(57)【要約】【課題】  米糠、米胚芽等の植物素材から得られたスフィンゴ糖脂質について、ナノリポソーム内包させ、或いはナノ分散水溶液とし、かかるナノ化製剤を皮膚に適用することによる、皮膚中に内因性セラミドを増加させることにより、効率よく皮膚のバリア機能、及び水分保持機能を発揮させること。【解決手段】  スフィンゴ糖脂質のナノリポソーム或いはナノ分散水溶液を皮膚に適用することによる、内因性セラミドを増加させる方法であり、特にスフィンゴ糖脂質が米糠、米胚芽及び／又はこれら由来のスフィンゴ糖脂質、好ましくはβ−グルコシルセラミドである表皮中内因性セラミドを増加させる方法。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノサイズに調製されたスフィンゴ糖脂質を皮膚に適用することを特徴とする表皮中内因性セラミドを生成・増加させる方法。
【請求項２】
ナノサイズに調製されたスフィンゴ糖脂質が、ナノリポソーム又はナノ分散水溶液である請求項１に記載の表皮中内因性セラミドを生成・増加させる方法。
【請求項３】
スフィンゴ糖脂質が米糠、米胚芽及び／又はこれら由来のスフィンゴ糖脂質である請求項１又は２に記載の表皮中内因性セラミドを生成・増加させる方法。
【請求項４】
スフィンゴ糖脂質がβ−グルコシルセラミドである請求項１、２又は３に記載の表皮中内因性セラミドを生成・増加させる方法。
【請求項５】
スフィンゴ糖脂質を内包するナノリポソームがリン脂質として、ジミリストイル−ホスファチジルコリン（dimyristoyl-phosphatidylcholine：ＤＭＰＣ）及びジミリストイル−ホスファチジルグリセロール（dimyristoyl-phosphatidylglycerol：ＤＭＰＧ）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（dipalmitoyl-phosphatidylcholine：ＤＰＰＣ）及びジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール（dipalmitoyl-phosphatidylglycerol：ＤＰＰＧ）、又はジステアロイル−ホスファチジルコリン（distearoyl-phosphatidylcholine：ＤＳＰＣ）及びジミリストイル−ホスファチジルグリセロール（distearoyl-phosphatidylglycerol：ＤＳＰＧ）を用い、作成されたものである請求項２に記載の表皮中内因性セラミドを生成・増加させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米糠、米胚芽等の植物素材から得られたスフィンゴ糖脂質について、ナノリポソーム内包させ、かかるリポソームを皮膚に適用することによる、皮膚中に内因性セラミドを生成・増加させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、皮膚最外層に存在する角質層の構造とその保湿機能が明らかになるにつれて、スフィンゴ糖脂質（グルコシルセラミド：GlcCer）やセラミドを配合した化粧料が種々提案されてきている（例えば、特許文献１）。
角質細胞間脂質の主成分であるセラミドは、皮膚においてはバリア機能、水分保持（水分蒸散防御）機能等重要な働きをしており、皮膚に適用して皮膚からの水分の蒸散を防ぐと共に、皮膚に保湿効果をもたらす作用を有する内因性セラミドである。
【０００３】
これまでに、これらスフィンゴ糖脂質やセラミドの有する特性を考慮し、これら物質を、例えばリポソームに内包させ化粧料として使用する検討も行われている（例えば、特許文献２、特許文献３）。
更には、リポソーム化したグルコシルセラミドを皮膚に適用し、皮膚中の美白効果の検討も行われてきている（例えば、特許文献４）。
しかしながら、スフィンゴ糖脂質等の細胞間脂質は、優れたバリア効果を示すものの、他の油性基剤との相溶性があまり高く無く、安定な製剤化がし難いといった問題点があった。
さらに、皮膚に塗布した場合、バリア効果による皮膚からの水分蒸散防御作用は期待できるものの、角質細胞間に滞留・存在させ、その状態での保水機能を期待することはできなかった。
【０００４】
また、これらスフィンゴ糖脂質やセラミドをリポソームに内包して配合する技術についても、製剤中にリポソームが安定した状態で保持されにくく、リポソームを皮膚に適用したとしても、必ずしも角質層の有する保水機能や水分蒸散防御機能を効率良く再現させるものではなく、化粧料としては未だ不十分なものであった。
【０００５】
あるいは、最近では、セラミドをナノサイズ化して水溶性分散液とした製剤も開発されており、かかる製剤は、セラミドの皮膚への浸透性を高めることにより、角質層の有する保水機能や水分蒸散防御機能を向上させるものであるといわれている（特許文献５、特許文献６）。
【０００６】
上記の検討は、いずれも皮膚への適用により、皮膚のバリア効果の増強、或いは角質層の有する保水機能や水分蒸散防御機能の再現を目的としたものであって、スフィンゴ糖脂質やセラミドを皮膚の適用した場合に、皮膚中に内因性セラミドを生成・増加させる点については一切検討されていない。
本発明者等は、これまでに、スフィンゴ糖脂質やセラミドを皮膚へ適用した場合に、皮膚中に内因性セラミドが生成・増加されるか否かの検討を積極的に行ってきている。
その検討の結果、具体的にはセラミドの前駆体であるスフィンゴミエリエンであるスフィンゴリン脂質をリポソームとして皮膚に適用し、皮膚中に内因性セラミドが生成・増加されることを新規に見出してきている。
【０００７】
そこで更に検討を進め、セラミドの前駆体であるグルコシルセラミドであるスフィンゴ糖脂質をリポソームに内包させるか、或いはナノ分散水溶液として、皮膚に適用した場合に、皮膚中の内因性セラミドを生成・増加させることができるか否かを検討した。
その結果、グルコシルセラミドであるスフィンゴ糖脂質を効率よくナノリポソームに内包させることができ、かつ、かかるナノリポソームが物理化学的に安定なものであって、皮膚に適用した場合に、効率よく皮膚中に内因性セラミドを生成・増加させることができることを確認した。さらに、ナノ分散水溶液にあっても、同様皮膚に適用した場合には、効率よく皮膚中に内因性セラミドを生成・増加させることができることを確認し、本発明を完成させるに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−８１８０９号公報
【特許文献２】再公表ＷＯ２００４／００９０４１号
【特許文献３】特開２００９−１０２２５７号公報
【特許文献４】特開２００６−３２８０２６号公報
【特許文献５】特開２００９−２６９８８８号公報
【特許文献６】特開２０１０−０９００９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
すなわち本発明は、米ぬか、米胚芽等の植物素材から得られたセラミドの前駆体であるグルコシルセラミドであるスフィンゴ糖脂質について、ナノリポソーム内包させ、或いはナノ分散水溶液とし、かかるリポソーム或いはナノ分散水溶液を皮膚に適用することにより、皮膚中に内因性セラミドを生成・増加させ、その結果、効率よく皮膚のバリア機能、或いは水分保持（水分蒸散防御）機能を発揮させ、皮膚の保湿を確保することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
かかる課題を解決するための本発明は、その基本的態様として、ナノサイズに調製されたスフィンゴ糖脂質を皮膚に適用することを特徴とする表皮中内因性セラミドを生成・増加させる方法である。
【００１１】
具体的には、ナノサイズに調製されたスフィンゴ糖脂質が、ナノリポソーム又はナノ分散水溶液である表皮中内因性セラミドを生成・増加させる方法である。
【００１２】
より具体的には、スフィンゴ糖脂質が米糠、米胚芽及び／又はこれら由来のスフィンゴ糖脂質であり、さらに具体的には、スフィンゴ糖脂質がβ−グルコシルセラミドである表皮中内因性セラミドを生成・増加させる方法である。
【００１３】
また本発明は、スフィンゴ糖脂質を内包するナノリポソームがリン脂質として、ジミリストイル−ホスファチジルコリン（dimyristoyl-phosphatidylcholine：ＤＭＰＣ）及びジミリストイル−ホスファチジルグリセロール（dimyristoyl-phosphatidylglycerol：ＤＭＰＧ）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（dipalmitoyl-phosphatidylcholine：ＤＰＰＣ）及びジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール（dipalmitoyl-phosphatidylglycerol：ＤＰＰＧ）、又はジステアロイル−ホスファチジルコリン（distearoyl-phosphatidylcholine：ＤＳＰＣ）及びジミリストイル−ホスファチジルグリセロール（distearoyl-phosphatidylglycerol：ＤＳＰＧ）を用い、作成されたものである上記の表皮中内因性セラミドを生成・増加させる方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、スフィンゴ糖脂をナノリポソームに効率よく内包させ、或いはスフィンゴ糖脂のナノ分散水溶液を、皮膚に適用することにより皮膚中の内因性セラミドが生成・増加されることが判明した。
これまでスフィンゴ糖脂質をリポソーム化、或いはナノ分散水溶液として皮膚に適用させる化粧料が提案されていたが、これらは、いずれもスフィンゴ糖脂質の有するバリア機能、或いは水分保持機能を検討しているものでしかなく、皮膚中の内因性セラミドを増加させている点を見出したのは本発明者等が始めてであり、その点で極めて特異的なものである。
【００１５】
本発明が提供する内因性セラミドを生成・増加させる方法は、スフィンゴ糖脂質を内包するナノリポソーム、或いはスフィンゴ糖脂のナノ分散水溶液を皮膚に適用することによってセラミドの前駆体であるスフィンゴ糖脂質を皮膚に浸透させ、その結果皮膚中において内因性セラミドに変換され、皮膚中に内因性セラミドが生成・増加されるものである。したがって、本発明方法により、効果的に皮膚のバリア機能が向上すると共に、皮膚からの水分蒸散が防止され、保湿性に富んだ皮膚状態が保持されることとなる。その点で、本発明提供する方法は、今後極め有効な化粧料を開発していく上で、一つの指針を与えるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の米ぬか由来グルコシルセラミドを内包するナノリポソームの粒子径の結果を示す図である。
【図２】本発明の米ぬか由来グルコシルセラミドを内包するナノリポソームの表面電位の結果を示す図である。
【図３】本発明の米ぬか由来グルコシルセラミドを内包するナノリポソームをヒト三次元培養表皮モデルへ適用した場合の内因性セラミドの生成の結果を示す図である。
【図４】対照としての合成グルコシルセラミドを内包するナノリポソームをヒト三次元培養表皮モデルへ適用した場合の内因性セラミドの生成の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は上記したように、その基本的態様は、スフィンゴ糖脂質（グルコシルセラミド）のナノリポソーム、或いはスフィンゴ糖脂質のナノ分散水溶液を皮膚に適用することによる、内因性セラミドを生成・増加させる方法である。
本発明に使用されるスフィンゴ糖脂質としては、セラミドの前駆体であり、特にその由来が限定されるものではなく、あらゆるスフィンゴ糖脂質を使用することができる。
そのなかでも、スフィンゴ糖脂質として、米糠、米胚芽及び／又はこれら由来のスフィンゴ糖脂質が好ましく、より好ましくは、スフィンゴ糖脂質がβ−グルコシルセラミドである。
【００１８】
このような米糠、米胚芽及び／又はこれら由来のスフィンゴ糖脂質、より好ましくは、スフィンゴ糖脂質がβ−グルコシルセラミド（β−GlcCer）としては、例えば、特開２０１０−２７０１０４号公報に記載する、米糠、米胚芽及び／又はこれら由来の素材を有機溶媒抽出して得たスフィンゴ糖脂質含有粗製画分を、クロマトグラフィー及び／又は再結晶により分画したスフィンゴ糖脂質精製画分からなるスフィンゴ糖脂質を挙げることができる。
また、これらのスフィンゴ糖脂質は、ヒト型セラミドの前駆体であるのがより好ましいものである。
【００１９】
本発明にあっては、このスフィンゴ糖脂質、例えばグルコシルセラミドをナノリポソーム中に内包させるものであるが、かかるナノリポソーム、例えば、一般的な薄膜法により調製することができる。
スフィンゴ糖脂質は、脂質としてそれ自体でナノリポソームを形成することが可能であるが、本発明者等の検討によれば、スフィンゴ糖脂質のみを用いてナノリポソームを調製することはできなかった。
そこで脂質としてさらにリン脂質を用い、薄膜法による調製で、効率よくスフィンゴ脂質を内包するナノリポソームを調製することができた
【００２０】
そのようなリン脂質としては、卵黄レシチンや大豆レシチンのような天然リン脂質、或いはその他の各種リン脂質を用いることができ、特に限定されるものではない。そのようなリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール等のグリセロリン脂質、スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質を挙げることができる。また、適宜脂肪酸の炭素数を変化させたリン酸エステル等であってもよい。
【００２１】
本発明者等の検討の結果、ジミリストイル−ホスファチジルコリン（dimyristoyl-phosphatidylcholine：ＤＭＰＣ）及びジミリストイル−ホスファチジルグリセロール（dimyristoyl-phosphatidylglycerol：ＤＭＰＧ）；ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（dipalmitoyl-phosphatidylcholine：ＤＰＰＣ）及びジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール（dipalmitoyl-phosphatidylglycerol：ＤＰＰＧ）；又はジステアロイル−ホスファチジルコリン（distearoyl-phosphatidylcholine：ＤＳＰＣ）及びジミリストイル−ホスファチジルグリセロール（distearoyl-phosphatidylglycerol：ＤＳＰＧ）を用いて効率よくナノリポソーム化することができた。
【００２２】
例えば、本発明のナノリポソームの調製は、リン脂質としてＤＭＰＣ用いることにより調製することができるが、得られるナノリポソームの安定化のためには荷電物質であるＤＭＰＧを一緒に添加してナノリポソームを調製するのが、ナノリポソームの安定化のために良いことが判明した。
その調製にあたっての配合量は、例えば、スフィンゴリン脂質：ＤＭＰＣとして４：４の比率で調製するのが良く、ＤＭＰＧを一緒に添加する場合には、スフィンゴリン脂質：ＤＭＰＣ：ＤＭＰＧとして、４：４：１の比率で調製するのがよい。
なお、この比率は好ましい比率として例示するものであって、この比率のみに限定されるものではなく、目的の含有量に併せ種々変更できることはいうまでもない。
【００２３】
かくして調製された、スフィンゴ糖脂質を内包するナノリポソームは、動的光散乱法によりその粒子径を測定したところ、平均粒子径が１４０ｎｍ程度のナノリポソームであった。
また、荷電物質であるＤＭＰＧを添加することによりゼータ電位から表面荷電を測定した結果、極めて良好な表面荷電値を有し、物理化学的に安定なものであり、化粧料への応用にあたって、従来のリポソームよりもより好ましいことが判明した。
【００２４】
かくして調製されたスフィンゴ糖脂質を内包するナノリポソームを、三次元培養表皮モデルを用いた皮膚への適用を検討した。すなわち、ナノリポソームを三次元培養表皮モデルとともに培養し、一定期間培養後、表皮モデルから脂質を抽出し、高性能薄層クロマトグラフィーで分離し、セラミドの定量を行ったところ、内因性セラミド量の生成・増加が認められた。
このことから、培養表皮中でセラミドの前駆体であるスフィンゴ糖脂質（グルコシルセラミド）からセラミドが生成され、皮膚中において内因性セラミドが生成・増加されていることが判明した。
【００２５】
以下に、実施例に代え、スフィンゴ糖脂質としてβ−グルコシルセラミド（β−GlcCer）を用い、具体的なナノリポソームへの内包の実際等を説明することにより、本発明をさらに詳細に説明する。
ただし、本発明は以下の説明に限定されるものではなく、特許請求の範囲を逸脱しない限り種々の変更が可能であり、その変更も本発明に包含されるものである点に留意すべきである。
【００２６】
以下の検討においては、スフィンゴ糖脂質としてβ−グルコシルセラミド（β−GlcCer）を用いた。このβ−グルコシルセラミド（β−GlcCer）は、具体的には、特開２０１０−２７０１０４号公報に記載する、米糠、米胚芽及び／又はこれら由来の素材を有機溶媒抽出して得たスフィンゴ糖脂質含有粗製画分を、クロマトグラフィー及び／又は再結晶により分画したスフィンゴ糖脂質精製画分からなるβ−グルコシルセラミド（β−GlcCer）である。
【００２７】
１．ナノリポソームの薄膜法による調製
一般的な薄膜法による調製により、β−グルコシルセラミド（β−GlcCer）を内包するナノリポソームを調製した。
すなわち、β−グルコシルセラミド（β−GlcCer）、リン脂質を、適当な溶媒に溶解させて、ビーカー内に入れ溶媒を留去し、ビーカー内壁にβ−グルコシルセラミド（β−GlcCer）及びリン脂質を付着させ、薄膜を形成し、水を加えて水和させ、機械的振動を加えることにナノリポソーム化し、そのまま凍結乾燥して、β−グルコシルセラミドリポソーム（β−GlcCer-L）を得た。このβ−GlcCer-Lをエクストルーダーにより、β−GlcCer-Lの粒子径を調節した。
【００２８】
この検討の結果、脂質でもあるβ−GlcCerのみではリポソームを調製することができなかった。
そこで、更にリン脂質としてジミリストイル−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）及びジミリストイル−ホスファチジルグリセロール（dimyristoyl-phosphatidylglycerol：ＤＭＰＧ）を選択し、以下の配合により、目的とするナノリポソーム（１）及び（２）の調製を行った。
【００２９】
＜ナノリポソーム（１）＞
β−グルコシルセラミド（β−GlcCer）にリン脂質としてジミリストイル−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）を添加して調製した。
β−GlcCer／ＤＭＰＣ＝４／４（荷電物質なし）
【００３０】
＜ナノリポソーム（２）＞
β−グルコシルセラミド（β−GlcCer）にリン脂質としてジミリストイル−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）を添加し、更にジミリストイル−ホスファチジルグリセロール（dimyristoyl-phosphatidylglycerol：ＤＭＰＧ）を添加して調製した。
β−GlcCer／ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ＝４／４／１（荷電物質あり）
得られたナノリポソーム（１）及び（２）の安定性を、タービスキャン（英弘精機）で検討したところ、ナノリポソーム（２）のほうがナノリポソーム（１）に比較して、極めて安定であることが判明した。
すなわち、ナノリポソームの表面を荷電することにより安定したナノリポソームが得られることが判明した。
【００３１】
２．得られたβ−グルコシルセラミドリポソーム（β−GlcCer-L）の粒子径と表面電位
上記で得られたβ−グルコシルセラミドリポソーム（β−GlcCer-L）［ナノリポソーム（１）及びナノリポソーム（２）］について、その粒子径を動的光散乱法にて測定し、また、ゼータ電位から表面電位を測定した。
その結果を図１（粒子径）及び図２（表面電位）に示した。
なお、図中において、ClcCer/DPPCはナノリポソーム（１）を、ClcCer/DPPC/DPPGは、ナノリポソーム（２）を意味する。
【００３２】
図中の結果から判明するように、ClcCer/DPPC［ナノリポソーム（１）］及びClcCer/DPPC/DPPG［ナノリポソーム（２）］共に、その粒子径は１４０ｎｍ程度であり、良好なナノリポソームであることが理解される。
また、荷電物質を添加したClcCer/DPPC/DPPG［ナノリポソーム（２）］は、良好な表面荷電を有していることが理解される。
【００３３】
３．培養皮膚への適用
＜方法＞
上記で得られたナノリポソーム（１）及び（２）を、ヒト３次元培養表皮モデル（Lab Cyte EPI-MODEL 12）を用い、７日間SPM-L適用で培養した。
培養後、培養液をクロロホルム：メタノール（２：１）にて抽出し、濃縮後、高性能薄層クロマトグラフィーで（High Performance Thin Layer Chromatography）にて、セラミドのタイプ別に分離し、ルミノイメージアナライザーシステム（LAS1000-plus；富士フイルム）により、密度から内因性セラミドとして、セラミド２（Cer2）、セラミド５（Cer5）、セラミド６（Cer6）を定量した。
なお、対照セラミドとして合成グルコシルセラミド（Avanti社製）を用い、ナノリポソームを調製し、同様にヒト３次元培養表皮モデルによる培養を行った。
【００３４】
＜結果＞
米ぬか由来グルコシルセラミドのナノリポソームの結果を図３に示し、同様に調製した対照の合成グルコシルセラミのナノリポソームの結果を図４に示した。
米ぬか由来のグルコシルセラミド、並びに対照の合成グルコシルセラミド共に、皮膚中の内因性セラミド量を生成・増加させていることが明らかとなった。
内因性セラミドとして、セラミド２（Cer2）については大きな変動はなかったが、セラミド６（Cer6）は、ナノリポソーム（２）で大きく変動し、安定化したナノリポソームが特に好ましいことが理解される。
【００３５】
皮膚中でのセラミドの生成経路を考慮すると、内因性セラミドであるセラミド２（Cer2）及びセラミド５（Cer5）は、皮膚顆粒層においてセラミドよりスフィンゴミエリンへ変換し、そのスフィンゴミエリンがスフィンゴミエリナーゼにより角質層でセラミド２（Cer2）及びセラミド５（Cer5）を生成する。
一方、セラミド６（Cer6）は、皮膚顆粒層においてセラミドよりグルシルセラミドへ変換され、グルコセレブロシダーゼにより角質層でセラミド６（Cer6）を生成する。
上記のヒト３次元培養表皮モデルの実験の結果は、かかるセラミドの生成経路に良く合致するものであって、グルコシルセラミドのナノリポソーム製剤の適用によりセラミド６（Cer6）の変動が大きなものとなっている。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
以上記載のように、本発明により、スフィンゴ糖脂、具体的にはグルコシルセラミド（GlcCer）をナノリポソームに内包させ、或いはスフィンゴ糖脂のナノ分散水溶液として皮膚に適用することにより、皮膚中の内因性セラミド、特にセラミド６（Cer6）が増加される。
この皮膚中の内因性セラミドを生成・増加させることにより、効果的に皮膚のバリア機能が増強させるものであって、その結果、皮膚からの水分蒸散が防止され、保湿性に富んだ皮膚状態が保持されることとなる。
本発明が提供する方法は、今後極め有効な化粧料を開発していく上で、一つの指針を与えるものであり、その産業上の利用性は多大なものである。
【図１】
2012184166.tif 000003
【図２】
2012184166.tif 000004
【図３】
2012184166.tif 000005
【図４】
2012184166.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成24年2月6日(2012.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
３．培養皮膚への適用
＜方法＞
上記で得られたナノリポソーム（１）及び（２）を、ヒト３次元培養表皮モデル（Lab Cyte EPI-MODEL 12）を用い、７日間SPM-L適用で培養した。
培養後、培養表皮を取り出し、クロロホルム：メタノール（２：１）にて抽出し、濃縮後、高性能薄層クロマトグラフィーで（High Performance Thin Layer Chromatography）にて、セラミドのタイプ別に分離し、ルミノイメージアナライザーシステム（LAS1000-plus；富士フイルム）により、密度から内因性セラミドとして、セラミド２（Cer2）、セラミド５（Cer5）、セラミド６（Cer6）を定量した。
なお、対照セラミドとして合成グルコシルセラミド（Avanti社製）を用い、ナノリポソームを調製し、同様にヒト３次元培養表皮モデルによる培養を行った。