(57)【要約】      （修正有）【課題】ルシフェラーゼの基質となりうる構造を有し、発光波長が７００ｎｍを超える化合物の提供。【解決手段】式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。2012020978.tif 000007【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（I）：
【化１】
2012020978.tif 000006
〔式中、R1は1個のカルボキシル基若しくは1個のスルホニル基で置換されていてもよいC1-6アルキル基を示し；R2はカルボキシル基若しくはそのエステル、又はスルホニル基若しくはそのエステルを示し；Y1及びY2のいずれか一方は一般式(II)で表される基［式中、nは0又は1ないし6の整数を示し；XはC1-10の直鎖アルキレン基(ただし該アルキレン基を構成する炭素原子のうち1〜3個の炭素原子はヘテロ原子で置きかえられていてもよく、該アルキレン基を構成する炭素原子のうち1〜3個はオキソ基を有していてもよい)を示す］を示し、他方は水素原子、又は1個のカルボキシル基若しくは1個のスルホニル基で置換されていてもよいC1-6アルキル基を示す〕で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
Y1が1個のカルボキシル基若しくは1個のスルホニル基で置換されていてもよいC1-4アルキル基である請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
R1及びY1がメチル基であり、R2がカルボキシル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、又はメトキシ置換メトキシカルボニル基であり、nが0であり、Xが-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-である請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の一般式(I)で表される化合物又はその塩からなるルシフェラーゼ基質。
【請求項５】
ルシフェラーゼの測定方法であって、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の一般式(I)で表される化合物又はその塩からなるルシフェラーゼ基質を用いる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ルシフェラーゼを用いた生物発光システムにおいて基質となる近赤外生物発光基質に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホタルルシフェラーゼとルシフェリンの組み合わせにより生じる生物発光を利用した生物発光法は、励起光を必要としないためバックグランドノイズがほぼゼロであり高感度な測定が可能である。また、励起光を必要としないことから簡単な構造の装置で測定をすることができる。これらの特長により、生物発光法は、ブロッティングにおける目的物質の検出やレポーター酵素など様々なアッセイ系に汎用されている。さらに、最近では、光透過性の悪い生物試料の深部のイメージングも可能であることから、イン・ビボのイメージング系への応用も検討されるようになってきた。
【０００３】
このようにイン・ビボのイメージングにおいて生物発光法は有効であると考えられているが、従来の生物発光法における発光波長はルシフェリンが有する570 nmに限られているため、イン・ビボのイメージングに用いるには波長が短いという問題がある。このため、発光波長をより組織透過性に優れた長波長側にシフトさせる研究が行われているが、これらの研究は、いずれの場合も酵素であるルシフェラーゼの特性を改変することにより行われており、基質であるルシフェリンについてアプローチした報告はほとんどない。これは、ルシフェラーゼの基質認識の特異性が高く、ルシフェリンに対するわずかな構造修飾でも発行特性が消失してしまうことが原因である。
【０００４】
一方、生物発光法はその感度に注目が集中していたが、標的分子の存在下のみで発光が生じるような生物発光特性のon/off制御が可能な機能性ルシフェラーゼ基質の研究も数例見られる（例えば特開2000-270894号公報、Miska, W, Geiger, R., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., Jan;25(1), pp.23-30, 1987など）。それらはルシフェリンやその類縁体を用いた発光のｏｎ／ｏｆｆ制御型のプローブに関するものであり、ルシフェリンのメチルエーテル型やアミノルシフェリンのアミド型は発光しないことを利用し、これらのルシフェリン類縁体を糖やペプチドに結合させて、それらと特異的に反応する酵素の活性を検出するという原理に基づくものである。しかしながら、この原理では適用可能なプローブの標的は非常に限られてしまうという問題がある。このため、機能性イン・ビボ発光イメージングを可能にする汎用性の高い生物発光プローブの開発が望まれている。
【０００５】
このような観点から、アミノルシフェリンのアミノ基をアルキル化した化合物が提案されており、この化合物では発光波長がルシフェリンに比べて長波長側にシフトしていること、及びこの化合物がイン・ビボのイメージングに有用であることが報告されている(特開2007-91695号公報)。
【０００６】
また、最近になってアミノルシフェリンのベンゾチアゾール環の6'位からアルキル基を伸ばしてリンカーとし、その先にBRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)のアクセプター候補となる蛍光団を結合することにより、従来のルシフェラーゼ基質よりも長波長で発光する新たな基質を開発する手法が提案された(日本薬学会第130年会、岡山、2010年3月、演題番号: 30TC-am10；及び日本ケミカルバイオロジー学会第5回年会、東京、2010年5月、演題番号:P47)。しかしながら、合成した種々の化合物に対するルシフェラーゼによる基質認識は、蛍光団の構造及びリンカーの構造によって大きく左右されることから、構造の最適化が必要であることもがあることも同時に報告されている。また、発光波長が約670 nmのルシフェラーゼ基質(Cy5 COOH-AL)も報告されているが（東京大学大学院薬学系研究課程博士論文発表会、「新規機能性生物発光プローブの開発とその応用」、高倉栄男、東京大学薬学部講堂、2009年12月15日）、従来、発光波長が700 nmを超えるルシフェラーゼ基質は報告されていない。
【０００７】
【化１】
2012020978.tif 000002
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2000-270894号公報
【特許文献２】特開2007-91695号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J. Clin. Chem. Clin. Biochem., Jan;25(1), pp.23-30, 1987
【非特許文献２】日本薬学会第130年会、岡山、2010年3月、演題番号: 30TC-am10
【非特許文献３】日本ケミカルバイオロジー学会第5回年会、東京、2010年5月、演題番号: P47
【非特許文献４】東京大学大学院薬学系研究課程博士論文発表会、「新規機能性生物発光プローブの開発とその応用」、高倉栄男、東京大学薬学部講堂、2009年12月15日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、ルシフェラーゼの基質となりうる構造を有する化合物であって、発光波長が700 nmを超える化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行い、アミノルシフェリンのベンゾチアゾール環の6'位からアルキル基を伸してリンカーとし、その先にBRET アクセプター候補となる蛍光団を結合する手法を採用して、ルシフェラーゼによる基質認識性を保ちつつ長波長で発光可能となるように化学構造の最適化を行った。最適化に際しては蛍光団の平面性の確保、適切なリンカーの選択、及び基質の実効濃度の低下を避けるためのスタッキングの回避が発光特性を喪失しない条件として重要であるとの仮説に基づいて、種々の化学構造修飾を検討した。その結果、下記の式で表される化合物がルシフェリンと同様の高い発光性を有し、かつ発光波長がルシフェリンに比べて大幅に長波長側にシフトして約800 nm程度の発光波長を与えることを見出した。本発明は上記の知見に基づいて完成されたものである。
【００１２】
すなわち、本発明により、下記の一般式（I）：
【化２】
2012020978.tif 000003
〔式中、R1は1個のカルボキシル基若しくは1個のスルホニル基で置換されていてもよいC1-6アルキル基を示し；R2はカルボキシル基若しくはそのエステル、又はスルホニル基若しくはそのエステルを示し；Y1及びY2のいずれか一方は一般式(II)で表される基［式中、nは0又は1ないし6の整数を示し；XはC1-10の直鎖アルキレン基(ただし該アルキレン基を構成する炭素原子のうち1〜3個の炭素原子はヘテロ原子で置きかえられていてもよく、該アルキレン基を構成する炭素原子のうち1〜3個はオキソ基を有していてもよい)を示す］を示し、他方は水素原子、又は1個のカルボキシル基若しくは1個のスルホニル基で置換されていてもよいC1-6アルキル基を示す〕で表される化合物又はその塩が提供される。
【００１３】
上記の発明の好ましい様態として、上記一般式(I)において、Y1が1個のカルボキシル基若しくは1個のスルホニル基で置換されていてもよいC1-4アルキル基である上記の化合物又はその塩；R1及びY1がメチル基である上記の化合物又はその塩；R2がカルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又はメトキシ置換メトキシカルボニル基である上記の化合物又はその塩；nが0である上記の化合物又はその塩；Xが-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-である上記の化合物又はその塩が提供される。
【００１４】
別の観点からは上記一般式(I)で表される化合物又はその塩からなるルシフェラーゼ基質が本発明により提供される。また、本発明により、上記一般式(I)で表される化合物又はその塩を含む生物発光分析用試薬、及び生体内においてルシフェラーゼを発現する細胞を検出する方法であって、上記一般式(I)で表される化合物又はその塩からなるルシフェラーゼ基質を用いる方法が提供される。
【００１５】
さらに、上記の一般式(I)で表される化合物又はその塩でラベル化された生物試料に対してルシフェラーゼを反応させる工程を含む生物発光分析法が本発明により提供される。また、上記の生物発光分析用試薬とルシフェラーゼとを要素として含む生物発光分析用キットが本発明により提供される。
【００１６】
さらに別の観点からは、生物発光プローブの製造のための上記一般式(I)で表される化合物又はその塩の使用、及び生物発光プローブの製造のための製造原料として用いる上記一般式(I)で表される化合物又はその塩が本発明により提供される。また、生物発光プローブであって、上記一般式(I)で表される化合物又はその塩の残基を含むプローブも本発明により提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により提供される化合物又はその塩はルシフェラーゼの基質となりうる性質を有している。本発明の化合物又はその塩のうち発光性の化合物又はその塩は、発光波長がルシフェリンに比べて顕著に長波長側にシフトしており、イン・ビボのイメージングや発光ラベル化剤として有用である。本発明により提供される化合物又はその塩を用いることにより、特に深部組織において高感度なイメージングが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】アミノルシフェリン(AL)の発光スペクトルと本発明の化合物(Cy7MeCOOH-AL)の発光スペクトルとを比較した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなる飽和炭化水素基を意味している。より具体的には、アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、イソブチル基、tert-ブチル基、シクロプロピルメチル基などを挙げることができる。
アラルキル基を構成するアリール基としては単環性又は多環性のアリール基のいずれであってもよいが、好ましくはフェニル基を用いることができる。
【００２０】
R1はC1-6アルキル基、好ましくはC1-4アルキル基を示すが、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、又はn-ブチル基などの直鎖アルキル基が好ましい。R1が示すC1-6アルキル基上には1個のカルボキシル基又は1個のスルホニル基が存在していてもよい。例えば、3-カルボキシ-1-プロピル基などを用いることができる。R1としてはメチル基が好ましい。Y1又はY2のいずれかがC1-6アルキル基を示す場合も同様である。
【００２１】
R2はカルボキシル基若しくはそのエステル、又はスルホニル基若しくはそのエステルを示すが、例えば、カルボキシル基、C1-4アルコキシカルボニル基、アリール置換アルコキシカルボニル基、C1-4アルコキシ置換C1-4アルコキシカルボニル基、スルホニル基などを示す。例えば、カルボキシル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、メトキシ置換メトキシカルボニル基、スルホニル基、C1-4アルキルスルホニル基などが好ましい。これらのうち、カルボキシル基、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、又はメトキシ置換メトキシカルボニル基が好ましい。特に好ましいのはカルボキシル基である。
【００２２】
Y1及びY2のいずれか一方は一般式(II)で表される基を示し、他方は水素原子を示すか、又は1個のカルボキシル基若しくは1個のスルホニル基で置換されていてもよいC1-6アルキル基、好ましくはC1-4アルキル基を示す。Y2が一般式(II)で表される基であることが好ましい。
【００２３】
一般式(II)で表される基において、nは0を示すか、又は1ないし6の整数を示す。nが0であることが好ましく、この場合には一般式(II)で表される基はカルボニル炭素で結合する基を示す。XはC1-10の直鎖アルキレン基、好ましくはC6-10の直鎖アルキレン基を示すが、該アルキレン基を構成する炭素原子のうち1〜3個の炭素原子はヘテロ原子で置きかえられていてもよい。ヘテロ原子としては、例えば、窒素原子、酸素原子、又はイオウ原子などを用いることができるが、ヘテロ原子としては窒素原子が好ましく、ヘテロ原子として1個又は2個の窒素原子を含むことが好ましい。例えば、2個の窒素原子を含むXとして-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-を例示することができるが、この特定の態様に限定されることはない。蛍光団のカルボン酸への結合形成を容易にするためにに末端にアミノ基を有することが特に好ましい。
【００２４】
また、Xが示すC6-10の直鎖アルキレン基を構成する炭素原子のうち1〜3個の炭素原子のうち1〜3個はオキソ基を有していてもよい。該アルキレン基を構成する炭素原子がヘテロ原子で置きかえられている場合には、該ヘテロ原子上にオキソ基が存在していてもよい。アルキレン鎖がヘテロ原子として窒素原子、酸素原子、又はイオウ原子を含む場合には、オキソ基を有する炭素原子とともにそれぞれアミド結合、エステル結合、又はチオアミド結合を形成することが好ましい場合がある。2個の窒素原子を含み、かつそのうちの1個の窒素原子がカルボニル炭素と隣接してアミド結合を形成することが好ましく、そのような例としてXが-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-NH-CH2-である場合を挙げることができる。
【００２５】
Xとしては、
-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-
-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-
-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-
-NH-CO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-
-O-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-
-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-NH-CH2-
-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-
-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-
-NH-CH2-CH2-O-CH2-CO-NH-CH2-CH2-
-CH2-NH-CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-
-NH-CH2-CH2-S-CH2-CO-NH-CH2-CH2-
などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００２６】
上記一般式(I)で表される本発明の化合物は酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。
【００２７】
上記一般式(I)で表される本発明の化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、1個又は2個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
【００２８】
本発明の化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明を基にして反応原料、反応条件、及び反応剤などを適宜選択し、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることによって、上記一般式（I）で表される本発明の化合物をいずれも製造することができる。
【００２９】
ルシフェリン−ルシフェラーゼ系の発光は、ATP及びMg2+の存在下、基質のD-ルシフェリンがルシフェラーゼによって発光体であるオキシルシフェリンに酸化される反応によっておこる。従来は発光が速やかに減衰してしまうためにオートインジェクターを備えたルミノメーターを必要としたが、現在はコエンザイムA（CoA）を添加した改良法（Promega Protocols and Application Guide, 2nd edition）により、より強く且つ安定した発光が得られるようになり、特別な装置は不要となっている。
【００３０】
【化３】
2012020978.tif 000004
【００３１】
ホタルルシフェラーゼとルシフェリンの組み合わせにより生じる生物発光を利用した生物発光法は、蛍光法に比べると励起光が必要ないためバックグランドが全く存在せず、しかも測定装置が簡単であることから臨床検査や衛生検査を含む分析化学に種々利用されている。また、イン・ビボでこの発光系を用いることにより、宿主細胞内の酵素によるバックグラウンドに全く影響されずにアデノシン三リン酸（ATP）の検出などを行なうことができるほか、レポーター蛋白としてルシフェラーゼ活性を検出するレポータージーンアッセイへの応用も盛んに行われている。本発明の化合物又はその塩はルシフェラーゼの基質となることができ、ATP及びMg2+の存在下でルシフェラーゼにより対応のオキシルシフェリン誘導体に酸化される性質を有している。
【００３２】
本発明の化合物又はその塩をルシフェラーゼ基質として用いる場合、上記一般式(I)で表される化合物又はその塩をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。
【００３３】
近年、CCDカメラや画像解析技術の進歩により、従来は捕捉が難しかった体内（イン・ビボ）の微量ルシフェラーゼ発光を捉えることにが可能となっている。ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞（癌細胞や細菌など）、トランスジェニックマウス、又は病態モデル動物などに対して、本発明の発光性のルシフェラーゼ基質を腹腔内投与することにより、イン・ビボにおける遺伝子やタンパク質発現、あるいは薬物の作用発現の経時的変化などを生きた生体内で長時間にわたりメージングすることが可能である。従来、このような目的にルシフェリンを用いる試みが知られているが、ルシフェリンによる発光の波長は570 nmであり組織透過性が低いという欠点がある。本発明の化合物は組織透過性の高い約800 nm程度の波長の発光を生じる性質を有しており、イン・ビボのイメージングに適用した場合にルシフェリンより好適な測定結果を得ることができる。上記一般式(I)で表される化合物又はその塩を用いると、特に深部組織においてルシフェラーゼを発現する細胞を高感度に測定することが可能になる。本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。
【００３４】
本発明の化合物又はその塩は、例えば発光ラベル化剤として用いることもできる。被ラベル化物質の種類は特に限定されず、例えば、タンパク質、核酸、脂質類などの生体分子のほか、各種の有機低分子又は有機高分子化合物をラベル化することができる。ラベル化の方法は特に限定されず、従来の発光ラベル化剤や蛍光ラベル化剤などを用いたラベル化の方法に準じて行なうことが可能である。例えば、PIERCE社カタログ：Applications Handbook and Catalog 2005/2006, Section 9に記載の架橋剤などの手段を利用することができる。
【００３５】
また、一般式(I)で表される本発明の化合物又はその塩を用いて、生物発光プローブを製造することができる。生物発光プローブは、それ自体はルシフェラーゼの基質とはならないか、又はルシフェラーゼには基質として認識されるもののルシフェラーゼによる化学変化を受けずに実質的に無発光性のまま保たれる性質を有しているが、例えば酵素などの測定対象物との接触により加水分解などの化学修飾を受けて、一般式(I)で表される本発明の化合物又はその塩を与える性質を有する。このような生物発光プローブは、一般的には一般式(I)で表される本発明の化合物又はその塩の残基を化学構造の一部として有している。本明細書において「残基」とは一般式(I)で表される本発明の化合物又はその塩から1個の水素原子を除いた残りの一価の基を意味するが、残基の選択にあたっては発光特性を損なわないように選択すべきである。このような選択は、例えばルシフェラーゼの3次元構造を用いたドッキングスタディにより容易に行うことができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例1
以下のスキームに従って本発明の化合物を製造した。
【化４】
2012020978.tif 000005
【００３７】
(a)化合物1の合成
6-アミノ-2-シアノベンゾチアゾール 475 mg (2,7 mmol 1eq.)及びN-(tert-ブトキシカルボニル)アミノアセトアルデヒド 500 mg (3.1 mmol, 1.2 eq.) をアセトニトリル 30 mLに溶かし、酢酸1 mlを加えた。固体がすべて溶けきったところでNaCNBH3を250 mg (4.0 mmol, 1.5eq.)を加え、室温にて10分撹拌した。反応液に20 mlの水を加えて反応を止めた後、溶媒を減圧除去した。ジクロロメタン 50mlを加え、有機層を飽和NaHCO3水溶液、水、及び飽和食塩水で順次洗浄した。続いてNa2SO4を加えて乾燥し、ろ過後に溶媒を除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（ジクロロメタン/メタノール 1.5%）して目的物を得た。(560 mg, 65%)
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS) δ  1.46 (s, 9H), 3.31-3.48 (m, 4H), 5.09 (br, 2H), 6.85-6.90(m, 2H), 7.87(d, 1H, J=8.8 Hz)
13C-NMR(75 MHz, CDCl3, TMS) δ 28.3, 39.6, 44.8, 53.4, 79.9, 99.3, 113.8, 116.9, 125.4, 129.3, 138.7, 144.5, 149.0, 156.9
HRMS (ESI+): calculated for [M+Na]+ 341.10482, Found 341.10427  (-0.54mmu)
【００３８】
(b)化合物2の合成
化合物1 225 mgを10 ml ジクロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢酸3 mlを添加し、室温にて1分撹拌した。溶媒を減圧除去してHPLCを用いて精製して目的化合物を得た (144 mg, 94%)。
eluent A (H2O 0.1% トリフルオロ酢酸) and eluent B (アセトニトリル 80%, H2O 20%, 0.1% トリフルオロ酢酸) (A/B = 80/20 to 20/80 for 20 min)。
1H-NMR (300 MHz, CD3OD, TMS) δ 3.24 (t, 2H, J=6.6 Hz), 3.57 (t, 2H, J=6.6 Hz), 7.05 (dd, 1H, J=2.2 Hz, 8.8 Hz), 7.15 (d, 1H, J=2.2 Hz), 7.83 (d, 1H, J=8.8 Hz)
13C-NMR(75 MHz, CDCl3, TMS) δ 39.4, 41.7, 101.0, 114.7, 118.6, 126.1, 130.9, 140.0, 145.8, 150.5)
【００３９】
(c)化合物3の合成
N-(tert-ブトキシカルボニル)-6-アミノヘキサン酸 250 mg (1.1mmol, 1eq.), WSCD 414 mg (2.0eq.), NHS 249 mg (2.0eq)を 5ml ジメチホルムアミドに溶解し、室温で8時間撹拌した。溶媒を減圧除去後、ジクロロメタン 30 mlを加え, 2N HClを用いて弱酸性に調整した水、及び飽和食塩水で順次洗浄した。Na2SO4を加えて乾燥し、ろ過後に溶媒を除去し、ジメチルホルムアミド 4 mlに残渣を溶解した。この溶液に化合物2 200 mg (0.92 mmol, 0.84 eq.)、DIEA 100μlを加え、室温で12時間撹拌した。溶媒を減圧蒸留後、ジクロロメタン 30 mlを加え、飽和NaHCO3水溶液、水、及び飽和食塩水で順次洗浄した。続いてNa2SO4を加えて乾燥し、ろ過後に溶媒を除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して（ジクロロメタン/メタノール 1%→3%）、目的物を得た(241 mg, 61%)。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS) δ 1.30-1.52 (m, 13H), 1.65 (q, 2H, J=7.4 Hz), 2.22 (t, 2H, J=7.3 Hz), 3.07 (q, 2H, J=6.6 Hz), 3.31-3.34 (m, 2H), 3.58 (q, 2H, J=5.9 Hz) 4.68 (br, 1H), 5.30 (s, 1H), 6.35 (br, 1H), 6.87-6.91 (m, 2H), 7.86 (d, 1H, J=10.2 Hz)  13C-NMR(75 MHz, CDCl3, TMS) δ 25.0, 26.2, 28.3, 29.6, 36.2, 38.6, 40.2, 44.6, 79.1, 99.3, 113.9, 117.0, 125.4, 129.3, 138.7, 144.5, 149.0, 156.1, 174.5
HRMS (ESI+): calculated for [M+Na]+ 454.18888, Found 454.18813 (-0.75 mmu)
【００４０】
(d)化合物4の合成
化合物3 34.6 mgをジクロロメタン 1 mlに溶解し、トリフルオロ酢酸200 μlを加え、室温にて1分撹拌した。溶媒を減圧蒸留して化合物4を得た。化合物4は精製せずに次の反応に用いた。
HRMS (ESI+): calculated for [M+H]+ 332.15451, Found 332.15450 (-0.10 mmu)
【００４１】
(e)化合物5の合成
4-ヒドラジノ安息香酸 5.16 g (34mmol, 1 eq.)及び3-メチル-4-ブタノン 3.65 ml (1 eq.)を酢酸 50mlに溶解し、濃硫酸 1 mlを添加して85℃で12時間加熱還流した。水 20 mlを加え、酢酸を減圧除去後、2 N NaOH aq.で中和し、さらに2N HClで弱酸性にした。ジクロロメタン 200 mlを加え、よく撹拌した後に不溶物をろ過した。ジクロロメタン層を飽和食塩水で洗浄した後、Na2SO4を加えて乾燥し、ろ過後に溶媒を除去して目的物の粗精製物5.00 gを得た。化合物5は精製せずに次の反応に用いた。
HRMS (ESI+): calculated for [M+H]+  204.10245, Found 204.09879 (-3.67 mmu)
【００４２】
(f)化合物6の合成
化合物5 1.61 gをアセトニトリル 15 mLに溶解し、ヨウ化メチル 1.69 g (1.5eq.)を加え、80℃にて48時間加熱還流した。溶媒を減圧留去し、ジエチルエーテルを30 ml加えて氷冷し、生成した沈殿をろ取した。得られた固体をジエチルエーテルでよく洗浄した後、固体を回収して乾燥し、目的物の粗精製物1.15 gを得た。化合物6は精製せずに次の反応に用いた。
HRMS (ESI+): calculated for [M]+  218.11810, Found 218.11512 (-2.99 mmu)
【００４３】
(g)化合物7の合成
グルタコンジアニル塩酸塩 124 mg (0.435 mmol, 1eq), DIEA 84.5 mg (0.651 mmol, 1.5eq.), 及び無水酢酸72.0 mg (0.695 mmol, 1.6eq.)をジクロロメタン 3 mlに溶解し、室温にて3時間撹拌した。この反応液を化合物6 300 mg及び酢酸ナトリウム 130 mg をアセトニトリル 10 mLに溶解した溶液に加え、80℃にて12時間加熱還流した。溶媒を減圧留去した後、HPLCを用いて精製を行い目的化合物を得た(21.1 mg, 3.5% (3 step))。
eluent A (水/0.1% トリフルオロ酢酸) 及びeluent B (アセトニトリル 80%, 水20%, 0.1% トリフルオロ酢酸) (A/B = 70/30 to 0/100 for 30 min)
1H-NMR (400 MHz, CD3OD, TMS) δ 1.71 (s, 12H), 3.63 (s, 6H), 6.34 (d, 2H, J=13.6 Hz), 6.61 (t, 2H, J=12.7 Hz), 7.34 (d, 2H, J=12.7 Hz, J=8.3 Hz), 7.66 (t, 1H, J=13.2 Hz), 7.98 (t, 2H, J=21.2 Hz), 8.07 (d, 1H, J=1.4 Hz), 8.10 (dd, 2H, J=1.4 Hz, 8.3 Hz)
13C-NMR(100 MHz, CD3OD, TMS) δ 27.8, 31.7, 50.0, 106.2, 111.4, 124.5, 128.2, 128.4, 132.3, 142.4, 148.2, 153.7, 158.6, 169.2, 174.5
HRMS (ESI+): calculated for [M]+  497.24403, Found 497.24141 (-2.62 mmu)
【００４４】
(h)化合物8の合成
化合物7 20.0 mg (0.040 mmol,), NHS 5.95 mg (1.3eq.), WSCD 10.2 mg (1.3eq.)をジメチルホルムアミド 2 mlに溶解し、室温にて6時間撹拌した。ESI-MSで化合物7のモノスクシンイミジルエステルが主生成物として生成していることを確認した。反応液に酢酸エチル20 ml、及び2N HClを用いて弱酸性に調整した水20 mlを加えた。分液して水層を捨てた後、有機層を2N HClを用いて弱酸性に調整した飽和食塩水で洗浄した。有機層にアセトニトリルを適量加えて不溶物を溶解した後、これにNa2SO4を加え乾燥、ろ過後溶媒を除去し、残渣をジメチルホルムアミド 3 mlに溶解した。この溶液に化合物3 34.6 mg (0.080 mmol, 2eq.)を脱保護して得られた化合物4、及びDIEA 100μlを加え、室温にて6時間撹拌した。トリフルオロ酢酸34 μlを加えて反応液を中和し、溶媒を留去し、HPLCを用いて精製を行い目的化合物 を得た(3.70 mg,11%)。
eluent A (水/0.1% トリフルオロ酢酸) 及び eluent B (アセトニトリル 80%, 水20%, 0.1% トリフルオロ酢酸) (A/B = 80/20 to 10/90 for 30 min) 
1H-NMR (300 MHz, CD3OD, TMS) δ 1.34-1.43 (m, 2H), 1.59-1.75 (m, 4H), 1.69 (s, 6H), 1.72 (s, 6H), 2.22 (t, 2H, J=7.3 Hz), 3.24-3.40 (m, 6H), 3.60 (s, 3H), 3.61 (s, 3H), 6.30 (d, 1H, J=13.2 Hz), 6.35 (d, 1H, J=13.9 Hz), 6.63 (t, 2H, J=12.5 Hz), 6.98 (dd, 1H, J=2.2 Hz, 9.5 Hz), 7.11 (d, 1H, J=2.2 Hz), 7.30 (d, 1H, J=8.8 Hz), 7.31 (d, 1H, J=8.8 Hz), 7.66 (t, 1H, J=13.2 Hz), 7.81 (d, 1H, J=9.5 Hz), 7.87-8.10 (m, 6H)
HRMS (ESI+): calculated for [M]+  810.38015, Found 810.37552 (-4.63mmu)
【００４５】
(i) 化合物9: Cy7MeCOOH-ALの合成
D-システイン塩酸塩 4.00 mg (0.0228 mmol, 5.0 eq.)を1.5 mlの水に溶解し、この溶液に0.05 M 炭酸カリウム水溶液を加えてpH 8.0に調整した。化合物8 3.70 mg (0.00456 mmol) をメタノール 2 mlに溶解し、この溶液にD-システイン溶液を全量加えた。アルゴン雰囲気下、室温にて10分撹拌した後、2N HClを数滴加えて反応液を弱酸性にし、溶媒を留去し、HPLCを用いて精製を行い目的化合物 Cy7MeCOOH-ALを得た (1.94 mg, 46%)。
eluent A (水/0.1% トリフルオロ酢酸) 及び eluent B (アセトニトリル 80%, 水 20%, 0.1% トリフルオロ酢酸) (A/B = 80/20 to 10/90 for 30 min) 。
1H-NMR (300 MHz, CD3OD, TMS) δ 1.28-1.40 (m, 2H), 1.64-1.72 (m, 16H), 2.23 (t, 2H, J=7.3 Hz), 3.20-3.31(m, 6H), 3.56 (s, 3H), 3.59 (s, 3H), 3.68-3.73 (m, 2H), 5.33 (t, 1H, J=9.5 Hz), 6.28 (d, 1H, J=13.9 Hz)  6.31 (d, 1H, J=13.9 Hz), 6.61 (t, 2H, J=12.5 Hz), 6.85 (dd, 1H, J=2.2 Hz, 8.8 Hz), 7.01 (d, 1H, J=2.2 Hz), 7.24 (d, 1H, J=8.8 Hz), 7.28 (d, 1H, J=8.8 Hz), 7.65 (t, 1H, J=13.2 Hz), 7.71 (d, 1H, J=8.8 Hz), 7.85-8.11 (m, 6H) 
HRMS (ESI+): calculated for [M]+  914.37335, Found 914.37160 (-1.74mmu)
【００４６】
例2：.発光スペクトルの測定
例1で合成した発光基質を用いて、HEPESバッファー中でルシフェラーゼによる発光アッセイを行った。その結果、ルシフェラーゼとの反応によってBRET acceptor由来の800 nm付近の発光が観測された。アミノルシフェリン(AL)の発光スペクトルとCy7MeCOOH-ALの発光スペクトルとを比較した結果を図1に示す。
反応条件： 30 mM HEPESバッファー中、MgSO4 5 mM, ATP 2.6 mM, 基質10 μM, ルシフェラーゼ(Photynus Pyralis由来, SIGMA L9506) 5 μg/ml(AL)又は200 μg/ml (Cy7MeCOOH-AL)
測定条件：日立分光蛍光高度計F-4500、 光増幅器：浜松ホトニクスR-928
蛍光側スリット：20 nm、増幅器電圧：950 V、レスポンス：自動（AL）、8 sec (Cy7 Me COOH-AL)、スキャンスピード240 nm /min、スペクトル補正：on、励起光は遮断。反応開始から3分後のスペクトルを測定。バックグラウンドを差し引いてスペクトルを算出。
【図１】
2012020978.tif 000008