(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便、迅速、および直接的にヒストンデアセチラーゼの酵素活性を検出する方法を提供する。【解決手段】一般式（Ｉ）および一般式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩。2012126765.tif 000019式（Ｉ）および式（ＩＩ）中、Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、互いに独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−または−ＮＲ−であり（Ｒは、低級アルキル基である）、Ｒ1、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、−Ｈまたは低級アルキル基であり、Ｙ1およびＹ2は、互いに独立して、蛍光性基であり、Ｚ１，Ｚ２およびＺ３は、互いに独立して、−ＣＨ３または、式（Ｅ）で表される基である。2012126765.tif 000020【選択図】図３
2012126765.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（ＩＡ）で表される化合物もしくは一般式（ＩＢ）で表される化合物またはその塩。
【化１３】
2012126765.tif 000016
前記式（ＩＡ）中、
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、互いに独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−または−ＮＲ−であり、
Ｒは、低級アルキル基であり、
Ｒ1、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、−Ｈまたは低級アルキル基であり、
Ｙ1およびＹ2は、互いに独立して、蛍光性基であり、
Ｚ1、Ｚ2およびＺ3は、互いに独立して、−ＣＨ3または、式（Ｅ）で表される基であり、
ｎ１、ｎ２およびｎ３は、互いに独立して、２〜４の整数である。
【化１４】
2012126765.tif 000017
前記式（Ｅ）中、
Ｒ2は、−Ｈまたは低級アルキル基であり、
ｍは、２または３である。
【請求項２】
前記Ｙ1が、式（Ａ）、式（Ｂ）または式（Ｃ）で表される基であり、前記Ｙ2が、式（Ｄ）で表される基である請求項１に記載の化合物。
【化１５】
2012126765.tif 000018
前記式（Ａ）中、
Ｒ11は、−Ｈ、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、−ＣＮ、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アリール基またはハロゲン原子であり、
Ｒ12は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＦ3、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アリール基またはハロゲン原子であり、
Ｒ13、Ｒ14およびＲ15は、互いに独立して、−Ｈ、−ＮＨ2、−ＯＨ、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アリール基またはハロゲン原子であり、
前記式（Ｂ）中、
Ｒ31およびＲ34は、互いに独立して、低級アルコキシ基であり、
Ｒ32は、−ＣＯＯＨ、−ＯＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ321、−ＯＣＨ2ＣＯＯＲ321、低級アルキル基または低級アルコキシ基であり、Ｒ321は、低級アルキル基であり、
Ｒ33は、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ331、低級アルキル基または低級アルコキシ基であり、Ｒ331は低級アルキル基であり、
Ｒ35、Ｒ36、Ｒ37およびＲ38は、−ＯＨであり、
前記式（Ｃ）中、
Ｒ41は、−ＣＯＯＨ、−ＯＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ411、−ＯＣＨ2ＣＯＯＲ411、低級アルキル基または低級アルコキシ基であり、Ｒ411は、低級アルキル基であり、
Ｒ42は、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ421、低級アルキル基または低級アルコキシ基であり、Ｒ421は、低級アルキル基であり、
Ｒ43およびＲ44は、互いに独立して、−ＯＨ、低級アルコキシ基またはハロゲン原子であり、
前記式（Ｄ）中、
Ｒ21およびＲ24は、互いに独立して、−Ｈまたはハロゲン原子であり、
Ｒ22およびＲ23は、互いに独立して、−Ｈ、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＮＨ2またはハロゲン原子であり、
Ｒ25、Ｒ26、Ｒ27およびＲ28は、互いに独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＯ2、低級アルコキシ基またはハロゲン原子である。
【請求項３】
請求項１または２に記載の化合物またはその塩を含むヒストンデアセチラーゼ活性を検出するためのプローブ。
【請求項４】
検体と、請求項３に記載のプローブとを反応させ、
生じる蛍光強度を測定する工程を含む
ヒストンデアセチラーゼ活性を検出する方法。
【請求項５】
被験組織切片または被験細胞と、請求項３に記載のプローブとを反応させ、
生じる蛍光強度を測定する工程を含む
ヒストンデアセチラーゼ活性を検出する方法。
【請求項６】
請求項１または２に記載の化合物またはその塩を含むヒストンデアセチラーゼ活性を検出するためのキット。
【請求項７】
被験化合物と、請求項３に記載のプローブと、ヒストンデアセチラーゼとを反応させ、生じる蛍光強度（第１蛍光強度）を測定する工程と、
比較対照としての蛍光強度（第２蛍光強度）と前記第１蛍光強度とを比較する工程とを含む、
前記検体のヒストンデアセチラーゼ阻害活性を測定する方法。
【請求項８】
被験化合物と、請求項３に記載のプローブと、ヒストンデアセチラーゼとを反応させ、生じる蛍光強度（第１蛍光強度）を測定する工程と、
比較対照としての蛍光強度（第２蛍光強度）と前記第１蛍光強度とを比較する工程とを含む、
前記検体のヒストンデアセチラーゼ阻害活性をスクリーニングする方法。
【請求項９】
請求項１または２に記載の化合物またはその塩と、ヒストンデアセチラーゼとを含むヒストンデアセチラーゼ阻害活性をスクリーニングするためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規蛍光性化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、ヒストンに存在するアセチル化リジンの脱アセチル化を触媒する酵素である。この脱アセチル化を通じて、ＨＤＡＣは、遺伝子転写の制御に深く関わっていることが知られている。また、ＨＤＡＣは、ヒストンに加え、転写因子や細胞骨格形成に関わるタンパク質など多くの非ヒストンタンパク質の脱アセチル化反応を触媒している。そのため、ＨＤＡＣの役割および意義を解明することは、生命科学分野において極めて重要視されている。さらに、ＨＤＡＣ活性の異常は、癌、生活習慣病、中枢神経疾患などの疾病の原因となることが知られている。そのため、ＨＤＡＣ活性を制御する医薬（阻害剤および活性化剤）の開発は、医学および創薬の分野で大きな注目を集めている。従って、ＨＤＡＣ活性を迅速に評価する方法の開発は、医薬品開発の観点から非常に重要である。
【０００３】
ＨＤＡＣの活性を検出する方法としては、（１）放射性同位体を利用する方法、（２）免疫学的検出法、（３）クロマトグラフィーおよび質量分析計による分析化学的方法、（４）蛍光ペプチド基質を用いる方法（例えば、特許文献１）が挙げられる。（１）の方法では、ＨＤＡＣの基質に放射性同位体標識したアセチル基を導入し、放射線を検出することにより、その基質の脱アセチル化反応の進行を検出する。この方法には、放射性同位体を用いるため、放射線管理区域内における実験に限られ、様々な取り扱い上の制約を受けるという問題点がある。また、この方法には、放射線被爆の危険性がある、という問題点がある。（２）の方法では、基質中のアセチル化リジンまたは脱アセチル化リジンを抗体によって検出する。この方法には、１次抗体との反応、二次抗体との反応、洗浄操作、ブロッキング操作など、検出までに数ステップが必要であり、迅速には活性を検出できず、さらに操作も複雑であるという問題点がある。（３）の方法は、基質と、基質の脱アセチル化反応により生じた生成物との、クロマグラフィーにおける溶出時間の変化を検出し、質量分析により、変化したピークの質量変化を検出する。この方法には、分析に時間がかかり、ハイスループットスクリーニングに用いることができないという問題点がある。
【０００４】
（４）の方法は、基質ペプチドに蛍光色素を結合させたプローブを利用して蛍光検出する方法である。具体的には、プローブとＨＤＡＣとを反応させ（脱アセチル化）、その後、脱アセチル化されたプローブをプロテアーゼにより処理すると、蛍光強度が上昇する。この方法では、この蛍光強度の変化を検出する。（４）の方法として、例えば、アルギニン−ヒスチジン−アセチル化されたリジン−蛍光性基という蛍光ペプチド基質を用いた方法が知られている（例えば、非特許文献１）。この方法では、蛍光ペプチド基質は、蛍光性ではない。この蛍光ペプチド基質にＨＤＡＣを作用させると、リジンの側鎖が脱アセチル化される。しかしまだ、この脱アセチル化生成物は蛍光性ではない。この脱アセチル化生成物をトリプシンで処理すると、ペプチド鎖と蛍光性基との結合が切断され、蛍光性基が遊離する。この蛍光性基由来の化合物が、蛍光を発するため、この蛍光性基由来の化合物の蛍光強度を測定すれば、ＨＤＡＣの活性を検出することができるのである。この方法では、蛍光検出するためにプロテアーゼ処理が必要であり、その結果、直接、酵素活性を検出することができないという問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−２２１３９９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Malik, Rら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010年、391巻、p. 739-743.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、簡便、迅速、および直接的にＨＤＡＣの酵素活性を検出する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、一般式（ＩＡ）で表される化合物もしくは一般式（ＩＢ）で表される化合物またはその塩である。
【化１】
2012126765.tif 000003
【０００９】
前記式（ＩＡ）および式（ＩＢ）中、
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、互いに独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−または−ＮＲ−であり、
Ｒは、低級アルキル基であり、
Ｒ1、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、−Ｈまたは低級アルキル基であり、
Ｙ1およびＹ2は、互いに独立して、蛍光性基であり、
Ｚ1、Ｚ2およびＺ3は、互いに独立して、−ＣＨ3または、式（Ｅ）で表される基であり、
ｎ１、ｎ２およびｎ３は、互いに独立して、２〜４の整数である。
【００１０】
【化２】
2012126765.tif 000004
【００１１】
前記式（Ｅ）中、
Ｒ2は、−Ｈまたは低級アルキル基であり、
ｍは、２または３である。
【００１２】
本発明はまた、前記化合物またはその塩を含むヒストンデアセチラーゼを検出するためのプローブである。
【００１３】
本発明は、また、検体と、前記プローブとを反応させ、生じる蛍光強度を測定する工程を含む、ヒストンデアセチラーゼ活性を検出する方法である。
【００１４】
本発明はまた、被験組織切片または被験細胞と、請求項３に記載のプローブとを反応させ、生じる蛍光強度を測定する工程を含むヒストンデアセチラーゼ活性を検出する方法である。
【００１５】
本発明は、また、前記化合物またはその塩を含むヒストンデアセチラーゼ活性を検出するためのキットである。本発明のキットは、さらに、キットの取り扱い説明書を含むのが好ましい。
【００１６】
本発明は、また、検体と、前記プローブと、ヒストンデアセチラーゼとを反応させ、生じる蛍光強度（第１蛍光強度）を測定する工程と、比較対照としての蛍光強度（第２蛍光強度）と前記第１蛍光強度とを比較する工程とを含む、前記検体のヒストンデアセチラーゼ阻害活性を測定する方法である。
【００１７】
本発明はまた、被験化合物と、請求項３に記載のプローブと、ヒストンデアセチラーゼとを反応させ、生じる蛍光強度（第１蛍光強度）を測定する工程と、比較対照としての蛍光強度（第２蛍光強度）と前記第１蛍光強度とを比較する工程とを含む、前記検体のヒストンデアセチラーゼ阻害活性をスクリーニングする方法である。
【００１８】
本発明は、また、前記化合物またはその塩と、ヒストンデアセチラーゼとを含むヒストンデアセチラーゼ阻害活性をスクリーニングするためのキットである。本発明のキットは、さらに、キットの取り扱い説明書を含むのが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の化合物は、それ自体では蛍光を示さない。一方、この化合物がヒストンデアセチラーゼと反応して生成した生成物は、蛍光を示す。従って、本発明の化合物を用いて、すなわち、この生成物の蛍光を測定することにより、直接的にＨＤＡＣの酵素活性を検出することができる。また、この方法は、簡便および迅速である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１（ａ）は、ＤＡＣＰとＳｉｒｔ１との反応をモニターした蛍光スペクトルのチャートを示す。図１（ｂ）は、ＤＡＣＰのみをモニターした蛍光スペクトルのチャートを示す。
【図２】図２（ａ）は、ＤＡＣＰとＳｉｒｔ１との反応をモニターしたＨＰＬＣチャートを示す。図２（ｂ）は、ＤＡＣＰのみをモニターしたＨＰＬＣチャートを示す。図２（ｃ）は、７−ヒドロキシクマリンのみのＨＰＬＣチャートを示す。
【図３】図３は、Ｓｉｒｔ１阻害剤の阻害効果をＤＡＣＰにより検出する蛍光スペクトルのチャートを示す。
【図４】図４は、を示す。ＤＡＣＰとＨＤＡＣ６との反応をモニターした蛍光スペクトルのチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の一般式（ＩＡ）で表される化合物もしくは一般式（ＩＢ）で表される化合物は、前記のように、
【００２２】
【化３】
2012126765.tif 000005
【００２３】
前記式（ＩＡ）および式（ＩＢ）中、
Ｘ1、Ｘ2およびＸ3は、互いに独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−または−ＮＲ−であり、
Ｒは、低級アルキル基であり、
Ｒ1、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、−Ｈまたは低級アルキル基であり、
Ｙ1およびＹ2は、互いに独立して、蛍光性基であり、
Ｚ1、Ｚ2およびＺ3は、互いに独立して、−ＣＨ3または、式（Ｅ）で表される基であり、
ｎ１、ｎ２およびｎ３は、互いに独立して、２〜４の整数である。
【００２４】
【化４】
2012126765.tif 000006
【００２５】
前記式（Ｅ）中、
Ｒ2は、−Ｈまたは低級アルキル基であり、
ｍは、２または３である。
【００２６】
本明細書において、用語「本発明の化合物」は、特に断りが無い限り、「一般式（ＩＡ）の化合物もしくは一般式（ＩＢ）の化合物」を意味する。本発明の化合物において、用語「蛍光性基」とは、可視光線、紫外線、Ｘ線等が照射され、そのエネルギーを吸収することにより電子が励起し、それが基底状態に戻る際に余分なエネルギーを電磁波として放出する性質を有する基を意味する。例えば、蛍光性基とは、クマリン色素、キサンテン色素、シアニン色素、アクリジン、イソインドール、ダンシル色素、アミノフタル酸ヒドラジド、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジシアノヒドロキノン等から誘導される基が挙げられる。
【００２７】
本発明の化合物において、前記Ｙ1が、式（Ａ）、式（Ｂ）または式（Ｃ）で表される基であり、前記Ｙ2が、式（Ｄ）で表される基であるのが好ましい。
【００２８】
【化５】
2012126765.tif 000007
【００２９】
前記式（Ａ）中、
Ｒ11は、−Ｈ、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、−ＣＮ、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アリール基またはハロゲン原子であり、
Ｒ12は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＦ3、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アリール基またはハロゲン原子であり、
Ｒ13、Ｒ14およびＲ15は、互いに独立して、−Ｈ、−ＮＨ2、−ＯＨ、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アリール基またはハロゲン原子である。
【００３０】
前記式（Ｂ）中、
Ｒ31およびＲ34は、互いに独立して、低級アルコキシ基であり、
Ｒ32は、−ＣＯＯＨ、−ＯＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ321、−ＯＣＨ2ＣＯＯＲ321、低級アルキル基または低級アルコキシ基であり、Ｒ321は、低級アルキル基であり、
Ｒ33は、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ331、低級アルキル基または低級アルコキシ基であり、Ｒ331は低級アルキル基であり、
Ｒ35、Ｒ36、Ｒ37およびＲ38は、−ＯＨである。
【００３１】
前記式（Ｃ）中、
Ｒ41は、−ＣＯＯＨ、−ＯＣＨ2ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ411、−ＯＣＨ2ＣＯＯＲ411、低級アルキル基または低級アルコキシ基であり、Ｒ411は、低級アルキル基であり、
Ｒ42は、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ421、低級アルキル基または低級アルコキシ基であり、Ｒ421は、低級アルキル基であり、
Ｒ43およびＲ44は、互いに独立して、−ＯＨ、低級アルコキシ基またはハロゲン原子である。
【００３２】
前記式（Ｄ）中、
Ｒ21およびＲ24は、互いに独立して、−Ｈまたはハロゲン原子であり、
Ｒ22およびＲ23は、互いに独立して、−Ｈ、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＮＨ2またはハロゲン原子であり、
Ｒ25、Ｒ26、Ｒ27およびＲ28は、互いに独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＯ2、低級アルコキシ基またはハロゲン原子である。
【００３３】
本発明の化合物において、低級アルキル基とは、炭素数１〜６のものが挙げられる。具体的には、低級アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｉ−ペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ｔ−ペンチル基、２−メチルブチル基、ｎ−ヘキシル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、および１−エチル−１−メチルプロピル基などの直鎖状または分岐状のアルキル基を挙げることができ、好適には炭素数１〜３のものが挙げられる。
【００３４】
本発明の化合物において、低級アルコキシ基とは、炭素数１〜６のものが挙げられる。具体的には、低級アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｉ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｉ−ペンチルオキシ基、ｓｅｃ−ペンチルオキシ基、ｔ−ペンチルオキシ基、２−メチルブチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、１−メチルペンチルオキシ基、２−メチルペンチルオキシ基、３−メチルペンチルオキシ基、４−メチルペンチルオキシ基、１−エチルブチルオキシ基、２−エチルブチルオキシ基、１，１−ジメチルブチルオキシ基、２，２−ジメチルブチルオキシ基、３，３−ジメチルブチルオキシ基、および１−エチル−１−メチルプロピルオキシ基などの直鎖状または分岐状のアルキルオキシ基を挙げることができ、好適には炭素数１〜３のものが挙げられる。
【００３５】
本発明の化合物において、アリール基とは、炭素数６〜１０のものが挙げられる。具体的には、アリール基としては、フェニル基、ナフチル基を挙げることができる。
【００３６】
本発明の化合物において、ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子が挙げられる。
【００３７】
本発明の化合物としては、Ｙ1が式（Ａ）で表される基であり、Ｚ1が、−ＣＨ3である式（ＩＡ）の化合物が好ましい。
【００３８】
本発明において、式（ＩＡ）の化合物の塩は、式（ＩＡ）の化合物と、酸または塩基との塩であってもよい。また、本発明において、式（ＩＢ）の化合物の塩は、式（ＩＢ）の化合物と、酸または塩基との塩であってもよい。そのような塩としては、例えば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などの無機塩基との塩、及びトリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンアミンなどの有機アミン塩、及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸塩、及びギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸などの有機カルボン酸塩、及びメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸付加塩、及びアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性又は酸性アミノ酸といった塩基との塩又は酸付加塩が挙げられる。
【００３９】
本発明において、式（ＩＡ）の化合物および式（ＩＢ）の化合物は、溶媒和物の形をとることもありうるが、これも本発明の範囲に含まれる。溶媒和物としては、好ましくは、水和物及びエタノール和物が挙げられる。
【００４０】
式（ＩＡ）の化合物は、例えば、以下のスキーム１に示す方法により製造することができる、または、式（ＩＡ）の化合物は、従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよい。式（ＩＡ）の化合物を、Ｘ＝Ｏである式（ＩＡ−１）の場合と、Ｘ＝ＮＨまたはＮＲである式（ＩＡ−２）の場合と分けて以下に説明する。
【００４１】
【化６】
2012126765.tif 000008
【００４２】
前記式中、Ｘ’は、−ＮＨ−または−ＮＲ−であり、
Ｒは、低級アルキル基であり、
Ｙ1は、蛍光性基であり、
Ｚ1は、−ＣＨ3または、式（Ｅ）で表される基であり、
Ｒ1は、−Ｈまたは低級アルキル基であり、
ｎ１は、２〜４の整数である。
【００４３】
式（ＩＩＡ−１）の化合物と、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＣＳ）、または式（ＩＩＡ−２）の化合物と、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）とをそれぞれ反応させ、活性な炭酸エステルである式（ＩＩＩＡ−１）の化合物または活性なカルバミン酸エステルである式（ＩＩＩＡ−２）の化合物を得る。得られた式（ＩＩＩＡ−１）の化合物または式（ＩＩＩＡ−２）の化合物を式（ＩＶＡ）の化合物と反応させ、式（ＩＡ−１）の化合物または式（ＩＡ−２）の化合物をそれぞれ得る。式（ＩＩＡ−１）の化合物、式（ＩＩＡ−２）の化合物および式（ＩＶＡ）の化合物は、市販で入手するか、従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよい。
【００４４】
式（ＩＢ）の化合物は、例えば、以下のスキーム２に示す方法により製造することができる、または、式（ＩＢ）の化合物は、従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよい。式（ＩＢ）の化合物を、Ｘ＝Ｏである式（ＩＢ−１）の場合と、Ｘ＝ＮＨまたはＮＲである式（ＩＢ−２）の場合と分けて以下に説明する。
【００４５】
【化７】
2012126765.tif 000009
【００４６】
【化８】
2012126765.tif 000010
【００４７】
前記式中、Ｘ’は、−ＮＨ−または−ＮＲ−であり、
Ｒは、低級アルキル基であり、
Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、−Ｈまたは低級アルキル基であり、
Ｙ2は、蛍光性基であり、
Ｚ2およびＺ3は、互いに独立して、−ＣＨ3または、式（Ｅ）で表される基であり、
ｎ２およびｎ３は、互いに独立して、２〜４の整数である。
【００４８】
式（ＩＩＢ−１）の化合物と、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＣＳ）、および式（ＩＩＢ−２）の化合物と、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＣＳ）とをそれぞれ反応させ、活性な炭酸エステルである式（ＩＩＩＢ−１）の化合物および式（ＩＩＩＢ−２）の化合物を得る。得られた式（ＩＩＩＢ−１）の化合物を式（ＩＶＢ）の化合物とを約１：１の量で反応させ、必要に応じて単離精製した後、式（ＩＩＩＢ−２）の化合物と反応させて、式（ＩＢ−１）の化合物を得る。または、式（ＩＩＢ−３）の化合物と、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、および式（ＩＩＢ−４）の化合物と、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）とをそれぞれ反応させ、活性なカルバミン酸エステルである式（ＩＩＩＢ−３）の化合物および式（ＩＩＩＢ−４）の化合物を得る。得られた式（ＩＩＩＢ−３）の化合物を式（ＩＶＢ）の化合物とを約１：１の量で反応させ、必要に応じて単離精製した後、式（ＩＩＩＢ−４）の化合物と反応させて、式（ＩＢ−２）の化合物を得る。
【００４９】
なお、式（ＩＩＢ−１）の化合物と式（ＩＶＢ）の化合物とを約２：１の量で反応させ、式（ＩＩＩＢ−２）の化合物とは反応させない場合、得られる式（ＩＢ−１）の化合物において、Ｚ3＝Ｚ2、Ｒ4＝Ｒ3、ｎ３＝ｎ２、Ｘ3＝Ｘ2の化合物を得ることができる。同様に、式（ＩＩＩＢ−３）の化合物と式（ＩＶＢ）の化合物とを約２：１の量で反応させ、式（ＩＩＩＢ−４）の化合物とは反応させない場合、得られる式（ＩＢ−２）の化合物において、Ｚ3＝Ｚ2、Ｒ4＝Ｒ3、ｎ３＝ｎ２、Ｘ3＝Ｘ2の化合物を得ることができる。
【００５０】
式（ＩＩＢ−１）の化合物、式（ＩＩＢ−２）の化合物、式（ＩＩＢ−３）の化合物、式（ＩＩＢ−４）の化合物および式（ＩＶＢ）の化合物は、市販で入手するか、従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよい。
【００５１】
本発明は、式（ＩＡ）の化合物が、それ自体では蛍光を示さない一方、この化合物がヒストンデアセチラーゼと反応した生成物は蛍光を示す。このような性質を利用し、本発明の化合物を用いて、直接的にＨＤＡＣの酵素活性を検出することができる。例えば、Ｚ1が−ＣＨ3の化合物（スキーム３中、式（Ｉ−３）で表す）について、以下のスキーム３を用いて説明する。
【００５２】
【化９】
2012126765.tif 000011
【００５３】
スキーム３中、Ｒ1、Ｘ1、Ｙ1およびｎ１は、式（ＩＡ）におけるものと同じ意味を有する。ＨＤＡＣは、ヒストンデアセチラーゼを意味する。
【００５４】
前記のように、式（Ｉ−３）の化合物はそれ自体では蛍光を示さない。式（Ｉ−３）の化合物は、アミノ基にアセチル基が結合しており、この部分がＨＤＡＣの基質になる。そうすると、式（Ｉ−３）の化合物がＨＤＡＣにより脱アセチル化され、式（Ｖ）に示す化合物に変換される。この式（Ｖ）化合物のアミノ基は、分子内のカルボニル炭素を攻撃し、環化して式（ＶＩ）の化合物を生じる。そして残った部分は式（ＶＩＩ）の化合物であり、Ｙ1が蛍光性基であるこの化合物は、蛍光を生じる。従って、式（Ｉ−３）の化合物を用いて、式（ＶＩＩ）の化合物の蛍光強度を測定することにより、ＨＤＡＣの酵素活性を検出することができる。
【００５５】
Ｚ1が、式（Ｅ）で表される化合物（スキーム４中、式（Ｉ−４）で表す）についても、式（Ｉ−３）の化合物と同様である（スキーム４参照）。
【００５６】
【化１０】
2012126765.tif 000012
【００５７】
スキーム４中、Ｒ1、Ｒ2、Ｘ1、Ｙ1、ｍおよびｎ１は、式（ＩＡ）におけるものと同じ意味を有する。ＨＤＡＣは、ヒストンデアセチラーゼを意味する。
【００５８】
前記のように、式（Ｉ−４）の化合物はそれ自体では蛍光を示さない。式（Ｉ−４）の化合物は、アミノ基にアセチル基が結合しており、この部分がＨＤＡＣの基質になる。そうすると、式（Ｉ−４）の化合物がＨＤＡＣにより脱アセチル化され、式（ＶＩＩＩ）に示す化合物に変換される。この式（ＶＩＩＩ）化合物のアミノ基は、分子内のカルボニル炭素を攻撃し、環化して式（ＩＸ）の化合物を生じる。そして残った部分は式（Ｖ）の化合物である。この式（Ｖ）の化合物のアミノ基は、さらに分子内のカルボニル炭素を攻撃し、環化して式（ＶＩ）の化合物を生じる。そして残った部分は式（Ｘ）の化合物であり、Ｙ1が蛍光性基であるこの化合物は、蛍光を生じる。従って、式（Ｉ−４）の化合物を用いて、式（Ｘ）の化合物の蛍光強度を測定することにより、ＨＤＡＣの酵素活性を検出することができる。
【００５９】
式（ＩＢ）の化合物についても、それ自体では蛍光を示さない一方、この化合物がヒストンデアセチラーゼと反応した生成物は蛍光を示す。このような性質を利用し、本発明の化合物を用いて、直接的にＨＤＡＣの酵素活性を検出することができる。例えば、Ｚ2およびＺ3が−ＣＨ3の化合物（スキーム５中、式（Ｉ−５）で表す）について、以下のスキーム５を用いて説明する。
【００６０】
【化１１】
2012126765.tif 000013
【００６１】
スキーム５中、Ｒ3、Ｒ4、Ｘ2、Ｘ3、ｎ２、ｎ３、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24、Ｒ25、Ｒ26、Ｒ27およびＲ28は、式（ＩＢ）におけるものと同じ意味を有する。ＨＤＡＣは、ヒストンデアセチラーゼを意味する。
【００６２】
前記のように、式（Ｉ−５）の化合物はそれ自体では蛍光を示さない。式（Ｉ−５）の化合物は、アミノ基にアセチル基が結合しており、この部分がＨＤＡＣの基質になる。そうすると、式（Ｉ−５）の化合物がＨＤＡＣにより脱アセチル化され、分子内環化して分解し、最終的に式（ＸＩ）の化合物を生じる。この化合物（ＸＩ）は、蛍光を生じる。従って、式（Ｉ−５）の化合物を用いて、式（ＸＩ）の化合物の蛍光強度を測定することにより、ＨＤＡＣの酵素活性を検出することができる。
【００６３】
前記のように、本発明のヒストンデアセチラーゼ活性を検出する方法は、検体と、前記プローブとを反応させ、生じる蛍光強度を測定する工程を含む方法である。前記検体としては、例えば、細胞溶解液等が挙げられる。
【００６４】
本発明のヒストンデアセチラーゼ活性を検出する方法によれば、放射性同位体を用いる必要はない。また、この方法によれば、蛍光を測定するのみの簡便な操作により、ヒストンデアセチラーゼ活性を検出することができる。また、この方法によれば、蛍光を測定するのみであるので、ハイスループットスクリーニングに用いることもできる。
【００６５】
また、前記のように、本発明のヒストンデアセチラーゼ活性を検出する方法は、被験組織切片または被験細胞と、前記プローブとを反応させ、生じる蛍光強度を測定する工程を含む方法である。前記被験組織切片は、ヒトまたは動物の組織をスライスすることにより調製することができる。被験組織切片または被験細胞と、前記プローブとを反応させるには、被験組織切片または被験細胞に、前記プローブの溶液または分散液を塗布または散布し、一定時間放置することにより行うことができる。生じる蛍光強度を測定する工程は、そのような処理を行った被験組織切片または被験細胞の蛍光強度を測定することにより行うことができる。
【００６６】
また、前記のように、本発明のヒストンデアセチラーゼ阻害活性を測定する方法は、検体と、前記プローブと、ヒストンデアセチラーゼとを反応させ、生じる蛍光強度（第１蛍光強度）を測定する工程と、比較対照としての蛍光強度（第２蛍光強度）と前記第１蛍光強度とを比較する工程とを含む。前記比較対照としての蛍光強度としては、前記プローブと、ヒストンデアセチラーゼとを反応させ、生じる蛍光強度、他の検体と、前記プローブと、ヒストンデアセチラーゼとを反応させ、生じる蛍光強度等であってもよい。
【００６７】
前記第１蛍光強度と前記第２蛍光強度とを比較し、前記第１蛍光強度が低下した場合、前記検体にはヒストンデアセチラーゼ阻害活性が認められる。検体と、前記プローブと、ヒストンデアセチラーゼとを反応させ、生じる蛍光強度（第１蛍光強度）を測定する工程は、複数種類の濃度の前記検体について行ってもよい。その場合、例えば濃度が増加する順に第１蛍光強度その１、第１蛍光強度その２、第１蛍光強度その３等、呼ぶとする。濃度が増加するにつれ第１蛍光強度が低下した場合、前記検体には、濃度依存的にヒストンデアセチラーゼ阻害活性が認められる。
【００６８】
また、前記のように、本発明の検体のヒストンデアセチラーゼ阻害活性をスクリーニングする方法は、被験化合物と、前記プローブと、ヒストンデアセチラーゼとを反応させ、生じる蛍光強度（第１蛍光強度）を測定する工程と、比較対照としての蛍光強度（第２蛍光強度）と前記第１蛍光強度とを比較する工程とを含む。前記比較対照としての蛍光強度としては、前記プローブと、ヒストンデアセチラーゼとを反応させ、生じる蛍光強度、他の検体と、前記プローブと、ヒストンデアセチラーゼとを反応させ、生じる蛍光強度等であってもよい。前記第１蛍光強度と前記第２蛍光強度とを比較し、前記第１蛍光強度が低下した場合、前記検体にはヒストンデアセチラーゼ阻害活性が認められる。前記スクリーニングする方法は、例えば９６孔のプレート中のウェルに、被験化合物（ウエルごとに種類、濃度等が相違する）と、前記プローブと、ヒストンデアセチラーゼとを入れ、一定時間反応させた後、プレートの蛍光強度を蛍光リーダーで読み取る。ウェルの１つに前記プローブと、ヒストンデアセチラーゼのみを入れて反応させた場合、これがコントロールとなる。このコントロールの生じる蛍光強度より弱い蛍光強度を示すウェルを特定することにより、ヒストンアセチラーゼ阻害活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。また、蛍光リーダーでプレートの蛍光強度を読み取った際、最も蛍光強度が弱いウェルを特定することにより、ヒストンアセチラーゼ阻害活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。
【００６９】
また、前記のように、本発明のヒストンデアセチラーゼ阻害活性をスクリーニングするためのキットは、また、前記化合物またはその塩と、ヒストンデアセチラーゼとを含む。
【００７０】
本発明におけるヒストンデアセチラーゼの例としては、１８種類のヒストンデアセチラーゼが挙げられる。分類と共に、これらのヒストンデアセチラーゼを以下の表に示す。
【００７１】
【表１】
2012126765.tif 000014
【００７２】
［実施例］
本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＰＩＰＥＳ：ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）
Ａｒ：アルゴン
【００７３】
［化合物および機器］
化合物は、入手できる最も高いグレードのものであり、東京化成工業株式会社、和光純薬工業株式会社、およびシグマ−アルドリッチジャパン株式会社から購入して、さらなる精製を行わずに用いた。酵素（ＨＤＡＣ）は、ＢＰＳバイオサイエンスおよびエンゾライフサイエンスから購入した。蛍光原アッセイキットは、ＢＰＳバイオサイエンスから得た。サレミド（Salermide）はカイマン・ケミカル社より提供を受け、阻害力学実験で用いた。
【００７４】
ＮＭＲスペクトルは、1Ｈ用には４００ＭＨｚで、13ＮＭＲ用には１００．４ＭＨｚで、テトラメチルシランを内部標準として用い、ＪＥＯＬ  ＪＮＭ−ＡＬ４００装置で測定した。質量スペクトル（ＥＳＩ）は、Waters LCT-Premier XE（日本ウォーターズ株式会社）で測定した。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）は、ＪＥＯＬ  ＪＭＳ−７００で測定した。ＨＰＬＣ分離は、Ｃ１８カラム（ＯＤＳ３、ＧＬサイエンス社）を用いて行った。サンプルは、溶媒Ａ（０．１％ギ酸を含む水）に対する溶媒Ｂ（０．１％ギ酸を含むアセトニトリル）の割合を増加させて、溶出させた。蛍光スペクトルは、日立分光蛍光光度計Ｆ−４５００を用いて測定した。光電子増倍管電圧は７００Ｖであった。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、ＢＷ−３００（富士シリシア化学株式会社）を用いて行った。全てのプローブは蛍光測定前にＤＭＳＯ（生化学用グレード、和光純薬工業株式会社）に溶解させた。
【００７５】
［ＤＡＣＰ(式２の化合物）の合成］
式２の化合物を、下記スキーム６に従い製造した。
【００７６】
【化１２】
2012126765.tif 000015
【００７７】
３−アミノプロパン−１−オール（６５．３ｍｍｏｌ，５ｍｌ）と、酢酸メチル（６５．３ｍｍｏｌ，３．７２ｍｌ）とを、溶媒無しで混合し、１２時間還流した。生じたメタノールを蒸留により除去した後、得られた生成物は、沸点が１３８℃であった。残渣を、ジクロロメタンおよびメタノール（９：１）の混合物で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）アセトアミド（化合物１）を得た（５ｇ，収率６５％）。
【００７８】
1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ 1.78 (m,2H), 1.98 (s,3H), 3.4 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.62 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 6.36 (s,H)
MS(ESI+) m/z  [M+H]+についての計算値：118.1480、実測値118.1557。
【００７９】
Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）アセトアミド（４００ｍｇ，３．４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ、３．４ｍｍｏｌ，８７０ｍｇ）を、無水アセトニトリル中に連続して溶解させ、そこへ、トリエチルアミン（６．８ｍｍｏｌ，９４１μＬ）を添加した。その混合物を室温でＡｒ雰囲気下で１時間攪拌し、次いで、７−ヒドロキシクマリンをその混合物へ添加した。トリエチルアミン（３．４ｍｍｏｌ，４７０μＬ）をその混合物へ更に添加し、室温で２時間攪拌した。反応混合物を、酢酸エチルと水の混合物（酢酸エチル：水＝１：１）で洗浄した。有機相をろ過し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を蒸発させた後、残渣を酢酸エチルで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、化合物２（以下、ＤＡＣＰと呼ぶ）を得た（２００ｍｇ，収率１９％）。
【００８０】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ 2.05 (m, 5H), 3.41 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 4.18 (t, J = 4.4 Hz, 2H) , 5.71 (s, H,), 6.42 (d, J  = 4.4 Hz, 2H), 7.13 (d, J = 2.0 Hz, 2H), 7.26(d, J = 2.4 Hz, 2H), 7.48(d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.68(d, J  = 10 Hz, 2H); 
13 C  NMR(100 MHz, CDCl3)δ163.9, 153.4, 147.2, 146.1, 145.5, 135.8,  121.8, 110.7, 109.8, 108.8, 102.5, 60.8, 28.8, 22.9, 15.9 ;
HRMS (EI+) m/z  計算値 305.0899、実測値 305.0894
【００８１】
＜蛍光スペクトル分析＞
蛍光スペクトルは、３４０ｎｍ、励起および放射についてスリット幅５．０ｎｍ、３０℃の温度における励起を記録した。ＤＡＣＰ（２０μＭ）をＨＤＡＣ（４８７ｎＭのＳｉｒｔ１）と共に、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌおよび１ｍＭのＭｇＣｌ2を含む２５ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中で、インキュベートした。蛍光スペクトルの測定は、定期的に行った。得られた蛍光スペクトルのチャートを図１（ａ）に示す。また、酵素（Ｓｉｒｔ１）を添加しない以外は、前記と同様にして得られた蛍光スペクトルのチャートを図１（ｂ）に示す。
【００８２】
Ｓｉｒｔ１（酵素）とＤＡＣＰを反応させて得られた蛍光スペクトルのチャートにおいては、経時的に蛍光強度の上昇が観測された（図１（ａ）参照）。一方、ＤＡＣＰ単独で得られた蛍光スペクトルにおいては、蛍光強度は低く、蛍光強度変化は確認されなかった（図１（ｂ）参照）。また、ＤＡＣＰの蛍光量子収率は０．０４３であり、酵素反応産物と考えられる７−ヒドロキシクマリンの量子収率（０．６０）に比べ低いことが確認できた。以上のことから、ＤＡＣＰは、Ｓｉｒｔ１と反応することで蛍光強度を上昇させることが確認できた。
【００８３】
＜ＨＰＬＣ分析＞
Ｓｉｒｔ１とＤＡＣＰの反応の進行は、３２０ｎｍの吸収を用いてＨＰＬＣでモニターした。ＤＡＣＰ（２０μＭ）を、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌおよび１ｍＭのＭｇＣｌ2を含む２５ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中において、Ｓｉｒｔ１（４８７ｎＭ）存在下又は不在下に、５分間、３０分、２時間、４時間および８時間、インキュベートした。ＨＰＬＣ分析は、インキュベーション後に行った。Ｓｉｒｔ１とＤＡＣＰの反応をモニターしたＨＰＬＣチャートを図２（ａ）に、ＤＡＣＰ単独をモニターしたＨＰＬＣチャートを図２（ｂ）に、７−ヒドロキシクマリンのＨＰＬＣチャートを図２（ｃ）に示す。
【００８４】
Ｓｉｒｔ１とＤＡＣＰの反応をモニターしたＨＰＬＣチャートにおいて、溶出時間１２分付近に示されるピークが時間と共に減少し、溶出時間１１分付近のピーク強度が増加した（図２（ａ）参照）。この溶出時間１２分付近のピークは、ＤＡＣＰのピークであり、溶出時間１１分は、７−ヒドロキシクマリンと同じである（図２（ｃ）参照）。この７−ヒドロキシクマリンは、ＤＡＣＰがヒストンデアセチラーゼと反応した後、生じる蛍光物質である、一方、酵素を添加せずに、ＤＡＣＰ単独をモニターしたＨＰＬＣチャートにおいては、溶出時間１１分付近のピークの変化はほとんど見られなかった（図２（ｂ）参照）。以上の結果から、この条件下においては、ＤＡＣＰ単独は安定であり、Ｓｉｒｔ１との反応により、ＤＡＣＰは分解したことを確認した。
【００８５】
＜蛍光量子収量＞
ＤＡＣＰをＤＭＳＯ中に溶解し、２ｍＭのストック溶液を得た。これらの溶液を、適切な緩衝液を用いて、所望の最終濃度にまで希釈した。プローブの蛍光量子収量を、２５ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中で、比較の参照として蛍光標準、キニンビスルフェートを用いて、５０ｍＭのＨ2ＳＯ4水溶液（Φ＝０．５５）中で測定した。その結果、ＤＡＣＰの蛍光量子収量は、０．０４３であった。
【００８６】
＜蛍光分析による阻害実験＞
ＤＡＣＰ（５μＭ）、Ｓｉｒｔ１（４８７ｎＭ）および阻害剤であるサレミド（０、５、２０、５０μＭ）を、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌおよび１ｍＭのＭｇＣｌ2を含む２５ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解させて、反応混合物を調製した。蛍光強度を、励起および放射のための２．５ｎｍスリット幅を用いて２時間にわたって、１６秒ごとに測定した。得られたチャートを図３に示す。
【００８７】
Ｓｉｒｔ１の阻害剤であるサレミドを添加したとき、その阻害効果をＤＡＣＰにより観測することができるかを検討した。阻害剤濃度を上昇させるにつれ、蛍光強度の上昇が抑制されることが明らかとなった。この結果から、ＤＡＣＰを用いることにより、Ｓｉｒｔ１阻害剤の酵素反応の阻害効果を調べることが可能であることが確認できた。
【００８８】
＜クラス２ＨＤＡＣとの反応性＞
ＤＡＣＰをクラス２ＨＤＡＣであるＨＤＡＣ６と反応させたところ、蛍光強度の上昇が確認された。その結果を図４に示す。この図４に示すように、本実験条件下において、ＤＡＣＰは選択的にＨＤＡＣと反応することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明のＨＤＡＣ活性を検出する方法は、ＨＤＡＣ阻害剤スクリーニング等に適用できる。
【図１】
2012126765.tif 000021
【図２】
2012126765.tif 000022
【図３】
2012126765.tif 000023
【図４】
2012126765.tif 000024