(57)【要約】【課題】  培地中に高濃度にケフィランを蓄積させることができる培養方法（ケフィランを効率よく産生させることができる）を提供すること。【解決手段】  乳酸菌を培養することにより多糖類を生産する方法において、培養開始時における培地中の炭素源が１０〜５０質量％消費された時点で、培養温度を下げた後、さらに当該乳酸菌を培養することを特徴とするする方法。本発明によれば、培養液中に高濃度の多糖類を蓄積することができることから、より効率良く多糖類を生産することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌を培養することにより多糖類を生産する方法において、
培養開始時における培地中の炭素源が１０〜５０質量％消費された時点で、培養温度を下げた後、さらに当該乳酸菌を培養することを特徴とするする方法。
【請求項２】
培養温度を１〜４℃下げる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
培養開始時の培養温度が３２〜２９℃である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
乳酸菌がケフィラン酸生産能を有する微生物である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ケフィラン酸生産能を有する微生物が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属に属する微生物、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ケフィラン酸生産能を有する微生物が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓである請求項５記載の方法。
【請求項７】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ＪＣＭ６９８５である請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は菌の体外に多糖類を生産することが知られており、菌の種類によって多種多様な多糖類を生産する。このような多糖類は、その物理化学的性質や生理機能により、食品や化粧品、医療用途等幅広い用途で用いられることから、その発酵生産方法について盛んに研究がなされている。
【０００３】
そのなかでも、ロシアのコーカサス地方原産の発酵乳ケフィールに含まれるケフィランは、美白、美肌、保湿等の美容効果やコレステロール低下、抗腫瘍、免疫賦活等の成人病予防の効果が期待できることから注目されている。ケフィランは乳酸菌による発酵生産により生産され、培地組成を変更した培養方法について検討が行われている（特許文献１〜３参照）。
【０００４】
しかしながら、これらの培地組成の変更のみでは、培地中に高濃度にケフィランを蓄積させることができない。すなわち、ケフィランを効率よく産生させることができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６１−２５７１９７号公報
【特許文献２】特開平３−２９２８９４号公報
【特許文献３】特開２００２−３３０７９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の主な目的は、培地中に高濃度にケフィランを蓄積させることができる培養方法（ケフィランを効率よく産生させることができる方法）を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、乳酸菌を培養する温度を変化させることにより上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、乳酸菌を培養することにより多糖類を生産する方法において、培養開始時における培地中の炭素源が１０〜５０質量％消費された時点で、培養温度を下げた後、さらに当該乳酸菌を培養することを特徴とするする方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、培養液中に高濃度の多糖類を蓄積することができることから、効率良く多糖類を生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（１）乳酸菌由来の多糖類
乳酸菌の生産する乳酸菌由来の多糖類には、単一の糖からなるホモ多糖と、複数の単糖や単糖誘導体からなるヘテロ多糖がある。
【００１１】
ホモ多糖には、グルコースからなるデキストラン、βグルカン、ムタン、アルテルナン等；フルクトースからなるレバン、イヌリン等；ガラクトースからなるガラクタン等が知られている。
【００１２】
ヘテロ多糖は、単糖のグルコース、ガラクトース、ラムノース、フコース、糖誘導体であるＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルクロン酸等の少なくとも２種類以上で構成されるユニットが連なったものである。代表的なヘテロ多糖としては、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸からなるヒアルロン酸、グルコースとガラクトースからなるケフィラン等が挙げられる。本明細書では、これらの多糖類のうち、代表してケフィランについて述べる。
【００１３】
（２）ケフィラン生産能を有する微生物
ケフィラン生産能を有する微生物としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属に属する微生物、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物等が挙げられる。これらの中でも、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物が好ましい。ケフィラン産生能が高いからである。また、これら以外の微生物でも、遺伝子工学的手法を用いてケフィラン生産能を得た微生物も使用することができる。
【００１４】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓが好ましく、特にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ＪＣＭ６９８５が好ましい。このＪＭＣ株については独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ）微生物材料開発室より入手することが可能である。
【００１５】
（３）培養方法
本発明では、乳酸菌の培養過程において、培養途中で培養温度を下げることにより、ケフィランを効率よく得ることができる。培養途中で培養温度を変化させるのは、まずは、できるだけ多くの乳酸菌を生育させ、ケフィラン生産酵素の産生を刺激し、当該生産酵素の至適温度に調整することにより効率よいケフィラン生産が可能になるためである。
【００１６】
より詳細には、乳酸菌の培養を開始して、培養開始時における培地中の炭素源が１０〜５０質量％（すなわち、培地中の炭素源の残量が５０〜９０質量％）、好ましくは１３〜４５質量％、より好ましくは１５〜４０質量％消費された時点で、培養温度を下げる。炭素源が１０質量％以上消費された時点で培養温度を下げるのは、十分な量の乳酸菌が生育するからである。炭素減が５０質量％消費された時点までに培養温度を下げるのは、乳酸菌におけるケフィラン生産に関与する酵素が十分に発現するための栄養源が必要だからである。便宜的に、本明細書において、培養温度を下げる前の期間を「培養前期」、培養温度を下げた後を「培養後期」とする。
【００１７】
培養前期の培養温度は２９〜３２℃、好ましくは２９．３〜３１．５℃、より好ましくは２９．５〜３１℃とすればよい。培養前期の培養温度をこの範囲に設定するのは、乳酸菌の生育が促進され、ケフィラン生産に関与する酵素が十分に発現するからである。
【００１８】
培養後期の培養温度は培養前期よりも低くする。例えば１〜４℃、好ましくは１．３〜３．５℃、より好ましくは１．５〜３℃低くすればよい。培養後期に温度を下げるのはケフィラン生産に関与する酵素の多糖合成能を促進することができるからである。
【００１９】
その他の培養条件は、ケフィランが生産できれば限定されるものではないが、ケフィラン産生菌が嫌気性細菌であるので、無通気状態で静置又は弱攪拌して培養することが好ましい。培地中の成分やｐＨを均一に保つためにも、弱撹拌（培地が泡立たない程度の撹拌）で培養を行うのがより好ましい。また、大気雰囲気下で培養することもできるが、培地中の溶存酸素を低下させるために培養槽内の気相部および培養液中を窒素等の不活性ガスによって置換しておくことがより好ましい。圧力についても限定されず、大気圧雰囲気下で培養すればよい。
【００２０】
培養中の培地のｐＨは４〜８、好ましくは４．３〜７、より好ましくは４．５〜６に制御すればよい。上記ｐＨの範囲で培養することにより十分にケフィランが産生されるからである。培養時間も限定されず、微生物の生育、培養液の量、所望のケフィランの量に応じて適宜選択することができる。
【００２１】
なお、培養（本培養）の前に、前培養を行うことが好ましい。前培養とは、本培養に接種するためのシード（種）を調製するための培養である。前培養を適切に行うことにより、本培養のシードとして必要な菌体量を確保することができる。前培養に用いる培地は、本培養において微生物が十分に生育しケフィランが十分得られれば限定されない。例えば、本培養の初発培地と同様の炭素源、窒素源等、無機塩類を含有することができ、必要に応じてその他の成分を添加することもできる。前培養時の培養温度やｐＨ、圧力、培養時間についても、本培養における微生物の生育を妨げる条件でなければよい。
【００２２】
例えば、前培養の条件としては、グルコース、フルクトース等の炭素源、ポリペプトン、酵母エキス、麦芽エキス等の窒素源、ビタミン、無機塩類を含む培地中で培養すればよい。ｐＨは４〜８に調整し、温度は２０〜３７℃に制御して嫌気的に培養することが好ましい。培養時間も特には限定されず、例えば４８〜９６時間とすればよい。
【００２３】
（４）培地（本培養）
本発明で使用する培地は、乳酸菌がケフィランを生産できれば限定されず、炭素源、窒素源、不飽和脂肪酸もしくはそのエステル、無機塩類、その他の成分を含んでいればよい。
【００２４】
（４−１）炭素源
炭素源としては、グルコース、フルクトース等の単糖類；ラクトース、スクロース、マルトース等の二糖類；オリゴ糖類、セルロース、アミロース、キチン、アガロース等の多糖類；酢酸、プロピオン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。これらの中でもグルコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース等が好ましく、グルコース、ラクトース、マルトースがより好ましい。
【００２５】
培地中における炭素源の濃度は特に限定されない。例えば、０．５〜２０（ｗ／ｖ）％、好ましくは２〜１５（ｗ／ｖ）％、より好ましくは５〜１３（ｗ／ｖ）％とすることができる。０．５（ｗ／ｖ）％以上用いるのはケフィラン産生能が上昇するからであり、２０（ｗ／ｖ）％以下とするのはそれ以上添加しても飛躍的な効果の上昇が認められないからである。
【００２６】
（４−２）窒素源
（i）ペプトン
ペプトンとは、タンパク質を加水分解、酵素分解又は発酵することによって得られる、アミノ酸が複数結合した物質をいう。由来によって様々なペプトンが存在し、例えば、肉エキス、カゼインペプトン、魚肉ペプトン、大豆ペプトン、エンドウ豆ペプトン、小麦ペプトン、大麦ペプトン、綿実ペプトン等が挙げられる。本発明では、これらの中でもカゼインペプトン、大豆ペプトンを用いることが好ましい。これらのペプトンを使用することにより、乳酸菌がケフィランを効率よく産生するからである。
【００２７】
ペプトンの培地中における濃度は特に限定されない。０．５〜１０（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．８〜８（ｗ／ｖ）％、より好ましくは１〜５（ｗ／ｖ）％の範囲とすればよい。０．５（ｗ／ｖ）％以上用いるのはケフィラン産生能が上昇するからであり、１０（ｗ／ｖ）％以下とするのはそれ以上添加しても飛躍的な効果の上昇が認められないからである。
【００２８】
（ii）酵母エキス
酵母エキスとは、酵母の有効成分を自己消化、酵素処理、熱水処理等で抽出したものをいう。例えば、パン酵母、ビール酵母、トルラ酵母由来のものが挙げられ、本発明ではいずれの酵母を用いてもよい。これらの中でも、パン酵母を使用することにより、乳酸菌がケフィランを効率よく産生するので好ましい。
【００２９】
酵母エキスの培地中における濃度は特に限定されない。０．２〜１０（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．５〜８（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．８〜４（ｗ／ｖ）％の範囲とすればよい。０．２（ｗ／ｖ）％以上用いるのはケフィラン産生能が上昇するからであり、１０（ｗ／ｖ）％以下とするのはそれ以上添加しても飛躍的な効果の上昇が認められないからである。
【００３０】
（４−３）不飽和脂肪酸又はそのエステル
本発明で使用する不飽和脂肪酸又はそのエステルとは、１つ以上の不飽和炭素結合を有する脂肪酸又はそのエステル化合物を意味する。本発明においては、乳酸菌が効率よくケフィランを産生することができれば、炭素数や不飽和度の数は限定されない。
【００３１】
より詳細には、例えば、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸等のモノ不飽和脂肪酸；リノール酸、エイコサジエン酸、ドコサジエン酸等のジ不飽和脂肪酸；リノレン酸、ミード酸等のトリ不飽和脂肪酸；アラキドン酸等のテトラ不飽和脂肪酸、又はこれら不飽和脂肪酸のエステルが挙げられられる。これらの中でもオレイン酸、エライジン酸、オレイン酸エステルが好ましく、オレイン酸及びオレイン酸エステルであるポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）がより好ましい。これらを使用することにより、乳酸菌が効率よくケフィランを産生することができるからである。
【００３２】
不飽和脂肪酸又はそのエステルの培地中への添加量は０．７〜８ｍＭとすればよく、好ましくは１〜６ｍＭ、より好ましくは１．５〜４ｍＭの範囲とすればよい。０．７ｍＭ以上とすることによりケフィランを効率よく生産することができる。また、８ｍＭ以下とするのは、それ以上使用しても更なるケフィランの生産効率の向上が認められないからである。
【００３３】
（４−４）無機塩類
培地に添加される無機塩類の種類は、微生物が十分にケフィランを産生することができれば、特には限定されない。例えば、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、カルシウム、マンガン、コバルト、ニッケル、モリブデン、タングステン、鉄、亜鉛、銅等の、酢酸、リン酸、硫酸、炭酸、塩化物等の塩が挙げられる。これらの中でも、塩化カリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛、硫酸銅からなる群から選ばれる少なくとも１種が好ましい。
【００３４】
これら無機塩類の添加量は限定されず、当業者が適宜選択することができる。例えば、複数の無機塩類を使用する場合、その合計量として、０．１〜１．６（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．３〜１．３（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．５〜１（ｗ／ｖ）％とすればよい。０．１（ｗ／ｖ）％以上用いるのはケフィラン産生能が上昇するからであり、１（ｗ／ｖ）％以下とするのはそれ以上添加しても飛躍的な効果の上昇が認められないからである。
【００３５】
（４−５）その他
その他、ビタミンや、培養中の培地の発泡を防ぐための消泡剤等を添加してもよい。さらに、ベクター及び目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧をかけた状態で培養してもよい。すなわち、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合には、相当する薬剤を培地に添加してもよい。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含む遺伝子組換え微生物を培養する場合には、培地にアンピシリンを添加してもよい。これらの添加量も限定されず、当業者が適宜選択することができる。
【００３６】
培地は、加熱処理（加熱殺菌）を行った後に、微生物の培養に用いることができる。滅菌（殺菌）の条件は、微生物が完全に殺菌されれば限定されない。例えば、１００〜１３０℃で５〜３０分間、より好ましくは１２１〜１２５℃で１５〜３０分間という条件を挙げることができる。また、培地に使用する成分により、培地の一部又は全部の成分を、ろ過滅菌等による非加熱滅菌を行って使用することもできる。
【００３７】
（５）ケフィラン
本発明で得られたケフィランは、そのまま保存することもできるし、公知の方法で精製することもできる。当該ケフィランは、増粘や感触の効果から食品用途；美白、保湿等の効果から化粧品用途；コレステロール低下、抗腫瘍、免疫賦活等の効果から健康食品用途に使用することができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例、比較例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００３９】
＜実施例１＞
ラクトース・１水和物１０（ｗ／ｖ）％、トリプトン２（ｗ／ｖ）％（Ｄｉｆｃｏ）、酵母エキス１（ｗ／ｖ）％（オリエンタル酵母）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）０．１（ｗ／ｖ）％；０．７６ｍｍｏｌ／Ｌ（和光純薬）、リン酸水素２カリウム０．２（ｗ／ｖ）％、酢酸ナトリウム０．５（ｗ／ｖ）％、硫酸マンガン・５水和物０．０２８（ｗ／ｖ）％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５８（ｗ／ｖ）％、塩化カルシウム・２水和物０．０７４（ｗ／ｖ）％、アデカプルロニックＬ−６１  ０．０２（ｗ／ｖ）％（旭電化工業）の組成からなる培地を３Ｌのジャーファメンターに２．０Ｌ添加した後、当該培地を１２１℃、２０分加熱殺菌した。
【００４０】
前培養として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ  ＪＣＭ６９８５をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈ  ５．５（ｗ／ｖ）％（Ｄｉｆｃｏ）からなる前培養培地２００ｍｌを含む３００ｍｌ三角フラスコに植菌し、３０℃、７２時間静置培養した。
【００４１】
得られた前培養液を上記滅菌済み培養液中に１質量％接種し、１２質量％水酸化ナトリウム水溶液にて培養液のｐＨを５．０に制御しながら無通気条件で微攪拌しながら３０℃で４８時間培養した（培養前期）。このとき、培地中の炭素源の消費割合は３４．１質量％であった。その後、培養温度を２７℃に変化させ、培養開始から８８時間まで培養を行った（培養後期）。
【００４２】
培養液中のラクトース含量はＦ−キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）で測定した。ケフィラン含量は、アンスロン硫酸法にて測定した。ケフィランの蓄積量は４．９０ｇ／Ｌであった。結果は表１に示す。
【００４３】
※  アンスロン硫酸法
培養液を０．２Ｍ  ＮａＣｌ水溶液で２０倍に希釈し、その０．７ｍｌにエタノールを等量加えて混合することによりケフィランを析出させた。遠心分離し、上清を取り除き沈殿を得た。上記操作を再度繰り返して得た沈殿に蒸留水を０．７ｍｌ加えて溶解し、ケフィラン含有液を作成した。
【００４４】
アンスロン液（アンスロン  ０．２ｇをＨ２ＳＯ４  ７５ｍｌと蒸留水  ２５ｍｌの混合液で溶解したもの）５ｍｌを試験管に取り、上記のケフィラン含有液０．５ｍｌを加えて１００℃で１０分湯浴した。室温まで水冷した後に、６２０ｎｍの波長における吸光度を測定してケフィラン含有液中の還元糖量を測定し、ケフィラン量を算出した。
【００４５】
＜実施例２＞
実施例１で、培養前期の培養時間を３６時間（培地中の炭素源の消費割合は１６．７質量％であった。）とした以外は実施例１と同様にに実験を行った（培養時間の合計は８８時間）。ケフィランの蓄積量は４．５９ｇ／Ｌであった。結果は表１に示す。
【００４６】
＜比較例１＞
実施例１で、培養前期の培養時間を２４時間（培地中の炭素源の消費割合は２．８質量％であった。）とした以外は実施例１と同様に実験を行った（培養時間の合計は８８時間）。結果は表１に示す。
【００４７】
＜比較例２＞
実施例１で、培養前期の培養温度を３６℃（培地中の炭素源の消費割合は７０．０質量％であった。）とした以外は実施例１と同様に実験を行った（培養時間の合計は８８時間）。結果は表１に示す。
【００４８】
＜比較例３＞
培養温度を変更せず、３０℃一定で培養した以外は実施例１と同様に実験を行った（培養時間の合計は８８時間）。結果は表１に示す。
【００４９】
＜比較例４＞
培養温度を変更せず、２４℃一定で培養した以外は実施例１と同様に実験を行った（培養時間の合計は８８時間）。結果は表１に示す。
【００５０】
＜比較例５＞
培養温度を変更せず、４０℃一定で培養した以外は実施例１と同様に実験を行った（培養時間の合計は８８時間）。結果は表１に示す。
【００５１】
【表１】
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