(57)【要約】【課題】血管内皮障害の検出・評価をより高い精度で行うことを可能としうる手段を提供する。【解決手段】本発明の一形態によれば、生体より採取した血漿試料について、１）血管内皮細胞由来マイクロパーティクルを検出または定量する工程と、２）組織因子含有マイクロパーティクルを検出または定量する工程とを含む、血管内皮障害の検査方法が提供される。また、本発明の他の形態によれば、血管内皮細胞由来マイクロパーティクルを特異的に認識する第１の抗体と、組織因子含有マイクロパーティクルを特異的に認識する第２の抗体とを含む、血管内皮障害の検査用キットが提供される。【選択図】図１１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体より採取した血液試料について、
１）血管内皮細胞由来マイクロパーティクルを検出または定量する工程と、
２）組織因子含有マイクロパーティクルを検出または定量する工程と、
を含む、血管内皮障害の検査方法。
【請求項２】
前記工程１）を、血管内皮細胞由来マイクロパーティクルを特異的に認識する第１の抗体を用いて行い、
前記工程２）を、組織因子含有マイクロパーティクルを特異的に認識する第２の抗体を用いて行う、
請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
前記第１の抗体が抗ＣＤ１４４抗体であり、前記第２の抗体が抗ＣＤ１４２抗体である、請求項２に記載の検査方法。
【請求項４】
前記第１および第２の抗体が蛍光色素で標識されたものであり、前記工程１）および前記工程２）を、フローサイトメトリー法を用いて行う、請求項２または３に記載の検査方法。
【請求項５】
前記血液試料について、
３）血小板由来マイクロパーティクルを検出または定量する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項６】
前記血液試料について、
４）単球由来マイクロパーティクルを検出または定量する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項７】
前記血液試料について、
５）好中球由来マイクロパーティクルを検出または定量する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の工程を含む、メタボリックシンドロームの予防・発症に関係するリスクファクターの検査方法。
【請求項９】
血管内皮細胞由来マイクロパーティクルを特異的に認識する第１の抗体と、
組織因子含有マイクロパーティクルを特異的に認識する第２の抗体と、
を含む、血管内皮障害の検査用キット。
【請求項１０】
前記第１の抗体が抗ＣＤ１４４抗体であり、前記第２の抗体が抗ＣＤ１４２抗体である、請求項９に記載の検査用キット。
【請求項１１】
前記第１および第２の抗体が蛍光色素で標識されたものであり、フローサイトメトリー法を用いた検査に用いられる、請求項９または１０に記載の検査用キット。
【請求項１２】
血管内皮細胞由来マイクロパーティクルの検出領域のうち、粒径の上限部位を規定するための第１のセッティングビーズと、
組織因子含有マイクロパーティクルの検出領域のうち、粒径の上限部位を規定するための第２のセッティングビーズと、
濃度既知の計数ビーズと、
マイクロパーティクルの検出領域のうち、最小強度閾値を定義するための閾値ビーズと、
をさらに含む、請求項１１に記載の検査用キット。
【請求項１３】
前記閾値ビーズの平均粒径が０．５μｍである、請求項１２に記載の検査用キット。
【請求項１４】
前記計数ビーズの平均粒径が３〜７μｍである、請求項１２または１３に記載の検査用キット。
【請求項１５】
前記第１および第２のセッティングビーズの平均粒径が１〜２μｍである、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の検査用キット。
【請求項１６】
前記蛍光色素が、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリン−Ｃｙ５、またはフィコエリトリンである、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮障害を検査するための新規な検査方法および検査用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
メタボリックシンドロームとは、内臓脂肪型肥満に、高血糖、高血圧および高脂血症のいずれか２種以上を合併した病態をいう。このメタボリックシンドロームは、高齢化社会に向けて、医療費抑制および高齢者のＱＯＬ確保等の観点から、予防・改善すべき病態である。そして、メタボリックシンドロームは、生活習慣の改善によってその発症を予防することが有効であると考えられている。
【０００３】
このメタボリックシンドロームの病態の進行には、血管内皮の障害が関与しているとされている。例えば、血管内皮に障害を受けた患者群ほど心血管イベントの発症率が高いことが報告されている。
【０００４】
ところで、活性化した種々の細胞は微小粒子（マイクロパーティクル（ＭＰ；MicroParticle））と呼ばれる小胞を放出することが知られている。直径１〜２μｍ程度のこれらのマイクロパーティクルは、由来する細胞に応じて、血小板由来マイクロパーティクル（ＰＤＭＰ；Platelet-Derived MicroParticle）、血管内皮細胞由来マイクロパーティクル（ＥＤＭＰ；Endothelial-Derived MicroParticle）、単球由来マイクロパーティクル（ＭＤＭＰ；Monocyte-Derived MicroParticle）などが知られており、生体内で重要な役割を演じているとされている。
【０００５】
これらのＭＰは、種々の受容体、膜タンパク質（GpIIb/IIIa、VE-cadherin、Tissue Factor（ＴＦ））などを発現し、血栓形成に関与すると考えられている。また、多くの病態で、血行中のＭＰレベルが高いことが観察されている。したがって、これらのＭＰの検出・定量は、種々の病態の進行における血栓前駆状態の重篤度の検出および評価、ひいてはメタボリックシンドロームの病態・重篤度の評価における重要な尺度となることが期待される。そして、これらの評価に基づく予防的医療が実現できれば、今後到来する高齢社会におけるその有用性は計り知れない。
【０００６】
従来、マイクロパーティクルを病態マーカーとして用いる、血管内皮障害に関連した各種病態の検査技術として、例えば特許文献１には、血小板由来マイクロパーティクル（ＰＤＭＰ）を指標とする血栓症前駆状態の検出・監視方法が開示されている。また、例えば特許文献２には、同じく血小板由来マイクロパーティクル（ＰＤＭＰ）を指標として心臓血管疾患を診断したり、その予後を評価したり、その進行の有無を評価したりする方法が開示されている。
【０００７】
従来、生体試料（例えば、血漿）中のマイクロパーティクルを検出・定量する手法としては、例えば濾過法や酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法などが従来提案されていた。しかし近年では、ＭＰのサイズおよび表面状態を同時に計測可能なフローサイトメトリー法を利用してＭＰを検出・定量することが広く行われている。フローサイトメトリー法の原理や、細胞・細胞粒子の部分集団を識別して定量する方法におけるその利点などは、今日では当該技術に精通する者にはよく知られており、ＭＰの検出・定量以外の用途でも、例えば、血液中の活性化された血小板の検出や、機能検定法による血小板由来のプロ凝血素性微粒子の検出などに既に利用されている。なお、フローサイトメトリー法を用いると、複数の計測対象を同時に計測することが可能である。にもかかわらず、従来提案されているフローサイトメトリー法によるＭＰの検出・定量方法は、単色の蛍光標識を利用して１種のみのＭＰを計測するものである。従来の技術はこの点で、フローサイトメトリー法の利点を十分に生かし切れていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００３−５３３６９８号公報
【特許文献２】特表２００８−５２９７０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、ＰＤＭＰを指標として各種病態の診断・予後評価を行う技術が従来提案されている。しかしながら、本発明者らの検討によれば、従来提案されているＰＤＭＰのみを指標とした手法では、血管内皮障害の検出・評価を確定的に行うには十分ではないことが判明した。その一因として、血漿中のＰＤＭＰは血管内皮障害以外のイベント（例えば、炎症の発生など）によってもそのレベルが上昇してしまうことが考えられた。
【００１０】
そこで本発明は、上述したような従来技術における課題に鑑み、血管内皮障害の検出・評価をより高い精度で行うことを可能としうる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上述した課題を解決することを目指して、鋭意研究を行なった。その過程で、血管内皮障害の高リスク患者群における各種マイクロパーティクルの検出・定量を試みた。また、それだけでなく、各マイクロパーティクル間での相関も調べてみた。そうしたところ、まったく予期していなかったことに、血管内皮障害の高リスク患者群においては、血漿中における血管内皮由来マイクロパーティクル（以下、単に「ＥＤＭＰ」とも称する）の量と、組織因子（ＴＦ；Tissue Factor）を含有するマイクロパーティクル（以下、「組織因子含有マイクロパーティクル」または「ＴＦ」とも称する）の量との間に高い相関が認められることを知得した。この知見に基づき、これら２種のマイクロパーティクルが血管内皮障害の病態マーカーとして用いられうるであろうと考え、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明の第１の形態によれば、生体より採取した血液試料について、
１）血管内皮細胞由来マイクロパーティクルを検出または定量する工程と、
２）組織因子含有マイクロパーティクルを検出または定量する工程と、
を含む、血管内皮障害の検査方法が提供される。
【００１３】
上記検査方法においては、工程１）を、血管内皮細胞由来マイクロパーティクルを特異的に認識する第１の抗体（例えば、抗ＣＤ１４４抗体）を用いて行い、工程２）を、組織因子含有マイクロパーティクルを特異的に認識する第２の抗体（例えば、ＣＤ１４２抗体）を用いて行うことが好ましい。
【００１４】
また、上記検査方法においては、第１および第２の抗体が蛍光色素で標識されたものであることが好ましく、この場合、工程１）および工程２）は、フローサイトメトリー法を用いて行われうる。
【００１５】
さらに、上記検査方法は、上記血液試料について、
３）血小板由来マイクロパーティクルを検出または定量する工程、および／または、
４）単球由来マイクロパーティクルを検出または定量する工程、および／または、
５）好中球由来マイクロパーティクル（ＮＤＭＰ；Neutrophil-Derived MicroParticle）を検出または定量する工程
をさらに含むことが好ましい。
【００１６】
なお、本発明の他の形態によれば、上記検査方法における上記工程を含む、メタボリックシンドロームの予防・発症に関係するリスクファクターの検査方法もまた、提供されうる。
【００１７】
また、本発明のさらに他の形態によれば、
血管内皮細胞由来マイクロパーティクルを特異的に認識する第１の抗体と、
組織因子含有マイクロパーティクルを特異的に認識する第２の抗体と、
を含む、血管内皮障害の検査用キットが提供される。
【００１８】
上記検査用キットにおいては、第１の抗体が抗ＣＤ１４４抗体であり、第２の抗体が抗ＣＤ１４２抗体であることが好ましい。
【００１９】
また、上記検査用キットにおいては、第１および第２の抗体が蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリン−Ｃｙ５、またはフィコエリトリンなど）で標識されたものであることが好ましく、この場合、当該検査用キットは、フローサイトメトリー法を用いた検査に用いられうる。さらにこの場合、上記検査用キットは、
血管内皮細胞由来マイクロパーティクルの検出領域のうち、粒径の上限部位を規定するための第１のセッティングビーズと、
組織因子含有マイクロパーティクルの検出領域のうち、粒径の上限部位を規定するための第２のセッティングビーズと、
濃度既知の計数ビーズと、
マイクロパーティクルの検出領域のうち、最小強度閾値を定義するための閾値ビーズと、
をさらに含むことが好ましい。なお、閾値ビーズの平均粒径は好ましくは０．５μｍであり、計数ビーズの平均粒径は好ましくは３〜７μｍであり、第１および第２のセッティングビーズの平均粒径は好ましくは１〜２μｍである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の検査方法や検査用キットを用いることで、血管内皮障害の検出・評価をより高い精度で行うことが可能となる。また、このようにして血管内皮障害の検出・評価を行うことで、ひいてはメタボリックシンドロームの予防・発症に関係するリスクファクターの検査を行うことも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】０．５μｍの平均粒径を有する閾値ビーズを計測し、ＦＳ×ＳＳサイトグラムのＦＳにおけるＭＰ検出領域の粒径の下限部位を決定する段階を説明するための説明図である。
【図２】１．０μｍの平均粒径を有するセッティングビーズを計測し、ＦＳ×ＳＳサイトグラムのＦＳにおけるＴＦ検出領域の粒径の上限部位を決定する段階を説明するための説明図である。
【図３】ＦＳ×ＳＳサイトグラム上で、ＴＦ検出のための１次領域（１次ゲート）を決定する段階を説明するための説明図である。
【図４】ＦＳ×ＦＬサイトグラム上で、ＴＦ検出領域を決定する段階を説明するための説明図である。
【図５】２．０μｍの平均粒径を有するセッティングビーズを計測し、ＦＳ×ＳＳサイトグラムのＦＳにおけるＥＤＭＰ検出領域の粒径の上限部位を決定する段階を説明するための説明図である。
【図６】ＦＳ×ＳＳサイトグラム上で、ＥＤＭＰ検出のための１次領域（１次ゲート）を決定する段階を説明するための説明図である。
【図７】ＦＳ×ＦＬサイトグラム上で、ＥＤＭＰ検出領域を決定する段階を説明するための説明図である。
【図８】実施例１において、計測サンプルにおけるＥＤＭＰおよびＴＦを検出した結果を示す図である。
【図９Ａ】実施例１におけるＥＤＭＰの検出結果をＦＳ×ＳＳスキャッタグラムに再展開した結果を示す図である。
【図９Ｂ】実施例１におけるＴＦの検出結果をＦＳ×ＳＳスキャッタグラムに再展開した結果を示す図である。
【図１０】計数ビーズを計測する段階を説明するための説明図である。
【図１１Ａ】実施例１において計測された、健常ボランティア由来の計測サンプル中のＥＤＭＰ濃度（平均値±標準偏差）と、患者由来の計測サンプルにおけるＥＤＭＰ濃度（平均値±標準偏差）とを比較したグラフである。
【図１１Ｂ】実施例１において計測された、健常ボランティア由来の計測サンプル中のＴＦ濃度（平均値±標準偏差）と、患者由来の計測サンプルにおけるＴＦ濃度（平均値±標準偏差）とを比較したグラフである。
【図１２】ＦＳ×ＦＬサイトグラム上で、ＰＤＭＰ検出領域を決定する段階を説明するための説明図である。
【図１３】実施例２において、計測サンプルにおけるＰＤＭＰを検出した結果を示す図である。
【図１４】実施例２におけるＰＤＭＰの検出結果をＦＳ×ＳＳスキャッタグラムに再展開した結果を示す図である。
【図１５】実施例２において計測された、健常ボランティア由来の計測サンプル中のＰＤＭＰ濃度（平均値±標準偏差）と、患者由来の計測サンプルにおけるＰＤＭＰ濃度（平均値±標準偏差）とを比較したグラフである。
【図１６】ＦＳ×ＦＬサイトグラム上で、ＭＤＭＰ検出領域を決定する段階を説明するための説明図である。
【図１７】実施例３において、計測サンプルにおけるＭＤＭＰを検出した結果を示す図である。
【図１８】実施例３におけるＭＤＭＰの検出結果をＦＳ×ＳＳスキャッタグラムに再展開した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の第１の形態は、生体より採取した血液試料について、
１）血管内皮細胞由来マイクロパーティクル（ＥＤＭＰ）を検出または定量する工程と、
２）組織因子含有マイクロパーティクル（ＴＦ）を検出または定量する工程と、
を含む、血管内皮障害の検査方法である。以下、本発明の検査方法を実施するための好ましい一形態について、ＭＰの検出・定量をフローサイトメトリー法により行う場合を例に挙げて具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、下記の具体的な実施形態のみには限定されない。
【００２３】
本発明の検査方法においては、検査対象の試料として、生体より採取した血液試料を用いる。本発明の検査方法を適用することができる対象としては、動物であれば特に限定されないが、例えば、哺乳動物等が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、霊長類、実験用動物、家畜、ペット等が挙げられ特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコなどが挙げられる。好ましくは、対象動物はヒトである。また、本発明の検査方法に用いられる血液試料について特に制限はなく、従来臨床検査において一般的に用いられている血液試料が用いられうる。血液試料は例えば、血漿試料であり、好ましくは血小板欠乏血漿（ＰＰＰ：Platelet Poor Plasma）である。
【００２４】
ここで、採血時に存在するＭＰを検出し、採血後にＭＰが発現しないようにするためには、血小板を活性化させないことが重要となる。従って、血漿試料等の血液試料の調製の際には、Ｃａイオンキレート作用を有するクエン酸やＥＤＴＡを抗凝固剤として用いることが好ましい。なお、従来ＭＰの計測ではクエン酸採血管を用いることが一般的に行われているが、本発明の検査方法のようにＭＰ計測のみが目的の場合には、試料安定性を向上させることを目的として、Ｃａイオンキレート効果が強いＥＤＴＡを抗凝固剤として用いることがより好ましい。
【００２５】
なお、全血試料にはＭＰに対して血球成分が多数存在することから、本発明の検査方法においては、血液試料として全血試料よりも血漿試料を用いることが好ましい。具体的には、全血試料の処理過程で血球細胞から余計なＭＰを生じさせないように、血球成分をできるだけ穏やかに除去し、特に血小板とのコンタミネーションをできるだけ排除する必要がある。全血試料から血球成分を除去して血漿試料を得るには、遠心操作により血漿成分を分離すればよい。この際の遠心条件について特に制限はなく、例えば、最も簡便な方法である８０００ｇで５分といった条件が用いられうる。なお、試料容器としてはＰＰ製マイクロチューブを用いればよい。
【００２６】
続いて、血球が沈殿した上清の血漿を別の試料容器（ＰＰ製マイクロチューブなど）に移し、フローサイトメトリー法の計測用試料とする。遠心操作によって得られた血漿は例えば４℃程度の温度で保存し、速やかに使用する。あるいは、計測に使用するまで−２０℃以下の低温で凍結保存し、解凍後速やかに計測に用いる。
【００２７】
次に、計測用試料中のＭＰを免疫染色する。具体的には、免疫染色に必要な抗体濃度となるように、計測用試料に抗体を分注し、試料中に含まれるＭＰの表面抗原と反応させる。この際、免疫染色において抗原抗体反応が問題なく行われるように、計測用試料中のＭＰ濃度の最大値を推定し、抗体分注量がＭＰを染色するのに十分であることを確認しておく。抗体濃度が不適切であると、抗原抗体結合部位に別の抗体がトラップされ偽陽性パターンとなることがある。抗体と表面抗原との間での抗原抗体反応を十分に進行させるための反応条件は特に制限されず、従来公知の知見が適宜参照されうる。例えば、室温にて５〜３０分間程度インキュベートすればよい。ただし、蛍光色素に対する悪影響を防止するという観点からは、インキュベートは遮光条件下で行うことが好ましい。また、反応終了後、計測用試料を緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）など）を用いて希釈してもよい。この際、ＭＰどうしの凝集を防止することを目的として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の凝集防止剤を０．１％程度の濃度で添加することが好ましい。
【００２８】
フローサイトメトリー法によって血管内皮細胞由来マイクロパーティクル（ＥＤＭＰ）を検出または定量するには、これを特異的に認識する抗体を蛍光色素で標識したものが用いられる。ＥＤＭＰを特異的に認識する抗体としては、その有する表面抗原に対応したものとして、抗ＣＤ１４４抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１４６抗体、抗ＣＤ６２Ｅ抗体などが用いられうる。なかでも、好ましくは抗ＣＤ１４４抗体が用いられる。同様に、フローサイトメトリー法によって組織因子含有マイクロパーティクル（ＴＦ）を検出または定量するには、これを特異的に認識する抗体を蛍光色素で標識したものが用いられる。ＴＦを特異的に認識する抗体としては、その有する表面抗原に対応したものとして、抗ＣＤ１４２抗体などが用いられうる。
【００２９】
抗体を蛍光標識するのに用いられる蛍光色素について特に制限はなく、本技術分野における公知の知見が適宜参照されうる。かような蛍光色素としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ＰＥ−Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５などが挙げられる。上述したように、フローサイトメトリー法によれば複数の計測対象を同時に計測することができるという利点があるが、これを実現するためには、同時に計測を希望する異なる２つ以上の抗体のそれぞれを、互いに異なる蛍光色素によって標識すればよい。
【００３０】
なお、フローサイトメトリー法による血液試料中のＥＤＭＰおよびＴＦの定量を可能とするために、計測用試料には、計数ビーズを添加しておく。具体的には、一定量の計数ビーズが既に含まれている計測用チューブ（例えば、TruCountTM tube（BD Biosciences）など）を用いてもよいし、別途準備した計数ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ（Polyscience、Philadelphia USA）など）を計量して、計測用チューブに添加してもよい。この際に用いる計数ビーズの平均粒径は、計測対象粒子と異なる血小板よりも大きな粒径が好ましく、好ましくは３〜７μｍであり、より好ましくは３μｍである。
【００３１】
本発明者らの検討によれば、血管内皮障害の高リスク群としての患者由来の計測サンプルについて、ＥＤＭＰ濃度とＴＦ濃度との間に極めて高い相関が見られることが今回初めて見出された。本発明の検査方法は当該知見に基づいて、血管内皮障害を検査することができる。具体的には、例えば、被験体から採取した血液試料中のＥＤＭＰ濃度およびＴＦ濃度を、健常者および血管内皮障害と確定診断された患者のそれぞれから採取した血液試料中のＥＤＭＰ濃度およびＴＦ濃度と比較して、被験体における血管内皮障害の有無や、血管内皮障害が存在する場合にはその程度を検査することが可能である。特に、ＥＤＭＰ濃度およびＴＦ濃度の双方の値が、健常者と比較して有意に高いか、または確定診断後の患者と比較して有意に低くないときには、血管内皮障害が存在する可能性が非常に高いと判定することができる。なお、フローサイトメトリー法によって血液試料中のＥＤＭＰ濃度やＴＦ濃度を計測する具体的な手法については、後述する。
【００３２】
さらに、本発明の検査方法は、上述した血液試料について、
３）血小板由来マイクロパーティクル（ＰＤＭＰ）を検出または定量する工程、および／または、
４）単球由来マイクロパーティクル（ＭＤＭＰ）を検出または定量する工程、および／または、
５）好中球由来マイクロパーティクル（ＮＤＭＰ）を検出または定量する工程
をさらに含むことが好ましい。
【００３３】
かような形態において、フローサイトメトリー法によってＰＤＭＰやＭＤＭＰ、ＮＤＭＰを検出または定量するには、これらを特異的に認識する抗体を蛍光色素で標識したものが用いられる。ＰＤＭＰを特異的に認識する抗体としては、その有する表面抗原に対応したものとして、抗ＣＤ４１抗体、抗ＣＤ６２Ｐ抗体、抗ＣＤ６１抗体などが用いられうる。なかでも、好ましくは抗ＣＤ４１抗体が用いられる。同様に、フローサイトメトリー法によって単球由来マイクロパーティクル（ＭＤＭＰ）を検出または定量するには、これを特異的に認識する抗体を蛍光色素で標識したものが用いられる。ＭＤＭＰを特異的に認識する抗体としては、その有する表面抗原に対応したものとして、抗ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）抗体、抗ＣＤ３２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ１４抗体などが用いられうる。なかでも、好ましくは抗ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）抗体が用いられる。同様に、フローサイトメトリー法によって好中球由来マイクロパーティクル（ＮＤＭＰ）を検出または定量するには、これを特異的に認識する抗体を蛍光色素で標識したものが用いられる。ＮＤＭＰを特異的に認識する抗体としては、その有する表面抗原に対応したものとして、抗ＣＤ６６ｂ抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ６４抗体などが用いられうる。なかでも、好ましくは抗ＣＤ６６ｂ抗体が用いられる。
【００３４】
上述した工程３）および／または工程４）および／または工程５）を含む実施形態によれば、上記で得られた血液試料中のＥＤＭＰ濃度およびＴＦ濃度に加えて、血液試料中のＰＤＭＰ濃度および／またはＭＤＭＰ濃度といった情報もまた、併せて検査に用いられうる。これにより、よりきめ細やかな検査（例えば、病態の細分類など）が可能となるため、好ましい。また、血液試料中のＰＤＭＰ濃度は、当該血液における凝固系の状態を反映する指標として用いられうる。したがって、例えば、高脂血症などを発症しており抗凝固薬を服用している患者を被験体とする場合には、得られたＰＤＭＰ濃度に関する情報をもとに、抗凝固薬の服用による臨床的な効果（治療効果・予防効果）を同時に検査することもできる。さらに、ＭＤＭＰは、ＨＰＳ（Hemophagocytic syndrome、血球貪食症候群）などのような免疫が不活化する場合などには関連がある。ＮＤＭＰは、炎症反応などに係る場合などに関連がある。よって、同時に計測することで内皮障害の原因追求に有効である。
【００３５】
そして、本発明の他の形態によれば、上記検査方法における上記工程を含む、メタボリックシンドロームの予防・発症に関係するリスクファクターの検査方法もまた、提供されうる。
【００３６】
フローサイトメトリー法によってＥＤＭＰやＴＦといったＭＰを検出・定量する具体的な手順については特に制限はなく、正確な値が精確に得られる限り、従来公知の知見が適宜参照されうる。以下、当該手順の一例について、ＥＤＭＰおよびＴＦを同時に検出・定量する場合を例に挙げて、図面を参照しつつ簡単に説明する。
【００３７】
まず、計測サンプルを用いた計測に先立ち、ＴＦ検出領域およびＥＤＭＰ検出領域を決定する。
【００３８】
具体的には、初めに、ＦＳ×ＳＳサイトグラムを用意する。ここで、フローサイトメトリー法ではその原理上、０．５μｍ未満の粒径を有するＭＰについては前方散乱光（ＦＳ；Forward Scatter）の強度の違いによって粒径を分析することはできない。よって、ここでは、図１に示すようにして、０．５μｍの平均粒径を有する閾値ビーズを計測し、ＦＳにおけるＭＰ検出領域の粒径の下限部位を決定する。
【００３９】
続いて、本発明者らの検討によれば、ＴＦ並びに、任意で用いられうるＰＤＭＰおよびＭＤＭＰについては、粒径の上限値を１．０μｍに設定することが妥当と結論づけられた。よって、ここでは、図２に示すようにして、１．０μｍの平均粒径を有するセッティングビーズを計測し、当該セッティングビーズのピーク値によって、ＦＳにおけるＴＦ検出領域の粒径の上限部位を決定する。
【００４０】
以上の手続きによって設定されたＭＰ検出領域の粒径の下限部位および上限部位に基づき、ＦＳ×ＳＳサイトグラム上で、図３に示すようにして、ＴＦ検出のための１次領域（１次ゲート）を決定する。
【００４１】
一方、ＦＳ×ＦＬサイトグラムを用意し、図４に示すようにして、ＴＦ検出領域（ゲート）を決定する。この際、縦軸（ＦＬ）の下限部位は、非特異的に染色された粒子を検出領域から可能な限り排除できるように設定されうる。
【００４２】
一方、ＥＤＭＰに関しては、本発明者らの検討によれば、１．５μｍよりも大きなイベントが出現する結果も観察されたことから、これらの大多数のイベントが含まれるようにＦＳの上限を拡大することとした。ただし、バックグランドノイズや核物質を含むapoptotic bodiesである大きなvesicleはできるだけ除外する必要があるため、ＦＳの上限は２．０μｍまで拡大することとした。よって、ここでは、図５に示すようにして、２．０μｍの平均粒径を有するセッティングビーズを計測し、当該セッティングビーズのピーク値によって、ＦＳにおけるＥＤＭＰ検出領域の粒径の上限部位を決定する。
【００４３】
その後、上記と同様に、ＦＳ×ＳＳサイトグラム上で、図６に示すようにして、ＥＤＭＰ検出のための１次領域（１次ゲート）を決定し、ＦＳ×ＦＬサイトグラム上で、図７に示すようにして、ＥＤＭＰ検出領域（ゲート）を決定する。
【００４４】
続いて、上記で調製した計測サンプルについて計測を行い、計測サンプルにおけるＥＤＭＰおよびＴＦを検出・定量する。なお、それぞれの抗体についてアイソタイプコントロールを用いたサンプルについて同様に計測を行い、非特異的な染色の確認を行う。
【００４５】
その後、ＥＤＭＰおよびＴＦのそれぞれのＦＳ−ＦＬスキャッタグラムで陽性領域を２次ゲートし、ゲート内に含まれたイベントをＭＰイベントとする。得られたＭＰイベントは、ＦＳ−ＳＳスキャッタグラムに再展開することで、ＭＰイベントのサイズの情報について把握することもできる（図９Ａおよび図９Ｂを参照）。
【００４６】
最後に、図１０に示すようにして計数ビーズを計測し、その値に基づいて、検出されたＥＤＭＰおよびＴＦの濃度（個／μＬ血液）を算出する。
【００４７】
以上、フローサイトメトリー法によって血液試料中のＭＰを検出・定量する場合を例に挙げて本発明の検査方法を詳細に説明したが、場合によっては、他の手法を用いて血液試料中のＭＰを検出・定量してももちろんよい。フローサイトメトリー法以外に検出・定量に用いられうる手法としては、例えば、濾過法、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法などが挙げられる。
【００４８】
本発明のさらに他の形態によれば、血管内皮障害を検査するための検査用キットが提供される。当該検査用キットは、その必須構成要素として、
血管内皮細胞由来マイクロパーティクルを特異的に認識する抗体と、
組織因子含有マイクロパーティクルを特異的に認識する抗体と、
を含む。これらの２種の抗体の具体的な形態については上述したとおりであるため、ここでは詳細な説明を省略する。
【００４９】
また、上記検査用キットにおいては、第１および第２の抗体が蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリン−Ｃｙ５、またはフィコエリトリンなど）で標識されたものであることが好ましく、この場合、当該検査用キットは、上述したようなフローサイトメトリー法を用いた検査に用いられうる。さらにこの場合、検査用キットは、
血管内皮細胞由来マイクロパーティクル（ＥＤＭＰ）の検出領域のうち、粒径の上限部位を規定するためのセッティングビーズと、
組織因子含有マイクロパーティクル（ＴＦ）の検出領域のうち、粒径の上限部位を規定するためのセッティングビーズと、
濃度既知の計数ビーズと、
マイクロパーティクルの検出領域のうち、最小強度閾値を定義するための閾値ビーズと、をさらに含むことが好ましい。なお、閾値ビーズの平均粒径は好ましくは０．５μｍであり、計数ビーズの平均粒径は好ましくは３〜５μｍであり、第１および第２のセッティングビーズの平均粒径は好ましくは１〜２μｍである。
【００５０】
本発明により提供される検査用キットは、上述した構成要素以外にも、例えば、試薬や試料を希釈するための緩衝液、反応容器、陽性対照、陰性対照、検査プロトコールを記載した指示書等を含むものであってもよい。これらの要素は、必要に応じて予め混合しておくこともできる。このキットを使用することにより、本発明の血管内皮障害の検査やメタボリックシンドロームの予防・発症に関係するリスクファクターの検査が簡便となり、早期の診断および／または治療方針決定に非常に有用である。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５２】
≪計測用試料の調製≫
血管内皮障害の高リスク群としての心臓弁膜症の患者、虚血性心疾患に対して経皮的冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）を実施した患者、またはカテーテル術受術患者（計２０名）から末梢血を採取し、ＣＲＰ値０．２ｍｇ／ｄＬ以下であることを確認して、以下の実験に用いた。この際、採血する際の抗凝固剤としてはＥＤＴＡを用いた。一方、健常者検体として、健常ボランティア（２４〜４７歳の健康な男女（２９名））からクエン酸採血管を用いて採取した末梢血を用いた。なお、すべての患者および健常ボランティアから、書面によるインフォームドコンセントを得ている。
【００５３】
採血した血液をＰＰ製マイクロチューブに移し（アシストＡ．１５０）、遠心操作により血漿成分を分離して、得られた血小板欠乏血漿（ＰＰＰ；Platelet Poor Plasma）を別のＰＰ製マイクロチューブに移し、計測用試料とした。なお、血漿分離の遠心条件は、８０００ｇ、５分で行った。また、得られた血漿は４℃で保存し、その日のうちに計測を行った。当日計測できない場合には、計測するまで−２０℃以下で凍結保存し、解凍後は速やかに計測を行った。
【００５４】
≪実施例１：ＥＤＭＰおよびＴＦの計測例≫
患者群由来の試料を用いた計測の際には、まず、TruCountTMtube（BD Biosciences）に、ＥＤＭＰを特異的に認識するＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１４４抗体（Serotec Oxford UK）およびＴＦを特異的に認識するＰＥ標識抗ＣＤ１４２抗体（BD Biosciences社製）をそれぞれ２．５μＬずつ添加し、さらに上記で調製した計測用試料５０μＬを添加した。なお、TruCountTM tubeには、計数ビーズであるTruCountTMビーズが凍結乾燥状態で含まれている。一方、健常者由来の試料を用いた計測の際には、TruCountTM tubeに代えて、濃度が既知の計数ビーズ（平均粒径３．０μｍのポリスチレンビーズ１．６８×１０９particles/mL（Polyscience、Philadelphia USA））を希釈分注して５００００個加えた。また、血漿中のＭＰ量の推測値から、抗体の添加量は十分であることを確認した。
【００５５】
室温遮光で１５分間インキュベートし、抗体と血漿中のＭＰとを反応させ、ＰＢＳ（０．１％ＢＳＡ）を４５０μＬ添加して希釈し、計測サンプルを調製した。
【００５６】
なお、計測サンプルを用いた計測に先立ち、以下の手順で、ＴＦ検出領域およびＥＤＭＰ検出領域を決定した。また、フローサイトメトリー法には、BD FACSCantoTM II フローサイトメーター（BD Biosciences）を用いた。
【００５７】
まず、ＦＳ×ＳＳサイトグラムを用意した。次いで、図１に示すようにして、０．５μｍの平均粒径を有する閾値ビーズを計測し、ＦＳにおけるＭＰ検出領域の粒径の下限部位を決定した。
【００５８】
続いて、図２に示すようにして、１．０μｍの平均粒径を有するセッティングビーズを計測し、ＦＳにおけるＴＦ検出領域の粒径の上限部位を決定した。さらに、ＦＳ×ＳＳサイトグラム上で、図３に示すようにして、ＴＦ検出のための１次領域（１次ゲート）を決定した。そして、ＦＳ×ＦＬ２サイトグラムを用意し、図４に示すようにして、ＴＦ検出領域を決定した。
【００５９】
一方、図５に示すようにして、２．０μｍの平均粒径を有するセッティングビーズを計測し、ＦＳにおけるＥＤＭＰ検出領域の粒径の上限部位を決定した。さらに、ＦＳ×ＳＳサイトグラム上で、図６に示すようにして、ＥＤＭＰ検出のための１次領域（１次ゲート）を決定した。そして、ＦＳ×ＦＬ１サイトグラムを用意し、図７に示すようにして、ＥＤＭＰ検出領域を決定した。
【００６０】
続いて、上記で調製した計測サンプルについて計測を行い、計測サンプルにおけるＥＤＭＰおよびＴＦを検出した。なお、それぞれの抗体についてアイソタイプコントロールを用いたサンプルについて同様に計測を行い、非特異的な染色の確認を行った。それぞれの検出結果を図８に示す。なお、ＥＤＭＰの検出結果をＦＳ×ＳＳスキャッタグラムに再展開したものを図９Ａに示し、ＴＦの検出結果をＦＳ×ＳＳスキャッタグラムに再展開したものを図９Ｂに示す。
【００６１】
最後に、図１０に示すようにして計数ビーズとして用いたTruCountTMビーズまたはポリスチレンビーズを計測し、その値に基づいて、検出されたＥＤＭＰおよびＴＦの血漿中濃度（個／μＬ血漿）を算出した。
【００６２】
以上のようにして求めた患者由来の計測サンプル中のＥＤＭＰ濃度およびＴＦ濃度について相関係数ｒを算出したところ、ｒ＝０．８７と極めて高い相関が見られた。ここで、図１１Ａ（ＥＤＭＰ濃度）および図１１Ｂ（ＴＦ濃度）に示すように、健常ボランティア由来の計測サンプル中のＥＤＭＰ濃度（平均値）およびＴＦ濃度（平均値）はいずれも、患者由来の計測サンプルにおける値（平均値）よりも有意に小さい値を示した。このことから、血漿中のＥＤＭＰ濃度およびＴＦ濃度を血管内皮障害の病態マーカーとして併用することで、血管内皮障害の検出・評価をより高い精度で行うことが可能となることが示唆された。なお、図１１Ａおよび図１１Ｂのグラフで示される値は、健常ボランティアおよび患者のそれぞれ由来の計測サンプルにおける平均値±標準偏差である。
【００６３】
≪実施例２：ＥＤＭＰ、ＴＦおよびＰＤＭＰの計測例≫
患者群由来の試料を用いた計測の際には、まず、TruCountTM tube（BD Biosciences）に、ＥＤＭＰを特異的に認識するＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１４４抗体（Serotec Oxford UK）、ＴＦを特異的に認識するＰＥ標識抗ＣＤ１４２抗体（BD Biosciences社製）、およびＰＤＭＰを特異的に認識するＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５標識抗ＣＤ４１抗体（DAKO Glostrup Denmark）をそれぞれ２．５μＬずつ添加し、さらに上記で調製した計測用試料５０μＬを添加した。なお、TruCountTM tubeには、計数ビーズであるTruCountTMビーズが凍結乾燥状態で含まれている。一方、健常者由来の試料を用いた計測の際には、TruCountTM tubeに代えて、濃度が既知の計数ビーズ（平均粒径３．０μｍのポリスチレンビーズ１．６８×１０９particles/mL（Polyscience、Philadelphia USA））を希釈分注して５００００個加えた。また、血漿中のＭＰ量の推測値から、抗体の添加量は十分であることを確認した。
【００６４】
室温遮光で１５分間インキュベートし、抗体と血漿中のＭＰとを反応させ、ＰＢＳ（０．１％ＢＳＡ）を４５０μＬ添加して希釈し、計測サンプルを調製した。
【００６５】
なお、計測サンプルを用いた計測に先立ち、以下の手順で、ＴＦ検出領域、ＰＤＭＰ検出領域、およびＥＤＭＰ検出領域を決定した。また、フローサイトメトリー法には、BD FACSCantoTM II フローサイトメーター（BD Biosciences）を用いた。
【００６６】
まず、ＦＳ×ＳＳサイトグラムを用意した。次いで、図１に示すようにして、０．５μｍの平均粒径を有する閾値ビーズを計測し、ＦＳにおけるＭＰ検出領域の粒径の下限部位を決定した。
【００６７】
続いて、図２に示すようにして、１．０μｍの平均粒径を有するセッティングビーズを計測し、ＦＳにおけるＴＦ検出領域およびＰＤＭＰ検出領域の粒径の上限部位を決定した。さらに、ＦＳ×ＳＳサイトグラム上で、図３に示すようにして、ＴＦおよびＰＤＭＰの検出のための１次領域（１次ゲート）を決定した。そして、ＦＳ×ＦＬ２サイトグラムを用意し、図４に示すようにして、ＴＦ検出領域を決定した。また、ＦＳ×ＦＬ３サイトグラムを用意し、図１２に示すようにして、ＰＤＭＰ検出領域を決定した。
【００６８】
一方、図５に示すようにして、２．０μｍの平均粒径を有するセッティングビーズを計測し、ＦＳにおけるＥＤＭＰ検出領域の粒径の上限部位を決定した。さらに、ＦＳ×ＳＳサイトグラム上で、図６に示すようにして、ＥＤＭＰ検出のための１次領域（１次ゲート）を決定した。そして、ＦＳ×ＦＬ１サイトグラムを用意し、図７に示すようにして、ＥＤＭＰ検出領域を決定した。
【００６９】
続いて、上記で調製した計測サンプルについて計測を行い、計測サンプルにおけるＥＤＭＰ、ＴＦおよびＰＤＭＰを検出した。なお、それぞれの抗体についてアイソタイプコントロールを用いたサンプルについて同様に計測を行い、非特異的な染色の確認を行った。ＰＤＭＰについての検出結果を図１３に示す。なお、ＰＤＭＰの検出結果をＦＳ×ＳＳスキャッタグラムに再展開したものを図１４に示す。
【００７０】
最後に、図１０に示すようにして計数ビーズとして用いたTruCountTMビーズまたはポリスチレンビーズを計測し、その値に基づいて、検出されたＥＤＭＰ、ＴＦおよびＰＤＭＰの血漿中濃度（個／μＬ血漿）を算出した。ここで、上述した実施例１と同様に、健常ボランティア由来の計測サンプル中のＰＤＭＰ濃度（平均値）は、患者由来の計測サンプルにおける値（平均値）よりも有意に小さい値を示した。また、図１５に示すように、健常ボランティア由来の計測サンプル中のＰＤＭＰ濃度（平均値）は、患者由来の計測サンプルにおける値（平均値）よりも有意に小さい値を示した。このことから、血管内皮障害の病態マーカーとして、実施例１で検討した血漿中のＥＤＭＰ濃度およびＴＦ濃度に加えてＰＤＭＰ濃度をさらに併用することで、血管内皮障害の検出・評価をより高い精度で行うことが可能となることが示唆された。なお、図１５のグラフで示される値は、健常ボランティアおよび患者のそれぞれ由来の計測サンプルにおける平均値±標準偏差である。
【００７１】
≪実施例３：ＥＤＭＰ、ＴＦ、ＰＤＭＰ、およびＭＤＭＰの計測例≫
患者群由来の試料を用いた計測の際には、まず、TruCountTMtube（BD Biosciences）に、ＥＤＭＰを特異的に認識するＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１４４抗体（Serotec Oxford UK）、ＴＦを特異的に認識するＰＥ標識抗ＣＤ１４２抗体（BD Biosciences社製）、ＰＤＭＰを特異的に認識するＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５標識抗ＣＤ４１抗体（DAKO Glostrup Denmark）、およびＭＤＭＰを特異的に認識するＰＥ−Ｃｙ７標識ＣＤ１１ｂ抗体をそれぞれ２．５μＬずつ添加し、さらに上記で調製した計測用試料５０μＬを添加した。なお、TruCountTM tubeには、計数ビーズであるTruCountTMビーズが凍結乾燥状態で含まれている。一方、健常者由来の試料を用いた計測の際には、TruCountTM tubeに代えて濃度が既知の計数ビーズ（平均粒径３．０μｍのポリスチレンビーズ１．６８×１０９particles/mL（Polyscience、Philadelphia USA））を希釈分注して５００００個加えた。また、血漿中のＭＰ量の推測値から、抗体の添加量は十分であることを確認した。
【００７２】
室温遮光で１５分間インキュベートし、抗体と血漿中のＭＰとを反応させ、ＰＢＳ（０．１％ＢＳＡ）を４５０μＬ添加して希釈し、計測サンプルを調製した。
【００７３】
なお、計測サンプルを用いた計測に先立ち、以下の手順で、ＴＦ検出領域、ＰＤＭＰ検出領域、およびＥＤＭＰ検出領域を決定した。また、フローサイトメトリー法には、BD FACSCantoTM II フローサイトメーター（BD Biosciences）を用いた。
【００７４】
まず、ＦＳ×ＳＳサイトグラムを用意した。次いで、図１に示すようにして、０．５μｍの平均粒径を有する閾値ビーズを計測し、ＦＳにおけるＭＰ検出領域の粒径の下限部位を決定した。
【００７５】
続いて、図２に示すようにして、１．０μｍの平均粒径を有するセッティングビーズを計測し、ＦＳにおけるＴＦ検出領域、ＰＤＭＰ検出領域、およびＭＤＭＰ検出領域の粒径の上限部位を決定した。さらに、ＦＳ×ＳＳサイトグラム上で、図３に示すようにして、ＴＦ、ＰＤＭＰ、およびＭＤＭＰの検出のための１次領域（１次ゲート）を決定した。そして、ＦＳ×ＦＬ２サイトグラムを用意し、図４に示すようにして、ＴＦ検出領域を決定した。また、ＦＳ×ＦＬ３サイトグラムを用意し、図１２に示すようにして、ＰＤＭＰ検出領域を決定した。さらに、ＦＳ×ＦＬ４サイトグラムを用意し、図１６に示すようにして、ＭＤＭＰ検出領域を決定した。
【００７６】
一方、図５に示すようにして、２．０μｍの平均粒径を有するセッティングビーズを計測し、ＦＳにおけるＥＤＭＰ検出領域の粒径の上限部位を決定した。さらに、ＦＳ×ＳＳサイトグラム上で、図６に示すようにして、ＥＤＭＰ検出のための１次領域（１次ゲート）を決定した。そして、ＦＳ×ＦＬ１サイトグラムを用意し、図７に示すようにして、ＥＤＭＰ検出領域を決定した。
【００７７】
続いて、上記で調製した計測サンプルについて計測を行い、計測サンプルにおけるＥＤＭＰ、ＴＦ、ＰＤＭＰおよびＭＤＭＰを検出した。なお、それぞれの抗体についてアイソタイプコントロールを用いたサンプルについて同様に計測を行い、非特異的な染色の確認を行った。ＭＤＭＰについての検出結果を図１７に示す。なお、ＭＤＭＰの検出結果をＦＳ×ＳＳスキャッタグラムに再展開したものを図１８に示す。
【００７８】
最後に、図１０に示すようにして計数ビーズとして用いたTruCountTMビーズまたはポリスチレンビーズを計測し、その値に基づいて、検出されたＥＤＭＰ、ＴＦ、ＰＤＭＰおよびＭＤＭＰの血漿中濃度（個／μＬ血漿）を算出した。
【図１】
2012168012.tif 000003
【図２】
2012168012.tif 000004
【図３】
2012168012.tif 000005
【図４】
2012168012.tif 000006
【図５】
2012168012.tif 000007
【図６】
2012168012.tif 000008
【図７】
2012168012.tif 000009
【図８】
2012168012.tif 000010
【図９Ａ】
2012168012.tif 000011
【図９Ｂ】
2012168012.tif 000012
【図１０】
2012168012.tif 000013
【図１１Ａ】
2012168012.tif 000014
【図１１Ｂ】
2012168012.tif 000015
【図１２】
2012168012.tif 000016
【図１３】
2012168012.tif 000017
【図１４】
2012168012.tif 000018
【図１５】
2012168012.tif 000019
【図１６】
2012168012.tif 000020
【図１７】
2012168012.tif 000021
【図１８】
2012168012.tif 000022