(57)【要約】【課題】フラーレン誘導体を含む光増感性が高く、水溶性の光増感性材料を提供する。【解決手段】本発明は、（１）親水性基と疎水性基とを含む脂質分子から構成されるリポソームの内部に所定のＣ６０フラーレン誘導体が存在するフラーレン含有リポソーム、または（２）シクロデキストリンに所定のＣ６０フラーレン誘導体が包接されたフラーレン−シクロデキストリン錯体を含む光増感性材料を用いることで、光増感性が高く、水溶性の光増感性材料を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）または（２）であらわされるＣ６０フラーレン誘導体を包含した包含材料であって、親水性基と疎水性基とを含む脂質分子から構成されるリポソームの内部に前記Ｃ６０フラーレン誘導体が存在するフラーレン含有リポソーム、または
シクロデキストリンに前記Ｃ６０フラーレン誘導体が包接されたフラーレン−シクロデキストリン錯体を含む光増感性材料。
【化１】
2012184199.tif 000009
（Ｒ１は水素または、親水性官能基を有する置換基または原子団を表す。Ｒ２およびＲ３は同一または、異なっていてもよく、水素、置換基または原子団を表す。Ｘ−はカウンターアニオンを表す。）
【請求項２】
請求項１記載の光増感性材料であって、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素または、少なくとも１の炭素を含み炭素数１０以下の置換基または原子団である光増感性材料。
【請求項３】
請求項２記載の光増感性材料であって、Ｒ１は親水性官能基を有するアルキル基、エステル基、エーテル基、アミド基またはアシル基のいずれかである光増感性材料。
【請求項４】
請求項２記載の光増感性材料であって、Ｒ２およびＲ３は炭素数６以下のアルキル基または、炭素数１０以下のエチレングリコール鎖である光増感性材料。
【請求項５】
請求項１から４記載の光増感性材料であって、前記光増感性材料に含まれるフラーレン含有リポソームの内部に存在するＣ６０フラーレン誘導体がリポソームを構成する脂質分子の親水性基に近接して存在する光増感性材料。
【請求項６】
請求項１から５記載の光増感性材料であって、前記光増感性材料に含まれるフラーレン含有リポソームの内部に、可視光領域に吸収波長を持つ蛍光物質が存在する光増感性材料。
【請求項７】
請求項１記載または２に記載の光増感性材料であって、前記光増感性材料に含まれるフラーレン含有リポソームの内部に存在する蛍光物質がリポソームを構成する脂質分子の親水性基に近接して存在する光増感性材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定のフラーレン誘導体および、シクロデキストリン、リポソームを用いた水溶化可能な光増感性材料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
フラーレンは、ナノテクノロジーの分野の新素材として、エレクトロニクス、医薬品、化粧料など様々な分野での活用が注目されている。例えば、フラーレンの高い耐熱性を利用した耐熱材料や、高い電荷輸送性を利用した燃料電池の固体電解質材料などへの応用がある。その他にも、有機光電変換素子として有機太陽電池、光センサ等への適用が開発されている。また、フラーレンの高い電子受容性を利用した人工光合成系構築の研究が報告されている。医薬品分野では光線力学療法用薬剤、抗HIV医薬、MRI用造影剤など種々の応用が開発されている。
【０００３】
フラーレンは炭素原子からなる球状の構造を持つ化合物である。代表的なものに６０個の炭素原子からなるＣ６０フラーレンが挙げられる。炭素数６０個よりも多いものを高次フラーレンといい、炭素数が７０個のＣ７０フラーレン、炭素数が７４個、７６個のものなど種々のものがある。また、球状の構造内に金属を内包した金属内包フラーレンがある。特に、安価に製造でき、化学的安定性に優れるＣ６０フラーレンが種々の用途に用いられる。
【０００４】
光増感性とは、光照射によってエネルギー移動を誘発する作用をいい、例えば酸素との共存によって活性酸素種を発生する能力などがある。フラーレンは、光照射をした場合、光エネルギーによってエネルギー移動を起こしやすい光増感性物質であることが知られており、光エネルギーによって種々の作用を生じる。例えば、Ｃ６０フラーレンやＣ７０フラーレンなどの一部の高次フラーレンでは光の照射によって酸素分子とのエネルギー移動により活性酸素種が発生し、金属内包フラーレンや一部の高次フラーレンでは活性酸素種の一種である一重項酸素とのエネルギー移動により、酸素分子が発生しやすいことが報告されている（特許文献１）。活性酸素種は、一重項酸素やフリーラジカルなどをいい、化学的に不安定で高い反応活性を持っている。このような性質を利用して、所定のターゲットに対する反応活性を持たせることで、選択的な物質の排除や情報の伝達などを実現することができる。
【０００５】
光増感性、特に光照射によって活性酸素種を発生する能力を有する物質は光線力学的治療法（photodynamic therapy：以下「PDT」ともいう。）におけるPDT薬剤として利用可能である。PDTは、PDT薬剤をがん腫瘍に直接導入したのち、もしくは静脈注射などによって体内に導入の上がん細胞に蓄積させたのち、光を照射することで活性酸素を発生させ、がん細胞を殺傷して、がんの治療を行う治療法である。このようなPDT薬剤への適合性を光線力学活性という。フラーレンは、一重項酸素やフリーラジカルなどの活性酸素種の発生能が高く、PDTにおいて高い光線力学活性を示す。PDTに適用可能なフラーレンとして、光照射によって活性酸素種を発生することができるＣ６０フラーレンやＣ７０フラーレンなどがある。
【０００６】
フラーレンは光増感性他の優れた特性を示すにもかかわらず、水や極性の高い有機溶媒への溶解性が低いため、産業応用性の向上が難しいという問題がある。その解決のため、フラーレンの誘導化や可溶化剤の添加など種々の検討がなされている。例えば、フラーレン骨格に極性官能基である水酸基（OH基）を導入した水酸化フラーレン誘導体があり、エステル系溶媒への高溶解性を示す水酸化フラーレン誘導体などが合成されている（特許文献２）。また、エーテル系溶媒など各種有機溶媒に高い溶解性を示すフラーレン誘導体が合成されている（特許文献３）。さらに、種々のフラーレン誘導体が報告されている。例えば、フラーレン誘導体の水中における電子受容能の評価、あるいはフラーレン誘導体−ＤＮＡハイブリッド錯体などが報告されている（非特許文献１から５）。
【０００７】
本発明者らはこれまでに、フラーレンを水に可溶化する方法を提案している。例えば、フラーレンに可溶化剤として、シクロデキストリンなどの多糖類やリポソーム、ポリマー類を加えて撹拌・混合することによりフラーレンを可溶化する方法がある（特許文献４、５、６、非特許文献１）。非特許文献６において、Ｃ６０フラーレン誘導体とシクロデキストリンとの錯体とその製造方法が開示されている。しかし、いずれの先行文献においても、フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体の可視光下における光増感性について言及されていない。
【０００８】
以下に先行技術文献を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００８−７４７６６
【特許文献２】特開２０１０−１１６３８０
【特許文献３】特開２００９−１３５２３７
【特許文献４】特開２００６−０６９８１２
【特許文献５】ＷＯ２００７／１３２９２３
【特許文献６】ＷＯ２００８／０９６７７９
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】D. M. Guldi, H. Hungerbuhler, K.-D. Asmus, J.Phys. Chem. A, 1997, 101, 1783.
【非特許文献２】A. M. Cassell, W. A. Scrivens, J. M. Tour,Angew. Chem.,Int. Ed. 1998, 37, 1528.
【非特許文献３】M. Maggini, A. Karlsson, L. Pasimeni, G .Scorrano, M. Prato, L. Valli, Tetrahedron Lett., 1994, 35, 2985.
【非特許文献４】I. Lamparth, A. Hirsch, J. Chem. Soc., Chem.Commun. 1994,1727.
【非特許文献５】C. Bingel, Chem. Ber. 1993, 126, 1957.
【非特許文献６】A. Ikeda, T. Genmoto, N. Maekubo, J. Kikuchi, M.Akiyama, T. Mochizuki, S. Kotani, T. Konishi, Chem. Lett. 2010, 39, 12, 1256.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
未修飾のＣ６０フラーレンやＣ７０フラーレンは水に全く溶解しないことが知られている。親水性置換基を導入したフラーレン誘導体は、その多くが自己会合しミセルとなって水溶化する。このようなミセル形成は、フラーレン誘導体を光増感性物質として利用する場合、光励起されたフラーレン誘導体による自己失活を招くという問題の原因となっている。つまり、水溶液中でミセルが形成されているために、フラーレン誘導体が受け取った光エネルギーを他に伝達する前に熱エネルギーとして失ってしまい、光増感性の低下、光活性の低下を招いている。
【００１２】
そこで、この問題を解決するため、可溶化剤を用いて未修飾フラーレンを可溶化する方法が提案されている。しかし、可溶化剤が光励起された未修飾フラーレンと溶存酸素を含めた基質間でのエネルギー移動を立体的に妨げるという問題が起こっている。そのため、可溶化剤を用いて水溶化した未修飾フラーレンについても光増感性が低いという問題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明者らは、所定の置換基を持つＣ６０フラーレン誘導体を用いることで、上記の問題を解決し、光活性が高くかつ水溶液化可能なＣ６０フラーレン誘導体を含有する光増感性材料を開発した。本発明は、リポソームまたはシクロデキストリンを合わせて用いることで水溶化可能であり、高い光活性を示す所定のＣ６０フラーレン誘導体を開発することによって、活用範囲の広い光増感性材料を実現した。
【００１４】
本発明の光増感性材料は、下記式（１）または（２）であらわされるＣ６０フラーレン誘導体を包含した包含材料であって、親水性基と疎水性基とを含む脂質分子から構成されるリポソームの内部に前記Ｃ６０フラーレン誘導体が存在するフラーレン含有リポソーム、またはシクロデキストリンに前記Ｃ６０フラーレン誘導体が包接されたフラーレン−シクロデキストリン錯体を含む。
【００１５】
【化１】
2012184199.tif 000002
（Ｒ１は水素または、親水性官能基を有する置換基または原子団を表す。Ｒ２およびＲ３は同一または、異なっていてもよく、水素、置換基または原子団を表す。Ｘ−はカウンターアニオンを表す。）
【００１６】
本発明の光増感性材料は、所定のＣ６０フラーレン誘導体が、シクロデキストリンに包接されたフラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体を含む光増感性材料または、所定のＣ６０フラーレン誘導体が、親水性基と疎水性基とを含む脂質分子から構成されるリポソームの内部に存在するフラーレン誘導体含有リポソームを含む光増感性材料である。本発明所定のＣ６０フラーレン誘導体は包含材料であるシクロデキストリンまたはリポソームを用いることで、容易に水溶性化することができる。さらに、水溶化された本発明所定のＣ６０フラーレン誘導体包含材料によれば、Ｃ６０フラーレン誘導体の光増感性を高効率で得ることができ、高性能の光増感性物質を得ることができる。
【００１７】
本発明の光増感性材料は、前記光増感性材料に含まれる包含材料に包含されるＣ６０フラーレン誘導体のＲ１、Ｒ２およびＲ３が、水素または、少なくとも１の炭素を含み炭素数１０以下の置換基または原子団であることが好ましい。なお、包含材料に包含されるとは、包含材料がシクロデキストリンの場合、シクロデキストリンに包接されることを意味し、包含材料がリポソームの場合、リポソームの内部に存在することを意味する。
【００１８】
本発明の光増感性材料は、前記光増感性材料に含まれる包含材料に包含されるＣ６０フラーレン誘導体のＲ１は、親水性官能基を有するアルキル基、エステル基、エーテル基、アミド基またはアシル基のいずれかであることが好ましい。親水性官能基を有することにより、包含材料との組み合わせによって、より容易に水溶化できる。
【００１９】
本発明の光増感性材料は、前記光増感性材料に含まれる包含材料に包含されるＣ６０フラーレン誘導体のＲ２およびＲ３は、炭素数６以下のアルキル基または、炭素数１０以下のエチレングリコール鎖であることが好ましい。Ｒ２およびＲ３が結合する窒素原子は、正の電荷を帯びており、包含材料との組み合わせによって、水溶化の性能がより高くなる。カウンターアニオン（Ｘ−）は、適宜負の電荷を帯びたイオンを用いることができる。
【００２０】
本発明の光増感性材料は、前記光増感性材料に含まれるフラーレン誘導体含有リポソームの内部に存在するＣ６０フラーレン誘導体がリポソームを構成する脂質分子の親水性基に近接して存在することが好ましい。近接して存在することにより、溶液中に存在する溶存酸素とリポソーム内に存在するＣ６０フラーレン誘導体との接触が容易となり、Ｃ６０フラーレン誘導体の活性酸素種発生効率を高めることができる。
【００２１】
本発明の光増感性材料は、前記光増感性材料に含まれるフラーレン誘導体含有リポソームの内部に、可視光領域に吸収波長を持つ蛍光物質が存在することが好ましい。蛍光物質をＣ６０フラーレン誘導体に合わせて存在させることにより、Ｃ６０フラーレン誘導体のエネルギー移動の効率を高め、活性酸素種発生効率を高めることができる。
【００２２】
本発明の光増感性材料は、前記光増感性材料に含まれる蛍光物質がリポソームを構成する脂質分子の親水性基に近接して存在することが好ましい。リポソーム内で、Ｃ６０フラーレン誘導体や蛍光物質が、リポソームを構成する脂質分子の親水性基に近接して存在することで、活性酸素種発生効率を高めることができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の光増感性材料によれば、水溶性が高く、かつ光増感性の高い材料を得ることができる。特に、未修飾のフラーレンを含有した含有材料を細胞に導入した場合と比較して、光照射による細胞致死率の向上が確認された。（１）シクロデキストリン錯体の系においては、未修飾Ｃ６０フラーレン、Ｃ７０フラーレンに比べての光細胞致死率の向上を達成した。さらに、（２）リポソームの系においては未修飾Ｃ６０フラーレンに比べての一重項酸素の発生量の向上、およびそれに基づく、光細胞致死率の向上を達成した。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は本発明の実施例および比較例に用いられるＣ６０フラーレン誘導体を示した図である。
【図２】図２はフラーレン誘導体含有リポソームにおける一重項酸素発生のメカニズムを模式的に表した図である。
【図３】図３は本発明のフラーレン誘導体含有リポソームの作製方法の模式図である。
【図４】図４は本発明の光増感性材料に用いられるフラーレン誘導体の可視から紫外光領域での吸収スペクトルを示した図である。
【図５】図５は本発明の光増感性材料に用いられるフラーレン誘導体の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示した図である。
【図６】図６は本発明のＣ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体の光線力学活性を示した図である。
【図７】図７は本発明のＣ６０フラーレン誘導体含有リポソームの光線力学活性を示した図である。
【図８】図８は本発明のＣ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体の一重項酸素の発生能を示した図である。
【図９】図９は本発明のＣ６０フラーレン誘導体含有リポソームの一重項酸素の発生能を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明のフラーレンは、炭素数６０のフラーレンを用いる。このようなフラーレンは、適宜市販品を用いることができる。
【００２６】
本発明に用いられるＣ６０フラーレン誘導体の一例を以下に示す。
【化２】
2012184199.tif 000003
（Ｒ１は水素または、親水性官能基を有する置換基または原子団を表す。Ｒ２およびＲ３は同一または、異なっていてもよく、水素、置換基または原子団を表す。Ｘ−はカウンターアニオンを表す。）
【００２７】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は親水性官能基を有する置換基または原子団を表す。この置換基または原子団は、少なくとも１の炭素を含み、炭素数１０以下の置換基または原子団であることが好ましい。Ｃ６０フラーレン誘導体の置換基は、親水性であることが必要である。上記（１）式のＣ６０フラーレン誘導体の置換基においては、親水性官能基が含まれる。上記（２）式のＣ６０フラーレン誘導体の置換基においては、置換基中の窒素原子（Ｎ）が正の電荷を帯びており、この正の電荷の存在の効果によって、親水性が確保される。カウンターカチオンは適宜選択することができる。
【００２８】
特に、Ｒ１は親水性官能基を有するアルキル基、エステル基、エーテル基、アミド基またはアシル基であることが好ましい。置換基または原子団の一部が親水性官能基によって置換されていてもよい。親水性官能基は、カチオン性、アニオン性、または中性のいずれであってもよい。カチオン性の親水性官能基は、例えば、アンモニウム基、ピリジニウム基など、アニオン性の親水性官能基は、例えば、カルボネート基（カルボン酸イオン）、スルホネート基（スルホン酸イオン）、ホスホネート基（リン酸イオン）など、中性の親水性官能基はオリゴエチレングリコール鎖、ポリエチレングリコール鎖などがこのましい。Ｒ２とＲ３は同一でも、異なっていてもよく、炭素数６以下の低級アルキル基または、炭素数１０以下のエチレングリコール鎖であることが好ましい。また、Ｃ６０フラーレン誘導体の置換基または原子団は、直鎖状であってもよく、枝分かれしていてもよい。
【００２９】
Ｃ６０フラーレンに導入する置換基は、例えば上記（２）式の化合物において、メチル基であることが好ましい。置換基をメチル基とすることでより容易に製造をすることができる。Ｃ６０フラーレンに置換基を導入する位置は、特に限定されない。Ｃ６０フラーレンに導入する置換基の数は、複数の置換基を導入することも可能であるが、１であることが好ましい。複数の置換基を導入する場合、高水溶性と高光増感性を実現するための置換基の数や、導入位置をコントロールすることが難しくなる。
【００３０】
本発明に用いられるシクロデキストリンは、グルコースが５個以上結合したものであればよく、グルコースが６個結合したα-シクロデキストリン（シクロヘキサアミロース）、７個結合したβ-シクロデキストリン（シクロヘプタアミロース）、８個結合したγ-シクロデキストリン（シクロオクタアミロース）、９個連結したδ-シクロデキストリンなどを用いることができる。特にγ-シクロデキストリンであることが好ましい。γ-シクロデキストリンを用いることで、本発明のＣ６０フラーレン誘導体をより確実に包接することができる。
【００３１】
本発明に用いられるリポソームは、脂質二重膜で構成される複合体であり、脂質二重膜は親水性基と疎水性基を含む脂質分子によって構成される。リポソームの具体的な組成は、特に限定されるものではなく、脂質分子は用途や目的に応じて、カチオン性脂質、アニオン性脂質および中性脂質を単独でまたは組み合わせて用いることができる。本発明の光増感性材料としては、リポソームの直径は４０〜５００ｎｍ、好ましくは５０〜２００ｎｍである。リポソームの膜厚は、選択する脂質分子によっても異なるが、３〜１０ｎｍ、好ましくは４〜７ｎｍである。
【００３２】
本発明のフラーレン誘導体含有リポソームにおいて、Ｃ６０フラーレン誘導体や蛍光物質がリポソーム内部に存在するとは、リポソームを構成する脂質二重膜の膜内部に存在することを意味する。なお、Ｃ６０フラーレン誘導体や蛍光物質が存在する脂質二重膜の膜内部の位置は、疎水性基同士が向かい合う膜中心部から親水性基に近いリポソーム表面付近までいずれの位置であってもよい。特に、Ｃ６０フラーレン誘導体や蛍光物質が膜内部において親水性基に近接して存在することが好ましい。このような位置に存在することで、光励起されたＣ６０フラーレン誘導体から溶存酸素へエネルギーを移動させることが容易となるため、活性酸素種をより効率的に発生させることができる。
【００３３】
図２は、リポソーム内部の親水性基にＣ６０誘導体が接している場合の一重項酸素発生の模式図である。図２中（Ａ）では未修飾のＣ６０フラーレンがリポソーム膜内でリポソームを構成する脂質分子の疎水性基の間に存在しており、図２中（Ｂ）では本発明のＣ６０フラーレン誘導体がリポソーム膜内でリポソームを構成する脂質分子の親水性基に近接して存在していることを示している。リポソーム表面近傍にＣ６０フラーレン誘導体が存在していることが、効率的な発生に資するといえる。
【００３４】
本発明に用いられる可視光領域に吸収波長を持つ蛍光物質は、波長が５００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲の光を吸収し得る物質であって、当該物質は光を吸収して光エネルギーを生成することを特徴とする。当該物質が生成する光エネルギーはすなわち蛍光である。このような物質として、カルボシアニン系色素、ローダミン系色素が挙げられる。蛍光物質が発生する光エネルギーを、本発明のＣ６０フラーレン誘導体が吸収してより高い光増感性を発揮することができる。蛍光物質は、上記Ｃ６０フラーレン誘導体と同様にリポソーム内部に存在しており、リポソームを構成する脂質分子の親水性基に近接して存在することが好ましい。
【００３５】
本発明のＣ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体の作製方法は、特に限定されないが、例えば高速振動粉砕法によって作製することができる。高速振動粉砕法用いたＣ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体の製造方法の一例を以下に示す。Ｃ６０フラーレン誘導体とシクロデキストリンを、高速振動粉砕容器に入れ、高速振動粉砕を行う。例えば、振動数は１０〜６０Ｈｚ、好ましくは２０〜４０Ｈｚ、振動時間は１０〜６０分好ましくは１５〜４５分とすることができる。振動数、振動時間は、高速振動装置の性能や振動方法などにより、適宜選択することができる。その後、水を加えて撹拌し、遠心分離にて不溶成分を取り除いて、褐色の上澄み液を採取する。この上澄み液が、Ｃ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体水溶液である。高速振動粉砕法については特開２００９−２３８８６を参考に当該方法を用いることができる。
【００３６】
本発明のＣ６０フラーレン誘導体含有リポソームの作製方法は、特に限定されないが、本発明のＣ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体とリポソームの交換反応によって作製することができる。交換反応は、Ｃ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体とリポソームを水中にて混合し、撹拌することによって達成される。水温は５０〜１００度、好ましくは７０〜９０度、撹拌時間１０分〜３時間、好ましくは３０分〜２時間とすることができる。水温、撹拌時間は、撹拌方法などにより、適宜選択することができる。このように作製されたＣ６０フラーレン誘導体含有リポソーム水溶液を本発明の光増感性材料とすることができる。
【００３７】
さらに、上記Ｃ６０フラーレン誘導体含有リポソーム水溶液について、メンブランフィルター付き遠沈管を用いた遠心分離により、シクロデキストリンを除くことができる。遠心分離後のろ液にシクロデキストリンが含まれており、ろ取したものがＣ６０フラーレン誘導体含有リポソームである。ろ取したＣ６０フラーレン誘導体含有リポソームを水に分散させることによって、Ｃ６０フラーレン誘導体含有リポソーム水溶液を得て、光増感性材料とすることができる。
【００３８】
本発明の光増感性材料は、Ｃ６０フラーレン誘導体を含むリポソームまたはＣ６０フラーレン誘導体を含むシクロデキストリン以外の材料を含むことができる。例えば、光増感性を発揮すべきターゲットまで光増感性材料を導くための物質として糖、葉酸や５−アミノレブリン酸などの低分子をはじめ、抗体、ペプチドやタンパク質などを導入できる。また、混合物として、シクロデキストリンが含まれていてもよい。本発明の光増感性材料は、種々の物質に含ませることができる。また、本発明の光増感性材料をほかの薬剤と合わせて用いることができる。また、本発明の光増感性材料を脱水乾燥して固形化、あるいはゲル化剤などによりゲル化して用いることができる。
【実施例１】
【００３９】
＜１＞Ｃ６０フラーレン誘導体の合成
以下の方法により、本発明の実施例に用いるＣ６０フラーレン誘導体を得た。実施例１および比較例１にて合成したＣ６０フラーレン誘導体およびＣ６０フラーレンを図１に示す。
【００４０】
図１中、化合物１１から化合物１３のＣ６０フラーレン誘導体については、非特許文献１から３を参照し、化合物１５のＣ６０フラーレン誘導体については、非特許文献３を参照し合成した。化合物１４は、以下の通り合成した。３０．０  ｍｇ（０．０３７  ｍｍｏｌ）のフレロピロリジン（化合物１５）をトルエン５０ｍｌに溶解し、そこへ無水コハク酸３７．０ｍｇ（０．３７ｍｍｏｌ）を加え還流した。６時間後、室温まで放冷し、沈殿物をろ取した。トルエンで洗浄して褐色の固体を得た。化合物１６および１７は以下の通り合成した。化合物１５もしくは化合物１１のシクロデキストリン錯体、もしくはリポソームに含有した水溶液に１Ｍの塩酸を加えた。合成経路を下記に示す。
【００４１】
【化３】
2012184199.tif 000004
【００４２】
その結果、下の通り式（１１）から式（１７）に示すフラーレン誘導体を得た。式（１２）のカウンターアニオンはＩ−（ヨウ素イオン）である。カウンターアニオンは、I（ヨウ素）以外にもCl、Br、NO3、BF4、PF6、ClO4、CH3OSO3などを用いることができるが、これらに限定されず、種々のものを用いることができる。
【００４３】
【化４】
2012184199.tif 000005
（Meはメチル基を表す。）
【００４４】
＜２＞Ｃ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体の作製
Ｃ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体を高速振動粉砕法によって作製する。前記の方法によって得た式（１１）から式（１４）のＣ６０フラーレン誘導体のそれぞれについて、６．９４ｍｍｏｌを、γ−シクロデキストリン２７．８ｍｍｏｌ（和光純薬製）を、高速振動粉砕容器に入れ、高速振動粉砕を２０分３０Ｈｚで行った。その後、得られた混合物に１．５ｍｌの水を加えて撹拌し、遠心分離にて不溶成分を取り除いて、褐色の上澄み液を採取した。この上澄み液が、Ｃ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体水溶液である。この水溶液を本発明の光増感性材料とすることができる。
【００４５】
＜３＞Ｃ６０フラーレン含有リポソームの作製
Ｃ６０フラーレン含有リポソームをＣ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体とリポソームの交換反応によって作製する。ここで用いたリポソームは日油株式会社製ジパルミトイルホスファチジルコリン（Dipalmitoylphosphatidylcholine：ＤＰＰＣ）と合成したカチオン性脂質の９：１（モル比）である。前記の方法によって得た（化４）式（１１）から式（１４）のＣ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体のそれぞれについて、０．２ｍＭ、０．５ｍＬと、リポソーム２ｍＭ（脂質濃度）、０．５ｍＬを混合する。この混合物を、８０度にて1時間撹拌を行った。これによりＣ６０フラーレン誘導体含有リポソーム水溶液が得られた。この水溶液を本発明の光増感性材料とすることができる。図３に作製方法の模式図を示す。図３において、「１２−シクロデキストリン錯体」とは（化４）式（１２）のフラーレン誘導体とγ−シクロデキストリンの錯体を、「１２含有リポソーム」とは、（化４）式（１２）のフラーレン誘導体を含有するリポソームを示す。
【００４６】
なお、温度条件が３０度の場合は、前記リポソームへのＣ６０フラーレン誘導体の交換反応は起こらなかった。また、同様に温度条件が３０度の場合は、未修飾のＣ６０フラーレンは、交換反応は起こらず、未修飾のＣ７０フラーレンは、交換反応が起こり、シクロデキストリンから外れて疑似細胞膜であるリポソームに移動した。なお、未修飾のＣ６０シクロデキストリン錯体とＣ７０シクロデキストリン錯体の直接的な細胞導入はすでに報告されている（A. Ikeda, M. Matsumoto, M. Akiyama, J. Kikuchi,
T. Ogawa, T. Takeya, Chem. Commun., 2009, 1547.）。
＜比較例１＞
＜１＞Ｃ６０フラーレン誘導体の合成
【００４７】
図１の化合物２１および化合物２２のＣ６０フラーレン誘導体については、非特許文献４および５を参照し、合成した。その結果、下の（化５）式（２１）および式（２２）に示すフラーレン誘導体を得た。
【００４８】
【化５】
2012184199.tif 000006
（Etはエチル基を表す。）
【００４９】
＜２＞Ｃ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体の作製
Ｃ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体を高速振動粉砕法によって作製する。前記の方法によって得た（化５）式（２１）および式（２２）のＣ６０フラーレン誘導体のそれぞれについて、前記（化４）式（１１）から式（１４）のＣ６０フラーレン誘導体と同様に高速振動粉砕法にて、Ｃ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン混合水溶液を得た。フラーレン誘導体（２１）については図５Ｆから１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおいてフラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体に基づくピークが観測できなかったことから錯体を形成していないことがわかる。一方フラーレン誘導体（２２）は図４においてフラーレンに基づく吸収がほとんど見られないことから溶解していないことがわかる。したがって、（化５）式（２１）および式（２２）のＣ６０フラーレン誘導体からＣ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体を作製することはできなかった。
【００５０】
以上の実施例および比較例により得た図１のフラーレン誘導体（１１）から（１４）、（２１）、（２２）およびＣ６０フラーレンについてフラーレン−シクロデキストリン錯体の可視−紫外吸収スペクトルを図４に示す。この図から、４３０ｎｍ付近のフラーレン誘導体に特徴的な吸収がはっきり確認できることから、フラーレン誘導体（１１）から（１４）およびＣ６０フラーレンは会合せず分散した状態で可溶化していることがわかる。一方、フラーレン誘導体（２１）については吸収がブロードとなっているため会合していることがわかる。さらに、フラーレン誘導体（２２）はフラーレンに基づく吸収がほとんど見られないことから溶解していないことがわかる。
【００５１】
以上の実施例および比較例により得た図１のＣ６０フラーレンおよびフラーレン誘導体（１１）から（１４）および（２１）について、フラーレン−クロデキストリン錯体の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図５に示す。図中、白丸は錯体形成していないγ−シクロデキストリン、黒丸はフラーレンと錯体を形成しているγ−シクロデキストリンによるピークを示す。図中、（Ａ）はＣ６０−シクロデキストリン錯体、（Ｂ）はフラーレン誘導体（１１）−シクロデキストリン錯体、（Ｃ）はフラーレン誘導体（１２）−シクロデキストリン錯体、（Ｄ）はフラーレン誘導体（１３）−シクロデキストリン錯体、（Ｅ）はフラーレン誘導体（１４）−シクロデキストリン錯体、（Ｆ）はフラーレン誘導体（２１）−シクロデキストリン混合物のスペクトルを示す。この図から、比較例（２１）のフラーレン誘導体は、γ−シクロデキストリンとの錯体が形成されていないことがわかる。これにより、Ｃ６０フラーレン誘導体のうちＣ６０フラーレン誘導体（１１）から（１４）を用いることで、シクロデキストリンとの錯体が形成されることがわかる。
【実施例２】
【００５２】
上記実施例１＜２＞および＜３＞において作製した光増感性材料、および未修飾のフラーレンを含む材料について、HeLa細胞を用いた光線力学活性の評価実験を行った。図６および図７にその結果を示す。光増感性材料のHeLa細胞への導入は、以下の通り行った。シャーレ中で培養したHeLa細胞の培養液中に光増感性材料を添加して、２４時間処理を行った。なお、細胞に取り込まれなかった光増感性材料は、ｐＨ７．４のPBS（リン酸緩衝生理食塩水）による洗浄を行うことで除去した。HeLa細胞に導入するＣ６０フラーレン誘導体は、種々の濃度で実験を行っており、図６および図７の横軸の濃度は、フラーレン誘導体の濃度を示したものである。光増感性材料を導入したHeLa細胞に、２５度の温度条件で、波長４００から７４０ｎｍ、照射光量３７ｍＷｃｍ−２の光を３０分間照射し、２４時間後に細胞生存率を測定することにより、光増感性材料の光線力学活性の評価を行った。
【００５３】
上記実施例１＜２＞において作製した光増感性材料であるＣ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体およびＣ６０フラーレン−シクロデキストリン錯体について、上記評価結果を図６および表１に示す。図６によると、Ｃ６０誘導体（１２）、（１３）および（１４）のシクロデキストリン錯体をHeLa細胞に導入したのち、波長４００から７４０ｎｍの光を照射した場合に、濃度依存的に細胞生存率の低下（もしくは“細胞死”）が確認され、暗所においた場合には、細胞の生存率に変化が見られないことが理解される。これに対し、Ｃ６０フラーレンおよびＣ７０フラーレンおよびＣ６０フラーレン誘導体（１１）のシクロデキストリン錯体では同じ条件で光を照射しても細胞生存率の低下がＣ６０誘導体フラーレン（１２）、（１３）および（１４）のシクロデキストリン錯体に比べあまり起こらないことがわかった。これにより、Ｃ６０誘導体（１２）、（１３）および（１４）のシクロデキストリン錯体が細胞に導入されたこと、またこれらの光増感性材料が光線力学活性を有することが確認できる。
【表１】
2012184199.tif 000007
【００５４】
上記実施例１＜３＞において作製した光増感性材料であるＣ６０フラーレン誘導体含有（１１）（１２）リポソームおよびＣ６０フラーレン含有リポソーム、Ｃ７０フラーレン含有リポソームについて、上記評価結果を図７および表２に示す。図７中（Ａ）と（Ｂ）とは、ｘ軸の濃度の値が異なっている。
【表２】
2012184199.tif 000008
【００５５】
ＩＣ５０とは細胞生存率を５０％阻害する濃度、すなわち５０％致死率におけるフラーレンもしくはフラーレン誘導体の添加濃度をいう。本発明の光増感性材料は、HeLa細胞を用いた光殺傷実験におけるＩＣ５０値が、（i）シクロデキストリン・Ｃ６０フラーレン誘導体（１２）およびＣ６０フラーレン誘導体（１４）−シクロデキストリン錯体では、Ｃ６０フラーレン−シクロデキストリン錯体に比べ約３５倍、Ｃ７０フラーレン−シクロデキストリン錯体に比べ約１６倍向上し、（ii）Ｃ６０フラーレン誘導体（１２）含有リポソームではＣ６０フラーレン含有リポソームに比べ約６６倍、Ｃ７０フラーレン含有リポソームに比べ約９倍向上した。
【実施例３】
【００５６】
本発明の光増感性材料であるＣ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体およびＣ６０フラーレン誘導体含有リポソームの活性酸素種の発生を確認する実験を行った。実験方法は次のとおりである。本発明の光増感性材料と９，１０−アントラセンジプロピオン酸ジナトリウム塩（9,10-anthracenedipropionic acid disodium salt：ADPA）を重水（Ｄ２Ｏ）中に添加する。濃度は未修飾フラーレン光増感性材料およびフラーレン誘導体光増感性材料が１５μＭ、ADPAが２５μＭである。溶液に波長４００ｎｍ以上の光を照射光量１５ｍＷｃｍ−２で照射して、照射時間ごとの光増感性材料からの活性酸素種の発生量を測定する。ADPAは通常の状態では波長４００ｎｍの光を吸収する性質を有する。一重項酸素の存在によって、ADPAの構造が変化し、前記の光を吸収しない構造をとる。これを利用し、照射時間ごとの溶液の光の吸収量を測定することによって、系中の活性酸素種の発生量を測定することができる。
【００５７】
実験の結果を図８および図９に示す。図８および図９において、グラフは光を照射する前の吸収量を１として規格化したものである。図８には、上記実施例１＜２＞において作製した光増感性材料であるＣ６０フラーレン誘導体−シクロデキストリン錯体およびＣ６０フラーレン−シクロデキストリン錯体についての結果を、図９には、上記実施例１＜３＞において作製した光増感性材料であるＣ６０フラーレン誘導体（１１）または（１２）を含有するリポソームおよびＣ６０フラーレン含有リポソーム、Ｃ７０フラーレン含有リポソームについての結果を示す。これにより、本発明の光増感性材料について、顕著に活性酸素種を発生量が多いことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明のＣ６０フラーレン誘導体によって、種々の分野において可視光下での活性酸素発生種としてＣ６０フラーレンを用いることができるので、Ｃ６０フラーレンを活用する用途の選択の幅を広げることができ、種々の装置、システムを高度化することができる。例えば、PDTにおいては、人体に安全な波長領域で効果的にターゲット細胞を破壊するPDTを実現することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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