(57)【要約】      （修正有）【課題】チューリッポシドＡ変換酵素の遺伝子断片を取得することで、チューリッポシド類をチューリッパリン類に変換する酵素活性を有するタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド、さらには、酵素源を植物体に由来しない組換え酵素の調製法を提供する。【解決手段】チューリップ花弁由来のチューリッポシドＡ変換酵素をコードすると予測される遺伝子断片を取得し、同酵素遺伝子のタンパク質コード領域のうち、シグナルペプチドを除いた成熟ポリペプチドコード領域のＮ末端にヒスチジンタグを付加した大腸菌発現ベクターを構築した。このベクターを宿主大腸菌に導入し、可溶性タンパク質として発現させることで組換え型の精製酵素を得た。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＡ１）又は配列番号１２（ＴｇＴＣＥＡ２）に示すアミノ酸配列を有する、タンパク質。
（Ｂ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＡ１）又は配列番号１２（ＴｇＴＣＥＡ２）に示すアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシド類をチューリッパリン類に変換する酵素活性を有する、タンパク質。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＡ１）又は配列番号１２（ＴｇＴＣＥＡ２）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＡ１）又は配列番号１２（ＴｇＴＣＥＡ２）に示すアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシド類をチューリッパリン類に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号７又は配列番号１０に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号７又は配列番号１０に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドであって配列番号９又は配列番号１２に示すタンパク質と同一の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物体内に有するチューリッポシド類からチューリッパリン類を得るのに有効な酵素及びそれをコードするポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
チューリッパリン類はα−メチレン−γ−ブチロラクトン類に相当し、耐熱性を有する透明樹脂の単量体、生理活性物質の合成中間体、さらには害虫忌避剤や抗変異原性剤としての利用が多数報告されている利用価値が高い化合物である。
これまで本化合物類の製造方法としては、多大なエネルギーを消費する化学合成法に頼っており、石油非依存かつ省エネルギーな製造方法が求められていた。
本発明者らはチューリップ組織に含まれるチューリッポシド変換酵素をチューリップ組織抽出物に作用させることで、温和な条件下での簡便なチューリッパリンの調製法を確立している（特許文献１）が、本法においては酵素源としてチューリップの組織を用いるため、原料入手の不安定さや実用化の際のスケールアップの困難が予想された。
この問題点を解決するため、チューリップからの同酵素をコードする遺伝子の単離、及び同組換え酵素の大量発現系の確立が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−２０７２１１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、チューリッポシドＡ変換酵素の遺伝子断片を取得することで、チューリッポシド類をチューリッパリン類に変換する酵素活性を有するタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドの提供を目的とする。
さらには、酵素源を植物体に由来しない組換え酵素の調製法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係るタンパク質は下記（Ａ）又は（Ｂ）からなる。
（Ａ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＡ１）又は配列番号１２（ＴｇＴＣＥＡ２）に示すアミノ酸配列を有する、タンパク質。
（Ｂ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＡ１）又は配列番号１２（ＴｇＴＣＥＡ２）に示すアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシド類をチューリッパリン類に変換する酵素活性を有する、タンパク質。
【０００６】
本発明に係るポリヌクレオチドは、下記のいずれかである。
（ａ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＡ１）又は配列番号１２（ＴｇＴＣＥＡ２）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号９（ＴｇＴＣＥＡ１）又は配列番号１２（ＴｇＴＣＥＡ２）に示すアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、チューリッポシド類をチューリッパリン類に変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号７又は配列番号１０に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号７又は配列番号１０に示す塩基配列と９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドであって配列番号９又は配列番号１２に示すタンパク質と同一の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【０００７】
本発明において、チューリッポシド類は、下記化学式（１）に示すチューリッポシドＡ（ＴｕｌｉｐｏｓｉｄｅＡ）及びその類縁体又は化学式（２）に示すチューリッポシドＢ（ＴｕｌｉｐｏｓｉｄｅＢ）及びその類縁体が含まれる。
【化１】
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【化２】
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チューリッポシドＡ又はＢの類縁体には、例えば化学式（３）（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６５（２００４）７３１−７３９；Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（２００５）４６：１２５−１３１）、化学式（４）（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３（１），１５２−１５４，１９９９）、化学式（５）（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ５１（３），２４４−２４８（１９９７））、化学式（６）及び（７）（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４０  Ｎｏ．１  ４９−５１（１９９５））等が例として挙げられる。
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【０００８】
本発明において、チューリッパリン類とは下記化学式（８）をいい、
【化８】
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（式中、Ｒ１，Ｒ２は独立して水素、水酸基又は炭素数１〜８のアルキル基を示し、Ｒ３，Ｒ４は独立して水素又は炭素数１〜８のアルキル基を示す。）
代表例としては、下記化学式（９）に示すチューリッパリンＡ（α−メチレン−γ−ブチロラクトン）及び下記化学式（１０）で示すチューリッパリンＢ（α−メチレン−β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン）が挙げられる。
【化９】
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【化１０】
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【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るタンパク質はシグナルペプチドを除いた成熟ポリペプチドのコード領域の例えばＮ末端にヒスチジンタグ等を付加した大腸菌発現ベクターを構築することで、宿主大腸菌に導入し、この組換え菌を培養することで組換え酵素として発現することができる。
よって、酵素源として植物体を用いていた従来法に比較して、同酵素の安定的かつ大量の供給が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】組換え酵素精製各ステップのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、（ａ）はＴｇＴＣＥＡ１、（ｂ）はＴｇＴＣＥＡ２の結果を示す。
【図２】アミノ酸配列の比較表を示す。（１）ＴｇＴＣＥＡ１、（２）ＴｇＴＣＥＡ２、（３）ＴｇＴＣＥＡ３、（４）ＴｇＴＣＥＡ４、（５）ＴｇＴＣＥＡ５、（６）ＴｇＴＣＥＡ６を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者らは、チューリップ花弁由来のチューリッポシドＡ変換酵素をコードすると予測される遺伝子断片を取得し、同酵素遺伝子のタンパク質コード領域のうち、シグナルペプチドを除いた成熟ポリペプチドコード領域のＮ末端にヒスチジンタグを付加した大腸菌発現ベクターを構築した。
このベクターを宿主大腸菌に導入し、可溶性タンパク質として発現させることで組換え型の精製酵素を得た。
以下ステップ毎に説明する。
【００１２】
＜クローニング及びシークエンシング＞
チューリップの花弁及び葯から精製したチューリッポシドＡ変換酵素（チューリッポシドＡをチューリッパリンＡに変換する酵素，ｔｕｌｉｐｏｓｉｄｅＡ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ：ＴｇＴＣＥＡ）のＮ末端アミノ酸配列及び花弁から精製した同酵素の内部ペプチド配列に基づいて下記の縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマー）を設計した。
ＴＣＥ−Ｎ−Ｆ１：gciytigayg aygarathgt（配列番号１）
ＴＣＥ−Ｎ−Ｆ２：gaygaygara thgtiytiga（配列番号２）
ＴＣＥ−ｉｎｔ−Ｒ１：acigtigtic ciarraaick ytc（配列番号３）
ＴＣＥ−ｉｎｔ−Ｒ２：cciarraaic kytcdatigg icc（配列番号４）
上記縮重プライマーを用いて、チューリップ品種「紫水晶」の花弁由来ｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行い、当該遺伝子の部分配列を取得し、さらに５’ＲＡＣＥ法及び３’ＲＡＣＥ法によりコード領域全長を含むｃＤＮＡ断片を単離した。
次に５’及び３’非翻訳領域に設計した下記のプライマーを用いて上記ｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行った。
ＴＣＥ−ＲＴ−Ｆ２：aagcatttct gtgaaatcaa ttaagtg（配列番号５）
ＴＣＥ−ＲＴ−Ｒ１：catcataaca atgccttaaa gagg（配列番号６）
その時の条件を下記に示す。
＜ＰＣＲ反応液（５０μｌ）組成＞
鋳型ｃＤＮＡ  １μｌ、１００ｐｍｏｌ/μｌプライマー  各０．２５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ３μl、１０ｘｂｕｆｆｅｒ  ５ μｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １μｌ、水  ３４．５μｌ
＜ＰＣＲ反応サイクル＞
９４℃、２分の加熱の後、変性（９８℃、１０秒）→アニーリング（５５℃、３０秒）→伸長（６８℃、１分）の３ステップからなる反応サイクルを３５回行った。
その結果、花弁由来ｃＤＮＡ１１クローンを得てシークエンシングしたところ、６種類のｃＤＮＡ配列が得られた。
その塩基配列とアミノ酸配列を下記に示す。
（１）−１．ＴｇＴＣＥＡ１の塩基配列を（配列番号７）に示す。
（１）−２．ＴｇＴＣＥＡ１のコドン対応アミノ酸配列を（配列番号８）に示す。
（１）−３．ＴｇＴＣＥＡ１のアミノ酸配列を（配列番号９）に示す。
（２）−１．ＴｇＴＣＥＡ２の塩基配列を（配列番号１０）に示す。
（２）−２．ＴｇＴＣＥＡ２のコドン対応アミノ酸配列を（配列番号１１）に示す。
（２）−３．ＴｇＴＣＥＡ２のアミノ酸配列を（配列番号１２）に示す。
（３）−１．ＴｇＴＣＥＡ３の塩基配列を（配列番号１３）に示す。
（３）−２．ＴｇＴＣＥＡ３のコドン対応アミノ酸配列を（配列番号１４）に示す。
（３）−３．ＴｇＴＣＥＡ３のアミノ酸配列を（配列番号１５）に示す。
（４）−１．ＴｇＴＣＥＡ４の塩基配列を（配列番号１６）に示す。
（４）−２．ＴｇＴＣＥＡ４のコドン対応アミノ酸配列を（配列番号１７）に示す。
（４）−３．ＴｇＴＣＥＡ４のアミノ酸配列を（配列番号１８）に示す。
（５）−１．ＴｇＴＣＥＡ５の塩基配列を（配列番号１９）に示す。
（５）−２．ＴｇＴＣＥＡ５のコドン対応アミノ酸配列を（配列番号２０）に示す。
（５）−３．ＴｇＴＣＥＡ５のアミノ酸配列を（配列番号２１）に示す。
（６）−１．ＴｇＴＣＥＡ６の塩基配列を（配列番号２２）に示す。
（６）−２．ＴｇＴＣＥＡ６のコドン対応アミノ酸配列を（配列番号２３）に示す。
（６）−３．ＴｇＴＣＥＡ６のアミノ酸配列を（配列番号２４）に示す。
一方、上記（配列番号５）及び（配列番号６）のプライマーを用いたゲノムＰＣＲを行った結果、ゲノムクローン２２種が得られ、上記ｃＤＮＡのうちゲノムクローンに含まれるものは（１）ＴｇＴＣＥＡ１及び（２）ＴｇＴＣＥＡ２の２種であった。
その時の条件を下記に示す。
＜ＰＣＲ反応液（５０μｌ）組成＞
５０ｎｇ/μｌ  ゲノムＤＮＡ  １μｌ、１００ｐｍｏｌ/μｌプライマー  各０．２５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ３μl、１０ｘｂｕｆｆｅｒ  ５ μｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １μｌ、水  ３４．５μｌ
＜ＰＣＲ反応サイクル＞
９４℃、２分の加熱の後、変性（９８℃、１０秒）→アニーリング（５５℃、３０秒）→伸長（６８℃、２分）の３ステップからなる反応サイクルを３５回行った。
ＴｇＴＣＥＡ１及びＴｇＴＣＥＡ２の２種の配列はエステラーゼ／リパーゼｓｕｐｅｒ  ｆａｍｉｌｙに属し、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）のジベレリンレセプターＧＩＤ１Ｌ２と４５〜４６％、セイヨウリンゴ（Ｍａｌｕｓ  ｐｕｍｉｌａ）のＣＸＥ  ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅと４４％のアミノ酸相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有していた。
図２の表は（１）ＴｇＴＣＥＡ１、（２）ＴｇＴＣＥＡ２、（３）ＴｇＴＣＥＡ３、（４）ＴｇＴＣＥＡ４、（５）ＴｇＴＣＥＡ５、（６）ＴｇＴＣＥＡ６のアミノ酸配列をそれぞれ示し、ＴｇＴＣＥＡ１〜Ａ６（１）〜（６）のアミノ酸配列を比較すると、２８番目、５６〜５８番目、１０９〜１２１番目、３１０番目、３２４番目、３４６番目のアミノ酸が異なる、相同性の高いものであることが分かる。
よって、本発明に係るタンパク質は、１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を含む。
また、（６）ＴｇＴＣＥＡ６を除くと１〜７個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列となる。
【００１３】
＜組換え酵素の調製＞
ＴｇＴＣＥＡの全長アミノ酸配列と植物体からの精製酵素のＮ末端配列の比較によって推定されたシグナルペプチドを除いた成熟ポリペプチドを発現するように、当該配列を大腸菌発現ベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングした。
組換え酵素のＮ末端側にはヒスチジンタグ（６ｘＨｉｓ）を含むようにした。
組換えベクターを大腸菌ＢＬ２１Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ  ＲＩＬ（ＤＥ３）に導入し、得られた組換え菌をＬＢ培地にてＯＤ６６０＝０．６−０．８に達するまで３７℃，２００ｒｐｍで培養した後、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、１８℃、２００ｒｐｍで１８時間培養することで組換え酵素を発現させた。
発現誘導後の菌体に超音波処理を施し、得られた可溶性タンパク質画分をＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｇｉｎを用いたアフィニティークロマトグラフィーに供した。
イミダゾールによって溶出された活性画分を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００によるゲルろ過クロマトグラフィーに供し、得られた活性画分を合一したものを精製組換え酵素とした。
ＴｇＴＣＥＡ１およびＴｇＴＣＥＡ２の組換え酵素精製時のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を図１（ａ）、（ｂ）にそれぞれ示す。  
精製組換え酵素のＧ３０００ＳＷｘｌカラムによるゲルろ過クロマトグラフィー分析の結果、組換え酵素は植物体由来のｎａｔｉｖｅ酵素と同様に２量体酵素として発現していることが分かった。
【００１４】
上記にて精製した組換え酵素の酵素活性試験を次のように行った。
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ６．５）中、４ｍＭチューリッポシドＡと組換え酵素を含む酵素反応液を室温で１０分インキュベートした後、０．５Ｍリン酸にて反応を停止し、酵素反応生成物であるチューリッパリンＡの生成量をＨＰＬＣにて定量した。  その結果、下記表１及び表２に示すようにＴｇＴＣＥＡ１およびＴｇＴＣＥＡ２の組換え酵素は両方ともチューリッポシドＡをチューリッパリンＡに変換する酵素活性を有していた。
また、上記両方の組換え酵素はチューリッポジドＢをチューリッパリンＢに変換する酵素活性を有していることが明らかになった。
【００１５】
５００ｍＬで培養した組換え大腸菌からのＴｇＴＣＥＡ１酵素の精製
【表１】
2012125162.tif 000013
１Ｕ；１分間に１μｍｏｌのチューリッパリンＡを生成する酵素量
【００１６】
組み換え酵素はチューリッポシドＢに対しても酵素活性を示した（２４．４Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）
【００１７】
５００ｍＬで培養した組換え大腸菌からのＴｇＴＣＥＡ２酵素の精製
【表２】
2012125162.tif 000014
１Ｕ；１分間に１μｍｏｌのチューリッパリンＡを生成する酵素量
【００１８】
組み換え酵素はチューリッポシドＢに対しても酵素活性を示した（２７．３Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）
【図１】
2012125162.tif 000015
【図２】
2012125162.tif 000016
【配列表】
2012125162000001.app