(57)【要約】      （修正有）【課題】細菌に対して増殖抑制活性を有する短鎖ペプチドを提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるヒト由来のポリペプチドもしくはタンパク質の、特定部分１２〜２１アミノ酸残基からなる短鎖ペプチド、または前記短鎖ペプチドの中から選択されるいずれか一つの短鎖ペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細菌に対して増殖抑制活性を有する短鎖ペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）の短鎖ペプチド。
（ａ）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列のうちの２８番目から４１番目までのアミノ酸残基、４２番目から５４番目までのアミノ酸残基、５５番目から６７番目までのアミノ酸残基、６８番目から７９番目までのアミノ酸残基、２４番目から４１番目までのアミノ酸残基、４２番目から５８番目までのアミノ酸残基、５９番目から６７番目までのアミノ酸残基または５９番目から７９番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチド
（ｂ）前記（ａ）の中から選択されるいずれか一つの短鎖ペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細菌に対して増殖抑制活性を有する短鎖ペプチド
【請求項２】
以下の（ｃ）または（ｄ）の短鎖ペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列のうちの２０番目から４３番目までのアミノ酸残基、３１番目から４３番目までのアミノ酸残基、３１番目から４４番目までのアミノ酸残基または２４番目から３１番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチド
（ｄ）前記（ｃ）の中から選択されるいずれか一つの短鎖ペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細菌に対して増殖抑制活性を有する短鎖ペプチド
【請求項３】
以下の（ｅ）または（ｆ）の短鎖ペプチド。
（ｅ）配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列のうちの１４８番目から１５７番目までのアミノ酸残基、９８番目から１０９番目までのアミノ酸残基または１１５番目から１２６番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチド
（ｆ）前記（ｅ）の中から選択されるいずれか一つの短鎖ペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細菌に対して増殖抑制活性を有する短鎖ペプチド
【請求項４】
以下の（ｇ）または（ｈ）の短鎖ペプチド。
（ｇ）配列表の配列番号１２で表されるアミノ酸配列のうちの７０番目から７９番目までのアミノ酸残基または８０番目から９０番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチド
（ｈ）前記（ｇ）の中から選択されるいずれか一つの短鎖ペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細菌に対して増殖抑制活性を有する短鎖ペプチド
【請求項５】
以下の（ｉ）または（ｊ）の短鎖ペプチド。
（ｉ）配列表の配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうちの２３４番目から２４７番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチド
（ｊ）前記（ｉ）の中から選択されるいずれか一つの短鎖ペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細菌に対して増殖抑制活性を有する短鎖ペプチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口腔ケア用品、衛生保健用品、食料品、飲料品、化粧品類などに、抗菌成分として添加し得る短鎖ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
人は、加齢とともに発音、咀嚼、嚥下、唾液分泌などの口腔機能が低下する。なかでも唾液分泌が低下すると、歯周病や口内炎、齲蝕（虫歯）、口臭といった口腔疾患が増大する。これは、一個人のみならず高齢化社会を迎える日本全体にとっても大きな問題である。
【０００３】
これまで、口腔ケア用品などに添加される抗菌成分や殺菌成分としては抗生物質やエタノールなどの有機溶媒が使われてきた。しかしながら、抗生物質には、長期間の使用によって細菌が耐性を示すようになったり、エタノールなどの有機溶剤には、体質的に受け付けられない方や幼児などに使用することができなかったりする問題があった。
【０００４】
このような状況下、非特許文献１には、本明細書に記載した配列表の配列番号１５（Gly-Pro-Pro-Pro-Gln-Gly-Gly-Arg-Pro-Gln）で表されるアミノ酸配列からなる短鎖ペプチドがPropionibacterium acnes（P. acnes）に対して増殖抑制活性を有する旨記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Chun-Ming Huang, Justin W. Torpey, Yu-Tseung Liu, Yun-Ru Chen, Katherine E. Williams, Elizabeth A. Komives, and Richard L. Gallo1, “A Peptide with a ProGln C Terminus in the Human Saliva Peptidome Exerts Bactericidal Activity against Propionibacterium acnes▽”, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2008,  52, 5, p.1834-1836
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１の短鎖ペプチド（配列表の配列番号１５（Gly-Pro-Pro-Pro-Gln-Gly-Gly-Arg-Pro-Gln）の短鎖ペプチド）がP. acnes以外の細菌に対して増殖抑制活性を有するか否か明らかでなく、また仮に増殖抑制活性を有していたとしてもその活性が十分でない場合もある。本発明者らが検討したところ、特に、歯周病菌として有名なPorphyromonas gingivalis（P. gingivalis）に対しては増殖抑制活性を有していないことが分かった。
【０００７】
抗生物質の場合もそうであるが、細菌の種や菌株ごとに効果の有無や多少が必ず生じる。１つの短鎖ペプチドが幅広い抗菌スペクトルを示すことはない。そのため、抗菌成分や殺菌成分として幅広い抗菌作用を得るためには、細菌に対して増殖抑制活性を有する短鎖ペプチドをなるべく多く得る必要がある。
【０００８】
本発明は前記状況に鑑みてなされたものであり、細菌に対して増殖抑制活性を有する短鎖ペプチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決した本発明は以下のようなものである。
〔１〕  以下の（ａ）または（ｂ）の短鎖ペプチド。
（ａ）列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列のうちの２８番目から４１番目までのアミノ酸残基、４２番目から５４番目までのアミノ酸残基、５５番目から６７番目までのアミノ酸残基、６８番目から７９番目までのアミノ酸残基、２４番目から４１番目までのアミノ酸残基、４２番目から５８番目までのアミノ酸残基、５９番目から６７番目までのアミノ酸残基または５９番目から７９番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチド
（ｂ）前記（ａ）の中から選択されるいずれか一つの短鎖ペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細菌に対して増殖抑制活性を有する短鎖ペプチド
【００１０】
〔２〕  以下の（ｃ）または（ｄ）の短鎖ペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列のうちの２０番目から４３番目までのアミノ酸残基、３１番目から４３番目までのアミノ酸残基、３１番目から４４番目までのアミノ酸残基または２４番目から３１番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチド
（ｄ）前記（ｃ）の中から選択されるいずれか一つの短鎖ペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細菌に対して増殖抑制活性を有する短鎖ペプチド
【００１１】
〔３〕  以下の（ｅ）または（ｆ）の短鎖ペプチド。
（ｅ）配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列のうちの１４８番目から１５７番目までのアミノ酸残基、９８番目から１０９番目までのアミノ酸残基または１１５番目から１２６番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチド
（ｆ）前記（ｅ）の中から選択されるいずれか一つの短鎖ペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細菌に対して増殖抑制活性を有する短鎖ペプチド
【００１２】
〔４〕  以下の（ｇ）または（ｈ）の短鎖ペプチド。
（ｇ）配列表の配列番号１２で表されるアミノ酸配列のうちの７０番目から７９番目までのアミノ酸残基または８０番目から９０番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチド
（ｈ）前記（ｇ）の中から選択されるいずれか一つの短鎖ペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細菌に対して増殖抑制活性を有する短鎖ペプチド
【００１３】
〔５〕  以下の（ｉ）または（ｊ）の短鎖ペプチド。
（ｉ）配列表の配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうちの２３４番目から２４７番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチド
（ｊ）前記（ｉ）の中から選択されるいずれか一つの短鎖ペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細菌に対して増殖抑制活性を有する短鎖ペプチド
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、細菌に対して増殖抑制活性を有する短鎖ペプチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｎｏ．１〜８、１３〜１８の各短鎖ペプチドのC. albicans NBRC1385に対する増殖抑制活性を示すグラフである。なお、縦軸はＲＬＵ［％］を示す。
【図２】Ｎｏ．１〜８、１３〜１８の各短鎖ペプチドのP. acnes JCM6425に対する増殖抑制活性を示すグラフである。なお、縦軸はＲＬＵ［％］を示す。
【図３】Ｎｏ．１〜８、１３〜１８の各短鎖ペプチドのP. acnes JCM6473に対する増殖抑制活性を示すグラフである。なお、縦軸はＲＬＵ［％］を示す。
【図４】Ｎｏ．１〜８、１３〜１８の各短鎖ペプチドのS. mutans JCM5705Tに対する増殖抑制活性を示すグラフである。なお、縦軸はＲＬＵ［％］を示す。
【図５】Ｎｏ．１〜８、１３〜１８の各短鎖ペプチドのP. gingivalis JCM8525に対する増殖抑制活性を示すグラフである。なお、縦軸はＲＬＵ［％］を示す。
【図６】Ｎｏ．１〜４の各短鎖ペプチドのF. nucleatum ATCC 25586を２晩培養した場合についての増殖抑制活性を示すグラフである。なお、横軸は短鎖ペプチドの希釈倍率を示し、縦軸は濁度（ＯＤ650）を示す。
【図７】Ｎｏ．１〜４の各短鎖ペプチドのF. nucleatum ATCC 25586を２晩培養した場合についての増殖抑制活性を示すグラフである。なお、横軸は短鎖ペプチドの希釈倍率を示し、縦軸は濁度（ＯＤ650）を示す。
【図８】Ｎｏ．１〜４の各短鎖ペプチドのP. gingivalis ATCC 33277を１晩培養した場合についての増殖抑制活性を示すグラフである。なお、横軸は短鎖ペプチドの希釈倍率を示し、縦軸は濁度（ＯＤ650）を示す。
【図９】Ｎｏ．１〜４の各短鎖ペプチドのA. actinomycetemcomitans 310aを１晩培養した場合についての増殖抑制活性を示すグラフである。なお、横軸は短鎖ペプチドの希釈倍率を示し、縦軸は濁度（ＯＤ650）を示す。
【図１０】Ｎｏ．１〜８、１３、１４、１６、１８の各短鎖ペプチドのサイトカイン産生抑制活性の有無を示すグラフである。なお、縦軸はＩＬ−６濃度の相対値［％］を示す。
【図１１】Ｎｏ．９〜１２の短鎖ペプチドのC. albicans NBRC1385に対する増殖抑制活性を示すグラフである。なお、縦軸はＲＬＵ［％］を示す。
【図１２】Ｎｏ．９の短鎖ペプチドのP. gingivalis JCM8525に対する増殖抑制活性を示すグラフである。なお、横軸は濃度［μＭ］を示し、縦軸はＲＬＵ［％］を示す。
【図１３】Ｎｏ．１０の短鎖ペプチドのP. gingivalis JCM8525に対する増殖抑制活性を示すグラフである。なお、横軸は濃度［μＭ］を示し、縦軸はＲＬＵ［％］を示す。
【図１４】Ｎｏ．１１の短鎖ペプチドのP. gingivalis JCM8525に対する増殖抑制活性を示すグラフである。なお、横軸は濃度［μＭ］を示し、縦軸はＲＬＵ［％］を示す。
【図１５】Ｎｏ．１２の短鎖ペプチドのP. gingivalis JCM8525に対する増殖抑制活性を示すグラフである。なお、横軸は濃度［μＭ］を示し、縦軸はＲＬＵ［％］を示す。
【図１６】４ｍＭのリン酸緩衝液中でのＮｏ．９〜１２の短鎖ペプチドの細胞膜分極作用を示すグラフである。なお、縦軸は蛍光強度（a. u.）を示す。
【図１７】グッド緩衝液中でのＮｏ．９〜１２の短鎖ペプチドの細胞膜分極作用を示すグラフである。なお、縦軸は蛍光強度（a. u.）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明では、ペプチド合成により特定のアミノ酸配列を有する短鎖ペプチドを得るためにペプチド合成装置を用い、短鎖ペプチドの奏する効果を評価するために各種の微生物やヒトの培養細胞を用いるものであるが、短鎖ペプチドの合成、各種微生物およびヒトの培養細胞の取り扱いや種々の必要な操作について、発明を実施するための形態および実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いることができる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いることができる。また、当業者であれば本明細書の記載および前記した標準的なプロトコール集などの記載から容易に本発明を再現することができる。
以下、本発明について、幾つかの実施形態を示して詳細に説明する。
【００１７】
［第１実施形態］
第１実施形態に係る短鎖ペプチドは、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列のうちの２８番目から４１番目までのアミノ酸残基（Gly-Pro-Tyr-Pro-Pro-Gly-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Gln-Pro-Phe）、４２番目から５４番目までのアミノ酸残基（Gly-Pro-Gly-Phe-Val-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Tyr）、５５番目から６７番目までのアミノ酸残基（Gly-Pro-Gly-Arg-Ile-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Ala-Pro-Tyr）、６８番目から７９番目までのアミノ酸残基（Gly-Pro-Gly-Ile-Phe-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Gln-Pro）、２４番目から４１番目までのアミノ酸残基（Arg-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Tyr-Pro-Pro-Gly-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Gln-Pro-Phe）、４２番目から５８番目までのアミノ酸残基（Gly-Pro-Gly-Phe-Val-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Tyr-Gly-Pro-Gly-Arg）、５９番目から６７番目までのアミノ酸残基（Ile-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Ala-Pro-Tyr）または５９番目から７９番目までのアミノ酸残基（Ile-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Ala-Pro-Tyr-Gly-Pro-Gly-Ile-Phe-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Gln-Pro）からなる。
【００１８】
配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ヒト唾液高プロリンタンパク質Ｐ−Ｂとして知られている。具体的には、Isemura, S., Saitoh, E., and Sanada, K., “Isolation and amino acid sequence of proline-rich peptides of human whole saliva”, J. Biochem. 86, p. 79-86 (1979)や、Isemura, S. and Saitoh, E., “Molecular cloning and sequence analysis of cDNA coding for the precursor of the human salivary proline-rich peptide P-B1”, J. Biochem., 115, p.1101-1106 (1994)や、Isemura, S., “Nucleotide sequence of gene PBII encoding salivary proline-rich protein P-B”, J. Biochem., 127, p.393-398 (2000)にて報告され、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号Ｄ２９８３３で登録されている。本明細書に記載した配列表の配列番号１は、そのｃＤＮＡ（complementary DNA）配列を表したものであり、配列番号２は、その翻訳産物を表したものである。
【００１９】
第１実施形態において前記選択肢の中から選択される各短鎖ペプチドは、細菌に対して増殖抑制活性を有している。これは、K. A. Brogdeng, “Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?”, Nature Rev. Microbiol., 3: p.238-249 (2005)や、松橋勝巳：抗菌性ペプチドによる先天性免疫機構：蛋白質・核酸・酵素４６巻１４号や、p.2060-2065、L. Otvos, Jr., “The short proline-rich antibacterial peptide family”, CMLS, Cell. Mol. Life Sci., 59, p.1138-1150 (2002)などで示唆されているように、比較的短いアミノ酸配列からなることと、プロリンなどの疎水性のアミノ酸が複数連続して結合していることから、短鎖ペプチドが細菌の細胞質内に入り込み易かったり、細胞膜に孔を開けたりし易いことによるものと考えられる。
【００２０】
つまり、これらの短鎖ペプチド中の親水性部分が、細菌の細胞膜の脂質二重層における外側の親水部と接触した後、短鎖ペプチド中において複数連続して結合した疎水性のアミノ酸（例えば、連続して結合したプロリン）が脂質二重層の疎水部に入り込み、さらにこれが反転するようにして細胞膜の内側の親水部に短鎖ペプチド中の親水性部分が表れ、そのまま細菌の細胞質内に侵入すると考えられる。細菌の細胞内に侵入した短鎖ペプチドは、菌体内の分子シャペロンや酵素と結合して菌体内の代謝系を撹乱し、その結果、細菌に対する増殖抑制活性を有すると考えられる。また、細菌の細胞膜と接触した短鎖ペプチドは、親水性部分を向き合わせるようにして複数集まり、細胞膜に樽孔状またはドーナツ状の孔を開けたり、多くの短鎖ペプチドが細胞膜に取り込まれると、親水性のアミノ酸が外側に配位されて界面活性作用を発揮し、細胞膜を破壊したりして、細胞内容物が外部に流出することにより、細菌に対する増殖抑制活性を有すると考えられる。細菌に対する増殖抑制活性は、例えば、３３．４μＭから１．２ｍＭの範囲で増殖抑制活性を得ることができる。また、０．１９ｍｇ／ｍＬ、０．３８ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬなどでも得ることができる。
【００２１】
前記した作用によって奏される増殖抑制活性は、グラム陰性菌、グラム陽性菌、真菌などに対して認められる。
このようなグラム陰性菌としては、例えば、Fusobacterium属、Porphyromonas属、Aggregatibacter属、Escherichia属などが挙げられる。
Fusobacterium属としては、例えば、Fusobacterium nucleatum（以下、F. nucleatum）が挙げられ、その一例としてF. nucleatum ATCC 25586が挙げられる。
Porphyromonas属としては、例えば、Porphyromonas gingivalis（以下、P. gingivalis）が挙げられ、その一例として、P. gingivalis JCM8525、P. gingivalis ATCC 33277などが挙げられる。
Aggregatibacter属としては、例えば、Aggregatibacter actinomycetemcomitans（以下、A. actinomycetemcomitans）が挙げられ、その一例として、A. actinomycetemcomitans 310aが挙げられる。
Escherichia属としては、例えば、Escherichia coli（以下、E. coli）が挙げられ、その一例として、E. coli K-12が挙げられる。
また、このようなグラム陽性菌としては、例えば、Propionibacterium属、Streptococcus属などが挙げられる。
Propionibacterium属としては、例えば、Propionibacterium acnes（以下、P. acnes）が挙げられ、その一例として、P. acnes JCM6425、P. acnes JCM6473などが挙げられる。
Streptococcus属としては、例えば、Streptococcus mutans（以下、S. mutans）が挙げられ、その一例として、S. mutans JCM5705Tが挙げられる。
さらに、このような真菌としては、Candida属が挙げられる。具体的にはCandida albicans（C. albicans）が挙げられ、より具体的にはC. albicans NBRC1385が挙げられる。
なお、第１実施形態において前記選択肢の中から選択される短鎖ペプチドはこれら以外の細菌に対しても増殖抑制活性を有し得ることはいうまでもない。
【００２２】
また、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列のうちの６８番目から７９番目までのアミノ酸残基、４２番目から５８番目までのアミノ酸残基または５９番目から７９番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチドについては、インターロイキン−６（ＩＬ−６）やインターロイキン−８（ＩＬ−８）などのサイトカインの産生を抑制する活性（サイトカイン産生抑制活性）を有する。サイトカインの産生を抑制すると、炎症の抑制を図ることができる。よって、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列のうちの６８番目から７９番目までのアミノ酸残基、４２番目から５８番目までのアミノ酸残基または５９番目から７９番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチドは、かかる活性を得ることを目的として、サイトカインの産生を抑制するために使用することができる。
サイトカイン産生抑制活性は、前記したようにして細胞質内に入り込んだ短鎖ペプチドが、サイトカインの産生に至るまでのいずれかの段階で細胞内伝達系を阻害するために得られると考えられる。
【００２３】
他方、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列のうちの２８番目から４１番目までのアミノ酸残基または４２番目から５４番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチドについては、前記したサイトカインの産生を促進させる活性（サイトカイン産生促進活性）を有する。サイトカインの産生を促進させると、創傷の治癒や免疫応答の促進を図ることができる。よって、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列のうちの２８番目から４１番目までのアミノ酸残基または４２番目から５４番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチドは、かかる活性を得ることを目的として、サイトカインの産生を促進させるために使用することができる。
サイトカイン産生促進活性は、前記したようにして細胞質内に入り込んだ短鎖ペプチドが、サイトカインの産生に至るまでのいずれかの段階で細胞内伝達系を亢進するために得られると考えられる。
【００２４】
サイトカイン産生抑制活性またはサイトカイン産生促進活性は、例えば、０．０７５ｍＭ、０．０８４ｍＭ、０．０９４ｍＭ、０．１ｍＭ、０．１１ｍＭ、０．１２ｍＭ０．１３ｍＭ、０．１６ｍＭ、０．１７ｍＭなどの濃度で得ることができる。
【００２５】
配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列のうちの２８番目から４１番目までのアミノ酸残基、４２番目から５４番目までのアミノ酸残基、５５番目から６７番目までのアミノ酸残基、６８番目から７９番目までのアミノ酸残基、２４番目から４１番目までのアミノ酸残基、４２番目から５８番目までのアミノ酸残基、５９番目から６７番目までのアミノ酸残基または５９番目から７９番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチドの細菌に対する増殖抑制活性は、例えば、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による発光強度を測定することによって確認することができる。ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応は、下記のような反応（１）によって発せられる光の強度を測定して細菌の増殖度を測定するものである。つまり、生きている細菌のＡＴＰ量を光の強度に変換して測定するものである。
【００２６】
【化１】
2012232923.tif 000002
【００２７】
サイトカイン産生抑制活性およびサイトカイン産生促進活性は、ＬＰＳ（Lipopolysaccharide）にて任意の培養細胞、好ましくはヒト培養細胞、より好ましくはヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ；Human Aortic Endothekiak Cells）を刺激するとともに、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列のうちの２８番目から４１番目までのアミノ酸残基、４２番目から５４番目までのアミノ酸残基、５５番目から６７番目までのアミノ酸残基、６８番目から７９番目までのアミノ酸残基、２４番目から４１番目までのアミノ酸残基、４２番目から５８番目までのアミノ酸残基、５９番目から６７番目までのアミノ酸残基または５９番目から７９番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチドを添加し、産生された各種サイトカインを対象としたＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）を行うことで確認できる。なお、培養細胞の培養は、培養細胞に応じた適宜の手法により行うことができ、ＥＬＩＳＡで用いる一次抗体、酵素標識二次抗体、基質、測定装置は市販のものを用いることができる。
【００２８】
［第２実施形態］
第２実施形態に係る短鎖ペプチドは、配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列のうちの２０番目から４３番目までのアミノ酸残基（Asp-Ser-His-Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-Glu-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyr）、３１番目から４３番目までのアミノ酸残基（Arg-Lys-Phe-His-Glu-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyr）、３１番目から４４番目までのアミノ酸残基（Arg-Lys-Phe-His-Glu-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyr-Arg）または２４番目から３１番目までのアミノ酸残基（Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg）からなる。
【００２９】
配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ヒト唾液に含まれるヒスタチン３（ｈｉｓｔａｔｉｎ  ３（ＨＴＮ３））として知られている。具体的には、Sabatini, L. M., and Azen, E. A., “Histatins, a family of salivary histidine-rich proteins, are encoded by at least two loci (HIS1 and HIS2)”, Biochem. Biophys. Res. Commun. 160 (2), p.495-502 (1989)や、vanderSpek, J. C., Offner, G. D., Troxler, R. F. and Oppenheim, F. G., “Molecular cloning of human submandibular histatins”, Arch. Oral Biol. 35 (2), p.137-143 (1990)や、vanderSpek, J. C., Wyandt, H. E., Skare, J. C., Milunsky, A., Oppenheim, F. G., and Troxler, R. F., “Localization of the genes for histatins to human chromosome 4q13 and tissue distribution of the mRNAs”, Am. J. Hum. Genet. 45 (3), p.381-387 (1989)や、Troxler, R. F., Offner, G. D., Xu, T., Vanderspek, J. C. and Oppenheim, F. G., “Structural relationship between human salivary histatins”, J. Dent. Res. 69 (1), p.2-6 (1990)などで報告され、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＭ＿０００２００で登録されている。本明細書に記載した配列表の配列番号３は、そのｃＤＮＡ配列を表したものであり、配列番号４は、その翻訳産物を表したものである。
【００３０】
第２実施形態において前記選択肢の中から選択される短鎖ペプチドも第１実施形態で説明した細菌のうちの少なくとも１つに対して増殖抑制活性を有する。これは、第１実施形態で説明したのと同様の理由によって得られると考えられる。細菌に対する増殖抑制活性は、例えば、３３．４μＭから１．２ｍＭの範囲で増殖抑制活性を得ることができる。また、０．１９ｍｇ／ｍＬ、０．３８ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬなどでも得ることができる。
【００３１】
これらの短鎖ペプチドの細菌に対する増殖抑制活性は、第１実施形態で説明したのと同様、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による発光強度を測定することによって確認することができる。
【００３２】
また、細胞膜に孔が開いたり、細胞膜が破壊されたりしたか否かは、ｄｉＳＣ3（５）（3, 3' - Dipropylthiadicarbocyanine iodide）を用いた蛍光強度の測定により確認することができる。ｄｉＳＣ3（５）は、蛍光染料である。従って、一旦、細菌にｄｉＳＣ3（５）を取り込ませ、測定対象となる物質を添加して蛍光強度が増加するか否かを測定することにより、細胞膜の破壊が起きたか否かを確認することができる。つまり、測定対象となる物質の添加によって細胞膜が破壊されると、菌体内に取り込まれたｄｉＳＣ3（５）がそこから菌体外に放出されるので、その蛍光強度を測定することで細胞膜に孔が開いたか否かの確認をすることができる。
【００３３】
第２実施形態において前記選択肢の中から選択される各短鎖ペプチドは、Imatani, T., Kato, T., Minaguchi, K., and Okuda, K., “Histatin 5 inhibits inflammatory cytokine induction from human gingival fibroblasts by Porphyromonas gingivalis”, Oral Microbiol. Immunol., 15 p.378-382 (2000)によれば、さらに、サイトカイン産生抑制活性を有することが示唆される。
【００３４】
［第３実施形態］
第３実施形態に係る短鎖ペプチドは、配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列のうちの１４８番目から１５７番目までのアミノ酸残基（Gly-Pro-Pro-Pro-Gln-Gly-Gly-Arg-Pro-Gln）、９８番目から１０９番目までのアミノ酸残基（Gly-Gly-His-Pro-Pro-Pro-Pro-Gln-Gly-Arg-Pro-Gln）または１１５番目から１２６番目までのアミノ酸残基（Gly-Gly-His-Pro-Arg-Pro-Pro-Arg-Gly-Arg-Pro-Gln）からなる。
【００３５】
配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ヒト高プロリンタンパク質ＨａｅＩＩＩサブファミリー１（ＰＲＨ１）として知られている。具体的には、Maeda, N., Kim, H. S., Azen, E. A. and Smithies, O., “Differential RNA splicing and post-translational cleavages in the human salivary proline-rich protein gene system”, J. Biol. Chem., 260 (20), p.11123-11130 (1985)にて詳細に報告され、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＭ＿００６２５０で登録されている。本明細書に記載した配列表の配列番号５は、そのｃＤＮＡ配列を表したものであり、配列番号６は、その翻訳産物を表したものである。
【００３６】
なお、第３実施形態において前記選択肢の中から選択されるいずれの短鎖ペプチドも、ヒト高プロリンタンパク質ＨａｅＩＩＩサブファミリー２（ＰＲＨ２）のトランスクリプトバリアント（転写産物変異体）１およびトランスクリプトバリアント２の翻訳産物における該当部分とアミノ酸配列が共通する。
【００３７】
ここで、ヒト高プロリンタンパク質ＨａｅＩＩＩサブファミリー２（ＰＲＨ２）のトランスクリプトバリアント１は、Wong, R. S., Hofmann, T. and Bennick, A., “The complete primary structure of a proline-rich phosphoprotein from human saliva”, J. Biol. Chem., 254 (11), p.4800-4808 (1979)や、Isemura, S., Saitoh, E. and Sanada,K., “The amino acid sequence of a salivary proline-rich peptide, P-C, and its relation to a salivary proline-rich phosphoprotein, protein C”, J. Biochem., 87 (4), p.1071-1077 (1980)や、Maeda, N., Kim, H. S., Azen, E. A. and Smithies, O., “Differential RNA splicing and post-translational cleavages in the human salivary proline-rich protein gene system”, J. Biol. Chem. 260 (20), p.11123-11130 (1985)などにて報告され、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＭ＿００５０４２で登録されている。本明細書に記載した配列表の配列番号７は、そのｃＤＮＡ配列を表したものであり、配列番号８は、その翻訳産物を表したものである。
【００３８】
また、ヒト高プロリンタンパク質ＨａｅＩＩＩサブファミリー２（ＰＲＨ２）のトランスクリプトバリアント２も、Wong, R. S., Hofmann, T. and Bennick, A., “The complete primary structure of a proline-rich phosphoprotein from human saliva”, J. Biol. Chem., 254 (11), p.4800-4808 (1979)や、Isemura, S., Saitoh, E. and Sanada,K., “The amino acid sequence of a salivary proline-rich peptide, P-C, and its relation to a salivary proline-rich phosphoprotein, protein C”, J. Biochem., 87 (4), p.1071-1077 (1980)や、Maeda, N., Kim, H. S., Azen, E. A. and Smithies, O., “Differential RNA splicing and post-translational cleavages in the human salivary proline-rich protein gene system”, J. Biol. Chem. 260 (20), p.11123-11130 (1985)などにて報告され、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＭ＿００１１１０２１３で登録されている。本明細書に記載した配列表の配列番号９は、そのｃＤＮＡ配列を表したものであり、配列番号１０は、その翻訳産物を表したものである。
【００３９】
配列表の配列番号８および配列番号１０で表されるポリペプチドは、配列表の配列番号７および配列番号９で表されるそれぞれのｃＤＮＡ配列をみて分かるように、異なる転写産物から翻訳されたものであるが、同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
そして、配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列のうちの１４８番目から１５７番目までのアミノ酸残基、９８番目から１０９番目までのアミノ酸残基または１１５番目から１２６番目までのアミノ酸残基と、配列表の配列番号８および配列番号１０で表されるアミノ酸配列のうちの１４８番目から１５７番目までのアミノ酸残基、９８番目から１０９番目までのアミノ酸残基または１１５番目から１２６番目までのアミノ酸残基とは、前記したように同一のアミノ酸配列からなる。
そのため、配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列のうちの１４８番目から１５７番目までのアミノ酸残基、９８番目から１０９番目までのアミノ酸残基または１１５番目から１２６番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチドは、配列番号８または配列番号１０で表されるポリペプチドの一部であるともいえる。
【００４０】
配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列のうちの１４８番目から１５７番目までのアミノ酸残基、９８番目から１０９番目までのアミノ酸残基または１１５番目から１２６番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチドも第１実施形態で説明した細菌のうちの少なくとも１つに対して増殖抑制活性を有する。これは、第１実施形態で説明したのと同様の理由によって得られると考えられる。細菌に対する増殖抑制活性は、例えば、３３．４μＭから１．２ｍＭの範囲で増殖抑制活性を得ることができる。また、０．１９ｍｇ／ｍＬ、０．３８ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬなどでも得ることができる。
【００４１】
これらの短鎖ペプチドの細菌に対する増殖抑制活性は、第１実施形態で説明したのと同様、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による発光強度を測定することによって確認することができる。
【００４２】
第３実施形態で示される、配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列のうちの１４８番目から１５７番目までのアミノ酸残基または９８番目から１０９番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチドについては、ＩＬ−６やＩＬ−８などのサイトカインの産生を抑制する活性（サイトカイン産生抑制活性）を有する。サイトカインの産生を抑制すると、炎症の抑制を図ることができる。よって、配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列のうちの１４８番目から１５７番目までのアミノ酸残基または９８番目から１０９番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチドは、かかる活性を得ることを目的として、サイトカインの産生を抑制するために使用することができる。サイトカイン産生抑制活性は、例えば、０．０７５ｍＭ、０．０８４ｍＭ、０．０９４ｍＭ、０．１ｍＭ、０．１１ｍＭ、０．１２ｍＭ０．１３ｍＭ、０．１６ｍＭ、０．１７ｍＭなどの濃度で得ることができる。
【００４３】
これらの短鎖ペプチドのサイトカイン産生抑制活性は、第１実施形態で説明したのと同様、ＬＰＳで培養細胞を刺激するとともにこれらの短鎖ペプチドを添加し、産生された各種サイトカインを対象としたＥＬＩＳＡを行うことで確認することができる。
【００４４】
［第４実施形態］
第４実施形態に係る短鎖ペプチドは、配列表の配列番号１２で表されるアミノ酸配列のうちの７０番目から７９番目までのアミノ酸残基（Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys-Pro-Gln）または８０番目から９０番目までのアミノ酸残基（Gly-Pro-Pro-Pro-Gln-Gly-Gly-Asn-Lys-Pro-Gln）からなる。
【００４５】
配列表の配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ヒト高プロリンタンパク質ＢｓｔＮＩ  サブファミリー２（ＰＲＢ２）として知られている。具体的には、Isemura, S., Saitoh, E. and Sanada, K., “Fractionation and characterization of basic proline-rich peptides of human parotid saliva and the amino acid sequence of proline-rich peptide P-E”, J. Biochem., 91 (6), p.2067-2075 (1982)や、Saitoh, E., Isemura, S., and Sanada, K., “Complete amino acid sequence of a basic praline-rich peptide of P-F, from human parotid saliva”, J. Biochem., 93, p.883-888 (1983)や、Maeda, N., Kim, H. S., Azen, E. A. and Smithies, O., “Differential RNA splicing and post-translational cleavages in the human salivary proline-rich protein gene system”, J. Biol. Chem., 260 (20), p.11123-11130 (1985)などで報告され、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＭ＿００６２４８で登録されている。本明細書に記載した配列表の配列番号１１は、そのｃＤＮＡ配列を表したものであり、配列番号１２は、その翻訳産物を表したものである。
【００４６】
なお、同一のポリペプチド（翻訳産物）中において、７０番目から７９番目までのアミノ酸配列と全く同じアミノ酸配列が、１３１番目から１４０番目、１９３番目から２０２番目、２５５番目から２６４番目および３１７番目から３２６番目に存在する。
また、同一のポリペプチド（翻訳産物）中において、８０番目から９０番目までのアミノ酸配列と全く同じアミノ酸配列が、１４１番目から１５１番目、２０３番目から２１３番目、２６５番目から２７５番目および３２７番目から３３７番目に存在する。
【００４７】
第４実施形態において前記選択肢の中から選択される短鎖ペプチドも第１実施形態で説明した細菌のうちの少なくとも１つに対して増殖抑制活性を有する。これは、第１実施形態で説明したのと同様の理由によって得られると考えられる。細菌に対する増殖抑制活性は、例えば、３３．４μＭから１．２ｍＭの範囲で増殖抑制活性を得ることができる。また、０．１９ｍｇ／ｍＬ、０．３８ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬなどでも得ることができる。
【００４８】
これらの短鎖ペプチドの細菌に対する増殖抑制活性は、第１実施形態で説明したのと同様、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による発光強度を測定することによって確認することができる。
【００４９】
また、配列表の配列番号１２で表されるアミノ酸配列のうちの７０番目から７９番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチドについては、ＩＬ−６やＩＬ−８などのサイトカインの産生を抑制する活性（サイトカイン産生抑制活性）を有する。サイトカインの産生を抑制すると、炎症の抑制を図ることができる。よって、配列表の配列番号１２で表されるアミノ酸配列のうちの７０番目から７９番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチドは、かかる効果を得ることを目的として、サイトカインの産生を抑制するために使用することができる。サイトカイン産生抑制活性は、例えば、０．０７５ｍＭ、０．０８４ｍＭ、０．０９４ｍＭ、０．１ｍＭ、０．１１ｍＭ、０．１２ｍＭ０．１３ｍＭ、０．１６ｍＭ、０．１７ｍＭなどの濃度で得ることができる。
【００５０】
この短鎖ペプチドによるサイトカイン産生抑制活性は、第１実施形態で説明したのと同様、ＬＰＳで培養細胞を刺激するとともにこれらの短鎖ペプチドを添加し、産生された各種サイトカインを対象としたＥＬＩＳＡを行うことで確認することができる。
【００５１】
［第５実施形態］
第５実施形態に係る短鎖ペプチドは、配列表の配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうちの２３４番目から２４７番目までのアミノ酸残基（Gly-Arg-Pro-Pro-Arg-Pro-Ala-Gln-Gly-Gln-Gln-Pro-Pro-Gln）からなる。
【００５２】
配列表の配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ヒト唾液高プロリンタンパク質前駆体（ＰＲＢ４）として知られている。具体的には、Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K., “Complete amino acid sequence of a basic roline-rich peptide P-D, from human parotid saliva”, J. Biochem., 93, p.495-502 (1983)や、Maeda, N., Kim, H. S., Azen, E. A. and Smithies, O., “Differential RNA splicing and post-translational cleavages in the human salivary proline-rich protein gene system”, J. Biol. Chem., 260 (20), p.11123-11130 (1985)にて報告され、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号Ｋ０３２０７で登録されている。本明細書に記載した配列表の配列番号１３は、そのｃＤＮＡ配列を表したものであり、配列番号１４は、その翻訳産物を表したものである。
【００５３】
配列表の配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうちの２３４番目から２４７番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチドも第１実施形態で説明した細菌のうちの少なくとも１つに対して増殖抑制活性を有する。これは、第１実施形態で説明したのと同様の理由によって得られると考えられる。細菌に対する増殖抑制活性は、例えば、３３．４μＭから１．２ｍＭの範囲で増殖抑制活性を得ることができる。また、０．１９ｍｇ／ｍＬ、０．３８ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬなどでも得ることができる。
【００５４】
この短鎖ペプチドの細菌に対する増殖抑制活性は、第１実施形態で説明したのと同様、ルシフェリン・ルシフェラーゼ反応による発光強度を測定することによって確認することができる。
【００５５】
また、配列表の配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうちの２３４番目から２４７番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチドは、ＩＬ−６やＩＬ−８などのサイトカインの産生を抑制する活性（サイトカイン産生抑制活性）を有する。サイトカインの産生を抑制すると、炎症の抑制を図ることができる。よって、配列表の配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうちの２３４番目から２４７番目までのアミノ酸残基からなる短鎖ペプチドは、かかる効果を得ることを目的として、サイトカインの産生を抑制するために使用することができる。サイトカイン産生抑制活性またはサイトカイン産生促進活性は、例えば、０．０７５ｍＭ、０．０８４ｍＭ、０．０９４ｍＭ、０．１ｍＭ、０．１１ｍＭ、０．１２ｍＭ０．１３ｍＭ、０．１６ｍＭ、０．１７ｍＭなどの濃度で得ることができる。
【００５６】
この短鎖ペプチドによるサイトカイン産生抑制活性は、第１実施形態で説明したのと同様、ＬＰＳで培養細胞を刺激するとともにこれらの短鎖ペプチドを添加し、産生された各種サイトカインを対象としたＥＬＩＳＡを行うことで確認することができる。
【００５７】
以上の第１実施形態から第５実施形態で説明した各短鎖ペプチドには、それぞれの実施形態で説明した短鎖ペプチドのアミノ酸残基のうちの１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細菌に対して増殖抑制活性を有する短鎖ペプチドと実質的に同一の増殖抑制活性を有する短鎖ペプチド、さらにはこれに加えてサイトカイン産生抑制活性またはサイトカイン産生促進活性を有する短鎖ペプチドも含まれる。
【００５８】
以上に説明した第１実施形態から第５実施形態に係る短鎖ペプチドは、全て市販のペプチド合成装置にて製造することができる。そして、合成した短鎖ペプチドは、市販の高速液体クロマトグラフにて適宜の条件で精製することができる。本発明に係る短鎖ペプチドはいずれもアミノ酸残基の数が少ないので、容易かつ安価にこれを製造することができる。
【００５９】
合成して精製された第１〜５実施形態に係る短鎖ペプチドは、口腔ケア用品、衛生保健用品、食料品、飲料品、化粧品類などに、抗菌成分として添加することができる。
【実施例】
【００６０】
次に、本発明の効果を確認した実施例について説明する。
【００６１】
表１に示すＮｏ．１〜１８で表される各アミノ酸配列からなる短鎖ペプチドをペプチド合成装置（Ｔｈｕｒａｍｅｄ社製Ｔｅｔｒａｓ  １０６）を用いて合成し、カラム（Ａｋｚｏｎｏｂｅｌ社製Ｋｒｏｍａｓｉｌ  Ｃ１８）を装着したＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製１０Ａ  ｓｙｓｔｅｍ）にて下記精製条件で精製した。
なお、Ｎｏ．１〜８の短鎖ペプチドは、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号Ｄ２９８３３で登録されているｃＤＮＡ配列とその翻訳産物のアミノ酸配列に基づいて設計した。
Ｎｏ．９〜１２の短鎖ペプチドは、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＭ＿０００２００で登録されているｃＤＮＡ配列とその翻訳産物のアミノ酸配列に基づいて設計した。
Ｎｏ．１３〜１５の短鎖ペプチドは、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＭ＿００６２５０、ＮＭ＿００５０４２またはＮＭ＿００１１１０２１３で登録されているｃＤＮＡ配列とその翻訳産物のアミノ酸配列に基づいて設計した。
Ｎｏ．１６、１７の短鎖ペプチドは、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＭ＿００６２４８で登録されているｃＤＮＡ配列とその翻訳産物のアミノ酸配列に基づいて設計した。
Ｎｏ．１８の短鎖ペプチドは、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号Ｋ０３２０７で登録されているｃＤＮＡ配列とその翻訳産物のアミノ酸配列に基づいて設計した。
なお、表１中の短鎖ペプチドのアミノ酸配列については、アミノ酸を三文字記号で表している。
【００６２】
《精製条件》
・溶媒Ａ：０．１質量％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル
・溶媒Ｂ：０．１質量％トリフルオロ酢酸を含む水
・流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
・波長：２２０ｎｍ
・インジェクション容量：２０μＬ
・グラジエント条件：０．０１ｍｉｎ（溶媒Ａ１０％、溶媒Ｂ９０％）→２５．０ｍｉｎ（溶媒Ａ３５％、溶媒Ｂ６５％）→２５．１ｍｉｎ（溶媒Ａ１００％、溶媒Ｂ０％）→３０ｍｉｎ（ＳＴＯＰ）
【００６３】
【表１】
2012232923.tif 000003
【００６４】
〔１〕Ｎｏ．１〜８、１３〜１８の短鎖ペプチドの抗菌性
まず、表１に示すＮｏ．１〜１８の短鎖ペプチドのうち、Ｎｏ．１〜８、１３〜１８のアミノ酸配列からなる短鎖ペプチドについて、E. coli K-12、P. acnes JCM6425、P. acnes JCM6473、S. mutans JCM5705T、C. albicans NBRC1385、P. gingivalis JCM8525に対する抗菌スペクトルを作成した。抗菌スペクトルは次のようにして作成した。
【００６５】
Ｎｏ．１〜８、１３〜１８の短鎖ペプチドは、濃度が１．２ｍＭとなるように各菌体の培養培地に加えて培養した。
ここで、E. coli K-12は、ＬＢ培地（１Ｌ中、ポリペプトン１０．０ｇ、酵母エキス５．０ｇ、塩化ナトリウム１０．０ｇ、ｐＨ７．５）を用いて好気条件下、３７℃で４〜６時間静置培養した。
P. acnes JCM6425およびP. acnes JCM6473は、ＧＡＭ培地（１Ｌ中、ペプトン１０．０ｇ、ダイズペプトン３．０ｇ、プロテオーゼペプトン１０．０ｇ、消化血清末１３．５ｇ、酵母エキス５．０ｇ、肉エキス２．２ｇ、肝臓エキス１．２ｇ、ブドウ糖３．０ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇ、溶性デンプン５．０ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、ｐＨ７．１）を用いて好気条件下、３７℃で２４時間静置培養した。
S. mutans JCM5705Tは、ＢＨＩ培地（１Ｌ中、仔ウシ脳浸出物１２．５ｇ、ウシ心筋浸出物５．０ｇ、プロテオースペプトン１０．０ｇ、ブドウ糖２．０ｇ、塩化ナトリウム５．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム２．５ｇ、ｐＨ７．４）を用いて好気条件下、３７℃で６〜１２時間静置培養した。
C. albicans NBRC1385は、ＹＭ培地（１Ｌ中、ポリペプトン１０．０ｇ、酵母エキス３．０ｇ、モルトエキス３．０ｇ、ｐＨ６．２）を用いて好気条件下、２５℃で２４〜４０時間静置培養した。
P. gingivalis JCM8525は、変法ＧＡＭ培地（１Ｌ中、ペプトン５．０ｇ、ダイズペプトン３．０ｇ、プロテオーゼペプトン５．０ｇ、消化血清末１０．０ｇ、酵母エキス２．５ｇ、肉エキス２．２ｇ、肝臓エキス１．２ｇ、ブドウ糖０．５ｇ、溶性デンプン５．０ｇ、Ｌ−トリプトファン０．２ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、Ｌ−アルギニン１．０ｇ、ビタミンＫ１５ｍｇ、ヘミン１０ｍｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇ、ｐＨ７．３）を用いて嫌気条件下、３７℃で４８〜５４時間静置培養した。
なお、各菌体について、培養培地に短鎖ペプチドを添加しないで同様の条件で静置培養し、これをコントロール（Control）とした。
【００６６】
前記条件で培養した後、各培養培地から１００μＬ分取して９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに加えた。次いで、添付の説明書に従い、ルシフェールＡＴＰ消去試薬セット（Ｋｉｋｋｏｍａｎ社製）を用いて試料中に含まれる細胞外ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を消去した。次いで、添付の説明書に従い、ＢａｃＴｉｔｅｒ‐ＧｌｏTM（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて生菌数を測定した。なお、ＢａｃＴｉｔｅｒ‐ＧｌｏTMは、生菌のＡＴＰ量に基づいてルシフェリン・ルシフェラーゼ反応により生菌数を測定することのできるキットである。発光強度は、マイクロプレートリーダーＡＲＶＯTM（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて測定した。
図１〜５に、Ｎｏ．１〜８、１３〜１８の各短鎖ペプチドを添加して培養した菌体について、コントロールのルシフェラーゼ活性を１００％とした場合の相対発光量（ＲＬＵ［％］）をグラフにして示した。なお、いずれの図においても縦軸はＲＬＵ［％］を示す。
【００６７】
図１に示すとおり、C. albicans NBRC1385については、Ｎｏ．１〜８、１３、１５、１８の短鎖ペプチドに増殖抑制活性が認められた。
また、図２に示すとおり、P. acnes JCM6425については、Ｎｏ．７の短鎖ペプチドに増殖抑制活性が認められた。
図３に示すとおり、P. acnes JCM6473については、Ｎｏ．１〜７、１３〜１８の短鎖ペプチドに増殖抑制活性が認められた。
図４に示すとおり、S. mutans JCM5705Tについては、Ｎｏ．１〜８、１３〜１８のすべての短鎖ペプチドに増殖抑制活性が認められた。
図５に示すとおり、P. gingivalis JCM8525については、Ｎｏ．５、１５の短鎖ペプチドに増殖抑制活性が認められた。
【００６８】
〔２〕Ｎｏ．１〜４の短鎖ペプチドの抗菌性
ここでは、F. nucleatum ATCC 25586と、P. gingivalis ATCC 33277と、A. actinomycetemcomitans 310aを用いてＮｏ．１〜４の短鎖ペプチドの抗菌性について調べた。
Ｎｏ．１〜４の短鎖ペプチドの濃度が１．５ｍｇ／ｍＬとなるように各菌体の培養培地を調製した。そして、これを用いて１／２倍希釈（０．７５ｍｇ／ｍＬ）、１／４倍希釈（０．３８ｍｇ／ｍＬ）および１／８倍希釈（０．１９ｍｇ／ｍＬ）した培養培地を調製するとともに、短鎖ペプチドを添加しない０ｍｇ／ｍＬ（便宜上、０倍希釈という。）の培養培地も調製した。さらに、溶媒の影響を確認するため、短鎖ペプチドの入っていない溶媒を前記希釈倍率に応じて添加したコントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に係る培養培地も調製した。調製した各培養培地を用いて各菌体を培養した。
【００６９】
なお、F. nucleatum ATCC 25586は、Todd Hewitt培地（１Ｌ中、牛心臓抽出物５００ｇ、ペプトン２０ｇ、ブドウ糖２ｇ、塩化ナトリウム２ｇ）を用いて嫌気条件下、３７℃で２晩（４１時間）または３晩（６５時間）培養した。
P. gingivalis ATCC 33277は、ヘミンおよびビタミンＫ3を添加したTrypticase soy broth培地（１Ｌ中、カゼイン１７ｇ、酵素分解大豆エキス３ｇ、ブドウ糖２．５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ビタミンＫ１５ｍｇ、ヘミン１０ｍｇ、ｐＨ７．４））を用いて嫌気条件下、３７℃で１晩（１７時間）培養した。
A. actinomycetemcomitans 310aは、酵母エキス添加Todd Hewitt培地（１Ｌ中、牛心臓抽出物５００ｇ、ペプトン２０ｇ、ブドウ糖２ｇ、塩化ナトリウム２ｇ、酵母エキス１０ｇ）を用いて嫌気条件下、３７℃で１晩（１７時間）培養した。
【００７０】
前記条件で培養した後、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５を用いて各培養培地の濁度（ＯＤ650）を測定した。
図６〜９に、Ｎｏ．１〜４の各短鎖ペプチドの希釈倍率と濁度（ＯＤ650）を示す。なお。いずれの図も横軸は短鎖ペプチドの希釈倍率を示し、縦軸は濁度を示す。
【００７１】
図６は、F. nucleatum ATCC 25586を２晩培養した場合についての増殖抑制活性を示している。図６に示すとおり、Ｎｏ．１〜４のいずれの短鎖ペプチドについても、短鎖ペプチドの添加濃度が高くなるにつれて細菌の増殖が抑制され、濁度が低下した。つまり、増殖抑制活性が認められた。特に、Ｎｏ．４の短鎖ペプチドについては、低い添加濃度から高い増殖抑制活性が認められた。
図７は、F. nucleatum ATCC 25586を２晩培養した場合についての増殖抑制活性を示している。図７に示すとおり、Ｎｏ．４の短鎖ペプチドについては、０．３８〜０．７５ｍｇ／ｍＬの間で濁度が大きく低下した。つまり、高い増殖抑制活性が認められた。Ｎｏ．１〜３の短鎖ペプチドも１．５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加することにより、Ｎｏ．４の短鎖ペプチドと同程度の増殖抑制活性を得ることができた。
図８は、P. gingivalis ATCC 33277を１晩培養した場合についての増殖抑制活性を示している。図８に示すとおり、Ｎｏ．１〜４のいずれの短鎖ペプチドも添加濃度が高くなるにつれて、濁度が同様に低下した。つまり、いずれの短鎖ペプチドにおいても増殖抑制活性が認められた。
図９は、A. actinomycetemcomitans 310aを１晩培養した場合についての増殖抑制活性を示している。図９に示すとおり、Ｎｏ．１〜４のいずれの短鎖ペプチドも添加濃度が高くなるにつれて、濁度が同様に低下した。つまり、いずれの短鎖ペプチドにおいても増殖抑制活性が認められた。
【００７２】
〔３〕サイトカイン産生抑制活性
次に、表１に示すＮｏ．１〜１８の短鎖ペプチドのうち、Ｎｏ．１〜８、１３、１４、１６、１８のアミノ酸配列からなる短鎖ペプチドについて、サイトカイン産生抑制活性の有無について確認した。サイトカイン産生抑制活性の有無は次のようにして確認した。
【００７３】
４８ウェルプレートTissue Culture Treated Polystyrene（ＩＷＡＫＩ社製）の各ウェルに分注したＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２（ＫＵＲＡＢＯ社製）にて、ＫＵＲＡＢＯ社製ヒト大動脈内皮細胞（凍結ＨＡＥＣ（Human Aortic Endothelial Cells）；細胞ストレイン番号４９６２８６または５Ｃ１１４３）を培養した。培養は、当初５×１０3Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2となるように細胞をまき、３７℃、５％ＣＯ2の条件下、１週間程度培養した。そして、コンフルエントな状態であることを確認した後、A. actinomycetemcomitans Y4株から精製したＬＰＳ（Lipopolysaccharide）を１０ｎｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬ用いて前記培養細胞を刺激するとともに、Ｎｏ．１〜８、１３、１４、１６、１８の短鎖ペプチドをそれぞれ表２に示す終濃度となるよう添加して、ＥＬＩＳＡによりサイトカインであるインターロイキン−６（ＩＬ−６）の濃度［ｐｇ／ｍＬ］を測定した。なお、ＥＬＩＳＡは、Ｅｎｄｏｇｅｎ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて行った。ＥＬＩＳＡによる一連の操作を終えた後、マルチモード・マイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（モレキュラーデバイス社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ450）を測定した。
【００７４】
【表２】
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【００７５】
図１０に、Ｎｏ．１〜８、１３、１４、１６、１８の各短鎖ペプチドのサイトカイン産生抑制活性の有無を示す。なお、図１０は、短鎖ペプチドの効果について、ＬＰＳのみを添加したＨＡＥＣのＩＬ−６濃度を１００％とした場合における相対値［％］で示している。なお、図１０において縦軸はＩＬ−６濃度の相対値［％］を示す。
図１０に示すように、Ｎｏ．４、６〜８、１４、１６、１８の短鎖ペプチドにサイトカイン産生抑制活性が認められた。
他方、Ｎｏ．１〜３、５の短鎖ペプチドにサイトカイン産生促進活性が認められた。
【００７６】
〔４〕Ｎｏ．９〜１２の短鎖ペプチドの抗菌性
表１に示すＮｏ．１〜１９のうち、Ｎｏ．９〜１２の短鎖ペプチドについて、C. albicans NBRC1385とP. gingivalis JCM8525に対する抗菌性を調べた。
【００７７】
まず、C. albicans NBRC1385に対する抗菌性について説明する。
ＹＭ培地にてC. albicans NBRC1385をプレ培養し、ＯＤ650が１．０になったら８０μＬ分取し、Ｎｏ．９〜１２の短鎖ペプチドを２００μＭとなるように添加したＹＭ培地１０ｍＬに植菌して好気条件下、２５℃で３６時間静置培養した。
そして、前記〔１〕と同様の条件でルシフェリン・ルシフェラーゼ活性を測定し、短鎖ペプチドを添加しないコントロール（Control）の発光量を１００％とした場合における相対発光量（ＲＬＵ［％］）を求めた。その結果を図１１に示す。なお、図１１において縦軸はＲＬＵ［％］を示す。
図１１に示すとおり、Ｎｏ．９〜１２の短鎖ペプチドは、いずれもC. albicans NBRC1385に対して増殖抑制活性を有していた。具体的には、ＲＬＵの比率で比較すると、コントロールと比較してＮｏ．９の短鎖ペプチドは８３．８％、Ｎｏ．１０の短鎖ペプチドは７６．４％、Ｎｏ．１１の短鎖ペプチドは８４．６％、Ｎｏ．１２の短鎖ペプチドは５１．４％減じることができた。
【００７８】
次いで、P. gingivalis JCM8525に対する抗菌性について説明する。
変法ＧＡＭ培地にてP. gingivalis JCM8525をプレ培養し、ＯＤ650が１．０になったら８０μＬ分取した。そして、Ｎｏ．９の短鎖ペプチドについては、濃度が０μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭとなるように、Ｎｏ．１０の短鎖ペプチドについては、濃度が０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、４００μＭ、８００μＭとなるように、Ｎｏ．１１の短鎖ペプチドについては、濃度が０μＭ、２．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭとなるように、Ｎｏ．１２の短鎖ペプチドについては、濃度が０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、４００μＭ、８００μＭとなるように添加した変法ＧＡＭ培地を調整し、それぞれの培地０．１ｍＬに前記分取した８０μＬのプレ培養液を添加して、嫌気条件下、３７℃で４８〜５４時間静置培養した。
【００７９】
そして、前記〔１〕と同様の条件でルシフェリン・ルシフェラーゼ活性を測定し、それぞれの場合について、短鎖ペプチドを添加しない０μＭの発光量を１００％とした場合における相対発光量（ＲＬＵ［％］）を求めた。その結果を図１２〜図１５に示す。図１２は、Ｎｏ．９の短鎖ペプチドのP. gingivalis JCM8525に対する増殖抑制活性を示すグラフであり、図１３は、Ｎｏ．１０の短鎖ペプチドのP. gingivalis JCM8525に対する増殖抑制活性を示すグラフであり、図１４は、Ｎｏ．１１の短鎖ペプチドのP. gingivalis JCM8525に対する増殖抑制活性を示すグラフであり、図１５は、Ｎｏ．１２の短鎖ペプチドのP. gingivalis JCM8525に対する増殖抑制活性を示すグラフである。なお、図１２〜図１５において、横軸は濃度［μＭ］を示し、縦軸はＲＬＵ［％］を示す。
図１２〜図１５に示すとおり、Ｎｏ．９、１１、１２の短鎖ペプチドは、添加濃度が高くなるに連れてＲＬＵが低下した。つまり、P. gingivalis JCM8525に対する増殖抑制活性があった。
【００８０】
（５）Ｎｏ．９〜１２の短鎖ペプチドの細胞膜分極作用
P. gingivalis JCM8525を変法ＧＡＭ培地で嫌気条件下、３７℃で４８〜５４時間静置培養した。培養後、遠心分離を行い、デカンテーションで上清を除去し、沈殿物を４ｍＭのリン酸緩衝液（４ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）１ｍＬで懸濁した。次いで、ｄｉＳＣ3（５）（3, 3' - Dipropylthiadicarbocyanine iodide）を添加し、４００秒経過したところでＮｏ．９〜１２の短鎖ペプチドをそれぞれ３３．４μＭとなるように添加し、６０秒経過したときの蛍光強度（任意単位（a. u.））を測定した。
また、比較のため、短鎖ペプチドに替えて、ペプチド系抗生物質であるＧｒａｍｉｃｉｄｉｎ  Ｄ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製１０１９０１）を過剰量となる５０μＭで添加した。そして、６０秒経過したときの蛍光強度を測定した。その結果を図１６に示す。なお、図１６において縦軸は蛍光強度を示す。単位は任意単位（a. u.）である。
図１６に示すように、Ｎｏ．９〜１２の短鎖ペプチドの添加により、細胞膜分極作用が認められた。つまり、細胞膜を破壊することが認められた。具体的には、Ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ  Ｄを１００％した場合に、Ｎｏ．９の短鎖ペプチドでは約４９％の蛍光強度であり、Ｎｏ．１０の短鎖ペプチドでは約１０％の蛍光強度であり、Ｎｏ．１１の短鎖ペプチドでは約２６％の蛍光強度であり、Ｎｏ．１２の短鎖ペプチドでは約２２％の蛍光強度であった。
【００８１】
同様の実験を、４ｍＭのリン酸緩衝液に替えて、ヒト唾液のｐＨ（７．２）とイオン強度を模倣したグッド緩衝液（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．２）にて行った。その結果を図１７に示す。なお、図１７において縦軸は蛍光強度を示す。単位は任意単位（a. u.）である。
図１７に示すように、図１６で示したものよりも若干効率は劣るものの、Ｎｏ．９〜１２の短鎖ペプチドは細胞膜分極作用が認められた。つまり、細胞膜を破壊することが認められた。具体的には、Ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ  Ｄを１００％した場合に、Ｎｏ．９の短鎖ペプチドでは約２５％の蛍光強度であり、Ｎｏ．１０の短鎖ペプチドでは約４％の蛍光強度であり、Ｎｏ．１１の短鎖ペプチドでは約１２％の蛍光強度であり、Ｎｏ．１２の短鎖ペプチドでは約１１％の蛍光強度であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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