(57)【要約】【課題】  適宜の耐熱性を有するのに加え、好気環境下であってもエタノール発酵能を有するエタノール産生菌、及びこの菌を用いてエタノールを生産する方法を提供する。【解決手段】  ザイモモナス・モビリスに抗生物質を作用させることによって呼吸欠損変異株であるザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６６）、ＲＤＭ−８（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６７）を得た。これらの菌株のエタノール産生能はいずれも、好気環境下では親株のエタノール生産量の略３倍であり、嫌気環境下では親株のエタノール生産量より高いものであった。更に、これらの菌株は、３９℃という高温でも通常の培養温度である３０℃でのエタノール産生量の７０％程度以上のエタノールを産生しており、耐熱性も有している。【選択図】  図１
2012060985.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖質原料からエタノールを産生するエタノール産生菌において、
ザイモモナス・モビリス  アールディーエム−フォー（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＲＤＭ−４）（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６６）、又はザイモモナス・モビリス  アールディーエム−エイト（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＲＤＭ−８）（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６７）であることを特徴とするエタノール産生菌。
【請求項２】
エタノール産生菌を用いて糖質原料からエタノールを生産する方法において、
前記エタノール産生菌として、ザイモモナス・モビリス  アールディーエム−フォー（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＲＤＭ−４）（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６６）、及び／又はザイモモナス・モビリス  アールディーエム−エイト（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＲＤＭ−８）（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６７）を用いることを特徴とするエタノール生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖質原料からエタノールを産生するエタノール産生菌、及び当該菌によってエタノールを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エタノール発酵を行うには従来より酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が用いられてきたが、酵母より高いエタノール産生能を有するザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）（以後、単にザイモモナス菌と呼ぶこともある。）が注目されており、例えば後記する特許文献１には次のようなザイモモナス菌が開示されている。
【０００３】
すなわち、熱帯気候の地域であるタイ王国において複数株のザイモモナス菌を単離し、３９℃と比較的高い温度でも良好に生育し、エタノール産生能が高い株を選択することによって、耐熱性が高いザイモモナス・モビリス  ＮＩＴＥ  ＡＰ−４１０及びＮＩＴＥ  ＡＰ−４１１を得た。
【０００４】
このようなザイモモナス菌を用いることによって、３７℃〜３９℃と比較的高い温度であっても効率的にエタノールを発酵することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−６０８３６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ザイモモナス菌は酵母と同様、嫌気的な環境下ではエタノール発酵を行うが、好気的な環境下では呼吸を行うためほとんどエタノール発酵が行われない。このようなザイモモナス菌を用いてタンク内でエタノール発酵を行うには、タンク内を撹拌しない静置培養によりエタノール発酵を実施しなければならず、かかる静置培養にあっては時間の経過とともに菌体がタンクの底部に沈降して行くため発酵効率が低下するという問題があった。
【０００７】
これを解決するには、タンク内に設置された撹拌羽根によって菌体を撹拌することが考えられるが、比較的低い回転速度で撹拌したとしても撹拌によって周囲の酸素が培地内に取り込まれるため、これに相応してエタノール発酵の効率が低下してしまう。そのため、窒素ガス又は炭酸ガスといった非酸素系のガスをタンク内に導入することが考えられるが、ランニングコストが嵩んでしまう。
【０００８】
また、上述したようにザイモモナス菌は好気的な環境下では主に呼吸を行うため、かかるザイモモナス菌を好気的な環境下で取り扱っていると、例えばエタノール発酵能が相対的に低いにも拘わらず呼吸能が高いものが優勢となってしまう場合も考えられ、エタノールの生産性が不安定になるという虞もあった。
【０００９】
本発明は斯かる事情に鑑みてなされたものであって、適宜の耐熱性を有するのに加え、好気環境下であってもエタノール発酵能を有するエタノール産生菌、及びこの菌を用いてエタノールを生産する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（１）本発明に係るエタノール産生菌は、糖質原料からエタノールを産生するエタノール産生菌において、ザイモモナス・モビリス  アールディーエム−フォー（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＲＤＭ−４）（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６６）、又はザイモモナス・モビリス  アールディーエム−エイト（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＲＤＭ−８）（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６７）であることを特徴とする。
【００１１】
ザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４及びザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−８は後記するように親株に比べて２０％程度から３０％程度しか酸素を取り込むことができない呼吸欠損変異株である。しかも、これら呼吸欠損変異株は、微生物又はその産生物を利用する食品産業の分野において永年に亘って用いられている突然変異の手法を用いて呼吸欠損変異株を造成した。従って、本発明に係るザイモモナス菌により生産されたエタノールは食品産業用として安全であり、当該エタノールを食品産業用の原料として用いることができる。
【００１２】
また、これらの菌株のエタノール産生能はいずれも、好気環境下では親株のエタノール生産量の略３倍であり、嫌気環境下では親株のエタノール生産量より高いものであった。更に、これらの菌株は、３９℃という高温でも通常の培養温度である３０℃でのエタノール産生量の７０％程度以上のエタノールを産生しており、耐熱性も有している。
【００１３】
このような菌株にあっては、好気的な環境下で取り扱っても、エタノール発酵能が相対的に低いにも拘わらず呼吸能が高いものが優勢となってしまうというような虞が無く、従って、エタノール生産のための本発酵前の各工程を好気環境下で取り扱えるので、各工程の操作を容易に行うことができる。
【００１４】
更に、例えばタンクによる本発酵において適宜に撹拌を行った場合であってもエタノール生産量を高レベルに維持することができるため、エタノール生産量を低下させることなく菌体が沈降することを防止することができ、効率的な発酵を行うことができる。
【００１５】
また、適宜の耐熱性も有するためより高い温度で発酵を行わせることによって、更にエタノール生産性の効率化を実現できる。
【００１６】
（２）本発明に係るエタノール生産方法は、エタノール産生菌を用いて糖質原料からエタノールを生産する方法において、前記エタノール産生菌としてザイモモナス・モビリス  アールディーエム−フォー（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＲＤＭ−４）（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６６）、及び／又はザイモモナス・モビリス  アールディーエム−エイト（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＲＤＭ−８）（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６７）を用いることを特徴とする。
【００１７】
前記糖質原料としてはグルコースを用いることができるが、それ以外にも天然素材としてサトウキビ、廃糖蜜、甜菜等を用いることができる。また、トウモロコシ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、米、麦等に含まれるデンプン、及びスイッチグラス、パルプ廃液、バガス、廃材木、もみ殻・稲藁等に含まれるセルロース等の多糖を分解した分解物を用いることもできる。
【００１８】
サトウキビ及び甜菜等はそれらの搾汁液を用い、廃糖蜜は糖度を調整して用いる。また、デンプン及びセルロース等の多糖は酵素分解又は化学分解により単糖に分解した分解液を用いる。
【００１９】
このような糖質原料に必要に応じてナトリウム、カリウム、マグネシウム等の塩類、酵母抽出物といったビタミン類を適宜添加し、ザイモモナス・モビリス  アールディーエム−フォー（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＲＤＭ−４）（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６６）、又はザイモモナス・モビリス  アールディーエム−エイト（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＲＤＭ−８）（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６７）を単独で、又は両菌株を併用して接種してエタノール発酵を行わせることによってエタノールを生産する。
【００２０】
この場合、エタノール発酵は適宜容量のタンクで行うが、菌体が沈降しない程度の回転速度で撹拌羽根を連続的に、又は断続的に回転させるとよい。これらの菌株は前述したように呼吸欠損変異株であるため、適宜の撹拌を行った場合であってもエタノール生産量を高レベルに維持することができる。従って、エタノール生産量を低下させることなく菌体が沈降することを防止することができ、効率的な発酵を行うことができる。
【００２１】
一方、前述したようにこれらの菌株は耐熱性を有するため、例えばデンプンを６０℃程度で酵素分解した後、分解液の温度が３５℃程度まで低下したタイミングで菌体を接種して発酵を開始し、その温度を維持してエタノール発酵を行わせることができる。
これによって、エタノール生産の効率化を実現できる。
【００２２】
一方、ザイモモナス・モビリス  アールディーエム−フォー（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＲＤＭ−４）（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６６）、又はザイモモナス・モビリス  アールディーエム−エイト（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＲＤＭ−８）（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６７）を単独で、又は両菌株を併用して、バイオリアクターで通常用いられている方法を用いて例えばビーズ状に菌体を固定する。そして、固定した菌体と前述した糖質原料とを接触させることによってエタノールを生産することもできる。
【００２３】
これらの菌株は前述したように好気的な環境下で取り扱っても、エタノール発酵能が相対的に低いにも拘わらず呼吸能が高いものが優勢となってしまうというような虞が無く、従って、エタノール生産のための本発酵前の各工程を好気環境下で取り扱えるので、各工程の操作を容易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】各菌株を好気培養した場合の培地中の溶存酸素を経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図２】各呼吸欠損変異株の嫌気環境下での培地中のエタノール含有量を測定した結果を示すヒストグラムである。
【図３】各呼吸欠損変異株の好気環境下での培地中のエタノール含有量を測定した結果を示すヒストグラムである。
【図４】嫌気環境下における各呼吸欠損変異株の生育度合いを経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図５】好気環境下における各呼吸欠損変異株の生育度合いを経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図６】嫌気環境下における各呼吸欠損変異株のエタノール産生量を経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図７】好気環境下における各呼吸欠損変異株のエタノール産生量を経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図８】３９℃で嫌気環境下における各呼吸欠損変異株のエタノール産生量を経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図９】３９℃で好気環境下における各呼吸欠損変異株のエタノール産生量を経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図１０】３９℃で嫌気環境下における各呼吸欠損変異株の生育度合いを経時的に測定した結果を示すグラフである。
【図１１】３９℃で好気環境下における各呼吸欠損変異株の生育度合いを経時的に測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（呼吸欠損変異株の造成）
本発明者は鋭意検討した結果、好気的な環境下であっても呼吸を行わない又は殆ど行わない呼吸欠損変異株を造成すれば、好気的環境下であってもエタノール発酵能を有するザイモモナス菌を得ることができると考え、ザイモモナス菌の呼吸欠損変異株を造成することによって本発明を完成するに至った。
【００２６】
ただし、遺伝子導入又は遺伝子欠損といった所謂遺伝子組み換え技術を用いて呼吸欠損変異株を造成した場合、当該菌株により生産されたエタノールを食品産業の原料として用いることに様々な障害を伴うことが予想されたため、微生物又はその産生物を利用する食品産業の分野において長年に亘って用いられている突然変異の手法を用いて呼吸欠損変異株を造成した。従って、本発明に係るザイモモナス菌により生産されたエタノールは食品産業用として安全であり、当該エタノールを食品産業用の原料として用いることができる。
【００２７】
しかしながら、突然変異の手法によく用いられる紫外線又は放射線を変異原とした場合、菌体のＤＮＡに作用するため、適宜の致死率であった菌液から生育させた複数のコロニーからランダムに釣菌した多くの株をそれぞれ検査しなければならず、目的とする呼吸欠損変異株を効率的に得ることができない。
【００２８】
そこで本発明にあっては、呼吸欠損変異株を効率的に得るべく、抗生物質耐性株を選択することとした。抗生物質としては蛋白質合成、蛋白質合成の前段階であるＲＮＡ合成を抑制する作用を有するものを１種類、又は複数種類を組み合わせて用いる。これによって、呼吸に関与する呼吸系酵素が変異した菌株を高効率に取得でき、呼吸系酵素が働かない呼吸欠損変異菌株を効率的に得ることができるのである。なお、抗生物質を添加する培地は液体状であっても固体状であってもよい。
【００２９】
ここで、抗生物質としてはストレプトマイシン（Ｓｍ）、カナマイシン（Ｋｍ）、ゲンタマイシン（Ｇｍ）、リファマイシン（Ｒｉｆ）を用いることができるが、本発明はこれらに限られない。
【００３０】
また、親株としては、食品産業用として用いられているザイモモナス菌とする。例えば、ザイモモナス・モビリス  エーティーシーシー２９１９１（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ２９１９１（ＮＢＲＣ１３７５６））を親株とすることができる。
【００３１】
後述する液体基本培地にザイモモナス菌を接種し、３０℃程度の温度で一晩培養する。後述する基本培地に前記抗生物質の１種類又は複数種類を、ザイモモナス菌の最小発育阻害濃度以上の適宜濃度になるように添加した薬剤添加培地を準備しておきこれに、液体の薬剤添加培地の場合はその１／６０程度の容量の培養菌液を接種し、またシャーレに流入させた固体の薬剤添加培地の場合はその表面に１００μＬ程度の培養菌液を広げた後、３０℃程度の環境下で２日から１週間程度静置培養し、生育してきた菌をモノコロニー分離することによって呼吸欠損変異候補株を得る。
【００３２】
このようにして得られた呼吸欠損変異候補株をエタノール及びグルコースを所定量以上含有するストレス培地に接種する。なお、ストレス培地は固形培地とするとよい。ここで、ザイモモナス菌の野生株はエタノールを３容量／容量％以上及び、グルコースを１２質量／容量％以上含有する培地には生育できない。そこで、例えばエタノールを４容量／容量％含み、グルコースを１４質量／容量％含むストレス培地に呼吸欠損変異候補株を接種する。そして、このストレス培地上で、３０℃程度、大気が存在する環境下で５日から３週間程度培養し、生育してきたコロニーを釣菌することによってエタノール高産生候補株を得る。これは、エタノールを産生するための基質たるグルコースとその産生物たるエタノールが共に高い濃度の環境下でも生育する菌株にあっては、エタノール産生能が高い場合が多いと考えられるからである。また、このような操作を大気が存在する環境下で実施することによって、酸素が存在しても高いエタノール産生能を有する株、すなわち呼吸欠損変異株を効率的に得ることができる。
【００３３】
なお、培地中のエタノール濃度は、高圧滅菌した培地が４０℃程度まで冷却したタイミングで当該培地に９５％程度のエタノールを所要量加えることによって調整した。
【００３４】
更に、このようにして得られたエタノール高産生候補株について、抗生物質の濃度をより高くして呼吸欠損変異候補株を得、得られた呼吸欠損変異候補株について、エタノール及び／又はグルコースの濃度がより高いストレス培地を用いてエタノール高産生候補株を得る。更に同様の操作を１又は複数回行ってもよい。
【００３５】
なお、ザイモモナス菌を培養するための基本培地としては、０．５質量／容量％の酵母エキス粉末（例えば和光純薬工業株式会社製）、２質量／容量％のグルコース（例えばシグマ−アルドリッチ社製）の組成の液体培地（ｐＨ５程度）を用い、固体培地の場合はこれに１．５質量／容量％となるように寒天粉末（例えばキシダ化学株式会社製）を添加したものを用いることができる。
【００３６】
なお、本実施形態では、呼吸欠損変異候補株及びエタノール高産生候補株を得るべく３０℃程度で培養を行っているが、本発明はこれに限らずより高温で培養を行ってもよい。
【００３７】
このようにして得られた呼吸欠損変異候補株の変異操作条件を次の表に示す。
【００３８】
【表１】
2012060985.tif 000003
【００３９】
なお、表中ＲＤＭは呼吸欠損変異株（Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｕｔａｎｔｓ）を表している。前述した如く得られた呼吸欠損変異候補株は後述するように全て呼吸欠損変異株であったので表１ではＲＤＭと表記してある。一方、ＬＭは液体培地を、ＳＭは固体培地を、Ｅｔはエタノールを、またＧｌｕはグルコースをそれぞれ表している。
【００４０】
ここで、ザイモモナス菌の野生株の最小発育阻害濃度は、ストレプトマイシン（Ｓｍ）は液体培地では３００μｇ／ｍｌであり、カナマイシン（Ｋｍ）は固体培地では５μｇ／ｍｌであり、ゲンタマイシン（Ｇｍ）は固体培地では１０μｇ／ｍｌであり、リファマイシン（Ｒｉｆ）は液体培地では１０μｇ／ｍｌであり、固体培地では５μｇ／ｍｌである。
【００４１】
前述した親株及び各呼吸欠損変異候補株は、液体基本培地で一晩静置培養して得られた菌液に予め高圧滅菌した８０％グリセロールを最終濃度が２０容量％となるように添加混合し、−８０℃で保存しておくことができる。
【００４２】
（呼吸能）
表１に示した菌株についてそれぞれ呼吸能を評価した。
【００４３】
呼吸能の評価は次のようにして行った。数ｍＬ（例えば３ｍＬ）の液体基本培地が入った試験管（例えば直径１６．５ｍｍ、高さ１６５ｍｍ）内に、前述した如く保存しておいた菌液を適宜量（例えば１００μＬ）投入し、３０℃程度で一晩静置培養する。数十ｍＬ（例えば５０ｍＬ）の液体基本培地が入った三角フラスコ内に、前記培養液を適宜量（例えば０．８ｍＬ）投入し、３０℃程度で一晩静置培養する。
【００４４】
容量が５Ｌのジャーファーメンター（ＴＳＣ―Ａ３（５Ｌ）型：株式会社高杉製作所製）に基本液体培地を適宜量（例えば２Ｌ）投入しておき、三角フラスコで培養した培養液を適宜量（例えば５０ｍＬ）投入し、３００ｒｐｍの回転速度で８時間好気培養し、培地中の溶存酸素をＤＯ電極（TYPE L：エイブル株式会社製）にて経時的に測定した。
【００４５】
図１は各菌株を好気培養した場合の培地中の溶存酸素を経時的に測定した結果を示すグラフであり、図中、縦軸は培地中の溶存酸素を、横軸は好気培養を開始してからの時間をそれぞれ示している。なお、図１中、野生株は前述した親株である。
【００４６】
図１から明らかな如く、いずれの呼吸欠損変異候補株も親株（野生株）の場合より溶存酸素の減少量が低いことが分かる。
【００４７】
次の表２には図１に示した結果から、１分間当たり、菌の１ｍｇ乾燥質量当たりに吸収した酸素量（μｍｏｌ）を求めた結果を示すものである。なお、表２中、ｗｔは親株たる野生株を示している。
【００４８】
【表２】
2012060985.tif 000004
【００４９】
表２から明らかな如く、いずれの呼吸欠損変異候補株も親株に比べて６０％程度から２０％程度しか酸素を取り込んでおらず、呼吸能が低下していた。
【００５０】
特に、ザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４及びザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−８は親株に比べて２０％程度から３０％程度しか酸素を取り込んでいなかった。
【００５１】
これらの結果より、分離された呼吸欠損変異候補株はいずれも呼吸欠損変異株であった。
【００５２】
（エタノール産生能）
次に、各呼吸欠損変異株のエタノール産生能を評価した結果について説明する。
【００５３】
基本培地が３ｍＬ入った複数の試験管（直径１６．５ｍｍ、長さ１６５ｍｍ）に各呼吸欠損変異株の保存菌液を１００μＬずつ添加して３０℃でそれぞれ一晩静置培養した。得られた各培養液を前同様、基本培地が３ｍＬ入った２グループの複数の試験管にそれぞれ添加し、一方のグループは静置培養することによって嫌気環境下で培養し、他方のグループは２２０ｒｐｍの回転速度で振盪培養することによって好気環境下で培養した。なお、いずれのグループも３０℃で培養した。そして、培養を開始してから１８時間経過したときに各試験管内の培地中に含有されているエタノールの量をガスクロマトグラフィー（ＧＣ−２０１４：株式会社島津製作所社製）にて測定した。なお、対照として親株である野生株についても同様の操作を行った。
【００５４】
図２は各呼吸欠損変異株の嫌気環境下での培地中のエタノール含有量を測定した結果を示すヒストグラムである。図中、縦軸は培地中のエタノール（Ethanol）濃度（質量／容量％）を示している。
【００５５】
図２から明らかな如く、嫌気環境下での培地中のエタノール含有量は、いずれの呼吸欠損変異株にあっても親株である野生株と略同程度であった。
【００５６】
なお、前述した如く基本培地に含まれるグルコールは２質量／容量％であるので、培地中のエタノール含有量の理論値は１．０２質量／容量％である。図２に示した如く、いずれの呼吸欠損変異株にあっても９５％程度の理論収率を示している。
【００５７】
図３は各呼吸欠損変異株の好気環境下での培地中のエタノール含有量を測定した結果を示すヒストグラムである。
【００５８】
図３から明らかな如く、好気環境下での培地中のエタノール含有量は、いずれの呼吸欠損変異株にあっても親株である野生株に比べて略３倍高い値であった。
【００５９】
図２及び図３に示した結果より、嫌気環境下及び好気環境下においてグルコース１ｇ当たり産生されたエタノールの量をそれぞれ求めた結果を表３に示す。
【００６０】
【表３】
2012060985.tif 000005
【００６１】
表３から明らかな如く、ザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４，８，９，１１にあっては、嫌気環境下において親株である野生株に比べてグルコース１ｇ当たり産生されたエタノール量が１〜３％程度高いものであった。
【００６２】
これは、嫌気環境下にあっても前述した如き静置培養にあっては僅かながら呼吸が行われているが、ザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４，８，９，１１は図１に示したように呼吸能の欠損の程度が高いので、呼吸によるグルコースの消費が削減され、その結果としてより多くのグルコースがエタノールの産生に利用された為であると考えられる。
【００６３】
このことは、図１及び表２に示した如く、呼吸能の欠損の程度が高い菌株ほどグルコース１ｇ当たり産生されたエタノール量が多いという結果からも首肯される。
【００６４】
以上のように各呼吸欠損変異株は好気環境下において高いエタノール産生能を有している。更に、好気環境下にあっては呼吸能の欠損の程度が高い菌株ほどグルコース１ｇ当たり産生されたエタノール量が多く、特に本発明に係るザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４，８は呼吸能の欠損の程度が他の呼吸欠損変異株より相対的に高く、嫌気環境下においてグルコース１ｇ当たり産生されるエタノール量も他の呼吸欠損変異株より相対的に高いものであった。
【００６５】
これらザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４，８を独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに寄託し、前者にはＮＩＴＥ  Ｐ−９６６、後者にはＮＩＴＥ  Ｐ−９６７の受託番号の付与を受けた。なお、両菌株の寄託日は２０１０年７月２０日であり、受託証の通知日は２０１０年７月２９日である。
【００６６】
ここで、各呼吸欠損変異株の増殖能について検討した結果について説明する。
図４は嫌気環境下における各呼吸欠損変異株の生育度合いを経時的に測定した結果を示すグラフであり、図５は好気環境下における各呼吸欠損変異株の生育度合いを経時的に測定した結果を示すグラフである。両図において縦軸は６６０ｎｍにおける吸光度（Ａ）を、横軸は時間をそれぞれ示している。
【００６７】
培養は図２及び図３で説明した操作と同様に行った。いずれも培養温度は３０℃であり、親株である野生株を対照とした。なお、両図中、黒四角印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４を、黒三角印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−５を、バッテン印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−７を、星印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−８を、黒丸印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−９を、縦棒印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−１１をそれぞれ表している。親株である野生株（ｗｔ）は単に線で示してある。
【００６８】
図４から明らかな如く、嫌気環境下では、いずれの呼吸欠損変異株の増殖速度は親株の増殖速度と略同程度であった。
【００６９】
従って、得られた呼吸欠損変異株にあっては、嫌気環境下では呼吸を欠損することによる増殖能への影響は殆どなかったと判断できる。
【００７０】
一方、図５から明らかな如く、好気環境下では、いずれの呼吸欠損変異株の増殖速度も嫌気環境下での増殖速度と略同程度であったが、親株の増殖速度は明らかに低い結果であった。
【００７１】
特に、ザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４，８にあっては嫌気環境及び好気環境のいずれであっても増殖速度が他の呼吸欠損変異株及び親株の増殖速度より高かった。
【００７２】
次に、各呼吸欠損変異株についてエタノール産生を経時的に検討した結果について説明する。
【００７３】
図６は嫌気環境下における各呼吸欠損変異株のエタノール産生量を経時的に測定した結果を示すグラフであり、図７は好気環境下における各呼吸欠損変異株のエタノール産生量を経時的に測定した結果を示すグラフである。
【００７４】
図２及び図３で説明した操作と同様に行って各呼吸欠損変異株を基本培地で増殖させエタノール産生量を経時的にガスクロマトグラフィーで定量した。いずれも培養温度は３０℃であり、親株である野生株を対照とした。なお、両図中、黒四角印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４を、黒三角印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−５を、バッテン印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−７を、星印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−８を、黒丸印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−９を、縦棒印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−１１をそれぞれ表している。親株である野生株（ｗｔ）は単に線で示してある。
【００７５】
図６及び図４、並びに図７及び図５から明らかな如く、嫌気環境下及び好気環境下において、いずれの呼吸欠損変異株及び親株も、経時的なエタノール産生量は当該菌株の経時的な増殖に略倣う結果であった。
【００７６】
また、前述したようにザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４，８にあっては嫌気環境及び好気環境のいずれであっても増殖速度が他の呼吸欠損変異株及び親株の増殖速度より高いので、エタノールの産生量も他の呼吸欠損変異株及び親株より高いものであった。
【００７７】
前述した如くザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４及びザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−８は親株に比べて２０％程度から３０％程度しか酸素を取り込むことができない呼吸欠損変異株である。しかも、これら呼吸欠損変異株は、微生物又はその産生物を利用する食品産業の分野において永年に亘って用いられている突然変異の手法を用いて造成されている。従って、本発明に係るザイモモナス菌により生産されたエタノールは食品産業用として安全であり、当該エタノールを食品産業用の原料として用いることができる。
【００７８】
また、これらの菌株のエタノール産生能はいずれも、好気環境下では親株のエタノール生産量の略３倍であり、嫌気環境下では親株のエタノール生産量より高いものであった。更に、これらの菌株は、３９℃という高温でも通常の培養温度である３０℃でのエタノール産生量の７０％程度以上のエタノールを産生しており、耐熱性も有している。
【００７９】
このような菌株にあっては、好気的な環境下で取り扱っても、エタノール発酵能が相対的に低いにも拘わらず呼吸能が高いものが優勢となってしまうというような虞が無く、従って、エタノール生産のための本発酵前の各工程を好気環境下で取り扱えるので、各工程の操作を容易に行うことができる。
【００８０】
更に、例えばタンクによる本発酵において適宜に撹拌を行った場合であってもエタノール生産量を高レベルに維持することができるため、エタノール生産量を低下させることなく菌体が沈降することを防止することができ、効率的な発酵を行うことができる。
【００８１】
また、適宜の耐熱性も有するためより高い温度で発酵を行わせることによって、更にエタノール生産性の効率化を実現できる。
【００８２】
（高温耐性能）
次に、各呼吸欠損変異株の高温耐性能について評価した結果について説明する。
図８は３９℃で嫌気環境下における各呼吸欠損変異株のエタノール産生量を経時的に測定した結果を示すグラフであり、図９は３９℃で好気環境下における各呼吸欠損変異株のエタノール産生量を経時的に測定した結果を示すグラフである。
【００８３】
図２及び図３で説明した操作と同様に行って各呼吸欠損変異株を基本培地で増殖させエタノール産生量を経時的にガスクロマトグラフィーで定量した。いずれも培養温度は３９℃であり、親株である野生株を対照とした。なお、両図中、黒四角印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４を、黒三角印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−５を、バッテン印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−７を、星印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−８を、黒丸印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−９を、縦棒印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−１１をそれぞれ表している。親株である野生株（ｗｔ）は単に線で示してある。
【００８４】
図８及び図９から明らかな如く、３９℃の高温で培養した場合、親株は嫌気環境下であっても好気環境下程度の量しかエタノールを産生することができなかった。
【００８５】
これに対して呼吸欠損変異株にあっては、いずれの菌株も嫌気環境下及び好気環境下において親株以上のエタノールを産生していた。
【００８６】
特に、ザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４，８にあっては嫌気環境では他の呼吸欠損変異株より高く、好気環境では他の呼吸欠損変異株より著しく高いものであった。
【００８７】
またこれらの結果と図１に示した呼吸欠損の程度の結果とから、エタノールの産生量と呼吸欠損程度との間には相関関係が存在するという知見が得られた。
【００８８】
かかる高温下での各呼吸欠損変異株の増殖を調べた。
図１０は３９℃で嫌気環境下における各呼吸欠損変異株の生育度合いを経時的に測定した結果を示すグラフであり、図１１は３９℃で好気環境下における各呼吸欠損変異株の生育度合いを経時的に測定した結果を示すグラフである。両図において縦軸は６６０ｎｍにおける吸光度を示している。いずれにあっても経時的に吸光度を測定する以外は前同様の操作を行った。なお、両図中、黒四角印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４を、黒三角印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−５を、バッテン印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−７を、星印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−８を、黒丸印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−９を、縦棒印はザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−１１をそれぞれ表している。親株である野生株（ｗｔ）は単に線で示してある。
【００８９】
図１０及び図１１から明らかな如く、親株は嫌気環境下で僅かに増殖していたが、好気環境下にあっては吸光度が０．２未満と殆ど増殖していなかった。
【００９０】
これに対して呼吸欠損変異株にあっては、いずれの菌株も嫌気環境下及び好気環境下において親株以上増殖していた。
【００９１】
特に、ザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４，８にあっては嫌気環境下及び好気環境下において吸光度が０．４を超える程度まで増殖しており、いずれの環境下において３９℃という高温であっても比較的良好な増殖能を示した。
【００９２】
以上より、ザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４，８にあっては所要の高温耐性を有していることが分かる。
【００９３】
（エタノール生産）
ザイモモナス・モビリス  ＲＤＭ−４，８を用いてエタノールを生産するには次のように行うことができる。
【００９４】
糖質原料としてはグルコースを用いることができるが、それ以外にも天然素材としてサトウキビ、廃糖蜜、甜菜等を用いることができる。また、トウモロコシ、ソルガム、ジャガイモ、サツマイモ、米、麦等に含まれるデンプン、及びスイッチグラス、パルプ廃液、バガス、廃材木、もみ殻・稲藁等に含まれるセルロース等の多糖を分解した分解物を用いることもできる。
【００９５】
サトウキビ及び甜菜等はそれらの搾汁液を用い、廃糖蜜は糖度を調整して用いる。また、デンプン及びセルロース等の多糖は酵素分解又は化学分解により単糖に分解した分解液を用いる。
【００９６】
このような糖質原料に必要に応じてナトリウム、カリウム、マグネシウム等の塩類、酵母抽出物といったビタミン類を適宜添加し、ザイモモナス・モビリス  アールディーエム−フォー（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＲＤＭ−４）（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６６）、又はザイモモナス・モビリス  アールディーエム−エイト（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＲＤＭ−８）（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６７）を単独で、又は両菌株を併用して接種してエタノール発酵を行わせることによってエタノールを生産する。
【００９７】
この場合、エタノール発酵は適宜容量のタンクで行うが、菌体が沈降しない程度の回転速度で撹拌羽根を連続的に、又は断続的に回転させるとよい。これらの菌株は前述したように呼吸欠損変異株であるため、適宜の撹拌を行った場合であってもエタノール生産量を高レベルに維持することができる。従って、エタノール生産量を低下させることなく菌体が沈降することを防止することができ、効率的な発酵を行うことができる。
【００９８】
一方、前述したようにこれらの菌株は耐熱性を有するため、例えばデンプンを６０℃程度で酵素分解した後、分解液の温度が３５℃程度まで低下したタイミングで菌体を接種して発酵を開始し、その温度を維持してエタノール発酵を行わせることができる。
【００９９】
これによって、エタノール生産の効率化を実現できる。
【０１００】
一方、ザイモモナス・モビリス  アールディーエム−フォー（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＲＤＭ−４）（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６６）、又はザイモモナス・モビリス  アールディーエム−エイト（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＲＤＭ−８）（ＮＩＴＥ  Ｐ−９６７）を単独で、又は両菌株を併用して、バイオリアクターで通常用いられている方法を用いて例えばビーズ状に菌体を固定する。そして、固定した菌体と前述した糖質原料とを接触させることによってエタノールを生産することもできる。
【０１０１】
これらの菌株は前述したように好気的な環境下で取り扱っても、エタノール発酵能が相対的に低いにも拘わらず呼吸能が高いものが優勢となってしまうというような虞が無く、従って、エタノール生産のための本発酵前の各工程を好気環境下で取り扱えるので、各工程の操作を容易に行うことができる。
【図１】
2012060985.tif 000006
【図２】
2012060985.tif 000007
【図３】
2012060985.tif 000008
【図４】
2012060985.tif 000009
【図５】
2012060985.tif 000010
【図６】
2012060985.tif 000011
【図７】
2012060985.tif 000012
【図８】
2012060985.tif 000013
【図９】
2012060985.tif 000014
【図１０】
2012060985.tif 000015
【図１１】
2012060985.tif 000016