(57)【要約】【課題】  高検出感度で核内受容体のリガンドの分析が可能な形質転換酵母を提供する。【解決手段】  本発明の形質転換酵母は、核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ核内受容体リガンドと核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母であって、さらに、細胞壁タンパク質の機能および排出ポンプタンパク質の機能の少なくとも一方が欠損されたことを特徴とする。本発明の形質転換酵母を使用すれば、核内受容体のリガンドを高感度で分析可能である。前記核内受容体遺伝子は、例えば、ヒト核内受容体のコード遺伝子であることが好ましい。【選択図】  図１
2012070730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ核内受容体リガンドと核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母であって、
さらに、細胞壁タンパク質の機能および排出ポンプタンパク質の機能の少なくとも一方が欠損されたことを特徴とする形質転換酵母。
【請求項２】
前記細胞壁タンパク質のコード遺伝子を欠失することにより、前記細胞壁タンパク質の機能を欠損する、請求項１記載の形質転換酵母。
【請求項３】
前記細胞壁タンパク質のコード遺伝子が、マンナン結合タンパク質のコード遺伝子である、請求項１または２記載の形質転換酵母。
【請求項４】
前記マンナン結合タンパク質のコード遺伝子が、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子、ＣＣＷ１４遺伝子、ＣＩＳ３遺伝子、ＫＲＥ１１遺伝子、ＰＩＲ１遺伝子、ＰＩＲ３遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子、ＴＩＲ１遺伝子およびＴＩＲ２遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項３記載の形質転換酵母。
【請求項５】
前記排出ポンプタンパク質のコード遺伝子を欠失することにより、前記排出ポンプタンパク質の機能を欠損する、請求項１から４のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項６】
前記排出ポンプタンパク質のコード遺伝子が、ＡＢＣトランスポーター遺伝子である、請求項１から５のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項７】
前記ＡＢＣトランスポーター遺伝子が、ＰＤＲ５遺伝子、ＳＴＥ６遺伝子、ＰＤＲ１２遺伝子、ＰＤＲ１５遺伝子、ＳＮＱ２遺伝子、ＹＯＲ１遺伝子、ＹＤＲ０６１Ｗ遺伝子、ＰＤＲ１８遺伝子、ＹＯＬ０７５Ｃ遺伝子、ＹＢＴ１遺伝子、ＡＵＳ１遺伝子、ＰＤＲ１０遺伝子、ＰＤＲ１１遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項６記載の形質転換酵母。
【請求項８】
前記細胞壁タンパク質のコード遺伝子および前記排出ポンプタンパク質のコード遺伝子を欠失する、請求項１から７のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項９】
前記核内受容体が、動物核内受容体である、請求項１から８のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項１０】
前記動物核内受容体が、ヒト核内受容体である、請求項９記載の形質転換酵母。
【請求項１１】
前記核内受容体が、ホモ二量体、ヘテロ二量体または単量体の受容体である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項１２】
前記ヘテロ二量体の受容体が、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）を含む受容体である、請求項１１記載の形質転換酵母。
【請求項１３】
前記ヘテロ二量体の受容体が、前記ＲＸＲとＰＸＲとのヘテロ二量体である、請求項１２記載の形質転換酵母。
【請求項１４】
前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項１５】
前記核内受容体遺伝子を染色体上に有し、
前記レポーター遺伝子をプラスミドに有し、
前記プラスミドは、前記レポーター遺伝子と作動的に組み込まれた核内受容体応答配列を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項１６】
前記形質転換酵母が、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項１７】
検体に含まれる、核内受容体に対するリガンドの分析に使用される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の形質転換酵母。
【請求項１８】
検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するための方法であって、
検体を含む培地中で、請求項１から１７のいずれか一項に記載の形質転換酵母を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記培地中に産生された前記レポーター遺伝子の発現産物を測定する測定工程とを含むことを特徴とする分析方法。
【請求項１９】
前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子であり、
前記培地が、炭素源として、ガラクトースおよびグルコースの少なくとも一方を含む、請求項１８記載の分析方法。
【請求項２０】
検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するための分析キットであって、
（ａ）培地と、
（ｂ）請求項１から１７のいずれか一項に記載の形質転換酵母と、
（ｃ）発色試薬と
を備えることを特徴とする分析キット。
【請求項２１】
前記培地が、グルコースおよびガラクトースの少なくとも一方を含む培地である、請求項２０記載の分析キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換酵母、それを用いた動物核内受容体リガンドの分析方法および分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中の化学物質の分析方法として、近年、核内受容体遺伝子を組み込んだ宿主細胞を使用して、レポーター遺伝子の発現の程度により、前記化学物質を分析するという手法が開発されている。この方法によれば、例えば、生物的な影響も評価できる。前記宿主細胞は、例えば、動物細胞および酵母が使用されている。
【０００３】
前記動物細胞は、例えば、ヒトの細胞株が使用されている。ヒト由来細胞を用いた分析は、例えば、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）に結合するリガンドであるテストステロン（Ｔ）等の分析が報告されている。この方法は、例えば、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）遺伝子を組み込んだヒト由来細胞株が使用されている（非特許文献１）。
【０００４】
一方、酵母を用いた方法は、例えば、雌化現象等で注目された環境ホルモン（内分泌撹乱物質）について、エストロゲン様活性の分析が報告されている。この方法は、例えば、ブルーギル由来のエストロゲン受容体遺伝子（特許文献１）、オオマキトカゲ由来エストロゲン受容体遺伝子、（特許文献２）、ワニ由来エストロゲン受容体遺伝子（特許文献３）、ファットヘッドミノー由来エストロゲン受容体遺伝子（特許文献４）等の各種動物のエストロゲン受容体遺伝子を酵母に組み込み、レポーター遺伝子の発現を測定するという手法が開発されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。この他に、例えば、ヒト由来エストロゲン受容体遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を用いて、アルキルフェノール化合物のエストロゲン様活性を測定する手法が開発されている（非特許文献２）。また、例えば、ダイオキシン等のアリールハイドロカーボン類を測定するために、モルモット由来のアリールハイドロカーボン受容体遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を用いた手法が開発されている（特許文献５）。
【０００５】
前記酵母を用いた手法では、前記酵母において、核内受容体遺伝子が発現し、発現した核内受容体に、測定対象のリガンド（例えば、化学物質等）が結合して複合体を形成する。そして、この複合体が、酵母内のレポーター遺伝子を発現させる。前記レポーター遺伝子は、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が使用されており、β−ガラクトシダーゼの酵素活性の測定により、前記レポーター遺伝子の発現が測定できる。
【０００６】
前記酵母を用いた分析方法は、動物細胞を用いた分析方法に比べて、例えば、短時間での分析が可能であり、操作の簡便性および低コスト等の利点を有する。しかしながら、酵母を用いた分析方法では、動物細胞を用いた分析手法に比べ、分析感度が低いという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−１９７８９０号公報
【特許文献２】特開２００３−２７４号公報
【特許文献３】特開２００２−３６０２７３号公報
【特許文献４】特開２００１−３５２９９２号公報
【特許文献５】特開２００５−８７０７７号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２２０（２００６）９０−１０３
【非特許文献２】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２７２，Ｎｏ．６，Ｆｅｂ．７  ｐｐ．３２８０−３２８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明の目的は、核内受容体リガンドを、高感度で分析可能な形質転換酵母、それを用いた核内受容体リガンドの分析方法および分析キットを提供することである。より詳細には、例えば、前記酵母に発現させる核内受容体の種類に関わらず、前記核内受容体リガンドを高感度で分析可能な形質転換酵母、それを用いた核内受容体リガンドの分析方法および分析キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明の形質転換酵母は、核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ核内受容体リガンドと核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母であって、さらに、細胞壁タンパク質の機能および排出ポンプタンパク質の機能の少なくとも一方が欠損されたことを特徴とする。
【００１１】
本発明の分析方法は、検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するための方法であって、
検体を含む培地中で、前記本発明の形質転換酵母を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記培地中に産生された前記レポーター遺伝子の発現産物を測定する測定工程とを含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の分析キットは、検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するためのキットであって、
（ａ）培地と、
（ｂ）前記本発明の形質転換酵母と、
（ｃ）発色試薬と
を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の形質転換酵母によれば、メカニズムは不明であるが、細胞壁タンパク質の機能および排出ポンプタンパク質の機能の少なくとも一方を欠損することによって、核内受容体に対するリガンドの分析感度を向上できる。このため、本発明の形質転換酵母によれば、核内受容体に対するリガンドを、高感度で分析可能である。特に、本発明の形質転換酵母は、前記形質転換酵母に導入される前記核内受容体遺伝子の種類に関わらず、リガンドの分析感度を向上できる。例えば、野生型の酵母等、従来公知の酵母によると、導入される核内受容体の種類によって、リガンドが存在しているにも関わらず、リガンドを検出できない場合がある。これに対して、本発明の形質転換酵母は、導入する前記核内受容体の種類に関わらず、例えば、前記野生型の酵母等では行うことができなかったリガンドの検出も可能である。このように本発明の形質転換酵母は、前記核内受容体遺伝子の種類に関わらず使用可能であることから、核内受容体の分析において、汎用性の高いツールと言える。また、本発明の分析キットを用いれば、さらに簡便に、核内受容体に対するリガンドの分析を実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、本発明の実施例２におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例４におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例６におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例８におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例１０におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例１２におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例１４におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例１６におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例１８におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例２０におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の実施例２２におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の実施例２４におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の形質転換酵母は、前述のように、核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ核内受容体リガンドと核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母であって、
さらに、細胞壁タンパク質の機能および排出ポンプタンパク質の機能の少なくとも一方が欠損されたことを特徴とする。
【００１６】
本発明の形質転換酵母は、前記細胞壁タンパク質のコード遺伝子を欠失することにより、前記細胞壁タンパク質の機能を欠損することが好ましい。
【００１７】
本発明の形質転換酵母は、前記細胞壁タンパク質のコード遺伝子が、マンナン結合タンパク質のコード遺伝子であることが好ましい。
【００１８】
本発明の形質転換酵母は、前記マンナン結合タンパク質のコード遺伝子が、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子、ＣＣＷ１４遺伝子、ＣＩＳ３遺伝子、ＫＲＥ１１遺伝子、ＰＩＲ１遺伝子、ＰＩＲ３遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子、ＴＩＲ１遺伝子、ＴＩＲ２遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つであることが好ましい。
【００１９】
本発明の形質転換酵母は、前記排出ポンプタンパク質のコード遺伝子を欠失することにより、前記排出ポンプタンパク質の機能を欠損することが好ましい。
【００２０】
本発明の形質転換酵母は、前記排出ポンプタンパク質のコード遺伝子が、ＡＢＣトランスポーター遺伝子であることが好ましい。
【００２１】
本発明の形質転換酵母は、前記ＡＢＣトランスポーター遺伝子が、ＰＤＲ５遺伝子、ＳＴＥ６遺伝子、ＰＤＲ１２遺伝子、ＰＤＲ１５遺伝子、ＳＮＱ２遺伝子、ＹＯＲ１遺伝子、ＹＤＲ０６１Ｗ遺伝子、ＰＤＲ１８遺伝子、ＹＯＬ０７５Ｃ遺伝子、ＹＢＴ１遺伝子、ＡＵＳ１遺伝子、ＰＤＲ１０遺伝子、ＰＤＲ１１遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つであることが好ましい。
【００２２】
本発明の形質転換酵母は、前記細胞壁タンパク質のコード遺伝子および前記排出ポンプタンパク質のコード遺伝子を欠失することが好ましい。
【００２３】
本発明の形質転換酵母は、前記核内受容体が、動物核内受容体であることが好ましく、より好ましくは、ヒト核内受容体である。
【００２４】
本発明の形質転換酵母は、前記核内受容体が、ホモ二量体、ヘテロ二量体または単量体の受容体であることが好ましい。前記ヘテロ二量体の受容体は、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）を含む受容体が好ましく、より好ましくは前記ＲＸＲとＰＸＲとのヘテロ二量体である。
【００２５】
本発明の形質転換酵母は、前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が好ましい。
【００２６】
本発明の形質転換酵母は、前記核内受容体遺伝子を染色体上に有し、
前記レポーター遺伝子をプラスミドに有し、
前記プラスミドは、前記レポーター遺伝子と作動的に組み込まれた核内受容体応答配列を含むことが好ましい。
【００２７】
本発明の形質転換酵母は、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であることが好ましい。
【００２８】
本発明の形質転換酵母は、検体に含まれる核内受容体リガンドの分析に使用されることが好ましい。
【００２９】
本発明の分析方法は、前述のように、検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するための方法であって、
検体を含む培地中で、前記本発明の形質転換酵母を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記培地中に産生された前記レポーター遺伝子の発現産物を測定する測定工程とを含むことを特徴とする。
【００３０】
本発明の分析方法は、前記レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子であり、
前記培地が、炭素源として、ガラクトースおよびグルコースの少なくとも一方を含むことが好ましい。
【００３１】
本発明の分析方法は、前記培地が、ガラクトースおよびグルコースを含み、
ガラクトースおよびグルコースの合計に対するグルコースの重量割合が、０を超え６０重量％以下の範囲であることが好ましい。
【００３２】
本発明の分析方法は、前記形質転換酵母が、予め、グリセロール存在下で保存されていた酵母であることが好ましい。
【００３３】
本発明の分析方法は、前記形質転換酵母が、予め、グルコース単独を炭素源とする培地で培養された酵母であることが好ましい。
【００３４】
本発明の分析キットは、前述のように、検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するための分析キットであって、
（ａ）培地と、
（ｂ）前記本発明の形質転換酵母と、
（ｃ）発色試薬と
を備えることを特徴とする。
【００３５】
本発明の分析キットは、前記培地が、グルコースおよびガラクトースの少なくとも一方を含む培地であることが好ましい。
【００３６】
つぎに、本発明について詳しく説明する。
【００３７】
本発明の形質転換酵母は、前述のように、例えば、導入される核内受容体遺伝子の種類に関わらず、前記核内受容体遺伝子から発現された核内受容体に結合する検体中のリガンドを検出できる。このため、本発明において、前記核内受容体および前記核内受容体に対するリガンドは、特に制限されない。
【００３８】
前記核内受容体遺伝子は、例えば、分析対象のリガンドに応じて、適宜選択すればよい。前記核内受容体遺伝子から発現する核内受容体の構造は、特に制限されず、単量体および二量体等があげられる。前記二量体は、例えば、同じ分子から構成されるホモ二量体でもよいし、異なる分子から構成されるヘテロ二量体でもよい。
【００３９】
前記核内受容体を構成する分子は、特に制限されず、例えば、以下のものがあげられる。
【００４０】
（１）ＴＲα：Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ
（２）ＴＲβ：Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ
（３）ＲＡＲα：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ
（４）ＲＡＲβ：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ
（５）ＲＡＲγ：Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ
（６）ＰＰＡＲα：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ（ＰＰＡＲ−ａｌｐｈａ）
（７）ＰＰＡＲδ：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｌｔａ（ＰＰＡＲ−ｄｅｌｔａ、ＰＰＡＲ−ｂｅｔａ、Ｎｕｃｌｅａｒ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、ＮＵＣ１）
（８）ＰＰＡＲγ１：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  １（ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ１）
（９）ＰＰＡＲγ２：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  ２（ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ２）
（１０）Ｒｅｖ−ｅｒｂα：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＲ１Ｄ１（Ｖ−ｅｒｂＡ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＥＡＲ−１、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡ−ａｌｐｈａ）
（１１）Ｒｅｖ−ｅｒｂβ：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＲ１Ｄ２（Ｒｅｖ−ｅｒｂ−ｂｅｔａ、ＥＡＲ−１Ｒ、Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＢＤ７３）
（１２）ＲＯＲα：Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＯＲ−ａｌｐｈａ（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＺＲ−ａｌｐｈａ）
（１３）ＲＯＲβ：Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＯＲ−ｂｅｔａ（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＺＲ−ｂｅｔａ）
（１４）ＲＯＲγ：Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＯＲ−ｇａｍｍａ（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＺＲ−ｇａｍｍａ）
（１５）ＬＸＲβ：Ｏｘｙｓｔｅｒｏｌｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＬＸＲ−ｂｅｔａ  （Ｌｉｖｅｒ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ、Ｎｕｃｌｅａｒ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＬＸＲ−ｂｅｔａ、Ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＥＲ）
（１６）ＬＸＲα：Ｏｘｙｓｔｅｒｏｌｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＬＸＲ−ａｌｐｈａ（Ｌｉｖｅｒ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ、Ｎｕｃｌｅａｒ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＬＸＲ−ａｌｐｈａ）
（１７）ＦＸＲ：Ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ  Ｘ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｆａｒｎｅｓｏｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＨＲＲ−１、Ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １４、ＲＸＲ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １４）
（１８）ＶＤＲ：Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＤＲ、１，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（１９）ＰＸＲ−１：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＰＸＲ−１（Ｐｒｅｇｎａｎｅ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１、Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＰＡＲ−１、Ｓｔｅｒｏｉｄ  ａｎｄ  ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１、ＳＸＲ−１）
（２０）ＰＸＲ−２：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＰＸＲ−２（Ｐｒｅｇｎａｎｅ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２、Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＰＡＲ−２、Ｓｔｅｒｏｉｄ  ａｎｄ  ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２、ＳＸＲ−２）
（２１）ＣＡＲ：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＲ１Ｉ３（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｎｄｒｏｓｔａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＡＲ、Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＭＢ６７）
（２２）ＨＮＦ４α：Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ４−ａｌｐｈａ（ＨＮＦ−４−ａｌｐｈａ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １４）
（２３）ＨＮＦ４γ：Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ４−ｇａｍｍａ（ＨＮＦ−４−ｇａｍｍａ）
（２４）ＲＸＲα：Ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＸＲ−ａｌｐｈａ
（２５）ＲＸＲβ：Ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＸＲ−ｂｅｔａ
（２６）ＲＸＲγ：Ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＸＲ−ｇａｍｍａ
（２７）ＴＲ２：Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＲ２（Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＲ２）
（２８）ＴＲ４：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＲ４（Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＡＫ１）
（２９）ＴＬＸ：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＲ２Ｅ１（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＬＸ、Ｔａｉｌｌｅｓｓ  ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｔｌｌ、ｈＴｌｌ）
（３０）ＰＮＲ：Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｒｅｔｉｎａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（３１）ＣＯＵＰ−ＴＦ  Ｉ：ＣＯＵＰ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １（ＣＯＵＰ−ＴＦ１、ＣＯＵＰ−ＴＦα、Ｖ−ｅｒｂＡ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＥＡＲ−３）
（３２）ＣＯＵＰ−ＴＦ  ＩＩ：ＣＯＵＰ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２（ＣＯＵＰ−ＴＦ２、ＣＯＵＰ−ＴＦβ、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１、ＡＲＰ−１）
（３３）ＥＡＲ−２：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥＡＲ−２（Ｖ−ｅｒｂＡ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＥＡＲ−２、ＣＯＵＰ−ＴＦγ）
（３４）ＥＲα：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＲ、Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＥＲ−ａｌｐｈａ）
（３５）ＥＲβ：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ（ＥＲ−ｂｅｔａ）
（３６）ＥＲＲα：Ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥＲＲ１（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ａｌｐｈａ、ＥＲＲ−ａｌｐｈａ、Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  １）
（３７）ＥＲＲβ：Ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥＲＲ２（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｂｅｔａ、ＥＲＲ−ｂｅｔａ、Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ２、ＥＲＲ  ｂｅｔａ−２）
（３８）ＥＲＲγ：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３、ＥＲＲ  ｇａｍｍａ−２）
（３９）ＧＲα：Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ
（４０）ＧＲβ：Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ
（４１）ＭＲ：Ｍｉｎｅｒａｌｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＭＲ）
（４２）ＰＲα：Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ
（４３）ＰＲβ：Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ
（４４）ＡＲ：Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（４５）ＮＧＦＩ−Ｂα：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＨＭＲ（Ｅａｒｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＡＫ１、ＴＲ３  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（４６）ＮＧＦＩ−Ｂβ：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＵＲＲ１（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＯＴ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（４７）ＮＧＦＩ−Ｂγ：Ｎｕｃｌｅａｒ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＯＲ−１（Ｎｅｕｒｏｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １、Ｍｉｔｏｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
（４８）ＳＦ−１：Ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  １（ＳＴＦ−１、ＳＦ−１、Ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＡＤ４ＢＰ、Ｆｕｓｈｉ  ｔａｒａｚｕ  ｆａｃｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １、ＦＴＺ−ＦＩα）
（４９）ＬＲＨ−１：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＲ５Ａ２（Ａｌｐｈａ−１−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ、Ｂ１−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ、ｈＢ１Ｆ、ＣＹＰ７Ａ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ、ＦＴＺ−ＦＩβ）
（５０）ＧＣＮＦ：Ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ（Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＲ６Ａ１、Ｒｅｔｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｅｓｔｉｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＲＴＲ）
（５１）ＤＡＸ１：Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＤＡＸ−１
（５２）ＳＨＰ：Ｓｍａｌｌ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｐａｒｔｎｅｒ（Ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＳＨＰ）
（５３）ＡｈＲ：ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡＨＲ、Ｄｉｏｘｉｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
【００４１】
前記ホモ二量体の核内受容体は、例えば、ＴＲ４、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ４γ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＲＸＲγ、ＴＲ２、ＰＮＲ、ＣＯＵＰ−ＴＦ  Ｉ、ＣＯＵＰ−ＴＦ  II、ＥＡＲ２、ＥＲα、ＥＲβ、ＧＲα、ＧＲβ、ＭＲ、ＰＲα、ＰＲβ、ＡＲ等があげられる。
【００４２】
前記ヘテロ二量体の核内受容体は、例えば、ＲＸＲを含む核内受容体またはＡｒｎｔを含む核内受容体があげられる。前記ＲＸＲを含む核内受容体は、二量体を構成する他方の分子として、例えば、ＴＲα、ＴＲβ、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＡＲγ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、ＰＰＡＲγ、ＬＸＲβ、ＬＸＲα、ＦＸＲ、ＶＤＲ、ＰＸＲ−１、ＰＸＲ−２、ＣＡＲがあげられる。中でも、ＲＸＲとＰＸＲ−１とのヘテロ二量体（ＲＸＲ／ＰＸＲ−１）、およびＲＸＲとＰＸＲ−２とのヘテロ二量体（ＲＸＲ／ＰＸＲ−２）が特に好ましい。また、前記Ａｒｎｔを含む核内受容体は、二量体を構成する他の分子として、例えば、ＡｈＲがあげられる。
【００４３】
前記単量体の核内受容体は、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ、ＲＯＲα、ＲＯＲβ、ＲＯＲγ、ＴＬＸ、ＥＲＲα、ＥＲＲβ、ＥＲＲγ、ＳＦ−１、ＬＲＨ、ＧＣＮＦ、ＤＡＸ１、ＳＨＰがあげられる。
【００４４】
前記単量体、ホモ二量体およびヘテロ二量体のいずれをも取り得る核内受容体は、例えば、ＮＧＦ１−Ｂα、ＮＧＦ１−Ｂβ、ＮＧＦ１−Ｂγがあげられる。
【００４５】
本発明においては、前記核内受容体遺伝子の種類を適宜設定することで、前記核内受容体に対するリガンドを検出できる。なお、本発明において分析対象のリガンドは、例えば、前記核内受容体に結合する公知リガンドでもよいし、前記核内受容体に結合する未知のリガンドでもよい。
【００４６】
本発明において、前記核内受容体は、例えば、分析対象のリガンドに応じて、適宜選択すればよい。
【００４７】
＜形質転換酵母＞
本発明の形質転換酵母は、前述のように、核内受容体遺伝子およびレポーター遺伝子が発現可能に導入されており、かつ核内受容体リガンドと核内受容体との複合体を認識して前記レポーター遺伝子を発現し得る形質転換酵母であって、さらに、細胞壁タンパク質の機能および排出ポンプタンパク質の機能の少なくとも一方が欠損されたことを特徴とする。
【００４８】
本発明の形質転換酵母は、例えば、出芽酵母、分裂酵母、糸状酵母等があげられ、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。本発明の形質転換酵母の形態は、特に制限されず、例えば、培養液、凍結乾燥菌体、グリセロール存在下での保存菌体（グリセロールストック）等の形態があげられる。
【００４９】
本発明の形質転換酵母は、前記細胞壁タンパク質の機能および前記排出ポンプタンパク質の機能の少なくとも一方を欠損すればよい。本発明の形質転換酵母は、例えば、前記細胞壁タンパク質の機能および前記排出ポンプタンパク質の機能のいずれか一方のみが欠損されてもよいが、前記細胞壁タンパク質の機能および前記排出ポンプタンパク質の機能の両方が欠損されたことが好ましい。
【００５０】
前記細胞壁タンパク質は、特に制限されず、例えば、マンナン結合タンパク質等があげられる。前記マンナン結合タンパク質は、例えば、ＣＷＰ１タンパク質、ＣＷＰ２タンパク質、ＣＣＷ１４タンパク質、ＣＩＳ３タンパク質、ＫＲＥ１１タンパク質、ＰＩＲ１タンパク質、ＰＩＲ３タンパク質、ＴＩＰ１タンパク質、ＴＩＲ１タンパク質、ＴＩＲ２タンパク質等があげられる。本発明の形質転換酵母において、前記機能が欠損された前記細胞壁タンパク質の種類は、例えば、一種類でもよいし、二種類以上でもよい。後者の場合、機能が欠損した前記細胞壁タンパク質の組合せは、特に制限されず、例えば、ＣＷＰ１タンパク質とＣＷＰ２タンパク質の組合せが例示できる。
【００５１】
前記排出ポンプタンパク質は、特に制限されず、例えば、ＡＢＣ（ＡＴＰ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）トランスポータータンパク質、ＭＦＳ（ｍａｊｏｒ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）トランスポータータンパク質等があげられる。前記ＡＢＣトランスポータータンパク質は、例えば、ＰＤＲ５タンパク質、ＳＴＥ６タンパク質、ＰＤＲ１２タンパク質、ＰＤＲ１５タンパク質、ＳＮＱ２タンパク質、ＹＯＲ１タンパク質、ＹＤＲ０６１Ｗタンパク質、ＰＤＲ１８タンパク質、ＹＯＬ０７５Ｃタンパク質、ＹＢＴ１タンパク質、ＡＵＳ１タンパク質、ＰＤＲ１０タンパク質、ＰＤＲ１１タンパク質等があげられる。本発明の形質転換酵母において、前記機能が欠損した前記排出ポンプタンパク質の種類は、例えば、一種類でもよいし、二種類以上でもよい。後者の場合、機能が欠損した前記排出ポンプの組合せは、特に制限されず、例えば、ＰＤＲ５タンパク質とＰＤＲ１０タンパク質の組み合わせが例示できる。
【００５２】
本発明の形質転換酵母は、前述のように、前記細胞壁タンパク質の機能および前記排出ポンプタンパク質の機能の両方が欠損されたことが好ましい。機能が欠損された前記細胞壁タンパク質および前記排出ポンプタンパク質の組み合わせは、特に制限されない。前記組み合わせは、例えば、前記マンナン結合タンパク質と前記ＡＢＣトランスポータータンパク質の組み合わせがあげられる。具体的には、例えば、
ＣＷＰ１タンパク質とＰＤＲ５タンパク質との組み合わせ、
ＣＷＰ１タンパク質とＰＤＲ１０タンパク質との組み合わせ、
ＣＷＰ２タンパク質とＰＤＲ５タンパク質との組み合わせ、
ＣＷＰ１タンパク質、ＣＷＰ２タンパク質およびＰＤＲ５タンパク質の組み合わせ、
ＣＷＰ１タンパク質、ＰＤＲ５タンパク質およびＰＤＲ１０タンパク質の組み合わせ
等があげられる。
【００５３】
本発明の形質転換酵母において、前記細胞壁タンパク質の機能および前記排出ポンプタンパク質の機能は、どのようなメカニズムによって欠損してもよい。タンパク質の機能は、例えば、前記形質転換酵母における、前記タンパク質のコード遺伝子の欠失、前記タンパク質のコード遺伝子における点変異または配列挿入等による欠損、前記タンパク質のコード遺伝子からの転写の抑制、転写産物からの翻訳の抑制により、欠損させることができ、中でも、前記コード遺伝子の欠失によることが好ましい。
【００５４】
本発明の形質転換酵母は、例えば、前記細胞壁タンパク質のコード遺伝子および／または前記排出ポンプタンパク質のコード遺伝子について、全領域を欠失してもよいし、部分領域を欠失してもよい。後者の場合、例えば、前記コード遺伝子におけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を欠失してもよいし、前記タンパク質の機能に関与する領域を欠失してもよい。本発明の形質転換酵母は、前記細胞壁タンパク質のコード遺伝子および前記排出ポンプタンパク質のコード遺伝子の少なくとも一方が、ＯＲＦを欠失することが好ましく、前記両方のコード遺伝子が、それぞれＯＲＦを欠失することがより好ましい。
【００５５】
前記細胞壁タンパク質のコード遺伝子は、特に制限されず、例えば、前述のタンパク質のコード遺伝子、すなわち、マンナン結合タンパク質等のタンパク質のコード遺伝子があげられる。前記マンナンタンパク質のコード遺伝子は、例えば、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子、ＣＣＷ１４遺伝子、ＣＩＳ３遺伝子、ＫＲＥ１１遺伝子、ＰＩＲ１遺伝子、ＰＩＲ３遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子、ＴＩＲ１遺伝子、ＴＩＲ２遺伝子があげられる。本発明の形質転換酵母において、前記細胞壁タンパク質のコード遺伝子は、例えば、一種類が欠失してもよいし、二種類以上が欠失してもよい。後者の場合、例えば、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子を欠失してもよい。
【００５６】
前記排出ポンプタンパク質のコード遺伝子は、特に制限されず、例えば、前述のタンパク質のコード遺伝子、すなわち、ＡＢＣトランスポータータンパク質、ＭＦＳ（ｍａｊｏｒ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）トランスポータータンパク質等のタンパク質のコード遺伝子があげられる。前記ＡＢＣトランスポータータンパク質のコード遺伝子は、例えば、ＰＤＲ５遺伝子、ＳＴＥ６遺伝子、ＰＤＲ１２遺伝子、ＰＤＲ１５遺伝子、ＳＮＱ２遺伝子、ＹＯＲ１遺伝子、ＹＤＲ０６１Ｗ遺伝子、ＰＤＲ１８遺伝子、ＹＯＬ０７５Ｃ遺伝子、ＹＢＴ１遺伝子、ＡＵＳ１遺伝子、ＰＤＲ１０遺伝子、ＰＤＲ１１遺伝子等があげられる。本発明の形質転換酵母において、前記排出ポンプタンパク質のコード遺伝子は、例えば、一種類が欠失してもよいし、二種類以上が欠失してもよい。後者の場合、例えば、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子を欠失してもよい。
【００５７】
本発明の形質転換酵母は、例えば、前記細胞壁タンパク質のコード遺伝子および前記排出ポンプタンパク質のコード遺伝子の両方を欠失することが好ましい。前記欠損した前記細胞壁タンパク質のコード遺伝子および前記排出ポンプタンパク質のコード遺伝子の組み合わせは、特に制限されない。前記組み合せは、例えば、前記マンナン結合タンパク質のコード遺伝子と前記ＡＢＣトランスポータータンパク質のコード遺伝子の組み合わせがあげられる。具体的には、
ＣＷＰ１遺伝子とＰＤＲ５遺伝子との組み合わせ、
ＣＷＰ１遺伝子とＰＤＲ１０遺伝子との組み合わせ、
ＣＷＰ２遺伝子とＰＤＲ５遺伝子の組み合わせ、
ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の組み合わせ、
ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の組み合わせ
等があげられ、好ましくはＣＷＰ１遺伝子とＰＤＲ５遺伝子との組み合わせである。
【００５８】
前記細胞壁タンパク質のコード遺伝子および／または前記排出ポンプタンパク質のコード遺伝子の欠失は、特に制限されない。本発明においては、前記細胞壁タンパク質のコード遺伝子および前記排出ポンプ遺伝子の少なくともいずれかを欠失させることで、様々な核内受容体遺伝子を導入した場合も、リガンドの分析に使用可能である。
【００５９】
前記核内受容体の種類に応じて、例えば、前記細胞壁タンパク質のコード遺伝子および前記排出ポンプ遺伝子の欠失を以下のように設定すれば、より優れた分析精度が実現できる。
【００６０】
前記核内受容体がＧＲのホモ二量体であり、ＧＲに対するリガンドを分析する場合、例えば、ＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＰＤＲ１０遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失が好ましく、より好ましくは、ＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失である。
【００６１】
前記核内受容体がＡｈＲとＡｒｎｔとのヘテロ二量体であり、ＡｈＲに対するリガンドを分析する場合、例えば、ＣＷＰ１遺伝子の欠失、ＣＷＰ２遺伝子の欠失、ＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＰＤＲ１０遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失が好ましく、より好ましくは、ＰＤＲ１０遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失であり、特に好ましくは、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失である。
【００６２】
前記核内受容体がＥＲαのホモ二量体であり、ＥＲαに対するリガンドを分析する場合、例えば、ＣＷＰ１遺伝子の欠失、ＣＷＰ２遺伝子の欠失、ＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失が好ましく、より好ましくは、ＣＷＰ１遺伝子の欠失、ＣＷＰ２遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子の欠失、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失である。
【００６３】
前記核内受容体がＥＲβのホモ二量体であり、ＥＲβに対するリガンドを分析する場合、例えば、ＣＷＰ１遺伝子の欠失、ＣＷＰ２遺伝子の欠失、ＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失が好ましく、より好ましくは、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子の欠失である。
【００６４】
前記核内受容体がＴＲαのホモ二量体であり、ＴＲαに対するリガンドを分析する場合、例えば、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子の欠失が好ましい。
【００６５】
前記核内受容体がＴＲβのホモ二量体であり、ＴＲβに対するリガンドを分析する場合、例えば、ＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子の欠失、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失が好ましく、より好ましくは、ＰＤＲ５遺伝子の欠失である。
【００６６】
前記核内受容体がＲＸＲとＰＸＲ−１とのヘテロ二量体であり、前記ヘテロ二量体に対するリガンドを分析する場合、例えば、ＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失が好ましく、より好ましくは、ＰＤＲ５遺伝子の欠失である。
【００６７】
前記核内受容体がＰＲのホモ二量体であり、ＰＲに対するリガンドを分析する場合、例えば、ＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＣＷＰ２遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子の欠失、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失が好ましく、より好ましくは、ＰＤＲ５遺伝子の欠失、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子の欠失である。
【００６８】
前記核内受容体がＡＲのホモ二量体であり、ＡＲに対するリガンドを分析する場合、例えば、ＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子の欠失、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失、ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失が好ましく、より好ましくは、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失、ならびに、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子の欠失である。
【００６９】
前記核内受容体がＭＲのホモ二量体であり、ＭＲに対するリガンドを分析する場合、例えば、ＰＤＲ５遺伝子の欠失が好ましい。
【００７０】
本発明の形質転換酵母は、例えば、発現する核内受容体が、動物核内受容体であることが好ましく、具体的には、ヒト核内受容体であることが好ましい。このため、本発明の形質転換酵母は、前記核内受容体遺伝子として、動物核内受容体遺伝子が導入されていることが好ましく、より好ましくは、ヒト核内受容体遺伝子が導入されている。
【００７１】
本発明の形質転換酵母によれば、任意の核内受容体に対するリガンドを分析できる。このため、本発明の形質転換酵母において、前記核内受容体遺伝子は、特に制限されず、分析対象である前記リガンドの種類に応じて、適宜決定できる。
【００７２】
本発明の形質転換酵母において、発現する前記核内受容体は、例えば、前述した核内受容体が例示でき、具体例としては、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、アリールハイドロカーボン受容体（ＡｈＲ）、レチノイン酸Ｘ受容体α（ＲＸＲα）、エストロゲン受容体α（ＥＲα）、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）、甲状腺ホルモン受容体α（ＴＲα）、甲状腺ホルモン受容体β（ＴＲβ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、鉱質コルチコイド受容体（ＭＲ）、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ（ＰＸＲ−１またはＰＸＲ−２））等があげられる。これらの核内受容体は、動物核内受容体が好ましく、より好ましくはヒト核内受容体である。
【００７３】
本発明の形質転換酵母は、さらに、転写共役因子遺伝子が発現可能に導入されてもよい。本発明の形質転換酵母において、例えば、前記転写共役因子遺伝子から発現された転写共役因子（コアクチベーター）は、前記核内受容体に直接結合して、前記レポーター遺伝子の転写を活性化する。前記転写共役因子遺伝子は、例えば、前記核内受容体遺伝子の種類に応じて、適宜決定できる。
【００７４】
本発明の形質転換酵母は、例えば、発現する転写共役因子が、動物転写共役因子であることが好ましく、より好ましくは、ヒト転写共役因子である。このため、本発明の形質転換酵母は、例えば、前記転写共役因子遺伝子として、動物転写共役因子遺伝子が導入されていることが好ましく、より好ましくは、ヒト転写共役因子遺伝子が導入されている。
【００７５】
発現する前記転写共役因子の由来は、特に制限されず、例えば、発現する前記核内受容体の由来と同じ系統であることが好ましく、より好ましくは同じ動物由来である。具体的には、前記核内受容体がヒト核内受容体の場合、前記転写共役因子は、ヒト転写共役因子が好ましい。このため、本発明の形質転換酵母は、例えば、前記核内受容体遺伝子として、動物核内受容体遺伝子が導入されている場合、前記動物転写共役因子遺伝子が導入されていることが好ましく、ヒト核内受容体遺伝子が導入されている場合、ヒト転写共役因子遺伝子が導入されていることが好ましい。このように、前記核内受容体遺伝子と前記転写共役因子遺伝子とを同じ由来とすることで、分析感度をさらに向上できる。このメカニズムは不明であるが、例えば、由来が同じ前記核内受容体と前記転写共役因子とを含む複合体により、前記レポーター遺伝子の転写の効率が向上すると推測される。本発明は、このメカニズムには制限されない。
【００７６】
以下に、前記転写共役因子と、それが結合可能な核内受容体の組み合わせを例示する。本発明は、これらの組み合わせには制限されない。
【表１】
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【００７７】
本発明の形質転換酵母において、前記レポーター遺伝子は、特に制限されず、公知の遺伝子があげられる。具体例としては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子等があげられる。
【００７８】
本発明の形質転換酵母において、前記核内受容体遺伝子の導入部位は、特に制限されない。前記核内受容体遺伝子は、例えば、前記酵母の染色体上に導入されていることが好ましい。
【００７９】
本発明の形質転換酵母が、導入された前記転写共役因子遺伝子を有する場合、前記転写共役因子遺伝子の導入部位は、特に制限されない。本発明の形質転換部位は、前記プラスミドを有し、前記プラスミドが、前記転写共役因子遺伝子を有することが好ましい。
【００８０】
本発明の形質転換酵母において、前記レポーター遺伝子の導入部位は、特に制限されない。本発明の形質転換酵母は、例えば、さらに、プラスミドを有し、前記プラスミドが、前記レポーター遺伝子を有することが好ましい。
【００８１】
本発明の形質転換酵母は、例えば、さらに、核内受容体応答配列が導入されていることが好ましい。前記核内受容体応答配列は、特に制限されず、前記核内受容体の種類に応じて適宜決定できる。
【００８２】
前記核内受容体応答配列の由来は、特に制限されず、例えば、発現する前記核内受容体の由来と同じ系統であることが好ましく、より好ましくは同じ動物由来である。具体的には、前記核内受容体がヒト核内受容体の場合、前記核内受容体応答配列は、ヒト核内受容体応答配列が好ましい。このため、本発明の形質転換酵母は、例えば、前記核内受容体遺伝子として、動物核内受容体遺伝子が導入されている場合、前記動物核内受容体応答配列が導入されていることが好ましく、ヒト核内受容体遺伝子が導入されている場合、ヒト核内受容体応答配列が導入されていることが好ましい。
【００８３】
本発明の形質転換酵母において、前記核内受容体応答配列の導入部位は、特に制限されない。本発明の形質転換酵母は、例えば、さらに、プラスミドを有し、前記プラスミドが、前記核内受容体応答配列を有することが好ましい。前記核内受容体応答配列は、例えば、前記レポーター遺伝子を有する前記プラスミドに、挿入されていることが好ましい。前記プラスミドにおいて、前記核内受容体応答配列および前記レポーター遺伝子は、作動的に連結して、挿入されていることが好ましい。前記プラスミドにおいて、前記核内受容体応答配列は、前記レポーター遺伝子の上流に挿入されていることが好ましい。前記核内受容体応答配列は、例えば、繰り返し配列として、前記プラスミドに挿入されていることが好ましい。
【００８４】
前記レポーター遺伝子と、前記転写共役因子遺伝子は、例えば、それぞれ、別個のプラスミドに挿入されていることが好ましい。以下、レポーター遺伝子および任意で前記核内受容体応答配列を有する前記プラスミドを、第１のプラスミド、前記転写共役因子遺伝子を有する前記プラスミドを、第２のプラスミドという。前記１のプラスミドは、例えば、低コピー型プラスミドが好ましく、前記第２のプラスミドは、例えば、高コピー型プラスミドが好ましい。
【００８５】
以下に、本発明の形質転換酵母の例として、前記核内受容体が、前述したＡＲ、ＧＲ、ＲＸＲα、ＥＲβ、ＴＲα、ＡｈＲ、ＥＲα、ＴＲβ、ＰＸＲ−１、ＰＲまたはＭＲであり、これらに対するリガンドの分析に使用する形質転換酵母について、説明する。
【００８６】
まず、前記核内受容体がＡＲであり、ＡＲ遺伝子が導入された形質転換酵母について説明する。
【００８７】
ＡＲに対するリガンドは、例えば、アンドロゲンまたはアンドロゲン様化学物質等があげられる。前記リガンドが存在すると、前記形質転換酵母において、ＡＲは、前記リガンドおよび前記転写共役因子と複合体を形成する。前記複合体は、前記核内受容体応答配列を認識して結合する。前記複合体の結合により、前記応答配列の下流に存在する前記レポーター遺伝子が発現する。この際、前記レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子によって、活性化される。前記核内受容体がＡＲの場合、前記応答配列は、例えば、グルココルチコイド応答配列（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ：ＧＲＥ）があげられる。
【００８８】
前記ＡＲは、特に制限されず、前述のように、動物ＡＲが好ましく、より好ましくはヒトＡＲである。本発明の形質転換酵母において、前記ヒトＡＲを発現させるには、例えば、ヒトＡＲ遺伝子が前記酵母の染色体上に導入されていることが好ましい。
【００８９】
前記ヒトＡＲ遺伝子は、例えば、下記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において、少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＡＲとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００９０】
前記（ｂ）のポリヌクレオチドは、前記（ａ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。前記（ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、例えば、前記相同性に対応した数である。
【００９１】
前記ＡＲ遺伝子は、例えば、配列番号１の塩基配列に基づいて、ヒトの核酸を使用して、クローニングすることにより得ることができる。前記核酸は、例えば、ＤＮＡでもよいし、トータルＲＮＡ等のＲＮＡでもよい。前記ＡＲ遺伝子は、例えば、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して、化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【００９２】
前記核内受容体がＡＲの場合、前記ＡＲに対する前記転写共役因子は、特に制限されず、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００およびＴＩＦ２等がある。これらの中で、例えば、ＳＲＣ１が好ましい。前記転写共役因子は、前述のように動物転写共役因子が好ましく、より好ましくはヒト転写共役因子である。前記転写共役因子遺伝子は、例えば、前述のように、前記第２のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型であることが好ましい。
【００９３】
前記核内受容体応答配列は、例えば、前述のように、前記第１のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記核内受容体応答配列および前記レポーター遺伝子は、前述のように、作動的に連結して、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記核内受容体応答配列、例えば、ＧＲＥは、繰り返し配列として、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記第１のプラスミドは、低コピー型であることが好ましい。
【００９４】
つぎに、前記核内受容体がＧＲであり、ＧＲ遺伝子が導入された形質転換酵母について説明する。
【００９５】
ＧＲに対するリガンドは、例えば、グルココルチコイドまたはグルココルチコイド様化学物質等があげられる。前記リガンドが存在すると、前記形質転換酵母において、ＧＲは、前記リガンドおよび前記転写共役因子と複合体を形成する。前記複合体は、前記核内受容体応答配列を認識して結合する。前記複合体の結合により、前記応答配列の下流に存在する前記レポーター遺伝子が発現する。この際、前記レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子によって、活性化される。前記核内受容体がＧＲの場合、前記応答配列は、例えば、グルココルチノイド応答配列（ＧＲＥ）があげられる。
【００９６】
前記ＧＲは、特に制限されず、前述のように、動物ＧＲが好ましく、より好ましくはヒトＧＲである。本発明の形質転換酵母において、前記ヒトＧＲを発現させるには、例えば、ヒトＧＲ遺伝子を前記酵母の染色体上に導入することが好ましい。
【００９７】
前記ヒトＧＲ遺伝子は、例えば、下記（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列において、少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＧＲとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００９８】
前記（ｄ）のポリヌクレオチドは、前記（ｃ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。前記（ｄ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、例えば、前記相同性に対応した数である。
【００９９】
前記ＧＲ遺伝子は、例えば、配列番号２の塩基配列に基づいて、ヒトの核酸を使用してクローニングすることにより得ることができる。前記核酸は、例えば、ＤＮＡでもよいし、トータルＲＮＡ等のＲＮＡでもよい。前記ＧＲ遺伝子は、例えば、ホスホルアミダイト法を利用して、化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【０１００】
前記核内受容体がＧＲの場合、前記ＧＲに対する前記転写共役因子は、特に制限されず、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００およびＴＩＦ２等がある。これらの中で、例えば、ＳＲＣ１が好ましい。前記転写共役因子は、前述のように動物転写共役因子が好ましく、より好ましくはヒト転写共役因子である。前記転写共役因子遺伝子は、例えば、前述のように、前記第２のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型であることが好ましい。
【０１０１】
前記核内受容体応答配列は、例えば、前述のように、前記第１のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記核内受容体応答配列および前記レポーター遺伝子は、前述のように、作動的に連結して、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記核内受容体応答配列、例えば、ＧＲＥは、繰り返し配列として、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記第１のプラスミドは、低コピー型であることが好ましい。
【０１０２】
つぎに、前記核内受容体がＲＸＲαであり、ＲＸＲα遺伝子が導入された形質転換酵母について説明する。
【０１０３】
ＲＸＲαに対するリガンドは、例えば、レチノイン酸またはレチノイン酸様化学物質等があげられる。前記リガンドが存在すると、前記形質転換酵母において、ＲＸＲαは、前記リガンドおよび前記転写共役因子と複合体を形成する。前記複合体は、前記核内受容体応答配列を認識して結合する。前記複合体の結合により、前記応答配列の下流に存在する前記レポーター遺伝子が発現する。この際、前記レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子によって、活性化される。前記核内受容体がＲＸＲαの場合、前記応答配列は、例えば、薬物応答配列（ＤＲ１エレメント）があげられる。
【０１０４】
前記ＲＸＲαは、特に制限されず、前述のように、動物ＲＸＲαが好ましく、より好ましくはヒトＲＸＲαである。本発明の形質転換酵母において、前記ヒトＲＸＲαを発現させるには、例えば、ヒトＲＸＲα遺伝子を前記酵母の染色体上に導入することが好ましい。
【０１０５】
前記ヒトＲＸＲα遺伝子は、例えば、下記（ｅ）または（ｆ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
（ｅ）配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｆ）配列番号３に記載の塩基配列において、少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＲＸＲαとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１０６】
前記（ｆ）のポリヌクレオチドは、前記（ｅ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。前記（ｆ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、例えば、前記相同性に対応した数である。
【０１０７】
前記ＲＸＲα遺伝子は、例えば、配列番号３の塩基配列に基づいて、ヒトの核酸を使用してクローニングすることにより得ることができる。前記核酸は、例えば、ＤＮＡでもよいし、トータルＲＮＡ等のＲＮＡでもよい。前記ＲＸＲα遺伝子は、例えば、ホスホルアミダイト法を利用して、化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【０１０８】
前記核内受容体がＲＸＲαの場合、前記ＲＸＲαに対する前記転写共役因子は、特に制限されず、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００およびＡＲＡ７０等がある。これらの中で、ＳＲＣ１が好ましい。前記転写共役因子は、前述のように動物転写共役因子が好ましく、より好ましくはヒト転写共役因子である。前記転写共役因子遺伝子は、例えば、前述のように、前記第２のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型であることが好ましい。
【０１０９】
前記核内受容体応答配列は、例えば、前述のように、前記第１のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記核内受容体応答配列および前記レポーター遺伝子は、前述のように、作動的に連結して、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記核内受容体応答配列、例えば、ＤＲ１エレメントは、繰り返し配列として、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記第１のプラスミドは、低コピー型であることが好ましい。
【０１１０】
つぎに、前記核内受容体がＥＲβであり、ＥＲβ遺伝子が導入された形質転換酵母について説明する。
【０１１１】
ＥＲβに対するリガンドは、例えば、エストロゲンまたはエストロゲン様化学物質等があげられる。前記リガンドが存在すると、前記形質転換酵母において、ＥＲβは、前記リガンドおよび前記転写共役因子と複合体を形成する。前記複合体は、前記核内受容体応答配列を認識して結合する。前記複合体の結合により、前記応答配列の下流に存在する前記レポーター遺伝子が発現する。この際、前記レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子によって、活性化される。前記核内受容体がＥＲβの場合、前記応答配列は、例えば、エストロゲン応答配列（ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ：ＥＲＥ）があげられる。
【０１１２】
前記ＥＲβは、特に制限されず、前述のように、動物ＥＲβが好ましく、より好ましくはヒトＥＲβである。本発明の形質転換酵母において、前記ヒトＥＲβを発現させるには、例えば、ヒトＥＲβ遺伝子を前記酵母の染色体上に導入することが好ましい。
【０１１３】
前記ヒトＥＲβ遺伝子は、例えば、下記（ｇ）または（ｈ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
（ｇ）配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｈ）配列番号４に記載の塩基配列において、少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＥＲβとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１１４】
前記（ｈ）のポリヌクレオチドは、前記（ｇ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。前記（ｈ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、例えば、前記相同性に対応した数である。
【０１１５】
前記ＥＲβ遺伝子は、例えば、配列番号４の塩基配列に基づいて、ヒトの核酸を使用してクローニングすることにより得ることができる。前記核酸は、例えば、ＤＮＡでもよいし、トータルＲＮＡ等のＲＮＡでもよい。前記ＥＲβ遺伝子は、例えば、ホスホルアミダイト法を利用して、化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【０１１６】
前記核内受容体がＥＲβの場合、前記ＥＲβに対する転写共役因子は、特に制限されず、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００、ＡＳＣ２およびＥＲＡＰ１４０等がある。これらの中で、例えば、ＳＲＣ１が好ましい。前記転写共役因子は、前述のように動物転写共役因子が好ましく、より好ましくはヒト転写共役因子である。前記転写共役因子遺伝子は、例えば、前述のように、前記第２のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型であることが好ましい。
【０１１７】
前記核内受容体応答配列は、例えば、前述のように、前記第１のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記核内受容体応答配列および前記レポーター遺伝子は、前述のように、作動的に連結して、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記核内受容体応答配列、例えば、ＥＲＥは、繰り返し配列として、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記第１のプラスミドは、低コピー型であることが好ましい。
【０１１８】
つぎに、前記核内受容体がＴＲαであり、ＴＲα遺伝子が導入された形質転換酵母について説明する。
【０１１９】
ＴＲαに対するリガンドは、例えば、甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモン様化学物質等があげられる。前記リガンドが存在すると、前記形質転換酵母において、ＴＲαは、前記リガンドおよび前記転写共役因子と複合体を形成する。前記複合体は、前記核内受容体応答配列を認識して結合する。前記複合体の結合により、前記応答配列の下流に存在する前記レポーター遺伝子が発現する。この際、前記レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子によって、活性化される。前記核内受容体がＴＲαの場合、前記応答配列は、例えば、薬物応答配列（ＩＲ０エレメント）があげられる。
【０１２０】
前記ＴＲαは、特に制限されず、前述のように、ヒトＴＲαが好ましい。本発明の形質転換酵母において、前記ヒトＴＲαを発現させるには、ヒトＴＲα遺伝子を前記酵母の染色体上に導入することが好ましい。
【０１２１】
前記ヒトＴＲα遺伝子は、例えば、下記（ｉ）または（ｊ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
（ｉ）配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｊ）配列番号５に記載の塩基配列において、少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＴＲαとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１２２】
前記（ｊ）のポリヌクレオチドは、例えば、ヒトの核酸を使用してクローニングすることにより得ることができる。前記核酸は、例えば、ＤＮＡでもよいし、トータルＲＮＡ等のＲＮＡでもよい。前記ＴＲα遺伝子は、例えば、ホスホルアミダイト法を利用して、化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【０１２３】
前記核内受容体がＴＲαの場合、前記ＴＲαに対する転写共役因子は、特に制限されず、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００、ＡＩＢ、ＡＲＡ７０およびＡＳＣ２等がある。これらの中で、例えば、ＳＲＣ１が好ましい。前記転写共役因子は、前述のように動物転写共役因子が好ましく、より好ましくはヒト転写共役因子である。前記転写共役因子遺伝子は、例えば、前述のように、前記第２のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型であることが好ましい。
【０１２４】
前記核内受容体応答配列は、例えば、前述のように、前記第１のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記核内受容体応答配列および前記レポーター遺伝子は、前述のように、作動的に連結して、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記核内受容体応答配列、例えば、ＩＲ０エレメントは、繰り返し配列として、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記第１のプラスミドは、低コピー型であることが好ましい。
【０１２５】
つぎに、前記核内受容体がＡｈＲであり、ＡｈＲ遺伝子が導入された形質転換酵母について説明する。
【０１２６】
ＡｈＲに対するリガンドは、例えば、β−ＮＦ（ナフトフラボン）、ダイオキシン、ダイオキシン様化学物質、ポリ塩化ジベンゾフラン（ＰＣＤＦ）、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）、３−メチルコラントレン、ベンゾピレン、ベンゾイミダゾール、ジベンゾアンスラセン、ペンタクロロフェノール、ジコホール、オクタクロロスチレンおよびこれらの誘導体等があげられる。前記リガンドが存在すると、前記形質転換酵母において、ＡｈＲは、前記リガンドおよび前記転写共役因子と複合体を形成する。前記複合体は、前記核内受容体応答配列を認識して結合する。前記複合体の結合により、前記応答配列の下流に存在する前記レポーター遺伝子が発現する。この際、前記レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子によって、活性化される。前記核内受容体がＡｈＲの場合、前記応答配列は、例えば、異物応答配列（Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ：ＸＲＥ）があげられる。
【０１２７】
前記ＡｈＲは、特に制限されず、前述のように、ヒトＡｈＲが好ましい。本発明の形質転換酵母において、前記ヒトＡｈＲを発現させるには、ヒトＡｈＲ遺伝子を前記酵母の染色体上に導入することが好ましい。前記転写共役因子は、前述のように動物転写共役因子が好ましく、より好ましくはヒト転写共役因子である。
【０１２８】
前記ヒトＡｈＲ遺伝子は、例えば、下記（ｋ）または（ｌ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
（ｋ）配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｌ）配列番号６に記載の塩基配列において、少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＡｈＲとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１２９】
前記（ｌ）のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号６の塩基配列に基づいて、ヒトの核酸を使用してクローニングすることにより得ることができる。前記核酸は、例えば、ＤＮＡでもよいし、トータルＲＮＡ等のＲＮＡでもよい。前記ＡｈＲ遺伝子は、例えば、ホスホルアミダイト法を利用して、化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【０１３０】
核内受容体がＡｈＲの場合、前記形質転換酵母は、例えば、さらに、ＡｈＲ核内移行因子（Ａｒｎｔ）遺伝子を有してもよい。前記形質転換酵母において、前記Ａｒｎｔ遺伝子の導入部位は、特に制限されない。前記Ａｒｎｔ遺伝子は、例えば、前記酵母の染色体上に導入されていることが好ましい。
【０１３１】
前記Ａｒｎｔは、特に制限されず、前述のように、ヒトＡｒｎｔが好ましい。本発明の形質転換酵母において、前記ヒトＡｒｎｔを発現させるには、ヒトＡｒｎｔ遺伝子を前記酵母の染色体上に導入することが好ましい。
【０１３２】
前記ヒトＡｒｎｔ遺伝子は、例えば、下記（ｍ）または（ｎ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
（ｍ）配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｎ）配列番号７に記載の塩基配列において、少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＡｒｎｔとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１３３】
前記（ｎ）のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号７の塩基配列に基づいて、ヒトの核酸を使用してクローニングすることにより得ることができる。前記核酸は、例えば、ＤＮＡでもよいし、トータルＲＮＡ等のＲＮＡでもよい。前記Ａｒｎｔ遺伝子は、例えば、ホスホルアミダイト法を利用して、化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【０１３４】
前記核内受容体応答配列は、例えば、前述のように、前記第１のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記核内受容体応答配列および前記レポーター遺伝子は、前述のように、作動的に連結して、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記核内受容体応答配列、例えば、ＸＲＥは、繰り返し配列として、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記第１のプラスミドは、低コピー型であることが好ましい。
【０１３５】
つぎに、前記核内受容体がＥＲαであり、ＥＲα遺伝子が導入された形質転換酵母について説明する。
【０１３６】
ＥＲαに対するリガンドは、例えば、エストロゲンまたはエストロゲン様化学物質等があげられる。前記リガンドが存在すると、前記形質転換酵母において、ＥＲαは、前記リガンドおよび前記転写共役因子と複合体を形成する。前記複合体は、前記核内受容体応答配列を認識して結合する。前記複合体の結合により、前記応答配列の下流に存在する前記レポーター遺伝子が発現する。この際、前記レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子によって、活性化される。前記核内受容体がＥＲαの場合、前記応答配列は、例えば、エストロゲン応答配列（ＥＲＥ）があげられる。
【０１３７】
前記ＥＲαは、特に制限されず、前述のように、動物ＥＲαが好ましく、より好ましくはヒトＥＲαである。本発明の形質転換酵母において、前記ヒトＥＲαを発現させるには、例えば、ヒトＥＲα遺伝子を前記酵母の染色体上に導入することが好ましい。
【０１３８】
前記ヒトＥＲα遺伝子は、例えば、下記（ｑ）または（ｒ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
（ｑ）配列番号３７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｒ）配列番号３７に記載の塩基配列において、少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＥＲαとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１３９】
前記（ｒ）のポリヌクレオチドは、前記（ｑ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。前記（ｒ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、例えば、前記相同性に対応した数である。
【０１４０】
前記ＥＲα遺伝子は、例えば、配列番号３７の塩基配列に基づいて、ヒトの核酸を使用してクローニングすることにより得ることができる。前記核酸は、例えば、ＤＮＡでもよいし、トータルＲＮＡ等のＲＮＡでもよい。前記ＥＲα遺伝子は、例えば、ホスホルアミダイト法を利用して、化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【０１４１】
前記核内受容体がＥＲαの場合、前記ＥＲαに対する転写共役因子は、特に制限されず、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００、ＡＳＣ２およびＥＲＡＰ１４０等がある。これらの中で、例えば、ＳＲＣ１が好ましい。前記転写共役因子は、前述のように動物転写共役因子が好ましく、より好ましくはヒト転写共役因子である。前記転写共役因子遺伝子は、例えば、前述のように、前記第２のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型であることが好ましい。
【０１４２】
つぎに、前記核内受容体がＴＲβであり、ＴＲβ遺伝子が導入された形質転換酵母について説明する。
【０１４３】
ＴＲβに対するリガンドは、例えば、甲状腺ホルモンまたは甲状腺ホルモン様化学物質等があげられる。前記リガンドが存在すると、前記形質転換酵母において、ＴＲβは、前記リガンドおよび前記転写共役因子と複合体を形成する。前記複合体は、前記核内受容体応答配列を認識して結合する。前記複合体の結合により、前記応答配列の下流に存在する前記レポーター遺伝子が発現する。この際、前記レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子によって、活性化される。前記核内受容体がＴＲβの場合、前記応答配列は、例えば、薬物応答配列（ＩＲ０エレメント）があげられる。
【０１４４】
前記ＴＲβは、特に制限されず、前述のように、ヒトＴＲβが好ましい。本発明の形質転換酵母において、前記ヒトＴＲβを発現させるには、ヒトＴＲβ遺伝子を前記酵母の染色体上に導入することが好ましい。
【０１４５】
前記ヒトＴＲβ遺伝子は、例えば、下記（ｓ）または（ｔ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
（ｓ）配列番号３８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｔ）配列番号３８に記載の塩基配列において、少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＴＲβとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１４６】
前記（ｔ）のポリヌクレオチドは、例えば、ヒトの核酸を使用してクローニングすることにより得ることができる。前記核酸は、例えば、ＤＮＡでもよいし、トータルＲＮＡ等のＲＮＡでもよい。前記ＴＲβ遺伝子は、例えば、ホスホルアミダイト法を利用して、化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【０１４７】
前記核内受容体がＴＲβの場合、前記ＴＲβに対する転写共役因子は、特に制限されず、例えば、ＳＲＣ１、ＣＢＰ、Ｐ３００、ＡＩＢ、ＡＲＡ７０、ＡＳＣ２およびＥＲＡＰ１４０等がある。これらの中で、例えば、ＳＲＣ１が好ましい。前記転写共役因子は、前述のように動物転写共役因子が好ましく、より好ましくはヒト転写共役因子である。前記転写共役因子遺伝子は、例えば、前述のように、前記第２のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型であることが好ましい。
【０１４８】
前記核内受容体応答配列は、例えば、前述のように、前記第１のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記核内受容体応答配列および前記レポーター遺伝子は、前述のように、作動的に連結して、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記核内受容体応答配列、例えば、ＩＲ０エレメントは、繰り返し配列として、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記第１のプラスミドは、低コピー型であることが好ましい。
【０１４９】
つぎに、前記核内受容体がＰＸＲ−１であり、ＰＸＲ−１遺伝子が導入された形質転換酵母について説明する。
【０１５０】
ＰＸＲ−１に対するリガンドは、例えば、リファンピシンまたはリファンピシン様化学物質等があげられる。前記リガンドが存在すると、前記形質転換酵母において、ＰＸＲ−１は、前記リガンドおよび前記転写共役因子と複合体を形成する。前記複合体は、前記核内受容体応答配列を認識して結合する。前記複合体の結合により、前記応答配列の下流に存在する前記レポーター遺伝子が発現する。この際、前記レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子によって、活性化される。前記核内受容体がＰＸＲ−１の場合、前記応答配列は、例えば、薬物応答配列（ＤＲ−３）があげられる。
【０１５１】
前記ＰＸＲ−１は、特に制限されず、前述のように、動物ＰＸＲ−１が好ましく、より好ましくはヒトＰＸＲ−１である。本発明の形質転換酵母において、前記ヒトＰＸＲ−１を発現させるには、例えば、ヒトＰＸＲ−１遺伝子を前記酵母の染色体上に導入することが好ましい。
【０１５２】
前記ヒトＰＸＲ−１遺伝子は、例えば、下記（ｕ）または（ｖ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
（ｕ）配列番号３９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｖ）配列番号３９に記載の塩基配列において、少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＰＸＲ−１として機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１５３】
前記（ｖ）のポリヌクレオチドは、前記（ｕ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。前記（ｖ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、例えば、前記相同性に対応した数である。
【０１５４】
前記ＰＸＲ−１遺伝子は、例えば、配列番号３９の塩基配列に基づいて、ヒトの核酸を使用してクローニングすることにより得ることができる。前記核酸は、例えば、ＤＮＡでもよいし、トータルＲＮＡ等のＲＮＡでもよい。前記ＰＸＲ−１遺伝子は、例えば、ホスホルアミダイト法を利用して、化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【０１５５】
前記核内受容体がＰＸＲ−１の場合、前記ＰＸＲ−１に対する前記転写共役因子は、特に制限されず、例えば、ＣＢＰおよびＰ３００等がある。前記転写共役因子は、前述のように動物転写共役因子が好ましく、より好ましくはヒト転写共役因子である。前記転写共役因子遺伝子は、例えば、前述のように、前記第２のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型であることが好ましい。
【０１５６】
前記核内受容体応答配列は、例えば、前述のように、前記第１のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記核内受容体応答配列および前記レポーター遺伝子は、前述のように、作動的に連結して、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記核内受容体応答配列、例えば、ＤＲ−３は、繰り返し配列として、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記第１のプラスミドは、低コピー型であることが好ましい。
【０１５７】
つぎに、前記核内受容体がＰＲであり、ＰＲ遺伝子が導入された形質転換酵母について説明する。
【０１５８】
ＰＲに対するリガンドは、例えば、プロゲステロンまたプロゲステロン様化学物質等があげられる。前記リガンドが存在すると、前記形質転換酵母において、ＰＲは、前記リガンドおよび前記転写共役因子と複合体を形成する。前記複合体は、前記核内受容体応答配列を認識して結合する。前記複合体の結合により、前記応答配列の下流に存在する前記レポーター遺伝子が発現する。この際、前記レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子によって、活性化される。前記核内受容体がＰＲの場合、前記応答配列は、例えば、グルココルチコイド応答配列（ＧＲＥ）があげられる。
【０１５９】
前記ＰＲは、特に制限されず、前述のように、ヒトＰＲが好ましい。本発明の形質転換酵母において、前記ヒトＰＲを発現させるには、ヒトＰＲ遺伝子を前記酵母の染色体上に導入することが好ましい。
【０１６０】
前記ヒトＰＲ遺伝子は、例えば、下記（ｗ）または（ｘ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
（ｗ）配列番号４０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｘ）配列番号４０に記載の塩基配列において、少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＰＲとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１６１】
前記（ｘ）のポリヌクレオチドは、前記（ｗ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。前記（ｘ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、例えば、前記相同性に対応した数である。
【０１６２】
前記ＰＲ遺伝子は、例えば、配列番号４０の塩基配列に基づいて、ヒトの核酸を使用して、クローニングすることにより得ることができる。前記核酸は、例えば、ＤＮＡでもよいし、トータルＲＮＡ等のＲＮＡでもよい。前記ＰＲ遺伝子は、例えば、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して、化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【０１６３】
前記核内受容体がＰＲの場合、前記ＰＲに対する前記転写共役因子は、特に制限されず、例えば、ＣＢＰおよびＰ３００等がある。前記転写共役因子は、前述のように動物転写共役因子が好ましく、より好ましくはヒト転写共役因子である。前記転写共役因子遺伝子は、例えば、前述のように、前記第２のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型であることが好ましい。
【０１６４】
前記核内受容体応答配列は、例えば、前述のように、前記第１のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記核内受容体応答配列および前記レポーター遺伝子は、前述のように、作動的に連結して、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記核内受容体応答配列、例えば、ＧＲＥは、繰り返し配列として、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記第１のプラスミドは、低コピー型であることが好ましい。
【０１６５】
つぎに、前記核内受容体がＭＲであり、ＭＲ遺伝子が導入された形質転換酵母について説明する。
【０１６６】
ＭＲに対するリガンドは、例えば、アルドステロンまたアルドステロン様化学物質等があげられる。前記リガンドが存在すると、前記形質転換酵母において、ＭＲは、前記リガンドおよび前記転写共役因子と複合体を形成する。前記複合体は、前記核内受容体応答配列を認識して結合する。前記複合体の結合により、前記応答配列の下流に存在する前記レポーター遺伝子が発現する。この際、前記レポーター遺伝子の転写は、前記転写共役因子によって、活性化される。前記核内受容体がＭＲの場合、前記応答配列は、例えば、グルココルチコイド応答配列（ＧＲＥ）があげられる。
【０１６７】
前記ＭＲは、特に制限されず、前述のように、ヒトＭＲが好ましい。本発明の形質転換酵母において、前記ヒトＭＲを発現させるには、ヒトＭＲ遺伝子を前記酵母の染色体上に導入することが好ましい。
【０１６８】
前記ヒトＭＲ遺伝子は、例えば、下記（ｙ）または（ｚ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
（ｙ）配列番号４１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｚ）配列番号４１に記載の塩基配列において、少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＭＲとして機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１６９】
前記（ｚ）のポリヌクレオチドは、前記（ｙ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。前記（ｚ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、例えば、前記相同性に対応した数である。
【０１７０】
前記ＭＲ遺伝子は、例えば、配列番号４１の塩基配列に基づいて、ヒトの核酸を使用して、クローニングすることにより得ることができる。前記核酸は、例えば、ＤＮＡでもよいし、トータルＲＮＡ等のＲＮＡでもよい。前記ＭＲ遺伝子は、例えば、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を利用して、化学的にＤＮＡ合成してもよい。前記クローニングの方法は、特に制限されず、例えば、市販のクローニングキット等を利用して実施できる。
【０１７１】
前記核内受容体がＭＲの場合、前記ＭＲに対する前記転写共役因子は、特に制限されず、例えば、ＣＢＰおよびＰ３００等がある。前記転写共役因子は、前述のように動物転写共役因子が好ましく、より好ましくはヒト転写共役因子である。前記転写共役因子遺伝子は、例えば、前述のように、前記第２のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記第２のプラスミドは、高コピー型であることが好ましい。
【０１７２】
前記核内受容体応答配列は、例えば、前述のように、前記第１のプラスミドに挿入し、このプラスミドを形質転換酵母に導入することが好ましい。前記核内受容体応答配列および前記レポーター遺伝子は、前述のように、作動的に連結して、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記核内受容体応答配列、例えば、ＧＲＥは、繰り返し配列として、前記第１のプラスミドに挿入することが好ましい。前記第１のプラスミドは、低コピー型であることが好ましい。
【０１７３】
前記転写共役因子遺伝子の一例として、前記ヒトＳＲＣ１遺伝子を以下に示す。前記ヒトＳＲＣ１遺伝子は、例えば、下記（ｏ）または（ｐ）のポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
（ｏ）配列番号８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｐ）配列番号８に記載の塩基配列において、少なくとも１つの塩基が置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、ヒトＳＲＣ１として機能するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０１７４】
前記（ｐ）のポリヌクレオチドは、前記（ｏ）のポリヌクレオチドとの相同性が、例えば、９０％以上であって、好ましくは、９３％以上であり、より好ましくは、９５％以上であり、さらに好ましくは、９８％以上である。前記（ｐ）のポリヌクレオチドにおいて、置換、付加、挿入もしくは欠失した塩基の数は、例えば、前記相同性に対応した数である。
【０１７５】
本発明の形質転換酵母の製造方法は、特に制限されない。本発明の形質転換酵母は、例えば、宿主となる酵母からの前記コード遺伝子の欠失、および、前記酵母への前記各種遺伝子の導入等により、製造できる。
【０１７６】
前記宿主となる酵母は、特に制限されず、例えば、出芽酵母、分裂酵母、糸状酵母等があり、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。
【０１７７】
前記酵母から、前記細胞壁タンパク質のコード遺伝子および前記排出ポンプタンパク質のコード遺伝子の少なくとも一方を欠失させる方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記コード遺伝子は、例えば、ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを利用して、欠失できる。
【０１７８】
前記酵母内に、前記核内受容体遺伝子を導入する方法は、特に制限されず、公知の遺伝子導入方法が採用できる。前記遺伝子導入方法は、例えば、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポソームを用いた方法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクターを用いる方法、マイクロピペットインジェクション法等があげられる。本発明において、前記核内受容体遺伝子の導入は、例えば、前記核内受容体に対するリガンドの分析に用いることが可能であればよい。このため、前記導入は、例えば、一過性型の導入、宿主である酵母の染色体上への組込み型の導入、または自律複製および分配が可能な人工染色体型もしくはプラスミド型の導入でもよい。中でも、例えば、取扱い、保存の容易性、ならびにリガンドの分析の迅速性、正確性および簡便性から、前述のように、宿主である酵母の染色体上への遺伝子導入が好ましい。
【０１７９】
前記酵母内に導入する前記核内受容体遺伝子は、例えば、酵母内で恒常的または任意に発現するように、必要な調節配列と作動的に連結されていることが好ましい。前記調節配列とは、例えば、宿主細胞すなわち酵母内において、作動的に連結された前記遺伝子の発現に必要な塩基配列である。真核細胞に適した前記調節配列は、特に制限されず、例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー等があげられる。本発明において、「作動的に連結」とは、例えば、各構成要素が機能を果たすことができるように並置していることを意味する。
【０１８０】
本発明において、前記核内受容体および前記リガンドの複合体を検出するためのレポーター遺伝子は、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が好ましい。前記β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、例えば、その上流に、前記複合体が認識して結合する前記応答配列と作動的に結合している。前記応答配列は、例えば、転写調節配列ともいう。前記応答配列は、例えば、前記核内受容体遺伝子の種類により適宜決定される。前記核内受容体が、ＡＲ、ＧＲ、ＰＲおよびＭＲの場合、前記応答配列は、例えば、ＧＲＥであり、ＲＸＲαの場合、前記応答配列は、例えば、ＤＲ１エレメントであり、ＥＲβおよびＥＲαの場合、前記応答配列は、例えば、ＥＲＥであり、ＴＲαおよびＴＲβの場合、前記応答配列は、例えば、ＩＲ０エレメントであり、ＡｈＲの場合、前記応答配列は、例えば、ＸＲＥであり、ＰＸＲ−１の場合は、前記応答配列は、ＤＲ−３である。前記応答配列および前記レポーター遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子）は、前述のように、第１のプラスミドに組み込んで、酵母に導入することが好ましい。前記レポーター遺伝子は、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子に限定されず、その他、ルシフェラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子等が使用できる。
【０１８１】
前記転写共役因子遺伝子は、例えば、前記レポーター遺伝子を組み込んだプラスミド（第１のプラスミド）とは別のプラスミド（第２のプラスミド）に組み込んで、酵母に導入することが好ましい。
【０１８２】
つぎに、本発明の形質転換酵母を用いて、検体に含まれる核内受容体リガンドを分析する方法の一例を示す。本例は、前記形質転換酵母として、前記マンナン結合タンパク質のコード遺伝子と前記排出タンパク質のコード遺伝子の両方を欠失し、且つ、前記核内受容体遺伝子、前記転写共役因子遺伝子、前記核内受容体応答配列および前記レポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が導入されたものの使用を例示する。本発明は、これらの例には制限されない。
【０１８３】
まず、前記形質転換酵母を準備する。前記形質転換酵母は、例えば、グリセロールストックを調製することが好ましい。前記グリセロールストックの調製に使用する培地は、特に制限されず、例えば、窒素源、炭素源、アミノ酸、核酸、ビタミン類等を含む培地があげられる。前記グリセロールストックの調製に使用する培地として、組成の一例を、下記表２に示す。
【０１８４】
【表２】
2012070730.tif 000004
【０１８５】
前記グリセロールストックの調製は、例えば、以下のように前記形質転換酵母を培養することで行える。前記形質転換酵母として、前記培地で継続的に培養された状態の前記形質転換酵母を使用する場合、例えば、前記継続培養後の培養液を５０μＬ分取し、前記表２に示す培地５０００μＬ中に加え、３０℃で１２〜２４時間程度振とう培養する。また、前記形質転換酵母として、凍結乾燥菌体を使用する場合、例えば、前記凍結乾燥菌体を、ＹＰＤ培地等の栄養培地を加え、３０℃で２４時間培養し、その培養液を５０μＬ分取し、前記表２に示す培地５０００μＬに加え、３０℃で１２〜２４時間程度振とう培養する。
【０１８６】
前記培養によって菌体を十分増殖させた後、得られた培養液から、１０倍濃縮グリセロールストック液を作製する。前記グリセロールストック液の組成は、例えば、培養液８０％およびグリセロール２０％を含む。前記グリセロールストック液は、例えば、−８０℃での保存も可能である。
【０１８７】
つぎに、前記形質転換酵母を、被検物質の存在下で、本培養する。この際、前述のように調製した前記グリセロールストック液を使用することが好ましい。
【０１８８】
前記本培養に使用する培地は、特に制限されず、例えば、前記表２に示す培地であって、前記炭素源として、ガラクトースおよびグルコースを含むものを使用する。ガラクトースとグルコースの比率は、特に制限されず、ガラクトースおよびグルコースの合計重量に対するグルコースの重量割合が、例えば、０を超え６０重量％以下、好ましくは、０を超え４０重量％以下、より好ましくは、１０〜３０重量％の範囲である。このように、前記培地にガラクトースおよびグルコースを添加した場合、本培養において、前記形質転換酵母の増殖をより促進できる。このため、例えば、より短時間の本培養で、前記被験物質を高感度かつ高信頼性で分析可能である。
【０１８９】
前記本培養は、前述のように、前記培地中に、化学物質等の被験物質を添加して行う。前記培地への前記被検物質の添加方法は、特に制限されず、例えば、直接添加してもよいし、溶媒に混合、溶解または懸濁してから添加してもよい。前記被験物質が固体の場合、例えば、前記被検物質を溶媒と混合してから、前記培地に混合することが好ましい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、前記形質転換酵母に対して毒性が低いまたは毒性を示さないものが好ましく、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が例示できる。
【０１９０】
前記本培養の条件は、特に制限されず、温度は、例えば、２８〜３０℃であり、前記時間は、例えば、１０〜４８時間、好ましくは、１５〜３６時間、より好ましくは１８〜２４時間である。前記本培養は、例えば、振とう培養でもよいし、静置培養でもよい。
【０１９１】
そして、前記本培養後の前記形質転換酵母を溶菌させる。前記溶菌の方法は、特に制限されず、例えば、公知の手法により行うことができる。前記溶菌は、例えば、溶菌液として、界面活性剤を含む緩衝液を使用して、行うことができる。前記界面活性剤は、特に制限されず、例えば、サルコシル（Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）があげられる。前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、Ｚバッファーがあげられる。前記溶菌液として、組成の一例を以下に示す。
【０１９２】
【表３】
2012070730.tif 000005
【０１９３】
つぎに、前記溶菌後の溶菌液について、産生されたβ−ガラクトシダーゼの活性を測定する。β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば、発色試薬と反応させ、その発色程度を、例えば、吸光度等として測定すればよい。前記発色試薬は、特に制限されず、ＯＮＰＧ（オルソニトロフェニルガラクトピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、ＣＰＲＧ（クロロフェノールレッドガラクトピラノシド）等の公知の発色基質が使用できる。
【０１９４】
活性測定において、予め、標準物質を用いて、検量線を作成しておくことが好ましい。前記検量線は、例えば、被験物質の測定と同じ条件で作成することが好ましく、被検物質の測定と同時に測定を行い、その結果に基づいて作成することが好ましい。活性測定においては、例えば、用量作用関係の範囲内に納まるように、被験物質を適宜希釈することが好ましい。このような分析方法によれば、例えば、吸光度を測定するだけでよく、簡便かつ迅速に被検物質を分析できる。
【０１９５】
＜分析方法＞
本発明の分析方法は、検体に含まれる核内受容体リガンドを分析するための方法であって、検体を含む培地中で、前記本発明の形質転換酵母を培養する培養工程と、
前記培養工程の後、前記培地中に産生された前記レポーター遺伝子の発現産物を測定する測定工程を含むことを特徴とする。
【０１９６】
本発明の分析方法は、前記本発明の形質転換酵母を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、何ら制限されない。本発明の分析方法は、例えば、前記本発明の形質転換酵母の説明において述べた方法により実施できる。
【０１９７】
本発明において、分析は、例えば、前記リガンドの検出、定性、定量のいずれであってもよい。
【０１９８】
＜分析キット＞
本発明の分析キットは、本発明の分析方法を簡単に実施するためのキットである。本発明の分析キットは、前述のように、培地、本発明の前記形質転換酵母および発色試薬を含むキットである。前記発色試薬は、例えば、前述のように、ＯＮＰＧ、ＣＰＲＧ等の発色基質があげられる。さらに、本発明の分析キットは、検量線作成のための標準物質等を含んでいてもよい。前記形質転換酵母は、凍結乾燥させて粉末状にしてもよい。本発明の分析キットは、さらに、使用説明書を含んでもよい。
【０１９９】
＜スクリーニング方法およびスクリーニングキット＞
本発明の分析方法および分析キットは、例えば、スクリーニング方法およびスクリーニングキットということもできる。本発明によれば、例えば、検体中に含まれる未知物質が、どのような核内受容体に結合するのかを、簡易にスクリーニングできる。本発明のスクリーニング方法は、例えば、各核内受容体についての本発明の形質転換酵母を、複数種類同時に使用するのが好ましい。
【実施例】
【０２００】
つぎに、本発明の実施例について、説明する。本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【０２０１】
〔実施例１〕
本実施例では、以下の手順により、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子を欠失させた二重欠失酵母を作製し、ヒトＧＲ遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を作製した。
【０２０２】
（１）遺伝子欠失酵母の作製
プラスミドｐＵＧ６は、ｌｏｘＰ配列で挟まれたＧ４１８耐性遺伝子を有し、前記Ｇ４１８耐性遺伝子が、菌類ＴＥＦプロモーターおよびターミネーターで制御されたプラスミドである（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （１９９６）  ２４、２５１９−２５２４）。前記プラスミドｐＵＧ６を鋳型として、下記プライマーＳＨ００５、ＳＨ００６、ＳＨ０１３およびＳＨ０１４を用いて、ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰ領域を、ＰＣＲにより増幅した。具体的には、ＣＷＰ１遺伝子の近傍配列が付加されたｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰ（以下、ＣＷＰ１近傍配列付加ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰという）およびＰＤＲ５遺伝子の近傍配列が付加されたｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰ（以下、ＰＤＲ５近傍配列付加ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰという）を増幅した。前記各プライマーは、それぞれ、ＣＷＰ１遺伝子またはＰＤＲ５遺伝子の近傍配列を含む配列とした。下記配列において、大文字の領域は、ＣＷＰ１遺伝子またはＰＤＲ５遺伝子の近傍配列の相補配列であり、小文字の領域は、ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰの相補配列である。
【０２０３】
（ＣＷＰ１近傍配列付加ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰ用プライマー）
ＳＨ００５（配列番号９）
５’−CTGAAGTAAAATATCCCGTAACAAACTAATAAATACTACGAcagctgaagcttcgtacgc−３’
ＳＨ００６（配列番号１０）
５’−TATTGAAGGAAATAAAACATGCAGGTTTTGTTCTCGTACcataggccactagtggatctg−３’
（ＰＤＲ５近傍配列付加ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰ用プライマー）
ＳＨ０１３（配列番号１１）
５’−TAAGTTTTCGTATCCGCTCGTTCGAAAGACTTTAGACAAAAcagctgaagcttcgtacgc−３’
ＳＨ０１４（配列番号１２）
５’−AAAGTCCATCTTGGTAAGTTTCTTTTCTTAACCAAATTCcataggccactagtggatctg−３’
【０２０４】
【表４】
2012070730.tif 000006
【０２０５】
（ＰＣＲ条件１）
９４℃で２分処理して、鋳型を熱変成した後、９４℃で３０秒、５０℃で１０秒および６８℃で２分を１サイクルとして、３５サイクル実施した。
【０２０６】
そして、ＰＣＲ後、増幅したＣＷＰ１近傍配列付加ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰまたはＰＤＲ５近傍配列付加ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰを、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３ａ株に、酢酸リチウム法にて導入した。この際、形質転換酵母の選択培地は、ＹＰＤ培地に、２００μｇ／ｍＬとなるようにＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を添加した、Ｇ４１８含有ＹＰＤ培地を使用した。
【０２０７】
ここで、前記配列の導入により、前記形質転換酵母が、ＣＷＰ１遺伝子またはＰＤＲ５遺伝子を欠失しているかを確認した。前記各遺伝子の欠失の確認は、前記形質転換酵母のＤＮＡを鋳型として、下記プライマーを用いて、ＰＣＲにより行った。下記プライマーを用いたＰＣＲによって、増幅が確認された場合は、ＣＷＰ１遺伝子またはＰＤＲ５遺伝子を欠失していると判断した。
【０２０８】
（５’ＣＷＰ１欠失の検証用プライマー）
ＳＨ００７（配列番号１３）
５’−gtgctcgaccttctatcccgt−３’
ＳＨ０１８（配列番号１４）
５’−ctgcgcacgtcaagactg−３’
（３’ＣＷＰ１欠失の検証用プライマー）
ＳＨ０１７（配列番号１５）
５’−cctcgacatcatctgccc−３’
ＳＨ００８（配列番号１６）
５’−cttgtattctcctatcagcctgg−３’
（５’ＰＤＲ５欠失の検証用プライマー）
ＳＨ０１５（配列番号１７）
５’−ggactgaaacttaagactgccc−３’
ＳＨ０１８（配列番号１４）
５’−ctgcgcacgtcaagactg−３’
（３’ＰＤＲ５欠失の検証用プライマー）
ＳＨ０１７（配列番号１５）
５’−cctcgacatcatctgccc−３’
ＳＨ０１６（配列番号１８）
５’−gcaaaagatccgattatacttacc−３’
【０２０９】
【表５】
2012070730.tif 000007
【０２１０】
（ＰＣＲ条件２）
９４℃で２分処理して、鋳型を熱変成した後、９４℃で３０秒、５０℃で１０秒および６８℃で１分を１サイクルとして、３５サイクル実施した。
【０２１１】
つづいて、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （１９９６）  ２４、２５１９−２５２４に準じて、プラスミドｐＳＨ４７を作製した。前記プラスミドｐＳＨ４７は、部位特異的組換え酵素Ｃｒｅ遺伝子およびウラシル選択マーカーＵＲＡ３遺伝子を有し、これらの遺伝子が、Ｇａｌ１−１０プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターで制御されたプラスミドである。前記プラスミドｐＳＨ４７を、前記形質転換酵母に、酢酸リチウム法によって導入した。この際、形質転換酵母の選択培地は、ウラシル無添加のグルコース培地を使用した。前記ウラシル無添加グルコース培地は、前記表２の培地組成において、炭素源としてグルコースを含み、前記ドロップアウトパウダーとして、下記表６の組成のドロップアウトパウダーを添加した。
【０２１２】
【表６】
2012070730.tif 000008
【０２１３】
得られたウラシル非要求性の形質転換酵母を、ウラシル無添加のグルコース液体培地を用いて、３０℃で一晩、前培養を行った。前培養した前記形質転換酵母を遠心分離によって集菌した後、滅菌水で２回洗浄した。培地を、ウラシル無添加のガラクトース液体培地に代え、前記洗浄後の前記形質転換酵母を、３０℃で４時間培養した。培養後、適宜希釈した菌液を、ＹＰＤ寒天培地上に播種した。そして、コロニー形成後、レプリカ法によって、Ｇ４１８感受性となったコロニーを選抜した。前記ウラシル無添加ガラクトース培地は、前記表２の培地組成において、炭素源としてガラクトースを含み、前記ドロップアウトパウダーとして、前記表６の組成のドロップアウトパウダーを添加した。
【０２１４】
ここで、Ｃｒｅ遺伝子によってＧ４１８耐性遺伝子が切り出され、最終的に、ＣＷＰ１遺伝子またはＰＤＲ５遺伝子のＯＲＦが、それぞれｌｏｘＰ配列に置換されたことを確認した。この確認は、前記Ｇ４１８感受性のコロニーのＤＮＡを鋳型とし、前記プライマーＳＨ００７（配列番号１３）、ＳＨ００８（配列番号１６）、ＳＨ０１５（配列番号１７）およびＳＨ０１６（配列番号１８）を用いて、ＰＣＲにより行った。前記ＰＣＲは、前記ＰＣＲ反応液２を使用し、前記ＰＣＲ条件２で行った。前記プライマーを用いたＰＣＲによって、増幅が確認された場合は、ＣＷＰ１遺伝子またはＰＤＲ５遺伝子を欠失していると判断した。
【０２１５】
以上のようにして、ＣＷＰ１遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、ＰＤＲ５遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株を得た。そして、最終的に、プラスミドｐＳＨ４７が脱落して、再びウラシル要求性となった一重欠失株を、遺伝子欠失酵母株として、以下の実験に用いた。
【０２１６】
さらに、前記ＣＷＰ１遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株または前記ＰＤＲ５遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株から、前述と同様の操作により、二重欠失株として、前記ＰＤＲ５遺伝子および前記ＣＷＰ１遺伝子の両方を欠失する遺伝子欠失酵母を作製した。すなわち、前記ＰＤＲ５遺伝子の欠失株に対しては、さらに、前述と同様に、ＣＷＰ１遺伝子欠失の操作を行い、ＰＤＲ５遺伝子およびＣＷＰ１遺伝子を欠失する遺伝子欠失株を得た。また、前記ＣＷＰ１遺伝子欠失株に対しては、さらに、前述と同様に、ＰＤＲ５遺伝子欠失の操作を行い、ＰＤＲ５遺伝子およびＣＷＰ１遺伝子を欠失する遺伝子欠失株を得た。そして、最終的に、プラスミドｐＳＨ４７が脱落して、再びウラシル要求性となった二重欠失株を、遺伝子欠失酵母株として、以下の実験に用いた。
【０２１７】
（２）レポータープラスミドの作製
Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．  ；  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０，  ５６８−５７３  （１９９６）に準じて、ｐＲＷ９５−３を作製した。前記プラスミドｐＲＷ９５−３は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するプラスミドである。
【０２１８】
ＧＲに応答する配列としてＧＲＥ配列を使用した。前記ＧＲＥ配列を含む下記オリゴＤＮＡ（配列番号１９）およびそれに相補なオリゴＤＮＡ（配列番号２０）を作製した。これらのオリゴＤＮＡをアニーリングした。アニーリングは、９４℃で１分間を１サイクルで実施した。アニーリング後、ＧＲＥ配列が連続して８個アニーリングしたものを精製して、ｐＲＷ９５−３のＢｇｌ  ＩＩサイトに挿入した。ＧＲＥ配列が連続して８個挿入されたプラスミドを、ＧＲレポータープラスミドとした。
【０２１９】
（ＧＲＥ配列）
ＧＲＥｃｓｆＢｇ（配列番号１９）
５’−agatctttgagaacaaactgttcttaaat−３’
ＧＲＥｃｓｒＢｃ（配列番号２０）
３’−aaactcttgtttgacaagaatttactag−５’
【０２２０】
（３）動物核内受容体発現プラスミドの作製
ＧＲ遺伝子のｃＤＮＡのＯＲＦを、ヒト精巣ｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型として、下記プライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、下記ＰＣＲ反応液３を用いて、下記ＰＣＲ条件３により行った。
【０２２１】
（ＧＲ用プライマー）
ＧＲｆＲｂＢｍ（配列番号２１）
５’−tcgaggatccaacaaaatggactccaaagaatcattaact−３’
ＧＲｒＸｈ（配列番号２２）
５’−attcttctcgaggcagtcacttttgatgaaac−３’
【０２２２】
【表７】
2012070730.tif 000009
【０２２３】
（ＰＣＲ条件３）
９４℃で４０秒、５８℃で２０秒、６８℃で３分のサイクルを１サイクルとして、４０サイクル実施した。
【０２２４】
つぎに、増幅させたＧＲ遺伝子のｃＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断した。切断した前記ｃＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ切断した前記プラスミドｐＵｄｐ６に挿入した。プラスミドｐＵｄｐ６は、両方向プロモーター領域ｇａｌ１、ｇａｌ１０およびｇａｌ１０の下流にＣＹＣターミネーターを持ち、ｇａｌ１の下流にＡＤＨターミネーターを持ち、さらにウラシル選択マーカーＵＲＡ３遺伝子を持つプラスミドである。前記切断したＧＲ遺伝子のｃＤＮＡは、前記プラスミドｐＵｄｐ６において、前記ＧＡＬ１０プロモーターの下流に挿入した。これによって、前記核内受容体遺伝子を有し、その上流にプロモーターを有するＧＲ発現プラスミドｐＵｄｐ６ＧＲを得た。
【０２２５】
（４）動物転写共役因子発現プラスミドの作製
ＳＲＣ１遺伝子のｃＤＮＡのＯＲＦを、ヒト精巣ｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型として、下記プライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、下記ＰＣＲ反応液４を用いて、下記ＰＣＲ条件４により行った。
【０２２６】
（ＳＲＣ１用プライマー）
ｈＳＲＣ１ｂｇＦ（配列番号２３）
５’−tggaactcaagatttgaccatatc−３’
ｈＳＲＣ１ｘｈＲ（配列番号２４）
５’−gagcattcctctagtctgtagtc−３’
【０２２７】
【表８】
2012070730.tif 000010
【０２２８】
（ＰＣＲ条件４）
９４℃で４０秒、５６℃で２０秒、６８℃で５分のサイクルを１サイクルとして、４０サイクル実施した。
【０２２９】
つぎに、増幅したＳＲＣ１遺伝子のｃＤＮＡを精製した。この精製ｃＤＮＡを鋳型として、さらに、下記プライマーを用いたＰＣＲにより、前記ｃＤＮＡに制限酵素サイトを付加した。ＰＣＲは、前記ＰＣＲ反応液４を用いて、下記ＰＣＲ条件５により行った。
【０２３０】
（ＰＣＲ条件５）
９４℃で４０秒、５６℃で２０秒、６８℃で５分のサイクルを１サイクルとして、２０サイクル実施した。
【０２３１】
（付加用プライマー）
ＳＲＣ−１ｅＦｂｇ２（配列番号２５）
５’−caaagaagatctcccaggtgtgaag−３’
ＳＲＣ−１ｅＲｘｈ２（配列番号２６）
５’−agggccctcgagactctagtctgtag−３’
【０２３２】
増幅した前記ｃＤＮＡを、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで切断した後、プラスミドｐＥＳＣ−Ｌｅｕのｇａｌ１プロモーター領域の下流に挿入した。得られたプラスミドを、動物転写因子発現プラスミドｐＥＳＣ−Ｌｅｕ−ｈＳＲＣ１とした。
【０２３３】
（５）形質転換酵母の作製
前記ＧＲ発現プラスミドｐＵｄｐ６ＧＲを、制限酵素ＥｃｏＲＶで処理し、直鎖状とした。前記直鎖状の前記ＧＲ発現プラスミドｐＵｄｐ６ＧＲを、以下に示すように、酢酸リチウム法により、宿主となる酵母へ導入し、さらに、染色体上への組込みを行った。宿主として、前記（１）で作製したＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、ＰＤＲ５遺伝子およびＣＷＰ１遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株を使用した。
【０２３４】
まず、前記ＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、ＰＤＲ５遺伝子およびＣＷＰ１遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株を、ＹＰＤ培地中で、ＯＤ６６０が１〜２になるまで、３０℃で培養した。培養した菌体を、ソリューションＡで洗浄した後、ＯＤ６６０が１５０となるように、前記ソリューションＡに再懸濁した。前記ソリューションＡの組成は、０．１ｍｏｌ／Ｌ  Ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡとした（いずれも最終濃度）。菌体の懸濁液を、１．５ｍＬマイクロチューブに１００μＬずつ分注して、３０℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、前記チューブに、前記直鎖状のプラスミドｐＵｄｐ６ＧＲ  ５μｇ、キャリアーＤＮＡ（商品名ＳＡＬＭＯＮ  ＴＥＳＴＥＳ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＳＩＧＭＡ社製）１５０μｇを合計２０μＬ添加し、さらに、ソリューションＢ  ８５０μＬを添加し、緩やかに混合した。前記ソリューションＢは、ソリューションＡ１００ｍＬにポリエチレングリコール４０００を混合したものを使用した。
【０２３５】
つぎに、前記混合液を、３０℃で３０分インキュベートし、４２℃で１５分熱処理した後、さらに、１０分室温に放置した。そして、５０００ｒｐｍ、１分間の遠心分離により、前記酵母を集菌した。前記酵母を、５〜１０ｍＬのＹＰＤ培地に懸濁し、３０℃で一晩培養した。培養後、前記酵母を集菌し、洗浄した後、０．９％ＮａＣｌ溶液に懸濁し、懸濁液１００μＬを、ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ（０．５ｇ／ｍＬ）を含むＹＰＤ選択プレートに塗布し、培養した。そして、ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ耐性株を、ｇａｌ１プロモーターおよびＧＲ遺伝子のｃＤＮＡ領域が、染色体上に組込まれた形質転換酵母として選択した。
【０２３６】
つづいて、前記形質転換酵母に、前記動物転写共役因子発現プラスミドｐＥＳＣ−Ｌｅｕ−ｈＳＲＣ１を導入した。この際、形質転換酵母の選択培地は、以下に示す前培養培地１にトリプトファンを１００ｍｇ添加した、トリプトファン添加前培養培地を使用した。下記組成において、ドロップアウトパウダーおよび窒素源は、前記表２と同様とした。
【０２３７】
【表９】
2012070730.tif 000011
【０２３８】
つぎに、前記形質転換酵母に、酢酸リチウム法により、前記ＧＲレポータープラスミドを導入した。この際、形質転換酵母の選択培地は、トリプトファン無添加の前記前培養培地を使用した。このようにして、ＣＷＰ１遺伝子、またはＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子を欠失し、レポーター遺伝子を前記ＧＲレポータープラスミドにより保持し、且つＳＲＣ１遺伝子を前記プラスミドｐＥＳＣ−Ｌｅｕ−ｈＳＲＣ１として保持し、ゲノムにヒトＧＲ遺伝子を有する、形質転換酵母株を作製した。以下、ＰＤＲ５遺伝子を欠失する前記形質転換酵母株を、ＰＤＲ５Δ株、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ遺伝子を欠失する前記形質転換酵母株を、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株という。
【０２３９】
〔実施例２〕
本実施例では、前記実施例１で作製した形質転換酵母を用いて、ＧＲに対するリガンドの分析を行った。比較例は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  Ｗ  ３０３ａ株を使用した。
【０２４０】
（１）形質転換酵母の前培養
前記形質転換酵母を、以下に示す前培養培地２を用いて、３０℃で１８時間、前培養を行った。その結果、濁度が、Ａｂｓ５９５ｎｍ＝１．０程度となり、前記形質転換酵母の増殖が確認された。下記組成において、ドロップアウトパウダーおよび窒素源は、前記表２と同様とした。
【０２４１】
【表１０】
2012070730.tif 000012
【０２４２】
（２）形質転換酵母の本培養
９６穴プレートを用い、１ウェルあたり、リガンド溶液１μＬ、前培養した菌体液（Ｏ．Ｄ．＝１〜１．５）５μＬおよび本培養培地１００μＬを混合し、３０℃で１８時間、静置培養を行った。前記リガンド溶液は、デキサメサゾン、コルチコステロンまたはヒドロコルチゾンを、所定の濃度となるように、ＤＭＳＯに溶解して調製した。下記本培養培地のドロップアウドパウダーは、トリプトファンおよびロイシンを未添加とした。下記組成において、ドロップアウトパウダーおよび窒素源は、前記表２と同様とした。
【０２４３】
【表１１】
2012070730.tif 000013
【０２４４】
（３）β−ガラクトシダーゼ活性の測定
前記本培養の後、各ウェルから培養液を５μＬずつ採取し、新たな９６穴プレートの各ウェルに移した。前記各ウェルに、以下の測定試薬  １００μＬを加えた後、３７℃で３０分間反応させた。反応後、マイクロプレートリーダーを用いて、前記反応液のβ−ガラクトシダーゼ活性および菌体量を測定した。前記β−ガラクトシダーゼ活性は、生成したｏ−ニトロフェノールの生成量から算出するため、４０５ｎｍにおける前記反応液の吸光度を測定した。また、前記菌体量は、５９５ｎｍにおける前記反応液の吸光度を測定した。各反応液について、４０５ｎｍの吸光度と５９５ｎｍの吸光度の比（Ａｂｓ．４０５ｎｍ／Ａｂｓ．５９５ｎｍ）を算出した。そして、分析結果は、リガンド無添加の反応液、すなわち、前記リガンド溶液に代えてＤＭＳＯ  １μＬを添加した反応液の比を「１」として、各反応液について誘導率で表わした。
【０２４５】
【表１２】
2012070730.tif 000014
【０２４６】
これらの結果を、下記表１３、表１４および図１に示す。図１において、（Ａ）は、デキサメサゾンに対する結果を示すグラフであり、（Ｂ）が、コルチコステロンに対する結果を示すグラフであり、（Ｃ）が、ヒドロコルチゾンに対する結果を示すグラフである。前記各グラフにおいて、横軸は、各リガンド濃度（ｌｏｇ  ｍｏｌ／Ｌ）であり、具体的には、０、１．００Ｅ−０７、５×１Ｅ−０７、１．００Ｅ−０６、３．３×１．００Ｅ−０６、６．６×１．００Ｅ−０６、１．００Ｅ−０５におけるプロットであり、縦軸は、前記誘導率である。前記各グラフにおいて、黒三角のプロットが、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株の結果であり、黒四角のプロットが、ＰＤＲ５Δ株の結果であり、黒菱形のプロットが、野生株の結果である。
【０２４７】
【表１３】
2012070730.tif 000015
【０２４８】
【表１４】
2012070730.tif 000016
【０２４９】
前記表１３、表１４および図１に示すように、野生株は、検出可能なデキサメタゾン濃度が１μｍｏｌ／Ｌ以上であった。これに対して、ＰＤＲ５Δ株およびＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株は、デキメサゾン濃度３００ｎｍｏｌ／Ｌでβ−ガラクトシダーゼの誘導が確認できた。この結果から、本発明の形質転換酵母によれば、低いリガンド濃度であっても、十分に優れた感度を得られるといえる。また、ＰＤＲ５Δ株およびＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株は、所定のデキメサゾン濃度に対して、野生株よりも高い誘導率を示した。具体例として、前記表１４に示すように、ＰＤＲ５Δ株およびＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株は、それぞれ、所定濃度において、野生株の１．５倍または２．２倍の誘導率を示した。特に、ＰＤＲ５遺伝子およびＣＷＰ１遺伝子の両方を欠失したＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株は、ＰＤＲ５Δ株よりも、誘導率をさらに１．５倍向上できた。これらの結果から、本発明の形質転換酵母によれば、所定のリガンド濃度に対して、野生株よりも、さらに優れた応答性を示すといえる。また、前記表１３に示すように、ＥＣ５０は、野生株が、８．３μｍｏｌ／Ｌであったのに対して、ＰＤＲ５Δ株およびＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株が、５００ｎｍｏｌ／Ｌであり、１／１６に低減された。
【０２５０】
前記表１３、表１４および図１に示すように、ＰＤＲ５Δ株およびＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株は、コルチコステロン濃度に対して、野生株よりも高い誘導率を示した。具体例として、前記表１４に示すように、ＰＤＲ５Δ株およびＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株は、それぞれ、所定のコルチコステロン濃度において、野生株の１．３倍または１．５倍の誘導率を示した。特に、ＰＤＲ５遺伝子およびＣＷＰ１遺伝子の両方を欠失したＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株は、ＰＤＲ５Δ株よりも、誘導率をさらに１．２倍向上できた。これらの結果から、本発明の形質転換酵母によれば、所定のリガンド濃度に対して、野生株よりも、さらに優れた応答性を示すといえる。また、前記表１３に示すように、ＥＣ５０は、野生株が、１μｍｏｌ／Ｌであったのに対して、ＰＤＲ５Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株が、５００ｎｍｏｌ／Ｌであり、１／２に低減された。
【０２５１】
前記表１３、表１４および図１に示すように、野生株は、検出可能なヒドロコルチゾン濃度が１μｍｏｌ／Ｌ以上であった。これに対して、ＰＤＲ５Δ株およびＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株は、ヒドロコルチゾン濃度６００ｎｍｏｌ／Ｌでβ−ガラクトシダーゼの誘導が確認できた。この結果から、本発明の形質転換酵母によれば、低いリガンド濃度であっても、十分に優れた感度を得られるといえる。また、ＰＤＲ５Δ株およびＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株は、所定のヒドロコルチゾン濃度に対して、野生株よりも高い誘導率を示した。具体例として、前記表１４に示すように、ＰＤＲ５Δ株およびＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株は、それぞれ、所定濃度において、野生株の２．３倍または２．５倍の誘導率を示した。特に、ＰＤＲ５遺伝子およびＣＷＰ１遺伝子の両方を欠失したＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株は、ＰＤＲ５Δ株よりも、誘導率をさらに１．１倍向上できた。これらの結果から、本発明の形質転換酵母によれば、所定のリガンド濃度に対して、野生株よりも、さらに優れた応答性を示すといえる。また、前記表１３に示すように、ＥＣ５０は、野生株が、１０μｍｏｌ／Ｌであったのに対して、ＰＤＲ５Δ株およびＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株が、１．５μｍｏｌ／Ｌであり、１／７に低減された。
【０２５２】
このように、ＰＤＲ５遺伝子および／またはＣＷＰ１遺伝子を欠失させることによって、前記形質転換酵母は、ＧＲのリガンドに対して、検出感度および／または検出応答性が改善された。このため、本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体に対するリガンドのアッセイに極めて有効といえる。
【０２５３】
〔実施例３〕
本実施例では、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子のいずれかを欠失させた二重欠失酵母を作製し、ヒトＡｈＲ遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を作製した。
【０２５４】
（１）遺伝子欠失酵母の作製
前記実施例１で作製した、前記ＣＷＰ１遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、前記ＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、ならびに、ＰＤＲ５遺伝子およびＣＷＰ１遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株を使用した。
【０２５５】
また、以下のようにして、ＣＷＰ２遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株を作製した。特に示さない限りは、前記実施例１における（１）遺伝子欠失酵母の作製と同様に行った。
【０２５６】
前記実施例１のプラスミドｐＵＧ６を鋳型として、下記プライマーＳＨ００９およびＳＨ０１０を用いて、ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰ領域を、ＰＣＲにより増幅した。具体的には、ＣＷＰ２遺伝子の近傍配列が付加されたｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰ（以下、ＣＷＰ２近傍配列付加ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰという）を増幅した。前記各プライマーは、それぞれ、ＣＷＰ２遺伝子の近傍配列を含む配列とした。下記配列において、大文字の領域は、ＣＷＰ２の近傍配列の相補配列であり、小文字の領域は、ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰの相補配列である。
【０２５７】
（ＣＷＰ２近傍配列付加ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰ用プライマー）
ＳＨ００９（配列番号２７）
５’−CAAGAATAAATAACTTCATCACATTCGCTACACACTAACAAcagctgaagcttcgtacgc−３’
ＳＨ０１０（配列番号２８）
５’−TACCTAGTAAAACCGAAAATTTTGAAAAAAGCCATATAGcataggccactagtggatctg−３’
【０２５８】
そして、ＰＣＲ後、増幅したＣＷＰ２近傍配列付加ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰを、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３ａ株に、酢酸リチウム法にて導入した。この際、形質転換酵母の選択培地は、ＹＰＤ培地に、２００μｇ／ｍＬとなるようにＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を添加した、Ｇ４１８含有ＹＰＤ培地を使用した。
【０２５９】
ここで、前記配列の導入により、前記形質転換酵母が、ＣＷＰ２遺伝子を欠失しているかを確認した。前記遺伝子の欠失の確認は、前記形質転換酵母のＤＮＡを鋳型として、下記プライマーを用いて、ＰＣＲにより行った。下記プライマーを用いたＰＣＲによって、増幅が確認された場合は、ＣＷＰ２遺伝子を欠失していると判断した。
【０２６０】
（５’ＣＷＰ２欠失の検証用プライマー）
ＳＨ０１１（配列番号２９）
５’−gctccgaagggcaattccaca−３’
ＳＨ０１８（配列番号１４）
５’−ctgcgcacgtcaagactg−３’
（３’ＣＷＰ２欠失の検証用プライマー）
ＳＨ０１７（配列番号１５）
５’−cctcgacatcatctgccc−３’
ＳＨ０１２（配列番号３０）
５’−cccaccgtagcacaccaatatc−３’
【０２６１】
ここで、Ｃｒｅ遺伝子によってＧ４１８耐性遺伝子が切り出され、最終的に、ＣＷＰ２遺伝子のＯＲＦが、ｌｏｘＰ配列に置換されたことを確認した。この確認は、前記Ｇ４１８感受性のコロニーのＤＮＡを鋳型とし、前記プライマーＳＨ０１１（配列番号２９）、ＳＨ０１２（配列番号３０）を用いて、ＰＣＲにより行った。前記ＰＣＲは、前記ＰＣＲ反応液２を使用し、前記ＰＣＲ条件２で行った。前記プライマーを用いたＰＣＲによって、増幅が確認された場合は、ＣＷＰ２遺伝子を欠失していると判断した。
【０２６２】
以上のようにして、ＣＷＰ２遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株を得た。そして、最終的に、プラスミドｐＳＨ４７が脱落して、再びウラシル要求性となった一重欠失株を、遺伝子欠失酵母株として、以下の実験に用いた。
【０２６３】
さらに、前記ＣＷＰ１遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株または前記ＣＷＰ２遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株から、前述と同様の操作により、二重欠失株として、前記ＣＷＰ１遺伝子および前記ＣＷＰ２遺伝子の両方を欠失する遺伝子欠失酵母を作製した。すなわち、前記ＣＷＰ１遺伝子の欠失株に対しては、さらに、前述と同様に、ＣＷＰ２遺伝子欠失の操作を行い、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子を欠失する遺伝子欠失株を得た。また、前記ＣＷＰ２遺伝子欠失株に対しては、さらに、前述と同様に、ＣＷＰ１遺伝子欠失の操作を行い、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子を欠失する遺伝子欠失株を得た。そして、最終的に、プラスミドｐＳＨ４７が脱落して、再びウラシル要求性となった二重欠失株を、遺伝子欠失酵母株として、以下の実験に用いた。
【０２６４】
（２）レポータープラスミドの作製
Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．  ；  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０，  ５６８−５７３  （１９９６）に準じて、ｐＲＷ９５−３を作製した。前記プラスミドｐＲＷ９５−３は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するプラスミドである。
【０２６５】
ＡｈＲに応答する配列として、ＸＲＥ配列を使用した。前記ＸＲＥ配列を含む下記オリゴＤＮＡ（配列番号３１）およびそれに相補なオリゴＤＮＡ（配列番号３２）を作製した。これらのオリゴＤＮＡをアニーリングした。アニーリングは、９４℃で１分間を１サイクルで実施した。アニーリング後、ＸＲＥ配列が連続して５個アニーリングしたものを精製して、ｐＲＷ９５−３のＢａｍＨＩ／ＸｍａＩ部位にサイトに挿入し、レポータープラスミドを作製した。ＸＲＥ配列が連続して５個挿入されたプラスミドを、ＡｈＲレポータープラスミドとした。
（ＸＲＥ配列）
ＸＲＥｆＢｍ（配列番号３１）
５’-atccttgcgtgaca-３’
ＸＲＥｒ（配列番号３２）
５’-ggattgtcacgcaa-３’
【０２６６】
（３）動物核内受容体発現プラスミドの作製
ＡｈＲ遺伝子またはＡｒｎｔ遺伝子のｃＤＮＡのＯＲＦを、ヒト精巣ｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型として、下記プライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、前記ＰＣＲ反応液３を用いて、前記ＰＣＲ条件３により行った。
【０２６７】
（ＡｈＲ用プライマー）
ＡｈＲｆＢｓｉＷＩ（配列番号３３）
５’−tcgacgtacgatgaacagcagcagcgccaacatc−３’
ＡｈＲｒＢｓｉＷＩ（配列番号３４）
５’−attccgtacgttacaggaatccactggatgtcaa−３’
（Ａｒｎｔ用プライマー）
ＡｒｎｔｆＸｂａＩ（配列番号３５）
５’−tcgatctagaatggcggcgactactgccaacccc−３’
ＡｒｎｔｒＳｓｅ８３８７Ｉ（配列番号３６）
５’−attccctgcaggctattctgaaaaggggggaaacat−３’
【０２６８】
つぎに、増幅させたＡｈＲ遺伝子のｃＤＮＡを、制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した。切断した前記ｃＤＮＡを、制限酵素ＢｓｉＷＩ切断した前記プラスミドＹＥｐＬａｃＧａｌ１、１０に挿入した。一方、増幅させたＡｒｎｔ遺伝子のｃＤＮＡを、制限酵素ＸｂａＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉで切断した。そして、ＡｈＲ遺伝子のｃＤＮＡを挿入した前記プラスミドＹＥｐＬａｃＧａｌ１、１０に、さらに、Ａｒｎｔ遺伝子のｃＤＮＡを挿入した。具体的には、切断したＡｒｎｔ遺伝子の前記ｃＤＮＡを、制限酵素ＸｂａＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉで切断した前記プラスミドＹＥｐＬａｃＧａｌ１、１０に挿入した。前記プラスミドＹＥｐＬａｃＧａｌ１、１０は、両方向プロモーター領域ｇａｌ１、ｇａｌ１０を持つプラスミドである。前記切断したＡｈＲ遺伝子のｃＤＮＡは、前記プラスミドＹＥｐＬａｃＧａｌ１、１０において、Ｇａｌ１プロモーターの下流に挿入し、前記切断したＡｒｎｔ遺伝子のｃＤＮＡは、前記プラスミドＹＥｐＬａｃＧａｌ１、１０において、Ｇａｌ１０プロモーターの下流に挿入した。これによって、前記核内受容体遺伝子を有し、その上流にプロモーターを有するプラスミドＹＥｐＬａｃＡｈＲ／Ａｒｎｔを得た。クローニングには、大腸菌ＨＢ１０１株を使用した。
【０２６９】
前記プラスミドＹＥｐＬａｃＡｈＲ／Ａｒｎｔから、ｇａｌ１プロモーター領域、ｇａｌ１０プロモーター領域および前記ｃＤＮＡを含むＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＳａｃＩおよびＳａｌＩで切り出し、プラスミドｐＡＵＲ１０１のＳａｃＩサイトおよびＳａｌＩサイトの間に挿入した。得られたプラスミドを、ＡｈＲ発現プラスミドｐＡＵＲ１０１ＡｈＲ／Ａｒｎｔとした。
【０２７０】
（４）形質転換酵母の作製
前記遺伝子欠失酵母、前記ＡｈＲレポータープラスミド、前記ＡｈＲ発現プラスミドを使用し、前記動物転写共役因子発現プラスミドを使用しなかった以外は、前記実施例１と同様にして形質転換酵母を作製した。以下、ＣＷＰ１遺伝子を欠失する前記形質転換酵母株を、ＣＷＰ１Δ株、ＣＷＰ２遺伝子を欠失する前記形質転換酵母株を、ＣＷＰ２Δ株、ＰＤＲ５遺伝子を欠失する前記形質転換酵母株を、ＰＤＲ５Δ株、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子を欠失する前記形質転換酵母株を、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子を欠失する前記形質転換酵母株を、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株という。
【０２７１】
〔実施例４〕
本実施例では、前記実施例３で作製した形質転換酵母を用いて、ＡｈＲに対するリガンドの分析を行った。比較例は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  Ｗ  ３０３ａ株を使用した。
【０２７２】
本実施例では、β−ＮＦを、所定の濃度となるように、ＤＭＳＯに溶解して調製したリガンド溶液を使用した以外は、前記実施例２と同様にして、誘導率を求めた。
【０２７３】
これらの結果を、下記表１５、表１６および図２に示す。図２は、β−ＮＦに対する結果を示すグラフである。前記グラフにおいて、横軸は、各リガンド濃度（μｍｏｌ／Ｌ）であり、具体的には、０、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００μｍｏｌ／Ｌにおけるプロットであり、縦軸は、前記誘導率である。前記グラフにおいて、黒三角のプロットが、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株の結果であり、黒逆三角のプロットが、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株の結果であり、黒丸のプロットが、ＣＷＰ１Δ株の結果であり、黒四角のプロットが、ＰＤＲ５Δ株の結果であり、白丸のプロットが、ＣＷＰ２Δ株の結果であり、黒菱形のプロットが、野生株の結果である。
【０２７４】
【表１５】
2012070730.tif 000017
【０２７５】
【表１６】
2012070730.tif 000018
【０２７６】
前記表１５、表１６および図２に示すように、野生株は、検出可能なβ−ＮＦ濃度が１００ｎｍｏｌ／Ｌ以上であった。これに対して、全ての変異株について、β−ＮＦ濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌでβ−ガラクトシダーゼの誘導が確認できた。この結果から、本発明の形質転換酵母によれば、低いリガンド濃度であっても、十分に優れた感度を得ることができる。また、全ての変異株が、検出可能なリガンド濃度において、野生株よりも高い誘導率を示した。具体例として、前記表１６に示すように、ＰＤＲ５Δ株およびＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株は、それぞれ、野生株の５．３倍または３．５倍の最大誘導率を示した。これらの結果から、本発明の形質転換酵母によれば、所定のリガンド濃度に対して、野生株よりも、さらに優れた応答性を示すといえる。また、前記表１５に示すように、ＥＣ５０は、野生株が、５００ｎｍｏｌ／Ｌであったのに対して、ＣＷＰ１Δが、９０ｎｍｏｌ／Ｌ、ＣＷＰ２Δが、１５０ｎｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ５Δ株が、１５０ｎｍｏｌ／Ｌ、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δが、１５ｎｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株では６０ｎｍｏｌ／Ｌであり、１／３から１／３０に低減された。
【０２７７】
このように、ＰＤＲ５遺伝子、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子の少なくともいずれかを欠失させることによって、前記形質転換酵母は、ＡｈＲのリガンドに対して、検出感度および／または検出応答性が改善された。このため、本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体に対するリガンドのアッセイに極めて有効といえる。
【０２７８】
以下の方法により、形質転換酵母を作製し、リガンド分析を行った。
【０２７９】
（Ａ）遺伝子欠失酵母の作製
下記の方法により、各１遺伝子欠失酵母、各２遺伝子欠失酵母および各３遺伝子欠失酵母を作製した。
【０２８０】
（１）１遺伝子欠失酵母の作製
（１−１）ＣＷＰ１遺伝子
実施例１と同様の方法で、ＣＷＰ１遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母を作製した。
【０２８１】
（１−２）ＰＤＲ５遺伝子
実施例１と同様の方法で、ＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母を作製した。
【０２８２】
（１−３）ＣＷＰ２遺伝子
実施例３と同様の方法で、ＣＷＰ２遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母を作製した。
【０２８３】
（１−４）ＰＤＲ１０遺伝子
下記のようにして、ＰＤＲ１０遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母を作製した。特に示さない限りは、前記実施例１における（１）遺伝子欠失酵母の作製と同様に行った。
【０２８４】
前記実施例１のプラスミドｐＵＧ６を鋳型として、下記プライマーＳＨ０４９およびＳＨ０５０を用いて、ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰ領域を、ＰＣＲにより増幅した。具体的には、ＰＤＲ１０遺伝子の近傍配列が付加されたｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰ（以下、ＰＤＲ１０近傍配列付加ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰという）を増幅した。前記各プライマーは、ＰＤＲ１０遺伝子の近傍配列を含む配列とした。下記配列において、大文字の領域は、ＰＤＲ１０遺伝子の近傍配列の相補配列であり、小文字の領域は、ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰの相補配列である。
【０２８５】
（ＰＤＲ１０近傍配列付加ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰ用プライマー）
ＳＨ０４９（配列番号４２）
５’−AAAAATCAAACAATAATTTCTGGTCTTACATAGTTGTTAGGcagctgaagcttcgtacgc−３’
ＳＨ０５０（配列番号４３）
５’−ATTTCTTTAATTTTTTGCTTTTCTTTGGAACCCGCACCAcataggccactagtggatctg−３’
【０２８６】
そして、ＰＣＲ後、増幅したＰＤＲ１０近傍配列付加ｌｏｘＰ−ＫａｎＭＸ−ｌｏｘＰを、以下のように、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３ａ株に、酢酸リチウム法にて導入した。この際、形質転換酵母の選択培地は、ＹＰＤ培地に、２００μｇ／ｍＬとなるようにＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を添加した、Ｇ４１８含有ＹＰＤ培地を使用した。
【０２８７】
ここで、前記配列の導入により、前記形質転換酵母が、ＰＤＲ１０遺伝子を欠失しているかを確認した。前記遺伝子の欠失の確認は、前記形質転換酵母のＤＮＡを鋳型として、下記プライマーを用いて、ＰＣＲにより行った。下記プライマーを用いたＰＣＲによって、増幅が確認された場合は、ＰＤＲ１０遺伝子を欠失していると判断した。
【０２８８】
（５’ＰＤＲ１０欠失の検証用プライマー）
ＳＨ０５１（配列番号４４）
５’−cgcgctataatgccaaaatccg−３’
ＳＨ０１８（配列番号１４）
５’−ctgcgcacgtcaagactg−３’
（３’ＰＤＲ１０欠失の検証用プライマー）
ＳＨ０１７（配列番号１５）
５’−cctcgacatcatctgccc−３’
ＳＨ０５２（配列番号４５）
５’−catcagacgtatattcagcagc−３’
【０２８９】
つづいて、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （１９９６）  ２４、２５１９−２５２４に準じて、プラスミドｐＳＨ４７を作製した。前記プラスミドｐＳＨ４７は、部位特異的組換え酵素Ｃｒｅ遺伝子およびウラシル選択マーカーＵＲＡ３遺伝子を有し、これらの遺伝子が、Ｇａｌ１−１０プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーターで制御されたプラスミドである。前記プラスミドｐＳＨ４７を、前記形質転換酵母に、酢酸リチウム法によって導入した。この際、形質転換酵母の選択培地は、ウラシル無添加のグルコース培地を使用した。前記ウラシル無添加グルコース培地は、前記表２の培地組成において、炭素源としてグルコースを含み、前記ドロップアウトパウダーとして、前記表６の組成のドロップアウトパウダーを添加した。
【０２９０】
得られたウラシル非要求性の形質転換酵母を、ウラシル無添加のグルコース液体培地を用いて、３０℃で一晩、前培養を行った。前培養した前記形質転換酵母を遠心分離によって集菌した後、滅菌水で２回洗浄した。培地を、ウラシル無添加のガラクトース液体培地に代え、前記洗浄後の前記形質転換酵母を、３０℃で４時間培養した。培養後、適宜希釈した菌液を、ＹＰＤ寒天培地上に播種した。そして、コロニー形成後、レプリカ法によって、Ｇ４１８感受性となったコロニーを選抜した。前記ウラシル無添加ガラクトース培地は、前記表２の培地組成において、炭素源としてガラクトースを含み、前記ドロップアウトパウダーとして、前記表６の組成のドロップアウトパウダーを添加した。
【０２９１】
ここで、Ｃｒｅ遺伝子によってＧ４１８耐性遺伝子が切り出され、最終的に、ＰＤＲ１０遺伝子のＯＲＦが、ｌｏｘＰ配列に置換されたことを確認した。この確認は、前記Ｇ４１８感受性のコロニーのＤＮＡを鋳型とし、前記プライマーＳＨ０５１（配列番号４４）およびＳＨ０５２（配列番号４５）を用いて、ＰＣＲにより行った。前記ＰＣＲは、前記ＰＣＲ反応液２を使用し、前記ＰＣＲ条件２で行った。前記プライマーを用いたＰＣＲによって、増幅が確認された場合は、ＰＤＲ１０遺伝子を欠失していると判断した。
【０２９２】
以上のようにして、一重欠失株として、ＰＤＲ１０遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株を得た。そして、最終的に、プラスミドｐＳＨ４７が脱落して、再びウラシル要求性となった株を、遺伝子欠失酵母株とした。
【０２９３】
（２）２遺伝子欠失酵母の作製
（２−１）ＰＤＲ５遺伝子およびＣＷＰ１遺伝子
実施例１と同様の方法で、ＰＤＲ５遺伝子およびＣＷＰ１遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母を作製した。
【０２９４】
（２−２）ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子
実施例３と同様の方法で、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母を作製した。
【０２９５】
（２−３）ＰＤＲ５遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子
下記のようにして、ＰＤＲ５遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株を作製した。特に示さない限りは、前記実施例１および前記実施例３における（１）遺伝子欠失酵母の作製と同様に行った（以下、同様）。
【０２９６】
前記ＣＷＰ２遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株または前記ＰＤＲ５遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株から、前述と同様の操作により、二重欠失株として、前記ＰＤＲ５遺伝子および前記ＣＷＰ２遺伝子の両方を欠失する遺伝子欠失酵母を作製した。すなわち、前記ＰＤＲ５遺伝子の欠失株に対しては、さらに、前述と同様に、ＣＷＰ２遺伝子欠失の操作を行い、ＰＤＲ５遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子を欠失する遺伝子欠失株を得た。また、前記ＣＷＰ２遺伝子欠失株に対しては、さらに、前述と同様に、ＰＤＲ５遺伝子欠失の操作を行い、ＰＤＲ５遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子を欠失する遺伝子欠失株を得た。そして、最終的に、プラスミドｐＳＨ４７が脱落して、再びウラシル要求性となった株を、遺伝子欠失酵母株とした。
【０２９７】
（２−４）ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子
前記ＣＷＰ１遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、または前記ＰＤＲ１０遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株から、前述と同様の操作により、二重欠失株として、前記ＣＷＰ１遺伝子および前記ＰＤＲ１０遺伝子の両方を欠失する遺伝子欠失酵母を作製した。すなわち、前記ＣＷＰ１遺伝子の欠失株に対しては、さらに、前述と同様に、ＰＤＲ１０遺伝子欠失の操作を行い、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子を欠失する遺伝子欠失株を得た。また、前記ＰＤＲ１０遺伝子欠失株に対しては、さらに、前述と同様に、ＣＷＰ１遺伝子欠失の操作を行い、ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子を欠失する遺伝子欠失株を得た。そして、最終的に、プラスミドｐＳＨ４７が脱落して、再びウラシル要求性となった株を、遺伝子欠失酵母株とした。
【０２９８】
（２−５）ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子
前記ＰＤＲ５遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、または前記ＰＤＲ１０遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株から、前述と同様の操作により、二重欠失株として、前記ＰＤＲ５遺伝子および前記ＰＤＲ１０遺伝子の両方を欠失する遺伝子欠失酵母を作製した。すなわち、前記ＰＤＲ５遺伝子の欠失株に対しては、さらに、前述と同様に、ＰＤＲ１０遺伝子欠失の操作を行い、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子を欠失する遺伝子欠失株を得た。また、前記ＰＤＲ１０遺伝子欠失株に対しては、さらに、前述と同様に、ＰＤＲ５遺伝子欠失の操作を行い、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子を欠失する遺伝子欠失株を得た。そして、最終的に、プラスミドｐＳＨ４７が脱落して、再びウラシル要求性となった株を、遺伝子欠失酵母株とした。
【０２９９】
（３）３遺伝子欠失酵母の作製
（３−１）ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子
前記ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、または前記ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、または前記ＣＷＰ２遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株から、前述と同様の操作により、三重重欠株として、前記ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子すべてを欠失する遺伝子欠失酵母を作製した。すなわち、前記ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子の欠失株に対しては、さらに、前述と同様に、ＰＤＲ５遺伝子欠失の操作を行い、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失株を得た。また、前記ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子欠失株に対しては、さらに、前述と同様に、ＣＷＰ２遺伝子欠失の操作を行い、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失株を得た。また、前記ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子欠失株に対しては、さらに、前述と同様に、ＣＷＰ１遺伝子欠失の操作を行い、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失株を得た。そして、最終的に、プラスミドｐＳＨ４７が脱落して、再びウラシル要求性となった株を、遺伝子欠失酵母株とした。
【０３００】
（３−２）ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子
前記ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、前記ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ１０遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、または前記ＰＤＲ５遺伝子、ＰＤＲ１０遺伝子およびＧ４１８耐性遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株から、前述と同様の操作により、三重重欠株として、前記ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子すべてを欠失する遺伝子欠失酵母を作製した。すなわち、前記ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子の欠失株に対しては、さらに、前述と同様に、ＰＤＲ１０遺伝子欠失の操作を行い、ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子を欠失する遺伝子欠失株を得た。また、前記ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子欠失株に対しては、さらに、前述と同様に、ＰＤＲ５遺伝子欠失の操作を行い、ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子を欠失する遺伝子欠失株を得た。また、前記ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子欠失株に対しては、さらに、前述と同様に、ＣＷＰ１遺伝子欠失の操作を行い、ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子を欠失する遺伝子欠失株を得た。そして、最終的に、プラスミドｐＳＨ４７が脱落して、再びウラシル要求性となった株を、遺伝子欠失酵母株とした。
【０３０１】
（Ｂ）レポータープラスミドの作製
Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．  ；  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０，  ５６８−５７３  （１９９６）に準じて、ｐＲＷ９５−３を作製した。前記プラスミドｐＲＷ９５−３は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するプラスミドである。
【０３０２】
核内受容体に応答する配列（応答配列）を含むオリゴＤＮＡおよびそれに相補的なオリゴＤＮＡを作製した。アニーリングは、９４℃で１分間を１サイクルで実施した。アニーリング後、前記応答配列が連続して複数個アニーリングしたものを精製して、ｐＲＷ９５−３の所定の制限酵素サイトに挿入した。前記応答配列が連続して複数個挿入されたプラスミドを、核内受容体レポータープラスミドとした。各応答配列についてのオリゴＤＮＡおよびそれに相補的なオリゴＤＮＡは、下記のとおりである。なお、応答配列である前記「ＧＲＥ配列」を含むオリゴヌクレオチドＤＮＡおよびそれに相補的なオリゴＤＮＡは、前記実施例１と同様のものを使用した。また、応答配列である前記「ＸＲＥ配列」を含むオリゴヌクレオチドＤＮＡおよびそれに相補的なオリゴＤＮＡは、前記実施例３と同様のものを使用した。
【０３０３】
（ＥＲＥ配列）
ＥＲＥ−Ｂｍｇ２（配列番号４６）
５’−gatcccaggtcaacatgacctagaa−３’
ＥＲＥ−Ｂｇｍ２（配列番号４７）
５’−gatcttctaggtcatgttgacctgg−３’
（ＩＲ−０配列）
ＩＲ０ＸｂａＦ  （配列番号４８）
５’−ctagatctcaggtcatgacctttcatcca−３’
ＩＲ０ＳｐｅＲ  （配列番号４９）
５’−ctagtggatgaaaggtcatgacctgagat−３’
（ＤＲ−３配列）
ＤＲ−３  Ｘｂ（配列番号５０）
５’−ctagaaacagttcataaagttcatctg−３’
ＤＲ−３  Ｎｈ（配列番号５１）
５’−ctagcagatgaactttatgaactgttt−３’
【０３０４】
（Ｃ）動物核内受容体発現プラスミドの作製
核内受容体遺伝子のｃＤＮＡのＯＲＦを、ヒトｃＤＮＡを鋳型として、下記プライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、前記ＰＣＲ反応液３を用いて、前記ＰＣＲ条件３により行った。なお、ＡｈＲ遺伝子については、ＡｈＲ遺伝子またはＡｒｎｔ遺伝子のｃＤＮＡのＯＲＦを増幅し、ＰＸＲ−１遺伝子については、ＰＸＲ−１遺伝子またはＲＸＲα遺伝子のｃＤＮＡのＯＲＦを増幅した。また、ＧＲ遺伝子用のプライマーは、前記実施例１と同様のものを使用した。ＡｈＲ遺伝子またはＡｒｎｔ遺伝子用のプライマーは、前記実施例３と同様のものを使用した。
【０３０５】
（ＥＲα用プライマー）
ＥＲａＲｂＳＰｆ（配列番号５２）
５’−ccacactagtctaaaaacatgatgaccatgaccctccacac−３’
ＥＲａＳＬｒ    （配列番号５３）
５’−ggaagtcgactcagaccgtggcagggaaaccctc−３’
（ＥＲβ用プライマー）
ＥＲβｆＸｂ（配列番号５４）
５’−gcctcttctagaaaggtgttttctcagc−３’
ＥＲβｒＨｄ（配列番号５５）
５’−acgcttaagcttgtgacctctgtgggcc−３’
（ＴＲα用プライマー）
ＴＲａＲｂＳｐＦ（配列番号５６）
５’−gggcactagtaacaaaatggaacagaagccaagca−３’
ＴＲａＨｄＲ    （配列番号５７）
５’−ggccaagcttgctttagacttcctgatcctcaaag−３’
（ＴＲβ用プライマー）
ＴＲｂ１ｆｒｂＳｐ（配列番号５８）
５’−caggactagtaaactatgactcccaacagtatgac−３’
ＴＲｂ１ｒＨｄ    （配列番号５９）
５’−ttcgtgaagcttcagtctaatcctcgaacacttcc−３’
（ＰＸＲ−１用プライマー）
ＰＸＲｆＲｂＳｐ（配列番号６０）
５’−ttccaactagtaaaacatggaggtgagacccaaag−３’
ＰＸＲｒＨｄ    （配列番号６１）
５’−ccttcaagcttctcagctacctgtgatgccgaac−３’
（ＲＸＲα用プライマー）
ＲＸＲａＲｂＫｐｎＦ（配列番号６２）
５’−aaaggggtacctcaaaaatggacaccaaacatttcctgcc−３’
ＲＸＲａＥｃｒ      （配列番号６３）
５’−cttaagaattctaagtcatttggtgcggc−３’
（ＰＲ用プライマー）
ｈＰＲｆＢｇ（配列番号６４）
５’−gggcagatctacaaaatgactgagctgaaggcaaa−３’
ｈＰＲｒＸｈ（配列番号６５）
５’−caagacctcgagatcctgaccaaac−３’
（ＡＲ用プライマー）
ＡＲｆＲｂＢｍ（配列番号６６）
５’−tcgaggatccaacaaaatggaagtgcagttagggctggg−３’
ＡＲｒＸｈ    （配列番号６７）
５’−agggggctcgagctggggtggggaaatagg−３’
（ＭＲ用プライマー）
ｈＭＲｆＢｇ（配列番号６８）
５’−ccgagatctaacacaatggagaccaaaggctacca−３’
ｈＭＲｒＨｉ（配列番号６９）
５’−gaattcaaagggacacaacaaggtgttcgaattcc−３’
【０３０６】
つぎに、増幅させた核内受容体遺伝子のｃＤＮＡを、所望の制限酵素で切断した。切断した前記ｃＤＮＡを、所望の制限酵素で切断した下記プラスミドに挿入した。これによって、前記核内受容体遺伝子を有し、その上流にプロモーターを有する核内受容体発現プラスミドを得た。
【０３０７】
（プラスミドｐＵｄｐ５）
プラスミドｐＵｄｐ５は、両方向プロモーター領域ｇａｌ１、ｇａｌ１０およびｇａｌ１０の下流にＣＹＣターミネーターおよびウラシル選択マーカーＵＲＡ３遺伝子を持つプラスミドである。プラスミドｐＵｄｐ５の作製方法等については、例えば、特開２００９−２３２６９７号公報（特願２００８−７９８０３）の［００８０］〜［００８４］の記載を参照できる。
（プラスミドｐＵｄｐ６）
プラスミドｐＵｄｐ６は、両方向プロモーター領域ｇａｌ１、ｇａｌ１０およびｇａｌ１０の下流にＣＹＣターミネーター、ｇａｌ１の下流にＡＤＨターミネーターを持ち、さらにウラシル選択マーカーＵＲＡ３遺伝子を持つプラスミドである。プラスミドｐＵｄｐ６の作製方法等については、例えば、「Ｓｈｉｉｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２４，  ６３８−６４４  （２０１０）の記載を参照できる。
（プラスミドｐＵｄｐ８）
プラスミドｐＵｄｐ８は、両方向プロモーター領域ｇａｌ１、ｇａｌ１０およびｇａｌ１０の下流にＵＲＳ  ｍＲＮＡ不安定化配列、ＣＹＣターミネーターおよびウラシル選択マーカーＵＲＡ３遺伝子を持つプラスミドである。プラスミドｐＵｄｐ８の作製方法等については、例えば、特開２００９−２３２６９７号公報（特願２００８−７９８０３）の［００８０］〜［００８７］の記載を参照できる。
（プラスミドｐＵｒａ３）
プラスミドｐＵｒａ３は、両方向プロモーター領域ｇａｌ１、ｇａｌ１０およびウラシル選択マーカーＵＲＡ３遺伝子を持つプラスミドである。プラスミドｐＵｄｐ３の作製方法等については、例えば、特開２００９−２３２６９７号公報（特願２００８−７９８０３）の［００８０］の記載を参照できる。
【０３０８】
（Ｄ）動物転写共役因子発現プラスミドの作製
前記実施例１と同様にして、動物転写共役因子発現プラスミドｐＥＳＣ−Ｌｅｕ−ｈＳＲＣ１を作製した。
【０３０９】
（Ｅ）形質転換酵母の作製
前記核内受容体発現プラスミドを、制限酵素ＥｃｏＲＶ処理し、直鎖状とした。なお、ＥＲβ発現プラスミドの場合には、制限酵素ＮｃｏＩ処理し、直鎖状とした。前記遺伝子欠失酵母、前記レポータープラスミド、直鎖状の前記核内受容体発現プラスミドを使用し、前記実施例１と同様にして形質転換酵母を作製した。なお、ＡｈＲについては、前記動物転写共役因子発現プラスミドを導入しなかった。
【０３１０】
各遺伝子を欠失する前記形質転換酵母株を、以下のように示す。
（１遺伝子欠失株）
ＣＷＰ１遺伝子を欠失：ＣＷＰ１Δ株
ＣＷＰ２遺伝子を欠失：ＣＷＰ２Δ株
ＰＤＲ５遺伝子を欠失：ＰＤＲ５Δ株
ＰＤＲ１０遺伝子を欠失：ＰＤＲ１０Δ株
（２遺伝子欠失株）
ＰＤＲ５遺伝子およびＣＷＰ１遺伝子を欠失：ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株
ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子を欠失：ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株
ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子を欠失：ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株
ＣＷＰ１遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子を欠失：ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ１０Δ株
ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子を欠失：ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株
（３遺伝子欠失株）
ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子を欠失：
ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株
ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子を欠失：
ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株
【０３１１】
（Ｆ）リガンド分析
作製した形質転換酵母を用いて、前記核内受容体に対するリガンドの分析を行った。比較例は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  Ｗ３０３ａ株（野生株）を使用した。
【０３１２】
具体的には、前記リガンドを所定の濃度となるように、ＤＭＳＯに溶解して調製したリガンド溶液を使用した。さらに分析結果について、前記実施例２および前記実施例４で算出した誘導率に代えて、リガンド無添加の反応液、すなわち、前記リガンド溶液に代えてＤＭＳＯ  １μＬを添加した反応液の値を、リガンド添加の反応液の値をから差し引いた誘導増加量を求めた。これら以外は、前記実施例２および前記実施例４と同様とした。前記誘導増加量を、レポーター活性値ということがあり、前記誘導の増加を、レポーター活性ということがある（以下、同様）。
【０３１３】
〔実施例５〕
本実施例では、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子のいずれかを欠失させた欠失酵母を作製し、ヒトＥＲα遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を作製した。
【０３１４】
（１）遺伝子欠失酵母の作製
前記ＰＤＲ５遺伝子、前記ＣＷＰ１遺伝子、または前記ＣＷＰ２遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、前記ＰＤＲ５遺伝子および前記ＣＷＰ１遺伝子、前記ＣＷＰ１遺伝子および前記ＣＷＰ２遺伝子、または前記ＣＷＰ２遺伝子および前記ＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母を使用した。
【０３１５】
（２）レポータープラスミドの作製
前記ＥＲαに応答する配列であるＥＲＥ配列が連続して３個アニーリングしたものを精製して、ｐＲＷ９５−３のＢｇｌＩＩ部位に挿入した。ＥＲＥ配列が３個挿入されたプラスミドを、ＥＲαレポータープラスミドとした。
【０３１６】
（３）動物核内受容体発現プラスミドの作製
増幅させたＥＲα遺伝子のｃＤＮＡを、制限酵素ＳｐｅＩおよびＳａｌＩで切断した。切断した前記ｃＤＮＡを、制限酵素ＳｐｅＩおよびＳａｌＩ切断したプラスミドｐＵｄｐ５に挿入した。前記プラスミドｐＵｄｐ５において、切断した前記ｃＤＮＡは、前記Ｇａｌ１０プロモーターの下流に挿入した。これによって、前記核内受容体遺伝子を有し、その上流にプロモーターを有するＥＲα発現プラスミドｐＵｄｐ５ＥＲαを得た。
【０３１７】
（４）形質転換酵母の作製
前記遺伝子欠失酵母、ＥＲαレポータープラスミド、直鎖状の前記ＥＲα発現プラスミド、前記動物転写因子発現プラスミドを使用し、下記の７種類の形質転換酵母を作製した。
１遺伝子欠失株：ＣＷＰ１Δ株、ＣＷＰ２Δ株、ＰＤＲ５Δ株
２遺伝子欠失株：ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株、ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株
３遺伝子欠失株：ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株
【０３１８】
〔実施例６〕
本実施例では、前記実施例５で作製した形質転換酵母を使用し、前記リガンドとして、１７β−エストラジオールを使用し、誘導増加量を求めた。
【０３１９】
これらの結果を、下記表１７、表１８および図３に示す。図３は、１７β−エストラジオールに対する結果を示すグラフである。前記グラフにおいて、横軸は、各リガンド濃度（μｍｏｌ／Ｌ）であり、具体的には、０．０００００１、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、１０μｍｏｌ／Ｌにおけるプロットであり、縦軸は、リガンドにより誘導された誘導増加量（レポーター活性値）である。前記グラフにおいて、黒菱形のプロット（◆）が野生株の結果であり、黒四角のプロット（■）がＣＷＰ１Δ株の結果であり、黒三角のプロット（▲）がＣＷＰ２Δ株の結果であり、バツのプロット（×）がＰＤＲ５Δ株の結果であり、アスタリスクのプロット（＊）がＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株の結果であり、黒丸のプロット（●）がＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株の結果であり、縦線のプロット（｜）がＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株の結果であり、白三角のプロット（△）がＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株の結果である。
【０３２０】
【表１７】
2012070730.tif 000019
【０３２１】
【表１８】
2012070730.tif 000020
【０３２２】
前記表１７、表１８および図３に示すように、野生株は、検出可能な１７β−エストラジオール濃度が１００ｐｍｏｌ／Ｌ以上であった。これに対して、全ての変異株について、１７β−エストラジオール濃度１０ｐｍｏｌ／Ｌでβ−ガラクトシダーゼの誘導が確認できた。この結果から、本発明の形質転換酵母によれば、ＰＤＲ５遺伝子、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子の少なくともいずれかを欠失させることによって、ＥＲαに対するリガンドが低濃度であっても、十分に優れた感度を得ることができる。また、全ての変異株が、検出可能なリガンド濃度において、野生株よりも高いレポーター活性を示した。具体例として、前記表１８に示すように、ＣＷＰ１Δ株、ＣＷＰ２Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株およびＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株は、それぞれ、野生株の４０．６倍、３７．９倍、４１．７倍、３６．１倍と、特に優れたレポーター活性を示した。その他の株も７〜１５倍のレポーター活性を示した。これらの結果から、本発明の形質転換酵母によれば、所定のリガンド濃度に対して、野生株よりも、さらに優れた応答性を示すといえる。また、前記表１７に示すように、ＥＣ５０は、野生株が、３９６ｐｍｏｌ／Ｌであったのに対して、ＣＷＰ１Δ株が、３３．６ｐｍｏｌ／Ｌ、ＣＷＰ２Δ株が、２５．６ｐｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ５Δ株が、６９．８ｐｍｏｌ／Ｌ、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株が、３７．９ｐｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株が、３３．６ｐｍｏｌ／Ｌであり、１／６から１／１５に低減された。
【０３２３】
以上のように、マンナン結合タンパク質のコード遺伝子または排出ポンプタンパク質のコード遺伝子のいずれを欠失させることにより、前記形質転換酵母は、ＥＲαのリガンドに対して、検出感度および／または検出応答性が改善された。このため、本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体に対するリガンドのアッセイに極めて有効といえる。
【０３２４】
〔実施例７〕
本実施例では、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子のいずれかを欠失させた欠失酵母を作製し、ヒトＥＲβ遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を作製した。
【０３２５】
（１）遺伝子欠失酵母の作製
前記ＰＤＲ５遺伝子、前記ＣＷＰ１遺伝子、または前記ＣＷＰ２遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、前記ＰＤＲ５遺伝子および前記ＣＷＰ１遺伝子、前記ＣＷＰ１遺伝子および前記ＣＷＰ２遺伝子、または前記ＣＷＰ２遺伝子および前記ＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母を使用した。
【０３２６】
（２）レポータープラスミドの作製
前記実施例５と同様にして、ＥＲＥ配列が３個挿入されたプラスミドを作製した。このプラスミドを、ＥＲβレポータープラスミドとした。
【０３２７】
（３）動物核内受容体発現プラスミドの作製
増幅させたＥＲβ遺伝子のｃＤＮＡを、制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。切断した前記ｃＤＮＡを、制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断した前記プラスミドｐＵｄｐ５に挿入した。前記プラスミドｐＵｄｐ５において、切断した前記ｃＤＮＡは、前記Ｇａｌ１０プロモーターの下流に挿入した。これによって、前記核内受容体遺伝子を有し、その上流にプロモーターを有するＥＲβ発現プラスミドｐＵｄｐ５ＥＲβを得た。
【０３２８】
（４）形質転換酵母の作製
前記遺伝子欠失酵母、ＥＲβレポータープラスミド、直鎖状の前記Ｅβ発現プラスミド、前記動物転写因子発現プラスミドを使用し、下記の７種類の形質転換酵母を作製した。
１遺伝子欠失株：ＣＷＰ１Δ株、ＣＷＰ２Δ株、ＰＤＲ５Δ株
２遺伝子欠失株：ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株、ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株
３遺伝子欠失株：ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株
【０３２９】
〔実施例８〕
本実施例では、前記実施例７で作製した形質転換酵母を使用し、前記リガンドとして、１７β−エストラジオールを使用し、誘導増加量を求めた。
【０３３０】
これらの結果を、下記表１９、表２０および図４に示す。図４は、１７β−エストラジオールに対する結果を示すグラフである。前記グラフにおいて、横軸は、各リガンド濃度（μｍｏｌ／Ｌ）であり、具体的には、０．０００００１、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、１０μｍｏｌ／Ｌにおけるプロットであり、縦軸は、リガンドにより誘導された誘導増加量（レポーター活性値）である。前記グラフにおいて、黒菱形のプロット（◆）が野生株の結果であり、黒四角のプロット（■）がＣＷＰ１Δ株の結果であり、黒三角のプロット（▲）がＣＷＰ２Δ株の結果であり、アスタリスクのプロット（＊）がＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株の結果であり、縦線のプロット（｜）がＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株の結果であり、白三角のプロット（△）がＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株の結果である。
【０３３１】
【表１９】
2012070730.tif 000021
【０３３２】
【表２０】
2012070730.tif 000022
【０３３３】
前記表１９、表２０および図４に示すように、野生株は、検出可能な１７β−エストラジオール濃度が１００ｐｍｏｌ／Ｌ以上であった。これに対して、ＣＷＰ２Δ以外の全ての変異株について、１７β−エストラジオール濃度１０ｐｍｏｌ／Ｌでβ−ガラクトシダーゼの誘導が確認できた。この結果から、本発明の形質転換酵母によれば、ＥＲβに対するリガンドが低濃度であっても、十分に優れた感度を得ることができる。また、全ての変異株が、検出可能なリガンド濃度において、野生株よりも高い誘導率を示した。具体例として、前記表２０に示すように、ＣＷＰ１Δ株、ＰＤＲ５Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株およびＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株は、それぞれ、野生株の１．６倍、１．８倍、２．７倍、２．３倍のレポーター活性を示した。その他の株も１．３倍のレポーター活性を示した。これらの結果から、本発明の形質転換酵母によれば、所定のリガンド濃度に対して、野生株よりも、さらに優れた応答性を示すといえる。
【０３３４】
以上のように、マンナン結合タンパク質のコード遺伝子または排出ポンプタンパク質のコード遺伝子のいずれを欠失させることにより、前記形質転換酵母は、ＥＲβのリガンドに対して、検出感度および／または検出応答性が改善された。このため、本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体に対するリガンドのアッセイに極めて有効といえる。
【０３３５】
〔実施例９〕
本実施例では、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子を欠失させた欠失酵母を作製し、ヒトＴＲα遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を作製した。
【０３３６】
（１）遺伝子欠失酵母の作製
前記ＣＷＰ１遺伝子および前記ＣＷＰ２遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母を使用した。
【０３３７】
（２）レポータープラスミドの作製
前記ＴＲαに応答する配列であるＩＲ−０配列が連続して５個アニーリングしたものを精製して、ｐＲＷ９５−３のＳｐｅＩ位にサイトに挿入した。ＩＲ−０配列が５個挿入されたプラスミドを、ＴＲαレポータープラスミドとした。
【０３３８】
（３）動物核内受容体発現プラスミドの作製
増幅させたＴＲα遺伝子のｃＤＮＡを、制限酵素ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。切断した前記ｃＤＮＡを、制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断した前記プラスミドｐＵｄｐ６に挿入した。前記プラスミドｐＵｄｐ６において、前記切断したｃＤＮＡは、前記Ｇａｌ１０プロモーターの下流に挿入した。これによって、前記核内受容体遺伝子を有し、その上流にプロモーターを有するＴＲα発現プラスミドｐＵｄｐ６ＴＲαを得た。
【０３３９】
（４）形質転換酵母の作製
前記遺伝子欠失酵母、ＴＲαレポータープラスミド、直鎖状の前記ＴＲα発現プラスミド、前記動物転写因子発現プラスミドを使用し、下記の１種類の形質転換酵母を作製した。
２遺伝子欠失株：ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株
【０３４０】
〔実施例１０〕
本実施例では、前記実施例９で作製した形質転換酵母を使用し、前記リガンドとして、トリヨードチロニンを使用し、誘導増加量を求めた。
【０３４１】
これらの結果を、下記表２１、表２２および図５に示す。図５は、トリヨードチロニンに対する結果を示すグラフである。前記グラフにおいて、横軸は、各リガンド濃度（μｍｏｌ／Ｌ）であり、具体的には、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００μｍｏｌ／Ｌにおけるプロットであり、縦軸は、リガンドにより誘導された誘導増加量（レポーター活性値）である。前記グラフにおいて、黒菱形のプロット（◆）が野生株の結果であり、縦線のプロット（｜）がＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株の結果である。
【０３４２】
【表２１】
2012070730.tif 000023
【０３４３】
【表２２】
2012070730.tif 000024
【０３４４】
前記表２１、表２２および図５に示すように、野生株は、検出可能なトリヨードチロニン濃度が１０ｎｍｏｌ／Ｌ以上であった。これに対して、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株では、リガンド濃度１ｎｍｏｌ／Ｌでレポーター活性が検出され、１０ｎｍｏｌ／Ｌでは野生株よりも高い活性を示した。具体例として、前記表２２に示すように、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株は野生株の１３倍であった。これらの結果から、本発明の形質転換酵母によれば、所定のリガンド濃度に対して、野生株よりも、さらに優れた応答性を示すといえる。また、前記表２１に示すように、ＥＣ５０は、野生株が、６５．５ｎｍｏｌ／Ｌであったのに対し、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株が、１３．６ｎｍｏｌ／Ｌであり、１／５に低減された。
【０３４５】
以上のように、ＣＷＰ１およびＣＷＰ２遺伝子を欠失させることにより、前記形質転換酵母は、ＴＲαのリガンドに対して、検出感度および／または検出応答性が改善された。このため、本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体に対するリガンドのアッセイに極めて有効といえる。
【０３４６】
〔実施例１１〕
本実施例では、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子のいずれかを欠失させた欠失酵母を作製し、ヒトＴＲβ遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を作製した。
【０３４７】
（１）遺伝子欠失酵母の作製
前記ＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、ならびに、ＰＤＲ５遺伝子、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株を使用した。
【０３４８】
（２）レポータープラスミドの作製
前記実施例９と同様にして、ＩＲ−０配列が５個挿入されたプラスミドを作製した。このプラスミドを、ＴＲβレポータープラスミドとした。
【０３４９】
（３）動物核内受容体発現プラスミドの作製
増幅させたＴＲβ遺伝子のｃＤＮＡを、制限酵素ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。切断した前記ｃＤＮＡを、制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断した前記プラスミドｐＵｄｐ６に挿入した。前記プラスミドｐＵｄｐ６において、前記切断したｃＤＮＡは、前記Ｇａｌ１０プロモーターの下流に挿入した。これによって、前記核内受容体遺伝子を有し、その上流にプロモーターを有するＴＲβ発現プラスミドｐＵｄｐ６ＴＲβを得た。
【０３５０】
（４）形質転換酵母の作製
前記遺伝子欠失酵母、ＴＲβレポータープラスミド、直鎖状の前記Ｔβ発現プラスミド、前記動物転写因子発現プラスミドを使用し、下記の３種類の形質転換酵母を作製した。
１遺伝子欠失株：ＰＤＲ５Δ株
２遺伝子欠失株：ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株
３遺伝子欠失株：ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株
【０３５１】
〔実施例１２〕
本実施例では、前記実施例１１で作製した形質転換酵母を使用し、前記リガンドとして、トリヨードチロニンを使用し、誘導増加量を求めた。
【０３５２】
これらの結果を、下記表２３、表２４および図６に示す。図６は、トリヨードチロニンに対する結果を示すグラフである。前記グラフにおいて、横軸は、各リガンド濃度（μｍｏｌ／Ｌ）であり、具体的には、０．００１、０．０１、０．１、１、１０μｍｏｌ／Ｌにおけるプロットであり、縦軸は、リガンドにより誘導された誘導増加量（レポーター活性値）である。前記グラフにおいて、黒菱形のプロット（◆）が野生株の結果であり、バツのプロット（×）がＰＤＲ５Δ株の結果であり、縦線のプロット（｜）がＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株の結果であり、白三角のプロット（△）がＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株の結果である。
【０３５３】
【表２３】
2012070730.tif 000025
【０３５４】
【表２４】
2012070730.tif 000026
【０３５５】
前記表２３、表２４および図６に示すように、すべての株で、検出可能なトリヨードチロニン濃度は１０ｎｍｏｌ／Ｌ以上であった。この結果から、本発明の形質転換酵母によれば、ＰＤＲ５遺伝子、ＣＷＰ１遺伝子およびＣＷＰ２遺伝子の少なくともいずれかを欠失させることによって、ＴＲβに対するリガンドが低濃度であっても、十分に優れた感度を得ることができる。全ての変異株は、リガンド濃度１μｍｏｌ／Ｌにおいて、野生株よりも高いレポーター活性を示した。具体例として、前記表２４に示すように、ＰＤＲ５Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株は、それぞれ、野生株の３．２１倍、２．２３倍、１．９０倍を示した。これらの結果から、本発明の形質転換酵母によれば、所定のリガンド濃度に対して、野生株よりも、さらに優れた応答性を示すといえる。また、前記表２３に示すように、ＥＣ５０は、野生株が、１．３１μｍｏｌ／Ｌであったのに対して、ＰＤＲ５Δ株が、１０．２ｎｍｏｌ／Ｌ、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株が、９２．５ｎｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株が、１８２ｎｍｏｌ／Ｌであり、１／１２８から１／７に低減された。
【０３５６】
以上のように、マンナン結合タンパク質のコード遺伝子または排出ポンプタンパク質のコード遺伝子のいずれを欠失させることにより、前記形質転換酵母は、ＴＲβのリガンドに対して、検出感度および／または検出応答性が改善された。このため、本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体に対するリガンドのアッセイに極めて有効といえる。
【０３５７】
〔実施例１３〕
本実施例では、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子のいずれかを欠失させた欠失酵母を作製し、ヒトＰＸＲ−１遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を作製した。
【０３５８】
（１）遺伝子欠失酵母の作製
前記ＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、前記ＰＤＲ５遺伝子および前記ＣＷＰ１遺伝子、または前記ＣＷＰ２遺伝子および前記ＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母を使用した。
【０３５９】
（２）レポータープラスミドの作製
前記ＰＸＲ−１に応答する配列であるＤＲ−３配列が連続して２個アニーリングしたものを精製して、ｐＲＷ９５−３のＸｂａＩ部位に挿入した。ＤＲ−３配列が２個挿入されたプラスミドを、ＰＸＲレポータープラスミドとした。
【０３６０】
（３）動物核内受容体発現プラスミドの作製
増幅させたＲＸＲα遺伝子のｃＤＮＡを、制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。切断した前記ｃＤＮＡを、制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで切断したプラスミドｐＵｄｐ８に挿入した。一方で、増幅させたＰＸＲ−１遺伝子のｃＤＮＡを、制限酵素ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。そして、ＲＸＲα遺伝子のｃＤＮＡを挿入した前記プラスミドｐＵｄｐ８に、さらに、ＰＸＲ−１遺伝子のｃＤＮＡを挿入した。具体的には、切断した前記ｃＤＮＡを、制限酵素ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断した前記プラスミドｐＵｄｐ８に挿入した。前記プラスミドｐＵｄｐ８において、前記切断したＲＸＲα遺伝子のｃＤＮＡは、前記Ｇａｌ１プロモーターの下流に挿入し、前記切断したＰＸＲ−１遺伝子のｃＤＮＡは、前記Ｇａｌ１０ロモーターの下流に挿入した。これによって、前記核内受容体遺伝子を有し、その上流にプロモーターを有するプラスミドｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαを得た。
【０３６１】
本実施例では、動物核内受容体発現プラスミドを、前記プラスミドｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαにおける、ＲＸＲαのＣ末端のＨｅｌｉｘ１２を欠失させたプラスミドｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαＴとした。前記プラスミドｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαＴは、以下のように作製した。
【０３６２】
まず、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使用して、前記ｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαに含まれるＲＸＲαｃＤＮＡの４４３番目のコドンにナンセンス変異を導入し、ＲＸＲαのＣ末端に存在するＨｅｌｉｘ１２領域を欠失させた。前記変異に使用したプライマー（配列番号７０および７１）および反応条件（ＰＣＲ反応液およびＰＣＲ条件）を、下記に示す。
【０３６３】
ＲＸＲ４４３Ｆ（配列番号７０）
５’−cttcttcaagctcatcgggtagacacccat−３’
ＲＸＲ４４３Ｒ（配列番号７１）
５’−ggtgtcaatgggtgtctacccgatgagctt−３’
【０３６４】
（ＰＣＲ反応液：１×反応バッファー）
０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ、３μＬ  Ｑｕｉｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ｐｆｕ  ｕｌｔｒａ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １０ｕｎｉｔ（以上、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、０．２５μｍｏｌ／Ｌ  各プライマー、１０ｎｇ  プラスミドＤＮＡを、ＰＣＲ反応液５０μＬ中に含む。
【０３６５】
（ＰＣＲ条件：サイクル）
９４℃で５０秒、６０℃で５０秒、６８℃で７分のサイクルを、１８サイクル実施した。
【０３６６】
前記ＰＣＲ後、制限酵素ＤｐｎＩで鋳型プラスミドＤＮＡを消化し、大腸菌に形質転換した。得られたプラスミドＤＮＡを、ＰＸＲ発現プラスミドｐＵｄｐ８ＰＸＲ／ＲＸＲαＴとした。
【０３６７】
（４）形質転換酵母の作製
前記遺伝子欠失酵母、ＰＸＲレポータープラスミド、直鎖状の前記ＰＸＲ発現プラスミド、前記動物転写因子発現プラスミドを使用し、下記の４種類の形質転換酵母を作製した。
１遺伝子欠失株：ＰＤＲ５Δ株
２遺伝子欠失株：ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株、ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株
３遺伝子欠失株：ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株
【０３６８】
〔実施例１４〕
本実施例では、前記実施例１３で作製した形質転換酵母を使用し、前記リガンドとして、リファンピシンを使用し、誘導増加量を求めた。
【０３６９】
これらの結果を、下記表２５、表２６および図７に示す。図７は、リファンピシンに対する結果を示すグラフである。前記グラフにおいて、横軸は、各リガンド濃度（μｍｏｌ／Ｌ）であり、具体的には、０．１、１、１０、１００μｍｏｌ／Ｌにおけるプロットであり、縦軸は、リガンドにより誘導された誘導増加量（レポーター活性値）である。前記グラフにおいて、黒菱形のプロット（◆）が野生株の結果であり、バツのプロット（×）がＰＤＲ５Δ株の結果であり、アスタリスクのプロット（＊）がＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ株の結果であり、黒丸のプロット（●）がＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株の結果であり、白三角のプロット（△）がＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株の結果である。
【０３７０】
【表２５】
2012070730.tif 000027
【０３７１】
【表２６】
2012070730.tif 000028
【０３７２】
前記表２５、表２６および図７に示すように、すべての株で検出可能なリファンピシン濃度が１μｍｏｌ／Ｌ以上であった。この結果から、本発明の形質転換酵母によれば、ＰＸＲ−１に対するリガンドが低濃度であっても、十分に優れた感度を得ることができる。また、全ての変異株が、リガンド濃度１μｍｏｌ／Ｌにおいて、野生株よりも高いレポーター活性を示した。具体例として、前記表２６に示すように、ＰＤＲ５Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ２Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株は、それぞれ、野生株の１３．３５倍、５．２１倍、２．２３倍、５．０２倍を示した。これらの結果から、本発明の形質転換酵母によれば、所定のリガンド濃度に対して、野生株よりも、さらに優れた応答性を示すといえる。また、前記表２５に示すように、ＥＣ５０は、野生株が、３１．６μｍｏｌ／Ｌであったのに対して、ＰＤＲ５Δ株が、７．８６μｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株が、７．３３μｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ２Δ株が、８．１０μｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株が、１０．０μｍｏｌ／Ｌであり、１／４から１／３に低減された。
【０３７３】
以上のように、マンナン結合タンパク質のコード遺伝子または排出ポンプタンパク質のコード遺伝子のいずれを欠失させることにより、前記形質転換酵母は、ＰＸＲ−１のリガンドに対して、検出感度および／または検出応答性が改善された。このため、本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体に対するリガンドのアッセイに極めて有効といえる。
【０３７４】
〔実施例１５〕
本実施例では、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子のいずれかを欠失させた欠失酵母を作製し、ヒトＰＲ遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を作製した。
【０３７５】
（１）遺伝子欠失酵母の作製
前記ＰＤＲ５遺伝子、または前記ＣＷＰ２遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、前記ＰＤＲ５遺伝子および前記ＣＷＰ１遺伝子、前記ＣＷＰ１遺伝子および前記ＣＷＰ２遺伝子、前記ＣＷＰ２遺伝子および前記ＰＤＲ５遺伝子、前記ＣＷＰ１遺伝子および前記ＰＤＲ１０遺伝子、または前記ＰＤＲ５遺伝子および前記ＰＤＲ１０遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、ならびに、前記ＣＷＰ１遺伝子、前記ＣＷＰ２遺伝子および前記ＰＤＲ５遺伝子、または、前記ＣＷＰ１遺伝子、前記ＰＤＲ５遺伝子および前記ＰＤＲ１０遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母を使用した。
【０３７６】
（２）レポータープラスミドの作製
前記ＰＲに応答する配列であるＧＲＥ配列が８個挿入されたプラスミドを、ＰＲレポータープラスミドとした。
【０３７７】
（３）動物核内受容体発現プラスミドの作製
増幅させたＰＲ遺伝子のｃＤＮＡを、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで切断した。切断した前記ｃＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ切断したプラスミドｐＵｄｐ６に挿入した。前記プラスミドｐＵｄｐ６において、前記切断したＰＲ遺伝子のｃＤＮＡは、前記Ｇａｌ１０プロモーターの下流に挿入した。これによって、前記核内受容体遺伝子を有し、その上流にプロモーターを有するＰＲ発現プラスミドｐＵｄｐ６ＰＲを得た。
【０３７８】
（４）形質転換酵母の作製
前記遺伝子欠失酵母、ＰＲレポータープラスミド、直鎖状の前記ＰＲ発現プラスミド、前記動物転写因子発現プラスミドを使用し、下記の９種類の形質転換酵母を作製した。
１遺伝子欠失株：ＣＷＰ２Δ株、ＰＤＲ５Δ株
２遺伝子欠失株：ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ２Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ１０Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株
３遺伝子欠失株：ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株
【０３７９】
〔実施例１６〕
本実施例では、前記実施例１５で作製した形質転換酵母を使用し、前記リガンドとして、プロゲステロンを使用し、誘導増加量を求めた。
【０３８０】
これらの結果を、下記表２７、表２８および図８に示す。図８は、プロゲステロンに対する結果を示すグラフである。前記グラフにおいて、横軸は、各リガンド濃度（μｍｏｌ／Ｌ）であり、具体的には、０．０００００１、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、１０μｍｏｌ／Ｌにおけるプロットであり、縦軸は、リガンドにより誘導された誘導増加量（レポーター活性値）である。前記グラフにおいて、黒菱形のプロット（◆）が野生株の結果であり、黒三角のプロット（▲）がＣＷＰ２Δ株の結果であり、バツのプロット（×）がＰＤＲ５Δ株の結果であり、アスタリスクのプロット（＊）がＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ株の結果であり、黒丸のプロット（●）がＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株の結果であり、縦線のプロット（｜）がＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株の結果であり、白三角のプロット（△）がＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株の結果であり、白菱形のプロット（◇）がＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ１０Δ株の結果であり、白丸のプロット（○）がＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株の結果であり、白四角のプロット（□）がＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株の結果である。
【０３８１】
【表２７】
2012070730.tif 000029
【０３８２】
【表２８】
2012070730.tif 000030
【０３８３】
前記表２７、表２８および図８に示すように、すべての株で検出可能なリガンド濃度において、野生株よりも高いレポーター活性を示した。具体例として、前記表２８に示すように、プロゲステロン濃度１μｍｏｌ／Ｌにおいて、ＣＷＰ２Δ株、ＰＤＲ５Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ株、ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ１０Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株は、それぞれ、野生株の３．９４倍、４８．５５倍、２９．９８倍、２２．９６倍、７７．２倍、１９．５６倍、２２．０２倍、２２．５倍、１８．６７倍のレポーター活性を示した。これらの結果から、本発明の形質転換酵母によれば、所定のリガンド濃度に対して、野生株よりも、さらに優れた応答性を示すといえる。また、前記表２７に示すように、ＥＣ５０は、野生株が、３．１６μｍｏｌ／Ｌであったのに対して、ＣＷＰ２Δ株が、１．３４μｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ５Δ株が、８５３ｎｍｏｌ／Ｌ、ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ株が、１．３６μｍｏｌ／Ｌ、ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株が、１．１３μｍｏｌ／Ｌ、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株が、１１４ｎｍｏｌ／Ｌ、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株が、６８９ｎｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株が、１．３９μｍｏｌ／Ｌ、ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ１０Δ株が、１２３ｎｍｏｌ／Ｌ、ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株が、６９６ｎｍｏｌ／Ｌであり、１／３から１／２８に低減された。
【０３８４】
以上のように、マンナン結合タンパク質のコード遺伝子または排出ポンプタンパク質のコード遺伝子のいずれを欠失させることにより、前記形質転換酵母は、ＰＲのリガンドに対して、検出感度および／または検出応答性が改善された。このため、本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体に対するリガンドのアッセイに極めて有効といえる。
【０３８５】
〔実施例１７〕
本実施例では、ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子、およびＰＤＲ１０遺伝子のいずれかを欠失させた欠失酵母を作製し、ヒトＧＲ遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を作製した。
【０３８６】
（１）遺伝子欠失酵母の作製
前記ＰＤＲ５遺伝子または前記ＰＤＲ１０遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、前記ＰＤＲ５遺伝子および前記ＣＷＰ１遺伝子、前記ＣＷＰ１遺伝子および前記ＰＤＲ１０遺伝子、または前記ＰＤＲ５遺伝子および前記ＰＤＲ１０遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母を使用した。
【０３８７】
（２）レポータープラスミドの作製
前記ＧＲに応答する配列であるＧＲＥ配列が８個挿入されたプラスミドを、ＧＲレポータープラスミドとした。
【０３８８】
（３）動物核内受容体発現プラスミドの作製
増幅させたＧＲ遺伝子のｃＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断した。切断した前記ｃＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ切断した前記プラスミドｐＵｄｐ６に挿入した。前記プラスミドｐＵｄｐ６において、前記切断したＧＲ遺伝子のｃＤＮＡは、前記ＧＡＬ１０プロモーターの下流に挿入した。これによって、前記核内受容体遺伝子を有し、その上流にプロモーターを有するＧＲ発現プラスミドｐＵｄｐ６ＧＲを得た。
【０３８９】
（４）形質転換酵母の作製
前記遺伝子欠失酵母、ＧＲレポータープラスミド、直鎖状の前記ＧＲ発現プラスミド、前記動物転写因子発現プラスミドを使用し、下記の６種類の形質転換酵母を作製した。
１遺伝子欠失株：ＰＤＲ５Δ株、ＰＤＲ１０Δ株
２遺伝子欠失株：ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ１０Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株
３遺伝子欠失株：ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株
【０３９０】
〔実施例１８〕
本実施例では、前記実施例１７で作製した形質転換酵母を使用し、前記リガンドとして、コルチコステロンを使用し、誘導増加量を求めた。
【０３９１】
これらの結果を、下記表２９、表３０および図９に示す。図９は、コルチコステロンに対する結果を示すグラフである。前記グラフにおいて、横軸は、各リガンド濃度（μｍｏｌ／Ｌ）であり、具体的には、０．１、１、１０μｍｏｌ／Ｌにおけるプロットであり、縦軸は、前記誘導増加量（レポーター活性値）である。前記グラフにおいて、黒三角のプロット（▲）が、ＰＤＲ５Δ株の結果であり、バツのプロット（×）がＰＤＲ１０Δ株の結果であり、アスタリスクのプロット（＊）が、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株の結果であり、黒丸のプロット（●）がＰＤＲ１０Δ−ＣＷＰ１Δ株の結果であり、縦線のプロット（｜）がＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株の結果であり、白三角のプロット（△）がＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株の結果であり、黒菱形のプロット（◆）が、野生株の結果である。
【０３９２】
【表２９】
2012070730.tif 000031
【０３９３】
【表３０】
2012070730.tif 000032
【０３９４】
前記表２９、表３０および図９に示すように、野生株は、検出可能なコルチコステロン濃度が１μｍｏｌ／Ｌ以上であった。これに対して、全ての欠失株について、コルチコステロン濃度１０〜３０ｎｍｏｌ／Ｌにおいて、β−ガラクトシダーゼの誘導が確認できた。この結果から、本発明の形質転換酵母によれば、ＰＤＲ５遺伝子、ＰＤＲ１０遺伝子およびＣＷＰ１遺伝子の少なくともいずれかを欠失させることによって、低いリガンド濃度であっても、十分に優れた感度を得ることができる。また、全ての遺伝子欠失株が、検出可能なリガンド濃度において、野生株よりも高いレポーター活性を示した。具体例として、前記表３０に示すように、リガンド濃度１μｍｏｌ／Ｌにおいて、ＰＤＲ５Δ株、ＰＤＲ１０Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株、ＰＤＲ１０Δ−ＣＷＰ１Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株は、それぞれ、野生株の１３．６８倍、３．５８倍、１３．６２倍、６．２１倍、１９．７８倍、１４．７２倍のレポーター活性を示した。これらの結果から、本発明の形質転換酵母によれば、所定のリガンド濃度に対して、野生株よりも、さらに優れた応答性を示すといえる。また、前記表２９に示すように、ＥＣ５０は、野生株が、６．５μｍｏｌ／Ｌであったのに対して、ＰＤＲ５Δ株が、６４８ｎｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ１０Δ株が、１μｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株が、７８９ｎｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ１０Δ−ＣＷＰ１Δ株が、１μｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株が、３１６ｎｍｏｌ／Ｌ、ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株が、７３９ｎｍｏｌ／Ｌであり、１／７から１／２０に低減された。
【０３９５】
以上のように、マンナン結合タンパク質のコード遺伝子または排出ポンプタンパク質のコード遺伝子のいずれを欠失させることにより、前記形質転換酵母は、ＧＲのリガンドに対して、検出感度および／または検出応答性が改善された。このため、本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体に対するリガンドのアッセイに極めて有効といえる。
【０３９６】
〔実施例１９〕
本実施例では、ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子、およびＰＤＲ１０遺伝子のいずれかを欠失させた欠失酵母を作製し、ヒトＡｈＲ遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を作製した。
【０３９７】
（１）遺伝子欠失酵母の作製
前記ＣＷＰ１遺伝子、前記ＰＤＲ５遺伝子、または前記ＰＤＲ１０遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、前記ＰＤＲ５遺伝子および前記ＣＷＰ１遺伝子、前記ＣＷＰ１遺伝子および前記ＰＤＲ１０遺伝子、または前記ＰＤＲ５遺伝子および前記ＰＤＲ１０遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子、および前記ＰＤＲ１０遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母を使用した。
【０３９８】
（２）レポータープラスミドの作製
前記ＡｈＲに応答する配列であるＸＲＥ配列が５個挿入されたプラスミドを、ＡｈＲレポータープラスミドとした。
【０３９９】
（３）動物核内受容体発現プラスミドの作製
増幅させたＡｈＲ遺伝子またはＡｒｎｔ遺伝子のｃＤＮＡを、前記実施例３と同様にして、前記プラスミドＹＥｐＬａｃＧａｌ１、１０に挿入した。これによって、前記核内受容体遺伝子を有し、その上流にプロモーターを有するプラスミドＹＥｐＬａｃＡｈＲ／Ａｒｎｔを得た。このプラスミドを、ＡｈＲ発現プラスミドとした。
【０４００】
（４）形質転換酵母の作製
前記遺伝子欠失酵母、前記ＡｈＲレポータープラスミド、直鎖状の前記ＡｈＲ発現プラスミドを使用し、下記の７種類の形質転換酵母を作製した。
１遺伝子欠失株：ＣＷＰ１Δ株、ＰＤＲ５Δ株、ＰＤＲ１０Δ株
２遺伝子欠失株：ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ株、ＣＷＰ1Δ−ＰＤＲ１０Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株
３遺伝子欠失株：ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株
【０４０１】
〔実施例２０〕
本実施例では、前記実施例１９で作製した形質転換酵母を使用し、前記リガンドとして、β−ナフトフラボンを使用し、誘導増加量を求めた。
【０４０２】
これらの結果を、下記表３１、表３２および図１０に示す。図１０は、β−ナフトフラボンに対する結果を示すグラフである。前記グラフにおいて、横軸は、各リガンド濃度（μｍｏｌ／Ｌ）であり、具体的には、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、１０μｍｏｌ／Ｌにおけるプロットであり、縦軸は、前記誘導増加量（レポーター活性値）である。前記グラフにおいて、黒四角のプロット（■）が、ＣＷＰ１Δ株の結果であり、黒三角のプロット（▲）が、ＰＤＲ５Δ株の結果であり、バツのプロット（×）がＰＤＲ１０Δ株の結果であり、アスタリスクのプロット（＊）が、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株の結果であり、黒丸のプロット（●）がＰＤＲ１０Δ−ＣＷＰ１Δ株の結果であり、縦線のプロット（｜）がＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株の結果であり、白三角のプロット（△）がＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株の結果であり、黒菱形のプロット（◆）が、野生株の結果である。
【０４０３】
【表３１】
2012070730.tif 000033
【０４０４】
【表３２】
2012070730.tif 000034
【０４０５】
前記表３１、表３２および図１０に示すように、野生株は、検出可能なβ−ナフトフラボン濃度が１０ｎｍｏｌ／Ｌ以上であった。これに対して、全ての欠失株について、β−ガラクトシダーゼの誘導が確認できた。中でも、ＰＤＲ５Δ株は、β−ナフトフラボン濃度が１０ｎｍｏｌ／Ｌの場合、野生株と比較して高いβ−ガラクトシダーゼの誘導が確認でき、また、その他の株は、β−ナフトフラボン濃度１ｎｍｏｌ／Ｌでβ−ガラクトシダーゼの誘導が確認できた。この結果から、本発明の形質転換酵母によれば、ＰＤＲ５遺伝子、ＰＤＲ１０遺伝子、およびＣＷＰ１遺伝子の少なくともいずれかを欠失させることによって、ＡｈＲに対するリガンドが低濃度であっても、十分に優れた感度を得ることができる。また、全ての遺伝子欠失株が、検出可能なリガンド濃度において、野生株よりも高いレポーター活性を示した。具体例として、前記表３２に示すように、リガンド濃度１０ｎｍｏｌ／ＬではＣＷＰ１Δ株、ＰＤＲ５Δ株、ＰＤＲ１０Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株、ＰＤＲ１０Δ−ＣＷＰ１Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株は、それぞれ、野生株の１６．６８倍、５．５２倍、３８．７３倍，２９．２５倍、１２．５４倍，９６．０８倍、または９５．２８倍のレポーター活性を示した。これらの結果から、本発明の形質転換酵母によれば、所定のリガンド濃度に対して、野生株よりも、さらに優れた応答性を示すといえる。また、前記表３１に示すように、ＥＣ５０は、野生株が、７７１ｎｍｏｌ／Ｌであったのに対して、ＣＷＰ１Δ株が、９６．９ｎｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ１０Δ株が、８６．２ｎｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株が、８５．６ｎｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ１０Δ−ＣＷＰ１Δ株が、９４．９ｎｍｏｌ／Ｌ、ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株が、２．７２ｎｍｏｌ／Ｌ、ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株が、１０．９ｎｍｏｌ／Ｌであり、１／８から１／２８３に低減された。
【０４０６】
以上のように、マンナン結合タンパク質のコード遺伝子または排出ポンプタンパク質のコード遺伝子のいずれを欠失させることにより、前記形質転換酵母は、ＡｈＲのリガンドに対して、検出感度および／または検出応答性が改善された。このため、本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体に対するリガンドのアッセイに極めて有効といえる。
【０４０７】
〔実施例２１〕
本実施例では、ＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子のいずれかを欠失させた欠失酵母を作製し、ヒトＡＲ遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を作製した。
【０４０８】
（１）遺伝子欠失酵母の作製
前記ＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、前記ＰＤＲ５遺伝子および前記ＣＷＰ１遺伝子、前記ＰＤＲ５遺伝子および前記ＣＷＰ２遺伝子、前記ＣＷＰ１遺伝子および前記ＣＷＰ２遺伝子、または前記ＰＤＲ５遺伝子および前記ＰＤＲ１０遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株、ならびに、ＣＷＰ１遺伝子、ＰＤＲ５遺伝子およびＰＤＲ１０遺伝子、またはＣＷＰ１遺伝子、ＣＷＰ２遺伝子およびＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母を使用した。
【０４０９】
（２）レポータープラスミドの作製
前記ＡＲに応答する配列であるＧＲＥ配列が８個挿入されたプラスミドを、ＡＲレポータープラスミドとした。
【０４１０】
（３）動物核内受容体発現プラスミドの作製
増幅させたＡＲ遺伝子のｃＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断した。切断した前記ｃＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ切断した前記プラスミドｐＵｄｐ６に挿入した。前記プラスミドｐＵｄｐ６において、前記切断したＡＲ遺伝子のｃＤＮＡは、前記ＧＡＬ１０プロモーターの下流に挿入した。これによって、前記核内受容体遺伝子を有し、その上流にプロモーターを有するＡＲ発現プラスミドｐＵｄｐ６ＡＲを得た。
【０４１１】
（４）形質転換酵母の作製
前記遺伝子欠失酵母、ＡＲレポータープラスミド、直鎖状の前記ＡＲ発現プラスミド、前記動物転写因子発現プラスミドを使用し、下記の７種類の形質転換酵母を作製した。
１遺伝子欠失株：ＰＤＲ５Δ株
２遺伝子欠失株：ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ１Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＣＷＰ２Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株
３遺伝子欠失株：ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株
【０４１２】
〔実施例２２〕
本実施例では、前記実施例２１で作製した形質転換酵母を使用し、前記リガンドとして、テストステロンを使用し、誘導増加量を求めた。
【０４１３】
これらの結果を、下記表３３、表３４および図１１に示す。図１１は、テストステロンに対する結果を示すグラフである。前記グラフにおいて、横軸は、各リガンド濃度（μｍｏｌ／Ｌ）であり、具体的には、０．０００００１、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００μｍｏｌ／Ｌにおけるプロットであり、縦軸は、リガンドにより誘導された誘導増加量（レポーター活性値）である。前記グラフにおいて、黒菱形のプロット（◆）が野生株の結果であり、黒四角のプロット（■）がＰＤＲ５Δ株の結果であり、黒三角のプロット（▲）がＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ株の結果であり、バツのプロット（×）がＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株の結果であり、アスタリスクのプロットが（＊）がＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２株の結果であり、黒丸のプロット（●）がＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株の結果であり、縦線のプロット（｜）がＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株の結果であり、白三角のプロット（△）がＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株の結果である。
【０４１４】
【表３３】
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【０４１５】
【表３４】
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【０４１６】
前記表３３、表３４および図１１に示すように、全ての変異株が、検出可能なリガンド濃度において、野生株よりも高いレポーター活性を示した。具体例として、前記表３４に示すように、テストステロン濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌにおいて、ＰＤＲ５Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ株、ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株、ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株、ＣＷＰ１Δ−ＰＤＲ５Δ−ＰＤＲ１０Δ株は、それぞれ、野生株の７．７倍、１８．５２倍、３．３３倍、５．４９倍、７．４２倍、１０．０７倍、４．５７倍のレポーター活性を示した。これらの結果から、本発明の形質転換酵母によれば、所定のリガンド濃度に対して、野生株よりも、さらに優れた応答性を示すといえる。また、前記表３３に示すように、ＥＣ５０は、野生株が、５３．１ｎｍｏｌ／Ｌであったのに対して、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δが、２６．４ｎｍｏｌ／Ｌ、ＣＷＰ１Δ−ＣＷＰ２Δ−ＰＤＲ５Δ株が、７．９９ｎｍｏｌ／Ｌであり、それぞれ１／２および１／７に低減された。
【０４１７】
以上のように、マンナン結合タンパク質のコード遺伝子または排出ポンプタンパク質のコード遺伝子のいずれを欠失させることにより、前記形質転換酵母は、ＡＲのリガンドに対して、検出感度および／または検出応答性が改善された。このため、本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体に対するリガンドのアッセイに極めて有効といえる。
【０４１８】
〔実施例２３〕
本実施例では、ＰＤＲ５遺伝子を欠失させた欠失酵母を作製し、ヒトＭＲ遺伝子を組み込んだ形質転換酵母を作製した。
【０４１９】
（１）遺伝子欠失酵母の作製
前記ＰＤＲ５遺伝子を欠失する遺伝子欠失酵母株を使用した。
【０４２０】
（２）レポータープラスミドの作製
前記ＭＲに応答する配列であるＧＲＥ配列が８個挿入されたプラスミドを、ＭＲレポータープラスミドとした。
【０４２１】
（３）動物核内受容体発現プラスミドの作製
増幅させたＭＲ遺伝子のｃＤＮＡを、制限酵素ＡｆｌＩＩで切断後平滑化し、その後ＢｇｌＩＩで切断した。切断した前記ｃＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断後、平滑化し、その後ＢａｍＨＩで切断した前記プラスミドｐＵｄｐ６に挿入した。前記プラスミドｐＵｄｐ６において、前記切断したＭＲ遺伝子のｃＤＮＡは、前記ｇａｌ１０プロモーターの下流に挿入した。これによって、前記核内受容体遺伝子を有し、その上流にプロモーターを有するＭＲ発現プラスミドｐＵｄｐ６ＭＲを得た。
【０４２２】
（４）形質転換酵母の作製
前記遺伝子欠失酵母、前記ＭＲレポータープラスミド、直鎖状の前記ＭＲ発現プラスミド、前記動物転写因子発現プラスミドを使用し、ＰＤＲ５Δ株を作製した。
【０４２３】
〔実施例２４〕
本実施例では、前記実施例２３で作製した形質転換酵母を使用し、前記リガンドとして、アルドステロンを使用し、誘導増加量を求めた。
【０４２４】
これらの結果を、下記表３５、表３６および図１２に示す。図１２は、アルドステロンに対する結果を示すグラフである。前記グラフにおいて、横軸は、各リガンド濃度（μｍｏｌ／Ｌ）であり、具体的には、０．００１、０．０１、０．１、１、１０μｍｏｌ／Ｌにおけるプロットであり、縦軸は、前記誘導増加量（レポーター活性値）である。前記グラフにおいて、黒四角のプロット（■）が、ＰＤＲ５Δ株の結果であり、黒菱形のプロット（◆）が、野生株の結果である。
【０４２５】
【表３５】
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【０４２６】
【表３６】
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【０４２７】
前記表３５、表３６および図１２に示すように、野生株、ＰＤＲ５Δ株ともに検出可能なアルドステロン濃度は１０ ｎｍｏｌ／Ｌ以上であった。ＰＤＲ５Δ株では、リガンド濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌにおいて、野生株の５９．１倍のレポーター活性を示した。またＥＣ５０は野生株が７９０ｎｍｏｌ／Ｌであったのに対し、ＰＤＲ５Δ株が、６１．１ｎｍｏｌ／Ｌであり、１／１３に低減された。
【０４２８】
以上のように、ＰＤＲ５遺伝子を欠失させることによって、前記形質転換酵母は、ＭＲのリガンドに対して、検出感度および／または検出応答性が改善された。このため、本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体に対するリガンドのアッセイに極めて有効といえる。
【０４２９】
以上の本発明の実施例の結果から、マンナン結合タンパク質のコード遺伝子または排出ポンプタンパク質のコード遺伝子のいずれを欠失させることにより、前記形質転換酵母は、核内受容体遺伝子の種類に関わらず、動物核内受容体のリガンドに対して、検出感度および／または検出応答性が改善された。このため、本発明の形質転換酵母は、動物核内受容体に対するリガンドのアッセイに極めて有効といえる。
【産業上の利用可能性】
【０４３０】
以上のように、本発明の形質転換酵母を用いれば、高検出感度で、核内受容体に対するリガンドの分析が可能となる。したがって、本発明の分析方法は、例えば、化学物質およびタンパク質等のリガンドの分析の分野において、有用な方法であり、その用途は制限されず広い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2012070730.tif 000048
【図１１】
2012070730.tif 000049
【図１２】
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【配列表】
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