(57)【要約】【課題】  Ｆｃ結合性タンパク質（ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域）が有する抗体への親和性を保持したまま、安定製造が可能なタンパク質、および遺伝子工学的手法を用いた前記タンパク質の製造方法を提供すること。【解決手段】  Ｆｃ結合性タンパク質を構成する３つのドメインのうち、Ｎ末端側の第１ドメインおよび第２ドメインを含み、かつＣ末端側の第３ドメインを欠失させた、小型化Ｆｃ結合性タンパク質、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および前記ベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体により前記課題を解決する。【選択図】  図５
2012130294.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも７番目のアラニンから１６９番目のスレオニンまでのアミノ酸を含む、Ｆｃ結合性タンパク質。
【請求項２】
配列番号５２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも７番目のアラニンから１６９番目のスレオニンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換された、Ｆｃ結合性タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号７に記載のヌクレオチド配列のうち、１番目から５２２番目までのヌクレオチドからなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３または４に記載のポリヌクレオチドを含む、Ｆｃ結合性タンパク質を発現させるためのベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを用いて宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【請求項７】
宿主が大腸菌である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６または７に記載の形質転換体を用いた、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト抗体に対する結合親和性の高いタンパク質、および遺伝子工学的手法を用いた前記タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、医薬品、研究試薬等に幅広く利用され、特に医療分野においては必須な物質として認識されている。抗体利用の拡大から、抗体を認識し結合する物質の需要も増加している。中でも、ヒトＦｃ受容体（以下、単に「ＦｃＲ」と略記する）は、ヒト抗体ＩｇＧに対する結合親和性が高いため、産業上の応用が試みられている（特許文献１）。
【０００３】
ＦｃＲには、抗体との複合体形成後の機能および構造上の分類からＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩのサブクラスが存在する。これらのＦｃＲは免疫細胞の表面に存在し、抗体と結合し複合体を形成することにより、免疫細胞内にシグナルが伝達されるなど、免疫機構の中核を担うタンパク質である。ＦｃＲサブクラス間のアミノ酸配列の相同性は非常に高く、抗体との複合体形成において、実際に抗体と相互作用するアミノ酸位置の推測も可能であるとされている。一方で、ＦｃＲサブクラスの一つであるＦｃγＲＩの細胞外領域（以下、「Ｆｃ結合性タンパク質」とする）には、他のＦｃＲには存在しない３つ目のドメインがＣ末端側に存在しており（非特許文献１および２）、この３つ目のドメインが存在することで、ＦｃγＲＩが高度な親和性、抗体選択性を備えていると考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００２−５３１０８６号公報
【特許文献２】特開２００８−２４５５８０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８，１９８９
【非特許文献２】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
抗体検出試薬等に使用する目的でＦｃ結合性タンパク質を製造・使用する際、従来はＦｃ結合性タンパク質が有する３つのドメインすべて含むタンパク質として発現（製造）し、使用してきた（特許文献２）。しかしながら、Ｆｃ結合性タンパク質の発現量は低く、また安定性等についても課題を有していた。
【０００７】
そこで本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質が有する抗体への親和性を保持したまま、安定製造が可能なタンパク質、および遺伝子工学的手法を用いた前記タンパク質の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＦｃγＲＩの細胞外領域（Ｆｃ結合性タンパク質）を構成する３つのドメインのうち、これまでＦｃγＲＩが高度な親和性、抗体選択性を備えている原因として考えられた、Ｃ末端側の第３ドメインを削除しても（すなわちＮ末端側の第１ドメインと第２ドメインのみであっても）、抗体への高い親和性を有していることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の態様を包含する：
（１）配列番号５２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも７番目のアラニンから１６９番目のスレオニンまでのアミノ酸を含む、Ｆｃ結合性タンパク質。
【００１０】
（２）配列番号５２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも７番目のアラニンから１６９番目のスレオニンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換された、Ｆｃ結合性タンパク質。
【００１１】
（３）（１）または（２）に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【００１２】
（４）配列番号７に記載のヌクレオチド配列のうち、１番目から５２２番目までのヌクレオチドからなるポリヌクレオチド。
【００１３】
（５）（３）または（４）に記載のポリヌクレオチドを含む、Ｆｃ結合性タンパク質を発現させるためのベクター。
【００１４】
（６）（５）に記載のベクターを用いて宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【００１５】
（７）宿主が大腸菌である、（６）に記載の形質転換体。
【００１６】
（８）（６）または（７）に記載の形質転換体を用いた、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
【００１７】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１８】
ヒトＦｃγＲＩは、図１に示すように、Ｎ末端側から、１５アミノ酸からなるシグナルペプチド領域（ＳＳ、配列番号６に記載のアミノ酸配列のうち１番目から１５番目までの領域）、２７７アミノ酸からなる細胞外領域（ＥＣ、配列番号６に記載のアミノ酸配列のうち１６番目から２９２番目までの領域）、２１アミノ酸からなる細胞膜貫通領域（ＴＭ、配列番号６に記載のアミノ酸配列のうち２９３番目から３１３番目までの領域）、６１アミノ酸からなる細胞内領域（Ｃ、配列番号６に記載のアミノ酸配列のうち３１４番目から３７４番目までの領域）、から構成される。またヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（Ｆｃ結合性タンパク質）は、公的データベース（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ１２３１４）より、さらにＮ末端側から第１ドメイン（配列番号６に記載のアミノ酸配列のうち２２番目から１０１番目までの領域）、第２ドメイン（配列番号６に記載のアミノ酸配列のうち９５番目から１８４番目までの領域）、第３ドメイン（配列番号６に記載のアミノ酸配列のうち１９０番目から２７７番目までの領域）を有していることが知られている。
【００１９】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、Ｆｃ結合性タンパク質（ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域）（配列番号６に記載のアミノ酸配列のうち１６番目から２９２番目までの領域）の一部領域である、配列番号５２（配列番号６に記載のアミノ酸配列のうち１６番目から１８９番目までの領域）に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも７番目のアラニンから１６９番目のスレオニンまでのアミノ酸（すなわち第１ドメインおよび第２ドメインの領域）を含むタンパク質である。なお、本発明のＦｃ結合性タンパク質を構成するアミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたタンパク質も、本発明のＦｃ結合性タンパク質に含まれる。前記タンパク質の一態様として、配列番号５２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも７番目のアラニンから１６９番目のスレオニンまでのアミノ酸を含むタンパク質であって、
（ア）配列番号５２の１０番目のスレオニンがリジンに置換
（イ）配列番号５２の２３番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（ウ）配列番号５２の３１番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（エ）配列番号５２の４７番目のアラニンがバリンに置換
（オ）配列番号５２の４８番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（カ）配列番号５２の５４番目のセリンがフェニルアラニンまたはスレオニンに置換
（キ）配列番号５２の５６番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（ク）配列番号５２の６２番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（ケ）配列番号５２の６３番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（コ）配列番号５２の７９番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（サ）配列番号５２の８５番目のイソロイシンがバリンに置換
（シ）配列番号５２の９５番目のセリンがアスパラギンに置換
（ス）配列番号５２の９９番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（セ）配列番号５２の１１０番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（ソ）配列番号５２の１１６番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（タ）配列番号５２の１３４番目のトリプトファンがロイシンに置換
（チ）配列番号５２の１４１番目のロイシンがプロリンに置換
（ツ）配列番号５２の１４５番目のイソロイシンがメチオニンに置換
（テ）配列番号５２の１４８番目のアスパラギンがセリンに置換
のいずれかのアミノ酸置換を一つ以上含む、タンパク質があげられる（特願２０１０−０５２７８９号）。また、ポリヒスチジンタグといった精製などを行なうためのタグペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加しても、本発明のＦｃ結合性タンパク質に含まれる。
【００２０】
本発明のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、単に「本発明のポリヌクレオチド」とする）の作製方法として、
（Ｉ）本発明のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成して作製する方法や、
（ＩＩ）ヒトＦｃγＲＩの全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはヒトＦｃγＲＩのｃＤＮＡなどからＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した前記ポリヌクレオチドを適当な方法で連結し作製する方法、
を例示することができる。なお、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際は、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。大腸菌のコドン使用頻度を基に、本発明のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換した例として、配列番号５２に記載のアミノ酸配列から変換した、配列番号７に記載のヌクレオチド配列のうち１番目から５２２番目までのヌクレオチドからなるポリヌクレオチドがあげられる。
【００２１】
なお、前記（Ｉ）または（ＩＩ）の方法で作製した本発明のポリヌクレオチドの５’末端側にシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加してもよく、宿主が大腸菌の場合は、前記シグナルペプチドとしてｐｅｌＢ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１の１番目から２２番目までの領域）、ＤｓｂＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＧ４の１から１９番目までの領域）、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９の１番目から２６番目までの領域、配列番号１）、ＴｏｒＴ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ３８６８３の１番目から１８番目の領域）といったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをあげることができる（特願２００９−２５６１８０号）。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する際は、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミドなど）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお、前記発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミド、ｐＵＣプラスミド、ｐＴｒｃ９９ａプラスミド、ｐＣＤＦプラスミド、ｐＢＢＲプラスミドなどを例示することができる。なお、前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際、本発明のポリヌクレオチドを複数連結した状態（連結部分にリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでもよい）で挿入してもよく、複数連結した状態で挿入することにより、形質転換体による本発明のＦｃ結合性タンパク質生産性の向上が期待できる（特願２００９−２７４３５２号、特願２００９−２７４３５３号）。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターを用いて宿主を形質転換するには当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、宿主として大腸菌などＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物を選択した場合には、ヒートショック法やエレクトロポレーション法などの方法により形質転換すればよい。前記方法で得られた形質転換体から適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を取得することができる。前記形質転換体のスクリーニングは、例えば、Ｆｃ結合性タンパク質の抗体に対する結合活性を評価することで可能である。結合活性の評価は、例えばＩｇＧに対する結合活性をＥＬＩＳＡ法や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定することにより可能である。前記測定に使用するＩｇＧは、ヒトＩｇＧが好ましく、ヒトＩｇＧ１がより好ましい。
【００２４】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、前記タンパク質をコードしたポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチド）を含む発現ベクターで形質転換された宿主（形質転換体）を培養することで製造することができる。本発明のＦｃ結合性タンパク質の製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげることができる。なお、発現ベクターを保持する形質転換体を安定に培養するためには、発現ベクターに挿入されている薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を培地中に添加して培養すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、１０℃から４０℃、好ましくは２５℃から３７℃、より好ましくは３０℃前後であるが、発現させるＦｃ結合性タンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに誘導性のプロモータを含んでいる場合は、本発明のＦｃ結合性タンパク質を含むポリペプチドが良好に発現できるような条件下で誘導すればよい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）が例示できる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定後、その値が約０．５となったときに適当量のＩＰＴＧを添加し、引き続き培養することで、本発明のＦｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は終濃度０．００５から１．０ｍＭが好ましく、より好ましくは終濃度０．０１から０．５ｍＭである。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
【００２６】
本発明の形質転換体の培養液から本発明のＦｃ結合性タンパク質を抽出するには、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよく、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清からＦｃ結合性タンパク質を抽出すればよい。一方、細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合には、遠心分離操作により集菌した後、超音波または酵素処理剤もしくは界面活性剤などを添加することにより菌体を破砕して、Ｆｃ結合性タンパク質を抽出すればよい。
【００２７】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を含む抽出物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を分離・精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよい。一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離・精製があげられる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどがあげられる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことによって、本発明のＦｃ結合性タンパク質を高純度に調製することができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（Ｆｃ結合性タンパク質）が有する３つのドメインのうち、少なくともＮ末端側の第１のドメインと第２のドメインを含むタンパク質であり、具体的には、
（１）配列番号５２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも７番目のアラニンから１６９番目のスレオニンまでのアミノ酸を含む、Ｆｃ結合性タンパク質、または
（２）配列番号５２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも７番目のアラニンから１６９番目のスレオニンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換された、Ｆｃ結合性タンパク質、
である。本発明のＦｃ結合性タンパク質は、これまでＦｃγＲＩが高度な親和性、抗体選択性を備えている原因として考えられた、Ｆｃ結合性タンパク質のＣ末端側にある第３ドメインが欠失しているが、Ｆｃ結合性タンパク質が有する抗体に対する高い結合親和性は保持しており、タンパク質分子の小型化にも成功している。そのため、遺伝子工学的手法を用いてＦｃ結合性タンパク質を製造する際、安定したタンパク質製造が可能となり、製造したＦｃ結合性タンパク質の抗体検出試薬等への利用性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ヒトＦｃγＲＩの構造を示す図である。
【図２】プラスミドｐＥＴＭａｌＥの作製方法および構造を示す図である。
【図３】プラスミドｐＥＴＦｃＲの作製方法および構造を示す図である。
【図４】プラスミドｐＥＴｓＦｃＲの作製方法および構造を示す図である。
【図５】野生型Ｆｃ結合性タンパク質および小型化Ｆｃ結合性タンパク質（本発明のＦｃ結合性タンパク質）のヒトＩｇＧ各サブクラスへの結合選択性を示した図である。
【図６】野生型Ｆｃ結合性タンパク質および小型化Ｆｃ結合性タンパク質（本発明のＦｃ結合性タンパク質）の分子量を確認した図である。
【図７】小型化Ｆｃ結合性タンパク質（本発明のＦｃ結合性タンパク質）のヒトＩｇＧへの親和性を評価した図である。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
実施例１
シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入したプラスミドを以下の方法で調製した。
（１）配列番号１（ＭＫＩＫＴＧＡＲＩＬＡＬＳＡＬＴＴＭＭＦＳＡＳＡＬＡ）に記載のアミノ酸配列からなる、ＭａｌＥシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製するために、配列番号２（５’−ＴＡＴＡ［ＣＡＴＡＴＧ］ＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＴＣＣ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｄｅＩサイト）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号３（５’−ＧＣＡＴＴＡＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＣＧＣＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号４（５’−ＡＴＣＧＴＣＧＴＴＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＧＡＧＧＡＴＧＣＧＴＧＣＡＣＣＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号５（５’−ＴＴＧＴＣ［ＣＣＡＴＧＧ］ＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴＴＴＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＧ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｃｏＩサイト）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれＰＣＲ法により連結した。ＰＣＲ反応は表１に示す反応液を用い、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なった。
【００３２】
【表１】
2012130294.tif 000003
なお、表１に記載のオリゴヌクレオチドミックスは、５０ｐｍｏＬ／μＬの前記４種類（配列番号２から５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド）の合成オリゴヌクレオチド溶液を、同量ずつ採取し混合した溶液を指す。
（２）（１）のＰＣＲ産物を鋳型とし、ＰＣＲプライマーとして配列番号２および配列番号５に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドを用いた他は、表１に記載の反応液と同じ組成を用い、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なうＰＣＲ反応により、ＭａｌＥシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。
（３）（２）で作製したＭａｌＥシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを、制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化した。前記消化物を、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化したｐＥＴ２６ｂ（＋）プラスミドベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にライゲーションし、ヒートショック法により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、形質転換体よりプラスミドＤＮＡを抽出することで、プラスミドｐＥＴＭａｌＥを調製した。ｐＥＴＭａｌＥ作製方法の概略およびｐＥＴＭａｌＥの構造を図２に示す。
【００３３】
実施例２
実施例１で調製したプラスミドに挿入するＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製した。
（１）野生型Ｆｃ結合性タンパク質として、配列番号６に記載のヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸からなるタンパク質を選択し、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを大腸菌のコドンを用いて変換し設計した。前記設計したポリヌクレオチド配列を配列番号７に示す。
（２）配列番号７に記載の配列からなるポリヌクレオチドを作製するための、合成オリゴヌクレオチドを作製した。作製したオリゴヌクレオチドの配列を配列番号８から４５に示す。
（３）（２）で作製した合成オリゴヌクレオチドから、下記に示す２段階のＰＣＲを行なうことで、野生型Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（３−１）１段階目のＰＣＲ反応は、表２に示す反応液を用い、９４℃で５分間熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６２℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
【００３４】
【表２】
2012130294.tif 000004
なお、表２に記載のオリゴヌクレオチドミックスは、５０ｐｍｏＬ／μＬの３８種類（配列番号８から４５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド）の合成オリゴヌクレオチド溶液を同量ずつ採取し混合した溶液を指す。
（３−２）２段階目のＰＣＲ反応は、表３に示す反応液を用い、９４℃で５分間熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６５℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。
【００３５】
【表３】
2012130294.tif 000005
なお、表３に示す組成のうち、鋳型は１段階目のＰＣＲ産物を用い、ＰＣＲプライマーは配列番号４６（５’−ＴＣＡＧ［ＣＣＡＴＧＧ］ＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡ−３’；角かっこ内は制限酵素ＮｃｏＩサイト）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４７（５’−ＣＣ［ＡＡＧＣＴＴ］ＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＧＴＴＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧ−３’；角かっこ内は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイト）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。なお、配列番号４７に記載の配列からなるＰＣＲプライマーは、野生型Ｆｃ結合性タンパク質のＣ末端側に検出用のタグである６個のヒスチジン（Ｈｉｓ）が付加するよう設計している。
（４）（３−２）でのＰＣＲ産物をアガロースゲルを用いて抽出精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ：キアゲン社製）し、野生型Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製した。
【００３６】
実施例３
実施例１で調製したプラスミドと、実施例２で調製したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドから、Ｆｃ結合性タンパク質発現プラスミドを調製した。
（１）実施例１で調製したｐＥＴＭａｌＥベクターと、実施例２で調製した野生型Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、それぞれ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ライゲーションし、ヒートショック法により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（２）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、定法に従いプラスミドを抽出し（Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）、これをｐＥＴＦｃＲ（挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を以下「野生型Ｆｃ結合性タンパク質」とする）と命名した。ｐＥＴＦｃＲ作製の概略およびｐＥＴＦｃＲの構造を図３に示す。
（３）ｐＥＴＦｃＲを用いてヒートショック法により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
【００３７】
実施例４  
ｐＥＴＦｃＲ（図３）に挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にて解析した。なお、シークエンス用プライマーとして、配列番号４８（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４９（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。解析の結果、ｐＥＴＦｃＲに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列は設計通りであることを確認した。
【００３８】
実施例５
実施例１で調製したプラスミドと、本発明のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドから、Ｆｃ結合性タンパク質発現プラスミドを調製した。
（１）実施例３で調製したプラスミドｐＥＴＦｃＲを鋳型として、表４に示す反応液を用い、ＰＣＲ反応を、９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。
【００３９】
【表４】
2012130294.tif 000006
なお、表４に示す組成のうち、ＰＣＲプライマーは配列番号４６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号５０（５’−ＣＣＧ［ＣＴＣＧＡＧ］ＧＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＣＡＧＴＴＣＴＴＴＧＡＣＧＧ−３’；角かっこ内は制限酵素ＸｈｏＩサイト）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
（２）（１）のＰＣＲ産物をアガロースゲルを用いて抽出精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ：キアゲン社製）し、ポリヌクレオチドを調製した。
（３）精製したポリヌクレオチドと、実施例１に調製したプラスミドｐＥＴＭａｌＥとを制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化し、ライゲーション後、ヒートショック法により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、定法に従いプラスミドを抽出し（Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ：キアゲン社製）、これをｐＥＴｓＦｃＲと命名した。プラスミドｐＥＴｓＦｃＲ作製の概略とｐＥＴｓＦｃＲの構造を図４に示す。
【００４０】
ｐＥＴｓＦｃＲを実施例４に記載の方法で配列確認を行なったところ、挿入したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列は設計通りであることを確認した。ｐＥＴｓＦｃＲのうち、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＭａｌＥシグナルペプチドおよび配列番号５２に記載のアミノ酸配列からなる本発明のＦｃ結合性タンパク質を含むタンパク質（以下「小型化Ｆｃ結合性タンパク質」とする）をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５１に示す。配列番号５１の詳細は、１番目から７８番目の塩基が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＭａｌＥシグナルペプチドをコードする配列、７９番目から９９番目までの塩基がリンカー配列、１００番目から６２１番目までの塩基が配列番号５２に記載のアミノ酸配列からなる本発明のＦｃ結合性タンパク質をコードする配列、６２２番目から６３０番目までの塩基がリンカー配列、である。なお、検出用のタグとしてｐＥＴＭａｌＥ由来の６個のヒスチジン（Ｈｉｓ）タグを使用している。配列確認を行なったｐＥＴｓＦｃＲを用いて、ヒートショック法により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
【００４１】
実施例６
実施例３で調製したプラスミドｐＥＴＦｃＲ形質転換体、および実施例５で調製したプラスミドｐＥＴｓＦｃＲ形質転換体を用いてＦｃ結合性タンパク質を発現させた。
（１）ｐＥＴＦｃＲ（図３）またはｐＥＴｓＦｃＲ（図４）により、それぞれ形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養（３７℃で１８時間）後、再調製した５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地（８００ｍＬ）に前記培養液８ｍＬを植菌した。
（２）培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）の値が１．０から２．０になった時点で培養温度を１５℃に切り替え、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭとなるように培養液に添加後、さらに２０時間培養した。
（３）培養液から遠心分離操作により菌体を集菌し、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した後、超音波破砕にて菌体からタンパク質を抽出し、遠心操作にて上清を回収した。
（４）回収した上清に終濃度で２０から５０ｍＭとなるようイミダゾールを加え、あらかじめ１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したニッケルキレートカラム（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ：Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にアプライ後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、５００ｍＭのイミダゾールと１０％のグリセリンを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてタンパク質を溶出させた。
【００４２】
実施例７
実施例６に記載の方法で精製した、野生型Ｆｃ結合性タンパク質または小型化Ｆｃ結合性タンパク質の、ヒトＩｇＧ各サブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）への結合活性を、以下に記載するＥＬＩＳＡ法により評価した。
（１）ヒトＩｇＧのサブクラスであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４（シグマアルドリッチ社製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌの濃度で固定した（４℃、１８時間）。
（２）固定化終了後、２％のスキムミルクを含んだ５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）によりブロッキングした。
（３）洗浄緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、調製したタンパク質溶液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で適宜希釈し、固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で１時間）。
（４）反応終了後、前記洗浄緩衝液で再度洗浄し、Ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識の抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）を１００００倍希釈し１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（５）３０℃で１時間反応後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し発色後、１Ｍのリン酸溶液で反応を停止させ４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４３】
測定結果を図５に示す。図中、Ｘ軸（横軸）はＩｇＧサブクラスを示し、Ｙ軸（縦軸）は、４５０ｎｍの吸光度（単位は任意）であり抗体結合活性を示す。図５に示すように、各ＩｇＧサブクラスへの反応性は、野生型Ｆｃ結合性タンパク質、小型化Ｆｃ結合性タンパク質、ともにＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞＞ＩｇＧ２という反応性を示した。したがって、本発明のＦｃ結合性タンパク質である小型化Ｆｃ結合性タンパク質は、ＩｇＧへの結合に関して野生型Ｆｃ結合性タンパク質と同等の性能を有しているといえる。
【００４４】
実施例８
小型化Ｆｃ結合性タンパク質の分子量を確認するため、下記に示すＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇを行なった。
（１）実施例６に記載の方法で精製した、野生型Ｆｃ結合性タンパク質または小型化Ｆｃ結合性タンパク質を還元処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離した。
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜（ＧＥヘルスケア社製）に転写し、転写されたＰＶＤＦ膜を５％のスキムミルクを含んだ５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）によりブロッキングした。
（３）洗浄緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、Ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識の抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）を反応させた（室温で１時間）。
（４）反応終了後、前記洗浄緩衝液で再度洗浄し、検出用試薬（ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ：ＧＥヘルスケア社製）を使用し検出を行なった。
【００４５】
測定結果を図６に示す。図中のＭはマーカー、ＡＰは実施例６においてカラムにアプライした試料、ＦＴはカラム通過画分、Ｆｒ１からＦｒ４はカラム溶出画分を示す。アミノ酸組成から計算される分子量は野生型Ｆｃ結合性タンパク質が約３２ｋＤａ、小型化Ｆｃ結合性タンパク質が約２１ｋＤａであるが、図６の結果より、野生型Ｆｃ結合性タンパク質が約３０ｋＤａの位置、小型化Ｆｃ結合性タンパク質が約２０ｋＤａの位置に、それぞれバンドを確認できた。よって、本発明のＦｃ結合性タンパク質である小型化Ｆｃ結合性タンパク質が、確かに野生型Ｆｃ結合性タンパク質よりも分子量が小さいことが判明した。
【００４６】
実施例９
小型化Ｆｃ結合性タンパク質のヒトＩｇＧ１に対する結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００（ＧＥヘルスケア社製）による表面プラズモン共鳴法を用いて測定した。
（１）実施例６に記載の方法で精製した小型化Ｆｃ結合性タンパク質を、１５０ｍＭのＮａＣｌと３ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で透析した。
（２）透析後の小型化Ｆｃ結合タンパク質をＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０を含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））にて、４．２ｎＭから希釈系列を作製した。
（３）（２）で作製した希釈系列を、２７３０．５ＲＵのヒトＩｇＧ１（シグマアルドリッチ社製）を固定化したセンサーチップ（ＣＭ５）を用いて、Ｆｃ結合性タンパク質とヒトＩｇＧ１の相互作用を解析した。
【００４７】
解析した結果を図７に示す。小型化Ｆｃ結合性タンパク質の結合速度定数（ｋａ）は７．４×１０６（１／Ｍｓ）、解離速度定数（ｋｄ）は８．２×１０−４（１／ｓ）、平衡解離定数（ＫＤ）は１．１×１０−１０（Ｍ）であり、野生型Ｆｃ結合性タンパク質の平衡解離定数（ＫＤ）：１０−１０（Ｍ）（非特許文献２）と同等の高い結合親和性を有することが判明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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