(57)【要約】【課題】  短時間で適正細胞を収集可能な細胞の収集装置等を提供する。【解決手段】  プレート３の下面には樹脂フィルム９が貼り付けられる。樹脂フィルム９は、プレート３の下面に対して接着剤で張り付けられる。ホルダー１１の下部には、透明板１３が設けられる。透明板１３はレーザを透過する板部材であり、例えばガラス板を用いることができる。透明板１３の下部には、計測器１５とレーザ源１７が設けられる。計測器１５は、ウェル７に収められる細胞の性状を計測するものである。計測器１５で計測された細胞の性状は、番地（どの位置のウェル７の細胞であるか）とともに装置内に記憶される。レーザ源１７は、例えば紫外線レーザを照射可能である。レーザ源１７の上部にはミラー１９が配置される。ミラー１９を動作することで、レーザ源１７から発振されるレーザを、任意のウェル７に向けて照射することができる。【選択図】図２
2012254077.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の収集装置であって、
細胞を保持するホルダーと、
前記ホルダーの下部に設けられる透明板と、
前記ホルダーに収容された細胞の性状を計測する計測器と、
前記透明板の下部に設けられるレーザ源と、
を具備し、
前記ホルダーは、収集対象の細胞に応じた径の複数のウェルを有するプレートと、前記プレートの下面に貼り付けられた樹脂フィルムとからなり、
それぞれの前記ウェルには、細胞が収容可能であり、
前記ホルダーの下部から収集対象となる細胞が収容されたウェルの下部の前記樹脂フィルムにレーザを照射することで、前記樹脂フィルムに穴をあけて、内部の細胞を前記透明板上に落下させることが可能であることを特徴とする細胞の収集装置。
【請求項２】
前記レーザ源は紫外線レーザであり、前記透明板は紫外線レーザを透過するとともに、前記樹脂フィルムが紫外線レーザを吸収し、前記樹脂フィルムが破れて穴が形成されることを特徴とする請求項１記載の細胞の収集装置。
【請求項３】
前記ウェルの下部に位置する前記樹脂フィルムは、張力が付与された状態で前記プレートに貼り付けられることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の細胞の収集装置。
【請求項４】
前記ホルダーの上面側は、加圧状態で保持されることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞の収集装置。
【請求項５】
前記透明板は傾斜して設けられ、前記透明板上に落下した細胞が傾斜によって収集されることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに記載の細胞の収集装置。
【請求項６】
細胞の収集方法であって、
請求項１から請求項５のいずれかに記載の細胞の収集装置を用い、
前記ホルダーの前記ウェルに細胞を収容し、
それぞれの前記ウェルの内部の細胞の性状を前記計測器で計測し、
前記計測器で適正な細胞と判断されたウェルの番地を記憶し、
所定範囲の細胞の計測が終了後、記憶した適正な細胞に対応するそれぞれの番地の前記ウェルに対応する番地位置の前記樹脂フィルムにレーザを照射して、当該部位の樹脂フィルムに穴をあけ、
対象となる細胞を前記透明板上に落下させて収集することを特徴とする細胞の収集方法。
【請求項７】
細胞の収集方法であって、
請求項１から請求項５のいずれかに記載の細胞の収集装置を用い、
前記ホルダーの前記ウェルに細胞を収容し、
それぞれの前記ウェルの内部の細胞の性状を前記計測器で計測し、
前記計測器で適正な細胞と判断されたウェルの番地を記憶し、
所定範囲の細胞の計測が終了後、記憶した適正な細胞に対応するそれぞれの番地以外の前記ウェルに対応する番地位置の前記樹脂フィルムにレーザを照射して、当該部位の樹脂フィルムに穴をあけ、当該ウェル内の細胞を前記透明板上に落下させ、
前記ホルダーに残った細胞を収集することを特徴とする細胞の収集方法。
【請求項８】
前記ホルダーに残った細胞を、前記ホルダーを反転して容器に収集するか、あるいは、前記ウェル内の適正細胞を吸引することにより行うことを特徴とする請求項７に記載の細胞の収集方法。
【請求項９】
細胞の収集に用いられる細胞ホルダーであって、
複数のウェルを有するプレートと、前記プレートの下面に貼り付けられた樹脂フィルムとからなり、
前記ウェルの径は２０〜３２μｍであり、
前記樹脂フィルムは紫外線レーザを吸収可能であり、
前記樹脂フィルムと前記プレートとは接着剤で接着され、前記接着剤の硬化に伴う収縮により、前記樹脂フィルムは、前記ウェルの下部に位置する部位に張力が付与された状態で前記プレートに貼り付けられることを特徴とする細胞ホルダー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば再生医療用の細胞を収集するための細胞の収集装置、収集方法およびこれに用いられる細胞ホルダーに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、例えば再生医療において細胞が収集されて用いられる。この場合、治療内容にもよるが、例えば数億個の細胞がシャーレ内で培養され、その中から数１０万個の多数の適正細胞が集められて細胞が収集される。
【０００３】
集められる細胞としては、その形態が適正（例えば細胞の大きさが大き過ぎず、小さ過ぎず）であり、かつ動作が活発な細胞が適正細胞として収集される。このような適正細胞の収集は、通常、顕微鏡を用いて人が目視判断し、先端が細いノズル形状のピペットを用いて手動で行われる（例えば特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−３４０１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ここで、細胞は培養液内にあるため、細胞の形態及び動作の計測には時間が掛ることも許容される。しかし、細胞の収集の際には、細胞を培養液から別の容器に移す必要がある。このため、例えば数１０万個の細胞を数分程度で集める必要がある。しかし、手動でこのような速度で細胞を収集するのは困難である。また、ピペットでの手動による細胞操作は、細胞に多くの損傷を与えるという問題がある。
【０００６】
本発明はこのような問題に鑑みてなされたもので、短時間で適正細胞を効率良く収集可能な細胞の収集装置等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前述した目的を達するために第１の発明は、細胞の収集装置であって、細胞を保持するホルダーと前記ホルダーの下部に設けられる透明板と前記ホルダーに収容された細胞の性状を計測する計測器と前記透明板の下部に設けられるレーザ源を具備し、前記ホルダーは、収集対象の細胞に応じた径の複数のウェルを有するプレートと前記プレートの下面に貼り付けられた樹脂フィルムとからなり、それぞれの前記ウェルには、細胞が収容可能であり、前記ホルダーの下部から収集対象となる細胞が収容されたウェルの下部の前記樹脂フィルムにレーザを照射することで、前記樹脂フィルムに穴をあけて、内部の細胞を前記透明板上に落下させることが可能であることを特徴とする細胞の収集装置である。
【０００８】
前記レーザ源の波長は、赤外線レーザも使用できるが、可能であれば紫外線レーザを照射することが望ましい。たとえば、前記透明板は紫外線レーザを透過するとともに、前記樹脂フィルムが紫外線レーザを吸収し、樹脂フィルムの紫外線レーザを吸収した個所が瞬時に蒸発、飛散して除去されるため、加工部周辺への熱影響をほとんど与えずに樹脂フィルムを溶融することができることから、紫外線レーザを用いると樹脂フィルムに熱損傷を与えずに穴を形成することができる。したがって、本発明におけるレーザは、赤外光の領域に発振波長を有する赤外線レーザも使用できるが、紫外光の領域に発振波長を有する紫外線レーザであることが熱影響を低減する意味では望ましい。ここで、赤外線レーザは赤外光の領域に発振波長を有するので、赤外光レーザと同義であり、紫外線レーザは紫外光の領域に発振波長を有するので、紫外光レーザと同義である。
【０００９】
前記ウェルの下部に位置する前記樹脂フィルムは、張力が付与された状態で前記プレートに貼り付けられてもよい。前記ホルダーの上面側は、加圧状態で保持されてもよい。前記透明板は傾斜して設けられ、前記透明板上に落下した細胞が傾斜によって収集されてもよい。
【００１０】
第１の発明によれば、レーザによって樹脂フィルムを破り、適正細胞のみを透明板上に落とすことができるため、細胞に損傷を与えることなく短時間で確実に適正細胞を収集することができる。このように、短時間で、適正細胞を収集することができるため、たとえ、一部の細胞に損傷を与えたとしても、大部分の細胞は損傷を与えることなく収集することが可能となる。
【００１１】
特に、紫外線レーザを用いれば、培養液が加熱されることがなく、培養液から蒸気が生じることがない。
【００１２】
また、樹脂フィルムが張力を付与された状態でプレート下面に貼り付けられることで、細胞が治められたホルダーの下部に設けられた樹脂フィルムに容易に穴をあけることができることから、細胞を傷つけることがない。
【００１３】
また、ホルダー上面側を加圧状態とすることで、樹脂フィルムに穴が形成された際に、内部の細胞を確実に透明板上に落下させることができる。
【００１４】
また、透明板を斜めに傾斜して配置することで、落下した細胞を容易に透明板の傾斜した部分の下側に収集することができる。
【００１５】
第２の発明は、細胞の収集方法であって、第１の発明にかかる細胞の収集装置を用い、前記ホルダーの前記ウェルに細胞を収容し、それぞれの前記ウェルの内部の細胞を前記計測器で計測し、前記計測器で適正な細胞と判断されたウェルの番地を記憶し、所定範囲の細胞の計測が終了後、記憶した適正な細胞に対応するそれぞれの番地の前記ウェルに対応する番地位置の前記樹脂フィルムにレーザを照射して、当該部位の樹脂フィルムに穴をあけ、対象となる細胞を前記透明板上に落下させて収集することを特徴とする細胞の収集方法である。
【００１６】
また、第２の発明は、細胞の収集方法であって、第１の発明にかかる細胞の収集装置を用い、前記ホルダーの前記ウェルに細胞を収容し、それぞれの前記ウェルの内部の細胞の性状を前記計測器で計測し、前記計測器で適正な細胞と判断されたウェルの番地を記憶し、所定範囲の細胞の計測が終了後、記憶した適正な細胞に対応するそれぞれの番地以外の前記ウェルに対応する番地位置の前記樹脂フィルムにレーザを照射して、当該部位の樹脂フィルムに穴をあけ、当該ウェル内の細胞を前記透明板上に落下させ、前記ホルダーに残った細胞を収集することを特徴とする細胞の収集方法としてもよい。
具体的には、細胞の収集は、ホルダーを反転して容器に収集するか、あるいは、ウェル内の適正細胞の吸引することにより、行うことができる。
【００１７】
第２の発明によれば、短時間で確実に適正細胞のみを収集することができる。
【００１８】
第３の発明は、細胞の収集に用いられる細胞ホルダーであって、複数のウェルを有するプレートと前記プレートの下面に貼り付けられた樹脂フィルムからなり、前記ウェルの径は２０〜３２μｍであり、前記樹脂フィルムは紫外線レーザを吸収可能であり、前記樹脂フィルムと前記プレートとは接着剤で接着され、前記接着剤の硬化に伴う収縮により、前記樹脂フィルムは、前記ウェルの下部に位置する部位に張力が付与された状態で前記プレートに貼り付けられることを特徴とする細胞ホルダーである。
【００１９】
第３の発明によれば、適正細胞を短時間で収集可能な細胞ホルダーを得ることができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、短時間で効率良く適正細胞を収集可能な細胞の収集装置等を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】細胞収集装置１を示す平面図。
【図２】細胞収集装置１を示す図であり、図１のＡ−Ａ線断面図。
【図３】細胞の計測を行う状態を示す図。
【図４】レーザにより樹脂フィルム９に穴をあける状態を示す図。
【図５】細胞を透明板１３上に落とした状態を示す図。
【図６】細胞が落とされた状態を示す平面図。
【図７】細胞収集装置３０を示す断面図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態について説明する。図１は、細胞収集装置１（プレート３）を示す平面図である。プレート３は、複数のエリア５に区分される。プレート３には複数の孔が形成される。孔は細胞が入れられるウェル７となる。
【００２３】
動物細胞の大きさは２０μｍ弱であるので、例えば、ウェル７のサイズとしてはφ２０μｍ〜φ３２μｍ程度（より望ましくはφ２８μｍ〜φ３２μｍ）とすればよい。また、例えば、ウェル７のサイズをφ２８μｍとし、ウェル７の間隔を７μｍとして、各エリア５内に１０００×１０００個＝１００万個のウェル７を設けるとすれば、各エリア５は３５ｍｍ×３５ｍｍとなる。
【００２４】
エリア５の周囲に０．５ｍｍの縁を設けるとエリア５の幅は３６ｍｍとなり、１枚のプレート３に５×５＝２５のエリア５が形成され、この際のプレート３のサイズは１８０ｍｍ×１８０ｍｍとなる。すなわち、１枚のプレート３には、２５００万個のウェル７が形成される。なお、１つのエリア５から１０００個の適正細胞を収集するとすれば、一枚のプレート３から２５０００個の細胞を収集することが可能であり、このようなプレート３を４枚用いることで約１０万個の細胞を集めることができる。上記のように、通常は収集する細胞の種類や目的に応じて、数千個や数十万個の細胞を集めることが可能になる。
【００２５】
図２は、図１のＡ−Ａ線断面図である。プレート３の下面には樹脂フィルム９が貼り付けられる。すなわち、ウェル７と樹脂フィルム９によって細胞が入れられるウェルを構成する。プレート３としては、例えば３０μｍ厚程度の樹脂製の板が用いられ、プレス等によってウェル７が形成される。なお、樹脂フィルム９が貼り付けられたプレート３をホルダー１１と称する。
【００２６】
樹脂フィルム９は、プレート３の下面に対して接着剤で張り付けられる。ここで、接着剤が硬化する際に接着剤は収縮する。このため、プレート３のウェル７の下部に位置し、プレート３との非接着部の樹脂フィルム９には、周囲の接着部方向に張力が付与される。なお、樹脂フィルム９としては、例えば５〜１０μｍ厚程度であり、後述するレーザ（例えば紫外線レーザ）を吸収する熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００２７】
ホルダー１１の下部には、透明板１３が設けられる。透明板１３はレーザを透過する板部材であり、例えばガラス板を用いることができる。
【００２８】
透明板１３の下部には、計測器１５とレーザ源１７が設けられる。計測器１５は、ウェル７に収められる細胞の性状を計測するものである。計測器１５としては、例えば、ウェル７内部に収められた細胞の画像解析を行い、細胞の大きさを計測するものである。また、同一の細胞の計測を、時間をおいて複数回行い、この際の細胞の変化を把握して、細胞の動作が活発であるかどうかを計測することもできる。なお、計測器１５は、必ずしもホルダー１１（透明板１３）の下部に位置する必要はなく、ホルダー１１の上部に設けられてもよい。
【００２９】
計測器１５で計測された細胞の性状は、番地（どの位置のウェル７の細胞であるか）とともに装置内に記憶される。
【００３０】
レーザ源１７は、例えば波長が１００〜５５０ｎｍのパルスレーザであり、さらに望ましくは波長が１００〜３８０ｎｍのパルスレーザであり、特に紫外線レーザを照射可能であることが望ましい。レーザ源１７の上部にはミラー１９が配置される。ミラー１９を動作することで、レーザ源１７から発振されるレーザを、任意のウェル７に向けて照射することができる。例えば、レーザ源１７としては７０〜１００ｋＨｚのパルスレーザを用いればよく、レーザが発振されていない間にミラー１９が駆動される。この場合には、１秒間に７万〜１０万の対象方向にレーザを発振することが可能であり、高速かつ確実に所望の位置の樹脂フィルム９に孔を形成することができる。
【００３１】
ここで、装置内に記憶された番地情報は、例えば、フレームメモリーで構成・補正するなどしてコントローラーに送られ、コントローラーによる当該情報に応じてミラー１９が制御され、レーザ源１７からのレーザ光が照射される。ここで、レーザ光を樹脂フィルム９上の各位置に正確に転送するのがミラー１９の役割であり、例えば、このミラーには六角形状のアルミニウム合金を精密切削し、酸化シリコンを真空蒸着させたポリゴンミラーが使用される。樹脂フィルム９にレーザ光を照射する時間は、樹脂フィルム９の種類や厚さにより適宜設計される。
【００３２】
次に、細胞収集装置１を用いて細胞を収集する方法について説明する。図３は、細胞収集装置１に細胞が入れられた状態を示す図である。まず、培養液とともに細胞２１をプレート３上に流して、各ウェル７に細胞２１を入れる。なお、以下の図において培養液の図示を省略する。
【００３３】
次に、計測器１５により各細胞２１の大きさや動作（活発度）を測定する（図中矢印ＢおよびＣ方向）。計測器１５によって計測されたそれぞれの細胞２１の性状は、ウェル７の番地とともに記憶される。また、計測結果により、一定以上の適正度の細胞２１が選択される。
【００３４】
次に、図４（ａ）に示すように、選択された細胞２１（図中矢印Ｄ）が入れられるウェル７に対応する位置の樹脂フィルム９に対して、レーザ源１７からレーザを照射する。この際、透明板１３はレーザを透過するため、レーザは確実に樹脂フィルム９に照射される。レーザの照射方向はミラー１９によって調整される。なお、実際に選択される細胞２１は、細胞の種類や培養条件により異なるものの、例えば、１０００個の細胞に対して１個程度であるが、図では模式的により多くの細胞が選択された状態を示す。
【００３５】
レーザが照射されると、図４（ｂ）に示すように樹脂フィルム９が破け、穴２３が形成される。この際、樹脂フィルム９に張力が付与されているため、樹脂フィルム９をより容易に破くことができる。樹脂フィルム９の材料としては、アクリル、ＰＥＴ、ポリカーボネート等を使用することができ、その他条件を満たせばいずれの材料を使用することもできる。
【００３６】
樹脂フィルム９に穴２３を形成することで、図５に示すように、当該ウェル７内に入れられている細胞２１が透明板１３上に落下する。透明板１３上に落下した回収細胞２１ａは、例えば、透明板１３を傾けて傾斜させることで、１か所に収集される。この際、透明板１３に回収細胞２１ａが付着しないように、透明板の表面は、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン／ｎ−ブチルメタクリレート共重合体）により被覆される。以上により、適正細胞が回収される。
【００３７】
図６は、プレート３の平面図である。図６に示すように、細胞２１の収集は、平面上で一括して行われる。すなわち、計測器１５による細胞の計測を、例えば１エリア毎に行い、測定結果に基づいて、１エリア内の全ての適正細胞の収集を一度に行うことで、短時間で適正細胞の回収を行うことができる。
【００３８】
以上、本発明によれば、適正細胞の収集をレーザの照射により行うため、短時間に多量の細胞を収集することができる。また、手動によりピペット等を用いる必要がないため、クリーンな環境で細胞の収集を行うことができ、異物の混入もない。
【００３９】
また、樹脂フィルム９に張力が付与されているため、容易に樹脂フィルム９を破くことができる。また、紫外線レーザを用いれば、熱によらずに樹脂フィルム９を破くことができる。このため、内部の培養液等が熱で蒸気となることがない。
【００４０】
また、透明板１３の表面に細胞が付着することを防止するための樹脂コーティングが施されるため、透明板１３上に落下した回収細胞２１ａを確実に回収することができる。
【００４１】
次に、第２の実施形態について説明する。図７は第２の実施の形態にかかる細胞収集装置３０を示す図である。なお、以下の説明において、細胞収集装置１と同一の機能を奏する構成には、図１と同様の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００４２】
細胞収集装置３０は、細胞収集装置１と略同様の構成であるが、加圧部３３が設けられる点で異なる。細胞収集装置３０は、プレート３上面側がチャンバ３１で覆われる。チャンバ３１の一部には加圧部３３が設けられる。加圧部３３は、外部からチャンバ３１内部に不活性ガス等を導入することができる（図中矢印Ｆ方向）。
【００４３】
細胞がウェル７に入れられた状態で、加圧部３３よりチャンバ内に不活性ガス等を導入することで、チャンバ３１内部の圧力を大気圧に対して加圧状態とすることができる。なお、加圧部３３からのガスの導入は、細胞回収前に一度行い、その後バルブを閉じて加圧状態を維持してもよく、または、常に一定の圧力でガスを導入した状態で保持してもよい。
【００４４】
この状態で、前述と同様に、レーザによって樹脂フィルム９に穴をあけると、プレート３上部が加圧状態であるため、ウェル７に対応する部位の樹脂フィルム９に張力を付与するこができるとともに、樹脂フィルム９をレーザによって破いた際に、ウェル７内部の細胞を透明板１３方向に勢いよく落下させることができる。このため、樹脂フィルム９を破いた後も、細胞がウェル７内部に留まることがなく、確実に細胞を透明板１３上に落下させることができる。このようにすることで、適正度の高い細胞のみを透明板１３上に落下させて、回収することができる。この際に適正な細胞がダメージを受けないように、照射するレーザの強度や照射時間を適宜調整できる。
【００４５】
なお、前述の実施形態においては、計測器１５によって一定以上の適正度である細胞２１を選択し、その細胞の入ったウェル７の番地位置に対応する位置の樹脂フィルム９に対して、レーザ源１７からレーザを照射する例について説明した。このようにすることで、一定以上の適正度の細胞２１を選択的に透明板１３に落下させて、収集することができる。
【００４６】
しかし、本発明では、計測器１５によって一定以上の適正度の細胞２１を選択した後、その細胞２１の入ったウェル７以外の番地位置に対応する樹脂フィルム９の位置に対して、レーザを照射することができる。すなわち、適正度の低い細胞２１が入ったウェル７（樹脂フィルム９）に対してのみレーザを照射することで実現できる。
【００４７】
このようにすることで、適正度の低い細胞のみを透明板１３上に落下させることができる。この際、レーザの照射によって、細胞がダメージを受ける恐れがあるが、レーザが照射される部位には、そもそも不適正な細胞が入っており、その後廃棄されるものであるため、照射するレーザの強度や照射時間を細胞がダメージを受けないよう調整する必要がない。したがって、一定以上の適正度の細胞２１のみを、ホルダー１１に残すことができる。この後、ホルダー１１を反転するか、または、ウェル７内の適正細胞の吸引等を行うことにより、所望の細胞のみを回収することができる。
【００４８】
以上、添付図を参照しながら、本発明の実施の形態を説明したが、本発明の技術的範囲は、前述した実施の形態に左右されない。当業者であれば、特許請求の範囲に記載された技術的思想の範疇内において各種の変更例または修正例に想到し得ることは明らかであり、それらについても当然に本発明の技術的範囲に属するものと了解される。
【符号の説明】
【００４９】
１、３０………細胞収集装置
３………プレート
７………ウェル
９………樹脂フィルム
１１………ホルダー
１３………透明板
１５………計測器
１７………レーザ源
１９………ミラー
２１………細胞
２１ａ………回収細胞
２３………穴
３１………チャンバ
３３………加圧部
【図１】
2012254077.tif 000003
【図２】
2012254077.tif 000004
【図３】
2012254077.tif 000005
【図４】
2012254077.tif 000006
【図５】
2012254077.tif 000007
【図６】
2012254077.tif 000008
【図７】
2012254077.tif 000009