(57)【要約】      （修正有）【課題】条件欠陥インフルエンザウイルス粒子を得るための方法によって得られたインフルエンザウイルス粒子の提供。【解決手段】７個の異なるインフルエンザ核酸セグメントを有しそして酸性ポリメラーゼを本質的にコードする一つのインフルエンザ核酸セグメントを欠失する欠陥インフルエンザウイルス粒子、並びに機能性ポリメラーゼを産生できないが、しかしウイルス粒子内へのウイルスの遺伝子セグメントのパッケージングを妨げない該遺伝子構築物を含む発現プラスミドを用いて複数の細胞をトランスフェクションし、ヘルパーウイルスを使用しないことを特徴とするインフルエンザウイルス粒子の生産方法。【選択図】図１
2012110339.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
条件欠陥インフルエンザウイルス粒子を得るための方法によって得られたインフルエンザウイルス粒子であって、当該方法が、
インフルエンザポリメラーゼをコードする核酸を内部欠失することにより誘導された１個もしくはそれ以上の遺伝子構築物であって、機能性ポリメラーゼを産生できないが、しかしウイルス粒子内へのウイルスの遺伝子セグメントのパッケージングを妨げない該遺伝子構築物を用い、かつ、インフルエンザウイルスをコードするが該インフルエンザポリメラーゼをコードしない相補性インフルエンザウイルス核酸セグメントを用い、かつ、該細胞内で該ポリメラーゼを発現できる１個もしくはそれ以上の発現プラスミドを用いて、適当な単一もしくは複数の細胞をトランスフェクションする工程、および
トランスフェクションの後適当な時点で該単一もしくは複数の細胞の上清から少なくとも１個のウイルス粒子を採取する工程を含むが、ヘルパーウイルスを使用しない、ことを特徴とする上記インフルエンザウイルス粒子。
【請求項２】
機能性インフルエンザポリメラーゼを産生できないようにし、かつ、複製について条件欠陥性のウイルス粒子をもたらすが、しかしインフルエンザウイルスの遺伝子セグメントのウイルス粒子内へのパッケージングは妨げないセグメント内の内部欠失を有する１個もしくはそれ以上の核酸セグメントを含んでなるインフルエンザウイルス粒子であって、ここで、該ポリメラーゼが酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）または塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）の群から選択されることを特徴とするインフルエンザウイルス粒子。
【請求項３】
機能性インフルエンザポリメラーゼを産生できないようにし、かつ、複製について条件欠陥性のウイルス粒子をもたらすが、しかしインフルエンザウイルスの遺伝子セグメントのウイルス粒子内へのパッケージングは妨げないセグメント内の内部欠失を有する１個もしくはそれ以上の核酸セグメントを含んでなるインフルエンザウイルス粒子であって、ここで、ポリメラーゼが酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）または塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）の群から選択され、かつ、ここで内部欠失が、
ＰＡタンパク質では５’非コード領域から数えてヌクレオチド５８と２０７の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そして３’非コード領域から数えてヌクレオチド２７と１９４の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、
ＰＢ１タンパク質では５’非コード領域から数えてヌクレオチド４３と２４６の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そして３’非コード領域から数えてヌクレオチド２４と１９７の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、
ＰＢ２タンパク質では５’非コード領域から数えてヌクレオチド３４と２３４の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そして３’非コード領域から数えてヌクレオチド２７と２０９の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わる
ことを特徴とするインフルエンザウイルス粒子。
【請求項４】
ウイルス糖タンパク質をコードするインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項５】
核タンパク質（ＮＰ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）、塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）をコードするインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項６】
核タンパク質（ＮＰ）、酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）をコードするインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項７】
核タンパク質（ＮＰ）、酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）をコードするインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項８】
Ａ型インフルエンザウイルスから誘導されたインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項９】
インフルエンザペプチドをコードしない核酸を備えている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の粒子を含むが、ヘルパーウイルスを含まないことを特徴とする細胞。
【請求項１１】
ポリメラーゼが、酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）または塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）の群から選択される、１個もしくはそれ以上のインフルエンザウイルスポリメラーゼを発現する請求項１０記載の細胞。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の粒子または請求項１０もしくは１１記載の細胞もしくは細胞から誘導される物質を含んでなる組成物。
【請求項１３】
インフルエンザウイルスへの患者の感染に対する免疫学的防御を生ぜしめる目的とする製薬学的組成物の生産のための、請求項１２記載の組成物の使用。
【請求項１４】
有効成分として、請求項１〜９のいずれか１項に記載の粒子または請求項１０もしくは１１記載の細胞もしくは細胞から誘導される物質を含んでなるインフルエンザウイルスへの患者の感染に対する免疫学的防御を生ぜしめるための製薬学的製剤。
【請求項１５】
細胞に対してインフルエンザペプチドをコードしない核酸の送達を目的とする組成物の生産のための、請求項９記載の粒子の使用。
【請求項１６】
対照者の細胞へのインフルエンザペプチドをコードしない核酸の送達を目的とする製薬学的組成物の生産のための、請求項９記載の粒子の使用。
【請求項１７】
請求項９記載の欠陥インフルエンザウイルス粒子を細胞に提供することを含んでなる、該細胞へのインフルエンザペプチドをコードしない核酸のインビトロでの送達の方法。
【請求項１８】
有効成分として、請求項９記載の欠陥インフルエンザウイルス粒子を含んでなる、該患者へインフルエンザペプチドをコードしない核酸を送達するための製薬学的製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスおよび流感に対するワクチン接種の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルス（オルトミクソウイルス科）は、分節ゲノムを有するエンベロープ付マイナス鎖ＲＮＡウイルスである（非特許文献１）。それらは二つの属に分けられる。それらの核タンパク質およびマトリックスタンパク質の間の著しい抗原性差異に基づいて、一方はＡ型およびＢ型インフルエンザを含み、他はＣ型インフルエンザから成る。３種のウイルス型は、病原性およびゲノム構成でも異なる。Ａ型は広範囲の温血動物に見られるが、一方ＢおよびＣ型は、主としてヒト病原体である。Ａ型インフルエンザウイルスは、ビリオンの表面から突出する赤血球凝集素（ＨＡ）およびＮＡ表面糖タンパク質の抗原性特性化によりさらに細分される。現在１５のＨＡおよびＮＡサブタイプがある。Ａ型インフルエンザウイルスは、鳥類、ブタ、ウマ、ヒト、およびその他の哺乳動物を含む広範囲の動物に感染する。水鳥は、すべての既知のＡ型インフルエンザサブタイプの天然の貯蔵庫となり、そして多分、ヒト汎流行インフルエンザ株の遺伝物質の起源であろう。
【０００３】
関連するパラミクソウイルスとは異なり、インフルエンザウイルスは分節ＲＮＡゲノムを有する。Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスは同様の構造を有し、一方Ｃ型はさらに分岐している。Ａ型およびＢ型ウイルスは、それぞれ少なくとも１個のタンパク質をコードする８個の分離した遺伝子セグメント（分節）をそれぞれ含み、Ｃ型は７個の分離したセグメントを含み、Ａ型およびＢ型のセグメント４および６を結合している。Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルスは、３種のタンパク質：ＨＡ、ＮＡおよび基質２（Ｍ２）の突起により覆われている。Ｃ型インフルエンザウイルスは、ただ１種の表面糖タンパク質を有する。それぞれのインフルエンザＲＮＡセグメントは、核タンパク質（ＮＰ）により包膜化されてリボヌクレオチド核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。３個のポリメラーゼタンパク質がＲＮＰ複合体の１個の末端と会合する。ＲＮＰは、一体部分としてマトリックスタンパク質（基質１）を有する膜により包囲されている。エンベロープのリン脂質部分は、細胞宿主膜から誘導される。ウイルス粒子中には非構造タンパク質２（ＮＳ２）も見いだされる。
【０００４】
インフルエンザウイルスの命名法に関する世界保健機構（ＷＨＯ）ガイドラインは下記である。最初にウイルスの型（Ａ、Ｂ、またはＣ）、次いで宿主（ヒト以外の場合）、単離の場所、単離番号、および単離の年（斜線で分離）を指定する。Ａ型インフルエンザに対しては、ＨＡおよびＮＡサブタイプを括弧内に記載する。例えば、２０００および２００１のシーズンでの最近の三価ワクチン内中含まれる株は：Ａ／パナマ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ニュー・カレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、およびＢ／山梨／１６／９８である。１９７７年以後、２種のインフルエンザＡサブタイプ：Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２がヒト間で同時に流行している。
【０００５】
インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼが複合体プルーフリーディング活性を持たないので、インフルエンザウイルスは複製の間に点変異を蓄積する。表面糖タンパク質の抗原性部分内のアミノ酸を変化させる変異は、すでに存在する免疫性を避けることをそれに可能とさせることにより、ウイルス株に選択的利益を与える。ＨＡ分子は、一定の宿主細胞上の受容体に結合することにより感染を開始する。ＨＡタンパク質に対する抗体は、受容体結合を防止しそして同一株による再感染を防止するために非常に有効である。ＨＡは、現在流行しているＨＡ遺伝子の変異が抗体結合を破壊する抗原ドリフトによるか、またはウイルスが新しいサブタイプのＨＡを取得する抗原シフトのいずれかにより、以前
取得した免疫性を避けることができる。抗原ドリフト圧力は、ＨＡ分子間で非平等であり、正に選択された変化は、主としてＨＡタンパク質の球状頭部上に起きる。それらの変化も、ＮＡよりもＨＡ中でより広範囲に蓄積される。他のインフルエンザタンパク質内の変化はさらに遅く起きる。同様に、抗原性ドリフト圧力は、ヒト適合インフルエンザ株中で最大であり、ブタおよびウマ適合株中では中間であり、そして鳥類適合株中では最低である。
【０００６】
インフルエンザウイルスは分節ゲノムを有するので、同じ宿主内での２種の異なる株の同時感染は、親の遺伝子セグメントの異なる組合せを含む新規の再構築されたインフルエンザ株の産生に導くことがある。１５種のＨＡサブタイプが野生鳥類中に存在することが知られており、そしてヒトには先例がないＨＡの起源を提供する。抗原シフトによる新規サブタイプを有するインフルエンザ株のヒト流行の発生は、１９５７年および１９６８年の少なくとも二回のインフルエンザ汎流行の原因であり、１９１８年のインフルエンザ汎流行の原因である可能性が高い。汎流行インフルエンザウイルスの発生に関するすべての知識に沿って考えると、汎流行性株は現在流行しているものとは抗原的に異なるＨＡを有するに違いない；このＨＡは、ヒト内で６０〜７０年間は流行できなかったものである；そしてウイルスはヒトからヒトに伝播できなければならない。１９５７年および１９６８年の双方で、汎流行はＨＡのシフトからもたらされ、そして両方の場合に、汎流行株のＨＡは、鳥類株と密接に関連していた。汎流行のための絶対的な要求の一つは、ＨＡが変化しなければならないことであるけれども、ウイルスの残部が変化可能または必須である範囲は知られていない。１９５７年および１９６８年の汎流行ウイルスのみが直接研究に利用でき、１９１８年汎流行インフルエンザウイルスは、分子考古学を用いて特性が研究されている。１９５７年には、３個の遺伝子が鳥類様遺伝子：ＨＡ、ＮＡ、およびポリメラーゼ複合体（ＰＢ１）のサブユニットにより置換された。１９６８年では、ＨＡおよびＰＢ１のみが置換された。
【０００７】
インフルエンザ感染の特定診断は、ウイルス単離、赤血球凝集阻害（ＨＩ）試験、免疫アッセイによる抗原検出、血清学的試験、分泌物中のＮＡ活性の証明、または分子に基づくアッセイにより行うことができる。試料は、痰、鼻咽頭スワブ、または緩衝塩溶液のうがいにより得られる鼻咽頭洗浄物として採取できる。インフルエンザ診断のための標準は、培養後の免疫学的特性化であった。血清学的分析は、それが急性および回復期血清の双方の採取を必要とするので、インフルエンザ感染に対しては、正確ではあるがしかし遡及的な方法となる。
【０００８】
インフルエンザウイルスは、孵化鶏卵または多数の組織培養システム中で培養できる。トリプシンの添加（ＨＡの切断活性化のため）は、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞およびその他の系統中でインフルエンザウイルス繁殖を可能とする。ワクチン生産の最初の方法は、卵内のままでのインフルエンザウイルスの培養である。細胞系統の培養物は、ヒトインフルエンザウイルス（Ａ型およびＢ型の同胞）の一次単離のために一般的に使用される。多数のヒトインフルエンザウイルスが孵化卵内の尿膜腔内で直接培養できる。一部のインフルエンザＡおよびＢ型ウイルスは、羊膜腔での初期培養、引き続いて尿膜腔に順応させることを要する。培養物単離の後、大部分のインフルエンザ単離物は免疫アッセイまたは免疫蛍光法を用いて厳格に分離できる。インフルエンザウイルスのＨＡ分子は、エントリーを増すためにウイルスの呼吸細胞の表面上のサリチル酸残基に結合する。
【０００９】
インフルエンザ株は、イン・ビトロで赤血球を凝集させるインフルエンザウイルスの能力を利用して抗原的に特性化できる。抗ＨＡ抗体は、凝集を阻害できる。従って、赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイはインフルエンザ株を特性化するために使用される標準的方法の一つである。ＨＩアッセイは、試料株が最近のワクチン株に免疫学的に関連（すなわち
交差反応性）するかどうかを決定するために使用される。一般的にフェレット内で産生される類型決定血清（ｔｙｐｉｎｇ  ｓｅｒａ）を一連の二倍希釈ウエルに加え、そして実験者が赤血球の懸濁物に対する凝集物を観察してウエルを採点する。大部分の場合に、血清のパネルがワクチンおよび対照試料に対して試料血清を一致させるために使用され、そして該当するインフルエンザシーズンの間に、大多数の使用株がＨＩアッセイにより一致させることに成功する。
【００１０】
ＷＨＯはガイドラインを提供し、そしてＷＨＯ協力センター（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ）は個別のウイルス株の抗原的特性の同定に関するガイダンスを提供する。試料株は、免疫学的系統、例えばＡ／モスクワ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ニュー・カレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、およびＢ／北京／１８４／９３様ウイルス、に従って分類される。ＨＩアッセイで特性化できなかった試料株に対して、実験者は、それらをフェレットに接種して株特異性抗血清を生産させなければならない。新しい抗血清が準備されると、上記のようにしてＨＩアッセイを再度行う。新血清が交差反応性に有意のギャップ（通常試料とワクチン株との間の４倍の差異として定義される）を示す場合には、それを通常の実験室パネル内に組入れ、そして新規の流行株を探索するために使用される。このようにして、ＨＩアッセイは、ワクチン株選択のためのインフルエンザウイルス監視の努力に非常に重要でありそして抗原ドリフトを評価するために最も一般的に使用される方法である。
【００１１】
インフルエンザウイルスは、個別の遺伝子セグメントの配列比較により一般的に特性化でき、そしてこの場合にもＷＨＯガイドラインおよびＷＨＯ協力センターがインフルエンザゲノムを含んでなるＲＮＡセグメントの個別同一性の同定に関するガイダンスを提供している；核タンパク質（ＮＰ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）、塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）、酸ポリメラーゼ（ＰＡ）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）をコードするＡ型およびＢ型インフルエンザウイルス核酸セグメント、および核タンパク質（ＮＰ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）、塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）、赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ様糖タンパク質（ＨＮ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）、および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）をコードするＣ型ウイルス核酸セグメント。抗原分析のため、核酸配列比較のため、およびワクチンウイルスの同定のための参照株の要求は、ＷＨＯ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，４５  Ｐｏｐｌａｒ  Ｒｏａｄ，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ  ３０５２，Ａｕｓｔｒａｌｉａ（ファックス：＋６１  ３  ９３８９  １８８１，ウエブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｃｅｎｔｒｅ，ｏｒｇ）；ＷＨＯ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｇａｋｕｅｎ  ４−７−１，Ｍｕｓａｓｈｉ−Ｍｕｒａｙａｍａ，Ｔｏｋｙｏ  ２０８−００１１，Ｊａｐａｎ（ファックス：＋８１
４２  ５６１０８１２または＋８１  ４２  ５６５２４９８）；ＷＨＯ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏ
ｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，１６００  Ｃｌｉｆｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｍａｉｌ  Ｓｔｏｐ  Ｇ１６，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ  ３０３３３，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（ファックス：＋１  ４０４  ６３９  ２３  ３４）；またはＷＨＯ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｔｈｅ  Ｒｉｄｇｅｗａｙ，Ｍｉｌｌ  Ｈｉｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ  ＮＷ７  １ＡＡ，Ｅｎ
ｇｌａｎｄ（ファックス：＋４４  ２０８  ９０６  ４４７７）。最新の疫学的情報は、ＷＨＯのウエブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｉｎｆｌｕｅｎｚｅおよび地理学的情報システム、ＦｌｕＮｅｔ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｆｌｕｎｅｔから入手できる。
【００１２】
インフルエンザのインパクトおよびその予防の健康および経済的利益の意識は増大しており、そして過去１０年間はワクチン接種の使用および利益が見られそして多数の抗インフルエンザ医薬がますます増えている。多数の国でより長い期待寿命の結果として、より多数の人々に合併症の危険があり、インフルエンザ流行の間の健康管理システムに対する負荷がさらに広く認識され、そしてさらに頻繁な国際旅行がウイルスの拡散の機会を与え、一方新製品の導入は疾患の予防および処置に対する選択肢を増やしている。約５０の国々が、政府出資の国内インフルエンザ免疫プログラムを有しそしてワクチンはその他の多数の国々でも利用できる。ワクチンの使用のための特定の指針はさまざまであるが、しかし一般的に、高齢者および既存の慢性病的条件のために重篤な疾患の危険が上昇している６カ月以上の人々への毎年の接種を含む。一部の国では、医療リスクが高い人々へのインフルエンザの拡散を低減するためにワクチンが使用される。メンバーステイト（Ｍｅｍｂｅｒ  Ｓｔａｔｅ）は、それらの全般的な公衆衛生優先事項の範囲内で、インフルエンザ予防活動の利益を考慮する必要がある。
【００１３】
不活化ワクチンは、それらが全ウイルス粒子、部分的に破壊されたウイルス粒子（スプリットワクチン）または精製されたエンベロープ抗原（サブユニットワクチン）を含むかどうかに依存して、数種のタイプに分類される。いくらかのサブユニットワクチンは、アジュバントまたは送達システムと複合される。
【００１４】
いくつかの国は一定の標的群に対して生弱毒インフルエンザワクチンを許可している。ロシア連邦では、１ワクチンの２種の異なる製剤が、健康な成人および小児に使用されており、別の生ワクチンが広範に試験されている。しかし、生弱毒ワクチンがさらに広範に入手可能となるまで、それはインフルエンザ予防のためにまだ一般的には推奨されない。
【００１５】
２種の抗ウイルス剤がインフルエンザの予防および処置のために開発されている。Ｍ２阻害剤、アマンタジン（ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）およびリマンタジン（ｒｉｍａｎｔａｄｉｎｅ）は、Ａ型インフルエンザウイルスの処置に限定され、そして感染の予防に有効であると報告されている。両方の製品はいくらかの副作用を起こすが。著しい神経学的副作用はアマンタジンの方が大きい。ノイラミニダーゼ阻害剤、例えばザナミビル（ｚａｎａｍｉｖｉｒ）およびオセルタミビル（ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ）は、Ａ型およびＢ型インフルエンザの処置のために多数の国で最近許可され、そして予防に有効であることが報告されている。双方の抗ウイルス剤を投与された患者内で、耐性変異体が検出されている。これは現在までは重要な公衆衛生問題として考慮されていないけれども、それらの薬剤がさらに大きいスケールで使用されると、状況は変化するであろう。
【００１６】
ＷＨＯは、全世界的な国際監視プログラムを、８２カ国に存在する１１０箇所の国内インフルエンザセンターおよび４箇所のインフルエンザ参照および研究のためのＷＨＯ協力センター（アトランタ（米国）、ロンドン（英国）、メルボルン（オーストラリア）および東京（日本）に位置する）の協力を得て維持している。それらのセンターは、流行ポテンシャルと共に発生する株の早期警告システムを提供する。インフルエンザワクチンが現在流行している株を含まない場合、インフルエンザワクチンの効力が低下するので、このシステムは重要である。ＷＨＯはワクチン組成の推奨を発行し、それは世界保健機構により出版されるＷｅｅｋｌｙ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｃｏｒｄ（例えば非特許文献２参照）中に見ることができ、２月には北半球で使用されるワクチン、９月には南半球で使用されるワクチンに関して公開されている。インフルエンザは赤道付近の地域
では季節的パターンがあまりはっきりしないので、疫学的考慮が、それらの推奨事項（２月または９月のどちらか）が赤道付近の国々に使用されるワクチンに適合するかに影響する。
【００１７】
協力センターは、各国センターから提出されたインフルエンザ単離物の抗原および遺伝子分析を行う。抗原変化の証拠が観察されると、変種の疫学的重要性を評価するために疫学的データを用いてこれを精査する。ワクチン接種の前後に採取したヒト血清のパネルを使用して、代表的な単離物を現在のワクチン株と比較して、現在のワクチンにそれらのウイルスに対する防御が期待できるかどうかを評価する。ＷＨＯの年間ワクチン推奨を公表に続いて、高度増殖株を開発しそしてワクチン生産のための種ウイルスの生成を支援するための参照ウイルスとして生産業者に提供する。インフルエンザワクチンの安全性および効力の試験は、ウイルス不活化、微生物の無菌性、ウイルスを破壊するために使用した化学薬品の測定および推奨する抗原濃度の確認を含む。ワクチンはＷＨＯの要求に合致すべきことが推奨されるが、しかし、各国の規制機関はその国内で使用される特定のワクチンウイルスを承認するべきである。国の公共保健機関は、ワクチンの使用に関する推奨に責任を持つべきである。また、ＷＨＯはインフルエンザの予防に関する推奨を発行している（非特許文献３参照）。
【００１８】
現在のワクチンがナイーブな個体を防御しないこと、すなわちそれまで流感感染に遭遇していない多数の個体が危険にさらされた場合に、インフルエンザの汎流行発生の場合に直ちに重要となるという事実はすでに証明されている。ウイルスは一般に細胞に入り宿主細胞表面受容体に付着し、そしてそれらのウイルス核酸を脱外被し、次いでウイルスゲノムの複製を行うことによりそれらはそのライフサイクルを開始する。ウイルスタンパク質および遺伝子の新しいコピーが合成された後、それらの成分は後代ビリオンに構築され、次いで細胞から出る。構築段階の間に、後代ウイルスは、細胞質内に存在するウイルスおよび細胞核酸の大きいプールからそのゲノム核酸を効率的に選択しなければならない。ビリオンへのウイルスゲノムのパッケージングは、典型的には、ウイルス核酸内のシス作用性配列のウイルス成分、いわゆる「パケージング・シグナル」による認識を含む。かかるシグナルの定義は、ウイルスライフサイクルを理解するために重要でありそして他者タンパク質の発現のためのウイルスベクターを構築するために使用できる情報を我々に提供する。実際、他者タンパク質の発現のための遺伝子送達ベクターのベヒクルとしてのレトロウイルスの利用は、それらのｖＲＮＡの後代ビリオン内へのパッケージングのプロセスの良く確立された知識に大部分が帰せられる。
【００１９】
他のＲＮＡウイルスのゲノムパッケージングシグナルは、良く理解されておらず、他者遺伝子の発現および送達のためのベクターとしてのそれらの使用に関する進歩を妨げている。例えばＡ型インフルエンザウイルスは、エンベロープされたマイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、その分節化ゲノムは、核タンパク質（ＮＰ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）、塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）、酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）、および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）のコーディング容量を有する。
【００２０】
このウイルスは、エンベロープ上に２種の膜貫通糖タンパク質、赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を有する。ＨＡタンパク質は、宿主細胞表面上のシアル酸含有受容体に結合し、そして受容体媒介エンドサイトーシスの後にエンドソーム膜とのウイルスエンベロープの融合を媒介する。対照的に、ＮＡタンパク質はシアリルオリゴサッカリドからシアル酸を除去し、従って新規に構築されたビリオンを細胞表面から離しそしてウイルス粒子の自己凝集を防止することにより、感染の後期に重要な役割を果たす。エンベロープ内で、８個の異なるウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）セグメントを含んでなるウイルスゲノムは、核タンパク質（ＮＰ）およびポリメラーゼタンパク質（ＰＡ、ＰＢ１、
およびＰＢ２）と緊密に連結し、リボヌクレオタンパク質複合体を形成する。すべての８個（またはＣ型の場合には、すべての７種）の機能性遺伝子セグメントは、感染性ウイルスを産生するために必要である。ポリメラーゼ遺伝子内の種々の変種が記載されており（特許文献１、特許文献２、特許文献３、非特許文献４）それらはポリメラーゼ活性を変化させるかまたは別の様式でポリメラーゼを改変するがしかしかかる複製が不能な変異ポリメラーゼを含むウイルスを与えるウイルスＲＮＡの合成におけるその機能は放さない。特許文献１中では、変異ＰＡ遺伝子を有する感染性ウイルスが産生され、それにより変異遺伝子を有する感染性ウイルスを産生および回収する選択システムの利益を示す。特許文献２中では、生弱毒ワクチンウイルス産生に関係する望ましい性質、例えば温度感受性またはその他の形の弱毒化を有するインフルエンザウイルスの産生および回収を可能とするポリメラーゼ遺伝子内の変異を有する感染性ウイルスを産生する方法が示されている。特許文献３中では、種々のポリメラーゼの特異性を改変しそして活性を低下させるであろうポリメラーゼ遺伝子セグメントが示唆されている。しかし、そのポリメラーゼ活性を全て喪失したウイルスを再構築することは別にして、それらはウイルス再構築には使用されなかった。さらに、上記の適用のいずれでも、複製するそれらの能力を失った欠陥粒子は産生されなかった。Ａ型ウイルスが高い多重度の感染で継代されると、１個もしくはそれ以上の機能性遺伝子セグメントを欠失した欠陥ウイルス粒子が産生される。かかるウイルス粒子中では、１個もしくはそれ以上の機能性遺伝子が、インフルエンザウイルスポリメラーゼにより作成されたエラーにより、欠陥干渉性（ＤＩ）遺伝子セグメントと置換される。高い多重度の感染により、そして１個を越えるウイルス粒子による細胞の感染により、ＤＩ  ＲＮＡを含むウイルスの欠陥は、欠損した機能性遺伝子の変化のないコピーを含むウイルスにより相補される。最近、酸性ポリメラーゼ遺伝子内の一定の変異が、欠陥遺伝子を有するウイルス粒子の生成の効率を上昇できることが示された（非特許文献４）。それらの実験における欠陥ウイルス粒子の生成および相補の双方が無作為的にかかる実験中で起きることが認識されたことは重要である。この無作為プロセスは、実際の適用におけるＤＩ  ＲＮＡおよび条件つき欠陥ウイルス粒子の使用を制限する。さらに、欠陥ウイルス粒子がそれらの公開された方法を用いて産生されると、所望の条件つき欠陥ウイルスの外に野生型複製適格ウイルスが産生される。かかる複製適格ウイルスは、完全に野生型（ヘルパーウイルス）であるかまたはヘルパーウイルスと欠陥ウイルスとの遺伝子混合からもたらされる再構築物のいずれかであろう。無作為的または特異的機構のいずれかを介するインフルエンザウイルスの遺伝子セグメントのパッケージングプロセスは、多年にわたって論議されている。双方の選択肢に数件の証拠が記載されている。無作為パッケージングの証拠は、凝集したウイルス粒子が非凝集ウイルス粒子よりも高い感染性を有しそして細胞培養物が低い感染モード（ｍｏｉ）で感染された場合には、一部の感染細胞は一つのセグメントの��現を欠失するというものであり、両方共に全てのインフルエンザウイルスゲノムは含まないビリオンがあることを示唆する。無作為パッケージングの別の証拠は、９個のセグメントを有するインフルエンザウイルスが実験的に産生されたことである。
【００２１】
特異性パッケージングプロセスのための一つの論拠は、すべての遺伝子セグメントがウイルス原料内に等量で存在するけれども、それらは、生産細胞内では異なる量で存在するというものである。さらに、欠陥干渉性（ＤＩ）粒子が生成された場合に、ＤＩｖＲＮＡは、それが誘導されたセグメントを置換する（欠陥干渉性粒子とは、遺伝子セグメントの一つが大きい内部欠失を有するウイルス粒子である。それらの粒子は、ウイルスが高いｍｏｉで継代された場合に生じる）。最後に、ビリオン形成の効率は、遺伝子セグメントの数が増えると増加する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】国際特許出願公開（ＷＯ）第２００４／０９４４６６号明細書
【特許文献２】国際特許出願公開（ＷＯ）第２００３／０９１４０１号明細書
【特許文献３】米国特許（ＵＳ）第５５７８４７３号明細書
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Ｔａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｌａｙｎｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、第６巻、第４号、２００１
【非特許文献２】第９号、２００４、７９、８８ページまたはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｗｅｒ
【非特許文献３】ＷＥＲ第３５号、２００２、２８１−２８８ページ
【非特許文献４】Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７，５０１７−５０２０．２００３
【発明の概要】
【００２４】
欠陥インフルエンザウイルス粒子（例えばＭｅｎａ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０１６−２４（１９９６）；Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：５４７−５１（２０００））は、ワクチン候補として有用であり、それはそれらがＨＡおよびＮＡ以外のウイルスタンパク質に対する抗体を誘導するからであり、そして、それらが宿主細胞に入ることができる場合には、それらが、体液反応に加えてウイルスに対する細胞免疫反応を誘導できるからである（例えばヘルパーＴ細胞、細胞毒性Ｔ細胞）。これまで、欠陥インフルエンザウイルス粒子の生産は、トランスフェクションにより達成され（Ｍｅｎａ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０１６−２４（１９９６）；Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：５４７−５１（２０００））、かかる粒子を大量に生産する可能性を低下する。この方法とは別の方法では、条件つき欠陥であるウイルス粒子を生産し、それらの一定の生産システム内での複製を可能とするが、しかし正常の細胞または生産システム内では可能としないものであろう。この目的で、生産システムの細胞は、欠陥インフルエンザウイルス粒子のトランス−相補を可能とするインフルエンザウイルス遺伝子または遺伝子産物の１種もしくはそれ以上の生産を可能とするように変性される。本発明は、欠陥インフルエンザウイルス粒子の一定のトランス相補（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を最初に開示する。実験室内で、インフルエンザウイルス粒子のトランス相補は、欠陥干渉性インフルエンザウイルスが、欠陥干渉性遺伝子セグメントの野生型バージョンを有するウイルスにより同じ細胞内で相補される場合に観察される。トランス相補の「天然システム」は、一定の条件つき欠陥インフルエンザウイルス粒子を生産するために有用ではない。第一に、このシステムは、完全に感染性のウイルスの望ましくない産生をもたらすであろう少なくとも１つの（部分的）複製適格ウイルスによる一つの（部分的）欠陥ウイルスの相補を必要とする。第二に、欠陥干渉性粒子の産生は種々の遺伝子セグメントに無作為的に起きるので、一定の条件つき欠陥ウイルス粒子を産生することは不可能である。
【００２５】
条件つき欠陥インフルエンザウイルス粒子は、理論的には、それらの全遺伝子セグメントまたは部分の欠失に基づくことができる。全遺伝子セグメントを欠失することにより一定の条件つき欠陥ウイルス粒子を産生（およびコードされた遺伝子産物をイントランス（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）で産生）する能力は、インフルエンザウイルスゲノムのパッケージングがすべての８セグメントの存在に依存するならば、限定されるであろうし、これは多く論議されている問題である（本明細書の別の箇所参照）。パッケージングプロセスがすべての８セグメントの存在を必要とする場合に、すべての遺伝子セグメントが全長として存在する必要であるかどうかは知られていず、それは条件つき欠陥ウイルス粒子の生産をさらに複雑にする。本発明はそれらの問題を解決する。
【００２６】
本発明は、インフルエンザポリメラーゼをコードする核酸を内部欠失することにより誘導されて本明細書中で提供される内部欠失を有する遺伝子構築物、例えばｐΔＰＢ２、ｐΔＰＢ１、ｐΔＰＡまたはｐＤＩＰＡであって、ここで、該遺伝子構築物はウイルスＲＮ
Ａをコピーまたは合成できる機能性ポリメラーゼを産生できなくなるものを用い、そしてインフルエンザウイルスをコードする相補性インフルエンザウイルス核酸セグメント、例えばＡ／ＷＳＮ／３３をコードする７個の相補性構築物（ＨＷ１８１−１８８、Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）を用い、そしてかかる細胞内に該ポリメラーゼを発現できる発現プラスミド、例えば本明細書中に記載のＨＭＧ−ＰＢ２、ＨＭＧ−ＰＢ１、ＨＭＧ−ＰＡを用いて、適切な第一細胞（単数または複数）、例えば２９３Ｔ細胞をトランスフェクションし、そして適当な時点、例えばトランスフェクションの後１０〜５０、好ましくは約２０〜３０時間以内に該第一細胞（単数または複数）の上清から少なくとも１個のウイルス粒子を採取する第一工程、および細胞内に該ポリメラーゼを発現できる発現プラスミドを用いて適切な第二細胞（単数または複数）例えばＭＤＣＫ細胞をトランスフェクションする第二工程、および該第一細胞から得た少なくとも１個のウイルス粒子を含んでなる上清を用いて該第二細胞（単数または複数）をトランスフェクションする第三工程、および適切な時点、例えばトランスフェクションの２４〜９６、好ましくは４８〜７２時間後に該第一細胞（単数または複数）の上清から少なくとも１個（内部欠失を有する遺伝子セグメントをパッケージングされたために産生されたウイルスがウイルスＲＮＡのコピーまたは合成が可能な機能性ポリメラーゼを発現する遺伝子セグメントを欠失するウイルスが産生されるので条件つき欠陥である）のウイルス粒子を採取することを含んでなる第四工程を含んでなる条件つき欠陥インフルエンザウイルス粒子を得る方法を提供する。
【００２７】
好ましくは、機能性タンパク質を産生不能ではあるが、しかしウイルス粒子内へのウイルスの遺伝子セグメントのパッケージングを阻止するほどは大きくない内部欠失である。好ましくは、それらの欠失は５’および３’非コード領域からそれぞれ数えられる。Ａ型インフルエンザでは、かかる好ましい欠失は、例えばＰＡタンパク質ではヌクレオチド５８と７５の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから初まり、そしてヌクレオチド２７と５０の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、ＰＢ一１タンパク質ではヌクレオチド４３と７５の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから初まり、そしてヌクレオチド２４と５０の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、ＰＢ一２タンパク質ではヌクレオチド３４と５０の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから初まり、そしてヌクレオチド２７と５０の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わる。さらに好ましくは、それらの欠失は、ＰＡタンパク質ではヌクレオチド５８と１００の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そしてヌクレオチド２７と１００の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、ＰＢ一１タンパク質ではヌクレオチド４３と１００の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そしてヌクレオチド２４と１００の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、ＰＢ一２タンパク質ではヌクレオチド３４と１００の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そしてヌクレオチド２７と１００の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わる。もっとさらに好ましくは、それらの欠失は、ＰＡタンパク質ではヌクレオチド５８と１５０の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そしてヌクレオチド２７と１５０の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、ＰＢ一１タンパク質ではヌクレオチド４３と１５０の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そしてヌクレオチド２４と１５０の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、ＰＢ一２タンパク質ではヌクレオチド３４と１５０の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そしてヌクレオチド２７と１５０の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わる。もっとさらに好ましくは、それらの欠失は、ＰＡタンパク質ではヌクレオチド５８と１７５の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオ
チドから始まり、そしてヌクレオチド２７と１７５の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、ＰＢ一１タンパク質ではヌクレオチド４３と１７５の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そしてヌクレオチド２４と１７５の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、ＰＢ一２タンパク質ではヌクレオチド３４と１７５の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そしてヌクレオチド２７と１７５の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わる。最も好ましくは、それらの欠失は、ＰＡタンパク質ではヌクレオチド５８と２０７の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そしてヌクレオチド２７と１９４の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、ＰＢ一１タンパク質ではヌクレオチド４３と２４６の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そしてヌクレオチド２４と１９７の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、ＰＢ一２タンパク質ではヌクレオチド３４と２３４の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そしてヌクレオチド２７と２０９の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わる。
【００２８】
本明細書中で、相補性セグメントとは、例えばＡ型インフルエンザウイルスの８個の遺伝子セグメントの完全な組に導くセグメントとして定義される。従って、セグメント１が欠陥セグメントを産生するために以前に使用された場合には、相補性（非欠陥）セグメントは、セグメント２、３、４、５、６、７および８である。２が欠陥の場合には、相補セグメントはセグメント１、３、４、５、６、７および８である。以下同様。
【００２９】
有利には、本発明はヘルパーウイルスが必要でなくまたは存在しない方法をもたらす。
【００３０】
本発明は、酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）および塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）の群から選択されたポリメラーゼをコードする機能性インフルエンザウイルス核酸セグメントを欠失する単離された条件つき欠陥インフルエンザウイルス粒子（本明細書中では条件つきの欠陥インフルエンザウイルス粒子とも呼ぶ）を提供し、かかる粒子はウイルスＲＮＡをコピーまたは合成するポリメラーゼを生成する供給源として生成または役立つことができず、それにより機能ポリメラーゼを用いてトランス相補された細胞内での複製ウイルス粒子の生成を条件つきで可能とするだけである。さらに、本発明は、機能性インフルエンザウイルスポリメラーゼを用いるトランス相補により細胞を提供することを含んでなる条件つき欠陥インフルエンザウイルス粒子を得る方法を提供する。
【００３１】
好ましい態様では、本発明による粒子は、粒子自体内では欠失している類似核酸セグメントを相補された細胞内で複製し、例えば、機能性インフルエンザウイルス核酸ＰＡセグメントを欠失する粒子は少なくとも機能性インフルエンザウイルス核酸ＰＡセグメントを備えた細胞内で複製し、機能性インフルエンザウイルス核酸ＰＢ１セグメントを欠失する粒子は少なくとも機能性インフルエンザウイルス核酸ＰＢ１セグメントを備えた細胞内で複製し、機能性インフルエンザウイルス核酸ＰＢ２セグメントを欠失する粒子は少なくとも機能性インフルエンザウイルス核酸ＰＢセグメントを備えた細胞内でそれぞれ複製する。好ましい態様では、本発明は、ウイルス糖タンパク質をコードするインフルエンザウイルス核酸セグメントを有し、さらに好ましくは、核タンパク質（ＮＰ）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）、および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）をコードするインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する本発明による粒子を提供する。一つの態様では、Ａ型インフルエンザウイルスから誘導されたインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する本発明による粒子が提供される。また、インフルエンザペプチドをコードしない核酸も備えている本発明に
よる粒子が提供される。また本発明は本発明による粒子を含んでなる単離された細胞を提供し、該細胞は野生型インフルエンザウイルスまたはヘルパーウイルスを含まないがしかし好ましくはインフルエンザウイルスポリメラーゼまたはそれをコードする遺伝子セグメントを備えるかまたは相補されている。好ましい態様では、かかる細胞はトランス相補された２９３ＴまたはＭＤＣＫ細胞である。一つの態様では、本発明は機能性インフルエンザウイルス核酸ＰＡセグメントを欠失した粒子を含んでなる単離された細胞を提供し、該細胞は野生型インフルエンザウイルスまたはヘルパーウイルスを含まないがしかし少なくとも機能性インフルエンザウイルス核酸ＰＡセグメントまたは機能性ＰＡを備えているかまたは相補されている。別の態様では、本発明は、機能性インフルエンザウイルス核酸ＰＢ１セグメントを欠失した粒子を含んでなる単離された細胞を提供し、該細胞は野生型インフルエンザウイルスまたはヘルパーウイルスを含まないがしかし少なくとも機能性インフルエンザウイルス核酸ＰＢ１セグメントまたは機能性ＰＢ１を備えている。さらに別の態様では、本発明は、機能性インフルエンザウイルス核酸ＰＢ２セグメントを欠失した粒子を含んでなる単離された細胞を提供し、該細胞は野生型インフルエンザウイルスまたはヘルパーウイルスを含まないがしかし好ましくは少なくとも機能性インフルエンザウイルス核酸ＰＢ２セグメントまたは機能性ＰＢ２を備えているかまたは相補されている。さらに、本発明は、本発明による粒子または本発明による細胞から誘導された細胞もしくは物質を含んでなる組成物、およびインフルエンザウイルスによる患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）の感染に対する免疫学的防御を生成することを目的とする製薬学的組成物の製造のためのかかる組成物の使用を提供する。これによって、本発明は免疫学的防御を必要とする患者に本発明による組成物を提供することを含んでなる、インフルエンザウイルスの患者の感染に対する免疫学的防御を生成するための方法を提供する。また、本発明はインフルエンザペプチドをコードしない核酸の細胞への送達を目的とする組成物の生産のための本発明によるインフルエンザウイルス粒子の使用を提供する。また、本発明は、インフルエンザペプチドをコードしない核酸の患者の細胞への送達を目的とする製薬学的組成物の生産のための本発明による粒子の使用、および該細胞または患者へ本発明による粒子を提供することを含んでなる細胞または患者へのインフルエンザペプチドをコードしない核酸の送達のための方法を提供する。
【００３２】
本発明は、天然のゲノムと比較すると一つの機能性インフルエンザウイルスセグメントを欠失する、すなわち：野生型またはヘルパーＡもしくはＢ型ウイルスと比較して、７個（８個ではなくて）の異なる機能性インフルエンザウイルス核酸セグメントを有するか、または野生型またはヘルパーＣ型ウイルスと比較して、６個（７個ではなくて）の異なるインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する条件つき欠陥インフルエンザウイルス粒子を提供する。本明細書中で「条件つき欠陥」の用語が使用される場合には、それはウイルスの遺伝子セグメントの一つがそれから発現されると非機能性タンパク質をもたらす大きい内部欠失を有するウイルス粒子を含み、それらに限定はされない。例えばＡ型インフルエンザウイルスのすべての８個の遺伝子セグメントおよびそれらによりコードされるすべてのタンパク質は、感染性ウイルスの生産に必要である。従って、欠陥遺伝子セグメントを含むウイルスはそれら自体が欠陥である：それは、すべてのウイルスタンパク質がビリオン内に存在するので細胞に感染できそして複製を一廻りできるが（このタンパク質は例えばウイルスが生産された場合に発現プラスミドにより産生される）しかしウイルスタンパク質の一つがウイルスにより産生できないので感染細胞内に感染性ウイルス粒子は産生されない。しかし、欠陥遺伝子セグメントにより通常発現されるタンパク質を発現する細胞が感染されると、すべてのウイルスタンパク質が存在するので欠陥ウイルスはそれらの細胞内で複製ができる。従って、それらのウイルスは、条件つき欠陥である：それらは、正しい状態の細胞が提供されない限り複製できない（この場合に、遺伝子セグメント内の欠失のためにウイルスによりコードされないウイルスタンパク質を細胞は発現する）。
【００３３】
さらに、本発明はポリメラーゼをコードする機能性インフルエンザウイルス核酸セグメ
ントを欠失する条件つき欠陥インフルエンザウイルス粒子を提供する。本明細書中で、機能性インフルエンザウイルス核酸セグメントは、複製性ウイルスの生成を可能としそのために必要な機能性インフルエンザタンパク質をコードする核酸を含んでなる。例えば、Ａ型インフルエンザウイルスは、８個の分節ゲノムを有するマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。８個の遺伝子セグメントは１１個のタンパク質をコードする；遺伝子セグメント１−８は、塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）およびＰＢ１−ＯＲＦ２（Ｆ２）、酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、赤血球凝集素（ＨＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質１および２（Ｍ１、Ｍ２）および非構造タンパク質１および２（ＮＳ１、ＮＳ２）をそれぞれコードする。８個の遺伝子セグメントのコード領域は、ウイルスＲＮＡ合成に必要な非コード領域（ＮＣＲ）に隣接している。ウイルスゲノムＲＮＡの５’および３’末端のそれぞれ端部１３および１２ヌクレオチドは、すべてのＡ型インフルエンザウイルスセグメントのなかでも保存されそして部分的に相補的であり、ウイルスポリメラーゼ複合体により認識される二次構造を形成する。ＮＣＲは、８個の遺伝子セグメントの間で保存はされないがしかし異なるインフルエンザウイルス間では比較的保存される６０個までの追加のヌクレオチドを含んでいるらしい。コード領域内のＮＣＲおよび隣接配列は、効率的なウイルスゲノムパッケージングのために必要らしい。従って、機能性インフルエンザウイルス核酸セグメントは、複製可能なウイルスの生成を可能とする機能性インフルエンザタンパク質のためのコーディングポテンシャルを有する配列（セグメント当たりに１または２個のオープンリーディングフレーム）、ｍＲＮＡの転写に必要なＮＣＲ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）およびウイルスＲＮＡに相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）およびＮＣＲ内に存在しそしてコード配列に隣接するパッケージングシグナルから成る。
【００３４】
一つのインフルエンザウイルス核酸を欠失する該条件つき欠陥インフルエンザウイルス粒子が機能性ポリメラーゼを、それがＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２であってもコードするセグメントを欠失することは好ましい。さらに、ワクチンの目的で、該粒子がウイルス糖タンパク質（単数または複数）をコードするインフルエンザウイルス核酸セグメント（単数または複数）を有することは好ましい。
【００３５】
一つの態様では、本発明は７個の異なるＡ型インフルエンザ核酸セグメントを有するＡ型インフルエンザ粒子を提供する。本発明による欠陥インフルエンザウイルス粒子は、相補されていなくても、ただ一回であっても適切な宿主動物または細胞内で複製できる。適切に相補された細胞内では、本発明による粒子はさらに多くの回数複製できる。ワクチンおよび遺伝子送達の目的で、欠陥粒子は正常のトランス相補されていない細胞内では無限に複製はできず、そのため、宿主から宿主へのワクチンウイルスの拡散のリスクを低減しそして野生型ウイルスへの復帰の危険が低減されることは大きい利点である。
【００３６】
７個の遺伝子セグメントのみを含みそして一回の複製のみを行うことができるか、または欠陥遺伝子セグメントがトランス相補された場合に複数回の複製ができる欠陥Ａ型インフルエンザウイルスが逆遺伝子学を用いて生産できるのは最初のことである。一つの態様では、本発明は、本質的に酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）をコードするインフルエンザ核酸セグメントを欠失する条件つき欠陥インフルエンザウイルス粒子を提供する。ＰＡのトランス相補と同様に、他のインフルエンザウイルス遺伝子のトランス相補も考えられる。しかし、他のインフルエンザウイルスタンパク質の発現レベルと比較してＰＡ発現レベルは重要性が低いので、ＰＡは欠失されるポリメラーゼ群の好ましい遺伝子セグメントであり、ＰＢ２およびＰＢ１欠失ウイルスも同様に生産でき、そしてＮＰ欠失ウイルスはトランス相補できなかった。好ましい態様では、本発明は、７個の異なるＡ型インフルエンザ核酸セグメントを有しそして本質的に酸性ポリメラーゼをコードするＡ型インフルエンザ核酸セグメントを欠失する条件つき欠陥Ａ型インフルエンザウイルス粒子を提供する。ワクチンの目的で、本発明による好ましい条件つき欠陥Ａ型インフルエンザウイルス粒子は、赤
血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質を本質的にコードするＡ型インフルエンザウイルス核酸セグメントを有し、それらのタンパク質は防御性を与えるために免疫学的に最も関係が深い。ワクチン内に包含するために適切な遺伝子セグメントを選択するために、ワクチン使用のためにＷＨＯにより推奨されたウイルスから遺伝子セグメントを選択するのが好ましい。勿論、ＨＡおよびＮＡサブタイプは、ワクチン化しようとするインフルエンザ変種のＨＡおよびＮＡサブタイプに依存して変化できる。核タンパク質（ＮＰ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）、塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）、および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）を本質的にコードし、すなわちそれぞれの遺伝子セグメントから機能性タンパク質が発現されることを本明細書中で特定して指定するものを本質的にコードするＡ型インフルエンザウイルス核酸セグメントを有する本発明による条件つき欠陥インフルエンザウイルス粒子を生成することが最も好ましい。かかる粒子は、機能性ＰＡまたはＰＡをコードする機能性遺伝子セグメントを備えた単離された細胞内に特定して提供される。別の態様では、核タンパク質（ＮＰ）、酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）、および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）を本質的にコードし、すなわちそれぞれの遺伝子セグメントから機能性タンパク質が発現されることを本明細書中で特定して指定するものを本質的にコードするＡ型インフルエンザ核酸セグメントを有する本発明による条件つき欠陥インフルエンザウイルス粒子が提供される。かかる粒子は、機能性ＰＢ１またはＰＢ１をコードする機能性遺伝子セグメントを備えた単離された細胞内に特定して提供される。別の態様では、核タンパク質（ＮＰ）、酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）、および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）を本質的にコードし、すなわちそれぞれの遺伝子セグメントから機能性タンパク質が発現されることを本明細書中で特定して指定するものを本質的にコードするＡ型インフルエンザウイルス核酸セグメントを有する本発明による条件つき欠陥インフルエンザウイルス粒子が提供される。かかる粒子は、機能性ＰＢ２またはＰＢ２をコードする機能性遺伝子セグメントを備えた単離された細胞内に特定して提供される。別の態様では、本発明は、インフルエンザペプチドをコードせず、例えば免疫反応を発現するために有用な他者タンパク質またはペプチドをコードする核酸を追加して備えるか、または細胞内の細胞もしくは病原体の機能に干渉できる核酸を備える本発明による粒子を提供する。
【００３７】
さらに、本発明は、本発明によるインフルエンザウイルス粒子を含んでなる細胞を提供する。粒子が所要のポリメラーゼを本質的にコードする遺伝子セグメントを備えていなかった場合には、このようにして相補された細胞内の欠陥インフルエンザウイルス粒子の複数回の複製を可能とすることに適合する機能性のインフルエンザポリメラーゼウイルスを細胞が備えるように考慮することが有効である。
【００３８】
また、本発明は、本発明による欠陥インフルエンザウイルス粒子または本発明による細胞もしくは細胞から誘導される物質を含んでなる組成物を提供し、かかる組成物は、例えば、インフルエンザウイルスによる患者の感染に対する免疫学的防御を生成することを目的とする製薬学的組成物の生産のために使用できる。また、本発明は、防御が必要な患者にかかる組成物を提供することを含んでなる、インフルエンザウイルスによる患者の感染に対する免疫学的防御を生成するための方法を提供する。ワクチンまたは免疫原的組成物としての本発明による粒子の使用の外に、かかる組成物は好ましくはワクチンとして、すなわちウイルス粒子、またはかかる粒子から誘導されたウイルスタンパク質（スプリットワクチン）を適当な製薬学的担体、例えば塩溶液またはアジュバント（例えばアルミニウム塩またはその他の一般的に使用される賦形剤（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｎｉｐ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｐｉｎｋ／Ａｐｐｅｎｄｉｃｅｓ／Ａ／Ｅ
ｘｃｉｐｉｅｎｔ．ｐｄｆ．）と混合して処方される。本発明による条件つき欠陥インフルエンザウイルス粒子も、他者遺伝子送達のためおよび他者タンパク質の発現のための候補ベクターでもあり、それは機能性遺伝子が例えば５’および３’ＰＡ配列の間に挿入できるからである。本発明が、可能ならば他者もしくは宿主核酸セグメントまたはそれらのフラグメントを備えた、条件つき欠陥インフルエンザウイルス粒子を得るための方法を提供することを考慮して、適当な第一細胞（単数または複数）を、インフルエンザタンパク質をコードする核酸を内部欠失することにより誘導された１個もしくはそれ以上の遺伝子構築物であって、ここで該遺伝子構築物は機能性タンパク質を産生できす、そしてウイルス粒子内へのウイルスの遺伝子セグメントのパッケージングを妨げないものを用い、そしてインフルエンザウイルスをコードする相補性インフルエンザウイルス核酸セグメントを用い、そして該細胞内に該タンパク質を発現できる１個もしくはそれ以上の発現プラスミドを用いてトランスフェクションし、そしてトランスフェクションの後適当な時点で該第一細胞（単数または複数）の上清から少なくとも１個のウイルス粒子を採取する第一工程、および細胞内に該タンパク質を発現できる１個もしくはそれ以上の発現プラスミドを用いて適切な第二細胞（単数または複数）をトランスフェクションする第二工程、および該第一細胞から得られた少なくとも１個のウイルス粒子を含んでなる上清を用いて該第二細胞（単数または複数）に感染させる第三工程、および感染の後の適当な時点で該第二細胞（単数または複数）の上清から少なくとも１個のウイルス粒子を採取することを含んでなる第四工程を含んでなる。これと共に、本発明は、適切な細胞（単数または複数）を、インフルエンザポリメラーゼをコードする核酸を内部欠失することにより誘導された１個もしくはそれ以上の遺伝子構築物であって、ここで、該遺伝子構築物は機能性ポリメラーゼを産生できないが、しかしウイルス粒子内へのウイルスの遺伝子セグメントのパッケージングを妨げないものを用い、そしてインフルエンザウイルスをコードする相補性インフルエンザウイルス核酸セグメントを用い、そして該細胞内に該ポリメラーゼを発現できる１個もしくはそれ以上の発現プラスミドを用いてトランスフェクションし、そしてトランスフェクションの後適当な時点で該細胞（単数または複数）の上清から少なくとも１個のウイルス粒子を採取する工程を含んでなる条件付欠陥インフルエンザウイルス粒子を得るための方法を提供する。かかる条件付欠陥インフルエンザウイルス粒子を得るための方法は、細胞内にインフルエンザポリメラーゼを発現できる１個もしくはそれ以上の発現プラスミドを用いて適切な細胞（単数または複数）をトランスフェクションする第一工程、および条件つき欠陥インフルエンザウイルス粒子を含んでなる上清を用いて該細胞（単数または複数）に感染させる第二工程、および感染の後の適当な時点で該細胞（単数または複数）の上清から少なくとも１個のウイルス粒子を採取することを含んでなる第三工程を含んでなるか、または条件つき欠陥インフルエンザウイルス粒子を得る方法は、適当な第一細胞（単数または複数）を、インフルエンザポリメラーゼをコードする核酸を内部欠失することにより誘導された１個もしくはそれ以上の遺伝子構築物であって、ここで該遺伝子構築物は機能性ポリメラーゼを産生できないが、しかしウイルス粒子内へのウイルスの遺伝子セグメントのパッケージングを妨げないものを用い、そしてインフルエンザウイルスをコードする相補性インフルエンザウイルス核酸セグメントを用い、そして該細胞内に該ポリメラーゼを発現できる１個もしくはそれ以上の発現プラスミドを用いてトランスフェクションし、そしてトランスフェクションの後適当な時点で該第一細胞（単数または複数）の上清から少なくとも１個のウイルス粒子を採取する第一工程、および細胞内に該ポリメラーゼを発現できる１個もしくはそれ以上の発現プラスミドを用いて適切な第二細胞（単数または複数）をトランスフェクションする第二工程、および該第一細胞から得られた少なくとも１個のウイルス粒子を含んでなる上清を用いて該第二細胞（単数または複数）に感染させる第三工程、および感染の後の適当な時点で該第二細胞（単数または複数）の上清から少なくとも１個のウイルス粒子を採取することを含んでなる第四工程を含んでなる方法である。該方法において、該ポリメラーゼは、例えば酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）または塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）であることができる。好ましくは、本発明は、内部欠失が、ＰＡタンパク質では非コード領域から数えてヌ
クレオチド５８と２０７の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そして非コード領域から数えてヌクレオチド２７と１９４の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、あるいはＰＢ１タンパク質では非コード領域から数えてヌクレオチド４３と２４６の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そして非コード領域から数えてヌクレオチド２４と１９７の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、あるいはＰＢ２タンパク質では非コード領域から数えてヌクレオチド３４と２３４の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そして非コード領域から数えてヌクレオチド２７と２０９の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わる、インフルエンザポリメラーゼをコードする核酸を内部欠失することから内部欠失がもたらされる方法を提供する。別の変法では、他者フラグメントがこの内部欠失内に挿入される。さらに、本発明は、条件つき欠陥インフルエンザウイルス粒子を含んでなる上清を用いて感染される細胞（単数または複数）が、非機能性ポリメラーゼ、例えば酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）または塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）および本明細書中に記載の方法により得られるインフルエンザ粒子をすでに発現している方法を提供する。例えば、遺伝子構築物および核酸セグメントを用いてトランスフェクションされた細胞（単数または複数）が非機能性ポリメラーゼをすでに発現することが本明細書中で提供される。具体的には、本発明は、セグメントが機能性インフルエンザポリメラーゼを産生できないようにするが、しかしウイルスの遺伝子セグメントのウイルス粒子内へのパッケージングは妨げないセグメント内の内部欠失を有する１個もしくはそれ以上の核酸セグメントを含んでなるインフルエンザウイルス粒子であって、ここで、ポリメラーゼが酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）または塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）の群から選択されるものを提供する。内部欠失が：ＰＡタンパク質では非コード領域から数えてヌクレオチド５８と２０７の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そして非コード領域から数えてヌクレオチド２７と１９４の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、ＰＢ１タンパク質では非コード領域から数えてヌクレオチド４３と２４６の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そして非コード領域から数えてヌクレオチド２４と１９７の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、ＰＢ２タンパク質では非コード領域から数えてヌクレオチド３４と２３４の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そして非コード領域から数えてヌクレオチド２７と２０９の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わると好ましい。好ましい態様では、本発明はウイルス糖タンパク質をコードするインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する本発明による粒子を提供する。本発明は、核タンパク質（ＮＰ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）、塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）をコードするインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する本発明による粒子、または核タンパク質（ＮＰ）、酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）をコードするインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する粒子、または核タンパク質（ＮＰ）、酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）をコードするインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する粒子を提供する。具体的には、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスから誘導されるインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する本発明による粒子を提供する。本発明は、インフルエンザペプチドをコードしない核酸を備える本発明による粒子も提供する。さらに、本発明は、本発明による粒子を含んでなる細胞、具体的には、ポリメラーゼは酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）、塩基性ポリメラーゼ２（Ｐ
Ｂ２）から選択される１個もしくはそれ以上のインフルエンザウイルスポリメラーゼを備えた細胞を提供する。それに加えて、本発明は、本発明による粒子または本発明による細胞もしくは細胞から誘導された物質を含んでなる組成物、インフルエンザウイルスによる患者の感染に対する免疫学的防御を生成することを目的とする製薬学的組成物の生産のためのかかる組成物の使用、およびかかる組成物を防御を必要とする患者に提供することを含んでなるインフルエンザウイルスへの患者の感染に対する免疫学的防御を生成する方法を提供する。さらに、本発明は、インフルエンザペプチドをコードしない核酸を細胞に送達することを目的とする組成物の生産のための本発明による粒子の使用、およびインフルエンザペプチドをコードしない核酸を患者の細胞に送達することを目的とする製薬学的組成物の生産のための本発明による粒子の使用を提供する。かかる核酸（本明細書中では他者核酸と称する）は、適合する抗原性エピトープもしくはタンパク質をコードする他者遺伝子もしくは遺伝子フラグメントをコードしてもよく、または細胞内で核酸転写を干渉できるヌクレオチドの鎖をコードしてもよい。一つの態様では、本発明は、インフルエンザペプチドをコードしない核酸をある細胞または患者の細胞に送達することを目的とする組成物の生産のための本発明によるＡ型インフルエンザウイルス粒子の使用を提供する。さらに、本発明は、本発明による他者核酸を備えた欠陥インフルエンザウイルス粒子を細胞または患者が備えることを含んでなる、該細胞または該患者に、インフルエンザペプチドをコードしない核酸を送達する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】条件つき欠陥Ａ型インフルエンザウイルスの生産および増殖。最初に、２９３Ｔ細胞を、Ａ／ＰＲ／８／３４、ｐＨＭＧ−ＰＡおよび適合する場合には、ｐΔＰＡもしくはｐＤＩＰＡをコードする７個の二方向プラスミドを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後に、トランスフェクションされた細胞の上清を採取しそしてＭＤＣＫ細胞および２４時間前にＨＭＧ−ＰＡを用いてトランスフェクションされたＭＤＣＫ細胞を接種するために使用した。ウイルス複製にポジティブなＭＤＣＫ−ＰＡ細胞の上清をＭＤＣＫおよびＭＤＣＫ−ＰＡ細胞上で４回継代した。
【図２】条件つき欠陥ウイルス粒子の生成に使用した構築物。上図は、野生型ＰＡ遺伝子セグメントを示す。非コード領域（ＮＣＲ）、および開始コドンが示されている。ｐΔＰＡは、Ａ／ＷＳＮ／３３のＰＡを含む二方向プラスミドであるｐＨＷ１８３（９）のＳｔｕｌを用いる消化、次いで再結合して構築された。ｐＤＩＰＡは、Ａ／ＰＲ／８／３４のＰＡ遺伝子セグメントの５’１９４および３’２０７ｎｔをｐＳＰ７２中にクローニングして構築された。次いで、挿入物は、二方向逆遺伝学ベクターに転移された。ｐΔＰＢ１およびｐΔＰＢ２は、本文記載のようにして構築された。
【図３】上清ｒＰＲ８−７、ｒＰＲ８−ΔＰＡおよびｒＰＲ８−ＤＩＰＡ内のＰＡ遺伝子セグメントの存在のＲＴ−ＰＣＲ分析。ＭＤＣＫ−ＰＡ継代４上清を２２μｍフィルターを通しそして遠心分離により濃縮した。続いて、ＲＮＡを単離しそしてＰＡセグメントの非コード領域を目標とするプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。野生型Ａ／ＰＲ／８／３４から単離されたＲＮＡを対照として使用した。レーン１：ｒＰＲ８−７、レーン２：ｒＰＲ８−ΔＰＡ、レーン３：ｒＰＲ８−ＤＩＰＡ、レーン４：野生型Ａ／ＰＲ／８／３４。マーカーサイズは左に記入されている。
【図４】欠失されたｐΔＰＡ構築物の追加の大きい部分、ｐΔＰＡ−２、ｐΔＰＡ−３、ｐΔＰＡ−４、ｐΔＰＡ−５をもたらす。
【００４０】
詳細な説明
【実施例１】
【００４１】
組換えＤＮＡから欠陥Ａ型インフルエンザウイルス粒子の生成
Ａ型インフルエンザウイルスは、ネガティブ・センスの分節化ウイルスである。ゲノムは８個の遺伝子セグメントから成る。すべての８個の機能性遺伝子セグメントは、感染性ウイルス、すなわちインフルエンザウイルス複製に通常適切と考えられる細胞内で無限もしくは少なくとも数回の複製が可能な複製可能ウイルスを産生することを要求される。無作為的または特異的機構のいずれかを介するＡ型インフルエンザウイルスの遺伝子セグメントのパッケージングプロセスが長年の間論議されている。双方の意見の証拠が記載されている。無作為的パッケージングの証拠は、凝集したウイルス粒子が非凝集ウイルス粒子よりも高い感染性を有すること（６）および細胞培養物が低いｍｏｉで感染された場合に、一部の感染細胞は一つのセグメントの発現を欠失すること（８）であり、双方共にすべてのインフルエンザウイルスゲノムは含まないビリオンがあることを示唆する。無作為的パッケージングのその他の証拠は、９個のセグメントを有するインフルエンザウイルスが実験的に産生されたことである（４）。ＢａｎｃｒｏｆｔおよびＰａｒｓｌｏｗは、ビリオン中のパッケージングのために同じ遺伝子セグメントに由来するｖＲＮＡ間に競合がなかったことを見いだした（１）。
【００４２】
特異的パッケージングプロセスのための一つの論議は、すべての遺伝子セグメントがウイルス原料中に等量で存在するけれども、それらは生産細胞中では異なる量で存在するというものである（１０）。さらに、欠陥干渉性（ＤＩ）粒子が生成した場合に、ＤＩ  ｖＲＮＡはそれが誘導されたセグメントを置換する（３）（欠陥干渉性粒子は遺伝子セグメントの一つが大きい内部欠失を有するウイルス粒子である。それらの粒子は、ウイルスが高いｍｏｉで継代された場合に起き、そしてポリメラーゼ酸性タンパク質のＲ６３８Ａ変異によっても起きると考えられる〔Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：５０１７−５０２０，２００３〕）。最後に、ビリオン形成の効率は、遺伝子セグメントの数が増えると増加する（５）。フジイら（Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ．）は、ビリオン内のセグメントの効率的な組込みに必要なＮＡセグメントの領域も示し、その後同じグループはＨＡおよびＮＳの領域がウイルス粒子内へのパッケージングに重要であることを示した。〔Ｆｕｊｉｉ，２００５＃２５６；Ｗａｔａｎａｂｅ，２００３＃１８４〕。
【００４３】
ここに、我々は特異性パッケージングの証拠を提出する。７個の機能性遺伝子セグメントのみを含むウイルス粒子を産生するために、我々はウイルス産生を止めることなくどの遺伝子セグメントを省くことができるかを決定する必要がある。ワクチンとしての複製欠失ウイルスの使用を考慮して、ＨＡおよびＮＡは省かれず、そしてＭＡもＮＳも省かれないが、それはこの場合に２個の分離した発現プラスミドが必要なためである。我々はポリメラーゼ遺伝子が欠失したウイルスを生産した。我々は、欠失された遺伝子セグメントが発現プラスミドを用いてトランス相補されなかった場合にはウイルスを産生できなかった（表１、２および３、ｒＰＲ８−７ｎｔｃ）。７個の遺伝子セグメントおよび通常、非常に低い力価で欠失遺伝子セグメントにより発現されるタンパク質を発現するプラスミドのトランスフェクションによりウイルスが産生できた（表１、２および３、ｒＰＲ８−７）。従って、インフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３の遺伝子セグメント１、２および３の欠失変異体は、１０３２、５２８および１１２０ヌクレオチドの内部欠失をそれぞれ包含して産生された。それらの欠失変異体は、ｐΔＰＢ２、ｐΔＰＢ１およびｐΔＰＡと命名された。図２参照。２９３Ｔ細胞は、以前の記載（ｄｅ  Ｗｉｔ，Ｅ．，Ｍ．Ｉ．Ｓｐｒｏｋｅｎ，Ｔ．Ｍ．Ｂｅｓｔｅｂｒｏｅｒ，Ｇ．Ｆ．Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎ，Ａ．Ｄ．Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ，ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｆｏｕｃｈｉｅｒ，２００４，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  Ａ／ＰＲ／８／３４  ｆｒｏｍ  ｅｉｇｈｔ  ｃＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１０３：１５５−６１）のようにして、それらの欠失遺伝子セグメントそれぞれ１個およびＡ／ＰＲ／８８．３４をコードする７個の相補二方向構築物（ｄｅ  Ｗｉｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９４）および適切な発現プラスミドを用いてトランスフェクションされた。上清はトランスフェクションの４８時間後に採取された。引き続いて、
ＭＤＣＫ細胞が、発現プラスミドＨＭＧ−ＰＢ２、ＨＭＧ−ＰＢ１またはＨＭＧ−ＰＡの一つを用いて以前の記載（２）のようにしてトランスフェクションされた。それらのトランスフェクションされた細胞は、トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞の相当する上清を用いて接種された（実験手順の説明に関しては図１参照）。それらのＭＤＣＫ細胞内のウイルス複製は、ＨＡアッセイにより決定された。最初に、非トランスフェクションＭＤＣＫ細胞内にはウイルス複製はなかった。ウイルス複製は相当する上清を接種されたＨＭＧ−ＰＢ２、ＨＭＧ−ＰＢ１またはＨＭＧ−ＰＡのいずれかを用いてトランスフェクションされたＭＤＣＫ細胞内に示された。次いで、我々は、インフルエンザ配列データベース（ｗｗｗ．ｆｌｕ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ、アクセッション番号Ｋ００８６７）から得られたインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の欠陥干渉性ＰＡ  ｖＲＮＡの配列に基づいて欠陥ＰＡ遺伝子セグメントをクローンした。ＰＡの５’２０７ｎｔおよび３’１９４ｎｔをＰＣＲ増幅しそして以前に記載したようにして（Ｄｅ  Ｗｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）変性したｐＨＷ２０００（７）から誘導された二方向転写ベクター内にクローンした。得られたプラスミドはｐＤＩＰＡと呼ばれた。図２）参照のこと。２９３Ｔ細胞をｐＤＩＰＡ，ＨＭＧ−ＰＡおよびインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の残りの遺伝子セグメントをコードする７個の二方向構築物を用いてトランスフェクションした（図２参照）。トランスフェクションの４８時間後に上清を採取しそして引き続いて、２４時間前にＨＭＧ−ＰＡを用いてトランスフェクションされたＭＤＣＫ細胞にこの上清を接種した。接種の７２時間後にそれらのＭＤＥＣＫ細胞の上清についてＨＡアッセイを行うと陽性であることがわかり、それはそれらの細胞内でのウイルス複製を示した。非トランスフェクションＭＤＣＫ細胞の接種もＨＡアッセイにより測定するとウイルス産生をもたらさなかった。非トランスフェクションもしくはＨＭＧ−ＰＡを用いてトランスフェクションしたＭＤＣＫ細胞上でのＰＡ欠損ウイルス粒子を含む上清の引き続く継代は、同様の結果に導いた（表１）。継代４まで、ウイルスはＨＭＧ−ＰＡを用いてトランスフェクションされたＭＤＣＫ細胞内で産生された。ＭＤＣＫｐ４の上清は、ウイルス力価の指数を得るために血清で順列的に希釈され、それは約１０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌであることが示された。
【００４４】
使用された方法の工程は以下である：２９３Ｔ細胞を構築物ｐΔＰＢ２、ｐΔＰＢ１、ｐΔＰＡ、ｐΔＮＡ、Ａ／ＰＲ／８／３４をコードする７個の相補構築物（Ｄｅ  Ｗｉｔ
ｅｔ  ａｌ，２００４）の一つおよびＨＭＧ−ＰＢ２、ＨＭＧ−ＰＢ１、ＨＭＧ−ＰＡ（発現プラスミドは、例えばＰｌｅｓｃｈｋａ，Ｓ．，Ｒ．Ｊａｓｋｕｎａｓ，Ｏ．Ｇ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｔ．Ｚｕｒｃｈｅｒ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，ａｎｄ  Ａ．Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ，１９９６，Ａ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７０：４１８８−９２；Ａ．Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｐａｌｅｓｅから入手）の一つを用いてトランスフェクションした（トランスフェクション・プロトコールはＤｅ  Ｗｉｔ  ｅｔ  ａｌ，２００４参照）。トランスフェクションの４８時間後に、トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞の上清を採取した。ウイルスが産生された場合には、それらは上清中に存在する。同時に、ＭＤＣＫ細胞を、発現プラスミドＨＭＧ−ＰＢ２、ＨＭＧ−ＰＢ１、ＰＭＧ−ＰＡの一つ（使用した欠損変異体に応じて、すなわちｐΔＰＢ２を用いた場合には、ＭＤＣＫ細胞はここでＨＭＧ−ＰＢ２を用いてトランスフェクションされる）を用いてトランスフェクションした（トランスフェクションプロトコールはＢａｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００参照）が、それはそれらが内部欠失を有する遺伝子セグメントをパッケージングしたので、産生されたウイルスがこのタンパク質を発現する遺伝子セグメントを欠失しているからである。トランスフェクションの２４時間後に、トランスフェクションされたＭＤＣＫ細胞を、トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞から得た上清を用いて接種する。２９３Ｔ上清中にウイルスが存在する場合には、このウイルスはトランスフェクションＭＤＣＫ細胞中で複製しそしてさらなるウイルスが産生される。この上清は、接種の７２時間後に再び採取できる。
【００４５】
機能性ＰＡ遺伝子セグメントをもたらす発生ＰＡまたはＤＩＰＡの組換えが起きていないことを証明するために、ＭＤＣＫｐ４の上清からＲＮＡを単離した。最初に、上清を２２μＭフィルターを通しそして遠心分離により濃縮した。次いで、ＲＮＡを分離しそしてＰＡセグメントの非コード領域を目的とするプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＡ  ｖＲＮＡに特異性のプライマーを用いて行ったＲＴ−ＰＣＲは、ΔＰＡおよびＤＩＰＡが複数回の継代の間も安定のままであることを示した。ＤＩＰＡウイルス粒子で感染されたＭＤＣＫ細胞の上清中に、約４００ｂｐの明確なバンドが現れ、ΔＰＡを含むウイルスを用いて感染されたＭＤＣＫ細胞の上清中には、１１００ｂｐのバンドが現れる。野生型Ａ／ＰＲ／８／３４を用いて感染されたＭＤＣＫ細胞の上清中には、約２３００ｎｔのバンドが見られる（図３）。それらの結果は、ΔＰＡＰＲ８遺伝子上清が安定にビリオン内にパッケージングされていることを示す。
【００４６】
ＰＢ２を欠失する細胞を産生するために、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の遺伝子セグメント２、３、４、５、６、７および８をコードする７個の二方向構築物（Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｅ．Ｇ．，Ｇ．Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｙ．Ｋａｗａｏｋａ，Ｇ．Ｈｏｂｏｍ，ａｎｄ  Ｒ．Ｇ．Ｗｅｂｓｔｅｒ，２０００，Ａ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｅｉｇｈｔ  ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７：６１０８−１３）を用いて２９３Ｔ細胞をトランスフェクションすると（ｄｅ  Ｗｉｔ，Ｅ．，Ｉ．Ｓｐｒｏｋｅｎ，Ｔ．Ｍ．Ｂｅｓｔｅｂｒｏｅｒ，Ｇ．Ｆ．Ｒｉｍｍｅｌｚｅａａｎ，Ａ．Ｄ．Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ，ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｆｏｕｃｈｉｅｒ，２００４，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  Ａ／ＰＲ／８／３４  ｆｒｏｍ  ｅｉｇｈｔ  ｃＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１０３：１５５−６１）、ｖＲＮＡおよびｍＲＮＡの発現をもたらした。Ａ／ＰＲ／８／３４のＰＢ２を発現するプラスミド、ｐＨＭＧ−ＰＢ２（Ｐｌｅｓｃｈｋａ，Ｓ．，Ｒ．Ｊａｓｋｕｎａｓ，Ｏ．Ｇ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｔ．Ｚｕｒｃｈｅｒ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，ａｎｄ  Ａ．Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ，１９９６，Ａ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：４１８８−９２）を共トランスフェクションした。対照として、Ａ／ＰＲ／８／３４をコードする７個の二方向構築物のみをトランスフェクションし、ｐＨＭＧ−ＰＢ２を除外した。上清をトランスフェクションの４８時間後に採取し、ＭＤＣＫ細胞または２４時間前に１００ｍｌ皿内でｐＨＭＧ−ＰＢ２（ＭＤＣＫ−ＰＢ２）を用いてトランスフェクションされたＭＤＣＫ細胞中に接種した。接種の３日後に、接種されたＭＤＣＫ細胞の上清を、ウイルス産生に関する指示としてシチメンチョウ赤血球を用いて血球凝集活性を試験した。ｐＨＭＧ−ＰＢ２を除いて７個の遺伝子セグメントのみを用いてトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞の上清を用いて接種された細胞中にウイルスは検出されなかった（ｒＰＲ８−７ｎｔｃ、表２）。７個の遺伝子セグメントおよびｐＨＭＧ−ＰＢ２を用いてトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞の上清を用いてトランスフェクションされたＭＤＣＫ−ＰＢ２細胞の上清は陽性であった。引き続いて、ｒＰＲ８−７上清をＭＤＣＫおよびＭＤＣＫ−ＰＢ２細胞内で継代した。ｒＰＲ８−７はＭＤＣＫ−ＰＢ２細胞内で複製したが、しかしＭＤＣＫ細胞内ではしなかった（表２）。我々は次いでインフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３の遺伝子のセグメント１の１０３２ｎｔ欠失変異体を生成させると、３４４アミノ酸欠失をもたらした（ｐΔＰＢ２、図２）。ΔＰＢ２を含む組換えウイルス（ｒＰＲ８−ΔＰＢ２）を上記のようにして生産した（図１）。ＭＤＣＫ細胞中にはウイルスは検出できなかったが、ｒＰＲ８−ΔＰＢ２を用いて接種されたＭＤＣＫ−ＰＢ２細胞中にはウイルスが検出された。ｒＰＲ８−ΔＰＢ２を継代した後、ＭＤＣＫ細胞内にウイルス産生の証拠はなく、ＭＤＣＫ−ＰＢ２細胞とは対照的であった（表２）。
【００４７】
ＰＢ１を欠失するウイルスも生産した。２９３Ｔ細胞を、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の遺伝子セグメント１、３、４、５、６、７および８をコードする７個の二方向構築物を用いてトランスフェクションすると、ｖＲＮＡおよびｍＲＮＡの発現をもたらした。Ａ／ＰＲ／８／３４のＰＢ１を発現するプラスミド、ｐＨＭＧ−ＰＢ１を共トランスフェクションした。対照として、ｐＨＭＧ−ＰＢ１を除いてＡ／ＰＲ／８／３４をコードする７個の二方向構築物のみをトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後に上清を採取しそしてＭＤＣＫ細胞または２４時間前に１００ｍｍ皿内でｐＨＭＧ−ＰＢ１を用いてトランスフェクションされたＭＤＣＫ細胞（ＭＤＣＫ−ＰＢ１）内に接種した（２）（図１）。接種の３日後に、接種されたＭＤＣＫ細胞の上清を、ウイルス産生の指示としてシチメンチョウ赤血球を用いて血球凝集活性を試験した。ｐＨＭＧ−ＰＢ１を除いて７個の遺伝子セグメントのみを用いてトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞の上清を用いて接種された細胞中にウイルスは検出されなかった（ｒＰＲ８−７ｎｔｃ、表３）。７個の遺伝子セグメントおよびｐＨＭＧ−ＰＢ１を用いてトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞の上清を用いて接種されたＭＤＣＫ−ＰＢ１細胞の上清は陽性であった。引き続いて、ｒＰＲ８−７上清をＭＤＣＫおよびＭＤＣＫ−ＰＢ１細胞内で継代した。ｒＰＲ８−７はＭＤＣＫ−ＰＢ１細胞内で複製したが、しかしＭＤＣＫ細胞内ではしなかった（表３）。我々は次いでインフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３の遺伝子セグメント２の５２８ｎｔ欠失変異体を生成させると、１７８アミノ酸欠失をもたらした（ｐΔＰＢ１、図２）。ΔＰＢ１を含む組換えウイルス（ｒＰＲ８−ΔＰＢ１）を上記のようにして生産した（図１）。ＭＤＣＫ細胞中にはウイルスは検出できなかったが、ｒＰＲ８−ΔＰＢ１を用いて接種されたＭＤＣＫ−ＰＢ１細胞中にはウイルスが検出された。ｒＰＲ８−ΔＰＢ１を継代した後、ＭＤＣＫ細胞内にウイルス産生の証拠はなく、ＭＤＣＫ−ＰＢ１細胞とは対照的であった（表３）。
【００４８】
このように、我々は、上記のようにしてｐΔＰＢ２、ｐΔＰＢ１またはｐΔＰＡ／ｐＤＩＰＡ構築物をもたらしそしてＲＮＡポリメラーゼＩＩ駆動ＰＢ２、ＰＢ１またはＰＡ発現プラスミドを用いてトランス相補して、セグメント１、２または３を欠失するウイルスを産生できる。ここに記載する条件つき欠陥ウイルスは、トランス相補されていない細胞中ではただ一周の複製が可能であるが、しかしそれはトランス相補された細胞中では繁殖できる。これは、７個の機能性遺伝子セグメントのみを含み複製一回のみが可能、または欠失遺伝子セグメントがトランス相補された場合には複数回の複製が可能な逆遺伝学を用いて欠陥ウイルスが生産された最初である。
【００４９】
この方法で生産された欠陥ウイルス粒子は、それらが感染性ウイルスを生産することなく一回の複製を行えるので、ワクチンの候補である。この一回複製の結果は、ワクチンが体液的および細胞的免疫反応の双方を誘導することである。それらの欠陥粒子は通常の細胞内では複製しないけれども、生産目的では欠陥タンパク質を発現する細胞系統内で大量のウイルスが増殖可能である。我々が示したように、複数回の複製はウイルスの遺伝子型に影響しない。ワクチンとしての欠陥ウイルス粒子の使用の外に、それらは遺伝子送達および他者タンパク質の発現のための候補ベクターでもあり、それというのも機能性遺伝子は５’および３’ＰＡ、ＰＢ２またはＰＢ１配列の間に挿入できるからである。これはＷａｔａｎａｂｅら（１１）によっても示されており、彼らはＨＡおよびＮＡを他者遺伝子で置換しそしてそれでもウイルス生産が可能なことも示した。
【００５０】
ｐΔＰＡのさらなる末端短縮
さらに、ｐΔＰＡ構築物のより大きい部分を欠失させると、ｐΔＰＡ−２、ｐΔＰＡ−３、ｐΔＰＡ−４、ｐΔＰＡ−５がもたらされる（図４）。２９３Ｔ細胞は、以前の記載（ｄｅ  Ｗｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）のようにそれらの欠失された遺伝子セグメントのそれぞれ一つおよびＡ／ＰＲ／８／３４をコードする７個の相補二方向性構築物（Ｄ
ｅ  Ｗｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）およびＰＡを発現する発現プラスミドを用いてトランスフェクションされた。トランスフェクションの４８時間後に上清を採取した。引き続いて、ＭＤＣＫ細胞を発現プラスミドＨＭＧ−ＰＡを用いて以前の記載（Ｂａｓｌｅｒ，Ｃ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ
Ａ  ９７：１２２８９−９４）のようにしてトランスフェクションした。それらのトランスフェクションされた細胞および非トランスフェクション細胞を、トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞の上清を用いて接種した。それらのＭＤＣＫおよびＭＤＣＫ−ＰＡ細胞内のウイルス複製は、ＨＡアッセイにより決定した。非トランスフェクションＭＤＣＫ細胞内では複製はなかった。ウイルス複製は、上清のいずれか一つを用いて接種された、ＨＭＧ−ＰＡを用いてトランスフェクションされたＭＤＣＫ細胞内に見られた。それらの構築物からもたらされたすべてのｖＲＮＡをビリオン内にパッケージングした（表４）。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
【表２】
2012110339.tif 000004
【００５３】
【表３】
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【００５４】
【表４】
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【実施例２】
【００５５】
欠陥組換えウイルスを用いるワクチン接種
機能性ＰＡ、ＰＢ１もしくはＰＢ２遺伝子を欠失する条件つき欠陥組換えウイルスを、高処理量ウイルスバックボーン（例えばワクチン株Ａ／ＰＲ／８／３４から誘導）に基づいて関連する流行性ウイルス（例えばＡ／モスクワ／１０／９９）のＨＡおよびＮＡ遺伝子を用いて、本明細書中に記載のようにして生産する。条件つき欠陥ウイルスはトランスフェクションにより生産され、その際、ポリメラーゼタンパク質発現はトランス相補を介して達成される。次いで関連ポリメラーゼを安定して発現する適切な細胞基質、例えばＭＤＣＫ細胞またはＶｅｒｏ細胞内でウイルスを増幅する。ウイルス上清は、１０分間、１０００ｘｇで遠心分離して清澄化する。ウイルスを２０〜６０％のスクロース勾配中で遠心分離して濃縮および精製し、ペレット化し、そしてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁する。ウイルス調製物の純度および品質は、クーマシー・ブリリアント・ブルーを用いて染色した１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲルを用いて確認されそして条件つき欠陥ウイルスのウイルス力価は、ＭＤＣＫ細胞および関連するポリメラーゼを発現するＭＤＣＫ細胞の感染および抗核タンパク質モノクローナル抗体を用いる染色により決定される。１ｘ１０Ｅ５  ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ−５０）を用いて気管内または鼻腔内にネブライザーを用いてマウスに接種する。ワクチン接種の前後に採取した血清試料中のインフルエンザウイルスのＨＡ、ＮＡおよび内部タンパク質に対する抗体力価は、赤血球凝集阻害アッセイ、ノイラニミダーゼ阻害アッセイ、ＥＬＩＳＡ、またはウイルス中和アッセイを用いて決定される。ワクチン接種された動物内の抗原特異性細胞免疫反応は、フローサイトメトリー、ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞のテトラマー染色、細胞溶解活性、Ｔ細胞増殖などにより細胞内サイトカイン発現を測定して定量化される。ワクチン接種
および対照動物を、ワクチン接種の６週間後にインフルエンザウイルスＡ／モスクワ／１０／９９または異種ウイルス単離物の１ｘ１０Ｅ６  ＴＣＩＤ−５０を用いて負荷する。負荷の後、鼻または咽頭スワブ試料を１０日間、毎日動物から採取し、そして感染した動物により分泌されたウイルスの量が定量ＰＣＲ分析またはウイルス滴定により決定される。得られたワクチン誘導体液免疫は抗体力価の上昇を定量することにより、得られたワクチン誘導細胞免疫はヘルパーおよび細胞毒性Ｔ細胞反応の上昇を定量することにより、そして免疫性の全体的レベルは負荷ウイルスを用いる感染に対する防御を確認することにより検出される。
【００５６】
【表５】
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【００５７】
＜本発明の特徴または態様＞
限定されるものではないが、本発明の主たる特徴または態様を以下に記載する。
【００５８】
態様１：条件欠陥インフルエンザウイルス粒子を得るための方法であって、インフルエンザポリメラーゼをコードする核酸を内部欠失することにより誘導された１個もしくはそれ以上の遺伝子構築物であって、機能性ポリメラーゼを産生できないが、しかしウイルス粒
子内へのウイルスの遺伝子セグメントのパッケージングを妨げない該遺伝子構築物を用い、かつ、インフルエンザウイルスをコードするが該インフルエンザポリメラーゼをコードしない相補性インフルエンザウイルス核酸セグメントを用い、かつ、該細胞内で該ポリメラーゼを発現できる１個もしくはそれ以上の発現プラスミドを用いて、適当な単一もしくは複数の細胞をトランスフェクションする工程、およびトランスフェクションの後適当な時点で該単一もしくは複数の細胞の上清から少なくとも１個のウイルス粒子を採取する工程を含むが、ヘルパーウイルスを使用しない、ことを特徴とする方法。
【００５９】
態様２：条件欠陥インフルエンザウイルス粒子を得るための方法であって、適切な単一もしくは複数の細胞を該細胞内でインフルエンザポリメラーゼを発現できる１個もしくはそれ以上の発現プラスミドを用いてトランスフェクションする第一工程、および機能性インフルエンザポリメラーゼを産生できない請求項１に記載の条件欠陥インフルエンザウイルス粒子を含む上清を用いて該単一もしくは複数の細胞に感染させる第二工程、および感染の後の適当な時点で該単一もしくは複数の細胞の上清から少なくとも１個のウイルス粒子を採取することを含む第三工程を含むが、ヘルパーウイルスを使用しない、ことを特徴とする方法。
【００６０】
態様３：条件欠陥インフルエンザウイルス粒子を得るための方法であって、
インフルエンザポリメラーゼをコードする核酸を内部欠失することにより誘導された１個もしくはそれ以上の遺伝子構築物であって、機能性ポリメラーゼを産生できないが、しかしウイルス粒子内へのウイルスの遺伝子セグメントのパッケージングを妨げない該遺伝子構築物を用い、かつ、インフルエンザウイルスをコードするが、該インフルエンザポリメラーゼをコードしない相補性インフルエンザウイルス核酸セグメントを用い、かつ、該細胞内で該ポリメラーゼを発現できる１個もしくはそれ以上の発現プラスミドを用いて適当な第一の単一もしくは複数の細胞をトランスフェクションし、かつ、トランスフェクションの後適当な時点で該第一の単一もしくは複数の細胞の上清から少なくとも１個のウイルス粒子を採取する第一工程、および適切な第二の単一もしくは複数の細胞を該細胞内で該ポリメラーゼを発現できる１個もしくはそれ以上の発現プラスミドを用いてトランスフェクションする第二工程、および該第一細胞から得られた少なくとも１個のウイルス粒子を含む上清を用いて該第二の単一もしくは複数の細胞に感染させる第三工程、および感染の後の適当な時点で該第二の単一もしくは複数の細胞の上清から少なくとも１個のウイルス粒子を採取することを含んでなる第四工程を含んでなるが、ヘルパーウイルスを使用しない、ことを特徴とする方法。
【００６１】
態様４：インフルエンザポリメラーゼをコードする核酸の内部欠失することからもたらされる内部欠失が、ＰＡタンパク質では５’非コード領域から数えてヌクレオチド５８と２０７の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そして３’非コード領域のから数えてヌクレオチド２７と１９４の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、ＰＢ１タンパク質では５’非コード領域から数えてヌクレオチド４３と２４６の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そして３’非コード領域から数えてヌクレオチド２４と１９７の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、ＰＢ２タンパク質では５’非コード領域から数えてヌクレオチド３４と２３４の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そして３’非コード領域から数えてヌクレオチド２７と２０９の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わることを特徴とする態様１および３のいずれかに記載の方法。
【００６２】
態様５：条件欠陥インフルエンザウイルス粒子を含んでなる上清を用いて感染される単一もしくは複数の細胞が条件欠陥インフルエンザウイルス粒子内で非機能性であるポリメラ
ーゼに相当するインフルエンザポリメラーゼをすでに発現している、態様２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【００６３】
態様６：ポリメラーゼが酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）である、態様１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【００６４】
態様７：ポリメラーゼが塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）である、態様１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【００６５】
態様８：ポリメラーゼが塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）である、態様１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【００６６】
態様９：態様１〜８のいずれかに記載の方法により得られるインフルエンザウイルス粒子。
【００６７】
態様１０：機能性インフルエンザポリメラーゼを産生できないようにし、かつ、複製について条件欠陥性のウイルス粒子をもたらすが、しかしインフルエンザウイルスの遺伝子セグメントのウイルス粒子内へのパッケージングは妨げないセグメント内の内部欠失を有する１個もしくはそれ以上の核酸セグメントを含んでなるインフルエンザウイルス粒子であって、ここで、該ポリメラーゼが酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）または塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）の群から選択されることを特徴とするインフルエンザウイルス粒子。
【００６８】
態様１１：機能性インフルエンザポリメラーゼを産生できないようにし、かつ、複製について条件欠陥性のウイルス粒子をもたらすが、しかしインフルエンザウイルスの遺伝子セグメントのウイルス粒子内へのパッケージングは妨げないセグメント内の内部欠失を有する１個もしくはそれ以上の核酸セグメントを含んでなるインフルエンザウイルス粒子であって、ここで、ポリメラーゼが酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）または塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）の群から選択され、かつ、ここで内部欠失が、ＰＡタンパク質では５’非コード領域から数えてヌクレオチド５８と２０７の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そして３’非コード領域から数えてヌクレオチド２７と１９４の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、ＰＢ１タンパク質では５’非コード領域から数えてヌクレオチド４３と２４６の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そして３’非コード領域から数えてヌクレオチド２４と１９７の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わり、ＰＢ２タンパク質では５’非コード領域から数えてヌクレオチド３４と２３４の間であってそれらは包含されない位置にある５’ヌクレオチドから始まり、そして３’非コード領域から数えてヌクレオチド２７と２０９の間であってそれらは包含されない位置にある３’ヌクレオチドで終わることを特徴とするインフルエンザウイルス粒子。
【００６９】
態様１２：ウイルス糖タンパク質をコードするインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する、態様９〜１１のいずれか１項に記載の粒子。
【００７０】
態様１３：核タンパク質（ＮＰ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）、塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）をコードするインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する、態様９〜１２のいずれか１項に記載の粒子。
【００７１】
態様１４：核タンパク質（ＮＰ）、酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）をコードするインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する、態様９〜１２のいずれか１項に記載の粒子。
【００７２】
態様１５：核タンパク質（ＮＰ）、酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）および非構造タンパク質（ＮＳ１およびＮＳ２）をコードするインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する、態様９〜１２のいずれか１項に記載の粒子。
【００７３】
態様１６：Ａ型インフルエンザウイルスから誘導されたインフルエンザウイルス核酸セグメントを有する、態様９〜１５のいずれか１項に記載の粒子。
【００７４】
態様１７：インフルエンザペプチドをコードしない核酸を備えている、態様９〜１６のいずれか１項に記載の粒子。
【００７５】
態様１８：態様９〜１７のいずれか１項に記載の粒子を含むが、ヘルパーウイルスを含まないことを特徴とする細胞。
【００７６】
態様１９：ポリメラーゼが、酸性ポリメラーゼ（ＰＡ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）または塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）の群から選択される、１個もしくはそれ以上のインフルエンザウイルスポリメラーゼを発現する態様１８記載の細胞。
【００７７】
態様２０：態様９〜１７のいずれか１項に記載の粒子または態様１８もしくは１９記載の細胞もしくは細胞から誘導される物質を含んでなる組成物。
【００７８】
態様２１：インフルエンザウイルスへの患者の感染に対する免疫学的防御を生ぜしめる目的とする製薬学的組成物の生産のための、態様２０記載の組成物の使用。
【００７９】
態様２２：有効成分として、態様９〜１７のいずれか１項に記載の粒子または態様１８もしくは１９記載の細胞もしくは細胞から誘導される物質を含んでなるインフルエンザウイルスへの患者の感染に対する免疫学的防御を生ぜしめるための製薬学的製剤。
【００８０】
態様２３：細胞に対してインフルエンザペプチドをコードしない核酸の送達を目的とする組成物の生産のための、態様１７記載の粒子の使用。
【００８１】
態様２４：対照者の細胞へのインフルエンザペプチドをコードしない核酸の送達を目的とする製薬学的組成物の生産のための、態様１７記載の粒子の使用。
【００８２】
態様２５：態様１７記載の欠陥インフルエンザウイルス粒子を細胞に提供することを含んでなる、該細胞へのインフルエンザペプチドをコードしない核酸のインビトロでの送達の方法。
【００８３】
態様２６：有効成分として、態様１７記載の欠陥インフルエンザウイルス粒子を含んでなる、該患者へインフルエンザペプチドをコードしない核酸を送達するための製薬学的製剤。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明により提供される条件欠陥インフルエンザウイルス粒子は、通常の条件下では、
生体内で複製、増殖されないので、インフルエンザの予防または治療に効果的に使用できる。したがって、例えば、医薬製造業で利用できる。
【図２】
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【図４】
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【図１】
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【図３】
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