(57)【要約】【課題】  工業的な製造が可能である、新たなセロビオース  ２−エピメラーゼを提供する。【解決手段】  本発明のセロビオース  ２−エピメラーゼは、下記の（Ａ）〜（Ｆ）の特性を有し、かつ好気性微生物由来であることを特徴とする。（Ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定された分子量が３７，８００〜４８，４００の範囲（Ｂ）分子量の理論値が４２，５００〜５０，１００の範囲（Ｃ）至適ｐＨが６〜９の範囲（Ｄ）ｐＨ安定性がｐＨ２〜１２の範囲（Ｅ）至適温度が３０〜９０℃の範囲（Ｆ）熱安定性の上限が３０〜８０℃の範囲【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）〜（Ｆ）の特性を有し、かつ好気性微生物由来であることを特徴とするセロビオース  ２−エピメラーゼ。
（Ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定された分子量が３７，８００〜４８，４００の範囲
（Ｂ）分子量の理論値が４２，５００〜５０，１００の範囲
（Ｃ）至適ｐＨが６〜９の範囲
（Ｄ）ｐＨ安定性がｐＨ２〜１２の範囲
（Ｅ）至適温度が３０〜９０℃の範囲
（Ｆ）熱安定性の上限が３０〜８０℃の範囲
【請求項２】
下記の（Ｐ１）から（Ｐ９）のいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１記載のセロビオース  ２−エピメラーゼ。
（Ｐ１）：下記の（Ｐ１ａ）、（Ｐ１ｂ）または（Ｐ１ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ１ａ）：配列番号２のアミノ酸配列
（Ｐ１ｂ）：配列番号２のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ１ｃ）：配列番号２のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ２）：下記の（Ｐ２ａ）、（Ｐ２ｂ）または（Ｐ２ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ２ａ）：配列番号４のアミノ酸配列
（Ｐ２ｂ）：配列番号４のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ２ｃ）：配列番号４のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ３）：下記の（Ｐ３ａ）、（Ｐ３ｂ）または（Ｐ３ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ３ａ）：配列番号６のアミノ酸配列
（Ｐ３ｂ）：配列番号６のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ３ｃ）：配列番号６のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ４）：下記の（Ｐ４ａ）、（Ｐ４ｂ）または（Ｐ４ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ４ａ）：配列番号８のアミノ酸配列
（Ｐ４ｂ）：配列番号８のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ４ｃ）：配列番号８のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ５）：下記の（Ｐ５ａ）、（Ｐ５ｂ）または（Ｐ５ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ５ａ）：配列番号１０のアミノ酸配列
（Ｐ５ｂ）：配列番号１０のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ５ｃ）：配列番号１０のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ６）：下記の（Ｐ６ａ）、（Ｐ６ｂ）または（Ｐ６ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ６ａ）：配列番号１２のアミノ酸配列
（Ｐ６ｂ）：配列番号１２のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ６ｃ）：配列番号１２のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ７）：下記の（Ｐ７ａ）、（Ｐ７ｂ）または（Ｐ７ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ７ａ）：配列番号１４のアミノ酸配列
（Ｐ７ｂ）：配列番号１４のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ７ｃ）：配列番号１４のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ８）：下記の（Ｐ８ａ）、（Ｐ８ｂ）または（Ｐ８ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ８ａ）：配列番号１６のアミノ酸配列
（Ｐ８ｂ）：配列番号１６のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ８ｃ）：配列番号１６のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ９）：下記の（Ｐ９ａ）、（Ｐ９ｂ）または（Ｐ９ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ９ａ）：配列番号１８のアミノ酸配列
（Ｐ９ｂ）：配列番号１８のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ９ｃ）：配列番号１８のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
【請求項３】
前記好気性微生物が、ロドサーマス  マリナス（Rhodothermus marinus）、サッカロファガス  デグラダンス（Saccharophagus degradans）、スピロソマ  リングアレ（Spirosoma linguale）、ヘルペトシフォン  アウランチアクス（Herpetosiphon aurantiacus）、テレディニバクター  ツルネラエ（Teredinibacter turnerae）、ディアドバクター  ファーメンタンス（Dyadobacter fermentans）、キチノファーガ  ピネンシス（Chitinophaga pinensis）、ペドバクター  ヘパリナス（Pedobacter heparinus）およびフラボバクテリウム  ジョンソニエ（Flavobacterium johnsoniae）からなる群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項１または２記載のセロビオース  ２−エピメラーゼ。
【請求項４】
前記セロビオース  ２−エピメラーゼが、固定化担体に固定化された固定化酵素であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のセロビオース  ２−エピメラーゼ。
【請求項５】
下記の（Ｇ１）から（Ｇ９）の塩基配列のいずれかの塩基配列からなることを特徴とするセロビオース  ２−エピメラーゼ遺伝子。
（Ｇ１）：下記の（Ｇ１ａ）、（Ｇ１ｂ）、（Ｇ１ｃ）または（Ｇ１ｄ）の塩基配列
（Ｇ１ａ）：配列番号１の塩基配列
（Ｇ１ｂ）：配列番号１の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ１ｃ）：配列番号１の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ１ｄ）：配列番号１の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ２）：下記の（Ｇ２ａ）、（Ｇ２ｂ）、（Ｇ２ｃ）または（Ｇ２ｄ）の塩基配列
（Ｇ２ａ）：配列番号３の塩基配列
（Ｇ２ｂ）：配列番号３の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ２ｃ）：配列番号３の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ２ｄ）：配列番号３の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ３）：下記の（Ｇ３ａ）、（Ｇ３ｂ）、（Ｇ３ｃ）または（Ｇ３ｄ）の塩基配列
（Ｇ３ａ）：配列番号５の塩基配列
（Ｇ３ｂ）：配列番号５の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ３ｃ）：配列番号５の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ３ｄ）：配列番号５の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ４）：下記の（Ｇ４ａ）、（Ｇ４ｂ）、（Ｇ４ｃ）または（Ｇ４ｄ）の塩基配列
（Ｇ４ａ）：配列番号７の塩基配列
（Ｇ４ｂ）：配列番号７の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ４ｃ）：配列番号７の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ４ｄ）：配列番号７の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ５）：下記の（Ｇ５ａ）、（Ｇ５ｂ）、（Ｇ５ｃ）または（Ｇ５ｄ）の塩基配列
（Ｇ５ａ）：配列番号９の塩基配列
（Ｇ５ｂ）：配列番号９の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ５ｃ）：配列番号９の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ５ｄ）：配列番号９の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ６）：下記の（Ｇ６ａ）、（Ｇ６ｂ）、（Ｇ６ｃ）または（Ｇ６ｄ）の塩基配列
（Ｇ６ａ）：配列番号１１の塩基配列
（Ｇ６ｂ）：配列番号１１の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ６ｃ）：配列番号１１の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ６ｄ）：配列番号１１の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ７）：下記の（Ｇ７ａ）、（Ｇ７ｂ）、（Ｇ７ｃ）または（Ｇ７ｄ）の塩基配列
（Ｇ７ａ）：配列番号１３の塩基配列
（Ｇ７ｂ）：配列番号１３の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ７ｃ）：配列番号１３の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ７ｄ）：配列番号１３の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ８）：下記の（Ｇ８ａ）、（Ｇ８ｂ）、（Ｇ８ｃ）または（Ｇ８ｄ）の塩基配列
（Ｇ８ａ）：配列番号１５の塩基配列
（Ｇ８ｂ）：配列番号１５の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ８ｃ）：配列番号１５の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ８ｄ）：配列番号１５の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ９）：下記の（Ｇ９ａ）、（Ｇ９ｂ）、（Ｇ９ｃ）または（Ｇ９ｄ）の塩基配列
（Ｇ９ａ）：配列番号１７の塩基配列
（Ｇ９ｂ）：配列番号１７の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ９ｃ）：配列番号１７の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ９ｄ）：配列番号１７の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
【請求項６】
セロビオース  ２−エピメラーゼの製造方法であって、ロドサーマス  マリナス（Rhodothermus marinus）、サッカロファガス  デグラダンス（Saccharophagus degradans）、スピロソマ  リングアレ（Spirosoma linguale）、ヘルペトシフォン  アウランチアクス（Herpetosiphon aurantiacus）、テレディニバクター  ツルネラエ（Teredinibacter turnerae）、ディアドバクター  ファーメンタンス（Dyadobacter fermentans）、キチノファーガ  ピネンシス（Chitinophaga pinensis）、ペドバクター  ヘパリナス（Pedobacter heparinus）およびフラボバクテリウム  ジョンソニエ（Flavobacterium johnsoniae）からなる群から選択される少なくとも一種の好気性微生物を培養する工程と、
前記好気性微生物の培養物から無細胞抽出物を得る工程と
を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項７】
請求項６のセロビオース  ２−エピメラーゼの製造方法に使用する好気性微生物であって、ロドサーマス  マリナス（Rhodothermus marinus）、サッカロファガス  デグラダンス（Saccharophagus degradans）、スピロソマ  リングアレ（Spirosoma linguale）、ヘルペトシフォン  アウランチアクス（Herpetosiphon aurantiacus）、テレディニバクター  ツルネラエ（Teredinibacter turnerae）、ディアドバクター  ファーメンタンス（Dyadobacter fermentans）、キチノファーガ  ピネンシス（Chitinophaga pinensis）、ペドバクター  ヘパリナス（Pedobacter heparinus）およびフラボバクテリウム  ジョンソニエ（Flavobacterium johnsoniae）からなる群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする好気性微生物。
【請求項８】
還元末端糖残基がβ−１，４結合で結合している、２つ以上の糖残基からなる糖を基質とし、セロビオース  ２−エピメラーゼの酵素反応により、前記還元末端糖残基の２位の水酸基がエピメリ化された糖を製造する、エピメリ化糖の製造方法であって、
前記セロビオース  ２−エピメラーゼとして、請求項１から４のいずれか一項に記載のセロビオース  ２−エピメラーゼを使用することを特徴とする製造方法。
【請求項９】
前記基質が、ラクトースである、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
前記酵素反応の温度が、４０〜１００℃の範囲である請求項８または９記載の製造方法。
【請求項１１】
前記酵素反応における基質濃度が、溶媒１００ｇあたり２５〜９０ｇの範囲である請求項８から１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記セロビオース  ２−エピメラーゼが、前記好気性微生物からの無細胞抽出物、および前記好気性微生物の菌体の少なくとも一方であることを特徴とする請求項８から１１のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のセロビオース  ２−エピメラーゼおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、エピラクトース（4−Ｏ−β−ガラクトシルマンノース）について、整腸、抗アレルギー、糖質代謝改善、脂質代謝改善、がんの抑制等、様々な生理的機能の可能性が報告されている。そこで、エピラクトースを機能性糖質として、飲食物等に利用することが望まれている。
【０００３】
しかしながら、エピラクトースは、加熱処理した牛乳に含まれるものの、非常に希少な糖であり、また、ラクトースをアルカリ異性化する方法が知られているが、効率よく生産することが困難であった(非特許文献１〜５)。
【０００４】
そこで、新たな合成方法として、Ruminococcus albusのセロビオース  ２−エピメラーゼ（ＥＣ  ５．１．３．１１）により、ラクトースからエピラクトースを酵素的に合成することが報告されている(非特許文献３)。これによって、比較的温和な条件で、容易にエピラクトースを調製することが可能となった。しかし、現在報告されているセロビオース  ２−エピメラーゼの起源は、Ruminococcus albusを始めとする嫌気性細菌のみである。嫌気性細菌の培養は、酸素を枯渇させた状態で行う必要があり、例えば、嫌気ジャー、嫌気グローブ・キャビネットまたは二酸化炭素インキュベータ等を使用して行う。嫌気状態を維持する方法は、例えば、化学薬品と水とを反応させて発生させた水素ガスもしくは触媒により発生させた水素ガスと、酸素とを反応させ、酸素を除去する方法（ガスパック法）、または、金属に酸素を吸収させるスチールウール法等がある。これらの方法は、実験室等での小規模な培養に用いることはできるが、工業的に大規模な培養の場合、大気中には大量の酸素が含まれているため、前記方法により嫌気状態を維持するのは極めて困難である。また、二酸化炭素ガスまたは窒素ガス等で、培地内または培養雰囲気の酸素を置換する方法がある。しかしながら、この方法は、ガスを大量に消費するほか、嫌気状態への移行が遅く、メンテナンスに多大な労力を要する。これらのことから、嫌気性細菌は、大規模の培養が困難であり、嫌気性細菌から酵素を工業的に製造し、利用することが極めて困難という問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ  １９８０；３５（１）：５−８
【非特許文献２】Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ  １９８１；３６（９）：５３３−５３６
【非特許文献３】Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８；  ７９：  ４３３−４４１
【非特許文献４】Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．２００８；９１：４５１８−４５２６
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２００７；  ３６０：６４０−６４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、工業的な製造が可能である、新たなセロビオース  ２−エピメラーゼの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のセロビオース  ２−エピメラーゼは、下記の（Ａ）〜（Ｆ）の特性を有し、かつ好気性微生物由来であることを特徴とする。
（Ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定された分子量が３７，８００〜４８，４００の範囲
（Ｂ）分子量の理論値が４２，５００〜５０，１００の範囲
（Ｃ）至適ｐＨが６〜９の範囲
（Ｄ）ｐＨ安定性がｐＨ２〜１２の範囲
（Ｅ）至適温度が３０〜９０℃の範囲
（Ｆ）熱安定性の上限が３０〜８０℃の範囲
【０００８】
本発明のセロビオース  ２−エピメラーゼ遺伝子は、下記の（Ｇ１）から（Ｇ９）の塩基配列のいずれかの塩基配列からなることを特徴とする。
（Ｇ１）：下記の（Ｇ１ａ）、（Ｇ１ｂ）、（Ｇ１ｃ）または（Ｇ１ｄ）の塩基配列
（Ｇ１ａ）：配列番号１の塩基配列
（Ｇ１ｂ）：配列番号１の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ１ｃ）：配列番号１の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ１ｄ）：配列番号１の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ２）：下記の（Ｇ２ａ）、（Ｇ２ｂ）、（Ｇ２ｃ）または（Ｇ２ｄ）の塩基配列
（Ｇ２ａ）：配列番号３の塩基配列
（Ｇ２ｂ）：配列番号３の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ２ｃ）：配列番号３の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ２ｄ）：配列番号３の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ３）：下記の（Ｇ３ａ）、（Ｇ３ｂ）、（Ｇ３ｃ）または（Ｇ３ｄ）の塩基配列
（Ｇ３ａ）：配列番号５の塩基配列
（Ｇ３ｂ）：配列番号５の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ３ｃ）：配列番号５の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ３ｄ）：配列番号５の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ４）：下記の（Ｇ４ａ）、（Ｇ４ｂ）、（Ｇ４ｃ）または（Ｇ４ｄ）の塩基配列
（Ｇ４ａ）：配列番号７の塩基配列
（Ｇ４ｂ）：配列番号７の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ４ｃ）：配列番号７の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ４ｄ）：配列番号７の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ５）：下記の（Ｇ５ａ）、（Ｇ５ｂ）、（Ｇ５ｃ）または（Ｇ５ｄ）の塩基配列
（Ｇ５ａ）：配列番号９の塩基配列
（Ｇ５ｂ）：配列番号９の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ５ｃ）：配列番号９の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ５ｄ）：配列番号９の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ６）：下記の（Ｇ６ａ）、（Ｇ６ｂ）、（Ｇ６ｃ）または（Ｇ６ｄ）の塩基配列
（Ｇ６ａ）：配列番号１１の塩基配列
（Ｇ６ｂ）：配列番号１１の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ６ｃ）：配列番号１１の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ６ｄ）：配列番号１１の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ７）：下記の（Ｇ７ａ）、（Ｇ７ｂ）、（Ｇ７ｃ）または（Ｇ７ｄ）の塩基配列
（Ｇ７ａ）：配列番号１３の塩基配列
（Ｇ７ｂ）：配列番号１３の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ７ｃ）：配列番号１３の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ７ｄ）：配列番号１３の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ８）：下記の（Ｇ８ａ）、（Ｇ８ｂ）、（Ｇ８ｃ）または（Ｇ８ｄ）の塩基配列
（Ｇ８ａ）：配列番号１５の塩基配列
（Ｇ８ｂ）：配列番号１５の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ８ｃ）：配列番号１５の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ８ｄ）：配列番号１５の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ９）：下記の（Ｇ９ａ）、（Ｇ９ｂ）、（Ｇ９ｃ）または（Ｇ９ｄ）の塩基配列
（Ｇ９ａ）：配列番号１７の塩基配列
（Ｇ９ｂ）：配列番号１７の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ９ｃ）：配列番号１７の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ９ｄ）：配列番号１７の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
【０００９】
本発明の製造方法は、セロビオース  ２−エピメラーゼの製造方法であって、ロドサーマス  マリナス（Rhodothermus marinus）、サッカロファガス  デグラダンス（Saccharophagus degradans）、スピロソマ  リングアレ（Spirosoma linguale）、ヘルペトシフォン  アウランチアクス（Herpetosiphon aurantiacus）、テレディニバクター  ツルネラエ（Teredinibacter turnerae）、ディアドバクター  ファーメンタンス（Dyadobacter fermentans）、キチノファーガ  ピネンシス（Chitinophaga pinensis）、ペドバクター  ヘパリナス（Pedobacter heparinus）およびフラボバクテリウム  ジョンソニエ（Flavobacterium johnsoniae）からなる群から選択される少なくとも一種の好気性微生物を培養する工程と、前記好気性微生物の培養物から無細胞抽出物を得る工程とを含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明の好気性微生物は、前記本発明のセロビオース  ２−エピメラーゼの製造方法に使用する好気性微生物であって、ロドサーマス  マリナス（Rhodothermus marinus）、サッカロファガス  デグラダンス（Saccharophagus degradans）、スピロソマ  リングアレ（Spirosoma linguale）、ヘルペトシフォン  アウランチアクス（Herpetosiphon aurantiacus）、テレディニバクター  ツルネラエ（Teredinibacter turnerae）、ディアドバクター  ファーメンタンス（Dyadobacter fermentans）、キチノファーガ  ピネンシス（Chitinophaga pinensis）、ペドバクター  ヘパリナス（Pedobacter heparinus）およびフラボバクテリウム  ジョンソニエ（Flavobacterium johnsoniae）からなる群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする。
【００１１】
本発明の製造方法は、還元末端糖残基がβ−１，４結合で結合している、２つ以上の糖残基からなる糖を基質とし、セロビオース  ２−エピメラーゼの酵素反応により、前記還元末端糖残基の２位の水酸基がエピメリ化された糖を製造する、エピメリ化糖の製造方法であって、前記セロビオース  ２−エピメラーゼとして、前記本発明のセロビオース  ２−エピメラーゼを使用することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のセロビオース  ２−エピメラーゼは、好気性微生物由来であることから、例えば、本発明の好気性微生物から容易に製造可能である。このため、本発明のセロビオース  ２−エピメラーゼは、例えば、工業的に生産可能であり、これによって、さらに、機能性糖質として有用性が高いエピラクトース等を、工業レベルで生産し、有効利用することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例１の粗酵素液における、糖の検出結果を示すチャートである。図１（ａ）は、ブランク、図１（ｂ）は、Ｆ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅの粗酵素液、図１（ｃ）は、Ｒ．ｍａｒｉｎｕｓの粗酵素液の結果を示す。
【図２】図２は、実施例１の粗酵素液による反応生成物の分析結果を示すチャートである。図２（ａ）は、Ｒ．ｍａｒｉｎｕｓの粗酵素液による反応生成物、図２（ｂ）は、エピラクトース標品の結果を示す。
【図３】図３は、実施例１の粗酵素液による反応生成物の単糖分析結果を示す写真である。
【図４】図４は、実施例２におけるＲｍＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥの解析結果を示す写真である。
【図５】図５は、実施例２におけるＲｍＣＥの至適ｐＨおよびｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例２におけるＲｍＣＥの至適温度および熱安定性の測定結果を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例２におけるＲｍＣＥによる反応生成物の確認結果を示す写真である。
【図８】図８は、実施例２におけるＲｍＣＥによるＮ−アセチルグルコサミンに対する反応の結果を示すチャートである。図８（ａ）は、ＲｍＣＥ未添加のブランクの結果、図８（ｂ）は、ＲｍＣＥ添加の反応液の結果を示す。
【図９】図９は、実施例２の粗酵素液によるエピラクトースへの変換率と反応温度との関係を示すグラフである。
【図１０】図１０は、実施例３におけるＦｊＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥの解析結果を示す写真である。
【図１１】図１１は、実施例３におけるＦｊＣＥの至適ｐＨおよびｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、実施例３におけるＦｊＣＥの至適温度および熱安定性の測定結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、実施例３におけるＦｊＣＥによる反応生成物の質量分析結果を示すチャートである。
【図１４】図１４は、実施例３におけるＦｊＣＥによる反応生成物の確認結果を示す写真である。図１４（ａ）は、ＦｊＣＥ添加の反応液の結果、図１４（ｂ）は、ＦｊＣＥ未添加のブランクの結果を示す。
【図１５】図１５は、実施例３におけるＦｊＣＥによるエピラクトースへの変換率とラクトース濃度との関係を示すグラフである。
【図１６】図１６は、実施例３におけるＦｊＣＥによるエピラクトースへの変換率と反応時間との関係を示すグラフである。
【図１７】図１７は、実施例４におけるＳｄＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥの解析結果を示す写真である。
【図１８】図１８は、実施例４におけるＳｄＣＥの至適ｐＨおよびｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。
【図１９】図１９は、実施例４におけるＳｄＣＥの至適温度および熱安定性の測定結果を示すグラフである。
【図２０】図２０は、実施例４におけるＳｄＣＥによる反応生成物の確認結果を示す写真である。
【図２１】図２１は、実施例４におけるＳｄＣＥによるＮ−アセチルグルコサミンに対する反応の結果を示すチャートである。図２１（ａ）は、ＳｄＣＥ未添加のブランクの結果、図２１（ｂ）は、ＳｄＣＥ添加の反応液の結果を示す。
【図２２】図２２は、実施例４におけるＳｄＣＥによる反応生成物の単糖分析結果を示す写真である。
【図２３】図２３は、実施例４におけるＳｄＣＥによるエピラクトースへの変換率とラクトース濃度との関係を示すグラフである。
【図２４】図２４は、実施例５におけるＨａＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥの解析結果を示す写真である。
【図２５】図２５は、実施例５におけるＨａＣＥの至適ｐＨおよびｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。
【図２６】図２６は、実施例５におけるＨａＣＥの至適温度および熱安定性の測定結果を示すグラフである。
【図２７】図２７は、実施例５におけるＨａＣＥによる反応生成物の確認結果を示す写真である。
【図２８】図２８は、実施例５におけるＨａＣＥによるＮ−アセチルグルコサミンに対する反応の結果を示すチャートである。図２８（ａ）は、ＨａＣＥ未添加のブランクの結果、図２８（ｂ）は、ＨａＣＥ添加の反応液の結果を示す。
【図２９】図２９は、実施例５におけるＨａＣＥによる反応生成物の単糖分析結果を示す写真である。
【図３０】図３０は、実施例５におけるＨａＣＥによる反応生成物への変換率と基質濃度との関係を示すグラフである。
【図３１】図３１は、実施例６におけるＤｆＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥの解析結果を示す写真である。
【図３２】図３２は、実施例６におけるＤｆＣＥの至適ｐＨおよびｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。
【図３３】図３３は、実施例６におけるＤｆＣＥの至適温度および熱安定性の測定結果を示すグラフである。
【図３４】図３４は、実施例６におけるＤｆＣＥによる反応生成物の確認結果を示す写真である。
【図３５】図３５は、実施例６におけるＤｆＣＥによるＮ−アセチルグルコサミンに対する反応の結果を示すチャートである。図３５（ａ）は、ＤｆＣＥ未添加のブランクの結果、図３５（ｂ）は、ＤｆＣＥ添加の反応液の結果を示す。
【図３６】図３６は、実施例６におけるＤｆＣＥによる反応生成物への変換率と基質濃度との関係を示すグラフである。
【図３７】図３７は、実施例７におけるＴｔＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥの解析結果を示す写真である。
【図３８】図３８は、実施例７におけるＴｔＣＥの至適ｐＨおよびｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。
【図３９】図３９は、実施例７におけるＴｔＣＥの至適温度および熱安定性の測定結果を示すグラフである。
【図４０】図４０は、実施例７におけるＴｔＣＥによる反応生成物の確認結果を示す写真である。
【図４１】図４１は、実施例７におけるＴｔＣＥによるＮ−アセチルグルコサミンに対する反応の結果を示すチャートである。図４１（ａ）は、ＴｔＣＥ未添加のブランクの結果、図４１（ｂ）は、ＴｔＣＥ添加の反応液の結果を示す。
【図４２】図４２は、実施例７におけるＴｔＣＥによる反応生成物の単糖分析結果を示す写真である。
【図４３】図４３は、実施例７におけるＴｔＣＥによる反応生成物への変換率と基質濃度との関係を示すグラフである。
【図４４】図４４は、実施例８におけるＰｈＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥの解析結果を示す写真である。
【図４５】図４５は、実施例８におけるＰｈＣＥの至適ｐＨおよびｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。
【図４６】図４６は、実施例８におけるＰｈＣＥの至適温度および熱安定性の測定結果を示すグラフである。
【図４７】図４７は、実施例８におけるＰｈＣＥによる反応生成物の確認結果を示す写真である。
【図４８】図４８は、実施例６におけるＤｆＣＥによるエピラクトースへの変換率とラクトース濃度との関係を示すグラフである。
【図４９】図４９は、実施例９におけるＳｌＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥの解析結果を示す写真である。
【図５０】図５０は、実施例９におけるＳｌＣＥの至適ｐＨおよびｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。
【図５１】図５１は、実施例９におけるＳｌＣＥの至適温度および熱安定性の測定結果を示すグラフである。
【図５２】図５２は、実施例９におけるＳｌＣＥによる反応生成物の確認結果を示す写真である。
【図５３】図５３は、実施例９におけるＳｌＣＥによるＮ−アセチルグルコサミンに対する反応の結果を示すチャートである。図５３（ａ）は、ＳｌＣＥ未添加のブランクの結果、図５３（ｂ）は、ＳｌＣＥ添加の反応液の結果を示す。
【図５４】図５４は、実施例１０におけるＣ．ｐｉｎｅｎｓｉｓの粗酵素液による反応生成物の確認結果を示す写真である。
【図５５】図５５は、実施例１１におけるＲｍＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥの解析結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、以下、セロビオース  ２−エピメラーゼを、ＣＥといい、セロビオース  ２−エピメラーゼ遺伝子を、ＣＥ遺伝子という。
【００１５】
＜セロビオース  ２−エピメラーゼ：ＣＥ＞
ＣＥとは、以下の触媒活性を有するポリペプチドを意味する。
（定義）
ＣＥは、国際生化学分子生物学連合により、ＥＣ番号  ５．１．３．１１に分類され、グルコースがβ―１，４結合されたセロビオースを４−Ｏ−β−グルコシルマンノースへ変換、またはその逆反応を触媒する。また、ＣＥは、還元末端糖残基がβ−１，４結合で結合している、２つ以上の糖残基からなる糖について、前記還元末端糖残基の２位の水酸基を２−エピメリ化（異性化）する反応、またはその逆反応を触媒する。以下、この触媒活性を、ＣＥ活性といい、前記糖を、糖基質という。
【００１６】
ＣＥの酵素単位１Ｕは、３０℃、ｐＨ７の条件下、１分間に１μｍｏｌの前記糖基質（例えば、ラクトース）をエピメリ化する（エピメリ化糖を生成する）酵素量とした。
【００１７】
本発明において、ポリペプチドは、タンパク質またはペプチドの意味を含む。
【００１８】
本発明のＣＥは、前述のように、下記の（Ａ）〜（Ｆ）の特性を有し、かつ好気性微生物由来であることを特徴とする。
（Ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定された分子量が３７，８００〜４８，４００の範囲
（Ｂ）分子量の理論値が４２，５００〜５０，１００の範囲
（Ｃ）至適ｐＨが６〜９の範囲
（Ｄ）ｐＨ安定性がｐＨ２〜１２の範囲
（Ｅ）至適温度が３０〜９０℃の範囲
（Ｆ）熱安定性の上限が３０〜８０℃の範囲
【００１９】
前記（Ａ）の分子量は、例えば、３９，８００〜４３，９００が好ましく、より好ましくは、３９，８００〜４２，８００の範囲、さらに好ましくは、４１，７００〜４２，８００の範囲である。
【００２０】
前記（Ａ）の分子量は、以下のＳＤＳ−ＰＡＧＥの条件により特定できる。なお、この方法は、前記（Ａ）の特性を特定するための方法であって、本発明を制限するものではない。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの条件は、例えば、ポリアクリルアミドゲルのゲル濃度１２．５％であり、定電流２５ｍＡ、精製タンパク質量１〜５μｇとした。
【００２１】
前記（Ｂ）の分子量の理論値は、例えば、４５，３００〜４８，１００が好ましく、より好ましくは、４５，３００〜４７，５００の範囲、さらに好ましくは、４５，３００〜４７，３００の範囲である。
【００２２】
前記（Ｃ）の至適ｐＨは、３０℃で最も高い活性を示すｐＨである。前記至適ｐＨは、例えば、５〜９が好ましく、より好ましくは、６〜８．８の範囲、さらに好ましくは、６．３〜８．４の範囲、特に好ましくは、６．３〜７の範囲である。ＣＥの基質となる還元糖は、例えば、アルカリ性条件下で高温にさらされた場合、その還元末端が異性化してしまう。すなわち、例えば、基質としてセロビオースを使用した場合、セロビウロース（β−Ｄ−グルコピラノシル−(１→４)−Ｄ−フラクトース）が、副生成物として生じる。また、基質としてラクトースを使用した場合、ラクチュロース（β−Ｄ−ガラクトピラノシル−(１→４)−Ｄ−フラクトース）が副生成物として生じる。これらの副生成物は、目的生成物である４−β−グルコシルマンノース(β−Ｄ−グルコピラノシル−(１→４)−Ｄ−マンノース)またはエピラクトースと分離することが、工業的に極めて困難である。このため、前記条件下でＣＥにより還元糖を変換した場合、目的生成物の収量が減じたり、目的生成物の純度が低下するおそれがある。このため、ＣＥによる還元糖の変換は、酸性領域の条件下で行うのが好ましい。したがって、酸性領域に高い活性を示す、本発明のＣＥは、例えば、少量で長時間に亘って、副生成物を生じさせずに、基質を目的生成物に変換できる。これにより、高い純度の目的生成物が得られる。このような観点から、本発明のＣＥは、有用である。なお、前記「副生成物を生じさせない」とは、基質から副生成物への生成率が、好ましくは５％以下であり、より好ましくは３％以下であり、特に好ましくは１％以下であることをいう。
【００２３】
前記（Ｄ）のｐＨ安定性は、例えば、２〜１２が好ましく、より好ましくは、２．２〜１１．８の範囲である。前記ｐＨ安定性は、所定ｐＨ、４℃、２４時間の条件で、ＣＥを保存した後、保存前のＣＥの活性を１００％とした場合に、８０％以上の残存活性を示すｐＨである。この場合、活性測定の条件は、例えば、３０〜４０℃、各ＣＥの前記至適ｐＨとする。
【００２４】
前記（Ｅ）の至適温度は、例えば、３５〜９０℃の範囲、好ましくは、４０〜８５℃の範囲、より好ましくは、４５〜８０℃の範囲である。酵素反応時における微生物汚染の防止の観点から、前記至適温度は、例えば、５５〜８０℃の範囲が特に好ましい。前記至適温度は、前記至適ｐＨにおいて、最も高いＣＥ活性を示す温度である。
【００２５】
前記（Ｆ）の熱安定性の上限は、例えば、３５〜８０℃が好ましく、より好ましくは、４０〜８０℃、さらに好ましくは、４５〜８０℃である。前記熱安定性は、所定温度、ｐＨ７．０、１５〜３０分間（例えば、１５分間または３０分間）の条件で、ＣＥを保存した後、保存前のＣＥの活性を１００％とした場合に、８０％以上の残存活性を示す温度である。この場合、活性測定の条件は、例えば、３０℃、各ＣＥの前記至適ｐＨとする。前記（Ｆ）の熱安定性の下限は、特に制限されない。
【００２６】
本発明のＣＥの基質は、還元末端糖残基がβ−１，４結合で結合している、２つ以上の糖残基からなる糖である。以下、前記糖を、糖基質という。本発明のＣＥは、例えば、前記糖基質に属するいずれか一種類の糖を基質としてもよいし、二種類以上の糖を基質としてもよい。なお、前記糖基質は、高純度である必要はなく、例えば、牛乳、ホエー等の、糖基質以外にタンパク質または脂質等を含有する飲食品、植物由来セルロースをセルラーゼで加水分解反応させた反応液そのもの等を用いてもよい。
【００２７】
前記糖基質において、糖残基の数は、前述のように２以上であればよく、その上限は特に制限されない。前記糖残基の上限は、例えば、４個であり、好ましくは、３個であり、より好ましくは、２個である。前記糖基質は、前記糖残基が２個の場合、二糖の基質ということができ、前記糖残基が３個以上の場合、多糖の基質ということができる。
【００２８】
前記糖基質の具体例としては、例えば、ラクトース、エピラクトース、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、４−β−グルコシルマンノース(β−Ｄ−グルコピラノシル−(１→４)−Ｄ−マンノース)、４−β−セロビオシルマンノース(β−Ｄ−グルコピラノシル−(１→４)−β−Ｄ−グルコピラノシル−(１→４)−Ｄ−マンノース)、４−β−セロトリオシルマンノース(β−Ｄ−グルコピラノシル−(１→４)−β−Ｄ−グルコピラノシル−(１→４)−β−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−マンノース)、４−β−セロテトラオシルマンノース(β−Ｄ−グルコピラノシル−(１→４)−β−Ｄ−グルコピラノシル−(１→４)−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−マンノース)、４−β−マンノビオース(β−Ｄ−マンノピラノシル−(１→４)−Ｄ−マンノース)、４−β−マンノシルグルコース(β−Ｄ−マンノピラノシル−(１→４)−Ｄ−グルコース)、グロボトリオース(α−Ｄ−ガラクトピラノシル−(１→４)−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−(１→４)−Ｄ−グルコース)等が例示できる。本発明のＣＥは、セロビオース、ラクトースを基質とすることが好ましい。
【００２９】
本発明のＣＥは、例えば、本発明のＣＥが固定化担体に固定化された固定化酵素でもよい。本発明のＣＥを固定化酵素とすることで、例えば、高基質濃度および高温において、反応生成物の製造を行うことができ、また、バイオリアクター方式による反応生成物の製造を行うこともできる。
【００３０】
前記固定化担体は、特に制限されず、例えば、本発明のＣＥが吸着または架橋結合され、本発明のＣＥの活性が保持されるもの使用できる。前記固定化担体は、例えば、陰イオン交換担体、陽イオン交換担体、疎水性担体等があげられる。前記固定化担体の具体例は、例えば、キトサンゲル、イオン交換ゲルである。前記キトサンゲルは、例えば、キトパールＢＣＷ−２５１０、キトパールＢＣＷ−３０１０、キトパールＢＣＷ−３５１０等のキトパールシリーズ（富士紡績社製）等があげられる。前記イオン交換ゲルは、例えば、ダイヤイオン（登録商標）ＳＫ１Ｂ、ダイヤイオン（登録商標）ＰＫ２１２、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰＡ２５等のダイヤイオン（登録商標）シリーズ（三菱化学社製）；セパビーズ（登録商標）ＳＰ−２０７、セパビーズ（登録商標）ＳＰ−８５０等のセパビーズ（登録商標）シリーズ（三菱化学社製）；デュオライトＡ５６８、デュオライトＡ７、デュオライトＸＡＤ７６１等のデュオライトシリーズ（三菱化学社製）等があげられる。前記固定化担体の形状は、特に制限されず、例えば、膜、ビーズ、プレート等があげられる。
【００３１】
本発明のＣＥの前記固定化担体への固定化方法は、特に制限されず、例えば、緩衝液等の溶媒に本発明のＣＥと前記固定化担体とを添加し、この混合液を振とうすることで行える。前記固定化の際の前記固定化担体と本発明のＣＥとの混合割合（重量比）は、特に制限されず、例えば、１：０．０００００１〜１：１の範囲であり、好ましくは１：０．０００００５〜１：０．１の範囲であり、より好ましくは１：０．００００１〜１：０．１の範囲である。
【００３２】
本発明のＣＥは、さらに、下記の（Ｇ）の特性を有することが好ましい。下記アシルグルコサミンは、例えば、Ｎ−アシル−Ｄ−グルコサミンがあげられる。下記アシルマンノサミンは、例えば、Ｎ−アシル−Ｄ−マンノサミンがあげられる。
（Ｇ）アシルグルコサミンおよびアシルマンノサミンを実質的に基質としない
【００３３】
実質的に基質にしないとは、例えば、ラクトースを基質とした相対活性を１００％とした場合に、アシルグルコサミンおよびアシルマンノサミンを基質とした相対活性が５％以下であることを意味し、好ましくは１％以下であり、より好ましくは０％であり、さらに好ましくは、アシルグルコサミンおよびアシルマンノサミンを基質とする活性が測定不可であり、特に好ましくは、アシルグルコサミンおよびアシルマンノサミンを基質とする触媒反応が完全に生じないことを意味する。
【００３４】
本発明のＣＥは、さらに、下記の（Ｈ）の特性を有することが好ましい。下記α−１，４結合の糖は、例えば、マルトースがあげられる。
（Ｈ）α−１，４結合の糖を実質的に基質としない
【００３５】
本発明のＣＥは、さらに、下記の（Ｉ）の特性を有することが好ましい。下記β−１，２結合の糖は、例えば、ソホロースがあげられる。
（Ｉ）β−１，２結合の糖を実質的に基質としない
【００３６】
本発明のＣＥは、さらに、下記の（Ｊ）の特性を有することが好ましい。下記β−１，３結合の糖は、例えば、ラミナリビオースがあげられる。
（Ｊ）β−１，３結合の糖を実質的に基質としない
【００３７】
本発明のＣＥは、さらに、下記の（Ｋ）の特性を有することが好ましい。下記β−１，６結合の糖は、例えば、ゲンチオビオースがあげられる。
（Ｋ）β−１，６結合の糖を実質的に基質としない
【００３８】
本発明のＣＥは、前記（Ａ）〜（Ｆ）の特性を満たしていればよく、その他の条件は特に制限されない。本発明のＣＥは、具体例として、下記の（Ｐ１）から（Ｐ９）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。以下、（Ｐ１）〜（Ｐ９）の各アミノ酸配列からなるＣＥを、それぞれ、ＲｍＣＥ、ＳｄＣＥ、ＳｌＣＥ、ＨａＣＥ、ＴｔＣＥ、ＤｆＣＥ、ＣｐＣＥ、ＦｊＣＥ、ＰｈＣＥという。
【００３９】
ＲｍＣＥ
（Ｐ１）：下記の（Ｐ１ａ）、（Ｐ１ｂ）または（Ｐ１ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ１ａ）：配列番号２のアミノ酸配列
（Ｐ１ｂ）：配列番号２のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ１ｃ）：配列番号２のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
【００４０】
（配列番号２）
VSTETIPDVRRLRALQAEVHEELTENILKFWATRTPDLVHGGFVGRVGPDGRPHPEAPRGAILNARILWTFAAAYRQLGTPLYREMAEHAYRYFVRHFVDADHGGVYWLVAADGRPLDTRKHVYAQSFAIYALSEWHRATGDEAALALARAIYGLIEAHCADRVHGGYVEACDRAWRPLEDVRLSAKDAPEPRSMNTHLHVLEAYTNLYRVWPDAELAVRLQALIELFLRAIYHPATGHLILFFDERWRPRSRAVSFGHDIETSWLLLEAVDVLGQATLRPRVQQASLHLARATLAEGRAPDGSLYYEIDEQGRLDTDRHWWPQAEALVGFLNAYQESGEVAFYEAAEGVWRYIRKRQRDTQGGEWFARVRDDGTPYPDDKVDFWKGPYHNGRACLEAIQRLRHLLEHARSR
【００４１】
前記（Ｐ１ａ）のポリペプチドは、例えば、好気性微生物Rhodothermus属から得ることができ、具体例としては、ロドサーマス  マリナス（Rhodothermus marinus  以下、Ｒｍという）から得ることができる。前記Ｒｍは、例えば、独立行政法人理化学研究所（登録番号JCM9785）、ＡＴＣＣ（登録番号ATCC43812）から入手できる。
【００４２】
前記（Ｐ１ａ）のポリペプチドは、例えば、前記（Ａ）〜（Ｆ）の特性として、以下の特性を有する。
（Ａ１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定された分子量が４０，８００〜４４，８００の範囲
（Ｂ１）分子量の理論値が４５，３００〜４９，３００の範囲
（Ｃ１）至適ｐＨが６〜７の範囲
（Ｄ１）ｐＨ安定性がｐＨ３〜１２の範囲
（Ｅ１）至適温度が８０〜９０℃の範囲
（Ｆ１）熱安定性の上限が３５〜８０℃の範囲
【００４３】
前記（Ｐ１ｂ）において、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸残基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。
【００４４】
前記（Ｐ１ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。相同性は、例えば、比較する配列同士を適切にアライメントしたときの同一性の程度であり、前記配列間のアミノ酸の正確な一致の出現率（％）を意味する。同一性は、例えば、配列におけるギャップの存在およびアミノ酸の性質が考慮される。前記アライメントは、例えば、任意のアルゴリズムの利用により行うことができ、具体的に、ＢＬＡＳＴ（Basic  local  alignment  search  tool)、ＢＬＡＳＴ−２、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｓａｌｉｎ等の相同性検索ソフトウエアが使用できる。同一性の算出は、例えば、前述のような公知の相同性検索プログラムを用いて算出でき、具体例は、例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）において、デフォルトのパラメーターを用いることによって算出できる。以下、同様である。
【００４５】
ＳｄＣＥ
（Ｐ２）：下記の（Ｐ２ａ）、（Ｐ２ｂ）または（Ｐ２ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ２ａ）：配列番号４のアミノ酸配列
（Ｐ２ｂ）：配列番号４のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ２ｃ）：配列番号４のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
【００４６】
（配列番号４）
MGVPLKKNKLNYSDLNNAFESELHAIADWWVDNTVDEIHGGFVGEMSVDNKVNATADKGIILNTRILWFFSEAALFTGNKRYAQMAERAYYYIVDHFLDTEHGGVFWALDYRGNVVNNRKQVYAQAFAIYGLSAYYRLTKQADVLAQAHAIFELTEANAQDENHQGYLEAFSNTWGRLDDMRLSEKDLNSPKSMNTHLHILEAYTALHIAAPSPKVSAAIKHCLELFDRYIINKANWHLRMFQDMDWEDVSASYSYGHDIECSWLMWEAVESLESEELHAHYKPAVIALAETCLEQGIGRYNEVLDAYNFETQTLVDERVWWVQAEALVGFLNAYHLAGEQRYLDAALNVWEFINSYQKDSVGGEWHWLSRLDLPHTGDCKMGPWKAPYHNGRAMMESIKLVQRIFGNNE
【００４７】
前記（Ｐ２ａ）のポリペプチドは、例えば、好気性微生物Saccharophagus属から得ることができ、具体例としては、サッカロファガス  デグラダンス（Saccharophagus degradans  以下、Ｓｄという)から得ることができる。前記Ｓｄは、例えば、ＡＴＣＣから入手できる（登録番号ATCC43961)。
【００４８】
前記（Ｐ２ａ）のポリペプチドは、例えば、前記（Ａ）〜（Ｆ）の特性として、以下の特性を有する。
（Ａ２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定された分子量が４３，０００〜４７，０００の範囲
（Ｂ２）分子量の理論値が４５，２００〜４９，２００の範囲
（Ｃ２）至適ｐＨが７〜８の範囲
（Ｄ２）ｐＨ安定性がｐＨ３．５〜１１の範囲
（Ｅ２）至適温度が３０〜４０℃の範囲
（Ｆ２）熱安定性の上限が３０〜４０℃の範囲
【００４９】
前記（Ｐ２ｂ）において、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸残基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。
【００５０】
前記（Ｐ２ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。
【００５１】
ＳｌＣＥ
（Ｐ３）：下記の（Ｐ３ａ）、（Ｐ３ｂ）または（Ｐ３ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ３ａ）：配列番号６のアミノ酸配列
（Ｐ３ｂ）：配列番号６のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ３ｃ）：配列番号６のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
【００５２】
（配列番号６）
MDLKQLRAELRQEHKDILAYWTRYAPDPVHGGFYGRVNYQNQPDPNAEKGIVLNARILWTFSAALRETQHEEYRSIADQAFQYIKTYFVDPEYGGIYWSVDATGKPKNALKHLYGQAFTLYGLSEYVRATKSEPALALAKEVFQNMVKHAYDPKKGGFVEALARDWSPATDYIISKYDNQEIKTMNTHLHILESFTCLYHVWPDKSVAEQMRGMLHMFQIHIIDPTTYRMNLFMDMNWKVRRTAVSYGHDIEASWLLPEAADLLAAKNPADKPLQKAFQHIGVKMARAASTGYDPTDGGMNYELEPDGHLNKERSWWVLAEAMVGFMNAYQLTHEKPFLDKSIKSWEFTKKYLLDRQNGEWYMGVTGDHTIVGKDKISMWKCPYHNSRACLEMLERLDHLHG
【００５３】
前記（Ｐ３ａ）のポリペプチドは、例えば、好気性微生物Spirosoma属から得ることができ、具体例としては、スピロソマ  リングアレ（Spirosoma linguale  以下、Ｓｌという)から得ることができる。前記Ｓｌは、例えば、ＡＴＣＣから入手できる（登録番号ATCC33905)。
【００５４】
前記（Ｐ３ａ）のポリペプチドは、例えば、前記（Ａ）〜（Ｆ）の特性として、以下の特性を有する。
（Ａ３）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定された分子量が４４，４００〜４８，４００の範囲
（Ｂ３）分子量の理論値が４４，６００〜４８，６００の範囲
（Ｃ３）至適ｐＨが７〜８の範囲
（Ｄ３）ｐＨ安定性がｐＨ２〜１０の範囲
（Ｅ３）至適温度が４０〜５０℃の範囲
（Ｆ３）熱安定性の上限が３５〜５０℃の範囲
【００５５】
前記（Ｐ３ｂ）において、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸残基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。
【００５６】
前記（Ｐ３ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。
【００５７】
ＨａＣＥ
（Ｐ４）：下記の（Ｐ４ａ）、（Ｐ４ｂ）または（Ｐ４ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ４ａ）：配列番号８のアミノ酸配列
（Ｐ４ｂ）：配列番号８のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ４ｃ）：配列番号８のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
【００５８】
（配列番号８）
MANLVDGGFDHGLREMWQAQFRDEVLGNILPFWANHTLDHEHGGFYGGLTNDLTIHNEFPRSAVLCGRILWTFACAYRMLGDPRDLAVAEYAYAYLKQAFWDQTYGGLYWSIDANGQPLADHKQTYAQSFAIYGLAEYVRATGDQSALELAQTLFHLIENHAFDAVYGGYIEGCDRVWQPLGDSRLSKLEPEARKTMNTMLHMMEAYANLLRVWDVADVRQQLASLIEACCEHIIDPVQGRFHLFFDDQWNHHEHGISYGHDIEGSWLLMEAAHVLGDEHLIAKAETLAIGMADAVYRNGRHADGSIIHERAPDGSINLERHWWPQAEAVVGFYNAYQATGKPEFAQAAYDSWNFIQRYFIDHDHGDWFKILDAQNQPLGAIPKVGPWECPYHHARVCFEMIERLAEHNVSVQMRG
【００５９】
前記（Ｐ４ａ）のポリペプチドは、例えば、好気性微生物Herpetosiphon属から得ることができ、具体例としては、ヘルペトシフォン  アウランチアクス（Herpetosiphon aurantiacus  以下、Ｈａという)から得ることができる。前記Ｈａは、例えば、ＡＴＣＣから入手できる（登録番号ATCC23779）。
【００６０】
前記（Ｐ４ａ）のポリペプチドは、例えば、前記（Ａ）〜（Ｆ）の特性として、以下の特性を有する。
（Ａ４）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定された分子量が３７，８００〜４１，８００の範囲
（Ｂ４）分子量の理論値が４５，５００〜４９，５００の範囲
（Ｃ４）至適ｐＨが７〜８の範囲
（Ｄ４）ｐＨ安定性がｐＨ７〜１２の範囲
（Ｅ４）至適温度が４０〜５０℃の範囲
（Ｆ４）熱安定性の上限が３５〜５０℃の範囲
【００６１】
前記（Ｐ４ｂ）において、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸残基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。
【００６２】
前記（Ｐ４ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。
【００６３】
ＴｔＣＥ
（Ｐ５）：下記の（Ｐ５ａ）、（Ｐ５ｂ）または（Ｐ５ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ５ａ）：配列番号１０のアミノ酸配列
（Ｐ５ｂ）：配列番号１０のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ５ｃ）：配列番号１０のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
【００６４】
（配列番号１０）
METETDTREQLILLQNNCANELAHLVSWWANNVVGDGNFSGEINSQGLPQHQAGKGGIYGSRLLWFFSEVAILGRDSLAPASGPTSGLASAKVSAQALYQYFSHHFIDPEYGGVVWELHANGELRDGRKQIYAQAFAIYCLSAYYRLTSDEDALAQALTIYELVEDFALDRAHCGYFEAFSREWRELDDIRLSEKDLASPKTMNTHLHLLEAYTGLLRALRQAGSPALQKVATSVQQLLELYVSRVYNSSSRHVHMFMNTHWEDESLAFSYGHDIESSWLLWEAADVLGDDALKQSYRHDVIALAETCLAQARATDGSLYDVFDKQRQLNIPERVWWVQAEAMVGFFNAWQLTGQQKYLDAVFSLWRYLEAEFITPGSEWPWLARSDQGAGYRAYLAGFWKGPYHNGRALMELISRINSVLNVDC
【００６５】
前記（Ｐ５ａ）のポリペプチドは、例えば、好気性微生物Teredinibacter属から得ることができ、具体例としては、テレディニバクター  ツルネラエ（Teredinibacter turnerae  以下、Ｔｔという)から得ることができる。前記Ｔｔは、例えば、ＡＴＣＣから入手できる（登録番号ATCC39867）。
【００６６】
前記（Ｐ５ａ）のポリペプチドは、例えば、前記（Ａ）〜（Ｆ）の特性として、以下の特性を有する。
（Ａ５）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定された分子量が４１，９００〜４５，９００の範囲
（Ｂ５）分子量の理論値が４６，１００〜５０，１００の範囲
（Ｃ５）至適ｐＨが８〜９の範囲
（Ｄ５）ｐＨ安定性がｐＨ３〜１１の範囲
（Ｅ５）至適温度が４０〜５０℃の範囲
（Ｆ５）熱安定性の上限が３５〜４５℃の範囲
【００６７】
前記（Ｐ５ｂ）において、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸残基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。
【００６８】
前記（Ｐ５ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。
【００６９】
ＤｆＣＥ
（Ｐ６）：下記の（Ｐ６ａ）、（Ｐ６ｂ）または（Ｐ６ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ６ａ）：配列番号１２のアミノ酸配列
（Ｐ６ｂ）：配列番号１２のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ６ｃ）：配列番号１２のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
【００７０】
（配列番号１２）
MAAFTPEAFKKEFIAILDYWEKYGLDSEKGGFYGRVNYENQPVKDAAKSVVLTGRILWTFSLAHRLLKEAKYLTLADRAYQQLARHFFDPEHGGVYWSVNADGSPLETKKQIYGNAFAMYGLAEYYRVTHFKPALEKAQSLFEIIEKHAFDPVNGGYREAFARDWSATDDYILSKSPWNKSMNTHLHLVEAYTNLYSVWPDARLKKQTAGMLDTIITRIVNPKTETMQLFFDEQWKAKDNIVSYGHDIEASWLLFETAEILHDEKLIGRMKQKSIAMAATAAKGLGADGALNYEYDPETKHTQTDRSWWVVAEQLVGFYNAYQLTKDAQFKTKAEKSWDYIVNEFIDHERGEWFGTVKEDGTPVKGDKINFWKCPYHNARACAEMWRRTGKA
【００７１】
前記（Ｐ６ａ）のポリペプチドは、例えば、好気性微生物Dyadobacter属から得ることができ、具体例としては、ディアドバクター  ファーメンタンス（Dyadobacter fermentans  以下、Ｄｆという)から得ることができる。前記Ｄｆは、例えば、ＡＴＣＣから入手できる（登録番号ATCC700827）。
【００７２】
前記（Ｐ６ａ）のポリペプチドは、例えば、前記（Ａ）〜（Ｆ）の特性として、以下の特性を有する。
（Ａ６）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定された分子量が３９，７００〜４３，７００の範囲
（Ｂ６）分子量の理論値が４３，３００〜４７，３００の範囲
（Ｃ６）至適ｐＨが７〜８の範囲
（Ｄ６）ｐＨ安定性がｐＨ２〜１０．５の範囲
（Ｅ６）至適温度が４５〜５５℃の範囲
（Ｆ６）熱安定性の上限が３５〜５０℃の範囲
【００７３】
前記（Ｐ６ｂ）において、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸残基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。
【００７４】
前記（Ｐ６ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。
【００７５】
ＣｐＣＥ
（Ｐ７）：下記の（Ｐ７ａ）、（Ｐ７ｂ）または（Ｐ７ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ７ａ）：配列番号１４のアミノ酸配列
（Ｐ７ｂ）：配列番号１４のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ７ｃ）：配列番号１４のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
【００７６】
（配列番号１４）
MNWTSDEKQQLPVNTLKQELLQELKRILVYWTTETVDERNGGFIGRISAHNVKDPYAVKGSVLNTRILWTFSAAYNLLKTDQYLTLANRAWDYLYAHFADKVHGGLYWTVDYTGKAVDGKKQVYAIAFGVYACSEYFKASRNETAKQTAIAWYHAIRQYAYDKIYGGYIEACTQDWQPLSDLRLSLKDANERKSMNTHLHVLEAWTTLYEIWPDEQLKADILELLMLFDKQIIHPTTHHLQLFFTDNWTVKSTLISYGHDIEAAWLLLEAAIAVGDEQELSRFRVRAINLVRAALKGMDKDGGLWYEYDTAEQHLIAEKHWWPQAEALVGLVNAWELSGDPYYLDKAMASWQFIQQFLLDKTDGEWHWGVGLDGKPIEEVKVGLWKCPYHNARACMEVVKRLK
【００７７】
前記（Ｐ７ａ）のポリペプチドは、例えば、好気性微生物Chitinophaga属から得ることができ、具体例としては、キチノファーガ  ピネンシス（Chitinophaga pinensis  以下、Ｃｐという)から得ることができる。前記Ｃｐは、例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手できる（登録番号NBRC15968）。
【００７８】
前記（Ｐ７ａ）のポリペプチドは、例えば、前記（Ｂ）の特性として、以下の特性を有する。
（Ｂ７）分子量の理論値が４４，７００〜４８，７００の範囲
【００７９】
前記（Ｐ７ｂ）において、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸残基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。
【００８０】
前記（Ｐ７ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。
【００８１】
ＦｊＣＥ
（Ｐ８）：下記の（Ｐ８ａ）、（Ｐ８ｂ）または（Ｐ８ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ８ａ）：配列番号１６のアミノ酸配列
（Ｐ８ｂ）：配列番号１６のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ８ｃ）：配列番号１６のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
【００８２】
（配列番号１６）
MPANLKQLKSELTAELDSILNYWSKHTLDNQNEGFVGQIDFNDHIVANAEKGSVLNSRILWTFSSSYQITKKENHKEIAKRAFEYLSKYFYDPEFNGLFWSINADKTPKDTKNQIYALAFAIYGLSEYYVISQDQKALETAVNLYKSIQKYSYDPVNKGYLEAFTRNWQPIEDLRLSDKDANEKKTMNTHLHIIEAYANLFKVWKDETLKKDSIELLETIEKHFINTETGHLRLFFDENWIEKPDVISYGHDIEAAWLLLQCAEVLEEENLIANYKKHAVQIAEVTKEGFDTDGGLWYEFEPKENELIAEKHWWVQAEALIGFYNAYQLTGNEEYLKIVFENWNFIKKHILDHKNGEWFWGIHKDYSLIQKDKAGFWKCPYHNSRACLELINRIKT
【００８３】
前記（Ｐ８ａ）のポリペプチドは、例えば、好気性微生物Flavobacterium属から得ることができ、具体例としては、フラボバクテリウム  ジョンソニエ（Flavobacterium johnsoniae  以下、Ｆｊという)から得ることができる。前記Ｆｊは、例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手できる（登録番号NBRC12017）。
【００８４】
前記（Ｐ８ａ）のポリペプチドは、例えば、前記（Ａ）〜（Ｆ）の特性として、以下の特性を有する。
（Ａ８）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定された分子量が３９，７００〜４３，７００の範囲
（Ｂ８）分子量の理論値が４４，７００〜４８，７００の範囲
（Ｃ８）至適ｐＨが８〜９の範囲
（Ｄ８）ｐＨ安定性がｐＨ４〜１０の範囲
（Ｅ８）至適温度が３５〜４０℃の範囲
（Ｆ８）熱安定性の上限が３５〜４０℃の範囲
【００８５】
前記（Ｐ８ｂ）において、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸残基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。
【００８６】
前記（Ｐ８ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。
【００８７】
ＰｈＣＥ
（Ｐ９）：下記の（Ｐ９ａ）、（Ｐ９ｂ）または（Ｐ９ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ９ａ）：配列番号１８のアミノ酸配列
（Ｐ９ｂ）：配列番号１８のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ９ｃ）：配列番号１８のアミノ酸配列との相同性が７０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
【００８８】
（配列番号１８）
MTSIFKNRLEQLQKVHQTLIHQKNQIETGGNGIFDRYRYPVLTAAHIPLTWKYDFDAKANPYFMERIGFNAVFNAGAIKFNGKFILVARVEGADRKSFFAIAESENGIDGFEFWNAPIVFDTDEHADTNVYDMRLVKHEDGWIYGLFCTEKRDPSAPESDQTSALAQCGIIRTKDLKKWDRLPDLKTPSPQQRNVVLHPEFVGGKYAFYTRPQDSFIEAGTGGGIGFGLADNIENATITHEAIFYKKEYHTVYEAKNGQGPAPIKTDKGWLHLAHGVRNTAAGLRYVLYMFMTDLDDLTKVIYKPGGYFIAPEGEERVGDVSNVTFCNGWIADQDEKVYIYYASSDTRMHVATSTVEQLIDYVVNTPEDGLSSAKSIKNIVGLIDKNSIHSFSKI
【００８９】
前記（Ｐ９ａ）のポリペプチドは、例えば、好気性微生物Pedobacter属から得ることができ、具体例としては、ペドバクター  ヘパリナス（Pedobacter heparinus  以下、Ｐｈという)から得ることができる。前記Ｐｈは、例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手できる（登録番号NBRC14942）。
【００９０】
前記（Ｐ９ａ）のポリペプチドは、例えば、前記（Ａ）〜（Ｆ）の特性として、以下の特性を有する。
（Ａ９）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定された分子量が３８，７００〜４２，７００の範囲
（Ｂ９）分子量の理論値が４２，５００〜４６，５００の範囲
（Ｃ９）至適ｐＨが６〜７の範囲
（Ｄ９）ｐＨ安定性がｐＨ５〜１２の範囲
（Ｅ９）至適温度が３５〜４０℃の範囲
（Ｆ９）熱安定性の上限が３５〜４０℃の範囲
【００９１】
前記（Ｐ９ｂ）において、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸残基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜４個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。
【００９２】
前記（Ｐ９ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。
【００９３】
前記（Ｐ１）〜（Ｐ９）の中でも、例えば、耐熱性に優れることから、（Ｐ１）のＲｍ由来ＣＥ、（Ｐ４）のＨａ由来ＣＥ、（Ｐ６）のＤｆ由来ＣＥ、（Ｐ３）のＳｌＣＥが好ましく、より好ましくは（Ｐ１）のＲｍ由来ＣＥである。このように耐熱性に優れるＣＥであれば、例えば、雑菌等の繁殖を防止するために、高い温度条件下で処理をする場合であっても、十分に優れた活性を維持した状態で使用できる。
【００９４】
本発明のＣＥは、例えば、前記（Ｐ１）〜（Ｐ９）のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸残基が、さらに修飾基を有してもよい。前記修飾基は、特に制限されず、例えば、糖鎖、リン酸基、メチル基等があげられる。
【００９５】
本発明のＣＥの活性は、前記基質から２−エピメリ化された生成物を定量または定性することにより、測定できる。本発明のＣＥを用いた反応は、例えば、緩衝液中で行うことができる。前記緩衝液のｐＨは、特に制限されず、例えば、前述のような至適ｐＨおよびｐＨ安定性のｐＨが好ましい。前記緩衝液の種類は、特に制限されず、例えば、グッド緩衝液、リン酸緩衝液、ブリトン−ロビンソン緩衝液、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液等が使用できる。
【００９６】
＜ＣＥ遺伝子＞
本発明のＣＥ遺伝子は、下記の（Ｇ１）から（Ｇ９）の塩基配列のいずれかの塩基配列からなることを特徴とする。本発明のＣＥ遺伝子は、前記本発明のＣＥをコードする遺伝子である。このため、本発明のＣＥ遺伝子を発現させることによって、前述した本発明ＣＥを得ることができる。以下、（Ｇ１）〜（Ｇ９）の各塩基配列からなるＣＥ遺伝子を、それぞれ、ＲｍＣＥ遺伝子、ＳｄＣＥ遺伝子、ＳｌＣＥ遺伝子、ＨａＣＥ遺伝子、ＴｔＣＥ遺伝子、ＤｆＣＥ遺伝子、ＣｐＣＥ遺伝子、ＦｊＣＥ遺伝子、ＰｈＣＥ遺伝子という。また、本発明のＣＥ遺伝子は、例えば、前記（Ｇ１）〜（Ｇ９）の各塩基配列に相補的な塩基配列からなるアンチセンス鎖でもよい。
【００９７】
ＲｍＣＥ遺伝子
（Ｇ１）：下記の（Ｇ１ａ）、（Ｇ１ｂ）、（Ｇ１ｃ）または（Ｇ１ｄ）の塩基配列
（Ｇ１ａ）：配列番号１の塩基配列
（Ｇ１ｂ）：配列番号１の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ１ｃ）：配列番号１の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ１ｄ）：配列番号１の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
【００９８】
（配列番号１）
GTGAGCACGGAAACCATCCCGGACGTTCGGCGCCTGCGCGCGCTGCAGGCGGAGGTCCACGAAGAACTGACCGAGAACATCCTGAAGTTCTGGGCCACGCGCACGCCCGATCTGGTGCACGGTGGGTTTGTGGGACGGGTGGGGCCGGACGGCCGGCCCCACCCGGAAGCCCCGCGCGGAGCGATCCTGAACGCCCGGATCCTGTGGACGTTTGCCGCGGCCTACCGCCAGCTCGGCACGCCGCTGTATCGGGAGATGGCCGAGCATGCCTACCGGTACTTCGTCCGGCACTTCGTGGACGCCGACCACGGCGGCGTTTACTGGCTGGTGGCCGCCGACGGCCGTCCGCTGGACACCCGCAAGCACGTCTACGCTCAGTCCTTCGCCATCTACGCCCTGAGCGAGTGGCACCGGGCCACGGGCGACGAAGCGGCGCTGGCGCTGGCCCGCGCGATCTATGGCCTGATCGAAGCCCACTGCGCCGATCGGGTGCACGGCGGCTATGTGGAAGCCTGCGATCGCGCCTGGCGGCCGCTCGAAGATGTGCGGCTCAGCGCCAAGGACGCGCCCGAGCCGCGCAGCATGAACACGCACCTGCACGTGCTGGAGGCCTACACCAACCTGTATCGCGTCTGGCCCGATGCGGAGCTGGCCGTACGGCTTCAGGCGCTGATCGAGCTGTTCCTGCGGGCCATCTACCACCCGGCCACCGGGCATCTCATCCTGTTCTTCGACGAGCGCTGGCGGCCGCGCTCGCGGGCCGTCTCGTTCGGGCACGACATCGAGACAAGCTGGCTGCTTCTGGAAGCCGTCGATGTGCTGGGGCAGGCGACGTTGCGCCCGCGGGTGCAGCAGGCTTCACTGCATCTGGCCCGCGCCACGCTGGCCGAAGGCCGGGCACCGGACGGTAGCCTCTACTACGAGATCGACGAGCAGGGCCGTCTCGATACCGACCGGCACTGGTGGCCACAGGCCGAAGCGCTGGTGGGATTCCTGAACGCCTATCAGGAAAGCGGCGAGGTGGCCTTCTACGAAGCGGCCGAAGGCGTCTGGCGCTACATCCGAAAGCGCCAGCGTGACACGCAGGGGGGCGAATGGTTTGCCCGCGTGCGCGACGACGGCACCCCCTACCCCGACGACAAGGTGGACTTCTGGAAGGGGCCCTACCACAACGGCCGCGCCTGTCTGGAGGCGATCCAGCGCTTGCGGCACCTCCTGGAACACGCTCGATCCCGGTAG
【００９９】
前記（Ｇ１ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、前記（Ｐ１ａ）のアミノ酸配列からなるＣＥをコードする。前記（Ｇ１ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、好気性微生物Rhodothermus属から得ることができ、具体例としては、前記Ｒｍから得ることができる。
【０１００】
前記（Ｇ１ｂ）の塩基配列において、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。前記欠失等された塩基配列は、例えば、配列番号１の塩基配列と、同じ読み枠の塩基配列である。
【０１０１】
前記（Ｇ１ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。相同性は、例えば、比較する配列同士を適切にアライメントしたときの同一性の程度であり、前記配列間の塩基の正確な一致の出現率（％）を意味する。同一性は、例えば、配列におけるギャップの存在および塩基の性質が考慮される。前記アライメントは、例えば、任意のアルゴリズムの利用により行うことができ、前述したアミノ酸配列と同様である。
【０１０２】
前記（Ｇ１ｄ）において、ストリンジェントな条件は、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられる。具体例としては、温度条件は、例えば、前記配列番号で示された塩基配列のＴｍ値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例は、５×ＳＳＣ溶液、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、１０分の洗浄（２回）があげられる。これらの条件以外にも、ハイブリダイゼーションについては、例えば、Molecular  Cloning（A  Laboratory  Manual  Second  Edition（Cold  Spring  Harber  Laboratory  press,  New  York（1989）.））等に準じて行うこともできる。また、市販のツールを使用する場合は、例えば、添付の使用説明書にしたがって行える。ストリンジェントな条件は、以下同様である。
【０１０３】
ＳｄＣＥ遺伝子
（Ｇ２）：下記の（Ｇ２ａ）、（Ｇ２ｂ）、（Ｇ２ｃ）または（Ｇ２ｄ）の塩基配列
（Ｇ２ａ）：配列番号３の塩基配列
（Ｇ２ｂ）：配列番号３の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ２ｃ）：配列番号３の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ２ｄ）：配列番号３の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
【０１０４】
（配列番号３)
ATGGGTGTGCCGCTTAAAAAAAATAAATTGAATTATTCCGATTTGAATAATGCTTTTGAATCGGAGTTACACGCTATAGCCGATTGGTGGGTGGACAATACGGTCGATGAAATCCACGGTGGTTTTGTGGGTGAAATGAGCGTAGACAACAAGGTGAACGCCACAGCCGATAAAGGCATTATCCTCAATACGCGTATTCTTTGGTTTTTTAGCGAAGCGGCACTGTTTACCGGCAACAAGCGCTATGCGCAAATGGCTGAGCGCGCATACTATTATATAGTGGACCATTTTTTAGATACCGAACATGGCGGTGTATTTTGGGCGTTAGATTACCGCGGTAACGTTGTAAATAACCGCAAACAAGTATATGCACAGGCGTTTGCCATTTACGGTTTAAGCGCTTATTACAGGCTTACTAAGCAAGCCGACGTGCTGGCGCAGGCGCATGCTATTTTTGAGCTAACAGAAGCCAACGCGCAGGATGAAAATCACCAAGGCTATTTAGAGGCTTTCTCTAATACTTGGGGTCGCTTAGACGATATGCGTTTAAGCGAAAAAGATTTAAATTCGCCCAAGTCCATGAACACGCATTTACACATTCTAGAAGCTTATACCGCATTACATATTGCCGCACCCAGCCCAAAAGTGAGCGCAGCTATAAAGCATTGCTTAGAGTTGTTCGACCGTTACATTATCAACAAGGCAAACTGGCATTTGCGCATGTTTCAAGATATGGATTGGGAGGATGTTTCCGCAAGCTATTCCTACGGGCATGATATTGAGTGCAGTTGGTTGATGTGGGAGGCGGTCGAGTCTTTAGAGTCCGAAGAGTTGCATGCACACTACAAACCCGCGGTTATTGCCTTAGCCGAAACCTGTTTAGAGCAGGGTATTGGCAGGTACAACGAAGTGCTCGATGCATACAACTTTGAAACCCAAACGTTGGTGGATGAGCGCGTGTGGTGGGTGCAAGCCGAAGCCCTGGTTGGCTTTTTAAATGCCTACCACCTTGCCGGTGAGCAGCGATATTTAGATGCAGCATTAAATGTTTGGGAATTTATAAATAGCTATCAAAAAGATAGCGTTGGGGGCGAGTGGCATTGGTTGTCGCGTTTAGATTTACCCCACACGGGCGATTGTAAAATGGGCCCTTGGAAAGCGCCGTACCATAATGGCCGCGCTATGATGGAATCGATAAAGCTTGTGCAGAGAATATTTGGTAATAACGAATAA
【０１０５】
前記（Ｇ２ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、前記（Ｐ２ａ）のアミノ酸配列からなるＣＥをコードする。前記（Ｇ２ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、好気性微生物Saccharophagus属から得ることができ、具体例としては、前記Ｓｄから得ることができる。
【０１０６】
前記（Ｇ２ｂ）の塩基配列において、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。前記欠失等された塩基配列は、例えば、配列番号３の塩基配列と、同じ読み枠の塩基配列である。
【０１０７】
前記（Ｇ２ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。
【０１０８】
ＳｌＣＥ遺伝子
（Ｇ３）：下記の（Ｇ３ａ）、（Ｇ３ｂ）、（Ｇ３ｃ）または（Ｇ３ｄ）の塩基配列
（Ｇ３ａ）：配列番号５の塩基配列
（Ｇ３ｂ）：配列番号５の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ３ｃ）：配列番号５の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ３ｄ）：配列番号５の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
【０１０９】
（配列番号５)
ATGGACTTAAAGCAACTTCGCGCCGAACTGCGGCAGGAACATAAGGACATACTTGCTTATTGGACCCGCTACGCGCCCGATCCTGTGCATGGTGGTTTCTACGGCCGGGTCAATTACCAAAACCAGCCCGACCCAAACGCCGAAAAAGGTATCGTTTTGAATGCCCGCATCTTGTGGACCTTCTCGGCGGCCCTCCGGGAGACGCAGCACGAAGAGTATCGCTCCATTGCCGATCAGGCTTTTCAATACATCAAGACGTACTTTGTCGACCCCGAATACGGCGGAATCTACTGGTCGGTGGATGCAACCGGCAAGCCTAAAAATGCCCTCAAGCATCTCTACGGACAGGCATTTACGCTCTATGGGCTCAGTGAGTACGTTCGTGCCACCAAATCGGAACCCGCGCTTGCTCTGGCCAAAGAGGTATTTCAAAATATGGTGAAGCACGCGTACGATCCCAAGAAAGGCGGGTTTGTAGAAGCTCTCGCCCGCGACTGGTCGCCCGCCACCGATTACATTATCAGCAAATACGATAATCAGGAAATAAAGACGATGAACACGCACCTCCACATTCTGGAGTCGTTCACGTGTCTGTATCATGTTTGGCCCGACAAATCCGTGGCTGAGCAGATGCGCGGTATGCTGCACATGTTTCAGATTCATATCATCGACCCGACAACTTACCGCATGAATCTGTTTATGGACATGAACTGGAAAGTCCGGCGGACGGCCGTTTCTTACGGTCACGACATCGAAGCCTCCTGGCTGCTCCCCGAAGCCGCCGATTTGCTGGCCGCCAAAAATCCAGCCGATAAGCCATTGCAAAAAGCGTTTCAGCACATTGGGGTAAAAATGGCGCGGGCAGCCTCCACCGGTTACGACCCAACCGACGGGGGAATGAACTACGAACTGGAGCCTGACGGCCACCTCAACAAAGAACGTTCGTGGTGGGTACTGGCCGAAGCCATGGTTGGGTTCATGAATGCTTACCAGCTCACACACGAGAAGCCGTTTCTGGACAAGTCCATAAAAAGCTGGGAATTCACAAAGAAGTACTTACTCGACCGCCAGAACGGCGAATGGTACATGGGCGTTACCGGCGATCATACCATAGTGGGAAAAGACAAAATCAGCATGTGGAAATGTCCTTACCACAATAGCCGCGCCTGTCTTGAAATGCTGGAACGACTGGATCATCTGCATGGATAA
【０１１０】
前記（Ｇ３ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、前記（Ｐ３ａ）のアミノ酸配列からなるＣＥをコードする。前記（Ｇ３ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、好気性微生物Spirosoma属から得ることができ、具体例としては、前記Ｓｌから得ることができる。
【０１１１】
前記（Ｇ３ｂ）の塩基配列において、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。前記欠失等された塩基配列は、例えば、配列番号５の塩基配列と、同じ読み枠の塩基配列である。
【０１１２】
前記（Ｇ３ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。
【０１１３】
ＨａＣＥ遺伝子
（Ｇ４）：下記の（Ｇ４ａ）、（Ｇ４ｂ）、（Ｇ４ｃ）または（Ｇ４ｄ）の塩基配列
（Ｇ４ａ）：配列番号７の塩基配列
（Ｇ４ｂ）：配列番号７の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ４ｃ）：配列番号７の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ４ｄ）：配列番号７の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
【０１１４】
（配列番号７)
ATGGCGAATCTCGTAGATGGCGGCTTTGATCATGGCTTGCGCGAAATGTGGCAAGCGCAGTTTCGCGATGAAGTGTTGGGCAATATTTTGCCATTTTGGGCAAACCACACGCTTGATCATGAGCACGGTGGCTTTTATGGCGGCTTAACCAACGATCTGACAATCCATAATGAGTTTCCTCGCTCAGCCGTATTATGTGGTCGGATTCTCTGGACGTTTGCCTGTGCCTATCGCATGCTCGGCGATCCCCGCGATTTGGCGGTGGCTGAGTATGCCTATGCCTACCTCAAACAGGCTTTTTGGGATCAAACTTATGGCGGATTGTATTGGTCGATCGATGCCAACGGCCAGCCTTTGGCCGACCATAAACAAACCTATGCTCAATCGTTCGCCATCTACGGGTTGGCCGAGTATGTTCGAGCTACAGGCGATCAGAGCGCCTTGGAATTGGCGCAAACCCTGTTTCACTTGATCGAAAATCATGCCTTTGATGCGGTTTATGGTGGCTATATCGAGGGCTGTGATCGGGTTTGGCAACCCTTGGGCGATAGCCGCCTGAGCAAGCTTGAGCCAGAAGCCCGCAAAACCATGAACACCATGTTGCATATGATGGAGGCCTATGCCAACTTGCTGCGAGTTTGGGATGTGGCCGATGTGCGCCAGCAATTGGCCAGCCTGATCGAGGCCTGCTGCGAACATATTATCGACCCTGTGCAAGGCCGCTTTCATCTATTTTTCGATGACCAATGGAACCACCACGAACATGGTATTTCGTATGGCCACGATATCGAAGGCAGTTGGTTATTGATGGAAGCAGCCCATGTGTTGGGCGATGAACACTTAATTGCCAAGGCCGAAACTTTAGCGATTGGCATGGCCGATGCGGTCTATCGCAATGGCCGCCACGCCGATGGCAGCATTATTCACGAACGCGCTCCCGATGGCTCGATTAATTTGGAACGCCATTGGTGGCCCCAAGCTGAAGCCGTTGTTGGCTTCTACAACGCCTATCAGGCCACTGGCAAACCTGAGTTTGCTCAAGCCGCCTACGATAGTTGGAATTTTATTCAACGCTATTTTATCGACCACGATCATGGTGATTGGTTCAAAATTCTTGATGCTCAAAACCAACCGTTGGGAGCGATTCCAAAAGTTGGCCCATGGGAATGCCCGTATCACCATGCCCGCGTTTGTTTTGAAATGATCGAACGTTTAGCTGAACACAACGTGAGTGTTCAGATGCGAGGGTAA
【０１１５】
前記（Ｇ４ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、前記（Ｐ４ａ）のアミノ酸配列からなるＣＥをコードする。前記（Ｇ４ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、好気性微生物Herpetosiphon属から得ることができ、具体例としては、前記Ｈａから得ることができる。
【０１１６】
前記（Ｇ４ｂ）の塩基配列において、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。前記欠失等された塩基配列は、例えば、配列番号７の塩基配列と、同じ読み枠の塩基配列である。
【０１１７】
前記（Ｇ４ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。
【０１１８】
ＴｔＣＥ遺伝子
（Ｇ５）：下記の（Ｇ５ａ）、（Ｇ５ｂ）、（Ｇ５ｃ）または（Ｇ５ｄ）の塩基配列
（Ｇ５ａ）：配列番号９の塩基配列
（Ｇ５ｂ）：配列番号９の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ５ｃ）：配列番号９の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ５ｄ）：配列番号９の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
【０１１９】
（配列番号９)
ATGGAAACTGAAACGGATACCCGCGAGCAGTTAATTCTCCTACAGAATAATTGTGCTAACGAATTAGCGCATCTGGTTAGCTGGTGGGCGAACAATGTGGTGGGCGATGGCAATTTTTCTGGTGAGATCAACAGCCAGGGGCTTCCCCAGCACCAAGCTGGTAAAGGCGGTATTTACGGTTCGCGCTTACTCTGGTTTTTTAGTGAAGTGGCAATACTGGGTAGAGATTCTTTAGCGCCTGCATCAGGACCGACGTCCGGGCTCGCATCTGCAAAGGTATCTGCACAGGCGCTCTACCAGTATTTTAGCCACCATTTTATTGATCCGGAATACGGCGGTGTTGTTTGGGAATTGCATGCAAACGGTGAGCTTCGCGACGGGCGCAAGCAAATATATGCGCAGGCATTTGCTATTTACTGTCTCAGTGCCTATTACCGATTAACCTCGGATGAGGATGCGTTAGCACAGGCGTTGACGATCTATGAGCTGGTGGAAGACTTTGCGCTGGATCGCGCCCACTGTGGATATTTCGAAGCGTTTAGTCGCGAGTGGCGTGAGCTCGACGATATTCGTTTAAGCGAAAAAGATTTAGCCAGCCCCAAAACCATGAACACGCATTTGCATTTACTGGAGGCGTATACGGGTTTACTGCGCGCACTCAGGCAGGCCGGGTCGCCAGCGCTACAGAAGGTTGCAACGAGTGTTCAGCAATTGCTCGAACTCTATGTTTCCCGTGTGTATAACTCGAGTTCCAGGCACGTTCACATGTTTATGAATACTCATTGGGAAGATGAAAGCCTGGCGTTCAGTTACGGTCACGATATAGAAAGCAGTTGGTTGCTGTGGGAAGCCGCTGATGTGCTGGGGGACGATGCGCTAAAGCAATCTTACCGGCACGATGTTATTGCGCTGGCTGAAACCTGCTTAGCCCAAGCGCGCGCAACCGATGGCTCGCTTTACGACGTGTTCGATAAACAGCGCCAGTTGAACATTCCGGAGCGAGTATGGTGGGTTCAGGCGGAGGCCATGGTGGGCTTTTTTAATGCGTGGCAATTAACAGGGCAACAAAAATACCTGGATGCCGTGTTTTCCCTGTGGCGATATTTGGAAGCGGAATTTATTACCCCGGGCAGTGAATGGCCCTGGCTCGCACGCAGTGATCAGGGGGCAGGTTATCGCGCCTATCTGGCGGGCTTTTGGAAGGGGCCGTATCACAACGGTCGTGCGCTGATGGAATTAATTTCTCGGATTAATTCGGTGTTGAATGTCGACTGTTAG
【０１２０】
前記（Ｇ５ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、前記（Ｐ５ａ）のアミノ酸配列からなるＣＥをコードする。前記（Ｇ５ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、好気性微生物Teredinibacter属から得ることができ、具体例としては、前記Ｔｔから得ることができる。
【０１２１】
前記（Ｇ５ｂ）の塩基配列において、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。前記欠失等された塩基配列は、例えば、配列番号９の塩基配列と、同じ読み枠の塩基配列である。
【０１２２】
前記（Ｇ５ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。
【０１２３】
ＤｆＣＥ遺伝子
（Ｇ６）：下記の（Ｇ６ａ）、（Ｇ６ｂ）、（Ｇ６ｃ）または（Ｇ６ｄ）の塩基配列
（Ｇ６ａ）：配列番号１１の塩基配列
（Ｇ６ｂ）：配列番号１１の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ６ｃ）：配列番号１１の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ６ｄ）：配列番号１１の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
【０１２４】
（配列番号１１)
ATGGCGAATCTCGTAGATGGCGGCTTTGATCATGGCTTGCGCGAAATGTGGCAAGCGCAGTTTCGCGATGAAGTGTTGGGCAATATTTTGCCATTTTGGGCAAACCACACGCTTGATCATGAGCACGGTGGCTTTTATGGCGGCTTAACCAACGATCTGACAATCCATAATGAGTTTCCTCGCTCAGCCGTATTATGTGGTCGGATTCTCTGGACGTTTGCCTGTGCCTATCGCATGCTCGGCGATCCCCGCGATTTGGCGGTGGCTGAGTATGCCTATGCCTACCTCAAACAGGCTTTTTGGGATCAAACTTATGGCGGATTGTATTGGTCGATCGATGCCAACGGCCAGCCTTTGGCCGACCATAAACAAACCTATGCTCAATCGTTCGCCATCTACGGGTTGGCCGAGTATGTTCGAGCTACAGGCGATCAGAGCGCCTTGGAATTGGCGCAAACCCTGTTTCACTTGATCGAAAATCATGCCTTTGATGCGGTTTATGGTGGCTATATCGAGGGCTGTGATCGGGTTTGGCAACCCTTGGGCGATAGCCGCCTGAGCAAGCTTGAGCCAGAAGCCCGCAAAACCATGAACACCATGTTGCATATGATGGAGGCCTATGCCAACTTGCTGCGAGTTTGGGATGTGGCCGATGTGCGCCAGCAATTGGCCAGCCTGATCGAGGCCTGCTGCGAACATATTATCGACCCTGTGCAAGGCCGCTTTCATCTATTTTTCGATGACCAATGGAACCACCACGAACATGGTATTTCGTATGGCCACGATATCGAAGGCAGTTGGTTATTGATGGAAGCAGCCCATGTGTTGGGCGATGAACACTTAATTGCCAAGGCCGAAACTTTAGCGATTGGCATGGCCGATGCGGTCTATCGCAATGGCCGCCACGCCGATGGCAGCATTATTCACGAACGCGCTCCCGATGGCTCGATTAATTTGGAACGCCATTGGTGGCCCCAAGCTGAAGCCGTTGTTGGCTTCTACAACGCCTATCAGGCCACTGGCAAACCTGAGTTTGCTCAAGCCGCCTACGATAGTTGGAATTTTATTCAACGCTATTTTATCGACCACGATCATGGTGATTGGTTCAAAATTCTTGATGCTCAAAACCAACCGTTGGGAGCGATTCCAAAAGTTGGCCCATGGGAATGCCCGTATCACCATGCCCGCGTTTGTTTTGAAATGATCGAACGTTTAGCTGAACACAACGTGAGTGTTCAGATGCGAGGGTAA
【０１２５】
前記（Ｇ６ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、前記（Ｐ６ａ）のアミノ酸配列からなるＣＥをコードする。前記（Ｇ６ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、好気性微生物Dyadobacter属から得ることができ、具体例としては、前記Ｄｆから得ることができる。
【０１２６】
前記（Ｇ６ｂ）の塩基配列において、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。前記欠失等された塩基配列は、例えば、配列番号１１の塩基配列と、同じ読み枠の塩基配列である。
【０１２７】
前記（Ｇ６ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。
【０１２８】
ＣｐＣＥ遺伝子
（Ｇ７）：下記の（Ｇ７ａ）、（Ｇ７ｂ）、（Ｇ７ｃ）または（Ｇ７ｄ）の塩基配列
（Ｇ７ａ）：配列番号１３の塩基配列
（Ｇ７ｂ）：配列番号１３の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ７ｃ）：配列番号１３の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ７ｄ）：配列番号１３の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
【０１２９】
（配列番号１３)
ATGAATTGGACATCAGACGAAAAACAACAGCTACCAGTCAACACGCTGAAACAGGAACTTTTACAGGAGCTTAAACGTATACTCGTTTACTGGACGACTGAAACTGTAGACGAGCGCAATGGCGGTTTTATAGGCCGTATCTCCGCTCACAATGTAAAAGACCCTTATGCCGTCAAAGGAAGTGTGCTCAATACCCGTATACTCTGGACATTCTCTGCAGCTTATAATCTGTTAAAGACTGACCAGTATCTTACATTGGCTAATCGCGCCTGGGATTACCTCTATGCTCACTTCGCTGATAAAGTGCATGGAGGTCTTTATTGGACGGTGGACTATACCGGTAAAGCAGTCGATGGCAAAAAGCAGGTCTATGCCATTGCATTCGGCGTATATGCCTGCAGCGAGTACTTTAAGGCAAGCAGAAACGAAACAGCTAAACAAACTGCGATAGCATGGTACCATGCTATCCGTCAGTATGCCTACGATAAGATATACGGCGGCTATATAGAAGCCTGTACGCAAGACTGGCAACCACTATCTGATCTTCGGCTGAGTCTGAAAGATGCGAATGAAAGAAAGTCCATGAATACACATCTGCATGTGCTGGAAGCCTGGACTACCTTATATGAGATCTGGCCGGATGAACAACTGAAAGCAGATATCCTGGAATTACTGATGCTTTTTGACAAGCAGATCATTCATCCCACTACACACCATTTGCAATTATTCTTCACGGACAACTGGACGGTGAAAAGCACCTTGATTTCTTATGGCCATGATATAGAAGCAGCATGGCTGTTACTGGAGGCGGCAATTGCAGTTGGTGATGAACAGGAGCTCAGTCGTTTCCGTGTCCGCGCCATCAACCTGGTAAGAGCCGCCCTGAAAGGCATGGATAAAGACGGTGGCCTCTGGTATGAATACGATACTGCTGAGCAACACCTGATAGCAGAAAAACACTGGTGGCCACAGGCGGAAGCCCTGGTAGGACTGGTCAATGCCTGGGAACTAAGCGGCGATCCTTACTACCTGGATAAAGCGATGGCCAGCTGGCAATTTATACAACAGTTCCTGCTGGATAAAACAGACGGAGAATGGCATTGGGGCGTCGGTCTCGACGGCAAGCCGATAGAAGAAGTAAAGGTAGGATTATGGAAGTGTCCCTATCATAATGCGAGAGCATGCATGGAGGTCGTGAAGCGTTTGAAGTGA
【０１３０】
前記（Ｇ７ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、前記（Ｐ７ａ）のアミノ酸配列からなるＣＥをコードする。前記（Ｇ７ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、好気性微生物Chitinophaga属から得ることができ、具体例としては、前記Ｃｐから得ることができる。
【０１３１】
前記（Ｇ７ｂ）の塩基配列において、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。前記欠失等された塩基配列は、例えば、配列番号１３の塩基配列と、同じ読み枠の塩基配列である。
【０１３２】
前記（Ｇ７ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。
【０１３３】
ＦｊＣＥ遺伝子
（Ｇ８）：下記の（Ｇ８ａ）、（Ｇ８ｂ）、（Ｇ８ｃ）または（Ｇ８ｄ）の塩基配列
（Ｇ８ａ）：配列番号１５の塩基配列
（Ｇ８ｂ）：配列番号１５の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ８ｃ）：配列番号１５の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ８ｄ）：配列番号１５の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
【０１３４】
（配列番号１５)
ATGCCAGCAAATCTAAAACAGCTTAAATCTGAATTGACAGCCGAACTTGACTCGATTTTAAATTATTGGTCAAAACATACGCTCGATAATCAAAATGAAGGTTTTGTCGGGCAGATTGATTTCAACGATCACATTGTTGCCAATGCAGAAAAAGGTTCCGTTTTGAATTCCAGAATTCTATGGACATTTTCATCCAGTTATCAGATCACAAAAAAAGAAAACCACAAAGAAATTGCAAAAAGAGCTTTCGAATATCTTTCAAAATATTTCTACGATCCTGAATTTAACGGGCTTTTTTGGAGCATAAACGCTGATAAAACACCAAAAGATACTAAAAACCAAATCTATGCCTTAGCTTTTGCTATTTATGGATTATCTGAATATTATGTTATTTCTCAAGATCAAAAAGCTTTAGAAACTGCTGTTAATTTATACAAAAGCATACAAAAATACAGTTACGATCCTGTAAACAAAGGCTATCTCGAAGCTTTTACACGCAATTGGCAGCCCATTGAAGATTTACGTTTAAGCGACAAAGACGCCAACGAAAAAAAGACGATGAATACACATTTGCATATTATTGAAGCGTATGCCAATTTGTTTAAAGTCTGGAAAGATGAAACACTCAAAAAAGACAGCATCGAACTATTAGAAACAATAGAAAAACATTTTATTAATACCGAAACCGGACATCTTCGTTTGTTTTTTGATGAAAACTGGATCGAAAAACCAGACGTAATTTCATACGGACACGACATCGAAGCAGCCTGGCTTTTATTGCAATGTGCAGAAGTTTTAGAAGAGGAAAACCTAATTGCCAATTATAAAAAACACGCTGTTCAAATTGCCGAAGTTACCAAAGAAGGATTCGATACCGATGGCGGATTATGGTACGAGTTTGAACCTAAAGAAAACGAATTAATTGCCGAAAAACACTGGTGGGTTCAGGCAGAAGCGCTGATTGGTTTTTACAATGCCTATCAATTAACAGGAAATGAAGAATATCTGAAGATTGTTTTTGAAAACTGGAATTTCATTAAAAAACACATTTTGGATCATAAAAATGGTGAATGGTTCTGGGGAATTCATAAAGATTATTCACTCATCCAAAAAGACAAAGCCGGATTCTGGAAATGTCCGTATCATAACAGCCGTGCCTGTTTAGAGCTTATTAACCGAATTAAAACCTAA
【０１３５】
前記（Ｇ８ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、前記（Ｐ８ａ）のアミノ酸配列からなるＣＥをコードする。前記（Ｇ８ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、好気性微生物Flavobacterium属から得ることができ、具体例としては、前記Ｆｊから得ることができる。
【０１３６】
前記（Ｇ８ｂ）の塩基配列において、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。前記欠失等された塩基配列は、例えば、配列番号１５の塩基配列と、同じ読み枠の塩基配列である。
【０１３７】
前記（Ｇ８ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。
【０１３８】
ＰｈＣＥ遺伝子
（Ｇ９）：下記の（Ｇ９ａ）、（Ｇ９ｂ）、（Ｇ９ｃ）または（Ｇ９ｄ）の塩基配列
（Ｇ９ａ）：配列番号１７の塩基配列
（Ｇ９ｂ）：配列番号１７の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ９ｃ）：配列番号１７の塩基配列との相同性が７０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ９ｄ）：配列番号１７の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
【０１３９】
（配列番号１７）
ATGAGCGAAATTCTTATACAAGAGTTTGAAAAGGAACTGGCCGGTATGCTGAACTACTGGGCTACATATACAGTAGACAAAGTGCATACAGGCTTTTATGGACAAGTTGATAATGACAATAATGCTATTGAAAAAGCAGATAAAGGTGCTGTGTTAAACTCCCGCATCCTTTGGTTTTTCTCTGCTGCCTATAATTACAAGAGCTGGCCCGAAAGTTTACATCTGGCCAGAAGAAGCTATGATTATATAAGAGACCACTTTGTGGACAAGCAATTTGGAGGAGTATATTGGTCTGTAGATTTTCAGGGCAAACCAGCAGATACCAAAAAACAGATGTATGCACTAGCGTTTGCCCTGTATGGGATAACAGAGTTTTATAAGGCTAGCAGAGAGGAAGAGGCATTGGCCCTGGCTAAAATTCTTTATGCTGATATAGAGAAACATAGCTTCGACCCCATAAATAATGGATATTTTGAAGCTTTTTCCTGCCAGTGGTCAGAATTGACAGACCAACGTTTAAGTGATAAGGATGCCAACGAAAAAAAGACTATGAATACACACCTTCATGTTTTAGAGGCATATACCAGTCTTTACACTGTTTGGCCCGATGAGGGATTGGGCAGGCAGATCCGTAATTTGCTTGGTGTTTTTACAGATAAGATTATTGACAGAGATACCCATCATCTGATGCTTTTTTTTGACGAAAGCTGGCATTCAAAATCCCGGGCAATTTCTTTTGGACACGATATAGAGGCTTCCTGGCTTTTGCTGGAAGCAGCGGAATCTTTGGGAGATGAAAACCTGATCTGGCAATTTAAAGATGTAGCAGTAAAGATGGCCATGGCATCTATTCAAGGGCTAGATGAAAATGGAGGGCTAAACTATGAGTTTGAACCATCCAATTGGAGCAGAGAAAAACATTGGTGGGTACAAGCTGAAGCCATGGTAGGTTTTTTTAATGCTTTTCAGCTTACGAAAGAACAGACCTACTACGATAAATTTTTAAAATGCTGGGAGTTTACAAAAGCGCACATTATCAATACACAAAAAGGAGAGTGGTTTTGGGGTGTAAATGAAGATCTTTCCTTGATGCCTGAACAATATAAAGTTGGTTTATGGAAGTGCCCATATCATAATGGCAGGGCCTGCTTGGAGATGATACGCCGCCTTGGTGTCAATTTCGATTTTTCCTGA
【０１４０】
前記（Ｇ９ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、前記（Ｐ９ａ）のアミノ酸配列からなるＣＥをコードする。前記（Ｇ９ａ）の塩基配列からなるＣＥ遺伝子は、例えば、好気性微生物Pedobacter属から得ることができ、具体例としては、前記Ｐｈから得ることができる。
【０１４１】
前記（Ｇ９ｂ）の塩基配列において、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜３０個、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは、１〜１０個、さらに好ましくは、１〜５個、特に好ましくは、１〜３個、最も好ましくは、１個または２個である。前記欠失等された塩基配列は、例えば、配列番号１７の塩基配列と、同じ読み枠の塩基配列である。
【０１４２】
前記（Ｇ９ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは、９０％以上であり、より好ましくは、９５％以上である。
【０１４３】
本発明のＣＥ遺伝子において、前記塩基配列は、例えば、前述したような好気性微生物から取得してもよいし、遺伝子工学的な手法または化学合成的な手法により、製造することもできる。
【０１４４】
＜ベクター＞
本発明のＣＥ発現ベクターは、本発明のＣＥ遺伝子を有することを特徴とする。本発明のＣＥ発現ベクターは、前記本発明のＣＥ遺伝子を発現可能なように有していればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明のＣＥ発現ベクターは、例えば、後述するように、宿主に導入し、前記宿主内で前記ＣＥ遺伝子を発現させることによって、本発明のＣＥを製造できる。
【０１４５】
本発明のＣＥ発現ベクターは、基本ベクターに前記本発明のＣＥ遺伝子が挿入されていることが好ましい。この際、前記ＣＥ遺伝子は、前記基本ベクターにおける発現制御配列に、機能的に結合または配置されていることが好ましい。機能的に結合または配置するとは、例えば、前記ＣＥ遺伝子が発現しうる状態で結合または配置されていることを意味する。前記基本ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、本発明のＣＥ発現ベクターを導入する宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記基本ベクターは、例えば、非ウイルス性ベクターおよびウイルス性ベクターがあげられる。前記非ウイルスベクターは、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等があげられる。前記プラスミドＤＮＡは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等の大腸菌由来プラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等の枯草菌由来のプラスミド；ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等の酵母由来のプラスミド等があげられる。前記ファージＤＮＡは、例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等のλファージ等があげられる。前記ウイルスベクターは、例えば、レトロウイルスまたはワクシニアウイルス等の動物ウイルス；バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター等があげられる。
【０１４６】
本発明のＣＥ発現ベクターは、例えば、さらに、他の塩基配列を有してもよい。前記塩基配列は、例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、リボソーム結合配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、タグをコードする塩基配列、選択マーカー遺伝子の塩基配列等があげられる。前記選択マーカー遺伝子は、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等があげられる。
【０１４７】
＜本発明の形質転換体＞
本発明の形質転換体は、本発明のＣＥ遺伝子を含む。本発明の形質転換体は、例えば、本発明のＣＥを発現し得るように、本発明のＣＥ遺伝子を宿主に導入することにより得られる。本発明の形質転換体は、例えば、本発明のＣＥ発現ベクターを有することが好ましい。この場合、宿主に、本発明のＣＥ発現ベクターを導入することによって、前記形質転換体を得ることができる。
【０１４８】
前記宿主は、特に制限されず、本発明のＣＥ遺伝子から本発明のＣＥを発現できるものがあげられる。前記宿主は、例えば、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バシラス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバシラス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌；サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母；ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞；Ｓｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞等があげられる。
【０１４９】
形質転換の方法は、制限されず、例えば、宿主および前記ベクターの種類に応じて、適宜、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、リン酸カルシウム法、スフェロプラスト法、ＤＥＡＥデキストラン法、接合伝達法、エレクトロポレーション法等があげられる。
【０１５０】
＜ＣＥの製造方法＞
本発明の製造方法は、ＣＥの製造方法であって、前述のように、ロドサーマス  マリナス（Rhodothermus marinus）、サッカロファガス  デグラダンス（Saccharophagus degradans）、スピロソマ  リングアレ（Spirosoma linguale）、ヘルペトシフォン  アウランチアクス（Herpetosiphon aurantiacus）、テレディニバクター  ツルネラエ（Teredinibacter turnerae）、ディアドバクター  ファーメンタンス（Dyadobacter fermentans）、キチノファーガ  ピネンシス（Chitinophaga pinensis）、ペドバクター  ヘパリナス（Pedobacter heparinus）およびフラボバクテリウム  ジョンソニエ（Flavobacterium johnsoniae）からなる群から選択される少なくとも一種の本発明の好気性微生物を培養する工程と、前記好気性微生物の培養物から無細胞抽出物を得る工程とを含むことを特徴とする。前記好気性微生物は、例えば、列挙した好気性微生物の変異株を含む。本発明の製造方法は、列挙した好気性微生物を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の製造方法は、例えば、前記無細胞抽出物を得る工程に代えて、または、さらに、前記培養物から培養上清を回収する工程を含んでもよい。
【０１５１】
本発明によれば、前述した本発明のＣＥを製造できる。特に、本発明の好気性微生物は、培養が容易であることから、例えば、工業的な大量培養が可能であり、これによって、本発明のＣＥを容易に製造できる。
【０１５２】
前記培養工程の条件は、例えば、前記好気性微生物の種類に応じて適宜設定できる。培養の温度は、例えば、２０〜８０℃であり、３０〜８０℃が好ましく、より好ましくは、４０〜８０℃である。前記好気性微生物が、Rhodothermus marinusの場合、培養の温度は、例えば、４０〜８０℃であり、５０〜８０℃が好ましく、Herpetosiphon aurantiacusの場合、培養の温度は、例えば、２０〜３７℃であり、２５〜３７℃が好ましい。培養のｐＨは、例えば、５〜１０であり、６〜９が好ましい。培養時間は、例えば、１５〜７２時間である。前記培養は、好気条件で行うことが好ましく、撹拌培養が好ましい。培地は、特に制限されず、前記好気性微生物の種類に応じて適宜使用できる。
【０１５３】
本発明は、前記好気性微生物の培養後、得られた培養物から無細胞抽出物を得る。前記好気性微生物において、本発明のＣＥは、例えば、菌体内酵素として生成される。そこで、前記無細胞抽出物は、例えば、前記培養物中の好気性微生物を破砕し、細胞画分を除去することにより得られる。前記好気性微生物の破砕方法は、特に制限されず、例えば、超音波破砕、ホモジナイザーによる破砕、ガラスビーズ等のビーズによる破砕、リゾチーム等の酵素による破砕等があげられる。前記細胞画分の除去は、例えば、破砕物を遠心分離または珪藻土ろ過等して、沈殿物を除去することにより行える。
【０１５４】
前記無細胞抽出物は、そのまま、本発明のＣＥを含む画分として使用してもよいし、さらに、精製処理を施してもよい。前記精製処理は、特に制限されず、従来公知の手法が採用でき、一種類でもよいし二種類の手法を組合せてもよい。前記精製処理は、例えば、塩析法、透析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等のアフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が採用できる。
【０１５５】
本発明のＣＥは、例えば、本発明の形質転換体を使用して製造することもできる。この場合、本発明の製造方法は、本発明の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする。本発明の製造方法は、本発明の形質転換体を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。前記形質転換体は、例えば、これらの変異株を含む。
【０１５６】
本発明の製造方法は、例えば、前記形質転換体の培養後、得られた培養物から無細胞抽出物を得る。本発明のＣＥは、例えば、前記形質転換体における本発明のＣＥ遺伝子に応じて、例えば、菌体内酵素として発現させてもよいし、菌体外酵素として発現させてもよい。前記本発明のＣＥが、菌体内酵素の場合、前記無細胞抽出物は、例えば、前記培養物中の形質転換体を破砕し、細胞画分を除去することにより得られる。前記本発明のＣＥが、菌体外酵素の場合、前記無細胞抽出物は、例えば、培養物から培養菌体を除去することにより得られる。また、前記無細胞抽出物は、前述のように、さらに精製処理を施してもよい。
【０１５７】
＜好気性微生物＞
本発明の好気性微生物は、前記本発明のＣＥの製造方法に使用する好気性微生物であって、ロドサーマス  マリナス（Rhodothermus marinus）、サッカロファガス  デグラダンス（Saccharophagus degradans）、スピロソマ  リングアレ（Spirosoma linguale）、ヘルペトシフォン  アウランチアクス（Herpetosiphon aurantiacus）、テレディニバクター  ツルネラエ（Teredinibacter turnerae）、ディアドバクター  ファーメンタンス（Dyadobacter fermentans）、キチノファーガ  ピネンシス（Chitinophaga pinensis）、ペドバクター  ヘパリナス（Pedobacter heparinus）およびフラボバクテリウム  ジョンソニエ（Flavobacterium johnsoniae）からなる群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする。本発明の好気性微生物は、列挙した好気性微生物の変異株も含む。本発明の好気性微生物によれば、前述した本発明のＣＥを容易に製造できる。このため、本発明の好気性微生物を、工業的に大量培養することによって、大量の本発明のＣＥを容易に製造できる。
【０１５８】
＜エピメリ化糖の製造方法＞
本発明の製造方法は、還元末端糖残基がβ−１，４結合で結合している、２つ以上の糖残基からなる糖を基質とし、ＣＥの酵素反応により、前記還元末端糖残基の２位の水酸基がエピメリ化された糖を製造する、エピメリ化糖の製造方法であって、前記ＣＥとして、本発明のＣＥを使用することを特徴とする。
【０１５９】
本発明の製造方法において、本発明のＣＥは、例えば、精製タンパク質でもよいし、未精製タンパク質でもよい。また、本発明のＣＥは、例えば、固定化されていない酵素でもよいし、固定化担体に固定化された固定化酵素でもよい。前記固定化担体の形状および材質等は、特に制限されず、例えば、前述と同様である。また、本発明の製造方法において、本発明のＣＥは、例えば、前記好気性微生物からの無細胞抽出物でもよいし、前記好気性微生物の菌体でもよい。前記好気性微生物の菌体は、例えば、エピラクトース等の製造に、菌体そのものとして使用してもよいし、前記菌体を固定化担体に固定化した状態で使用してもよい。前記固定化担体は、例えば、前述と同様のものを使用できる。
【０１６０】
前記基質は、特に制限されず、前述のような糖基質が使用でき、中でも、好ましくはラクトースである。また、前記糖基質は、高純度である必要はなく、糖基質以外にタンパク質または脂質等を含有する牛乳、ホエー等を使用してもよい。
【０１６１】
前記酵素反応の条件は、特に制限されず、例えば、前述した本発明のＣＥの特性、反応形態または反応液の生成処理条件等に応じて、適宜決定できる。さらに、前記酵素反応の条件は、例えば、特開２００４−２２２５０６号公報を参照し、他の酵素と組み合わせて、ＣＥの基質となるセロビオースを生成し、同時に、セロビオースをＣＥと反応させる場合、または、植物由来セルロースをセルラーゼで加水分解し、同時に、基質をＣＥと反応させる場合には、組み合わせる他の酵素の特性、例えば、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、熱安定性等を考慮して決定できる。反応温度は、例えば、４０〜１００℃の範囲であり、好ましくは、４５〜９５℃の範囲であり、より好ましくは、５０〜９０℃の範囲であり、特に好ましくは、５０〜８５℃の範囲である。反応ｐＨは、例えば、４〜９の範囲であり、好ましくは、５〜８．５の範囲であり、より好ましくは、５．５〜８．５の範囲であり、特に好ましくは、６〜８．５の範囲である。
【０１６２】
前記反応液における基質濃度は、特に制限されず、例えば、前記酵素反応が進行可能な範囲において、基質濃度が高いほど経済的に有利である。基質としてラクトースを使用する場合、ラクトース濃度は、例えば、反応液の溶媒を水１００ｇと仮定した場合、前記溶媒１００ｇあたり２５〜９０ｇの範囲であり、好ましくは、３０〜７０ｇの範囲であり、より好ましくは、３０〜６７ｇの範囲である。前記反応液の溶媒は、特に制限されず、例えば、水、前述のような緩衝液等があげられる。なお、選択した基質の溶媒への溶解度が低い場合、例えば、所望の濃度で完全に溶解されない場合がある。バッチ式で酵素反応を行う場合、例えば、反応初期において基質が完全に溶解された状態である必要はなく、酵素反応の終了時に溶解される基質濃度を選択すればよい。一方、固定化酵素を充填したカラムを酵素反応に使用する場合、例えば、カラムの目詰まりによる圧力損失を避けるために、基質が完全に溶解された状態であることが好ましい。また、固定化酵素を充填したカラムを酵素反応に使用する場合、例えば、基質溶液を、前記カラムに還流させて、連続的に通液するのが好ましい。
【実施例】
【０１６３】
つぎに、本発明の実施例について説明する。本発明は、以下の実施例により制限されない。
【０１６４】
［実施例１］
本例では、好気性微生物から、ＣＥを単離し、その活性を確認した。
【０１６５】
（１）粗酵素液の調製
（１−１）フラボバクテリウム  ジョンソニアエ（Ｆ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ）の粗酵素液の調製
Ｆ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅは、独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託されている菌株（ＮＢＲＣ  １４９４２）を使用した。まず、下記表１の培地に、１．５ｗ／ｖ％となるようにアガー（和光純薬工業社製）を添加して、寒天培地を調製した。本菌株を、前記寒天培地で、３０℃、２日間培養し、シングルコロニーを得た。このシングルコロニーを、下記表１に示す培地５０ｍＬに接種し、３０℃、１日間振とう培養した。培養終了後、得られた培養液を、６８，６００ｍ／ｓ２（７，０００×ｇ）、４℃、１０分の条件で遠心分離し、菌体を回収した。前記菌体を、５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、ｍｉｃｒｏｓｏｍ（登録商標）  ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｒｕｐｔｏｒを用いて、破砕した。得られた菌体破砕液を、前述と同様の条件で遠心分離し、上清を回収した。前記上清を、粗酵素液（無細胞抽出液）とした。
【０１６６】
（表１）
成分                        濃度（ｗ／ｖ％）
ポリペプトン※１                     １
イーストエキストラクト※２           ０．２
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                 １
コンニャク抽出物※３                 ０．２
※１  日本製薬（株）製（以下、同様）
※２  ディフコ社製（以下、同様）
※３  清水化学（株）製  商品名「レオレックスワン」（以下、同様）
【０１６７】
（１−２）ロドサーマス  マリナス（Ｒ．ｍａｒｉｎｕｓ）の粗酵素液の調製
Ｒ．ｍａｒｉｎｕｓは、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターに分譲されているものを使用した。まず、下記表２の培地に、１．５ｗ／ｖ％となるようにアガー（和光純薬工業社製）を添加して、寒天培地を調製した。本菌株を、前記寒天培地で、７０℃、３日間培養し、シングルコロニーを得た。このシングルコロニーを、前記表２の培地５０ｍＬに摂取し、７０℃、１日間振とう培養した。培養終了後、得られた培養液を、前記（１−１）と同様に処理し、粗酵素液（無細胞抽出液）を調製した。
【０１６８】
（表２）
成分                        濃度（ｗ／ｖ％）
マリンブロス２２１６※４             ３．７
コンニャク抽出物※３                 ０．２
※４  商品名、ディフコ社製
【０１６９】
（２）エピラクトース生成能の評価
（２−１）反応生成物の検出
ＣＥ活性として、前記（１）で調製した粗酵素液について、エピラクトース生成能を評価した。まず、前記粗酵素液４０μＬに、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）５０μＬおよび水１０μＬを添加し、所定条件で反応させた。反応条件は、Ｆ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅの粗酵素液について、３０℃、１５分間として、Ｒ．ｍａｒｉｎｕｓの粗酵素液について、４０℃、２４時間とした。反応後、前記反応液を水で１０倍に希釈し、前記希釈液を、イオン交換樹脂（オルガノ社製：商品名アンバーライト（登録商標）ＭＢ４、以下、同様）を用いて脱塩し、さらに、フィルター（孔径０．４５μｍ、Φ１３ｍｍ、ミリポア社製、商品名「ＭＩＬＬＥＸ  ＨＰ」、以下、同様）でろ過した。そして、ろ液を、下記条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、前記ろ液中のエピラクトースを検出した。また、ブランクとして、前記粗酵素液に代えて、水を使用し、反応条件を、４０℃、２４時間とした以外は、前述と同様にして、ＨＰＬＣを行った。
（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）  Ｓｕｇａｒ  ＳＰ０８１０（昭和電工（株）製）
カラムサイズ：Φ８．０×３００ｍｍ
カラム温度：８０℃
サンプル注入量：９９μＬ
溶離液：水
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：示差屈折計
【０１７０】
図１に、ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。図１（ａ）は、ブランク、図１（ｂ）は、Ｆ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅの粗酵素液、図１（ｃ）は、Ｒ．ｍａｒｉｎｕｓの粗酵素液の結果を示す。図１に示すように、前記各粗酵素液を添加したものでは、ラクトースのピークの後に、ブランクでは検出されなかった反応生成物のピーク（図１（ｂ）および（ｃ）において、矢印で示すピーク）が検出された。前記図１（ｂ）および（ｃ）において、リテンションタイムがほぼ同等であったことから、前記両粗酵素液を用いた反応液において、同じ反応生成物が得られていると考えられる。
【０１７１】
（２−２）反応生成物の精製および分析
前記Ｒ．ｍａｒｉｎｕｓの粗酵素液による反応生成物を精製し、分析した。
【０１７２】
前記（１）で調製したＲ．ｍａｒｉｎｕｓの粗酵素液４００μＬに、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）５００μＬおよび水１００μＬを添加し、４０℃で４８時間反応させた。反応後、前記（２−１）と同様にして、前記反応液からろ液を回収し、同条件のＨＰＬＣにより、反応生成物を分取した。同じ操作を６回繰り返し、反応生成物約２ｍｇを得た。
【０１７３】
前記反応生成物を、前記（２−１）と同条件のＨＰＬＣに供した。図２（ａ）に、ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。また、図２（ｂ）に、エピラクトース標品（シグマアルドリッチ社製）のＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。図２（ａ）および（ｂ）に示すように、前記反応生成物と前記エピラクトース標品のピークは、完全に同じリテンションタイムであることから、前記反応生成物は、エピラクトースであることが推測された。
【０１７４】
さらに、前記反応生成物を酸加水分解して、単糖分析を行った。まず、０．４ｗ／ｖ％  反応生成物２５μＬおよび４ｍｏｌ／Ｌ  トリフルオロ酢酸２５μＬを混合し、１００℃で２時間反応させた。反応後の混合液を、減圧下に置き、トリフルオロ酢酸を除去して、乾固させた。この乾固物を、水２５μＬに溶解し、１μＬを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供した。ＴＬＣの展開溶媒は、１−ブタノール：２−プロパノール：水＝体積比２：２：１の混合溶媒を使用した。糖の検出は、１０％硫酸／メタノールをＴＬＣプレートに噴霧し、オーブントースターで加熱して行った。
【０１７５】
図３に、ＴＬＣの写真を示す。図３において、レーン１は、反応生成物の酸加水分解物、レーン２は、グルコース、レーン３は、ガラクトース、レーン４は、マンノース、レーン５は、フラクトースの結果を示す。図３に示すように、前記反応生成物の酸加水分解物は、ガラクトースとマンノースとからなることがわかった。このため、Ｒ．ｍａｒｉｎｕｓの粗酵素液により、ラクトース中のグルコシル基がマンノシル基に変換され、エピラクトースが生成されたと判断された。
【０１７６】
以上の結果から、Ｆ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅおよびＲ．ｍａｒｉｎｕｓが、ラクトースをエピメリ化し、エピラクトースを生成することが確認された。
【０１７７】
［実施例２］
本例では、Ｒ．ｍａｒｉｎｕｓ由来のセロビオース  ２−エピメラーゼ（以下、ＲｍＣＥという）を精製し、ＲｍＣＥの特性評価を行った。
【０１７８】
（基質）
ラクトース１水和物およびグルコースは、関東化学工業社製、セロビオース、ソホロース、ゲンチオビオース、セロテトラオース、セロペンタオースおよびマンノースは、シグマアルドリッチ社製、ラミナリビオース、マンノビオースおよびセロトリオースは、生化学工業社製、ガラクトースは、和光純薬工業社製、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルマンノサミンは、ナカライテスク社製のものを、それぞれ使用した。エピラクトースは、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ由来のセロビオース  ２−エピメラーゼにより生成し、精製したものを使用した。グルコシルマンノースおよびマンノシルグルコースは、Ｆ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ由来のセロビオース  ２−エピメラーゼにより生成し、精製したものを使用した。マルトースは、日本食品化工社製、フラクトースは、ナカライテスク社製のものを使用した。
【０１７９】
（活性測定）
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍＬに、酵素試料０．５ｍＬを添加して、３０℃で１０分間反応させた。この反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸０．２ｍＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。前記反応液に、さらに、水０．１５ｍＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール０．１５ｍＬを添加し、前記イオン交換樹脂を用いた脱塩、前記フィルターを用いたろ過を行った。そして、サンプル注入量を５０μＬとした以外は、前記実施例１の（２−１）と同条件のＨＰＬＣを行った。そして、ＨＰＬＣの結果から、標準曲線を用いて、生成したエピラクトース量を測定した。エピラクトースの標準曲線は、０〜０．２５ｗ／ｖ％エピラクトースを用いて作成した。酵素単位１Ｕは、前記条件下で、1分間に１μｍｏｌのエピラクトースを生成させる酵素量と定義した。以下の実施例においても、特に示さない限り、同様である。
【０１８０】
（タンパク質の定量）
粗酵素液のタンパク質定量は、ブラッドフォード法により行った。すなわち、適宜水で希釈した酵素試料０．１ｍＬに、５倍希釈ブラッドフォード試薬(バイオラッド社製)１ｍＬを添加し、このうちの０．２ｍＬを９６ウェルプレートに入れ、波長５９５ｎｍの吸光度（Ａ５９５）を測定した。また、カラムクロマトグラフィーにより得られた画分のタンパク質定量は、波長２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）を測定した。いずれの方法においても、タンパク質の標準曲線は、０〜０．１４ｍｇ／ｍＬ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（バイオラッド社製）を用いて作成した。以下の実施例においても、特に示さない限り、同様である。
【０１８１】
（タンパク質の純度）
タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  Ｐｏｌｙ−Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）により評価した。ポリアクリルアミドゲル（１２．５％）は、アトー社製の商品名「ｅ−ＰＡＧＥＬ」を使用した。タンパク質は、５μｇを供した。サイズマーカーは、インビトロジェン社製の商品名「Ｍａｒｋ１２  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ」を使用した。電気泳動は、２５ｍＡの定電流で行った。タンパク質の染色は、関東化学社製の商品名「ラピッド  ＣＢＢ  Ｋａｎｔｏ」を使用して、添付のプロトコルに従って行った。以下の実施例においても、特に示さない限り、同様である。
【０１８２】
（１）ＲｍＣＥの精製
まず、Ｒ．ｍａｒｉｎｕｓを、下記表３の培地（消泡剤未添加）５０ｍＬに接種し、７０℃、１５０ｒｐｍ、２４時間、回転振とう培養した。前記培養した本菌株を、下記表３の培地３Ｌに入れ、アジテーター速度６００ｒｐｍ、通気量０．５ＷＶＭ、７０℃の条件で、１６〜２０時間培養した。得られた培養液を、６８，６００ｍ／ｓ２（７，０００×ｇ）、４℃、１０分の条件で遠心分離し、菌体を回収した。前記菌体を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）２００ｍＬに懸濁し、前記実施例１の（１−１）と同様にして、超音波破砕により菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を、９８，０００ｍ／ｓ２（１０，０００×ｇ）、４℃、２０分の条件で遠心分離し、上清を回収した。前記上清に、９０ｗ／ｖ％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃に静置した。前記培養から塩沈までの操作を５回繰り返した。前記静置後の液体を、９８，０００ｍ／ｓ２（１０，０００×ｇ）、４℃、２０分の条件で遠心分離して、沈殿を回収した。前記沈殿物を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）２００ｍＬに溶解し、同じ緩衝液で透析した。これを、粗酵素液とした。前記粗酵素液は、タンパク質量が１１，８３９ｍｇであり、ＣＥ活性の総活性が約１８２Ｕであり、比活性が０．０１５３Ｕ／ｍｇであった。
【０１８３】
（表３）
成分                        濃度（ｗ／ｖ％）
マリンブロス２２１６※４             ３．７
コンニャク抽出物※３                 ０．２
消泡剤※５                           ０．０５
※５  信越化学（株）製、商品名ＫＭ７２Ｆ
【０１８４】
前記粗酵素液を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したイオン交換カラムに、以下の条件で供し、非吸着画分（部分精製酵素液１）を回収した。
（条件）
カラム：ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ（東ソー（株）製）
カラムサイズ：Φ５．０×４２ｃｍ
ゲル量：８２４ｍＬ
溶出液：１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
流速：２ｍＬ／ｍｉｎ
【０１８５】
前記部分精製酵素液１は、タンパク質量が４９０ｍｇ、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性の総活性が２８９Ｕ、比活性が０．５８９Ｕ／ｍｇであり、前記粗酵素液からの精製度は３９倍であった。
【０１８６】
前記部分精製酵素液１に、硫酸アンモニウムの濃度が０．５ｍｏｌ／Ｌとなるように添加した後、これを、０．５ｍｏｌ／Ｌ  硫酸アンモニウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した疎水性カラムに、以下の条件で供した。そして、硫酸アンモニウム濃度０．４ｍｏｌ／Ｌ付近で溶出された活性画分（部分精製酵素液２）を回収した。
（条件）
カラム：ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）  Ｂｕｔｙｌ（東ソー（株）製）
カラムサイズ：Φ２．６×３５ｃｍ
ゲル量：約１７５ｍＬ
溶出液：１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
硫酸アンモニウム濃度０．５ｍｏｌ／Ｌ〜０ｍｏｌ／Ｌのリニアグラジエント
溶出液量：６００ｍＬ
流速：２ｍＬ／ｍｉｎ
【０１８７】
前記部分精製酵素液２は、タンパク質量が８．３６ｍｇ、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性の総活性が２４Ｕ、比活性が４．１９Ｕ／ｍｇであり、前記粗酵素液からの精製度は１９０倍であった。
【０１８８】
前記部分精製酵素液２を、限外ろ過膜（分画分子量：１０，０００、ミリポア社製、商品名「ＵＬＴＲＡＣＥＬ−１０Ｋ」）を用いて、５ｍＬ程度に濃縮した後、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）で洗浄したゲルろ過カラムに、以下の条件で供した。そして、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性が認められた画分を回収した。
（条件）
カラム：Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）  Ｓ−２００（ＧＥヘルスケア社製）
カラムサイズ：Φ２．６×８７ｃｍ
ゲル量：４３５ｍＬ
溶出液：０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７） 
流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
【０１８９】
前記画分は、タンパク質量が１．０５ｍｇであり、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性の総活性が６．３６Ｕ、比活性が６．０５Ｕ／ｍｇであり、前記粗酵素液からの精製度は４００倍、前記粗酵素液からの回収率は、３．５％であった。この画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより供した。この結果を、図４の写真に示す。図４において、レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、前記画分の結果である。図４のレーン２に示すように、一本のバンドのみが検出されたことから、前記画分において、ＲｍＣＥは単一に精製されていることがわかった。得られた精製ＲｍＣＥについて、各種特性を確認した。下記表４に、ＲｍＣＥの精製の概要を示す。下記表４において、比活性は、タンパク質１ｍｇあたりのＣＥ活性（Ｕ／ｍｇ）を示し、回収率は、粗酵素液の総活性に対するＣＥ活性の残存率（％）を示し、精製度は、粗酵素液の比活性に対する倍率（倍）を示す（以下、同様）。
【０１９０】
【表４】
2012130332.tif 000002
【０１９１】
（２）ＲｍＣＥの特性
（２−１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量
前記図４のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、ＲｍＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は、４２．８ｋＤａであった。
【０１９２】
（２−２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性
至適ｐＨ
まず、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物１００μＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ブリトン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ６．０〜１２．０）２５μＬおよび水０．４ｍＬを混合し、３０℃で５分間インキュベートした。前記混合液に、１６０μｇ／ｍＬ  ＲｍＣＥ  ２５μＬを添加して、さらに３０℃で１０分間インキュベートして、酵素反応させた。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸５０μＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水７５μＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール３７．５μＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例１の（２−１）と同条件のＨＰＬＣにより、生成したエピラクトース量を測定した。そして、最も高いエピラクトース生成量を示したｐＨの活性を１００％として、各ｐＨの相対活性（％）を求めた。
【０１９３】
ｐＨ安定性
まず、１９０μｇ／ｍＬ  ＲｍＣＥ  ５μＬに、１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ブリトン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ３．０〜１２．０）２０μＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．０）１０μＬまたは０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１３．０）１０μＬを添加し、４℃で２４時間インキュベートした。前記混合液に、容量が１２５μＬとなるように水を添加し、さらに、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３）１２５μＬを添加し、４０℃で６０分間インキュベートして、酵素反応させた。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸５０μＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水４１２．５μＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール３７．５μＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例１の（２−１）と同条件のＨＰＬＣにより、生成したエピラクトース量を測定した。そして、最も高いエピラクトース量を示したｐＨの活性を１００％として、各ｐＨの残存活性（％）を求めた。
【０１９４】
図５のグラフに、ＲｍＣＥの至適ｐＨおよびｐＨ安定性の結果を示す。図５において、横軸はｐＨであり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、黒丸（●）は至適ｐＨの結果、白丸（○）はｐＨ安定性の結果を示す。図５に示すように、ＲｍＣＥは、ｐＨ６．３において最大活性を示し、ｐＨ３．４〜１１．８において、８０％以上の残存活性を示した。この結果から、ＲｍＣＥの至適ｐＨは６．３であり、ｐＨ安定領域は、ｐＨ３．４〜１１．８であることがわかった。
【０１９５】
（２−３）至適温度および熱安定性
至適温度
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３）０．１２５ｍＬを、４０℃〜１００℃で５分間インキュベートした。これに、３２．２μｇ／ｍＬ  ＲｍＣＥ  ０．１２５ｍＬを添加して、４０〜１００℃で３０分間インキュベートして、酵素反応させた。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸５０μＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水３７．５μＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール３７．５μＬを添加し、さらに、水で２倍希釈した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例１の（２−１）と同条件のＨＰＬＣにより、生成エピラクトース量を測定した。そして、最も高いエピラクトース生成量を示した温度の活性を１００％として、各温度の相対活性（％）を求めた。
【０１９６】
熱安定性
まず、３２．２μｇ／ｍＬ  ＲｍＣＥ  ０．１２５ｍＬを、４０〜１００℃で３０分間インキュベートし、速やかに氷冷した。氷冷後のＲｍＣＥを使用し、緩衝液をｐＨ６．３とした以外は、前記「活性測定」に示す方法により、生成したエピラクトース量を測定した。そして、最も高いエピラクトース量を示した温度の活性を１００％として、各温度の残存活性（％）を求めた。
【０１９７】
図６のグラフに、ＲｍＣＥの至適温度および熱安定性の結果を示す。図６において、横軸は、温度であり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、黒丸（●）は、至適温度の結果、白丸（○）は、熱安定性の結果を示す。図６に示すように、ＲｍＣＥは、８０〜９０℃において最大活性を示した。また、ＲｍＣＥは、８０℃以下で８０％以上の残存活性を示し、７０℃以下で９５％以上の残存活性を示し、さらに、１００℃においても活性を示した。この結果から、ＲｍＣＥの至適温度は９０℃であり、熱安定領域は、８０℃以下であることがわかった。
【０１９８】
（２−４）基質特異性
ＲｍＣＥについて、ラクトース１水和物、セロビオース、マンノビオース、エピラクトース、マンノース、グルコース、ガラクトース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチオビオース、セロトリオース、マルトース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルマンノサミンの基質に対する特異性を評価した。
【０１９９】
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  基質５μＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３）２．５μＬおよび１９０μｇ／ｍＬ  ＲｍＣＥ  ２．５μＬを混合し、４０℃で２４時間インキュベートした。この反応液のうち１μＬを、ＴＬＣに供した。ＴＬＣは、前記実施例１の（２−２）と同様にして行った。
【０２００】
Ｎ−アセチルグルコサミンについては、反応生成物をＨＰＬＣで検出することにより、基質特異性を確認した。まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−アセチルグルコサミン５０μＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３）２５μＬおよび１９０μｇ／ｍＬ  ＲｍＣＥ  ２５μＬを混合し、４０℃で２４時間インキュベートした。この反応液を、水で１０倍希釈し、前記実施例１の（２−１）と同条件のＨＰＬＣにより、反応生成物を確認した。また、ブランクとして、ＲｍＣＥに代えて水を使用し、同様にしてＨＰＬＣを行った。
【０２０１】
図７に、ＴＬＣの結果を示す。図７において、「Ｇｌｃ」はグルコース、「Ｇａｌ」はガラクトース、「Ｌａｃ」はラクトース１水和物、「Ｅｐｉ」はエピラクトース、「Ｃｅｌ」はセロビオース、「Ｃｅｌ３」はセロトリオース、「Ｍａｎ２」はマンノビオース、「Ｇｅｎ」はゲンチオビオース、「Ｍａｌ」はマルトース、「Ｌａｍ」はラミナリビオース、「Ｓｏｐ」はソホロース、「Ｍａｎ」はマンノース、「ＧｌｃＮＡｃ」はＮ−アセチルグルコサミン、「ＭａｎＮＡｃ」はＮ−アセチルマンノサミンを示す。各基質について、左側のレーンは基質の結果を示し、右側のレーンは反応生成物の結果を示す。図７に示すように、ＲｍＣＥは、セロビオース、ラクトース、エピラクトースおよびマンノビオース等のβ−１，４結合からなる二糖類およびセロトリオースに作用した。一方、ＲｍＣＥは、Ｎ−アセチルマンノサミンには作用しなかった。
【０２０２】
図８に、ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。図８（ａ）は、ブランクの結果、図８（ｂ）は、基質としてＮ−アセチルグルコサミンを用いた反応液の結果を示す。図８に示すように、同じ保持時間のみにピークが確認されたことから、ＲｍＣＥは、Ｎ−アセチルグルコサミンに作用しないことがわかった。
【０２０３】
（２−５）エピラクトース生成反応に対する温度の影響
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）５０μＬに、前記（１）で調製した粗酵素液（比活性：０．１８Ｕ／ｍｇ）４０μＬおよび水１０μＬを添加し、所定温度（４０℃、５０℃、６０℃および７０℃）で２４時間インキュベートした。この反応液を、水で１０倍に希釈した後、前記実施例１の（２−１）と同条件のＨＰＬＣにより、生成したエピラクトース量を測定した。そして、反応に供したラクトース量を１００％とし、エピラクトースに変換されたラクトース量の相対値を変換率（％）として求めた。
【０２０４】
図９のグラフに、ラクトースからエピラクトースへの変換率と反応温度との関係を示す。図９において、横軸は反応温度（℃）、縦軸はエピラクトースへの変換率（％）を示す。図９に示すように、反応温度５０℃および６０℃の場合に、エピラクトースへの変換率がそれぞれ２６．８％および２６．７％となった。高温（７０℃）での反応では、非酵素的異性化によるラクチュロースの生成が認められ、反応後のラクチュロース含量は７．２％であった。このことから、高温（７０℃）での反応におけるエピラクトース生成量の低下は、非酵素的異性化によることが明らかになった。
【０２０５】
（２−６）アミノ酸配列
定法に従い２５０ｐｍоｌの精製ＲｍＣＥについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ＰＶＤＦ膜（商品名ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＰＳＱ、ミリポア社製）への転写を行い、これを、Ｎ末端アミノ酸配列分析の試料とした。そして、プロテインシーケンサー（商品名Ｐｒｏｃｉｓｅ４９２ｃＬＣＮ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、前記精製ＲｍＣＥのＮ末端アミノ酸配列を解析した。その結果、Ｎ末端アミノ酸配列は、Ｅ−Ｔ−Ｉ−Ｐ−Ｄ−Ｖ−Ｒ−Ｒ−Ｌであることが明らかとなった。本配列は、配列番号１に示すＲｍＣＥ塩基配列の１０〜３６塩基に対応するアミノ酸配列と一致していた。したがって、ＣＥ活性を有する本タンパク質は、配列番号１に示す遺伝子の翻訳産物であることがわかった。
【０２０６】
（３）ＲｍＣＥ遺伝子のクローニング
Ｒ．ｍａｒｉｎｕｓ（ＪＣＭ９７８５）から、ＲｍＣＥ遺伝子をクローニングした。ＲｍＣＥ遺伝子の塩基配列は、配列番号１の塩基配列であった。前記塩基配列から、ＲｍＣＥは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、分子量の理論値は、４７．３ｋＤａであることがわかった。
【０２０７】
（４）参考例：非酵素反応によるラクチュロースの生成
ラクトースから効率的にエピラクトースを生成するには、副生成物ラクチュロースの生成を抑制することが重要である。そこで、非酵素反応におけるラクチュロースの生成を確認し、前記ＲｍＣＥが、至適ｐＨにおいて、ラクチュロース生成を抑制して、効率的にエピラクトースを生成可能であることを確認した。
【０２０８】
まず、２５０ｍｍоｌ／Ｌ  ラクトース１水和物水溶液０．４ｍＬに、０．１ｍоｌ／Ｌ  ブリトン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ５〜９）０．１ｍＬを添加し、６０℃または８０℃で２４時間静置した。前記反応液を、適宜希釈し、前記「活性測定」と同条件のＨＰＬＣを行い、ラクチュロース量を測定した。そして、ラクチュロースの生成率を、ラクトースとラクチュロースとの総量に対するラクチュロース量の割合（％）として求めた。ラクチュロース標品は、シグマアルドリッチ社製のものを使用した。
【０２０９】
下記表５に、ラクチュロースの生成率とｐＨおよび温度との関係を示す。下記表５に示すように、ｐＨ５．２〜８．９の範囲において、ｐＨおよび温度が高いほど、ラクチュロース生成量が多くなることが明らかとなった。特に、ｐＨ７．２以上、８０℃の条件において、ラクチュロース生成率が１０％を超えた。このことから、このような条件は、エピラクトース製造において不都合であることが明らかとなった。一方、ｐＨ６．１およびｐＨ５．２の条件では、ラクチュロースの生成率は、８０℃および６０℃において、それぞれ、３％未満および０％であった。ＲｍＣＥは、前述のように、至適ｐＨが６．３であることから、特に、副生成物ラクチュロースの産生を抑え、かつ、より効率的にエピラクトースを製造可能であることがわかった。
【０２１０】
【表５】
2012130332.tif 000003
【０２１１】
［実施例３］
本実施例では、Ｆ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅからＣＥ遺伝子（ＦｊＣＥ遺伝子）をクローニングし、組換酵素ＦｊＣＥの特性評価を行った。
【０２１２】
（１）ＦｊＣＥ遺伝子のクローニング
Ｆ．ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ（ＮＢＲＣ１４９４２）から、ＦｊＣＥ遺伝子をクローニングした。ＦｊＣＥ遺伝子の塩基配列は、配列番号１５の塩基配列であった。前記塩基配列から、ＦｊＣＥは、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、分子量の理論値は、４６．７ｋＤａであることがわかった。
【０２１３】
（２）ＦｊＣＥの精製
配列番号１５に示すＦｊＣＥ遺伝子をｐＥＴ２２ｂのＸｈｏＩ−ＮｄｅＩサイトに導入して、発現ベクターを構築した。前記発現ベクターを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬに導入して、形質転換体を調製した。前記形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢＡ培地２５ｍＬに植菌し、３７℃で一晩培養した。これを、ＬＢＡ培地５００ｍＬに入れ、波長６００ｎｍの吸光度（Ａ６００）が０．５になるまで、３７℃で培養した。培養液を氷冷した後、終濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、０．１ｍｏｌ／Ｌ  イソプロピルβ−チオガラクトピラノシド０．５ｍＬを添加して、１６℃で２４時間培養した。培養液を、６８，６００ｍ／ｓ２（７，０００×ｇ）、４℃、１０分の条件で遠心分離し、菌体を回収した。菌体を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）１５ｍＬに懸濁し、前記実施例１の（１−１）と同様にして、超音波破砕により菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を、９８，０００ｍ／ｓ２（１０，０００×ｇ）、４℃、５分の条件で遠心分離し、上清を回収した。これを、粗酵素液とした。前記粗酵素液は、タンパク質量が４２０ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が５７８０Ｕであった。
【０２１４】
前記粗酵素液を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したイオン交換カラムに、以下の条件で供した。
（条件）
カラム：ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）  ＤＥＡＥ（東ソー社製）
カラムサイズ：Φ１．６×１５ｃｍ
ゲル量：３０ｍＬ
溶出液：塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）
塩化ナトリウム濃度０ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌのリニアグラジエント
溶出液量：１００ｍＬ
流速：２ｍＬ／ｍｉｎ
【０２１５】
前記イオン交換カラムにより、塩化ナトリウム濃度０．１〜０．２ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌで溶出された吸着画分に、目的の活性が確認された。各画分の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、純度の高い画分を回収した。回収した画分は、タンパク質量が７１．８ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が１９００Ｕ、比活性が３２．８Ｕ／ｍｇであり、前記粗酵素液からの回収率は、３２．９％であった。この画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより供した。この結果を、図１０の写真に示す。図１０において、レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、前記画分の結果である。図１０のレーン２に示すように、一本のバンドのみが検出されたことから、前記画分において、ＦｊＣＥは単一に精製されていることがわかった。得られた精製ＦｊＣＥについて、各種特性を確認した。下記表６に、ＦｊＣＥの精製の概要を示す。
【０２１６】
【表６】
2012130332.tif 000004
【０２１７】
前記精製ＦｊＣＥを、５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した後、終濃度が３０ｖ／ｖ％となるようにグリセロールを添加し、−２０℃で保存した。
【０２１８】
（３）ＦｊＣＥの特性
（３−１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量
前記図１０のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、ＦｊＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は、４１．７ｋＤａであった。
【０２１９】
（３−２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性
至適ｐＨ
まず、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物０．４ｍＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ブリトン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ６．０〜１２．０）０．１ｍＬおよび水０．４ｍＬを混合し、３０℃で５分間インキュベートした。前記混合液に、７１．８μｇ／ｍＬ  ＦｊＣＥ  ０．１ｍＬを添加して、さらに３０℃で１０分間インキュベートして、酵素反応させた。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸０．２ｍＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水０．１５ｍＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール０．１５ｍＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例１の（２−１）と同条件のＨＰＬＣにより、生成したエピラクトース量を測定した。そして、最も高いエピラクトース生成量を示したｐＨの活性を１００％として、各ｐＨの相対活性（％）を求めた。
【０２２０】
ｐＨ安定性
まず、７．１８ｍｇ／ｍＬ  ＦｊＣＥ  １０μＬに、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ブリトン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ３．０〜１２．０）１０μＬおよび水８０μＬを添加し、４℃で２４時間インキュベートした。前記混合液に、５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）４００μＬ、および、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）５００μＬを添加し、３０℃で１０分間インキュベートした。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸２００μＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水１５０μＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール１５０μＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例１の（２−１）と同条件のＨＰＬＣにより、生成したエピラクトース量を測定した。そして、最も高いエピラクトース量を示したｐＨの活性を１００％として、各ｐＨの残存活性（％）を求めた。
【０２２１】
図１１のグラフに、ＦｊＣＥの至適ｐＨおよびｐＨ安定性の結果を示す。図１１において、横軸はｐＨであり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、白丸（○）は至適ｐＨ、黒丸（●）はｐＨ安定性の結果を示す。図１１に示すように、ＦｊＣＥは、ｐＨ８．４において最大活性を示し、ｐＨ４．７〜９．８において、８０％以上の残存活性を示し、ｐＨ４．７〜９．８において、９０％以上の残存活性を示した。この結果から、ＦｊＣＥの至適ｐＨは８．４であり、ｐＨ安定領域は、ｐＨ４．７〜９．８であることがわかった。なお、ＦｊＣＥ無添加では、エピラクトース生成が確認されなかったことから、エピラクトース生成は、ＦｊＣＥによることは明らかである。
【０２２２】
（３−３）至適温度および熱安定性
至適温度
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４）０．５ｍＬを、２５〜５５℃でインキュベートした。これに、１４．４μｇ／ｍＬ  ＦｊＣＥ  ０．５ｍＬを添加して、２５〜５５℃で１０分間インキュベートして、酵素反応させた。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸０．２ｍＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水０．１５ｍＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール０．１５ｍＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例１の（２−１）と同条件のＨＰＬＣにより、生成したエピラクトース量を測定した。そして、最も高いエピラクトース生成量を示した温度の活性を１００％として、各温度の相対活性（％）を求めた。
【０２２３】
熱安定性
まず、１４．４μｇ／ｍＬ  ＦｊＣＥ  ０．５ｍＬを、２５〜５５℃で１５分間インキュベートし、速やかに氷冷した。氷冷後のＦｊＣＥを使用し、緩衝液をｐＨ８．４とした以外は、前記実施例２の「活性測定」に示す方法により、生成したエピラクトース量を測定した。そして、最も高いエピラクトース量を示した温度の活性を１００％として、各温度の残存活性（％）を求めた。
【０２２４】
図１２のグラフに、ＦｊＣＥの至適温度および熱安定性の結果を示す。図１２において、横軸は、温度であり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、白丸（○）は至適温度、黒丸（●）は熱安定性の結果を示す。図１２に示すように、ＦｊＣＥは、３５℃において最大活性を示した。また、ＦｊＣＥは、４０℃以下で８０％以上の残存活性を示し、３０℃以下で９０％以上の残存活性を示した。この結果から、ＦｊＣＥの至適温度は３５℃であり、熱安定領域は、４０℃以下であることが明らかになった。
【０２２５】
（３−４）反応生成物の構造解析
ＦｊＣＥによるラクトースからの反応生成物について、核磁気共鳴（ＮＭＲ）および質量分析（ＭＳ）により構造解析を行った。まず、１０ｗ／ｖ％ラクトース１水和物を含む５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４）に、７．１８ｍｇ／ｍＬ  ＦｊＣＥ  ６８μＬ（ラクトース１ｇ当たり１０Ｕ）を添加し、３０℃で一晩インキュベートした。前記反応液を、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例１の（２−２）と同様にして、ＴＬＣに供した。具体的には、シリカゲルプレート（厚み２ｍｍ）に、前記反応液７５０μＬを供し、２０ｃｍ展開させた。展開後、前記シリカゲルプレートの両端を１．５ｃｍ程度ずつ切り取り、エタノールで１０ｖ／ｖ％に希釈した硫酸を噴霧し、加熱して糖を検出した。前記シリカゲルプレートから、反応生成物と同様の移動度の領域を掻き取り、水１００ｍＬに懸濁した。この懸濁液をろ紙でろ過し、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩し、さらに、前記フィルター（孔径：０．４５μｍ）でろ過した。このろ液を、１ｍＬ程度に濃縮し、前記濃縮液を、前記実施例１の（２−１）と同条件でＨＰＬＣに供し、反応生成物を精製した。このようにして、純度９７．６％の反応生成物１２．８ｍｇを得た。これを試料として、ＥＳＩ−ＭＳおよび１３Ｃ−ＮＭＲを用いて、構造解析を行った。
【０２２６】
図１３に、ＥＳＩ−ＭＳによる反応生成物の質量分析の結果を示す。図１３に示すように、前記反応生成物の分子量は、３４２であった。この結果から、反応生成物が、二糖類であることが確認された。
【０２２７】
下記表７に、前記反応生成物およびエピラクトースの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示す。下記表７に示すように、両者の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムは、ほぼ一致していることから、ＦｊＣＥによる反応生成物は、エピラクトースであることがわかった。
【０２２８】
【表７】
2012130332.tif 000005
【０２２９】
（３−５）基質特異性
ＦｊＣＥについて、前記実施例２の（２−４）で列挙した基質に対する特異性を評価した。
【０２３０】
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  基質５μＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４）２．５μＬおよび１．５Ｕ／ｍＬ  ＦｊＣＥ  ２．５μＬ（５０Ｕ／ｇ−ｄｓ）を混合し、室温で２４時間インキュベートした。この反応液のうち１μＬを、ＴＬＣに供した。ＴＬＣは、前記実施例１の（２−２）と同様にして行った。なお、上記酵素濃度における「ｄｓ」は、固形分を示す（以下、同様）。
【０２３１】
図１４に、ＴＬＣの結果を示す。図１４（ａ）は、ＦｊＣＥ添加の反応液の結果、図１４（ｂ）は、ＦｊＣＥ未添加のブランクの結果を示す。図１４（ａ）および（ｂ）において、基質の表記は、前記図７と同様である。図１４（ａ）において、矢印は、反応生成物を示している。図１４に示すように、ＦｊＣＥは、セロビオース、ラクトース、エピラクトース、およびマンノビオース等のβ−１，４結合からなる二糖類に作用した。
【０２３２】
（３−６）基質濃度の影響
１０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を基質として、各濃度における反応生成物の生成量を測定した。まず、前記ラクトース溶液１ｍＬに、１ｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４）１０μＬおよび７．１８ｍｇ／ｍＬ  ＦｊＣＥ  １０μＬを添加し、３０℃で４時間インキュベートした。前記反応液を、基質濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。これを、サンプル注入量を５０μＬとした以外は、前記実施例１の（２−１）と同条件でＨＰＬＣに供し、生成したエピラクトース量を測定した。そして、反応に供したラクトース量を１００％とし、エピラクトースに変換されたラクトース量の相対値を変換率（％）として求めた。
【０２３３】
図１５のグラフに、ラクトースからエピラクトースへの変換率とラクトース濃度との関係を示す。図１５において、横軸は、ラクトース濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）、縦軸は、エピラクトースへの変換率（％）を示す。図１５に示すように、ラクトース濃度１０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌの間において、エピラクトースへの変換率には、ほぼ変化は無く、２８％程度であった。
【０２３４】
（３−７）エピラクトース含有液糖の調製
ラクトース１水和物５００ｇを水２Ｌに懸濁し、さらに、１ｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．３）およびＦｊＣＥ  １０００Ｕを添加した。これを、２５℃で３日間インキュベートした。この結果、２５ｗ／ｖ％のエピラクトースが生成された。
【０２３５】
（３−８）エピラクトースの最大生成量
１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍＬに、７．１８ｍｇ／ｍＬ  ＦｊＣＥ  １０μＬを添加し、３０℃で４時間インキュベートし、酵素反応した。前記反応液のうち０．１ｍＬを、経時的にサンプリングし、煮沸して酵素を失活させた後、水で１０倍希釈した。これを、サンプル注入量を５０μＬとした以外は、前記実施例１の（２−１）と同条件でＨＰＬＣに供し、反応生成物の生成量を測定した。そして、反応に供したラクトース量を１００％とし、エピラクトースに変換されたラクトース量の相対値を変換率（％）として求めた。
【０２３６】
図１６のグラフに、ラクトースからエピラクトースへの変換率と反応時間との関係を示す。図１６において、横軸は、反応時間（時間）を示し、縦軸は、エピラクトースへの変換率（％）を示す。図１６に示すように、反応開始から２．５時間まで反応生成物の生成量が増加し、それ以降はほぼ変化が無かった。ＦｊＣＥによる変換率は、２９．６％程度であった。
【０２３７】
［実施例４］
本実施例では、サッカロファガス  デグラダンス（Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ）からＣＥ遺伝子（ＳｄＣＥ遺伝子）をクローニングし、組換酵素ＳｄＣＥの特性評価を行った。
【０２３８】
（１）ＳｄＣＥ遺伝子のクローニング
Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ（ＡＴＣＣ４３９６１）から、ＳｄＣＥ遺伝子をクローニングした。ＳｄＣＥ遺伝子の塩基配列は、配列番号３の塩基配列であった。前記塩基配列から、ＳｄＣＥは、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、分子量の理論値は、４７．２ｋＤａであることがわかった。
【０２３９】
（２）ＳｄＣＥの精製
配列番号３に示すＳｄＣＥ遺伝子を使用した以外は、前記実施例３の（２）と同様にして、形質転換体を調製した。前記形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢＡ培地２５ｍＬに植菌し、３７℃で一晩培養した。これを、ＬＢＡ培地３Ｌに入れ、波長６００ｎｍの吸光度（Ａ６００）が０．５になるまで、３７℃で培養した。培養液を氷冷した後、終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、０．１ｍｏｌ／Ｌ  イソプロピルβ−チオガラクトピラノシド３０ｍＬを添加して、１６℃で２４時間培養した。培養液を、６８，６００ｍ／ｓ２（７，０００×ｇ）、４℃、１０分の条件で遠心分離し、菌体を回収した。菌体を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）４０ｍＬに懸濁し、前記実施例１の（１−１）と同様にして、超音波破砕により菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を、９８，０００ｍ／ｓ２（１０，０００×ｇ）、４℃、５分の条件で遠心分離し、上清を回収した。これを、粗酵素液とした。前記粗酵素液は、タンパク質量が３４７ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が２２７０Ｕであった。
【０２４０】
前記粗酵素液を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したイオン交換カラムに、以下の条件で供した。
（条件）
カラム：ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ（東ソー社製）
カラムサイズ：Φ１．６×１５ｃｍ
ゲル量：３０ｍＬ
溶出液：塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）
塩化ナトリウム濃度０ｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｏｌ／Ｌのリニアグラジエント
溶出液量：８０ｍＬ
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
分画液量：非吸着画分１５ｍＬ、吸着画分１ｍＬ
【０２４１】
前記イオン交換カラムにより、塩化ナトリウム濃度０．１〜０．２ｍｏｌ／Ｌで溶出された吸着画分に、目的の活性が確認された。各画分の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、純度の高い画分を回収した。回収した画分は、タンパク質量が７７．３ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が８７８Ｕ、比活性が１１．４Ｕ／ｍｇであり、前記粗酵素液からの回収率は、３８．８％であった。
【０２４２】
回収した画分を、５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。これを、同緩衝液で平衡化した吸着カラムに、以下の条件で供した。
（条件）
カラム：Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ａｐａｔｉｔｅ  Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＴ  Ｇｅｌ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）
カラムサイズ：Φ１．６×７ｃｍ
ゲル量：１４ｍＬ
溶出液：リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
リン酸ナトリウム濃度５ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌのリニアグラジエント
溶出液量：８０ｍＬ
流速：２ｍＬ／ｍｉｎ
分画液量：５ｍＬ
【０２４３】
前記吸着カラムにより、リン酸ナトリウム濃度５ｍｍｏｌ／Ｌの非吸着画分に、目的の活性が確認された。各画分５μＬについて、純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、単一バンドとなった画分を回収した。回収した画分は、タンパク質量が３０．７ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が８４４Ｕ、比活性が２７．５Ｕ／ｍｇであり、前記粗酵素液からの回収率は、３７．２％であった。この画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。この結果を、図１７の写真に示す。図１７において、レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、前記画分の結果である。図１７のレーン２に示すように、一本のバンドのみが検出されたことから、前記画分において、ＳｄＣＥは単一に精製されていることがわかった。前記精製ＳｄＣＥは、限外ろ過膜（分画分子量１０，０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、商品名「Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ」、以下、同様）を用いて濃縮した後、終濃度が３０ｖ／ｖ％となるようにグリセロールを添加し、−２０℃で保存した。前記精製ＳｄＣＥについて、各種特性を確認した。下記表８に、ＳｄＣＥの精製の概要を示す。
【０２４４】
【表８】
2012130332.tif 000006
【０２４５】
（３）ＳｄＣＥの特性
（３−１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量
前記図１７のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、ＳｄＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は、４５．０ｋＤａであった。
【０２４６】
（３−２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性
至適ｐＨ
まず、前記実施例３の（３−２）と同様にして混合液を調製し、３０℃で５分間インキュベートした。前記混合液に、１００μｇ／ｍＬ  ＳｄＣＥ  ０．１ｍＬを添加し、さらに３０℃で１０分間インキュベートして酵素反応させた。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸０．２ｍＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水０．１５ｍＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール０．１５ｍＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−２）と同様にして、各ｐＨの相対活性（％）を求めた。
【０２４７】
ｐＨ安定性
まず、４．８ｍｇ／ｍＬ  ＳｄＣＥ  １２．５μＬに、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ブリトン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ３．０〜１２．０）１０μＬおよび水７７．５μＬを添加し、４℃で２４時間インキュベートした。前記混合液に、５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）４００μＬ、および、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）５００μＬを添加し、３０℃で１０分間インキュベートした。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸２００ｍＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水１５０μＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール１５０μＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−２）と同様にして、各ｐＨの残存活性（％）を求めた。
【０２４８】
図１８のグラフに、ＳｄＣＥの至適ｐＨおよびｐＨ安定性の結果を示す。図１８において、横軸はｐＨであり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、黒丸（●）は至適ｐＨ、白丸（○）はｐＨ安定性の結果を示す。図１８に示すように、ＳｄＣＥは、ｐＨ７．７において最大活性を示し、ｐＨ３．９〜１０．８において、８０％以上の残存活性を示した。この結果から、ＳｄＣＥの至適ｐＨは７．７であり、ｐＨ安定領域は、ｐＨ３．９〜１０．８であることがわかった。なお、ＳｄＣＥ無添加では、エピラクトース生成が確認されなかったことから、エピラクトース生成は、ＳｄＣＥによることは明らかである。
【０２４９】
（３−３）至適温度および熱安定性
至適温度
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）０．５ｍＬを、２５〜５５℃でインキュベートした。これに、２０μｇ／ｍＬ  ＳｄＣＥ  ０．５ｍＬを添加し、３０℃で１０分間インキュベートして酵素反応させた。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸０．２ｍＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水０．１５ｍＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール０．１５ｍＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−３）と同様にして、各温度の相対活性（％）を求めた。
【０２５０】
熱安定性
まず、２０μｇ／ｍＬ  ＳｄＣＥ  ０．５ｍＬを、４０〜１００℃で３０分間インキュベートし、速やかに氷冷した。氷冷後のＳｄＣＥを使用し、緩衝液をｐＨ７．７とした以外は、前記実施例２の「活性測定」に示す方法により、生成したエピラクトース量を測定した。そして、最も高いエピラクトース量を示した温度の活性を１００％として、各温度の残存活性（％）を求めた。
【０２５１】
図１９のグラフに、ＳｄＣＥの至適温度および熱安定性の結果を示す。図１９において、横軸は、温度であり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、黒丸（●）は至適温度、白丸（○）は熱安定性の結果を示す。図１９に示すように、ＳｄＣＥは、３５℃において最大活性を示した。また、ＳｄＣＥは、３５℃以下で８０％以上の残存活性を示した。この結果から、ＳｄＣＥの至適温度は３５℃であり、熱安定領域は、３５℃以下であることが明らかになった。
【０２５２】
（３−４）基質特異性
ＳｄＣＥについて、前記実施例２の（２−４）で列挙した基質に対する特異性を評価した。
【０２５３】
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  基質５μＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）２．５μＬおよび１．５Ｕ／ｍＬ  ＳｄＣＥ  ２．５μＬ（５０Ｕ／ｇ−ｄｓ）を混合し、室温で２４時間インキュベートした。この反応液のうち１μＬを、ＴＬＣに供した。ＴＬＣは、前記実施例１の（２−２）と同様にして行った。
【０２５４】
Ｎ−アセチルグルコサミンについては、反応生成物をＨＰＬＣで検出することにより、基質特異性を確認した。まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−アセチルグルコサミン０．５ｍＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）０．２５ｍＬおよび１．５Ｕ／ｍＬ  ＳｄＣＥ  ０．２５ｍＬを混合し、室温で２４時間インキュベートした。この反応液を、前記実施例１の（２−１）と同条件のＨＰＬＣにより、反応生成物を確認した。また、ブランクとして、ＳｄＣＥに代えて水を使用し、同様にしてＨＰＬＣを行った。
【０２５５】
図２０に、ＴＬＣの結果を示す。図２０において、基質の表記は、前記図７と同様である。各基質について、左側のレーンは基質の結果を示し、右側のレーンは反応生成物の結果を示す。図２０に示すように、ＳｄＣＥは、ラクトース、エピラクトース、セロビオースおよびマンノビオース等のβ−１，４結合からなる二糖類に作用した。これらの反応生成物は、それぞれ、エピラクトース、ラクトース、グルコシルマンノース（図示せず）およびマンノシルグルコース（図示せず）と同一のＲｆ値を示した。また、ＳｄＣＥは、セロトリオースにも作用した。
【０２５６】
図２１に、ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。図２１（ａ）は、ブランクの結果、図２１（ｂ）は、基質としてＮ−アセチルグルコサミンを用いた反応液の結果を示す。図２１に示すように、同じ保持時間のみにピークが確認されたことから、ＳｄＣＥは、Ｎ−アセチルグルコサミンに作用しないことがわかった。
【０２５７】
（３−５）反応生成物の分析
基質として、ラクトース、エピラクトース、セロビオースおよびマンノビオースを使用し、ＳｄＣＥによる反応生成物を分析した。
【０２５８】
まず、１００ｍｍｏｌ／Ｌの前記基質を含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）１００μＬに、４．８ｍｇ／ｍＬ  ＳｄＣＥ  １０μＬを添加し、３０℃で２４時間インキュベートした。この反応液を煮沸してＳｄＣＥを失活させた後、水で５倍に希釈した。これを、前記実施例１の（２−１）と同条件でＨＰＬＣに供した。溶出液を２０秒毎に分取し、分取した各画分を、同じ条件でＨＰＬＣに供した。そして、反応生成物が単一成分として検出された画分、減圧下で乾固させた。この乾固物を、純水５０μＬに溶解し、さらに、４ｍｏｌ／Ｌ  トリフルオロ酢酸溶液４５０μＬを添加して、１００℃で２時間インキュベートした。これにより、前記反応生成物のグリコシド結合を切断した。この反応液を、再度、減圧下で乾固させた後、純水５０μＬに溶解した。得られた溶液のうち２μＬを、ＴＬＣに供した。ＴＬＣの展開溶媒は、前記実施例１の（２−２）と同じ混合溶媒を使用した。糖の検出は、アニスアルデヒド溶液（エタノール６８ｍＬ、硫酸２．５ｍＬ、酢酸１．２ｍＬおよびアニスアルデヒド１．９ｍＬ）をＴＬＣプレートに噴霧し、オーブントースターで加熱して行った。
【０２５９】
図２２に、単糖の分析結果を示す。図２２において、「Ｌａｃ」はラクトースの反応生成物、「Ｅｐｉ」は、エピラクトースの反応生成物、「Ｃｅｌ」はセロビオースの反応生成物、「Ｍａｎ２」はマンノビオースの反応生成物の結果を示す。「Ｇｌｃ」はグルコース、「Ｇｌａ」はガラクトース、「Ｆｒｃ」はフラクトース、「Ｍａｎ」はマンノースを示す。図２２に示すように、ラクトースからの反応生成物は、その構成糖が、ガラクトースおよびマンノースであった。エピラクトースからの反応生成物は、その構成糖が、ガラクトースおよびグルコースであった。セロビオースからの反応生成物は、その構成糖が、グルコースおよびマンノースであった。マンノビオースからの反応生成物は、その構成糖が、グルコースおよびマンノースであった。このように、各反応生成物は、基質であるエピラクトース、ラクトース、グルコシルマンノースおよびマンノシルグルコースと同様の単糖組成であった。
【０２６０】
また、ラクトースおよびエピラクトースからの反応生成物は、それぞれ、エピラクトースおよびラクトースと同一のＲｆ値であった。このことから、ＳｄＣＥによる反応は、還元末端糖であるグルコースまたはマンノースの２位のＯＨ基をエピメリ化することが明らかとなった。一方、セロビオースおよびマンノビオースからの反応生成物は、その単糖の組成が、いずれもグルコースおよびマンノースであった。ＳｄＣＥは、前述のように、還元末端糖に作用することが明らかであるため、これら二糖類の反応生成物は、グルコシルマンノースおよびマンノシルグルコースであると判断した。すなわち、ＳｄＣＥは、還元末端糖であるグルコシル残基またはマンノシル残基の２位のＯＨ基をエピメリ化する酵素であることが明らかとなった。
【０２６１】
（３−６）基質濃度の影響
１０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物およびセロビオースを基質として、各濃度における反応生成物の生成量を測定した。まず、前記基質溶液１ｍＬに、１ｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）１０μＬおよび４．８ｍｇ／ｍＬ  ＳｄＣＥ  １００μＬを添加し、３０℃で２４時間インキュベートした。前記反応液を、基質濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。そして、前記実施例３の（３−６）と同様にして、基質から反応生成物への変換率を求めた。
【０２６２】
図２３のグラフに、基質から反応生成物への変換率と基質濃度との関係を示す。図２３において、横軸は、基質濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）、縦軸は、反応生成物への変換率（％）を示す。図２３に示すように、基質濃度１０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌの間において、反応生成物への変換率には、ほぼ変化は無く、３０％程度であった。
【０２６３】
［実施例５］
本実施例では、ヘルペトシフォン  アウランチアクス（Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）からＣＥ遺伝子（ＨａＣＥ遺伝子）をクローニングし、組換酵素ＨａＣＥの特性評価を行った。
【０２６４】
（１）ＨａＣＥ遺伝子のクローニング
Ｈ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（ＡＴＣＣ２３７７９）から、ＨａＣＥ遺伝子をクローニングした。ＨａＣＥ遺伝子の塩基配列は、配列番号７の塩基配列であった。前記塩基配列から、ＨａＣＥは、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、分子量の理論値は、４７．５ｋＤａであることがわかった。
【０２６５】
（２）ＨａＣＥの精製
配列番号７に示すＨａＣＥ遺伝子を使用した以外は、前記実施例３の（２）と同様にして、形質転換体を調製した。前記形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢＡ培地２５ｍＬに植菌し、３７℃で一晩培養した。これを、ＬＢＡ培地２Ｌに入れ、波長６００ｎｍの吸光度（Ａ６００）が０．５になるまで、３７℃で培養した。培養液を氷冷した後、終濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、０．１ｍｏｌ／Ｌ  イソプロピルβ−チオガラクトピラノシド２ｍＬを添加して、１６℃で２４時間培養した。培養液を、６８，６００ｍ／ｓ２（７，０００×ｇ）、４℃、１０分の条件で遠心分離し、菌体を回収した。菌体を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）３５ｍＬに懸濁し、前記実施例１の（１−１）と同様にして、超音波破砕により菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を、９８，０００ｍ／ｓ２（１０，０００×ｇ）、４℃、５分の条件で遠心分離し、上清を回収した。これを，粗酵素液とした。前記粗酵素液は、タンパク質量が１０８５ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が２２３５１Ｕであった。
【０２６６】
前記粗酵素液を、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したイオン交換カラムに、以下の条件で供した。
（条件）
カラム：ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ（東ソー社製）
カラムサイズ：Φ１．６×１５ｃｍ
ゲル量：３０ｍＬ
溶出液：塩化ナトリウムを含む２５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）
塩化ナトリウム濃度０ｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｏｌ／Ｌのリニアグラジエント
溶出液量：１００ｍＬ
流速：２ｍＬ／ｍｉｎ
分画液量：非吸着画分１５ｍＬ、吸着画分３ｍＬ
【０２６７】
前記イオン交換カラムにより、塩化ナトリウム濃度０．１〜０．２ｍｏｌ／Ｌで溶出された吸着画分に、目的の活性が確認された。各画分の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、純度の高い画分を回収した。回収した画分は、タンパク質量が２６１ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が８４３０Ｕ、比活性が３２．３Ｕ／ｍｇであり、前記粗酵素液からの回収率は、３７．７％であった。
【０２６８】
回収した画分を、５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。これを、前記実施例４の（２）と同条件で、吸着カラムに供した。
【０２６９】
前記吸着カラムにより、リン酸ナトリウム緩衝液濃度５ｍｍｏｌ／Ｌの非吸着画分に、目的の活性が確認された。各画分５μＬについて、純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、目的サイズの単一バンドとなった画分を回収した。回収した画分は、タンパク質量が１４０ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が６４９０Ｕ、比活性が４６．４Ｕ／ｍｇであり、前記粗酵素液からの回収率は、２９．０％であった。この画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。この結果を、図２４の写真に示す。図２４において、レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、前記画分の結果である。図２４のレーン２に示すように、一本のバンドのみが検出されたことから、前記画分において、ＨａＣＥは単一に精製されていることがわかった。前記精製ＨａＣＥは、前記実施例４の（２）と同様にして濃縮した後、終濃度が３０ｖ／ｖ％となるようにグリセロールを添加し、−２０℃で保存した。前記精製ＨａＣＥについて、各種特性を確認した。下記表９に、ＨａＣＥの精製の概要を示す。
【０２７０】
【表９】
2012130332.tif 000007
【０２７１】
（３）ＨａＣＥの特性
（３−１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量
前記図２４のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、ＨａＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は、３９．８ｋＤａであった。
【０２７２】
（３−２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性
至適ｐＨ
まず、前記実施例３の（３−２）と同様にして混合液を調製し、３０℃で５分間インキュベートした。前記混合液に、４００μｇ／ｍＬ  ＨａＣＥ  ０．１ｍＬを添加し、さらに３０℃で１０分間インキュベートして酵素反応させた。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸０．２ｍＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水０．１５ｍＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール０．１５ｍＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−２）と同様にして、各ｐＨの相対活性（％）を求めた。
【０２７３】
ｐＨ安定性
まず、０．８ｍｇ／ｍＬ  ＨａＣＥ  ４５μＬに、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ブリトン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ３．０〜１２．０）１０μＬおよび水４５μＬを添加し、４℃で２４時間インキュベートした。前記混合液に、５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）４００μＬ、および、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）５００μＬを添加し、３０℃で１０分間インキュベートした。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸２００μＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水１５０μＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール１５０μＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−２）と同様にして、各ｐＨの残存活性（％）を求めた。
【０２７４】
図２５のグラフに、ＨａＣＥの至適ｐＨおよびｐＨ安定性の結果を示す。図２５において、横軸はｐＨであり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、黒丸（●）は至適ｐＨ、白丸（○）はｐＨ安定性の結果を示す。図２５に示すように、ＨａＣＥは、ｐＨ７．３において最大活性を示し、ｐＨ７．３〜１１．８において、８０％以上の残存活性を示し、ｐＨ３．５〜６．３において、５０〜６０％の残存活性を示した。この結果から、ＨａＣＥの至適ｐＨは７．３であり、ｐＨ安定領域は、ｐＨ７．３〜１１．８であることがわかった。なお、ＨａＣＥ無添加では、エピラクトース生成が確認されなかったことから、エピラクトース生成は、ＨａＣＥによることは明らかである。
【０２７５】
（３−３）至適温度および熱安定性
至適温度
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）０．５ｍＬを、２５〜５５℃でインキュベートした。これに、８０μｇ／ｍＬ  ＨａＣＥ  ０．５ｍＬを添加し、２５〜５５℃で１０分間インキュベートして酵素反応させた。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸０．２ｍＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水０．１５ｍＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール０．１５ｍＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−３）と同様にして、各温度の相対活性（％）を求めた。
【０２７６】
熱安定性
まず、８０μｇ／ｍＬ  ＨａＣＥ  ０．５ｍＬを、２５〜５５℃で１５分間インキュベートし、速やかに氷冷した。氷冷後のＨａＣＥを使用し、緩衝液をｐＨ７．３とした以外は、前記実施例２の「活性測定」に示す方法により、生成したエピラクトース量を測定した。そして、最も高いエピラクトース量を示した温度の活性を１００％として、各温度の残存活性（％）を求めた。
【０２７７】
図２６のグラフに、ＨａＣＥの至適温度および熱安定性の結果を示す。図２６において、横軸は、温度であり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、黒丸（●）は至適温度、白丸（○）は熱安定性の結果を示す。図２６に示すように、ＨａＣＥは、４５℃において最大活性を示した。また、ＨａＣＥは、５０℃以下で８０％以上の残存活性を示した。この結果から、ＨａＣＥの至適温度は４５℃であり、熱安定領域は、５０℃以下であることが明らかになった。
【０２７８】
（３−４）基質特異性
ＨａＣＥについて、前記実施例２の（２−４）で列挙した基質、セロテトラオースおよびセロペンタオースに対する特異性を評価した。
【０２７９】
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  基質５μＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）２．５μＬおよび１．５Ｕ／ｍＬ  ＨａＣＥ  ２．５μＬ（５０Ｕ／ｇ−ｄｓ）を混合し、室温で２４時間インキュベートした。この反応液のうち１μＬを、ＴＬＣに供した。ＴＬＣは、前記実施例１の（２−２）と同様にして行った。
【０２８０】
Ｎ−アセチルグルコサミンについては、反応生成物をＨＰＬＣで検出することにより、基質特異性を確認した。本実施例では、緩衝液として、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）、酵素として、１．５Ｕ／ｍＬ  ＨａＣＥ  ０．２５ｍＬを用いた以外は、前記実施例４の（３−４）と同様にして、反応生成物を確認した。また、ブランクとして、ＨａＣＥに代えて水を使用し、同様にしてＨＰＬＣを行った。
【０２８１】
図２７に、ＴＬＣの結果を示す。図２７において、「Ｃｅｌ４」は、セロテトラオース、「Ｃｅｌ５」は、セロペンタオースを示し、これら以外の基質の表記は、前記図７と同様である。各基質について、左側のレーンは基質の結果を示し、右側のレーンは反応生成物の結果を示す。図２７に示すように、ＨａＣＥは、セロビオース、ラクトース、エピラクトースおよびマンノビオース等のβ−１，４結合からなる二糖類およびセロトリオースに作用した。一方、ＨａＣＥは、セロテトラオース、セロペンタオースおよびＮ−アセチルマンノサミンには作用しなかった。
【０２８２】
図２８に、ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。図２８（ａ）は、ブランクの結果、図２８（ｂ）は、基質としてＮ−アセチルグルコサミンを用いた反応液の結果を示す。図２８に示すように、同じ保持時間のみにピークが確認されたことから、ＨａＣＥは、Ｎ−アセチルグルコサミンに作用しないことがわかった。
【０２８３】
（３−５）反応生成物の分析
基質としてラクトース、セロビオース、マンノビオースおよびエピラクトースを使用し、ＨａＣＥによる反応生成物を分析した。
【０２８４】
緩衝液として、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）を使用し、酵素として、８０μｇ／ｍＬ  ＨａＣＥを使用した以外は、前記実施例４の（３−５）と同様にして、反応生成物を分析した。
【０２８５】
図２９の写真に、単糖の分析結果を示す。図２９において、基質の表記は、前記図２２と同様である。図２９に示すように、ラクトースからの反応生成物は、その構成糖が、ガラクトースおよびマンノースであった。エピラクトースからの反応生成物は、その構成糖が、ガラクトースおよびグルコースであった。セロビオースからの反応生成物は、その構成糖が、グルコースおよびマンノースであった。マンノビオースからの反応生成物は、その構成糖が、グルコースおよびマンノースであった。このように、各反応生成物は、基質であるエピラクトース、ラクトース、グルコシルマンノースおよびマンノシルグルコースと同様の単糖組成であった。
【０２８６】
また、ラクトースおよびエピラクトースの反応生成物は、それぞれ、エピラクトースおよびラクトースと同一のＲｆ値であった。このことから、ＨａＣＥによる反応は、還元末端糖であるグルコースまたはマンノースの２位のＯＨ基をエピメリ化することが明らかとなった。一方、セロビオースおよびマンノビオースからの反応生成物は、その単糖の組成が、いずれもグルコースおよびマンノースであった。ＨａＣＥは、前述のように、還元末端糖に作用することが明らかであるため、これら二糖類の反応生成物は、グルコシルマンノースおよびマンノシルグルコースであると判断した。すなわち、ＨａＣＥは、還元末端糖であるグルコシル残基またはマンノシル残基の２位のＯＨ基をエピメリ化する酵素であることが明らかとなった。
【０２８７】
（３−６）基質濃度の影響
１０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物およびセロビオースを基質として、各濃度における反応生成物の生成量を測定した。まず、前記基質溶液１ｍＬに、１ｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）１０μＬおよび０．８ｍｇ／ｍＬ  ＨａＣＥ  １００μＬを添加し、３０℃で２４時間インキュベートした。前記反応液を、基質濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。この希釈液を使用した以外は、前記実施例３の（３−６）と同様にして、基質から反応生成物への変換率を求めた。
【０２８８】
図３０のグラフに、基質から反応生成物への変換率と基質濃度との関係を示す。図３０において、横軸は、基質濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）、縦軸は、反応生成物への変換率（％）を示し、黒丸（●）はラクトースの結果、白丸（○）はセロビオースの結果を示す。図３０に示すように、ラクトースおよびセロビオースの両基質において、基質濃度１０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌの間において、反応生成物への変換率には、ほぼ変化は無く、３０％程度であった。
【０２８９】
［実施例６］
本実施例では、ディアドバクター  ファーメンタンス（Ｄ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）からＣＥ遺伝子（ＤｆＣＥ遺伝子）をクローニングし、組換酵素ＤｆＣＥの特性評価を行った。
【０２９０】
（１）ＤｆＣＥ遺伝子のクローニング
Ｄ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＡＴＣＣ７００８２７）から、ＤｆＣＥ遺伝子をクローニングした。ＤｆＣＥ遺伝子の塩基配列は、配列番号１１の塩基配列であった。前記塩基配列から、ＤｆＣＥは、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、分子量の理論値は、４５．３ｋＤａであることがわかった。
【０２９１】
（２）ＤｆＣＥの精製
配列番号１１に示すＤｆＣＥ遺伝子を使用した以外は、前記実施例３の（２）と同様にして、形質転換体を調製した。前記形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢＡ培地２５ｍＬに植菌し、３７℃で一晩培養した。これを、ＬＢＡ培地１．５Ｌに入れ、波長６００ｎｍの吸光度（Ａ６００）が０．５になるまで、３７℃で培養した。培養液を氷冷した後、終濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、０．１ｍｏｌ／Ｌ  イソプロピルβ−チオガラクトピラノシド１．５ｍＬを添加して、１６℃で２４時間培養した。培養液を、６８，６００ｍ／ｓ２（７，０００×ｇ）、４℃、１０分の条件で遠心分離し、菌体を回収した。菌体を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）３５ｍＬに懸濁し、前記実施例１の（１−１）と同様にして、超音波破砕により菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を、９８，０００ｍ／ｓ２（１０，０００×ｇ）、４℃、５分の条件で遠心分離し、上清を回収した。これを粗酵素液とした。前記粗酵素液は、タンパク質量が４８６ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が６６３７Ｕであった。
【０２９２】
前記粗酵素液を、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したイオン交換カラムに、前記実施例５の（２）と同条件で供した。
【０２９３】
前記イオン交換カラムにより、非吸着画分に目的の活性が確認された。各画分の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、純度の高い画分を回収した。回収した画分は、タンパク質量が４８１ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が１０３７７Ｕ、比活性２１．６Ｕ／ｍｇであり、前記粗酵素液からの回収率は、１５６％であった。
【０２９４】
回収した画分を、５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。これを、カラムサイズΦ１．６×１０ｃｍ、ゲル量２０ｍＬ、溶出液量６０ｍＬとした以外は、前記実施例４の（２）と同条件で、吸着カラムに供した。
【０２９５】
前記吸着カラムにより、リン酸ナトリウム緩衝液濃度５０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌで溶出された吸着画分に、目的の活性が確認された。各画分１μＬまたは５μＬについて、純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、目的サイズの単一バンドとなった画分を回収した。回収した画分は、タンパク質量が２５２ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が６６２４Ｕ、比活性が２６．２Ｕ／ｍｇであり、前記粗酵素液からの回収率は、１００％であった。回収した画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。この結果を、図３１の写真に示す。図３１において、レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、前記画分の結果である。図３１のレーン２に示すように、一本のバンドのみが検出されたことから、前記画分において、ＤｆＣＥは単一に精製されていることがわかった。前記精製ＤｆＣＥは、終濃度が３０ｖ／ｖ％となるようにグリセロールを添加し、−２０℃で保存した。前記精製ＤｆＣＥについて、各種特性を確認した。下記表１０に、ＤｆＣＥの精製の概要を示す。
【０２９６】
【表１０】
2012130332.tif 000008
【０２９７】
（３）ＤｆＣＥの特性
（３−１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量
前記図３１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、ＤｆＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は、４１．７ｋＤａであった。
【０２９８】
（３−２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性
至適ｐＨ
まず、前記実施例３の（３−２）と同様にして混合液を調製し、３０℃で５分間インキュベートした。前記混合液に、５００μｇ／ｍＬ  ＤｆＣＥ  ０．１ｍＬを添加し、さらに３０℃で１０分間インキュベートして酵素反応させた。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸０．２ｍＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水０．１５ｍＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール０．１５ｍＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−２）と同様にして、各ｐＨの相対活性（％）を求めた。
【０２９９】
ｐＨ安定性
まず、１０ｍｇ／ｍＬ  ＤｆＣＥ  ５μＬに、水８５μＬおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ  ブリトン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ３．０〜１２．０）１０μＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．０）または０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１３．０）１０μＬを添加し、４℃で２４時間インキュベートした。前記混合液に、５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）４００μＬ、および、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）５００μＬを添加し、３０℃で１０分間インキュベートした。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸２００μＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水１５０μＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール１５０μＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−２）と同様にして、各ｐＨの残存活性（％）を求めた。
【０３００】
図３２のグラフに、ＤｆＣＥの至適ｐＨおよびｐＨ安定性の結果を示す。図３２において、横軸はｐＨであり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、黒丸（●）は至適ｐＨ、白丸（○）はｐＨ安定性の結果を示す。図３２に示すように、ＤｆＣＥは、ｐＨ７．７において最大活性を示し、ｐＨ２．２〜１０．２において、８０％以上の残存活性を示した。この結果から、ＤｆＣＥの至適ｐＨは７．７であり、ｐＨ安定領域は、ｐＨ２．２〜１０．２であることがわかった。なお、ＤｆＣＥ無添加では、エピラクトース生成が確認されなかったことから、エピラクトース生成は、ＤｆＣＥによることは明らかである。
【０３０１】
（３−３）至適温度および熱安定性
至適温度
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）０．５ｍＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）０．４ｍＬとの混合液を、２５〜５５℃でインキュベートした。前記混合液に、５００μｇ／ｍＬ  ＤｆＣＥ  ０．１ｍＬを添加し、２５〜５５℃で１０分間インキュベートして酵素反応させた。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸０．２ｍＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水０．１５ｍＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール０．１５ｍＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−３）と同様にして、各温度の相対活性（％）を求めた。
【０３０２】
熱安定性
まず、５００μｇ／ｍＬ  ＤｆＣＥ  ０．１ｍＬを、２５〜５５℃で１５分間インキュベートし、速やかに氷冷した。氷冷後のＤｆＣＥを使用し、緩衝液をｐＨ７．７とした以外は、前記実施例２の「活性測定」に示す方法により、生成したエピラクトース量を測定した。そして、最も高いエピラクトース量を示した温度の活性を１００％として、各温度の残存活性（％）を求めた。
【０３０３】
図３３のグラフに、ＤｆＣＥの至適温度および熱安定性の結果を示す。図３３において、横軸は、温度であり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、黒丸（●）は至適温度、白丸（○）は熱安定性の結果を示す。図３３に示すように、ＤｆＣＥは、５０℃において最大活性を示した。また、ＤｆＣＥは、５０℃以下で８０％以上の残存活性を示した。この結果から、ＤｆＣＥの至適温度は５０℃であり、熱安定領域は、５０℃以下であることが明らかになった。
【０３０４】
（３−４）基質特異性
ＤｆＣＥについて、前記実施例２の（２−４）で列挙した基質に対する特異性を評価した。
【０３０５】
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  基質５μＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）２．５μＬおよび１．５Ｕ／ｍＬ  ＤｆＣＥ  ２．５μＬ（５０Ｕ／ｇ−ｄｓ）を混合し、室温で２４時間インキュベートした。この反応液のうち１μＬを、ＴＬＣに供した。ＴＬＣは、前記実施例１の（２−２）と同様にして行った。
【０３０６】
Ｎ−アセチルグルコサミンについては、反応生成物をＨＰＬＣで検出することにより、基質特異性を確認した。本実施例では、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）および１．５Ｕ／ｍＬ  ＤｆＣＥを用いた以外は、前記実施例４の（３−４）と同様にして、反応生成物を確認した。また、ブランクとして、ＤｆＣＥに代えて水を使用し、同様にしてＨＰＬＣを行った。
【０３０７】
図３４に、ＴＬＣの結果を示す。図３４において、基質の表記は、前記図７と同様である。各基質について、左側のレーンは基質の結果を示し、右側のレーンは反応生成物の結果を示す。図３４に示すように、ＤｆＣＥは、セロビオース、ラクトース、エピラクトースおよびマンノビオース等のβ−１，４結合からなる二糖類に作用した。
【０３０８】
図３５に、ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。図３５（ａ）は、ブランクの結果、図３５（ｂ）は、基質としてＮ−アセチルグルコサミンを用いた反応液の結果を示す。図３５に示すように、同じ保持時間のみにピークが確認されたことから、ＤｆＣＥは、Ｎ−アセチルグルコサミンに作用しないことがわかった。
【０３０９】
（３−５）基質濃度の影響
１０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物およびセロビオースを基質として、各濃度における反応生成物の生成量を測定した。まず、前記基質溶液０．５ｍＬに、１ｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）５μＬおよび５ｍｇ／ｍＬ  ＤｆＣＥ  ５０μＬを添加し、３０℃で２４時間インキュベートした。前記反応液を、基質濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。この希釈液を使用した以外は、前記実施例３の（３−６）と同様にして、基質から反応生成物への変換率を求めた。
【０３１０】
図３６のグラフに、基質から反応生成物への変換率と基質濃度との関係を示す。図３６において、横軸は、基質濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）、縦軸は、反応生成物への変換率（％）を示し、白丸（○）はラクトースの結果、白三角（△）はセロビオースの結果を示す。図３６に示すように、ラクトースおよびセロビオースの両基質において、基質濃度１０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌの間において、反応生成物への変換率には、ほぼ変化は無く、３０％程度であった。
【０３１１】
（３−６）高基質濃度におけるエピラクトース生成反応
ラクトース１水和物を、ラクトース無水物に換算して以下の所定濃度となるように、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に添加した。前記所定濃度は、２９、３４、４０または４６ｗ／ｗ％（溶媒１００ｇに対してそれぞれラクトース無水物４０．６ｇ、５２．０ｇ、６６．９ｇまたは８６．５ｇ）とした。前記ラクトースを含む前記緩衝液を、沸騰水中で完全に溶解した。前記溶液を、５０〜６０℃で３０分間インキュベートし、１３０Ｕ／ｍＬ  ＤｆＣＥを５Ｕ／ｇ−ｄｓとなるよう添加し、５０〜６０℃で１００時間インキュベートした。前記反応液を水でブリックス５に希釈し、前記希釈液のうち１０μＬを、前記実施例２の「活性測定」と同様の条件でＨＰＬＣを行い、前記実施例２の（２−５）と同様の方法で、エピラクトース変換率を算出した。
【０３１２】
図４８のグラフに、ラクトースからエピラクトースへの変換率とラクトース濃度との関係を示す。図４８において、横軸は、ラクトース濃度（ｗ／ｗ％）、縦軸は、エピラクトースへの変換率（％）を示し、白丸（○）は５０℃の結果、白三角（△）は５５℃の結果、白四角（□）は６０℃の結果を示す。図４８に示すように、ラクトース濃度２９〜４０ｗ／ｗ％の間において、エピラクトースへの変換率には、ほぼ変化はなく、約３０％であった。また、ラクトース濃度４６（ｗ／ｗ％）、６０℃の結果も同様であった。また、これらの変換率は、上記（３−５）のラクトース濃度３００ｍｍｏｌ／Ｌにおけるエピラクトース変換率と同等であった。このように、ＤｆＣＥは、耐熱性であることから、例えば、高濃度基質の場合にも、より効率よくエピメリ化できることがわかった。
【０３１３】
なお、実施例２のＲｍＣＥについても、同様の条件で「高基質濃度におけるエピラクトース生成反応」を確認したところ、ＤｆＣＥと同じ結果を示した。
【０３１４】
（３−７）牛乳に含まれるラクトースの変換
糖基質以外にタンパク質または脂質等を含有する飲食品である牛乳について、ＤｆＣＥによる、エピラクトースの生成量を測定した。
【０３１５】
まず、牛乳（ｐＨ６．７、商品名「おいしい牛乳」、明治乳業社製）１０ｍＬに、１３０Ｕ／ｍＬ  ＤｆＣＥ  ６．５Ｕを添加し、５０℃で３時間インキュベートした。前記反応液を、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩し、さらに、前記フィルター（孔径：０．４５μｍ）でろ過した。そして、ろ液のうち１０μＬを、前記実施例２の「活性測定」と同様の条件でＨＰＬＣに供し、前記実施例２の（２−５）と同様の方法で、エピラクトース変換率を算出した。ブランクは、ＤｆＣＥ無添加とした。なお、反応前の前記牛乳には、エピラクトースは含まれていないことを確認済みである。
【０３１６】
ブランクおよびＤｆＣＥの反応液におけるエピラクトースへの変換率は、それぞれ、０％および２９．９％であった。この結果から、牛乳のような、ラクトース以外のタンパク質および脂質を含む溶液においても、本実施例のＣＥは機能し、例えば、本実施例のように、３時間といった短時間の反応においても、エピラクトースを有効に生成可能であることがわかった。
【０３１７】
［実施例７］
本実施例では、テレディニバクター  ツルネラエ（Ｔ．ｔｕｒｎｅｒａｅ）からＣＥ遺伝子（ＴｔＣＥ遺伝子）をクローニングし、組換酵素ＴｔＣＥの特性評価を行った。
【０３１８】
（１）ＴｔＣＥ遺伝子のクローニング
Ｔ．ｔｕｒｎｅｒａｅ（ＡＴＣＣ３９８６７）から、ＴｔＣＥ遺伝子をクローニングした。ＴｔＣＥ遺伝子の塩基配列は、配列番号９の塩基配列であった。前記塩基配列から、ＴｔＣＥは、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、分子量の理論値は、４８．１ｋＤａであることがわかった。
【０３１９】
（２）ＴｔＣＥの精製
配列番号９に示すＴｔＣＥ遺伝子をｐＥＴ２２ｂのＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩサイトに導入して、発現ベクターを構築した以外は、前記実施例３の（２）と同様にして、形質転換体を調製した。前記形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢＡ培地２５ｍＬに植菌し、３７℃で一晩培養した。これを、ＬＢＡ培地２Ｌに入れ、波長６００ｎｍの吸光度（Ａ６００）が０．５になるまで、３７℃で培養した。培養液を氷冷した後、終濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、０．１ｍｏｌ／Ｌ  イソプロピルβ−チオガラクトピラノシド２ｍＬを添加して、１６℃で２４時間培養した。培養液を、６８，６００ｍ／ｓ２（７，０００×ｇ）、４℃、１０分の条件で遠心分離し、菌体を回収した。菌体を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）３５ｍＬに懸濁し、前記実施例１の（１−１）と同様にして、超音波破砕により菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を、９８，０００ｍ／ｓ２（１０，０００×ｇ）、４℃、５分の条件で遠心分離し、上清を回収した。これを、粗酵素液とした。前記粗酵素液は、タンパク質量が４００ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が３２４８Ｕであった。
【０３２０】
前記粗酵素液を、前記実施例５の（２）と同じ条件で、イオン交換カラムに供した。前記イオン交換カラムにより、塩化ナトリウム濃度約０．１ｍｏｌ／Ｌで溶出された吸着画分に、目的の活性が確認された。各画分の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、純度の高い画分を回収した。回収した画分は、タンパク質量が１１７ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が１４１５Ｕ、比活性が１２．１Ｕ／ｍｇであり、前記粗酵素液からの回収率は、４３．６％であった。
【０３２１】
回収した画分を、５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。これを、前記実施例４の（２）と同条件で、吸着カラムに供した。
【０３２２】
前記吸着カラムにより、リン酸ナトリウム緩衝液濃度５ｍｍｏｌ／Ｌの非吸着画分に、目的の活性が確認された。各画分５μＬについて、純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、目的サイズの単一バンドとなった画分を回収した。回収した画分は、タンパク質量が７２．２ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が５８４Ｕ、比活性が８．１Ｕ／ｍｇであり、前記粗酵素液からの回収率は、１８．０％であった。この画分を、前記限外ろ過膜を用いて、１．６ｍｇ／ｍＬ程度に濃縮した後、タンパク質量１μｇを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。この結果を、図３７の写真に示す。図３７において、レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、前記画分の結果である。図３７のレーン２に示すように、一本のバンドのみが検出されたことから、前記画分において、ＴｔＣＥは単一に精製されていることがわかった。前記精製ＴｔＣＥは、終濃度が３０ｖ／ｖ％となるようにグリセロールを添加し、−２０℃で保存した。前記精製ＴｔＣＥについて、各種特性を確認した。下記表１１に、ＴｔＣＥの精製の概要を示す。
【０３２３】
【表１１】
2012130332.tif 000009
【０３２４】
（３）ＴｔＣＥの特性
（３−１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量
前記図３７のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、ＴｔＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は、４３．９ｋＤａであった。
【０３２５】
（３−２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性
至適ｐＨ
まず、前記実施例３の（３−２）と同様にして混合液を調製し、３０℃で５分間インキュベートした。前記混合液に、９００μｇ／ｍＬ  ＴｔＣＥ  ０．１ｍＬを添加し、さらに３０℃で１０分間インキュベートして酵素反応させた。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸０．２ｍＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水０．１５ｍＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール０．１５ｍＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−２）と同様にして、各ｐＨの相対活性（％）を求めた。
【０３２６】
ｐＨ安定性
まず、０．４５ｍｇ／ｍＬ  ＴｔＣＥ  ９０μＬに、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ブリトン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ３．０〜１２．０）１０μＬまたは０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．０）１０μＬを添加し、４℃で２４時間インキュベートした。前記混合液に、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ブリトン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ８．８）４００μＬ、および、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ブリトン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ８．８）５００μＬを添加し、３０℃で１０分間インキュベートした。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸２００μＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水１５０μＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール１５０μＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−２）と同様にして、各ｐＨの残存活性（％）を求めた。
【０３２７】
図３８のグラフに、ＴｔＣＥの至適ｐＨおよびｐＨ安定性の結果を示す。図３８において、横軸はｐＨであり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、黒丸（●）は至適ｐＨ、白丸（○）はｐＨ安定性の結果を示す。図３８に示すように、ＴｔＣＥは、ｐＨ８．８において最大活性を示し、ｐＨ３．４〜１０．２において、８０％以上の残存活性を示した。この結果から、ＴｔＣＥの至適ｐＨは８．８であり、ｐＨ安定領域は、ｐＨ３．４〜１０．２であることがわかった。なお、ＴｔＣＥ無添加では、エピラクトース生成が確認されなかったことから、エピラクトース生成は、ＴｔＣＥによることは明らかである。
【０３２８】
（３−３）至適温度および熱安定性
至適温度
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８）０．５ｍＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ブリトン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ８．８）０．４ｍＬとの混合液を、２５〜５５℃でインキュベートした。前記混合液に、９００μｇ／ｍＬ  ＴｔＣＥ  ０．１ｍＬを添加し、２５〜５５℃で１０分間インキュベートして、酵素反応させた。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸０．２ｍＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水０．１５ｍＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール０．１５ｍＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−３）と同様にして、各温度の相対活性（％）を求めた。
【０３２９】
熱安定性
まず、９００μｇ／ｍＬ  ＴｔＣＥ  ０．１ｍＬを、２５〜５５℃で１５分間インキュベートし、速やかに氷冷した。氷冷後のＴｔＣＥを使用し、緩衝液をｐＨ８．８とした以外は、前記実施例２の「活性測定」に示す方法により、生成したエピラクトース量を測定した。そして、最も高いエピラクトース量を示した温度の活性を１００％として、各温度の残存活性（％）を求めた。
【０３３０】
図３９のグラフに、ＴｔＣＥの至適温度および熱安定性の結果を示す。図３９において、横軸は、温度であり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、黒丸（●）は至適温度、白丸（○）は熱安定性の結果を示す。図３９に示すように、ＴｔＣＥは、３５℃において最大活性を示した。また、ＴｔＣＥは、４５℃以下で８０％以上の残存活性を示した。この結果から、ＴｔＣＥの至適温度は３５℃であり、熱安定領域は、４５℃以下であることが明らかになった。
【０３３１】
（３−４）基質特異性
ＴｔＣＥについて、前記実施例２の（２−４）で列挙した基質、およびセロテトラオースに対する特異性を評価した。
【０３３２】
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  基質５μＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８）２．５μＬおよび１．５Ｕ／ｍＬ  ＴｔＣＥ  ２．５μＬ（５０Ｕ／ｇ−ｄｓ）を混合し、室温で２４時間インキュベートした。この反応液のうち１μＬを、ＴＬＣに供した。ＴＬＣは、前記実施例１の（２−２）と同様にして行った。
【０３３３】
Ｎ−アセチルグルコサミンについては、反応生成物をＨＰＬＣで検出することにより、基質特異性を確認した。本実施例では、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８）および１．５Ｕ／ｍＬ  ＴｔＣＥを用いた以外は、前記実施例４の（３−４）と同様にして、反応生成物を確認した。また、ブランクとして、ＴｔＣＥに代えて水を使用し、同様にしてＨＰＬＣを行った。
【０３３４】
図４０に、ＴＬＣの結果を示す。図４０において、基質の表記は、前記図７および前記図２７と同様である。各基質について、左側のレーンは基質の結果を示し、右側のレーンは反応生成物の結果を示す。図４０に示すように、ＴｔＣＥは、セロビオース、ラクトース、エピラクトースおよびマンノビオース等のβ−１，４結合からなる二糖類に作用した。一方、セロテトラオースには作用しなかった。
【０３３５】
図４１に、ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。図４１（ａ）は、ブランクの結果、図４１（ｂ）は、基質としてＮ−アセチルグルコサミンを用いた反応液の結果を示す。図４１に示すように、同じ保持時間のみにピークが確認されたことから、ＴｔＣＥは、Ｎ−アセチルグルコサミンに作用しないことがわかった。
【０３３６】
（３−５）反応生成物の分析
基質としてラクトース、セロビオース、マンノビオースおよびエピラクトースを使用し、ＴｔＣＥによる反応生成物を分析した。
【０３３７】
緩衝液として、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８）を使用し、酵素として、９００μｇ／ｍＬ  ＴｔＣＥを使用した以外は、前記実施例４の（３−５）と同様にして、反応生成物を分析した。
【０３３８】
図４２の写真に、単糖の分析結果を示す。図４２において、基質の表記は、前記図２２と同様である。図４２に示すように、ラクトースからの反応生成物は、その構成糖が、ガラクトースおよびマンノースであった。エピラクトースからの反応生成物は、その構成糖が、ガラクトースおよびグルコースであった。セロビオースからの反応生成物は、その構成糖が、グルコースおよびマンノースであった。マンノビオースからの反応生成物は、その構成糖が、グルコースおよびマンノースであった。このように、各反応生成物は、基質であるエピラクトース、ラクトース、グルコシルマンノースおよびマンノシルグルコースと同様の単糖組成であった。
【０３３９】
また、ラクトースおよびエピラクトースの反応生成物は、それぞれ、エピラクトースおよびラクトースと同一のＲｆ値であった。このことから、ＴｔＣＥによる反応は、還元末端糖であるグルコースまたはマンノースの２位のＯＨ基をエピメリ化することが明らかとなった。一方、セロビオースおよびマンノビオースからの反応生成物は、その単糖の組成が、いずれもグルコースおよびマンノースであった。ＴｔＣＥは、前述のように、還元末端糖に作用することが明らかであるため、これら二糖類の反応生成物は、グルコシルマンノースおよびマンノシルグルコースであると判断した。すなわち、ＴｔＣＥは、還元末端糖のグルコシル残基またはマンノシル残基の２位のＯＨ基をエピメリ化する酵素であることが明らかとなった。
【０３４０】
（３−６）基質濃度の影響
１０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物およびセロビオースを基質として、各濃度における反応生成物の生成量を測定した。
【０３４１】
まず、前記所定濃度の基質溶液１ｍＬに、１ｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８）１０μＬおよび０．９ｍｇ／ｍＬ  ＴｔＣＥ  １００μＬを添加し、３０℃で２４時間インキュベートした。前記反応液を、基質濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。この希釈液を使用した以外は、前記実施例３の（３−６）と同様にして、基質から反応生成物への変換率を求めた。
【０３４２】
図４３のグラフに、基質から反応生成物への変換率と基質濃度との関係を示す。図４３において、横軸は、基質濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）、縦軸は、反応生成物への変換率（％）を示し、白丸（○）はラクトースの結果、白三角（△）はセロビオースの結果を示す。図４３に示すように、ラクトースおよびセロビオースの両基質において、基質濃度１０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌの間において、反応生成物への変換率には、ほぼ変化は無く、３０％程度であった。
【０３４３】
［実施例８］
本実施例では、ペドバクター  ヘパリナス（Ｐ．ｈｅｐａｒｉｎｕｓ）からＣＥ遺伝子（ＰｈＣＥ遺伝子）をクローニングし、組換酵素ＰｈＣＥの特性評価を行った。
【０３４４】
（１）ＰｈＣＥ遺伝子のクローニング
Ｐ．ｈｅｐａｒｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１２０１７）から、ＰｈＣＥ遺伝子をクローニングした。ＰｈＣＥ遺伝子の塩基配列は、配列番号１７の塩基配列であった。前記塩基配列から、ＰｈＣＥは、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、分子量の理論値は、４４．５ｋＤａであることがわかった。
【０３４５】
（２）ＰｈＣＥの精製
配列番号１７に示すＰｈＣＥ遺伝子を使用した以外は、前記実施例３の（２）と同様にして、形質転換体を調製した。前記形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢＡ培地３０ｍＬに植菌し、３７℃で一晩培養した。これを、ＬＢＡ培地２１００ｍＬ（７００ｍＬ×３）に入れ、波長６００ｎｍの吸光度（Ａ６００）が０．５になるまで、３７℃で培養した。培養液を氷冷した後、終濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、０．１ｍｏｌ／Ｌ  イソプロピルβ−チオガラクトピラノシド２．１ｍＬ（０．７ｍＬ×３）を添加して、１２℃で４８時間培養した。培養液を、６８，６００ｍ／ｓ２（７，０００×ｇ）、４℃、１０分の条件で遠心分離し、菌体を回収した。菌体を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）３５ｍＬに懸濁し、前記実施例１の（１−１）と同様にして、超音波破砕により菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を、９８，０００ｍ／ｓ２（１０，０００×ｇ）、４℃、１０分の条件で遠心分離し、上清を回収した。これを粗酵素液とした。前記粗酵素液は、タンパク質量が２５２ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が１９５０Ｕであった。
【０３４６】
前記粗酵素液を、リン酸ナトリウム緩衝液の濃度を１０ｍｍｏｌ／Ｌとし、溶出液量を１２０ｍＬとし、吸着画分の分画液量を４ｍＬとした以外は、前記実施例５の（２）と同条件で、イオン交換カラムに供した。
【０３４７】
前記イオン交換カラムにより、塩化ナトリウム濃度０．１〜０．２ｍｏｌ／Ｌで溶出された吸着画分に、目的の活性が確認された。各画分の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、純度の高い画分を回収した。回収した画分は、タンパク質量が１８９ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が８６１Ｕ、比活性が４．６Ｕ／ｍｇであり、前記粗酵素液からの回収率は、４４．２％であった。
【０３４８】
回収した画分を、５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で透析した。これを、同緩衝液で平衡化した吸着カラムに、以下の条件で供した。
（条件）
カラム：Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ａｐａｔｉｔｅ  Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＴ  Ｇｅｌ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）
カラムサイズ：Φ１．６×１５ｃｍ
ゲル量：３０ｍＬ
溶出液：リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）
リン酸ナトリウム濃度５ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌのリニアグラジエント
溶出液量：１２０ｍＬ
流速：２ｍＬ／ｍｉｎ
分画液量：非吸着画分１５ｍＬ、吸着画分４ｍＬ
【０３４９】
前記吸着カラムにより、非吸着画分およびリン酸ナトリウム濃度１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌで溶出された吸着画分に、目的の活性が確認された。前記両画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、純度を確認し、目的サイズの単一バンドであった前記非吸着画分を回収した。回収した画分は、タンパク質量が３０．７ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が３３１Ｕ、比活性が１０．８Ｕ／ｍｇであり、前記粗酵素液からの回収率は、１７．０％であった。回収した画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。この結果を、図４４の写真に示す。図４４において、レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、前記画分の結果である。図４４のレーン２に示すように、一本のバンドのみが検出されたことから、前記画分において、ＰｈＣＥは単一に精製されていることがわかった。得られた精製ＰｈＣＥについて、各種特性を確認した。下記表１２に、ＰｈＣＥの精製の概要を示す。
【０３５０】
【表１２】
2012130332.tif 000010
【０３５１】
（３）ＰｈＣＥの特性
（３−１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量
前記図４４のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、ＰｈＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は、４０．７ｋＤａであった。
【０３５２】
（３−２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性
至適ｐＨ
まず、前記実施例３の（３−２）と同様にして混合液を調製し、３０℃で５分間インキュベートした。前記混合液に、２２１μｇ／ｍＬ  ＰｈＣＥ  ０．１ｍＬを添加し、さらに３０℃で１０分間インキュベートして酵素反応させた。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸０．２ｍＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水０．１５ｍＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール０．１５ｍＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−２）と同様にして、各ｐＨの相対活性（％）を求めた。
【０３５３】
ｐＨ安定性
まず、１．７７ｍｇ／ｍＬ  ＰｈＣＥ  １０μＬに、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ブリトン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ３．０〜１２．０）１０μＬおよび水８０μＬを添加し、４℃で２４時間インキュベートした。前記混合液に、５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３）４００μＬ、および、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３）５００μＬを添加し、３０℃で１０分間インキュベートした。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸２００μＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水１５０μＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール１５０μＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−２）と同様にして、各ｐＨの残存活性（％）を求めた。
【０３５４】
図４５のグラフに、ＰｈＣＥの至適ｐＨおよびｐＨ安定性の結果を示す。図４５において、横軸はｐＨであり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、黒丸（●）は至適ｐＨ、白丸（○）はｐＨ安定性の結果を示す。図４５に示すように、ＰｈＣＥは、ｐＨ６．３において最大活性を示し、ｐＨ５．３〜１１．８において、８０％以上の残存活性を示した。この結果から、ＰｈＣＥの至適ｐＨは６．３であり、ｐＨ安定領域は、ｐＨ５．３〜１１．８であることがわかった。なお、ＰｈＣＥ無添加では、エピラクトース生成が確認されなかったことから、エピラクトース生成は、ＰｈＣＥによることは明らかである。
【０３５５】
（３−３）至適温度および熱安定性
至適温度
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４）０．５ｍＬを、２５〜５５℃でインキュベートした。これに、４４．３μｇ／ｍＬ  ＰｈＣＥ  ０．５ｍＬを添加し、２５〜５５℃で１０分間インキュベートして酵素反応させた。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸０．２ｍＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水０．１５ｍＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール０．１５ｍＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−３）と同様にして、各温度の相対活性（％）を求めた。
【０３５６】
熱安定性
まず、４４．３μｇ／ｍＬ  ＰｈＣＥ  ０．５ｍＬを、２５〜５５℃で１５分間インキュベートし、速やかに氷冷した。氷冷後のＰｈＣＥを使用し、緩衝液のｐＨを６．３とした以外は、前記実施例２の「活性測定」に示す方法により、生成したエピラクトース量を測定した。そして、最も高いエピラクトース量を示した温度の活性を１００％として、各温度の残存活性（％）を求めた。
【０３５７】
図４６のグラフに、ＰｈＣＥの至適温度および熱安定性の結果を示す。図４６において、横軸は、温度であり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、黒丸（●）は至適温度、白丸（○）は熱安定性の結果を示す。図４６に示すように、ＰｈＣＥは、３５℃において最大活性を示した。また、ＰｈＣＥは、３５℃以下で８０％以上の残存活性を示した。この結果から、ＰｈＣＥの至適温度は３５℃であり、熱安定領域は、３５℃以下であることが明らかになった。
【０３５８】
（３−４）基質特異性
ＰｈＣＥについて、前記実施例２の（２−４）で列挙した基質（Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルマンノサミンを除く）に対する特異性を評価した。
【０３５９】
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  基質５μＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３）２．５μＬおよび１．５Ｕ／ｍＬ  ＰｈＣＥ  ２．５μＬ（５０Ｕ／ｇ−ｄｓ）を混合し、室温で２４時間インキュベートした。この反応液のうち１μＬを、ＴＬＣに供した。ＴＬＣは、前記実施例１の（２−２）と同様にして行った。
【０３６０】
図４７に、ＴＬＣの結果を示す。図４７において、基質の表記は、前記図７と同様である。各基質について、左側のレーンは基質の結果を示し、右側のレーンは反応生成物の結果を示す。図４７に示すように、ＰｈＣＥは、セロビオース、ラクトース、エピラクトースおよびマンノビオース等のβ−１，４結合からなる二糖類に作用した。一方、セロトリオースには作用しなかった。
【０３６１】
［実施例９］
本実施例では、スピロソマ  リングアレ（Ｓ．ｌｉｎｇｕａｌｅ）からＣＥ遺伝子（ＳｌＣＥ遺伝子）をクローニングし、組換酵素ＳｌＣＥの特性評価を行った。
【０３６２】
（１）ＳｌＣＥ遺伝子のクローニング
Ｓ．ｌｉｎｇｕａｌｅ（ＡＴＣＣ３３９０５）から、ＳｌＣＥ遺伝子をクローニングした。ＳｌＣＥ遺伝子の塩基配列は、配列番号５の塩基配列であった。前記塩基配列から、ＳｌＣＥは、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、分子量の理論値は、４６．６ｋＤａであることがわかった。
【０３６３】
（２）ＳｌＣＥの精製
配列番号５に示すＳｄＣＥ遺伝子を使用した以外は、前記実施例３の（２）と同様にして、形質転換体を調製した。前記形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢＡ培地５ｍＬに植菌し、３７℃で一晩培養した。これを、ＬＢＡ培地０．６Ｌに入れ、波長６００ｎｍの吸光度（Ａ６００）が０．５になるまで、３７℃で培養した。培養液を氷冷した後、終濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、０．１ｍｏｌ／Ｌ  イソプロピルβ−チオガラクトピラノシド０．６ｍＬを添加して、１６℃で２４時間培養した。培養液を、６８，６００ｍ／ｓ２（７，０００×ｇ）、４℃、１０分の条件で遠心分離し、菌体を回収した。菌体を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）３０ｍＬに懸濁し、前記実施例１の（１−１）と同様にして、超音波破砕により菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を、９８，０００ｍ／ｓ２（１０，０００×ｇ）、４℃、５分の条件で遠心分離し、上清を回収した。これを、粗酵素液とした。前記粗酵素液は、タンパク質量が８８．９ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が１９７３Ｕであった。
【０３６４】
前記粗酵素液を、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したイオン交換カラムに、前記実施例５の（２）と同条件で供した。
【０３６５】
前記イオン交換カラムにより、塩化ナトリウム濃度０ｍｏｌ／Ｌの非吸着画分に、目的の活性が確認された。各画分の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、純度の高い画分を回収した。回収した画分は、タンパク質量が３７．２ｍｇ、ＣＥ活性の総活性が１７０２Ｕ、比活性が４５．７Ｕ／ｍｇであり、前記粗酵素液からの回収率は、８６．３％であった。
【０３６６】
回収した画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。この結果を、図４９の写真に示す。図４９において、レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、前記画分の結果である。図４９のレーン２に示すように、一本のバンドのみが検出されたことから、前記画分において、ＳｌＣＥは単一に精製されていることがわかった。終濃度が３０ｖ／ｖ％となるようにグリセロールを添加し、−２０℃で保存した。前記精製ＳｌＣＥについて、各種特性を確認した。下記表１３に、ＳｌＣＥの精製の概要を示す。
【０３６７】
【表１３】
2012130332.tif 000011
【０３６８】
（３）ＳｌＣＥの特性
（３−１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量
前記図４９のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、ＳｌＣＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は、４６．４ｋＤａであった。
【０３６９】
（３−２）至適ｐＨおよびｐＨ安定性
至適ｐＨ
まず、前記実施例３の（３−２）と同様にして混合液を調製し、３０℃で５分間インキュベートした。前記混合液に、１２０μｇ／ｍＬ  ＳｌＣＥ  ０．１ｍＬを添加し、さらに３０℃で１０分間インキュベートして酵素反応させた。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸０．２ｍＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水０．１５ｍＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール０．１５ｍＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−２）と同様にして、各ｐＨの相対活性（％）を求めた。
【０３７０】
ｐＨ安定性
まず、６００μｇ／ｍＬ  ＳｌＣＥ  ２０μＬに、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ブリトン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ３．０〜１２．０）または０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２.０）１０μＬおよび水７０μＬを添加し、４℃で２４時間インキュベートした。前記混合液に、５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）４００μＬ、および、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）５００μＬを添加し、３０℃で１０分間インキュベートした。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸２００μＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水１５０μＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール１５０μＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−２）と同様にして、各ｐＨの残存活性（％）を求めた。
【０３７１】
図５０のグラフに、ＳｌＣＥの至適ｐＨおよびｐＨ安定性の結果を示す。図５０において、横軸はｐＨであり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、黒丸（●）は至適ｐＨ、白丸（○）はｐＨ安定性の結果を示す。図５０に示すように、ＳｌＣＥは、ｐＨ７．７において最大活性を示し、ｐＨ２．２〜９．５において、８０％以上の残存活性を示した。この結果から、ＳｌＣＥの至適ｐＨは７．７であり、ｐＨ安定領域は、ｐＨ２．２〜９．５であることがわかった。なお、ＳｌＣＥ無添加では、エピラクトース生成が確認されなかったことから、エピラクトース生成は、ＳｌＣＥによることは明らかである。
【０３７２】
（３−３）至適温度および熱安定性
至適温度
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）０．５ｍＬを、２５〜５５℃でインキュベートした。これに、５ｍｍоｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）および１５０μｇ／ｍＬ  ＳｌＣＥ  ０．１ｍＬを添加し、２５〜５５℃で１０分間インキュベートして酵素反応させた。前記反応液に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  塩酸０．２ｍＬを添加して反応を停止し、２分間煮沸した。これに、水０．１５ｍＬおよび内部標準として１ｗ／ｖ％ソルビトール０．１５ｍＬを添加した。これを、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩した後、前記実施例３の（３−３）と同様にして、各温度の相対活性（％）を求めた。
【０３７３】
熱安定性
まず、１５０μｇ／ｍＬ  ＳｌＣＥ  ０．１ｍＬを、２５〜５５℃で１５分間インキュベートし、速やかに氷冷した。氷冷後のＳｌＣＥを使用し、緩衝液をｐＨ７．７とした以外は、前記実施例２の「活性測定」に示す方法により、生成したエピラクトース量を測定した。そして、最も高いエピラクトース量を示した温度の活性を１００％として、各温度の残存活性（％）を求めた。
【０３７４】
図５１のグラフに、ＳｌＣＥの至適温度および熱安定性の結果を示す。図５１において、横軸は、温度であり、左側の縦軸は相対活性（％）、右側の縦軸は残存活性（％）であり、黒丸（●）は至適温度、白丸（○）は熱安定性の結果を示す。図５１に示すように、ＳｌＣＥは、４５℃において最大活性を示した。また、ＳｌＣＥは、５０℃以下で８０％以上の残存活性を示した。この結果から、ＳｌＣＥの至適温度は４５℃であり、熱安定領域は、５０℃以下であることが明らかになった。
【０３７５】
（３−４）基質特異性
ＳｌＣＥについて、前記実施例２の（２−４）で列挙した基質に対する特異性を評価した。
【０３７６】
まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  基質５μＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）２．５μＬおよび１．５Ｕ／ｍＬ  ＳｌＣＥ  ２．５μＬ（５０Ｕ／ｇ−ｄｓ）を混合し、室温で２４時間インキュベートした。この反応液のうち１μＬを、ＴＬＣに供した。ＴＬＣは、前記実施例１の（２−２）と同様にして行った。
【０３７７】
Ｎ−アセチルグルコサミンについては、反応生成物をＨＰＬＣで検出することにより、基質特異性を確認した。まず、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−アセチルグルコサミン０．５ｍＬ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．７）０．２５ｍＬおよび１．５Ｕ／ｍＬ  ＳｌＣＥ  ０．２５ｍＬを混合し、室温で２４時間インキュベートした。この反応液を、前記実施例１の（２−１）と同条件のＨＰＬＣにより、反応生成物を確認した。また、ブランクとして、ＳｌＣＥに代えて水を使用し、同様にしてＨＰＬＣを行った。
【０３７８】
図５２に、ＴＬＣの結果を示す。図５２において、基質の表記は、前記図７と同様である。各基質について、左側のレーンは基質の結果を示し、右側のレーンは反応生成物の結果を示す。図５２に示すように、ＳｌＣＥは、ラクトース、エピラクトース、セロビオースおよびマンノビオース等のβ−１，４結合からなる二糖類に作用した。これらの反応生成物は、それぞれ、エピラクトース、ラクトース、グルコシルマンノース（図示せず）およびマンノシルグルコース（図示せず）と同一のＲｆ値を示した。また、ＳｌＣＥは、セロトリオースにも作用した。
【０３７９】
図５３に、ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。図５３（ａ）はブランクの結果、図５３（ｂ）は基質としてＮ−アセチルグルコサミンを用いた反応液の結果を示す。図５３に示すように、同じ保持時間のみにピークが確認されたことから、ＳｌＣＥは、Ｎ−アセチルグルコサミンに作用しないことがわかった。
【０３８０】
［実施例１０］
本実施例では、キチノファーガ  ピネンシス（Ｃ．ｐｉｎｅｎｓｉｓ）からＣＥ遺伝子（ＣｐＣＥ遺伝子）をクローニングし、組換酵素ＣｐＣＥの特性評価を行った。
【０３８１】
（１）ＣｐＣＥ遺伝子のクローニング
Ｃ．ｐｉｎｅｎｓｉｓ（ＮＢＲＣ１５９６８）から、ＣｐＣＥ遺伝子をクローニングした。ＣｐＣＥ遺伝子の塩基配列は、配列番号１３の塩基配列であった。前記塩基配列から、ＣｐＣＥは、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、分子量の理論値は、４６．７ｋＤａであることがわかった。
【０３８２】
（２）粗酵素液の調製
配列番号１３に示すＣｐＣＥ遺伝子を使用した以外は、前記実施例３の（２）と同様にして、形質転換体を調製した。前記形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢＡ培地５ｍＬに植菌し、３７℃で一晩培養した。これを、ＬＢＡ培地１００ｍＬに入れ、波長６００ｎｍの吸光度（Ａ６００）が０．５になるまで、３７℃で培養した。培養液を氷冷した後、終濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、０．１ｍｏｌ／Ｌ  イソプロピルβ−チオガラクトピラノシド０．１ｍＬを添加して、１６℃で２４時間培養した。培養液を、６８，６００ｍ／ｓ２（７，０００×ｇ）、４℃、１０分の条件で遠心分離し、菌体を回収した。菌体を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）３０ｍＬに懸濁し、前記実施例１の（１−１）と同様にして、超音波破砕により菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を、９８，０００ｍ／ｓ２（１０，０００×ｇ）、４℃、５分の条件で遠心分離し、上清を回収した。これを粗酵素液とし、下記の実験に使用した。
【０３８３】
（３）エピラクトース生成能の評価
ＣＥ活性として、前記（２）で調製した粗酵素液について、エピラクトース生成能を評価した。まず、前記粗酵素液０．８ｍＬ、１ｍｏｌ／Ｌ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１２５μＬ、５ｗ／ｖ％  ラクトース１水和物４ｍＬを混合し、室温で一晩インキュベートした。これを、煮沸し、前記イオン交換樹脂を用いて脱塩し、さらに、前記フィルターでろ過した。そして、ろ液のうち１μＬを、ＴＬＣに供した。ＴＬＣの展開溶媒は、イソプロパノール：１−ブタノール：水＝体積比７：６：２の混合溶媒を使用した。発色試薬は、アニスアルデヒド試薬（１％アニスアルデヒドおよび２％硫酸を酢酸と混合したもの）を使用した。糖の検出は、前記発色試薬をＴＬＣプレートに噴霧し、オーブントースターで加熱して行った。
【０３８４】
図５４に、ＴＬＣの写真を示す。図５４において、「Ｌａｃ」は、ラクトースの結果、「Ｅｐｉ」はエピラクトースの結果、「Ｐ」は、Ｃ．ｐｉｎｅｎｓｉｓの粗酵素液による反応生成物の結果を示す。図５４に示すように、Ｃ．ｐｉｎｅｎｓｉｓの粗酵素液による反応生成物において、エピラクトースと同Ｒｆ値のスポットが観察された。したがって、Ｃ．ｐｉｎｅｎｓｉｓの粗酵素液により、ラクトースがエピラクトースに変換されていることが明らかとなった。
【０３８５】
［実施例１１］
本実施例では、前記実施例２の（３）でクローニングしたＲｍＣＥ遺伝子について、組換酵素ＲｍＣＥを精製し、その特性を確認した。
【０３８６】
（１）ＲｍＣＥの精製
配列番号１に示すＲｍＣＥ遺伝子を使用した以外は、前記実施例３の（２）と同様にして、形質転換体を調製した。前記形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢＡ培地３ｍＬに植菌し、３０℃で一晩培養した。前記培養液のうち０．２ｍＬを、新たなＬＢＡ培地２００ｍＬに入れ、波長６００ｎｍの吸光度（Ａ６００）が０．５になるまで、３０℃で振とう培養した。培養液を氷冷した後、終濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように０．１ｍｏｌ／Ｌのイソプロピルβ−チオガラクトピラノシドを添加し、１６℃で２４時間振とう培養した。前記培養液から、前記実施例３と同様にして、菌体の回収・破砕および菌体破砕液の遠心分離を行い、粗酵素液４０ｍＬを得た。前記粗酵素液は、タンパク質量が１３４ｍｇ、ＣＥの活性は１０５０Ｕであった。
【０３８７】
本粗酵素液を、７０℃にて３０分間インキュベートし、前記インキュベート後、遠心分離（６８，６００ｍ／ｓ２（７０００×ｇ））により、凝集成分を取り除いた。凝集成分除去前の粗酵素液および凝集成分除去後の精製酵素液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより供した。この結果を、図５５の写真に示す。図５５において、レーンＭは、分子量マーカーであり、レーン１は、前記凝集成分除去前の粗酵素液の結果であり、レーン２は、前記凝集成分除去後の精製酵素液の結果である。図５５のレーン２に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一バンドのみが検出されたことから、前記凝集成分除去後の精製酵素液において、ＲｍＣＥが単一に精製されていることがわかった。
【０３８８】
得られたＲｍＣＥ（組換えＲｍＣＥ）の各種特性を確認した。その結果、組換えＲｍＣＥは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量、至適ｐＨおよびｐＨ安定性、至適温度および熱安定性、基質特異性、ならびにエピラクトース生成反応に対する温度の影響について、前記実施例２で野生株Ｒ．ｍａｒｉｎｕｓより精製したＲｍＣＥと、ほぼ同様の性質を示した。なお、本実施例では、反応温度を６０℃とした以外は、前記実施例２と同条件で、活性測定を行った。
【０３８９】
（２）基質濃度の影響
１０〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌラクトース１水和物を基質として、各濃度における反応生成物の生成量を測定した。前記所定濃度のラクトース１水和物を含む５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に、３０Ｕ／ｇ−ｄｓとなるように組換えＲｍＣＥを添加し、６０℃で２４時間インキュベートした。前記反応液を煮沸して組換えＲｍＣＥを失活させた。そして、前記実施例３の（３−６）と同様にして、基質から反応生成物への生成率（変換率、％）を求めた。
【０３９０】
下記表１４に、基質から反応生成物への生成率と基質濃度との関係を示す。下記表１４に示すように、基質濃度１０〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの間において、エピラクトースの生成率は、約３０％であった。この結果から、耐熱性を示すＲｍＣＥを使用することにより、高基質濃度および高温において、エピラクトース生成反応を行えることがわかった。
【０３９１】
【表１４】
2012130332.tif 000012
【０３９２】
（３）固定化酵素の調製
本実施例の組換えＲｍＣＥを、固定化担体に吸着させて、固定化酵素を調製した。具体的には、固定化担体として、キトパールＢＣＷ−２５１０、キトパールＢＣＷ−３０１０、キトパールＢＣＷ−３５１０（いずれも、富士紡績社製）；ダイヤイオン（登録商標）ＨＰＡ２５、セパビーズ（登録商標）ＳＰ−２０７、セパビーズ（登録商標）ＳＰ−８５０（いずれも、三菱化学社製）；デュオライトＡ５６８、デュオライトＡ７、デュオライトＸＡＤ７６１（いずれも、住化ケムテックス社製）を使用した。前記組換えＲｍＣＥの前記固定化担体への吸着処理は、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に、前記固定化担体（樹脂）および前記組換えＲｍＣＥを、それぞれ適当量添加し、室温で数時間振とうすることで行った。このようにして、各種固定化担体に固定化された固定化酵素を調製した。
【０３９３】
（４）固定化酵素によるエピラクトース生成
１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース溶液（ｐＨ６．５）６ｍＬに、前記組換えＲｍＣＥを固定化した樹脂１ｇを添加し、この混合液を、６０℃で２時間保持した。この反応液を、前記実施例１の（２−１）と同条件のＨＰＬＣにより、生成したエピラクトース量を測定した。そして、反応に供したラクトース量を１００％とし、エピラクトースに変換されたラクトース量の相対値を生成率（変換率、％）として求めた。エピラクトース生成率は、１７〜３０％であった。
【０３９４】
（５）バイオリアクター方式によるエピラクトースの生成
上記（３）と同様にして、キトパールＢＣＷ−３５１０  １ｇあたりに、本実施例の組換えＲｍＣＥを０．５ｍｇ吸着させて、固定化酵素を調製した。この固定化酵素を、ガラスカラム（φ３０ｍｍ）に、高さ１３０ｍｍとなるように充填した。このカラムを６５℃に保持した状態で、３０ｗ／ｖ％  ラクトース１水和物を含む５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を、流速８．４ｍＬ／ｈで、前記カラムに通液させた。通液開始から２４時間経過後に、前記カラムから溶出された反応液を採取した。この反応液を、前記実施例１の（２−１）と同条件のＨＰＬＣにより、生成したエピラクトース量を測定した。そして、反応に供したラクトース量を１００％とし、エピラクトースに変換されたラクトース量の相対値を生成率（変換率、％）として求めた。エピラクトース生成率は、２９．５％であった。また、前記カラムに前記リン酸カリウム緩衝液を５日間連続して通液した後に採取した反応液では、エピラクトース生成率は、２８．６％であった。これらの結果、ＲｍＣＥの固定化酵素により、従来不可能であった高温および高基質濃度において、バイオリアクター方式によるエピラクトースの製造が可能であることが明らかとなった。
【０３９５】
［実施例１２］
本実施例では、Ｒ．ｍａｒｉｎｕｓ菌体によるエピラクトース生成を確認した。
【０３９６】
前記Ｒ．ｍａｒｉｎｕｓを、前記表２の培地５０ｍＬで、７０℃で１１４時間振とう培養した。培養終了後、得られた培養液から、遠心分離（６８，６００ｍ／ｓ２（７０００×ｇ））により、菌体を回収した。回収した菌体を、５ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）  ５ｍＬに懸濁した。この懸濁液を、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ラクトース１水和物を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）  ０．５ｍＬに等量添加し、６０℃で１０分間インキュベートした。前記反応液を、定法に従いフィルターろ過し、前記実施例１の（２−１）と同条件のＨＰＬＣにより、生成したエピラクトース量を測定した。そして、反応に供したラクトース量を１００％とし、エピラクトースに変換されたラクトース量の相対値を生成率（変換率、％）として求めた。エピラクトース生成率は、１．７％であった。この結果、ＣＥを有する好気性微生物の菌体そのものによっても、ラクトースを基質として、エピラクトースを生成できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０３９７】
以上のように、本発明のＣＥは、好気性微生物由来であることから、例えば、本発明の好気性微生物から容易に製造が可能である。このため、本発明のＣＥを、例えば、工業的に生産することが可能であり、これによって、さらに、機能性糖質として有用性が高いエピラクトース等を、工業レベルで生産し、有効利用することが可能となる。
【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図３０】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３６】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４３】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１７】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３１】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３７】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４４】
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【図４７】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年3月26日(2012.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ１）〜（Ｆ１）および（Ｇ）の特性を有し、かつ好気性微生物由来であることを特徴とするセロビオース  ２−エピメラーゼ。
（Ａ１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定された分子量が４０，８００〜４４，８００の範囲
（Ｂ１）分子量の理論値が４５，３００〜４９，３００の範囲
（Ｃ１）至適ｐＨが６〜７の範囲
（Ｄ１）ｐＨ安定性がｐＨ３〜１２の範囲
（Ｅ１）至適温度が８０〜９０℃の範囲
（Ｆ１）熱安定性の上限が３５〜８０℃の範囲
（Ｇ）Ｎ−アシル−Ｄ−グルコサミンを実質的に基質としない
【請求項２】
下記の（Ｐ１）のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１記載のセロビオース  ２−エピメラーゼ。
（Ｐ１）：下記の（Ｐ１ａ）、（Ｐ１ｂ）または（Ｐ１ｃ）のアミノ酸配列
（Ｐ１ａ）：配列番号２のアミノ酸配列
（Ｐ１ｂ）：配列番号２のアミノ酸配列において、１個から数個のアミノ酸残基が、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
（Ｐ１ｃ）：配列番号２のアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列
【請求項３】
前記好気性微生物が、ロドサーマス  マリナス（Rhodothermus marinus）であることを特徴とする請求項１または２記載のセロビオース  ２−エピメラーゼ。
【請求項４】
前記セロビオース  ２−エピメラーゼが、固定化担体に固定化された固定化酵素であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のセロビオース  ２−エピメラーゼ。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のセロビオース  ２−エピメラーゼをコードする、下記の（Ｇ１）の塩基配列からなることを特徴とするセロビオース  ２−エピメラーゼ遺伝子。
（Ｇ１）：下記の（Ｇ１ａ）、（Ｇ１ｂ）、（Ｇ１ｃ）または（Ｇ１ｄ）の塩基配列
（Ｇ１ａ）：配列番号１の塩基配列
（Ｇ１ｂ）：配列番号１の塩基配列において、１個から数個の塩基が、欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ１ｃ）：配列番号１の塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
（Ｇ１ｄ）：配列番号１の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、セロビオース  ２−エピメラーゼをコードする塩基配列
【請求項６】
請求項１から４のいずれか一項に記載のセロビオース  ２−エピメラーゼの製造方法であって、好気性微生物ロドサーマス  マリナス（Rhodothermus marinus）を培養する工程と、
前記好気性微生物の培養物から無細胞抽出物を得る工程と
を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項７】
請求項６のセロビオース  ２−エピメラーゼの製造方法に使用する好気性微生物であって、ロドサーマス  マリナス（Rhodothermus marinus）であることを特徴とするセロビオース  ２−エピメラーゼ製造用好気性微生物。
【請求項８】
還元末端糖残基がβ−１，４結合で結合している、２つ以上の糖残基からなる糖を基質とし、セロビオース  ２−エピメラーゼの酵素反応により、前記還元末端糖残基の２位の水酸基がエピメリ化された糖を製造する、エピメリ化糖の製造方法であって、
前記セロビオース  ２−エピメラーゼとして、請求項１から４のいずれか一項に記載のセロビオース  ２−エピメラーゼを使用することを特徴とする製造方法。
【請求項９】
前記基質が、ラクトースである、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
前記酵素反応の温度が、４０〜１００℃の範囲である請求項８または９記載の製造方法。
【請求項１１】
前記酵素反応における基質濃度が、溶媒１００ｇあたり２５〜９０ｇの範囲である請求項８から１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記セロビオース  ２−エピメラーゼが、前記好気性微生物からの無細胞抽出物、および前記好気性微生物の菌体の少なくとも一方であることを特徴とする請求項８から１１のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記酵素反応のｐＨが、４〜９の範囲である請求項８から１２のいずれか一項に記載の製造方法。