(57)【要約】【課題】原料に対する収率が高くかつCO2排出量が少ない有機酸及びアルコールの製造方法を提供する。【解決手段】サッカロマイセス属に属する酵母のゲノムに、ピルビン酸デカルボキシラーゼ1（PDC1）遺伝子のプロモーターの制御下に乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入し、ゲノム上のPDC1遺伝子を破壊した酵母を用いて糖化原料を発酵させ、得られる発酵液から乳酸及びエタノールを採取することを特徴とする乳酸及びエタノールの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロマイセス属に属する酵母のゲノムに、ピルビン酸デカルボキシラーゼ1（PDC1）遺伝子のプロモーターの制御下に乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入し、ゲノム上のPDC1遺伝子を破壊した酵母を用いて糖化原料を発酵させ、得られる発酵液から乳酸及びエタノールを採取することを特徴とする乳酸及びエタノールの製造方法。
【請求項２】
発酵が、中和剤で処理することなく行われるものである請求項１記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機酸及びアルコール生成微生物並びにそれを用いた有機酸及びアルコールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のエタノール発酵を利用したエタノール生産技術が確立されている。しかし、糖化原料をエタノール発酵する場合、エタノールとほぼ同量のCO2が排出されるため原料に対する生産物の収率が約50%と低く、この方法は非効率である。またエタノールとほぼ同量のCO2が排出されるため、環境に対して負荷が大きい。エタノールはクリーンなエネルギーとして注目されているにもかかわらず、その生産時に大量のCO2を排出するという問題が生じている。
【０００３】
一方、ビフィズス菌の乳酸発酵を利用して乳酸を製造する方法も確立されている。しかし、ビフィズス菌は乳酸発酵の際に酢酸も生成するため、培養液中の酸性度が高くなる。ビフィズス菌は嫌酸性であり、酸性環境下において生育できないため、pHが低くなるとそれ以上乳酸を生成することができない。このため、ビフィズス菌の培養管理において中和剤の使用が必須である。この場合、中和剤の使用は、廃棄物が大量に出るという点で問題がある。
【０００４】
従って、糖化原料に対する生産物の収率が高くかつCO2排出量の少ないエタノールの製造方法と、中和剤を使用しない乳酸の製造方法が望まれていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、原料に対する収率が高くかつCO2排出量が少ない有機酸及びアルコールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、酵母サッカロマイセス・セレビシエにおいてPDC1（ピルビン酸デカルボキシラーゼ１）プロモーターの制御下に乳酸脱水素酵素（ラクテートデヒドロゲナーゼ）遺伝子を含有する形質転換株を作製し、この形質転換株を用いて糖化原料を発酵させることにより、中和剤を使用することなく乳酸を製造し、かつCO2排出量を低減させたエタノール製造を行いうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、アルコール生成微生物に有機酸生成酵素をコードする遺伝子を組み込んだことを特徴とする微生物である。アルコール生成微生物としては、耐酸性のもの（例えば酵母）が挙げられる。ここで、酵母としてサッカロマイセス属に属するものを例示することができる。本発明の微生物は、上記有機酸生成酵素をコードする酵素とともに、さらにPDC1プロモーターが組み込まれたものであることが好ましい。有機酸としては、L-乳酸が挙げられる。
【０００８】
さらに、本発明は、有機酸生成酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターを用いてアルコール生成微生物を形質転換することを特徴とする、アルコール及び有機酸を生成する微生物の作出方法である。
【０００９】
さらに、本発明は、前記微生物を用いて糖化原料を発酵させ、得られる発酵液から有機酸及びアルコールを回収することを特徴とするアルコール及び有機酸の製造方法である。この場合、発酵は中和剤で処理することなく行うことができる。また、有機酸としてはL-乳酸が挙げられる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、耐酸性微生物を用いた有機酸及びアルコールの製造方法が提供される。本発明の方法は、原料に対する収率が高くかつCO2排出量が少ないため有用である。また本発明の方法は中和剤の使用を必要としないため有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】染色体導入型ベクターpBTrp-PDC1-LDHの構築図である。
【図２】染色体導入型ベクターpBTrp-PDC1-LDHの構築図である。
【図３】ベクターpBTrp-PDC1-LDHを用いて酵母サッカロマイセス・セレビシエの形質転換を行った場合に得られる株のゲノム構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、アルコール生成微生物に有機酸生成酵素をコードする遺伝子（有機酸生成酵素遺伝子という）を組み込むことにより、同一宿主細胞からアルコールと有機酸とを同時に生産することができるように改変した微生物である。また、本発明の有機酸及びアルコールの製造方法は、有機酸生成酵素遺伝子を含む組換えベクターを含有するアルコール生成微生物を用いて糖化原料を発酵させ、得られる発酵液から有機酸及びアルコールを採取することを特徴とする。
【００１３】
本発明に係る方法の概要は以下の通りである。
１．有機酸生成酵素遺伝子の単離
まず、有機酸生成酵素遺伝子を宿主であるアルコール生成微生物に組み込むに際し、有機酸生成酵素遺伝子を含む組換えベクターを構築する。「有機酸」には、当業者に理解されうるあらゆる有機酸が含まれるが、例えば、乳酸、コハク酸、酢酸、クエン酸、グルコン酸などが挙げられる。「有機酸生成酵素」とは、上記有機酸が生成する過程において作用する酵素を意味し、例えば、ピルビン酸から乳酸を生成する乳酸脱水素酵素、コハク酸からフマル酸を生成するコハク酸脱水素酵素などの脱水素酵素や、オキザロ酢酸からクエン酸を生成するクエン酸シンターゼなどが挙げられる。
【００１４】
本発明において使用する有機酸生成酵素遺伝子は、上述のような有機酸生成酵素をコードする遺伝子であればどのようなものでもよく、また、宿主生物に導入する目的遺伝子は、宿主と同種の生物由来の遺伝子でもよく異種生物由来の遺伝子でもよい。
【００１５】
例えば、ピルビン酸から乳酸を生成する乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子（LDH遺伝子）などが挙げられる。LDH遺伝子は、ストレプトコッカス属に属する微生物、リゾプス属に属する微生物、ビフィドバクテリウム属に属する微生物などから単離することが可能である。
【００１６】
但し、目的遺伝子である有機酸生成酵素遺伝子はLDH遺伝子に限定されるものではなく、その他酢酸生成遺伝子、クエン酸生成遺伝子が挙げられる。
【００１７】
目的遺伝子の調製は、当技術分野で周知の任意の手法を採用することができる。例えば、目的遺伝子を供与源から単離する場合には、グアニジンイソチオシアネート法により調製されたRNAからcDNAを合成する方法により調製する。
【００１８】
また、上記有機酸生成酵素遺伝子は、該遺伝子の配列が公知である場合、その配列に基づいてプライマーを作製し、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用して、別途調製することができる。あるいは、市販の生物細胞又は組織由来のcDNAライブラリー又はゲノムライブラリーから上記遺伝子を増幅し、精製することによって得ることもできる。上記遺伝子の配列が既知ではない場合には、先ず対応するタンパク質を精製してその部分配列を決定し、その配列に基づいて放射性標識プローブを作製し、これを用いてcDNAライブラリー又ははゲノムライブラリーから上記遺伝子を含むクローンをスクリーニングし、必要に応じて再クローン化することによって上記遺伝子を得ることができる。遺伝子クローニング及びスクリーニングの手法については、例えば、Sambrook, J.,Fritsch, E., F.及びManiatis, T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd. ColdSpring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.に記載される方法を使用することができる。
【００１９】
２．有機酸生成酵素遺伝子を含む組換えベクターの構築
上記単離された有機酸生成酵素遺伝子をアルコール生成微生物に導入するために、有機酸生成酵素遺伝子を含む組換えベクターを構築する。組換えベクターは、適当なベクターに有機酸生成酵素遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。有機酸生成酵素遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。
【００２０】
プラスミド DNAとしては、例えばpRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101又はpAUR135などのYIp型大腸菌-酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396又はpTrc99AなどのColE系プラスミド、pACYC177又はpACYC184などのp15A系プラスミド、pMW118、pMW119、pMW218又はpMW219などのpSC101系プラスミド等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）、φX174、M13mp18又はM13mp19などが挙げられる。レトロトランスポゾンとしては、Ty因子などが挙げられる。YAC用ベクターとしてはpYACC2などが挙げられる。
【００２１】
ベクターに有機酸生成酵素遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００２２】
有機酸生成酵素遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、組換えベクターには、プロモーターに有機酸生成酵素遺伝子を連結して発現カセットを作製し、これに、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、トリプトファン合成遺伝子（Trp1遺伝子）、栄養要求性能を持つUra3遺伝子、Ade2遺伝子、His3遺伝子、又は薬剤耐性能を持つG418耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などが利用可能である。
【００２３】
本発明においては、発現カセットのターミネーター配列としてグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（GAPDH）のターミネーター遺伝子を使用しているが、本発明はこれに限定されるものではなく、使用可能なターミネーター配列であればいかなるものを使用してもよい。
【００２４】
３．組換えベクターによるアルコール生成微生物の形質転換
次に、上記組換えベクターを用いてアルコール生成微生物宿主（この宿主は対酸性微生物である）を形質転換し、有機酸生成遺伝子を含む組換えベクターを含有する微生物を得る。
【００２５】
本発明に使用する微生物は、耐酸性を有し、かつアルコール発酵を行うことができる限り特に限定されるものではなく、天然から採取されたものも含まれる。「耐酸性微生物」とは、酸性条件、好ましくはpHが6以下、さらに好ましくはpH２〜５でアルコール発酵を行うことができる微生物を意味する。本発明では、例えば乳酸脱水素遺伝子を組み込んだ組換えベクターを上記耐酸性微生物に導入して形質転換体を得、乳酸脱水素遺伝子が機能するように操作することにより、アルコールを生成するとともに、乳酸も生成することができるようになる。「乳酸脱水素遺伝子が機能する」とは、該遺伝子が組み込まれたベクターを導入した宿主（微生物）を培養して乳酸を生成させたときに、乳酸の蓄積により培地のpHが酸性になっても（特に、pH6以下に下がっても）当該発現が維持されて乳酸を生成し得るように発現することを意味する。
【００２６】
本発明において宿主として使用される耐酸性のアルコール生成微生物は、例えば、サッカロマイセス属等の酵母、あるいはリゾプス属に属するカビなどが挙げられるが(例えば下記微生物参照)、これらの微生物に限定されるものではない。
【００２７】
(i) 酵母菌
サッカロマイセス属：サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・クルーベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロマイセス・パラドキサス(Saccharomyces paradoxus)、サッカロマイセス・パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus) 
クルーベルマイセス属：クルーベルマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、クルーベルマイセス・マルキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)
ピキア属：ピキア・パストリス(Pichia pastoris）
【００２８】
(ii)カビ
リゾプス属：リゾプス・デレマー(Rhyzopus delemer)
アスペルギルス属：アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリザ(Aspergillus oryzae)
ムコール属：ムコール・ロウキシ（Mucor rouxii）
ザイモモナス属：ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）
【００２９】
酵母を宿主とする場合は、前記プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばピルビン酸デカルボキシラーゼ１プロモーター（PDC1プロモーター）、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等が挙げられる。サッカロマイセス属に属する酵母を宿主として使用する場合には、PDC1プロモーターを用いることが好ましく、また、このプロモーターは染色体導入型ベクターと組み合わせて使用することが好ましい。PDC1プロモーターは強力なプロモーターであり、このプロモーターの制御下において有機酸生成酵素遺伝子は高発現される。また、PDC1プロモーターと共に有機酸生成酵素遺伝子を宿主の染色体上に導入することによってPDC1プロモーターが元来制御する遺伝子（PDC1）が失われても、宿主は生育及び代謝を継続することができるため（これをオートレギュレーションという）、このプロモーターの使用には利点がある。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法(Becker, D.M. et al. (1990) Methods. Enzymol., 194,182-187)、スフェロプラスト法(Hinnen, A. et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 75, 1929-1933)、酢酸リチウム法(Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153, 163-168)等が挙げられる。
【００３０】
細菌を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、有機酸生成酵素遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法(Cohen, S.N. et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA69, 2110-2114)、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３１】
上述のようにして、アルコール生成微生物に有機酸生成酵素遺伝子を含む組換えベクターを導入することにより、形質転換された耐酸性微生物を得ることができる。なお、形質転換体は、導入した組換えベクター中に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択される。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を選択マーカーとして使用した場合には、アンピシリンを含有する培地中で培養することにより形質転換体を選択する。
【００３２】
４．耐酸性アルコール生成微生物を用いた発酵
酵母菌等の耐酸性のアルコール生成微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００３３】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、30℃で６〜24時間行う。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、LacZプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を培地に添加してもよい。
【００３４】
上述のようにして培養した耐酸性微生物は、集菌して、さらに糖化原料を添加した発酵条件下にて培養する。集菌は、培養菌体が対数増殖期初期から定常期までのいずれの状態にある時に行ってもよいが、対数増殖期中期から後期の状態にある時に行うのが好ましい。また、集菌は、遠心分離の他、濾過、沈降分離等のいかなる方法で行ってもよい。菌体の洗浄には、生理食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等のいかなる緩衝液を使用してもよく、また、水を用いて菌体を洗浄することもできる。
【００３５】
集菌した微生物を発酵条件下にて培養するための培地としては、通常は糖類、ペプトン、酵母エキスを含む。好ましくは、0.1〜10％グルコース、0.1〜10％ペプトン及び0.1〜10％酵母エキスを含み、さらに好ましくは約2％のグルコース、約2％のペプトン及び約1％の酵母エキスを含む培地が使用される。
【００３６】
また、培地として予め濾過除菌したものを用いることができ、特に酵母用培地としてYPD液体培地が挙げられる。培地には、発酵される糖化原料の他、コーンスティープリカー、サツマイモ糖化液等を含有させてもよい。ここで、「発酵」とは、本発明の耐酸性アルコール生成微生物が糖化原料を分解し、新たな生成物を生成する現象を指し、例えば、アルコール発酵、乳酸発酵、プロピオン酸発酵などが挙げられる。
【００３７】
糖化原料としては、さつまいも、ジャガイモ、トウモロコシ等が挙げられる。これらの原料を洗浄及び破砕した後、液化・糖化槽に入れ、90〜120℃、好ましくは120℃の蒸気で5〜30分、好ましくは15分処理する。
【００３８】
原料に対し0.5〜2.5倍の水を加えた後、α-アミラーゼ、グルコアミラーゼなどの市販の酵素（例えば「ターマミル」（ノボザイム・ジャパン社）及び「スミチーム」（新日本化学社））を原料重量に対して0.5〜１％添加する。温度50〜95℃、好ましくは60℃で15〜20時間保持すれば原料の液化、糖化が完了する。
上記のようにして得られた液を遠心分離にかけ、固形分（リグニン等）を分離し、原液とする。
【００３９】
発酵条件は以下の通りである。
温度：25〜33℃、好ましくは30℃
菌体密度：10〜30％、好ましくは25％（湿重量ベース）
基質濃度：5〜20％、好ましくは10％（バッチ発酵の初期濃度）
発酵時間：10〜30時間、好ましくは20〜24時間
【００４０】
発酵培養後、有機酸及びアルコールはその発酵液から回収することにより得ることができる。「発酵液」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。有機酸及びアルコールが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより抽出する。また、有機酸及びアルコールが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、有機酸及びアルコールの単離精製に用いられる一般的な生化学的方法を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から有機酸及びアルコールを単離精製することができる。
【００４１】
乳酸を単離精製する場合は、発酵液を遠心分離装置又はフィルターにかけて菌体と液分とを分離し、乳酸の液分の採取（精製・濃縮）を行う。液分の精製・濃縮は、一般に海水や食品の脱塩に広く採用されているイオン交換膜を利用した電気透析装置（例えばアシライザー（旭化成社））により行うことができる。
【００４２】
なお、電気透析時の各種液の温度は、通常、20〜45℃、好ましくは35〜40℃の範囲である。電気透析を行うと、イオン性物質と非イオン性物質を分離すると同時に乳酸を濃縮することが可能である。
【００４３】
一方、アルコールを分離精製する場合は、発酵液を遠心分離装置又はフィルターにかけて菌体と液分とを分離し、エタノールの液分の採取を行う。液分の精製・濃縮は蒸留法により行うことができる。
【００４４】
電気透析で除去できなかったアミノ酸、無機イオン（K,Ca,Mg等）等は、クロマト分離装置、イオン交換装置により除去することができる。クロマト分離装置としては、例えば固定層式、移動層式、類似的移動層式等が挙げられる。
【００４５】
ところで、本発明に従って、エタノールを生産する酵母にL-乳酸脱水素酵素遺伝子の導入を行い、エタノール発酵を行うと同時に乳酸発酵を行う酵母を作出すると、当該酵母において以下の２つの反応が行われる。
【００４６】
（1）C6H12O6    →    2C2H5OH+2 CO2      エタノール発酵
（2）C6H12O6    →    2CH3CH(OH)COOH     乳酸発酵
【００４７】
乳酸発酵の反応(2)ではCO2は排出されないため、エタノール発酵と同時に乳酸発酵(1)を行うことで、エタノール発酵の際に排出されるCO2量を低減できる。さらにまた、この酵母を用いることにより糖化原料に対する生産物の収率を向上することができる。
【００４８】
また本発明に従って作出した上記酵母を用いた乳酸発酵は、上記酵母が耐酸性であるため、培地が酸性になっても生育し、発酵を維持することができる。従って、上記発酵の際に炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニアなどの中和剤を添加する必要はなく、中和反応に伴う副産物（廃棄物）が排出されないため、コスト低減を図ることができる。
【実施例】
【００４９】
以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５０】
〔実施例１〕ベクターの構築
本実施例のために新たに構築した染色体導入型ベクターをpBTrp-PDC1-LDHと名付け、以下に本ベクター構築例の詳細を記す。なお本実施例の概要を図１に示す。ベクター構築の手順はこれに限定されるものではない。
【００５１】
本実施例において、サッカロマイセス・セレビシエ由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ１遺伝子（PDC1遺伝子）プロモーター配列の制御下で、異種遺伝子としてビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）由来のラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子（LDH遺伝子）を使用した。
【００５２】
ベクターの構築にあたって、必要な遺伝子断片であるPDC1遺伝子のプロモーター断片（PDC1P）971bpと、PDC1遺伝子下流領域断片（PDC1D）518bpは、サッカロマイセス・セレビシエ YPH株（Stratagene社）のゲノムDNAを鋳型として使用したPCR増幅法によって単離を行った。
【００５３】
サッカロマイセス・セレビシエ YPH株のゲノムDNAは、ゲノム調製キット、Fast DNA Kit（Bio 101社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従い、調製した。DNA濃度は分光光度計Ultro spec 3000（Amersham Pharmacia Biotech社）にて測定した。
【００５４】
PCR反応には、増幅酵素として、増幅断片の正確性が高いとされるPyrobest DNA polymerase（宝酒造社）を使用した。上記手法にて調製したサッカロマイセス・セレビシエ YPH株のゲノムDNA 50ng/サンプル、プライマーDNA 50pmol/サンプル、及びPyrobest DNA polymerase 0.2ユニット/サンプルを合計で50μlの反応系に調製した。反応溶液を、PCR増幅装置Gene Amp PCR system 9700（PE Applied Biosystems社）によってDNA増幅を行った。PCR増幅装置の反応条件は、96℃ 2分の後、（96℃ 30秒→55℃ 30秒→72℃ 90秒）を25サイクル行い、その後4℃とした。PDC1P増幅断片とPDC1D増幅断片を1%TBEアガロースゲル電気泳動にて遺伝子増幅断片の確認を行った。なお反応に使用したプライマーDNAは、合成DNA（サワデーテクノロジー社）を用い、このプライマーのDNA配列は以下の通りである。
【００５５】
PDC1P断片の増幅
・PDC1P-LDH-U（31mer,Tm値58.3℃）末端に制限酵素BamHIサイトを付加
：ATA TAT GGA TCC GCG TTT ATT TAC CTA TCT C（配列番号１）
・PDC1P-LDH-D（31mer、Tm値54.4℃）末端に制限酵素EcoRIサイトを付加
：ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT GAC TGT G（配列番号２）
PDC1D断片の増幅
・PDC1D-LDH-U（31mer、Tm値55.3℃）末端に制限酵素XhoIサイトを付加
：ATA TAT CTC GAG GCC AGC TAA CTT CTT GGT CGA C（配列番号３）
・PDC1D-LDH-D（31mer、Tm値54.4℃）末端に制限酵素ApaIサイトを付加
：ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT GAC TGT G（配列番号４）。
【００５６】
上記反応にて取得したPDC1P及びPDC1D各遺伝子増幅断片をそれぞれ、エタノール沈殿処理によって精製した後、PDC1P増幅断片を制限酵素BamHI/EcoRI、及びPDC1D増幅断片を制限酵素XhoI/ApaIにて制限酵素反応処理を行った。なお以下に用いた酵素類はすべて宝酒造社製のものを用いた。また、エタノール沈殿処理、制限酵素処理の一連操作の詳細なマニュアルはMolecular Cloning A Laboratory Manual second edition（Maniatis et al.,Cold Spring Harbor Laboratory press.1989）に従った。
【００５７】
ベクターの構築における一連の反応操作は、一般的なDNAサブクローニング法に準じて行った。すなわち、制限酵素BamHI/EcoRI（宝酒造社）及び脱リン酸化酵素Alkaline Phosphatase（BAP、宝酒造社）を施したpBluescriptII SK+ベクター（東洋紡社）に、上記PCR法にて増幅し、制限酵素処理を施したPDC1P断片をT4 DNA Ligase反応によって連結させた（図１A）。T4 DNA Ligase反応には、LigaFast Rapid DNA Ligation System（プロメガ社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。
【００５８】
次にLigation反応を行った溶液を、コンピテント細胞へ形質転換を行った。コンピテント細胞は大腸菌JM109株（東洋紡社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従って行った。得られた培養液は抗生物質アンピシリン100μg/mlを含有したLBプレートにまいて一晩培養した。生育したコロニーを、インサート断片のプライマーDNAを用いたコロニーPCR法による確認、及びミニプレップによるプラスミドDNA調製溶液を、制限酵素処理による確認を行い、目的とするベクターpBPDC1Pベクターを単離した（図１B）。
【００５９】
ついでトヨタ自動車（株）によって構築されたpYLD1ベクターを制限酵素EcoRI/AatII処理及び末端修飾酵素T4 DNA polymerase処理することで得られるLDH遺伝子断片を、同じく制限酵素EcoRI処理、末端修飾酵素T4 DNA polymerase処理を行ったpBPDC1Pベクター中に、上述と同様の操作でサブクローニングを行い、pBPDC1P-LDH Iベクターを作製した（図１C）。なお、上記のpYLD1ベクターは大腸菌に導入され（名称：「E. coli pYLD1」）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に、受託番号FERM BP-7423としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている（原寄託日：平成11（1999）年10月26日）。続いてこのベクターをXhoI/ApaI処理し、増幅したPDC1D断片を連結させてpBPDC1P-LDH IIベクターを作製した（図２A）。最後にpBPDC1P-LDH IIベクターをEcoRV処理したものに、pRS404ベクター(Stratagene社)をAatII/SspI処理、T4 DNA polymerase処理して得られたTrp1マーカー断片を連結させて、最終コンストラクトである染色体導入型pBTrp-PDC1-LDHベクターを構築した（図２B）。
【００６０】
構築した染色体導入型pBTrp-PDC1-LDHベクターの確認の為に塩基配列決定を行った。塩基配列解析装置としてはABI PRISM 310 Genetic Analyzer（PE Applied Biosystems社）を使用し、試料の調製法、及び機器の使用方法などの詳細は本装置付属のマニュアルに従った。試料となるベクターDNAはアルカリ抽出法により調製したものを用い、これをGFX DNA Purification kit（Amersham Pharmacia Biotech社）にてカラム精製した後、分光光度計Ultro spec 3000（Amersham Pharmacia Biotech社）にてDNA濃度を測定したものを用いた。
【００６１】
〔実施例２〕組換えベクターの宿主への導入
宿主である酵母IFO2260株（社団法人・発酵研究所に登録されている菌株）のトリプトファン要求株は、10mlYPD培地にて30℃で対数増殖期まで培養を行い、集菌及びTEバッファーによる洗浄を行った後、0.5mlTEバッファーと0.5ml、0.2M酢酸リチウムを加え、30℃にて１時間振盪培養を行った。その後、制限酵素Apa1及びSpe1で処理したpBTRPPDC1LDHを加えた。
【００６２】
このプラスミドの菌懸濁液を30℃で30分間振盪培養後、70%ポリエチレングリコール4000を150ml加え、よく撹絆した。30℃にて１時間振盪培養した後、42℃にて5分間ヒートショックを与えた。菌体を洗浄した後、200mlの水に懸だくしたものを選択培地に塗株した。
【００６３】
得られたコロニーを選択培地で単離を行い、コロニーを得た後、PCRにてPDC1プロモーターの下流にLDHが導入されている株を取得した。更に、胞子形成培地で胞子形成を行い、2倍体である染色体両方に上記ベクターが導入されている株を取得した。
【００６４】
酵母サッカロマイセス・セレビシエが図２に示したpBTRPPDC1LDHで形質転換され、ゲノム上に導入されたことをPCRで確認した。上記ベクターのゲノム上の構造を図３に示す。
【００６５】
〔実施例３〕発酵試験
YPD液体培地(グルコース15%)を用いて、上記形質転換株と非形質転換株に対して発酵テストを行った。
【００６６】
乳酸及びエタノールは、それぞれ、王子計測機器株式会社製バイオセンサBF-4により測定した。収率は、生産物量を発酵前の糖含量で割ることにより計算した。更にCO2発生率について見積りを行った。CO2発生率は、100から、生産物の収率を引くことにより計算した。
この結果を表１に示す。
【００６７】
【表１】
2012061006.tif 000002
【００６８】
表１に示す結果によれば、乳酸脱水素酵素遺伝子（LDH）を含有する形質転換株は、エタノール製造に伴うCO2排出量を20%低減できるとともに、エタノールと乳酸をあわせた生産物の量についても約15%増加している。従って、本発明の方法は、エタノール及び乳酸の製造に有効な手段であるといえる。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
配列番号１：合成DNA
配列番号２：合成DNA
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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