(57)【要約】【課題】増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る核酸増幅法において融解曲線解析を行う際に、高い核酸の増幅反応効率および融解曲線解析の解析精度を得るための技術の提供。【解決手段】増幅対象核酸と二本鎖を形成し得るプローブ核酸の存在下で増幅対象核酸の増幅反応を行い、増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る手順と、前記増幅産物と前記プローブ核酸の融解曲線解析を行う手順と、を含み、前記プローブ核酸として、前記増幅反応の温度よりも融解温度が低いプローブ核酸を用いる核酸塩基配列解析方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
増幅対象核酸と二本鎖を形成し得るプローブ核酸の存在下で増幅対象核酸の増幅反応を行い、増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る手順と、
前記増幅産物と前記プローブ核酸の融解曲線解析を行う手順と、を含み、
前記プローブ核酸として、前記増幅反応の温度よりも融解温度が低いプローブ核酸を用いる核酸塩基配列解析方法。
【請求項２】
前記プローブ核酸として、前記増幅反応のためのプライマーよりも融解温度が低い核酸鎖を用いる請求項１記載の核酸塩基配列解析方法。
【請求項３】
前記プローブ核酸として、前記増幅産物のループ部位と二本鎖形成する核酸鎖を用いる請求項２記載の核酸塩基配列解析方法。
【請求項４】
増幅対象核酸を該増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬と、前記増幅産物との融解曲線解析のためのプローブ核酸と、が反応領域内に保持され、
前記プローブ核酸の融解温度が前記反応の温度よりも低くされている核酸塩基配列解析用マイクロチップ。
【請求項５】
前記反応領域が複数配設され、各反応領域内に異なる塩基配列のプローブ核酸が保持されている請求項４記載の核酸塩基配列解析用マイクロチップ。
【請求項６】
前記プローブ核酸として、前記増幅対象核酸の塩基配列保存領域に相補的な塩基配列を有する基準用プローブ核酸を保持させた反応領域を有する請求項５記載の核酸塩基配列解析用マイクロチップ。
【請求項７】
増幅対象核酸を該増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬と、前記増幅産物との融解曲線解析のためのプローブ核酸と、が混合されてなり、
前記プローブ核酸の融解温度が前記反応の温度よりも低くされている核酸塩基配列解析用混合試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、核酸塩基配列解析方法および核酸塩基配列解析のためのマイクロチップと混合試薬に関する。より詳しくは、核酸増幅反応に続けて融解曲線解析を行って増幅対象核酸鎖の塩基配列を解析する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
二本鎖を形成する核酸鎖が２本の一本鎖核酸に解離（融解）する温度を融解温度（Ｔｍ)という。融解曲線解析では、二本鎖を形成する核酸鎖を徐々に昇温して２本の一本鎖核酸に融解させながら融解に伴って変化するシグナルを検出することにより、温度変化に対するシグナル検出量の変化を測定する。融解温度は、温度変化に対してシグナル検出量の変化をプロットして得られる融解曲線から決定することができる。融解温度は２本の一本鎖核酸の相同性を反映するため、融解温度に基づけば２本の一本鎖核酸の塩基配列の同一性を判定できる。融解曲線解析は、プローブ核酸に対する標的核酸の塩基配列の同一性を判定するために有用であり、核酸増幅反応の特異性の確認や一塩基多型（ＳＮＰｓ）などの遺伝子型の判定のために利用されている。
【０００３】
ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法は、増幅対象核酸の６つの領域に対して４種類のプライマーを用いて、等温条件下で、鎖置換反応を利用した連続的な核酸増幅反応を行う方法である。ＬＡＭＰ法では、両端に相補的な配列を持ち、この相補的配列の自己アニールによって両端にループが形成された鋳型が合成される。ＬＡＭＰ法では、このループを介して増幅対象核酸が連続的に配列した増幅産物が得られる。
【０００４】
ＬＡＭＰ法のように増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る核酸増幅法では、増幅産物とプローブ核酸との融解曲線解析を行う場合、プローブ核酸の設計に制約がある。すなわち、プローブ核酸が増幅産物と二本鎖形成（ハイブリダイゼーション）できるように、プローブ核酸は増幅産物において一本鎖が維持されているループ形成部位にハイブリダイズするように設計する必要がある。例えば、特許文献１には、ＬＡＭＰ法による増幅産物の遺伝子型判定のためのプローブ核酸を、ＬＡＭＰ反応に特徴的にみられる一本鎖ループにアニーリングするように設計することが記載されている（当該文献段落００１５参照）。
【０００５】
また、本技術に関連して、特許文献２には、ＬＡＭＰ法を用いた遺伝子の変異検出方法において、非標的塩基配列上からの相補鎖合成を防止するため、非標的塩基配列上の変異部位に特異的にアニールしうるオリゴヌクレオチドを設計することが記載されている（当該文献請求項１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−０６０８３８号公報
【特許文献２】特開２００３−１５９１００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＬＡＭＰ法のように増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る核酸増幅法では、増幅産物とプローブ核酸との融解曲線解析を行う場合、プローブ核酸をループ形成部位にハイブリダイズするように設計する必要がある。このため、融解曲線解析によりＳＮＰｓなどの遺伝子型判定を行う場合には、ループ形成部位にＳＮＰｓなどが位置するようにプライマーを設計しなければならず、プライマー設計の自由度が低く、設計そのものが困難な場合がある。
【０００８】
ＬＡＭＰ法では、ループ形成部位に対してループプライマーと称される５番目および６番目のプライマーが設けられる場合がある。ループプライマーを用いることで、４種類のプライマーのみを用いる場合に比べて増幅反応の起点となるプライマーのアニーリング部位を増やして増幅反応時間を短縮することができる。しかし、ループ形成部位に融解曲線解析のためのプローブ核酸を設計した場合には、ループプライマーとプローブ核酸が競合的にハイブリダイズすることとなるため、増幅反応効率が著しく低下してしまう問題がある。増幅反応が低下すると、融解曲線解析におけるシグナルの検出感度も低下し、解析精度に問題が生じる。
【０００９】
そこで、本技術は、増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る核酸増幅法において融解曲線解析を行う際に、高い核酸の増幅反応効率および融解曲線解析の解析精度を得るための技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題解決のため、本技術は、増幅対象核酸と二本鎖を形成し得るプローブ核酸の存在下で増幅対象核酸の増幅反応を行い、増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る手順と、前記増幅産物と前記プローブ核酸の融解曲線解析を行う手順と、を含み、前記プローブ核酸として、前記増幅反応の温度よりも融解温度が低いプローブ核酸を用いる核酸塩基配列解析方法を提供する。
この核酸塩基配列解析方法では、プローブ核酸の融解温度が増幅反応の温度よりも低くされているため、プローブ核酸の存在下で増幅反応を行った場合にも、プローブ核酸が他の核酸鎖にハイズリダイズすることがない。
前記プローブ核酸の融解温度は、前記増幅反応のためのプライマーよりも低くされることがより好ましい。これにより、プローブ核酸が増幅反応のためのプライマーと競合的にハイブリダイズしたり、ダイマーを形成したりするのを抑制できる。
この核酸塩基配列解析方法において、前記プローブ核酸には、前記増幅産物のループ部位と二本鎖形成する核酸鎖を用いることができる。この場合にも、プローブ核酸がループ部位において増幅反応のためのプライマーと競合的にハイブリダイズすることがない。
【００１１】
また、本技術は、増幅対象核酸を該増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬と、前記増幅産物との融解曲線解析のためのプローブ核酸と、が反応領域内に保持され、前記プローブ核酸の融解温度が前記反応の温度よりも低くされている核酸塩基配列解析用マイクロチップを提供する。
この核酸塩基配列解析用マイクロチップは、前記反応領域が複数配設され、各反応領域内に異なる塩基配列のプローブ核酸が保持されたものとできる。このうちいくつかの反応領域内には、前記プローブ核酸として、前記増幅対象核酸の塩基配列保存領域に相補的な塩基配列を有する基準用プローブ核酸を保持させてもよい。
【００１２】
さらに、本技術は、増幅対象核酸を該増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬と、前記増幅産物との融解曲線解析のためのプローブ核酸と、が混合されてなり、前記プローブ核酸の融解温度が前記反応の温度よりも低くされている核酸塩基配列解析用混合試薬をも提供する。
【００１３】
増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る核酸増幅法には、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いた核酸増幅法が広く包含され、例えばＬＡＭＰ法、ＳｍａｒｔＡｍｐ法などが含まれる。
【発明の効果】
【００１４】
本技術により、増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る核酸増幅法において融解曲線解析を行う際に、高い核酸の増幅反応効率および融解曲線解析の解析精度を得るための技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本技術に係る核酸塩基配列解析用マイクロチップの構成を説明するための図である。（Ａ）は上面図、（Ｂ）は（Ａ）中Ｐ−Ｐ断面に対応する断面図を示す。
【図２】実施例で用いたプライマーの設計領域を説明する図である。
【図３】実験例１において測定された増幅反応曲線を示す図面代用グラフである。
【図４】実験例２において測定された融解曲線を示す図面代用グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．核酸塩基配列解析方法
（１）増幅反応手順
（２）融解曲線解析手順
２．核酸塩基配列解析用マイクロチップ
【００１７】
１．核酸塩基配列解析方法
（１）増幅反応手順
本技術に係る核酸塩基配列解析方法は、プローブ核酸の存在下で増幅対象核酸の増幅反応を行い、増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る手順（増幅反応手順）と、増幅産物と前記プローブ核酸の融解曲線解析を行う手順（融解曲線解析手順）と、を含む。
【００１８】
増幅反応手順では、塩基配列を解析する核酸を対象として増幅反応を行う。増幅反応は、ＬＡＭＰ法、ＳｍａｒｔＡｍｐ法などにより行うことができる。増幅反応により増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物が得られる。
【００１９】
ＬＡＭＰ法を用いて増幅反応を行う場合、増幅対象核酸の６つの領域に対して４種類のプライマーを設定し、鎖置換反応を利用して一定温度で反応させる。増幅対象核酸、プライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質（核酸モノマー）、反応緩衝液（バッファー）等を混合し、一定温度（６５℃付近）で保温することによって反応が進み、増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物が得られる。
【００２０】
さらに、ＬＡＭＰ法では、５番目および６番目のプライマーとして、ループ形成部位に対するプライマーを用いてもよい。ループプライマーを用いることで、４種類のプライマーのみを用いる場合に比べて増幅反応の起点となるプライマーのアニーリング部位を増やして増幅反応時間を短縮することができる。
【００２１】
増幅反応は、増幅産物との融解曲線解析のためのプローブ核酸の存在下で行われる。増幅反応の反応温度は、増幅反応のためのプライマー（ＬＡＭＰ法では、４つのプライマーと２つのループプライマー）の融解温度よりも低く設定される。プローブ核酸の融解温度は、この増幅反応の反応温度よりもさらに低く設定される。
【００２２】
プローブ核酸の融解温度を増幅反応の温度よりも低く設定することで、増幅反応中、プローブ核酸が他の核酸鎖にハイズリダイズすることがない。このため、プローブ核酸がプライマーと競合的にハイブリダイズしたり、ダイマーを形成したりすることがなく、プローブ核酸が増幅反応の反応効率を低下させることがない。特に、増幅産物のループ形成部位にプローブ核酸を設計した場合にも、プローブ核酸がループプライマーと競合的にハイブリダイズすることがないため、プローブ核酸とループプライマーとの競合的ハイブリダイズに起因する反応効率の低下を防止できる。
【００２３】
プローブ核酸の融解温度は、増幅反応の反応温度（６５℃付近）よりも５〜１５℃低く設定されることが好ましい。プローブ核酸の融解温度の設定は、従来公知の手法によって行うことができ、核酸の塩基配列とその長さを適宜設計することより所望の温度に設定できる。プローブ核酸の融解温度は、増幅反応のためのプライマーの融解温度よりも低くされることがより好ましい。
【００２４】
より具体的には、プローブ核酸の融解温度は例えば以下の計算式よって算出することができるため、この算出値が増幅反応の反応温度よりも５〜１５℃低くなるように、プローブ核酸のＧＣ含量および長さを設計すればよい。なお、反応緩衝液の塩濃度によっても核酸の融解温度が変化することから、より好ましくは、反応緩衝液の塩濃度条件も考慮して所望の融解温度が付与されるようにプローブの核酸のＧＣ含量および長さを設計する。
Ｔｍ（℃）＝６０．８＋０．４１×（ＧＣ％）−（５００／ｎ）
（ＧＣ％）：オリゴヌクレオチド中のＧＣ含量（％）
ｎ：オリゴヌクレオチドの長さ（ｍｅｒ）
【００２５】
（２）融解曲線解析手順
融解曲線解析手順では、まず、増幅反応手順後の反応溶液をプローブ核酸の融解温度未満まで冷却する。冷却により反応溶液の温度がプローブ核酸の融解温度をよりも低くなると、プローブ核酸が増幅産物にハイブリダイズして二本鎖を形成する。冷却は、通常、増幅反応の反応温度（６５℃付近）から、室温〜４０℃まで行われる。
【００２６】
次に、反応溶液を加熱し、二本鎖を形成する核酸鎖を徐々に昇温してプローブ核酸と増幅産物の二本鎖を一本鎖核酸に融解させながら融解に伴って変化するシグナルを検出し、温度変化に対するシグナル検出量の変化を測定する。昇温は、通常、冷却後の温度（室温〜４０℃）から、９０℃付近まで行われる。
【００２７】
検出するシグナル量は、例えばプローブ核酸として二本鎖の形成によって蛍光を生じるかあるいは逆に蛍光を消失するものを用いる場合には、一本鎖核酸への融解に伴って増加あるいは減少する蛍光強度とできる。二本鎖の形成によって蛍光が消失するプローブ核酸としては、市販のＱＰｒｏｂｅと称されるものを利用できる。
【００２８】
増幅反応手順後冷却を行う前に、増幅産物の熱変性を行ってもよい。熱変性は、通常、反応溶液を９０〜１００℃、好ましくは９５℃前後まで加熱することによって行われる。熱変性により増幅産物のうち増幅対象核酸が連続的に配列する二本鎖形成部分が部分的に解離する。このため、増幅産物のループ形成部位以外の二本鎖形成部分にプローブ核酸を設計した場合にも、冷却によりプローブ核酸を解離した二本鎖形成部分にハイブリダイズさせることができ、融解曲線解析を行うことが可能となる。
【００２９】
本技術に係る核酸塩基配列解析方法では、プローブ核酸の融解温度を増幅反応の温度よりも低く設定することで、増幅産物のループ形成部位にプローブ核酸を設計した場合にも、プローブ核酸とループプライマーとの競合的ハイブリダイズに起因する増幅反応効率の低下を防止できる。また、融解曲線解析手順において熱変性を行うことで、増幅産物のループ形成部位以外の二本鎖形成部分にプローブ核酸を設計した場合にも、融解曲線解析を行うことができる。従って、本技術に係る核酸塩基配列解析方法によれば、高い融解曲線解析の解析精度が得られる。また、融解曲線解析によりＳＮＰｓなどの遺伝子型判定を行う場合に、ループ形成部位にＳＮＰｓなどが位置するようにプライマーを設計する必要がなく、高いプライマー設計の自由度が得られる。
【００３０】
なお、融解曲線解析によりＳＮＰｓなどの遺伝子型判定を行う場合、プライマーは、判定対象とする遺伝子多型（変異）部位を含まない領域に設計する必要があり、逆にプローブ核酸は遺伝子多型部位を含む領域に設計する必要がある。この場合、プライマーとプローブ核酸の設計領域は一部重複してもよいが、完全一致しないようにすることが望ましい。
【００３１】
２．核酸塩基配列解析用マイクロチップ
本技術に係る核酸塩基配列解析用マイクロチップ（以下、単に「マイクロチップ」とも称する）の構成を図１に示す。（Ａ）は上面図、（Ｂ）は（Ａ）中Ｐ−Ｐ断面に対応する断面図を示す。
【００３２】
マイクロチップ１には、外部から液体（サンプル溶液）が導入される導入部２と、核酸増幅反応の反応場となる複数のウェル（反応領域）４１，４２，４３，４４，４５と、一端において導入部２に連通する流路３１，３２，３３，３４，３５が配設されている。ここでは、マイクロチップ１に縦横５例で合計２５個のウェルを均等間隔で配設する場合を例として、これら２５個のウェルを５区分し、１区分のウェル５つに同一の符号を付した。流路３１の他端は、５つ配設されたウェル４１のそれぞれに接続されている。同様に、流路３２，３３，３４，３５の他端も、各５つ配設されたウェル４２，４３，４４，４５のそれぞれに接続されている。
【００３３】
導入部２から導入されたサンプル溶液は、流路３１，３２，３３，３４，３５を送液され、ウェル４１，４２，４３，４４，４５の内部に供給される。サンプル溶液には、塩基配列の解析を行う増幅対象核酸が含まれ得る。
【００３４】
マイクロチップ１は、導入部２、流路３１，３２，３３，３４，３５、ウェル４１，４２，４３，４４，４５を形成した基板層１１に基板層１２を貼り合わせて構成されている。基板層１１，１２の材質は、ガラスや各種プラスチック（ポリプロピレン、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、ポリジメチルシロキサン）とすることができる。融解曲線解析を光学的に行う場合には、基板層１１，１２の材質は、光透過性を有し、自家蛍光が少なく、波長分散が小さいために光学誤差の少ない材料を選択することが好ましい。
【００３５】
ウェル４１，４２，４３，４４，４５内には、増幅対象核酸を該増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬と、増幅産物との融解曲線解析のためのプローブ核酸と、が保持されている。プローブ核酸の融解温度は、本技術に係る核酸塩基配列解析方法において説明したように、核酸増幅反応の温度よりも低くされている。
【００３６】
試薬は、増幅産物を得るために必要な物質であって、具体的には、例えばＬＡＭＰ法を用いて増幅反応を行う場合、プライマー（４つのプライマーと必要に応じて２つのループプライマー）、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質（核酸モノマー）、反応緩衝液（バッファー）溶質などとされる。本技術に係る核酸塩基配列解析用混合試薬は、これらの試薬とプローブ核酸とが予め混合されてなるものである。
【００３７】
プローブ核酸は、ウェルの区分４１，４２，４３，４４，４５毎に異なる塩基配列のプローブ核酸が保持されている。例えば融解曲線解析により既知の遺伝子変異検出を行う場合、異なる塩基配列のプローブ核酸として、変異型用プローブ核酸と野生型用プローブ核酸をウェルに保持させる。野生型用プローブ核酸は、塩基配列の解析を行う増幅対象核酸の野生型に相補的な塩基配列を有する。変異型用プローブ核酸は、変異型に相補的な塩基配列を有する。なお、遺伝子変異には、ＳＮＰｓなどの遺伝子多型も含まれるものとする。
【００３８】
増幅対象核酸を含むサンプル液をウェル内に導入後、上述した増幅反応手順および融解曲線解析手順を行い、野生型用プローブ核酸が保持されたウェルで得られた融解曲線と変異型用プローブ核酸が保持されたウェルで得られた融解曲線とを比較する。増幅対象核酸が野生型である場合には、塩基配列が完全一致する野生型用プローブ核酸が保持されたウェルにおいてより高い融解温度を示す融解曲線が得られる。一方、増幅対象核酸が変異型である場合には、塩基配列が完全一致する変異型用プローブ核酸が保持されたウェルにおいてより高い融解温度を示す融解曲線が得られる。遺伝子の変異パターンが複数存在する場合には、例えば野生型用プローブ核酸をウェル４１に、変異パターンに対応する必要な数の変異型用プローブ核酸をウェル４２〜４５に収容しておけばよい。
【００３９】
また、例えば融解曲線解析により未知の遺伝子変異検出を行う場合、異なる塩基配列のプローブ核酸として、基準用プローブ核酸と検出用プローブ核酸をウェルに保持させる。基準用プローブ核酸は、塩基配列の解析を行う増幅対象核酸のうち、塩基配列の保存性が高く、遺伝子変異が存在しないことが明らかな領域（塩基配列保存領域）に相補的な塩基配列を有する。検出用プローブ核酸は、増幅対象核酸のうち、未知の遺伝子変異が存在する可能性がある領域に相補的な塩基配列を有する。
【００４０】
融解曲線解析の結果は、２本の一本鎖核酸鎖の塩基配列の相同性のみでなく、塩濃度や共存物質濃度などの反応溶液条件や核酸増幅産物の濃度にも依存する。反応溶液中の塩濃度や共存物質濃度は解析を行うサンプル液毎に変化し得るものであり、また核酸増幅産物の産物量も反応毎にばらつきを生じる。そのため、未知の遺伝子変異を検出しようとする場合には、増幅対象核酸とプローブ核酸と塩基配列が完全一致であるのか一部不一致であるのかが不明であるため、当該増幅対象核酸とプローブ核酸との融解曲線が野生型に由来するものであるのか変異型に由来するものであるのかを容易に判断できない場合がある。この場合、プローブ核酸として、遺伝子変異が存在しないことが明らかな領域に結合する基準用プローブ核酸を予めウェルに保持させておき、塩基配列が完全一致した場合の融解曲線を得ることが有用となる。塩基配列が完全一致した場合の融解曲線との比較によって、検出用プローブ核酸を保持させたウェルで得られた融解曲線が野生型に由来するものであるのか変異型に由来するものであるのかを容易に判定することが可能となる。
【００４１】
増幅対象核酸を含むサンプル液をウェル内に導入後、上述した増幅反応手順および融解曲線解析手順を行い、基準用プローブ核酸が保持されたウェルで得られた融解曲線と検出用プローブ核酸が保持されたウェルで得られた融解曲線とを比較する。増幅対象核酸が野生型である場合には、基準用プローブ核酸および検出用プローブ核酸ともに塩基配列が完全一致となり、これらのプローブ核酸が保持されたウェルで得られる融解曲線が示す融解温度はほぼ一致する。一方、増幅対象核酸が変異型である場合には、塩基配列が完全一致する基準用プローブ核酸が保持されたウェルにおいてより高い融解温度を示す融解曲線が得られ、検出用プローブ核酸が保持されたウェルで得られる融解曲線の融解温度はより低くなる。遺伝子の変異パターンが増幅対象核酸の複数個所に存在する可能性がある場合には、例えば基準用プローブ核酸をウェル４１に、変異パターンに対応する必要な数の検出用プローブ核酸をウェル４２〜４５に収容しておけばよい。
【００４２】
なお、本技術は以下のような構成もとることができる。
（１）増幅対象核酸と二本鎖を形成し得るプローブ核酸の存在下で増幅対象核酸の増幅反応を行い、増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る手順と、前記増幅産物と前記プローブ核酸の融解曲線解析を行う手順と、を含み、前記プローブ核酸として、前記増幅反応の温度よりも融解温度が低いプローブ核酸を用いる核酸塩基配列解析方法。
（２）前記プローブ核酸として、前記増幅反応のためのプライマーよりも融解温度が低い核酸鎖を用いる前記（１）に記載の核酸塩基配列解析方法。
（３）前記プローブ核酸として、前記増幅産物のループ部位と二本鎖形成する核酸鎖を用いる前記（１）または（２）に記載の核酸塩基配列解析方法。
（４）増幅対象核酸を該増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬と、前記増幅産物との融解曲線解析のためのプローブ核酸と、が反応領域内に保持され、前記プローブ核酸の融解温度が前記反応の温度よりも低くされている核酸塩基配列解析用マイクロチップ。
（５）前記反応領域が複数配設され、各反応領域内に異なる塩基配列のプローブ核酸が保持されている前記（４）に記載の核酸塩基配列解析用マイクロチップ。
（６）前記プローブ核酸として、前記増幅対象核酸の塩基配列保存領域に相補的な塩基配列を有する基準用プローブ核酸を保持させた反応領域を有する前記（４）または（５）に記載の核酸塩基配列解析用マイクロチップ。
（７）増幅対象核酸を該増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物として増幅する反応のための試薬と、前記増幅産物との融解曲線解析のためのプローブ核酸と、が混合されてなり、前記プローブ核酸の融解温度が前記反応の温度よりも低くされている核酸塩基配列解析用混合試薬。
【実施例】
【００４３】
＜実験例１＞
１．核酸増幅反応
ヒトアクチンβ遺伝子cDNA（配列番号１参照）を鋳型核酸鎖として、LAMP法による核酸増幅反応を行った。図２に、鋳型核酸鎖の塩基配列中におけるプライマーの設計領域を示す。プライマーFIP, BIP, LF, LB, F3, B3の塩基配列（配列番号２〜７参照）を表１に示す。
【００４４】
【表１】
2012239424.tif 000002
【００４５】
ループプライマーLBと重複する領域に、融解温度６２℃のプローブ核酸（Probe1）と、融解温度５０℃のプローブ核酸（Probe2）を設計した。また、Probe3として、ヒトアクチンβ遺伝子cDNAの塩基配列に対して一塩基の不一致を塩基配列中に有するプローブ核酸鎖（融解温度５０℃）を設計した。Probe1〜3の塩基配列を表２に示す。各プローブは、受託合成によりQProbeとして作製した。
【００４６】
【表２】
2012239424.tif 000003
【００４７】
表３に従ってプライマーミックスを調製した。LAMP試薬（栄研化学）を用い、表４に従って核酸増幅反応を行った。反応温度は、６２℃とした。
【００４８】
【表３】
2012239424.tif 000004
【００４９】
【表４】
2012239424.tif 000005
【００５０】
増幅反応曲線を図３に示す。図中符号（A）は、プローブ核酸として融解温度が反応温度と同じProbe1を加えた反応溶液における増幅曲線を示す。また、符号（B）は、プローブ核酸として融解温度が反応温度よりも低いProbe2を加えた反応溶液における増幅曲線を示す。
【００５１】
Probe1を加えた反応溶液の増幅曲線（A）では、Probe2を加えた反応溶液の増幅曲線（B）に比して立ち上がりが遅れており、ループプライマーLBと重複する領域に設計された、融解温度の高いProbe1が増幅反応を阻害していることが確認される。これに対して、融解温度が低いProbe2を加えた反応溶液ではこのような反応効率の低下はないか、あるいは起こり難かったといえる。
【００５２】
＜実験例２＞
２．融解曲線解析
増幅反応後、引き続いて融解曲線解析を行った結果を図４に示す。図中符号（A1）は、プローブ核酸としてヒトアクチンβ遺伝子cDNAの塩基配列に完全一致の塩基配列を有するプローブ核酸鎖Probe2を加えた反応溶液における融解曲線である。また、符号（A2）は、該融解曲線における単位時間当たりの蛍光強度増加量を示す曲線である。一方、図中符号（B1）は、プローブ核酸としてヒトアクチンβ遺伝子cDNAの塩基配列に対して一塩基の不一致を塩基配列中に有するプローブ核酸鎖Probe3を加えた反応溶液における融解曲線である。また、符号（B2）は、該融解曲線における単位時間当たりの蛍光強度増加量を示す曲線である。
【００５３】
Probe3を加えた反応溶液では、Probe2を加えた反応溶液に比して融解曲線の立ち上げ温度が低下（融解温度が低下）している。単位時間当たりの蛍光強度増加量（dI/dT）は、Probe2を加えた反応溶液において54.0であったのに対して、Probe2を加えた反応溶液では48.0であった。以上の結果から。これらの融解曲線に基づけば、LAMP増幅産物とプローブ核酸の塩基配列間の一塩基の不一致を検出できること、さらには増幅対象核酸中に存在し得る一塩基多型や変異を検出できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本技術によれば、増幅対象核酸がループを介して連続的に配列した増幅産物を得る核酸増幅法において融解曲線解析を行う際に、高い核酸の増幅反応効率および融解曲線解析の解析精度を得ることができる。従って、本技術は、核酸増幅反応の特異性の確認や一塩基多型（ＳＮＰｓ）などの遺伝子型の判定のために好適に利用され得る。
【符号の説明】
【００５５】
１：核酸塩基配列解析用マイクロチップ、１１，１２：基板層、２：導入部、３１，３２，３３，３４，３５：流路、４１，４２，４３，４４，４５：ウェル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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