(57)【要約】【課題】本発明の目的は、化学発光基質又は発色基質を化学発光又は発色させる酵素反応において、酵素反応性を高め、化学発光効率又は発色効率を向上させる技術を提供することである。【解決手段】化学発光基質又は発色基質を化学発光又は発色させる酵素反応において、特定のベタイン誘導体を添加することによって、酵素反応性が著しく高まり、化学発光効率又は発色効率を向上させることが可能になる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式(1)に示すベタイン誘導体の存在下で、発光基質又は発色基質に対して酵素を作用させることを特徴とする、酵素反応方法。
【化１】
2012100654.tif 000011
［一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基を示し、且つR1〜R3の少なくとも１つは、炭素数３〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基を示す。ｎは１〜５の整数を示す。］
【請求項２】
R1〜R3が同一又は異なって炭素数３〜６の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１である、請求項１に記載の酵素反応方法。
【請求項３】
酵素がペルオキシダーゼである、請求項１又は２に記載の酵素反応方法。
【請求項４】
一般式(1)に示すベタイン誘導体が０．００００１〜１Ｍの濃度で存在する、請求項１乃至３のいずれかに記載の酵素反応方法。
【請求項５】
発光基質又は発色基質を用いた酵素反応において発光効率又は発色効率を向上させるために使用される発光効率又は発色効率の向上剤であって、下記一般式(1)に示すベタイン誘導体からなることを特徴とする、発光効率又は発色効率の向上剤。
【化２】
2012100654.tif 000012
［一般式(1)中、R1〜R3及びｎは前記と同じ。］
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の酵素反応方法を行うためのキットであって、下記一般式(1)に示すベタイン誘導体と、発光基質又は発色基質と、を含むことを特徴とする、キット。
【化３】
2012100654.tif 000013
［一般式(1)中、R1〜R3及びｎは前記と同じ。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発光基質又は発色基質を化学発光、蛍光発光又は発色させる酵素反応において、酵素反応効率を向上させ、発色効率又は発色効率を高める技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、酵素反応は、生成物やエフェクター分子との結合によって反応過程で反応速度が頭打ちになる場合が多い。このような頭打ちとなる現象を改善して酵素反応の効率を高めることができれば、酵素反応を利用する様々な分野で多大なメリットをもたらすことになる。とりわけ、酵素反応を利用した発光や発色は、臨床検査薬、ELISAやウエスタンブロッティング等を利用した目的物質の検出法において広く利用されている技術であり、当該発光や発色の効率を向上できれば、目的物質の検出感度を高め、更には目的物質の検出時間を短縮することも可能になる。
【０００３】
従来、酵素反応において、酵素活性を高める技術は報告されている。例えば、非特許文献１及び２には、糖を含むアルコール、ポリオール類を酵素反応溶液に添加することにより酵素活性を向上させる方法が開示されている。また、非特許文献３及び４には、ポリエチレングリコールや牛血清アルブミンのようなタンパク質を酵素反応溶液に添加することによって、酵素活性を向上できることが開示されている。また、非特許文献５には、グリシンが酵素活性を向上させることも開示されている。
【０００４】
また、近年、酵素反応に使用する基質を改良して発光効率や発色効率を改善したり、或いは酵素自身を遺伝子光学的手法によって改変することにより、酵素反応の効率を高める手法が報告されている。
【０００５】
しかしながら、発光基質又は発色基質を化学発光、蛍光発光又は発色させる酵素反応において、酵素や基質の改変以外の手法で、化学発光効率又は発色効率を向上させるための技術的手段は提言されていない。
【０００６】
一方、特定構造のベタイン誘導体が核酸合成効率を向上させることが報告されているが（特許文献１）、ベタイン誘導体と発光又は発色させる酵素反応との関連性については一切明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−９６７６６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】S. N. Timasheff, Adv. Protein Chem., 51, 355 (1998)
【非特許文献２】M.Mejri, et al., Carbohydr. Polym., 45, 161 (2001)
【非特許文献３】K. Hayashi, et al., Nucleic Acids Res., 14, 7817 (1986)
【非特許文献４】K. Totani, et al., J. Am. Chem. Soc., 130, 2101 (2008)
【非特許文献５】V. Vathipadiekal, et al., Biol. Chem., 388, 61 (2007)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、発光基質又は発色基質を化学発光又は発色させる酵素反応において、酵素反応性を高め、発光効率又は発色効率を向上させる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決すべき鋭意検討を行ったところ、発光基質又は発色基質を発光又は発色させる酵素反応において、特定のベタイン誘導体を添加することによって、酵素反応性が著しく高まり、発光効率又は発色効率を向上させることが可能になることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  一般式(1)に示すベタイン誘導体の存在下で、発光基質又は発色基質に対して酵素を作用させることを特徴とする、酵素反応方法。
【化１】
2012100654.tif 000002
［一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基を示し、且つR1〜R3の少なくとも１つは、炭素数３〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基を示す。ｎは１〜５の整数を示す。］
項２．  R1〜R3が同一又は異なって炭素数３〜６の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１である、項１に記載の酵素反応方法。
項３．  酵素がペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼである、項１又は２に記載の酵素反応方法。
項４．  一般式(1)に示すベタイン誘導体が0.00001〜1Mの濃度で存在する、項１乃至３のいずれかに記載の酵素反応方法。
項５．  発光基質又は発色基質を用いた酵素反応において発光効率又は発色効率を向上させるために使用される発光効率又は発色効率の向上剤であって、下記一般式(1)に示すベタイン誘導体からなることを特徴とする、発光効率又は発色効率の向上剤。
【化２】
2012100654.tif 000003
［一般式(1)中、R1〜R3及びｎは前記と同じ。］
項６．  項１乃至５のいずれかに記載の酵素反応方法を行うためのキットであって、下記一般式(1)に示すベタイン誘導体と、発光基質又は発色基質と、を含むことを特徴とする、キット。
【化３】
2012100654.tif 000004
［一般式(1)中、R1〜R3及びｎは前記と同じ。］
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、発光基質又は発色基質を化学発光、蛍光発光又は発色させる酵素反応において、酵素反応効率を向上させ、発光効率又は発色効率を高めることができる。特に、本発明は、臨床診断薬、ELISA、ウエスタンブロッティング等を利用した目的物質の検出法における酵素反応に好適に適用でき、当該目的物質の検出精度を向上させ、更には当該目的物質を検出するまでの時間を短縮させることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】発色基質を用いた酵素反応（酵素：西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、基質：４-アミノアンチピリン／Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-ｍ-トルイジンナトリウム塩）において、ベタイン誘導体の添加による発色効率を評価した結果を示す図である。
【図２】発色基質を用いた酵素反応（酵素：西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、基質：４-アミノアンチピリン／Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-ｍ-トルイジンナトリウム塩）において、ベタイン誘導体の添加による発色効率を評価した結果を示す図である。
【図３】発色基質を用いた酵素反応（酵素：西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、基質：４-アミノアンチピリン／Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-ｍ-トルイジンナトリウム塩）において、ベタイン誘導体の添加による発色効率を評価した結果を示す図である。
【図４】発色基質を用いた酵素反応（酵素：西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、基質：４-アミノアンチピリン／Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-ｍ-トルイジンナトリウム塩）において、ベタイン誘導体の添加による発色効率を評価した結果を示す図である。
【図５】化学発光基質を用いた酵素反応（酵素：西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、基質：ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）において、ベタイン誘導体の添加による発色効率を評価した結果を示す図である。
【図６】化学発光基質を用いた酵素反応（酵素：ペルオキシダーゼ、基質：ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）において、ベタイン誘導体の添加による発色効率を評価した結果を示す図である。
【図７】発色基質を用いた酵素反応（酵素：西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、基質：４-アミノアンチピリン／Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-ｍ-トルイジンナトリウム塩）において、ベタイン誘導体の添加による発色効率を評価した結果を示す図である。
【図８】発色基質を用いた酵素反応（酵素：Ｅ．  ｃｏｌｉ由来アルカリフォスファターゼ、基質：４-ニトロフェニルフォスフェイト）において、ベタイン誘導体の添加による発色効率を評価した結果を示す図である。
【図９】発色基質を用いた酵素反応（酵素：エビ由来アルカリフォスファターゼ、基質：４-ニトロフェニルフォスフェイト）において、ベタイン誘導体の添加による発色効率を評価した結果を示す図である。
【図１０】発色基質を用いた酵素反応（酵素：仔ウシ腸由来アルカリフォスファターゼ、基質：４-ニトロフェニルフォスフェイト）において、ベタイン誘導体の添加による発色効率を評価した結果を示す図である。
【図１１】発色基質を用いた酵素反応（酵素：Ｅ．  ｃｏｌｉ由来アルカリフォスファターゼ、基質：ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）において、ベタイン誘導体の添加による発色効率を評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．酵素反応方法
本発明は、一般式(1)に示すベタイン誘導体の存在下で、発光基質又は発色基質に対して酵素を作用させることを特徴とする。
【００１５】
本発明で使用するベタイン誘導体は、以下の一般式(1)に示す構造である。
【化４】
2012100654.tif 000005
【００１６】
一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基を示し、且つR1〜R3の少なくとも１つは、炭素数３〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基を示す。一般式(1)中、R1〜R3は、好ましくは炭素数３〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基であり、更に好ましくは炭素数３〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基であり、特に好ましくは炭素数３又は４の直鎖又は分岐状のアルキル基である。
【００１７】
また、一般式(1)中、ｎは、１〜５、好ましくは１〜３、更に好ましくは１の整数を示す。
【００１８】
本発明に使用される一般式(1)に示すベタイン誘導体として、好ましくは、R1〜R3が同一又は異なって炭素数３〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基であり、且つｎが１〜３の整数；更に好ましくはR1〜R3が同一又は異なって炭素数３〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基であり、且つｎが１〜３の整数；より好ましくはR1〜R3が同一又は異なって炭素数３〜６の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１〜３の整数；特に好ましくはR1〜R3が同一又は異なって炭素数３〜６の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１；最も好ましくはR1〜R3が同一又は異なって炭素数３又は４の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１であるものが例示される。
【００１９】
一般式(1)に示すベタイン誘導体の製造方法については、例えば、特開２００９−９６７６６号公報等で公知であり、更に公知の有機合成法から導き出されるものである。
【００２０】
本発明の酵素反応方法では、酵素を発光基質又は発色基質と反応させる。本発明に使用される酵素としては、発光基質又は発色基質と反応可能であって、発光又は発色を生じさせ得るものである限り特に制限されないが、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ等が例示される。これらの中でも、本発明は、ペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼを用いた発光又は発色反応に好適である。
【００２１】
本発明の酵素反応方法において、使用される発光基質及び発色基質は、使用する酵素の種類に応じて適宜選択される。ここで、発光基質は、過酸化水素やアデノシン三リン酸等の化学結合エネルギーを光エネルギーに変換して発光する性質の基質（即ち、化学発光基質）と、加水分解反応などによって、蛍光分子の量子収率が上昇し、蛍光発光が増す性質の基質（即ち、蛍光発光基質）に大別されるが、本発明では、これらのいずれを使用してもよい。また、発色基質とは、酸化反応や加水分解反応などによって、色素分子の極大吸収波長に変化が生じる性質の基質である。
【００２２】
例えば、酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合、４-アミノアンチピリン／Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム塩、３-アミノ-９-エチルカルバゾール、３，４’−ジアミノベンジジン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン）−６−スルホン酸、ｏ−フェニレンジアミン、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリサイクリックアシッド、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、４−クロロ−１−ナフトール等の発色基質；或いはＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ルミノール等の化学発光基質が例示される。
【００２３】
また、例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ａｎｄ  ５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−２−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ロッシュ）、ファーストレッド（シグマ）、ニトロフェニルフォスフェイト等の発色基質；アトフォス（商標）（ロッシュ社製）やHNPP (hydroxy-3-naphthoic  acid-2'-phenylanilidephosphate)等の蛍光発光基質；ジオキセタン等の化学発光基質が例示される。
【００２４】
また、例えば、酵素としてルシフェラーゼを使用する場合、ルシフェリン等の化学発光基質が例示される。
【００２５】
上記酵素、及び化学発光基質、蛍光発光基質又は発色基質の中でも、本発明の酵素反応は、酵素として、ペルオキシダーゼを使用し、且つ化学発光基質又は発色基質として、４-アミノアンチピリン／Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-ｍ-トルイジンナトリウム塩、３-アミノ-９-エチルカルバゾール、３，３’-ジアミノベンジジン、又はＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを使用する酵素反応において好適に使用される。
【００２６】
本発明の酵素反応では、上記基質又は発色基質に上記酵素を作用させる従来の酵素反応系に、上記一般式(1)に示すベタイン誘導体を添加することにより行われる。
【００２７】
本発明の酵素反応において、酵素及び発光基質又は発色基質の濃度については、特に制限されず、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、生体組織片の染色等に使用される酵素反応での一般的な濃度範囲であればよい。一例として、酵素の濃度としては、通常０．０００１〜１０００ｎｇ／ｍＬが挙げられ、発光基質又は発色基質の濃度としては、通常０．０００００１〜０．０５Ｍが挙げられる。
【００２８】
また、本発明の酵素反応において、一般式(1)に示すベタイン誘導体は、化学構造によって最適の使用濃度は異なるが、例えば、０．００００１〜１Ｍ、好ましくは０．０００１〜０．５Ｍ、更に好ましくは０．００１〜０．２Ｍの濃度で使用される。このような濃度範囲を充足させると、酵素反応の効率化が一層図られ、発光効率又は発色効率を向上させることができる。
【００２９】
より具体的には、一般式(1)に示すベタイン誘導体の構造毎の使用濃度としては、下記範囲が好適に例示される。
一般式(1)に示すベタイン誘導体がR1〜R3が同一又は異なって炭素数３又は４の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１である場合：好ましくは０．００１〜０．４Ｍ、特に好ましくは０．００１〜０．２Ｍ、
一般式(1)に示すベタイン誘導体がR1〜R3が同一又は異なって炭素数５又は６の直鎖状のアルキル基であり、且つｎが１である場合：好ましくは０．０００１〜０．１Ｍ、特に好ましくは０．００５〜０．０２Ｍ。
【００３０】
また、本発明の酵素反応において、ペルオキシダーゼを発色基質と反応させる場合には、反応系に発色を生じさせるために過酸化水素を添加しておくことが望ましい。かかる酵素反応において、過酸化水素の濃度としては、例えば、０．０００００１〜８．８Ｍ、好ましくは０．０００１〜２．０Ｍ、更に好ましくは０．００１〜０．５Ｍが例示される。
【００３１】
本発明の酵素反応は、酵素反応を行うのに適した溶媒（例えば、緩衝液）中で行われる。
【００３２】
本発明の酵素反応は、臨床検査薬、ELISA、ウエスタンブロッティング、生体組織片の染色等における化学発光検出又は発色検出のために使用される。
【００３３】
２．発光効率又は発色効率の向上剤
また、本発明は、一般式(1)に示すベタイン誘導体からなる発光又は発色効率の向上剤を提供する。
【００３４】
当該剤は、酵素を発光基質又は発色基質に作用させる酵素反応系で、発光効率又は発色効率を向上させるために使用されるものであり、その使用態様は、前記「１．酵素反応方法」の欄に記載の通りである。
【００３５】
３．キット
更に、本発明は、上記酵素反応方法を行うためのキットをも提供する。
【００３６】
本発明のキットは、一般式(1)に示すベタイン誘導体、及び発光基質又は発色基質を含むものである。
【００３７】
本発明のキットは、必要に応じて、発光基質又は発色基質から化学発光又は発色を生じさせる酵素を含んでいてもよく、当該酵素は、抗体やタンパク質に連結された状態であってもよい。
【００３８】
また、本発明のキットは、ペルオキシダーゼと化学発光基質の酵素反応に使用するものである場合には、過酸化水素を含むものであってもよい。
【００３９】
また、本発明のキットは、前述する酵素反応についてのプロトコールを示した実験手順書が含まれていてもよい。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４１】
試験例１：ペルオキシダーゼによる発色基質の発色効率の評価−１
ペルオキシダーゼ、西洋わさび由来（和光純薬製、カタログ番号：１６５-１０７９３）の可溶性基質に対するベタイン誘導体の添加効果を比較した。基質としては、４-アミノアンチピリン（和光純薬製、カタログ番号：０１７-０２２７２）とＮ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-ｍ-トルイジンナトリウム塩（和光純薬製、カタログ番号：３４６-０８８１１）を用い、ベタイン誘導体としては、下記のベタイン１〜９を用いた。なお、ベタイン５は、一般式(1)におけるR1〜R3がn-プロピル基であり、ｎが１であるベタイン誘導体（トリプロピルグリシン）であり、ベタイン６は、一般式(1)におけるR1〜R3がn-ブチル基であり、ｎが１であるベタイン誘導体（トリブチルグリシン）である。
【００４２】
【化５】
2012100654.tif 000006
【００４３】
酵素反応は、以下の条件で行った。先ず、ＭＥＳ（2-(N- morpholino) ethanesulfonic acid）緩衝溶液（ｐＨ５．７）、ベタイン誘導体、４-アミノアンチピリン、Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-ｍ-トルイジンナトリウム塩、過酸化水素水、ペルオキシダーゼを、最終濃度がそれぞれ７９ｍＭ、０〜４００ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、２０ｍＭ、１２５ｎｇ／ｍＬになるように９６穴マイクロプレートのウェルに加えた。ただし、４Ｍ過酸化水素水溶液、２５μｇ／ｍＬペルオキシダーゼ溶液はウェルの壁面に液滴として１μＬずつ付着させた。
【００４４】
次に、３７℃の温度条件で、プレートを振とうさせ、ウェル内の溶液を混合することで反応を開始した。酸化反応が進行すると、５４０ｎｍ付近に極大吸収波長を持つ生成物が生成する。反応の進行は５４０ｎｍの吸光度変化をマイクロプレートリーダー（サーモサイエンティフィック社製、Ｍｕｌｔｉ-ｓｋａｎ）で測定した。全ての条件で酵素反応は６時間で吸光度の上昇が停止した。
【００４５】
各ベタイン誘導体の添加濃度毎に６時間後における５４０ｎｍの吸光度を測定した結果を図１〜４に示す。この結果から、ベタイン５（トリプロピルグリシン）及びベタイン６（トリブチルグリシン）を添加した場合において、ペルオキシダーゼの活性が著しく向上しており、発色強度が強く検出された。これに対して、他のベタイン誘導体（ベタイン１−４、７−９）では、化学発光の強度はさほど増強されていなかった。
【００４６】
この結果から、本発明で規定する一般式(1)に示すベタイン誘導体を選択し、これを発色基質にて化学発光を行う酵素反応系に添加することによって、発色基質に対する酵素の反応性を高め、発色効率を向上できることが明らかとなった。
【００４７】
試験例２：ペルオキシダーゼによる発色基質の発色効率の評価−２
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、西洋わさび由来（和光純薬製、カタログ番号：１６５-１０７９３）の沈殿性基質に対するベタイン誘導体の添加効果を比較した。基質としては、３，３’-ジアミノベンジジン（ナカライ製、カタログ番号：１１００９-４１）を用い、ベタイン誘導体としては、前記するベタイン１及び６を用いた。
【００４８】
酵素反応は、以下の条件で行った。先ず、ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ５．５）、ベタイン誘導体、３，３’-ジアミノベンジジン、過酸化水素水を、最終濃度がそれぞれ１００ｍＭ、５０ｍＭ、１．０ｍＭ、１７６ｍＭになるように９６穴マイクロプレートのウェルに加えた。また、ペルオキシダーゼ溶液は、ウェルの壁面に付着させ、ウェル内の添加量が０．０５ｎｇ（最終濃度０．０００２５ｎｇ／μＬ）になるように添加した。
【００４９】
次に、３７℃の温度条件で、プレートを振とうさせ、ウェル内の溶液を混合することで反応を開始した。酸化反応が進行すると、茶褐色の沈殿が生じる。ここでは、散乱に伴う５４０ｎｍの吸光度上昇をマイクロプレートリーダー（サーモサイエンティフィック社製、Ｍｕｌｔｉ-ｓｋａｎ）で測定した。
【００５０】
１０分後の５４０ｎｍの吸光度をＨＲＰの添加濃度毎に測定した結果を表１に示す。表１から明らかなように、３，３’-ジアミノベンジジンの発色強度は、ベタイン６を添加した場合に顕著に強くなった。一方、ベタイン１を加えた場合には、発色強度の増強は認められなかった。以上の結果から、本発明で規定する一般式(1)に示すベタイン誘導体は、その構造上の特徴に基づいて、発色基質による発色効率を上昇させていることが確認された。
【００５１】
【表１】
2012100654.tif 000007
【００５２】
試験例３：ペルオキシダーゼによる発色基質の発色効率の評価−３
ペルオキシダーゼ、西洋わさび由来（和光純薬製、カタログ番号：１６５-１０７９３）の沈殿性基質に対するベタイン誘導体の添加効果を比較した。基質としては、３-アミノ-９-エチルカルバゾール（和光純薬製、カタログ番号：０１４-１４７５２）を用い、ベタイン誘導体としては、前記するベタイン１及び６を用いた。
【００５３】
酵素反応は、以下の条件で行った。先ず、酢酸緩衝溶液（ｐＨ５．５）、ベタイン誘導体、３-アミノ-９-エチルカルバゾール、過酸化水素水を、最終濃度がそれぞれ１００ｍＭ、５０ｍＭ、１．０ｍＭ、１７６ｍＭになるように９６穴マイクロプレートのウェルに加えた。また、ペルオキシダーゼ溶液は、ウェルの壁面に付着させ、ウェル内の添加量が０．２０ｎｇ（最終濃度０．００１ｎｇ／μＬ）になるように添加した。
【００５４】
次に、３７℃の温度条件で、プレートを振とうさせ、ウェル内の溶液を混合することで反応を開始した。酸化反応が進行すると、５４０ｎｍ付近の吸光度が増大した。反応の進行は５４０ｎｍの吸光度変化をマイクロプレートリーダー（サーモサイエンティフィック社製、Ｍｕｌｔｉ-ｓｃａｎ）で測定することで評価した。
【００５５】
１０分後の５４０ｎｍの吸光度をＨＲＰの添加濃度毎に測定した結果を表２に示す。表２から分かるように、ベタイン６を添加した場合はベタイン非存在下と比較して３-アミノ-９-エチルカルバゾールの発色が強くなった。一方、ベタイン１を加えた場合には、ベタイン非存在下と３-アミノ-９-エチルカルバゾールの化学発光の強度は殆ど同じであった。即ち、この結果からも、本発明で規定する一般式(1)に示すベタイン誘導体は、発色基質による化学発光の効率を上昇させることが確認された。
【００５６】
【表２】
2012100654.tif 000008
【００５７】
試験例４：ペルオキシダーゼによる化学発光効率の評価結果−１
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、西洋わさび由来（和光純薬製、カタログ番号：１６５-１０７９３）の化学発光基質に対するベタイン誘導体の添加効果を比較した。基質としては、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（プロメガ社製、カタログ番号：Ｗ１００１）を用い、ベタイン誘導体としては、前記するベタイン１及び６を用いた。
【００５８】
酵素反応は、以下の条件で行った。ヌンク社製９６穴プレート（白色）を用い、ウェルにＬｕｍｉｎｏｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、蒸留水、ベタイン誘導体（３ｍｏｌ／Ｌ）、ＨＲＰ（１ｎｇ／μＬ）を４μＬ、１８９μＬ、３μＬ、１μＬ加えた。ベタイン誘導体を加えないコントロールには３μＬの蒸留水を加えている。化学発光はサーモサイエンティフィック社製、ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ  ＦＬＡＳＨを用いた。インジェクターより、３μＬのＰｅｒｏｘｉｄｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎをウェルに入れ、１秒ごとに発光強度を５５秒間モニターした。
【００５９】
結果を図５に示す。図５より、ベタイン６を添加した場合は、Ｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加後、急速な化学発光が確認され、且つ、６０秒後の発光強度はベタイン誘導体非存在下やベタイン１存在下と比較して５倍も高くなった。つまり、本発明で規定する一般式(1)に示すベタイン誘導体は、化学発光基質による化学発光効率の向上にも有効であることが、本試験結果によって示された。
【００６０】
試験例５：ペルオキシダーゼによる化学発光効率の評価結果−２
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，  ＥＩＡ  ｇｒａｄｅ（ロシュ社製、カタログ番号：１０  ８１４  ３９３  ００１）を用い、化学発光基質に対するベタイン誘導体の添加効果を比較した。基質としては、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（プロメガ社製、カタログ番号：Ｗ１００１）を用い、ベタイン誘導体としては、前記するベタイン１及び６を用いた。
【００６１】
酵素反応は、以下の条件で行った。ヌンク社製９６穴プレート（白色）を用い、ウェルにＬｕｍｉｎｏｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、蒸留水、ベタイン誘導体（３ｍｏｌ／Ｌ）、ＨＲＰ（１ｎｇ／μＬ）を４μＬ、１８９．４μＬ、３μＬ、０．６μＬ加えた。ベタイン誘導体を加えないコントロールには３μＬの蒸留水を加えた。化学発光はサーモサイエンティフィック社製、ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ  ＦＬＡＳＨを用いた。インジェクターより、３μＬのＰｅｒｏｘｉｄｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎをウェルに入れ、１秒ごとに発光強度を５５秒間モニターした。
【００６２】
結果を図６に示す。図６から明らかなように、ベタイン６を添加した場合は、Ｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加後、急速な発光が確認され、且つ、６０秒後の発光強度はベタイン非存在下やベタイン１存在下と比較して２倍程度も高くなった。この結果から、本発明で規定する一般式(1)に示すベタイン誘導体による、化学発光効率の向上効果は、ペルオキシダーゼの種類に拘わらず奏されることが確認された。
【００６３】
試験例６：ペルオキシダーゼによる発色基質の発色効率の評価−４
より低濃度での発色効率を向上させるベタイン誘導体を調べるために、ブチル基よりも長いアルキル基を持つ下記ベタイン１０および１１を用いてペルオキシダーゼの酸化反応に対するベタインの添加効果を調べた。ペルオキシダーゼとしては、市販のペルオキシダーゼ (Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ由来（型番３０３-５０９９１）、オリエンタルイースト)を用いて評価し、ベタイン誘導体としては化合物１０および１１を用いた。基質としては、４-アミノアンチピリンと３-［エチル（ｍ-トリル）アミノ］-２-ヒドロキシ-１-プロパンスルホン酸ナトリウム水和物を用いた。
【００６４】
【化６】
2012100654.tif 000009
【００６５】
酵素反応は、以下の条件で行った。先ず、ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ5.7）、ベタイン誘導体、４-アミノアンチピリン／Ｎ-エチル-Ｎ-（２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル）-ｍ-トルイジンナトリウム塩、４-アミノアンチピリン、過酸化水素水を、最終濃度がそれぞれ７９ｍＭ、０〜２０ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２ｍＭ、２０ｍＭになるように９６穴マイクロプレートのウェルに加えた。また、ペルオキシダーゼ溶液は、ウェルの壁面に付着させ、ウェル内の最終濃度1.25×10-3ｍｇ/ｍＬになるように添加した。
【００６６】
次に、３７℃の温度条件で、プレートを振とうさせ、ウェル内の溶液を混合することで反応を開始した。酸化反応が進行すると、５４０ｎｍ付近の吸光度が増大した。反応の進行は５４０ｎｍの吸光度変化をマイクロプレートリーダー（サーモサイエンティフィック社製、Ｍｕｌｔｉ-ｓｃａｎ）で測定することで評価した。全ての条件で酵素反応は６時間で吸光度の上昇が停止した。
【００６７】
各ベタイン誘導体の添加濃度毎に酵素反応６時間後における５４０ｎｍの吸光度を測定した結果を図７に示す。この結果から、ベタイン１０および１１を使用した場合には、１〜２０ｍＭという低濃度であっても、発色強度が増強されており、これらのベタイン誘導体は低濃度で発色基質の発色効率を向上させ得ることが明らかになった。
【００６８】
試験例７：アルカリフォスファターゼによる発色基質の発色効率の評価−１
アルカリフォスファターゼ(Ｅ．  ｃｏｌｉ由来（型番３１８-０１５３１）、和光純薬製、エビ由来（型番２９６-６８３０１）、和光純薬製、仔ウシ腸由来（型番０１６-１４６３１）)の発色基質に対するベタイン誘導体の添加効果を比較した。基質としては、４-ニトロフェニルフォスフェイを用い、ベタイン誘導体としては、前記ベタイン６を用いた。
【００６９】
酵素反応は、以下の条件で行った。先ず、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ8.0）、ベタイン誘導体、ＭｇＳＯ４、４-ニトロフェニルフォスフェイトを、最終濃度がそれぞれ１００ｍＭ、０又は５０ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭになるように９６穴マイクロプレートのウェルに加えた。更に、アルカリフォスファターゼ溶液は、ウェルの壁面に付着させ、ウェル内の添加量が最終濃度2×10-6units／μlになるように添加した。
【００７０】
次に、３７℃の温度条件で、プレートを振とうさせ、ウェル内の溶液を混合することで反応を開始した。酸化反応が進行すると、４０５ｎｍ付近の吸光度が増大した。反応の進行は４０５ｎｍの吸光度変化をマイクロプレートリーダー（サーモサイエンティフィック社製、Ｍｕｌｔｉ-ｓｃａｎ）で、反応開始から１０分毎に計６０分間経時的に測定することで評価した。
【００７１】
酵素反応開始から６０分後まで４０５ｎｍの吸光度を測定した結果を図８〜１０に示す。この結果から、ベタイン６を添加した場合は、ペルオキシダーゼの場合と同様に、アルカリフォスファターゼによる発色効率を格段に向上させ得ることが確認された。
【００７２】
試験例７：アルカリフォスファターゼによる発色基質の発色効率の評価−２
アルカリフォスファターゼの汎用基質に対するベタイン誘導体の添加効果を検討するため、一般的によく利用される５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）／ｐ-ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）を用いて実験を行った。アルカリフォファターゼとしては、市販のアルカリフォスファターゼ（Ｅ．  ｃｏｌｉ由来（型番３１８-０１５３１）、和光純薬製）を用い、ベタイン誘導体としては、前記ベタイン１、４、５及び６を用いた。
【００７３】
酵素反応は、以下の条件で行った。先ず、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ９．５）、ベタイン誘導体、ＢＣＩＰ、ＮＢＴを、最終濃度がそれぞれ１００ｍＭ、０〜１０００ｍＭ、０．０１重量％、０．０３重量％になるように９６穴マイクロプレートのウェルに加えた。更に、アルカリフォスファターゼ溶液は、ウェルの壁面に付着させ、ウェル内の添加量が最終濃度2×10-6units／μlになるように添加した。
【００７４】
次に、３７℃の温度条件で、プレートを振とうさせ、ウェル内の溶液を混合することで反応を開始した。酸化反応が進行すると、５４０ｎｍ付近の吸光度が増大した。反応の進行は５４０ｎｍの吸光度変化をマイクロプレートリーダー（サーモサイエンティフィック社製、Ｍｕｌｔｉ-ｓｃａｎ）で測定することで評価した。全ての条件で酵素反応は２時間で吸光度の上昇が停止した。
【００７５】
各ベタイン誘導体毎に酵素反応２時間後における５４０ｎｍの吸光度を測定した結果を図１１及び表３に示す。図１１及び表３から分かるように、ベタイン５及び６を添加した場合は、ベタイン１及び４を添加した場合に比して、ＢＣＩＰ／ＮＢＴの発色が顕著に増強されていた。即ち、この結果からも、本発明で規定する一般式(1)に示すベタイン誘導体は、発色基質による発色効率を上昇させることが確認された。
【００７６】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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