(57)【要約】【課題】液体試料３中に含まれる微量のエンドトキシンを安価な試薬を用いて短時間で精度良く検出することが可能なエンドトキシン検出方法を提供する。【解決手段】液体試料３中のエンドトキシンの検出方法であって、（ａ）選択透過膜４に酸化剤２と反応するエンドトキシン以外の分子量が１０００以下の酸化可能化合物を含有する液体試料３を通すことによりエンドトキシンを捕捉する工程、（ｂ）洗浄液５を前記液体試料３と同じ方向に通すことにより、前記選択透過膜４を洗浄して前記酸化可能化合物を除去する工程、（ｃ）剥離液を前記液体試料３と逆方向に流すことにより、前記選択透過膜４からエンドトキシン濃縮試料を得る工程、（ｄ）前記エンドトキシン濃縮試料と酸化剤２とを混合することによりエンドトキシンと酸化剤２との酸化反応を行う工程、（ｅ）未反応の酸化剤２の量を計測する工程、をこの順番で行ってエンドトキシンを検出する。【選択図】図１
2012026807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化剤と反応するエンドトキシン以外の分子量が１０００以下の酸化可能化合物を含有する液体試料中のエンドトキシンの検出方法であって、
（ａ）エンドトキシンを捕捉し、前記酸化可能化合物が透過する選択透過膜に前記液体試料を通すことによりエンドトキシンを捕捉する工程、
（ｂ）エンドトキシンと、前記酸化可能化合物のいずれも含有しない洗浄液を前記液体試料と同じ方向に通すことにより、前記選択透過膜を洗浄して前記酸化可能化合物を除去する工程、
（ｃ）剥離液を前記液体試料と逆方向に流すことにより、前記選択透過膜からエンドトキシン濃縮試料を得る工程、
（ｄ）前記エンドトキシン濃縮試料と酸化剤とを混合することによりエンドトキシンと酸化剤との酸化反応を行う工程、
（ｅ）未反応の酸化剤の量を計測する工程、
をこの順番で行うことを特徴とするエンドトキシンの検出方法。
【請求項２】
前記選択透過膜が、中空糸膜である請求項１記載のエンドトキシンの検出方法。
【請求項３】
前記選択透過膜の平均孔径が０．００４〜０．５μｍである請求項１又は２記載のエンドトキシンの検出方法。
【請求項４】
（ｅ）工程において、未反応の酸化剤の量を化学発光により計測する請求項１〜３のいずれか記載のエンドトキシンの検出方法。
【請求項５】
酸化剤と反応するエンドトキシン以外の分子量が１０００以下の酸化可能化合物を含有する液体試料中のエンドトキシンの検出装置であって、
エンドトキシンを捕捉し、酸化剤と反応するエンドトキシン以外の分子量が１０００以下の酸化可能化合物が透過する選択透過膜に、前記酸化可能化合物を含有する液体試料を通してエンドトキシンを捕捉する手段と、
エンドトキシンと、前記酸化可能化合物のいずれも含有しない洗浄液を前記液体試料と同じ方向に通して前記選択透過膜を洗浄して前記酸化可能化合物を除去する手段と、
剥離液を前記液体試料と逆方向に流して前記選択透過膜からエンドトキシン濃縮試料を得る手段と、
前記エンドトキシン濃縮試料と酸化剤とを混合してエンドトキシンと酸化剤との酸化反応を行い、未反応の酸化剤の量を計測する手段とを備えたことを特徴とするエンドトキシン検出装置。
【請求項６】
請求項５記載のエンドトキシン検出装置を備えた人工透析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料中のエンドトキシンの検出方法、及びそれに用いられるエンドトキシン検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンは各種微生物の細胞壁成分であり、体内に入ると著しい発熱、血圧低下、代謝障害等を生じ、時には死に至る場合もある。例えば、透析液中にエンドトキシンが含まれていると透析治療の際に障害が生じるおそれがあるため、透析治療現場ではエンドトキシンの検出が必須である。
【０００３】
エンドトキシンの検出方法としては、リムルス試薬を用いる方法が一般的に知られている。リムルス試薬を用いた具体的なエンドトキシンの検出方法として、試料溶液にリムルス試薬を加えて攪拌後に約３７℃で加温し、そのゲル化を透過光の変化あるいは比色法によって検出し、ゲル化するまでの時間や光透過率からエンドトキシン濃度を測定する方法が知られている。しかしながら、リムルス試薬を用いたエンドトキシンの検出方法は、通常の測定に約９０分を要し、また、リムルス試薬は非常に高価（１回の測定コストが約３，０００円）である。したがって、安全性を確認するためには頻繁に測定することが必要であるにも関わらず、最低限の測定しかなされていなかった。
【０００４】
特許文献１には、リムルス試薬を用いたエンドトキシンの検出方法の代わりに、エンドトキシンと特異的に結合するポリミキシンＢを金薄膜に固定化し、これをエンドトキシンを含む検体と接触させることによりエンドトキシンを捕捉し、捕捉されたエンドトキシンに対して酵素標識物質を直接又は間接的に結合させ、酵素と反応して化学発光する発光基質を接触させて、化学発光量を測定することによりエンドトキシンを測定する方法について記載されている。これによれば、簡便にエンドトキシンを測定することができるとされている。しかしながら、エンドトキシンを特異的に吸着させる担体を作製するには時間を要する等の問題がある。また、酵素標識物質を用いた酵素活性を測定する方法は、エンドトキシンと直接反応する化合物を測定する方法とは異なり、必ずしも簡便にエンドトキシンの測定ができるわけではない。
【０００５】
また、特許文献２には、アミノ基またはイミノ基を有する化合物を固定化した織布または不織布を、フィルターに固定し、固定された織布または不織布に、リポ多糖の存在が疑われる検体液を一回もしくは数回通過させて、クロースエンザイムイムノアッセイを行うリポ多糖（ＬＰＳ）の検出方法について記載されている。これによれば、リポ多糖を吸着させることのできるポリミキシンＢを用いた場合と比べて、安価にリポ多糖吸着体を提供でき、また、ポリミキシンＢを用いた場合と同等あるいはそれ以上の測定感度を有するとされている。しかしながら、標識抗体を用いたイミノアッセイによりリポ多糖を検出する方法は、エンドトキシンと直接反応する化合物を測定する方法とは異なり、必ずしも簡便にエンドトキシンの測定ができるわけではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２００９６１号公報
【特許文献２】特開２００３−２０２３２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、液体試料中に含まれる微量のエンドトキシンを、安価な試薬を用いて短時間で精度良く検出することが可能なエンドトキシン検出方法を提供することを目的とするものである。また、そのような検出方法を実現させる好適な装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
エンドトキシンが過酸化水素などの酸化剤により酸化されることは知られているが、極低濃度のエンドトキシンを含む液体中のエンドトキシンを検出するには、酸化剤と反応する他の共存物質を除去するとともに、液体中のエンドトキシンを検出可能な濃度にまで濃縮する手段が必要である。エンドトキシンは多糖体部位と疎水性基からなり水溶液中では多糖体部位を外側に疎水性基を内側にした分子量数十万から数百万のミセル会合体を形成するが、透析液などの電解質中ではこれらのミセルが解離し、分子量の低いエンドトキシンフラグメントに分解することが報告されている（山下征二著「エンドトキシンとパイロジェン、血液透析スタッフのためのハイパフォーマンスメンブレン，p.247，東京医学社，東京，1990」）。
【０００９】
この性質を利用して、エンドトキシンを含む電解質溶液（例えば透析液）をエンドトキシンを吸着・捕獲しやすいフィルター膜（例えば疎水性部分を有する半透膜）に流通してエンドトキシンを吸着・捕獲し、次に洗浄液（例えば精製水）をこの膜に流通して酸化剤と反応する低分子量の妨害物質を膜外に排出すると共に低分子量の電解質を膜外に排出することによりエンドトキシンにミセルを形成せしめる。次にエンドトキシンがミセルを形成する剥離液（例えば精製水）を逆方向に流通せしめることによりミセル化したエンドトキシンが容易にフィルター膜から剥離して剥離液中に分散することを見出した。この結果に基づいて以下のエンドトキシンの濃縮・検出方法を考案した。
【００１０】
上記課題は、酸化剤と反応するエンドトキシン以外の分子量が１０００以下の酸化可能化合物を含有する液体試料中のエンドトキシンの検出方法であって、
（ａ）エンドトキシンを捕捉し、前記酸化可能化合物が透過する選択透過膜に前記液体試料を通すことによりエンドトキシンを捕捉する工程、
（ｂ）エンドトキシンと、前記酸化可能化合物のいずれも含有しない洗浄液を前記液体試料と同じ方向に通すことにより、前記選択透過膜を洗浄して前記酸化可能化合物を除去する工程、
（ｃ）剥離液を前記液体試料と逆方向に流すことにより、前記選択透過膜からエンドトキシン濃縮試料を得る工程、
（ｄ）前記エンドトキシン濃縮試料と酸化剤とを混合することによりエンドトキシンと酸化剤との酸化反応を行う工程、
（ｅ）未反応の酸化剤の量を計測する工程、をこの順番で行うことを特徴とするエンドトキシンの検出方法を提供することによって解決される。
【００１１】
このとき、前記選択透過膜が、中空糸膜であることが好適であり、前記選択透過膜の平均孔径が０．００４〜０．５μｍであることが好適である。また、（ｅ）工程において、未反応の酸化剤の量を化学発光により計測することが好適である。
【００１２】
また、上記課題は、酸化剤と反応するエンドトキシン以外の分子量が１０００以下の酸化可能化合物を含有する液体試料中のエンドトキシンの検出装置であって、
エンドトキシンを捕捉し、酸化剤と反応するエンドトキシン以外の分子量が１０００以下の酸化可能化合物が透過する選択透過膜に、前記酸化可能化合物を含有する液体試料を通してエンドトキシンを捕捉する手段と、
エンドトキシンと、前記酸化可能化合物のいずれも含有しない洗浄液を前記液体試料と同じ方向に通して前記選択透過膜を洗浄して前記酸化可能化合物を除去する手段と、
剥離液を前記液体試料と逆方向に流して前記選択透過膜からエンドトキシン濃縮試料を得る手段と、
前記エンドトキシン濃縮試料と酸化剤とを混合してエンドトキシンと酸化剤との酸化反応を行い、未反応の酸化剤の量を計測する手段とを備えたことを特徴とするエンドトキシン検出装置を提供することによっても解決される。
【００１３】
このとき、上記エンドトキシン検出装置を備えた人工透析装置が本発明の好適な実施態様である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、液体試料中に含まれる微量のエンドトキシンを安価な試薬を用いて短時間で精度良く検出することができる。特に、液体試料が透析液である場合、透析液にエンドトキシンが存在するかどうかを短時間で精度良く検出することができるため、安全性の確認等を迅速に行うことができる。また、本発明のエンドトキシン検出方法は、繰返し測定することができ、例えば、透析治療中においても透析液にエンドトキシンが存在するかどうかを適宜迅速に行うことができるため、透析治療の安全性をより向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明のエンドトキシン検出装置の一例を示した概略図である。
【図２】実施例１で得られた化学発光応答波形図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図面を参照しながら本発明をより具体的に説明する。図１は、本発明のエンドトキシン検出装置１の一例を示した概略図であり、エンドトキシンを捕捉し、酸化剤２と反応するエンドトキシン以外の分子量が１０００以下の酸化可能化合物が透過する選択透過膜４に、前記酸化可能化合物を含有する液体試料３を通してエンドトキシンを捕捉する手段と、エンドトキシンと、前記酸化可能化合物のいずれも含有しない洗浄液５を前記液体試料３と同じ方向に通して前記選択透過膜４を洗浄して前記酸化可能化合物を除去する手段と、エンドトキシンと、前記酸化可能化合物のいずれも含有しない剥離液を前記液体試料３と逆方向に通して前記選択透過膜４からエンドトキシン濃縮試料を得る手段と、前記エンドトキシン濃縮試料と酸化剤２とを混合してエンドトキシンと酸化剤２との酸化反応を行い、未反応の酸化剤２の量を計測する手段とを備えたものである。
【００１７】
本発明のエンドトキシン検出装置１は、酸化剤２と反応するエンドトキシン以外の分子量が１０００以下の酸化可能化合物が透過する選択透過膜４に、前記酸化可能化合物を含有する液体試料３を通してエンドトキシンを選択透過膜４に捕捉する手段を備える。図１では、液体試料供給部６内にある液体試料３が、電動スライダ２７の移動により電磁バルブ（三方弁）１２を通じてサンプリング容器７内に導入される。次いで、容器８側に電磁バルブ１２を切り替え、電動スライダ２７の移動により、液体試料３が容器８内に配管１７を通じて導入される。これにより、エンドトキシンが選択透過膜４に吸着し、前記酸化可能化合物が選択透過膜４を通過して排出されるため、選択透過膜４にエンドトキシンを捕捉することができる。
【００１８】
本発明で用いられる液体試料３としては、エンドトキシンの検出を必要とする試料であれば特に限定されず、透析液、透析廃液、血液、尿、注射用水、医薬品、組織液（腹水、胸水）等が挙げられる。また、本発明において、酸化剤２と反応するエンドトキシン以外の分子量が１０００以下の酸化可能化合物とは、酸化剤２と反応することにより酸化される分子量が１０００以下の化合物であってエンドトキシン以外のものをいう。前記酸化可能化合物は、好適には分子量が５００以下の化合物である。例えば、本発明で用いられる液体試料３が透析液である場合は、酸化剤２と反応することにより酸化されるブドウ糖、電解質等が挙げられる。
【００１９】
本発明で用いられるサンプリング容器７としては特に限定しないが、可変容量型容器であることが好ましい。サンプリング容器７の形状としては、円筒容器であっても角型の筒状容器であってもよく、好適には円筒容器が用いられる。また、サンプリング容器７に各試料を導入する操作としては特に限定されず、一定量の各試料を導入することができる観点から、電動スライダ２７のような自動制御手段が備えられていることが好ましい。
【００２０】
本発明で用いられる液体試料供給部６としては、液体試料３の供給が可能であれば特に限定されず、図１に示されるように液体試料３が一定量満たされた容器等が挙げられる。液体試料３に含まれるエンドトキシンの検出をリアルタイムで行う観点からは、液体試料溶液供給部６に対して随時新たな液体試料３を供給できる手段を備えていることが好ましい。
【００２１】
本発明で用いられる選択透過膜４は、エンドトキシンを捕捉し、酸化剤２と反応するエンドトキシン以外の分子量が１０００以下の酸化可能化合物が透過するものである。選択透過膜４の形状としては特に限定されず、平膜であっても中空糸膜であってもよいが、単位体積当たりの表面積を大きくすることができる観点から中空糸膜が好適に採用される。選択透過膜４を構成する材料としては特に限定されず、医療用の材料、特に血液透析に用いられる材料が好適に採用される。具体的には、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリフェニルスルホンなどのポリスルホンポリマー；ポリアクリロニトリル；ポリアミド；ポリメチルメタクリレート；ポリテトラフルオロエチレン；ポリビニルアルコール；エチレン−ビニルアルコール共重合体；セルロース；ポリエチレンからなる群から選択される少なくとも１種が選択透過膜４として好適に用いられる。前記材料は、単独重合体でも共重合体であっても構わない。中でも、ポリスルホンポリマー、ポリアクリロニトリル、セルロース、ポリエチレンからなる群から選択される少なくとも１種が選択透過膜４としてより好適に用いられる。
【００２２】
本発明で用いられる選択透過膜４の平均孔径としては特に限定されず、０．００４〜０．５μｍであることが好ましい。平均孔径が０．００４μｍ未満の場合、液体試料３を選択透過膜４に通す際に著しく長時間を要し、また該選択透過膜４が目詰まりを起こして、エンドトキシン濃縮試料を得ることが困難となるおそれがあり、０．００６μｍ以上であることがより好ましい。一方、平均孔径が０．５μｍを超える場合、エンドトキシンが選択透過膜４を通過してしまい、エンドトキシン濃縮試料を得ることが困難となるおそれがあり、０．３μｍ以下であることがより好ましい。また、本発明で用いられる選択透過膜４の膜厚としては特に限定されず、３０〜７０μｍであることが好ましい。また、本発明で用いられる選択透過膜４が中空糸膜である場合、中空糸膜の内径が１００〜４００μｍであることが好ましく、１７０〜３３０μｍであることがより好ましい。
【００２３】
また、本発明のエンドトキシン検出装置１は、エンドトキシンと、前記酸化可能化合物のいずれも含有しない洗浄液５を前記液体試料３と同じ方向に通して前記選択透過膜４を洗浄して前記酸化可能化合物を除去する手段を備える。図１では、洗浄液供給部９内にある洗浄液５が、電動スライダ２７の移動により電磁バルブ（三方弁）１１を通じてサンプリング容器７内に導入される。次いで、容器８側に電磁バルブ１１を切り替え、電動スライダ２７の移動により、洗浄液５が容器８内に配管１７を通じて導入される。これにより、洗浄液５が液体試料３と同じ方向に選択透過膜４を通過して該選択透過膜４が洗浄され、酸化剤２と反応するエンドトキシン以外の分子量が１０００以下の酸化可能化合物が除去される。洗浄液５としては、精製水等が好適に使用される。
【００２４】
本発明で用いられる洗浄液供給部９としては、洗浄液５の供給が可能であれば特に限定されず、図１に示されるように洗浄液５が一定量満たされた容器等が挙げられる。また、洗浄液供給部９に対して随時新たな洗浄液５を供給できる手段を備えていることも好適な実施態様である。
【００２５】
また、本発明のエンドトキシン検出装置１は、剥離液を前記液体試料３と逆方向に通して前記選択透過膜４からエンドトキシン濃縮試料を得る手段を備える。図１では、容器８内の選択透過膜４の反対側に存在する液体が、剥離液として電動スライダ２７の移動により選択透過膜４を通過して配管１７を通じてサンプリング容器７内に導入される。これにより、サンプリング容器７内にエンドトキシン濃縮試料が得られることとなる。本発明において、別途剥離液供給部を設けて、該剥離液供給部から剥離液が供給される実施態様であってもよい。その場合、剥離液としては、前記洗浄液５と同様に精製水等が好適に使用される。
【００２６】
また、図１に示されるように、エンドトキシンと酸化剤２を均一に混合すると共に、その混合液の一定量を精確にサンプリングして反応槽シリンジ２４に導入する観点から、サンプリング容器７内に導入されたエンドトキシン濃縮試料が電磁バルブ１４、配管１８を通じて、バッファタンク２０内に一時的にストックされることが好ましい。このとき、エンドトキシンがバッファタンク２０内壁へ付着するのを防止するとともに、後述するエンドトキシンと酸化剤２との酸化反応が精度良く行われる観点から、バッファタンク２０内にあるエンドトキシン濃縮試料を適宜攪拌する手段あるいは常時流通する手段を備えていることが好ましい。
【００２７】
更に、本発明のエンドトキシン検出装置１は、前記エンドトキシン濃縮試料と酸化剤２とを混合してエンドトキシンと酸化剤２との酸化反応を行い、未反応の酸化剤２の量を計測する手段を備える。図１では、バッファタンク２０内に酸化剤２が電磁バルブ１３、電磁バルブ１４、配管１８を通じて添加され、バッファタンク２０内にあるエンドトキシン濃縮試料と酸化剤２とが混合されてエンドトキシンと酸化剤２との酸化反応が行われる。次いで、未反応の酸化剤２の量を計測する手段により、未反応の酸化剤２の量が計測され、エンドトキシンの検出が可能となる。
【００２８】
本発明で用いられる酸化剤供給部１０としては、酸化剤２の供給が可能であれば特に限定されず、図１に示されるように酸化剤２が一定量満たされた容器等が挙げられる。また、酸化剤供給部１０に対して随時新たな酸化剤２を供給できる手段を備えていることも好適な実施態様である。
【００２９】
本発明で用いられる酸化剤２としては、エンドトキシンと酸化反応する化合物であれば特に限定されず、過酸化水素；次亜塩素酸、次亜臭素酸、次亜ヨウ素酸などの次亜ハロゲン酸又はその塩；過マンガン酸塩等が挙げられる。中でも、過酸化水素、次亜ハロゲン酸又はその塩が好適に用いられる。
【００３０】
本発明で用いられる反応槽２４としては特に限定されないが、可変容量型容器であることが好ましい。反応槽２４の形状としては、円筒容器であっても角型の筒状容器であってもよいが、攪拌効率が良好である観点から、好適には円筒容器が用いられる。未反応の酸化剤２の量を計測する手段が、未反応の酸化剤２と化学発光試薬２２との反応により生じた化学発光を測定する手段である場合、反応槽２４の少なくとも一部が透明部を有していて、該透明部の外側に光電子増倍管２６が配置されていることが好ましい。また、反応槽２４に各試料を導入する操作としては特に限定されず、一定量の各試料を精度良く導入することができる観点から、電動スライダ２８のような自動制御手段が備えられていることが好ましい。
【００３１】
ここで、本発明において、未反応の酸化剤２の量を計測する手段としては特に限定されず、未反応の酸化剤２と化学発光試薬２２との反応により生じた化学発光を測定する手段であってもよいし、酸化剤の電極反応を利用したポテンシオメトリーあるいはアンペロメトリーなどの電気化学的手段であってもよい。短時間で精度良く低濃度のエンドトキシンの検出が可能である観点から、未反応の酸化剤２の量を計測する手段が、未反応の酸化剤２と化学発光試薬２２との反応により生じた化学発光を測定する手段であることが好適な実施態様である。
【００３２】
図１に示されるように、未反応の酸化剤２の量を計測する手段として、未反応の酸化剤２と化学発光試薬２２との反応により生じた化学発光を測定する手段を備えている。具体的には、バッファタンク２０内にある未反応の酸化剤２を含む混合液が電動スライダ２８の移動により、配管１９、電磁バルブ１５、電磁バルブ１６を通じて反応槽２４に導入され、次いで、化学発光触媒供給部２３から化学発光触媒２１が反応槽２４内に導入され、更に、化学発光試薬供給部２５から化学発光試薬２２が反応槽２４内に導入される。その結果、反応槽２４内で未反応の酸化剤２と化学発光試薬２２との反応により化学発光が生じ、光電子増倍管２６により化学発光量が測定される。
【００３３】
本発明のエンドトキシン検出方法は、（ａ）エンドトキシンを捕捉し、前記酸化可能化合物が透過する選択透過膜４に前記液体試料３を通すことによりエンドトキシンを捕捉する工程、（ｂ）エンドトキシンと、前記酸化可能化合物のいずれも含有しない洗浄液５を前記液体試料３と同じ方向に通すことにより、前記選択透過膜４を洗浄して前記酸化可能化合物を除去する工程、（ｃ）剥離液を前記液体試料３と逆方向に流すことにより、前記選択透過膜４からエンドトキシン濃縮試料を得る工程、（ｄ）前記エンドトキシン濃縮試料と酸化剤２とを混合することによりエンドトキシンと酸化剤２との酸化反応を行う工程、（ｅ）未反応の酸化剤２の量を計測する工程をこの順番で行うことを特徴とする。
【００３４】
すなわち、本発明のエンドトキシン検出方法は、選択透過膜４に液体試料３を通すことによりエンドトキシンを選択透過膜４に吸着させ、洗浄液５を用いて前記選択透過膜４を洗浄して前記酸化可能化合物を除去し、剥離液を前記液体試料３と逆方向に流すことにより、前記選択透過膜４からエンドトキシン濃縮試料を得て、得られたエンドトキシン濃縮試料と酸化剤２とを混合することによりエンドトキシンと酸化剤２との酸化反応を行い、酸化剤２の残存量を測定することで液体試料３中にエンドトキシンが存在するかどうかを確認できる方法である。本発明のように、（ａ）〜（ｅ）の工程をこの順番で行うエンドトキシン検出方法は、液体試料３中に含まれる微量のエンドトキシンを短時間で検出することができる。
【００３５】
（ａ）工程は、選択透過膜４に液体試料３を通すことによりエンドトキシンを捕捉することを特徴とする。（ａ）工程において、選択透過膜４に液体試料３を通す方法としては特に限定されず、適宜、手動で液体試料３を選択透過膜４に通してもよいし、図１に示されるように、電動スライダ２７あるいは定量送液ポンプのような自動制御手段により、液体試料３が一定量配管１７を通じて供給されて、液体試料３を選択透過膜４に通すような実施態様であってもよい。また、本発明では、エンドトキシンを捕捉する（ａ）工程を繰り返すことにより、選択透過膜４にエンドトキシンを吸着させる量を増やすことができるため、液体試料３中に含まれるエンドトキシンが極微量であっても検出することが可能となる。
【００３６】
（ｂ）工程は、（ａ）工程において液体試料３を選択透過膜４に通す方法と同様に、洗浄液５を前記液体試料３と同じ方向に通して選択透過膜４を洗浄し、前記酸化可能化合物を除去することを特徴とする。前記酸化可能化合物が残存している場合には、後述するエンドトキシンと酸化剤２との酸化反応において、前記酸化可能化合物と酸化剤２との酸化反応も同時に行われてしまうため、酸化剤２の残存量に影響を及ぼすこととなる。したがって、洗浄液５を用いて選択透過膜４を洗浄することの意義は大きい。洗浄液５を前記液体試料３と同じ方向に通して選択透過膜４を洗浄する方法としては特に限定されず、（ａ）工程において液体試料３を選択透過膜４に通す方法と同様の方法を採用することができる。また、（ｂ）工程を繰り返すことにより、酸化剤２と反応するエンドトキシン以外の分子量が１０００以下の酸化可能化合物を除去する効果が大きくなる。
【００３７】
（ｃ）工程は、剥離液を前記液体試料３と逆方向に流すことにより、前記選択透過膜４からエンドトキシン濃縮試料を得る工程である。図１に示されるように、容器８内の選択透過膜４の反対側に存在する液体が、剥離液として電動スライダ２７の移動により選択透過膜４を透過して配管１７を通じてサンプリング容器７内に導入される実施態様が好適に採用される。また、選択透過膜４中に存在する液体が剥離液として機能してもよく、膜中に存在する液体が移動して膜の表面に付着しているエンドトキシンを剥離することもできる。更に、別途剥離液供給部を設けて、該剥離液供給部から剥離液が供給される実施態様であってもよい。
【００３８】
（ｄ）工程は、前記エンドトキシン濃縮試料と酸化剤２とを混合することによりエンドトキシンと酸化剤２との酸化反応を行うことを特徴とする。エンドトキシン濃縮試料と酸化剤２とを混合する方法としては特に限定されず、通常の攪拌装置を用いて混合する方法が好適に採用される。図１に示されるように、バッファタンク２０内でエンドトキシン濃縮試料を攪拌している中に酸化剤２を添加することにより混合する実施態様であってもよいし、酸化剤２を含む試料を攪拌している中にエンドトキシン濃縮試料を添加することにより混合する実施態様であってもよい。
【００３９】
（ｅ）工程は、（ｄ）工程においてエンドトキシンと酸化剤２との酸化反応を行った後の未反応の酸化剤２の量を計測することを特徴とする。未反応の酸化剤２の量を計測する方法としては特に限定されず、未反応の酸化剤２と化学発光試薬２２との反応により生じた化学発光を測定する方法であってもよいし、未反応の酸化剤２の電極反応を利用した電気化学的測定方法であってもよい。短時間で精度良く低濃度のエンドトキシンの検出が可能である観点から、未反応の酸化剤２の量を計測する工程が、未反応の酸化剤２の量を化学発光により計測する工程であることが好ましい。ここで、未反応の酸化剤２の量を化学発光により計測する方法としては特に限定されないが、図１に示されるように、反応槽２４内で未反応の酸化剤２と化学発光試薬２２とが混合されて化学発光が生じ、生じた化学発光を光電子増倍管２６により計測する方法が好適に採用される。
【００４０】
このように、本発明のエンドトキシン検出方法は、短時間で精度良くエンドトキシンを検出することができ、特に、リアルタイムでエンドトキシンを検出することができるため、安全性の確認等を迅速に行うことができる。例えば、透析治療、薬剤調製、食品加工等を行う際に、エンドトキシンが試料中に含まれているかどうかを短時間で精度良く検出することができる。したがって、短時間で繰返し測定することができ、例えば、透析治療中においても透析液にエンドトキシンが存在するかどうかを適宜迅速に行うことができるため、透析治療の安全性をより向上させることができる。また、本発明は、自動制御によるエンドトキシンの検出を行うことも可能であるため、熟練した技術者等でなくてもエンドトキシンを検出することができる。例えば、家庭での透析治療においても安全性の確認を簡便かつ迅速に行うことができる。
【００４１】
本発明で用いられる液体試料３が透析液や透析廃液等である場合、本発明のエンドトキシン検出装置１を備えた人工透析装置が本発明の好適な実施態様である。このとき、血液透析前に予め人工透析装置に用いられる透析液にエンドトキシンが含まれていないかを検出する実施態様であってもよいし、血液透析後における透析廃液にエンドトキシンが含まれていないことを検出する実施態様であってもよい。特に、血液透析を行う際に直接体内に必要成分が輸液される実施態様である場合には、予めエンドトキシンが含まれていないことを確認することで安全性を確保することができる。また、極めてまれに透析液中に細菌が混入する場合があるが、このような細菌は分子量が１０００以上であるため選択透過膜４に捕獲されて剥離液中に分散し、酸化剤と反応するために酸化剤の濃度低下として検出できるので、安全性を更に向上させることができる。更に、透析治療の終了のタイミングを知ることのできる尿素濃度測定装置と組み合わせて使用することも本発明の好適な実施態様である。このとき、エンドトキシンの検出と尿素濃度の測定を同じ測定装置を用いて行うことも可能である。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明する。
【００４３】
実施例１
図１は本発明のエンドトキシン検出装置１の一例を示した概略図である。サンプリング容器７としてサンプリングシリンジ７、選択透過膜４を有する容器８としてダイアライザ８、液体試料３として、リムルス試薬を用いて測定されたエンドトキシン濃度が各々９．３ＥＵ／Ｌ（透析液Ａ）と０．８５ＥＵ／Ｌ（透析液Ｂ）である透析液３、酸化剤２として過酸化水素、化学発光触媒２１としてヘモグロビン触媒、化学発光試薬２２としてルミノール試薬を用い、以下の手順によりエンドトキシンの検出を行った。
【００４４】
（１）電磁バルブ１２を切り替えて、エンドトキシンの有無を検出する液体試料３として透析液３をサンプリングシリンジ７に１００ｍＬ吸入した。次いで、電磁バルブ１２を切り替え、透析液３をサンプリングシリンジ７からダイアライザ８（ニプロ株式会社製シュアライザーＰＥＳ−１７０Ｅβ（平均孔径：０．００７６μｍ、膜厚４０μｍ、中空糸膜の内径：２００μｍ）に配管１７を通じて排出した。この操作を５回繰り返した。このとき、ダイアライザ８の血液排出口が閉じられているため、透析液３中のエンドトキシン以外の分子量が１０００以下の酸化可能化合物であるブドウ糖や電解質などはダイアライザ８における中空繊維を透過して排出され、中空繊維を透過できないエンドトキシンは選択透過膜４に捕捉され、中空繊維内に滞留した。上記（１）の全操作に要した時間は約３．５分であった。
【００４５】
（２）次に、電磁バルブ１１を切り替えて、洗浄液５である精製水をサンプリングシリンジ７に１００ｍＬ吸入した。次いで、電磁バルブ１１を切り替えて、前記精製水をサンプリングシリンジ７からダイアライザ８に配管１７を通じて排出した。この操作を２回繰り返した。このとき、ダイアライザ８内の透析液３中のエンドトキシン以外の分子量が１０００以下の酸化可能化合物であるブドウ糖や電解質のすべてがダイアライザ８から排出され、中空繊維内にはエンドトキシンが濃縮されて滞留した。上記（２）の全操作に要した時間は約１．４分であった。
【００４６】
（３）続いて、選択透過膜４の反対側に存在する液体を前記透析液３と逆方向に選択透過膜４を通過させることにより、ダイアライザ８からエンドトキシンを含む濃縮試料を配管１７、電磁バルブ１１、１２、１３、１４を通じてサンプリングシリンジ７に導入した。次いで、電磁バルブ１４を切り替えて、前記エンドトキシンを含む濃縮試料を配管１８を通じてバッファタンク２０内に９０ｍＬ導入した。このとき、エンドトキシンがバッファタンク２０の壁面に付着しないように、攪拌子２９及び磁気攪拌器３０を用いてバッファタンク２０内のエンドトキシンを含む濃縮試料を常に攪拌した。
【００４７】
（４）更に、電磁バルブ１３及び１４を切り替え、酸化剤供給部１０から１００ｐｐｂの過酸化水素水を電磁バルブ１３及び１４を通じてサンプリングシリンジ７に１０ｍＬ吸入した。その後、電磁バルブ１４を切り替えて、前記過酸化水素水の全量をバッファタンク２０に添加した。このとき、過酸化水素水の濃度は、バッファタンク２０内のエンドトキシンを含む濃縮試料によって希釈されて減少するとともに、バッファタンク２０内でエンドトキシンと過酸化水素との酸化反応が行われることによって、エンドトキシンの量に応じて過酸化水素が消費され、過酸化水素の濃度が減少した。上記（４）の操作に要した時間は約０．５分であった。
【００４８】
（５）次いで、電磁バルブ１５及び１６を切り替えて、バッファタンク２０内から配管１９、電磁バルブ１５、１６を通じて未反応の過酸化水素を含む試料を０．２ｍＬ反応槽シリンジ２４内に配管１９を通じて導入した。
【００４９】
（６）更に、電磁バルブ１６を切り替えて、化学発光触媒供給部２３から触媒を含む水溶液（ヘモグロビン５ｍｇ／ｄＬ、スクロース４９５ｍｇ／ｄＬ）０．２ｍＬを電磁バルブ１６を通じて反応槽シリンジ２４内に導入した。
【００５０】
（７）最後に、電磁バルブ１５及び１６を切り替えて、化学発光試薬供給部２５からルミノール試薬（０．０８Ｎ  ＮａＯＨ、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ  ルミノール）０．６ｍＬを電磁バルブ１５、１６を通じて反応槽シリンジ２４内に導入した。その結果、反応槽シリンジ２４内で生じたルミノールの化学発光を光電子増倍管２６（浜松ホトニクス株式会社製「Ｈ７１５５」）でフォトンカウンティング法により計測した。上記（１）〜（７）の手順に要した時間は約８．５分であった。
【００５１】
リムルス試薬を用いて測定されたエンドトキシン濃度が９．３ＥＵ／Ｌである透析液Ａ、及び０．８５ＥＵ／Ｌである透析液Ｂについて、上記（１）〜（７）の手順により生じた化学発光を光電子増倍管２６（浜松ホトニクス株式会社製「Ｈ７１５５」）で３回繰り返し計測して得られた化学発光応答波形図を図２に示す。
【００５２】
図２から分かるように、エンドトキシン濃度が０．８５ＥＵ／Ｌである透析液Ｂについての化学発光強度（応答波形Ｂ）に比べて、エンドトキシン濃度が９．３ＥＵ／Ｌである透析液Ａについての化学発光強度（応答波形Ａ）における反応２分後の値は明らかに減少しており、３回の繰り返し測定においていずれも明確な差異が認められた。したがって、本発明のエンドトキシン検出方法により、９ＥＵ／Ｌ程度のエンドトキシンの存在を明確に検出できることが分かった。特に、エンドトキシン濃度が９ＥＵ／Ｌ以下の透析液は、透析治療に用いても問題ないものとされているため、本発明のエンドトキシン検出方法を用いることにより、透析液中のエンドトキシン濃度が安全な範囲にあるか否かを判別することが可能であることが明らかとなった。
【符号の説明】
【００５３】
１  エンドトキシン検出装置
２  酸化剤
３  液体試料（透析液）
４  選択透過膜
５  洗浄液
６  液体試料供給部
７  サンプリング容器（サンプリングシリンジ）
８  容器（ダイアライザ）
９  洗浄液供給部
１０  酸化剤供給部
１１、１２、１３、１４、１５、１６  電磁バルブ（三方弁）
１７、１８、１９  配管
２０  バッファタンク
２１  化学発光触媒
２２  化学発光試薬
２３  化学発光触媒供給部
２４  反応槽（反応槽シリンジ）
２５  化学発光試薬供給部
２６  光電子増倍管
２７、２８  電動スライダ
２９  攪拌子
３０  磁気攪拌器
【図１】
2012026807.tif 000003
【図２】
2012026807.tif 000004