(57)【要約】      （修正有）【課題】器具に残留した蛋白質を正確に抽出し、高感度で測定可能な蛋白質抽出方法、蛋白質検出方法及び蛋白質検出装置を提供する。【解決手段】器具に付着した蛋白質を抽出する方法であって、前記器具を抽出液に浸漬させるとともに、超音波を照射することを特徴とする。前記蛋白質検出方法は、前記蛋白質溶液と蛍光試薬とを反応させる反応工程と、反応させた溶液に励起光を照射して蛍光量を測定する蛍光測定工程と、前記蛍光測定工程にて測定された蛍光量に基づいて、前記蛋白質溶液の濃度を算出する定量工程を含むことを特徴とする。【選択図】図１
2012063298.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
器具に付着した蛋白質を抽出する方法であって、
前記器具を抽出液に浸漬させるとともに、超音波を照射することを特徴とする蛋白質抽出方法。
【請求項２】
前記抽出液は、純水であることを特徴とする請求項１に記載の蛋白質検出方法。
【請求項３】
前記抽出液は、濃度が２０ｍＭ以下のアルカリ溶液であることを特徴とする請求項１に記載の蛋白質抽出方法。
【請求項４】
前記器具は洗浄後のものであることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の蛋白質抽出方法。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれかに記載の蛋白質抽出方法を用いて得られた蛋白質溶液を用いて、蛋白質を検出することを特徴とする蛋白質検出方法。
【請求項６】
前記蛋白質検出方法は、前記蛋白質溶液と蛍光試薬とを反応させる反応工程と、
反応させた溶液に励起光を照射して蛍光量を測定する蛍光測定工程と、
前記蛍光測定工程にて測定された蛍光量に基づいて、前記蛋白質溶液の濃度を算出する定量工程を含むことを特徴とする請求項５に記載の蛋白質検出方法。
【請求項７】
前記蛍光試薬は、ナノオレンジであることを特徴とする請求項５に記載の蛋白質検出方法。
【請求項８】
請求項５から請求項７のいずれかに記載の蛋白質検出方法を用いて、前記器具に付着した蛋白質量を測定することを特徴とする蛋白質検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療機関などで用いる各種医療器具や、食品製造分野で用いる各種製造器具等に付着する蛋白質を抽出する方法、蛋白質検出方法、及び蛋白質検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
病院等の医療機関や検査機関における検査数、治療数の増大に伴い、検査や治療による感染事故が国内外で多数報告されている。これら感染例の多くは、内視鏡、管状カテーテル類、鉗子類、剪刀類などの医療器具の不十分な洗浄消毒によることが原因とされており、検査や治療に伴う感染の完全な防止方法の確立が求められている。また、食品製造分野においても、使用される器具や設備に付着した汚れに起因した、食中毒などの被害の発生を防止するために、食品の加工・製造に用いられる器具や設備における衛生面での管理が強く求められている。
【０００３】
特に、医療分野においては、手術器具や内視鏡等の医療用器具は、ウォッシャーディスインフェクター等の医療用洗浄機を用いて汚染物を洗浄除去したのちに、滅菌処理を行い、再利用されるが、洗浄工程での洗浄残渣があると、十分な滅菌処理が行えず、感染の危険性が高くなる。このため、洗浄機での洗浄後に洗浄残渣である残留蛋白質を測定し、医療用洗浄機の性能確認を行うことで、洗浄工程の管理が行われている。従来、この残留蛋白質の検出方法としては、特許文献１に示すように、アルカリ水溶液に洗浄後の器具を浸漬させ、器具に付着した残留蛋白質を溶出させたものに対し、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０や、アミドブラック１０Ｂ等を用いて蛋白質を染色し、目視や吸光度計により色差を測定する方法が知られている。
【０００４】
しかしながら、特許文献１に示された方法では、蛋白質量の定量評価が可能であるが、検出感度はせいぜい１μｇ／ｍｌ程度であり、十分な検出感度、例えば、１μｇ／ｍｌ以下の蛋白質濃度を測定することが困難であった。また、アミドブラック１０Ｂを用いた染色では、目視での判定となり、定量評価が行えない。このため、院内感染リスクを極力低減させるために、洗浄機の性能向上へのニーズが高まっているにもかかわらず、高感度の検査が行えないという問題がある。
【０００５】
一方、蛋白質を高感度で検出する方法として、蛍光試薬を用いて蛋白質と反応させ、蛍光量を測定することにより、検出する方法（以下、蛍光法と記載する。）が一般に知られている。例えば、非特許文献１に記載されているように、蛍光法では１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの微量の蛋白質検出が可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１４５２７１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．４（２００３）  ８５０−８６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、一般的な蛍光法は、蛋白質溶液に溶け込んだ蛋白質を高感度に検出できるという点ではすぐれているが、前記非特許文献には、蛋白質溶液をどのように作製するか、あるいはどのように蛋白質を抽出液中に抽出するかについては、記載されていない。このため、洗浄後の器具から抽出した蛋白質溶液を用いて、器具に付着した残留蛋白質量を測定するといった特殊な用途においては、蛋白質の抽出に用いられたアルカリ水溶液に含まれる水酸化ナトリウムなどの測定妨害物質が存在し、残留蛋白質の量を正しく測定することが困難であるといった課題について、何ら解決方法を提供するものではない。すなわち、該文献に示された蛍光法をそのまま適用したとしても、蛍光試薬はアルカリ水溶液と反応することから、正確に蛋白質量を測定することが困難となる。また、アルカリ性が強い水溶液では蛋白質が変性し、高感度に蛋白質を検出する上で問題であった。
【０００９】
また、蛋白質量の測定に影響を与えない程度のアルカリ濃度の水溶液、もしくは純水に、洗浄後の器具を浸漬して器具に付着した残留蛋白質を抽出することは、ある程度は可能であるが、ただ浸漬するだけでは器具付着した残留蛋白質を完璧に抽出することは困難であった。さらに、一般的に、器具の洗浄にはアルカリ洗剤を用いるため、本洗浄でアルカリ洗剤を用いた洗浄が行われた場合、アルカリ洗剤で落ちなかった残留蛋白質をアルカリ溶液で抽出しようとしても、完璧に抽出することは難しい。
【００１０】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、器具に残留した蛋白質を的確に抽出する蛋白質抽出方法、及び抽出された蛋白質を高感度で測定可能な蛋白質検出方法、及び蛋白質検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る蛋白質抽出方法は、器具に付着した蛋白質を抽出する方法であって、前記器具を抽出液に浸漬させるとともに、超音波を照射することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係る蛋白質抽出方法は、前記抽出液は、純水であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明に係る蛋白質抽出方法は、前記抽出液は、濃度が２０ｍＭ以下のアルカリ溶液であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明に係る蛋白質抽出方法は、前記器具は洗浄後のものであることを特徴とする。
【００１５】
本発明に係る蛋白質検出方法は、上記のいずれかに記載の蛋白質抽出方法を用いて得られた蛋白質溶液を用いて、蛋白質を検出することを特徴とする。
【００１６】
また、本発明に係る蛋白質検出方法は、前記蛋白質溶液と蛍光試薬とを反応させる反応工程と、反応させた溶液に励起光を照射して蛍光量を測定する蛍光測定工程と、前記蛍光測定工程にて測定された蛍光量に基づいて、前記蛋白質溶液の濃度を算出する定量工程を含むことを特徴とする。
【００１７】
また、本発明に係る蛋白質検出方法は、前記蛍光試薬は、ナノオレンジであることを特徴とする。
【００１８】
本発明に係る蛋白質検出装置は、上記のいずれかに記載の蛋白質検出方法を用いて、前記器具に付着した蛋白質量を測定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、洗浄後の器具に残留した蛋白質を的確に抽出する蛋白質抽出方法、及び抽出された蛋白質を高感度で測定可能な蛋白質検出方法及び装置を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の蛋白質検出工程を示すフロー図である。
【図２】水酸化ナトリウム濃度と蛍光量の関係を示すグラフである。
【図３】本発明の蛍光法での検量線の一例を示すグラフである。
【図４】本発明の蛋白質検出装置の概略構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、本発明の図面において、同一の参照符号は、同一部分または相当部分を表わすものとする。
【００２２】
本発明の蛋白質検出方法を、蛋白質検出工程を示すフロー図として、図１に示す。工程には、洗浄後の器具から残留蛋白質を抽出する抽出工程１０１、抽出した蛋白質溶液を蛍光試薬と混合する反応工程１０２、蛍光量を測定する蛍光測定工程１０３、蛍光量を蛋白質濃度に換算する定量工程１０４などの工程を含む。以下、各工程について詳細に説明する。
【００２３】
（抽出工程）
蛋白質の抽出工程１０１においては、抽出液として、純水を用いる。純水としては、蒸留水、ＲＯ水、脱イオン水等を使用することができる。なお、抽出液としては純水以外に、希アルカリ溶液を用いることができる。アルカリ溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、リン酸ナトリウム等の水溶液が用いられる。抽出液としてアルカリ溶液を使用する場合、アルカリ濃度が高いと抽出液に蛋白質以外の物質が多く含まれることになり、この蛋白質以外の物質が蛍光試薬と反応し、蛍光を発したり、蛋白質と蛍光試薬との反応を阻害する可能性がある。一方、アルカリ濃度が極端に低いと、器具に付着した残留蛋白質を十分に抽出できない可能性があるので、これらを考慮して、適切な濃度に調整することが求められる。そこで、次のような測定を行い、蛋白質抽出に適切なアルカリ溶液の濃度を調査した。
【００２４】
まず、蛋白質の含まれていない、濃度の異なる水酸化ナトリウム水溶液を作製し、次にそれぞれナノオレンジ（ＣＳＬベーリング株式会社製）を反応させ、蛍光量を測定した。蛍光の測定は、蛍光プレートリーダー（パーキンエルマー社製  ＡＲＶＯ  ＭＸ  １４２）を使用し、励起波長は４７０ｎｍ、蛍光波長は５７０ｎｍを使用した。プレートはコーニング社製９６ｗｅｌｌプレート（型番３６３２）を使用した。
【００２５】
図２は、上記の方法にて測定された、水酸化ナトリウム水溶液の濃度と蛍光量の関係を示すグラフである。その結果、蛋白質を含まないにも関わらず、濃度が２０ｍＭ（以下、ｍｏｌ／ｌをＭとあらわす。）を超えた場合に、急激に蛍光量が増大しており、蛋白質の測定に影響があることが判明した。このことから、抽出液としては濃度２０ｍＭ以下の溶液を使用することが望ましい。なお、今回は、水酸化ナトリウム水溶液を用いてその濃度と蛍光量を示したが、水酸化ナトリウム以外に、上述した水酸化カリウム等のアルカリ溶液においても、濃度が１０ｍＭ以下の溶液であれば、蛍光試薬の影響をほとんど受けないため、蛋白質の抽出溶液として用いることができる。
【００２６】
さらに、詳細に調べるため、以下のような実験を行った。抽出液及び超音波照射に関して、下記に示す条件Ａ〜Ｃでの時間経過による評価を実施した。また、評価対象サンプルとしては、下記のサンプル１〜３を使用し、抽出前後の質量変化から抽出の可否を判断した。抽出液は１０ｍｌとし、ポリエチレン製の袋に器具と抽出液を入れることで器具を抽出液に浸漬させた。なお、条件ＡおよびＣの純水としては、上記に示したように、蒸留水、ＲＯ水、脱イオン水等を使用することができるが、本実験においては、ミリＱ水（ミリポア社製の超純水装置で作られた超純水）を使用した。また、超音波の照射には、卓上超音波洗浄機（シャープ株式会社製  ＵＴ−６０６  出力６００Ｗ）を使用した。
〔条件〕
条件Ａ：純水にサンプルを浸漬し、超音波を照射
条件Ｂ：濃度５ｍＭの水酸化ナトリウム溶液にサンプルを浸漬し、超音波を照射
条件Ｃ：純水にサンプルを浸漬
〔サンプル〕
１：ステンレス板に羊血（日本生物材料センター製ヘパリン添加羊血に、和光純薬製１％硫酸プロタミン水溶液を１０：１の比率で混合）を６０μｌ塗布し、２４時間自然乾燥させたもの
２：洗浄評価用インジケータ（Ｐｅｒｅｇ社製、商品名：ＴＯＳＩ：ステンレス基材に擬似汚染物を塗布したもの）
３：サンプル２の洗浄評価用インジケータを１３０℃で３０分間加熱したもの
【００２７】
【表１】
2012063298.tif 000003
【００２８】
表１に各条件での抽出結果を示す。表中の○印は、ほぼ全抽出が可能、△印は残留１０％未満、×印は９０％以上が残留を示している。
《条件Ａでの結果》
サンプル３以外では抽出が可能であった。一般に医療用の洗浄装置の洗浄工程では、洗浄剤による洗浄、水によるすすぎ、温風による乾燥工程があり、乾燥工程時に蛋白質が器具に固着し、剥離されにくくなることが考えられる。サンプル３での結果は乾燥工程による固着の影響を評価したものとなる。但し、洗浄後の器具残留蛋白質を評価するにあたっては、乾燥工程を必ずしも通す必要がない。このことから、乾燥工程に関する留意が必要であるが、条件Ａにおいては器具の残留蛋白質を抽出する方法としてほぼ問題ない。条件Ａでは純水での抽出をおこなっていることから、溶液による測定妨害を起こすことなく蛍光法での測定が可能となり、高感度での蛋白質濃度の検出が可能となることから好ましい。
《条件Ｂでの結果》
５分以上抽出を行った場合、全てのサンプルにおいて蛋白質の抽出が可能であり、最も良好な結果となった。蛋白質の変性等の問題についても、条件Ｂでは見られなかった。濃度５ｍＭの水酸化ナトリウム溶液を用いているため、濃度が低く、蛋白質が変性することは無かった。
《条件Ｃでの結果》
浸漬時間を３０分にしても、サンプル１〜３において、基材部に白い残渣が多量に残留した。条件Ａと比較すると残留する残渣が多く、一部赤色の残渣が含まれており、蛋白質が十分に抽出されていないと考えられる。
【００２９】
以上の実験結果から、洗浄後の器具残留蛋白質を抽出する際には、超音波が有効であることがわかった。また、抽出液として純水を用いることで、溶液による蛋白質の変質や測定妨害が生じる虞がない。また、一般に本洗浄にはアルカリ性の洗剤を用いることが多いため、洗浄後の残留蛋白質の抽出には、同じアルカリ性の抽出液にただ浸漬するだけでは、アルカリ洗剤で落ちなかった蛋白質を完璧に抽出することは難しい。このため、アルカリ性の溶液を用いるのとは異なる、超音波を用いた抽出を行えば、アルカリ性の溶液では抽出できなかった残留蛋白質を抽出することができる。また、図２に示された結果から、さらに補助的に、抽出液として濃度２０ｍＭ以下のアルカリ溶液を用いて、超音波を照射した場合は、濃度の低いアルカリ溶液であるため、アルカリの影響を受けることなく、蛋白質をより効果的に抽出することができる。このようにして抽出された蛋白質溶液は、抽出液に溶け込んだ蛋白質が変性しておらず、その蛋白質濃度を極めて的確に測定することができる。
【００３０】
次に上記の方法で得られた蛋白質溶液から、蛋白質を検出する方法について、以下に説明する。なお、本実施形態では、蛍光法を用いた検出方法を例に挙げて説明する。蛍光法は、蛋白質を高感度で検出する方法として、特に有効であるため、洗浄済みの器具に付着した残留蛋白質のような微量の蛋白質の検出に好適であるが、検出方法はこれに限られるものではない。
【００３１】
（反応工程）
次に、上記の抽出工程１０１にて抽出した蛋白質溶液を蛍光試薬と混合し、反応させる反応工程１０２について説明する。蛍光試薬としては、特定の蛋白質に反応するものではなく、総蛋白質を検出できるものが好ましく、例えば、ナノオレンジやＣＢＱＣＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ株式会社製）等が検出感度が高いため、好ましい。
【００３２】
例えば、ナノオレンジを使用する場合、抽出工程１０１で抽出した蛋白質溶液にナノオレンジを混合し、９３℃で１０分間加熱し、室温にて冷却を行うことで反応工程１０２が終了する。反応条件については、使用する蛍光試薬に適した条件を適宜選択すればよい。
【００３３】
（蛍光測定工程）
続いて、蛍光測定工程１０３について説明する。本工程では、抽出した蛋白質溶液と蛍光試薬とを混合し、反応させた混合液に、励起光を照射し、混合液から発せられる蛍光量を測定する。測定は上記抽出工程にて説明した手順と同様であり、一般的なプレートリーダーや蛍光顕微鏡、蛍光分光計等を使用することができる。励起光や蛍光の波長は、使用する蛍光試薬に適したものを選択して用いる。例えば、ナノオレンジを使用する場合、励起波長としては４７０ｎｍ近傍、蛍光波長としては５７０ｎｍ近傍であり、これに適したフィルタ等により分光を行う。
【００３４】
（定量工程）
最後に、蛍光量を溶液の蛋白質濃度に換算する定量工程１０４について説明する。ここでは、上記蛍光測定工程１０３にて測定された蛍光量に基づいて、蛋白質溶液の濃度を算出する。具体的には、予め既知の濃度の蛋白質溶液にて検量線を作成しておき、検出された蛍光量をこの検量線を用いて溶液の蛋白質濃度を算出する。検量線の作成にはＢＳＡ（牛血清アルブミン）等の蛋白質を使用することができる。
【００３５】
図３に、蛍光試薬としてナノオレンジを使用した場合の、ＢＳＡ濃度と蛍光量の関係を示す。ＢＳＡの溶媒としては、抽出液と同一のものを使用する。図３は溶媒として濃度５ｍＭの水酸化ナトリウムを使用した場合のグラフである。約０．１μｇ／ｍｌ以下のＢＳＡ濃度まで検出が可能であった。器具に残留した蛋白質量は、検出した蛋白質濃度に抽出液量を積算することで算出することができる。例えば、検出蛋白質濃度が０．１μｇ／ｍｌ、抽出液量が１０ｍｌの場合、残留蛋白質量は１μｇ／器具となる。従来の吸光度を用いた検出方法では、検出感度は１０μｇ／器具程度であり、蛍光法を用いることで高感度に検出が可能となる。
【００３６】
また、更なる高感度化を図る場合、抽出工程１０１で抽出した蛋白質溶液を濃縮することが好ましい。例えば、抽出液量が１０ｍｌの場合、１ｍｌまで濃縮することで実質の測定感度が１０倍向上することになる。濃縮方法としては、限外濾過法が簡易であり、蛋白質の分子量と水酸化ナトリウムの分子量の差を利用して、フィルタを選択することにより、適切に濃縮することができる。
【００３７】
以上示したように、洗浄後の器具残留蛋白質を抽出する際に、超音波を照射することにより、器具からの蛋白質抽出工程で、蛋白質をほぼ残留なく抽出することができ、さらに蛋白質の変性や、蛋白質検出時の溶質による測定妨害のない蛋白質溶液を得ることができる。また、これにより抽出された蛋白質を蛍光法を用いて検出することにより、高感度に残留蛋白質量を定量することが可能となる。
【００３８】
以下に、本発明の検出方法を用いた蛋白質検出装置１について説明する。本発明の蛋白質検出装置１は、器具からの蛋白質抽出部１１、蛍光試薬混合部１２、および蛍光測定部１３を有し、各部において上述した各工程が行われる。
【００３９】
図４は、蛋白質検出装置１の概略図である。検査対象の器具２に付着した残留蛋白質は、まず、蛋白質抽出部１１において抽出される。器具２は、浴槽４で抽出液３に浸漬され、超音波発生器（図示せず）により超音波が照射され、蛋白質が抽出される。蛋白質抽出が終了すると第１の弁５が開放し、流路６を通って蛋白質溶液が試薬混合部に搬送される。次に試薬混合部１２において、試薬容器７中の試薬が第２の弁８で適量に調整されて蛋白質溶液と混合される。次に第３の弁９により混合液が蛍光測定部１３に搬送され、蛍光測定光学系１０により蛍光量が測定され、解析部（図示せず）により蛋白質濃度が算出される。また、測定後の溶液は排出部（図示せず）から排出される。
【００４０】
このように、各工程を一体とした蛋白質検出装置１により、簡易に蛋白質の検出が可能となるとともに、小型化が可能となるので、医療機関や食品製造ライン等において、任意の場所での測定が可能となる。
【００４１】
上記の実施形態は医療用器具に関する記述であるが、これに限定されるものではなく、例えば、食品製造ラインで使用する器具等、蛋白質が付着した器具に広く応用することが可能である。また、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明に係る蛋白質の抽出方法、検出方法、検出装置は、例えば医療器具の洗浄精度評価や、医療用洗浄機の性能評価、食品工場の製造ラインの汚染物検出に好適に利用できる。
【符号の説明】
【００４３】
１  蛋白質検出装置
２  器具
３  抽出液
４  浴槽
５  第１の弁
６  流路
７  試薬容器
８  第２の弁
９  第３の弁
１０  蛍光測定光学系
１１  蛋白質抽出部
１２  試薬混合部
１３  蛍光測定部
【図１】
2012063298.tif 000004
【図２】
2012063298.tif 000005
【図３】
2012063298.tif 000006
【図４】
2012063298.tif 000007