(57)【要約】【課題】広範囲に均一な強度分布を有するレーザスポットを形成し、サンプル流中の微小粒子に照射されるレーザの実効強度を均一化して、高精度かつ高速な測定が可能な微小粒子測定装置の提供。【解決手段】光源１からの光を、位相段差素子４を透過させて、微小粒子Ｐが通流するサンプル流Ｓに集光する光照射系を備え、位相段差素子４は、サンプル流Ｓの送流方向をＸ軸方向、光のサンプル流Ｓへの照射方向をＺ軸方向、ＺＸ平面に対する垂直方向をＹ軸方向とすると、Ｙ軸方向に分割された複数の領域からなり、各領域を透過する光の波面間に位相差を生じさせるものである、微小粒子測定装置を提供する。【選択図】図１
2012026754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からの光を、位相段差素子を透過させて、微小粒子が通流するサンプル流に集光する光照射系を備え、
前記位相段差素子は、サンプル流の送流方向をＸ軸方向、光のサンプル流への照射方向をＺ軸方向、ＺＸ平面に対する垂直方向をＹ軸方向とすると、Ｙ軸方向に分割された複数の領域からなり、各領域を透過する光の波面間に位相差を生じさせるものである、微小粒子測定装置。
【請求項２】
前記位相段差素子が、Ｙ軸方向に３つの領域に分割され、中央の領域を透過する光の波面と両端の領域を透過する光の波面との間に位相差を生じさせるものである請求項１記載の微小粒子測定装置。
【請求項３】
中央の領域を透過する光の波面と両端の領域を透過する光の波面との間に生じる位相差がπである請求項２記載の微小粒子測定装置。
【請求項４】
中央の領域を透過する光のスポット径が、前記位相段差素子を透過する光のスポット径の２５〜７５％である請求項２又は３記載の微小粒子測定装置。
【請求項５】
光源からの光を、複数の分割された領域からなり各領域を透過する光の波面間に位相差を生じさせる位相段差素子を透過させて、対象物に集光する光照射装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小粒子測定装置及び光照射装置に関する。より詳しくは、細胞やマイクロビーズ等の微小粒子の特性を光学的に分析する微小粒子測定装置等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、フローセル内やマイクロチップ上に形成された流路内を通流する微小粒子に光（レーザ）を照射し、微小粒子からの散乱光や、微小粒子そのものあるいは微小粒子に標識された蛍光物質から発生する蛍光を検出して、微小粒子の光学特性を測定する微小粒子測定装置が用いられている。この微小粒子測定装置では、光学特性の測定の結果、所定の条件を満たすと判定されたポピュレーション（群）を、微小粒子中から分別回収することも行われている。このうち、特に微小粒子として細胞の光学特性を測定したり、所定の条件を満たす細胞群を分別回収したりする装置は、フローサイトメータあるいはセルソータ等と呼ばれている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、「互いに異なる波長を有する複数の励起光を、所定の周期および互いに異なる位相で照射する複数の光源と、複数の励起光を同一の入射光路上に導光し、染色された粒子に集光する導光部材とを備えたフローサイトメータ」が開示されている。このフローサイトメータは、互いに異なる波長を有する複数の励起光を照射する複数の光源と、前記複数の励起光を同一の入射光路上に導光し、染色された粒子に集光する導光部材と、前記複数の励起光のそれぞれが前記粒子を励起して生じた蛍光を検出し、蛍光信号を出力する複数の蛍光検出器と、を備えるものである（当該文献請求項１・３、図１・３参照）。
【０００４】
従来の微小粒子測定装置では、図６に示すように、レーザＬは集光レンズ１０３によってサンプル流Ｓに集光され、微小粒子Ｐは集光されたレーザＬのスポットを横切るようにしてサンプル流Ｓ中を通流する。このとき、レーザスポットの強度分布は、スポット中心で強く、周辺では大きく減弱するガウシアン分布となっている。図７に、従来の微小粒子測定装置におけるレーザスポットの強度分布の一例を示す。そのため、サンプル流Ｓ中の微小粒子Ｐの送流位置にばらつきが存在すると、レーザスポットの中央を通過する微小粒子Ｐと周辺を通過する微小粒子Ｐとの間で照射されるレーザの実効強度に差が生じ、得られる信号強度に誤差が生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−４６９４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
サンプル流中の微小粒子の送流位置のばらつきによる測定誤差を排除するため、従来、サンプル流に集光されるレーザのスポット形状をサンプル流の幅方向（図６中Ｙ軸方向）に拡がった楕円形とすることが行われている。スポット形状をこのような楕円形とすることで、レーザスポットの強度分布がサンプル流の幅方向に広いガウシアン分布となるため、サンプル流中の送流位置の違いに起因して各微小粒子間に生じるレーザの照射強度差を抑制できる。
【０００７】
しかし、スポット形状を楕円形とした場合であっても、測定速度を高めるためにサンプル流の送液圧を高めると、サンプル流の層流幅が楕円形スポットに対してさらに拡がってしまうこととなり、各微小粒子に照射されるレーザの実効強度を安定的に均一化することは難しかった。
【０００８】
そこで、本発明は、広範囲に均一な強度分布を有するレーザスポットを形成し、サンプル流中の微小粒子に照射されるレーザの実効強度を均一化して、高精度かつ高速な測定を可能とする技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題解決のため、本発明は、光源からの光を、位相段差素子を透過させて、微小粒子が通流するサンプル流に集光する光照射系を備え、前記位相段差素子は、サンプル流の送流方向をＸ軸方向、光のサンプル流への照射方向をＺ軸方向、ＺＸ平面に対する垂直方向をＹ軸方向とすると、Ｙ軸方向に分割された複数の領域からなり、各領域を透過する光の波面間に位相差を生じさせるものである、微小粒子測定装置を提供する。
この微小粒子測定装置では、光源から出射された光を位相段差素子に透過させ、Ｙ軸方向に分割された各領域を透過する光の波面間に異なる位相を付与することで、集光レンズによって集光される光のレーザスポットをＹ軸方向に幅広としてサンプル流に集光できる。
この微小粒子測定装置において、前記位相段差素子は、Ｙ軸方向に３つの領域に分割され、中央の領域を透過する光の波面と両端の領域を透過する光の波面との間に位相差を生じさせるものとできる。この場合において、中央の領域を透過する光の波面と両端の領域を透過する光の波面との間に生じる位相差はπであり、中央の領域を透過する光のスポット径は前記位相段差素子を透過する光のスポット径の２５〜７５％であることが好適となる。
また、本発明は、光源からの光を、複数の分割された領域からなり各領域を透過する光の波面間に位相差を生じさせる位相段差素子を透過させて、対象物に集光する光照射装置をも提供する。
【００１０】
本発明において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれるものとする。
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。対象とする細胞には、動物細胞(血球系細胞など)および植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。さらに、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。
また、工業用粒子は、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。これら微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、広範囲に均一な強度分布を有するレーザスポットを形成し、サンプル流中の微小粒子に照射されるレーザの実効強度を均一化して、高精度かつ高速な測定を可能とする技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の第一実施形態に係る微小粒子測定装置の光照射系の構成を説明する模式図である。
【図２】位相段差素子の構成を説明する模式図である。
【図３】第一実施形態に係る微小粒子測定装置におけるレーザスポットの強度分布を説明する図である。
【図４】本発明の第二実施形態に係る微小粒子測定装置の光照射系の構成を説明する模式図である。
【図５】第二実施形態に係る微小粒子測定装置におけるレーザスポットの強度分布を説明する図である。
【図６】従来の微小粒子測定装置の光照射系の構成を説明する模式図である。
【図７】従来の微小粒子測定装置におけるレーザスポットの強度分布を説明する図である。
【図８】第一実施形態に係る微小粒子測定装置において、第一領域を透過するレーザのスポット径を２０％として形成した不適当なレーザスポットの強度分布を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．第一実施形態に係る微小粒子測定装置
２．第二実施形態に係る微小粒子測定装置
【００１４】
１．第一実施形態に係る微小粒子測定装置
図１に、本発明の第一実施形態に係る微小粒子測定装置の光照射系の構成を示す。
【００１５】
図中、符号１で示す光源から出射された光（レーザ）は、コリメータレンズ２により略平行光にカップリングされ、位相段差素子４を透過した後、集光レンズ３によって微小粒子Ｐが通流するサンプル流Ｓに対して集光される。サンプル流Ｓは、フローセル内、あるいはマイクロチップ上に形成された流路内を送液されるものであってよい。ここで、サンプル流Ｓの送流方向をＸ軸方向、光のサンプル流Ｓへの照射方向をＺ軸方向、ＺＸ平面に対する垂直方向をＹ軸方向と定義する。
【００１６】
サンプル流Ｓに集光され照射された光によって微小粒子Ｐあるいは微小粒子Ｐに標識された蛍光物質から発生する散乱光や蛍光は、不図示の光検出系によって検出される。光検出系は、対物レンズやフィルタ、ミラー、光検出器等によって構成でき、従来公知の微小粒子測定装置と同様の構成とできる。光検出器からの電気信号は、微小粒子Ｐの光学特性の測定のために供される。光学特性測定のためのパラメータは、従来公知の微小粒子測定装置と同様に、例えば、微小粒子Ｐの大きさを判定する場合には前方散乱光が、構造を判定する場合には側方散乱光が、微小粒子Ｐに標識された蛍光物質の有無を判定する場合には蛍光が採用される。
【００１７】
図２に、位相段差素子４の構成を示す。図中、符号Ｏは位相段差素子４を透過する光のスポットを示し、符号Ｄはその径を示す。
【００１８】
位相段差素子４は、Ｙ軸方向に複数の領域に分割され、中央の第一領域４１と、その両側の第二領域４２及び第三領域４３とからなっている。符号ｄは、位相段差素子４を透過する光のスポット径Ｄのうち、第一領域４１を透過する光のスポット径を示す。
【００１９】
第一領域４１には、第二領域４２及び第三領域４３に対して物理的な段差が付けられており、第一領域４１を透過する光の波面は、第二領域４２及び第三領域４３を透過する光の波面との間で位相差πを生じるように構成されている。すなわち、第一領域４１と第二領域４２及び第三領域４３との間の位相段差高さ（図２中、符号ｈ参照）は、以下の式を満たす。なお、第一領域４１の位相段差高さｈは、第二領域４２及び第三領域４３に対して、図に示すような凸であっても、あるいは逆に凹であってもよい。
【００２０】
ｈ×（ｒ−１）＝π
（式中、ｒは、第一領域４１を構成する材料の屈折率を表す。）
【００２１】
集光レンズに入射する光の波面の位相がそろっている場合、光は、集光レンズによって一点に集光される。これに対して、集光レンズに入射される光の波面間に位相差が存在する場合、光は、一点に集光されずより広範に集光される。本実施形態に係る微小粒子測定装置では、光源１から出射された光を位相段差素子４に透過させ、Ｙ軸方向に分割された各領域を透過する光の波面間に異なる位相を付与することで、集光レンズ３によって集光される光のレーザスポットをＹ軸方向に幅広に集光できる。
【００２２】
図３に、本実施形態に係る微小粒子測定装置において、サンプル流Ｓ上に集光されるレーザスポットの強度分布の一例を示す。
【００２３】
図は、波長６３８ｎｍ帯の半導体レーザとした光源１の発散角をＸ軸及びＹ軸方向ともに９度、コリメータレンズ２のＮＡを０．０５、集光レンズ３のＮＡを０．０１とした場合に、サンプル流Ｓ上に集光されるレーザスポットの強度分布を演算（シミュレーション）により求めた結果である。ここでは、第一領域４１を透過する光のスポット径ｄが、位相段差素子４を透過する光のスポット径Ｄの７０％である場合について計算を行った。
【００２４】
レーザスポットは、Ｘ軸方向にはガウシアン分布を維持し、Ｙ軸方向には中心部分が平坦で広範囲に均一な強度分布を示していることが分かる。
【００２５】
本実施形態に係る微小粒子測定装置において、第一領域４１を透過する光のスポット径ｄは、位相段差素子４を透過する光のスポット径Ｄの２５〜７５％であることが好適である。第一領域４１を透過する光のスポット径ｄをこの数値範囲に設定することにより、各領域を透過する光を、Ｙ軸方向の中心部分が平坦で連続的に一定の強度を有するレーザスポットとして集光できる。
【００２６】
比較のため、第一領域４１を透過する光のスポット径ｄが、位相段差素子４を透過する光のスポット径Ｄの２０％である場合について同様の計算を行って得たレーザスポットの強度分布を図８に示す。レーザスポットは、Ｙ軸方向に分断され、不均一な強度分布を示している。
【００２７】
以上のように、本実施形態に係る微小粒子測定装置では、レーザをＹ軸方向に幅広で広範囲に均一な強度分布を有するスポットとしてサンプル流Ｓ上に集光することができる。従って、この微小粒子測定装置では、レーザスポットの強度分布をサンプル流Ｓの幅方向（Ｙ軸方向）に広いガウシアン分布とし、サンプル流Ｓ中の送流位置の違いに起因して各微小粒子Ｐ間に生じるレーザの照射強度差を効果的に抑制できる。そして、サンプル流Ｓ中の微小粒子Ｐの送流位置のばらつきによる測定誤差を排除して、高精度かつ高速な測定が可能とされる。
【００２８】
本実施形態では、第一領域４１に物理的な段差を付与することで、第一領域４１を透過する光の波面と第二領域４２及び第三領域４３を透過する光の波面との間に位相差を生じる構成としたが、位相差は光学的異方性を有する液晶分子を利用して生じさせることもできる。すなわち、第一領域４１と、第二領域４２及び第三領域４３とに光学的異方性を有する液晶分子を異なる配向で配列する。そして、光を直線偏光として位相段差素子に透過させ、第一領域４１と、第二領域４２及び第三領域４３とにおいて屈折率差を生じさせることで位相差を与えてもよい。液晶分子をＩＴＯ膜で挟持し、第一領域４１と、第二領域４２及び第三領域４３とにおいて独立して電圧を制御することによって、液晶分子の配向を制御することも可能である。この場合、電圧の制御によって、本発明の適用の有無を切り換えて、レーザスポットの強度分布を通常のガウシアン分布とサンプル流Ｓの幅方向に広いガウシアン分布とに切り換えることができる。
【００２９】
また、本実施形態では、位相段差素子４をＹ軸方向に３つの領域に分割する場合を例に説明したが、位相段差素子の分割領域数は、本発明の効果が奏される限りにおいて４以上としてもよい。また、各領域を透過する光の波面間に生じる位相差も、上記のπに限定されず、本発明の効果が奏される限りにおいて適宜変更が可能である。
【００３０】
２．第二実施形態に係る微小粒子測定装置
図４に、本発明の第二実施形態に係る微小粒子測定装置の光照射系の構成を示す。
【００３１】
図中、符号１で示す光源から出射された光（レーザ）は、コリメータレンズ２により略平行光にカップリングされ、位相段差素子４を透過した後、母線が互いに直交する一対のシリンダレンズ３１，３２によって微小粒子Ｐが通流するサンプル流Ｓに対して集光される。サンプル流Ｓは、フローセル内、あるいはマイクロチップ上に形成された流路内を送液されるものであってよい。ここで、サンプル流Ｓの送流方向をＸ軸方向、光のサンプル流Ｓへの照射方向をＺ軸方向、ＺＸ平面に対する垂直方向をＹ軸方向と定義する。
【００３２】
本実施形態に係る微小粒子測定装置において、位相段差素子４の構成及び散乱光や蛍光を検出するための光検出系の構成は、第一実施形態に係る微小粒子測定装置と同様である。
【００３３】
本実施形態に係る微小粒子測定装置では、Ｘ方向の集光ＮＡに対してＹ方向の集光ＮＡを相対的に小さくしたシリンダレンズ３１，３２を用いることで、サンプル流Ｓに集光されるレーザスポットをＹ軸方向に拡がった楕円形としている。加えて、光源１から出射された光を位相段差素子４に透過させ、Ｙ軸方向に分割された各領域を透過する光の波面間に異なる位相を付与することで、集光レンズ３によって集光される光のレーザスポットをＹ軸方向に一層幅広に集光できる。
【００３４】
図５に、本実施形態に係る微小粒子測定装置において、サンプル流Ｓ上に集光されるレーザスポットの強度分布の一例を示す。
【００３５】
図は、波長６３８ｎｍ帯の半導体レーザとした光源１の発散角をＸ軸方向に８．７度、Ｙ軸方向に２３度、コリメータレンズ２のＮＡを０．２５、Ｘ軸方向を集光するシリンダレンズ３１のＮＡを０．０６７、Ｙ軸方向を集光するシリンダレンズ３２のＮＡを０．０１とした場合に、サンプル流Ｓ上に集光されるレーザスポットの強度分布を演算（シミュレーション）により求めた結果である。ここでは、第一領域４１を透過する光のスポット径ｄが、位相段差素子４を透過する光のスポット径Ｄの５０％である場合について計算を行った。
【００３６】
レーザスポットは、Ｘ軸方向にはガウシアン分布を維持し、Ｙ軸方向には中心部分が平坦で広範囲に均一な強度分布を示していることが分かる。また、図３に示した第一実施形態に係る微小粒子測定装置におけるシミュレーション結果に比較して、Ｘ軸方向の幅が非常に小さくされている。
【００３７】
本実施形態に係る微小粒子測定装置において、第一領域４１を透過する光のスポット径ｄは、位相段差素子４を透過する光のスポット径Ｄの２５〜７５％であることが好適である。第一領域４１を透過する光のスポット径ｄをこの数値範囲に設定することにより、各領域を透過する光を、Ｙ軸方向の中心部分が平坦で連続的に一定の強度を有するレーザスポットとして集光できる。
【００３８】
以上のように、本実施形態に係る微小粒子測定装置では、レーザをＹ軸方向に幅広で広範囲に均一な強度分布を有し、かつＸ軸方向に幅が狭く光密度の高いスポットとしてサンプル流Ｓ上に集光することができる。従って、この微小粒子測定装置では、レーザスポットの強度分布をサンプル流Ｓの幅方向（Ｙ軸方向）に広いガウシアン分布とし、サンプル流Ｓ中の送流位置の違いに起因して各微小粒子Ｐ間に生じるレーザの照射強度差を効果的に抑制できる。そして、サンプル流Ｓ中の微小粒子Ｐの送流位置のばらつきによる測定誤差を排除できる。さらに、微小粒子Ｐに高密度の光を照射して、強い信号強度を得ることもできる。そのため、高精度かつ高速な測定が可能とされ、高い検出感度が実現される。
【００３９】
なお、第一領域４１を透過する光の波面と第二領域４２及び第三領域４３を透過する光の波面との間の位相差は光学的異方性を有する液晶分子を利用して生じさせることもできる点は、第一実施形態に係る微小粒子測定装置に同じである。また、位相段差素子の分割領域数は、本発明の効果が奏される限りにおいて４以上としてもよい点、各領域を透過する光の波面間に生じる位相差は、本発明の効果が奏される限りにおいて適宜変更が可能である点も、第一実施形態に係る微小粒子測定装置に同じである。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明に係る微小粒子測定装置は、広範囲に均一な強度分布を有するレーザスポットを形成し、サンプル流中の微小粒子に照射されるレーザの実効強度を均一化することで、高精度かつ高速な測定が可能である。従って、本発明は、フローサイトメータあるいはセルソータ等の微小粒子測定装置として好適に実施され得る。
【符号の説明】
【００４１】
１：光源、２：コリメータレンズ、３：集光レンズ、３１，３２：シリンダレンズ、４：位相段差素子、４１：第一領域、４２：第二領域、４３：第三領域、Ｓ：サンプル流、Ｐ：微小粒子
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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