(57)【要約】      （修正有）【課題】マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性及び／又は発現を抑制し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化を抑制し、及び／又はコラーゲンの発現を促進することにより、皮膚の質の改善／ケアの効果を提供する。【解決手段】化学式（Ｉ）の化合物、薬学上許容し得る塩、エステル、及びこれらの混合物を使用する。2012056937.tif 000010【選択図】図７
2012056937.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性を抑制するための医薬組成物、マトリックスメタロプロテアーゼの発現を抑制するための医薬組成物、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化を抑制するための医薬組成物、及びコラーゲンの発現を促進するための医薬組成物からなる群より少なくとも１つ選ばれた医薬組成物であって、
化学式（Ｉ）の化合物、前記化合物の薬学上許容し得る塩、前記化合物の薬学上許容し得るエステル、及びこれらの混合物からなる群より選ばれた有効量の活性成分を含有する医薬組成物。
【化１】
2012056937.tif 000009
【請求項２】
前記活性成分が化学式（Ｉ）の化合物である、
ことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記マトリックスメタロプロテアーゼがマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）を含む、
ことを特徴とする、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を抑制する、及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼの発現を抑制する請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）がＪｕｎ−Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、ｐ３８タンパク質、及びこれらの組み合わせからなる群より選ばれる、
ことを特徴とする、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化を抑制する請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記コラーゲンがＩ型コラーゲンである、
ことを特徴とする、コラーゲンの発現を促進する請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
皮膚を改善し、修復し、及び／又はケアする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
皮膚の光老化を抑制する請求項１乃至５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
中波長紫外線（ＵＶＢ）により生じた皮膚の光老化を抑制する請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性の抑制、マトリックスメタロプロテアーゼの発現の抑制、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化の抑制、及び／又はコラーゲンの発現の促進におけるトルメント酸の使用に関し、特には皮膚の改善、修復及び／又はケアにおけるトルメント酸の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの自然な老化プロセスは、皮膚の弛緩、しわの形成、及び皮膚の暗色化を含み、それらは老化に伴い徐々に現れる。皮膚の層は上部から下部に向かって、表皮層、真皮層、及び皮下組織である。皮膚の老化の原因は、内因性のファクターと外因性のファクターとに分類され得る。内因性の老化は、ヒトの身体の自然な老化プロセスであり、それには細胞のアポトーシス、ホルモン減少、及び免疫力低下が含まれる。ホルモン分泌の低下は、皮膚の新陳代謝を遅らせ得、真皮層における繊維芽細胞の機能を低下させ得るため、コラーゲン及びエラスチンの生成を徐々に低減させ得る。結果として、真皮層における結合組織が退化し、皮膚の弛緩及び皮膚のしわさえ引き起こす。さらに、真皮層における結合組織の退化は、皮膚の保水機能を低下させ得、皮膚の乾燥及び水分不足等を引き起こす。
【０００３】
外因性の老化は、太陽光、汚染、フリーラジカル、及び喫煙といった外在性のファクターにより引き起こされる。皮膚に最もダメージを与え皮膚の老化を加速する主要なファクターは、太陽からの紫外線（ＵＶ）である。波長に依存して、紫外線は、長波長ＵＶ（ＵＶＡ）、中波長ＵＶ（ＵＶＢ）、及び短波長ＵＶ（ＵＶＣ）に分類され得る。日常生活において人々が最も照射を受けている紫外線は、ＵＶＡ及びＵＶＢであり、それらは紅斑、日焼け、皮膚の細胞におけるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）へのダメージ、皮膚の免疫機構の異常、及び皮膚の癌を引き起こし得る。紫外線により引き起こされる老化現象は、“光老化”と呼ばれ、それはマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路のリン酸化を介して真皮層におけるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の増加をもたらし得る。マトリックスメタロプロテアーゼは、皮膚においてコラーゲンを分解し得る。コラーゲンの支持無しでは、皮膚は弛緩し、表皮が過形成され得る。それにより、皮膚は暗色化し、しわが形成される。
【０００４】
現在知られている動物のコラーゲンは、およそ２１タイプに分類され得る。異なる種類のコラーゲンは、異なる組織に存在する。皮膚組織における全てのコラーゲン中、Ｉ型コラーゲンは、最も含有量が多く（皮膚のコラーゲンの８０％）、最も多くの機能を有する。ＩＩＩ型コラーゲンは、皮膚のコラーゲンの約２０％を構成する。真皮層における繊維芽細胞は主に、皮膚のＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンを生成する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述のように、マトリックスメタロプロテアーゼは、コラーゲンを分解し、皮膚におけるコラーゲン含有量を低下させ得る。したがって、ＭＡＰＫ経路又は細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼの活性及び／又は発現が抑制され得るとしたら、皮膚の質の改善／ケアの効果が得られ得る。
【０００６】
本発明者らは、トルメント酸がマトリックスメタロプロテアーゼの活性を抑制し、マトリックスメタロプロテアーゼの発現を抑制し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化を抑制し、及び／又はコラーゲンの発現を促進する優れた効果を有すること、並びにそれが皮膚の改善、修復及び／又はケアに用いられ得ることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第一の目的は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性を抑制するための方法、マトリックスメタロプロテアーゼの発現を抑制するための方法、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化を抑制するための方法、及び／又は哺乳動物のコラーゲンの発現を促進するための方法を提供することである。それは、化学式（Ｉ）の化合物、該化合物の薬学上許容し得る塩、該化合物の薬学上許容し得るエステル、及びこれらの混合物からなる群より選ばれた活性成分の有効量を哺乳動物に投与する方法を含む。
【化１】
2012056937.tif 000003
【０００８】
本発明の他の目的は、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を抑制するための医薬組成物、マトリックスメタロプロテアーゼの発現を抑制するための医薬組成物、マイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化を抑制するための医薬組成物、及び／又はコラーゲンの発現を促進するための医薬組成物を提供することである。それは、前記活性成分の有効量を含有する。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を抑制するための医薬の製造における前記活性成分の使用、マトリックスメタロプロテアーゼの発現を抑制するための医薬の製造における前記活性成分の使用、マイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化を抑制するための医薬の製造における前記活性成分の使用、及び／又はコラーゲンの発現を促進するための医薬の製造における前記活性成分の使用を提供することである。
【００１０】
詳細な技術及び本発明のために実施された好ましい実施態様は、この技術分野における当業者が特許請求の範囲に記載された発明の特徴をよく理解できるように、添付された図とともに後述の段落において記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞の抽出物におけるトルメント酸のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】トルメント酸によるＭＭＰのゼラチン分解活性の抑制率を示す染色像及びカラム図である。
【図３】トルメント酸によるＭＭＰのコラゲナーゼ基質分解活性の抑制率を示すカラム図である。
【図４】ＷＳ１ヒト皮膚真皮繊維芽細胞におけるプロコラーゲン−１及びＭＭＰ−１のタンパク質電気泳動像である。
【図５】ＷＳ１ヒト皮膚真皮繊維芽細胞における非リン酸化及びリン酸化されたマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＪＮＫ，ＥＲＫ，及びｐ３８タンパク質）のタンパク質電気泳動像である。
【図６】ＷＳ１ヒト皮膚真皮繊維芽細胞の核におけるＡＰ−１のタンパク質電気泳動像である。
【図７】ＵＶＢを照射したマウスの皮膚の厚さ及びしわ形成の変化を示す写真及びカラム図である。
【図８】ＵＶＢを照射したマウスの表皮層及び真皮層の厚さの変化を示す染色像及びカラム図である。
【図９】ＵＶＢを照射したマウスの真皮層の全体領域に対するコラーゲンの割合の変化を示す染色像及びカラム図である。
【図１０】ＵＶＢを照射したマウスの皮膚の全体領域に対するＭＭＰ−１の割合の変化を示す染色像及びカラム図である。
【図１１】ＵＶＢを照射したマウスの皮膚におけるＣＯＸ−２の変化を示す染色像である。
【図１２】ＵＶＢを照射したマウスの皮膚の全体領域に対する過酸化水素の割合の変化を示す染色像及びカラム図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
特にことわらない限り、本文中で（特に後述の特許請求の範囲において）用いられる“一”、“該”又は同様の用語は、単数形式及び複数形式の両方を包含するように理解されるべきである。
【００１３】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性を抑制するための医薬組成物、マトリックスメタロプロテアーゼの発現を抑制するための医薬組成物、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化を抑制するための医薬組成物、及び／又はコラーゲンの発現を促進するための医薬組成物に関する。それは、化学式（Ｉ）の化合物、該化合物の薬学上許容し得る塩、該化合物の薬学上許容し得るエステル、及びこれらの混合物からなる群より選ばれた活性成分の有効量を含む。
【化２】
2012056937.tif 000004
【００１４】
本発明の医薬組成物は、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を抑制する効果、及びマトリックスメタロプロテアーゼの発現を抑制する効果を有し、コラーゲンの破壊を抑制又は減少させ得る。マトリックスメタロプロテアーゼは、コラゲナーゼ、ストロメライシン、ゼラチナーゼ、マトリリシン、膜貫通型ＭＭＰ等に分類され得る。一般的なマトリックスメタロプロテアーゼは、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）、マトリックスメタロプロテアーゼ−３（ＭＭＰ−３）、マトリックスメタロプロテアーゼ−７（ＭＭＰ−７）、マトリックスメタロプロテアーゼ−８（ＭＭＰ−８）、マトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）、マトリックスメタロプロテアーゼ−１０（ＭＭＰ−１０）、マトリックスメタロプロテアーゼ−１１（ＭＭＰ−１１）、マトリックスメタロプロテアーゼ−１２（ＭＭＰ−１２）、マトリックスメタロプロテアーゼ−１３（ＭＭＰ−１３）、マトリックスメタロプロテアーゼ−１４（ＭＭＰ−１４）等を含む。具体的に、本発明の医薬組成物は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）の形成（又は発現）を効果的に抑制し得る。ＭＭＰ−１はコラゲナーゼ−１とも呼ばれ、コラゲナーゼファミリーに属する。ＭＭＰ−１の他の名称は、組織コラゲナーゼ又は繊維芽細胞型コラゲナーゼを含む。
【００１５】
マトリックスメタロプロテアーゼの活性及び／又は発現を抑制する効果に加えて、本発明の医薬組成物はまた、マイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化を抑制する効果を有し、具体的にはＪｕｎ−Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、及びｐ３８タンパク質のリン酸化を抑制する効果を有する。前述のように、マイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化は、真皮層におけるマトリックスメタロプロテアーゼの量を増加させ得、さらにはコラーゲンの分解の機会を増加させ、その結果皮膚におけるコラーゲン含有量を低下させる。
【００１６】
本発明の医薬組成物は、（１）直接的にマトリックスメタロプロテアーゼの活性及び／又は発現を抑制し、（２）マイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化を抑制することにより間接的にマトリックスメタロプロテアーゼの発現を抑制する効果を有するため、皮膚におけるコラーゲンの分解を顕著に低減させ得、その結果コラーゲン含有量、具体的にはＩ型コラーゲンの含有量を増加させ、皮膚を効果的に改善し、修復し、及び／又はケアし得る。例えば、本発明の医薬組成物は、抗老化、抗光老化、皮膚のしわの低減、皮膚の質及び皮膚の弛緩性の改善、創傷治癒の促進等の効果を有し得る。
【００１７】
化学式Ｉ（すなわちトルメント酸）の化合物は、下記の工程を含む方法により調製され得る。ビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉の培養細胞を９５容量％エタノールで抽出した。該抽出物をフィルターペーパーでろ過し、ろ液を収集し減圧濃縮して濃縮物を得た。該濃縮物をその後５０容量％メタノールに溶解しフィルターペーパーでろ過し、未溶解部分を収集した。その後、該未溶解部分を８５容量％メタノールに溶解し、フィルターペーパーでろ過した。該ろ液を収集し減圧濃縮してビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞の抽出物を得た。それには十分な量の化学式（Ｉ）の化合物が含まれる。最終的に、高性能液体クトマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置で該抽出物を精製して化学式（Ｉ）の化合物を得た。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、特定の制限無くいかなる形態にも適用し得る。例えば、該医薬組成物は、スキンケア製品、化粧品等といった、外用のエマルション、クリーム、又はジェルの形態となり得る。該医薬組成物はまた、健康食品、美容飲料等といった嚥下用又は飲用の食品の形態で調製され得る。さらに、該医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、流エキス剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、チンキ剤、静脈内注射剤、粉末注射剤、懸濁注射剤、粉末−懸濁注射剤等といった、一般的な剤型となり得る。
【００１９】
本発明の医薬組成物の用量は、適用対象の年齢及び適用目的（例えば、皮膚のしわを低減させる、又は創傷治癒を促進する）により調節され得、適用頻度もまた任意に調節され得る。該医薬組成物中のその他の成分及びその含有量は、該医薬組成物の最終的な形態に依存する。例えば、該医薬組成物がスキンケア製品として調製される場合は、適切かつ適当な量のエマルション、香料、及び皮膚の質を向上させる他の活性成分が該医薬組成物中に加えられ得る。一般的に、化学式（Ｉ）の化合物の効果に悪影響を及ぼさない限り、いかなる成分をも該医薬組成物中に加えられ得る。
【００２０】
本発明はまた、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を抑制し、マトリックスメタロプロテアーゼの発現を抑制し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化を抑制し、及び／又はコラーゲンの発現を促進するための医薬の製造における前記活性成分（すなわち、化学式（Ｉ）の化合物、該化合物の薬学上許容し得る塩、該化合物の薬学上許容し得るエステル、及びこれらの混合物）の使用を提供する。該医薬は、皮膚の改善、修復及び／又はケアのために用いられ得、特には抗光老化のために用いられ得る。加えて、該医薬は特に、ＭＭＰ−１の活性及び／若しくは発現を抑制し、並びに／又はＩ型コラーゲンの発現を促進するために用いられ得る。
【００２１】
本発明はまた、マトリックスメタロプロテアーゼの活性を抑制し、マトリックスメタロプロテアーゼの発現を抑制し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化を抑制し、及び／又は哺乳動物におけるコラーゲンの発現を促進するための方法を提供する。それは、化学式（Ｉ）の化合物、該化合物の薬学上許容し得る塩、該化合物の薬学上許容し得るエステル、及びこれらの混合物からなる群より選ばれた有効量の活性成分を哺乳動物に投与する方法を含む。
【００２２】
後述において、下記の実施例を参照して本発明についてさらに解説する。しかしながら、これらの実施例は説明のために提供されるにすぎず、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００２３】
トルメント酸（化学式（Ｉ）の化合物）の調製
【００２４】
（１．ビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）の無菌苗の確立）
台湾台中県トウベングンの果樹園の成熟ビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）由来の種子を収集した。その後、該種子を３０分間洗浄し、約１分間７０％エタノールに浸した。さらに、該種子を０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０の１％塩素酸ナトリウム溶液に浸し、超音波振動子に置いた。約１５分間の表面消毒後、該種子を層流型ベンチに置いた。その後該種子を３〜４時間滅菌水で洗浄し、３０ｇ／Ｌスクロース含有のＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地）で栽培した。２〜３週間後、該種子は発芽し始め、発芽後２カ月の該種子の葉を収集し、試験用マテリアルとした。
【００２５】
（２．カルス組織の誘導）
種子の葉を約０．３ｃｍにカットし、培養のための固形培地（ＭＳ基本配合中２．５ｐｐｍ  ６−ベンジルアデニン（ＢＡ）、１ｐｐｍ  α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、３％（３０ｇ／Ｌ）スクロース、及び０．３％（３ｇ／Ｌ）ゲルライトを含む）に移した。１カ月後、浅黄色のカルス組織が切創から発生していた。
【００２６】
（３．ビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞の培養）
６０ｇの上述の浅黄色のカルス組織（新しいビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞に分化し得る）を取り５９０μｍのふるいでふるい分けし、カルス組織細胞を特定のサイズに分離した。その後、ふるい分けされた該カルス組織細胞を培養のために４，０００ｍＬの培養液（ＭＳ基本配合中２．５ｐｐｍ  ＢＡ、１ｐｐｍ  ＮＡＡ、３％（３０ｇ／Ｌ）スクロースを含む）を含有する生物反応器（ＢｉｏＦｌｏ１１０  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ、ニューブランズウィックサイエンティフィック、アメリカ）に移した（培養条件：通気量は０．３ｖ．ｖ．ｍ（１分当たり液体容積単位当たりの気体流量容積（ｔｈｅ  ｇａｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ｆｌｏｗ  ｐｅｒ  ｕｎｉｔ  ｏｆ  ｌｉｑｕｉｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ））であり；撹拌速度は４０ｒｐｍであり：温度は２４〜２６℃であった）。該カルス組織を１０日おきに新しい培養液を用いて継代培養するときには、元の細胞懸濁液（すなわち培養液）を５００ｍＬ残し、新しい培養液を４，５００ｍＬ追加した。元の培養液の残りの４，５００ｍＬ（約３２０ｇの細胞を含む）を、２５．５Ｌの培養液（ＭＳ基本配合中２．５ｐｐｍ  ＢＡ、１ｐｐｍ  ＮＡＡ、及び３％（３０ｇ／Ｌ）スクロースを含む）が入っている生物反応器（３０Ｌの容量のステンレス製のボトル）に移した。その後、ビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞の１ｐｐｍのラフィネートを該培養液に加え、分化されたビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞の培養を継続した。培養は１８日後に終了した。
【００２７】
（４．ビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞のラフィネートの調整）
培養されたビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞を個々のバッチ培養から取り出し、乾燥させた（乾燥前約５，４００ｇ；乾燥後約３２０ｇ）。該細胞を９５容量％エタノールで３回還流抽出した。得られた抽出物をフィルターペーパーでろ過し、ろ液を収集し減圧濃縮して濃縮物を得た。その後、該濃縮物を５０容量％メタノールに２回溶解し、フィルターペーパーでろ過して未溶解部分を収集した。さらに、該未溶解部分を８５容量％メタノールに３回溶解し、フィルターペーパーでろ過した。未溶解部分を収集し、ビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞のラフィネートを得た。
【００２８】
（５．ビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞の抽出物の調製）
培養されたビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞を個々のバッチ培養から取り出し、６０℃で乾燥させた（乾燥前約５，４００ｇ；乾燥後約３２０ｇ）。該細胞を９５容量％エタノールで３回還流抽出した。得られた抽出物をフィルターペーパーでろ過し、ろ液を収集し減圧濃縮して濃縮物を得た。その後、該濃縮物を５Ｌの５０容量％メタノールに２回溶解し、フィルターペーパーでろ過して未溶解部分を得た。さらに、該未溶解部分を１０Ｌの８５容量％メタノールに３回溶解し、フィルターペーパーでろ過した。ろ液を収集し減圧濃縮してビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞の抽出物の白色粉末約５３ｇを得た。前述の工程で得られたビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞の抽出物は実質的に５０容量％メタノールに可溶であり８５容量％メタノールに不溶である成分を含んでいなかった。
【００２９】
（６．トルメント酸の精製）
ビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞の抽出物の白色粉末約１ｇをシリカゲル（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ  ＲＰ−１８、Ｅ．メルク、４０〜６３μｍ）に載せ、メタノールと水の比率が８：２から１０：０の分配で分取高性能液体クトマトグラフィー（ＨＰＬＣ，ポンプ：島津ＬＣ−８Ａ（京都、日本）（移動相：８５容量％メタノール；流速：３ｍＬ／分；カラム：ＹＭＣ，Ｊ’ＳｐｈｅｒｅシリーズＯＤＳ−Ｈ８０カラム（内径：１０ｍｍ；長さ：２５０ｍｍ；粒径：５μｍ））により精製し、トルメント酸を得た。
【００３０】
精製された化合物を、質量分析法（ＧＣｍａｔｅ、ＪＯＥＬ社（東京、日本）から購入）及びＮＭＲ（１Ｈ，１３Ｃ，ＤＥＰＴ，ＣＯＳＹ，ＨＭＱＣ，ＨＭＢＣ，Ｊｅｏｌ  ５００  ＭＨｚ、東京、日本）により分析し、主要成分がトルメント酸（化学式（Ｉ）の化合物）であることが認められた。
【化３】
2012056937.tif 000005
【００３１】
トルメント酸（２５．３ｍｇ）の１Ｈ−ＮＭＲ（ピリジン−ｄ５）の結果は、δ０．９２（３Ｈ，ｓ，Ｈ−２４），δ１．００（３Ｈ，ｓ，Ｈ−２５），δ１．１２（３Ｈ，ｓ，Ｈ−２６），δ１．１２（３Ｈ，ｓ，Ｈ−３０），δ１．２８（３Ｈ，ｓ，Ｈ−２３），δ１．４３（３Ｈ，ｓ，Ｈ−２９），δ１．６５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−２７），１．７４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，Ｈ−１），１．９０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．０，３．８Ｈｚ，Ｈ−１），δ２．３４（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝１３．２，４．１Ｈｚ，Ｈ−１５），δ３．０５（３Ｈ，ｓ，Ｈ−１８），δ３．１４（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝１３．１，４．１Ｈｚ，Ｈ−１６），δ３．７７（３Ｈ，ｓ，Ｈ−３），δ４．３１（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１０，２．６Ｈｚ，Ｈ−２），δ５．５９（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１２）．であり、１３Ｃ−ＮＭＲ（ピリジン−ｄ５）の結果は、δ１７．１（Ｃ−３０），１７．２（Ｃ−２５），１９．１（Ｃ−６），２２．８（Ｃ−２４），１７．７（Ｃ−２６），２４．５（Ｃ−１１），２５．１（Ｃ−２７），２６．９（Ｃ−１６），２７．４（Ｃ−２１），２７．６（Ｃ−２９），２９．７（２Ｃ，Ｃ−１５，Ｃ−２３），３４．０（Ｃ−７），３９．０（Ｃ−２２），３９．１（Ｃ−１０），３９．３（Ｃ−４），４１．１（Ｃ−８），４２．６（Ｃ−１），４２．８（Ｃ−２０），４３．３（Ｃ−１４），４８．１（Ｃ−９），４８．７（Ｃ−１７），４９．２（Ｃ−５），５５．１（Ｃ−１８），６６．６（Ｃ−２），７３．２（Ｃ−１９），７９．８（Ｃ−３），１２８．５（Ｃ−１２），１４０．４（Ｃ−１３），１８１．２（Ｃ−２８）．であった。
【００３２】
（７．トルメント酸含量の測定）
トルメント酸の含量をＨＰＬＣで測定した。ＨＰＬＣの測定条件は下記の通りである：ポンプは島津ＬＣ−１０ＡＴｖｐであった；屈折率測定器は島津ＲＩＤ−１０Ａであった；ＨｙＰＵＲＩＴＹ  Ｃ−１８カラム（内径：４．６ｍｍ；長さ：２５０ｍｍ；粒径：５μｍ）；溶媒系は容積比８５：１５のメタノール／０．１５容量％酢酸含有水であった：流速は０．５ｍＬ／分であった；温度は３５℃であった。図１で示されるように、トルメント酸の含量は、ビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞の抽出物の乾燥重量に基づき約４８重量％であった。
【実施例２】
【００３３】
マトリックスメタロプロテアーゼ活性の抑制試験
【００３４】
マトリックスメタロプロテアーゼ（コラゲナーゼ）は、コラーゲンの分解に加えて、ゼラチンを分解する作用を有する。この実施例では、分解されたゼラチン及び分解された市販のコラゲナーゼ基質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（ラホヤ，カナダ）から購入）の蛍光発生の特性を用いて、トルメント酸のマトリックスメタロプロテアーゼ抑制作用を評価した。
【００３５】
（実験Ａ  ゼラチンの分解試験）
エッペンドルフチューブに５０μＬの緩衝液（ｐＨ７．８、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  塩化カルシウム、及び０．１５Ｍ  塩化ナトリウムを含む）、３０μＬの滅菌水、及び１０μＬのバクテリアのマトリックスメタロプロテアーゼ（０．１ｍｇ／ｍＬ、シグマ）を加え、その後該エッペンドルフチューブに種々の濃度（２５，５０，１００，又は２００μｇ／ｍＬ）の（ジメチルスルホキシドに溶解された）トルメント酸溶液１０μＬ、又はポジティブコントロールとしてのドキシサイクリンを加えた。それらを混合し、室温で６０分間インキュベートした。
【００３６】
その混合物（３０μＬ）を取り出し、ゼラチン培地で覆われた円形フィルターペーパーに滴下した。その後、培地とともにフィルターペーパーを３７℃のインキュベーターに置いた。１８時間のインキュベーション後、該フィルターペーパーを取り除いた。該培地をクマシーブルーＲ−２５０染色溶液（アムレスコ社（アメリカ）から購入）で染色し、その後脱色溶液で脱色した。マトリックスメタロプロテアーゼで分解されたゼラチンはクマシーブルー染色溶液で染色されないため、該培地の透明度がマトリックスメタロプロテアーゼの活性を表し得る。該培地を撮影後、画像を画像分析ソフトウェア（ＡｌｐｈａＤｉｇｉＤｏｃ  １２０１，アルファイノテック社（アメリカ）から購入）で分析し、トルメント酸のマトリックスメタロプロテアーゼのゼラチン分解活性における抑制率を測定した。その試験結果を表１及び図２に示す。
【表１】
2012056937.tif 000006
【００３７】
表１及び図２に示されるように、トルメント酸はマトリックスメタロプロテアーゼのゼラチン分解活性を顕著に抑制した。
【００３８】
（実験Ｂ  蛍光性基質試験）
特定量のコラゲナーゼ基質ＩＩＩの溶液（Ｍｃｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ｌｙｓ  （ＤＮＰ）−ＯＨ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（ラホヤ，カナダ）から購入）、マトリックスメタロプロテアーゼ（コラゲナーゼ、シグマ）溶液、トルメント酸又はポジティブコントロールとしてのドキシサイクリンを混合し、９６ｗｅｌｌプレートに加えた。その後、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、ルミネセンス励起光（２８５ｎｍ）下及び放射光（４０５ｎｍ）下の各々での該混合物の吸収値を測定した。結果を表２及び図３に示す。ここでΔＦは、時間ゼロでの基礎蛍光値を差し引いた蛍光値である。
【表２】
2012056937.tif 000007
【００３９】
表２及び図３は、トルメント酸が蛍光発生を抑え得ることを示し、トルメント酸がマトリックスメタロプロテアーゼのコラゲナーゼ基質ＩＩＩ分解活性を抑制し得ることを示している。
【００４０】
実験Ａ及び実験Ｂの結果により、本発明の医薬組成物及び方法はマトリックスメタロプロテアーゼの活性を抑制し得ることが示唆された。
【実施例３】
【００４１】
細胞試験
【００４２】
（実験Ｃ  細胞生存率の試験）
以下の実験は、ＷＳ１ヒト皮膚真皮繊維芽細胞（フードインダストリーリサーチアンドデベロップメントインスティチュート（台湾）より購入）を用いて行われた。０ｍＪ／ｃｍ２から１２０ｍＪ／ｃｍ２の強度範囲での紫外線（ＵＶ）照射下では、ＷＳ１ヒト皮膚真皮繊維芽細胞は死に至らない。そこで、この試験は９０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶ強度で行われた。まず、種々の濃度（０，０．１，１．０，２．０，又は１０μｇ／ｍＬ）のトルメント酸を、ＷＳ１ヒト皮膚真皮繊維芽細胞を含む培養液（最小必須培地α、１０％の非働化牛胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含む）に加えた。該細胞を２４時間培養後、ＭＴＳアッセイ（３−（４，５−ジ−メチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、プロメガ社（マディソン、ウィスコンシン、アメリカ）から購入）を行って、細胞生存率を測定した。結果を表３に示す。ＭＴＳアッセイのメカニズムは以下の通りである：生存細胞のデヒドロゲナーゼ活性は、ＭＴＳを赤紫色の水溶性産生物に還元させることができる。それは４９０ｎｍの波長で極大吸収を示し、それゆえ、細胞生存率は吸収値により測定され得る。
【表３】
2012056937.tif 000008
【００４３】
表３に示されるように、細胞に９０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶを照射した場合、トルメント酸は１０μｇ／ｍＬの濃度で細胞の死を起こさせた。しかし、２μｇ／ｍＬよりも低い濃度では細胞の死を起こさなかった。この実験により、トルメント酸は低濃度では細胞毒性を有しないことが示された。
【００４４】
（実験Ｄ  プロコラーゲン−１及びマトリックスメタロプロテアーゼ−１の分析）
実験ＣでのＷＳ１ヒト皮膚真皮繊維芽細胞のタンパク質を収集し、ウェスタンブロッティンッグアッセイを行い、繊維芽細胞におけるタンパク質発現レベルを調べた。結果を図４に示す。該細胞に２４時間ＵＶ照射した後、ＷＳ１ヒト皮膚真皮繊維芽細胞のプロコラーゲン−１の発現は低減され、マトリックスメタロプロテアーゼ−１の発現は亢進していた。しかしながら、該細胞を収集前１時間トルメント酸で処理すると、マトリックスメタロプロテアーゼ−１の発現は抑制され、プロコラーゲン−１の発現は亢進された。
【００４５】
この実施例により、本発明の医薬組成物及び方法は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１の発現を抑制し、プロコラーゲン−１の発現を亢進する効果を有することが示唆された。
【００４６】
（実験Ｅ  マイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化の分析）
紫外線により引き起こされる皮膚の“光老化”は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化を介して真皮層におけるマトリックスメタロプロテアーゼの増加を起こし得る。そこで、この実施例でもウェスタンブロッティンッグアッセイを行い、細胞におけるマイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化に対するトルメント酸の作用を調べた。結果を図５に示す。
【００４７】
図５に示されるように、ＷＳ１ヒト皮膚真皮繊維芽細胞に２４時間ＵＶ光を照射した後では、３種類のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（Ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、及びｐ３８タンパク質）のリン酸化されたタンパク質の発現は亢進された。しかしながら、該細胞を収集前１時間トルメント酸で処理すると、ＪＮＫ、ＥＲＫ、及びｐ３８タンパク質のリン酸化は抑制され得た。
【００４８】
この実施例により、本発明の医薬組成物及び方法は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の抑制を介してマトリックスメタロプロテアーゼ−１の発現を抑制し、その結果コラーゲンの発現を促進する効果を有することが示唆された。
【００４９】
（実験Ｆ  アクチベータータンパク質１遺伝子転写因子の発現分析）
細胞へのＵＶ照射により、ＪＮＫ及びｐ３８が誘導され、ｃ−Ｊｕｎが活性化される。それはその後核内に入る。その後、ｃ−ＦｏｓがＥＲＫ及びｐ３８の調節下で核内に移行する。ｃ−Ｊｕｎサブユニットはｃ−Ｆｏｓサブユニットと結合し、アクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）遺伝子転写因子を形成する。それはその後、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写を促進させるように遺伝子発現に関与し、プロコラーゲン−１α１（Ｉ型コラーゲンのプロコラーゲンα１）の遺伝子発現を低減させる。そこで、この実施例では、ウェスタンブロッティンッグアッセイを行い、さらに核におけるＡＰ−１のタンパク質発現を調べた。結果を図６に示す。ＷＳ１ヒト皮膚真皮繊維芽細胞に２４時間ＵＶ光を照射した後では、核におけるｃ−Ｊｕｎ及びｃ−Ｆｏｓの発現レベルは亢進された。しかしながら、該細胞を収集前１時間トルメント酸で処理すると、ｃ−Ｊｕｎ及びｃ−Ｆｏｓの発現レベルは抑制された。
【００５０】
この実施例により、本発明の医薬組成物及び方法は、ＵＶ照射により誘導されたマイトジェン活性化プロテインキナーゼのリン酸化の抑制を介してＡＰ−１の核内移行を抑制し、その結果ＭＭＰ−１及びプロコラーゲン−１α１遺伝子の転写を抑制する作用を有することが示唆された。
【実施例４】
【００５１】
動物実験
【００５２】
（実験Ｇ  皮膚のしわの分析）
下記の実施例は、７週齢のＳＫＨ−１無毛雄マウス（チャールズリバーラボ社（アメリカ）から購入）を用いて行われた。マウスは、コントロール群（６マウス）及びＵＶＢ（中波長ＵＶ）の群（２４マウス）の２群に分けられた。ＵＶＢの群のマウスには、１週間に３回（すなわち、月曜日、水曜日、及び金曜日）ＵＶＢを照射した。第１週目のＵＶＢ照射の強度は９０ｍＪ／ｃｍ２であり、第２週から第１２週では１２０ｍＪ／ｃｍ２であった。
【００５３】
ＵＶＢの群をさらに８マウスずつの３群に分類した。３群は各々、１）ＵＶＢを照射するのみ（以後“ＵＶＢ群”とする）、２）ＵＶＢを照射し、クリームのビヒクルを適用する（以後“ビヒクル群”とする。該ビヒクルは、０．５重量％のプエラリア（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｉｒｉｆｉｃａ）抽出物、５重量％のスクアラン、２重量％のアスコルビルリン酸ナトリウム、５重量％の１，３−ブチレングリコール、２重量％のジプロピレングリコール、３重量％のポリエチレングリコール４００、０．５重量％のキサンタンガム、５重量％のグリセロール、及び７７重量％の純水を含む。）、及び３）ＵＶＢを照射し、０．５重量％のビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞の抽出物を含有するクリームを適用する（トルメント酸を含み、以後“抽出物群”とする）。ビヒクル群及び抽出物群にＵＶＢを照射した後、０．２ｍＬのビヒクルエマルション又は０．５重量％のビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞の抽出物を含むクリームをそれぞれマウスの背部に即座に塗布した。
【００５４】
ＵＶＢ照射最終日の翌日、マウスの皮膚の厚さを測定し、マウスの皮膚を観察及び撮影した。皮膚のしわの程度をビセット（Ｂｉｓｓｅｔｔ）の評価方法（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ｓａｐｏｎｉｎｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｒｅｄ  ｇｉｎｓｅｎｇ  ｏｎ  ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｂ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｋｉｎ  ａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｈａｉｒｌｅｓｓ  ｍｉｃｅ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００９；６０２：１４８−１５６に記載され、これはその内容の全てが参照によって本出願に取り込まれる。）により４つのレベル（０，２，４，及び６）にスケール化した。結果を図７に示す。
【００５５】
図７に示すように、ＵＶＢ照射無しのコントロール群に比して、マウスに１２週間ＵＶＢを照射した後では、マウスの背部の皮膚はより厚くなっており、しわが発生していた。抽出物群におけるマウスの皮膚の厚さ及びしわの形成のレベルは、ＵＶＢ群のマウスよりも著しく低減され、ビヒクル群では明らかな改善は認められなかった。この実施例により、トルメント酸が皮膚の抗光老化の効果を有することが示唆された。
【００５６】
（実験Ｈ  組織染色分析−表皮層、真皮層、及びコラーゲン）
皮膚のしわ分析の終了後、マウスにＣＯ２を吸入することにより麻酔し、屠殺した。マウスの背部の皮膚を採取し、６片に分けた。背部の皮膚の１片を、凍結切片用に３０重量％の糖溶液に浸した。他の１片を、パラフィン切片用に１０重量％ホルマリン溶液に浸した。残りの４片を、それぞれラベルをつけたジッパーバッグに収集し、−８０℃で保存した。
【００５７】
１０重量％ホルマリン溶液に１週間浸された皮膚片をパラフィン包埋及びスライスし、該スライスをその後２つの方法で染色した。一つめの方法は、一般的な染色であるヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）であり、もう一方の方法は、コラーゲン用の特殊な染色（すなわちシリウスレッド染色）であった。各マウスの各ＨＥ染色スライス像における１０の画像ブロックをランダムに選択し、画像分析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ５．１，メディアサイバネティクス社（ＭＤ、アメリカ）から購入）で分析し、表皮層及び真皮層の厚さを評価した。その後、全体の皮膚の厚さに対する表皮層又は真皮層の厚さの割合を算出した。結果を図８に示す。一方、全体の皮膚に対するシリウスレッド染色スライスのコラーゲンの割合を分析し算出した。結果を図９に示す。
【００５８】
図８に示されるように、ＨＥ染色の結果、ＵＶＢ照射無しのコントロール群に比して、１２週間ＵＶＢを照射したマウスの表皮層の厚さは著しく増加し、真皮層の厚さは著しく低減していることが示された。しかしながら、ビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞の抽出物を塗布したマウスの表皮層の厚さは低減し、真皮層の厚さは増加していた。さらに、ビヒクル群のマウスの表皮層の厚さは低減し、真皮層の厚さは影響を受けていなかった。
【００５９】
図９に示されるように、シリウスレッド染色の結果、ＵＶＢ照射無しのコントロール群に比して、１２週間ＵＶＢを照射したマウスの背部の皮膚におけるコラーゲンは著しく減少し、一方、抽出群のマウスの皮膚におけるコラーゲンはＵＶＢ群のマウスのそれよりも著しく多いことが示された。ビヒクル群においては明確な改善はみられなかった。
【００６０】
実験Ｈの実施例により、本発明の医薬組成物及び方法は、皮膚の真皮層におけるコラーゲン含量を増加させる効果を有することが示唆された。
【００６１】
（実験Ｉ  組織染色分析−マトリックスメタロプロテアーゼ−１）
実験Ｈで３０重量％糖溶液に２４時間浸した皮膚組織を凍結切片用に取り出した。該皮膚組織を組織凍結液中で凍結及び包埋し、−８０℃で保存した。染色前に６μｍの厚さの皮膚組織サンプルを凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓ、ライカ社（ドイツ）から購入）で組織から切り取った。さらに、該サンプルをマイクロスライドに貼り付け、１０分間室温下アイスアセトンで固定した。その後、ＭＭＰ−１の免疫組織化学蛍光染色及びＣＯＸ−２（シクロオキシゲナーゼ−２）の免疫染色及び過酸化水素染色を行った。
【００６２】
ＭＭＰ−１の免疫組織化学蛍光染色は下記の工程で行った。最初に、凍結切片をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で３回洗浄し、３０分間反応用の５重量％ミルクに浸し、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、抗ＭＭＰ−１抗体（サンタクルーズ社から購入）を該切片に加え、該切片をパラフィン中に広げ、４℃で一晩ウェットボックスに置き、その後ＰＢＳで３回洗浄した。さらに、蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標名）４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ）、インビトロジェンから購入）を該切片に加え、その後該切片をパラフィン中に広げ、ウェットボックスに置き、４５分間室温で遮光して保存した。その後、該切片をＰＢＳで３回洗浄し、気泡を取り込まないようにウェットな状態でカバーガラスで被覆し、即座に蛍光顕微鏡で撮影した。最後に、皮膚の全体の領域に対するＭＭＰ−１の割合を画像分析ソフトウェアで分析した。結果を図１０に示す。
【００６３】
図１０に示されるように、ＵＶＢ照射無しのコントロール群に比して、１２週間ＵＶＢを照射したマウスの背部の皮膚におけるＭＭＰ−１は著しく増加した。しかし、抽出物群におけるマウスのＭＭＰ−１の発現は、ＵＶＢ群のそれより低かった。ビヒクル群においては明確な改善はみられなかったため、これにより皮膚の抗老化の効果は主にビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞の抽出物に由来するものであることが示唆された。
【００６４】
（実験Ｊ  組織染色分析−抗炎症作用）
ＣＯＸ−２免疫染色は、下記の工程を含む。第一に、実験Ｈでの凍結切片をＰＢＳで３回洗浄し、０．３重量％過酸化水素／ＰＢＳに浸した。第二に、該切片を１０分間室温に置いた後ＰＢＳで少し洗浄した。その後、該切片をブロッキングバッファーに浸し、室温で３０分間置き、ＰＢＳで３回洗浄した。抗ＣＯＸ−２一次抗体（セルシグナリングから購入）を該切片に加え、該切片をパラフィン中に広げ、４℃で一晩ウェットボックスに置き、ＰＢＳで３回洗浄した。さらに、二次抗体を該切片に加え、室温で３０分間反応させた。最後に、着色反応のために免疫検出キット（バイオジェネックス社（サンラモン、カナダ）から購入）及びジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用い、該切片をヘマトキシリンで染色した。その後、該切片を脱水及びシールした。結果を図１１に示す。
【００６５】
図１１に示されるように、ＵＶＢ照射無しのコントロール群に比して、１２週間ＵＶＢを照射したマウスの背部の皮膚におけるＣＯＸ−２の発現は著しく増加した。抽出物群におけるマウスのＣＯＸ−２の発現は、ＵＶＢ群のそれよりも低かった。ビヒクル群においては明確な改善はみられなかった。これらの結果から、トルメント酸を含有するビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞の抽出物は抗炎症作用を介して抗老化の効果を達成し得ることが示唆された。
【００６６】
（実験Ｋ  組織染色分析−抗酸化作用）
該切片の過酸化水素染色をダンネンベルグ（Ｄａｎｎｅｎｂｅｒｇ）らの方法（Ｄａｎｎｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｆｉｘｅｄ−ｆｒｏｚｅｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｌｅｓｉｏｎｓ．  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．  １９９４；５：４３６−４３に記載される。これはその内容の全てが参照によって本出願に取り込まれる。）に従い行った。まず、実験Ｈにおける凍結切片を１ｍｇ／ｍＬグルコース及び１ｍｇ／ｍＬジアミノベンジジンを含有する０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ  ７．５）に浸し、３７℃で６時間インキュベーターに置いた。その後、該切片をＰＢＳで３回洗浄し、ヘマトキシリンで染色した。ＰＢＳで少し洗浄した後、該切片を気泡を取り込まないようにウェットな状態でカバーガラスで被覆し、即座に顕微鏡で撮影した。皮膚の全体の領域に対する過酸化水素の割合を画像分析ソフトウェアで分析した。結果を図１２に示す。
【００６７】
図１２に示されるように、ＵＶＢ照射無しのコントロール群に比して、１２週間ＵＶＢを照射したマウスの背部の皮膚における過酸化水素は著しく増加した。抽出物群におけるマウスの過酸化水素の量は、ＵＶＢ群のそれよりも低かった。ビヒクル群においては明確な改善はみられなかった。これらの結果から、トルメント酸を含有するビワ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｌｉｎｄｌ．）葉細胞の抽出物は酸化ストレスのダメージの軽減を介して皮膚の抗老化の効果を達成し得ることが示唆された。
【００６８】
前述の実施例により、本発明の医薬組成物及び方法は、皮膚を改善し、修復し、及び／又はケアする効果を有することが示される。
【００６９】
前述の開示は、詳述された技術内容及び本発明の特徴に関する。本技術分野における当業者であれば、本発明の特徴から逸脱することなく、本明細書に記載された発明の開示及び示唆に基づき種々の変更及び置換を行い得る。それにもかかわらず、このような変更及び置換は前述の説明には完全には開示されていないものの、それらは下記に添えられた特許請求の範囲に実質的に含まれる。
【００７０】
（関連する出願）
本出願は、台湾特許出願０９９１２９８７９（出願日２０１０年９月３日）に基づく優先権を主張しており、その内容は本明細書に参照として取り込まれる。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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