(57)【要約】【課題】食品成分を摂取する者の感受性の個体差や感受性の変化を評価する方法、またはその感受性を見ることで他の成分の摂取に与える影響の予測などの評価方法を提供する。【解決手段】所定の遺伝子群のうち１又は複数の遺伝子に対する被験物質の作用を判定する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、前記被験物質の作用と関連づけることを特徴とする前記方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の遺伝子群のうち１又は複数の遺伝子に対する被験物質の作用を判定する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、前記被験物質の作用と関連づけることを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
６７ＬＲ、ＺＡＰ７０、ＦＹＮ、ＢＣＬ２、ＢＣＬｘｌ、ＣＤ４、ＶＩＭ、ｅＥＦ１Ａ、ＭＹＰＴ１、ＡＲ、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＰＡＰｄ５、ＥＳＲＲＢ、ＳＩＲＴ１、ＡＤＯＲＡ３、ＡＨＲ、ＧＡＢＲＡ１、ＧＡＢＢＲ１、ＧＡＢＢＲ２、ＰＰＡＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧ、ＧＰＲ４０、ＧＰＲ１２０、ＦＦＡＲ３、ＧＰＲ４３、ＧＰＲ８４、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ２、ＦＯＬＲ３、Ｆｏｌｒ４、ＣＤ３６、ＳＴＸ３、ＴＡＳ１Ｒ１、ＧＰＲＣ６Ａ、ＴＯＰ１、ＰＯＬＢ、ＦＡＢＰ５、ＣＲＡＢＰ２、ＲＸＲａ、ＲＸＲｂ、ＲＸＲｇ、ＲＡＲａ、ＲＡＲｂ、ＶＤＲ、ＳＸＲ、Ｈｉｃ２、Ｐ３８ＩＰ、ＡＤＩＰＯＲ１、ＡＤＩＰＯＲ２、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＡ１、ＡＤＲＡ１Ａ、ＩＴＬＮ１、ＴＲＰＭ８、Ｃ３、ＡＤＯＲＡ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＤＯＲＡ２Ｂ、ＣＬＥＣ７Ａ、ＣＤ１１ｂ、ＬＸＲ、ＧＬＲＡ１、ＧＬＲＡ２、Ｇｌｒａ３、Ｇｌｒａ４、Ｇｌｒｂ、ＮＡＲＧ１、ＧＲＩＡ１、ＧＲＩＡ２、ＧＲＩＡ３、ＧＲＩＡ４、ＬＴＢ４Ｒ、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＧＡＬＳ３、ＡＧＥＲ、ＳＣＡＦ１、ＳＣＡＲＢ１、ＯＬＲ１、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＢ２、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９
【請求項２】
被験生物の被験物質に対する感受性を判定する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
６７ＬＲ、ＺＡＰ７０、ＦＹＮ、ＢＣＬ２、ＢＣＬｘｌ、ＣＤ４、ＶＩＭ、ｅＥＦ１Ａ、ＭＹＰＴ１、ＡＲ、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＰＡＰｄ５、ＥＳＲＲＢ、ＳＩＲＴ１、ＡＤＯＲＡ３、ＡＨＲ、ＧＡＢＲＡ１、ＧＡＢＢＲ１、ＧＡＢＢＲ２、ＰＰＡＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧ、ＧＰＲ４０、ＧＰＲ１２０、ＦＦＡＲ３、ＧＰＲ４３、ＧＰＲ８４、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ２、ＦＯＬＲ３、Ｆｏｌｒ４、ＣＤ３６、ＳＴＸ３、ＴＡＳ１Ｒ１、ＧＰＲＣ６Ａ、ＴＯＰ１、ＰＯＬＢ、ＦＡＢＰ５、ＣＲＡＢＰ２、ＲＸＲａ、ＲＸＲｂ、ＲＸＲｇ、ＲＡＲａ、ＲＡＲｂ、ＶＤＲ、ＳＸＲ、Ｈｉｃ２、Ｐ３８ＩＰ、ＡＤＩＰＯＲ１、ＡＤＩＰＯＲ２、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＡ１、ＡＤＲＡ１Ａ、ＩＴＬＮ１、ＴＲＰＭ８、Ｃ３、ＡＤＯＲＡ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＤＯＲＡ２Ｂ、ＣＬＥＣ７Ａ、ＣＤ１１ｂ、ＬＸＲ、ＧＬＲＡ１、ＧＬＲＡ２、Ｇｌｒａ３、Ｇｌｒａ４、Ｇｌｒｂ、ＮＡＲＧ１、ＧＲＩＡ１、ＧＲＩＡ２、ＧＲＩＡ３、ＧＲＩＡ４、ＬＴＢ４Ｒ、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＧＡＬＳ３、ＡＧＥＲ、ＳＣＡＦ１、ＳＣＡＲＢ１、ＯＬＲ１、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＢ２、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９
【請求項３】
被験物質の機能を予測する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
＜遺伝子群＞
６７ＬＲ、ＺＡＰ７０、ＦＹＮ、ＢＣＬ２、ＢＣＬｘｌ、ＣＤ４、ＶＩＭ、ｅＥＦ１Ａ、ＭＹＰＴ１、ＡＲ、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＰＡＰｄ５、ＥＳＲＲＢ、ＳＩＲＴ１、ＡＤＯＲＡ３、ＡＨＲ、ＧＡＢＲＡ１、ＧＡＢＢＲ１、ＧＡＢＢＲ２、ＰＰＡＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧ、ＧＰＲ４０、ＧＰＲ１２０、ＦＦＡＲ３、ＧＰＲ４３、ＧＰＲ８４、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ２、ＦＯＬＲ３、Ｆｏｌｒ４、ＣＤ３６、ＳＴＸ３、ＴＡＳ１Ｒ１、ＧＰＲＣ６Ａ、ＴＯＰ１、ＰＯＬＢ、ＦＡＢＰ５、ＣＲＡＢＰ２、ＲＸＲａ、ＲＸＲｂ、ＲＸＲｇ、ＲＡＲａ、ＲＡＲｂ、ＶＤＲ、ＳＸＲ、Ｈｉｃ２、Ｐ３８ＩＰ、ＡＤＩＰＯＲ１、ＡＤＩＰＯＲ２、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＡ１、ＡＤＲＡ１Ａ、ＩＴＬＮ１、ＴＲＰＭ８、Ｃ３、ＡＤＯＲＡ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＤＯＲＡ２Ｂ、ＣＬＥＣ７Ａ、ＣＤ１１ｂ、ＬＸＲ、ＧＬＲＡ１、ＧＬＲＡ２、Ｇｌｒａ３、Ｇｌｒａ４、Ｇｌｒｂ、ＮＡＲＧ１、ＧＲＩＡ１、ＧＲＩＡ２、ＧＲＩＡ３、ＧＲＩＡ４、ＬＴＢ４Ｒ、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＧＡＬＳ３、ＡＧＥＲ、ＳＣＡＦ１、ＳＣＡＲＢ１、ＯＬＲ１、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＢ２、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９
【請求項４】
分子Ａ又は遺伝子Ａを標的として作用する被験物質Ｘ、及び当該分子Ａ又は遺伝子Ａとは異なる他の分子Ｂ又は遺伝子Ｂを標的として作用する被験物質Ｙを、同時に又は相前後して接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を指標として、前記被験物質Ｘと被験物質Ｙとが互いに影響を及ぼすか否かを予測する方法。
＜遺伝子群＞
６７ＬＲ、ＺＡＰ７０、ＦＹＮ、ＢＣＬ２、ＢＣＬｘｌ、ＣＤ４、ＶＩＭ、ｅＥＦ１Ａ、ＭＹＰＴ１、ＡＲ、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＰＡＰｄ５、ＥＳＲＲＢ、ＳＩＲＴ１、ＡＤＯＲＡ３、ＡＨＲ、ＧＡＢＲＡ１、ＧＡＢＢＲ１、ＧＡＢＢＲ２、ＰＰＡＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧ、ＧＰＲ４０、ＧＰＲ１２０、ＦＦＡＲ３、ＧＰＲ４３、ＧＰＲ８４、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ２、ＦＯＬＲ３、Ｆｏｌｒ４、ＣＤ３６、ＳＴＸ３、ＴＡＳ１Ｒ１、ＧＰＲＣ６Ａ、ＴＯＰ１、ＰＯＬＢ、ＦＡＢＰ５、ＣＲＡＢＰ２、ＲＸＲａ、ＲＸＲｂ、ＲＸＲｇ、ＲＡＲａ、ＲＡＲｂ、ＶＤＲ、ＳＸＲ、Ｈｉｃ２、Ｐ３８ＩＰ、ＡＤＩＰＯＲ１、ＡＤＩＰＯＲ２、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＡ１、ＡＤＲＡ１Ａ、ＩＴＬＮ１、ＴＲＰＭ８、Ｃ３、ＡＤＯＲＡ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＤＯＲＡ２Ｂ、ＣＬＥＣ７Ａ、ＣＤ１１ｂ、ＬＸＲ、ＧＬＲＡ１、ＧＬＲＡ２、Ｇｌｒａ３、Ｇｌｒａ４、Ｇｌｒｂ、ＮＡＲＧ１、ＧＲＩＡ１、ＧＲＩＡ２、ＧＲＩＡ３、ＧＲＩＡ４、ＬＴＢ４Ｒ、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＧＡＬＳ３、ＡＧＥＲ、ＳＣＡＦ１、ＳＣＡＲＢ１、ＯＬＲ１、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＢ２、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９
【請求項５】
被験物質が食品又は薬物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的遺伝子の発現変化による食品機能成分及び医薬品感受性評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の社会では健康に対する意識が年々高まっており、そのような社会背景も後押しして、医療や医薬の分野での研究は勿論のこと、食品の分野においても健康に関する研究が飛躍的に進んできている。食には以下の３つの機能があり、栄養を補給する生命維持の一次機能、味覚や嗜好を満足させる二次機能、そして体内の生理系統を調節して健康の維持や健康の回復に効果を及ぼす第三次機能があるが、近年、この第三次機能が注目を集めている。昭和５９年の文部省特定研究「食品機能の系統的解析と展開」を礎として食品の第三次機能の研究が進み、また、平成３年の特定保健用食品制度のスタートにより、食品の第三次機能についての研究がより盛んに行われるようになってきた。
【０００３】
特定保健用食品としては、血中コレステロールの低減や血圧上昇抑制や整腸作用、血糖値上昇抑制などの効果が謳われているものが多く販売されているが、それらの特定保健用食品に含まれる機能成分の作用メカニズムについては詳細が解明されていない部分も多く、現在も作用メカニズムの研究が行われている。
【０００４】
食品機能成分の作用メカニズムの研究において、近年の報告では食品機能成分が細胞内外の受容体に結合し、その結合後に機能が発揮されることが報告されている（非特許文献１）。これは、食品の機能成分が特定の標的分子に結合することで細胞内にシグナルを伝達して効果を発揮するというものであり、受け取り側のその標的分子の有無または発現量により、同じ食品成分であっても効果が異なることを示している。
【０００５】
食品や医薬品の活性評価としては、その評価対象に期待される効果によって様々な評価方法がある。その中のひとつとして、遺伝子の発現量によって評価を行う方法もいくつかは報告されており、例えば漢方の活性を複数の遺伝子発現量の変化により評価する方法も報告されている（特許文献１）。また、疾患に対してどのような医学的介入を行うかの決定を遺伝子発現解析より個体差を考慮して判定する方法（特許文献２）も報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７３１９０５１号公報
【特許文献２】特表２００９５３７１５４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔａｃｈｉｂａｎａ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００４；１１：３８０−３８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、食品機能成分や治療薬が結合する又は標的とする各物質の遺伝子発現量に着目して、食品成分を摂取する者の感受性の個体差や感受性の変化を評価する方法、またはその感受性を見ることで他の成分の摂取に与える影響の予測などの評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、所定の遺伝子の発現に着目することにより、被験生物の感受性などを検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）  下記の遺伝子群のうち１又は複数の遺伝子に対する被験物質の作用を判定する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、前記被験物質の作用と関連づけることを特徴とする前記方法。
（２）  被験生物の被験物質に対する感受性を判定する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
（３）  被験物質の機能を予測する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、対照と比較することを特徴とする前記方法。
（４）  分子Ａ又は遺伝子Ａを標的として作用する被験物質Ｘ、及び当該分子Ａ又は遺伝子Ａとは異なる他の分子Ｂ又は遺伝子Ｂを標的として作用する被験物質Ｙを、同時に又は相前後して接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を指標として、前記被験物質Ｘと被験物質Ｙとが互いに影響を及ぼすか否かを予測する方法。
＜遺伝子群＞
６７ＬＲ、ＺＡＰ７０、ＦＹＮ、ＢＣＬ２、ＢＣＬｘｌ、ＣＤ４、ＶＩＭ、ｅＥＦ１Ａ、ＭＹＰＴ１、ＡＲ、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＰＡＰｄ５、ＥＳＲＲＢ、ＳＩＲＴ１、ＡＤＯＲＡ３、ＡＨＲ、ＧＡＢＲＡ１、ＧＡＢＢＲ１、ＧＡＢＢＲ２、ＰＰＡＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧ、ＧＰＲ４０、ＧＰＲ１２０、ＦＦＡＲ３、ＧＰＲ４３、ＧＰＲ８４、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ２、ＦＯＬＲ３、Ｆｏｌｒ４、ＣＤ３６、ＳＴＸ３、ＴＡＳ１Ｒ１、ＧＰＲＣ６Ａ、ＴＯＰ１、ＰＯＬＢ、ＦＡＢＰ５、ＣＲＡＢＰ２、ＲＸＲａ、ＲＸＲｂ、ＲＸＲｇ、ＲＡＲａ、ＲＡＲｂ、ＶＤＲ、ＳＸＲ、Ｈｉｃ２、Ｐ３８ＩＰ、ＡＤＩＰＯＲ１、ＡＤＩＰＯＲ２、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＡ１、ＡＤＲＡ１Ａ、ＩＴＬＮ１、ＴＲＰＭ８、Ｃ３、ＡＤＯＲＡ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＤＯＲＡ２Ｂ、ＣＬＥＣ７Ａ、ＣＤ１１ｂ、ＬＸＲ、ＧＬＲＡ１、ＧＬＲＡ２、Ｇｌｒａ３、Ｇｌｒａ４、Ｇｌｒｂ、ＮＡＲＧ１、ＧＲＩＡ１、ＧＲＩＡ２、ＧＲＩＡ３、ＧＲＩＡ４、ＬＴＢ４Ｒ、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＧＡＬＳ３、ＡＧＥＲ、ＳＣＡＦ１、ＳＣＡＲＢ１、ＯＬＲ１、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＢ２、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、様々な食品機能成分や治療薬が結合する又は標的とする各物質の遺伝子発現量に着目し、その遺伝子発現の変化を複数同時に測定することで、その食品機能成分や治療薬を摂取する生体のその摂取成分に対する感受性を評価することや、食品機能成分や治療薬の生態機能を予測し、また他の食品、医薬品との相性を予測することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の方法の概要を示す図である。
【図２】本発明の方法の概要を示す図である。
【図３】本発明の方法によりプラセボ対照３群並行群間比較試験二重盲検法でお茶成分の摂取者の時間経過（摂取期間）による感受性の変化及び摂取物の機能の予測を行った結果を示す図である。
【図４】本発明の方法によりＡＴＲＡの機能、他の食品成分への影響を予測した結果を示す図である。
【図５】本発明の方法によりｅｑｕｏｌを測定し、クラスター解析でフラボノイド系成分と比較した結果を示す図である。
【図６Ａ】高脂肪高ショ糖食摂取によるマウス大腿四頭筋の遺伝子発現量の変化を示すグラフである。
【図６Ｂ】高脂肪高ショ糖食摂取によるマウス大腿四頭筋の遺伝子発現量の変化を示すグラフである。
【図７Ａ】高脂肪高ショ糖食摂取によるマウス肝臓の遺伝子発現量の変化を示すグラフである。
【図７Ｂ】高脂肪高ショ糖食摂取によるマウス肝臓の遺伝子発現量の変化を示すグラフである。
【図７Ｃ】高脂肪高ショ糖食摂取によるマウス肝臓の遺伝子発現量の変化を示すグラフである。
【図８Ａ】廃用性筋萎縮における遺伝子発現量の変化を示すグラフである。
【図８Ｂ】廃用性筋萎縮における遺伝子発現量の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明の概要
本発明は、被験物質を摂取又は投与された被験生物から試料を採取し、その採取した試料中の遺伝子を検出して被験物質の所定の遺伝子群に対する作用を測定することで、被験生物の感受性を評価する方法、又は被験物質の機能（作用）を予測する方法である。本発明において対象となる遺伝子群を以下に示す。また、表１に標的となるタンパク質の遺伝子名、被験物質群、被験物質が標的に結合した場合に作用する機能を示している。
＜遺伝子群＞
６７ＬＲ、ＺＡＰ７０、ＦＹＮ、ＢＣＬ２、ＢＣＬｘｌ、ＣＤ４、ＶＩＭ、ｅＥＦ１Ａ、ＭＹＰＴ１、ＡＲ、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＰＡＰｄ５、ＥＳＲＲＢ、ＳＩＲＴ１、ＡＤＯＲＡ３、ＡＨＲ、ＧＡＢＲＡ１、ＧＡＢＢＲ１、ＧＡＢＢＲ２、ＰＰＡＲＡ、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧ、ＧＰＲ４０、ＧＰＲ１２０、ＦＦＡＲ３、ＧＰＲ４３、ＧＰＲ８４、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ２、ＦＯＬＲ３、Ｆｏｌｒ４、ＣＤ３６、ＳＴＸ３、ＴＡＳ１Ｒ１、ＧＰＲＣ６Ａ、ＴＯＰ１、ＰＯＬＢ、ＦＡＢＰ５、ＣＲＡＢＰ２、ＲＸＲａ、ＲＸＲｂ、ＲＸＲｇ、ＲＡＲａ、ＲＡＲｂ、ＶＤＲ、ＳＸＲ、Ｈｉｃ２、Ｐ３８ＩＰ、ＡＤＩＰＯＲ１、ＡＤＩＰＯＲ２、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＡ１、ＡＤＲＡ１Ａ、ＩＴＬＮ１、ＴＲＰＭ８、Ｃ３、ＡＤＯＲＡ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＤＯＲＡ２Ｂ、ＣＬＥＣ７Ａ、ＣＤ１１ｂ、ＬＸＲ、ＧＬＲＡ１、ＧＬＲＡ２、Ｇｌｒａ３、Ｇｌｒａ４、Ｇｌｒｂ、ＮＡＲＧ１、ＧＲＩＡ１、ＧＲＩＡ２、ＧＲＩＡ３、ＧＲＩＡ４、ＬＴＢ４Ｒ、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＧＡＬＳ３、ＡＧＥＲ、ＳＣＡＦ１、ＳＣＡＲＢ１、ＯＬＲ１、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＢ２、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９
【表１】
2012231786.tif 000002
【００１３】
生体の細胞表面などには、機能性成分（リガンド）に対する受容体が発現しており、リガンドが受容体に結合することにより、その後のシグナル伝達が起こり、所定の機能が発揮される。
しかしながら、個体差や環境の変化により、受容体が発現しない場合がある。例えば、図１において、個体Ａ（左パネル）と個体Ｂ（右パネル）において、成分ａに対する受容体１はどちらの個体にも発現するのに対し、個体Ｂにおいては受容体ｂが発現せず、リガンドである成分ｂを結合することができない。従って、個体によって、受容体２を介したシグナル伝達が起こらずに、生体機能や感受性に個体差が生じることとなる。
本発明においては、所定の成分（図１では成分ａや成分ｂ）を摂取又は投与した生体から所定の遺伝子（例えば受容体１の遺伝子や受容体２の遺伝子）の発現を検出し、その検出の態様によって機能性成分の作用、あるいは機能性成分に対する被験生物の感受性などを判定することを特徴とするものである。
【００１４】
また、図２に示すように、受容体１のリガンドである成分ａを摂取し、その摂取を継続すると、何らかの相互作用が生じて受容体１とは異なる受容体２が増加することがある。その結果、受容体２のリガンドである成分ｂに対する反応性が高まる（図２Ｂ）。このことは、成分ａの摂取により成分ｂの感受性が高まったことを示すものであり、また、成分ａは成分ｂに影響を及ぼす分子であることを示すものである。他方、成分ａを摂取し続けると、成分ａに対する受容体が増えて成分ａに対する反応性又は感受性が摂取開始時と比較して高まることもある（図２Ｃ）。
【００１５】
このように、成分の摂取前後や摂取期間中における受容体遺伝子の発現を比較することにより、一の成分が他の成分にどのように影響を及ぼすのか、あるいは、一の成分の感受性が高まるのか低下するのかを調べることができる。
【００１６】
そこで本発明は、被験生物の感受性の評価、被験物質の機能を予測する工程を含む。各工程を以下に示す。
（１）被験物質を接触、摂取又は投与する前、又は投与等を行なった後の被験生物から試料を採取する。
（２）採取された試料を検出可能な状態へ処理し、遺伝子の検出を行う。
（３）得られた検出結果より、被験生物の感受性の評価や被験物質の機能予測を行う。
【００１７】
２．定義
被験物質とは、被験生物に接触させる物質、被験生物が摂取する物質又は被験生物に投与する物質を意味し、食品や薬物が含まれる。
食品とはすべての飲食物のことであり、生鮮食品、加工食品、飲料、調味料材料、食品添加物などの加工材料、植物の粉砕物、植物からの抽出物、それら食品の混合物、食品成分といったものが含まれる。薬物としては医薬品、医薬部外品、薬剤候補物、薬剤混合物、化粧品、化粧品成分、香料、着色料が含まれる。
【００１８】
食品は本発明においては特に効能、機能が示されている食品が好ましく、以下に分類分けと食品例を挙げるが、これに限定するものではない。
例えば生鮮食物であれば、コメ、麦、トウモロコシ、カブ、ダイコン、ハツカダイコン、ワサビ、ホースラディッシュ、ゴボウ、チョロギ、ショウガ、ニンジン、ラッキョウ、レンコン、ユリ根、ナス、ペピーノ、トマト、タマリロ、タカノツメ、トウガラシ、シシトウガラシ、ハバネロ、ピーマン、カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、ツノニガウリ、シロウリ、ツルレイシ、トウガン、ヘチマ、ユウガオ、オクラ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、エダマメ、ササゲ、シカクマメ、ソラマメ、ダイズ、ナタマメ、ラッカセイ、レンズマメ、ゴマ、スプラウト、モヤシ、かいわれ大根、イチゴ、スイカ、メロン、マクワウリ、カラシナ、キャベツ、クレソン、ケール、コマツナ、サイシン、サンチュ、山東菜、シュンギク、シロナ、セリ、セロリ、タアサイ、ダイコンナ、タカナ、チシャ、チンゲンサイ、ニラ、菜の花、野沢菜、白菜、パセリ、ハルナ、フダンソウ、ホウレンソウ、ミズナ、ミブナ、ミツバ、メキャベツ、ルッコラ、レタス、はなっこりー、ワサビナ、アサツキ、アスパラガス、ウド、コールラビ、ザーサイ、タケノコ、ニンニク、ヨウサイ、ネギ、ワケギ、タマネギ、アーティチョーク、ブロッコリー、カリフラワー、食用菊、なばな、フキノトウ、ミョウガ、サツマイモ、サトイモ、ジャガイモ、ナガイモ、ヤマノイモ、エノキタケ、エリンギ、キクラゲ、キヌガサタケ、シイタケ、シメジ、シロキクラゲ、タモギタケ、チチタケ、ナメコ、ナラタケ、ハタケシメジ、ヒラタケ、ブナシメジ、ブナピー、ポルチーニ、ホンシメジ、マイタケ、マッシュルーム、マツタケ、ヤマブシタケ、カリン、チュウゴクナシ、ナシ、マルメロ、セイヨウカリン、ジューンベリー、シポーバ、リンゴ、アメリカンチェリー、アンズ、ウメ、サクランボ、スミミザクラ、スピノサスモモ、スモモ、モモ、アーモンド、イチョウ、クリ、クルミ、ペカン、アケビ、イチジク、カキ、キイチゴ、キウイフルーツ、グミ、クワ、クランベリー、コケモモ、ザクロ、サルナシ、シーバックソーン、スグリ、ナツメ、ニワウメ、ビルベリー、フサスグリ、ブドウ、ブラックベリー、ブルーベリー、ポーポー、マツブサ、ラズベリー、ユスラウメ、柑橘類、オリーブ、ビワ、ヤマモモ、トロピカルフルーツ、イチゴ、スイカ、メロン、バナナ及びこれらの食材の可食部、葉、種子、他に牛肉、豚肉、鶏肉、卵、馬肉、羊肉、猪肉、鹿肉、魚やカニ、海老、イカ、蛸といった魚介類、海草などが挙げられる。加工食品としてはケフィア、ヨーグルト、納豆、味噌、醤油、漬物などといった発酵食品が挙げられ、他に煎茶、玉露、番茶といった緑茶や、白茶、ウーロン茶といった青茶、紅茶、黒茶、コーヒーのような飲料、前述した生鮮食品からの窄汁、塩、こしょうといった調味料などを挙げることができる。
【００１９】
さらに食品中の成分として例を挙げると、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）などを含むカテキン類、ダイゼイン、ダイジン、ゲニステイン、ゲニスチン、グリシテイン、グリシチン、フォルモノネチンなどを含むイソフラボン類、シアニジン、ペラルゴニジン、デルフィニジンなどを含むアントシアニン類、ケルセチン、ミリセチン、ルチン、レスベラトロール、ケンフェロール、セサミン、クルクミン、リモニン、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、アスタキサンチン、ガランギン、シトラール、トリゴネリン塩酸塩、エラグ酸、キナ酸、サポニン、カプサイシン、ハイドロコルチゾン、オレイン酸、ベンジルイソチオシアネート、マンギフェリン、アピゲニン、ルテオリン、クロロゲン酸、リモネン、スクアレン、レチノール、ロズマリン酸、カフェ酸、リポ酸などの物質、カロテノイド類、アラキドン酸、リノレン酸などを含む多価不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸、９ｃ１１ｔＣＬＡ、１０ｔ１２ｃＣＬＡなどを含む共役リノール酸類、胆汁酸、葉酸、ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミン誘導体などのビタミン類、アミノ酸、アミノ酸誘導体、糖類、糖化最終産物、免疫賦活物質、その他リバビリン、インターフェロン類など多様な化合物を挙げることができる。また食品中の成分としては厚生労働省の指定添加物リスト記載の添加物等が含まれる。
【００２０】
薬物としても以下に分類分けと食品例を挙げるが、これに限定するものではない。たとえば薬剤成分としてはアスピリン、アミラーゼ、アラントイン、アロイン、アンジオテンシン、アンドロステンジオン、インベルターゼ、ＡＭＴ、Ｎ−ニトロソフェンフルラミン、エフェドリン、カオリン、カタラーゼ、γ−オリザノール、グアイフェネジン、グルタチオン、２Ｃ−Ｉ、２−ＣＴ−２、２−ＣＴ−７、ＧＨＢ、ＧＢＬ、シクロフェニール、臭化水素酸デキストロメトルファン、スルフォンアミド、タイシャセキ、タウリン、脱Ｎ−ジメチルシブトミン、ＤＨＥＡ、１−デオキシノジリマイシン、ＴＭＡ−２、ニコチン、パパイン、パンクレアチン、ＢＺＰ  １、ＢＤ、ＢＤＤ、５−ＨＴＰ（ヒドロキシトリプトファン）、ビンカミン、プロスタグランジン、プロテアーゼ、ブロメライン、ペプシン、ホモシルデナフィル、マルターゼ、メラトニン、ヨウキセキ、ラクターゼ、リパーゼ、ルンブルキナーゼ等の薬剤成分、ビンブラスチン、ビンクリスチンや、パクリタキセル、リグナン由来の薬剤が挙げられ、そのほか厚生労働省  「医薬品の範囲に関する基準」に記載の植物由来物、動物由来物、化学物質等なども挙げられる。
【００２１】
化粧品成分としてはアクリル酸、アシタバエキス、アスコルビン酸、アセトン、アセロラエキス、アプレシエ、甘草エキス、アミノ酪酸、アラントイン、アルギニン、アルテアエキス、アルブチン、アルミナ、アロエベラエキス、安息香酸Ｎａ、イオウ、イソオクタン酸セチル、イソステアリン酸、イソフラボン、イチョウエキス、ウコンエキス、ウワウルシエキス、エタノール、エステル類、エデト酸、エラグ酸、塩化アルキルトリメチルアンモニウム、オウゴンエキス、オキシベンゾン、オタネニンジンエキス、オリーブ油、オレイン酸、加水分解コラーゲン、加水分解コンキオリン、カッコンエキス、カミツレエキス、カルボマー、カロチン、カワラヨモギエキス、カンフル、キウイエキス、キサンタンガム、キュウリエキス、クエン酸、グリコール酸、グリセリン、グリチルリチン酸２カリウム、グルタチオン、グルタミン酸、クロレラエキス、ケイヒエキス、ケラチン、コーン油、コウジ酸、コハク酸、コムギ胚芽エキス、コメヌカエキス、サクラ葉エキス、サフラワー油、サリチル酸ナトリウム、酸化亜鉛、酸化鉄、酸化チタン、シクロメチコン、ジステアリン酸グリコール、シソエキス、シャクヤクエキス、ジブチルヒドロキシトルエン、ジブロピレングリコール、ジメチコン、シラカバエキス、シリカ、シルクエキス、スーパーオキシドジスムターゼ、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水添レシチン、酢酸トコフェロール、スクワラン、ステアリン酸、ステアリルアルコール、スルホコハク酸、セージエキス、セタノール、セラミド３、セリン、ソウハクヒエキス、ソルビトール、ダイズエキス、ダイズステロール、タルク、チャエキス、チューベロース、月見草油、ツバキ油、テトラオレイン酸ソルベス−６０、テンシャエキス、トウエキス、トコフェロール、トリエタノールアミン、トレハロース、ナイアシンアミド、ナイロン１２、ナガサリエキス、ナズナエキス、ニコチン酸トコフェロール、乳酸、乳酸ナトリウム、尿素、ネオペンタン酸オクチルドデシル、ノバラ油、パーフルオロ、白金、パパイン、ハマメリスエキス、パラフィン、パラベン、パルミチン酸レチノール、パレス−３硫酸ナトリウム、パンテノール、ＢＧ、ＰＧ、ＰＣＡ−ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒトオリゴペプチド、ビフィズス菌発酵エキス、フェノキシエタノール、ブクリョウエキス、ブドウ種子油、ブナエキス、フラーレン、プラセンタエキス、フラビンアデニンジヌクレオチド、プルラン、ベタイン、ベニバナ、ベンジルアルコール、ホップエキス、ホホバ油、ポリアクリル酸Ｎａ、ポリエチレン、ポリソルベート６０、ポリビニルアルコール、マイカ、マカデミアナッツ油、マンニトール、ミツロウ、ミネラルオイル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ムクロジエキス、メトキシケイヒ酸オクチル、メドウフォーム油、メントール、ヤシ油脂肪酸、ユーカリエキス、ユキノシタエキス、ユズエキス、ユリエキス、ヨクイニンエキス、ラウリン酸、ラウレス７、ラウロイル加水分解シルク、ラクトフェリン、ラノリン、リノール酸、リボフラビン、レイシエキス、レチノール、レモンエキス、ローズマリーエキス、ローズヒップ油、ローヤルゼリー、ワセリン、ワレモコウエキスなどが挙げられる。
【００２２】
被験生物とは、被験物質を接触、摂取又は投与する対象となる生物であり、動植物個体、動植物組織、動植物細胞（培養細胞を含む）、線形動物及び微生物（ウイルス、菌類）などが含まれる。
動物は昆虫、魚類、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類の生きている動物を指す。動物はヒト、マウス、ラット、ウマ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウシ、ブタ、アカゲザル、コモンマーモセット、ニワトリ、アフリカツメガエル、ニシツメガエル、ゼブラフィッシュ、メダカ、蚊、線虫、ショウジョウバエ、マラリア原虫などが挙げられ、植物としては、アブラナ、藻類、褐藻類などが挙げられる。
細胞は培養細胞としてＵ９３７細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨＬ−６０細胞、ＭＯＬＴ−４細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦ−７細胞、Ａ４３１細胞、Ｓ１Ｔ細胞、Ｓｕ９Ｔ０１細胞、ＨＵＴ１０１細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ−５細胞、Ｌｉ９０細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、ＨＭＥＣ細胞、ＨＴ１７細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、３Ｔ３−Ｌ１細胞、ＭＨ１３４細胞、ｄＲＬｈ−８４細胞、ＲＬＮ−１０細胞、ＰＣ３細胞、ＰＣ１２細胞、３Ｙ１細胞、Ｂ１６細胞、ＫＵ８１２、ＰＡＮＣ−１細胞、Ｕ２６６細胞、Ａ５４９細胞、ＲＰＭＩ８２２６細胞、ＡＲＨ−７７細胞、ＭＫＮ−４５細胞などヒト、マウス、ラットなど哺乳動物由来細胞株、またはこれらの細胞株から派生する細胞株、各種組織由来の初代細胞、幹細胞、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を挙げることができる。菌類としては出芽酵母、分裂酵母、大腸菌、枯草菌、黄色ブドウ球菌、マラリア、緑膿菌、古細菌、真菌、キノコ類を挙げることができる。
【００２３】
接触、摂取または投与する方法は、動物に対しては被験物質を経口、経皮、静脈、腹腔、局所で投与することであり、細胞、菌類に対しては、培地に対して被験物質を添加することをいう。接触、摂取又は投与する被験物質の状態は固体、粉末、溶液、懸濁液といずれでもかまわないが、摂取する方法に適した状態が望ましい。
被験生物から採取された試料とは、被験生物から単離又は取り出した生体試料のことをいい、血液、皮膚、粘膜、その他臓器、破砕液又はそれらより取り出された核酸のことをいう。試料中の遺伝子の検出とは採取された試料中のｍＲＮＡの量を測定することである。ｍＲＮＡ量測定法としては、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ法）、リアルタイムＰＣＲ法、ノーザンブロッティング及びドットブロット、核酸マイクロアレイなどの方法が挙げられる。測定のための試料の調製は各測定方法に適した方法で行う。
参照とは、被験生物の測定結果と比較し、その結果を判断するための対照被験生物及び対象被験生物群である。
【００２４】
３．測定方法
ＲＴ−ＰＣＲ法の場合、生体試料から抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを合成し、測定対象の遺伝子配列に相補的な２種類のＤＮＡ断片をプライマーとしたＰＣＲ法により測定対象の遺伝子の一部配列を増幅し、増幅されたＤＮＡ断片を検出することで、ｍＲＮＡ量を定量することができる。使用するプライマーは、測定対象の遺伝子の塩基配列をＰＣＲ法等の核酸増幅法により増幅できるように設計・合成することができる。核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーの設計・合成は当業者に容易に実施することができる。例えば、ＰＣＲ法においては、２つのプライマーの一方が測定対象遺伝子の２本鎖ＤＮＡのプラス鎖に対合し、他方のプライマーが２本鎖ＤＮＡ  のマイナス鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。プライマーの長さとしては、例えば、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも２０塩基とする。具体的に、プライマーは、ＧｅｎｂａｎｋやＮＣＢＩなどのデータベースより各遺伝子のアクセッション番号により登録された１種以上の塩基配列に基づき設計し、化学合成できる。プライマーの調製は常法に従って実施できる。ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動の後、ＤＮＡに特異的に結合するエチジウムブロマイドやＳＹＢＥＲ  ＧＲＥＥＮなどの蛍光物質で標識することにより視覚化し、定量することができる。
【００２５】
また、ＰＣＲ法としては、定量性の高いリアルタイムＰＣＲ法を採用することがより好ましい。ＡＢＩＰＲＩＳＭ７５００（アプライドバイオシステムズ社製）などのリアルタイムＰＣＲ装置を用いてＰＣＲを行うことで、増幅産物をリアルタイムに検出・モニタリングし、測定対象の遺伝子発現量（ｍＲＮＡ量）をより定量的に測定することが可能である。増幅されるＤＮＡは前述のＳＹＢＥＲ  ＧＲＥＥＮなどの蛍光物質で標識することにより検出できる。また、リアルタイムＰＣＲ法では、通常の２種類のプライマーと合わせてＴａｑＭａｎプローブを用いる方法が、核酸増幅の特異性及び測定の感度を上げる方法としてより好ましい。予めクエンチングされたＦＡＭ、ＶＩＣなどの蛍光物質で標識されているＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを含めた３種のＤＮＡ断片を用いることにより、測定対象の遺伝子配列を特異的に増幅し、高感度に検出することが可能である。ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法は周知であり、使用するプローブとプライマーの選択は当業者に容易に実施することができる。遺伝子特異的なプローブ及びプライマーは、各遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列情報に基づいて、Ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓ（アプライドバイオシステムズ社製）などの作製ソフトを使用することにより設計することが可能である。また、既に特定の遺伝子を検出するために特異的にデザインされ、製品化されたプローブ及びプライマーを用いることもできる。
【００２６】
ノーザンブロッティング及びドットブロット等の解析法を適用する場合、測定対象の遺伝子に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片を用いて測定することができる。この解析方法において使用されるＤＮＡ断片の長さは、特に限定されないが、測定対象の遺伝子に対してストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズさせるのに十分な長さである。
【００２７】
ＤＮＡ断片の長さとしては、例えば、少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。すなわち、高い相同性（相同性又は同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を有する一対のポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、当該分野において周知慣用な手法、例えば、ノーザンブロッティング法、ドットブロット法、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンブロットハイブリダイゼーション法などにおいて採用される条件を設定することができる。具体的には、ポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ；１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより達成できる。
【００２８】
これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。また、この解析法で使用するＤＮＡ断片は、表１に示した遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに対して特異的にハイブリダイズする塩基配列であればよく、最も好ましくは、表１に示した遺伝子の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列として設計することができる。
【００２９】
また、この解析法で使用するＤＮＡ断片は、表１に示した遺伝子のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに対して特異的にハイブリダイズするならば、表１に示した遺伝子の塩基配列の相補鎖に対して高い相同性（相同性又は同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を有する塩基配列として設計することもできる。ここで、特異的にハイブリダイズするとは、上述したストリンジェントな条件と言い換えることができる。さらに、この解析法で使用するＤＮＡ断片としては、上述した遺伝子の塩基配列に基づいて設計するが、これら遺伝子において知られるＳＮＰ等の多型を含まないように設計することが好ましい。これによりＤＮＡ断片を用いた遺伝子の検出誤差を低く抑えることができる。さらにまた、遺伝子発現量を測定する手段としては、特に限定されず、生体由来試料に由来するｃＤＮＡを固定化したメンブレンフィルター又はリボプローブを用いたＲＮＡプロテクションアッセイ等の従来公知の手段を適用することができる。
【００３０】
また、本発明においては検出のために核酸マイクロアレイを使用した解析方法を適用することができる。核酸マイクロアレイでは、特定の遺伝子と特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド）をチップ上で高密度に合成・集積した核酸マイクロアレイに対して、生体試料由来のＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ（ａＲＮＡ）をハイブリダイズすることにより、遺伝子のｍＲＮＡ量を網羅的に定量することができる。例えば、三菱レイヨン社製のＤＮＡチップ（ジェノパール（登録商標））の場合、各対応配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブは、高密度に固定化されており、生体試料由来のＲＮＡからＴ７  オリゴｄＴプライマーを使用して２本鎖ｃＤＮＡ合成を行った後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎによりａＲＮＡを合成する。ａＲＮＡ合成の際にビオチンを取り込み、サンプルを標識する。ビオチン標識ａＲＮＡを断片化してＤＮＡアレイにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後に蛍光色素を修飾したストレプトアビジンなどによりａＲＮＡを検出する。蛍光検出機で蛍光を読み取り、得られたアレイイメージを数値化し、各遺伝子の発現量を比較・定量することができる。また、用いる核酸マイクロアレイは上述の方法に限るものではなく、当業者が入手可能な複数種の核酸マイクロアレイを用いて同様の解析が可能である。
【００３１】
４．遺伝子検出結果と被験物質の作用と関連付ける方法
被験物質を接触、摂取又は投与した被験生物からの試料及び接触、摂取又は投与前またはブランク（プラセボ、溶媒のみなど）を接触、摂取又は投与した被験生物からの試料を測定し、得られたｍＲＮＡ量測定結果より被験物質の作用を関連付ける。測定結果で評価に使用するデータは、判定値以上の値のみを使用する。判定値はネガティブコントロールの平均値Ｘを用いることができ、さらにはＸに標準偏差σを足した値、さらにはＸ＋２σ、さらにはＸ＋３σが望ましい。ネガティブコントロールとは、被験生物からの試料で検出されるはずのない遺伝子であり、例えば被験生物と異なる他種生物の遺伝子などである。得られたデータの各サンプル間の誤差をハウスキーピング遺伝子（ｇａｐｄｈ、ａｃｔｉｎ、ａｒｂｐ等）の値で補正し、補正したデータを用いてｍＲＮＡ量の変動を判定する。ｍＲＮＡ量の変動は検定により統計的に判定する。各被験生物より試料をｎ＝３以上取得し、ｔ検定を行う。Ｐ値が０．０５以下の場合に、さらには０．０１以下の場合に有意に変動したと判定する。変動した遺伝子の中で被験物質の接触、摂取又は投与した場合のみで変動した遺伝子がある場合、被験物質はその遺伝子に対して作用したと判定する。
【００３２】
ところで、本発明の方法では、複数の被験生物由来の試料を用いてｍＲＮＡのレベルを測定する場合がある。従って、予め規定された数の被験生物（１次母集団）において上記ｍＲＮＡを測定し、得られた測定値を基本データとして、この基本データと、検出の対象となる単数又は複数の被験生物由来の試料のｍＲＮＡとを比較することができる。
さらに、上記測定された被験生物由来のデータを前記母集団の値に組み込んでｍＲＮＡレベルを再度データ処理し（平均値化等）、対象となる被験生物（母集団）の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、ｍＲＮＡの臨界値の精度を高め、場合により臨界値を適宜修正することにより、検出精度を高めることができる（本発明の感受性評価方法、機能予測方法、及び被験物質の影響を予測する方法についても、同様に実施することができる）。
【００３３】
５．被験生物の感受性評価方法
感受性の評価は、前項に記載の作用した遺伝子と表１の被験物質となる成分、被験物質となる成分が標的のタンパク質と結合した場合の機能を見て、評価を行う。例えばＭＹＰＴ１のｍＲＮＡ量が減少していても６７ＬＲとＺＡＰ７０、ＢＣＬ２のｍＲＮＡ量が増加していた場合、お茶のＥＧＣＧに対して、アポトーシス誘導作用を促進する機能の点で感受性が高いと評価することが出来る。さらに、評価の方法としては被験生物と参照とを比較して行い、複数の遺伝子のｍＲＮＡ量を総合的に評価することが好ましい。被験生物とは、被験物質を接触、摂取又は投与し、表１の遺伝子の発現量の変化を観測することで感受性を評価する対象者であり、参照とは、被験生物の測定結果と比較し、その結果を判断するための対照被験生物及び対象被験生物群である。
【００３４】
総合的に評価する方法は以下の通りである。
比較方法は被験物質を摂取した場合の生態変化（体重、血中の成分など被験物質が及ぼす効果に関するデータ）や生活習慣とｍＲＮＡ量とを対応付けしたデータベースを作成し、そのデータベースと被験生物のｍＲＮＡ量の測定結果とを照らし合わせて総合的に評価する。評価方法は、多変量解析による計算処理を行うのが好ましく、回帰分析、学習法、クラスター解析、相関分析などがある。まず被験生物について、被験物質摂取後の各遺伝子の発現量の値をハウスキーピング遺伝子を基準に相対値に表す、又は摂取後の値を摂取前の値又はブランクで除算した値を百分率又はＬｏｇなどで表す。参照についても同様に表し、被験生物と参照との値から計算処理を行う。このときに使用する遺伝子のデータは前項で記載した方法で変動した又は作用したと判断した遺伝子群の値を用いることが望ましい。
【００３５】
６．被験物質の機能予測方法
被験物質の機能の予測方法においては、ｍＲＮＡ量測定結果より各遺伝子に関連する機能からその被験物質の機能を予測することができる。複数の遺伝子の結果を用いて複合的に評価するのが好ましい。
総合的に評価する方法は以下の通りである。
例えば、ある被験物質Ａの摂取前後で、６７ＬＲとＺＡＰ７０、ＢＣＬ２のｍＲＮＡ量が増加し、ｅＥＦ１ＡやＭＹＰＴ１に変化がない場合、この被験物質Ａはアポトーシス誘導作用を促進する機能が強いと予測できる。また、６７ＬＲとｅＥＦ１Ａ、ＭＹＰＴ１のｍＲＮＡ量が増加した場合はヒスタミン放出阻害作用を促進する機能が強いと予測できる。さらに定量的に機能の予測を行う場合は被験生物と参照又は参照群を比較する方法が好ましく、ここでいう参照は機能性が既知の試料を摂取した被験生物群が好ましい。具体的な比較方法は機能性既知試料を摂取した参照群のｍＲＮＡ量とその機能性を対応付けしたデータベースを作成し、機能性未知試料を摂取した被験生物のｍＲＮＡ量の測定結果を総合的に評価して機能性未知材料の機能性を予測する。総合的な評価方法は、前項に記載の方法と同様に行う。
本発明においては、被験物質に関するポジティブな機能性に加えて、副作用や毒性といったネガティブ機能性に関しても、ｍＲＮＡ量の変化の方向、組合せなどから、総合的に判定できるようにするのが望ましい。それにより、食材、医薬品、医薬品候補物質のポジティブな機能性だけでなく、ネガティブな機能性も併せて評価することができる。また、総合的に判断することで、他の摂取する物質への影響を評価することが出来る。例えば、治療患者の補完代替医療として用いる食品、サプリメントにおいては、その治療患者にどの食品、そのサプリメントを摂取することが良いかを評価することができ、また医薬品同士、食品成分同士を組み合わせた摂取においてもそれらの組合せによる影響を予測することもできる。
【００３６】
７．被験物質の影響を予測する方法
本発明は、分子Ａ又は遺伝子Ａを標的として作用する被験物質Ｘ、及び当該分子Ａ又は遺伝子Ａとは異なる他の分子Ｂ又は遺伝子Ｂを標的として作用する被験物質Ｙを、同時に又は相前後して接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、前記遺伝子群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を指標として、前記被験物質Ｘと被験物質Ｙとが互いに影響を及ぼすか否かを予測する方法を提供する。
この方法は、成分ａが他の成分ｂにどのように影響するかを評価するというものである（図２）。
具体的には、以下の手法により評価する。
被験物質Ｘの接触、摂取又は投与前後で採取された試料のｍＲＮＡ量を検出し、前述と同様にｍＲＮＡの量の変動を判定する。変動している遺伝子に結合する成分が被験物質Ｙとすると、ＸとＹは影響を及ぼすと判定できる。ただし影響の効果が正に働くか（お互いの機能を高めあうか）、負に働くか（お互いの機能を打ち消しあうか）は変動の増減のみでは一様に述べることはできず、これは表１の被験物質が結合した場合の機能を参照する。例えば、Ｘ＝アポトーシス誘導作用、Ｙ＝アポトーシス抑制作用の場合、被験物質Ｘを摂取して、Ｙが結合する遺伝子が増加した場合、お互いの機能を打ち消しあうと評価できる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
以下の通り、プラセボ対照３群並行群間比較試験二重盲検法により評価した。
介入群にはやぶきた茶エキス粉末を入れたカプセルもしくはたべにふうきエキス粉末を入れたカプセルを粉末１．８ｇ／ｄａｙとなるように計１２週間投与した。対照群には実薬と外観の類似したプラセボ（デンプン粉）を１２週間投与した。また、試験開始１ヶ月前から試験終了までの１６週間、被験者にカテキンを含む緑茶、紅茶、ウーロン茶、サプリメント等の摂取制限をした。３０〜７０歳の住民２４９人を予備検査（血液・尿検査、身体測定）等の結果から総コレステロールやＬＤＬ−コレステロールが高い人を中心に１６１人を選考後、無作為に３群に分けた。摂取開始日、摂取６週間後、摂取１２週間後にパクスジーンＲＮＡ採血管（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて採血し、採血した血液検体２．５ｍＬから、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。このＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇより合成Ａｍｐ  ＩＩ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｄキット（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、添付のプロトコールに従ってａＲＮＡの調製を行った。得られたａＲＮＡ  ５μｇをプラスチックチューブに入れ、Ｍｅｓｓａｇｅ  ＡｍｐＩＩ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｄキット（アプライドバイオシステムズ社製）付属の５ｘ  Ａｒｒａｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅを４μＬ添加し、２０μＬにメスアップしてよく混合した後、９４℃で７．５分間加熱して断片化を行った。断片化後の溶液２０μＬに、１８μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（インビトロジェン社製）、１８μＬの１Ｍ  ＮａＣｌ溶液（ナカライテスク社製）及び１５μＬの０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液をそれぞれ混合し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒで１５０μＬにメスアップして、検体液を調製した。
【００３８】
調製した検体液に、核酸マイクロアレイ（三菱レイヨン株式会社製ＤＮＡチップ  プローブは表２に示すものを用いた（配列番号１〜９８）。）を浸漬し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーション反応を行った。当該アレイからハイブリダイゼーションに用いた検体液を除去した後、当該アレイを６５℃の０．１２Ｍ  ＴＮＴ溶液（０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１２Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液）中に浸漬し（２０分間×２回）、次いで、６５℃に温めた０．１２Ｍ  ＴＮ溶液（０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１２Ｍ  ＮａＣｌ）に１０分間浸漬して、洗浄した。核酸マイクロアレイにおけるシグナルの検出は、ＤＮＡチップ検出装置（横河電機製：ＭＢ−Ｍ３Ａ、レーザー波長：６３３ｎｍ）を用い、Ｃｙ５の蛍光強度を測定した（露光時間：０．１秒，  １秒，  ４秒，  ４０秒）。なお、結果はバックグランドを減算後、β−ａｃｔｉｎの値を用いて補正した。
【表２−１】
2012231786.tif 000003
【表２−２】
2012231786.tif 000004
【００３９】
結果を図３に示す。図３の各遺伝子に記載のグラフは、左からやぶきた０週、やぶきた６週、やぶきた１２週、べにふうき０週、べにふうき６週、プラセボ０週、プラセボ１２週である。
やぶきた茶を摂取した人々においては、６７ＬＲやｅＥＦ１Ａ、ＭＹＴＰ１などＥＧＣＧに関連する遺伝子、ＴＬＲファミリーが摂取期間と共に増加しているのに対し、べにふうき茶、プラセボを摂取した人々では増加していない。このことから、やぶきた茶はべにふうき茶と比較してポジティブフィードバックの効果があり、また自然免疫反応を促進する効果もあることがわかる。また、やぶきた茶を摂取した場合はＦＯＬＲ３が増加したのに対して、べにふうき茶、プラセボはＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ２が増加したことから、やぶきた茶とべにふうき茶で葉酸レセプターに働く作用が異なることが分かる。従って、本発明の方法は摂取者の時間経過（摂取期間）による感受性の変化を観測すること、また摂取物の機能の予測をする点で有効であるといえる。
【実施例２】
【００４０】
マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６を１  ｘ  １０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ  にて２ｍＬ  ｄｉｓｈに播種し、５％  ＦＢＳ−ＤＭＥＭで２４ｈ培養した。その後終濃度０．１  ｍＭのＡＴＲＡ含有１％  ＦＢＳ−ＤＭＥＭ  （５  ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）  に置換し、２４ｈあるいは  ４８  ｈ  培養した後、Ｔｒｉｚｏｌにて細胞を溶解した。Ｍｅｓｓａｇｅ  Ａｍｐ  ＩＩ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｄキット（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、添付のプロトコールに従ってＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  １  ｍｇからａＲＮＡの調製を行った。ａＲＮＡ  ５μｇをプラスチックチューブに入れ、Ｍｅｓｓａｇｅ  ＡｍｐＩＩ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｄキット（アプライドバイオシステムズ社製）付属の５ｘ  Ａｒｒａｙ
Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅを４μＬ添加し、２０μＬにメスアップしてよく混合した後、９４℃で７．５分間加熱して断片化を行った。断片化後の溶液  ２０μＬに、１８μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（インビトロジェン社製）、１８μＬの１Ｍ  ＮａＣｌ溶液（ナカライテスク社製）及び１５μＬの０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液をそれぞれ混合し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒで１５０μＬにメスアップして、検体液を調製した。
【００４１】
調製した検体液に、核酸マイクロアレイ（三菱レイヨン株式会社製ＤＮＡチップ  プローブは表３に示すもの（配列番号９９〜１８８）を使用した。）を浸漬し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーション反応を行った。当該アレイからハイブリダイゼーションに用いた検体液を除去した後、当該アレイを６５℃の０．１２Ｍ  ＴＮＴ溶液（０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１２Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液）中に浸漬し（２０分間×２回）、次いで、６５℃に温めた０．１２Ｍ  ＴＮ溶液（０．１２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１２Ｍ  ＮａＣｌ）に１０分間浸漬して、洗浄後にシグナルを検出した。核酸マイクロアレイにおけるシグナルの検出は、ＤＮＡチップ検出装置（横河電機製：ＭＢ−Ｍ３Ａ、レーザー波長：６３３ｎｍ）を用い、Ｃｙ５の蛍光強度を測定した（露光時間：０．１秒，  １秒，  ４秒，  ４０秒）。なお、結果はバックグランドを減算後、β−ａｃｔｉｎの値を用いて補正した。
【表３−１】
2012231786.tif 000005
【表３−２】
2012231786.tif 000006
【００４２】
結果を図４に示す。ＡＴＲＡを添加した場合はＶｉｍｅｎｔｉｎの発現量がブランク（エタノール）と比較して約５０％減少しており、６７ＬＲ、Ｐｐａｒｇ、ＴｏｐＩ、Ｆａｂｐ５、Ａｄｉｐｏｒ１、Ａｄｉｐｏｒ２、Ｃ３、Ａｇｅｒ、ＴＬＲ９の発現量は約２５％から９５％増加していた。このことから、ＡＴＲＡはカテキン（ＥＧＣＧ）、フラボノイド、脂肪酸などの感受性を増加させると予想され、それらの成分を含む食品の摂取に影響を与えると考えられる。従って、本発明の方法は食品成分の組み合わせを評価する点で有効である。
【実施例３】
【００４３】
マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６を１  ｘ  １０４  ｃｅｌｌｓ／ｍＬにて２ｍＬ  ｄｉｓｈに播種し、５％  ＦＢＳ−ＤＭＥＭで２４ｈｒ培養した。その後終濃度０．１  ｍＭのｅｑｕｏｌ含有１％  ＦＢＳ−ＤＭＥＭ  （５  ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）に置換し、以下実施例２と同様の操作を行った。得られた結果をｃｈｒｙｓｉｎ、ａｐｉｇｅｎｉｎ、ｌｕｔｅｏｌｉｎ、ｄａｉｄｚｅｉｎ、ｇｅｎｉｓｔｅｉｎの結果と比較して評価した。評価方法はバックグランドを減算後、ハウスキーピング遺伝子で補正し、ブランクサンプルの値を基準に百分率で表し、それを解析ソフトＭｅｖ（Ｔｉｇｒ）のＨＣＬ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）でクラスタリングを行った。その結果を図５に示す。クラスタリングの結果ｅｑｕｏｌはａｐｉｇｅｎｉｎと近い性質を示す可能性が示唆された。
【実施例４】
【００４４】
マウスを用いて高脂肪高ショ糖食による感受性遺伝子の変化を観測した。
１２週齢のオスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（九動株式会社）に、普通食（ＡＩＮ−９３Ｇ、株式会社ＫＢＴオリエンタル）または高脂肪高ショ糖食（株式会社ＫＢＴオリエンタル）を６週間制限摂食させた（４  ｇ／ｄａｙ／ｍｏｕｓｅ）。その後イソフルラン（アボットジャパン株式会社）麻酔下で腹部大動脈採血により屠殺を行い、肝臓および大腿四頭筋を摘出した。摘出した臓器よりＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、添付のプロトコールに従ってＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。以下ａＲＮＡの調製、核酸マイクロアレイアレイによる測定、データ解析は実施例１と同様に行った。
大腿四頭筋の結果を図６Ａ及びＢ、肝臓の結果を図７Ａ〜Ｃに示す。図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は普通食を摂食させたマウスの結果を示し、ＨＦＨＳは高脂肪高ショ糖食を摂食させたマウスの結果を示す（Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５）。
大腿四頭筋においては普通食群と比較して高脂肪高ショ糖食群では複数の遺伝子で有意な発現量の減少が観測された。大腿四頭筋で発現が有意に減少した遺伝子（Ｐ＜０．０５）は、Ｚａｐ７０、Ａｒ、Ｅｓｒ１、Ｓｔｘ３、Ｃｌｅｃ７ａ、Ｃｄ１１ｂ、Ｇｒｉａ３、Ｇｒｉａ４、Ｔｌｒ１及びＴｌｒ９であった。また、発現量が増加した遺伝子は観測されなかった。
肝臓では発現量が有意に変化した食品因子感知遺伝子は一種類であった。肝臓で発現が有意に減少した遺伝子（Ｐ＜０．０５）は、Ｃｄ１１ｂであった。
これらの結果から、高脂肪高ショ糖による感受性遺伝子の変化及び臓器間で感受性遺伝子の発現量変化の違いを測定することができた。
【実施例５】
【００４５】
廃用性筋萎縮の状態と通常の状態とでの感受性遺伝子の変化を観測した。
１２週齢のオスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（九動株式会社）を平均体重が等しくなるように群分けし、水をゾンデによって２日に一回強制投与した。投与開始から７日後、尾懸垂群（ＴＳ：Ｔａｉｌ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ群、Ｎ＝３）と通常群（ＧＲ：Ｇｒｏｕｎｄ群、Ｎ＝３）に分け、尾懸垂試験を開始した。尾懸垂試験開始から１０日後、イソフルラン（アボットジャパン株式会社）麻酔下で腹部大動脈採血により屠殺を行い、各臓器及び各筋肉を摘出した。餌は固形ＭＦ食（株式会社ＫＢＴオリエンタル）を自由摂食させた。
大腿四頭筋から  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、添付のプロトコールに従ってＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。以下ａＲＮＡの調製、核酸マイクロアレイアレイによる測定、解析は実施例１と同様に行った。
有意な発現量の変化があった遺伝子の結果を図８Ａ及びＢに示す。図中、「ＴＳ」は尾懸垂群を示し、「ＧＲ」は通常群を示す（Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。食品因子感知遺伝子の多くが廃用性筋萎縮により発現量が減少する傾向が見られ、増加した遺伝子はＰｐａｒｄとＬｇａｌｓ３、Ｆｅｅｌ−２であった。この結果のように、廃用性筋萎縮状態により感受性遺伝子の発現量が低下することを該核酸マイクロアレイで測定することができた。
【配列表フリーテキスト】
【００４６】
配列番号１〜１８８：合成ＤＮＡ
【図６Ａ】
2012231786.tif 000007
【図６Ｂ】
2012231786.tif 000008
【図７Ａ】
2012231786.tif 000009
【図７Ｂ】
2012231786.tif 000010
【図７Ｃ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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