(57)【要約】【課題】致死性、全身性、呼吸器或いは消化器疾患を起こすサルモネラ症を予防するための不活化抗原を用いたワクチンを提供する。【解決手段】サルモネラ菌増殖用培地に特定の塩、有機酸を加え、免疫応答反応を高める効果を有する防御関連蛋白の発現を誘導する。得られた菌体を不活化し、リポソームを主体とするアジュバントと組み合わせることにより、実用性の高いサルモネラ用不活化ワクチンとなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルモネラ菌が増殖し得る基本的な培地に特定の添加物を加え、感染防御に有用な蛋白質の発現を誘導したサルモネラ菌を用いることを特徴とするサルモネラ菌症用ワクチン製剤。
【請求項２】
サルモネラ菌の全菌体及び／又は菌体破砕物を不活化することを特徴とする請求項１に記載のワクチン製剤。
【請求項３】
特定の添加物が、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酪酸、プロピオン酸、ナリジクス酸、エタノール、シュクロース、過酸化水素或いはビピリジルから少なくとも１種選択されることを特徴とする請求項１〜２に記載のワクチン製剤。
【請求項４】
添加物の濃度が、塩化ナトリウム０．５〜６％、酢酸ナトリウム１０〜４００ｍＭ、ビピリジル０．０５〜０．３ｍＭの範囲であることを特徴とする請求項１〜３に記載のワクチン製剤。
【請求項５】
サルモネラ菌がサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・コレラスイス、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｅｓ）、サルモネラ・ダブリン（Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ）、サルモネラ・インファンティス（Ｓ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）である請求項１〜４に記載のワクチン製剤。
【請求項６】
塩化ナトリウム及びビピリジルを添加して培養したサルモネラ・ティフィムリウムの菌体破砕物を不活化したことを特徴とする請求項１〜４に記載のワクチン製剤。
【請求項７】
酢酸ナトリウムを添加して培養したサルモネラ・コレラスイスの全菌体を不活化したことを特徴とする請求項１〜４に記載のワクチン製剤。
【請求項８】
アジュバントに水酸化アルミニウムゲル、リポソーム、油性アジュバントなどを用いることを特徴とする請求項１〜７に記載のワクチン製剤。
【請求項９】
リポソームが、水素添加大豆リン脂質、コレステロール、塩化ジステアリル・ジメチルアンモニウムを組成とし、ポリオキシエチレンステロール、ポリエチレングリコール脂肪酸エステルなどの修飾ポリエチレングリコールを含むことを特徴とする請求項１〜８に記載のワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、動物のサルモネラ症を予防する不活化ワクチン製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】サルモネラ菌は、細胞内寄生細菌であり、これに対する防御免疫は細胞性免疫を必要とする。このため病原性に関与する遺伝子を欠損させた弱毒生ワクチンの開発が進められている。ａｒｏＡ，ａｒｏＣ，ｈｕｐＡ，ｄｌｋｓＡなどの病原性に関与する遺伝子を欠損させれば、細胞内寄生の効率や生存率が低下するなどの作用を表す。しかし、弱毒生ワクチンはサルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）の病原性プラスミド欠損菌以外、産業利用されていないのが現状である。【０００３】サルモネラ菌は、生体内に侵入後、菌が発現する蛋白を変化させる。これは腸内、腸管上皮細胞、マクロファージといった微小環境に対して発現する遺伝子が変化することによる。腸管内ではＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｉｓｌａｎｄ  １（ＳＰＩ１）の遺伝子群が作用し、腸管上皮細胞やマクロファージ内ではＳＰＩ２の遺伝子群が作用してこれらに対応する蛋白質が発現し、殺菌を免れる。【０００４】細菌の防御に関連する抗原は、定着因子である線毛、運動を司る鞭毛、毒素などが特定されている。しかしながらサルモネラ菌においては、それら単体を抗原としたサブユニット・ワクチンは実験室レベルでは製造できても産業利用には程遠い現状である。【０００５】サルモネラ菌体の不活化ワクチンも状況は同様である。主として鶏用不活化ワクチンとして、Ｏ４群に属するサルモネラ菌の不活化ワクチチン（特許文献１を参照）、それにＯ９群及びＯ７群に属するサルモネラ菌を加えた３価の不活化ワクチン（特許文献２を参照）及びＳ．エンテリティディスの不活化菌体または不活化菌体由来成分からなるワクチンが報告されているに過ぎない（特許文献３を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平６−１９２１２６号
【特許文献２】特開２００９−２１５２２６号
【特許文献３】特開２００２−８０３９６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】サルモネラ菌の弱毒生ワクチンが産業利用されるまでには多くの課題を解決しなければならない。一方、不活化ワクチンでは防御に関連する抗原を効率よく発現させることとサルモネラ菌感染に対する防御免疫を誘導することが必要である。【０００８】多くの不活化ワクチンでは防御免疫を誘導するためにアジュバントを用いている。しかし、用いたアジュバントにより注射部位にワクチンが残留、または注射部位筋肉の変性などの副反応が起こることがある。このため食肉用動物への注射には制限が設けられることがあり、これら制限がないワクチン製剤の開発が望まれている。【０００９】本発明の発明者は、そのようなワクチン製剤の開発のため鋭意研究の結果、サルモネラ感染症の予防に困難と言われた不活化ワクチンで動物の致死性感染を防御、或いは症状を軽減させることに成功した。さらに、産業利用可能な抗原の効率的発現、防御免疫の誘導法及び注射を制限することがないアジュバントを見出した。
【課題が解決するための手段】
【００１０】サルモネラ菌が増殖する基本的な培地（例えば、ＬＢ培地）に酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酪酸、プロピオン酸、ナリジクス酸、エタノール、シュクロース、過酸化水素或いはビピリジルを添加することにより、増殖中のサルモネラ菌に感染防御に関わる抗原蛋白の発現を誘導した。これを不活化した後、全菌体のまま或いはホモジナイザー等で破砕して陽性荷電リポソームなどのアジュバントを加えて、ワクチン製剤とした。
【発明の効果】
【００１１】本発明のワクチン製剤は、サルモネラ菌による致死感染の防御或いは菌の排泄や臨床症状の軽減をすることができる。また、注射部位におけるワクチンの残留や筋肉の変性などの副反応が起きない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】誘導発現した抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図。
【図２】培地の種類と抗原発現量を示した平面図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】本発明は、防御に関連する抗原を誘導・発現させることを目的とし、可能な限り腸管内、細胞内等の微小環境に近似した培地或いは動物体内には無い環境を模した培地で培養したサルモネラ菌を用いたワクチン製剤である。誘導された抗原蛋白は、機能が明らかでないものの、従来の培地で培養したサルモネラ菌体単独に比べ有為に高い免疫誘導効果が得られている。【００１４】サルモネラ菌を増殖する培地として、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）、ラバポート・バシリアディス（ＲＶ）、ミューラーヒントン（ＭＨ）、マグネシウム最小培地（ＭｇＭ）、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）、トリプトース・ソイ・ブロス（ＢＨＩ）、ＥＥＭブイヨン等が挙げられる。これらのうち特に好ましい培地はＬＢ培地である。抗原蛋白発現を誘導する培地添加剤は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、酪酸、プロピオン酸、ナリジクス酸、エタノール、シュクロース、過酸化水素或いはビピリジルなどから１種または複数選択する。【００１５】サルモネラ菌種によって培地、添加物及び培養菌体の形態（全菌体又は菌体破砕物）を適宜変更する。例えばサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）においては、ＬＢ培地に塩化ナトリウムとビピリジルを添加し不活化した菌体破砕物を使用し、サルモネラ・コレラスイスではＬＢ培地に酢酸ナトリウムを添加して不活化した全菌体を使用する。ホルマリンによって不活化後、必要なら超音波、超高圧ホモジナイザー等で破砕しワクチン抗原とする。【００１６】添加物の至適濃度は、以下の通りである；
塩化ナトリウム；０．５〜６ｗ／ｖ％、より好ましくは１〜３ｗ／ｖ％
ビピリジル：０．０５〜０．３ｍＭ、より好ましく０．２〜０．３ｍＭ
酢酸ナトリウム：１０〜４００ｍＭ、より好ましくは３０〜１５０ｍＭ
酪酸：２０〜３００ｍＭ、より好ましくは４０〜２５０ｍＭ
プロピオン酸：５〜５０ｍＭ、より好ましくは２０〜３０ｍＭ
ナリジスク酸：１０〜１００μｇ／ｍｌより好ましくは４０〜７０μｇ／ｍｌ【００１７】効果的な免疫を誘導するために、アジュバントとして水酸化アルミニウムゲル、油性アジュバント、リポソームなどを抗原と混合する。注射部位のワクチンの残留や注射局所筋肉等の変性の少ないリポソームの使用が好ましく、鎖長が２〜２２のポリエチレングリコールの修飾脂肪酸を０．０１〜０．１ｗ／ｖ％含む陽性荷電リポソームが好ましい。
【実施例】
【実施例１】
【００１８】（サルモネラ・コレラスイスの培養）
サルモネラ・コレラスイスを種々の組成の培地で培養し、菌数を測定した。培地はルリア・ベルターニ（ＬＢ）、ラバポート・バシリアディス（ＲＶ）、ミューラーヒントン（ＭＨ）、マグネシウム最小培地（ＭｇＭ）、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）、トリプトース・ソイ・ブロス（ＢＨＩ）、Ｍ９、或いはＬＢ培地に以下の物質を添加したものを用いた。添加物は０．２ｍＭビピリジル、２０ｗ／ｖ％  シュクロース、３ｗ／ｖ％  塩化ナトリウム、１０ｍＭブチレート、３０ｍＭ酢酸ナトリウム、６０μｇ／ｍｌナリジクス酸などである。【００１９】（誘導・発現した抗原の反応性比較）
集菌してリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で菌体を洗浄後、少量の滅菌水に菌を浮遊した。浮遊菌液を６０℃で２０分間感作して遠心上清（加熱抽出抗原）を採取し、蛋白量をＢＣＡ法で測定した。蛋白量を１０μｇ／ｍｌに０．０５ｍｏｌ／Ｌ炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で合わせ、丸底のＥＬＩＳＡプレートのウェルに固相した。サルモネラ・コレラスイス感染豚血清とペルオキシダーゼ標識抗豚ＩｇＧ抗体を用いてＥＬＩＳＡ（酵素抗体）法を行い、誘導・発現した抗原の感染豚血清との反応性を比較検討した。【００２０】（誘導・発現した抗原の分子量）
先の加熱抽出抗原をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、ゲルをクマシー・ブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色して誘導・発現した抗原の分子量を比較検討した（図１参照）。【００２１】（抗血清との反応性）
菌数は７×１０７〜４．９×１０９ｃｆｕ／ｍｌで、最小がマグネシウム最小培地（ＭｇＭ）、最高が３０ｍＭ酢酸ナトリウム添加ＬＢ（ｐＨ６．７）培地で培養した時であった。ＥＬＩＳＡ法によるサルモネラ・コレラスイス感染豚血清との反応性は、３ｗ／ｖ％塩化ナトリウム添加ＬＢ培地、１０ｍＭブチレート添加ＬＢ培地、３０ｍＭ酢酸ナトリウム添加ＬＢ培地（ｐＨ６．７）の順に良かった（図２参照）。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる加熱抽出抗原の解析では、０．２ｍＭビピリジル添加ＬＢ培地、２０ｗ／ｖ％シュクロース添加ＬＢ培地、３ｗ／ｖ％塩化ナトリウム添加ＬＢ培地、３０ｍＭ酢酸ナトリウム添加ＬＢ培地で培養・作製した時、高分子量領域で他の検体との違いが認められた（図１参照）。
【実施例２】
【００２２】（ワクチンの製造）
サルモネラ・コレラスイスをＬＢ培地で３７℃、一晩振盪培養した。次に、３ｗ／ｖ％塩化ナトリウム添加ＬＢ培地、３０ｍＭ酢酸ナトリウム添加ＬＢ培地（ｐＨ６．７）、５ｗ／ｖ％トリプトース・フォスフェイト・ブロス（ＴＰＢ）添加ＭｇＭ培地、１０ｗ／ｖ％ＴＰＢ添加Ｍ９培地の各培地へ菌液を１／１００量接種して３７℃で一晩振盪培養した。各培養菌液を７，０００ｒｐｍ、４℃、２０分間の遠心にかけ集菌した。菌体を元の培地の１／１０量のりん酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）に浮遊し、ホルマリンを０．３ｖｏｌ％加えた。３７℃で一晩感作して菌を不活化した。【００２３】陽性荷電リポソームは、水素添加大豆リン脂質０．６ｗ／ｖ％、コレステロール０．３ｗ／ｖ％、塩化ジステアリル・ジメチルアンモニウム０．１５ｗ／ｖ％を組成とし、ジステアリン酸ポリエチレングリコール０．０２ｗ／ｖ％を少量のクロロホルムに溶解して薄膜法で作製した。この陽性荷電リポソームと不活化前生菌数で約１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌとした各菌体抗原を等量に混合した。
【実施例３】
【００２４】実施例２で調製した４種の不活化ワクチンを１群２頭の３週齢のＳｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｒｅｅｐａｔｈｏｇｅｎ（ＳＰＦ）豚の頸部筋肉内に１ｍｌを３週間隔２回注射した。また攻撃試験として、３週後にＬＢ培地で培養したサルモネラ・コレラスイスＮｏ．３株（動物衛生研究所より分与）１．９６×１０１０ｃｆｕを鼻腔内に投与した。結果を表１に示す。【００２５】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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