(57)【要約】【課題】表皮角化細胞の成熟・分化過程で観察されるプロフィラグリンやケラチン１０の発現を促進する作用を有し、安全性の優れた表皮角化正常化作用を有する表皮角化正常化剤を提供すること。【解決手段】サクランボ抽出物を有効成分とする表皮角化正常化剤からなる。該表皮角化正常化剤の有効成分であるサクランボ抽出物は、表皮角化細胞の成熟・分化過程で観察されるプロフィラグリンやケラチン１０の発現を促進する作用を有し、有効な表皮角化正常化作用を有する表皮角化正常化剤を提供する。該表皮角化正常化剤は、有効な表皮角化正常化作用と安全性に優れ、化粧品、医薬部外品を含む皮膚外用剤として有効に使用することが可能である。本発明の表皮角化正常化剤の有効成分であるサクランボ抽出物は、桜桃果実を熱水抽出し、該抽出液を濃縮した抽出濃縮物として調製することができる。該抽出濃縮物は、更に、加熱して水分を蒸発させ、固形物として調製することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サクランボ抽出物を有効成分として含有する表皮角化正常化剤。
【請求項２】
表皮角化正常化が、サクランボ抽出物の表皮角化細胞におけるプロフィラグリン産生促進作用及び／又はケラチン１０産生促進作用によるものであることを特徴とする請求項１記載の表皮角化正常化剤。
【請求項３】
サクランボ抽出物が、桜桃果実を熱水抽出し、濃縮した、抽出濃縮物であることを特徴とする請求項１又は２記載の表皮角化正常化剤。
【請求項４】
サクランボ抽出物に、製剤化補助剤及び安定化剤を配合して、皮膚外用剤として調製したことを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の表皮角化正常化剤。
【請求項５】
製剤化補助剤及び安定化剤に、更に細胞賦活剤を配合し、皮膚外用剤として調製したことを特徴とする請求項４記載の表皮角化正常化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表皮角化細胞の成熟・分化過程で観察されるプロフィラグリンやケラチン１０の発現を促進する作用を有し、安全性の優れた表皮角化正常化作用を有する有効成分を含有し、化粧品、医薬部外品を含む皮膚外用剤として有効に使用可能な表皮角化正常化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮は皮膚の最も外側を構成している組織であり、外界からの様々な刺激から生体を防御したり、水分の過剰な蒸発を防いだりする役割を担っている。表皮は最下層である基底細胞層に始まり、有棘細胞層、顆粒細胞層、角質細胞層へと続く４層から構成されている。これら表皮を構成する約９５％の細胞は、基底細胞層から細胞分裂・分化した表皮角化細胞である。表皮角化細胞は基底層から徐々に成熟・分化しながら上層へ移動し、約２週間で角質細胞となって角質層を形成する。角質層に到達した角質細胞は次の２週間で最外層に到達し、最終的に細胞核が消失して垢などの角質断片となり、剥がれ落ちる。表皮ではそのバリア機能を維持するために基底層で角化細胞が誕生してから、角質層に至って剥がれ落ちるまでのサイクルを約４週間の周期で繰り返している。
【０００３】
しかし、加齢や紫外線、不規則な生活、ストレスなどの原因で新陳代謝の低下や炎症が起こると、くすみや肌荒れ、小じわなどの皮膚トラブルが発生する。皮膚トラブルを解消する手段としては、従来、種々の外的刺激や加齢により失われたコラーゲン、ヒアルロン酸やアミノ酸などの成分を皮膚に塗布して補うことや紫外線や活性酸素から身を守るための防御物質を配合した組成物の使用が主流であった。しかし、これらの物質は皮膚を構成する細胞そのものが持つ機能を改善するものではなく、十分な効果を有するものではなかった。
【０００４】
ケラチンは表皮角化細胞の細胞骨格としてトノフィラメントを形成する。これは表皮角化細胞の形態保持に必要不可欠である。ケラチン１０分子は、表皮角化細胞が成熟・分化した有棘細胞層や顆粒細胞層で強く発現することが知られている。顆粒細胞層のケラチン線維は、角化する際にフィラグリンと呼ばれるタンパク質と一緒に凝集して“ケラチンパターン”を形成する。顆粒細胞内のケラトヒアリン顆粒にはフィラグリンの前駆物質であるプロフィラグリンがタンパク質分解酵素などで分解されフィラグリンになる。遊離したフィラグリンは角質細胞の細胞質内でケラチン線維を凝集させた後、角質細胞層上層でアミノ酸などに分解される。これらは保水機能、紫外線吸収能を有することから、天然保湿因子と呼ばれている。フィラグリンが角質細胞の内部構築に関与すること、及び皮膚内部の水分保持に必要不可欠であることが知られている。従って、プロフィラグリンの発現を通じてフィラグリンの産生を促進し、表皮及び角質層を正常化しうる成分の提供が望まれる。
【０００５】
皮膚外用剤に配合される有効成分としては、皮膚に対する安全性も重要であることから、従来、天然物由来成分である種々の植物抽出物が皮膚外用剤の有効成分として提案されている。例えば、ヒトリシズカ抽出物が、培養した表皮角化細胞に対してプロフィラグリン／フィラグリン産生促進作用や表皮角化細胞増殖促進作用を有することが（特開２００８−８８０７５号公報）、大麦発酵エキス又は大麦発酵エキス多糖に表皮分化促進作用のあることが（特開２００９−７２９８号公報）、また、酸性キシロオリゴ糖を含む成分に、表皮角化細胞の成熟・分化マーカー蛋白質であるケラチン１０やインボルクリンの発現を促進することが（特開２００９−１４３８３２号公報）、見出されて、該成分を有効成分とする、表皮角化細胞増殖促進剤或いは表皮角化正常化剤が提案されている。
【０００６】
この他にも、表皮角化細胞増殖促進作用や、表皮角化正常化作用等を有する多くの植物成分が開示されている。例えば、表皮角化細胞増殖促進作用を有する植物成分としては、ハス胚芽抽出物（特開２００２−６８９９３号公報）、セキチク、トコナツのようなナデシコ属植物の抽出物（特開２００６−１３７７４２号公報）、タイソウの抽出物（特開２００６−３１６０２８号公報）、ラカシシュの抽出物（特開２００７−２１０９７７号公報）、ブラックジンジャーの抽出物（特開２００９−５１７９０号公報）、ワカメ、ヒジキの抽出物（特開２００９−６７７０１号公報）、鳳凰木の抽出物（特開２００９−６７７４７号公報）、バイベリー、ブルーブラック等の抽出物（特開２０１０−６５００９号公報）及び、羅漢果の花部からの抽出物（特開２０１０−１８４８７３号公報）が開示されている。
【０００７】
また、表皮角化正常化作用を有する植物成分としては、スフィンゴシン（特開２０００−２６２７１号公報）、マツヨイグサ属植物の抽出物（特開２００４−９１３７６号公報）、サイシン、ラフマの抽出物（特開２００７−１９１４号公報）、スギナ、ヘチマ、ダイダイ等の抽出物（特開２００８−７４１１号公報）、モモ、アロエ、ノイバラ等の抽出物（特開２００８−７４１２号公報）、及び、アルピニア・カツマダイの抽出物（特開２０１０−２４１９０号公報）が開示されている。更に、表皮角化促進作用を有する植物成分としては、スギノリ科イリダエア属、スギノリ属、ツノマタ属、コンブ科カジメ属等に属する海藻の抽出物（特開２００１−１３１０４９号公報）、イソハナ属、トサカノリ属、フルセリア属等の海藻の抽出物（特開２００１−３５４５１８号公報）、及び、メマツヨイグサエキス（特開２００７−８９１１号公報）が開示されている。
【０００８】
また、更に他の天然物成分として、お茶ポリフェノールとして知られるエピガロカテキン−３−ガレートが、表皮角化細胞の分化マーカー蛋白質として知られるフィラグリン、ケラチン１、トランスグルタミナーゼ産生の促進作用を報告されている（J. Pharmacol. Exp. Therapeut. 306: 29-34, 2003）。しかし、これらの天然物由来抽出物又は成分に表皮角化正常化促進作用が報告されているが、これまでにサクランボ抽出成分中に表皮角化促進作用があるという報告はされていない。
【０００９】
他方、サクランボから精製されたポリフェノール（シアニジン−グルコシドやシアニジン−ルチノシドなど）が、炎症や発がんに関与するシクロオキシゲナーゼの活性を抑制すること、活性酸素を生成する過酸化脂質の生成を抑制することが報告されている（Phytomedicine, 8: 362-368, 2001；J. Agric. Food Chem. 57: 1239-1246, 2009）。サクランボを経口投与したラットでは高脂血症や脂肪肝の症状が軽減されることを報告している（J. Med. Food, 11: 252-259, 2008；J. Med. Food, 12: 935-942, 2009）。しかし、サクランボ由来の天然物成分に表皮角化正常化促進作用があるという知見についての報告はされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０００−２６２７１号公報。
【特許文献２】特開２００１−１３１０４９号公報。
【特許文献３】特開２００１−３５４５１８号公報。
【特許文献４】特開２００２−６８９９３号公報。
【特許文献５】特開２００４−９１３７６号公報。
【特許文献６】特開２００６−１３７７４２号公報。
【特許文献７】特開２００６−３１６０２８号公報。
【特許文献８】特開２００７−２１０９７７号公報。
【特許文献９】特開２００７−１９１４号公報。
【特許文献１０】特開２００７−８９１１号公報。
【特許文献１１】特開２００８−７４１１号公報。
【特許文献１２】特開２００８−７４１２号公報。
【特許文献１３】特開２００８−８８０７５号公報。
【特許文献１４】特開２００９−７２９８号公報。
【特許文献１５】特開２００９−５１７９０号公報。
【特許文献１６】特開２００９−６７７０１号公報。
【特許文献１７】特開２００９−６７７４７号公報。
【特許文献１８】特開２００９−１４３８３２号公報。
【特許文献１９】特開２０１０−２４１９０号公報。
【特許文献２０】特開２０１０−６５００９号公報。
【特許文献２１】特開２０１０−１８４８７３号公報。
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】J. Pharmacol. Exp. Therapeut. 306: 29-34, 2003.
【非特許文献２】Phytomedicine, 8: 362-368, 2001.
【非特許文献３】J. Agric. Food Chem. 57: 1239-1246, 2009.
【非特許文献４】J. Med. Food, 11: 252-259, 2008.
【非特許文献５】J. Med. Food, 12: 935-942, 2009.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、表皮角化細胞の成熟・分化過程で観察されるプロフィラグリンやケラチン１０の発現を促進する作用を有し、安全性の優れた表皮角化正常化作用を有する有効成分を含有し、化粧品、医薬部外品を含む皮膚外用剤として有効に使用可能な表皮角化正常化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決すべく、天然素材を対象に、安全性に優れ、有効な表皮角化正常化作用を有する成分について鋭意探索する中で、サクランボ抽出物（果肉・種・じくを含む桜桃抽出物）が表皮角化細胞の成熟・分化に重要であるプロフィラグリン及びケラチン１０の発現を促進することを見出し、更に、有効な表皮角化正常化作用と安全性に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、サクランボ抽出物を有効成分とする表皮角化正常化剤からなる。
【００１４】
本発明の表皮角化正常化剤における表皮角化正常化は、サクランボ抽出物の表皮角化細胞におけるプロフィラグリン産生促進作用及び／又はケラチン１０産生促進作用によるものである。本発明の表皮角化正常化剤の有効成分であるサクランボ抽出物は、桜桃果実を熱水抽出し、該抽出液を濃縮した抽出濃縮物として調製することが好ましい。該抽出濃縮物は、更に、加熱して水分を蒸発させ、固形物として調製することができる。
【００１５】
本発明の表皮角化正常化剤は、サクランボ抽出物に、製剤化補助剤及び安定化剤を配合して、皮膚外用剤として調製することができる。また、本発明の表皮角化正常化剤は、サクランボ抽出物に、製剤化補助剤及び安定化剤を配合し、更に細胞賦活剤を配合し、皮膚外用剤として調製することができる。
【００１６】
すなわち、具体的には本発明は、（１）サクランボ抽出物を有効成分として含有する表皮角化正常化剤や、（２）表皮角化正常化が、サクランボ抽出物の表皮角化細胞におけるプロフィラグリン産生促進作用及び／又はケラチン１０産生促進作用によるものであることを特徴とする前記（１）記載の表皮角化正常化剤や、（３）サクランボ抽出物が、桜桃果実を熱水抽出し、濃縮した、抽出濃縮物であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の表皮角化正常化剤や、（４）サクランボ抽出物に、製剤化補助剤及び安定化剤を配合して、皮膚外用剤として調製したことを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載の表皮角化正常化剤や、（５）製剤化補助剤及び安定化剤に、更に細胞賦活剤を配合し、皮膚外用剤として調製したことを特徴とする前記（４）記載の表皮角化正常化剤からなる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の表皮角化正常化剤のサクランボ抽出物は、表皮角化細胞の成熟・分化に重要であるプロフィラグリンやケラチン１０の発現を促進する作用を有し、本発明は、有効な表皮角化正常化作用と安全性に優れた表皮角化正常化剤を提供する。本発明の表皮角化正常化剤は、化粧品、医薬部外品を含む皮膚外用剤として有効に使用可能な表皮角化正常化剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の実施例における、ヒト表皮角化細胞の増殖に対するサクランボ抽出物の効果についての試験において、サクランボ抽出物の添加濃度に対するヒト表皮角化細胞の細胞数の関係を示す図である。
【図２】図２は、本発明の実施例における、ヒト表皮角化細胞に対するサクランボ抽出物の添加効果についての試験において、サクランボ抽出物の添加におけるヒト表皮角化細胞の形態変化を示す写真である。図２Ａは、サクランボ抽出物無添加区を、図２Ｂは、２．５ｍｇ／ｍＬサクランボ抽出物添加区を示す。
【図３】図３は、本発明の実施例における、ヒト表皮角化細胞に対するサクランボ抽出物の添加効果についての試験において、サクランボ抽出物処理におけるヒト表皮角化細胞のプロフィラグリン及びケラチン１０遺伝子の発現増強効果について示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、サクランボ抽出物を有効成分として含有する表皮角化正常化剤からなる。本発明で有効成分の抽出に用いられる、サクランボは、バラ科サクラ属の落葉高木である桜桃の果実である。桜桃の種類としては、セイヨウミザクラ（Prunus avium）や、スミミザクラ(Prunus cerasus)等を挙げることができる。
【００２０】
本発明の表皮角化正常化剤において、有効成分であるサクランボ抽出物は、抽出濃縮物として調製し、用いることができる。該抽出濃縮物を調製するには、例えば、サクランボ（桜桃の果実）を、加熱し、抽出温度９０〜１００℃で、３０〜６０分程度熱水抽出を行う。ろ過により、ろ過残渣を分離後、エバポレーターを用い、４０℃程度の温度で濃縮して、水分を限界まで蒸発させる。該濃縮したサクランボ抽出液は、更に、加熱処理を行って、水分を蒸発させ、固形物として、調製することができる。該サクランボ抽出物は、表皮角化正常化剤の製剤化にあたって、所定濃度、通常０．１〜５ｍｇ／ｍＬの濃度に調整して用いることができる。
【００２１】
本発明の表皮角化正常化剤は、製剤化補助剤及び安定化剤を配合して、表皮角化正常化用皮膚外用剤として調製し、製剤化することができる。また、製剤化補助剤及び安定化剤に、更に細胞賦活剤を配合し、製剤化することができる。本発明の表皮角化正常化用皮膚外用剤へのサクランボ抽出物の配合量は０.０１〜２０％が好ましく、更に好ましくは０.１〜５％である。
【００２２】
本発明の表皮角化正常化剤は、皮膚外用剤として用いる観点からは、ｐＨを好ましくは４〜７、更には４.５〜６.５とするのが特に好ましい。本発明の表皮角化正常化剤の製剤化に際しては、有効成分であるサクランボ抽出物の表皮角化正常化作用を損なわない範囲で、通常、皮膚外用剤の製剤化に使用される製剤化補助剤及び安定化剤を用いることができる。製剤化補助剤としては、例えば低級アルコール類・シリコーン類・油脂類・エステル油剤・ステロール類及びその誘導体・炭化水素類等の油性成分、乳化・可溶化剤、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、防腐剤、殺菌剤、キレート剤、ｐＨ調整剤・酸・アルカリ、紫外線吸収剤、美白剤、溶剤、角質剥離・溶解剤、消炎剤、清涼剤、収れん剤、高分子粉体、ヒドロキシ酸・ビタミン類及びその誘導体類、糖類及びその誘導体類、有機酸類、酵素類、無機粉体類、香料、色素等を配合することができる。
【００２３】
本発明の表皮角化正常化剤の皮膚外用剤としての製剤化に際しては、その表皮角化細胞に対する増殖の促進を補助するために、細胞賦活剤を配合することができる。該細胞賦活剤としては、例えば、リボ核酸、デオキシリボ核酸のような核酸及びその塩、キサンチン及びその誘導体（カフェイン等）、アミノ酸及びその誘導体（セリン、グルタミン酸、テアニン、ヒドロキシプロリン、ピロリドンカルボン酸等）、アーモンド、アスパラガス、アンズ（キョウニン）、イチョウ等各種植物の抽出物、ドコサヘキサエン酸及び、エイコサペンタエン酸等の不飽和脂肪酸及びその誘導体、乳酸菌抽出物、ビフィズス菌抽出物などの微生物由来の抽出物或いは発酵代謝産物等、各種の公知の細胞賦活剤を挙げることができる。
【００２４】
また、本発明の表皮角化正常化剤の皮膚外用剤としての製剤化に際しては、その表皮角化細胞に対する増殖の促進を補助するために、保湿剤を配合することができる。該保湿剤としては、例えば、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、ソルビトール、トレハロース、グルコース、マルトース、マルチトール、キシロース、果糖、及びそれらの誘導体；コラーゲン、エラスチン、ケラチン、フィブロネクチン等のタンパク質及びそれらの誘導体及びそれらの加水分解物並びにそれらの塩；ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン及びケラタン硫酸等のムコ多糖類及びその誘導体又はそれらの塩；セリン、グリシン、アスパラギン酸、アルギニン等のアミノ酸及びそれらの誘導体並びにそれらの塩；デキストリン及びその誘導体；ハチミツ等の糖類；糖脂質、セラミド、ムチン、尿素等の公知の保湿剤を挙げることができる。
【００２５】
本発明の表皮角化正常化剤は、表皮角化正常化用の皮膚外用剤として、適宜の製剤形態で、製剤化することができる。例えば、かかる皮膚外用剤の製剤形態としては、ローション、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、固形状、シート状、パウダー状、ジェル状、ムース状、スプレー状など、従来公知の剤型を使用することができ、通常の方法に従って製造することができる。
【００２６】
以下に本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
［試験方法１：サクランボ抽出物の製造方法］
サクランボの果実部分５Ｋｇに対してイオン交換水１０Ｌを加えて二重釜で加熱する。抽出温度は９０℃以上で３０分間熱水抽出を行なった。冷却後、ポリエチレン製の水切りネットで残渣を粗ろ過した（ろ液１）。このサクランボ残渣にイオン交換水７Ｌを加えて二重釜で加熱した。抽出温度は９０℃以上で３０分間抽出を行なった。冷却後、ポリエチレン製の水切りネットで残渣を粗ろ過した（ろ液２）。ろ液１と２を合わせ、ろ液をカートリッジフィルター（TCW-05N-PPS:ADVANTEC）に通して回収した液をロータリーエバポレーターで糖度１５度以上（液量２．５Ｌ以下）になるまで４０℃で濃縮した。濃縮液にエタノールを８０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）になるように加えてよく撹拌し、一晩以上室温で放置した。
【００２８】
上清をカートリッジフィルター（TCW-05N-PPS）に通して回収した液を４０℃でロータリーエバポレーターを使用して１Ｌまで濃縮し、濃縮液１Ｌに同量(１Ｌ)のイオン交換水を加えて、再び１Ｌになるまで濃縮を行なった。同様の操作を２回繰り返し、濃縮液が糖度４０以上であることを糖度計で確認した。濃縮したサクランボ抽出液（糖度４１．２）を１０．０２ｇ秤量し、９０℃以上の温浴中で２時間加熱処理を行い、水分を蒸発させ、４．７９５５ｇの固形物を回収し、これをサクランボ抽出物として試験に使用した。
【００２９】
［試験方法２：ヒト表皮角化細胞の増殖に対するサクランボ抽出物の効果］
ヒト新生児由来表皮角化細胞(ケラチノサイト細胞；クラボウ)を試験に用いた。増殖用培地として、無血清培地であるHumedia-KG2(クラボウ)を用い、培養環境は、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿条件で行った。まず、Ｉ型コラーゲン液(１０μｇ／ｍＬ)で６０分間コート処理したＴ−２５培養フラスコにHumedia-KG2培地を入れ、３〜４日間培養してsubconfluent（ほぼ飽和状態）となった継代回数３〜５回の細胞を用いた。表皮角化細胞は、カルシウム、マグネシウムを含まないリン酸緩衝液(ＰＢＳ−液)で１回洗浄し、次にトリプシン(０．０５％；ｗｔ／ｖｏｌ)＋ＥＤＴＡ(２００μｇ／ｍＬ)処理を行なった後に、ピペッティングにより単一細胞に分散させ、血球計算版で細胞数を計測した。
【００３０】
Ｉ型コラーゲン液で処理した２４穴培養プレートに１×１０４個の細胞を播き、それぞれの濃度（０，０．５，１，１．５，２，２．５ｍｇ／ｍＬ）のサクランボ抽出物を添加した培地で４日間培養した。その後、培地を吸引除去し、ＰＢＳ液で１回洗浄した後に、トリプシン＋ＥＤＴＡ液を処理して細胞を分散させた。細胞数は、コールターカウンター(Beckman社、モデル：Ｚ１)で計測した。統計処理は各濃度の３ウェルの平均値±ＳＤで表示した。
【００３１】
［試験方法３：サクランボ抽出物を処理したヒト表皮角化細胞の形態観察］
試験方法２と同様に調製した細胞浮遊液を、Ｉ型コラーゲン液で処理した２４穴培養プレートに１×１０４個播き、それぞれの濃度（０，２ｍｇ／ｍＬ）のサクランボ抽出物を添加したHumedia-KG2培地で４日間培養した。その後細胞の形態を倒立型顕微鏡(OLYMPUS社、モデル：ＩＭＴ−２)、デジタルカメラ(OLYMPUS社、モデル：Ｃ−４１００ ＺＯＯＭ)を用いて撮影した。
【００３２】
［試験方法４：サクランボ抽出物を処理したヒト表皮角化細胞におけるプロフィラグリン及びケラチン１０遺伝子の発現増強作用］
試験方法２、３と同様に調製した細胞浮遊液を、Ｉ型コラーゲン液で処理したＴ−２５培養フラスコに１．２５×１０５個を播き、Humedia-KG2培地にそれぞれの濃度（０，２ｍｇ／ｍＬ）となるようにサクランボ抽出物を添加し、３日間培養した。TRIzolR Reagent (invitrogen)を用いて、total ＲＮＡを抽出し、このtotal ＲＮＡに対して逆転写酵素SMARTScribeTM Reverse Transcriptase (Clontech) を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、プロフィラグリン、ケラチン１０の発現量の解析をＰＣＲ法により実施した。
【００３３】
プライマーは、プロフィラグリン用センスプライマー（5'−CAG ACA ATC AGG CAC TCG TCA−3'）、アンチセンスプライマー（5'−ACT GGA CCC TCG GTT TCC AC−3'）、ケラチン１０用センスプライマー（5'−ACT GGC CTT GAA ACA ATC C−3'）、アンチセンスプライマー（5'−TTC AGT ATT CTG GCA CTC G−3'）、ＧＡＰＤＨ(グリセルアルデヒド３−リン酸  デヒドロゲナーゼ；ハウスキーピング遺伝子として使用)用センスプライマー（5'−GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC−3'）、アンチセンスプライマー（5'−GCC TTC TCC ATG GTG GTG AA−3'）を用いた。
【００３４】
ＰＣＲの反応にはAdvantageR 2 Polymerase Mix (Clontech)を用いた。ＰＣＲ装置にはTakara社 ＰＣＲ Thermal Cycler ＤＩＣＥ ＴＰ６００を用いた。ＰＣＲ反応液はｃＤＮＡ２．５μＬ、プライマー各１μＬ、ｄＮＴＰ Mix １μＬ、１０× AdvantageR ２ＰＣＲ Buffer ５μＬ、AdvantageR ２ Polymerase Mix １μＬ、超純水３８．５μＬを加えた５０μＬの反応系とした。ケラチン１０、ＧＡＰＤＨのＰＣＲの反応条件は、９４℃で５分間の反応後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを３５回行った。また、プロフィラグリン、ＧＡＰＤＨのＰＣＲ反応条件は、９４℃で５分間の反応後、９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０回行なった。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルを用いて電気泳動し、０．１μｇ／ｍＬエチジウムブロミド処理後、TRANSILLUMINATOR（SPECTROLINE社、モデル：ＴＭ２５４Ａ）、デジタルカメラ（NIKON社、モデル：CoolPIX ５７００）で写真撮影を行った。
【００３５】
［実施例１：ヒト表皮角化細胞の増殖に対するサクランボ抽出物の効果(図１)］
結果を図１に示す。培地にサクランボ抽出物を添加すると、濃度依存的に細胞数の減少傾向が観察された。培養４日後のサクランボ抽出物無添加区（コントロール）の細胞数（８．８２×１０４個）に対して、サクランボ抽出物（２．５ｍｇ／ｍＬ）添加区の細胞数(４．８７×１０４個)は５５．２％であった。しかし、２．５ｍｇ／ｍＬ添加区の細胞数（４．８７×１０４個）は播種した細胞数（１×１０４個）に対して４．８７倍増加した。高濃度のサクランボ抽出物添加により、ヒト表皮角化細胞の細胞分裂が誘導されるものの、増殖速度が遅くなることが推察された。
【００３６】
［実施例２：サクランボ抽出物添加におけるヒト表皮角化細胞の形態変化(図２)］
結果を図２（サクランボ抽出物添加におけるヒト表皮角化細胞の形態変化）に示す。サクランボ抽出物無添加区（図２Ａ）及び２．５ｍｇ／ｍＬサクランボ抽出物添加区（図２Ｂ）についてヒト表皮角化細胞における形態観察を行なった。無添加区では、ほとんどの細胞は比較的サイズの小さい、均一で、細胞伸展の発達した集団であった。これらの形態は、未分化な表皮角化細胞に見られる特徴として知られている。一方、サクランボ抽出物添加区では、肥大化した細胞が多く観察され、薄くて扁平な形状の細胞が相互に接着しながら島状に増殖する、いわゆる、分化した表皮角化細胞に特徴的な形態が見られた。
【００３７】
［実施例３：サクランボ抽出物処理におけるヒト表皮角化細胞のプロフィラグリン及びケラチン１０遺伝子の発現増強効果(図３)］
結果を図３（サクランボ抽出物添加におけるヒト表皮角化細胞のプロフィラグリン及びケラチン１０遺伝子の発現増強効果）に示す。サクランボ抽出物添加区（２．０ｍｇ／ｍＬ）において、表皮角化細胞の分化マーカー蛋白質として知られるケラチン１０及びプロフィラグリン遺伝子が発現していることが明らかになった。一方、無添加区では、どちらの遺伝子についても発現が見られず、未分化な状態の細胞として維持されていると推測された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の表皮角化正常化剤のサクランボ抽出物は、表皮角化細胞の成熟・分化に重要であるプロフィラグリンやケラチン１０の発現を促進する作用を有し、本発明は、有効な表皮角化正常化作用と安全性に優れた表皮角化正常化剤を提供する。本発明の表皮角化正常化剤は、化粧品、医薬部外品を含む皮膚外用剤として有効に使用可能な表皮角化正常化剤を提供する。
【図１】
2012167048.tif 000002
【図２】
2012167048.tif 000003
【図３】
2012167048.tif 000004
【配列表】
2012167048000001.app