(57)【要約】【課題】ＣＤ８１タンパク質およびＣＤ８１タンパク質をコードする核酸、ならびにＣ型肝炎の治療およびＣ型肝炎の診断のための薬学的組成物、Ｃ型肝炎の治療およびＣ型肝炎の診断のための動物モデルおよびＣ型肝炎の治療およびＣ型肝炎の診断のための診断キットを提供すること。【解決手段】ＨＣＶの治療または診断に使用するためのＣＤ８１タンパク質、またはその機能的な等価物。ＨＣＶの感染を処置するための方法であって、治療的に効果的な量のＣＤ８１タンパク質もしくはその機能的な等価物を患者に投与する工程、またはウイルスの感染力を減少するために該ＣＤ８１タンパク質に特異的に結合する化合物を投与する工程を包含する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｃ型肝炎の治療および診断におけるＣＤ８１タンパク質およびこのタンパク質をコードする核酸の使用、ならびにそのような使用のための薬学的組成物、動物モデルおよび診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
（先行技術の簡単な説明）
総ての刊行物、説明書、特許、および本明細書に引用された特許出願は、全体が参考として援用される。ＨＣＶ（以前は非Ａ  非Ｂ肝炎−ＮＡＮＢＶとして公知であった）は、約３０００アミノ酸のポリタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレームを有する約１００００のヌクレチドの＋鎖ＲＮＡウイルスである。ウイルスの構造が、組換えＤＮＡ技術（ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０３１８２１６およびヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０３８８２３２）によって解明されたにもかかわらず、ウイルスそれ自体は、単離されず、そしてポリタンパク質のタンパク質分解によって産生された様々なウイルスタンパク質は、類似のゲノム組織の他の類似のウイルスとの類似性によって推論されただけである（非特許文献１）。
【０００３】
ウイルスタンパク質は、組換え型において全て利用可能であり、種々の細胞および細胞型（酵母、細菌、昆虫、植物、および哺乳動物細胞を含む）において発現する（（非特許文献２および非特許文献３）。
【０００４】
Ｅ１およびＥ２（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３８３および３８４〜７５０にそれぞれ相当する）と名付けられた２つのタンパク質は、標的細胞へのウイルスの結合の原因であるウイルス外被の外側タンパク質であることが示された。
【０００５】
ＨＣＶの研究は、ウイルスの限定された宿主範囲によって非常に著しく妨害される。ＨＣＶ感染の唯一の信頼のおける動物モデルは、チンパンジーであり、そしてＨＣＶは、組織培養で容易に増殖しない。
【０００６】
本発明者らの同時係属の国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ９５／００６９２（特許文献１）において、本発明者らは、ＨＣＶレセプターを有する細胞を同定するためにフローサイトメトリーを利用する方法を記載する。本発明者らは、組換えＥ２外被タンパク質を有する標識細胞によって、フローサイトメトリーを用いてＥ２に特異的に結合する能力のあるそれらの細胞を単離し、従って、潜在的にＨＣＶウイルスを保有する細胞を識別することが可能であることを示した。
【０００７】
本発明者らの同時係属の国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ９６／００９４３（特許文献２）において、本発明者らは、ＨＣＶのＥ２外被タンパク質に結合する能力のあるタンパク質を同定した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第９６／０５５１３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９７／０９３４９号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｈｏｏら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（１９９１）８８  ２４５１〜２４５５
【非特許文献２】Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ（１９９２）８９  １００１１〜１００１５
【非特許文献３】Ｓｐａｅｔｅ，Ｒ．Ｒ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２）１８８  ８１９〜８３０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、現在、ＨＣＶレセプターをコードするＤＮＡをクローニングするいくつかの困難に成功し、そして驚くことに、ＤＮＡがＣＤ８１として公知の細胞タンパク質をコードすることを発見した。本発明者らは、ＣＤ８１とＨＣＶの間の文献において、いかなる関連も知らない。ＣＤ８１は、インビトロ細胞増殖を阻害した抗増殖性抗体（ＴＡＰＡ−１）の標的としてモノクローナル抗体によってまず同定された。この新規の情報、および与えられた公のデータベースにおけるＣＤ８１の配列知識が備わったので、今や、ＨＣＶに対する治療上のおよび診断上の試薬の武器を設計および産生することが可能である。
【００１１】
（本発明の要旨）
本発明に従って、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）の治療または診断に使用するためのＣＤ８１タンパク質、またはその機能的な等価物が提供される。本発明のさらなる局面に従って、ＨＣＶの治療または診断に使用するためのＣＤ８１タンパク質に特異的に結合する化合物が提供される。
【００１２】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ８１タンパク質、またはその機能的な等価物」とは、ＳＷＩＳＳＰＬＯＴデータベース（受託番号Ｐ１８５８２）またはＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫデータベース（受託番号Ｍ３３６９０）において記載されるタンパク質配列によって定義されたヒトＣＤ８１タンパク質、またはその機能的な等価物を意味する。ＣＤ８１の機能的な等価物とは、ＨＣＶに（好ましくはＨＣＶのＥ２タンパク質に）結合する能力のある化合物である。好ましくは、機能的な等価物とは、ペプチドまたはタンパク質である。用語「機能的な等価物」とは、ＣＤ８１のアナログ、ＣＤ８１のフラグメント、ならびにＣＤ８１変異体およびムテインを含む。
【００１３】
本明細書中でＨＣＶのＥ２タンパク質に結合することに関与されることを示したヒトＣＤ８１タンパク質の１つの領域は、図１に示した全長のヒト配列のアミノ酸１１３〜２０１を含む「ＥＣ２」領域である。本発明は、ヒトＣＤ８１のこの領域を含むか、または例えば、図１で同定されたチンパンジーの配列のような、この領域の機能的な等価物を含むタンパク質およびタンパク質フラグメントを含む。好ましくは、この機能的な等価物は、例えば、Ｐｉｌｅｕｐ配列解析ソフトウェア（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，１９９６）のような任意の従来の解析アルゴリズムによって評価された場合、タンパク質のＥＣ２領域にわたってヒトＣＤ８１配列と少なくとも８０％の相同性があり、好ましくは、少なくとも９０％の相同性がある。
【００１４】
用語「機能的に等価なフラグメント」とはまた、本明細書で使用される場合、ＨＣＶに結合（好ましくは、ＨＣＶのＥ２タンパク質への結合）する完全なタンパク質の任意のフラグメントまたはフラグメントの集合体を意味する。完全なタンパク質は、１つあるいは両方の末端で切断され得るか、またはドメインは、内部的に規定された定義された機能を保持するタンパク質を取り除き得る。例えば、膜に結合（図１のＴＭ１からＴＭ４）する原因となるタンパク質の１つ以上の領域は、組換えプロセスによって作製された場合、可溶性のタンパク質を与えることを取り除き得る。フラグメントの選択は、ＣＤ８１タンパク質（アミノ酸１１３〜２０１）の細胞外ループ２（図１のＥＣ２）を含む。
【００１５】
タンパク質の場合、機能的に等価なフラグメントまたはアナログは、本明細書で同定されたヒトＣＤ８１タンパク質として同一のタンパク質ファミリーに属し得る。「タンパク質ファミリー」とは、共通の機能を共有し、そして共通の配列相同性を示すタンパク質の群を意味する。配列相同性とは、タンパク質配列が、ヒトとチンパンジーの間の場合のように、共通の祖先からの分岐によって関連付けられたタンパク質の配列を意味する。チンパンジーＣＤ８１は、従って、ＨＣＶへ結合する機能的に等価なタンパク質の例である。
【００１６】
好ましくは、機能的に等価なタンパク質配列の間の相同性は、完全なタンパク質または完全なＥＣ２フラグメント（アミノ酸１１３〜２０１）のアミノ酸配列の全てにわたって少なくとも２５％である。より好ましくは、相同性は、少なくとも５０％であり、なおより好ましくは、タンパク質またはタンパク質フラグメントのアミノ酸配列の全体にわたって７５％である。最も好ましくは、相同性は、配列の全体にわたって８０％より大きい。
【００１７】
用語「機能的に等価なアナログ」とは、ＣＤ８１タンパク質の活性に相同な機能を有し、そして例えば、ペプチド、環状ペプチド、ポリペプチド、抗体または抗体フラグメントを含み得るそれらの化合物を記載するために用いられる。これらの化合物は、タンパク質であり得るか、またはインヒビタータンパク質上の特定の構造またはエピトープを模倣するために設計された合成薬剤であり得る。好ましくは、その化合物は、抗体または抗体フラグメンとである。
【００１８】
用語「機能的に等価なアナログ」とはまた、タンパク質アナログがＨＣＶに（好ましくはＨＣＶのＥ２タンパク質に）結合する能力を保持するように、例えば、１つ以上のアミノ酸欠失、置換、または付加によってアミノ酸配列を変化させることによって得られた、ＣＤ８１の任意のアナログを含む。アミノ酸置換は、例えば、アミノ酸配列をコードするＤＮＡの点変異によって作製され得る。
【００１９】
ＣＤ８１の機能的な等価物は、ＣＤ８１のフラグメントのアナログであり得る。ＣＤ８１または機能的な等価物は、ＨＣＶ（好ましくはＨＣＶのＥ２タンパク質）への結合するためのその能力を保持する場合に化学的に修飾され得る。
【００２０】
そのような分子は、ＨＣＶ感染の予防治療において極端に有用であることが認識される。なぜなら、これらの分子は、ウイルスに特異的に結合し、従って、細胞中へのウイルスの内部移行を妨げるからである。本明細書で使用される場合、「特異的結合」とは、機能的に等価なアナログが、ＨＣＶウイルスのＥ２タンパク質に対して高い親和性を有し、そして類似の高い親和性で任意の他のタンパク質に結合しないことを意味する。特異的結合は、ウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳ分析、または免疫沈降のような多数の技術により測定され得る。好ましくは、機能的に等価なアナログは、少なくとも１０-8の親和性で、好ましくは、少なくとも１０-9で、そして最も好ましくは、１０-10より大きい親和性でＥ２タンパク質に結合する。
【００２１】
本発明のさらなる実施態様に従って、ＨＣＶの診断または治療に使用するためのＣＤ８１に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体のようなＣＤ８１へ結合する化合物を提供する。好ましくは、その化合物は、少なくとも１０-8の親和性でＣＤ８１に特異的に結合し、好ましくは、少なくとも１０-9で、そして最も好ましくは、１０-10より大きい親和性で。そのような化合物は、ウイルスの患者細胞への結合および内部移行されるのを妨げるために使用され得る。
【００２２】
ＣＤ８１分子は、多数の異なった細胞型に存在する。理想的には、ＣＤ８１へ結合する化合物は、従って、ＣＤ８１の通常機能が健常細胞を損なわないために、ＨＣＶの存在下においてＣＤ８１と相互作用だけする。抗体およびそのような抗体に対するスクリーニングの適切な方法は、同時係属特許出願ＥＰ９６９２８６４８．３およびＥＰ９５９２７９１８．３に記載される。
【００２３】
ＣＤ８１タンパク質またはその機能的な等価物は、当業者に明白である場合、任意の適切な手段によって作製され得る。本発明に従って使用するために十分な量のＣＤ８１タンパク質またはその機能的な等価物を作製するために、発現は、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的な等価物を含む組換え宿主細胞に適切な条件下で培養することによって好都合に成し遂げられ得る。
【００２４】
種々の異なる宿主細胞においてポリペプチドのクローニングおよび発現の系は、周知である。
【００２５】
本発明に従うキャリアータンパク質の構築の好ましい２つの方法は、直接的な化学合成、および組換えタンパク質の産生による。好ましくは、ＣＤ８１タンパク質は、組換え手段により、コードしている核酸分子から発現することにより産生される。組換え発現は、タンパク質の産生が、安価で、安全で、容易で、そして後で除去が必要とされる得る毒性の化合物の使用を含まないという利点を有する。
【００２６】
組換え型において発現された場合、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的な等価物は、好ましくは、宿主細胞においてコードしている核酸から発現することにより生成される。任意の宿主細胞は、特定の系の個々の必要性に依存して、使用され得る。適切な宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母またはバキュロウイルス系を含む。当該分野で異種ポリペプチドの発現のために利用可能である哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベイビーハムスター腎細胞および他の多くを含む。好ましくは、細菌宿主は、容易に細菌が操作および増殖され得るので、組換えタンパク質の産生のために使用される。通常、好ましい細菌宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００２７】
好ましくは、組換え的に産生された場合、ＣＤ８１タンパク質または機能的な等価物は、合成核酸インサートを含むプラスミドから発現される。ＣＤ８１タンパク質または機能的な等価物をコードしている核酸がクローニングされた発現プラスミドの挿入部位は、「フラッグ（ｆｌａｇ）」ペプチドまたはポリヒスチジンのようなタグへのタンパク質の連結を可能にし得る。この配置は、後に続く組換えタンパク質の精製を容易にする。
【００２８】
本発明のさらなる局面に従って、ＨＣＶ感染の治療または診断に使用するための、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的な等価物をコードする核酸分子もまた提供される。好ましくは、核酸はヒトＣＤ８１タンパク質をコードする。当業者に明白である場合、そのような核酸分子は、所望のタンパク質またはペプチドをコードするための遺伝暗号を用いて設計される。本発明のこの局面に従った核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡからなり得、さらにコード配列中のヌクレオチドアナログを含み得る。好ましくは、核酸分子は、ＤＮＡを含む。
【００２９】
本発明のこの実施態様の範囲内に含まれるヌクレオチド配列は、標準の条件下でＣＤ８１タンパク質をコードしている核酸にハイブリダイズする配列である。本明細書で使用される場合、標準の条件は、低いストリンジェンシーの条件下での洗浄（２×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド、室温、または２×ＳＳＣ、４２℃）を用いるストリンジェントでない標準ハイブリダイゼーション条件（６×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド、室温）、または高いストリンジェンシーの標準条件（例えば、２×ＳＳＣ、６５℃（ここでＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２））の両方を含む。好ましくは、用語標準的な条件とは、高いストリンジェンシーの条件をいう。
【００３０】
好ましくは、そのような核酸分子は、ＣＤ８１またはそのフラグメントをコードしている核酸分子に特異的にハイブリダイズする能力を保持し、そしてＰｉｌｅｕｐ  ｃｏｍｍａｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（バージョン９、１９９６）により定義されるように、ヒトＣＤ８１遺伝子配列の全体にわたり４０％の相同性を有する核酸配列を含む。より好ましくは、相同性は、遺伝子配列全体にわたり少なくとも６５％である。最も好ましくは、相同性は、遺伝子配列全体にわたり少なくとも７０％より大きい。
【００３１】
ＣＤ８１または機能的な等価物をコードする核酸は、タンパク質発現の正確な制御を可能にしている誘導性のプロモーターの制御下でクローン化され得る。適切な誘導性の系は、当業者に周知である。
【００３２】
ＣＤ８１タンパク質またはその機能的な等価物の発現に適切なベクターは、市販の供給源から選択され得るか、または特定の発現系に適合させるために構築され得る。そのようなベクターは、例えば、プロモーター配列、終結配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列およびマーカー遺伝子のような適切な調節配列を含む。ベクターは、プラスミド、またはウイルスに基づき得る。さらなる詳細のために、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を参照のこと。核酸の操作およびタンパク質の分析のための多数の公知の技術およびプロトコールは、「Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ」第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９２）において詳細に記載される。
【００３３】
組換えタンパク質の単離および精製のための方法は、当業者に対して周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）において要約されている。特に、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌において、組換えタンパク質は、細菌細胞内で封入体を形成し、従ってその調製を容易にしている。封入体において産生される場合、キャリアタンパク質は、その天然の高次構造にリホールドされる必要があり得る。
【００３４】
さらに、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的な等価物の厳密な特性を正確に合わせるために、当業者は、変化が１以上のヌクレオチドの付加、置換、欠失、または挿入によって既知のＣＤ８１配列からヌクレオチドレベルでなされ得ることを理解する。部位特異的変異誘発（ＳＤＭ）は、本発明に従って変異タンパク質を生成するために使用される好ましい方法である。当業者にとって現在既知のＳＤＭの多くの技術が存在し、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）によって示されるようなＰＣＲを使用した、または市販のキットを使用したオリゴヌクレオチド特異的変異誘発を含む。
【００３５】
適切なベクターは、選択または構築され得、適切な調節配列を含み、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を適切に含む。ベクターは、適切にプラスミド、例えば、ウイルス性のファージまたはファージミドであり得る。さらに詳細には、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。核酸の操作に関する（例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現ならびにタンパク質の分析における）多くの既知の技術およびプロトコールは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２中のＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに詳細に記載されている。Ｓａｍｂｏｏｋら、およびＡｕｓｕｂｅｌらの開示は、参考として本明細書中に援用される。
【００３６】
本発明のさらなる局面に従って、治療的に有効な量のＣＤ８１タンパク質またはウイルスの感染性を減少するのに有効なその機能的等価物を患者に投与することを含むＨＣＶの感染を処置する方法が提供される。
【００３７】
ＨＣＶの感染機構は、細胞表面レセプターの利用可能性に一部、依存すると思われるので、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物の可溶形態を利用可能にすることは、細胞レセプターに対するＨＣＶの結合のアンタゴニストとして作用し、従って、感染プロセスを減少または予防し、それによって疾患を処置する。
【００３８】
ＣＤ８１タンパク質の適切な可溶形態、またはその機能的等価物は、例えば、１以上の膜貫通ドメインまたはドメインＴＭ１−ＴＭ４が、化学または組換えＤＮＡ合成におけるタンパク質切断工程によって、または設計によってのいずれかで除去されているタンパク質の切断された形態を含み得る。このタンパク質の好ましい可溶形態は、ＥＣ２ドメイン（図１で同定される場合、残基１１３〜２０１）を含む。ＥＣ１ドメインは、ＨＣＶについてのタンパク質の親和性または特異性を増加させるために作用し得る。
【００３９】
あるいは、少なくとも１個の粒子形成タンパク質（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原またはその粒子形成フラグメント）を含むハイブリッド粒子は、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物と組み合わせて細胞レセプターに対するＨＣＶの結合のアンタゴニストとして使用し得る。
【００４０】
本発明のよりさらなる局面に従って、ＣＤ８１タンパク質に特異的に結合する治療的に有効な量の化合物（例えば、ＣＤ８１に対するモノクローナル抗体）を患者に投与する工程を含むＨＣＶ感染の処置法が提供される。この治療ストラテジーの理論的根拠は、別の化合物に対する細胞表面レセプターの結合がこのレセプターに対するＨＣＶの結合を妨げ、その結果感染プロセスを妨げ、そしてそれによって疾患を処置することである。
【００４１】
本発明のさらなる局面に従って、薬学的に受容可能なキャリアーと組み合わせて、必要に応じて薬学的に受容可能な塩としてＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物を含む薬学的組成物が提供される。本発明のよりさらなる局面に従って、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、必要に応じて薬学的に受容可能な塩としてＣＤ８１タンパク質と特異的に結合する化合物を含む薬学的組成物が提供される。
【００４２】
薬学的組成物は、経口、非経口、経皮性（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）および経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）組成物を含む投与のための任意の適切な形態で存在し得る。この組成物は、単独で、または処置されるべき状態に同時または連続的のいずれかで依存した他の処置と組み合わせて投与され得る。
【００４３】
１つのプロセスはまた、薬学的組成物を作製するために提供され、ここで本発明のタンパク質は、薬学的に受容可能なキャリアとの結合をもたらす。
【００４４】
本発明のさらなる局面に従って、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物、あるいは薬剤としての使用のためのＣＤ８１タンパク質に対して特異的に結合する化合物が提供される。
【００４５】
本発明のさらなる局面に従って、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物あるいはＨＣＶ感染の処置のための医薬の製造においてＣＤ８１タンパク質に特異的に結合する化合物の使用が提供される。
【００４６】
ＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物のＨＣＶに対する結合能力は、ＨＣＶ感染の診断としてのこのタンパク質の使用（例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）またはＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）における）を可能にする。
【００４７】
タンパク質の可溶形態は、例えば血清中で中和抗体を測定するためにＥＬＩＳＡ形態のアッセイにおいて使用され得る。さらに好ましくは、ＣＤ８１に対する抗体は、この文脈での使用のために適切である。なぜならこれらの分子は、ＨＣＶそのものに関する抗イディオタイプ抗体であるからである。
【００４８】
本発明のさらなる局面に従って、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物に対する結合についてのサンプルにおける抗体と既知量のＨＣＶタンパク質との間の競合結合を可能にする工程、および結合した既知のＨＣＶタンパク質を測定する工程を含む血清サンプルにおけるＨＣＶ抗体についてのアッセイが提供される。
【００４９】
好ましくは、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物は、固体支持体およびＨＣＶタンパク質に固定され、これは、適切にはＥ２  ＨＣＶエンベロープタンパク質であり得、必要な場合には組換えＥ２タンパク質が標識される。この標識は、放射活性標識、ペプチド、エピトープ、酵素、または任意の他の生物活性を有する化合物であり得る。好ましくは、この標識は酵素を含む。
【００５０】
この形態のアッセイにおいて、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物に対する結合についての抗体とＨＣＶタンパク質との間の競合結合は、血清サンプル中の抗体、最も詳細には、血清サンプル中のＨＣＶ中和抗体の測定である結合ＨＣＶタンパク質を生じる。
【００５１】
このアッセイの重要な利点は、直接測定が結合抗体（すなわち、ＨＣＶエンベロープタンパク質の細胞レセプターに対する結合を妨げるこれらの抗体）の中和をすることからなる。特にＥＬＩＳＡ試験の形態で、このようなアッセイは、臨床環境において、そして慣用の血液スクリーニングにおいてかなりの適用を有する。
【００５２】
またこのアッセイは、結合抗体力価の中和を測定するので、このアッセイは、推定のワクチン効力の準備測定を形成し、結合抗体力価の中和は、宿主保護と相関する。
【００５３】
本発明のさらなる局面において、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物を含む診断キットが提供される。好ましくは、このキットはまた、少なくとも１つの標識されたＨＣＶタンパク質、必要に応じて酵素標識されたＨＣＶタンパク質を含む。このキットはまた、血清中でＨＣＶまたは抗ＨＣＶ抗体の存在を分析するために必要な他の成分を含む。このような成分は、当業者に容易に明らかとなる。
【００５４】
ＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物は、ＨＣＶレセプターに対する結合を担うＨＣＶ表面構造を模倣した化合物をスクリーニングするために使用され得る。
【００５５】
本発明のさらなる局面に従って、宿主細胞に対する結合を担うＨＣＶ領域に対する結合能力について化合物をスクリーニングするための方法が提供され、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物に対してスクリーニングされるべき化合物の結合を測定する工程を含む。この宿主細胞は、任意の哺乳動物細胞、好ましくはヒト宿主細胞であり得る。
【００５６】
本発明のこの局面は、単独、薬学的に受容可能な塩の形態、１以上の他の活性化合物との組み合わせ、および／または１以上の薬学的に受容可能なキャリアとの組み合わせであろうとスクリーニングプロセスの産物を含む。本発明のプロセスによって同定される化合物が薬学的に受容可能なキャリアとの結合をもたらす薬学的組成物を作製するプロセスもまた、提供される。
【００５７】
この化合物は、有機化合物であり得、そしてアミノ酸またはアミノ酸アナログを含み得る。しかし、好ましくは、この化合物は、ペプチド、ポリペプチドまたはその特定の性質（例えば、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物に対する結合親和性、あるいはそのインビボでの安定性）を変化するために化学的に改変されたポリペプチドである。
【００５８】
本発明のさらなる局面に従って、ＨＣＶの診断または治療における使用のためのＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物をコードする核酸が提供される。この核酸は、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物の任意の一部をコードし得る。好ましくは、この核酸は、ＨＣＶ  Ｅ２と結合するＣＤ８１の部分をコードする。本発明のよりさらなる局面によれば、ＣＤ８１に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチド化合物をコードする核酸が提供される。
【００５９】
この核酸に対する変化は、１以上のヌクレオチドの付加、置換、欠失または挿入によって核酸レベルで行われ得、この変化は、アミノ酸レベルで反映され反映されなくてもよい。そしてこれは遺伝コードの縮重に依存する。
【００６０】
この核酸は、ベクター中に含まれ得、必要に応じてＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物を産生するために適切な宿主において、核酸の発現を可能にする発現ベクター中に含まれ得る。
【００６１】
ＨＣＶレセプター、すなわちＣＤ８１をコードするＤＮＡの同定は、ＨＣＶの分子分析、詳細にはその感染機構についての全力の分子生物学を利用可能にし、このウイルスを処置する方法を設計する可能性を初めて提供する。ＰＣＲ法を用いて、このレセプターを保有する細胞を同定し得、そしてＤＮＡ分子をこの関連においてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして作用するように設計し得る。ＣＤ８１は広く行き渡っており、そして正常なヒト機能に関連するが、本発明は、ＨＣＶの処置およびＨＣＶ感染の処置のための医薬品の製造において使用するためのＣＤ８１生成阻害性アンチセンス分子を含む。
【００６２】
ＣＤ８１タンパク質における多型の同定は、ＨＣＶ感染に対する感受性または類似の予後に関連することが見出され得る。従って、ＨＣＶレセプターをコードする遺伝子の同定は、ヒト集団を通して存在する多型の評価を可能にする。
【００６３】
本発明のさらなる局面によれば、ＨＣＶ感染の処置およびＨＣＶ感染の処置のための医薬品の製造における使用のための、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物に対する抗体が提供される。抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。例えば、ＨＣＶ感染血液による偶発的な感染の直後に、このような抗体を用いて、ＣＤ８１レセプターを一時的にブロックして、ＨＣＶによる感染を予防し得る。
【００６４】
現在は、ＨＣＶ感染について利用可能な唯一の動物モデルは、チンパンジーであり、チンパンジーは、保護種である。このような動物における実験は、同時に非常に多量の費用（１匹のチンパンジーでの１年間の実験には、＄７０，０００がかかり得る）となる、多数の困難性を提起する。これと比較して、マウスモデルは、ずっと受け入れられ易い。不幸なことには、下記のように、ＨＣＶレセプターは、ヒトに偏在し、そしてチンパンジーに見出されるが、他の哺乳動物には存在しない。おそらく正常に見出されるよりも多量または少量で発現される、細胞表面上にＨＣＶレセプターを保有するトランスジェニック哺乳動物（例えば、マウス）は、ＨＣＶ研究およびワクチンの開発に対して非常に利益がある。細胞表面における変異ＣＤ８１タンパク質の発現はまた、有用な研究ツールである。
【００６５】
本発明のさらなる局面によれば、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物をコードするトランスジーンを保有する、非ヒトトランスジェニック動物（適切には、マウスのような哺乳動物）が提供される。
【００６６】
本発明のトランスジェニック動物は、ＨＣＶ感染を保持するのを補助する１以上の他のトランスジーンを保有し得る。
【００６７】
トランスジェニック動物を作製するためのプロセスもまた提供される。このプロセスは、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物をコードするＤＮＡを、非ヒト哺乳動物（好ましくは、マウス）の胎仔に導入する工程を含む。好ましくは、ＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物は、ヒトＣＤ８１タンパク質である。
【００６８】
本発明のさらなる局面によれば、ＨＣＶの制御における防御免疫原として使用するためのＣＤ８１タンパク質またはその機能的等価物が提供される。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）  ＨＣＶの治療または診断に使用するためのＣＤ８１タンパク質、またはその機能的な等価物。
・（項目２）  ＨＣＶの治療もしくは診断に使用するためのＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベース（受託番号Ｐ１８５８２）、もしくはＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫデータベース（受託番号Ｍ３３６９０）に記載されるヒトＣＤ８１配列、またはその機能的な等価物を含む、タンパク質。
・（項目３）  ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベース（受託番号Ｐ１８５８２）、もしくはＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫデータベース（受託番号Ｍ３３６９０）に記載されるヒトＣＤ８１配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であって、相同性がＰｉｌｅｕｐ配列解析ソフトウエアパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，１９９６）を用いて定義され、ＨＣＶの治療または診断に使用するための、タンパク質。
・（項目４）  ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベース（受託番号Ｐ１８５８２）、もしくはＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫデータベース（受託番号Ｍ３３６９０）に記載されるヒトＣＤ８１配列のアミノ酸１１３〜２０１、またはその機能的な等価物からなる、タンパク質。
・（項目５）  ＨＣＶの治療または診断に使用するための項目４に記載のタンパク質。
・（項目６）  ＣＤ８１タンパク質に特異的に結合する化合物であって、ＨＣＶの治療または診断に使用するための化合物。
・（項目７）  ＨＣＶの感染を処置するための方法であって、治療的に効果的な量のＣＤ８１タンパク質もしくはその機能的な等価物を患者に投与する工程、またはウイルスの感染力を減少するために当該ＣＤ８１タンパク質に特異的に結合する化合物を投与する工程を包含する、方法。
・（項目８）  ＣＤ８１タンパク質、またはその機能的な等価物、またはＣＤ８１タンパク質に特異的に結合する化合物を含む薬学的組成物であって、必要に応じて薬学的に受容可能な塩として薬学的に受容可能なキャリアーと組み合わせる、薬学的組成物。
・（項目９）  薬学的に受容可能なキャリアーと組み合わせる項目４に記載のタンパク質を含む、薬学的組成物。
・（項目１０）  ＨＣＶの治療または診断に使用するための、項目８または９のいずれかに記載の、薬学的組成物。
・（項目１１）  項目８または９において定義された薬学的組成物を調製するためのプロセスであって、ＣＤ８１タンパク質、またはその機能的な等価物、または項目４に記載のタンパク質、またはＣＤ８１タンパク質に特異的に結合する化合物が、薬学的に受容可能なキャリアーとの会合を起こさせる、プロセス。
・（項目１２）  ＨＣＶ感染の処置または診断のための医薬の製造における、ＣＤ８１タンパク質、その機能的な等価物またはＣＤ８１タンパク質に特異的に結合する化合物の、使用。
・（項目１３）  ＨＣＶ感染の処置または診断のための医薬の製造における、項目４に記載のタンパク質の、使用。
・（項目１４）  血清試料中に存在するＨＣＶ抗体に関するアッセイであって、当該試料中の抗体、公知の量のＨＣＶタンパク質と公知の量のＣＤ８１タンパク質、またはその機能的な等価物との間の競合結合を可能にする工程、および当該ＣＤ８１タンパク質に結合する公知の当該ＨＣＶタンパク質の量を測定する工程を包含する、アッセイ。
・（項目１５）  血清試料中のＨＣＶに関するアッセイであって、当該試料中の抗体と公知の量のＣＤ８１タンパク質、またはその機能的な等価物との間の競合結合を可能にする工程、および公知のＣＤ８１タンパク質結合の量を測定する工程を包含する、アッセイ。
・（項目１６）  必要に応じて標識されたＣＤ８１タンパク質、または機能的な等価物を含む、診断用キット。
・（項目１７）  項目１６に記載の診断用キットであって、ここで上記標識が、放射性標識、ペプチド、エピトープ、酵素、または他の生物活性化合物を含む、診断用キット。
・（項目１８）  宿主細胞への結合の原因であるＨＣＶ領域へ結合するための能力について化学的化合物をスクリーニングするための方法であって、スクリーニングされる化学的化合物の、そのＣＤ８１タンパク質、またはその機能的な等価物への結合を測定する工程を包含する、方法。
・（項目１９）  ＣＤ８１タンパク質、またはその機能的な等価物をコードする導入遺伝子を保有する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
・（項目２０）  トランスジェニック動物を作製するためのプロセスであって、非ヒト哺乳動物（好ましくはマウス）の胚へＣＤ８１タンパク質をコードするＤＮＡを導入する工程を包含する、プロセス。
・（項目２１）  ＨＣＶの処置または診断に使用するためのＣＤ８１タンパク質、またはその機能的な等価物をコードする、核酸分子。
・（項目２２）  標準条件下で項目２１に定義されるような核酸分子にハイブリダイズする、核酸分子。
・（項目２３）  高度にストリンジェントな条件下（２×ＳＳＣ、６５℃）で項目２１において定義されるような核酸分子にハイブリダイズする、核酸分子。
・（項目２４）  ＤＮＡを含む項目２１〜２３のいずれかに記載の、核酸分子。
・（項目２５）  ＨＣＶの制御下において保護性の免疫原として使用するためのＣＤ８１タンパク質、またはその機能的な等価物。
・（項目２６）  ＨＣＶの処置または診断に使用するためのＣＤ８１タンパク質またはその機能的な等価物を含む、融合タンパク質。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、ヒト、チンパンジー、ミドリザル、ハムスター、ラット、およびマウスのＣＤ８１遺伝子配列の間の相同性を示す配列アライメントである。
【図１Ａ】図１Ａは、スクリーニングの第１、第２、および第３ラウンドの模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、スクリーニングの最終ラウンドの模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｅ２結合細胞のＦＡＣＳスキャン分析である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｅ２結合細胞のＦＡＣＳスキャン分析である。
【図３】図３は、組換えＥ２によるＢ細胞へ結合する抗ＣＤ８１の用量依存的阻害を示す。データを、平均の蛍光強度の％阻害として表す。
【図４】図４は、抗ＣＤ８１抗体により免疫沈降された膜タンパク質画分の認識を示すイムノブロットである。レーン２：Ｅ２に対するチンパンジー抗血清で沈降した組換えＥ２；レーン３、チンパンジー免疫前血清で沈降した組換えＥ２  レーン４：ヤギ抗マウスＩｇＧで沈降した２０μｇの抗ＣＤ８１  ｍＡｂ（クローンＪＳ８１  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、レーン５：コントロール、（２０μｇの不適切なモノクローナル抗体、抗ヒトＣＤ９、ＡＴＣＣ）タンパク質Ａセファロースに結合したヤギ抗マウスＩｇＧで沈降した。レーン１：ポジティブコントロール、膜タンパク質の調製物。
【図５】図５は、ｐＴｈｉｏ−Ｈｉｓ  Ｃでクローン化されたＥＣ２フラグメントのヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列ならびにチオレドキシンのカルボキシ末端およびエンテロキナーゼ切断部位をコードする上流のプラスミド配列を示す。
【図６】図６は、誘導された試料からの抽出物中のチオレドキシン−ＥＣ２の予想される分子量のタンパク質バンドの外観を示す。
【図７】図７は、チオレドキシン−ＥＣ２の精製を示すＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色したゲルである。
【図８】図８は、ｐＧＥＸ−ＫＧ中へクローン化されたＥＣ２−Ｈｉｓ6フラグメントのヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列ならびにＧＳＴのカルボキシ末端、トロンビン切断部位および小さなグリシンスペーサーをコードする上流のプラスミド配列を示す。
【図９】図９は、ＧＳＴ−ＥＣ２−（Ｈｉｓ）6を発現するＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉクローンの全タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１０】図１０は、グルタチオンセファロースカラムでのタンパク質の精製後の、ＧＳＴ−ＥＣ２−（Ｈｉｓ）6のトロンビン開裂を示すＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図１１】図１１は、ヒトＣＤ８１の主要な細胞外ループ（ＥＣ２）を発現する組換え分子による、肝臓ガン細胞に結合するＥ２の用量依存的阻害を示す。
【図１２】図１２は、ＣＤ８１へのＨＣＶの結合を示す。
【図１３】図１３は、ヒトＣＤ８１遺伝子のｍｉｒｅトランスジェニックの産生に使用するための核酸ベクターの構築を示す。
【図１４】図１４は、ヒトＣＤ８１遺伝子のｍｉｒｅトランスジェニックの産生に使用するための核酸ベクターの構築を示す。
【図１５】図１５は、ヒトＣＤ８１遺伝子のｍｉｒｅトランスジェニックの産生に使用するための核酸ベクターの構築を示す。
【図１６】図１６は、ヒトＣＤ８１遺伝子のｍｉｒｅトランスジェニックの産生に使用するための核酸ベクターの構築を示す。
【図１７】図１７は、ヒトＣＤ８１遺伝子のｍｉｒｅトランスジェニックの産生に使用するための核酸ベクターの構築を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
（発明の詳細な説明）
（実施例１：本研究において使用される、組換えＥ２、細胞株、ベクターＤＮＡ、および抗体）
このスクリーニングにおいて用いた組換えＥ２を、ＣＨＯ細胞において生成した（Ｅ２−ＣＨＯ）（ＷＯ９７／０９３４９）。Ｅ２−ＣＨＯは、ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株Ｍｏｌｔ−４に結合する。Ｍｏｌｔ−４亜株（Ａ２Ａ６と名づける）を、個々のＭｏｌｔ−４細胞コロニーを拡大すること、および細胞表面に結合したＥ２−ＣＨＯの量を試験することにより同定した。Ａ２Ａ６亜株は、その親株より多くのＥ２−ＣＨＯ分子にその表面で結合することが見出され、従って、ＲＮＡの供給源として選択された。このことは、この亜株が、Ｅ２結合分子をコードする転写産物がより多量に示されていることを期待している。これらの細胞を、アッセイを用いて選択し、このアッセイによって、ヒトＢリンパ腫細胞株およびＴリンパ腫細胞株ならびに悪性肝細胞ガン細胞株を、Ｄ．Ｒｏｓａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１７５９（１９９６）に記載のように哺乳動物細胞（ＣＨＯ）において発現された組換えＥ２とともにインキュベートし、そしてＲｏｓａら（１９９６）に記載のようにビオチン標識抗Ｅ２抗体を用いて染色した。最大のＥ２結合能を有する細胞を、ＦａｃｓＶａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて選別し、そして限界希釈によってサブクローニングした。増殖するクローンを、ＦａｃｓにおいてＥ２結合についてスクリーニングし、そして最大の平均蛍光強度を有するクローンをさらに拡大させた。
ＷＯＰは、ポリオーマＴ抗原を発現するＮＩＨ３Ｔ３由来細胞である（Ｌ．ＤａｉｌｅｙおよびＣ．Ｂａｓｉｌｉｃｏ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５４，７３９（１９８５））。この細胞株では、ポリオーマの複製起点を含有するプラスミドがエピソーム的に増幅し得る。ｐＣＤＭ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて構築した組換えＤＮＡを、選択したトランスフェクタントから回収し得る。このトランスフェクタントは、ポリオーマの複製起点を含み、そして真核生物細胞における発現ライブラリーの操作のために設計される。
【００７１】
抗Ｅ２マウスモノクローナル抗体（２９１Ａ２）を、トランスフェクタントの細胞表面に結合したＥ２−ＣＨＯの検出のために用いた。この抗体を以下の通りに得た：ＢＡＬＢ−ｃマウスを、完全フロイントアジュバント中の組換えＥ２（１０μｇ）で３回免疫した。脾臓細胞と非生産性骨髄腫細胞との間の細胞融合を、標準的技術に従って行った。次いで、融合物からの上清を、Ｍｏｌｔ−４細胞に結合したＥ２に対する結合についてスクリーニングし、その結果、Ｅ２分子上に曝露された部位に結合したモノクローナル抗体を同定した。このような様式で同定した最も適切な抗体を、２９１Ａ２と名づけた。
【００７２】
（実施例２：ｃＤＮＡライブラリーの構築）
総ＲＮＡを、Ａ２Ａ６細胞株から、ＣｈｏｍｃｚｉｎｓｋｙおよびＳａｃｃｈｉ（Ｃｈｏｍｃｚｉｎｓｋｙ，Ｐ．およびＳａｃｃｈｉ，Ｎ．（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９）によって記載される方法に従って抽出した。ポリ（Ａ）＋を、オリゴ（ｄＴ）セルロースを用いて２回富化した。テンプレートとしての２μｇのこのＲＮＡから出発して、二本鎖の相補的なＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をオリゴ（ｄＴ）（１００ｎｇ）およびランダムヘキサマープライマー（１００ｎｇ）の存在下で用いて合成した。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いてこのｃＤＮＡを平滑末端化し、そしてＢｓｔＸＩリンカーと連結した。ＢｓｔＸＩリンカーは、発現ベクターｐＣＤＭ８のポリリンカー領域における同じ制限部位へのこのフラグメントの挿入を可能にする。リンカーに連結したｃＤＮＡをフェノール抽出し、そして硫酸アンモニウムを用いてエタノール沈殿して遊離のモノヌクレオチドを除去し、続いてＳｅｐｈａｃｒｙｌ  ５００クロマトグラフィー（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を行ってｃＤＮＡをサイズ分画した。５００ｂｐを超える精製ｃＤＮＡフラグメントをプールし、そしてＢｓｔＸＩ消化ｐＣＤＭ８と分子比約１：１で連結した。この最終連結反応物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１／Ｐ３の形質転換から、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯＲＡＤ）を用いるエレクトロポレーションにより用いた。計２×１０6ｃｆｕが増幅され、そしてｃＤＮＡライブラリーとして液体細菌培養物中にプールされた。
【００７３】
（実施例３：ライブラリースクリーニング）
スクリーニング手順は、大部分はＣａｍｐｂｅｌｌら（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｇ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．，Ｆｏｕｌｋｅｓ，Ｗ．Ｄ．およびＴｒｏｗｓｄａｌｅ，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５３２９−５３３８，１９９１）により記載された方法に基づいていた。富化を、磁性ビーズ（１回目〜３回目）（図１Ａ）およびパンニング技術（４回目）（図１Ｂ）を用いて実施した。
【００７４】
（３．１：１回目のスクリーニング）
計３７５μｇの増幅されたＤＮＡ（これは、独立した２×１０6個のｃＤＮＡクローンを示す）を調製した。各々のトランスフェクションでは、２５μｇのＤＮＡを、１０7個のＷＯＰ細胞と、３００Ｖ／５００μＦの条件下でＧｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて混合した。１５セットのトランスフェクションを行った。トランスフェクション後、細胞を、３７℃にて２日間インキュベートし、次いでトリプシン処理により細胞を脱離させ、そして３６０×ｇにて１０分間、４℃の遠心分離により５％  ＦＣＳおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを補充したＰＢＳで２回洗浄した。細胞ペレットを、５％ＦＣＳおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを補充したＰＢＳ中に再懸濁し（１０7細胞／ｍｌ）、次いでＥ２−ＣＨＯを、１０μｇ／ｍｌの濃度で細胞懸濁物に添加した。細胞を、氷上で６０分間インキュベートした。５％ＦＣＳおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを補充したＰＢＳで２回洗浄した後、細胞懸濁物を、２９１Ａ２抗体とともに氷上で３０分間インキュベートした。５％ＦＣＳおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを補充したＰＢＳで２回洗浄した後、１０μｌのヤギ抗マウスＩＧカップリングＤｙｎａｂｅａｄｓ（ＤＹＮＡＬ）を細胞懸濁物に添加した。混合物を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｉｘｅｒ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）を６０分間、４℃にて用いて穏やかに攪拌した。結合した細胞を、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（ＤＹＮＡＬ）を製造業者の使用説明書に従って用いて、非バインダーから分離し、このようにしてＥ２結合トランスフェクタントを富化した。プラスミドＤＮＡを、結合したトランスフェクト細胞から、Ｃａｍｐｂｅｌｌら（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｉ．Ｇ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．，Ｆｏｕｌｋｅｓ，Ｗ．Ｄ．およびＴｒｏｗｓｄａｌｅ，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５３２９−５３３８，１９９１）により記載されたプロトコルを用いて回収した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１／Ｐ３を、エレクトロポレーションによりこのプラスミドを用いて形質転換した。このＤＮＡプールを、最初の富化プール（１°ＥＰ）と呼ぶ。
【００７５】
（３．２：２回目のスクリーニング）
１°ＥＰ由来の計１５０μｇの増幅したＤＮＡを調製し、そして６セットのトランスフェクションを行い、そしてトランスフェクタントを、１回目のスクリーニングと同じ条件を用いて富化した。このＤＮＡプールを２°ＥＰと呼ぶ。
【００７６】
（３．３：３回目のスクリーニング）
２°ＥＰ由来の計２５μｇの増幅したＤＮＡを調製し、そして１セットのトランスフェクションを行った。トランスフェクタントを、１回目のスクリーニングと同じ条件を用いて富化した。この分離工程の間にトランスフェクタントは凝集体を形成した。この凝集は、無関係な接着分子の発現により生じ得る。これは、富化の効率を減少させ得る。なぜなら、これらの凝集体は、非特異的に磁性ビーズを含んでいたからである。この潜在的な問題を回避するために、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒによる２回目の分離後のトランスフェクタントを希釈し、そしてＴｅｒａｓａｋｉプレートにプレーティングした。顕微鏡下で同定された約１００個の単一細胞をプールし、そしてプラスミドＤＮＡをそれらから抽出した。この工程から調製したＤＮＡプールを、３°ＥＰと呼ぶ。
【００７７】
（３．４：４回目のスクリーニング）
２９１Ａ１モノクローナル抗体を、ペトリ皿（９０ｍｍ）中で１０μｇ／ｍｌの濃度で４℃にて一晩インキュベートした。
【００７８】
３°ＥＰ由来の計２５μｇの増幅したＤＮＡを調製し、そして１セットのトランスフェクションを行った。トランスフェクトした細胞を、上記のようにＥ２−ＣＨＯとともにインキュベートし、そして２９１Ａ２でコーティングしたプレート上に４℃にて６０分間置いた。５％ＦＣＳおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを補充した大過剰のＰＢＳを用いて２回リンスした後、結合した細胞を、溶解溶液で直接処理し、そしてプラスミドを上記のように抽出した。このＤＮＡプールを４°ＥＰと呼ぶ。
【００７９】
（３．４：組換えＥ２に結合する分子をコードするｃＤＮＡの同定）
ＤＮＡを、４°ＥＰに由来する単一コロニーから単離した。単一トランスフェクションを、各々のプラスミド調製物について、先のスクリーニング工程について用いたのと同じ条件を用いて行った。形質転換体のＥ２結合を、抗体結合体化Ｄｙｎａｂｅａｄｓの代わりにモノクローナルヤギ抗マウスＩｇのフィコエリトリン結合体化Ｆａｂフラグメントを用いて検出した。３°ＥＰおよび４°ＥＰのトランスフェクタントをまた、同様にして分析した。Ｅ２に結合した細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で検出し、そしてＬＹＳＩＳ  ＩＩプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した（図２）。Ｅ２−ＣＨＯは、精製工程が進むにつれてますます結合する。単一クローンＰ３は、強力なＥ２結合を示した。
【００８０】
（実施例４：ＤＮＡ配列決定および分析）
Ｐ３は、約１ｋｂのインサートを含む。トランスフェクションの際にＷＯＰへのＥ２結合を付与するｃＤＮＡクローンのインサートのＤＮＡ配列を、Ｔ７プライマーを使用して、自動化配列決定システムによって決定した。Ｔ７プライマー配列は、ｐＣＤＭ８のクローニング部位に隣接して位置する。この配列は、ＵＮＩＸコンピューター上でＧＣＧプログラムを使用して、ＧｅｎＢａｎｋデータベースを介してスクリーニングした。この分析によって、Ｐ３インサートの５’部分がヒトＣＤ８１（ＴＡＰＡ−１）と同一であることが明らかになった。３つの酵素（ＢｓｔＸＩ、ＨｉｎｃＩＩおよびＮｃｏＩ）を使用する、Ｐ３の制限分析もまた、ヒトＣＤ８１  ｃＤＮＡの制限マップと一致した。
【００８１】
（実施例５：組換えＥ２へのＣＤ８１の結合）
抗ＣＤ８１抗体を使用して、Ｅ２とＣＤ８１との間の相互作用を評価した。ＥＢＶ  Ｂ細胞を、漸増濃度の組換えＥ２とともに４℃で１時間インキュベートし、次いで、抗ＣＤ８１モノクローナル抗体（クローンＪＳ−８１，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて染色した。図３に示されるように、組換えＥ２は、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）への抗ＣＤ８１抗体の結合を競合的に阻害することが見出された。このデータは、平均蛍光強度の阻害％として表される（Ｒｏｓａら、１９９６）。
【００８２】
さらに、ウェスタンブロットにおいて抗ＣＤ８１と反応するＥ２は、物質を沈降させた（図４）。この図は、膜タンパク質画分が抗ＣＤ８１抗体によって免疫沈降したというＥ２認識を示す。Ａ２Ａ６細胞株から調製された約３００μｇの膜タンパク質抽出物を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の８ｍＭ  ＣＨＡＰＳに可溶化し、１０μｇの組換えＥ２（レーン２および３）、２０μｇの抗ＣＤ８１ｍＡｂ（クローンＪＳ８１；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（レーン４）、またはコントロールとして、２０μｇの無関係のモノクローナル抗体（抗ヒトＣＤ９、ＡＴＣＣ）（レーン５）とともに４℃で２時間インキュベートした。そして最終的に、プロテインＡセファロース（ＣＬ−４Ｂ、ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合したＥ２に対するチンパンジー抗血清（レーン２）、チンパンジー免疫前血清（レーン３）、またはヤギ抗マウスＩｇＧ（レーン４および５）を用いて沈降させた。このペレットを、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中に溶解し、そして非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。エレクトロブロッティング後に、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１μｇ／ｍｌの組換えＥ２とともに一晩室温でインキュベートし、そして２９１Ａ２抗Ｅ２モノクローナル抗体とともに２時間インキュベートした。免疫沈降したタンパク質に結合しているＥ２を、抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ結合ポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。陽性コントロールとして、膜タンパク質もまたゲル上にロードした（レーン１）。分子量標準の移動度を左側にキロダルトンで示す。
【００８３】
ＣＤ８１はまた、ビオチン標識したＥ２または抗ＣＤ８１を用いた免疫組織化学的染色によって示されるように、新鮮なリンパ球および肝細胞において発現される（データは示さず）。
【００８４】
ＣＤ８１がリガンドのインターナリゼーションを媒介し得るか否かを評価するために、本発明者らは、ＣＤ８１が、Ｂリンパ球の表面上のＣＤ１９およびＣＤ２１と複合体を形成する（Ｄ．Ｔ．ＦｅａｒｏｎおよびＲ．Ｈ．Ｃａｒｔｅｒ，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３，１２７）という事実を探索した。Ｂ細胞をＥ２とともに、３７℃で異なる時間でインキュベートし、細胞表面上のＣＤ１９またはＣＤ２１レベルを免疫染色によって測定した。Ｂ細胞のＥ２とのインキュベーションによって、ＣＤ１９およびＣＤ２１の両方のダウンレギュレーションが生じた（データは示さず）。従って、ＣＤ８１がこれらのリガンド両方のインターナリゼーションを媒介し得るかのように思われる。
【００８５】
（実施例６：ＣＤ８１の主要細胞外ループは組換えＥ２およびウイルス粒子に結合する）
Ｅ２タンパク質に結合するＣＤ８１ドメインをマップするために、本発明者らの取り組みは、このタンパク質のＥＣ２親水性細胞外ループに焦点を当てた。このフラグメントを、チオレドキシン−ＥＣ２融合タンパク質（これは、チオレドキシンとＥＣ２との間にエンテロキナーゼ部位を有する）およびＧＳＴ−ＥＣ２融合タンパク質（これは、ＧＳＴとＥＣ２との間にトロンビン部位を有する）としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして６ヒスチジンタグをこのタンパク質のカルボキシ末端に付加した。本発明者らは、両方のタンパク質が発現されかつＨＣＶ  Ｅ２に結合し得ることを示す。競合実験において、本発明者らはまた、精製された融合タンパク質およびＧＳＴ−トロンビン−ＥＣ２−（Ｈｉｓ）6から切り出されたＥＣ２−ＨｉｓフラグメントがＣＤ８１発現細胞の表面上のＥ２の結合を阻害し得ることを示す。
【００８６】
（６．１  ｐＴｈｉｏ−ＨｉｓにおけるＥＣ２のクローニング）
図５は、ｐＴｈｉｏ−Ｈｉｓ  ＣにクローニングされたＥＣ２フラグメントのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列ならびにチオレドキシンのカルボキシ末端およびエンテロキナーゼ切断部位をコードする上流プラスミド配列を示す。示されるように、ＥＣ２を、エンテロキナーゼ部位によってチオレドキシンとインフレームで融合する。このエンテロキナーゼ部位は、融合タンパク質からチオレドキシン部位を除去するために使用され得る。
【００８７】
ＥＣ２をコードするフラグメントを、プラスミドｐＣＤＭ８／Ｐ３から、以下のオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ増幅した：
【００８８】
【化１】
2012125246.tif 000002
標準的なクローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を使用して、ＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、同じ制限酵素で消化したｐＴｈｉｏ−Ｈｉｓ  Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、そしてＴｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。形質転換体を制限酵素分析およびプラスミドのＤＮＡ決定によって選択した後、予測されるチオレドキシンエンテロキナーゼ部位−ＥＣ２融合タンパク質をコードする正しい構築物を同定した。選択されたクローンのグリセロールバッチを−８０℃で保存した。
【００８９】
ＩＰＴＧ添加の前後に、チオレドキシン−ＥＣ２発現クローンの全タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、タンパク質発現を分析した。図６は、誘導されたサンプルからの抽出物中の推定分子量（２３．４ｋＤａ）のタンパク質バンドが現れたことを示す。この図はまた、融合タンパク質のＥ２との反応性を示す。ｐＴｈｉｏ−ｈｉｓＣ−ＥＣ２プラスミドを含むＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉクローンおよびインサートを欠失したｐＴｈｉｏ−ＨｉｓＣプラスミドを含むＴＯＰ１０クローンを誘導し、可溶性タンパク質抽出物を両方のクローンから調製し、そしてＥ２タンパク質を用いてＦａｒウェスタンブロットに供した。このブロットについて、タンパク質サンプルを、３×ローディングサンプル緩衝液（ＬＳＢ）を使用して１×ＬＳＢ（５％ｗ／ｖ  ＳＤＳ、１０％ｖ／ｖ  グリセロール、６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０５％ブロモフェノールブルー）を作製した。サンプルを１５％ポリアクリルアミドゲルに流し、そしてＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。膜をブロッキング溶液（ＰＢＳ、１０％  ｗ／ｖスキムミルク、０．０５％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０）中で、３０分間インキュベートした。１μｇ／ｍｌのＣＨＯ−Ｅ２を含むブロッキング溶液とともに４℃で１５時間インキュベートした後、膜を１：２５０に希釈した２９１Ａ２抗Ｅ２モノクローナル抗体とともに２時間インキュベートし、そして１：２０００に希釈した過酸化したヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）とともに１時間インキュベートした。全てのインキュベーション工程の間にブロッキング溶液（これはまた、抗体を希釈するためにもまた使用される）を使用して３回洗浄工程を行った。最終的にＰＢＳで洗浄した後、膜をルミノール（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともに１分間インキュベートし、そしてＨｙｐｅｒ−ｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に曝露した。
【００９０】
これらの図に示され得るように、チオレドキシン−ＥＣ２の分子量に対応するバンドは、ｐＴｈｉｏ−ＨｉｓＣ−ＥＣ２からの可溶性タンパク質をロードしたレーンにおいて見られた。このようなバンドは、ｐＴｈｉｏ−ＨｉｓＣクローンの可溶性タンパク質をロードしたレーンには存在しなかった。
【００９１】
（６．２  チオレドキシン−ＥＣ２の精製）
チオレドキシン−ＥＣ２の精製について、以下の手順を開発した：
１）細胞の浸透圧ショック、２）３０％飽和硫酸アンモニウムでのタンパク質沈降、および３）ＩＭＡＣ。浸透圧ショックののち、融合タンパク質の約５０％を細胞から夾雑タンパク質とともに放出させた。硫酸アンモニウム沈澱は、大量の夾雑タンパク質を欠失したチオレドキシン−ＥＣ２を含んだペレットを生じた。再懸濁した沈澱物のＩＭＡＣは、融合タンパク質を生じ、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価されたように約８５％の純度であった。この手順を用いて、本発明者らは、１リットルの培養物から５ｍｇのチオレドキシン−ＥＣ２を精製した。この手順は、以下で詳細に記載される。
【００９２】
チオレドキシン−ＥＣ２を発現するＥ．ｃｏｌｉクローンを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５００ｍｌのＬＢ培地中でインキュベートした。ＯＤ600＝０．５で、０．５ｍＭのＩＰＴＧを培養物に添加し、そして増殖をさらに３．５時間、３７℃で継続した。次いで、培養物を４０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、細胞ペレットを５０ｍｌの氷冷高張溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％スクロース、ｐＨ  ８．０）で再懸濁し、そして１０分間水上に置いた。再懸濁した細胞を上記のように再び遠心分離し、そしてペレットを低張緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ,２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁して、細胞に浸透圧ショックを与えた。０℃で２０分間懸濁物を１２，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した後、上清を、ＮＨ2（ＳＯ4）2の室温飽和溶液を使用して、３０％  ＮＨ2（ＳＯ4）2にした。懸濁物を４℃で一晩インキュベートし、次いで、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを１５ｍｌの２０ｍＭ  リン酸緩衝液、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ６．０を使用して再懸濁して、遠心分離によって明澄化した。そしてこれを、同じ緩衝液で平衡化したニッケル活性化したキレート化セファロースファストフロー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の２ｍｌのカラムにロードした。
【００９３】
吸着後、カラムを１０ｍｌの平衡化緩衝液で洗浄し（流速０．５ｍｌ／分）、次いで、チオレドキシン−ＥＣ２を、２０ｍＭ  リン酸緩衝液、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ６．０中の０〜５０ｍＭ  イミダゾールの３０ｍｌの勾配を使用して溶出し、次いで、１０ｍｌの４００ｍＭイミダゾールで無勾配溶出した。２．４ｍｌの画分を回収した。組換えタンパク質を含む画分をプールし、ＰＢＳに対して透析し、そして−２０℃で保存した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてタンパク質含量を、標準タンパク質としてＢＳＡを使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりアッセイした。
【００９４】
精製したチオレドキシン−ＥＣ２を図７に示す。
【００９５】
（６．３  ｐＧＥＸ−ＫＧにおけるＥＣ２−（Ｈｉｓ）6のクローニング）
図８は、ｐＧＥＸ−ＫＧにおいてクローニングされたＥＣ２−（Ｈｉｓ）6フラグメントのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列、ならびにＧＳＴのカルボキシ末端、トロンビン切断部位、および小さなグリシンスペーサーをコードする上流プラスミド配列を示す。示されるように、ＥＣ２を、トロンビン部位を介してＧＳＴとインフレームで融合する。このトロンビン部位は、融合タンパク質からＧＳＴを除去するために使用され得る。トロンビン部位とＥＣ２との間に位置するグリシンリッチスペーサーは、融合タンパク質のトロンビンによる切断を容易にする（Ｇｕａｎ，Ｋ．Ｌ．およびＤｉｘｏｎ，Ｊ．Ｅ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２，２６２−２６７）。
【００９６】
ＥＣ２をコードするフラグメントを、プラスミドｐＣＤＭ８／Ｐ３から、以下のオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ増幅した：
【００９７】
【化２】
2012125246.tif 000003
ＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じ制限酵素で消化したｐＧＥＸ−ＫＧ（Ｇｕａｎ，Ｋ．Ｌ．，およびＤｉｘｏｎ，Ｊ．Ｅ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２，２６２−２６７）に連結し、そしてＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。形質転換体を制限酵素分析およびプラスミドのヌクレオチド配列決定によって選択した後、予測されるサイズのインサートを有するプラスミドが、上流トロンビンおよびＧＳＴコード配列とインフレームで正しいＥＣ２−（Ｈｉｓ）6配列を有することを見出した。次いで、選択されたＴＯＰ１０クローンから調製されたプラスミドを、ＢＬ２１細胞に形質転換した。選択されたクローンのグリセロールバッチを−８０℃で保存した。
【００９８】
図９は、ＧＳＴ−ＥＣ２−（Ｈｉｓ）6を発現するＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉクローンの全タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを表す。この分析は、誘導されたサンプルの抽出物において、推定分子量（３９ｋＤａ）を有するタンパク質バンドが存在することを明らかに示す。対応するＦａｒウェスタンブロットは、Ｅ２が融合タンパク質と特異的に反応することを明示する。
【００９９】
（６．４  ＧＳＴ−ＥＣ２−（Ｈｉｓ）6の精製）
ＧＳＴ−ＥＣ２−（Ｈｉｓ）6融合タンパク質をグルタチオンセファロースカラムで精製し、そしてトロンビンで消化した（図１０）。消化後、ＥＣ２−（Ｈｉｓ）6を部分を、ＧＳＴフラグメントを除去するためのグルタチオンセファロースカラムおよびＩＭＡＣクロマトグラフィーから構成されているさらなる２つのクロマトグラフィー工程によってさらに精製した。この手順を以下で詳細に示す。
【０１００】
ＧＳＴ−ＥＣ２融合タンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉクローンの１つのコロニーを１０ｍｌのＬＢ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンに接種し、そして細胞を３７℃で一晩増殖させた。次いで、培養物を５００ｍｌの培地中に接種し、そしてＯＤ600＝０．５に到達したときに、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを添加した。３．５時間後に細胞を遠心分離によって回収し、９ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、そしてＦｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ（ＳＬＭ  Ａｍｉｃｏｎ）を使用して、１８，０００ｐｓｉで２回通過させることにより破壊した。溶解物を３０，０００×ｇで遠心分離し、そして上清を、ＰＢＳ中で平衡化した、１ｍのグルタチオンセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラムにロードした。
【０１０１】
このカラムを１０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、そして４ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ還元型グルタチオン、ｐＨ  ８．０で溶出した。この溶出されたタンパク質をＰＢＳに対して透析し。そして−２０℃で保存した。
【０１０２】
（６．５  ＧＳＴ−ＥＣ２−（Ｈｉｓ）6のトロンビンでの消化およびＥＣ２−（Ｈｉｓ）6の精製）
グルタチオンセファロースカラムから回収された９．６ｍｇのタンパク質を、２２ユニットのトロンビン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で８時間室温で消化し、次いで、この酵素を０．１３ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ）を使用して不活化させた。次いで、反応混合物をＰＢＳに対して透析し、そしてＰＢＳで平衡化した０．５ｍｌのＧＳＴ−セファロースカラムにロードした。カラムを１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。流出および洗浄をプールし、そして０．２５０ｍｌのニッケル活性化したキレート化セファロースカラムにロードした。ＥＣ２−（Ｈｉｓ）6を、１ｍｌの２０ｍＭ  リン酸緩衝液、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、４００ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ  ７．８で溶出してカラムから回収した。次いで、透析をＰＢＳに対して行った。
【０１０３】
（実施例７：ウイルスへのＣＤ８１フラグメントの結合）
ヒト（マウスではない）のＣＤ８１のＥＣ２ループを含むタンパク質をウェスタンブロットにおいてＥ２と結合させ（データは示さず）、そしてこれは、Ｅ２がヒト細胞へ結合することを阻害した（図１１）。キメラタンパク質をポリスチレンビーズにコーティングして、既知量のウイルスＲＮＡ分子を含む感染血漿とともにインキュベートした。洗浄後、ビーズに結合したウイルスを、結合したＨＣＶ  ＲＮＡの量について定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。この実験を以下で記載のように行った。
【０１０４】
ポリスチレンビーズ（直径１／４インチ）（Ｐｉｒｅｃｅ）を、クエン酸緩衝液（ｐＨ  ４）中の精製したＥＣ２組換えタンパク質で室温で一晩コーティングした。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ＴＥＮ）緩衝液中の２％ＢＳＡで１時間飽和させた後、各ビーズを、５×１０5ＨＣＶ  ＲＮＡ分子を含む、２００μｌのＴＥＮ希釈感染チンパンジー血漿中で２時間３７℃でインキュベートした。
【０１０５】
阻害実験については、ＥＣ２コーティングポリスチレンビーズを１０μｇ／ｍｌの精製したモノクローナル抗体とともに１時間室温でインキュベートした。次いで、これをウイルスとともにインキュベートした。各ビーズを１５ｍｌのＴＥＮ緩衝液を用いて自動化洗浄機（Ａｂｂｏｔ）で５回洗浄し、そしてウイルスＲＮＡをＶｉｒａｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、抽出した。ＲＮＡ（８ｍｌ）を、１００ｐｍｏｌのＨＣＶアンチセンスプライマー：ＣＧＧＴＴＣＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＴＡＴＧ、４０ＵのＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５ｎｍｏｌのｄＮＴＰ、１１０ｎｍｏｌのＭｇＣｌ2、１０Ｕ  Ｍ−ＭｕＲＴ（Ｂｏｈｅｒｉｎｇｅｒ）を含む、２０ｍｌの緩衝液Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｔａｑ  Ｍａｎ）中、４２℃で９０分間逆転写した。ｃＤＮＡ（２０ｍｌ）を、１００ｐｍｏｌのＨＣＶセンスプライマー：ＴＣＴＴＣＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡ、５ｐｍｏｌの蛍光検出プローブ：５’（ＦＡＭ）ＴＧＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＡ（ＴＡＭＲＡ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ａｎｄ  ＵｐｊｏｈｎのＤａｖｉｄ  Ｓｌａｄｅ氏から提供していただいた）、１５ｎｍｏｌ  ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ2、および１．２５Ｕ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含む、５０ｍｌの緩衝液Ａ中でＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＡＢＩ  ７７００配列検出システム（４５サイクル）を使用して増幅した。全ての反応を、ＨＣＶ（遺伝子型Ｉａ）感染血漿（３０ｍＥｑ／ｍｌのｂＤＮＡ力価）を使用して定量して、標準曲線を作成した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒからの配列検出ソフトウェアは、以前に記載されている（Ｕ．Ｅ．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｃ．Ａ．ＨｅｉｄおよびＰ．Ｍ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６，９９５（１９９６））。
【０１０６】
図１２に示されるように、ヒトＣＤ８１細胞外ループを含む分子は、濃度依存的様式においてＨＣＶと結合し、そして抗ＣＤ８１抗体とキメラタンパク質のプレインキュベーションによってウイルス結合が阻害された。さらに組換えＥ１／Ｅ２エンベロープヘテロ二量体（Ｑ−．Ｌ．Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，１２９４（１９９４））を用いたワクチン接種による相同なチャレンジから防御されたチンパンジー由来の血清は、ビーズにコーティングされたＣＤ−８１へのＨＣＶの結合を完全に阻害したが、ワクチン接種され、防御されなかった動物由来の血清が阻害しなかった（データは示さず）。
【０１０７】
これらのデータは、ヒトＣＤ８１の発現、特にその主要細胞外ループは、Ｅ２だけでなく、ＨＣＶ粒子もまた結合するために十分であることを示す。ＣＤ８１の広範な分布によって（Ｓ．Ｌｅｖｙ，Ｓ．Ｃ．ＴｏｄｄおよびＨ．Ｔ．Ｍａｅｃｋｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６，８９（１９９８））、これらの結果は、ＨＣＶが結合しかつ肝細胞以外の種々の細胞によってインターナライズされ得ることを意味する。事実、ＨＣＶ  ＲＮＡは、Ｔリンパ球およＢリンパ球ならびに単球において見出された（Ｋ．Ｂｌｉｇｈｔ，Ｒ．Ｒ．Ｌｅｓｎｉｅｗｓｋｉ，Ｊ．Ｔ．ＬａＢｒｏｏｙおよびＥ．Ｊ．Ｇｏｗａｎｓ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２０，５５３（１９９４）；Ｐ．Ｂｏｕｆｆａｒｄら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６６，１２７６（１９９２）；Ｚｉｇｎｅｇｏら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１５，３８２（１９９２））。結合しているどんなウイルスが引き続き侵入し、全ての細胞型において感染するかは、効率的なインビトロでのＨＣＶの培養システムがないために、明らかではない。ＣＤ８１がＨＣＶ結合レセプターであり、そしてさらなる因子がウイルス融合または感染性には必要であることが十分で有り得る。
【０１０８】
ＣＤ８１は、異なる細胞型における異なる分子複合体に関与し、事実、ＨＣＶ感染についてのレセプターとして作用するか、または細胞を標的化するために調節シグナルを送達する能力に影響を与え得る。例えば、これは、上皮細胞および造血細胞上のインテグリンと結合する（Ｆ．Ｂｅｒｄｉｔｃｈｅｖｓｋｉ，Ｍ．ＺｕｔｔｅｒおよびＭ．Ｅ．Ｈｅｍｌｅｒ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ７，１９３（１９９６）；Ｂ．Ａ．Ｍａｎｎｉｏｎ，Ｆ．Ｂｅｒｄｉｔｃｈｅｖｓｋｉ，Ｓ．−Ｋ．Ｋｒａｅｆｔ，Ｌ．Ｂ．ＣｈｅｎおよびＭ．Ｅ．Ｈｅｍｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７，２０３９（１９９６））が、これは、Ｂ細胞上のＣＤ２１、ＣＤ１９、およびＬｅｕ１３を含むシグナル伝達複合体の一部である（Ｌ．Ｅ．Ｂｒａｄｂｕｒｙ、Ｇ．Ｓ．Ｋａｎｓａｓ、Ｓ．Ｌｅｖｙ、Ｒ．Ｌ．ＥｖａｎｓおよびＴ．Ｆ．Ｔｅｄｄｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，２８４１（１９９１））。この複合体は、Ｂ細胞の活性化の閾値を低下させることによって抗原特異的刺激を容易にすることが示された（Ｄ．Ｔ．ＦｅａｒｏｎおよびＲ．Ｈ．Ｃａｒｔｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｕｎｏｌ．１３，１２７（１９９５））。ＨＣＶは、ＥＢＶレセプター（ＣＤ２１）を含む同じ複合体の一部である分子を使用するようである（Ｎ．Ｒ．Ｃｏｏｐｅｒ、Ｍ．Ｄ．ＭｏｏｒｅおよびＧ．Ｒ．Ｎｅｍｅｒｏｗ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｕｎｏｌ．６，８５（１９８８））ことを注意するに値し、そしてＥＢＶが、Ｂリンパ球を活性化かつ不死化する能力が十分に示されている。
【０１０９】
（実施例８：トランスジーンの構築）
以下の構築物を設計し、そしてヒトＣＤ８１についてのマウストランスジェニックを生成するために作製した。
【０１１０】
（１．ヒトＣＤ８１  ｃＤＮＡフラグメントに対するウサギβグロブリン遺伝子のスプライシングシグナル付加およびポリアデニル化シグナル付加）  ｐＣＤＭ８／Ｐ３クローンからのヒトＣＤ８１  ｃＤＮＡフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ  ＩＩ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に移入し、次いで、ｐＳＰＰプラスミド（ＢＭＧＳＣ発現ベクターに由来する）（Ｋａｒａｓｕｙａｍａ博士（Ｂａｓｅｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）から贈与された）に、２つのフラグメント（一方は、第２のイントロンを含み、他方は、ウサギβグロブリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む（それぞれ、９０２〜１５４７位および１５４３〜２０８１位））の間に挿入した（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｍ１２６０３号）（図１１におけるｐＳＲ１Ｐ）。得られた組替えＤＮＡフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ  ＩＩ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から、ＳａｌＩ（５’末端）およびＢａｍＨＩ（３’末端）によって切り出した。
【０１１１】
（２．ヒトＣＤ８１の遍在性の発現のためのトランスジーンの作製）
ｐＳＲ１ＰインサートのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＣＡＧＧＳ（条件つきでＪ．Ｍｉｙａｚａｋｉ博士（Ｏｓａｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊａｐａｎ）から贈与された）の改変されたプラスミドであるｐＣＡＧｍｃｓの適合性の制限部位に挿入した。ｐＣＡＧｍｃｓは、ニワトリβアクチンプロモーターおよびヒトサイトメガロウイルスエンハンサーを含む（Ｎｉｗａ，Ｈ．ら、Ｇｅｎｅ  １０８，ｐ１９３（１９９１））（図１２におけるｐＣＡＧＳＲ１Ｐｐ）。３．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを接合子注入に供した。
【０１１２】
（３．ヒトＣＤ８１の肝臓特異的発現のためのトランスジーンの作製）
ｐＳＲ１ＰのＳａｌＩ部位を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いた平滑末端形成の後に、ＢａｍＨＩリンカー連結によってＢａｍＨＩ部位に変更した。このＢａｍＨＩフラグメントを、ＡＬＢ  ｅ／ｐ  プラスミド（マウスアルブミンプロモーターおよびエンハンサーを有する（Ｐｉｎｋｅｒｔ，Ｃ．Ａ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１，ｐ２６８（１９８７）））（Ｆ．Ｃｈｉｓａｒｉ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）から受け取った）のＢａｍＨＩ部位に挿入した（図１３のｐＡＩｂＳＲＩＰ）。４．５ｋｂのＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを、接合子注入に供した。
（４．ヒトＣＤ８１のＢリンパ球特異的発現のためのトランスジーンの作製）
マウスイムノグロブリン重鎖エンハンサー（Ａ．Ｋｕｄｏ博士（Ｂａｓｅｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）から贈与された）の７００ｂｐ  ＢａｍＨＩフラグメントおよびマウスκ軽鎖プロモーターの２．３ｋｂ  ＸｂａＩ−ＳａｃＩフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ  ＩＩ（＋）ベクターにサブクローニングした。ＳａｃＩ部位を、上記のＨｉｎｄＩＩＩリンカーライゲーションによって、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に変更した。ｐＣＡＧＳＲ１ＰのＢａｍＨＩ部位を、まずＮｏｔＩ部位に変更した。次いで、改変されたｐＣＡＧＳＲ１Ｐ構築物のプロモーター領域を、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限消化によって除去し、そしてイムノグロブリンプロモーター−エンハンサーフラグメント（図１５におけるｐＥｈＫｐＳＲ１Ｐ）と置き換えた。５．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを接合子注入に供した。
【０１１３】
本発明者らのデータは、ＣＤ８１がＨＣＶについての結合レセプターであり、そしてＨＣＶ感染病理についての機構に新たな知見を提供し得ることをともに示す。ＣＤ８１はＢ細胞表面上の活性化複合体と結合するので、本知見は、たとえＢ細胞におけるウイルス複製が存在しないとしてもクリオグロブリン血症に関連するＨＣＶの病理を説明し得る。さらに、ＨＣＶとＣＤ１との間の相互作用を同定することによって、ウイルスエンベロープ上の保存された中和エピトープをマッピングすることを補助し得る。これは、有効なワクチンを開発し、そしてウイルス中和のためのデコイレセプターを提供するために重要であるはずである。
【図１】
2012125246.tif 000004
【図１Ａ】
2012125246.tif 000005
【図１Ｂ】
2012125246.tif 000006
【図２Ａ】
2012125246.tif 000007
【図２Ｂ】
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【図３】
2012125246.tif 000009
【図４】
2012125246.tif 000010
【図５】
2012125246.tif 000011
【図６】
2012125246.tif 000012
【図７】
2012125246.tif 000013
【図８】
2012125246.tif 000014
【図９】
2012125246.tif 000015
【図１０】
2012125246.tif 000016
【図１１】
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【図１２】
2012125246.tif 000018
【図１３】
2012125246.tif 000019
【図１４】
2012125246.tif 000020
【図１５】
2012125246.tif 000021
【図１６】
2012125246.tif 000022
【図１７】
2012125246.tif 000023
【配列表】
2012125246000001.app