(57)【要約】【課題】安定化したオゾンナノバブルを含有しているオゾンナノバブル水の強力な殺菌効果を利用して歯周治療等、医療分野に応用している例は従来からあるが、オゾンナノバブル水を、夫々の用途に対して最適化したオゾンナノバブル水の条件、特に、その塩分濃度の最適条件は提案されていない。【解決手段】本発明では、塩分濃度が1％から2％の水中に、オゾンマイクロバブルの圧壊により形成されて安定化して存在するオゾンナノバブルが含有されている組成物を膀胱癌増殖抑制用として提案している。本発明の組成物は抗癌剤を希釈して使用することにより、抑制効果を更に高めることができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩分濃度が1％から2％の水中に、オゾンマイクロバブルの圧壊により形成されて安定化して存在するオゾンナノバブルが含有されていることを特徴とする膀胱癌増殖抑制用組成物。
【請求項２】
抗癌剤が含有されていることを特徴とする請求項１に記載の膀胱癌増殖抑制用組成物。
【請求項３】
抗癌剤がゲムシタビンである請求項２に記載の膀胱癌増殖抑制用組成物。
【請求項４】
抗癌剤がドキソルビシンである請求項２に記載の膀胱癌増殖抑制用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オゾンマイクロバブルの圧壊により形成されて安定化して存在するオゾンナノバブルが含有されている組成物、特に、膀胱癌増殖抑制用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、水中にナノレベルの大きさの気泡、即ち、所望の気体のナノバブルを含有させた水が注目されており、医療、農業、水産・養殖等の各分野への応用が図られている。
【０００３】
例えば、非特許文献１には、マイクロバブルとナノバブルの基礎と工学的な応用について記載されている。また非特許文献２〜４には、オゾンナノバブルの殺菌能や、オゾンナノバブルの細胞賦活化能、組織保存能等を利用した医療分野への応用について記載されている。また、非特許文献５には、農業への応用、非特許文献６にはマイクロあるいはナノバブルの水産・養殖分野への応用について記載されている。また上記非特許文献１には、ナノバブルの解析方法として、動的光散乱光度計による測定方法や、ナノバブルに起因するフリーラジカルを計測する電子スピン共鳴法（ＥＳＲ）による計測方法が記載されている。
【０００４】
更に、マイクロバブルの生成と、ナノバブルとしての安定化のメカニズム、そして概念的な安定化の方法は、上記非特許文献１に記載されており、またオゾンナノバブル水の製造方法の具体例が特許文献１に記載されている。
【０００５】
即ち、特許文献１に記載されたオゾンナノバブルの製造方法は、ミネラル類の電解質イオンが混入した水に、直径が10〜50μｍの微小気泡、いわゆるマイクロバブルとしてオゾンを供給し、そして水中放電に伴う衝撃波や、水の流動時に生じる圧縮、膨張及び渦流等の物理的刺激を加えて圧壊させることにより、微小気泡を縮小させ、この際、水素イオンや水酸化物イオン及び電解質イオンが気液界面に濃縮されて縮小された微小気泡の周囲を取り囲む殻として作用させることにより、縮小した微小気泡、即ち、オゾンナノバブルを水中に安定化して存在するようにするものである。
【０００６】
ナノバブルを含む水は、非特許文献２の項目３に記載されているように、生体に対して、組織の保存能力の他、修復、再生などの様々な力価や殺菌効果を有しており、非特許文献３では、オゾンナノバブル含む水の強力な殺菌効果（塩素系の殺菌剤と比較して10〜30倍の殺菌効果）を利用した歯周治療への応用において、含嗽による歯周ポケットの改善、ＢＯＰの減少が報告されている。またオゾン又はオゾンナノバブル水による殺菌では耐性菌を発生させないということが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４０５９５０６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】高橋、「マイクロバブルとナノバブルの基礎と工学的応用」、月刊マテリアルインテグレーション、株式会社ティー・アイ・シー、2009年4月25日、第２２巻、第５号、ｐ．2-19
【非特許文献２】眞野、「ナノバブルの医療分野への応用」、月刊マテリアルインテグレーション、株式会社ティー・アイ・シー、2009年4月25日、第２２巻、第５号、ｐ．30-35
【非特許文献３】荒川、外２名、「ナノバブル水の歯周治療への応用」、月刊マテリアルインテグレーション、株式会社ティー・アイ・シー、2009年4月25日、第２２巻、第５号、ｐ．36-43
【非特許文献４】北條、「オゾンナノバブルの抗炎症・抗細胞増殖作用−血管内皮および平滑筋細胞における効果−」、月刊マテリアルインテグレーション、株式会社ティー・アイ・シー、2009年4月25日、第２２巻、第５号、ｐ．44-48
【非特許文献５】玉置、「マイクロバブルの農業分野への利用の可能性−オゾンマイクロバブルを利用した水耕培養液の殺菌−」、月刊マテリアルインテグレーション、株式会社ティー・アイ・シー、2009年4月25日、第２２巻、第５号、ｐ．20-23
【非特許文献６】山本、「マイクロバブルの水産・養殖分野への応用」、月刊マテリアルインテグレーション、株式会社ティー・アイ・シー、2009年4月25日、第２２巻、第５号、ｐ．24-29
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述した文献に示されるように、オゾンナノバブル水の強力な殺菌効果を利用して歯周治療等、医療分野に応用している例は従来からあるが、オゾンナノバブル水を、夫々の特定の用途に対して最適化したオゾンナノバブル水の条件、特に、その塩分濃度の最適条件は提案されていない。
【００１０】
例えば、従来は、例えば非特許文献３の第40頁左欄４行〜８行に「４名の中等度の歯周炎患者を被験者として、オゾンナノバブル水原液１回，20ml，20秒間の含嗽を毎日２回、２週間続けていただきました．その結果，３mm以上の歯周ポケットの61.8％（225部位中139部位）が１mm以上改善しました。」と記載されているように、工業用や水産加工用として入手可能なオゾンナノバブル水をそのまま使用しており、塩分濃度を最適化する点は開示されていない。尚、このように入手可能なオゾンナノバブル水の塩分濃度は約2％であった。
【００１１】
本発明者、上記オゾンナノバブル水の膀胱癌への適用を課題とし、鋭意研究の結果なされたものであり、即ち、膀胱癌の増殖抑制に効果的なオゾンナノバブルを含む組成物を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明では、上記課題を解決するために、塩分濃度が1％から2％の水中に、オゾンマイクロバブルの圧壊により形成されて安定化して存在するオゾンナノバブルが含有されている膀胱癌増殖抑制用組成物を提案するものである。
【００１３】
また本発明では、上記構成において、抗癌剤が含有されている膀胱癌増殖抑制用組成物を提案するものである。
【００１４】
そして本発明では、上記抗癌剤の例として、ゲムシタビンやドキソルビシンを提案する。
【発明の効果】
【００１５】
１．膀胱癌細胞株６種（Ｔ２４，ＫＵ−７，ＵＭ−ＵＣ−２，ＵＭ−ＵＣ−３，ＵＭ−ＵＣ−６，ＵＭ−ＵＣ−１４）を標準培地（ＲＰＭＩ）にて一夜培養した後、塩分濃度が１％と２％の本発明組成物で希釈した培地に培地交換して２時間培養し、しかる後、標準培地に培地交換して、細胞の状態を観察し評価した。
【００１６】
膀胱癌細胞の生存状態を観察すると、全ての膀胱癌細胞株において細胞増殖抑制効果を認めた。この細胞増殖抑制効果は塩分濃度1％の本発明組成物よりも塩分濃度2％の本発明組成物の方が強い傾向にあった。
【００１７】
２．上記１の試験を、塩分濃度が１％と２％の本発明組成物により抗癌剤としてのゲムシタビンを希釈して行ったところ、１の試験結果と同様に全ての膀胱癌細胞株において本発明組成物による細胞増殖抑制効果を認め、この細胞増殖抑制効果は塩分濃度1％の本発明組成物よりも塩分濃度2％の本発明組成物の方が強い傾向にあった。
【００１８】
３．塩分濃度２％の本発明組成物による細胞への影響をＰＣＲアレイで網羅的に調べたところ、ＴＲＡＩＬ（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand ）の上昇を認めた。このことから、本発明組成物による殺細胞効果のメカニズムとして、アポトーシスへの誘導の増強が推定された。
【００１９】
４．浸潤性膀胱癌同所性マウスモデルに対して、発癌剤として０．０５％のＢＢＮと共に、塩分濃度１％と２％の本発明組成物を投与して、内服による効果を病理学的に調べたところ、癌発生数の低減効果と、浸潤増殖様式や静脈、リンパ管浸潤等において発生頻度の抑制効果が確認された。
【００２０】
５．浸潤性膀胱癌同所性マウスモデルに対して、飲用水に０．０５％のＢＢＮを混入させて飲用させ、相当の期間が経過した後に、塩分濃度１％の本発明組成物を単独及び抗癌剤と共に、マウスの膀胱内に注入し、尿道をクランプして所定時間維持する試験を行い、その効果を病理学的に調べたところ、２％の本発明組成物単独ではまったく発癌を認めなかったのに対し、０．０５％ＢＢＮ投与群では１００％の発癌率であった。また０．０５％ＢＢＮと１％ならびに２％の本発明組成物を同時投与した場合、その発癌率はそれぞれ85.7%、88.9%へと低下を認めた。さらに、病理学的進行度（pT、Grade、INF、静脈・リンパ管浸潤度）のいずれにおいても、１％、２％の本発明組成物投与群において０．０５％単独群と比較し抑制効果を認めた。また、２％本発明組成物投与群においてはいかなる毒性も認めなかった。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明組成物による膀胱癌細胞株に対しての効果を評価する試験の流れを模式的に示す説明図である。
【図２】図２は、図１に示される試験において、膀胱癌細胞株ＫＵ−７を標準培地で培養した状態と、塩分濃度２％の本発明組成物により希釈した培地により２時間培養した後、８時間経過した状態を示す写真である。
【図３】図３は、図１に示される試験の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、図１に示される試験を、本発明組成物により抗癌剤を希釈して行った結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明組成物による細胞への影響をＰＣＲアレイで網羅的に調べた結果を示す表である。
【図６】図６は、浸潤性膀胱癌同所性マウスモデルに対して、発癌剤として０．００５％のＢＢＮと共に、塩分濃度１％と２％の本発明組成物を投与して、内服による効果を病理学的に評価する方法を経時的に示す模式図である。
【図７】図７は、図５に示される方法により試験した結果を示す写真である。
【図８】図８は、図５に示される方法により試験した結果を示す表である。
【図９】図９は、浸潤性膀胱癌同所性マウスモデルに対して、飲用水に０．００５％のＢＢＮを混入させて飲用させ、相当の期間が経過した後に、塩分濃度１％の本発明組成物を単独及び抗癌剤と共に、マウスの膀胱内に注入し、その効果を病理学的に評価する方法を経時的に示す模式図である。
【図１０】図１０は、図９に示される方法により試験した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
次に、本発明を実施するための形態を説明する。
本発明の膀胱癌増殖抑制用組成物は、例えば、上述した特許文献１に示されるような製造方法を用い、塩分濃度を調節する塩化ナトリウム、その他のミネラル類の電解質イオンが混入した水に、直径が10〜50μｍの微小気泡、いわゆるマイクロバブルとしてオゾンを供給し、水中放電に伴う衝撃波や、水の流動時に生じる圧縮、膨張及び渦流等の物理的刺激を加えて圧壊させることにより、微小気泡を縮小させ、この際、水素イオンや水酸化物イオン及び電解質イオンが気液界面に濃縮されて縮小された微小気泡の周囲を取り囲む殻として作用させることにより、縮小した微小気泡、即ち、オゾンナノバブルを水中に安定化して存在するようにするものである。この際、圧壊後又は圧壊前に塩分濃度を１％〜２％の範囲に調整して、本発明に係る膀胱癌増殖抑制用組成物を得ることができる。
【００２３】
原料水としては、例えば、塩分濃度が2％程度の海辺の井戸水や、塩分濃度が3％程度の清浄な海域の海水が用いられ、この場合、これらの原料水を圧壊後に逆浸透膜を透過させて脱塩した水を希釈水として使用して、塩分濃度を所定の値に調整することができる。
【実施例１】
【００２４】
＜本発明の組成物の各種効果を確認するための試験＞
まず、膀胱癌細胞株６種（Ｔ２４，ＫＵ−７，ＵＭ−ＵＣ−２，ＵＭ−ＵＣ−３，ＵＭ−ＵＣ−６，ＵＭ−ＵＣ−１４）を培地にて培養して、本発明の組成物による効果を試験した。この試験は、図１に示すように、夫々の膀胱癌細胞株を標準培地（ＲＰＭＩ）にて一夜培養した後、塩分濃度が１％と２％の本発明組成物で希釈した培地に培地交換して２時間培養し、しかる後、標準培地に培地交換して、細胞の状態を観察して評価するものとした。
【００２５】
図３の写真、即ち、膀胱癌細胞株ＫＵ−７を標準培地で培養した状態と、塩分濃度２％の本発明組成物により希釈した培地により２時間培養した後、８時間経過した状態を示す写真を参照すると、塩分濃度２％の本発明組成物により膀胱癌細胞の増殖が抑制されていることが分かる。
【００２６】
そして、この試験において、膀胱癌細胞の生存状態を観察すると、図３から分かるように、全ての膀胱癌細胞株において細胞増殖抑制効果を認めることができた。そして、この細胞増殖抑制効果は、図３に示されるように、塩分濃度1％の本発明組成物よりも塩分濃度2％の本発明組成物の方が強い傾向にあることが分かった。
【実施例２】
【００２７】
上記試験を、塩分濃度が１％と２％の本発明組成物により抗癌剤としてのゲムシタビンを希釈して行ったところ、上記の試験結果と同様に、図４に示されるように、全ての膀胱癌細胞株において本発明組成物による細胞増殖抑制効果を認め、この細胞増殖抑制効果は、上述と同様に、塩分濃度１％の本発明組成物よりも塩分濃度２％の本発明組成物の方が強い傾向にあることが分かった。またジェムシタビン単独療法と比較し、１％あるいは２％本発明組成物とジェムシタビンの併用で、より強い細胞増殖抑制効果を認めた。また、その傾向は、ジェムシタビンの濃度が低いほど強かった。
【実施例３】
【００２８】
次に、塩分濃度２％の本発明組成物につき、それによる細胞への影響をＰＣＲアレイ、ここでは、SABiosciences社のＲＴ2  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（登録商標）ＰＣＲ−ＡＲＲＡＹを用いて網羅的に調べた。
【００２９】
その結果、図５に示されるように、ＴＲＡＩＬ（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand）が上昇していることが分かった。さらに、Bcl-2関連蛋白の発現は抑制されており、このことは、本発明組成物による殺細胞効果のメカニズムとして、アポトーシスへの誘導の増強が推定された。
【実施例４】
【００３０】
次に、浸潤性膀胱癌同所性マウスモデルに対して、本発明の組成物による効果を試験した。即ち、ＣＨ／Ｈｅ雌マウス（５週齢）に対して、発癌剤として０．００５％のＢＢＮ（N-Butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine）を投与し、２０週で上皮内癌（ＣＩＳ）、２６週で浸潤性膀胱癌（invasive
BCa）が発生するマウスをモデルとして使用して試験を行った。
【００３１】
上述したマウスモデルに対して、図６に示すように、１週目から、コントロールとしての水道水、塩分濃度２％の本発明組成物単独、生理食塩水により希釈した０．００５％のＢＢＮ単独、塩分濃度１％と２％の本発明組成物により希釈した０．００５％のＢＢＮを投与して、本発明組成物の内服による効果を病理学的に調べた。尚、投与は、１ケージあたり最大５匹ずつのマウスに対して、週２回、２００ｍＬずつ行い、最長２６週間継続した。
【００３２】
以上の試験を行った結果は、図７の写真と図８の表に示されるとおりである。
まず図７において、（Ａ）のＢＢＮ単独群では、膀胱内を占拠する腫瘍の増大を認め、病理学的進展度も、pT2以上のいわゆる進行性膀胱癌の形態をとり、さらに増殖因子であるKi-67の過剰発現を認める。これと比較し、（Ｂ）、（Ｃ）の１％、２％本発明組成物とＢＢＮの投与群では、進行度の抑制、ならびにKi-67発現の低下を認めた。
また図８のpTでは、０．００５％のＢＢＮ単独の場合には、pT2以上の進行癌であるものの割合が夫々５、５匹と大きいが、塩分濃度１％の本発明組成物で希釈した場合には、pT2以上が夫々３、２匹と進行度の低いものの割合が大きくなり、塩分濃度２％の本発明組成物で希釈した場合には、pT2以上が夫々１、０と進行度の低いものの割合が更に大きくなり、pT3は０となる。このことから本発明組成物が癌の進行を抑制していることが分かる。この傾向は細胞の悪性度であるGrade、進展度であるINF、さらに静脈浸潤度（ｖ）、リンパ管浸潤度（ly）についても同様の傾向が見られた。
以上のことから、本発明組成物による癌発生数の低減効果と、浸潤増殖様式や静脈、リンパ管浸潤等において発生頻度の抑制効果が確認された。また血算検査を行った結果、貧血や血小板減少等の副作用は認められなかった。
【００３３】
次に、上述したマウスモデルに対して、図９に示すように、１週目から、飲用水により希釈した０．０５％のＢＢＮを投与し、２２週経過した時点で、下記のＡ〜Ｆをマウスの膀胱内に注入して、２４週後に病理学的な評価を行った。尚、注入は、週１回を２クールで１００μＬずつ行い、注入した後、尿道を１時間クランプした。
Ａ：生理食塩水
Ｂ：本発明組成物（１％濃度）単独
Ｃ：ジエムシタビン（１ｍｇ／１００μＬ）単独
Ｄ：ジエムシタビン（１ｍｇ／５０μＬ）を本発明組成物（２％濃度、５０μＬ）で希釈
Ｅ：ドキソルビシン（１００μｇ／１００μＬ）単独
Ｆ：ドキソルビシン（１００μｇ／５０μＬ）を本発明組成物（２％濃度、５０μＬ）で希釈
【００３４】
以上の試験を行った結果は、図１０の写真に示されるとおりであり、生理食塩水を膀胱に注入したコントロール群と比較し、ジェムシタビン、ドキソルビシンの膀胱内注入により膀胱癌進展が抑制されるが、これら抗癌剤を本発明組成物との混合物を注入した場合に、より強い膀胱癌抑制効果を認めた。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
以上のとおり本発明に係る組成物は、単独での内服又は注入により、膀胱癌の増殖抑制効果を発揮すると共に、ゲムシタビンやドキソルビシン等の抗癌剤を希釈した上で内服又は注入を行うことにより、更に増殖抑制効果を向上することができ、膀胱癌の予防又は治療に利用することができる。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【図７】
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【図１０】
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