(57)【要約】      （修正有）【課題】目的のタンパク質あるいはペプチドを更に高感度に検出、定量するために、非特異的な吸着を抑制するとともに、タンパク質あるいはペプチドの認識能を向上させるための新たな手段を提供する。【解決手段】電極基板にタンパク質またはペプチドを選択的に認識する糖類を末端に有する分子とともに、さらに電子授受機能を有する有機レドックス化合物が直接あるいはリンカー分子を介して固定化する。該電極基板に電位を印加し、有機レドックス化合物を酸化型に移行させることにより、タンパク質あるいはペプチドの認識能は顕著に向上し、かつ非特異的な吸着は効果的に抑制できる。【選択図】図１
2012108024.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質またはペプチドを選択的に認識する糖類を末端に有する分子が固定化された基板において、さらに電子授受機能を有する有機レドックス化合物が直接あるいはリンカー分子を介して固定化された電極基板。
【請求項２】
上記固定化により、タンパク質またはペプチドを選択的に認識する糖類が有機レドックス化合物よりも突出した状態の混合薄膜が形成されていることを特徴とする、請求項１に記載の電極基板。
【請求項３】
混合薄膜が単分子膜であることを特徴とする、請求項２の電極基板。
【請求項４】
タンパク質またはペプチドを選択的に認識する糖類に対する有機レドックス化合物の割合が、モル比で1：1〜1000：1である混合薄膜が形成されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の電極基板。
【請求項５】
タンパク質またはペプチドを選択的に認識する糖類が単糖類または２糖類であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の電極基板。
【請求項６】
電極に固定化する電子授受機能を有する有機レドックス化合物が還元型であることを特徴とする請求項１〜５に記載の電極基板。
【請求項７】
還元型有機レドックス化合物が、還元型フェロセン、ヒドロキノン類化合物、若しくはこれらの誘導体であることを特徴とする、請求項６に記載の電極基板。
【請求項８】
上記電極基板への固定化が、タンパク質またはペプチドを選択的に認識する糖類を末端に有する分子、または有機レドックス化合物あるいは該化合物を末端に有するリンカー分子に設けたチオール基、ジスルフィド基、スルフィド基、シランカップリング基、あるいはアジド基を介する化学結合であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の電極基板。
【請求項９】
タンパク質がレクチン類であることを特徴とする上記請求項１〜８のいずれかに記載の電極基板。
【請求項１０】
タンパク質あるいはペプチドを含有する試料溶液を請求項１〜９のいずれかに記載の電極基板に接触させ、該電極基板表面の質量変化あるいは光学的定数変化を指標に該溶液中の目的タンパク質あるいはペプチドを検出及び／または定量する方法であって、上記溶液を該電極基板に接触させる前または後に、上記基板にポジティブ電位を印加し、該電極基板表面の有機レドックス化合物を還元型から酸化型に変換することを特徴とする、上記検出及び／または定量方法。
【請求項１１】
タンパク質またはペプチドを含有する試料溶液を請求項１〜９のいずれかに記載の電極基板に接触させる前または後に、上記基板にポジティブ電位を印加し、該電極基板表面の有機レドックス化合物を還元型から酸化型に変換させて、タンパク質またはペプチドを選択的に該基板に捕捉させた後、該基板の電位をネガティブ方向に掃引して、有機レドックス化合物を還元型に戻し、次いで該基板を酸性水溶液、アルカリ水溶液、中性塩水溶液、界面活性剤含有水溶液、あるいは捕捉されたタンパク質に対して基板に固定化された分子末端の糖類よりも親和性の高い糖類含有水溶液と接触することにより、捕捉されたタンパク質またはペプチドを離脱させることを特徴とする、捕捉されたタンパク質またはペプチドの回収方法、及び該電極基板の再生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質あるいはペプチドを選択的に認識することのできる電極基板及び該基板を使用したタンパク質あるいはペプチドの検出及びまたは定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
以前より、生体の有する特異的分子認識機構を利用して、タンパク質、ウイルス、細胞などを検出する方法が利用されてきている。抗原抗体反応（免疫手法）を利用した生体分子の検出は、特異性も高く結合安定性も高いことから、頻繁に利用されている。しかし免疫手法では、抗体開発に時間がかかること、得られた抗体の安定性の保持が困難であること、抗体開発コストが高いことなど種々の問題があった。
目的生体分子（タンパク質）を効率よく検出するために、我々は糖鎖含有分子と基板への非特異的な吸着を抑制するための分子とで混合単分子層修飾膜を作成している（特許文献１）。
【０００３】
上記糖鎖部分とタンパク質の特異的な相互作用を十分に活かし、特定タンパク質を高感度に検出することが可能であったが、実際の疾病マーカタンパクの検出などのためには、さらに感度を十分に上げる必要があるとともに、この際に非特異的な吸着によるノイズ応答はできるだけ下げた状態での測定がより望まれる。このような非特異的な吸着を抑制するための分子として、トリエチレングリコール末端を有する分子を作製し、膜構築に用いることでノイズ応答をできるだけ低く抑える工夫も重ねてきている（非特許文献1）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2008-128840号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Y.Satoら、"Recognition  of  lectin  with  high  S/N  ratio:carbohydrate-/tri(ethylene  glycol)alkanethiol  co-adsorbed  monolayer”, Chem.  Commun.,4909-4911(2008).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明は、タンパク質あるいはペプチドの選択的認識能を有する糖類を末端に有する分子で修飾した基板を用いて目的のタンパク質あるいはペプチドを更に高感度に検出、定量するため、タンパク質あるいはペプチドの認識能を向上させ、かつ非特異的な吸着を抑制するための新たな手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究の結果、電極基板に、タンパク質あるいはペプチドの選択的認識能を有する糖類を末端に有する分子ともに、有機レドックス化合物を修飾することにより、糖類による目的のタンパク質あるいはペプチドの認識補足能が向上するとともに、かつ、非特異的な吸着も効果的に抑制する基板が得られることを見いだし本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下のとおりである。
【０００８】
（１）タンパク質またはペプチドを選択的に認識する糖類を末端に有する分子が固定化された基板において、さらに電子授受機能を有する有機レドックス化合物が直接あるいはリンカー分子を介して固定化された電極基板。
（２）上記固定化により、タンパク質またはペプチドを選択的に認識する糖類が有機レドックス化合物よりも突出した状態の混合薄膜が形成されていることを特徴とする、上記（１）に記載の電極基板。
（３）混合薄膜が単分子膜であることを特徴とする、上記（２）の電極基板。
（４）タンパク質またはペプチドを選択的に認識する糖類に対する有機レドックス化合物の割合が、モル比で１：１〜１０００：１である混合薄膜が形成されていることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の電極基板。
（５）タンパク質またはペプチドを選択的に認識する糖類が単糖類または２糖類であることを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の電極基板。
（６）電極に固定化する電子授受機能を有する有機レドックス化合物が還元型であることを特徴とする上記（１）〜（５）に記載の電極基板。
（７）還元型有機レドックス化合物が、還元型メタロセン、ヒドロキノン類化合物、若しくはこれらの誘導体であることを特徴とする、上記（６）のいずれかに記載の電極基板。
（８）上記電極基板への固定化が、タンパク質またはペプチドを選択的に認識する糖類を末端に有する分子、または有機レドックス化合物あるいは該化合物を末端に有するリンカー分子に設けたチオール基、ジスルフィド基、スルフィド基、シランカップリング基、あるいはアジド基を介する化学結合であることを特徴とする、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の電極基板。
（９）タンパク質がレクチン類であることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれかに記載の電極基板。
（１０）タンパク質あるいはペプチドを含有する試料溶液を上記（１）〜（９）のいずれかに記載の電極基板に接触させ、該電極基板表面の質量変化あるいは光学的定数変化を指標に該溶液中の目的タンパク質あるいはペプチドを検出及び／または定量する方法であって、上記溶液を該電極基板に接触させる前または後に、上記基板にポジティブ電位を印加し、該電極基板表面の有機レドックス化合物を還元型から酸化型に変換することを特徴とする、上記検出及び／または定量方法。
（１１）タンパク質またはペプチドを含有する試料溶液を上記（１）〜（９）のいずれかに記載の電極基板に接触させる前または後に、上記基板にポジティブ電位を印加し、該電極基板表面の有機レドックス化合物を還元型から酸化型に変換させて、タンパク質またはペプチドを選択的に該基板に捕捉させた後、該基板の電位をネガティブ方向に掃引して、有機レドックス化合物を還元型に戻し、次いで該基板を酸性水溶液、アルカリ水溶液、中性塩水溶液、界面活性剤含有水溶液、あるいは捕捉されたタンパク質に対して基板に固定化された分子末端の糖類よりも親和性の高い糖類含有水溶液と接触することにより、捕捉されたタンパク質またはペプチドを離脱させることを特徴とする、捕捉されたタンパク質またはペプチドの回収方法、及び該電極基板の再生方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、タンパク質またはペプチドを選択的に認識する糖類を末端に有する分子とともに、電子授受機能を有する有機レドックス化合物を直接あるいは該有機レドックス化合物をリンカー分子を介して電極基板に固定化した、タンパク質またはペプチドの検出、定量用の基板に関するものであって、該基板に電位を印加し、上記有機レドックス化合物を酸化型にしてタンパク質あるいはペプチド含有溶液と接触させるとき、上記糖類と溶液中の目的タンパク質あるいはペプチドとの相互作用による選択的結合能が顕著に向上するとともに、基板に対する非目的タンパク質あるいはその他夾雑物の非特異的吸着を極めて有効に抑制でき、目的タンパク質あるいはペプチドを極めて高感度で検出することができる。
【００１０】
また、本発明の基板によれば、検出対象とするタンパク質と混合膜中の糖鎖部分との間で相互作用があったときのみ、基板表面での質量変化あるいは光学的定数の変化が生じ、目的タンパクの有無を瞬時に検出できる。さらに、予め、目的とするタンパク質、ペプチドを既知の各濃度で含む溶液を作成し、上記本発明の基板を用いて、これら各濃度の溶液に対する上記質量変化あるいは光学的定数変化の程度を測定して、これら変化の程度とタンパク質、ペプチド濃度との関係を求めて検量線を作成しておけば、目的とするタンパク質、ペプチドの定量も行うことができる。
【００１１】
さらに、本発明の基板により捕捉されたタンパク質あるいはペプチドは、極めて簡単な操作で脱離可能であり、これにより捕捉されたタンパク質あるいはペプチドの回収とともに、基板の再生も容易にできる。したがって、本願発明の基板は、タンパク質あるいはペプチドの検出、定量を迅速かつ正確に行うために極めて有力な手段となりうる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明による電極基板の電位変化による有機レドックス化合物の酸化型移行と糖類によるタンパク質の捕捉能変化の様子を表す模式図。
【図２】表面プラズモン共鳴(SPR)測定による、フェロセニルアルカンチオールとマルトシドアルカンチオール混合膜上でのCon  Aの吸着挙動応答測定の結果を示す図。
【図３】表面プラズモン共鳴(SPR)測定による、フェロセニルヘキサンチオール膜上でのCon  Aの吸着挙動検出結果を示す図。
【図４】表面プラズモン共鳴(SPR)測定による、フェロセニルヘキサンチオールとマルトシドチオール混合膜上でのヒマ豆レクチン（Ricinus  communis）の吸着挙動応答の測定結果を示す図。
【図５】フェロセニルヘキサンチオール膜の電位変化（0Vから0.6V,  サイクリック）における周波数変化量と同時測定した共振抵抗値変化を示す図。
【図６】表面プラズモン共鳴(SPR)測定による、ヒドロキノン＋マルトシド単分子層のCon  Aの吸着量変化を測定した結果を示す図。
【図７】電位変化と水酸化ナトリウム溶液による、基板に対するCon  Aの吸着、脱離応答を表面プラズモン共鳴(SPR)測定により検出した結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において目的タンパク質あるいはペプチドを検出するために用いるため新たに提供される基板は、末端にたんぱく質あるいはペプチドを認識する糖類を有する分子と、電子授受機能を有する有機レドックス化合物を直接あるいは該芳香族化合物をリンカー分子を介して電極基板に固定化した基板である。
本発明において、上記糖類とは、単糖類、二糖あるいは三糖以上の糖鎖構造を有するものあるいは糖タンパク質中の糖類あるいは糖鎖を含む。
【００１４】
一方、本発明における電子授受機能を有する有機レドックス化合物とは、電極を介する電子の授受により酸化型と還元型の両方の状態に移行可能な有機化合物であって、これには、例えば、メタロセン等の有機金属化合物、キノン類化合物等が挙げられ、メタロセンとしてはフェロセン、オスモセン等、キノン類化合物としては、キノン、１，２−キノン、アントラキノン、１，２−アントラキノン、１，４−アントラキノン等が挙げられるが、これら化合物においては酸化還元に直接的には関与しない他の置換基（例えば、フェロンセンにおける水酸基、アミノ基、カルボキシル基、アルキル基、あるいはキノン類化合物におけるアルキル基等）でさらに修飾されていても、電極を介する電子の授受により酸化型と還元型の両方の状態に移行可能な化合物であれば、これらも使用できる。
【００１５】
また、本発明において使用する電極基板としては、金、白金、銀、銅等からなる電極基板、シリコン等の半導体電極基板、酸化インジウムスズ（ITO）等の透明導電性電極基板、あるいはキャリアをドーピングした共役系高分子からなる導電性のプラスチック基板が好都合に利用できる。例えば、表面プラズモン共鳴測定装置に使用する金等の金属基板はそのまま本願発明の電極基板として使用できる。
【００１６】
また、本発明においては、末端にたんぱく質あるいはペプチドを認識する糖類は、検出対象のタンパク質あるいはペプチドをより認識しやすくし、かつ電極基板上の他のタンパク質あるいは夾雑物質の非特異的吸着、結合を防止するため、有機レドックス化合物よりも電極基板から突出して配置されていることが好ましい。このため、有機レドックス化合物がリンカー分子を介して電極基板に固定化する場合には、有機レドックス化合物とリンカー分子を含んだ長さよりも、糖類を末端に有する分子の長さを長くすることが好ましい。
【００１７】
末端にたんぱく質あるいはペプチドを認識する糖類を末端に有する分子としては、糖タンパク質あるいは糖類にリンカー分子を結合させたものでもよく、リンカー分子としては、糖と反対側端部に、電極基板表面と強固な化学結合を形成するための官能基を設けたものが挙げられる。
このような官能基としては、例えば、金等の金属電極基板の場合は、金属−Ｓ結合を形成するためのチオール基、ジスルフィド基、スルフィド基等の含硫黄官能基、シリコン等の半導体基板の場合は、−Ｓｉ（ＯＣＨ３）３、−Ｓｉ（ＯＣ２Ｈ５）３、−ＳｉＸ３（Ｘはハロゲン）等のシランカップリング反応を生起可能な基、プラスチック基板の場合は、フェニルアジド基等が挙げられる。糖タンパク質の場合タンパク質のアミノ酸のアミノ基、カルボキシル基、チオール基も利用できるが、必要に応じて、上記官能基をさらに導入してもよい。
【００１８】
末端に糖類を有するリンカー分子の例としては、例えば、以下の式（１）の化合物を挙げることができる。
Ｇ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ  ・・・・（１）
（式中、Ｇは単糖類、2糖類等の糖類を表し、ｎは1〜20の整数を表す。）  
このような化合物の具体例としては、１２−メルカプトドデシル−α−グルコシド、１２−メルカプトドデシル−β−マルトシド、８−メルカプトオクチルα−Ｄグルコシド、８−メルカプトオクチルβ−Ｄマルトシド等が挙げられる。
リンカー分子を構成する分子鎖としては、アルカン鎖の他、エチレングリコールの繰り返しを含むアルカン類なども用いられる。
【００１９】
一方、有機レドックス化合物は、上記したように電極基板に直接あるいはリンカー分子を介して固定されるが、このような固定化に用いる官能基は、上記した糖類−リンカー分子を電極基板に結合させるための官能基を用いることができる。
有機レドックス化合物を直接電極基板に固定する場合には、有機レドックス化合物に直接上記官能基を導入する。
【００２０】
また、有機レドックス化合物を末端に有するリンカー分子としては、例えば以下の式（２）の化合物を挙げることができる。
Ｒ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ  ・・・（２）
（式中、Ｇは有機レドックス化合物を表し、ｎは1〜20の整数を表す。）  
ただし、この分子中のアルキル鎖（−（ＣＨ２）ｎ−）のｎは、上記式（１）の化合物よりも少ない数に設定する。これにより糖類が、電極基板に形成された混合薄膜上に突出した状態にすることができ、糖類による目的タンパク質あるいはペプチドをより認識しやすくする。
【００２１】
また、上記と同様にリンカー分子を構成する分子鎖として、アルキレン鎖の他直鎖のアルカン、ビニル基の繰り返しなども用いられる。
本発明の電極基板を得るためには、上記糖類末端に有する分子、またはレドックス化合物若しくはレドックス化合物を末端に有するリンカー分子の一方を上記官能基を利用して電極基板に固定化した後、該基板の空き領域に他方を電極基板に固定化してもよいが、官能基を共通にして上記糖類末端に有する分子、またはレドックス化合物若しくはレドックス化合物を末端に有するリンカー分子を混合物の形態で使用して、一度に固定化することがより効率的でかつ均質な混合薄膜が形成できる点でより好ましく、また、このようにすれば単分子膜を形成できる。
【００２２】
このように形成された混合薄膜においては、糖類が混合薄膜表面に点在した状態で突出し、その間の領域を有機レドックス化合物が埋めるような形態で存在していることが好ましい。有機レドックス化合物は、糖類の検出対象のタンパク質あるいはペプチドの捕捉認識能を高めるが、それのみではなく、他のタンパク質あるいは夾雑物質の非特異的吸着、結合を防止する機能も有する。また、上記糖類及びレドックス化合物の使用割合を変更することにより、種々の特性の電極基板を得ることができる。本発明においてタンパク質またはペプチドを選択的に認識する糖類に対する有機レドックス化合物の割合は、モル比で1：1〜1000：1が好ましく、さらに9：1〜99：1が好ましい。
【００２３】
本発明における糖類を末端に有する分子と、有機レドックス化合物を直接あるいはリンカー分子を介して固定化した電極基板（以下、固定化電極基板）を用いる場合、固定化電極基板上の有機レドックス化合物は還元型にする。還元型にするためには、固定化において還元型の有機レドックス化合物を使用してもよいし、酸化型の有機レドックス化合物あるいは一部酸化型が含まれる有機レドックス化合物を固定化した後、固定化電極基板にネガティブ電位を印加して還元型に変換してもよい。なお、市販フェロセンは通常還元型である。
このようにして還元型の有機レドックス化合物を有する電極基板は、タンパク質あるいはペプチド溶液を接触させる前または接触させた後、ポジティブ電位を印加し、有機レドックス化合物を酸化型に移行させる。この操作により、糖類の検出対象タンパク質あるいはペプチドの認識捕捉能は向上する。しかも検出対象外のタンパク質あるいは夾雑物の非特異的結合、吸着も有効に防止することができる。
【００２４】
上記ポジティブ電位の印加による有機レドックス化合物の酸化型に移行させることに伴い、固定化電極基板上の共振抵抗値は増大する。すなわち、固定化膜のフレキシビリティは増加している結果が得られているが、この結果と上記タンパク質の認識捕捉能の向上効果との関連は未だ明らかではない。
【００２５】
本発明において検出対象の目的タンパク質あるいはペプチドとしては、例えばレクチン、ガレクチン、酵素、血液凝集性タンパク質、細胞膜糖タンパク質等が挙げられる。特にレクチンと糖類の結合は解離定数も大きく（KD=10-3〜10-6）、抗原抗体反応などと比較すると大変弱いものであるが、本発明の固定化電極基板は、レクチンに対しても極めて高い認識捕捉能を発揮する。
本発明の固定化電極基板に検出対象タンパク質あるいはペプチドが捕捉された場合、周知の検出手段で検出することができる。例えば、表面プラズモン共鳴センサーにより、固定化基板表面の屈折率変化を追跡したり、あるいは水晶振動子マイクロバランス法により固定化電極表面での質量変化を追跡したりすることにより、検出対象のタンパク質あるいはペプチドの有無を検出することができる。また、上記捕捉の有無は、捕捉前後のＩＲスペクトルを測定することでも検出可能ある。さらに、予めタンパク質の溶液濃度と上記検出手段により計測された変化量との関係を求めて検量線を作成しておけば、目的とするタンパク質の定量を行うこともできる。
【００２６】
一方、本発明の固定化電極基板から、捕捉されたタンパク質あるいはペプチドを離脱させ、これらタンパク質あるいはペプチドを回収するとともに、固定化電極基板を次の検出、定量に使用するため再生させることが可能である。
これには、目的タンパク質あるいはペプチドを捕捉した固定化電極基板は、洗浄後、基板の電位をネガティブ方向に掃印して、電極基板表面の有機レドックス化合物を酸化型から還元型に戻す。これにより、基板上の糖類と捕捉されたタンパク質あるいはペプチドの結合力は弱まり、該固定化基板を酸性水溶液、アルカリ水溶液あるいは中性塩水溶液、界面活性剤含有水溶液と接触させることにより、捕捉された目的タンパク質あるいはペプチドは、極めて容易に離脱し、上記溶液中から目的タンパク質あるいはペプチドが回収可能となるとともに、固定化基板の再生がなされる。
【００２７】
酸性水溶液あるいはアルカリ水溶液を使用する場合、基板自体を浸食し傷けることがないように、弱酸性水溶液あるいは弱アルカリ性水溶液を用いるのが好ましい。より具体的には、アルカリ水溶液として、例えば、水酸化ナトリウム溶液を使用する場合、水酸化ナトリウムの濃度は１〜５０ｍM濃度が好ましく、さらに１０〜２０ｍM濃度がより好ましい。酸性水溶液として塩酸溶液を使用する場合には、塩酸濃度は10〜100mMが好ましく、さらに10〜20mMが好ましい。中性塩水溶液として食塩溶液を用いる場合、塩化ナトリウム濃度は10mM〜2Mが好ましく、さらに、100mM〜1Mがより好ましい。
【００２８】
本発明において、上記の他、アルカリ水溶液としては、グリシン−NaOH緩衝液や、エタノールアミン水溶液が、酸性水溶液としてグリシン−HCl緩衝液、リン酸緩衝液などが用いられる。これらアルカリ水溶液あるいは酸性水溶液の濃度は、上記水酸化ナトリウム、塩酸、食塩について上述した各濃度と同様のイオン強度になるように調整する。さらに、界面活性剤含有水溶液として、Tween20やSDS水溶液なども用いることが可能であり、SDS水溶液の場合、好ましくは0.5％以下の濃度、Tween20の場合、5％以下の濃度で使われるのが好ましい。本発明においては、このような低濃度の各溶液を用いることにより、基板を傷めることなく、また回収するタンパク質の変性も抑制することができる。
【００２９】
また、このような溶液の他、本発明においては、捕捉されたタンパク質に対して基板に固定化された分子末端の糖類よりも親和性の高い糖類含有水溶液と接触させてもよい。このような例としては、糖類としてマルトシドを保持する固定化電極基板を用いて、Con  Aを捕捉した場合、このマルトシドよりもCon  Aに対してより親和性の高いα−メチルマンノシドの水溶液を用いる例が挙げられる。
また、本発明において、タンパク質あるいはペプチド捕捉した状態の固定化電極基板とこれら溶液との接触の形態としては、例えば、該固定化電極基板を上記溶液中に浸漬する手法、あるいは固定化電極基板をこれら溶液でリンスする手法等が挙げられる。このようにして再生された本発明の固定化基板は、次の検出、定量に再利用される。
【実施例】
【００３０】
以下に、本発明の実施例を示すが、これら実施例は本発明を限定するものではない。
【００３１】
〔実施例１〕
この実験は基板としてガラス上の金薄膜（以下、金基板という。）を用い、12-メルカプトドデシル-β-マルトシド（発明者らが合成、精製したもの）と、非特異吸着抑制分子としてフェロセニルヘキサンチオールを用いて、以下１）の修飾方法により、混合薄膜修飾電極基板を作成し、該基板を用いてCon  Aの認識、吸着実験を行った結果を、参照比較実験の結果と併せて示すものである。上記混合薄膜修飾電極基板によるCon  Aの捕捉の様子は模式図として、図１(a)に示される。
【００３２】
１）修飾方法
Con  Aを特異的に認識するマルトシド基を末端に持つ12-メルカプトドデシル−β−マルトシド（MalC12SH）と、Con  Aを認識せず、非特異的な吸着も起こらないフェロセニルヘキサンチオール（FcC6SH）の1mM溶液（エタノール溶液）を調整し、1：1の割合で両液を混合した溶液を作製、金基板をこの溶液で１時間修飾し、金基板上に混合薄膜を作製した。混合修飾薄膜に対しての対照実験として、糖鎖のみの薄膜およびフェロセンのみの膜を作製する際は、12-メルカプトドデシル-β-マルトシド溶液のみ、または、フェロセニルヘキサンチオール溶液にて、各々の基板表面を１時間修飾した。修飾の後、修飾分子を含まないエタノール、水で十分に基板を洗浄の後、表面プラズモン共鳴測定装置にセットし、流路（電気化学セル）を配置した。
【００３３】
２）フェロセニルアルカンチオールとマルトシドアルカンチオール混合膜上でのCon  Aの認識
12-メルカプトドデシル−β−マルトシド（MalC12SH）と、フェロセニルヘキサンチオール（FcC6SH）とを1：1の割合で混合した溶液で金基板上に修飾単分子層を作製し、この表面に基板に電位を印加し、Con  A（5μM、緩衝溶液（10mM  Hepes,150mM  NaCl.3mM  EDTA,0.5%tween）を流速10マイクロリットル/分で流して、Con  Aの吸着をSPR装置（ハンディSPR、NTT-AT社製）で測定した。また並行して電位変化を与えない場合も参照実験として行った。結果を図２に示す。
【００３４】
図２中、（ａ）は＋電位を印加した場合のCon  Aの吸着挙動を測定したものであり、同（ｂ）は参照実験の結果を示し、電位をかけず、０Ｖに保持した状態でＣｏｎ  Ａ吸着挙動を検討したものである。図中、縦軸は表面プラズモン共鳴装置にて測定した角度変化応答、横軸は時間を表している。図中、(1)の矢印は基板電極電位を+0.56Vに変化させた時点（（ａ）のみ）、(2)および(2’)’の矢印は緩衝液からCon  A溶液(5μM)に切り替えた時点、(3)および(3’)’の矢印はCon  A溶液(5μM)から、緩衝液に切り替えた時点、(4)の矢印は基板電位を（（ａ）のみ）+0.56Vから0Vに変化させた時点を示す。
【００３５】
図２（ａ）に示すように、基板の電位を＋0.56Vに保持した結果、Con  A認識により、225ミリ度の角度変化が確認された。膜そのものの電位による変化が50ミリ度あるので、膜そのものの変化を差し引くと175ミリ度の角度変化が確認できた。一方、同じ認識膜に対して電位を印加せずにCon  Aを流した参照実験の場合は、図２（ｂ）に示すように15ミリ度の変化のみであった。つまり、基板の電位を+0.56Vとし、膜を構成するフェロセン基を酸化状態にしておくことで、Con  Aの認識が12倍近く高感度化できることが示された。
【００３６】
３）フェロセン含有単分子層表面へのCon  A吸着に関する参照実験
糖類を末端に有する分子を用いずに、フェロセニルヘキサンチオールのみ用いて上記１）の修飾法と同様にして、金基板上に１００％フェロセニルヘキサンチオールのみで構成した単分子膜を形成した。得られた基板に電位を印加した場合と（ａ）、印加しない場合（ｂ）に分け、上記２）と同様にして、Con  Aを流し、ＳＰＲ装置でそのＳＰＲ角度変化を測定した。結果を図３に示す。
図３中、（ａ）は電位を印加し、電位を+0.56Vに保持した場合の測定結果を、（ｂ）は電位を印加せず、０Ｖに保持した場合の測定結果を示し、図中、(1)の矢印は緩衝液からCon  A溶液(5μM)に切り替えた時点、(2)及び(2’’)の矢印はCon  A溶液(5μM)から、緩衝液に切り替えた時点を示す。
【００３７】
（ｂ）に示されるように電位を特にかけない場合では、ＳＰＲ角度変化が極めて小さく、また緩衝液を切り替えた時点で、ＳＰＲ角度変化が急速に低下し、これは緩衝液による洗浄によるもので、ほとんどCon  A吸着が起こっていないことを示す。一方、（ａ）に示すように、電位をポジティブ（+0.56V）にした場合でも、（ｂ）に比べ10ミリ度の程度の増大が観測されるだけであり、上記２）のCon  A吸着量増大結果と比較して極めて低く、フェロセン含有単分子層表面へのCon  Aの非特異的な吸着の影響については、ほとんど測定に影響がないことがわかる。
【００３８】
４）マルトシドを認識しないレクチンを用いた場合の実験例
上記１）で作成した12-メルカプトドデシル−β−マルトシド（MalC12SH）とフェロセニルヘキサンチオール（FcC6SH）との単分子層を表面に有する金基板を用いて、マルトシドを認識しないヒマ豆（Ricinus  communis）レクチンについての吸着をＳＰＲ角度変化により測定した。実験手法は、レクチンが異なる他は上記２）と同様である。結果を図４に示す。
図中、(a)は＋電位を印加した場合の測定結果を示し、(b)は電位を印加せず、０Ｖに保持した場合の測定結果を示す。図中、(1)の矢印は+0.56Vの電位を印加した時点（（ａ）のみ）、(2)および(2’)の矢印は緩衝溶液からヒマ豆レクチン5μM溶液に切り替えた時点。(3)および(3’)の矢印はヒマ豆レクチンから緩衝溶液に切り替えた時点、(4)の矢印は電位を再び0Vへと変化させた時点（（ａ）のみ）を表す。
【００３９】
これによれば、電位を印加しない場合は、全く吸着がおこっておらず、また、電位を印加した場合でも、その変化は極めて微弱であり、これはこのレクチンがガラクトシドなどの認識に特異性があり、マルトシドを全く認識しないという性質に基づくものである。また、本結果より、電位変化させた糖鎖単分子膜自体への無関係なレクチンの吸着（非特異的な吸着）は効果的に抑制していることが確認できる。
【００４０】
５）基板電位の変化と膜の抵抗値の変化
糖類を末端に有する分子を用いずに、フェロセニルヘキサンチオールのみ用いて上記１）の修飾法と同様にして、金基板上に１００％フェロセニルヘキサンチオールのみで構成した単分子膜を形成した。
該基板を0.1M  NaClO4溶液に投入し、基板電位を0Vより+0.6Vまで正方向に掃引したのち、+0.6Vから0Vまで負方向に掃引し、これを２回繰り返し（0.01V/ｓの走査速度で変化）、電位を周期的に変化させたときの周波数変化の値(Hz)と膜に生じる共振抵抗値（Ω）を測定したものである。
結果を図５に示す。図中、電位変化に伴う基板表面での周波数変化量を丸印（Hz）で表し、同時に測定した共振抵抗値を菱形印（Ω）で表す。
【００４１】
これによれば、電位が0Vから+0.4Vあたりまではフェロセンは電気的に中性であり、価数（電荷）は0である。そのときには周波数変化も起こらない。電位が＋0.45Vより正になると、ここでフェロセンが酸化されて１価のカチオンとなることにともなって溶液中のアニオンを引き寄せると基板の表面質量は増加し、ΔF＝−C・Δｍ；F共振周波数、C定数、m質量、の式により、質量変化と周波数変化とはマイナスの関係があるから、基板の共振周波数変化は減少する。しかし、図５の結果にみられるように、共振周波数変化の減少時、つまり酸化されたときには、共振抵抗値は増大していることが確認できる。
これはフェロセン基が酸化されたときに膜が柔らかくなり同じ単分子でも振動に対して、抵抗を与える状態になったことを意味している。つまり、フェロセン基が酸化される電位より正の電位では、膜全体がよりフレキシビリティが上がり、レクチンの認識が高まったのではないかと考えられる。
【００４２】
〔実施例２〕
１）メルカプトヒドロキノンとマルトシドアルカンチオール混合膜上でのCon Aの認識
メルカプトヒドロキノンと12-メルカプトドデシル-β-マルトシドを用いて、金基板上に混合薄膜を作製し、電位変化によるたんぱく質（レクチン）認識能の変化を試験した。
12-メルカプトドデシル-β-マルトシド（MalC12SH）およびメルカプトヒドロキノン（HQSH）のそれぞれ1mMエタノール溶液を調製し、1：9の割合で両液を混合した後、金基板をこの溶液で修飾し（１時間）、修飾後にエタノールおよび水で洗浄し作製したものである。このように作成された修飾基板を用いて、上記＋電位を印加した場合と印加しない場合とにおける、レクチンの認識捕捉の変化について調べた。
【００４３】
一方、これとは別に、マルトシドを末端に有する分子を用いない他は、上記と同様にして、ヒドロキノンのみを固定化させた修飾基板を作成し、＋電位を印加した場合のCon  A認識捕捉能について調べた。
なお、該修飾基板を用いて、Con  Aが捕捉された様子は、模式図として図１（ｂ）に示される。
結果は図６に示される。図中（a）は、上記メルカプトヒドロキノンと12-メルカプトドデシル-β-マルトシドを用いて修飾した基板の電位を+0.55Vに保持して、Con  Aの認識、捕捉能をＳＰＲ装置により測定した結果であり、（ｂ）は（ａ）に使用したのと同一基板を用い電位を0Vに保持したままで、同様に測定した結果であり、（ｃ）はマルトシド末端の分子を用いず、ヒドロキノンのみを固定化させた修飾基板において電位を+0.55Vに保持した場合のCon  Aの吸着挙動を示したものである。
【００４４】
図６に明らかなように、ヒドロキノン表面へのCon  Aの非特異的な吸着はまったく起こっておらず（ｃ）、しかも、メルカプトヒドロキノンと12-メルカプトドデシル-β-マルトシドを用いて修飾した基板は、＋電位を印加することにより、Con  Aの認識、捕捉能は向上している。
【００４５】
〔実施例３〕
Con  A認識後の基板の再生
図７は12-メルカプトドデシル-β-マルトシド（MalC12SH）およびメルカプトヒドロキノン（HQSH）のそれぞれ1mMエタノール溶液を調製し、1：1の割合で両液を混合した後、金基板をこの溶液で修飾し（１時間）、修飾後にエタノールおよび水で洗浄し作製した修飾基板において、基板電位を変化させながら、Con  Aの吸着と基板の再生について検討した。この実験においては、脱離溶液として20mM水酸化ナトリウムを用い、Con  A脱離に際し、基板に５分間流した。また、緩衝液としてHBS-EP溶液（10mM  Hepes,150mM  NaCl,3mM  EDTA,0.5%tween）を用いた。
結果を図７に示す。
【００４６】
図中、（１）の矢印は+0.04Vの電位を印加した時点、（２）の矢印は緩衝溶液からCon  A  5μM溶液に切り替えた時点。（３）はCon  A溶液から緩衝溶液に切り替えた時点、（４）の矢印は電位を再び0Vへと変化させた時点、（５）の矢印は、緩衝溶液から20mM  NaOH溶液に切り替えた時点、（５）の矢印はNaOHから緩衝液に切り替えた時点を表す。また、（７）の矢印は基板の電位を+0.55Vに変化させた時点、（８）の矢印はCon  Aの5μM溶液に切り替えた点、（９）の矢印はCon  Aから緩衝溶液に切り替えた時点を示す。さらに（１０）の矢印は、電位を+0.55Vから0Vに切り替えた時点、（１１）の矢印は基板再生のため、緩衝溶液から20mM  NaOH溶液に切り替えた時点、（１２）の矢印はNaOHから緩衝液に切り替えた時点を表す。
【００４７】
これによれば、印加した電位を０Vに切り替え（（４）,（１０））、さらにその後20mM  NaOH溶液に切り替えた時点（（５）,（１１））において、急速にSPR角度変化量が減少しているが、これは、マルトシドからのCon  A脱離によるSPR角度変化と溶液組成の変更による基本的なSPR角度の変化の両者が合算されたものである。
すなわち、図７の結果によれば、再び、NaOH溶液から緩衝液にもどすことで（（６）、（１２））、SPR角度変化量は上昇するが、NaOH溶液切り替え時点のSPR角度変化量までは復帰しない。つまり、（５）と（６）、及び（１１）と（１２）におけるSPR角度変化の差分がCon A脱離分であり、NaOH溶液の使用により、Con  Aの脱離が起こったことが分かる。
【００４８】
また、電位を+0.55Vから0Vに変化させる時点（（１０））でも電位変化による角度変化に加えてさらに明らかなSPR角度変化量の減少が生じており、＋電位の印加により捕捉されたCon  Aにおいて、電位をネガティブ方向に掃引することにより、ある程度の離脱が生じており、マルトシドとCon  Aの結合力が低下したことが分かる。
さらに、NaOH溶液を緩衝液に切り替え後のSPR角度変化量は、完全に、元々のCon  Aの吸着の前の時点のSPR角度変化量に復帰しており（（６）,（１２））、電位のネガティブ方向への掃引と水酸化ナトリウム溶液の使用によって、基板が再生されることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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