(57)【要約】【課題】肺がんのリンパ節転移の有無をより高い精度で検査することができる肺がんのリンパ節転移の検査方法、肺がんのリンパ節転移判定装置およびコンピュータプログラムを提供する。【解決手段】肺がん患者から採取された、肺がんの転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された測定試料に含まれるストラティフィンのｍＲＮＡの発現量を取得し、取得したストラティフィンのｍＲＮＡの発現量が過剰である場合に、前記リンパ節組織に肺がんが転移していると判定する。【選択図】図３
2012000031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺がん患者から採取された、肺がんの転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された測定試料に含まれる、ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量を取得し、
取得したストラティフィンのｍＲＮＡの発現量が過剰である場合に、前記リンパ節組織に肺がんが転移していると判定する、肺がんのリンパ節転移の検査方法。
【請求項２】
ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量は、核酸増幅法によって取得される、請求項１に記載の肺がんのリンパ節転移の検査方法。
【請求項３】
核酸増幅法が、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応法、転写増幅法のいずれかである、請求項２に記載の肺がんのリンパ節転移の検査方法。
【請求項４】
ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量は、核酸増幅法による核酸増幅反応のサイクル数に基づく値である、請求項２に記載の肺がんのリンパ節転移の検査方法。
【請求項５】
核酸増幅反応のサイクル数と所定の閾値とを比較し、サイクル数が所定の閾値より小さい場合に、前記リンパ節組織に肺がんが転移していると判定する、請求項４に記載の肺がんのリンパ節転移の検査方法。
【請求項６】
核酸増幅反応のサイクル数が所定の閾値より大きい場合に、前記リンパ節組織に肺がんが転移していないとさらに判定する、請求項５に記載の肺がんのリンパ節転移の検査方法。
【請求項７】
ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量は、核酸増幅法によって算出されたストラティフィンのｍＲＮＡの定量値である、請求項２に記載の肺がんのリンパ節転移の検査方法。
【請求項８】
算出されたストラティフィンのｍＲＮＡの定量値と所定の閾値とを比較し、定量値が所定の閾値より大きい場合に、前記リンパ節組織に肺がんが転移していると判定する、請求項７に記載の肺がんのリンパ節転移の検査方法。
【請求項９】
定量値が所定の閾値より小さい場合に、前記リンパ節組織に肺がんが転移していないとさらに判定する、請求項８に記載の肺がんのリンパ節転移の検査方法。
【請求項１０】
リンパ節組織は、肺に所属するリンパ節を含む組織である、請求項１〜９のいずれかに記載の肺がんのリンパ節転移の検査方法。
【請求項１１】
肺に所属するリンパ節は、上縦上部リンパ節、気管傍リンパ節、気管前リンパ節、前縦隔リンパ節、気管後リンパ節、気管気管支リンパ節、大動脈下リンパ節、大動脈傍リンパ節、気管分岐部リンパ節、食道傍リンパ節、肺靱帯リンパ節などの縦隔リンパ節；主気管支周囲リンパ節、葉気管支間リンパ節、葉気管支周囲リンパ節などの肺門リンパ節；区域気管支周囲リンパ節、亜区域気管支周囲リンパ節のいずれかである、請求項１０に記載の肺がんのリンパ節転移の検査方法。
【請求項１２】
リンパ節組織を用いて調製された測定試料は、肺がんの転移が疑われる組織を前処理液中でホモジナイズして得られた試料である、請求項１〜１１のいずれかに記載の肺がんのリンパ節転移の検査方法。
【請求項１３】
前処理液のｐＨは、２．５〜５．０である、請求項１２に記載の肺がんのリンパ節転移の検査方法。
【請求項１４】
前処理液は、緩衝液を含む、請求項１２または１３のいずれかに記載の肺がんのリンパ節転移の検査方法。
【請求項１５】
前処理液は、界面活性剤を含む、請求項１２〜１４のいずれかに記載の肺がんのリンパ節転移の検査方法。
【請求項１６】
肺がんの転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された測定試料に含まれる、ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量を取得する測定部と、
前記測定部で得られたストラティフィンのｍＲＮＡの発現量が過剰である場合に、前記リンパ節組織に肺がんが転移していると判定する判定部と、
前記判定部で得られた判定結果を出力する出力部と
を備える肺がんのリンパ節転移判定装置。
【請求項１７】
コンピュータに、
肺がんの転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された測定試料に含まれる、ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量を受け取る受領ステップと、
受領ステップで得られたストラティフィンのｍＲＮＡの発現量が過剰である場合に、前記リンパ節組織に肺がんが転移していると判定する判定ステップと、
前記判定ステップで得られた判定結果を出力する出力ステップと、
を実行させるためのコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺がんのリンパ節転移の検査方法、肺がんのリンパ節転移判定装置およびコンピュータプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺がんの診断において、リンパ節転移の有無は、機能温存手術のための切除範囲の決定や術後の化学療法の決定のための有益な情報となる。多くの医療機関などにおいては、かかるリンパ節転移の有無の検査は、リンパ節組織から作製された切片を顕微鏡で観察する組織診によって行なわれている。
しかしながら、組織診は、リンパ節組織中に癌細胞が実際に存在しているときであっても、がん細胞を含まない切断面で作製された切片が用いられた場合や、リンパ節転移が微小転移である場合には、正確な診断結果を得ることができないことがある。
また、組織診は、診断する病理医の熟練度によって、その診断結果にばらつきが生じることがある。
そこで、分子マーカーの発現に基づいて肺がんを検査する方法が提案されている。
【０００３】
例えば、非特許文献１には、肺がんのリンパ節転移の分子マーカーとして、ＴＡＣＳＴＤ１、ＣＫ１９、ＣＥＡなどが記載されている。ここでは、リンパ節組織中において、これら分子マーカーの発現レベルが高まるほど、肺がんがリンパ節に転移している可能性が高まることを用いて、肺がんのリンパ節転移の有無を検査する方法が開示されている。しかしながら、より高い精度で肺がんのリンパ節転移の有無を検査するために、さらなる分子マーカーや方法の開発が望まれている。
【０００４】
一方、ストラティフィン（１４‐３‐３σ）という遺伝子の発現が、がんの抑制に関与しているという報告がある。
例えば、非特許文献２には、乳がんのがん細胞では、正常細胞と比べて、前記ストラティフィンのｍＲＮＡの発現が抑制されていることが開示されている。
また、非特許文献３には、肺がんの原発巣におけるストラティフィンのタンパク質レベルでの発現と、転移リンパ節組織におけるストラティフィンのタンパク質レベルでの発現とを比較すると、ストラティフィンは、肺がんの転移リンパ節組織において、ダウンレギュレーションしていることが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｉｑｉａｎｇ  Ｘｉら、「Ａ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ  Ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ  Ｄｅｔｅｃｔｓ  Ｌｙｍｐｈ  Ｎｏｄｅ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  Ｎｏｎ‐Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年４月１５日、第１２巻、ｐ．２４８４-２４９１
【非特許文献２】Ａｎｎｅ  Ｔ．  Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、「Ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  １４−３−３  σ  ｌｏｃｕｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年５月２３日、第９７巻、ｐ．６０４９−６０５４
【非特許文献３】Ｄａｎ−ｊｕａｎ  Ｌｉら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｎｇ  １４−３−３  ｓｉｇｍａ  ａｓ  ａ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００９年、第２７９巻、ｐ．６５−７３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、肺がんのリンパ節転移の有無をより高い精度で検査することが可能な肺がんのリンパ節転移の検査方法、肺がんのリンパ節転移判定装置およびコンピュータプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述のように、従来、がんの転移リンパ節組織においては、ストラティフィンの発現量が低下していると考えられていた。しかしながら、本発明者らは、肺がんの転移が組織学的に認められたリンパ節（以下、「転移陽性リンパ節」ともいう）および肺がんの転移が組織学的に認められないリンパ節（以下、「転移陰性リンパ節」ともいう）それぞれにおけるｍＲＮＡの発現プロファイルを調べたところ、転移陽性リンパ節におけるストラティフィンのｍＲＮＡ量が転移陰性リンパ節におけるストラティフィンのｍＲＮＡ量よりも多いことを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明の肺がんのリンパ節転移の検査方法は、肺がん患者から採取された、肺がんの転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された測定試料に含まれる、ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量を取得し、
取得したストラティフィンのｍＲＮＡの発現量が過剰である場合に、前記リンパ節組織に肺がんが転移していると判定することを特徴としている。
【０００９】
本発明の肺がんのリンパ節転移判定装置は、肺がんの転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された測定試料に含まれる、ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量を取得する測定部と、前記測定部で得られたストラティフィンのｍＲＮＡの発現量が過剰である場合に、前記リンパ節組織に肺がんが転移していると判定する判定部と、前記判定部で得られた判定結果を出力する出力部とを備えることを特徴とする。
【００１０】
本発明のコンピュータプログラムは、コンピュータに、肺がんの転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された測定試料に含まれる、ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量を受け取る受領ステップと、受領ステップで得られたストラティフィンのｍＲＮＡの発現量が過剰である場合に、前記リンパ節組織に肺がんが転移していると判定する判定ステップと、前記判定ステップで得られた判定結果を出力する出力ステップと、を実行させるためのコンピュータプログラムである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の肺がんのリンパ節転移の検査方法、肺がんのリンパ節転移判定装置およびコンピュータプログラムによれば、肺がんのリンパ節転移の有無をより高い精度で検査することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】肺がんのリンパ節転移の判定を実行する判定装置の一実施形態である。
【図２】肺がんのリンパ節転移判定の一例を示すフローチャートである。
【図３】試験例１において、リンパ節転移の有無およびマーカーの種類とＰＣＲサイクル数との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［１．肺がんのリンパ節転移の検査方法］
本発明の肺がんのリンパ節転移の検査方法（以下、単に、「検査方法」ともいう）は、肺がん患者から採取された、肺がんの転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された測定試料に含まれる、ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量を取得し、取得したストラティフィンのｍＲＮＡの発現量が過剰である場合に、前記リンパ節組織に肺がんが転移していると判定することを特徴としている。
【００１４】
ストラティフィンは、細胞周期をＧ２／Ｍ期で停止させる機能を有すると考えられているタンパク質である。かかるストラティフィンは、１４−３−３σとも称されている。前記ストラティフィンのｍＲＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００６１４２として、米国生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により提供されているデータベースＧｅｎＢａｎｋより入手することができる。なお、前記ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、２０１０年３月１４日時点での最新リリースでの番号である。
【００１５】
［１−１．発現量の取得］
本発明の検査方法では、まず、肺がん患者から採取された、肺がんの転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された測定試料に含まれる、ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量を取得する。
【００１６】
前記測定試料は、ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量の測定に適した試料であればよい。かかる測定試料は、例えば、リンパ節組織に含まれる細胞を適切な前処理液と混合し、得られた混合物中の細胞に対して、化学的処理および／または物理的処理を施すこと、市販のＲＮＡ抽出キットを用いてリンパ節組織に含まれる細胞からＲＮＡを抽出することなどによって得ることができる。前記測定試料の調製は、簡便かつ短時間で測定試料を調製することができることから、前処理液を用いる方法により行なうことが好ましい。
【００１７】
前記リンパ節組織としては、肺に所属するリンパ節を含む組織であればよい。前記リンパ節としては、例えば、上縦上部リンパ節、気管傍リンパ節、気管前リンパ節、前縦隔リンパ節、気管後リンパ節、気管気管支リンパ節、大動脈下リンパ節、大動脈傍リンパ節、気管分岐部リンパ節、食道傍リンパ節、肺靱帯リンパ節などの縦隔リンパ節；主気管支周囲リンパ節、葉気管支間リンパ節、葉気管支周囲リンパ節などの肺門リンパ節；区域気管支周囲リンパ節、亜区域気管支周囲リンパ節などの肺内リンパ節などが挙げられる。これらのリンパ節は、本実施の形態に係る検査方法の適用対象となる患者の状態などに応じて適宜選択することができる。
【００１８】
前処理液は、リンパ節組織に含まれる細胞中のｍＲＮＡを可溶化させることができる溶液であればよい。前記前処理液は、ＲＮＡの分解を抑制する観点から、酸性ｐＨを有することが好ましく、ｐＨ２．５〜ｐＨ５．０を有することが好ましく、ｐＨ３．０〜ｐＨ４．０を有することがより好ましい。かかる前処理液としては、例えば、緩衝液などを含む溶液などが挙げられる。前記緩衝液としては、例えば、グリシン−塩酸緩衝液などが挙げられる。なお、前処理液中の緩衝液の濃度は、前処理液のｐＨを酸性ｐＨに保つことができる範囲であればよく、適宜設定することができる。
【００１９】
また、前処理液は、リンパ節組織に含まれる細胞からのｍＲＮＡの抽出効率を向上させる観点から、界面活性剤をさらに含有していることが好ましい。前記界面活性剤は、リンパ節組織に含まれる細胞の細胞膜や核膜を損傷させ、細胞中の核酸を抽出しやすくすることができるのであれば、特に限定されるものではない。前記界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤などが挙げられる。かかる非イオン性界面活性剤のなかでは、リンパ節組織に含まれる細胞からのｍＲＮＡの抽出効率を向上させる観点から、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が好ましく、式（Ｉ）：
【００２０】
Ｒ1−Ｒ2−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−Ｈ                          （Ｉ）
【００２１】
（式中、Ｒ1は炭素数１０〜２２のアルキル基、炭素数１０〜２２のアルケニル基、炭素数１０〜２２のアルキニル基または炭素数１０〜２２のイソオクチル基を示し、Ｒ2は、酸素原子またはフェニレンオキシ基を示し、ｎは８〜１２０の整数を示す)
で表されるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤がより好ましい。前記ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、特に限定されないが、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクテルフェニルエーテルなどが挙げられる。かかるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（オキシエチレン基の付加モル数２３）（シグマ−アルドリッチ社製、商品名：Ｂｒｉｊ３５）などを用いることができる。前処理液中の界面活性剤の濃度は、リンパ節組織に含まれる細胞からｍＲＮＡを十分に抽出させる観点から、０．１〜６体積％が好ましく、より好ましくは１〜５体積％である。
【００２２】
なお、前記ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量を後述の核酸増幅法によって取得する場合、前処理液は、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」という）を含有することが好ましい。これにより、核酸増幅法に用いられる核酸合成酵素の活性の低下を抑制することができる。しかも、前記核酸合成酵素の反応を阻害する物質（阻害物質）がリンパ節組織中に含まれている場合であっても、当該阻害物質の影響を効果的に低減させることができる。前処理液中のＤＭＳＯの濃度は、かかる効果を十分に発揮させる観点から、１〜５０体積％が好ましく、５〜３０体積％がより好ましく、１０〜２５体積％がさらに好ましい。
【００２３】
測定試料の調製の際に用いる前処理液の量は、前処理液の種類などによって異なるので、前処理液の種類などに応じて適宜設定することできる。通常、測定試料の調製の際に用いる前処理液の量は、リンパ節組織１ｍｇあたり０．０００１〜０．０００５ｍＬである。
リンパ節組織に含まれる細胞と前処理液との混合は、例えば、室温でリンパ節組織に含まれる細胞と前処理液とを撹拌させることにより行なうことができる。
【００２４】
前記化学的処理としては、例えば、界面活性剤などによる細胞の可溶化処理、クロロホルムなどの有機溶媒によるＲＮＡの分離処理などが挙げられる。また、前記物理的処理としては、ホモジナイザーなどを用いた破砕処理、凍結融解処理などが挙げられる。前記化学的処理および／または物理的処理で得られた産物は、必要に応じて、遠心分離、フィルター濾過、カラムクロマトグラフィーなどの精製方法によって精製してもよい。
【００２５】
ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量の取得は、例えば、核酸増幅法、ストラティフィンのｍＲＮＡに対応する核酸が配置されたＤＮＡマイクロアレイを用いたＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション法など公知の方法によって行なうことができる。
【００２６】
なお、本明細書において、前記核酸増幅法によって行なう場合における「ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量」とはストラティフィンのｍＲＮＡの発現量に関するデータであれば特に限定されない。ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量とは、例えば、増幅されたｍＲＮＡに基づく光学的測定値（例えば、蛍光強度、濁度、吸光度など）、前記光学的測定値が所定の基準値に達したときのサイクル数または時間、核酸増幅反応による光学的測定値の変化量が所定の基準値に達した時のサイクル数または時間、前記光学的測定値やサイクル数などと検量線とから算出されたｍＲＮＡの定量値（発現量）などをいう。また、本明細書において、前記ＤＮＡチップを用いる方法によって行なう場合における「ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量に関するデータ」とは、例えば、ＤＮＡチップ上の前記核酸とハイブリダイズしたストラティフィンのｍＲＮＡに基づく蛍光強度、前記蛍光強度と検量線とから算出されたｍＲＮＡの定量値（発現量）などをいう。核酸増幅反応による光学的測定値の変化量とは、核酸増幅反応の１サイクルの反応前後における光学的測定値の変化量をいう。
ここで、前記所定の基準値は、前記データの種類に応じて適宜設定することができる。例えば、前記データがサイクル数である場合、核酸増幅反応が対数増殖を示す時の蛍光強度の変化量を基準値として設定することができる。
【００２７】
前記ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量は、ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量に関するデータなどの取得が容易であることから、核酸増幅法によって取得してもよい。
【００２８】
前記核酸増幅法は、例えば、測定試料と、ストラティフィンのｍＲＮＡ、当該ｍＲＮＡの一部、前記ｍＲＮＡに対応する核酸（例えば、ｃＤＮＡなど）を増幅するためのプライマー対（またはプライマーセット）と、核酸合成酵素とを含む反応液を適切な反応条件下に維持することにより行なうことができる。
【００２９】
前記核酸増幅法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応法、転写増幅法などが挙げられる。前記ポリメラーゼ連鎖反応法としては、例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ）法などが挙げられる。前記鎖置換反応法としては、例えば、定量的ＲＴ−ＬＡＭＰ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＬＡＭＰ）法（例えば、米国特許６４１０２７８号明細書などを参照）などが挙げられる。転写増幅法としては、例えば、ＴＡＳ法などが挙げられる。これらのなかでは、前記データの取得が容易であることから、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法および定量的ＲＴ−ＬＡＭＰ法が好ましい。
【００３０】
前記定量的ＲＴ−ＰＣＲ法としては、ＴａｑＭａｎ法（「ＴａｑＭａｎ」はロシュモレキュラーシステムス社の登録商標である）、インターカレーター〔例えば、商品名：ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（モレキュラー・プローブ・インク（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．）製）〕を用いるインターカレーター法などが挙げられる。前記定量的ＲＴ−ＰＣＲ法においては、核酸の増幅に伴って反応液の光学的状態が変化することから、前記反応液の光学的測定値をリアルタイムに測定することにより、迅速、かつ簡便に前記発現量を取得することができる。
【００３１】
定量的ＲＴ−ＬＡＭＰ法においては、ストラティフィンのｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの増幅に伴って、反応液に含まれる液体成分に対して不溶性であるピロリン酸マグネシウムが生成される。したがって、定量的ＲＴ−ＬＡＭＰ法では、前記ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量に関するデータを、反応液の濁度または吸光度が所定の基準値に達するまでの時間に基づいて算出することができる。
【００３２】
前記プライマー対（またはプライマーセット）に含まれるプライマーは、ストラティフィンのｍＲＮＡの塩基配列に基づいて、核酸増幅法の種類に応じて設計される。核酸増幅法が定量的ＲＴ-ＰＣＲ法である場合、前記プライマー対（またはプライマーセット）としては、特に限定されないが、例えば、配列番号：１に示される塩基配列（5'-GCAGGCCGAACGCTATGA-3'）からなるフォワードプライマーと、配列番号：２に示される塩基配列（5'-GCAGGTTTCGCTCTTCGCA-3'）からなるリバースプライマーとからなるプライマー対などが挙げられる。前記プライマー対（またはプライマーセット）に含まれるプライマーは、前記反応液の光学的測定値の測定が容易であることから、標識物質により標識されていることが好ましい。前記標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位体、蛍光物質、リガンド、色素などが挙げられる。
【００３３】
核酸合成酵素は、核酸増幅法の種類に応じた酵素であればよい。なお、本明細書においては、前記核酸合成酵素とは、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下、「逆転写酵素」という）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下、「ＤＮＡポリメラーゼ」という）、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼなどをいう。核酸増幅法が定量的ＲＴ-ＰＣＲ法である場合、前記核酸合成酵素として、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼが用いられる。前記逆転写酵素としては、例えば、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素などが挙げられる。また、前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。なお、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法では、前記核酸増幅酵素として、逆転写酵素活性およびＤＮＡ合成活性の両方を有する酵素を用いてもよい。
【００３４】
核酸増幅法における反応条件は、核酸増幅法の種類、用いられるプライマー対の種類などによって異なるので、一概には決定することができない。かかる反応条件は、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル第２版〔Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年発行〕などに記載の方法を参照して、核酸増幅法の種類、用いられるプライマー対の種類などに応じて適宜設定することができる。
【００３５】
［１−２．肺がんの転移判定］
つぎに、取得したストラティフィンのｍＲＮＡの発現量が過剰である場合に、前記リンパ節組織に肺がんが転移していると判定する。
【００３６】
ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量が過剰であるか否かは、前記発現量に関するデータと、前記データの種類に応じた閾値とを比較して示すことができる。ここで、「ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量が過剰である」とは、例えば、発現量に関するデータがストラティフィンのｍＲＮＡの発現量が閾値に対応する発現量より大きいことを示すことをいう。例えば、前記データが、核酸増幅反応による蛍光強度の変化量が所定の基準値に達したときのサイクル数である場合、「サイクル数＜閾値」のとき、ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量が過剰であることを意味する。このとき、前記リンパ節組織に肺がんが転移していると判定することができる。そして、「サイクル数＞閾値」のとき、ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量が過剰ではないことを意味する。このとき、前記リンパ節組織に肺がんが転移していないと判定することができる。
また、前記データが、前記ｍＲＮＡの定量値（発現量）である場合、「ｍＲＮＡの定量値（発現量）＞閾値」のとき、ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量が過剰であることを意味する。このとき、前記リンパ節組織に肺がんが転移していると判定することができる。そして、「ｍＲＮＡの定量値（発現量）＜閾値」のとき、ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量が過剰ではないことを意味する。このとき、前記リンパ節組織に肺がんが転移していないと判定することができる。
【００３７】
閾値は、前記発現量に関するデータの種類に応じて、種々の方法によって設定することができる。すなわち、閾値は、肺がんの転移が認められるリンパ節群と転移が認められないリンパ節群とに分類可能な所定の発現量を示す値に経験的に設定することができる。より具体的には、発現量に関するデータがサイクル数である場合、肺がんの転移が組織学的に認められた複数のリンパ節および肺がんの転移が組織学的に認められない複数のリンパ節それぞれについてサイクル数を取得し、リンパ節転移が認められたリンパ節群とリンパ節転移が認められないリンパ節群とを２群に分類するようなサイクル数を閾値として設定することができる。
【００３８】
［２．肺がんのリンパ節転移判定装置］
つぎに、添付図面を参照しつつ、本発明の一実施の形態に係る検査方法を実施するのに好適な装置の一例として、本発明の一実施の形態に係る肺がんのリンパ節転移判定装置（以下、「判定装置」ともいう）について詳細に説明する。
なお、本実施の形態に係る判定装置は、前記ｍＲＮＡの発現量に関するデータとして、蛍光強度の変化量が所定の基準値に達した時のサイクル数を用い、当該サイクル数とサイクル数の閾値とを比較して判定を行なう装置である。
【００３９】
［２−１．判定装置の構成］
図１は、本発明の一実施の形態に係る判定装置１の全体構成を示すブロック図である。
本実施の形態に係る判定装置１は、核酸増幅測定装置１００と、この核酸増幅測定装置１００と接続された情報処理装置２００とから構成されている。
核酸増幅測定装置（測定部）１００は、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法などを行なうことが可能なＰＣＲ装置からなる。この核酸増幅測定装置１００は、ストラティフィンのｍＲＮＡを増幅するとともに、増幅されたｍＲＮＡに基づく蛍光強度と、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法におけるサイクル数とを測定するものである。
この核酸増幅測定装置１００には、情報処理装置（コンピュータ）２００が接続されている。
この情報処理装置２００は、核酸増幅測定装置１００の動作を制御するとともに、この核酸増幅測定装置１００で測定された前記蛍光強度のデータおよび前記サイクル数のデータを用い、リンパ節転移が陽性であるかどうかを判定する。
【００４０】
情報処理装置２００は、情報処理装置本体（判定部）２１０と、必要なデータを情報処理装置本体２１０に入力する入力デバイス２３０と、入出力データなどを表示する表示部（出力部）２２０とを備えている。この情報処理装置２００には、必要に応じて、外部記録媒体２４０が含まれる。
【００４１】
情報処理装置本体２１０は、ＣＰＵ２１０ａと、ＲＯＭ２１０ｂと、ＲＡＭ２１０ｃと、ハードディスク２１０ｄと、読出装置２１０ｅと、入出力インタフェース２１０ｆと、画像出力インタフェース２１０ｈと、バス２１０ｉとを備えている。
情報処理装置本体２１０内において、ＣＰＵ２１０ａ、ＲＯＭ２１０ｂ、ＲＡＭ２１０ｃ、ハードディスク２１０ｄ、読出装置２１０ｅ、入出力インタフェース２１０ｆおよび画像出力インタフェース２１０ｈは、それぞれバス２１０ｉにて、データの送受信可能なように接続されている。
【００４２】
ＣＰＵ２１０ａは、ＲＯＭ２１０ｂに記憶されているコンピュータプログラムおよびＲＡＭ２１０ｃにロードされたコンピュータプログラムを実行することができる。ＲＯＭ２１０ｂには、ＣＰＵ２１０ａによって実行されるコンピュータプログラムおよびＣＰＵ２１０ａがコンピュータプログラムを実行するためのデータなどが記録されている。ＲＡＭ２１０ｃは、ＲＯＭ２１０ｂおよびハードディスク２１０ｄに記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、ＲＡＭ２１０ｃは、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ２１０ａの作業領域として利用される。
ハードディスク２１０ｄには、オペレーティングシステム（ＯＳ）やアプリケーションプログラムなど、ＣＰＵ２１０ａに実行させるための種々のコンピュータプログラムおよびそのコンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
ハードディスク２１０ｄにインストールされているプログラムには、肺がんのリンパ節転移の検査方法を実現するためのアプリケーションプログラム２４０ａおよび核酸増幅測定装置１００を制御するプログラムが含まれている。また、ハードディスク２１０ｄには、肺がんのリンパ節転移の検査方法を実現するためのプログラムの実行に用いるデータとして、閾値などが記憶されている。
【００４３】
読出装置２１０ｅは、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されており、外部記録媒体２４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。なお、アプリケーションプログラム２４０ａは、外部記録媒体２４０に記録されていてもよく、情報処理装置本体２１０内に設けられたＲＯＭ２１０ｂまたはＲＡＭ２１０ｃに保存されていてもよい。
また、ＣＰＵ２１０ａが外部記録媒体２４０から当該アプリケーションプログラム２４０ａを読み出し、アプリケーションプログラム２４０ａをハードディスク２１０ｄにインストールする構成を採用することも可能である。
【００４４】
また、ハードディスク２１０ｄには、例えば、米国マイクロソフト社が製造販売するＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）などのグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。以下の説明においては、上述した判定に係るアプリケーションプログラム２４０ａは、当該オペレーティングシステム上で動作するものとしている。
【００４５】
入出力インタフェース２１０ｆは、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェースおよびＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェースなどから構成されている。入出力インタフェース２１０ｆには、キーボードやマウスなどの入力デバイス２３０が接続されている。また、入出力インタフェース２１０ｆには核酸増幅測定装置１００が接続されている。これにより、情報処理装置本体２１０は、入出力インタフェース２１０ｆを介して核酸増幅測定装置１００とデータの送受信が可能である。
【００４６】
画像出力インタフェース２１０ｈは、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成された表示部２２０に接続されており、ＣＰＵ２１０ａから与えられた画像データに応じた映像信号を表示部２２０に出力する。表示部２２０は、入力された映像信号にしたがって、画像（画面）を表示する。また、表示部２２０は、後述するＣＰＵ２１０ａから与えられた判定結果を表示する。
【００４７】
ここで、上記判定装置１にて実施されるアプリケーションプログラム２４０ａの動作フローの一例について、図２を用いて説明する。
【００４８】
まず、ＣＰＵ２１０ａは、核酸増幅装置１００から入出力インタフェース２１０ｆを介して、核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量のデータおよびサイクル数のデータを受領する（ステップＳ１）。
【００４９】
つぎに、ステップＳ２において、ＣＰＵ２１０ａは、核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量のデータおよびサイクル数のデータに基づき、核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量が基準値０．０８に達したときのサイクル数（サイクル数Ａ）を算出する。
【００５０】
ついで、ステップＳ３において、ＣＰＵ２１０ａは、予めアプリケーションプログラム２４０ａのデータとしてハードディスク２１０ｄに記憶させていたサイクル数の閾値（３１．４サイクル）のデータと、前記サイクル数Ａのデータとを比較する。本ステップＳ３では、前記サイクル数Ａがサイクル数の閾値（３１．４サイクル）よりも小さいかどうかについて、比較判断される。
前記サイクル数Ａが３１．４サイクルよりも小さい場合（Ｙｅｓ）、ＣＰＵ２１０ａは、ステップＳ４−１に処理を進める。一方、サイクル数Ａが３１．４サイクルよりも小さいものではない場合（Ｎｏ）、ＣＰＵ２１０ａは、ステップＳ４−２に処理を進める。
【００５１】
ステップＳ４−１では、ＣＰＵ２１０ａは、リンパ節組織に肺がんが転移している（リンパ節転移陽性）と判定する。また、ステップＳ４−２では、ＣＰＵ２１０ａは、リンパ節組織に肺がんが転移していない（リンパ節転移陰性）と判定する。
【００５２】
その後、ステップＳ５において、ＣＰＵ１１０ａは、上記の判定結果を、ＲＡＭ２１０ｃに格納するとともに画像出力インタフェース２１０ｈを介して、表示部２２０に出力する。
【００５３】
なお、本実施形態において、核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量のデータおよびサイクル数のデータは、核酸増幅測定装置１００から入出力インタフェース２１０ｆを介して取得するようにしていたが、これに限定されるものではなく、核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量のデータおよびサイクル数のデータを入力デバイス２３０により入力し、ＣＰＵ２１０ａがこれら入力された値から核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量が基準値に達したときのサイクル数（サイクル数Ａ）を算出して取得するようにしてもよい。なお、核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量とは、例えば、核酸増幅反応の１サイクルの反応前後における蛍光強度の変化量をいう。
また、本実施形態において、核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量が基準値に達したときのサイクル数（サイクル数Ａ）は、ＣＰＵ２１０ａが核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量のデータおよびサイクル数のデータから算出して取得するようにしているが、これに限定されるものではなく、核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量が基準値に達したときのサイクル数（サイクル数Ａ）を入力デバイス２３０により入力して取得するようにしてもよい。
【００５４】
なお、本実施形態において、ＣＰＵ２１０ａは、核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量のデータおよびサイクル数のデータに基づき、核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量が基準値に達したときのサイクル数を算出しているが、これに限定されるものではなく、蛍光強度やサイクル数などと検量線とからストラティフィンのｍＲＮＡの定量値を算出するようにしてもよい。この場合、ステップＳ３において、前記定量値が所定の閾値よりも大きい場合にステップＳ４−１に処理を進め、定量値が所定の閾値よりも小さい場合にステップＳ４−２に処理を進めるようにすることができる。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５６】
（調製例１）
肺がんの転移が組織学的に認められた１５個のリンパ節〔陽性検体（転移陽性リンパ節）１〜１５〕および肺がんの転移が組織学的に認められない２０個のリンパ節〔陰性検体（転移陰性リンパ節）１〜２０〕を用いて、下記のようにして測定試料を調製した。陽性検体１〜１５それぞれのリンパ節の部位および名称を表１に、陰性検体１〜２０それぞれのリンパ節の部位および名称を表２に示す。
【００５７】
【表１】
2012000031.tif 000003
【００５８】
【表２】
2012000031.tif 000004
【００５９】
まず、前記リンパ節（約３０〜３７０ｍｇ／個）に可溶化液［組成：２００ｍＭグリシン−塩酸（ｐＨ３．４）、５体積％ポリオキシエチレンラウリルエーテル（オキシエチレン基の付加モル数２３）（シグマ−アルドリッチ社製、商品名：Ｂｒｉｊ３５）、２０体積％ジメチルスルホキシドおよび０．０５体積％消泡剤〔信越化学工業（株）製、商品名：ＫＳ−５３８〕］４ｍＬを添加した。つぎに、ブレンダーで前記リンパ節をホモジナイズした。得られたホモジネートを、室温で１００００×ｇ、１分間遠心分離し、上清を得た。その後、ＲＮＡ抽出・精製用キット（キアゲン社製、商品名：ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット、カタログ番号７４０１４）を用いて、前記上清４００μＬからＲＮＡを抽出・精製してＲＮＡ溶液６０μＬを得た。得られた各ＲＮＡ溶液について、波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。得られたＲＮＡ溶液を測定試料として用いた。
【００６０】
（試験例１）
調製例１で得られた各測定試料と、ストラティフィン用プライマー対と、定量ＲＴ−ＰＣＲキット（キアゲン社製、商品名：Ｑｕａｎｔｉ  Ｔｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲキット、カタログ番号２０４２４５）とを用い、リアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオシステムズ社製、商品名：ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７５００）でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を行ない、各測定試料について、増幅産物に基づく蛍光強度の変化量が基準値に達したときのＰＣＲサイクル数を決定した。得られたＰＣＲサイクル数を、測定試料におけるストラティフィンのｍＲＮＡの発現量の指標として用いた（実施例１）。
【００６１】
また、ストラティフィン用プライマー対の代わりに、ＣＥＡ用プライマー対（比較例１）またはＴＡＣＳＴＤ１用プライマー対（比較例２）を用いたことを除き、前記と同様に操作を行ない、各測定試料について、増幅産物に基づく蛍光強度の変化量が基準値に達したときのＰＣＲサイクル数を決定した。ＣＥＡおよびＴＡＣＳＴＤ１は、いずれも、肺がんのリンパ節転移に対する既知の分子マーカーである。
【００６２】
なお、対照として、ストラティフィン用プライマー対の代わりに、β−アクチン用プライマー対を用いたことを除き、前記と同様に操作を行ない、各測定試料について、増幅産物に基づく蛍光強度の変化量が基準値に達したときのＰＣＲサイクル数を決定した。
【００６３】
また、実施例１、比較例１および２それぞれについて、陽性検体の測定試料を用いたときのＰＣＲサイクル数の最小値と陰性検体の測定試料におけるＰＣＲサイクル数の最大値との間の差（陽性検体と陰性検体と間のＰＣＲサイクル数の差）を算出した。
【００６４】
ストラティフィンのｍＲＮＡを増幅する場合における蛍光強度の変化量の基準値は０．０８、ＣＥＡのｍＲＮＡを増幅する場合における基準値は０．０２、ＴＡＣＳＴＤ１のｍＲＮＡを増幅する場合における基準値は０．０２である。なお、これらの基準値は、ストラティフィンのｍＲＮＡ、ＣＥＡのｍＲＮＡおよびＴＡＣＳＴＤ１のｍＲＮＡそれぞれにおける核酸増幅反応において、核酸増幅反応が対数増殖期にあるときの蛍光強度の変化量である。また、これら基準値は、単位鎖長あたりの蛍光強度の変化量に換算したとき、ほぼ同じ値になるように設定している。
【００６５】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で用いたプライマー対を表３に、反応液の組成を表４に示す。
【００６６】
【表３】
2012000031.tif 000005
【００６７】
【表４】
2012000031.tif 000006
【００６８】
また、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法におけるサーマルプロファイルは、５０℃で３０分間の保温および９５℃で１０分間の保温後、９４℃で１５秒間の変性と５３℃で３０秒間のアニーリングと７２℃３０秒間の伸長とを１サイクルとする４０サイクルの反応である。
【００６９】
試験例１において、リンパ節転移の有無およびマーカーの種類とＰＣＲサイクル数との関係を図３に示す。図中、「ＰＣＲサイクル数」は、陽性検体の測定試料または陰性検体の測定試料を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法において、増幅産物に基づく蛍光強度の変化量が各基準値に達したときのサイクル数である。また、図３中、「＋」は陽性検体の測定試料を用いたときのＰＣＲサイクル数、「−」は陰性検体の測定試料を用いたときのＰＣＲサイクル数を示す。
【００７０】
図３に示された結果から、分子マーカーとしてストラティフィンを用いた場合（実施例１）の陽性検体と陰性検体と間のＰＣＲサイクル数の差は、ＣＥＡ（比較例１）やＴＡＣＳＴＤ１（比較例２）を用いた場合の陽性検体と陰性検体と間のＰＣＲサイクル数の差と比べて大きいことがわかる。かかる結果から、陽性検体と陰性検体との間におけるストラティフィンのｍＲＮＡの発現量の差は、陽性検体と陰性検体との間におけるＣＥＡまたはＴＡＣＳＴＤ１のｍＲＮＡの発現量の差と比べて大きいことがわかる。また、陽性検体と陰性検体との間におけるストラティフィンのｍＲＮＡの発現量の差が大きいことから、肺がんのリンパ節転移陽性検体と陰性検体とを区別するための閾値が設定しやすいと考えられる。したがって、ストラティフィンによれば、ＣＥＡやＴＡＣＳＴＤ１と比べて、陽性検体と陰性検体とを明確に区別化することができることから、リンパ節組織への肺がんの転移の有無を高い精度で検査することができることが示唆される。
【００７１】
さらに、図３に示された結果から、ストラティフィンを用いた場合の陽性検体間および陰性検体間それぞれにおけるＰＣＲサイクル数のばらつきの範囲は、ＣＥＡを用いた場合よりも小さいことがわかる。かかる結果から、陽性検体間および陰性検体間それぞれにおけるストラティフィンのｍＲＮＡの発現量のばらつきは、陽性検体間および陰性検体間それぞれにおけるＣＥＡのｍＲＮＡの発現量のばらつきと比べて小さいことがわかる。そのため、肺がんのリンパ節転移の検査に際して、分子マーカーとしてストラティフィンを用いた場合、検体における当該ストラティフィンのｍＲＮＡの発現量に関する情報に基づいて、当該検体を陽性検体または陰性検体に容易に分類することができると考えられる。
【００７２】
以上の結果から、ストラティフィンによれば、既知の分子マーカーであるＣＥＡやＴＡＣＳＴＤ１と比べて、肺がんのリンパ節転移を高い精度で検査することができることが示唆される。
【符号の説明】
【００７３】
１    判定装置
１００    核酸増幅測定装置
２００    情報処理装置（コンピュータ）
２１０    情報処理装置本体
２２０    表示部
２３０    入力デバイス
２４０    外部記録媒体
２１０ａ  ＣＰＵ
２１０ｂ  ＲＯＭ
２１０ｃ  ＲＡＭ
２１０ｄ  ハードディスク
２１０ｅ  読出装置
２１０ｆ  入出力インタフェース
２１０ｈ  画像出力インタフェース
２１０ｉ  バス
２４０ａ  アプリケーションプログラム
【配列表フリーテキスト】
【００７４】
配列番号：１は、ストラティフィン用フォワードプライマーの配列である。
配列番号：２は、ストラティフィン用リバースプライマーの配列である。
配列番号：３は、ＣＥＡ用フォワードプライマーの配列である。
配列番号：４は、ＣＥＡ用リバースプライマーの配列である。
配列番号：５は、ＴＡＣＳＴＤ１用フォワードプライマーの配列である。
配列番号：６は、ＴＡＣＳＴＤ１用リバースプライマーの配列である。
配列番号：７は、β−アクチン用フォワードプライマーの配列である。
配列番号：８は、β−アクチン用リバースプライマーの配列である。
【図１】
2012000031.tif 000007
【図２】
2012000031.tif 000008
【図３】
2012000031.tif 000009
【配列表】
2012000031000001.app