(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫測定の発光法及び蛍光法においても優れた検出感度を示す高活性なペルオキシダーゼを提供する。【解決手段】一般式（１）で表されるポルフィセン誘導体を補欠分子として含有する、ペルオキシダーゼ。2012110284.tif 000007［式中、Ｒ1〜Ｒ8は独立に水素原子、炭素数１〜１２の直鎖、分岐又は環状のアルキル基及び炭素数６〜１２のアリール基からなる群から選ばれる原子又は置換基であり、置換基の場合その置換基の水素原子の少なくとも１つがカルボキシル基、水酸基及び／又はハロゲン原子で置換されていてもよく、Ｍは３〜１３族に属する金属原子である。］【選択図】図１
2012110284.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で表されるポルフィセン誘導体を補欠分子として含有することを特徴とするペルオキシダーゼ。
【化１】
2012110284.tif 000006
［式中、Ｒ1〜Ｒ8はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜１２の直鎖、分岐又は環状のアルキル基及び炭素数６〜１２のアリール基からなる群から選ばれる原子又は置換基であり、置換基の場合その置換基の水素原子の少なくとも１つがカルボキシル基、水酸基及び／又はハロゲン原子で置換されていてもよく、Ｍは３〜１３族に属する金属原子である。］
【請求項２】
前記一般式（１）におけるＭが、アルミニウム、クロム、鉄、マンガン、亜鉛又はルテニウムである請求項１記載のペルオキシダーゼ。
【請求項３】
タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖類、合成樹脂、金属、金属酸化物又はガラスに結合してなる請求項１又は２記載のペルオキシダーゼ。
【請求項４】
前記タンパク質が抗体又は抗原である請求項３記載のペルオキシダーゼ。
【請求項５】
前記多糖類、合成樹脂、金属、金属酸化物又はガラスの形状が、繊維状、顆粒状、板状、棒状又は球状である請求項３記載のペルオキシダーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載のペルオキシダーゼを用いる免疫測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシダーゼに関する。更に詳しくは、特定の補欠分子を含有するペルオキシダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、基質の脱水素反応において、酸化剤として過酸化水素を用いた反応を触媒する酵素としてペルオキシダーゼが知られている。ペルオキシダーゼは、生化学及び分子生物学の基礎研究から医療・保健・食品・環境などの分野で必須とされる抗体を用いた免疫学的な発光法・蛍光法・着色法・色素沈降法などの検出法及び分子認識に必須である。
【０００３】
この汎用されるペルオキシダーゼには、検出等の高感度化の観点から高い酵素活性が求められている。現在汎用されているペルオキシダーゼには、植物に由来するペルオキシダーゼが使用されているが、種々の微生物に由来する高い活性のペルオキシダーゼの探索が盛んに行われている（例えば、特許文献１及び２参照）。また、酵素のアミノ酸配列を人工的に組み換え、高い活性を有するペルオキシダーゼへと改質させる方法が知られている（例えば、特許文献３参照）。
【０００４】
しかし、これらの組み換えペルオキシダーゼは、免疫測定の検出法において、着色法、色素沈降法などには顕著な効果が現れるが、現行の免疫測定の内、最も測定感度が良いとされる発光法及び蛍光法においては、顕著な効果が現れず検出限界を低濃度化できないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平８−７０８６２号公報
【特許文献２】特開２０００−１５２７８６号公報
【特許文献３】特開２００３−７０４７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、免疫測定の発光法及び蛍光法においても優れた検出感度を示す高活性なペルオキシダーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、本発明に到達した。即ち、本発明は、一般式（１）で表されるポルフィセン誘導体を補欠分子として含有することを特徴とするペルオキシダーゼ及び該ペルオキシダーゼを用いる免疫測定法である。
【化１】
2012110284.tif 000003
［式中、Ｒ1〜Ｒ8はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜１２の直鎖、分岐又は環状のアルキル基及び炭素数６〜１２のアリール基からなる群から選ばれる原子又は置換基であり、置換基の場合その置換基の水素原子の少なくとも１つがカルボキシル基、水酸基及び／又はハロゲン原子で置換されていてもよく、Ｍは３〜１３族に属する金属原子である。］
【発明の効果】
【０００８】
本発明のペルオキシダーゼは、補欠分子として一般式（１）で表されるポルフィセン誘導体を含有するため、酵素の酸化活性が高く、発光法又は蛍光法による免疫測定に使用することで、優れた検出感度を示す。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＡＦＰ濃度と発光量の関係を示す検量線のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のペルオキシダーゼは、補欠分子として一般式（１）で表されるポルフィセン誘導体を含有する。
【００１１】
【化２】
2012110284.tif 000004
【００１２】
一般式（１）におけるＲ1〜Ｒ8はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１〜１２の直鎖、分岐又は環状のアルキル基及び炭素数６〜１２のアリール基からなる群から選ばれる原子又は置換基であり、置換基の場合その置換基の水素原子の少なくとも１つがカルボキシル基、水酸基及び／又はハロゲン原子で置換されていてもよく、Ｍは３〜１３族に属する金属原子である。
【００１３】
炭素数１〜１２の直鎖、分岐又は環状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−又はｉｓｏ−プロピル基、ｎ−、ｉｓｏ−又はｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−又はｉｓｏ−ペンチル基、シクロペンチル基、ｎ−又はｉｓｏ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、ｎ−又はｉｓｏ−ヘプチル基、ｎ−又はｉｓｏ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−又はｉｓｏ−ノニル基及びｎ−又はｉｓｏ−デシル基等が挙げられる。
【００１４】
炭素数６〜１２のアリール基としては、フェニル基、トリル基、キシリル基、クメニル基、メシチル基、ビフェニル基及びナフチル基等が挙げられる。
【００１５】
上記置換基の水素原子の少なくとも１つがカルボキシル基で置換された置換基としては、カルボキシメチル基、２−カルボキシエチル基、２−又は３−カルボキシプロピル基、２−、３−又は４−カルボキシブチル基、４−カルボキシ−３−メチルブチル基、５−カルボキシペンチル基、５−カルボキシ−４−メチルペンチル基、６−カルボキシヘキシル基、６−カルボキシ−５−メチルヘプチル基、７−カルボキシヘプチル基、７−カルボキシ−６−メチルヘプチル基、８−カルボキシオクチル基、８−カルボキシ−７−メチルオクチル基及び９−カルボキシノニル基等が挙げられる。
【００１６】
上記置換基の水素原子の少なくとも１つが水酸基で置換された置換基としては、ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、２−又は３−ヒドロキシプロピル基、２−、３−又は４−ヒドロキシブチル基、４−ヒドロキシ−３−メチルブチル基、５−ヒドロキシペンチル基、５−ヒドロキシ−４−メチルペンチル基、６−ヒドロキシヘキシル基、６−ヒドロキシ−５−メチルヘプチル基、７−ヒドロキシヘプチル基、７−ヒドロキシ−６−メチルヘプチル基、８−ヒドロキシオクチル基、８−ヒドロキシ−７−メチルオクチル基及び９−ヒドロキシノニル基等が挙げられる。
【００１７】
上記置換基の水素原子の少なくとも１つがハロゲン原子で置換された置換基としては、トリフルオロメチル基及びペンタフルオロエチル基等が挙げられる。
【００１８】
これらの置換基の内、酵素活性の観点から、Ｒ1〜Ｒ5及びＲ8としては、メチル基及びエチル基が好ましく、Ｒ6及びＲ7としては、２−カルボキシエチル基が好ましい。
【００１９】
一般式（１）におけるＭとして酵素活性の点から好ましいのは、アルミニウム、クロム、鉄、マンガン、亜鉛又はルテニウムであり、更に好ましいのは鉄である。
【００２０】
一般式（１）で表されるポルフィセン誘導体の合成方法は、特に限定されるものではなく、周知の方法等で合成することができる。
【００２１】
本発明に使用できるペルオキシダーゼは、特に限定されるものではなく、臨床診断に一般的に用いられる西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ、ダイズ由来のペルオキシダーゼなどの植物由来ペルオキシダーゼ、アクレモニウム属真菌由来のペルオキシダーゼなどの真菌由来のペルオキシダーゼ、バチルス属細菌由来のペルオキシダーゼなどの真菌由来のペルオキシダーゼ等が挙げられる。
本発明のペルオキシダーゼの合成法としては、ペルオキシダーゼの補欠分子を解離させたアポペルオキシダーゼと本発明のポルフィセン誘導体との複合体を形成させる方法（Ｔｅａｌｅ，Ｆ．Ｗ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  １９５９年、３５巻、５４３ページ及びＹｏｎｅｔａｎｉ，Ｔ．，Ａｓａｋｕｒａ，  Ｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９６９年  ２４４巻  ４５８０ページに記載の方法）等が挙げられる。
【００２２】
本発明のペルオキシダーゼは、試薬、医薬品及び食品等の分野において使用することができる。また、本発明のペルオキシダーゼは、他のタンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖類、合成樹脂、金属、金属酸化物及びガラスに結合させ使用してもよい。
【００２３】
他のタンパク質、ペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡに結合させたペルオキシダーゼは、生化学及び分子生物学の基礎研究から医療・保健・食品・環境などの分野で必須とさられる抗体を用いた免疫学的な発光法・蛍光法・着色法・色素沈降法などの検出法及び分子認識等に用いることができる。
免疫測定等に用いる場合、他のタンパク質としては特異性の観点から抗体及び抗原が好ましい。
【００２４】
多糖類、合成樹脂、金属、金属酸化物又はガラスに結合させたペルオキシダーゼは、バイオチップ等に用いることができる。
多糖類、合成樹脂、金属、金属酸化物及びガラスの形状は、繊維状、顆粒状、板状、棒状又は球状であることが好ましい。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例及び比較例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下、特に規定しない限り、％は重量％、部は重量部を示す。
【００２６】
製造例１：ポルフィセン誘導体の製造
５−ヨード−４−（３−メトキシ−３−オキソプロピル）−３−メチル−１Ｈ−ピロール−カルボン酸ベンジル２９．２部と４−Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジン０．８３部を乾燥塩化メチレン３３０部に溶解させ、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル１８．２部を加え、窒素雰囲気下、室温で１時間攪拌し反応させた。反応溶液をシリカゲル上で濾過し、減圧下に溶媒を除去した。その残渣を乾燥ジメチルホルムアミド１６５部に溶解させ、活性化した銅粉末３９．０部を混合し、窒素雰囲気下、１１０℃に昇温後、１時間攪拌し反応させた。反応液をセライト濾過することにより銅粉末を除去し、クロロホルム５５０部、水５５０部を加えて振盪して洗浄後分液し、得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下に溶媒を除去した。残渣を１７０℃で１時間加熱して反応させた後、クロロホルム１６５部に溶解させ、シリカゲル上で濾過した後減圧下に溶媒を除去することで白色固体を１５．９部得た。この白色固体１５．９部を乾燥テトラヒドロフラン２００部に溶解させ、パラジウム炭素（１０％）８．４部を加え、水素雰囲気下、混合物を室温で４８時間攪拌し反応させた。反応後、反応液をセライト濾過後減圧下に溶媒を除去して得られた残渣を減圧下（０．０７ｍｍＨｇ）２１０℃で４時間反応させた。反応物を乾燥ジメチルホルムアミド３００部に溶解させ、窒素雰囲気の下、撹拌下５℃で塩化ホスホニル２３部を滴下し、室温で１時間攪拌後、６０℃に昇温し更に１時間攪拌した。続いて水２００部に酢酸ナトリウム２６０部を溶解させた水溶液を加え、８５℃で２時間攪拌し反応させた後、室温まで冷却し、−２０℃で再結晶させ、５，５’−ジホルミル−４，４’−ジメチル−１Ｈ，１’Ｈ−２，２’−ビピロール−３，３’−ビスプロピオン酸ジメチルを得た。
【００２７】
亜鉛粉末３．３部及び無水塩化銅（Ｉ）０．４９部を溶解させた乾燥テトラヒドロフラン１００部に、四塩化チタン４．７部を窒素雰囲気下、０℃で２時間かけて滴下し、滴下後０℃で更に３時間反応させた。この反応液に、５，５’−ジホルミル−４，４’−ジエチル−３，３’−ジメチル−１Ｈ，１’Ｈ−２，２’−ビピロール０．１１２部と５，５’−ジホルミル−４，４’−ジメチル−１Ｈ，１’Ｈ−２，２’−ビピロール−３，３’−ビスプロピオン酸ジメチル０．１６０部を乾燥テトラヒドロフラン２００部に溶解させた溶液を１０時間かけて滴下した。滴下終了後、昇温して溶媒還流下３０分反応させた。室温まで冷却後、１０％炭酸ナトリウム水溶液８０部を１０℃で２時間かけて滴下し、生成した沈殿を濾過し、濾液にクロロホルム１００部及び水５０部を加え、水で有機層を洗浄して分液後、有機層から減圧下溶媒を除去した。残渣をクロロホルム５部に溶解させ、アルミナカラムにより処理［展開液：クロロホルム／酢酸エチル＝１０／１（Ｖ／Ｖ）］し、更にシリカゲルカラムクロマトグラフィにより処理後、溶液から減圧下に溶媒を除去して、青色固体を得た。この青色固体を酢酸７部に溶解させ、塩化鉄（ＩＩＩ）無水物０．０１７部と酢酸ナトリウム０．００１部を加え、１２０℃に昇温し、３時間攪拌し反応させた。反応液をシリカゲル上で濾過し、クロロホルム２０部及び水２０部を加え、水で洗浄後分液して、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下に溶媒を除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ［展開液：クロロホルム／メタノール＝１００／１（Ｖ／Ｖ）］により処理後、溶液から減圧下に溶媒を除去して、テトラヒドロフラン４部とメタノール４部の混合溶媒に溶解させ、１０％水酸化ナトリウム水溶液４部加え、室温で４時間攪拌した。減圧下に有機溶媒を除去し、５％塩酸を加え、生じた沈殿を濾過し、水で洗浄することで、上記一般式（１）におけるＲ1及びＲ4がエチル基、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ8がメチル基、Ｒ6及びＲ7が２−カルボキシエチル基、Ｍが鉄原子であるポルフィセン誘導体（緑色固体）を０．００４３部得た。
【００２８】
実施例１：ポルフィセン誘導体含有ペルオキシダーゼ（ｒＰＯＤ）の製造
製造例１で得られたポルフィセン誘導体とリン酸緩衝液／ピリジン＝１／１（Ｖ／Ｖ）とからなる０．２ｍＭポルフィセン溶液を０．３ｍＭアポペルオキシダーゼ溶液［リン酸緩衝液（ｐＨ＝７）］に４℃でゆっくり攪拌しながら滴下した。混合溶液を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）に透析し、４℃で２４時間静置した。遠心分離（４，０００ｒｐｍ，１０分間）した後、上澄みをＳｅｐｈａｄｅｘ−Ｇ２５カラムにより精製し、本発明のポルフィセン誘導体を含有するペルオキシダーゼ（ｒＰＯＤ）を得た。
【００２９】
得られたペルオキシダーゼ（ｒＰＯＤ）と表１に記載の各濃度の標準ＡＦＰ溶液を用いて以下の操作に従って、発光量を測定した。
＜測定方法＞
（１）発光試薬Ａの調製
ルミノール（東京化成製）０．１８ｇ及び４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇをｐＨ８．５の０．１Ｍ（モル／ｌ）トリス／塩酸緩衝液１リットルに溶解した。使用するまで遮光、冷蔵保存した。
（２）発光試薬Ｂの調製
２００μｌの３５％過酸化水素水を脱イオン水１リットルに溶解し、発光試薬Ｂとした。使用するまで冷蔵保存した。
【００３０】
（３）抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ビーズの調製
抗ＡＦＰポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製）をｐＨ９の０．１Ｍ炭酸緩衝液に２０μｇ／ｍｌの濃度で溶解した。この溶液に、直径６．４ｍｍのポリスチレンビーズを加え、４８時間反応させたのち、０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液でコーティングし、凍結乾燥した。
（４）ペルオキシダーゼ結合抗ＡＦＰポリクローナル抗体の調製
抗ＡＦＰポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製）及び実施例１で得られたｒＰＯＤを用い、文献［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２（１９８２）１４１３−１４２４］に記載の方法でペルオキシダーゼ結合抗ＡＦＰポリクローナル抗体を調製した。使用時に１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液で希釈して使用した。
【００３１】
（５）免疫反応用試薬と免疫反応操作試験管中で、表１に記載の各濃度の標準ＡＦＰ溶液２０μｌと１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液３００μｌ及び上記（３）で調製した「抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ビーズ」１個を３７℃で１時間反応させた。ビーズを緩衝液で洗浄後、上記（４）で調製した「ペルオキシダーゼ結合抗ＡＦＰポリクローナル抗体」の希釈液（濃度：２０ｎＭ）３００μｌを加え３７℃で１時間応させた後、緩衝液で洗浄してＡＦＰ免疫複合体結合ビーズを得た。
（６）発光量の測定
ＡＦＰ免疫複合体結合ビーズの入った試験管（１２×７５ｍｍ）をアロカ社製ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホルダーにセットし、発光試薬Ａ２００μｌ及び発光試薬Ｂ２００μｌを加え発光反応を開始した。発光反応開始から１分間の発光量を計測した。
（７）測定結果
測定したＡＦＰ濃度と発光量の関係を表１及び図１に示した。図１は、ＡＦＰ濃度と発光量の関係を示す検量線である。
【００３２】
比較例１
実施例１におけるｒＰＯＤを西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（東洋紡製）に変更した以外は、実施例１と同様にして求めたＡＦＰ濃度と発光量の関係を表１及び図１に示した。
【００３３】
【表１】
2012110284.tif 000005
【００３４】
表１及び図１から本発明のペルオキシダーゼは、免疫測定の化学発光法において同じ抗原量でも発光量が高く、検出感度に優れることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明のペルオキシダーゼは、酸化酵素活性が優れているため、免疫測定の酵素化学発光法用の酵素として有用である。
【図１】
2012110284.tif 000008