(57)【要約】【課題】本発明は、ヘモグロビン含有リポソーム中のフィチン酸ナトリウムの定量方法の提供。【解決手段】ヘモグロビン含有リポソームを２−プロパノールと撹拌してリポソーム膜を破壊した後、溶液のｐＨを８.０以上に調整する量のｐＨ９以上の緩衝液および有機溶媒を加え、リポソーム膜成分を有機溶媒中に抽出分離して得られた水相を測定試料とする、ヘモグロビン含有リポソーム中のフィチン酸の定量方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビン含有リポソームを２−プロパノールと撹拌してリポソーム膜を破壊した後、溶液のｐＨを８.０以上に調整する量のｐＨ９以上の緩衝液および有機溶媒を加え、リポソーム膜成分を有機溶媒中に抽出分離して得られた水相を測定試料とする、ヘモグロビン含有リポソーム中のフィチン酸の定量方法。
【請求項２】
前記測定試料をイオンクロマトグラフィーで測定する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
測定内標準としてチオシアン酸カリウムを用いる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記緩衝液がｐＨ１０のグリシン−ＮａＯＨ溶液である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記溶液のｐＨを８.４以上に調整する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記２−プロパノールと撹拌した後、所定温度に加温することを含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記測定試料をろ過した後測定に供する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィチン酸ナトリウム、特にヘモグロビン含有リポソーム中のフィチン酸ナトリウムの定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
輸血、血液製剤に代替しうる安全な人工酸素運搬体として、ヒトヘモグロビンをウィルス不活化・除去処理して利用する種々の方法が研究・開発されてきた。なかでも有用性が見込まれる技術として、そのようなヘモグロビンをナノカプセル化したヘモグロビン含有リポソームがある。
このようなヘモグロビン含有リポソームでは、ヘモグロビンの酸素運搬能を保持するためにヘモグロビンのメト化を防止することが知られている。具体的には、ヘモグロビンのリポソーム内封入前の上記処理中に失われるアロステリック因子（２,３-ＤＰＧ）を補填するために、フィチン酸ナトリウム（イノシトールヘキサリン酸１２ナトリウム）を添加している（特許文献１など参照）。
【０００３】
しかしながらこのような目的で添加されるフィチン酸ナトリウムは、ヘモグロビン含有リポソーム中の製造過程で損失する可能性があり、最終製品における残存量を測定する必要がある。また、フィチン酸ナトリウムの定量値は、ヘモグロビン含有リポソームの貯蔵による酸素運搬能の変化などを評価する指標とすることもできる。
【０００４】
生体物質の一種であるフィチン酸（ＩＨＰ）は、従来、医薬に利用されており、また穀類や種子に多く含まれることから、医薬および食品中のフィチン酸の分析方法はいくつか検討されている。フィチン酸の検出方法としては、従来、Wade試薬（０.３（w/v）％スルホサリチル酸を含む０.０３（w/v）％塩化第二鉄水溶液）を用いて沈殿させたフィチン酸鉄塩中のリン含有量を５００ｎｍで測定する吸光光度法が一般的である。最近、陽イオン交換樹脂カラムで前処理してイオンクロマトグラフィー測定装置に導入する方法も開発されている。この方法では、フィチン酸（ＩＰ６）とその各分解物（ＩＰ３〜ＩＰ５）が分離ピークとして観測されるイオンクロマトグラムも示されている（非特許文献１参照）。
上記吸光光度法またはイオンクロマトグラフィーの測定に際しては、検体をトリクロロ酢酸で抽出した後、抽出液を遠心する前処理が施され、その遠心上清が測定試料として供される。
【０００５】
小麦ふすま中のフィチン酸の定量においては、上記トリクロロ酢酸以外のフィチン酸抽出溶媒の検討もあり、クエン酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、アジピン酸などの各種有機酸が使用できることが報告されている（非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−２１５５１７
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「フィチン酸について」，ＪＦＲＬニュース，財団法人日本食品分析センター，２００８年８月，７８
【非特許文献２】「小麦由来機能性成分の新規利用技術の開発」，埼玉県産業技術総合センター研究報告，２００７年，第５巻
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記公知の方法が、ヘモグロビン含有リポソーム中のフィチン酸ナトリウムに適用し得るとの報告はない。ヘモグロビン含有リポソームの品質管理のため、ヘモグロビン含有リポソームに添加されたフィチン酸ナトリウムを定量し得る分析方法の確立が求められる。
このような背景において、本発明者は、上記トリクロロ酢酸で抽出した遠心上清をイオンクロマトグラフィーで測定する方法を、ヘモグロビン含有リポソーム中のフィチン酸ナトリウムの定量分析に試みたところ、トリクロロ酢酸をヘモグロビンの沈澱すなわちリポソーム膜の破壊が確認できる程度に添加した場合でも、フィチン酸ナトリウムの定量値は、仕込み量に対し８０％未満の値でしか測定されないことが分かった。また、イオンクロマトグラフィーでは、測定内標準のチオシアン酸カリウムのピークがトリクロロ酢酸の巨大ピークのショルダー部分で検出され、影響を受けてしまう。抽出溶媒としてトリクロロ酢酸を用いて前処理する従来公知の方法は、ヘモグロビン含有リポソーム中のフィチン酸ナトリウムの定量には適さないことが分かった。
したがって、本発明は、特にヘモグロビン含有リポソーム中のフィチン酸ナトリウムの定量方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決すべく鋭意検討し、本発明者は、ヘモグロビン含有リポソーム中のフィチン酸ナトリウムが低い定量値となる原因は、測定前処理のトリクロロ酢酸による抽出では、上記のとおりリポソーム膜は破壊可能であるにも拘わらず充分に抽出し得ないのは、フィチン酸ナトリウムとヘモグロビンとの相互作用、リポソーム膜の影響などが推測される。このようなヘモグロビン含有リポソーム特有の課題を解決するため、さまざまな検討を重ねたところ、２−プロパノールを用いて脂質膜を溶解した後、緩衝液を加えて溶液のｐＨを特定範囲に調整した後、脂質膜を抽出除去する前処理によれば、ヘモグロビン含有リポソームからフィチン酸ナトリウムを高回収率で抽出することができ、したがって高い信頼性でフィチン酸ナトリウムを定量できることを見出し、以下のような本発明を完成するに至った。なお、上記検討の過程では、イオンクロマトグラフィーへの陽イオン交換樹脂カラム連結、あるいはヘモグロビン含有リポソームの界面活性剤添加凍結融解液の限外ろ過処理などの試みも行ったが、低回収率あるいはろ過膜への吸着など種々の問題を含み、満足できるものではなかった。
【００１０】
本発明は、ヘモグロビン含有リポソームを２−プロパノールと撹拌してリポソーム膜を破壊した後、溶液のｐＨを８.０以上に調整する量のｐＨ９以上の緩衝液および有機溶媒を加え、リポソーム膜成分を有機溶媒中に抽出分離して得られた水相を測定試料とする、ヘモグロビン含有リポソーム中のフィチン酸の定量方法を提供する。
【００１１】
本発明では、上記測定試料をイオンクロマトグラフィーで測定することができる。
その場合、測定内標準としてチオシアン酸カリウムを用いることができる。
【００１２】
上記緩衝液は、ｐＨ１０のグリシン−ＮａＯＨ溶液が好ましく用いられる。
また、上記溶液のｐＨは、８.４以上に調整することが好ましい。
【００１３】
上記において、２−プロパノールと撹拌した後、好ましくは所定温度に加温することを含む。また、測定試料は、通常、ろ過した後測定に供することが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、高い信頼性でヘモグロビン含有リポソーム中のフィチン酸ナトリウムを定量することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、測定検体となるヘモグロビン含有リポソーム（以下、「ＬＨｂ」とも記す）は、ヘモグロビンを含有する以外は、膜および封入液成分、その構造など特に限定されない。フィチン酸ナトリウムを含有するヘモグロビン含有リポソームおよびその製造方法などは、たとえば特許文献１などに具体的に記載されており、これらの記載を引用することにより本明細書に記載されているものとすることができる。特にこれらに制限される訳ではないが、一例として挙げれば、リポソーム膜構成脂質は、少なくともリン脂質を含み、必要に応じてコレステロール、ステアリン酸なども含む。
膜修飾剤として、ポリエチリングリコール結合リン脂質などを含むものもある。
【００１６】
上記ヘモグロビンは、公知の方法によりヒト期限切れ濃厚赤血球製剤より白血球、血小板、血漿および赤血球膜が除去され、無菌化およびウィルス除去・不活化処理が施されている。リポソーム内には、限外濃縮、ダイアライザーなどにより、通常、３０〜６０％に調製した精製ヒトヘモグロビン（以下、「ｐｈＨｂ」とも記す。）が封入されている。
このｐｈＨｂは、通常ｐＨ６.５〜８.０である。
【００１７】
フィチン酸ナトリウム（ＩＨＰ-Ｎａ）は、アロステリック因子としてヘモグロビン溶液に添加されている。通常、ヘモグロビン（Ｈｂ）に対するＩＨＰ-Ｎａ添加量は、モル比（ＩＨＰ／Ｈｂ）で０.１〜２である。
【００１８】
本発明では、上記のようなＬＨｂ中のＩＨＰ-Ｎａを測定するに際して、以下の前処理を行う。
まず、ＬＨｂに内標準物質の水溶液および２−プロパノールを加えて激しく撹拌する。撹拌後の溶液は、通常、３７℃で１０分間行う。
【００１９】
次に、上記撹拌液中に溶解したリポソーム膜成分を有機溶媒で抽出する。抽出に先立って上記撹拌液に緩衝液を加えてｐＨを８.０以上に調整する。
ＬＨｂのｐＨは、通常、ｐＨ７程度であり、撹拌液のｐＨを８.０以上とするには、通常、ｐＨ９以上、好ましくはｐＨ１０以上の緩衝液が用いられる。
このような緩衝剤としては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（通常、トリス）（ｐＨ９.０）、グリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１０.０）が挙げられる。これら緩衝液は、撹拌液のｐＨを８.０以上とすることができれば、適宜濃度に調整した緩衝液を適宜量を用いることができる。上記ｐＨ８.０以上は、通常、０.１〜１mol／Ｌ（１００ｍＭ〜１Ｍ）の濃度の緩衝液を用いて、終濃度（撹拌液中の緩衝剤濃度）が１０〜１００ｍＭとなる量で用いることで達成することができる。
本発明では、撹拌液のｐＨを８.４以上にするのが好ましく、９.０以上とするのがより好ましい。ｐＨの上限値は緩衝液の種類で制限されるが、通常１０以下である。
【００２０】
有機溶媒は、水相からリポソーム膜成分を抽出して分離除去し得るものであれば特に制限されないが、分離手段は遠心分離が好ましく利用されることから、水相との分離の面などから特にクロロホルムが好ましい。
遠心上清（水相）を測定試料とするが、測定試料は、通常、ろ過した後測定に供することが好ましい。ろ過には、通常、０.４５μｍメンブランフィルターを用いることができる。
【００２１】
本発明では、通常、上記測定試料中のＩＨＰ量を測定する。ＩＨＰ量の測定は、ＩＨＰを検出・定量可能な手段であれば特に制限されないが、イオンクロマトグラフィーで行えば、ＩＨＰを直接測定することができる。
イオンクロマトグラフィーは、たとえばDIONEX社製Ion Pac A11（市販品）カラムを用いて６０mmol／ＬＮａＯＨ溶液を移動相として測定することができる。
本発明では、測定内標準としてチオシアン酸カリウムを用いることができる。
ＩＨＰのピーク面積から、一般的な検量線法（ピーク面積）を用いて、ＩＨＰ-Ｎａ量を算出することができる。
【００２２】
上記のような本発明によれば、ＬＨｂ中のＩＨＰ-Ｎａを、高い回収率で抽出して測定に供することができる。たとえば、ＩＨＰ-Ｎａを、ＩＨＰ／Ｈｂモル比で０.１〜１となる量で仕込んだＬＨｂ中のＩＨＰ-Ｎａについて、本発明の方法で測定試料を調製しイオンクロマトグラフィーで定量した場合、ＩＨＰ-Ｎａ仕込み量（理論量）に対し８５％以上の高い回収率での定量値が得られる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。以下の実施例は本発明を説明するたもめのものであって、本発明はこれに限定されるものではない。
実験で使用した各溶液は、以下のとおり調製した。
＜緩衝液＞
１）１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ９.０）：１ｍｏｌ／Ｌ塩酸５ｍＬおよび１ｍｏｌ／Ｌトリス溶液５０ｍＬを量り、水を加えて１００ｍＬとした。
２）０.１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ９.０）：０.１ｍｏｌ／Ｌ塩酸５ｍＬおよび０.１ｍｏｌ／Ｌトリス溶液５０ｍＬを量り、水を加えて１００ｍＬとした。
３）１ｍｏｌ／Ｌグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０）：グリシン（Ｋ８２９１，試薬特級，和光純薬）７.５１ｇに水を加えて正確に１００ｍＬとして１ｍｏｌ／Ｌグリシン溶液とした。１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液は、精密分析用５０％ＮａＯＨ溶液（和光純薬工業）５.２５ｍＬに水を加えて１００ｍＬとして調製した。
１ｍｏｌ／Ｌグリシン溶液５０ｍＬおよび１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液３３ｍＬを量り、水を加えて１００ｍＬとした。
４）０.１ｍｏｌ／Ｌグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０）：０.１ｍｏｌ／Ｌグリシン溶液５０ｍＬおよび０.１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液３２ｍＬを量り、水を加えて１００ｍＬとした。
＜内標準溶液＞
内標準溶液：チオシアン酸カリウム０.１３ｇに水を加えて正確に１００ｍＬとし、内標準原液とした。
＜標準溶液＞
標準原液（濃度４５０μｇ／ｍＬ）：定量用フィチン酸１２ナトリウム（ＩＨＰ-Ｎａ）を、脱水物換算で約０.０４５ｇ精密に量り、水を加えて正確に１００ｍＬとし、標準原液とした（濃度４５０μｇ／ｍＬ）。
標準溶液Ａ（濃度４.５μｇ／ｍＬ）：標準原液１ｍＬを正確に量り、内標準溶液１６ｍＬを正確に加え、水を加えて正確に１００ｍＬとした。
標準溶液Ｂ（濃度９μｇ／ｍＬ）：標準原液１ｍＬ、内標準溶液８ｍＬを正確に加え、水を加えて正確に５０ｍＬとした。
標準溶液Ｃ（濃度１８μｇ／ｍＬ）：標準原液２ｍＬ、内標準溶液８ｍＬを正確に加え、水を加えて正確に５０ｍＬとした。
標準溶液Ｄ（濃度３６μｇ／ｍＬ）：標準原液４ｍＬ、内標準溶液８ｍＬを正確に加え、水を加えて正確に５０ｍＬとした。
標準溶液Ｅ（濃度５４μｇ／ｍＬ）：標準原液６ｍＬ内標準溶液８ｍＬを正確に加え、水を加えて正確に５０ｍＬとした。
標準溶液Ｆ（濃度７２μｇ／ｍＬ）：標準原液８ｍＬ内標準溶液８ｍＬを正確に加え、水を加えて正確に５０ｍＬとした。
【００２４】
（実施例１〜６）
以下のＬＨｂについて、本発明によるＩＨＰ-Ｎａ回収率を試験した。
ＬＨｂ：ヘモグロビン濃度０．０６ｇ／ｇ、ＩＨＰ／Ｈｂモル比で０.５のＩＨＰ-Ｎａを添加したヘモグロビン含有リポソーム。
上記ＬＨｂ約０.９８ｍＬを遠心沈殿管に精密に量りとり、内標準溶液２ｍＬを正確に加えた後、２−プロパノール１.２５ｍＬを加え、直ちに激しくかき混ぜ、３７℃で１０分間加温した。
これに、０.１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ９.０）４ｍＬおよびクロロホルム０.４ｍＬおよび水を適宜加え水相の終濃度を１０ｍＭとし、１０分間激しく振り混ぜ、２０７０×ｇで１０分間（２０℃）遠心分離した。
水相（遠心上清）全量を分取し、水を加えて５０ｍＬとし、０.４５μｍのメンブランフィルターでろ過し、測定試料１とした。
上記において、トリス緩衝液を表１に示す濃度および添加量に変える以外は同様にして測定試料２〜３、または表１に示すグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０）を用いる以外は同様にして測定試料４〜６を得た。
水相のｐＨ測定値を表１に示す。
また、各測定試料について、イオンクロマトグラフィーを測定してＩＨＰ-Ｎａ量を定量し、ＬＨｂ中へのＩＨＰ-Ｎａ仕込み量に対する回収率を算出した。結果を表１に示す。
【００２５】
【表１】
2012211779.tif 000002
【００２６】
＜イオンクロマトグラフィー測定条件＞
測定装置：イオンクロマトグラフICS-1500（ダイオネクス社製）
検出器：電気伝導度検出器
カラム：内径４ｍｍ×長さ２５ｃｍのＰＥＥＫ管に、４級アルカノールアミンを化学結合させたエチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン共重合樹脂基材（粒径１５μｍ）を充填したもの。
ガードカラム：内径４ｍｍ×長さ５０ｍｍのＰＥＥＫ管に、４級アルカノールアミンを化学結合させたエチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン共重合樹脂基材（粒径１５μｍ）を充填したもの。
カラム温度：３７℃付近の一定温度
移動相：６０ｍｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液
再生液：水
流量：１ｍＬ／ｍｉｎ
＜システム適合性＞
システムの性能：標準溶液Ｃ２５μＬにつき、試験条件に従って操作するとき、内標準物質、フィチン酸（ＩＨＰ）の順に溶出し、その分離度は２.０以上である。
システムの再現性：標準溶液Ｃ２５μＬにつき、試験条件に従って試験を６回繰り返すとき、内標準物質のピーク面積に対するＩＨＰのピーク面積の比の相対標準偏差は２.０％以下である。
【００２７】
＜検量線による定量＞
標準溶液２５μＬにつき、上記条件で液体クロマトグラフフィーを測定し、標準溶液のＩＨＰ-Ｎａ濃度を横軸に、内標準物質のピーク面積に対するＩＨＰのピーク面積の比を縦軸にとって、検量線を作成する。
試料溶液２５μＬにつき、同条件で測定し、内標準物質のピーク面積に対するＩＨＰのピーク面積の比ＱＴから、検量線を用いて次式により試料溶液のＩＨＰ-Ｎａの量を求める。
【数１】
2012211779.tif 000003
ＩＨＰ-Ｎａ：ＬＨｂ中のＩＨＰ-Ｎａ量（％）
ａ：検量線の傾き
ｂ：検量線の切片
ρ：検体ＬＨｂの密度（ｇ／ｍＬ）
Ｗ：検体量（ｇ）
【００２８】
（比較例１）
実施例と同様のＬＨｂ１ｍＬに、１０％トリクロロ酢酸溶液５ｍＬを加え混合した後、１０分間激しく振盪し、２０分間遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０℃）し、上清を回収した。
上清を１０％トリクロロ酢酸および水を加えて正確に２０ｍＬとした。この１０ｍＬを正確に量り、内標準溶液１ｍＬを正確に加え、水を加えて正確に２０ｍＬとし、実施例と同様にイオンクロマトグラフィーを測定した。
別に、上記と同様に得た沈殿に、再び１０％トリクロロ酢酸５ｍＬを加え、上記操作を２回繰り返した。３回の抽出上清を合わせて水を加えて正確に２０ｍＬとした以外は上記と同様にしてイオンクロマトグラフィーを測定した。
【００２９】
ＬＨｂ中のＩＨＰ-Ｎａは、仕込み量（理論量）に対し、１回抽出の場合５２.０％、３回抽出の場合７５.３％の低値であった。これら値は、実施例のうちのもっとも低い回収率８５.１％（実施例１）に対する割合では、それぞれ５４.５％、７８.９％でしかない。定量方法としては採用できるものではなかった。
【００３０】
（参考例１）
実施例で使用したＬＨｂの製造過程で調製されるリポソーム封入前のＩＨＰ-Ｎａ含有（ＩＨＰ／Ｈｂモル比＝０.５）精製ヒトヘモグロビン（ｐｈＨｂ）について、実施例６と同様の方法で分析（３点）したところ、８８.１〜８９.２％の回収率で定量され、本発明の方法であれば、リポソーム膜の有無の影響を受けないことが確かめられた。