(57)【要約】【課題】バイオ人工腎臓および基材上への生細胞の固定化を含む他の用途において使用するための、膜のような基材を提供すること。【解決手段】本発明は、基材；基材の少なくとも一部分の上に配置された、カテコール部分を有する分子および／または分子を含むポリマーを含む接着剤；接着剤の少なくとも一部分の上に配置された細胞支持タンパク質；ならびに細胞支持タンパク質でコーティングされた基材の少なくとも一部分の上に配置された細胞を備える物品を提供する。本発明はまた、血液の供給源と流体連絡可能となるように配置された基材；基材の少なくとも一部分の上に配置された、カテコール部分を有する分子および／または分子を含むポリマーを含む接着剤；接着剤の少なくとも一部分の上に配置された、タンパク質および／またはペプチド；ならびにタンパク質および／またはペプチドの少なくとも一部分の上に配置された細胞を備えるバイオ人工臓器を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
基材と；
該基材の少なくとも一部分の上に配置された接着剤であって、該接着剤は、カテコール部分を有する分子および／または該分子を含むポリマーを含む、接着剤と；
該接着剤の少なくとも一部分の上に配置された細胞支持タンパク質と；
該細胞支持タンパク質でコーティングされた該基材の少なくとも一部分の上に配置された細胞と
を備える、物品。
【請求項２】
前記基材がポリマーを含む、請求項１に記載の物品。
【請求項３】
前記基材がガラスを含む、請求項１または２のいずれか１項に記載の物品。
【請求項４】
前記基材が金属を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の物品。
【請求項５】
前記基材がセラミックを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の物品。
【請求項６】
前記接着剤が、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＯＰＡ）を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の物品。
【請求項７】
前記接着剤がポリ（ドパミン）を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の物品。
【請求項８】
前記接着剤がポリ（ＤＯＰＡ）を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項９】
前記接着剤が、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン−リジンを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１０】
前記細胞支持タンパク質の少なくとも約５０％が細胞外マトリクスタンパク質を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１１】
前記細胞支持タンパク質の少なくとも約７０％が細胞外マトリクスタンパク質を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１２】
前記細胞支持タンパク質が本質的に細胞外マトリクスタンパク質からなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１３】
前記細胞外マトリクスタンパク質がコラーゲンを含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１４】
前記コラーゲンがＩＶ型コラーゲンを含む、請求項１３に記載の物品。
【請求項１５】
前記コラーゲンがＩ型コラーゲンを含む、請求項１３または１４のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１６】
前記コラーゲンがヒト胎盤コラーゲンである、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１７】
前記細胞外マトリクスタンパク質がラミニンを含む、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１８】
前記細胞支持タンパク質が、細胞の分化を改善するタンパク質を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項１９】
前記細胞支持タンパク質がＢＭＰ−７を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２０】
前記細胞支持タンパク質が合成ペプチドを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２１】
前記細胞支持タンパク質が、細胞外マトリクスタンパク質に特徴的なアミノ酸配列を含む合成ペプチドを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２２】
前記配列がＲＧＤである、請求項２１に記載の物品。
【請求項２３】
前記細胞支持タンパク質がヒトタンパク質を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２４】
前記基材が膜である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２５】
前記膜が半透膜である、請求項２４に記載の物品。
【請求項２６】
前記膜が限外濾過膜である、請求項２４または２５のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２７】
前記膜が血液透析膜である、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２８】
前記膜が血液濾過膜である、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項２９】
加えられた圧力に抵抗するための前記膜に対する支持を提供するように構成および配置された膜支持層をさらに備える、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の物品。
【請求項３０】
前記基材が、ポリスルホンを含有するポリマーを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の物品。
【請求項３１】
前記基材が、ポリビニルピロリドンを含有するポリマーを含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の物品。
【請求項３２】
前記基材が、ポリエーテルスルホンを含有するポリマーを含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の物品。
【請求項３３】
前記基材が、再生セルロース膜を含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の物品。
【請求項３４】
前記基材が、酢酸セルロースを含有するポリマーを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の物品。
【請求項３５】
前記基材が、ポリカーボネートを含有するポリマーを含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の物品。
【請求項３６】
前記基材が、ポリ（エチレン）を含有するポリマーを含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の物品。
【請求項３７】
前記基材が、ポリオレフィンを含有するポリマーを含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の物品。
【請求項３８】
前記基材が、ポリプロピレンを含有するポリマーを含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項３９】
前記基材が、ポリアミドを含有するポリマーを含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の物品。
【請求項４０】
前記基材が、ポリアリールエーエルスルホンを含有するポリマーを含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の物品。
【請求項４１】
前記基材が、ポリアクリロニトリルを含有するポリマーを含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の物品。
【請求項４２】
前記基材が、ポリ（フッ化ビニリデン）を含有するポリマーを含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の物品。
【請求項４３】
前記基材が管状の構成を有する、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の物品。
【請求項４４】
前記基材が非管状構成を有する、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の物品。
【請求項４５】
前記基材が実質的に平坦である、請求項４４に記載の物品。
【請求項４６】
前記基材が約５０μｍと約５００μｍとの間の厚みを有する、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の物品。
【請求項４７】
前記基材が約１０μｍと約２００μｍとの間の厚みを有する、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の物品。
【請求項４８】
バイオ人工臓器である、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の物品。
【請求項４９】
バイオ人工腎臓である、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の物品。
【請求項５０】
少なくとも１つの血液透析カートリッジを含む、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の物品。
【請求項５１】
以下：
血液の供給源と流体連絡可能となるように配置された基材と；
該基材の少なくとも一部分の上に配置された接着剤であって、該接着剤は、カテコール部分を有する分子および／または該分子を含むポリマーを含む、接着剤と；
該接着剤の少なくとも一部分の上に配置されたタンパク質および／またはペプチドと；
該タンパク質および／またはペプチドの少なくとも一部分の上に配置された細胞と
を備える、バイオ人工臓器。
【請求項５２】
前記基材がポリマーを含む、請求項５１に記載のバイオ人工臓器。
【請求項５３】
前記基材がガラスを含む、請求項５１または５２のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項５４】
前記基材が金属を含む、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項５５】
前記基材がセラミックを含む、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項５６】
前記バイオ人工臓器がバイオ人工腎臓である、請求項５１〜５５のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項５７】
前記バイオ人工臓器が少なくとも１つの血液透析カートリッジを含む、請求項５１〜５６のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項５８】
前記基材が、血液の供給源と流体連絡可能な第一の区画を、血液濾過液の供給源と流体連絡可能な第二の区画から分離するポリマー膜である、請求項５６または５７のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項５９】
前記接着剤が前記基材の片側のみに配置される、請求項５１〜５８のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項６０】
前記接着剤が３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニンを含む、請求項５１〜５９のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項６１】
前記タンパク質が細胞外マトリクスタンパク質である、請求項５１〜６０のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項６２】
前記細胞外マトリクスタンパク質がコラーゲンを含む、請求項６１に記載のバイオ人工臓器。
【請求項６３】
前記コラーゲンがＩＶ型コラーゲンを含む、請求項６２に記載のバイオ人工臓器。
【請求項６４】
前記タンパク質が合成ペプチドを含む、請求項５１〜６３のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項６５】
前記タンパク質が、細胞外マトリクスタンパク質に特徴的なアミノ酸配列を含む合成ペプチドを含む、請求項５１〜６３のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項６６】
前記基材が半透膜である、請求項５１〜６５のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項６７】
前記基材が限外濾過膜である、請求項５１〜６６のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項６８】
前記基材が血液透析膜である、請求項５１〜６７のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項６９】
前記基材が血液濾過膜である、請求項５１〜６８のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項７０】
前記基材が、ポリスルホンを含有するポリマーを含む、請求項５１〜６９のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項７１】
前記基材が、ポリビニルピロリドンを含有するポリマーを含む、請求項５１〜７０のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項７２】
前記基材が、ポリエーテルスルホンを含有するポリマーを含む、請求項５１〜７１のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項７３】
前記基材が、酢酸セルロースを含有するポリマーを含む、請求項５１〜７２のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項７４】
前記基材が、ポリカーボネートを含有するポリマーを含む、請求項５１〜７３のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項７５】
前記基材が、ポリ（エチレン）を含有するポリマーを含む、請求項５１〜７４のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項７６】
前記基材が、ポリオレフィンを含有するポリマーを含む、請求項５１〜７５のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項７７】
前記基材が、ポリプロピレンを含有するポリマーを含む、請求項５１〜７６のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項７８】
前記基材が、ポリアミドを含有するポリマーを含む、請求項５１〜７７のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項７９】
前記基材が、ポリアリールエーエルスルホンを含有するポリマーを含む、請求項５１〜７８のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項８０】
前記基材が、ポリアクリロニトリルを含有するポリマーを含む、請求項５１〜７９のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項８１】
前記基材が、ポリ（フッ化ビニリデン）を含有するポリマーを含む、請求項５１〜８０のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【請求項８２】
以下：
基材の少なくとも一部分を、カテコール部分を有する分子および／または該分子を含むポリマーを含む接着剤でコーティングする工程と；
該接着剤の少なくとも一部分を、細胞支持タンパク質でコーティングする工程と；
該細胞支持タンパク質の少なくとも一部分の上に細胞を接種する工程と
を包含する、方法。
【請求項８３】
前記基材がポリマーを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記基材がガラスを含む、請求項８２または８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記基材が金属を含む、請求項８２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記基材がセラミックを含む、請求項８２〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記基材が膜である、請求項８２〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記接着剤が３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニンを含む、請求項８２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記接着剤が、基材の少なくとも一部分を、カテコール部分を有する分子および／またはそのポリマーを含む接着剤でコーティングする前記工程において、該基材の一部分に塗布される第一の溶液中に含有される、請求項８２〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記第一の溶液を前記基材上にスピンコーティングする工程を包含する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記細胞支持タンパク質が細胞外マトリクスタンパク質を含む、請求項８２〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記細胞外マトリクスタンパク質が、前記基材に塗布される第二の溶液中に含有される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記細胞外マトリクスタンパク質がＩＶ型コラーゲンを含む、請求項９１または９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞の少なくとも一部が、ヒト腎臓近位尿細管細胞である、請求項８２〜９３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記細胞支持タンパク質が合成ペプチドを含む、請求項８２〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記細胞支持タンパク質が、細胞外マトリクスタンパク質に特徴的なアミノ酸配列を含む合成ペプチドを含む、請求項８２〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
以下：
基材の少なくとも一部分を接着剤でコーティングする工程と；
該接着剤の少なくとも一部分をタンパク質でコーティングする工程と；
該タンパク質でコーティングされた該基材の少なくとも一部分の上に細胞を接種する工程
を包含し、該タンパク質が、該基材上に接種された該細胞の分化を促進する、方法。
【請求項９８】
前記細胞支持タンパク質が合成ペプチドを含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記細胞支持タンパク質が、細胞外マトリクスタンパク質に特徴的なアミノ酸配列を含む合成ペプチドを含む、請求項９７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般に、バイオ人工（ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ）腎臓のようなバイオ人工臓器、および他の用途において使用するための、膜のような改変された基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
急性腎不全（ＡＲＦ）、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、または末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を有する被験体は、腎臓の最小機能単位であるネフロンの中程度〜重篤な機能不全を経験し得る。例えば、ＣＫＤでは、ネフロンはまだ一部分は機能的であり得るが、疾患が進行するにつれ、この機能は低下し、そして、糸球体濾過率が正常なレベルの１０％未満である場合、この疾患は、ＥＳＲＤへと進行したことになる。危篤状態のＡＲＦを有する被験体は、例えば、病院に収容された被験体で約５０％と約７０％との間の比較的高い死亡率を有し得る。加えて、ＡＲＦ被験体は、代表的に、生存のために血液透析または血液濾過に依存している。
【０００３】
糸球体は、腎臓の重要な構成要素であり、そして、糸球体の構造が、その透過選択性（ｐｅｒｍｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）を決定する。ここでは、小さな分子および／または正に荷電した分子とは異なり、大きな分子および／または負に荷電した分子は糸球体を通過することが妨害される。このような特性は、クレアチニンおよび尿素のような尿毒症性の物質を、水、グルコースおよびイオンと一緒に、限外濾過液として糸球体を横切って通過することを可能にし、それと同時に、血球およびより大きなタンパク質を循環系内に保持することを可能にする。生じた限外濾過液は、ネフロンの細管を横切って流れ、それによって、特定の分子が循環系内に戻る生物学的再吸収が生じる。水、グルコースおよびイオンの選択的な生物学的再吸収は、尿細管の内側を覆う上皮細胞層によって行われる。加えて、近位尿細管の上皮は、しばしば、糸球体濾過によって効率的に排除できない生体異物および薬物を糸球体濾過液へと分泌する。さらに、近位尿細管の上皮は、炭酸水素塩の再吸収によって血液のｐＨを制御するのを支援し得る。上皮はまた、重要な代謝および内分泌上の機能を有する。再吸収されない分子は、尿として身体から除去される。それぞれ、糸球体または尿細管によって提供される、機械的な濾過または尿細管の機能不全は、ＡＲＦ、ＣＫＤまたはＥＳＲＤのような臨床上の合併症を生じ得る。
【０００４】
平均余命が延長されているため、適当なドナーの数に対して、臓器の交換を必要とするＣＫＤまたはＥＳＲＤの被験体の割合が増大している。これらの被験体の生存率を向上させるために、糸球体の機械的な濾過機能を人工的に補うために、血液透析処置が用いられている。これらの透析装置では、しばしば、中空糸の形状の、開放型の相互に連結された孔を持つポリマー膜が使用され、この装置において、これらの膜は、慎重に制御された口径を持つ篩媒体（ｓｉｅｖｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）として機能する。この処置は一般に、２〜４時間の処置にわたり、１週間に３または４回、被験体に対して施される。成功はしているが、短期間で溶質および液体を大きく入れ替える結果としての血流力学的な不安定性に起因して、長く断続的な処置は、長期にわたっては有害となり得る。加えて、これは、尿細管の失われた再吸収、代謝、分泌または内分泌の機能は補わない。それゆえ、血液透析のために使用される透析装置は、腎機能を不完全にのみ補い、そして、ＡＲＦ、ＣＫＤまたはＥＳＲＤの被験体にとっての理想的な処置ではない。
【０００５】
近年、調査者らは、このような機械的デバイスにおいて細胞の機能を組み合わせて、バイオ人工腎臓（ＢＡＫ）を作製した。例えば、尿細管の細胞機能を提供するために、機能的な腎細胞を含むバイオ人工腎臓が開発された。ＢＡＫ処置は、危篤状態のＡＲＦを有する被験体の死亡率を低下させ得る。ＢＡＫは代表的に、多孔性の膜を含むバイオリアクターカートリッジと直列に接続された合成血液濾過器（ｈｅｍｏｆｉｌｔｅｒ）を含み、この多孔性の膜の上に、腎近位尿細管細胞のような細胞が接種される。簡便にＢＡＫに使用される透析装置においては、代表的に、数千の中空糸膜が平行に配置される。これらの膜は通常、ポリスルホン（ＰＳ）、またはタンパク質保持力が低いＰＳ改変体であるポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）から製造される。代表的なＢＡＫシステムでは、初代ヒト腎近位尿細管細胞（ＨＰＴＣ）のような細胞が、ポリマー膜上で付着、増殖および機能し、この細胞が今度は、細胞足場の一部として機能もする。しかしながら、これらの基材の上で培養されたＨＰＴＣは、代表的には種々雑多な結果を生じている。
【０００６】
初代ヒト腎近位尿細管細胞（ＨＰＴＣ）は、ＢＡＫの臨床用途に使用されている。このような尿細管細胞は、インビボで単層上皮を形成し、多様な輸送機能、代謝機能、内分泌学的機能、そしておそらくは免疫調節機能も果たす。このような細胞の輸送機能としては、糸球体濾過液からのグルコース、小さな溶質および炭酸水素塩の再吸収、ならびに、尿細管管腔内への毒素、生体異物および薬物の輸送が挙げられる。しかしながら、ＢＡＫにおいてこのような機能を効率的に行うためには、ＨＰＴＣは、多孔性膜上で制御可能な漏れの度合いを持つ十分に分化した上皮を形成しなければならない。ＢＡＫシステムにおいて使用するための適切な膜表面上にＨＰＴＣを接種すること、そして／または、このようなＨＰＴＣに適切な分化した構造を形成させることは困難であり得る。
【０００７】
加えて、そしてより一般的には、例えば、バイオ移植組織片（ｂｉｏｉｍｐｌａｎｔ）およびバイオ人工臓器の状況において、固体表面上に接着した細胞の増殖および分化を伴うか、または必要とする用途は、仮に増殖および分化が達成可能であるとしても、しばしば、細胞を固定して増殖／維持および細胞分化の両方を促進するための材料を製造するのに、非常に多額を要するか、製造が困難である。医療用途において従来使用されており、かつ容易に利用可能な多くの固形材料が、その上部に接種した特定の細胞の増殖および分化を支援するには無力であること、ならびに、この欠点の克服における、特定の従来の表面修飾およびコーティングの技術での難しさは、バイオ人工臓器／生体移植組織片の設計の分野、および、人工的な表面および／または加工された表面上に固定された細胞の分化が所望される他の分野／用途において、問題となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
よって、このような技術における改良が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、一般に、バイオ人工腎臓において使用するための膜のような基材、および、このような基材上での生細胞の固定化を伴う他の用途に関する。本発明の主題は、いくつかの場合、相互に関係する製品、特定の問題に対する代替的な解決策、そして／または、１以上のシステムおよび／もしくは物品の複数の異なる使用を含む。
【００１０】
一局面において、本発明は物品に関する。一組の実施形態によれば、この物品は、基材と、基材の少なくとも一部分の上に配置された接着剤（ａｄｈｅｓｉｖｅ）と、接着剤の少なくとも一部分の上に配置された細胞支持タンパク質（ｃｅｌｌ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と、細胞支持タンパク質でコーティングされた基材の少なくとも一部分の上に配置された細胞とを備える。いくつかの場合、接着剤は、カテコール部分を有する分子、および／または、この分子を含むポリマーを含む。
【００１１】
いくつかの局面において、本発明は、一般に、バイオ人工臓器に関する。一組の実施形態において、このバイオ人工臓器は、血液の供給源と流体連絡可能となるように配置された基材と、基材の少なくとも一部分の上に配置された接着剤と、接着剤の少なくとも一部分の上に配置されたタンパク質および／またはペプチドと、タンパク質および／またはペプチドの少なくとも一部分の上に配置された細胞とを備える。いくつかの場合、接着剤は、カテコール部分を有する分子、および／または、この分子を含むポリマーを含む。
【００１２】
本発明の他の局面は、一般に、特定の方法に関する。一組の実施形態によれば、この方法は、基材の少なくとも一部分を、カテコール部分を有する分子および／またはこの分子を含むポリマーを含む接着剤でコーティングする工程と、接着剤の少なくとも一部分を、細胞支持タンパク質でコーティングする工程と、細胞支持タンパク質の少なくとも一部分の上に細胞を接種する工程とを包含する。この方法は、特定の場合、基材の少なくとも一部分を接着剤でコーティングする工程と、接着剤の少なくとも一部分をタンパク質でコーティングする工程と、タンパク質でコーティングされた基材の少なくとも一部分の上に細胞を接種する工程とを包含する。いくつかの実施形態において、このタンパク質は、基材上に接種された該細胞の分化を促進し得る。
【００１３】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される１以上の実施形態、例えば、コーティングされた膜を作製する方法を包含する。なお別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される１以上の実施形態、例えば、コーティングされた膜を使用する方法を包含する。
【００１４】
本発明の他の利点および新規な特徴は、添付の図面と組み合わせて考慮したとき、以下の、本発明の種々の非限定的な実施形態の詳細な説明から明らかとなる。本明細書と、参考として援用される文献とが、矛盾する、および／または、相反する開示を含んでいる場合には、本明細書が支配するものとする。
【００１５】
例えば、本発明は以下を提供する：
（項目１）  以下：
基材と；
該基材の少なくとも一部分の上に配置された接着剤であって、該接着剤は、カテコール部分を有する分子および／または該分子を含むポリマーを含む、接着剤と；
該接着剤の少なくとも一部分の上に配置された細胞支持タンパク質と；
該細胞支持タンパク質でコーティングされた該基材の少なくとも一部分の上に配置された細胞と
を備える、物品。
【００１６】
（項目２）  前記基材がポリマーを含む、上記項目に記載の物品。
【００１７】
（項目３）  前記基材がガラスを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００１８】
（項目４）  前記基材が金属を含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００１９】
（項目５）  前記基材がセラミックを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００２０】
（項目６）  前記接着剤が、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＯＰＡ）を含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００２１】
（項目７）  前記接着剤がポリ（ドパミン）を含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００２２】
（項目８）  前記接着剤がポリ（ＤＯＰＡ）を含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００２３】
（項目９）  前記接着剤が、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン−リジンを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００２４】
（項目１０）  前記細胞支持タンパク質の少なくとも約５０％が細胞外マトリクスタンパク質を含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００２５】
（項目１１）  前記細胞支持タンパク質の少なくとも約７０％が細胞外マトリクスタンパク質を含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００２６】
（項目１２）  前記細胞支持タンパク質が本質的に細胞外マトリクスタンパク質からなる、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００２７】
（項目１３）  前記細胞外マトリクスタンパク質がコラーゲンを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００２８】
（項目１４）  前記コラーゲンがＩＶ型コラーゲンを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００２９】
（項目１５）  前記コラーゲンがＩ型コラーゲンを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００３０】
（項目１６）  前記コラーゲンがヒト胎盤コラーゲンである、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００３１】
（項目１７）  前記細胞外マトリクスタンパク質がラミニンを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００３２】
（項目１８）  前記細胞支持タンパク質が、細胞の分化を改善するタンパク質を含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００３３】
（項目１９）  前記細胞支持タンパク質がＢＭＰ−７を含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００３４】
（項目２０）  前記細胞支持タンパク質が合成ペプチドを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００３５】
（項目２１）  前記細胞支持タンパク質が、細胞外マトリクスタンパク質に特徴的なアミノ酸配列を含む合成ペプチドを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００３６】
（項目２２）  前記配列がＲＧＤである、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００３７】
（項目２３）  前記細胞支持タンパク質がヒトタンパク質を含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００３８】
（項目２４）  前記基材が膜である、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００３９】
（項目２５）  前記膜が半透膜である、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００４０】
（項目２６）  前記膜が限外濾過膜である、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００４１】
（項目２７）  前記膜が血液透析膜である、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００４２】
（項目２８）  前記膜が血液濾過膜である、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００４３】
（項目２９）  加えられた圧力に抵抗するための前記膜に対する支持を提供するように構成および配置された膜支持層をさらに備える、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００４４】
（項目３０）  前記基材が、ポリスルホンを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００４５】
（項目３１）  前記基材が、ポリビニルピロリドンを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００４６】
（項目３２）  前記基材が、ポリエーテルスルホンを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００４７】
（項目３３）  前記基材が、再生セルロース膜を含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００４８】
（項目３４）  前記基材が、酢酸セルロースを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００４９】
（項目３５）  前記基材が、ポリカーボネートを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００５０】
（項目３６）  前記基材が、ポリ（エチレン）を含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００５１】
（項目３７）  前記基材が、ポリオレフィンを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００５２】
（項目３８）  前記基材が、ポリプロピレンを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００５３】
（項目３９）  前記基材が、ポリアミドを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００５４】
（項目４０）  前記基材が、ポリアリールエーエルスルホンを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００５５】
（項目４１）  前記基材が、ポリアクリロニトリルを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００５６】
（項目４２）  前記基材が、ポリ（フッ化ビニリデン）を含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００５７】
（項目４３）  前記基材が管状の構成を有する、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００５８】
（項目４４）  前記基材が非管状構成を有する、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００５９】
（項目４５）  前記基材が実質的に平坦である、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００６０】
（項目４６）  前記基材が約５０μｍと約５００μｍとの間の厚みを有する、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００６１】
（項目４７）  前記基材が約１０μｍと約２００μｍとの間の厚みを有する、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００６２】
（項目４８）  バイオ人工臓器である、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００６３】
（項目４９）  バイオ人工腎臓である、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００６４】
（項目５０）  少なくとも１つの血液透析カートリッジを含む、上記項目のいずれか１項に記載の物品。
【００６５】
（項目５１）  以下：
血液の供給源と流体連絡可能となるように配置された基材と；
該基材の少なくとも一部分の上に配置された接着剤であって、該接着剤は、カテコール部分を有する分子および／または該分子を含むポリマーを含む、接着剤と；
該接着剤の少なくとも一部分の上に配置されたタンパク質および／またはペプチドと；
該タンパク質および／またはペプチドの少なくとも一部分の上に配置された細胞と
を備える、バイオ人工臓器。
【００６６】
（項目５２）  前記基材がポリマーを含む、上記項目に記載のバイオ人工臓器。
【００６７】
（項目５３）  前記基材がガラスを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００６８】
（項目５４）  前記基材が金属を含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００６９】
（項目５５）  前記基材がセラミックを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００７０】
（項目５６）  前記バイオ人工臓器がバイオ人工腎臓である、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００７１】
（項目５７）  前記バイオ人工臓器が少なくとも１つの血液透析カートリッジを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００７２】
（項目５８）  前記基材が、血液の供給源と流体連絡可能な第一の区画を、血液濾過液の供給源と流体連絡可能な第二の区画から分離するポリマー膜である、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００７３】
（項目５９）  前記接着剤が前記基材の片側のみに配置される、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００７４】
（項目６０）  前記接着剤が３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニンを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００７５】
（項目６１）  前記タンパク質が細胞外マトリクスタンパク質である、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００７６】
（項目６２）  前記細胞外マトリクスタンパク質がコラーゲンを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００７７】
（項目６３）  前記コラーゲンがＩＶ型コラーゲンを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００７８】
（項目６４）  前記タンパク質が合成ペプチドを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００７９】
（項目６５）  前記タンパク質が、細胞外マトリクスタンパク質に特徴的なアミノ酸配列を含む合成ペプチドを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００８０】
（項目６６）  前記基材が半透膜である、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００８１】
（項目６７）  前記基材が限外濾過膜である、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００８２】
（項目６８）  前記基材が血液透析膜である、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００８３】
（項目６９）  前記基材が血液濾過膜である、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００８４】
（項目７０）  前記基材が、ポリスルホンを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００８５】
（項目７１）  前記基材が、ポリビニルピロリドンを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００８６】
（項目７２）  前記基材が、ポリエーテルスルホンを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００８７】
（項目７３）  前記基材が、酢酸セルロースを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００８８】
（項目７４）  前記基材が、ポリカーボネートを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００８９】
（項目７５）  前記基材が、ポリ（エチレン）を含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００９０】
（項目７６）  前記基材が、ポリオレフィンを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００９１】
（項目７７）  前記基材が、ポリプロピレンを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００９２】
（項目７８）  前記基材が、ポリアミドを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００９３】
（項目７９）  前記基材が、ポリアリールエーエルスルホンを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００９４】
（項目８０）  前記基材が、ポリアクリロニトリルを含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００９５】
（項目８１）  前記基材が、ポリ（フッ化ビニリデン）を含有するポリマーを含む、上記項目のいずれか１項に記載のバイオ人工臓器。
【００９６】
（項目８２）  以下：
基材の少なくとも一部分を、カテコール部分を有する分子および／または該分子を含むポリマーを含む接着剤でコーティングする工程と；
該接着剤の少なくとも一部分を、細胞支持タンパク質でコーティングする工程と；
該細胞支持タンパク質の少なくとも一部分の上に細胞を接種する工程と
を包含する、方法。
【００９７】
（項目８３）  前記基材がポリマーを含む、上記項目に記載の方法。
【００９８】
（項目８４）  前記基材がガラスを含む、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
【００９９】
（項目８５）  前記基材が金属を含む、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
【０１００】
（項目８６）  前記基材がセラミックを含む、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
【０１０１】
（項目８７）  前記基材が膜である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
【０１０２】
（項目８８）  前記接着剤が３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニンを含む、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
【０１０３】
（項目８９）  前記接着剤が、基材の少なくとも一部分を、カテコール部分を有する分子および／またはそのポリマーを含む接着剤でコーティングする前記工程において、該基材の一部分に塗布される第一の溶液中に含有される、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
【０１０４】
（項目９０）  前記第一の溶液を前記基材上にスピンコーティングする工程を包含する、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
【０１０５】
（項目９１）  前記細胞支持タンパク質が細胞外マトリクスタンパク質を含む、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
【０１０６】
（項目９２）  前記細胞外マトリクスタンパク質が、前記基材に塗布される第二の溶液中に含有される、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
【０１０７】
（項目９３）  前記細胞外マトリクスタンパク質がＩＶ型コラーゲンを含む、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
【０１０８】
（項目９４）  前記細胞の少なくとも一部が、ヒト腎臓近位尿細管細胞である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
【０１０９】
（項目９５）  前記細胞支持タンパク質が合成ペプチドを含む、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
【０１１０】
（項目９６）  前記細胞支持タンパク質が、細胞外マトリクスタンパク質に特徴的なアミノ酸配列を含む合成ペプチドを含む、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
【０１１１】
（項目９７）  以下：
基材の少なくとも一部分を接着剤でコーティングする工程と；
該接着剤の少なくとも一部分をタンパク質でコーティングする工程と；
該タンパク質でコーティングされた該基材の少なくとも一部分の上に細胞を接種する工程
を包含し、該タンパク質が、該基材上に接種された該細胞の分化を促進する、方法。
【０１１２】
（項目９８）  前記細胞支持タンパク質が合成ペプチドを含む、上記項目に記載の方法。
【０１１３】
（項目９９）  前記細胞支持タンパク質が、細胞外マトリクスタンパク質に特徴的なアミノ酸配列を含む合成ペプチドを含む、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
【０１１４】
（概要）
本発明は、一般に、バイオ人工腎臓のようなバイオ人工臓器および他の用途において使用するための膜のような改変された基材に関する。特定の局面は、一般に、細胞の付着を促進するために改変された膜または他の基材に関する。一組の実施形態において、基材または膜は、例えば膜または基材の片側が、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ポリ（ドパミン）のような接着剤、または、カテコール部分を有する分子を含む他の接着剤で少なくとも部分的にコーティングされ得る。この基材の接着剤でコーティングされた部分の少なくとも一部分の上に、細胞外マトリクスタンパク質（例えば、コラーゲン）のようなタンパク質がコーティングされ得、ここに、初代ヒト腎近位尿細管細胞のような細胞が付着され得る。驚くべきことに、このような二重コーティングは、他の方法では細胞の付着を促進しない場合がある、膜または他の基材へのこのような細胞の付着を促進するために使用され得る。特定の実施形態では、コーティングはまた、細胞の接着だけでなく、細胞の増殖および／または分化も助長または促進し得る。このような膜または他の基材は、例えば、バイオ人工腎臓のようなバイオ人工臓器、血液透析カートリッジ、バイオ移植組織片、バイオセンサ、バイオリアクタなどにおいて有用であり得る。特定の実施形態では、細胞は、膜または他の基材の片側のみに付着され得るが、もう片側には細胞が付着されないままであり得る。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
本発明の非限定的な実施形態が、一例として添付の図面を参照して説明される。図面は、図式的なものであり、縮尺で製図をすることは意図されない。図面において、同一またはほぼ同一に図示される構成要素は各々、代表的には、単一の数字で表される。明確にする目的で、全ての図において全ての構成要素は標識化されず、本発明の各実施形態の全ての構成要素は示されないが、図解は、必ずしも、当業者に本発明を理解させるものではない。
【図１】図１は、本発明の特定の実施形態に従う、バイオ人工腎臓の一例を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｆは、本発明の特定の実施形態に従う異なるポリマー膜上のヒト腎近位尿細管細胞を示す写真である。
【図３】図３は、本発明のいくつかの実施形態における、異なる基材上のＦＩＴＣ結合体化ＩＶ型コラーゲンの吸着を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の種々の実施形態における、特定の膜上でのヒト腎近位尿細管細胞の増殖を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の特定の実施形態に従う膜の親水性に対する、特定の表面処理の効果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の特定の実施形態に従う特定の膜のゼータ電位を示すグラフである。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に従う特定の膜表面上のカルボン酸基導入に対する、特定の表面処理の効果を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の一実施形態における特定の膜に対するＨＫ−２細胞の接着を示すグラフである。
【図９】図９Ａ〜９Ｂは、本発明の特定の実施形態における特定の膜上の、ＨＫ−２細胞の増殖および分化を示す顕微鏡写真である。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、本発明の一実施形態に従う特定の膜上の、初代ヒト腎近位尿細管細胞の増殖を示す顕微鏡写真（図１０Ａおよび１０Ｂ）およびグラフ（図１０Ｃ）である。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄは、本発明の種々の実施形態における特定のコーティングした膜上の、初代ヒト腎近位尿細管細胞の性能を示す顕微鏡写真である。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、本発明の種々の実施形態に従う特定の膜上のヒト腎近位尿細管細胞の増殖を示す顕微鏡写真である。
【図１３】図１３は、本発明の特定の実施形態に従う、コーティングした膜およびコーティングしていない膜を通る水流を示すグラフである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＶｉｖａｓｐｉｎＴＭカラムを示す写真画像である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、本発明の一実施形態に従う、タンパク質フラグメントについての特定の膜の透過性を示すゲルの写真画像である。
【発明を実施するための形態】
【０１１６】
（詳細な説明）
本発明は、一般に、バイオ人工腎臓のようなバイオ人工臓器および他の用途において使用するための膜のような改変された基材に関する。特定の局面は、一般に、細胞の付着を促進するために改変された膜または他の基材に関する。一組の実施形態において、基材または膜は、例えば膜または基材の片側が、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、３，４−ジヒドロキシ−Ｄ−フェニルアラニン、ポリ（ドパミン）、ポリ（ＤＯＰＡ）、ポリ（３，４−ジヒドロキシ−Ｄ−フェニルアラニン）のような接着剤、または、カテコール部分を有する分子を含む他の接着剤で少なくとも部分的にコーティングされ得る。この基材の接着剤でコーティングされた部分の少なくとも一部分の上に、細胞外マトリクスタンパク質（例えば、コラーゲン）のようなタンパク質がコーティングされ得、ここに、初代ヒト腎近位尿細管細胞のような細胞が接着され得る。驚くべきことに、このような二重コーティングは、他の方法では細胞の接着を促進しない場合がある、膜または他の基材へのこのような細胞の付着を促進するために使用され得る。特定の実施形態では、コーティングはまた、細胞の接着だけでなく、細胞の増殖および／または分化も助長または促進し得る。このような膜または他の基材は、例えば、バイオ人工腎臓のようなバイオ人工臓器、血液透析カートリッジ、バイオ移植組織片、バイオセンサ、バイオリアクタなどにおいて有用であり得る。特定の実施形態では、細胞は、膜または他の基材の片側のみに付着され得るが、もう片側には細胞が付着されないままであり得る。
【０１１７】
本発明の特定の実施形態に従って提供される膜または基材は、血液が、被験体から引き抜かれ、そして、そのデバイス内へ／デバイスを通して通過させられるバイオ人工臓器デバイスのような用途において使用され得る。すなわち、例えば、膜または他の基材は、例えば、ヒトまたは非ヒト動物のような被験体の血液の供給源と流体連絡可能となるように、デバイス内に配置され得る。基材／膜は、基材／膜の第一の部分が実質的に細胞を含まない一方で、基材／膜の第二の部分が付着された細胞を含むように処理され得る。一組の実施形態において、これらの領域は、例えば、基材または膜が、血液に露出される一方のチャンバを、付着した細胞を含む別のチャンバから分離するように、基材または膜の反対側に位置し得、これらの細胞は、血液と相互作用可能であるか、または、それらの部分が膜を横切って通過可能である。例えば、膜は、限外濾過膜、血液透析膜、血液濾過膜、および／または、半透膜であり得、ここでは、例えば、以下に考察されるように、血液の１以上の成分が第一のチャンバから、膜を横切って、第二のチャンバへと通過可能であり、一方で、血液細胞のような細胞および血液からの他の成分（例えば、血清タンパク質またはフィブリン）が、血液に直接露出された膜の領域には実質的に付着することができない。これに対し、第二のチャンバでは、膜に付着した１以上の細胞または細胞の型が存在し得、これらの細胞または細胞の型は、例えば、血液を浄化する、化学反応を引き起こす、血液に物質を追加するか、または血液から物質を取り除く、などのために、膜を横切って輸送される血液の成分と相互作用し得る。バイオ人工腎臓の場合、特定の非限定的な例として、細胞は、その細胞が露出されている限外濾過液から、血液中に水、グルコース、タンパク質および／または小さな溶質を輸送するために使用され得、そして／または、これらの細胞は、（その細胞によって産生された）１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３のような他の物質を血液中に産生または分泌することを可能にし得る。
【０１１８】
特定の例として、バイオ人工臓器は、バイオ人工腎臓、または、透析のために使用される血液透析カートリッジであり得る。バイオ人工腎臓の非限定的な例は、図１を参照して以下に検討される。血液透析カートリッジの多くの型が容易に商業上入手可能である。膜は、被験体から引き抜かれた血液を含む第一のチャンバを、細胞を含む第二のチャンバから分離するためにこのようなデバイスにおいて使用され得、これらの細胞は、膜を横切って輸送される血液の成分と相互作用可能である。第二のチャンバはまた、限外濾過液を含み得、細胞はこの濾過液から物質を再吸収することが可能である。しかしながら、第二のチャンバ内の細胞は、例えば、基材または膜の存在によって、流出して、被験体の血液に入ることは不可能であり得る。
【０１１９】
代表的には、バイオ人工腎臓は、２つ（またはそれより多く）のユニット、例えば、血液透析カートリッジまたは血液濾過カートリッジのような２つのカートリッジを含む。第一のユニットは、通常の血液濾過を行うために使用され得、例えば、ここでは、尿毒症の毒素を含む限外濾過液が血液から分離される。第一のユニットは、いかなる固定化された腎細胞を含まない可能性がある。次に、限外濾過液および血液は、第二のユニットへと流れ得、この第二のユニットは、本明細書中に記載されるもののような細胞を含み得る。限外濾過液は、細胞が存在するのと同じチャンバ内（例えば、中空糸膜の管腔内）にあり、一方で、血液は、異なるチャンバ内（例えば、中空糸膜の外側）にある。第二のユニット内の細胞は、例えば、本明細書中に考察されるように、血流と限外濾過液との間で物質を交換可能であり得る。バイオ人工腎臓の非限定的な例は、Ｚｉｎｋらによる国際特許出願第ＰＣＴ／ＳＧ２０１０／０００３８０号（２０１０年１０月６日出願、発明の名称「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＢＭＰ−７  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」；およびＹｉｎｇらによる国際特許出願第ＰＣＴ／ＳＧ２０１０／０００３７７号（２０１０年１０月４日出願、発明の名称「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｋｉｄｎｅｙｓ」）に見られ得、これらは各々が本明細書中に参考として援用される。別の例として、肝細胞は、血液からの物質を解毒するか、または、血液中で見られるタンパク質、アミノ酸、炭水化物などと相互作用するように機能し得る。さらに別の例として、膵臓β細胞は、被験体の血液内の血中グルコースレベルに応じてインシュリンを産生するために使用され得る。例えば、処置または治療の目的のために、このような細胞を、被験体から取り出された血液と相互作用可能にさせ、一方で（例えば、血液が被験体に戻されるときに）被験体の血液および／または身体にこのような細胞が入る能力を低減ないし排除することが望ましい場合がある。
【０１２０】
本発明に従って修飾可能な膜または他の基材は、任意の適切な材料、例えば、ポリマーもしくはプラスチック、ガラス、セラミック、金属など、ならびに、これらおよび／または他の材料の組合せから形成され得る。いくつかの実施形態では、基材または膜は、血液からの成分の濾過または輸送を可能にし得、同時にこれらの基材または膜を通る細胞のアクセスまたは輸送を防ぐ、１以上の穴、孔、チャネル、経路などを含み得る。例えば、膜は、半透膜（例えば、拡散および／または対流（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ）によって特定の分子および／またはイオンのみを通過させる膜）および／または限外濾過膜（例えば、約１マイクロメートル未満、約５００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約１０ｎｍ未満、約５ｎｍ未満、約３ｎｍ未満などの平均孔径を有する膜）であり得る。このような孔径は、例えば、ＢＥＴまたは水銀ポロシメトリーを用いて決定され得るか、または、電子顕微鏡法を用いて推定され得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、膜または基材は、例えばタンパク質の選択性を制御するために使用され得る孔径を有し得る。例えば、膜は、約１０％未満、約５％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２％未満、約０．１％未満などの、（例えば、血液内で代表的に見られるタンパク質の）総タンパク質浸透性を有し得る。いくつかの場合、膜の孔径は、膜が、予め決められた分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）値を有し得るように選択され得る。例えば、膜は、約５０，０００Ｄａ未満、約３０，０００Ｄａ未満、約２０，０００Ｄａ未満、約１０，０００Ｄａ未満、約５，０００Ｄａ未満、約２，０００Ｄａ未満、約１，０００Ｄａ未満などのＭＷＣＯを有し得る（当業者に理解されるように、ＭＷＣＯは、厳密な数値限定としてではなく、孔径に関する指標または推定値として一般に使用される）。特定の非限定的な例として、いくつかの実施形態では、膜は、血液から尿毒症性の物質（例えば、尿素およびクレアチニン）を選択的に除去し、一方で、有用なタンパク質（例えば、アルブミン）の漏れを防ぐことが可能である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、膜または他の基材は、ポリマーから形成されるか、または、ポリマーを含む。ポリマーは、用途における使用に適した任意のポリマーであり得、その用途では、膜または他の基材は、血液と相互作用することが意図され、いくつかの場合には、血液から（例えば、ヒト被験体のような血液の供給源から）細胞を分離するために使用される。ポリマーは、例えば、ポリスルホン（ＰＳＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ならびに／または、これらおよび／もしくは他のポリマーの任意の組合せ（例えば、ＰＥＳ／ＰＶＰおよびＰＳＦ／ＰＶＰ）、ならびに、本明細書中で言及されるポリマーのうちの任意のもののコポリマーであり得る。なお別の例としては、ＦｕｌｌｃｕｒｅＴＭ（Ｏｂｊｅｔ  Ｇｅｏｍｅｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）のようなアクリルベースの光重合体が使用され得る。なお別の例として、ポリマーは、再生セルロースであり得る。本明細書中に記載される構造を形成するために使用され得るポリマーのさらなる例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：酢酸セルロース、ポリアリールエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリビニルブトリル（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｂｕｔｒｙｌ）、ポリビニルピリジル、ポリビニルピロリドン、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリロニトリル、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、エチレン−プロピレンゴム類（ＥＰＤＭまたはＥＰＲ）、塩素化ポリエチレン（ＣＰＥ）、エチレンビスアクリルアミド（ＥＢＡ）、アクリレート類（例えば、アルキルアクリレート類、グリコールアクリレート類、ポリグリコールアクリレート類、エチレンエチルアクリレート（ＥＥＡ））、水素化ニトリルブタジエンゴム（ＨＮＢＲ）、天然ゴム、ニトリルブタジエンゴム（ＮＢＲ）、特定のフルオロポリマー類、シリコーンゴム、ポリイソプレン、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）、クロロスルホニルゴム、フッ化ポリ（アリーレンエーテル）（ＦＰＡＥ）、ポリエーテルケトン類、ポリスルホン類、ポリエーテルイミド類、ジエポキシド類、ジイソシアネート類、ジイソチオシアネート類、ホルムアルデヒド樹脂、アミノ樹脂、ポリウレタン類（ｐｌｙｕｒｅｔｈａｎｅｓ）、不飽和ポリエーテル類、ポリグリコールビニルエーテル類、ポリグリコールジビニルエーテル類、ポリ（無水物）類、ポリオルトエステル類、ポリホスファゼン類、ポリブチレン類、ポリカプロラクトン類（ｐｏｌｙｃａｐｒａｌａｃｔｏｎｅｓ）、ポリカーボネート類、ならびにアルブミン、コラーゲンおよび多糖類のようなタンパク質ポリマー類、これらのコポリマー、ならびに、このようなポリマーのモノマー。
【０１２３】
本明細書中に記載される膜または他の基材を形成するために使用され得るポリマーのなお他の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ポリアミン類（例えば、ポリ（エチレンイミン）およびポリプロピレンイミン（ＰＰＩ））；ポリアミド類（例えば、ポリアミド（Ｎｙｌｏｎ）、ポリ（ε−カプロラクタム）（Ｎｙｌｏｎ  ６）、ポリ（ヘキサメチレンアジパミド）（Ｎｙｌｏｎ  ６６））、ポリイミド類（例えば、ポリイミド、ポリニトリルおよびポリ（ピロメリットイミド（ｐｙｒｏｍｅｌｌｉｔｉｍｉｄｅ）−１，４−ジフェニルエーテル）（Ｋａｐｔｏｎ））；ビニルポリマー類（例えば、ポリアクリルアミド、ポリ（２−ビニルピリジン）、ポリビニルピロリドン）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（フッ化ビニル）、ポリ（２−ビニルピリジン）、ビニルポリマー、ポリクロロトリフルオロエチレンおよびポリ（イソヘキシルシアノアクリレート））；ポリアセタール類；ポリオレフィン類（ｐｏｌｙｏｌｅｆｍｓ）（例えば、ポリ（ブテン−１）、ポリ（ｎ−ペンテン−２）、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン）；ポリエステル類（例えば、ポリカーボネート、ポリブチレンテレフタレート、ポリヒドロキシブチレート）；ポリエーテル類（ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（プロピレンオキシド）（ＰＰＯ）、ポリ（テトラメチレンオキシド）（ＰＴＭＯ））；ビニリデンポリマー類（例えば、ポリイソブチレン、ポリ（メチルスチレン）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（塩化ビニリデン）およびポリ（フッ化ビニリデン））；ポリアラミド類（例えば、ポリ（イミノ−１，３−フェニレンイミノイソフタロイル）およびポリ（イミノ−１，４−フェニレンイミノテレフタロイル））；ポリ複素芳香族化合物類（例えば、ポリベンゾイミダゾール（ＰＢＩ）、ポリベンゾビスオキサゾール（ＰＢＯ）およびポリベンゾビスチアゾール（ＰＢＴ））；ポリ複素環式化合物類（例えば、ポリピロール）；ポリウレタン類；フェノール系ポリマー類（例えば、フェノール−ホルムアルデヒド）；ポリアルキン類（例えば、ポリアセチレン）；ポリジエン類（例えば、１，２−ポリブタジエン、ｃｉｓ−またはｔｒａｎｓ−１，４−ポリブタジエン）；ポリシロキサン類（例えば、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）、ポリ（ジエチルシロキサン）（ＰＤＥＳ）、ポリ（テトラフルオロエチレン）（ＰＴＦＥ）、ポリ（エチレン）（ＰＥ）、ポリオレフィン、ポリジフェニルシロキサン（ＰＤＰＳ）およびポリメチルフェニルシロキサン（ＰＭＰＳ））；ならびに、無機ポリマー類（例えば、ポリホスファゼン、ポリホスホネート、ポリシラン類、ポリシラザン類）。使用され得るさらなるポリマーは、Ｙｉｎｇらによる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３５６１０号（発明の名称「Ｐｏｒｏｕｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ａｒｔｉｃｌｅｓ」、２００６年９月１２日出願、２００８年１月１０日にＷＯ  ２００８／００５０３５として公開）に記載され、この出願は本明細書中に参考として援用される。いくつかの実施形態では、Ｐａｌｌ  ＯｍｅｇａＴＭメンブレン（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のような市販の膜が使用され得る。
【０１２４】
他の物質が、ポリマーの代わりに、または、ポリマーに加えて、基材において使用され得る。例えば、基材は、ガラス、金属、セラミック、半導体などを含み得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、膜または他の基材は、膜または基材に対して抗付着（ａｎｔｉ−ｆｏｕｌｉｎｇ）特性を与える１以上の組成物で処理され得るか、または、このような組成物を含み得る。例えば、膜または他の基材は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、３−メチルアクリロイルオキシプロピルトリメトキシシラン、または、他の非付着性（ｎｏｎ−ｆｏｕｌｉｎｇ）組成物を含み得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、膜または他の基材は、所望の性能特性を生じるように選択され得る。例えば、膜の厚みを減らすと、一方の側面からもう一方の側面までの流体が流れなければならない距離を短縮することによって、より効率的な限外濾過が可能となり得る。膜の厚みは、いくつかの実施形態では、５０マイクロメートルと５００マイクロメートルとの間、５０マイクロメートルと４００マイクロメートルとの間、５０マイクロメートルと３００マイクロメートルとの間、５０マイクロメートルと２００マイクロメートルとの間、１００マイクロメートルと５００マイクロメートルとの間、１００マイクロメートルと４００マイクロメートルとの間、または、２００マイクロメートルと４００マイクロメートルとの間であり得る。
【０１２７】
しかしながら、厚みを減らすことはまた、膜または基材の機械的強度も低下させ得る。したがって、いくつかの実施形態では、マクロ多孔性（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）の支持層が、膜または他の基材を補強するために使用され得る。例えば、支持層は、例えば限外濾過液または血液濾過液の供給源と流体連絡した、バイオ人工腎臓（または他のバイオ人工臓器）において、膜または他の基材に隣接して配置され得る。任意の適切な生体適合性材料が支持層を製造するために使用され得る。いくつかの実施形態では、支持層は、膜または他の支持体と比してマクロ多孔性であり得る。支持層を製造するために使用され得るポリマーの非限定的な例としては、上記のポリマーが挙げられる。支持層と膜または基材とはまた、同じ材料から形成されても、異なる材料から形成されてもよい。
【０１２８】
膜または基材は、任意の適切な形状および構成を有し得る。例えば、膜は、（例えば、中空糸透析カートリッジまたは血液透析カートリッジにおいてのような）管状構成、または、非管状構成を有し得る。いくつかの実施形態では、膜は、実質的に平らなシートの形状であり得る。例えば、膜はディスク様もしくはプレート様であり得、厚みは、膜の幅、長さまたは直径よりもかなり小さい。
【０１２９】
特定の局面では、細胞は、本発明の膜または基材を組み込んだデバイス内に組み込まれ得る。しかしながら、このようなデバイスにおいて、細胞から血液を分離するために使用される膜または他の基材は、代表的には、有益かつ同時に、細胞側への細胞の（例えば、腎細胞または肝細胞のような細胞の）接着を促進し、一方では、血液側への細胞の（例えば、血小板またはマクロファージのような細胞の）接着を低減または阻害する。このような機能を提供する１つの方法は、異なる側面には異なる特性を持つ膜または基材を使用することである。例えば、一方の側面は、比較的疎細胞性（ｃｙｔｏｐｈｏｂｉｃ）であり得るのに対し、もう一方の側面は、比較的親細胞性（ｃｙｔｏｐｈｉｌｉｃ）である。したがって、一組の実施形態では、比較的疎細胞性の膜および／または血液適合性（ｈｅｍｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）な膜または他の基材が使用され、ここで、膜の一方の側面は、比較的疎細胞性となるように処理される。血液適合性膜の例としては、血液透析において使用するために市販されているものが挙げられる；これらの膜はしばしば、細胞、ならびに血清アルブミンおよびフィブリンのような血液タンパク質の接着の低減を示す。例えば、以下に考察されるように、膜または他の基材の一方の側面は、必要に応じて膜への細胞支持タンパク質の結合を促進するための接着剤を介して、細胞支持タンパク質でコーティングされ得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、膜または他の基材に接着される１以上のタンパク質が存在し得る。例えば、膜または他の基材は、１以上の細胞支持タンパク質を含み得る。「細胞支持タンパク質」は、少なくとも接着を促進し、そしてまた、そのタンパク質が付着されるか、またはそのタンパク質と接した細胞の増殖および／または分化を促進し得る、任意のタンパク質またはペプチドであり得る。例えば、膜または他の基材に付着され、そして、必要に応じて分極した上皮を形成する、適切な細胞（例えば、バイオ人工腎臓については、ヒト腎近位尿細管細胞）の数が、細胞支持タンパク質が存在する場合に、細胞支持タンパク質が存在しない場合よりも多くなり得る。細胞支持タンパク質は、天然のものであっても、合成のものであってもよく、そして、ヒトのものであっても、ヒト由来のものであっても、ヒト別の生物由来のものであっても（例えば、マウスタンパク質）、人工的に作り出されたものであってもよい。細胞支持タンパク質は、任意の適切な供給源、例えば、合成されたもの、細胞内でインビトロで増殖させたもの、特定の生物から取得したものなどから入手され得る。本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」および「ペプチド」は交換可能である、すなわち、当業者によって理解されるように、タンパク質とペプチドとの間には、残基の長さまたは数の点で、特定の同意を得たカットオフは存在しないことに留意すべきである。細胞支持タンパク質の例としては、例えば、細胞外マトリクスタンパク質および／またはポリカチオン性ペプチドが挙げられる。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、膜もしくは他の基材上、または、少なくともその一方の表面上のタンパク質の少なくとも約５０％が、細胞外マトリクスタンパク質のような細胞支持タンパク質であり、特定の場合、膜または他の基材上のタンパク質の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％が細胞支持タンパク質である。いくつかの場合、細胞支持タンパク質の少なくとも一部は、１以上の細胞外マトリクスタンパク質を含み得、そして特定の実施形態においては、膜または他の基材上の細胞支持タンパク質の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％が、１以上の細胞外マトリクスタンパク質を含む。
【０１３２】
広範な種々の細胞支持タンパク質が使用され得る。細胞支持タンパク質は、細胞の分化、細胞の接着、細胞の伸展（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）、細胞の移動などを向上させるタンパク質であり得る。細胞支持タンパク質として有用であるか、または有用である可能性がある、適切な細胞外マトリクスタンパク質の非限定的な例としては、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、または種々のコラーゲン類（例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ＶＩＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、ＸＩＩ型コラーゲン、ＸＩＩＩ型コラーゲン、ＸＩＶ型コラーゲン、ＸＶ型コラーゲン、ＸＶＩ型コラーゲン、ＸＶＩＩ型コラーゲン、ＸＶＩＩＩ型コラーゲン、ＸＩＸ型コラーゲン、ＸＸ型コラーゲン、ＸＸＩ型コラーゲン、ＸＸＩＩ型コラーゲン、ＸＸＩＩＩ型コラーゲン、ＸＸＩＶ型コラーゲン、ＸＸＶ型コラーゲン、ＸＸＶＩ型コラーゲン、ＸＸＶＩＩ型コラーゲン、ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンまたはＸＸＩＸ型コラーゲン）が挙げられる。コラーゲンは、任意の適切な供給源、例えば、ヒト胎盤コラーゲン、皮膚コラーゲンなどに由来し得る。細胞支持タンパク質として使用するために適しているか、または、適している可能性がある、ポリカチオン性ペプチドの例としては、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−ヒスチジン、ならびに／あるいは、これら、および／または、他の適切なポリカチオン性ペプチドもしくは他の種のコポリマーもしくはブレンドが挙げられるがこれらに限定されない。細胞支持タンパク質のなお他の例としては、ＲＧＤ配列（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）を含むタンパク質が挙げられ、この配列は、上記のもののような細胞外マトリクスタンパク質において一般に見出される配列である。このような配列は、特定の細胞外マトリクスタンパク質から誘導され得るか、さもなくば、特定の細胞外マトリクスタンパク質において見出され得、すなわち、この配列は、細胞外マトリクスタンパク質に特徴的なものであり得る。なお別の例として、細胞支持タンパク質は、細胞外マトリクスタンパク質に特徴的な配列（例えば、ＲＧＤ配列）を含む合成ペプチドであり得る。いくつかの場合、細胞支持タンパク質は、基材または膜上での細胞の細胞分化を促進し得る。このようなタンパク質の１つの非限定的な例は、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）である。例えば、Ｚｉｎｋらによる、国際特許出願第ＰＣＴ／ＳＧ２０１０／０００３８０号（２０１０年１０月６日出願、発明の名称「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＢＭＰ−７  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」；本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０１３３】
いくつかの局面において、細胞外マトリクスタンパク質のようなタンパク質は、接着剤を用いて、膜または他の基材に対して接着され得るか、さもなくば、固定化され得る。接着剤は、タンパク質と膜または他の基材との間に配置され得、そして、（タンパク質、接着剤および膜／基材の性質に依存する）任意の適切な機構（例えば、共有結合、非共有結合、イオン性の力、ファンデルワールス相互作用、水素結合、物理的な挿入（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ）など）によって、膜または他の基材に対するタンパク質の接着を引き起こし得るか、または、増強し得る。接着剤は、接着剤の非存在下で接着され得るタンパク質の量または濃度と比して、膜または他の基材に対して接着または固定化されるタンパク質の量または濃度を増加させ得る、あらゆる適切な物質であり得る。いくつかの実施形態では、接着剤は、膜または他の基材の片側のみに配置される。
【０１３４】
一組の実施形態では、接着剤は、カテコール部分、例えば、以下：
【０１３５】
【化１】
2012157653.tif 000002
【０１３６】
のような部分を有する分子を含み、上記式において、波線は、例えば、カテコール部分を含む以下の例に示されるように、この部分の、分子の残りへの付着点を示す。すなわち、このような接着剤の非限定的な例としては、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＯＰＡ）および３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン−リジンが挙げられる。いくつかの場合、接着剤は、ポリ（ドパミン）、ポリ（ドパミンメタクリルアミド−ｃｏ−メトキシエチルアクリレート）（ｐＤＭＡ−ｃｏ−ＭＥＡ）、ＰＥＧ−ＤＯＰＡなどのような、カテコール部分を含むポリマーまたはコポリマーであるか、または、これらのポリマーまたはコポリマーを含む。ＤＯＰＡは以下の構造：
【０１３７】
【化２】
2012157653.tif 000003
【０１３８】
を有する。ｐＤＭＡ−ｃｏ−ＭＥＡは以下の構造：
【０１３９】
【化３】
2012157653.tif 000004
【０１４０】
を有する。
【０１４１】
加えて、他の実施形態では、これらおよび／または他の接着剤（例えば、カテコール部分を有する分子を含む他の接着剤）の組合せが使用され得る。
【０１４２】
いかなる理論にも束縛されることは望まないが、カテコール性アミノ酸を含む分子を含む接着剤は、特定のタンパク質の固体化（ｓｏｌｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）につながる特定の架橋反応に関与し得ると考えられ、この場合、この架橋反応には、Ｆｅ３＋のような金属イオンについて役割が存在し得る。すなわち、いくつかの場合、酸化されたカテコール性アミノ酸残基が接着剤の固体化につながる架橋反応において役割を担い得る。加えて、架橋は別にして、ＤＯＰＡは、配位、共有結合、水素結合などを介して、種々の化学的に異なる表面（有機および無機）に対して高い親和性を有することが知られている。また、いくつかの実施形態では、ＤＯＰＡのような接着剤は、基材の表面をコーティングするか、および／または、変換するか、および／または、表面と反応して、特定の場合には、細胞支持タンパク質の非存在下でさえも、基材の表面をより親細胞性の形態に変え得る。例えば、細胞支持タンパク質での処理の後にＤＯＰＡまたは他のこのような接着剤で処理された基材は、細胞支持タンパク質では処理されているが、ＤＯＰＡまたは他の接着剤は用いていない同様の表面よりも良好な細胞接着特性を示し得る。
【０１４３】
このように、本発明の種々の実施形態において、１以上の細胞および／または細胞型は、膜または他の基材上に配置された細胞支持タンパク質上に配置され得、この配置は、例えば、接着剤を介してそこに付着または接着されることによってなされる。表面は、部分的または完全に細胞で覆われ得る。用途に応じて、任意の適切な細胞が使用され得る。例えば、細胞は、ヒトおよび／または非ヒトの細胞、例えば、非ヒト哺乳動物細胞を含み得る。細胞の特定の非限定的な例としては、腎細胞（例えば、腎近位尿細管細胞）、肝細胞（例えば、肝実質細胞）、リンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、膵臓β細胞（例えば、血中に送達するためのインシュリンを産生するためのもの）、リンパ細胞（ｌｙｍｐｈ  ｃｅｌｌ）などが挙げられる。さらなる非限定的な例として、細胞は、初代細胞、非不死化細胞、幹細胞（例えば、胚性幹細胞、間葉系幹細胞および人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞）、分化細胞（例えば、幹細胞から得られるもの）などを含み得るか、または、本質的にこれらからなり得る。
【０１４４】
特定の非限定的な例として、膜または他の基材上の細胞は、例えば、バイオ人工腎臓のような用途のために、腎近位尿細管細胞を含み得、バイオ人工腎臓は、このような細胞を含む１以上の血液透析カートリッジを備え得る。いくつかの場合、本明細書中で考察されるように、細胞は、膜または他の基材の一方の表面上にのみ、例えば、デバイスの血液側から隔離された側に配置される。特定の実施形態において、細胞は、膜の少なくとも一部分の上に連続した層を形成し得、その結果、限外濾過液は、腎近位尿細管細胞層を通過することなく膜を通過できない。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、膜上でコンフルエントな上皮を形成する。特定の実施形態では、細胞近傍の（ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）空間が、接着結合によって密封され得る。いくつかの場合、細胞は、膜の表面上に単層を形成することが可能である。
【０１４５】
一組の実施形態では、腎近位尿細管細胞は、他の細胞と同時に培養される。例えば、特定の実施形態では、腎近位尿細管細胞は、腎細胞型（例えば、遠位尿細管細胞、集合尿細管細胞（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  ｄｕｃｔ  ｃｅｌｌ）、有足突起および腎線維芽細胞）または内皮細胞と同時に培養され得る。いくつかの実施形態では、腎近位尿細管細胞の性能（例えば、物質を再吸収する能力）は、同時培養において改善され得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、例えば、Ｚｉｎｋらによる国際特許出願第ＰＣＴ／ＳＧ２０１０／０００３８０号（２０１０年１０月６日出願、発明の名称「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＢＭＰ−７  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」；この出願は本明細書中に参考として援用される）において考察されるように、１以上の因子が、腎近位尿細管細胞の形態およびコンフルエンスの形成および／または維持を促進するために使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）が因子として使用され得る。いくつかの実施形態では、１以上の因子は、ＢＡＫ内から制御された様式で放出され得る。いくつかの場合、１以上の因子は、腎尿細管細胞内で産生され得る。
【０１４７】
加えて、本発明のいくつかの局面は、本明細書中に記載されるもののようなポリマー膜を製造するためのシステムおよび方法に関する。例えば、ポリマー膜または他の基材は、接着剤（例えば、カテコール部分を有する分子を含む接着剤）でコーティングされ得る。膜もしくは他の基材、またはこれらの一部分は、まず、このような接着剤または接着剤の前駆物質を含む溶液に曝露され得る。例えば、膜もしくは基材が溶液中に浸漬され得るか、溶液が膜もしくは基材の上に塗られ得るか、または、溶液が、スピンコーティング（ｓｐｉｎ−ｃｏａｔｉｎｇ）技術を用いて膜もしくは基材に付加され得る。溶液は、次に、（例えば、待つか、加熱するか、乾燥環境に曝露するなどによって）必要に応じて乾燥させられ得、そして必要に応じて、例えば、ｐ（ＤＭＡ−ｃｏ−ＭＥＡ）を形成するためのＤＭＡおよびＭＥＡモノマーのフリーラジカル共重合によって、乾燥溶液内で重合が誘導され得るが、特定の用途においては、膜は、（例えば脱イオン水を用いて）洗浄されるのみで、乾燥されない場合がある。
【０１４８】
一度十分な乾燥が生じると、接着剤は、１以上の細胞支持タンパク質（例えば、細胞外マトリクスタンパク質または本明細書中で考察される他のタンパク質（複数可））を含む別の溶液でコーティングされ得る。タンパク質でのコーティングは、例えば、上で記載したもののような技術を用いて実施され得る。コーティングプロセスは、接着剤で用いられるコーティングプロセスと同じであっても異なっていてもよい。コーティングはまた、例えば、上で記載したもののような技術を用いて乾燥され得る。接着剤は、細胞支持タンパク質の基材への接着を促進し得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、いくつかの細胞支持タンパク質は、少なくとも部分的に、これらの領域における接着剤の存在なしに、膜または他の基材に接着することが可能であり得る。
【０１４９】
一度十分に乾燥または洗浄されると、１以上の細胞または細胞型が、膜または他の基材の上に（例えば、少なくとも細胞支持タンパク質でコーティングされた膜／基材の部分の上に）播種もしくはプレーティングされ得る。例えば、細胞支持タンパク質が配置される基材の部分の上に、例えば、細胞を含む溶液を基材上に塗布することによってなど、基材上に細胞を播種するための任意の適切な技術が使用され得る。いくつかの場合、膜または基材の他の部分にも同様に播種され得る。
【０１５０】
加えて、本発明の特定の局面は、一般に、バイオ人工腎臓すなわちＢＡＫに関する。バイオ人工腎臓の非限定的な例は、Ｙｉｎｇらによる国際特許出願第ＰＣＴ／ＳＧ２０１０／０００３７７号（２０１０年１０月４日出願、発明の名称「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｋｉｄｎｅｙｓ」）に見出され得、この出願はその全体が本明細書中に参考として援用される。いくつかの実施形態では、ＢＡＫは、限外濾過ユニットとバイオリアクタユニット（例えば、固定化された細胞を含むもの）を含み得る。いくつかの実施形態では、限外濾過ユニットとバイオリアクタユニットとは、単一のハウジング内に収容され得、この単一のハウジングは、特定の場合には、限外濾過ユニットを含む第一の堅い壁で囲まれた区画と、バイオリアクタユニットを含む第二の堅い壁で囲まれた区画とに区分され得る。特定の他の実施形態においては、単一のハウジングは、限外濾過セクション（限外濾過ユニット）を形成する膜（複数可）と、バイオリアクタユニットを形成する膜（複数可）の両方を含む単一の堅い壁で囲まれた区画のみを含み得る。特定の実施形態では、限外濾過ユニットおよびバイオリアクタユニットは、各々が物理的に隔てられた、独立の可動式ハウジング内に含まれ、ここで、これらのハウジングは、互いに流体連絡して接続される。
【０１５１】
バイオリアクタユニットは一般に、再吸収膜を含み、この膜の少なくとも一部は、その上に複数の腎近位尿細管細胞が配置され得、ここで、腎近位尿細管細胞は、選択的に分子を輸送し、そして、溶質がこの再吸収膜を通過することを選択的に可能にする。特定の実施形態では、複数のヒト腎近位尿細管細胞は、バイオリアクタユニットの膜の少なくとも一部の上で細胞の単層を実質的に形成し、そして、特定のこのような実施形態においては、複数のヒト腎近位尿細管細胞は、バイオリアクタユニットの膜の少なくとも片側の実質的に全体において、細胞の単層を実質的に形成する。いくつかの実施形態では、バイオリアクタユニットは、実質的に平らなデバイス（例えば、デバイスの幅、長さまたは直径よりもかなり小さい厚みを有するディスク様またはプレート様）として構成され得、腎近位尿細管細胞層の改善された保全、および、腎近位尿細管細胞層のより容易なモニタリング、ならびに、特定の実施形態においては、より大きい携帯性および装着性といった、有益な特性を与え得る。他の実施形態では、再吸収ユニットは、中空糸の濾過または透析カートリッジを含む。
【０１５２】
中空糸ＢＡＫの非限定的な例が図１に示される。ＢＡＫ  １００は、被験体の循環系１１１と流体連絡する入口１１０を備える。血液は、入口を通って濾過ユニット１２０内に流れる。濾過ユニットは、流体は通過できるが細胞は通過できない複数の中空糸膜１２１を備える。「限外濾過液（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅ）」は、この膜を通過した流体をいう。「保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）」は、膜を横切らない血液の部分をいう。血液は、濾過ユニットの中空糸内に流れ、そして、血液からの流体が、中空糸膜を通過して、中空糸の外部にある空間１２２内に限外濾過液の形成を生じる。保持液１２３および限外濾過液１２４は、次に、バイオリアクタユニット１３０内に流れる。バイオリアクタユニットは中空糸膜１３１を備え、この中に、濾過ユニットからの限外濾過液が流れる。濾過ユニットからの保持液は、中空糸の外側にある空間１３２内に流れる。バイオリアクタユニットの中空糸の内部表面は、その上部に播種された腎近位尿細管細胞１３３を有する。濾過ユニットからの限外濾過液は、バイオリアクタユニットの中空糸内に流れ、ここで、腎近位尿細管細胞と接する。限外濾過液からの流体の一部が、腎近位尿細管細胞が播種された中空糸を通過して、中空糸の外側にある空間内へと入る。この流体は、本明細書において、「再吸収液（ｒｅａｂｓｏｒｂａｔｅ）」と称される。腎臓の尿細管と同様に、ヒト近位尿細管細胞は、グルコース、水およびイオンのような重要な物質の再吸収および代謝の調節において、その生物学的な機能を果たし得る。いくつかの非限定的な実施形態では、治療的に活性なタンパク質または他の因子は、バイオリアクタユニット内の細胞および／または別の成分（例えば、図１においてＢＭＰ−７  １４０によって例証される）によって放出され得る。残りの限外濾過液１３５は、ＢＡＫから出て、廃液容器内へと流れる。いくつかの実施形態では、組み合わされた保持液および再吸収液１３６が、ＢＡＫから流れ出て、被験体の循環系内に戻る。いくつかの実施形態では、平底型（ｆｌａｔ−ｂｅｄ）ＢＡＫは、例えば、Ｙｉｎｇらによる国際特許出願第ＰＣＴ／ＳＧ２０１０／０００３７７号（２０１０年１０月４日出願、発明の名称「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｋｉｄｎｅｙｓ」）に記載されるように使用され得、この出願は、本明細書中に参考として援用される。
【０１５３】
以下の文献が、本明細書中に参考として援用される：Ｚｉｎｋらによる国際特許出願第ＰＣＴ／ＳＧ２０１０／０００３８０号（２０１０年１０月６日出願、発明の名称「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＢＭＰ−７  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」）；および、Ｙｉｎｇらによる国際特許出願第ＰＣＴ／ＳＧ２０１０／０００３７７号（２０１０年１０月４日出願、発明の名称「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｋｉｄｎｅｙｓ」）。
【０１５４】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を例示することが意図されるが、本発明の全範囲を例示するものではない。
【実施例】
【０１５５】
実施例１
バイオ人工腎臓（ＢＡＫ）は、従来の血液濾過器（ｈｅｍｏｆｉｌｔｅｒ）を、腎近位尿細管細胞のような腎細胞を含むバイオリアクタと直列で組み合わせる。これらの細胞は、グルコース、アミノ酸、炭酸水素塩、電解質および水の再吸収、毒素および生体異物の分泌、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の産生、免疫調節機能などの機能を提供し得る。ヒト初代腎近位尿細管細胞（ＨＰＴＣ）は、臨床治験において使用されており、そしてこれらは、ＢＡＫ用途に効果的である。
【０１５６】
近位尿細管細胞は、代表的には適切に分化され、そして、ＢＡＫの多孔性膜上に接着結合によって密閉されるコンフルエントな上皮を形成し得る。万一これが生じない場合、いくつかの場合では、細胞の機能は弱められる場合がある。このような条件下では、ＢＡＫ全体は、依然として、通常の血液濾過デバイスの機能を行い得るが、限外濾過液の成分が、バイオリアクタユニット内の血液へと戻る拡散が生じ得る。
【０１５７】
この実施例は、多様なポリマー膜上での、未処理であるか、または、異なる表面処理およびコーティングの手法に供されたかのいずれかのヒト腎近位尿細管細胞の性能を検討する。
【０１５８】
５１ｋＤａの平均分子量（ＭＷ）を持つＰＥＳ（Ｕｌｔｒａｓｏｎ（登録商標）Ｅ６０２０Ｐ）をＢＡＳＦ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＰＶＰ（２５ｋＤａの平均ＭＷ）をＭｅｒｃｋ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）から購入した。Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を溶媒として使用した。ＰＳＦ（２２ｋＤａの平均ＭＷ）、ポリ（エーテルイミド）（ＰＥＩ、１２ｋＤａの平均ＭＷ）、ポリ（無水マレイン酸−ａｌｔ−１−オクタデセン）（ＰＡ−１８、約３０〜５０ｋＤａのＭＷ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ、０．０１％）、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＯＰＡ）および過酸化水素（３１％）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。市販の再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）−ＨＡ）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｃｏｒｋ，Ｉｒｅｌａｎｄ）から購入し、市販のポリ（エチレンテレフタラート）（ＰＥＴ，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標））膜を、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）から入手した。
【０１５９】
ＰＥＳ／ＰＶＰ、ＰＳＦ／ＰＶＰおよびＰＳＦ膜の調製および表面処理：ＰＥＳ／ＰＶＰ膜およびＰＳＦ／ＰＶＰ膜は、相反転法により調製した。簡単に述べると、ＰＥＳおよびＰＶＰを、１８／８／７４重量％のＰＥＳ／ＰＶＰ／ＮＭＰの最終組成でＮＭＰ中に溶解させた。約５ｍｌのポリマー溶液をシリコンウエファー上に導入し、市販のスピンコーティング装置（ＣＥＥ  １００ＣＢ  Ｃｏａｔ  Ｂａｋｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｒｅｗｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｏｌｌａ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いることにより、１５００ｒｐｍで３０秒間回転させた。回転の後、ウエファーを直接水浴中に浸漬させた。シリカウエファーから自然に剥がれた後、このＰＥＳ／ＰＶＰ膜を大量の脱イオン（ＤＩ）水で洗浄し、使用前に室温にてＤＩ水中に保存した。同様に、ＰＳＦ／ＰＶＰ膜およびＰＳＦ膜を、それぞれ、２０／５／７５重量％のＰＳＦ／ＰＶＰ／ＮＭＰまたは２５／７５重量％のＰＳＦ／ＮＭＰの最終濃度で調製した。全ての膜は、同じスピンコーティング条件（１５００ｒｐｍ、３０秒間）下で作製した。異なる表面処理に用いた条件を表１に列挙する。
【０１６０】
表１．ＰＥＳ／ＰＶＰ膜の表面処理
【０１６１】
【表１】
2012157653.tif 000005
【０１６２】
水接触角の測定：１μｌのＤＩ水を膜の表面上にピペットで移した。水接触角を、ＳＣＡ２０ソフトウェアを用いて、ゴニオメーター（Ｃｏｎｔａｃｔ  Ａｎｇｌｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＯＣＡ  ３０，ＤａｔａＰｈｙｓｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ，Ｆｉｌｄｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定した。
【０１６３】
ゼータ電位の測定：未処理および処理済のＰＥＳ／ＰＶＰ膜のゼータ電位を、めっきしたサンプルセル（ｐｌａｔｅｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｃｅｌｌ）を備える動電学分析器（ＥＫＡ  １．００，Ａｎｔｏｎ−Ｐａａｒ  ＧｍｂＨ，Ｇｒａｚ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いることにより測定した。膜を２ｃｍ×１ｃｍの片に切断した。測定は、ｐＨ６．８にて１ｍＭのＫＣｌ溶液中、２５℃で行った。各場合において、測定は３回反復して行った。
【０１６４】
膜表面上のカルボン酸基の特徴付け：未処理および処理済のＰＥＳ／ＰＶＰ膜上のカルボン酸基の表面密度を、トルイジンブルーＯ（ＴＢＯ）染色アッセイを用いることにより決定した。膜を、ｐＨ１０のＴＢＯ溶液（０．５ｍＭ）中に浸した。ＤＩ水で洗浄することにより複合体形成しなかった色素分子を除去した。カルボン酸基上に吸着された色素分子を、５０％酢酸溶液中で脱着させた。この溶液中の色素の濃度を、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ２ＴＭ，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、６３３ｎｍにおける吸光度を測定することによって決定した。
【０１６５】
Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）：ＸＰＳを、ＶＧ  ＥＳＣＡ  ２２０ｉ−ＸＬ画像化ＸＰＳシステム（ＬＰＤ  Ｌａｂ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，ＵＫ）を用いて実施した。Ａｌ  Ｋα（Ｋ−アルファ）Ｘ線を供給源として用いた（ｈν（ｈニュー）＝１４８６．６ｅＶ）。サンプルについての全結合エネルギーを、外来炭素Ｃ（１ｓ）のピークを２８５ｅＶに設定することによって関係付けた。
【０１６６】
インビトロ細胞培養：ＨＫ−２細胞および１バッチのＨＰＴＣは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手した。ＨＫ−２細胞を、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて培養した。ＡＴＣＣからのＨＰＴＣを、０．５％  ＦＢＳおよび腎上皮細胞増殖キット−ＢＢＥ（ＡＴＣＣ）を補充した上皮細胞基本培地中で培養した。ＨＰＴＣのさらなるバッチをＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手し、販売元によって推奨される培地（これは、２％  ＦＢＳおよび１％上皮細胞増殖補充物（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を補充した腎上皮細胞基本培地であった）中で培養した。バッチに依存する影響を排除するために、継代回数が少ないＨＰＴＣ（継代３〜５回）のみを適用し、そして、異なるバッチの初代細胞を使用した。全ての細胞培養培地に、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を補充し、そして、全ての細胞を、標準的な組織培養プラスチックウェアを用いて増殖させ、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃にてインキュベートした。Ｖｉ−ＣｅｌｌＴＭ分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて細胞の計数を行った。
【０１６７】
バイオリアクタの条件およびγ（ガンマ）−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）アッセイ：膜を、平底型のバイオリアクタ内に組み立てた。細胞を播種した膜は、約３０ｃｍ２の面積を有する。バイオリアクタを、バイオリアクタの入口を通して培地を注入することによって調整し、そして、培地で満たしたバイオリアクタを、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃にて６０分間インキュベートした。その後、培地を捨てた。細胞をトリプシン処理し、そして、バイオリアクタ内に細胞懸濁物を注入し、確実に気泡が存在しないようにすることにより、１×１０７個のＨＫ−２細胞を膜上に播種した。次いで、細胞を播種したバイオリアクタを、細胞の付着を可能にする静置条件下で、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃にて５時間インキュベートした。ＨＰＴＣの場合には、４×１０６個の細胞を播種した。底のチャンバを、１０ｍｌの培地で満たした。ＨＰＴＣを、細胞を付着させるために、４時間または一晩（ＧＧＴアッセイについて）インキュベートした。細胞の付着の後、バイオリアクタを、０．５ｍｌ／分または８０μｌ／分（ＧＧＴアッセイについて）の中程度の（ｍｅｄｉｕｍ）流速での灌流のために、ポンプに接続した。ＧＧＴアッセイについては、第二のバイオリアクタにＮＩＨ／３Ｔ３細胞を播種し、そして、平行して実験を行った。
【０１６８】
ＧＧＴ活性をアッセイするために、バイオリアクタを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した２０ｍＭのグリシル−グリシンおよび１ｍＭのＬ−ガンマ−グルタミル−（ｐ−ニトロアニリド）を補充した、フェノールレッドを含まない細胞培養培地で灌流した。バイオリアクタを、調整のためにこの培地で４時間灌流し、そして、続く１時間の間に回収した培地を用いてアッセイを行った。４−ニトロアニリドの濃度を、４０５ｎｍにてマイクロプレートリーダーにより決定した。
【０１６９】
免疫染色：免疫染色のために、細胞を含む膜を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そして、室温にて１０分間、３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定した。密着結合タンパク質である閉鎖帯（ｚｏｎｕｌａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ）（ＺＯ）−１およびα（アルファ）−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の間接的免疫染色を行った。細胞の核を、４’，６’−ジアミジノ−２’−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。各場合における免疫染色結果の評価のために、３つの複製物（ｒｅｐｌｉｃａ）を全体的に目で観察し、そして、各サンプルの異なる領域から複数の像を撮った。実験の大部分は、少なくとも１回繰り返し、そして、異なるバッチのＨＰＴＣを使用した。
【０１７０】
ＥＣＭコーティングならびにＤＯＰＡおよびＩＶ型コラーゲンを用いた二重コーティング：マウスＩ型コラーゲン（７５０μｇ／ｍｌ；Ａｌｌｅｒｇａｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ヒト胎盤ＩＶ型コラーゲン（１５０μｇ／ｍｌ，Ｍｅｒｃｋ）、またはラミニンと混合したヒト胎盤ＩＶ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１５０μｇ／ｍｌのＩＶ型コラーゲンと混合した１００μｇ／ｍｌのラミニン）を使用した。膜を、Ｈ．Ｚｈａｎｇら、”Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｏａｔｉｎｇｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｉｎ  ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｋｉｄｎｅｙｓ”，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００９，３０（１５），２８９９−２９１１（本明細書中に参考として援用される）に記載される手法に従って、ＥＣＭ成分でコーティングした。簡単に述べると、ＥＣＭ成分を、細胞培養培地を用いてその最終濃度まで希釈した。コーティング溶液を膜に加え、例えば、層流式フード（ｌａｍｉｎａｒ  ｆｌｏｗ  ｈｏｏｄ）内で一晩乾燥させた。この方法は、未処理の膜または表１に記載される手法に従ってＤＯＰＡでコーティングされた膜に適用した。
【０１７１】
異なる基材上に吸着されたフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合体化ＩＶ型コラーゲンの量の定量：この実験は、ＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と結合体化させたヒト胎盤ＩＶ型コラーゲンを用いて行った。簡単に述べると、未処理およびＤＯＰＡコーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ膜上に吸着されたＩＶ型コラーゲンの量を定量するために、ＦＩＴＣ標識したＩＶ型コラーゲンを使用した。１５０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ＩＶ型コラーゲン（ヒト胎盤、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、３７℃にて１時間、９６ウェル組織培養プレート（Ｎｕｎｃ）内の未処理およびＤＯＰＡコーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ膜上に吸着させた。ＴＣＰＳがコントロールとしての役目を果たした。緩く結合したタンパク質を解離させ、再結合を防ぐために、それぞれ、４８５ｎｍの励起波長および５３０ｎｍの発光波長でのマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  ＳａｆｉｒｅＴＭ，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）における蛍光の読み取りの前に、基材をＰＢＳで３回洗浄した。３つの複製物を評価した。既知量のＦＩＴＣ標識ＩＶ型コラーゲンを使用して標準曲線を作成した。
【０１７２】
ＰＥＳ／ＰＶＰ膜に対する細胞の付着：ＴＢＯアッセイを用いて、ＨＫ−２細胞の膜への付着を決定した。簡単に述べると、未処理および表面処理したＰＥＳ／ＰＶＰ膜を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル内にフィットするように切断した。ＨＫ−２細胞を、膜の上に、６×１０４細胞／サンプルの密度で播種した。細胞を１時間付着させ、そして、接着していない細胞をサンプルから濯ぎ落とした。接着した細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、４％パラホルムアルデヒド中０．５％のＴＢＯで染色した。染色を１％ドデシル硫酸ナトリウムで可溶化し、そして、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  ＳａｆｉｒｅＴＭ，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、６３０ｎｍにて吸光度を測定した。
【０１７３】
製造業者によって提供される説明書に従い、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシ−メトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ  テトラゾリウム分子内塩（ＭＴＳ）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を実施した。簡単に述べると、各時点で、１９：１の容量比でＭＴＳ試薬を含む完全培地中で細胞をインキュベートした。１時間のインキュベーションの後、光学密度（ＯＤ）を４９０ｎｍにて測定した。示される結果は、ブランクウェルで得られた値を引いた後の吸光度の測定値を示す。
【０１７４】
画像化：Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ−ＤＳＵ（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）蛍光顕微鏡を使用して、落射蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）画像化を行った。細胞の走査型電子顕微鏡法のために、まず、サンプルをＰＢＳ中２．５％グルタルアルデヒドにおいて固定し、続いて、エタノール系列（３０％、７０％、８０％、９０％、９５％、３×１００％、各３０分）で脱水した。その後、これらのサンプルを、Ａｕｔｏｓａｍｄｒｉ  ８２５臨界点乾燥機（Ｔｏｕｓｉｍｉｓ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）内で乾燥させた。最後に、サンプルを、金でスパッタリングし、そして、ＪＳＭ−７４００Ｆ電界放出形走査電子顕微鏡（ＪＥＯＬ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてＳＥＭを行った。膜のＳＥＭは、サンプルを一晩凍結乾燥させ、白金を用いたスパッタコーティングの後に、同じ顕微鏡を用いて行った。
【０１７５】
統計学：全ての統計的分析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を用いて行った。有意レベルの判定には、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を用いた。
【０１７６】
ポリマー膜上でのＨＰＴＣの性能：第一のシリーズの実験において、ＨＰＴＣの性能は、種々のポリマー膜上で検討した。細胞の性能は、特定の物質が長期の用途により適切であり得るかどうかを確認するために、３週間の期間にわたり検討した。検討した膜の材料には、現在、血液透析または血液濾過に広く使用されており、ＢＡＫにおいて応用されているＰＳＦ／ＰＶＰを含めた。加えて、ＰＥＳ／ＰＶＰおよび再生セルロース（ＲＣ）の膜（これらもまた血液透析または血液濾過に使用されている）もまた研究した。さらに、ポリ（エーテルイミド）−ＦＣ（ＰＥＩ−ＦＣ）の膜もまた検討した。ポリ（エーテルイミド）ベースの膜は、バイオハイブリッド型（ｂｉｏｈｙｂｒｉｄ）臓器の構築によく適しているようであった。ポジティブコントロールとして、ＰＥＴ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜を用い、この膜は、共培養系でのインビトロ細胞培養において、そしてまた、腎細胞と共に頻繁に使用されている。ＰＥＴ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜は、生体適合性を高めるために、酸素プラズマで処理した。検討した他の膜は全て、いかなる表面処理にも供さなかった。
【０１７７】
ＨＰＴＣを、示した材料から構成される異なるポリマー膜上で３週間にわたり培養した（播種密度：１×１０５細胞／ｃｍ２）。全ての材料は、別のポジティブコントロールとして用いた組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）を除いてコーティングされておらず、ＴＣＰＳはＩＶ型コラーゲンでコーティングした。ＺＯ−１およびα（アルファ）−ＳＭＡを、免疫染色（ＤＡＰＩ）により検出した。かなりの量のα（アルファ）−ＳＭＡを発現する筋線維芽細胞が、ＰＥＴ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜上に検出された。各場合において、３つの複製物を評価した。各サンプルから、異なる領域から複数の像を記録した。代表的な像を図２に示す。スケールバーは５０μｍである。
【０１７８】
３週間の培養期間の後、ＰＳＦ／ＰＶＰ膜、ＰＥＳ／ＰＶＰ膜、ＲＣ膜およびＰＥＩ−ＦＣ膜上にはほんのわずかな細胞しか存在しなかった（図２Ａ〜２Ｄ）。これに対し、ポジティブコントロールであるＰＥＴ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜上では、かなりの数の細胞と、単層の形成が認められた（図２Ｅ）。しかしながら、ＺＯ−１免疫染色パターンによって示されるように（密着結合成分であるＺＯ−１は、上皮分化のマーカーであり、そして、亀甲金網様のＺＯ−１免疫染色パターンは、適切な密着結合の形成を反映している）、上皮の分化は不十分であった。また、ＰＥＴ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜上には、かなりの数のα（アルファ）−ＳＭＡ発現筋線維芽細胞が存在した（図２Ｅ；α（アルファ）−ＳＭＡ発現筋線維芽細胞は、上皮から間葉系への移行のプロセスによって、インビトロ培養においてＨＰＴＣ内に生じるようである）。
【０１７９】
これに対し、別のポジティブコントロールとしての役割を果たした、ＩＶ型コラーゲンコーティングした組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）上では、ＨＰＴＣは、分化した上皮を形成した（図２Ｆ）。これらの上皮は、亀甲金網様のＺＯ−１免疫染色パターンによって示されるように、広範囲にわたる密着結合の形成を示した。亀甲金網様のＺＯ−１免疫染色パターンを示すＨＰＴＣ上皮は、分極しており、そして、先端の刷子縁を露呈した。これらの特徴は、ＢＡＫにおける適切な細胞の性能に重要であり得る。ＴＣＰＳを、生体適合性を改善するために酸素プラズマで処理し、そして、ＨＰＴＣの分化した上皮は、ＩＶ型コラーゲンコーティングしたＴＣＰＳ上で約２〜３週間の期間にわたり維持され得る。
【０１８０】
ＥＣＭコーティングした膜上でのＨＰＴＣの性能：上に略述した知見は、ＨＰＴＣの性能が、検討された従来のポリマー膜材料上では十分ではなかったらしいことを示した。この結果はまた、表面処理と、適切な細胞外マトリクス（ＥＣＭ）コーティングが、ＨＰＴＣの性能を改善し得ることを示唆した。ＥＣＭコーティングが、血液透析または血液濾過のために使用される膜材料上でのＨＰＴＣの性能を十分に改善し得るかどうかを調べるため、未処理またはＥＣＭコーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ膜上での細胞の増殖を分析した。Ｉ型コラーゲンおよびＩＶ型コラーゲンをコーティング材料として使用した。なぜなら、ヒト腎近位尿細管細胞の最も高い増殖速度が、以前にこれらのＥＣＭコーティング上で観察されたからである。特に、ＨＰＴＣの分化および分化したＨＰＴＣ上皮の維持の点では、ＩＶ型コラーゲンコーティングで、良好な結果が得られた。さらに、ＩＶ型コラーゲンとラミニンの混合物（これらはともに、基底板の成分である）を検討した。ＦＩＴＣ標識ＩＶ型コラーゲンを用いたコントロール実験は、ＰＥＳ／ＰＶＰ膜に対するこのコーティング材料の吸着が、少なくとも、ＴＣＰＳと同程度に良好であったことを示した（図３）。細胞増殖実験についてのコントロールとして、コーティングなしおよびＥＣＭコーティングしたＰＥＴ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜（この上では、ＨＰＴＣは十分に増殖した）を使用した（図２Ｅ）。
【０１８１】
図３は、異なる基材上でのＦＩＴＣ結合体化ＩＶ型コラーゲンの吸着を示す。バー（平均±ＳＤ、ｎ＝３）は、ＴＣＰＳ、そして、未処理またはＤＯＰＡコーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ膜の表面に吸着されたＦＩＴＣ結合体化ＩＶ型コラーゲンの量を示す。有意差は、アスタリスクによって示す（*：ｐ＜０．０５、***：ｐ＜０．００１）。
【０１８２】
１×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種したＨＰＴＣを、ＰＥＳ／ＰＶＰまたはＰＥＴ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜上で４週間まで培養した。これらの膜は、コーティングしないか、または、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、もしくは、ＩＶ型コラーゲンとラミニンの混合物でコーティングした。平行に培養したサンプルの対応するサブセットを用いて細胞を計数することにより、細胞数を毎週決定した。各群の
４つの白色およびグレーのバーは（図４）、それぞれ、１週、２週、３週および４週（左から右、平均±標準偏差（ＳＤ）、ｎ＝３）における、ＰＥＳ／ＰＶＰおよびＰＥＴ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜上での細胞数を示した。
【０１８３】
これらの結果は、ＨＰＴＣの性能が、ＥＣＭコーティングよりもかなり多く、下にある（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ）膜の材料によって影響されたことを示した。ＨＰＴＣは、ＰＥＴ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜上で首尾よく増殖し、そして、これは、コーティングなしの膜にもコーティングした膜にも当てはまったが、増殖速度に対して、異なるＥＣＭコーティングによるいくらかの影響が観察された（図４）。これに対し、細胞数は常に、コーティングなしおよびコーティングした膜の両方について、ＰＥＳ／ＰＶＰ膜において非常に低いままであった（図４）。繰り返しになるが、ＥＣＭコーティングによるいくらかの影響が観察され、そして、インキュベーション期間の後半では、細胞数は、コーティングなしの膜と比して、ＥＣＭコーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ膜上でより高かった。それにもかかわらず、細胞数は、全ての場合において非常に低いままであり、ＥＣＭコーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ膜で得られた結果は、上で論じた用途には不十分であった。同じことを、ＩＶ型コラーゲンまたは他のＥＣＭコーティングでコーティングしたＰＳＦ／ＰＶＰ膜に当てはめた（データ示さず）。さらに、ＥＣＭコーティングしたＰＥＴ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）膜の免疫染色および視覚による検査は、この場合、ＥＣＭコーティングが、細胞の分化を適切には改善できなかったことを明らかにした（データ示さず）。このように、総合すると、これらの結果は、膜の材料が、ＥＣＭコーティングを適用した後でさえも、ＨＰＴＣの性能に対して重大な影響を有することを示す。非ＨＰＴＣ適合性膜は、適切なＥＣＭコーティングを適用することによっては、有意に改善できなかった。
【０１８４】
ＰＥＳ／ＰＶＰ膜の親水性に対する表面処理の効果：ＨＰＴＣは、ＢＡＫにおける用途について関心があるＰＥＳ／ＰＶＰおよびＰＳＦ／ＰＶＰを含む種々の従来のポリマー膜材料上では上手く作動せず、そして、ＥＣＭコーティングを適用することによっても十分な改善が容易には達成できなかったので、従来の膜材料の種々の表面改変について検討した。まず、表面改変の効果を調べた。最初のシリーズの実験では、水接触角を測定して、ＰＥＳ／ＰＶＰ膜の親水性に対する種々の表面処理の効果を決定した。ＨＰＴＣは、親水性のガラスまたはＴＣＰＳ表面上で上手く増殖および分化し、表面の親水性を増すことが、ＨＰＴＣの性能を改善する助けとなり得ることが示唆された。
【０１８５】
種々の処理および成分（表１を参照）は、以下の理由から選択した。ポリ（無水マレイン酸−ａｌｔ−１−オクタデセン）（ＰＡ−１８）は、両親媒性コポリマーである。水性環境におけるこのコポリマーでの疎水性表面のコーティングは、両親媒性分子の規則正しい配置をもたらし、結果として、その親水性部分が露出され、すなわち、表面がより親水性となり得る。ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）は、正に荷電しており、しばしば、基材表面への細胞の接着を改善するために使用される。過酸化水素は、強力な酸化剤であり、親水性官能基を導入する。酸素プラズマ処理は、膜表面にカルボン酸基およびヒドロキシル基を導入することが知られ、そして、しばしば、ポリマー性基材の細胞適合性（ｃｙｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）を改善するために使用される。３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＯＰＡ）は、湿った表面への強力な接着のためにイガイによって分泌される化合物である。これは、異なる基材上で薄い接着剤ポリマーフィルムを形成し得る。
【０１８６】
図５は、ＰＥＳ／ＰＶＰ膜に種々の処理を適用した後に測定した水接触角を示す。未処理のＰＥＳ／ＰＶＰの水接触角は６２．５°±１．１°であったが、ＴＣＰＳ（細胞培養のための「ゴールドスタンダード（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）」）の水接触角は約４５°であった。ＰＥＳ／ＰＶＰ膜の水接触角は、種々の表面処理を適用することによって体系的に変更され得る（図５）。ＰＡ−１８処理したＰＥＳ／ＰＶＰは、未処理のＰＥＳ／ＰＶＰよりもなお疎水性であった（７５．４°±４．８°の水接触角）。ＰＡ−１８とは対照的に、他の表面処理は、未処理のＰＥＳ／ＰＶＰと比較して、より親水性の膜表面を生じた。ＰＬＬ処理は、水接触角を約５０°まで幾分減少させた。過酸化水素および酸素プラズマ処理は、接触角の約４０°までのさらなる減少をもたらした。表面の親水性における最大の変化は、ＤＯＰＡ処理によって誘導され、この処理は、接触角を１５°まで減少させた。図５では、バーは、未処理または処理済みのＰＥＳ／ＰＶＰ膜上の水滴の接触角を示す（ｎ＝４、平均±ＳＤ）。
【０１８７】
表面電荷およびカルボン酸基の密度に対する種々の処理の効果：次のシリーズの実験では、未処理のＰＥＳ／ＰＶＰ膜のゼータ電位、ならびに、表面電荷に対する種々の処理の効果を特徴付けた。未処理のＰＥＳ／ＰＶＰ膜は、わずかに負の表面電荷を有する（図６）。この図は、ＰＥＳ／ＰＶＰ膜のゼータ電位を示す。バーは、未処理または処理済のＰＥＳ／ＰＶＰ膜のゼータ電位（平均±ＳＤ；ｎ＝３）を示す。予測されたとおり、正に荷電したＰＬＬでの処理は、約＋４ｍＶの正のゼータ電位を生じた。これに対し、酸素プラズマ処理およびＤＯＰＡ処理したＰＥＳ／ＰＶＰ膜は、約−６〜−７ｍＶのより負のゼータ電位を示し（図６）、カルボン酸基のような負に荷電した官能基の導入が示唆された。したがって、ＴＢＯ色素アッセイを用いて、未処理および処理済のＰＥＳ／ＰＶＰ膜の表面上でのカルボン酸基の密度を調べた。
【０１８８】
図７は、ＰＥＳ／ＰＶＰ膜の表面上へのカルボン酸基の導入を示す。図７Ａは、ＴＢＯアッセイを用いて決定した、ＰＥＳ／ＰＶＰ膜の表面上のカルボン酸基の量を示す。バーは、６３３ｎｍにおける吸光度を示す（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。図７Ｂおよび７Ｃは、未処理（図７Ｂ）および酸素プラズマ処理（図７Ｃ）したＰＥＳ／ＰＶＰ膜の高解像度ＸＰＳスペクトルを示す。
【０１８９】
このように、図７Ａは、酸素プラズマ処理が最も高い密度の官能基を導入したことを示し、この官能基は、ＸＰＳ分光法によりカルボン酸基であることが確認された（図７Ｂおよび７Ｃ）。高解像度ＸＰＳ  Ｃ１ｓスペクトルは、酸素プラズマ処理したＰＥＳ／ＰＶＰ上のカルボキシル基およびカルボニル基の存在を示したが（図７Ｃ）、これは、未処理のサンプル上では検出されなかった（図７Ｂ）。ＴＢＯ色素アッセイは、高い密度の官能基がまた、ＤＯＰＡ処理によって導入されたことを明らかにした（図７Ａ）。このことは、含まれるＤＯＰＡ分子と結合したカルボン酸基に起因するものと考えられ得る。予測されたとおり、ＰＬＬコーティングおよび過酸化水素処理は、官能基の表面密度に有意な変化をもたらさなかった。
【０１９０】
ヒト近位尿細管細胞の付着：次に、異なる処理と、表面特性における変化、そして、それらがどのようにヒト近位尿細管細胞の付着に影響したかを検討した。アッセイは、ＨＫ−２細胞（ヒト近位尿細管細胞株）を用いて実施し、そして、膜に対する細胞の付着は、ＴＢＯアッセイを用いることにより定量した。図８に示されるように、ＤＯＰＡ処理で良好な結果が得られ、そして、細胞の付着は、未処理のＰＥＳ／ＰＶＰ膜およびＰＬＬ、過酸化水素または酸素プラズマで処理した膜と比較して、有意に増強された。図８では、細胞の接着は、細胞の播種から１時間後に、ＴＢＯアッセイを用いて決定した（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。アスタリスクは有意差を示す（***：ｐ＜０．００１、*：ｐ＜０．０５）。
【０１９１】
これらの結果はまた、ＤＯＰＡおよび酸素プラズマ処理の両方が、正味の負表面電荷につながり（図６）、そして、カルボン酸基の密度を増加させた（図７）が、ＤＯＰＡ処理したＰＥＳ／ＰＶＰ膜に対する細胞の付着は、酸素プラズマ処理した膜と比較して有意に増強された（図８）ことを示した。このことは、ＤＯＰＡ処理した表面に対する細胞の付着の高い程度が、ＤＯＰＡ分子中に存在するアミノ基のような他の官能基の導入に起因するものであったことを示唆した。細胞の付着の点での良好な結果がＤＯＰＡコーティングした膜で得られたが、より長い期間での腎細胞の性能に対するＤＯＰＡコーティングの効果は不確かであったので、この局面を、さらに、以下の実験で調べた。
【０１９２】
ＤＯＰＡ処理膜上での近位尿細管細胞の増殖および分化：まず、ＨＫ−２細胞の増殖および分化を検討した。図９Ｂは、１週間のインビトロ培養後に、これらの細胞がＤＯＰＡコーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ膜上でコンフルエントな分化した上皮を形成したことを示す。これに対し、未処理のＰＥＳ／ＰＶＰ膜上ではほんのわずかな単細胞しか見出すことができなかった（図９Ａ）。
【０１９３】
具体的には、ＨＫ−２細胞を、未処理（図９Ａ）またはＤＯＰＡコーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ膜（図９Ｂ）上に播種し（１×１０５細胞／ｃｍ２）、そして、１週間のインビトロ培養後にこれらの膜を画像化した。ＺＯ−１は、免疫染色により検出した。各場合において、３つの複製物を評価した。各サンプルから複数の像を撮った。代表的な像を示す。スケールバーは５０μｍである。
【０１９４】
それにも関わらず、ＨＫ−２細胞は、常にＨＰＴＣと同等に機能的というわけではなく、これは、臨床上の大きな問題である。それゆえ、ＨＰＴＣの増殖および分化も特徴付けた。まず、１週間の培養期間の増殖を検討した。図１０Ｃは、未処理のＰＥＳ／ＰＶＰ膜上では、ＨＰＴＣの数が、播種後の最初の２日間でかなり低下し、そして、培養期間の残りでは、絶えず少ないままであったことを示す。これに対し、ＤＯＰＡコーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ膜上では、播種後の最初の２日間で細胞数がわずかに減少した後、培養期間の残りでは、急激な増殖が観察された。これらのデータは、視覚的な印象（図１０Ａおよび１０Ｂ）、そして、上で考察した最初の知見（図２）と一致していた。目での観察もまた、未処理の膜上で多くの死細胞および傷ついた細胞を明らかにし、ここで観察された少ない細胞数が、弱い細胞の付着のみに起因するものではなかったことが示唆された。
【０１９５】
図１０Ａおよび１０Ｂは、未処理（図１０Ａ）およびＤＯＰＡコーティングした（図１０Ｂ）ＰＥＳ／ＰＶＰ膜上での１週間のインビトロ培養（５×１０４細胞／ｃｍ２の播種密度）後に記録した、ＨＰＴＣのＤＡＰＩ染色した核の顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍである。図１０Ｃでは、未処理またはＤＯＰＡコーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ膜上に細胞を播種してから０日後、２日後、５日後および７日後に、ＨＰＴＣ数を計数した（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【０１９６】
ＤＯＰＡコーティングした膜およびＤＯＰＡ／ＩＶ型コラーゲンコーティングした膜上でのＨＰＴＣの性能：次に、ＨＰＴＣによる分化した上皮の形成を調べた。ＺＯ−１の免疫染色パターンは、ＨＫ−２細胞（図９）とは対照的に、ＨＰＴＣが、ＤＯＰＡコーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ膜上では、適切に分化した上皮を形成しなかった（データ示さず）ことを示した。また、これまでに、ＨＰＴＣは、ＥＣＭコーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ上でも上手く作動しなかったことが分かった（図４）。しかしながら、ＨＰＴＣの増殖および単層の形成がＤＯＰＡコーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ上で改善され（図１０）、そして、細胞が適切な基材上で増殖した場合には、ＩＶ型コラーゲンが、ＨＰＴＣによる分化した上皮の形成を促進したという知見を考慮し、次に、ＨＰＴＣが、まずＤＯＰＡでコーティングし、続いてＩＶ型コラーゲンの層でコーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ膜上で分化した上皮を形成し得るかどうかを検討した。ＦＩＴＣ結合体化ＩＶ型コラーゲンを用いて行ったコントロール実験は、ＤＯＰＡコーティングが、未処理のＰＥＳ／ＰＶＰおよびＴＣＰＳ（図３）と比較して、吸着されたＩＶ型コラーゲンの量を有意に増大させたことを示した。
【０１９７】
その後、二重コーティングした膜上で１週間培養したＨＰＴＣによる分化した上皮の形成を検討した。未処理（図１１Ａ）、ＩＶ型コラーゲンコーティング（図１１Ｂ）およびＤＯＰＡおよびＩＶ型コラーゲンコーティング（図１１Ｃ）したＰＥＳ／ＰＶＰ膜上での１週間のインビトロ培養（５×１０４細胞／ｃｍ２の播種密度）後に、ＨＰＴＣを画像化した。図１１Ｄは、ＤＯＰＡおよびＩＶ型コラーゲンでコーティングしたＰＳＦ／ＰＶＰ膜（同じ播種密度および培養期間）で得られた結果を示す。ＺＯ−１は、免疫蛍光法（ＺＯ−１およびＤＡＰＩ）によって検出した。図１１Ｃの矢印は、密着結合の形成が生じたいくつかの領域を指し示す。しかしながら、細胞は、二重コーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ膜上での１週間の培養後もまだコンフルエントに足りず（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）、そして、広範囲にわたる密着結合の形成は示さなかった。これに対し、二重コーティングしたＰＳＦ／ＰＶＰ膜上での１週間の培養の後には、ＨＰＴＣはコンフルエントであり、広範囲にわたる密着結合の形成が生じた（図１１Ｄ）。図１１Ｄ内の差込図は、密着結合の形成が認められた、四角に囲まれた領域を拡大したものを示す。広範囲にわたる密着結合の形成が生じたが、密着結合は、図１１Ｄの全域では認められない。なぜなら、密集した膜表面は、完全には平らではなかったからである。それゆえ、異なる領域が、異なる焦点平面に存在していた。各場合において、３つの複製物を評価した。各サンプルから、異なる領域から複数の像を記録した。代表的な像を示す。スケールバーは５０μｍである。
【０１９８】
図１１Ｃは、ＤＯＰＡ／ＩＶ型コラーゲンコーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ膜上で、未処理またはＩＶ型コラーゲンコーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ膜（図１１Ａおよび１１Ｂ）と比較して、増大した細胞数および増強された密着結合の形成が観察されたことを示す。しかしながら、細胞を播種してから１週間後には、コンフルエントな上皮は形成されなかった。ＨＰＴＣの性能が、下にある膜の材料と表面のコーティングによって影響されたので、細胞の性能が、別の膜材料、すなわち、ＰＳＦ／ＰＶＰ（これは、すでにＢＡＫにおいて応用されている）を使用することによってさらに改善され得るかどうかについてもまた調べた。図１１Ｄは、ＨＰＴＣが、ＤＯＰＡ／ＩＶ型コラーゲンコーティングしたＰＳＦ／ＰＶＰ膜上で、播種から１週間後に、十分に分化したコンフルエントな上皮を形成したことを示す。これに対し、未処理またはＩＶ型コラーゲンコーティングしたＰＳＦ／ＰＶＰ膜（図２、およびデータ示さず）上では、ＨＰＴＣの性能は劣っていた。
【０１９９】
まとめると、これらの結果は、適切なＥＣＭ成分または近位尿細管細胞の挙動に影響を与える他の分子のいずれかを用いたＰＥＳ／ＰＶＰまたはＰＳＦ／ＰＶＰ膜の単独コーティングは、ＢＡＫにおける用途にとって十分にはＨＰＴＣの性能を改善しなかったことを示した。しかしながら、ＤＯＰＡおよびＩＶ型コラーゲンを用いたＰＳＦ／ＰＶＰ膜の二重コーティングは、ＢＡＫにおける用途にとって重要な、ＨＰＴＣによる分化した上皮の形成につながった。
【０２００】
純粋なＰＥＳおよびＰＳＦ膜上でのＨＰＴＣの性能：図１２では、ＨＰＴＣを、純粋なＰＳＦの膜上で１週間（図１２Ａ〜１２Ｃ）または３週間（図１２Ｄ）培養した（５×１０４細胞／ｃｍ２の播種密度）。ＺＯ−１を免疫染色（ＤＡＰＩ）により検出した。ＰＳＦ膜は、コーティングなし（図１２Ａおよび１２Ｄ）か、ＩＶ型コラーゲンでコーティングするか（図１２Ｂ）、または、ＤＯＰＡおよびＩＶ型コラーゲンで二重コーティングした（図１２Ｃ）。
【０２０１】
ＰＳＦまたはＰＥＳのいずれかをベースとした現在の合成血液透析膜は、代表的には、抗付着剤としてＰＶＰを含む。しかしながら、ＰＶＰは、腎細胞の付着、増殖および生存に対し、負の影響を有し得る。実際、細胞の増殖、生存および分化は、純粋なＰＥＳ（データ示さず）およびＰＳＦ膜（ＰＶＰを含有する膜と比較して；図２および１２Ｄ）上で、これらの純粋な膜がコーティングなしの場合でさえも、大いに改善された。ＨＰＴＣの増殖および生存は、ＩＶ型コラーゲンの単独コーティングまたはＤＯＰＡとＩＶ型コラーゲンの二重コーティングによってさらに改善され得る（図１２Ａ〜１２Ｃ）。コーティングなしの純粋なＰＳＦまたはＰＥＳ膜上での細胞の増殖は比較的遅く、そして、分化した上皮の形成は、約２〜３週間の培養期間の後にのみ観察され得る（図１２）。
【０２０２】
これらの実験は、未処理、または、異なる表面処理およびコーティングの手法に供されたかのいずれかのポリマー膜上での、ヒト腎近位尿細管細胞の性能を検討した。ＨＰＴＣは、ＲＣ、ＰＳＦ／ＰＶＰおよびＰＥＳ／ＰＶＰ膜を含む大部分の未処理の膜の上では、分化した上皮を形成しないことがわかった。これらの材料の膜は、血液透析または血液濾過に使用されており、そして、ＰＳＦ／ＰＶＰ膜はまた、ＥＣＭコーティングの後に、ＢＡＫにおいて適用されている。本明細書において検討し、ＤＯＰＡまたはＥＣＭによる単独コーティングを持つ表面処理は全て、これらの膜上でのＨＰＴＣの性能を十分には改善しなかった。これらの知見は、ＥＣＭコーティングしたＰＳＦ／ＰＶＰ膜が、少なくともＨＰＴＣを用いる場合に、ＢＡＫのバイオリアクタユニットにおける用途に適切でない場合があることを示唆した。また、ＨＰＴＣとは対照的に、ヒトの不死化された近位尿細管細胞株であるＨＫ−２は、ＤＯＰＡコーティングしたＰＥＳ／ＰＶＰ膜上で分化した上皮を形成することがわかった。このことは再度、ＨＰＴＣと確立された細胞株の異なる挙動を強調した。
【０２０３】
また、単独コーティングを使用した場合、細胞の挙動はしばしば、用いられる膜の材料と、適用されるコーティングの組み合わせによって影響を受けることも分かった。このことは、単独コーティングが依然として膜の材料と細胞表面との間にいくらかの相互作用を可能にしており、そのことが、細胞の挙動を損ね得るということに起因し得る。膜表面との異なる型の相互作用を示す異なるコーティング材料を用いた二重コーティングは、膜表面の細胞に対する接近可能性を低下させ得、そして、このことが、何故、ＤＯＰＡとＩＶ型コラーゲンによる二重コーティングがＰＥＳ／ＰＶＰおよびＰＳＦ／ＰＶＰ膜上でのＨＰＴＣの性能を顕著に改善したかを説明し得る。ＨＰＴＣは純粋なＰＳＦまたはＰＥＳ膜上で分化した上皮を形成したが、上皮の形成は比較的ゆっくりであったので、ＰＶＰは、これらの膜において重要な成分であることが分かった。
【０２０４】
データは、親水性が重要な膜の特徴であり得ることを示唆する。ＨＰＴＣは、親水性のＴＣＰＳおよびガラスの表面上で分化した上皮を形成した。このことはまた、ＰＳＦおよびＰＥＳ膜上でも生じたが、上皮の形成は、これらの疎水性表面上ではかなり遅く、よりゆっくりとした細胞の増殖が示唆された。検討した全ての処理のうち、ＤＯＰＡコーティングは、最も顕著な親水性の増大をもたらしたことに注意すべきである。正に荷電した表面は、ＨＰＴＣの接着は促進し得るが、分化した上皮の形成は促進しない。このことは、ＨＰＴＣが、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングされたＴＣＰＳ上で分化した上皮を形成しなかったという事実によって示唆された。すなわち、親水性でかつ負に荷電した表面がより適切であり得る。
【０２０５】
これらの結果はまた、カルボン酸基も、生物学的な細胞接着分子またはシグナル伝達分子も重要ではなかったことを示唆した。また、ＨＰＴＣを用いた用途のために設計される表面は、良好な接着特性を有するべきであることに注意することも重要であった。実際、ＰＶＰによって引き起こされる問題は、ＰＳＦ膜に導入する際の、その抗接着作用に起因するようであった。細胞培養培地中のＰＶＰは、ＨＰＴＣの性能を損ねなかった。他の腎細胞型（例えば、ＭＤＣＫおよびＬＬＣ−ＰＫ１）は、ＰＶＰを含有する材料および他の接着性の低い材料においても十分に作動したことから、ＨＰＴＣは、基材の表面接着性に対して特に感受性であるようであった。
【０２０６】
まとめると、ＨＰＴＣのための基材表面、好都合には親水性で、負に荷電し、かつ接着性であるようである。これらの特性は、重要ではあるが、適切に分化したＨＰＴＣ上皮を生成するには十分ではないようである。このことは、単独ＤＯＰＡコーティングした膜がこれらの特性を示し、ＨＰＴＣの付着および増殖を維持するが、この細胞型による分化した上皮の形成は維持しないという事実によって示唆される。このように、本研究は、ＥＣＭコーティングが、接着、増殖および生存が損ねられない条件下で分化を促進するために適用され得ることを実証する。
【０２０７】
ＨＰＴＣのための膜材料が、良好な接着特性を有するべきであるという見解は、両方の表面が同じ材料から構成された膜はＢＡＫの用途に有用ではない場合があることを示唆するが、これは、血液に曝露される表面が抗接着性であるべきであるからである。非対称膜の概念は重要であり、そして、血液適合性の非接着性側面はまた、必要とされる機械的強度も提供し得る。
【０２０８】
これらの結果は、ＢＡＫにおいて使用される従来の材料が、今までのところ、ＨＰＴＣを用いた用途には十分には合っていないことを示す。血液透析膜は、血液適合性については最適化されたが、混成の初代細胞の増殖については最適化されなかった。分化した上皮は、純粋なＰＳＦまたはＰＥＳ膜（より長時間の間隔を要するが）およびＤＯＰＡとＥＣＭの二重コーティングを持つＰＳＦ／ＰＶＰ膜の上で、ＨＰＴＣによって首尾よく形成された。
【０２０９】
実施例２
これらの実験は、本明細書において考察される接着剤用いた膜のコーティングが、膜を通る水流に実質的に不利な影響を及ぼし得ないことを示す。図１３に示されるように、３０ｋＤａの分子量カットオフを持つＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製の市販のポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を用いて実験を行った。コーティングなし（左の棒）およびコーティングあり（右の棒）のＰＥＳ膜で得られた結果は、有意には異ならなかった（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、ｐ＞０．０５）。実験を繰り返し、コーティングした膜とコーティングなしの膜との間には一貫して差が認められなかった。
【０２１０】
コントロールとしてのコーティングなしのＶｉｖａｓｐｉｎＴＭカラムおよびＤＯＰＡおよびＩＶ型コラーゲンでコーティングしたＶｉｖａｓｐｉｎＴＭカラムを用いて、膜の透過性に対する潜在的な影響を決定するためのさらなる実験を行った。使用したＶｉｖａｓｐｉｎＴＭカラムは、３０，０００ｋＤａの分子量カットオフを持つＰＥＳ膜から構成された。ＶｉｖａｓｐｉｎＴＭカラムの一例を図１４Ａに示す。３ｍｇの尿素溶液をＶｉｖａｓｐｉｎＴＭの上側の区画に加えた。細胞培養培地を下側の区画に加えた。磁気撹拌子を使用して、上側の区画に力を生じさせた。この設定を一晩そのままにした。コーティングしたスピンカラムおよびコーティングなしのスピンカラムの両方について、ｉ−Ｓｔａｔ分析器を用いて、上側および下側の区画における尿素の量を測定した。それぞれの区画における尿素の割合は、以下のようにして計算した：
（区画内の尿素の量／３ｍｇの尿素）×１００。
【０２１１】
理論上、尿素の大部分は、下側の区画へと流れるはずである。表２に示されるように、最初に加えた尿素の９０％が、コーティングなしのカラムの下側の区画に見られた。これに対し、コーティングしたカラムの下側区画では、尿素の６８％が見られ、コーティングしたカラムについては、流れがやや遅い可能性があり得ることが示唆された。それにも関わらず、尿素の大部分は、コーティングしたカラムおよびコーティングなしのカラムの両方について下側区画で見られた。コーティングしたカラムの場合、尿素の２１％（すなわち、１００％−１１％−６８％）が、上側または下側のいずれの区画においても見られなかった。このことは、尿素の一部が膜に固着した可能性があることを示し得、これは特に、ＤＯＰＡが接着性の物質であるからである。
【０２１２】
【表２】
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【０２１３】
５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、２０μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｋを用いて、還元条件下、５５℃にて１時間消化した。１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）プロテアーゼインヒビターを用いて消化を停止させた。
【０２１４】
消化したＢＳＡを、ＶｉｖａｓｐｉｎＴＭカラムの上側区画に加え、そして、３０００ｇで３分間遠心分離した。上側区画（レーン３および４）または下側区画（レーン５および６）からの等量のタンパク質をゲル上にロードし、そして、ＮｕＰＡＧＥシステムを用いてタンパク質を分離した（図１４Ｂ）。ＶｉｖａｓｐｉｎＴＭカラムにアプライしなかった消化ＢＳＡを、コントロールとして用いた（レーン２）。事前に染色されたＰａｇｅｒｕｌｅｒマーカーをレーン１にロードした。実験は、コーティングしたカラム（レーン３および５）およびコーティングなしのカラム（レーン４および６）の両方を用いて行った。
【０２１５】
膜の分子量カットオフはおよそ３０ｋＤａであったので、３０ｋＤａより大きいサイズのタンパク質フラグメントは、大部分が上側の区画（レーン３および４）に限定されるはずであり、それに対して、より小さなフラグメントは膜を通過し得、そして、下側の区画で検出され得る。これらの結果は、より大きなタンパク質フラグメントの大部分が、上側の区画において検出され（レーン３および４の四角によって示される）、それに対して、下側の区画は、主として３５ｋＤａよりも小さなサイズのタンパク質を含む（レーン５および６の四角）ことを示す。
【０２１６】
これらの結果はまた、コーティングした膜とコーティングなしの膜との間（レーン３および４と、レーン５および６との間）には大きな差がないことを示唆し、二重コーティングが、膜の分子量カットオフに対して負の影響を有さないことを示している。
【０２１７】
本発明のいくつかの実施形態が本明細書において記載され、そして例示されてきたが、当業者は、本明細書に記載される機能を実施し、そして／または、結果および／もしくは１以上の利点を達成するための種々の他の手段および／または構造を容易に想像し、このような改変および／または修正の各々は、本発明の範囲内とみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書中に記載される全てのパラメータ、寸法、材料および構成が、例示的なものを意図し、実際のパラメータ、寸法、材料および／または構成は、本発明の教示が使用される特定の用途に依存することを容易に理解する。当業者は、慣用的に過ぎないな実験を使用して、本明細書中に記載される発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または、確認することが可能である。それゆえ、上述の実施形態は、一例としてのみ提示されること、そして、添付の特許請求の範囲およびそれに対する等価物の範囲内で、本発明は、具体的に記載および特許請求されるものとは別のやり方で実施され得ることが理解されるべきである。本発明は、本明細書中に記載される各個々の特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法に関する。さらに、このような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が互いに矛盾しない場合、２以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組合せは、本発明の範囲内に包含される。
【０２１８】
本明細書中で定義および使用される定義は全て、辞書の定義、参考として援用される文書における定義、および／または、定義される用語の通常の意味の上位で支配するものと理解されるべきである。
【０２１９】
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、そうでないと明確に示されない限り、「少なくとも１（つ、個）の」を意味するものと理解されるべきである。
【０２２０】
語句「および／または（および／もしくは、ならびに／あるいは）」は、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、このように等位接続された要素の「いずれかまたは両方」を意味する、すなわち、要素は、いくつかの場合には接続的に存在し、そして、他の場合には離接的に存在するものと理解されるべきである。「および／または（および／もしくは、ならびに／あるいは）」と共に列挙された複数の要素は、同じ様式で、すなわち、このように等位接続された要素のうちの「１またはそれより多く」と解釈されるべきである。他の要素が、必要に応じて、「および／または（および／もしくは、ならびに／あるいは）」節によって具体的に同定された要素以外に、これらの具体的に同定された要素と関連するにせよ、関連しないにせよ、存在し得る。すなわち、非限定的な例として、「Ａおよび／または（および／もしくは、ならびに／あるいは）Ｂ」に対する参照は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような開放型（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）の言語と組み合わせて使用される場合、ある実施形態では、Ａのみ（必要に応じてＢ以外の要素を含む）；別の実施形態では、Ｂのみ（必要に応じてＡ以外の要素を含む）；なお別の実施形態では、ＡとＢの両方（必要に応じて他の要素を含む）などを指し得る。
【０２２１】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、「または（もしくは、あるいは）」は、上で定義された「および／または（および／もしくは、ならびに／あるいは）」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内で項目を分ける際、「または（もしくは、あるいは）」または「および／または（および／もしくは、ならびに／あるいは）」は、包括的である、すなわち、多数の要素または要素のリストのうちの、少なくとも１つを包含するが、１より多くも、そして必要に応じて、リスト外の追加の項目も包含するものとして解釈されるものとする。「〜のうちの１つ（１個、一方）だけ」、または「〜のうちの厳密に１つ（１個、一方）」、または特許請求の範囲において使用される場合には、「〜からなる」のような、明確にそうでないと示される用語だけが、多数の要素または要素のリストのうちの厳密に１つの要素を包含することをいう。一般に、用語「または（もしくは、あるいは）」は、本明細書中で使用される場合、「いずれか」、「〜のうちの１つ（１個、一方）」、「〜のうちの１つ（１個、一方）だけ」または「〜のうちの厳密に１つ（１個、一方）」のような排他的な用語が先行する際には、排他的選択肢（すなわち、「一方または他方であるが両方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるものとする。「本質的に〜からなる」は、特許請求の範囲において使用される場合、特許法の分野において使用される通常の意味を有するものとする。
【０２２２】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、語句「少なくとも１（つ、個）の」は、１またはそれより多くの要素のリストに対する参照において、その要素のリスト内の任意の１またはそれより多くの要素から選択された少なくとも１つの要素を意味すると理解されるものとするが、必ずしも、要素のリスト内に具体的に列挙された各々全ての要素のうちの少なくとも１つを含まず、また、要素のリスト内の要素の任意の組合せも排除しない。この定義はまた、必要に応じて、語句「少なくとも１つ（１個、一方）の」が参照する要素のリスト内で具体的に同定された要素以外に、これらの具体的に同定された要素と関連するにせよ、関連しないにせよ、要素が存在し得ることを容認する。すなわち、非限定的な例として、「Ａおよび（ならびに）Ｂの少なくとも一方」（または、同意義で、「Ａまたは（もしくは、あるいは）Ｂの少なくとも一方」、または、同意義で、「Ａおよび／または（および／もしくは、ならびに／あるいは）Ｂの少なくとも一方」）は、一実施形態では、少なくとも１つの（必要に応じて１より多くを含む）Ａであり、Ｂは存在しない（そして、必要に応じてＢ以外の要素を含む）；別の実施形態では、少なくとも１つの（必要に応じて１より多くを含む）Ｂであり、Ａは存在しない（そして、必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）；なお別の実施形態では、少なくとも１つの（必要に応じて１より多くを含む）Ａと、少なくとも１つの（必要に応じて１より多くを含む）Ｂである（そして、必要に応じて他の要素を含む）；などを指し得る。
【０２２３】
また、そうでないと明確に示されない限り、本明細書において特許請求される１より多くの工程または行為を含むあらゆる方法において、その方法の工程または行為の順序は、必ずしも、その方法の工程または行為が記載される順序に限定されないものと理解されるべきである。
【０２２４】
特許請求の範囲において、ならびに、上記の明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む、伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「〜から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」などのような移行句は全て、開放型、すなわち、〜を含むがそれに限定されないことを意味するものと理解されるべきである。米国特許庁の特許審査便覧、第２１１１．０３節に示されるように、移行句「〜からなる」および「本質的に〜からなる」だけが、それぞれ、閉鎖型（ｃｌｏｓｅｄ）または半閉鎖型（ｓｅｍｉ−ｃｌｏｓｅｄ）の移行句であるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【外国語明細書】
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