(57)【要約】【課題】  微粒子の凝集が従来の高分子凝集剤レベルで迅速に起こり、安価であり、かつ二次公害のおそれのない凝集剤を提供する。【解決手段】  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＭＢ−Ａ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２０８９）が生産するポリアミノ酸を有効成分として含有する凝集剤。この凝集剤は、一般的な水処理や鉱物性粒子の回収に極めて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＭＢ−Ａ株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２０８９）が生産するポリアミノ酸。
【請求項２】
請求項１に記載のポリアミノ酸を有効成分として含有する凝集剤。
【請求項３】
鉱物性微粒子の回収に使用される請求項２に記載の凝集剤。
【請求項４】
ポリアミノ酸を生産するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＭＢ−Ａ株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２０８９）。
【請求項５】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＭＢ−Ａ株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２０８９）を培養し、得られた培養液からポリアミノ酸を精製する、請求項１に記載のポリアミノ酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の微生物が生産するポリアミノ酸に関し、特に水処理用凝集剤に好適に使用できるものに関する。
【背景技術】
【０００２】
水処理、すなわち浄水の確保、工場排水や生活排水の浄化、土木浚渫工事における水の清澄、活性汚泥の廃棄などの分野において、凝集剤は非常に重要な役割を有しており、用途に応じて各種の無機系のあるいは有機系高分子の凝集剤が使い分けられ、あるいは両者を組み合わせて用いられている。特に高分子凝集剤は、無機系凝集剤に比べて少量で強力な活性を有すること、また１μｍ程度の比較的大きな微粒子を１００〜１０００μｍ程度の沈降しやすい粒子に凝集させる効果に優れていることから、様々な水処理用途において盛んに用いられている。
【０００３】
このような高分子凝集剤の主流をなすポリアクリルアミド系（ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミド／ポリアクリル酸共重合物、部分水解ポリアクリルアミドを含む）の高分子凝集剤は、その性能や経済性において優れているものの、その剤に微量混入している残留モノマー（アクリルアミド）には強力な神経毒性があり、取扱い上の安全性や環境面で必ずしも好ましいものではない。また、これらを含むほとんどの有機高分子凝集剤は、生分解性がなく、この点でも環境への無制限な排出は好ましくない。
【０００４】
一方、微生物の代謝産物として微粒子凝集活性を持つものが知られており、これらは人体への毒性のない凝集剤として注目されている。例えばロドコッカス属細菌由来のＮＯＣ−１、アルカリゲネス属細菌由来の多糖類（特許文献１参照）、メチロバクテリウム属細菌由来の多糖類などを挙げることができるが、いまだ実用化されるに至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平３―５６１０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記の従来技術の問題を解決するためになされたものであり、その目的は、微粒子の凝集が従来の高分子凝集剤レベルで迅速に起こり、安価であり、かつ二次公害のおそれのない凝集剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するために優れた活性を有する微生物由来の凝集剤について鋭意検討した結果、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌のＭＢ−Ａ株が優れた凝集活性を有する物質を大量に生産することをつきとめ、さらに上記凝集活性の有効成分がこの物質のポリアミノ酸にあることをつきとめ、本発明の完成に至った。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（５）の構成を有するものである。
（１）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＭＢ−Ａ株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２０８９）が生産するポリアミノ酸。
（２）（１）に記載のポリアミノ酸を有効成分として含有する凝集剤。
（３）鉱物性微粒子の回収に使用される（２）に記載の凝集剤。
（４）ポリアミノ酸を生産するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＭＢ−Ａ株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２０８９）。
（５）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＭＢ−Ａ株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２０８９）を培養し、得られた培養液からポリアミノ酸を精製する、（１）に記載のポリアミノ酸の生産方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の特定の微生物が生産するポリアミノ酸は、少量の使用であっても被処理物中の微粒子の凝集、特に鉱物性微粒子の凝集沈殿による水の清澄を迅速かつ容易に行うことができる。また、本発明のポリアミノ酸は、二次公害のおそれもなく、有機高分子凝集剤の代替品として好適であり、工業的に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】種々のカチオン添加による凝集活性への影響の検討結果を表わしたグラフである。横軸に各カチオンを示し、縦軸に凝集活性を示す。
【図２】Ａｌ（ＩＩＩ）濃度の凝集活性への影響の検討結果を表わしたグラフである。横軸に添加したＡｌ（ＩＩＩ）濃度を示し、縦軸に凝集活性を示す。
【図３】ポリアミノ酸濃度の凝集活性への影響の検討結果を表わしたグラフである。横軸に添加したポリアミノ酸濃度を示し、縦軸に凝集活性を示す。
【図４】ｐＨ変化の凝集活性への影響の検討結果を表わしたグラフである。横軸に添加したカオリン懸濁液のｐＨを示し、縦軸に凝集活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＭＢ−Ａ株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２０８９）が生産するポリアミノ酸である。このポリアミノ酸は、水処理や鉱物性微粒子の回収などに使用される凝集剤の有効成分として作用することができる。
【００１２】
該ポリアミノ酸は、以下の（ｉ）〜（ｖ）の特徴を有することが好ましい。
（ｉ）アスパラギンを、３０〜４０モル％含有する；
（ｉｉ）グリシンおよびセリンを、それぞれ１０〜２０モル％有する；
（ｉｉｉ）アスパラギン酸、スレオニンおよびアラニンをそれぞれ５〜７モル％含有する；
（ｉｖ）バリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、およびアルギニンを、それぞれ１〜５モル％含有する；
（ｖ）グルタミン酸、グルタミン、プロリン、ヒドロキシプロリン、システイン、メチオニンおよびチロシンを、実質的に含有しない。
【００１３】
該ポリアミノ酸の平均分子量は８０００〜１００００であることが好ましく、このような高分子量のポリアミノ酸は、その凝集剤としての効果が大きい。ここで、平均分子量は、例えばレーザー散乱計、ゲルろ過等の公知の方法により求めることができ、本発明においては、実施例において記載するようにゲルろ過法により求めた。
【００１４】
該ポリアミノ酸を生産する微生物としては、本発明者らによって土壌中より分離され同定された、シュードモナス属のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＭＢ−Ａ株（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２０８９）が使用される。本株は、茨城県つくば市東１−１−１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、そこから容易に入手することができる。
【００１５】
この微生物は、ポリアミノ酸、特に上記のようにアスパラギンを多く含む高分子量のポリアミノ酸を大量に生産する。また、この微生物は、培養が容易であり、大量に培養して凝集活性物質を製造するのに適した性質を備えている。即ち、グルコースを唯一の炭素源とした無機塩類のみよりなる培地で良好に生育し、培養物自体あるいは低級アルコール類によって沈殿、濃縮しうる画分に強力な凝集活性を有する。
【００１６】
微生物の培養方法については、通常微生物の培養に用いられる培地で良いが、培地に含まれる微生物の成育に必要な炭素源としては、グルコースが好ましく用いられ、その濃度は０．１〜５重量％程度、より好ましくは０．２〜２．０重量％程度である。また、窒素源としては、アンモニウム塩が好ましく用いられ、特にｐＨ緩衝能やリン分の補給の点からリン酸ナトリウムが好ましい。また、培養が進行すると培地のｐＨが低下するため、アルカリを滴下してｐＨ６〜８、より好ましくは６．５〜７．５の範囲となるように調整して培養を行うことが好ましい。この際、使用されるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、アミン化合物など任意のものが使用できるが、細胞増殖のための窒素源を補給する面からアンモニアが好ましく用いられる。また、培地にはビタミン類などの補給のため酵母エキスを添加しても良い。また、炭素源のグルコースも細胞増殖につれて徐々に減少していくので、順次追加していく必要があるが、この際にアンモニアとグルコースの混合液を追加することもできる。追加の方法としては、一定量ずつ断続的に追加する方法、連続的に追加する方法などあらゆる方法を採用することができる。また、培養温度としては、細胞の増殖速度の面から通常０〜４０℃で行うが、より好ましくは２５〜３５℃付近である。
【００１７】
このようにして培養した培養液からポリアミノ酸が回収されるが、回収に先立って微生物菌体を遠心分離などの操作で培養液から予め除去しておくこともできる。ポリアミノ酸の回収には、メタノール、イソプロパノール等の低級アルコールを添加する方法が利用できる。この方法で回収されたポリアミノ酸は公知の方法により乾燥した粉末として、あるいは再度水に溶解して水溶液として利用される。
【００１８】
本発明の凝集剤は、上記の微生物が生産するポリアミノ酸を有効成分とするが、ポリアミノ酸を生産した微生物の培養液をそのまま用いても、あるいは、培養液からポリアミノ酸を精製したものを用いてもよい。特に凝集剤を少量で用いる場合には、精製したものを用いる方が凝集剤中のポリアミノ酸の濃度を高めることができるので効果的である。また、凝集剤には、凝集効果を高めるための種々の添加剤を加えることができる。添加剤としては、凝集剤の剤型を保つためやポリアミノ酸が分解等によりその効果を減じてしまうのを防ぐために安定化剤を用いたり、実際の使用を容易とするために水等の液体を用いたりすることができる。また、凝集剤の剤型としては、液状、固体状のいずれでもよく、使用時の容易さから液状の剤型とすることが好ましい。
【００１９】
本発明の凝集剤は、微粒子を含有する被処理物に十分に接触させることによって微粒子を効果的に凝集させることができる。微粒子を含有する被処理物としては、特に限定されるものではないが、河川水、湖水、下水、工場排水、生活排水、土木工事排水、活性汚泥水、さらにはレアアース金属などの鉱物性粒子を含む水、種々の用途に使用されるラテックス、各種無機微粉末懸濁液、セメント工場のような粉体処理工場の廃液などが挙げられる。被処理物に含まれる微粒子によっては、沈降性が悪く、たとえ沈降するにしても時間がかかり、その後処理や次工程に問題を生じるものがあるが、本発明の凝集剤は、被処理物中に含まれる微粒子がこのような性質を有し、０．１〜１００μｍ程度の粒子径を有する場合でも好適に凝集させることができる。
【００２０】
本発明の凝集剤を被処理物に接触させる際の条件としては、その効果が発揮できる条件であればいかなる条件であってもよいが、処理コスト面や環境面から常温常圧程度の条件で実施することが好ましい。また、その処理時間としては、被処理物中の微粒子の大きさや、共存するイオンの種類、イオン強度、ｐＨ、温度、添加する凝集剤の量などにより左右されるが、数分から数十時間程度で十分である。被処理物の凝集処理がほぼ終了したか否かを確認するには、被処理物の濁り等を目視で確認するか、又は実際に分光光度計などを用いてその吸光度を測定することによって行うことができる。
【００２１】
本発明の凝集剤は、カチオンとの組合せで用いることが好ましい。使用されるカチオンは特に限定されないが、アルミニウム（ＩＩＩ）イオン、または、鉄（ＩＩＩ）イオンが好ましい。これらのカオチンの供給方法は、特に限定されないが、例えば、塩化アルミニウム（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）などの形態で添加することができる。
【００２２】
本発明の凝集剤と被処理物とを接触させる際、被処理物に凝集剤を加えた後、通常は撹拌してあるいは撹拌せずに混和するが、撹拌する場合、撹拌を所定時間実施してフロックを形成させ、その後静置してそのフロックを大きく成長させて沈殿させる方法が一般的である。撹拌、静置の操作は交互に繰り返しても良い。また、凝集剤は、一度に加えても徐々に少量ずつ加えてもよい。このようにして処理された後、沈殿部分と上清部分とを分離する必要がある場合には、公知の分離方法を用いればよい。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２４】
実施例１  ＜菌株の取得＞
固形培地（ＩＬの脱イオン水に、ポリペプトン、酵母エキス、ＮａＣｌをそれぞれ０．１０重量％、０．０５重量％、１重量％になるように溶解し、水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨを７．０に調整し、粉末寒天５ｇを加えたもの）を滅菌（１２１℃、１５分間）した後、別に滅菌した色素、塩基性色素Ｍｅｔｙｌｅｎｅ  Ｂｌｕｅ（ナカライテスク社製、終濃度０．０２％）を添加して、シャーレ中に固化する。１白金耳量の土壌試料を適当量の滅菌水にて分散し、一部を上記寒天平板培地上に塗布により植菌する。３０℃にて１４〜３０日間培養し、コロニー（細胞集落）の周縁に形成される色素の吸着域の存在を特徴とする菌株を、酸性ポリアミノ酸生産菌の候補として選抜した。選抜した株のこのうちの一株をＭＢ−Ａ株とした。
【００２５】
実施例２  ＜菌株の同定＞
このＭＢ−Ａ株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号１）及び５’−ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＡ／ＧＣＣＧＣＡ−３’（配列番号２）をプライマーとして、常法に従いＰＣＲを行い、１６ＳｒＲＮＡをコードする領域を増幅させた。得られた増幅断片の塩基配列を解読し、１６ＳｒＲＮＡの部分配列を決定した。
【００２６】
解読した配列と相同性のある配列をＢＬＡＳＴ検索したところ、シュードモナス  メンドシナの１６ＳｒＲＮＡとの間でと９８％の同一性を有しており、また、シュードモナス  シュードアルカリゲネスの１６ＳｒＲＮＡとの間で９８％の同一性を有しており、シュードモナス  アルカリフィリアの１６ＳｒＲＮＡとの間で９８％の同一性を有しており、ＭＢ−Ａ株は、シュードモナス属の菌株と近縁種であることが示された。また、ＭＢ−Ａ株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、５’−ＧＡＡ    ＧＴＣＡＴＣＡＴＧＡＣＣＧＴＴＣＴＧＣＡＹＧＣＮ  ＧＧＮ  ＧＧＮ  ＡＡＲ  ＴＴＹ  ＧＡ−３’（配列番号３）及び５’−ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＧＴＡ  ＣＧＧ  ＡＴＧ  ＴＧＣ  ＧＡＧ  ＣＣＲ  ＴＣＮ  ＡＣＲ  ＴＣＮ  ＧＣＲ  ＴＣＮ  ＧＴＣ  Ａ−３’（配列番号４）をプライマーとして、常法に従いＰＣＲを行い、得られた増幅領域を、５’−ＧＡＡ    ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＣＡ−３’（配列番号５）及び５’−ＡＧＣ  ＡＧＧ  ＧＴＡ  ＣＧＧ  ＡＴＧ  ＴＧＣ  ＧＡＧ  ＣＣ−３’（配列番号６）をプライマーとして、更にｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲによりｇｙｒＢ遺伝子をコードする領域を増幅させた。得られた増幅断片の塩基配列を解読し、ｇｙｒＢ遺伝子の部分配列を決定した。
【００２７】
解読した配列と相同性のある配列をＢＬＡＳＴ検索したところ、シュードモナス  アルカリフィリアのｇｙｒＢ遺伝子との間で９５％の同一性を有しており、ＭＢ−Ａ株は、シュードモナス属の菌株と近縁種であることが示された。
【００２８】
以上の結果から、ＭＢ−Ａ株がシュードモナス属に属するシュードモナス・エスピーであると同定した。
【００２９】
実施例３  ＜微生物の培養＞
シュードモナス属細菌ＭＢ−Ａ株の培養は、５００ｍｌ容の坂口フラスコ中、ポリペプトン０．１０重量％、酵母エキス０．０５重量％、ＮａＣｌ１重量％からなる培地（ｐＨ７．０）６０ｍｌで１６時間３０℃で振盪培養した後、６Ｌの０．６重量％リン酸二ナトリウム、０．３重量％リン酸二水素カリウム、０．０５重量％ＮａＣｌ，０．１重量％塩化アンモニウム、２重量％グルコース、０．０１２重量％硫酸マグネシウム、０．００２重量％塩化カルシウム、０．００１重量％チアミンからなる本培養培地に１／１００容量植菌し、４５時間、３０℃で通気培養することによって行った。
【００３０】
実施例４  ＜ポリアミノ酸の調製＞
実施例３に記載の培養の終了後、８０００ｘＧ、２０℃、２０分間にて遠心分離して微生物菌体を含む不溶性成分を除去した。この培養液上清に、２倍容量のエタノールを加え、４℃で１６時間静置した。生じた沈殿を８０００ｘＧ、４℃、２０分間にて遠心分離して集め、遠心分離した上清部分の１／５００容量の蒸留水に懸濁して、３０分間撹拌した。これを透析チューブ（分画分子量３５００）内で、蒸留水に対して、透析を行い、得られた透析物を、遠心分離にかけて沈殿する画分を除き、凍結乾燥を行い、ポリアミノ酸を得た。
【００３１】
得られたポリアミノ酸を凍結乾燥してポリアミノ酸標品を得た。上記培養液の上清１Ｌからの収量は約０．１ｇであった。酸加水分解後の産物はニンヒドリンによる呈色反応を示し、アスパラギンを含むポリアミノ酸であることが示された。また、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量を測定した。カラムはＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ（東ソー製）、溶離液は０．２Ｍリン酸カリウム−０．２Ｍ塩化ナトリウム、検出はＵＶ検出器（日立製、型式Ｌ−２４００）を用いた。ポリアミノ酸試料を上記溶離液に１８ｍｇ／ｍｌの濃度となるように溶解したものを６０μｌ注入し、０．８ｍｌ／分の流速で送液した。なお分子量の標準試料としては、ゲルろ過スタンダード（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用いた。これにより、本ポリアミノ酸は平均分子量８０００〜１００００の高分子であることが示された。
【００３２】
実施例５  ＜ポリアミノ酸標品の構成アミノ酸の分析＞
３．３ｍｇのポリアミノ酸標品を０．２ｍｌの６Ｎ塩酸に溶解させ、０．１６５重量％の溶液を調製し、蓋付きのバイアル瓶に分注した。水流アスピレーターを用いてデシケーター内で３０分減圧、窒素置換することにより酸素を除去した。１１０℃にて２０時間加水分解を行なった後、６０℃にて減圧乾固させ、０．０２ＮＨＣｌ１００μｌで再溶解した後、適宜希釈して測定サンプルとする。
【００３３】
アミノ酸（ニンヒドリン法）分析システム（日立ハイテク社製、型式：Ｌ−２０００、カラム：＃２６２２ＰＦ、４．６ｍｍ（内径）ｘ６０ｍｍ（長さ））にて、ポリアミノ酸標品中のアミノ酸を分析したところ、この標品のアスパラギン、グリシン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、アルギニンに一致するピークが観察された。グルタミン酸、グルタミン、プロリン、ヒドロキシプロリン、システイン、メチオニンおよびチロシンは観察されなかった。そして、そのピーク面積の割合から、それらのアミノ酸の含有割合（モル濃度の割合）は、アスパラギン３６．９８％、グリシン１６．８９％、セリン１５．３１％、スレオニン５．４１％、アスパラギン酸６．２１％、アラニン５．６５％、バリン３．１９％、ロイシン３．２８％、イソロイシン１．４４％、リジン２．１０％、アルギニン１．３４％と判断された。
【００３４】
実施例６  ＜ポリアミノ酸の凝集活性へのカチオンの影響＞
上記で得られたポリアミノ酸とカチオンとの組合せについて検討した。
はく陶土（Ｋａｏｌｉｎ、和光純薬製）１．５ｇを蒸留水２５０ｍｌに懸濁して、ｐＨを１ＮＮａＯＨ水溶液で５．０に調整した後、３００ｍｌまでメスアップ後、撹拌子で３０分間以上撹拌し、人工濁水とした。人工濁水４．６５ｍｌを内径１５ｍｍ、高さ１３０ｍｍの試験管に分注して、これに対し１０ｍＭ塩化アルミニウム（ＩＩＩ）、硫化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムのカチオン溶液を各々０．２５ｍｌ加えて良く撹拌した後、これに実施例４で得たポリアミノ酸の１０ｍｇ／ｍｌ溶液を０．１ｍｌ加えて、改めて１０秒間撹拌してから５分間静置し、試験液の中ほどから０．８ｍｌほど抜き出し、速やかにＯＤ５５０を測定した。凝集活性（ＦＡ）は以下の式により算出した。
ＦＡ＝１／（サンプルのＯＤ５５０）−１／（コントロールのＯＤ５５０）
ここで、コントロールは、カチオンもポリアミノ酸溶液も加えずに同様の処理を施したものである。図１に各カチオンに対する凝集活性の結果を示す。図１から、塩化アルミニウム（ＩＩＩ）あるいは塩化鉄（ＩＩＩ）を添加するだけで高い凝集活性があることがわかる。
【００３５】
これまで報告されているバイオポリマー凝集剤が要求するイオンの価数は一定ではないことが多い。例えば、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓとＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｉｓ．ｃｕｐｉｄｕｓが産生するバイオポリマー凝集剤はＣａ２＋とＡｌ３＋のいずれのイオンでも凝集沈殿が起こり、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｍａｒｅのポリマーはＮａ＋、Ｃａ２＋、Ａｌ３＋、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｊ−１はＮａ＋とＭｇ２＋と価数の異なる金属イオンの添加により凝集沈殿が起こることが報告されている。本ポリマーではこのようなことはなく、利便性が高い。
【００３６】
実施例７  ＜ポリアミノ酸の凝集活性へのアルミニウム（ＩＩＩ）イオン濃度の影響＞
実施例６で、本発明のポリアミノ酸との組合せでアルミニウム（ＩＩＩ）イオンが好適であることがわかったので、次にアルミニウム（ＩＩＩ）イオンの濃度について検討した。
はく陶土（Ｋａｏｌｉｎ、和光純薬製）１．５ｇを蒸留水２５０ｍｌに懸濁して、ｐＨを１ＮＮａＯＨ水溶液で５．０に調整した後、３００ｍｌまでメスアップ後、撹拌子で３０分間以上撹拌し、人工濁水とした。人工濁水４．６５ｍｌを内径１５ｍｍ、高さ１３０ｍｍの試験管に分注して、これに対し０．１ｍＭから１００ｍＭの塩化アルミニウム（ＩＩＩ）を各々０．２５ｍｌ加えて良く撹拌した後、これに実施例４で得たポリアミノ酸の１０ｍｇ／ｍｌ溶液を０．１ｍｌ加えて、改めて１０秒間撹拌してから５分間静置し、試験液の中ほどから０．８ｍｌほど抜き出し、速やかにＯＤ５５０を測定した。
凝集活性（ＦＡ）は以下の式により算出した。
ＦＡ＝１／（サンプルのＯＤ５５０）−１／（コントロールのＯＤ５５０）
ここで、コントロールは、塩化アルミニウム（ＩＩＩ）もポリアミノ酸溶液も加えずに同様の処理を施したものである。図２にカチオン濃度に対する凝集活性の結果を示す。図２から、塩化アルミニウム（ＩＩＩ）を１０ｍＭ添加するだけで高い凝集活性があることがわかる。
【００３７】
実施例８  ＜ポリアミノ酸の凝集活性へのポリアミノ酸濃度の影響＞
実施例７で、本発明のポリアミノ酸と組み合わせるアルミニウム（ＩＩＩ）イオンの濃度として１０ｍＭが好適であることがわかったので、次にポリアミノ酸の濃度について検討した。
はく陶土（Ｋａｏｌｉｎ、和光純薬製）１．５ｇを蒸留水２５０ｍｌに懸濁して、ｐＨを１ＮＮａＯＨ水溶液で５．０に調整した後、３００ｍｌまでメスアップ後、撹拌子で３０分間以上撹拌し、人工濁水とした。人工濁水４．６５ｍｌを内径１５ｍｍ、高さ１３０ｍｍの試験管に分注して、これに対し１０ｍＭの塩化アルミニウム（ＩＩＩ）を０．２５ｍｌ加えて良く撹拌した後、これに実施例４で得たポリアミノ酸の１．０〜２０ｍｇ／ｍｌ溶液を０．１ｍｌ加えて、改めて１０秒間撹拌してから５分間静置し、試験液の中ほどから０．８ｍｌほど抜き出し、速やかにＯＤ５５０を測定した。
凝集活性（ＦＡ）は以下の式により算出した。
ＦＡ＝１／（サンプルのＯＤ５５０）−１／（コントロールのＯＤ５５０）
ここで、コントロールは、塩化アルミニウム（ＩＩＩ）もポリアミノ酸溶液も加えずに同様の処理を施したものである。図３にポリアミノ酸濃度に対する凝集活性の結果を示す。図３から、ポリアミノ酸を１０ｍｇ／ｍｌ添加した時に最も高い凝集活性（５．２）があることがわかる。
【００３８】
比較例として、ポリアミノ酸のかわりにペクチンを用いて同様の試験を行った（添加量０．５〜３．０ｇ／ｌ、鉄（ＩＩＩ）イオン５ｍＭ、ｐＨ３．０）。その結果は、凝集活性が最大３．９（１ｇ／ｌ添加時）であった。凝集に適した条件は、凝集剤によって違いがあるので全く同一の条件での比較はできないが、本発明のポリアミノ酸が、従来から汎用されているペクチンと同等以上の凝集活性を有することが示された。
【００３９】
実施例９  ＜ポリアミノ酸の凝集活性へのｐＨ影響＞
本発明のポリアミノ酸の凝集活性に及ぼすｐＨの影響を確認した。
はく陶土（Ｋａｏｌｉｎ、和光純薬製）１．５ｇを蒸留水２５０ｍｌに懸濁して、ｐＨを１ＮＮａＯＨ水溶液で４．０から９．０に調整した後、３００ｍｌまでメスアップ後、撹拌子で３０分間以上撹拌し、人工濁水とした。人工濁水４．６５ｍｌを内径１５ｍｍ、高さ１３０ｍｍの試験管に分注して、これに対し１０ｍＭの塩化アルミニウム（ＩＩＩ）を０．２５ｍｌ加えて良く撹拌した後、これに実施例４で得たポリアミノ酸の１０ｍｇ／ｍｌ溶液を０．１ｍｌ加えて、改めて１０秒間撹拌してから５分間静置し、試験液の中ほどから０．８ｍｌほど抜き出し、速やかにＯＤ５５０を測定した。
凝集活性（ＦＡ）は以下の式により算出した。
ＦＡ＝１／（サンプルのＯＤ５５０）−１／（コントロールのＯＤ５５０）
ここで、コントロールは、塩化アルミニウム（ＩＩＩ）もポリアミノ酸溶液も加えずに同様の処理を施したものである。図４に各ｐＨに対する凝集活性の結果を示す。図４から、いずれのｐＨにおいても高い凝集活性があることがわかる。
【００４０】
比較例として、ポリアミノ酸の代わりにペクチンを用いて同様の試験を行った（添加量１．０ｇ／ｌ、鉄（ＩＩＩ）イオン５ｍＭ）。その結果は、酸性における凝集活性が本発明のポリアミノ酸と同等であったが、中性からアルカリ性ｐＨにおいて凝集活性が低下することがわかった。
【００４１】
実施例１０  ＜ポリアミノ酸による酸化チタンの回収＞
本発明のポリアミノ酸を用いた鉱物性微粒子の回収について検討した。
はく陶土（Ｋａｏｌｉｎ、和光純薬製）の代わりに、酸化チタン２５ｍｇを蒸留水２００ｍｌに懸濁して、ｐＨを１ＮＮａＯＨ水溶液で４．０に調整した後、２５０ｍｌまでメスアップ後、撹拌子で３０分間以上撹拌し、人工濁水とした。人工濁水４．６５ｍｌを内径１５ｍｍ、高さ１３０ｍｍの試験管に分注して、これに対し２０ｍＭの塩化アルミニウム（ＩＩＩ）を０．２５ｍｌ加えて良く撹拌した後、これに実施例４で得たポリアミノ酸の２５ｍｇ／ｍｌ溶液を０．１ｍｌ加えて、改めて１０秒間撹拌してから１０分間静置し、試験液の中ほどから０．８ｍｌほど抜き出し、速やかにＯＤ５５０を測定した。凝集活性（ＦＡ）は以下の式により算出した。
ＦＡ＝１／（サンプルのＯＤ５５０）−１／（コントロールのＯＤ５５０）
ここで、コントロールは、塩化アルミニウム（ＩＩＩ）もポリアミノ酸溶液も加えずに同様の処理を施したものである。ポリアミノ酸の凝集活性は８．１を示し、酸化チタンを効果的に回収することができた。
【００４２】
比較例として、ポリアミノ酸の代わりにペクチンを用いて同様の試験（添加量５．０ｇ／ｌ、鉄（ＩＩＩ）イオン５ｍＭ、ｐＨ３．０）を行った結果、凝集活性は０．７であった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明のポリアミノ酸は、少量の使用でも被処理物中の微粒子の凝集、特に鉱物性微粒子の凝集沈殿による水の清澄を迅速かつ容易に行うことができる。また、二次公害のおそれもなく、有機高分子凝集剤の代替品として好適な素材となり、工業的に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００４４】
配列番号１は、実施例１に記載の設計ポリヌクレオチドの配列である。
配列番号２は、実施例２に記載の設計ポリヌクレオチドの配列である。
配列番号３は、実施例３に記載の設計ポリヌクレオチドの配列である。
配列番号４は、実施例４に記載の設計ポリヌクレオチドの配列である。
配列番号５は、実施例５に記載の設計ポリヌクレオチドの配列である。
配列番号６は、実施例６に記載の設計ポリヌクレオチドの配列である。
【図１】
2012206998.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
2012206998000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年6月8日(2011.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＭＢ−Ａ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２０８９）が生産するポリアミノ酸。
【請求項２】
請求項１に記載のポリアミノ酸を有効成分として含有する凝集剤。
【請求項３】
鉱物性微粒子の回収に使用される請求項２に記載の凝集剤。
【請求項４】
ポリアミノ酸を生産するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＭＢ−Ａ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２０８９）。
【請求項５】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＭＢ−Ａ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２０８９）を培養し、得られた培養液からポリアミノ酸を精製する、請求項１に記載のポリアミノ酸の生産方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（５）の構成を有するものである。
（１）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＭＢ−Ａ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２０８９）が生産するポリアミノ酸。
（２）（１）に記載のポリアミノ酸を有効成分として含有する凝集剤。
（３）鉱物性微粒子の回収に使用される（２）に記載の凝集剤。
（４）ポリアミノ酸を生産するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＭＢ−Ａ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２０８９）。
（５）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＭＢ−Ａ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２０８９）を培養し、得られた培養液からポリアミノ酸を精製する、（１）に記載のポリアミノ酸の生産方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＭＢ−Ａ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２０８９）が生産するポリアミノ酸である。このポリアミノ酸は、水処理や鉱物性微粒子の回収などに使用される凝集剤の有効成分として作用することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
該ポリアミノ酸を生産する微生物としては、本発明者らによって土壌中より分離され同定された、シュードモナス属のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＭＢ−Ａ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２２０８９）が使用される。本株は、茨城県つくば市東１−１−１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、そこから容易に入手することができる。