(57)【要約】【課題】癌新生血管のブロックまたは新生阻止をすることができる遺伝子発現に関連するユビキチン融合遺伝子、それを用いたＤＮＡワクチンおよびその用途を提供すること。【解決手段】プロテアソームへ導くＴａｇ（誘導）分子であるユビキチンをコードするユビキチン遺伝子と、癌組織の栄養血管の新生に関連する遺伝子とを結合したユビキチン融合（フュージョン）遺伝子を用いたＤＮＡワクチンは、癌・腫瘍細胞上の主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子の発現が実質的に低下／欠如しているような悪性度の高い癌・腫瘍に対して、癌・腫瘍組織の栄養血管ブロックおよび／または新生阻止をすることにより効果を示す。また、この発明に係るユビキチン融合遺伝子を用いたＤＮＡワクチンは、癌・腫瘍の種類には制限されることなく、それらの栄養血管のブロックおよび／または新生阻止をすることができることから、癌・腫瘍の予防および治療に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユビキチンをコードするユビキチン遺伝子と、癌新生血管形成関連遺伝子をコードする対遺伝子とを融合させたユビキチン融合遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載のユビキチン融合遺伝子であって、該ユビキチン融合遺伝子が主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子の発現が実質的に低下／欠如している腫瘍に対しても抗腫瘍免疫を誘導することを特徴とするユビキチン融合遺伝子。
【請求項３】
請求項１または２に記載のユビキチン融合遺伝子であって、前記対遺伝子がアクアポリン−１（ＡＱＰ−１）遺伝子、ニューロピリン（ＮＲＰ）遺伝子、Ｄｌｌ−４遺伝子、Ｒｇｓ５遺伝子、Ｒｏｂｏ−４遺伝子またはＩｄ１遺伝子であることを特徴とするユビキチン融合遺伝子。
【請求項４】
請求項１、２または３に記載のユビキチン融合遺伝子であって、前記対遺伝子がアクアポリン−１（ＡＱＰ−１）遺伝子であることを特徴とするユビキチン融合遺伝子。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のユビキチン融合遺伝子を含む形質転換体。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のユビキチン融合遺伝子を含有することを特徴とするユビキチン融合遺伝子のＤＮＡワクチン。
【請求項７】
請求項６に記載のユビキチン融合遺伝子のＤＮＡワクチンであって、前記対遺伝子がアクアポリン−１（ＡＱＰ−１）遺伝子、ニューロピリン（ＮＲＰ）遺伝子、Ｄｌｌ−４遺伝子、Ｒｇｓ５遺伝子、Ｒｏｂｏ−４遺伝子またはＩｄ１遺伝子であることを特徴とするユビキチン融合遺伝子のＤＮＡワクチン。
【請求項８】
請求項６または７に記載のユビキチン融合遺伝子のＤＮＡワクチンであって、前記対遺伝子がアクアポリン−１（ＡＱＰ−１）遺伝子であることを特徴とするユビキチン融合遺伝子のＤＮＡワクチン。
【請求項９】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のユビキチン融合遺伝子をＤＮＡワクチンとして投与すること、または請求項６ないし８に記載のＤＮＡワクチンを投与することによって、癌ならびに／もしくは腫瘍の新生血管をブロックならびに／もしくは新生阻止することを特徴とする癌ならびに／もしくは腫瘍の新生血管のブロックならびに／もしくは新生阻止方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の癌ならびに／もしくは腫瘍の新生血管のブロックならびに／もしくは新生阻止方法によって、癌または腫瘍の治療をすることを特徴とする癌または腫瘍の予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ユビキチン融合遺伝子およびそれを用いたＤＮＡワクチンに関するものである。更に詳細には、この発明は、ユビキチンをコードするユビキチン遺伝子と、癌新生血管管形成関連遺伝子をコードする遺伝子とを融合させたユビキチン融合遺伝子およびそれを用いたＤＮＡワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高等生物には、免疫機構という生体防御機構が備わっていて、生体内に侵入してきた病原体などの異物質を抗原として特異的に認識することができる抗体・Ｔ細胞を生成し、その抗原を分解、中和または不活性化することによって生体を保護する役目を果たしている。
【０００３】
この免疫機構には、自然免疫系と獲得免疫系という２種類の免疫応答機構がある。この免疫応答機構のうち、自然免疫系は、一次防御機構として元来備わっていて、侵入してきたあらゆる種類の病原性物質などの抗原を非特異的に排除する役目を果たしていて、人が病原菌に曝された環境の中で生活をしていても疾患にあまり罹患しないように働いている。
【０００４】
一方、獲得免疫系は、この自然免疫系で防御しきれなくなって病原性物質などの抗原が生体内へ侵入し、ＮＫ細胞やマクロファージだけではもはや対抗することができなくなった場合に、その抗原を分解、中和または不活性化して生体を保護する役目を果たしている。この獲得免疫系は、自然免疫系で防御しきれずに侵入してきた抗原を、まず抗原提示細胞で捕え、その情報をＴ細胞に伝え、その情報を受けたＴ細胞が、その情報をさらにＢ細胞に伝え、抗体を作るように指令を出し、その情報を従ってその抗原に特異的な抗体を産生することによって、侵入抗原を破壊するように働いている。
【０００５】
この免疫応答機構は、生体内へ侵入してきた抗原を分解、中和または不活性化して生体を保護する役目を果たしているとともに、一度侵入した抗原を記憶し、再度同じ抗原が侵入した場合に極めて迅速かつ有効に免疫応答を誘起し、獲得免疫を取得するという極めて重要な機構を備えている。
【０００６】
さらに、免疫応答機構は、上記のような外部からの抗原に対処する役割ばかりではなく、生体内に生ずる各種新生物生成疾患、すなわち癌の発症においても重要な役割を担っていると考えられるようになってきた。つまり、ある種の免疫担当細胞は、常に生体の全ての細胞と物体とを監視し、非自己と判断された細胞を排除する機能を担っており、形質転換を起こした細胞、すなわち腫瘍細胞の発生も、これら監視機構によって常時チェックされており、発生した腫瘍細胞の多くは悪性の癌となる前に排除されているのではないかと考えられている。この免疫応答機構は、癌細胞を傷害するキラーＴ細胞（ＣＴＬ）というリンパ球をはじめ、単核食細胞、マクロファージ、好中球、ＮＫ細胞などが司る主に細胞性免疫と呼ばれる仕組みによって成り立っていることが明らかとなってきた。
【０００７】
この免疫機構は疾患の予防ならびに治療に積極的に利用されていて、その獲得免疫を利用した予防・治療法がワクチンであり、このワクチンの技術は、不活性化した感染性生物または感染性生物の構成物質の一部を予め生体に接種し擬似感染を成立させることによって、獲得免疫を取得し、感染時に生体内に記憶された免疫応答を有効に引き出し、感染症に対する耐性を発揮させるというものである。
【０００８】
ワクチンとしては、例えば、日本脳炎、ワイル病等に対する不活化ワクチン、破傷風、ジフテリア等のトキソイドに対するワクチン、ＢＣＧ、ポリオ等に対する弱毒ワクチン、Ｂ型肝炎ウイルス等に対する遺伝子組換えワクチンなどが、ウイルス感染症の予防または治療には一般的に使用されている。
【０００９】
しかし、これらのワクチンは、抗体産生を誘導するが、細胞性免疫を誘導しにくいという欠点があり、これら従来型のワクチンは、製造から被検体に接種するまでの間冷蔵保存する必要があるため、コストの増加と効力の低下を生じるという問題点がある。
【００１０】
このような従来型のワクチンの欠点や問題点を改善すべく、最近では、ワクチンの研究開発が進み、免疫原性タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡの投与をすることにより、免疫誘発をもたらす新しいワクチン種（ＤＮＡワクチン）が開発されてきている。このＤＮＡワクチンは、体液性免疫応答のみならず、細胞性免疫を強力に誘導できるので、感染症に対する防御能を賦与することが可能となるとともに、高度に純化できること、また室温もしくは高温下でも安定であり、冷蔵保存が必須ではなく、その上長期間の貯蔵も可能であるなどの大きな利点を有している。その上、このＤＮＡワクチンは、遺伝子工学的手法により改良が迅速にかつ容易に可能であることから、その開発に要する時間の短縮と費用の軽減ができるとともに、ワクチンを大量にかつ安価に製造できるという大きな利点がある。
【００１１】
このようにワクチンの研究開発が進み、また現実的に臨床サイドからも早急な開発が期待されているにも拘わらず、世界的に蔓延し大きな社会問題となっているマラリア、結核、トキソプラズマなどの免疫回避エスケープ機構が複雑な細胞内寄生病原体に対するワクチンは、これまで幾度となく開発が試みられてきたもののことごとく失敗に帰してきた。これは、かかる難治性感染症に対応する病原体の感染および寄生適応機構の解明が十分に進んでおらず、またそれらの病原体排除に要求される宿主防御機構も特定されていないことに起因している。そこで、本発明者らは、この免疫回避エスケープ機構が複雑な病原体に対し十二分な予防効果を発揮するワクチン法を確立するためには、これまでのワクチン戦略を抜本的に見直し、感染免疫の分子論的基盤に立脚した総合的な研究を展開していく必要があると考え、このＤＮＡワクチンの技術を試みた。
【００１２】
これまで、本発明者らは、トキソプラズマ、リーシュマニア、クルーズトリパノソーマ、マラリア等の細胞内寄生原虫などの感染において、初期ならびに後期感染防御に関わる免疫細胞集団が異なることを明らかにした。また、従来のワクチン法ではなし得なかった任意の免疫応答の特異的防御ならびに誘導をフュージョン（融合）ＤＮＡワクチンおよびＩＬ−１２、ＩＬ−１５等のサイトカイン遺伝子とのコンビネーションＤＮＡワクチンを用いることにより、病原体のエスケープ機構の相違に対応した予防・治療法を提案している（特許文献１）。これらのワクチン技術は、任意の免疫応答を誘導できることが最大の利点であり、従来のワクチンの問題点を克服できうる有用な手法であると考えられる。
【００１３】
ところで、ほとんどの癌細胞を免疫学的に排除するためには、ＣＤ８＋Ｔ細胞（キラーＴ細胞）が必須の関わりを持つことは周知の事実であり、そのためのキラーＴ細胞（ＣＴＬ）の認識の対象となる癌抗原のエピトープも多数同定されている。しかしながら、それらのエピトープペプチドを用いた癌免疫治療の成功例は皆無に近い。これは、癌患者の生体内ではそれらのエピトープに対応するＣＤ４＋Ｔ細胞は誘導できるが、キラーＴ細胞が誘導されにくいのが原因である。例えば、メラノーマ抗原に対して特異的にキラーＴ細胞を活性化させるためには、その抗原ペプチドを抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩ分子に提示させることが必須である。しかしながら、そのためには、抗原を細胞質のプロテアソームで処理させることが前提となる。
【００１４】
そこで、本発明者らは、プロテアソームに導くＴａｇ（誘導）分子であるユビキチンをコードする遺伝子を癌抗原遺伝子と結合させてユビキチン遺伝子結合癌抗原遺伝子を得、この結合遺伝子を遺伝子銃で細胞質内に直接導入することにより、細胞質内で癌抗原とユビキチンの融合タンパク質を産生させて、その癌抗原に特異的なキラーＴ細胞を主体とする強力な抗癌腫瘍免疫を誘導させることが可能な癌遺伝子ワクチンを作製した（特許文献２）。この癌遺伝子ワクチンは、リコンビナントタンパク質ワクチンや病原体タンパク質を用いたワクチンとは異なり、頻回投与によってもアナフィラキシーショックを引き起こす可能性が低く、安全性に優れており、またリコンビナントタンパク質／サイトカインワクチンに比べ精製・調製が簡便でかつ経済的であるという効果がある。
【００１５】
しかし、癌抗原は、同種の癌／腫瘍でも個体差があり、また同定されていない癌も多いこと、癌細胞に対する主たる攻撃細胞はキラーＴ細胞（ＣＴＬ）であるが、ＣＴＬは癌細胞上の主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子（ヒトではＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）に提示された癌抗原ペプチドを認識したうえで癌細胞を攻撃するが、癌が悪性化するほどＭＨＣクラスＩ分子が発現されなくなるので、それらの癌細胞はＣＴＬのターゲットにならないこと、また、癌抗原に個体差がない場合でも、ＭＨＣクラスＩ分子が異なれば、各々の個体のＭＨＣクラスＩ分子が異なった癌抗原ペプチドを提示する必要があることから、ペプチド抗原を用いた免疫療法は、各々の個体に対応するテイラーメイド的な癌抗原ペプチドの同定を必要とする。したがって、薬剤耐性癌や転移癌に対しては免疫学的アプローチの必要性が指摘されているが、困難を極めている。
【００１６】
以上の如く、癌細胞を直接のターゲットとした免疫療法の確立は非常に困難であることから、近年、免疫学的治療の方向性として、癌組織の栄養血管のブロックまたは新生阻止が有力な手段として想定されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特開２００６−１５１８１３号公報
【特許文献２】特開２００６−９６６６３号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Saadoun, S., et., Nature [Vol. 434] 7 April, 2005, pp. 786-792
【非特許文献２】Pan, O., et al.,Cancer Cell 11, 53-67, January 2007
【非特許文献３】Caunt, M., et al., Cancer Cell 13,331-342, April 2008
【非特許文献４】Mailhos, C., et al., Differentiation(2001) 69:135-144
【非特許文献５】Hamzah, J., et., Vol453/15 May 2008/doi:10.1038/nature06868
【非特許文献６】P. Seth, et al. Biochem. and Biopgys.Communications 332 (2005) 533-541
【非特許文献７】Gao, D/, et al., SCIENCE Vol. 319 11 Jan 2008, pp. 195-198
【非特許文献８】Sambrook, et al.,: Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (2001)
【非特許文献９】別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、１９９６
【非特許文献１０】別冊実験医学、遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社、１９９７
【非特許文献１１】日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９
【非特許文献１２】別冊実験医学、遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社、１９９４
【非特許文献１３】http://rsb.info.nih.gov/ij
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
そこで、本発明者らは、癌新生血管のブロックまたは新生に関連する遺伝子について鋭意研究した結果、特にプロテアソームへ導くＴａｇ（誘導）分子であるユビキチンをコードするユビキチン遺伝子と、癌組織の栄養血管新生に関連する遺伝子とを結合したユビキチン融合（フュージョン）遺伝子を用いたＤＮＡワクチンが、癌組織の栄養血管ブロックし、癌組織の発育抑制／退縮させることを見出して、この発明を完成した。
【００２０】
したがって、この発明は、ユビキチンをコードするユビキチン遺伝子と、癌新生血管形成関連遺伝子をコードする対遺伝子とを融合させたユビキチン融合遺伝子を提供することを目的としている。
【００２１】
なお、本明細書において使用する用語「対遺伝子」は、ユビキチンをコードするユビキチン遺伝子と結合して融合遺伝子を形成する癌新生血管形成関連遺伝子をコードする遺伝子を意味するものとする。また、本明細書において、「癌」または「腫瘍」という用語は、特に癌または腫瘍に限定した意味で個別に使用されているのではなく、両者はいずれも互換できる意味で使用されているものとする。
【００２２】
また、この発明は、好ましい態様として、ＭＨＣクラスＩ分子の発現が実質的に低下／欠如している悪性度の高い腫瘍に対しても強い抗腫瘍免疫を誘導することができるユビキチン融合遺伝子を提供することを目的としている。
【００２３】
この発明のさらに好ましい別の態様として、上記対遺伝子がアクアポリン−１（ＡＱＰ−１）遺伝子、ニューロピリン（ＮＲＰ）遺伝子、Ｄｌｌ−４遺伝子、Ｒｇｓ５遺伝子、Ｒｏｂｏ−４遺伝子またはＩｄ１遺伝子であるユビキチン融合遺伝子を提供することを目的としている。
【００２４】
この発明は、別の形態として、上記ユビキチン融合遺伝子を含む形質転換体を提供することを目的としている。
この発明は、別の形態として、上記ユビキチン融合遺伝子を含有するユビキチン融合遺伝子のＤＮＡワクチンを提供することを目的としている。
【００２５】
この発明は、別の好ましい態様として、上記対遺伝子がアクアポリン−１（ＡＱＰ−１）遺伝子、ニューロピリン（ＮＲＰ）遺伝子、Ｄｌｌ−４遺伝子、Ｒｇｓ５遺伝子、Ｒｏｂｏ−４遺伝子またはＩｄ１遺伝子であるユビキチン融合遺伝子のＤＮＡワクチンを提供することを目的としている。
【００２６】
さらに、この発明は、別の形態として、上記ユビキチン融合遺伝子を含むＤＮＡワクチンを投与することによって癌・腫瘍の新生血管をブロックならびに／もしくは新生阻止することからなる癌・腫瘍の予防または治療方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
上記目的を達成するために、この発明は、ユビキチンをコードするユビキチン遺伝子と、癌新生血管の形成関連遺伝子をコードする対遺伝子とを融合させたユビキチン融合遺伝子を提供する。
【００２８】
また、この発明は、好ましい態様として、ＭＨＣクラスＩ分子の発現が実質的に低下／欠如している悪性度の高い腫瘍に対しても強い抗腫瘍免疫を誘導することができるユビキチン融合遺伝子を提供する。
【００２９】
この発明は、さらに好ましい別の態様として、上記対遺伝子がアクアポリン−１（ＡＱＰ−１）遺伝子、ニューロピリン（ＮＲＰ）遺伝子、Ｄｌｌ−４遺伝子、Ｒｇｓ５遺伝子、Ｒｏｂｏ−４遺伝子またはＩｄ１遺伝子であるユビキチン融合遺伝子を提供する。
【００３０】
この発明は、別の形態として、ユビキチン遺伝子と、上記対遺伝子とを結合させた上記ユビキチン融合遺伝子を含む形質転換体を提供する。
この発明は、別の形態として、上記ユビキチン融合遺伝子を含有するユビキチン融合遺伝子のＤＮＡワクチンを提供する。
【００３１】
この発明は、別の好ましい態様として、上記対遺伝子がアクアポリン−１（ＡＱＰ−１）遺伝子、ニューロピリン（ＮＲＰ）遺伝子、Ｄｌｌ−４遺伝子、Ｒｇｓ５遺伝子、Ｒｏｂｏ−４遺伝子またはＩｄ１遺伝子であるユビキチン融合遺伝子のＤＮＡワクチンを提供する。
【００３２】
この発明は、さらに別の形態として、上記ユビキチン融合遺伝子を含むＤＮＡワクチンを投与することによって癌・腫瘍の新生血管をブロックならびに／もしくは新生阻止することからなる癌・腫瘍の新生血管のブロックならびに／もしくは新生阻止方法と共に、この方法による癌・腫瘍の予防または治療方法を提供する。
【発明の効果】
【００３３】
この発明によれば、癌・腫瘍の新生栄養血管に発現するアクアポリン−１（aquaporin-1：ＡＱＰ−１）などの癌新生血管形成関連遺伝子（つまり対遺伝子）と、ユビキチン遺伝子とを融合させたユビキチン融合遺伝子は、ＤＮＡワクチンを行うと、癌組織中の癌細胞上の主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子の発現が低下／欠如しているＢ１６Ｆ１０メラノーマなどの悪性度の高い癌種に対しても強い抗腫瘍免疫の誘導を行うことができるという効果がある。
【００３４】
つまり、この発明のＤＮＡワクチンは、癌組織中の癌細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現が低下／欠如しているような悪性度の高い腫瘍・癌に対しても有効であり、このワクチンで誘導されるＣＤ８キラーＴ細胞が認識する標的分子は、癌細胞それ自身ではなく、癌細胞を栄養する新生血管に発現する分子であるところから、例えば、ＡＱＰ−１特異的ＣＴＬ（ＣＤ８キラーＴ細胞）がＭＨＣクラスＩと共にＡＱＰ−１を発現している新生栄養血管を破壊することによる“兵糧攻め”効果を誘導するという効果を示すことができる。
なお、ＡＱＰ−１等の癌新生血管関連遺伝子は、癌の種類、および、癌宿主の個体差を越えて発現している場合が多い。また、悪性度の高い腫瘍ではＭＨＣクラスＩ分子の発現が実質的に低下または欠如しているのに対して、新生栄養血管においてはＭＨＣクラスＩ分子が常に発現していることから、かかる新生栄養血管を標的とするこの発明に係るＤＮＡワクチンは、各々の個体のＭＨＣクラスＩ分子の対応するテイラーメイド的な抗原ペプチドの同定を必要としないユニバーサル・ワクチンとして利用できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ユビキチン遺伝子とアクアポリン−１（aquaporin-1：ＡＱＰ−１）遺伝子との融合遺伝子を含むプラスミド構築体の構成を示す図。（実施例１）
【図２】ユビキチン遺伝子とニューロポリン−１（Neuropilin-1：ＮＲＰ−１）遺伝子との融合遺伝子を含むプラスミド構築体の構成を示す図。（実施例２）
【図３】ユビキチン遺伝子とユビキチン−ニューロポリン−２（Neuropilin-1：ＮＲＰ−２）遺伝子との融合遺伝子を含むプラスミド構築体の構成を示す図。（実施例３）
【図４】ユビキチン遺伝子とＲｏｂｏ−４（roundabout-4：Ｒｏｂｏ−４）遺伝子との融合遺伝子を含むプラスミド構築体の構成を示す図。（実施例４）
【図５】ユビキチン遺伝子とＲＧＳ−５（GProtein Signalling 5）遺伝子との融合遺伝子を含むプラスミド構築体の構成を示す図。（実施例５）
【図６】ユビキチン遺伝子とＤｌｌ−４（delta-like4）遺伝子との融合遺伝子を含むプラスミド構築体の構成を示す図。（実施例６）
【図７】ユビキチン遺伝子とＩｄ−１（inhibitorof differentiation-1/DNA binding-1）遺伝子遺伝子との融合遺伝子を含むプラスミド構築体の構成を示す図。（実施例７）
【図８Ａ】ｐｃＤＮＡ、ｐＡＱＰ−１またはｐＵＢ−ＡＱＰ−１をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞ライセート（lysate）からの抽出タンパクの抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロット解析図。（実施例８）
【図８Ｂ】ｐＡＱＰ−１またはｐＵＢ−ＡＱＰ−１をトランスフェクトして抽出したＣＯＳ−７細胞ライセートのウェスタンブロット解析図。（実施例８）
【図８Ｃ】図８Ｂのウェスタンブロットのデジタル・イメージ・アナライザー（digital image analyzer）での解析結果を示す図。（実施例８）
【図９】癌遺伝子ワクチン（ｐＵＢ−ＡＱＰ−１）のマウスメラノーマに対する治療的効果を示す図（実施例１６）。図９Ａは腫瘍サイズの経時的変化を示し、図９Ｂは生存率を示す図である。
【図１０】癌遺伝子ワクチン（ｐＵＢ−ＡＱＰ−１）のマウスメラノーマに対する予防的ワクチン効果を示す図（実施例１７）。図１０Ａは腫瘍サイズの経時的変化を示し、図１０Ｂは生存率を示す図である。
【図１１】ｐＡＱＰ−１またはｐＵＢ−ＡＱＰ−１免疫マウスの脾臓細胞を各抗体で染色した結果を示す（実施例１８）。図１１Ａは、ＦＡＣＳフローサイトメーターで採集したマウス脾臓細胞のＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアでの分析結果を示す図である。図１１Ｂは、マウス脾臓細胞のＰＭＡ／Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎでの刺激によるＣＤ８陽性Ｔ細胞のＩＦＮ−γ、パーフォリンまたはグランザイムＢ発現の細胞内ＦＡＣＳ法による解析結果を示す図である。
【図１２Ａ】樹状細胞ラインＤＣ２．４（ｐＵＢ−ＡＱＰ−１をトランスフェクト後に放射線照射）、遺伝子免疫したマウスの脾臓中のＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＤ８Ｔ細胞と上記ＤＣ２．４の共培養によるＩＦＮ−γ産生のＥＬＩＳＡ測定結果を示す図。（実施例１９−１）
【図１２Ｂ】樹状細胞ラインＤＣ２．４（ｐＵＢ−ＡＱＰ−１をトランスフェクト後に放射線照射）、遺伝子免疫したマウスの脾臓中のＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＤ８Ｔ細胞と上記ＤＣ２．４の共培養による細胞増殖反応を示す図。（実施例１９−２）
【図１３】ＣＤ４Ｔ細胞あるいは、ＣＤ８Ｔ細胞を除去した遺伝子免疫マウスにＢ１６Ｆ１０メラノーマを接種し抗腫瘍効果に対するＴ細胞サブセット除去の効果を判定した図（実施例２０）。図１３Ａは腫瘍サイズの経時的変化を示し、図１３Ｂは生存率を示している。
【図１４】マウスにおける腫瘍血管組織像を示す図（実施例２１）。図１４Ａはコントロールを示し、図１４Ｂはユビキチン−アクアポリン−１融合遺伝子免疫マウスにおける腫瘍血管組織像を示している。
【図１５Ａ】図１４Ａの画像をImageJを用いて解析し血管の直径をカウントし、血管径毎にコントロール群における腫瘍内栄養血管の一定面積あたりの数（density）を算出した結果を示す図。（実施例２１）
【図１５Ｂ】図１４Ｂの画像をImageJを用いて解析し血管の直径をカウントし、血管径毎に遺伝子免疫群における腫瘍内栄養血管の一定面積あたりの数（density）を算出した結果を示す図。（実施例２１）
【発明を実施するための形態】
【００３６】
この発明に係るユビキチン融合遺伝子は、ユビキチンをコードするユビキチン遺伝子と、癌新生血管形成関連遺伝子をコードする対遺伝子とを融合させたユビキチン融合遺伝子である。このように、この発明のユビキチン融合遺伝子は、癌／腫瘍の新生栄養血管に発現するアクアポリン−１（aquaporin-1：ＡＱＰ−１）などの遺伝子を対遺伝子として、抗原を処理するブロテアソームに導くＴａｇ分子であるユビキチンをコードするユビキチン遺伝子に結合させることによって、癌新生血管に発現する分子を標的にすることができる。また、このユビキチン融合遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ分子の発現が実質的に低下／欠如している悪性度の高い腫瘍に対しても抗腫瘍免疫を誘導することができるという特長を有している。
【００３７】
この発明におけるユビキチンは、タンパク質の分解提示シグナルの機能等を有する保存性の高いタンパク質であり、ユビキチン遺伝子は、細胞内に生じた異常タンパク質を排除する他、様々な生物機能に関係しているユビキチンタンパク質をコードする遺伝子である。
本明細書において使用する用語「ユビキチン遺伝子」は、特段の場合を除いて、ユビキチンをコードする遺伝子のプロモーター、ユビキチンをコードする構造遺伝子、ならびにこれら両者を含むＤＮＡ配列をも併せて意味して使用されているものとする。
【００３８】
一方、この発明のユビキチン融合遺伝子において、ユビキチン遺伝子と結合する融合パートナーである対遺伝子は、癌新生血管の形成に関与する因子であればいずれでもよく、かかる対遺伝子としては、例えば、アクアポリン−１（ＡＱＰ−１）遺伝子、ニューロピリン（ＮＲＰ）遺伝子、Ｄｌｌ−４遺伝子、Ｒｇｓ５遺伝子、Ｒｏｂｏ−４遺伝子またはＩｄ１遺伝子などが挙げられる。
【００３９】
かかる対遺伝子のうち、アクアポリン−１（Aquaporin-1：ＡＱＰ−１）遺伝子は、水チャンネルとして生体内での水透過に関連するファミリー遺伝子の一員であって、細胞膜に存在する細孔を持ち、水分子だけを選択的に通過させることができる膜タンパク質をコードする遺伝子である。このＡＱＰ−１は、最近の研究では、癌の新生血管生成にも関連しているとの報告がなされている（非特許文献１）。
【００４０】
ニューロピリン（Neuropilin：ＮＲＰ）遺伝子には、ニューロピリン−１（ＮＲＰ−１）遺伝子およびニューロピリン−２（ＮＲＰ−２）遺伝子があり、ＮＲＰ−１遺伝子は、血管新生に関与する血管内皮増殖因子ＶＥＧＦのサブタイプとして、生物学的活性が強いＶＥＧＦ−Ａの塩基性ドメインに特異的に会合する細胞質タンパク質であるニューロピリン−１（ＮＲＰ−１）をコードする遺伝子である。ニューロピリン−１（ＮＲＰ−１）は、ニューロン・ガイダンスを規制する機能を有している（非特許文献２）。一方、ニューロピリン−２（ＮＲＰ−２）遺伝子は、アクソン・ガイダンス受容体（axon-guidance receptor）として同定されたが、腫瘍細胞転移に関与する因子としても機能している可能性が示唆されている（非特許文献３）。
【００４１】
Ｄｌｌ−４（Delta-like-4）遺伝子は、血管形成部位に発現する内皮特異的ノッチ（Notch）リガンドをコードする遺伝子である（非特許文献４）。Ｒｇｓ５遺伝子は、マウスにおいて異常腫瘍血管形態に関与するマスタージーンとして同定されたＧプロテイン・シグナル伝達規制因子（Ｒｇｓ５）である（非特許文献５）。Ｒｏｂｏ−４遺伝子は腫瘍内皮細胞移動に重要な機能を有している（非特許文献６）。Ｉｄ１遺伝子は、多様な機能を有していることが知られているが、かかる機能の一つとして、癌新生栄養血管ならびに転移に関連する機能も有しているとの報告もある（非特許文献７）。
【００４２】
この発明に使用するそれぞれの遺伝子の構築は、当該技術分野における常套手段によって行うことができる。例えば、遺伝子の既知配列をデータベースより検索し、その配列両端についてそれぞれプライマーを合成し、腫瘍細胞よりフェノール・クロロホルム法によりＲＮＡを抽出し、そのＲＮＡをテンプレートとして、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて逆転写し、遺伝子を構築する。ここで、ＰＣＲ法とは、ＤＮＡ鎖の特定部位のみ繰り返し複製する反応で、微量のＤＮＡを１００万倍程度まで増幅できる。複製反応のプライマーとしては、増幅部両端の塩基配列を含む合成オリゴヌクレオチオを用いて、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼにより行う。また、ＲＴ−ＰＣＲ法とは、第一回目の反応に逆転写酵素を用いることにより、ＲＮＡからＤＮＡを合成し、その後は通常用いられるＰＣＲ法によって、特定のＤＮＡ部位を増幅する方法である。
【００４３】
この発明に係るユビキチン融合遺伝子は、例えば、上記の構築したそれぞれの遺伝子の融合対象のポリヌクレオチドが連結された核酸と、選択マーカー遺伝子と、適切な宿主内で複製可能な任意のベクター、例えば、プラスミド、ファージ、ウイルスなどとから構成される融合遺伝子調製用ベクターを用いて、文献既知の方法で構築することができる。かかる融合遺伝子調製用ベクターは、例えば、融合対象の１つのポリヌクレオチドと、選択マーカー遺伝子と、融合対象の他のポリヌクレオチドと、適切な宿主内で複製可能な任意のプラスミドとを、文献記載の方法（例えば、非特許文献８参照）に記載の慣用の遺伝子工学的手法によって連結させることにより構築することができる。この発明に使用する融合遺伝子調製用ベクターには、上記の構成因子の他に、ターミネーターおよびエンハンサーなども含んでいてもよい。また、これらの因子は、いずれもそれぞれ機能的に作用するように連結するのがよく、それぞれの挿入位置は、ベクターの複製に関与していない領域であればどこの領域であってもよく、通常はベクター内のマルチクローニングサイトが利用される。
【００４４】
上記融合遺伝子調製用ベクターの構築に使用可能な選択マーカー遺伝子としては、例えば、ストレプトマイシン、スペクチオマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール等の抗生物質などの薬剤に感受性であるポリペプチドをコードしたポリヌクレオチド、例えば、ｒｐｓＬ、ｒｐｓＥ、ｒｐｏＢ、ｇｙｒＡなどが挙げられる。なお、融合遺伝子の形成の際の検出感度ならびに選択性の観点から、ｒｐｓＬ遺伝子、ｒｐｓＥ遺伝子等の薬剤感受性マーカー遺伝子が好ましい。
【００４５】
また、この発明において使用することができるベクターは、この発明の目的を阻害しないものであって、宿主細胞内で複製可能なものであればいずれも使用することができるが、宿主細胞の種類によって適宜選択するのがよい。かかるベクターとしては、例えば、プラスミド、バクテリオファージなどが使用できる。宿主が大腸菌である場合は、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＨＳＧ３９６、ｐＨＳＧ３９９、ｐＣＹＣ１８４ならびにこれらの誘導体などの慣用のプラスミドベクターが挙げられ、また宿主が酵母である場合は、例えば、ｐＹＡＣ誘導体などの慣用のプラスミドベクターなどが挙げられる。
【００４６】
この発明によれば、上記のようにして構築した融合遺伝子調製用ベクターを宿主細胞に導入することによって形質転換体を作製することができる。宿主細胞としては、例えば、大腸菌などの細菌細胞、酵母細胞、動植物細胞などの当該技術分野で慣用されている細胞であればいずれの細胞も使用することができる。形質転換の方法としては、当該技術分野で慣用されている方法であればいずれの方法も使用することができ、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法などが使用できる。この方法により融合遺伝子調製用ベクターを保持した細胞を形質転換体として得ることができる。
【００４７】
次いで、得られた形質転換体を導入した細胞を適切な培地で培養することによって融合遺伝子を含む核酸を有する細胞を得ることができる。つまり、その形質転換体を導入した細胞を、選択マーカー遺伝子である薬剤感受性マーカー遺伝子に対応する薬剤の存在下ならびに不存在下の培地で培養することによって、該薬剤に抵抗性を有する細胞、つまり該マーカー遺伝子がコードするポリペプチドの機能に相反する機能を含有する細胞を選別することができる。このようにして得られた融合遺伝子を含有した核酸は、例えば、上記マニュアルに記載の慣用の核酸単離法などによって抽出単離することができる。
【００４８】
上記したユビキチン融合遺伝子は、通常非ウイルスベクターあるいはウイルスベクターに発現可能に挿入された形態で用いられる。かかる発現可能な形態としては、例えば、ＤＮＡワクチンが挙げられる。
【００４９】
この発明に係るＤＮＡワクチンは、上記ユビキチン融合遺伝子を、一般には非ウイルスベクターまたはウイルスベクターに発現可能なように挿入することにより調製することができる。なお、これらの非ウイルスベクターおよびウイルスベクターの調製法、投与法などは当該技術分野で既に公知である（例えば、非特許文献９、１０および１１参照）。
【００５０】
非ウイルスベクターとしては、哺乳動物の生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであればいずれの発現ベクターであっても使用することができ、例えばｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶなどの発現ベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターが代表的なものであり、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスも挙げることができる。これらのうち、感染効率が高いことから、アデノウイルスベクター系を用いることが好ましい。
【００５１】
この発明に係るＤＮＡワクチンは、病気罹患の際に免疫学的により好ましい免疫応答のできる免疫システムが達成されるような、あらゆる組成物をも含むことができる。通常、ワクチンは、免疫決定要因と、この免疫決定要因の応答を、迅速強化するような作用を呈する免疫助成剤とを含み、免疫決定要因は免疫助成剤と組み合わせて用いるのが好適である。免疫助成剤は、通常用いられる、例えば、フロインド（Freund）複合体助成剤や、フロインド非複合体助成剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ただし、この発明のＤＮＡワクチンは、免疫助成剤を用いなくとも効能を有するという効果も有している。
【００５２】
この発明に係るＤＮＡワクチンにおける遺伝子の含有量は、種々の要因により適宜変更できるが、マウス一匹（２０ｇ）当たり、１μｇ〜２０μｇ、好ましくは、５μｇ〜１０μｇであるのがよい。この範囲外になるにつれワクチン効果が減弱するという傾向が見られる。また、ユビキチン遺伝子と対遺伝子とは、１：１で混合させるのが好ましいが、種々の条件により適宜変更できる。
【００５３】
この発明のＤＮＡワクチンをヒトなどへ導入する方法としては、ＤＮＡワクチンを直接体内に導入するin vivo法やヒトからある種の細胞を取り出して体外でＤＮＡワクチンを該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo法などがある（例えば、非特許文献１１参照）。in vivo法としては、例えば本発明のＤＮＡワクチンを適当な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填して注射剤を調製して、ヒトへ注射することにより投与される。注射剤には必要に応じて慣用の担体などを添加してもよい。また、脂質二重膜で作られたリポソーム中にＤＮＡワクチンを封入し、さらにこのリポソームと不活化したセンダイウイルス（Hemagglutinating
Virus of Japan : HVJ）とを融合させたＨＶＪ−リポソームとして投与することもできる（例えば、非特許文献９、１２）。本発明のＤＮＡワクチンは、筋肉、皮膚、鼻腔内等に投与することができる。ex vivo法としては、リポフェクション法、リン酸−カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管などを用いて細胞内へＤＮＡワクチンを直接注入する方法などが挙げられる。
【００５４】
この発明のＤＮＡワクチンの投与量は、投与する対象、投与方法、投与形態などによって異なるが、通常成人１人当たり対象タンパク質をコードする目的遺伝子として約５００μｇ〜約５０ｍｇの範囲、好ましくは約５００μｇ〜１ｍｇの範囲であるのがよい。
【００５５】
この発明に係るＤＮＡワクチンは、癌新生血管に発現する分子を標的とすることができる。つまり、この発明のＤＮＡワクチンによって誘導されたＣＴＬの標的は、癌抗原そのものではなく、新生栄養血管にＭＨＣクラスＩ分子と共に発現される分子である。そのため、この発明のＤＮＡワクチンは、癌・腫瘍の種類には限定されず、また、ＭＨＣクラスＩ分子の発現が実質的に低下／欠如している悪性度の高い癌・腫瘍に対しても、その組織内の新生栄養血管を破壊することにより、癌細胞の増殖抑制ならびに死滅を誘導することができることが、免疫組織学的解析により明らかになった。なお、発明に係るＤＮＡワクチンは、癌新生血管のみならず新生リンパ管にも発現している分子を標的としている可能性があり、抗腫瘍効果として相乗効果を示す可能性が高い。
【００５６】
以上説明したように、この発明に係る癌ＤＮＡワクチンは、癌新生栄養血管に発現する癌新生血管の形成に関連する分子を標的とすることができることから、主に、腫瘍疾患、具体的には、肝癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫、悪性黒色腫（メラノーマ）および肺、結腸、乳房、膀胱、卵巣、精巣、前立腺、睾丸腫瘍、子宮、頚部、膵臓、胃、大腸、小腸、皮膚、その他の器官の癌を包含する多様なタイプの癌や腫瘍の治療あるいは予防に有効に使用できる。
【００５７】
なお、本明細書では、ユビキチン遺伝子の融合パートナーである対遺伝子およびユピキチン融合遺伝子としては、ＡＱＰ−１遺伝子およびＵＢ−ＡＱＰ−１融合遺伝子を例として説明する。ただし、これらのＡＱＰ−１遺伝子およびＵＢ−ＡＱＰ−１融合遺伝子についての説明は、ニューロピリン（ＮＲＰ）遺伝子、Ｄｌｌ−４遺伝子、Ｒｇｓ５遺伝子、Ｒｏｂｏ−４遺伝子ならびにＩｄ１遺伝子などのその他の新生栄養血管関連遺伝子およびそれらとユビキチン遺伝子との融合遺伝子についても実質的に同様に適用できるものと理解される。
【００５８】
以下、この発明を実施例により更に詳細に説明するが、この発明は下記実施例によって何らその範囲が限定されるものではなく、また下記実施例は、この発明の範囲を限定するものではなく、この発明の具体的な例示に過ぎないものである。さらに、この発明は、下記実施例から当業者が容易に類推することができるあらゆる改変、変更などもその範囲に包含するものと理解することができる。
【００５９】
〔実施例１〕
実施例１はユビキチン−アクアポリン−１融合遺伝子を作製した例を示す。
（１−１：ユビキチン遺伝子の作製）
ユビキチン遺伝子は、下記プライマーを用いて、マウス筋肉の全ｃＤＮＡから当該技術分野での常套手法であるＲＴ−ＰＣＲ法で増幅して作製した。
センスプライマーの塩基配列：
5’-gcatcgctagccacatttgttaacaggtcaaaatgcagatc-3’（配列番号１）
アンチセンスプライマーの塩基配列：
5’-atggatccttaatgatgatgatgatgatgctcgagagcggccgcaccgcggaggcgaaggaccag-3’
（配列番号２）
【００６０】
（１−２：アクアポリン−１遺伝子の作製）
アクアポリン−１（ＡＱＰ−１）遺伝子は、下記プライマーを用いて、マウス皮膚の全ｃＤＮＡから当該技術分野での常套手法であるＲＴ−ＰＣＲ法で増幅して作製した。
センスプライマーの塩基配列：
5’-gcatcgctagcccgcggtgtcatggccagtgaaatcaagaagaag-3’（配列番号３）
アンチセンスプライマーの塩基配列：
5’-gtcatctcgagtttgggcttcatctccaccctg-3’（配列番号４）
【００６１】
（１−３：ユビキチン遺伝子をコードするｐＵＢベクターの構築）
ユビキチン遺伝子をコードするベクターｐＵＢは、ユビキチンのＰＣＲ産物を切断酵素Ｎｈｅ  ＩとＢａｍＨ  Ｉで処理した後、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）（invitrogen）のＮｈｅ  ＩとＢａｍＨ  Ｉとの切断部位に導入して作製した。
【００６２】
（１−４：ユビキチン−アクアポリン−１融合遺伝子の作製）
ユビキチン−アクアポリン−１（ｐＵＢ−ＡＱＰ−１）融合遺伝子をコードするベクターｐＵＢ−ＡＱＰ−１は、アクアポリン−１のＰＣＲ産物を切断酵素Ｓａｃ  ＩＩとＸｈｏ  Ｉで処理した後、上記ベクターｐＵＢのＳａｃ  ＩＩとＸｈｏ  Ｉとの切断部位に導入して作製した。ユビキチン−アクアポリン−１融合遺伝子の塩基配列は配列番号５に示すとおりである（図１）。
【００６３】
〔実施例２〕
本実施例はユビキチン−ニューロピリン−１融合遺伝子を作製した例を示す。
（２−１：ニューロピリン−１遺伝子の作製）
ニューロピリン−１（Neuropilin-1：ＮＲＰ−１）遺伝子は、下記プライマーを用いて、マウス筋肉の全ｃＤＮＡから当該技術分野での常套手法であるＲＴ−ＰＣＲ法で増幅して作製した。
センスプライマーの塩基配列：
5’-gcatcgctagcccgcggtgtcATGGAGAGGGGGCTGCCG-3’（配列番号６）
アンチセンスプライマーの塩基配列：
5’-gtcatctcgagcgcctctgagtaattactctgtgg-3’（配列番号７）
【００６４】
（２−２：ユビキチン−ニューロピリン−１融合遺伝子の作製）
ユビキチン−ニューロピリン−１融合遺伝子をコードするベクターｐＵＢ−ＮＲＰ−１は、ニューロピリン−１のＰＣＲ産物を切断酵素Ｓａｃ  ＩＩとＸｈｏ  Ｉで処理した後、上記ベクターｐＵＢのＳａｃ  ＩＩとＸｈｏ  Ｉとの切断部位に導入して作製した。ユビキチン−ニューロピリン−１融合遺伝子の塩基配列は配列番号８に示すとおりである（図２）。
【００６５】
〔実施例３〕
本実施例はユビキチン−ニューロピリン−２融合遺伝子を作製した例を示す。
（３−１：ニューロピリン−２遺伝子の作製）
ニューロピリン−２（Neuropolin-2：ＮＲＰ−２）遺伝子は、下記プライマーを用いて、マウス筋肉の全ｃＤＮＡから当該技術分野での常套手法であるＲＴ−ＰＣＲ法で増幅して作製した。
センスプライマーの塩基配列：
5’-gcatcgctagcccgcggtgtcATGGATATGTTTCCTCTTACCTGGG-3’（配列番号９）
アンチセンスプライマーの塩基配列：
5’-gtcatctcgagtgcctccgagcagcacttctg -3’（配列番号１０）
【００６６】
（３−２：ユビキチン−ニューロピリン−２融合遺伝子の作製）
ユビキチン−ニューロピリン−２融合遺伝子をコードするベクターｐＵＢ−ＮＲＰ−２は、ニューロポリン−２のＰＣＲ産物を切断酵素Ｓａｃ  ＩＩとＸｈｏ  Ｉで処理した後、上記ベクターｐＵＢのＳａｃ  ＩＩとＸｈｏ  Ｉとの切断部位に導入して作製した。ユビキチン−ニューロピリン−２融合遺伝子の塩基配列は配列番号１１に示すとおりである（図３）。
【００６７】
〔実施例４〕
本実施例はユビキチン−Ｒｏｂｏ−４融合遺伝子を作製した例を示す。
（４−１：Ｒｏｂｏ−４遺伝子の作製）
Ｒｏｂｏ−４（roundabout-4）遺伝子は、下記プライマーを用いて、マウス筋肉の全ｃＤＮＡから当該技術分野での常套手法であるＲＴ−ＰＣＲ法で増幅して作製した。
センスプライマーの塩基配列：
5’-catcGCGGCCGCccgcggtgtcATGGGACAAGGAGAGGAGCCGAGAGCA-3’（配列番号１２）
アンチセンスプライマーの塩基配列：
5’-tcatggtaccttagtgatggtggtgatggtgggaggaatcaccagccttgggcacag-3’（配列番号１３）
【００６８】
（４−２：ユビキチン−Ｒｏｂｏ−４融合遺伝子の作製）
ユビキチン−Ｒｏｂｏ−４融合遺伝子をコードするベクターｐＵＢ−Ｒｏｂｏ−４は、Ｒｏｂｏ−４のＰＣＲ産物を切断酵素Ｓａｃ  ＩＩとＡｓｐ７１８で処理した後、上記ベクターｐＵＢのＳａｃ  ＩＩとＡｓｐ７１８との切断部位に導入して作製した。ユビキチン−Ｒｏｂｏ−４融合遺伝子の塩基配列は配列番号１４に示すとおりである（図４）。
【００６９】
〔実施例５〕
本実施例はユビキチン−ＲＧＳ−５融合遺伝子の作製を示す例である。
（５−１：ＲＧＳ−５遺伝子の作製）
ＲＧＳ−５（regulator of G
Protein Signalling 5：ＲＧＳ−５）遺伝子は、下記プライマーを用いて、マウス筋肉の全ｃＤＮＡから当該技術分野での常套手法であるＲＴ−ＰＣＲ  法で増幅して作製した。
センスプライマーの塩基配列：
5’-gcatcgctagcccgcggtgtcATGTGTAAGGGACTGGC-3’（配列番号１５）
アンチセンスプライマーの塩基配列：
5’-gtcatctcgagcttgattagctccttataaaattcagagc-3’（配列番号１６）
【００７０】
（５−２：ユビキチン−ＲＧＳ−５融合遺伝子の作製）
ユビキチン−ＲＧＳ−５融合遺伝子をコードするベクターｐＵＢ−ＲＧＳ−５は、ＲＧＳ−５のＰＣＲ産物を切断酵素Ｓａｃ  ＩＩとＸｈｏ  Ｉで処理した後、上記ベクターｐＵＢのＳａｃ  ＩＩとＸｈｏ  Ｉとの切断部位に導入して作製した。ユビキチン−ＲＧＳ−５融合遺伝子の塩基配列は配列番号１７に示すとおりである（図５）。
【００７１】
〔実施例６〕
本実施例はユビキチン−Ｄｌｌ−４融合遺伝子を作製した例を示す。
（６−１：Ｄｌｌ−４遺伝子の作製）
Ｄｌｌ−４（Ｄｌｌ−ｌｉｋｅ  ４：Ｄｌｌ−４）遺伝子は、下記プライマーを用いて、マウス筋肉の全ｃＤＮＡから当該技術分野での常套手法であるＲＴ−ＰＣＲ法で増幅して作製した。
センスプライマーの塩基配列：
5’-gcatcgctagcccgcggtgtcATGACGCCTGCGTCCCGGA-3’（配列番号１８）
アンチセンスプライマーの塩基配列：
5’-gtcatctcgagtacctctgtggcaatcacacac-3’（配列番号１９）
【００７２】
（６−２：ユビキチン−Ｄｌｌ−４融合遺伝子の作製）
ユビキチン−Ｄｌｌ−４融合遺伝子をコードするベクターｐＵＢ−  Ｄｌｌ−４は、Ｄｌｌ−４のＰＣＲ産物を切断酵素Ｓａｃ  ＩＩとＸｈｏ  Ｉで処理した後、上記ベクターｐＵＢのＳａｃ  ＩＩとＸｈｏ  Ｉとの切断部位に導入して作製した。ユビキチン−Ｄｌｌ−４融合遺伝子の塩基配列は配列番号２０に示すとおりである（図６）。
【００７３】
〔実施例７〕
本実施例はユビキチン−Ｉｄ−１融合遺伝子を作製した例を示す。
（７−１：Ｉｄ−１遺伝子の作製）
Ｉｄ−１（inhibitor of
differentiation-1／ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ−１：Ｉｄ−１）遺伝子は、下記プライマーを用いて、マウス筋肉の全ｃＤＮＡから当該技術分野での常套手法であるＲＴ−ＰＣＲ法で増幅して作製した。
センスプライマーの塩基配列：
5’-atcgctagcccgcggtgtcATGAAGGTCGCCAGTGGCAGTG-3’（配列番号２１）
アンチセンスプライマーの塩基配列：
5’-catctcgag gcgacacaagatgcgatcgtcg-3’（配列番号２２）
【００７４】
（７−２：ユビキチン−Ｉｄ−１融合遺伝子の作製）
ユビキチン−Ｉｄ−１融合遺伝子をコードするベクターｐＵＢ−Ｉｄ−１は、Ｉｄ−１のＰＣＲ産物を切断酵素Ｓａｃ  ＩＩとＸｈｏ  Ｉで処理した後、上記ベクターｐＵＢのＳａｃ  ＩＩとＸｈｏ  Ｉとの切断部位に導入して作製した。ユビキチン−Ｉｄ−１融合遺伝子の塩基配列は配列番号２３に示す通りである（図７）。
【００７５】
〔実施例８〕
実施例１で作製したユビキチン−アクアポリン−１（ｐＵＢ−ＡＱＰ−１）融合遺伝子が実際に細胞内で発現しているかどうかを、ＣＯＳ細胞にトランスフェクションしてウェスタンブロッテイングにて確認した。
ユビキチン−アクアポリン−１（ｐＵＢ−ＡＱＰ−１）融合遺伝子２μｇを、ＣＯＳ細胞（２００万個）に、リポフェクタミンを用いて各プラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞ライセートを調製し、タンパク質１５μｇを用いてウエスタンブロッテイングした。ウエスタンブロッテイングでは、抗Ｈｉｓ体を第１抗体として、また抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）体を第２抗体として使用した。
トランスフェクションした１２時間後、プロテアソーム阻害剤として、濃度１０μＭのＭＧ−１３２を添加し、ＭＧ−１３２を添加１２時間後細胞ライセートを調製した。このＤＣ２．４細胞（２００万個）に用量２μｇのｐＵＢ−ＡＱＰ−１をリポフェクタミンを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの６時間後、セレクションのために、Ｇ４１８を濃度５００μｇ／ｍｌの割合で培地に添加し、１２〜１８日後、Ｇ４１８耐性細胞クローンを単離し、トランスフェクションして、培養デイッシュをエクスパンションと解析のために分けた。その結果を図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃに示す。
【００７６】
図８Ａは、ＣＯＳ−７細胞（２ｘ１０６）にリポフェクタミンを用いてｐｃＤＮＡ、ｐＡＱＰ−１またはｐＵＢ−ＡＱＰ−１をトランスフェクトし、２４時間後の細胞ライセート（lysate）から抽出した１５μｇのタンパクを抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロット法にて解析した結果を示している。
【００７７】
図８Ｂは、ＣＯＳ−７細胞にｐＡＱＰ−１またはｐＵＢ−ＡＱＰ−１をトランスフェクト後１２時間後に、プロテアソーム阻害剤（ＭＧ−１３２）１０μＭ添加（＋）あるいは、無添加（−）、さらに１２時間後に細胞ライセートを抽出しウェスタンブロット（抗Ｈｉｓ抗体及び、抗ＨＳＰ９０抗体）を行った結果を示している。
【００７８】
図８Ｃは、図８Ｂのウェスタンブロットをデジタル・イメージ・アナライザー（digital image analyzer）で解析し、ＡＱＰ−１タンパク量をＨＳＰ９０タンパク量で除した相対比を示す。ｐＵＢ−ＡＱＰ−１のトランスフェクションはｐＡＱＰ−１をトランスフェクトした場合よりもＡＱＰ−１のタンパク量が減少しており、その減少は抗プロテアソーム阻害剤を添加すると認められなくなる。即ち、ｐＵＢ−ＡＱＰ−１コンストラクトのトランスフェクトではユビキチン・プロテアソーム経路によるタンパク質の分解が昂進していることを示している。
【００７９】
〔実施例９〕
本実施例は、実施例１で作製したユビキチン−アクアポリン−１融合遺伝子を含有する癌遺伝子ワクチン（ＵＢ−ＡＱＰ−１）を調製した例を示す。
上記ユビキチン−アクアポリン−１融合遺伝子を含有する発現プラスミドを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ培地５００ｍｌ中で３７℃の恒温槽にて一晩（〜１６時間）振盪培養を行った。
次いで、４℃、１２，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行った後、得られた上清を除去し、沈殿物である菌体成分を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１０ｍｌに溶解した。続いて、アルカリ溶液２００ｍＭ  ＮａＯＨ／１％ＳＤＳ溶液１０ｍｌにて菌体成分を溶菌した後、中和溶液３．１Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．５）１０ｍｌにて中和して反応を止めた。
その後、６００ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）３０ｍｌにて平衡化した核酸精製用陰イオン交換樹脂カラム（MARLIGEN BIOSCIENCE INC.製）に中和溶液を室温にて１２，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離を行った上清を充填し、８００ｍＭ  ＮａＣｌ／１００ｍＭ酢酸カリウム溶液にてカラムを洗浄し、１．２５Ｍ  ＮａＣｌ／１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）にて溶出して、所望の癌遺伝子ワクチン（ＵＢ−ＡＱＰ−１）を調製した。
【００８０】
〔実施例１０〕
本実施例では、実施例２で作製したユビキチン−ニューロポリン−１融合遺伝子を含有する癌遺伝子ワクチン（ＵＢ−ＮＲＰ−１）を、実施例９と実質的に同様にして処理して調製した。
【００８１】
〔実施例１１〕
本実施例では、実施例３で作製したユビキチン−ニューロポリン−２融合遺伝子を含有する癌遺伝子ワクチン（ＵＢ−ＮＲＰ−２）を、実施例９と実質的に同様にして処理して調製した。
【００８２】
〔実施例１２〕
本実施例では、実施例４で作製したユビキチン−ニューロポリン−２ユビキチン−Ｒｏｂｏ−４融合遺伝子を含有する癌遺伝子ワクチン（ＵＢ−Ｒｏｂｏ−４）を、実施例９と実質的に同様にして処理して調製した。
【００８３】
〔実施例１３〕
本実施例では、実施例５で作製したユビキチン−ＲＧＳ−５融合遺伝子を含有する癌遺伝子ワクチン（ＵＢ−ＲＧＳ−５）を、実施例９と実質的に同様にして処理して調製した。
【００８４】
〔実施例１４〕
本実施例では、実施例６で作製したユビキチン−Ｄｌｌ−４融合遺伝子を含有する癌遺伝子ワクチン（ＵＢ−Ｄｌｌ−４）を、実施例９と実質的に同様にして処理して調製した。
【００８５】
〔実施例１５〕
本実施例では、実施例７で作製したユビキチン−Ｉｄ−１融合遺伝子を含有する癌遺伝子ワクチン（ＵＢ−Ｉｄ−１）を、実施例９と実質的に同様にして処理して調製した。
【００８６】
〔実施例１６〕
癌遺伝子ワクチン（ｐＵＢ−ＡＱＰ−１）のマウスメラノーマに対する治療的効果
実施例９で調製した癌遺伝子ワクチン（０．３ｍｇ／ｋｇ）およびその他の被験プラスミドを含むワクチンを、マウスメラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０）を担癌した１０週齢のＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）雌マウスに対して、遺伝子銃を用いて、腹部皮下に導入し、２日おきに腫瘍サイズを観察した。尚、マウスは一群につき６匹を用い、担癌（challenge）した日をｄａｙ０とした。担癌したメラノーマ細胞数は、マウス一匹当たり５×１０３個であった。遺伝子ワクチンの導入はｄａｙ２より開始し、３日毎に計５回行った。その結果は図９Ａおよび図９Ｂに示す。
【００８７】
図９Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにメラノーマ（melanoma）Ｂ１６Ｆ１０細胞（２ｘ１０３個）を腹部皮下に移植後、２日目より遺伝子免疫（コントロールベクター、ｐＡＱＰ−１、ＵＢ−ＡＱＰ−１）を開始し、３日毎に計５回施行した。経時的に腫瘍サイズを評価した。腫瘍サイズは：
π×［（ａ×ｂ）１／２］３
（式中、ａおよびｂはそれぞれ２つの主要垂直方向の直径を示している。）
で測定した。マウスは一群６匹で行った。
【００８８】
図９Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにメラノーマ（melanoma）Ｂ１６Ｆ１０細胞２×１０３を腹部皮下に移植後２日目より遺伝子免疫（コントロールベクター、ｐＡＱＰ−１、ＵＢ−ＡＱＰ−１）を開始し、３日毎に計５回施行した３群のマウスの生存曲線を示す。この結果、ｐＵＢ−ＡＱＰ−１遺伝子治療群で担癌マウスの有意な生存延長が認められた。
【００８９】
〔実施例１７〕
本実施例は、癌遺伝子ワクチン（ｐＵＢ−ＡＱＰ−１）のマウスメラノーマに対する予防的ワクチン効果を示す例である。
Ｂ６マウスに、各プラスミド６μｇを１週間間隔で３回免疫した。最終免疫の７日後、１×１０５個のメラノーマ（melanoma）Ｂ１６Ｆ１０癌細胞のリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）液（２００μｌ）を各Ｂ６マウスに皮下注射（ｓ．ｃ．）した。腫瘍サイズは２日毎に計測し、腫瘍容量は下記にて算出した。
π／６×［（ａ×ｂ）１／２］３
（式中、ａおよびｂはそれぞれ２つの主要垂直方向の直径を示している。）
癌遺伝子ワクチン（ｐＵＢ−ＡＱＰ−１）のマウスメラノーマに対する予防的ワクチン効果の結果を図１０に示す。図１０Ａは腫瘍サイズの経時的変化を示し、図１０Ｂは生存率を示す。図に示す結果から、ｐＵＢ−ＡＱＰ−１遺伝子ワクチン群においてメラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０）接種後の有意な生存率の向上が認められた。
【００９０】
〔実施例１８〕
癌遺伝子免疫最終日から１０日後、マウスの脾臓細胞（１００万個）を取り出し、それを１２ウェルプレートに注入し、ＰＭＡ（phorbol
12-myristate 13-acetate）（５０ｎｇ／ｍｌ），calcium
ionophore（１μｇ／ｍｌ）およびbrefeldin A（１μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ  １６４０コンプリート培地で４時間培養した。細胞を遠心分離して採取し、allophycocyanin標識抗ＣＤ４抗体、ＰＥ標識ＣＤ８抗体、ＦＩＴＣ標識ＩＦＮ−γ抗体、あるいはＦＩＴＣ標識パーフォリン（ＰＦ）抗体、ＦＩＴＣ標識グランザイムＢ抗体（ＧＺＭ−Ｂ）を用いて４℃で３０分間染色した。染色した細胞を２回洗浄し、細胞をＦＡＣＳフローサイトメーターに採集し、CellQuestソフトウエアで分析した。その結果を図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。
【００９１】
図１１Ａは、癌遺伝子免疫最終日から１０日後、マウスの脾臓細胞をＰＭＡ／ionophoreで刺激し、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のＩＦＮ−γ、パーフォリン、グランザイムＢの発現を細胞内ＦＡＣＳ法にて解析した結果を示している。図１１Ｂは、図１１Ａのそれぞれの遺伝子免疫群マウス脾臓細胞をＰＭＡ／Ionomycinで刺激した際のＣＤ８Ｔ細胞におけるＩＦＮγ、パーフォリン（ＰＦ），グランザイムＢ（ＧＺＭ−Ｂ）の発現陽性率からＣＤ８Ｔ細胞の絶対数を求めたものを示す。この結果は、ｐＵＢ−ＡＱＰ−１遺伝子免疫によりＩＦＮγ、パーフォリン（ＰＦ）、グランザイムＢ産生ＣＤ８キラーＴ細胞の誘導が効率よく起きていることを示している。
【００９２】
〔実施例１９−１〕
ＣＤ８＋Ｔ細胞（２０，０００個）を９６ウエルプレートに注入し、ｐＵＢ−ＡＱＰ−１をトランスフェクションした後５．５Ｇｙγ−線を照射したＤＣ２．４細胞（２，０００個）と培養した。３日培養後、上清を採取し、ＩＦＮ−γの産生をＥＬＩＳＡで測定した。同様に、ｐＵＢ−ＡＱＰ−１をトランスフェクト後に放射線照射した樹状細胞ラインＤＣ２．４および遺伝子免疫したマウスの脾臓中のＣＤ８＋Ｔ細胞を９６ウエルプレートで３日培養後、上清を採取し、ＩＦＮ−γの産生をＥＬＩＳＡで測定した。その結果を図１２Ａで示す。
図１２Ａの結果から明らかなように、コントロール免疫群やｐＡＱＰ−１免疫群のマウスに比べて、ｐＵＢ−ＡＱＰ１遺伝子免疫群のマウスから取り出したＣＤ８Ｔ細胞は、ｐＵＢ−ＡＱＰ−１トランスフェクトした樹状細胞ラインＤＣ２．４との共培養により顕著なＩＦＮγの産生が認められた。
【００９３】
〔実施例１９−２〕
ＣＤ８＋Ｔ細胞（２０，０００個）を９６ウエルプレートに注入し、ｐＵＢ−ＡＱＰ−１をトランスフェクションした後５．５Ｇｙγ−線を照射したＤＣ２．４細胞（２，０００個）と培養した。３日後に［３Ｈ］thymidineを添加し、１０時間培養後に、細胞とその培地をガラスファイバーフィルター上に採取し、その放射能レベルをβシンチレーションカウンターで測定し、細胞増殖を算出した。同様に、ｐＵＢ−ＡＱＰ−１をトランスフェクト後に放射線照射した樹状細胞ラインＤＣ２．４および遺伝子免疫したマウスの脾臓中のＣＤ８＋Ｔ細胞を９６ウエルプレートで３日培養後、［３Ｈ］thymidineを添加し、１０時間培養後に、細胞とその培地をガラスファイバーフィルター上に採取し、その放射能レベルをβシンチレーションカウンターで測定し、細胞増殖を算出した。その結果を図１２Ｂに示す。
図１２Ｂの結果から明らかなように、コントロール免疫群やｐＡＱＰ−１免疫群のマウスに比べて、ｐＵＢ−ＡＱＰ１遺伝子免疫群のマウスから取り出したＣＤ８Ｔ細胞はｐＵＢ−ＡＱＰ−１トランスフェクトした樹状細胞ラインＤＣ２．４との共培養により顕著な細胞増殖反応が認められた。
【００９４】
〔実施例２０〕
癌遺伝子免疫したマウスに、抗ＣＤ４抗体（クローンＧＫ１．５）または抗ＣＤ８抗体（５３−６．７２）を、Ｂ１６Ｆ１０細胞に担癌する前のｄａｙ３ならびにｄａｙ１にマウス１匹当たり０．５ｍｇの割合で腹腔内投与して、それぞれのＴ細胞サブセットを除去した。この結果、各Ｔ細胞サブセットの９８％以上が除去されていることをフローサイトメトリーで確認した。これにより、ＣＤ４Ｔ細胞あるいは、ＣＤ８Ｔ細胞を抗体投与により除去した遺伝子免疫マウスにＢ１６Ｆ１０メラノーマを接種し抗腫瘍効果に対するＴ細胞サブセット除去の効果を判定した。図１３Ａは腫瘍サイズの経時的変化を示し、図１３Ｂは生存率を示している。
【００９５】
図１３Ａの結果から、抗ＣＤ８抗体投与群では、抗腫瘍免疫効果がほぼ消失していたことが確認された。また、図１３Ｂの結果から、抗ＣＤ８抗体投与群では、抗腫瘍免疫効果が顕著に消失し、コントロールマウスと同程度の生存率曲線を示していた。このことは、この発明による癌遺伝子免疫（ｐＵＢ−ＡＱＰ−１）の抗腫瘍効果がＣＤ８Ｔ細胞により担われていることを示している。
【００９６】
〔実施例２１〕
コントロール群（Ａ）または癌遺伝子（ｐＵＢ−ＡＱＰ−１遺伝子）免疫群（Ｂ）のマウスにＢ１６Ｆ１０メラノーマを接種し２週間後に癌組織を採取した。採取した癌組織サンプルを液体窒素−冷却ＯＣＴコンパウンド内で急速冷凍し、−２０℃で貯蔵した。この冷凍癌組織サンプルを厚さ５μｍの切片に切って、ガラススライド上に積層し、このスライドをＰＢＳでそれぞれ５分間３回洗浄し、０．２％トリトン（登録商標）Ｘ１００のＰＢＳ溶液中で１５分間培養し、再度ＰＢＳで洗浄した。この癌組織サンプルを、１％ウシ胎児血清（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液（ＰＢＳ−ＢＳＡ）を用いて室温で３０分間培養して、非特異的結合をブロックした。
【００９７】
このように処理した癌組織切片をＰＥ標識抗ＣＤ３１抗体（１：１０００）およびＤＡＰＩ抗体（１：１０００）を用いて４℃で一晩二重染色した。染色後、ＰＢＳでそれぞれ５分間ずつ３回洗浄し、スライドに積層し、ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）で染色した。この癌組織標本をＢｉｏｚｅｒｏ蛍光顕微鏡を用いて撮影し、撮影した写真を１００〜２００枚程度結合して結合写真を作成した（図１４Ａａおよび１４Ｂａ）。この結合写真をソフトウエアＩｍａｇｅＪ（非特許文献１３）で解析して、血管の直径（図１４Ａｂと１４Ｂｂ）および面積（図１４Ａａと１４Ｂａ）をカウントした。図１４Ａｂおよび図１４Ｂｂは腫瘍栄養血管の輪郭が示しており、図１４Ａｃおよび図１４Ｂｃは腫瘍栄養血管内腔が黒く塗りつぶされて示されている。
【００９８】
図１５Ａは、図１４ＡおよびＢの画像をＩｍａｇｅＪで解析し血管の直径をカウントし、血管径毎にコントロール群（Ａ）と遺伝子免疫群（Ｂ）における腫瘍内栄養血管の一定面積あたりの数（ｄｅｎｓｉｔｙ）を算出した結果を示している。図１５Ｂは、図１４ＡおよびＢの画像をＩｍａｇｅＪで解析し血管の面積をカウントし、コントロール群（Ａ）と遺伝子免疫群（Ｂ）の腫瘍面積全体における腫瘍栄養血管面積の比を算出した結果を示している。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
従来の抗癌剤による化学療法は、悪性腫瘍などに対して強力な増殖抑制作用を有しているが、薬剤耐性がしばしば誘導され、また正常細胞の細胞分裂をも阻止するという強い副作用も併せ持っている。これに対して、この発明による癌新生血管関連遺伝子を用いた免疫療法は、生体の免疫反応を利用して悪性腫瘍などの腫瘍・癌細胞の増殖を促進する血管新生因子を標的にして新生栄養血管を破壊する。このことから、本発明によるワクチンは、癌・腫瘍の種類に限定されることなく、またＭＨＣクラスＩ分子の発現が低下／消失している癌・腫瘍であって、かつ既存の免疫療法では全く無効な悪性度の高い癌に対しても有効である可能性が高く、その副作用も既存の抗癌剤と比較して劇的に軽減できることが予想される。また、投与方法にしても、皮下の免疫細胞に提示するだけで十分な効果が見られることから、皮下投与型という次世代型抗癌療法としても期待できる。さらに、この発明の抗癌療法は、既存の抗ＶＥＧＦ抗体による癌組織の栄養新生血管のブロックと比較すると、遙かに安価に、かつ安全性も高く、大量に製造することができることも期待できると共に、これまでの抗体療法ではその効果が不十分で繰り返し投与が必要であるのに対して、より高い効果が期待できることから、繰り返し投与が不必要であると期待することもできる。したがって、この発明は、癌・腫瘍の種類に限定されることなく癌・腫瘍の予防および治療に有用である。
【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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