(57)【要約】【課題】  ウシの品種判別方法を提供すること。【解決手段】  被検ウシ個体から単離したゲノムＤＮＡにおいて、黒毛和種と、ホルスタイン種との品種間でアリル頻度の差が大きい１８個のＳＮＰのいずれか４個以上における塩基を決定することにより、そのウシ個体の品種を判別することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ（Bos taurus）個体の品種判別のためのマーカーであって、
４個以上のＳＮＰを有する塩基を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、
前記塩基は、互いに異なる位置にあり、
ウシゲノムアッセンブリ（Btau4.0）における１番染色体の62,347,547番目の塩基に対応する塩基１、
Btau4.0における２番染色体の21,197,107番目の塩基に対応する塩基２、
Btau4.0における２番染色体の72,527,748番目の塩基に対応する塩基３、
Btau4.0における３番染色体の9,887,418番目の塩基に対応する塩基４、
Btau4.0における３番染色体の44,462,889番目の塩基に対応する塩基５、
Btau4.0における４番染色体の79,623,054番目の塩基に対応する塩基６、
Btau4.0における８番染色体の111,309,164番目の塩基に対応する塩基７、
Btau4.0における９番染色体の97,919,713番目の塩基に対応する塩基８、
Btau4.0における１１番染色体の13,472,745番目の塩基に対応する塩基９、
Btau4.0における１２番染色体の34,476,412番目の塩基に対応する塩基１０、
Btau4.0における１３番染色体の6,365,748番目の塩基に対応する塩基１１、
Btau4.0における１４番染色体の7,620,648番目の塩基に対応する塩基１２、
Btau4.0における１４番染色体の75,476,607番目の塩基に対応する塩基１３、
Btau4.0における１５番染色体の6,452,017番目の塩基に対応する塩基１４、
Btau4.0における２０番染色体の54,183,343番目の塩基に対応する塩基１５、
Btau4.0における２２番染色体の53,561,274番目の塩基に対応する塩基１６、
Btau4.0における２６番染色体の22,269,111番目の塩基に対応する塩基１７、および、
Btau4.0における２８番染色体の103,000番目の塩基に対応する塩基１８、
のいずれかであることを特徴とするマーカー。
【請求項２】
被検ウシ（Bos taurus）個体のＳＮＰ決定方法であって、
前記ウシから単離されたポリヌクレオチドにおいて、４個以上のＳＮＰを有する塩基を決定する工程を含み、前記塩基は、互いに異なる位置にあり、
ウシゲノムアッセンブリ（Btau4.0）における１番染色体の62,347,547番目の塩基に対応する塩基１、
Btau4.0における２番染色体の21,197,107番目の塩基に対応する塩基２、
Btau4.0における２番染色体の72,527,748番目の塩基に対応する塩基３、
Btau4.0における３番染色体の9,887,418番目の塩基に対応する塩基４、
Btau4.0における３番染色体の44,462,889番目の塩基に対応する塩基５、
Btau4.0における４番染色体の79,623,054番目の塩基に対応する塩基６、
Btau4.0における８番染色体の111,309,164番目の塩基に対応する塩基７、
Btau4.0における９番染色体の97,919,713番目の塩基に対応する塩基８、
Btau4.0における１１番染色体の13,472,745番目の塩基に対応する塩基９、
Btau4.0における１２番染色体の34,476,412番目の塩基に対応する塩基１０、
Btau4.0における１３番染色体の6,365,748番目の塩基に対応する塩基１１、
Btau4.0における１４番染色体の7,620,648番目の塩基に対応する塩基１２、
Btau4.0における１４番染色体の75,476,607番目の塩基に対応する塩基１３、
Btau4.0における１５番染色体の6,452,017番目の塩基に対応する塩基１４、
Btau4.0における２０番染色体の54,183,343番目の塩基に対応する塩基１５、
Btau4.0における２２番染色体の53,561,274番目の塩基に対応する塩基１６、
Btau4.0における２６番染色体の22,269,111番目の塩基に対応する塩基１７、および、
Btau4.0における２８番染色体の103,000番目の塩基に対応する塩基１８、
のいずれかの塩基であることを特徴とするＳＮＰ決定方法。
【請求項３】
請求項２に記載のＳＮＰ決定方法であって、
前記工程において、塩基１から塩基１８の１８個の塩基を決定することを特徴とするＳＮＰ決定方法。
【請求項４】
黒毛和種のウシ個体とホルスタイン種のウシ個体、あるいは、黒毛和種のウシ個体と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１のウシ個体とを判別するための線形判別関数における判別係数を決定する方法であって、
黒毛和種のウシ個体とホルスタイン種のウシ個体、あるいは、黒毛和種のウシ個体と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１のウシ個体とから単離されたポリヌクレオチドにおいて、請求項２または３に記載のＳＮＰ決定方法によって決定された４個以上のＳＮＰから前記判別係数を決定する工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項５】
被検ウシ（Bos taurus）個体の品種判別方法であって、
請求項４に記載の方法に従って、黒毛和種のウシ個体とホルスタイン種のウシ個体、あるいは、黒毛和種のウシ個体と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１のウシ個体とを判別するための前記線形判別関数における前記判別係数を決定する工程と、
前記決定された判別係数と、前記決定されたＳＮＰを数値化した変数とを、前記線形判別関数に代入して判別得点を算出する工程と、
前記算出された黒毛和種のウシ個体の判別得点と、前記算出されたホルスタイン種のウシ個体、または、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１の判別得点とを比較し、前記黒毛和種とホルスタイン種、あるいは、黒毛和種と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１を判別するための閾値を決定する工程と、
前記被検ウシ個体において決定された前記ＳＮＰを数値化した変数を前記線形判別関数に導入し、前記被検ウシ個体の判別得点を算出する工程と、
前記算出された判別得点を前記閾値と比較する工程を含むことを特徴とする判別方法。
【請求項６】
被検ウシ（Bos taurus）個体の品種判別方法であって、
黒毛和種のウシ個体とホルスタイン種のウシ個体、あるいは、黒毛和種のウシ個体と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１のウシ個体から単離されたポリヌクレオチドにおいて、請求項３に記載のＳＮＰ決定方法によってＳＮＰを決定する工程と、
判別係数と、前記決定されたＳＮＰを数値化した変数とを線形判別関数に代入して判別得点を算出する工程と、
前記算出された黒毛和種のウシ個体の判別得点と、前記算出されたホルスタイン種のウシ個体、または、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１の判別得点とを比較し、前記黒毛和種とホルスタイン種、あるいは、黒毛和種と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１を判別するための閾値を決定する工程と、
前記被検ウシ個体から単離されたポリヌクレオチドにおいて、請求項３に記載のＳＮＰ決定方法によってＳＮＰを決定する工程と、
判別係数と、前記被検ウシ個体において決定されたＳＮＰを数値化した変数を、前記線形判別関数に導入し、前記被検ウシ個体の判別得点を算出する工程と、
前記被検ウシ個体の判別得点を前記閾値と比較する工程を含み、
前記線形判別関数は、
2012239429.tif 000069
で表わされ、式中、
ｚは判別得点を示し、
ａk（ｋは１〜１８のいずれかの整数）は、前記決定されたＳＮＰに対応する判別係数ａを示し、
ｘk（ｋは１〜１８のいずれかの整数）は、前記決定されたＳＮＰを数値化した変数ｘを示し、
前記変数は、前記決定されたＳＮＰが、黒毛和種型ホモ接合の場合には０、黒毛和種型塩基とホルスタイン種型塩基のヘテロ接合の場合には１、ホルスタイン種型ホモ接合の場合には２であり、
塩基１のＳＮＰに対するａは−０．５３６０１９８であり、
塩基２のＳＮＰに対するａは−１．０６１５７１６であり、
塩基３のＳＮＰに対するａは−０．３６５６７３８であり、
塩基４のＳＮＰに対するａは−０．１５７８５６８であり、
塩基５のＳＮＰに対するａは−０．１５７２３１１であり、
塩基６のＳＮＰに対するａは１．２４５０４９８であり、
塩基７のＳＮＰに対するａは０．３５７９８２７であり、
塩基８のＳＮＰに対するａは−０．９９４１６１７であり、
塩基９のＳＮＰに対するａは０．２０６５６７３であり、
塩基１０のＳＮＰに対するａは０．１７０４１３６であり、
塩基１１のＳＮＰに対するａは０．４２３４３３４であり、
塩基１２のＳＮＰに対するａは０．２１５４８６４であり、
塩基１３のＳＮＰに対するａは−０．４８５１３６であり、
塩基１４のＳＮＰに対するａは−０．４８９２１８１であり、
塩基１５のＳＮＰに対するａは０．２３７２５４５であり、
塩基１６のＳＮＰに対するａは−０．７４５０７７４であり、
塩基１７のＳＮＰに対するａは０．５８３２０８７であり、
塩基１８のＳＮＰに対するａは０．４４０７４３７であることを特徴とする、品種判別方法。
【請求項７】
被検ウシ（Bos taurus）個体の品種判別方法であって、
前記被検ウシ個体から単離されたポリヌクレオチドにおいて、請求項３に記載のＳＮＰ決定方法によってＳＮＰを決定する工程と、
判別係数と、前記被検ウシ個体において決定されたＳＮＰを数値化した変数を、前記線形判別関数に導入し、前記被検ウシ個体の判別得点を算出する工程と、
前記被検ウシ個体の判別得点を閾値と比較する工程を含み、
前記線形判別関数は、
2012239429.tif 000070
で表わされ、式中、
ｚは判別得点を示し、
ａk（ｋは１〜１８のいずれかの整数）は、前記決定されたＳＮＰに対応する判別係数ａを示し、
ｘk（ｋは１〜１８のいずれかの整数）は、前記決定されたＳＮＰを数値化した変数ｘを示し、
前記変数は、前記決定されたＳＮＰが、黒毛和種型ホモ接合の場合には０、黒毛和種型塩基とホルスタイン種型塩基のヘテロ接合の場合には１、ホルスタイン種型ホモ接合の場合には２であり、
塩基１のＳＮＰに対するａは−０．５３６０１９８であり、
塩基２のＳＮＰに対するａは−１．０６１５７１６であり、
塩基３のＳＮＰに対するａは−０．３６５６７３８であり、
塩基４のＳＮＰに対するａは−０．１５７８５６８であり、
塩基５のＳＮＰに対するａは−０．１５７２３１１であり、
塩基６のＳＮＰに対するａは１．２４５０４９８であり、
塩基７のＳＮＰに対するａは０．３５７９８２７であり、
塩基８のＳＮＰに対するａは−０．９９４１６１７であり、
塩基９のＳＮＰに対するａは０．２０６５６７３であり、
塩基１０のＳＮＰに対するａは０．１７０４１３６であり、
塩基１１のＳＮＰに対するａは０．４２３４３３４であり、
塩基１２のＳＮＰに対するａは０．２１５４８６４であり、
塩基１３のＳＮＰに対するａは−０．４８５１３６であり、
塩基１４のＳＮＰに対するａは−０．４８９２１８１であり、
塩基１５のＳＮＰに対するａは０．２３７２５４５であり、
塩基１６のＳＮＰに対するａは−０．７４５０７７４であり、
塩基１７のＳＮＰに対するａは０．５８３２０８７であり、
塩基１８のＳＮＰに対するａは０．４４０７４３７であり、
前記閾値が−３．８９４であって、
前記判別得点が−３．８９４以上であった場合に、前記被検ウシ個体の品種が黒毛和種であると判別し、前記判別得点が−３．９８４未満であった場合に、前記被検ウシ個体の品種がホルスタイン種、または、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１であると判別することを特徴とする品種判別方法。
【請求項８】
ウシ（Bos taurus）個体の品種判別用キットであって、４個以上のＳＮＰを有する塩基を含むポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーペアを含み、前記塩基は、互いに異なる位置にあり、
ウシゲノムアッセンブリ（Btau4.0）における１番染色体の62,347,547番目の塩基に対応する塩基１、
Btau4.0における２番染色体の21,197,107番目の塩基に対応する塩基２、
Btau4.0における２番染色体の72,527,748番目の塩基に対応する塩基３、
Btau4.0における３番染色体の9,887,418番目の塩基に対応する塩基４、
Btau4.0における３番染色体の44,462,889番目の塩基に対応する塩基５、
Btau4.0における４番染色体の79,623,054番目の塩基に対応する塩基６、
Btau4.0における８番染色体の111,309,164番目の塩基に対応する塩基７、
Btau4.0における９番染色体の97,919,713番目の塩基に対応する塩基８、
Btau4.0における１１番染色体の13,472,745番目の塩基に対応する塩基９、
Btau4.0における１２番染色体の34,476,412番目の塩基に対応する塩基１０、
Btau4.0における１３番染色体の6,365,748番目の塩基に対応する塩基１１、
Btau4.0における１４番染色体の7,620,648番目の塩基に対応する塩基１２、
Btau4.0における１４番染色体の75,476,607番目の塩基に対応する塩基１３、
Btau4.0における１５番染色体の6,452,017番目の塩基に対応する塩基１４、
Btau4.0における２０番染色体の54,183,343番目の塩基に対応する塩基１５、
Btau4.0における２２番染色体の53,561,274番目の塩基に対応する塩基１６、
Btau4.0における２６番染色体の22,269,111番目の塩基に対応する塩基１７、および、
Btau4.0における２８番染色体の103,000番目の塩基に対応する塩基１８、
のいずれかであるキット。
【請求項９】
請求項８に記載のキットであって、
塩基１から塩基１８の１８個の塩基を含むポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーペアを含むことを特徴とするキット。
【請求項１０】
ウシ（Bos taurus）個体の品種判別のための、ＳＮＰの組み合わせの選択方法であって、
候補となるＳＮＰの組み合わせを用いて、品種が明らかになっている２頭以上のウシ個体において、請求項５〜７のいずれか１項に記載の品種判別方法によって前記ウシ個体の品種を判別し、
誤判別率が、所定の割合以下になるＳＮＰの組み合わせを選択する、選択方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシの品種判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、国産牛肉のほとんどは、黒毛和種(３９％)、ホルスタイン種(３４％)、黒毛和種とホルスタイン種との交雑種(２５％)で占められている（括弧内は、農林水産省２００８年統計の枝肉生産量より算出した割合）。このうち、黒毛和種の牛肉は脂肪交雑に優れ市場において高額で流通しているが、近年、黒毛和種とホルスタイン種との交雑牛が黒毛和種牛として偽装表示され店頭で不当に高額で販売されていることが問題となっている。そのため、簡便な肉牛の品種判別方法の開発が望まれている。
【０００３】
これまでに、マイクロサテライトマーカーを用いた黒毛和種牛と他品種との品種判別法が開発されている（非特許文献１参照）。しかし、複数のマイクロサテライトマーカーのタイピングは多検体の処理には不向きであり、より簡便な肉牛の品種判別方法の開発が期待されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Watanabe et al. (2008) Anim. Gnet. 39, 374-382
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＳＮＰマーカーを用いたウシの品種判別方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、黒毛和種と、ホルスタイン種との品種間でアリル頻度の差が大きい１８個のＳＮＰを見出した。そして、これらのＳＮＰにおける塩基を決定することにより、黒毛和種と、黒毛和種とホルスタイン種とのＦ１とを判別することができることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００７】
ここで、本明細書において「ウシ」はBos taurus種のウシを指す。また、「ウシゲノム」は、２００６年８月１５日付でBaylor College of MedicineによりリリースされたBtau4.0 ゲノムアッセンブリ（例えば、Khatker et al. BMC Bioinformatics 2010, 22:171参照）により開示される配列に基づいて表されている。
【０００８】
すなわち、本発明に係るウシ（Bos taurus）個体の品種判別のためのマーカーは、４個以上のＳＮＰを有する塩基を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、前記塩基は、互いに異なる位置にあり、ウシゲノムアッセンブリ（Btau4.0）における１番染色体の62,347,547番目の塩基に対応する塩基１、Btau4.0における２番染色体の21,197,107番目の塩基に対応する塩基２、Btau4.0における２番染色体の72,527,748番目の塩基に対応する塩基３、Btau4.0における３番染色体の9,887,418番目の塩基に対応する塩基４、Btau4.0における３番染色体の44,462,889番目の塩基に対応する塩基５、Btau4.0における４番染色体の79,623,054番目の塩基に対応する塩基６、Btau4.0における８番染色体の111,309,164番目の塩基に対応する塩基７、Btau4.0における９番染色体の97,919,713番目の塩基に対応する塩基８、Btau4.0における１１番染色体の13,472,745番目の塩基に対応する塩基９、Btau4.0における１２番染色体の34,476,412番目の塩基に対応する塩基１０、Btau4.0における１３番染色体の6,365,748番目の塩基に対応する塩基１１、Btau4.0における１４番染色体の7,620,648番目の塩基に対応する塩基１２、Btau4.0における１４番染色体の75,476,607番目の塩基に対応する塩基１３、Btau4.0における１５番染色体の6,452,017番目の塩基に対応する塩基１４、Btau4.0における２０番染色体の54,183,343番目の塩基に対応する塩基１５、Btau4.0における２２番染色体の53,561,274番目の塩基に対応する塩基１６、Btau4.0における２６番染色体の22,269,111番目の塩基に対応する塩基１７、および、Btau4.0における２８番染色体の103,000番目の塩基に対応する塩基１８、のいずれかであることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明に係る被検ウシ（Bos taurus）個体のＳＮＰ決定方法は、前記ウシから単離されたポリヌクレオチドにおいて、４個以上のＳＮＰを有する塩基を決定する工程を含み、前記塩基は、互いに異なる位置にあり、ウシゲノムアッセンブリ（Btau4.0）における１番染色体の62,347,547番目の塩基に対応する塩基１、Btau4.0における２番染色体の21,197,107番目の塩基に対応する塩基２、Btau4.0における２番染色体の72,527,748番目の塩基に対応する塩基３、Btau4.0における３番染色体の9,887,418番目の塩基に対応する塩基４、Btau4.0における３番染色体の44,462,889番目の塩基に対応する塩基５、Btau4.0における４番染色体の79,623,054番目の塩基に対応する塩基６、Btau4.0における８番染色体の111,309,164番目の塩基に対応する塩基７、Btau4.0における９番染色体の97,919,713番目の塩基に対応する塩基８、Btau4.0における１１番染色体の13,472,745番目の塩基に対応する塩基９、Btau4.0における１２番染色体の34,476,412番目の塩基に対応する塩基１０、Btau4.0における１３番染色体の6,365,748番目の塩基に対応する塩基１１、Btau4.0における１４番染色体の7,620,648番目の塩基に対応する塩基１２、Btau4.0における１４番染色体の75,476,607番目の塩基に対応する塩基１３、Btau4.0における１５番染色体の6,452,017番目の塩基に対応する塩基１４、Btau4.0における２０番染色体の54,183,343番目の塩基に対応する塩基１５、Btau4.0における２２番染色体の53,561,274番目の塩基に対応する塩基１６、Btau4.0における２６番染色体の22,269,111番目の塩基に対応する塩基１７、および、Btau4.0における２８番染色体の103,000番目の塩基に対応する塩基１８、のいずれかの塩基であることを特徴とする。
【００１０】
ここで、本発明に係るＳＮＰ決定方法に関し、４個以上のＳＮＰを有する塩基を決定する工程において、塩基１から塩基１８の１８個の塩基を決定することが好ましい。
【００１１】
本発明に係る、黒毛和種のウシ個体とホルスタイン種のウシ個体、あるいは、黒毛和種のウシ個体と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１のウシ個体とを判別するための線形判別関数における判別係数を決定する方法は、黒毛和種のウシ個体とホルスタイン種のウシ個体、あるいは、黒毛和種のウシ個体と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１のウシ個体とから単離されたポリヌクレオチドにおいて、本発明に係るいずれかのＳＮＰ決定方法によって決定された４個以上のＳＮＰから前記判別係数を決定する工程を含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明に係る被検ウシ（Bos taurus）個体の品種判別方法は、本発明に係る、黒毛和種のウシ個体とホルスタイン種のウシ個体、あるいは、黒毛和種のウシ個体と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１のウシ個体とを判別するための線形判別関数における判別係数を決定する方法に従って、黒毛和種のウシ個体とホルスタイン種のウシ個体、あるいは、黒毛和種のウシ個体と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１のウシ個体とを判別するための前記線形判別関数における前記判別係数を決定する工程と、前記決定された判別係数と、前記決定されたＳＮＰを数値化した変数とを、前記線形判別関数に代入して判別得点を算出する工程と、前記算出された黒毛和種のウシ個体の判別得点と、前記算出されたホルスタイン種のウシ個体、または、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１の判別得点とを比較し、前記黒毛和種とホルスタイン種、あるいは、黒毛和種と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１を判別するための閾値を決定する工程と、前記被検ウシ個体において決定された前記ＳＮＰを数値化した変数を前記線形判別関数に導入し、前記被検ウシ個体の判別得点を算出する工程と、前記算出された判別得点を前記閾値と比較する工程を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明に係る被検ウシ（Bos taurus）個体の品種判別方法は、黒毛和種のウシ個体とホルスタイン種のウシ個体、あるいは、黒毛和種のウシ個体と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１のウシ個体から単離されたポリヌクレオチドにおいて、本発明に係るＳＮＰ決定方法のいずれかによってＳＮＰを決定する工程と、判別係数と、前記決定されたＳＮＰを数値化した変数とを線形判別関数に代入して判別得点を算出する工程と、前記算出された黒毛和種のウシ個体の判別得点と、前記算出されたホルスタイン種のウシ個体、または、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１の判別得点とを比較し、前記黒毛和種とホルスタイン種、あるいは、黒毛和種と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１を判別するための閾値を決定する工程と、前記被検ウシ個体から単離されたポリヌクレオチドにおいて、本発明に係るＳＮＰ決定方法のいずれかによってＳＮＰを決定する工程と、判別係数と、前記被検ウシ個体において決定されたＳＮＰを数値化した変数を、前記線形判別関数に導入し、前記被検ウシ個体の判別得点を算出する工程と、前記被検ウシ個体の判別得点を前記閾値と比較する工程を含み、前記線形判別関数は、
2012239429.tif 000002
で表わされ、式中、ｚは判別得点を示し、ａk（ｋは１〜１８のいずれかの整数）は、前記決定されたＳＮＰに対応する判別係数ａを示し、ｘk（ｋは１〜１８のいずれかの整数）は、前記決定されたＳＮＰを数値化した変数ｘを示し、前記変数は、前記決定されたＳＮＰが、黒毛和種型ホモ接合の場合には０、黒毛和種型塩基とホルスタイン種型塩基のヘテロ接合の場合には１、ホルスタイン種型ホモ接合の場合には２であり、塩基１のＳＮＰに対するａは−０．５３６０１９８であり、塩基２のＳＮＰに対するａは−１．０６１５７１６であり、塩基３のＳＮＰに対するａは−０．３６５６７３８であり、塩基４のＳＮＰに対するａは−０．１５７８５６８であり、塩基５のＳＮＰに対するａは−０．１５７２３１１であり、塩基６のＳＮＰに対するａは１．２４５０４９８であり、塩基７のＳＮＰに対するａは０．３５７９８２７であり、塩基８のＳＮＰに対するａは−０．９９４１６１７であり、塩基９のＳＮＰに対するａは０．２０６５６７３であり、塩基１０のＳＮＰに対するａは０．１７０４１３６であり、塩基１１のＳＮＰに対するａは０．４２３４３３４であり、塩基１２のＳＮＰに対するａは０．２１５４８６４であり、塩基１３のＳＮＰに対するａは−０．４８５１３６であり、塩基１４のＳＮＰに対するａは−０．４８９２１８１であり、塩基１５のＳＮＰに対するａは０．２３７２５４５であり、塩基１６のＳＮＰに対するａは−０．７４５０７７４であり、塩基１７のＳＮＰに対するａは０．５８３２０８７であり、塩基１８のＳＮＰに対するａは０．４４０７４３７であることを特徴とする。
【００１４】
本発明に係る被検ウシ（Bos taurus）個体の品種判別方法は、前記被検ウシ個体から単離されたポリヌクレオチドにおいて、本発明に係るＳＮＰ決定方法のいずれかによってＳＮＰを決定する工程と、判別係数と、前記被検ウシ個体において決定されたＳＮＰを数値化した変数を、前記線形判別関数に導入し、前記被検ウシ個体の判別得点を算出する工程と、前記被検ウシ個体の判別得点を閾値と比較する工程を含み、前記線形判別関数は、
2012239429.tif 000003
で表わされ、式中、ｚは判別得点を示し、ａk（ｋは１〜１８のいずれかの整数）は、前記決定されたＳＮＰに対応する判別係数ａを示し、ｘk（ｋは１〜１８のいずれかの整数）は、前記決定されたＳＮＰを数値化した変数ｘを示し、前記変数は、前記決定されたＳＮＰが、黒毛和種型ホモ接合の場合には０、黒毛和種型塩基とホルスタイン種型塩基のヘテロ接合の場合には１、ホルスタイン種型ホモ接合の場合には２であり、塩基１のＳＮＰに対するａは−０．５３６０１９８であり、塩基２のＳＮＰに対するａは−１．０６１５７１６であり、塩基３のＳＮＰに対するａは−０．３６５６７３８であり、塩基４のＳＮＰに対するａは−０．１５７８５６８であり、塩基５のＳＮＰに対するａは−０．１５７２３１１であり、塩基６のＳＮＰに対するａは１．２４５０４９８であり、塩基７のＳＮＰに対するａは０．３５７９８２７であり、塩基８のＳＮＰに対するａは−０．９９４１６１７であり、塩基９のＳＮＰに対するａは０．２０６５６７３であり、塩基１０のＳＮＰに対するａは０．１７０４１３６であり、塩基１１のＳＮＰに対するａは０．４２３４３３４であり、塩基１２のＳＮＰに対するａは０．２１５４８６４であり、塩基１３のＳＮＰに対するａは−０．４８５１３６であり、塩基１４のＳＮＰに対するａは−０．４８９２１８１であり、塩基１５のＳＮＰに対するａは０．２３７２５４５であり、塩基１６のＳＮＰに対するａは−０．７４５０７７４であり、塩基１７のＳＮＰに対するａは０．５８３２０８７であり、塩基１８のＳＮＰに対するａは０．４４０７４３７であり、前記閾値が−３．８９４であって、前記判別得点が−３．８９４以上であった場合に、前記被検ウシ個体の品種が黒毛和種であると判別し、前記判別得点が−３．９８４未満であった場合に、前記被検ウシ個体の品種がホルスタイン種、または、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１であると判別することを特徴とする。
【００１５】
本発明に係るウシ（Bos taurus）個体の品種判別用キットは、４個以上のＳＮＰを有する塩基を含むポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーペアを含み、前記塩基は、互いに異なる位置にあり、ウシゲノムアッセンブリ（Btau4.0）における１番染色体の62,347,547番目の塩基に対応する塩基１、Btau4.0における２番染色体の21,197,107番目の塩基に対応する塩基２、Btau4.0における２番染色体の72,527,748番目の塩基に対応する塩基３、Btau4.0における３番染色体の9,887,418番目の塩基に対応する塩基４、Btau4.0における３番染色体の44,462,889番目の塩基に対応する塩基５、Btau4.0における４番染色体の79,623,054番目の塩基に対応する塩基６、Btau4.0における８番染色体の111,309,164番目の塩基に対応する塩基７、Btau4.0における９番染色体の97,919,713番目の塩基に対応する塩基８、Btau4.0における１１番染色体の13,472,745番目の塩基に対応する塩基９、Btau4.0における１２番染色体の34,476,412番目の塩基に対応する塩基１０、Btau4.0における１３番染色体の6,365,748番目の塩基に対応する塩基１１、Btau4.0における１４番染色体の7,620,648番目の塩基に対応する塩基１２、Btau4.0における１４番染色体の75,476,607番目の塩基に対応する塩基１３、Btau4.0における１５番染色体の6,452,017番目の塩基に対応する塩基１４、Btau4.0における２０番染色体の54,183,343番目の塩基に対応する塩基１５、Btau4.0における２２番染色体の53,561,274番目の塩基に対応する塩基１６、Btau4.0における２６番染色体の22,269,111番目の塩基に対応する塩基１７、および、Btau4.0における２８番染色体の103,000番目の塩基に対応する塩基１８、のいずれかであることを特徴とする。
【００１６】
ここで、本発明に係るウシ（Bos taurus）個体の品種判別用キットに関し、塩基１から塩基１８の１８個の塩基を含むポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーペアを含むことが好ましく、塩基１を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがgccaggtatttgccacactt（配列番号１）とtctgcctcaaggagcaatct(配列番号１９)であって、塩基２を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがtcactttggcaaggagagaga(配列番号２)とcccaaatcctgcagtttcat(配列番号２０)であって、塩基３を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがgctcctctttccagtgacca(配列番号３)とgcatccaatctcaatgcctta(配列番号２１)であって、塩基４を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがtgctttatataccctatgttgtctca(配列番号４)とaaataatgcaccacaagttaccc(配列番号２２)であって、塩基５を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがgcagtgatttcccttggcta(配列番号５)とggtcagagcacttctgacatct(配列番号２３)であって、塩基６を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがagaagaggtcagccttgcag(配列番号６)とagtgtgccaaacagagcaga(配列番号２４)であって、塩基７を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがaggagaagccctgatcctgt(配列番号７)とcctggagcaaacttggatgt(配列番号２５)であって、塩基８を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがaccagcaacaggaatggtgt(配列番号８)とctgcagggcttgagacattt(配列番号２６)であって、塩基９を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがtggctagaactgaacccagaa(配列番号９)とctgtcctgactgccacagg(配列番号２７)であって、塩基１０を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがgcctcctctctgttctgtgc(配列番号１０)とgaggcaggctgagtctctgt(配列番号２８)であって、塩基１１を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがtctgggtgagaagcctcagt(配列番号１１)とgaataaggaccccaggaagg(配列番号２９)であって、塩基１２を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがtgggattcactgggatcttc(配列番号１２)とgagttgcatgtcaggggtct(配列番号３０)であって、塩基１３を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがgaagaactgtgtggggagga(配列番号１３)とaactttgggccccttcagt(配列番号３１)であって、塩基１４を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがtcagactcacgtccatcgag(配列番号１４)とgttctcccgagagtgagcag(配列番号３２)であって、塩基１５を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがcttgtgtgatcctggggact(配列番号１５)とtgtgtattccatcatacacgtctt(配列番号３３)であって、塩基１６を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがcactctgaatctccccacct(配列番号１６)とagtttgccgacccctaatct(配列番号３４)であって、塩基１７を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがctcccgctcgactgtttc(配列番号１７)とgagactaccgggtgtgcag(配列番号３５)であって、塩基１８を含むポリヌクレオチドを増幅させるためのプライマーペアがgcttccggatcacagcac(配列番号１８)とccgagagtgcttcaccttct(配列番号３６)であることがより好ましい。
【００１７】
本発明に係る、ウシ（Bos taurus）個体の品種判別のためのＳＮＰの組み合わせの選択方法は、候補となるＳＮＰの組み合わせを用いて、品種が明らかになっている２頭以上のウシ個体において、本発明に係るいずれかの品種判別方法によって前記ウシ個体の品種を判別し、誤判別率が、所定の割合以下になるＳＮＰの組み合わせを選択することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によると、ウシの品種判別方法を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態において、４〜１８個のＳＮＰにおける塩基を決定し、その結果を実施例で構築した線形判別関数に導入して判別得点を算出してウシの品種を判別した場合の、品種誤判別率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコルを用いる。
【００２１】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２２】
＝＝品種判別のためのマーカー＝＝
本発明において、ウシの品種判別のためのマーカーは、ウシゲノムアッセンブリ（Btau4.0）における１８個のＳＮＰ（表１）を有する塩基に対応する塩基のいずれか４個以上を含む、１以上の単離されたウシゲノムＤＮＡである。なお、ＤＮＡを構成する塩基数は特に限定されない。また、マーカーが有するＳＮＰは、この１８個のＳＮＰの中の４個以上１８個以下であれば、どの組み合わせであってもかまわない。
【表１】
2012239429.tif 000004
【００２３】
これらのＳＮＰにおける塩基は、例えば、塩基配列を直接決定することによって、あるいはＰＣＲやＲＦＬＰを利用することによって決定してもよく、特に決定方法は限定されない。塩基配列を直接決定する場合には、ＤＮＡを構成する全ての塩基を決定してもよいが、マーカーを構成するＤＮＡに含まれる、表１の１８個のＳＮＰのいずれか４個以上における塩基を決定することができれば十分である。
【００２４】
＝＝品種判別方法＝＝
【００２５】
ウシの品種の判別のためには、その個体から単離されたウシゲノムＤＮＡにおいて、表１に記載の１８個のＳＮＰのいずれか少なくとも４個のＳＮＰにおける塩基を決定する。
【００２６】
１８個のＳＮＰにおけるそれぞれの塩基の決定は、表１に記載の塩基番号１〜１８に対応する１８個のＳＮＰにおける塩基のうち、いずれか４個以上のＳＮＰにおける塩基を含む１つ以上の単離されたウシゲノムＤＮＡについて、このＤＮＡに含まれるＳＮＰにおける塩基を常法により決定することで行えばよい。なお、例えば、同じ染色体上に位置する複数のＳＮＰの塩基の決定については、それらの複数のＳＮＰを含むＤＮＡの領域をＰＣＲによって増幅し、複数のＳＮＰにおける塩基を一度に決定することもできる。なお、１８個のＳＮＰにおけるそれぞれの塩基の決定は、その塩基自体を調べて決定するのが最も正確であるが、１８個のＳＮＰのそれぞれと連鎖不平衡にあるＳＮＰを調べ、その結果によって、１８個のＳＮＰのそれぞれにおける塩基を推定してもよい。
【００２７】
また、ウシゲノムＤＮＡを単離する組織は、ＳＮＰの塩基を決定するために必要な量が得られる範囲で特に制限されない。
【００２８】
ここで、４個以上のＳＮＰにおける塩基を決定すれば、その個体の品種を判別することができるが、８個以上のＳＮＰにおける塩基を決定すれば、より正確にその個体の品種を判別することができ、１２個以上のＳＮＰにおける塩基を決定すれば、さらに正確にその個体の品種を判別することができ、１６個以上のＳＮＰにおける塩基を決定すれば、さらに正確にその個体の品種を判別することができ、１８個全てのＳＮＰにおける塩基を決定すれば、最も正確にその個体の品種を判別することができる。
【００２９】
なお、４個〜１７個のＳＮＰにおける塩基を決定してウシの品種判別を行う場合、そのＳＮＰの組み合わせは特に限定されず、タイピングのし易さなどを考慮していずれの４個〜１７個のＳＮＰを組み合わせてもよい。
【００３０】
４個以上のＳＮＰにおいて決定された塩基の情報に基づいたウシの品種判別は、例えば、線形判別関数を用いた線形判別分析、あるいは、主成分分析により行うことができる。以下に、一例として線形判別関数を用いた場合のウシの品種判別方法を説明する。
【００３１】
まず、表１の塩基番号１〜１８から選択される４個〜１８個のＳＮＰを使用し、黒毛和種個体と、ホルスタイン種、または、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１とを判別する場合、予め黒毛和種の複数個体からなる学習集団およびホルスタイン種（または黒毛和種とホルスタイン種のＦ１）の複数個体からなる学習集団において前述の４個〜１８個のＳＮＰにおける塩基を決定する。得られた遺伝子型情報を用いて線形判別関数における各判別係数を決定する。
【００３２】
各判別係数の決定は、当業者に周知の方法によって行えばよいが、例えば、The R project for statistical computing(http://www.r-project.org/)による統計学用インタープリタ言語Ｒを利用し、lda関数にｎ×ｍ（ｎはサンプル数、ｍはＳＮＰ数）の遺伝子型情報とｎ×１の集団情報を代入し、線形判別分析によって行うことができる。ここで、黒毛和種の学習集団、あるいは、ホルスタイン種（または黒毛和種とホルスタイン種のＦ１）の学習集団に含まれる個体数は、最低２個体であるが、決定された判別係数を用いて構築された線形判別関数を用いた被検個体における判別確率を考慮すると多いほど好ましく、例えば、１０個体以上であることが好ましく、５０個体以上であることがより好ましく、１００個体以上であることがさらに好ましい。なお、黒毛和種、あるいは、ホルスタイン種（または黒毛和種とホルスタイン種のＦ１）の学習集団のいずれかの品種でパラメータがばらついていることが好ましい。
【００３３】
ここで、線形判別関数は、
2012239429.tif 000005
で表わされる。
【００３４】
ここで、式中ｚは判別得点を示す。また、ａk（ｋは１〜ｎのいずれかの整数）は、決定されたＳＮＰに対応する判別係数ａを示し、ｘk（ｋは１〜ｎのいずれかの整数）は、決定されたＳＮＰを数値化した変数ｘを示す。
【００３５】
例えば、塩基番号１、３、４、１０、１７の５個のＳＮＰが決定された場合、ｎ＝５、すなわち、ｋは１〜５であり、前記線形判別関数は、
ｚ＝ａ１ｘ１＋ａ２ｘ２＋ａ３ｘ３＋ａ４ｘ４＋ａ５ｘ５となり、
式中、ａ１は、塩基番号１に対応する判別係数であり、ａ２は、塩基番号３に対応する判別係数であり、ａ３は、塩基番号４に対応する判別係数であり、ａ４は、塩基番号１０に対応する判別係数であり、ａ５は、塩基番号１７に対応する判別係数である。すなわち、判別得点（ｚ）は、塩基番号１（ｋ＝１）に対応する判別係数ａ１と塩基番号１のＳＮＰを数値化したｘ１の積、塩基番号３（ｋ＝２）に対応する判別係数ａ２と塩基３のＳＮＰを数値化したｘ２の積、塩基番号４（ｋ＝３）に対応する判別係数ａ３と塩基４のＳＮＰを数値化したｘ３の積、塩基番号１０（ｋ＝４）に対応する判別係数ａ４と塩基１０のＳＮＰを数値化したｘ４の積、および、塩基番号１７（ｋ＝５）に対応する判別係数ａ５と塩基１７のＳＮＰを数値化したｘ５の積の総和である。
【００３６】
ここで、各ｘには、被検個体における品種判別のための判別得点の計算のために、その個体で調べられた各ＳＮＰの種類を数値化した変数が代入される。例えば、黒毛和種個体と、ホルスタイン種、または、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１とを判別する場合、ＳＮＰにおける塩基が黒毛和種型ホモ接合の場合には０、黒毛和種型ヘテロ接合の場合には１、ホルスタイン種型ホモ接合の場合には２を代入してもよい。または、例えば、黒毛和種型アリルが存在する場合、すなわち、黒毛和種型ホモ接合の場合と、黒毛和種型ヘテロ接合の場合に１、それ以外の場合に０を代入してもよい。ここで、黒毛和種型ホモ接合とは、表１に示す黒毛和種型塩基のホモ接合であって、ホルスタイン種型ホモ接合とは、表１に示すホルスタイン種型塩基のホモ接合であって、黒毛和種型ヘテロ接合とは、黒毛和種型塩基とホルスタイン種型塩基のヘテロ接合であることを意味する。
【００３７】
以上のようにして、学習集団に含まれる各個体の判別得点を計算した後、黒毛和種とホルスタイン種、あるいは、黒毛和種と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１を判別するための閾値を決定する。
【００３８】
例えば、学習集団に含まれる各個体の判別得点の分布を、各個体の品種と対応させてプロットしたグラフを作成する。このグラフから、黒毛和種とホルスタイン種、あるいは、黒毛和種と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１を判別できる判別得点値を定め、これを、品種判別のための閾値としてもよい。または、例えば、判別する２品種における判別得点の中間値、判別する２品種における判別得点の各平均値の中間値、判別する２品種における判別得点の最大値および最小値の中間値、判別する２品種のいずれかにおける判別得点の最大値あるいは最小値を閾値としてもよい。
【００３９】
閾値は、黒毛和種の誤判別率、および、ホルスタイン種または黒毛和種とホルスタイン種のＦ１の誤判別率が、それぞれ１０％以下になるように定めることが好ましく、５％以下になるように定めることがより好ましく、２％以下になるように定めることがさらに好ましく、０．５％以下になるように定めることがさらに好ましく、０％になるように定めることが最も好ましい。ただし、黒毛和種の誤判別率と、ホルスタイン種または黒毛和種とホルスタイン種のＦ１の誤判別率が両方とも０％になるように閾値を定められない場合には、その品種判別の目的に従って閾値を定めてもよく、例えば、黒毛和種だと判別される個体が１００％黒毛和種であることが必要で、ホルスタイン種または黒毛和種とホルスタイン種のＦ１と判別される個体集団に黒毛和種が含まれていても構わない場合には、黒毛和種の誤判別率が高くても、黒毛和種と判別される個体集団から必ずホルスタイン種または黒毛和種とホルスタイン種のＦ１が排除できる数値を閾値としてもよい。一方、例えば、ホルスタイン種または黒毛和種とホルスタイン種のＦ１だと判別される個体が１００％ホルスタイン種または黒毛和種とホルスタイン種のＦ１であることが必要で、黒毛和種と判別される個体集団にホルスタイン種または黒毛和種とホルスタイン種のＦ１が含まれていても構わない場合には、ホルスタイン種または黒毛和種とホルスタイン種のＦ１の誤判別率が高くても、ホルスタイン種または黒毛和種とホルスタイン種のＦ１と判別される個体集団から必ず黒毛和種が排除できる数値を閾値としてもよい。
【００４０】
あるいは、閾値ではなく、黒毛和種と判別するための判別得点の範囲、および、ホルスタイン種または黒毛和種とホルスタイン種のＦ１と判別するための判別得点の範囲を定めてもよい。このような判別得点の範囲を定める場合にも、黒毛和種の誤判別率、および、ホルスタイン種または黒毛和種とホルスタイン種のＦ１の誤判別率が、それぞれ１０％以下になるように定めることが好ましく、５％以下になるように定めることがより好ましく、２％以下になるように定めることがさらに好ましく、０．５％以下になるように定めることがさらに好ましく、０％になるように定めることが最も好ましい。ただし、黒毛和種の誤判別率、および、ホルスタイン種または黒毛和種とホルスタイン種のＦ１の誤判別率の両方を０％になるように判別得点の範囲を定められない場合には、閾値の場合と同様に、その目的に従って適宜定めればよい。
【００４１】
次に、品種が不明な被検個体について、学習集団で用いたのと同じ組み合わせの４〜１８個のＳＮＰにおける塩基を決定し、各ＳＮＰの種類を数値化した変数ｘを定め、前述の線形判別関数に代入して判別得点（ｚ）を算出する。ここで、各ｘｋには、例えば、被検個体における各ＳＮＰの塩基が黒毛和種型ホモ接合の場合に０、ホルスタイン種型ホモ接合の場合に２、黒毛和種型ヘテロ接合の場合に１として代入してもよい。この場合、例えば、被検個体において塩基番号１（ｋ＝１）、３（ｋ＝２）、４（ｋ＝３）、１０（ｋ＝４）、１７（ｋ＝５）の５個のＳＮＰを調べ、塩基番号１、３、４のＳＮＰが黒毛和種型ホモ接合、塩基番号１０のＳＮＰが黒毛和種型ヘテロ接合、塩基番号１７のＳＮＰがホルスタイン種型ホモ接合であれば、ｘ１、ｘ２、ｘ３はそれぞれ０、ｘ４は１、ｘ５は２となり、よって、線形判別関数は、
ｚ＝ａ１×０＋ａ2×０＋ａ３×０＋ａ４×１＋ａ５×２となり、
式中、ａ１は、塩基番号１（ｋ＝１）に対応する判別係数であり、ａ２は、塩基番号３（ｋ＝２）に対応する判別係数であり、ａ３は、塩基番号４（ｋ＝３）に対応する判別係数であり、ａ４は、塩基番号１０（ｋ＝４）に対応する判別係数であり、ａ５は、塩基番号１７（ｋ＝５）に対応する判別係数である。
【００４２】
または、線形判別関数の各ｘｋには、例えば、黒毛和種型アリルが存在する場合、すなわち、黒毛和種型ホモ接合の場合と、黒毛和種型ヘテロ接合の場合に１、それ以外の場合に０を代入してもよい。
【００４３】
このように算出された被検個体の判別得点（ｚ）を閾値と比較し、その被検個体が黒毛和種個体であるか、あるいは、ホルスタイン種個体または黒毛和種とホルスタイン種のＦ１個体であるかを判別することができる。
【００４４】
ここで、特に、１８個全てのＳＮＰを使用し、黒毛和種とホルスタイン種との判別、または、黒毛和種と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１との判別を行う場合、学習集団によるＳＮＰ解析を基にした判別係数の決定を行わず、表２に示す判別係数または小数点以下のいずれかの位（例えば、小数点第１位、小数点第２位、小数点第３位、小数点第４位、小数点第５位、小数点第６位）で四捨五入した値を前述の線形判別関数におけるａに代入して判別得点を算出してもよい。なお、表２に示す各ＳＮＰに対応する判別係数は、黒毛和種個体１３００頭と、黒毛和種とホルスタイン種とのＦ１個体９４頭を学習集団として得られた判別係数である。
【表２】
2012239429.tif 000006
【００４５】
さらに、特に１８個のＳＮＰ全てにおける塩基を決定してウシの品種判別をした場合には、閾値を−３．８９４または小数点以下のいずれかの位（例えば、小数点第１位、小数点第２位）で四捨五入した値とすればよく、判別得点（ｚ）が、その閾値以上の場合には、その被検個体は黒毛和種の可能性が高いと判別し、一方、判別得点（ｚ）がその閾値未満の場合には、被検個体はホルスタイン種個体、あるいは、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１個体である可能性が高いと判別することができる。
【００４６】
＝＝ＳＮＰの組み合わせの選択方法＝＝
１８個のＳＮＰにおける組み合わせの中から、特にウシの品種判別のために優れたＳＮＰの組み合わせを、以下のようにして選択することができる。
【００４７】
まず、候補となるＳＮＰの組み合わせを用いて、品種が明らかになっている２頭以上のウシ個体において、上述した品種判別方法によって、品種を判別する。その時の誤判別率が、予め設定された所定の割合以下になるＳＮＰの組み合わせを選択すればよい。誤判別率は低い方が好ましく、例えば、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下、さらに好ましくは０．５％以下になるように設定すれば良い。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例及び図を用いてより詳細に説明する。
[１］  ＤＮＡの抽出及びＳＮＰのタイピング方法
ゲノムＤＮＡは、精液、腎周囲脂肪もしくは血液より常法により抽出した。目的とするゲノム断片を特異的に増幅できるプライマー（配列番号１〜３６、表３）を用いて、ＰＣＲ法により該当ゲノム領域を増幅した。各ＳＮＰにおける塩基は、Big Dye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (アプライドバイオシステムズ社)を用いてＰＣＲ増幅産物のダイレクトシークエンシングを行うことによって決定した。
【表３】
2012239429.tif 000007
【００４９】
[２]  学習集団における解析による判別係数の決定
学習集団として、黒毛和種個体１３００頭についてBovine SNP50 BeadChip（イルミナ社）を用いたジェノタイピングにより、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１個体９４頭について[１]の方法により、表１の塩基番号１〜１８に対応する１８個のＳＮＰにおける塩基を決定した。ここで得られた塩基のデータを、The R project for statistical computing(http://www.r-project.org/)による統計学用インタープリタ言語Ｒを利用し、lda関数にｎ×ｍ（ｎはサンプル数、ｍはＳＮＰ数）の遺伝子型情報とｎ×１の集団情報を代入して線形判別分析を行い、各ＳＮＰに関する判別係数を決定した（表４）。
【表４】
2012239429.tif 000008
【００５０】
[３]  誤判別率
前記[２]で決定した判別係数を、以下の線形判別関数に代入し、この線形判別関数を用いてウシの品種判別を行った場合の判別確率を算出した。
線形判別関数：
2012239429.tif 000009
【００５１】
具体的には、まず、学習集団の黒毛和種個体１３００頭と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１個体９４頭の各個体について、表１の塩基番号１〜１８に対応する１８個のＳＮＰから４〜１８個のＳＮＰを選択し、これらのＳＮＰの種類を数値化した変数を、ｘに代入することにより判別得点（ｚ）を算出した。ｘは、被検個体における対応するＳＮＰの塩基が表１に示す黒毛和種型ホモ接合の場合に０、ホルスタイン種型ホモ接合の場合に２、黒毛和種型ヘテロ接合の場合に１を代入した。なお、４〜１８個のＳＮＰの選択は、１８個のＳＮＰから得られる４個のＳＮＰの全ての組み合わせ、および、表５に示す４〜１８個のＳＮＰの組み合わせを行った。
【００５２】
その後、１８個のＳＮＰから選択される４〜１８個のＳＮＰの組み合わせについて、黒毛和種の各個体の判別得点と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１各個体の判別得点をグラフ上にプロットし、最も正確に品種を判別できる点を閾値として定めた。さらに、黒毛和種個体１３００頭と、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１個体９４頭、それぞれの判別得点の平均値と標準偏差を算出した。この平均値と標準偏差に対して正規分布の累積分布関数の値を求め、これを判別確率とした。
累積分布関数：
2012239429.tif 000010
なお、本関数を用いた判別確率の算出は、Microsoft Excelの関数：normdist(x, mean, sd, flag)を用いて行った。ｘは品種判別のための閾値、meanは各品種の平均値、sdは各品種の標準偏差、flag=TRUEで累積分布関数の値を返した。
【表５】
2012239429.tif 000011
【００５３】
１８個のＳＮＰから選択可能な４個のＳＮＰの組み合わせ全てを用いた場合の、ＳＮＰの組み合わせと、誤判別率について表６に示す。
【表６】
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【００５４】
また、表５で示した４〜１８個のＳＮＰの組み合わせを用いて品種判別した場合の誤判別率を図１に示す。黒毛和種の誤判別率、および、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１の誤判別率はより多くのＳＮＰを用いた場合に低下する傾向があった。
【００５５】
[４]  評価用個体における品種判別
[３]に記載の線形判別関数：
2012239429.tif 000067
に、[２]で決定した判別係数を代入した場合のウシの品種判別を評価するため、評価用集団の黒毛和種個体１６１頭、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１個体５５頭について、[１]の方法により、表１の塩基番号１〜１８に対応するＳＮＰの塩基を決定した。各ＳＮＰの種類を数値化した変数（ｘ）を、線形判別関数に代入し、評価用集団の各個体について、前記判別得点（ｚ）を算出した。この際、変数ｘには、そのＳＮＰの塩基が黒毛和種型のホモの場合に０、黒毛和種型ヘテロの場合に１、ホルスタイン種型のホモの場合に２を代入した。このようにして算出した各個体の判別得点に関し、[３]において１８個のＳＮＰを使用した場合の品種判別のための閾値として定められた−３．８９４を基準に、−３．８９４以上の場合を黒毛和種、−３．８９４未満の場合を黒毛和種とホルスタイン種のＦ１個体とした。
【００５６】
評価用集団における品種判別の結果を表７に示す。
【表７】
2012239429.tif 000068
以上の結果は、黒毛和種１６１個体全頭、黒毛和種とホルスタイン種のＦ１５５個体全頭を正確に判別できたことを示している。このように、[２]で決定した判別係数を代入した線形判別関数を用いて高い確率でウシの品種を判別できる。
【図１】
2012239429.tif 000071
【配列表】
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