(57)【要約】      （修正有）【課題】短時間でより簡便、且つ安価にHBVの薬剤耐性株を検出するための手段を提供する。【解決手段】Ｂ型肝炎ウイルスの薬剤耐性に関連する多型配列をＬＡＭＰ増幅するための核酸プライマーセットであって、特定の配列で示されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３であるプライマーセット１、および特定の配列で示されるＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマーであるプライマーセット２からなる群より少なくとも１つ選択されたプライマーセットを含む核酸プライマーセット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルスの薬剤耐性に関連する多型配列をＬＡＭＰ増幅するための核酸プライマーセットであって、
前記多型配列は、前記ウイルスのポリメラーゼ領域の２０４位および２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列であり、
前記核酸プライマーセットは、ＦＩＰプライマーと、Ｆ３プライマーと、ＢＩＰプライマーと、Ｂ３プライマーとを具備し、
前記ＦＩＰプライマーは配列番号１、前記ＢＩＰプライマーは配列番号２、前記Ｆ３プライマーは配列番号１３、前記Ｂ３プライマーは配列番号１４でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット１、および
前記ＦＩＰプライマーは配列番号３、前記ＢＩＰプライマーは配列番号４、前記Ｆ３プライマーは配列番号１３、前記Ｂ３プライマーは配列番号１５でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット２
からなる群より少なくとも１つ選択されたプライマーセットを含む核酸プライマーセット。
【請求項２】
前記核酸プライマーセットは更にループプライマーを具備し、当該ループプライマーは、配列番号１９で示されるプライマーおよび／または配列番号２０で示されるプライマーである請求項１に記載の核酸プライマーセット。
【請求項３】
請求項１または２に記載の核酸プライマーセットを用いたＬＡＭＰ増幅で得られた増幅産物について、多型配列を特定するための核酸プローブセットであって、
前記多型配列は、前記ウイルスのポリメラーゼ領域の２０４位および２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列であり、
当該核酸プローブセットが、配列番号２２で示されるプローブ、配列番号２３で示されるプローブ、配列番号２４で示されるプローブ、配列番号２５で示されるプローブ、配列番号２６で示されるプローブ、配列番号２７で示されるプローブ、配列番号２８で示されるプローブ、配列番号２９で示されるプローブ、配列番号３０で示されるプローブ、配列番号３１で示されるプローブ、配列番号３２で示されるプローブ、配列番号３３で示されるプローブ、配列番号３４で示されるプローブ、配列番号３５で示されるプローブ、配列番号３６で示されるプローブ、配列番号３７で示されるプローブおよび／またはこれらの相補鎖により示されるプローブを含む核酸プローブセット。
【請求項４】
Ｂ型肝炎ウイルスの薬剤耐性株に関連する多型配列を特定するためのアッセイキットであって、
前記多型配列は、前記ウイルスのポリメラーゼ領域の２０４位および２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列であり、
前記アッセイキットは、核酸プライマーセットと核酸プローブセットとを含み、
（１）前記核酸プライマーセットは、請求項１または２に記載の核酸プライマーセットであり、
（２）前記核酸プローブセットは、請求項３に記載の核酸プローブセットである
Ｂ型肝炎ウイルスの薬剤耐性株に関連する多型配列を特定するためのアッセイキット。
【請求項５】
Ｂ型肝炎ウイルスの薬剤耐性株を検出するための核酸プライマーセットであって、
請求項１または２に記載の核酸プライマーセットと、
以下の核酸プライマーセット；
ポリメラーゼ領域の１８１位および２０４位のアミノ酸をコードする塩基配列を増幅するための、
前記ＦＩＰプライマーが配列番号５、前記ＢＩＰプライマーが配列番号６、前記Ｆ３プライマーが配列番号１６、前記Ｂ３プライマーが配列番号１７でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット３、および／または
前記ＦＩＰプライマーが配列番号７、前記ＢＩＰプライマーが配列番号８、前記Ｆ３プライマーが配列番号１６、前記Ｂ３プライマーが配列番号１８でそれぞれ示されるプライアーであるプライマーセット４；と
を含む核酸プライマーセット。
【請求項６】
前記核酸プライマーセットは更にループプライマーを具備し、当該ループプライマーは、配列番号１９で示されるプライマー、配列番号２０で示されるプライマーおよび／または配列番号２１で示されるプライマーである請求項５に記載の核酸プライマーセット。
【請求項７】
請求項５または６に記載の核酸プライマーセットを用いたＬＡＭＰ増幅で得られた増幅産物について、多型配列を特定し、Ｂ型肝炎ウイルスの薬剤耐性株を検出するための核酸プローブセットであって、
配列番号２２で示されるプローブ、配列番号２３で示されるプローブ、配列番号２４で示されるプローブ、配列番号２５で示されるプローブ、配列番号２６で示されるプローブ、配列番号２７で示されるプローブ、配列番号２８で示されるプローブ、配列番号２９で示されるプローブ、配列番号３０で示されるプローブ、配列番号３１で示されるプローブ、配列番号３２で示されるプローブ、配列番号３３で示されるプローブ、配列番号３４で示されるプローブ、配列番号３５で示されるプローブ、配列番号３６で示されるプローブ、配列番号３７で示されるプローブ、配列番号４７で示されるプローブ、配列番号４８で示されるプローブ、配列番号４９で示されるプローブ、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブおよび配列番号６１で示されるプローブおよびこれらの相補鎖により示されるプローブからなる群より少なくとも１つ選択される核酸プローブ。
【請求項８】
Ｂ型肝炎ウイルスの薬剤耐性株を検出するためのアッセイキットであって、前記アッセイキットは、核酸プライマーセットと核酸プローブセットとを含み、
（１）前記核酸プライマーセットは、請求項５または６に記載の核酸プライマーセットであり、
（２）前記核酸プローブセットは、請求項７に記載の核酸プローブセットである
Ｂ型肝炎ウイルスの薬剤耐性株を検出するためのアッセイキット。
【請求項９】
Ｂ型肝炎ウイルスの薬剤耐性株を検出する方法であって、
（Ａ）請求項５または６のいずれかに記載の核酸プライマーセットを用いて試料溶液中のＢ型肝炎ウイルス核酸をＬＡＭＰ増幅し、増幅産物を得ることと、
（Ｂ）前記増幅産物と、以下の核酸プローブ；
（ａ）配列番号２２で示されるプローブ、配列番号２３で示されるプローブ、およびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブ；および
（ｂ）配列番号２４で示されるプローブ、配列番号２５で示されるプローブ、配列番号２６で示されるプローブ、配列番号２７で示されるプローブ、配列番号２８で示されるプローブ、配列番号２９で示されるプローブ、配列番号３０で示されるプローブ、配列番号３１で示されるプローブ、およびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブ；および
（ｃ）配列番号３２で示されるプローブ、配列番号３３で示されるプローブ、配列番号３４で示されるプローブ、配列番号３５で示されるプローブおよびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブ；および
（ｄ）配列番号３６で示されるプローブ、配列番号３７で示されるプローブおよびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブ；および
（ｅ）配列番号４７で示されるプローブ、配列番号４８で示されるプローブ、配列番号４９で示されるプローブ、およびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブ；および
（ｆ）配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、およびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブ；
とを反応させ、ハイブリダイゼーションの有無に基づいて当該多型配列を特定し、前記ウィルスの薬剤耐性を判定することと、
を含むＢ型肝炎ウィルスの薬剤耐性株の検出方法。
【請求項１０】
Ｂ型肝炎ウイルスの薬剤耐性株を検出する方法であって、
（Ａ）（ａ）前記ウイルスのポリメラーゼ領域の２０４位および２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列であり、
前記核酸プライマーセットは、ＦＩＰプライマーと、Ｆ３プライマーと、ＢＩＰプライマーと、Ｂ３プライマーとを具備し、
前記ＦＩＰプライマーは配列番号１、前記ＢＩＰプライマーは配列番号２、前記Ｆ３プライマーは配列番号１３、前記Ｂ３プライマーは配列番号１４でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット１、および
前記ＦＩＰプライマーは配列番号３、前記ＢＩＰプライマーは配列番号４、前記Ｆ３プライマーは配列番号１３、前記Ｂ３プライマーは配列番号１５でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット２、および
（ｂ）前記ウイルスのポリメラーゼ領域の１８１位および２０４位のアミノ酸をコードする塩基配列をＬＡＭＰ増幅するための核酸プライマーセットであり、前記プライマーセットは、ＦＩＰプライマーと、Ｆ３プライマーと、ＢＩＰプライマーと、Ｂ３プライマーとを具備し、
前記ＦＩＰプライマーは配列番号５、前記ＢＩＰプライマーは配列番号６、前記Ｆ３プライマーは配列番号１６、前記Ｂ３プライマーは配列番号１７でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット３、および
前記ＦＩＰプライマーは配列番号７、前記ＢＩＰプライマーは配列番号８、前記Ｆ３プライマーは配列番号１６、前記Ｂ３プライマーは配列番号１８でそれぞれ示されるプライアーであるプライマーセット４；
を用いて試料溶液中の核酸をＬＡＭＰ増幅し、増幅産物を得ること、
（Ｂ）前記増幅産物と、以下の核酸プローブセット；
配列番号２２で示されるプローブ、配列番号２３で示されるプローブ、配列番号２４で示されるプローブ、配列番号２５で示されるプローブ、配列番号２６で示されるプローブ、配列番号２７で示されるプローブ、配列番号２８で示されるプローブ、配列番号２９で示されるプローブ、配列番号３０で示されるプローブ、配列番号３１で示されるプローブ、配列番号３２で示されるプローブ、配列番号３３で示されるプローブ、配列番号３４で示されるプローブ、配列番号３５で示されるプローブ、配列番号３６で示されるプローブ、配列番号３７で示されるプローブ、配列番号４７で示されるプローブ、配列番号４８で示されるプローブ、配列番号４９で示されるプローブ、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、および／またはその相補鎖により示されるプローブを含む核酸プローブセット
とを反応させ、ハイブリダイゼーションの有無に基づいて当該多型配列を特定し、前記ウイルスの薬剤耐性を判断することと、
を含むＢ型肝炎ウィルスの薬剤耐性株の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施態様は、Ｂ型肝炎ウイルスの薬剤耐性に関連する多型配列を増幅または特定する手段、並びに当該薬剤耐性株を検出する手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルス（以下、「HBV」と記す）患者への治療方法のひとつとして、逆転写酵素阻害剤等のDNA増殖を阻害する薬剤を投与する方法がある。このような薬剤は、DNA複製時に本来ならdCTPが結合する位置に対して結合し、HBVの増殖を阻害する。この阻害は、逆転写酵素がdCTPを取り込もうとする作業を拮抗的に阻害する作用と、複製中の(−)鎖DNAに取り込まれる作用によりDNA鎖が伸長するのを阻害する作用によるものである。
【０００３】
しかしながら、例えば、ラミブジンの長期投与を行った場合、あるアミノ酸領域（例えばYMDD領域）に変異を持つ変異ウイルスが出現することがある。この変異ウイルスはラミブジンに対して耐性があるため、ウイルス量の再上昇を引き起こす。従って、治療においては、薬剤耐性株の出現をモニタリングすること、薬剤耐性株が出現した場合には、薬剤の変更等の早急な対処を行うことが重要である。薬剤耐性株の検出は、HBVのDNAをPCRにより増幅し、シークエンス解析により、上記アミノ酸変異をコードする塩基配列を読む方法により行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】肝臓、47巻11号、499-502(2006)
【非特許文献２】Int.J.Med.Sci.2005 2(1)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、Ｂ型肝炎ウイルスの薬剤耐性に関連する多型配列を増幅するための核酸プライマーセット、当該多型配列を特定するために核酸プローブ、それらを用いた薬剤耐性株の検出方法およびアッセイキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
実施形態によれば、
［１］  Ｂ型肝炎ウイルスの薬剤耐性に関連する多型配列をＬＡＭＰ増幅するための核酸プライマーセットであって、
前記多型配列は、前記ウイルスのポリメラーゼ領域の２０４位および２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列であり、
前記プライマーセットは、ＦＩＰプライマーと、Ｆ３プライマーと、ＢＩＰプライマーと、Ｂ３プライマーとを具備し、
前記ＦＩＰプライマーは配列番号１、前記ＢＩＰプライマーは配列番号２、前記Ｆ３プライマーは配列番号１３、前記Ｂ３プライマーは配列番号１４でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット１、および
前記ＦＩＰプライマーは配列番号３、前記ＢＩＰプライマーは配列番号４、前記Ｆ３プライマーは配列番号１３、前記Ｂ３プライマーは配列番号１５でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット２
からなる群より少なくとも１つ選択されたプライマーセットを含む核酸プライマーセット；
［２］  前記［１］に記載の核酸プライマーセットを用いたＬＡＭＰ増幅で得られた増幅産物について、前記多型配列を特定するための核酸プローブセットであって、配列番号２２で示されるプローブ、配列番号２３で示されるプローブ、配列番号２４で示されるプローブ、配列番号２５で示されるプローブ、配列番号２６で示されるプローブ、配列番号２７で示されるプローブ、配列番号２８で示されるプローブ、配列番号２９で示されるプローブ、配列番号３０で示されるプローブ、配列番号３１で示されるプローブ、配列番号３２で示されるプローブ、配列番号３３で示されるプローブ、配列番号３４で示されるプローブ、配列番号３５で示されるプローブ、配列番号３６で示されるプローブ、配列番号３７で示されるプローブで示されるプローブ
およびこれらの相補鎖により示されるプローブからなる核酸プローブセット；
［３］  Ｂ型肝炎ウイルスの薬剤耐性に関連する多型配列を特定するためのアッセイキットであって、前記多型配列は、前記ウイルスのポリメラーゼ領域の２０４位および２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列であり、前記アッセイキットは、核酸プライマーセットと核酸プローブセットとを含み、
（１）前記核酸プライマーセットは、前記［１］に記載の核酸プライマーセットであり、
（２）前記核酸プローブセットは、前記［２］に記載の核酸プローブセットである
アッセイキット；
［４］  Ｂ型肝炎ウイルスの薬剤耐性株を検出する方法であって、
（１）前記［１］に記載の核酸プライマーセットと、
以下の核酸プライマーセット；
ポリメラーゼ領域の１８１位および２０４位のアミノ酸をコードする塩基配列を増幅するための、
前記ＦＩＰプライマーが配列番号５、前記ＢＩＰプライマーが配列番号６、前記Ｆ３プライマーが配列番号１６、前記Ｂ３プライマーが配列番号１７でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット３、および
前記ＦＩＰプライマーが配列番号７、前記ＢＩＰプライマーが配列番号８、前記Ｆ３プライマーが配列番号１６、前記Ｂ３プライマーが配列番号１８でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット４；
からなる群より少なくとも１つ選択されたプライマーセットを含む核酸プライマーセットとを用いて、試料溶液中の核酸をＬＡＭＰ増幅し、増幅産物を得ることと、
（２）前記増幅産物と、以下の核酸プローブ；
（ａ）ポリメラーゼ領域２０４位のアミノ酸が非薬剤耐性株由来の塩基配列を含むプローブであり、配列番号２２で示されるプローブ、配列番号２３で示されるプローブ、およびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブ；および／または
（ｂ）ポリメラーゼ領域２０４位のアミノ酸が薬剤耐性株由来の塩基配列を有するプローブであり、配列番号２４で示されるプローブ、配列番号２５で示されるプローブ、配列番号２６で示されるプローブ、配列番号２７で示されるプローブ、配列番号２８で示されるプローブ、配列番号２９で示されるプローブ、配列番号３０で示されるプローブ、配列番号３１で示されるプローブ、およびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブ；および
（ｃ）ポリメラーゼ領域２３６位のアミノ酸が非薬剤耐性株由来の塩基配列を有するプローブであり、配列番号３２で示されるプローブ、配列番号３３で示されるプローブ、配列番号３４で示されるプローブ、配列番号３５で示されるプローブおよびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブ；および／または
（ｄ）ポリメラーゼ領域２３６位のアミノ酸が薬剤耐性株由来の塩基配列を有するプローブであり、配列番号３６で示されるプローブ、配列番号３７で示されるプローブおよびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブ；および
（ｅ）ポリメラーゼ領域１８１位のアミノ酸が非薬剤耐性株由来の塩基配列を有するプローブであり、配列番号４７で示されるプローブ、配列番号４８で示されるプローブ、配列番号４９で示されるプローブ、およびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブ；および／または
（ｆ）ポリメラーゼ領域１８１位のアミノ酸が薬剤耐性株由来の塩基配列を有するプローブであり、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示されるプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、およびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブ；
とを反応させ、ハイブリダイゼーションの有無に基づいて当該多型配列を特定し、前記ウィルスの薬剤耐性を判定することと、
を含むＢ型肝炎ウィルスの薬剤耐性株の検出方法；
が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】LAMP法の概要図。
【図２】LAMP法の中間産物およびインナープライマー（FIP、BIP）のアニール位置を示す模式図。
【図３】ループプライマーの配置を示す概要図。
【図４】LAMP法の中間産物およびループプライマー（LFc、LBc）のアニール位置を示す模式図。
【図５】増幅産物の検出位置を示す模式図。
【図６】プローブ固定化基体の一実施形態の平面模式図。
【図７】プローブ固定化基体の一実施形態の平面模式図。
【図８】データバンクに登録されているHBV配列の受諾番号を示す図。
【図９】データバンクに登録されているHBV配列の受諾番号を示す図。
【図１０】HBVの基準配列を示す図。
【図１１】HBVの基準配列を示す図。
【図１２】核酸プライマー配列、検出対象配列の相対位置を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
HBVの薬剤耐性株は、一種の変異株である。当該薬剤耐性株は、HBVのポリメラーゼ領域のアミノ酸配列の181位、204位、または236位のアミノ酸が非薬剤耐性株（即ち、野生型株）とは異なる。このような変異は、HBVの遺伝子の変異に由来するものであり、また、当該変異部位は当該アミノ酸配列をコードする塩基配列の変異の存在による。従って、当該領域の塩基変異に基づく塩基多型を特定することによりHBVの薬剤耐性株を検出することが可能である。延いてはHBV感染患者などの対象からのHBVが薬剤耐性であるか、否かを判定することが可能である。
【０００９】
このような塩基変異に基づく塩基多型（以下「塩基多型」と表記する）の検出は、従来では主にPCR（Polymerase chain reaction）法より行われている。しかしながら、PCR法は核酸抽出などの前処理が煩雑である。また、サーマルサイクラーのような複雑な温度制御が必須であり、さらに反応時間に2時間以上を要するなどの不都合がある。また、PCR法による増幅産物は2本鎖であるため、相補鎖が、検出の際にプローブに対するコンペティターとなり、検出感度を低下させる。そこで、増幅産物を1本鎖にするため、酵素や磁気ビーズを用いて、相補鎖を分解または分離する方法がとられているが、いずれも操作が煩雑であり、また費用がかかる。
【００１０】
１態様に従うと、PCR法に替わってLAMP（Loop-mediated isothermal amplification）法を利用し、且つ増幅産物を核酸プローブとハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションを検知することにより塩基多型を検出する。
【００１１】
LAMP法とは、核酸を等温条件下60〜65℃で増幅する技術である。LAMP法はPCR法と比較して、短時間で多量の増幅産物が得られるという利点を有する。また、サンプル中の不純物の影響を受けにくい。LAMP法を用いることによって、簡便に標的核酸を増幅することが可能である。
【００１２】
増幅産物の検出は、これに限定されるものではないが、例えば核酸プローブを用いて測定することができる。核酸プローブは、本発明に従うLAMP増幅用プライマーにより増幅される領域を特異的に検出するプローブであればよい。核酸プローブは、野生型（即ち、非耐性株）の増幅産物および／または変異型（即ち、耐性株）の増幅産物にそれぞれ相補的であり、且つ相互の交差反応性がより低い核酸プローブを用いればよい。増幅産物とそれぞれの核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせ、それぞれの核酸プローブに結合した増幅産物を検出する。野生型の核酸プローブに結合した増幅産物と、変異型の核酸プローブに結合した増幅産物をそれぞれ検出することにより、検体中のHBVウイルスが薬剤耐性型か否かを判定することができる。
【００１３】
＜LAMP法の概要＞
以下にLAMP法の概要を説明する。なお、本明細書では、塩基多型の検出に供される核酸を検体核酸と称する。また、本態様に従うLAMP増幅プライマーにより増幅されるHBVのポリメラーゼ領域の181位、204位、または236位のアミノ酸をコードする領域を含む核酸を標的核酸と称する。LAMP法によって得られた産物を増幅産物と称する。また、増幅の対象となるHBVを含む溶液を試料溶液と称する。
【００１４】
LAMP法では、標的核酸に対してその5’末端側から順にF3領域、F2領域、F1領域を設定し、3’末端側から順にB3c領域、B2c領域、およびB1c領域を設定する。そして、図１に示すような4種のプライマーを用いて標的核酸を増幅する。なお、F1c、F2c、F3c、B1、B2、およびB3領域はそれぞれ、F1、F2、F3、B1c、B2c、およびB3c領域の相補鎖における領域を示す。
【００１５】
LAMP法において核酸を増幅するために使用される4種のプライマーとは、（１）3’末端側に前記F2領域と同じ配列を有し、且つ5’末端側に前記F1領域と相補的な配列を有するFIPプライマー；（２）前記F3領域と同じ配列から成るF3プライマー；（３）3’末端側に前記B2c領域と相補的な配列を有し、且つ5’末端側に前記B1c領域と同じ配列を有するBIPプライマー；および、（４）前記B3c領域と相補的な配列から成るB3プライマーである。一般に、FIPプライマーおよびBIPプライマーはインナープライマーと呼ばれ、F3プライマーおよびB3プライマーはアウタープライマーと呼ばれる。
【００１６】
上記4種のプライマーを用いてLAMP増幅を行うと、図２に示すようなダンベル構造を有する中間産物が生成される。一本鎖ループ内のF2cおよびB2c領域にFIPおよびBIPプライマーが結合し、該プライマーの3’末端および中間産物自体の3’末端から伸長反応が進行する。詳細には、特許第3313358号を参照されたい。
【００１７】
LAMP法ではさらに、ループプライマー；（５）と呼ばれるさらなるプライマーを任意に用いることによって、増幅時間を短縮させることができる。この場合、図３に示すように、前記F2領域からF1領域にかけての部分においてLF領域を設定し、前記B2c領域からB1c領域にかけての部分においてLBc領域を設定する。これらはループプライマー領域と称する。そして、上記の４種のプライマーに加えて、LF領域と相補的な配列から成るループプライマーLFｃ、および上記LBｃ領域と同じ配列から成るループプライマーLBｃを用いる。詳細には、WO2002/0249028号を参照されたい。これらのループプライマーLFｃおよびLBｃは、同時に用いてもよいが、何れか一方のみを用いてもよい。ループプライマーは、図４に示すように、FIPおよびBIPプライマーがアニールするループとは別のループにアニールし、さらなる合成起点を与えることによって増幅を促進させる。
【００１８】
塩基多型を検出する場合は、検出される多型部位を図５に示すFP領域（F-Loop）またはBPc領域（B-Loop）に位置させてもよい。或いは、FP領域およびBPc領域のそれぞれに異なる多型を位置させてもよい。図５に記載したように、F2領域からF1領域にかけての部分は、増幅産物中で一本鎖となる部分である。同様に、B2c領域からB1c領域にかけての部分も増幅産物中で一本鎖となる部分である。一本鎖である部分に検出すべき多型部位を位置させることによって核酸プローブとの反応効率が良く、核酸プローブによる検出を簡便にすることができる。
【００１９】
これらのプライマーの選択の詳細については後述する。
【００２０】
＜LAMP増幅産物の検出；核酸プローブ＞
核酸プローブは、多型部位を含むFP領域またはBPc領域と結合するように設計する。即ち、核酸プローブは、FP領域またはBPc領域のうち、多型部位を含む領域の配列と相補的な配列を有する。
【００２１】
なお、増幅産物中には、FP領域およびBPc領域とそれぞれ相補的なFPc領域およびBP領域も存在する。よって、これらのFPc領域およびBP領域を検出に利用することも可能である。
【００２２】
本明細書においては、野生型の増幅産物と相補的な配列を含む核酸プローブを野性型核酸プローブまたは非薬剤耐性プローブと称し、変異型の増幅産物と相補的な配列を含む核酸プローブを変異型核酸プローブまたは薬剤耐性プローブと称する。
【００２３】
核酸プローブは、特に限定されないが、DNA、RNA、PNA、LNA、メチルホスホネート骨格の核酸、その他の人工核酸鎖から構成されてよい。基体に固定化するために、末端をアミノ基、カルボキシル基、ヒドロシル基、チオール基、スルホン基などの反応性官能基で修飾してもよい。該官能基とポリヌクレオチドの間にスペーサーを導入することも可能である。スペーサーには、例えばアルカン骨格、エチレングリコール骨格などを用いることができる。
【００２４】
核酸プローブの長さは下限が１５塩基以上、上限が４５塩基以下である。より好ましくは１５塩基以上４０塩基以下、さらに好ましくは１８塩基以上３５塩基以下である。
【００２５】
＜核酸プローブ固定化基体＞
核酸プローブは、これに限定されないが、基体上に固定化して用いることができる。核酸プローブ固定化基体は、DNAチップ、DNAマイクロアレイと称されるそれ自身公知の装置を利用してもよい。
【００２６】
プローブ固定化基体の一実施態様の模式図を図６に示した。核酸プローブは、基体１上の固定化領域２に固定化される。基体１は例えばシリコン基板などから製造することができるが、これに限定されない。核酸プローブの固定化は、公知の手段によって行えばよい。1つの基体１に固定化される核酸プローブは１種でも複数種類であってもよく、その配置や数は当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。後述するように、核酸プローブを蛍光検出する場合には、本実施態様のような核酸プローブ固定化基体を用いることができる。
【００２７】
核酸プローブ固定化基体の他の実施態様の模式図を図７に示した。本実施態様においては、基体１１に電極１２が備えられる。核酸プローブは電極１２に固定化される（図示せず）。電極１２は、電気的情報を取り出すためのパット１３に接続される。基体１１は例えばシリコン基板などから製造することができるが、これに限定されない。電極の製造および核酸プローブの固定化は、公知の手段によって行えばよい。電極は、特に限定されるものではないが、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウムおよびタングステン等の金属単体およびそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボンのような炭素、およびこれらの酸化物または化合物で製造することができる。
【００２８】
図７の固定化基体は１０個の電極を備えるが、これに限定されず、1つの基体に配置される電極の数は任意に変更できる。また電極の配置パターンも図に示したものに限定されず、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。基体１には、必要に応じて、参照電極および対極を設けてもよい。後述するように、核酸プローブを電気化学的に検出する場合には、本実施態様のような核酸プローブ固定化基体を用いることができる。
【００２９】
＜核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーション＞
核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションは適切な条件下で行う。適切な条件は、増幅産物の種類や構造、検出配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブの種類によって異なる。例えば、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液中で行う。反応溶液中には、ハイブリダーゼション促進剤である硫酸デキストラン、並びにサケ精子DNA、牛胸腺DNAやEDTAおよび界面活性剤などを添加してもよい。反応温度は、例えば10℃〜90℃の範囲で行い、攪拌や振盪などで反応効率を高めてもよい。反応後の洗浄には、例えばイオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いればよい。
【００３０】
＜ハイブリダイゼーションの検出方法＞
前記基体に固定化された核酸プローブと増幅産物とがハイブリダイズすると2本鎖核酸が生じる。この2本鎖核酸は、電気化学的にまたは蛍光により検出することができる。
【００３１】
(a)電流検出方式
電気化学的に2本鎖核酸を検出する方法を説明する。この方法では、2本鎖核酸を特異的に認識する2本鎖認識体を用いる。2本鎖認識体の例には、例えば、ヘキスト33258、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーターなどが含まれるが、これらに限定されない。更に、これらの物質を電気化学的に活性な金属錯体、例えばフェロセン、ビオロゲンなどで修飾することも可能である。
【００３２】
2本鎖認識体の濃度はその種類によって異なるが、一般的には１ng/mL〜1mg/mLの範囲で使用する。この際には、イオン強度0.001〜5の範囲でpH5〜10の範囲の緩衝液を用いればよい。
【００３３】
ハイブリダイゼーション反応中または反応後、反応溶液中に2本鎖認識体を添加する。ハイブリダイズによって2本鎖核酸が生じている場合は、2本鎖認識体がこれに結合する。そこで、例えば2本鎖認識体が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加して、2本鎖認識体に由来する反応電流値を測定することができる。この際、電位は定速で印加するか、あるいは、パルスで印加するかあるいな定電位を印加してもよい。測定の際に、例えばポテンショスタット、デジタルマルチメーター、およびファンクションジェネレーターなどの装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。例えば特開平10-146183号公報に記載された公知の電気化学的検出手段が好適に用いられる。
【００３４】
(ｂ)蛍光検出法
蛍光によって２本鎖核酸を検出する方法を説明する。予め、プライマーを蛍光学的に活性な物質で標識しておく。または、蛍光学的に活性な物質で標識した2次プローブを用いて検出する。或いは、複数の標識を使用してもよい。蛍光学的に活性な物質は、これらに限定されないが、FITC、Cy3、Cy5、もしくはローダミンなどの蛍光色素を含む。蛍光物質は、例えば蛍光検出器を用いて検出される。標識の種類に応じた適宜の検出装置を用い、標識された検出配列または2次プローブを検出する。
【００３５】
＜核酸プライマーおよび核酸プローブの選択指針＞
図５に示すように、問題の塩基多型部位をB1cとB2cの間、すなわちBPc領域に位置させる場合、BIPプライマーは、B2c領域と相補的な配列、および、B1c領域と同じ配列を有するプライマーである。したがって、このB2c領域とB1c領域とが、問題の塩基多型部位を挟んで位置する限り、様々な種類のプライマーを設計し、目的の増幅産物を得ることが可能である。
【００３６】
同様に、問題の塩基多型部位をF2とF1の間、すなわちFP領域に位置させる場合、FIPプライマーは、F1領域と相補的な配列、および、F2領域と同じ配列を有するプライマーである。したがって、このF1領域とF2領域とが、問題の塩基多型部位を挟んで位置する限り、様々な種類のプライマーを設計し、目的の増幅産物を得ることが可能である。
【００３７】
さらに、増幅産物を、核酸プローブを用いて検出する場合には、増幅産物と核酸プローブとのハイブリダイゼーションが、高効率で生じることが必要である。よって、ハイブリダイゼーションの効率が優れた増幅産物であるかどうかも、上記プライマーを評価する際に考慮される。
【００３８】
塩基多型を間に挟まないもう一方のインナープライマーについては、F2からB2までの長さが450bp以下、より好ましくは350bp以下となる領域に設計することが好ましい。また、1本鎖ループの長さは、100bp以下、より好ましくは70bp以下となるように両インナープライマーを設計することが好ましい。
【００３９】
プライマー同士の非特異的な増幅はLAMP反応でしばしば見られる現象である。FIPプライマーはF1c領域とF2領域を含むため、長鎖の核酸となる。同じくBIPプライマーもB1c領域とB2領域を含むため、長鎖の核酸となる。よって、FIPプライマー同士、BIPプライマー同士、またはFIPプライマーとBIPプライマーが互いに絡み合い、プライマーを鋳型として増幅してしまう確率が高くなる。また、LAMP反応は、F3プライマー、B3プライマー、さらに場合によってはLFプライマー、LBcプライマーも反応液中に存在するため、PCR反応と比較して非特異反応の確率はさらに高くなる。このような非特異反応が発生すると、検体核酸を鋳型とする所望のLAMP産物の量が低下する。
【００４０】
＜核酸プライマーおよび核酸プローブの設計＞
以上を踏まえて、ＬＡＭＰ増幅用の核酸プライマーおよびその増幅産物を検出するための核酸プローブの塩基配列の設定は、以下のように行った。まず、基準配列をデータベースを基に設定した。まず、遺伝子配列情報データベースであるGenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov./Genbank/index.html)から、Ｂ型およびＣ型のＨＢＶの配列情報を入手した。図８および図９に、当該設定に使用した配列の受諾番号(Accession No.)を示す（図８および図９）。
【００４１】
次に、ＨＢＶのＢ型およびＣ型のそれぞれについて、アラインメント解析を行い、各塩基配列位置について最も高い頻度で存在ずる塩基を基準配列とした。基準配列を、Ｂ型については図１０に、Ｃ型については図１１に示した。この基準配列を基に、本発明に従うプライマーセット１、２の２種のプライマーセットおよび核酸プローブの塩基配列を決定した。
【００４２】
＜プライマーの設計＞
［ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー］
まず、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーを決定した。表１に、ＨＢＶ薬剤耐性に関連する多型配列をＬＡＭＰ増幅するためのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーからなるプライマーペアを示す。
【表１】
2012060939.tif 000002
【００４３】
表中、「Pair No.」はプライマーペア番号を示し、「FIP or BIP」は、ＦＩＰプライマーであるかＢＩＰプライマーであるかを示し、「SEQ.ID.NO.」は各プライマーに割り当てた配列番号を示し、「対象Type」はそのプライマーがＨＢＶのＢ型またはＣ型の何れを検出対象とするかを示し、「検出対象」は、対象となる塩基変異部位を含む核酸が何位のアミノ酸に該当するかを示した。このようなＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーを使用することにより、検出対象アミノ酸をコードする塩基多型部位をループ内部にもつ、ＬＡＭＰの増幅産物(一般的には、ターゲット核酸、ターゲットＤＮＡとも称する)を得ることができる。
【００４４】
ここで、表１に示した核酸プライマーは、そこに記載された核酸プライマーが、プライマーとしての機能を維持できる限りにおいて、当該多型塩基の位置の以外の位置にある塩基が一部置換されてもよく、当該多型塩基の位置以外の部位に更なる塩基が付加されてもよく、また、当該多型塩基の位置以外の部位の塩基が一部欠失してもよい。
【００４５】
［Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマー］
Ｆ３およびＢ３プライマーは、Ｆ２領域の５’末端より上流の領域、Ｂ２ｃ領域の３’末端より下流の領域に結合する配列を有するものであればよい。表１に示す各プライマーペアに対して表２に記載する配列、即ち、Ｆ３およびＢ３プライマーを追加してプライマーセットとして使用されてよい。
【表２】
2012060939.tif 000003
【００４６】
表中、「Primer No.」はプライマー番号を示し、「F or B」は、当該プライマーがＦ３プライマーであるか、Ｂ３プライマーであるかの識別を示し、「プライマー配列」は各プライマーの塩基配列を示し、「SEQ.ID.NO.」は各プライマーに割り当てた配列番号を示し、「対象プライマーペア」はそれぞれが組み合わせるのに適切な表１のプライマーペア番号を示した。これらの好ましいＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーの組み合わせの例をプライマーセットとして後述の表Ａに示す。
【００４７】
ここで、表２に示したプライマーは、そこに記載されたプライマーがプライマーとしての機能を維持できる限りにおいて、当該多型塩基の位置の以外の位置にある塩基が一部置換されてもよく、当該多型塩基の位置以外の部位に更なる塩基が付加されてもよく、また、当該ＳＮＰの位置以外の部位の塩基が一部欠失してもよい。
【００４８】
［ループプライマー］
増幅効率の向上を目的として、各プライマーセットにループループプライマーを添加してもよく、本発明に従うと、例えば、表３に記載する配列をループプライマーとして使用してよい。
【表３】
2012060939.tif 000004
【００４９】
表中、「Primer No.」はプライマー番号を示し、「F or B」は、当該プローブがFのループプライマーであるか、Ｂのループプライマーであるかの識別を示し、「プライマー配列」は各プライマーの塩基配列を示し、「SEQ.ID.NO.」は各プライマーに割り当てた配列番号を示し、「対象プライマーペア」はそれぞれが組み合わせるのに好ましい表１のプライマーペア番号を示した。
【００５０】
ここで、表３に示したプライマーは、そこに記載されたプライマーがプライマーとしての機能を維持できる限りにおいて、当該多型塩基の位置の以外の位置にある塩基が一部置換されてもよく、当該多型塩基の位置以外の部位に更なる塩基が付加されてもよく、また、当該多型塩基の位置以外の部位の塩基が一部欠失してもよい。
【００５１】
［プライマーセット］
上述のＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーの好ましい組み合わせの例をプラマーセットとして以下の表Ａ（即ち、表Ａ−１および表Ａ−２）に示した。各プライマーセットの直下の欄には、それらに組み合わせて任意に使用されるループプライマーを示した。
【表Ａ−１】
2012060939.tif 000005
【００５２】
【表Ａ−２】
2012060939.tif 000006
【００５３】
ここで、表Ａに示したプライマーは、そこに記載されたプライマーがプライマーとしての機能を維持できる限りにおいて、当該多型塩基の位置の以外の位置にある塩基が一部置換されてもよく、当該多型塩基の位置以外の部位に更なる塩基が付加されてもよく、また、当該ＳＮＰの位置以外の部位の塩基が一部欠失してもよい。
【００５４】
＜核酸プローブの設計＞
図１０および図１１に示した各々の基準配列に基づいて核酸プローブの設計を行なった。四角で囲んだ３塩基がそれぞれ変異部位である１８１位、２０４位または２３６位のアミノ酸をコードするコドン領域の位置である。塩基変異に基づいて四角で囲んだ３塩基の配列は異なったものとなる。本発明で使用される核酸プローブは、Ｂ型、Ｃ型の１８１位、２０４位または２３６位の対象アミノ酸に対応する核酸プローブをその希望する検出対象に応じて選択して用いる。
【００５５】
本発明に使用する核酸プローブ配列を表４（即ち、表４−１、表４−２および表４−３）に示す。
【表４−１】
2012060939.tif 000007
【００５６】
【表４−２】
2012060939.tif 000008
【００５７】
【表４−３】
2012060939.tif 000009
【００５８】
表中、「Probe No.」はプローブ番号を示し、「対象アミノ酸No.」は、検出の対象となる変異部位である１８１位、２０４位または２３６位の識別を示し、「対象Type」はＨＢＶのＢ型、Ｃ型の識別を示し、「アミノ酸」は、当該検出対象アミノ酸の種類を示し、「薬剤耐性」は非耐性プローブ（即ち、非薬剤耐性プローブ）であるか、耐性プローブ（即ち、薬剤耐性プローブ）であるかを示し、「塩基配列」は各プローブに必須の塩基配列を示し、「SEQ.ID.NO.」は各プローブに割り当てた配列番号を示した。
【００５９】
表４に示される配列のうち配列番号２２〜３１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなる核酸プローブは、検出条件を限定した際に、検体のウィルスＤＮＡのポリメラーゼ２０４位のアミノ酸をコードする塩基配列が、薬剤耐性を示すものであるか、薬剤非耐性を示すものであるかを、より効率的に識別することができるプローブ配列である。特に各プローブＤＮＡを固層に固定し、このプローブに標的核酸（ウィルスＤＮＡからプライマーセット３または４のいずれかを用いて増幅されたＬＡＭＰ産物）を反応させ、０．２×ＳＳＣ溶液中で、３６℃で洗浄工程を行うことを仮定した場合、ポリメラーゼ２０４位のアミノ酸をコードする塩基配列を明確に識別することが可能であり、好ましい。
【００６０】
表４に示される配列のうち配列番号３２〜３７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブは、検出条件を限定した際に、検体のウィルスＤＮＡのポリメラーゼ２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列が、薬剤耐性を示すものであるか、薬剤非耐性を示すものであるかを、より効率的に識別することができるプローブ配列である。特に各プローブＤＮＡを固層に固定し、このプローブに標的核酸（ウィルスＤＮＡからプライマーセット１または２のいずれかを用いて増幅されたＬＡＭＰ産物）を反応させ、０．２×ＳＳＣ溶液中で、３６℃で洗浄工程を行うことを仮定した場合、ポリメラーゼ２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列を明確に識別することが可能であり、好ましい。
【００６１】
表４に示される配列のうち配列番号４７〜５２で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号５５で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号５８で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブ、配列番号６０で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるプローブは、検出条件を限定した際に、検体のウィルスＤＮＡのポリメラーゼ１８１位のアミノ酸をコードする塩基配列が、薬剤耐性を示すものであるか、薬剤非耐性を示すものであるかを、より効率的に識別することができるプローブ配列である。特に各プローブＤＮＡを固層に固定し、このプローブに標的核酸（ウィルスＤＮＡからプライマーセット３または４のいずれかを用いて増幅されたＬＡＭＰ産物）を反応させ、０．２×ＳＳＣ溶液中で、３６℃で洗浄工程を行うことを仮定した場合、ポリメラーゼ１８１位のアミノ酸をコードする塩基配列を明確に識別することが可能であり、好ましい。
【００６２】
なお、表４に示した何れの核酸プローブも、核酸プローブとしての機能を維持できる限りにおいて、当該多型塩基の位置の以外の位置にある塩基が一部置換されてもよく、当該多型塩基の位置以外の部位に更なる塩基が付加されてもよく、また、当該多型塩基の位置以外の部位の塩基が一部欠失してもよい。
【００６３】
各核酸プローブは、３箇所、即ち、１８１位、２０４位または２３６位の対象アミノ酸に対応するプローブをその希望する検出対象に応じて選択して用いてよく、当該多型塩基の箇所に異なる塩基を具備する複数のプローブを同時に使用することが好ましい。
【００６４】
例えば、Ｂ型とＣ型の２０４位の対象アミノ酸をコードする塩基多型をそれぞれ検出する場合、配列番号２２〜３１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ（プローブ群１）を使用する。また、２３６位の対象アミノ酸をコードする塩基多型を検出する場合、配列番号３２〜４７で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ（プローブ群２）を使用する。また、Ｂ型とＣ型の１８１位の対象アミノ酸をコードする塩基多型を検出する場合、配列番号４７〜６１で示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むプローブ（プローブ群３）を使用する。Ｂ型およびＣ型の１８１位、２０４位および２３６位の対象アミノ酸をコードする塩基多型を検出する場合、プローブ群１〜３を同時に使用すればよい。
【００６５】
上記データベースの配列情報は、追加登録される可能性があること、また、ある特定集団の均一な塩基頻度を示している保証は無いため、経時的に、または、対象集団により、基準配列の変更が想定される。従って、上記基準配列は、暫定的な配列であり、配列情報の変更に伴い、表１から表４および表Ａに記載の配列も変更することが望ましい。これを考慮し、上記配列に対して、８０%程度以上の相同性を有するか、または、ＨＢＶに対して増幅反応が生じる程度の相同性があればよい。核酸プライマー、核酸プローブに使用する塩基配列の範囲については、表１から表４および表Ａの配列を含むものであれば、その一部を削除した塩基数の少ない配列、または、基準範囲を参照して得られる周辺の配列を加えた、塩基数の多い配列でもよい。また、高頻度の変異が存在する場合、タイプ特異的な変異が存在する場合などは、核酸プライマー配列、核酸プローブ配列にミックス塩基（即ち、複数種塩基の混合）、修飾塩基を入れることも可能である。
【００６６】
また、核酸プローブは、所望に応じた基体に固定化されて、核酸プローブ固定化基体として提供されてもよい。
【００６７】
＜各核酸プライマーセットの使用について＞
当該プライマーセット１および２を用いて検体核酸をＬＡＭＰ増幅する際には、検出を行なうジェノタイプや多型塩基の種類に応じて、プライマーセット１または２を単独で、プライマーセット１および２を混合して、または他のプライマーセットと組み合わせてそれらを混合して、増幅を行ってもよい。ここで、他のプライマーセットとは、上記のプライマーセット３〜６から選択された少なくとも１のプライマーセットであってもよく、或いは他のＦＩＰプライマーと、Ｆ３プライマーと、ＢＩＰプライマーと、Ｂ３プライマーとからなるプライマーセットであってもよい。また、更にループプライマーを追加して混合して使用してもよい。
【００６８】
例えば、当該プライマーセット１および２は、Ｂ型肝炎ウィルスのポリメラーゼ領域の２３６位を検出するために使用してもよく、または２０４位と２３６位を同時に検出するために使用してもよい。また、その他のプライマーセットと組み合わせて１８１位、２０４位または２３６位のうち複数を検出するために使用してもよい。
【００６９】
なお、複数のジェノタイプ若しくは、当該１８１位、２０４位および２３６位に関する以外の異なる塩基多型を検出するために、上記のプライマーセット１、２を単独若しくは複数用いてＬＡＭＰ増幅を行なった後、さらに別個に行なった増幅で得られた増幅産物を混合し、核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応に供してもよい。
【００７０】
検出対象がＢ型、Ｃ型の１８１位、２０４位、および２３６位であり増幅効率および検出効率が良好な望ましい形態例としては、
プライマーセット１と２（検出対象：Ｂ型、Ｃ型、２３６位）の混合プライマーを用いて検体核酸に対してＬＡＭＰ増幅反応を実施して増幅産物（第１の増幅産物）を得て、また別個にプライマーセット３と４（検出対象：Ｂ型、Ｃ型、１８１位、２０４位）の混合プライマーを用いて検体核酸に対してＬＡＭＰ増幅反応を実施して増幅産物（第２の増幅産物）を得て、さらに第１および第２の増幅産物を混合し、この混合物を、Ｂ型、Ｃ型の１８１位、２０４位、および２３６位検出用プローブとのハイブリダイゼーションに供する。
【００７１】
上記プライマーを使用したＢ型肝炎ウイルスの薬剤耐性に関連する多型配列を増幅する方法も１つの態様として本発明に含まれる。
【００７２】
＜アッセイキット＞
アッセイキットは、ＨＢＶの薬剤耐性株に関連する多型配列を特定するためのアッセイキットまたはＨＢＶの薬剤耐性株を検出するためのアッセイキットであってよい。
【００７３】
ＨＢＶの薬剤耐性株に関連する多型配列を特定するためのアッセイキットは、ＨＢＶのポリメラーゼ領域の２０４位および２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列を増幅するための上述した何れかの核酸プライマーまたはプライマーセットを含み、更に、ループプライマー、何れかの核酸プローブ、プローブ群、基体に固定化された核酸プローブ若しくはプローブ群、核酸プローブを固定化するための基体、ＬＡＭＰ増幅に必要な試薬、ハイブリダイズ反応に必要な試薬、そこにおいて反応を行う反応場としての容器および／または取扱説明書などを含んでよい。また更に、所望の更なる核酸プライマーおよび／または核酸プローブを含んでもよい。
【００７４】
ＨＢＶの薬剤耐性株を検出するためのアッセイキットは、ＨＢＶのポリメラーゼ領域の２０４位、２３６位および１８１位のアミノ酸をコードする塩基配列を増幅するための上述した何れかの核酸プライマーまたはプライマーセットを含み、更に、ループプライマー、何れかの核酸プローブ、核酸プローブ群、基体に固定化された核酸プローブ若しくは核酸プローブ群、核酸プローブを固定化するための基体、ＬＡＭＰ増幅に必要な試薬、ハイブリダイズ反応に必要な試薬、そこにおいて反応を行う反応場としての容器および／または取扱説明書などを含んでよい。また更に、所望の更なる核酸プライマーおよび／または核酸プローブを含んでもよい。
【００７５】
上記アッセイキットを使用したＢ型肝炎ウイルスの薬剤耐性に関連する多型配列を増幅する方法およびＢ型肝炎ウイルスの薬剤耐性株を検出する方法も１つの態様として本発明に含まれる。
【００７６】
＜検出方法＞
ＨＢＶの薬剤耐性株を検出する方法は、例えば、次のことを具備すればよい；
（Ａ）Ｂ型肝炎ウイルスの薬剤耐性に関連する多型配列を増幅するための上記何れかの核酸プライマーを用いて、試料溶液中の核酸をＬＡＭＰ増幅し、増幅産物を得ること、
（Ｂ）前記増幅産物と、前記多型配列を特定するための上記何れかの核酸プローブとを反応させ、ハイブリダイゼーションの有無に基づいて当該多型配列を特定し、前記ウイルスの薬剤耐性を判定することと。
【００７７】
当該多型配列は、ＨＢＶのポリメラーゼ領域の２０４位、２３６位および１８１位のアミノ酸をコードする塩基配列を少なくとも含む。従って、ＨＢＶのポリメラーゼ領域の２０４位、２３６位および１８１位のアミノ酸をコードする塩基配列であっても、これらの塩基配列を含む領域の塩基配列であってもよく、また、これらの塩基配列またはこれを含む領域の塩基配列に加えて、何れか他の塩基配列が増幅されてもよい。
【００７８】
試料溶液は、対象または患者などから採取された生体由来の物質であってもよい。例えば、血液、リンパ液、血漿および／または血清などの体液、組織、細胞および便などであってよい。そのような物質は、必要に応じてそれ自身公知の手段により、核酸の増幅に適した状態に前処理したものであってもよく、何れの前処理もなされなくてもよい。例えば、そのような前処理の例は、変性、濾過、核酸抽出、不純物除去などを含む。
【００７９】
＜例＞
例として幾つかの態様について説明する。
【００８０】
＜例１＞  多型特定用プラマーセット、プローブセットおよびアッセイキット
ＨＢＶの薬剤耐性に関連する多型配列をＬＡＭＰ増幅するための核酸プライマーセットの例を示す。これらの核酸プライマーセットは、ＨＢＶのポリメラーゼ領域の２０４位および２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列を増幅するための核酸プライマーセットの例である。このような核酸プライマーセットは、ＨＢＶの薬剤耐性株の検出において有益に利用される。
【００８１】
核酸プライマーセットは、ＦＩＰプライマーと、Ｆ３プライマーと、ＢＩＰプライマーと、Ｂ３プライマーとを具備し、
ポリメラーゼ領域の２０４位および２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列を増幅するための、
前記ＦＩＰプライマーは配列番号１、前記ＢＩＰプライマーは配列番号２、前記Ｆ３プライマーは配列番号１３、前記Ｂ３プライマーは配列番号１４でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット１、および
前記ＦＩＰプライマーが配列番号３、前記ＢＩＰプライマーが配列番号４、前記Ｆ３プライマーが配列番号１３、前記Ｂ３プライマーが配列番号１５でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット２
からなる群より少なくとも１選択される核酸プライマーセットを含む核酸プライマーセットである。
【００８２】
この核酸プライマーセットは、更に、ループプライマーを具備してもよく、例えば、配列番号１９で示されるプライマーおよび／または配列番号２０で示されるプライマーが具備されてもよい。上記核酸プライマーセットと、ループプライマーとの組み合わせは、プライマーセット１のためには配列番号１９が好ましく、プライマーセット２のためには配列番号２０が好ましい。核酸プライマーセットが、プライマーセット１または２の何れかを含む場合には、その含まれるプライマーセットに従って何れかのループプライマーが更に含まれればよい。
【００８３】
好ましい核酸プライマーセットは、プライマーセット１およびプライマーセット２を共に含む。その場合、核酸プライマーセットには、ループプライマーとして配列番号１９で示されるプライマーと配列番号２０で示されるプライマーが共に含まれてもよく、何れか一方のみが含まれてもよい。
【００８４】
上記の核酸プライマーセットを用いたＬＡＭＰ増幅から得られた増幅産物について、ＨＢＶのポリメラーゼ領域の２０４位および２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列の多型を決定するために使用されるプローブセットの例を示す。
【００８５】
核酸プローブセットは、
（Ａ）ポリメラーゼ領域２０４位のアミノ酸が非薬剤耐性株由来の塩基配列および／または薬剤耐性株由来の塩基配列を含むプローブと、
（Ｂ）ポリメラーゼ領域２３６位のアミノ酸が非薬剤耐性株由来の塩基配列および／または薬剤耐性株由来の塩基配列を含むプローブと、
を含み、
ここで、
（ａ）前記ポリメラーゼ領域２０４位のアミノ酸が非薬剤耐性株由来の塩基配列を含むプローブが、配列番号２２で示されるプローブ、配列番号２３で示されるプローブ、およびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されるプローブであり、
（ｂ）ポリメラーゼ領域２０４位のアミノ酸が薬剤耐性株由来の塩基配列を含むプローブが、配列番号２４で示されるプローブ、配列番号２５で示されるプローブ、配列番号２６で示されるプローブ、配列番号２７で示されるプローブ、配列番号２８で示されるプローブ、配列番号２９で示されるプローブ、配列番号３０で示されるプローブ、配列番号３１で示されるプローブ、およびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されるプローブであり、
（ｃ）ポリメラーゼ領域２３６位のアミノ酸が非薬剤耐性株由来の塩基配列を含むプローブが、配列番号３２で示されるプローブ、配列番号３３で示されるプローブ、配列番号３４で示されるプローブ、配列番号３５で示されるプローブ、配列番号３８で示されるプローブ、配列番号３９で示されるプローブ、配列番号４０で示されるプローブ、配列番号４１で示されるプローブ、配列番号４２で示されるプローブ、配列番号４３で示されるプローブ、および／またはこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されるプローブであり、
（ｄ）ポリメラーゼ領域２３６位のアミノ酸が薬剤耐性株由来の塩基配列を含むプローブが、配列番号３６で示されるプローブ、配列番号３７で示されるプローブ、配列番号４４で示されるプローブ、配列番号４５で示されるプローブ、配列番号４６で示されるプローブ、およびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなるプローブセットである。
【００８６】
好ましい核酸プローブセットは、配列番号２２で示されるプローブ、配列番号２３で示されるプローブ、配列番号２４で示されるプローブ、配列番号２５で示されるプローブ、配列番号２６で示されるプローブ、配列番号２７で示されるプローブ、配列番号２８で示されるプローブ、配列番号２９で示されるプローブ、配列番号３０で示されるプローブ、配列番号３１で示されるプローブ、配列番号３２で示されるプローブ、配列番号３３で示されるプローブ、配列番号３４で示されるプローブ、配列番号３５で示されるプローブ、配列番号３６で示されるプローブ、配列番号３７で示されるプローブ、配列番号３８で示されるプローブ、配列番号３９で示されるプローブ、配列番号４０で示されるプローブ、配列番号４１で示されるプローブ、配列番号４２で示されるプローブ、配列番号４３で示されるプローブ、配列番号４４で示されるプローブ、配列番号４５で示されるプローブ、配列番号４６で示されるプローブおよび／またはこれらの相補鎖により示されるプローブを含む核酸プローブセットである。
【００８７】
上述の核酸プライマーセットおよび核酸プローブセットは、これらを含むアッセイキットの形態で提供されてもよい。そのようなアッセイキットは、ＨＢＶのポリメラーゼ領域の２０４位および２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列の多型を決定するためのアッセイキットであってもよい。
【００８８】
このような核酸プライマーセットを用いて、ＨＢＶに由来する核酸をＬＡＭＰ増幅することにより、短時間で簡便に且つ安価にＨＢＶの薬剤耐性に関連する多型配列を含む核酸を増幅することが可能である。それにより得られる増幅産物は、ＨＢＶの薬剤耐性株を検出するために利用することが可能である。また、それらの核酸プライマーセットに組み合わせて当該ループプライマーセットを使用すれば、更にその効果は増大する。また、それらの多型配列を特定するために、当該核酸プローブセットを使用することも短時間で簡便に且つ安価にＨＢＶの薬剤耐性に関連する多型配列を特定することが可能である。
【００８９】
＜例２＞  多型配列を特定する方法
ＨＢＶの薬剤耐性に関連する多型配列を特定する方法の例を以下に示す。
【００９０】
ＨＢＶの薬剤耐性に関連する多型配列を特定する方法は、
（Ａ）例１に示したＨＢＶのポリメラーゼ領域の２０４位および２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列を増幅するための核酸プライマーセットを用いて試料溶液中のＨＢＶ核酸をＬＡＭＰ増幅し、増幅産物を得ることと、
（Ｂ）前記増幅産物と、例１に示した核酸プローブセットとを反応させ、ハイブリダイゼーションの有無に基づいて当該多型配列を特定することと
を具備する。
【００９１】
このような方法により、短時間で簡便に且つ安価にＨＢＶの薬剤耐性に関連する多型配列を特定できる。
【００９２】
＜例３＞  検出用プラマーセット、プローブセットおよびアッセイキット
ＨＢＶの薬剤耐性株を検出するための核酸プライマーセットの例を以下に示す。
【００９３】
核酸プライマーセットは、ＦＩＰプライマーと、Ｆ３プライマーと、ＢＩＰプライマーと、Ｂ３プライマーとを具備し、
ポリメラーゼ領域の２０４位および２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列を増幅するための、
前記ＦＩＰプライマーは配列番号１、前記ＢＩＰプライマーは配列番号２、前記Ｆ３プライマーは配列番号１３、前記Ｂ３プライマーは配列番号１４でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット１、および
前記ＦＩＰプライマーが配列番号３、前記ＢＩＰプライマーが配列番号４、前記Ｆ３プライマーが配列番号１３、前記Ｂ３プライマーが配列番号１５でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット２、並びに、
ポリメラーゼ領域の１８１位および２０４位のアミノ酸をコードする塩基配列を増幅するための、
前記ＦＩＰプライマーが配列番号５、前記ＢＩＰプライマーが配列番号６、前記Ｆ３プライマーが配列番号１６、前記Ｂ３プライマーが配列番号１７でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット３、および
前記ＦＩＰプライマーが配列番号７、前記ＢＩＰプライマーが配列番号８、前記Ｆ３プライマーが配列番号１６、前記Ｂ３プライマーが配列番号１８でそれぞれ示されるプライアーであるプライマーセット４；
を含む核酸プライマーセットである。
【００９４】
この核酸プライマーセットは、更にループプライマーを具備してもよく、当該ループプライマーは、配列番号１９で示されるプライマー、配列番号２０で示されるプライマーおよび／または配列番号２１で示されるプライマーである。
【００９５】
上記のＨＢＶの薬剤耐性株を検出するための核酸プライマーセットを用いたＬＡＭＰ増幅により得られた増幅産物について、ＨＢＶのポリメラーゼ領域の２０４位、２３６および１８１位のアミノ酸をコードする塩基配列の多型を決定するための核酸プローブセットの例を示す。
【００９６】
核酸プローブセットは、
（Ａ）ポリメラーゼ領域２０４位のアミノ酸が非薬剤耐性株由来の塩基配列および／または薬剤耐性株由来の塩基配列を含むプローブと、
（Ｂ）ポリメラーゼ領域２３６位のアミノ酸が非薬剤耐性株由来の塩基配列および／または薬剤耐性株由来の塩基配列を含むプローブと、
（Ｃ）ポリメラーゼ領域１８１位のアミノ酸が非薬剤耐性株由来の塩基配列および／または薬剤耐性株由来の塩基配列を含むプローブと、
を含み、
ここで、
（ａ）前記ポリメラーゼ領域２０４位のアミノ酸が非薬剤耐性株由来の塩基配列を含むプローブは、配列番号２２で示されるプローブ、配列番号２３で示されるプローブ、およびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブであり、
（ｂ）前記ポリメラーゼ領域２０４位のアミノ酸が薬剤耐性株由来の塩基配列を有するプローブは、配列番号２４で示されるプローブ、配列番号２５で示されるプローブ、配列番号２６で示されるプローブ、配列番号２７で示されるプローブ、配列番号２８で示されるプローブ、配列番号２９で示されるプローブ、配列番号３０で示されるプローブ、配列番号３１で示されるプローブ、およびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブであり、
（ｃ）前記ポリメラーゼ領域２３６位のアミノ酸が非薬剤耐性株由来の塩基配列を有するプローブは、配列番号３２で示されるプローブ、配列番号３３で示されるプローブ、配列番号３４で示されるプローブ、配列番号３５で示されるプローブ、配列番号３８で示されるプローブ、配列番号３９で示されるプローブ、配列番号４０で示されるプローブ、配列番号４１で示されるプローブ、配列番号４２で示されるプローブ、配列番号４３で示されるプローブ、および／またはこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブであり、
（ｄ）前記ポリメラーゼ領域２３６位のアミノ酸が薬剤耐性株由来の塩基配列を有するプローブは、配列番号３６で示されるプローブ、配列番号３７で示されるプローブ、配列番号４４で示されるプローブ、配列番号４５で示されるプローブ、配列番号４６で示されるプローブ、および／またはこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブであり、
（ｅ）前記ポリメラーゼ領域１８１位のアミノ酸が非薬剤耐性株由来の塩基配列を有するプローブは、配列番号４７で示されるプローブ、配列番号４８で示されるプローブ、配列番号４９で示されるプローブ、およびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブであり、
（ｆ）前記ポリメラーゼ領域１８１位のアミノ酸が薬剤耐性株由来の塩基配列を有するプローブは、配列番号５０で示されるプローブ、配列番号５１で示されるプローブ、配列番号５２で示されるプローブ、配列番号５３で示されるプローブ、配列番号５４で示されるプローブ、配列番号５５で示されるプローブ、配列番号５６で示されるプローブ、配列番号５７で示される含むプローブ、配列番号５８で示されるプローブ、配列番号５９で示されるプローブ、配列番号６０で示されるプローブ、配列番号６１で示されるプローブ、およびこれらのプローブの相補鎖であるプローブからなる群より少なくとも１つ選択されたプローブである。
【００９７】
上述のＨＢＶの薬剤耐性株を検出するための核酸プライマーセットおよび核酸プローブセットは、これらを含むアッセイキットの形態で提供されてもよい。そのようなアッセイキットは、ＨＢＶの薬剤耐性株を検出するためのアッセイキットである。
【００９８】
このような核酸プライマーセット、核酸プローブセットおよびアッセイキットは、短時間で簡便に且つ安価にＨＢＶの薬剤耐性株を検出するために有用である。
【００９９】
＜例４＞  ＨＢＶの薬剤耐性株を検出する方法（その１）
ＨＢＶの薬剤耐性株を検出する方法の例を以下に示す。
【０１００】
ＨＢＶの薬剤耐性株を検出する方法は、
（１）例３に記載された核酸プライマーセットを用いて試料溶液中のＢ型肝炎ウイルス核酸をＬＡＭＰ増幅し、増幅産物を得ることと、
（２）前記増幅産物と、例３に記載された核酸プローブセットとを反応させ、ハイブリダイゼーションの有無に基づいて当該多型配列を特定し、前記ウィルスの薬剤耐性を判定することと、
を含む。
【０１０１】
更に、Ｂ型肝炎ウイルスの薬剤耐性株を検出する方法であって、
（１）（ａ）例１に記載の核酸プライマーセット、即ち、ポリメラーゼ領域の２０４位および２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列を増幅するための、
前記ＦＩＰプライマーは配列番号１、前記ＢＩＰプライマーは配列番号２、前記Ｆ３プライマーは配列番号１３、および前記Ｂ３プライマーは配列番号１４でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット１、および／または
前記ＦＩＰプライマーは配列番号３、前記ＢＩＰプライマーは配列番号４、前記Ｆ３プライマーは配列番号１３、前記Ｂ３プライマーは配列番号１５でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット２、並びに
（ｂ）前記ウイルスのポリメラーゼ領域の１８１位および２０４位のアミノ酸をコードする塩基配列をＬＡＭＰ増幅するための核酸プライマーセットであり、前記プライマーセットは、ＦＩＰプライマーと、Ｆ３プライマーと、ＢＩＰプライマーと、Ｂ３プライマーとを具備し、
前記ＦＩＰプライマーは配列番号５、前記ＢＩＰプライマーは配列番号６、前記Ｆ３プライマーは配列番号１６、前記Ｂ３プライマーは配列番号１７でそれぞれ示されるプライマーであるプライマーセット３、および／または
前記ＦＩＰプライマーは配列番号７、前記ＢＩＰプライマーは配列番号８、前記Ｆ３プライマーは配列番号１６、前記Ｂ３プライマーは配列番号１８でそれぞれ示されるプライアーであるプライマーセット４；
を用いて試料溶液中の核酸をＬＡＭＰ増幅し、増幅産物を得ること、
（２）前記増幅産物と、以下の核酸プローブセット；
（ａ）前記ポリメラーゼ領域２０４位のアミノ酸が非薬剤耐性株由来の塩基配列を含むプローブであり、配列番号２２またはその相補鎖で示されるプローブおよび配列番号２３またはその相補配列で示されるプローブ、
（ｂ）前記ポリメラーゼ領域２０４位のアミノ酸が薬剤耐性株由来の塩基配列を有するプローブであり、配列番号２４またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号２５またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号２６またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号２７またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号２８またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号２９またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号３０またはその相補鎖で示されるプローブ、および配列番号３１またはその相補鎖で示されるプローブ、
（ｃ）前記ポリメラーゼ領域２３６位のアミノ酸が非薬剤耐性株由来の塩基配列を有するプローブであり、配列番号３２またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号３３またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号３４またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号３５またはその相補鎖で示されるプローブ、
（ｄ）前記ポリメラーゼ領域２３６位のアミノ酸が薬剤耐性株由来の塩基配列を有するプローブであり、配列番号３６またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号３７またはその相補鎖で示されるプローブ、
（ｅ）前記ポリメラーゼ領域１８１位のアミノ酸が非薬剤耐性株由来の塩基配列を有するプローブであり、配列番号４７またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号４８またはその相補鎖で示されるプローブ、および配列番号４９またはその相補鎖で示されるプローブ、並びに
（ｆ）前記ポリメラーゼ領域１８１位のアミノ酸が薬剤耐性株由来の塩基配列を有するプローブは、配列番号５０またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号５１またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号５２またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号５３またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号５４またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号５５またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号５６またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号５７またはその相補鎖で示される含むプローブ、配列番号５８またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号５９またはその相補鎖で示されるプローブ、配列番号６０またはその相補鎖で示されるプローブ、および配列番号６１またはその相補鎖で示されるプローブ
とを反応させ、ハイブリダイゼーションの有無に基づいて当該多型配列を特定し、前記ウイルスの薬剤耐性を判断することと、
を含む。
【０１０２】
このような方法により、短時間で簡便に且つ安価にＨＢＶの薬剤耐性株を検出することが可能である。
【０１０３】
＜例５＞    プライマーセットの例
ＨＢＶの薬剤耐性株を検出するための更なる核酸プライマーセットの例を以下に示す。
【０１０４】
このような核酸プライマーセットは、ＨＢＶのポリメラーゼ領域の１８１位、２０４位、２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出するための核酸プライマーセットであってよく、二本鎖標的核酸の一方の一本鎖核酸の５’末端側から順にＦ３領域、Ｆ２領域およびＦ１領域とし、他方の一本鎖核酸の３’末端側から順にＢ３ｃ領域、Ｂ２ｃ領域およびＢ１ｃ領域として設計されてよい。
【０１０５】
当該核酸プライマーセットは、ＦＩＰプライマーセットと、Ｆ３プライマーセットと、ＢＩＰプライマーセットと、Ｂ３プライマーセットとを具備し、
前記ＦＩＰプライマーセットは、配列番号１で示されるプライマー、配列番号３で示されるプライマー、配列番号５で示されるプライマーおよび配列番号７で示されるプライマーを含み、
前記ＢＩＰプライマーセットは、配列番号２で示されるプライマー、配列番号４で示されるプライマー、配列番号６で示されるプライマーおよび配列場号８で示されるプライマーを含み、
前記Ｆ３プライマーセットは、配列番号１３で示されるプライマーおよび配列番号１６で示されるプライマーを含み、
前記Ｂ３プライマーセットは、配列番号１４で示されるプライマー、配列番号１５で示されるプライマー、配列番号１７で示されるプライマーおよび配列番号１８で示されるプライマーを含む。
【０１０６】
更に、ループプライマーセットを同時に使用してもよい。上記の核酸プローブセットの場合において、ループプライマーとして使用するのに好ましい組み合わせは、配列番号１９で示されるプライマー、配列番号２０で示されるプライマー、および配列番号２１で示されるプライマーを含むループプライマーセットである。
【０１０７】
また、このようなＦＩＰプライマーセットと、Ｆ３プライマーセットと、ＢＩＰプライマーセットと、Ｂ３プライマーセットと、任意のループプライマーセットを含む上記の核酸プライマーセットを使用する場合、同時に使用することが好ましい核酸プローブセットは、配列番号２２〜６１でそれぞれ示されるプローブを含む核酸プローブセットおよび／または配列番号２２〜６１の相補配列でそれぞれ示されるプローブを含む核酸プローブセットである。より好ましい核酸プローブセットは、配列番号２２〜３７および配列番号４７〜６１でそれぞれ示されるプローブを含む核酸プローブセットおよび／またはそれらの相補配列でそれぞれ示されるプローブを含む核酸プローブセットである。
【０１０８】
このような核酸プライマーセットを用いて、ＨＢＶに由来する核酸をＬＡＭＰ増幅することにより、短時間で簡便に且つ安価にＨＢＶの薬剤耐性株を検出することが可能である。更に、それらに組み合わせて当該ループプライマーセットおよび当該核酸プローブセットを使用すれば、更にその効果は増大する。
【０１０９】
＜例６＞  薬剤耐性株の検出方法
対象からの血液、血清および／または臓器などを試料として、上述の何れかの検出用核酸プライマーセットと核酸プローブを用いて、ＨＢＶからの標的核酸が薬剤耐性であるか、非薬剤耐性であるかを調べることができる。その例を以下に記す。
【０１１０】
まず、試料から核酸を抽出する。得られた試料溶液について、例３で示されるプライマーを用いて、適切な増幅を得うる条件化で、例えば、等温条件下６０〜６５℃で適切なバッファーを用いてＬＡＭＰ増幅を行う。
【０１１１】
得られた増幅産物を各々例３で示される核酸プローブを固定化した基体（以下、「核酸プローブ固定化基体」と記す）を用いてハイブリダイズ信号を検出する。当該核酸プローブ固定化基体に対して、増幅産物を添加し、ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズ信号を検出し、試料からのＨＢＶが薬剤耐性株であるか、非薬剤耐性株であるかを判定する。
【０１１２】
このような方法により、短時間で簡便に且つ安価にＨＢＶの薬剤耐性に関する情報を得ることが可能であり、また、ＨＢＶの薬剤耐性株を検出することも可能である。
【０１１３】
＜実施例＞
＜実施例１＞
以下、ＨＢＶ感染患者からの血清２２サンプルを試料として、表１〜３に記載のプライマーを用いてLAMP増幅を行い、表４に記載の核酸プローブをそれぞれ１つの電極に対して固定化したＤＮＡチップを用いて、ＨＢＶのポリメラーゼ領域の２３６位のアミノ酸をコードする塩基配列を検出する例を記載する。
【０１１４】
（１）核酸抽出
対象とする血清２２サンプルからＨＢＶを含む核酸を抽出した。
【０１１５】
（２）ＬＡＭＰ法による標的核酸の増幅
表１に記載のプライマーセット１およびプライマーセット２、またはプライマーセット５およびプライマーセット６を、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーはそれぞれ40pmoL、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーをそれぞれ5pmoL、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーをそれぞれ5pmoL、ループプライマーをそれぞれ20pmoLの濃度で含み、並びにＬＡＭＰ反応に必要な酵素（Bst-DNPポリメラーゼ(NEB社製)を2μL）、ｄＮＴＰおよびＬＡＭＰ反応用緩衝溶液を含むＬＡＭＰ反応溶液を調製した。調製した反応溶液に対し、抽出核酸を各々5μLずつ添加し、６３℃で１時間反応させた。それぞれに得られた反応液の一部分について電気泳動を行い、ＬＡＭＰ産物が得られたことを確認した。
【０１１６】
残りの反応液をＬＡＭＰ産物溶液とし、これに２０×ＳＳＣ溶液を終濃度２×ＳＳＣとなるように添加し、標的核酸溶液とした。
【０１１７】
（３）核酸プローブ固定化電極の作製
本実施例では核酸プローブの支持体として金電極を使用した。核酸プローブを固定する作用極、電気化学測定に必要な対極と参照極、さらにこれらの電極と配線されている電極パッドが一枚のガラス基板上に複数配置されているＤＮＡチップ用基板を作製した。
【０１１８】
表４に示す配列番号３２〜３７の核酸プローブのそれぞれの末端にＳＨ基が修飾されている核酸プローブ、又は３８〜４６の核酸プローブのそれぞれの末端にＳＨ基が修飾されている核酸プローブをそれぞれ含む核酸プローブ溶液を作用極に滴下し、１時間放置した。その後、超純水で洗浄し乾燥させることで、核酸プローブ固定化電極(即ち、ＤＮＡチップ)を作製した。
【０１１９】
（４）標的核酸の検出
上記で調製した標的核酸溶液を、上記核酸プローブ固定化電極上に添加後、４５℃で１０分間反応することで、標的核酸を核酸プローブにハイブリダイズさせた。その後、非特異的に吸着または結合している標的核酸を除去するために、０．２×ＳＳＣ溶液を添加し、３７℃で１０分間反応させることで洗浄を行った。洗浄用緩衝液を除去したあと、核酸に結合する挿入剤としてヘキスト３３２５８を添加した。その後、リニアスイープボルタンメトリーを行い、得られたボルタモグラムからヘキスト３３２５８の酸化に由来するピーク電流値を算出した。
【０１２０】
標的核酸溶液添加以降の、設定温度でのハイブリダイズ反応、洗浄用緩衝液の添加、設定温度での洗浄、挿入剤の添加、電流検出、各電極から得られる電流値の比較は、これらに必要な送液制御系、温度制御系、ポテンシオスタットを含む自動検出装置、および各部の制御ソフトウェアを使用して行った。
【０１２１】
（５）結果
表５に血清から抽出したＢ型肝炎ウィルス２２サンプルの、ポリメラーゼ領域の２３６位の塩基配列の検出における陽性率を示した。搭載した何れかの核酸プローブにおいてＳ／Ｂ比が２．０以上となったものを陽性とした。この結果から、２３６位の塩基配列の検出においては、プライマーセット１およびプライマーセット２を組み合わせたプライマーセット、および配列番号３２〜３７を具備する核酸プローブセットを用いることが好ましいということが示された。
【表５】
2012060939.tif 000010
【０１２２】
＜実施例２＞
以下、プライマーセット３、４を用いてＬＡＭＰ増幅を行い、Ｂ型肝炎ウィルスのポリメラーゼ領域の１８１位のアミノ酸(Thr)をコードする塩基配列を検出する例を記載する。
【０１２３】
（１）鋳型配列
鋳型配列として、以下の６種類の配列を合成した。
【０１２４】
テンプレート１は以下の配列である。
【化１】
2012060939.tif 000011
【０１２５】
テンプレート２は、上述のテンプレート１の配列中の四角で囲まれた部分及びその前の３塩基を含む配列、即ち、「TTGGCT」が「CTGGCT」である塩基配列である；
テンプレート３は、上述のテンプレート１の配列中の四角で囲まれた部分及びその前の３塩基を含む配列、即ち、「TTGGCT」が「ATGGCT」である塩基配列である；
テンプレート４は、上述のテンプレート１の配列中の四角で囲まれた部分及びその前の３塩基を含む配列、即ち、「TTGGCT」が「TTGACT」である塩基配列である；
テンプレート５は、上述のテンプレート１の配列中の四角で囲まれた部分及びその前の３塩基を含む配列、即ち、「TTGGCT」が「CTGACT」である塩基配列である；
テンプレート６は、上述のテンプレート１の配列中の四角で囲まれた部分及びその前の３塩基を含む配列、即ち、「TTGGCT」が「ATGACT」である塩基配列である；
図１２に、１例としてプライマーペア１〜４に対応する配列領域、検出対象アミノ酸の相対的な位置関係を示した。
【０１２６】
四角で囲んだ３塩基がそれぞれ検出対象アミノ酸をコードするコドン領域である。プライマーセット１では四角に「GCT」と記した領域が181位のアミノ酸をコードする領域である。同様に四角に「ATG」と記した領域が204位のアミノ酸をコードする領域である。プライマーセット２では、四角に「GCT」と記した領域が181位のアミノ酸をコードする領域であり、四角に「ATG」と記した領域が204位のアミノ酸をコードする領域である。プライマーセット３では、四角に「AAC」と記した領域が236位のアミノ酸をコードする領域である。プライマーセット４では、四角に「AAC」と記した領域が236位のアミノ酸をコードする領域である。
【０１２７】
（２）LAMP法による標的核酸の増幅
表１に記載のプライマーセット３および４を使用した。ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーをそれぞれ40pmol、Ｆ３プライマーおよびＢ３をそれぞれ5pmolで、およびループプライマーを20pmolで含み、且つＬＡＭＰ反応に必要な酵素（Bst-DNPポリメラーゼ(NEB社製)を2μL）、ｄＮＴＰ、ＬＡＭＰ反応用緩衝溶液を含むＬＡＭＰ反応溶液を８本調製した。調製反応溶液に対し、テンプレート１からテンプレート６をそれぞれ終濃度1E+03copies/reactionとなるように添加し、６３℃で１時間反応させた。それぞれに得られた反応液の一部分について電気泳動を行い、ＬＡＭＰ産物が得られたことを確認した。
【０１２８】
残りの反応液をＬＡＭＰ産物溶液とし、これに２０×ＳＳＣ溶液を終濃度２×ＳＳＣとなるように添加し、標的核酸溶液とした。即ち、テンプレート１〜テンプレート６より得られた標的核酸溶液をそれぞれ核酸溶液Ｃ−１〜核酸溶液Ｃ−６とした。その中に含まれる標的核酸を標的核酸Ｃ−１〜標的核酸Ｃ−６とした。別に、標的核酸を含まないこと以外は組成が同じ溶液を作成し、これをネガティブコントロールとしての核酸溶液Ｎとした。
【０１２９】
（３）核酸プローブ固定化電極の作製
本実施例ではＤＮＡプローブの支持体として金電極を使用した。核酸プローブを固定する作用極、電気化学測定に必要な対極と参照極、さらにこれらの電極と配線されている電極パッドが一枚のガラス基板上に複数配置されているＤＮＡチップ用基板を作製した。
【０１３０】
配列番号５３から配列番号６１の配列それぞれの末端にＳＨ基が修飾されている核酸プローブをそれぞれ含む核酸プローブ溶液を作用極に滴下し、１時間放置した。その後、超純水で洗浄し乾燥させることで、核酸プローブ固定化電極をＤＮＡチップとして作製した。
【０１３１】
（４）標的核酸の検出
上記で調製した核酸溶液Ｃ−１〜Ｃ−６、を上記核酸プローブ固定化電極上に添加後、４５℃で１０分間反応することで、標的核酸を核酸プローブにハイブリダイズさせた。その後、非特異的に吸着または結合している標的核酸を除去するために、０．２×ＳＳＣ溶液を添加し、３６℃で１０分間反応させることで洗浄を行った。洗浄用緩衝液を除去したあと、核酸に結合する挿入剤としてヘキスト３３２５８を添加した。その後、リニアスイープボルタンメトリーを行い、得られたボルタモグラムからヘキスト３３２５８の酸化に由来するピーク電流値を算出した。
【０１３２】
核酸溶液添加以降の、設定温度でのハイブリダイズ反応、洗浄用緩衝液の添加、設定温度での洗浄、挿入剤の添加、電流検出、各電極から得られる電流値の比較は、これらに必要な送液制御系、温度制御系、ポテンシオスタットを含む自動検出装置、および各部の制御ソフトウェアを使用して行った。
【０１３３】
（５）結果
本例は、プローブと標的核酸の一部が完全に相補的である組み合わせ、およびプローブと標的核酸の一部が１塩基だけ異なる組み合わせを選択し、各核酸プローブ固定化電極から得られる電流値をバックグラウンド電流値に対する割合（Ｓ／Ｂ比）として表６〜８に示した。
【表６】
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【０１３４】
【表７】
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【０１３５】
【表８】
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【０１３６】
表６には配列番号５３から５５の核酸プローブに対して、核酸溶液Ｃ−１、Ｃ−４、およびＮを反応させた際に得られたＳ／Ｂ比を、表７には配列番号５６〜５８の核酸プローブに対して核酸溶液Ｃ−２、Ｃ−５、およびＮを反応させたときのＳ／Ｂ比を、表８には配列番号５９〜６１の核酸プローブに対して核酸溶液Ｃ−３、Ｃ−６、およびＮを反応させたときのＳ／Ｂ比を示した。
【０１３７】
例えば、表６では、配列番号５３〜５５で示される核酸プローブに対して核酸溶液Ｃ−１、Ｃ−４、およびＮを反応させた際に得られたＳ／Ｂ比が示されているが、配列番号５３〜５５で示される核酸プローブは、それぞれ異なる塩基数であり、標的核酸Ｃ−１の相補鎖の一部と1塩基異なる配列を有し、標的核酸Ｃ−４の一部と相補的な配列を有する。使用した核酸プローブと標的核酸が１塩基異なる場合は値が低くなるべきであり、一方、核酸プローブと標的核酸が完全相補の場合は値が高くなるべきである。
【０１３８】
表６では、配列番号５５で示される核酸プローブを使用することにより、核酸溶液Ｃ−１を反応させた際により低い値を示し、核酸溶液Ｃ−４を反応させた際により高い値を示すことが明らかとなった。従って、本条件では配列番号５５で示される核酸プローブを使用することが好ましい。
【０１３９】
同様に、表７、表８に示すように、配列番号５６〜６１で示される核酸プローブについても数値を取得し、各プローブ配列の複数の塩基数から最も好ましい塩基数を決定した。
【０１４０】
表７に示した結果から、配列番号５６〜５８で示される核酸プローブの中では配列番号５８で示される核酸プローブが好ましく、表８に示した結果から、配列番号５９〜６１の中では配列番号６０で示される核酸プローブが好ましかった。
【０１４１】
これらの結果から、配列番号５５で示される塩基配列またはその相補鎖である核酸プローブ、配列番号５８で示される塩基配列またはその相補鎖である核酸プローブ、配列番号６０で示される塩基配列またはその相補鎖である核酸プローブにおいて、洗浄温度３６℃において目的の標的核酸鎖を明確に識別できることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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