(57)【要約】      （修正有）【課題】セルラーゼ（Ａ）の活性の持続性が高いセルラーゼ組成物及びこれを含有する洗剤組成物を提供する。【解決手段】下記セルラーゼ（Ａ）、下記セルラーゼ安定化剤（Ｂ）及び水を含有するセルラーゼ組成物（Ｃ）。セルラーゼ（Ａ）：特定のアミノ酸配列である、又はこのアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び付加からなる群より選ばれる少なくとも１種により変質したアミノ酸配列有するセルラーゼ。セルラーゼ安定化剤（Ｂ）：マンニトール、トレハロース、セロビオース、グリコール酸、ピロガロール、Ｎ−α−アセチルアルギニン、ソルビタンモノオレート、ソルビタントリオレート及びヤシ油脂肪酸ソルビタンモノエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種であるセルラーゼ安定化剤。セルラーゼ組成物（Ｃ）及び界面活性剤（Ｄ）を含有する洗剤組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記セルラーゼ（Ａ）、下記セルラーゼ安定化剤（Ｂ）及び水を含有するセルラーゼ組成物（Ｃ）。
セルラーゼ（Ａ）：配列番号１のアミノ酸配列である、又はこのアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び付加からなる群より選ばれる少なくとも１種により変質したアミノ酸配列を有するセルラーゼ。
セルラーゼ安定化剤（Ｂ）：マンニトール、トレハロース、セロビオース、グリコール酸、ピロガロール、Ｎ−α−アセチルアルギニン、ソルビタンモノオレート、ソルビタントリオレート及びヤシ油脂肪酸ソルビタンモノエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種であるセルラーゼ安定化剤。
【請求項２】
セルラーゼ（Ａ）、セルラーゼ安定化剤（Ｂ）及び水の含有量が、（Ａ）、（Ｂ）及び水の合計重量を基準として、（Ａ）が０．０００１〜０．１重量％、（Ｂ）が０．１〜２０重量％、水が７９.９〜９９．８９９９重量％である請求項１に記載のセルラーゼ組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のセルラーゼ組成物（Ｃ）及び界面活性剤（Ｄ）を含有する洗剤組成物。
【請求項４】
セルラーゼ組成物（Ｃ）及び界面活性剤（Ｄ）の含有量が、（Ｃ）及び（Ｄ）の合計重量を基準として、（Ｃ）が１〜９９重量％、（Ｄ）が１〜９９重量％である請求項３に記載の洗剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルラーゼ組成物及び洗剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、酵素の利用が飛躍的に拡大し、特にセルラーゼはその特性を活かしてさまざまな産業分野で利用されている。具体的な利用分野の一つは、産業用及び家庭用の洗剤である。セルラーゼは、洗浄作用を補助するための添加剤として、洗剤組成中に含まれている。しかし、洗剤組成物中のセルラーゼは不安定であることから、貯蔵の際に活性を失いやすい問題がある。特に液状やゲル状の洗剤組成物の場合、セルラーゼ活性の損失が顕著である。したがって、セルラーゼを液体の洗剤組成物に用いる際の貯蔵安定性が課題となっている。
セルラーゼ等の酵素の貯蔵安定性を改善する方法としては、酵素安定化剤を使用する方法があり、数多くの酵素安定化剤が知られている。例えば、ホウ素化合物を使用する方法（特許文献１、５及び６）、ポリオール（例えば１，２−プロパンジオール、ソルビトール及びグリセロール等）を使用する方法（特許文献２）、カルシウムイオン供給化合物（例えば塩化カルシウム及び酢酸カルシウム等）、ポリヒドロキシ化合物（グリセリン、１，２−ヘキサンジオール、１，２−ドデカンジオール、グルコース、ソルビトール及びマルトース等）又は蟻酸を使用する方法（特許文献３）、カルボン酸（例えば酢酸、プロピオン酸、アジピン酸及びコハク酸等）又はアミノ酸（例えばバリン、フェニルアラニン、ヒスチジン、プロリン及びメチオニン等）を使用する方法（特許文献４）、グルコサミン多糖のキトサンを使用する方法（非特許文献１）及びポリアミン（例えばプトレシン、スペルミジン及びスペルミン等）を使用する方法（非特許文献２）等があり、数多くの酵素安定化剤が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−５０７０８５号公報
【特許文献２】特開２００２−０６９４８８号公報
【特許文献３】特開２００９−１３８０５６号公報
【特許文献４】特開２００１−１５７５８１号公報
【特許文献５】特開２００６−２５７４３５号公報
【特許文献６】特開平１１−０６９９７３号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｕｄｒｉａｓｈｏｖａ  ＥＶ、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｋｈｉｍ．、３５（３）、２００９  Ｍａｙ−Ｊｕｎ、ｐ３６８〜３７５
【非特許文献２】Ｋｕｄｏｕ  Ｍ、Ｅｕｒ  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２７０（２２）、２００３  Ｎｏｖ、ｐ４５４７−４５５４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
また、本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列である、又はこのアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び付加からなる群より選ばれる少なくとも１種により変質したアミノ酸配列を有するものが、セルラーゼであることを見いだした。しかしながら、このセルラーゼを安定化することができる有効な安定化剤は知られていない。
本発明は、このセルラーゼが安定化され、セルラーゼ活性の持続性が高いセルラーゼ組成物及びこれを含有する洗剤組成物を提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、セルラーゼ（Ａ）の活性の持続性の高いセルラーゼ組成物を得るべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。すなわち、本発明のセルラーゼ組成物は、下記セルラーゼ（Ａ）、下記セルラーゼ安定化剤（Ｂ）及び水を含有するセルラーゼ組成物（Ｃ）である。
セルラーゼ（Ａ）：配列番号１のアミノ酸配列である、又はこのアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び付加からなる群より選ばれる少なくとも１種により変質したアミノ酸配列を有するセルラーゼ。
セルラーゼ安定化剤（Ｂ）：マンニトール、トレハロース、セロビオース、グリコール酸、ピロガロール、Ｎ−α−アセチルアルギニン、ソルビタンモノオレート、ソルビタントリオレート及びヤシ油脂肪酸ソルビタンモノエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種であるセルラーゼ安定化剤。
また、本発明の洗剤組成物は、セルラーゼ組成物（Ｃ）及び界面活性剤（Ｄ）を含有する洗剤組成物である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のセルラーゼ組成物は、長期保存後もセルラーゼ活性を保つことができる。また、本発明の洗剤組成物は、長期保存後も洗浄性を保つことができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明において、セルラーゼ（Ａ）は、配列番号１のアミノ酸配列である、又はこのアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び付加からなる群より選ばれる少なくとも１種により変質したアミノ酸配列を有するセルラーゼであり、β−１，４−グルカンのグリコシド結合を加水分解するというエンド−１，４−β−グルカナーゼ活性を有するセルラーゼである。
本発明において、セルラーゼ活性はエンド−１，４−β−グルカナーゼ活性を意味する。
また、本発明において、「セルラーゼ活性の持続性が高い」とは、一定期間保管した後に測定したセルラーゼ活性と、保管する直前に測定したセルラーゼ活性との差が小さく、一定のセルラーゼ活性を示すことを意味する。
【０００９】
配列番号１のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び付加からなる群より選ばれる少なくとも１種により変質したアミノ酸配列を有するセルラーゼとは、変質後も依然としてセルラーゼ活性を保持するアミノ酸配列を有するセルラーゼであり、配列番号１のアミノ酸配列と等価であるアミノ酸配列を有するセルラーゼを意味する。
上記アミノ酸の付加とは、配列番号１のアミノ酸配列中のアミノ酸とアミノ酸との間に、１若しくは数個のアミノ酸が付加することを意味し、アミノ酸配列のＮ及び／又はＣ末端へのアミノ酸の付加は含まない。
上記１若しくは数個は、セルラーゼ活性を有する観点から、１〜１０個が好ましく、さらに好ましくは１〜５個である。
【００１０】
セルラーゼ（Ａ）は、セルラーゼ活性を有するものであれば、配列番号１又はこのアミノ酸配列と等価であるアミノ酸配列のＮ及び／又はＣ末端に、ペプチド配列（Ｎ）を有していてもいい。（Ｎ）は、アミノ酸１個又はアミノ酸が２個以上結合したペプチド配列である。（Ｎ）として、具体的には、ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡＭＤ配列（配列番号２）等が挙げられる。
（Ｎ）を構成するアミノ酸の数は、セルラーゼ活性を有する観点から、１〜３０個が好ましく、さらに好ましくは１〜２０個、特に好ましくは１〜１０個である。
【００１１】
また、セルラーゼ（Ａ）は、上記（Ｎ）以外に、セルラーゼ（Ａ）のＮ又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９TM、ＣｒｕｚＴａｇ２２TM、ＣｒｕｚＴａｇ４１TM、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等が挙げられる。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ）  （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）  （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ  （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ  （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ  （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ  （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ  （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるセルラーゼ（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
【００１２】
セルラーゼ（Ａ）のセルラーゼ活性は、粘度測定法によって測定できる。粘度測定法は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）とセルラーゼ（Ａ）を作用させ、エンド形式でＣＭＣを加水分解した際に生じるＣＭＣの粘度の減少幅を観察する方法である。具体的には、下記の方法により測定できる。
【００１３】
＜粘度測定法＞
ｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸バッファー水溶液に、１７．５ｇ／ＬになるようにＣＭＣ（和光純薬社製）を溶解し、基質溶液を調整する。ｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸バッファー水溶液に、一定量のセルラーゼ（Ａ）を溶解したセルラーゼ（Ａ）溶液を調整する。基質溶液３ｍＬとセルラーゼ（Ａ）溶液５μＬを混合し、４０℃に温度を調節した粘度計（例えば、ＴＶＥ−２２Ｌ粘度計、２ｒｐｍ）に移す。混合直後に粘度を読み取り、１、２、３、４、５及び６分後に粘度を読み取る。セルラーゼ（Ａ）の濃度が異なるセルラーゼ（Ａ）溶液を用いて同様に測定する。セルラーゼ（Ａ）溶液及び基質溶液を混合直後の粘度と５分後の粘度を比較して、５分後の粘度が１／２となるセルラーゼ（Ａ）の量（ｍｇ）を、エンド−１，４−β−グルカナーゼ活性１単位と定義する。
【００１４】
上記粘度測定法によるエンド−１，４−β−グルカナーゼ活性は、洗浄性を向上させる観点から、１〜１００００単位／ｍｇが好ましく、さらに好ましくは５０〜２０００単位／ｍｇである。
【００１５】
本発明において、セルラーゼ組成物（Ｃ）は、セルラーゼ（Ａ）として、配列番号１又はこのアミノ酸配列と等価であるアミノ酸配列を有するセルラーゼ１種類を含んでいればよく、２種類以上含んでいてもいい。
【００１６】
上記セルラーゼ（Ａ）は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するセルラーゼ又はこのアミノ酸配列と等価のアミノ酸配列を有するセルラーゼをコードする遺伝子を微生物等の宿主に導入し、宿主を培養液中で培養し、培養液中からセルラーゼを採取及び精製することによって生産することができる。
【００１７】
なお、セルラーゼ（Ａ）をコードする遺伝子は、自然界等から得ることも可能ではあるが、更に部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することもできる。
【００１８】
セルラーゼ（Ａ）をコードする遺伝子を用いてセルラーゼ（Ａ）を生産する方法は、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、セルラーゼ（Ａ）をコードする遺伝子を組込み、この組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、組み換えベクターを含む形質転換体を得る。得られた形質転換体を培養し、この培養液からセルラーゼを採取すればよい。
【００１９】
組換えベクターは、適当なベクターにセルラーゼ（Ａ）をコードする遺伝子を挿入することによって得ることができる。
ベクターは種々のものが公知であり、市販品も多く存在する。当業者であれば、宿主の種類に応じて適切なベクターを容易に選択することができる。ベクターの具体例としては、ｐＥＴシリーズ、ｐＵＣシリーズなどが挙げられる。
組換えベクターの調製方法自体は周知の常法である。適当なベクターにセルラーゼ（Ａ）をコードする遺伝子を挿入し、宿主を形質転換する具体的な方法としては、エレクトロポレーション法、カルシウム法等が挙げられる。
【００２０】
本発明において、宿主としては、動物細胞、昆虫細胞、微生物、植物細胞などが挙げられる。
動物細胞としては、特に限定されないが、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞及びＣＨＯ細胞等が挙げられる。
昆虫細胞としては、特に限定されないが、Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞等が挙げられる。
微生物としては、特に限定されないが、細菌及び酵母等が挙げられる。
細菌としては、真正細菌及び古細菌が含まれる。
真正細菌には、グラム陰性菌及びグラム陽性菌が含まれる。グラム陰性細菌としては、エシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、リゾビウム属菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属）等が挙げられる。グラム陽性菌としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ属）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ビフィドバクテリウム属 (Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属)、ラクトコッカス属 (Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属)、エンテロコッカス属 (Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属)、ペディオコッカス属(Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属)、リューコノストック属 (Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属)、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属）等が挙げられる。
植物細胞としては、特に限定されないが、ＢＹ−２細胞等が挙げられる。
【００２１】
本発明において、宿主としては、クローニングの容易さの観点から、微生物が好ましく、さらに好ましくはエシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、リゾビウム属菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属）であり、特に好ましくはエシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属）である。
【００２２】
セルラーゼ（Ａ）は、セルラーゼ（Ａ）をコードする遺伝子を、例えばバチラス属に属する微生物、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ等から、ショットガン法、ＰＣＲ法を用いてクローニングし、適当なベクターと宿主菌を用いて大量に生産することができる。
【００２３】
培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００２４】
本発明において、培養液からセルラーゼ（Ａ）を採取及び精製する方法としては、常法に準じて行うことができる。例えば、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００２５】
本発明において、セルラーゼ安定化剤（Ｂ）は、マンニトール、トレハロース、セロビオース、グリコール酸、ピロガロール、Ｎ−α−アセチルアルギニン、ソルビタンモノオレート、ソルビタントリオレート及びヤシ油脂肪酸ソルビタンモノエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種である。
本発明のセルラーゼ組成物（Ｃ）は、セルラーゼ安定化剤（Ｂ）を含有することにより、セルラーゼ（Ａ）が安定化され、セルラーゼ活性の持続性が高くなる。したがって、長期保存後もセルラーゼ活性を保つことができる。
【００２６】
本発明において、上記セルラーゼ安定化剤（Ｂ）として、同時に２種以上使用する場合、セルラーゼ活性の持続性の観点から、マンニトール及びソルビタントリオレートの組合せ並びにマンニトール及びＮ−α−アセチルアルギニンの組合せが好ましい。
【００２７】
本発明において、水は特に限定されるものではなく、水道水、イオン交換水、蒸留水及び逆浸透水等が挙げられる。また、水中に、後述するｐＨ調整剤（Ｅ）を含むバッファー水溶液等が挙げられる。水中には、セルラーゼ（Ａ）の活性が発揮されるｐＨであるｐＨ５．０〜９．０に調整する観点から、ｐＨ調整剤（Ｅ）を含有することが好ましい。
【００２８】
本発明のセルラーゼ組成物（Ｃ）に含まれるセルラーゼ（Ａ）の含有量は、セルラーゼ活性の持続性の観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び水の合計重量を基準として、０．０００１〜０．１重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００５〜０．０７５重量％、特に好ましくは０．０１５〜０．０５重量％である。
【００２９】
本発明のセルラーゼ組成物に含まれるセルラーゼ安定化剤（Ｂ）の含有量は、セルラーゼ活性の持続性の観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び水の合計重量を基準として、０．１〜２０重量％が好ましく、さらに好ましくは１〜２０重量％、特に好ましくは５〜２０重量％である。
【００３０】
本発明のセルラーゼ組成物に含まれる水の含有量は、セルラーゼ活性の持続性の観点から、（Ａ）、（Ｂ）及び水の合計重量を基準として、７９．９〜９９．８９９９重量％が好ましく、さらに好ましくは７９．９２５〜９８．９９５重量％、特に好ましくは７９．９５〜９４．９８５重量％である。
【００３１】
本発明のセルラーゼ組成物（Ｃ）は、セルラーゼ（Ａ）、セルラーゼ安定化剤（Ｂ）及び水以外に、ｐＨ調整剤（Ｅ）を含有することができる。
【００３２】
ｐＨ調整剤（Ｅ）としては、ＧｏｏｄバッファーであるＨＥＰＥＳバッファー、クエン酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー及びリン酸バッファー等が挙げられる。（Ｅ）として、セルラーゼ組成物（Ｃ）のセルラーゼ活性を高くする観点から、クエン酸バッファー及びリン酸バッファーが好ましい。
セルラーゼ組成物中の（Ｅ）の濃度（モル濃度）は、セルラーゼ（Ａ）の活性が発揮されるｐＨに調整する観点から、１０〜５００ｍＭが好ましい。
【００３３】
セルラーゼ組成物（Ｃ）のｐＨは、セルラーゼ（Ａ）の活性が発揮されるｐＨである観点から、ｐＨ５．０〜９．０が好ましく、さらに好ましくはｐＨ６．５〜８．５である。
【００３４】
本発明のセルラーゼ組成物（Ｃ）は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（１）水にセルラーゼ安定化剤（Ｂ）を加え、２５℃で均一になるまで撹拌する。
（２）セルラーゼ（Ａ）以外の成分を所定量添加し均一に溶解させる。
（３）最後にセルラーゼ（Ａ）を添加し溶解させ、セルラーゼ組成物（Ｃ）を製造する。
【００３５】
本発明のセルラーゼ組成物（Ｃ）の使用方法は、従来のセルラーゼ組成物の使用方法と同じでよく、特に限定されるものではないが、例えば、洗剤用、製紙パルプ処理用及びセルラーゼ糖化用のセルラーゼ組成物として使用できる。
【００３６】
本発明の洗剤組成物は、上記セルラーゼ組成物（Ｃ）及び界面活性剤（Ｄ）を含有する洗剤組成物である。本発明の洗剤組成物は、セルラーゼ活性の持続性の高いセルラーゼ組成物（Ｃ）を含有しているので、長期保存後も洗浄性を保つことができる。
【００３７】
界面活性剤（Ｄ）としては、非イオン性界面活性剤（Ｄ−１）、アニオン性界面活性剤（Ｄ−２）、カチオン性界面活性剤（Ｄ−３）、両性界面活性剤（Ｄ−４）及びバイオサーファクタント（Ｄ−５）が含まれる。
【００３８】
非イオン性界面活性剤（Ｄ−１）としては、アルキレンオキサイド付加型非イオン性界面活性剤（Ｄ−１−１）及び多価アルコール型非イオン性界面活性剤（Ｄ−１−２）等が挙げられる。
【００３９】
（Ｄ−１−１）としては、高級アルコール（炭素数８〜１８）アルキレン（炭素数２〜４、好ましいのは２）オキサイド付加物（活性水素１個当たりの付加モル数１〜３０）、アルキル（炭素数１〜１２）フェノールエチレンオキサイド（以下、エチレンオキサイドをＥＯと記載することがある）付加物（付加モル数１〜３０）、高級アミン（炭素数８〜２２）アルキレン（炭素数２〜４、好ましいのは２）オキサイド付加物（活性水素１個当たりの付加モル数１〜４０）、脂肪酸（炭素数８〜１８）ＥＯ付加物（活性水素１個当たりの付加モル数１〜６０）、ポリオキシプロピレングリコール（以下、ポリプロピレングリコールをＰＰＧと記載することがある）（数平均分子量（Ｍｎ）２００〜４，０００）ＥＯ付加物（活性水素１個当たりの付加モル数１〜５０）、ポリオキシエチレン（繰り返し単位数３〜３０）アルキル（炭素数６〜２０）アリルエーテル並びにソルビタンモノラウレートＥＯ付加物（活性水素１個あたりの付加モル数１〜３０）及びソルビタンモノオレートＥＯ付加物（活性水素１個あたりの付加モル数１〜３０）等の多価（２〜８価又はそれ以上）アルコール（炭素数２〜３０）の脂肪酸（炭素数８〜２４）エステルＥＯ付加物（活性水素１個あたりの付加モル数１〜３０）等が挙げられる。
【００４０】
（Ｄ−１−２）としては、グリセリンモノステアレート、グリセリンモノオレート、ソルビタンモノラウレート及びソルビタンモノオレート等の多価（２〜８価又はそれ以上）アルコール（炭素数２〜３０）の脂肪酸（炭素数８〜２４）エステル並びにラウリン酸モノエタノールアミド及びラウリン酸ジエタノールアミド等の脂肪酸アルカノールアミド等が挙げられる。
【００４１】
アニオン性界面活性剤（Ｄ−２）としては、炭素数８〜２４のアルキルエーテルカルボン酸又はその塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレンエーテルカルボン酸又はその塩［（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテル酢酸ナトリウム及び（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルスルホコハク酸２ナトリウム等］、炭素数８〜２４のアルキル硫酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレン硫酸エステル塩［ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）硫酸ナトリウム及びラウリル（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）硫酸−トリエタノールアミン塩等］、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド硫酸スルホン酸ナトリウム、炭素数８〜２４のアルキルフェニルスルホン酸塩［ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等］、炭素数８〜２４のアルキルリン酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレンリン酸エステル塩［ラウリルリン酸ナトリウム及び（ポリ）オキシエチレン（重合度＝１〜１００）ラウリルエーテルリン酸ナトリウム等］、脂肪酸塩［ラウリン酸ナトリウム及びラウリン酸トリエタノールアミン等］、及びアシル化アミノ酸塩［ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム、ヤシ油脂肪酸ザルコシンナトリウム、ヤシ油脂肪酸ザルコシントリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸トリエタノールアミン、Ｎ−ヤシ油脂肪酸アシル−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム及びラウロイルメチル−β−アラニンナトリウム等］等が挙げられる。
【００４２】
カチオン性界面活性剤（Ｄ−３）としては、第４級アンモニウム塩型［塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベヘニルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム及びエチル硫酸ラノリン脂肪酸アミノプロピルエチルジメチルアンモニウム等］及びアミン塩型［ステアリン酸ジエチルアミノエチルアミド乳酸塩、ジラウリルアミン塩酸塩及びオレイルアミン乳酸塩等］等が挙げられる。
【００４３】
両性界面活性剤（Ｄ−４）としては、ベタイン型両性界面活性剤［ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ラウリルヒドロキシスルホベタイン及びラウロイルアミドエチルヒドロキシエチルカルボキシメチルベタインヒドロキシプロピルリン酸ナトリウム等］及びアミノ酸型両性界面活性剤［β−ラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等］等が挙げられる。
【００４４】
バイオサーファクタント（Ｄ−５）としては、サーファクチン及びラムノリピッド等が挙げられる。
【００４５】
（Ｄ）としては、１種又は２種以上が使用出来る。２種以上を使用する場合、その組み合わせとしては、例えばノニオン性界面活性剤とアニオン性界面活性剤の組み合わせ、ノニオン性界面活性剤とカチオン性界面活性剤の組み合わせ及びノニオン性界面活性剤と両性界面活性剤の組み合わせ等が挙げられる。
【００４６】
（Ｄ）として、洗浄性の観点から、ノニオン性界面活性剤単独での使用、及びノニオン性界面活性剤とアニオン性界面活性剤との組み合わせでの使用が好ましい。
ノニオン性界面活性剤としては、洗浄性の観点から、脂肪族アルコール（炭素数８〜２４）エチレンオキサイド付加物（重合度＝１〜１００）及び高級アミン（炭素数８〜２２）アルキレン（炭素数２〜４、好ましいのは２）オキサイド付加物（活性水素１個当たりの付加モル数１〜４０）が好ましく、さらに好ましくは脂肪族アルコール（炭素数１２〜１８）ＥＯ付加物（重合度４〜２０）及び高級アミンＥＯプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと記載することがある）付加物（重合度は各々１〜２０）、次にさらに好ましくは脂肪族アルコール（炭素数１２〜１５）エチレンオキサイド付加物（重合度＝８〜１２）及び高級アミン（炭素数１２〜２２）ＥＯＰＯ付加物（重合度は各々１〜２０）、特に好ましくはオレイルアルコールＥＯ１１モル付加物及びモノオキシエチレンモノオキシプロピレンパルミチルアミンである。
アニオン性界面活性剤としては、洗浄性の観点から、炭素数８〜２４のアルキルフェニルスルホン酸塩、脂肪酸塩、炭素数８〜２４のアルキル硫酸エステル塩及び炭素数８〜２４のアルキル（ポリ）オキシエチレン硫酸エステル塩が好ましく、さらに好ましくは、炭素数１２〜１６のアルキルフェニルスルホン酸塩及び炭素数８〜１６の脂肪酸塩、次にさらに好ましくは、ドデシルベンゼンスルホン酸モノエタノールアミン塩及びラウリン酸ナトリウムである。
【００４７】
洗剤組成物中のセルラーゼ組成物（Ｃ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、（Ｃ）及び（Ｄ）の合計重量に基づいて、１〜９９重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜９０重量％、特に好ましくは２０〜８０重量％である。
洗剤組成物中の界面活性剤（Ｄ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、（Ｃ）及び（Ｄ）の合計重量に基づいて、１〜９９重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜９０重量％、特に好ましくは２０〜８０重量％である。
【００４８】
洗剤組成物中のセルラーゼ組成物（Ｃ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、１〜５０重量％が好ましく、さらに好ましくは５〜４０重量％、特に好ましくは１０〜３０重量％である。
洗剤組成物中の界面活性剤（Ｄ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、１〜７０重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜６０重量％、特に好ましくは２０〜５０重量％である。
洗剤組成物中のセルラーゼ（Ａ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０．０００００１〜０．１重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０００００５〜０．０．０８重量％、特に好ましくは０．００００１〜０．０５重量％である。
洗剤組成物中のセルラーゼ安定化剤（Ｂ）の含有量（重量％）は、洗浄性の持続性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０．００００１〜２０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．００００５〜１５重量％、特に好ましくは０．０００１〜１０重量％である。
【００４９】
本発明の洗剤組成物は、セルラーゼ組成物（Ｃ）及び界面活性剤（Ｄ）以外に、水、ｐＨ調整剤（Ｅ）、セルラーゼ（Ａ）以外の酵素（Ｆ）、ビルダー（Ｇ）、キレート剤（Ｈ）、色素（Ｉ）、香料（Ｊ）、蛍光増白剤（Ｋ）、消泡剤（Ｌ）及び親水性溶媒（Ｍ）等を含有することができる。
【００５０】
水は特に限定されるものではなく、水道水、イオン交換水、蒸留水及び逆浸透水等が挙げられる。また、水中にｐＨ調整剤（Ｅ）を含むバッファー水溶液等が挙げられる。
洗剤組成物中の水の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、１〜９８重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜８５重量％であり、特に好ましくは２０〜７０重量％である。
【００５１】
ｐＨ調整剤（Ｅ）としては、ＧｏｏｄバッファーであるＨＥＰＥＳバッファー、クエン酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー及びリン酸バッファー等が挙げられる。（Ｅ）として、洗浄性の観点から、クエン酸バッファー及びリン酸バッファーが好ましい。
洗剤組成物中の（Ｅ）の濃度（モル濃度）は、至適ｐＨに調整する観点から、１０〜５００ｍＭが好ましい。
【００５２】
洗剤組成物のｐＨは、洗浄性の観点から、ｐＨ５．０〜９．０が好ましく、さらに好ましくはｐＨ６．５〜８．５である。
【００５３】
セルラーゼ（Ａ）以外の酵素（Ｆ）には、プロテアーゼ（Ｆ−１）、アミラーゼ（Ｆ−２）、リパーゼ（Ｆ−３）及びオキシドレダクターゼ（Ｆ−４）が含まれる。
【００５４】
プロテアーゼ（Ｆ−１）としては、動物、植物又は微生物起源のものが含まれ、入手しやすさの観点から、微生物起源のものが好ましい。プロテアーゼには、化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。プロテアーゼのうち、洗浄性の観点から、セリンプロテアーゼが好ましく、さらに好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼ及びトリプシン様プロテアーゼである。
【００５５】
アルカリ性微生物プロテアーゼとしては、サブチリシン、特にバシラス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のもの、例えばサブチリシン  Ｎｏｖｏ、サブチリシン  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン  ３０９、サブチリシン  １４７及びサブチリシン  １６８等が挙げられる。
トリプシン様プロテアーゼとしては、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源のもの）及びフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼ等が挙げられる。
【００５６】
市販のプロテアーゼとしては、ノボザイムス社のＡｌｃａｌａｓｅTM、ＳａｖｉｎａｓｅTM、ＰｒｉｍａｓｅTM、ＤｕｒａｚｙｍTM及びＥｓｐｅｒａｓｅTM並びにジェネンコア社のＰｕｒａｆｅｃｔTM及びＰｕｒａｆｅｃｔ  ＯＸＰTM等が挙げられる。
【００５７】
アミラーゼ（Ｆ−２）としては、細菌又は真菌起源のものが含まれる。アミラーゼには、化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。アミラーゼとしては、例えば、英国特許第１，２９６，８３９号明細書に詳細に記載されているＢ．リヘニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特殊株から得られるα−アミラーゼ等が挙げられる。
市販のアミラーゼとしては、ノボザイムス社の  ＤｕｒａｍｙｌTM、ＴｅｒｍａｍｙｌTM、ＦｕｎｇａｍｙｌTM及びＢＡＮTM並びにＧｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ社のＲａｐｉｄａｓｅTM及びＭａｘａｍｙｌ  ＰTM等が挙げられる。
【００５８】
リパーゼ（Ｆ−３）としては、細菌又は真菌起源のものが含まれる。リパーゼには、化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。リパーゼの例としては、フミコーラ・ランギノーザ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（欧州特許第２５８  ０６８号明細書及び欧州特許第３０５  ２１６号明細書）、リゾムーコル・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）リパーゼ（欧州特許第２３８  ０２３号明細書）、Ｃ．アンタークティカ（Ｃ．ｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡ及びＢ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ）リパーゼ（欧州特許第２１４  ７６１号明細書）、Ｐ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）及びＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）リパーゼ（欧州特許第２１８  ２７２号明細書）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ（欧州特許第３３１  ３７６号明細書）、Ｐ．スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）リパーゼ、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）リパーゼ及びバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼ（英国特許第１，３７２，０３４号明細書）、Ｂ．サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リパーゼ（Ｄａｒｔｏｉｓ  他（１９９３），  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ１１３１，２５３−２６０）、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ（特公昭６４−７４４９９２号公報）並びにＢ．ピュミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）リパーゼ（国際公開第９１／１６４２２号）等が挙げられる。
【００５９】
市販のリパーゼとしては、ジェネンコア社の  Ｍ１  ＬｉｐａｓｅTM、Ｌｕｍａ  ｆａｓｔTM及びＬｉｐｏｍａｘTM、ノボザイムス社のＬｉｐｏｌａｓｅTM及びＬｉｐｏｌａｓｅ  ＵｌｔｒａTM並びに天野エンザイム社のＬｉｐａｓｅ  Ｐ“Ａｍａｎｏ”TM等が挙げられる。
【００６０】
オキシドレダクターゼ（Ｆ−４）としては、ペルオキシダーゼ及びオキシダーゼ（例えばラッカーゼ）が含まれる。
ペルオキシダーゼとしては、植物、細菌又は真菌起源のものが含まれる。ペルオキシダーゼには、化学的に、又は遺伝子的に修飾された変異体も含まれる。ペルオキシダーゼとしては、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）（例えばＣ．シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）又はＣ．マクロリザス（Ｃ．ｍａｃｒｏｒｈｉｚｕｓ）の菌株由来のもの）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（Ｂ．ピュミラス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）の菌株由来のもの）及び国際公開第９１／０５８５８号に記載されたペルオキシダーゼが好ましく、特に好ましくは国際公開第９１／０５８５８号に記載されたペルオキシダーゼである。
ラッカーゼとしては、細菌又は真菌起源のものが含まれる。ラッカーゼとしては、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）（例えばＴ．ビロサ（Ｔ．ｖｉｌｌｏｓａ）又はＴ．ベルシコロール（Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）の菌株由来のもの］、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）［例えばＣ．シネレウス（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）の菌株由来のもの］及びミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）［例えばＭ．サーモフィラ（Ｍ．  ｔｈｅｒｍｏｐｈｌｌａ）の菌株由来のもの］等が挙げられる。
【００６１】
洗剤組成物中の（Ａ）以外の酵素（Ｆ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０〜０．１重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０５〜０．１重量％、特に好ましくは０．０７５〜０．１重量％である。
【００６２】
ビルダー（Ｇ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されているビルダーが使用でき、例えば、ポリカルボン酸塩（アクリル酸塩ホモポリマー及びマレイン酸塩ホモポリマー等）、多価カルボン酸塩（クエン酸及びリンゴ酸等）、及びアルカリビルダー（苛性ソーダ、ソーダ灰、アンモニア、トリエタノールアミン、トリポリリン酸ソーダ及びケイ酸ソーダ等）等が挙げられる。
【００６３】
キレート剤（Ｈ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されているキレート剤が使用でき、例えば、ニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、トリエチレンテトラアミン六酢酸及びジエンコル酸等のアミノポリ酢酸又はこれらの塩、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、グルコン酸、カルボキシメチルコハク酸及びカルボキシメチル酒石酸等の有機酸又はこれらの塩並びにアミノトリ（メチレンホスホン酸）、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）又はこれらのアルカリ金属若しくは低級アミン塩等が挙げられる。
【００６４】
洗剤組成物中のビルダー（Ｇ）及びキレート剤（Ｈ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜５重量％である。
【００６５】
色素（Ｉ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されている色素が使用でき、例えば、ブロモフェノールブルー等が挙げられる。
【００６６】
香料（Ｊ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されている香料が使用でき、例えば、フェニルエチルアルコール等が挙げられる。
【００６７】
蛍光増白剤（Ｋ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されている蛍光増白剤が使用でき、例えば、ビフェニルスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００６８】
消泡剤（Ｌ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されている消泡剤が使用でき、例えば、シリコーン系消泡剤、ポリオキシアルキレン系消泡剤及び鉱物油系消泡剤等が挙げられる。
【００６９】
洗剤組成物中の色素（Ｉ）、香料（Ｊ）、蛍光増白剤（Ｋ）及び消泡剤（Ｌ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０〜５重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜２重量％である。
【００７０】
親水性溶媒（Ｍ）としては、特に限定するものではなく、従来の洗剤組成物に使用されている親水性溶媒が使用でき、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール及びプロピレングリコール等が挙げられる。
洗剤組成物中の親水性溶媒（Ｍ）の含有量（重量％）は、洗浄性の観点から、洗剤組成物の重量に基づいて、０〜２０重量％が好ましく、さらに好ましくは０〜１０重量％である。
【００７１】
本発明の洗剤組成物は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（１）界面活性剤（Ｄ）に、セルラーゼ組成物（Ｃ）及び酵素（Ｆ）以外の成分を加え、２５℃で均一になるまで撹拌する。
（２）セルラーゼ組成物（Ｃ）を所定量添加し、均一に溶解させる。必要により酵素（Ｆ）を所定量添加し、均一に溶解させる。
【００７２】
本発明の洗剤組成物の使用方法は、従来の洗剤組成物の使用方法と同じでよく、特に限定されるものではない。衣料用洗剤としての使用方法の１例を下記に示す。
（１）洗濯物が入った洗濯機に水道水を張り、洗剤組成物を２５℃で添加し、軽く撹拌して溶解させる。
（２）洗濯機で洗濯物を洗浄する。
（３）洗濯機から液を抜き、水道水で１〜２回すすぐ。
（４）適宜脱水をかける。
【実施例】
【００７３】
以下の実施例、比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００７４】
＜製造例１＞
プライマー１（配列番号４）と２（配列番号５）を用いてＰＣＲ法によりＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのｂｇｌＣ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ増幅断片を制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで処理後、ｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ制限酵素サイトとＢａｍＨＩ制限酵素サイトに結合した。その後、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へ形質転換を行い、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列からなる配列番号３のセルラーゼ（Ａ−１）を発現する大腸菌（α）を作成した。
【００７５】
大腸菌（α）の終夜培養液１０ｍｌを作製し、２５０ｍＬ培養液（ＴＢ培養液（Ｄｉｆｃｏ社）、０．７重量％硫酸アンモニウム、０．０５重量％クエン酸２アンモニウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム）に植菌し、１Ｌ微生物培養装置（エイブル社）を用いてｐＨ７．０、３７℃で維持したまま培養を行った。培養開始３時間後に、１Ｍ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を０．７５ｍＬ加え、さらに、培養液中の濃度が１．０重量％になるようにヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン（三洋化成工業（株）製、商品名「レボン２０００」）を加えた。培養を４８時間行った後、培養液１５ｍＬから遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ社製「５９２２」、４℃、６０００×ｇ、１０分）を用いて菌体を分離し、上清のみを回収した。得られた上清を、遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ社製「５９２２」、４℃、６０００×ｇ、１０分）を用いて沈殿除去を行った後、限外ろ過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製「アミコンウルトラ−１５」分画分子量１００００）を用いて、５ｍＬ程度になるまで上清の濃縮を行い、リン酸バッファー水溶液１０ｍＬ加えて再び５ｍＬ程度になるまで濃縮を行い、再度リン酸バッファー水溶液を加え５ｍＬ程度になるまで濃縮を行い、セルラーゼ（Ａ−１）を含む水溶液を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、水溶液中のセルラーゼ（Ａ−１）の濃度は１５ｇ／Ｌであることが分かった。
【００７６】
＜セルラーゼ活性の測定＞
ｐＨ７．５の１００ｍＭリン酸バッファー水溶液に、１７．５ｇ／ＬになるようにＣＭＣ（和光純薬工業（株）製）を溶解し、基質溶液を調整した。ｐＨ７．５のリン酸バッファー水溶液３ｍＬに、セルラーゼ（Ａ−１）の水溶液を加え、リン酸バッファー水溶液で１００倍希釈して、セルラーゼ（Ａ−１）溶液を調整した。基質溶液３ｍＬとセルラーゼ（Ａ−１）溶液５μＬを混合し、４０℃に温度を調節した粘度計（ＴＶＥ−２２Ｌ粘度計、２ｒｐｍ）に移した。混合直後に粘度を読み取り、その後、１、２、３、４、５及び６分後に粘度を読み取った。セルラーゼ（Ａ−１）の濃度が異なるセルラーゼ（Ａ−１）溶液を作成して同様に測定し、混合直後の粘度と５分後の粘度を比較した。５分後の粘度が１／２となるセルラーゼ（Ａ−１）の量（エンド−１，４−β−グルカナーゼ活性１単位）は０．０５ｍｇであった。したがって、セルラーゼ（Ａ−１）の粘度測定法によるセルラーゼ活性は２０単位／ｍｇであった。
【００７７】
＜実施例１〜１１＞
表１に記載の割合で２５℃で配合し、本発明のセルラーゼ組成物を作製した。セルラーゼ組成物のｐＨは全て７．５であった。
【００７８】
＜比較例１〜４１＞
表２〜５に記載の割合で２５℃で配合し、比較のセルラーゼ組成物を作製した。セルラーゼ組成物のｐＨは全て７．５であった。
【００７９】
【表１】
2012196170.tif 000002
【００８０】
【表２】
2012196170.tif 000003
【００８１】
【表３】
2012196170.tif 000004
【００８２】
【表４】
2012196170.tif 000005
【００８３】
【表５】
2012196170.tif 000006
【００８４】
表１〜５中の各成分は、下記のものを使用した。
セルラーゼ（Ａ−１）：製造例１で得たセルラーゼを用いた。表中の量（重量％）は、セルラーゼ（Ａ−１）の純分で示した。
水：１００ｍＭリン酸バッファー水溶液、和光純薬工業（株）製
マンニトール：和光純薬工業（株）製
トレハロース：和光純薬工業（株）製
セロビオース：和光純薬工業（株）製
グリコール酸：和光純薬工業（株）製
ピロガロール：和光純薬工業（株）製
Ｎ−α−アセチルアルギニン：ＳＩＧＭＡ社製
ソルビタンモノオレート：三洋化成工業（株）製、商品名「イオネットＳ−８０」
ソルビタントリオレ−ト：三洋化成工業（株）製、商品名「イオネットＳ−８５」
ヤシ油脂肪酸ソルビタンモノエステル：三洋化成工業（株）製、商品名「イオネットＳ−２０」
キシロース：和光純薬工業（株）製
グルコース：和光純薬工業（株）製
フルクトース：和光純薬工業（株）製
マルトース：和光純薬工業（株）製
エリスリトール：和光純薬工業（株）製
イノシトール：和光純薬工業（株）製
サリシン：和光純薬工業（株）製
エタノールアミン：和光純薬工業（株）製
ジエタノールアミン：三洋化成工業（株）製
ブタンジアミン：三洋化成工業（株）製
ジメチルドデシルアミンオキシド：三洋化成工業（株）製
スルホコハク酸ポリオキシエチレンラウロイルエタノールアミド二ナトリウム：三洋化成工業（株）製、商品名「ビューライトＡ−５０００」
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール：三洋化成工業（株）製、商品名「ニューポール  ＰＥ−７５」
コレステロール：和光純薬工業（株）製
ＰＰＧ（Ｍｎ＝１，０００）：三洋化成工業（株）製
カプリル酸：和光純薬工業（株）製
コール酸ナトリウム：和光純薬工業（株）製
シュウ酸ナトリウム：和光純薬工業（株）製
ピルビン酸：和光純薬工業（株）製
イソフタル酸：和光純薬工業（株）製
ギ酸ナトリウム：和光純薬工業（株）製
メタノ−ル：和光純薬工業（株）製
エチレングリコール：三洋化成工業（株）製
プロピレングリコール：和光純薬工業（株）製
グリセロール：和光純薬工業（株）製
ホルムアルデヒド：和光純薬工業（株）製
プロリン：和光純薬工業（株）製
イソロイシン：和光純薬工業（株）製
アスパラギン酸：和光純薬工業（株）製
アルギニン：和光純薬工業（株）製
β-アラニン：和光純薬工業（株）製
サルコシン：和光純薬工業（株）製
アルギニンメチルエステル：和光純薬工業（株）製
トリプトファン：和光純薬工業（株）製
Ｎ-アセチルトリプトファン：和光純薬工業（株）製
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ｍｎ＝２００）：三洋化成工業（株）製
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ｍｎ＝２０，０００）：三洋化成工業（株）製
塩化ナトリウム：富田製薬（株）製
塩化カルシウム無水物：和光純薬工業（株）製
硫酸アンモニウム：和光純薬工業（株）製
【００８５】
＜配合直後のセルラーゼ活性の測定＞
「セルラーゼ活性の測定」において、「セルラーゼ（Ａ−１）の水溶液」に変えて「実施例１〜１１及び比較例１〜４１のセルラーゼ組成物」を用いて配合直後のセルラーゼ活性を求めた。実施例１〜１１及び比較例１〜４１のセルラーゼ組成物において、配合直後のセルラーゼ活性は全て２０単位／ｍｇであった。
【００８６】
＜３ヶ月保存後のセルラーゼ活性の測定＞
実施例１〜１１及び比較例１〜４１のセルラーゼ組成物を、２５℃で３ヶ月静置し、３ヶ月保存後のセルラーゼ活性を測定した。
「セルラーゼ活性の測定」において、「セルラーゼ（Ａ−１）の水溶液」に変えて「実施例１〜１１及び比較例１〜４１のセルラーゼ組成物を２５℃で３ヶ月静置したセルラーゼ組成物」をそれぞれ用いる以外は同様にして、３ヶ月保存後のセルラーゼ活性をそれぞれ測定した。結果を表１〜５に示す。
また、次式より３ヶ月保存後のセルラーゼ組成物の残存活性を求めた。結果を表１〜５に示す。
残存活性（％）＝〔（３ヶ月保存後のセルラーゼ活性（単位／ｍｇ））／（配合直後のセルラーゼ活性（単位／ｍｇ））×１００
【００８７】
＜実施例１２〜３３＞
配合直後の実施例のセルラーゼ組成物を用いて、表６の割合で２５℃で配合し、本発明の洗剤組成物を作製した。洗剤組成物のｐＨは全て７．５であった。
【００８８】
＜比較例４２〜６９＞
配合直後の比較例のセルラーゼ組成物を用いて、表７の割合で２５℃で配合し、比較の洗剤組成物を作製した。洗剤組成物のｐＨは全て７．５であった。
【００８９】
【表６】
2012196170.tif 000007
【００９０】
【表７】
2012196170.tif 000008
【００９１】
表６及び７中の各成分は、下記のものを使用した。
水：１００ｍＭリン酸バッファー水溶液、和光純薬工業（株）製
モノオキシエチレンモノオキシプロピレンパルミチルアミン：三洋化成工業（株）製
クエン酸ナトリウム：和光純薬工業（株）製
ブロモフェノールブルー：和光純薬工業（株）製
フェニルエチルアルコール：三洋化成工業（株）製
ビフェニルスルホン酸ナトリウム：三洋化成工業（株）製
シリコーン系消泡剤：サンノプコ（株）製、商品名「ダッポーＨ−２１０」
エタノール：和光純薬工業（株）製
【００９２】
実施例１２〜３３及び比較例４２〜６９の配合直後及び２５℃で３ヶ月間保存後の洗剤組成物を用いて、下記方法により洗浄性保持率を測定した。
＜洗浄性保持率の測定＞
実施例１２〜３３及び比較例４２〜６９の配合直後の洗剤組成物０．８ｇをそれぞれ１Ｌビーカーに入れ、２５℃の水９９９．２ｇを加えて溶解させた。この溶液に、４ｃｍ角に切った布（日本洗濯協会より販売されており、ＪＩＳ  Ｃ９６０６−１９９３「電気洗濯機」の洗浄力試験用汚染布として指定されている２０番手綿カナキン湿式人工汚染布）を一枚入れ、２５℃で直径４ｃｍの攪拌羽のついた攪拌機を用いて、回転速度３００ｒｐｍで２０分攪拌した。布を取り出し、ビーカー中の溶液を捨てた。ビーカーに２５℃の水を１Ｌを入れ、取り出した布を入れ、１０分間、攪拌（３００ｒｐｍ）してすすぎを行った。布をとりだし、８０℃で１時間乾燥した後、ＪＩＳ  Ｚ８９３０で定義される配合直後洗剤組成物の白色度をスガ試験機社のカラーコンピュータにより測定した。
「配合直後の洗剤組成物」に変えて「２５℃で３ヶ月間保存した洗剤組成物」を用いる以外は同様にして、２５℃３ヶ月保存後の洗剤組成物の白色度を測定した。
次式によって洗浄性保持率を求めた。
洗浄性保持率（％）＝〔（２５℃３ヶ月保存後の洗剤組成物の白色度）／（配合直後洗剤組成物の白色度）〕×１００
算出した洗浄性保持率を、下記の基準で表６及び７に記載した。
◎：洗浄性保持率が８０％以上
○：洗浄性保持率が５０％以上、８０％未満
×：洗浄性保持率が５０％未満
【００９３】
セルラーゼ安定化剤を使用しない比較例１のセルラーゼ組成物の残存活性は２２％であった。また、従来の安定化剤を含む比較例２〜４１のセルラーゼ組成物の残存活性は、１６〜２４％であり、セルラーゼ安定化剤を使用しない比較例１の残存活性と同程度であった。さらに、セルラーゼ安定化剤を使用しない比較例１の残存活性よりも低いものが多かった。一方、セルラーゼ安定化剤（Ｂ）を含む実施例１〜１１のセルラーゼ組成物の残存活性は４６〜７８％と非常に高く、３ヶ月保存後もセルラーゼ活性を保つことができていることが分かる。
また、比較例４２〜６９の洗剤組成物は洗浄性保持率が５０％未満と低いのに対し、実施例１〜１１のセルラーゼ組成物を含有する実施例１２〜３３の洗剤組成物は、洗浄性保持率が高く、長期間保存後も洗浄性を保つことができることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明のセルラーゼ組成物は、長期保存後もセルラーゼ活性を保つことができる。したがって、洗剤用、製紙パルプ処理用及びセルラーゼ糖化用のセルラーゼ組成物として使用できる。また、本発明の洗剤組成物は、長期保存後も洗浄性を保つことができ、衣料用洗剤、自動食器洗浄機用洗剤及びコンタクトレンズ用洗剤として使用できる。
【配列表】
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