(57)【要約】【課題】Ｐ−糖タンパク質およびその使用の提供。【解決手段】本発明は、イヌＰ−糖タンパク質およびイヌ特異的アミノ酸を含む関連Ｐ−糖タンパク質、ならびにこれらのポリペプチドをコードする核酸に関する。本発明はまた、イヌＰ−糖タンパク質のフラグメントおよび生物学的に機能的な改変体を含む。本発明はさらに、このようなイヌＰ−糖タンパク質の核酸およびポリペプチドを用いる方法、特に、薬物のバイオアベイラビリティを決定するための方法およびイヌＰＧＰのインヒビターをスクリーニングするための方法に関する。イヌＰＧＰの発現または機能を阻害することによって、イヌＰＧＰ活性を阻害するイヌＰＧＰインヒビターもまた、含まれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）のＰ−糖タンパク質に
関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｐ−糖タンパク質（ＰＧＰ；多剤トランスポーター、ＭＤＲ１としてもまた公
知）は、ＡＢＣトランスポータースーパーファミリーのメンバーであり、そして
ヒトの腸、肝臓および他の組織で発現される。この酵素は、細胞膜を渡って低分
子を輸出する流出ポンプとしてはたらく。数年間、高レベルのＰＧＰ発現が癌化
学療法に対する腫瘍耐性に関する機構であることが知られている。ＰＧＰの腸発
現は、このトランスポーターの基質である薬物分子の経口バイオアベイラビリテ
ィに影響を及ぼし得る。ＰＧＰは、流出薬物を効率的に腸管腔へ戻し得、このよ
うにして循環へ侵入する薬物の量を減少する。
【０００３】
ＰＧＰとの相互作用の測定は、特定の薬物が低いまたは高いバイオアベイラビ
リティを示す理由のより良い理解を提供し得る。ＰＧＰとの相互作用は、極性が
与えられた細胞系における薬物輸送の直接的アッセイまたは薬物刺激ＡＴＰａｓ
ｅ活性および蛍光基質輸送の阻害のような間接的アッセイのいずれかを用いて研
究され得る。
【０００４】
従って、上記の薬物アッセイにおける使用のための、さらなるＰＧＰポリペプ
チド（好ましくは、これは、ヒトＰＧＰに密接に関連する）に関する必要性があ
る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）のＰ−糖タンパク質をコードする
核酸が、ここで、同定され、単離され、クローン化され、そして配列決定された
。このＰＧＰは、ヒトＰＧＰと非常に関連している（高い割合の同一性を有する
）。本発明は、単離された核酸分子、これらの分子の特有のフラグメント、上記
のものを含む発現ベクター、およびこれらの分子を用いてトランスフェクトされ
た宿主細胞を提供する。本発明はまた、単離されたポリペプチドならびに薬物輸
送を減少する上記の核酸およびポリペプチドのインヒビターを提供する。このＰ
ＧＰの核酸およびポリペプチドは、薬物のバイオアベイラビリティを評価するた
めのアッセイ、ならびにこの薬物の最適化または発見のためのアッセイにおいて
有用である。さらに、上記のものは、ＰＧＰ活性によって特徴付けられる状態の
診断または処置において使用され得、そしてＰＧＰ活性を増加または減少するた
めの治療的に有用である方法に使用され得る。
例えば、本願発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）  単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸分子、
（ｂ）（ａ）の対立遺伝子改変体であって、ここで該対立遺伝子は、配列番号３および配列番号５を除く、対立遺伝子改変体、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補体、
からなる群より選択される、単離された核酸分子。
（項目２）  前記単離された核酸分子が配列番号２をコードする、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目３）  前記単離された核酸が配列番号１のヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目４）  前記単離された核酸が配列番号１のコード領域を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
（項目５）  前記対立遺伝子改変体が、配列番号２３、配列番号２５、および配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸分子である、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目６）  前記対立遺伝子改変体が、配列番号２３をコードする、請求項５に記載の単離された核酸分子。
（項目７）  前記対立遺伝子改変体が、配列番号２５をコードする、請求項５に記載の単離された核酸分子。
（項目８）  前記対立遺伝子改変体が、配列番号２７をコードする、請求項５に記載の単離された核酸分子。
（項目９）  前記核酸分子が、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、項目５に記載の単離された核酸分子。
（項目１０）  前記ヌクレオチド配列が配列番号２２を含む、項目９に記載の単離された核酸分子。
（項目１１）  前記ヌクレオチド配列が配列番号２４を含む、項目９に記載の単離された核酸分子。
（項目１２）  前記ヌクレオチド配列が配列番号２６を含む、項目９に記載の単離された核酸分子。
（項目１３）  前記核酸分子が、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列のコード領域を含む、請求項５に記載の単離された核酸分子。
（項目１４）  単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、配列番号２の２５位、１９２位、１９７位、２１２位、２８８位、３２９位、５３２位、６９６位、１２７３位および１３５５位；配列番号２５の２５位；ならびに、配列番号２７の２５位および１１４８位からなる群から選択されるイヌＰ−糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を含む、単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。
（項目１５）  単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラ
グメントであって、配列番号２の３位、６位、８位、１０位、１２位、１４〜２
６位、３６位、３８位、４８位、５２位、５６位、６４位、７４位、７８位、８
４〜９２位、９４位、９６位、９８位、９９位、１０１位、１０３位、１０４位
、１０６位、１０８位、１１２位、１１５位、１４７位、１８７位、１９７位、
１９９位、２３３位、２８８位、３２１位、３２６位、３４７位、３９７位、４
５０位、４５４位、４５５位、４６７位、４７２位、５２０位、６３３位、６３
７位、６４３位、６４４位、６５０位、６５７位、６５８位、６６１位、６６６
位、６６７位、６７４〜６７７位、６７９位、６８５位、６８９位、６９１位、
６９３位、６９４位、７０３位、７０７位、７１７位、７３１位、７３６位、７
４０位、７４４位、７４５位、７５６位、７５９位、７６３位、８５３位、９１
４位、９２０位、９４２位、９４３位、９４６位、９６８〜９７０位、９７２位
、９７４位、９８３位、１００５位、１０１０位、１０１７位、１０２５位、１
０２６位、１０２９位、１０４０位、１０９５位、１０９８位、１１０５位、１
１４４位、１１４８位、１１４９位、１１５８位、１１６２位、１１６５位、１
１６８位、１１７０位、１２５２位および１２７９位、ならびに配列番号２７の
３２９位からなる群から選択されるイヌＰ−糖タンパク質の少なくとも１つのア
ミノ酸を含み、ここで該Ｐ−糖タンパク質は、イヌＰ−糖タンパク質の該少なく
とも１つのアミノ酸を除いて、ヒトＰ−糖タンパク質と同一である、単離された
Ｐ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。
（項目１６）  前記ヒトＰ−糖タンパク質が、配列番号７および配列番号８の群から選択される、項目１５に記載の単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。
（項目１７）  前記ポリペプチドまたはそのフラグメントのアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２のフラグメント、配列番号２３のフラグメント、配列番号２５のフラグメントおよび配列番号２７のフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項１４〜１６のいずれかに記載の単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。
（項目１８）  項目１４〜１７のいずれかに記載の単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする、単離された核酸分子。
（項目１９）  プロモーターに作動可能に連結された、項目１に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
（項目２０）  プロモーターに作動可能に連結された、項目１８に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
（項目２１）  項目１９に記載の発現ベクターを用いて形質転換されたかまたはトランスフェクトされた、宿主細胞。
（項目２２）  項目２０に記載の発現ベクターを用いて形質転換されたかまたはトランスフェクトされた、宿主細胞。
（項目２３）  項目１４に記載の単離されたポリペプチドを選択的に結合する、因子。
（項目２４）  前記因子が、ヒトＰ−糖タンパク質もイヌＰ−糖タンパク質も結合しない、項目２３に記載の方法。
（項目２５）  前記因子がポリペプチドである、項目２３に記載の因子。
（項目２６）  項目２５に記載の因子であって、ここで、前記ポリペプチドは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）2抗体フラグメントおよびＣＤＲ３領域を含む抗体フラグメントからなる群より選択される、因子。
（項目２７）  項目１または項目１８に記載の単離された核酸分子を選択的に結合する、因子。
（項目２８）  前記因子が、前記単離された核酸分子に選択的に結合するアンチセンス核酸である、項目２７に記載の因子。
（項目２９）  化合物のバイオアベイラビリティを予測する方法であって、該方法は、以下：
第１のＰ−糖タンパク質による試験化合物の膜貫通輸送を測定する工程、
該第１のＰ−糖タンパク質および第２のＰ−糖タンパク質による該試験化合物の膜貫通輸送を比較し、該試験化合物のバイオアベイラビリティを予測する工程であって、ここで、該第１のＰ−糖タンパク質および該第２のＰ−糖タンパク質による相対的な輸送量または輸送速度は、該試験化合物のバイオアベイラビリティを予測する、工程、
を包含する、方法。
（項目３０）  前記第１のＰ−糖タンパク質が、イヌＰ−糖タンパク質および霊長類Ｐ−糖タンパク質からなる群より選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）  前記第１のＰ−糖タンパク質が、項目１４〜１７に記載のポリペプチドである、項目２９に記載の方法。
（項目３２）  前記第２のＰ−糖タンパク質が、ヒトＰ−糖タンパク質である、項目２９に記載の方法。
（項目３３）  哺乳動物細胞中のＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を阻害する方法であって、該方法は、該哺乳動物細胞を、該哺乳動物細胞におけるＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を阻害するに有効な量の項目２７に記載の因子と接触させる工程を包含する、方法。
（項目３４）  被験体中の薬物のバイオアベイラビリティを増加する方法であって、該方法は、このような処置が必要な被験体に、薬物のバイオアベイラビリティを増加するに有効な量で項目２７に記載の因子を投与する工程を包含する、方法。
（項目３５）  インヒビターが前記薬物を投与する前に投与される、請求項３４に記載の方法。
（項目３６）  インヒビターが前記薬物と同時に投与される、項目３４に記載の方法。
（項目３７）  細胞中のＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を増加する方法であって、該方法は、該細胞を、項目１に記載の核酸分子および項目１８に記載の核酸分子からなる群より選択される分子と、該細胞におけるＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を増加するに有効な量で接触させる工程を包含する、方法。
（項目３８）  Ｐ−糖タンパク質トランスポーター活性と関連する疾患の処置において有用な薬理学的因子に関するリード化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
項目１４または１５に記載のＰ−糖タンパク質を含む、細胞または他の膜包囲空間を提供する工程；
該細胞または他の膜包囲空間を、候補薬理学的因子の非存在下でＰ−糖タンパク質トランスポーター活性の第１の量をもたらす条件下で、該候補薬理学的因子と接触させる工程；
該Ｐ−糖タンパク質トランスポーター活性に対する該薬理学的因子の効果の尺度として、Ｐ−糖タンパク質トランスポーター活性の第２の量を決定する工程であって、ここで、該第１の量よりも少ないＰ−糖タンパク質トランスポーター活性の第２の量は、該候補薬理学的因子がＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を減少する薬理学的因子に関するリード化合物であることを示し、そしてここで、該第１の量よりも多いＰ−糖タンパク質トランスポーター活性の第２の量は、該候補薬理学的因子がＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を増加する薬理学的因子に関するリード化合物であることを示す、工程、を包含する、方法。
（項目３９）  項目３８に記載の方法であって、該方法は、検出可能な化合物を前記細胞または他の膜包囲空間に負荷する工程であって、ここで該化合物は、前記Ｐ−糖タンパク質トランスポーター活性の尺度として検出される、工程、をさらに包含する、方法。
（項目４０）  Ｐ−糖タンパク質を選択的に結合する化合物を同定する方法であって、
項目１４または１５に記載のＰ−糖タンパク質を化合物と接触させる工程、
該化合物の該Ｐ−糖タンパク質への結合を決定する工程、を包含する、方法。
（項目４１）  前記Ｐ−糖タンパク質のＰ−糖タンパク質トランスポーター活性に対する前記化合物の効果を決定する工程をさらに包含する、項目４０に記載の方法。
（項目４２）  前記Ｐ−糖タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性に対する前記化合物の効果を決定する工程をさらに包含する、項目４０に記載の方法。
（項目４３）  Ｐ−糖タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性を決定する方法であって、該方法は、以下：
項目２１もしくは２２に記載の宿主細胞またはその膜画分を、試験薬物と接触させる工程、および
該Ｐ−糖タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性を測定する工程、を包含する、方法。
（項目４４）  前記ＡＴＰａｓｅ活性を測定する工程が、異なる時間に少なくとも２回実施される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）  Ｐ−糖タンパク質による化合物の膜貫通輸送を決定する方法であって、該方法は、以下：
項目２１もしくは２２に記載の宿主細胞またはその膜画分を、試験薬物と接触させる工程、および
頂端側から側底側の方向および側底側から頂端側の方向からなる群より選択される少なくとも１つの輸送方向の傾斜条件下において、該試験薬物の輸送を測定する工程、を包含する、方法。
（項目４６）  前記試験薬物の輸送を測定する工程が、異なる時間に少なくとも２回実施される、項目４５に記載の方法。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明の１つの局面に従って、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列をコードする
核酸分子、（ｂ）（ａ）の対立遺伝子改変体（ここで、この対立遺伝子改変体は
、配列番号３および配列番号５を除く）、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相
補体からなる群より選択される単離された核酸分子が提供される。好ましい対立
遺伝子改変体は、配列番号２３、配列番号２５および配列番号２７からなる群よ
り選択されるアミノ酸配列をコードする核酸分子、詳細には、配列番号２２、配
列番号２４および配列番号２６からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含
む。好ましい実施形態において、この単離された核酸分子は、配列番号２をコー
ドするか、または配列番号１のヌクレオチド配列を含む。特に好ましい実施形態
において、この核酸分子は、上記のヌクレオチドのコード領域を含むか、あるい
はこれらからなる。
【０００７】
本発明の他の局面に従って、単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたは
そのフラグメントが提供される。このポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２
５、１９２、１９７、２１２、２８８、３２９、５３２、６９６、１２７３およ
び１３５５；配列番号２３のアミノ酸２５；ならびに配列番号２５のアミノ酸２
５および１１４８からなる群より選択されるイヌＰ−糖タンパク質の少なくとも
１つのアミノ酸を含む。他の単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそ
のフラグメントは、配列番号２のアミノ酸３、６、８、１０、１２、１４〜２６
、３６、３８、４８、５２、５６、６４、７４、７８、８４〜９２、９４、９６
、９８、９９、１０１、１０３、１０４、１０６、１０８、１１２、１１５、１
４７、１８７、１９７、１９９、２３３、２８８、３２１、３２６、３４７、３
９７、４５０、４５４、４５５、４６７、４７２、５２０、６３３、６３７、６
４３、６４４、６５０、６５７、６５８、６６１、６６６、６６７、６７４〜６
７７、６７９、６８５、６８９、６９１、６９３、６９４、７０３、７０７、７
１７、７３１、７３６、７４０、７４４、７４５、７５６、７５９、７６３、８
５３、９１４、９２０、９４２、９４３、９４６、９６８〜９７０、９７２、９
７４、９８３、１００５、１０１０、１０１７、１０２５、１０２６、１０２９
、１０４０、１０９５、１０９８、１１０５、１１４４、１１４８、１１４９、
１１５８、１１６２、１１６５、１１６８、１１７０、１２５２および１２７９
；ならびに配列番号２７のアミノ酸３２９からなる群より選択されるイヌＰ−糖
タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸（ここで、Ｐ−糖タンパク質は、イヌＰ
−糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を除いて、ヒトＰ−糖タンパク質に
同一である）を含む。特定の実施形態において、ヒトＰ−糖タンパク質は、配列
番号７および配列番号８の群から選択される。さらに他の単離されたＰ−糖タン
パク質ポリペプチドまたはそのフラグメントは、カニクイザルＰ−糖タンパク質
とは異なるイヌＰ−糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸（ここで、このＰ
−糖タンパク質は、イヌＰ−糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸以外はカ
ニクイザルＰ−糖タンパク質に同一である）を含む。さらに他のポリペプチドは
、上記のイヌＰＧＰポリペプチド、ヒトＰＧＰポリペプチドおよびカニクイザル
ＰＧＰポリペプチドの組み合わせを含む。好ましい実施形態において、この単離
されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号２、
配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２のフラグメント、配列
番号２３のフラグメント、配列番号２５のフラグメント、および配列番号２７の
フラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【０００８】
本発明のさらに他の実施形態に従って、上記の単離されたＰ−糖タンパク質ポ
リペプチドまたはそのフラグメントをコードする単離された核酸分子が提供され
る。さらに、プロモーターに作動可能に連結された上記の単離された核酸分子を
含む発現ベクター、ならびにこの発現ベクターを用いて形質転換されたかまたは
トランスフェクトされた宿主細胞が含まれる。
【０００９】
本発明の別の局面において、単離されたＰＧＰポリペプチドを選択的に結合す
る因子が、提供される。好ましくは、この因子は、本明細書中に提供されるもの
以外はヒトＰ−糖タンパク質またはイヌＰ−糖タンパク質を結合しない。特定の
実施形態において、この因子は、ポリペプチド、好ましくはモノクローナル抗体
、ポリクローナル抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）2抗体フラグメン
トおよびＣＤＲ３領域を含む抗体フラグメントからなる群より選択されるもので
ある。上記の単離された核酸分子に選択的に結合する因子、好ましくは単離され
た核酸分子を選択的に結合するアンチセンス核酸分子がまた提供される。
【００１０】
本発明の別の局面に従って、化合物のバイオアベイラビリティを予測する方法
が提供される。この方法は、第１のＰ−糖タンパク質による試験化合物の膜貫通
輸送を測定する工程、この第１のＰ−糖タンパク質および第２のＰ−糖タンパク
質によるこの試験化合物の膜貫通輸送を比較し、この試験化合物のバイオアベイ
ラビリティを予測する工程であって、ここで、第１のＰ−糖タンパク質および第
２のＰ−糖タンパク質による相対的な輸送量または輸送速度は、この試験化合物
のバイオアベイラビリティを予測する、工程、を包含する。特定の実施形態にお
いて、第１のＰ−糖タンパク質は、イヌＰ−糖タンパク質および霊長類Ｐ−糖タ
ンパク質からなる群より選択され、好ましくは上記のポリペプチドのうちの１つ
である。他の実施形態において、この第２のＰ−糖タンパク質は、ヒトＰ−糖タ
ンパク質である。
【００１１】
本発明のさらに他の局面において、哺乳動物細胞においてＰ−糖タンパク質ト
ランスポーター活性を阻害する方法が、提供される。この方法は、哺乳動物細胞
を、この哺乳動物細胞におけるＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を阻害す
るのに有効な量の上記因子のうちの１つと接触させる工程を包含する。
【００１２】
被験体中の薬物のバイオアベイラビリティを増加するための方法がまた、本発
明に含まれる。この方法は、そのような処置が必要な被験体に、薬物のバイオア
ベイラビリティを増加するのに有効な量で上記因子のうちの１つを投与する工程
を包含する。このインヒビターは、この薬物を投与する前またはこの薬物と同時
に投与され得る。
【００１３】
細胞中のＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を増加する方法もまた、提供
される。この方法は、この細胞を、上記核酸分子からなる群より選択される分子
と、この細胞におけるＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を増加するに有効
な量で接触させる工程を包含する。この細胞は、Ｐ−糖タンパク質が発現される
条件下で接触され得る。
【００１４】
本発明のなお別の局面に従って、Ｐ−糖タンパク質トランスポーター活性と関
連する疾患の処置において有用な薬理学的因子に関するリード化合物を同定する
方法が提供される。この方法は、本明細書中に提供されるようなＰ−糖タンパク
質を含む、細胞または他の膜包囲空間を提供する工程；この細胞または他の膜包
囲空間を、候補薬理学的因子の非存在下でＰ−糖タンパク質トランスポーター活
性の第１の量をもたらす条件下で、この候補薬理学的因子と接触させる工程；お
よび、Ｐ−糖タンパク質トランスポーター活性に対するこの薬理学的因子の効果
の尺度として、Ｐ−糖タンパク質トランスポーター活性の第２の量を決定する工
程であって、ここで、第１の量よりも少ないＰ−糖タンパク質トランスポーター
活性の第２の量は、候補薬理学的因子がＰ−糖タンパク質トランスポーター活性
を減少する薬理学的因子に関するリード化合物であることを示し、そしてここで
、第１の量よりも多いＰ−糖タンパク質トランスポーター活性の第２の量は、候
補薬理学的因子がＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を増加する薬理学的因
子に関するリード化合物であることを示す工程、を包含する。この方法は、検出
可能な化合物でこの細胞または他の膜包囲空間を負荷する工程であって、ここで
、この化合物は、Ｐ−糖タンパク質トランスポーター活性の尺度として検出され
る工程をさらに包含し得る。
【００１５】
Ｐ−糖タンパク質を選択的に結合する化合物を同定する方法もまた、含まれる
。この方法は、本明細書中に提供されるＰ−糖タンパク質を化合物と接触させる
工程、およびこの化合物のＰ−糖タンパク質への結合を決定する工程を包含する
。この方法は、このＰ−糖タンパク質のＰ−糖タンパク質トランスポーター活性
に対する化合物の効果を決定する工程、またはこのＰ−糖タンパク質のＡＴＰａ
ｓｅ活性に対する化合物の効果を決定する工程をさらに包含し得る。
【００１６】
本発明に従って提供されるさらなる方法は、Ｐ−糖タンパク質のＡＴＰａｓｅ
活性を決定する方法を含む。この方法は、上記に提供されるような宿主細胞また
はその膜画分を、試験薬物と接触させる工程、およびこのＰ−糖タンパク質のＡ
ＴＰａｓｅ活性を測定する工程を包含する。特定の実施形態において、このＡＴ
Ｐａｓｅ活性を測定する工程は、異なる時間に少なくとも２回実施される。Ｐ−
糖タンパク質による化合物の膜貫通輸送を決定する方法もまた、提供される。こ
の方法は、上記に提供される宿主細胞またはその膜画分を、試験薬物と接触させ
る工程、および頂端側（ａｐｉｃａｌ）から側底側（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ）
の方向および側底側から頂端側の方向からなる群より選択される少なくとも１つ
の輸送方向の傾斜（ｓｉｎｋ）条件下において、試験薬物の輸送を測定する工程
を包含する。特定の実施形態において、この試験薬物の輸送を測定する工程は、
異なる時間に少なくとも２回実施される。
【００１７】
本発明のこれらおよび他の局面は、より詳細に以下に記載される。
【００１８】
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、イヌＰ−糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列（遺伝子
型Ｃ）である。
【００１９】
配列番号２は、配列番号１によってコードされるイヌＰ−糖タンパク質のアミ
ノ酸配列である。
【００２０】
配列番号３は、先行分野のイヌＰ−糖タンパク質をコードするヌクレオチド配
列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０４５０１６）である。
【００２１】
配列番号４は、配列番号３によってコードされるイヌＰ−糖タンパク質のアミ
ノ酸配列である。
【００２２】
配列番号５は、別の先行分野のイヌＰ−糖タンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０９２８１０）である。
【００２３】
配列番号６は、配列番号５によってコードされるイヌＰ−糖タンパク質のアミ
ノ酸配列である。
【００２４】
配列番号７は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１４７５８を有する、先行分野のヒ
トＰ−糖タンパク質のアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号８は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０１６５３５またはＮＭ＿０００
９２７を有する第２の先行分野のヒトＰ−糖タンパク質のアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号９は、ヒトＰＧＰ１に対して相同性のＰＣＲプライマーのヌクレオチ
ド配列である。
【００２７】
配列番号１０は、イヌＰＧＰ２に対して相同性のＰＣＲプライマーのヌクレオ
チド配列である。
【００２８】
配列番号１１は、イヌＰＧＰ１に対して相同性のＰＣＲプライマーのヌクレオ
チド配列である。
【００２９】
配列番号１２は、ヒトＰＧＰ１に対して相同性のＰＣＲプライマーのヌクレオ
チド配列である。
【００３０】
配列番号１３は、イヌＰＧＰ１に対して相同性のＰＣＲプライマーのヌクレオ
チド配列である。
【００３１】
配列番号１４は、ヒトＰＧＰ１に対して相同性のＰＣＲプライマーのヌクレオ
チド配列である。
【００３２】
配列番号１５は、イヌＰＧＰ１に対して相同性のＰＣＲプライマーのヌクレオ
チド配列である。
【００３３】
配列番号１６は、ヒトＰＧＰ１に対して相同性のＰＣＲプライマーのヌクレオ
チド配列である。
【００３４】
配列番号１７は、イヌＰＧＰ１に対して相同性のＰＣＲプライマーのヌクレオ
チド配列である。
【００３５】
配列番号１８は、ベクターに対して相同性のＰＣＲプライマーのヌクレオチド
配列である。
【００３６】
配列番号１９は、イヌＰＧＰ１に対して相同性のＰＣＲプライマーのヌクレオ
チド配列である。
【００３７】
配列番号２０は、ヒトＰＧＰ１に対して相同性のＰＣＲプライマーのヌクレオ
チド配列である。
【００３８】
配列番号２１は、イヌＰＧＰ１に対して相同性のＰＣＲプライマーのヌクレオ
チド配列である。
【００３９】
配列番号２２は、イヌＰ−糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列（遺伝
子型Ａ）である。
【００４０】
配列番号２３は、配列番号２２によってコードされるイヌＰ−糖タンパク質の
アミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号２４は、イヌＰ−糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列（遺伝
子型Ｂ）である。
【００４２】
配列番号２５は、配列番号２４によってコードされるイヌＰ−糖タンパク質の
アミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号２６は、イヌＰ−糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列（遺伝
子型Ｄ）である。
【００４４】
配列番号２７は、配列番号２５によってコードされるイヌＰ−糖タンパク質の
アミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号２８は、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ増幅キットからのｃＤＮＡ合成
プライマーのヌクレオチド配列である。
【００４６】
配列番号２９は、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ増幅キットからのｃＤＮＡアダ
プタープライマー１のヌクレオチド配列である。
【００４７】
配列番号３０は、イヌＰＧＰ１に対して相同性のＰＣＲプライマーのヌクレオ
チド配列である。
【００４８】
配列番号３１は、イヌＰＧＰ１に対して相同性のＰＣＲプライマーのヌクレオ
チド配列である。
【００４９】
配列番号３２は、イヌＰＧＰ１に対して相同性のＰＣＲプライマーのヌクレオ
チド配列である。
【００５０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、１つの局面において、イヌのＰ−糖タンパク質（本明細書中でイヌ
ＰＧＰという）をコードする新規のｃＤＮＡの同定を含む。イヌＰＧＰ（「遺伝
子型Ｃ」と称する）のヌクレオチド配列は、配列番号１として示され、そしてこ
のイヌＰＧＰのアミノ酸配列は、配列番号２として示される。
【００５１】
遺伝子型ＣのイヌＰＧＰの３つの対立遺伝子改変体が単離された（「遺伝子型
Ａ」「遺伝子型Ｂ」および「遺伝子型Ｄ」）。遺伝子型Ａのヌクレオチド配列お
よびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２０および２１として示される。遺伝子
型Ａのアミノ酸配列は、配列番号２のヌクレオチド６０７でのＣ→Ａ変化に基づ
くアミノ酸１９７（ヒスチジン→グルタミン）において、遺伝子型Ｃのアミノ酸
配列と異なる。遺伝子型Ｂのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ
配列番号２２および２３として示される。遺伝子型Ｂのアミノ酸配列は、配列番
号２のヌクレオチド９１でのＴ→Ａ変化に基づくアミノ酸２５（アスパラギン→
ロイシン）において、およびに配列番号２のヌクレオチド６０７でのＴ→Ａ変化
に基づくアミノ酸１９７（ヒスチジン→グルタミン）において、遺伝子型Ｃのア
ミノ酸配列と異なる。遺伝子型Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、そ
れぞれ配列番号２０および２１として示される。遺伝子型Ｄのヌクレオチド配列
およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２４および２５として示される。遺伝
子型Ｄのアミノ酸配列は、配列番号２のヌクレオチド９１でのＣ→Ａ変化に基づ
くアミノ酸２５（アスパラギン→リジン）において、配列番号２のヌクレオチド
６０７でのＣ→Ａ変化に基づくアミノ酸１９７（ヒスチジン→グルタミン）にお
いて、配列番号２のヌクレオチド１００１でのＣ→Ａ変化に基づくアミノ酸３２
９（セリン→スレオニン）において、配列番号２のヌクレオチド３４５８でのＣ
→Ａ変化に基づくアミノ酸１１４８（メチオニン→バリン）において、遺伝子型
Ｃのアミノ酸配列と異なる。
【００５２】
密接に関連した２つのヒトＰＧＰ配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番
号ＡＦ０４５０１６（完全ｃＤＮＡ）およびＡＦ０９２８１０（部分ｃＤＮＡ）
として寄託された。本明細書中に示されるポリペプチドのほとんどが公知のイヌ
ＰＧＰに同一であるが、本発明のイヌＰＧＰ（配列番号２、配列番号２１、配列
番号２３および配列番号２５）は、先行技術の配列とは異なり、少なくとも１つ
の欠失を含む。Ｐ−糖タンパク質の非常に高度に保存されたタンパク質ドメイン
におけるこれらの対立遺伝子の差異は、全く予想されない。
【００５３】
本発明は、１つの局面において、イヌＰＧＰ核酸およびポリペプチド、ならび
にこれらに関する治療を含む。本発明はまた、前述の核酸およびポリペプチド；
前述の核酸の相補体；および前述の核酸およびポリペプチドに選択的に結合する
分子の、単離された機能的に等価な改変体、有用なアナログおよびフラグメント
を含む。
【００５４】
本発明のイヌＰＧＰ核酸およびポリペプチドは単離される。本明細書中で核酸
に関して使用される場合、用語「単離された（される）」は：（ｉ）例えば、ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってインビトロで増幅された（される）；（
ｉｉ）クローニングによって組換え的に産生された（される）；（ｉｉｉ）切断
およびゲル分離によるように精製された（される）；または（ｉｖ）例えば、化
学合成によって合成された（される）、ことを意味する。単離された核酸は、当
該分野において周知の組換えＤＮＡ技術によって容易に操作可能であるものであ
る。従って、５’制限部位および３’制限部位が公知であるベクターまたはポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が開示されたベクターに含まれるヌ
クレオチド配列は、単離されたと認識されるが、その天然の宿主中にそのネイテ
ィブな状態で存在する核酸配列は、単離されたと認識されない。単離された核酸
は、実質的に精製され得るが、実質的に精製される必要はない。例えば、クロー
ニングベクターまたは発現ベクター内に単離された核酸は、その核酸の存在する
細胞中にその物質のほんの少しのパーセントを含み得るという点で純粋ではない
。しかし、この用語が本明細書中で使用される場合、このような核酸は、単離さ
れた（される）である。なぜなら、当業者に公知の標準技術によって容易に操作
可能であるからである。本明細書中で使用される場合、単離された核酸は、天然
に存在する染色体ではない。
【００５５】
ポリペプチドに関して本明細書中で使用される場合、「単離された（される）
」は、そのネイティブの環境から分離され、そしてその同定または使用を可能に
するに十分な量で存在することを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関
していわれる場合、単離された（される）は、例えば：（ｉ）発現クローニング
によって選択的に産生された（される）、または（ｉｉ）クロマトグラフィーま
たは電気泳動によるように精製された（される）、ことを意味する。単離された
タンパク質またはポリペプチドは、実質的に純粋であり得るが、実質的に純粋で
ある必要はない。用語「実質的に純粋」は、タンパク質またはポリペプチドが、
その意図された使用に実用的および適切である範囲で、天然にかまたはインビボ
の系で見出され得る他の物質が本質的にないことを意味する。実質的に純粋なポ
リペプチドは、当該分野において周知の技術によって産生され得る。単離された
タンパク質は薬学的調製物中に薬学的に受容可能なキャリアと混合され得るので
、タンパク質は、調製物の少ない重量％のみを含み得る。にもかかわらず、タン
パク質は、生存系において関与し得る物質から分離された（すなわち、他のタン
パク質から単離された）という点で、単離された（される）である。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、イヌＰＧＰ核酸は、単離された核酸分子をいう
。これは、イヌＰＧＰポリペプチドをコードする。このような核酸分子は、配列
番号２、配列番号２３、配列番号２５および配列番号２７ならびにこれらのフラ
グメントのアミノ酸配列を含む、イヌＰＧＰポリペプチドをコードする。核酸分
子は、配列番号１のヌクレオチド配列、ならびに、遺伝コードの縮重に起因する
コドン配列において配列番号１の配列とは異なるヌクレオチド配列を含む。本発
明のイヌＰＧＰ核酸はまた、前述の核酸（配列番号２２、２４、２６）の対立遺
伝子（以前から公知のイヌＰＧＰ対立遺伝子（例えば、配列番号３および５）の
核酸配列を除く）、およびコードされたポリペプチドの対立遺伝子、ならびに前
述の核酸およびポリペプチドのフラグメントの対立遺伝子を含む。このようなフ
ラグメントは、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとし
て、および、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして、使用
され得る。好ましいイヌＰＧＰ核酸は、配列番号１、配列番号２２、配列番号２
４、配列番号２６およびこれらのフラグメントの核酸配列を含む。前述の核酸の
相補体はまた、本発明によって含まれる。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「イヌＰＧＰ活性」は、細胞膜を横切って低分
子を運び出すＰＧＰポリペプチドの能力をいう。イヌＰＧＰ活性を阻害する分子
（アンタゴニスト）は、ＰＧＰを介して低分子の運び出しを阻害するものであり
、そしてイヌＰＧＰ活性を増加する分子（アゴニスト）は、ＰＧＰを介して低分
子の運び出しを増加するものである。イヌＰＧＰ活性における変化は、細胞から
の蛍光化合物の流出を含む、本明細書中に記載されるようなアッセイによって測
定され得る。
【００５８】
本発明のイヌＰＧＰ核酸の対立遺伝子は、慣用的な技術によって同定され得る
。例えば、イヌＰＧＰの対立遺伝子は、ｃＤＮＡライブラリーとストリンジェン
トな条件下で、配列番号１のフラグメントを少なくとも含むプローブをハイブリ
ダイズすること、および陽性クローンを選択することによって単離され得る。従
って、本発明の１つの局面は、イヌＰＧＰポリペプチドをコードする核酸配列お
よびストリンジェントな条件下で配列番号１からなる核酸分子にハイブリダイズ
する（以前から公知のイヌＰＧＰ対立遺伝子（例えば、配列番号３および５）の
核酸配列を除く）核酸配列である。本明細書中で使用される場合、用語「ストリ
ンジェントな条件」は、当業者が精通するパラメーターをいう。核酸ハイブリダ
イゼーションパラメーターは、このような方法を編集する参考文献中（例えば、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａ
ｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏ
ｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏ
ｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９、または、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編
、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出され得
る。より特定には、本明細書中で使用される場合、ストリンジェントな条件は、
例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％  Ｆｉｃ
ｏｌｌ、０．０２％  ポリビニルピロリドン、０．０２％  ウシ血清アルブミン
、２．５ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７）、０．５％  ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ
）中で６５℃でのハイブリダイゼーションをいう。ＳＳＣは、０．１５Ｍ  塩化
ナトリウム／０．１５Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７）であり；ＳＤＳは、ド
デシル硫酸ナトリウムであり；およびＥＤＴＡは、エチレンジアミン３酢酸であ
る。ハイブリダイゼーション後、その上にＤＮＡが転写される膜は、２×ＳＳＣ
で室温にて洗浄され、次いで、室温〜６８℃までの０．１〜０．５×ＳＳＣ／０
．１×ＳＤＳで洗浄される。
【００５９】
同程度のストリンジェンシーを生じる、使用され得る他の条件、試薬、などが
存在する。当業者は、このような条件に精通しており、従って、本明細書中で示
されない。しかし、当業者が、これらの条件を、本発明のイヌＰＧＰ核酸の対立
遺伝子の明瞭な同定を可能にする様式で操作し得ることは明白である。当業者は
また、このような分子の発現のための細胞およびライブラリーのスクリーニング
、次いで慣用的な単離、引き続く適切な核酸分子の単離および配列決定について
の方法論に精通している。
【００６０】
イヌＰＧＰ核酸についてのスクリーニングにおいて、サザンブロットは、放射
活性なプローブとともに前述のストリンジェントな条件を使用して実施され得る
。ＤＮＡが最終的に転写された膜の洗浄後に、この膜は、放射活性なシグナルを
検出するためにＸ線フィルムに対して置かれ得る。
【００６１】
本発明のイヌＰＧＰ核酸はまた、ネイティブな物質中に存在する核酸に対して
代替的なコドンを含む縮重核酸を含む。例えば、セリン残基は、コドンＴＣＡ、
ＡＧＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴおよびＡＧＣによってコードされる。これら６
つのコドンの各々は、セリン残基をコードする目的について等価である。従って
、セリンをコードするヌクレオチドトリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）のいずれも
が、伸長するイヌＰＧＰポリペプチドにセリン残基を組み込むための、インビト
ロまたはインビボでタンパク質合成装置を指向するために使用され得ることが、
当業者に明白である。同様に、他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列
トリプレットとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＣＣＡ、ＣＣ
Ｃ、ＣＣＧおよびＣＣＴ（プロリンコドン）；ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ
、ＡＧＡおよびＡＧＧ（アルギニンコドン）；ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧおよびＡ
ＣＴ（スレオニンコドン）；ＡＡＣおよびＡＡＴ（アルギニンコドン）；ならび
にＡＴＡ、ＡＴＣおよびＡＴＴ（イソロイシンコドン）。他のアミノ酸残基は、
多様なヌクレオチド配列によって同様にコードされ得る。従って、本発明は、遺
伝コードの縮重に起因するコドン配列において、生物学的に単離された核酸とは
異なる縮重核酸を含む。
【００６２】
本発明はまた、改変された核酸分子を提供する。これは、１つ以上のヌクレオ
チドの付加、置換および欠失を含む。好ましい実施形態において、これらの改変
された核酸分子および／またはこれら核酸分子がコードするポリペプチドは、改
変されなかった核酸分子および／またはポリペプチドの少なくとも１つの活性ま
たは機能（例えば、トランスポーター活性など）を保持する。特定の実施形態に
おいて、改変された核酸分子は、改変されたポリペプチド、好ましくは、本明細
書中の他の場所で記載されるような保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドを
コードする。改変された核酸分子は、改変されない核酸分子に構造的に関し、好
ましい実施形態において、改変されない核酸分子に十分に構造的に関し、その結
果、改変された核酸分子および改変されない核酸分子は、当業者に公知のストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００６３】
例えば、単一のアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする改変された核
酸分子は、調製され得る。これらの核酸分子の各々は、本明細書中で記載される
ような遺伝コードの縮重に対応するヌクレオチド変化を除いて、１、２または３
ヌクレオチド置換を有し得る。同様に、２アミノ酸変化を有するポリペプチドを
コードする改変された核酸分子は、例えば２〜６ヌクレオチド変化を有して調製
され得る。これらのような多数改変された核酸分子は、当業者によって容易に想
像され、例えば、アミノ酸２および３、２および４、２および５、２および６な
どをコードするコドン中のヌクレオチド置換を含む。前述の例において、２アミ
ノ酸の各組合せは、改変された核酸分子ならびにアミノ酸置換をコードする全て
のヌクレオチド置換のセット中に含まれる。さらなる置換（すなわち、３以上）
、付加、または欠失（例えば、停止コドンもしくはスプライシング部位の導入に
よって）を有するポリペプチドをコードするさらなる核酸分子はまた、調製され
得、そして当業者によって容易に想像されるように本発明によって含まれる。前
述の核酸またはポリペプチドのいずれもが、本明細書中に開示される核酸および
／またはポリペプチドに対する構造的な関係または活性の保持について、慣用的
な実験によって試験され得る。
【００６４】
本発明はまた、配列番号１の単離されたフラグメントを提供する。これらのフ
ラグメントは、このような核酸を同定するためのサザンブロット分析におけるプ
ローブとして使用され得るか、またはこれらを利用するＰＣＲのような増幅アッ
セイにおいて使用され得る。より小さいフラグメントは、１２、１３、１４、１
５、１６、１７、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０または７５および
これらの間の全ての整数のヌクレオチドを含むフラグメントであり、例えば、核
酸増幅手順についてのプライマーとして有用である。当業者に公知であるように
、２００、２５０、３００、４００以上のヌクレオチドのような大きいプローブ
は、サザンブロットのような特定の使用に好ましいが、小さいフラグメントは、
ＰＣＲのような使用に好ましい。フラグメントはまた、抗体を作製するためかま
たはポリペプチドフラグメントの結合を決定するための融合タンパク質を産生す
るために使用され得る。同様に、フラグメントは、例えば、抗体の調製、免疫ア
ッセイなどにおいて有用な、イヌＰＧＰポリペプチドの融合されないフラグメン
トを産生するために利用され得る。前述の核酸フラグメントはさらに、イヌＰＧ
Ｐ核酸およびポリペプチドの発現を阻害するためのアンチセンス分子として、以
下により詳細に記載されるように、特に治療目的に使用され得る。
【００６５】
本発明はまた、イヌＰＧＰの機能的に等価な改変体を含む。これは、イヌＰＧ
Ｐの１以上の機能的な特性を残す改変体核酸およびポリペプチドを含む。例えば
、改変体は、分子を輸送する能力を保持するイヌＰＧＰの細胞外ドメインおよび
膜貫通ドメインを含む融合タンパク質を含む。なお他の機能的に等価な改変体は
、配列番号１の配列に対するアミノ酸の短縮、欠失、点変異または付加を含み（
例えば、本明細書中に示される対立遺伝子）、これらは、配列番号２の機能を保
持する。機能的に等価な改変体はまた、除去されたかまたは別のＰ−糖タンパク
質からの同様のドメインによって置換された、Ｎ末端の一部を有するイヌＰＧＰ
（例えば、「ドメイン交換（ｓｗａｐｐｉｎｇ）」改変体）を含む。他の機能的
に等価な改変体は、このような改変体を調製する方法と同様に、当業者に公知で
ある。機能的に等価な改変体の活性は、本明細書中および他の種のＰ−糖タンパ
ク質を使用するアッセイを記載した参考文献中に提供される方法を使用して決定
され得る。このような改変体は、イヌＰＧＰの輸送機能を結合および／または調
節する化合物の同定についてのアッセイにおいて、薬物のバイオアベイラビリテ
ィを評価するために、そして輸送活性が要求されるイヌＰＧＰの部分を決定する
ためにとりわけ有用である。
【００６６】
非機能的である改変体はまた、上記されるように調製され得る。このような改
変体は、例えば、トランスポーター活性を試験する実験におけるネガティブコン
トロールとして有用である。
【００６７】
１つの実施形態において、イヌＰＧＰ核酸は、真核生物細胞または原核生物細
胞内にイヌＰＧＰ核酸の発現を指向する遺伝子発現配列に作動可能に連結される
。「遺伝子発現配列」は、任意の調節核酸配列（例えば、プロモーター配列また
はプロモーター−エンハンサー組合わせ（これは、作動可能に連結されるイヌＰ
ＧＰ核酸の効果的な転写および翻訳を容易にする））である。遺伝子発現配列は
、例えば、哺乳動物またはウイルスのプロモーター（例えば、構成的プロモータ
ーまたは誘導性プロモーター）であり得る。構成的哺乳動物プロモーターとして
は、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヒポキサンチンホスホリボシル
トランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナー
ゼの遺伝子についてのプロモーター、β−アクチンプロモーターおよび他の構成
的プロモーター。真核生物細胞に構成的に機能するウイルスプロモーターの例示
としては、以下が挙げられる：例えば、シミアンウイルス、パピローマウイルス
、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サ
イトメガロウイルス、モロニーマウス白血病ウイルスおよび他のレトロウイルス
の長末端反復（ＬＴＲ）由来のプロモーター、および単純ヘルペスウイルスのチ
ミジンキナーゼプロモーター。他の構成的プロモーターは、当業者に公知である
。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターはまた、誘導性プロモータ
ーを含む。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現される。例えば、メタ
ロチオネインプロモーターは、特定の金属イオンの存在下で転写および翻訳を促
進するように誘導される。他の誘導性プロモーターは、当業者に公知である。
【００６８】
一般には、遺伝子発現配列は、必要ならば、それぞれ転写の開始および翻訳の
開始に関与する、５’非転写配列および５’非翻訳配列（例えば、ＴＡＴＡボッ
クス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列など）を含む。特に、このような５’非
転写配列は、作動可能に連結されたイヌＰＧＰ核酸の転写制御についてのプロモ
ーター配列を含むプロモーター領域を含む。遺伝子発現配列は、必要ならば、所
望されるようにエンハンサー配列または上流のアクチベーター配列を含む。
【００６９】
イヌＰＧＰ核酸配列および遺伝子発現配列は、これらが共有結合されてこの遺
伝子発現配列の影響下または制御下でイヌＰＧＰコード配列を転写および／また
は翻訳する方向に置かれる場合、「作動可能に連結される（された）」といわれ
る。イヌＰＧＰ配列が機能的タンパク質に翻訳されることが所望される場合、２
つのＤＮＡ配列は、５’遺伝子発現配列中のプロモーターの誘導がイヌＰＧＰ配
列の転写を生じる場合、および２つのＤＮＡ配列の間の連結の特性が以下ではな
い場合、作動可能に連結されるといわれる：（１）フレームシフト変異の導入を
生じる、（２）イヌＰＧＰ配列の転写を指向するプロモーター領域の能力を緩衝
する、または（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質中に翻訳される能力を緩
衝する。従って、遺伝子発現配列がイヌＰＧＰ核酸配列の転写を影響し得その結
果生じる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得る場合、遺
伝子発現配列は、イヌＰＧＰ核酸配列に作動可能に連結される。
【００７０】
本発明のイヌＰＧＰ核酸分子およびイヌＰＧＰポリペプチド（以下に記載され
るイヌＰＧＰインヒビターを含む）は、真核生物細胞または原核生物細胞に単独
でかまたはベクターと組合わせて送達され得る。その最も広い意味において、「
ベクター」は、以下を容易にし得る任意のビヒクルである：（１）標的細胞への
イヌＰＧＰ核酸またはポリペプチドの送達、（２）標的細胞によるイヌＰＧＰ核
酸またはポリペプチドの取り込み、または（３）標的細胞でのイヌＰＧＰ核酸分
子またはポリペプチドの発現。好ましくは、減少した分解を伴う、イヌＰＧＰ核
酸もしくはポリペプチドの標的細胞へのベクター輸送は、ベクターの非存在を生
じる分解の範囲に関する。必要ならば、「標的リガンド」は、ベクターに付着し
て、その標的リガンドに対する同属のレセプター（例えば、抗体によって認識さ
れるレセプター、抗原）をその表面上に発現する細胞に選択的にベクターを送達
し得る。この様式において、ベクター（イヌＰＧＰ核酸またはイヌＰＧＰポリペ
プチドを含む）は、特定の細胞に選択的に送達され得る。一般には、本発明にお
いて有用なベクターは、２つのクラスに分けられる：生物学的ベクターおよび化
学的／物理的ベクター。生物学的ベクターは、標的細胞へのイヌＰＧＰ核酸の送
達、標的細胞によるイヌＰＧＰ核酸の取り込みについてより有用である。化学的
／物理的ベクターは、標的細胞へのイヌＰＧＰ核酸またはイヌＰＧＰタンパク質
の送達、標的細胞によるイヌＰＧＰ核酸またはイヌＰＧＰタンパク質の取り込み
についてより有用である。
【００７１】
生物学的ベクターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：プラ
スミド、ファージミド、ウイルス、本発明の核酸配列の挿入または組み込みによ
って操作されたウイルスまたは細菌の供給源由来の他のビヒクル、および本発明
の核酸配列に連結され得る遊離核酸フラグメント。ウイルスベクターは、生物学
的ベクターの好ましい型であり、以下のウイルス由来の核酸配列を含むがこれら
に限定されない：モロニーマウス白血病ウイルスのようなレトロウイルス；Ｈａ
ｒｖｅｙマウス肉腫ウイルス；マウス哺乳動物腫瘍ウイルス；ラウス肉腫ウイル
ス；アデノウイルス；アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウ
イルス；ポックスウイルス；レトロウイルス；エプスタイン−バーウイルス；パ
ピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；およびポリオウイ
ルス。当該分野において名前はないが公知である他のベクターは、容易に利用さ
れ得る。
【００７２】
好ましいウイルスベクターは、必須ではない遺伝子が目的の遺伝子と置換され
ている、非細胞傷害性真核生物ウイルスベースである。非細胞傷害性ウイルスは
、レトロウイルスを含み、このウイルスの生活環は、引き続くプロウイルスの宿
主細胞のＤＮＡへの組み込みを有する、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転
写を含む。一般には、レトロウイルスは、複製欠損（すなわち、所望のタンパク
質の合成を指向し得るが、感染性粒子を製造し得ない）である。このような遺伝
的に変化されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボで高効率の遺伝子導入
について一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標
準的プロトコール（プラスミドへの外因性遺伝物質の組み込み工程、プラスミド
でのパッケージング細胞株のトランスフェクション工程、パッケージング細胞株
による組換えレトロウイルスの産生工程、組織培養培地からのウイルス粒子の回
収工程、およびウイルス粒子での標的細胞の感染工程を包含する）は、Ｋｒｉｅ
ｇｌｅｒ，Ｍ．，「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃ
．Ｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）およびＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．編、「Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第７巻、Ｈｕｍａｎ
ａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１
）に提供される。
【００７３】
特定の適用についての別の好ましいウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルスである
アデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損であるように操作
され得、そして広範な範囲の細胞型および種を感染し得る。これは、利点（例え
ば、熱安定性および脂質溶媒安定性；多様な系統の細胞における高頻度の形質転
換；および複数の一連の形質転換を可能にする重複感染阻害の欠失）をさらに有
する。すでに報告されるように、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的様式でヒト
細胞性ＤＮＡ中に組み込まれ得、これにより、挿入性変異の可能性および挿入さ
れた遺伝子の発現の可変性を最小化し得る。さらに、野生型アデノ随伴ウイルス
感染は、選択的圧力の非存在下で１００パッセージを超える組織培養を継代した
。このことは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みは、比較的安定な事象であ
ることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外様式で機能し得る。
【００７４】
発現について必要な要素を全て含む発現ベクターは、市販されており、そして
当業者に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓ
ｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参
照のこと。細胞は、イヌＰＧＰポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改
変体をコードする異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）の細胞への形質導入によって遺伝的に操
作される。この異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）は、転写要素の作動可能な制御下に置かれ
、宿主細胞での異種ＤＮＡの発現を可能にする。
【００７５】
哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡ発現についての好ましい系は、ｐＲｃ／ＣＭＶ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）のような系であ
る。ｐＲｃ／ＣＭＶは、Ｇ４１８耐性を与える遺伝子のような選択マーカー（安
定にトランスフェクトされた細胞株の選択を容易にする）およびヒトサイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター配列を含む。さらに、ｐＣＥ
Ｐ４ベクターは（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、霊長類細胞株またはイヌ細胞株に
おける発現について適切である。これは、多コピーの染色体外要素としてプラス
ミドの維持を容易にする、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）複製起点を含む
。別の発現ベクターは、インビトロでの効率的な転写を刺激するポリペプチド延
長因子１αのプロモーターを含むｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドである。このプラス
ミドは、ＭｉｓｈｉｚｕｍａおよびＮａｇａｔａ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ
．１８：５３２２，１９９０）によって記載され、トランスフェクション実験に
おけるその使用は、例えば、Ｄｅｍｏｕｌｉｎ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
１６：４７１０−４７１６，１９９６）によって開示される。なお別の好ましい
発現ベクターは、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔによって記載さ
れるアデノウイルスであり、Ｅ１タンパク質およびＥ３タンパク質を欠損する（
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０，１９９２）。
【００７６】
生物学的ベクターに加えて、化学的／物理的ベクターは、イヌＰＧＰ核酸また
はポリペプチドを標的細胞に送達してそれにより取り込みを容易にするために使
用され得る。本明細書中で使用される場合、「化学的／物理的ベクター」は、単
離されたイヌＰＧＰ核酸またはポリペプチドを細胞に送達し得る、細菌性供給源
またはウイルス性供給源由来の分子以外の天然の分子または合成分子をいう。
【００７７】
本発明の好ましい化学的／物理的ベクターは、膠様分散系である。膠様分散系
は、水中油乳濁液、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの
系を含む。本発明の好ましい膠様系は、リポソームである。リポソームは、イン
ビボまたはインビトロでの送達ベクターとして有用である人工膜ビヒクルである
。これは、サイズが０．２〜４．０μの範囲である巨大な多層状のビヒクル（Ｌ
ＵＶ）が巨大分子をカプセル化し得ることを示した。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびイン
タクトなビリオンは、水性の内部にカプセル化され得、そして生物学的に活性な
形態で細胞中に送達され得る（Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｓｃｉ．，第６巻第７７頁（１９８１））。リポソームが効果的な核酸輸送ベ
クターであるためには、１以上の以下の特性が存在すべきである：（１）生物学
的活性の保持を有する、目的の核酸の高効率でのカプセル化；（２）非標的細胞
に比べて、標的細胞に対する優先的および実質的な結合；（３）ビヒクルの水性
内容物の標的細胞細胞質への高効率での送達；ならびに（４）遺伝情報の正確か
つ効果的な発現。
【００７８】
リポソームは、特異的なリガンド（例えば、モノクローナル抗体、糖、糖脂質
、またはタンパク質）へのリポソームの連結によって特定の組織に標的化され得
る。特定の細胞へリポソームを標的化するために有用であり得るリガンドは、特
定の細胞型または組織型に依存する。さらに、ベクターが核酸をカプセル化する
場合、ベクターは、イヌＰＧＰ核酸を宿主細胞の核へ指向する核標的化ペプチド
と連結され得る。
【００７９】
リポソームは、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTMおよびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣ
ＥTMとしてＧｉｂｃｏ  ＢＲＬから市販される。これらは、Ｎ−［１−（２，３
ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロ
リド（ＤＯＴＭＡ）およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（Ｄ
ＤＡＢ）のようなカチオン性脂質で形成される。リポソームを作製するための方
法は、当該分野において公知であり、そして多くの刊行物に記載されている。
【００８０】
標的細胞によるイヌＰＧＰ核酸の取り込みを容易にするために使用され得る他
の例示的組成物としては、リン酸カルシウムおよび細胞内輸送の他の化学的メデ
ィエーター、マイクロインジェクション組成物、エレクトロポレーションならび
に（例えば、イヌＰＧＰ核酸を標的細胞染色体内の予め選択された位置に組み込
むための）相同組換え組成物が挙げられる。
【００８１】
本発明はまた、いわゆる発現キットを包含し、これは、技術者が所望の発現ベ
クターを調製することを可能にする。このような発現キットは、以前議論された
コード配列の少なくとも別個の部分を含む。必要とされる、以前に述べられた配
列が含まれる限り、所望の場合、他の成分が添加され得る。
【００８２】
本発明は、発現ベクターにおけるイヌのＰＧＰ  ｃＤＮＡ配列の使用、ならび
に宿主細胞および細胞株（これらは、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、また
は真核生物（例えば、ＣＯＳ細胞、酵母発現系および、昆虫細胞における組換え
バキュロウイルス発現）である）をトランスフェクトすることを包含することも
認識され得る。哺乳動物細胞（例えば、ヒト、ブタ、ヤギ、霊長類など）が、特
に有用である。それらは、広範な種々な組織型であり得、そして始原細胞および
細胞株を含む。特定の例としては、腸細胞および肝細胞が挙げられる。この発現
ベクターは、適切な配列（すなわち、前記されるそれらの核酸）が、プロモータ
ーに作動可能に連結されることを必要とする。
【００８３】
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列およびそれらのフラグメントを含む
、単離されたイヌのＰＧＰポリペプチド（これは、上記イヌのＰＧＰ核酸により
コードされる）を提供する。イヌのＰＧＰポリペプチドはまた、対立遺伝子（例
えば、配列番号２３、２５、および２７（配列番号３および５でないものを除く
）、機能的に等価な改変体およびアナログ（１、２、３、４、５、またはそれ以
上のアミノ酸により、開示されたイヌのＰＧＰポリペプチド由来のアミノ酸配列
において変化するそれらの非対立遺伝子ポリペプチド）を包含し、但し、このよ
うなポリペプチドは、イヌのＰＧＰ活性を保持する。非機能的改変体もまた、本
発明により包含され；これらは、輸送体機能のアンタゴニストとして、アッセイ
におけるネガティブコントロールとしてなどに有用である。このような対立遺伝
子、改変体、アナログおよびフラグメントは、アッセイの成分として含む種々の
目的のための、例えば、単独または融合タンパク質として有用である。
【００８４】
ポリペプチドのフラグメントは、好ましくは、イヌのＰＧＰポリペプチドの異
なる機能的能力、特に種々の分子の輸送体として保持するそれらのフラグメント
である。イヌのＰＧＰポリペプチドのフラグメントにおいて保持され得る他の機
能的能力としては、抗体との相互作用および他のポリペプチドとの相互作用（例
えば、タンパク質複合体において見出される）が挙げられる。当業者は、イヌの
ＰＧＰの機能的能力を保持するフラグメントを選択するための方法において十分
に精通する。このフラグメントの機能的能力の確認は、標準的な方法に従って、
フラグメントの合成および能力を試験することにより行われ得る。例えば、イヌ
のＰＧＰフラグメントの輸送体活性を試験するために、分子輸送体が、測定され
得る細胞において、フラグメントを挿入または発現する。当該分野において標準
的であるこのような方法が、本明細書中にさらに記載される。
【００８５】
本発明は、上記のイヌのＰＧＰポリペプチドの改変体を包含する。本明細書中
に記載されるように、イヌのＰＧＰポリペプチドの「改変体」は、イヌのＰＧＰ
ポリペプチドの主なアミノ酸配列に対する１つ以上の改変を含むポリペプチドで
ある。イヌのＰＧＰ改変体を作製する改変は、種々の理由のためにイヌのＰＧＰ
ポリペプチドに対して作製され得、これは以下を含む：１）イヌのＰＧＰポリペ
プチドの活性（例えば、輸送）を低減するかまたは除去すること；２）イヌのＰ
ＧＰポリペプチドの特性（例えば、発現系におけるタンパク質安定性またはタン
パク質−タンパク質結合の安定性）を増強すること；３）イヌのＰＧＰポリペプ
チドに対する新規の活性または特性（例えば、抗原エピトープの添加または検出
可能部分の添加）を提供すること；または４）アミノ酸置換が分子輸送体活性に
影響するかまたはしないことを確立すること、を含む。イヌのＰＧＰポリペプチ
ドに対する改変は、イヌのＰＧＰポリペプチドをコードする核酸に対して代表的
に作製され、そしてアミノ酸部分または非アミノ酸部分の欠失、点変異、短縮、
アミノ酸置換および付加が挙げられ得る。あるいは、改変は、例えば、切断、リ
ンカー分子の付加、検出可能部分の付加（例えば、ビオチン）、脂肪酸の付加な
どにより、ポリペプチドに直接作製され得る。改変はまた、イヌのＰＧＰアミノ
酸配列の全てまたは１部を含む融合タンパク質を含む。当業者は、タンパク質配
列における変化のタンパク質構造に関する効果を予測するための方法に精通し、
従って、公知の方法に従って、改変体イヌのＰＧＰを「設計」し得る。このよう
な方法の１つの例は、ＤａｈｉｙａｔおよびＭａｙｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８
：８２−８７，１９９７に記載され、これにより、タンパク質は、新規に設計さ
れ得る。方法は、ポリペプチド配列の１つの部分のみを変更するために公知のタ
ンパク質に適用され得る。ＤａｈｉｙａｔおよびＭａｙｏの計算方法を適用する
ことにより、イヌのＰＧＰポリペプチドの特異的な改変体が提案され、そして改
変体が所望の構造を保持するか否かを決定することが試験される。
【００８６】
改変体としては、その生理学的活性に関連しないポリペプチドの特徴を変更す
るために特に改変されるイヌのＰＧＰポリペプチドが挙げられる。例えば、シス
テイン残基は、所望しないジスルフィド結合を防ぐために置換され得るかまたは
欠失され得る。同様に、特定のアミノ酸は、発現系におけるプロテアーゼによる
タンパク質分解を除去することにより、イヌのＰＧＰポリペプチドの発現を増強
するために変化され得る（例えば、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母発
現系における二塩基性アミノ酸残基）。
【００８７】
イヌのＰＧＰポリペプチドをコードする核酸の変異は、コード配列のアミノ酸
リーディングフレームを好ましくは保存し、そして２次構造（例えば、ヘアピン
またはループ）を形成するためにハイブリダイズしそうな核酸における領域（こ
れは、改変体ポリペプチドの発現に対して有害であり得る）を好ましくは作製し
ない。
【００８８】
変異は、アミノ酸置換を選択することによるか、またはこのポリペプチドをコ
ードする核酸において選択される部位の無作為な変異誘発により作製され得る。
次いで、改変体ポリペプチドは、どの変異体が所望の特性を有する改変体ポリペ
プチドを提供するかを決定するために発現され、そして１つ以上の活性について
試験される。さらなる変異体が、ポリペプチドのアミノ酸配列に関してサイレン
トであるが、特定の宿主における翻訳のために好ましいコドンを提供する改変体
に対して（または、非改変体イヌのＰＧＰポリペプチド）に対して作製され得る
。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける核酸の翻訳のために好ましいコドンが、当業者
に周知である。なお他の変異が、このポリペプチドの発現を増強するためにイヌ
のＰＧＰ遺伝子またはｃＤＮＡクローンの非コード配列に対して作製され得る。
【００８９】
イヌのＰＧＰポリペプチドの改変体の活性は、改変体イヌのＰＧＰポリペプチ
ドをコードする遺伝子を、細菌または哺乳動物発現ベクターへクローニングし、
適切な宿主細胞中にこのベクターを導入し、改変体イヌのＰＧＰポリペプチドを
発現し、そして本明細書中に開示されるようなイヌのＰＧＰポリペプチドの機能
的能力について試験することにより、試験され得る。例えば、改変体イヌのＰＧ
Ｐポリペプチドは、以下の例に示されるように、分子輸送体（例えば、流出）を
提供する能力について試験され得る。他の改変体ポリペプチドの調製は、他の活
性の試験に好まれ得、これは当業者に公知である。
【００９０】
当業者はまた、保存的アミノ酸置換が、イヌのＰＧＰポリペプチドにおいて、
前述のポリペプチドの機能的に等価な改変体（すなわち、イヌのＰＧＰポリペプ
チドの機能的能力を保持する改変体）を提供するために作製され得ることを認識
する。本明細書中で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸置
換が作製されるポリペプチドに特徴的な、相対的な電荷または相対的なサイズを
変更しないアミノ酸置換をいう。改変体は、このような方法を集めた参考文献（
例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏａｒｔｏｒｙ  Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂ
ｅｌら、編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒ
ｋ）において見出されるような、当業者に公知のポリペプチド配列を変更するた
めの方法に従って、調製され得る。イヌのＰＧＰポリペプチドの例示的な機能的
に等価な改変体としては、配列番号２または配列番号４の保存的アミノ酸置換が
挙げられる。アミノ酸の保存的置換は、以下の群内のアミノ酸の中で作製される
置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（
ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００９１】
イヌのＰＧＰの機能的に等価な改変体を産生するためのイヌのＰＧＰポリペプ
チドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、代表的に、イヌのＰＧＰポ
リペプチドをコードする核酸配列（例えば、配列番号１）の変更により作製され
る。このような置換は、当業者に公知の種々の方法により作製され得る。例えば
、アミノ酸置換は、Ｋｕｎｋｅｌの方法（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４８８−４９２、１９８５）に従って、Ｐ
ＣＲ指向性変異、部位指向性変異誘発により、またはイヌのＰＧＰポリペプチド
をコードする遺伝子の化学合成により作製され得る。イヌのＰＧＰポリペプチド
の機能的に等価なフラグメントの活性が、化合物の膜貫通輸送を媒介するために
、変更されたイヌのＰＧＰポリペプチドをコードする遺伝子を、細菌性発現ベク
ターまたは哺乳動物発現ベクター中にクローニングし、このベクターを適切な宿
主細胞中に導入し、この変更されたイヌのＰＧＰポリペプチドを発現し、そして
イヌのＰＧＰポリペプチドの能力を試験することにより、試験され得る。化学的
に合成されるペプチドが、機能について直接試験され得る。
【００９２】
当業者に周知の種々の方法論が、単離されたイヌのＰＧＰ分子を得るために利
用され得る。ポリペプチドは、クロマトグラフィー手段または免疫学的認識によ
り、このポリペプチドを天然に産生する細胞から精製され得る。あるいは、発現
ベクターは、このポリペプチドの産生を引き起こすために細胞に導入され得る。
別の手段において、ｍＲＮＡ転写物が、コードされたポリペプチドの産生を引き
起こすために、細胞に微小注入されてもよいし、またはその他の手段で細胞導入
されてもよい。無細胞系抽出物（例えば、網状赤血球溶解産物系）におけるｍＲ
ＮＡの翻訳もまた、ポリペプチドを産生するために使用され得る。当業者はまた
、イヌのＰＧＰポリペプチドを単離するための公知の手段に容易に従い得る。こ
れらとしては、免疫クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィーおよび免疫親和性クロマトグラフィーが挙げ
られるがこれらに限定されない。
【００９３】
本明細書中に記載されるような発明は、多数の使用を有し、そのいくつかは、
その他で本明細書中に記載される。例えば、本発明は、例えば、標準的なプロト
コールを使用して単離され得る多量のポリペプチドを産生するための組換え核酸
の発現により、イヌのＰＧＰポリペプチド分子の単離を可能にする。別の例とし
て、イヌのＰＧＰ遺伝子の単離は、イヌのＰＧＰが、分子輸送のアッセイのため
の方法（例えば、薬物のバイオアベイラビリティ研究）において使用されること
を可能にする。これらの方法は、この薬物のバイオアベイラビリティを決定また
は予測するための方法として、最初の種のＰＧＰ（例えば、イヌ）による薬物の
輸送を、他の種のＰＧＰ（例えば、ヒト）による薬物の輸送に対する比較におい
て、決定することを含む。従って、薬物の代謝における動物研究全体の結果が、
薬物のＰ糖タンパク質輸送の、相対的速度または量の点で評価され得る。例えば
、イヌに投与される薬物が、優れた経口バイオアベイラビリティおよびイヌＰＧ
Ｐによる低い輸送を有する場合、ヒトＰＧＰによる輸送もまた低い場合に、ヒト
における薬物の経口バイオアベイラビリティは優れていることが予測され得る。
逆に、ヒトＰＧＰによる薬物の輸送が高い場合、次いで、薬物のバイオアベイラ
ビリティは、低いことが予測される。
【００９４】
本発明はまた、イヌのＰＧＰ核酸分子またはペプチドに選択的に結合する因子
ならびに本明細書中に記載されるようなポリペプチドおよび核酸の改変体および
フラグメントに結合する因子を包含する。この因子は、イヌのＰＧＰ、およびア
ンチセンス核酸に結合するポリペプチドを含み、この両方が、以下により詳細に
記載される。この因子は、イヌのＰＧＰ活性を阻害または増大し得る（それぞれ
、アンタゴニストおよびアゴニスト）。
【００９５】
この因子のいくつかは、インヒビターである。イヌのＰＧＰインヒビターは、
細胞膜を横切る分子のイヌのＰＧＰ媒介輸送を阻害する因子である。流出アッセ
イは、イヌのＰＧＰインヒビターが、イヌのＰＧＰ活性を阻害する能力を有する
か否か、およびこの阻害が選択的であるか否かを、スクリーニングおよび／また
は決定するために実施され得る。流出の例示的アッセイは、実施例において、以
下に記載される。
【００９６】
１つ実施形態において、イヌのＰＧＰインヒビターは、細胞におけるイヌのＰ
ＧＰ（または他の種のＰＧＰ）の発現を減少するために、イヌのＰＧＰ核酸分子
に選択的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。これは、実質的に
任意の医学的条件において所望され、ここで、ＰＧＰ輸送活性の減少は、例えば
、細胞における細胞傷害性因子の維持を増加するために所望される。
【００９７】
本明細書中に使用される場合、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」また
は「アンチセンス」は、生理学的条件下で、特定の遺伝子を含むＤＮＡまたはそ
の遺伝子のｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズし、そしてそれにより、その遺伝子
の転写および／またはそのｍＲＮＡの翻訳を阻害する、オリゴヌクレオチド、オ
リゴデオキシリボヌクレオチド、改変されたオリゴヌクレオチド、または改変さ
れたオリゴデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを記載する。こ
のアンチセンス分子が設計され、その結果、標的遺伝子または転写物とのハイブ
リダイゼーションに関して、標的遺伝子の転写または翻訳を仲介する。当業者は
、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドの正確な長さおよびその標的との相補性
のその程度は、選択された特定の標的に依存し、これは、この標的の配列および
その配列を含む特定の塩基を含むことを認識する。アンチセンスオリゴヌクレオ
チドが、構築されかつ配置され、その結果、生理学的条件下で、標的と選択的に
結合する（すなわち、生理学的条件下で、標的細胞における任意の他の配列に対
してより多く、標的配列に実質的にハイブリダイズすることが好ましい。配列番
号１、または対立遺伝子（配列番号３および５を除く）もしくはホモログゲノム
配列および／もしくはｃＤＮＡ配列に基づいて、当業者は、本発明に従って、使
用のために多数の適切なアンチセンス分子のいずれかを容易に選択し、かつ合成
し得る。阻害に関して、十分選択的であり、かつ強力であるために、このような
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、この標的に相補的である、少なくとも１０
、およびより好ましくは、少なくとも１５の保存的塩基を含むべきであるが、特
定の場合、７塩基長と同じくらい短い改変されたオリゴヌクレオチドが、アンチ
センスオリゴヌクレオチドとして首尾よく使用された（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎａｔ
ｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４０−８４４、１９９６）。最も好ま
しくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０〜３０塩基の相補的な配列を
含む。その遺伝子またはｍＲＮＡ転写物の任意の領域に対するアンチセンスであ
るオリゴヌクレオチドが選択され得るが、好ましい実施形態において、このアン
チセンスオリゴヌクレオチドは、Ｎ末端部位または５’上流部位（例えば、翻訳
開始部位、転写開始部位、またはプロモーター部位）に対応する。さらに、３’
非翻訳領域が、標的化され得る。ｍＲＮＡスプライシング部位に対する標的化も
また、当該分野において使用されていたが、代替のｍＲＮＡスプライシングが生
じる場合、あまり好まれ得ない。さらに、このアンチセンスは、好ましくは、ｍ
ＲＮＡ２次構造が期待されない部位（例えば、Ｓａｉｎｉｏら、Ｃｅｌｌ  Ｍｏ
ｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１４（５）：４３９−４５７、１９９４を参照のこと
）およびポリペプチドが結合することが期待されない部位に、好ましくは、標的
化される。従って、本発明はまた、配列番号１を含むイヌのＰＧＰ核酸に対応す
る対立遺伝子（配列番号３および５を除く）または相同なｃＤＮＡおよびゲノム
ＤＮＡに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた提供する。
【００９８】
実施形態の１つの組において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
「天然の」デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組
み合わせからなり得る。つまり、あるネイティブなヌクレオチドの５’末端およ
び別のネイティブなヌクレオチドの３’末端が、ホスホジエステルヌクレオシド
内連結を介して、天然の系として共有結合され得る。これらのオリゴヌクレオチ
ドは、手動または自動合成により実施され得る、当該分野で認識される方法によ
り、調製され得る。それらはまた、ベクターにより、組換え的に産生され得る。
【００９９】
しかし、好ましい実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドはまた、「改変された」オリゴヌクレオチドを含み得る。つまり、このオリゴ
ヌクレオチドは、これらが、これらの標的にハイブリダイズすることを妨げない
が、それらの安定性または標的化を増強するか、またはその他に、それらの治療
的有効性を増強する多数の方法で改変され得る。
【０１００】
本明細書中で使用される場合、用語「改変されたオリゴヌクレオチド」は、（
１）そのヌクレオチドの少なくとも２つが、合成ヌクレオシド内連結（すなわち
、１つのヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチドの３’末端との間のホスホ
ジエステル連結以外の連結）を介して共有結合され、そして／または（２）核酸
と通常会合しない化学基が、このオリゴヌクレオチドに共有結合されたオリゴヌ
クレオチドを記載する。好ましい合成ヌクレオシド内連結は、ホスホロチオエー
ト、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、ホスフェートエステル、ア
ルキルホスホロチオエート（ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｏｔｈｉｏａｔｅ）、
ホスホラミデート、カルバメート、カルボネート、ホスフェートトリエステル、
アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。
【０１０１】
用語「改変されたオリゴヌクレオチド」はまた、共有結合的に、改変された塩
基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。例えば、改変されたオ
リゴヌクレオチドは、３’位置のヒドロキシル基以外および５’位置のリン酸基
以外の低分子量有機基に共有結合される骨格糖を有するオリゴヌクレオチドを含
む。従って、改変されたオリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−アルキル化リボース
基を含み得る。さらに、改変されたオリゴヌクレオチドは、リボースの代わりに
、アラビノースのような糖を含み得る。従って、本発明は、生理学的条件下で、
薬学的に受容可能なキャリアと一緒に、イヌのＰＧＰポリペプチドをコードする
核酸と相補的であり、そしてそれとハイブリダイズする改変されたアンチセンス
分子を含む薬学的調製物を、企図する。
【０１０２】
イヌのＰＧＰを結合する因子はまた、結合ペプチド、ならびにイヌのＰＧＰポ
リペプチドおよびイヌのＰＧＰポリペプチドを含む複合体に結合する他の分子を
含む。この結合分子がインヒビターである場合、この分子は、イヌのＰＧＰに結
合し、その活性を阻害する。イヌのＰＧＰ結合因子が、イヌのＰＧＰに結合する
か否かを決定するために、任意の公知の結合アッセイが使用され得る。例えば、
この結合因子は、表面に固定され得、次いで標識されたイヌのＰＧＰポリペプチ
ドと接触され得る。次いで、イヌのＰＧＰ結合因子と相互作用するイヌのＰＧＰ
の量またはイヌのＰＧＰ結合因子に結合しない量は、イヌのＰＧＰ結合因子が、
イヌのＰＧＰに結合するか否かを決定するために定量され得る。
【０１０３】
イヌのＰＧＰ結合因子は、イヌのＰＧＰポリペプチドに選択的または優先的に
結合する多数のサイズおよび型の分子、ならびにイヌのＰＧＰポリペプチドおよ
びそれらの結合パートナーの両方の複合体を含む。これらの分子は、種々の供給
源に由来し得る。例えば、イヌのＰＧＰ結合因子は、固定された形態において、
またはファージディスプレイライブラリーとして、溶液中で容易に調製され得る
変性ペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより提供され得る。１つ
以上のアミノ酸を含むペプチドのコンビナトリアルライブラリーもまた、合成さ
れ得る。ペプチド合成部分および非ペプチド合成部分のライブラリーが、さらに
合成され得る。
【０１０４】
ファージディスプレイが、本発明にしたがった有用な結合ペプチドを同定する
ことにおいて特に有効であり得る。簡潔には、ファージライブラリー（例えば、
ｍ１３、ｆｄ、またはλファージを使用する）を調製し、従来の方法を使用して
、４〜約８０個のアミノ酸残基由来の挿入物をディスプレイする。この挿入物は
、例えば、完全に変性したか、または偏ったアレイを示し得る。次いで、イヌの
ＰＧＰポリペプチドに結合するファージ保有挿入物を選択し得る。このプロセス
は、イヌのＰＧＰポリペプチドに結合するファージの再選択のいくつかのサイク
ルを介して繰り返され得る。繰り返されるラウンドは、特定の配列を保有してい
るファージの富化に導く。ＤＮＡ配列分析は、発現されたポリペプチドの配列を
同定するために行われ得る。イヌのＰＧＰポリペプチドに結合する配列の最小の
線形部分が、決定され得る。１つ以上のさらなる変性残基をその上流または下流
に加えた最小の線形部分の一部または全てを含む挿入物を含む偏ったライブラリ
ーを使用して、この手順を繰り返し得る。酵母ツーハイブリッドスクリーニング
法はまた、イヌのＰＧＰポリペプチドに結合するポリペプチドを同定するために
使用され得る。従って、本発明のイヌのＰＧＰポリペプチドまたはそのフラグメ
ントが、ペプチドライブラリー（ファージディスプレイライブラリーを含む）を
スクリーニングするために、本発明のイヌのＰＧＰポリペプチドのペプチド結合
パートナーを同定かつ選択するために、使用され得る。このような分子は、記載
されるように、スクリーニングアッセイのために、精製プロトコールのために、
イヌのＰＧＰの機能と直接干渉するために、および当業者に明らかである他の目
的のために使用され得る。
【０１０５】
従って、本発明は、一般的に、薬理学的因子または異常なＰＧＰ活性と関連す
る状態の処置に有用である因子についてのリード化合物ならびにそこで同定され
る化合物および因子を同定する有効な方法を提供する。一般的に、スクリーニン
グ方法は、イヌのＰＧＰを介した分子の輸送を阻害または増強する化合物につい
てのアッセイを包含する。このような方法は、化合物の、自動化されたハイスル
ープットスクリーニングに適合される。このような方法の例は、米国特許第５，
４２９，９２１号において記載される。
【０１０６】
薬理学的因子についての種々のアッセイが、提供され、これには、標識された
インビトロタンパク質結合アッセイ、検出可能な分子を使用した流出アッセイな
どが含まれる。例えば、タンパク質結合スクリーニングが、イヌのＰＧＰへの候
補薬理学的因子の結合を迅速に調べるために使用される。この候補薬理学的因子
は、例えば、コンビナトリアルペプチドライブラリーに由来し得る。このような
アッセイのための従来の試薬は、当該分野で公知である。流出の例示的細胞ベー
スアッセイは、検出可能に標識された分子の流出が生じ得る条件下で、候補薬理
学的因子と、イヌのＰＧＰを有する細胞とを接触することを含む。特定の条件は
、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｓｈａｒｏｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌ．５８：５７１−５８６、１９９９およびそこで引用される参
考文献に記載される。候補薬理学的因子の存在下における流出の減少は、この候
補薬理学的因子が、イヌのＰＧＰの流出活性を減少することを示す。候補薬理学
的因子の存在下における流出の増加は、候補薬理学的因子が、イヌのＰＧＰの流
出活性を増大することを示す。
【０１０７】
本発明の方法において使用されるイヌのＰＧＰは、単離されたポリペプチドと
して（ここで候補薬理学的因子の結合が、測定されるべきである）、またはイヌ
のＰＧＰポリペプチドを含む細胞または他の膜包囲空間として、アッセイ混合物
に添加され得る。後者のアッセイ構成において、細胞または他の膜包囲空間は、
予め負荷されるポリペプチドとして、または核酸としてイヌのＰＧＰを含み得る
（例えば、イヌのＰＧＰを含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞）。
本明細書中に記載されたアッセイにおいて、イヌのＰＧＰポリペプチドが、組換
え的に産生され得るか、または生物学的抽出物から単離され得るが、好ましくは
、インビトロで合成される。イヌのＰＧＰポリペプチドは、別のポリペプチド（
例えば、タンパク質−タンパク質結合を提供もしくは増強するか、またはアッセ
イ条件下で、イヌのＰＧＰポリペプチドの安定性を増強することが可能なポリペ
プチド）との、イヌのＰＧＰポリペプチドの融合物を含むキメラタンパク質を含
む。イヌのＰＧＰポリペプチドに融合されたポリペプチドまたはそのフラグメン
トはまた、例えば、免疫学的認識によるか、または蛍光標識により、融合タンパ
ク質を容易に検出する手段を提供し得る。
【０１０８】
アッセイ混合物はまた、候補薬理学的因子を含む。代表的には、複数のアッセ
イ混合物が、種々の濃度に対して異なる応答を得るために、異なる因子の濃度と
平行して行われる。代表的に、これらの濃度の１つは、ネガティブコントロール
（すなわち、因子のゼロ濃度で、または、アッセイ検出の限度以下の因子の濃度
で）として働く。候補因子は、多数の化学クラスを含むが、代表的に、それらは
有機化合物である。好ましくは、候補薬理学的因子は、小さい有機化合物であり
、すなわち、それらは、５０より大きいが、約２５００未満の分子量を有する化
合物）である。候補因子は、ポリペプチドと構造的な相互作用に必要である官能
基の化学基を含み、そして代表的には、少なくとも１つのアミン基、カルボニル
基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの官能基
の化学基およびより好ましくは少なくとも３つの官能基の化学基を含む。この候
補因子は、１つ以上の上記同定された官能基で置換された環状炭素または複素環
式構造および／または芳香族構造もしくは多芳香族構造を含み得る。候補因子は
また、生体分子（例えば、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロール、イソプ
レノイド、プリン、ピリミジン、上記の誘導体もしくは構造的アナログ、または
それらの組み合わせなど）であり得る。この因子が核酸である場合、この因子は
、代表的にはＤＮＡまたはＲＮＡ分子であるが、非天然結合またはサブユニット
を有する改変された核酸もまた、企図される。
【０１０９】
候補因子は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む広範な種々の
供給源から得られる。例えば、多数の手段が、広範な種々の有機化合物および生
体分子の無作為および指向された合成に利用可能であり、これは、無作為化され
たオリゴヌクレオチドの発現、合成有機コンビナトリアルライブラリー、無作為
ペプチドのファージディスプレイライブラリーなどを含む。あるいは、細菌抽出
物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形態における天然の化合物のラ
イブラリーが、利用可能であるかまたは容易に産生される。さらに、天然にそし
て合成的に産生されるライブラリーおよび化合物が、従来の化学的手段、物理学
的手段、および生化学的手段を通じて容易に改変され得る。さらに、既知の薬理
学的因子は、指向されるかまたは無作為の化学的改変（例えば、アシル化、アル
キル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などに供され、
その因子の構造的アナログを産生し得る。
【０１１０】
従って、候補因子の供給源は、公知のＰ−糖タンパク質インヒビターに基づい
た分子のライブラリーであり、ここで、このインヒビターの構造は、より多くも
しくはより少ない化学的部分または異なった化学的部分を保有するように、分子
の１以上の位置において変化している。アナログインヒビターのライブラリーを
作成する際に分子になされる構造的変化は、方向付けられるか、無作為であるか
、あるいは、方向付けられるかまたは無作為の両方の置換および／または付加の
組合せであり得る。組換えライブラリーの調製の当業者は、既存のＰ−糖タンパ
ク質インヒビターに基づいたこのようなライブラリーを容易に調製し得る。
【０１１１】
種々の他の試薬はまた、混合物中に含まれ得る。これらとしては、塩、緩衝液
、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などの試薬が挙げられ、
これらは、最適なタンパク質−タンパク質および／またはタンパク質−核酸結合
を容易にするために使用され得る。このような試薬はまた、反応物成分の非特異
的またはバックグラウンドの相互作用を減少し得る。プロテアーゼインヒビター
、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物剤などのようなアッセイの効率を改善す
る他の試薬もまた使用され得る。
【０１１２】
前述のアッセイ材料の混合物は、候補薬学的因子の存在を除き、イヌＰＧＰが
、薬物などの化合物の制御量の流出を媒介する条件下でインキュベートされる。
候補薬学的因子のイヌＰＧＰへの結合を決定するために、混合物を結合を可能に
する条件下でインキュベートする。成分の添加の順序、インキュベーション温度
、インキュベーションの時間、およびアッセイの他のパラメーターは、容易に決
定され得る。このような実験法は単にアッセイパラメーターの最適化を含むのみ
であり、アッセイの基本的な組成物は含まない。インキュベーション温度は、代
表的には、約４℃と４０℃の間である。インキュベーション時間は、好ましくは
、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするために最小化され、そし
て代表的には、１分と１０時間との間である。
【０１１３】
インキュベーション後、流出のレベル、またはイヌＰＧＰポリペプチドと候補
薬学的因子との間の特異的な結合のレベルを、使用者に利用可能な任意の簡便な
方法によって検出する。細胞遊離結合型アッセイについて、分離段階はしばしば
、非結合成分から結合成分を分離するために使用される。この分離段階は、種々
の方法によって達成され得る。簡便には、少なくとも１つの成分が固体基板上に
固定され、そこから非結合成分は簡単に分離され得る。固体基板は、広範な種々
の材料から作製され得、そして広範な種々の形状（例えば、マイクロタイタープ
レート、マイクロビーズ、ディップスティック、ビーズ粒子など）であり得る。
この基板は、好ましくは、ＳＮ比を最大にするために、主にバックグラウンド結
合を最小化するため、ならびに、分離の容易さおよび費用のために選択される。
【０１１４】
分離は、例えば、リザーバからビーズまたはディップスティックを除去するこ
とによって、マイクロタイタープレートウェルなどのリザーバを空にするかもし
くは希釈することによって、ビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラムまたはフ
ィルターを洗浄溶液または溶媒を使用してリンスすることによって、もたれされ
得る。分離段階は、好ましくは、多数のリンスまたは洗浄を含む。例えば、固体
支持体がマイクロタイタープレートである場合、ウェルは洗浄溶液を使用して数
回洗浄され得、この洗浄溶液は、代表的には、塩、緩衝液、界面活性剤、非特異
的タンパク質などの、特定の結合において沈殿しないインキュベーション混合物
のこれらの成分を含む。固体基板が磁性ビーズである場合、このビーズは、洗浄
溶液を使用して１回以上洗浄され得、そして磁石を使用して単離され得る。
【０１１５】
膜貫通輸送アッセイなどの細胞ベースのアッセイのための任意の簡便な方法に
おいて、検出はもたらされ得る。直接的または間接的に検出可能な産物（例えば
、カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）ＡＭまたはローダミン１２３のような蛍光性分
子）の輸送が好ましい。細胞遊離結合アッセイについて、成分の１つは、通常、
検出可能な標識を含むかまたはこれに結合される。直接的検出（例えば、放射性
活性、ルミネセンス、光学密度または電子密度など）または間接的検出（例えば
、ＦＬＡＧエピトープなどのエピトープタグ、西洋ワサビペルオキシダーゼなど
の酵素タグなど）を提供するような広範な種々の標識が使用され得る。この標識
は、イヌＰＧＰポリペプチドまたは候補薬学的因子に結合し得る。
【０１１６】
種々の方法が標識を検出するために使用され得、標識の性質および他のアッセ
イ成分に依存する。例えば、固体基板に結合される間かまたは固体基板から続い
て分離される間、標識は検出され得る。標識は、光学密度または電子密度、放射
性放射、非放射性エネルギー伝達などを介して直接的に検出され得るかまたは抗
体結合体、ストレプトアビジン−ビオチン結合体などを使用して間接的に検出さ
れ得る。これらの標識を検出する方法は、当該分野で周知である。
【０１１７】
イヌＰＧＰ結合因子はまた、抗体であり得るかまたは機能的に活性な抗体フラ
グメントであり得る。抗体は、免疫学の科学の当業者にとって周知である。本明
細書で使用される場合、用語「抗体」は、インタクトな抗体分子だけではなく、
イヌＰＧＰ結合能力を保持する抗体分子のフラグメントも意味する。このような
フラグメントはまた、当該分野で周知であり、インビトロおよびインビボの両方
において調節的に使用される。特に、本明細書中で使用される場合、用語「抗体
」は、インタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性フラグメントＦ
（ａｂ’）2、およびＦａｂをも意味する。インタクトな抗体のＦｃフラグメン
トを欠くＦ（ａｂ’）2およびＦａｂフラグメントは、循環からより迅速にクリ
アーし、そして、インタクトな抗体のあまり非特異的でない組織結合を有し得る
（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。
【０１１８】
モノクローナル抗体は、免疫原としてイヌＰＧＰまたはそのフラグメントを利
用して当該分野で公知の任意の方法を使用して作成され得る。あるいは、抗体は
、イヌＰＧＰ活性を阻害するイヌＰＧＰに特異的なポリクローナル抗体であり得
る。ポリクローナル抗体の調製および使用はまた、当業者に公知である。
【０１１９】
当該分野で公知のように、抗体分子のごく一部；パラトープが、そのエピトー
プに対する抗体の結合に有意に関与している（一般的には、Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ
．（１９８６）Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  
ｏｆ  Ｍｅｄｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第７版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  
Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄを参照のこと）。ｐＦｃ’およびＦｃ
領域は、例えば、相補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与し
ていない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断されているかまたはｐＦｃ’領域なしで
産生された抗体（Ｆ（ａｂ’）2フラグメントと命名される）は、インタクトな
抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断された
かまたはＦｃ領域なしで産生された抗体（Ｆａｂフラグメントと命名される）は
、インタクトな抗体分子の抗原結合部位の１つを保持する。さらに進むと、Ｆａ
ｂフラグメントは、共有結合した抗体軽鎖およびＦｄと示される抗体重鎖の一部
からなる。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主要な決定因子であり（単一のＦ
ｄフラグメントは、抗体特異性を変更することなく１０までの異なった軽鎖と関
連し得る）そしてＦｄフラグメントは単離の際、エピトープ結合能力を保持する
。
【０１２０】
抗体の抗原結合部分内には、当該分野で周知のように、相補性決定領域（ＣＤ
Ｒ）が存在し、これは、抗原のエピトープおよび枠組み領域（ＦＲ）と直接的に
相互作用し、この枠組み領域は、パラトープの三次構造を維持する（一般的には
、Ｃｌａｒｋ，１９８６；Ｒｏｉｔｔ，１９９１を参照のこと）。ＩｇＧ免疫グ
ロブリンの重鎖Ｆｄフラグメントおよび軽鎖の両方において、３つの相補性決定
領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）によってそれぞれ分離された４つの枠組み領域（
ＦＲ１からＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、より特定には重鎖
ＣＤＲ３が、抗体特異性の主な原因である。
【０１２１】
一般的には、インタクトな抗体は、「Ｆｃ」および「Ｆａｂ」領域を含むとい
われている。このＦｃ領域は、相補体活性化に関与しており、そして、抗原結合
に関与していない。Ｆｃ’領域が酵素的に切断されたかまたはＦｃ’領域なしで
産生された抗体（「Ｆ（ａｂ’）2」として命名される）は、インタクトな抗体
の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断されたかま
たはＦｃ領域なしで産生された抗体（「Ｆａｂ’」フラグメントとして命名され
る）は、インタクトな抗体の抗原結合部位の１つを保持する。Ｆａｂ’フラグメ
ントは、共有結合した抗体軽鎖および抗体重鎖の一部からなり、「Ｆｄ」と示さ
れる。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主要な決定因子である（単一のＦｄフ
ラグメントは、抗体特異性を変更することなく１０までの異なった軽鎖と関連し
得る）。単離されたＦｄフラグメントは、抗原エピトープに特異的に結合する能
力を保持する。
【０１２２】
上記に提供されたアッセイにおいて本発明に従って有用であると同定された抗
イヌＰＧＰモノクローナル抗体の抗原結合Ｆａｂ’部分、ならびに関連したＦＲ
およびＣＤＲ領域の配列は、当該分野で慣例的なアミノ酸配列決定方法を使用し
て決定され得る。哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域は、元の抗体のエピトープ特異性
を保持する限り、非特異的または異種特異的抗体の対応する領域と置換され得る
ことが確立されている。非ヒトＣＤＲがヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’
領域に共有結合され機能的な抗体を産生する「ヒト化」抗体の開発および使用の
ために、この技術は有用である。イヌＰＧＰ活性を阻害する非ヒト動物（例えば
、マウス）抗体が同定される場合、抗体をヒト化する技術は特に有用である。こ
れらの非ヒト化動物抗体は、本発明に従う方法において、ヒト被験体の処置にお
ける使用のためにヒト化され得る。マウス抗体をヒト化するための方法の例は、
米国特許第４，８１６，５６７号、同第５，２２５，５３９号、同第５，５８５
，０８９号、同第５，６９３，７６２号および同第５，８５９，２０５号におい
て提供される。他の抗体（抗原結合能力を有するインタクトな抗体のフラグメン
トを含む）は、しばしば、「キメラ」抗体といわれる。
【０１２３】
従って、当業者に明らかなように、本発明はまた、抗イヌＰＧＰモノクローナ
ル抗体のＦ（ａｂ’）2、およびＦａｂフラグメント；抗イヌＰＧＰ抗体のＦｃ
および／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／ま
たは軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列によって置換されたキメラ
抗体；抗イヌＰＧＰ抗体のＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２
および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同なヒトまたは非ヒト配列によって置換
されたキメラＦ（ａｂ’）2フラグメント抗体；ならびにＦＲおよび／またはＣ
ＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトま
たは非ヒト配列によって置換されたキメラＦａｂフラグメント抗体を提供する。
【０１２４】
本発明に従って、イヌＰＧＰインヒビターはまた、配列番号２由来の「ドミナ
ントネガティブな」ポリペプチドを含む。ドミナントネガティブなポリペプチド
は、細胞性機構と相互作用することにより、活性ポリペプチドが細胞性機構と相
互作用することを妨げるかまたは活性ポリペプチドと競合する、ポリペプチドの
不活性な改変体であり、これによって、活性ポリペプチドの効果を減少する。例
えば、リガンドと結合するが、リガンドの結合に応答してシグナルを伝達しない
ドミナントネガティブなレセプターは、リガンド発現の生物学的効果を減少し得
る。
【０１２５】
本発明のドミナントネガティブなイヌＰＧＰポリペプチドの細胞中における発
現の最終結果は、分子輸送のようなＰＧＰ活性の減少である。当業者は、１つ以
上のドミナントネガティブな改変体ポリペプチドを作製する標準的な変異誘発技
術を使用して、イヌＰＧＰポリペプチドのドミナントネガティブ改変体の能力を
評価し得る。例えば、イヌＰＧＰポリペプチドの本明細書中に含まれる教示を考
えれば、当業者は、部位特異的変異誘発、走査変異誘発、部分的な遺伝子欠損ま
たは短縮などによって、イヌＰＧＰポリペプチドの配列を改変し得る。例えば、
米国特許第５，５８０，７２３号およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ
Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。次いで、当業者は、変異誘発された
ポリペプチドの集団を、イヌＰＧＰ活性における減少および／またはこのような
活性の保持について試験し得る。イヌＰＧＰポリペプチドのドミナントネガティ
ブな改変体を作製および試験するための方法は、当業者に明らかである。
【０１２６】
本発明の組成物の各々は、種々の治療目的または非治療目的に有用である。例
えば、本発明のイヌＰＧＰ核酸は、オリゴヌクレオチドプローブとして有用であ
る。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、同一または実質的に類似の核酸
配列を有するゲノムライブラリークローンまたはｃＤＮＡライブラリークローン
を同定するために、本明細書中で使用され得る。ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件下で所望の配列にハイブリダイズし得る、適切なオリゴヌクレ
オチドまたはオリゴヌクレオチドのセット、そのようなオリゴヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチドのセットの改変体もしくはそのフラグメントあるいはアン
チセンス相補体は、当該分野で周知の手段によって合成され得（例えば、Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮ
Ａ，Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ編、１９８７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａ
ｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照のこと）、そして当該分野で公知の技術によって、
その所望の配列、その改変体またはフラグメントを同定および単離するためのプ
ローブとして使用され得る。核酸ハイブリダイゼーションおよびクローン同定の
技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ
ｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ（１９８
９）に開示される。所望の核酸配列、あるいはその改変体またはフラグメントの
検出を容易にするために（クローニング目的または配列の存在の単なる検出に関
わらず）、上記のプローブは、検出可能な基で標識され得る。このような検出可
能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質であり得る。
このような物質は、核酸ハイブリダイゼーションの分野で良く開発されており、
一般に、このような方法において有用な多くの標識が、本発明に適用され得る。
特に有用なのは、放射性標識である。十分なシグナルを提供しそして十分な半減
期を有する任意の放射性標識が、使用され得る。一本鎖の場合、オリゴヌクレオ
チドは、キナーゼ反応を使用して放射性標識され得る。あるいは、オリゴヌクレ
オチドはまた、ビオチン、酵素または蛍光基のような非放射性マーカーで標識さ
れた場合にも、核酸ハイブリダイゼーションプローブとして有用である。例えば
、Ｌｅａｒｙ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ
）８０：４０４５（１９８３）；Ｒｅｎｚ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒ
ｅｓ．１２：３４３５（１９８４）；およびＲｅｎｚ，Ｍ．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：
８１７（１９８３）を参照のこと。
【０１２７】
さらに、イヌＰＧＰ核酸の相補体が、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして
有用であり得る。例えば、これは、イヌＰＧＰ「ノックアウト」表現型を誘導す
るために、このアンチセンスオリゴヌクレオチドを動物に送達することによる。
遺伝子発現をブロックするためのアンチセンスＲＮＡプローブの投与は、Ｌｉｃ
ｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３３：８０１−８０２（１９８８
）に議論される。
【０１２８】
あるいは、本発明のイヌＰＧＰ核酸は、非ヒトトランスジェニック動物を作製
するために使用され得る。「トランスジェニック動物」は、細胞内に人工的に挿
入されたＤＮＡを含む細胞を有する動物であり、ＤＮＡは、その細胞から発生す
る動物のゲノムの一部となる。好ましいトランスジェニック動物は、霊長類、マ
ウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌおよびネコである。トラ
ンスジェニック実験に適切な動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｌｉｍｉ
ｎｇｔｏｎ，ＭＡ）、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）、Ｈａｒ
ｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）な
どの標準的な商業的供給源から入手され得る。特定の疾患に関連する特定の特性
を有するトランスジェニック動物は、それらの疾患に対する種々の薬物および処
置方法の影響を研究するために使用され得、従って、多くのヒト疾患の研究の遺
伝モデルとして機能し得る。従って、本発明は、細胞膜を通過する分子の輸送に
関与する障害の研究のためのモデルとしての、イヌＰＧＰノックアウト動物およ
びトランスジェニック動物の使用を意図する。当業者に公知の種々の方法が、本
発明に関連するトランスジェニック動物の作製に利用可能である。
【０１２９】
内因性ＰＧＰ／ＭＤＲ１の不活性化または置換は、胚性幹細胞を使用する相同
組換え系によって達成され得る。ＰＧＰ-/-ノックアウト表現型を有する、得ら
れたトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、イヌＰＧＰについてトランスジェニ
ックにされ得、そしてイヌＰＧＰのモジュレーター（アゴニストまたはアンタゴ
ニスト／インヒビター）としての化合物のスクリーニングのモデルとして使用さ
れ得る。この様式で、このような治療薬物が同定され得る。
【０１３０】
さらに、イヌＰＧＰの正常または変異体バージョンを生殖系列に挿入し、イヌ
ＰＧＰの正常または変異体形態を構成的または誘導的に発現するトランスジェニ
ック動物を作製し得る。これらの動物は、細胞におけるイヌＰＧＰの役割および
機能を規定するための研究において有用である。
【０１３１】
本発明の組成物はまた、治療目的に有用である。従って、本発明は、哺乳動物
細胞においてイヌＰＧＰ活性を阻害するための方法を包含する。本発明はさらに
、細胞におけるイヌＰＧＰ活性を減少または増加するための方法を提供する。１
つの実施形態において、この方法は、哺乳動物細胞に、その哺乳動物細胞の分子
輸送を阻害するのに有効な量のイヌＰＧＰの核酸またはポリペプチドを接触させ
る工程を包含する。このような方法は、例えば、薬物耐性および薬物バイオアベ
イラビリティの減少に関与する機構を解明する目的のために、インビトロで有用
である。
【０１３２】
本発明はまた、細胞または被験体においてＰＧＰ発現を増加するための方法を
包含する。イヌＰＧＰの量は、細胞または被験体における膜貫通輸送を増加する
のに有効な量の本発明のＰＧＰ核酸またはＰＧＰポリペプチドを、細胞に接触さ
せるかまたは被験体に投与することによって、このような細胞または被験体にお
いて増加され得る。ＰＧＰ活性の増加は、本明細書中に記載のアッセイ（例えば
、膜貫通輸送のアッセイ）によって測定され得る。
【０１３３】
本発明の調製物は、有効量で投与され得る。有効量とは、単独でかまたはさら
なる用量と共に、所望の応答を生成する薬学的調製物の量である。もちろん、こ
のような量は、処置される特定の状態、その状態の重篤度、個々の患者のパラメ
ーター（年齢、身体的条件、サイズおよび体重を含む）、処置の継続時間、併用
治療（もしあれば）の特性、特定の投与経路、およびこのような医療従事者の知
識および技術内の因子に依存する。最大用量（すなわち、正確な医学的判断に従
う、最も高い安全用量）が使用されることが、一般的に好ましい。しかし、患者
が、医学的理由、心理学的理由または実質的に任意の他の理由のために、より低
用量または許容可能な用量を要求し得ることは、当業者に理解される。
【０１３４】
一般に、活性化合物の用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／ｋ
ｇ／日である。５０〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量が適切であり、そして１日
あたり１回または数回で投与されることが期待される。より低い用量は、他の投
与形態（例えば、静脈内投与）から生じる。被験体における応答が適用した初回
用量で不十分である場合には、より高い用量（すなわち、異なるより局在化した
送達経路による、効果的なより高い用量）が、患者の耐性が許容する程度に使用
され得る。１日あたり複数回の用量が、適切な全身の化合物レベルを達成するた
めに意図されるが、化合物が、徐放性医薬または持続放出医薬として調製される
場合には、より少数回の用量が代表的に与えられる。
【０１３５】
投与される場合、本発明の薬学的調製物は、薬学的に受容可能な量でかつ薬学
的に受容可能な組成物において適用され得る。このような調製物は、塩、緩衝化
剤、保存剤、適合性のキャリア、および必要に応じて他の治療剤を、慣用的に含
み得る。医薬において使用される場合、塩は、薬学的に受容可能であるが、薬学
的に受容可能でない塩が、その薬学的に受容可能な塩を調製するために都合よく
使用され得、そして本発明の範囲から排除されない。このような薬理学的かつ薬
学的に受容可能な塩としては、以下の酸から調製される塩が挙げられるが、これ
らに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸
、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。また、薬学的に受容
可能な塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（例えば、ナトリウム塩
、カリウム塩またはカルシウム塩）として調製され得る。
【０１３６】
本発明に従う有用なイヌＰＧＰインヒビターまたはイヌＰＧＰの核酸およびポ
リペプチドは、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアと合わせられ得る。
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、ヒト
への投与に適切な、１以上の適合性の固体充填剤または液体充填剤、希釈剤ある
いは包囲物質を意味する。用語「キャリア」とは、適用を容易にするために活性
成分と合わせられる、有機成分または無機成分（天然性または合成性）を示す。
薬学的組成物の成分は、所望の薬学的効力を実質的に損なう相互作用が存在しな
い様式で、本発明の分子と、および互いに、混合され得る。
【０１３７】
薬学的組成物は、適切な緩衝化剤を含み得、これらとしては、酢酸（塩）；ク
エン酸（塩）；およびリン酸（塩）が挙げられる。
【０１３８】
薬学的組成物はまた、必要に応じて、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノー
ル、パラベンおよびチメロサールのような、適切な保存剤を含み得る。
【０１３９】
種々の投与経路が利用可能である。もちろん、選択される特定の様式は、選択
される特定の化合物、処置される状態の重篤度、および治療効力に必要とされる
投薬量に依存する。一般的に言うと、本発明の方法は、医学的に受容可能な任意
の投与様式を使用して行われ得、この様式は、臨床的に受容可能でない有害な効
果を引き起こすことなく効果的なレベルの活性化合物を生成する任意の様式を意
味する。このような投与様式としては、経口経路、直腸経路、局所経路、鼻内経
路、経皮（ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ）経路または非経口経路が挙げられる。用語
「非経口」とは、皮下、静脈内、髄腔内、筋内または注入が挙げられる。静脈内
経路または筋内経路が、特にではないが、長期の治療および予防に適切である。
【０１４０】
薬学的組成物は、単位投薬形態で都合よく存在し得、そして薬学分野で周知の
任意の方法によって調製され得る。全ての方法は、活性因子を、１以上の補助的
成分を構成するキャリアと会合させる工程を包含する。一般に、組成物は、活性
化合物を、液体キャリア、細粒固体キャリアまたは両方と、均一かつ密接に会合
させ、次いで、必要に応じて、生成物を成形することによって調製される。
【０１４１】
経口投与に適切な組成物は、個別の単位（例えば、カプセル剤、錠剤、ロゼン
ジ）として存在し得、これらは各々、所定の量の活性化合物を含む。他の組成物
としては、水性の液体または非水性の液体（例えば、シロップ、エリキシルまた
はエマルジョン）中の懸濁液が挙げられる。
【０１４２】
非経口投与に適切な組成物は、都合よくは、イヌＰＧＰインヒビターまたはイ
ヌＰＧＰの核酸およびポリペプチドの滅菌水性調製物を含み、この調製物は、好
ましくは、レシピエントの血液と等張性である。この水性調製物は、適切な分散
剤または湿潤剤、および懸濁剤を使用して、公知の方法に従って処方され得る。
滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の
滅菌の注射可能な溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液
）であり得る。使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒としては、とりわけ
、水、リンゲル溶液、および等張性の塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌
の不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として都合よく使用される。この目的のた
めに、任意の無菌の（ｂｌａｎｄ）不揮発性油が使用され得、これには、合成の
モノグリセリドまたはジグリセリドが挙げられる。さらに、オレイン酸のような
脂肪酸が、注射剤の調製物に使用され得る。経口投与、皮下投与、静脈内投与、
髄腔内投与、筋内投与などに適切なキャリア処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに見い出され得る。
【０１４３】
他の送達系としては、時限放出（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅ）、遅延放出（ｄ
ｅｌａｙｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）または持続放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌ
ｅａｓｅ）送達系（例えば、上記で議論される生物学的／化学的ベクター）が挙
げられ得る。このような系は、活性化合物の繰り返しの投与を回避し得、これが
、被験体および主治医に対する簡便性を増加する。多くの型の放出送達系が利用
可能であり、当業者に公知である。長期持続放出移植片の使用が所望され得る。
本明細書中で使用される長期放出とは、その移植片が、少なくとも３０日間、そ
して好ましくは６０日間、治療レベルの活性成分を送達するように構築および配
置されることを意味する。長記持続放出移植片は、当業者に周知であり、そして
これらには、上記の放出系のいくらかが含まれる。
【０１４４】
本発明は、以下の実施例を参照してより完全に理解される。しかし、これらの
実施例は、本発明の実施形態を例示するために単に意図され、本発明の範囲を限
定すると解釈されない。
【０１４５】
（実施例）
（実施例１：イヌＰ−糖タンパク質の単離）
ｃＤＮＡライブラリーを、標準的な手順に従って、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍ
ｉｌｉａｒｉｓ）ｍＲＮＡを使用して調製した。ヒトＰ−糖タンパク質ＤＮＡプ
ローブを用いて、Ｐ−糖タンパク質クローンについて、このライブラリーをスク
リーニングした。クローンを、以下に記載されるような標準的な手順に従って、
単離し、精製し、そして配列決定した。
【０１４６】
肝臓および肺の組織を、ビーグル犬の組織サンプルから切除し、そして液体窒
素中で瞬間凍結した。
【０１４７】
イヌＰＧＰ１の８９０ｂｐのフラグメントを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅに発注さ
れたλｇｔ１１ベクターｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅した。Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈからの試薬を用いて、ＰＣＲを実施した。プライマーをカスタムデザイン
した（一方はヒトＰＧＰ１に対して相同な配列に対して特異的、他方はイヌＰＧ
Ｐ２に相同な配列に対して特異的）。
【０１４８】
【化１】
2012061008.tif 000002
ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９７００サーモサイクラーで実施した
。ＰＣＲを、９４℃にて２分間、次いで、９４℃にて３０秒間、４０℃にて２０
秒間、および７２℃にて２分３０秒間の４０サイクルで実施し、次いで、７２℃
にて３分間インキュベートした。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルにおいて泳
動し、そしてＥｔＢｒで染色した。９１７ｂｐのＤＮＡバンドを切り出し、そし
てＱｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．からのＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉ
ｏｎ  ｋｉｔを用いて精製した。
【０１４９】
次いで、このＤＮＡを、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＯｒｉｇｉｎａｌ  ＴＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔを用いてベクターｐＣＲ２．１に連結した。ＩＮＶα
Ｆ’細胞を、連結保持物（ｒｅｔａｉｎ）で形質転換し、コロニーを選択し、ア
ンピシリンを含む１００ｍＬのＬブロス中で増殖させた。ＤＮＡ精製を、Ｑｉａ
ｇｅｎからのＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを
用いて実施した。挿入物を、ＡＢＩ３７７シークエンサーを使用して配列決定し
た。この配列は、イヌＰＧＰの８９０ｂｐフラグメント（オープンリーディング
フレームにおける塩基８１６〜塩基１７０６）に対応する。
【０１５０】
他の５つのフラグメントを、以下に記載する手順における任意の差異を伴って
上述と同じ方法を使用して、単離し、クローン化し、そして配列決定した。
【０１５１】
イヌ肺組織からのＲＮＡ抽出を、ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＮｕｃｌｉｏｂｏｎ
ｄ  ＲＮＡ  Ｍａｘｉ  Ｐｒｅｐ．ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて
実施した。ｃＤＮＡを、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＳｕｐｅｒ
ｓｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｆ
ｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓを用いて、ＲＮＡ調製
物から合成した。
【０１５２】
【化２】
2012061008.tif 000003
これは、オープンリーディングフレームにおける塩基１３６４〜塩基２３４５の
イヌＰＧＰの９８１ｂｐフラグメントに対応する。
【０１５３】
【化３】
2012061008.tif 000004
これは、オープンリーディングフレームにおける塩基１６３５〜塩基３３６２の
イヌＰＧＰの１７２８ｂｐフラグメントに対応する。
【０１５４】
【化４】
2012061008.tif 000005
これは、オープンリーディングフレームにおける塩基３００４〜塩基３７８３の
イヌＰＧＰの７７９ｂｐフラグメントに対応する。
【０１５５】
イヌ肝臓組織からのＲＮＡ調製物を、先に使用したのと同じ方法を使用して、
実施した。ｃＤＮＡを、このＲＮＡ調製物から、ＳＭＡＲＴ  ＩＩオリゴヌクレ
オチドを用いて、ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａ
ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して作製した。ＰＣＲ条件を、以下の
通りに変更した：９４℃にて５分間、次いで、以下の５サイクル９４℃にて３０
秒間、および７２℃にて２分間。次いで、９４℃にて３０秒間、７０℃にて４５
秒間、および７２℃にて２分間の５サイクルを実施した。最後の３０サイクルは
、９４℃にて３０秒間、６８℃にて４５秒間、および７２℃にて２分間であった
。このＰＣＲを、７２℃にて７分間で終えた。
【０１５６】
【化５】
2012061008.tif 000006
これは、オープンリーディングフレームにおける塩基３２１２〜塩基４２６４の
イヌＰＧＰの３’末端フラグメントに対応する。
【０１５７】
イヌ肝臓組織由来のＲＮＡ調製物を、先に使用したのと同じ方法を使用して、
実施した。ｃＤＮＡを、このＲＮＡ調製物から、遺伝子特異的プライマーＤＭ１
６８０ＲＬ  ５’−ｃｇｃ  ａｇｃ  ｃａｃ  ｔｇｔ  ｔｃｃ  ｃａａ  ｃｃａ
ｇｃｇ  ｃｃａ  ｃｔ−３’，２９マー，配列番号１９，イヌＰＧＰ１を用い
て、ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して作製した。
【０１５８】
【化６】
2012061008.tif 000007
これは、オープンリーディングフレームにおける塩基−１５〜塩基９４５のイヌ
ＰＧＰのＡＴＧフラグメントに対応する。
【０１５９】
（クローンのアセンブリ）
１Ｋｂフラグメント（８９０ｂｐ）および９８１ｂｐフラグメント
ＤＮＡプレップを、各フラグメントから作製した。両方のフラグメントを、Ｎ
ｃｏＩ制限酵素で切断した。１Ｋｂフラグメントをまた、ＥｃｏＲＩで切断した
。９８１ｂｐフラグメントをまた、ＢａｍＨＩで切断した。各フラグメントを精
製し、共に連結し、次いで末端を切断し、切断分子をゲル精製し、そしてＥｃｏ
ＲＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ１９中に連結した。
【０１６０】
１Ｋｂフラグメント（８９０ｂｐ）／９８１ｂｐフラグメントおよび１７２８
ｂｐフラグメント
両方のフラグメントをＢａｍＨＩで切断し、そして１７２８ｂｐフラグメント
もまたＸｂａＩで切断したことを除いて、これらのフラグメントを上記の通りに
アセンブルした。
【０１６１】
１Ｋｂフラグメント（８９０ｂｐ）／９８１ｂｐフラグメント／１７２８ｂｐ
フラグメントおよびＡＴＧフラグメント３’末端および７７９ｂｐフラグメント
１Ｋｂフラグメント（８９０ｂｐ）／９８１ｂｐフラグメント／１７２８ｂｐ
フラグメントＡＴＧフラグメントおよび３’末端／７７９ｂｐフラグメント
いくつかの場合では、フラグメントをそのヌクレオチド配列に従って、異なる
制限酵素で切断したことを除いて、これらのすべてのフラグメントを上記の通り
にアセンブルした。
【０１６２】
イヌＰ−糖タンパク質のヌクレオチド配列を、配列番号１として表す。コード
配列は、ヌクレオチド１７〜３８５９からなり、１２８１アミノ酸のポリペプチ
ド（配列番号２）を産生する。
【０１６３】
（実施例２：イヌＰ−糖タンパク質の活性）
（材料および方法）
イヌＰＧＰ  ｃＤＮＡ（配列番号１）を、ハイグロマイシンＢに対する耐性を
付与するベクター中のＬＬＣ−ＰＫ１細胞のクローン化集団中に導入する。ＬＬ
Ｃ−ＰＫ１細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎｓから得て、そして７％胎仔ウシ血清を補充した培地１９９中で増殖
する。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、トランスフェクション前に再クローン化して、細
胞集団の均質性を確証する。簡潔には、イヌＰＧＰ  ｃＤＮＡを、ｐ２２２ＣＭ
Ｖベクター中に組み込む。このベクターは、エプスタインバーウイルスについて
のＯｒｉＰ配列およびＥＢＮＡ−１遺伝子産物に基づいたｐ２２０．２エピソー
ムベクター系に由来する（Ｓｕｇｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：
４１０−４１３、１９８５；Ｙａｔｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．）３１３
：８１２−８１５、１９８５）。ＰＧＰ  ｃＤＮＡを、サイトメガロウイルス（
ＣＭＶ）極初期プロモーターの制御下におく。このベクターは、ハイグロマイシ
ンＢに対する耐性を付与する。細胞（０．４ｍＬ中）およびＤＮＡ（１０〜２０
μｇ）を、２ｍｍギャップ（ｇａｐ）細胞、１００Ｖ、２５００μＦキャパシタ
ンスおよび７２ｏｈｍ抵抗を使用して、ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  ｃｅｌｌ  ｍ
ａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ｍｏｄｅｌ  ６００を用いるエレクトロポレーションに
よってトランスフェクトした。エレクトロポレーション後、細胞を、１０％コン
フルエンスでマルチウェルプレート（４８ウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａ
ｒ）にプレーティングした。トランスフェクションの１〜２日後、ハイグロマイ
シンＢを、最終濃度４００〜６００μｇ／ｍｌで導入する。細胞に、２〜４日お
きに再給餌し、そして４００〜６００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ中で６〜８
日間増殖させ、この時点で野生型細胞のバルクを剥離した。ハイグロマイシンＢ
を、１００μｇ／ｍｌまで減少させ、そしてこの濃度のハイグロマイシンＢ中で
維持する。１４〜１８日後、このウェルを検査し、そして単一コロニーを含むウ
ェルをトリプシン処理し、そしてバルク培養物へとスケールアップする。ＰＧＰ
の発現を、ＴｒａｎｓｗｅｌｌｓTM中のビンブラスチン（０．１μＭ）輸送の分
極（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）によって測定する。
【０１６４】
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞に基づく輸送研究を、２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌｓTM
（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３４１５）中で実施する。Ｔｒ
ａｎｓｗｅｌｌｓTMを、側底側空間（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ  ｓｐａｃｅ）に
０．６ｍＬ培地を添加し、そして頂端側空間（ａｐｉｃａｌ  ｓｐａｃｅ）に０
．１ｍＬ培地を添加することによって調製する。細胞を、１挿入物あたり４×１
０4細胞で播種し（代表的に０．０５ｍＬ〜０．１５ｍＬ中）、２〜４日おきに
新鮮培地で再給餌し、そして播種後４〜８日目に輸送研究に使用する。輸送アッ
セイを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳで緩衝化したハンクス平衡生理食塩水（ＨＢＳＳ
）中で実施する（ｐＨ７〜７．２）。細胞単層を、輸送アッセイにおいて使用す
る前に、ＨＢＳＳでリンスする。輸送を、頂端側から側底側（Ａ→Ｂ）および側
底側から頂端側（Ｂ→Ａ）の方向の両方の傾斜条件下で測定する。１回の決定に
つき、少なくとも二連の単層を使用する。所望される時点で、サンプルを、レシ
ーバーチャンバー（頂端側チャンバーまたは側底側チャンバー）から回収する。
輸送された化合物の量の定量は、ＵＶまたは質量分析検出での液体シンチレーシ
ョン計数（ビンブラスチン）またはＨＰＬＣによる。
【０１６５】
イヌＰＧＰ  ｃＤＮＡを、バキュロウイルスベクターを用いて、昆虫細胞中で
発現させる。（Ｓａｒｋａｄｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：４８５４
−４８５８、１９９２）の方法に従って、膜を調製し、そして使用まで−８０℃
で保存する。ＡＴＰａｓｅアッセイを、９６ウェルマイクロタイタープレートに
おいて実施する。アッセイを、（Ｓａｒｋａｄｉら、１９９２、およびＤｒｕｅ
ｋｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３０：１７３−１７７、１９９５）の
方法の改変版を使用して実施する。
【０１６６】
９６ウェルプレートの各ウェルについての詳細な方法は、以下を包含する：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＭＥＳ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ
ジチオトレイトール、および５ｍＭアジ化ナトリウムを含有する緩衝液中に４０
μｇ膜、２０μＭベラパミル（ポジティブコントロール）または試験薬物、およ
び３〜５ｍＭ  ＭｇＡＴＰを含む０．０６ｍｌの反応混合物を、３７℃で２０分
間インキュベートする。１００μＭオルトバナジン酸ナトリウムを含む同一の反
応混合物を、並行してアッセイする。オルトバナジン酸塩は、ヌクレオチド結合
部位にＭｇＡＤＰを捕捉することによって、ＰＧＰを阻害する。従って、オルト
バナジン酸塩の存在下で測定されるＡＴＰａｓｅ活性は、非ＰＧＰ  ＡＴＰａｓ
ｅ活性を表し、そしてオルトバナジン酸塩なしで生成された活性から差し引かれ
て、バナジン酸塩感受性ＡＴＰａｓｅ活性を生成し得る。３０μｌの１０％ＳＤ
Ｓ＋消泡剤Ａの添加によって、反応を停止する。２つのさらなる反応混合物（オ
ルトバナジン酸塩＋および−）（しかし、ＭｇＡＴＰを含まない）もまた調製し
、そして他のものと共にインキュベートし、次いで、ＳＤＳおよびＭｇＡＴＰを
補充して、時間＝０分目の反応を表す。インキュベーションに次いで、１５ｍＭ
酢酸亜鉛：１０％アスコルビン酸（１：４）中の３５ｍＭモリブデン酸アンモニ
ウムを２００μｌ添加し、そしてさらに２０分間３７℃にてインキュベートする
。無機ホスフェートの遊離を、８００ｎｍでのその吸光度によって検出し、そし
てホスフェートの検量線に対してこの吸光度を比較することによって、定量する
。
【０１６７】
リガンド結合アッセイおよび蛍光色素取り込みの阻害を測定するためのアッセ
イを、Ｓｈａｒｏｍら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５８：５７１−
５８６、１９９９）によって記載されたように実施する。
【０１６８】
（Ｉ．ＬＬＣ−ＰＫ１細胞における安定なＰＧＰ発現）
イヌＰＧＰの機能的発現を、ビンブラスチンの輸送の分極によって測定する。
コントロール細胞は、代表的に、１と３との間のＢ→Ａ／Ａ→Ｂ比を示す。ＰＧ
Ｐトランスフェクト細胞は、より高い比率を示す。ｃＤＮＡ由来のイヌの発現は
安定である。
【０１６９】
（ＩＩ．ＰＧＰ膜におけるＡＴＰａｓｅ活性の活性化）
ＡＴＰａｓｅアッセイの刺激によって、薬物とＰＧＰとの任意の相互作用の濃
度依存性の迅速な測定が提供される。遊離の無機ホスフェートを、マイクロタイ
タープレート形式で実施される単純な分光光度学的アッセイによって測定する。
複数の薬物濃度を試験することによって、ＰＧＰに対する薬物の親和性を推定す
ること、およびその応答の飽和が観察されたか否かを推定することが可能となる
。
【０１７０】
（ＩＩＩ．細胞単層を横断する薬物輸送）
ＡＴＰａｓｅアッセイは、直接的には、薬物輸送を測定しない。ＡＴＰａｓｅ
活性と実際の輸送との間の一致を試験するために、薬物の輸送速度を、コントロ
ールＬＬＣ−ＰＫ１およびイヌＰＧＰ細胞単層において測定する。各薬物濃度に
ついて、４つの測定をなす：
Ａ：Ａ→Ｂ      コントロール細胞
Ｂ：Ｂ→Ａ      コントロール細胞
Ｃ：Ａ→Ｂ      ＰＧＰ細胞
Ｄ：Ｂ→Ａ      ＰＧＰ細胞。
【０１７１】
輸送の分極を、コントロール細胞（Ｂ／Ａ）およびＰＧＰ細胞（Ｄ／Ｃ）にお
いて算出する。ＰＧＰの内因的活性（ＩＡ）を、コントロール細胞と比較してＰ
ＧＰ細胞中でＰＧＰがＢ→Ａ輸送を容易にした量（Ｄ−Ｂ）と、コントロール細
胞と比較してＰＧＰ細胞中でＰＧＰがＡ→Ｂ輸送を妨害した量（Ａ−Ｃ）との合
計として算出する。ＰＧＰの内因的クリアランスを、非飽和条件下の線のスロー
プを算出することか、または飽和が観察された場合に算出された見かけ上のＫｍ
およびＶｍａｘ値からのいずれかによって、濃度依存性データのプロットから算
出する。内因的クリアランスを、ｍＬ／ｍ2／分として表す。
【０１７２】
ＡＴＰａｓｅデータは、有用な濃度応答データを表す。例えば、いくつかの化
合物についての見かけ上のＫｍ値は、ＡＴＰａｓｅと輸送系との間で良好な一致
する。しかし、他の薬物はＡＴＰａｓｅ活性を活性化するが、ＰＧＰによる輸送
は検出可能ではない。少なくとも、ＡＴＰａｓｅアッセイは、下回るとＰＧＰに
よる輸送に対する応答が薬物濃度に対して線形となる濃度範囲を同定し得る。こ
れは、ＰＧＰの内因的クリアランスを測定するための実験設計の単純化を可能に
し、これは、大量の化合物を試験する場合に重要な考慮事項となる。
【０１７３】
（ＩＶ．バイオアベイラビリティ）
バイオアベイラビリティ研究を、２つ以上の異なるＰＧＰ型を用いる上記アッ
セイの１つ以上を実施することによって行う。異なるＰＧＰ型は、異なる種（例
えば、イヌおよびヒト、カニクイザルおよびヒト、イヌおよびカニクイザルなど
）により得るか、または同一種の異なる対立遺伝子であり得る。これらのアッセ
イの結果を比較して、異なる種の個体または異なるＰＧＰ対立遺伝子を発現する
個体における薬物のバイオアベイラビリティを決定または推定する。１つの決定
の結果はまた、過去の（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ）コントロールとして、例えば、
ＡＴＰａｓｅまたは輸送に関して以前に決定された値に対して比較され得る。
【０１７４】
（プロトコールおよび手順）
（ＲＮＡの単離）
凍結したビーグルの肝臓を乳鉢および乳棒を用いて粉砕した。粉砕化された組
織（３００ｍｇ）を、ダンス型ホモジナイザーに移した。ＴＲＩｓｏｌ試薬（３
ｍＬ；カタログ番号１５５９６（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから））
を添加して、この組織をホモジネートし、次いで、室温で１５分間インキュベー
トした。溶液のアリコート（１ｍＬ）を３つのミクロチューブ（ｍｉｃｒｏｆｕ
ｇｅ  ｔｕｂｅ）に移し、そして２００μＬのクロロホルムを各チューブに添加
した。各チューブを高設定で１５秒間ボルテックスし、次いで、室温で３分間イ
ンキュベートし、次いで、１００００ｇで１５分間４℃にて遠心分離した。上部
の「水性」層を新しいミクロチューブに移し、一方、残存する下部および間の層
を捨てた。５００μＬのイソプロパノールを新しいチューブの各々に添加し、そ
してこのチューブを数回反転させることによって混合した。次いで、各チューブ
を室温で１０分間インキュベートし、次いで、１００００ｇでさらに１０分間４
℃にて遠心分離した。小さな白色ペレットが観察され、そして上清を捨てた。１
ｍＬの７５％エタノールを各チューブに添加した。このチューブを手短にボルテ
ックスし、次いで、１００００ｇで１０分間４℃にて遠心分離した。上清を捨て
、そしてペレットを室温で５分間乾燥させた。５０μＬのＤＥＰＣ処理滅菌脱イ
オン水を、各チューブに添加した。各ペレットを再懸濁し、そして各チューブの
内容物をプールした。
【０１７５】
再懸濁されたペレットの光学密度を、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｕ３０１０分光光度計
を用いて分析し、単離されたＲＮＡの量を決定した。次いで、このＲＮＡをＤＥ
ＰＣ処理滅菌脱イオン水を用いて、０．５５μｇ／μＬの濃度まで希釈した。２
ｍＬのこのＲＮＡを２つのミクロチューブに均等に分けた。次いで、１００μＬ
の５Ｍ  ＮａＣｌを各チューブに添加した。両方のチューブを１５分間６５℃ま
で加温し、次いで、氷上に５分間配置した。ＭｅｓｓａｇｅＭａｋｅｒ  ｍＲＮ
Ａ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号１０５５１−０１８（Ｌ
ｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから））からの５００μＬのＯｌｉｇｏ（ｄ
Ｔ）Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎを、両方のチューブに添加した
。次いで、これらのチューブを１０分間３７℃でインキュベートした。このチュ
ーブの内容物を、ＭｅｓｓａｇｅＭａｋｅｒ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  
Ｓｙｓｔｅｍに提供されたＦｉｌｔｅｒ  Ｓｙｒｉｎｇｅに移した。液体内容物
を排出した後、シリンジ中のペレットを、製造業者の指示書に従って、Ｗａｓｈ
Ｂｕｆｆｅｒ１およびＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ２を使用して洗浄した。シリン
ジ中のＲＮＡペレットを１ｍＬのＤＥＰＣ処理滅菌脱イオン水（６５℃）中に再
懸濁し、次いで、２．５μＬの５０μｇ／ｍＬグリコゲンおよび１００μＬの７
．５Ｍ酢酸アンモニウムを添加し、そして反転によって混合した。次いで、チュ
ーブの内容物を、２つのミクロチューブに移し、そして１ｍＬのエタノールを各
チューブに添加した。両方のチューブの内容物を、反転によって混合し、次いで
、−２０℃で一晩インキュベートした。
【０１７６】
このチューブを、１００００ｇで３０分間４℃にて遠心分離した。この上清を
捨て、そして２００μＬの７５％エタノールを各チューブに添加した。このチュ
ーブを１０秒間ボルテックスし、次いで、１００００ｇで１５分間４℃にて遠心
分離した。この上清を捨て、そして残存するすべての液体を注意深くピペッティ
ングで取り出した。このペレットを、１０μＬのＤＥＰＣ処理滅菌脱イオン水中
に再懸濁した。
【０１７７】
（ｃＤＮＡの調製）
ｃＤＮＡを、以下のように、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｋ１８０２−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡから））を用いて調
製した。４μＬの再懸濁ｍＲＮＡを、新しいミクロチューブに移し、そして以下
のプライマー（１０μＭ濃度）のうちの１つ（１μＬ）を添加した：Ｄｍ１６８
０ＲＬ  ｃｇｃ  ａｇｃ  ｃａｃ  ｔｇｔ  ｔｃｃ  ｃａａ  ｃｃａ  ｇｃｇ  
ｃｃａ  ｃｔ（配列番号１９；カスタムデザイン，Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．により合成）またはＭａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＫｉｔからのｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｉ
ｍｅｒ，ｎｎｔ  ｔｔｔ  ｔｔｔ  ｔｔｔ  ｔｔｔ  ｔｔｔ  ｔｔｔ  ｔｔｔ  
ｔｔｔ  ｔｔｔ  ｔｔｃ  ｇｃｃ  ｇｇｃ  ｇａｃ  ｔｔａ  ａｇａ  ｔｃｔ  
ｔ（配列番号２８）。チューブを７０℃で２分間インキュベートし、次いで、氷
上に５分間配置した。２μＬの５×Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ，
１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘおよび１μＬの２０Ｕ／μＬ  ＡＭＶ  Ｒ
ｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを各チューブに添加し、そして穏や
かに混合した。このチューブを４２℃にて１時間インキュベートし、次いで、氷
上に配置した。２μＬの各一本鎖ｃＤＮＡを、ＰＣＲにおけるテンプレートとし
て使用した（以下の「ＰＣＲ条件」を参照のこと）。４８．４μＬのＤＥＰＣ処
理脱イオン水、１６μＬの５×Ｓｅｃｏｎｄ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ，１
．６μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘおよび４μＬの２０×Ｓｅｃｏｎｄ−Ｓ
ｔｒａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを、残存するｃＤＮＡサンプルに
添加した。このチューブを、１６℃にて１．５時間インキュベートした。２μＬ
の５Ｕ／μＬ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼをこのチューブに添加し、次いで、こ
のチューブを１６℃にてさらに４５分間インキュベートした。２０×ＥＤＴＡ／
Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｍｉｘ（４μＬ）を添加し、次いで、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（カタログ番号２８３０４（ＱＩ
ＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡから））からの４３０μＬのＢｕ
ｆｆｅｒ  ＰＮを添加した。次いで、このサンプルをＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉ
ｎ  Ｃｏｌｕｍｎにローディングし、そして１００００ｇで１分間遠心分離した
。収集チューブを空にし、そして７５０μＬのＰＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＱＩＡＧＥ
Ｎ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに添加し、これを再度１００
００ｇで１分間遠心分離した。収集チューブを、もう一度空にし、そしてＱＩＡ
ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを１００００ｇで１分間遠心分離して、カ
ラムメンブレンを乾燥させた。５０℃まで加熱した５０μＬの滅菌脱イオン水を
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに添加し、そして室温で１分間イン
キュベートして、次いで、きれいなミクロチューブに、１００００ｇで１分間遠
心分離した。
【０１７８】
核酸を沈殿するために、１０．８μＬの７．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび１４
４μＬのエタノールをチューブに添加し、次いで、これを１００００ｇで２０分
間遠心分離した。この上清を除去し、次いで、３００μＬの７５％エタノールを
添加した。チューブをボルテックスし、そして１００００ｇで２０分間遠心分離
した。この上清を除去し、そしてこのサンプルを１２μＬの滅菌脱イオン水中に
再懸濁した。５μＬのこのｃＤＮＡを、きれいなミクロチューブに配置した。Ｍ
ａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔからの２μＬ
の１０μＭ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｄａｐｔｅｒ，２μＬ  ５×ＤＮ
Ａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒおよび１μＬの４００Ｕ／μＬ  Ｔ４  Ｄ
ＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを、このｃＤＮＡに添加し、そして穏やかに混合した。この
混合物を１６℃にて一晩インキュベートした。リガーゼを、７０℃で５分間、熱
不活化した。ＰＣＲを、テンプレートとしてこのサンプルを用いて実施した。
【０１７９】
（ＰＣＲ条件）
ＰＣＲを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ，ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）で供給された試薬を用いて実施した。簡潔
には、２μＬのｃＤＮＡを２００μＬ  ＭｉｃｒｏＡｍｐ反応チューブ（カタロ
グ番号Ｎ８０１−０５４０，ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中に配置し、次いで
、３４μＬの滅菌脱イオン水、５μＬの１０×Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ａｄｖａｎｔ
ａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（カタログ番号４７００−１  Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、３μＬの１０ｍＭ  Ａ
ｄｖａｎｔａｇｅ  ＵｌｔｒａＰｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ  Ｍｉｘ（カタログ番号８４３０−１  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、および各々２μＬの順方向および逆方向プライマー（
１０ｍＭ濃度）を添加した。プライマーは、以下のいずれかであった：Ｍａｒａ
ｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＫｉｔからのＭａｒａｔｈ
ｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｄａｐｔｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ  １，ｃｃａ  ｔｃｃ  ｔａａ
ｔａｃ  ｇａｃ  ｔｃａ  ｃｔｇ  ｔａｇ  ｇｇｃ（配列番号２９）、または
Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．によって作製された種々の
カスタム遺伝子特異的プライマー。カスタムプライマーとしては、以下が挙げら
れる（すべて、５’−３’として列挙した）：Ｄｍ４０９ＦＬ：ｇｇａ  ｇｃｇ
ｃｇａ  ｇｇｔ  ｃｇｇ  ｇａｔ  ｇｇａ  ｔｃ（配列番号２０），Ｄｍ１４
５５ＲＬ：ｇｃａ  ａａｔ  ｇｃｔ  ｔｃａ  ａｔｇ  ｃｔｔ  ｇｇｇ  ｇａｔ
ｇｃｃ  ｔｇｔ  ｃｃａ  ａ（配列番号３０），Ｄｍ２０３７Ｆ：ａｇａ  ａ
ａｃ  ａｇａ  ｇａａ  ｔｃｇ  ｃｃａ  ｔｔｇ  ｃｔｃ（配列番号１３），Ｄ
ｍ３９２０ＲＬ：ｇａｇ  ｃｔｇ  ｇｇｔ  ｔｃｃ  ｔｔｔ  ｇｔｃ  ｔｃｃ  
ｔａｃ  ｔｃｔ  ｇｇｔ  ｇｔｔ（配列番号３１），Ｄｐ１２１６Ｆ：ｇａａ  
ｃｔｇ  ｔｇａ  ｔｔｇ  ｃｇｔ  ｔｔｇ  ｇａｇ  ｇａｃ（配列番号９）およ
びＤｐ２５８７Ｒ：ｇｃａ  ａａｔ  ｇｃｔ  ｇｇｔ  ｔｇｃ  ａｇｇ  ｃｃｔ
ｃｃ（配列番号３２）。
【０１８０】
熱サイクルを、９４℃にて３０秒間、次いで、９４℃にて５秒間および７２℃
にて４分間の２サイクル、次いで、９４℃にて５秒間および６８℃にて４分間の
１６サイクルで、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９７００を使用して実施した。
【０１８１】
４つのフラグメントを、各遺伝子型についてのＰＣＲによって獲得した。フラ
グメント１は、プライマーにＭａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｄａｐｔｅｒ  Ｐ
ｒｉｍｅｒ  １およびＤｍ１４５５ＲＬを使用して生成された。フラグメント２
は、プライマーＤｐ１２１６ＦおよびＤｐ２５８７Ｒを使用して生成された。フ
ラグメント３は、プライマーＤｍ２０３７ＦおよびＤｍ３９２０ＲＬを使用して
生成された。フラグメント４は、プライマーＤｐ３６１２ＦＬおよびＭａｒａｔ
ｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｄａｐｔｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ  １を使用して生成された。
【０１８２】
（ＰＣＲ後サンプリングプロセス）
電気泳動を、１０×ゲルローディング緩衝液ＩＶ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら編，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１
９８９，６．１２頁）を使用して、ＥｔＢｒを含有する０．５×ＴＢＥ緩衝液（
Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｂ−２３頁）中における１％アガロースゲルにおいて、す
べてのＰＣＲ産物に対して実施した。ＰＣＲ産物を含有するゲルのフラグメント
を切り出し、そして２ｍＬのミクロチューブ中に配置した。各フラグメントの質
量を決定し、そしてＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ
（カタログ番号２８７０４（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．から））からの３μＬ／ｍ
ｇのＢｕｆｆｅｒ  ＱＸ１を添加した。次いで、各チューブを、２分毎に混合し
つつ、５０℃で１０分間インキュベートした。１μＬ／ｍｇのイソプロパノール
を各チューブに添加し、そして混合した。生じた溶液をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅ
ｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ＫｉｔからのＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌ
ｕｍｎに移した。これらのカラムを、室温にて１分間１００００ｇで遠心分離し
た。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔからの７５０μ
ＬのＢｕｆｆｅｒ  ＰＥを、各チューブに添加し、次いで、室温にて１分間１０
０００ｇで遠心分離した。各カラムを、再度、室温にて１分間１００００ｇで遠
心分離して、あらゆる残留緩衝液を除去した。３０μＬの滅菌脱イオン水（５０
℃）を各カラムに添加し、そして室温にて１分間インキュベートした。次いで、
各カラムをミクロチューブ中に配置し、そして１分間１００００ｇで遠心分離し
た。
【０１８３】
次いで、６μＬの精製ＰＣＲ産物を、きれいなミクロチューブに移し、そして
１μＬの１０×Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ，２μＬのｐＣＲ２．１ベクタ
ーおよび１μＬのＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（すべて、Ｏｒｉｇｉｎａｌ  Ｔ
Ａ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｋ２０００−Ｊ１０）Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから）をこのミクロチューブに添加し、そし
て混合した。この反応物を、１６℃で一晩インキュベートした。
【０１８４】
凍結したＯｎｅ  Ｓｈｏｔコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１つ
の５０μＬバイアルを、各連結反応のために、氷上で解凍した。３．５μＬの連
結反応混合物を、コンピテント細胞に添加し、そして穏やかに混合した。この細
胞を、３０分間氷上でインキュベートし、次いで、４２℃で３０秒間「熱ショッ
ク」を与えた。再度氷上で冷却した後、２５０μＬのＳＯＣ培地（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）を各バイアルに添加し、そしてこのバイアルを直接、３７℃の水浴中
に１時間配置した。各形質転換反応物の５０μＬおよび２００μＬのアリコート
を、１％アガロース，１ｍｇ／ｍＬグルコース，５０ｎｇ／ｍＬアンピシリンお
よび１．６ｎｇ／ｍＬ  Ｘ−ｇａｌを含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ  Ｍ
ｅｄｉｕｍ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ａ−１頁）に配置した。次いで、接種したプ
レートを、３７℃で一晩インキュベートした。白色化コロニーを選択し、そして
５０ｎｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬ−Ｂ培地の個々の１００ｍＬ培養物を
接種するために使用した。これを、１００ｒｐｍで撹拌しつつ、３７℃で一晩イ
ンキュベートした。
【０１８５】
プラスミドＤＮＡを、以下のように製造業者の指示書に従って、ＱＩＡＧＥＮ
Ｍｉｄｉ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（カタログ番号１２１４３（ＱＩＡＧＥＮ
Ｉｎｃ．から））を用いて調製した。各１００ｍＬの培養物を、２つの５０ｍ
Ｌ円錐状バイアル中に等分し、そして３０００ｇで１０分間４℃にて遠心分離し
た。上清を注ぎ出し、そして４ｍＬのＢｕｆｆｅｒ  Ｐ１を用いて、２つのバイ
アルの一方で、このペレットを再懸濁した。この上清を他のチューブに移し、そ
してこのペレットを再懸濁するために使用した。Ｂｕｆｆｅｒ  Ｐ２（４ｍＬ）
を添加し、混合し、そしてこの懸濁物を室温で５分間インキュベートした。Ｂｕ
ｆｆｅｒ  Ｐ３（４ｍＬ）を添加し、混合し、そして懸濁物を４℃で１５分間イ
ンキュベートした。このサンプルを、３０００ｇで１５分間４℃にて遠心分離し
た。すべての上清を、４ｍＬのＢｕｆｆｅｒ  ＱＢＴで予め処理されたＱＩＡｇ
ｅｎ−ｔｉｐ  １００に移した。この上清をカラムから流出させた。Ｂｕｆｆｅ
ｒ  ＱＣ（１０ｍＬ）をこのカラムに添加し、そして流出させた。さらなる１０
ｍＬのＢｕｆｆｅｒ  ＱＣを添加し、そして流出させた。最後に４ｍＬのＢｕｆ
ｆｅｒ  ＱＦをカラムに添加して、そしてきれいな１５ｍＬの円錐状チューブ中
に流出させた。２．８ｍＬのイソプロパノールを添加し、そしてこの溶液と混合
した。これを、ミクロチューブに等分し、４℃にて１０分間インキュベートし、
そして１００００ｇで１５分間４℃にて遠心分離した。上清を除去し、次いで、
１ｍＬの７０％エタノールを各ミクロチューブに添加した。各チューブを、手短
にボルテックスし、次いで、１００００ｇで１５分間４℃にて遠心分離した。こ
の上清を除去し、そして１００μＬの滅菌１×ＴＥ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋら
，Ｂ−２０頁）を添加した。
【０１８６】
制限消化を、精製ＤＮＡにおいて実施した。フラグメントを切り出すために使
用された酵素は、以下の通りであった：フラグメント１，ＫｐｎＩ（カタログ番
号Ｒ０１４２Ｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖ
ｅｒｌｙ，ＭＡから））およびＮｓｉＩ（カタログ番号Ｒ０１２７Ｓ（Ｎｅｗ  
Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から））；フラグメント２，Ｎｓｉ
ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（カタログ番号Ｒ０１０４Ｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から））；フラグメント３，ＨｉｎｄＩＩＩおよび
ＰｓｔＩ（カタログ番号Ｖ０２７９Ｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ
ｓ，Ｉｎｃ．から））；ならびに、フラグメント４，ＰｓｔＩおよびＮｏｔＩ（
カタログ番号Ｒ０１８９Ｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ
．から））。すべての制限消化を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓに
よって推奨される消化緩衝液中で３７℃にて実施した。
【０１８７】
電気泳動を、１０×ゲルローディング緩衝液ＩＶ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、６．
１２頁）を使用して、ＥｔＢｒを含有する０．５×ＴＢＥ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら、Ｂ−２３頁）中における１％アガロースゲルにおいて、すべての制限消
化産物に対して実施した。制限消化産物を含有するゲルのフラグメントを切り出
し、そして２ｍＬのミクロチューブ中に配置した。ＤＮＡフラグメントを、製造
業者の指示に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉ
ｔ（カタログ番号２８７０４（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．から））を使用して、ゲ
ルスライスから抽出した。各フラグメントの質量を決定し、そして３μＬ／ｍｇ
のＢｕｆｆｅｒ  ＱＸ１を添加した。次いで、各チューブを、２分毎に混合しつ
つ、１０分間５０℃でインキュベートした。１容量のイソプロパノールを各チュ
ーブに添加して、そして混合した。生じた溶液を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｓｐｉｎ
ｃｏｌｕｍｎに移し、そして１分間１００００ｇで室温にて遠心分離した。Ｂ
ｕｆｆｅｒ  ＰＥ（７５０μＬ）を各カラムに添加し、次いで、１分間１０００
０ｇで室温にて遠心分離した。各カラムを、再度１分間１００００ｇで室温にて
遠心分離して、あらゆる残留緩衝液を除去する。３０μＬの滅菌脱イオン水（５
０℃）を各カラムに添加し、そして１分間室温にてインキュベートする。次いで
、各カラムを、ミクロチューブ中に配置し、そして１分間１００００ｇで遠心分
離する。
【０１８８】
２μＬの各フラグメントを、ミクロチューブに添加し、同様に１μＬの１０×
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒおよび１μＬのＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（
カタログ番号Ｍ０２０２Ｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ
．から））を添加した。この反応物を、１６℃で一晩インキュベートした。制限
酵素ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ（各々１μＬ）を反応に添加し、そして３７℃で１
時間インキュベートした。電気泳動を、１０×ゲルローディング緩衝液ＩＶを用
いて、ＥｔＢｒを含有する０．５×ＴＢＥ緩衝液中において１％アガロースゲル
において実施した。アセンブルした産物を含有するフラグメントを切り出し、そ
して上記のようにＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを
使用して、ＤＮＡフラグメントを抽出した。
【０１８９】
フラグメントを、以下のように、Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  
Ｋｉｔを使用して、ベクター中に連結した：６μＬの精製ＤＮＡを、きれいなミ
クロチューブに移し、そして１μＬの１０×Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ，
２μＬのｐＣＲ２．１ベクター（予め、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化），およ
び１μＬのＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを添加し、そして混合した。この反応物
を、１６℃にて一晩インキュベートした。連結反応混合物（３．５μＬ）を用い
て、上記のようにＯｎｅ  Ｓｈｏｔコンピテント細胞を形質転換するために使用
した。形質転換反応物の５０μＬおよび２００μＬのアリコートを、１％アガロ
ース，１ｍｇ／ｍＬグルコース，５０ｎｇ／ｍＬアンピシリンおよび１．６ｎｇ
／ｍＬ  Ｘ−ｇａｌを含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ  Ｍｅｄｉｕｍに配
置し、そして上記のように増殖した。白色化コロニーを、上記のように選択し、
そして増殖した。プラスミドＤＮＡを、上記のようにＱＩＡＧＥＮ  Ｍｉｄｉ  
Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔを用いて単離し、そして精製した。ＤＮＡを、１００μ
Ｌの滅菌１×ＴＥ緩衝液中に再懸濁した。次いで、このＤＮＡを、Ｔｕｆｔｓ  
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｒｅ  ＦａｃｉｌｉｔｙによるＡＢＩ  １００  Ｄ
ＮＡシーケンサー（ＡＢＩから）を使用して、配列決定した。
【０１９０】
（イヌＰ−糖タンパク質の４つの遺伝子型の同定）
実施例１において同定されたイヌＰ−糖タンパク質を、ここで、遺伝子型Ｃと
命名した。本実施例に記載されたようなビーグル肝臓から単離されたＤＮＡの配
列決定によって、イヌＰ−糖タンパク質の３つのさらなる対立遺伝子改変体（遺
伝子型Ａ、Ｂ、およびＤと命名）の同定が可能となった。ＤＮＡ配列における対
立遺伝子差異を、以下の表１に示す。
【０１９１】
【表１】
2012061008.tif 000008
遺伝子型Ａは、配列番号２に対して塩基番号６０７に、異なるヌクレオチドを
有する。これは、ＤＮＡ配列におけるＣからＡへの塩基変化であり、これによっ
て、アミノ酸１９７位でのヒスチジンからグルタミンへのアミノ酸変化が引き起
こされる。遺伝子型Ｂは、配列番号２に対して塩基番号９１および６０７で異な
るヌクレオチドを有する。９１位での塩基変化は、ＴからＡへであり、そしてア
ミノ酸２５位でのアスパラギンからリシンへのアミノ酸変化を引き起こす。６０
７位での塩基変化は、遺伝子型Ａにおける変化と同一である。遺伝子型Ｄは、配
列番号２に対して塩基番号９１、６０７、１００１、および３４５８に、異なる
ヌクレオチドを有する。９１位および６０７位での塩基変化は、遺伝子型Ｂにお
ける変化と同一である。１００１位での塩基変化は、ＴからＡへであり、そして
アミノ酸３２９位でのセリンからスレオニンへのアミノ酸変化を引き起こす。３
４５８位での塩基変化は、ＡからＧへであり、そしてアミノ酸１１４８位でのメ
チオニンからバリンへのアミノ酸変化を引き起こす。
【０１９２】
以前に同定されたイヌＰ−糖タンパク質（配列番号３および４；ＧｅｎＢａｎ
ｋ登録番号ＡＦ０４５０１６）は、遺伝子型ＣイヌＰ−糖タンパク質ヌクレオチ
ド配列（配列番号１）とは異なる１３個のヌクレオチドを有している。ＡＡＴを
取り去る塩基８９〜塩基９１（配列番号１に対して）に３塩基欠失が存在し、こ
れによって、アミノ酸２５位のアスパラギンの欠失が引き起こされる。５９０位
でのＡからＧへの塩基変化が存在し、これによって、アミノ酸１９２位でのイソ
ロイシンからバリンへのアミノ酸変化が引き起こされる。６０７位でのＣからＡ
への塩基変化が存在し、これによって、アミノ酸１９７位でのヒスチジンからグ
ルタミンへのアミノ酸変化が引き起こされる。６５１位でのＧからＣへの塩基変
化が存在し、これによって、アミノ酸２１２位でのアルギニンからプロリンへの
アミノ酸変化が引き起こされる。８７８位でのＧからＡへの塩基変化が存在し、
これによって、アミノ酸２８８位でのグリシンからアルギニンへのアミノ酸変化
が引き起こされる。１００１位でのＴからＡへの塩基変化が存在し、これによっ
て、アミノ酸３２９位でのセリンからスレオニンへのアミノ酸変化が引き起こさ
れる。１０１２位でのＡからＧへの塩基変化が存在する。これによっては、アミ
ノ酸変化は引き起こされない。これは、アミノ酸３３２位のグルタミンでのサイ
レントな点変異である。１６１１位でのＡからＧへの塩基変化が存在し、これに
よって、アミノ酸５３２位でのグルタミンからアルギニンへのアミノ酸変化が引
き起こされる。２０９８位でのＡからＴへの塩基変化が存在する。これによって
は、アミノ酸変化は引き起こされない。これは、アミノ酸６９４位のバリンでの
サイレントな点変異である。２１０２位でのＣからＴへの塩基変化が存在し、こ
れによって、アミノ酸６９６位でのプロリンからセリンへのアミノ酸変化が引き
起こされる。３８０８位でのＣからＴへの塩基変化が存在する。これによっては
、アミノ酸変化は引き起こされない。これは、アミノ酸１２６４位のアラニンで
のサイレントな点変異である。３８３３位でのＧからＡへの塩基変化が存在し、
これによって、アミノ酸１２７３位でのバリンからイソロイシンへのアミノ酸変
化が引き起こされる。４０８０位でのＣからＴへの塩基変化が存在し、これによ
って、アミノ酸１３５５位でのスレオニンからイソロイシンへのアミノ酸変化が
引き起こされる。
【０１９３】
前述の特許、特許出願、および参考文献の各々が、本明細書中で参考として援
用される。本発明を、特定の実施形態に関して記載してきたが、多くの改変およ
び変更が、本発明の意図から逸脱することなく当業者によってなされ得ることが
理解されるべきである。このような改変、変更、および等価物は、以下の特許請
求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【数１】
2012061008.tif 000009
【数２】
2012061008.tif 000010
【数３】
2012061008.tif 000011
【数４】
2012061008.tif 000012
【数５】
2012061008.tif 000013
【数６】
2012061008.tif 000014
【数７】
2012061008.tif 000015
【数８】
2012061008.tif 000016
【数９】
2012061008.tif 000017
【数１０】
2012061008.tif 000018
【数１１】
2012061008.tif 000019
【数１２】
2012061008.tif 000020
【数１３】
2012061008.tif 000021
【数１４】
2012061008.tif 000022
【数１５】
2012061008.tif 000023
【数１６】
2012061008.tif 000024
【数１７】
2012061008.tif 000025
【数１８】
2012061008.tif 000026
【数１９】
2012061008.tif 000027
【数２０】
2012061008.tif 000028
【数２１】
2012061008.tif 000029
【数２２】
2012061008.tif 000030
【数２３】
2012061008.tif 000031
【数２４】
2012061008.tif 000032
【数２５】
2012061008.tif 000033
【数２６】
2012061008.tif 000034
【数２７】
2012061008.tif 000035
【数２８】
2012061008.tif 000036
【数２９】
2012061008.tif 000037
【数３０】
2012061008.tif 000038
【数３１】
2012061008.tif 000039
【数３２】
2012061008.tif 000040
【数３３】
2012061008.tif 000041
【数３４】
2012061008.tif 000042
【数３５】
2012061008.tif 000043
【数３６】
2012061008.tif 000044
【数３７】
2012061008.tif 000045
【数３８】
2012061008.tif 000046
【数３９】
2012061008.tif 000047
【数４０】
2012061008.tif 000048
【数４１】
2012061008.tif 000049
【数４２】
2012061008.tif 000050
【数４３】
2012061008.tif 000051
【数４４】
2012061008.tif 000052
【数４５】
2012061008.tif 000053
【数４６】
2012061008.tif 000054
【数４７】
2012061008.tif 000055
【数４８】
2012061008.tif 000056
【数４９】
2012061008.tif 000057
【数５０】
2012061008.tif 000058
【数５１】
2012061008.tif 000059
【数５２】
2012061008.tif 000060
【数５３】
2012061008.tif 000061
【数５４】
2012061008.tif 000062
【配列表】
2012061008000001.app
【外国語明細書】
2012061008000001.pdf