(57)【要約】【課題】マイクロＲＮＡ等の低分子核酸を高感度且つ簡便に検出することができる、核酸の検出方法及び検出用キットを提供する。【解決手段】第１の核酸プローブ、第２の核酸プローブ、及び互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブを含む、標的核酸の検出に用いられる検出用キットであって、前記第１の核酸プローブは、標的核酸に相補的な第１の塩基配列及び前記第２の核酸プローブに相補的な第２の塩基配列を有し且つ該第１の塩基配列と該第２の塩基配列が隣接してなり、前記第２の核酸プローブは、前記複数種のシグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有するようにした。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）標的核酸、該標的核酸に相補的な第１の塩基配列と第２の塩基配列とを有する第１の核酸プローブ、及び該第１の核酸プローブの第２の塩基配列に相補的な塩基配列を有する第２の核酸プローブを反応させ、該標的核酸、該第１の核酸プローブ及び該第２の核酸プローブを含む複合体を形成させる工程；
（ｂ）前記複合体に対し、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブを添加し、前記複合体と結合したプローブポリマーを形成させる工程；及び
（ｃ）前記プローブポリマーを検出する工程；を含み、
前記第１の核酸プローブの前記第１の塩基配列と前記第２の塩基配列は隣接してなり、
前記第２の核酸プローブは、前記複数種のシグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有することを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項２】
前記第１の核酸プローブが、担体に固定されているか担体に固定可能な部分が導入されていることを特徴とする請求項１記載の標的核酸の検出方法。
【請求項３】
前記複数種のシグナル増幅用プローブの少なくとも１つが標識物質で標識されてなることを特徴とする請求項１又は２記載の標的核酸の検出方法。
【請求項４】
前記複数種のシグナル増幅用プローブが第１のシグナル増幅用プローブと第２のシグナル増幅用プローブとからなり、
該第１のシグナル増幅用プローブが３箇所以上の核酸領域を含み、且つ５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、
該第２のシグナル増幅用プローブが３箇所以上の核酸領域を含み、且つ５’端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の標的核酸の検出方法。
【請求項５】
前記標的核酸がマイクロＲＮＡであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の標的核酸の検出方法。
【請求項６】
第１の核酸プローブ、第２の核酸プローブ、及び互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブを含む、標的核酸の検出に用いられる検出用キットであって、
前記第１の核酸プローブは、標的核酸に相補的な第１の塩基配列及び前記第２の核酸プローブに相補的な第２の塩基配列を有し且つ該第１の塩基配列と該第２の塩基配列が隣接してなり、
前記第２の核酸プローブは、前記複数種のシグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有することを特徴とする検出用キット。
【請求項７】
前記第１の核酸プローブが、担体に固定されているか担体に固定可能な部分が導入されていることを特徴とする請求項６記載の検出用キット。
【請求項８】
前記複数種のシグナル増幅用プローブの少なくとも１つが標識物質で標識されてなることを特徴とする請求項６又は７記載の検出用キット。
【請求項９】
前記複数種のシグナル増幅用プローブが第１のシグナル増幅用プローブと第２のシグナル増幅用プローブとからなり、
該第１のシグナル増幅用プローブが３箇所以上の核酸領域を含み、且つ５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、
該第２のシグナル増幅用プローブが３箇所以上の核酸領域を含み、且つ５’端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項記載の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロＲＮＡ等の低分子核酸を高感度且つ簡便に検出することができる、核酸の検出方法及び検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（microRNA、miRNA）はヒトを含む様々な真核生物で転写されている低分子ＲＮＡの一種である。ゲノム上の非遺伝子領域やイントロン部分から一次転写産物（pri-miRNA）として転写され、プロセッシングにより、ヘアピン構造のマイクロＲＮＡ前駆体（pre-miRNA）を生成した後、２２塩基程度の成熟型のマイクロＲＮＡ（mature-miRNA）となる（非特許文献１）。このマイクロＲＮＡは、転写されたｍＲＮＡからたんぱく質への翻訳過程における調節因子として働いていることが明らかにされた（非特許文献２）。現在、ヒトゲノム上には８００種以上のマイクロＲＮＡが存在すると予想されているが（非特許文献３）、その調節機能の対象となるｍＲＮＡが同定されていないものも多い。
【０００３】
しかしこれまでの研究から、多くのマイクロＲＮＡが多細胞生物の発生や分化、細胞増殖などに関与している遺伝子の発現調節を行っていることが明らかになっている（非特許文献４）。また、細胞のがん化やがん抑制機構において機能していると考えられるマイクロＲＮＡも報告され、それらはがん細胞内での発現量が正常細胞と比較して増加もしくは減少しているものも多い（非特許文献５）。そこで、将来的にはマイクロＲＮＡの発現量を調べることで、その細胞や組織のがん化についてのプロファイリングを行うことも可能になると考えられ、今後は細胞や組織でのマイクロＲＮＡの同定、定量を行うことが癌の診断にとって重要な項目のひとつとなると予期される。
【０００４】
これまでにマイクロＲＮＡ検出方法として、ノーザン・ブロット法（非特許文献６）、プライマー伸長法（非特許文献７及び８）、インベーダー法（非特許文献９）、リボザイムのシグナル増幅法（非特許文献１０）、mirMASAビーズベースの技術（非特許文献１１）、ビーズベースのフロー・サイトメトリー（非特許文献１２）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（非特許文献１３及び１４）、マイクロアレイ（非特許文献１５）等が報告されており、金粒子を用いたラベル方法（非特許文献１６）が試みられている。また研究用試薬として、ＲＮアーゼプロテクションアッセイを用いたキットも発売されている（非特許文献１７）。
【０００５】
しかしながら、上記の方法は、感度が充分でない（ノーザン・ブロット法）、標的となるマイクロＲＮＡ前駆体をＰＣＲによって増幅させる必要がある（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ等）、検出までに時間がかかり操作が煩雑である（ビーズベースのフロー・サイトメトリー）、多種の標的核酸を同時に解析するのが難しい（プライマー伸長法）等の問題点がある。
【０００６】
一方、特許文献１〜４は、酵素を使用しない新規な等温でのシグナル増幅方法を開示している。この方法は、互いに相補的塩基配列領域を保持させた複数種のオリゴヌクレオチド・プローブを自己集合反応させてプローブ同士の集合体（プローブポリマー）を形成させる方法であり、該ポリマーを定量することにより、試料中の標的核酸の検出に応用するものである。この方法は、例えば、使用するプローブの相補的塩基配列領域の１箇所を試料中の標的核酸と相補的塩基配列とすることにより、該プローブと標的核酸とを結合させてからプローブのポリマーを形成させることにより標的核酸を有効に検出する方法であって、パルサー（ＰＡＬＳＡＲ）法と呼ばれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３２６７５７６号公報
【特許文献２】特許第３３１０６６２号公報
【特許文献３】国際公開第０２／３１１９２号パンフレット
【特許文献４】特開２００２−３５５０８１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kim VN, Nam JW. Genomics of microRNA. Trends Genet. 2006 Mar; 22(3):165-73.
【非特許文献２】Sontheimer, E., J. Assembly and function of RNA silencing complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2005 Feb; 6 127-138
【非特許文献３】Bentwich I, Avniel A, Karov Y, Aharonov R, Gilad S, Barad O, Barzilai A, Einat P, Einav U, Meiri E, Sharon E, Spector Y, Bentwich Z. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 2005 Jul; 37(7):766-70
【非特許文献４】Alvarez-Garcia I, Miska EA. MicroRNA functions in animal development and human disease. Development. 2005 Nov; 132(21):4653-62.
【非特許文献５】Esquela-Kerscher A, Slack FJ. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nat Rev Cancer. 2006 Apr; 6(4):259-269
【非特許文献６】Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., and Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 2003 Feb; 9(2):175-179.
【非特許文献７】Zeng, Y. and Cullen, B.R. Sequence requirements for micro RNA processing and function in human cells. RNA. 2003 Jan; 9(1):112-123.
【非特許文献８】Raymond CK, Roberts BS, Garrett-Engele P, Lim LP, Johnson JM. Simple, quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA. 2005 Nov; 11:1737-1744
【非特許文献９】Allawi, H.T., Dahlberg, J.E., Olson, S., Lund, E., Olson, M., Ma, W.P., Takova, T., Neri, B.P., and Lyamichev, V.I. Quantitation of microRNAs using a modified Invader assay. RNA. 2004 Jul; 10(7):1153-1161.
【非特許文献１０】Hartig, J.S., Grune, I., Najafi-Shoushtari, S.H., and Famulok, M. Sequence-specific detection of MicroRNAs by signal-amplifying ribozymes. J. Am. Chem. Soc. 2004 Jan 28; 126(3): 722-723.
【非特許文献１１】Barad O, Meiri E, Avniel A, Aharonov R, Barzilai A, Bentwich I, Einav U, Gilad S, Hurban P, Karov Y, Lobenhofer EK, Sharon E, Shiboleth YM, Shtutman M, Bentwich Z, Einat P. MicroRNA expression detected by oligonucleotide microarrays: system establishment and expression profiling in human tissues. Genome Res. 2004 Dec; 14(12):2486-94.
【非特許文献１２】Lu J, Getz G, Miska EA, Alvarez-Saavedra E, Lamb J, Peck D, Sweet-Cordero A, Ebert BL, Mak RH, Ferrando AA, Downing JR, Jacks T, Horvitz HR, Golub TR. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 2005 Jun 9; 435(7043):834-8
【非特許文献１３】Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, Barbisin M, Xu NL, Mahuvakar VR, Andersen MR, Lao KQ, Livak KJ, Guegler KJ. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2005 Nov 27; 33(20):e179.
【非特許文献１４】Tang F, Hajkova P, Barton SC, Lao K, Surani MA. MicroRNA expression profiling of single whole embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 2006 Jan 24; 34(2):e9.
【非特許文献１５】Liu CG, Calin GA, Meloon B, Gamliel N, Sevignani C, Ferracin M, Dumitru CD, Shimizu M, Zupo S, Dono M, Alder H, Bullrich F, Negrini M, Croce CM. An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jan 29; 101(26):9740-4.
【非特許文献１６】Liang RQ, Li W, Li Y, Tan CY, Li JX, Jin YX, Ruan KC. An oligonucleotide microarray for microRNA expression analysis based on labeling RNA with quantum dot and nanogold probe. Nucleic Acids Res. 2005 Jan 31; 33(2):e17.
【非特許文献１７】mirVana miRNA Detection kit (Ambion Inc.)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、マイクロＲＮＡ等の低分子核酸を高感度且つ簡便に検出することができる、核酸の検出方法及び検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を行った結果、驚くべきことに、パルサー法において用いられるシグナル増幅用プローブと、標的核酸に相補的な配列を有する第１の核酸プローブと、該第１の核酸プローブに相補的な配列を有し標的核酸と隣接する状態で第１の核酸プローブと結合可能であり且つシグナル増幅用プローブの一つと結合可能な第２の核酸プローブを用いて試料中の標的核酸を検出することにより、試料中に標的核酸が存在する場合は、シグナル増幅用プローブの自己集合反応により形成されたプローブポリマーが、標的核酸と第１の核酸プローブと第２の核酸プローブとを含む複合体に結合した状態で検出されるが、試料中に標的核酸が存在しない場合は、第２の核酸プローブが第１の核酸プローブから解離し、複合体に結合したプローブポリマーは検出されないことを見出した。
【００１１】
即ち、本発明の標的核酸の検出方法は、（ａ）標的核酸、該標的核酸に相補的な第１の塩基配列と第２の塩基配列とを有する第１の核酸プローブ、及び該第１の核酸プローブの第２の塩基配列に相補的な塩基配列を有する第２の核酸プローブを反応させ、該標的核酸、該第１の核酸プローブ及び該第２の核酸プローブを含む複合体を形成させる工程；（ｂ）前記複合体に対し、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブを添加し、前記複合体と結合したプローブポリマーを形成させる工程；及び（ｃ）前記プローブポリマーを検出する工程；を含み、前記第１の核酸プローブの前記第１の塩基配列と前記第２の塩基配列は隣接してなり、前記第２の核酸プローブは、前記複数種のシグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有することを特徴とする。
【００１２】
前記第１の核酸プローブが、担体に固定されているか担体に固定可能な部分が導入されていることが好ましい。
【００１３】
前記複数種のシグナル増幅用プローブの少なくとも１つが標識物質で標識されてなることが好ましい。
【００１４】
前記複数種のシグナル増幅用プローブが第１のシグナル増幅用プローブと第２のシグナル増幅用プローブとからなり、該第１のシグナル増幅用プローブが３箇所以上の核酸領域を含み、且つ５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、該第２のシグナル増幅用プローブが３箇所以上の核酸領域を含み、且つ５’端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであることが好適である。
【００１５】
本発明の標的核酸の検出方法により、標的核酸としてマイクロＲＮＡ等の低分子核酸の検出も可能である。
【００１６】
本発明の検出用キットは、第１の核酸プローブ、第２の核酸プローブ、及び互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し自己集合反応によるプローブポリマーの形成が可能な複数種のシグナル増幅用プローブを含む、標的核酸の検出に用いられる検出用キットであって、前記第１の核酸プローブは、標的核酸に相補的な第１の塩基配列及び前記第２の核酸プローブに相補的な第２の塩基配列を有し且つ該第１の塩基配列と該第２の塩基配列が隣接してなり、前記第２の核酸プローブは、前記複数種のシグナル増幅用プローブ中の１つのシグナル増幅用プローブの一部又は全てと同じ塩基配列を有することを特徴とする。
【００１７】
前記第１の核酸プローブが、担体に固定されているか担体に固定可能な部分が導入されていることが好ましい。
【００１８】
前記複数種のシグナル増幅用プローブの少なくとも１つが標識物質で標識されてなることが好ましい。
【００１９】
前記複数種のシグナル増幅用プローブが第１のシグナル増幅用プローブと第２のシグナル増幅用プローブとからなり、該第１のシグナル増幅用プローブが３箇所以上の核酸領域を含み、且つ５’端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚを含む核酸プローブであり、該第２のシグナル増幅用プローブが３箇所以上の核酸領域を含み、且つ５’端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ’、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ’及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ’を含む核酸プローブであることが好適である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、標的核酸を高感度且つ簡便に検出することができる。本発明によれば、低分子核酸や少量の核酸分子を直接標的核酸として使用することが可能であり、逆転写反応やＰＣＲを用いた増幅が不要であり、操作が簡便であり、比較的短時間で測定できるという甚大な効果を奏する。さらに、本発明によれば、複数の標的核酸の同時検出も可能である。本発明は、マイクロＲＮＡや少量のＲＮＡ分子の検出に特に著しい効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】標的核酸及び本発明に用いられる核酸プローブ及びシグナル増幅用プローブの第１の例を示す概略説明図であり、（ａ）は標的核酸、（ｂ）は第１の核酸プローブ、（ｃ）は第２の核酸プローブ、及び（ｄ）はシグナル増幅用プローブをそれぞれ示す。
【図２】本発明の標的核酸の検出方法の一例を示す概略説明図であり、試料中に標的核酸が存在する場合の工程（ａ）の概略説明図である。
【図３】本発明の標的核酸の検出方法の一例を示す概略説明図であり、試料中に標的核酸が存在する場合の工程（ｂ）の概略説明図である。
【図４】本発明の標的核酸の検出方法の一例を示す概略説明図であり、試料中に標的核酸が存在しない場合の工程（ｂ）の概略説明図である。
【図５】本発明に用いられる核酸プローブ及びシグナル増幅用プローブの第２の例を示す概略説明図であり、（ａ）は第１の核酸プローブ、（ｂ）は第２の核酸プローブ、及び（ｃ）はシグナル増幅用プローブをそれぞれ示す。
【図６】本発明に用いられる核酸プローブ及びシグナル増幅用プローブの第３の例を示す概略説明図であり、（ａ）は第１の核酸プローブ、（ｂ）は第２の核酸プローブ、及び（ｃ）はシグナル増幅用プローブをそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。
【００２３】
本発明は、第１の核酸プローブ、第２の核酸プローブ、及び複数種のシグナル増幅用プローブを用いて、試料中の標的核酸の存在を検出するものである。
図１は、標的核酸及び本発明に用いられる核酸プローブ及びシグナル増幅用プローブの第１の例を示す概略説明図である。図２〜図４は、本発明の標的核酸の検出方法の一例を示す概略説明図であり、図１記載の核酸プローブ及びシグナル増幅用プローブを用いた例を示した。図１において、（ａ）は標的核酸１０、（ｂ）は第１の核酸プローブ１２ａ、（ｃ）は第２の核酸プローブ１４ａ、並びに（ｄ）はシグナル増幅用プローブ１６をそれぞれ示す。
【００２４】
本発明方法に用いられる複数種のシグナル増幅用プローブは、互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し、自ら自己集合して集合体（プローブポリマー）を形成することができるものであり、例えば、特許文献１〜４記載のオリゴヌクレオチド・プローブが用いられる。
【００２５】
前記複数種のシグナル増幅用プローブとしては、例えば、図１（ｄ）に示した如く、５’端部から順に核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられ、下記化学式（１）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなるプローブ（符号１６ａ，ＨＣＰ−１と称する）と、５’端部から順に核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙ’及び核酸領域Ｚ’が設けられ、下記化学式（２）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなるプローブ（符号１６ｂ，ＨＣＰ−２と称する）と、からなる一対のプローブ（ＨＣＰと称する）が好適である。
【化１】
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【化２】
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【００２６】
前記化学式（１）及び（２）において、核酸領域Ｘと核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙと核酸領域Ｙ’、核酸領域Ｚと核酸領域Ｚ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的領域であり、前記第１及び第２プローブをハイブリダイズさせることにより、下記化学式（３）に示されるポリマーを形成することができる。
【化３】
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【００２７】
また、前記複数種のシグナル増幅用プローブとして、下記化学式（４）及び化学式（５）で示される第１及び第２ダイマープローブを使用することが好適である。各ダイマープローブは化学式（６）及び化学式（７）のヌクレオチドをハイブリダイズすることにより作製される。
【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【００２８】
ここで、核酸領域ＡとＡ’、ＢとＢ’、ＣとＣ’、ＤとＤ’、ＥとＥ’、ＦとＦ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的領域であり、前記第１及び第２ダイマープローブをハイブリダイズさせることにより、前記化学式（３）に示されるポリマーを形成することができる。
【００２９】
また、ダイマープローブとして、前記化学式（５）の構造を有するダイマープローブの代わりに下記化学式（８）の構造を有するダイマープローブを用いることもできる。
【化８】
2012070635.tif 000010
【００３０】
また、前記複数種のシグナル増幅用プローブとして、下記化学式（９）に示される第１ダイマープローブと下記化学式（１０）に示される２本のオリゴヌクレオチドである架橋プローブを使用することが好ましい。
【化９】
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【化１０】
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【００３１】
ここで、核酸領域ＡとＡ’、ＢとＢ’、ＣとＣ’、ＤとＤ’、ＥとＥ’、ＦとＦ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的領域であり、前記第１ダイマープローブ及び架橋プローブをハイブリダイズさせることにより、前記化学式（１２）に示されるポリマーを形成することができる。
【化１１】
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【００３２】
また、架橋プローブとして、前記化学式（１０）の構造を有するヌクレオチドの代わりに下記化学式（１２）の構造を有する２本のヌクレオチドを用いることもできる。
【化１２】
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【００３３】
上記に加え、例えば相補的塩基配列領域の数が４箇所でも５箇所でもポリマーの形成は可能であり（特許文献１〜４）、またダイマープローブは２種類を使用しているが、相補的塩基配列領域の位置関係を工夫すれば、さらに多種類のダイマープローブを使用することもできる（特許文献３）。このように、使用するプローブは、上記に記載のプローブの他にも相補的塩基配列領域の配置を工夫することによって他の種類のプローブも使用可能であり、自己集合するポリマーを形成するのであれば本発明に含まれる。
【００３４】
前記シグナル増幅用プローブの各相補的塩基配列領域の長さは、塩基数にして、少なくとも５塩基であり、好ましくは少なくとも８塩基、さらに好ましくは１０塩基〜１００塩基、さらに好ましくは１２〜３０塩基である。また、それぞれのプローブにおける相補的塩基配列領域の長さは同じであることが望ましい。
【００３５】
図１〜図４では、複数種のシグナル増幅用プローブ１６として、一対のＨＣＰ［符号１６ａ：ＨＣＰ−１（核酸領域ＸＹＺ）、符号１６ｂ：ＨＣＰ−２（核酸領域Ｘ’Ｙ’Ｚ’）］を用いた場合の例を示した。
【００３６】
前記複数種のシグナル増幅用プローブ１６は、標識物質で標識されたものを用いることが好ましい。前記標識物質としては、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素等が好適な例として挙げられる。
【００３７】
図１（ａ）において、符号１０は標的核酸であり、標的配列Ｔを含む。本発明において、標的核酸の種類は特に限定されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ｒＲＮＡ，ｎｃＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ，ｓｎoＲＮＡなど）、その他の核酸が使用可能である。標的核酸及び標的核酸の標的配列の長さも特に限定されず、マイクロＲＮＡ等の低分子核酸の検出も可能である。また、同時に多種の核酸分子を検出することも出来る。なお、図１では標的核酸１０の全配列を標的配列Ｔとした例を示したが、本発明はこれに限定されず、標的核酸の一部の配列を標的配列としてもよい。
【００３８】
図１（ｂ）に示した如く、第１の核酸プローブ１２ａは、標的核酸１０の標的配列Ｔに相補的な第１の塩基配列Ｔ’と、該第１の塩基配列Ｔ’に隣接する位置に任意の塩基配列からなる第２の塩基配列Ｐと、を含む。
第１の核酸プローブ１２ａにおいて、第１の塩基配列Ｔ’の長さは特に制限はなく、標的核酸の標的配列の長さに応じて設定すればよい。
第１の核酸プローブ１２ａにおいて、第２の塩基配列Ｐは、前記第１の塩基配列Ｔ’と間隔なく配置される。第２の塩基配列Ｐの長さは６〜２０塩基が好ましい。
【００３９】
前記第１の核酸プローブ１２ａは、担体１３に固定されているかもしくは担体１３に固定可能な部分が導入されていることが好ましい。
前記担体１３としては、例えば、蛍光微小粒子、磁気粒子、マイクロプレート、マイクロアレイ、スライドガラス、電気伝導性基板等の基板を用いることが好ましい。なお、図は微小粒子を用いた場合の例を示したが、本発明において担体１３は特に限定されないものである。
【００４０】
担体１３は、図１に示した如く、第１の塩基配列Ｔ’側に結合されることが好ましい。なお、図１では、第１の核酸プローブ１２ａに直接担体１３を結合させた例を示したが、他の核酸プローブや有機物等を介して第１の核酸プローブ１２ａと担体１３とを結合せしめてもよい。例えば、第１の核酸プローブ１２ａが捕捉領域Ｋをさらに有するように構成し、該捕捉領域Ｋに相補的な領域Ｋ’を有する捕捉用プローブを固定化した担体１３を用いてもよい。また、第１の核酸プローブ１２ａが、第１の塩基配列Ｔ’と担体１３との結合部分との間に、他の核酸領域や炭素鎖を始めとする有機物等を含んでいてもよく、図５（ａ）に示した如く、標的核酸及び使用するプローブのいずれとも結合しないスペーサー領域Ｓ１を含むことが好適である。
【００４１】
なお、図１（ｂ）では、第１の核酸プローブの核酸領域が、第１の塩基配列Ｔ及び第２の塩基配列Ｐからなる場合を示したが、本発明において、第１の核酸プローブは、第１の塩基配列Ｔ及び第２の塩基配列Ｐに加えて、他の核酸領域を含んでいてもよい［例えば、図５（ａ）及び図６（ａ）］。但し、他の核酸領域を含む場合は、第１の塩基配列Ｔ及び第２の塩基配列Ｐが隣接されるように他の核酸領域を設けなければならない。
【００４２】
図１（ｃ）に示した如く、第２の核酸プローブ１４ａは、シグナル増幅用プローブ１６中の１つのシグナル増幅用プローブ１６ａの一部又は全てと同じ塩基配列を含む第１の塩基配列（例えば、配列ＸＹＺ）と、第１の核酸プローブ１２ａの第２の塩基配列Ｐに相補的な第２の塩基配列Ｐ’と、を含む。
なお、図１（ｃ）では、第２の核酸プローブの核酸領域が、第１の塩基配列（配列ＸＹＺ）及び第２の塩基配列Ｐ’からなる場合を示したが、本発明において、第２の核酸プローブは、第１の塩基配列及び第２の塩基配列に加えて、他の核酸領域を含んでいてもよい［例えば、図５（ｂ）］。
【００４３】
図１では、第２の核酸プローブ１４ａの第１の塩基配列が、シグナル増幅用プローブ１６ａの全てと同じ塩基配列（配列ＸＹＺ）を有する例を示したが、本発明において、該第１の塩基配列は第２の核酸プローブ１４ａとシグナル増幅用プローブ１６が特異的に結合できる配列であれば特に限定されず、シグナル増幅用プローブの一部と同じ塩基配列を有する配列（例えば、配列Ｘ、配列Ｙ、配列Ｚ、配列ＸＹ、配列ＹＺ、配列ＺＹＺ、配列ＸＹＸまたはこれら配列の部分配列等）を用いてもよい。
【００４４】
図２〜図４は、図１記載の２種の核酸プローブ１２ａ，１４ａ及び２種のシグナル増幅用プローブ１６ａ，１６ｂを用いた本発明の標的核酸の検出方法の一例を示す概略説明図である。図２は、試料中に標的核酸１０が存在する場合の工程（ａ）の概略説明図である。図３は、試料中に標的核酸１０が存在する場合の工程（ｂ）の概略説明図である。図４は、試料中に標的核酸１０が存在しない場合の工程（ｂ）の概略説明図である。
【００４５】
標的核酸１０を含む可能性のある試料、前記第１の核酸プローブ１２ａ、前記第２の核酸プローブ１４ａを反応させる［工程（ａ）］。試料中に標的核酸が存在する場合は、標的核酸１０と第２の核酸プローブ１４ａが隣接する状態で第１の核酸プローブ１２ａとハイブリダイズし、標的核酸１０と第１の核酸プローブ１２ａと第２の核酸プローブ１４ａとを含む複合体１８が形成される（図２）。
【００４６】
前記工程（ａ）後、複数種のシグナル増幅用プローブ（１６ａ，１６ｂ）を添加し、第２の核酸とシグナル増幅用プローブ１６ｂをハイブリダイズさせると共にシグナル増幅用プローブ１６ａ，１６ｂの自己集合体反応によりプローブポリマー２０を形成させる。試料中に標的核酸１０が存在する場合は、第２の核酸プローブ１４ａを介して複合体１８と結合したプローブポリマー２０が形成され、プローブポリマー２０は担体１３に捕捉されるが（図３）、標的核酸１０が存在しない場合は、第２の核酸プローブ１４ａは第１の核酸プローブ１２ａから解離し、プローブポリマー２０は担体１３に捕捉されない（図４）。
【００４７】
よって、プローブポリマー２０を検出することにより、標的核酸１０の存在を検出することができる［工程（ｃ）］。プローブポリマーの検出方法は特に限定されず、例えば、蛍光、発光、発色等により検出することが好適である。
【００４８】
なお、図２〜図４では、予め担体１３に固定化させた第１の核酸プローブ１２ａを用いた例を示したが、第１の核酸プローブ１２ａを担体１３に固定化させる時期は特に制限はなく、複合体形成時又は複合体形成後に第１の核酸プローブ１２ａと担体１３とを直接又は間接的に結合せしめてもよい。
【００４９】
本発明において、第１の塩基配列Ｔ’が異なる複数の第１の核酸プローブ１２ａを併用することにより、複数種の標的核酸を同時に検出することが可能である。複数種の標的核酸の同時検出において、複数種のシグナル増幅用プローブ１６及び第２の核酸プローブ１４ａは同一のものが使用可能であり、担体１３及び第１の核酸プローブ１２ａのみを複数種準備すればよく、作業性に優れ、低コストである。
【００５０】
図５は、本発明で用いられる核酸プローブ及びシグナル増幅用プローブの第２の例を示す概略説明図であり、（ａ）は第１の核酸プローブ１２ｂ、（ｂ）は第２の核酸プローブ１４ｂ、（ｃ）はシグナル増幅用プローブ１６をそれぞれ示す。図５は、シグナル増幅用プローブ１６として、図１と同様の例を示した。
図５（ａ）において、第１の核酸プローブ１２ｂは、標的核酸に相補的な第１の塩基配列Ｔ’及び第２の塩基配列Ｐに加えて、標的核酸、第２の核酸プローブ及びシグナル増幅用プローブのいずれとも結合しないスペーサー領域Ｓ１をさらに有する。図５（ａ）に示した如く、第１の核酸プローブは、第１の塩基配列Ｔ’又は第２の塩基配列Ｐと、担体１３との結合部分の間に、標的核酸、第２の核酸プローブ及びシグナル増幅用プローブのいずれとも結合しないスペーサー領域Ｓ１を含むことが好適である。
【００５１】
第１の核酸プローブがスペーサー領域Ｓ１を含む場合、該スペーサー領域Ｓ１に相補的なアンチスペーサー領域Ｓ１’を含む核酸プローブをさらに用いることにより、検出感度をさらに向上させることができる。
【００５２】
図５（ｂ）において、第２の核酸プローブ１４ｂは、シグナル増幅用プローブの一部と同じ塩基配列を含む第１の塩基配列（配列ＺＹＺ）、及び第１の核酸プローブに相補的な第２の塩基配列Ｐ’に加えて、標的核酸、第１の核酸プローブ及びシグナル増幅用プローブのいずれとも結合しないスペーサー領域Ｓ２をさらに有する。図５（ｂ）に示した如く、第２の核酸プローブは、第１の塩基配列及び第２の塩基配列の間に、標的核酸、第１の核酸プローブ及びシグナル増幅用プローブのいずれとも結合しないスペーサー領域Ｓ２を含むことが好適である。
【００５３】
図６は、本発明で用いられる核酸プローブ及びシグナル増幅用プローブの第３の例を示す概略説明図であり、（ａ）は第１の核酸プローブ１２ｃ、（ｂ）は第２の核酸プローブ１４ｃ、（ｃ）はシグナル増幅用プローブ１６をそれぞれ示す。図６は、シグナル増幅用プローブ１６として、図１と同様の例を示した。
図６において、第１の核酸プローブ１２ｃは、標的核酸に相補的な第１の塩基配列Ｔ’、第２の塩基配列Ｐ、及びスペーサー領域Ｓ１を含む核酸プローブであり、第２の塩基配列Ｐが、シグナル増幅用プローブの一部（配列Ｘ）と相補的な配列（配列Ｘ’）である。第２の核酸プローブ１４ｃは、シグナル増幅用プローブの一部と同じ塩基配列を含む第１の塩基配列（配列ＹＺ）と、第１の核酸プローブに相補的な第２の塩基配列Ｐ’（配列Ｘ）とを含む核酸プローブであって、シグナル増幅用プローブ１６ａと同一である。
図６に示した如く、第１の核酸プローブの任意の塩基配列である第２の塩基配列Ｐをシグナル増幅用プローブの一部と相補的な配列とすることにより、シグナル増幅用プローブの１つ（１６ａ）を第２の核酸プローブ１４ｃとして用いることができる。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
標的核酸として２１塩基のターゲットオリゴＤＮＡ−１を用いた。
ターゲットオリゴＤＮＡ−１の塩基配列（5'-T1-3')
5'-GCATTGAGGCTCGCTGAGAGT-3'（配列番号１）
【００５５】
第１の核酸プローブとして、標的核酸に相補的な塩基配列（２１塩基）及び任意の塩基配列（１２塩基）からなる核酸プローブ［第１の核酸プローブ−１］を用いた。
第１の核酸プローブ−１の塩基配列(5'-P1-T1'-3')
5'-CCAATAAAAGTG ACTCTCAGCGAGCCTCAATGC-3'（配列番号２）
前記第１の核酸プローブの３’末端を蛍光微小粒子（Luminex bead、Luminex社製）の表面に固定して用いた。第１の核酸プローブの蛍光微小粒子への固定はLuminex社の方法に準じて行った。
【００５６】
シグナル増幅用プローブとして、３’末端がＣｙ３で標識されている２種類の核酸プローブ［ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２］を用いた。
ＨＣＰ−１の塩基配列(5'-X-Y-Z-3')
5'-CATCTCTGCTGGTC CCACATTCAGACCC GTTCGCCATAGACG-3'（配列番号３）
ＨＣＰ−２の塩基配列(5'-X'-Y'-Z'-3')
5'-GACCAGCAGAGATG GGGTCTGAATGTGG CGTCTATGGCGAAC-3'（配列番号４）
【００５７】
第２の核酸プローブとして、前記第１の核酸プローブ−１に相補的な塩基配列（１２塩基）及びＨＣＰ−１の一部と同じ塩基配列（配列ＺＹＺ）を有する核酸プローブ［第２の核酸プローブ−１］を用いた。
第２の核酸プローブ−１の塩基配列（5'-P1'-Z-Y-Z-3')
5'-CACTTTTATTGG GTTCGCCATAGACG CCACATTCAGACCC GTTCGCCATAGACG-3'（配列番号５）
【００５８】
０．２ｍＬチューブに０、０．１、１、１０又は１００ｆｍｏｌの標的核酸、第１の核酸プローブを表面に固定した微小粒子を１×１０３個、並びに１０ｆｍｏｌの第２の核酸プローブをＴＭＡＣ緩衝液［1.5M TMAC (tetra-methyl ammonium chloride)、50mM Tris-HCl (pH8.0)、4mM EDTA (pH8.0)、0.1% N-lauroylsarcosine］５０μＬに加え、９５℃で２分間反応させた後、５６℃で２時間反応させ、１５℃に保持した。
その後、２種のシグナル増幅用プローブ（ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２）を各々５０ｐｍｏｌ含むＴＭＡＣ緩衝液５０μＬを加え、計１００μＬとし、５６℃で１時間反応させ、１５℃に保持した。
反応終了後、フローサイトメトリー（Luminex社、Luminex 100）でＣｙ３の蛍光及び蛍光微小粒子の蛍光を測定した。結果を表１に示す。
【００５９】
（実施例２）
標的核酸として２２塩基のオリゴＲＮＡを用いた。
ターゲットオリゴＲＮＡの塩基配列(5'-T2-3')
5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'（配列番号６）
【００６０】
第１の核酸プローブとして、任意の塩基配列（１０塩基）、標的核酸に相補的な塩基配列（２２塩基）、いずれのプローブ及び標的核酸とも結合しないスペーサー領域（２０塩基）からなる核酸プローブ［第１の核酸プローブ−２］を用いた。
第１の核酸プローブ−２の塩基配列(5'-P2-T2'-S1-3')
5'-GAGAAGGTGT TCAACATCAGTCTGATAAGCTA GATCTCGCTCACGGTAGTGC-3'（配列番号７）
前記第１の核酸プローブの３’末端を蛍光微小粒子（Luminex bead、Luminex社製）の表面に固定して用いた。
【００６１】
シグナル増幅用プローブとして、実施例１で用いた３’末端がＣｙ３で標識されているＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２を用いた。
【００６２】
第２の核酸プローブとして、前記第１の核酸プローブ−２に相補的な塩基配列（１０塩基）、いずれのプローブ及び標的核酸とも結合しないスペーサー領域（５塩基）、及びＨＣＰ−１の一部と同じ塩基配列（配列ＺＹＺ）を有する核酸プローブ［第２の核酸プローブ−２］を用いた。
第２の核酸プローブ−２の塩基配列(5'-P2'-S2-Z-Y-Z-3')
5'-ACACCTTCTC CTTCA GTTCGCCATAGACG CCACATTCAGACCC GTTCGCCATAGACG-3'（配列番号８）
【００６３】
０．２ｍＬチューブに０、０．１又は１ｆｍｏｌの標的核酸、第１の核酸プローブを表面に固定した微小粒子を５００個、並びに２０ｆｍｏｌの第２の核酸プローブを４×ＳＳＣ緩衝液［0.06M クエン酸ナトリウム、0.6M 塩化ナトリウム、0.1% N-lauroylsarcosine、50mM Tris-HCl (pH8.0)、4mM EDTA (pH8.0)］２５μＬに加え、６５℃で２分間反応させた後、４６．３℃で２時間反応させ、１５℃に保持した。
その後、２種のシグナル増幅用プローブ（ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２）を各々５０ｐｍｏｌ含む溶液［0.1% N-lauroylsarcosine、50mM Tris-HCl (pH8.0)、4mM EDTA (pH8.0)］２５μＬを加え、計５０μＬとし、５３．７℃で１時間反応させ、１５℃に保持した。
反応終了後、フローサイトメトリーでＣｙ３の蛍光及び蛍光微小粒子の蛍光を測定した。結果を表１に示す。
【００６４】
（実施例３）
第１の核酸プローブ−２のスペーサー領域に相補的な核酸プローブ［アンチスペーサー領域オリゴ］を更に用いた以外は実施例２と同様に実験を行った。
アンチスペーサー領域オリゴの塩基配列(5'-S1'-3')
5'-GCACTACCGTGAGCGAGATC-3'（配列番号９）
【００６５】
０．２ｍＬチューブに０、０．１又は１ｆｍｏｌの標的核酸、第１の核酸プローブを表面に固定した微小粒子を５００個、２０ｆｍｏｌの第２の核酸プローブ、並びに１００ｆｍｏｌのアンチスペーサー領域オリゴを４×ＳＳＣ緩衝液２５μＬに加え、６５℃で２分間反応させた後、４６．３℃で２時間反応させ、１５℃に保持した。
その後、２種のシグナル増幅用プローブ（ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２）を各々５０ｐｍｏｌ含む溶液［0.1% N-lauroylsarcosine、50mM Tris-HCl (pH8.0)、4mM EDTA (pH8.0)］２５μＬを加え、計５０μＬとし、５３．７℃で１時間反応させ、１５℃に保持した。
反応終了後、フローサイトメトリーでＣｙ３の蛍光及び蛍光微小粒子の蛍光を測定した。結果を表１に示す。
【００６６】
（実施例４）
標的核酸として、２２塩基のターゲットオリゴＤＮＡ−２を用いた。
ターゲットオリゴＤＮＡ−２の塩基配列(5'-T3-3')
5'-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3'（配列番号１０）
【００６７】
シグナル増幅用プローブとして、実施例１で用いた３’末端がＣｙ３で標識されているＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２を用いた。第２の核酸プローブとして、実施例１で用いたＨＣＰ−１を用いた。
【００６８】
第１の核酸プローブとして、ＨＣＰ−１に相補的な塩基配列（１１塩基）、標的核酸に相補的な塩基配列（２１塩基）及びいずれのプローブ及び標的核酸とも結合しないスペーサー領域（２０塩基）からなる核酸プローブ［第１の核酸プローブ−３］を用いた。
第１の核酸プローブ−３の塩基配列(5'-X1'-T3'-S3-3')
5'-CAGCAGAGATG TCAACATCAGTCTGATAAGCTA GATCTCGCTCACGGTAGTGC-3'（配列番号１１）
前記第１の核酸プローブの３’末端を蛍光微小粒子（Luminex bead、Luminex社製）の表面に固定化した。
【００６９】
０．２ｍＬチューブに０、０．１、１又は１０ｆｍｏｌの標的核酸、第１の核酸プローブを表面に固定した微小粒子を１×１０３個、並びに１００ｆｍｏｌの第２の核酸プローブ（ＨＣＰ−１）をＴＭＡＣ緩衝液５０μＬに加え、９５℃で２分間反応させた後、４８℃で２時間反応させ、１５℃に保持した。
その後、２種のシグナル増幅用プローブ（ＨＣＰ−１及びＨＣＰ−２）を各々５０ｐｍｏｌ含むＴＭＡＣ緩衝液５０μＬを加え、計１００μＬとし、５４℃で１時間反応させ、１５℃に保持した。
反応終了後、フローサイトメトリーでＣｙ３の蛍光及び蛍光微小粒子の蛍光を測定した。結果を表１に示す。
【００７０】
【表１】
2012070635.tif 000015
【００７１】
表１に示すように、試料中に標的核酸が存在しない場合は、十分なシグナルが検出されなかったのに対し、試料中に標的核酸が存在する場合は、その含有量に応じたシグナルが検出され、２１塩基及び２２塩基の低分子核酸が簡便且つ高感度に検出された。
【符号の説明】
【００７２】
１０：標的核酸、１２ａ，１２ｂ，１２ｃ：第１の核酸プローブ、１３：担体、１４ａ，１４ｂ，１４ｃ：第２の核酸プローブ、１６，シグナル増幅用プローブ、１６ａ：ＨＣＰ−１、１６ｂ：ＨＣＰ−２、１８：複合体、２０：プローブポリマー。
【図１】
2012070635.tif 000016
【図２】
2012070635.tif 000017
【図３】
2012070635.tif 000018
【図４】
2012070635.tif 000019
【図５】
2012070635.tif 000020
【図６】
2012070635.tif 000021
【配列表】
2012070635000001.app