(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸増幅反応後に試料の高感度な光学測定を簡便に行うことのできる容器の提供。【解決手段】一体成形された樹脂からなる側壁部２と底壁部３とを備え、側壁部２が、一端に向かって先細となる筒状に形成され、底壁部３が、光学的に透明であるとともに、側壁部２の長手軸に略直交する平板状に形成され一端を閉塞している核酸増幅反応用容器１。平板状の底壁部３を介して光学顕微鏡によって内部を観察可能でありながら、側壁部２と底壁部３とが樹脂から一体成形されていることにより核酸増幅反応時の高温や温度変化にも十分に耐性を有している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一体成形された樹脂からなる側壁部と底壁部とを備え、
前記側壁部が、一端に向かって先細となる筒状に形成され、
前記底壁部が、光学的に透明であるとともに、前記側壁部の長手軸に略直交する平板状に形成され前記一端を閉塞している核酸増幅反応用容器。
【請求項２】
前記底壁部が、可視光に対して７０％以上の透過率を有する請求項１に記載の核酸増幅反応用容器。
【請求項３】
前記底壁部は、両方の端面が鏡面加工されている請求項１または請求項２に記載の核酸増幅反応用容器。
【請求項４】
前記樹脂が、ポリプロピレンである請求項１から請求項３のいずれかに記載の核酸増幅反応用容器。
【請求項５】
前記樹脂が、シクロオレフィン系樹脂である請求項１から請求項３のいずれかに記載の核酸増幅反応用容器。
【請求項６】
前記底壁部が、０．１５〜０．２５ｍｍの厚さを有する請求項１から請求項５のいずれかに記載の核酸増幅反応用容器。
【請求項７】
前記側壁部および底壁部が、前記側壁部の半径方向に複数組連結されてなる請求項１から請求項６のいずれかに記載の核酸増幅反応用容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅反応用容器に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの核酸増幅反応を行うにあたり使用される反応容器としてＰＣＲチューブが知られている（例えば、特許文献１および２参照。）。このようなＰＣＲチューブによれば、内部に収容された試料の蛍光強度を測定することにより、増幅された核酸を定量したりすることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平６−３４５４６号公報
【特許文献２】特許第２９０９２１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１および２のＰＣＲチューブの場合、試料全体の蛍光強度を測定することは可能であるが、共焦点光学系による高感度な光学測定が可能な構成とはなっていない。したがって、核酸増幅反応後の試料を、共焦点顕微鏡を使用した蛍光相関分光分析法（ＦＣＳ）や蛍光強度分布分析法（ＦＩＤＡ）、蛍光偏光解析法（ＦＩＤＡ−Ｐｏ）などによって高感度に光学測定するときには、底面がカバーガラスからなる容器に試料を移し変えなければならない。この移し変えの作業は、特に試料が微量であったり多数の試料を同時に扱ったりする場合には煩雑となり、試料の取り違えが生じる可能性もあるという問題がある。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、核酸増幅反応後に試料の高感度な光学測定を簡便に行うことができる核酸増幅反応用容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、一体成形された樹脂からなる側壁部と底壁部とを備え、前記側壁部が、一端に向かって先細となる筒状に形成され、前記底壁部が、光学的に透明であるとともに、前記側壁部の長手軸に略直交する平板状に形成され、前記一端を閉塞している核酸増幅反応用容器を提供する。
【０００７】
本発明によれば、内部に収容した試料中の核酸をＰＣＲ等の核酸増幅反応によって増幅させた後、底壁部の下側から内部の試料をそのまま光学測定装置によって測定することができる。
この場合に、平板状の底壁部を介して光学顕微鏡によって内部を観察可能でありながら、側壁部と底壁部とが樹脂から一体成形されていることにより核酸増幅反応時の比較的高い温度や急激な温度変化にも十分に耐性を有している。これにより、核酸増幅反応後に試料を他の容器等に移し変えることなくそのまま簡便に光学顕微鏡等によって高感度な光学測定を行うことができる。
【０００８】
上記発明においては、前記底壁部が、可視光に対して７０％以上の透過率を有していることが好ましい。
このようにすることで、光学測定装置による測定精度を向上することができる。
また、上記発明においては、前記底壁部は、両方の端面が鏡面加工されていることが好ましい。
このようにすることで、底壁部の光透過率を向上することができる。
【０００９】
また、上記発明においては、前記樹脂が、ポリプロピレン（ＰＰ）であってもよい。
このようにすることで、試料中の核酸などの側壁部および底壁部への吸着を低減することができる。
また、上記発明においては、前記樹脂が、シクロオレフィン系樹脂（ＣＯＰ）であってもよい。
このようにすることで、ＣＯＰはガラスと同様の良好な光学的特性を有するので、光学測定により好適に使用することができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記底壁部が、０．１５〜０．２５ｍｍの厚さを有することが好ましい。
このようにすることで、従来の対物レンズによっても、補正環によって良好に収差を補正した試料の像を得ることができる。
また、上記発明においては、前記側壁部および底壁部が、前記側壁部の半径方向に複数組連結されてなっていてもよい。
このようにすることで、複数の試料を同時に扱う際の操作を簡便にすることができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、核酸増幅反応後に試料の高感度な光学測定を簡便に行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施形態に係る核酸増幅反応用容器の全体構成図である。
【図２】図１の核酸増幅反応用容器の変形例を示す図である。
【図３】本発明に係るＰＰ製の核酸増幅反応用容器の温度応答性を測定した結果を示すグラフである。
【図４】本発明に係るＣＯＰ製の核酸増幅反応用容器の温度応答性を測定した結果を示すグラフである。
【図５】本発明に係るＰＰ製およびＣＯＰ製の核酸増幅反応用容器を使用してＰＣＲを行った結果を示す電気泳動写真である。
【図６】本発明に係るＰＰ製の核酸増幅反応用容器を使用してＦＣＳによるＳＮＰタイピングを行った結果を示す図である。
【図７】本発明に係るＰＰ製の核酸増幅反応用容器を使用してＰＣＲおよびＦＣＳによるＳＮＰタイピングを行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明の一実施形態に係る核酸増幅反応用容器１について図１および図２を参照して説明する。
本実施形態に係る核酸増幅反応用容器１は、図１に示されるように、一端に向かって先細に形成されたテーパ部２１を有する筒状の側壁部２と、該側壁部２の一端を閉塞する平板状の底壁部３とを備えている。
【００１４】
側壁部２の他端は開口し、別体の蓋体４によって密閉可能となっている。また、側壁部２は、他端の位置において半径方向外方に突出したフランジ部２２が形成されている。なお、他端は、蓋体４に代えてシールなどによって密閉されてもよい。このように、核酸増幅反応用容器１は、側壁部２が従来のＰＣＲチューブと同様の形状を有しており、核酸増幅反応に用いられる従来の機器や周辺用具、例えば、サーマルサイクラやチューブラックなどに使用することができる。
【００１５】
底壁部３は、テーパ部２１の先端から連続して一体成形され、側壁部２の長手方向に対して略垂直に形成されている。底壁部３は、両方の端面が鏡面加工されており、可視光に対して十分に高い透過率を、好ましくは７０％以上の透過率を有している。
【００１６】
また、底壁部３は、０．１５〜０．２５ｍｍの厚さを有している。これにより、比較的高倍率の対物レンズを使用して、底壁部３を介して外側から内側を観察することができる。また、対物レンズとして、０．１７ｍｍの厚さのカバーガラスの使用に最適化されている従来の対物レンズを使用しても、対物レンズに備えられた補正環の調節によって良好に収差が補正された鮮明な像を得ることができる。
【００１７】
側壁部２および底壁部３は、核酸の吸着性が低く、さらに耐薬品性に優れるＰＰからなる。また、側壁部２および底壁部３は、より光学測定に好適な構成とするために、ガラスと同様の光学測定に良好な屈折率などの光学特性を有するＣＯＰからなっていてもよい。
【００１８】
次に、このように構成された核酸増幅反応用容器１の作用について説明する。
本実施形態に係る核酸増幅反応用容器１は、ＰＣＲ等の核酸増幅反応および光学測定に使用される。まず、核酸増幅反応用容器１内に収容した試料中の核酸を核酸増幅反応によって増幅させる。このときに、増幅された核酸と結合することにより発光する蛍光色素を試料中に添加しておく。次いで、核酸増幅反応用容器１をチューブラック等によって支持させた状態で倒立型の光学顕微鏡によって底壁部３の下側から底壁部３の上側の試料を観察する。これにより、増幅された核酸を蛍光色素の発光として観察することができる。
【００１９】
このときに、底壁部３が十分に薄い平板状に形成され、かつ、可視光に対して十分に高い透過率を有しているので、生体試料観察用の光学顕微鏡に装着されている比較的倍率が高い対物レンズを使用して試料を高感度に観察することができる。例えば、共焦点光学顕微鏡によって試料中の微小領域内の核酸を一分子レベルで観察することにより、ＦＣＳやＦＩＤＡなどの高感度な光学測定を行うことができる。また、底壁部３の内面に細胞を接着させることが可能であるので、例えば、細胞内で増幅させた核酸について高感度に測定することもできる。
【００２０】
この場合に、樹脂からなる側壁に底面としてカバーガラスが接合された容器の場合、核酸増幅反応時に行う温度サイクルにおいて、カバーガラスや接合部分が比較的高い温度や急激な温度変化に耐えられずに破損してしまう、また、比較的高価になってしまうという。これに対して、本実施形態に係る核酸増幅反応用容器１によれば、樹脂により側壁部２と底壁部３とが一体成形されているため、ＰＣＲの温度サイクルにも十分に耐えることができるとともに、比較的安価に製造することができるという利点がある。
【００２１】
また、底壁部３が比較的高倍率の対物レンズによる観察にも適した形状および光学特性を有しているので、共焦点光学顕微鏡などを使用した高感度な光学測定であっても、核酸増幅反応の後に試料を他の容器に移し替えることなく同一の核酸増幅反応用容器１内において簡便に行うことができるという利点がある。
【００２２】
なお、本実施形態においては、単一の核酸増幅反応用容器１について説明したが、これに代えて、図２に示されるように、複数組（図示する例では８つ）の側壁部２および底壁部３が、側壁部２同士が略平行に配列されるように連結されていてもよい。また、複数組の側壁部２および底壁部３が平面状に２方向に連結されることによりプレート様に構成されていてもよい。このようにすることで、複数の試料の核酸増幅反応の操作を一度に行うことができる。
また、図１には蓋体４として側壁部２および底壁部３と別体のものを示したが、図２に示されるように、蓋体４は側壁部２に連結されていてもよい。
【００２３】
また、核酸増幅反応用容器１の用途は上述したものに限定されず、例えば、ハイブリダイゼーション処理や、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの定温増幅反応にも用いられることができる。また、核酸増幅反応と並行して試料を光学測定することにより、増幅された核酸の濃度などを実時間で高感度に測定することもできる。
【実施例】
【００２４】
次に、上述した本発明の一実施形態に係る核酸増幅反応用容器の実施例について説明する。
〔実施例１〕
本発明に係る２種類の核酸増幅反応用容器を以下の手順により製造した。
ＰＰ原料として、ノバッテクＭＧ０３Ｂ（日本ポリプロ社製）、ＣＯＰ原料としてＺＥＯＮＥＸ４８０（日本ゼオン社製）を用いた。これらの樹脂から、側壁部が従来のＰＣＲチューブと同様の形状を有する核酸増幅反応用容器を射出一体成形により形成した。射出一体成形の際に、底壁部が鏡面となるように加工が施された金型を使用した。以上の手順により、ＰＰからなる第１の核酸増幅反応用容器およびＣＯＰからなる第２の核酸増幅反応用容器を製造した。底壁部の厚さは、０．２ｍｍとした。
【００２５】
〔実施例２〕
次に、実施例１に係る第１および第２の核酸増幅反応用容器の温度応答性を以下の実験により評価した。
第１および第２の核酸増幅反応用容器内に試料として２０μＬの超純水を注入し、該超純水の上にミネラルオイル２０μＬを重層させることにより超純水の蒸発を防止した。次に、サーマルサイクラ（ＰＴＣ−２２５、ＭＪリサーチ社製）を使用して温度サイクルを加え、熱電対によって各核酸増幅反応用容器内の試料の温度を測定した。対照実験として、従来のＰＰ製ＰＣＲチューブ（ＱＳＰ社製）についても同様の測定を行った。
【００２６】
第１の核酸増幅反応用容器１の測定結果を図３に、第２の核酸増幅反応用容器の測定結果を図４に示す。図３および図４において、破線が従来のＰＣＲチューブの試料温度を、実線が実施例１に係る核酸増幅反応用容器の試料温度を示している。
【００２７】
なお、各核酸増幅反応用容器に加えた温度サイクルは以下の通りである。
ＳＴＥＰ    温度      時間
１    ２７℃    ３０秒
２    ９０℃    ３０秒
３    ５５℃    ３０秒
４    ７２℃    ３０秒
５  ｇｏ  ｔｏ  ＳＴＥＰ２  ９サイクル
６    ２７℃    ３０秒
【００２８】
実施例１の第１および第２の核酸増幅反応用容器内の試料において、従来のＰＣＲチューブ内の試料と略同様の温度変化が測定された。また、温度サイクルを加えた後、底壁部には変形や曇りなどの異常は確認されなかった。これにより、実施例１に係る第１および第２の核酸増幅反応用容器は、従来のＰＣＲチューブと同様にＰＣＲに使用可能であることが確認された。
【００２９】
〔実施例３〕
次に、実施例１の第１および第２の核酸増幅反応用容器を使用してＰＣＲを行った。核酸増幅反応用容器内の試料の蒸発を防ぐため、従来のＰＣＲチューブ用の蓋（ＱＳＰ社製）により開口を塞いでＰＣＲを行った。ＰＣＲにより得られた産物を、２．５％アガロースゲルを用いて電気泳動した結果を図５に示す。なお、ＰＣＲに使用したプライマ１（シグマ社製）の塩基配列は配列番号１で、プライマ２（シグマ社製）の塩基配列は配列番号２で、それぞれ配列表内において表される。ＰＣＲの温度サイクルは以下の通りである。
【００３０】
試料の成分
滅菌水                  ５μＬ
２×ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  １０μＬ
プライマ１              ２μＬ（５μＭ）
プライマ２              ２μＬ（５μＭ）
鋳型                    １μＬ（５ｎｇ／μＬ）
全液量                  ２０μＬ
【００３１】
温度サイクル
ＳＴＥＰ      温度        時間
１      ９５℃      １０分
２      ９５℃      ３０秒
３  ６７．７℃      ３０秒
４      ７２℃      ３０秒
５  ｇｏ  ｔｏ  ＳＴＥＰ２  ３９サイクル
６      ７２℃      １０分
【００３２】
図５に示されるように、鋳型を含むポジティブコントロール試料（Ｐｏｓ．）においては、第１の核酸増幅反応用容器（ＰＰ製）および第２の核酸増幅反応用容器（ＣＯＰ製）の両方で産物（図中、矢印を参照。）が確認され、非特異産物は確認されなかった。一方、鋳型を含まないネガティブコントロール試料（Ｎｅｇ．）においては、両方の核酸増幅反応用容器において産物は確認されなかった。以上の結果から、実施例１に係る第１および第２の核酸増幅反応用容器は、ＰＣＲに正常に使用可能であることが確認された。
【００３３】
〔実施例４〕
次に、実施例１の第１および第２の核酸増幅反応用容器を用いてＦＣＳ測定を行った。
測定試料として、蛍光色素であるＡＴＴＯ６３３（励起波長６３３ｎｍ）の１ｎＭの溶液を用いた。測定には一分子蛍光分析システムＭＦ２０（オリンパス社製）を用いた。計測条件は、レーザの出力を１００μＷ、計測時間を１０秒とした。５回測定を行い、５回の測定値の平均値を算出した。対照実験として、ガラスボトムプレート（オリンパス社製）を使用した以外は同じ条件で測定を行った。その結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
ガラスボトムプレートを使用した場合に比べて、第１の核酸増幅反応用容器（ＰＰ製）および第２の核酸増幅反応用容器（ＣＯＰ製）を使用した場合、共焦点顕微鏡のレーザ光が集光される焦点領域（コンフォーカルボリューム）のサイズに対応する共焦点領域の縦横比がやや大きくなった。これに対応して拡散時間も若干長くなったが、十分な精度でＦＣＳによる測定を行うことができることが確認された。
【００３６】
〔実施例５〕
次に、従来のＰＣＲチューブ（ＱＳＰ社製）を使用し、１塩基のみ異なるプライマ３，４を用いてＰＣＲを行い、得られた産物を実施例１の第１の核酸増幅反応用容器を使用してＦＣＳ測定することによりＳＮＰ（一塩基多型）タイピングを行った。なお、ポジティブコントロール用の試料として、鋳型を含む試料を用いた。鋳型は、１種類のホモ接合型および２種類のヘテロ接合型を使用した。ネガティブコントロール用の試料として、鋳型を含まない試料を使用した。プライマ３，４（シグマ社製）はそれぞれ蛍光色素ＡＴＴＯ６４７Ｎ（励起波長５４３ｎｍ）またはＴＡＭＲＡ（励起波長６３３ｎｍ）によって修飾した。ＰＣＲに使用したプライマ３の塩基配列は配列番号３で、プライマ４の塩基配列は配列番号４で、それぞれ配列表内において表される。
【００３７】
このようにして行ったＳＮＰタイピングの結果を図６に示す。図６の横軸のＫ２（％）は増幅された試料の第２成分（伸長した鎖長のうち長い方）の比率を示し、横軸に励起波長５４３ｎｍにおける比率、縦軸に励起波長６３３ｎｍにおける比率を示している。図中、ａはネガティブコントロールであり、各軸に近い位置の左上もしくは右下に位置するｂおよびｄは一方の成分のみ有するホモ型を示し、右上のｃは両方の成分を有するヘテロ型を示している。
【００３８】
図６から分かるように、実施例１の第１の核酸増幅反応用容器はＦＣＳによるＳＮＰタイピングに使用可能であることが確認された。ＦＣＳと同様に共焦点光学系を用いた測定方法であるＦＩＤＡおよびＦＩＤＡ−Ｐｏにも実施例１の核酸増幅反応用容器を使用可能であると考えられる。
【００３９】
〔実施例６〕
次に、実施例１の第１の核酸増幅反応用容器を使用してＰＣＲおよびＦＣＳの両方を行い、ＳＮＰタイピングを行った。ＰＣＲに用いた試料の成分は次の通りである。プライマ３，４は、実施例５と同じ塩基配列のものを使用した。
【００４０】
試料の成分
滅菌水                  １．０μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ      ２．０μＬ
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ        ３．２μＬ（１０ｍＭ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ））
ＭｇＣｌ２              ３．２μＬ（２５．０ｍＭ）
Ｓｔｏｆｆｅｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ    ０．２μＬ（１０Ｕ／μＬ）
プライマ３              ３．２μＬ（５．０μＭ）
プライマ４              ３．２μＬ（５．０μＭ）
プライマｔ              １．０μＬ（１００ｎＭ）
プライマａ              １．０μＬ（１００ｎＭ）
鋳型                    ２．０μＬ（２５００ｃｏｐｙ／μＬ）
全液量                  ２０．０μＬ
【００４１】
ポジティブコントロール用の試料として、鋳型（ＧＥＮＳＣＲＩＰＴ社製）を含む試料を用いた。鋳型は、ホモ型およびヘテロ型を１種類ずつ使用した。また、ネガティブコントロール用の試料として、鋳型を含まない試料を用いた。プライマ３，４は、蛍光色素であるＡＴＴＯ６４７Ｎ（励起波長５４３ｎｍ）およびＴＡＭＲＡ（励起波長６３３ｎｍ）によって修飾した。該試料をＭＦ２０を使用してＦＣＳ測定した。ＦＣＳ測定の条件は、各波長におけるレーザの出力を１００μＷとし、各試料を１５秒×３回測定した。そして、３回の測定値の平均値を測定結果とした。
【００４２】
なお、ＰＣＲの温度サイクルは以下の通りである。
ステップ１        ９５（℃）      ２分
ステップ２        ９５            ６０秒
ステップ３    ５５．５            ３０秒
ステップ４        ７２            ２０秒
ステップ５    ｇｏ  ｔｏ  ＳＴＥＰ２  ３４サイクル
ステップ６        ７２            １０分
ステップ７        １０          （ｅｖｅｒ）
【００４３】
このようにして行ったＦＣＳ測定によるＳＮＰタイピングの結果を図７に示す。図７のＫ２％は増幅された試料の第２成分（伸長した鎖長の長い方）の比率を示し、横軸に励起波長５４３ｎｍでの比率、縦軸に励起波長６３３ｎｍでの比率を示している。図中、縦軸に近い左上のｂは一方の成分のみを有するホモ型を示し、右上のｃは両方の成分を高い比率で有するヘテロ型を示し、左下のａは２つの成分を共に有さないネガティブコントロールを示している。
【００４４】
図７から分かるように、実施例１に係る第１の核酸増幅反応用容器を使用して正常にＳＮＰタイピングを行うことができることが確認された。すなわち、実施例１の核酸増幅反応用容器は、ＰＣＲとＦＣＳの両方に連続して使用可能であることが確認された。ＦＣＳと同様に共焦点光学系を用いた測定方法であるＦＩＤＡおよびＦＩＤＡ−Ｐｏにも、ＰＣＲの後に連続して実施例１の核酸増幅反応用容器を使用可能であると考えられる。
【符号の説明】
【００４５】
１  核酸増幅反応用容器
２  側壁部
２１  テーパ部
２２  フランジ部
３  底壁部
４  蓋体
【図１】
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【図２】
2012196177.tif 000005
【図３】
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【図４】
2012196177.tif 000007
【図５】
2012196177.tif 000008
【図６】
2012196177.tif 000009
【図７】
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