(57)【要約】【課題】樹状細胞におけるクロスプレゼンテーションのメカニズム、並びにクロスプレゼンテーションを制御する遺伝子およびタンパク質を明らかにするとともに、これらを利用して、自己免疫疾患による組織傷害を抑える組成物およびその利用技術を提供する。【解決手段】樹状細胞におけるエンドソームから細胞質への抗原物質の放出を阻害する薬剤を有効成分として含む、自己免疫疾患による組織傷害を抑えるための組成物を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状細胞におけるエンドソームから細胞質への抗原物質の放出を阻害する薬剤を有効成分として含む、自己免疫疾患による組織傷害を抑えるための組成物。
【請求項２】
上記薬剤は、Ｓｅｃ６１タンパク質の機能を阻害するものである請求項１に記載の自己免疫疾患による組織傷害を抑えるための組成物。
【請求項３】
上記薬剤は、Pseudomonas aeruginosa exotoxin Aである請求項２に記載の自己免疫疾患による組織傷害を抑えるための組成物。
【請求項４】
樹状細胞において、エンドソームから細胞質への抗原物質の放出が亢進している性質を有する、自己免疫疾患による組織傷害を発症する組織傷害発症モデル動物。
【請求項５】
上記樹状細胞では、Ｓｅｃ６１タンパク質の機能が亢進している請求項４に記載の自己免疫疾患による組織傷害を発症する組織傷害発症モデル動物。
【請求項６】
樹状細胞において、エンドソームから細胞質への抗原物質の放出を阻害する薬剤のスクリーニング方法であって、
エンドソームに抗原物質を含む樹状細胞と、薬剤候補物質とを接触させる第１工程と、
第１工程後に、上記抗原物質が細胞質に放出されたか否かを判定する第２工程と、を含むスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患による組織傷害を抑えるための組成物、およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、本来外界からの有害な異物の侵入に対する生体の防御機構として存在するものである。しかし、時にはこの免疫系の働きが、結果的に生体に有害であることがある。その１つがアレルギーである。
【０００３】
生体は、外界からの異物に対してのみならず、自己の成分に対してもアレルギー反応を起こすことが知られており、自己免疫現象と呼ばれている。そして、自己免疫によりある種の病態が生じた疾患は、自己免疫疾患と呼ばれている。
【０００４】
自己免疫疾患は、全身性の疾患であるが、臓器特異性のある疾患（臓器特異的自己免疫疾患）と、臓器特異性のない疾患（臓器非特異的自己免疫疾患）との２つに大別される。臓器特異的自己免疫疾患には、慢性甲状腺炎、原発性粘膜水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交感性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、突発性血小板減少性紫斑病、およびシェーグレン症候群がある。臓器非特異的自己免疫疾患には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症、および混合結合組織病がある。
【０００５】
これら自己免疫疾患の多くは、組織に病変が認められるとともに、組織傷害を伴うものである。
【０００６】
ところで、実験動物を同一の抗原で繰り返して免疫し続けると、免疫応答は極期をむかえ、やがて疲弊する。その結果として、組織傷害を伴う種々の自己免疫疾患（病態）が生じることが知られている（例えば、特許文献１参照および非特許文献１）。
【０００７】
自己免疫疾患による組織傷害に関する研究は現在進みつつあり、組織傷害に、抗原提示細胞による抗原のクロスプレゼンテーションが関わっていることが明らかにされている。具体的には、（１）自己免疫疾患を患うと、樹状細胞における抗原のクロスプレゼンテーションが増強されること、（２）樹状細胞におけるクロスプレゼンテーションが増強されるとＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化し、当該ＣＤ８＋Ｔ細胞によって細胞傷害が誘導されること、が明らかにされている（例えば、特許文献２および非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−２８８３８２号公報（２００６年１０月２６日公開）
【特許文献２】特開２０１０−００４７５０号公報（２０１０年  １月１４日公開）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Tsumiyama K et al., PLoS ONE, Vol.4, No.12, e8382, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
自己免疫疾患による組織傷害に樹状細胞における抗原のクロスプレゼンテーションが関与することが明らかになっているが、当該クロスプレゼンテーション自体のメカニズム、並びにクロスプレゼンテーションを制御する遺伝子およびタンパク質に関しては不明な点が多い。
【００１１】
本発明は、樹状細胞におけるクロスプレゼンテーションのメカニズム、並びにクロスプレゼンテーションを制御する遺伝子およびタンパク質を明らかにするとともに、これらを利用して、自己免疫疾患による組織傷害を抑える組成物およびその利用技術を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、樹状細胞において、（１）抗原のクロスプレゼンテーションには小胞体ではなく、エンドソームが関与していること、（２）抗原のクロスプレゼンテーションにはＳｅｃ６１タンパク質が関与していること、（３）Ｓｅｃ６１タンパク質により、エンドソームから細胞質へ抗原物質が放出されることがクロスプレゼンテーションにおいて重要な過程であること、という新規知見を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明の自己免疫疾患による組織傷害を抑えるための組成物は、上記課題を解決するために、樹状細胞におけるエンドソームから細胞質への抗原物質の放出を阻害する薬剤を有効成分として含むことを特徴としている。
【００１４】
本発明の自己免疫疾患による組織傷害を抑えるための組成物では、上記薬剤は、Ｓｅｃ６１タンパク質の機能を阻害するものであることが好ましい。
【００１５】
本発明の自己免疫疾患による組織傷害を抑えるための組成物では、上記薬剤は、Pseudomonas aeruginosa exotoxin Aであることが好ましい。
【００１６】
本発明の自己免疫疾患による組織傷害を発症する組織傷害発症モデル動物は、上記課題を解決するために、樹状細胞において、エンドソームから細胞質への抗原物質の放出が亢進している性質を有することを特徴としている。
【００１７】
本発明の自己免疫疾患による組織傷害を発症する組織傷害発症モデル動物は、上記樹状細胞では、Ｓｅｃ６１タンパク質の機能が亢進していることが好ましい。
【００１８】
本発明の薬剤のスクリーニング方法は、上記課題を解決するために、樹状細胞において、エンドソームから細胞質への抗原物質の放出を阻害する薬剤のスクリーニング方法であって、エンドソームに抗原物質を含む樹状細胞と、薬剤候補物質とを接触させる第１工程と、第１工程後に、上記抗原物質が細胞質に放出されたか否かを判定する第２工程と、を含むことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る組成物によれば、自己免疫疾患による組織傷害を抑えることができるという効果を奏する。
【００２０】
また、本発明は、簡便に、自己免疫疾患による組織傷害を発症する組織傷害発症モデル動物を作製することができるという効果を奏する。
【００２１】
さらに、本発明に係るスクリーニング方法によれば、簡便に、樹状細胞におけるエンドソームから細胞質への抗原物質の放出を阻害する薬剤をスクリーニングすることができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例において、抗原のクロスプレゼンテーションにエンドソームが関与することを示す図である。
【図２】実施例において、抗原のクロスプレゼンテーションに小胞体が関与しないことを示す図である。
【図３】実施例において、抗原のクロスプレゼンテーションにＳｅｃ６１タンパク質が関与することを示す図である。
【図４】実施例において、タンパク尿を検出した結果を示す。
【図５】実施例において、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下に、本発明の「自己免疫疾患による組織傷害を抑えるための組成物」（以下、本発明に係る組成物と称する。）、「自己免疫疾患による組織傷害を発症する組織傷害発症モデル動物」（以下、本発明に係るモデル動物と称する。）および「樹状細胞におけるエンドソームから細胞質への抗原物質の放出を阻害する薬剤のスクリーニング方法」（以下、本発明に係るスクリーニング方法と称する。）の一実施形態について詳述するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２４】
〔１．本発明に係る組成物〕
本明細書において、「自己免疫疾患」とは、自己成分（例えば、免疫グロブリンなど）に対する自己抗体（例えば、リウマチ因子など）が検出され、自己免疫が病態に関与している疾患が意図される。
【００２５】
自己免疫疾患としては、臓器特異的自己免疫疾患（例えば、慢性甲状腺炎、原発性粘膜水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、急性進行性糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、インスリン抵抗性糖尿病、若年性糖尿病、アジソン病、萎縮性胃炎、男性不妊症、早発性更年期、水晶体原性ぶどう膜炎、交感性脈炎、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性血色素尿症、突発性血小板減少性紫斑病、およびシェーグレン症候群など）、および臓器非特異的自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症、および混合結合組織病など）が挙げられる。関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、多発性筋炎、強皮症および混合結合組織病は、膠原病として知られている。すなわち膠原病は、全身性自己免疫疾患に含まれるものである。本発明における自己免疫疾患は、膠原病であることが好ましい。
【００２６】
本明細書において、「組織傷害」とは、生体内の組織の形態および生理学的機能のうち少なくとも何れかが、健常者と比べて異なる状態が意図される。例えば、腎臓における組織傷害の場合には、増殖性糸球体腎炎の発症およびタンパク尿の陽性度の異常が挙げられる。
【００２７】
本明細書において、「自己免疫疾患による組織傷害」とは、上述した組織傷害が免疫応答の異常による自己免疫現象により引き起こされるものが意図される。自己免疫現象とは、外界からの異物に対してではなく、自己の成分に対して免疫反応を起こす現象である。
【００２８】
自己免疫疾患による組織傷害が発症する可能性のある組織としては、例えば、腎臓、肝臓、甲状腺、唾液腺（顎下腺）、耳介および皮膚などが挙げられる。
【００２９】
本明細書において、「クロスプレゼンテーション」とは、抗原提示細胞が外来性抗原を取り込み、プロテアソーム等により外来性抗原をプロセッシングした後、ＭＨＣクラスＩ分子によって抗原を提示する抗原提示機構をいう。
【００３０】
通常、ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞内に侵入した細菌およびウイルスによって産生されプロセッシングされた抗原（例えば、プロテアソームにより分解されて生じたペプチド断片）を提示する。一方、体内に侵入した細菌および毒物等の外来性抗原は、抗原提示細胞にエンドサイトーシスによって取り込まれると、細胞内の酵素によってプロセッシングされ分解される。そしてこの分解産物（例えば、ペプチド断片）が抗原としてＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される。すなわち、抗原提示細胞によって取り込まれた外来性抗原は、本来、ＭＨＣクラスＩＩ分子により提示される。
【００３１】
しかしながら、クロスプレゼンテーションによれば、本来ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される抗原が、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示される。なお、本明細書中で使用される場合、「クロスプレゼンテーション」は、本来ＭＨＣクラスＩＩ分子により提示される抗原が、ＭＨＣクラスＩ分子により提示される現象または提示されている状態をも意図するものである。
【００３２】
以下に、本実施の形態の組成物に関して更に詳細に説明する。
【００３３】
本実施の形態の自己免疫疾患による組織傷害を抑えるための組成物は、樹状細胞におけるエンドソームから細胞質への抗原物質の放出を阻害する薬剤を有効成分として含んでいる。
【００３４】
上記薬剤は、樹状細胞において、エンドソームから細胞質への抗原物質の放出を阻害する活性を有するものであればよく、特に限定されない。例えば、エンドソームから細胞質への抗原物質の放出（分泌）に関与するタンパク質の機能を阻害する薬剤等を挙げることができる。
【００３５】
エンドソームから細胞質への抗原物質の放出に関与するタンパク質としては、例えば、トランスロコンおよびＳｅｃ６１タンパク質などが知られている。したがって、上記薬剤は、これらのタンパク質の少なくとも１つの機能を阻害するものであることが好ましく、特にＳｅｃ６１タンパク質の機能を阻害するものであることが好ましい。なお、Ｓｅｃ６１タンパク質は、タンパク質膜透過チャネル（トランスコロン）として機能する、３種類のヘテロタンパク質からなるタンパク質である（例えば、Hellmuth-Alexander Meyer et al., Journal of Biological Chemistry, Vol.275, No.19, p14550-14557, 2000参照）。
【００３６】
上記薬剤は、例えば、ポリヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡ（double stranded RNA）、ｄｓＲＮＡ発現用ベクター、ドミナントネガティブ変異体発現用ベクターなど）、ポリペプチド、抗体（例えば、Ｓｅｃ６１特異的抗体、中和抗体など）、低分子化合物または高分子化合物などであり得るが、これらに限定されない。
【００３７】
上記薬剤がＳｅｃ６１タンパク質の機能を阻害する薬剤である場合には、例えば、Pseudomonas aeruginosa exotoxin Aであることが好ましい。
【００３８】
上記薬剤が低分子化合物である場合には、当該低分子化合物は、抗原物質とＳｅｃ６１との相互作用を阻害するもの、Ｓｅｃ６１のタンパク質の膜透過（膜輸送）機能を阻害するものなどであり得るが、これらに限定されない。
【００３９】
Ｓｅｃ６１タンパク質の機能を阻害する薬剤としては、Ｓｅｃ６１のｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を引き起こすことができるｄｓＲＮＡを用いることも可能である。ｄｓＲＮＡの塩基配列としては特に限定されず、適宜設計することが可能である。上記ｄｓＲＮＡの長さとしては特に限定されないが、例えば、１５ｂｐ〜３０ｂｐであることが好ましく、１５ｂｐ〜２５ｂｐであることが更に好ましく、２１ｂｐであることが最も好ましい。上記ｄｓＲＮＡのＧＣ含有率は特に限定されないが、例えば、４０％〜６０％であることが好ましく、４５％〜５５％であることが更に好ましく、５０％であることが最も好ましい。
【００４０】
上記ｄｓＲＮＡの具体的な配列は特に限定されないが、例えば、５´末端の塩基配列が、「ＡＡ」「ＡＡＧ」または「ＡＡＣ」であることが好ましい。
【００４１】
上記ｄｓＲＮＡの更に具体的な配列は特に限定されないが、例えば、以下の配列であり得る。なお、以下に示す配列は単なる例示であって、本発明は、これらに限定されない。
【００４２】
・ｄｓＲＮＡ（１）：５´−GCAAGUACACUCGUUCGUA−３´        （配列番号１）
・ｄｓＲＮＡ（２）：５´−UGUUCCAGUAUUGGUUAUGA−３´       （配列番号２）
・ｄｓＲＮＡ（３）：５´−GCCAAGUCGGCAGUUUGUAAAGGAC−３´  （配列番号３）
・ｄｓＲＮＡ（４）：５´−GUCCUUUACAAACUGCCGACUUGGC−３´  （配列番号４）
・ｄｓＲＮＡ（５）：５´−GCAAGUACACGCGAUCAUA−３´        （配列番号５）
・ｄｓＲＮＡ（６）：５´−CAUCGCUGCUGUAUUUAUG−３´        （配列番号６）
・ｄｓＲＮＡ（７）：５´−CCACUGUUCGGCAGAGAAA−３´        （配列番号７）
・ｄｓＲＮＡ（８）：５´−GGCGAUUCUACACGGAAGA−３´        （配列番号８）
・ｄｓＲＮＡ（９）：５´−AAUGAUCAUUACUAUCGGU−３´        （配列番号９）
なお、上記ｄｓＲＮＡがＳｅｃ６１のｍＲＮＡに対してＲＮＡ干渉を引き起こすことができることは、「Molecular Biology of the Cell, Vol.18, 1064-1072, March 2007」、「BMC Cell Biology, vol.10, 11, February 2009」、「Cancer Research, vol.69, 9105-9111, December 2009」、「Nature, vol.461, 788-792, October 2009」、および「International Immunology, vol.17, 45-53, January 2005」などに実証されている。
【００４３】
上記薬剤は、上記ｄｓＲＮＡを発現することが可能なベクターであっても良い。この場合には、市販のキットを用いて上記ｄｓＲＮＡを発現することが可能なベクターを作製すればよい。具体的には、市販のベクター（例えば、アデノウイルスベクター）に、上記ｄｓＲＮＡに相当する二本鎖ＤＮＡを挿入することによって、上記ｄｓＲＮＡを発現することが可能なベクターを作製することが可能である。
【００４４】
Ｓｅｃ６１タンパク質の機能を阻害する薬剤としては、Ｓｅｃ６１タンパク質の機能を阻害する中和抗体を用いることも可能である。中和抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であっても良い。中和抗体は、公知のものを使用することが可能であるし、作製することも可能である。
【００４５】
中和抗体を作製する場合には、公知のモノクローナル抗体の作製方法に従って作製することが可能である。例えば、Ｓｅｃ６１タンパク質の全長アミノ酸を抗原としてマウスを免疫し、当該マウスから分離した抗体生産細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマ細胞株を樹立する。そして、各ハイブリドーマ細胞株が生産する抗体について、Ｓｅｃ６１タンパク質の機能を阻害する中和活性があるか否かを検討すればよい。
【００４６】
中和活性の有無を調べる具体的なアッセイ方法としては特に限定されない。以下にその一例を示す。
【００４７】
Ｓｅｃ６１タンパク質は、エンドソーム内の抗原物質を細胞質へ放出する機能を有している。後述する実施例からも明らかなように、樹状細胞内においてＳｅｃ６１タンパク質が存在する位置（Ｓｅｃ６１タンパク質の局在化位置）と抗原物質が存在する位置とが重なっていることから、抗原物質はＳｅｃ６１タンパク質を経由して細胞質に放出されると考えられる。このため、例えば、抗原物質とＳｅｃ６１タンパク質との相互作用を阻害する抗体を中和抗体として利用できる。かかる中和抗体は、例えば、樹状細胞内においてＳｅｃ６１タンパク質が存在する位置と抗原物質が存在する位置とが重なっていないことを指標として識別できる。
【００４８】
また、樹状細胞と抗原物質とを接触させれば、通常、一時的にエンドソームのマーカータンパク質（例えば、ＥＥＡ１など）が存在する位置と抗原物質が存在する位置とが重なった後、両者の存在位置は異なるものになる。それ故に、一定の時間（例えば、抗原物質と樹状細胞とを接触させてから５分間）のみエンドソームのマーカータンパク質が存在する位置と抗原物質が存在する位置とが重なり、その後、両者の存在位置が異なるものになれば、抗原物質は細胞質に放出されたと判定される。一方、一定の時間（例えば、抗原物質と樹状細胞とを接触させてから１５分間〜３０分間）にわたってエンドソームのマーカータンパク質が存在する位置と抗原物質が存在する位置とが重なっていれば、抗原物質は細胞質に放出されないと判定される。したがって、一定の時間（例えば、抗原物質と樹状細胞とを接触させてから１５分間〜３０分間）にわたってエンドソームのマーカータンパク質が存在する位置と抗原物質が存在する位置とを重ならせることができる抗体を、中和抗体として識別すればよい。
【００４９】
例示した２種類のアッセイにおいて、細胞に対してモノクローナル抗体を投与する方法は特に限定されないが、確実に細胞内へモノクローナル抗体を導入するという観点からは、インジェクション法またはリポソーム法を用いることが好ましい。
【００５０】
本実施の形態の組成物は、薬学的に受容可能な任意のキャリアをさらに含み得る。キャリアとしては、例えば、滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、植物油、乳化剤、懸濁剤、塩、安定剤、保存剤、界面活性剤、徐放剤、他のタンパク質（ＢＳＡなど）およびトランスフェクション試薬（リポフェクション試薬、リポソーム等を含む）等が挙げられる。さらに、本発明において使用可能なキャリアとしては、グルコース、ラクトース、アラビアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプン、マグネシウムトリシリケート、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、および尿素などが挙げられる。
【００５１】
本実施の形態の組成物の剤型は特に制限されず、例えば、溶液（注射剤）、粉体、マイクロカプセルまたは錠剤などであってもよい。
【００５２】
本実施の形態の組成物の患者への投与経路は適宜選択され、例えば、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、皮下、脊髄腔内、脳室内または経口的に行われ得るがこれらに限定されない。また、本実施の形態の組成物は全身的または局所的に投与され得るが、全身投与による副作用が問題となる場合には、病変部位への局所投与が好ましい。投与量および投与方法は、有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者は適宜選択し得る。
【００５３】
本実施の形態の組成物中に含まれる有効成分の割合は特に限定されず、適宜設定することが可能である。例えば、有効成分を総組成物の０．１重量％〜９０重量％含むことが可能であり、５０重量％〜９０重量％含むことも可能であり、７５重量％〜９０％含むことも可能であるが、これらに限定されない。
【００５４】
本実施の形態の組成物中に含まれる有効成分の投与量は特に限定されないが、非経口投与では、１日当たり体重１ｋｇ当たり、０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜３００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１００ｍｇである。しかし、組成物中に含まれる有効成分の投与量は、疾患状態、体重、治療に対する患者の反応、投与形態、病気の経過の段階、または投与の間隔に依存して適宜調整され得る。なお、投与は、１回〜数回に分けておこなわれ得、例えば、１日あたり１〜５回投与され得る。
【００５５】
本実施の形態の組成物の投与対象としては、例えば、ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、およびサルなど）、ならびにその他の脊椎動物が挙げられる。非ヒト哺乳動物への適用は、ヒトの組織傷害疾患に対する予防法または治療法を開発するためにも有用である。例えば、投与対象として非ヒト哺乳動物を用いて作製したモデル動物を用いることにより、自己免疫疾患による組織傷害の発症を予防する新たな治療プロトコルを開発することができる。
【００５６】
〔２．本発明に係るモデル動物〕
本実施の形態の自己免疫疾患による組織傷害を発症する組織傷害発症モデル動物は、樹状細胞におけるエンドソームから細胞質への抗原物質の放出が亢進している性質を示すものである。
【００５７】
具体的には、本実施の形態の組織傷害発症モデル動物では、樹状細胞におけるエンドソームから細胞質への抗原物質の放出に関与するタンパク質の機能が亢進していることが好ましい。上記タンパク質としては特に限定されないが、例えば、トランスロコンおよびＳｅｃ６１タンパク質の少なくとも１つであることが好ましく、少なくともＳｅｃ６１タンパク質の機能が亢進していることが更に好ましい。
【００５８】
本実施の形態の組織傷害発症モデル動物は、ヒト以外の哺乳動物であれば限定されるものではないが、ヒトの自己免疫疾患による組織傷害に対する予防法または治療法を開発するために用いられる実験動物が好ましい。例えば、マウス、ラット、ウサギ、サル、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシおよびイヌ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
以下に、本実施の形態の自己免疫疾患による組織傷害を発症する組織傷害発症モデル動物の製造方法を説明する。なお、本発明は、当該組織傷害発症モデル動物の製造方法を包含する。
【００６０】
自己免疫疾患による組織傷害を発症する組織傷害発症モデル動物の製造方法は、樹状細胞におけるエンドソームから細胞質への抗原物質の放出を亢進する工程を含むことを特徴としている。上記組織傷害発症モデル動物の製造方法では、上記工程は、Ｓｅｃ６１の機能を亢進することを含むことが好ましい。上記工程としては特に限定されないが、少なくとも樹状細胞において、エンドソームから細胞質への抗原物質の放出に関与するタンパク質の機能を亢進する工程であることが好ましい。
【００６１】
上述したように、エンドソームから細胞質への抗原物質の放出に関与するタンパク質としては、例えば、トランスロコンおよびＳｅｃ６１タンパク質などが知られている。したがって、上記工程は、これらのタンパク質の少なくとも１つの機能を亢進させる工程であることが好ましく、少なくともＳｅｃ６１タンパク質の機能を亢進させる工程であることが更に好ましい。
【００６２】
具体的には、上記工程は、少なくとも樹状細胞において、エンドソームから細胞質への抗原物質の放出に関与するタンパク質の少なくとも１つを強制発現させることを含んでいることが好ましく、少なくともＳｅｃ６１タンパク質を強制発現させることを含んでいることが更に好ましい。
【００６３】
樹状細胞においてこれらのタンパク質を強制発現させる方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、周知のトランスジェニック動物の作成方法に従って作成することが可能である。
【００６４】
本実施の形態の組織傷害発症モデル動物は、自己免疫疾患による組織傷害を抑えるための薬剤のスクリーニングなどに利用することができる。
【００６５】
〔３．本発明に係るスクリーニング方法〕
本実施の形態のスクリーニング方法は、樹状細胞におけるエンドソームから細胞質への抗原物質の放出を阻害する薬剤のスクリーニング方法であって、エンドソームに抗原物質を含む樹状細胞と、薬剤候補物質とを接触させる第１工程と、上記抗原物質が細胞質に放出されたか否かを判定する第２工程と、を含んでいる。
【００６６】
以下に、第１工程および第２工程について説明する。
【００６７】
〔３−１．第１工程〕
第１工程は、エンドソームに抗原物質を含む樹状細胞と、薬剤候補物質とを接触させる工程である。
【００６８】
エンドソームに抗原物質を含む樹状細胞は、例えば、生体由来の樹状細胞と抗原物質とを共培養することによって作製することができる。上記樹状細胞の由来は特に限定されないが、例えば、一般的なモデル動物由来の樹状細胞のほか、上述した本発明に係るモデル動物由来の樹状細胞を用いることも可能である。
【００６９】
実施例に示しているように、骨髄由来ＤＣを『Inaba K, et al. J Exp Med. 176:1693-1702, 1992.』および『Lutz MB, et al. J Immunol Methods. 223:77-92, 1999.』に記載されている方法にしたがって入手する。次いで、所望の抗原物質の存在下で、骨髄由来ＤＣを培養する。抗原物質としては特に限定されず、例えば、卵白アルブミンなどを用いることが可能である。以上のようにして、エンドソームに抗原物質を含む樹状細胞を作製することができる。
【００７０】
また、抗原物質は、放射性同位元素（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ））、ならびに蛍光標識（例えば、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）、フルオレセインおよびローダミン）ならびにビオチン等の標識物質で標識されていることが好ましい。また、ｉｎ  ｖｉｖｏでの画像解析のための標識またはマーカーとして、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、またはＥＳＲによって検出可能なものも適宜使用可能である。Ｘ線撮影法については、適切な標識として、検出可能な放射線を放射するが、被検体に対して明らかには有害ではない、バリウムまたはセシウムのような放射性同位元素が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーとして、関連する樹状細胞に栄養分の標識等によって取り込まれ得る、重水素のような検出可能な特徴的な回転を有するものが挙げられる。
【００７１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの試験では、放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射性不透過体（radio-opaque）基質、又は核磁気共鳴によって検出可能な物質のような適切な検出可能な画像解析部分で標識されている、抗原物質が、試験される哺乳動物中に（例えば、非経口的、皮下、または静脈内）導入される。被検体の大きさおよび使用される画像解析システムによって、診断用の画像を生じるために必要とされる画像解析部分の量が決定されることが、当該分野で理解される。放射性同位元素部分の場合、ヒト被検体については、注射される放射活性の量は、通常約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。次いで、標識抗体または抗体フラグメントは、本発明に係るタンパク質に対する抗体を含む細胞の位置に優先的に蓄積する。なお、参考例として、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍の画像解析については、S. W. Burchielら、「Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments」（Tumer Imaging 第13章: The Radiochemical Detection of Cancer, Burchiel, S. W. およびRhodes, B. A. 編、Masson Publishing Inc.（1982））に記載されている。
【００７２】
適切な放射性同位体標識の例としては、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、１５２Ｅｕ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄなどが挙げられる。１１１Ｉｎは、in vivoでのイメージングが用いられる場合に好ましい同位体である。これら放射性核種は、イメージングのためにより好ましいγ放出エネルギーを有する（Perkinsら、Eur. J. Nucl. Med. 10: 296-301（1985）； Carasquilloら、J. Nucl. Med. 28: 281-287（1987））。
【００７３】
また、適切な非放射性同位体標識の例としては、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｔｒ、および５６Ｆｅが挙げられる。
【００７４】
また、適切な蛍光標識の例としては、１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、ｏ−フタルアルデヒド標識、およびフルオレサミン標識が挙げられる。
【００７５】
化学発光標識の例としては、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびエクオリン標識が挙げられる。
【００７６】
核磁気共鳴コントラスト剤の例としては、Ｇｄ、Ｍｎ、およびＦｅのような重金属原子核が挙げられる。
【００７７】
第１工程では、上述した樹状細胞と薬剤候補物質とを接触させる。
【００７８】
薬剤候補物質としては特に限定されない。例えば、薬剤候補物質はポリヌクレオチド、ポリペプチド、低分子化合物または高分子化合物などであり得、これらを１つまたは複数含むものであり得る。
【００７９】
樹状細胞と薬剤候補物質とを接触させる具体的な方法は特に限定されない。例えば、樹状細胞を培養している培養液へ、薬剤候補物質を直接投与することが可能である。薬剤候補物質がポリヌクレオチドである場合には、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法などによって、より確実に薬剤候補物質を樹状細胞内へ導入することが好ましい。薬剤候補物質がポリペプチドまたは高分子化合物である場合には、インジェクション法またはリポソーム法などによって、より確実に薬剤候補物質を樹状細胞内へ導入することが好ましい。
【００８０】
〔３−２．第２工程〕
第２工程は、抗原物質が細胞質に放出されたか否かを判定する工程である。
【００８１】
当該工程は、抗原物質がエンドソームから細胞質に放出されたか否かを判定することができる工程であればよく、具体的な構成は特に限定されない。
【００８２】
例えば、上記第２工程は、エンドソームのマーカータンパク質（例えば、ＥＥＡ１など）が存在する位置と抗原物質が存在する位置とが重なっているか否かを判定することを含んでいることが好ましい。位置が重なっているか否かを判定する具体的な方法は特に限定されないが、蛍光染色法や上述した各種標識物質を利用した方法等によって判定することが、簡便さおよび精度の面で好ましいといえる。
【００８３】
後述する実施例に示すように、樹状細胞と抗原物質とを接触させれば、通常、一時的にエンドソームのマーカータンパク質が存在する位置と抗原物質が存在する位置とが重なった後、両者の存在位置は異なるものになる。したがって、一定の時間（例えば、抗原物質と樹状細胞とを接触させてから５分間）のみエンドソームのマーカータンパク質が存在する位置と抗原物質が存在する位置とが重なり、その後、両者の存在位置が異なるものになれば、抗原物質は細胞質に放出されたと判定される。一方、一定の時間（例えば、抗原物質と樹状細胞とを接触させてから１５分間〜３０分間）にわたってエンドソームのマーカータンパク質が存在する位置と抗原物質が存在する位置とが重なっていれば、抗原物質は細胞質に放出されないと判定される。
【００８４】
当該第２工程において、薬剤候補物質の作用により、樹状細胞において、抗原物質がエンドソームから細胞質に放出されない場合、当該薬剤候補物質は、自己免疫疾患による組織傷害を抑えるための物質と判断できる。かかる物質の機能については、樹状細胞において、抗原物質がエンドソームから細胞質に放出させない機能を有しておればよく、Ｓｅｃ６１タンパク質の機能を阻害する物質、Ｓｅｃ６１タンパク質と抗原物質との相互作用を阻害する物質、Ｓｅｃ６１タンパク質の発現を阻害する物質等を挙げることができる。
【００８５】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施の形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施の形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００８６】
＜１．骨髄由来ＤＣ（ＢＭ−ＤＣ）の入手＞
骨髄由来ＤＣ（bone marrow-dendritic cell：ＢＭ−ＤＣ）は、『Inaba K, et al. J Exp Med. 176:1693-1702, 1992.』および『Lutz MB, et al. J Immunol Methods. 223:77-92, 1999.』に記載されている方法にしたがって入手した。以下に、その方法について説明する。
【００８７】
ＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿骨から採取した骨髄細胞（５×１０６細胞）を、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor：ＧＭ−ＣＳＦ）の濃度が２０ｎｇ／ｍＬであるＲＰＭＩ  １６４０培地１０ｍＬにて培養した。
【００８８】
培養開始３日後に、ＧＭ−ＣＳＦの濃度が２０ｎｇ／ｍＬであるＲＰＭＩ培地１０ｍＬを加えた。
【００８９】
培養開始６日後に、培地１０ｍＬを、ＧＭ−ＣＳＦの濃度が２０ｎｇ／ｍＬであるＲＰＭＩ培地１０ｍＬと交換した。
【００９０】
培養開始７日後に、浮遊細胞を回収した後、磁気分離法によってＣＤ１１ｃをマーカーとして骨髄由来ＤＣを単離した。
【００９１】
＜２．抗原およびエンドソームの局在に関する検討＞
本実施例では、抗原として蛍光標識した卵白アルブミン（ovalbumin :ＯＶＡ）を用いた。更に具体的には、蛍光標識した卵白アルブミンとしては、市販の蛍光標識ＯＶＡ（Invitrogen社製のAlexa Fluor488標識ＯＶＡ、または、Alexa Fluor594標識ＯＶＡ）を用いた。
【００９２】
ＢＭ−ＤＣを、蛍光標識した卵白アルブミンと共に５分間、１５分間または３０分間培養した。その後、蛍光標識抗体を用いて初期エンドソームのマーカーであるearly endosome antigen 1（ＥＥＡ１）を染色した。なお、染色には市販の抗体（Affinity BioReagents社製の抗EEA1抗体およびInvitrogen社製のAlexa Fluor594標識抗rabbit IgG抗体）を用いた。また、Hoechstを用いて核を染色した。
【００９３】
次いで、蛍光顕微鏡下において、ＢＭ−ＤＣ内におけるＯＶＡおよびＥＥＡ１の局在を観察した。
【００９４】
図１に観察結果を示す。５分間培養した場合には、ＯＶＡの存在位置とＥＥＡ１の存在位置とが重なった。つまり、５分間培養した場合には、ＯＶＡは初期エンドソームに存在しており、このことは、クロスプレゼンテーション、およびクロスプレゼンテーションによって引き起こされる組織傷害に、初期エンドソームが関与していることを示している。
【００９５】
１５分間培養した場合には、５分間培養した場合よりも、ＯＶＡの存在位置とＥＥＡ１の存在位置との重なりが減少した。また、３０分間培養した場合には、１５分間培養した場合よりも、ＯＶＡの存在位置とＥＥＡ１の存在位置との重なりが更に減少した。つまり、１５分間、３０分間と培養時間を増加させるにつれて、初期エンドソームに存在していたＯＶＡが細胞質へと放出された。
【００９６】
＜３．抗原および小胞体の局在に関する検討＞
ＢＭ−ＤＣを、蛍光標識した卵白アルブミンと共に５分間、１５分間または３０分間培養した。その後、蛍光標識抗体を用いて小胞体（endoplasmic reticulum：ＥＲ）のマーカーであるカルネキシン（calnexin）を染色した。なお、染色には市販の抗体（Stressgen社製の抗カルネキシン抗体およびInvitrogen社製のAlexa Fluor635標識抗rabbit IgG抗体）を用いた。また、Hoechstを用いて核を染色した。
【００９７】
次いで、蛍光顕微鏡下において、ＢＭ−ＤＣ内におけるＯＶＡおよびカルネキシンの局在を観察した。
【００９８】
図２に観察結果を示す。５分間、１５分間および３０分間培養した何れの場合も、ＯＶＡの存在位置とカルネキシンの存在位置とが重なることはなかった。つまり、５分間、１５分間および３０分間培養した何れの場合も、ＯＶＡが小胞体に存在することはなかった。このことは、クロスプレゼンテーション、およびクロスプレゼンテーションによって引き起こされる組織傷害に、小胞体は関与していないことを示している。
【００９９】
＜４．抗原およびＳｅｃ６１タンパク質の局在に関する検討＞
ＢＭ−ＤＣを、蛍光標識した卵白アルブミンと共に１５分間培養した。その後、蛍光標識抗体を用いてトランスコロンであるＳｅｃ６１タンパク質を染色した。なお、染色には市販の抗体（Proteintech Group社製の抗Sec61B抗体およびInvitrogen社製のAlexa Fluor488標識抗rabbit IgG抗体）を用いた。また、Hoechstを用いて核を染色した。
【０１００】
次いで、蛍光顕微鏡下において、ＢＭ−ＤＣ内におけるＯＶＡおよびＳｅｃ６１タンパク質の局在を観察した。
【０１０１】
図３に観察結果を示す。図３から明らかなように、ＯＶＡの存在位置とＳｅｃ６１タンパク質の存在位置とが重なった。このことは、クロスプレゼンテーション、およびクロスプレゼンテーションによって引き起こされる組織傷害に、Ｓｅｃ６１タンパク質が関与していることを示している。つまり、このことは、クロスプレゼンテーション、およびクロスプレゼンテーションによる組織傷害を引き起こすためには、Ｓｅｃ６１タンパク質によって、抗原物質がエンドソームから細胞質へ放出されることが重要であることを示している。
【０１０２】
＜５．Ｓｅｃ６１タンパク質の阻害実験＞
Ｓｅｃ６１タンパク質の機能を、Pseudomonas aeruginosa由来のexotoxin Aで阻害した場合における、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の生成と、組織傷害のひとつである腎炎の発症とを、in vivoにて検討した。その実験方法と実験結果とを以下に示す。なお、exotoxin AはＳｅｃ６１タンパク質の阻害剤の一例であって、当業者であれば、Ｓｅｃ６１タンパク質の機能を阻害し得るものであれば、exotoxin Aと同様の効果が得られることを理解するであろう。
【０１０３】
ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ、Ｓｅｃ６１タンパク質の阻害剤であるexotoxin A （２．５μｇ）を投与した。exotoxin Aを投与した３時間後に、０．５ｍｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）を、上記ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ投与した。上記exotoxin AおよびＯＶＡの投与を、５日毎に合計１２回、繰り返し行った。対照実験として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のみを５日毎に合計１２回繰り返し投与する実験と、ＯＶＡのみを５日毎に合計１２回繰り返し投与する実験とを行った。
【０１０４】
腎炎発症の有無を検討するために、最終投与から２日後にタンパク尿を検出した。具体的には、アルブスティックス（バイエル社）を用いて、テトラブロムフェノールブルーによる呈色反応に基づいてタンパク尿を検出した（なお、同様の検出方法が、本明細書中に記載された特許文献１および２、並びに、非特許文献１にも記載されているので参考のこと）。
【０１０５】
ＣＴＬの生成を検討するために、最終投与から９日後にＢＡＬＢ／ｃマウスを屠殺し、脾臓におけるＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメーターにて検出した。具体的には、細胞内染色によってＩＦＮ−γを染色し、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメーターにて検出した（なお、同様の検出方法が、本明細書中に記載された特許文献１および２、並びに、非特許文献１にも記載されているので参考のこと）。
【０１０６】
図４に、タンパク尿を検出した結果を示す。図４に示すように、ＰＢＳのみを投与した場合には、腎炎は発症しないのでタンパク尿は検出されず、ＯＶＡのみを投与した場合には、腎炎が発症してタンパク尿が検出される。このとき、ＯＶＡとexotoxin Aとの両方を投与した場合には、ＯＶＡのみを投与した場合と比較して、タンパク尿のスコアが低下していた。このことは、ＯＶＡとexotoxin Aとの両方を投与することによって、腎炎の発症が有意に抑制されたことを示している。
【０１０７】
図５に、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出した結果を示す。図５に示すように、ＰＢＳのみを投与した場合には、脾臓においてＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞は増加せず、ＯＶＡのみを投与した場合には、脾臓においてＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞が増加する。ＯＶＡとexotoxin Aとの両方を投与した場合には、ＯＶＡのみを投与した場合と比較して、脾臓におけるＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加が有意に抑制された。
【０１０８】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明は、自己免疫疾患による組織傷害の治療に用いることができる。また、本発明は、医療分野、製薬分野および保健医学分野をはじめ、生命科学分野の産業に広く利用することができる。
【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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