(57)【要約】      （修正有）【課題】生体試料内部で発生する光を正確に画像化できる方法および装置を提供すること。【解決手段】生体内部で発生する光を異なる焦点距離において高NAのレンズにより集光し、集光した複数の光をそれぞれ結像し、結像した複数の光のそれぞれのコントラストに基づき焦点距離ごとに画像として採用する形状を判定し、判定結果に応じて三次元の画像として形成するとして採用するか否かを判定し、判定結果に応じて画像を形成する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内部で発生する光を高NAのレンズにより集光し、集光した光を結像し、結像した光のコントラストに基づき画像として採用するか否かを判定し、判定結果に応じて画像を形成することを特徴とする生体内部の画像化方法。
【請求項２】
生体内部で発生する複数の光を高NAのレンズにより集光し、集光した複数の光をそれぞれ結像し、結像した複数の光のそれぞれのコントラストに基づき何れの結像光を画像として採用するか否かを判定し、判定結果に応じて画像を形成することを特徴とする生体内部の画像化方法。
【請求項３】
生体内部で発生する光を異なる焦点距離において高NAのレンズにより集光し、集光した複数の光をそれぞれ結像し、結像した複数の光のそれぞれのコントラストに基づき焦点距離ごとに画像として採用する形状を判定し、判定結果に応じて三次元の画像として形成するとして採用するか否かを判定し、判定結果に応じて画像を形成することを特徴とする生体内部の画像化方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、異なる焦点距離は、共通の光軸に沿って互いに平行な複数の結像領域である方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法において、異なる焦点距離は、平行でない複数の光軸のそれぞれに対し、互いに平行であるような複数の結像領域が配置している方法。
【請求項６】
生体内部で発生する光を集光するための高NAのレンズを含む対物光学系と、集光した光を結像する結像光学系と、結像した光を撮像する撮像手段と、撮像した結像データにおけるコントラストに基づき画像として採用するか否かを判定する判定部を有する制御部を具備することを特徴とする生体内部の画像化装置。
【請求項７】
前記判定部は、結像データに対し走査線を設定するとともに該走査線上のコントラスト値を連続的に取得し比較する比較部をさらに有する請求項６に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内部で発生する光を正確に画像化する方法に関し、詳しくはレポーターのような生体情報を反映する光情報を正確に把握できる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞生物学、分子生物学などの研究分野では、顕微鏡をベースとした観察技術を用いて、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ；Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）や生物発光酵素であるルシフェラーゼ遺伝子を発現のレポーターとして働かせ、生体を分子生物学的に解析する技術が広まっている。例えば、細胞内の特定部位や機能蛋白質に上記のレポーターを標識することで、生きた細胞（生細胞）内部におけるシグナル伝達物質の動態や諸条件における遺伝子発現の様子を観察することが出来るようになった。このような細胞等の生体試料の観察では、通常、発現量の経時変化を捉えるため、時系列に細胞を観察し続ける必要がある。
【０００３】
このような時系列な観察を行う顕微鏡としては、励起光を用いて高輝度の蛍光画像を生じるようにした蛍光顕微鏡や、比較的長時間の露光によって発光画像を得るようにした発酵顕微鏡が使用されている。これら蛍光顕微鏡や発光顕微鏡は、多数の生細胞や組織切片を所定の容器の中で培養しながら、タイムラプスモードで時系列に撮像することによって、画像情報に基づく解析を行なっている。
【０００４】
培養状態の生細胞や生体組織を容器内（in  vitro）で観察する場合、好ましくは、細胞層や組織切片の厚さを十分に小さくすることで、より明るい画像が得られる。また、マウス等の小動物や植物のように、顕微鏡ステージに配置できる小さな生物個体を観察する場合、比較的表皮に近い部位で蛍光や発光するような生体内（in  vivo）の細胞群をモザイク状の光強度分布として可視化できる。
【０００５】
発生過程の胚や生体組織のように、培養細胞や組織切片よりは厚みが大きく光透過性が比較的低い生体試料については、上下方向や側方といった異なる角度から微弱光としての発光画像を複数枚撮像して組み合わせることで、立体的な発光イメージングを構築しようとする提案がなされている（特許文献１参照）。また、in  vivo観察において生体試料の皮下部分に存在するレポーターによるイメージを画像化しようとする試みも有って、例えば、深さごとに光強度分布として検出した後に光子関数を用いてレポーターが発する光の源の位置や形状を推測しようとする提案もなされている（特許文献２参照）。さらに、in  vivo観察において、深さ方向の焦点を移動させながら、多数のピンホールを用いて個別に光検出することで試料内部のレポーターを三次元の画像として取得しようとする提案もなされている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−８９５２１号公報
【特許文献２】特開２００６−７９５１０号公報
【特許文献３】特表２００４−５２８９１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように、レポーターがもたらす画像を用いる生体試料の解析は、徐々に生体試料内部の詳細情報や深部情報に向かう潮流がある。かかる潮流に沿って生体試料の内部情報を正確に把握するために、レポーターのように生体内部で発生する光を深さごとに鮮明に画像化できる技術が要望される。また、レポーター自身の立体的な形状または三次元的ボリュームも正確に把握できる技術が要望される。さらに、同じ試料内部に複数のレポーターが存在していても見分けることも必要である。
【０００８】
本発明は、生体試料内部で発生する光を正確に画像化できる方法および装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するため、ルシフェラーゼによる発光蛋白質を各種試料（細胞、組織切片、胚、微生物等）に適用した例において非常に微弱な発光を発するレポーターを、発光イメージングシステム（商標名はＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ）を用いて得られた発光画像を鋭意検討することによって本発明を完成するに至った。このシステムは、極めて精密な遮光環境下で高感度に発光等の微弱光による画像を提供できる比類無いイメージング機器であるために、生体試料の種々の焦点面において取得した発光画像を詳細に比較検討することが可能であった。この検討により、生体試料内部で散乱しながら試料表面に到達する微弱光を適切な光学的な条件および画像分類でもって正確且つ鮮明に画像化できる方法および装置を見出すことができた。
【００１０】
すなわち、本発明の請求項１は、生体内部で発生する光を高NAのレンズにより集光し、集光した光を結像し、結像した光のコントラストに基づき画像として採用するか否かを判定し、判定結果に応じて画像を形成することを特徴とする生体内部の画像化方法である。高NAのレンズにより生体試料から発生する光を効率良く集光して、結像後の画像における詳細なコントラスト情報を提供し、この詳細なコントラスト情報から生体内部で発生した光による散乱状況を正確に把握できるようになる。この正確な散乱状況の把握により、初めて、その画像がレンズの焦点面に近いかどうかを判定できる。
【００１１】
また、本発明の請求項２は、生体内部で発生する複数の光を高NAのレンズにより集光し、集光した複数の光をそれぞれ結像し、結像した複数の光のそれぞれのコントラストに基づき何れの結像光を画像として採用するか否かを判定し、判定結果に応じて画像を形成することを特徴とする生体内部の画像化方法である。高NAのレンズにより生体試料から発生する光を効率良く集光して、結像後の画像における詳細なコントラスト情報を提供し、この詳細なコントラスト情報から生体内部で発生した複数の光による散乱状況を正確に比較できるようになる。この正確な散乱状況の比較により、初めて、その画像の中でレンズの焦点面に近い光による画像部分と遠い光による画像部分とを相対的に判定できる。
また、本発明の請求項３は、生体内部で発生する光を異なる焦点距離において高NAのレンズにより集光し、集光した複数の光をそれぞれ結像し、結像した複数の光のそれぞれのコントラストに基づき焦点距離ごとに画像として採用する形状を判定し、判定結果に応じて三次元の画像として形成するとして採用するか否かを判定し、判定結果に応じて画像を形成することを特徴とする生体内部の画像化方法である。高NAのレンズにより生体試料から発生する光を効率良く集光して、結像後の画像における詳細なコントラスト情報を提供し、この詳細なコントラスト情報から生体内部で発生した光による散乱状況を正確に比較できるようになる。この正確な散乱状況の比較により、初めて、異なる焦点距離において焦点距離ごとにレンズの焦点面に近い光による画像部分だけを選ぶような判定ができる。このように焦点距離ごとに選ばれた（または抽出した）複数の画像部分をつなぎ合わせれば、三次元の画像を正確に形成できる。
【００１２】
上記の方法において、異なる焦点距離は、共通の光軸に沿って互いに平行な複数の結像領域であるのが好ましい。互いに平行な複数の結像領域は、例えば対物レンズの光軸上で焦点を移動させることによって得られる。互いに平行であることにより、三次元の画像を形成するのが容易である。
また上記の方法において、異なる焦点距離は、平行でない複数の光軸のそれぞれに対し、互いに平行であるような複数の結像領域が配置していることがさらに好ましい。平行な複数の結像面を、平行でない複数の光軸のぞれぞれに設けることにより、三次元の画像を形成し易くなる。
【００１３】
また、本発明は、生体内部で発生する光を集光するための高NAのレンズを含む対物光学系と、集光した光を結像する結像光学系と、結像した光を撮像する撮像手段と、撮像した結像データにおけるコントラストに基づき画像として採用するか否かを判定する判定部を有する制御部を具備することを特徴とする生体内部の画像化装置である。ここで、前記判定部は、結像データに対し走査線を設定するとともに該走査線上のコントラスト値を連続的に取得し比較する比較部をさらに有するのが好ましい。
【００１４】
本発明は、蛍光蛋白質や発光蛋白質のようなレポーターに限らず、生体内で光を発生するあらゆる物質に適用できる。また、レポーターその他の生体内の光（生体光と称す）について、生体光ごとの光強度の違いや生体内で存在する深さの違いを、コントラストの
本発明によれば、生体試料をレポーターとして用いる検査（レポーターアッセイ）、例えば医薬品開発のための薬剤スクリーニングや再生医療のための幹細胞の成長過程のモニタリングに適している。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、生体試料内部で発生する光を正確に画像化できる。
【００１６】
請求項１の発明によれば、レポーターのように生体内部で発生する光を深さごとに鮮明に画像化できる。 また請求項２の発明によれば、同じ試料内部に複数のレポーターが存在していても見分けることが可能である。さらに、請求項３の発明によれば、レポーターのように生体内部で発生する光自身の立体的な形状または三次元的ボリュームも正確に把握できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の方法により得られる三次元画像の例を示すイメージ図である。
【図２】本発明の方法を実施する装置の一例を示す模式図である。
【図３】生体試料内部の異なる位置から発生する光を特定の焦点面において結像した画像をそのまま表示した表示画像を示す図である。
【図４】生体試料を複数の焦点面においてセクショニングした状態を示す図である。
【図５】多様な位置関係にある細胞から発生されるレポーターによる光の結像画面における各走査結果のデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、生体試料として細胞をルシフェラーゼのような生物発光を発する発光蛋白質により標識した場合の画像化方法および装置について、図面を参照しながら本発明の実施の形態について述べる。 本発明は、以下の説明に限定されず、種々の生体試料（例えば、生体組織、組織切片、培養細胞、微生物、植物、動物）に対し、種々のレポーター（蛍光蛋白質、発光蛋白質等）を種々の導入手法（トランスフェクション法、マイクロインジェクション法等）により標識したものを観察対象とする画像化方法に適用できる。また、生物発光を結像および撮像する構成以外にも、蛍光を結像および撮像する構成にも適用できる。蛍光を結像する場合、レポーターとしての蛍光物質を励起する励起光を照射する構成も必要である。さらに、各種レポーターからの光の発生を誘起または抑制するような実験系において、外部からの刺激（薬剤、光、電気、熱、ストレス性物質等）を画像化の前後に付加するような方法および装置に適用してもよい。したがって、本発明は、本質的には、生体試料内部で発生する光（生体自身が発光を生成する場合を含む）が対物レンズに入射する際、生体内部の散乱を受けて生体表面ではほとんど滲んだ光しか出て来ない状況で画像化しようとする全ての場面において、正確且つ鮮明な画像化方法および装置を提供しようとするものである。
【００１９】
図１は、本発明により得られる三次元の発光画像のイメージ図である。
図２は、本発明の方法を適用した発光顕微鏡の構成の例を示す図である。
図３は、本発明の方法を説明するための１つの焦点面におけるレポーターによる部分画像を示す模式図である。
図４は、三次元の関心領域である所望の大きさの立体空間（解析ボリューム）３１における複数の焦点面における部分画像の判定を説明するための模式図である。
図５は、焦点面におけるレポーターによる複数の部分画像（細胞）の位置関係の違いを示すコントラストの走査データの図である。
【００２０】
図１には、複数の異なる発光部位を有する胚等の生体試料が立体的に描写されている。この図で特徴的なのは、生体試料内部の様子が発光部位ごとに三次元で鮮明に表示されることであり、個々の発光部位の立体形状はもちろんのこと、発光部位ごとの三次元的な位置関係が対応付けられて、正確且つ鮮明に表現されている点が従来の生体内部の画像化技術とは異なる。後述するように、この正確且つ鮮明な画像を得るには、
【００２１】
図２に示す発光顕微鏡は、胚等の生体試料１を適宜収容する矩形状の容器２を保持する保持手段としての回転式試料ステージ３が、モータ４により水平方向に沿って間欠的に回転可能となっている。試料ステージ３の側方（図の右側）には、容器２の側面と平行に対峙するように光軸が水平方向に向いて対物レンズ光学系５を配置している。ここで、対物レンズの特性は、発光試料からの発光を画像データとして処理できる解像度にまで十分に集光するよう、高開口数（NA）の光学設計となっている。また、対物レンズ光学系５は、図示するように容器２に対し進退するように移動可能な駆動部も含まれており、容器２に収容された生体試料１内部の各種焦点距離において焦点面を設けることができる構成となっている。また、対物レンズ光学系５のレンズのNAの条件は、顕微鏡としては通常よりも明るい（すなわち高NA）であることが重要であり、詳しくは、NA÷投影倍率の２乗の値が０．０１以上であることを満足するのが好ましく、さらにその値は０．０７以上である方がより好ましい。
【００２２】
対物レンズ光学系５の後方（生体試料とは反対側の方向）には、対物レンズで集光した発光を画像として結像を行うための結像レンズ６が配置し、さらに結像レンズの後方にはCCD等の撮像素子７が配置している。撮像素子７で受光した画像情報は、装置全体を制御したり各種演算処理を行なうための制御部であるCPU８に送られ、本発明の方法を実施するためにコンピュータで読み取り可能なプログラムにより画像処理された後に表示部９に表示される。表示部９は、撮像素子７により得られた画像をそのまま表示することもできるようになっており、使用者は画面を見ながら、本発明の方法に基づき、画像を判定したり、部分画像を選ぶようにすることも可能になっている。
【００２３】
次に、図３は、本発明の方法を説明するための模式図であり、対物レンズ光学系５により得られる特定の焦点面２１において結像された生体試料内部のレポーター画像を示すものである。特定の焦点面においてコントラストが高い発光試料である細胞２２Aと、コントラストが低い発光試料である細胞２２Bと、その両方が混在するコントラストである細胞２２Cとが共に発光している状態となっている。ここで、コントラストが高い発光イメージを示す細胞２２A（図の左側の黒丸）は、結像に選んだ焦点２１面上に細胞が位置している状態である。コントラストが低い発光イメージを示す細胞２２B（図の右側の点描の丸）は、結像に選んだ焦点面２１から外れた位置に細胞が位置している状態である。コントラストが高いものと低いものとが混在する発光イメージを示す細胞２２C（図の下側の小さい黒丸を含んだ点描の丸）は、結像に選んだ焦点面２１の焦点深度の範囲内に細胞の一部が入っている状態である。
【００２４】
このように、細胞２２の位置によってコントラストが違う像が映る理由は、生体試料が比較的強い光散乱性を有するために、焦点面から外れるが焦点面に近い位置に存在するレポーター（発光）による残光が不鮮明な輪郭の像として焦点面に映りこんでしまうためである。焦点面から有意に離れると、残光による像は映らなくなる。このように異なるコントラストの発光像が映りこむ現象は、対物レンズのNAにも関係し、上述したような十分に高いNAにおいては、焦点深度が浅いために、焦点面からより多くの距離（例えば焦点面の前後にそれぞれ細胞数個分）の範囲で発光する光が残像として映りこむこととなる。このようなコントラストの違いは、CPU８の演算処理により、個々の画像部分である細胞２２Aおよび細胞２２Bについて、コントラスト演算、例えば１本以上の走査線上で微分値を連続的に計算して得て比較することによって、相対的なコントラストの大小を正確に判定することができる。演算したコントラストの値に閾値を設けることによって、焦点面の焦点深度の有効範囲から得られた画像なのか、それとも、その有効範囲外である焦点面から離れた場所から散乱し到達して得られた高散乱性画像なのかを識別するようにすることもできる。
【００２５】
コントラストの大小により選択された画像を表示することで、散乱による映りこんだ画像を除外し、正確且つ鮮明が画像を得ることができる。
【００２６】
図４は、三次元の関心領域である所望の大きさの立体空間（解析ボリューム）３１における部分画像を判定するための模式図である。レポーターの標的である細胞が少なくとも２回交わるようなピッチ間隔（例えば細胞であれば約４μｍ以内）で一定に焦点位置を変化させることで得られる平行な各焦点面３３ａ、３３ｂ、３３ｃ、３３ｄに対して、異なる位置に存在する複数（図では２個）の細胞３２A、３２Bについて、各焦点面ごとにセクショニングして得られる画像情報に基づきぞれぞれの細胞の位置を識別したり、単一の細胞についての三次元的な形状を決定するような判定の方法を説明するための模式図である。図４において、図２で述べたように移動可能な対物レンズが図の側方に配置しており、その光軸に沿って複数の焦点面が上下方向に均等な間隔で並んでいる。かかる複数の焦点面は、図の２つの細胞３２A、３２Bに対し、異なる位置で横断する仮想断面を形成している。右から順に、焦点面３３ａは上方に位置する細胞３２Aの上側を横断していて、下方に位置する細胞３２Bからは有意に離れているものとする。次に焦点面３３ｂでは、細胞３２Aのほぼ中央を横切るとともに、細胞Bが焦点面の近傍まで近付いているものとする。次に焦点面３３ｃでは、細胞Aの下側を横断するとともに、細胞３２Bの上側端部に接するようになっているものとする。最後の焦点面３３ｄは、最も下方に位置し、細胞３２Aからは有意に離れ、細胞３２Bの上側を横断しているものとする。
【００２７】
ここにおいて、焦点面３３ａ、３３ｂ、３３ｃ、３３ｄの各部分画像によるコントラストに基づき、上述した位置関係が判定結果として導き出される。この判定結果に基づき、画像を合成することによって、散乱による映りこみが除外された正確な三次元画像を形成することができる。
【００２８】
図５は、図３および図４で述べた多様な位置関係にある細胞から発生されるレポーターによる光の結像画面における各走査結果のデータを示す図である。すなわち、図３を例に説明すると、図３の各発光画像２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃのそれぞれについて、画像認識または画面上でのユーザー走査により各中央を横断する走査線２３ａ、２３ｂ、２３ｃを設定し、これら走査線ごとに、発光像の領域について連続的にコントラストの変化を比較していく。具体的には、走査線の一方向に向けて順次ピクセル間の輝度の微分値を計算して、その値をコントラスト値として連続的なコントラストデータを得る。このようにすることで、図５に示すように、発光画像２２Ａにおいてはコントラストデータ４０１のような急峻な波形の曲線が得られ、発光画像２２Ｂにおいては若干広めの波形においてほぼ一定の低いピークの波形のコントラストデータ４０２が得られ、発光画像２２Ｃにおいてはやや傾いた曲線とピーク幅が短い波形のコントラストデータ４０３が得られる。これらの判定については、CPU８内部に搭載される判定部（不図示）が行うことになり、この判定部はさらに、走査線の設定とコントラストデータの取得を行って比較を実行する比較部を有していることとなる。
【００２９】
このように、レポーターが発する光により得られる種々の部分画像において、適宜の走査線を設定し、走査線上のコントラストデータを連続して得ることによって、それぞれの部分画像の位置関係を判定することができる。このようにコントラストの連続データを取得し、波形の傾斜および／またはピーク幅を個々の部分画像について評価したり、部分画像同士で比較することによって、上述したような発光画像としての採用可否を行って、散乱のみにより部分画像に映りこんだ散乱性画像を除去するように画像処理することができる。これにより、焦点面に応じた発光画像を正確に決定することができ、複数の焦点面を適用することで、部分画像の三次元画像も正確に形成することができる。さらに、コントラストの変化により鮮明な画像でもって表示することが可能となるため、タイムラプス観察による時系列な画像においても、常に、複数の部分画像を適切に配置した臨場感の有る３D映像を上映したり、並列的なコマ表示を行うことができる。
【００３０】
なお、本発明は、上述した例以外にも、本発明の主旨に基づき、種々の変更、追加、削除を行なうことができる。例えば、上述した例では、図２に示されるように、波長選択フィルター１０により、生体内部の種々のターゲット物質（遺伝子、シグナル伝達分子等）を異なる波長特性を有するレポーターで標識した上で識別するようにしてもよい。また、図２に示されるように、明視野用の照明手段としてのLEDにより、生体試料１の明視野画像も容器２の回転と同期しながら同じ撮像素子７により取得することで、生体試料１の立体的な外形を構築したステレオ画像を得ることも可能である。かかるステレオ画像と、本発明による三次元のレポーター画像を合成することによって、臨場感の有る３D画像を提供できる。
【符号の説明】
【００３１】
１    生体試料
２    容器
３    回転式試料ステージ
４    モータ
５    対物レンズ光学系
６    結像レンズ光学系
７    CCD（撮像素子）
８    CPU（制御部）
９    表示部
１０  波長選択フィルター
１１  明視野用LED照明
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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