(57)【要約】      （修正有）【課題】末梢血、臍帯血、骨髄など各血球成分を含む体液から、有核細胞または単核球を効率的に回収する、細胞分離器と細胞分離方法の提供。【解決手段】入口と出口を有する容器と、有核細胞を実質的に捕捉し赤血球は実質的に通過する不織布から構成され、前記容器内に前記不織布が圧縮された状態で積層された体液から有核細胞または単核球を分離する細胞分離器と、該分離器を用いる細胞分離方法。前記入口と出口とが、不織布を挟んでそれぞれ逆方向に位置し、容器の入口側の面を面１とし、入口と面１とが接触する点を点１とし、面１の重心から点１までの距離Ｌが、面１の重心から面１の最遠点までの距離をＲとしたとき、ＬがＲ／２以下であり、かつ前記容器の出口側の面を面２とし、出口と面２とが接触する点を点２とし、面２の重心から点２までの距離Ｓが、面２の重心から面２の最遠点までの距離をＴとしたとき、ＳがＴ／２以下である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
入口と出口を有する容器と、有核細胞を実質的に捕捉し赤血球は実質的に通過する不織布から構成され、前記容器内に前記不織布が圧縮された状態で積層された体液から有核細胞または単核球を分離する細胞分離器であって、前記入口と前記出口とが、前記不織布を挟んでそれぞれ逆方向に位置し、前記容器の前記入口側の面を面１とし、前記入口と前記面１とが接触する点を点１とし、面１の重心から点１までの距離Ｌが、面１の重心から面１の最遠点までの距離をＲとしたとき、ＬがＲ／２以下であることを特徴とし、且つ、前記容器の前記出口側の面を面２とし、前記出口と前記面２とが接触する点を点２とし、面２の重心から点２までの距離Ｓが、面２の重心から面２の最遠点までの距離をＴとしたとき、ＳがＴ／２以下であることを特徴とする細胞分離器。
【請求項２】
捕捉された有核細胞を剥離回収させる手段において、体液の出口から溶液を導入し、入口より捕捉された有核細胞を回収することを含む請求項１に記載の細胞分離器。
【請求項３】
容器の面２に対する出口の角度αが４５度より大きく１３５度より小さいことを特徴とする請求項１または２に記載の細胞分離器。
【請求項４】
容器の面２に対する出口の角度αが垂直であることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞分離器。
【請求項５】
血小板も実質的に捕捉する不織布が積層された請求項１から４のいずれかに記載の細胞分離器。
【請求項６】
分離された有核細胞が単核球を含むことを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の細胞分離器。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の細胞分離器を用いることを特徴とする、細胞分離方法。
【請求項８】
低粘度の回収液を用いることを特徴とする、請求項７に記載の細胞分離方法。
【請求項９】
回収液が生理食塩水、細胞培養用培地、ヒドロキシエチルスターチ、デキストランを含む溶液であることを特徴とする、請求項８に記載の細胞分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末梢血、臍帯血、骨髄、組織抽出物、月経血など各血球成分を含む体液、及び、それらを祖分離した体液から、有核細胞を実質的に捕捉する細胞分離器を用いて有核細胞または単核球を分離する手段において、捕捉された有核細胞または単核球を効率的に回収することが出来る細胞分離器とそれを用いた細胞分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血液学や科学テクノロジーの急速な進歩に伴い、全血・骨髄・臍帯血・組織抽出物をはじめとする体液から必要な血液分画のみを分離して患者に投与することで治療効果をより高め、さらに、治療に必要のない分画は投与しないことで副作用をより抑制する、という治療スタイルが広く普及している。
【０００３】
例えば、血液輸血もその1つである。赤血球製剤は、出血および赤血球が不足する状態、または赤血球の機能低下により酸素が欠乏している場合に使用される血液製剤である。そのため異常な免疫反応や移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などの副作用を誘導する白血球は不要であり、除去する必要がある。場合によっては白血球に加えて血小板も除去することもある。
【０００４】
一方、血小板製剤は、血液凝固因子の欠乏による出血ないし出血傾向にある患者に使用される血液製剤である。遠心分離により、血小板以外の不要な細胞や成分は除去され、必要とされる血小板成分のみを採取している。
【０００５】
加えて近年、白血病や固形癌治療に向けた造血幹細胞移植が盛んに行われるようになり、治療に必要な細胞（造血幹細胞を含む白血球群）を分離し投与するようになってきた。この造血幹細胞のソースとして、ドナーの負担が少ない、増殖能力が優れている等の利点から、骨髄や末梢血に加えて臍帯血も注目を浴びている。また近年、月経血中にも幹細胞が豊富に存在することが示唆され、これまで廃棄されていた月経血も貴重な幹細胞ソースとして利用される可能性がある。
【０００６】
骨髄や末梢血に関して、不要な細胞を除き白血球を分離・純化して投与することが望まれている一方で、臍帯血についても血縁者のためのバンキングが盛んになり、使用時まで凍結保存する必要性から、凍結保存による赤血球溶血を防ぐことを目的に白血球は分離・純化されている。
【０００７】
分離方法としてはフィコールを用いた比重液による遠心分離法や赤血球沈降剤であるヒドロキシエチルスターチを用いた遠心分離法が提案されているが、閉鎖系での処理が不可能であり異物や菌が混入すること、処理するのに要する時間長いことなどの問題を有している。
【０００８】
遠心分離法を用いない細胞分離方法として、最近では、赤血球と血小板は捕捉されず白血球のみを捕捉するフィルター材料を用いて白血球を除去する方法（特許文献１、特許文献２）も報告されており、現在主流となっている白血球除去フィルター（旭化成メディカル株式会社製「セパセル」、ポール社製「ピュアセルＲＣ」等）では、フィルター面に対して液の入口と出口の位置が面の中心から外れる、いわゆるクロスフロータイプが採用されている。
【０００９】
さらに、クロスフロータイプの中でも、細胞を効率的に捕捉可能な形状が検討されている（特許文献３）が、それら白血球除去フィルターで使用できる回収液は限られており、低粘度の回収液を使用すると細胞の回収率が低下するのが問題であった。また、高粘度の回収液を用いた場合にも、使用するためには遠心して溶液置換する必要があり、用途が制限されるという問題もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００１−５１８７９２
【特許文献２】国際公開番号ＷＯ９８／３２８４０
【特許文献３】特開平１１−２６６８５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、末梢血、臍帯血、骨髄、組織抽出物、月経血など各血球成分を含む体液、及び、それらを祖分離した体液から、有核細胞を実質的に捕捉する細胞分離器を用いて有核細胞または単核球を分離する手段において、捕捉された有核細胞または単核球を効率的に回収することが出来、且つ、回収液に依存しない細胞分離器と細胞分離方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、従来検討されていない、捕捉された有核細胞または単核球を効率的に回収することが出来、且つ、回収液に依存しない細胞分離器と細胞分離方法に関して検討を行った結果、以下に示す細胞分離器及び細胞分離方法が効果的であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち本発明は、（１）入口と出口を有する容器と、有核細胞を実質的に捕捉し赤血球は実質的に通過する不織布から構成され、前記容器内に前記不織布が圧縮された状態で積層された体液から有核細胞または単核球を分離する細胞分離器であって、前記入口と前記出口とが、前記不織布を挟んでそれぞれ逆方向に位置し、前記容器の前記入口側の面を面１とし、前記入口と前記面１とが接触する点を点１とし、面１の重心から点１までの距離Ｌが、面１の重心から面１の最遠点までの距離をＲとしたとき、ＬがＲ／２以下であることを特徴とし、且つ、前記容器の前記出口側の面を面２とし、前記出口と前記面２とが接触する点を点２とし、面２の重心から点２までの距離Ｓが、面２の重心から面２の最遠点までの距離をＴとしたとき、ＳがＴ／２以下であることを特徴とする細胞分離器
（２）捕捉された有核細胞を剥離回収させる手段において、体液の出口から溶液を導入し、入口より捕捉された有核細胞を回収することを含む（１）に記載の細胞分離器
（３）容器の面２に対する出口の角度αが４５度より大きく１３５度より小さいことを特徴とする（１）または（２）に記載の細胞分離器
（４）容器の面２に対する出口の角度αが垂直であることを特徴とする（１）または（２）に記載の細胞分離器
（５）血小板も実質的に捕捉する不織布が積層された（１）から（４）のいずれかに記載の細胞分離器。
（６）分離された有核細胞が単核球を含むことを特徴とする（１）から（５）のいずれかに記載の細胞分離器
（７）（１）から（６）のいずれかに記載の細胞分離器を用いることを特徴とする、細胞分離方法
（８）低粘度の回収液を用いることを特徴とする、（７）に記載の細胞分離方法
（９）回収液が生理食塩水、細胞培養用培地、ヒドロキシエチルスターチ、デキストランを含む溶液であることを特徴とする、（８）に記載の細胞分離方法
であり、本発明の細胞分離器と細胞分離方法を用いると、従来より効率良く有核細胞または単核球を回収でき、尚且つ、回収液による依存も少ない。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、末梢血、臍帯血、骨髄、組織抽出物、月経血など各血球成分を含む体液またはそれらを粗分離した体液中から有核細胞を分離する細胞分離手段において、捕捉した有核細胞または単核球を高収率で回収でき、尚且つ、幅広い回収液を使用できるため、回収細胞の使用用途も格段に広まる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】面１におけるＬ、Ｒを説明した図
【図２】面２におけるＳ、Ｔを説明した図
【図３】面２に対する出口の角度αを説明した図
【図４】本発明における容器の形状
【図５】回路を供えた細胞分離器の例
【図６】（ａ）実施例に用いた容器、（ｂ）比較例に用いた容器
【図７】実施例での白血球回収率
【図８】比較例での白血球回収率
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に本発明について詳細に説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではない。
【００１７】
本発明における体液とは、末梢血、骨髄、臍帯血、月経血、組織抽出物を意味し、それらを粗分離したものであっても構わない。また動物種に関しても制限は無く、ヒト、ウシ、マウス、ラット、ブタ、サル、イヌ、ネコなど哺乳動物であれば何であっても構わない。さらに体液の抗凝固剤の種類も問わず、ＡＣＤ（acid-citrate-dextrose）液、ＣＰＤ（citrate-phosphate-dextrose）液、ＣＰＤＡ（citrate-phosphate-dextrose-adenine）液などのクエン酸抗凝固であってもヘパリン、低分子ヘパリン、フサン（メチル酸ナファモスタット）、ＥＤＴＡで抗凝固していても良い。使用する目的に応じて影響がなければ体液の保存条件も一切問わない。
【００１８】
本発明において、細胞分離器に充填される細胞分離材は特に制限されないが、滅菌耐性や細胞への安全性の観点からは、ポリエチレンテレフタート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレン、高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン、ポリビニルアルコール、塩化ビニリデン、レーヨン、ビニロン、ポリプロピレン、アクリル（ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアクリルニトリル、ポリアクリル酸、ポリアクリレート）、ナイロン、ポリイミド、アラミド（芳香族ポリアミド）、ポリアミド、キュプラ、カーボン、フェノール、ポリエステル、パルプ、麻、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリカーボネートなどの合成高分子、アガロース、セルロース、セルロースアセテート、キトサン、キチンなどの天然高分子、ガラスなどの無機材料や金属等が挙げられる。
【００１９】
好ましくはポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリプロピレン、アクリル、ナイロン、ポリウレタン、ガラスである。これらの材料は一種類の単独とは限らず、必要に応じて材料を複合・混合・融合して用いても良い。さらには必要ならば、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、糖類など特定の細胞に親和性のある分子を固定しても構わない。
【００２０】
本発明の細胞分離器は、捕捉された細胞を効率的に回収するために、以下の点を有することを特徴とする。（１）入口と出口を有する容器と、有核細胞を実質的に捕捉し赤血球は実質的に通過する不織布から構成され、前記容器内に前記不織布が圧縮された状態で積層されていること。(２) 前記入口と前記出口とが、前記不織布を挟んでそれぞれ逆方向に位置していること。（３）前記容器の前記入口側の面を面１とし、前記入口と前記面１とが接触する点を点１とし、面１の重心から点１までの距離Ｌが、面１の重心から面１の最遠点までの距離をＲとしたとき、ＬがＲ／２以下であること。（３）前記容器の前記出口側の面を面２とし、前記出口と前記面２とが接触する点を点２とし、面２の重心から点２までの距離Ｓが、面２の重心から面２の最遠点までの距離をＴとしたとき、ＳがＴ／２以下であること。
【００２１】
ＬがＲ／２より大きい、または、ＳがＴ／２より大きい場合は、低粘度の回収液を用いた場合に有意に有核細胞の回収率が低下するが、ＬがＲ／２以下、ＳがＴ／２以下の場合には、低粘度の回収液であっても有核細胞の回収率は低下しない。これは、入口や出口が各面に於いて面の端に位置していると回収液が細胞分離器全体に行き渡らないため回収率が低下すると考えられる。
【００２２】
更には、本発明の細胞分離器は、容器の面２に対する出口の角度αが４５度より大きく１３５度より小さいという特徴も有する。容器の面２に対する出口の角度αが０度以上４５度未満または１３５度より大きく１８０度以下の場合は、低粘度の回収液を用いると有意に有核細胞の回収率が低下するが、容器の面２に対する出口の角度αが４５度より大きく１３５度より小さい場合には、低粘度の回収液であっても細胞の回収率は低下しない。これは、容器の面２に対する出口の角度αが４５度より大きく１３５度より小さい場合には細胞分離器全体に液が拡散されるが、容器の面２に対する出口の角度αが０度以上４５度以下または１３５度以上１８０度以下の場合には回収液が局所的にしか流れなくなるためであると考えられる。
【００２３】
本発明で規定する面１の重心から点１までの距離Ｌ、面１の重心から面１の最遠点までの距離Ｒ、面２の重心から点２までの距離Ｓ、面２の重心から面２の最遠点までの距離Ｔは、図１または図２に示した通りである。また角度αは図３に示した通りである。
【００２４】
また、本発明において実質的に赤血球が通過するとは処理した体液のうち６０％以上が不織布を通過することを意味し、実質的に有核細胞が実質的に捕捉されるとは処理した体液のうち６０％以上が不織布に捕捉されることを意味する。
また、本発明における容器は、図４に示したように円柱、四角柱、楕円柱、ひし形中など如何なる形状であっても構わない。その容器の形状に応じて不織布を切り取る、または不織布の形状に応じて容器を選択すれば良い。また圧縮された状態で不織布を積層して充填、すなわち、上記容器において全ての方向に対して不織布が圧縮されていても良く、一方向、例えば図４の矢印に示したような方向に圧縮されていても構わない。入口と出口の位置は圧縮された方向に、図４でいう矢印の面に於いて不織布を挟んで位置している方が好ましいが、本発明はこれらに限定されない。
【００２５】
本発明の細胞分離器を用いて閉鎖的に細胞を分離するために、以下に示す回路を用いることも可能である。つまり入口側にバッグと接続可能なコネクター、例えばびん針が少なくとも１つ備わっている、または入口側に血液又はプライミング液を収容するバッグを少なくとも１つ備わっており、更に出口側には細胞分離器を通過した液を収容するためのバッグが備わった回路が付属されていても良い。出口側に捕捉された細胞を回収するためのシリンジ接続部、入口側に捕捉された細胞を収容するための回収バッグが付属されている回路を備えている方がより好ましい。またこれらの回路は液の流れを制御するために、三方活栓、ローラークレンメ、クランプなども備えている方がより好ましい。図５に閉鎖系で処理するための回路を備えた細胞分離器を例示した。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２６】
また、本発明は、本発明の細胞分離器を用いた細胞分離方法も提供する。特に、低粘度の回収液を用いる際には、本発明の細胞分離器の利用が望ましい。低粘度の回収液とは、粘度が８ｍＰａ・Ｓ以下の回収液を意味し、例えば、生理食塩水や細胞培養用培地、ヒドロキシエチルスターチ、デキストランを含む溶液が挙げられる。好ましくは７ｍＰａ・Ｓ以下、より好ましくは６ｍＰａ・ｓ以下である。細胞培養用培地としては、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ＭＥＭ（日水）、α−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、ＭＥＭ（日水）、ＩＭＥＭ（日水）、ＲＰＭＩ−１６４０（日水）培地等が代表的なものとして挙げられるがこれらに限定されない。更にこれらの回収液にはアルブミンやＦＢＳなどの蛋白質が含まれていても構わない。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例において本発明に関して詳細に述べるが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）
厚さ（内径）９ｍｍ、直径（内径）３２ｍｍの円柱型の容器に、直径３２ｍｍの円形に切断したポリブチレンテレフタレート製不織布（繊維径２．７マイクロメートル）７６枚を圧縮した状態で積層し細胞分離器を作成した。これは、図４に示したような円柱形の容器であり、矢印に示した方向に不織布を圧縮して充填した。具体的な細胞分離器の形は図６（ａ）に示した通りである。まず始めに生理食塩水５０ｍＬをシリンジにとり、手押しで前記容器の入口より導入し、通液した。次にＣＰＤ抗凝固の新鮮ウシ血液８０ｍＬ（ＣＰＤ：血液＝２００：２８で混合した１２％ＣＰＤを含むウシ末梢血）を１５ｍＬ／ｍｉｎの流速で、次いで生理食塩水１５ｍＬを同様に１５ｍＬ／ｍｉｎの流速でシリンジポンプを用いて通血した。その後、通液とは逆に出口側より１０％ＡＣＤ−Ａ液と１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ培地３０ｍＬをシリンジを用いて手押しして、入口側より回収した。処理前血液の血算、回収した溶液の血算を血球カウンター（シスメックス、Ｋ−４５００）により測定し、白血球の回収率を算出した。結果は表１、図７に示した。
【００２９】
（実施例２）
回収液として１０％ＡＣＤ−Ａ液と１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ培地３０ｍＬの代わりに１０％ＡＣＤ−Ａ液と４％ヒト血清アルブミンを含むデキストラン糖注を用いること以外は実施例１と同様に実施した。結果は表１、図７に示した。
【００３０】
（実施例３）
回収液として１０％ＡＣＤ−Ａ液と１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ培地３０ｍＬの代わりに１０％ＡＣＤ−Ａ液と４％ヒト血清アルブミンを含むサリンヘスを用いること以外は実施例１と同様に実施した。結果は表１、図７に示した。
【００３１】
（実施例４）
回収液として１０％ＡＣＤ−Ａ液と１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ培地３０ｍＬの代わりに１０％ＡＣＤ−Ａ液添加生理食塩水を用いること以外は実施例１と同様に実施した。結果は表１、図７に示した。
【００３２】
（比較例１）
厚さ（内径）９ｍｍ、一辺（内径）３０ｍｍの四角柱型の容器に、一辺３０ｍｍの四角形に切断したポリブチレンテレフタレート製不織布（繊維径２．７マイクロメートル）７６枚を圧縮した状態で積層し細胞分離器を作成した。これは、図４に示したような四角柱形の容器であり、矢印に示した方向に不織布を圧縮して充填した。具体的な細胞分離器の形は図６（ｂ）に示した通りである。まず始めに生理食塩水５０ｍＬをシリンジにとり、手押しで前記容器の入口より導入し、通液した。次にＣＰＤ抗凝固の新鮮ウシ血液８０ｍＬ（ＣＰＤ：血液＝２００：２８で混合した１２％ＣＰＤを含むウシ末梢血）を１５ｍＬ／ｍｉｎの流速で、次いで生理食塩水１５ｍＬを同様に１５ｍＬ／ｍｉｎの流速でシリンジポンプを用いて通血した。その後、通液とは逆に出口側より１０％ＡＣＤ−Ａ液と１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ培地３０ｍＬをシリンジを用いて手押しして、入口側より回収した。処理前血液の血算、回収した溶液の血算を血球カウンター（シスメックス、Ｋ−４５００）により測定し、白血球の回収率を算出した。結果は表２、図８に示した。
【００３３】
（比較例２）
回収液として１０％ＡＣＤ−Ａ液と１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ培地３０ｍＬの代わりに１０％ＡＣＤ−Ａ液と４％ヒト血清アルブミンを含むサリンヘスを用いること以外は実施例１と同様に実施した。結果は表２、図８に示した。
【００３４】
（比較例３）
回収液として１０％ＡＣＤ−Ａ液と１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ培地３０ｍＬの代わりに１０％ＡＣＤ−Ａ液添加生理食塩水を用いること以外は実施例１と同様に実施した。結果は表２、図８に示した。
【００３５】
【表１】
2012120458.tif 000002
【００３６】
【表２】
2012120458.tif 000003
【符号の説明】
【００３７】
１．プライミング溶液が収容された容器と接続可能なコネクターおよびプライミング溶液を収容する容器
２．シリンジと接続可能なコネクター
３．細胞分離器
４．体液が収容された容器と接続可能なコネクターおよび体液を収容する容器
５．廃液バッグ
６．回収バッグ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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