(57)【要約】      （修正有）【課題】検出手段を保護して光量オーバーによるオーバーロードを防ぎ、好適なデータを取得できる共焦点顕微鏡を提供する。【解決手段】試料を照明するための照明光学系と、前記試料からの光をピンホールの開口に集光するための集光レンズと、前記ピンホールの開口を介して前記試料からの光を受光する検出手段と、前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段と、前記照明光学系と前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段とを制御する制御手段とを有する共焦点顕微鏡であって、前記制御手段は、前記照明光学系を用いた前記試料への刺激と前記試料の画像取得のシーケンスを制御し、前記試料への刺激開始時から前記試料の画像取得開始時までの間に前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを制御して、前記検出手段への光の入射を阻害する。【選択図】図１
2012173516.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を照明するための照明光学系と、
前記試料からの光をピンホールの開口に集光するための集光レンズと、
前記ピンホールの開口を介して前記試料からの光を受光する検出手段と、
前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段と前記照明光学系の少なくとも一つを制御する制御手段と
を有する共焦点顕微鏡であって、
前記制御手段は、前記照明光学系を用いた前記試料への刺激と前記試料の画像取得のシーケンスを制御し、前記試料への刺激開始時から前記試料の画像取得開始時までの間に前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを制御して、前記検出手段への光の入射を阻害することを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
前記試料への刺激開始時から前記試料の画像取得開始時までの時間を刺激時間ｔ1、
前記制御手段が、前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前記試料の画像取得時の設定状態から、前記試料への刺激に伴って生じる前記試料からの光が前記検出手段に入射するのを阻害する状態に変化させるのに要する時間を駆動時間ｔ2、
前記制御手段が、前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前記試料の画像取得時の設定状態に変化してから、前記検出手段によって前記試料を観察可能な状態になるまでの時間を予備時間ｔ3とし、（但し、ｔ1＞０、ｔ2＞０、ｔ3≧０）
（ｔ1−ｔ3）／２≧ｔ2のとき、
前記試料への刺激とほぼ同時に、前記制御手段は、前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前記試料の画像取得時の設定状態から前記検出手段へ光が入射するのを阻害する状態に変化させ、
前記試料への刺激開始からｔ1−ｔ2−ｔ3経過したときに、前記制御手段は、前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前記検出手段へ光が入射するのを阻害する状態から前記試料の画像取得時の設定状態に変化させ、
（ｔ1−ｔ3）／２＜ｔ2のとき、
前記試料の刺激とほぼ同時に、前記制御手段は、前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前記試料の画像取得時の設定状態から前記検出手段へ光が入射するのを阻害する状態へ変化させ、
前記試料への刺激開始から（ｔ1−ｔ3）／２経過したときに、前記制御手段は前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前記検出手段へ光が入射するのを阻害する状態から前記試料の画像取得時の設定状態に変化させることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項３】
請求項１に記載の共焦点顕微鏡は、蛍光顕微鏡であることを特徴とする請求項１又は２に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項４】
前記制御手段は、前記ピンホールの開口径制御によって前記検出手段へ光が入射するのを阻害することを特徴とする請求項１乃至３の何れか一項に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項５】
前記検出手段は、複数の検出器と、
前記ピンホールと複数の前記検出器との間に配置され、前記試料からの光を任意の前記検出器へ導くための光路切替手段とを有し、
前記制御手段は、前記光路切替手段の光路切替位置によって前記検出手段へ光が入射するのを阻害することを特徴とする請求項１乃至４の何れか一項に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項６】
前記制御手段は、前記集光レンズの配置位置を変化させることで前記検出手段へ光が入射するのを阻害することを特徴とする請求項１乃至５の何れか一項に記載の共焦点顕微鏡。
【請求項７】
共焦点顕微鏡であって、照明光学系によって試料を照明し、
集光レンズによって前記試料からの光をピンホールの開口に集光し、
前記ピンホールの開口を介した前記試料からの光を検出手段によって受光し、
前記照明光学系を用いた前記試料への刺激と前記試料の画像取得のシーケンスを前記制御手段によって制御し、前記試料への刺激開始時から前記試料の画像取得開始時までの間に前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを制御して、前記検出手段への光の入射を阻害することを特徴とする方法。
【請求項８】
前記試料への刺激開始時から前記試料の画像取得開始時までの時間を刺激時間ｔ1、
前記制御手段が、前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前記試料の画像取得時の設定状態から、前記試料への刺激に伴って生じる前記試料からの光が前記検出手段に入射するのを阻害する状態に変化させるのに要する時間を駆動時間ｔ2、
前記制御手段が、前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前記試料の画像取得時の設定状態に変化してから、前記検出手段によって前記試料を観察可能な状態になるまでの予備時間を予備時間ｔ3とし、（但し、ｔ1＞０、ｔ2＞０、ｔ3≧０）
（ｔ1−ｔ3）／２≧ｔ2のとき、
前記試料への刺激とほぼ同時に、前記制御手段は、前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前期試料の画像取得時の設定状態から前記検出手段へ光が入射するのを阻害する状態に変化させ、
前記試料への刺激開始からｔ1−ｔ2−ｔ3経過したときに、前記制御手段は、前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前記検出手段へ光が入射するのを阻害する状態から前記試料の画像取得時の設定状態に変化させ、
（ｔ1−ｔ3）／２＜ｔ2のとき、
前記試料の刺激とほぼ同時に、前記制御手段は、前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前記試料の画像取得時の設定状態から前記検出手段へ光が入射するのを阻害する状態へ変化させ、
前記試料への刺激開始から（ｔ1−ｔ3）／２経過したときに、前記制御手段は前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前記検出手段へ光が入射するのを阻害する状態から前記試料の画像取得時の設定状態に変化させることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
共焦点蛍光顕微鏡を用いることを特徴とする請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記制御手段は、ピンホールの開口径制御によって前記検出手段へ光が入射するのを阻害することを特徴とする請求項７乃至９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記制御手段は、前記標本からの光の光路中に配置された検出光路切替手段の制御によって前記検出手段へ光が入射するのを阻害することを特徴とする請求項７乃至１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記制御手段は、前記集光光学系に含まれる集光レンズの配置位置を変化させることで前記検出手段へ光が入射するのを阻害することを特徴とする請求項７乃至１１の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、蛍光試料の刺激と画像取得とを行う共焦点顕微鏡が知られている。例えば特許文献１は、光刺激用レーザ光源と観察用レーザ光源とを備え、光刺激用レーザで蛍光試料を刺激した後、刺激後の試料の変化を知るために観察用レーザで蛍光試料に励起光を照射し、蛍光画像の取得を行う。共焦点顕微鏡では、試料からの蛍光を検出する検出手段として光電子増倍管（ＰＭＴ）が広く使用されているが、ＰＭＴは強い光を受光することで光電面が劣化する恐れがある。そのため、強い光を受光して光量オーバーの状態が所定の時間続くと、ＰＭＴにかかる印加電圧を０Ｖに落とし、オーバーロード状態にして受光感度を落とすことで保護を行っていた。
【０００３】
また、例えば特許文献２のように、光路中にＮＤフィルターやシャッターなどを配置し、ＰＭＴを保護する技術が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−３４５７６４
【特許文献２】特開２００３−１７７３０７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載のオーバーロード状態にすることによるＰＭＴの保護の方法の場合、刺激直後の画像取得においてＰＭＴから好適なデータが得られないことがあった。また、光電面に強い光が当たることを避けられなかった。
【０００６】
特許文献２に記載の方法の場合、ＰＭＴに入射する光を抑えるためにはフィルターやシャッターなどの光量制御手段を新たに設置しなければならなかった。
【０００７】
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり検出手段を保護して光量オーバーによるオーバーロードを防ぎ、好適なデータを取得できる共焦点顕微鏡を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
試料を照明するための照明光学系と、前記試料からの光をピンホールの開口に集光するための集光レンズと、前記ピンホールの開口を介して前記試料からの光を受光する検出手段と、前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段と前記照明光学系の少なくとも一つを制御する制御手段とを有する共焦点顕微鏡であって、前記制御手段は、前記照明光学系を用いた前記試料への刺激と前記試料の画像取得のシーケンスを制御し、前記試料への刺激開始時から前記試料の画像取得開始時までの間に前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを制御して、前記検出手段への光の入射を阻害することが好ましい。
【０００９】
さらに、前記試料への刺激開始時から前記試料の画像取得開始時までの時間を刺激時間ｔ1、前記制御手段が、前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前記試料の画像取得時の設定状態から、前記試料への刺激に伴って生じる前記試料からの光が前記検出手段に入射するのを阻害する状態に変化させるのに要する時間を駆動時間ｔ2、前記制御手段が、前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前記試料の画像取得時の設定状態に変化してから、前記検出手段によって前記試料を観察可能な状態になるまでの時間を予備時間ｔ3とし、
（但し、ｔ1＞０、ｔ2＞０、ｔ3≧０）
（ｔ1−ｔ3）／２≧ｔ2のとき、
前記試料への刺激とほぼ同時に、前記制御手段は、前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前記試料の画像取得時の設定状態から前記検出手段へ光が入射するのを阻害する状態に変化させ、前記試料への刺激開始からｔ1−ｔ2−ｔ3経過したときに、前記制御手段は、前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前記検出手段へ光が入射するのを阻害する状態から前記試料の画像取得時の設定状態に変化させ、
（ｔ1−ｔ3）／２＜ｔ2のとき、
前記試料の刺激とほぼ同時に、前記制御手段は、前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前記試料の画像取得時の設定状態から前記検出手段へ光が入射するのを阻害する状態へ変化させ、前記試料への刺激開始から（ｔ1−ｔ3）／２経過したときに、前記制御手段は前記ピンホールと前記集光レンズと前記検出手段の少なくとも一つを前記検出手段へ光が入射するのを阻害する状態から前記試料の画像取得時の設定状態に変化させることが好ましい。
【００１０】
さらに、共焦点蛍光顕微鏡であることが好ましい。
【００１１】
さらに、前記制御手段は、前記ピンホールの開口径制御によって前記検出手段へ光が入射するのを阻害することが好ましい。
【００１２】
さらに、前記検出手段は、複数の検出器と、前記ピンホールと複数の前記検出器との間に配置され、前記試料からの光を任意の前記検出器へ導くための光路切替手段とを有し、前記制御手段は、前記光路切替手段の光路切替位置によって前記検出手段へ光が入射するのを阻害することが好ましい。
【００１３】
さらに、前記制御手段は、前記集光レンズの配置位置を変化させることで前記検出手段へ光が入射するのを阻害することが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、検出手段を保護し、光量オーバーによるオーバーロードを防ぐことで好適なデータを取得できる共焦点顕微鏡を実現し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施形態に係る共焦点顕微鏡の構成を示す図である。
【図２】ピンホールの構成例を示す図である。
【図３】実施形態に係る試料への刺激と試料の画像取得の制御シーケンスを示す図である。
【図４】（ｔ1−ｔ3）／２≧ｔ2のときの時間とピンホールの開口径の位置の関係を示す図である。
【図５】（ｔ1−ｔ3）／２＜ｔ2のときの時間とピンホールの開口径の関係を示す図である。
【図６】光路切替部材の構成例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図を用いて本発明の実施形態を説明する。
【００１７】
図１は、実施形態に係る共焦点顕微鏡の構成を示す。簡単のため、複雑な光学系は図示していない。
【００１８】
実施形態に係る共焦点顕微鏡は、照明光学系と、集光光学系と、検出部９とからなる。
【００１９】
照明光学系は、単一又は複数のレーザ光源を備えたレーザ光源部１と、ダイクロイックミラー２と、スキャナ３と、スキャナ３からの光を試料上に集光する対物レンズ４とを有する。ダイクロイックミラー２は、レーザ光源部１からのレーザ光を反射して試料５からの蛍光を透過する。また、スキャナ３は、レーザ光を試料上で走査するための２枚の走査用ミラー（Ｘ，Ｙ方向）を備えている。
【００２０】
集光光学系は対物レンズ４と、スキャナ３と、ダイクロイックミラー２と、ダイクロイックミラー２を透過した蛍光を集光する集光レンズ６と、略集光位置に配置されるピンホール７とを有し、光学ユニット内に配置されている。ピンホール７と対物レンズ４による試料上の集光位置とは共役関係にある。
【００２１】
検出部９は、主に２つの検出方式の検出機構が配置される。１つは、フィルターで選択した特定の波長の光を検出するためのＰＭＴを単一又は複数備えた機構である。もう１つは、分散させた光を複数配列したＰＭＴで、波長帯域ごとに検出する機構である。また、検出部９が１つのＰＭＴであってもよい。
【００２２】
レーザ光源部１から射出されたレーザ光はダイクロイックミラー２で反射し、スキャナ３を介して対物レンズ４によって試料５に集光される。試料５から発生した蛍光は、対物レンズ４で受光され、スキャナ３でデスキャンされる。その後、ダイクロイックミラー２を透過し、集光レンズ６でピンホール７の略開口位置に集光される。ピンホール７の開口を通過した蛍光は光路切替手段８を介して検出部９で検出される。
【００２３】
また、コンピュータ１５に内蔵のソフトウェア１６は、コントローラ１０内のＣＰＵ１１へ指示信号を送り、ＣＰＵ１１はソフトウェア１６へ出力信号を送る。ＣＰＵ１１が受信した指示信号は、ピンホール７、光路切替手段８、検出部９、キャプチャ制御部１２、スキャン制御部１３、レーザ制御部１４に振り分けて送信され、各部は信号に従って動作する。キャプチャ制御部１２には、検出部９から出力される受光強度に応じた値の電気信号が供給され、所定のタイミングで電気信号をサンプリングする。さらに、サンプリングした電気信号から画像を構築し、不図示のモニターに出力する。
【００２４】
また、スキャナ制御部１３は、スキャナ３を構成する２枚の走査用ミラーを夫々回転させるための駆動信号（駆動電圧）を、ユーザーが指定した走査位置や走査範囲から作成し、スキャナ３へ供給する。さらに、レーザ制御部１４は、ユーザーが指定した波長、光量などからレーザ駆動信号を作成してレーザ制御部１へ供給する。
【００２５】
実施例１は、共焦点顕微鏡の一部であるピンホール７の開口径を調整することによりＰＭＴへ入射する蛍光の光量を低減している。本来、ピンホール７は開口径を絞ることで共焦点性を高めてオプティカルセクショニング効果を得る作用を担っている。共焦点顕微鏡の一部であるピンホール７を光量制御手段に用いることで、新たな機構を設置する必要がない。そのため、コストを軽減することができる。
【００２６】
図２はピンホール７の構成を示す。図２（ａ）はピンホール７を構成する開口板７ａで、開口板７ａの一部に五角形の開口部７ｂが備えられている。開口板７ａは五角形の開口部７ｂのみで光を通し、開口部以外の斜線部分で光を遮光する。一点破線は開口板７ａの対称軸７ｃを示す。
【００２７】
図２（ｂ）はピンホール７の開口径を観察に最適な開口径ｘ0にした状態を示す。ピンホール７は図２（ａ）に示した開口板７ａを三枚使用し、各開口板７ａの対称軸上７ｃの交点（図２（ｂ）の黒点）を中心点として、三枚の開口板７ａが夫々１２０°異なるように回転させた配置である。ピンホール７の開口部７ｄは、図２（ｂ）の中央に位置する六角形の部分となる。開口径ｘ0は、開口部７ｄの六角形の向かい合う辺の間の距離とする。
【００２８】
各開口板７ａは夫々の対称軸７ｃに沿って移動可能に構成され、図中の矢印の方向に夫々移動させることで開口径の大きさを変化させる。開口径を大きく変化させる場合は、開口板７ａを夫々図中の＋方向へ移動させる。開口径を小さく変化させる場合は、開口板７ａを夫々図中の−方向へ移動させる。図２（ｃ）は、ピンホール７の開口径を最小の開口径ｘ1にした状態を示す。
【００２９】
ここで、試料５への刺激と試料５の画像取得とを交互に繰り返す場合を想定し、試料５の刺激開始直前（観察終了時）のピンホール７の開口径は観察に最適な開口径ｘ0に設定される。刺激時に検出部９に入射する光量を最少にするためのピンホール７の開口径は、最小の開口径ｘ1に設定される。例えば、ピンホール７の開口径の可動範囲が最小５０μｍから最大１０００μｍの場合、開口径ｘ1は５０μｍとなる。
【００３０】
刺激開始から蛍光画像取得開始までの時間、つまり試料５に刺激光を照射して刺激を開始してから励起光を試料５に照射して蛍光画像の取得を開始するまでの時間をｔ1、ピンホール７が開口径ｘ0の状態から開口径ｘ1の状態になるまでに要する時間を駆動時間ｔ2とする。さらに、ピンホール７が開口径ｘ0の状態になり、検出部９から電気信号の取得が可能となるまでの予備時間をｔ3とする。予備時間ｔ3を考慮する必要がない場合は、予備時間ｔ3＝０としてもよい。
【００３１】
観察に最適なピンホール７の開口径ｘ0や駆動時間ｔ2は、顕微鏡の光学系や蛍光波長などを考慮してソフトウェア１６によって算出される。また、レーザ光の波長や刺激位置や刺激時間ｔ1などの指定は、ユーザーが事前に設定を行ってもよいし、適宜指定を行ってもよい。
【００３２】
試料５への刺激と試料５の画像取得とのシーケンスを図３に示した制御シーケンス及び図４、図５を用いて説明する。特に問題がなければ、制御シーケンスの処理や判断の追加や削除や順序の変更を行ってもよい。
【００３３】
図４は、（ｔ1−ｔ3）／２≧ｔ2の場合の経過時間ｔとピンホール７の開口径ｘの関係を示す。横軸が経過時間ｔで、縦軸がピンホール７の開口径ｘである。試料５への刺激開始時、ピンホール７は開口径ｘ0の状態である。
【００３４】
刺激シーケンスの指令を受けたＣＰＵ１１は、指示信号をスキャナ制御部１３に送信し、走査用ミラーの回転駆動の開始信号をスキャナ３へ供給する（処理１）。また処理１とほぼ同時に、ＣＰＵ１１は指示信号をレーザ制御部１４に送信し、刺激光の照射の開始信号をレーザ光源部１へ供給する（処理２）。
【００３５】
さらに処理１及び２とほぼ同時に、（ｔ1−ｔ3）／２≧ｔ2か否かを判断する（判断１）。
【００３６】
（ｔ1−ｔ3）／２≧ｔ2の場合（判断１の結果Ｙ）、試料５への刺激開始(レーザ光照射)と略同時に、ピンホール７の開口径を開口径ｘ0の状態から開口径ｘ1の状態へ変化させる（処理３）。
【００３７】
次に、刺激開始時からの経過時間ｔを判断する（判断２）。刺激時間ｔ1の残り時間が駆動時間ｔ2と予備時間ｔ3との和となる、経過時間ｔ＝ｔ1−ｔ2−ｔ3となると（判断２の結果Ｙ）、ピンホール７を開口径ｘ1の状態から開口径ｘ0の状態へ変化させる（処理４）。
【００３８】
図５は、（ｔ1−ｔ3）／２＜ｔ2の場合の経過時間ｔとピンホール７の開口径ｘの関係を示す。横軸が経過時間ｔで、縦軸がピンホール７の開口径ｘである。
【００３９】
（ｔ1−ｔ3）／２＜ｔ2の場合（判断１の結果Ｎ）、試料５への刺激開始(レーザ光照射)と略同時に、ピンホール７を開口径ｘ0の状態からピンホール７の三枚の開口板７ａを夫々図２（ｂ）の−方向へ移動させ、開口径を小さくしていく（処理３）。次に、刺激開始時からの経過時間ｔを判断する（判断２）。刺激時間ｔ1の残り時間が刺激時間ｔ1−ｔ3の半分となる、経過時間ｔ＝（ｔ1−ｔ3）／２（＝ｔ2'）となると（判断２の結果Ｙ）、ピンホール７の三枚の開口板７ａを夫々図２（ｂ）の＋方向へ移動させ、ピンホール７を開口径ｘ0の状態へ変化させる（処理４）。
【００４０】
処理４の後に、経過時間がｔ＝ｔ1か否か、つまり試料５への刺激が終了したか否かを判断する（判断３）。
【００４１】
試料５への刺激が終了すると（判断３の結果Ｙ）、ＣＰＵ１１は指示信号をレーザ制御部１４に送信し、刺激光の照射の停止信号をレーザ光源部１へ供給する（処理５）。また処理５とほぼ同時に、ＣＰＵ１１は指示信号をレーザ制御部１４に送信し、励起光の照射の開始信号をレーザ光源部１へ供給する（処理６）。さらに処理５及び６とほぼ同時に、ＣＰＵ１１は指示動作をキャプチャ制御部１３に送信し、検出部９から電気信号の取得及び蛍光画像の構築を開始し（処理７）、試料５の観察を開始する。
【００４２】
次に、試料５の観察を終了するか否か判断する（判断４）。
【００４３】
試料５の観察が終了すると（判断４の結果Ｙ）、ＣＰＵ１１は指示信号をレーザ制御部１４に送信し、励起光の照射の停止信号をレーザ光源部１へ供給する（処理８）。また処理８とほぼ同時に、ＣＰＵ１１は指示動作をキャプチャ制御部１３に送信し、検出部９から電気信号の取得及び蛍光画像の構築を停止する（処理９）。
【００４４】
最後に、刺激シーケンスを終了するか否かを判断する（判断５）。刺激シーケンスを終了する場合は（判断５の結果Ｙ）、そのまま刺激シーケンスを終了させる。刺激シーケンスを続ける場合は（判断５の結果Ｎ）、処理１に戻る。
【００４５】
また、試料５に刺激光を照射しても検出部９が光量オーバーとならない場合は、ピンホール７の開口径の調節を行わなくてもよい。
【００４６】
実施例２は、検出部９を構成する第１の検出器９ａ、第２の検出器９ｂの何れか一方に試料５からの光を導くために光路を切り替える光路切替手段８の光路切替位置の調整によりＰＭＴへ入射する蛍光の光量を低減している。多くの共焦点顕微鏡には異なる検出方式を持つ検出器が設置され、取得したいデータに応じて第１の検出器９ａ及び第２の検出器９ｂの何れか一方を選択している。光路切替手段８は、試料５からの光が所望の検出器９ａ又は９ｂに入射するように、試料５からの光を第１の検出器９ａ及び第２の検出器９ｂの何れか一方に向かうための光路に切替るための部材である。
【００４７】
図６は光路切替手段の構成を示す。検出光路切替手段８は、ターレット状板に複数の光学素子（図中のａ、ｂ等）が設置された構成である。第１の検出器９ａに試料５からの光を入射させる場合、ターレット状板を図中の中心点を中心に回転させ、集光光学系の光軸上に第１の光学素子ａを配置させる。第１の検出器９ａは第１の光ファイバー１７ａの一端と不図示の第１の接続部で接続され、第１の光ファイバー１７ａの他端は、光学ユニット１８と不図示の第２の接続部で接続されている。また、第２の検出器９ｂは第２の光ファイバー１７ｂの一端と不図示の第３の接続部で接続され、第２の光ファイバー１７ｂの他端は、光学ユニット１８と不図示の第４の接続部で接続されている。さらに、光路切替手段８と第１の接続部との間には、第１の光学素子ａが光軸上に配置されたときに、第１の光学素子ａで反射した光を第２の接続部へ導くための不図示の第１の光学系が配置されている。また、第２の光学素子ｂが光軸上に配置されたときに、第２の光学素子ｂで反射した光を第４の接続部へ導くための不図示の第２の光学系が配置されている。
【００４８】
ここで、光路切替手段８のターレット状板上には、第１の光学素子ａの隣に、第２の光学素子ｂが配置されている。さらに、第１の光学素子ａと第２の光学素子ｂとの間には、試料５からの光を第１の検出器９ａ及び第２の検出器９ｂへ導かない領域ｃ（図中斜線部分上）がある。例えば領域ｃは、試料５からの光を遮光する領域であってもよく、試料５からの光が検出部９に入射しない方向へ導く領域であってもよい。
【００４９】
刺激開始から蛍光画像取得開始までの時間、つまり試料５に刺激光を照射して刺激を開始してから励起光を試料５に照射して蛍光画像の取得を開始するまでの時間をｔ1、試料５からの光が光路切替手段８の第１の光学素子ａで反射する状態から領域ｃに入射する状態になるまでの所要時間を駆動時間ｔ2とする。さらに、試料５からの光が光路切替手段８の第１の光学素子ａで反射する状態になり、第１の検出器９ａから電気信号の取得が可能となるまでの予備時間をｔ3とする。予備時間ｔ3を考慮する必要がない場合は、予備時間ｔ3＝０としてもよい。
【００５０】
実施例１と同様に、上記の刺激時間ｔ1、駆動時間ｔ2、予備時間ｔ3を用いて刺激シーケンスを実行する。
【００５１】
また、試料５に刺激光を照射しても第１の検出器９ａが光量オーバーとならない場合は、光路切替手段８の光路切替位置の調節を行わなくてもよい。
【００５２】
実施例３は、試料５からの光をピンホール７の開口部７ｄに集光するための集光レンズ６の配置位置を調整することによりＰＭＴへ入射する蛍光の光量を低減している。図１では簡単のため、集光レンズ６を１枚のレンズで表している。
【００５３】
観察に最適な状態では、集光レンズ６の後側焦点位置がピンホール７の開口部７ｄに、一致するように配置され、試料５からの光は集光レンズ６によりピンホール７の開口部７ｄに集光され、検出部９で受光される。この観察に最適な状態の光路を形成する集光レンズ６の光軸の位置を位置ｘ0（集光光学系の光軸と一致）とする。また、集光レンズ６の光軸の位置を光軸（ｚ軸）に直行するｘｙ平面内のｘ方向（任意の方向）にのみ移動することで、試料５からの光がピンホール７によって遮光され、検出部９に入射させない状態に偏向することができる。この試料５からの光が検出部９に入射しない状態の光路を形成する集光レンズ６の光軸の位置を位置ｘ1とする。
【００５４】
刺激開始から蛍光画像取得開始までの時間、つまり試料５に刺激光を照射して刺激を開始してから励起光を試料５に照射して蛍光画像の取得を開始するまでの時間をｔ1、集光レンズ６の光軸の位置ｘ0から集光レンズ６の光軸の位置ｘ1に移動するまでの所要時間を駆動時間ｔ2とする。さらに、集光レンズ６の光軸の位置ｘ1から集光レンズ６の光軸の位置ｘ0になり、検出部９から電気信号の取得が可能となるまでの予備時間をｔ3とする。予備時間ｔ3を考慮する必要がない場合は、予備時間ｔ3＝０としてもよい。
【００５５】
実施例１と同様に、上記の刺激時間ｔ1、駆動時間ｔ2、予備時間ｔ3を用いて刺激シーケンスを実行する。
【００５６】
また、試料５に刺激光を照射しても検出部９が光量オーバーとならない場合は、集光レンズ６の配置位置の調節を行わなくてもよい。
【００５７】
実施例４は、検出部９の印加電圧値の制御を制御シーケンスで行うことで、ＰＭＴへ入射する蛍光の光量を低減している。
【００５８】
観察に最適な検出部９の印加電圧値を電圧ｘ0とし、検出部９の感度を低下して検出部９を保護するための印加電圧値を電圧ｘ1（ｘ1＝０Ｖ）とする。
【００５９】
刺激開始から蛍光画像取得開始までの時間、つまり試料５に刺激光を照射して刺激を開始してから励起光を試料５に照射して蛍光画像の取得を開始するまでの時間をｔ1、検出部９の印加電圧値を電圧ｘ0から電圧ｘ1に変化させるのまでの所要時間を駆動ｔ2とする。さらに、試料５からの光を検出部９で最適に観察する電圧ｘ0になり、検出部９から電気信号の取得が可能となるまでの予備時間をｔ3とする。予備時間ｔ3を考慮する必要がない場合は、予備時間ｔ3＝０としてもよい。
【００６０】
実施例１と同様に、上記の刺激時間ｔ1、駆動時間ｔ2、予備時間ｔ3を用いて刺激シーケンスを実行する。
【００６１】
また、試料５に刺激光を照射しても検出部９が光量オーバーとならない場合は、検出部９の印加電圧値の制御を行わなくてもよい。
【００６２】
実施例１〜４は、単独で実施されてもよく、他の光量制御手段と並列または連動して実施されてもよい。また、顕微鏡内に検出部９へ入射する光を阻害可能な部材が備えられている場合、その部材を光量制御手段として利用しても良い。
【００６３】
以上のように、本発明を分かりやすくするため実施形態の構成要件を付して説明したが、本発明がこれに限定されるものではないことは言うまでもない。
【符号の説明】
【００６４】
１   レーザ光源部
２   ダイクロイックミラー
３   スキャナ
４   対物レンズ
５   試料
６   集光レンズ
７   ピンホール
８   検出光路切替手段
９   検出部
１０ コントローラ
１１ ＣＰＵ
１２ キャプチャ制御部
１３ スキャナ制御部
１４ レーザ制御部
１５ コンピュータ
１６ ソフトウェア
１７ 光ファイバー
１８ 光学ユニット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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