(57)【要約】【課題】リガンド結合活性を維持した状態で膜貫通受容体を大量発現させる技術を提供する。【解決手段】膜貫通受容体をコードする遺伝子が導入され、前記膜貫通受容体を細胞膜上で発現可能である組換え真核細胞であって、前記膜貫通受容体は細胞膜の内側にＣ末端が存在するものであり、前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドが連結され、リガンド結合活性を保持した状態で前記膜貫通受容体を発現可能である組換え真核細胞が提供される。膜貫通受容体をコードする遺伝子を細胞に導入する工程を有し、前記膜貫通受容体は細胞膜の内側にＣ末端が存在するものであり、前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドを連結することにより、前記膜貫通受容体のリガンド結合活性を保持しつつ細胞内シグナル伝達を抑制する細胞内シグナル伝達抑制方法も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜貫通受容体をコードする遺伝子が導入され、前記膜貫通受容体を細胞膜上で発現可能である組換え真核細胞であって、前記膜貫通受容体は細胞膜の内側にＣ末端が存在するものであり、前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドが連結され、リガンド結合活性を保持した状態で前記膜貫通受容体を発現可能であることを特徴とする組換え真核細胞。
【請求項２】
前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドが連結された膜貫通受容体をコードする遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項１に記載の組換え真核細胞。
【請求項３】
前記タンパク質又はポリペプチドの分子量は、６万以上かつ１８万以下であることを特徴とする請求項１又は２に記載の組換え真核細胞。
【請求項４】
前記膜貫通受容体は、７回膜貫通型受容体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の組換え真核細胞。
【請求項５】
前記７回膜貫通型受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体であることを特徴とする請求項４に記載の組換え真核細胞。
【請求項６】
前記Ｇタンパク質共役型受容体は、ＧＰＲ１１９又はアンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩであることを特徴とする請求項５に記載の組換え真核細胞。
【請求項７】
膜貫通受容体をコードする遺伝子を真核細胞に導入する工程を有し、前記膜貫通受容体は細胞膜の内側にＣ末端が存在するものであり、前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドを連結することにより、前記膜貫通受容体のリガンド結合活性を保持しつつ細胞内シグナル伝達を抑制することを特徴とする細胞内シグナル伝達抑制方法。
【請求項８】
前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドが連結された膜貫通受容体をコードする遺伝子を細胞に導入することを特徴とする請求項７に記載の細胞内シグナル伝達抑制方法。
【請求項９】
前記タンパク質又はポリペプチドの分子量は、６万以上かつ１８万以下であることを特徴とする請求項７又は８に記載の細胞内シグナル伝達抑制方法。
【請求項１０】
前記膜貫通受容体は、７回膜貫通型受容体であることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の細胞内シグナル伝達抑制方法。
【請求項１１】
前記７回膜貫通型受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体であることを特徴とする請求項１０に記載の細胞内シグナル伝達抑制方法。
【請求項１２】
前記Ｇタンパク質共役型受容体は、ＧＰＲ１１９又はアンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩであることを特徴とする請求項１１に記載の細胞内シグナル伝達抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組換え真核細胞、並びに、細胞内シグナル伝達抑制方法に関し、さらに詳細には、膜貫通受容体をコードする遺伝子が導入された組換え真核細胞、並びに、膜貫通受容体をコードする遺伝子を真核細胞に導入する細胞内シグナル伝達抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膜貫通受容体の中でも特にＧタンパク質共役型受容体（G protein-coupled receptor；ＧＰＣＲ）は、現在市販されている低分子医薬品の約半数がこの受容体を標的としているため、医薬品開発において極めて注目を集めている。ＧＰＣＲは７回膜貫通型受容体であり、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。すなわち、ＧＰＣＲの細胞外ドメインは、Ｎ末端ドメイン、細胞外第１ループ、細胞外第２ループ、および細胞外第３ループから構成されている。一方、ＧＰＣＲの細胞内ドメインは、細胞内第１ループ、細胞内第２ループ、細胞内第３ループ、およびＣ末端ドメインから構成されている。
【０００３】
医薬品スクリーニングの為のリガンド結合評価や膜貫通受容体の結晶化、又は膜貫通受容体そのものの基礎的研究を行う為には大量の受容体が必要である。そのためには、膜貫通受容体が細胞膜における構造とリガンド結合活性を維持した状態で、大量発現が可能な技術が必要不可欠である。ところが、一般的に、膜貫通受容体を大量発現させることは可溶性タンパク質に比べて困難である。
【０００４】
例として、ＧＰＣＲの一種であるヒト由来ＧＰＲ１１９（以下、「ｈＧＰＲ１１９」と称する。）を挙げる。ｈＧＰＲ１１９はグルコース依存性インスリン分泌性受容体であり、糖尿病に関連するターゲットである。ｈＧＰＲ１１９は、主に膵臓及び消化管に発現している。生理活性脂質であるリゾホスファチジルコリン及びオレイルエタノールアミド（ＯＥＡ）をリガンドとして相互に作用し、グルコース依存性インクレチンおよびインスリンの分泌を促進することが知られている。
【０００５】
ｈＧＰＲ１１９のｃＤＮＡが導入された組換え細胞は、例えばMultispan社から供給されており、市場から入手可能である。この細胞は、発現量指標となるＦＬＡＧタグをｈＧＰＲ１１９のＮ末端に挿入して発現させた細胞である。この細胞は、受容体そのもののリガンド結合活性はあるものの、抗ＦＬＡＧ抗体の染色では検出できない程度の発現量であるとされている。そこで、ｈＧＰＲ１１９の発現量を増加させる技術が求められている。
【０００６】
ｈＧＰＲ１１９の発現量を増加させる方法に関し、Flp-In T-Rex ベクターsystem（インビトロジェン社）を用いた方法が知られている（非特許文献１）。そして、このベクターを用いて発現させた細胞に対してテトラサイクリンを添加すると、ｍＲＮＡ量を増加させることが報告されている。しかし、ｈＧＰＲ１１９発現量の増加については明記されておらず、実際のｈＧＰＲ１１９発現量の増加は定かでない。また、発現を行う宿主細胞にとって、ターゲットタンパク質が毒性または細胞の増殖阻害性を示す場合、ｍＲＮＡ量を増加させることで発現量を増加させることは、発現量増加の目的に対しては逆効果である。なぜなら、細胞に対しての毒性または増殖阻害性を示すタンパク質をより増やすことは、細胞へのダメージをより増やすことになるからである。根本的な解決には膜貫通受容体の性質に基づいて抜本的な改善手法を発明することが必要である。
【０００７】
非特許文献２によれば、動物細胞でＧＰＣＲの高発現株が取得できないのは、ＧＰＣＲが高発現になることでリガンドがなくてもシグナルが流れるようになり、細胞が正常に増殖しなくなるためと考えられている。
【０００８】
また非特許文献３によれば、ｈＧＰＲ１１９においては、過剰発現によってＧｓタンパク質の恒常的な活性化が引き起こされていることが示唆されている。このことから、ＧＰＣＲの発現における恒常的な活性化を抑えることが細胞増殖、ひいては大量発現に良い結果をもたらすと考えられる。Ｇタンパク質の活性化を抑える方法としては、Ｇタンパク阻害剤を加える方法が挙げられる。しかし、この方法は目的受容体以外のシグナル伝達も阻害するため、増殖阻害を引き起こすと考えられ、不適である。また目的受容体のアンタゴニストが公知である場合、アンタゴニストを培地に添加することで目的受容体に対して特異的にシグナル伝達を阻害することは可能であるが、非常にコストがかかる。また、アンタゴニストが公知でない場合は、この方法は適用できない。
【０００９】
ｈＧＰＲ１１９以外のＧＰＣＲにも、嗅覚受容体など、発現が非常に難しいものが数多くあると考えられ、それらの発現をうまくハンドリングできるようにすることで、医薬品開発や新たな創薬ターゲットの探索を効率的に進められるようになる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】HA Overton et al., Cell Metabolism. (2006) 3 pp.167-175
【非特許文献２】生物物理 45 (5) 236-242 (2005)
【非特許文献３】Y Sakamoto et al., Biochemical and biophysical Research Communications 351 (2006) 474-480
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このように、細胞膜における構造とリガンド結合活性を維持した状態で膜貫通受容体を大量発現させることには、多くの困難性がある。そこで本発明は、リガンド結合活性を維持した状態で膜貫通受容体を大量発現させる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題を解決するための方策を種々検討した。その結果、膜貫通受容体のＣ末端に所定以上の分子量を有するタンパク質を付加することにより、当該膜貫通受容体の発現量が増大させることができるとともに、その発現量、リガンド結合活性、及び細胞の状態（例えば形態）を長期間にわたって維持できることを見出した。さらに、これらの効果の要因として、細胞内シグナル伝達の抑制が関係していることを見出し、本発明を完成した。上記した課題を解決するために提供される本発明は、以下のとおりである。
【００１３】
請求項１に記載の発明は、膜貫通受容体をコードする遺伝子が導入され、前記膜貫通受容体を細胞膜上で発現可能である組換え真核細胞であって、前記膜貫通受容体は細胞膜の内側にＣ末端が存在するものであり、前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドが連結され、リガンド結合活性を保持した状態で前記膜貫通受容体を発現可能であることを特徴とする組換え真核細胞である。
【００１４】
本発明は、膜貫通受容体をコードする遺伝子が導入され、前記膜貫通受容体を細胞膜上で発現可能である組換え真核細胞に係るものである。本発明の組換え真核細胞においては、当該膜貫通受容体は細胞膜の内側にＣ末端が存在するものであり、当該膜貫通受容体のＣ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチド（以下、「付加タンパク質」と称することがある。）が連結されている。この構成により、膜貫通受容体のリガンド結合活性を維持しつつ、膜貫通受容体の発現量を増加させることができる。本発明の組換え真核細胞によれば、リガンド結合活性を維持した状態で膜貫通受容体を大量発現させることができる。
【００１５】
膜貫通受容体のＣ末端に連結される分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチド（付加タンパク質）は、１つのタンパク質又はポリペプチドで構成されていてもよいし、複数のタンパク質又はポリペプチドからなる集合体であってもよい。また、連結の様式は、共有結合（ペプチド結合等）と非共有結合のいずれでもよい。
【００１６】
請求項２に記載の発明は、前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドが連結された膜貫通受容体をコードする遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項１に記載の組換え真核細胞である。
【００１７】
本発明の組換え真核細胞は、「Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドが連結された膜貫通受容体をコードする遺伝子」、換言すれば「膜貫通受容体のＣ末端に付加タンパク質が連結されてなる融合タンパク質又は融合ポリペプチドをコードする遺伝子」が導入されている。すなわち本発明の組換え真核細胞では、膜貫通受容体と付加タンパク質とがペプチド結合を介して連結され、１つの融合タンパク質又は融合ポリペプチドを構成している。かかる構成により、付加タンパク質の連結が確実となり、膜貫通受容体の大量発現がより確実となる。
【００１８】
請求項３に記載の発明は、前記タンパク質又はポリペプチドの分子量は、６万以上かつ１８万以下であることを特徴とする請求項１又は２に記載の組換え真核細胞である。
【００１９】
かかる構成により、膜貫通受容体の発現量が特に大きいものとなる。
【００２０】
請求項１〜３のいずれかに記載の組換え真核細胞において、前記膜貫通受容体は、７回膜貫通型受容体であることが好ましい（請求項４）。
【００２１】
請求項４に記載の組換え真核細胞において、Ｇタンパク質共役型受容体であることが好ましい（請求項５）。
【００２２】
請求項５に記載の組換え真核細胞において、前記Ｇタンパク質共役型受容体は、ＧＰＲ１１９又はアンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩであってもよい（請求項６）。
【００２３】
請求項７に記載の発明は、膜貫通受容体をコードする遺伝子を真核細胞に導入する工程を有し、前記膜貫通受容体は細胞膜の内側にＣ末端が存在するものであり、前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドを連結することにより、前記膜貫通受容体のリガンド結合活性を保持しつつ細胞内シグナル伝達を抑制することを特徴とする細胞内シグナル伝達抑制方法である。
【００２４】
本発明は細胞内シグナル伝達抑制方法に係るものである。本発明は、膜貫通受容体をコードする遺伝子を真核細胞に導入する工程を有し、当該膜貫通受容体は細胞膜の内側にＣ末端が存在するものである。そして、当該膜貫通受容体のＣ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチド（付加タンパク質）を連結する。これにより、膜貫通受容体のリガンド結合活性を保持しつつ細胞内シグナル伝達を抑制する。本発明を真核細胞に適用することにより、細胞内シグナル伝達抑制に起因する膜貫通受容体の大量発現を実現することができる。
【００２５】
本発明においても、膜貫通受容体のＣ末端に連結される分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチド（付加タンパク質）は、１つのタンパク質又はポリペプチドで構成されていてもよいし、複数のタンパク質又はポリペプチドからなる集合体であってもよい。また、連結の様式は、共有結合（ペプチド結合等）と非共有結合のいずれでもよい。
【００２６】
請求項７に記載の細胞内シグナル伝達抑制方法において、前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドが連結された膜貫通受容体をコードする遺伝子を細胞に導入することが好ましい（請求項８）。
【００２７】
請求項７又は８に記載の細胞内シグナル伝達抑制方法において、前記タンパク質又はポリペプチドの分子量は、６万以上かつ１８万以下であることが好ましい（請求項９）。
【００２８】
請求項７〜９のいずれかに記載の細胞内シグナル伝達抑制方法において、前記膜貫通受容体は、７回膜貫通型受容体であることが好ましい（請求項１０）。
【００２９】
請求項１０に記載の細胞内シグナル伝達抑制方法において、前記７回膜貫通型受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体であることが好ましい（請求項１１）。
【００３０】
請求項１１に記載の細胞内シグナル伝達抑制方法において、前記Ｇタンパク質共役型受容体は、ＧＰＲ１１９又はアンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩであってもよい（請求項１２）。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の組換え真核細胞によれば、リガンド結合活性を維持した状態で膜貫通受容体を大量発現させることができる。また、長期継代培養が可能である。その結果、膜画分の大量調製及び精製が容易になり、膜貫通受容体の結晶化プロセスにおいて膜画分調製のコストが低減できる。また、医薬品スクリーニングのための膜貫通受容体のリガンド結合評価において、低コスト化が可能となる。
【００３２】
本発明の細胞内シグナル伝達抑制方法についても同様であり、細胞内シグナル伝達抑制に起因する膜貫通受容体の大量発現と長期継代培養を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ｈＧＰＲ１１９のＣ末端に各種タンパク質を連結させた場合の解析結果を表すヒストグラムであり、（ａ）は陰性対照、（ｂ）はＦＬＡＧタグ（Ｎ末端）を連結させた場合、（ｃ）はシグナル配列（Ｎ末端）とＥＧＦＰを連結させた場合、（ｄ）はＧｒｏＥＬを連結させた場合を表す。
【図２】ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にＧｒｏＥＬの１〜７量体を連結させた場合の解析結果を表すヒストグラムであり、（ａ）は陰性対照、（ｂ）〜（ｈ）はそれぞれＧｒｏＥＬの１〜７量体を連結させた場合を表す。
【図３】蛍光顕微鏡による細胞の観察結果を表す写真であり、（ａ）は、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にＥＧＦＰのみを連結させた場合、（ｂ）は、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にＥＧＦＰとＧｒｏＥＬ２量体を連結させた場合を表す。
【図４】継代によるｈＧＰＲ１１９発現量の経時変化を表すグラフである。
【図５】ｈＧＰＲ１１９のｃＡＭＰシグナル測定結果を表すグラフである。
【図６】ｈＡＧＴＲ１のリガンド結合活性の解析結果を表すヒストグラムであり、（ａ）は陰性対照、（ｂ）は陽性対照、（ｃ）は、ｈＡＧＴＲ１のＣ末端に付加タンパク質を連結しない場合、（ｄ）は、ｈＡＧＴＲ１のＣ末端にＧｒｏＥＬ２量体を連結させた場合、（ｅ）は、ｈＡＧＴＲ１のＣ末端にＧｒｏＥＬ３量体を連結させた場合を現す。
【図７】ｈＡＧＴＲ１のカルシウムシグナル測定実験の結果を表すグラフであり、（ａ）は陽性対照、(ｂ)はＧｒｏＥＬ２量体を連結させた場合、（ｃ）はＧｒｏＥＬ３量体を連結させた場合、（ｄ）は陰性対照を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の１つの様相は、膜貫通受容体をコードする遺伝子が導入され、前記膜貫通受容体を細胞膜上で発現可能である組換え真核細胞であって、前記膜貫通受容体は細胞膜の内側にＣ末端が存在するものであり、前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドが連結され、リガンド結合活性を保持した状態で前記膜貫通受容体を発現可能であることを特徴とする組換え真核細胞である。
【００３５】
膜貫通受容体としては、Ｃ末端が細胞膜の内側に存在するものであれば特に限定はない。貫通の回数は、１回でもよいし、３回以上でもよい。またシグナル伝達機構についても限定はなく、例えば、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、イオンチャネル型受容体、酵素連結型受容体のいずれでもよい。
【００３６】
好ましい実施形態では、膜貫通受容体が７回膜貫通型受容体であり、より好ましくはＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である。ＧＰＣＲの例としては、ＧＰＲ１１９、アンジオテンシンＩＩ受容体、ＣＣケモカイン受容体、ＣＸＣケモカイン受容体、Ｃケモカイン受容体、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体、嗅覚受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、アドレナリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、セロトニン受容体、アンギオテンシン受容体、カンナビノイド受容体、コレシストキニン受容体、ドーパミン受容体、Ｐ２Ｙ受容体、グルカゴン受容体、ヒスタミン受容体、ガストリン受容体、オピオイド受容体、ロドプシン、セクレチン受容体、ソマトスタチン受容体、オーファン受容体、などが挙げられる。
【００３７】
本発明の組換え真核細胞では、導入された遺伝子により発現される膜貫通受容体のＣ末端に、分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチド（付加タンパク質）が連結されている。付加タンパク質は、分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドで、且つリガンド結合活性を保持した状態で当該膜貫通受容体を発現可能とするものであれば特に限定はない。付加タンパク質は、細胞内で可溶性の状態で発現されるものであることが好ましい。
【００３８】
好ましい実施形態では、付加タンパク質の分子量が６万以上１８万以下である。この範囲であれば、膜貫通受容体の発現量がより大きくなる。例えば、分子シャペロンの一種であるシャペロニン（chaperonin）を構成するサブユニット（「ＨＳＰ６０」ともいう）は、分子量が約６万であり、付加タンパク質として好適に採用される。複数のシャペロニンサブユニットを直列に連結させたシャペロニンサブユニットの連結体（特許第４０３８５５５号公報に記載）も、付加タンパク質として好適に採用される。シャペロニンの例として、大腸菌由来シャペロニンであるＧｒｏＥＬが挙げられる。ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子は、宿主となる動物細胞との関係においてマイナーコドンを含んでおらず、特に好適に採用される。ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子の塩基配列を配列番号４に示す。
【００３９】
なお、細胞内における局在の標識マーカーとして、膜貫通受容体のＣ末端に緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ；分子量２万７千）を連結させる技術が公知である。しかし、後述の実施例で示されるように、本発明における付加タンパク質としてＥＧＦＰを用いても、膜貫通受容体の発現量を増大させることはできない。本発明における付加タンパク質は、分子量が３万以上であることが必要である。
【００４０】
膜貫通型受容体と付加タンパク質との連結の態様としては、これらがペプチド結合を介して連結された態様が代表的である。この場合は、膜貫通型受容体のＣ末端に付加タンパク質が連結されてなる融合タンパク質又は融合ポリペプチドを、細胞内で発現させればよい。具体的には、前記融合タンパク質をコードする遺伝子を、発現可能な状態で導入すればよい。
【００４１】
ペプチド結合以外の連結様式を利用することもできる。一例を挙げると、ＦＬＡＧタグのようなタグ配列を膜貫通型受容体のＣ末端に連結する。そして、このタグ配列を認識する抗体を結合させる。これにより、タグ配列と抗体とからなる集合体が付加タンパク質として機能できるようになる。この場合には、膜貫通受容体とタグ配列との融合タンパク質と、タグ配列を認識する抗体を、別々のベクター上で共発現させればよい。抗体としては、例えば、Ｆｖ型抗体等の抗体断片を用いることができる。付加タンパク質の分子量は、タグ配列の数およびタグ配列に結合する抗体の数を調整することにより、自由に設定することができる。タグ配列の例としては、ＦＬＡＧタグの他、ｃ−ｍｙｃタグ、Ｈａｌｏタグ、ＧＦＰなどが挙げられる。
【００４２】
膜貫通受容体のＮ末端には、シグナル配列を付与してもよい。これにより、細胞内で発現した膜貫通受容体の細胞膜への移行を容易にすることができる。当該シグナル配列としては、小胞体輸送に関連するものであれば特に限定はない。例として、ＳｉｇｎａｌＩＰのソフト解析から推定されるマウスエンドセリン受容体タイプＡのシグナル配列（以下、「ｍＡｓｓ」と称する。）が挙げられる。
【００４３】
本発明の組換え真核細胞の宿主となる細胞としては、動物細胞が好ましく用いられる。動物細胞の例としては、ＣＯＳ−７細胞、マウスＡｔＴ−２０細胞、ラットＧＨ３細胞，ラットＭｔＴ細胞，マウスＭＩＮ６細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｌ９２９細胞などが挙げられる。動物細胞以外の例としては、酵母が挙げられる。
【００４４】
膜貫通受容体をコードする遺伝子の細胞への導入は、発現ベクターに組み込まれた状態で行うことが好ましい。例えば、膜貫通受容体（例えばｈＧＰＲ１１９）の遺伝子の３’末端に付加タンパク質（例えばＧｒｏＥＬサブユニット）の遺伝子を連結し、融合遺伝子を作製する。この融合遺伝子を発現ベクターに組み込んでプロモーターの制御下に置き、宿主細胞に導入する。発現ベクターの例としては、ｐＣＩ、ｐＳＩ、ｐＡｄＶａｎｔａｇｅ、ｐＴｒｉＥＸ、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳなどが挙げられる。また、発現ベクター上のプロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーター、ＡＭＬプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター等が挙げられる。さらに、発現ベクターには、プロモーター活性を増強するエンハンサーを含めてもよい。
【００４５】
ベクターを宿主細胞に導入する方法としては特に限定はなく、公知の方法を採用することができる。例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、遺伝子銃を用いた方法が挙げられる。
【００４６】
本発明の他の様相は、膜貫通受容体をコードする遺伝子を真核細胞に導入する工程を有し、前記膜貫通受容体は細胞膜の内側にＣ末端が存在するものであり、前記Ｃ末端に分子量３万以上のタンパク質又はポリペプチドを連結することにより、前記膜貫通受容体のリガンド結合活性を保持しつつ細胞内シグナル伝達を抑制することを特徴とする細胞内シグナル伝達抑制方法である。本発明の細胞内シグナル伝達抑制方法においても、上記した実施形態と同様の実施形態が可能である。
【００４７】
ＧＰＣＲは、他のＧＰＣＲとヘテロダイマーを形成したり、また他のタンパク質と会合することが報告されている（Nakahataら，YAKUGAKU ZASSHI, 127, 3-14(2007)）。ＧＰＣＲは種類によっては、発現や活性の調節に必要な別の因子が関与していることがある。本発明によって膜貫通受容体の大量精製が可能となることで実験が容易となり、これまで未知であったＧＰＣＲの活性調節に関与する因子を発見できる可能性がある。未知の因子を見出すことは、ＧＰＣＲの発現制御をより容易に行うことにつながる。
【００４８】
また、ＧｒｏＥＬは天然状態では７量体を１つのリングとした構造を形成する。よって、Ｃ末端に６個以下のＧｒｏＥＬサブユニットを連結させたＧＰＣＲを精製し、ＧｒｏＥＬサブユニット単体を後から添加することで７量体を形成させ、ＧｒｏＥＬの構造体が形成するリング構造内にＧＰＣＲを閉じ込めた複合体を形成させることが可能である。ＧｒｏＥＬは２次元結晶が作製可能であることから、この複合体を用いた結晶構造解析も可能である。
【００４９】
膜貫通受容体のＣ末端と付加タンパク質との連結部分に、プロテアーゼによる切断サイトを導入しておくと、膜貫通受容体を大量発現させた後にプロテアーゼを添加することにより、膜貫通受容体のみを大量精製することができる。当該プロテアーゼと切断サイトの例としては、トロンビン、エンテロカイネース、活性型血液凝固第１０因子等の限定分解型プロテアーゼ等とそれらの切断サイトが挙げられる。
【００５０】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
（１）ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製
大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株（ノバジェン社）からゲノムＤＮＡを抽出・精製した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１及び２示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子（配列番号４）を含むＤＮＡ断片を増幅した（以下、「ＤＮＡ断片Ａ」と称する。）。ＤＮＡ断片Ａには、プライマーに由来して、５'末端にＳａｌＩサイト、３'末端にストップコドン（ＴＡＡ）をコードする配列及びＮｏｔＩサイトが導入された。すなわち、ＤＮＡ断片Ａに含まれるＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子は、ストップコドンを有するものである。
【００５２】
一方、前記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１及び３示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子（配列番号４）を含むＤＮＡ断片を増幅した（以下、「ＤＮＡ断片Ｂ」と称する。）。ＤＮＡ断片Ｂには、プライマーに由来して、５'末端にＳａｌＩサイト、３'末端にＸｈｏＩサイトが導入された。すなわち、ＤＮＡ断片Ｂに含まれるＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子は、ストップコドンを有さないものである。
【００５３】
（２）ヒト由来ＧＰＲ１１９（ｈＧＰＲ１１９）遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製
ＮＣＢＩデータベースのヌクレオチド番号NM_178471の情報に基づいて、ｈＧＰＲ１１９遺伝子（ＤＮＡ）（配列番号１２）を人工遺伝子合成（GenScript社）にて取得した。この人工合成ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ｈＧＰＲ１１９遺伝子（配列番号１２）を含むＤＮＡ断片を増幅した（以下、「ＤＮＡ断片Ｃ」と称する。）。ＤＮＡ断片Ｃには、プライマーに由来して、５'末端にＮｈｅＩサイト、３'末端にストップコドンをコードする配列及びＸｈｏＩサイトが導入された。すなわち、ＤＮＡ断片Ｃに含まれるｈＧＰＲ１１９遺伝子は、ストップコドンを有するものである。
【００５４】
一方、前記人工合成ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び７示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ｈＧＰＲ１１９遺伝子（配列番号１２）を含むＤＮＡ断片を増幅した（以下、「ＤＮＡ断片Ｄ」と称する。）。ＤＮＡ断片Ｄには、プライマーに由来して、５'末端にＮｈｅＩサイト、３'末端にＸｈｏＩサイトが導入された。すなわち、ＤＮＡ断片Ｄに含まれるｈＧＰＲ１１９遺伝子は、ストップコドンを有さないものである。
【００５５】
（３）ヒト由来アンジオテンシン受容体遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製
NCBIのACCESSION番号NM_000685の情報に基づいて、ヒト由来アンジオテンシンＩＩ受容体タイプＩ（ｈＡＧＴＲ１）遺伝子（配列番号１６）を人工遺伝子合成（GenScript社）にて取得した。人工合成したｈＡＧＴＲ１遺伝子を鋳型とし、配列番号１３及び１４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ｈＡＧＴＲ１遺伝子（配列番号１６）を含むＤＮＡ断片を増幅した（以下、「ＤＮＡ断片Ｅ」と称する。）。ＤＮＡ断片Ｅには、プライマーに由来して、５'末端にＮｈｅＩサイト、３'末端にストップコドンをコードする配列及びＮｏｔＩサイトが導入された。すなわち、ＤＮＡ断片Ｅに含まれるｈＡＧＴＲ１遺伝子は、ストップコドンを有するものである。
【００５６】
一方、前記人工合成ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３及び１５示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ｈＡＧＴＲ１遺伝子（配列番号１６）を含むＤＮＡ断片を増幅した（以下、「ＤＮＡ断片Ｆ」と称する。）。ＤＮＡ断片Ｆには、プライマーに由来して、５'末端にＮｈｅＩサイト、３'末端にＳａｌＩサイトが導入された。すなわち、ＤＮＡ断片Ｆに含まれるｈＡＧＴＲ１遺伝子は、ストップコドンを有さないものである。
【００５７】
（４）ＥＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（GenBank Accession#U55762、BD Biosciences, Clontech、CA、USA）を鋳型とし、配列番号１７及び１８に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、ＥＧＦＰ遺伝子（配列番号１９）を含むＤＮＡ断片を増幅した（以下、「ＤＮＡ断片Ｇ」と称する。）。ＤＮＡ断片Ｇには、プライマーに由来して、５'末端にＳａｌＩサイト、３'末端にＸｈｏＩサイトが導入された。すなわち、ＤＮＡ断片Ｇに含まれるＥＧＦＰ遺伝子は、ストップコドンを有さないものである。
【００５８】
（５）ｈＧＰＲ１１９遺伝子を含む各種ベクターの作製（一過性発現用）
哺乳動物細胞の一過性発現用ベクターであるpCI mammalian Expression Vector（プロメガ社）を、制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ（タカラバイオ社）を用いて制限酵素処理を行った。また、上記（１）で作製したＤＮＡ断片Ａ（ストップコドンを有するＧｒｏＥＬ遺伝子を含む断片）も同様に制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩを用いて制限酵素処理を行った。これらの断片をライゲーションキット（タカラバイオ社）を用いて連結した。これにより、pCI mammalian Expression VectorにＧｒｏＥＬサブユニット（分子量６万）遺伝子が挿入されたベクター（以下、「pCGベクター」と称する。）が作製された。
【００５９】
pCGベクターを制限酵素ＮｈｅＩおよびＳａｌＩ（タカラバイオ社）で処理を用いて制限酵素処理を行った。同様に、上記（２）で調製したＤＮＡ断片Ｄ（ストップコドンを有しないｈＧＰＲ１１９遺伝子を含む断片）についても制限酵素ＮｈｅＩおよびＳａｌＩで制限酵素処理を行った。これらの断片をライゲーションキットを用いて連結した。これにより、pCGベクターにｈＧＰＲ１１９が挿入されたベクター（以下、「pCG-hGPR119ベクター」と称する。）が作製された。
【００６０】
PCG-hGPR119ベクターを制限酵素ＮｈｅＩで制限酵素処理したサイトに、配列番号１０及び配列番号１１で示されるプライマー断片の等モル混合溶液を１００℃で３分インキュベートさせて室温に戻すことでアニールさせた断片（以下、「mAssFLAG断片」と称する。）をライゲーション反応させた。これにより、pCG-hGPR119ベクターにおけるｈＧＰＲ１１９のＮ末端にマウス由来エンドセリン受容体タイプＡのシグナル配列（ｍＡｓｓ）とＦＬＡＧタグを付加したベクター（以下、「pCG-mAssFLAG-hGPR119ベクター」と称する。）が作製された。
【００６１】
また、同様に、PCG-hGPR119ベクターを制限酵素ＮｈｅＩで制限酵素処理したサイトに、配列番号８及び配列番号９で示されるプライマー断片の等モル混合溶液を１００℃で３分インキュベートさせて室温に戻すことでアニールさせた断片（以下、「FLAG断片」と称する。）をライゲーション反応させた。これにより、pCG-hGPR119ベクターにおけるｈＧＰＲ１１９のＮ末端にＦＬＡＧタグが付加されたベクター（以下、「pCG-FLAG-hGPR119ベクター」と称する。）が作製された。
【００６２】
pCG-mAssFLAG-hGPR119ベクターを制限酵素ＳａｌＩで制限酵素処理した。また、上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ｂ（ストップコドンを有しないＧｒｏＥＬ遺伝子を含む断片）を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ（タカラバイオ社）で制限酵素処理した。これらの断片をライゲーションキットを用いて連結した。ＳａｌＩの制限酵素断片とＸｈｏＩの制限酵素断片はライゲーション可能であり、ＧｒｏＥＬ遺伝子が正方向の連結体としてライゲーションすることが可能である。これにより、pCG-mAssFLAG-hGPR119ベクターにさらにＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子が１個から６個付加された（ＧｒｏＥＬが２連結から７連結された）ベクター（以下、「pCG2-mAssFLAG-hGPR119ベクター」、「pCG3-mAssFLAG-hGPR119ベクター」、「pCG4-mAssFLAG-hGPR119ベクター」、「pCG5-mAssFLAG-hGPR119ベクター」、「pCG6-mAssFLAG-hGPR119ベクター」、「pCG7-mAssFLAG-hGPR119ベクター」とそれぞれ称する。）が得られた。
【００６３】
（６）ｈＧＰＲ１１９遺伝子を含む各種ベクターの作製（安定発現用）
哺乳動物細胞の安定発現用ベクターであるpIRESneo3ベクター（クロンテック社）を制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで制限酵素処理を行った。同様に、上述のpCG2-mAssFLAG-hGPR119ベクターも制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで制限酵素処理を行い、ｈＧＰＲ１１９とＧｒｏＥＬ２量体融合体に相当する遺伝子断片（以下、「hGPR119-(GroEL)2断片」と称する。）を得た。hGPR119-(GroEL)2断片とpIRESneo3ベクターをライゲーションキットを用いて連結し、pIRESneo3-hGPR119-(GroEL)2ベクターを得た。
【００６４】
pIRESneo3-hGPR119-(GroEL)2ベクターを再度制限酵素ＮｈｅＩで処理し、先に述べたmAssFLAG断片を挿入してpIRESneo3-mAssFLAG-hGPR119-(GroEL)2ベクターを得た。
【００６５】
続いて、pIRESneo3-mAssFLAG-hGPR119-(GroEL)2ベクターを制限酵素ＳａｌＩで制限酵素処理した後に、上記（４）で調製したＤＮＡ断片Ｇ（ストップコドンを有さないＥＧＦＰ遺伝子を含む断片）の制限酵素ＳａｌＩ処理済みの断片を挿入した。これにより、pIRESneo3-mAssFLAG-hGPR119-EGFP-(GroEL)2ベクターを得た。
【００６６】
（７）ｈＧＰＲ１１９遺伝子を含む各種ベクターの作製（ＥＧＦＰ融合、比較例）
pEGFP-N1ベクター（GenBank Accession番号  #U55762）のＮｈｅＩ制限酵素サイトとＸｈｏＩ制限酵素サイトを、それぞれ制限酵素ＮｈｅＩとＸｈｏＩで切断した。このサンプルの電気泳動を行い、ベクター断片側をWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社）によって回収した。回収したベクター断片をバクテリア由来アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）にて脱リン酸化処理を行った。一方、上記（２）で調製したＤＮＡ断片Ｄ（ストップコドンを有しないｈＧＰＲ１１９遺伝子を含む断片）についても同様に、制限酵素ＮｈｅＩとＸｈｏＩで切断後に電気泳動を行い、ｈＧＰＲ１１９に相当する断片をWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemによって回収した。これらのＤＮＡ断片を、ライゲーションキットを用いて連結し、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にＥＧＦＰが連結された融合タンパク質の遺伝子を含むベクター（以下、「pEGFP-hGPR119ベクター」と称する。）を得た。
【００６７】
pEGFP-hGPR119ベクターを制限酵素ＮｈｅＩで制限酵素処理し、そのサイトに、FLAG断片を挿入した。これにより、pEGFP-hGPR119ベクターにおけるｈＧＰＲ１１９のＮ末端にＦＬＡＧ配列が付加されたベクター（以下、「pEGFP-FLAG-hGPR119ベクター」と称する。）を得た。
【００６８】
pEGFP-hGPR119ベクターを制限酵素ＮｈｅＩで制限酵素処理した断片に、mAssFLAG断片を挿入し、pEGFP-hGPR119ベクターにおけるｈＧＰＲ１１９のＮ末端にマウス由来エンドセリン受容体タイプＡのシグナル配列が付加されたベクター（以下、「pEGFP-mAssFLAG-hGPR119ベクター」と称する。）が作製された。
【００６９】
（８）ｈＡＧＴＲ１遺伝子を含む各種ベクターの作製（一過性発現用）
上記（５）で作製したpCGベクターを制限酵素ＮｈｅＩおよびＳａｌＩを用いて制限酵素処理を行った。同様に、上記（３）で調製したＤＮＡ断片Ｆ（ストップコドンを有しないｈＡＧＴＲ１遺伝子を含む断片）についても制限酵素ＮｈｅＩおよびＳａｌＩで制限酵素処理を行った。それぞれの断片をライゲーションキット用いて連結した。これにより、pCGベクターにｈＡＧＴＲ１遺伝子が挿入されたベクター（以下、「pCG-hAGTR1ベクター」と称する。）が作製された。
【００７０】
続いて、pCG-hAGTR1ベクターを制限酵素ＮｈｅＩで制限酵素処理し、そのサイトにFLAG断片を挿入した。これにより、pCG-hAGTR1ベクターにおけるｈＡＧＴＲ１のＮ末端にＦＬＡＧ配列が付加されたベクター（以下、「pCG-FLAG-hAGTR1ベクター」と称する。）を得た。
【００７１】
pCG-FLAG-hAGTR1ベクターを制限酵素ＳａｌＩで制限酵素処理し、続いて上記（１）で調製したＤＮＡ断片Ｂ（ストップコドンを有しないＧｒｏＥＬ遺伝子を含む断片）を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩで制限酵素処理した。これらの断片をライゲーションキットを用いて連結した。ＳａｌＩの制限酵素断片とＸｈｏＩの制限酵素断片はライゲーション可能であり、ＧｒｏＥＬ遺伝子が正方向の連結体としてライゲーションすることが可能である。これにより、pCG-FLAG-hAGTR1ベクターにさらにＧｒｏＥＬ遺伝子が１個から２個付加された（ＧｒｏＥＬが２連結から３連結された）ベクター（以下、「pCG2-FLAG-hAGTR1ベクター」、「pCG3-FLAG-hAGTR1ベクター」とそれぞれ称する。）が得られた。
【００７２】
哺乳動物細胞の安定発現用ベクターであるpIRESneo3ベクター（クロンテック社）を制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで制限酵素処理を行った。同様に、上記（３）で調製したＤＮＡ断片Ｅ（ストップコドンを有するｈＡＧＴＲ１遺伝子を含む断片）も制限酵素ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで制限酵素処理を行った。これらの断片とpIRESneo3ベクターをライゲーションキットを用いて連結し、pIRESneo3-hAGTR1ベクターを得た。このベクターを再度制限酵素ＮｈｅＩで処理し、先に述べたＦＬＡＧ断片を挿入してpIRESneo3-FLAG-hAGTR1ベクターを得た。
【００７３】
構築した各ベクターと発現される膜貫通受容体の構成を表１に纏めた。
【表１】
2012120507.tif 000003
【００７４】
（９）ｈＧＰＲ１１９の安定発現細胞の作製
宿主細胞としてＨＥＫ２９３細胞（Stratagene社）を用いた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はネオマイシン耐性であるため、安定発現細胞の作製にはＨＥＫ２９３細胞が宿主細胞として適している。
pEGFP-mAssFLAG-h119ベクター、pIRESneo3-mAssFLAG-hGPR119-(GroEL)2ベクター、またはpIRESneo3-mAssFLAG-h119-EGFP-(GroEL)2ベクターを、Lipofectamine 2000（インビトロジェン社）およびOpti-MEM（ギブコ社）を用いて、プロトコールに従い、DNA(μg)/Opti-MEM(ml)=192μg / 2.4 ml、Lipofectamine(μl)/Opti-MEM(ml)=180μl / 2.4mlの組成でＨＥＫ２９３細胞へ導入した。
遺伝子導入２日後、細胞をトリプシンで剥離・回収し、フローサイトメーター（ＦＣＭ; FACS Calibur、ベクトンディッキンソン社）にて発現を確認した。さらに遺伝子が導入された細胞を６ウェルプレート（コーニング社）へ２．０×１０5cellsずつ播種し、通常培地に抗生物質Ｇ４１８を２００μg／ｍＬ〜１２００μg／ｍＬの濃度範囲で加え、薬剤選択培地にて培養を行った。培地交換を行いながら遺伝子未導入細胞が死滅後、ウェルがコンフルエントになったら再びＦＣＭにて発現を確認した。
各Ｇ４１８濃度で得られた薬剤耐性株から、限界希釈を行い、通常培地にて２週間培養後にコロニーを形成しているウェルから６ウェルへ移した（これ以後、２００μg／ｍＬの選択培地（１０％ＦＢＳ、0.1 mM ＮＥＡＡ混合ＤＭＥＭ培地）にて培養、必要に応じて濃度を変えた）。ウェルがコンフルエントになった時点でＦＣＭにて発現を確認し、発現量が高いクローンをスクリーニングした。
この操作によって得られた安定発現細胞株を、それぞれ、「mAssFLAG-hGPR119-EGFP/HEK293細胞」、「mAssFLAG-hGPR119-（GroEL）2/HEK293細胞」、「mAssFLAG-hGPR119-EGFP-(GroEL)2/HEK293細胞」とした。
【００７５】
（１０）ｈＡＧＴＲ１の安定発現細胞の作製
宿主細胞として、ＣＨＯ細胞を用いた。
pIRESneo3-FLAG-hAGTR1ベクターを用い、Lipofectamine 2000とOpti-MEMを用いて上記（９）と同様の操作を行った。この操作によって得られたｈＡＧＴＲ１安定発現細胞株を、「FLAG-hAGTR1/CHO細胞」とした。
【００７６】
作製した各安定発現細胞と発現される膜貫通受容体の構成を表２に纏めた。
【表２】
2012120507.tif 000004
【００７７】
（１１）ｈＧＰＲ１１９のＦＣＭによる発現量測定
Lipofectamine 2000とOpti-MEMを用いて上記（９）と同様の操作を行い、pEGFP-FLAG-hGPR119ベクター、pEGFP-mAssFLAG-hGPR119ベクター、又はpCG-FLAG-hGPR119ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞へ導入し、ｈＧＰＲ１１９を一過性発現させた。
細胞表面に発現しているhGPR119の量を知るために、ＦＬＡＧ抗体の結合量を調べた。すなわち、濃度１０μｇ／ｍＬのＡＮＴＩ-ＦＬＡＧ Ｍ２ マウスモノクローナル抗体（シグマアルドリッチ社）（以下、単に「ＦＬＡＧ抗体」と略記することがある。）のＰＢＳ溶液（以下、「ＦＬＡＧ抗体溶液」と略記することがある。）を調製した。
pEGFP-FLAG-hGPR119ベクター、pEGFP-mAssFLAG-hGPR119ベクター、又はpCG-FLAG-hGPR119ベクターが導入された各ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をそれぞれＰＢＳで洗浄した後、ＦＬＡＧ抗体溶液を各細胞と混合し、４℃で１時間インキュベーションを行った。その後、各細胞をＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてフィコエリスリン（ＰＥ）で標識された抗マウスＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社製）を添加した後、４℃で３０分間インキュベーションを行った。各細胞をＰＢＳで洗浄後、フローサイトメーター（FACSCalibur）を用いて、各細胞とＦＬＡＧ抗体との相互作用を解析した。２次抗体染色操作の対照として、２次抗体染色していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞の解析も行った。
【００７８】
結果を図１（ａ）〜（ｄ）に示す。図１（ａ）は、ＦＬＡＧ抗体での染色を行わなかったpEGFP-FLAG-hGPR119一過性発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、図１(ｂ)は、ＦＬＡＧ抗体での染色を行ったpEGFP-FLAG-hGPR119一過性発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、図１（ｃ）は、ＦＬＡＧ抗体での染色を行ったpEGFP-mAssFLAG-hGPR119一過性発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、図１（ｄ）は、ＦＬＡＧ抗体での染色を行ったpCG-FLAG-hGPR119（Ｃ末端ＧｒｏＥＬ１量体融合）一過性発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果である。図１（ａ）の領域Ｃは、２次抗体染色していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞に相当する部分である。
【００７９】
図１（ａ）と図１（ｂ）との比較より、pEGFP-FLAG-hGPR119一過性発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ではＦＬＡＧ抗体による染色の差が見られなかった。このことから、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にＥＧＦＰ（分子量２万７千）を付加してもｈＧＰＲ１１９の発現量が増加することはなく、ｈＧＰＲ１１９は一般的な方法では発現できないことが分かった。
【００８０】
図１（ｃ）に示すように、Ｎ末端にシグナル配列（ｍＡｓｓ）を付加することによって、細胞膜上でのｈＧＰＲ１１９の発現量が増加することが分かった。なお、図中の領域Ｒ２は、ＥＧＦＰ融合ベクターの発現をバックグラウンドとした場合に比して、ＦＬＡＧ抗体の結合が観察される領域に相当する。Ｒ２領域に含まれる、ＦＬＡＧ抗体の結合における平均蛍光強度は５５であった。
【００８１】
図１（ｄ）に示すように、Ｃ末端にＧｒｏＥＬ（分子量６万）を付加することによっても、細胞膜上でのｈＧＰＲ１１９の発現量が増加することが分かった。領域Ｒ１は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をバックグランドにした場合に比して、ＦＬＡＧ抗体の結合が観察される領域に相当する。なお、Ｒ１領域に含まれるＦＬＡＧ抗体の結合における平均蛍光強度は６０であり、図１（ｃ）の平均蛍光強度（５５）よりも大きかった。
これにより、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にＧｒｏＥＬを付加することによりｈＧＰＲ１１９の発現量が増大することが示された。さらにＧｒｏＥＬの付加は、シグナル配列（ｍＡｓｓ）を付加して細胞膜への膜移行を行う従来の手法に比してより発現量を増加させることが分かった。
【００８２】
（１２）ＧｒｏＥＬ多量体を付加した場合の発現量検討
pCG-mAssFLAG-hGPR119ベクター、pCG2-mAssFLAG-hGPR119ベクター、pCG3-mAssFLAG-hGPR119ベクター、pCG4-mAssFLAG-hGPR119ベクター、pCG5-mAssFLAG-hGPR119ベクター、pCG6-mAssFLAG-hGPR119ベクター、又はpCG7-mAssFLAG-hGPR119ベクターを用いて、上記（１１）と同様のＦＣＭを行い、ＧｒｏＥＬ多量体（ｎ＝１〜７）をＣ末端に付加した場合のｈＧＰＲ１１９発現量の増加を調べた。結果を図２（ａ）〜（ｈ）に示す。図２（ａ）は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のみ（陰性対照）、図２（ｂ）〜（ｈ）はそれぞれｎ＝１〜７の場合を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に相当するバックグランド領域を図２（ａ）の領域Ｃとした。図２（ｂ）〜（ｈ）において、領域Ｃに対してＦＬＡＧ抗体の結合が観察される領域Ｒ１とし、その領域に含まれる平均蛍光強度を解析した。その結果、ｎ＝１の場合（分子量６万）は平均蛍光強度が７５、ｎ＝２（分子量１２万）の場合は平均蛍光強度が１１２、ｎ＝３の場合（分子量１８万）は平均蛍光強度が６１、ｎ＝４の場合（分子量２４万）は平均蛍光強度が５０、ｎ＝５の場合（分子量３０万）は平均蛍光強度が４４、ｎ＝６の場合（分子量３６万）は平均蛍光強度が３４、ｎ＝７の場合（分子量４２万）は平均蛍光強度が４１であった。
以上より、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にＧｒｏＥＬ多量体を付加することによってもｈＧＰＲ１１９の発現量が増大することが示された。また発現量に関し、ｎ＝２の場合に最も高い値が得られ、ｎ＝１，３の場合もそれに次ぐ高い値が得られた。
【００８３】
（１３）顕微鏡観察による細胞におけるｈＧＰＲ１１９の発現分布
ＧｒｏＥＬ付加によってｈＧＰＲ１１９の発現量が増加した細胞について、細胞の状態を蛍光顕微鏡を用いて観察した。ベクターとしてpEGFP-mAssFLAG-hGPR119ベクターとpIRESneo3-mAssFLAG-h119-EGFP-(GroEL)2ベクターを用い、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞による一過性発現の系で行った。一過性発現は、Lipofectamine 2000とOpti-MEMを用いて上記（９）と同様の方法で行った。
プレート上の細胞を蛍光顕微鏡（オリンパスＩＸ７０、ＷＩＢフィルター、倍率４００倍）により観察した。結果を図３（ａ），（ｂ）に示す。図３（ａ）はpEGFP-mAssFLAG-hGPR119ベクターを用いた一過性発現細胞の場合、図３（ｂ）はpIRESneo3-mAssFLAG-h119-EGFP-(GroEL)2ベクターを用いた一過性発現細胞の場合の結果をそれぞれ示す。
【００８４】
その結果、pEGFP-mAssFAG-hGPR119ベクターを用いた一過性発現細胞（図３（ａ））は、pIRESneo3-mAssFLAG-h119-EGFP-GroEL2 ベクターを用いた一過性発現細胞（図３（ｂ））に比して、細胞内にタンパク質が局在しており、あまり細胞膜上に発現していないことが分かった。また細胞の形態についても、pEGFP-mAssFAG-hGPR119ベクターを用いた一過性発現細胞（図３（ａ））は丸みがかった細胞になっており、通常のＨＥＫ２９３Ｔ細胞とは異なった形態をとっているため、細胞に非常にストレスがかかった状態であった。それに対し、pIRESneo3-mAssFLAG-h119-EGFP-GroEL2ベクターを用いた一過性発現細胞（図３（ｂ））の場合は、細胞の形態は、通常のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に近い状態であり、発現も細胞膜により局在していることが分かった。
【００８５】
（１４）継代によるｈＧＰＲ１１９安定発現細胞における発現安定性検討
上記（９）で作製した、mAssFLAG-hGPR119-EGFP/HEK293細胞、mAssFLAG-hGPR119-(GroEL)2/HEK293細胞、およびmAssFLAG-hGPR119-EGFP-(GroEL)2/HEK293細胞を、安定発現株取得完了時点を０日目として継代を続け、経過時間ごとのｈＧＰＲ１１９の細胞表面におけるｈＧＰＲ１１９の発現量の経時変化をプロットした。発現量の測定は、上述のＦＬＡＧ抗体を用いたＦＣＭにて行った。結果を図４に示す。各プロットは、ＦＬＡＧ抗体で染色された細胞集団の蛍光強度の平均値である。すなわち、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にＥＧＦＰのみ（分子量２万７千）を付加した場合は、継代を重ねるごとに発現量が低下し、１４日目以降で発現量がほぼバックグランド程度に低下した（図４の（●））。これに対し、ＧｒｏＥＬ２量体（分子量１２万）またはＧｒｏＥＬ２量体とＥＧＦＰ（分子量１４万７千）を付加した場合は、継代を重ねても長期間にわたって高発現が維持された（図４の（■）と（▲））。
【００８６】
（１５）ｈＧＰＲ１１９のｃＡＭＰシグナル測定
上記（９）で作製した、mAssFLAG-hGPR119-EGFP/HEK293細胞、mAssFLAG-hGPR119-（GroEL）2/HEK293細胞、及びmAssFLAG-hGPR119-EGFP-(GroEL)2/HEK293細胞、並びにＨＥＫ２９３細胞（陰性対照）を用い、ｈＧＰＲ１１９のｃＡＭＰシグナルを測定した。ｈＧＰＲ１１９に対するリガンドとして、N-Oleoylethanolamine（ＯＥＡ）（シグマアルドリッチ社）を用いた。ｃＡＭＰ測定は、ｃＡＭＰ測定キット（CatchPoint Cyclic-AMP Fluorescent Assay Kit, モレキュラーデバイス社）を用いて行い、ＥＣ５０値を算出した。
【００８７】
結果を図５に示す。まず、mAssFLAG-hGPR119-EGFP/HEK293細胞（■）では、ＥＣ５０が６．７×１０-6Ｍであった。この値は非特許文献１に記載の値とほぼ同等であり、ｈＧＰＲ１１９が有する本来の活性と考えられた。すなわち、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にＥＧＦＰを付加してもｈＧＰＲ１１９の立体構造に変化はなく、かつシグナル抑制も起こっていないと考えられた。
一方、mAssFLAG-hGPR119-(GroEL)2/HEK293細胞（▼）では、mAssFLAG-hGPR119-EGFP/HEK293細胞（■）の曲線と比較して、ｃＡＭＰシグナル変異量がＯＥＡの添加量に対して小さく、ｃＡＭＰシグナルが抑制されていた。ＥＣ５０については１．７×１０-6Ｍであり、非特許文献１に記載の値とほぼ同等であることから、ｈＧＰＲ１１９が有する本来の活性と考えられた。すなわち、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にＧｒｏＥＬ２量体を付加してもｈＧＰＲ１１９の立体構造に変化はないと考えられた。
さらに、mAssFLAG-hGPR119-EGFP-(GroEL)2/HEK293細胞（◆）では、シグナル強度の変化が観察されず（ＥＣ５０が算出不能）、ＨＥＫ２９３細胞（陰性対照）と同レベルまでｃＡＭＰシグナルが抑制されていた。
以上より、ｈＧＰＲ１１９のＣ末端にタンパク質を付加した場合、ＥＧＦＰのみ（分子量２万７千）の付加ではｃＡＭＰシグナルが抑制されないが、ＧｒｏＥＬ２量体（分子量１２万）の付加及びＧｒｏＥＬ２量体とＥＧＦＰ（分子量１４万７千）の付加ではｃＡＭＰシグナルが抑制されることが示された。
なお、ＧｒｏＥＬ２量体とＥＧＦＰを付加した場合の方がＧｒｏＥＬ２量体のみの付加よりもシグナル伝達がより抑制されたのは、可能性として、分子量の違いによる立体障害の差によるものと考えられる。
【００８８】
（１６）フローサイトメトリーを用いたｈＡＧＴＲ１の蛍光リガンド結合実験
上記（１０）で作製したＦＬＡＧ-ｈＡＧＴＲ１/ＣＨＯ細胞（ｈＡＧＴＲ１の安定発現細胞）、並びに、pIRESneo3-FLAG-hAGTR１ベクター、pCG2-hAGTR１ベクター、又はpCG3-hAGTR1ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞で一過性発現させた細胞を用いて、ＦＣＭによる蛍光リガンド結合実験を行った。一過性発現は、Lipofectamine 2000とOpti-MEMを用いて上記（９）と同様の方法で行った。蛍光色素（Ａｌeｘa４８８）を結合したＡＴＩＩのリガンドとして、ＡＴＩＩ−Ａｌeｘa４８８（インビトロジェン社、Ｅｘ＝４９５ｎｍ、Ｅｍ＝５１９ｎｍ）を用いた。
【００８９】
各細胞を培養フラスコから剥がし、ＰＢＳで洗浄した後、３０μＭのＡＴＩＩ−Ａｌeｘa４８８のＰＢＳ溶液で、４℃で１時間インキュベーションを行った。その後、各細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメーター（FACSCalibur）を用いて、ｈＡＧＴＲ１発現細胞とＡＴＩＩの結合相互作用を解析した。
【００９０】
結果を図６（ａ）〜（ｅ）に示す。図６（ａ）はリガンドを添加していないｈＡＧＴＲ１の安定発現細胞の測定結果であり、バックグランドに相当する（陰性対照）。図６（ｂ）はリガンドを添加した場合のｈＡＧＴＲ１の安定発現細胞の測定結果である（陽性対照）。図６（ｂ）のように、安定発現細胞では細胞の集団全体がＸ軸方向（ＡＴＩＩ−Ａｌeｘa４８８の蛍光強度の増加方向）にシフトしており、リガンドが結合したことを示している。
図６（ｃ）はpIRESneo3-FLAG-hAGTR１ベクターを用いた一過性発現細胞、図６（ｄ）はpCG2-FLAG-hAGTR１ベクターを用いた一過性発現細胞、図６（ｅ）はpCG3-FLAG-hAGTR1ベクターを用いた一過性発現細胞の結果である。いずれの場合も、細胞の集団全体がＸ軸方向（ＡＴＩＩ−Ａｌeｘa４８８の蛍光強度の増加方向）にシフトしており、リガンドが結合していた。これは、ｈＡＧＴＲ１のＣ末端にＧｒｏＥＬ２量体またはＧｒｏＥＬ３量体を付加した場合でも、リガンド結合活性を保持していることを示していた。なお、宿主細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた場合はＸ軸方向へのシフトはみられなかった。
【００９１】
（１７）ｈＡＧＴＲ１のカルシウムシグナル測定実験
pCG2-hAGTR1ベクターとpCG3-hAGTR1ベクターの一過性発現ＣＨＯ細胞を用いて、細胞内Ｃａ2+シグナル伝達活性評価を行った。陽性対照としてpIRESneo3-FLAG-hAGTR1ベクターの一過性発現ＣＨＯ細胞を用いた（ｈＡＧＴＲ１発現、シグナル伝達あり）。陰性対照として、宿主細胞であるＣＨＯ細胞（ｈＡＧＴＲ１未発現、シグナル伝達なし）を用いた。
【００９２】
各細胞２×１０4個を９６穴マイクロタイタープレートに蒔き、播種したプレートの各穴にリガンドであるＡＴＩＩ（ペプチド研究所）を１０μＭになるように添加した。ＡＴＩＩを添加した後、各細胞がＡＴＩＩによって刺激された際の細胞内Ｃａ2+濃度の一過的上昇度を測定した。測定はＮ＝３で実施し、シグナル変化量をベースライン値（１０秒までの値）と最大との差分の平均値として算出した。Ｃａ2+濃度変化測定は、Ｃａ2+シグナル解析装置（ＦＬＩＰＲ；Molecular Devices社）及び細胞内Ｃａ染色キット（Ｃａ３ｋｉｔ；Molecular Devices社）を用いて行った。
【００９３】
結果を図７に示す。（ａ）はpIRESneo3-FLAG-hAGTR1ベクター（陽性対照）、（ｂ）はpCG2-FLAG-hAGTR1ベクター、（ｃ）はpCG3-FLAG-hAGTR1ベクターの、各一過性発現ＣＨＯ細胞の結果である。（ｄ）はＣＨＯ細胞の結果である（陰性対照）。図７においてリガンドであるＡＴＩＩを添加した横軸１０秒の地点をベース（最小値）とし、Ｃａ2+シグナル変化量の最大値との差に相当するシグナル変化量は、（ａ）：８４．３、（ｂ）：７４．２、（ｃ）：４９．５、（ｄ）：４７．０であった。
以上より、ｈＡＧＴＲ１のＣ末端にＧｒｏＥＬ２量体またはＧｒｏＥＬ３量体を連結することにより、細胞内Ｃａ2+シグナル伝達を抑制することができた。また、分子量が大きいＧｒｏＥＬ３量体（ｃ）の方が、ＧｒｏＥＬ２量体（ｂ）に比べてシグナル伝達抑制効果が高かった。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図３】
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【配列表】
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