７０−２３０ｍｅｓｈ) Ｍｅｒｃｋ社製。以下同じ）に付し、精製することでメチルビキシン３５．２ｍｇを得た。
【００４５】
【化６】
2012097003.tif 000007
【００４６】
HR-ESI-MS m/z 431.2220 [M+Na]+calcd for C26H32O4 (431.2193).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 1.94 (3H of α and 6H of β, br s, Hα-21 and Hβ-21, 24), 1.96 (3H of α, s, Hα-24), 1.98 (3H of α and 6H of β, br s, Hα-22 and Hβ-22, 23), 2.00 (3H of α, s, Hα-23), 3.76 (3H of α and 6H of β, s, OCH3), 3.79 (3H of α, s, OCH3), 5.88 (1H of α and 2H of β, d, J = 15.6 Hz, Hα-2 and Hβ-2, 19), 5.91 (1H of α, d, J = 15.6 Hz, Hα-19), 6.30-6.42 (4H of α and 2H of β, m, Hα-9, 12, 14, 16 and Hβ-9, 12), 6.48 - 6.53 (2H of α and 4H of β, m, Hα-5, 7 and Hβ-5, 7, 14, 16), 6.59 - 6.70 (3H of α and 4H of β, m, Hα-6, 10, 11 and Hβ-6, 10, 11, 15), 6.85 (1H of α, dd, J = 14.6, 12.2 Hz, Hα-11), 7.39 (1H of α and 2H of β, d , J = 15.6 Hz,, Hα-3 and Hβ-3, 18), 7.96 (1H of α, d, J = 15.6 Hz, H-18). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 12.7 (Cα-21, Cβ-21, 24), 12.8 (Cα-22, Cβ-22, 23), 13.0 (Cα-23), 20.3 (Cα-24), 51.5 (OCH3 of α, 2xOCH3 of β), 51.6 (OCH3 of α), 115.8 (Cα-2), 115.9 (Cβ-2, 19), 117.5 (Cα-19), 123.3 (Cα-15), 124.3 (Cα-6), 124.4 (Cβ-6, 15), 130.7 (Cα-11), 131.1 (Cβ-10, 11), 131.2 (Cα-10), 131.5 (Cα-17), 133.4 (Cα-4), 133.5 (Cβ-4), 134.2 (Cα-12), 134.77 (Cβ-9, 12), 134.84 (Cα-9), 136.6 (Cα-8), 136.8(Cβ-8, 13), 137.0(Cα-13), 137.9 (Cα-16), 139.45 (Cβ-5, 16), 139.49 (Cα-5), 140.39 (Cα-18), 140.44 (Cα-14), 141.68 (Cβ-7, 14), 141.74 (Cα-7), 149.1 (Cα-3, Cβ-3), 167.9 (Cβ-1, 20), 168.0 (Cα-1, 20).
【００４７】
［合成例２］
エチルビキシンの合成（Ｂｘ−２：化合物Ｉ−３）
ビキシン３００ｍｇを過剰量のエタノール（３０ｍＬ）に溶解後、濃硫酸１．０ｍＬを添加し、８０℃にて反応を行った。反応生成物は酢酸エチル−水系にて液液分配を行った。得られた酢酸エチル相の溶媒を留去した後、移動相にヘキサン−酢酸エチル（４：１（体積比））混合溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、精製する事でエチルビキシン２７．５ｍｇを得た。
【００４８】
【化７】
2012097003.tif 000008
【００４９】
HR-ESI-MS m/z 445.2317 [M+Na]+calcd for C27H34O4 (445.2349).
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 1.31 (3H, t, H-2’), 1.94 (3H, s, H-22), 1.96 (3H, s, H-23), 1.98 (3H, s, H-22), 2.00 (3H, s, H-22), 3.79 (3H, s, OCH3), 4.22 (2H, q, J = 14.3, 6.9 Hz,H-1’), 5.88 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-2), 5.91 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-19), 6.32 (1H, d, J = 9.7 Hz, H-12), 6.37 (2H, d, J = 11.5 Hz, H-9 and H-16, overlapped signals), 6.41 (1H, d, J = 14.9 Hz, H-14), 6.54 (2H, br d, J = 13.1 Hz, H-5 and H-7, overlapped signals), 6.63 (1H, m, H-6), 6.67 (1H, m, H-10), 6.71 (1H, m, H-11), 6.86 (1H, dd, J = 12.0, 14.3 Hz, H-15), 7.46 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-3), 7.97 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-18). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 12.8 (C-21), 12.9 (C-22), 14.5 (C-23), 14.5 (H-2’), 20.4 (C-24), 51.7 (OCH3), 60.3(H-1’), 116.4 (C-2), 117.6 (C-19), 123.4 (C-15), 124.4 (C-6), 130.9 (C-11), 131.3 (C-10), 131.6 (C-17), 133.6 (C-4), 134.4 (C-12), 134.9 (C-9), 136.7 (C-8), 137.0 (C-13), 138.1 (C-16), 139.4 (C-5), 140.5 (C-18), 140.6 (C-14), 141.7 (C-7), 148.9 (C-3), 167.6 (C-20), 168.1 (C-1).
【００５０】
［合成例３］
イソブチルビキシンの合成（Ｂｘ−３：化合物Ｉ−４）
ビキシン３００ｍｇを過剰量の２−ブタノール（３０ｍＬ）に溶解後、濃硫酸１．０ｍＬを添加し、１００℃にて反応を行った。反応生成物は酢酸エチル−水系にて液液分配を行った。得られた酢酸エチル相の溶媒を留去した後、移動相にヘキサン−酢酸エチル（３：１（体積比））混合溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、精製する事でイソブチルビキシン４．３ｍｇを得た。
HR-ESI-MS m/z 473.2651 [M+Na]+ calcd for C29H38O4(473.2662).
【００５１】
［合成例４］
２’−メトキシエチルビキシンの合成（Ｂｘ−４：化合物Ｉ−５）
ビキシン３００ｍｇを過剰量のエチレングリコールモノメチルエーテル（１５０ｍＬ）に溶解後、濃硫酸２．０ｍＬを添加し、１００℃にて反応を行った。反応生成物は酢酸エチル−水系にて液液分配を行った。得られた酢酸エチル相の溶媒を留去した後、移動相にヘキサン−酢酸エチル（４：１（体積比））混合溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、精製する事で２’-メトキシエチルビキシン１７．６ｍｇを得た。
【００５２】
HR-ESI-MS m/z 475.2411 [M+Na]+calcd for C28H36O5 (475.2455).
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 1.94 (3H, s, H-22), 1.96 (3H, s, H-23), 1.98 (3H, s, H-22), 2.00 (3H, s, H-22), 3.41 (3H, s, 2’-OCH3), 3.65 (2H, t, J = 4.6 Hz, H-1’), 3.78 (3H, s, COOCH3), 4.32 (2H, t, J = 4.6 Hz, H-2’), 5.91 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-2), 5.94 (1H, d, J = 13.7 Hz, H-19), 6.32 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-12), 6.36 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-9), 6.37 (1H, d, J = 11.5 Hz, H-16), 6.41 (1H, d, J = 14.3 Hz, H-14), 6.51 (1H, br d, J = 10.4 Hz, H-7), 6.52 (1H, br d, J = 14.4 Hz, H-5), 6.62 (1H, m, H-6), 6.69 (1H, m, H-10), 6.70 (1H, m, H-11), 6.86 (1H, dd, J = 12.0, 14.9 Hz, H-15), 7.41 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-3), 7.96 (1H, d, J = 15.5 Hz, H-18). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 12.7 (C-21), 12.8 (C-22), 13.0 (C-23), 20.4 (C-24), 51.6 (COOCH3), 59.0 (2’-OCH3), 63.31 (C-1’), 70.7 (C-2’), 115.9 (C-2), 117.5 (C-19), 123.3 (C-15), 124.3 (C-6), 130.8 (C-11), 131.2 (C-10), 131.5 (C-17), 133.5 (C-4), 134.3 (C-12), 134.9 (C-9), 136.6 (C-8), 137.0 (C-13), 138.0 (C-16), 139.7 (C-5), 140.4 (C-18), 140.5 (C-14), 141.8 (C-7), 149.4 (C-3), 167.5 (C-20), 168.0 (C-1).
【００５３】
［実施例１］
In vitroにおけるアナトー、ビキシンおよびメチルビキシンの細胞保護効果
マウス網膜神経節細胞株であるＲＧＣ−５を、９６穴プレートに１穴あたり１０００個の細胞密度で播種し、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭを用いて、３７℃５％ＣＯ２の条件下で、培養した。２４時間後に培養液を交換し、上記のとおりにして得たアナトー、ビキシン及びメチルビキシンの各被検物質を添加した。
【００５４】
各被検物質を添加１時間後に、各種ストレス誘発剤（０．３ｍＭ過酸化水素又は２μｇ／ｍＬツニカマイシン）をそれぞれ添加して反応させた。なお、過酸化水素及びツニカマイシンによる各々の細胞保護試験では、過酸化水素又はツニカマイシンを含まない系を対照群として用いた。また、２７時間後に、ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２およびヨウ化プロピジウムを添加して、核の二重染色法により死細胞率を計測した。過酸化水素を用いた結果を図１（アナトー）及び図２（ビキシン及びメチルビキシン）に、ツニカマイシンを用いた結果を図３（アナトー）及び図４（ビキシン及びメチルビキシン）に、それぞれ示す。図中、「ビヒクル（Ｖｅｈｉｃｌｅ）」は、各被検物質を含まない系を意味する。
【００５５】
図１及び図３に示されるように、アナトーは過酸化水素誘発細胞死に対して濃度依存的な細胞保護効果を示し、３μｇ／ｍｌで有意な細胞死抑制効果が認められ、また、ツニカマイシン誘発細胞死に対しても濃度依存的な保護効果を示し、０．１μｇ／ｍｌ以上で有意な細胞死抑制効果が認められた。
図２及び図４に示されるように、ビキシンおよびメチルビキシンはツニカマイシン誘発細胞死に対して細胞保護効果を示し、３μｇ／ｍｌ以上で有意な細胞死抑制効果が認められ、また、過酸化水素に対してメチルビキシンは３μｇ／ｍｌ以上で有意な細胞死抑制効果を示し、ビキシンより低濃度で保護効果が認められた。
【００５６】
［実施例２］
In vitroにおける各ビキシン誘導体の細胞保護効果
マウス網膜神経節細胞株であるＲＧＣ−５を、９６穴プレートに１穴あたり１０００個の細胞密度で播種し、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭを用いて、３７℃５％ＣＯ２の条件下で培養した。２４時間後に培養液を交換し、表１に示すとおり、上記のようにして得た各被検物質を所定の濃度で添加した。
【００５７】
各被検物質を添加１時間後に、２μｇ／ｍＬのツニカマイシンをそれぞれ添加して反応させた。２７時間後に、ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２およびヨウ化プロピジウムを添加して、核の二重染色法により死細胞率を計測した。ストレス誘発剤を添加し且つ被検物質を含まない系（「Vehicle」）を対照群とした。各群における細胞障害比を表１に示す。なお、細胞障害比は、Vehicleの死細胞率を１００％としたときの各群の死細胞率の比である。
【００５８】
【表１】
2012097003.tif 000009
【００５９】
表１に示されるように、本発明にかかるビキシン誘導体は、いずれもストレス抑制効果があることわかる。特に、ビキシン、メチルビキシン及びＢｘ−２には、低濃度でもストレス抑制効果が得られることがわかる。
【００６０】
［実施例３］
In vivoにおけるアナトー、ビキシンおよびメチルビキシンの細胞保護効果 
ｄｄＹマウス（雄、７週齢）にイソフルラン麻酔下、各抑制物質及びストレス物質（片目あたり１μｇのツニカマイシン）（溶媒は５％  ＤＭＳＯ）を各々２μＬ、硝子体内投与し、７日後眼球摘出した。なお、メチルビキシンは５００μＭの濃度で投与した。１晩、４℃の条件で４％パラホルムアルデヒドに浸漬させ、その後パラフィン置換を行った。５μｍの厚さの薄切切片を作製してヘマトキシリン・エオジン染色を行い、視神経乳頭から３７５μｍ〜６２５μｍのＧＣＬ（網膜神経節細胞）の数、ＩＰＬ（内網状層）の厚さを評価した。結果を図５（ＧＣＬ）及び図６（ＩＰＬ）に示す。なお、図５及び図６は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝８〜１８）の値であり、＊及び＊＊は、ツニカマイシン添加群の値に対して、それぞれ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１を意味する。
【００６１】
図５に示されるように、ツニカマイシン誘発網膜障害におけるＧＣＬの細胞数の減少は、アナトー又はビキシンの硝子体内投与によって用量依存的に抑制された。また、メチルビキシンの投与によっても同様に細胞減少の抑制が認められた。
さらに、図６に示されるように、ツニカマイシンによるＩＰＬの薄層化において、メチルビキシン（５００μＭ）はビキシンと比較してより強力な保護効果を示した。
【図１】
2012097003.tif 000014
【図２】
2012097003.tif 000015
【図３】
2012097003.tif 000016
【図４】
2012097003.tif 000017
【図５】
2012097003.tif 000018
【図６】
2012097003.tif 000019