(57)【要約】      （修正有）【課題】多孔性ハイドロゲルマトリックスを含む生体活性組成物、並びに、有機溶剤中に安定であるハイドロゲルタンパク質複合材を提供する。【解決手段】多孔性ハイドロゲルマトリックスを含む生体活性組成物。少なくとも１種のタンパク質は多孔性ハイドロゲルマトリックス中に固定化され、有機溶剤中に安定である前記ハイドロゲルタンパク質複合材。生体活性組成物の安定化法であって、タンパク質分子の周囲にハイドロゲルマトリックス細孔を形成、及び、ハイドロゲルマトリックス細孔内の含水率を低減し、有機溶剤中に安定であるハイドロゲルタンパク質複合材を形成する工程を含む前記方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔性ハイドロゲルマトリックス、
前記多孔性ハイドロゲルマトリックス中に固定化され、有機溶剤中で安定であるハイドロゲル−タンパク質複合材を形成している、少なくとも１種のタンパク質、
を含む生体活性組成物。
【請求項２】
前記ハイドロゲル−タンパク質複合材は有機溶剤中にて遊離消化性タンパク質対照物の半減期の少なくとも１０００倍長い半減期を有する、請求項１記載の生体活性組成物。
【請求項３】
前記ハイドロゲル−タンパク質複合材は有機溶剤中で活性を維持する、請求項１記載の生体活性組成物。
【請求項４】
前記ハイドロゲル−タンパク質複合材は、有機溶剤中にて遊離消化性タンパク質対照物よりも１０００倍高い活性を有する、請求項１記載の生体活性組成物。
【請求項５】
前記ハイドロゲルタンパク質は高温にて生物学的活性を維持する、請求項１記載の生体活性組成物。
【請求項６】
前記タンパク質は最大１１０℃の温度に暴露された後に生物学的活性を維持する、請求項１記載の生体活性組成物。
【請求項７】
前記タンパク質はプロテアーゼ、アミラーゼ、セルロース、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、チロシナーゼ、グリコシダーゼ、ヌクレアーゼ、アルドラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、デヒドロゲナーゼ及びリゾチームならびにそれらの組み合せから選ばれる、請求項１記載の生体活性組成物。
【請求項８】
抗体、核酸、脂肪酸、ホルモン、ビタミン、ミネラル、構造タンパク質、酵素、ならびに、ヒスタミンブロッカー及びヘパリンを含む治療薬からなる群より選ばれる生化学活性剤をさらに含む、請求項１記載の生体活性組成物。
【請求項９】
前記ハイドロゲルマトリックスは含水率がハイドロゲルマトリックスの０〜５質量％である、請求項１記載の生体活性組成物。
【請求項１０】
前記消化性タンパク質はハイドロゲルマトリックスの約０．２〜４．５乾燥質量％である、請求項１記載の生体活性組成物。
【請求項１１】
タンパク質分子の周囲にハイドロゲルマトリックス細孔を形成すること、及び、
前記ハイドロゲルマトリックス細孔内の含水率を低減し、有機溶剤中に安定であるハイドロゲル−タンパク質複合材を形成すること、
を含む、生体活性組成物の安定化法。
【請求項１２】
タンパク質分子の周囲にハイドロゲルマトリックス細孔を形成する工程はタンパク質を脱イオン水中に所望の濃度で溶解させること、プレポリマーを脱イオン水中に所望の濃度で溶解させること、溶解したタンパク質及び溶解したプレポリマーを所望の比率で混合すること、及び、該プレポリマーの重合を開始することの工程を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
重合を開始する工程は、架橋剤を添加すること、開始剤を添加すること、及び、溶解したタンパク質と溶解したプレポリマーとの混合物の温度を調節すること、から選ばれる少なくとも１つの工程を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
溶解したプレポリマーの比率は総体積に対して２０〜２８質量％である、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
ハイドロゲルマトリックス細孔内の含水率を低減する工程はハイドロゲルマトリックスを２０〜１１０℃の温度に２４時間〜７日間加熱することを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
ハイドロゲルマトリックス細孔内の含水率を低減する工程はハイドロゲルマトリックスを２０〜８０℃の温度に２４時間加熱し、次いで、室温にて１週間空気乾燥することを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ハイドロゲルマトリックス細孔内の含水率を低減する工程はハイドロゲルマトリックスを２０〜５５℃の温度に２４時間加熱し、次いで、室温にて１週間空気乾燥することを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
ハイドロゲルマトリックス細孔内の含水率を低減する工程は湿潤ゲル体積と比較して１５〜２１％、孔体積を低減する、請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
ハイドロゲルマトリックス細孔内の含水率を低減する工程は孔体積を低減し、そして基質が孔に入ることを可能にし、前記タンパク質と前記基質との間の反応が可能になる、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は生体活性材料を安定化させる組成物及び生体活性材料を安定化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質、核酸及び機能的な酵素などの生物活性高分子は、生物医学及び産業用途の様々な局面で利用されうる。タンパク質は洗剤の消化クリーニング効率を高めるために様々な洗剤混合物中で利用されうる一方、たとえば、核酸はポリメラーゼ連鎖反応のための遺伝子鋳型として利用することができる。さらに、消化性タンパク質又は酵素などのタンパク質は触媒して有機分子を分解するのに利用することができる。消化性タンパク質は有機媒体で利用することができ、それにより、様々な基質を利用できるようになる。もしも基質が水中で不溶性であるか又は水にわずかにしか可溶性でないならば、消化性タンパク質の最大活性は水溶液中で達成されえない。
【０００３】
消化性タンパク質又は酵素などのタンパク質は様々な有機分子を分解しそしてその有機分子と反応することができるが、それは一般に高温で熱的に安定でない。さらに、このようなタンパク質又は消化性酵素は一般に非水性有機溶剤中で安定でない。
【０００４】
それゆえ、高温及び乾燥条件下で使用することができる熱的に安定した生体活性組成物が当該技術分野において必要である。また、有機溶剤中で高い触媒活性を維持する生体活性組成物も当該技術分野において必要である。有機溶剤中で高い触媒活性を維持する熱的に安定な生体活性組成物及びその生体活性組成物の製造方法が当該技術分野においてさらに必要である。
【発明の概要】
【０００５】
発明の要旨
１つの態様において、多孔性ハイドロゲルマトリックスを含む生体活性組成物が開示される。多孔性ハイドロゲルマトリックス中に固定化された少なくとも１種のタンパク質は有機溶剤中に安定であるハイドロゲルタンパク質複合材を形成している。
【０００６】
別の態様において、タンパク質分子の周囲にハイドロゲルマトリックス細孔を形成すること、及び、前記ハイドロゲルマトリックス細孔内の含水率を低減し、有機溶剤中に安定であるハイドロゲルタンパク質複合材を形成することの工程を含む、生体活性組成物の安定化法が開示される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は事前処理されたゲルに捕捉されたＧＯx、ならびに、未処理のゲルに捕捉されたＧＯx及び天然ＧＯx酵素のエタノール中における相対活性の時間の関数としてのグラフである。
【０００８】
【図２】図２はハイドロゲル中に捕捉する酵素の分子量のモノマー濃度の関数としてのプロットである。
【０００９】
【図３】図３は８０℃にて異なる時間インキュベートした後の、事前処理α−キモトリプシンに関する８０℃での相対活性の時間の関数としてのグラフである。
【００１０】
【図４】図４はα−ＣＴの天然酵素、α−ＣＴの未処理ハイドロゲル酵素及びα−ＣＴの事前処理ハイドロゲル酵素に関するメタノール中における相対活性の時間の関数としてのプロットである。
【００１１】
【図５】図５は処理されたゲルα−ＣＴ及びα−ＣＴの天然酵素の両方に関するエステル転移反応の反応速度のプロットである。
【００１２】
【図６】図６は異なる含水率に対する依存性を含めて、天然α−キモトリプシン及び乾燥ハイドロゲルに捕捉されたα−キモトリプシンの初期エステル転移速度を詳細に示すプロットである。
【００１３】
【図７】図７はｎ−ヘキサン中でのエステル転移反応に関する天然α−ＣＴ酵素及びハイドロゲルに捕捉されたα−ＣＴ酵素の相対活性の時間の関数としてのプロットである。
【００１４】
【図８】図８は加水分解エステル転移反応及び有機エステル転移反応の両方における様々な使用サイクルにわたるゲル閉じ込め酵素の相対活性のプロットである。
【００１５】
好ましい実施形態の詳細な説明
多孔性ハイドロゲルマトリックス及びその多孔性ハイドロゲルマトリックス中に固定化された少なくとも１種のタンパク質を含み、有機溶剤中及び高温で安定であるハイドロゲルタンパク質複合材を形成する生体活性組成物がここに開示される。１つの態様において、ハイドロゲルタンパク質複合材は有機溶剤中にて遊離消化性タンパク質対照物の半減期の少なくとも１０００倍長い半減期を有する。さらに、ハイドロゲルタンパク質複合材は有機溶剤中で活性を維持する。１つの態様において、ハイドロゲルタンパク質複合材は、有機溶剤中にて遊離消化性タンパク質対照物よりも１０００倍高い活性を有する。
【００１６】
ハイドロゲルタンパク質複合材の有機溶剤中での安定性に加えて、ハイドロゲルタンパク質は高温にて生物学的活性を維持する。１つの態様において、タンパク質は１１０℃までの温度に暴露された後に生物学的活性を維持する。
【００１７】
様々なタンパク質はここに開示される生体活性組成物中において使用されうる。１つの態様において、タンパク質はプロテアーゼ、アミラーゼ、セルロース、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、チロシナーゼ、グリコシダーゼ、ヌクレアーゼ、アルドラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、デヒドロゲナーゼ及びリゾチームならびにそれらの組み合せから選ばれることができる。さらに、抗体、核酸、脂肪酸、ホルモン、ビタミン、ミネラル、構造タンパク質、酵素、ならびに、ヒスタミンブロッカー及びヘパリンを含む治療薬を含む生体活性剤を使用できる。
【００１８】
生体活性組成物は、含水率がハイドロゲルマトリックスの０〜０．５質量％であるハイドロゲルマトリックスを含む。１つの態様において、消化性タンパク質はハイドロゲルマトリックスの約０．１〜１０乾燥質量％であり、そして１つの態様において、ハイドロゲルマトリックスの約０．２〜４．５乾燥質量％である。
【００１９】
タンパク質分子の周囲にハイドロゲルマトリックス細孔を形成すること、及び、ハイドロゲルマトリックス細孔内の含水率を低減し、有機溶剤中に安定であるハイドロゲルタンパク質複合材を形成することを含む、生体活性組成物の安定化法もここに開示される。１つの態様において、タンパク質分子の周囲にハイドロゲルマトリックス細孔を形成する工程はタンパク質を脱イオン水中に所望の濃度で溶解させること、及び、プレポリマーを脱イオン水中に所望の濃度で溶解させること、及び、溶解したタンパク質及び溶解したプレポリマーを特定の比率で混合することの工程を含む。次に、プレポリマー組成物の重合を開始する。１つの態様において、重合を開始する工程は、架橋剤を添加すること、開始剤を添加すること、溶解したタンパク質と溶解したプレポリマーとの混合物の温度を調節することから選ばれることができる少なくとも１つの工程を含む。１つの態様において、溶解したプレポリマーの総体積に対する比率は２０〜２８質量％である。
【００２０】
ハイドロゲルマトリックス細孔内の含水率を低減する工程はハイドロゲルマトリックスを２０〜１００℃の温度に２４時間〜７日間加熱することを含むことができる。さらに、ハイドロゲルマトリックス内の含水率を低減する工程はハイドロゲルマトリックスを２０〜８０℃の温度に２４時間加熱し、次いで、室温にて特定の時間、たとえば、１週間空気乾燥することを含むことができる。
【００２１】
さらに、ハイドロゲルマトリックス細孔内の含水率を低減する工程はハイドロゲルマトリックスを２０〜５５℃の温度に２４時間加熱し、次いで、室温にて特定の時間、たとえば、１週間空気乾燥することを含むことができる。
【００２２】
さらに、ハイドロゲルマトリックス細孔内の含水率を低減する工程は湿潤ゲル体積と比較して１５〜２１％、孔体積を低減することができる。含水率を低減する工程は孔体積を低減することができ、そして基質が孔に入ることを可能にし、タンパク質と基質との間の反応が可能になる。このようにして、生体活性組成物は様々な反応において使用されうる。１つの態様において、生体活性組成物の架橋も、捕捉された酵素の細孔中への基質のアクセスを可能にするように調節されうる。生体活性組成物は様々な反応のために使用されるときに、繊維、ビーズ、フィラメント又はロッドなどの様々な形状を有することができる。
【表１】
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【００２３】
１つの態様において、生体活性組成物の事前処理は使用される酵素の構造変化を引き起こす転移温度に基づいて様々であることができる。下記の表を参照すると、様々な酵素は摂氏温度で転移温度ラベル化ＴＭを有することが判る。グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、α−キモトリプシン、サーモリシン、α−アミラーゼ及びリパーゼを含む様々な酵素が表中に示されている。表から判るように、提案される事前処理温度は転移温度ＴＭに基づいて様々であろう。表において判るように、提案される事前処理温度は酵素の大きな構造的変化をもたらす転移温度を大きく超えることはない。
【実施例】
【００２４】
本発明の様々な態様は下記の非限定的な実施例により例示される。実施例は例示の目的のみであり、本発明の実施に対して限定しない。変更及び改変は本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行えることが理解されるであろう。
例
【００２５】
例１−改良された熱及び触媒安定性をもたらすポリアクリルアミドハイドロゲル中へのグルコースオキシダーゼの捕捉
材料
アクリルアミド/ビス溶液及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）はBio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USAの製品であった。D-（+）-グルコース、クロコウジカビからのグルコースオキシダーゼ（ＧＯX）（ＥＣ１．１．３．４）、セイヨウワサビからのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ＥＣ１．１１．１．７）、ｏ−ジアニシジン、ＨＰＬＣグレードのエタノール、メタノール及びクロロホルム、トルエン、過硫酸アンモニウムはSigma Chemical Co., St. Louis, MO, USAから入手した。特に言及しない限り、実験で使用される他のすべての試薬及び溶剤は市販の最高等級のものであった。
【００２６】
ポリアクリルアミドハイドロゲル中へのグルコースオキシダーゼ（ＧＯx）の捕捉
ＧＯxのポリアクリルアミドハイドロゲル中への捕捉を下記の手順により行った。０．５〜１０ｍｇのＧＯXを含む０．１ＭのｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝液 ２ｍｌを調製し、次いで、３０％のアシルアミド/ビス溶液６．８ｍｌ及びＤＩＨ2Ｏ１．２ｍｌと混合して、合計モノマー濃度２０％（ｗ／ｖ）及び架橋剤濃度５％（ｗ／ｗ）を有する１０ｍｌの溶液を製造した。予め決められた形状のハイドロゲルディスクを得るためにエンクロージャ（８．３×７×０．０７５ｃｍ3）を使用して、１００μlの新鮮に調製された過硫酸アンモニウム（脱イオン水中１０％ｗ／ｖ）及び4μlのＴＥＭＥＤを室温で添加することによって重合を開始した。完全にゲル化させて酵素を捕捉するのに少なくとも４時間を要した。得られたハイドロゲルディスクをガラスエンクロージャから取り出し、さらなる試験のために直径１６ｍｍの小さなディスクへと打ち抜き加工した。
【００２７】
天然ＧＯx及びヒドロゲルに捕捉されたＧＯxの活性アッセイ
セイヨウワサビペルオキシダーゼ及びｏ−ジアニシジンを用いた共役酵素反応を応用してＧＯxの活性を決定した。天然酵素に関しては、反応混合物（１．１ｍｌ）は０．１モルのグルコース、７μｇのセイヨウワサビペルオキシダーゼ、０．１７ｍＭのｏ−ジアニシジン及び３５μｌの酵素（０．４〜０．８Ｕ／ｍｌ）を５０ｍＭのｐＨ５．１の酢酸ナトリウム緩衝液中に含んだ。室温での５００ｎｍでの吸光度の増加を活性の計算のために記録した。ヒドロゲルに捕捉したＧＯxを用いた反応は２０ｍｌガラスバイアル中で行った。
【００２８】
ハイドロゲルに捕捉したＧＯxの活性を測定するために、乾燥したハイドロゲルディスクを脱イオン水中に少なくとも２時間浸漬し、活性試験の前に完全に膨潤した状態にさせた。セイヨウワサビペルオキシダーゼ０．１４ｍｇ及びｏ−ジアニシジン１．１ｍｇを含む０．１Ｍのグルコース溶液２０．７ｍｌに対してハイドロゲルディスクを添加した。各１ｍｌのアリコートを周期的に取り出し、そして５００ｎｍでのＵＶ吸光度を用いて製品濃度を測定した後に即座に再混合した。
【００２９】
ハイドロゲルに捕捉した酵素の事前処理（乾燥）
ハイドロゲルに捕捉したグルコースオキシダーゼに関して、有効な事前処理温度は２０℃〜８０℃の範囲であることが判った。好ましくは、新鮮なハイドロゲルディスクをペトリ皿に入れ、炉内で８０℃にて２４時間インキュベートし、次いで、室温にて空気中で１週間乾燥し、完全な乾燥状態とした。最終的に、乾燥したハイドロゲルディスクをさらなる試験のために用い、活性を上記のとおりの水溶液中での加水分解により測定した。
【００３０】
事前処理されたハイドロゲルに捕捉したＧＯxの熱安定性
ＧＯxを含有するハイドロゲルディスクを上記のとおりに事前処理し、ガラスプレート上に置き、炉内で高温（８０℃、１１０℃及び１３０℃）でインキュベートした。特定の時点で、ハイドロゲルディスクを炉から取り出し、残留触媒活性を上記のとおりのアッセイ手順を用いて評価した。
【００３１】
事前処理されたハイドロゲルに捕捉したＧＯxの有機溶剤中での安定性
事前処理の後に、ハイドロゲルに捕捉した酵素の安定性を、アセトン、メタノール、エタノールなどの極性型溶剤もしくはトルエンなどの非極性型溶剤などの有機溶剤中で検査した。同一のバッチからの事前処理されたハイドロゲルディスクを、ネジでキャップした２０ｍＬバイアル中で各溶剤１０ｍｌ中にてインキュベートした。天然の酵素及び事前処理していないハイドロゲルディスクを比較として用いた。ハイドロゲルディスクを活性アッセイのために特定の時刻で溶剤から取り出し、残留活性を決定した。
【００３２】
室温にて、事前処理されたハイドロゲルに捕捉したＧＯxのメタノール中での平均寿命は５，６５０時間という長さであり、一方、天然酵素の平均寿命は５分未満であり、そして事前処理されていない湿潤ハイドロゲルに捕捉した酵素に関しては５０．３時間であることが判った。
【表２】
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【００３３】
乾燥したハイドロゲルに捕捉したＧＯxの有機溶剤中での高温での安定性
事前処理の後に、ハイドロゲルに捕捉したＧＯxの安定性を、高温及び極性溶剤の随伴効果の下に調べた。典型的には、乾燥したハイドロゲルディスクを、１０ｍｌの純粋エタノール中で７４℃の固定温度でインキュベートした。ネジでキャップした２０ｍＬバイアルを用いた。特定の時刻で、ハイドロゲルディスクをエタノール溶液から取り出し、残留活性を決定した。
【００３４】
図１に詳細に示すとおり、事前処理した収縮したハイドロゲルに捕捉したＧＯxの活性は長時間にわたって有意な損失がないが、天然のＧＯx及び事前処理していない湿潤ハイドロゲルに捕捉したＧＯxの両方は急速に不活性化した。半減期は４５００時間の範囲であると評価され、同一の条件下の天然の酵素と比較して２×１０6倍の驚くべき安定性の向上である。
【００３５】
例２−向上した熱及び触媒安定性を生じるポリアクリルアミドハイドロゲル中のα−キモトリプシンの捕捉
材料
例1に詳述した多くの同一の材料を用い、さらに、ウシ膵臓からのα-キモトリプシン（α−ＣＴ）（ＥＣ３．４．２１．１）、ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンエチルエステル（ＡＰＥＥ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)から購入したn-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe p-ニトロアニリド(n-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p- nitroanilide)（ＳＡＡＰＰＮ）を用いた。ｎ−プロピルアルコール（N- PrOH、HPLC等級）はEM (Gibbstown, NJ)から購入した。すべての有機溶剤は使用される前に少なくとも２４時間3Åモレキュラーシーブで処理した。特に言及しない限り、実験で使用される他のすべての試薬及び溶剤は市販の最高等級のものであった。
【００３６】
ポリアクリルアミドハイドロゲル中のα−キモトリプシン（α−ＣＴ）の捕捉
ポリアクリルアミドハイドロゲル中へのα-ＣＴの捕捉は下記手順により行った。０．５〜 １０ｍｇのα−ＣＴを含む０．０１ＭのｐＨ７．５の酢酸ナトリウム緩衝液０．４２ｍｌを調製し、次いで、３０％アシルアミド/ビス溶液９．３３ｍｌ及びＤＩＨ2Ｏ０．２５ｍｌと混合し、合計モノマー濃度２８％（ｗ／ｖ％）及び架橋剤濃度５％を有する１０ｍｌの溶液を製造した。予め決められた形状（８．３×７×０．０７５ｃｍ3）のハイドロゲルディスクを得るためのガラスエンクロージャを使用して、１００μlの新鮮に調製された過硫酸アンモニウム（脱イオン水中１０％ｗ／ｖ）及び4μlのＴＥＭＥＤを室温で添加することによって重合を開始した。完全にゲル化させて酵素を捕捉するのに少なくとも４時間を要した。得られたハイドロゲルディスクをガラスエンクロージャから取り出し、さらなる試験のために直径１６ｍｍの小さなディスクへと打ち抜き加工した。
【００３７】
天然のα―ＣＴ及びハイドロゲルに捕捉したα-ＣＴに関する水性活性アッセイ
天然の酵素では、酵素溶液（１ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを、ＳＡＢ２．４４ｍｌ及びDMSO中の１６０ｍＭのＳＡＡＰＰＮ原料溶液１３μｌと混合した。反応速度は４１０ｎｍでの吸光度をモニターすることによって決定した。
【００３８】
ハイドロゲルに捕捉したα−ＣＴの場合には、乾燥したゲルディスクを脱イオン水中に少なくとも２時間浸漬し、活性試験の前に完全に膨潤した状態にさせた。５ｍＭの酢酸カルシウムを含むｐＨ７．５で１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液４．９７５ｍｌ及び１６０ｍＭのＳＡＡＰＰＮ原料２５μｌを含む２０ｍＬバイアル中での反応により活性を測定した。２００ｒｐｍで攪拌しながら、ハイドロゲルに捕捉した酵素を添加することにより反応を開始した。各１ｍｌのアリコートを周期的に取り出し、そして４１０ｎｍでのＵＶ吸光度を用いて製品濃度を測定した後に即座に再混合した。
【００３９】
ハイドロゲルに捕捉した酵素の事前処理（乾燥）
ハイドロゲルに捕捉したα−キモトリプシンに関して、有効な乾燥温度は２０℃〜５５℃の範囲であることが判った。好ましくは、新鮮なハイドロゲルディスクを炉内で５５℃で２４時間インキュベートし、次いで、室温にて空気中で１週間乾燥し、完全な乾燥状態とした。最終的に、乾燥したハイドロゲルディスクをさらなる試験のために用い、活性を上記のとおりの水溶液中での加水分解により測定した。
【００４０】
図３において判るように、α−キモトリプシンの事前処理により、８０℃での酵素熱安定性の驚くべき向上が得られ、単一法（室温又は５５℃での乾燥）で有意な差異は観測されえない。１０００時間にわたって、８０℃という高温であるにも関わらず、初期活性の１５％しか損失せず、一方、湿潤及び乾燥状態の天然酵素はずっと速く活性を損失した。
【００４１】
事前処理された（乾燥）ハイドロゲルに捕捉したα−ＣＴのメタノール中での安定性
事前処理の後に、ハイドロゲルに捕捉したα−ＣＴの安定性を、メタノール中で検査した。同一のバッチからの単一の事前処理されたハイドロゲルディスクを、ネジでキャップした２０ｍＬバイアル中で純粋メタノール１０ｍｌ中にてインキュベートした。天然の酵素及び事前処理していないハイドロゲルディスクを比較として用いた。ハイドロゲルディスクを特定の時刻で溶剤から取り出し、残留活性を決定した（上記のアッセイ）。
【００４２】
ゲルに捕捉したα―ＣＴは、また、図４に詳細に示すとおり、有機溶剤中での大きく向上した安定性を示す。乾燥ゲルα−ＣＴの半減期はメタノール中で約１４０日であり、天然のα―ＣＴよりも１０5倍という驚くべき向上である。
【００４３】
天然のα−ＣＴ及び事前処理されたハイドロゲルα―ＣＴのエステル転移活性
室温にて、ＡＰＥＥ（２．５〜３０Ｍｍの範囲の濃度）事及び０．５Ｍのｎ−ＰｒＯＨを含むヘキサン又はイソオクタン中で、天然のα−ＣＴの有機溶剤中でのエステル転移活性を測定した。典型的には、５ｍｇの天然ＣＴ粉末を、反応溶液１０ｍＬに添加して反応を開始した。２００ｒｐｍでの反応の間に、反応溶液からのアリコート２００μＬを、０．２２μｍＰＴＦＥシリンジフィルターを用いたろ過により周期的に取り出し、次いで、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１００μｌの体積の上層液をガスクロマトグラフ分析（下記のＧＣ法）のために用いた。
【００４４】
ハイドロゲルに捕捉したα−ＣＴでは、１片の乾燥したハイドロゲルディスクを、ＡＰＥＥ（２．５〜３０Ｍｍの範囲の濃度）及び０．５Ｍのｎ−ＰｒＯＨを含むヘキサンもしくはイソオクタン１０ｍｌ中に添加した。反応物を２００ｒｐｍで振盪させ、一方、２００μｌのアリコートを周期的に取り出し、そして１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１００μｌの体積の上層液をガスクロマトグラフ分析のために用いた。
【００４５】
生成物の濃度を、ＦＩＤ検出器及びＲＴＸ−５キャピラリーカラム（０．２５ｍｍ×０．２５μｍ×１０ｍ、Shimadzu）を装備したガスクロマトグラフを用いてモニターした。２０℃／分の加熱速度で１００〜１９０℃の温度勾配、次いで、１９０℃で５分間保持を使用した。インジェクション温度カラムを２１０℃に維持し、一方、検出器温度は２８０℃であった。ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニンプロピルエステル（ＡＰＰＥ）の生成の初期反応速度を算出した。図５に示すように。１％の含水率では０．８μｍｏｌＡＰＰＥ／分／ｍｇ酵素の初期エステル転移速度となり、それは天然の酵素の比活性と比較して約13倍高くなっていた。
【００４６】
活性に対する含水率の効果
ゲルに閉じ込められたα-ＣＴの活性を、０〜１．５ｖ／ｖ％の範囲の様々な水の量をｎ−ヘキサン中に含む有機溶媒中で調べた。同一の含水率を有するヘキサン中に懸濁された天然のα-ＣＴ粉末を対照物として用いた。図６で詳細に示すとおり、含水率はゲルに閉じ込められたα-ＣＴの活性に有意な影響を与え、1％の水で最大値となる。この含水率で、反応物に追加の水を添加しなかった場合に、ゲルに閉じ込められた酵素は、ヘキサン中に懸濁した天然のα-ＣＴの粉末と比較して、エステル転移活性の３桁以上の向上を示した。０．１％及び０．５％の含水率では、ゲルに捕捉された酵素は、天然の酵素と比較して２倍及び４．５倍しか活性の向上を示さなかった。この観察は、ハイドロゲル及び酵素分子の間の水競合効果、及び、基質及び生成物の両方についてのゲル中の物質移動の制限によるものである可能性がある。含水率を１．０％から１．５％に増加させたときに、初期反応速度に増加は観測されなかった。このことから、ゲルが１．０％のしきい値含水率を超えて水和したときに、物質移動が大きな役割を果たさないことが推測される。
【００４７】
図７を参照すると、有機溶剤中のゲルに閉じ込められたα-ＣＴは活性だけでなく、操作安定性も改善されたことが理解できる。天然の酵素の反応速度は時間とともに急速に減少し、天然の酵素は最初の５時間以内に初期活性の９０％を超える量で活性を失うが、一方、ゲルに閉じ込められた酵素は、１６時間の間に１０％のみの活性の損失を示した。また、ゲルに閉じ込められた酵素は、図８に示すように、水性加水分解及び有機エステル転移反応の両方に対する活性を有意に失うことなく、少なくとも５サイクル再利用できることも示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【外国語明細書】
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