(57)【要約】【課題】試料の輪郭位置近傍に配置される小領域においても鮮明なミクロ画像を取得して、空間分解能の高いバーチャルスライドを構築する。【解決手段】試料Ａを搭載したスライドガラスＢのマクロ画像を取得するマクロ撮像部７と、マクロ画像において試料Ａを抽出する抽出部１０と、抽出された試料Ａ全体を含む領域を複数の小領域に分割する領域分割部１１と、各小領域について試料に対しオートフォーカス動作を行いながらミクロ画像を取得するミクロ撮像部８と、各小領域内における試料Ａの占める面積割合を算出する面積割合算出部１３と、算出された該面積割合が所定の閾値以上であるいずれかの小領域において最初にオートフォーカス動作を行った後に、試料Ａの輪郭を含むいずれかの小領域からミクロ画像の取得を行うようにミクロ撮像部８を制御する顕微鏡制御部１５とを備える顕微鏡装置１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を搭載したスライドガラスのマクロ画像を取得するマクロ撮像部と、
該マクロ撮像部により取得されたスライドガラスのマクロ画像において、試料を抽出する抽出部と、
該抽出部により抽出された試料全体を含む領域を複数の小領域に分割する領域分割部と、
該領域分割部により生成された各小領域について、該小領域内の試料に対しオートフォーカス動作を行いながら前記マクロ画像よりも解像度の高いミクロ画像を取得するミクロ撮像部と、
前記領域分割部により生成された各小領域内における試料の占める面積割合を算出する面積割合算出部と、
該面積割合算出部により算出された前記面積割合が所定の閾値以上であるいずれかの小領域を最初にオートフォーカス動作を行う初期フォーカス小領域として設定する初期フォーカス設定部と、
該初期フォーカス小領域において最初にオートフォーカス動作を行った後に、試料の輪郭を含むいずれかの小領域から前記ミクロ画像の取得を開始するように前記ミクロ撮像部を制御する顕微鏡制御部とを備える顕微鏡装置。
【請求項２】
前記初期フォーカス設定部は、前記面積割合が所定の閾値以上の小領域の中で、前記ミクロ画像の取得を開始する取得開始小領域に最も近い小領域を前記初期フォーカス小領域として設定する請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記初期フォーカス設定部は、前記面積割合が前記閾値以上の小領域が存在しない場合には、前記閾値を下げて、前記初期フォーカス小領域を探索する請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記面積割合算出部は、前記ミクロ画像の取得を開始する取得開始小領域に近い順に、前記面積割合を算出し、
前記初期フォーカス設定部は、前記面積割合が最初に所定の閾値以上となった小領域を前記初期フォーカス小領域として設定する請求項１または３に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記面積割合算出部は、前記ミクロ画像を取得する順に、前記面積割合を算出し、
前記初期フォーカス設定部は、前記面積割合が最初に所定の閾値以上となった小領域を前記初期フォーカス小領域として設定する請求項１または３に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
試料を搭載したスライドガラスのマクロ画像を取得するマクロ画像取得ステップと、
該マクロ画像取得ステップにより取得されたスライドガラスのマクロ画像において試料を抽出する試料抽出ステップと、
該試料抽出ステップにより抽出された試料全体を含む領域を複数の小領域に分割する小領域生成ステップと、
該小領域生成ステップにより生成された各小領域内における試料の占める面積割合を算出する面積割合算出ステップと、
該面積割合算出ステップにより算出された面積割合が所定の閾値以上であるいずれかの小領域において最初にオートフォーカス動作を行う初期オートフォーカスステップと、
該初期オートフォーカスステップの後に、試料の輪郭を含むいずれかの小領域から、前記試料に対しオートフォーカス動作を行いながら前記マクロ画像よりも解像度の高いミクロ画像を取得するミクロ画像取得ステップとを含む画像取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置および画像取得方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、スライドガラス上の試料のマクロ画像を取得して、該マクロ画像内の試料の領域を抽出し、この領域を複数の小領域に分割して、各小領域に対応する高解像度のミクロ画像を取得する顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。取得された複数のミクロ画像をつなぎ合わせることにより、試料全体を高解像度で観察可能ないわゆるバーチャルスライドを構築することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−２３３０９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の顕微鏡では、複数の小領域のミクロ画像を取得する際に、各小領域においてオートフォーカスをかけることとしているが、試料の輪郭位置に配置される小領域においては、小領域内に占める試料の割合が少ない場合にオートフォーカス動作が行われず、不鮮明なミクロ画像が取得されてしまうという不都合がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、試料の輪郭位置近傍に配置される小領域においても鮮明なミクロ画像を取得して、空間分解能の高いバーチャルスライドを構築することができる顕微鏡装置および画像取得方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、試料を搭載したスライドガラスのマクロ画像を取得するマクロ撮像部と、該マクロ撮像部により取得されたスライドガラスのマクロ画像において、試料を抽出する抽出部と、該抽出部により抽出された試料全体を含む領域を複数の小領域に分割する領域分割部と、該領域分割部により生成された各小領域について、該小領域内の試料に対しオートフォーカス動作を行いながら前記マクロ画像よりも解像度の高いミクロ画像を取得するミクロ撮像部と、前記領域分割部により生成された各小領域内における試料の占める面積割合を算出する面積割合算出部と、該面積割合算出部により算出された前記面積割合が所定の閾値以上であるいずれかの小領域を最初にオートフォーカス動作を行う初期フォーカス小領域として設定する初期フォーカス設定部と、該初期フォーカス小領域において最初にオートフォーカス動作を行った後に、試料の輪郭を含むいずれかの小領域から前記ミクロ画像の取得を開始するように前記ミクロ撮像部を制御する顕微鏡制御部とを備える顕微鏡装置を提供する。
【０００７】
本発明によれば、マクロ撮像部により取得されたスライドガラスのマクロ画像から、抽出部により試料が抽出され、試料を含む領域が領域分割部によって複数の小領域に分割される。面積割合算出部は、各小領域において試料が占める面積割合を算出する。初期フォーカス設定部は、面積割合算出部により算出された前記面積割合が所定の閾値以上であるいずれかの小領域を最初にオートフォーカス動作を行う初期フォーカス小領域として設定する。初期フォーカス小領域において最初にオートフォーカス動作を行った後に、試料の輪郭を含むいずれかの小領域から前記ミクロ画像の取得を開始するように前記ミクロ撮像部を制御する。
このようにすることで、所定の閾値以上の面積にわたって試料が存在する小領域においては、オートフォーカス動作により試料への合焦を容易に行うことができる。そして、一旦合焦が行われた後には、面積割合が小さい小領域に移動してオートフォーカス動作が行われない場合にも試料に対してある程度の合焦が得られるので、鮮明なミクロ画像を取得することが可能となる。
【０００８】
上記発明においては、前記初期フォーカス設定部は、前記面積割合が所定の閾値以上の小領域の中で、前記ミクロ画像の取得を開始する取得開始小領域に最も近い小領域を前記初期フォーカス小領域として設定してもよい。
このようにすることで、最初にオートフォーカス動作を行った小領域に対して高低差が少ない小領域からミクロ画像の取得を開始することができる。したがって、試料の面積割合が小さいために正常なオートフォーカス動作が行われない場合においても、鮮明なミクロ画像を取得することが可能となる。
【０００９】
上記発明においては、前記初期フォーカス設定部は、前記面積割合が前記閾値以上の小領域が存在しない場合には、前記閾値を下げて、前記初期フォーカス小領域を探索してもよい。
このようにすることで、最初にオートフォーカス動作を行う小領域が発見されない不都合の発生を防止することができる。
【００１０】
上記発明においては、前記面積割合算出部は、前記ミクロ画像の取得を開始する取得開始小領域に近い順に、前記面積割合を算出し、前記初期フォーカス設定部は、前記面積割合が最初に所定の閾値以上となった小領域を前記初期フォーカス小領域として設定してもよい。
【００１１】
また、上記発明においては、前記面積割合算出部は、前記ミクロ画像を取得する順に、前記面積割合を算出し、前記初期フォーカス設定部は、前記面積割合が最初に所定の閾値以上となった小領域を前記初期フォーカス小領域として設定してもよい。
このようにすることで、最初にオートフォーカス動作を行う小領域を迅速に探索することができ、ミクロ画像の取得を開始するまでの時間を短縮することができる。
【００１２】
また、本発明は、試料を搭載したスライドガラスのマクロ画像を取得するマクロ画像取得ステップと、該マクロ画像取得ステップにより取得されたスライドガラスのマクロ画像において試料を抽出する試料抽出ステップと、該試料抽出ステップにより抽出された試料全体を含む領域を複数の小領域に分割する小領域生成ステップと、該小領域生成ステップにより生成された各小領域内における試料の占める面積割合を算出する面積割合算出ステップと、該面積割合算出ステップにより算出された面積割合が所定の閾値以上であるいずれかの小領域において最初にオートフォーカス動作を行う初期オートフォーカスステップと、該初期オートフォーカスステップの後に、試料の輪郭を含むいずれかの小領域から、前記試料に対しオートフォーカス動作を行いながら前記マクロ画像よりも解像度の高いミクロ画像を取得するミクロ画像取得ステップとを含む画像取得方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、試料の輪郭位置近傍に配置される小領域においても鮮明なミクロ画像を取得して、空間分解能の高いバーチャルスライドを構築することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の顕微鏡装置により取得された（ａ）マクロ画像の一例、（ｂ）グリッドの一例、（ｃ）ミクロ画像の取得順序の一例を示す図である。
【図３】図１の顕微鏡装置を用いた画像取得方法を示すフローチャートである。
【図４】図１の顕微鏡装置による初期フォーカス小領域の探索順序の一例を示す図である。
【図５】図３の画像取得方法の変形例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置１および画像取得方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１は、図１に示されるように、顕微鏡本体２と、制御部３と、後述するマクロ画像およびミクロ画像等を表示する表示部としてのモニタ４と、画像記憶部５とを備えている。
【００１６】
顕微鏡本体２は、試料Ａを搭載したスライドガラスＢを載置して水平でかつ互いに直交する２方向に移動させるステージ６と、該ステージ６上に搭載された試料Ａ全体を含むマクロ画像を取得するマクロ撮像部としてのマクロカメラ７と、マクロ画像よりも高い解像度を有する試料Ａの部分的なミクロ画像を取得するミクロ撮像部としてのミクロカメラ８と、試料Ａに対して自動的に焦点位置合わせを行うオートフォーカス装置９とを備えている。
【００１７】
オートフォーカス装置９は、ステージ６を水平方向に移動させながら、試料Ａに対して合焦位置を連続的に検出する（オートフォーカス動作を連続的に行う）いわゆるリアルタイムオートフォーカス装置である。
このオートフォーカス装置９は、ミクロカメラ８の光軸上に試料Ａが存在している場合、試料に対して常に合焦位置を検出し、また、ミクロカメラ８の光軸上に試料Ａが存在しなくなった場合、試料Ａに対して合焦位置が検出できなくなる直前の合焦位置すなわちミクロカメラ８の光軸上に試料Ａが存在しなくなる直前の合焦位置を維持するようになっている。
【００１８】
なお、オートフォーカス装置９は、ミクロカメラ８の光軸上に配置されている後述する小領域に対する合焦位置が、直前の小領域における合焦位置に対して一定の移動範囲内に収まる場合にオートフォーカス動作を行い、一定の移動範囲内に収まらない場合には、直前のオートフォーカス動作を行った小領域における合焦位置を維持するようにしてもよい。
【００１９】
制御部３は、ＣＰＵ（中央演算処理装置）であり、マクロカメラ７により取得されたマクロ画像を処理して、スライドガラスＢ上の試料Ａの輪郭形状を抽出する抽出部１０と、該抽出部１０により抽出された輪郭形状を含むようにグリッドを当てはめて、試料Ａを複数の小領域に分割する領域分割部１１とを備えている。ここで、小領域の大きさは、ミクロカメラ８の視野と同一に設定している。
【００２０】
また、制御部３は、生成された複数の小領域に対して、ミクロカメラ８によるミクロ画像の取得順序を定める撮像順序設定部１２を備えている。例えば、格子状に正方配列された複数の小領域について、図２（ｃ）に矢印で示されるように、配列の左上から順に、左右に蛇行しながら一筆書きで最下段まで走査する順序でミクロ画像を取得していくようになっている。
【００２１】
さらに、制御部３は、マクロ画像に基づいて、各小領域ごとに、その小領域内において試料Ａが占める面積割合を算出する面積割合算出部１３を備えている。試料Ａの輪郭が含まれる小領域では、試料Ａの面積割合は低く、輪郭が含まれない小領域では、面積割合は高くなっている。制御部３は、この面積割合が、所定の閾値以上（例えば、９０％以上）である小領域を一連のミクロ画像の取得に先立って、最初にオートフォーカス装置９によるオートフォーカス動作を行わせる小領域（初期フォーカス小領域）として設定する初期オートフォーカス設定部１４を備えている。ここで、閾値は、操作者が図示しない入力装置を用いて、設定値として設定してもよい。
【００２２】
制御部３は、初期オートフォーカス設定部１４により設定された初期フォーカス小領域と、撮像順序設定部１２により設定されたミクロ画像の取得順序とを受けて、顕微鏡本体２各部の制御を行う顕微鏡制御部１５を備えている。
【００２３】
顕微鏡制御部１５は、まず、初期フォーカス小領域の中央部がミクロカメラ８の光軸上に配置されるようにステージ６を駆動し、オートフォーカス装置９を作動させて最初のオートフォーカス動作を行わせる。そして、顕微鏡制御部１５は、その後、撮像順序設定部１２から入力された取得順序に従って、ステージ６を駆動し、オートフォーカス装置９を作動させてオートフォーカス動作を行いながら、ミクロカメラ８を作動させて、各小領域におけるミクロ画像の取得するようになっている。
ミクロカメラ８によって取得されたミクロ画像は、画像処理部１６において処理された後、画像記憶部５に記憶されるとともに、必要に応じて複数つなぎ合わせてモニタ４に表示されるようになっている。
【００２４】
このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置１を用いた画像取得方法について以下に説明する。
本実施形態に係る画像取得方法は、図３に示されるように、スライドガラスＢのマクロ画像Ｇ１を取得するマクロ画像取得ステップＳ１と、取得されたスライドガラスＢのマクロ画像Ｇ１において試料Ａを抽出する試料抽出ステップＳ２と、抽出された試料全体を含む領域を複数の小領域に分割する小領域生成ステップＳ３とを含んでいる。
【００２５】
マクロ画像取得ステップＳ１においては、図２（ａ）に示されるように、マクロカメラ７により試料Ａ全体のマクロ画像Ｇ１が取得される。
試料抽出ステップＳ２においては、制御部３に備えられた抽出部１０により、マクロ画像Ｇ１から試料Ａの輪郭形状が抽出される。
そして、小領域生成ステップＳ３においては、制御部３に備えられた領域分割部１１により、図２（ｂ）に示されるように、抽出部１０によって抽出された輪郭形状を含むようにグリッドＧが当てはめられ、試料Ａが複数の小領域Ｒに分割される。
【００２６】
この時点で、制御部３に備えられた撮像順序設定部１２は、生成された複数の小領域Ｒについてミクロ画像を取得する順序を決定する（順序決定ステップＳ４）。制御部３に備えられた撮像順序設定部１２は、図２（ｃ）に矢印Ｃで示されるように、正方配列された複数の小領域Ｒのうちの左上の小領域Ｒ０から順に、左右に蛇行しながら最下段まで走査するようにミクロ画像の取得順序を決定する。したがって、ミクロ画像の取得は、小領域Ｒ内に部分的に試料Ａが存在するような、試料Ａの輪郭を含む小領域（取得開始小領域）Ｒ０から開始されるようになっている。
【００２７】
また、本実施形態に係る画像取得方法は、小領域生成ステップＳ３により生成された各小領域Ｒ内における試料Ａの占める面積割合を算出する面積割合算出ステップＳ５と、面積割合が所定の閾値以上であるいずれかの小領域Ｒにおいて最初にオートフォーカス動作を行う初期オートフォーカスステップＳ６と、初期オートフォーカスステップＳ６の後に、予め設定された小領域Ｒ０から、該小領域Ｒ０内の試料Ａに対しオートフォーカス動作を行いながらミクロ画像を取得するミクロ画像取得ステップＳ７とを含んでいる。
【００２８】
面積割合算出ステップＳ５においては、制御部３に備えられた面積割合算出部１３が、分割生成された全ての小領域Ｒについて試料Ａの面積割合を算出して、初期オートフォーカス設定部１４が、所定の閾値以上の面積割合を有するいずれかの小領域Ｒを、最初にオートフォーカス動作を行う初期フォーカス小領域Ｒとして設定するようになっている。
【００２９】
本実施形態では、初期オートフォーカス設定部１４は、面積割合が所定の閾値以上である全ての小領域Ｒの中から取得開始小領域Ｒ０に最も近い小領域Ｒを選択して、初期フォーカス小領域Ｒとして設定している。
初期オートフォーカスステップＳ６においては、制御部３に備えられた顕微鏡制御部１５がステージ６を作動させて、面積割合算出ステップＳ５により設定された初期フォーカス小領域Ｒの中央部がミクロカメラ８の光軸上に配置され、オートフォーカス装置９によってオートフォーカス動作が行われる。
【００３０】
ミクロ画像取得ステップＳ７においては、制御部３に備えられた顕微鏡制御部１５がステージ６を作動させて、順序決定ステップＳ４において決定された取得開始小領域Ｒ０をミクロカメラ８の光軸上に配置する。
ここで、初期フォーカス小領域Ｒの中央部がミクロカメラ８の光軸上に配置されている状態から取得開始小領域Ｒ０の中央部がミクロカメラ８の光軸上に配置される状態に移動するときも、オートフォーカス装置９によるオードフォーカス動作は行われている。
【００３１】
したがって、顕微鏡制御部１５は、取得開始小領域Ｒ０の中央部がミクロカメラ８の光軸上に配置されるまでの間に、ミクロカメラ８の光軸上に試料Ａが存在しなくなった場合、試料Ａに対して合焦位置が検出できなくなる直前の合焦位置すなわちミクロカメラ８の光軸上に試料Ａが存在しなくなる直前の合焦位置を維持するように制御する。
そして、ミクロカメラ８は、取得開始小領域Ｒ０の中央部がミクロカメラ８の光軸上に配置された時点で、最初のミクロ画像の取得が行われる。
【００３２】
その後、取得開始小領域Ｒ０の中央部がミクロカメラ８の光軸上に配置されている状態から取得開始小領域Ｒ０に隣接する小領域Ｒの中央部がミクロカメラ８の光軸上に配置される状態に移動するときも、オートフォーカス装置９によるオードフォーカス動作は行われる。
そして、ミクロカメラ８は、取得開始小領域Ｒ０に隣接する小領域Ｒの中央部がミクロカメラ８の光軸上に配置された時点で、次のミクロ画像の取得が行われる。
ミクロ画像取得ステップＳ７においては、これらの動作が、順序決定ステップＳ４によって決定された順序に従って全ての小領域Ｒに対して繰り返される。
【００３３】
このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置１および画像取得方法によれば、取得開始領域Ｒ０におけるミクロ画像の取得に先立って、試料Ａの面積割合が所定の閾値以上の初期フォーカス小領域Ｒに対してオートフォーカス動作が行われるので、取得開始小領域Ｒ０における試料Ａの面積割合が低いために、該取得開始小領域Ｒ０においては十分なオートフォーカス動作が行われない場合であっても、初期に行われたオートフォーカス動作による合焦状態を維持して取得開始小領域Ｒ０における鮮明なミクロ画像を取得することができる。
【００３４】
すなわち、初期に行われたオートフォーカス動作は、小領域Ｒ内における試料Ａの面積割合が十分に大きな小領域Ｒにおいて行われるので、確実に実施される。そして、取得開始小領域Ｒ０において、試料Ａが少ないためにオートフォーカス動作が行われない場合には、直前の合焦位置が維持されるので、合焦に失敗した状態でミクロ画像が取得されてしまう不都合の発生を防止することができる。
また、試料Ａの輪郭部分において、試料ＡとスライドガラスＢの表面との高低差が大きい場合においても、オートフォーカス動作の失敗を防止することができる。
【００３５】
なお、本実施形態においては、面積割合算出ステップＳ５において、制御部３が、分割生成された全ての小領域Ｒについて試料Ａの面積割合を算出することとしたが、これに代えて、複数の小領域Ｒについて任意の順序（例えばミクロ画像を取得する順序と同一）で面積割合を算出していき、面積割合が、最初に所定の閾値以上となった小領域Ｒを初期フォーカス小領域として設定してもよい。これにより、初期にオートフォーカス動作を行う小領域の決定を迅速に行うことができ、ミクロ画像の取得に要する時間を短縮することができる。
【００３６】
さらに、面積割合算出ステップＳ５としては、予め設定されたミクロ画像の取得開始小領域Ｒ０を基準として、その取得開始小領域Ｒ０に隣接する領域から、図４に矢印Ｄで示されるように面積割合を算出していき、面積割合が、最初に所定の閾値以上となった小領域Ｒを最初に初期フォーカス小領域として設定してもよい。これにより、面積割合が所定の閾値以上となる小領域Ｒの内、ミクロ画像の取得開始小領域Ｒ０に最も近い小領域Ｒを初期フォーカス領域として設定することができる。
【００３７】
このようにして設定された領域は、ミクロ画像の取得開始小領域Ｒ０に近いので、高低差が少ないと考えることができる。その結果、オートフォーカス動作の失敗をなくして、鮮明なミクロ画像を迅速に取得することができるという利点がある。
【００３８】
また、面積割合算出ステップＳ５において算出された面積割合に基づいて初期フォーカス小領域を探索した結果（ステップＳ８）、全ての小領域Ｒにおいて所定の閾値未満であった場合（ステップＳ９）には、図５に示されるように、閾値を低減して（例えば、閾値を９０％から６０％に下げる）（ステップＳ１０）、再度、初期フォーカス小領域を探索する（ステップＳ８）ことにすればよい。
また、本実施形態においては、グリッドＧの一例として、正方配列された複数の正方形の小領域Ｒを規程するものを例示したが、これに代えて、他の任意の形状の小領域Ｒを規程するグリッドＧを採用してもよい。
【００３９】
また、上記実施形態においては、マクロ画像を取得するマクロカメラ７とミクロ画像を取得するミクロカメラ８とを別個に設けたが、単一のカメラによってマクロ画像およびミクロ画像の両方を取得することにしてもよい。
【符号の説明】
【００４０】
１  顕微鏡装置
７  マクロカメラ（マクロ撮像部）
８  ミクロカメラ（ミクロ撮像部）
９  オートフォーカス装置（ミクロ撮像部）
１０  抽出部
１１  領域分割部
１５  顕微鏡制御部
Ａ  試料
Ｂ  スライドガラス
Ｒ  小領域
Ｓ１  マクロ画像取得ステップ
Ｓ２  試料抽出ステップ
Ｓ３  小領域生成ステップ
Ｓ５  面積割合算出ステップ
Ｓ６  初期オートフォーカスステップ
Ｓ７  ミクロ画像取得ステップ
【図１】
2012003116.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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