(57)【要約】      （修正有）【課題】植物材料、とりわけイネ科植物材料を効率よく脱リグニンしうる新規菌株、ならびにそれらを用いた植物材料、とりわけイネ科植物材料の脱リグニン方法を提供する。【解決手段】木材腐朽菌またはその抽出物をイネ科植物材料と接触させることを特徴とする、イネ科植物材料の脱リグニン方法。イネ科植物はいずれのものであってもよく、特に限定はないが、イネ、タケ、ササ、オオムギ、コムギ、ライムギ、カラスムギ、ハトムギなどのムギ類、アワ、ヒエ、トウモロコシ、サトウキビ、カヤ、ヨシ、シバ、エノコログサ、ススキ、アシなどが例示されるが、とくに余剰植物資源としてのタケを有効利用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
木材腐朽菌またはその抽出物をイネ科植物材料と接触させることを特徴とする、イネ科植物材料の脱リグニン方法。
【請求項２】
イネ科植物がタケである請求項１記載の方法。
【請求項３】
木材腐朽菌が、Ｐｕｎｃｔｕｌａｒｉａ属の菌株である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
Ｐｕｎｃｔｕｌａｒｉａ属の菌株が、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−９７０として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領された菌株である請求項３記載の方法。
【請求項５】
木材腐朽菌が、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−９７１として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領された菌株である請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−９７０として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領された菌株。
【請求項７】
受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−９７１として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領された菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規リグニン分解菌、ならびにそれを用いた植物材料、特に、イネ科植物材料の脱リグニン方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、世界各地で余剰の植物資源の処理が問題となっている。例えば、間伐材、廃材、わらくず、作物の残りカス、放置されたタケ林などが大量に存在しており、それらを処理するために、バイオエタノールの製造などの様々な取り組みがなされている。
【０００３】
タケは日本では昔から建築材、楽器、食料、すだれなどの生活に密着した道具の材料として用いられてきた。しかし、１９６０年代以降、中国などの諸外国より安価なタケノコやタケ材が輸入されるようになり、国内産の需要は減少傾向をたどっている。その結果、全国においてタケ林が次第に利用されなくなり放置されたタケ林の拡大および荒廃が進んでいる（徳永・荒木、２００７）。そのため現在、このタケの有効利用法が求められている。
【０００４】
このような植物資源中には、様々な有用物質の生産の原料となる糖類が多く含まれている。木質中に含まれているリグノセルロースには、多糖類であるブドウ糖から構成されるセルロースとマンノース、アラビノースおよびガラクツロン酸などの六単糖およびキシロースなどの五単糖からなるヘミセルロースが含まれており、これらの低分子化合物は化学的・生物学的プロセスによりさまざまな有用物質の生産の原料として重要である。しかしながら、これらのセルロースは強靭なリグニンによって被覆されている。このリグニンは、分子量が５万以上あり、セルロースやヘミセルロースとともに高等植物の主成分である。草本類であるイネ科に属するタケにおいては、３種のモノリグノール（コニフェニリルアルコール、シナピルアルコール、ｐ−クマリルアルコール）が脱水素架橋重合したもので、三次元網目構造を持つことが知られている。したがって、例えばタケを原料としてバイオエタノールを製造する場合には、リグニンを除去してから、セルロース、ヘミセルロースを利用することが必要である。すなわち、脱リグニンは、植物資源からの有用物質生産の前段階として非常に重要な工程である。
【０００５】
リグニン除去には化学的処理・物理的処理などの方法がある。例えば、薬剤を用いて高湿度で脱リグニンをおこなう蒸解法、アルカリ性の薬剤（水酸化ナトリウムおよび亜硫酸水素カルシウム）を用いるクラフト法、酸性の薬剤（亜硫酸および亜硫酸水素カルシウム）を用いるサルフィト法、リグノセルロース原料を高温・高圧の水蒸気にさらし、圧力を急激に常圧に戻し植物組織を破壊させ、ヘミセルロースを加水分解によって低分子化させる爆砕法などが報告されている（非特許文献１参照）。
【０００６】
しかし、これらのプロセスには大量のエネルギーが必要であり高コストかつ薬品などによる環境負荷が高いため、近年では菌類による生物学的処理が注目されている。菌類の中でも、担子菌類に所属する木材腐朽菌は、木質を分解する生物として一般的に認識されており、これまでに、白色腐朽菌を用いたリグニン分解が検討されている（非特許文献１〜３参照）。これらの菌は一般にはセルロースやヘミセルロースをエネルギー源および生育源として利用し、この過程でリグニンを分解していると考えられている。そのため、これらの菌はリグニン分解と同時にセルロース類の資化をしている。これらの菌を用いて脱リグニンを行った原料をバイオエタノールの製造に使用すると、エタノールの収量が減少してしまう。セルロースやヘミセルロースよりもリグニンを優先的に除去する菌株を用いた脱リグニンについても研究されているが（非特許文献４および５参照）、タケを原料として脱リグニンを行った例はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】桑原正章  バイオマスエネルギー利用技術（2001）pp.147-157シーエムシー出版
【非特許文献２】Yu Fukasawa, Takashi Osono, Hiroshi TakedaDecomposition of Japanese beech wood by diverse fungi isolated from a cool temperate deciduous forest. Mycoscience (2005) 46:97-101.
【非特許文献３】Xiaoyu Zhang, Hongbo Yu, Huiyan Huang, Youxun LiuCollege of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, 430074 Wuhan, P.R. China, Evaluation of biological pretreatment with white rot fungi for the enzymatic hydrolysis of bamboo culms, International Biodeterioration & Biodegradation 60 （2007） 159-164.
【非特許文献４】Karin Fackler , Cornelia Gradinger , Barbara Hinterstoisser ,Kurt Messner, Manfred Schwanninger, Lignin degradation by white rot fungi on spruce wood shavings during short-time solid-state fermentations monitored by near infrared spectroscopy, Enzyme and Microbial Technology 39 （2006） 1476-1483.
【非特許文献５】Yasunori Ohashi, Yoshihiko Kan, Takahito Watanabe, Yoichi Honda, Takashi Watanabe, Redox silencing of the Fenton reaction system by an alkylitaconic acid, ceriporic acid B produced by a selective lignin-degrading fungus, Ceriporiopsis subvermispora, Organic & Biomolecular Chemistry 5（2007）840-847.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
植物材料中のリグニンに対してさらに高い選択的分解能を有する菌株を提供することが本発明の解決課題であった。特に、近年我が国で問題となっている余剰のタケの脱リグニンに有効な菌株を提供することも本発明の解決課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を重ね、植物材料、とりわけタケのリグリンに対して非常に高い選択的分解能を有する菌株を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は下記のものを提供する：
（１）木材腐朽菌またはその抽出物をイネ科植物材料と接触させることを特徴とする、イネ科植物材料の脱リグニン方法；
（２）イネ科植物がタケである（１）記載の方法；
（３）木材腐朽菌が、Ｐｕｎｃｔｕｌａｒｉａ属の菌株である（１）または（２）記載の方法；
（４）Ｐｕｎｃｔｕｌａｒｉａ属の菌株が、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−９７０として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領された菌株である（３）記載の方法；
（５）木材腐朽菌が、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−９７１として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領された菌株である（１）または（２）記載の方法；
（６）受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−９７０として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領された菌株；
（７）受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−９７１として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領された菌株。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、植物材料、特に、イネ科植物材料を効率よく脱リグニンしうる新規菌株、ならびにそれらを用いた植物材料、特に、イネ科植物の脱リグニン方法が提供される。本発明によれば、余剰植物資源、とりわけ、近年我が国で問題となっている余剰のタケの脱リグニンを効果的に行うことができ、バイエタノール等の有用物質の製造に資することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は２年堆積地の様子を示す。
【図２】図２はグァイアコール呈色反応の一例を示す。
【図３】図３はタケ粉末スラント培地を用いた脱色試験の結果を示す。上３本がＰｕｎｃｔｕｌａｒｉａ  ｓｐ．（ＴＵＦＣ２００８３）処理区、一番下は無処理区である。
【図４】図４は腐朽実験後のリグニン残存量を示す。一番上が無処理区、上から２番目がポジティブコントロール（Ｃ４）、下６つが供試菌のなかでリグニン含量が少なかった菌株での結果である。
【図５】図５は腐朽実験後のホロセルロース残存量を示す。一番上が無処理区、上から２番目がポジティブコントロール（Ｃ４）、下６つが供試菌のなかでホロセルロース含量が多かった菌株での結果である。
【図６】図６は腐朽実験後のリグニンおよびホロセルロースの相対値を示す。一番上が無処理区、上から２番目がポジティブコントロール（Ｃ４）、下６つは図４、図５に示した菌株と同じである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、１の態様において、木材腐朽菌またはその抽出物をイネ科植物材料と接触させることを特徴とする、イネ科植物材料の脱リグニン方法を提供する。本発明により脱リグニンされるイネ科植物はいずれのものであってもよく、特に限定はないが、イネ、タケ、ササ、オオムギ、コムギ、ライムギ、カラスムギ、ハトムギなどのムギ類、アワ、ヒエ、トウモロコシ、サトウキビ、カヤ、ヨシ、シバ、エノコログサ、ススキ、アシなどが例示される。このうち、タケについては放置されたタケ林などが大量に存在しており問題となっているので、本発明の方法を適用することにより余剰植物資源としてのタケを有効利用することができる。もちろん、他のイネ科植物であっても、タケと同様に本発明の方法にて脱リグニンすることができる。
【００１４】
イネ科植物材料は、生育しているイネ科植物体のみならず、収穫、伐採等により得られたイネ科植物体の部分であってもよい。
【００１５】
本発明の脱リグニン方法に使用できる菌類は木材腐朽菌であって、リグニン分解活性の高いものであればいずれの種類の菌であってもよい。このような木材腐朽菌の例としては、Ｃｏｐｒｉｎｅｌｌｕｓ属、Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ  属、Ｃｏｌｌｙｂｉａ属、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  属、Ｇｙｍｎｏｐｉｌｕｓ属、Ｌｙｃｏｐｅｒｄｏｎ属、Ｐｓａｔｈｙｒｅｌｌａ属、Ｐｕｎｃｔｕｌａｒｉａ属、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ属、Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ属、Ｐａｎｕｓ属、Ｔｒａｍｅｔｅｓ属、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ属、Ｐｈｏｌｉｏｔａ属、Ｋｕｅｈｎｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｔｅｒｅｕｍ属、Ｍｙｃｏｌｅｐｔｏｄｏｎｏｉｄｅｓ属、Ｐｏｌｙｐｏｒｅｌｌｕｓ属、Ｐｏｒｏｓｔｅｒｅｕｍ属、Ｈｅｒｉｃｉｕｍ属、Ｇｒｉｆｏｒａ属の菌株が挙げられるがこれらに限定されない。菌を自然界から得てもよく、保存機関のストック菌株を用いてもよい。本発明において好ましいのは白色木材腐朽菌である。白色木材腐朽菌の例としては、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属、Ｃｅｒｉｐｏｒａ属、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ属、Ｈｙｐｈｏｄｅｒｍａ属、Ｈｙｐｈｏｄｏｎｔｉａ属、Ｐｈｌｅｂｉａ属、Ｐｕｎｃｔｕｌａｒｉａ属、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ属、Ｔｒａｍｅｔｅｓ属、Ｐｈｌｅｂｉａ属、Ｐｈｌｅｂｉａ属、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ属、Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ属、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ属、Ｓｐｈａｅｒｏｂｏｌｕｓ属、Ｃｒｕｃｉｂｕｌｕｍ属、Ｃｙａｔｈｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｃｏｌｕｓ属、Ｐｈａｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｏｐｈｏｒａ属、Ｒｅｓｉｎｉｃｉｕｍ属の菌株が挙げられるがこれらに限定されない。白色木材腐朽菌のなかでも、Ｐｕｎｃｔｕｌａｒｉａ属の菌がより好ましく本発明に用いられる。特に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託され受領番号ＡＰ−９７０を付与されたＰｕｎｃｔｕｌａｒｉａ属の菌（ＴＵＦＣ２００５６）および独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託され受領番号ＡＰ−９７１を付与された白色木材腐朽菌（ＴＵＦＣ２００５７／図表中では２００８１０１０−（Ｂ）、２００８１０１０−Ｂとして記載）は本発明において非常に好ましい菌株であり、イネ科植物材料のリグニンに対して非常に高い選択的分解能を有し、セルロースやヘミセルロースをほとんど分解しないという特徴を有する。これらの菌株は、自然界から採取され、スクリーニングされたものである。なお、「ＴＵＦＣ」は鳥取大学附属菌類きのこ遺伝資源研究センターの保存株であることを表す。
【００１６】
リグニン分解活性は公知の方法にて測定することができる。リグニン分解酵素として、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、ラッカーゼおよび／またはポリフェノールオキシダーゼなどが知られており、これらの酵素活性を公知方法により測定することにより、菌のリグニン分解活性を調べることができる。
【００１７】
本発明の脱リグニン方法において、イネ科植物材料に木材腐朽菌の菌糸または胞子を接種することにより、脱リグニンを開始させることができる。その際に、イネ科植物材料を公知の手段・方法にて細断あるいは粉砕等して、チップ、ペレット、粉末などの形態にしたものに、木材腐朽菌の菌糸または胞子を接種することができる。接種する菌糸は、固体培地または液体培地にて数日〜数週間培養されたものであってもよい。固体培養は、例えば寒天平板培地で行ってもよく、液体培養は、フラスコ等において振盪しながら行ってもよい。培養の際に、脱リグニンすべきイネ科植物材料を培地に添加して（例えば、タケ粉を培地に混合して）、菌体の脱リグニン酵素活性を誘導してもよい。木材腐朽菌に使用する培地の種類や培養温度、ｐＨ、通気条件、培養時間などの培養条件は当業者が選択、決定することができる。さらに、イネ科植物材料に木材腐朽菌を接種してリグニン分解を行う際の諸条件、例えば、材料の形状（チップ、粉末など）、材料への菌の接種量、脱リグニン反応時の温度、時間、湿度、通気条件、材料の水分量などは、材料の種類、形状、サイズ、量、および木材腐朽菌の種類などの諸因子を考慮して、当業者が適宜選択、決定できるものである。例えば、タケチップを上記菌株（ＴＵＦＣ２００５６またはＴＵＦＣ２００５７）にて脱リグニンする場合には、約１５℃〜約３０℃で約１ヶ月〜約６ヶ月行ってもよい。実用的には、サイロのような施設内，もしくは大型のコンテナのような容器のなかで、タケチップと培養菌株を混合し、適宜攪拌しながら、好ましくは温度および湿度をコントロールしながら処理を行なってもよい。
【００１８】
また、本発明において、木材腐朽菌の抽出液をイネ科植物材料と接触させることにより脱リグニンを行ってもよい。例えば、木材腐朽菌を液体培養した場合には、培養液を濾過し、硫安やエタノールなどを用いて濃縮された抽出液を得てもよい。また、木材腐朽菌を固体培養した場合には、菌糸が生育した培養物を適当な抽出溶媒、例えば水、あるいは水とアルコール（メタノール、エタノールなど）またはグリセリンなどの混合物を用いて抽出してもよい。得られた抽出液を公知の方法にてさらに濃縮、精製してもよい。木材腐朽菌の抽出液を得る場合において、脱リグニンすべきイネ科植物材料を培地に添加して培養し、菌体の脱リグニン酵素活性を誘導しておいてもよい。
【００１９】
木材腐朽菌またはその抽出物をイネ科植物材料と「接触」させるとは、木材腐朽菌の菌糸またはその抽出液に由来するリグニン分解酵素がイネ科植物材料に直接的に接触して作用し、イネ科植物材料中のリグニンが分解されうる状況にすることをいう。例えば、チップ状にしたイネ科植物材料に木材腐朽菌の菌糸または胞子をまんべんなく接種して、十分にリグニンが分解されるまで、あるいは目安として材料が十分に白化するまで培養することにより、脱リグニンを行うことができる。菌糸または胞子の接種量、培養温度や培養時間などの培養条件は、イネ科植物材料の種類やサイズ、木材腐朽菌の種類などの諸条件に応じて、当業者が選択、決定することができる。
【００２０】
イネ科植物材料の脱リグニンの確認は、例えば、材料の白化を確認すること、材料中のリグニンを定量すること等によって行うことができる。材料の白化は肉眼で確認することができる。リグニンは、硫酸（クラーソン）法（木質科学実験マニュアル、日本木材学会編、文永堂出版、2000年、ISBN4-8300-4094-7）により定量することができる。これらの方法は当業者に公知である。
【００２１】
さらに本発明は、リグニンに対して高い選択性を有し、ヘミセルロース、セルロースなどのホロセルロースに対して低い選択性を有するリグニン分解菌であって、イネ科植物材料の脱リグニンに好適な木材腐朽菌を提供する。これらの菌株なかで好ましいものは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託され受領番号ＡＰ−９７０を付与されたＰｕｎｃｔｕｌａｒｉａ属の菌（ＴＵＦＣ２００５６）および独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託され受領番号ＡＰ−９７１を付与された白色木材腐朽菌（ＴＵＦＣ２００５７）である。これらの菌株を用いることにより、イネ科植物材料の脱リグニンを効率的に行うことができ、しかも、セルロース、ヘミセルロースなどのホロセルロース成分の分解が少ないので、バイオエタノールなどの有用物質の製造等に資することができる。
【００２２】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は単なる例示説明であり、本発明を限定するものと解釈してはならない。
【実施例１】
【００２３】
（サンプリングおよび分離）
０年、半年、２年間（０９年４月時点）堆積（Ｗ  ２ｍ×Ｄ  ２ｍ  ×Ｈ  ２０ｃｍ、図１）した腐朽段階の異なるＰｈｙｌｌｏｓｔａｃｈｙｓ  ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ（モウソウチク）のタケチップから担子菌類の子実体の発生が見られるものを中心にそれぞれ５サンプルずつ採取し、分離株の単離を行った。分離方法は、子実体が発生していたものは、マルトエキス寒天培地［ＭＡ培地、１．５％（ｗ／ｖ）麦芽エキス、１．５％（ｗ／ｖ）寒天］に多胞子分離により分離を行った。子実体の発生が見られないものは、材の腐朽部から組織分離［０．１％（ｖ／ｖ）のビオコートを含むＭＡ培地］を行い、その後ＭＡ培地に移植した。このようにして単離した菌株６３株を以下の実験に用いた。そして、鳥取大学附属菌類きのこ遺伝資源研究センター保有のタケを基質とする菌として分離された菌株４株、および行木（２００８）の検討でスギ材に対して高い選択的リグニン分解能を示した菌株１株を供試菌とした。ポジティブコントロールとしてＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｓｏｒｄｉｄａ  （ＴＭＩＣ３１２２７）、Ｐｈｌｅｂｉａ  ｓｐ．（Ｃ４）、Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（ＴＵＦＣ１０５３７）を用いた（表１）。以下に説明する一次スクリーニングに用いた供試菌は、ポジティブコントロールを含めて合計６８株であった。
【実施例２】
【００２４】
（一次スクリーニング（グァイアコール試験））
０．０２％（ｖ／ｖ）グァイアコールを含むＭＡ平板培地に植菌し、２４℃、暗所下で２週間培養後に菌糸の直径と変色部の長さを測定した。選抜基準は呈色領域半径１ｃｍ以上を示す菌株とした。一次スクリーニングを行った結果、６７菌株のうち４０菌株において酸化酵素活性の指標となるグァイアコールの呈色反応が認められた。グァイアコールの呈色反応の一例を図２に示す。そのうち呈色半径が１．０ｃｍ以上を優良菌株とし３６菌株を選抜した（表２、ポジティブコントロールとして用いたＰｈｌｅｂｉａ  ｓｐ．（Ｃ４）および２００５０７１０−０３を含む）。
【００２５】
【表１】
2012039904.tif 000002
【００２６】
【表２】
2012039904.tif 000003
【００２７】
一番活性が強いものはＴＵＦＣ２００７７で３．７ｃｍの値を示した。呈色反応が見られなかった菌株は２７株あった。選抜した３６菌株および、ポジティブコントロールである２００５０７１０−０３、Ｐｈｌｅｂｉａ  ｓｐ．（Ｃ４）、Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（ＴＵＦＣ１０５３７）、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｓｏｒｄｉｄａ（ＴＵＦＣ３１２２７）の４菌株を合わせた４０菌株を二次スクリーニングに用いた。
【実施例３】
【００２８】
（二次スクリーニング（脱色度試験））
タケに対する腐朽力を検定するために、タケ粉末培地［０．３％（ｗ／ｖ）麦芽溶液１４００ｍＬとタケ粉末１０００ｇを混合］を口径１８ｍｍの試験管に３分の１程度詰め、タケ粉末が斜面状になるように薬さじで成形した。その後、シリコン栓で蓋をしてオートクレーブ（１２１℃、１５分）で滅菌し、タケ粉末培地を作成した。タケ粉末スラント培地にグァイアコール呈色反応の見られた菌株を、ＭＡ培地にあらかじめ培養した各供試菌の菌糸体を接種し３ヶ月間の培養を行った。接種源にはＭＡ平板培地に生育させた菌糸体の先端付近を同心円状に孔径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、菌糸体ディスク２個をランダムに選んで用いた。１ヶ月ごとに目視で培地の脱色度を観察し、腐朽の観測を行った。３ヶ月培養後、強い脱色が確認された２６菌株を選抜した。目視評価はコントロールと比較して、（−）〜（＋＋＋＋）の５段階で評価した（表２）。
【００２９】
【表３】
2012039904.tif 000004
【実施例４】
【００３０】
（リグニン定量、ホロセルロース定量、および重量減少率の測定）
二次スクリーニングの結果、脱色度が一番高かったものはＰｕｎｃｔｕｌａｒｉａ  ｓｐ．であり（図３に結果を例示する）、処理前のタケ粉末培地と比較して、顕著な脱色を示した。二次スクリーニングで脱色度の高かった２６菌株について、リグニン定量、ホロセルロース定量、および重量減少率の測定を行った（表３に結果をまとめた）。
【００３１】
【表４】
2012039904.tif 000005
【００３２】
（重量減少率の測定）
培養ビンに２０ｍＬのＭＡ培地を入れ、供試菌を植菌し２週間培養後、あらかじめ秤量したタケ片（約１．２ｇ）をそれぞれ１つずつビンに入れ２１℃、暗所下で２ヶ月間培養した。２ヶ月後、タケのみを取り出して、タケに付着した菌糸を取り除き１０５℃で３日間乾燥させ、タケの重量減少率を測定した。重量減少率は次式のとおりである。
【化１】
2012039904.tif 000006
【００３３】
重量減少率は、菌株により低い（３．４％）もの（ＴＵＦＣ２００８３）から約２１％の菌株（ＴＵＦＣ２００６５）まで、様々な値であった。
【００３４】
（リグニン、ホロセルロース定量）
Ａ．アルベン抽出
脱脂はアルベン抽出法を用いた。３ヶ月培養したタケチップ培地を２日間風乾させ、１００ｍＬの三角フラスコに移した。エタノール（９９．５％、Ｗａｋｏ）とｎ−へキサン（９６．０％、Ｗａｋｏ）の混合溶液（容量比、１：２）７５ｍＬを加え３８℃、３０分超音波処理し、ろ過を行った。この操作を８回繰り返し、２日間風乾させ、リグニン定量、ホロセルロース定量に用いた。
【００３５】
Ｂ．  リグニン定量
アルベン抽出後、風乾したタケ粉末を０．３ｇ秤量し、７２％硫酸４．５ｍＬを３回に分け加えて１００ｒｐｍ、２．５時間、３８℃で振とう後、１７０ｍＬの純水を加えオートクレーブ（１２０℃、３０分）処理し、あらかじめ秤量済みのガラス繊維ろ紙（ＧＡ２００、ｓｉｚｅ  ４７ｍｍ；Ｔｏｙｏ  Ｒｏｓｈｉ）で吸引ろ過した。沈殿物は熱水４００ｍＬ、および冷水４００ｍＬで洗浄し、１０５℃に設定した滅菌乾燥機に一晩かけ、デシケーターで半日放冷した。その後秤量し、増加した重量を酸不溶性リグニン量とした。ろ液は酸可溶性リグニン量を求めるため少量残し、ろ液の２１０ｎｍの吸光度が０．３〜０．７の範囲になるように３％硫酸水溶液で希釈して２１０ｎｍの波長で吸光度測定を行い、次式により酸可溶性リグニン量を算出した。
【化２】
2012039904.tif 000007
【００３６】
リグニン定量に関する操作は、木質科学実験マニュアル（黒田、９４頁（２００１））にしたがって行った。
【００３７】
リグニン定量の結果を表３、図４に示す。無処理区のリグニン量は２２．７％であった。ポジティブコントロールで用いたＰｈｌｅｂｉａ  ｓｐ．Ｃ４のリグニン残存量（１５．５％）と比較して、ＴＵＦＣ２００５６（１０．６％）、ＴＵＦＣ２００７６（１１．５％）、ＴＵＦＣ２００７７（１４．６％）、ＴＵＦＣ２００７８（１４．１％）、２００８１０１０−（Ｂ）（１０．５％）および２００８１０１０−Ｂ（１０．７％）の６菌株（括弧内はリグニン残存量）がリグニンをより多く分解した。また、特にリグニン減少が顕著に見られた３菌株（ＴＵＦＣ２００５６および２００８１０１０−（Ｂ）、２００８１０１０−Ｂ）は、無処理区のリグニン含量と比較して５０％以上の減少が確認できた。ただし、２００８１０１０−（Ｂ）、２００８１０１０−Ｂは再現性試験のための同一の菌株をもちいており、現在はＴＵＦＣ２００５７を付与している。
【００３８】
Ｃ．  ホロセルロース定量
脱脂を終えたタケ粉末０．７５ｇを３００ｍＬ容三角フラスコに移し、蒸留水１５０ｍＬ、亜塩素酸ナトリウム（Ｗａｋｏ）１．０ｇおよび酢酸（Ｗａｋｏ）０．２ｍＬを加え、１００ｍＬ容三角フラスコでゆるく蓋をして、７０〜８０℃のウォーターバス内で１時間反応させた。実験はドラフト中で行った。次いで、亜塩素酸ナトリウム１．０ｇおよび酢酸０．２ｍＬを加える操作を、内容物が白く変色するまで１時間おきに計４回繰り返した。この際、内容物を混和させるために軽く振った。内容物が白く変色した後、あらかじめ秤量済みのガラス繊維ろ紙を用いて白色内容物を吸引ろ過し、アセトンおよび冷水で洗浄後、１０５℃の乾燥機中で乾燥させ、デシケーター中で半日放冷後秤量し、増加した重量をホロセルロース量とした。
【００３９】
ホロセルロース定量に関する操作は、木質科学実験マニュアル（黒田、９４頁（２０００））にしたがって行った。
【００４０】
ホロセルロース定量の結果を表３、図５に示した。無処理区のホロセルロース量は７３．１１％であった。Ｐｈｌｅｂｉａ  ｓｐ．（Ｃ４）のホロセルロース残存量（６６．９％）と比較して、ＴＵＦＣ２００５６（７１．５９％）が高い値を示した。次いで、２００８１０１０−（Ｂ）（６６．７％）が高い値を示した。優れた白色腐朽菌とされるカワラタケＴＵＦＣ１０５３７では、５９．５％と低い値を示した。他の菌株ではＴＵＦＣ２００７２（５７．８％）を除いて、６２−６６％の値を示した。
【００４１】
リグニン定量およびホロセルロース定量の結果、タケ材のリグニン含有量２２．７％およびホロセルロース含有量７３．１％に対して、ＴＵＦＣ２００５６がリグニン残存量で１０．６％、ホロセルロース残存量で７１．６％の高い選択的リグニン分解能を示した。ポジティブコントロールとして用いたＰｈｌｅｂｉａ  ｓｐ．（Ｃ４）のリグニン残存量（１５．５％）およびホロセルロース量（６６．９％）と比較しても優れた選択的リグニン分解能を有していた。今回、リグニン含量が１０．５％−１４．６％の高いリグニン分解能を示した菌株は６株あり、そのうち４株は形態学的、遺伝子学的同定の結果、Ｐｕｎｃｔｕｌａｒｉａ  ｓｐ．であることが分かった（図４参照）。これら６株を作用させた後のリグニンおよびホロセルロースの相対値を図６に示す。
【実施例５】
【００４２】
（酵素活性測定）
リグニン定量およびホロセルロース定量試験の結果が良かった上位１０菌株（Ｃ４、ＴＵＦＣ２００５６、２００８１０１０−Ｂ、２００８１０１０−（Ｂ）、ＴＵＦＣ２００７６、ＴＵＦＣ２００７７、ＴＵＦＣ２００８３、ＴＵＦＣ２００７９、２００９０８０３−１２、２００９１０１３−０８）を液体培地で２週間培養し、各リグニン分解酵素の活性を測定した（表４）。ＴＵＦＣ２００７９およびＴＵＦＣ２００８３の２菌株は液体培地では生育しなかった。
【００４３】
Ａ．供試菌の培養
１００ｍＬ容三角フラスコに１０ｍＬのタケ粉末液体培地［１．５％（ｗ／ｖ）麦芽エキス、０．５％（ｗ／ｖ）タケ粉末］を分注し、通気性のあるシリコンキャップで蓋をし、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌した。その後、あらかじめＭＡ平板培地に培養した供試菌の菌糸体を接種した。接種源にはＭＡ平板培地に生育している菌糸体の先端付近を同心円状に口径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、菌糸体ディスク３個をランダムに選んで用いた。クリーンベンチ内で接種後、シリコンキャップでふたをし、２５℃、暗所下で２週間静置培養を行った。その後、菌糸体を吸引ろ過により除去した。ろ過にはガラス繊維ろ紙（ＧＡ−２００、サイズ４７ｍｍ；Ｔｏｙｏ  Ｒｏｓｈｉ）およびメンブランフィルター（ＰＴＦＥ、サイズ４７ｍｍ; 孔径３．０μｍ、０．４５μｍ、０．２μｍ；Ｔｏｙｏ  Ｒｏｓｈｉ）を用いて４段階ろ過した。回収したろ液を粗酵素溶液とし酵素活性測定に用いた。
【００４４】
Ｂ．リグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ）活性測定
７１．４３ｍｍｏｌ／Ｌコハク酸緩衝液（ｐＨ３．０）７００μＬ、１０ｍｍｏｌ／Ｌベラトリルアルコール溶液５０μＬ、粗酵素液２００μＬをキュベットにそれぞれ入れ、最後に２ｍｍｏｌ／Ｌ過酸化水素水５０μＬを添加し、素早く混合した。対照区には、コハク酸緩衝液７００μＬ、ベラトリルアルコール溶液５０μＬ、粗酵素液２００μＬをキュベットに入れ混合し、３１０ｎｍでの吸光度を分光光度計（日本分光、東京）により１８０秒間測定した。吸光度が直線的に増加したことを確認し、直線部の傾きから１分間あたりの吸光度変化を求めた後、酵素活性を算出した。ネガティブコントロールは過酸化水素を加えてないものを用いた。酵素活性１Ｕは１分間に１μｍｏｌの反応生成物を生じる酵素量とした。その結果、ほとんどの菌においてＬｉＰ活性を確認することができなかった。ほとんどの菌が０に近い値であったが、２００８１０１０−Ｂ（０．３Ｕ／Ｌ）にわずかな活性が見られた。
【００４５】
Ｃ．マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）活性測定
７１．４３ｍｍｏｌ／Ｌマロン酸緩衝液（ｐＨ４．５）７００μＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸マンガン溶液５０μＬ、粗酵素液２００μＬをキュベットにそれぞれ入れ、最後に２ｍｍｏｌ／Ｌ過酸化水素水５０μＬを添加し、素早く混合した。対照区には、マロン酸緩衝液７００μＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸マンガン溶液５０μＬ、粗酵素液２００μＬをキュベットに入れ混合し、２７０ｎｍにおける吸光度を分光光度計により１８０秒間測定した。吸光度が直線的に増加したことを確認し、直線部の傾きから１分間あたりの吸光度変化を求めた後、酵素活性を算出した。酵素活性１Ｕは１分間に１μｍｏｌの反応生成物を生じる酵素量とした。その結果、ＭｎＰ活性に関して最も活性が高い菌株は、２００８１０１０−Ｂで７２．５Ｕ／Ｌの値を示した。Ｐｈｌｅｂｉａ  ｓｐ．（Ｃ４）（２８．５Ｕ／Ｌ）と比較してＴＵＦＣ２００７７（１０．４Ｕ／Ｌ）以外の全ての菌がＰｈｌｅｂｉａ  ｓｐ．（Ｃ４）よりも高い値を示した。また、ＴＵＦＣ２００５６（６８．２Ｕ／Ｌ）、２００８１０１０−Ｂ（７２．５Ｕ／Ｌ）、２００８１０１０−（Ｂ）（６９．９Ｕ／Ｌ）およびＴＵＦＣ２００７６（６６．４Ｕ／Ｌ）においては、Ｃ４の２倍以上の活性が確認できた。
【００４６】
Ｄ．ラッカーゼ（Ｌａｃ）活性測定
７１．４３ｍｍｏｌ／Ｌ酒石酸緩衝液（ｐＨ３．０）７００μＬ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート）（ＡＢＴＳ）５０μＬ、粗酵素液２００μＬをキュベットにそれぞれ入れ、最後に２ｍｍｏｌ／Ｌ過酸化水素水５０μＬを添加し、素早く混合した。対照区には、７１．４３ｍｍｏｌ／Ｌ酒石酸酸緩衝液（ｐＨ３．０）７００μＬ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＢＴＳ  ５０μＬ、蒸留水２００μＬをキュベットに入れ混合し、４３６ｎｍにおける吸光度を分光光度計により３分間モニターした。吸光度が直線的に増加したことを確認し、直線部の傾きから１分間あたりの吸光度変化を求めた後、酵素活性を算出した。酵素活性１Ｕは１分間に１μｍｏｌの反応生成物を生じる酵素量とした。その結果、Ｌａｃ活性において最も活性が高い菌株はＴＵＦＣ２００５６であり、３６．２Ｕ／Ｌの値を示した。Ｃ４の活性は１５．０Ｕ／Ｌであり、全ての菌株の中で最も低い値を示した。Ｃ４と最も活性が高かったＴＵＦＣ２００５６との差は２倍以上であった。
【００４７】
Ｅ．ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）活性測定
７１．４３ｍｍｏｌ／Ｌコハク酸緩衝液（ｐＨ３．０）７００μＬ、５０ｍｍｏｌ／ｌ  ２，６−ジメトキシ−フェノール溶液５０μＬ、粗酵素液２００  μＬ、最後に２ｍｍｏｌ／Ｌ過酸化水素水５０  μＬを添加し素早く混合した。対照区には、７１．４３ｍｍｏｌ／Ｌコハク酸緩衝液７００μＬ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ２，６−ジメトキシ−フェノール溶液５０μＬ、蒸留水２００μＬを入れ混合し、２７０ｎｍにおける吸光度を分光光度計により１８０秒間測定した。吸光度が直線的に増加したことを確認し、直線部の傾きから１分間あたりの吸光度変化を求めた後、酵素活性を算出した。酵素活性１Ｕは１分間に１μｍｏｌの反応生成物を生じる酵素量とした。その結果、ＰＰＯ活性に関して最も活性が高い菌株はＴＵＦＣ２００７７で３４．２Ｕ／Ｌの値を示した。Ｃ４の値（１６．７Ｕ／Ｌ）と比較して、２倍以上の値であった。次いで、２００８１０１０−（Ｂ）、ＴＵＦＣ２００５６および２００８１０１０−ＢのＰＰＯ活性が高かった。
【００４８】
【表５】
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【００４９】
上記結果を総合して、リグニンに対する選択性、分解能が高く、ヘミセルロース、セルロースなどのホロセルロースに対する選択性、分解能が低い木材腐朽菌として、ＴＵＦＣ２００５６、２００８１０１０−Ｂおよび２００８１０１０−（Ｂ）を選択した。さらなる検討により、２００８１０１０−Ｂおよび２００８１０１０−（Ｂ）は同一菌株であることが判明し、ＴＵＦＣ２００５７と命名した。ＴＵＦＣ２００５６株を２０１０年７月２２日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託し、２０１０年７月２９日に受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−９７０を付与された。ＴＵＦＣ２００５７株を２０１０年７月２２日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託し、２０１０年７月２９日に受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−９７１を付与された。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、林業、製材業、製紙業、エネルギー分野、環境分野、製薬業などにおいて利用可能である。
【受託番号】
【００５１】
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−９７０
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−９７１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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