(57)【要約】【課題】走査型顕微鏡において、低ノイズの画像を高速で取得する。【解決手段】走査型顕微鏡は、光源ユニット、第１の走査手段１１４ａ、第１の光制限体１１５ａ、および光量検出器１１８を有する。光源ユニットは試料に照射する照射光を第１、第２の出射点から出射する。第１の走査手段１１４ａは照射光の偏向方向を変える。第１の光制限体１１５ａは照射光を通過させる複数の孔部１１５ａｓを有する。光量検出器１１８は試料への照射により生じる信号光の受光量を検出する。第１の走査手段１１４ａは走査点を照射光の偏向方向を変えることにより第１の走査方向に沿って移動可能である。複数の孔部１１５ａｓは、第１の走査手段１１４ａによる偏向方向の連続的な変化に応じて、第１、第２の出射点から出射された照射光が異なる時期に孔部１１５ａｓを通過するように、配置される【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも第１、第２の出射点を同一平面上に有し、試料に照射する照射光を前記第１、第２の出射点から主光線が互いに平行になるように出射する光源ユニットと、
前記光源ユニットから出射した前記照射光の偏向方向を変える第１の走査手段と、
前記第１の走査手段により偏向された前記照射光が照射される第１の照射面を有し、前記第１の照射面には前記照射光を通過させる複数の孔部が形成される第１の光制限体と、
前記光制限体を通過した前記照射光を前記試料上に集光させる対物レンズと、
前記照射光の前記試料への照射により生じる信号光の受光量を検出する光量検出器と、
前記試料と前記光量検出器との間に設けられ、前記信号光を前記照射光から分離する光学的分離器と、
前記光量検出器による光量の検出時点における前記照射光の前記試料上の走査点の位置を検出する位置検出部と、
前記光量と前記走査点の位置に基づいて前記試料の画像を再構成する画像処理装置に、前記受光量と前記走査点の位置とを出力する出力器とを備え、
前記第１の走査手段は、前記試料上に照射される前記照射光の走査点を、前記照射光の偏向方向を変えることにより第１の走査方向に沿って移動可能であり、
前記複数の孔部は、前記第１の走査手段による偏向方向の連続的な変化に応じて、前記第１、第２の出射点から出射された前記照射光それぞれが異なる前記孔部を通過し、且つ、前記第１、第２の出射点から出射された前記照射光が異なる時期に前記孔部を通過するように、配置される
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載の走査型顕微鏡において、前記光源ユニットは、フェムト秒パルス光を前記照射光として出射することを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項３】
請求項１に記載の走査型顕微鏡において、前記光源ユニットは連続波を前記照射光として出射し、前記光学的分離器が前記光源ユニットと前記第１の光制限体との間に設けられ、前記第１の光制限体は前記照射光が通過している前記孔部と前記対物レンズにより集光された前記照射光の集光点とが共役な位置になるように配置されることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項４】
請求項３に記載の走査型顕微鏡において、
前記信号光が入射する第２の照射面を有し、前記第１、第２の出射点に対応する前記集光点と共役な位置に第２のスリットが形成され、前記第２のスリットは前記第１の走査手段による前記走査点の変位に対応する前記第２の照射面における前記信号光の変位方向に延びるように形成される第２の光制限体を備え、
前記孔部は、前記第１、第２の出射点から出射する前記照射光の夫々の前記第１の照射面上における照射位置を通る方向および前記第１の変位方向のいずれにも傾斜する方向に延びる第１のスリットであり、
前記第１の走査手段による偏向角度を変えることにより、前記第１、第２の出射点から出射した前記照射光が対応する前記照射光が、同一の前記第１のスリットを通過可能である
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡において、
前記光制限体と前記対物レンズとの間に設けられ、前記第１の走査方向と異なる第２の走査方向に沿って、前記走査点を相対的に移動させる第２の走査手段を備え、
前記第１、第２の出射点は、前記第１、第２の出射点それぞれに対応する前記走査点が前記第２の走査方向に沿った異なる範囲を変位するように配置される
ことをと特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の走査型顕微鏡において、
前記光源ユニットは、
前記照射光を出射する単一の光源と、
前記照射光の主光線が相互に平行となるように前記出射方向に垂直な平面上に配置された前記複数の出射端に、前記光源から出射する前記照射光を分岐する分岐器とを備える
ことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項７】
少なくとも第１、第２の出射点を同一平面上に有し、試料に照射する照射光を前記第１、第２の出射点から主光線が互いに平行になるように出射する光源ユニットと、
前記光源ユニットから出射した前記照射光の偏向方向を変える第１の走査手段と、
前記第１の走査手段に偏向された前記照射光が照射される第１の照射面を有し、前記第１の照射面には前記照射光を通過させる複数の孔部が形成される第１の光制限体と、
前記光制限体を通過した前記照射光を前記試料上に集光させる対物レンズと、
前記照射光の前記試料への照射により生じる信号光の受光量を検出する光量検出器と、
前記試料と前記光量検出器との間に設けられ、前記信号光を前記照射光から分離する光学的分離器と、
前記光量検出器による光量の検出時点における前記照射光の前記試料上の走査点の位置を検出する位置検出部と、
前記光量と前記走査点の位置に基づいて前記試料の画像を再構成する画像処理装置に、前記受光量と前記走査点の位置とを出力する出力器と、
前記光量と前記照射位置に基づいて前記試料の画像を再構成する画像処理装置と、
前記試料の画像を表示するモニタとを備え、
前記第１の走査手段は、前記試料上に照射される前記照射光の走査点を、前記照射光の偏向方向を変えることにより第１の走査方向に沿って移動可能であり、
前記複数の孔部は、前記第１の走査手段による偏向方向の連続的な変化に応じて、前記第１、第２の出射点から出射された前記照射光それぞれが異なる前記孔部を通過し、且つ、前記第１、第２の出射点から出射された前記照射光が異なる時期に前記孔部を通過するように、配置される
ことを特徴とする走査型顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点走査を行う走査型顕微鏡および走査型顕微鏡システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、数多くの種類の共焦点走査型顕微鏡が提案され（非特許文献１参照）、製品化されている。これらの共焦点走査型顕微鏡は、大きく分けて、シングルビーム走査装置を用いた顕微鏡と、マルチビーム走査装置を用いた顕微鏡（特許文献１〜特許文献３参照）の２種類に分類される。以下に、２種類の顕微鏡の基本構成を簡単に説明する。
【０００３】
まず、シングルビーム走査装置を用いた走査型顕微鏡（以下、シングルビーム走査型顕微鏡と呼ぶ）の基本構成を説明する。シングルビーム走査型顕微鏡において、光源より発した光束は、集光レンズによって一点に集光される。集光位置に配置された第１の微小開口の透過像が、第１のリレーレンズと対物レンズを介して標本上に結像される。標本によって反射された光束は、対物レンズと第１のリレーレンズとの間に配置されたビームスプリッタによって、第１の微小開口の方向とは異なる方向に偏向される。偏向された光束は、第２のリレーレンズによって、第１の微小開口の共役位置にある第２の微小開口に集光される。第２の微小開口を通過した光の強度が、例えばフォトマルチプライアなどの検出器によって検出される。
【０００４】
また、対物レンズとビームスプリッタの間には走査装置が配置されている。この走査装置は、例えばガルバノミラーやポリゴンミラーを有していて、第１の微小開口の像を標本面上で走査する。この走査装置と検出器に接続されているコントローラは、走査装置による光束の偏向量から、標本上での第１の微小開口の結像位置を検出する。検出位置と検出器により検出された光の強度とに基づいて、広い領域における標本像が再構成され、テレビモニタなどの画像表示装置に表示される。なお、光源としてフェムト秒パルス光源を用いた場合には、上述の第１の微小開口が省略されることもある。
【０００５】
次に、マルチビーム走査装置を用いた走査型顕微鏡（以下、マルチビーム走査型顕微鏡と呼ぶ）の一例としてニポーディスクを用いた走査型顕微鏡の基本構成を説明する。マルチビーム走査型顕微鏡において、光源より発した光束は、コンデンサレンズによってニポーディスク上に照射される。ニポーディスクに設けられた複数の小開口を透過することによって分割された複数の光束は、夫々、リレーレンズと対物レンズを介して標本上の一点に集光される。標本から反射した光束は、対物レンズとリレーレンズとを介して再びニポーディスクの小開口上に集光される。
【０００６】
ニポーディスクとコンデンサレンズとの間に配置されたビームスプリッタは、ニポーディスクからの透過光を、光源とは異なる方向へ偏向させる。偏向された透過光が撮影レンズによってイメージセンサ上に集光される。このような構成により、イメージセンサ上には、標本の像が形成される。形成された像がイメージセンサにより検出され、画像表示装置に表示される。ニポーディスクに設けられた複数の小開口は所定の間隔を空けて設けられるので、標本上に一度に当たる照明は多重スポット照明となる。しかし、ニポーディスクをモータによって高速に回転させているので、短時間ですべての標本面上を走査でき、肉眼による共焦点の観察が可能になる。
【０００７】
このように、両者の基本構成の差異から理解されるように、シングルビーム走査型顕微鏡においては、光源の照明効率などが良いが、顕微鏡の視野全体の走査時間はマルチビーム走査型顕微鏡より長い。近年、試料の外観などの高速な時間変化を観察することが求められている。例えば、ビデオレート以上の１００ｆｐｓで画像を取得するためには、走査装置に数十ＫＨｚ相当の高速性能が必要である。しかし、走査装置に備えられる反射部のサイズを大きく保ったまま高速性能を満たすことは困難である。一方、上述のようにニポーディスクを用いているものを含めたマルチビーム走査型顕微鏡においては、走査時間が非常に短いので、１０００ｆｐｓで高速に画像を取得可能であり、試料外観の高速な時間変化を観察するのに適している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表平１−５０３４９３号公報
【特許文献２】特開平５−６０９８０号公報
【特許文献３】特開平８−２１１２９６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】T.R.Corle and G.S.Kino, “Confocal Scanning Optical Microscopy and Related Imaging Systems”, Academic Press (1966)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ところで、このような高速観察に好適なマルチビーム走査型顕微鏡においても、散乱を伴う組織の観察において問題点がある。走査型顕微鏡は、試料中に集光したレーザのスポットと共役な位置にピンホールを配置することにより、レーザのスポット近傍のみの信号光（例えば、蛍光）を選択して取得することを可能足らしめることを特徴としている。それゆえ、試料による光の散乱が大きくないとみなせる場合には、その効力が発揮される。しかし、特に生体組織を試料とする場合には、生体組織の強散乱性によってレーザスポット近傍の信号光はたちまち散乱される。従って、ニポーディスクによって生成された多数のマルチビームが標本上に集光されても、マルチビームで発生した信号光は強く散乱し、対応する小開口とは別の小開口に信号光が染出すクロストークが発生する。小開口は光学的に共役な微小領域以外の微小領域における信号光も透過するため、ノイズ成分が増加する。クロストークを減少させるためにはマルチビームの空間的な間隔を広げることが考えられる。しかし、散乱の影響が非常に大きい場合には、マルチビームの本数が２本であったとしても、クロストークが発生し得る。
【００１１】
従って、上記のような問題点に鑑みてなされた本発明では、マルチビームによって発生する信号光に空間的なクロストークが生じても、ノイズの少ない画像を取得可能な走査型顕微鏡および操作型顕微鏡システムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述した諸課題を解決すべく、第１の発明による走査型顕微鏡は、
少なくとも第１、第２の出射点を同一平面上に有し、試料に照射する照射光を第１、第２の出射点から主光線が互いに平行になるように出射する光源ユニットと、
光源ユニットから出射した照射光の偏向方向を変える第１の走査手段と、
第１の走査手段により偏向された照射光が照射される第１の照射面を有し、第１の照射面には照射光を通過させる複数の孔部が形成される第１の光制限体と、
光制限体を通過した照射光を前記試料上に集光させる対物レンズと、
照射光の試料への照射により生じる信号光の受光量を検出する光量検出器と、
試料と光量検出器との間に設けられ、信号光を前記照射光から分離する光学的分離器と、
光量検出器による光量の検出時点における照射光の試料上の走査点の位置を検出する位置検出部と、
光量と走査点の位置に基づいて試料の画像を再構成する画像処理装置に、受光量と走査点の位置とを出力する出力器とを備え、
第１の走査手段は、試料上に照射される照射光の走査点を、照射光の偏向方向を変えることにより第１の走査方向に沿って移動可能であり、
複数の孔部は、第１の走査手段による偏向方向の連続的な変化に応じて、第１、第２の出射点から出射された照射光それぞれが異なる孔部を通過し、且つ、第１、第２の出射点から出射された照射光が異なる時期に孔部を通過するように、配置される
ことを特徴とするものである。
【００１３】
本発明の第１の発明による操作型顕微鏡システムは、
少なくとも第１、第２の出射点を同一平面上に有し、試料に照射する照射光を第１、第２の出射点から主光線が互いに平行になるように出射する光源ユニットと、
光源ユニットから出射した照射光の偏向方向を変える第１の走査手段と、
第１の走査手段に偏向された照射光が照射される第１の照射面を有し、第１の照射面には照射光を通過させる複数の孔部が形成される第１の光制限体と、
光制限体を通過した照射光を試料上に集光させる対物レンズと、
照射光の前記試料への照射により生じる信号光の受光量を検出する光量検出器と、
試料と光量検出器との間に設けられ、信号光を照射光から分離する光学的分離器と、
光量検出器による光量の検出時点における照射光の試料上の走査点の位置を検出する位置検出部と、
光量と走査点の位置に基づいて試料の画像を再構成する画像処理装置に、受光量と走査点の位置とを出力する出力器と、
光量と前記照射位置に基づいて試料の画像を再構成する画像処理装置と、
試料の画像を表示するモニタとを備え、
第１の走査手段は、試料上に照射される照射光の走査点を、照射光の偏向方向を変えることにより第１の走査方向に沿って移動可能であり、
複数の孔部は、第１の走査手段による偏向方向の連続的な変化に応じて、第１、第２の出射点から出射された照射光それぞれが異なる孔部を通過し、且つ、第１、第２の出射点から出射された照射光が異なる時期に孔部を通過するように、配置される
ことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１４】
上記のように構成された本発明に係る走査型顕微鏡によれば、マルチビームを用いながら、ノイズの少ない画像を取得可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る走査型顕微鏡を含む走査型顕微鏡システムの光学的な概略構成および電気的な概略構成を示す構成図である。
【図２】図１における分岐器、第１のガルバノミラー、および第１のスリットの配置図である。
【図３】各列の励起光により走査される試料上の領域を説明する図である。
【図４】図１における第１のスリットアレイの正面図である。
【図５】第１のスリットアレイに入射する励起光の照射位置の時間変化を説明するタイミングチャートである。
【図６】第２の実施形態に係る走査型顕微鏡を含む走査型顕微鏡システムの光学的な概略構成および電気的な概略構成を示す構成図である。
【図７】図６における第１のスリットアレイに対する第２のスリットアレイの配置および形状を示す構成図である。
【図８】第３の実施形態に係る走査型顕微鏡を含む走査型顕微鏡システムの光学的な概略構成および電気的な概略構成を示す構成図である。
【図９】図８における分岐器、第１のガルバノミラー、および第１のスリットの配置図である。
【図１０】第１のスリットアレイの第１の変形例を示す正面図である。
【図１１】第１のスリットアレイの第２の変形例を示す正面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の適用した走査型顕微鏡の実施形態について、図面を参照して説明する。
【００１７】
図１は、本発明の第１の実施形態に係る走査型顕微鏡を含む走査型顕微鏡システムの光学的な構成および電気的な概略構成を示す構成図である。
【００１８】
走査型顕微鏡システム１００は、走査型顕微鏡１１０、画像処理装置１０１、モニタ１０２によって構成される。後に詳述するように、走査型顕微鏡１１０は、スポット状の励起光（照射光）で試料Ｓを走査する。また、試料Ｓに照射された励起光による蛍光の光量が、走査型顕微鏡１１０により検出される。また、走査型顕微鏡１１０からは走査点の位置が検出される。蛍光の光量および走査点の位置が、画像処理装置１０１に伝達される。画像処理装置１０１では、蛍光の光量と照射位置に基づいて、試料Ｓの画像を再構成する。再構成された画像はモニタ１０２に送信され、表示される。
【００１９】
次に、走査型顕微鏡１１０の構成について、説明する。走査型顕微鏡１１０は、光源１１１、分岐器１１２、第１〜第５のレンズ１１３ａ〜１１３ｅ、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂ（第１、第２の走査手段）、第１のスリットアレイ１１５（第１の光制限体）、ダイクロイックミラー１１６（光学的分離器）、対物レンズ１１７、ＰＭＴ１１８（光量検出器、出力器）、および位置検出部１１９（位置検出部、出力器）などによって構成される。
【００２０】
光源１１１から、生体に照射すると蛍光を発生させる励起光がフェムト秒パルスとして出射される。励起光は、分岐器１１２により強度が実質的に等しくなるように４列に分岐される。分光器１１２の第１〜第４の出射端は、後述する一定の間隔で直線上に並び且つ出射される励起光の主光線が互いに平行となるように、形成される。なお、分岐器１１２は、例えばハーフミラー（図示せず）およびミラー（図示せず）の組合せ、ファイバカプラ（図示せず）の組合せ、および回折格子などにより形成可能である。
【００２１】
第１、第２のレンズ１１３ａ、１１３ｂは正レンズであり、リレー光学系を構成する。リレー光学系により、第１〜第４の出射端から出射される第１〜第４列の励起光は両側にテレセントリックにリレーされ、第１のスリットアレイ１１５ａ上に別々に集光される。第１、第２のレンズ１１３ａ、１１３ｂの間において対物レンズ１１７の瞳位置との共役位置に、第１のガルバノミラー１１４ａが配置される。図２に示すように、第１のガルバノミラー１１４ａは、第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４を結ぶ第１の直線Ｌ１に平行な直線を軸に回転させた偏向方向に、励起光を反射させる。偏向方向を連続的に変えることにより、励起光によって試料Ｓ上の第１の走査方向（図３参照）に沿って試料Ｓが走査される。
【００２２】
第１のガルバノミラー１１４ａによる励起光の偏向方向には、第２のレンズ１１３ｂおよび第１のスリットアレイ１１５ａが配置される。第１のスリットアレイ１１５ａは多数の第１のスリット１１５ａｓ（孔部）が形成された平板であり、板面が第１の直線Ｌ１に平行となるように配置される。また、図４に示すように、第１のスリットアレイ１１５ａには、取得する画像の第１の走査方向の画素数に相当する第１のスリット１１５ａｓが形成される。第１のスリット１１５ａｓは、板面上において第１の直線Ｌ１に垂直な第２の方向ｄ２に並べられる。なお、第２の方向ｄ２は第１の走査方向に対応する。
【００２３】
すべての第１のスリット１１５ａｓは、板面において第２の方向ｄ２に垂直な第１の方向ｄ１に対して傾斜した形状を有している。さらに、第１〜第４の列の中の単一の列の励起光（図４におけるＥＬ３参照）が第１のスリット１１５ａｓを通過している間は、他の３列の励起光（図４におけるＥＬ１、ＥＬ２、ＥＬ４参照）が第１のスリットアレイ１１５ａの板面上に照射されように、第１の方向ｄ１に対する第１のスリット１１５ａｓの傾斜角が定められる。また、第１のスリット１１５ａｓは、第２の方向ｄ２に対して傾斜させながら単一の第１のスリット１１５ａｓに第１〜第４列の励起光が通過可能となるように、形成される。
【００２４】
前述のように、４列に分岐させた励起光を互いに主光線が平行となるように第１のスリットアレイ１１５ａ上に集光するので、第１のスリットアレイ１１５ａ上には第１の方向ｄ１に沿って励起光による４列の照射スポット像が形成される。このような構成の第１のスリットアレイ１１５ａを第１〜第４列の励起光で走査することにより、第１〜第４列の励起光は異なる時間に第１のスリット１１５ａｓを通過して、試料Ｓに照射される。図５に示すように、タイミングｔ１において、第１列の励起光ＥＬ１のみが１列目の第１のスリット１１５ａｓを通過し、第２〜第４列の励起光ＥＬ２〜ＥＬ４は第１のスリットアレイ１１５ａの板面に照射される。その後、第１のガルバノミラー１１４ａにより偏向方向が変えられ、励起光による照射スポット像は第２の方向ｄ２に変位する。タイミングｔ２において、第２列の励起光ＥＬ２のみが１列目の第１のスリット１１５ａｓを通過し、第１、第３、第４列の励起光ＥＬ１、ＥＬ３、ＥＬ４は第１のスリットアレイ１５ａの板面に照射される。同様に、タイミングｔ３、ｔ４においては、夫々第３、第４列の励起光ＥＬ３、ＥＬ４のみが１列目の第１のスリット１１５ａｓを通過する。第４列の励起光ＥＬ４のみが１列目の第１のスリット１１５ａｓを通過後励起光による照射スポット像がさらに第２の方向ｄ２に変位し、タイミングｔ５において第１列の励起光のみが２列目の第１のスリット１１５ａｓを通過する。以後、同様に、第１〜第４列の励起光の２、３、…列目の第１のスリット１１５ａｓの通過を順次繰返す。
【００２５】
この結果、第１のガルバノミラー１１４ａが周波数ＲＨｚで第１の走査方向に沿って往復走査する場合には、１列の励起光による２Ｒ個／ｓの照射スポット像によって光学的共役位置にある試料Ｓが照射される。それゆえ、４列の励起光によって、４倍の８Ｒ個／ｓの照射スポット像によって試料Ｓが照射される。
【００２６】
第１のスリットアレイ１１５ａを通過した励起光は、第３、第４のレンズ１１３ｃ、１１３ｄによって両側にテレセントリックにリレーされる。第３、第４のレンズ１１３ｃ、１１３ｄの間において対物レンズ１１７の瞳位置との共役位置に、第２のガルバノミラー１１４ｂが配置される。第２のガルバノミラー１１４ｂは、第２の方向ｄ２に平行な直線を軸に回転させた偏向方向に、第３のレンズ１１３ｃを透過した励起光を反射させる。偏向方向を連続的に変えることにより、励起光によって試料Ｓ上の第１の走査方向に垂直な第２の走査方向（図３参照）に沿って試料Ｓが走査される。
【００２７】
図３に示すように、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂそれぞれによる第２、第１の走査方向に沿った走査によって、走査型顕微鏡１００の視野範囲全域ｅａ（以後、全照射領域と呼ぶ）が照射スポット像によって照射される。第１列の励起光ＥＬ１によって、全照射領域ｅａを第２の走査方向に沿って４分割した第１の部分領域ｕａ１がラスタ走査される。同様に、第２〜第４列の励起光ＥＬ２〜ＥＬ４によって、第１の部分領域ｕａ１と別の第２〜第４の部分領域ｕａ２〜ｕａ４がラスタ走査される。例えば、全照射領域ｅａを５１２本の走査線によって走査する場合には、第１〜第１２８の走査線を第１列の励起光ＥＬ１によって走査させ、第１２９〜第２５６の走査線を第２列の励起光ＥＬ２によって走査させ、第２５７〜第３８４の走査線を第３列の励起光ＥＬ３によって走査させ、第３８５〜第５１２の走査線を第４列の励起光ＥＬ４によって走査させる。なお、第１〜第４列の励起光ＥＬ１〜ＥＬ４により、それぞれ第１〜第４の部分領域ｕａ１〜ｕａ４が走査されるように、第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４の間隔が定められる。
【００２８】
図１に示すように、第２のガルバノミラー１１４ｂによって反射された励起光は、第４、第５のレンズ１１３ｄ、１１３ｅ、ダイクロイックミラー１１６、および対物レンズ１１７を介して試料Ｓ上に投影される。ダイクロイックミラー１１６は、励起光を透過し且つ励起光により生体組織が発する蛍光を反射するように形成される。したがって、第５のレンズ１１３ｅを透過した励起光はダイクロイックミラー１１６を透過する。投影される励起光は、結像レンズである第５のレンズ１１３ｄおよび対物レンズ１１７によって試料Ｓ上において集光される。
【００２９】
励起光が試料Ｓに照射されると、照射された励起光の集光点において試料Ｓが励起されて蛍光（信号光）が対物レンズ１１７に向かって発生する。したがって、前述のように８Ｒ個／ｓの照射スピードで試料を照射することにより、同じ発生スピードで蛍光が順次発生する。発生した蛍光は対物レンズ１１７を透過して、ダイクロイックミラー１１６に到達する。蛍光はダイクロイックミラー１１６により反射され、励起光の試料Ｓによる反射光はダイクロイックミラー１１６を透過する。したがって、蛍光が励起光の反射光から分離される。分離された蛍光はＰＭＴ１１８によって受光される。ＰＭＴ１１８は蛍光強度に応じた電気信号に変換した画素信号を生成する。画素信号は、画像処理装置１０１に伝達される。
【００３０】
なお、各列の励起光に対応する蛍光は対物レンズ１１７、ダイクロイックミラー１１６を介して、ＰＭＴ１１８の受光部上に広く分布する。蛍光の入射範囲より広い受光部を有するＰＭＴ１１８が選択され、用いられる。
【００３１】
なお、画像処理装置１０１には画素信号だけでなく、位置検出部１１９において検知される励起光の走査点の位置が位置信号として伝達される。位置検出部１１７は、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂに設けられる回転速度メータ（図示せず）により検出される第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂの回転速度に基づいて第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂによる各列の励起光パルスの偏向方向を算出する。位置検出部１１９は、偏向方向に基づいて走査点の位置を検出する。
【００３２】
画像処理装置１０１は、画素信号と位置信号とに基づいて試料Ｓの２次元状の画像を再構成する。再構成された２次元画像はモニタ１０２に送信され、表示される。
【００３３】
以上のような構成の第１の実施形態の走査型顕微鏡によれば、低ノイズの画像を高速に取得可能である。４本のマルチビームにより試料を走査するので、第１のガルバノミラー１１４ａの走査周波数で制限される走査速度を、分岐させる光束分だけ高速化させることが可能である。したがって、高速で試料画像を採取可能である。また、マルチビームの試料Ｓへの照射時期が分離されているので、空間的なクロストークの影響を除去することが可能である。
【００３４】
また、第１の実施形態の走査型顕微鏡によれば、上述のように第１〜第４の出射端ｔ１〜ｔ４を配置することにより、照射時期を分離させた構成において第２のガルバノミラー１１４ｂの制御の簡素化を図りながら、フレームレートの最速化を図ることが可能である。例えば本実施形態と異なる構成として、第１、第２、第３、第４の出射端から出射される励起光が、第（４ｎ−３）、第（４ｎ−２）、第（４ｎ−１）、第４ｎの走査線（１≦ｎ≦１２８）に沿って走査される構成が考えられる。このような構成においてフレームレートを最速化するためには、第１の走査方向に沿った端部に走査点が達したときに、高速で第２の走査方向に４本の走査線に相当する距離だけ走査点を移動させる必要がある。したがって、第１のガルバノミラー１１４ａによる偏向方向に応じて第２のガルバノミラー１１４ｂによる走査速度を変える必要がある。一方、本実施形態の構成によれば、第１のガルバノミラー１１４ａの偏向方向に拠らず、第２のガルバノミラー１１４ｂの走査速度を一定に保つことが可能で、制御が簡素化される。
【００３５】
また、第１の実施形態の走査型顕微鏡によれば、試料Ｓに照射する励起光にフェムト秒パルスレーザが用いられ、２光子吸収により発生する蛍光により画像が取得される。２光子吸収は、実質的に光子密度の高い集光点でのみ発生する。それゆえ、共焦点効果を適用する必要が無く、即ちピンホールが不要であり、部品数を削減可能である。
【００３６】
次に本発明の第２の実施形態に係る走査型顕微鏡について説明する。第２の実施形態は、光源の種類および光学部材の配置において第１の実施形態と異なっている。以下に、第１の実施形態と異なる点を中心に第２の実施形態について説明する。なお、第１の実施形態と同じ機能および構成を有する部位には同じ符号を付す。
【００３７】
図６に示すように、第２の実施形態を適用した走査型顕微鏡２１０において、分岐器１１２、第１〜第５のレンズ１１３ａ〜１１３ｅ、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂ、第１のスリットアレイ１１５ａ、対物レンズ１１７、ＰＭＴ１１８、および位置検出部１１９の機能および構成は第１の実施形態と同じである。また、画像処理装置１０１およびモニタ１０２の機能および構成も第１の実施形態と同じである。
【００３８】
第１の実施形態と異なり、光源２１１は連続波（ＣＷ）の励起光を出射する。また、ダイクロイックミラー２１６は第１のガルバノミラー１１４ａと第２のレンズ１１３ｂとの間に設けられる。また、第２のスリットアレイ１１５ｂが、第１のスリットアレイ１１５ａに積層されるように、配置される。また、第１、第２のスリットアレイ１１５ａ、１１５ｂは対物レンズ１１７の焦点と共役な位置に配置される。
【００３９】
図７に示すように、第２のスリットアレイ１１５ｂには第２の方向ｄ２に沿って延びる４つの第２のスリット１１５ｂｓが形成される。第１のスリット１１５ａｓを通過する第１〜第４列の励起光ＥＬ１〜ＥＬ４の照射位置それぞれに、第２のスリット１１５ｂｓが形成される。
【００４０】
上述の構成において、第１のガルバノミラー１１４ａに反射された第１列〜第４列の励起光ＥＬ１〜ＥＬ４はダイクロイックミラー２１６および第２のレンズ１１３ｂを透過する。透過した第１〜第４列の励起光の中から、試料Ｓに照射する励起光が第１のスリットアレイ１１５ａによって選択される。なお、第２のスリットアレイ１１５ｂでは、第１のスリットアレイ１１５ａを通過する励起光が制限されない。後述するように、第２のスリットアレイ１１５ｂは、試料Ｓから発する蛍光を制限するために用いられる。第１、第２のスリットアレイ１１５ａ、１１５ｂを通過した励起光は第３のレンズ１１３ｃ、第２のガルバノミラー１１４ｂ、第４、第５のレンズ１１３ｄ、１１３ｅ、および対物レンズ１１７を介して試料Ｓ上に集光されて照射される。
【００４１】
励起光の照射により発生する蛍光が対物レンズ１１７、第５、第４のレンズ１１３ｅ、１１３ｄ、第２のガルバノミラー１１４ｂ、第３のレンズ１１３ｃを介して、第２のスリットアレイ１１５ｂに到達する。第１、第２のスリット１１５ａ、１１５ｂにより集光点以外の領域において発生した蛍光は遮光され、集光点において発生した蛍光のみが第１、第２のスリット１１５ａｓ、１１５ｂｓを通過する。したがって、第１、第２のスリット１１５ａｓ、１１５ｂｓにより共焦点効果を得ることが可能である。第１、第２のスリット１１５ａｓ、１１５ｂｓを通過した蛍光は第２のレンズ１１３ｂを透過して、ダイクロイックミラー２１６により励起光から分離され、ＰＭＴ１１８に受光される。
【００４２】
第１の実施形態と同様に、ＰＭＴ１１８により生成される画素信号および位置検出部により検出される位置信号が、画像処理装置１０１に伝達され、試料Ｓの２次元状の画像が再構成される。
【００４３】
以上のような構成の第２の実施形態の走査型顕微鏡によっても、第１の実施形態と同じく、低ノイズの画像を高速に取得可能である。また、第１の実施形態と同様に、フレームレートの最速化を達成することが可能である。
【００４４】
なお、第１の実施形態と異なり、ダイクロイックミラー２１６を第１のガルバノミラー１１４ａと第２のレンズ１１３ｂとの間に設けることにより、第１、第２のスリット１１５ａｓ、１１５ｂｓによる共焦点効果を得ることが可能である。第１の実施形態と異なり、共焦点効果を利用することにより光源から出射する励起光の種類をフェムト秒パルスレーザに限定することなく、連続波である励起光などを用いることが可能である。
【００４５】
次に本発明の第３の実施形態に係る走査型顕微鏡について説明する。第３の実施形態は、光学部材の配置などにおいて第２の実施形態と異なっている。以下に、第２の実施形態と異なる点を中心に第３の実施形態について説明する。なお、第１、第２の実施形態と同じ機能および構成を有する部位には同じ符号を付す。
【００４６】
図８に示すように、第３の実施形態を適用した走査型顕微鏡３１０において、光源２１１、分岐器１１２、第１〜第５のレンズ１１３ａ〜１１３ｅ、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂ、第１、第２のスリットアレイ１１５ａ、１１５ｂ、対物レンズ１１７、ＰＭＴ１１８、および位置検出部１１９の機能および構成は第２の実施形態と同じである。また、画像処理装置１０１およびモニタ１０２の機能および構成も第２の実施形態と同じである。
【００４７】
第２の実施形態と異なり、ダイクロイックミラー３１６は、分岐器１１２と第１のレンズ１１３ａとの間に設けられる。また、ダイクロイックミラー３１６とＰＭＴ１１８との間には、４つのコリメートレンズ１２０ｃを有するレンズアレイ１２０と集光レンズ１２１とが設けられる。
【００４８】
第１〜第４列の励起光ＥＬ１〜ＥＬ４に対応する蛍光がダイクロイックミラー３１６により反射されレンズアレイ１２０上に入射する位置それぞれに、コリメートレンズ１２０ｃが配置される。コリメートレンズ１２０ｃにより蛍光が平行光に変換され、集光レンズ１２１に入射する。集光レンズ１２１により、各列に対応する蛍光はＰＭＴ１１８の一点に集光される。
【００４９】
第２の実施形態と同様に、ＰＭＴ１１８により生成される画素信号および位置検出部１１９により検出される位置信号が、画像処理装置１０１に伝達され、試料Ｓの２次元状の画像が再構成される。
【００５０】
以上のような構成の第３の実施形態の走査型顕微鏡によっても、第２の実施形態と同じく、低ノイズの画像を高速で取得可能である。また、第２の実施形態と同様に、フレームレートの最速化、および連続波を出射する光源を適用が可能である。
【００５１】
さらに、第２の実施形態と異なり、レンズアレイ１２０を透過した蛍光は、励起光を出射した出射端によらず平行な方向に出射される。平行な方向に出射されるので集光レンズ１２１を用いることによりＰＭＴ１１８の１点に集光させることが可能である。したがって、第２の実施形態と異なり、検出部の小さなＰＭＴ１１８を用いることが可能となる。
【００５２】
本発明を諸図面や実施例に基づき説明してきたが、当業者であれば本開示に基づき種々の変形や修正を行うことが容易であることに注意されたい。従って、これらの変形や修正は本発明の範囲に含まれることに留意されたい。
【００５３】
例えば、上記の第１〜第３の実施形態において、第１のスリット１１５ａｓは第１の方向ｄ１に対して傾斜した形状であるが、このような形状に限定されない。例えば、図９に示すように、第１の直線Ｌ１が第１のガルバノミラー１１４ａの回転軸に対して傾斜している場合には、図１０に示すように、第１の方向ｄ１に平行な方向に延びる形状に第１のスリット１１５ａｓを形成してもよい。単一の第１のスリット１１５ａｓに何れか列の励起光が通過するときに、他の列の励起光がすべての第１のスリット１１５ａｓに入射されないように、第１のスリット１１５ａｓが形成されれば、本実施形態と同じ効果を得ることが可能である。
【００５４】
また、第１のスリットアレイ１１５ａには、第１のスリット１１５ａｓが形成される構成であるが、図１１に示すように、スリットの代わりに複数の孔部１２２が形成されてもよい。各列の励起光の照射位置は、第１のガルバノミラー１１４ａにより第２の方向に沿って変位する。各列の励起光の照射位置の連続的な変位に応じて、各列の励起光それぞれを異なる孔部１２２に通過させ、且つ、全列の励起光が異なる時期に孔部１２２を通過するように、孔部１２２が配置されれば、本実施形態と同様の効果を得ることが可能である。各列の励起光の照射位置の連続的な変位に応じて各列の励起光それぞれを異なる孔部１２２を通過させることにより、試料Ｓ上における画素として光学像を採取する複数の位置に各列の励起光を照射可能となるからである。また、各列の励起光の照射位置の連続的な変位に応じて、全列の励起光を異なる時期に孔部１１２に通過させることにより、照射時期を分離させることが可能である。なお。第１のスリット１１５ａｓの代わりに孔部１２２を形成する構成にすれば、第２、第３の実施形態において、第２のスリットアレイ１１５ｂは不要である。
【００５５】
また、第２、第３の実施形態において、第１のスリットアレイ１１５ａに積層させて第２のスリットアレイ１１５ｂを配置しているが、第２のスリットアレイ１１５ｂは設けなくてもよい。第２のスリットアレイ１１５ｂを設けなくても、第１のスリットアレイ１１５ａにより第１のスリットを通過する光束以外の光を制限することは可能である。
【００５６】
また、第２、第３の実施形態において、励起光を出射する光源２１１と、蛍光を分離するためにダイクロイックミラー１１６とを用いたが、通常の可視光を出射する光源を用い、偏向ビームスプリッタとλ／４板とを組合わせた構成のように光源から出射した光を透過し反射光分離する光学的分離器をダイクロイックミラー１１６の代わりに用いてもよい。
【００５７】
また、第１の実施形態において、走査型顕微鏡１１０は落射型顕微鏡に適用される構成であるが、透過型顕微鏡に適用することも可能である。
【００５８】
また、第１〜第３の実施形態において、第２のガルバノミラー１１４ｂを用いて励起光を偏向させることにより試料Ｓを第２の走査方向に走査する構成であるが、試料を変位させるステージスキャナを用いて試料Ｓを走査する構成であってもよい。
【００５９】
また、第１〜第２の実施形態において、分岐器１１２を用いて励起光を４列に分岐する構成であるが、分岐器１１２を用いずに直接４つの光源を設けて、励起光を発する構成であってもよい。なお、分岐器１１２による分岐は４列に限定されない。２列以上に分岐されれば、シングルビーム走査型内視鏡に比べて画像取得が高速化される。
【００６０】
また、第１〜第３の実施形態において、第１、第２のガルバノミラー１１４ａ、１１４ｂの回転速度に基づいて励起光の走査点を検出する構成であるが、他の方法により走査点を検出する構成であってもよい。例えば、エンコーダを用いて回転位置を検出して、回転位置に基づいて走査点を検出する構成であってもよい。
【００６１】
また、第１の実施形態において、ダイクロイックミラー１１６は対物レンズ１１７と第５のレンズ１１３ｅとの間に設けられる構成であるが、分岐器１１２から対物レンズ１１７までの間のいかなる位置に設けられてもよい。また、第２の実施形態において、ダイクロイックミラー１１６は第１のガルバノミラー１１４ａと第２のレンズ１１３ｂとの間に設けられる構成であるが、分岐器１１２から第１のスリットアレイ１１５ａまでの間のいかなる位置に設けられても良い。
【符号の説明】
【００６２】
１００  走査型顕微鏡システム
１０１  画像処理装置
１１０、２１０、３１０  走査型顕微鏡
１１１、２１１  光源
１１２  分岐器
１１３ａ〜１１３ｅ  第１〜第５のレンズ
１１４ａ、１１４ｂ  第１、第２のガルバノミラー
１１５ａ、１１５ｂ  第１、第２のスリットアレイ
１１５ａｓ、１１５ｂｓ  第１、第２のスリット
１１６、２１６、３１６  ダイクロイックミラー
１１７  対物レンズ
１１８  ＰＭＴ
１１９  位置検出部
ＥＬ１〜ＥＬ４  第１〜第４列の励起光
Ｓ  試料
ｔ１〜ｔ４  第１〜第４の出射端
【図１】
2012208361.tif 000003
【図２】
2012208361.tif 000004
【図３】
2012208361.tif 000005
【図４】
2012208361.tif 000006
【図５】
2012208361.tif 000007
【図６】
2012208361.tif 000008
【図７】
2012208361.tif 000009
【図８】
2012208361.tif 000010
【図９】
2012208361.tif 000011
【図１０】
2012208361.tif 000012
【図１１】
2012208361.tif 000013