(57)【要約】      （修正有）【課題】高アジュバント性および低反応原性（low reactogenicity）を有するアジュバント組成物の提供、並びに免疫原を含む免疫原性組成物の提供。【解決手段】イオン性多糖成分および免疫賦活複合体を含み、ここでイオン性多糖成分の免疫賦活複合体成分に対する質量比が５０〜３００の範囲であるアジュバント組成物で、該イオン性多糖成分が、ＤＥＡＥ‐デキストランのようなイオン性デキストランであり、免疫賦活複合体成分にはサポニン成分を含有するものであり、並びに免疫原として視床下部ホルモン黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）を含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）イオン性多糖成分および（Ｂ）免疫賦活複合体を含み、ここでイオン性多糖成分の免疫賦活複合体成分に対する質量比が５０〜３００の範囲である、アジュバント組成物。
【請求項２】
イオン性多糖がイオン性デキストランである、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項３】
イオン性デキストランがＤＥＡＥ‐デキストランである、請求項２に記載のアジュバント組成物。
【請求項４】
免疫賦活複合体が無タンパク質免疫賦活複合体である、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項５】
免疫賦活複合体中のサポニン成分がQuil Ａである、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項６】
イオン性多糖成分の免疫賦活複合体成分に対する質量比が１００〜１４０の範囲である、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項７】
イオン性多糖成分１０ｍｇおよび免疫賦活複合体８０μｇを含み、ここで前記イオン性多糖成分がＤＥＡＥ‐デキストランである、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項８】
イオン性多糖成分１００ｍｇおよび免疫賦活複合体８００μｇを含み、ここで前記イオン性多糖成分がＤＥＡＥ‐デキストランである、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項９】
免疫原および請求項１に記載されたアジュバント組成物を含む、免疫原性組成物。
【請求項１０】
免疫原がＬＨＲＨを含む、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
免疫原がＬＨＲＨ‐ジフテリアトキソイド接合体を含む、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
ＬＨＲＨ‐ジフテリアトキソイド接合体５〜５００μｇ、イオン性多糖５〜５００ｍｇおよび免疫賦活複合体４０〜４０００μｇを含んでいる、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
（ｉ）請求項９に記載の免疫原性組成物、および（ｉｉ）１種以上の製薬上許容されるキャリアを含んでいる、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項９に記載の免疫原性組成物の有効量を動物に投与することを含む、非ヒト動物で有効な免疫応答を働かせる方法。
【請求項１５】
前記免疫原性組成物が、さらに１種以上の製薬上許容されるキャリアを含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、通常、高アジュバント性および低反応原性（low reactogenicity）を有するアジュバント組成物に関する。本発明のアジュバント組成物は、免疫原性組成物の投与後における、例えば、限定されないが、家庭ペットまたは消費用家畜の稔性（繁殖）および行動パターンの改変向け予防および／または治療剤としてのＬＨＲＨ組成物の投与後における、反応原性の発現が許されない場合に有用である。
【発明の背景】
【０００２】
この明細書の著者により引用された文献の目録詳細は、その記載の最後にまとめられている。
【０００３】
アジュバントは、免疫応答を増加させて、一部の場合には指示するために、ワクチンおよび他の免疫原性処方物に含有または添加される（Gupta,1998,Cox and Coulter,1992,Azuma,1992およびAguado et al.,1999の文献参照）。一部のアジュバント、例えば水中油型および油中水型エマルジョンは、高レベルの抗体を刺激しうるほど強いアジュバントと広くみなされているが、このようなアジュバントの反応原性が多くの動物種またはヒトで日常的使用を妨げていることは明らかであろう。許容されない反応原性は、動物における伝統的フロイント水中油型エマルジョンの使用が、たとえ実験目的でも、一部の国で禁止または抑止されるようなところまで、多くの動物でこのアジュバントにより証明されている。牛で水中混合油型／ＤＥＡＥ‐デキストランアジュバントの使用（Hodgkinson et al.,1990）は、予防接種された動物の３０％で重大な望ましくない反応を生じた。
【０００４】
ヒトおよび動物で最も広く用いられているアジュバントは、普遍包括的に“ミョウバン”と称されている不溶性アルミニウム塩、特に水酸化物およびリン酸塩形をベースにしている。Aguadoら(1999)による最近の文献では、更に有効なワクチンの開発のために、ヒトおよび動物の双方でより強いアジュバントの必要性が残っていることを強調している。
例えば、広範囲の可溶性抗原があるが、単独で投与されたこのような抗原に対する免疫応答は非常に乏しく、多くの場合に２回の予防接種後でさえ検出しえない。このような抗原は、一定の免疫応答を促す上で、アジュバントの使用を要する。公知のアジュバントは免疫応答を促せるある範囲の能力を呈するが、免疫抗原に対する抗体応答の点で通常限定されることは、明らかであろう。
キャリアタンパク質にカップリングさせたハプテンの場合には、強力なアジュバントが必要とされることが広く認識されている。例えば、視床下部ペプチドホルモンＬＨＲＨは１０アミノ酸ペプチドであって、それのみでは非免疫原性である。キャリアタンパク質、例えばジフテリアトキソイドまたはオボアルブミンへのＬＨＲＨのカップリングは、ＬＨＲＨハプテンに対する免疫応答に必要なＴ細胞の介助をもたらす。他の大きな分子量および複合抗原の場合には、Ｔ細胞の介助はその分子自体内のＴ細胞エピトープにより通常もたらされる。
【０００５】
アジュバントとしてＤＥＡＥ‐デキストランの使用は、科学文献でよく記載されている。Wittmanら(1975)はブタで口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ワクチンをアジュバントするためにＤＥＡＥ‐デキストランを用いて、それが非常に高レベルの免疫を誘導することを示した。Houstonら(1976)はウマウイルスでサルを予防接種するために１〜５mg/kg体重の用量率でこのアジュバントを用い、それが高力価の抗体を誘導することを示した。Behおよびlascelles(1985)もオボアルブミンでヒツジを免疫するためにこのアジュバントを用い、他の可溶性アジュバントよりも高い抗体力価を誘導することを示した。これらいずれの研究でもＤＥＡＥ‐デキストランの部位反応性を考慮していなかったが、彼らはこれらの動物種でＤＥＡＥ‐デキストランの有意なアジュバント効果については記載していた。ＤＥＡＥ‐デキストランはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）抗原と一緒にシカで用いられた（Hibma and Griffin,1992）。この研究では、ＤＥＡＥ‐デキストランはフロイントアジュバントまたはミョウバンよりも大きなＩｇＧ応答をＫＬＨに対して誘導した。
【０００６】
免疫原に対する抗体力価を高めうる能力を有していることから、サポニンのアジュバント性が長年知られていた。ここで用いられている“サポニン”という用語は、ステロイドまたはトリテルペノイド構造の疎水性領域と共に、親水性領域（通常いくつかの糖鎖）から構成されている、植物源の界面活性グリコシドのグループに関する。サポニンは様々な供給源から入手しうるが、有用なアジュバント活性を有するサポニンは南米木Quillaja saponaria(Molina)から得ていた。この供給源からのサポニンは“Quil Ａ”と称される“同種”フラクションを単離するために用いられた（Dalsgaad,1974）。
【０００７】
用量‐部位反応性は、ワクチン製剤としてQuil Ａの動物およびヒト双方への使用上、大きな関心事である。Quil Ａのこの毒性を避けるための１つの手法は、免疫賦活複合体（Immuno Stimulating COMplexesの略号、IscomsTMとして知られている）の使用である。これは、主に、Quil Ａが免疫賦活複合体中に組み込まれたとき低い反応性となり、複合体でコレステロールと一緒にすると、細胞膜でコレステロールと結合する能力、ひいては細胞溶解効果を減少させるからである。加えて、同レベルのアジュバント効果を生じさせるために、より少ない量のQuil Ａで済むからである。
Quil
Ａサポニンの免疫調節性、およびそれらが免疫賦活複合体中に組み込まれたときにこれらサポニンから派生する追加効果は、様々な文献、例えばCox and Coulter,1992；Dalsgaard,1974；Moreinらのオーストラリア特許明細書５５８２５８、５８９９１５、５９０９０４および６３２０６７で記載されている。
【０００８】
視床下部ホルモン黄体形成ホルモン放出ホルモン（ここでは“ＬＨＲＨ”と称されるが、ＧｎＲＨとしても知られている）に対するワクチン接種は、１９７０年代初期から生殖をコントロールする免疫学的方法として証明されていた（Fraser 1975,Jeffcoate et al,1982）。ＬＨＲＨに対する免疫応答の誘導は、性腺‐雄性で睾丸および雌性で卵巣の発育および維持に必要なホルモンＬＨおよびＦＳＨの、下垂体前葉からの放出を妨げる。こうしたＬＨおよびＦＳＨレベルの減少は生殖機能の喪失をもたらす。
【０００９】
去勢（または中性化）手術が、獣医学および家畜動物の取扱い上で最も広く行われている外科処置である。相当な割合の両性の家畜動物およびコンパニオンアニマルが、性的な成熟に伴う様々な望ましくない特徴を妨げるために、ルーチンで外科的に去勢されている。その特質には攻撃性、遊走性、性的行動、体調の喪失、生殖器の腫瘍および妊娠がある。
イヌ、ネコおよびウマのようなコンパニオンアニマル、並びに家畜、特に雄性ブタ、雄性および雌性ウシで、ＬＨＲＨ接合体ワクチンの予防接種による交尾行動のコントロールは、稔性のコントロールと同様に重要な目標として扱われてきた。
同様に、ヒトおよび動物双方の性腺および他の生殖器の障害、例えば睾丸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、前立腺肥大または子宮内膜症の抑制および治療も重要である。
【００１０】
国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ９８／００５３２では、その内容が参考のためここに組み込まれるが、ＬＨＲＨがジフテリアトキソイドおよびイオン性多糖、例えばＤＥＡＥ‐デキストランとの接合体として投与されたとき、ＬＨＲＨに対する予防接種の効力が有意に改善されることを開示している。しかしながら、その効力が改善されても、その処方物は投与部位で目に見える腫脹のような反応原性をを誘導し、これは長く続くことがある。一部の場合、例えばその処方物が家庭ペット（例えばイヌ）または消費用家畜に予防接種するために用いられる場合には、この処方物を利用したＬＨＲＨに対する予防接種後におけるこのような反応原性の発生は許容されない。したがって、効力および低い反応原性の双方を示すＬＨＲＨワクチンを開発する必要性がある。
【００１１】
本発明に至る研究の一面において、ジフテリアトキソイドおよびイオン性多糖に接合されたＬＨＲＨの反応原性が、ある割合のイオン性多糖成分がサポニン成分、特に免疫賦活複合体で置き換えられたときに減少しうることがわかった。
【発明の要旨】
【００１２】
この明細書および請求の範囲の全体を通して、別記されないかぎり、“含む”という用語、並びに“含有する”および“からなる”というバリエーションは、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを包含した意味であるが、いずれか他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを除外するわけではないと理解されるであろう。
明細書で言及されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関する配列アイデンティティーナンバー（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ.）は文献目録後に掲載されている。ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ.の概要は例の後に掲載されている。
【００１３】
本発明の一面は、イオン性高分子成分およびサポニン成分、特に免疫賦活複合体成分からなるアジュバント組成物に関する。
このようなアジュバント組成物は、低反応原性と共に高アジュバント活性を有することがわかった。他の公知アジュバントにはないこの組合せアジュバントの利点は：ａ）ある範囲の抗原に対して非常に強い免疫反応を発揮させる能力、およびｂ）同時に非常に低い反応原性または反応性を有することｃ）反応原性が、その組合せにおける、高反応原性成分のものよりも低いこと、およびｄ）アジュバント効果または免疫賦活効果がいずれのアジュバント成分単独のものよりも大きいことを含めて、性質の特異な組合せを有していることである。
【００１４】
更にもう１つの面では、イオン性多糖成分およびサポニン成分、特に免疫賦活複合体成分からなるアジュバント組成物が提供される。
更にもう１つの面では、イオン性多糖成分およびサポニン成分、特に無タンパク質免疫賦活複合体成分からなるアジュバント組成物が提供される。
本発明の別な面では、アジュバント組成物がイオン性高分子成分およびサポニン成分、特に免疫賦活複合体成分からなる、免疫原およびアジュバント組成物を含んだ免疫原性組成物が提供される。
本発明のもう１つの別な面では、アジュバント組成物がイオン性多糖成分およびサポニン成分、特に免疫賦活複合体成分からなる、免疫原およびアジュバント組成物を含んだ免疫原性組成物が提供される。
本発明の更にもう１つの別な面では、アジュバント組成物がイオン性多糖成分およびサポニン成分、特に無タンパク質免疫賦活複合体成分からなる、免疫原およびアジュバント組成物を含んだ免疫原性組成物が提供される。
【００１５】
本発明の更にもう１つの別な面では、１種以上の製薬上許容されるキャリアおよび／または希釈物と一緒に、広く前記されたような免疫原性組成物を含んだ、医薬組成物が提供される。
本発明のもう１つの面は、有効な免疫応答を動物で働かせる方法に関し、その方法は広く前記されたような免疫原性組成物の有効量を上記動物に投与することからなる。
更にもう１つの面において、本発明は、動物で有効な免疫応答を働かせるための組成物の製造に関する、広く前記されたようなアジュバント組成物の使用を提供する。
【発明の具体的な説明】
【００１６】
本発明は、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ９８／００５３２で開示されたようにジフテリアトキソイドへ接合されたＬＨＲＨを含むワクチンのイオン性多糖成分が免疫賦活複合体と組み合わされたときに、免疫原性組成物の反応原性が効力の有意な減少なしに減る、という発見に一部基づいている。
このように、本発明の１つの好ましい面は、ＬＨＲＨに対して有効な免疫を働かせる上で有用な免疫原性組成物に関し、その組成物はＬＨＲＨ‐ジフテリアトキソイド接合体およびアジュバント組成物からなり、アジュバント組成物はイオン性多糖または他のイオン性高分子成分およびサポニン成分、特に免疫賦活複合体成分からなる。
【００１７】
例えばワクチンの投与部位で、免疫原性製剤に対する反応原性の発現は、触診により、または重度であれば、目、発赤および膿瘍形成により検出しうる、腫脹のような炎症の症状を含めたいくつかの症状の発生を参考にして通常判断される。反応原性の程度は、これら症状のうち１以上の発生、期間および重篤度を参考にして通常調べられる。例えば、目に見える膿瘍形成をもたらす反応原性は、腫脹のみを伴う反応原性よりもかなり重い。更に、目に見える腫脹は、触診のみにより検出しうる腫脹よりも重篤な反応原性の表れである。本発明によると、“低い”反応原性とは、検出しえない症状または目に見えない症状を生じる反応原性として理解すべきである。例えば、触診のみにより検出しうる腫脹が低い反応原性の例である。本発明では、いかなる反応原性も全くない、という程度で理解すべきである。本発明の関係では、低反応原性とはほんの短い期間で目に見える腫脹を含めて理解してもよい。
【００１８】
“イオン性高分子”または“イオン性多糖”とは、いずれか正または負に荷電した多糖または他の高分子、またはその誘導体もしくは化学的相当物に関する、と理解すべきである。“誘導体”および“化学的相当物”とは、以下で記載されるような意味を有している、と理解すべきである。
【００１９】
多糖または他の高分子は化学的に修飾して荷電基を導入してもよく、こうするとそれは高度に荷電するようになる。固体または溶液状態のとき、全体の正味電荷がゼロであるかまたはゼロに近くなるように、荷電基は対イオンとペアにされる。多糖は、例えば濾過による滅菌に役立つように、いくつかのこのような分子、好ましくは可溶性分子のうちいずれか１つから選択されるが、不溶性物質でも、溶解性に依存しない照射、湿式もしくは乾式加熱または他のプロセスにより滅菌しうるため、多糖は可溶性多糖に限定されない。好ましくは、多糖は可溶性デキストランを形成するためにα１‐６結合されたグルコースのポリマーであるが、α１‐３結合されたデキストランの不溶形も用いてよい。
【００２０】
多糖または他の高分子は、５．０〜８．０のｐＨ値で強い正（＋ｖｅ）の荷電基を供するように修飾してもよい。修飾基はいくつかの＋ｖｅ荷電基のうちいずれか１つから選択しうるが、好ましくはジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基である。代わりの＋ｖｅ荷電多糖はＱＡＥ‐デキストランである。ＤＥＡＥ‐デキストランとして知られる修飾デキストランは、５０，０００〜５×１０６Ｄａ範囲の分子サイズ、好ましくは５００，０００〜１．５×１０６ｄａの分子量範囲を有する。デキストランのような大きな高分子はサイズが雑多であり、典型的には９５％の物質が約４倍のサイズ範囲内にあることが知られている。修飾のレベルは高く、平均して三番目毎のグルコース残基がＤＥＡＥ基で置換される。このような物質は市販されているか、そうでなければデキストランから製造してよい。一方、デキストランまたは他の多糖は、例えば硫酸基での修飾により、負に荷電させてもよい。好ましくは、本発明のアジュバント組成物のイオン性多糖成分はＤＥＡＥ‐デキストラン成分である。
【００２１】
サポニン成分には、例えばQuil Ａまたは他の精製もしくは半精製サポニン調製物（サポニンフラクションの混合物を含む）がある。好ましくは、サポニン成分は免疫賦活複合体の形で供される。
本発明によるアジュバント組成物中に配合される免疫賦活複合体（またはIscomsTM）は、Cox and Coulter,1992およびMoreinらのオーストラリア特許明細書５５８２５８、５８９９１５、５９０９０４および６３２０６７の文献（それらの開示は参考のためここに組み込まれる）で詳細に記載されている当業者に周知の技術により製造してもよい。
【００２２】
簡単にいうと、免疫賦活複合体は典型的には径が３０〜４０ｎｍの小さなケージ様構造をとるが、それに限定されない。最適量のタンパク質との免疫賦活複合体の最終処方は、５：１：１：１の比率で、Quil Ａ、コレステロール、ホスファチジルコリンおよびタンパク質のモル比からなる。免疫賦活複合体は、例えば５〜１０重量％のQuil Ａ、１〜５％のコレステロールおよびリン脂質、および残部のタンパク質を含有している。ペプチドも免疫賦活複合体中へ直接組み込んでも、または免疫賦活複合体中へのタンパク質の組込み後にキャリアタンパク質（例えば、ジフテリアトキソイドまたはインフルエンザエンベロープタンパク質）へ化学的カップリングにより組み込んでよい。“免疫賦活複合体”とは、その誘導体、化学的相当物およびアナログも含める、と理解すべきである。例えば、免疫賦活複合体の誘導体には、例えば、Quil Ａ、コレステロール、ホスファチジルコリンまたはタンパク質のうち１種以上が欠損しているか、あるいはQuil Ａ、コレステロール、ホスファチジルコリンまたはタンパク質に加えてある成分がその複合体に付加されている、免疫賦活複合体を含む。免疫賦活複合体の機能性相当物として、その４成分のうち１種以上が機能的相当物で置き換えられた免疫賦活複合体もある。本発明の好ましい態様において、免疫賦活複合体のタンパク質成分は欠損している。このタイプの免疫賦活複合体はここでは“無タンパク質免疫賦活複合体”（またはIscomatrixTM）と称される。
【００２３】
本発明のアジュバント組成物中における免疫賦活複合体は、イオン性多糖成分と反対に荷電させるべきである。そのため、正荷電ＤＥＡＥ‐デキストランとの好ましい組合せでは、免疫賦活複合体は負に荷電させる。この望ましい特徴は、構造中への荷電サポニンの配合により獲得してもよい。免疫賦活複合体を負荷電多糖成分と組み合わせることによる有効なアジュバント組成物の形成では、免疫賦活複合体が正に荷電されることを必要とするであろう。別な形では、正荷電免疫賦活複合体が負荷電イオン性多糖成分と組み合わされる。
【００２４】
可溶性タンパク質抗原、キャリアタンパク質に接合されたペプチドハプテンおよび抗原としての全ウイルスを含めた、広範囲の抗原または他の免疫原が、本発明の新規アジュバント組成物と組み合わされる。加えて、アジュバントおよびそれらの活性、他の抗原、例えば組換えタンパク質、抗原性多糖、抗原性脂質、ペプチドおよび他の粒状抗原に関する以前の知識も、このアジュバント組成物で適切に用いられる。
【００２５】
最終処方物は、選択された抗原に対する免疫応答を高めるために用いられる。抗原担持免疫賦活複合体または無タンパク質免疫賦活複合体の双方が、アジュバント組成物を形成するために用いうる。組合せアジュバントは、抗原を最初に免疫賦活複合体中へ組み込んで形成してもよい。別な形として、抗原はアジュバントの処方後に組合せアジュバントへ加えてもよい。一形態のアジュバントでも広範囲の抗原に用いてよいため、これは実験的にも商業的にもワクチンの製造上多くの利点を有している。
【００２６】
ＤＥＡＥ‐デキストランは非常に強いアジュバントであると当業界では知られているが、許容しえない反応原性もしばしば有している。免疫賦活複合体もそれ自体で許容しうるアジュバントとして知られているが、ＤＥＡＥ‐デキストランと比較して免疫賦活活性の程度がかなり少ない。更に詳しくは、新規なアジュバントはＤＥＡＥ‐デキストランおよび免疫賦活複合体の慎重にコントロールされた組合せであって、そのコントロールされた比率は、双方の成分、特に強力な方のアジュバントＤＥＡＥ‐デキストランの、但し免疫賦活複合体についても、アジュバント活性を維持するようなものであるが、その組合せはＤＥＡＥ‐デキストランの望ましくない反応原性が中和されるようなものにする。当業界では、アジュバントの組合せは個別成分の場合よりも反応原性であると予想されている。油エマルジョンと組み合わされたＤＥＡＥ‐デキストランの場合もそうである（Hodgkinson et al.,1990）。
【００２７】
ある範囲の動物種での広い実験では、ＤＥＡＥ‐デキストランのようなイオン性多糖の質量比が、免疫賦活複合体の場合より多いことが、低い反応原性の組合せアジュバントを得る上で重要であることを示した。ＤＥＡＥ‐デキストランのレベルを１／１０に減らすと、弱い活性で反応原性も低い、組合せアジュバントをもたらすであろう。例で示されているように、例えば２０８の質量比で、免疫賦活複合体の比を低くして高レベルのＤＥＡＥ‐デキストランを用いると、やや低い免疫賦活活性で、許容しえないほど高い反応原性の組合せアジュバントをもたらす。
ここで言及された質量比は、デキストランが約三番目毎のグルコース残基で置換されたＤＥＡＥ‐デキストラン、および５：１：１のQuil Ａ：コレステロール：リン脂質比を有する無タンパク質免疫賦活複合体からなる、好ましいアジュバント組成物に関するものである。
【００２８】
５０〜３００範囲の質量比を有する処方物が有効とわかったが、好ましい範囲は１００〜１４０である。好ましい処方物は、ＤＥＡＥ‐デキストラン対免疫賦活複合体の質量比１２５のものである。これは、イヌまたはヒトのような小型または感受性の高い動物で使用の場合ＤＥＡＥ‐デキストラン約１０ｍｇおよび免疫賦活複合体約８０μｇ、あるいは同様にウマ、ウシ、ヒツジおよびブタのような大型動物で使用の場合ＤＥＡＥ‐デキストラン約１００ｍｇおよび免疫賦活複合体約８００μｇまたはＤＥＡＥ‐デキストラン約１５０ｍｇおよび免疫賦活複合体約５００μｇを含有したワクチンで例示される。
【００２９】
“有効”免疫応答とは、望ましい予防または治療効果を直接または間接的にもたらす免疫応答として理解すべきである。免疫原がＬＨＲＨ‐ジフテリア毒素接合体からなる場合には、このような応答は処置された動物の少くとも９０％、好ましくは少くとも９５％で生殖機能の減少または完全阻止を誘導する（即ち、生殖器活性のうちいずれか１種以上の亢進または機能化を減少または防止するか、あるいは生殖または生殖活性のうちいずれか１種以上の面が減少するように動物のホルモンレベルを調節する）。循環抗体の存在のみでは生殖機能を阻止しうる循環抗体の能力を必ずしも発揮しえないため、効力はあくまでも機能性の尺度にすぎず、抗ＬＨＲＨ抗体力価のみでは規定しえない、と理解すべきである。“生殖器”という用語は、雄性および雌性性腺、および副生殖器にもおよぶ、最広義で理解すべきである。“副生殖器”とは最広義で理解すべきであり、例えば前立腺、乳房、精嚢および子宮を含む。
【００３０】
以下で“ＬＨＲＨ”とは、すべての形のＬＨＲＨおよびその誘導体、相当物およびアナログを含めて読み取るべきである。
“誘導体、相当物およびアナログ”とは、融合タンパク質をはじめ、天然、合成または組換え源からの断片、一部、部分、化学的相当物、変異体、ホモログおよびアナログを含めて理解すべきである。例えば、ＬＨＲＨについて、そのＬＨＲＨには、実質的にＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３またはＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４で示されるようなアミノ酸の配列からなるか、あるいはそれと少くとも５０％の類似性を有したペプチドを含める。ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１、２および３で規定される分子はヒト由来であって、すべての哺乳動物で保存されている。ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４はＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２の誘導体であって、スペーサーがＮ末端に導入されている。ＬＨＲＨの化学的相当物はＬＨＲＨの機能性アナログとして作用しうる。化学的相当物は必ずしもＬＨＲＨから誘導しなくてよいが、ある類似性を有している。一方、化学的相当物はＬＨＲＨのある生理化学的性質を模倣するように特別にデザインしてもよい。化学的相当物は化学的に合成しても、または例えば天然物スクリーニングで検出してもよい。
ここで考えられるＬＨＲＨのホモログには、鳥、魚、爬虫類および無脊椎動物を含めた、異なる門に由来するＬＨＲＨがあるが、それらに限定されない。
【００３１】
“誘導体”はアミノ酸の挿入、欠損または置換から誘導してもよい。アミノ酸挿入誘導体には、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合物、並びに単一または複数アミノ酸の配列内挿入物がある。挿入アミノ酸配列変種とは、１以上のアミノ酸または非天然アミノ酸残基がタンパク質の既定部位中に導入されたものをいうが、ランダム挿入も得られる産物を適切にスクリーニングすれば可能である。欠損変種は配列から１以上のアミノ酸の除去により特徴づけられる。置換アミノ酸配列変種とは、配列中で少くとも１つの残基が除去されて、異なる天然または非天然残基がその箇所に挿入されたものをいう。典型的な置換は表１に従い行われるものである：
表 １ 
アミノ酸置換に適した残基
元の残基 例示置換
Ａｌａ
Ｓｅｒ
*Ａｒｇ
Ｌｙｓ
Ａｓｎ
Ｇｌｎ；Ｈｉｓ
Ａｓｐ
Ｇｌｕ
Ｃｙｓ
Ｓｅｒ
Ｇｌｎ
Ａｓｎ 
*Ｇｌｕ
Ａｌａ 
*Ｇｌｙ
Ｐｒｏ 
*Ｈｉｓ
Ａｓｎ；Ｇｌｎ
Ｉｌｅ
Ｌｅｕ；Ｖａｌ 
*Ｌｅｕ
Ｉｌｅ；Ｖａｌ
Ｌｙｓ
Ａｒｇ；Ｇｌｎ；Ｇｌｕ
Ｍｅｔ
Ｌｅｕ；Ｉｌｅ
Ｐｈｅ
Ｍｅｔ；Ｌｅｕ；Ｔｙｒ 
*Ｓｅｒ
Ｔｈｒ
Ｔｈｒ
Ｓｅｒ 
*Ｔｒｐ
Ｔｙｒ 
*Ｔｙｒ
Ｔｒｐ；Ｐｈｅ
Ｖａｌ
Ｉｌｅ；Ｌｅｕ 
注記：アステリスクで示されたアミノ酸残基は、哺乳動物ＬＨＲＨ配列に存在する残基を示している。
非天然アミノ酸の例には上記アミノ酸のＤ異性体があるが、それに限定されない。アミノ酸配列への“付加”には、他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との融合を含む。
ジフテリアトキソイドとは、すべての形のジフテリアトキソイドおよびその誘導体に関すると理解すべきである。“誘導体”という用語は前記と同様の意味を有している。誘導体には、例えば、ジフテリアトキソイドＴ細胞エピトープまたは分離してそのＴ細胞エピトープを含んだ分子がある。
【００３２】
好ましくは、上記のＬＨＲＨは少くとも５つのアミノ酸のＬＨＲＨ
Ｃ末端断片からなる。更に好ましくは、上記のＬＨＲＨは、全長ＬＨＲＨ、またはＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１で実質的に示されるようなアミノ酸配列からなる“ＬＨＲＨ１‐１０形”である。更に一層好ましくは、上記のＬＨＲＨはＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２で実質的に示されるようなアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列のカルボキシル末端はアミド化されている。その好ましいＬＨＲＨは“ＬＨＲＨ２‐１０形”とここでは称される。
【００３３】
このように、１つの好ましい態様では、ＬＨＲＨ２‐１０形‐ジフテリアトキソイド接合体およびアジュバント組成物（そのアジュバント組成物はイオン性多糖成分（好ましくはＤＥＡＥ‐デキストラン成分）およびサポニン成分、特に免疫賦活複合体成分からなる）からなる、ＬＨＲＨに対して有効な免疫応答を働かせる上で有用な組成物が提供される。
もう１つの態様では、ＬＨＲＨ２‐１０形‐ジフテリアトキソイド接合体およびアジュバント組成物（そのアジュバント組成物はイオン性多糖成分（好ましくはＤＥＡＥ‐デキストラン成分）およびサポニン成分、特に無タンパク質免疫賦活複合体成分からなる）からなる、ＬＨＲＨに対して有効な免疫応答を働かせる上で有用な組成物が提供される。
【００３４】
本発明のこの態様をいずれか１つの方法に限定するつもりはないが、ＬＨＲＨペプチドはＦｍｏｃ化学により合成して、得られたペプチドをキャリアタンパク質ジフテリアトキソイドへカップリングしてもよい。そのカップリングはLaddら,1990またはBonneauら,1994で記載されたように行って、ペプチドおよびキャリアタンパク質で得られた接合体（ここでは“ペプチド‐接合体”と称される）が未結合ペプチドおよび接合体の他の副産物を含まないようにプロセッシングされる。このようなプロセッシングは慣用的な透析または限外濾過により行える。得られたペプチド‐接合体はイオン性多糖アジュバントへ吸着される。
【００３５】
本発明をいずれか１つの理論または作用様式に限定することなく、本発明のＬＨＲＨ製剤の有効量の投与は、先行技術で記載されたＬＨＲＨ‐キャリア‐アジュバント組成物よりも、ＬＨＲＨに対して有意に有効な免疫応答を誘導する。その改善された効力は、免疫原性ＬＨＲＨ組成物が特にキャリアジフテリアトキソイドおよびイオン性多糖アジュバントを含むときに観察される。イオン性多糖成分の一部を免疫原性複合体成分で置き換えることにより、ＬＨＲＨ‐接合体製剤の反応原性が減少しながら、その効力が維持される。
本発明による使用に適したＬＨＲＨ‐接合体製剤では、好ましくは、イオン性多糖（例えばＤＥＡＥ‐デキストラン）５〜５００ｍｇ／免疫賦活複合体（例えばIscomatrixTM）４〜４００μｇ中にＬＨＲＨ‐ジフテリアトキソイド接合体５〜５００μｇを含んでいる。
【００３６】
本発明による医薬組成物は、ワクチン業界で現在知られているいずれかの経路による注射、例えば皮下、筋肉内、皮内注射または経口投与により、または粘膜適用により、溶液またはゲル、または他の適切な処方での直接適用で、または鼻もしくは気道表面へのエアゾール投与で投与される。好ましくは、処方物は皮下または筋肉内注射により投与される。
処方物は、フリーズドライまたは凍結乾燥により、あるいはスプレードライまたは他の形の乾燥により凍結または乾燥された、固体として貯蔵される。
【００３７】
注射用に適した剤形には、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌注射用溶液または分散液の即席製剤向け無菌粉末がある。それは製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の汚染作用から防御されねばならない。キャリアには、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含めた、溶媒または分散媒体がある。適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散物の場合には所要粒径の維持および界面活性剤の使用により維持しうる。微生物の作用の阻止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより行える。多くの場合に、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムのような塩を含有させることが好ましい。注射用組成物の長期吸収または遅延放出は、吸収を遅らせる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に用いて行える。
【００３８】
無菌注射液は、先に列挙された様々な他の成分と共に適切な溶媒中で活性化合物を必要量で配合して、必要ならば、その後で濾過滅菌することにより製造される。通常、分散液は、ベースの分散媒体および先に列挙されたもので必要な他の成分を含有した無菌ビヒクル中に、様々な滅菌活性成分を配合することにより製造される。無菌注射液の製造向け無菌粉末の場合には、好ましい製造方法は真空乾燥、フリーズドライ技術およびスプレードライ技術であって、先に無菌濾過された溶液から活性成分および望ましい追加成分の粉末を得る。
【００３９】
活性成分が適切に保護されているとき、それらは例えば不活性希釈物または同化性食用キャリアと共に経口投与しても、あるいはそれらは硬または軟殻ゼラチンカプセルに封入し、錠剤に圧縮し、または食物と直接混ぜてもよい。経口投与の場合、活性化合物は賦形剤と配合して、摂取用錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハースなどの形態で用いられる。組成物および製剤のパーセンテージはもちろん変更してもよく、便宜的に単位剤形の約５〜約８０重量％である。このような有用な組成物中における活性化合物の量は、適切な用量が得られるような量である。
【００４０】
錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどは次のような成分：ガム、アラビアガム、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸などのような崩壊剤；およびステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤も含有してよい。単位剤形がカプセルであるとき、それは上記タイプの物質に加えて液体キャリアも含有してよい。様々な他の物質が、コーティングとしてまたは単位剤形の物理的形態を変更するために存在してもよい。シロップまたはエリキシルは、活性化合物、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、および色素を含有してもよい。もちろん、単位剤形を製造する上で用いられるいかなる物質も、用いられた量のとき、獣医学上純粋で、実質的に無毒性でなければならない。加えて、活性化合物は徐放製剤および処方物中に配合してもよい。
【００４１】
製薬上許容されるキャリアおよび／または希釈物には、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などがある。獣医学上活性な物質用にこのような媒体および剤の使用は当業界で周知である。慣用的な媒体または剤が活性成分と不適合でなければ、治療用組成物でその使用が考えられる。補充活性成分も組成物中に配合しうる。
【００４２】
投与しやすさおよび用量の均一性のために、単位剤形で非経口組成物を処方することが、特に有利である。家畜への投与の場合、反復予防接種ガンへ接続されたマルチ用量容器を用いることが特に有利である。ここで用いられているような単位剤形とは、治療される対象向けの単位用量として適した、物理的に別個の単位に関する；各単位は必要な製薬キャリアと一緒にすると望ましい治療効果を発揮するように計算された既定量の活性物質を含有している。本発明の新規単位剤形の細部は、（ａ）活性物質の独特な特徴および達成すべき具体的治療効果、および（ｂ）身体的健康がここで詳細に開示されたように損なわれた病状を有する生存対象で疾患の治療用にこのような活性物質を配合する上で当業界に固有の制限により定められ、それらに直接依存している。
【００４３】
主活性成分は、前記のような単位剤形で、適切な製薬上許容されるキャリアと共に、有効量で、便利で有効な投与用に配合される。単位剤形は、例えば、０．５〜約２０００μｇ範囲の量で主活性化合物を含有することができる。割合で表示されたとき、活性化合物はキャリアｍｌ当たり約０．５〜約２０００μｇで通常存在する。補充活性成分を含有する組成物の場合、投与量は上記成分の常用量および投与方式を参考にして決められる。
【００４４】
“動物”とは、霊長類（例えば、ヒト、サル）、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、ブタ）、実験試験動物（例えば、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）、捕獲野生動物（例えば、エミュー、カンガルー、シカ、キツネ）、鳥類（例えば、ニワトリ、カモ、チャボ、キジ、エミュー、ダチョウ）、爬虫類（例えば、トカゲ、ヘビ、カエル）および魚（例えば、マス、サケ、マグロ）を含めたすべての動物に関すると理解すべきである。上記の動物は雄性でもまたは雌性でもよい。
【００４５】
本発明のこれ以上の特徴は下記例で更に詳しく記載されている。しかしながら、この詳細な記載は本発明を例示する目的で単に含まれていることを理解すべきである。上記のような本発明の広い記載に対する制限としては、とにかく理解すべきでない。
【００４６】
例１
ＬＨＲＨ接合体調製物の製造
ＬＨＲＨ接合体は、キャリアタンパク質にカップリングされた合成２‐１０形の黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）ペプチドをベースにしている。そのペプチド自体は小さすぎて抗原性がないため、そのペプチドがハプテンとして作用して、免疫がＬＨＲＨに対して誘導されるためには、キャリアタンパク質にカップリングされることが必要である。キャリアタンパク質はジフテリア‐トキソイドである。
そのペプチドをＦｍｏｃ化学により合成し、得られた２‐１０形ＬＨＲＨペプチドをジフテリアトキソイドにカップリングさせる。カップリングはLaddら,1990またはBonneauら,1994で記載されたように行い、ペプチドおよびジフテリアトキソイドで得られた接合体は未結合ペプチドおよび接合体の他の副産物を含まないようにプロセッシングしてもよい。このようなプロセッシングは慣用的な透析または限外濾過により行える。
得られたＬＨＲＨ‐キャリアタンパク質調製物は、アジュバントと一緒のまたはその中への処方による投与用の組成物を製造するために用いてよい。活性成分およびアジュバントのレベルは、標的とされる種および反応原性の欠如（即ち、組織適合性）に一部依存しており、要求される免疫応答の望ましいレベルおよび期間を得られるように選択される。
【００４７】
例２
Ａ．無タンパク質免疫賦活複合体（IscomatrixTM）の製造
２０％Mega１０洗剤中Quil Ａ（Superfos,Denmark）溶液（無菌）およびジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）／コレステロール溶液を、Quil Ａ：ＤＰＰＣ：コレステロールについて５：１：１（重量）の出発割合をもたらすように計算された量で、無菌温度制御反応容器中ＧＭＰ条件下で無菌的に混合する。反応後に、調製物を限外濾過して、未組込み出発物質および遊離Mega１０洗剤を除去する。IscomatrixTMとして知られるこの調製物は、本質的に無タンパク質免疫賦活複合体粒子からなる前形成アジュバントである。
【００４８】
Ｂ．ＤＥＡＥ‐デキストランおよびIscomatrixTMからなる組合せアジュバントの製造
ＤＥＡＥ‐デキストラン（Pharmacia、ＭＷ範囲５００，０００〜１，５００，０００）は、最初に水に溶解し、ｐＨをＮａＯＨで７．５に調整し、容量を調整して所要濃度にし、その後濾過滅菌することにより、２０％w/v溶液として単に調製する。
次いでIscomatrixTMおよびＤＥＡＥ‐デキストラン＋抗原を適切な比率で混ぜ、その後希釈物を加えて最終容量に調整し、ワクチンのすべての成分について正しい濃度にする。
適量のＤＥＡＥ‐デキストランを、適切な攪拌装置を備えた無菌混合容器に最初に加える。２Ｌ以下の容量の場合には、磁気攪拌棒が適切である。次いで適量のIscomatrixTM（〜２mg/ml）、その後適量の抗原、次いで希釈物を加えて、物質を正しい容量にする。最終処方物全体を適切な等張度にすることで、高張度または生理的オスモル濃度よりも高いことに起因する注射時の痛みを避けられるように、選択される希釈物は低イオン強度のものである。注射に起因するひどい痛みは高度に望ましくなく、処方全体を不適切にすることから、これはワクチン処方業界で特に重要である。イヌ用ワクチンに適することがわかった希釈物は注射用無菌水、即ち無発熱物質蒸留水である。
【００４９】
例３
Ａ．イヌ試験用ワクチンの製造
ａ．ＤＥＡＥ‐デキストランアジュバント単独
この試みで試験するために必要な処方物は、無菌リン酸緩衝液中に、保存剤としてチメロサール（０．０１％）を加えた、ＤＥＡＥ‐デキストラン５０ｍｇ、ＬＨＲＨ‐ジフテリアトキソイド接合体２００μｇを含有する１ｍｌ容量であった。
このワクチン用のアジュバントは、ＤＥＡＥ‐デキストランを蒸留水に溶解して、水酸化ナトリウムでｐＨを７．５に調整することにより調製する。ＤＥＡＥ‐デキストランの最終濃度をｐＨ調整後に蒸留水の添加で２０％w/vに調整する。次いで溶液を濾過滅菌する。ＬＨＲＨペプチド（２‐１０ＬＨＲＨ）を例１で記載されたようにジフテリアトキソイドへ接合させる。その接合体調製物を濾過滅菌し、タンパク質濃度を標準法、例えばＢＣＡタンパク質アッセイで調べる。この研究で用いられる調製物は５．７ｍｇタンパク質／ｍｌであった。
【００５０】
ｂ．IscomatrixTMアジュバント単独
この試みで試験するために必要な処方物は、無菌リン酸緩衝液中に、保存剤としてチメロサール（０．０１％）を加えた、IscomatrixTM６０μｇ、ＬＨＲＨ‐ジフテリアトキソイド接合体２００μｇを含有する１ｍｌ容量であった。
このワクチン用のアジュバントIscomatrixTMは、コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）および洗剤としてMega１０と一緒に、サポニン誘導体としてQuil Ａを用いて、例２Ａで記載されたように調製する。そのプロセスは、添加前にすべての成分を滅菌して、無菌条件下で行う。Quil Ａ濃度は２．２４mg/mlとわかった。
ＬＨＲＨペプチド（２‐１０ＬＨＲＨ）を例１で記載されたようにジフテリアトキソイドへ接合させる。接合体調製物を濾過滅菌し、タンパク質濃度を標準法、例えばＢＣＡタンパク質アッセイで調べる。この研究で用いられる調製物は５．７ｍｇタンパク質／ｍｌであった。
【００５１】
ｃ．IscomatrixTM＋ＤＥＡＥ‐デキストラン
この試みで試験するために必要な処方物は、無菌リン酸緩衝液中に、保存剤としてチメロサール（０．０１％）を加えた、IscomatrixTM６０μｇ＋ＤＥＡＥ‐デキストラン１０ｍｇ、ＬＨＲＨ‐ジフテリアトキソイド接合体２００μｇを含有する１ｍｌ容量であった。
このワクチン用のアジュバントは、適切な割合のIscomatrixTMおよびＤＥＡＥ‐デキストランを混合して得られる、複合アジュバントである。IscomatrixTMは例２で記載されたように製造する。ＤＥＡＥ‐デキストランは上記のように製造する。
ＬＨＲＨペプチド（２‐１０ＬＨＲＨ）を例１で記載されたようにジフテリアトキソイドへ接合させる。接合体調製物を濾過滅菌し、タンパク質濃度を標準法、例えばＢＣＡタンパク質アッセイで調べる。この研究で用いられる調製物は４．９ｍｇタンパク質／ｍｌであった。
【００５２】
Ｂ．イヌの予防接種 
すべての試みを同一に行った。
６〜１２月齢で両性のイヌを、自由に屋外へ出られる屋内オリで飼育した。それらに市販のバランスのとれた食餌を与えた。
イヌ（７匹のグループ）に１ｍｌ用量のワクチンで０および４週目に首筋で皮下予防接種した。すべてのワクチンは２３ゲージ針装備２ｍｌシリンジから投与した。
イヌから規則的間隔で採血して、ＬＨＲＨに対する抗体レベルをモニターした。ワクチンの反応原性は、予防接種後にイヌの綿密な試験により調べた。
試験はワクチン部位および周辺領域の視覚検査および丁寧な手触診によるものであった。
部位反応は、注射部位および周辺領域の綿密な視覚試験および身体触診により評点した。反応は次のように評点した：
０ 目に見えるまたは検出しうる反応なし 
１ 触診で検出しうるのみの反応 
２ 触診せずに検出しうる目視反応 
３ 重度の膿瘍反応 
2012072157.tif 000002
【００５３】
これらの結果は、ＤＥＡＥ‐デキストラン処方物がIscomatrixTM処方物またはIscomatrixTM＋ＤＥＡＥ‐デキストラン処方物よりかなり大きな反応性であることを示している。ＤＥＡＥ‐デキストラン単独のとき、有意の反応（評点１以上）は少くとも２週間にわたり持続した。IscomatrixTM処方物のときは反応が検出されず、ＤＥＡＥ‐デキストラン＋IscomatrixTM処方物では小さな反応が２／７イヌで１週間だけ持続した。
反応原性のより定量的な指標を示すために、部位反応の概算容量を幅×長さ×高さとしてｃｍで測定した。上記表から追加免疫後（ＰＢ）１および２週目の結果が以下で示されている。部位反応容量はIscomatrixTMワクチン処方物グループで示されていないが、それは部位反応が検出されなかったからである。
2012072157.tif 000003
これらの結果は、反応の大きさで示されるように、反応原性の程度がＤＥＡＥ‐デキストラン処方物単独の場合よりもIscomatrixTM＋ＤＥＡＥ‐デキストラン処方物でかなり少ないことを示している。
【００５４】
例４
ＤＥＡＥ‐デキストランおよびIscomatrixの比率を変えたイヌの予防接種
Beagle
foxhound雑種イヌ（８または１３匹のグループ）を、ＤＴへ接合された２‐１０ＬＨＲＨの処方物で予防接種した。活性成分をＤＥＡＥ‐デキストラン単独、Iscomatrix単独または組合せアジュバントＤＥＡＥ‐デキストラン＋Iscomatrix中で処方した。
Ａ）ＤＥＡＥ‐デキストランワクチン：各用量は、ＤＥＡＥ‐デキストラン１０または５０ｍｇおよび２‐１０ＬＨＲＨ‐ＤＴ接合体２００μｇを含有するように処方して、１ｍｌの容量中に含有させた。
Ｂ）Iscomatrix：各用量は、Iscomatrix６０または１５０μｇおよび２‐１０ＬＨＲＨ‐ＤＴ接合体２００μｇで１ｍｌ中に処方した。
Ｃ）組合せアジュバント：各用量は、２‐１０ＬＨＲＨ‐ＤＴ接合体２００μｇと共に下記比率でＤＥＡＥ‐デキストランおよびIscomatrixを含有するように処方して、１ｍｌの容量中に含有させた。
組合せアジュバントは以下を含有していた：
１．ＤＥＡＥ‐デキストラン１０ｍｇおよびIscomatrix６０μｇ‐１０／６０ワクチンと称される
２．ＤＥＡＥ‐デキストラン１２．５ｍｇおよびIscomatrix６０μｇ‐１２．５／６０ワクチンと称される
３．ＤＥＡＥ‐デキストラン１０ｍｇおよびIscomatrix８０μｇ‐１０／８０ワクチンと称される
予防接種スケジュール： 
これらの処方物は０および４週目に皮下注射でイヌに投与した。血液サンプルを２回目予防接種後２週目に採取し、ＬＨＲＨに対する抗体についてアッセイした。
部位反応は１週間隔で注射部位および周辺組織の慎重な触診により調べた。得られた部位反応データは追加免疫予防接種後（ＰＢ）のものである。予防接種に対する反応はある状況下のとき予防接種の継続で増し、そのため追加免疫後の反応原性は一次予防接種後よりも厳密な試験とみなせる。
部位反応評点 
部位反応は、下記スケールの評点で、綿密な検査および触診により評点する。
０ 目に見えるまたは検出しうる反応なし 
１ 触診で検出しうるのみの反応 
２ 触診せずに検出しうる目視反応 
３ 重度の膿瘍反応 
2012072157.tif 000004
【００５５】
部位反応容量 
容量は触診で調べた部位反応の測定サイズから計算し、容量はｍｌで表示されている。この測定値は部位反応の重篤度の良い指標を与える。
2012072157.tif 000005
【００５６】
結 論：
２‐１０ＬＨＲＨジフテリアトキソイド接合体を用いたイヌでのこれらデータは、ＤＥＡＥ‐デキストラン対Iscomatrixの比率を変えた組合せアジュバントが様々な程度の反応原性を有することを示している。様々な処方物の部位反応原性の比較では、デキストランと比較して、ＤＥＡＥ‐デキストラン１２．５ｍｇ対Iscomatrix６０μｇの比率で処方された組合せアジュバントが同用量のＤＥＡＥ‐デキストラン単独とせいぜい同程度の反応原性であることを示している。これは２０８の質量比である。
逆に、ＤＥＡＥ‐デキストラン１０ｍｇおよびIscomatrix８０μｇを含有した処方物はＤＥＡＥ‐デキストラン単独または１２．５／６０処方物よりも有意に低い反応性を有している。この処方物は注射後のいかなる時点でも目に見える反応を示さず、反応容量の比較では、注射後のすべての時点で、１０／８０処方物では反応がかなり少なく、生じたわずかなものでも２週間後にイヌ１３匹中３匹というのがピークであり、許容しうるものであって、期間が短いことを示している。これは１２５の質量比である。
【００５７】
アジュバントの免疫賦活有効性は、発揮された抗体応答の程度および期間により判断される。追加免疫後８週目の抗体力価が、ＤＥＡＥ‐デキストランおよび組合せアジュバントについて以下で示されている。
2012072157.tif 000006
【００５８】
結 論：
上記表の力価は、１０／８０ワクチン（質量比１２５）が組合せアジュバント１２．５／６０ワクチン（質量比２０８）またはＤＥＡＥ‐デキストラン１０ｍｇ単独アジュバントワクチンよりも強い免疫賦活剤であることを示している。
応答性が最低のイヌで最少力価を上昇させたという点で、１０／８０ワクチンの有効性が特に注目される。ワクチン効力は多くの場合に試験群のうち割合の少ない無効応答により減少するが、試験群の割合からみて最大有効応答によっては通常左右されない。
双方の組合せアジュバントワクチンとも、ＤＥＡＥ‐デキストラン単独処方物またはIscomatrixベースワクチンよりも有効である。組合せアジュバントの応答は相加効果よりも大きく、そのため２種成分は相乗的に作用していると判断される。１２５の質量比は低応答イヌを増やす上で有効である。
【００５９】
例５
組合せアジュバントでウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）によるヒツジの予防接種
１．ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）の増殖および不活化：
ウイルス抗原の増殖： 
オーストラリアで感染牛から単離されたＢＶＤＶウイルス２株TrangleおよびBegaを用いた。用いられた増殖培地は、非必須アミノ酸シングルストレンクスおよび３％重炭酸塩、２％ＨＥＰＥＳおよび２％成熟牛血清を含有したEagles最少必須培地であった。
１×１７００ｃｍ２ローラーボトルを０．１の感染多重度（ＭＯＩ）でTrangle（ＡＪ０５０）で接種した。そのボトルを３７℃で５日間にわたりローリングしてインキュベートし、その後凍結した。１×１７００ｃｍ２ローラーボトルを１．０のＭＯＩでBega（ＷＶＳｐ３）で接種し、３７℃で５日間にわたりローリングしてインキュベートし、その後凍結した。ローラーボトルを解凍し、抗原の内容を抗原特異的ＥＬＩＳＡアッセイにより試べた。ワクチン処方物で用いられた調製物の特徴は次の通りである：
Trangle：Ｅ２（表面糖タンパク質）レベル＝１／８ 
ＮＳ３（非構造タンパク質）レベル＝１／８
Bega： Ｅ２レベル＝１／８ 
ＮＳ３レベル＝１／４ 
【００６０】
不活化： 
各ウイルス５０ｍｌを５００ｍｌボトル中に入れ、２．８％重炭酸ナトリウム５０ml/Ｌ＝５ｍｌを加え、１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液２０ml/Ｌ＝２．１ｍｌを加え、β‐プロピオラクトン（ＢＰＬ）１ml/Ｌ＝１０７μＬを加える。
内容物を磁気スターラーを入れた新しい５００ｍｌボトルへ移し、２〜８℃で２１時間攪拌した。不活化物質を３７℃にし、更に３時間攪拌して、残留ＢＰＬを加水分解させた。
【００６１】
２．ワクチン処方：
組合せアジュバント：各用量は不活化ウイルス２ｍｌおよび組合せアジュバント１ｍｌからなっていた。
バルクワクチンは次のように処方した： 
不活化BegaおよびTrangie３０ｍｌ 
組合せアジュバント１５ｍｌ（ｍｌ当たりＤＥＡＥ‐デキストラン１１１ｍｇ
およびIscomatrix８８０μg、１２５の質量比に相当）
保存剤としてチメロサール４５０μＬ
IscomTMアジュバント：各用量は、２ｍｌの全容量中で、双方のウイルス株 およびQuil Ａ相当物としてIscomTM２ｍｇからなっていた。
ワクチンは、攪拌および反転で混合してからバルクプラスチックピローパック中に分配し、２〜８℃で貯蔵した。
【００６２】
予防接種スケジュール： 
双方のワクチンを下記のように投与した：
０日目：ヒツジに、組合せアジュバントワクチン各３ｍｌまたはIscomTM ワクチン２ｍｌで、首に皮下投与した
２８日目：各動物に上記のように２回目のワクチン投与を行った
グループ：ヒツジ１０匹をIscomTMアジュバントワクチンで予防接種した。
ヒツジ４匹を組合せアジュバントワクチンで予防接種した。
【００６３】
部位反応：
組合せアジュバント：ヒツジを一次および二次予防接種後に７日間隔で試験した。ヒツジ４匹中１匹は、一次予防接種後に、評点１の部位反応（目に見えないが、触診しうる小さな腫脹）を呈した。これは予防接種後２週間で消失した。
IscomTM：ヒツジを追加免疫後６日目に試験した。ヒツジ１０匹中７匹は注射部位で大きな反応を呈した。
結論：組合せアジュバントは小さくてまれな部位反応を呈するだけであり、それが低レベルの反応原性を誘導することを示した。
【００６４】
例６
組合せアジュバントでオボアルブミンによるマウスの予防接種
Ｃ５７／Ｂｌｋ６マウス（ｎ＝３／グループ）に、下記で処方された鶏卵アルブミン（オボアルブミン、ＯＶＡ）で皮下予防接種した：
１．ＤＥＡＥ‐デキストラン０．６２５ｍｇ
２．Iscomatrix５μｇ
３．ＤＥＡＥ‐デキストラン０．６２５ｍｇおよびIscomatrix５μｇ。これは、質量比１２５の好ましい組合せアジュバントを含有したワクチンである。
上記ワクチンの各用量は１００μＬ容量中にオボアルブミン１２．５μｇを含有しており、諸成分の容量および濃度を注射用無菌水で調整した。
マウスを１回だけ皮下予防接種して、血液サンプルを一次予防接種後１４日目に安楽死させて採取した。こうして得られた血清をＯＶＡに対するＩｇＭおよびＩｇＧ応答についてアッセイした。
マウスを健康および全身反応原性の徴候についてモニターした。
【００６５】
反応原性： 
ＤＥＡＥ‐デキストランおよび組合せアジュバントグループのマウスは、一次予防接種後も１４日間にわたり健全なままであった。
しかしながら、Iscomatrixで予防接種されたマウス３匹中２匹は予防接種から８日間で死んだ。マウスに対するIscomTM、サポニンおよびIscomatrixの毒性は周知である。組合せアジュバントグループのマウスは健全なままであり、組合せアジュバントが全身的に低い反応原性であることを示した。
【００６６】
抗体力価：
一次予防接種後１４日目に得られた血清を、ＥＬＩＳＡアッセイにより、オボアルブミンに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体力価についてアッセイした。
一次予防接種後１４日目における、オボアルブミンに対するマウスＩｇＭ力価
全力価は１／２００血清希釈度でＥＬＩＳＡ光学密度として示されている。
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一次予防接種後１４日目における、オボアルブミンに対するマウスＩｇＧ力価
全力価は１／２００血清希釈度でＥＬＩＳＡ光学密度として示されている。
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結 論：
上記データは、試験されたすべてのアジュバントで可溶性抗原ＯＶＡによるマウスの免疫が、単回予防接種後１４日間で、ＩｇＭおよびＩｇＧ双方のイソタイプで抗体応答を誘導したことを示している。
組合せアジュバントおよびＤＥＡＥ‐デキストラン単独の処方は、Iscomatrixアジュバントワクチンよりも高い抗体応答を呈した。
当業者であれば、アジュバントの存在下で可溶性抗原によるマウスの単回予防接種は主にＩｇＭ応答を生じると予想したであろう。
組合せアジュバントは、単回予防接種から１４日間で、ＯＶＡで予防接種されたマウスで強いＩｇＧ応答を誘導した。この結果は、ＤＥＡＥ‐デキストランアジュバントが初期ＩｇＭからＩｇＧ応答への切換え期間を短縮して、初期段階で予防接種に対するＩｇＧ応答を増加させるという、以前に公表された結論（Houston et al.,1976）を支持している。これも組合せアジュバントの特性であるらしい。
【００６７】
例７
組合せアジュバントで２‐１０ＬＨＲＨ‐ＤＴによるウシの予防接種
ワクチンおよび予防接種スケジュール： 
未経産の若雌牛（雌性ウシ）に、２‐１０ＬＨＲＨ接合体２００μｇおよび：
１．ＤＥＡＥ‐デキストラン（２００ｍｇ／用量）‐ウシ５０匹
２．組合せアジュバント（ＤＥＡＥ‐デキストラン１５０ｍｇおよびIscomatrix５００μｇ、質量比３００）‐ウシ６匹
で処方されたワクチンを皮下注射で投与した。
すべてのワクチンを２ｍｌ用量として処方した。
ワクチンを０および４週目に投与し、追加免疫後２週目、即ち６週目に採血した。
部位反応を、半定量的な０〜３の評点で、追加免疫後２週目に評点した。
血液サンプルを追加免疫後２週目（６週目）に頚静脈または尾静脈の穿刺により採取した。血清は、それを凝固させ、遠心分離することにより、血液サンプルから得た。ＩｇＧイソタイプの血清力価をＥＬＩＳＡによりＬＨＲＨに対してアッセイした。
【００６８】
部位反応 
部位反応評点を下記スケールでつけた：
０ 目に見えるまたは検出しうる反応なし 
１ 触診で検出しうるのみの反応 
２ 触診せずに検出しうる目視反応 
３ 重度の膿瘍反応 
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結 論：
アジュバントとしてＤＥＡＥ‐デキストランの使用は、予防接種ウシ３匹で評点３の重篤な部位反応（膿瘍）を起こした。
組合せアジュバントはいずれのウシでも重篤な反応を誘導せず、評点３の障害は生じなかった。
【００６９】
抗体力価： 
追加免疫予防接種後２週目にＬＨＲＨに対する血清ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより調べた。
ワクチングループ グループ平均力価 力価の範囲
ＤＥＡＥ‐デキストラン                 ４１８１          100-16836
ＤＥＡＥ‐デキストラン＋IscomatrixTM １５８６９          1841-51920
結 論：
組合せアジュバントは、１５，０００より大きなグループ平均力価で、すべての予防接種ウシで高力価を誘導した。比較すると、アジュバントとしてＤＥＡＥ‐デキストラン単独の使用は４１８１の低いグループ平均力価を示し、かなり低い応答範囲であった。
【００７０】
当業者であれば、ここで記載された発明が具体的に記載されたもの以外のバリエーションおよび改変をうけることもある、とわかるであろう。本発明にはすべてのこのようなバリエーションおよび改変を含むことが、理解されるべきである。本発明には、この明細書で言及または記載されたすべてのステップ、特徴、組成物および化合物を個別的または包括的に、更には上記ステップまたは特徴のうちいずれか２以上のすべての組合せも包含している。
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