(57)【要約】【課題】蘇生率が高く細菌の分離が容易なＶＢＮＣ状態の細菌の蘇生方法を提供する。【解決手段】生きているが培養困難な状態の細菌を、分子量５万〜３０万のタンパク質を含む哺乳類由来の培養細胞抽出物を含有する栄養培地で培養し、当該培地より分離することを特徴とする細菌の分離方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きているが培養困難な状態の細菌を、分子量５万〜３０万のタンパク質を含む哺乳類由来の培養細胞抽出物を含有する栄養培地で培養し、当該培地より分離することを特徴とする細菌の分離方法。
【請求項２】
哺乳類由来の培養細胞が、上皮細胞である請求項１記載の細菌の分離方法。
【請求項３】
前記培養細胞抽出の培地中の含有量が、５μｇ／ｍＬ以上である請求項１又は２記載の細菌の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生きているが培養困難な状態の細菌を培養可能な状態に蘇生して分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然界には極めて多種類の細菌が生存しており、それらの細菌の分離手段の典型的な手段は、平板培養法であり、その他種々の分離培養技術が開発されてきた。
【０００３】
しかし、最近、生きているが培養困難な状態（ｖｉａｂｌｅ  ｂｕｔ  ｎｏｎ−ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ：ＶＢＮＣ）で自然界に存在する細菌が数多く存在することが明らかになった。このようなＶＢＮＣ状態の細菌は、培養可能な状態に蘇生させることによってはじめて、その存在が確認できる。かかるＶＢＮＣ状態の細菌の蘇生技術としては、カタラーゼ、システイン化合物、ココナツジュース等を含有する培地で培養する方法（特許文献１〜３）、培養細胞と共培養する方法（非特許文献１〜３）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−８９０１０６号公報
【特許文献２】特開２００６−２８８２７２号公報
【特許文献３】特開２００８−１４２００２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】日本細菌学雑誌，６４（１），１１７頁，２００９
【非特許文献２】日本細菌学雑誌，６５（１），１０７頁，２０１０
【非特許文献３】Miocribiol Immunol., 54(9), 502-507, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、前記従来のＶＢＮＣ状態からの蘇生方法では、蘇生率が十分でない、共培養する場合には蘇生した細菌の単離が困難である等の問題があった。
従って、本発明の課題は、蘇生率が高く、細菌の分離が容易なＶＢＮＣ状態の細菌の蘇生方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、種々の成分を添加してＶＢＮＣ状態の細菌を培養したところ、哺乳類由来の培養細胞抽出物であって、分子量５万〜３０万のタンパク質を含む画分を添加して培養すると、効率良くＶＢＮＣ状態から蘇生し、当該細菌を容易に分離できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、生きているが培養困難な状態の細菌を、分子量５万〜３０万のタンパク質を含む哺乳類由来の培養細胞抽出物を含有する栄養培地で培養し、当該培地より分離することを特徴とする細菌の分離方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明方法によれば、ＶＢＮＣ状態の細菌を効率良く蘇生させ、かつ容易に分離することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の対象細菌は、ＶＢＮＣ状態にある細菌である。ＶＢＮＣ状態にある細菌は、通常、自然界に存在するＶＢＮＣ状態にある細菌である。ここで自然界には、土壌、河水、湖水、植物、動物、海、農地、建物、尿、血液等が含まれる。既知のＶＢＮＣ状態にある細菌の中には、ヒトや動物に対して病原性のある細菌も多く存在する。例えばＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ：コレラ菌）、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｏ１５７を含む各種大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ等が挙げられる。本発明において、これらのヒトや動物に対する病原性細菌のＶＢＮＣ状態を蘇生できれば、感染源の特定等に特に有用である。本発明では、このようなＶＢＮＣ状態の病原菌の存在が疑われる水、土壌、食品等の検体を対象とするのが好ましい。
【００１１】
本発明方法のＶＢＮＣ状態の細菌の蘇生に用いられる培地添加成分は、哺乳類由来の培養細胞抽出物であって、分子量５万〜３０万のタンパク質を含む抽出物である。哺乳類由来の培養細胞としては、ヒトを含む哺乳類由来の細胞であって、培養細胞として供給できることが知られている細胞である。例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、Ｎ１Ｈ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｖｅｒｏ、ＨＴ−２９、Ｃａｃｏ−２、Ｔ８４、Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ４０７、Ｈｅｐ−２等が挙げられる。これらの培養細胞のうち、ヒトに対する病原性細菌を分離するには、ヒト由来の培養細胞がより好ましく、さらに上皮細胞系が好ましく、ＨＴ−２９、Ｔ８４、Ｃａｃｏ−２、Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ４０７等の腸管由来の細胞が特に好ましい。
【００１２】
これらの培養細胞から分子量５万〜３０万のタンパク質を抽出するには、例えばガラスビーズによる破砕法がある。当該タンパク質は、１００℃５分又は７０℃５分で活性を失う。またプロテアーゼＫ処理で活性を失う。またプロテアーゼＫ処理による失活は、プロテアーゼＫの阻害剤、例えば４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルフォニルフルオライドの添加で失活が防止できる。また、培養細胞の培養に用いた培地中には、このタンパク質は存在しない。
従って、培養細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、ガラスビーズによる破砕により得られた抽出物を用いるのが特に好ましい。
【００１３】
栄養培地への前記抽出物のタンパク質としての添加量（含有濃度）は、５μg／ｍＬ以上が好ましく、さらに５〜１３３．３μｇ／ｍＬが好ましく、８．３〜１３３．３μg／ｍＬがさらに好ましい。
【００１４】
ＶＢＮＣ状態の細菌の培養に用いる培地は、通常の栄養培地であればよく、例えばＮＵＴＲＩＥＮＴ  ＢＲＯＴＨ（ＮＢ培地）（ＤＩＦＣＯ社）、ＬＢ−ＢＲＯＴＨ（Ｌｕｒｉａ−Ｂａｒｔａｎｉ−ｂｒｏｔｈ：カゼイン加水分解物  １．０％、酵母エキス  ０．５％、食塩  １．０％、ＤＩＦＣＯ社）、ＴＯＲＹＰＴＩＣ  ＳＯＹ  ＢＲＯＴＨ（ＤＩＦＣＯ社）、ＹＧ培地（グルコース  ０．１％、酵母エキス  ０．１％、Ｋ2ＨＰＯ4  ０．０３％、ＫＨ2ＰＯ4  ０．０２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ０．０２％、ｐＨ６．８）等が使用される。
【００１５】
培養条件は、存在が疑われる細菌が増殖し得る条件、例えば１０〜４０℃で、２４時間〜１０日程度培養すればよい。
【００１６】
蘇生した細菌を分離するには、試料を段階的に希釈後、平板培地に塗布し、一定時間平板培養後、プレート上に形成されるコロニーを分取する方法、あるいは一旦液体培地で集積培養を行った後、平板培養法で分離する方法が行われる。
【実施例】
【００１７】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
【００１８】
実施例１
（１）蘇生因子（ＨＴ−２９抽出物）の調製
コンフルエント状態のＨＴ−２９を集め、ガラスビーズで破砕する。破砕液を４℃、２０，０００ｘｇ、５分間遠心分離し、その上清を回収する。
【００１９】
（２）ＨＴ−２９抽出物の特性
易熱性（１００℃、５分で不活化又は７０℃、５分で不活化）、プロテアーゼＫ処理で不活化し、プロテアーゼＫ阻害剤の添加で不活化を阻害できた。
分子量は限外濾過により５〜３０万の間、およそ１０万程度であり、細胞を培養した培地中には存在しない。
【００２０】
（３）ＨＴ−２９抽出物を添加した寒天平板の調製法
普通寒天をオートクレーブ（ＴＣＢＳの場合は加温溶解）後６０℃に保温する。その後ＨＴ-２９抽出物を２．４ｍｇ／ｐｌａｔｅになるよう加えた後、シャーレに分注する。
【００２１】
（４）ＶＢＮＣの調製
Ｍｉｃｒｏｃｏｓｍ培地の調製；Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎが１％になるよう蒸留水を加えた後、０．２２μｍのフィルターで濾過、オートクレーブを行い、培地中に結晶が見えなくなるまで濾過を繰り返す。
アルカリペプトン水（ＡＰＷ）で１６時間培養したコレラ菌の培養液を遠心管に移し、５０００ｘｇで１０分遠心する。上清を捨て、沈査に等量のＭｉｃｒｏｃｏｓｍ培地を加え、ゆるやかに撹拌する。室温で５０００ｘｇで１０分遠心し、再度洗浄を行う。上清を捨て、沈査を再度懸濁させる。ＯＤ６００ｎｍの吸光度が０．５になるように調製する（このときの菌数が１×１０9ｃｅｌｌ／ｍＬに相当）。Ｍｉｃｒｏｃｏｓｍフラスコに１×１０8ｃｅｌｌ／ｍＬになるよう菌を接種（１Ｌの容量にたいして２００ｍＬ添加）し、４℃で遮光して静置する。
【００２２】
実施例２
（１）ＶＢＮＣの作製
Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａＯ１３９ＶＣ−２８０をＡＰＷで前培養した後、１０8ＣＦＵ／ｍＬになるように１％  Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎに懸濁し、４℃に静置。４２日後、１％  ＮａＣｌ  加普通寒天で培養すると培養可能なＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅは０になったが、ＡＰＷで培養すると、増殖可能なＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅが存在した。その２８日後、つまり、４℃に静置してから７０日後、ＡＰＷで培養しても増殖可能なＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅが認められなかった。
【００２３】
（２）ＶＢＮＣからの回復（蘇生・復帰）
ＶＢＮＣ状態のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅを、培養細胞から抽出した細胞抽出液を適当量加えたＡＰＷに接種し、３７℃で培養した。１〜３日後、ＶＢＮＣ  Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａは培養可能となり、ＡＰＷ中で増殖した。ＶＢＮＣ  Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅが培養可能状態へ復帰したのを確認した細胞はＨＴ−２９、Ｃａｃｏ−２、Ｔ８４、Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ４０７、ＨｅＬａ、ＣＨＯで、最も効果が見られたのはＨＴ−２９細胞であった（表１）。接種したＶＢＮＣはすべて同量とした。用いた細胞抽出液濃度は１．２ｍｇ／ｍＬである。従って、１６倍希釈液の細胞抽出液濃度は０．０７５ｍｇ／ｍＬである。
【００２４】
【表１】
2012110309.tif 000002
【００２５】
（３）他の腸内細菌の効果
ＶＢＮＣ化した各細菌に適量のＨＴ−２９細胞抽出液を加えて、３７℃で培養した。１〜３日後ＶＢＮＣの培養可能状態への復帰が見られた。コレラ菌はＡＰＷ、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（腸炎ビブリオ）は３％ＮａＣｌ加普通ブイヨン、その他の細菌（腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、赤痢菌、サルモネラ菌）は１％ＮａＣｌ加普通ブイヨンで復帰を観察した。得られた結果を表２に示す。希釈倍数と濃度の関係は表１と同じである。
【００２６】
【表２】
2012110309.tif 000003
【００２７】
表１及び表２の結果より、ＶＢＮＣを哺乳類由来の培養細胞抽出液５μg／ｍＬ以上含有する栄養培地で培養すれば、ＶＢＮＣが回復することが判明した。