(57)【要約】【課題】  遺伝子導入に供する植物材料（外植体）の準備が簡便であり、形質転換植物の大量生産に好適な遺伝子導入方法、及び当該導入方法を利用した形質転換植物の作出方法を提供する。【解決手段】  外来性ＤＮＡを有する形質転換用ベクターを含むアグロバクテリウムを用いて、前記外来性ＤＮＡを植物組織に導入する方法において、前記アグロバクテリウムの懸濁液に、植物の葉（葉柄及び葉身）を浸漬させる浸漬処理工程と、前記葉の葉柄から吸水できる条件で生育させる生育工程を含む。前記浸漬処理工程は、減圧下での浸漬処理を含むことが好ましく、前記生育工程は、水を収容した容器に挿し葉することにより行うことが好ましい。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来性ＤＮＡを有する形質転換用ベクターを含むアグロバクテリウムを用いて、前記外来性ＤＮＡを植物組織に導入する方法において、
前記アグロバクテリウムの懸濁液に、植物の葉（葉柄及び葉身）を浸漬させる浸漬処理工程と、
前記葉の葉柄から吸水できる条件で生育させる生育工程とを含む植物への遺伝子導入方法。
【請求項２】
前記浸漬処理工程は、減圧下での浸漬処理を含む請求項１に記載の遺伝子導入方法。
【請求項３】
前記生育工程は、水を収容した容器に挿し葉することにより行う請求項１又は２に記載の遺伝子導入方法。
【請求項４】
前記アグロバクテリウムの懸濁液には、界面活性剤が含有されている請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子導入方法。
【請求項５】
前記植物の葉として、茎に接着した複数の葉を用いる請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子導入方法。
【請求項６】
前記植物は、双子葉植物である請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子導入方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子導入方法を含む形質転換植物の作出方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により遺伝子導入した前記植物の葉の葉柄から前記アグロバクテリウムを殺菌する抗生物質含有液を吸水させる工程を含む請求項７の形質転換植物の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アグロバクテリウムを用いた植物に対する遺伝子導入方法に関し、特に作業性、生産性を高めた遺伝子導入方法、及び当該方法を用いた形質転換植物の作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物に外来遺伝子を導入して、形質転換を行う方法として、土壌細菌アグロバクテリウムを用いる方法がある。
アグロバクテリウムを用いる植物の形質転換方法（アグロバクテリウム媒介形質転換方法）は、エレクトロポレーション法等の直接法と比較して、不都合な変異が少ない、コピー数は少なくとも高発現領域に挿入される傾向が強い、導入遺伝子の再構成が少ない等の利点を有していることから、近年、形質導入植物の作出方法の主流となっている。
【０００３】
アグロバクテリウム媒介形質転換法は、通常、前培養したカルス、植物組織片、植物培養細胞等に、目的の外来遺伝子を導入したベクターを有するアグロバクテリウムを接種した後、共存培地に移して共存培養することにより、目的の外来遺伝子をカルス、植物組織片、植物培養細胞等内に導入している。その後、アグロバクテリウムを除菌し、さらに選択培地で選択培養することにより、適切なマーカーを指標に遺伝子組み換えカルス、植物を選抜する。
【０００４】
アグロバクテリウムを接種する植物材料、すなわちアグロバクテリウム属細菌の感染対象となる植物組織等として一般に使用されるカルスは、感染前に植物組織から脱分化誘導させる作業、期間が必要となるため、迅速性に欠ける。このような事情下、カルスを誘導せずに、葉若しくは茎由来の分化植物細胞にアグロバクテリウムを感染させ、遺伝子導入する方法も種々研究されている。
【０００５】
例えば、特開平６−２３３６３６号公報（特許文献１）に、シクラメンの形質転換作出についてであるが、葉柄、葉身を用いることが開示されている。具体的には、葉脈を含むように約７ｍｍ角に切断した葉身、及び５〜１０ｍｍに切断した葉柄を菌懸濁液に浸した後、取り出し、滅菌水で浸した濾紙上に置床し、共培養する。３日後、除菌のために、抗生物質を添加した培地で培養している（段落番号００１２）。
【０００６】
また、特開２００４−２８３０５１号公報（特許文献２）では、バラ科果樹などの大本植物の組換え体作出方法について、腋芽の直近に遺伝子導入のための切り口を設けた培養シュートの茎からなる外植体を用いた遺伝子導入方法が開示されている。この方法では、個体再分化を経由しないので、バラ科果樹のように個体再分化が難しい植物にも適用でき、短期間で組換えシュートが得られ、葉片を用いる場合等と比較して高効率で遺伝子を導入できると説明されている（段落番号００１２）。このような外植体は、茎の切り口からアグロバクテリウムが吸収され、腋芽成長点部位の細胞に外来遺伝子を導入できるとある（段落番号００１７）。
【０００７】
また、特表２００９−５１６２４号公報（特許文献３）では、ハクサイの形質転換体の製造方法として、外来遺伝子が導入された形質転換用ベクターを含むアグロバクテリウムを、白菜の花茎組織に感染させて組織培養することを提案している。具体的には、花茎の幼組織を切片に切って、滅菌後、アグロバクテリウム培養液に浸漬して感染させた後、共同培養することにより行っている。そして、花茎組織を用いたハクサイの形質転換効率は２．８％であり、子葉及び胚軸を利用する形質転換効率（０．４％、０．８％）よりも２倍以上向上することが示されている。
【０００８】
ＷＯ２００６−１１２０３４号公報（特許文献４）では、アイスプラントの作出方法であるが、アイスプラントの子葉節を用いることが提案されている。具体的には、アイスプラントの苗条の子葉展開時に、子葉節部分を切除、取得し、小さな苗条を形成するまで培養した後、この子葉節を、アグロバクテリウム懸濁液に浸漬させることにより感染させている。感染後、抗生物質を含む培地で共培養し、アグロバクテリウムの除菌、さらには形質転換された子葉節を選択的に取得している。感染効率を上げるために、超音波処理、減圧湿潤処理することも提案されている。
【０００９】
さらに、特表２００８−５０１３２７号公報（特許文献５）では、トランスジェニックダイズ植物の作製方法において、ダイズ幼苗の第１節又は第２節以上の葉節点の腋生分裂組織を用いる方法が提案されている。ここで、第１節又は第２節以上の腋生分裂組織としては、幼苗全体又はその実質的な部分（根を欠損する幼苗、又は１若しくは両方の子葉を欠損する幼苗）が利用でき、具体的には、（ｉ）幼苗全体、（ii）根を取り除いた幼苗、（iii）根及び１又は両方の子葉を取り除いた幼苗、（iv）根、両方の子葉及び上胚軸の一部を取り除き、上胚軸の一部に付いている腋生分裂組織が残っている幼苗が挙げられている（段落番号００２４）。
【００１０】
特表２００８−５２６１８３号公報（特許文献６）では、ユーカリプツスの形質転換方法として、葉、葉柄を用いることが提案されている。実施例では、葉の先端部分をハサミで取り除き、移植片を背面軸を下にして、前培養培地に置き、移植片上にアグロバクテリウム培養液を滴下することで、形質転換を行っている。共培養してもよいとある。（段落番号０１１４）。その後、選択培地で培養している。葉及び葉柄移植片は、節間移植片よりも感染に敏感であったことが示されている（感染率は茎の６倍以上、表８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平６−２３３６３６号公報
【特許文献２】特開２００４−２８３０５１号公報
【特許文献３】特表２００９−５１６２４号公報
【特許文献４】ＷＯ２００６−１１２０３４号公報
【特許文献５】特表２００８−５０１３２７号公報
【特許文献６】特表２００８−５２６１８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
以上のように、外植体として、葉、茎、花器、シュート、茎頂などの分化細胞を用いる方法も種々提案され、植物の種類に応じて、感染率の高い器官を適宜選択することにより、感染率を高めている。
しかし、いずれの器官であっても、感染対象となる試料としては、５〜１０ｍｍ程度の組織切片として用いたり、特許文献５のように特定部分を取り除いたり、特許文献４のように子葉といった植物体の特定部分を用いている。このため、外植体の調製作業性、大量の外植体の調製という点で不利である。また、切片を用いる場合、器官部位によって感染効率が異なる場合があるため、種々の部位の試料をそれぞれ大量に準備しておく必要がある。このように、大量の形質転換植物を作出するためには、外植体の作業性、大量の材料の取得容易性の点から、改良が求められる。
【００１３】
本発明の目的は、遺伝子導入に供する植物材料（外植体）の準備が簡便であり、形質転換植物の大量生産に好適な遺伝子導入方法、及び当該導入方法を利用した形質転換植物の作出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
すなわち、本発明の植物の遺伝子導入方法は、外来性ＤＮＡを有する形質転換用ベクターを含むアグロバクテリウムを用いて、前記外来性ＤＮＡを植物組織に導入する方法において、前記アグロバクテリウムの懸濁液に、植物の葉（葉柄及び葉身）を浸漬させる浸漬処理工程と、前記葉の葉柄から吸水できる条件で生育させる生育工程を含む。
【００１５】
前記浸漬処理工程は、減圧下での浸漬処理を含むことが好ましく、前記生育工程は、水を収容した容器に挿し葉することにより行うことが好ましい。また、前記アグロバクテリウムの懸濁液には、界面活性剤が含有されていることが好ましい。
【００１６】
前記植物の葉として、茎に接着した複数の葉を用いてもよい。前記植物は、双子葉植物であることが好ましい。
【００１７】
本発明の形質転換植物の作出方法は、上記本発明の遺伝子導入方法を利用した方法であり、さらに、上記本発明の遺伝子導入方法により遺伝子導入した前記植物の葉の葉柄から前記アグロバクテリウムを殺菌する抗生物質含有液を吸水させる工程を含むことが好ましい。
【００１８】
ここで、「葉」とは、葉身及び葉柄をそなえた状態をいい、たく葉を含んでもよいし、含まなくてもよい。
「葉身」とは、表皮と葉肉と葉脈とから構成される葉の主要部分で、葉柄に支えられて茎につく。
「葉柄」とは、葉身を支えて茎に接着している葉の部分をいう。葉柄の維管束の上端は葉脈に、下端は葉跡をへて茎の維管束に連絡する。
「葉脈」とは「葉」に形成される維管束系をいう。
「茎」とは、維管束植物の胞子体を構成する栄養器官の１つで、葉を支える軸状構造のものをいう。
「維管束」とは、導管、師管、形成層からなる。
「外植体」とは、摘出された植物組織や器官をいう。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の遺伝子導入方法は、外来性ＤＮＡを導入する植物材料（外植体）として葉を、カット等することなく、そのまま用いているので、外植体の調製作業が簡便であり、しかもその後の除菌処理を効率よく行うことができるので、カルス誘導、シュート形成効率が高く、形質転換植物の効率的な大量生産を図ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】アグロバクテリウム接種工程を説明するための概略模式図である。
【図２】接種後の共培養工程を説明するための概略模式図である。
【図３】接種後の葉（実施例）を組織化学染色した後の写真である。暗影部分（矢印部分）は青く染色された部分であり、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子が発現した部分である。
【図４】実施例で誘導されたカルスを撮影した実体顕微鏡写真であり、（ｂ）は（ａ）を拡大した写真（実線長さ２．００ｍｍ）である。
【図５】比較例における遺伝子導入後の葉を組織化学染色した後の顕微鏡写真である。矢印の暗影部分が青く染色された部分であり、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子が発現した部分である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
＜植物の遺伝子導入方法＞
本発明の遺伝子導入方法は、アグロバクテリウム媒介形質転換方法において、感染に供する植物材料（外植体）として、葉（葉柄が付着した状態の葉身）を用いる点に特徴がある。以下、詳述する。
【００２２】
〔遺伝子導入用アグロバクテリウムの調製〕
遺伝子導入用アグロバクテリウムとは、所望する外来遺伝子を保持したアグロバクテリウムのことである。
【００２３】
アグロバクテリウムとしては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・リゾゲネスのいずれの菌種を用いることもできるが、好ましくはＴｉプラスミドを保持したアグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いる。
【００２４】
アグロバクテリウムを用いる形質転換方法としては、バイナリーベクター法が好ましい。バイナリーベクター法とは、Ｔ−ＤＮＡ領域のボーダー（ＬＢ及びＲＢ）を有するプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域に目的の外来遺伝子を組み込んだプラスミドをアグロバクテリウムに導入して植物に感染させることにより、目的遺伝子を植物ゲノムに挿入する方法である。
【００２５】
バイナリーベクター法を利用した発現カセットは、Ｔ−ＤＮＡ領域に、形質転換の目的とする外来遺伝子（耐乾燥性、耐寒性遺伝子など）、及び当該遺伝子発現のためのプロモータ、ターミネータ、マーカー遺伝子、レポータ遺伝子を含んでいる。
【００２６】
プロモータとしては、３５Ｓカリフラワーモザイクウィルスプロモータ、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモータ、並びにβファゼオリン、ナピン、ユビキチンなどの他の胚乳特異的プロモータが挙げられる。
【００２７】
ターミネータとしては、プロモータにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネータ、オクトビン合成酵素（ＯＣＳ）、ＣａＭＶ３５Ｓ  ＲＮＡ遺伝子のターミネータが挙げられる。
【００２８】
選択マーカー遺伝子としては、抗生物質または除草剤のような選択剤に対する抵抗性を付与する遺伝子が用いられる。具体的には、カナマイシン耐性遺伝子、パロモマイシンＢ耐性遺伝子、またはグルフォシネート及びグリフォセートのような除草剤に対する抵抗性遺伝子などが挙げられる。
形質転換体を視覚的に同定できる選択マーカー、例えば、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような発色または蛍光タンパク質を発現する遺伝子又は種々の発色体基質が知られているβグルクロニダーゼまたはＧＵＳを発現する遺伝子も利用することができる。このような選択マーカーは、レポータ遺伝子としても利用できる。
【００２９】
必要に応じて、さらにエンハンサー、タグなどを含んでもよい。エンハンサーは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域などが挙げられる。
【００３０】
バイナリーベクターとしては、上記発現カセットをＴ−ＤＮＡ領域に含むもので、具体的には、ｐＢＩ系、ｐＲＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系、ｐＧＷＢ系などの市販ベクターに上記発現カセットを組み入れたものを用いることができる。
【００３１】
以上のような構成を有するバイナリーベクターを、エレクトロポレーション法等によりアグロバクテリウムに導入することにより、遺伝子導入用アグロバクテリウムを調製できる。
【００３２】
〔感染液（アグロバクテリウム懸濁液）の調製〕
遺伝子導入用のアグロバクテリウム懸濁液としては、例えば、ＡＢ培地、ＹＥＰ培地、ＬＢ培地などの培地で、外来遺伝子を保持したアグロバクテリウムを、１５〜２４時間程度培養した培養液を用いてもよいし、培養したアグロバクテリウム属細菌を集菌し、ＴＤＺ、アセトシリンゴンを含むＭＳ培地に懸濁することにより調製してもよいし、上記培養液をそのまま、接種液として用いてもよい。
【００３３】
アグロバクテリウム懸濁液の組成は特に限定しないが、アセトシリンゴンを１０〜３０ｍｇ／Ｌ程度及び必要な塩類を含有させた溶液に、アグロバクテリウム濃度（ＯＤ600）の値で０．０５−０．４に調整したものが好ましく用いられる。
【００３４】
接種液には、さらに界面活性剤を含有することが好ましい。界面活性剤は、水の表面張力を低下させ、これにより、アグロバクテリウム懸濁液の葉身に対する濡れ性が高められ、有効に葉身内にアグロバクテリウム懸濁液を取り込ませることができる。
【００３５】
使用する界面活性剤としては、水の表面張力を低下させて、感染液の組織への浸透を促進できるものであればよく、例えば、形質転換用試薬として市販されているSILWET  L-77、Tween  80、Tween  20、Triton  X-100などが挙げられる。界面活性剤の濃度は、界面活性剤の種類にもよるが、０．００５〜０．０１％水溶液が用いられる。
【００３６】
〔外植体の調製〕
本発明の遺伝子導入方法は、アグロバクテリウム媒介形質転換方法が可能な植物であればよく、双子葉植物、単子葉植物のいずれにも適用できる。好ましくは、一般に葉身の面積が大きく、葉脈が網状脈となっている双子葉植物が好ましく用いられる。双子葉植物としては、大豆及び他の豆類；タバコ、ナタネ等のアブラナ属；ジャトロファと等のトウダイグサ目などが挙げられ、種子を収穫できるまでの期間が長い植物、例えば、ジャトロファなどのトウダイグサ目などに好ましく適用される。
【００３７】
遺伝子導入及び除菌に供される植物の器官は、上記植物から採取される葉（本葉）であり、葉柄がついた状態の葉身である。葉身は、一部欠いていてもよいが、好ましくは欠失部分がない葉身全部である。また、托葉はついていてもよいし、いなくてもよい。複葉の場合、葉柄に複数の小葉がついたものを用いることが好ましい。さらに、茎に、複数の葉身及び葉柄が接着した状態で用いることもできるが、遺伝子導入の作業性、除菌の効率化の観点からは、全葉１枚を１つの供試材料単位として用いることが好ましい。
【００３８】
植物体のどの葉位の葉身を使用するかについては限定しない。成熟した葉を用いることもできる。成長が進んだ植物体から、第２位以上の葉身、茎頂を除く部分の葉全てを試料の対象とすることで、同一個体から大量の植物試料（外植体）を得ることが可能である。但し、感染により遺伝子導入の起こった葉から、カルスを経て植物体を再分化させる効率は、若い葉の方が高く、第２位から第４位までが望ましい。
【００３９】
なお、遺伝子導入に供する植物材料は、葉身全体である。後述するように、気孔を通じてアグロバクテリウム懸濁液を葉身組織内に取り込むので、従来の葉の切片を用いる培養のように、アグロバクテリウム取り込み効率を高めるために、切断、摩擦、穴あけ、微粒子若しくは加圧流体での貫通、プラズマ創傷、などの創傷を施す必要がないが、これらの創傷を葉身に施すことを排除するものではない。
【００４０】
〔感染工程〕
感染は、上記で調製した外植体、すなわち葉（葉身及び葉柄）の状態で、図１に示すように、アグロバクテリウム懸濁液に浸漬することにより行う。浸漬前には、流水（塩素を含む水道水）下で５分程度、葉を洗浄し、目的とするアグロバクテリウム以外の微生物の植物体への進入を最小限に抑制する。
【００４１】
浸漬時間は、特に限定しないが、アグロバクテリウムを葉身内に取り込むことができる程度の時間、通常５〜１０分程度で足りる。浸漬時間が長くなりすぎると、葉身が枯死又は腐敗してしまう。
【００４２】
浸漬処理は減圧下で行うことが好ましい。これにより、アグロバクテリウム懸濁液の吸い込み効率を高くできるとともに、葉身内の細胞間間隙全体にアグロバクテリウム液を浸透させることができる。特に、ジャトロファのように、葉身の表皮が硬く、気孔が少ない植物体の場合、上記のような短時間で十分量のアグロバクテリウム接種液を吸い込ませるためには、減圧湿潤を行うことが好ましい。
【００４３】
以上のような浸漬処理により、アグロバクテリウム懸濁液は、主として、植物体の葉身の気孔から取り込まれ、細胞間間隙に浸透する。細胞間間隙に取り込まれたアグロバクテリウムが十分に細胞に感染して、細胞内に目的の外来遺伝子を送りこむことができるように、浸漬後、２〜４日間程度、図２に示すような、挿し葉状態で生育させる。
【００４４】
生育は、葉身が生存できる条件であればよい。具体的には、気孔から水分が蒸散して葉が枯死しないように、葉柄から吸水できる水が容器に収容されていればよい。光量は低く抑えることが好ましい。
【００４５】
容器に収容する水は特に限定せず、水道水を用いることもできる。
この点、組織切片やカルスの組織培養のように、細胞の生存に必要な養分としての炭素源、窒素源、無機塩などを含んだ溶液を用いなくてもよい。さらに、全葉の状態では、切り口が実質的に葉柄先端部分だけであることから、組織切片やカルスの組織培養と異なり、微生物汚染のおそれが少ないので、滅菌シートに置床する等の滅菌条件下で行う必要もない。
但し、葉の生育の観点からは、ハイポネックス（商品名）等の液体肥料を添加した水を用いてもよい。
【００４６】
以上のような遺伝子導入方法によれば、葉身の細胞全体に高効率で、感染させることができる。しかも、外植体として、成長した植物体から葉を採取し、そのまま外植体として利用できるので、葉を切片に切り分けたりするなどの手間が不要であり、外植体の調製作業が簡便である。さらに、成熟に時間がかかる植物体であっても、同一植物体から、大量の外植体を準備することができる。かかる意味においても、形質転換植物の生産性がよい。
【００４７】
さらに、植物の種類によっては、葉の切片部位によって、感染しにくい葉片もあったが、本発明の方法では、１つの外植体が葉身全体を対象としているので、葉身の部位による感染効率を問題とせずに済む。
【００４８】
＜形質転換植物の作出方法＞
本発明の形質転換植物の作出方法は、上記本発明の遺伝子導入方法で導入した葉を用いて、カルス誘導し、シュート形成し、植物体を再生する方法である。以下、詳述する。
【００４９】
〔除菌〕
アグロバクテリウムを用いて遺伝子導入を行った葉は、葉内にアグロバクテリウムが残存している。このアグロバクテリウムは、植物体の成長阻害要因となるので、カルス誘導前に、殺菌、除菌しておくことが好ましい。通常、除菌は、アグロバクテリウムに対して殺菌力を有する抗生物質を、ＭＳ基本培地等に添加した培地（除菌用培地）で培養することにより行う。
除菌に使用する抗生物質は、アグロバクテリウムの殺菌に用いられる従来より公知の抗生物質であればよく、セフォタキシム、モキサラクタム、メロペネムなどを用いることができ、入手容易性の点から、通常、セフォタキシムが好ましく用いられる。
【００５０】
除菌方法としては、（ｉ）適当なサイズ（通常３〜１０ｍｍ）にカッティングし、得られた葉のカット片を除菌用培地で１週間程度、組織培養する方法、（ｉｉ）まず除菌用抗生物質を含む溶液（除菌用溶液）に一晩〜一昼夜程度、挿し葉の状態で静置（以下、この処理を「除菌処理Ａ」と称して、除菌用培地で組織培養することにより行われる除菌処理と区別する）した後、適当なサイズにカッティングして、カット片を除菌用培地で培養する方法がある。好ましくは（ｉｉ）の方法である。
【００５１】
（ｉ）の方法では、除菌用培地における抗生物質濃度は、抗生物質の種類、植物材料の種類により適宜異なる。セフォタキシムを用いる場合、挿し葉するための除菌用溶液で、４００〜６００ｍｇ／Ｌ程度であり、ジャトロファの場合、通常約５００ｍｇ／Ｌである。
【００５２】
組織培養の前処理として、表面に付着した雑菌を殺菌するために、次亜塩素酸水溶液で滅菌することが好ましい。次亜塩素酸水溶液で滅菌することにより、葉表面に付着した雑菌を殺菌することができ、組織培養を無菌的に行うことが可能となる。
次亜塩素酸水溶液としては、通常、市販のキッチンブリーチ（界面活性剤を含むために好ましい）を１０倍希釈したもの（有効塩素濃度０．６％程度）を用いることができる。また、次亜塩素酸水溶液での処理時間は５分〜３０分間、好ましくは２０分程度である。次亜塩素酸は葉身表皮から細胞内にまで浸透することができるので、処理時間が長くなると、葉組織に対するダメージが大きく、ついには枯死又は壊死させてしまう。
【００５３】
（ｉｉ）の方法で行う除菌処理Ａは、抗生物質含有溶液（除菌用溶液）に挿し葉の状態で放置している間に、抗生物質を導管及び葉脈を通じて葉身全体に送りこむというものである。除菌処理Ａは、葉内、すなわち葉の細胞間間隙の余剰なアグロバクテリウムの殺菌を効率よく行うことができ、除菌効率がよい。具体的には、一晩吸水させただけで、アグロバクテリウム菌体数を１／１０程度にまで減少させることができる。従って、続いて行うカルス誘導、シュート形成に用いる除菌用培地の抗生物質濃度を低減できるという効果がある。
【００５４】
ここで、挿し葉の状態とは、図２に示すように、容器に除菌用溶液を入れ、葉柄を除菌用溶液に挿しこんだ状態をいう。共培養にあたる生育のときは、容器内に水、必要に応じて養分（ハイポネックスなど）を含む水溶液であったのに対し、除菌処理Ａでは、アグロバクテリウム除菌用抗生物質を含む水溶液であるという点が異なっている。
【００５５】
除菌処理Ａで使用する除菌用溶液中の抗生物質濃度は、抗生物質の種類、植物材料の種類により適宜異なる。セフォタキシムを用いる場合、挿し葉するための除菌用溶液で、４００〜６００ｍｇ／Ｌ程度であり、ジャトロファの場合、通常約５００ｍｇ／Ｌである。除菌処理Ａ後、葉カット片を組織培養するときに用いられる除菌用培地の抗生物質濃度は、除菌処理Ａで使用した除菌用溶液の抗生物質濃度より低くてよい。具体的には、前記除菌用溶液の抗生物質含有濃度の１／２〜１／５程度の濃度で足りる。例えば、ジャトロファでは、１００ｍｇ／Ｌ以上〜２５０ｍｇ／Ｌ未満程度でよい。
【００５６】
挿し葉状態で行う除菌処理Ａを行った後、組織培養前に、次亜塩素酸水溶液で葉を滅菌することが好ましい。葉身表面を次亜塩素酸水溶液で滅菌することにより、葉表面に付着した雑菌を殺菌することができ、組織培養を無菌的に行うことが可能となる。次亜塩素酸水溶液を用いる殺菌処理（次亜塩素酸水溶液の濃度、処理時間など）は、（ｉ）の方法の場合と同様である。
【００５７】
〔遺伝子導入植物のスクリーニング〕
除菌後、目的遺伝子が導入された細胞をスクリーニングする。スクリーニングにあたっては、除菌した後の葉の葉カット片からカルスを誘導するとともに、目的遺伝子が導入された細胞をスクリーニングする必要がある。除菌を（ｉｉ）の方法で行った場合（すなわち、除菌処理Ａを行った場合）、除菌後、適当なサイズ（通常３〜１０ｍｍ）にカッティングし、得られた葉カット片をカルス誘導する。
【００５８】
カルス誘導は、従来より公知の方法により行うことができる。具体的には、植物ホルモンとして、オーキシンとサイトカイニンを含み、さらに酸素源、ビタミン類を加え、特定のゲル化剤を加えて固化したカルス誘導用固体培地で培養すればよい。さらに、アグロバクテリウムが葉内に残存しているおそれがある場合には、培地に抗生物質を含有させておくことが好ましい。
【００５９】
ここで、培地に含有させる抗生物質は、除菌に使用した抗生物質と同種類のものを使用できる。また、培地中の抗生物質濃度は、（ｉ）の方法による除菌では、除菌用培地と同程度濃度とすることが好ましい。一方、（ｉｉ）の方法、すなわち除菌処理Ａを行った場合、カルス誘導用固体培地における抗生物質濃度は、除菌処理Ａで用いた除菌用溶液の抗生物質濃度より低くてよい。具体的には、除菌処理Ａで用いた除菌用溶液の抗生物質含有濃度の１／２〜１／５程度の濃度で足りる。例えば、ジャトロファでは、１００ｍｇ／Ｌ以上〜２５０ｍｇ／Ｌ未満程度でよい。
さらに、（ｉｉ）の方法、すなわち除菌処理Ａを行った場合には、カルス誘導の初期、具体的にはカルス誘導開始後２〜７日間は、カルス誘導用固体培地には抗生物質を含有させて除菌を行いながらカルス誘導を行うが、その後は、抗生物質不在下で培養することも可能である。すなわち除菌処理Ａを行うことにより葉内に含まれるアグロバクテリウム数を激減させることが可能であるため、抗生物質濃度を下げた培地で１週間程度の組織培養を行った後は、残存アグロバクテリウム数がほとんど０にまで除菌されている場合もあるからである。このことは、カルス、シュートの形成、成長を阻害する原因となる除菌用抗生物質（例えば、セフォタキシム）不在下でカルス誘導、シュート形成を行うことができることを意味し、結果として、カルス誘導、シュート形成効率の向上をもたらす。
【００６０】
上記オーキシンとしては、インドール−３−酪酸（ＩＢＡ）、ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、及び２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）が挙げられる。サイトカイニンとしてベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン、チジアズロンなどを挙げることができる。
【００６１】
カルス誘導とともに、あるいはカルス誘導を行った後に、目的の遺伝子が導入された細胞をスクリーニングする。スクリーニングは、選抜用マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子など）に対応する薬剤（例えばカナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質）をさらに添加した培地で培養することにより行うことができる。
【００６２】
培地におけるこれらの含有量は、形質転換された植物の種類、培養条件等に応じて、適宜選択される。培養環境条件としては、光照射条件で、培養する。
例えばジャトロファでは、１０〜３０℃、好ましくは２５℃の温度で、暗所で、３０〜１２０日間、好ましくは６０〜９０日間培養すると、組織片から不定芽もしくは不定胚が形成される。
【００６３】
＜形質転換植物体の再生＞
選抜したカルスを、シュート形成用、発根用培地に移して、シュート形成、発根させ、植物体へ再分化させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシンやサイトカイニン等の植物成長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。
【実施例】
【００６４】
本発明を実施するための形態を実施例により説明する。下記実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６５】
（１）アグロバクテリウム懸濁液（感染液）の調製
アグロバクテリウム菌として、ｇｖ３１０１株を用いた。
バイナリーベクターとしては、Ｔ−ＤＮＡのＬＢ及びＲＢ領域を含み、カリフラワーモザイクウィルス由来の３５Ｓプロモータ、ノバリン合成遺伝子のターミネーターが組み込まれ、マーカー遺伝子としてカナマイシン遺伝子、さらに遺伝子導入の確認のための外来遺伝子としてβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を有するプラスミドｐＢＩ１２１を購入して使用した。このプラスミドを、ヒートショック法によりアグロバクテリウムに導入して得られた形質転換アグロバクテリウムを、マーカーであるカナマイシン５０μｇ／ｍｌの濃度で含有させたＬ−液体培地にて、３０℃で一晩培養した。
【００６６】
培養後、遠心分離により集菌し、集菌した菌をＹＥＢ培地に再懸濁して、６００ｎｍにおける吸光度ＯＤ600＝０．１−０．２の感染用菌液を調製した。懸濁用培地は、１ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含む。
このアグロバクテリウム懸濁液に、界面活性剤としてSILWET  L-77を０．００５％の割合で添加して、感染用アグロバクテリウム懸濁液とした。
【００６７】
（２）外植体
タイ系統のジャトロファ（通常の温室で生育させた６カ月から１年程度の木週令）の４位置の葉を採取した。葉（葉身の長径約６−８ｃｍ、短径約５−６ｃｍ、葉柄４−６ｃｍ）を水洗して用いた。
【００６８】
（３）アグロバクテリウム接種
（１）で調製したアグロバクテリウム懸濁液を容器に入れ、図１に示すように、（２）で調製した葉を浸漬し、−０．１ＭＰａで５分間減圧湿潤処理した。
次いで、表面に残った懸濁液を水道水で軽く洗い流した後、図２に示すように、水道水をいれた容器に、葉柄を付けた状態で、５日間生育させた。
【００６９】
（４）遺伝子導入の確認
生育後の葉身では、形質転換に起因すると考えられる変色が全体に分布していた。変色部分をカットし、ＧＵＳ遺伝子発現の有無を確認するために、葉カット片を組織化学的染色法で染色した。染色後の葉カット片の状態を撮影した写真を図３に示す。図３において、暗影部分（矢印部分）は染色された部分であり、外来遺伝子であるＧＵＳ遺伝子が発現した部分である。葉身全体に対する染色部分の割合が高く、しかも染色部分が濃く、形質転換が有効に行われたことが確認できた。
【００７０】
また、５日間の生育後の葉内に残存するアグロバクテリウムの菌体数を測定したところ、１７１５±４９９／leaf  diskであった。leaf  diskは直径２ｍｍの円形である。尚、葉内のアグロバクテリウム菌体数の測定は、葉を次亜塩素酸溶液（１０％）に２０分間浸漬し、水洗した後に行った（以下、同様）。
（４）除菌、カルス誘導、シュート形成
（３）にて、生育させた葉を、セフォタキシム（５００ｍｇ／Ｌ）含有溶液に、図２に示すように挿し葉の状態で、一晩静置した（除菌処理Ａ）。静置後、葉内に残存しているアグロバクテリウム菌体数を測定したところ、１８６±１０２／leaf  diskであった。
【００７１】
上記除菌処理Ａを行った葉について、葉身表面に付着しているアグロバクテリウムバクテリウムを除菌するために、次亜塩素酸溶液（１０％）に２０分間浸漬した後、葉身をカットし、葉身のカット片を、さらに、下記組成を有するカルス誘導培地で１週間培養した。
MS基本培地              1x, (pH5.8)
スクロース              3%
Myo-inositol         100 mg / l
Thiamine-HCl（pH5.8）  １0 mg / l
Agar                    0.8 %
TDZ (thidiazuron)                0.5 mg / l
BA (6-benzylaminopurine)          1 mg / l
IBA (indole-3-butyric acid)      0.075 mg /l
Cefotaxime-Na                   200 mg /l
カナマイシン                      20 mg /l
１週間後、葉内のアグロバクテリウム菌体数を測定したところ、０／leaf  diskであった。
【００７２】
セフォタキシムを添加しない以外は、上記と同様組成のカルス誘導培地で、さらに３０日間培養し、カルス誘導を行った。誘導されたカルスを撮影した顕微鏡写真を図４に示す。誘導されたカルスが、形質転換された細胞で構成されていることがわかる。次いで、得られたカルスをシュート誘導培地（３ｍｇ／ＬのＩＢＡ、０．５ｍｇ／ＬのＢＡ、０．７％の寒天、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンをふくむＭＳ固体培地）に移植し、２５℃、２０００ルクス、１６時間の明時間条件下で、４週間培養し、シュートを形成させた。
【００７３】
〔比較例〕
（１）外植体
タイ系統のジャトロファ（温室で生育させた６カ月から１年程度の木）の４位置の葉を採取した。葉（葉身の長径約６−８ｃｍ、短径約５−６ｃｍ、葉柄４−６ｃｍ）を次亜塩素酸溶液（１０％）に２０分間浸漬した後、５−８ｍｍにカットした。得られた葉カット片を外植体として用いた。
【００７４】
（２）アグロバクテリウム接種
実施例（１）で調製したアグロバクテリウム懸濁液に、上記で調製した葉カット片を浸漬し、10分間振とうした後、３日間、25℃で遮光環境下で、滅菌シートを載置した寒天培地上で共培養した。共培養培地としては、下記組成を有する共存培地を用いた。
MS基本培地
TDZ (thidiazuron)               0.5 mg / l
BA (6-benzylaminopurine) 1 mg / l
IBA (indole-3-butyric acid)    0.075 mg /l
AS (Acetosyringone)           20 mg /l
【００７５】
（３）遺伝子導入の確認
共培養した葉カット片を、ＧＵＳ活性検出のための染色後、目視で観察した。形質転換に起因する青色は目視では殆ど観察できず、顕微鏡下で観察した場合に、図５に示すように、薄い青色で部分（矢印部分）が見えた程度であった。顕微鏡下での観察で、着色が見られる葉カット片は、培養に供した葉カット片の９±１％であった。葉身１枚あたりで実施例と比べると、実施例では葉身のほぼ全ての部分でカルス誘導、シュート形成に供することができた（培養に供した葉カット片に換算してほぼ１００％）のに対して、比較例では１０％程度であり、しかも形質転換された細胞数（青色にＧＵＳ染色される面積）はとても小さく、形質転換効率が劣っていたことがわかる。
【００７６】
（４）除菌
共培養後、植物組織内に残存するアグロバクテリウムの菌体数を測定したところ、１０００００／leaf  diskであった。
次いで、下記組成を有するカルス誘導培地で１週間培養した。
MS基本培地              1x, (pH5.8)
スクロース              3%
Myo-inositol         100 mg / l
Thiamine-HCl（pH5.8）  １0 mg / l
Agar                    0.8 %
TDZ (thidiazuron)                0.5 mg / l
BA (6-benzylaminopurine)          1 mg / l
IBA (indole-3-butyric acid)      0.075 mg /l
Cefotaxime-Na                   200 mg /l
カナマイシン                      20 mg /l
残存しているアグロバクテリウム菌体数を測定したところ、８００−１６００／leaf  diskであった。このため、次に行うカルス誘導、シュート形成も、抗生物質（セファタキシム）存在下で培養する必要があった。
【００７７】
比較例の方法では、実施例の方法と比べて、外植体単位（葉１枚）あたりのカルス誘導、シュート形成効率が低かった。さらに除菌についても、実施例の方法では除菌効率が高い除菌処理Ａを併用でき、その結果、アグロバクテリウム除菌用の抗生物質不在下でカルス誘導、シュート形成することが可能であることから、形質転換植物の生産効率がよい。これに対して、比較例（従来の葉カット片を用いて遺伝子導入する方法）では、遺伝子導入された植物組織（葉カット片）を得られる割合が実施例より低いだけでなく、その後で行う除菌については、抗生物質存在下での組織培養による方法を採用せざるを得ないため、除菌効率が低くなる。その結果、アグロバクテリウム除菌用抗生物質を含有する培地でカルス誘導、シュート形成を行うことが必要となり、最終的に形質転換植物を得られる効率が、実施例と比べて、更に低くなる。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の遺伝子導入方法では、外植体として、全葉をそのまま使用できるので、遺伝子導入のための植物材料の調製が簡便であり、しかも除菌工程を、葉内に残存するアグロバクテリウムを効率的に除菌できる除菌処理を併用することが可能となるので、大量に形質転換植物を得るための遺伝子導入方法として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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