(57)【要約】【課題】癌患者における、５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法の施行に当たり、その治療効果を精度良く予測できる方法の提供。【解決手段】患者から採取した生体試料に含まれるｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１７＊、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ａ＊、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−６３０及びｌｅｔ−７ａ＊から選ばれる１以上のｍｉＲＮＡの発現量を指標とした、癌患者における５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法に対する治療効果を予測する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）〜（２）を含む、癌患者における５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法に対する治療効果を予測する方法：
（１）患者から採取された癌細胞を含み得る生体試料に含まれるｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１７＊、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ａ＊、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−６３０及びｌｅｔ−７ａ＊から選ばれる１以上のｍｉＲＮＡの発現量を測定する工程、
（２）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの場合に、患者が５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法に対し治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
（ａ）上記工程（１）で得られたｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−２２３から選ばれる１以上のｍｉＲＮＡの発現量が、組織学的効果を予測するための対応するカットオフ値より高い場合
（ｂ）上記工程（１）で得られたｍｉＲ−２２３の発現量が、ＲＥＣＩＳＴ分類による治療効果を予測するための対応するカットオフ値より高い場合、又は上記工程（１）で得られたｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１７＊、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ａ＊、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−２２３及びｌｅｔ−７ａ＊から選ばれる１以上のｍｉＲＮＡの発現量がＲＥＣＩＳＴ分類による治療効果を予測するための対応するカットオフ値より低い場合
（ｃ）上記工程（１）で得られたｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−２２３及びｍｉＲ−６３０から選ばれる１以上のｍｉＲＮＡの発現量が、ダウンステージ効果を予測するための対応するカットオフ値より高い場合
【請求項２】
５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤が、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム＝１：０．４：１（モル比））である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
癌患者が、結腸直腸癌患者である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
化学療法が、さらに放射線療法を併用するものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１７＊、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ａ＊、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−６３０及びｌｅｔ−７ａ＊から選ばれる１種以上のｍｉＲＮＡと特異的にハイブリダイズするプライマー及び／又はプローブを含有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法に使用するための診断キット。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法により５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法が治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に投与することを特徴とする、５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含有する抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌患者における、５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法に対する治療効果を予測する方法および診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌治療、特に結腸直腸癌の治療においては、外科手術による腫瘍摘出が標準治療であるが、腫瘍が大きい場合などは、腫瘍摘出が困難である。そこで、腫瘍摘出の前に、腫瘍摘出を行いやすくするために、腫瘍を縮小させる化学放射線療法（いわゆる術前補助化学放射線療法）が行われており、具体的には、５−フルオロウラシル／ロイコボリン放射線療法やＴＳ−１（テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウムを１：０．４：１で配合した製剤、商品名：ティーエスワン（登録商標）、大鵬薬品工業製）／イリノテカン放射線療法など、５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤をベースとした化学放射線療法が用いられている。
【０００３】
しかし、これら術前補助化学放射線療法は、患者の体質によっては腫瘍縮小効果が不十分である場合があり、術前補助化学放射線療法を施行する前に、その効果を予測することができれば、不要な化学放射線療法を減らすことができ、ひいては患者のＱＯＬ及び医療経済の面からも好ましい。このような考えの下、結腸直腸癌における５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学放射線療法の効果予測についての多くの研究が行われており、例えば、Ｍｅｔ、ＭＭＰ７（非特許文献１）、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｌｅｔ−７ｇ（非特許文献２）の発現がＴＳ−１の治療効果と関連していることが報告されている。
【０００４】
しかしながら、これらの知見に基づく化学放射線療法の効果予測は不十分であり、さらに優れた化学療法の効果予測方法が望まれている。
【非特許文献１】日本外科学会誌  ２００７；１０８臨時増刊２号、１２６．ＰＤ−７−７
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．  ２００６；３（５）：３１７−３２４．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、癌患者における５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法の施行に当たり、その感受性を精度良く予測できる方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、癌に対する５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤の治療効果を予測する方法について研究を重ねた結果、結腸直腸癌において、下表１記載のｍｉＲＮＡの発現とテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤に対する治療効果（組織学的効果、ＲＥＣＩＳＴ分類による治療効果又はダウンステージ効果）が統計学上有意に相関し、当該ｍｉＲＮＡの発現量を測定することにより、癌患者における５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤の治療効果を予測できることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の１）〜６）に係るものである。
１）下記工程（１）〜（２）を含む、癌患者における５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法に対する治療効果を予測する方法：
（１）患者から採取された癌細胞を含み得る生体試料に含まれるｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１７＊、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ａ＊、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−６３０及びｌｅｔ−７ａ＊から選ばれる１以上のｍｉＲＮＡの発現量を測定する工程、
（２）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの場合に、患者が５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法に対し治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
（ａ）上記工程（１）で得られたｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−２２３から選ばれる１以上のｍｉＲＮＡの発現量が、組織学的効果を予測するための対応するカットオフ値より高い場合
（ｂ）上記工程（１）で得られたｍｉＲ−２２３の発現量が、ＲＥＣＩＳＴ分類による治療効果を予測するための対応するカットオフ値より高い場合、又は上記工程（１）で得られたｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１７＊、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ａ＊、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−２２３及びｌｅｔ−７ａ＊から選ばれる１以上のｍｉＲＮＡの発現量がＲＥＣＩＳＴ分類による治療効果を予測するための対応するカットオフ値より低い場合
（ｃ）上記工程（１）で得られたｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−２２３及びｍｉＲ−６３０から選ばれる１以上のｍｉＲＮＡの発現量が、ダウンステージ効果を予測するための対応するカットオフ値より高い場合
２）５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤が、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤（テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム＝１：０．４：１（モル比））である、上記１）の方法。
３）癌患者が、結腸直腸癌患者である、上記１）又は２）の方法。
４）化学療法が、さらに放射線療法を併用するものである、上記１）〜３）のいずれかの方法。
５）ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１７＊、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ａ＊、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−６３０及びｌｅｔ−７ａ＊から選ばれる１種以上のｍｉＲＮＡと特異的にハイブリダイズするプライマー及び／又はプローブを含有する、上記１）〜４）のいずれかの方法に使用するための診断キット。
６）上記１）〜４）のいずれかの方法により５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法が治療効果を示す可能性が高いと予測された癌患者に投与することを特徴とする、５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含有する抗腫瘍剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の予測方法は、癌患者、特に結腸直腸癌患者における、５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤（特に、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤）を投与する化学療法（又は化学放射線療法）に対する感受性を精度良く予測できるため、術前化学放射線療法を施行する場合等において、当該化学療法の開始及び継続の判断に有用であり、ひいては患者のＱＯＬや医療経済の改善に貢献しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の予測方法は、後述する本発明のｍｉＲＮＡの発現量を指標として、５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤に対する治療効果を予測するものである。ここでｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡとも呼ばれる）とは、２０〜２５塩基ほどの１本鎖ＲＮＡであり、それ自身はタンパク質をコードしていないものの、他の遺伝子のｍＲＮＡと結合することにより、その発現を調節する機能を有していると考えられている。
【００１０】
本発明のｍｉＲＮＡは下表に記載された１２種類のｍｉＲＮＡから選ばれるものである。後述する実施例のとおり、これらのｍｉＲＮＡを指標として、５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤に対する治療効果を予測することが可能である。また、これらｍｉＲＮＡの塩基配列はすべて公知であり、各ｍｉＲＮＡの情報は下表に示すｍｉＲＢＡＳＥ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏに基づきｍｉＲＢＡＳＥ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）などから入手することができる。また、本発明のｍｉＲＮＡは、下表の配列番号で示した塩基配列からなる成熟したｍｉＲＮＡだけではなく、その前駆体であるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを含むものである。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
本発明において、５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤とは、５−フルオロウラシルだけではなく、活性代謝物質が５−フルオロウラシルである５−フルオロウラシル誘導体を含むものであり、具体的には、５−フルオロウラシル、テガフール、テガフール・ウラシル配合剤、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、ドキシフルリジン、カペシタビン、カルモフールなどが例示できる。これらのうちテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤が好ましく、テガフール、ギメラシル、オテラシルカリウムを１：０．４：１のモル比で配合したテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤が特に好ましい。
【００１３】
本発明における化学療法は、５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含むものであれば特に制限はなく、さらに別の抗腫瘍剤を併用しても良い。例えば、ロイコボリン、イリノテカン、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、放射線照射などと併用しても良い。好ましくは、５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤単独投与又は５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤と放射線の併用である。
【００１４】
本発明の化学療法は、その施行の前後に腫瘍摘出を伴うものであっても、伴わないものであってもよく、好ましくは腫瘍摘出前に施行される術前補助化学療法である。
本発明において、有効成分であるテガフール（一般名、化学名：５−フルオロ−１−（２−テトラヒドロフリル）−２，４−（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン）は、公知の化合物であり、生体内で活性化を受けて抗腫瘍活性の本体である５−フルオロウラシルを放出する薬剤である。テガフールは、公知の方法、例えば特公昭４９−１０５１０号に記載されている方法に従って製造できる。
【００１５】
本発明において、有効成分であるギメラシル（一般名、化学名：２，４−ジヒドロキシ−５−クロロピリジン）も、公知の化合物であり、それ自身全く抗腫瘍活性を有さないものであるが、５−フルオロウラシルが生体内において代謝されて不活性化されることを抑制するものであり、抗腫瘍効果を増強させることができる。
本発明において、有効成分であるオテラシルカリウム（一般名、化学名：モノポタシウム  １，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−１，３，５−トリアジン−６−カルボキシレート）も公知の化合物であり、それ自身は抗腫瘍活性を有さないが、主に消化管に分布してその部位での５−フルオロウラシルの活性化を抑制することにより消化管障害を抑制するものである。
【００１６】
本発明の化学療法において投与されるテガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤の各有効成分の割合は、それぞれの配合目的を奏する範囲であれば特に制限されず、例えば、特許第２６１４１６４号公報に記載されている公知の配合剤と同様の範囲で良く、テガフール１モルに対して、ギメラシルを０．１〜５モル程度、好ましくは０．２〜１．５モル程度とすればよく、オテラシルカリウムを０．１〜５モル程度、好ましくは０．２〜２モル程度とすればよい。特に好ましくは、テガフール：ギメラシル：オテラシルカリウム（モル比）＝１：０．４：１である。
【００１７】
本発明の抗腫瘍剤における各有効成分の投与量及び投与スケジュールは、用法、患者の年齢、性別、病期、転移の有無、治療暦、他の抗腫瘍剤の有無などの条件により適宜選択される。また、各有効成分は１日に１回又は複数回に分けて投与される。各有効成分が１日に複数回に分けて投与される場合、各有効成分は同時又は間隔を空けて投与され、その投与順序は特に制限されない。
【００１８】
本発明の抗腫瘍剤における投与形態としては特に制限は無く、具体的には経口剤（錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤など）、注射剤、坐剤、貼付剤、軟膏剤等が例示できる。
【００１９】
本発明の抗腫瘍剤は、薬理学的に許容される担体を用いて、それぞれの投与形態に応じて通常公知の製剤化方法により製造される。かかる担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を例示できる。
【００２０】
本発明の予測方法の対象となる癌は特に制限はなく、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、肝癌、腎癌、膵癌、胆道癌、膀胱癌、子宮頸癌などが例示でき、結腸直腸癌が好ましく、直腸癌が特に好ましい。
【００２１】
本発明の予測方法は、具体的には、患者から採取された癌細胞を含み得る生体試料に含まれる上記のｍｉＲＮＡの発現量を測定する工程（１）と、後記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの場合に、患者が５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法に対し治療効果を示す可能性が高いと予測する工程（２）を行うものである。
【００２２】
１）工程（１）
生体試料としては、癌患者から採取したものであり癌細胞を含む可能性がある試料であれば特に限定されず、体液（血液、尿等）、組織、その抽出物及び採取した組織の培養物などが例示できる。また、生体試料の採取方法は、生体試料の種類や癌種に応じ適宜選択することができる。生体試料からのＲＮＡの調製は、通常公知の方法により行うことができる。
【００２３】
ｍｉＲＮＡの発現量は、各ｍｉＲＮＡと特異的にハイブリダイズするプローブ又はプライマーを用いて、ｍｉＲＮＡマイクロアレイ法、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法など公知の遺伝子発現量測定法に従い測定することができる。
【００２４】
斯かるプローブ及びプライマーは、ｍｉＲＮＡの塩基配列内の少なくとも１５塩基長〜全塩基長、好ましくは１８塩基長〜全塩基長の連続した塩基配列と特異的にハイブリダイズするように、通常公知のプローブ又はプライマー設計方法に従い上記各塩基長を有するポリヌクレオチドとして設計される。
なお、当該プローブは、各ｍｉＲＮＡと特異的にハイブリダイズするものであれば、完全に相補的である必要はない。かかるポリヌクレオチドとして、好ましくは各ｍｉＲＮＡの塩基配列において連続する少なくとも１５塩基以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその相補ポリヌクレオチドと比較して、塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するポリヌクレオチドである。ここで、塩基配列の同一性は、相同性検索、配列アラインメントプログラム、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣｌｕｓｔａｌＷなどにて計算することができる。
【００２５】
なお、本発明において「特異的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されないことをいう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、通常公知の方法に従ってハイブリッドを形成する核酸の融解温度（Ｔｍ）などに基づいて決定することができる。具体的なハイブリダイズ状態を維持できる洗浄条件として通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件、より厳格には「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度の条件、さらに厳格には「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件が挙げられる。
【００２６】
また、本発明のｍｉＲＮＡの塩基配列が公知であるため、当該プローブ又はプライマーは、当該塩基配列に基づいて、通常公知の合成方法、例えば市販のヌクレオチド合成機によって作製することができる。また、当該塩基配列を鋳型としてＰＣＲ法によって調製することもできる。
【００２７】
また、当該プローブ又はプライマーは、ｍｉＲＮＡを容易に検出できるように、通常慣用されている放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、または酵素で標識されていてもよい。
【００２８】
ｍｉＲＮＡマイクロアレイ法によるｍｉＲＮＡの発現量の測定は、通常公知の方法により行うことができる。例えば、患者の癌細胞から抽出されたＲＮＡを脱リン酸化し、これを放射性同位元素や蛍光物質などで標識する。標識されたＲＮＡをｍｉＲＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイズさせる。続いて、形成されたプローブとＲＮＡの二本鎖の量を、該プローブの標識に由来するシグナルとして測定する。シグナルの検出は、プローブの標識物に応じて通常公知の方法、例えば、放射線検出器や蛍光検出器で測定して行うことができる。なお、市販ｍｉＲＮＡマイクロアレイ法用キットを利用して、該キットのプロトコールにしたがって実施することも可能である。
【００２９】
ノーザンブロット法によるｍｉＲＮＡの発現量の測定は、通常公知の方法により行うことができる。例えば、患者の癌細胞から調製されたＲＮＡをナイロンメンブレン等にトランスファーしておき、これに放射性同位元素や蛍光物質などで標識されたプローブをハイブリダイズさせる。続いて、形成されたプローブとＲＮＡの二本鎖の量を、該プローブの標識に由来するシグナルとして測定する。シグナルの検出は、プローブの標識物に応じて通常公知の方法、例えば、放射線検出器や蛍光検出器で測定して行うことができる。なお、市販ノーザンブロット法用キットを利用して、該キットのプロトコールにしたがって実施することも可能である。
【００３０】
ＲＴ−ＰＣＲ法によるｍｉＲＮＡの発現量の測定は、通常公知の方法により行うことができる。例えば、患者の癌細胞から調製されたＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、これに放射性同位元素や蛍光物質などで標識された一対のプライマーをハイブリダイズさせて、通常公知の方法に従いＰＣＲを行う。続いて、得られた増幅二本鎖ＤＮＡの量を、当該プライマーの標識に由来するシグナルとして測定する。シグナルの検出は、通常公知の方法、例えば、放射線検出器や蛍光検出器で測定して行うことができる。なお、市販ＲＴ−ＰＣＲ用キットを利用して、該キットのプロトコールにしたがって実施することも可能である。
【００３１】
２）工程（２）
本工程において、前記工程（１）によって測定されたｍｉＲＮＡの発現量を用いて、５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法に対して治療効果を示す可能性が予測されるが、ここで「治療効果を示す」とは、腫瘍の大きさが一定の割合で縮小することなどを指し、具体的には（１）組織学的効果がｇｒａｄｅ２以上であること、（２）ＲＥＣＩＳＴ分類による治療効果がＰＲ以上であること、（３）ダウンステージ効果があること、のいずれかの基準を満たすことをいう。
なお、「組織学的効果」とは、患者検体を病理組織学的検査することのより判断される効果であり、その効果は大腸癌研究会「大腸癌取扱い規約」（第６版）に準じて以下の基準により判断されるものである。
ｇｒａｄｅ−０：無効（癌細胞に治療による変性、壊死などの障害をほとんど認めない。）、
ｇｒａｄｅ−１ａ：ごく軽度の効果（癌の約１／３未満に変性・壊死ならびに融解などを認める。）、
ｇｒａｄｅ−１ｂ：軽度の効果（癌の１／３以上２／３未満に癌細胞の変性・壊死ならびに融解などを認める。）、
ｇｒａｄｅ−２：かなりの効果（癌の２／３以上に著明な変性・壊死ならびに融解・消失などを認める。）、
ｇｒａｄｅ−３：著効（癌全体がすべて壊死に陥っているか、または融解、消失した場合。肉芽様組織あるいは線維化巣で置き換えられている。）。
【００３２】
また、「ＲＥＣＩＳＴ分類による治療効果」は、ＲＥＣＩＳＴ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ）ガイドライン日本語訳ＪＣＯＧ版に準じて以下の基準により判断されるものである。
完全奏効（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ；  ＣＲ）：すべての標的病変の消失。
部分奏効（ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ；  ＰＲ）：ベースライン長径和と比較して標的病変の最長径の和が３０％以上減少。
【００３３】
進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ；  ＰＤ）：治療開始以降に記録された最小の最長径の和と比較して標的病変の最長径の和が２０％以上増加。
安定（ｓｔａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ；  ＳＤ）：ＰＲとするには腫瘍の縮小が不十分で，かつＰＤとするには治療開始以降の最小の最長径の和に比して腫瘍の増大が不十分。
【００３４】
また、「ダウンステージ効果」とは、ＴＮＭ分類（腫瘍の大きさや転移の有無などにより判断される分類）に基づくステージ分類（Ｓｔａｇｅ０〜IV）において、化学療法の前後でステージが下がる
効果である。なお、ＴＮＭ分類やステージ分類は大腸癌研究会「大腸癌取扱い規約」（第６版）に準じて判断されるものである。
【００３５】
治療効果の予測は、具体的には、工程（１）で得られたｍｉＲＮＡの発現量と治療効果を予測するための対応するカットオフ値を比較し、その高低により行われる。すなわち、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか１以上の条件に該当するとき、患者が５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法に対し治療効果を示す可能性が高いと予測できる。
（ａ）ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−２２３から選ばれる１以上のｍｉＲＮＡの発現量が、組織学的効果を予測するための対応するカットオフ値より高い場合
（ｂ）ｍｉＲ−２２３の発現量が、ＲＥＣＩＳＴ分類による治療効果を予測するための対応するカットオフ値より高い場合、又はｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１７＊、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ａ＊、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−２２３及びｌｅｔ−７ａ＊から選ばれる１以上のｍｉＲＮＡの発現量がＲＥＣＩＳＴ分類による治療効果を予測するための対応するカットオフ値より低い場合
（ｃ）ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−２２３及びｍｉＲ−６３０から選ばれる１以上のｍｉＲＮＡの発現量が、ダウンステージ効果を予測するための対応するカットオフ値より高い場合
【００３６】
また、上記（ａ）のいずれか１つ以上の条件に該当するとき、患者が５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法に対しｇｒａｄｅ２以上の組織学的効果を示す可能性が高いと予測すること、上記（ｂ）のいずれか１つ以上の条件に該当するとき、患者が５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法に対しＰＲ以上のＲＥＣＩＳＴ分類による治療効果を示す可能性が高いと予測すること、上記（ｃ）のいずれか１つ以上の条件に該当するとき、患者が５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法に対しダウンステージ効果を示す可能性が高いと予測することも可能である。
【００３７】
本発明におけるカットオフ値は、ｍｉＲＮＡ発現量の測定方法の種類などの諸条件により変動するものであるため、条件に合わせて予め設定する必要がある。ここでカットオフ値は、予め測定しておいた本発明のｍｉＲＮＡの発現量から種々の統計解析手法により求めることができる。例えば、ｇｒａｄｅ２以上の組織学的効果を予測するためのカットオフ値としては、５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法を受けた患者における本発明のｍｉＲＮＡの発現量の平均値や中央値など、及び５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法を受けた患者における本発明のｍｉＲＮＡの発現量と各患者の組織学的効果との関係から感度と特異度の和が最大となるようＲＯＣ分析に基づき求められる値が例示できる。なお、ここでＲＯＣ分析（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）とは、臨床検査診断に頻用されている、感度と特異度の和が最大となる閾値を求める分析手法である。また、ＰＲ以上のＲＥＣＩＳＴ分類における治療効果やダウンステージ効果を予測するためのカットオフ値についても、同様の考え方により適宜カットオフ値を設定できる。
【００３８】
また、後述する実施例のとおり、ｍｉＲＮＡマイクロアレイ法によりｍｉＲＮＡの発現量を測定する場合における、ｇｒａｄｅ２以上の組織学的効果を予測する場合のカットオフ値（ＲＯＣ分析）としては、例えばｍｉＲ−１４２−３ｐが１９７９．１７、ｍｉＲ−２２３が２２６２．６４、ＲＥＣＩＳＴ分類におけるＰＲ以上の治療効果を予測する場合のカットオフ値（ＲＯＣ分析）としては、ｍｉＲ−１７が７２０．６９、ｍｉＲ−１７＊が６３．５７、ｍｉＲ−２０ａが１３７９．５３、ｍｉＲ−２０ａ＊が２１．１９、ｍｉＲ−２０ｂが４８４．５５、ｍｉＲ−９２ａが８０１．８７、ｍｉＲ−１０６ａが１０１．０１、ｍｉＲ−２２３が２３９０．０４、ｌｅｔ−７ａ＊が２．１３、ダウンステージ効果を奏することを予測する場合のカットオフ値（ＲＯＣ分析）としては、ｍｉＲ−１２６＊が６０．２９、ｍｉＲ−２２３が１３４９．００、ｍｉＲ−６３０が１３８．２２、の如く例示できる。
【００３９】
本発明の予測方法は、５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤を含む化学療法を受ける前（又は受けた後）に適用されても、受けている間に適用されても良い。前者の場合、本発明の予測方法は当該化学療法の開始（又は再開）判断に有用であり、後者の場合、当該化学療法の継続判断に有用である。
【００４０】
本発明の診断キットは、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１７＊、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２０ａ＊、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−６３０及びｌｅｔ−７ａ＊から選ばれる１種以上のｍｉＲＮＡと特異的にハイブリダイズするプライマー及び／又はプローブを含有するものであり、本発明の予測方法に使用するための診断用試薬として有用である。
当該診断キットは、上記のプライマー及び／又はプローブの他に、ｍｉＲＮＡの検出に必要な１種以上の成分を含んでもよい。斯かる成分としては、例えば、制限酵素、ポリメラーゼ、バッファー、ｄＮＴＰ、標識用及び検出用試薬、説明書等が挙げられる。
【実施例】
【００４１】
実施例１  ｍｉＲＮＡマイクロアレイ解析
直腸癌患者２２例に対して、ＴＳ−１（大鵬薬品工業製）と放射線を併用した術前化学放射線療法を施行した。ＴＳ−１は体表面積に従い、テガフール換算量で８０〜１２０ｍｇ／日を１日２回５日間連日内服した後２日間休薬した。放射線は２Ｇｙを、ＴＳ−１同日に、すなわち５日間連日照射した後２日間休止した。この１週間を１コースとして４コース実施した（ｔｏｔａｌ  ４０Ｇｙ）。 ＴＳ−１の初回基準量（１回量）は体表面積に合わせて次の基準値とし、朝食後及び夕食後の１日２回に経口投与した。
【００４２】
【表２】
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【００４３】
術前化学放射線療法施行後に、術前生検を行い生体試料を得た。生体試料からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ｔａｋａｒａ製）を用いて脱リン酸化を行った。また、ｍｉＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｐＣｐ−Ｃｙ３（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いて各サンプルを標識化した。
【００４４】
調整した各サンプルについて、Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｖ２（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いて、８２１のｍｉｃｒｏＲＮＡについてｍｉＲＮＡマイクロアレイ解析を行った。なお、シグナルの測定は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）により行い、得られたシグナル値が０．０１以下の場合に０．０１に置き換える標準化を行った。
【００４５】
シグナル値についてＱｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌを行い、シグナル値が低く信頼性の低いデータを除去し、残った２０６のｍｉｃｒｏＲＮＡについて解析を行った。
【００４６】
「組織学的効果」「ＲＥＣＩＳＴ分類による治療効果」「ダウンステージ効果」について、各症例の治療結果から群分けを行い、標準化したシグナル値が群間で１．５倍以上変動しており、且つその変動が統計学的に有意差があるｍｉＲＮＡを抽出した（ｔ検定：Ｐ＜０．０５）。結果を以下に示す。
（１）組織学的効果
【００４７】
【表３】
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【００４８】
効果あり群（ｇｒａｄｅ２、３）：１５例、効果なし群（ｇｒａｄｅ０、１）：７例（奏効率６８％）。効果あり群においてｍｉＲ−１４２−３ｐ、２２３が有意に高発現していた。
また、効果あり群を予測するためのＲＯＣ分析により求められた各ｍｉＲＮＡ量のカットオフ値は、それぞれ、ｍｉＲ−１４２−３ｐが１９７９．１７、ｍｉＲ−２２３が２２６２．６４であり、このカットオフ値による効果あり群の予測率はそれぞれ、ｍｉＲ−１４２−３ｐが１００．０％、ｍｉＲ−２２３が９０．９％と顕著に高いものであった。
したがって、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、２２３は、それぞれ独立して、５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤、特にＴＳ−１を含む術前化学放射線療法において、組織学的効果を予測する因子として有用である。
【００４９】
（２）ＲＥＣＩＳＴ分類による治療効果
【００５０】
【表４】
2012039876.tif 000005
【００５１】
ＲＥＣＩＳＴ分類に基づくＰＲ：１４例、ＳＤ：８例（奏効率６３％）。ＰＲ症例においてｍｉＲ−２２３が有意に上昇しており、ｍｉＲ−１７、１７＊、２０ａ、２０ａ＊、２０ｂ、９２ａ、１０６ａ、ｌｅｔ−７ａ＊が有意に低下していた。
また、ＰＲ以上の群を予測するためのＲＯＣ分析により求められた各ｍｉＲＮＡ量のカットオフ値は、それぞれ、ｍｉＲ−１７が７２０．６９、ｍｉＲ−１７＊が６３．５７、ｍｉＲ−２０ａが１３７９．５３、ｍｉＲ−２０ａ＊が２１．１９、ｍｉＲ−２０ｂが４８４．５５、ｍｉＲ−９２ａが８０１．８７、ｍｉＲ−１０６ａが１０１．０１、ｍｉＲ−２２３が２３９０．０４、ｌｅｔ−７ａ＊が２．１３であり、このカットオフ値によるＰＲ以上の群の予測率はそれぞれ、ｍｉＲ−１７が９１．７％、ｍｉＲ−１７＊が９１．７％、ｍｉＲ−２０ａが９１．７％、ｍｉＲ−２０ａ＊が９１．７％、ｍｉＲ−２０ｂが９１．７％、ｍｉＲ−９２ａが９２．３％、ｍｉＲ−１０６ａが９２．３％、ｍｉＲ−２２３が９０．０％、ｌｅｔ−７ａ＊が１００．０％と顕著に高いものであった。
したがって、ｍｉＲ−１７、１７＊、２０ａ、２０ａ＊、２０ｂ、９２ａ、１０６ａ、２２３、ｌｅｔ−７ａ＊は、それぞれ独立して、５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤、特にＴＳ−１を含む術前化学放射線療法において、ＲＥＣＩＳＴ分類を予測する因子として有用である。
【００５２】
（３）ダウンステージ効果
【００５３】
【表５】
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【００５４】
ダウンステージあり群：１３例、ダウンステージなし群：９例。ダウンステージあり群においてｍｉＲ−１２６＊、２２３、６３０が有意に高発現していた。
また、ダウンステージ効果あり群を予測するためのＲＯＣ分析により求められた各ｍｉＲＮＡ量のカットオフ値は、それぞれ、ｍｉＲ−１２６＊が６０．２９、ｍｉＲ−２２３が１３４９．００、ｍｉＲ−６３０が１３８．２２であり、このカットオフ値によるダウンステージ効果あり群の予測率はそれぞれ、ｍｉＲ−１２６＊が８０．０％、ｍｉＲ−２２３が８０．０％、ｍｉＲ−６３０が８８．９％と顕著に高いものであった。
したがって、ｍｉＲ−１２６＊、２２３、６３０は、それぞれ独立して、５−フルオロウラシル系抗腫瘍剤、特にＴＳ−１を含む術前化学放射線療法において、ダウンステージ効果を予測する因子として有用である。
【配列表】
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