(57)【要約】【課題】２型シャルコーマリーツース病の予防や治療などに有用な、２型シャルコーマリーツース病において変性した末梢神経軸索を再生させる薬剤又は方法を提供すること。【解決手段】c-Junアミノ末端キナーゼ（JNK）活性化物質は、２型シャルコーマリーツース病において変性した末梢神経軸索を再生させる作用を有することから、２型シャルコーマリーツース病において変性した末梢神経軸索の再生剤、２型シャルコーマリーツース病の予防や治療などの医薬として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２型シャルコーマリーツース（Charcot-Marie-Tooth）病において変性した末梢神経軸索を再生させる薬剤であって、c-Junアミノ末端キナーゼ（JNK）活性化作用を有する物質を有効成分として含有する末梢神経軸索再生剤。
【請求項２】
２型シャルコーマリーツース（Charcot-Marie-Tooth）病の予防又は治療のための医薬であって、c-Junアミノ末端キナーゼ（JNK）活性化作用を有する物質を有効成分として含有する医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２型ＣＭＴ病において変性した末梢神経軸索を再生させる薬剤又は方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Charcot-Marie-Tooth（シャルコーマリーツース；以下「ＣＭＴ」と称する）病は、末梢神経変性症の総称であり、１型ＣＭＴ病や２型ＣＭＴ病（非特許文献１〜４参照）などの主要なタイプが知られている。２型ＣＭＴ病は、末梢神経の軸索変性（軸索の退縮や欠失などを含む。）を引き起こし、遠位筋の筋力低下と萎縮、知覚障害、足部の潰瘍形成がみられる。重症化すると、潰瘍形成を原因とした反復感染によって、足部切断に至る場合もある。しかし、現在のところ、特異的治療薬はなく、その開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Shy et al., 2002. “Hereditary motor and sensory neuropathies: a biological perspective”. Lancet Neurol 1:110-118.
【非特許文献２】Suter and Scherer, 2003. “Disease mechanisms in inherited neuropathies”. Nat Rev Neurosci 4:714-726.
【非特許文献３】Nicholson, 2006. “The dominantly inherited motor and sensory neuropathies: clinical and molecular advances”. Muscle Nerve 33:589-597.
【非特許文献４】Barisic et al., 2008. “Charcot-Marie-Tooth disease: a clinicogenetic confrontation”. Ann Hum Genet 72:416-441.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、２型ＣＭＴ病の予防や治療などに有用な、２型ＣＭＴ病において変性した末梢神経軸索を再生させる薬剤又は方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、２Ｂ型ＣＭＴ病の発症原因である、低分子量GTP結合蛋白質Rab7（Ras analog in brain 7）の点変異体を発現するベクターを導入した末梢神経細胞にバルプロ酸（VPA）を作用させたところ、変性した軸索が再生されることを見出した。
また、Rab7の点変異体を発現する末梢神経細胞において、JNK（c-Junアミノ末端キナーゼ：c-Jun N-terminal kinase）活性が低下していること、及び、バルプロ酸の作用がJNKシグナル伝達経路を介していること、すなわち、バルプロ酸がJNKシグナル伝達経路を活性化することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、JNK活性化作用を有する物質を有効成分として含有する、２型ＣＭＴ病において変性した末梢神経軸索を再生させる薬剤、又は２型ＣＭＴ病の予防若しくは治療のための医薬などである。
また、本発明は、２型ＣＭＴ病において変性した末梢神経軸索を再生させる方法であって、２型ＣＭＴ病に罹患した哺乳動物に、JNK活性化作用を有する物質を有効量投与する工程を含む方法；２型ＣＭＴ病の予防又は治療のための方法であって、２型ＣＭＴ病に罹患した哺乳動物に、JNK活性化作用を有する物質を有効量投与する工程を含む方法などである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、２型ＣＭＴ病の予防や治療などに有用な、２型ＣＭＴ病において変性した末梢神経軸索を再生させる薬剤又は方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の一実施例において、Rab7変異体発現N1E-115細胞に対するバルプロ酸の作用を調べた結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、Rab7変異体発現N1E-115細胞に対するトリコスタチンＡの作用を調べた結果を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、Rab7変異体発現N1E-115細胞に対するニコチンアミドの作用を調べた結果を示す図である。
【図４】本発明の一実施例において、遺伝子変異によって変性した末梢神経軸索を再生させるというバルプロ酸の作用が、JNK阻害剤によって抑制されることを示す図である。
【図５】本発明の一実施例において、Rab7の変異によるJNK活性化の変化と、Rab7変異体発現N1E-115細胞をVPAで処理した場合にJNKが活性化されるかどうかを調べた結果を示す図である。
【図６】本発明の一実施例において、Rab7変異体発現DRGニューロンに対するバルプロ酸の作用を調べた結果を示す図である。
【図７】本発明の一実施例において、バルプロ酸の存在下または非存在下で培養した各種DRGニューロンに対するJNK阻害剤の作用を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
上記知見に基づき完成した本発明を実施するための形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１０】
＝＝本発明に係る化合物の薬理作用＝＝
実施例で示すように、JNK活性化作用を有する物質は、２型ＣＭＴ病において変性した末梢神経軸索を再生させる作用を有することから、２型ＣＭＴ病において変性した末梢神経軸索の再生や、２型ＣＭＴ病の予防（進行抑制、病状悪化、発病予防などを含む。）又は治療（病状改善なども含む。）などに有用である。ここで、「変性した末梢神経軸索」とは、一旦軸索が形成された後で変性しても、最初から軸索が伸張しなくてもよく、「末梢神経軸索を再生させる」というのは、いずれの場合であっても、神経細胞に対して末梢神経軸索を伸張させることを意味する。
【００１１】
２型ＣＭＴ病としては、例えば、KIF1BやMitofusin2の点変異が発症原因である２Ａ型ＣＭＴ病、Rab7の点変異が発症原因である２Ｂ型ＣＭＴ病、２Ｃ型ＣＭＴ病、Glycyl-tRNA synthetaseの点変異が発症原因である２Ｄ型ＣＭＴ病、Neurofilament triplet L proteinの点変異が発症原因である２Ｅ型ＣＭＴ病、Small heat shock protein 27/HSPB1の点変異が発症原因である２Ｆ型ＣＭＴ病などの末梢神経軸索の変性を引き起こす病気を挙げることができる。
【００１２】
JNK活性化作用を有する物質は、JNKに直接作用してJNKを活性化するものであってもよいし、JNKシグナル伝達経路においてJNKの上流の因子に作用することにより、JNKを活性化するものであってもよい。JNK活性化作用を有する物質としては、例えば、バルプロ酸（VPA）、神経栄養因子（nerve growth factor：NGF）、バルプロ酸ナトリウム、アニソマイシン、MT-21（N-Octyl-3-acetyl-4,5-dimethyl-5-hydroxy-3-pyrrolin-2-one）、亜ヒ酸ナトリウム、ソルビトールなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
＝＝本発明に係る薬剤・医薬＝＝
本発明に係る薬剤・医薬は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、注射剤、坐剤、液剤、塗布剤などの剤形にしてもよい。また、本発明に係る薬剤・医薬は、固形、液状、ゲル状、粉末状、ゼリー状、油状、ペースト状、泡状、クリーム状などの形状にしてもよい。なお、本発明に係る薬剤・医薬を哺乳動物に投与する場合には、製剤化して、経口投与してもよいし、腹腔内や静脈内への注射や点滴により非経口投与してもよい。本発明に係る薬剤・医薬の製剤化は、従来使用されている製剤添加物を用いて、常法で行うことができる。前記製剤添加物としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、矯味矯臭剤、溶剤、安定剤、基剤、湿潤剤、保存剤などの既存の添加物を用いることができる。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明を実施例及び図を用いてより具体的に説明する。
＜実施例１＞Rab7発現細胞又はRab7変異体発現細胞の調製
ヒトRab7 cDNA（Missouri S&T Resource Center; Rolla, MO）を鋳型として、プライマー（配列番号１：5’-ccgggatccatgacctctaggaagaaagtgttgctgaag-3’、及び配列番号２：5’-ccgggatcctcagcaactgcagctttctgcc-3’）及びExTaq polymerase（Takara Bio）を用いてPCRを行った。リボソーム内部侵入部位（IRES）によってRab7と緑色蛍光蛋白質ZsGreenを同時に発現できるように、PCR産物を、pRetroX-IRES-ZsGreen1ベクター（Takara Bio）のマルチクローニングサイトのBamHI切断部位に導入し、Rab7組換えベクターを作製した。このベクターを、Lipofectamine-Plus kit（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて末梢神経モデル細胞株であるN1E-115細胞に導入し、Rab7発現N1E-115細胞を得た。また、Rab7組換えベクターを、Nucleofector II device（program A033; Lonza, Basal, Switzerland）及びBasic Neuron Nucleofector kit（Lonza; Kuramoto et al., 2009. “Regulation of dendrite growth by the Cdc42 activator Zizimin1/Dock9 in hippocampal neurons”. J Neurosci Res 87:1794-17805.）を用いてラット初代後根神経節（DRG：dorsal root ganglia）由来神経細胞（以下、DRGニューロンと称する）にエレクトロポレーションによって導入し、Rab7発現DRGニューロンを得た。さらに、コントロールとして、pRetroX-IRES-ZsGreen1ベクターを導入した、N1E-115細胞（コントロール細胞Ｉ）及びラットDRGニューロン（コントロール細胞II）を調製した。
【００１５】
また、２Ｂ型ＣＭＴ病に関連するRab7変異体（L129F, K157N, N161T又はV162M）とZsGreenを同時に発現する変異Rab7組換えベクターを、pRetroX-IRES-ZsGreen1ベクターと、QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis kit（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）とを用いて作製した。各変異Rab7組換えベクターを、上記と同様に、N1E-115細胞又はラットDRGニューロンに導入し、Rab7変異体発現N1E-115細胞又はRab7変異体発現DRGニューロンを得た。
【００１６】
＜実施例２＞Rab7変異体発現N1E-115細胞に対するVPAの作用
3mM バルプロ酸（VPA；Nacalai Tesque）の存在下又は非存在下で、Rab7発現N1E-115細胞（Wild type Rab7）、４種類のRab7変異体発現N1E-115細胞（Rab7 L129F、Rab7 K157N、Rab7 N161T、及びRab7 V162M）、及びコントロール細胞Ｉ（Control）を、10% 非働化FBS、50 U/ml ペニシリン及び50μg/ml ストレプトマイシンを含むDMEMにて48時間培養した。その後、AxioVision software (Car Zeiss, Oberkochen, Germany)及びEclipse TE-300 microscope system (Nikon, Tokyo, Japan)、又はAF6000 software (Lecia)及びDMI4000B microscope system (Leica, Heerbrugg, Switzerland)を用いて神経細胞を観察し、総神経細胞数（ZsGreen陽性神経細胞数）に対する、神経細胞の細胞体の２倍以上に神経軸索が伸張した細胞数の割合を算出した。その結果を図１に示す。
なお、統計的分析は、GraphPad Prism software (GraphPad, San Diego, CA)により行った。また、図１〜図７において、トランスフェクトした遺伝子と薬剤処理（VPAの存在下又は非存在下での処理）の２要因の分散分析（ANOVA）は、ポストホック比較（post hoc comparison）としてのボンフェローニ多重比較検定（Bonferroni multiple comparison test；＋P＜0.01 vs. wild type）に従って行った。また、１要因の分散分析は、ポストホック比較としてのフィッシャー（Fisher’s）のPLSD（protected least significant difference）検定（★P＜0.01，★★P＜0.02，＃は有意差なしを意味する）に従って行った。
図１に示すように、４種類のRab7変異体発現N1E-115細胞において神経軸索の変性（退縮や欠失）が認められたが、４種類のRab7変異体発現N1E-115細胞をVPAで処理することにより、コントロール細胞ＩやRab7発現N1E-115細胞と同様のレベルまで神経軸索が再生されることが確認された。
【００１７】
＜実施例３＞Rab7変異体発現N1E-115細胞に対するTSAの作用
上記VPAによる神経軸索再生が、VPAが有する脱アセチル化酵素（HDAC）阻害作用によるものでないことを示すため、本実施例では、VPAの代わりにHDAC阻害作用を有するトリコスタチンＡ（TSA；Merck；最終濃度で300 nM）を用いて、実施例２に記載の方法と同様に、変性した末梢神経軸索をTSAで処理した。
図２に示すように、Rab7の変異により変性した末梢神経の軸索は、トリコスタチンＡで処理しても再生されなかった。このように、変性した末梢神経軸索の再生がHDAC阻害作用によるものでないことがわかる。
【００１８】
＜実施例４＞Rab7変異体発現N1E-115細胞に対するNamの作用
近年、VPAがNAD+依存的デアセチラーゼに関与することが報告されている（Reid et al., 2005. “Multiple mechanisms induce transcriptional silencing of a subset of genes, including oestrogen receptor alpha, in response to deacetylase inhibition by valproic acid and trichostatin A”. Oncogene 24:4894-4907.及びSuuronen et al., 2008. “Regulation of ER alpha signaling pathway in neuronal HN10 cells: role of protein acetylation and Hsp90”. Neurochem Res 33:1768-1775.）が、VPAによる神経軸索再生が、VPAが有するNAD+依存的デアセチラーゼ阻害作用によらないことを示すため、VPAの代わりにNAD+依存的デアセチラーゼ阻害作用を有するニコチンアミド（Nam；Wako Chemical；最終濃度で30mM）を用いて、実施例２に記載の方法と同様に、変性した末梢神経軸索を有する神経細胞をNamで処理した。
図３に示すように、ニコチンアミドは、変性した末梢神経軸索に対して再生作用を有していなかった。このように、変性した末梢神経軸索の再生がNAD+依存的デアセチラーゼ阻害作用によるものでないことがわかる。
【００１９】
＜実施例５＞JNKを介したRab7変異体発現N1E-115細胞に対するVPAの作用
神経発生における主要なキナーゼとしてJNK（c-Junアミノ末端キナーゼ：c-Jun N-terminal kinase）が知られており（Chang et al., 2003. JNK1 is required for maintenance of neuronal microtubules and controls phosphorylation of microtubule-associated proteins. Dev Cell 4:521-533.及びKawauchi et al., 2003. The in vivo roles of STEF/Tiam1, Rac1 and JNK in cortical neuronal migration. EMBO J 22:4190-4201.）、VPAの作用がJNKシグナル伝達経路を介していることを示すため、変性した末梢神経軸索を有する神経細胞を、実施例２に記載の方法と同様に、VPAと共に、JNK阻害剤として知られているSP600125（JNK inhibitor II；Merck；10μM）またはJNK inhibitor I（Nacalai Tesque；10μM）で処理した。
図４に示すように、SP600125及びJNK inhibitor Iは、Rab7の変異によって変性した末梢神経軸索を再生させるというVPAの作用を、コントロール細胞Ｉを処理したものと同じレベルまで低下させた（図４Ｂ〜Ｅ参照）。このように、VPAの作用はJNKシグナル伝達経路を介していることがわかる。
【００２０】
＜実施例６＞Rab7の変異によるJNK活性化の変化とVPAによる作用
本実施例では、実際に、Rab7の変異によってJNKの活性化が低下していること、及びVPAがJNKを活性化することを示す。
実施例２に記載のようにVPAで処理した各種細胞の溶解物に対して、１次抗体として抗(pTHr183/pTyr185)JNK抗体（Cell Signaling Technology, Danvers, MA）又は抗JNK1抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）を、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗体（GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom）を用いて、免疫ブロットを行った。なお、抗体の検出は、Chemi-Lumi One L kit（Nacalai Tesque）を用いて行った。その結果を図５に示す。
図５に示すように、VPAで処理していないRab7発現細胞（Wild type Rab7）では、JNKリン酸化が保持されていたが（図５Ａ及びＢ−レーン６）、VPAで処理していないRab7変異体発現N1E-115細胞ではJNKリン酸化が低下していた。これに対して、VPAで処理したRab7変異体発現N1E-115細胞においては、JNKリン酸化が正常レベルにまで回復していた（図５Ａ及びＢ−レーン１及び３）。このように、実際に、Rab7の変異によってJNKの活性化が低下していること、及びVPAがJNKを活性化することがわかる。
【００２１】
＜実施例７＞Rab7変異体発現DRGニューロンに対するVPAの作用
本実施例では、初代DRGニューロンにおいて、N1E-115細胞と同様のメカニズムで、同様の現象が起きることを示す。
2.5 cmカバーガラスで被ったコラーゲンコート皿において、Rab7発現DRGニューロン（Wild type Rab7）、４種類のRab7変異体発現DRGニューロン（Rab7 L129F、Rab7 K157N、Rab7 N161T、及びRab7 V162M）、又はコントロール細胞II（Control）を、10% FBS、100 ng/ml 神経成長因子 (NGF)、8μM フルオロデオキシウリジン、及び4μM ウリジンを含むDMEM-Glutamax (Invitrogen)中で、300μM VPAの存在下又は非存在下にて培養した。その後、実施例２に記載のように神経細胞を観察し、ZsGreen陽性神経細胞における軸索の長さを測定した。
図６に示すように、４種類のRab7変異体発現DRGニューロンにおいて、神経軸索の形成が強く阻害されていたが、VPAで処理することにより神経軸索が形成された。
また、VPAと同時に10μM SP600125で処理したところ、図７に示すように、VPAによる末梢神経軸索の再生がSP600125によって阻害された。このように、初代DRGニューロンにおいても、VPAは、JNKシグナル伝達経路を介して、２Ｂ型ＣＭＴ病に関連するRab7の変異によって変性した末梢神経軸索の再生を引き起こす。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図１】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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