(57)【要約】【課題】本発明の目的は、生物個体内、組織内、細胞内、細胞内小器官内、又は水溶液中において、光刺激によりカルシウムイオン濃度を制御することができる化合物及び方法を提供することである。【解決手段】前記課題は、（ａ）カルシウムイオン結合タンパク質、又はカルシウムイオン結合能を有するその改変体；（ｂ）光受容体ペプチド、又は光刺激により構造の変化するその改変体；及び（ｃ）カルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド、又はカルシウムイオン結合タンパク質への結合能を有するその改変体；を含む、光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体により解決することができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）カルシウムイオン結合タンパク質、又はカルシウムイオン結合能を有するその改変体；
（ｂ）光受容体ペプチド、又は光刺激により構造の変化するその改変体；及び
（ｃ）カルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド、又はカルシウムイオン結合タンパク質への結合能を有するその改変体；
を含む、光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体。
【請求項２】
（ａ）カルシウムイオン結合タンパク質、又はカルシウムイオン結合能を有するその改変体；
（ｂ）光受容体ペプチド、又は光刺激により構造の変化するその改変体；及び
（ｃ）カルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド、又はカルシウムイオン結合タンパク質への結合能を有するその改変体；
をＮ末端から順に含み、光刺激によりカルシウムと結合する、請求項１に記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体。
【請求項３】
（ａ１）カルシウムイオン結合タンパク質Ｎ末側ペプチド、又はその改変体；
（ｂ）光受容体ペプチド、又は光刺激により構造の変化するその改変体；
（ａ２）カルシウムイオン結合タンパク質Ｃ末側ペプチド、又はその改変体；及び
（ｃ）カルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド、又はカルシウムイオン結合タンパク質への結合能を有するその改変体；
をＮ末端から順に含み、光刺激によりカルシウムを放出する、請求項１に記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体。
【請求項４】
前記光受容体ペプチドが、フォトトロピン１のＬＯＶ１ドメイン、フォトトロピン１のＬＯＶ２ドメイン、フォトトロピン２のＬＯＶ１ドメイン、フォトトロピン２のＬＯＶ２ドメイン、オーレオクロム１のＬＯＶドメイン、オーレオクロム２のＬＯＶドメイン、及びＦＫＦ−１のＬＯＶドメインからなる群から選択される光受容体ペプチドであり；
前記カルシウムイオン結合タンパク質及びカルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチドの組み合わせが、カルモジュリン及びカルモジュリン結合ペプチド、トロポニンＣ及びトロポニンＩ、ミオシン軽鎖及びミオシンII重鎖、並びにレコベリン及びロドプシンキナーゼからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体。
【請求項５】
（ａ）カルモジュリン、又はカルシウムイオン結合能を有するカルモジュリン改変体；
（ｂ）ＬＯＶ２ドメイン、又は光刺激により構造の変化するＬＯＶ２ドメイン改変体；及び
（ｃ）Ｍ１３ペプチド、又はカルモジュリン結合能を有するＭ１３ペプチド改変体；
をＮ末端から順に含み、光刺激によりカルシウムと結合する、請求項２に記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体。
【請求項６】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる、請求項５に記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体。
【請求項７】
（ａ１）カルモジュリンＮ末側ペプチド、又はその改変体；
（ｂ）ＬＯＶ２ドメイン、又は光刺激により構造の変化するＬＯＶ２ドメイン改変体；
（ａ２）カルモジュリンＣ末側ペプチド、又はその改変体；及び
（ｃ）Ｍ１３ペプチド、又はカルモジュリン結合能を有するＭ１３ペプチド改変体；
をＮ末端から順に含み、光刺激によりカルシウムを放出する、請求項３に記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体。
【請求項８】
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなる、請求項７に記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体。
【請求項９】
シグナルペプチドを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、又は配列番号３０で表される塩基配列からなる、請求項１０に記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載のＤＮＡを含むプラスミド。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、若しくはその機能的等価改変体、又は請求項１０若しくは１１に記載のＤＮＡを用いて発現するタンパク質に、励起光を照射することを特徴とする、カルシウムイオン濃度の制御方法。
【請求項１４】
前記励起光の励起波長が、３００〜５００ｎｍである請求項１３に記載のカルシウムイオン濃度の制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光駆動カルシウムイオン制御タンパク及びカルシウムイオン濃度の制御方法に関する。本発明によれば、カルシウムイオン濃度を制御することができ、例えば、細胞内におけるカルシウムイオンの濃度を上昇させること、又は低下させることができる。
【背景技術】
【０００２】
カルシウムイオンは、通常、細胞内液にはほとんど存在せず、細胞外からのカルシウムイオンの流入、又は細胞内の小胞体等に蓄えられたカルシウムイオンの放出などによって、細胞内の濃度が上昇し、細胞内の様々な生理活性のシグナルとしての役割をはたしている。この細胞内のカルシウムイオン濃度の変化によって、筋肉収縮、神経の情報伝達、短期記憶、長期記憶、神経の成長、免疫系細胞の活性化、胃酸・胃液・腸粘液・汗等の分泌、酵素の活性化、アポトーシス、及び細胞分裂など、生体の多くの生理現象がコントロールされている。
【０００３】
従って、細胞内で起きるカルシウムイオンの濃度変化と、生体の生理現象との関係は、正常な生体の機能ばかりではなく、多くの疾患との関連性も指摘されている。そのため、細胞内で起きるカルシウムイオンの濃度変化を解析することは、非常に重要である。特に、カルシウムイオン濃度の変化は、細胞内の特定の領域又は細胞内小器官付近で起きることもあり、細胞内の任意の位置でカルシウムイオン濃度を制御する実験方法の開発が期待されている。
【０００４】
従来、カルシウムイオンによる細胞又は生体への影響を調べる方法として、光照射によりカルシウムイオンを放出するカルシウムイオンキレート剤である光駆動ケージドカルシウムイオン化合物（例えば、ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−ＥＧＴＡ：以下、ＮＰ−ＥＧＴＡと称する）を用いる方法が知られている（非特許文献１）。ＮＰ−ＥＧＴＡは、マイクロインジェクションにより、細胞内に注入し、光照射によりカルシウムイオンを放出させ、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させることができる。しかしながら、マイクロインジェクションによる細胞への導入は煩雑な手技を要し、また導入したＮＰ−ＥＧＴＡを細胞内の任意の位置にとどめることは困難であり、細胞内の特定の領域のカルシウムイオン濃度を制御することは不可能であった。更に、励起時に紫外光を用いなければならず、細胞に対して害を与える可能性があった。
一方、光照射によって細胞外からカルシウムイオンを流入させる光駆動カルシウムイオントランスポーターを用いる方法が開発された（非特許文献２）。しかしながら、この方法も、カルシウムイオンを細胞外から流入させるため、カルシウムイオン濃度の変化が、細胞全体で起こるものであった。従って、細胞内の任意の領域又は位置でのカルシウムイオン濃度の変化に対する応答を調べることは、原理上不可能であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences）」（米国）１９９４年、第９１巻、ｐ．１８７−９１
【非特許文献２】「ネイチャー（Nature）」（英国）２００２年、第２８巻、ｐ．３９８−４０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記の光駆動ケージドカルシウムイオン化合物（例えば、ＮＰ−ＥＧＴＡ）には、マイクロインジェクションが不要な膜透過性のものも開発されているが、膜透過性の化合物でも、細胞内の局所におけるカルシウムイオンの濃度の制御は困難である。また、前記のように、光駆動カルシウムイオントランスポーターは、細胞外からのカルシウムイオンの流入を行うものであり、やはり細胞内におけるカルシウムイオンの濃度の制御は不可能である。
従って、本発明の目的は、生物個体内、組織内、細胞内、細胞内小器官内、又は水溶液中において、光刺激によりカルシウムイオン濃度を制御することができる化合物及び方法を提供することである。具体的には、カルシウムイオン濃度を上昇又は低下させることが可能な化合物及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、カルシウムイオン濃度を制御することができる実験方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、カルシウムイオン結合タンパク質、光励起によって立体構造が変化する光受容体ペプチド、カルシウムイオン結合タンパク質に結合するカルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチドを含む融合タンパク質を用いることにより、カルシウムイオン濃度を低下させること、又は上昇させることが可能であることを見出した。すなわち、光刺激により光受容体ペプチドの構造が変化することを利用して、カルシウムイオン結合タンパク質及びカルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチドの構造を調整し、融合タンパク質にカルシウムイオンを結合させること、又は融合タンパク質からカルシウムイオンを放出させることが可能であることを見出した。従って、これらの融合タンパク質を用いることによって、細胞内などのカルシウムイオン濃度を制御することが可能である。
前記カルシウムイオン結合タンパク質として、カルモジュリンが最もよく研究されているが、従来、カルモジュリンを用いた融合タンパク質としては、細胞内のカルシウムイオン濃度を測定することのできる融合タンパク質が、本発明者らによって報告されている（Nature Methods, vol.7, No.9, p.729-732）。この融合タンパク質は、カルモジュリン、カルモジュリンと結合するＭ１３ペプチド、及び蛍光タンパク質からなる融合タンパク質であり、カルモジュリンへのカルシウムイオンの結合により、蛍光タンパク質の構造が変化し、カルシウムイオンの濃度を測定することができるプローブ（融合タンパク質）である。しかしながら、このカルシウムイオン濃度測定のプローブ（融合タンパク質）は、カルモジュリン及びＭ１３の複合体にカルシウムイオンが結合することにより、蛍光タンパク質の構造を変化させ、それによって蛍光タンパク質の蛍光強度が変化することを利用するものである。一方、本発明の融合タンパク質は、光刺激により光受容体ペプチドの構造が変化することを利用して、カルモジュリン及びＭ１３の複合体と、カルシウムイオンとの結合を制御するものであり、カルモジュリン、Ｍ１３ペプチド及び蛍光タンパク質からなる融合タンパク質とは、全く異なるものである。更に、本発明者らは、カルシウムイオンと結合する融合タンパク質と、カルシウムイオンを放出するタンパク質とを調製することができたが、この２種類の融合タンパク質は、カルモジュリン、Ｍ１３ペプチド、及び光受容体ペプチドの３つのタンパク質の配置を変更することのみによって、得られたものであり、驚くべきことである。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、
［１］（ａ）カルシウムイオン結合タンパク質、又はカルシウムイオン結合能を有するその改変体；（ｂ）光受容体ペプチド、又は光刺激により構造の変化するその改変体；及び
（ｃ）カルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド、又はカルシウムイオン結合タンパク質への結合能を有するその改変体；を含む、光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体、
［２］（ａ）カルシウムイオン結合タンパク質、又はカルシウムイオン結合能を有するその改変体；（ｂ）光受容体ペプチド、又は光刺激により構造の変化するその改変体；及び
（ｃ）カルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド、又はカルシウムイオン結合タンパク質への結合能を有するその改変体；をＮ末端から順に含み、光刺激によりカルシウムと結合する、［１］に記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質（以下、カルシウムイオン吸収融合タンパク質と称することがある）、又はその機能的等価改変体（以下、まとめてカルシウムイオン吸収融合タンパク質等と称することがある）、
［３］（ａ１）カルシウムイオン結合タンパク質Ｎ末側ペプチド、又はその改変体；
（ｂ）光受容体ペプチド、又は光刺激により構造の変化するその改変体；（ａ２）カルシウムイオン結合タンパク質Ｃ末側ペプチド、又はその改変体；及び（ｃ）カルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド、又はカルシウムイオン結合タンパク質への結合能を有するその改変体；をＮ末端から順に含み、光刺激によりカルシウムを放出する、［１］に記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質（以下、カルシウムイオン吸収融合タンパク質と称することがある）、又はその機能的等価改変体（以下、まとめてカルシウムイオン吸収融合タンパク質等と称することがある）、
［４］前記光受容体ペプチドが、フォトトロピン１のＬＯＶ１ドメイン、フォトトロピン１のＬＯＶ２ドメイン、フォトトロピン２のＬＯＶ１ドメイン、フォトトロピン２のＬＯＶ２ドメイン、オーレオクロム１のＬＯＶドメイン、オーレオクロム２のＬＯＶドメイン、及びＦＫＦ−１のＬＯＶドメインからなる群から選択される光受容体ペプチドであり；
前記カルシウムイオン結合タンパク質及びカルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチドの組み合わせが、カルモジュリン及びカルモジュリン結合ペプチド、トロポニンＣ及びトロポニンＩ、ミオシン軽鎖及びミオシンII重鎖、並びにレコベリン及びロドプシンキナーゼからなる群から選択される、［１］〜［３］のいずれかに記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体、
［５］（ａ）カルモジュリン、又はカルシウムイオン結合能を有するカルモジュリン改変体；（ｂ）ＬＯＶ２ドメイン、又は光刺激により構造の変化するＬＯＶ２ドメイン改変体；及び（ｃ）Ｍ１３ペプチド、又はカルモジュリン結合能を有するＭ１３ペプチド改変体；をＮ末端から順に含み、光刺激によりカルシウムと結合する、［２］に記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体、
［６］配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる、［５］に記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体、
［７］（ａ１）カルモジュリンＮ末側ペプチド、又はその改変体；（ｂ）ＬＯＶ２ドメイン、又は光刺激により構造の変化するＬＯＶ２ドメイン改変体；（ａ２）カルモジュリンＣ末側ペプチド、又はその改変体；及び（ｃ）Ｍ１３ペプチド、又はカルモジュリン結合能を有するＭ１３ペプチド改変体；をＮ末端から順に含み、光刺激によりカルシウムを放出する、［３］に記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体、
［８］配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなる、［７］に記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体、
［９］シグナルペプチドを含む、［１］〜［８］のいずれかに記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体、
［１０］［１］〜［９］のいずれかに記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体をコードするＤＮＡ、
［１１］配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、又は配列番号３０で表される塩基配列からなる、［１０］に記載のＤＮＡ、
［１２］［１０］又は［１１］に記載のＤＮＡを含むプラスミド、
［１３］［１］〜［９］のいずれかに記載の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、若しくはその機能的等価改変体、又は［１０］若しくは［１１］に記載のＤＮＡを用いて発現するタンパク質に、励起光を照射することを特徴とする、カルシウムイオン濃度の制御方法、
［１４］前記励起光の励起波長が、３００〜５００ｎｍである［１３］に記載のカルシウムイオン濃度の制御方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体によれば、カルシウムイオン濃度を制御すること、すなわちカルシウムイオン濃度を上昇、又は低下させることができる。
また、本発明のＤＮＡ又はプラスミドを用いることにより、細胞内において、容易に本発明の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質を発現させることが可能である。従って、従来の光駆動ケージドカルシウムイオン化合物又は光駆動カルシウムイオントランスポーターと比較して、本発明の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質は、細胞内での取り扱いが容易である。
更に、本発明の細胞内小器官ターゲット配列を有する光駆動カルシウムイオン制御タンパク質は、細胞内の特定の領域に移行（存在）させることが可能であり、細胞内の任意の位置でカルシウムイオン濃度を制御することができる。すなわち、本発明のカルシウムイオン制御タンパク質、又はその機能的等価改変体は、生物個体内、組織内、細胞内、細胞内小器官内、又は水溶液中のいずれにおいても、使用することが可能であり、生体内等のカルシウムイオン濃度を容易に制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のＰａｃｍａｎ（カルシウムイオン吸収融合タンパク質）及びＣＡＲＢＹ（カルシウムイオン放出融合タンパク質）の吸収スペクトルを、ＬＯＶ２ドメインの吸収スペクトルと比較したグラフである。
【図２】本発明のＰａｃｍａｎ（カルシウムイオン吸収融合タンパク質）又はＣＡＲＢＹ（カルシウムイオン放出融合タンパク質）を用いて、光励起によりカルシウムイオン濃度が変化すること示したグラフである。
【図３】本発明のＰａｃｍａｎ（カルシウムイオン吸収融合タンパク質）の構造の模式図である。
【図４】本発明のＣＡＲＢＹ（カルシウムイオン放出融合タンパク質）の構造の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［１］光駆動カルシウムイオン制御タンパク質
（光駆動カルシウムイオン制御タンパク質）
本発明の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質は、（ａ）カルシウムイオン結合タンパク質、又はカルシウムイオン結合能を有するその改変体（以下、カルシウムイオン結合タンパク質等（ａ）と称することがある）；（ｂ）光受容体ペプチド、又は光刺激により構造の変化するその改変体（以下、光受容体ペプチド等（ｂ）と称することがある）；及び（ｃ）カルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド、又はカルシウムイオン結合タンパク質結合能を有するその改変体（以下、カルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド等（ｃ）と称することがある）；を含む。また、光駆動カルシウムイオン制御タンパク質は、カルシウムイオン結合タンパク質等（ａ）、光受容体ペプチド等（ｂ）、及びカルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド等（ｃ）からなってもよく、更に後述のペプチドリンカー等、及び／又はシグナルペプチドを含んでもよい。。
【００１２】
（カルシウムイオン結合タンパク質）
本発明のカルシウムイオン制御タンパク質に用いるカルシウムイオン結合タンパク質は、カルシウムイオン結合能を有する限り、特に限定されるものはないが、例えばカルモジュリン、トロポニンＣ、ミオシン軽鎖、又はレコベリンを挙げることができる。これらのカルシウムイオン結合タンパク質は、後述のカルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチドとの複合体を形成することにより、カルシウムイオンとの親和性が上昇するタンパク質であり、本発明のカルシウムイオン制御タンパク質に好ましく用いることができる。また、カルシウムイオン結合タンパク質の由来も特に限定されるものではなく、すべての生物由来のカルシウムイオン結合タンパク質を使用することが可能である。
【００１３】
前記カルシウムイオン結合タンパク質のうち、カルモジュリンは酸性のタンパク質で、約１４８残基のアミノ酸からなる。４つのＥＦハンドモチーフを有しており、それぞれにカルシウムイオンが結合する。カルモジュリンは、様々な細胞で発現し、細胞における存在部位も、細胞内小器官内及び膜上など様々であり、カルシウムイオンによるシグナル伝達に重要な役割を果たしているタンパク質である。
本発明のカルシウムイオン制御タンパク質に用いるカルモジュリンは、カルシウムイオン結合能を有する限り、特に限定されるものはなく、すべての生物由来のカルモジュリンを使用することが可能であり、例えば配列番号３１で表されたアミノ酸配列からなるタンパク質であるカルモジュリンを用いることができる。
【００１４】
（カルシウムイオン結合タンパク質改変体）
カルシウムイオン結合タンパク質の改変体とは、カルシウムイオン結合タンパク質の本来有しているカルシウムイオン結合能を有している改変体を意味する。具体的には、そのアミノ酸配列が、元となるカルシウムイオン結合タンパク質のアミノ酸配列において１以上（特には１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、しかも、元となるカルシウムイオン結合タンパク質と実質的に同じ活性（カルシウムイオン結合能）を有しているタンパク質を意味する。前記アミノ酸の欠失、置換、又は付加は、例えば３０個であり、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜１０個である。例えば、Ｎ末側の１〜３０個のアミノ酸の欠失した改変体、より好ましくは１〜２０個のアミノ酸の欠失した改変体、更に好ましくは１〜１０個のアミノ酸欠失した改変体、Ｃ末側の１〜３０個のアミノ酸の欠失した改変体、より好ましくは１〜２０個のアミノ酸の欠失した改変体、更に好ましくは１〜１０個のアミノ酸欠失した改変体を挙げることができる。
【００１５】
カルシウムイオン結合タンパク質の改変体のうち、カルモジュリンの改変体とは、カルモジュリンの本来有しているカルシウムイオン結合能を有している改変体を意味する。例えば、そのアミノ酸配列が、配列番号３１で表されるアミノ酸配列において１以上（特には１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、しかも、元となるカルモジュリンと実質的に同じ活性（カルシウムイオン結合能）を示すタンパク質を意味する。前記アミノ酸の欠失、置換、又は付加は、例えば３０個であり、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜１０個である。例えば、Ｎ末側の１〜３０個のアミノ酸の欠失したカルモジュリン改変体、より好ましくは１〜２０個のアミノ酸の欠失したカルモジュリン改変体、更に好ましくは１〜１０個のアミノ酸欠失したカルモジュリン改変体、Ｃ末側の１〜３０個のアミノ酸の欠失したカルモジュリン改変体、より好ましくは１〜２０個のアミノ酸の欠失したカルモジュリン改変体、更に好ましくは１〜１０個のアミノ酸欠失したカルモジュリン改変体を挙げることができる。
【００１６】
（光受容体ペプチド）
本発明の光駆動生カルシウムイオン制御タンパク質に用いる光受容体ペプチドは、光刺激により構造の変化するペプチドであり、例えばフォトトロピン１のＬＯＶ１ドメイン、フォトトロピン１のＬＯＶ２ドメイン、フォトトロピン２のＬＯＶ１ドメイン、フォトトロピン２のＬＯＶ２ドメイン、オーレオクロム１のＬＯＶドメイン、オーレオクロム２のＬＯＶドメイン、ＦＫＦ−１のＬＯＶドメイン、ＡｐｐＡのＢＬＵＦドメイン、及びＴｅＰｉｘＤ−Ｉ６６ＣのＢＬＵＦドメインを挙げることができ、好ましくはフォトトロピン１のＬＯＶ１ドメイン、フォトトロピン１のＬＯＶ２ドメイン、フォトトロピン２のＬＯＶ１ドメイン、フォトトロピン２のＬＯＶ２ドメイン、オーレオクロム１のＬＯＶドメイン、オーレオクロム２のＬＯＶドメイン、又はＦＫＦ−１のＬＯＶドメインであり、より好ましくはフォトトロピン１のＬＯＶ２ドメイン、又はフォトトロピン２のＬＯＶ２ドメインである。
【００１７】
前記光受容体ペプチドの由来も、特に限定されるものではなく、すべての生物由来（例えば、動物由来、又は植物由来）の光受容体ペプチドを用いることができる。すなわち、多くの生物が、光受容体ペプチドを含むタンパク質であるフォトトロピン１、フォトトロピン２、オーレオクロム１、オーレオクロム２、ＦＫＦ−１、ＡｐｐＡ、及びＴｅＰｉｘＤ−Ｉ６６Ｃを有しており、それぞれのタンパク質に含まれる光受容体ペプチドを用いることができる。
【００１８】
なお、フォトトロピンは、植物特有の青色光受容体であり、光屈性、葉緑体の光定位運動、気孔の開口、葉の平坦化、葉の光定位運動などを誘導する。フォトトロピンには、前記のようにフォトトロピン１及びフォトトロピン２があり、フォトトロピン１は弱光から中高強光域の光センサーとして、フォトトロピン２は強光域の光センサーとして機能する。フォトトロピン１及びフォトトロピン２は、ともにＬＯＶ１ドメイン及びＬＯＶ２ドメインを有しており、ＬＯＶ１ドメインは光感受性制御に関連した機能を有しており、ＬＯＶ２ドメインがキナーゼ活性の光制御分子スイッチとして機能すると考えられている。また、オーレオクロムは、黄色植物（ヒバマタ、コンブ、及びケイ藻など）が有する青色光受容体であり、ＬＯＶドメインを有しており、青色光を吸収して構造が変化することによって、光センサーとして機能する。
【００１９】
例えば、前記フォトトロピン１は、燕麦、シロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシ、イネ又はシダ類などが有しており、これらの植物のフォトトロピン１のＬＯＶ２ドメインを本発明の光駆動生カルシウムイオン制御タンパク質に用いることができるが、特には配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである燕麦由来のＬＯＶ２ドメインが好ましい。
【００２０】
光受容体ペプチドは、光刺激によりその立体構造が変化するが、立体構造が変化する励起波長は、光受容体ペプチドの種類により、適宜選択することができる。例えば、フォトトロピン１、フォトトロピン２、オーレオクロム１、及びオーレオクロム２は青色光受容体であり、青色周辺の励起波長を用いることが好ましい。従って、フォトトロピン１のＬＯＶ１ドメイン、フォトトロピン１のＬＯＶ２ドメイン、フォトトロピン２のＬＯＶ１ドメイン、及びフォトトロピン２のＬＯＶ２ドメイン、及びオーレオクロム１のＬＯＶドメイン、オーレオクロム２ＬＯＶドメインの励起波長は、３００〜５００ｎｍを用いることが可能であり、３５０〜４９０ｎｍが好ましく、４３０〜４７０ｎｍがより好ましい。
【００２１】
（光受容体ペプチド改変体）
前記光受容体ペプチドの改変体とは、その光受容体ペプチドの本来有している性質、すなわち光刺激により構造の変化することのできる改変体を意味する。具体的には、そのアミノ酸配列が、元となる光受容体ペプチドのアミノ酸配列において１以上（特には１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、しかも、元となる光受容体ペプチドと実質的に同じ活性（光刺激による構造変化）を示すペプチドを意味する。前記アミノ酸の欠失、置換、又は付加は、例えば３０個であり、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜１０個である。例えば、Ｎ末側の１〜３０個のアミノ酸の欠失した改変体、より好ましくは１〜２０個のアミノ酸の欠失した改変体、更に好ましくは１〜１０個のアミノ酸欠失した改変体、Ｃ末側の１〜３０個のアミノ酸の欠失した改変体、より好ましくは１〜２０個のアミノ酸の欠失した改変体、更に好ましくは１〜１０個のアミノ酸欠失した改変体を挙げることができる。
【００２２】
例えば、ＬＯＶ２ドメイン改変体とは、ＬＯＶ２ドメインの本来有している性質を有する改変体、すなわち光刺激により構造の変化することのできる改変体を意味する。例えば、そのアミノ酸配列が、配列番号３２で表されるアミノ酸配列において１以上（特には１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、しかも、元となるＬＯＶ２ドメインと実質的に同じ活性（光刺激による構造変化）を示すタンパク質を意味する。前記アミノ酸の欠失、置換、又は付加は、例えば３０個であり、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜１０個である。特に、例えば、Ｎ末側の１〜３０個のアミノ酸の欠失したＬＯＶ２ドメイン改変体、より好ましくは１〜２０個のアミノ酸の欠失したＬＯＶ２ドメイン改変体、更に好ましくは１〜１０個のアミノ酸欠失したＬＯＶ２ドメイン改変体、Ｃ末側の１〜３０個のアミノ酸の欠失したＬＯＶ２ドメイン改変体、より好ましくは１〜２０個のアミノ酸の欠失したＬＯＶ２ドメイン改変体、更に好ましくは１〜１０個のアミノ酸欠失したＬＯＶ２ドメイン改変体を挙げることができる。具体的には、後述の実施例に示すように、前記フォトトロピン１のＬＯＶ２ドメインの改変体としては、Ｃ末側アミノ酸が１７個、１６個、１５個、１４個、１２個、９個、又は３個欠失した改変体を挙げることができ、これらの改変体はＬＯＶ２ドメインと同じように、光刺激により構造が変化する。
【００２３】
（カルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド）
本発明のカルシウムイオン制御タンパク質は、更にカルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチドを含む。このペプチドは、カルシウムイオン結合タンパク質への結合能を有する限り、特に限定されるものはないが、例えばカルモジュリン結合ペプチド、トロポニンＩ、ミオシンII重鎖、又はロドプシンキナーゼを挙げることができる。これらのカルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチドは、前記カルシウムイオン結合タンパク質との複合体を形成することにより、カルシウムイオン結合タンパク質のカルシウムイオンとの親和性を上昇させることができる。具体的には、カルモジュリン結合ペプチドはカルモジュリンと、トロポニンＩはトロポニンＣと、ミオシンII重鎖はミオシン軽鎖と、及びロドプシンキナーゼはレコベリンとそれぞれ複合体を形成する。
【００２４】
前記カルモジュリン結合ペプチドは、いくつかのキナーゼなどに存在しており、例えば骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼ、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ、カルモジュリン依存キナーゼII、カルモジュリン依存キナーゼキナーゼ等のカルモジュリン結合領域のペプチドを挙げることができる。
【００２５】
本発明のカルシウムイオン制御タンパク質に用いるカルモジュリン結合ペプチドの生物種の由来も、カルモジュリンに結合するものである限り、特に限定されるものではなく、すべての生物由来のカルモジュリン結合ペプチドを用いることが可能である。すなわち、すべての生物由来に骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼのカルモジュリン結合領域のペプチド、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼのカルモジュリン結合領域のペプチド、カルモジュリン依存キナーゼIIのカルモジュリン結合領域のペプチド、カルモジュリン依存キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合領域のペプチド等を用いることができる。例えば、配列番号３３で表されるアミノ酸配列からなる、アフリカツメガエルの骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼのカルモジュリン結合領域であるＭ１３ペプチドを用いることが可能である。
前記Ｍ１３ペプチドは、骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼのカルモジュリン結合領域に由来する２６残基ペプチド（KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL）（Blumenthal, D. K., & Krebs, E. G. (1987) Methods Enzymol. 139,115-126）であり、カルシウムイオンが結合したカルモジュリン（カルシウムイオン−カルモジュリン）に結合し、安定した複合体を形成する。従って、本発明のカルシウムイオン制御タンパク質はＭ１３ペプチドを含むことにより、カルモジュリンがカルシウムイオンと結合した場合、強固な結合を形成することが可能である。
【００２６】
更に、Ｍ１３ペプチド以外の具体的なカルモジュリン結合ペプチドを以下の表１に挙げる。
【００２７】
【表１】
2012157306.tif 000003
【００２８】
本発明のカルシウムイオン制御タンパク質において、前記表１に記載の２３種類のカルモジェリン結合ペプチドを、Ｍ１３ペプチドに代えて用いることが可能である。それぞれのカルモジェリン結合ペプチドは、２０アミノ酸からなるペプチド又は１６アミノ酸からなるペプチドのみでもカルモジュリンと結合可能であり、そのまま本発明のカルシウムイオン制御タンパク質に用いることが可能である。しかしながら、Ｍ１３ペプチドと同じように、それぞれのペプチドのＣ末側に続く１〜１０個のアミノ酸（好ましくは４〜８アミノ酸、より好ましくは６アミノ酸）を含んだペプチドを用いることもできる。更に、それらのペプチドの改変体を用いることも可能である。
【００２９】
（カルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド改変体）
カルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド改変体とは、カルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド改変体の本来有しているカルシウムイオン結合タンパク質への結合能を有している改変体を意味する。具体的には、そのアミノ酸配列が、元となるペプチドのアミノ酸配列において１以上（特には１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、しかも、元となるペプチドと実質的に同じ活性（カルシウムイオン結合タンパク質結合能）を有しているペプチドを意味する。前記アミノ酸の欠失、置換、又は付加は、例えば１０個であり、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個である。例えば、Ｎ末側の１〜１０個のアミノ酸の欠失したペプチド改変体、より好ましくは１〜５個のアミノ酸の欠失したペプチド改変体、更に好ましくは１〜３個のアミノ酸欠失したペプチド改変体、Ｃ末側の１〜１０個のアミノ酸の欠失したペプチド改変体、より好ましくは１〜５個のアミノ酸の欠失したペプチド改変体、更に好ましくは１〜３個のアミノ酸欠失したペプチド改変体を挙げることができる。
【００３０】
カルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド改変体のうち、Ｍ１３ペプチド改変体とは、Ｍ１３ペプチドの本来有している性質を有する改変体、すなわちカルモジュリンへの結合能を有する改変体を意味する。例えば、そのアミノ酸配列が、配列番号３３で表されるアミノ酸配列において１以上（特には１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、しかも、元となるＭ１３ペプチドと実質的に同じ活性（カルモジュリンへの結合能）を示すペプチドを意味する。前記アミノ酸の欠失、置換、又は付加は、例えば１０個であり、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個である。特に、例えば、Ｎ末側の１〜１０個のアミノ酸の欠失したＭ１３ペプチド改変体、より好ましくは１〜５個のアミノ酸の欠失したＭ１３ペプチド改変体、更に好ましくは１〜３個のアミノ酸欠失したＭ１３ペプチド改変体、Ｃ末側の１〜１０個のアミノ酸の欠失したＭ１３ペプチド改変体、より好ましくは１〜５個のアミノ酸の欠失したＭ１３ペプチド改変体、更に好ましくは１〜３個のアミノ酸欠失したＭ１３ペプチド改変体を挙げることができる。例えば、後述の実施例に示すように、前記Ｍ１３ペプチド改変体としては、Ｎ末側アミノ酸が１個又は２個欠失した改変体を挙げることができ、この改変体はＭ１３ペプチドと同じように、カルモジュリンへの結合能を示す。
【００３１】
（シグナルペプチド）
また、本発明の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質を、細胞内の任意の位置で発現させるため、光駆動カルシウムイオン制御タンパク質は、シグナルペプチドを含んでもよい。シグナルペプチドを含むことによって、細胞内の特定の領域又は細胞内小器官内若しくは細胞内小器官の膜上で光駆動カルシウムイオン制御タンパク質を発現させることができる。
シグナルペプチドは、約３〜６０アミノ酸からなるペプチドであり、局在シグナル、輸送シグナル、又は移行シグナルと呼ばれることもある。シグナルペプチドは、その種類に応じて、Ｎ末端、Ｃ末端、又はタンパク質内部のアミノ酸配列に存在し、細胞質内で生合成されたタンパク質の細胞内の局所への輸送および局在化を誘導する。具体的には、シグナルペプチドとして、ミトコンドリア膜間スペース局在化シグナル、ゴルジ体局在化シグナル、小胞体局在化シグナル、ペルオキシソーム局在化シグナル、核局在シグナル、ミトコンドリアのマトリックス局在シグナル、細胞膜局在シグナル及び葉緑体局在シグナルなどを挙げることができる。
例えば、Ｎ末端に存在するシグナルペプチドとしては、小胞体移行シグナル（H2N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-Gln-）、ミトコンドリアマトリックスシグナル（H2N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu-）、及びペルオキシソームシグナル（PTS2）（H2N-----Arg-Leu-X5-His-Leu）を挙げることができ、Ｃ末端に存在するシグナルペプチドとしては、小胞体保留シグナル（-Lys-Asp-Glu-Leu-COOH）、及びペルオキシソームシグナル（PTS1）（-Ser-Lys-Leu-COOH）を挙げることができ、タンパク質内部に存在するシグナルペプチドとしては、核移行シグナル（NLS）（-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val）を挙げることができる。
これらのシグナルペプチドを、本発明の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、又はタンパク質内部に含ませることにより、光駆動カルシウムイオン制御タンパク質を細胞内の特定の領域に局在させ、カルシウムイオン濃度の変化による細胞の動態を解析することが可能である。
【００３２】
（機能的等価改変体）
本発明の機能的等価改変体は、前記光駆動カルシウムイオン制御タンパク質の機能的等価改変体である。本明細書において「機能的等価改変体」とは、元となるタンパク質のアミノ酸配列において１以上（特には１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、しかも、元となるタンパク質と実質的に同じ活性を示すタンパク質を意味する。前記アミノ酸の欠失、置換、又は付加は、例えば１０個であり、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜２個である。例えば、配列番号１〜１５で表されたアミノ酸配列のそれぞれにおいて、１以上（特には１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、しかも、光駆動カルシウムイオン制御タンパク質と実質的に同じ活性を有するタンパク質、すなわち、光照射によりカルシウムイオンの濃度を制御可能であり、そしてその光照射の励起波長が実質的に同じであるタンパク質を意味する。
【００３３】
（リンカー及び制限酵素サイト）
本発明のカルシウムイオン制御タンパク質における、カルシウムイオン結合タンパク質等（ａ）と光受容体ペプチド等（ｂ）との間、及び光受容体ペプチド等（ｂ）とカルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド等（ｃ）との間には、カルシウムイオン制御タンパク質の機能を阻害しない限りにおいて、適当な長さのペプチドリンカー又は制限酵素サイトのヌクレオチド配列から翻訳される２〜数アミノ酸の配列を含むことができる。
【００３４】
本発明のカルシウムイオン制御タンパク質は、カルシウムイオン吸収融合タンパク質及びカルシウムイオン放出融合タンパク質を含む。カルシウムイオン吸収融合タンパク質は、光刺激により周囲のカルシウムを吸収（結合）し、周囲の環境のカルシウム濃度を低下させることができる。カルシウムイオン放出融合タンパク質は、保持しているカルシウムイオンを光刺激により放出し、周囲の環境のカルシウムイオン濃度を上昇させることができる。
【００３５】
（カルシウムイオン吸収融合タンパク質）
本発明のカルシウムイオン吸収融合タンパク質は、（ａ）カルシウム結合タンパク質、又はカルシウム結合能を有するその改変体；（ｂ）光受容体ペプチド、又は光刺激により構造の変化するその改変体；及び（ｃ）カルシウム結合タンパク質結合ペプチド、又はカルシウム結合タンパク質への結合能を有するその改変体；をＮ末端から順に含み、光刺激によりカルシウムと結合するものである。また、光駆動カルシウムイオン吸収融合タンパク質は、カルシウムイオン結合タンパク質等（ａ）、光受容体ペプチド等（ｂ）、及びカルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド等（ｃ）からなってもよく、更に前記ペプチドリンカー等、及び／又はシグナルペプチドを含んでもよい。
【００３６】
カルシウムイオン吸収融合タンパク質の１つの態様として、（ａ）カルモジュリン、又はカルシウムイオン結合能を有するカルモジュリン改変体（以下、カルモジュリン等（ａ）と称する）；（ｂ）ＬＯＶ２ドメイン、又は光刺激により構造の変化するＬＯＶ２ドメイン改変体（以下、ＬＯＶ２ドメイン等（ｂ）と称する）；及び（ｃ）Ｍ１３ペプチド、又はカルモジュリン結合能を有するＭ１３ペプチド改変体（以下、Ｍ１３ペプチド等（ｃ）と称する）；をＮ末端から順に含み、光刺激によりカルシウムイオンと結合する融合タンパク質を挙げることができる。具体的には、カルシウムイオン吸収融合タンパク質として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質を挙げることができる。
【００３７】
本発明のカルシウムイオン吸収融合タンパク質の機能的等価改変体は、実質的にカルシウムイオン吸収融合タンパク質と同じ活性を有するものである。「カルシウムイオン吸収融合タンパク質と同じ活性」とは、光照射によりカルシウムイオンと結合し、そしてその光照射の励起波長が実質的に同じであることを意味する。例えば、カルモジュリン又はカルモジュリン改変体のカルシウムイオンと結合する機能が維持されており、そしてＭ１３ペプチド又はＭ１３ペプチド改変体のカルモジュリンに結合する機能が維持されていることを意味する。そして、励起波長として３００〜５００ｎｍを用いることによって、機能的等価改変体がカルシウムイオンと結合できることを意味する。
【００３８】
本発明のカルシウムイオン吸収融合タンパク質は、例えば、カルモジュリン又はカルモジュリン改変体（ａ）、ＬＯＶ２ドメイン又はＬＯＶ２ドメイン改変体（ｂ）、及びＭ１３ペプチド又はＭ１３ペプチド改変体（ｃ）が、Ｎ末端から順に連結された構造をとっている。カルモジュリンは、単体ではカルシウムイオンとの結合はそれほど強くないが、Ｍ１３ペプチドと結合することにより、解離定数が小さくなり、カルモジュリン及びＭ１３の複合体は、カルシウムイオンを強固に結合させることが可能になる。本発明のカルシウムイオン吸収融合タンパク質は、光照射されない状態では、ＬＯＶ２ドメイン等（ｂ）が、カルモジュリン等（ａ）と、Ｍ１３ペプチド等（ｃ）との間に組み込まれていることにより、カルモジュリン等（ａ）とＭ１３ペプチド等（ｃ）とが結合できない状態であり、カルモジュリンの解離定数は大きいと推定される。一方、光照射された場合、ＬＯＶ２ドメイン等（ｂ）の構造が変化し、カルモジュリン等（ａ）と、Ｍ１３ペプチド等（ｃ）とが結合可能な状態になり、カルモジュリン等（ａ）とＭ１３ペプチド等（ｃ）との複合体は、カルシウムイオン吸収融合タンパク質の周囲のカルシウムイオン濃度より小さな解離定数を有する状態になる。そのため、本発明のカルシウムイオン吸収融合タンパク質周囲のカルシウムイオンを吸収することができると推定される。また、カルシウムイオン結合タンパク質等（ａ）、光受容体ペプチド等（ｂ）、及びカルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド等（ｃ）との関係も、それぞれカルモジュリン等（ａ）、ＬＯＶ２ドメイン等（ｂ）、及びＭ１３ペプチド等（ｃ）との関係と同じであると推定される。しかしながら、本発明は前記の推定により限定されるものではない。
【００３９】
（リンカー及び制限酵素サイト）
本発明のカルシウムイオン吸収融合タンパク質において、カルシウムイオン結合タンパク質等（ａ）（例えば、カルモジュリン等（ａ））と光受容体ペプチド等（ｂ）（例えば、ＬＯＶ２ドメイン等（ｂ））との間、及び光受容体ペプチド等（ｂ）（例えば、ＬＯＶ２ドメイン等（ｂ））とカルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド等（ｃ）（例えば、Ｍ１３ペプチド等（ｃ））との間には、カルシウムイオン吸収融合タンパク質の機能を阻害しない限りにおいて、適当な長さのペプチドリンカー又は制限酵素サイトのヌクレオチド配列から翻訳される２〜数アミノ酸の配列を含むことができる。
ペプチドリンカーしては、例えば「Ｇ」、「ＧＧ」、「ＧＧＳ」、「ＧＧＧＳ」、「ＧＧＧＧＳ」、「ＧＧＧＳＫ」、「ＧＧＳＧＧ」、又は「ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ」を挙げることができる。また、制限酵素サイトのヌクレオチド配列から翻訳されるアミノ酸配列としては、ＬＥ及びＧＴなどを含むことができる。
後述の実施例に示すように、カルモジュリン等（ａ）とＬＯＶ２ドメイン等（ｂ）との間に制限酵素サイトＸｈｏＩから翻訳されるＬＥ、及びペプチドリンカー「Ｇ」、「ＧＧＳ」、「ＧＧＧＧＳ」を含んでも、本発明のカルシウムイオン吸収融合タンパク質を発揮することができる。
【００４０】
（カルシウムイオン放出融合タンパク質）
本発明のカルシウムイオン放出融合タンパク質は、（ａ１）カルシウム結合タンパク質Ｎ末側ペプチド、又はその改変体（以下、カルシウム結合タンパク質Ｎ末側ペプチド等（ａ１）と称することがある）；（ｂ）光受容体ペプチド、又は光刺激により構造の変化するその改変体；（ａ２）カルシウム結合タンパク質Ｃ末側ペプチド、又はその改変体（以下、カルシウム結合タンパク質Ｃ末側ペプチド等（ａ２）と称することがある）；及び（ｃ）カルシウム結合タンパク質結合ペプチド、又はカルシウム結合タンパク質への結合能を有するその改変体；をＮ末端から順に含み、光刺激によりカルシウムを放出するものである。また、光駆動カルシウムイオン放出収融合タンパク質は、カルシウム結合タンパク質Ｎ末側ペプチド等（ａ１）、光受容体ペプチド等（ｂ）、カルシウム結合タンパク質Ｃ末側ペプチド等（ａ２）、及びカルシウム結合タンパク質結合ペプチド（ｃ）からなってもよく、更に前記ペプチドリンカー等、及び／又はシグナルペプチドを含んでもよい。
【００４１】
カルシウムイオン吸収融合タンパク質の１つの態様として、（ａ１）カルモジュリンＮ末側ペプチド、又はその改変体；（ｂ）（以下、カルモジュリンＮ末側ペプチド等（ａ１）と称することがある）；ＬＯＶ２ドメイン、又は光刺激により構造の変化するＬＯＶ２ドメイン改変体（以下、ＬＯＶ２ドメイン等（ｂ）と称する）；（ａ２）カルモジュリンＣ末側ペプチド、又はその改変体（以下、カルモジュリンＣ末側ペプチド等（ａ２）と称することがある）；及び（ｃ）Ｍ１３ペプチド、又はカルモジュリン結合能を有するＭ１３ペプチド改変体（以下、Ｍ１３ペプチド等（ｃ）と称する）、をＮ末端から順に含み、光刺激によりカルシウムを放出する融合タンパク質を挙げることができる。具体的には、カルシウムイオン放出融合タンパク質として、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質を挙げることができる。
【００４２】
ＬＯＶ２ドメインが挿入される、カルモジュリンＮ末側ペプチド等（ａ１）と、カルモジュリンＣ末側ペプチド等（ａ２）との切断位置は、カルモジュリンＮ末側ペプチド等（ａ１）、カルモジュリンＣ末側ペプチド等（ａ２）、及びＭ１３ペプチド等（ｃ）の複合体のカルシウムイオン結合能が阻害されない限り、限定されるものではなく、例えばカルモジュリンの２０〜１３０番に存在する連続する２アミノ酸の間であればよい。例えば、２５〜５５番に存在する任意の２アミノ酸の間で切断してよく、３０〜５０番に存在する任意の２アミノ酸の間で切断してよく、３５〜５５番に存在する任意の２アミノ酸の間で切断してもよい。
【００４３】
従って、カルモジュリンＮ末側ペプチド等（ａ１）と、カルモジュリンＣ末側ペプチド等（ａ２）のアミノ酸の鎖長も限定されるものはないが、例えばカルモジュリンＮ末側ペプチド等（ａ１）は、１〜２０番のアミノ酸からなるペプチドから１〜１３０番のアミノ酸からなるペプチドであってよく、１〜２０番のアミノ酸からなるペプチドから１〜６０番のアミノ酸からなるペプチドであってよく、１〜３０番のアミノ酸からなるペプチドから１〜５０番のアミノ酸からなるペプチドであってよく、１〜４０番のアミノ酸からなるペプチドであってよい。また、カルモジュリンＣ末側ペプチド等（ａ２）は、２１〜１５０番のアミノ酸からなるペプチドから１３１〜１５０番のアミノ酸からなるペプチドであってよく、２１〜１５０番のアミノ酸からなるペプチドから６１〜１５０番のアミノ酸からなるペプチドであってよく、３１〜１５０番のアミノ酸からなるペプチドから５１〜１５０番のアミノ酸からなるペプチドであってよく、４１〜１５０番のアミノ酸からなるペプチドであってよい。但し、カルモジュリンＮ末側ペプチド等（ａ１）のＣ末端と、カルモジュリンＣ末側ペプチド等（ａ２）のＮ末端は、実質的に元のカルモジュリンのアミノ酸配列におけるアミノ酸配列の重複及び欠失を含まないものする。ここで、実質的にアミノ酸配列の重複及び欠失を含まないとは、カルモジュリンＮ末側ペプチド等（ａ１）、カルシウムイオン吸収融合タンパク質におけるカルモジュリンＣ末側ペプチド等（ａ２）、及びＭ１３ペプチド等（ｃ）の複合体の形成に影響を与えないものであればよいが、具体的には、１０アミノ酸以下であり、好ましくは５アミノ酸以下である。
また、カルモジュリンＮ末側ペプチド等（ａ１）及びカルモジュリンＣ末側ペプチド等（ａ２）の関係は、カルシウム結合タンパク質Ｎ末側ペプチド等（ａ１）及びカルシウム結合タンパク質Ｃ末側ペプチド等（ａ２）の関係にも当てはまるものである。
【００４４】
本発明のカルシウムイオン放出融合タンパク質の機能的等価改変体は、実質的にカルシウムイオン放出融合タンパク質と同じ活性を有するものである。「カルシウムイオン放出融合タンパク質と同じ活性」とは、光照射によりカルシウムイオンを放出し、そしてその光照射の励起波長が実質的に同じであることを意味する。例えば、カルモジュリンＣ末側ペプチド等（ａ１）、カルモジュリンＣ末側ペプチド等（ａ２）、及びＭ１３ペプチド等（ｃ）の複合体のカルシウムイオン結合能が維持されており、そして光刺激により複合体のカルシウムイオンとの結合能が消失することを意味する。そして、励起波長として３００〜５００ｎｍを用いることによって、機能的等価改変体がカルシウムイオン放出できることを意味する。
【００４５】
本発明のカルシウムイオン放出融合タンパク質は、前記のように（ａ１）カルモジュリンＮ末側ペプチド、又はその改変体、（ｂ）ＬＯＶ２ドメイン、又はＬＯＶ２ドメイン改変体、（ａ２）カルモジュリンＣ末側ペプチド、又はその改変体、及び（ｃ）Ｍ１３ペプチド、又はＭ１３ペプチド改変体が、Ｎ末端から順に連結された構造をとっている。このカルシウムイオン放出融合タンパク質は、光照射されない状態では、カルモジュリンＮ末側ペプチド等（ａ１）、カルモジュリンＣ末側ペプチド等（ａ２）及びＭ１３ペプチド等（ｃ）が複合体を形成し、解離定数が小さくなりカルシウムイオンと強固に結合できる構造となっていると推定される。一方、光照射された場合、カルモジュリンＮ末側ペプチド等（ａ１）及びカルモジュリンＣ末側ペプチド等（ａ２）の間に組み込まれたＬＯＶ２ドメイン等（ｂ）の構造が変化し、カルモジュリンＮ末側ペプチド等（ａ１）、カルモジュリンＣ末側ペプチド等（ａ２）、及びＭ１３ペプチド等（ｃ）の複合体の結合が維持できなくなり、解離定数が大きくなることによって、カルシウムイオンを放出するものと推定される。また、カルシウム結合タンパク質Ｎ末側ペプチド等（ａ１）、光受容体ペプチド等（ｂ）、カルシウム結合タンパク質Ｃ末側ペプチド等（ａ２）、及びカルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド等（ｃ）との関係も、それぞれカルモジュリンＮ末側ペプチド等（ａ１）、ＬＯＶ２ドメイン等（ｂ）、カルモジュリンＣ末側ペプチド等（ａ２）、及びＭ１３ペプチド等（ｃ）との関係と同じであると推定される。しかしながら、本発明は前記の推定により限定されるものではない。
【００４６】
（リンカー及び制限酵素サイト）
本発明のカルシウムイオン吸収融合タンパク質において、カルシウム結合タンパク質Ｎ末側ペプチド等（ａ１）（例えば、カルモジュリンＮ末側ペプチド等（ａ１））と光受容体ペプチド等（ｂ）（例えば、ＬＯＶ２ドメイン等（ｂ））との間、光受容体ペプチド等（ｂ）（例えば、ＬＯＶ２ドメイン等（ｂ））とカルシウム結合タンパク質Ｃ末側ペプチド等（ａ２）（例えば、カルモジュリンＣ末側ペプチド等（ａ２））との間、及びカルシウム結合タンパク質Ｃ末側ペプチド等（ａ２）（例えば、カルモジュリンＣ末側ペプチド等（ａ２））とカルシウムイオン結合タンパク質結合ペプチド等（ｃ）（例えば、Ｍ１３ペプチド等（ｃ））との間には、カルシウムイオン吸収融合タンパク質の機能を阻害しない限りにおいて、適当な長さのペプチドリンカー又は制限酵素サイトのヌクレオチド配列から翻訳される２〜数アミノ酸の配列を含むことができる。
ペプチドリンカーしては、例えば「Ｇ」、「ＧＧ」、「ＧＧＳ」、「ＧＧＧＳ」、「ＧＧＧＧＳ」、「ＧＧＧＳＫ」、「ＧＧＳＧＧ」、「ＧＧＧＧＳＫ」、又は「ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ」を挙げることができる。また、制限酵素サイトのヌクレオチド配列から翻訳されるアミノ酸配列としては、ＬＥ及びＧＴなどを含むことができる。
例えば、後述の実施例に示すように、カルモジュリンＮ末側ペプチド等とＬＯＶ２ドメイン等（ｂ）との間に、「Ｇ」、「ＧＧ」、「ＧＧＳ」、又は「ＧＧＧＳ」のペプチドリンカーを含んでもよい。また、カルモジュリンＣ末側ペプチド等（ａ２）とＭ１３ペプチド等（ｃ）との間に、「ＧＧＧＧＳ」のペプチドリンカーを含んでもよい。
【００４７】
本発明によるＤＮＡは、本発明の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質又はその機能的等価改変体をコードする限り、特に限定されるものではなく、例えば、配列表の配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、又は配列番号３０で表される塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。
配列表の配列番号１６で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡは、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＰａｃｍａｎ（カルシウムイオン吸収融合タンパク質）をコードする。また、配列表の配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、及び配列番号２２で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡは、それぞれ、配列表の配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるカルシウムイオン吸収融合タンパク質をコードする。
配列表の配列番号２３で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡは、配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるＣＡＲＢＹ（カルシウムイオン放出融合タンパク質）をコードする。また、配列表の配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、及び配列番号３０で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡは、それぞれ、配列表の配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるカルシウムイオン放出融合タンパク質をコードする。
【００４８】
本発明によるプラスミドは、本発明による前記ＤＮＡを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明による前記ＤＮＡを挿入することにより得られるプラスミドを挙げることができる。
得られたプラスミドを所望の宿主細胞に形質転換することにより、形質転換体を得ることができる。前記形質転換体も、本発明による前記プラスミドを含む限り、特に限定されるものではない。
【００４９】
前記宿主細胞としては、例えば、通常使用される公知の微生物、例えば、大腸菌又は酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、あるいは、公知の培養細胞、例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、又はＣＯＳ細胞）又は昆虫細胞（例えば、ＢｍＮ４細胞）を挙げることができる。
【００５０】
また、公知の前記発現ベクターとしては、例えば、大腸菌に対しては、ｐＵＣ、ｐＴＶ、ｐＧＥＸ、ｐＫＫ、又はｐＴｒｃＨｉｓを；酵母に対しては、ｐＥＭＢＬＹ又はｐＹＥＳ２を；ＣＨＯ細胞に対してはｐｃＤＮＡ３又はｐＭＡＭｎｅｏを；ＨＥＫ−２９３細胞に対してはｐｃＤＮＡ３を；ＣＯＳ細胞に対してはｐｃＤＮＡ３を；ＢｍＮ４細胞に対しては、カイコ核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーターを有するベクター（例えば、ｐＢＫ２８３）を挙げることができる。
【００５１】
［２］カルシウムイオン濃度の制御方法
本発明のカルシウムイオン濃度の制御方法は、前記光駆動カルシウムイオン制御タンパク質若しくはその機能的等価改変体、又は前記ＤＮＡを用いる。そして光駆動カルシウムイオン制御タンパク質又はその機能的等価改変体に、励起光を照射することにより、カルシウムイオンの濃度を制御する方法である。
本発明のカルシウムイオンの濃度制御方法において、用いる励起波長は光駆動カルシウムイオン制御タンパク質に使用されている光受容体ペプチドの種類により、適宜選択することができる。すなわち、光刺激により立体構造が変化する励起波長を用いることができる。例えば、青色光受容体であるフォトトロピン１、又はフォトトロピン２のＬＯＶ１ドメイン又はＬＯＶ２ドメイン、又はオーレオクロム１、又はオーレオクロム２のＬＯＶドメインを光受容体ペプチドとして用いた場合は、３００〜５００ｎｍの励起波長を用いることが可能であり、３５０〜４９０ｎｍが好ましく、４３０〜４７０ｎｍがより好ましい。
前記カルシウムイオン吸収融合タンパク質を用いることにより、周囲のカルシウムイオン濃度を低下させることができる。また、カルシウムイオン放出融合タンパク質を用いることにより、周囲のカルシウムイオン濃度を上昇させることができる。
更に、前記シグナルペプチドを含む光駆動カルシウムイオン制御タンパク質を用いることによって、細胞内の特定の領域又は細胞内小器官内若しくは細胞内小器官の膜上でカルシウムイオン濃度を制御することが可能である。具体的には、ミトコンドリア膜間スペース、ゴルジ体小胞体、ペルオキシソーム、核、ミトコンドリアのマトリックス、細胞膜、及び葉緑体などにおいて、カルシウムイオン濃度を制御することができる。
【００５２】
［３］光駆動カルシウムイオン制御タンパク質等の利用
本発明の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質若しくはその機能的等価改変体、又は前記ＤＮＡは、カルシウムイオン代謝異常を伴う疾患の治療又は予防用医薬組成物として用いることができる。カルシウムイオン代謝異常を伴う疾患としては、中枢神経系疾患（例えば、脳卒中、頭部外傷、脊髄損傷、外傷性ショック、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮側索硬化症、てんかん、発作、痙攣性疾患、低酸素誘因神経細胞損傷、疼痛、うつ病、不安神経症、パニック障害、脅迫神経症、外傷後ストレス障害、麻酔後認識衰退、オピオイド耐性、薬物乱用、アルコール依存症、統合失調症）、又は循環器系疾患（例えば、高血圧、狭心症、不整脈）を挙げることができる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５４】
《実施例１》
本実施例１では、カルシウムイオン吸収融合タンパク質であるPacmanを製造した。
（１）ＬＯＶ２遺伝子の調製
融合タンパク質の構築に用いるＬＯＶ２ドメインをコードするＤＮＡを調製した。Ｌｅｅらの報告(Lee J. et al. Surface sites for engineering allosteric control in proteins.Science.17. 438-42 2008)を参考にして、以下のＬＯＶ２の骨格オリゴヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチド、及びＰＣＲに用いるプライマーを合成した。
【００５５】
（骨格オリゴヌクレオチド）
LOV2-skel1  5’-TCGAGCTGGCCACCACTCTAGAGCGCATCGAGAAGAACTTCGTGATCACC-3’（配列番号３７）
LOV2-skel2  5’-GACCCCCGCCTGCCCGACAACCCCATCATCTTCGCCTCCGACTCC-3’（配列番号３８）
LOV2-skel3  5’-TTCCTGCAGCTGACCGAGTACTCCCGCGAGGAGATCCTGGGCCGCAAC-3’（配列番号３９）
LOV2-skel4  5’-TGCCGCTTCCTGCAGGGCCCCGAGACCGACCGCGCCACCGTGCGC-3’（配列番号４０）
LOV2-skel5  5’-AAGATCCGCGACGCCATCGACAACCAGACCGAGGTGACCGTG-3’（配列番号４１）
LOV2-skel6  5’-CAGCTGATCAACTACACCAAGTCCGGCAAGAAGTTCTGGAACCTGTTC-3’（配列番号４２）
LOV2-skel7  5’-CACCTGCAGCCCATGCGCGACCAGAAGGGCGACGTGCAGTACTTCATC-3’（配列番号４３）
LOV2-skel8  5’-GGCGTGCAGCTGGACGGCACCGAGCACGTGCGCGACGCCGCC-3’（配列番号４４）
LOV2-skel9  5’-GAGCGCGAGGGCGTGATGCTGATCAAGAAGACCGCCGAGAAC-3’（配列番号４５）
LOV2-skel10  5’-ATCGACGAGGCCGCCAAGGAGCTGCCCGACGCCAACCTGCGC-3’（配列番号４６）
LOV2-skel11  5’-CCCGAAGATCTGTGGGCCAACCACGGTAC-3’（配列番号４７）
【００５６】
（アダプターオリゴヌクレオチド）
LOV2-adop1  5’-GGGGTCGGTGAT-3’（配列番号４８）
LOV2-adop2  5’-CAGGAAGGAGTC-3’（配列番号４９）
LOV2-adop3  5’-GCGGCAGTTGCG-3’（配列番号５０）
LOV2-adop4  5’-GATCTTGCGCAC-3’（配列番号５１）
LOV2-adop5  5’-CAGCTGCACGGT-3’（配列番号５２）
LOV2-adop6  5’-CAGGTGGAACAG-3’（配列番号５３）
LOV2-adop7  5’-CACGCCGATGAA-3’（配列番号５４）
LOV2-adop8  5’-GCGCTCGGCGGC-3’（配列番号５５）
LOV2-adop9  5’-GTCGATGTTCTC-3’（配列番号５６）
LOV2-adop10  5’-TTCGGGGCGCAG-3’（配列番号５７）
【００５７】
（プライマー）
LOV2-fw  5’-TTT CTCGAG CTG GCC ACC ACT CTA-3’（配列番号５８）
LOV2-rv  5’-TT GGTACC GTG GTT GGC CCA CA-3’（配列番号５９）
【００５８】
前記骨格オリゴヌクレオチドＬＯＶ２−ｓｋｅｌ１〜１１を、１μＭモル濃度に調整し、５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化した。その後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを７０℃／１０ｍｉｎにて失活した。得られたオリゴヌクレオチドのリン酸化処理産物に、アダプターオリゴヌクレオチドＬＯＶ２−ａｄｏｐ１〜１０とＴ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅを加え、１６℃でＯ／Ｎのライゲーションを行った。すなわち、ＬＯＶ２−ｓｋｅｌ１〜１１は、それぞれ終濃度０．５μＭになるように調製し、ＬＯＶ２−ａｄｏｐ１〜１０は、それぞれ終濃度５μＭになるように調整し、混合した。この混合物１０．５μＬに２ＸＲａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）を１２μＬ及びＴ４  ＤＮＡライゲースを１．５μＬとを加え、１６℃でＯ／Ｎのライゲーションを行った。得られたライゲーション産物を鋳型とし、フォワードプライマーＬＯＶ２−ｆｗと、リバースプライマーＬＯＶ２−ｒｖを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲサイクルは９４℃２分の後、９４℃３０秒−６２℃３０秒−６８℃１分のサイクルを３０サイクル行い、その後に６８℃１０分間、保持した。ポリメラーゼは、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。ＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルム抽出にて精製し、ＸｈｏＩ／ＫｐｎＩで制限酵素処理を行った。制限酵素処理産物を電気泳動した後、目的のバンドを切り出し、ＱＩＡＥＸIIＧｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製を行った。得られたフラグメントを、試料１とする。プラスミドベクターｐＲＳＥＴＢ（インビトロジェン社製（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を、同様にＸｈｏＩ／ＫｐｎＩで制限酵素処理を行い、電気泳動により精製した。得られたＸｈｏＩ／ＫｐｎＩ切断ベクターを、試料２とする。試料１と試料２を混和し、Ｔ４ＤＮＡライゲースでライゲーションし、ＬＯＶ２遺伝子を導入したｐＲＳＥＴＢを得た。このプラスミドベクターを、「ｐＲＳＥＴＢ／ＬＯＶ２」と称する。
【００５９】
（２）pRSETB/CaM-LOV2の構築
ＣａＭ及びＬＯＶ２を含むベクターpRSETB/CaM-LOV2の構築を行った。
用いたプライマーを以下に示す。
BHI-CaM-fw  5’-CG GGATCCC CGC ATG CAT GAC CAA CTG-3’（配列番号６０）
CaM-ERI-rv  5’-G GAATTC TTA CTT TGC TGT CAT CAT TTG-3’（配列番号６１）
ＣａＭ及びＭ１３ペプチドを含むベクターｐＲＳＥＴＢ／ＹＣ３．６（Nagai T. et al Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 20. 10554-9 2004）を鋳型として、フォワードプライマーＢＨＩ−ＣａＭ−ｆｗ及びリバースプライマーＣａＭ−ＸｈｏＩ−ｒｖを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲサイクルは９４℃２分の後、９４℃３０秒−６２℃３０秒−６８℃１分のサイクルを３０サイクル行い、その後に６８℃１０分間である。ＰＣＲ産物を、フェノール／クロロホルム抽出し、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで制限酵素処理し、電気泳動によって、ゲル精製を行った。得られたＣａＭのフラグメントを試料３とする。前記（１）の工程で得られたｐＲＳＥＴＢ／ＬＯＶ２を、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで制限酵素処理し、電気泳動によりゲル精製を行った。得られたＬＯＶ２を含むベクターを試料４とする。試料３と試料４を混和し、Ｔ４ＤＮＡライゲースで、ライゲーションしてカルモジュリンをＬＯＶ２の５’側に持つ融合遺伝子を得た、このプラスミドベクターを、「ｐＲＳＥＴＢ／ＣａＭ−ＬＯＶ２」と称する。
【００６０】
（３）Pacman遺伝子の構築
図３の模式図に示したPacman遺伝子を構築するために、ＬＯＶ２ドメインを含む前記（１）の工程で得られたベクターｐＲＳＥＴＢ／ＬＯＶ２、及びＣａＭ及びＭ１３ペプチドを含むベクターｐＲＳＥＴＢ／ＹＣ３．６（Nagai T. et al Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 20. 10554-9 2004）を鋳型として、ＰＣＲを行い、得られたフラグメントをｐＲＳＥＴＢ／ＣａＭ−ＬＯＶ２に組み込んだ。使用したプライマーを以下に示す。
LOV2-fw-GGGGS-XhoI  5’-TTT CTCGAG GGAGGTGGAGGTAGT CTG GCC ACC ACT CT-3’（配列番号６２）
LOV2-Cd17-M13  5’-GAC GAG GCC GCC AGG CGC TGG AAG -3’（配列番号６３）
M13-ERI-rv  5’-G GAATTC TTA GAG CTC CAG TGC CCC GGA-3’（配列番号６４）
【００６１】
ＰＣＲの鋳型として、ｐＲＳＥＴＢ／ＬＯＶ２及びｐＲＳＥＴＢ／ＹＣ３．６を用いた。プライマーとして、ＬＯＶ２−ｆｗ−ＧＧＧＧＳ−ＸｈｏＩ及びＭ１３−ＥＲＩ−ｒｖを終濃度０．３μＭになるように添加し、ＬＯＶ２−Ｃｄ１７−Ｍ１３を終濃度０．０３μＭとなるように添加した。ＰＣＲのサイクルは、９４℃２分の後、９４℃３０秒−６２℃３０秒−６８℃１分のサイクルを３０サイクル行い、その後に６８℃１０分間、保持した。
なお、本ＰＣＲでは、初期段階において、主にｐＲＳＥＴＢ／ＹＣ３．６を鋳型にして、フォワードプライマーＬＯＶ２−Ｃｄ１７−Ｍ１３及びリバースプライマーＭ１３−ＥＲＩ−ｒｖによって、一段階目のＭ１３ペプチドを含む断片の増幅が起こる。この断片の５’端側にはＬＯＶ２−ＣＤ１７のＣ末端側の配列がコードされている。この断片が蓄積すると、ｐＲＳＥＴＢ／ＬＯＶ２を鋳型にして、フォワードプライマーＬＯＶ２−ｆｗ−ＧＧＧＧＳ−ＸｈｏＩ３、及びリバースプライマーとして一段階目のＭ１３ペプチドを含む断片の相補鎖を用いた二段階目の増幅が起き、ＬＯＶ２ドメイン及びＭ１３ペプチドを含む全長の配列が得られる。さらに、この全長の配列を鋳型にしてフォワードプライマーＬＯＶ２−ｆｗ−ＧＧＧＧＳ−ＸｈｏＩ３及びリバースプライマーＭ１３−ＥＲ−ｒｖを用いた増幅により、目的の増幅断片が得られる。
得られたＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルム抽出し、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、電気泳動により、ゲル精製を行った。得られたフラグメントを、試料５とした。次に、ｐＲＳＥＴＢ／ＣａＭ−ＬＯＶ２を、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、電気泳動により、ゲル精製を行った。得られた切断ベクターを試料６とする。試料５と試料６を混和し、Ｔ４ＤＮＡライゲースで、ライゲーションしてカルモジュリンをＬＯＶ２の３’側に持ち、Ｃ末端アミノ酸を１７個欠失したＬＯＶ２（ＬＯＶ２△Ｃ１７）、及びＮ末端アミノ酸を１個欠失したＭ１３ペプチド（Ｍ１３△Ｎ１）を持つ、融合遺伝子を得た。得られたベクターを「ｐＲＳＥＴＢ／Pacman」と称する。
なお、この融合遺伝子から得られる融合タンパク質は、カルモジュリンとＬＯＶ２△Ｃ１７との間にＸｈｏＩサイトから翻訳される２個のアミノ酸ＬＥを含む。
【００６２】
《実施例２》
本実施例では、カルモジュリンをＬＯＶ２の３’側に持ち、Ｃ末端アミノ酸を１４個欠失したＬＯＶ２（ＬＯＶ２△Ｃ１４）、及びＮ末端アミノ酸を１個欠失したＭ１３ペプチド（Ｍ１３△Ｎ１）を持つ、融合遺伝子の調製を行った。
プライマーLOV2-Cd17-M13に代えて、以下のLOV2-Cd14-M13を用いたことを除いては、実施例１の（３）の操作を繰り返し、融合遺伝子を得た。
LOV2-Cd14-M13  5’-GAG GCC GCC AAG GAG CTG AGG CGC TGG AGG-3’（配列番号６５）
【００６３】
《実施例３》
本実施例では、カルモジュリンをＬＯＶ２の３’側に持ち、Ｃ末端アミノ酸を１５個欠失したＬＯＶ２（ＬＯＶ２△Ｃ１５）、及びＮ末端アミノ酸を１個欠失したＭ１３ペプチド（Ｍ１３△Ｎ１）を持つ、融合遺伝子の調製を行った。
プライマーLOV2-Cd17-M13に代えて、以下のLOV2-Cd15-M13を用いたことを除いては、実施例１の（３）の操作を繰り返し、融合遺伝子を得た。
LOV2-Cd15-M13  5’-GAG GCC GCC AAG GAG AGG CGC TGG AAG-3’（配列番号６６）
【００６４】
《実施例４》
本実施例では、カルモジュリンをＬＯＶ２の３’側に持ち、Ｃ末端アミノ酸を１６個欠失したＬＯＶ２（ＬＯＶ２△Ｃ１６）、及びＮ末端アミノ酸を１個欠失したＭ１３ペプチド（Ｍ１３△Ｎ１）を持つ、融合遺伝子の調製を行った。
プライマーLOV2-Cd17-M13に代えて、以下のLOV2-Cd16-M13を用いたことを除いては、実施例１の（３）の操作を繰り返し、融合遺伝子を得た。
LOV2-Cd16-M13  5’-GAG GCC GCC AAG AGG CGC TGG AAG-3’（配列番号６７）
【００６５】
《実施例５》
本実施例では、カルモジュリンをＬＯＶ２の３’側に持ち、Ｃ末端アミノ酸を１７個欠失したＬＯＶ２（ＬＯＶ２△Ｃ１７）、及びＮ末端アミノ酸を１個欠失したＭ１３ペプチド（Ｍ１３△Ｎ１）を持つ、融合遺伝子の調製を行った。また、カルモジュリンとＬＯＶ２△Ｃ１７との間のリンカーを、ＧＧＧＧＳからＧＧＳに変更した。
プライマーLOV2-fw-GGGGS-XhoIに代えて、以下のLOV2-fw-GGS-XhoIを用いたことを除いては、実施例１の（３）の操作を繰り返し、融合遺伝子を得た。
LOV2-fw-GGS-XhoI  5’-TTT CTCGAG GGAGGTAGT CTG GCC ACC ACT CT-3’（配列番号６８）
【００６６】
《実施例６》
本実施例では、カルモジュリンをＬＯＶ２の３’側に持ち、Ｃ末端アミノ酸を１７個欠失したＬＯＶ２（ＬＯＶ２△Ｃ１７）、及びＮ末端アミノ酸を１個欠失したＭ１３ペプチド（Ｍ１３△Ｎ１）を持つ、融合遺伝子の調製を行った。また、カルモジュリンとＬＯＶ２△Ｃ１７との間のリンカーを、ＧＧＧＧＳからＧに変更した。
プライマーLOV2-fw-GGGGS-XhoIに代えて、以下のLOV2-fw-G-XhoIを用いたことを除いては、実施例１の（３）の操作を繰り返し、融合遺伝子を得た。
LOV2-fw-G-XhoI  5’-TTT CTCGAG GGT CTG GCC ACC ACT CT-3’（配列番号６９）
【００６７】
《実施例７》
本実施例では、カルモジュリンをＬＯＶ２の３’側に持ち、Ｃ末端アミノ酸を１７個欠失したＬＯＶ２（ＬＯＶ２△Ｃ１７）、及びＮ末端アミノ酸を２個欠失したＭ１３ペプチド（Ｍ１３△Ｎ２）を持つ、融合遺伝子の調製を行った。
プライマーLOV2-Cd17-M13に代えて、以下のLOV2-Cd17-M13△Ｎ１を用いたことを除いては、実施例１の（３）の操作を繰り返し、融合遺伝子を得た。
LOV2-Cd17-M13△Ｎ１  5’-GAC GAG GCC GCC CGC TGG AAG AAA-3’（配列番号７０）
【００６８】
《実施例８》
本実施例８では、カルシウムイオン放出融合タンパク質であるCARBYを製造した。
（１）ｐＲＳＥＴＢ／ＣａＭ４０−ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ−４１ＣａＭ−Ｍ１３の作製
ＣａＭ及びＭ１３ペプチドが、ＧＧＧＧＳのリンカーで結合されているベクターｐＲＳＥＴＢ／ＹＣ−ｎａｎｏ１５（Horikawa K. et al. Spontaneous network activity visualized by ultrasensitive Ca(2+) indicators, yellow Cameleon-Nano.. Nat Methods.7.729-32. 2010）を用いて、カルモジュリンの第４０番のアミノ酸と４１番のアミノ酸との間に、ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩの制限酵素サイトを導入したベクターｐＲＳＥＴＢ／ＣａＭ４０−ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ−４１ＣａＭ−Ｍ１３を作製した。
【００６９】
変異を導入するために以下のプライマーを合成した。
QC-CaM41-XhoI-TAA-KpnI  5’-G TCG CTT GGA CTCGAG TAA GGTACC CAA CCA ACG-3（配列番号７１）
プライマーQC-CaM41-XhoI-TAA-KpnIの５’端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化した。得られたプライマーを用いて、ＰＣＲ法により変異を含むＰＣＲ産物を調製した。ｐＲＳＥＴＢ／ＹＣ−ｎａｎｏ１５を５０ｎｇ、ＱＣ−ＣａＭ４１−ＸｈｏＩ−ＴＡＡ−ＫｐｎＩを１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ３．７５ｎｍｏｌ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）１．２５Ｕ、Ｐｆｕ  ＤＮＡ  リガーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を２０Ｕを含む反応溶液４０μＬを準備した。まず、６５℃、５分のプレインキュベーションを行ってＰｆｕ  ＤＮＡ  リガーゼにより、鋳型ＤＮＡのニックを修復し、その後９４℃、１分の最初の変性を行った。ＰＣＲのサイクルは、９４℃、１０秒のＤＮＡ変性、５５℃、３０秒のアニーリング反応及び６５℃、１０分の伸長・連結反応を１サイクルとして３５サイクル行った。最後に７５℃、１０分のポストインキュベーションを行った。
【００７０】
得られたＰＣＲ産物のうち、変異が含まれていない断片を、ＤｐｎＩを用いて切断した。すなわち、前記ＰＣＲ後の反応溶液４０μＬに１μＬ（２０Ｕ）のＤｐｎＩ（New England BioLab社製）を加え、３７℃で２時間インキュベートすることによって、メチル化またはヘミメチル化した鋳型プラスミドＤＮＡを選択的に消化した。ＤｐｎＩは［５’−Ｇｍ６ＡＴＣ−３’］を認識して２本鎖ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。
【００７１】
次に、得られた反応液を用いて、メガプライマーを用いた突然変異が導入されたＤＮＡの相補鎖の合成を行った。
前記反応溶液４１μＬを９４℃、３０秒で変性させ、次いで９５℃で３０秒、５５℃で１分、６５℃で１０分の３サイクルのＰＣＲを行った。このとき反応溶液に含まれるＤＮＡ断片のうちのいくつかが、メガプライマーとして作用する。この２本鎖突然変異導入環状ＤＮＡ鎖反応溶液４１μＬを、エタノール沈殿し、沈殿物を乾燥させた。
【００７２】
前記２本鎖突然変異導入環状ＤＮＡ鎖を鋳型とし、フォワードプライマーＢＨＩ−ＣａＭ−ｆｗ及びリバースプライマーＭ１３−ＥＲＩ−ｒｖを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、フェノール／クロロホルム抽出し、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、電気泳動によりゲル精製を行った。得られたフラグメントを、試料７とする。ベクターｐＲＳＥＴＢを、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、電気泳動によりゲル精製を行った。得られた切断ベクターを、試料８とする。試料７と試料８を混和し、Ｔ４  ＤＮＡライゲースで、ライゲーションしてカルモジュリンの４０番目のアミノ酸と４１番目のアミノ酸の間にＸｈｏＩ制限酵素サイト、終始コドン、ＫｐｎＩ制限酵素サイトを持ち、カルモジュリンのＣ末端側にリンカーとしてＧＧＧＧＳを持ち、更にそのＣ末端側にＭ１３を持つ融合遺伝子を得た、このプラスミドベクターを「ｐＲＳＥＴＢ／ＣａＭ４０−ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ−４１ＣａＭ−Ｍ１３」と称する。
【００７３】
（２）CARBYの作製
ベクターｐＲＳＥＴＢ／ＣａＭ４０−ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ−４１ＣａＭ−Ｍ１３を、ＸｈｏＩ／ＫｐｎＩで制限酵素処理し、電気泳動によってゲル精製を行った。得られた切断ベクターを試料９とする。試料９と前記実施例１の工程（１）で得られた試料１を混和し、Ｔ４  ＤＮＡライゲースで、ライゲーションしてｐＲＳＥＴＢ／ＣａＭ４０−ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ−４１ＣａＭ−Ｍ１３のカルモジュリンの４０番目と４１番目のアミノ酸の間にＬＯＶ２が挿入された融合遺伝子を得た。すなわち、カルモジュリンの１〜４０番目のアミノ酸からなるペプチド（Ｎ−ＣａＭ（１−４０））、ＬＯＶ２ドメイン、カルモジュリンの４１〜１５０番目のアミノ酸からなるペプチド（Ｃ−ＣａＭ（４１−１５０））及びＭ１３ペプチドを持つ、融合遺伝子を得た。得られたベクターを「ｐＲＳＥＴＢ／CARBY」と称する。
なお、この融合遺伝子から得られる融合タンパク質は、カルモジュリン（１〜４０番目のアミノ酸）とＬＯＶ２との間のＸｈｏＩ制限酵素サイトから翻訳される２個のアミノ酸ＬＥ、及びＬＯＶ２とカルモジュリン（４１〜１５０番目のアミノ酸）との間のＫｐｎＩ制限酵素サイトから翻訳される２個のアミノ酸ＧＴとを含む。
【００７４】
《実施例９》
本実施例では、カルモジュリンの１〜４０番目のアミノ酸からなるペプチド（Ｎ−ＣａＭ（１−４０））、Ｃ末端アミノ酸を３個欠失したＬＯＶ２（ＬＯＶ２△Ｃ３）、カルモジュリンの４１〜１５０番目のアミノ酸からなるペプチド（Ｃ−ＣａＭ（４１−１５０））及びＭ１３ペプチドを、この順番に持つ融合遺伝子の調製を行った。
前記ｐＲＳＥＴＢ／ＬＯＶ２を鋳型として、以下のプライマーによってＰＣＲを行った。
ＬＯＶ２−ｆｗ
3'LOV2-Nd3-KpnI  5’-GG GGTACC CCA CAG ATC TTC GGG GCG-3’（配列番号７２）
ｐＲＳＥＴＢ／ＬＯＶ２を鋳型として、フォワードプライマーＬＯＶ２−ｆｗ及びリバースプライマー3'LOV2-Nd3-KpnIを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲサイクルは９４℃２分の後、９４℃３０秒−６２℃３０秒−６８℃１分のサイクルを３０サイクル行い、その後に６８℃１０分間である。ＰＣＲ産物を、フェノール／クロロホルム抽出し、ＸｈｏＩ／ＫｐｎＩで制限酵素処理し、電気泳動によって、ゲル精製を行った。得られたＬＯＶ２△３のフラグメントを試料１０とする。
前記試料９と試料１０を混和し、Ｔ４  ＤＮＡライゲースで、ライゲーションしてｐＲＳＥＴＢ／ＣａＭ４０−ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ−４１ＣａＭ−Ｍ１３のカルモジュリンの４０番目と４１番目のアミノ酸の間にＬＯＶ２△３が挿入された融合遺伝子を得た。
【００７５】
《実施例１０》
本実施例では、カルモジュリンの１〜４０番目のアミノ酸からなるペプチド（Ｎ−ＣａＭ（１−４０））、Ｃ末端アミノ酸を９個欠失したＬＯＶ２（ＬＯＶ２△Ｃ９）、カルモジュリンの４１〜１５０番目のアミノ酸からなるペプチド（Ｃ−ＣａＭ（４１−１５０））及びＭ１３ペプチドを、この順番に持つ融合遺伝子の調製を行った。
リバースプライマー3'LOV2-Nd3-KpnIに代えて、3'LOV2-Nd9-KpnI 5’-GG GGTACC CAG GTT GGC GTC GGG CAG-3’（配列番号７３）を用いたことを除いては実施例９の操作を繰り返して、カルモジュリンの４０番目と４１番目のアミノ酸の間にＬＯＶ２△９が挿入された融合遺伝子を得た。
【００７６】
《実施例１１》
本実施例では、カルモジュリンの１〜４０番目のアミノ酸からなるペプチド（Ｎ−ＣａＭ（１−４０））、Ｃ末端アミノ酸を１２個欠失したＬＯＶ２（ＬＯＶ２△Ｃ１２）、カルモジュリンの４１〜１５０番目のアミノ酸からなるペプチド（Ｃ−ＣａＭ（４１−１５０））及びＭ１３ペプチドを、この順番に持つ融合遺伝子の調製を行った。
リバースプライマー3'LOV2-Nd3-KpnIに代えて、3'LOV2-Nd12-KpnI  5’-GG GGTACC GTC GGG CAG CTC CTT GGC-3’（配列番号７４）を用いたことを除いては実施例９の操作を繰り返して、カルモジュリンの４０番目と４１番目のアミノ酸の間にＬＯＶ２△１２が挿入された融合遺伝子を得た。
【００７７】
《実施例１２》
本実施例では、カルモジュリンの１〜４０番目のアミノ酸からなるペプチド（Ｎ−ＣａＭ（１−４０））、ＬＯＶ２ドメイン、カルモジュリンの４１〜１５０番目のアミノ酸からなるペプチド（Ｃ−ＣａＭ（４１−１５０））及びＭ１３ペプチドを、この順番に持つ融合遺伝子の調製を行った。また、Ｎ−ＣａＭ（１−４０）とＬＯＶ２ドメインとの間にリンカーＧを導入した。
フォワードプライマーＬＯＶ２−ｆｗに代えて、LOV2-fw-G-XhoIを用いたことを除いては実施例９の操作を繰り返して、カルモジュリンの４０番目と４１番目のアミノ酸の間にＬＯＶ２が挿入され、Ｎ−ＣａＭ（１−４０）とＬＯＶ２ドメインとの間にリンカーＧを有する融合遺伝子を得た。
【００７８】
《実施例１３》
本実施例では、カルモジュリンの１〜４０番目のアミノ酸からなるペプチド（Ｎ−ＣａＭ（１−４０））、ＬＯＶ２ドメイン、カルモジュリンの４１〜１５０番目のアミノ酸からなるペプチド（Ｃ−ＣａＭ（４１−１５０））及びＭ１３ペプチドを、この順番に持つ融合遺伝子の調製を行った。また、Ｎ−ＣａＭ（１−４０）とＬＯＶ２ドメインとの間にリンカーＧＧを導入した。
フォワードプライマーＬＯＶ２−ｆｗに代えて、LOV2-fw-GG-XhoI  5’-TTT CTCGAG GGTAGT CTG GCC ACC ACT CT-3’（配列番号７５）を用いたことを除いては実施例９の操作を繰り返して、カルモジュリンの４０番目と４１番目のアミノ酸の間にＬＯＶ２が挿入され、Ｎ−ＣａＭ（１−４０）とＬＯＶ２ドメインとの間にリンカーＧＧを有する融合遺伝子を得た。
【００７９】
《実施例１４》
本実施例では、カルモジュリンの１〜４０番目のアミノ酸からなるペプチド（Ｎ−ＣａＭ（１−４０））、ＬＯＶ２ドメイン、カルモジュリンの４１〜１５０番目のアミノ酸からなるペプチド（Ｃ−ＣａＭ（４１−１５０））及びＭ１３ペプチドを、この順番に持つ融合遺伝子の調製を行った。また、Ｎ−ＣａＭ（１−４０）とＬＯＶ２ドメインとの間にリンカーＧＧＳを導入した。
フォワードプライマーＬＯＶ２−ｆｗに代えて、LOV2-fw-GGS-XhoIを用いたことを除いては実施例９の操作を繰り返して、カルモジュリンの４０番目と４１番目のアミノ酸の間にＬＯＶ２が挿入され、Ｎ−ＣａＭ（１−４０）とＬＯＶ２ドメインとの間にリンカーＧＧＳを有する融合遺伝子を得た。
【００８０】
《実施例１５》
本実施例では、カルモジュリンの１〜４０番目のアミノ酸からなるペプチド（Ｎ−ＣａＭ（１−４０））、ＬＯＶ２ドメイン、カルモジュリンの４１〜１５０番目のアミノ酸からなるペプチド（Ｃ−ＣａＭ（４１−１５０））及びＭ１３ペプチドを、この順番に持つ融合遺伝子の調製を行った。また、Ｎ−ＣａＭ（１−４０）とＬＯＶ２ドメインとの間にリンカーＧＧＧＳを導入した。
フォワードプライマーＬＯＶ２−ｆｗに代えて、LOV2-fw-GGGS-XhoIを用いたことを除いては実施例９の操作を繰り返して、カルモジュリンの４０番目と４１番目のアミノ酸の間にＬＯＶ２が挿入され、Ｎ−ＣａＭ（１−４０）とＬＯＶ２ドメインとの間にリンカーＧＧＧＳを有する融合遺伝子を得た。
【００８１】
《融合タンパク質の発現及び精製》
実施例１〜１５において得られたベクターを用いて、ヒートショック法により大腸菌コンピテントセル（ＪＭ１０９（ＤＥ３））を形質転換した。形質転換した大腸菌細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ固体培地で、３７℃にて培養し、単一コロニーをピックアップして１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培養液２ｍＬ中へ移し、３７℃で一晩培養して増殖させた。融合タンパク質は、Ｔ７発現系（ｐＲＳＥＴＢ／ＪＭ１０９（ＤＥ３））を用いて発現させた。すなわち、培養液の１００倍希釈物を作製し、更に２３℃で３日間培養した。得られた細胞をフレンチプレスにより破砕し、得られた上清液から、ニッケルキレートカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてポリヒスチジン標識化タンパク質を精製した。さらに、この溶出液（１００ｍＭイミダゾール、５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．４、３００ｍＭＮａＣｌ）中のタンパク質サンプルをＰＤ１０脱塩・バッファー交換カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ（ｐＨ７．５）を用いて精製を行った。
【００８２】
《融合タンパク質の吸収スペクトルの測定》
得られた融合タンパク質に含まれているＬＯＶ２が、ＬＯＶ２本来の構造を維持していることを、吸収スペクトルから確認した。ＬＯＶ２は、４４７ｎｍ、４７３ｎｍ、及び３７０ｎｍに吸収極大が存在する。
実施例１〜１５において得られたベクターを発現させて得られた融合タンパク質の吸収スペクトルのうち、実施例１のPacman及び実施例８のCARBYの吸収スペクトルを規格化したものを図１に示す。また、陽性コントロールとして、ＬＯＶ２の吸収スペクトルも記載した（Imaizumi T. et al FKF1 is essential for photoperiodic-specific light signalling in Arabidopsis. Nature 20. 302-6 2003 Nov 20;426(6964):302-6.）。図１中、（Ａ）がＰａｃｍａｎ、（Ｂ）がＣＡＲＢＹ、（Ｃ）がＬＯＶ２の規格化吸収スペクトルである。
本発明の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質は、ＬＯＶ２と同じ吸収スペクトルを示しており、融合したＬＯＶ２がその機能を維持していることを示している。
【００８３】
更に、ＬＯＶ２の吸収極大ε４４７＝１３，８００  Ｍ−１ｃｍ−１（Strickland D. et al Light-activated DNA binding in a designed allosteric protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 105. 10709-14 2008）を用いてタンパク質のモル濃度を決定した、その後タンパク質のモル濃度をPacmanは１００μＭに合わせ、CARBYは２００μＭに合わせてサンプル溶液とした。
【００８４】
《光照射によるカルシウムイオン濃度変化の測定》
本発明の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質が、光照射により周囲のカルシウムイオン濃度を制御可能であることを確認した。
カルシウムイオン濃度の測定は、測定用試薬としてカルシウムイオン指示薬を用いて行った。カルシウムイオン指示薬は、Ｒｈｏｄ−２−ＡＭ（同仁堂）を、エステラーゼ・ブタ肝臓由来（Ｓｉｇｍａ）で処理した化合物であるＲｈｏｄ−２を用いた。終濃度１００μＭになるようにＲｈｏｄ−２−ＡＭを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）に溶解し、エステラーゼを１０Ｕ加え、室温でＯ／Ｎ放置した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）で１０倍希釈し、１０μＭのＲｈｏｄ−２を得た。
【００８５】
前記精製した融合タンパク質を含むサンプル溶液を、以下の測定条件に従って、測定した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を８０μＬ、サンプル溶液を１０μＬ、１０μＭのＲｈｏｄ−２を１０μＬを石英セルに滴下し、分光蛍光光度計であるＦ２５００（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて測定を行った。測定条件は蛍光スペクトルモード、励起波長は５５０ｎｍ、スキャンスピードは１５００ｎｍ／ｍｉｎ、初期待ち時間は０秒、励起側／蛍光側スリットは５ｎｍ／５ｎｍ、ホトマル電圧は７００Ｖ、レスポンスは０．０４秒である。最初に、前記の条件で測定したのち、励起波長を４５０ｎｍに変更し１０秒光刺激した後、励起波長を５５０ｎｍに戻して、再度蛍光スペクトルを測定した、その後シャッターを閉め、１分間待ち、シャッターをあけて、再度蛍光スペクトルを測定した。
Pacmanでは５７０ｎｍにおける蛍光強度が４０％程度減少した後にその蛍光強度が回復することが観測され（図２Ａ）、CARBYでは５７０ｎｍにおける蛍光強度が１５％程度増加した後にその蛍光強度が回復することが観測された（図２Ｂ）。これはPacmanでは溶液中のカルシウムイオン濃度が光励起により低下し、時間経過と共に回復したことを示しており、CARBYでは溶液中のカルシウムイオン濃度が光励起により上昇し、時間経過と共に低下したことを示している。Ｒｈｏｄ−２の５７０ｎｍにおける蛍光強度から計算したカルシウムイオン濃度は、Pacmanの場合は約４００ｎｍが約２００ｎｍに、CARBYの場合は約１．３μＭが約２μＭに変化していた。また、実施例２〜７、及び実施例９〜１５の融合タンパク質のカルシウムの吸収（結合）又はカルシウムの放出については、表２及び表３に示す。
【００８６】
カルモジュリン、Ｍ１３ペプチド、及びＬＯＶ２ドメインを、適切な順番で結合させることにより、カルシウムイオン指示薬であるＲｈｏｄ−２の励起光／蛍光を、５５０ｎｍ／５７０ｎｍで測定した時の蛍光強度が、４５０ｎｍの光刺激により蛍光強度が低下すること、又は蛍光強度が増加することが確認できた。すなわち、本発明の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質は光刺激によってカルシウムイオン濃度を低下、又は上昇させることができる。
【００８７】
【表２】
2012157306.tif 000004
【００８８】
【表３】
2012157306.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明の光駆動カルシウムイオン制御タンパク質は、カルシウムイオンの生物個体内、組織内、細胞内、細胞内小器官内、又は水溶液中における濃度を制御することが可能であり、カルシウムイオンの細胞等における機能の解析に用いることができる。また、カルシウムイオンの濃度を制御することにより、それらの濃度異常を原因とする疾患の治療、又は予防に用いることも可能である。
【図１】
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【図２】
2012157306.tif 000007
【図３】
2012157306.tif 000008
【図４】
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【配列表】
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