(57)【要約】      （修正有）【課題】高安定化MHCクラスＩＩタンパク質の提供。【解決手段】ヒトMHCクラスII分子のα又はβサブユニットとして機能する組換えポリペプチドであって、ペプチド結合溝外の位置に導入された少なくとも一つの置換アミノ酸とその周囲のアミノ酸との間の分子間相互作用が増強されることにより、野生型α又はβサブユニットから構成されるヒトMHCクラスII分子と比較して、該組換えポリペプチドを含むヒトMHCクラスII分子の安定性が向上する組換えポリペプチド。【選択図】図２
2012120488.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトMHCクラスII分子のα又はβサブユニットとして機能する組換えポリペプチドであって、ペプチド結合溝外の位置に導入された少なくとも一つの置換アミノ酸とその周囲のアミノ酸との間の分子間相互作用が増強されることにより、野生型α又はβサブユニットから構成されるヒトMHCクラスII分子と比較して、該組換えポリペプチドを含むヒトMHCクラスII分子の安定性が向上することを特徴とする、前記組換えポリペプチド。
【請求項２】
導入された置換アミノ酸とその周囲のアミノ酸と間に水素結合が新たに形成されることにより、ヒトMHCクラスII分子の安定性が向上することを特徴とする、請求項１記載の組換えポリペプチド。
【請求項３】
ヒトMHCクラスIIがHLA- DQである、請求項１又は２記載の組換えポリペプチド。
【請求項４】
以下のいずれかのアミノ酸変異が導入されて成る、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド：
（１）ＤＱＡ１のＮ末端から２番目のアミノ酸（２α）におけるアスパラギン酸；
（２）ＤＱＡ１のＮ末端から４７番目のアミノ酸（４７α）におけるリシン、アルギニン、又はグルタミン；又は
（３）ＤＱＢ１のＮ末端から１４番目のアミノ酸（１４β）におけるメチオニン。
【請求項５】
野生型α又はβサブユニットが疾患感受性アリル由来である、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６】
疾患が自己免疫疾患、感染症、脳神経疾患、又は、薬物有害反応である、請求項５記載の組換えポリペプチド。
【請求項７】
自己免疫疾患が１型糖尿病、セリアック病、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、又は,インスリン自己免疫性症候群（ＩＡＳ）である、請求項６記載の組換えポリペプチド。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子。
【請求項９】
請求項８記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項１０】
α又はβサブユニットの少なくとも一方が請求項１ないし７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドから構成される組換え型ヒトMHCクラスII分子。
【請求項１１】
野生型ヒトMHCクラスII分子と比較して安定性（SI測定値）が１．４倍〜９倍に向上した、請求項１０記載の組換え型ヒトMHCクラスII分子。
【請求項１２】
HLA- DQ分子である、請求項１０又は１１記載の組換え型ヒトMHCクラスII分子。
【請求項１３】
請求項１０ないし１２のいずれか一項に記載の組換え型ヒトMHCクラスII分子と抗原ペプチドとの複合体から成る多量体。
【請求項１４】
更に蛍光標識されて成る請求項１３記載の多量体を活性成分として含有する、抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞の検出用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、T細胞検出に有効なMHC多量体試薬等に利用できる、安定化組換えＭＨＣタンパク質等に関する。
【背景技術】
【０００２】
MHC(Major Histocompatibility Complex主要組織適合性複合体)は形質膜上に発現される膜結合型糖タンパク質であり、抗原がタンパク質分解酵素により分解されてできたペプチドを結合して、これをT細胞に提示する機能を有する。尚、ヒトではHLA（Human Leukocyte Antigen：ヒト白血球抗原）として知られている。
【０００３】
MHC抗原には、構造、組織分布及びT細胞に提示できる抗原ペプチドの由来を異にする、クラスI及びクラスIIの２種類が存在する。この中のMHCクラスIIは外来性、内在性抗原ペプチドをCD4陽性T細胞受容体(TCR)に提示する。サブクラスとしてHLA-DR, DQ, DPがあり、いずれも6番染色体(6p21)上のHLA領域にコードされる。MHCクラスIIを構成するタンパク質はα、βサブユニットから構成されるヘテロ二量体を形成し細胞表面に発現される。両サブユニットのαへリックス、βシートからなるペプチド結合溝へ10-30残基程度のペプチドが提示される。この提示されるペプチドにおいて、数個のアミノ酸を介して飛び石状に存在する３〜５個のアミノ酸残基がＭＨＣクラスII分子への結合に重要な役割を担っている。尚、MHCクラスII分子のα、βサブユニットは、それぞれ分子量が約34,000及び約29,000であり、夫々、２つの細胞外領域、膜貫通領域、及び細胞内領域からなる。
【０００４】
各サブユニットとも多種類の対立遺伝子（アリル）が集団内に保たれており、その頻度・多型性は集団間で異なる。これらのアリル間の非同義多型は主にペプチド結合溝に位置するため、アリル間の機能的差異はペプチド結合特異性にあると考えられている。
【０００５】
自己免疫疾患を初め特定の疾病の患者集団又は人種集団においては、特定のHLA対立遺伝子、又はそれら対立遺伝子の特定の組合せ（ハプロタイプ）の頻度が有意に異なることが知られている。
【０００６】
MHCテトラマー試薬は、1996年にAltmanらによって開発された技術であり(非特許文献１)、特定のMHC-ペプチド複合体を認識するT細胞の検出、単離に用いられる。基本的な作製方法は、可溶型MHCタンパク質のＣ末端側へのビオチン結合配列の付加とアビジンを介した4量体化で蛍光標識されたものである。MHC-TCR間の親和性は低いことが知られているため(解離定数> μMオーダー)、多量体化によるアビディティーの増強がテトラマーでのT細胞検出に有効である。近年では、さらに多量体化して検出感度を向上させたMHC多量体試薬が開発されている。尚、このようなテトラマーのα2, β2ドメイン間へのＳ−Ｓ結合導入による安定化を試みた報告（非特許文献２）があるが、安定性に関するデータは記載されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Altmen, et al. Phenotype analysis of antigen -specific T lymphocytes. Science 1996, 274:94-96
【非特許文献２】Landais, E. et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation J. Immunol. 2009, 183, 7949-7957.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、MHC多量体製品群は主にMHCクラスＩに限られている。これは、クラスＩ組換えタンパク質が大腸菌発現系による発現とリフォールディングにより比較的容易に大量に調製することが可能であるのに対して、MHCクラスIIタンパク質は大腸菌発現が困難であり、昆虫細胞・哺乳類細胞発現が必要であり、多大な労力を要するためである。このためMHCクラスII多量体（テトラマー等）を購入する場合、通常、アリルとペプチドを指定した個別のオーダーが必要であり、販売価格もクラスＩと比較して高価である。
【０００９】
そこで、MHCクラスＩＩタンパク質を高安定化することにより、タンパク質産生量・試薬保存期間の向上、T細胞同定の高感度化を図ることが望まれる。又、安定性多型の導入は、テトラマー試薬のみならず、T細胞受容体を標的としたタンパク質医薬の開発においても、高安定化による半減期の向上、あるいは低安定化による半減期短縮による副作用の軽減等の用途へ応用可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、MHCクラスIIを構成するタンパク質はα、βサブユニットにおける多型がペプチド結合特異性のみならず、タンパク質安定性にも顕著な違いを産み出していることを明らかにした（相対的安定性のアリル間差異：最大約100倍）。安定性に影響を与える多型の多くはペプチド結合溝内に位置するため、ペプチドとの相互作用を介してMHC-ペプチド複合体を安定化させると考えられる。一方、ペプチド結合溝外に位置し、安定性のみに顕著な影響を与える（安定性を向上させる）多型（本明細書中、これらを「安定性多型」と総称する）も複数同定された。尚、既知のMHC-TCR結晶構造から、これらの多型はT細胞受容体認識部位ではないと予想される。
【００１１】
本発明者はこれらの新たな知見に基づき、これらの安定性多型を低安定性アリルに人為的に導入することにより、ペプチド結合特異性を変化させずに、MHCクラスII多量体（ヘテロ二量体）を安定化させることに成功し、本発明を完成した。
【００１２】
即ち、本発明は以下に示す各態様に係るものである。
[態様１]ヒトMHCクラスII分子のα又はβサブユニットとして機能する組換えポリペプチドであって、ペプチド結合溝外の位置に導入された少なくとも一つの置換アミノ酸とその周囲のアミノ酸との間の分子間相互作用が増強されることにより、野生型α又はβサブユニットから構成されるヒトMHCクラスII分子と比較して、該組換えポリペプチドを含むヒトMHCクラスII分子の安定性が向上することを特徴とする、前記組換えポリペプチド。
[態様２]導入された置換アミノ酸とその周囲のアミノ酸と間に水素結合が新たに形成されることにより、ヒトMHCクラスII分子の安定性が向上することを特徴とする、態様１記載の組換えポリペプチド。
[態様３]ヒトMHCクラスIIがHLA- DQである、態様１又は２記載の組換えポリペプチド。
[態様４]
以下のいずれかのアミノ酸変異が導入されて成る態様１ないし３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド：
（１）ＤＱＡ１のＮ末端から２番目のアミノ酸（２α）におけるアスパラギン酸；
（２）ＤＱＡ１のＮ末端から４７番目のアミノ酸（４７α）におけるリシン、アルギニン、又はグルタミン；又は
（３）ＤＱＢ１のＮ末端から１４番目のアミノ酸（１４β）におけるメチオニン。
[態様５]野生型α又はβサブユニットが疾患感受性アリル由来である、態様１ないし４のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
[態様６]疾患が自己免疫疾患、感染症、脳神経疾患、又は、薬物有害反応である、態様５記載の組換えポリペプチド。
[態様７]自己免疫疾患が１型糖尿病、セリアック病、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、又は,インスリン自己免疫性症候群（ＩＡＳ）である、態様６記載の組換えポリペプチド。
[態様８]態様１ないし７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子。
[態様９]態様８記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
[態様１０]α又はβサブユニットの少なくとも一方が態様１ないし７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドから構成される組換え型ヒトMHCクラスII分子。
[態様１１]野生型ヒトMHCクラスII分子と比較して安定性（SI測定値）が１．４倍〜９倍に向上した、態様１０記載の組換え型ヒトMHCクラスII分子。
[態様１２]HLA- DQ分子である、態様１０又は１１記載の組換え型ヒトMHCクラスII分子。
[態様１３]態様１０ないし１２のいずれか一項に記載の組換え型ヒトMHCクラスII分子と抗原ペプチドとの複合体から成る多量体。
[態様１４]更に蛍光標識されて成る態様１３記載の多量体を活性成分として含有する、抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞の検出用試薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の組換えポリペプチドは、ヒトMHCクラスII分子のα、βサブユニットにおけるペプチド結合溝外に見られ、安定性に寄与すると考えられるアミノ酸を他のアリルのヒトMHCクラスII分子のα又はβサブユニットにおける相当する位置に導入し元のアミノ酸と置換することによって得られるもので、置換アミノ酸の導入によって、該組換えポリペプチドを含むヒトMHCクラスII分子（MHCクラスII多量体）の安定性が顕著に向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】各ｃＤＮＡコンストラクトの構造の概要を示す。
【図２】レトロウイルスベクターの構造と発現系の概要を示す。
【図３】フローサイトメトリーによる結果の一例を示す。
【図４】Stability Index(SI)の算出例を示す。
【図５】各DQA1-DQB1アリルの組み合わせについてのSI測定値（n>3の平均値）を示す。
【図６】MHCクラスII（HLA）領域と疾患感受性・抵抗性に有意な関連が認められる疾患例を示す。
【図７】SI測定値と人種における主要ハプロタイプとの相関を示す。ここで、東アジア人集団の主要ハプロタイプ（左、四角枠内）、及び、コーカソイド集団の主要ハプロタイプ(右、四角枠内)を示す。「感受性アリル」及び「抵抗性アリル」は、夫々、１型糖尿病、セリアック病疾患感受性アリル及び１型糖尿病疾患抵抗性関連アリルを示す。
【図８】DQA1及びDQB1における２種類のアリル間で比較したSI測定値を示す。ここで、各a〜ｃにおける右欄の数値はSI値（p<0.01（黒）、p<0.05（灰色）：両側t検定）を示す。左欄において四角で囲まれたアミノ酸はペプチド結合溝外に位置し安定性のみに顕著な影響を与える多型を示す。
【図９】DQA1の各アリルの具体的なアミノ酸配列及びそこに見られる多型を示す。
【図１０】DQB1の各アリルの具体的なアミノ酸配列及びそこに見られる多型を示す。
【図１１】安定型組換え型ヒトMHCクラスII分子の作製例を示す。
【図１２】安定型組換え型ヒトMHCクラスII分子の作製例を示す。
【図１３】安定型組換え型ヒトMHCクラスII分子の作製例を示す。
【図１４】安定型組換え型ヒトMHCクラスII分子の作製例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の組換えポリペプチドはヒトMHCクラスII分子のα又はβサブユニットとして機能するものである。該組換えポリペプチドは、安定性多型等のα又はβサブユニットのポリペプチドの（抗原）ペプチド結合溝外の位置に見られ、α、βサブユニットの立体構造の安定性に寄与すると考えられるアミノ酸の少なくとも一つを、他種類のアリルのα又はβサブユニット（野生型）の対応する位置に導入し、元のアミノ酸と置換することによって得られる。こうして作製された組換えポリペプチドにおいては、該置換アミノ酸とその周囲のアミノ酸との間の分子間相互作用（例えば、水素結合、酸−塩基ペア間の静電気的作用）が増強されることにより、該組換えポリペプチドを含むヒトMHCクラスII分子の安定性は、野生型α又はβサブユニットから構成されるヒトMHCクラスII分子と比較して向上したものとなる。
【００１６】
組換えポリペプチドに導入されるアミノ酸置換は一つ又はそれ以上、例えば、数個でも良い。このようなアミノ酸置換の代表例として、以下の置換を挙げることが出来る。尚、アミノ酸の残基番号は、mature proteinのＮ末端からの位置を示す（Ｎ末シグナルが20-30残基ついている）。
（１）ＤＱＡ１のＮ末端から２番目のアミノ酸（２α）におけるアスパラギン酸;
（２）ＤＱＡ１のＮ末端から４７番目のアミノ酸（４７α）におけるリシン、アルギニン、又はグルタミン; 及び
（３）ＤＱＢ１のＮ末端から１４番目のアミノ酸（１４β）におけるメチオニン。
【００１７】
更に、本発明において、置換アミノ酸が導入される位置として、ヒトMHCクラスII分子のα又はβサブユニット立体構造の位置からドメイン間相互作用に関与することが予測されるアミノ酸である以下のものを挙げることが出来る：
ＤＱＡ１（６α、７α、１７α、１８α、１９α、２４α、２８α、３０α、３２α、３３α、５０α、５５α、８０α、８３α、８５α、８７α、８８α、８９α、９６α、９７α、１１４α、１１６α、１１７α、１１８α、１３９α、１４０α、１４２α、１４５α、１４６α、１５０α、１５３α、１７１α）；及び
ＤＱＢ１（３β、６β、７β、１０β、１８β、１９β、２８β、３２β、３３β、３４β、３５β、３６β、５１β、８６β、９３β、１１１β、１２１β、１３９β、１４９β、１５０β、１５２β、１５３β、１５６β）。
【００１８】
ヒトMHCクラスIIにはサブクラスとしてHLA-DR, DQ, DPがあり、本発明のヒトMHCクラスII分子の対象としてはそのいずれも可能である。例えば、ＤＱＡ１及びＤＱＢ１分子の2α、47α、14βにおける上記の置換アミノ酸の例は、いずれもDR又はDP遺伝子の各座にコードされるα鎖及びβ鎖の相当する位置においても適用可能である。更に、本発明の組換えポリペプチドは、その使用目的（例えば、後述するような、組換え型ヒトMHCクラスII分子と抗原ペプチドとの複合体を適当なリンカー物質を介して結合させ、該複合体から成る多量体を作製する場合）等に応じて、ヒトMHCクラスII分子のα又はβサブユニットの一部、例えば、膜貫通領域及び細胞内領域は含まないもの、２つの細胞外領域のみ又はその一部を含むもの等でも良い。
【００１９】
ここで、野生型α又はβサブユニットのアリルの種類及び由来に特に制限はない。本発明に係る組換え型ヒトMHCクラスII分子の試薬又は医薬品等への応用の観点からは、疾患感受性アリルに由来するものが好ましい。このような疾患としては、例えば、自己免疫疾患（１型糖尿病:T1D、セリアック病:CD、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、インスリン自己免疫性症候群（ＩＡＳ）等）、感染症（ハンセン病・Ｂ型肝炎等）、脳神経疾患（パーキンソン病、ナルコレプシー、統合失調症）、及び、薬物有害反応等を挙げることが出来る。
【００２０】
アリルの種類としては、例えば、本明細書の図５に示したような各種アリル、DQA1*03 (例えば、DQA1*03:01), DQA1*04, DQA1*05 (例えば、DQA1*05:01), DQA1*06(例えば、DQA1*06:01)、並びに、DQB1*05 (例えば、DQB1*05:01)及び DQB1*06等を挙げることが出来る。
【００２１】
特に、図６に示されているような様々な自己免疫疾患に対する感受性に相関する各アリルに由来する野生型α又はβサブユニットにおいて、（抗原）ペプチド結合溝外の位置に他の安定性多型アリルに見られるアミノ酸を導入しこれら野生型α又はβサブユニットにおける元のアミノ酸と置換することによって、本発明の組換えポリペプチドを作製することが上記の観点から好ましい。
【００２２】
組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子（ポリヌクレオチド）は、例えば、本明細書の図９及び図１０に示したDQA1及びDQB1における具体的なアミノ酸配列（DQA1*01:01のアミノ酸配列：配列番号１、DQB1*02:01のアミノ酸配列：配列番号２）等の具体的な配列に基づき、当業者に公知の遺伝子工学的手法（例えば、部位特異的変異）を用いることによって容易に調製することが出来る。
尚、サブクラスDR及びDPの各種α又はβサブユニットのアミノ酸配列は当業者に公知であり、例えば、以下の書籍/論文、又はデータベースを挙げることが出来る。
（１）Marsh S.G.E., Parham,P. and Barber,L.D. (2000) The HLA FactsBook. Academic Press, London, UK. 
（２）Marsh SG, et al. Nomenclature for factors of the HLA system, 2010.
Tissue Antigens. 2010 75:291-455.
（３）配列データベース（IMGT-HLA database）(文献としては；Robinson J, Waller MJ, Parham P, de Groot N, Bontrop R, Kennedy LJ, Stoehr P, Marsh SGE  IMGT/HLA and IMGT/MHC: sequence databases for the study of the major histocompatibility complex. Nucleic Acids Research (2003), 31:311-314) 
【００２３】
従って、本発明はこのような組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子及び、該ＤＮＡ分子を含むベクターにも係るものである。この発現ベクターにおいては、適当なプロモータの発現制御下に組換えポリペプチドをコードするＤＮＡが結合されている。
【００２４】
本発明の発現ベクターの形態・構造に特に制限はなく、例えば、ウイルスベクター及びプラスミドベクターであり得る。図１に示されるように、発現ベクターは、例えば、細胞を標識する場合には、適当な標識マーカーとして、GFP等の各種の蛍光タンパク質等をコードする遺伝子、並びに、抗体結合部位・ビオチン化部位となる各種のペプチドタグ（FLAG及びAviTag等）等をコードするＤＮＡを含むことが出来る。
【００２５】
本発明の発現ベクターは、プロモータに加えて、適宜、発現に必要な他の調節配列、例えば、エンハンサー及びその他の発現調節因子（例えば、ポリアデニル化シグナル）、リボソーム結合部位、合成オリゴヌクレオチドアダプター並びにリンカー等を含むことができる。
【００２６】
本発明の発現ベクターは、以上の外来性遺伝子、他の構成要素（単位）、及び導入する細胞の種類等に応じて、当業者が適宜設計・構築することが出来る。一実施例として、本発明の発現ベクターは、マウス等の哺乳動物細胞で機能する発現ベクターである。
【００２７】
このような発現ベクターを当業者に公知の発現系に用いることによって、ヒトMHCクラスII分子のα又はβサブユニットとして機能する組換えポリペプチドを発現させることができる。その結果、図２に示すように、α又はβサブユニットの少なくとも一方が本発明の組換えポリペプチドから構成される組換え型ヒトMHCクラスII分子（例えば、HLA- DQ分子）を調製することが出来る。
【００２８】
このようにして調製された組換え型ヒトMHCクラスII分子は、以下の実施例に示されているように、野生型ヒトMHCクラスII分子（野生型α及びβサブユニットから構成されるヒトMHCクラスII分子）と比較して安定性（SI測定値）が１．４倍〜９倍に向上している。
【００２９】
こうして得られる組換え型ヒトMHCクラスII分子と抗原ペプチドとの複合体を適当なリンカー物質を介して結合させ、該複合体から成る多量体（例えば、４量体）を作製することが可能である。リンカー物質としては、当業者に公知の任意の化合物、例えば、ビオチン−アビジン結合系を使用することが出来る。
【００３０】
更に、FITC, PE 及びAPC等の適当な蛍光物質でこのような多量体を蛍光標識することによって、主にフローサイトメトリーでの抗原特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞受容体の特異的検出等の試薬の活性成分、及びT細胞受容体に対する特異的抗体として機能しT細胞受容体を標的とする医薬品の活性成分として用いることが出来る。
【００３１】
尚、上記の試薬及び医薬品には、活性成分の他に、当業者に公知の任意の他の物質、例えば、薬学上許容可能な各種の助剤、緩衝剤、及び補助剤等を含むことが出来、目的・用途に応じて、液体又は粉末状等の固体などの任意の状態を取り得る。
【００３２】
以下に実施例を参照して本発明を具体的に説明するが、これらは単に本発明の説明のために提供されているものである。従って、これらの実施例は、本願で開示する発明の範囲を限定し、又は制限するものではない。本発明では、特許請求の範囲の請求項に記載された技術的思想に基づく様々な実施形態が可能であることは当業者には容易に理解される。
【００３３】
尚、実施例において用いた方法・手段などに関して特に記載のない場合には、当該技術分野における標準的な方法で実施した。
【実施例１】
【００３４】
MHCクラスII細胞表面発現量（相対的な安定性）測定
まず、レトロウイルスベクターpMXs-puro(Kitamura, T., et al., Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp Hematol, 2003. 31： 1007-14.)）にDQB1 cDNA全長を導入し、PLAT-E（Morita, S., T. Kojima, and T. Kitamura, Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Ther, 2000. 7: 1063-6.）をパッケージング細胞として生成したウイルスをマウス繊維芽細胞NIH3T3に感染させ、puromycin(６μg/ml)存在下でDQB1安定発現株を作製した。
【００３５】
次に、DQA1 cDNA 全長が挿入されたpMXs-Igベクター（同上）を同様な方法で作製し、各DQB1安定発現株に感染させ、DQA1及びGFPを一過性に発現させた。
【００３６】
各ｃＤＮＡコンストラクトの構造及びレトロウイルスベクターの構造と発現系の概要を図１及び図２に示す。
【００３７】
感染48時間後にフローサイトメトリー（Beckman Coulter, EPICS-XL）で、細胞質内でのGFP発現量、及び、GFP発現細胞群にゲートをかけ細胞表面のHLA-DQ発現量を定量した（図３）。DQA1 cDNA 全長を挿入したpMXs-Igベクターの感染を複数のウイルス濃度で行うことにより、GFPおよびHLA-DQを異なる量発現させた試料を各DQA1-DQB1アリルの組み合わせについて作成し、各試料間の発現量差から、GFP増分に対するHLA-DQ増分の比（ΔHLA/ΔGFP）を各アリルの組み合わせについて算出した。測定日毎にDQA1*01:02-DQB1*06:02アリルのΔHLA/ΔGFPを測定し、各DQA1-DQB1アリルのΔHLA/ΔGFP値を、同一測定日に測定したDQA1*01:02-DQB1*06:02アリルのΔHLA/ΔGFP値で標準化し、この値をStability Index(SI)とした。SI=0.005以上を表面発現の下限値とした（図４）。フローサイトメトリーは、抗-HLA-DP, DQ, DRβ mAb (WR18) (AbD Serotec)を一次抗体、phycoerythrin conjugated anti-mouse IgG (Rockland Inc.)を二次抗体として用いた。上記の方法によって算出された各DQA1-DQB1アリルの組み合わせについてのSI測定値を図５に示した。
【００３８】
既に記載したように、MHCクラスII（HLA）と図６に挙げたような各種疾患、特に、自己免疫疾患に対する感受性には相関があることが知られている。そこで、こうして得られたSI測定値と人種における主要ハプロタイプとの比較から、１型糖尿病、セリアック病に対する疾患感受性アリルはいずれも低安定性であることが分かった（図７）。更に、得られたSI測定値をDQA1及びDQB1における２種類のアリル間で比較した（図８）。尚、DQA1及びDQB1における具体的なアミノ酸配列及びそこに見られる多型を、夫々、図９及び図１０に示す。
【００３９】
以上の結果、既に知られているHLA-DQ分子の結晶構造（Lee, K.H., K.W. Wucherpfennig, and D.C. Wiley, Structure of a human insulin peptide-HLA-DQ8 complex and susceptibility to type 1 diabetes. Nat Immunol, 2001. 2, 501-7; Siebold, C., et al., Crystal structure of HLA-DQ0602 that protects against type 1 diabetes and confers strong susceptibility to narcolepsy. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101: 1999-2004; Kim, C.Y., et al., Structural basis for HLA-DQ2-mediated presentation of gluten epitopes in celiac disease. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101:4175-9.）等に基づき、ペプチド結合溝外に位置し、HLA-DQ分子の安定性を有意に向上させることが可能な多型を同定した。これらの例を以下に示す。
【００４０】
（１）ＤＱＡ１のＮ末端から２番目のアミノ酸（２α）におけるアスパラギン酸；
（２）ＤＱＡ１のＮ末端から４７番目のアミノ酸（４７α）におけるリシン、アルギニン、又はグルタミン；及び
（３）ＤＱＢ１のＮ末端から１４番目のアミノ酸（１４β）におけるメチオニン。
【００４１】
例えば、DQA1*01:02-DQB*06:02から成るHLA-DQ分子において、Asp2αはSer141αとの間で、Met14βはTyr16β及びArg29βとの間で水素結合を形成していることが分かっている。また、DQA1*01:02-DQB*06:02から成るHLA-DQ分子におけるArg47αは水分子を介してα2ドメインとの間で水素結合を形成していることが分かっている。
【実施例２】
【００４２】
安定型組換え型ヒトMHCクラスII分子の作製
上記の結果に基づき、以下のように各アリル遺伝子の部位特異的変異を行い、本発明のHLA-DQ分子の安定型多型を有する組換え型ヒトMHCクラスII分子を作製した。
（１）DQA1*01:04の２αにおいてグリシン（Ｇ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換する（Ｇ２Ｄ）ことによって、安定性（SI測定値）が約１．４〜３倍に増加した（図１１）。尚、HLA-DQ分子の作製に際してDQB1としてはDQB1*05:02, *05:03, *06:01, *06:02, *06:03, *06:04を使用した。
（２）DQA1*06:01の４７αにおいてシステイン（Ｃ）をグルタミン（Ｑ）アルギニン（Ｒ）,リシン（Ｋ）に置換する(（Ｃ４７Ｑ）（Ｃ４７Ｒ）（Ｃ４７Ｋ））ことによって、安定性（SI測定値）が約２〜９倍に増加した（図１２）。尚、HLA-DQ分子の作製に際してDQB1としては、DQB1*02:01, DQB1*03:01 及びDQB1*04:01を使用した。尚、構造的にDQA1*06と類似しているDQA1*03, *04, 及び*05アリルでも同様の効果が予測される。
（３）１型糖尿病:T1D、セリアック病:CD感受性アリルであるDQA1*05:01の４７αにおけるシステイン（Ｃ）をグルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）及びリシン（Ｋ）に置換する（（Ｃ４７Ｑ）（Ｃ４７Ｒ）（Ｃ４７Ｋ））こと、並びに、DQA1*03:01の４７αにおけるグルタミン（Ｑ）をアルギニン（Ｒ）及びリシン（Ｋ）に置換する（（Ｑ４７Ｒ）及び（Ｑ４７Ｋ））ことによって、安定性（SI測定値）が約２〜３倍に増加した（図１３）。尚、HLA-DQ分子の作製に際してDQB1としては、DQB1*02:01, DQB1*03:02をそれぞれ使用した。（４）DQB1*05:01の１４βにおいてロイシン（Ｌ）をメチオニン（Ｍ）に置換する（Ｌ１４Ｍ）ことによって、安定性（SI測定値）が約２倍に増加した（図１４）。尚、HLA-DQ分子の作製に際してDQA1としては、DQA1*01:02を使用した。
尚、図１１〜１４における棒グラフすべて, *; p<0.05, ** p<0.01,  ***p<0.001である。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の組換えポリペプチドを含む組換え型ヒトMHCクラスII分子は抗原ペプチドと複合体を形成させて多量体化する（例えば、MHCテトラマー）ことによって、様々な検出用試薬および医薬品等への応用が可能である。その結果、このような試薬・医薬品は、例えば、以下のような利点・可能性を有する。
【００４４】
（１）MHCテトラマー作製への応用
i) 安定性を高めることにより試薬の特性が向上する。
ii) 同様の知見を、より汎用されているclass Iテトラマー、class II テトラマー(DR, DP)及び研究試薬として広く用いられているマウスMHC class IIテトラマーの作成に応用できる。
【００４５】
（２）MHCを基本骨格としたT細胞受容体を標的とする医薬品への応用
i) Ｔ細胞受容体は自己のMHC-抗原ペプチド複合体を特異的に認識する。
ii) Ｔ細胞受容体を介したシグナル伝達は、MHC-ペプチド-TCR複合体の安定性（半減期）により制御され、活性化（Ｔ細胞増殖）又は非活性化（アネジー）を誘導する。
iii) 特定のT細胞活性化は腫瘍免疫の誘導、ウイルス・病原微生物感染防御を増強する。
iv) 特定のT細胞非活性化により、自己免疫反応（自己免疫疾患・臓器移植時拒絶反応）を回避出来る。
【図５】
2012120488.tif 000003
【図６】
2012120488.tif 000004
【図９】
2012120488.tif 000005
【図１０】
2012120488.tif 000006
【図１】
2012120488.tif 000007
【図２】
2012120488.tif 000008
【図３】
2012120488.tif 000009
【図４】
2012120488.tif 000010
【図７】
2012120488.tif 000011
【図８】
2012120488.tif 000012
【図１１】
2012120488.tif 000013
【図１２】
2012120488.tif 000014
【図１３】
2012120488.tif 000015
【図１４】
2012120488.tif 000016
【配列表】
2012120488000001.app