(57)【要約】【課題】  新規コレクチンの製造手段と製造方法を提供する。【解決手段】  配列番号：４５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換した細胞を培養し、産生された新規コレクチンタンパク質を採取する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：４５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む、ことを特徴とするベクター。
【請求項２】
発現ベクターｐｃＤＮＡ３.１/Ｍｙｃ-Ｈｉｓ(＋)Ａ-ＣＬ-Ｌ２-１である請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
請求項１または２に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項４】
大腸菌、動物細胞、および、昆虫細胞からなるグループから選択される請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
請求項３または４に記載の細胞を培養し、および、産生されたコレクチンタンパク質を採取する、工程を含むことを特徴とするコレクチンタンパク質の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法に従って製造されたコレクチンタンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項５に記載の方法に従って製造されたコレクチンタンパク質を用いる、ことを特徴とする薬物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単離されたヒトおよびマウスの新規コレクチン(本明細書において各々「ｈＣＬ-Ｌ２」および「ｍＣＬ-Ｌ２」と称し、両者を区別しない場合は単に「ＣＬ-Ｌ２」と称する。)遺伝子およびタンパク質、それらの相同体、変異体、修飾体および多形性変種(これらを総じて「誘導体」と称する)、それらの断片(以下、それら全てを「ＣＬ-Ｌ２ｓ」と称する)ならびにそれらの検出に関する。また、ＣＬ-Ｌ２ｓを含む医薬用、診断用、研究用組成物、それらの製造方法および使用に関する。さらには、ＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質のアゴニストおよびアンタゴニスト、ＣＬ-Ｌ２ｓを用いた薬物のスクリーニング方法に関する。さらには、ＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子を含む発現ベクター、該発現ベクターによって形質転換された形質転換細胞、ＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質に対する抗体および該抗体を産生する細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体防御に重要な役割を担っている補体系は免疫グロブリンを認識分子とし、補体第一成分であるＣ１が活性化される古典的経路および細菌等の異物に補体第三成分であるＣ３が直接結合する第二経路が知られている。近年、これらの補体活性化経路に加えて、血清レクチンであるマンノース結合タンパク質(以下、ＭＢＰと称する)が異物表面の糖鎖を直接認識し結合することにより補体系を活性化させるレクチン経路が明らかにされた(Sato, T. et al.; Int. Immunol., 6, 665-669, 1994)。
【０００３】
ＭＢＰは、Ｃａ存在下、マンノースやＮ-アセチルグルコサミン等に特異的に結合するＣ型レクチンであり、その構造は、少なくとも(Gly-Xaa-Yaa)nから成るコラーゲン様領域、糖鎖認識領域(ＣＲＤ)を含んでいる。ＭＢＰと同様に、コラーゲン様領域およびＣＲＤを有するレクチンはコレクチンと総称され(Malhotora, R. et al. ; Eur. J. Immunol., 22, 1437-1445, 1992)、ＭＢＰ以外にコレクチン-４３(ＣＬ-４３)、サーファクタントタンパク質Ａ(ＳＰ-Ａ)、サーファクタントタンパク質Ｄ(ＳＰ-Ｄ)およびウシコングルチニン(ＢＫｇ)等を挙げることができる。コレクチンは、オプソニン活性を有し、細菌、ウィルスを始めとする様々な微生物に対する基礎免疫に関与していると考えられている(Kawasaki, N. et al.; J. Biochem., 106, 483-489, 1989、Ikeda, K. et al.; J. Biol. Chem., 262, 7451-7454, 1987、 Ohta, M. et al.; J. Biol. Chem., 265, 1980-1984, 1990、Summerfield, J. A. et al.; Lancet, 345, 886, 1995)。
【０００４】
これらのコレクチンは、第１図(ａ)に示すような、(１)ＣＲＤおよび(２)コラーゲン様領域等の特徴的な領域を含む基本構造から構成されていることが知られており(Malhortra et al.; Eur. J. Immunol., 22, 1437-1445, 1992)、この基本構造が、コラーゲン様領域においてトリプルへリックスを構成することによりサブユニットを形成し、さらにこのサブユニットが、３量体、４量体、６量体等のオリゴマー構造を形成している。
【０００５】
最近、コレクチンによる非特異的な免疫応答への関与が示唆され、例えば、母親の移行抗体や特異的防御システムが十分に発達していない小児に対し、種々の微生物の中和作用や排除に重要な役割を果たしているとの報告がなされている(Super et al.; Lancet, 2, 1236-1239, 1989)。さらに、宿主の生体防御におけるこれらのコレクチンの役割について、例えば、ＭＢＰの遺伝子上の変異に起因したＭＢＰの血中濃度の低下によって、宿主が感染を受けやすくなるという研究結果が報告されている(Sumiya et al.; Lancet, 337, 1569-1570, 1991)。また、オプソニン化不全の血清中ＭＢＰ含量は低値を示し(Madsen, H. O. et al.; Immuno genetics, 40, 37-44, 1994)細菌感染を起こしやすいという報告があり(Garred, P. et al.; Lancet, 346, 941-943, 1995)、ＭＢＰは免疫機構において重要な役割を担っていると考えることができる。
【０００６】
本発明者らは、以前にＢＫｇおよびＭＢＰがＨ１およびＨ３タイプのインフルエンザＡ型ウィルスの感染や赤血球凝集活性を阻害することを見出した(Wakamiya et al.; Glycoconjugate J., 8, 235, 1991、Wakamiya et al.; Biochem. Biophys. Res. Comm., 187, 1270-1278, 1992)。その後さらに、ＢＫｇをコードするｃＤＮＡクローンを取得し、ＢＫｇとＳＰ-Ｄ等との関連性も見出されている(Suzuki et al.; Biochem. Biophys. Res. Comm., 191, 335-342, 1993)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Sato, T. et al.; Int. Immunol., 6, 665-669, 1994
【非特許文献２】Malhotora, R. et al.; Eur. J. Immunol., 22, 1437-1445, 1992
【非特許文献３】Kawasaki, N. et al.; J. Biochem., 106, 483-489, 1989
【非特許文献４】Ikeda, K. et al.; J. Biol. Chem., 262, 7451-7454, 1987
【非特許文献５】Ohta, M. et al.; J. Biol. Chem., 265, 1980-1984, 1990
【非特許文献６】Summerfield, J.A. et al.; Lancet, 345, 886, 1995
【非特許文献７】Super et al.; Lancet, 2, 1236-1239, 1989
【非特許文献８】Sumiya et al.; Lancet, 337, 1569-1570, 1991
【非特許文献９】Madsen, H. O. et al.; Immuno genetics, 40, 37-44, 1994
【非特許文献１０】Garred, P. et al.; Lancet, 346, 941-943, 1995
【非特許文献１１】Wakamiya et al.; Glycoconjugate J., 8, 235, 1991
【非特許文献１２】Wakamiya et al.; Biochem. Biophys. Res. Comm., 187, 1270-1278, 1992
【非特許文献１３】Suzuki et al.; Biochem. Biophys. Res. Comm., 191, 335-342, 1993
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、コレクチンは、生体防御機構の解明における有用性および生理活性物質としての有用性等が期待される物質であり、このファミリーに属する新規分子種の発見は、感染症の治療の他、種々の医療分野そして生物学の分野にも寄与するところ大である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、基礎免疫の機能の解明、細菌感染症等を始めとする各種疾患等の発症機構の解明、さらにその診断、予防および治療法、並びにそれらのための試薬や医薬の開発に利用できるものを提供することを目的とする。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の(１)〜(３３)をその要旨とするものである。
【００１１】
(１)配列番号２のアミノ酸番号１〜２７１に示すアミノ酸２７１個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、または、配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸番号１〜２７１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質、あるいはこれらの誘導体および断片。
【００１２】
(２)配列番号４５(配列番号１の塩基番号２６５〜１０７７に相当)に示す塩基配列、配列番号２のアミノ酸番号１〜２７１に示すアミノ酸配列またはその断片をコードする塩基配列、または、これら塩基配列もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２のアミノ酸番号１〜２７１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００１３】
(３)配列番号４のアミノ酸番号１〜２４５に示すアミノ酸２４５個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、または、配列番号４のアミノ酸番号１〜２４５に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号４のアミノ酸番号１〜２４５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質、あるいはこれらの誘導体および断片。
【００１４】
(４)配列番号４６(配列番号３の塩基番号１４１〜８７５に相当)に示す塩基配列、配列番号４のアミノ酸番号１〜２４５に示すアミノ酸配列またはその断片をコードする塩基配列、または、これら塩基配列もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号４のアミノ酸番号１〜２４５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００１５】
(５)配列番号４７(配列番号２のアミノ酸番号１１３〜２７１に相当)に示すアミノ酸１５９個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、または、配列番号２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸番号１１３〜２７１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質、あるいはこれらの誘導体および断片。
【００１６】
(６)配列番号４８(配列番号１の塩基番号６０１〜１０７７に相当)に示す塩基配列、配列番号２のアミノ酸番号１１３〜２７１に示すアミノ酸配列またはその断片をコードする塩基配列、または、これら塩基配列もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２のアミノ酸番号１１３〜２７１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００１７】
(７)(５)に記載のタンパク質のN末端側に(Gly-Xaa-Yaa)n(但しｎは１以上５０以下の整数を示し、XaaおよびYaaはアミノ酸残基を示し、XaaとYaaは同一アミノ酸残基であっても異なるアミノ酸残基であっても良い)の構造をさらに含むことを特徴とするタンパク質。
【００１８】
(８)(７)における(Gly-Xaa-Yaa)nが下記群、すなわち、
Gly-Leu-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-Arg-Pro-Gly-Arg-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Met-Gly-Asp-Lys-Gly-Gln-Lys-Gly-Ser-Val-Gly-Arg-His-Gly-Lys-Ile-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro(配列番号４９(配列番号２：アミノ酸番号４１〜１１２に相当))、
Gly-Asp-Ala-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-Arg-Pro-Gly-Arg-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Met-Gly-Asp-Lys-Gly-Gln-Lys-Gly-Ser-Val-Gly-Arg-His-Gly-Lys-Ile-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro(配列番号５０(配列番号２：アミノ酸番号４４〜１１２、もしくは配列番号４：アミノ酸番号１８〜８６に相当))、
Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro(配列番号５１(配列番号２：アミノ酸番号９２〜１１２、もしくは配列番号４：アミノ酸番号６６〜８６に相当))、
Gly-Asp-Met-Gly-Asp-Lys-Gly-Gln-Lys-Gly-Ser-Val-Gly-Arg-His-Gly-Lys-Ile-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro(配列番号５２(配列番号２：アミノ酸番号６８〜１１２、もしくは配列番号４：アミノ酸番号４２〜８６に相当))、
Gly-Asp-Ala-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-Arg-Pro-Gly-Arg-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro(配列番号１１(配列番号２：アミノ酸番号４４〜６７および９２〜１１２、もしくは配列番号４：アミノ酸番号１８〜４１および６６〜８６に相当))、
Gly-Leu-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro(配列番号４３(配列番号２：アミノ酸番号４１〜４３および９２〜１１２に相当))、
Gly-Leu-Lys-Gly-Asp-Met-Gly-Asp-Lys-Gly-Gln-Lys-Gly-Ser-Val-Gly-Arg-His-Gly-Lys-Ile-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro(配列番号４２(配列番号２：アミノ酸番号４１〜４３および６８〜１１２に相当))、または
Gly-Leu-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-Arg-Pro-Gly-Arg-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro(配列番号４４(配列番号２：アミノ酸番号４１〜６７および９２〜１１２に相当))
を含む配列から選択されることを特徴とする(７)のタンパク質。
【００１９】
(９)(７)または(８)に記載のタンパク質をコードする塩基配列。
【００２０】
(１０)(７)または(８)に記載のタンパク質の(Gly-Xaa-Yaa)nの構造のＮ末端に以下のアミノ酸配列、すなわち、
Met-Arg-Gly-Asn-Leu-Ala-Leu-Val-Gly-Val-Leu-Ile-Ser-Leu-Ala-Phe-Leu-Ser-Leu-Leu-Pro-Ser-Gly-His-Pro-Gln-Pro-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Cys-Ser-Val-Gln-Ile-Leu-Val-Pro(配列番号５３(配列番号２：アミノ酸番号１〜４０に相当))をさらに含むことを特徴とするタンパク質。
【００２１】
(１１)(７)または(８)に記載のタンパク質の(Gly-Xaa-Yaa)nの構造のＮ末端に以下のアミノ酸配列、すなわち、
Met-Trp-Trp-Val-Pro-Pro-Ser-Pro-Tyr-Gly-Cys-Leu-Pro-Cys-Ala-Leu-Pro(配列番号５４(配列番号４：アミノ酸番号１〜１７に相当))をさらに含むことを特徴とするタンパク質。
【００２２】
(１２)(１０)または(１１)に記載のタンパク質をコードする塩基配列。
【００２３】
(１３)配列番号６のアミノ酸番号１〜１９７に示すアミノ酸１９７個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、または、配列番号６に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号６のアミノ酸番号１〜１９７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質、あるいはこれらの誘導体および断片。
【００２４】
(１４)配列番号５５(配列番号５の塩基番号１４１〜７３１に相当)に示す塩基配列、配列番号６のアミノ酸番号１〜１９７に示すアミノ酸配列またはその断片をコードする塩基配列、または、これら塩基配列もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号６のアミノ酸番号１〜１９７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００２５】
(１５)配列番号８のアミノ酸番号１〜２２１に示すアミノ酸２２１個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、または、配列番号８のアミノ酸番号１〜２２１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号８のアミノ酸番号１〜２２１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質、あるいはこれらの誘導体および断片。
【００２６】
(１６)配列番号５６(配列番号７の塩基番号１４１〜８０３に相当)に示す塩基配列、配列番号８のアミノ酸番号１〜２２１に示すアミノ酸配列またはその断片をコードする塩基配列、または、これら塩基配列もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号８のアミノ酸番号１〜２２１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００２７】
(１７)配列番号１０のアミノ酸番号１〜２２１に示すアミノ酸２２１個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、または、配列番号１０のアミノ酸番号１〜２２１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１０のアミノ酸番号１〜２２１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質、あるいはこれらの誘導体および断片。
【００２８】
(１８)配列番号５７(配列番号９の塩基番号１４１〜８０３に相当)に示す塩基配列、配列番号１０のアミノ酸番号１〜２２１に示すアミノ酸配列またはその断片をコードする塩基配列、または、これら塩基配列もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１０のアミノ酸番号１〜２２１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００２９】
(１９)配列番号１３のアミノ酸番号１〜２７１に示すアミノ酸２７１個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、または、配列番号１３のアミノ酸番号１〜２７１に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１３のアミノ酸番号１〜２７１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質、あるいはこれらの誘導体および断片。
【００３０】
(２０)配列番号５８(配列番号１２の塩基番号１５７〜９６９に相当)に示す塩基配列、配列番号１３のアミノ酸番号１〜２７１に示すアミノ酸配列またはその断片をコードする塩基配列、または、これら塩基配列もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１３のアミノ酸番号１〜２７１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００３１】
(２１)配列番号３７のアミノ酸番号１〜２２３に示すアミノ酸２２３個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、または、配列番号３７のアミノ酸番号１〜２２３に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号３７のアミノ酸番号１〜２２３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質、あるいはこれらの誘導体または断片。
【００３２】
(２２)配列番号５９(配列番号３６の塩基番号２６５〜９３３に相当)に示す塩基配列、配列番号３７のアミノ酸番号１〜２２３に示すアミノ酸配列またはその断片をコードする塩基配列、または、これら塩基配列もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号３７のアミノ酸番号１〜２２３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００３３】
(２３)配列番号３９のアミノ酸番号１〜２４７に示すアミノ酸２４７個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、または、配列番号３９のアミノ酸番号１〜２４７に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号３９のアミノ酸番号１〜２４７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質、あるいはこれらの誘導体または断片。
【００３４】
(２４)配列番号６０(配列番号３８の塩基番号２６５〜１００５に相当)に示す塩基配列、配列番号３９のアミノ酸番号１〜２４７に示すアミノ酸配列またはその断片をコードする塩基配列、または、これら塩基配列もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号３９のアミノ酸番号１〜２４７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００３５】
(２５)配列番号４１のアミノ酸番号１〜２４７に示すアミノ酸２４７個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、または、配列番号４１のアミノ酸番号１〜２４７に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号４１のアミノ酸番号１〜２４７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質、あるいはこれらの誘導体または断片。
【００３６】
(２６)配列番号６１(配列番号４０の塩基番号２６５〜１００５に相当)に示す塩基配列、配列番号４１のアミノ酸番号１〜２４７に示すアミノ酸配列またはその断片をコードする塩基配列、または、これら塩基配列もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号４１のアミノ酸番号１〜２４７に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００３７】
(２７)(２)、(４)、(６)、(９)、(１２)、(１４)、(１６)、(１８)、(２０)、(２２)、(２４)または(２６)に記載の塩基配列を含むことを特徴とするベクター。
【００３８】
(２８)(２)、(４)、(６)、(９)、(１２)、(１４)、(１６)、(１８)、(２０)、(２２)、(２４)または(２６)に記載の塩基配列を発現可能に保持する形質転換細胞。
【００３９】
(２９)(２)、(４)、(６)、(９)、(１２)、(１４)、(１６)、(１８)、(２２)、(２４)または(２６)に記載の塩基配列で形質転換した細胞を培養し、産生されたｈＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質を採取することを特徴とするタンパク質の製造法。
【００４０】
(３０)(２０)記載の塩基配列で形質転換した細胞を培養し、産生されたｍＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質を採取することを特徴とするタンパク質の製造法。
【００４１】
(３１)細胞が大腸菌、動物細胞または昆虫細胞である、(２９)または(３０)に記載の製造法。
【００４２】
(３２)ＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子の発現レベルを変化させたトランスジェニック非ヒト動物。
【００４３】
(３３)ｍＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子の機能を欠損させたノックアウトマウス。
【００４４】
(３４)(１)、(３)、(５)、(７)、(８)、(１０)、(１１)、(１３)、(１５)、(１７)、(１９)、(２１)、(２３)または(２５)に記載のタンパク質またはその断片に対する抗体。
【００４５】
(３５)ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはペプチド抗体である(３４)記載の抗体。
【００４６】
(３６)(３４)または(３５)に記載の抗体とＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質またはその断片との免疫学的な結合に基づいて、該タンパク質またはその断片を測定する方法。
【００４７】
(３７)(１)、(３)、(５)、(７)、(８)、(１０)、(１１)、(１３)、(１５)、(１７)、(１９)、(２１)、(２３)または(２５)に記載のタンパク質の機能を刺激するアゴニスト。
【００４８】
(３８)(１)、(３)、(５)、(７)、(８)、(１０)、(１１)、(１３)、(１５)、(１７)、(１９)、(２１)、(２３)または(２５)に記載のタンパク質の機能を阻害するアンタゴニスト。
【００４９】
(３９)(１)、(３)、(５)、(７)、(８)、(１０)、(１１)、(１３)、(１５)、(１７)、(１９)、(２１)、(２３)または(２５)に記載のタンパク質を用いることを特徴とする薬物のスクリーニング方法。
【００５０】
(４０)(３９)に記載のスクリーニング方法によって得られた薬物。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】従来報告されている主なコレクチンの基本構造(ａ)およびタンパク質(ＭＢＰ、ＳＰ-ＡおよびＳＰ-Ｄ)の概観を示す図である。
【図２】従来報告されている４種のコレクチンのアミノ酸配列のアラインメントの前半部分を示す図である。
【図３】従来報告されている４種のコレクチンのアミノ酸配列のアラインメントの後半部分を示す図である。
【図４】本発明の新規コレクチンの塩基配列を決定するために使用した各プライマーと、得られた新規コレクチンを示す図である。
【図５】従来報告されている４種のコレクチンと、本発明の新規コレクチン(ｈＣＬ-Ｌ２-１)のアミノ酸配列のアラインメントの前半部分を示す図である。
【図６】従来報告されている４種のコレクチンと、本発明の新規コレクチン(ｈＣＬ-Ｌ２-１)のアミノ酸配列のアラインメントの後半部分を示す図である。
【図７】本発明の新規コレクチンｈＣＬ-Ｌ２の臓器分布を示す、ヒトの種々の組織におけるｍＲＮＡの分布の分析結果を示す図である。
【図８】種々のコレクチンの遺伝的系統樹を示す図である。
【図９】本発明の新規コレクチン(ｈＣＬ-Ｌ２-１およびｈＣＬ-Ｌ２-２)の臓器分布を示す、ヒトの種々の組織におけるｍＲＮＡの分布の分析結果を示す図である。
【図１０】本発明の新規コレクチンｈＣＬ-Ｌ２-１の糖結合特性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明者らはヒトおよびマウス新規コレクチン遺伝子(ｈＣＬ-Ｌ２およびｍＣＬ-Ｌ２)のクローニングに成功した。新規ＣＬ-Ｌ２のＣ末端側には、基礎免疫に関与すると考えられるＣＲＤ(配列番号２および１３のアミノ酸番号１１３〜２７１、配列番号４のアミノ酸番号８７〜２４５)ならびに(Gly-Xaa-Yaa)n構造を有するコラーゲン様領域(配列番号２および１３のアミノ酸番号４１〜１１２、配列番号４のアミノ酸番号１８〜８６)を有していた。
【００５３】
また、ｈＣＬ-Ｌ２には第４図に示したように、Ｎ末端側のアミノ酸配列が異なる２種類のタンパク質(ＣＬ-Ｌ２-１およびＣＬ-Ｌ２-２)が存在していた。具体的には、ＣＬ-Ｌ２-１(配列番号２に示す)のＮ末端側(第１〜４３位)アミノ酸とＣＬ-Ｌ２-２(配列番号４に示す)のＮ末端側(第１〜１７位)アミノ酸が異なっており、その余は同一であった。さらに、ＣＬ-Ｌ２-１のＮ末端側アミノ酸の第１〜４３位にはシグナル配列およびコラーゲン構造１巻分等が含有されていたが、ＣＬ-Ｌ２-２のＮ末端側アミノ酸第１〜１７位にはシグナル配列およびコラーゲン様構造一巻分は存在しなかった。
【００５４】
加えて、ＣＬ-Ｌ２-２にはｍＲＮＡのオルターナティブスプライシングによって生じる３種のタンパク質が存在していた。それらをＣＬ-Ｌ２-２ｖ１(配列番号５、６)、ＣＬ-Ｌ２-２ｖ２(配列番号７、８)およびＣＬ-Ｌ２-２ｖ３(配列番号９、１０)と称す。ＣＬ-Ｌ２-２ｖ１は、配列番号４に示すＣＬ-Ｌ２-２のアミノ酸番号１８〜６５間が欠失(配列番号３に示すＣＬ-Ｌ２-２の塩基番号１９２〜３３５間が欠失)したものであり、ＣＬ-Ｌ２-２ｖ２は、配列番号４に示すＣＬ-Ｌ２-２のアミノ酸番号１８〜４１間が欠失(配列番号３に示すＣＬ-Ｌ２-２の塩基番号１９２〜２６３間が欠失)したものであり、ＣＬ-Ｌ２-２ｖ３は、配列番号４に示すＣＬ-Ｌ２-２のアミノ酸番号４２〜６５間が欠失(配列番号３に示すＣＬ-Ｌ２-２の塩基番号２６４〜３３５間が欠失)したものである。これら３種のタンパク質は、すべてＣＬ-Ｌ２-２のコラーゲン様領域内のスプライシングの差異により生じていた。
【００５５】
さらに、ＣＬ-Ｌ２-１にはｍＲＮＡのオルターナティブスプライシングによって生じる３種のタンパク質が存在していた。それらをＣＬ-Ｌ２-１ｖ１(配列番号３６、３７)、ＣＬ-Ｌ２-１ｖ２(配列番号３８、３９)およびＣＬ-Ｌ２-１ｖ３(配列番号４０、４１)と称す。ＣＬ-Ｌ２-１ｖ１は、配列番号２に示すＣＬ-Ｌ２-１のアミノ酸番号４４〜９１間が欠失(配列番号１に示すＣＬ-Ｌ２-１の塩基番号３９４〜５３７間が欠失)したものであり、ＣＬ-Ｌ２-１ｖ２は、配列番号２に示すＣＬ-Ｌ２-１のアミノ酸番号４４〜６７間が欠失(配列番号１に示すＣＬ-Ｌ２-１の塩基番号３９４〜４６５間が欠失)したものであり、ＣＬ-Ｌ２-１ｖ３は、配列番号２に示すＣＬ-Ｌ２-１のアミノ酸番号６８〜９１間が欠失(配列番号１に示すＣＬ-Ｌ２-１の塩基番号４６６〜５３７間が欠失)したものである。これら３種のタンパク質は、すべてＣＬ-Ｌ２-１のコラーゲン様領域内のスプライシングの差異により生じていた。
【００５６】
本明細書において使用するｈＣＬ-Ｌ２遺伝子とは、特記しない限り、それぞれ配列番号１に示すｈＣＬ-Ｌ２-１、配列番号３に示すｈＣＬ-Ｌ２-２、配列番号５に示すｈＣＬ-Ｌ２-２ｖ１、配列番号７に示すｈＣＬ-Ｌ２-２ｖ２、配列番号９に示すｈＣＬ-Ｌ２-２ｖ３、配列番号３６に示すｈＣＬ-Ｌ２-１ｖ１、配列番号３８に示すｈＣＬ-Ｌ２-１ｖ２、および配列番号４０に示すｈＣＬ-Ｌ２-１ｖ３を包含する。本明細書において使用するｈＣＬ-Ｌ２タンパク質とは、特記しない限り、それぞれ配列番号２に示すｈＣＬ-Ｌ２-１、配列番号４に示すｈＣＬ-Ｌ２-２、配列番号６に示すｈＣＬ-Ｌ２-２ｖ１、配列番号８に示すｈＣＬ-Ｌ２-２ｖ２、配列番号１０に示すｈＣＬ-Ｌ２-２ｖ３、配列番号３７に示すｈＣＬ-Ｌ２-１ｖ１、配列番号３９に示すｈＣＬ-Ｌ２-１ｖ２、および配列番号４１に示すｈＣＬ-Ｌ２-１ｖ３を包含する。また、それらの相同体、変異体、修飾体および多形性変種(これらを総じて「誘導体」と称する)、並びにそれらの断片を含むものとする。これらは天然または人工的作製を問わない。本発明には前記記載の全てが包含される。
【００５７】
本明細書において使用するｍＣＬ-Ｌ２遺伝子とは、特記しない限り、配列番号１２に示すｍＣＬ-Ｌ２を包含する。本明細書において使用するｍＣＬ-Ｌ２タンパク質とは、特記しない限り、それぞれ配列番号１３に示すｍＣＬ-Ｌ２を包含する。また、それらの相同体、変異体、修飾体および多形性変種(これらを総じて「誘導体」と称する)、並びにそれらの断片を含むものとする。これらは天然または人工的作製を問わない。本発明には前記記載の全てが包含される。
【００５８】
また、本発明には、実質的に配列番号２、４、６、８、１０、１３、３７、３９もしくは４１、配列番号４７(配列番号２のアミノ酸番号１１３〜２７１に相当)または配列番号１３のアミノ酸番号１１３〜２７１に示すアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列、および実質的に配列番号２、４、６、８、１０、１３、３７、３９もしくは４１、配列番号４７(配列番号２のアミノ酸番号１１３〜２７１に相当)または配列番号１３のアミノ酸番号１１３〜２７１に示すアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列をコードする塩基配列も含まれる。さらにこれらのアミノ酸配列を有するタンパク質も含まれる。配列番号２、４、６、８、１０、１３、３７、３９もしくは４１、配列番号４７(配列番号２のアミノ酸番号１１３〜２７１に相当)または配列番号１３のアミノ酸番号１１３〜２７１示すアミノ酸配列に実質的に類似するアミノ酸配列とは、配列番号２、４、６、８、１０、１３、３７、３９もしくは４１、配列番号４７(配列番号２のアミノ酸番号１１３〜２７１に相当)または配列番号１３のアミノ酸番号１１３〜２７１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質と同等の性質を有する範囲内で、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入等の改変を有するアミノ酸配列をいう。これらは天然または人工的作製を問わない。
【００５９】
かかる１または複数のアミノ酸の欠失、置換及び／または付加とは、新規コレクチンの親水性・疎水性、酸性・塩基性、含有基などに大幅な変化をきたさず、(１)Ｃａ２＋要求性の糖認識構造様領域(ＣＲＤ)及び(２)コラーゲン様領域の有する各々の基本的な特徴を変えることが少ない範囲でのアミノ酸の欠失、置換及び／または付加を称する。これまでに報告されているコレクチンファミリーのタンパク質のアミノ酸配列とその構造に基づき、例えば(１)Ｃａ２＋要求性の糖認識構造様領域(ＣＲＤ)において１〜１０程度、(２)コラーゲン様領域において１〜５０程度、好ましくは１〜１５のアミノ酸の欠失、置換及び／または付加が許容されると考えられる。
【００６０】
そして同等の性質とは、改変前のアミノ酸配列を含むタンパク質固有の性質、例えばタンパク質三次構造に関わる特性を称するものとする。
【００６１】
さらに、本発明には、配列番号１、３、５、７、９、１２、３６、３９もしくは４１、配列番号４８(配列番号１の塩基番号６０１〜１０７７に相当)または配列番号１２の塩基番号４９３〜９６９のいずれかに記載の核酸配列またはその断片を含む核酸配列、またはこれらに相補的な核酸配列(以下、特定配列と称する)とストリンジェントな条件下ハイブリダイズすることができる核酸配列も含まれる。本発明におけるストリンジェントな条件とは、例えば、５×ＳＳＣ、５％デンハート溶液(０.１％ ＢＳＡ、０.１％ Ficol 1400、０.１％ ＰＶＰ)、０.５％ ＳＤＳおよび２０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で、３７℃にて一夜インキュベートし、ついで室温にて０.１％ ＳＤＳ含有２×ＳＳＣで洗浄する条件である。ＳＳＣの代わりに適宜ＳＳＰＥを使用してもよい。この様にして得られた核酸配列は、少なくとも特定配列と５０％以上の相同性(ホモロジー)を有すると考えられる。特定配列とストリンジェントな条件下ハイブリダイズすることができる核酸配列によってコードされるタンパク質は、ＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質と同等の性質を持つものが多いと考えられ、ＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質と同等の性質を有する限り、該タンパク質も本発明に含まれる。
【００６２】
特に、配列番号２に示すｈＣＬ-Ｌ２-１(アミノ酸番号１〜２７１)のアミノ酸配列はアミノ酸２７１個から成るタンパク質であり、それをコードする塩基配列(配列番号４５)は塩基数８１３個から成る。該配列にはシグナル配列、コラーゲン様ドメイン、ＣＲＤドメイン等の特徴的なアミノ酸配列が存在していた。このタンパク質をコードする塩基配列を配列番号１に示した。
【００６３】
また、配列番号４に示すｈＣＬ-Ｌ２-２(アミノ酸番号１〜２４５)のアミノ酸配列はアミノ酸２４５個から成るタンパク質であり、それをコードする塩基配列(配列番号４６)は塩基数７３５個から成る。該配列にはコラーゲン様ドメイン、ＣＲＤドメイン等の特徴的なアミノ酸配列が存在していた。このタンパク質をコードする塩基配列を配列番号３に示した。
【００６４】
また、配列番号６に示すｈＣＬ-Ｌ２-２ｖ１(アミノ酸番号１〜１９７)のアミノ酸配列はアミノ酸１９７個から成るタンパク質であり、それをコードする塩基配列(配列番号５５)は塩基数５９１個から成る。該配列にはコラーゲン様ドメイン、ＣＲＤドメイン等の特徴的なアミノ酸配列が存在していた。このタンパク質をコードする塩基配列を配列番号５に示した。
【００６５】
また、配列番号８に示すｈＣＬ-Ｌ２-２ｖ２(アミノ酸番号１〜２２１)のアミノ酸配列はアミノ酸２２１個から成るタンパク質であり、それをコードする塩基配列(配列番号５６)は塩基数６６３個から成る。該配列にはコラーゲン様ドメイン、ＣＲＤドメイン等の特徴的なアミノ酸配列が存在していた。このタンパク質をコードする塩基配列を配列番号７に示した。
【００６６】
また、配列番号１０に示すｈＣＬ-Ｌ２-２ｖ３(アミノ酸番号１〜２２１)のアミノ酸配列はアミノ酸２２１個から成るタンパク質であり、それをコードする塩基配列(配列番号５７)は塩基数６６３個から成る。該配列にはコラーゲン様ドメイン、ＣＲＤドメイン等の特徴的なアミノ酸配列が存在していた。このタンパク質をコードする塩基配列を配列番号９に示した。
【００６７】
また、配列番号３７に示すｈＣＬ-Ｌ２-１ｖ１(アミノ酸番号１〜２２３)のアミノ酸配列はアミノ酸２２３個から成るタンパク質であり、それをコードする塩基配列(配列番号５９)は塩基数６６９個から成る。該配列にはコラーゲン様ドメイン、ＣＲＤドメイン等の特徴的なアミノ酸配列が存在していた。このタンパク質をコードする塩基配列を配列番号３６に示した。
【００６８】
また、配列番号３９に示すｈＣＬ-Ｌ２-１ｖ２(アミノ酸番号１〜２４７)のアミノ酸配列はアミノ酸２４７個から成るタンパク質であり、それをコードする塩基配列(配列番号６０)は塩基数７４１個から成る。該配列にはコラーゲン様ドメイン、ＣＲＤドメイン等の特徴的なアミノ酸配列が存在していた。このタンパク質をコードする塩基配列を配列番号３８に示した。
【００６９】
また、配列番号４１に示すｈＣＬ-Ｌ２-１ｖ２(アミノ酸番号１〜２４７)のアミノ酸配列はアミノ酸２４７個から成るタンパク質であり、それをコードする塩基配列(配列番号６１)は塩基数７４１個から成る。該配列にはコラーゲン様ドメイン、ＣＲＤドメイン等の特徴的なアミノ酸配列が存在していた。このタンパク質をコードする塩基配列を配列番号４０に示した。
【００７０】
さらに、配列番号１３に示すｍＣＬ-Ｌ２(アミノ酸番号１〜２７１)のアミノ酸配列はアミノ酸２７１個から成るタンパク質であり、それをコードする塩基配列(配列番号５８)は塩基数８１３個から成る。該配列にはコラーゲン様ドメイン、ＣＲＤドメイン等の特徴的なアミノ酸配列が存在していた。このタンパク質をコードする塩基配列を配列番号１２に示した。
【００７１】
本明細書中で使用する相同体とは、ホモロジーが高い核酸配列またはアミノ酸配列であり、ホモロジーが少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上のものをいう。配列中に欠失や挿入が存在する場合には、ギャップ結合を許した相同性検索を行うと良い。例えば、マルチプル・アライメント(商品名：ＳＯＤＨＯ、富士通)の手法を用いて検索することができる。また、相同性検索のアルゴリズムには、最も厳密なSmith-Watermanアルゴリズムを用いることができる。その他、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴ等、インターネットを通じて利用することができる。
【００７２】
本明細書中で使用する変異体とは、例えば、対立遺伝子(アレル)、一ヌクレオチド多型(Single Nucleotide Polymorphism：ＳＮＰ)等を挙げることができる。また、核酸配列の変異はコドンの縮重の範囲内で変化したものも本発明の核酸配列に含まれる。核酸配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドから成るプライマーを利用した部位特異的変異導入法(Mark, D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, 5662, 1984)等に従って行うことができる、得られた人工的遺伝子変異体も本発明の核酸配列に含まれる。また、コドンの縮重の範囲を超えた場合であっても、変異したコドンによって翻訳された変異アミノ酸が、正常アミノ酸と類似の性質であることが好ましい。例えば、脂肪族アミノ酸であるアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン間での変異、中性アミノ酸であるグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、トリプトファン、アスパラギンおよびグルタミン間での変異、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸およびグルタミン酸間での変異、塩基性アミノ酸であるアルギニン、リジンおよびヒスチジン間での変異、水酸基を有するセリンおよびトレオニン間での変異、芳香環を有するフェニルアラニンおよびチロシン間での変異等、アミノ酸の性質・機能・特性等が類似のものであるのが好ましい。これら人工的または天然に変異したタンパク質も本発明のタンパク質の含まれる。人工的には、ＰＣＲ法を用いて部位特異的変異を起こすことができ、その他公知の方法を用いて任意の場所に変異を起こさせることができる。
【００７３】
本明細書中で使用する修飾体とは、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ミリストイル化、グリコシル化、水酸化、リン酸化、硫酸化、ホルミル化、メチル化、ポリエチレングリコール化、脂質結合、ヌクレオチド結合、金属結合(カルシウム付加体等)、多のタンパク質(アルブミン等)との融合体、二量体等の改変を通常の技術を用いて施すことができる。例えば、グリコシル化は宿主が大腸菌では起こらないため、グリコシル化を企図する場合には、真核細胞に発現すると良い。昆虫細胞も哺乳細胞と同様に翻訳後にグリコシル化を行うため使用することができる。
【００７４】
本明細書中で使用する多型性変種とは、例えば、染色体ＤＮＡの構造や形態の差異により生じる多型性、ある遺伝子が対立遺伝子に変化したために生じる多型性等をいう。一般に真核生物の遺伝子は多形現象を示すことが多く、この現象によって１個あるいはそれ以上のアミノ酸が置換される場合もあり、また、その場合であってもタンパク質の活性が保持される場合もある。ゆえに、配列番号２、４、６、８、１０もしくは１３、３７、３９もしくは４１、配列番号４７(配列番号２のアミノ酸番号１１３〜２７１に相当)または配列番号１３のアミノ酸番号１１３〜２７１のいずれかに示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を人工的に改変したものを用いて得られたタンパク質をコードする遺伝子は、該タンパク質が本発明の遺伝子の特徴的な機能を有する限り全て本発明に含まれる。さらに、配列番号２、４、６、８、１０もしくは１３、３７、３９もしくは４１、配列番号４７(配列番号２のアミノ酸番号１１３〜２７１に相当)または配列番号１３のアミノ酸番号１１３〜２７１のいずれかに示されるアミノ酸配列を人工的に改変したタンパク質は、本発明のタンパク質の特徴を有する限り全て本発明に含有される。改変とは、置換、欠失、付加および／または挿入を含むと解する。
【００７５】
本明細書中で使用する断片とは、例えば、上述したＣＬ-Ｌ２ｓが有するアミノ酸配列中の任意の断片を意味し、例えば、細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、コラーゲン様ドメイン、ＣＲＤドメイン、コレクチン様ドメイン、疎水性ドメイン(膜貫通ドメイン等)、親水性ドメイン(疎水性ドメイン以外)等を挙げることができ、またこれら断片を融合させた断片挙げることができる。
【００７６】
例えば、配列番号２に示すｈＣＬ-Ｌ２-１アミノ酸配列において、ＣＲＤドメインを形成する約１１３〜２７１番目のアミノ酸を有する断片、ＣＲＤドメインおよびコラーゲン様ドメインを形成する約４１〜２７１番目のアミノ酸を有する断片、コラーゲン様ドメインを形成する約４１〜１１２番目のアミノ酸を有する断片を挙げることができる。さらに、配列番号４に示すｈＣＬ-Ｌ２-２アミノ酸配列において、ＣＲＤドメインおよびコラーゲン様ドメインを形成する約１８〜２４５番目のアミノ酸を有する断片、コラーゲン様ドメインを形成する約１８〜８６番目のアミノ酸を有する断片；配列番号６に示すｈＣＬ-Ｌ２-２ｖ１アミノ酸配列において、ＣＲＤドメインおよびコラーゲン様ドメインを形成する約１８〜１９７番目のアミノ酸を有する断片、コラーゲン様ドメインを形成する約１８〜３８番目のアミノ酸を有する断片；配列番号８に示すｈＣＬ-Ｌ２-２ｖ２アミノ酸配列において、ＣＲＤドメインおよびコラーゲン様ドメインを形成する約１８〜２２１番目のアミノ酸を有する断片、コラーゲン様ドメインを形成する約１８〜６２番目のアミノ酸を有する断片；配列番号１０に示すｈＣＬ-Ｌ２-２ｖ３アミノ酸配列において、ＣＲＤドメインおよびコラーゲン様ドメインを形成する約１８〜２２１番目のアミノ酸を有する断片、コラーゲン様ドメインを形成する約１８〜６２番目のアミノ酸を有する断片を挙げることができる。そして、配列番号３７に示すｈＣＬ-Ｌ２-１ｖ１アミノ酸配列において、ＣＲＤドメインおよびコラーゲン様ドメインを形成する約４１〜２２３番目のアミノ酸を有する断片、コラーゲン様ドメインを形成する約４１〜６４番目のアミノ酸を有する断片；配列番号３９に示すｈＣＬ-Ｌ２-１ｖ２アミノ酸配列において、ＣＲＤドメインおよびコラーゲン様ドメインを形成する約４１〜２４７番目のアミノ酸を有する断片、コラーゲン様ドメインを形成する約４１〜８８番目のアミノ酸を有する断片；配列番号４１に示すｈＣＬ-Ｌ２-１ｖ３アミノ酸配列において、ＣＲＤドメインおよびコラーゲン様ドメインを形成する約４１〜２４７番目のアミノ酸を有する断片、コラーゲン様ドメインを形成する約４１〜８８番目のアミノ酸を有する断片を挙げることができる。また、配列番号１３に示すｍＣＬ-Ｌ２アミノ酸配列において、ＣＲＤドメインを形成する約１１３〜２７１番目のアミノ酸を有する断片、ＣＲＤドメインおよびコラーゲン様ドメインを形成する約４１〜２７１番目のアミノ酸を有する断片、コラーゲン様ドメインを形成する約４１〜１１２番目のアミノ酸を有する断片を挙げることもできる。
【００７７】
ＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子取得方法
本発明のＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子は、いかなる方法で得られるものであっても良い。例えば、本発明のＣＬ-Ｌ２ｓをコードする塩基配列は、該タンパク質を発現している細胞からｍＲＮＡを調製して、常法により二本鎖ＤＮＡに変換して得ることができる。ｍＲＮＡの調製にはグアニジンイソチオシアネート・塩化カルシウム法(Chirwin, et al., Biochemistry, 18, 5294, 1979)等を用いることができる。全ＲＮＡからのポリ(Ａ)＋ＲＮＡの調製は、オリゴ(ｄＴ)を結合した担体、例えばセファロースあるいはラテックス粒子等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等を用いて行うことができる。上記のごとくして得られたＲＮＡを鋳型にして、３’末端に存在するポリ(Ａ)鎖に相補的なオリゴ(ｄＴ)またはランダムプライマーあるいはＣＬ-Ｌ２ｓのアミノ酸配列の一部に相応する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして逆転写酵素で処理し(Mol. Cell Biol., 2, 161, 1982、Mol. Cell Biol., 3, 280, 1983、Gene, 25, 263, 1983)、この様にして得られたｃＤＮＡ鎖を、例えば、E.coli RNaseH、E.coli DNA polymerase 1、E.coli DNA ligaseで処理し、ＤＮＡ鎖に変換することにより、二本鎖ｃＤＮＡを得ることができる。このｃＤＮＡをプラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターに組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいはインビトロパッケージングを施した後、大腸菌にトランスフェクトすることによりｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。
【００７８】
ここで用いることができるプラスミドベクターとしては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限されなく、ファージベクターについても宿主内で増殖できるものであれば特に制限されない。クローニング用ベクターとして、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、λｇｔ１０、λｇｔ１１等が挙げられる。また、免疫学的スクリーニングに供する場合には、宿主内でＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子を発現させることができるプロモーターを有するベクターであることが好ましい。
【００７９】
プラスミドにｃＤＮＡを組み込む方法としては、Maniatisらの方法(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition)等を参考にすることができる。また、ファージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、Hyunhらの方法(DNA cloning, a practical approach, 1, 49, 1985)等を参考にすることができる。
【００８０】
上記発現ベクターの宿主細胞への導入法としては、例えば、リポポリアミン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ハナハン法、リポフェクチン法、リン酸カルシウム法によるトランスフェクション、マイクロインジェクションおよびエレクトロポーレーション等の方法(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition)がある。インビトロパッケージングは、市販のキット(Stratagene社製、Amersham社製)を用いることによって簡便に行うことができる。
【００８１】
上記方法によって作製されたｃＤＮＡライブラリーから、ＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質をコードするｃＤＮＡを単離する方法は、一般的なｃＤＮＡスクリーニング方法を組み合わせて行うことができる。例えば、３２Ｐで標識したプローブを作製し、コロニーハイブリダイゼーション法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961, 1975)、プラークハイブリダイゼーション法(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition、Cold Spring Harbor Laboratory, 2, 108, 1989)により目的のｃＤＮＡを含有するクローンをスクリーニングすることができる。また、ＰＣＲ法によりクローンを選択することもできる。さらに、ｃＤＮＡを発現しうるベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した場合には、ＣＬ-Ｌ２ｓを認識する抗体を用いることにより目的のクローンを選択することができる。
【００８２】
また、ＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子を発現する細胞よりＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子を単離する際には、例えば、該発現細胞をＳＤＳまたはプロテナーゼＫを用いて溶解し、フェノール処理を行う。不用のＲＮＡをリボヌクレアーゼにより消化する。得られるＤＮＡを制限酵素により消化し、得られるＤＮＡ断片をファージまたはコスミドで増幅してライブラリーを作製する。その後、目的のクローンを選択し、ＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子を取得することができる。
【００８３】
この様にして得られたＤＮＡの塩基配列はマキサム・ギルバート法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560, 1977)またはサンガー法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977)によって決定することができる。ＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子は、上記得られたクローンから制限酵素等によって切り出すことにより得ることができる。
【００８４】
ＣＬ-Ｌ２塩基配列をもとに合成したプライマーを用いて、ＣＬ-Ｌ２ｓ発現細胞ポリ(Ａ)＋ＲＮＡを鋳型にしてＲＴ-ＰＣＲ法によりクローニングすることも可能である。また、ＰＣＲによらず、ＣＬ-Ｌ２ｓ塩基配列をもとにプローブを作製・合成し、直接ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、目的とするｃＤＮＡを得ることもできる。本発明の遺伝子を、これらの方法により得られた遺伝子の中から、その遺伝子の塩基配列を確認することにより選択することができる。本発明の遺伝子は、例えばホスホイミダイト法(Mattencci, M. D. et al., J. Am. Chem. Soc., 130, 3185, 1981)等の核酸化学合成を用いる常法に従って製造することもできる。
【００８５】
発現ベクターの作製方法
本発明はまた、ＣＬ-Ｌ２ｓ核酸配列を含むことを特徴とするベクターにも関する。ベクターは、例えば、ＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質を発現することができるものであれば特に制限されないが、プラスミドベクター、ＲＮＡベクター、ＤＮＡベクター、ウィルスベクター、ファージベクター等を用いることができる。具体的には、Invitrogen社製のｐＢＡＤ/Ｈｉｓ、ｐＲＳＥＴＡ、ｐｃＤＮＡ２.１、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ａ、ｐＹＥＳ２、ｐBlueBac４.５、ｐｃＤＮＡ３.１、ｐSecTag2、Novagen社製のｐＥＴ、ｐＢＡＣ、Promega社製のｐＧＥＭ、Stratagene社製のpBluescriptII、ｐＢＳ、Phagescript、ｐＳＧ、ｐＳＶ２ＣＡＴもしくはFarmacia社製のｐＧＥＸ、ｐＵＣ１８/１９、ｐＢＰＶ、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ等が挙げられる。
【００８６】
発現ベクターにライゲーションしたＣＬ-Ｌ２ｓｃＤＮＡ配列は、プロモーターに機能的に連結させる。プロモーターは例えば、ファージλＰＬプロモーター、E.coli ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、Ｔ７およびＴ３プロモーター、レトロウィルスＬＴＲプロモーターが挙げられる。特に、真核細胞に使用するプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、レトロウィルスＬＴＲプロモーター、ＲＳＶプロモーター、メタロチオネインプロモーターがある。また、発現ベクターは、形質転換した宿主を選択可能にすべきマーカーおよびエンハンサーを含有しても良い。マーカーには、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子等がある。エンハンサーには、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウィルス初期エンハンサープロモーター、アデノウィルスエンハンサー等がある。
【００８７】
形質転換細胞の作製方法
さらに、本発明は上記したようなベクターによりこれらが保持する本発明の塩基配列を発現可能に保持する形質転換細胞を提供する。本明細書における形質転換細胞に用いる宿主細胞としては、好ましくは動物細胞および昆虫細胞であるが、本発明の発現ベクター中のＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質を発現することが可能な全ての細胞(微生物を含む)が挙げられる。
【００８８】
本明細書における動物細胞もしくは昆虫細胞としては、それぞれヒト由来の細胞、ハエもしくはカイコ由来の細胞が挙げられる。例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ミエローマ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Jurkat細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウスＦＭ３Ａ細胞、マウス繊維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、High Five(登録商標)細胞等がある。本明細書における微生物とは、大腸菌もしくは酵母等が含まれる。これら宿主への導入は上記記載した方法を用いることができる。
【００８９】
本発明のＣＬ-Ｌ２ｓ発現細胞は、感染症、免疫等に関わるコレクチン経路を解析するために用いることができる。また、ＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質または糖鎖のあるＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質の製造に利用することができる。ＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質に対するアゴニストまたはアンタゴニストの取得のためのスクリーニングにも利用できる。
【００９０】
タンパク質取得方法
本発明は、上記したような本発明の塩基配列で形質転換した細胞を培養し、産生されたＣＬ-Ｌ２ｓを採取する、ＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質の製造法にも関する。細胞の培養、タンパク質の分離、精製も、自体公知の方法によって行うことができる。
【００９１】
本発明のタンパク質は、それ自体、単離・精製・認識しやすいように組換え融合タンパク質として発現させることができる。組換え融合タンパク質とは目的タンパク質をコードする核酸配列により発現されたタンパク質のＮ末端側または／およびＣ末端側に適当なペプチド鎖を付加して発現させたタンパク質である。発現したタンパク質の精製を容易にする目的で、細胞外分泌シグナルを有する融合タンパク質として発現させても良い。また、タンパク質は、各種原料、例えば培養細胞、培養組織、形質転換細胞等のタンパク質産生原料から従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法等の塩析、セファデックス等によるゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、色素ゲルクロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外濾過法、アフィニティークロマトグラフィー法および高速液体クロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて得ることができる。
【００９２】
遺伝子利用方法
配列番号１、３、５、７、９、１２、３６、３８もしくは４０、配列番号４８(配列番号１の塩基番号６０１〜１０７７に相当)または配列番号１２の塩基番号４９３〜９６９のいずれかに記載の塩基配列に基づいて、ＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子を検出するためのプローブを設定することができる。あるいは、これらの塩基配列を含むＤＮＡやＲＮＡを増幅するためのプライマーを設定することができる。与えられた配列をもとにプローブやプライマーを設定することは、当業者が日常的に行っている。設定された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成によって得ることができる。そしてそのオリゴヌクレオチドに適当な標識を付加すれば、様々な形式のハイブリダイゼーションアッセイに利用することができる。あるいはＰＣＲの様な核酸の合成反応に利用することができる。プライマーに利用するオリゴヌクレオチドは少なくとも１０塩基、好適には１５〜５０塩基の長さとするのが望ましく、プローブに利用するオリゴヌクレオチドは１００塩基から全長の長さであることが望ましい。また、ＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質をコードする遺伝子変異の検出およびＳＮＰの検出等にも用いることができことから、ＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子変異によって生ずる疾患の診断に用いることができる。例えば、細菌感染症等を始めとする各種疾患等の診断に利用できるものと予想される。また、ＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子を生体内に導入し発現させることによる遺伝子治療にも有用である。
【００９３】
さらに、本発明が提供するＣＬ-Ｌ２ｓのｃＤＮＡ塩基配列に基づいて、ゲノム中に存在するＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子のプロモーター領域、エンハンサー領域を取得することも可能である。具体的には特開平６−１８１７６７号、J. Immunol., 155, 2477, 1995、Proc. Natl. Acad. Sci, USA., 92, 3561, 1995)等と同様の方法でこれらの制御領域の取得が可能である。本明細書中で言うプロモーター領域とは転写開始部位の上流に存在する遺伝子の発現を制御するＤＮＡ領域を、エンハンサー領域とはイントロン、５’非翻訳領域、または３’非翻訳領域に存在する遺伝子の発現を増強するＤＮＡ領域を言う。
【００９４】
タンパク質利用方法
本発明のＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質は、基礎免疫の機能の解明、細菌感染症等を始めとする各種疾患等の発症機構の解明、さらにその診断、予防および治療法、並びにそれらのための試薬や医薬の開発に利用できる可能性がある。また、ＣＬ-Ｌ２ｓに対する抗体を作製する際の抗原として用いることができる。さらに、アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法にも利用できる。
【００９５】
アゴニストおよびアンタゴニスト
本発明は、また、本発明のＣＬ-Ｌ２ｓの活性または活性化を刺激するアゴニストにも関する。本発明は、また、本発明のＣＬ-Ｌ２ｓの活性または活性化を阻害するアンタゴニストにも関する。アンタゴニストのスクリーニングは、例えば、ＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質を発現させた細胞に候補阻害剤とマンノースまたは抗体を作用させる競合的実験系を用いることができ、マンノースとの結合割合から候補阻害剤をスクリーニングすることができる。その他、自体公知の方法により行うことができる。また、アンタゴニストにはＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子の発現を阻害するアンチセンス核酸も含まれる。他のスクリーニング方法として、受容体の活性化によって生じる細胞外ｐＨの変化を測定する方法(Science, 246, 181-296, 1989)などを挙げることができる。
【００９６】
トランスジェニック非ヒト動物
本発明は、ＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子の発現レベルを変化させたトランスジェニック非ヒト動物に関する。ここで、ＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子とは、ｈＣＬ-Ｌ２ｓもしくはｍＣＬ-Ｌ２ｓをコードするｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡあるいは合成ＤＮＡを含む。また、遺伝子の発現には転写と翻訳のいずれのステップも含まれる。本発明によるトランスジェニック非ヒト動物は、ＣＬ-Ｌ２の機能あるいは発現調節の研究、ＣＬ-Ｌ２ｓが関与すると予想される疾患のメカニズム解明、医薬品のスクリーニング・安全性試験に用いる疾患モデル動物の開発に有用である。
【００９７】
本発明においては、遺伝子の発現を正常に調節しているいくつかの重要な部位(エンハンサー、プロモーター、イントロン等)の一部に欠失、置換、付加および／または挿入などの変異を起こさせることにより、本来の遺伝子の発現レベルと比較して上昇または下降するように人工的に修飾することができる。この変異の導入は、公知の方法により行うことができ、トランスジェニック動物を得ることができる。
【００９８】
トランスジェニック動物とは狭義には遺伝子組換えにより、外来遺伝子が生殖細胞に人為的に導入された動物のことをいい、広義にはアンチセンスＲＮＡを用いて特定の遺伝子の機能を抑えたアンチセンス・トランスジェニック動物や、胚性幹細胞(ＥＳ細胞)を用いて特定の遺伝子をノックアウトした動物、点突然変異ＤＮＡを導入した動物を含み、個体発生の初期に外来遺伝子が安定して染色体に導入され、その子孫に遺伝形質として伝達され得る動物のことをいう。
【００９９】
本明細書中でいうトランスジェニック動物とはヒト以外のすべての脊椎動物を含む広義の意味に解する。本発明におけるトランスジェニック動物は、ＣＬ-Ｌ２ｓの機能あるいは発現調節の研究、ヒトにおいて発現している細胞に関連する疾患のメカニズムの解明、医薬品のスクリーニング・安全性試験に用いる疾患モデル動物の開発に有用である。
【０１００】
トランスジェニック動物の作製方法は、位相差顕微鏡下で前核期卵子の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法(マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号)、胚性幹細胞(ＥＳ細胞)を使用する方法などがある。その他、レトロウィルスベクターまたはアデノウイルスベクターに遺伝子を挿入し、卵子に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵子に導入する精子ベクター法等が開発されている。
【０１０１】
精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である(M. Lavitranoetら、Cell, 57, 717, 1989)。あるいはバクテリオファージＰ１のｃｒｅ/ｌｏｘＰリコンビナーゼ系やサッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)のＦＬＰリコンビナーゼ系等によるin vivoにおける部位特異的遺伝子組換えを用いることもできる。また、レトロウィルスを使用して、非ヒト動物へ目的タンパク質のトランスジーンを導入する方法も報告されている。
【０１０２】
マイクロインジェクション法によるトランスジェニック動物作製方法は、例えば、以下に示すようにして行われる。
【０１０３】
まず、発現制御に関わるプロモーター、特定のタンパク質をコードする遺伝子、ポリＡシグナルから基本的に構成されるトランスジーンが必要である。プロモーター活性により特定分子の発現様式や発現量が左右され、また、導入トランスジーンのコピー数や染色体上の導入部位により作製されたトランスジェニック動物が系統間で異なるため、各系統間で発現様式・発現量を確認する。非翻訳領域やスプライシングにより発現量が変化することが判明しているため、予めポリＡシグナルの前にスプライシングされるイントロン配列を導入してもよい。受精卵に導入する遺伝子はできるだけ純度の高いものを使用することが重要である。使用する動物としては、受精卵採取用マウス(５〜６週齢)、交配用雄マウス、偽妊娠雌マウス、輸精管結紮雄マウス等が用いられる。
【０１０４】
効率よく受精卵を得るために、ゴナドトロピン等により排卵を誘発してもよい。受精卵を回収し、マイクロインジェクション法にて卵子の雄性前核にインジェクションピペット中の遺伝子を注入する。注入した卵子を輸卵管に戻すための動物(偽妊娠雌マウス等)を用意し、一匹に対して約１０〜１５個を移植する。その後、誕生したマウスにトランスジーンが導入されているか否かを、尾の先端部からゲノムＤＮＡを抽出し、サザン法あるいはＰＣＲ法によりトランスジーンを検出するか、あるいは相同組み換えが起こったときのみに活性化するマーカー遺伝子を挿入したポジティブクローニング法により確認することができる。さらに、トランスジーンの発現を確認するため、ノザン法もしくはＲＴ-ＰＣＲ法によりトランスジーン由来転写産物を検出する。または、タンパク質またはその断片に対する特異的抗体によって、ウェスタンブロッティングを行ってもよい。
【０１０５】
ノックアウトマウス
本発明のノックアウトマウスは、ＣＬ-Ｌ２ｓ遺伝子の機能が失われるように処理されたものである。ノックアウトマウスとは相同組換え技術により任意の遺伝子を破壊し、機能を欠損させたトランスジェニックマウスをいう。ＥＳ細胞を用いて相同組換えを行い、一方の対立遺伝子を改変・破壊した胚性幹細胞を選別し、ノックアウトマウスを作製することができる。例えば、受精卵の胚盤胞や桑実胚期に遺伝子を操作した胚性幹細胞を注入して、胚性幹細胞由来の細胞と胚由来の細胞が混ざったキメラマウスを得る。このキメラマウス(キメラとは、２個以上の受精卵に基づいた体細胞で形成される単一個体をいう)と正常マウスを交配すると、一方の対立遺伝子の全てが改変・破壊されたヘテロ接合体マウスを作製することができる。さらに、ヘテロ接合体マウス同士を交配することで、ホモ接合体マウスが作製できる。
【０１０６】
相同組換えとは、遺伝子組換え機構で塩基配列が同じ、または非常に類似している２つの遺伝子間で起こる組換えのことをいう。相同組換えを起こした細胞の選別にはＰＣＲを使用することができる。挿入遺伝子の一部と挿入が期待される領域の一部をプライマーとして用いるＰＣＲを行い、増幅産物ができた細胞で相同組換えを起こしていることが判明できる。また、胚幹細胞で発現している遺伝子に相同組み換えを起こさせる場合には、導入遺伝子にネオマイシン耐性遺伝子を結合させておき、導入後に細胞をネオマイシン耐性にさせることにより選択することができる等、公知の方法およびそれらの変法を用いて容易に選択することができる。
【０１０７】
抗体の作製方法
本発明はまた、ＣＬ-Ｌ２ｓまたはその断片を認識する抗体を提供する。本発明の抗体には例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１３、３７、３９もしくは４１、配列番号４７(配列番号２のアミノ酸番号１１３〜２７１)または配列番号１３のアミノ酸番号１１３〜２７１のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片に対する抗体が含まれる。ＣＬ-Ｌ２ｓまたはその断片に対する抗体(例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ペプチド抗体)または抗血清は、本発明のＣＬ-Ｌ２ｓまたはの断片等を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。特に、ＣＬ-Ｌ２ｓの機能を制御できる抗体(例えばＣＲＤおよびコラーゲン様ドメイン等を認識する抗体)は抗体含有医薬品として有用である。
【０１０８】
本発明のＣＬ-Ｌ２ｓまたはその断片は、投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体または希釈剤、担体と共に温血動物に対して投与される。投与に際して抗体産生を高めるために、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与しても良い。投与は通常１〜６週毎に１回づつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ等が挙げられるが、マウスおよびラットが好ましくは用いられる。ラットにはWistarおよびＳＤ系ラット等が好ましく、マウスにはＢＡＬＢ/ｃ、Ｃ５７ＢＬ/６およびＩＣＲ系マウス等が好ましく用いられる。
【０１０９】
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められる個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば後記の標識化ＣＬ-Ｌ２ｓと抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法(Nature, 256, 495, 1975)やその変法(J. Immunol. Method, 39, 285, 1980、Eur. J. Biochem., 118, 437, 1981、Nature, 285, 446, 1980)に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)やセンダイウィルス等が挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。さらに融合効率を高めるために、適宜レクチン、ポリ-Ｌ-リジンもしくはＤＭＳＯを添加することもできる。
【０１１０】
骨髄腫細胞としては例えばＸ-６３Ａｇ８、ＮＳ-１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２/０、ＡＰ-１等が挙げられるが、好ましくはＳＰ２/０が用いられる。用いられる抗体産生細胞(脾臓細胞)数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：２０〜２０：１であり、ＰＥＧ(好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００)を１０〜８０％程度の濃度で添加し、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。抗ＣＬ-Ｌ２ｓ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、ＣＬ-Ｌ２ｓ抗原を直接または担体と共に吸着させた固相(例えば、マイクロプレート)にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体(細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる)またはプロテインＡを加え、固相に結合した抗ＣＬ-Ｌ２ｓ抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素等で標識したＣＬ-Ｌ２ｓを加え、固相に結合した抗ＣＬ-Ｌ２ｓモノクローナル抗体を検出する方法等が挙げられる。
【０１１１】
抗ＣＬ-Ｌ２ｓモノクローナル抗体の選別およびクローニングは、自体公知またはそれに準じる方法に従って行うことができる。通常ＨＡＴ(ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン)を添加した動物細胞用培地で行われる。選別、クローニングおよび育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地、またはハイブリドーマ培養用無血清培地等を用いることができる。培養温度は、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行われる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗ＣＬ-Ｌ２ｓ抗体価の測定と同様にして測定できる。すなわち、測定方法としてはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)法、酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)法、ＦＩＡ(蛍光イムノアッセイ)法、プラーク測定法、凝集反応法等を用いることができるが、以下に示すようなＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【０１１２】
ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングは以下の方法に準じて行うことができる。免疫抗原と同様の操作で調製したタンパク質をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルの表面に固定化する。次に、非特異的吸着を防止する目的で、ＢＳＡ、ＭＳＡ、ＯＶＡ、ＫＬＨ、ゼラチンもしくはスキムミルク等を各ウェルに固定化する。この各ウェルにハイブリドーマ培養上清液を添加し、一定時間放置し免疫反応を行わせる。ＰＢＳ等を洗浄液として各ウェルを洗浄する。この洗浄液中には界面活性剤を添加することが好ましい。酵素標識二次抗体を添加し一定時間放置する。標識酵素としては、β-ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等を用いることができる。同じ洗浄液で各ウェルを洗浄後、使用した標識酵素の基質溶液を添加し酵素反応を行わせる。添加したハイブリドーマ培養上清液中に目的とする抗体が存在する場合は酵素反応が進行し基質溶液の色が変化する。
【０１１３】
クローニングは、通常半固体アガー法や限界希釈法等のそれ自体公知の方法で行うことができ、具体的には前記の方法で目的とする抗体を産生するウェルを確認した後、クローニングを行いシングルクローンを得る。クローニング法としては、培養プレート１ウェル当たりに１個のコロニーが形成するようにハイブリドーマ細胞を希釈して培養する限界希釈法等を用いると良い。限界希釈法によるクローニングには、コロニー形成能と高めるために支持細胞を用いるか、インターロイキン６などの細胞増殖因子を添加しても良い。その他、ＦＡＣＳおよびシングルセルマニプレーション法を用いてクローニングすることができる。クローン化されたハイブリドーマを、好ましくは無血清培地中で培養し、至適量の抗体をその上清に加える。この様にして得られた単一のハイブリドーマは、フラスコや細胞培養装置を用いて大量培養を行うか、動物の腹腔内で培養する(J. Immunol. Meth., 53, 313, 1982)ことにより、モノクローナル抗体を得ることができる。フラスコ内で培養を行う場合は、０〜２０％のＦＣＳを含む細胞培養用培地(ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０およびＭＥＭ等)を用いて行うことができる。動物の腹腔内で培養する場合は、細胞融合に使用した骨髄腫細胞の由来となった動物と同種、同系統の動物または胸腺欠損ヌードマウス等を使用することが好ましく、予めプリスタン等の鉱物油を投与してからハイブリドーマを移植する。１〜２週間後腹腔内に骨髄腫細胞が増殖し、モノクローナル抗体を含む腹水を得ることができる。
【０１１４】
本発明によるモノクローナル抗体は、ＣＬ-Ｌ２ｓに特異的なエピトープを認識するものを選択することによって、他のタンパク質と交差しないものとすることができる。一般的にそのタンパク質を構成するアミノ酸配列の中から、連続する少なくとも５以上のアミノ酸残基、望ましくは７〜２０アミノ酸のアミノ酸配列によって提示されるエピトープは、そのタンパク質に固有のエピトープを示すと言われている。従って、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１３、３７、３９もしくは４１、配列番号４７(配列番号２のアミノ酸番号１１３〜２７１に相当)または配列番号１３のアミノ酸番号１１３〜２７１のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片のいずれかに記載されたアミノ酸から選択され、かつ連続する少なくとも５アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を持つペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体は、本発明におけるｈＣＬ-Ｌ２ｓもしくはｍＣＬ-Ｌ２ｓ特異的なモノクローナル抗体といえる。配列番号２、４、６、８、１０、１３、３７、３９もしくは４１に記載されたアミノ酸配列の間で保存されたアミノ酸配列を選べば、ＣＬ-Ｌ２ｓに共通のエピトープを選択することができる。あるいは、各配列に特異的なアミノ酸配列を含む領域であれば、それぞれのタンパク質の識別が可能なモノクローナル抗体を選択することができる。
【０１１５】
抗ＣＬ-Ｌ２ｓモノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。公知の精製法としては、例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、硫安沈殿法、イオン交換体(例えば、ＤＥＡＥ)による吸脱着法、超遠心法、ゲル濾過法、抗原結合固相またはプロテインＡもしくはプロテインＧ等の活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法のような手法を施すことができる。精製過程において凝集物の形成や抗体価の低下を防止する目的で、例えば、ヒト血清アルブミンを０.０５〜２％の濃度で添加する。その他、グリシン、α-アラニン等のアミノ酸類、特にリジン、アルギニンおよびヒスチジン等の塩基性アミノ酸、グルコースやマンニトール等の糖類または塩化ナトリウム等の塩類を添加しても良い。ＩｇＭ抗体の場合、特に凝集しやすいことが知られているため、β-プロピオニラクトンおよび無水酢酸で処理しても良い。
【０１１６】
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原(タンパク質抗原)自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体を作り、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質またはその断片に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。温血動物を免役するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免役したハプテンに対して抗体が効率よくできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させても良いが、例えばウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカップリングさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカップリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオピリジル基を含有する活性エステル試薬などが用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与しても良い。投与は、通常２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行われる。ポリクローナル抗体は上記の方法で免役された温血動物の血液、腹水等、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
【０１１７】
抗体の利用方法
ＣＬ-Ｌ２ｓまたはその断片に対するモノクローナル抗体ならびにポリクローナル抗体は、ＣＬ-Ｌ２ｓを発現している細胞に関連する疾病の診断や治療に利用することが可能である。これらの抗体を用いて、本発明のＣＬ-Ｌ２ｓまたはその断片との免疫学的な結合に基づき、ＣＬ-Ｌ２ｓまたはその断片を測定することができる。具体的にこれらの抗体を用いてＣＬ-Ｌ２ｓまたはその断片を測定する方法としては、例えば、不溶性担体に結合させた抗体と標識化抗体とによりＣＬ-Ｌ２ｓまたはその断片を反応させて生成したサンドイッチ錯体を検出するサンドイッチ法、また、標識化ＣＬ-Ｌ２ｓと検体中のＣＬ-Ｌ２ｓまたはその断片を抗体と競合的に反応させ、抗体と反応した標識抗原量から検体中のＣＬ-Ｌ２ｓまたはその断片を測定する競合法を利用して検体中のＣＬ-Ｌ２ｓまたはその断片を測定する方法が挙げられる。
【０１１８】
サンドイッチ法によるＣＬ-Ｌ２ｓまたはその断片の測定においては、まず、固定化抗体とＣＬ-Ｌ２ｓまたはその断片とを反応させた後、未反応物を洗浄によって完全に除去し、標識化抗体を添加して固定化抗体-ＣＬ-Ｌ２ｓ標識化抗体を形成させる２ステップ法もしくは固定化抗体、標識化抗体およびＣＬ-Ｌ２ｓまたはその断片を同時に混合する１ステップ法などを用いることができる。
【０１１９】
測定に使用される不溶性担体は、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリル酸エステル、ナイロン、ポリアセタール、フッ素樹脂等の合成樹脂、セルロース、アガロース等の多糖類、ガラス、金属等が挙げられる。不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等の種々の形状を用いることができる。抗体を吸着した担体は、適宜アジ化ナトリウム等の防腐剤の存在下、冷所に保存する。
【０１２０】
抗体の固層化には、公知の化学的結合法または物理的吸着法を用いることができる。化学的結合法としては、例えば、グルタルアルデヒドを用いる方法、Ｎ-スクシニイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレートおよびＮ-スクシニイミジル-２-マレイミドアセテートなどを用いるマレイミド法、１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸などを用いるカルボジイミド法が挙げられる。その他、マレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシサクシニミドエステル法、Ｎ-サクシミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオン酸法、ビスジアゾ化ベンジジン法、ジパルミチルリジン法が挙げられる。あるいは、先に被検出物質とエピトープの異なる２種類の抗体を反応させて形成させた複合体を、抗体に対する第３の抗体を上記の方法で固層化させておいて捕捉することも可能である。
【０１２１】
標識物質としては、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質および金属キレート等を使用するのが好ましい。酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β-Ｄ-ガラクトシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ-５-ステロイドイソメラーゼ、α-グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋わさびパーオキシダーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等が挙げられ、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチアネート、フィコビリプロテイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オルトフタルアルデヒド等が挙げられ、発光物質としては、イソルミノール、ルシゲニン、ルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびその修飾エステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリン等が挙げられ、放射性物質としては、１２５Ｉ、１２７Ｉ、１３１Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３５Ｓ等が挙げられるが、これらに限らず免疫学的測定法に使用することができるものであれば特に限定されない。さらに、抗体にビオチン、ジニトロフェニル、ピリドキサールまたはフルオレサミンの様な低分子ハプテンを結合させても良い。好ましくは、西洋わさびペルオキシダーゼを標識化酵素として用いる。本酵素は多くの基質と反応することができ、過ヨウ素酸法によって容易に抗体に結合させることができる。
【０１２２】
標識化剤が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、必要により発色剤を用いる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質溶液としてＨ２Ｏ２を用い、発色剤として２，２’-アジノ-ジ-[３-エチルベンズチアゾリンスルホン酸]アンモニウム塩(ＡＢＴＳ)、５-アミノサリチル酸、オルトフェニレンジアミン、４-アミノアンチピリン、３，３’，５，５’-テトラメチルベンジジン等を使用することができ、酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は基質としてオルトニトロフェニルフォスフェート、パラニトロフェニルリン酸等を使用することができ、酵素にβ-Ｄ-ガラクトシダーゼを用いる場合は基質としてフルオレセイン-ジ-(β-Ｄ-ガラクトピラノシド)、４-メチルウンベリフェニル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド等を使用することができる。本発明には、また、前述のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および試薬類をキット化したのものも含まれる。
【０１２３】
架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’-オルトフェニレンジマレイミド、４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン酸・Ｎ-スクシンイミドエステル、６-マレイミドヘキサン酸・Ｎ-スクシンイミドエステル、４，４’-ジチオピリジン、その他公知の架橋剤が利用可能である。これらの架橋剤と酵素および抗体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に応じて既知の方法に従って行えばよい。また、抗体としては、場合によっては、そのフラグメント、例えば、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)２を用いる。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体にかかわらず同様の処理により酵素標識体を得ることができる。上記架橋剤を用いて得られる酵素標識体をアフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法にて精製すれば、さらに感度の高い免疫測定系が可能となる。精製した酵素標識化抗体は、安定剤としてチメロサールもしくはグリセリン等を加えて、あるいは、凍結乾燥して冷暗所に保存する。
【０１２４】
測定対象は、血漿、血清、血液、尿、組織液、脳脊髄液等の体液、各種細胞、組織等、ＣＬ-Ｌ２ｓを含む試料であれば限定されない。
【０１２５】
ヒト化抗体の作製方法
ヒトに任意の抗原を免疫して抗体を製造することは倫理上不可能である。また、マウスモノクローナル抗体をヒトの体内に投与すると、ヒトにとっては異種タンパクであるので種々の副作用が起こる危険性がある。そこで、ヒトに抗体を投与する場合にはヒトに対し抗原性を低くした抗体が好ましい。
【０１２６】
ヒトモノクローナル抗体の作製方法には細胞融合法以外にも、エプスタイン・バール(Epstein-Barr)ウィルス(ＥＢＶ)で形質転換する方法、さらにはその形質転換した細胞を親細胞と融合させる方法、遺伝子工学を利用しキメラ抗体、ヒト化抗体を作製する方法などがある。キメラ抗体とは異種の動物の免疫グロブリン遺伝子断片をつなげて作製された抗体であり、ヒト化抗体とはマウスなどにヒトにとって異種の抗体を改変して、Ｈ鎖とＬ鎖の相補性決定部(ＣＤＲ)以外の一次構造をヒトの抗体の対応する一次構造に置換した抗体をいう。
【０１２７】
キメラ抗体の作製方法として、まずマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部(Ｖ領域)を切り出し、ヒト骨髄腫由来の抗体定常部(Ｃ領域)遺伝子と結合してキメラ遺伝子を作製する。このキメラ遺伝子を宿主細胞で発現させれば、ヒト・マウス・モノクローナル抗体が産生できる。キメラ抗体はヒトに対する抗原性が少ないため、ヒト体内に投与する治療用や画像診断用モノクローナル抗体等として利用できる。公知のキメラ抗体の関連技術として、特開平０５−３０４９８９号、特開平０４−３３０２９５号、WO9106649、特開昭６３−０３６７８６号、特公平０６−９８０２１号等がある。
【０１２８】
また、最近キメラ抗体よりも有用であるといわれるヒト化抗体が開発された。ヒト化抗体とは抗体分子の抗原結合部位(ＣＤＲ：Complementary determining reagion、相補性決定領域)の遺伝子配列のみをヒト抗体遺伝子に移植(ＣＤＲグラフティング)し、抗体分子のＣＤＲを除いた全分子をヒト化した抗体である。本抗体はヒト・マウス・キメラ抗体より、マウスの抗体部分が少ないため、抗原性が少なく安全性が高いと言われている。ヒトモノクローナル抗体作製用の親細胞は、ヒト/マウスのヘテロミエローマであるＳＨＭ-Ｄ３３株(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６８)またはＲＦ-Ｓ１株を用いるとマウスの親細胞と同等の高い融合効率が得られる。これらの親細胞を用いて得られたハイブリドーマはフィーダー細胞なしでクローニングが可能であり、ＩｇＧタイプの抗体を比較的安定にしかも大量に産生することができる。親細胞の培養には、１５％ＦＣＳを加えたＥＲＤＦ培地を用い、その他の操作はマウスの場合と同様である。また、ＩｇＧタイプのヒトモノクローナル抗体を作製するには抗原で充分に感作されたヒトリンパ球を末梢血から採取して用いるのが好ましい。充分に抗原で感作されたリンパ球の取得が困難な場合にはin vitroで抗原感作を行うこともできる。我が国では現在、成人性T細胞白血病に対するヒト化抗体の臨床試験が行われている。ヒト化抗体の製造方法およびその関連技術については、米国Genentech社(WO9222653、WO9845332、WO9404679、WO9837200、WO9404679、)および英国Celltech社(WO9429451、WO9429351、WO9413805、WO9306231、WO9201059、WO9116927、WO9116928、WO9109967、WO8901974、WO8901783)等が特許出願している。
【０１２９】
上記示した方法等を用いることにより、本発明の抗体をヒト化することができ、ヒトに投与する場合には非常に有用である。
【０１３０】
組成物
ＣＬ-Ｌ２ｓポリヌクレオチドまたはタンパク質は、細菌感染症等を始めとする各種疾患等の診断、予防および治療法、ならびに、それらのための試薬や医薬の開発に利用できる可能性がある。
【０１３１】
本発明の医薬組成物の成分には、ＣＬ-Ｌ２ｓポリヌクレオチドまたはタンパク質、ＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質の機能を刺激する物質もしくは阻害する物資、ＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質に対する抗体等の物質(以下、ＣＬ-Ｌ２ｓ関連物質)が含まれる。ＣＬ-Ｌ２ｓ関連物質は、そのままあるいは水に希釈する等の各種処理を施して使用することができるが、医薬品、医薬部外品等に配合して使用することができる。この場合、該物質の配合量は製品に応じて適宜選択されるところではあるが、通常全身投与製剤の場合には、０.００１〜５０重量％、特に０.０１〜１０重量％とすることができ、０.００１％より少ないと満足する涙液分泌促進作用が認められない可能性があり、また、５０％を越えると製品そのものの安定性や香味等の特性が損なわれる可能性がある。
【０１３２】
投与経路は前記示した経口投与および静脈内投与以外に、経粘膜投与、経皮投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸内投与等が適宜選択できる。
【０１３３】
本発明のＣＬ-Ｌ２ｓ関連物質は塩として製剤中に含有されていてもよい。薬剤学的に許容される塩としては、例えば、無機塩基、有機塩基等の塩基との塩、無機酸、有機酸、塩基性または酸性アミノ酸などの酸付加塩等が挙げられる。無機塩基としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属、アルミニウム、アンモニウム等が挙げられる。有機塩基としては、例えば、エタノールアミン等の第一級アミン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’-ジベンジルエチレンジアミン等の第二級アミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、トリエタノールアミン等の第三級アミン等が挙げられる。無機酸としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等が挙げられる。有機酸としては、例えば、ギ酸、酢酸、乳酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、安息香酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ-トルエンスルホン酸等が挙げられる。塩基性アミノ酸としては、例えば、アルギニン、リジン、オルニチン等が挙げられる。酸性アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【０１３４】
経口投与を行う場合の剤型として、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤およびシロップ剤等があり、適宜選択することができる。また、それら製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等の修飾を施すことができる。また、口腔内局所投与を行う場合の剤型として、咀嚼剤、舌下剤、バッカル剤、トローチ剤、軟膏剤、貼布剤、液剤等があり、適宜選択することができる。また、それら製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等の修飾を施すことができる。
【０１３５】
前記示した剤型について、公知のドラッグデリバリーシステム(ＤＤＳ)の技術を採用することができる。本明細書に言うＤＤＳ製剤とは、除法化製剤、局所適用製剤(トローチ、バッカル錠、舌下錠等)、薬物放出制御製剤、腸溶性製剤および胃溶性製剤等、投与経路、バイオアベイラビリティー、副作用等を勘案した上で、最適の製剤形態にした製剤を言う。
【０１３６】
ＤＤＳの構成要素には基本的に薬物、薬物放出モジュール、覆いおよび治療プログラムから成り、各々の構成要素について、特に放出を停止させた時に速やかに血中濃度が低下する半減期の短い薬物が好ましく、投与部位の生体組織と反応しない覆いが好ましく、さらに、設定された期間において最良の薬物濃度を維持する治療プログラムを有するのが好ましい。薬物放出モジュールは、基本的に、薬物貯蔵庫、放出制御部、エネルギー源および放出孔または放出表面を有している。これら基本的構成要素は全て揃っている必要はなく、適宜追加あるいは削除等を行い、最良の形態を選択することができる。
【０１３７】
ＤＤＳに使用できる材料としては、高分子、シクロデキストリン誘導体、レシチン等がある。高分子には不溶性高分子(シリコーン、エチレン・酢酸ビニル共重合体、エチレン・ビニルアルコール共重合体、エチルセルロース、セルロースアセテート等)、水溶性高分子およびヒドロキシルゲル形成高分子(ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレート架橋体、ポリアクリル架橋体、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、水溶性セルロース誘導体、架橋ポロキサマー、キチン、キトサン等)、徐溶解性高分子(エチルセルロース、メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合体の部分エステル等)、胃溶性高分子(ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースナトリウム、マクロゴール、ポリビニルピロリドン、メタアクリル酸ジメチルアミノエチル・メタアクリル酸メチルコポリマー等)、腸溶性高分子(ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、酢酸フタルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース、アクリル酸系ポリマー等)、生分解性高分子(熱凝固または架橋アルブミン、架橋ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、ポリシアノアクリレート、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリβヒドロキシ酢酸、ポリカプロラクトン等)があり、剤型によって適宜選択することができる。
【０１３８】
特に、シリコーン、エチレン・酢酸ビニル共重合体、エチレン-ビニルアルコール共重合体、メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合体の部分エステルは薬物の放出制御に使用でき、セルロースアセテートは浸透圧ポンプの材料として使用でき、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースは徐放性製剤の膜素材として使用でき、ポリアクリル架橋体は粘膜付着剤として使用できる。
【０１３９】
また、製剤中にはその剤形(経口投与剤、注射剤、座剤等の公知の剤形)に応じて、溶剤、賦形剤、コーティング剤、基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤等の添加剤を加えて製造することができる。
【０１４０】
上記添加剤をそれぞれ具体例を挙げて例示するが、これらに特に限定されるものではない。
〔溶剤〕精製水、注射用水、生理食塩水、ラッカセイ油、エタノール、グリセリン、
〔賦形剤〕デンプン類、乳糖、ブドウ糖、白糖、結晶セルロース、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、タルク、酸化チタン、トレハロース、キシリトール、
〔コーティング剤〕白糖、ゼラチン、酢酸フタル酸セルロース、および、上記記載した高分子、
〔基剤〕ワセリン、植物油、マクロゴール、水中油型乳剤性基剤、油中水型乳剤性基剤、
〔結合剤〕デンプンおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、トラガント、アラビアゴム等の天然高分子化合物、ポリビニルピロリドン等の合成高分子化合物、デキストリン、ヒドロキシプロピルスターチ、
〔滑沢剤〕ステアリン酸およびその塩類、タルク、ワックス類、コムギデンプン、マクロゴール、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、
〔崩壊剤〕デンプンおよびその誘導体、寒天、ゼラチン末、炭酸水素ナトリウム、セルロースおよびその誘導体、カルメロースカルシウム、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースおよびその塩類ならびにその架橋体、低置換型ヒドロキシプロピルセルロース、
〔溶解補助剤〕シクロデキストリン、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、
〔懸濁化剤〕アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、モノステアリン酸アルミニウム、クエン酸、各種界面活性剤、
〔粘稠剤〕カルメロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ホドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、
〔乳化剤〕アラビアゴム、コレステロール、トラガント、メチルセルロース、各種界面活性剤、レシチン、
〔安定剤〕亜硫酸水素ナトリウム、アスコルビン酸、トコフェロール、キレート剤、不活性ガス、還元性物質、
〔緩衝剤〕リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、ホウ酸、
〔等張化剤〕塩化ナトリウム、ブドウ糖、
〔無痛化剤〕塩酸プロカイン、リドカイン、ベンジルアルコール、
〔保存剤〕安息香酸およびその塩類、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、逆性石けん、ベンジルアルコール、フェノール、チロメサール、
〔矯味剤〕白糖、サッカリン、カンゾウエキス、ソルビトール、キシリトール、グリセリン、
〔芳香剤〕トウヒチンキ、ローズ油、ならびに
〔着色剤〕水溶性食用色素、レーキ色素。
【実施例】
【０１４１】
以下に、本発明の新規コレクチンに関して、実施例に沿って詳細に説明するが、これら実施例の開示によって、本発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。
【０１４２】
すなわち、ＥＳＴ(Expressed Sequence Tags)データベースの検索(実施例１)、新規ヒトコレクチンのヒト肝臓由来cDNAライブラリーからのＰＣＲによるスクリーニングと塩基配列の決定(実施例２)、新規ヒトコレクチンのヒト腎臓由来キャップサイトｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲによるスクリーニングと塩基配列の決定(実施例３)、新規ヒトコレクチンの相同性検索(実施例４)、新規マウスコレクチンのｃＤＮＡの取得(実施例５)、新規ヒトコレクチンのヒトの組織における発現分布解析(実施例６)、新規ヒトコレクチンの遺伝学的解析(実施例７)、新規コレクチンＣＬ-Ｌ２-１およびＣＬ-Ｌ２-２のヒトの組織における発現分布解析(実施例８)、新規コレクチンの発現ベクターpcDNA3.1/Myc-His(+)-ＣＬ-Ｌ２-1,2の構築(実施例９)、新規コレクチンの安定発現細胞株の作成(実施例１０)、新規コレクチンの糖特異性の解析(実施例１１)について以下に説明する。
【０１４３】
［実施例１：ＥＳＴデータベースの検索］
第１図に示した様に共通の構造を有する既知のコレクチンすなわちヒトＭＢＰ、ヒトＳＰ-Ａ、ヒトＳＰ-Ｄと本発明者が最近単離に成功したヒト肝臓由来コレクチンＣＬ-Ｌ１(特開平１１−２０６３７７号参照)のアミノ酸残基の相同性を第２および３図に示した。図中、相同と認められるアミノ酸残基部分に囲みを付した。この図中、ＣＬ-Ｌ１のレクチン活性を担うＣＲＤ(糖鎖認識領域)のアミノ酸配列(配列番号１４)を用い、ＥＳＴ(Expressed Sequence Tags)データベースの検索を行った。
【０１４４】
その結果、相同性の高いアミノ酸配列を含むデータがいくつか得られた。得られたデータのアミノ酸配列についてＧｅｎＢａｎｋ/ＥＳＴデータベースの検索を行い、既知または未知物質のいずれであるかを判定した結果、相同性は高いが未知の塩基配列を含む１種のデータ(Ｈ３０４５５：胸部由来)を得ることができた。得られたＥＳＴクローンの塩基配列を用い、再度ＥＳＴデータベースを検索した結果、同一の塩基配列を含むことが認められた９種のデータ(登録番号：AA558494：生殖細胞由来、AA582499：腎臓由来、AI420986：前立腺由来、AA742449：生殖細胞由来、AA954657：腎臓由来、AA908360：卵巣由来、AI264145：腎臓由来、AA089855：心臓由来、AA456055：メラノサイト、妊娠子宮、胎児心臓由来)を得ることができた。これらはすべて同一の新規コレクチンの塩基配列の一部を示すクローンであった。
【０１４５】
［実施例２：ヒト肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲによるスクリーニングと塩基配列の決定］
上記の１０種のクローンの塩基配列よりコンセンサス配列を作製し(配列番号１５)、新規ヒトコレクチンのｃＤＮＡの５’上流領域をクローニングするため、実施例１で得られたコンセンサス配列を基に上流方向への２種類のプライマーCAP1(5'-agattttattgtatagcttgg-3'(配列番号１６)、GAP2(5'-ctgggtaataattacataatg-3'(配列番号１７)と、ヒト肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーのベクター領域の一部分のプライマーλTriplEx-F1(5'-aagctccgagatctggacgag-3'(配列番号１８))、λTriplEx-F2(5'-ctcgggaagcgcgccattgtg-3'(配列番号１９))をPE Applied Biosystems社製３９２Ａ ＤＮＡ/ＲＮＡシンセサイザーにより合成し、以下のようにＰＣＲによるスクリーニングを行った(第４図)。
【０１４６】
ＰＣＲによるスクリーニングのテンプレートとしてヒト肝臓由来ｃＤＮＡライブラリー(クローンテック社製)を用い、第一回ＰＣＲを行った。反応混液は、総液量５０μLにて、LA PCR Buffer II(Ｍｇ２＋不含)、２.５ｍＭ ＭｇＣｌ２、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ(以上、すべて宝酒造社製)を１μＬ、ヒト肝臓由来ｃＤＮＡライブラリー(クローンテック社製)、０.５μＭλTriplEx-F1プライマー、ならびに０.５μＭ CAP1プライマーを含むものとした。ＰＣＲは熱変性９５℃にて２０秒、アニーリング６０℃にて２０秒、伸長反応７２℃にて９０秒を３５サイクル、また繰り返し反応前に熱変性９５℃にて５分、最後に伸長反応７２℃にて５分を含むプログラムで行った。第１回ＰＣＲ終了後、第２回ＰＣＲを行った。第１回ＰＣＲ産物1μLを鋳型とし、プライマーはλTriplEx-F2プライマーおよびCAP2プライマーを用い、第１回ＰＣＲと同様の反応組成、プログラム(但し、サイクル数は２５サイクル)で行った。以上のＰＣＲはPE Applied Biosystems社製GeneAmp PCR System9700により行った。得られた ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により確認後、バンドをゲルより切り出し、−８０℃、１０分間で凍結し、１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離後、上清をエタノール沈澱することにより精製した。
【０１４７】
精製したＤＮＡ断片は、Novagen社製pT7Blue Vectorに組み込み、このベクターをコンピテントセルXL1-Blue細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢ培地(100μg/mLアンピシリン)で培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出し、PE Applied Biosystems社製BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kitおよびABI PRISM 377シーケンサで塩基配列の決定を行った。プライマーはM13 Universalプライマー(5'-cgacgttgtaaaacgacggccagt-3'(配列番号２０))およびM13 Reverseプライマー(5'-caggaaacagctatgac-3'(配列番号２１))(両プライマーともにCAP1プライマーと同様にして合成した)を用いた。この結果得られた塩基配列はCAP2プライマーの３’末端側からＮ末端側に５７５塩基長い配列であることが明らかとなった(第４図に示すＣＬ-Ｌ２-1 ORFのアミノ酸番号６８〜２７１、またはＣＬ-Ｌ２-2 ORFのアミノ酸番号４２〜２４５に相当する領域)。但し、実施例１で得られたＥＳＴのコンセンサス配列の５’末端領域の塩基配列と若干の相違が認められた。
【０１４８】
［実施例３：新規ヒトコレクチンのヒト腎臓由来キャップサイトｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲによるスクリーニングと塩基配列の決定］
実施例２で得られた塩基配列よりさらに転写開始点を含む５’末端領域のクローニングを行うため、実施例２で得られた塩基配列をもとに上流方向への２種類のプライマーCAP3(5'-ggtcctatgtcaccggaatc-3'(配列番号２２))、CAP4(5'-ttccatgacgacccacactgc-3'(配列番号２３))をPE Applied  Biosystems社製392A DNA/RNAシンセサイザーにより合成し、以下のようにキャップサイトｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲによるスクリーニングを行った(第４図)。
【０１４９】
Cap Site cDNA、Human Kidney(NIPPON GENE社製)により、添付の1RC2プライマー(5'-caaggtacgccacagcgtatg-3'(配列番号２４))およびCAP3プライマーを用いて第１回ＰＣＲを行った。反応混液は、総液量５０μLにて、LA PCR Buffer II(Ｍｇ２＋不含)、２.５ｍＭ ＭｇＣｌ２、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ(以上、宝酒造社製)を１μL、Cap Site cDNA Human Kidney、0.5μM 1RC2プライマー(以上NIPPON GENE 社製)、ならびに０.５μＭ CAP3プライマーを含むものとした。ＰＣＲは、熱変性９５℃にて２０秒、アニーリング６０℃にて２０秒、伸長反応７２℃にて６０秒を３５サイクル、また繰り返し反応前に熱変性９５℃にて５分、最後に伸長反応７２℃にて１０分を含むプログラムで行った。第１回ＰＣＲ終了後、第２回ＰＣＲを行った。第１回ＰＣＲ産物１μLを鋳型とし、プライマーは添付の2RC2プライマー(5'-gtacgccacagcgtatgatgc-3'(配列番号２５))および CAP4プライマーを用い、第１回ＰＣＲと同様の反応組成、プログラム(但し、サイクル数は２５サイクル)で行った。以上のＰＣＲはPE Applied Biosystems社製GeneAmp PCR System9700により行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により確認後、バンドをゲルより切り出し、−８０℃、１０分間凍結し、１５０００ｒｐｍ、１０分、遠心分離後、上清をエタノール沈澱することにより精製した。
【０１５０】
精製したＤＮＡ断片は、Novagen社製pT7Blue Vectorに組み込み、このベクターをコンピテントセルXL1-Blue細胞に形質転換した。形質転換体をＬＢ培地(１００μg/ml アンピシリン)で培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出し、PE Applied Biosystems社製BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kitおよびABI PRISM 377シーケンサで塩基配列の決定を行った。プライマーはM13 Universalプライマー(5'-cgacgttgtaaaacgacggccagt-3'(配列番号２０))およびM13 Reverseプライマー(5'-caggaaacagctatgac-3'(配列番号２１))を用いた。この結果得られた２種類の塩基配列は、実施例２で得られた塩基配列からＮ末端側に４９２塩基長い配列(配列番号１)と実施例２で得られた塩基配列からＮ末端側に２７４塩基長い配列(配列番号３)であることが明らかとなった。
【０１５１】
以上のことから、ここで得られたＣＬ-Ｌ２は８１３塩基のＯＲＦ(転写解読枠)を有し(配列番号１)、配列番号２に示される２７１のアミノ酸をコードしているｃＤＮＡ(ＣＬ-Ｌ２-１)、並びに７３５塩基のＯＲＦ(転写解読枠)を有し(配列番号３)、配列番号４に示される２４５のアミノ酸をコードしているｃＤＮＡ(ＣＬ-Ｌ２-２)の２種類が得られた。
【０１５２】
［実施例４：相同性検索］
次いで、ＧｅｎＢａｎｋデータベースでＤＮＡおよびアミノ酸についての相同性の検索を行った結果、得られたアミノ酸配列は、従来見出されているコレクチンのいずれとも異なる新規タンパク質の配列であることが明らかとなった。
【０１５３】
従来報告されている３種のコレクチン(ＭＢＰ、ＳＰ-ＡおよびＳＰ-Ｄ)と本発明者が最近単離したヒト肝臓由来コレクチンＣＬ-Ｌ１(特開平１１−２０６３７７号参照)のアミノ酸配列と、本発明の新規コレクチンのコレクチン構造部分のアミノ酸配列を比較し、その結果を第５および６図に示す。第２および３図と同様に、相同性を有するアミノ酸残基部分に囲みを付した。このアラインメントにより、得られた新規タンパク質は既知コレクチンタンパク質と相同性を有し、コレクチンファミリーに属していることが示される。
【０１５４】
また、配列番号４に示すアミノ酸配列の第１８〜６５番目のアミノ酸が欠失した配列番号５に示す塩基配列の第１４１〜７３１番目によってコードされる変異体(配列番号６)、配列番号４に示すアミノ酸配列の第１８〜４１番目のアミノ酸が欠失した配列番号７に示す塩基配列の第１４１〜８０３番目によってコードされる変異体(配列番号８)および配列番号４に示すアミノ酸配列の第４２〜６５番目のアミノ酸が欠失した配列番号９に示す塩基配列の第１４１〜８０３番目によってコードされる変異体(配列番号１０)が得られた。
【０１５５】
［実施例５：新規マウスコレクチンのｃＤＮＡの取得］
ｈＣＬ-Ｌ２と同様の方法により、マウス肝臓ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行うことによりｍＣＬ-Ｌ２遺伝子を得ることができた。得られたｍＣＬ-Ｌ２のｃＤＮＡクローンは８１３塩基のＯＲＦ(転写解読枠)を有し(配列番号１２)、配列番号１３に示される２７１のアミノ酸をコードしていることが確認できた。
【０１５６】
［実施例６：新規コレクチンのヒトの組織における発現分布解析］
新規コレクチンの種々の組織での発現を調べるため、ＲＴ-ＰＣＲ法により解析を行った。得られた新規コレクチンのｃＤＮＡ配列のネック領域から糖鎖認識領域を増幅できるような２種類のプライマーRTF1(5'-agattccggtgacataggacc-3'(配列番号２６))、RTR1(5'-tggtctgggctctgtccctgc-3'(配列番号２７))と各組織での新規コレクチンの発現量を比較するためβ-アクチン遺伝子の一部分を増幅できる２種類のプライマーヒトβ-アクチン・センスプライマー(5'-caagagatggccacggctgct-3'(配列番号２８))、ヒトβ-アクチン・アンチセンスプライマー(5'-tccttctgcatcctgtcggca-3'(配列番号２９))(全てのプライマーはCAP1プライマーと同様にして合成した)を用い、ＲＴ-ＰＣＲを行った。
【０１５７】
種々のヒト由来組織のＲＮＡ((１)脳、(２)心臓、(３)腎臓、(４)肝臓、(５)肺、(６)気管、(７)骨髄、(８)結腸、(９)小腸、(１０)脾臓、(１１)胃、(１２)胸腺、(１３)乳腺、(１４)前立腺、(１５)骨格筋、(１６)精巣、(１７)子宮、(１８)小脳、(１９)胎児脳、(２０)胎児肝臓、(２１)脊髄、(２２)胎盤、(２３)副腎、(２４)膵臓、(２５)唾液腺、(２６)甲状腺)をテンプレートとし、RNA LA PCR KIT(AMV) VER1.1(宝酒造社製)を用いてＲＴ-ＰＣＲを実施した。まず以下の反応組成で逆転写反応を行った。
【０１５８】
５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１× ＲＮＡ ＰＣＲ Buffer、１ｍＭ ｄＮＴＰ Mixture、１Ｕ/μＬ RNaseインヒビター、ＲＮＡ ２μｇを含み、全量４０μＬになるようにRNase不含の蒸留水で調節した。同時に逆転写酵素を含まない反応組成も調整して、ネガテイブコントロールとした。上記反応液を０.２ｍＬチューブに入れ、PE Applied Biosystems社製GeneAmp PCR System9700で４２℃で３０分間、９９℃で５分間、５℃で５分間の１サイクルで逆転写反応を行った。得られた逆転写反応産物の１０μＬを用いて、以下の反応組成でＬＡ ＰＣＲをそれぞれ２８サイクルと３５サイクルで行った。２.５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１× ＬＡ ＰＣＲ  Buffer(Ｍｇ２＋不含)、２Ｕ TaKaRa LA Taq、０.２μＭ ＲＴＦ１プライマー、０.２μＭ ＲＴＲ１プライマーを加え、全量５０μＬになるように滅菌蒸留水で調節した。ＰＣＲは、熱変性９５℃にて２０秒、アニーリング６０℃にて２０秒、伸長反応７２℃にて６０秒を２８サイクルおよび３５サイクル、また繰り返し反応前に熱変性９５℃にて５分、最後に伸長反応７２℃にて１０分を含むプログラムで行った。反応生成物を１.５％アガロースゲル電気永動により分離し、エチジウムブロマイド溶液(０.１μｇ／ｍＬ)で染色を行い、トランスイルミネーターで泳動パターンを確認し、発現組織を同定した。各組織での発現量を比較するために、各組織でのβ-アクチン遺伝子の一部分を増幅させるＲＴ-ＰＣＲを行い、ＲＮＡの補正を行った。方法は上記同様、逆転写反応、ＰＣＲを行い、判定を行った。この結果を第７図に示すが、本発明の新規コレクチンは、２８サイクルのＰＣＲでは腎臓(レーン３)での発現が強く、その他肝臓(レーン４)、小腸(レーン９)、胸腺(レーン１２)、胎児肝臓(レーン２０)、脊髄(レーン２１)、副腎(レーン２３)、膵臓(レーン２４)での発現が確認できた。また３５サイクルのＰＣＲでは新規コレクチンの発現に強弱は認められるが、試した全ての組織においてユビキタスな発現が確認できた。
【０１５９】
［実施例７：新規コレクチンの遺伝学的解析］
得られた新規コレクチンのＤＮＡ配列(ｈＣＬ-Ｌ２-１(配列番号１)およびｍＣＬ-Ｌ２(配列番号：１２))に基づき、既知のコレクチンとの遺伝的位置付けを明らかにするために解析を行い、遺伝的系統樹を作製した。
【０１６０】
解析の対象としたコレクチンは、第８図に示す各種コレクチンファミリーのタンパク質(図中、ＣＬ-Ｌ１、ＣＬ-Ｐ１は本発明者らが最近単離に成功した)であり、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからそれぞれのアミノ酸配列を検索して得られたデータをもとにレクチンドメインを含む領域を用いてclustalw法でマルチプル・アライメントを作成し、それらをもとにＮ-Ｊ法(neighbor-joining法)を用い、Phylip version 3.57c packageプログラムを用いて遺伝的系統樹を作成した。
【０１６１】
その結果、ＳＰ-Ｄ、ウシＣＬ-４３、およびウシコングルチニンで一つのクラスターを形成し、さらにＭＢＰおよびＳＰ-Ａでそれぞれ別々にクラスターを形成しているが、本発明の新規コレクチン遺伝子はこれらのクラスターには属せず、ＣＬ-Ｌ１と同様のクラスターに属しておりＣＬ-Ｌ１のホモログであると推測された。
【０１６２】
［実施例８：新規コレクチン(ＣＬ-Ｌ２-１およびＣＬ-Ｌ２-２)のヒトの組織における発現分布解析］
ＣＬ-Ｌ２-１(配列番号１)およびＣＬ-Ｌ２-２(配列番号３)の種々の組織での発現を調べるため、ＲＴ−ＰＣＲ法により解析を行った。得られたＣＬ-Ｌ２-１の全長の翻訳領域を増幅できるプライマー(RTF2(5'-atgagggggaatctggccctggtg-3'(配列番号３０))、RTR2(5'-catgttctccttgtcaaactcac-3'(配列番号３１)))、得られたＣＬ-Ｌ２-２の全長の翻訳領域を増幅できるプライマー(RTF3(5'-atgtggtgggtgcctccgagtc-3'(配列番号３２))、RTR2(配列番号３１))、および各組織での新規コレクチンの発現量を比較するためβ-アクチン遺伝子の一部分を増幅できる実施例６で使用した２種類のヒトβ-アクチンプライマー(全てのプライマーはCAP1プライマーと同様にして合成した)を用い、実施例6と同様の方法でＲＴ-ＰＣＲを行った。
【０１６３】
この結果を第９図に示すが、本発明のＣＬ-Ｌ２-１(配列番号１)は、２８サイクルのＰＣＲでは腎臓(レーン３)、肝臓(レーン４)、小腸(レーン９)、胸腺(レーン１２)、胎児肝臓(レーン２０)、脊髄(レーン２１)、副腎(レーン２３)、膵臓(レーン２４)での発現が強く、また３５サイクルのＰＣＲではＣＬ-Ｌ２-１(配列番号１)の発現に強弱は認められるが、試した全ての組織においてユビキタスな発現が確認できた。またＣＬ-Ｌ２-２(配列番号３)は、２８サイクルのＰＣＲでは、腎臓(レーン３)での発現が強く、また３５サイクルのＰＣＲではＣＬ-Ｌ２-２(配列番号３)の発現は腎臓(レーン３)の他、発現レベルは低いが、前立腺(レーン１４)、精巣(レーン１６)、脊髄(レーン２１)、胎盤(レーン２２)での発現が確認された。
【０１６４】
また、第９図に示したように、ＣＬ-Ｌ２-１およびＣＬ-Ｌ２-２のRT-PCR産物に数本の増幅断片が確認された。これらのバンドをゲルより切り出し、実施例２と同様の方法、すなわち−８０℃, 10 min. 凍結し、15,000 rpm、10分間の遠心分離をした後、上清をエタノール沈澱することにより精製した。精製したDNA断片は、Novagen社製 pT7Blue Vector に組み込み、このベクターをコンピテントセル XL1-Blue 細胞に形質転換した。形質転換体をLB培地(100μg/mlアンピシリン)で培養し、アルカリSDS法によりプラスミドを抽出し、PE Applied Biosystems社製 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kitおよびABI PRISM 377シーケンサで塩基配列の決定を行った。プライマーはM13 Universalプライマー(5'-cgacgttgtaaaacgacggccagt-3'(配列番号２０)) および M13 Reverseプライマー(5'-caggaaacagctatgac-3'(配列番号２１))を用いた。
【０１６５】
この結果得られた塩基配列は、実施例２で得られたＣＬ-Ｌ２-２(配列番号３)の変異体であるＣＬ-Ｌ２-２ｖ１、ＣＬ-Ｌ２-２ｖ２およびＣＬ-Ｌ２-２ｖ３と同様のものであった。また、配列番号２に示すＣＬ-Ｌ２-１にはｍＲＮＡのオルターナティブスプライシングにより３種のタンパク質が存在していた。それらをＣＬ-Ｌ２-１ｖ１(配列番号３６、３７)、ＣＬ-Ｌ２-１ｖ２(配列番号３８、３９)およびＣＬ-Ｌ２-１ｖ３(配列番号４０、４１)と称す。ＣＬ-Ｌ２-１ｖ１は、配列番号２に示すＣＬ-Ｌ２-１のアミノ酸番号４４〜９１間が欠失(配列番号１に示すＣＬ-Ｌ２-１の塩基番号３９４〜５３７間が欠失)したものであり、そのアミノ酸配列は配列番号３６に示す塩基配列の第２６５〜９３３番目(配列番号５９)によってコードされる。ＣＬ-Ｌ２-１ｖ２は、配列番号２に示すＣＬ-Ｌ２-１のアミノ酸番号４４〜６７間が欠失(配列番号１に示すＣＬ-Ｌ２-１の塩基番号３９４〜４６５間が欠失)したものであり、そのアミノ酸配列は配列番号３８に示す塩基配列の第２６５〜１００５番目(配列番号６０)によってコードされる。ＣＬ-Ｌ２-１ｖ３は、配列番号２に示すＣＬ-Ｌ２-１のアミノ酸番号６８〜９１間が欠失(配列番号１に示すＣＬ-Ｌ２-１の塩基番号４６６〜５３７間が欠失)したものであり、そのアミノ酸配列は配列番号４０に示す塩基配列の第２６５〜１００５番目(配列番号６１)によってコードされる。また実施例４と同様の方法にてｍＣＬ-Ｌ２-２遺伝子を得ることができた。
【０１６６】
［実施例９：新規コレクチンの発現ベクターpcDNA3.1/Myc-His(+)A-CL-L２-1,2の構築］
ＣＬ-Ｌ２-１(配列番号１)の翻訳領域を、CL-L２-1Fプライマー(5'-gggaagcttcgatcaggatgagggggaatctggccctggtg-3'(配列番号：３３))とCL-L２-1Rプライマー(5'-gggctcgagcatgttctccttgtcaaactcac-3'(配列番号：３４))を用いて、また新規コレクチン(配列番号３)の翻訳領域をＣＬ-Ｌ２-2Fプライマー(5'-gggaagcttccagcacaatgtggtgggtgcctccgagtc-3'配列番号：３５))とＣＬ-Ｌ２-1Rプライマー(配列番号：３４)を用いて、ヒト腎臓由来cDNAライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ(タカラ社製：Takara Thermal Cycler MP)により増幅させた。得られたＣＬ-Ｌ２-１ｃＤＮＡを、pT7Blue T-Vector(Novagen社製)にライゲーションし、大腸菌XLI-Blueにトランスフォメーションを行った。得られたクローンからＣＬ-Ｌ２-１ｃＤＮＡを含むプラスミドを精製し、シークエンサーにより塩基配列を確認後、誤りのないプラスミドを制限酵素Hind IIIとXho Iで消化して、同様の酵素で消化し精製したpcDNA3.1/Myc-His(+)Aベクター(インビトロジェン社製)にライゲーションを行った。ライゲーションしたプラスミドは、大腸菌XLI-Blueにトランスフォメーション後、得られたクローンを培養し、プラスミドを精製して、発現ベクターpcDNA3.1/Myc-His(+)A-ＣＬ-Ｌ２-1,2とした。なお、この際にＣＬ-Ｌ２-１とＣＬ-Ｌ２-２の変異体(配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号３６、配列番号３８および配列番号４０)についても同様に発現ベクターを作製した。
【０１６７】
［実施例１０：新規コレクチンの安定発現細胞株の作成］
実施例９により得られた発現ベクターpcDNA3.1/Myc-His(+)A-CL-L2-1とpEGFP-Fベクター(クローンテック社製)を、LIPOFECTAMINE 2000(LF2000)Reagent(GIBCOBRL社製)を用いてCHO細胞にコトランスフェクトし、一過性発現をさせた。まず、LF2000 Reagent溶液0.5ml(LF2000 Reagent 30μl、Nutrient Mixture F-12 Ham(Ham's F-12培地)(シグマ社製))を準備し、５分間室温でインキュベートした後、ベクター溶液0.5 ml(pcDNA3.1/Myc-His(+)A-CL-L２-1,2：7.5μg、pEGFP-Fベクター2.5μg、Ham's F-12培地)と混和し、２０分間インキュベートした。その後、25cm2フラスコで、５ml Ham's F-12培地(5％FCS含む)で高密度にまで培養したCHO細胞に添加した。４時間、37℃、５％CO2下で培養を行った後、新しい培地と交換し、さらに続けて20時間、37℃、５％CO2下で培養を行った。次に、培地をHam's F-12培地(５％FCS、0.4 mg/ml Geneticin(GIBCOBRL社製)含む)に交換し、さらに、10日間培養を行った。途中一度培地交換を行った。
【０１６８】
この10日間の薬剤セレクションにより、形質転換細胞のみが生存し増殖したが、形質転換されなかった細胞は死滅した。得られた形質転換細胞から高発現な細胞を得るためにGFPの蛍光をマーカーにしてセルソーター(Becton Dickinson 社製)によりソーティングを行った。形質転換した25cm２フラスコの細胞を５ml PBS(-)で２回洗浄した後、EDTA solution 0.02％(ナカライテスク社製)0.3mlで細胞をはがし、10ml PBS(-)に懸濁した後、200×g、７分間、４℃で遠心後、上清を除去し、0.5mlの２％FCS/PBS(-)に懸濁し、ソーティングサンプルとした。サンプルはセルストレーナーキャップ付き５ml チューブ(Becton Dickinson社製)を通した後にセルソーターにかけた。同様に処理した形質転換していないCHO細胞をコントロールとして蛍光強度が10倍以上高いものをセレクションした。これらの細胞はあらかじめHam's F-12培地(５％FCS、0.4mg/ml Geneticin含む)を100μlずつ入れておいた96穴細胞培養用プレートに１穴あたり１細胞ずつ分取した。37℃、５％CO2下で培養を行い、１週間培養後、さらに、100μlずつ培養液を加え、さらに１週間培養を行った。Geneticinによる薬剤セレクションにより増殖してきたクローンを二分割して、12穴および24穴細胞培養用プレート継代した。このとき、１穴に２細胞以上から増殖してきているようなクローンは除外し、12穴および24穴細胞培養用プレートには９：１の細胞比で細胞を播いた。37℃、５％CO2下で培養を行い、12穴のプレートの細胞が高密度にまで達した時、その培養上清の200μlをImmobiloＮ-Pメンブレン(ミリポア社製)にBio-Dot Microfiltration Apparatus(BIO-RAD社製)を用いてドットブロットし、抗myc抗体(Invitorogen社製)を0.05％Tween 20/TBS buffer(宝酒造社製)で5000倍希釈した溶液に室温で１時間インキュベートした後、100mlの0.05％Tween 20/TBS bufferでメンブレンを室温で20分間×３回洗浄し、さらに抗マウスIgG-HRP(ケミコン社製)を0.05％Tween 20/TBS bufferで5000倍希釈した溶液に室温で１時間インキュベートした後、100mlの0.05％Tween 20/TBS bufferでメンブレンを室温で20分間×３回洗浄し、TMB Membrane Peroxidase substrate system(フナコシ社製)を用いて検出した。発色の強かったクローンを確認した後、それぞれ対応する24穴のプレートの細胞を安定発現細胞株(CHO/ＣＬ-Ｌ２-1)とした。
【０１６９】
［実施例１１：新規コレクチンの糖結合特性の解析］
実施例１０で作製した新規コレクチンの安定発現細胞株(CHO/CL-L２-１)の培養上清1LをVIVAPORE10(フナコシ社製)を用いて50mlに濃縮した後、Ni-NTAアガロース(キアゲン社製)を200μl加え、一晩、４℃で浸透しながらインキュベーションすることにより新規コレクチンをNi-NTAアガロースに結合させた。Ni-NTAアガロースをPoly-Prep Chromatography Columns(バイオラッド社製)に充填し、５mlの50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM イミダゾール、0.05％Tween20(pH8.0)で３回洗浄した後、200μlの50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mMイミダゾール、0.05％Tween20(pH8.0)で５回溶出することにより精製した。精製した新規コレクチンを定量し、糖特異性の解析に使用した。
【０１７０】
すなわち、精製した新規コレクチン(１μg)を、結合特性を調べる糖鎖プローブの種類分Immobilon-Ｐメンブレン(ミリポア社製)にBio-Dot Microfiltration Apparatus(BIO-RAD社製)を用いてドットブロットした後、各ドットを１cm画に切り取り、ブロックエース(大日本製薬社製)に浸けて、室温で1時間インキュベートした。次にメンブレンを0.05％Tween20、５mM CaCl2、TBS bufferで３回洗浄し、５mM CaCl2、TBS bufferで1μg/mlに希釈した各種糖鎖プローブ(第１０図)溶液中で室温で１時間インキュベートした後、再度0.05％Tween20、５mM CaCl2、TBS bufferで３回洗浄した。次に0.05％Tween20、５mM CaCl2、TBS bufferで1000倍希釈したStreptabvidin-biotinylated HRP(アマシャム社製)溶液中に室温で30分間インキュベートし、0.05％Tween20、５mM CaCl2、TBS bufferで３回洗浄した後、TMB Membrane Peroxidase substrate system(フナコシ社製)を用いて検出した。第１０図に示した様に新規コレクチンはマンノース、フコース、Ｎ-アセチルガラクトサミン、Ｎ-アセチルノイラミン酸、マンノース-６-リン酸と結合する活性を有していた。
【０１７１】
本発明のＣＬ-Ｌ２ｓタンパク質は、コレクチン構造を有していることから、それらに特有の効果を示す物質と考えられ、基礎免疫の機能の解明、細菌感染症等を始めとする各種疾患等の発症機構の解明、さらにその診断、予防および治療法、並びにそれらのための試薬や医薬の開発に利用できるものである。
【配列表フリーテキスト】
【０１７２】
<210> 2
<223> 配列番号：１に記載のヌクレオチド配列から推定した新規コレクチンのアミノ酸配列。
<210> 4
<223> 配列番号：３に記載のヌクレオチド配列から推定した新規コレクチンのアミノ酸配列。
<210> 6
<223> 配列番号：５に記載のヌクレオチド配列から推定した新規コレクチンのアミノ酸配列。
<210> 8
<223> 配列番号：７に記載のヌクレオチド配列から推定した新規コレクチンのアミノ酸配列。
<210> 10
<223> 配列番号：９に記載のヌクレオチド配列から推定した新規コレクチンのアミノ酸配列。
<210> 11
<223> 成熟した新規コレクチンのコラーゲン様ドメインの推定アミノ酸配列。
<210> 13
<223> 配列番号：12に記載のヌクレオチド配列から推定した新規コレクチンのアミノ酸配列。
<210> 14
<223> ＥＳＴデータベースの検索に用いた公知のＣＬ-Ｌ１の既知のＣＲＤアミノ酸配列。
<210> 15
<223> ＥＳＴデータベースから得た幾つかのヌクレオチド配列から誘導した新規コレクチンのコンセンサスヌクレオチド配列。
<210> 16
<223> 新規コレクチンの５'上流領域をクローニングするための合成プライマーＣＡＰ１。
<210> 17
<223> 新規コレクチンの５'上流領域をクローニングするための合成プライマーＣＡＰ２。
<210> 18
<223> 新規コレクチンの５'上流領域をクローニングするための合成プライマーλトリプルＥｘ-Ｆ１。
<210> 19
<223> 新規コレクチンの５'上流領域をクローニングするための合成プライマーλトリプルＥｘ-Ｆ２。
<210> 20
<223> 新規コレクチンの配列決定のための合成Ｍ１３ユニバーサルプライマー。
<210> 21
<223> 新規コレクチンの配列決定のための合成Ｍ１３リバースプライマー。
<210> 22
<223> 新規コレクチンの５'上流領域をさらにクローニングするための合成プライマーＣＡＰ３。
<210> 23
<223> 新規コレクチンの５'上流領域をさらにクローニングするための合成プライマーＣＡＰ４。
<210> 24
<223> 新規コレクチンの５'上流領域をさらにクローニングするための合成プライマー１ＲＣ２。
<210> 25
<223> 新規コレクチンの５'上流領域をさらにクローニングするための合成プライマー２ＲＣ２。
<210> 26
<223> 新規コレクチンの組織分布を決定するＲＴ-ＰＣＲのための合成プライマーＲＴＦ１。
<210> 27
<223> 新規コレクチンの組織分布を決定するＲＴ-ＰＣＲのための合成プライマーＲＴＦ１。
<210> 28
<223> コントロールレベルを決定するＲＴ-ＰＣＲのための合成β-アクチンセンスプライマー。
<210> 29
<223> コントロールレベルを決定するＲＴ-ＰＣＲのための合成β-アクチンアンチセンスプライマー。
<210> 30
<223> ＣＬ-Ｌ２-１を増幅するための合成プライマーＲＴＦ２。
<210> 31
<223> ＣＬ-Ｌ２-１を増幅するための合成プライマーＲＴＲ２。
<210> 32
<223> ＣＬ-Ｌ２-２を増幅するための合成プライマーＲＴＦ３。
<210> 33
<223> ＣＬ-Ｌ２-１を増幅するための合成プライマーＣＬ-Ｌ２-１Ｆ。
<210> 34
<223> ＣＬ-Ｌ２-１を増幅するための合成プライマーＣＬ-Ｌ２-１Ｒ。
<210> 35
<223> ＣＬ-Ｌ２-２を増幅するための合成プライマーＣＬ-Ｌ２-２Ｆ。
<210> 37
<223> 配列番号：36に記載のヌクレオチド配列から推定した新規コレクチン変異体のアミノ酸配列。
<210> 39
<223> 配列番号：38に記載のヌクレオチド配列から推定した新規コレクチン変異体のアミノ酸配列。
<210> 41
<223> 配列番号：40に記載のヌクレオチド配列から推定した新規コレクチン変異体のアミノ酸配列。
<210> 42
<223> 変異した新規コレクチンのコラーゲン様ドメインの推定アミノ酸配列。
<210> 43
<223> 変異した新規コレクチンのコラーゲン様ドメインの推定アミノ酸配列。
<210> 44
<223> 変異した新規コレクチンのコラーゲン様ドメインの推定アミノ酸配列。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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