(57)【要約】      （修正有）【課題】ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を、高い感度で、簡便に検出できる多型検出用プローブを提供する。【解決手段】（Ｐ１）特定の塩基を含む塩基長１１〜５０の配列であり、４１１番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は上記特定配列と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、上記４１１番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、又は（Ｐ１’）上記特定配列のうち４０１〜４１１番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の配列であり、上記４１１番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は上記特定配列と同一の塩基を有する塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、上記４１１番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブ。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３、Ｐ３’、Ｐ４、Ｐ４’、Ｐ５及びＰ５’からなる群から選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブ；
（Ｐ１）配列番号１で示される配列のうち４０１番目〜４１１番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の配列であり、配列番号１における４１１番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は、配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号１で示される配列のうち４１１番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ１’）配列番号１で示される配列のうち４０１番目〜４１１番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の配列であり、配列番号１における４１１番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は、配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１で示される配列のうち４１１番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ２）配列番号２で示される配列のうち２０１番目〜２０５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の配列であり、配列番号２における２０５番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号２で示される配列のうち２０５番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ２’）配列番号２で示される配列のうち２０１番目〜２０５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の配列であり、配列番号２における２０５番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号２で示される配列のうち２０５番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ３）配列番号２で示される配列のうち１９０番目〜２０１番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号２における１９０番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号２の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号２で示される配列のうち１９０番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ３’）配列番号２で示される配列のうち１９０番目〜２０１番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号２における１９０番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号２で示される配列のうち１９０番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ４）配列番号２で示される配列のうち１８６番目〜２０１番目の塩基を含む塩基長１６〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号２における１８６番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号２の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号２で示される配列のうち１８６番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ４’）配列番号２で示される配列のうち１８６番目〜２０１番目の塩基を含む塩基長１６〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号２における１８６番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号２で示される配列のうち１８６番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ５）配列番号３で示される配列のうち４９６番目〜５０１番目の塩基を含む塩基長６〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号３における４９６番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号３の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号３で示される配列のうち４９６番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ５’）配列番号３で示される配列のうち４９６番目〜５０１番目の塩基を含む塩基長６〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号３における４９６番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号３と同一の塩基を有する塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号３で示される配列のうち４９６番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、配列番号１における４０１番目の塩基の多型を認識する、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
【請求項３】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、前記蛍光色素で標識された前記塩基を３'末端から数えて１〜３番目に有する、請求項１または２に記載の多型検出用プローブ。
【請求項４】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、前記蛍光色素で標識された前記塩基を３'末端に有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項５】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するか又は増加する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項６】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項７】
前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、１５〜３０塩基長であり、
前記Ｐ２及びＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、１０〜３０塩基長であり、
前記Ｐ３及びＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、１２〜４０塩基長であり、
前記Ｐ４及びＰ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、１６〜４０塩基長であり、
前記Ｐ５及びＰ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、１０〜４０塩基長である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項８】
前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、１５〜２０塩基長であり、
前記Ｐ２及びＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、１０〜２０塩基長であり、
前記Ｐ３及びＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、１５〜３０塩基長であり、
前記Ｐ４及びＰ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、２０〜３０塩基長であり、
前記Ｐ５及びＰ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、２０〜３０塩基長である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項９】
前記多型検出用プローブが、融解曲線分析用のプローブである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項１０】
前記多型検出用プローブが、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３又は配列番号４５で示される塩基配列を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項１１】
前記多型検出用プローブが、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号４４又は配列番号１２で示される塩基配列を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の多型検出用プローブを用いることにより、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出する多型検出方法。
【請求項１３】
（Ｉ）前記多型検出用プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記多型検出用プローブ及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッド形成体を得ること、
（ＩＩ）前記ハイブリッド形成体を含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッド形成体を解離させ、前記ハイブリッド形成体の解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること、
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッド形成体の解離温度であるＴｍ値を検出すること、及び、
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型の存在を検出すること、
を含む、請求項１２に記載の多型検出方法。
【請求項１４】
さらに、前記（Ｉ）の前または（Ｉ）と同時に、核酸を増幅することを含む、請求項１３に記載の多型検出方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の多型検出方法により、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出すること、及び、
検出された多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を評価すること、を含む、薬剤の薬効評価方法。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の多型検出用プローブを含む、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出するための多型検出用試薬キット。
【請求項１７】
さらに、前記多型検出用プローブがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、請求項１６に記載の多型検出用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効評価方法及び多型検出用試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＹＰ（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０）は、ステロイドホルモン等の生体物質の代謝、薬物及び環境汚染物質等の酸化的解毒反応に関与する酸化酵素である。ＣＹＰは、多数の分子種を含むスーパーファミリーを形成しており、中でも、ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ５は、例えば、医薬品の代謝に影響する多型の存在が知られている（非特許文献１）。
【０００３】
ＣＹＰ３Ａ５をコードするＣＹＰ３Ａ５遺伝子は、ヒトの第７染色体に位置する。そして、例えば、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子の部分配列（配列番号１）における４０１番目の塩基（ｒ）について、アデニン（ａ）からグアニン（ｇ）への変異（ＣＹＰ３Ａ５＊３）等が知られている（非特許文献２等）。この塩基の変異により、スプライシング異常が生じ、ＣＹＰ３Ａ５の発現が大幅に低下する。
【０００４】
また、ＣＹＰ３Ａ４をコードするＣＹＰ３Ａ４遺伝子は、ヒトの第７染色体に位置する。そして、例えば、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の部分配列（配列番号２）における２０１番目の塩基（ｓ）について、シトシン（ｃ）からグアニン（ｇ）への変異（ＣＹＰ３Ａ４＊１６）等が知られている（非特許文献２等）。この塩基の変異により、ＣＹＰ３Ａ４の１８５番目のトレオニン（Ｔ）は、セリン（Ｓ）に変異する。
【０００５】
これらの変異は、例えば、免疫抑制剤タクロリムス等の薬物代謝との関連が報告されている（非特許文献２）。したがって、ＣＹＰ３Ａ遺伝子における、これらの多型を検出することにより、例えば、薬剤耐性をより高感度で予測できる可能性があると考えられている。
【０００６】
現在、遺伝子の多型を検出する方法として、例えば、ＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）−ＲＦＬＰ（Restriction  Fragment  Length  Polymorphism）法等が知られている（非特許文献３）。この方法は、検出目的の塩基を含む部分を増幅するよう設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、前記特定塩基における変異の有無によって切断の有無が異なるような制限酵素で切断し、その後、電気泳動で切断されたかどうかを検出する方法である。
【０００７】
また、変異を含む領域をＰＣＲ法で増幅した後、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて塩基配列の変異を解析する方法も知られている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−１１９２９１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ、２００４年、Ｖｏｌ．２３、Ｉｓｓｕｅ  １、ｐ．１００−１０８
【非特許文献２】Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００６年、Ｖｏｌ．８０、ｐ．１７９−１９１
【非特許文献３】Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．、２０１０年、第９巻、第１号、ｐ．３４−４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の変異には、前述の通り、種々の変異が存在している。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法では、ＰＣＲ反応後に増幅産物を取り出し、制限酵素処理を行う必要がある。このため、前記増幅産物が、次の反応系に混入する恐れがあり、これに起因して、偽陽性及び偽陰性の結果が得られてしまう場合がある。また、ＰＣＲ終了後、制限酵素で処理を行い、その後さらに電気泳動を行うため、検出までに必要な時間も非常に長くなる場合がある。さらに、操作が複雑なため、自動化が困難である。これらの現状を踏まえ、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型検出のために、さらなる技術開発が待ち望まれていた。
【００１１】
本発明は、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いる多型検出方法を提供することを課題とする。また、本発明は、前記多型検出方法を用いた薬効評価方法を提供することを課題とする。さらに本発明は、前記多型検出用プローブを用いた多型検出用試薬キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、以下の通りである。
＜１＞  下記Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３、Ｐ３’、Ｐ４、Ｐ４’、Ｐ５及びＰ５’からなる群から選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブ；
（Ｐ１）配列番号１で示される配列のうち４０１番目〜４１１番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の配列であり、配列番号１における４１１番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は、配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号１で示される配列のうち４１１番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ１’）配列番号１で示される配列のうち４０１番目〜４１１番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の配列であり、配列番号１における４１１番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は、配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１で示される配列のうち４１１番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ２）配列番号２で示される配列のうち２０１番目〜２０５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の配列であり、配列番号２における２０５番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号２で示される配列のうち２０５番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ２’）配列番号２で示される配列のうち２０１番目〜２０５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の配列であり、配列番号２における２０５番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号２で示される配列のうち２０５番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ３）配列番号２で示される配列のうち１９０番目〜２０１番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号２における１９０番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号２の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号２で示される配列のうち１９０番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ３’）配列番号２で示される配列のうち１９０番目〜２０１番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号２における１９０番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号２で示される配列のうち１９０番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ４）配列番号２で示される配列のうち１８６番目〜２０１番目の塩基を含む塩基長１６〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号２における１８６番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号２の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号２で示される配列のうち１８６番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ４’）配列番号２で示される配列のうち１８６番目〜２０１番目の塩基を含む塩基長１６〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号２における１８６番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号２で示される配列のうち１８６番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ５）配列番号３で示される配列のうち４９６番目〜５０１番目の塩基を含む塩基長６〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号３における４９６番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号３の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号３で示される配列のうち４９６番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、
（Ｐ５’）配列番号３で示される配列のうち４９６番目〜５０１番目の塩基を含む塩基長６〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号３における４９６番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号３と同一の塩基を有する塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号３で示される配列のうち４９６番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド。
＜２＞  前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、配列番号１における４０１番目の塩基の多型を認識する、＜１＞に記載の多型検出用プローブ。
＜３＞  前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、前記蛍光色素で標識された前記塩基を３'末端から数えて１〜３番目に有する、＜１＞または＜２＞に記載の多型検出用プローブ。
＜４＞  前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、前記蛍光色素で標識された前記塩基を３'末端に有する、＜１＞〜＜３＞のいずれか一つに記載の多型検出用プローブ。
＜５＞  前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するか又は増加する、＜１＞〜＜４＞のいずれか一つに記載の多型検出用プローブ。
＜６＞  前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する、＜１＞〜＜５＞のいずれか一つに記載の多型検出用プローブ。
＜７＞  前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、１５〜３０塩基長であり、前記Ｐ２及びＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、１０〜３０塩基長であり、前記Ｐ３及びＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、１２〜４０塩基長であり、前記Ｐ４及びＰ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、１６〜４０塩基長であり、前記Ｐ５及びＰ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、１０〜４０塩基長である、＜１＞〜＜６＞のいずれか一つに記載の多型検出用プローブ。
＜８＞  前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、１５〜２０塩基長であり、前記Ｐ２及びＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、１０〜２０塩基長であり、前記Ｐ３及びＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、１５〜３０塩基長であり、前記Ｐ４及びＰ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、２０〜３０塩基長であり、前記Ｐ５及びＰ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、２０〜３０塩基長である、＜１＞〜＜７＞のいずれか一つに記載の多型検出用プローブ。
＜９＞  前記多型検出用プローブが、融解曲線分析用のプローブである、＜１＞〜＜８＞のいずれか一つに記載の多型検出用プローブ。
＜１０＞  前記多型検出用プローブが、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３又は配列番号４５で示される塩基配列を有する、＜１＞〜＜９＞のいずれか一つに記載の多型検出用プローブ。
＜１１＞  前記多型検出用プローブが、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号４４又は配列番号１２で示される塩基配列を有する、＜１＞〜＜９＞のいずれか一つに記載の多型検出用プローブ。
＜１２＞  ＜１＞〜＜１１＞のいずれか一つに記載の多型検出用プローブを用いることにより、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出する多型検出方法。
＜１３＞  （Ｉ）前記多型検出用プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記多型検出用プローブ及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッド形成体を得ること、
（ＩＩ）前記ハイブリッド形成体を含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッド形成体を解離させ、前記ハイブリッド形成体の解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること、
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッド形成体の解離温度であるＴｍ値を検出すること、及び、
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型の存在を検出すること、
を含む、＜１２＞に記載の多型検出方法。
＜１４＞  さらに、前記（Ｉ）の前または（Ｉ）と同時に、核酸を増幅することを含む、＜１３＞に記載の多型検出方法。
＜１５＞  ＜１２＞〜＜１４＞のいずれか一つに記載の多型検出方法により、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出すること、及び、検出された多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を評価すること、を含む、薬剤の薬効評価方法。
＜１６＞  ＜１＞〜＜１１＞のいずれか一つに記載の多型検出用プローブを含む、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出するための多型検出用試薬キット。
＜１７＞  さらに、前記多型検出用プローブがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、＜１６＞に記載の多型検出用試薬キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いる多型検出方法を提供できる。また、本発明は、当該多型検出方法を用いた薬効評価方法を提供できる。さらに、本発明は、当該多型検出用プローブを用いた多型検出用試薬キットを提供できる。なお、本発明は、例えば、医療分野に関わらず、生化学等の広い分野におけるＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型検出に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の実施例１にかかる試料の融解曲線である。
【図２】図２は、本発明の実施例１にかかる試料の融解曲線である。
【図３】図３は、本発明の実施例１にかかる試料の融解曲線である。
【図４】図４は、本発明の実施例１にかかる試料の融解曲線である。
【図５】図５は、本発明の実施例１にかかる試料の融解曲線である。
【図６】図６は、本発明の実施例２にかかる試料の融解曲線である。
【図７】図７は、本発明の実施例３にかかる試料の融解曲線である。
【図８】図８は、比較例１にかかる試料の融解曲線である。
【図９】図９は、比較例２にかかる試料の融解曲線である。
【図１０】図１０は、本発明の実施例４にかかる試料の融解曲線である。
【図１１】図１１は、本発明の実施例４にかかる試料の融解曲線である。
【図１２】図１２は、本発明の実施例４にかかる試料の融解曲線である。
【図１３】図１３は、本発明の実施例５にかかる試料の融解曲線である。
【図１４】図１４は、比較例３−１にかかる試料の融解曲線である。
【図１５】図１５は、比較例３−２にかかる試料の融解曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明にかかるＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型検出用プローブ（以下、単に「多型検出用プローブ」ということがある）は、前記Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３、Ｐ３’、Ｐ４、Ｐ４’、Ｐ５及びＰ５’からなる群から選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブである。
【００１６】
本発明にかかるＣＹＰ３Ａ遺伝子多型検出方法は、前記ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブを少なくとも１種用いて、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出することを含む方法である。本発明にかかる薬剤の薬効評価方法は、前記ＣＹＰ３Ａ遺伝子多型検出方法によりＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出すること、及び、検出された多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を評価することを含む方法である。本発明にかかる多型検出用試薬キットは、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブを含むものである。
【００１７】
本発明における「ＣＹＰ３Ａ遺伝子」は、既に公知である。ＣＹＰ３Ａ５遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．ＮＣ０００００７．１３の９９２４５８１３〜９９２７７６２１の配列を意味する。ＣＹＰ３Ａ５遺伝子の部分配列を示す配列番号１は、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰのアクセッションＮｏ．ＮＧ００７９３８の６６８３〜７４８３の配列である。ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．ＮＣ０００００７．１３の９９３５４５８３〜９９３８１８１１の配列を意味する。ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の部分配列を示す配列番号２は、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰのアクセッションＮｏ．ＮＧ００８４２１の１５５１９〜１５９２８の配列であり、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の部分配列を示す配列番号３は、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰのアクセッションＮｏ．ＮＴ００７９３３．１４の２４６１６１７２〜２４６１６８７２の配列である。配列番号１〜３の塩基配列において、ｒは、ａ又はｇ、ｓは、ｃ又はｇ、ｗは、ａ、ｔ又はｕ、ｖは、ｇ、ａ又はｃを示す。
【００１８】
ＣＹＰ３Ａ５遺伝子の野生型では、配列番号１に示される配列のうち４０１番目に対応する塩基（ｒ）は、Ａ（アデニン）であるが、変異型では、前記塩基（ｒ）がＧ（グアニン）に変異している。以下、配列番号１のＣＹＰ３Ａ５遺伝子の前記多型を「ＣＹＰ３Ａ５＊３多型」という。ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の野生型では、配列番号２に示される配列のうち２０１番目に対応する塩基（ｓ）は、Ｃ（シトシン）であるが、変異型では、前記塩基（ｓ）がＧ（グアニン）に変異している。以下、配列番号２のＣＹＰ３Ａ４遺伝子の前記多型を「ＣＹＰ３Ａ４＊１６多型」という。
【００１９】
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の野生型では、配列番号３に示される配列のうち５０１番目に対応する塩基（ｒ）は、Ａ（アデニン）であるが、変異型では、前記塩基（ｒ）がＧ（グアニン）に変異している。以下、配列番号３のＣＹＰ３Ａ４遺伝子の前記多型を「ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ多型」という。
【００２０】
ＣＹＰ３Ａ遺伝子において、前記３ヶ所の多型のうち少なくとも一つが前述のような変異型であれば、例えば、免疫抑制剤タクロリムス等の薬物代謝が低下する可能性があると判断できる。
【００２１】
本発明において、検出対象となる試料中の試料核酸、多型検出用プローブ又はプライマーの個々の配列に関して、これら互いの相補的な関係に基づいて記述された事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、各配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な当該配列について本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列は、当業者にとっての技術常識の範囲内で、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列に、明細書全体を読み替えるものとする。
【００２２】
本発明において、「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が解離する温度（解離温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。即ち、二本鎖核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。本発明におけるＴｍ値は、特に断らない限り、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度をいう。
【００２３】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、例えば、他の工程と明確に区別できない場合であっても、本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。また、本明細書において、「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を、それぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。また、本発明において、組成物中の各成分の量は、前記組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、前記組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。本発明において、オリゴヌクレオチドの配列に関して「３’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端を１番目として数える。
【００２４】
＜ＣＹＰ３Ａ遺伝子多型検出用プローブ＞
本発明にかかるＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型検出用プローブは、前記Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３、Ｐ３’、Ｐ４、Ｐ４’、Ｐ５及びＰ５’からなる群から選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブである。
【００２５】
ＣＹＰ３Ａ５遺伝子の野生型では、配列番号１に示される配列のうち４０１番目に対応する塩基（ｒ）は、Ａ（アデニン）であるが、変異型では、前記塩基（ｒ）がＧ（グアニン）に変異している。以下、配列番号１のＣＹＰ３Ａ５遺伝子の前記多型を「ＣＹＰ３Ａ５＊３多型」という。この多型を検出するプローブを、以下、ＣＹＰ３Ａ５＊３用プローブともいう。
【００２６】
本発明において、前記Ｐ１及びＰ１’からなる群から選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチド（以下、「前記（Ｐ１）又は（Ｐ１’）蛍光標識オリゴヌクレオチド」ともいう。）は、配列番号１に示す塩基配列の４０１番目の塩基における多型を検出できるプローブである。
【００２７】
本発明の前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、具体的には、配列番号１で示される配列のうち４０１番目〜４１１番目の塩基を含む配列である。前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１に示す塩基配列の４０１番目の塩基に対応する塩基（ｒ）が、Ａでもよいし、Ｇでもよい。
（Ｐ１）配列番号１で示される配列のうち４０１番目〜４１１番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の配列であり、配列番号１における４１１番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は、配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号１で示される配列のうち４１１番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド
【００２８】
本発明の前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１における４１１番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列に対して同一性を有すことを要する。具体的には、本発明の前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１における４１１番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列に対して、８０％以上の同一性を示す。また、検出感度の観点より、例えば、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。また、前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号１における４１１番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）であり、且つ、４０１番目の塩基に対応する塩基が、ｒ（ＡまたはＧ）である以外は、配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列に対して同一性を有すことが好ましい。ここで、「配列番号と同一の塩基を有する塩基配列」とは、変更された前記プローブに現れる、前記配列番号の配列における領域を意味する（以下、同様）。
【００２９】
本発明の前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、例えば、配列番号１の４０１番目の塩基に対応する塩基が、変異型のＧである場合、例えば、以下のようなことがいえる。本発明の前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドと、配列番号１における４１１番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列とを比較した際、その同一性が８０％未満である場合には、変異型のＣＹＰ３Ａ５遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が低くなる。
【００３０】
本発明の前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１における４０１番目の塩基の多型を認識する蛍光標識オリゴヌクレオチドでもよい。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、特定の塩基配列を有することに加え、配列番号１における４０１番目の塩基の多型を認識するという機能を有する。このため、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１の４０１番目の塩基に対応する塩基が、変異型Ｇである場合、変異型のＣＹＰ３Ａ５遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が高くなる傾向がある。
【００３１】
本発明における前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１における４１１番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを要する。前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１に示す塩基配列の４０１番目の塩基に対応する塩基（ｒ）が、Ａでもよいし、Ｇでもよい。
（Ｐ１’）配列番号１で示される配列のうち４０１番目〜４１１番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の配列であり、配列番号１における４１１番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は、配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１で示される配列のうち４１１番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド
【００３２】
前記ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）  に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。典型的なストリンジェントな条件は、例えば、カリウム濃度は約２５ｍｍｏｌ／Ｌ〜約５０ｍｍｏｌ／Ｌ、及びマグネシウム濃度は約１．０ｍｍｏｌ／Ｌ〜約５．０ｍｍｏｌ／Ｌ中において、ハイブリダイゼーションを行う条件があげられる。本発明の条件の１例として、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２５ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、及び１．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２中においてハイブリダイゼーションを行う条件が挙げられるが、これに限定されるものではない。その他、ストリンジェントな条件としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。当業者は、ハイブリダイゼーション反応や、ハイブリダイゼーション反応液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択できる。
【００３３】
本発明の前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１における４０１番目の塩基の多型を認識する蛍光標識オリゴヌクレオチドでもよい。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、特定の塩基配列を有することに加え、配列番号１における４０１番目の塩基の多型を認識するという機能を有する。このため、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号１の４０１番目の塩基に対応する塩基が、変異型Ｇである場合、変異型のＣＹＰ３Ａ５遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が高くなる傾向がある。
【００３４】
本発明における前記Ｐ１または前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドには、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドに、塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも包含される。前記塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数は、１塩基又は２塩基以上が挙げられる。前記塩基の数は、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば、１塩基〜１０塩基、又は１塩基〜５塩基が挙げられる。
【００３５】
中でも、本発明における前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドには、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基が置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも包含される。前記塩基が置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、置換の位置は、特に限定されない。例えば、検出感度の観点より、配列番号１で示される配列のうち４０１番目〜４１１番目の塩基以外に位置する塩基が置換されることが挙げられる。置換される塩基の数は、１塩基又は２塩基以上が挙げられる。置換される塩基の数は、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば、１塩基〜５塩基、又は１塩基〜３塩基が挙げられる。
【００３６】
本発明の前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、１１〜５０塩基（ｍｅｒ）であることを要する。前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが、１０塩基以下または５１塩基以上である場合、ＣＹＰ３Ａ遺伝子多型の検出感度が低下する。また、本発明の前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、例えば、１５〜３０塩基、１５〜２１塩基、又は１５〜２０塩基としうる。例えば、前記１５〜３０塩基という範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。また前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、例えば、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドがその相補鎖と形成するハイブリッド形成体の解離温度であるＴｍ値を、所望の値とすることができる。
【００３７】
以下に、本発明における前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基配列の一例を示すが、本発明はこれらに限定されない。
5'-ttgtctttcartatctcttcc-3'    （配列番号３７）
5'-ttgtctttcagtatctcttcc-3'    （配列番号４）（3FL-CYP3A5*3-mt-F1-21）
5'-ttgtctttcaatatctcttcc-3'    （配列番号５）
【００３８】
本発明の前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列のうち４１１番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されていることを要する。
【００３９】
前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいて、この蛍光標識された４１１番目の塩基は、３’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に存在することができ、また、３’末端に存在することができる。これにより、例えば、多型検出感度がより向上し、また、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドを、生産性よく得ることができる。
【００４０】
本発明において、前記Ｐ２、前記Ｐ２’、前記Ｐ３、前記Ｐ３’、前記Ｐ４及び前記Ｐ４’からなる群より選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチド（以下、「前記（Ｐ２）、（Ｐ２’）、（Ｐ３）、（Ｐ３’）、（Ｐ４）又は（Ｐ４’）蛍光標識オリゴヌクレオチド」ともいう。）は、配列番号２に示す塩基配列の２０１番目の塩基における多型を検出できるプローブである。
【００４１】
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の野生型では、配列番号２に示される配列のうち２０１番目に対応する塩基（ｓ）は、Ｃ（シトシン）であるが、変異型では、前記塩基（ｓ）がＧ（グアニン）に変異している。以下、配列番号２のＣＹＰ３Ａ４遺伝子の前記多型を「ＣＹＰ３Ａ４＊１６多型」という。この多型を検出するプローブを、以下、ＣＹＰ３Ａ４＊１６用プローブともいう。
【００４２】
本発明の前記Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、具体的には、配列番号２で示される配列のうち２０１番目〜２０５番目の塩基を含む配列である。前記Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２に示す塩基配列の２０１番目の塩基に対応する塩基（ｓ）が、Ｃでもよいし、Ｇでもよい。
（Ｐ２）配列番号２で示される配列のうち２０１番目〜２０５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の配列であり、配列番号２における２０５番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号２で示される配列のうち２０５番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド
【００４３】
本発明の前記Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号２における２０５番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列に対して同一性を有すことを要する。具体的には、本発明の前記Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号２における２０５番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列に対して、８０％以上の同一性を示す。また、検出感度の観点より、例えば、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。また、前記Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号２における２０５番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）であり、且つ、２０１番目の塩基に対応する塩基が、ｓ（ＣまたはＧ）である以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列に対して同一性を有すことが好ましい。
【００４４】
本発明の前記Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、例えば、配列番号２の２０１番目の塩基に対応する塩基が、変異型のＧである場合、例えば、以下のようなことがいえる。本発明の前記Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドと、配列番号２における２０５番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列とを比較した際、その同一性が８０％未満である場合には、変異型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が低くなる。
【００４５】
本発明の前記Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２における２０１番目の塩基の多型を認識する蛍光標識オリゴヌクレオチドでもよい。当該蛍光標識オリゴヌクレオチドは、特定の塩基配列を有することに加え、配列番号２における２０１番目の塩基の多型を認識するという機能を有する。このため、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２の２０１番目の塩基に対応する塩基が、変異型Ｇである場合、変異型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が高くなる傾向がある。
【００４６】
本発明における前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号２における２０５番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを要する。前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２に示す塩基配列の２０１番目の塩基に対応する塩基（ｓ）が、Ｃでもよいし、Ｇでもよい。前記ハイブリダイゼーションならびにストリンジェントな条件は、前述の通りである。
（Ｐ２’）配列番号２で示される配列のうち２０１番目〜２０５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の配列であり、配列番号２における２０５番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号２で示される配列のうち２０５番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド
【００４７】
本発明の前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２における２０１番目の塩基の多型を認識する蛍光標識オリゴヌクレオチドでもよい。当該蛍光標識オリゴヌクレオチドは、特定の塩基配列を有することに加え、配列番号２における２０１番目の塩基の多型を認識するという機能を有する。このため、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２の２０１番目の塩基に対応する塩基が、変異型Ｇである場合、変異型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が高くなる傾向がある。
【００４８】
本発明における前記Ｐ２または前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドには、前記Ｐ２又は前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドに、塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも包含される。前記塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ２又は前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数は、１塩基又は２塩基以上が挙げられる。前記塩基の数は、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば、１塩基〜１０塩基、又は１塩基〜５塩基が挙げられる。
【００４９】
中でも、本発明における前記Ｐ２又は前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドには、前記Ｐ２又は前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基が置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも包含される。前記塩基が置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ２又は前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、置換の位置は、特に限定されない。例えば、検出感度の観点より、配列番号２で示される配列のうち２０１番目〜２０５番目の塩基以外に位置する塩基が置換されることが挙げられる。置換される塩基の数は、１塩基又は２塩基以上が挙げられる。置換される塩基の数は、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば、１塩基〜５塩基、又は１塩基〜３塩基が挙げられる。
【００５０】
本発明の前記Ｐ２又は前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、５〜５０塩基（ｍｅｒ）であることを要する。前記Ｐ２又は前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが、４塩基以下または５１塩基以上である場合、ＣＹＰ３Ａ遺伝子多型の検出感度が低下する。また、本発明の前記Ｐ２又は前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、例えば、１０〜３０塩基、又は１０〜２０塩基としうる。例えば、前記１０〜３０塩基という範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。また前記Ｐ２又は前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、例えば、前記Ｐ２又は前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドがその相補鎖と形成するハイブリッド形成体の解離温度であるＴｍ値を、所望の値とすることができる。
【００５１】
以下に、本発明における前記Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基配列の一例を示すが、本発明はこれらに限定されない。
5'-gatgtgatcastagc-3'    （配列番号３８）
5'-gatgtgatcagtagc-3'    （配列番号６）（3T-CYP3A4*16-MF1）
5'-gatgtgatcactagc-3'    （配列番号７）
【００５２】
本発明の前記Ｐ２又は前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号２の配列のうち２０５番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されていることを要する。
【００５３】
前記Ｐ２又は前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいて、この蛍光標識された２０５番目の塩基は、３’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に存在することができ、また、３’末端に存在することができる。これにより、例えば、多型検出感度がより向上し、また、前記Ｐ２又は前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドを、生産性よく得ることができる。
【００５４】
本発明において、前記Ｐ３及びＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２に示す塩基配列の２０１番目の塩基に相補的な塩基（ｓ）が、Ｇでもよいし、Ｃでもよい。
【００５５】
本発明の前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、具体的には、配列番号２で示される配列のうち１９０番目〜２０１番目の塩基を含む配列に相補的な配列である。前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２に示す塩基配列の２０１番目の塩基に相補的な塩基（ｓ）が、Ｃでもよいし、Ｇでもよい。
（Ｐ３）配列番号２で示される配列のうち１９０番目〜２０１番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号２における１９０番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号２の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号２で示される配列のうち１９０番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド
【００５６】
本発明の前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号２における１９０番目の塩基に相補的な塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号２の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して同一性を有すことを要する。具体的には、本発明の前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号２における１９０番目の塩基に相補的な塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号２の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して、８０％以上の同一性を示す。また、検出感度の観点より、例えば、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。また、前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号２における１９０番目の塩基に相補的な塩基がＣ（シトシン）であり、且つ、２０１番目の塩基に相補的な塩基が、ｓ（ＣまたはＧ）である以外は、配列番号２の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して、同一性を有すことが好ましい。
【００５７】
本発明の前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、例えば、配列番号２の２０１番目の塩基に相補的な塩基が、変異型のＣである場合、例えば、以下のようなことがいえる。本発明の前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドと、配列番号２における１９０番目の塩基に相補的な塩基がＣ（シトシン）である以外は配列番号２の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列とを比較した際、その同一性が８０％未満である場合には、変異型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が低くなる。
【００５８】
本発明にかかる前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２における２０１番目の塩基の多型を認識する蛍光標識オリゴヌクレオチドでもよい。当該蛍光標識オリゴヌクレオチドは、特定の塩基配列を有することに加え、配列番号２における２０１番目の塩基の多型を認識するという機能を有する。このため、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２の２０１番目の塩基に相補的な塩基が、変異型Ｃである場合、変異型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が高くなる傾向がある。
【００５９】
本発明における前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号２における１９０番目の塩基に相補的な塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを要する。前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２に示す塩基配列の２０１番目の塩基に相補的な塩基（ｓ）が、Ｃでもよいし、Ｇでもよい。前記ハイブリダイゼーションならびにストリンジェントな条件は、前述の通りである。
（Ｐ３’）配列番号２で示される配列のうち１９０番目〜２０１番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号２における１９０番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号２で示される配列のうち１９０番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド
【００６０】
本発明の前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２における２０１番目の塩基の多型を認識する蛍光標識オリゴヌクレオチドでもよい。当該蛍光標識オリゴヌクレオチドは、特定の塩基配列を有することに加え、配列番号２における２０１番目の塩基の多型を認識するという機能を有する。このため、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２の２０１番目の塩基に相補的な塩基が、変異型Ｃである場合、変異型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が高くなる傾向がある。
【００６１】
本発明における前記Ｐ３または前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドには、前記Ｐ３又は前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドに、塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも包含される。前記塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ３又は前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数は、１塩基又は２塩基以上が挙げられる。前記塩基の数は、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば、１塩基〜１０塩基、又は１塩基〜５塩基が挙げられる。
【００６２】
中でも、本発明における前記Ｐ３又は前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドには、前記Ｐ３又は前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基が置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも包含される。前記塩基が置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ３又は前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、置換の位置は、特に限定されない。例えば、検出感度の観点より、配列番号３で示される配列のうち１９０番目〜２０１番目の塩基以外に位置する塩基に相補的な塩基が置換されることが挙げられる。置換される塩基の数は、１塩基又は２塩基以上が挙げられる。置換される塩基の数は、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば、１塩基〜５塩基、又は１塩基〜３塩基が挙げられる。
【００６３】
本発明の前記Ｐ３又は前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、１２〜５０塩基（ｍｅｒ）であることを要する。前記Ｐ３又は前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが、１１塩基以下または５１塩基以上である場合、ＣＹＰ３Ａ遺伝子多型の検出感度が低下する。また、本発明の前記Ｐ３又は前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、例えば、１２〜４０塩基、又は１５〜３０塩基としうる。例えば、前記１２〜４０塩基という範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。また前記Ｐ３又は前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、例えば、前記Ｐ３又は前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドがその相補鎖と形成するハイブリッド形成体の解離温度であるＴｍ値を、所望の値とすることができる。
【００６４】
以下に、本発明における前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基配列の一例を示すが、本発明はこれらに限定されない。
5'-tgtgctastgatcacatcc-3'    （配列番号３９）
5'-tgtgctactgatcacatcc-3'    （配列番号８）（3T-CYP3A4*16-MR1）
5'-tgtgctagtgatcacatcc-3'    （配列番号４０）
【００６５】
本発明の前記Ｐ３又は前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号２の配列のうち１９０番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されていることを要する。
【００６６】
前記Ｐ３又は前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいて、この蛍光標識された１９０番目の塩基に相補的な塩基は、３’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に存在することができ、また、３’末端に存在することができる。これにより、例えば、多型検出感度がより向上し、また、前記Ｐ３又は前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドを、生産性よく得ることができる。
【００６７】
本発明において、前記Ｐ４及びＰ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２に示す塩基配列の２０１番目の塩基に相補的な塩基（ｓ）が、Ｇでもよいし、Ｃでもよい。
【００６８】
本発明の前記Ｐ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、具体的には、配列番号２で示される配列のうち１８６番目〜２０１番目の塩基を含む配列に相補的な配列である。前記Ｐ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２に示す塩基配列の２０１番目の塩基に相補的な塩基（ｓ）が、Ｃでもよいし、Ｇでもよい。
（Ｐ４）配列番号２で示される配列のうち１８６番目〜２０１番目の塩基を含む塩基長１６〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号２における１８６番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号２の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号２で示される配列のうち１８６番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド
【００６９】
本発明の前記Ｐ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号２における１８６番目の塩基に相補的な塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号２の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して同一性を有すことを要する。具体的には、本発明の前記Ｐ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号２における１８６番目の塩基に相補的な塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号２の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して、８０％以上の同一性を示す。また、検出感度の観点より、例えば、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。また、前記Ｐ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号２における１８６番目の塩基に相補的な塩基がＣ（シトシン）であり、且つ、２０１番目の塩基に相補的な塩基が、ｓ（ＣまたはＧ）である以外は、配列番号２の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して同一性を有すことが好ましい。
【００７０】
本発明の前記Ｐ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、例えば、配列番号２の２０１番目の塩基に相補的な塩基が、変異型のＣである場合、例えば、以下のようなことがいえる。本発明の前記Ｐ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドと、配列番号４における１８６番目の塩基に相補的な塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号２の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列とを比較した際、その同一性が８０％未満である場合には、変異型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が低くなる。
【００７１】
本発明の前記Ｐ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２における２０１番目の塩基の多型を認識する蛍光標識オリゴヌクレオチドでもよい。当該蛍光標識オリゴヌクレオチドは、特定の塩基配列を有することに加え、配列番号２における２０１番目の塩基の多型を認識するという機能を有する。このため、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２の２０１番目の塩基に相補的な塩基が、変異型Ｃである場合、変異型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が高くなる傾向がある。
【００７２】
本発明における前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号２における１８６番目の塩基に相補的な塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを要する。前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２に示す塩基配列の２０１番目の塩基に相補的な塩基（ｓ）が、Ｃでもよいし、Ｇでもよい。前記ハイブリダイゼーションならびにストリンジェントな条件は、前述の通りである。
（Ｐ４’）配列番号２で示される配列のうち１８６番目〜２０１番目の塩基を含む塩基長１６〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号２における１８６番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号２と同一の塩基を有する塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号２で示される配列のうち１８６番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド
【００７３】
本発明の前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２における２０１番目の塩基の多型を認識する蛍光標識オリゴヌクレオチドでもよい。当該蛍光標識オリゴヌクレオチドは、特定の塩基配列を有することに加え、配列番号２における２０１番目の塩基の多型を認識するという機能を有する。このため、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２の２０１番目の塩基に相補的な塩基が、変異型Ｃである場合、変異型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が高くなる傾向がある。
【００７４】
本発明における前記Ｐ４または前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドには、前記Ｐ４又は前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドに、塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも包含される。前記塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ４又は前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数は、１塩基又は２塩基以上が挙げられる。前記塩基の数は、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば、１塩基〜１０塩基、又は１塩基〜５塩基が挙げられる。
【００７５】
中でも、本発明における前記Ｐ４又は前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドには、前記Ｐ４又は前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基が置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも包含される。前記塩基が置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ４又は前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、置換の位置は、特に限定されない。例えば、検出感度の観点より、配列番号２で示される配列のうち１８６番目〜２０１番目の塩基以外に位置する塩基に相補的な塩基が置換されることが挙げられる。置換される塩基の数は、１塩基又は２塩基以上が挙げられる。置換される塩基の数は、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば、１塩基〜５塩基、又は１塩基〜３塩基が挙げられる。
【００７６】
本発明の前記Ｐ４又は前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、１６〜５０塩基（ｍｅｒ）であることを要する。前記Ｐ４又は前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが、１５塩基以下または５１塩基以上である場合、ＣＹＰ３Ａ遺伝子多型の検出感度が低下する。また、本発明の前記Ｐ４又は前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、例えば、１６〜４０塩基、又は２０〜３０塩基としうる。例えば、前記１６〜４０塩基という範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。また前記Ｐ４又は前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、例えば、前記Ｐ４又は前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドがその相補鎖と形成するハイブリッド形成体の解離温度であるＴｍ値を、所望の値とすることができる。
【００７７】
以下に、本発明における前記Ｐ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基配列の一例を示すが、本発明はこれらに限定されない。
5'-atgatgtgctastgatcacatccatgc-3'    （配列番号４１）
5'-atgatgtgctactgatcacatccatgc-3'    （配列番号１０）（U0-3TMR4）
5'-atgatgtgctagtgatcacatccatgc-3'    （配列番号４２）
5'-gatgtgctastgatcacatccatgc-3'    （配列番号４３）
5'-gatgtgctactgatcacatccatgc-3'    （配列番号４４）
5'-gatgtgctagtgatcacatccatgc-3'    （配列番号１１）
【００７８】
本発明の前記Ｐ４又は前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号２の配列のうち１８６番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されていることを要する。
【００７９】
前記Ｐ４又は前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいて、この蛍光標識された１８６番目の塩基に相補的な塩基は、３’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に存在することができ、また、３’末端に存在することができる。これにより、例えば、多型検出感度がより向上し、また、前記Ｐ４又は前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドを、生産性よく得ることができる。
【００８０】
本発明において、前記Ｐ５及びＰ５’からなる群より選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチド（以下、「前記（Ｐ５）又は（Ｐ５’）蛍光標識オリゴヌクレオチド」ともいう。）は、配列番号３に示す塩基配列の５０１番目の塩基における多型を検出できるプローブである。
（Ｐ５）配列番号３で示される配列のうち４９６番目〜５０１番目の塩基を含む塩基長６〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号３における４９６番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号３の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号３で示される配列のうち４９６番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド
（Ｐ５’）配列番号３で示される配列のうち４９６番目〜５０１番目の塩基を含む塩基長６〜５０の配列に相補的な配列であり、配列番号３における４９６番目の塩基に相補的な塩基がシトシンである以外は、配列番号３と同一の塩基を有する塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号３で示される配列のうち４９６番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド
【００８１】
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の野生型では、配列番号３に示される配列のうち５０１番目に対応する塩基（ｒ）は、Ａ（アデニン）であるが、変異型では、前記塩基（ｒ）がＧ（グアニン）に変異している。以下、配列番号３のＣＹＰ３Ａ４遺伝子の前記多型を「ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ多型」という。この多型を検出するプローブを、以下、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ用プローブともいう。
【００８２】
本発明において、前記Ｐ５及びＰ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号３に示す塩基配列の５０１番目の塩基に相補的な塩基（ｙ）が、Ｃでもよいし、Ｔでもよい。
【００８３】
本発明の前記Ｐ５の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、具体的には、配列番号３で示される配列のうち４９６番目〜５０１番目の塩基を含む配列に相補的な配列である。前記Ｐ５の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号３に示す塩基配列の５０１番目の塩基に相補的な塩基（ｙ）が、Ｃでもよいし、Ｔでもよい。
【００８４】
本発明の前記Ｐ５の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号３における４９６番目の塩基に相補的な塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号３の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して同一性を有すことを要する。具体的には、本発明の前記Ｐ５の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号３における４９６番目の塩基に相補的な塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号３の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して、８０％以上の同一性を示す。また、検出感度の観点より、例えば、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。また、前記Ｐ５の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号３における４９６番目の塩基に相補的な塩基がＣ（シトシン）であり、且つ、５０１番目の塩基に相補的な塩基が、ｙ（ＣまたはＴ）である以外は、配列番号３の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列に対して同一性を有すことが好ましい。
【００８５】
本発明の前記Ｐ５の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、例えば、配列番号３の５０１番目の塩基に相補的な塩基が、変異型のＣである場合、例えば、以下のようなことがいえる。本発明の前記Ｐ５の蛍光標識オリゴヌクレオチドと、配列番号５における４９６番目の塩基に相補的な塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号５の相補鎖と同一の塩基を有する塩基配列とを比較した際、その同一性が８０％未満である場合には、変異型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が低くなる。
【００８６】
本発明の前記Ｐ５の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３における５０１番目の塩基の多型を認識する蛍光標識オリゴヌクレオチドでもよい。当該蛍光標識オリゴヌクレオチドは、特定の塩基配列を有することに加え、配列番号３における５０１番目の塩基の多型を認識するという機能を有する。このため、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号３の５０１番目の塩基に相補的な塩基が、変異型Ｃである場合、変異型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が高くなる傾向がある。
【００８７】
本発明における前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号３における４９６番目の塩基に相補的な塩基がＣ（シトシン）である以外は、配列番号３と同一の塩基を有する塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを要する。前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号３に示す塩基配列の５０１番目の塩基に相補的な塩基（ｙ）が、Ｃでもよいし、Ｔでもよい。前記ハイブリダイゼーションならびにストリンジェントな条件は、前述の通りである。
【００８８】
本発明の前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３における５０１番目の塩基の多型を認識する蛍光標識オリゴヌクレオチドでもよい。当該蛍光標識オリゴヌクレオチドは、特定の塩基配列を有することに加え、配列番号３における５０１番目の塩基の多型を認識するという機能を有する。このため、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、例えば、配列番号３の５０１番目の塩基に相補的な塩基が、変異型Ｃである場合、変異型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が高くなる傾向がある。
【００８９】
本発明における前記Ｐ５または前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドには、前記Ｐ５又は前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドに、塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも包含される。前記塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ５又は前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数は、１塩基又は２塩基以上が挙げられる。前記塩基の数は、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば、１塩基〜１０塩基、又は１塩基〜５塩基が挙げられる。
【００９０】
中でも、本発明における前記Ｐ５又は前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドには、前記Ｐ５又は前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基が置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも包含される。前記塩基が置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ５又は前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、置換の位置は、特に限定されない。例えば、検出感度の観点より、配列番号３で示される配列のうち４９６番目〜５０１番目の塩基以外に位置する塩基に相補的な塩基が置換されることが挙げられる。置換される塩基の数は、１塩基又は２塩基以上が挙げられる。置換される塩基の数は、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば、１塩基〜５塩基、又は１塩基〜３塩基が挙げられる。
【００９１】
本発明の前記Ｐ５又は前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、６〜５０塩基（ｍｅｒ）であることを要する。前記Ｐ５又は前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが、５塩基以下または５１塩基以上である場合、ＣＹＰ３Ａ遺伝子多型の検出感度が低下する。また、本発明の前記Ｐ５又は前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、例えば、１０〜４０塩基、又は２０〜３０塩基としうる。例えば、前記１０〜４０塩基という範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。また前記Ｐ５又は前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、例えば、前記Ｐ５又は前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドがその相補鎖と形成するハイブリッド形成体の解離温度であるＴｍ値を、所望の値とすることができる。
【００９２】
以下に、本発明における前記Ｐ５の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基配列の一例を示すが、本発明はこれらに限定されない。
5'-taaatcgccgctctcytgccc-3'    （配列番号４５）
5'-taaatcgccgctctcctgccc-3'    （配列番号１２）（3PB-CYP3A4*1B-R3）
5'-taaatcgccgctctcttgccc-3'    （配列番号１３）
【００９３】
本発明の前記Ｐ５又は前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号３の配列のうち４９６番目の塩基に相補的な塩基が蛍光色素で標識されていることを要する。
【００９４】
前記Ｐ５又は前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいて、この蛍光標識された４９６番目の塩基に相補的な塩基は、３’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に存在することができ、また、３’末端に存在することができる。これにより、例えば、多型検出感度がより向上し、また、Ｐ５又は前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドを、生産性よく得ることができる。
【００９５】
前記Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３、Ｐ３’、Ｐ４、Ｐ４’、Ｐ５及びＰ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドについて、ハイブリッド形成体のＴｍ値は、例えば、Ｍｅｌｔｃａｌｃ  ９９  ｆｒｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）を用いて算出できる。設定条件は、特に制限されず、例えば、Ｏｌｉｇｏｃｏｎｃ［μＭ］０．２、Ｎａ  ｅｑ．［ｍＭ］５０の条件があげられる。前記ハイブリッド形成体は、検出部位に対応する塩基が変異型である前記蛍光標識オリゴヌクレオチド（変異型蛍光標識オリゴヌクレオチド）と、検出部位が変異型である相補的配列又は検出部位が野生型である相補的配列とのハイブリッド形成体、検出部位に対応する塩基が野生型である前記蛍光標識オリゴヌクレオチド（野生型蛍光標識オリゴヌクレオチド）と、検出部位が変異型である相補的配列又検出部位が野生型である相補的配列とのハイブリッド形成体があげられる。前記変異型蛍光標識オリゴヌクレオチドと変異型相補配列とのＴｍ値は、前記変異型蛍光標識オリゴヌクレオチドと野生型相補配列とのＴｍ値との差が、例えば、３℃以上、４℃以上、５℃以上、３０℃以下である。また、前記野生型蛍光標識オリゴヌクレオチドと野生型相補配列とのＴｍ値は、前記野生型蛍光標識オリゴヌクレオチドと変異型相補配列とのＴｍ値との差が、例えば、３℃以上、４℃以上、５℃以上、又は７℃以上等、例えば、３０℃以下等である。
【００９６】
本発明の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、相補鎖にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、相補鎖にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）するかまたは増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドとすることができる。その中でも、相補鎖にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、相補鎖にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する蛍光標識オリゴヌクレオチドとすることができる。
【００９７】
このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般的に、グアニン消光プローブと呼ばれており、いわゆるＱ  Ｐｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。中でも、３’末端もしくは５’末端がシトシン（Ｃ）となるように設計され、その末端のＣがグアニン（Ｇ）に近づくと、発光が弱くなるように蛍光色素で標識化されたオリゴヌクレオチドであることが、特に好ましい。このようなプローブを使用すれば、例えば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認できる。
【００９８】
Ｑ  Ｐｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、Ｔａｑ−ｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ法、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ法又はＭＧＢ  Ｐｒｏｂｅ法などを挙げることができる。
【００９９】
前記蛍光色素としては、特に制限されず、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられる。前記蛍光色素の市販品は、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ、ＦＡＭ、Ｃｙ３及びＣｙ５、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドの検出条件は、特に制限されず、使用する前記蛍光色素により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅは、検出波長４４５ｎｍ〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬは、検出波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍで検出できる。このような蛍光色素を有するプローブを使用すれば、それぞれの蛍光シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認できる。前記蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合は、通常の方法、例えば、特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って行うことができる。
【０１００】
また、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、３'末端にリン酸基が付加されてもよい。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドの３'末端にリン酸基を付加させておくことで、プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを十分に抑制できるためである。後述するように、変異の有無を検出するＤＮＡ（標的ＤＮＡ）は、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって調製できる。その際、３'末端にリン酸基が付加された蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いることで、これを増幅反応の反応液中に共存させることができる。また、前記プローブの３'末端に、例えば、前述のような標識化物質（蛍光色素）を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【０１０１】
前記各蛍光標識オリゴヌクレオチドは、ＣＹＰ３Ａ遺伝子における多型、特に、ＣＹＰ３Ａ５＊３、ＣＹＰ３Ａ４＊１６及び／またはＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂを検出する、ＣＹＰ３Ａ遺伝子多型検出用プローブとして使用することができる。また、前記ＣＹＰ３Ａ遺伝子多型検出用プローブは、後述する融解曲線分析用のプローブとして使用することができる。
【０１０２】
なお、本発明にかかる前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、前述のような条件に基づいて蛍光色素で標識された塩基を用いる以外は、オリゴヌクレオチドの合成方法として知られている公知の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って作製することができる。
【０１０３】
＜プライマー＞
後述するＣＹＰ３Ａ遺伝子多型検出方法では、例えば、検出対象となるＣＹＰ３Ａ遺伝子多型を含む配列を、ＰＣＲ法等の増幅法により増幅する場合、プライマーが用いられる。本発明において使用しうるプライマーは、特に制限されず、目的とする検出対象となるＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型の部位を含む核酸を増幅可能であればよい。前記核酸は、例えば、配列番号１の４０１番目の塩基に対応する塩基を含む核酸、配列番号２の２０１番目の塩基に対応する塩基を含む核酸、配列番号３の５０１番目の塩基に対応する塩基を含む核酸等があげられる。
【０１０４】
増幅法に適用するプライマーは、本発明の多型検出用プローブがハイブリダイゼーションできる領域が増幅できるものであれば、特に制限されず、配列番号１、配列番号２及び配列番号３で示される塩基配列から、当業者であれば適宜設計できる。前記プライマーの長さ及びＴｍ値は、例えば、１２〜４０塩基（ｍｅｒ）及び４０〜７０塩基、又は、１６〜３０塩基及び５５〜６０塩基にすることができる。また、プライマーセットの各プライマーの長さは、例えば、同一でなくてもよいが、両プライマーのＴｍ値は、ほぼ同一、又は、両プライマーのＴｍ値の差が５℃以内であることが好ましい。
【０１０５】
以下に、本発明の多型検出方法において、本発明の多型検出用プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列の増幅に使用できるプライマーの例を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
【０１０６】
前記配列番号１で示される配列のうち４０１番目の塩基（ｒ）における多型を検出するためのプライマーは、下記Ｐ６、Ｐ６’、Ｐ７及びＰ７’からなる群より選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドが好ましい。前記ハイブリダイゼーションならびにストリンジェントな条件は、前述の通りである。
（Ｐ６）配列番号１で示される塩基配列のうち３２２番目〜３４４番目の塩基を含む塩基長２３〜５０の塩基配列に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ６’）配列番号１に示す塩基配列において３２２番目〜３４４番目の塩基を含む塩基長２３〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（Ｐ７)配列番号１で示される塩基配列のうち４４６番目〜４６３番目の塩基を含む塩基長１８〜５０塩基の塩基配列の相補鎖に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ７’)配列番号１に示す塩基配列において４４６番目〜４６３番目の塩基を含む塩基長１８〜５０の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
【０１０７】
前記Ｐ６のオリゴヌクレオチドは、配列番号１で示される塩基配列のうち３２２番目〜３４４番目の塩基を含む塩基長２３〜５０の塩基配列に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号１における４０１番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドであってもよい。前記Ｐ６’のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において３２２番目〜３４４番目の塩基を含む塩基長２３〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号１における４０１番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０１０８】
前記Ｐ７のオリゴヌクレオチドは、配列番号１で示される塩基配列のうち４４６番目〜４６３番目の塩基を含む塩基長１８〜５０塩基の塩基配列の相補鎖に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号１における４０１番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドであってもよい。前記Ｐ７’のオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において４４６番目〜４６３番目の塩基を含む塩基長１８〜５０の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号１における４０１番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドでもよい。
【０１０９】
以下に、本発明の多型検出方法において、前記配列番号１における４０１番目の塩基（ｒ）を含む領域の増幅に使用できるプライマーの一例を示す。
Ｐ６  Ｆプライマー  （配列番号１４）（CYP3A5*3 F4）
5'-cgtatgtaccacccagcttaacg-3'
Ｐ７  Ｒプライマー  （配列番号１５）（CYP3A5*3 R4）
5'-cacaggagccacccaagg-3'
【０１１０】
また、前記配列番号１における４０１番目の塩基（ｒ）の多型を検出するためには、前記Ｐ６又はＰ６’で表わされるオリゴヌクレオチド、及びＰ７又はＰ７’で表されるオリゴヌクレオチドを、一対のプライマーセットとして用いることがより好ましい。
【０１１１】
前記配列番号２で示される配列のうち２０１番目の塩基（ｓ）における多型を検出するためのプライマーは、下記Ｐ８、Ｐ８’、Ｐ９、Ｐ９’、Ｐ１０及びＰ１０’からなる群より選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドが好ましい。前記ハイブリダイゼーションならびにストリンジェントな条件は、前述の通りである。
（Ｐ８）配列番号２で示される塩基配列のうち１１８番目〜１３７番目の塩基を含む塩基長２０〜５０の塩基配列に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ８’）配列番号２で示される塩基配列のうち１１８番目〜１３７番目の塩基を含む塩基長２０〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（Ｐ９）配列番号２で示される塩基配列のうち２２番目〜４９番目の塩基を含む塩基長２８〜５０の塩基配列に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ９’) 配列番号２で示される塩基配列のうち２２番目〜４９番目の塩基を含む塩基長２８〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（Ｐ１０)配列番号２で示される塩基配列のうち２９２番目〜３１２番目の塩基を含む塩基長２１〜５０塩基の塩基配列の相補鎖に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ１０’)配列番号２に示す塩基配列において２９２番目〜３１２番目の塩基を含む塩基長２１〜５０の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
【０１１２】
前記Ｐ８のオリゴヌクレオチドは、配列番号２で示される塩基配列のうち１１８番目〜１３７番目の塩基を含む塩基長２０〜５０の塩基配列に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号２における２０１番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドであってもよい。前記Ｐ８’のオリゴヌクレオチドは、配列番号２で示される塩基配列のうち１１８番目〜１３７番目の塩基を含む塩基長２０〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号２における２０１番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０１１３】
前記Ｐ９のオリゴヌクレオチドは、配列番号２で示される塩基配列のうち２２番目〜４９番目の塩基を含む塩基長２８〜５０の塩基配列に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号２における２０１番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドであってもよい。前記Ｐ９’のオリゴヌクレオチドは、配列番号２で示される塩基配列のうち２２番目〜４９番目の塩基を含む塩基長２８〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号２における２０１番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０１１４】
前記Ｐ１０のオリゴヌクレオチドは、配列番号２で示される塩基配列のうち２９２番目〜３１２番目の塩基を含む塩基長２１〜５０塩基の塩基配列の相補鎖に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号２における２０１番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドであってもよい。前記Ｐ１０’のオリゴヌクレオチドは、配列番号２に示す塩基配列において２９２番目〜３１２番目の塩基を含む塩基長２１〜５０の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号２における２０１番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０１１５】
以下に、本発明の多型検出方法において、前記配列番号２における２０１番目の塩基（ｓ）を含む領域の増幅に使用できるプライマーの一例を示す。
Ｐ８  Ｆプライマー  （配列番号１６）
5'-aggatggtaaaaaggtgctg-3'
Ｐ１０  Ｒプライマー  （配列番号１７）
5'-gagagaaagaatggatccaaa-3'
【０１１６】
前記プライマーは、例えば、後述するように付加配列を有してもよく、以下のプライマーが例示できる。下記配列において、下線部のCTAGA及びGACGAが、前記付加配列に該当する。
Ｐ９  Ｆプライマー  （配列番号１８）（CYP3A4*16-F6+CTAGA）
5'-CTAGAggagtgtgatagaaggtgatctagtaga-3'
Ｐ１０  Ｒプライマー  （配列番号２８）（U0-R3+GACGA）
5'-GACGAgagagaaagaatggatccaaa-3'
【０１１７】
また、前記配列番号２における２０１番目の塩基（ｓ）の多型を検出するためには、前記Ｐ８、Ｐ８’、Ｐ９又はＰ９’で表わされるオリゴヌクレオチド、及びＰ１０又はＰ１０’で表されるオリゴヌクレオチドを、一対のプライマーセットとして用いることがより好ましい。
【０１１８】
前記配列番号３で示される配列のうち５０１番目の塩基（ｒ）における多型を検出するためのプライマーは、下記Ｐ１１、Ｐ１１’、Ｐ１２及びＰ１２’からなる群より選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドが好ましい。前記ハイブリダイゼーションならびにストリンジェントな条件は、前述の通りである。
（Ｐ１１）配列番号３で示される塩基配列のうち４３２番目〜４５７番目の塩基を含む塩基長２６〜５０の塩基配列に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ１１’）配列番号３に示す塩基配列において４３２番目〜４５７番目の塩基を含む塩基長２６〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
（Ｐ１２)配列番号３で示される塩基配列のうち５０８番目〜５３９番目の塩基を含む塩基長３２〜５０塩基の塩基配列の相補鎖に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド
（Ｐ１２’)配列番号３に示す塩基配列において５０８番目〜５３９番目の塩基を含む塩基長３２〜５０の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
【０１１９】
前記Ｐ１１のオリゴヌクレオチドは、配列番号３で示される塩基配列のうち４３２番目〜４５７番目の塩基を含む塩基長２６〜５０の塩基配列に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号３における５０１番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドであってもよい。前記Ｐ１１’のオリゴヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列において４３２番目〜４５７番目の塩基を含む塩基長２６〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号３における５０１番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドでもよい。
【０１２０】
前記Ｐ１２のオリゴヌクレオチドは、配列番号３で示される塩基配列のうち５０８番目〜５３９番目の塩基を含む塩基長３２〜５０塩基の塩基配列の相補鎖に対して、少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号３における５０１番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドであってもよい。前記Ｐ１２’のオリゴヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列において５０８番目〜５３９番目の塩基を含む塩基長３２〜５０の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号３における５０１番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドでもよい。
【０１２１】
以下に、本発明の多型検出方法において、前記配列番号３における５０１番目の塩基（ｒ）を含む領域の増幅に使用できるプライマーの一例を示す。
Ｐ１１  Ｆプライマー  （配列番号２６）（CYP3A4-1B-F1）
5'-ctgtaggtgtggcttgttgggatgaa-3'
Ｐ１２  Ｒプライマー  （配列番号２７）（CYP3A4-1B-R1）
5'-ggagccattggcataaaatctattaaatcgc-3'
【０１２２】
また、前記配列番号３における５０１番目の塩基（ｒ）の多型を検出するためには、前記Ｐ１１又はＰ１１’で表わされるオリゴヌクレオチド、及びＰ１２又はＰ１２’で表されるオリゴヌクレオチドを、一対のプライマーセットとして用いることがより好ましい。
【０１２３】
前記Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１及びＰ１２において、前記同一性は、例えば、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。
【０１２４】
本発明におけるプライマーは、前記オリゴヌクレオチドを含むプライマーでもよいし、前記オリゴヌクレオチドからなるプライマーでもよい。前者の場合、本発明のプライマーは、例えば、前記オリゴヌクレオチドの３’末端及び５’末端の少なくとも一方に、付加配列を有してもよい。前記付加配列は、特に制限されず、その長さが、例えば、１〜２０塩基長、３〜１５塩基長、５〜１０塩基長等であり、そのＧＣ含量が、例えば、２０〜８０％程度、４０〜７０％程度、４０〜６０％程度である。
【０１２５】
本発明の多型の検出方法は、前記蛍光標識ヌクレオチドをプローブとして利用する方法であれば、特に制限されない。前記蛍光標識ヌクレオチドをプローブとして用いる多型検出方法の一例として、Ｔｍ解析を利用した多型検出方法について、以下に説明する。
【０１２６】
＜多型検出方法＞
本発明にかかるＣＹＰ３Ａ遺伝子多型検出方法は、前記ＣＹＰ３Ａ遺伝子多型検出用プローブを少なくとも１種用いて、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出することを含む、ＣＹＰ３Ａ遺伝子多型検出方法である。本発明にかかる多型検出方法によれば、前記多型検出用プローブを少なくとも１種使用することにより、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を、簡便に、感度よく検出可能にする。
【０１２７】
本発明の多型検出方法は、ＣＹＰ３Ａ遺伝子における多型の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜（ＩＶ）を含むことができ、下記工程（Ｖ）を含んでいてもよい。なお、本発明の多型検出方法は、前記多型検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。
（Ｉ）前記多型検出用プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記多型検出用プローブ及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズしてハイブリッド形成体を得ること。
（ＩＩ）前記ハイブリッド形成体を含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッド形成体を解離させ、前記ハイブリッド形成体の解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること。
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッド形成体の解離温度であるＴｍ値を測定すること。
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＣＹＰ３Ａ遺伝子における多型の存在を検出すること。
（Ｖ）前記多型の存在に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、多型を有する一本鎖核酸の存在比を検出すること。
【０１２８】
また、本発明においては、前記工程（Ｉ）〜（ＩＶ）又は前記工程（Ｉ）〜（Ｖ）に加えて、さらに、工程（Ｉ）の前又は工程（Ｉ）と同時に、核酸を増幅することを含んでいてもよい。なお、前記（ＩＩＩ）でＴｍ値を測定することには、例えば、ハイブリッド形成体の解離温度を測定することだけでなく、ハイブリット形成体の融解時に、温度に応じて変動する蛍光シグナルの微分値の大きさを測定することを含んでもよい。
【０１２９】
本発明において、前記試料中の核酸は、一本鎖核酸でもよいし二本鎖核酸でもよい。前記核酸が二本鎖核酸の場合、例えば、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることに先立って、加熱により前記試料中の二本鎖核酸を融解（解離）させて、一本鎖核酸とすることを含むことが好ましい。二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズが可能となる。
【０１３０】
本発明において、試料に含まれる検出対象である核酸は、例えば、生体試料に元来含まれる核酸でもよいが、検出精度が向上できることから、生体試料に元来含まれている核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の増幅法により、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の変異した部位を含む領域を増幅させた増幅産物であることが好ましい。前記増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０〜１０００塩基（ｍｅｒ）、又は８０〜２００塩基にすることができる。また、試料中の核酸は、例えば、生体試料由来のＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）からＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡであってもよい。
【０１３１】
本発明において、前記試料中の核酸に対する、本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は特に制限されない。試料中のＤＮＡに対して、例えば、１倍以下が挙げられる。また、十分な検出シグナル確保の観点より、前記試料中の核酸に対する、本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、０．１倍以下としうる。ここで、試料中の核酸は、例えば、検出目的の多型が発生している検出対象核酸と、前記多型が発生していない非検出対象核酸との合計でもよいし、検出目的の多型が発生している検出対象配列を含む増幅産物と、前記多型が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中の核酸における前記検出対象核酸の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して１０倍以下としうる。また、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して、５倍以下、又は３倍以下としうる。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上、０．０１倍以上、又は０．１倍以上としうる。
【０１３２】
前記ＤＮＡに対する本発明の多型検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【０１３３】
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、前記多型検出用プローブに付加した標識のシグナルに基づくシグナルであって、一本鎖ＤＮＡと前記多型検出用プローブとのハイブリッド形成の状態に応じて変動するシグナルを測定することが好ましい。このため、前記多型検出用プローブとして、前述の蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用することが好ましい。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、標的配列（相補配列）にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチド、または標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０１３４】
前者のようなプローブであれば、例えば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際には蛍光シグナルを示さないか、蛍光シグナルが弱いが、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルを示すようになるか、蛍光シグナルが増加する。また、後者のプローブであれば、例えば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによって蛍光シグナルを示し、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルが減少（消失）する。したがって、この蛍光標識に基づく蛍光シグナルの変化を、前記蛍光標識特有の条件（蛍光波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。
【０１３５】
次に、本発明の多型検出方法について、蛍光色素に基づくシグナルの変化を検出する方法について、具体例を挙げて説明する。なお、本発明の多型検出方法は、前記多型検出用プローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。
【０１３６】
核酸増幅を行う際の鋳型となる核酸を含む試料としては、核酸、特に、ＣＹＰ３Ａ遺伝子を含んでいればよく、特に制限されない。例えば、大腸や肺等の組織、白血球細胞等の血球、全血、血漿、喀痰、口腔粘膜懸濁液、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、乳、腹水液、パラフィン包埋組織、胃液、胃洗浄液、尿、腹膜液、羊水、細胞培養などの任意の生物学的起源に由来する又は由来しうるものを挙げられる。なお、試料の採取方法、核酸を含む試料の調製方法等は、特に制限されず、いずれも従来公知の方法が採用できる。また、鋳型となる核酸は、該起源から得られたままで、直接的に使用でき、あるいは、前記サンプルの特性を改変するために前処理した後で使用することができる。例えば、全血を試料とする場合、全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【０１３７】
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む多型検出用プローブを添加する。前記多型検出用プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、適当な溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものが挙げられる。
【０１３８】
前記多型検出用プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述するＰＣＲ等の増幅処理を行う場合、増幅処理の後に、ＰＣＲ増幅産物に対して添加してもよいし、増幅処理前に添加してもよい。ＰＣＲ等による増幅処理前に、前記検出用プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、前記多型検出用プローブの３'末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
【０１３９】
核酸増幅の方法としては、例えばポリメラーゼを用いる方法等が挙げられる。その例としては、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法等が挙げられる。ポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことが好ましい。用いるプローブ及びポリメラーゼに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのＴｍ値を解析するだけで多型を評価できるので、反応終了後、増幅産物を取り扱う必要がない。よって、前記増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要がなく、自動化も容易である。
【０１４０】
また、ＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常用いられるＤＮＡポリメラーゼを特に制限なく用いることができる。例えば、ＧｅｎｅＴａｑ（ニッポンジーン社製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、Ｔａｑ  ポリメラーゼ等を挙げることができる。ポリメラーゼの使用量としては、特に制限されず、通常用いられている濃度があげられる。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる場合、反応溶液量５０μｌに対して、例えば、０．０１Ｕ〜１００Ｕの濃度とすることができる。これにより、ＣＹＰ３Ａ遺伝子多型の検出感度が高まるなどの傾向がある。
【０１４１】
また、ＰＣＲ法は、通常用いられる条件を適宜選択することで行うことができる。なお、増幅の際、例えば、リアルタイムＰＣＲによって増幅をモニタリングし、試料に含まれるＤＮＡ（検出対象配列）のコピー数を調べることもできる。すなわち、ＰＣＲによるＤＮＡ（検出対象配列）の増幅に従ってハイブリッドを形成するプローブの割合が増えるので、蛍光強度が変動する。これをモニタリングすることで、試料に含まれる検出対象配列（正常ＤＮＡまたは変異ＤＮＡ）のコピー数や存在比を評価できる。
【０１４２】
本発明の多形検出方法においては、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドと、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、両者をハイブリダイズさせる。試料中の一本鎖核酸は、例えば、前述のようにして得られたＰＣＲ増幅産物を解離することで調製できる。
【０１４３】
前記ＰＣＲ増幅産物の解離（解離工程）における加熱温度は、特に制限されず、前記増幅産物が解離できる温度があげられる。前記温度は、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されない。加熱時間は、例えば、１秒〜１０分、又は１秒〜５分としうる。
【０１４４】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０〜５０℃である。
【０１４５】
ハイブリダイズ工程の反応液における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液におけるＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１μｍｏｌ／Ｌ〜１μｍｏｌ／Ｌ、又は０．１μｍｏｌ／Ｌ〜０．５μｍｏｌ／Ｌとしうる。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲であり、例えば、０．００１μｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌ、又は０．００１μｍｏｌ／Ｌ〜１μｍｏｌ／Ｌとしうる。
【０１４６】
そして、得られた前記一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光シグナルの変動を測定する。例えば、ＱＰｒｏｂｅを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、解離した状態に比べて蛍光強度が減少（または消光）する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【０１４７】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃、又は２５〜７０℃としうる。終了温度は、例えば、４０〜１０５℃としうる。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１℃／秒〜２０℃／秒、又は０．３℃／秒〜５℃／秒としうる。
【０１４８】
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値として決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における微分値（−ｄ蛍光強度／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、ハイブリッド形成によりシグナル強度が増加するプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【０１４９】
また、本発明においては、前述のように、ハイブリッド形成体を加熱して、温度上昇に伴う蛍光シグナル変動（好ましくは蛍光強度の増加）を測定するが、この方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを添加した試料の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際の前記温度降下に伴う蛍光シグナル変動を測定してもよい。
【０１５０】
具体例として、ＱＰｒｏｂｅを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が大きいが、温度の降下によりハイブリッド形成体を形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記加熱した試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、ハイブリッド形成によりシグナルが増加する標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が小さい（または消光）が、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光強度が増加するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【０１５１】
本発明の多型検出方法において、前記多型検出用プローブは、例えば、いずれか一種を使用してもよいし、二種以上を併用してもよい。使用する前記多型検出用プローブの種類は、例えば、検出目的の多型に応じて適宜決定できる。本発明においては、例えば、ＣＹＰ３Ａ５＊３多型のみ、ＣＹＰ３Ａ４＊１６多型のみ、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ多型のみを検出してもよいし、いずれか二種又は三種全ての多型を、一つの反応系で検出することもできる。また、前記ＣＹＰ３Ａ５＊３多型、ＣＹＰ３Ａ４＊１６多型及びＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ多型の少なくともいずれかと、その他の多型とを、一つの反応系で検出することも可能である。
【０１５２】
本発明の多型検出方法において、前記多型検出用プローブを二種以上併用する場合、例えば、各プローブが、異なる蛍光色素を有する標識プローブであることが好ましい。前記異なる蛍光色素は、例えば、検出条件の異なる蛍光色素があげられる。
【０１５３】
複数の遺伝子多型を、同一の系で検出する方法としては、特に制限されるものではない。例えば、各多型を検出できる各プローブを予め混合し、試料に添加してもよいし、一本鎖核酸を含む試料に各多型を検出できる各プローブを連続的に添加してもよい。ここで、「系」とは、蛍光標識オリゴヌクレオチド及び一本鎖核酸がハイブリダイズしたハイブリッド形成体を含む試料で形成される１個の独立した反応系を意味する。
【０１５４】
＜薬効判定方法＞
本発明の薬効判定方法は、前述した多型検出方法によりＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出すること、及び、前記検出結果に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定することを含む。
【０１５５】
前記多型検出方法では、本発明における多型検出用プローブを用いて、感度よく且つ簡便に、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を検出する。このため、ＣＹＰ３Ａ遺伝子におけるこの多型に基づいて、薬剤の判定を感度よく且つ簡便に行うことができる。
【０１５６】
また、多型の有無、変異配列と正常配列との存在比に基づいて、薬剤に対する耐性や薬剤の薬効を判定することができる。そして、本発明の薬効判定方法は、変異の有無、変異配列の存在比に基づいて、薬剤の投与量の増加、他の治療薬への変更等への切り替え等の疾病の治療方針を決定するのに有用である。前記判定対象となる薬剤としては、例えば、免疫抑制剤、分子標的治療薬、抗うつ薬等が挙げられ、特に免疫抑制剤及び分子標的治療薬が挙げられる。前記薬剤の具体例としては、例えば、タクロリムス等の免疫抑制剤があげられる。
【０１５７】
前記薬剤は、例えば、以下のような作用機序の物質があげられる。
（１）ＧＡＢＡＡ（ガンマ−アミノ−ブチル酸レセプター）の特異的な部位に結合する物質：例えば、アルプラゾラム（alprazolam）、エスタゾラム（estazolam）、エスゾピクロン（eszopiclone）、ミダゾラム（midazolam）等の向精神薬
（２）ナトリウムチャンネルの不活性化状態を安定化する物質：例えば、カルバマゼピン（carbamazepine）等の向精神薬
（３）D2部分アゴニスト（D2  partial  agonist）：例えば、アリピプラゾール（aripiprazole）等の向精神薬
（４）セトロニン  5-HT1Aレセプター部分アゴニスト（serotonin  5-HT1A  receptor  partial  agonist）：例えば、ブスピロン（buspirone）等の向精神薬
（５）選択的セロトニン再取り込みインヒビター（selective  serotonin  reuptake  inhibitor）：例えば、シタロプラム（citalopram）、フルオキセチン（fluoxetine）等の向精神薬
（６）セロトニン−ノルエピネフリン再取り込みインヒビター（serotonin-norepinephrine  reuptake  inhibitor）：例えば、アミトリプチリン（amitriptyline）等の向精神薬
（７）D2レセプターをブロックする物質：例えば、ハロペリドール（haloperidol）等の向精神薬
（８）5-HT2Aレセプターのアンタゴニスト（antagonist  at  the  5-HT2A  receptors）：例えば、ネファゾドン（nefazodone）等の向精神薬
（９）以下のポストシナプスレセプターをブロックするピモジド（Pimozide）：
D2（極めて強い）、D3、α1-アドレナリン、5-HT2A（強い）
（１０）以下の薬理作用を有するクエチアピン（Quetiapine）：
D1  (IC50  =  1268nM)，D2  (IC50  =  329nM)，D3およびD4レセプターアンタゴニスト，5-HT1A  (IC50  =  717nM)，5-HT2A  (IC50  =  148nM)，5-HT2C，および5-HT7レセプターアンタゴニスト，mAChレセプター  (IC50  =  >5000nM)アンタゴニスト
（１１）これらの他に、向精神薬として、例えば、リスペリドン（risperidone）、セルトラリン（sertraline）、トラゾドン（trazodone）、トリアゾラム（triazolam）、ザレプロン（zaleplon）、ゾルピデム（zolpidem）があげられ、喘息用薬（Asthma Medication）として、例えば、フルチカゾン（fluticasone）、サルメテロール（salmeterol）、ジレウトン（zileuton）があげられ、抗生物質／抗真菌薬／免疫抑制剤（Antibiotics/Antifungals/Immunosuppresant）として、例えば、マクロライド系（macrolides）（アジスロマイシンazithromycinを除く）、タクロリムス（Tacrolimus）、イトラコナゾール（itraconazole）、ケトコナゾール（ketoconazole）、テリスロマイシン（telithromycin）があげられ、抗けいれん薬（Anticonvulsants）として、例えば、カルバマゼピン（Carbamazepine）、エトスクシミド（ethosuximide）、フェルバメート（felbamate）、チアガビン（tiagabine）、ゾニサミド（Zonisamide）があげられ、抗ヒスタミン薬（Antihistamines）として、例えば、デスロラタジン（Desloratadine）、フェキソフェナジン（fexofenadine）、ロラタジン（loratadine）があげられ、薬物乱用／治療（Drugs of abuse/treatment）として、例えば、ブプレノルフィン（buprenorphine）、コカイン（cocaine）、フェンタニル（fentanyl）、ケタミン（ketamine）、メタドン（methadone）、オキシコドン（oxycodone）、フェンシクリジン（phencyclidine）があげられ、カルシウムチャネル遮断薬／ホルモン／化学療法剤（Calcium  Channel  Blockers/Hormones/chemo-therapeutics）として、例えば、コルチゾール（cortisols）、デソゲストレル（ｐ）（desogestrel  (p)）、エチニルエストラジオール（ethinyl  estradiol）、黄体ホルモン（progestins）、プロゲステロン（progesterone）、ビンクリスチン等（vincristine and others）があげられ、その他の薬剤として、例えば、アプレピタント（aprepitant）、シナカルセト（cinacalcet）、エソメプラゾール（esomeprazole）、グラニセトロン（granisetron）、ナテグリニド（nateglinide）、オメプラゾール（omeprazole）、ピオグリタゾン（pioglitazone）、キニジン（quinidine）、シルデナフィル（sildenafil）、スタチン類（Statins）、アトルバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン（atorvastatin,  lovastatin,  simvastatin）、トルテロジン（tolterodine）があげられ、ＨＩＶインヒビター（HIV  inhibitor）として、例えば、リトナビル（ritonavir）、サクイナビル（saquinavir）があげられる。なお、これらの薬剤には限定されず、例えば、これらの薬剤と同じまたは類似するメカニズムおよび／または同じまたは類似する経路により代謝される薬剤等も含まれる。
【０１５８】
＜多型検出用試薬キット＞
本発明のＣＹＰ３Ａ遺伝子における多型を検出するためのＣＹＰ３Ａ遺伝子多型検出用試薬キットは、前述した多型検出用プローブを含む。前記多型検出用試薬キットには、ＣＹＰ３Ａ遺伝子のうち配列番号１で示される配列のうち４０１番目の塩基における多型、配列番号２で示される配列のうち２０１番目の塩基における多型及び／又は配列番号３で示される配列のうち５０１番目の塩基における多型を、簡便にかつ感度よく検出することが可能な前記多型検出用プローブを、少なくとも１種を含むことにより、例えば、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型の検出を、より簡便に行うことができる等の傾向がある。
【０１５９】
また、本発明における多型検出用試薬キットは、前述の検出対象となるＣＹＰ３Ａ遺伝子多型を含む配列を増幅するためのプライマーを、さらに含んでいてもよい。これにより、本発明における多型検出用試薬キットは、精度よく、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型の検出を行うことができる。なお、前記多型検出用試薬キットに含まれ得る前記プローブ及びプライマーについては、前述した事項をそのまま適用できる。
【０１６０】
前記多型検出用プローブとして、２種以上の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む場合、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドは、混合された状態で含まれていても、別個に含まれていてもよい。また、２種類以上の本発明のプローブが混合された状態で本発明の多型検出用試薬キットに含まれる場合、および、別個の試薬として含まれているが、例えば使用時に同じ反応系で各蛍光標識オリゴヌクレオチドと各検出対象配列とのＴｍ解析を行う場合、２種以上の各プローブは発光波長が互いに異なる蛍光色素で標識化されていることが好ましい。このように蛍光物質の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれのプローブについての検出を行うことも可能になる。
【０１６１】
また、本発明における検出用試薬キットは、前記プローブの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。また、前記プローブ、前記プライマー及びその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
【０１６２】
なお、「別個に収容」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも独立して取り扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。
【０１６３】
本発明の検出用試薬キットは、多型部位を含む配列（プローブがハイブリダイズする領域）を増幅するためのプライマーセットを含むことで、例えば、より高感度に多型を検出できる。
【０１６４】
さらに、本発明の多型検出用試薬キットは、取り扱い説明書を含むことが好ましい。前記取り扱い説明書は、例えば、前記多型検出用プローブを使用して、検出対象である核酸を含む試料について微分融解曲線を作成し、そのＴｍ値解析を行って、ＣＹＰ３Ａ遺伝子における変異を検出することが記載された取扱い説明書、又は検出用試薬キットに含まれる若しくは追加的に含むことが可能な各種の試薬について記載された使用説明書があげられる。
【実施例】
【０１６５】
本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。
【０１６６】
［実施例１］
本例では、野生型の被検核酸と、変異型の被検核酸との共存下、Ｔｍ解析を行い、ＣＹＰ３Ａ遺伝子のＣＹＰ３Ａ５＊３多型及びＣＹＰ３Ａ４＊１６多型を検出した。
【０１６７】
核酸試料として、希釈血液、精製ゲノム及びプラスミドを準備した。前記希釈血液は、ＥＤＴＡ採血管を用いて採取した全血１０μＬと、下記表１に示す希釈液１  ７０μＬとを混合して混合液を調製し、前記混合液  １０μＬと下記表１に示す希釈液２  ７０μＬとを混合後、さらに、これを９５℃で１０分間加熱することにより、調製した。前記全血に含まれる被検核酸は、ＣＹＰ３Ａ５＊３多型が、野生型と変異型とのヘテロ型であり、ＣＹＰ３Ａ４＊１６多型が、野生型のホモ型である。前記精製ゲノムは、常法により、全血から調製した。前記精製ゲノムは、ＣＹＰ３Ａ５＊３多型が変異型のホモ型であり、ＣＹＰ３Ａ４＊１６多型が野生型のホモ型である。前記プラスミドは、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の部分配列として、配列番号２における塩基番号１〜４１１のオリゴヌクレオチドが挿入されたＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型プラスミドを準備した。前記ＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型プラスミドにおいて、配列番号２における塩基番号２０１の塩基（ｓ）は、グアニン（ｇ）である。
【０１６８】
【表１】
2012196209.tif 000003
【０１６９】
前記核酸試料を、下記に示す割合で混合し、下記試料１〜４を調製した。
（試料）
試料        希釈血液    精製ゲノム    ＣＹＰ３Ａ４＊１６
Ｎｏ．                                変異型プラスミド  
１          １００％          ０％          ０％
２              ０％      １００％          ０％
３              ０％        ５０％        ５０％
４              ０％          ０％      １００％
【０１７０】
前記各試料を含む、５０μＬのＰＣＲ反応混合物を調製した。前記ＰＣＲ反応混合物は、前記試料４μＬと、下記表２に示すＰＣＲ反応液の各成分とを、以下の濃度となるように混合して、調製した。前記ＰＣＲ反応混合物について、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）ＩＳ−５３１０、アークレイ社製）を用いて、ＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲは、９５℃で１分処理した後、９５℃１秒及び５６℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。そして、さらに、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて、前記反応液を、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から７５℃に加熱していき、蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定することによって、Ｔｍ解析を行った。また、コントロールとして、前記試料に代えて、前記希釈液２を用いた以外は、前述と同様にして、ＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。BODIPY  FLの検出波長は、５２０−５５５ｎｍ、TAMRAの検出波長は、５８５−７００ｎｍとした（以下、同様）。
【０１７１】
【表２】
2012196209.tif 000004
【０１７２】
前記ＣＹＰ３Ａ５＊３用プライマー及びＣＹＰ３Ａ４＊１６用プライマーの配列を以下に示す。
（ＣＹＰ３Ａ５＊３用プライマー）
Ｆプライマー  （配列番号１４）（CYP3A5*3 F4）
5'-cgtatgtaccacccagcttaacg-3'
Ｒプライマー  （配列番号１５）（CYP3A5*3 R4）
5'-cacaggagccacccaagg-3'
（ＣＹＰ３Ａ４＊１６用プライマー）
Ｆプライマー  （配列番号１６）（UO-F2）
5'-aggatggtaaaaaggtgctg-3'
Ｒプライマー  （配列番号１７）（UO-R3）
5'-gagagaaagaatggatccaaa-3'
【０１７３】
前記ＣＹＰ３Ａ５＊３用プローブは、下記配列のＣＹＰ３Ａ５＊３変異型プローブを使用した。前記ＣＹＰ３Ａ５＊３用プローブは、ＣＹＰ３Ａ５＊３変異型のＣＹＰ３Ａ遺伝子のアンチセンス鎖用の変異型プローブである。前記配列において、下線部の塩基が、ＣＹＰ３Ａ５＊３変異型配列に対して同一性を示す塩基である。前記ＣＹＰ３Ａ５＊３用プローブは、３’末端を、蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬで標識化した。前記ＣＹＰ３Ａ４＊１６用プローブは、下記配列のＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型プローブを使用した。前記ＣＹＰ３Ａ４＊１６用プローブは、ＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型のＣＹＰ３Ａ遺伝子のセンス鎖用の変異型プローブである。前記配列において、下線部の塩基が、ＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型配列に相補的な塩基である。前記ＣＹＰ３Ａ４＊１６用プローブは、３’末端を、蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識化した。
ＣＹＰ３Ａ５＊３用プローブ  （配列番号４）（3FL-CYP3A5*3-mt-F1-21）
5'-ttgtctttcaGtatctcttcc-(BODIPY  FL)-3'
ＣＹＰ３Ａ４＊１６用プローブ  （配列番号１０）（U0-3TMR4）
5'-atgatgtgctaCtgatcacatccatgc-(TAMRA)-3'
【０１７４】
これらの結果を図１〜５に示す。図１〜５は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１は、試料１、図２は、試料２、図３は、試料３、図４は、試料４、図５は、コントロールの結果である。図１〜３及び５において、（Ａ）は、ＣＹＰ３Ａ５＊３用プローブに関する融解曲線であり、（Ｂ）は、ＣＹＰ３Ａ４＊１６用プローブに関する融解曲線である。図４は、ＣＹＰ３Ａ４＊１６用プローブに関する融解曲線である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。前記ＣＹＰ３Ａ５＊３用プローブは、ＣＹＰ３Ａ５＊３野生型とのＴｍ値が４９℃付近、ＣＹＰ３Ａ５＊３変異型とのＴｍ値が５６℃付近であり、前記ＣＹＰ３Ａ４＊１６用プローブは、ＣＹＰ３Ａ４＊１６野生型とのＴｍ値が５９℃付近、ＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型とのＴｍ値が６７℃付近である。
【０１７５】
図１（Ａ）に示すように、ＣＹＰ３Ａ５＊３多型について、野生型と変異型とをヘテロ型で有する試料１は、野生型及び変異型のＴｍ値で、それぞれピークが確認された。図１（Ｂ）に示すように、ＣＹＰ３Ａ４＊１６多型について、野生型をホモ型で有する試料１は、野生型のＴｍ値のみでピークが確認された。
【０１７６】
図２（Ａ）に示すように、ＣＹＰ３Ａ５＊３多型について、変異型をホモ型で有する試料２は、変異型のＴｍ値のみでピークが確認された。図２（Ｂ）に示すように、ＣＹＰ３Ａ４＊１６多型について、野生型をホモ型で有する試料２は、野生型のＴｍ値のみでピークが確認された。
【０１７７】
図３（Ａ）に示すように、ＣＹＰ３Ａ５＊３多型について、変異型をホモ型で有する試料３は、変異型のＴｍ値のみでピークが確認された。図３（Ｂ）に示すように、ＣＹＰ３Ａ４＊１６多型について、前記精製ゲノムの野生型と前記プラスミドの変異型とを有する試料３は、野生型と変異型のＴｍ値でそれぞれピークが確認された。
【０１７８】
図４に示すように、ＣＹＰ３Ａ４＊１６多型について、変異型をホモ型で有する試料４は、変異型のＴｍ値のみでピークが確認された。なお、ＣＹＰ３Ａ５＊３多型を含む領域の塩基配列を有さない試料４は、ＣＹＰ３Ａ５＊３の多型のピークが確認されなかった。
【０１７９】
図５（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、コントロールである希釈液２は、両ピーク共に確認されなかった。
【０１８０】
［実施例２］
本例では、アンチセンス鎖にハイブリダイズするプローブを使用して、野生型人工核酸及び変異型人工核酸について、Ｔｍ解析を行い、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型（ＣＹＰ３Ａ４＊１６）を検出した。
【０１８１】
下記配列に示す、配列番号２における塩基番号１７３〜２２２に相補的な変異型人工核酸（ｍｔ）及び野生型人工核酸（ｗｔ）を調製した。前記配列において、下線部が、配列番号２における塩基番号２０１の塩基に対応する。各人工核酸を０．１μｍｏｌ／Ｌに調整して、試料とした。
ｍｔ（配列番号１９）
ttcactccaratgatgtgctaCtgatcacatccatgctgtaggccccaaa
ｗｔ（配列番号２０）
ttcactccaratgatgtgctaGtgatcacatccatgctgtaggccccaaa
【０１８２】
前記各試料を含む、５０μＬの反応混合物を調製した。前記反応混合物は、下記表３に示す反応液の各成分を、以下の濃度となるように混合して、調製した。前記反応混合物について、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）ＩＳ−５３１０、アークレイ社製）を用いて、Ｔｍ解析を行った。前記Ｔｍ解析は、前記反応液を、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した後、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から７５℃に加熱していき、蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定することによって、行った。
【０１８３】
【表３】
2012196209.tif 000005
【０１８４】
前記プローブは、下記配列のＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型プローブを使用した。前記プローブは、変異型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子のアンチセンス鎖用の変異型プローブである。前記配列において、下線部の塩基が、ＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型配列に対して同一性を示す塩基である。前記プローブは、３’末端を、蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識化した。
ＣＹＰ３Ａ４＊１６用変異型プローブ  （配列番号６）（3T-CYP3A4*16-MF1）
5'-gatgtgatcagtagc-(TAMRA)-3'
【０１８５】
これらの結果を図６に示す。図６は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図６において、（Ａ）はｍｔ  １００％、（Ｂ）はｗｔ  １００％の結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。前記ＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型プローブは、ｍｔとのＴｍ値が６０℃付近、ｗｔとのＴｍ値が５３℃付近である。
【０１８６】
図６（Ａ）に示すように、ｍｔは、ｍｔのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、図６（Ｂ）に示すように、ｗｔは、ｗｔのＴｍ値でのみピークが確認された。
【０１８７】
［実施例３］
本例では、センス鎖にハイブリダイズするプローブを使用して、野生型人工核酸及び変異型人工核酸について、Ｔｍ解析を行い、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型（ＣＹＰ３Ａ４＊１６）を検出した。以下に示す野生型人工核酸、変異型人工核酸及びＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型プローブを使用した以外は、前記実施例２と同様にして、Ｔｍ解析を行った。
【０１８８】
下記配列に示す、配列番号２における塩基番号１７３〜２２２に相同な変異型人工核酸（ｍｔ）及び野生型人工核酸（ｗｔ）を調製した。前記配列において、下線部が、配列番号２における塩基番号２０１の塩基に対応する。各人工核酸を０．１μｍｏｌ／Ｌに調整して、試料とした。
ｍｔ（配列番号２１）
tttggggcctacagcatggatgtgatcaGtagcacatcatytggagtgaa
ｗｔ（配列番号２２）
tttggggcctacagcatggatgtgatcaCtagcacatcatytggagtgaa
【０１８９】
前記プローブは、下記配列のＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型プローブを使用した。前記プローブは、変異型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子のセンス鎖用の変異型プローブである。前記配列において、下線部の塩基が、ＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型配列に相補的な塩基である。前記プローブは、３’末端を、蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識化した。
ＣＹＰ３Ａ４＊１６用プローブ  （配列番号８）（3T-CYP3A4*16-MR1）
5'-tgtgctactgatcacatcc-(TAMRA)-3'
【０１９０】
これらの結果を図７に示す。図７は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図７において、（Ａ）はｍｔ  １００％、（Ｂ）はｗｔ  １００％の結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。前記ＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型プローブは、ｍｔとのＴｍ値が７５℃付近、ｗｔとのＴｍ値が６８℃付近である。
【０１９１】
図７（Ａ）に示すように、ｍｔは、ｍｔのＴｍ値でのみピークが確認された。一方、図７（Ｂ）に示すように、ｗｔは、ｗｔのＴｍ値でのみピークが確認された。
【０１９２】
［比較例１］
本例では、センス鎖にハイブリダイズするプローブを使用して、野生型人工核酸及び変異型人工核酸について、Ｔｍ解析を行い、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型（ＣＹＰ３Ａ５＊３）を検出した。以下に示す野生型人工核酸、変異型人工核酸及びＣＹＰ３Ａ５＊３変異型プローブを使用した以外は、前記実施例２と同様にして、Ｔｍ解析を行った。
【０１９３】
下記配列に示す、配列番号１における塩基番号３７９〜４２８に相同な変異型人工核酸（ｍｔ）及び野生型人工核酸（ｗｔ）を調製した。下記配列において、下線部が配列番号１における４０１番目の塩基に対応する。各人工核酸を０．１μｍｏｌ／Ｌに調整して、試料とした。
ｍｔ（配列番号２３）
taaagagctcttttgtctttcaAtatctcttccctgtttggaccacatta
ｗｔ（配列番号２４）
taaagagctcttttgtctttcaGtatctcttccctgtttggaccacatta
【０１９４】
前記プローブは、下記配列のＣＹＰ３Ａ５＊３変異型プローブを使用した。前記プローブは、変異型のＣＹＰ３Ａ５遺伝子のセンス鎖用の変異型プローブである。前記配列において、下線部の塩基が、ＣＹＰ３Ａ５＊３変異型配列に相補的な塩基である。前記ＣＹＰ３Ａ５＊３変異型プローブは、３’末端を、蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識化した。
ＣＹＰ３Ａ５＊３変異型プローブ  （配列番号２５）（5T-CYP3A5*3-mt-R1-22）
5'-(TAMRA)-cagggaagagataCtgaaagac-P-3'
【０１９５】
これらの結果を図８に示す。図８は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図８において、（Ａ）はｍｔ  １００％、（Ｂ）はｗｔ  １００％の結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。
【０１９６】
図８（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、ｍｔ及びｗｔは共に、明瞭なピークが確認できなかった。
【０１９７】
［比較例２］
本例では、センス鎖にハイブリダイズするプローブを使用して、野生型人工核酸及び変異型人工核酸について、Ｔｍ解析を行い、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型（ＣＹＰ３Ａ４＊１６）を検出した。以下に示すＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型プローブを使用した以外は、前記実施例３と同様にして、Ｔｍ解析を行った。
【０１９８】
前記プローブは、下記配列のＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型プローブを使用した。前記プローブは、変異型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子のセンス鎖用の変異型プローブである。前記配列において、下線部の塩基が、ＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型配列に相補的な塩基である。前記ＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型プローブは、３’末端を、蛍光色素ＴＡＭＲＡで標識化した。
ＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型プローブ  （配列番号９）(U0-3TMR2）
5'-ctaCtgatcacatccatgctg-(TAMRA)-3'
【０１９９】
これらの結果を図９に示す。図９は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図９において、（Ａ）はｍｔ  １００％、（Ｂ）はｗｔ  １００％の結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。
【０２００】
図９（Ａ）に示すように、ｍｔは、ｍｔのＴｍ値のみでピークが確認された。一方、図９（Ｂ）に示すように、ｗｔはピークが確認されなかった。
【０２０１】
［実施例４］
本例では、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子のＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ、ＣＹＰ３Ａ４＊１６及びＣＹＰ３Ａ５＊３の多型を、同一反応液を用いて検出した。
【０２０２】
核酸試料として、精製ゲノム、プラスミド及び前処理済の全血を準備した。前記精製ゲノムは、常法により、ＥＤＴＡ採血管を用いて採取した全血から調製し、４００コピー／μＬに調整したものを試料として使用した。前記プラスミドは、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の部分配列として、配列番号３における塩基番号３６６〜６５１のオリゴヌクレオチドが挿入されたＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ変異型プラスミドと、配列番号２における塩基番号１〜４１１のオリゴヌクレオチドが挿入されたＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型プラスミドを準備した。前者のＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ変異型プラスミドは、配列番号３における塩基番号５０１を変異型（ｇ）とし、後者のＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型プラスミドは、配列番号２における塩基番号２０１を変異型（ｇ）とした。それぞれのプラスミドを２０００コピー／μＬに調整し、０．５μＬずつ混合したものを試料として使用した。前記前処理済の全血は、前記精製ゲノムの調製に使用した同じ前記全血１０μＬと、前記表１に示す希釈液１  ７０μＬとを混合して混合液を調製し、前記混合液  １０μＬと前記表１に示す希釈液２  ７０μＬとを混合後、さらに、これを９５℃で１０分間加熱することにより、調製した。前記全血に含まれる被検核酸は、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ多型が、野生型のホモ型であり、ＣＹＰ３Ａ５＊３多型が、野生型と変異型とのヘテロ型であり、ＣＹＰ３Ａ４＊１６多型が、野生型のホモ型である。
【０２０３】
前記各試料を含む、５０μＬのＰＣＲ反応混合物を調製した。前記ＰＣＲ反応混合物は、前記試料と、下記表４に示すＰＣＲ反応液の各成分を、以下の濃度となるように混合して、調製した。前記ＰＣＲ反応混合物において、精製ゲノム試料の濃度は、２×１０６ｃｏｐｙ／Ｌ、プラスミド試料の濃度は、２×１０７ｃｏｐｙ／Ｌ、全血試料は、５．３ｍＬ／Ｌとした。前記ＰＣＲ反応混合物について、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）ＩＳ−５３１０、アークレイ社製）を用いて、ＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。前記ＰＣＲは、９５℃で１分処理した後、９５℃１秒及び５８℃３０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。そして、さらに、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した後、前記反応液を、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から７５℃に加熱していき、蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定することによって、Ｔｍ解析を行った。また、コントロールとして、前記試料に代えて、前記希釈液２を用いた以外は、前述と同様にして、ＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。Pacific  Blueの検出波長は、４４５−４８０ｎｍ、BODIPY  FLの検出波長は、５２０−５５５ｎｍ、TAMRAの検出波長は、５８５−７００ｎｍとした。
【０２０４】
【表４】
2012196209.tif 000006
【０２０５】
前記ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ用のプライマー及びプローブの配列を以下に示す。
（ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ用プライマー）
Ｆプライマー  （配列番号２６）（CYP3A4-1B-F1）
5'-ctgtaggtgtggcttgttgggatgaa-3'
Ｒプライマー  （配列番号２７）（CYP3A4-1B-R1）
5'-ggagccattggcataaaatctattaaatcgc-3'
（ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ用プローブ）
変異型プローブ（配列番号１２）（3PB-CYP3A4*1B-R3）
5'-taaatcgccGctctcctgccc-(Pacific  Blue)-3'
【０２０６】
前記ＣＹＰ３Ａ４＊１６用のプライマー及びプローブの配列を以下に示す。
（ＣＹＰ３Ａ４＊１６用プライマー）
Ｆプライマー  （配列番号１８）（CYP3A4*16-F6+CTAGA）
5'-ctagaggagtgtgatagaaggtgatctagtaga-3'
Ｒプライマー  （配列番号２８）（U0-R3+GACGA）
5'-GACGAgagagaaagaatggatccaaa-3'
（ＣＹＰ３Ａ４＊１６用プローブ）
変異型プローブ（配列番号６）（3T-CYP3A4*16-MF1）
5'-gatgtgatcaGtagc-(TAMRA)-3'
【０２０７】
前記ＣＹＰ３Ａ５＊３用のプライマー及びプローブの配列を以下に示す。
（ＣＹＰ３Ａ５＊３用プライマー）
Ｆプライマー  （配列番号１４）（CYP3A5*3 F4）
5'-cgtatgtaccacccagcttaacg-3'
Ｒプライマー  （配列番号１５）（CYP3A5*3 R4）
5'-cacaggagccacccaagg-3'
（ＣＹＰ３Ａ５＊３用プローブ）
変異型プローブ（配列番号４）（3FL-CYP3A5*3-mt-F1-21）
5'-ttgtctttcaGtatctcttcc-(BODIPY FL)-3'
【０２０８】
これらの結果を図１０〜１２に示す。図１０〜１２は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１０は、精製ゲノムの試料、図１１は、混合プラスミドの試料、図１２は、前処理済み全血の試料の結果である。図１０及び図１２において、（Ａ）は、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ用変異型プローブに関する融解曲線であり、（Ｂ）は、ＣＹＰ３Ａ５＊３用変異型プローブに関する融解曲線であり、（Ｃ）は、ＣＹＰ３Ａ４＊１６用変異型プローブに関する融解曲線である。図１１において、（Ａ）は、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ用変異型プローブに関する融解曲線であり、（Ｂ）は、ＣＹＰ３Ａ４＊１６用変異型プローブに関する融解曲線である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ変異型とＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ用変異型プローブとのＴｍ値は、６１℃付近、ＣＹＰ３Ａ５＊３変異型とＣＹＰ３Ａ５＊３用変異型プローブとのＴｍ値は、５６℃付近、ＣＹＰ３Ａ４＊１６変異型とＣＹＰ３Ａ４＊１６用変異型プローブとのＴｍ値は、５３℃付近である。
【０２０９】
図１０（Ａ）に示すように、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ多型について、野生型のホモ型である精製ゲノムは、変異型のＴｍ値よりも低い温度でピークが確認された。図１０（Ｂ）に示すように、ＣＹＰ３Ａ５＊３多型について、野生型と変異型のヘテロ型である精製ゲノムは、変異型のＴｍ値とそれよりも低い温度において、合計２つのピークが確認された。図１０（Ｃ）に示すように、ＣＹＰ３Ａ４＊１６多型について、野生型のホモ型である精製ゲノムは、変異型のＴｍ値よりも低い温度でピークが確認された。
【０２１０】
図１１（Ａ）に示すように、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ多型について、変異型であるプラスミドを含む試料は、変異型のＴｍ値のみでピークが確認された。図１１（Ｂ）に示すように、ＣＹＰ３Ａ４＊１６多型について、変異型であるプラスミドを含む試料は、変異型のＴｍ値のみでピークが確認された。前記プラスミド試料はＣＹＰ３Ａ５＊３多型を含まないことから、ピークは確認されなかった。
【０２１１】
図１２（Ａ）に示すように、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ多型について、野生型のホモ型である前処理済み全血は、変異型のＴｍ値よりも低い温度でピークが確認された。図１２（Ｂ）に示すように、ＣＹＰ３Ａ５＊３多型について、野生型と変異型のヘテロ型である前処理済み全血は、変異型のＴｍ値とそれよりも低い温度において、合計２つのピークが確認された。図１２（Ｃ）に示すように、ＣＹＰ３Ａ４＊１６多型について、野生型のホモ型である前処理済み全血は、変異型のＴｍ値よりも低い温度でピークが確認された。
【０２１２】
［実施例５］
本例では、センス鎖にハイブリダイズするプローブを使用して、野生型人工核酸及び変異型人工核酸について、Ｔｍ解析を行い、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型（ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ）を検出した。
【０２１３】
センス鎖の人工核酸として、下記配列に示す、配列番号３における塩基番号４８２〜５２１に相同的な野生型人工核酸（ＷＴ１）及び変異型人工核酸（ｍｔ１−１、ｍｔ１−２）を調製した。前記配列において、下線部が配列番号３における塩基番号５０１の塩基に対応する。前記配列において、小文字の塩基は、配列番号３とは異なる塩基に置換した。前記各人工核酸を０．１μｍｏｌ／Ｌに調整した。
ＷＴ１（配列番号２９）（CYP3A4*1B-WT-F）
AGCCATAGAGACAAGGGCAAGAGAGgGGCGATTTAATAGA
ｍｔ１−１（配列番号３０）（CYP3A4*1B-mt1-F）
AGCCATAGAGACAAGGGCAGGAGAGaGGCGATTTAATAGA
ｍｔ１−２（配列番号３１）（CYP3A4*1B-mt2-F）
AGCCATAGAGACAAGGGCAGGAGAGgGGCGATTTAATAGA
【０２１４】
前記各人工核酸を含む、５０μＬの反応混合物を調製した。前記反応混合物は、下記表５に示す反応液の各成分を、以下の濃度となるように混合して、調製した。前記反応混合物について、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）ＩＳ−５３１０、アークレイ社製）を用いて、Ｔｍ解析を行った。前記Ｔｍ解析は、前記反応液を、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した後、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から７５℃に加熱していき、蛍光色素に応じた検出波長における、経時的な蛍光強度の変化を測定することによって、行った。Pacific  Blueの検出波長は、４４５−４８０ｎｍとした。
【０２１５】
【表５】
2012196209.tif 000007
【０２１６】
前記プローブとして、下記配列のＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ変異型プローブを使用した。前記プローブは、変異型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子のセンス鎖用の変異型プローブである。前記配列において、下線部の塩基が、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ変異型配列に相補的な塩基である。
ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ用プローブ  （配列番号１２）（3PB-CYP3A4*1B-R3）
5'-taaatcgccGctctcctgccc-(Pacific  Blue)-3'
【０２１７】
[比較例３]
（比較例３−１）
本例では、センス鎖にハイブリダイズするプローブを使用して、野生型人工核酸及び変異型人工核酸について、Ｔｍ解析を行い、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型（ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ）を検出した。
【０２１８】
前記ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ用プローブとして、下記配列のプローブを使用した。前記プローブは、野生型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子のセンス鎖用の野生型プローブである。前記配列において、下線部の塩基が、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ変異型配列に相補的な塩基である。
プローブ３−１（配列番号３２）（5PB-CYP3A4*1B-R1）
5'-(Pacific  Blue)-ctctcttgcccttgt-3'
【０２１９】
前記ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ用プローブとして、前記プローブ３−１を使用した以外は、前記実施例５と同様にしてＴｍ解析を行った。
【０２２０】
（比較例３−２）
本例では、アンチセンス鎖にハイブリダイズするプローブを使用して、野生型人工核酸及び変異型人工核酸について、Ｔｍ解析を行い、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型（ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ）を検出した。
【０２２１】
アンチセンス鎖の人工核酸として、下記配列に示す、配列番号３における塩基番号４８２〜５２１に相補的な野生型人工核酸（ＷＴ２）及び変異型人工核酸（ｍｔ２−１、ｍｔ２−２）を調製した。前記配列において、下線部が配列番号３における塩基番号５０１の塩基に対応する。前記各人工核酸を０．１μｍｏｌ／Ｌに調整した。
ＷＴ２（配列番号３３）（CYP3A4*1B-WT-R）
tctattaaatcgccCctctcttgcccttgtctctatggct
ｍｔ２−１（配列番号３４）（CYP3A4*1B-mt1-R）
tctattaaatcgccTctctcctgcccttgtctctatggct
ｍｔ２−２（配列番号３５）（CYP3A4*1B-mt2-R）
tctattaaatcgccCctctcctgcccttgtctctatggct
【０２２２】
前記ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ用プローブとして、下記配列のプローブ２−２を使用した。前記プローブは、野生型のＣＹＰ３Ａ４遺伝子のアンチセンス鎖用の野生型プローブである。前記配列において、下線部の塩基が、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ野生型配列に対して同一性を示す塩基である。
プローブ２−２  （配列番号３６）（5PB-CYP3A4*1B-F1）
5'-(Pacific  Blue)-CAAGGGCAAGAGAGAG-3'
【０２２３】
前記野生型人工核酸として、前記ＷＴ２、前記変異型人工核酸として、前記ｍｔ２−１又はｍｔ２−２を使用し、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｂ用プローブとして、前記プローブ２−２を使用した以外は、前記実施例５と同様にしてＴｍ解析を行った。
【０２２４】
これらの結果を図１３〜１５に示す。図１３〜１５は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１３は、実施例５の結果、図１４は、比較例３−１の結果、図１５は、比較例３−２の結果である。横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」（ｄＦ／ｄｔ）とした。
【０２２５】
図１３に示すように、実施例５では、ＰＣＲ反応液に、ＷＴ１とｍｔ１−１又はＷＴ１とｍｔ１−２とを添加した場合、ＷＴ１（５５℃）とｍｔ１−１（６４℃）又はｍｔ１−２（６４℃）のいずれにおいても、ピークが確認された。一方、図１４に示すように、比較例３−１では、ＰＣＲ反応液に、ＷＴ１とｍｔ１−１とを添加した場合、ＷＴ１とｍｔ１−１とのピークが重なっており、また、ＷＴ１とｍｔ１−２とを添加した場合、ＷＴ１とｍｔ１−２とのピークは確認されなかった。また、図１５に示すように、比較例３−２では、ＰＣＲ反応液にＷＴ２とｍｔ２−２とを添加した場合、ＷＴ２とｍｔ２−２とのピークが重なっており、また、ＷＴ２とｍｔ２−１とを添加した場合、ＷＴ２とｍｔ２−１とのピークは確認されなかった。
【０２２６】
以上の通りであるので、本発明によれば、高い感度で、簡便にＣＹＰ３Ａ遺伝子における多型を検出することができることが明らかになった。
【０２２７】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
【０２２８】
この出願は、２０１１年３月９日に出願された日本出願特願２０１１−０５１６３１を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０２２９】
本発明の多型検出方法によれば、ＣＹＰ３Ａ遺伝子の多型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いる多型検出方法を提供できる。また、本発明は、当該多型検出方法を用いた薬効評価方法を提供できる。さらに、本発明は、当該多型検出用プローブを用いた多型検出用試薬キットを提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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