(57)【要約】【課題】複数波長の観察光を同時検出可能で省スペース化を図った共焦点顕微鏡。【解決手段】照明光の一部を制限して複数のスリット光を形成する複数のスリットが形成された第１遮光部材１０と、走査手段１２と、走査手段１２で走査された第１遮光部材１０からの複数のスリット光を試料２に集光し、試料２上に前記複数のスリット光によるスリットパターンを投影する対物レンズ４と、第１遮光部材１０と共役な位置に配置され、対物レンズ４で集光された試料２からの観察光束の一部を制限する複数のスリットが形成された第２遮光部材２０と、第２遮光部材２０の複数のスリットを通過した光を検出する検出器２８ａとを有し、前記第２遮光部材２０の複数のスリットのうちの１つのスリットは、他のスリットと波長透過特性が異なる。【選択図】図２
2012118363.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からの照明光の一部を制限して複数のスリット光を形成するための複数のスリットが並んで形成された第１遮光部材と、
前記第１遮光部材で形成された複数のスリット光を走査する走査手段と、
前記走査手段で走査された複数のスリット光を試料に集光し、前記試料上に前記複数のスリット光によるスリットパターンを投影する対物レンズと、
前記第１遮光部材と共役な位置に配置され、前記対物レンズで集光された前記試料からの観察光束の一部を制限する複数のスリットが並んで形成された第２遮光部材と、
前記第２遮光部材の複数のスリットを通過した光を検出する検出器とを有し、
前記第２遮光部材の複数のスリットのうちの１つのスリットは、他のスリットと波長透過特性が異なることを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
さらに、前記検出器の検出面を構成する複数の画素のうち、前記第２遮光部材の複数のスリットを通過した光の前記検出面上の走査方向と直交する方向に並んだ画素群に、前記第２遮光部材の複数のスリットのうち、いずれか１つのスリットを通過した光束が当該画素群に入射するタイミングに合わせて、受光を実行させる制御部を有することを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項３】
前記第１遮光部材の複数のスリットには、波長透過特性の異なる励起フィルタが備えられており、
前記第２遮光部材の複数のスリットには、前記波長透過特性の異なる励起フィルタに対応する蛍光フィルタが備えられていることを特徴とする請求項２に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項４】
前記検出器の前記画素群から出力された検出信号を波長毎に記憶する記憶部を有することを特徴とする請求項２又は請求項３に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項５】
波長の異なる複数の照明光を出力する光源を有することを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項６】
前記検出器としてＣＭＯＳカメラを有することを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、試料面に照射した１本のライン状の光を走査して観察を行う共焦点顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１を参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表平５−５０９４１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上述のような従来の共焦点顕微鏡によって試料から発せられた複数の波長の観察光を同時に検出したい場合には、複数の検出器を用意し、これによって観察光を波長毎に検出しなければならなかった。このため、従来の共焦点顕微鏡は波長毎に光路を形成する必要があり、小型化が難しいという問題があった。
そこで本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、複数の波長の観察光を同時に検出可能で省スペース化を図った共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために本発明は、
光源からの照明光の一部を制限して複数のスリット光を形成するための複数のスリットが並んで形成された第１遮光部材と、
前記第１遮光部材で形成された複数のスリット光を走査する走査手段と、
前記走査手段で走査された複数のスリット光を試料に集光し、前記試料上に前記複数のスリット光によるスリットパターンを投影する対物レンズと、
前記第１遮光部材と共役な位置に配置され、前記対物レンズで集光された前記試料からの観察光束の一部を制限する複数のスリットが並んで形成された第２遮光部材と、
前記第２遮光部材の複数のスリットを通過した光を検出する検出器とを有し、
前記第２遮光部材の複数のスリットのうちの１つのスリットは、他のスリットと波長透過特性が異なることを特徴とする共焦点顕微鏡を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、複数の波長の観察光を同時に検出可能で省スペース化を図った共焦点顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡の光学系の構成を示す図である。
【図３】（ａ）は照明側スリット部に備えられたマルチスリットの一例を示す図であり、（ｂ）は（ａ）に対応して観察側スリット部に備えられたマルチスリットの一例を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡の主要部分のブロック図である。
【図５】（ａ）は検出器の検出面と複数のスリット光の様子を示す図であり、（ｂ）は各ラインで検出された検出信号を一時記憶部内のフレームバッファに記憶する様子を示す図である。
【図６】検出器の各ラインの受光タイミング及び検出信号出力タイミングの一例を示すタイムチャートである。
【図７】本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡の受光動作設定ルーチンを示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡を添付図面に基づいて説明する。
はじめに、本実施形態に係る共焦点顕微鏡の全体的な構成を説明する。
図１に示すように共焦点顕微鏡１は、試料２を載置するステージ３、対物レンズ４、及び顕微鏡本体５を有している。顕微鏡本体５の側面には、照明光を供給する光源６が備えられており、共焦点顕微鏡１の各部を制御するコンピュータ（ＰＣ）７が接続されている。
【０００９】
図２（ａ）に示すように顕微鏡本体５内の光路１００上には、光源６側から順に照明側スリット部９と第１ダイクロイックミラー１１が備えられている。
第１ダイクロイックミラー１１の反射光路１０１上には走査ミラー１２が備えられており、さらに走査ミラー１２の表側反射面の反射光路１０２上にはレンズ１３、反射ミラー１４、及び対物レンズ４が順に備えられている。また、走査ミラー１２から見て第１ダイクロイックミラー１１の透過光路１０３上には、レンズ１６、反射ミラー１７、観察側スリット部１９、反射ミラー２１、レンズ２２、及び反射ミラー２３が順に備えられている。
反射ミラー２３から見て走査ミラー１２の裏側反射面の反射光路１０４上には、ズームレンズ２５、集光レンズ２７ａ、及び検出器２８ａが順に備えられている。ズームレンズ２５により観察側スリット部１９の像を結像するか、又は、観察側スリット部１９の各スリットを透過した光束が検出器２８ａの同一画素に重畳して集光されないようにしている。
【００１０】
光源６は、複数の波長の光を含んだ照明光を出力する光源であって、本実施形態では白色光源が用いられている。
検出器２８ａには、ＣＭＯＳカメラが用いられている。また、検出器２８ａには、図４に示すようにＰＣ７に備えられているＣＰＵ３０からの指示に基づいて検出器２８ａを制御するための検出器制御部２９ａが備えられている。なお、検出器制御部２９ａには、走査ミラー１２の動作と同期して検出器２８ａを制御するためのタイミング信号を検出器制御部２９ａへ出力する信号発生回路３０ａが備えられている。
【００１１】
照明側スリット部９と観察側スリット部１９は、いずれも対物レンズ４の物体側の所定の位置に対して光学的に共役な位置に配置されている。
照明側スリット部９は、複数種類のマルチスリット１０を切替可能に保持する回転切替部材である。各マルチスリット１０は、図３（ａ）にその一例を示すように複数の細長い長方形状のスリットが並んで形成された遮光部材であって、各スリットには波長透過特性の異なる励起フィルタが貼り付けられている。本実施形態では、マルチスリット幅Ｌが異なり、かつ励起フィルタの波長透過特性の組み合わせが異なる３つのマルチスリット１０が照明側スリット部９に保持されている。ここで、マルチスリット幅Ｌとは、全てのスリット幅と全てのスリット間隔を合計した長さであって、スリット数、スリット幅、及びスリット間隔によって定められるものである。なお、本実施形態における３つのマルチスリット１０は、いずれもスリット間隔がスリット幅の２．５倍以上に設計されている。これにより、各スリットを通過したスリット光どうしの干渉を防止することができる。具体的には、図３（ａ）に示したマルチスリットの一例は、黒塗り部分が各スリットを示しており、スリット数が１０、スリット長が５ｍｍ、スリット幅が１０μｍ、スリット間隔が９０μｍ、マルチスリット幅Ｌが８９０μｍである。
斯かる構成の照明側スリット部９には、図４に示すようにＰＣ７のＣＰＵ３０からの指示に基づいて照明側スリット部９を回転させるための駆動部３１が備えられており、これによって３つのマルチスリット１０を切り替えて光路中に選択的に配置することができる。
【００１２】
観察側スリット部１９は、上記照明側スリット部９が保持する３つのマルチスリット１０と同じマルチスリット幅Ｌの３つのマルチスリット２０を切替可能に保持する回転切替部材である。なお、マルチスリット２０の各スリットには、図３（ｂ）にその一例を示すように、マルチスリット幅Ｌの同じマルチスリット１０の各スリットに貼り付けられている励起フィルタに対応しており、波長透過特性の異なる蛍光フィルタが貼り付けられている。
斯かる観察側スリット部１９には、図４に示すようにＰＣ７のＣＰＵ３０からの指示に基づいて観察側スリット部１９を回転させるための駆動部３２が備えられており、これによって３つのマルチスリット２０を切り替えて光路中に選択的に配置することができる。
なお、上記構成の照明側スリット部９が保持する３つのマルチスリット１０と、観察側スリット部１９が保持する３つのマルチスリット２０は、観察に際して、同じマルチスリット幅Ｌのものどうしが光路中に配置して使用される。また、照明側スリット部９及び観察側スリット部１９のいずれにもスリットが設けられていない開口部を有していてもよい。
走査ミラー１２には、ガルバノミラーが用いられており、図４に示すようにＰＣ７のＣＰＵ３０からの指示に基づいて走査ミラー１２の動作を制御するためのミラー制御部３３が備えられている。
【００１３】
以上の構成の下、光源６から射出された照明光は、照明側スリット部９のマルチスリット１０を透過することで波長の異なる複数のスリット光となる。この複数のスリット光は、第１ダイクロイックミラー１１で反射され、さらに走査ミラー１２の表側反射面で反射された後、レンズ１３、反射ミラー１４、及び対物レンズ４を順に介してステージ３上の試料２に照射される。これにより励起された試料２から発せられた観察光（蛍光）は、再び対物レンズ４、反射ミラー１４、及びレンズ１３を順に介し、走査ミラー１２の表側反射面で反射された後、第１ダイクロイックミラー１１を透過する。そしてこの観察光は、レンズ１６と反射ミラー１７を介し、観察側スリット部１９の位置に試料２に投影されたマルチスリット１０の像が形成される。その像を形成する光線がマルチスリット２０を透過することで、試料２における観察側スリット部１９と共役な位置からの光線のみが取り出される。また、各々のスリットを通ったスリット光は、波長が異なる。この複数の波長の異なるスリット光は、反射ミラー２１、レンズ２２、及び反射ミラー２３を順に経て走査ミラー１２の裏側反射面で反射され、ズームレンズ２５と集光レンズ２７ａを介して検出器２８ａで検出される。
なお、試料２に照射される波長の異なる複数のスリット光は、走査ミラー１２によって試料面上を一次元的に走査されるため、検出器２８ａでは試料２の観察領域全体にわたって複数の波長による観察光が時系列に検出されることとなる。これによりＰＣ７は、検出器２８ａから観察光の検出信号を時系列に取得することで、各々の波長における観察光を試料２の各々の観察領域で検出し、これに基づいて試料２の二次元画像を波長毎に生成してＰＣ７のモニタ７ａに表示させる。このようにして使用者は、観察波長が異なる複数の共焦点画像を１回の走査ミラー１２の走査により観察することが可能となる。
【００１４】
ここで、検出器２８ａによって複数の波長の観察光を同時に検出する方法について説明する。
上述のように試料２から発せられた観察光は、波長の異なる複数のスリット光として検出器２８ａの検出面に照射され、走査ミラー１２によって検出面上を一次元的に走査されるため、図５（ａ）に示すように検出面上の各ラインには複数のスリット光が順次入射することになる。このため、各ラインは、各々のスリット光が入射するタイミングに同期して受光開始と受光終了を繰り返し、それぞれの受光開始から受光終了までの間で検出された検出信号の出力を行う（図６を参照。）。なお、検出器２８ａの各ラインから出力された検出信号は、ＰＣ７の一時記憶部３６内に確保された複数のフレームバッファに波長毎に別々に記憶される（図５（ｂ）を参照。）。したがって、波長の異なる複数のスリット光が検出面上を一回走査することで、一時記憶部３６に一画面分の検出信号が波長毎に記憶されることになり、これに基づいてＰＣ７のＣＰＵ３０は観察波長の異なる複数の二次元画像を生成することが可能となる。なお、検出器２８ａのラインとは、図５（ａ）に示すように検出器２８ａの検出面を構成する複数の画素のうち、スリット光の走査方向と直交する方向に並んだ画素の集合（画素群）をいう。また、本実施形態において、図４に示すＰＣ７には、検出器２８ａの各ラインで検出された検出信号を波長毎に一時的に記憶するための一時記憶部３６が備えられている。
【００１５】
上記構成の下、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、検出器２８ａの各ラインの受光動作を設定するための図７に示す受光動作設定ルーチンを実行可能に構成されている。
受光動作設定ルーチンは、使用者が本ルーチンの開始の指示をＰＣ７へ入力することで開始される。
ステップＳ１：ＰＣ７のＣＰＵ３０が、使用者によって走査ミラー１２の所望の駆動周波数と振幅、及び所望の受光時間がＰＣ７へ入力されているか否かを判定する。これらがＰＣ７へ入力されている場合はステップＳ２へ進み、そうでない場合は本ステップＳ１を再度実行する。なお、前記所望の受光時間は、各ラインの受光時間を設定する上で基準となるものである。
ステップＳ２：ＣＰＵ３０が、使用者によって観察側スリット部１９の３つのマルチスリット２０から所望のマルチスリット２０が選択され、その情報がＰＣ７へ入力されているか否かを判定する。所望のマルチスリット２０の情報がＰＣ７へ入力されている場合はステップＳ３へ進み、そうでない場合は本ステップＳ２を再度実行する。
【００１６】
ステップＳ３：ＣＰＵ３０が、ステップＳ１で得られた走査ミラー１２の所望の駆動周波数と振幅に基づいて、検出器２８ａの検出面上を走査する複数のスリット光の各ラインへの到達時間（各スリット光が走査し始めてから各ラインへ到達するまでの時間）を算出する。またＣＰＵ３０が、ＰＣ７の一時記憶部３６内に、前記複数のスリット光と同じ数のフレームバッファ、即ちステップＳ２で選択された所望のマルチスリット２０のスリット数と同じ数のフレームバッファを確保する。
ステップＳ４：ＣＰＵ３０が、ステップＳ３で得られた各スリット光の各ラインへの到達時間を、各スリット光が各ラインに入射する度に各ラインで実行される受光の受光開始時間として、各ラインの各スリット光に対する受光開始時間と受光時間からなる制御テーブルを作成する。なお、本実施形態において、当該受光時間は全て共通であり、ステップＳ１で得られた所望の受光時間がそのまま用いられる。
ステップＳ５：ＣＰＵ３０が、ステップＳ４で作成した制御テーブルの情報を検出器制御部２９ａへ出力し、本ルーチンが終了する。
【００１７】
本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、上記受光動作設定ルーチンを実行することで、走査ミラー１２の所望の駆動周波数と振幅、所望の受光時間、及び観察側スリット部１９のマルチスリット２０に合わせて、各ラインの受光動作を制御するための制御テーブルを作成し、これを検出器制御部２９ａへ出力することができる。
これにより、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１において、検出器２８ａが試料２からの観察光を検出する、即ち受光を行う際には、上記制御テーブルに基づいて信号発生回路３０ａがタイミング信号を出力する。そして、このタイミング信号にしたがって検出器制御部２９ａが検出器２８ａの各ラインの受光動作を制御することで、各ラインの受光開始時間と受光時間を適切に制御することができる（図６を参照。）。したがって、検出器２８ａの検出面上を走査する複数のスリット光が各ラインに順次入射する度に、各ラインで受光を適切に行うことができる。なお、検出器制御部２９ａは、各ラインが受光を行う度に、受光によって得られた検出信号をＰＣ７の一時記憶部３６内の所定のフレームバッファへ出力する（図６を参照。）。以上のようにして検出器２８ａの各ラインは各スリット光が入射するのと同期して受光の開始を行い、受光終了までの間に受光された検出信号の出力を適切に行うことができ、一時記憶部３６の複数のフレームバッファに検出信号が波長毎に記憶されることとなる。そしてこれに基づいてＣＰＵ３０は、観察波長の異なる複数の二次元画像を生成することが可能となる。
【００１８】
以上、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１によれば、試料２から発せられた複数の波長の観察光を１つの検出器２８ａで同時に検出することができ、上述した従来の共焦点顕微鏡のように複数の検出器を必要としないため、小型化が実現でき、部品点数も少なくなるので低価格化を実現することもできる。また、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、上述のように照明側スリット部９が保持するマルチスリット１０の各スリットに励起フィルタを貼り付け、観察側スリット部１９が保持するマルチスリット２０の各スリットに蛍光フィルタを貼り付けた構成であるため、これらのフィルタは従来の共焦点顕微鏡に備えられた励起フィルタや蛍光フィルタに比して十分に小型であり、これによってさらなる低価格化を実現することができる。
【００１９】
なお、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１において、照明側スリット部９が保持するマルチスリット１０の各スリットには、上述のように波長透過特性の異なる励起フィルタが貼り付けられており、観察側スリット部１９が保持するマルチスリット２０の各スリットには、前記励起フィルタに対応した蛍光フィルタが貼り付けられている。しかしこれに限られず、マルチスリット１０の各スリットのうち、複数のスリットに波長透過特性の同じ励起フィルタを貼り付け、これに対応してマルチスリット２０の各スリットのうち、複数のスリットに波長透過特性の同じ蛍光フィルタを貼り付けた構成としてもよい。この構成により、観察波長の同じ複数の共焦点画像を取得することができるため、これらの画像をＰＣ７のＣＰＵ３０が合成することで、１枚の明るい共焦点画像を取得することが可能となる。したがって、低い強度の照明光によって試料２の明るい共焦点画像を取得することが可能となり、高い強度の照明光が試料２に悪影響を及ぼしてしまうという光毒性の問題を解消することができる。
【００２０】
また、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１において、上記受光動作設定ルーチンで作成される制御テーブル中の受光時間は、上述のように全て共通である。しかしこれに限られず、受光時間を必要に応じて適宜変更した制御テーブルを作成する構成としてもよい。例えば、走査ミラー１２の動作速度、即ち複数のスリット光が検出器２８ａの検出面上を走査する速度の変化に応じて、ライン毎に受光時間を変更して制御テーブルを作成する構成としてもよい。これにより、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１で取得される観察波長の異なる複数の共焦点画像の明るさムラを解消することができる。
【００２１】
また、本実施形態に係る共焦点顕微鏡１は、上述のように照明側スリット部９のマルチスリット１０に励起フィルタを備え、観察側スリット部１９のマルチスリット２０に蛍光フィルタを備えており、これによって試料２が発した蛍光を観察する共焦点蛍光顕微鏡である。しかしこれに限られず、少なくとも観察側スリット部１９が保持するマルチスリット２０の各スリットに波長透過特性の異なる波長選択フィルタを貼り付けた構成とすることで、通常の共焦点顕微鏡を実現することもできる。
【符号の説明】
【００２２】
１        共焦点顕微鏡
２        試料
４        対物レンズ
７        ＰＣ
９        照明側スリット部
１０      マルチスリット
１２      走査ミラー
１９      観察側スリット部
２０      マルチスリット
２８ａ，２８ｂ      検出器
２９ａ，２９ｂ      検出器制御部
３０ａ，３０ｂ      信号発生回路
３０      ＣＰＵ
３６      一時記憶部
【図１】
2012118363.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2012118363.tif 000008
【図７】
2012118363.tif 000009