(57)【要約】      （修正有）【課題】アルツハイマー病、プリオン疾患、家族性アミロイドニューロパシーなどを包含する多数のアミロイド疾患を予防もしくは治療するための製薬学的組成物および方法の提供。【解決手段】患者においてアミロイド成分に対する免疫応答を誘導するのに有効な作用物質および製薬学的賦形剤を含んで成る製薬学的組成物。該作用物質は、ＡＡ、ＡＬ、ＡＴＴＲ、ＡアポＡ１、Ａｌｙｓ、Ａｇｅｌ、Ａｃｙｓ、Ａβ、ＡＢ2Ｍ、ＡＳｃｒ、Ａｃａｌ、ＡＩＡＰＰおよびシヌクレイン−ＮＡＣフラグメントより成る群から選択される原線維前駆体タンパク質由来である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者においてアミロイド成分に対する免疫応答を誘導するのに有効な作用物質および製薬学的賦形剤を含んで成る製薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトおよび他の哺乳動物の脊椎動物におけるアミロイドに関係する症状の処置組成物および処置方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドーシスは、限局された部位でもしくは全身性に発生することができる、多数の「アミロイド沈着物」を形成するタンパク質原線維の細胞外沈着を特徴とする多数の疾患を記述する一般的用語である。これらの沈着物の原線維組成は、多様な形態のアミロイド疾患を同定する特徴である。例えば、主としてβアミロイドペプチド（β−ＡＰ）の原線維より構成される脳内および脳血管系の沈着物はアルツハイマー病（家族性および散発性双方の形態）に特徴的であり、島アミロイドタンパク質ペプチド（ＩＡＰＰ；アミリン）はＩＩ型糖尿病に関連する膵島細胞アミロイド沈着物中の原線維に特徴的であり、また、β２−ミクログロブリンは長期の血液透析治療の結果として生じるアミロイド沈着物の主成分である。より最近、クロイツフェルト−ヤーコブ病のようなプリオン関連疾患もまたアミロイド疾患として認識されている。
【０００３】
多様な形態の疾患は、主として、アミロイドーシスが根底にある全身性の疾病と関連しているかもしくはいないかに基づいて複数のクラスに分けられている。従って、ある種の障害は原発性アミロイドーシスであると考えられ、ここでは先在するもしくは共存する疾患の証拠は存在しない。一般に、疾患の原発性アミロイドーシスは「アミロイド軽鎖型」（ＡＬ型）タンパク質原線維の存在を特徴とし、免疫グロブリン軽鎖（κ鎖もしくはλ鎖）の多様なフラグメントに対するＡＬ原線維のＮ末端領域の相同性のためそのように命名された。
【０００４】
二次性もしくは「反応性」アミロイドーシスは、血清アミロイドＡタンパク質（アポＳＳＡ）由来のＡＡ型原線維の沈着を特徴とする。これらの形態のアミロイドーシスは、根底にある慢性の炎症性もしくは感染性疾患状態（例えば慢性関節リウマチ、骨髄炎、結核、らい）を特徴とする。
根底にある慢性の炎症性もしくは感染性疾患状態（例えば慢性関節リウマチ、骨髄炎、結核、らい）を特徴とする。
【０００５】
家族遺伝性アミロイドーシスは、ＡＴＴＲトランスチレチン型の関連するニューロパシー性、腎性もしくは心血管系の沈着物を有することができる。他の家族遺伝性アミロイドーシスは他の症候群を包含し、そして異なったアミロイド成分を有することができる（例えば、ＡＡ原線維を特徴とする家族性地中海熱）。他の形態のアミロイドーシスは、孤立した器官に生じる病巣性のしばしば腫瘍様の沈着物を特徴とする局所の形態を包含する。他のアミロイドーシスは加齢に関連し、そして普遍的には心もしくは脳における斑形成を特徴とする。長期の血液透析に関連するアミロイド沈着物もまた普遍的である。これらおよび他の形態のアミロイド疾患を表１に要約する。（Ｔａｎ，Ｓ．Ｙ．とＰｅｐｙｓ、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２５：４０３−４１４、１９９４；Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ
Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１３版、Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ，Ｋ．Ｊ．ら編、マグロウ−ヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）、サンフランシスコ、１９９５）。
【０００６】
【表１−１】
2012102131.tif 000002
【０００７】
【表１−２】
2012102131.tif 000003
【０００８】
【表１−３】
2012102131.tif 000004
【０００９】
しばしば、アミロイド沈着物の塊を形成する原線維は１種もしくはそれ以上の一次前駆体タンパク質もしくはペプチド由来であり、そして通常、硫酸化されたグリコサミノグリカンを伴う。加えて、アミロイド沈着物は、後に続く節でより詳細に記述されるとおり、プロテオグリカン、ガングリオシドおよび他の糖類のような他の成分とともに、多様な型の少ないタンパク質およびペプチドを包含することができる。
【００１０】
現在、アミロイド疾患のいずれに対しても、特異的なアミロイドに向けられた治療は存在しない。根底にあるもしくは関連する疾患状態が存在する場合、治療は、根底にある疾患を治療することによりアミロイド形成性（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ）タンパク質の産生を減少させることに向けられる。これは、抗生物質を用いる結核の治療により例示され、それによりミコバクテリアの負荷を低下させ、炎症の抑制およびＳＳＡタンパク質の関連する減少をもたらす。多発性骨髄腫によるＡＬアミロイドの場合には、患者に化学療法薬が投与され、形質細胞の減少および骨髄腫免疫グロブリンのレベルの低下を引き起こす。これらのレベルが減少する際に、ＡＬアミロイドが消失することができる。共通に所有される（ｃｏ−ｏｗｎｅｄ）、１９９８年１１月３０日に出願された米国特許出願第ＵＳＳＮ  ０９／２０１，４３０号明細書、および１９９９年５月２８日に出願された同第ＵＳＳＮ  ０９／３２２，２８９号明細書は、アルツハイマー病に関連するアミロイド斑の負荷量を、β−アミロイドペプチド（Ａβ）およびそのフラグメントに向けられる免疫応答を生じさせるもしくは賦与する作用物質の投与により大きく低下させる（そして予防する）ことができることを示す。多様なアミロイド斑成分に対する免疫応答の誘導が広範なアミロイド疾患の治療において有効であることが、本発明の発見である。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、多数のアミロイド疾患を治療するための製薬学的組成物および方法に向けられる。一局面によれば、本発明は、有効成分として、患者においてアミロイド成分に対する免疫応答を誘導するのに有効である作用物質を包含する製薬学的組成物を包含する。こうした組成物は、一般に、賦形剤もまた包含することができ、そして、好ましい態様においてはアジュバントを包含することができる。さらなる好ましい態様において、アジュバ
ントは、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ＭＰＬ（商標）、ＱＳ−２１（スティミュロン［Ｓｔｉｍｕｌｏｎ］（商標））もしくはフロイントの不完全アジュバントを包含する。関係する一態様によれば、こうした製薬学的組成物は、患者における１種以上のアミロイド成分に対する免疫応答を誘導するのに有効な複数の作用物質を包含することができる。
【００１２】
関係する一態様において、作用物質は、原線維ペプチドもしくはタンパク質のアミロイド成分に対し向けられる免疫応答を生じさせるのに有効である。好ましくは、こうした原線維ペプチドもしくはタンパク質は、本明細書に記述されるとおり、ある種の形態のアミロイド疾患に関連することが既知の原線維前駆体タンパク質由来である。こうした前駆体タンパク質は、限定されるものでないが、血清アミロイドＡタンパク質（アポＳＳＡ）、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、アポＡＩ、トランスチレチン、リゾチーム、フィブローゲン（ｆｉｂｒｏｇｅｎ）α鎖、ゲルゾリン、シスタチンＣ、アミロイドβタンパク質前駆体（β−ＡＰＰ）、β2ミクログロブリン、プリオン前駆体タンパク質（ＰｒＰ）、心房性ナトリウム利尿因子、ケラチン、島アミロイドポリペプチド、ペプチドホルモンおよびシヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）を挙げることができる。こうした前駆体はまた、こうした前駆体の突然変異体タンパク質、タンパク質フラグメントおよびタンパク質分解性ペプチドも包含する。好ましい一態様において、作用物質は、原線維前駆体タンパク質に関して、原線維タンパク質もしくはペプチドにより形成される新エピトープ（ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ）に対し向けられる免疫応答を誘導するのに有効である。すなわち、本明細書により詳細に記述されるとおり、多くの原線維形成ペプチドもしくはタンパク質は、上に列挙されたもののような、こうした前駆体タンパク質のフラグメントである。タンパク質分解性切断によるような、こうしたフラグメントが形成される場合、該フラグメントが前駆体タンパク質の一部である場合に前駆体上に存在せずそして従って免疫系に免疫学的に利用可能でないエピトープが現れることができる。こうしたエピトープに向けられる作用物質は好ましい治療薬であることができる。なぜなら、それらは患者において自己免疫応答を誘導することがおそらくより少ない可能性があるからである。
【００１３】
関係する一態様によれば、本発明の製薬学的組成物は、限定されるものでないが以下の原線維ペプチドもしくはタンパク質、すなわちＡＡ、ＡＬ、ＡＴＴＲ、ＡアポＡ１、Ａｌｙｓ、Ａｇｅｌ、Ａｃｙｓ、Ａβ、ＡＢ2Ｍ、ＡＳｃｒ、Ａｃａｌ、ＡＩＡＰＰおよびシヌクレイン−ＮＡＣフラグメントを初めとする群から選択されるもののようなアミロイド成分に向けられる作用物質を包含する。これらのペプチドの完全な名称および組成は本明細書に記述する。こうしたペプチドは、本明細書に記述されるとおり、当該技術分野で公知の方法に従って作成することができる。
【００１４】
さらなる関係する一態様によれば、こうした製薬学的組成物に包含される作用物質は、ある一定の硫酸化されたプロテオグリカンもまた包含する。関係する一態様において、プロテオグリカンはヘパリン硫酸グリコサミノグリカン、好ましくはパールカン、デルマタン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、もしくはペントサンポリ硫酸である。
【００１５】
別の関係する局面によれば、本発明は、哺乳動物被験体におけるアミロイド沈着を特徴とする障害の予防もしくは治療方法を包含する。本発明のこの局面に従い、被験体は、該被験体が罹っているアミロイド障害に特徴的なアミロイド成分に対する免疫応答を生じさせるのに有効なある投薬量の作用物質を与えられる。本質的に、該方法は、上述されたもののような障害に特異的な免疫原性のアミロイド成分を含有する製薬学的組成物を投与することを包含する。こうした方法は、被験体における免疫原性の応答の誘導におけるそれらの有効性をさらに特徴とする。好ましい一態様によれば、該方法は、免疫原性の作用物質が向けられるアミロイド成分に関して、最低１：１０００の血清力価を特徴とする免疫学的応答を生じさせるのに有効である。なおさらなる好ましい一態様において、血清力価
は原線維成分に関して最低１：５０００である。関係する一態様によれば、免疫応答は、処理前の対照の血清サンプルで測定された免疫反応性の血清レベルより約４倍より高いより大きいに対応する免疫反応性の血清量を特徴とする。この後者の特徴づけは、血清の免疫反応性をＥＬＩＳＡ技術により測定する場合にとりわけ適切であるが、しかし、血清の免疫反応性のいずれかの相対的もしくは絶対的測定値に当てはまることができる。好ましい一態様によれば、免疫反応性は約１００倍の血清希釈物で測定する。
【００１６】
なおさらなる関係する一局面によれば、本発明はアミロイド障害の治療を受けている患者の予後の決定方法を包含する。ここで、選択された障害に特徴的なアミロイド成分に対する免疫反応性の患者の血清量を測定し、そして血清の免疫反応性の基準線対照レベルの最低４倍の免疫反応性の患者の血清量は、特定のアミロイド障害に関して改善された状態の予後を示すものとする。好ましい態様によれば、患者の血清中に存在する選択されたアミロイド成分に対する免疫反応性の量は、アミロイド成分に関して、最低約１：１０００、もしくは最低１：５０００の血清力価を特徴とする。
【００１７】
さらなる関係する一局面によれば、本発明は、アミロイド疾患を予防もしくは治療するためのいわゆる「受動免疫感作」法および製薬学的組成物もまた包含する。本発明の本局面によれば、患者は、選択されたアミロイド成分、好ましくは治療されるべき疾患に特徴的なアミロイド沈着物中に存在する原線維成分に特異的に結合する、有効投薬量の抗体を与えられる。一般に、こうした抗体は、この節の先行する段落に記述された製薬学的組成物および方法に関して、記述された多様なタンパク質、ペプチドおよび成分を特異的に結合するそれらの能力について選択される。関係する一態様によれば、こうした方法および組成物は、最低２種のアミロイド原線維成分を結合する抗体の組み合わせを包含することができる。一般に、製薬学的組成物は、対照の血清サンプル中で測定された成分に対する免疫反応性の血清レベルより最低約４倍より高い、標的のアミロイド成分に対する免疫反応性の血清量を提供するために投与する。抗体は、本明細書に記述されるとおり、担体とともに投与することもまたできる。一般に、本発明の本局面に従えば、こうした抗体は、腹腔で、経口で、鼻内に、皮下に、筋肉内に、局所でもしくは静脈内に投与する（もしくは投与のため処方する）ことができるが、しかし、いずれかの製薬学的に有効な経路（すなわち、上および本明細書に示されるような、示された治療的レベルを生じさせるのに有効な）により投与することができるか、もしくはそれによる投与のために処方することができる。
【００１８】
関係する一態様によれば、治療的抗体は、最低１種の抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを患者に投与することにより投与することができる。本発明の本局面によれば、ポリヌクレオチドが患者中で発現され、患者中で抗体鎖を製薬学的有効量で産生させる。こうしたポリヌクレオチドは、抗体の重鎖および軽鎖をコードすることができ、それにより患者中で重鎖および軽鎖を産生させる。
【００１９】
好ましい態様によれば、上述された免疫感作レジメンは、当該技術分野で既知の方法に従い、もしくは免疫学的応答により評価されるような患者の必要に従い、初期免疫感作、次いで６週間隔のような時間間隔での追加抗原刺激の注入のような、６ヶ月の期間にわたるような複数の投薬量での抗体を包含する作用物質の投与を包含することができる。あるいは、もしくは加えて、こうしたレジメンは、当該技術分野で既知であるような、「持続性放出」製剤の使用を包含することができる。
【００２０】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、本発明の以下の詳細な記述を付随する図面とともに読む場合により完全に明らかになるであろう。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
Ａ．定義
別の方法で示されない限り、本明細書で使用される全部の用語は、それらが本発明の当業者にとって有するであろうと同一の意味を有する。実務者は、とりわけ、生化学および分子生物学の技術分野で既知の定義、技術の用語および標準的方法について、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（第２版）、コールド  スプリング  ハーバー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州プレーンビュー、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン  ワイリー  アンド  サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク州ニューヨークに向けられる。本発明は、記述される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されないことが理解される。なぜなら、これらは同一の結果を生じるように変えることができるからである。
【００２２】
「アジュバント」という用語は、抗原とともに投与される場合に抗原に対する免疫応答を増強するが、しかし単独で投与される場合に抗原に対する免疫応答を生じさせない化合物を指す。アジュバントは、リンパ球動員、Ｂおよび／もしくはＴ細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激を包含するいくつかの機構により免疫応答を増強することができる。
【００２３】
「アミロイド疾患」もしくは「アミロイドーシス」は、症状もしくはその病理学の一部としてアミロイド斑の蓄積もしくは形成を有する多数の障害のいずれかを指す。
【００２４】
「アミロイド斑」は、主としてタンパク質性の原線維より構成される細胞外沈着物である。一般に、原線維は１種の優勢なタンパク質もしくはペプチドより構成されるが；しかしながら、該斑はまた本明細書に記述されるようなペプチドもしくは非ペプチド分子である付加的な成分も包含することができる。
【００２５】
「アミロイド成分」は、こうした分子の抗原性部分を包含するアミロイド斑中に存在するいずれかの分子の実体である。アミロイド成分は、限定されるものでないがタンパク質、ペプチド、プロテオグリカンおよび炭水化物を挙げることができる。「特定のアミロイド成分」は、目的のアミロイド斑中に主としてもしくは独占的に見出される分子の実体を指す。
【００２６】
「作用物質」は、合成もしくは生物学的起源の化学的分子である。本発明の文脈上、作用物質は、一般に製薬学的組成物中で使用することができる分子である。
【００２７】
「抗アミロイド作用物質」は、能動もしくは受動免疫感作技術により投与される場合に、脊椎動物の被験体においてアミロイド斑成分に対する免疫応答を生じさせることが可能である作用物質である。
【００２８】
本明細書で互換可能に使用されるところの「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、典型的なポリヌクレオチドに水素結合することが可能な塩基を支持する主鎖を有するポリマー分子を指し、ここで、ポリマーの主鎖は、該ポリマー分子と典型的なポリヌクレオチド（例えば一本鎖ＤＮＡ）との間で配列特異的な様式でこうした水素結合形成を可能にする様式で塩基を提示する。こうした塩基は、典型的にはイノシン、アデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシルおよびチミジンである。ポリマー分子は、二本鎖および一本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡ、ならびにその主鎖の修飾（例えばメチルホスホネート結合）を包含する。
【００２９】
本明細書で使用されるところの「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合により連
結されたアミノ酸残基の一本鎖から構成される化合物を指す。「タンパク質」という用語は「ポリペプチド」という用語と同義であることができるか、または２個もしくはそれ以上のポリペプチドの複合体を指すことができる。
【００３０】
「ペプチド」という用語もまた、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基より構成される化合物を指す。一般に、ペプチドは１００もしくはより少ないアミノ酸より構成される一方、ポリペプチドもしくはタンパク質は１００以上のアミノ酸を有する。本明細書で使用されるところの「タンパク質フラグメント」という用語もまたペプチドを意味するように読むことができる。
【００３１】
「原線維ペプチド」もしくは「原線維タンパク質」は、アミロイド斑中に存在する原線維を形成する単量体もしくは凝集された形態のタンパク質もしくはペプチドを指す。こうしたペプチドおよびタンパク質の例を本明細書に提供する。
【００３２】
「製薬学的組成物」は、哺乳動物の個体への投与に適する化学的もしくは生物学的組成物を指す。こうした組成物は、限定されるものでないが経口、非経口、静脈内、動脈内、皮下、鼻内、舌下、脊椎内、脳室内などを挙げることができる多数の経路の１種もしくはそれ以上を介する投与のため特別に処方することができる。
【００３３】
「製薬学的賦形剤」もしくは「製薬学的に許容できる賦形剤」は、その中に有効な治療薬が処方される担体（通常は液体）である。賦形剤は、一般に、該処方にいかなる薬理学的活性も提供しないが、それは、化学的および／もしくは生物学的安定性、放出の特徴などを提供することができる。例示的製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｇｒｅｎｎａｒｏ，Ａ．編、１９９５に見出すことができる。
【００３４】
「糖タンパク質」は、最低１個の炭水化物鎖（オリゴ多糖）が共有結合されるタンパク質である。
【００３５】
「プロテオグリカン」は、炭水化物鎖の最低１個がグリコサミノグリカン（対の１メンバーが通常糖酸（ウロン酸）でありかつ他方がアミノ糖である反復する二糖の長い直線状のポリマーである）である糖タンパク質である。
【００３６】
「免疫学的」もしくは「免疫」もしくは「免疫原性の」応答という用語は、脊椎動物の個体における抗原に対し向けられた体液性（抗体に媒介される）および／もしくは細胞性（抗原特異的Ｔ細胞もしくはそれらの分泌産物により媒介される）応答の発生を指す。こうした応答は、免疫原の投与により誘導される能動的応答、または抗体もしくはプライミングされたＴ細胞の投与により誘導される受動的応答であることができる。細胞性免疫応答は、抗原特異的ＣＤ４+  Ｔヘルパー細胞および／もしくはＣＤ８+  細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する、クラスＩもしくはクラスＩＩのＭＨＣ分子と共同してのポリペプチドエピトープの提示により導き出される。該応答はまた、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、小膠細胞、好酸球もしくは内在的免疫の他の成分の活性化も必要とすることができる。細胞に媒介される免疫学的応答の存在は、当該技術分野で既知の標準的増殖アッセイ（ＣＤ４+  Ｔ細胞）もしくはＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイにより測定することができる。免疫原の保護もしくは治療効果に対する体液性および細胞性の応答の相対的寄与は、免疫感作された共通遺伝子の動物から免疫グロブリン（ＩｇＧ）およびＴ細胞画分を別個に単離すること、ならびに第二の被験体における保護もしくは治療効果を測定することにより識別することができる。
【００３７】
「免疫原性の作用物質」もしくは「免疫原」もしくは「抗原」は、アジュバントととも
に、もしくはその非存在下のいずれかでの患者への投与に際して、それ自身に対する免疫学的応答を誘導することが可能である分子である。こうした分子は、例えば、ＫＬＨ、Ｃｄ３もしくは破傷風トキシンのような担体タンパク質に結合されたアミロイド原線維ペプチドもしくはそのフラグメントを包含する。
【００３８】
「エピトープ」もしくは「抗原決定基」は、抗体の抗原結合領域に結合する抗原の部分である。
【００３９】
「Ａβ」、「Ａβペプチド」および「アミロイドβ」ペプチドという用語は同義であり、そして本明細書に記述されるようなβアミロイド前駆体タンパク質（β−ＡＰＰ）由来の約３８〜４３アミノ酸の１種もしくはそれ以上のペプチド組成物を指す。「Ａβｘｘ」はアミロイドβペプチド１−ｘｘを指し、ここでｘｘはペプチド中のアミノ酸の番号を示す数字であり；例えば、Ａβ４２はＡβ１−４２と同一であり、これは本明細書で「ＡＮ１７９２」ともまた称され、また、Ａβ４０はＡβ１−４０と同一であり、これは本明細書で「ＡＮ１５７８」ともまた称される。
【００４０】
成分に分けられたもしくは単量体のＡβは、Ａβの可溶性の単量体のペプチド単位を意味する。単量体のＡβを調製する一方法は、凍結乾燥されたペプチドを、超音波処理を用いて正味のＤＭＳＯ中に溶解することである。生じる溶液を遠心分離していかなる不溶性の微粒子も除去する。凝集されたＡβは、単量体の単位が非共有結合により一緒に保持されるオリゴマーの混合物である。
【００４１】
「裸のポリヌクレオチド」という用語は、コロイド状物質と複合体形成されないポリヌクレオチドを指す。裸のポリヌクレオチドは、ときに、プラスミドベクターにクローン化される。
【００４２】
「患者」という用語は、予防的もしくは治療的のいずれかの治療を受領するヒトおよび他の哺乳動物の被験体を包含する。
【００４３】
「と有意に異なる」、「統計学的に有意の」、「より有意に高い（もしくは低い）」という用語、および類似の句は、データもしくは他の測定値間の比較を指し、ここで、２個の比較された個体もしくは群の間の差異は、訓練された観察者にとって明らかにもしくは理にかなって異なるか、または統計学的に有意である（該句が「統計学的に」という用語を包含する場合、もしくはｐ値のような統計学的検定のなんらかの表示が存在する場合、もしくは、分析される場合にデータが当該技術分野で既知の標準的統計学的検定により統計学的差異を生じさせる場合）。
【００４４】
１種もしくはそれ以上の列挙される要素を「含んで成る」組成物もしくは方法は、特別に列挙されない他の要素を包含することができる。例えば、原線維成分ペプチドを含んで成る組成物は、単離されたペプチド、およびより大きなポリペプチド配列の成分としてのペプチドの双方を包含する。さらなる例として、要素ＡおよびＢを含んで成る組成物は、Ａ、ＢおよびＣより成る組成物もまた包含する。
【００４５】
Ｂ．アミロイド疾患
１．概観および病因
アミロイド疾患もしくはアミロイドーシスは、広範な外見的症状を有する多数の疾患状態を包含する。これらの障害は、普遍的に、「アミロイド沈着物」もしくは「アミロイド斑」として知られるタンパク質原線維の異常な細胞外沈着物の存在を有し、これらは通常直径が約１０〜１００μｍであり、そして特定の器官もしくは組織領域に局在する。こうした斑は主として天然に存在する可溶性のタンパク質もしくはペプチドより構成される。
これらの不溶性沈着物は、一般に、直径がおよそ１０〜１５ｎｍである原線維の側方（ｌａｔｅｒａｌ）凝集物より構成される。アミロイド原線維は、コンゴーレッド色素で染色される場合に、偏光中で特徴的な澄んだ黄緑色の複屈折を生じさせる。該障害は、下述されるとおり、斑沈着物を形成する主要な原線維成分に基づいて分類される。
【００４６】
斑沈着物を形成するペプチドもしくはタンパク質は、しばしば、より大きな前駆体タンパク質から産生される。より具体的には、アミロイド原線維沈着物の病因は、一般に、「異常な」前駆体タンパク質のフラグメントへのタンパク質分解性の切断を必要とする。これらのフラグメントは、一般に、逆平行のβプリーツシートに凝集するが；しかしながら、家族性アミロイド多発神経障害（変異体トランスチレチン原線維）および透析に関係するアミロイドーシス（β2ミクログロブリン原線維）においては、ある種の分解されない形態の前駆体タンパク質が凝集しそして原線維を形成することが報告されている（Ｔａｎら、１９９４、上記）。
【００４７】
２．臨床的症候群
本節は、それらの特徴的な斑原線維組成物を包含する主要な型のアミロイドーシスの記述を提供する。アミロイド疾患を、多様な疾患特異的アミロイド沈着物の１種の成分もしくは複数の成分に対する免疫応答を刺激するよう作用する作用物質を投与することにより治療することができることが、本発明の全般的発見である。下のＣ節にてより詳細に論考されるとおり、こうした成分は、好ましくは斑を形成する原線維の構成要素である。下の節は、アミロイドーシスの主要な形態を例示するようはたらき、そして本発明を限定することを意図していない。
【００４８】
ａ．ＡＡ（反応性）アミロイドーシス
一般に、ＡＡアミロイドーシスは持続性の急性期応答を惹起する多数の疾患の症状発現である。こうした疾患は、慢性炎症性障害、慢性の局所もしくは全身性の微生物感染症、および悪性新生物を包含する。
【００４９】
ＡＡ原線維は、一般に、血清アミロイドＡタンパク質（アポＳＳＡ）（ＨＤＬ粒子中に存在しかつＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦのようなサイトカインに応答して肝細胞中で合成される循環するアポリポタンパク質）のタンパク質分解性の切断により形成される、８０００ダルトンのフラグメント（ＡＡペプチドもしくはタンパク質）より構成される。沈着は、実質器官に対する好みを伴い、身体中で広く行き渡ることができる。脾は通常、沈着部位であり、そして腎もまた冒されることができる。沈着はまた心および消化管でも普遍的である。
【００５０】
ＡＡアミロイド疾患は、限定されるものでないが、慢性関節リウマチ、若年性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節症、ライター症候群、成人スティル病、ベーチェット症候群およびクローン病のような炎症性疾患を挙げることができる。ＡＡ沈着物は、らい、結核、気管支拡張症、蓐瘡潰瘍、慢性腎盂腎炎、骨髄炎およびホウィップル病のような慢性の微生物感染症の結果としてもまた生じる。ある種の悪性新生物もまたＡＡ原線維アミロイド沈着物をもたらす可能性がある。これらは、ホジキンリンパ腫、腎癌、腸、肺および尿生殖管の癌、基底細胞癌、ならびに毛様細胞性白血病のような病状を包含する。
【００５１】
ｂ．ＡＬアミロイドーシス
ＡＬアミロイド沈着は、一般に、形質細胞の悪性病変（多発性骨髄腫）から良性単一クローン性高ガンマグロブリン血症までの範囲にわたる、Ｂリンパ球系統のほとんどいかなる疾患にも関連する。ときに、アミロイド沈着物の存在は根底にある疾患の主たる指標であることができる。
【００５２】
ＡＬアミロイド沈着物の原線維は、単一クローンの免疫グロブリン軽鎖もしくはそのフラグメントより構成される。より具体的には、フラグメントは軽鎖（κ鎖もしくはλ鎖）のＮ末端領域由来であり、そしてその可変（ＶL）ドメインの全部もしくは部分を含有する。沈着物は、一般に間葉組織中に存在し、末梢性および自律性ニューロパシー、手根管症候群、巨舌症、拘束型心筋症、大型関節の関節症、免疫疾患、骨髄腫、ならびに不顕性疾患を引き起こす。しかしながら、ほとんどいかなる組織、とりわけ心のような内蔵器官も関与することができることが注目されるべきである。
【００５３】
ｃ．遺伝性全身性アミロイドーシス
多くの形態の遺伝性全身性アミロイドーシスが存在する。それらは比較的稀な病状であるとは言え、症状の成人の発症およびそれらの遺伝パターン（通常、常染色体優性）は、一般的集団においてこうした障害の持続につながる。一般に、該症候群は変異体のアミロイド形成性のペプチドもしくはタンパク質の産生につながる、前駆体タンパク質中の点突然変異に帰することができる。表２は、これらの障害の例示的形態の原線維組成を要約する。
【００５４】
【表２】
2012102131.tif 000005
【００５５】
表２に提供されるデータは例示的であり、そして本発明の範囲を限定することを意図していない。例えば、トランスチレチン遺伝子中の４０以上の別個の点突然変異が記述されており、その全部は臨床的に類似の形態の家族性アミロイド多発神経障害を生じさせる。
【００５６】
トランスチレチン（ＴＴＲ）は、ときにプレアルブミンともまた称される１４キロダルトンのタンパク質である。それは肝および脈絡叢により産生され、そしてそれは甲状腺ホルモンおよびビタミンＡの輸送で機能する。それぞれが単一アミノ酸変化を特徴とする、
該タンパク質の最低５０の変異体の形態が、多様な形態の家族性アミロイド多発神経障害の原因である。例えば、位置５５のロイシンのかわりのプロリンの置換は、とりわけ進行性の形態のニューロパシーをもたらし；位置１１１のロイシンのかわりのメチオニンの置換は、デンマーク人患者で重症の心臓障害をもたらす。全身性アミロイドーシスの患者の心組織から単離されたアミロイド沈着物は、該沈着物が、ＴＴＲ、および集合的にＡＴＴＲ（その完全長の配列は特徴づけられている）と称されるそのフラグメントの不均質な混合物より構成されることを示した。ＡＴＴＲの原線維成分はこうした斑から抽出することができ、そしてそれらの構造および配列は当該技術分野で既知の方法に従って決定することができる（例えば、Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎ，Ａ．ら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔ．７３：７０３−７０８、１９９５；Ｋａｍｅｔａｎｉ，Ｆ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２５：６２２−６２８、１９８４；Ｐｒａｓ，Ｍ．ら、ＰＮＡＳ  ８０：５３９−４２、１９８３）。
【００５７】
分子アポリポタンパク質ＡＩ中に点突然変異を有する人（例えばＧｌｙ→Ａｒｇ２６；Ｔｒｐ→Ａｒｇ５０；Ｌｅｕ→Ａｒｇ６０）は、タンパク質アポリポタンパク質ＡＩもしくはそのフラグメント（ＡアポＡＩ）の沈着物を特徴とするある形態のアミロイドーシス（エステルターク（ヨｓｔｅｒｔａｇ）型）を表す。これらの患者は、低レベルの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を有し、そして末梢性ニューロパシーもしくは腎不全とともに現れる。
【００５８】
酵素リゾチームのα鎖中の突然変異（例えばＩｌｅ→Ｔｈｒ５６もしくはＡｓｐ→Ｈｉｓ５７）は、英国人の家族で報告されている別の形態のエステルターク（ヨｓｔｅｒｔａｇ）型の非ニューロパシー性遺伝性アミロイドの基礎である。ここでは、突然変異体のリゾチームタンパク質の原線維（Ａｌｙｓ）が沈着し、そして患者は一般に損なわれた腎機能を表す。このタンパク質は、本明細書に記述される原線維形成タンパク質の大部分と異なり、通常は全体の（フラグメント化されない）形態で存在する（Ｂｅｎｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．ら  ＣＩＢＡ  Ｆｄｎ．Ｓｙｍｐ．１９９：１０４−１３１、１９９６）。
【００５９】
βアミロイドペプチド（Ａβ）は、βアミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）として知られる大型のタンパク質からのタンパク質分解により生じうる３９〜４３アミノ酸のペプチドである。βＡＰＰ中の突然変異は、Ａβ原線維および他の成分より構成される斑の脳沈着を特徴とする、家族性の形態のアルツハイマー病、ダウン症候群および／もしくは老人性痴呆をもたらす（下にさらに詳細に記述する）。アルツハイマー病に伴うＡＰＰ中の既知の突然変異は、βもしくはγ分泌酵素（ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）の切断部位のすぐ近く、またはＡβ内に存在する。例えば、位置７１７は、そのＡβへのプロセシングにおけるＡＰＰのγ−分泌酵素切断の部位にすぐ近く、また、位置６７０／６７１はβ−分泌酵素切断の部位にすぐ近い。これらの残基のいずれかでの突然変異は、おそらくＡＰＰから生じられる４２／４３アミノ酸の形態のＡβの量の増大を引き起こすことにより、アルツハイマー病をもたらすことができる。多様な長さのＡβペプチドの構造および配列は当該技術分野で公知である。こうしたペプチドは当該技術分野で既知の方法に従って作成することができる（例えば、ＧｌｅｎｎｅｒとＷｏｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２９：８８５−８９０、１９８４；ＧｌｅｎｎｅｒとＷｏｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２２：１１３１−１１３５、１９８４）。加えて、多様な形態のペプチドが商業的に入手可能である。
【００６０】
シヌクレインはアリポプロテイン（ａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）に似ているシナプス関連のタンパク質であり、そしてニューロンの細胞質およびシナプス前末端で豊富である。ＮＡＣと命名されるα−シヌクレイン由来のペプチドフラグメントもまたアルツハイマー病のアミロイド斑の成分である。（Ｃｌａｙｔｏｎら、１９９８）。この成分もまた、下に詳述されるとおり、本発明の免疫学的に基づく治療の標的として作用する。
【００６１】
ゲルゾリンは、およびフラグメントアクチンフィラメントに結合するカルシウム結合タンパク質である。該タンパク質の位置１８７の突然変異（例えばＡｓｐ→Ａｓｎ；Ａｓｐ→Ｔｙｒ）は、フィンランドの患者ならびにオランダ人もしくは日本人起源の人で通常見出されるある形態の遺伝性全身性アミロイドーシスをもたらす。苦しめられる個体においては、ゲルゾリンフラグメントから形成される原線維（Ａｇｅｌ）は、通常、アミノ酸１７３−２４３（６８ｋＤａのカルボキシ末端フラグメント）より成り、そして血管および基底膜中に沈着し、角膜変性、および末梢性ニューロパシーに進行する頭蓋ニューロパシー、ジストロフィー性の皮膚変化、ならびに他の器官への沈着をもたらす。（Ｋａｎｇａｓ，Ｈ．ら  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５（９）：１２３７−１２４３、１９９６）。
【００６２】
フィブリノーゲンの突然変異体のα鎖（ＡｆｉｂＡ）および突然変異体のシスタチンＣ（Ａｃｙｓ）のような他の突然変異されたタンパク質もまた原線維を形成し、そして特徴的な遺伝性障害を生じさせる。ＡｆｉｂＡ原線維は、腎疾患を伴う非ニューロパシー性の遺伝性アミロイドに特徴的な沈着物を形成し；Ａｃｙｓ沈着物は、アイスランドで報告された遺伝性脳アミロイド血管障害に特徴的である。（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒら、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、マグロウ−ヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）、サンフランシスコ、１９９５；Ｂｅｎｓｏｎら、上記）。少なくとも数例において、脳アミロイド血管障害（ＣＡＡ）の患者では、βタンパク質とともに非突然変異体の形態のシスタチンＣを含有するアミロイド原線維を有することが示されている。（Ｎａｇａｉ，Ａ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．３３：６３−７８、１９９８）。
【００６３】
ある種の形態のプリオン疾患は、今や遺伝性であると考えられ、症例の１５％までの原因であり、以前は主に性質が感染性であると考えられていた。（Ｂａｌｄｗｉｎら、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、ジョン  ワイリー  アンド  サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、１９９５中）。こうしたプリオン障害においては、患者は、正常なプリオンタンパク質の異常なアイソフォーム（ＰｒＰc）より構成される斑を発生する。ＡＳｃｒともまた称される優勢な突然変異体のアイソフォームＰｒＰScは、プロテアーゼ分解に対するその抵抗性、洗剤抽出後の不溶性、二次的リソゾーム中の沈着、翻訳後合成、および高いβプリーツシート含量において、正常な細胞タンパク質と異なる。クロイツフェルト−ヤーコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群（ＧＳＳ）および致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）をもたらす少なくとも５つの突然変異について、遺伝子の関連が確立されている。（Ｂａｌｄｗｉｎ）スクラピー原線維からの原線維ペプチドの抽出、配列の決定、およびこうしたペプチドの作成方法は、当該技術分野で既知である。（例えば、Ｂｅｅｋｅｓ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６：２５６７−７６、１９９５）。
【００６４】
例えば、一形態のＧＳＳはコドン１０２のＰｒＰ突然変異に結びつけられている一方、終脳のＧＳＳはコドン１１７の突然変異を伴い分離する。コドン１９８および２１７の突然変異は、アルツハイマー病に特徴的な神経炎斑がＡβペプチドの代わりにＰｒＰを含有する、ある形態のＧＳＳをもたらす。ある種の形態の家族性ＣＪＤはコドン２００および２１０の突然変異を伴い；コドン１２９および１７８の突然変異は家族性ＣＪＤおよびＦＦＩの双方で見出されている。（Ｂａｌｄｗｉｎ、上記）。
【００６５】
ｄ．老人性全身性アミロイドーシス
全身性もしくは病巣性のいずれかのアミロイド沈着は年齢とともに増加する。例えば、野性型トランスチレチン（ＴＴＲ）の原線維は、高齢の個体の心組織で普遍的に見出され
る。これらは無症候性で臨床的に沈黙であることができるか、もしくは心不全をもたらすことができる。無症候性の原線維の病巣性沈着物は、脳（Ａβ）、前立腺のアミロイド小体（Ａβ2ミクログロブリン）、関節および精嚢にもまた存在することができる。
【００６６】
ｅ．脳アミロイドーシス
アミロイドの局所沈着は、とりわけ高齢の個体において脳で普遍的である。脳における最も頻繁な型のアミロイドは主としてＡβペプチド原線維より構成され、痴呆もしくは散発性（非遺伝性）アルツハイマー病をもたらす。事実、散発性アルツハイマー病の発生率は、遺伝性であることが示された形態を大きく上回る。これらの斑を形成する原線維ペプチドは、遺伝性の形態のアルツハイマー病（ＡＤ）に関して、上述されたものに非常に類似している。
【００６７】
ｆ．透析に関係するアミロイドーシス
β2ミクログロブリン（Ａβ2Ｍ）原線維より構成される斑は、普遍的に、長期の血液透析もしくは腹腔透析を受領する患者で発生する。β2ミクログロブリンは、１１．８キロダルトンのポリペプチドであり、かつ、全部の有核細胞上に存在する、クラスＩ  ＭＨＣ抗原の軽鎖である。通常の状況下では、それは細胞膜から継続的に流され、そして通常は腎により濾過される。損なわれた腎機能の場合におけるような消失の失敗は、腎および他の部位（主として関節のコラーゲン豊富な組織）中の沈着につながる。Ａβ2Ｍ分子は、他の原線維タンパク質と異なり、一般に、原線維中でフラグメント化されない形態で存在する。（Ｂｅｎｓｏｎ、上記）。
【００６８】
ｇ．ホルモン由来のアミロイドーシス
内分泌器官は、とりわけ加齢した個体において、アミロイド沈着物をもつことができる。ホルモン分泌性の腫瘍もまた、ホルモン由来のアミロイド斑を含有することができ、その原線維は、カルシトニン（甲状腺の髄質の癌腫）、島アミロイドポリペプチド（アミリン；ＩＩ型糖尿病の大部分の患者に存在する）および心房性ナトリウム利尿ペプチド（孤立性心房性アミロイドーシス）のようなポリペプチドホルモンから構成される。これらのタンパク質の配列および構造は当該技術分野で公知である。
【００６９】
ｈ．雑多なアミロイドーシス
アミロイドの限局された沈着物として通常明白である多様な他の形態のアミロイド疾患が存在する。一般に、これらの疾患は、おそらく、特定の原線維前駆体の限局された産生および／もしくは異化作用の欠如または原線維沈着に対する（関節のような）特定の組織の素因の結果である。こうした特発性沈着の例は、結節のＡＬアミロイド、皮膚のアミロイド、内分泌性アミロイドおよび腫瘍に関係するアミロイドを包含する。
【００７０】
Ｃ．製薬学的組成物
アミロイド斑のある成分に向けられる免疫応答を導き出すもしくは提供することが可能な組成物は、アミロイド疾患を治療もしくはその発生を予防するのに有効であることが、本発明の発見である。とりわけ、本明細書で提供される本発明によれば、免疫刺激用量の抗アミロイド作用物質もしくは対応する抗アミロイド免疫試薬を患者に投与する場合に、悩まされる個体におけるアミロイド斑負荷量の進行を予防する、その症状を緩和する、および／もしくはそれを低下させることが可能である。この節は、アミロイド斑に対する能動ならびに受動免疫を生じさせる例示的抗アミロイド作用物質を記述し、また、アミロイド斑負荷量に対するこうした組成物を使用する効果治療を示す例示的データを提供する。
【００７１】
一般に、本発明の抗アミロイド作用物質は、前の節で記述されかつ下に例示されるような、通常は特徴的なタンパク質、ペプチドもしくはそれらのフラグメントである特定の斑成分、好ましくは斑を形成する成分より構成される。より一般的には、本発明での使用の
ための治療薬は、斑、もしくはより具体的にはその原線維成分に対する免疫応答を生じさせるかもしくは誘導する。従って、こうした作用物質は、限定されるものでないが該成分それ自身およびその変異体、成分に対する抗体を誘導しかつ／もしくはそれと交差反応する成分の類似物および模倣物、ならびにアミロイド成分と特異的に反応性である抗体もしくはＴ細胞を挙げることができる。重要な一特徴によれば、製薬学的組成物は非特異的成分、すなわち一般に循環するもしくは身体中に遍在する成分から選択されない。例として、血清アミロイドタンパク質（ＳＡＰ）は、肝で産生されかつ大部分の既知の形態のアミロイド沈着物に結合する、循環する血漿糖タンパク質である。治療的組成物は、好ましくはこの成分に向けられる。
【００７２】
免疫応答の誘導は、免疫原が投与されて患者において該成分と反応性の抗体もしくはＴ細胞を誘導する場合のように能動的、またはそれ自身が患者中でアミロイド成分に結合する抗体が投与される場合のように受動的であることができる。アミロイド斑に対する免疫応答を誘導するもしくは生じさせるための例示的作用物質を下の節に記述する。
【００７３】
本発明の製薬学的組成物は、免疫原性の作用物質（１種もしくは複数）に加えて、有効量のアジュバントおよび／もしくは賦形剤を包含することができる。製薬学的に有効かつ有用なアジュバントおよび賦形剤は当該技術分野で公知であり、そして後に続く節でより詳細に記述する。
【００７４】
１．免疫刺激剤（能動免疫応答）
ａ．抗原線維組成物
好ましい抗アミロイド作用物質の１つの一般的な分類は、アミロイド原線維タンパク質由来である作用物質より成る。上に挙げられたとおり、アミロイド疾患の顕著な特徴は、主として原線維より成るアミロイド斑の１つの器官もしくは器官における沈着であり、原線維は順に特徴的な原線維タンパク質もしくはペプチドより構成される。本発明によれば、こうした原線維タンパク質もしくはペプチド成分は、抗アミロイド免疫応答を誘導するための有用な作用物質である。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】Ａβ１−４２の注入後のトランスジェニックマウスにおける抗体力価。
【図２】海馬におけるアミロイド負荷量。Ａβ特異的モノクローナル抗体３Ｄ６との反応性により定義される、アミロイド斑により占有される海馬領域の面積のパーセンテージを、免疫反応された脳切片のコンピュータ支援定量的画像分析により決定した。個々のマウスの値は治療群ごとに分類されて示す。各グループ分けの水平線は分布の中央値を示す。
【図３】海馬における神経炎ジストロフィー。ヒトＡＰＰ特異的モノクローナル８Ｅ５とのそれらの反応性により定義される、ジストロフィー性の軸索により占有される海馬領域の面積のパーセンテージを、免疫反応された脳切片の定量的コンピュータ支援画像分析により決定した。個々のマウスの値は、ＡＮ１７９２処理された群およびＰＢＳ処理された対照群について示す。各グループ分けの水平線は分布の中央値を示す。
【図４】後板状筋皮質（ｒｅｔｒｏｓｐｌｅｎｉａｌ  ｃｏｒｔｅｘ）中の星状細胞。神経膠線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）陽性の星状細胞により占有される皮質領域の面積のパーセンテージを、免疫反応された脳切片の定量的コンピュータ支援画像分析により決定した。個々のマウスの値は治療群ごとに分類されて示し、そして中央値の群の値を水平線により示す。
【図５】０．１４、０．４、１．２、３．７、１１、３３、１００もしくは３００μｇを含有する８用量のＡβ４２（「ＡＮ１７９２」）の範囲での免疫感作後のＡβ４２に対する抗体力価の幾何平均。
【図６】ＡＮ１７９２免疫感作に対する抗体応答の動力学。力価は、各群中６匹の動物の値の幾何平均として表す。
【図７】ＰＢＳおよびＡＮ１７９２で処理されたマウスにおける皮質のアミロイド負荷量の定量的画像分析。
【図８】ＰＢＳおよびＡＮ１７９２で処理されたマウスにおける神経炎斑の負荷量の定量的画像分析。
【図９】ＰＢＳおよびＡＮ１７９２で処理されたマウスにおける星状細胞により占有される後板状筋皮質のパーセントの定量的画像分析。
【図１０】ＡＮ１７９２処理された（上図）もしくはＰＢＳ処理された（下図）マウスからの脾細胞でのリンパ球増殖アッセイ。
【図１１】大脳皮質における総Ａβレベル。フロイントのアジュバントと組み合わせられたＡβもしくはＡＰＰ誘導体で免疫感作されたマウスにおける個々のＡβプロフィルの散乱図（ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔ）。
【図１２】Ａβペプチド複合物Ａβ１−５、Ａβ１−１２およびＡβ１３−２８；完全長のＡβ凝集物Ａβ４２（「ＡＮ１７９２」）ならびにＡβ１−４０（「ＡＮ１５２８」）で免疫感作されたマウス、ならびにＰＢＳ処理された対照群の免疫反応された脳切片の定量的画像分析により決定された、皮質中のアミロイド負荷量。
【図１３】フロイントのアジュバントと組み合わせられたＡβもしくはＡＰＰ誘導体で免疫感作されたマウスの群の、Ａβ特異的抗体の力価の幾何平均。
【図１４】多様なアジュバントと組み合わせられたＡＮ１７９２、もしくはそのパルミトイル化された誘導体で免疫感作されたモルモットの群の、Ａβ特異的抗体の力価の幾何平均。
【図１５（Ａ−Ｅ）】多様なアジュバントを伴うＡＮ１７９２もしくはＡＮ１５２８で処理された１２月齢のＰＤＡＰＰマウスの皮質中のＡβレベル。
【図１６】Ａβに対するポリクローナル抗体で処理されたマウスの平均力価。
【図１７】Ａβに対するモノクローナル抗体１０Ｄ５で処理されたマウスの平均力価。
【図１８】Ａβに対するモノクローナル抗体２Ｆ１２で処理されたマウスの平均力価。
【００７６】
〔本発明の実施の形態〕
表１および表２は、多様なアミロイド疾患に特徴的である例示的原線維形成タンパク質を要約する。本発明の本局面に従えば、その相同物もしくはフラグメントを包含する適切な原線維タンパク質もしくはペプチドを包含する免疫刺激組成物の、苦しめられるもしくは影響を受けやすい個体への投与は、アミロイド疾患に関して、治療薬もしくは予防薬を提供する。
【００７７】
例として、βアミロイドペプチドもしくはＡ４ペプチド（米国特許第４，６６６，８２９号明細書；ＧｌｅｎｎｅｒとＷｏｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２０、１１３１（１９８４）を参照されたい）としてもまた知られるＡβは、アルツハイマー病の特徴的な斑の主成分である３９〜４３アミノ酸のペプチドである。Ａβは、βおよびγ−分泌酵素と称される２種の酵素によるより大きなタンパク質ＡＰＰのプロセシングにより生成される（Ｈａｒｄｙ、ＴＩＮＳ  ２０、１５４（１９９７）を参照されたい）。
【００７８】
実施例Ｉは、本発明の支持において実施された実験の結果を記述し、ここで、Ａβ４２ペプチドを、位置７１７に突然変異をもつヒトＡＰＰを過剰発現するヘテロ接合性のトランスジェニックマウスに投与した。「ＰＤＡＰＰマウス」として知られるこれらのマウスはアルツハイマー様の病理学を表し、そしてアルツハイマー病の動物モデルであると考えられている（Ｇａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：５２３−７、１９９５）。該実施例に詳述されるとおり、これらのマウスは、約６月齢で開始するそれらの脳における検出可能なＡβ斑の神経病理学を表し、斑の沈着は時間にわたって進行する。本明細書に記述される実験において、凝集されたＡβ４２（ＡＮ１７９２）をマウスに投与した。処理されたマウスの大部分（７／９）は、その全部が１３月齢で有意の脳のアミロイド負荷量を示した、（生理的食塩水を注入されたかもしくは未処理の）対照マウスと対照的に、この齢でそれらの脳中に検出可能なアミロイドを有しなかった（図２）。これらの差異は海馬においてより顕著でさえあった（図３）。処理されたマウスは、Ａβに対する有意な血清抗体力価もまた表した（全部が１：１０００より大きく、８／９が１／１０，０００より大きい；図１、表３Ａ）。一般に、生理的食塩水で処理されたマウスは、試験された全部の時点で、１００倍の希釈物でのＡβに対する抗体の４〜５倍のバックグラウンドレベル未満を表し、そして従って対照に関して有意の応答を有しないように思われた（表３Ｂ）。これらの研究は、特定の原線維を形成するペプチドＡβの注入が、Ａβアミロイド斑の沈着に対する保護を提供することを立証した。
【００７９】
血清アミロイドタンパク質（ＳＡＰ）は、肝で産生され、かつ、アルツハイマー病における脳アミロイド斑の原線維を包含する全部の形態のアミロイド原線維にカルシウム依存性の様式で結合する、循環する血漿糖タンパク質である。前述の実験の一部として、一群のマウスにＳＡＰを注入し；これらのマウスはＳＡＰに対する有意の血清力価（１：１０００〜１：３００００）を発生したが、しかし、Ａβペプチドに対する検出可能な血清力価を発生せず、そして脳の斑の神経病理学を発生した（図２）。
【００８０】
実施例ＩＩに詳述されるさらなる実験は、５週齢と約８月齢との間処理されたマウスにおけるＡβ注入の免疫原性の効果の用量依存性を立証する。これらのマウスにおいては、抗Ａβペプチド抗体の平均の血清力価が、免疫感作の数および増大する投薬量とともに増大したが；しかしながら、４回の免疫感作後、免疫感作５日後に測定された血清力価は、より高用量（１〜３００μｇ）にわたって約１：１００００のレベルで水平状態となった（図５）。
【００８１】
本発明の支持における付加的実験を実施例ＩＩＩに記述し、ここでは、ＰＤＡＰＰモデルマウスを、アミロイド斑がそれらの脳中に既に存在した後の時点（約１１月齢）で開始してＡβ４２で処理した。これらの研究では、動物をＡβ４２もしくは生理的食塩水で免疫感作し、そして１５もしくは１８月齢でアミロイド負荷量の試験のために殺した。図７に具体的に説明されるとおり、１８月齢で、Ａβ４２で処理されたマウスは、ＰＢＳで処理された１８月齢の対照（斑負荷量、４．７％）もしくは１２月の未処理の動物（０．２８％）のいずれかよりも有意により低い平均のアミロイド斑負荷量（斑負荷量、０．０１％）を表し、ここで、斑負荷量は実施例ＸＩＩＩ、８部に詳述されるとおり画像分析により測定する。これらの実験は、現存する斑負荷量の減少および病気の個体における斑負荷
量の進行の予防における、本発明の治療方法の効力を立証する。
【００８２】
本発明の本局面によれば、治療薬は、目的の疾患に特徴的である斑を含んで成る原線維ペプチドもしくはタンパク質由来である。あるいは、こうした作用物質は、原線維成分ともまた交差反応する免疫応答を誘導するのに十分にこうした成分と抗原的に類似である。表１および２はこうした原線維ペプチドおよびタンパク質の例を提供し、それらの組成および配列は当該技術分野で既知であるか、もしくは当該技術分野で既知の方法に従って容易に決定することができる。（多様な原線維ペプチド成分の抽出のための方法および／もしくは組成を特別に教示する参考文献については、下およびＢ２節に引用される参考文献を参照されたい；さらなる例示的原線維成分を下述する。）
【００８３】
従って、本発明に従えば、臨床的および／もしくは生検の決定に基づいてアミロイド疾患の診断がなされる場合、熟練した実務者は、該アミロイド沈着物の原線維組成を確かめそして原線維ペプチドもしくはタンパク質に向けられる免疫応答を誘導する作用物質を提供することが可能であることができる。
【００８４】
例として、上述されたとおり、アルツハイマー病、もしくはＡβ原線維の沈着を特徴とする他のアミロイド疾患の治療で使用される治療薬は、天然に存在する形態のＡβペプチド、およびとりわけヒトの形態（すなわちＡβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２もしくはＡβ４３）のいずれかであることができる。これらのペプチドの配列およびＡＰＰ前駆体とのそれらの関係は、当該技術分野で既知であり、かつ、当該技術分野で公知である（例えば、Ｈａｒｄｙら、ＴＩＮＳ  ２０、１５５−１５８（１９９７））。例えば、Ａβ４２は、配列：
【００８５】
【化１】
2012102131.tif 000006
【００８６】
を有する。
【００８７】
Ａβ４１、Ａβ４０およびＡβ３９は、該ペプチドのＣ末端からのそれぞれＡｌａ、Ａｌａ−ＩｌｅおよびＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌの省略によりＡβ４２と異なる。Ａβ４３は、Ｃ末端の１個のトレオニン残基の存在によりＡβ４２と異なる。本発明の好ましい一態様によれば、治療薬は目的の疾患の原線維成分の全部もしくは一部分に対する免疫応答を誘導することができる。例えば、好ましいＡβ免疫原性組成物は、Ａβの遊離のＮ末端に特異的な抗体を誘導する作用物質である。こうした組成物は、それが前駆体タンパク質β−ＡＰＰを認識せず、それによりそれを自己免疫を生じさせることをおそらくより少なくするものとみなされるという利点を有する。
【００８８】
さらなる例として、ＡＡ原線維の沈着を特徴とする疾患、例えば上述されたような、ある種の慢性炎症性障害、慢性の局所もしくは全身性の微生物感染症および悪性新生物に苦しめられる患者は、血清アミロイドＡタンパク質（アポＳＳＡ）の既知の８キロダルトンのフラグメント、ＡＡペプチドで治療することができることが真価をみとめられる。例示的ＡＡアミロイド障害は、限定されるものでないが、慢性関節リウマチ、若年性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬、乾癬性関節症、ライター症候群、成人スティル病、ベーチェット症候群、クローン病のような炎症性疾患、らい、結核、気管支拡張症、蓐瘡潰瘍、慢性腎盂腎炎、骨髄炎およびホウィップル病のような慢性の微生物感染症、ならびにホジキンリン
パ腫、腎癌、腸、肺および尿生殖管の癌、基底細胞癌、ならびに毛様細胞性白血病のような悪性新生物を挙げることができる。
【００８９】
ＡＡペプチドは、前駆体タンパク質の残基１、２もしくは３で開始しかつ残基５８と８４の間のいずれかの点で終了する、前駆体タンパク質血清アミロイドＡ（アポＳＳＡ）のＮ末端由来のペプチドの不均質な一群の１種もしくはそれ以上を指し；普遍的に、ＡＡ原線維はアポＳＳＡの残基１−７６より構成される。正確な構造および組成を決定することができ、かつ当該技術分野で公知の方法に従って適切なペプチドを合成することができる（Ｌｉｅｐｎｉｅｋｓ，Ｊ．Ｊ．ら  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２７０：８１−８６、１９９５）。
【００９０】
さらなる例として、免疫グロブリン軽鎖（κ鎖もしくはλ鎖）の可変（ＶL）ドメインの全部もしくは部分を含有するＮ末端領域由来のフラグメントは、一般に、間葉組織中のアミロイド沈着物を含んで成り、末梢性および自律性ニューロパシー、手根管症候群、巨舌症、拘束型心筋症、大型関節の関節症、免疫疾患、骨髄腫、ならびに不顕性疾患を引き起こす。本発明の組成物は、好ましくは、軽鎖の一部分、好ましくは「新エピトープ」（親分子のフラグメント化の結果として形成されるエピトープ）に対する免疫応答を誘導して可能な自己免疫効果を低下させることができる。
【００９１】
多様な遺伝性アミロイド疾患もまた、本発明の治療方法に敏感に反応する。こうした疾患は上のＢ．２節に記述される。例えば、多様な形態の家族性アミロイド多発神経障害は、それぞれが単一アミノ酸変化を特徴とする、肝により産生される１４キロダルトンのタンパク質、トランスチレチン（ＴＴＲ）の最低５０の突然変異体の形態の結果である。これらの形態のこの疾患の多くは、それらの特定の病理学および／もしくは人口統計学的起源に基づいて識別可能である一方、治療的組成物は、一般に有用な治療的組成物を提供するために、野性型ＴＴＲを包含する２種もしくはそれ以上の形態のＡＴＴＲの混合物のような、１種以上の形態のＴＴＲに対する免疫応答を誘導する作用物質より構成することもまたできることが真価をみとめられる。
【００９２】
アポＡＩを含有するアミロイド沈着物は、分子アポリポタンパク質ＡＩ中に点突然変異を有する人で見出される。この形態の疾患の患者は、一般に、末梢性ニューロパシーもしくは腎不全を伴って現れる。本発明によれば、治療的組成物は、本明細書に記述されるもしくは当該技術分野で既知の多様な形態のＡアポＡＩの１種もしくはそれ以上を構成する。
【００９３】
ある種の家族性の形態のアルツハイマー病ならびにダウン症候群は、βアミロイド前駆体タンパク質中の突然変異の結果であり、主としてβ−アミロイドペプチド（Ａβ）より構成される原線維を有する斑の沈着をもたらす。本発明の治療的組成物中でのＡβペプチドの使用は上述され、かつ、本明細書に例示される。
【００９４】
上で論考されたような遺伝性の形態のアミロイドーシスを治療するための他の製剤は、遺伝性全身性アミロイドーシスの治療のためのゲルゾリンフラグメント、遺伝性ニューロパシーの治療のための突然変異体のリゾチームタンパク質（Ａｌｙｓ）、腎疾患として明白な非ニューロパシー性の形態のアミロイドーシスのためのフィブリノーゲンの突然変異体のα鎖（ＡｆｉｂＡ）、アイスランドで報告されたある形態の遺伝性脳血管障害の治療のための突然変異体のシスタチンＣ（Ａｃｙｓ）に対する免疫応答を生じさせる組成物を包含する。加えて、ある種の遺伝性の形態のプリオン疾患（例えば、クロイツフェルト−ヤーコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群（ＧＳＳ）および致死性家族性不眠症（ＦＦＩ））は、プリオンタンパク質の突然変異体のアイソフォーム、ＰｒＰScを特徴とする。このタンパク質は、本発明に従い、ＰｒＰ斑の沈着の
治療および予防のための治療的組成物中で使用することができる。
【００９５】
上で論考されたとおり、全身性もしくは病巣性のいずれかのアミロイド沈着は加齢にもまた関連する。影響を受けやすい個体に、こうした加齢に関連する１種もしくはそれ以上のタンパク質より成る組成物を投与することにより、こうした沈着を予防もしくは治療することができることは、本発明のさらなる一局面である。従って、野性型ＴＴＲ由来のＡＴＴＲより構成される斑は、高齢者の心組織中で頻繁に見出される。同様に、ある高齢の個体は、彼らの脳中にＡβの無症候性の原線維の病巣性沈着物を発生することができ；本明細書で詳述されるようなＡβペプチド治療をこうした個体において正当化することができる。β2ミクログロブリンは前立腺のアミロイド小体の頻繁な成分であり、そして従って本発明に従ったさらなる一候補作用物質である。
【００９６】
さらなる例として、しかし制限としてでなく、本発明の治療方法の候補である多数の付加的な非遺伝性の形態のアミロイド疾患が存在する。β2ミクログロブリン原線維斑は、普遍的に、長期の血液透析もしくは腹腔透析を受領する患者で発症する。こうした患者は、本発明に従い、β２ミクログロブリン、もしくは、より好ましくは、その免疫原性のエピトープに向けられる治療的組成物を用いる治療により治療することができる。
【００９７】
ホルモンを分泌する腫瘍もまたホルモン由来のアミロイド斑を含有することができ、その組成は一般に冒されている特定の内分泌器官に特徴的である。従って、こうした原線維は、カルシトニン（甲状腺の髄質の癌腫）、島アミロイドポリペプチド（ＩＩ型糖尿病の大部分の患者に存在する）および心房性ナトリウム利尿ペプチド（孤立性心房性アミロイドーシス）のようなポリペプチドホルモンより構成されることができる。アテローム硬化症において大動脈内膜（ａｏｒｔｉｃ  ｉｎｔｉｍａ）中で生じるアミロイド沈着物に向けられる組成物もまた本発明により企図される。例えば、Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋらは、こうした斑を形成するアポリポタンパク質Ａの６９アミノ酸のＮ末端フラグメントを記述し（Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４７：１１８６−９２；１９９５）；本発明の治療的組成物はこうしたフラグメントに向けられる免疫学的試薬、ならびにフラグメントそれ自身を包含する。
【００９８】
前述の論考は、多様な形態のアミロイド疾患の治療もしくは予防において治療薬として使用することができるアミロイド原線維成分に焦点を当てた。該治療薬はまた、ヒトへの投与に際して類似の保護的もしくは治療的免疫応答を誘導するエピトープを含有する天然に存在するもしくは突然変異体の原線維ペプチドもしくはタンパク質の活性のフラグメントもしくは類似物であることもできる。免疫原性のフラグメントは、典型的には、天然のペプチドからの最低３、５、６、１０もしくは２０の連続するアミノ酸の配列を有する。例示的Ａβペプチドの免疫原性のフラグメントは、Ａβ１−５、１−６、１−７、１−１０、３−７、１−３、１−４、１−１２、１３−２８、１７−２８、１−２８、２５−３５、３５−４０および３５−４２を包含する。天然に存在する形態の原線維成分中に存在する最低１個、およびときに最低５もしくは１０個のＣ末端アミノ酸を欠くフラグメントを、いくつかの方法で使用する。例えば、Ａβ４３のＣ末端からの５アミノ酸を欠くフラグメントは、ＡＢのＮ末端からの最初の３８アミノ酸を包含する。ＡβのＮ末端の半分からのフラグメントがいくつかの方法で好ましい。類似物は、対立遺伝子変異体、種の変異体および誘導された変異体を包含する。類似物は、典型的には、しばしば保存的置換のゆえに、１個もしくは数個の位置で、天然に存在するペプチドと異なる。類似物は、典型的には、天然のペプチドとの最低８０もしくは９０％の配列の同一性を表す。数種の類似物は非天然のアミノ酸またはＮもしくはＣ末端アミノ酸の修飾もまた包含する。非天然のアミノ酸の例は、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、γ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、γ−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３
−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、ω−Ｎ−メチルアルギニンである。
【００９９】
一般に、当業者は、本発明の本局面に従って設計されるフラグメントおよび類似物を、下述されるようなトランスジェニック動物モデルにおいて、天然に存在する原線維成分との交差反応性、および／または予防もしくは治療効力についてスクリーニングすることができることの真価をみとめるであろう。こうしたフラグメントもしくは類似物は、それらの免疫反応性および動物モデルの効力が、アミロイド原線維成分について測定された対応するパラメータにほぼ同等かもしくはそれより大きい場合に、本発明の治療的組成物中で使用することができる。
【０１００】
こうしたペプチド、タンパク質もしくはフラグメント、類似物および他のアミロイド形成性ペプチドは、当該技術分野で公知の標準的方法に従って、固相ペプチド合成もしくは組換え発現により合成することができるか、または天然の供給源から得ることができる。例示的原線維組成物、原線維の抽出の方法、原線維ペプチドもしくはタンパク質成分の配列は、本明細書に提供される特定の原線維成分の記述とともに引用される参考文献の多くにより提供される。加えて、他の組成物、配列の抽出および決定方法は、当該技術分野で既知こうした組成物を作成しかつ使用することを所望する人に利用可能である。自動ペプチド合成機は、こうした組成物を作成するのに使用することができ、そしてアプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（パーキン  エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）；カリフォルニア州フォスターシティ）のような多数の製造元から商業的に入手可能であり、また、合成ペプチドを製造するための手順は当該技術分野で既知である。組換え発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌、酵母、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞中であることができるか；あるいは、タンパク質は、当該技術分野で既知の細胞を含まないインビトロ翻訳系を使用して製造することができる。組換え発現のための手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｐ．プレス（Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｐ．Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州  第２版、１９８９）により記述される。ある種のペプチドおよびタンパク質は商業的にもまた入手可能であり；例えば、いくつかの形態のＡβペプチドは、アメリカン  ペプチズ  カンパニー  インク（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州サニーヴェイル、およびカリフォルニア  ペプチド  リサーチ  インク（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州ナパのような供給元から入手可能である。
【０１０１】
治療薬は、例えば、他のアミノ酸と一緒に活性のペプチド原線維フラグメントもしくは類似物を包含するより長いポリペプチドより構成されることもまたできる。例えば、Ａβペプチドは、無傷のＡＰＰタンパク質、もしくはＡβのＮ末端で開始しかつＡＰＰの末端まで続くＣ−１００フラグメントのようなそのセグメントとして存在することができる。こうしたポリペプチドを、下述されるような動物モデルにおいて予防もしくは治療効力についてスクリーニングすることができる。Ａβペプチド、類似物、活性のフラグメントもしくは他のポリペプチドは、会合された形態（すなわちアミロイドペプチドとして）もしくは解離された形態で投与することができる。治療薬は、単量体の免疫原性の作用物質の多量体、もしくは複合物、または担体タンパク質を包含することもまたでき、そして／あるいは、上で挙げられたとおり、より広範な抗アミロイド斑活性を提供するために、他の原線維成分に添加することができる。
【０１０２】
さらなる一変形物において、Ａβのフラグメントのような免疫原性のペプチドは、免疫原性の組成物の部分としてウイルスもしくは細菌により提示することができる。免疫原性のペプチドをコードする核酸が、ウイルスもしくは細菌のゲノムもしくはエピソーム中に組込まれる。場合によっては、核酸は、分泌されるタンパク質、またはペプチドが表示されるようにウイルスの外側表面タンパク質もしくは細菌の膜貫通タンパク質との融合タン
パク質として、免疫原性のペプチドが発現されるような様式で組込まれる。こうした方法で使用されるウイルスもしくは細菌は、非病原性であるかもしくは弱毒化されているべきである。適するウイルスは、アデノウイルス、ＨＳＶ、ベネズエラウマ脳炎ウイルスおよび他のアルファウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ならびに他のラブドウイルス、ワクシニアおよび鶏痘を包含する。適する細菌はサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）および赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）を包含する。ＨＢＶのＨＢｓＡｇへの免疫原性のペプチドの融合がとりわけ適する。治療薬はまた、Ａβとの有意のアミノ酸配列の類似性を必ずしも有しないがしかしにもかかわらずＡβの模倣物として作用しかつ類似の免疫応答を誘導する、ペプチドおよび他の化合物も包含する。例えば、βプリーツシートを形成するいかなるペプチドおよびタンパク質も適合性についてスクリーニングすることができる。Ａβもしくは他のアミロイド形成性ペプチドに対するモノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体もまた使用することができる。こうした抗Ｉｄ抗体は抗原を模倣し、そしてそれに対する免疫応答を生じさせる（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｉｔ編、ブラックウェル  サイエンティフィック  パブリケーションズ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、パロアルト、第６版）、ｐ．１８１を参照されたい）。Ａβペプチド以外の作用物質は、上に列挙されたＡβの好ましいセグメント（例えば、１−１０、１−７、１−３および３−７）の１種もしくはそれ以上に対する免疫原性の応答を誘導するべきである。好ましくは、こうした作用物質は、Ａβの他のセグメントに向けられることなく、これらのセグメントの１つに特異的に向けられる免疫原性の応答を誘導する。
【０１０３】
ペプチドもしくは他の化合物のランダムライブラリーもまた適合性についてスクリーニングすることができる。段階的な様式で合成することができる多くの型の化合物について、組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）ライブラリーを生じさせることができる。こうした化合物は、ポリペプチド、βターン模倣物、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーのＮ置換グリシンおよびオリゴカルバメートを包含する。化合物の大規模の組み合わせライブラリーは、アフィマックス（Ａｆｆｙｍａｘ）、国際特許出願第ＷＯ  ９５／１２６０８号明細書、アフィマックス（Ａｆｆｙｍａｘ）、国際特許出願第ＷＯ  ９３／０６１２１号明細書、コロンビア大学、国際特許出願第ＷＯ  ９４／０８０５１号明細書、ファルマコペイア（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）、国際特許出願第ＷＯ  ９５／３５５０３号明細書、およびスクリップス（Ｓｃｒｉｐｐｓ）、国際特許出願第ＷＯ  ９５／３０６４２号明細書（これらのそれぞれは全部の目的上引用により組み込まれる）に記述されるコードされる合成ライブラリー（ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）（ＥＳＬ）法により構築することができる。ペプチドライブラリーはファージディスプレイ法によってもまた生じさせることができる。例えば、Ｄｅｖｌｉｎ、国際特許出願第ＷＯ  ９１／１８９８０号明細書を参照されたい。
【０１０４】
組み合わせライブラリーおよび他の化合物は、最初に、Ａβ、もしくはＡＴＴＲのような他のアミロイド形成性ペプチドに特異的であることが既知の抗体もしくはリンパ球（ＢもしくはＴ）に結合するそれらの能力を測定することにより、適合性についてスクリーニングする。例えば、最初のスクリーニングを、Ａβ、もしくは目的のいずれかの他のアミロイド形成性ペプチドに対するいずれかのポリクローナル血清もしくはモノクローナル抗体を用いて実施することができる。その後、こうしたスクリーニングにより同定された化合物を、Ａβもしくは他のアミロイド形成性ペプチドに対する抗体もしくは反応性のリンパ球を誘導する能力についてさらに分析する。例えば、血清の複数の希釈物を、原線維ペプチドで予め被覆されているマイクロタイタープレート上で試験することができ、そして、標準的ＥＬＩＳＡを実施してＡβに対する反応性抗体について試験することができる。その後、実施例に記述されるとおり、あるアミロイド形成性疾患に対する素因を作られたトランスジェニック動物において、予防および治療効力について化合物を試験することが
できる。こうした動物は、例えば、Ｇａｍｅｓら、上記により記述されたＡＰＰの７１７突然変異を担持するマウス、ならびに、ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅら、米国特許第５，６１２，４８６号明細書およびＨｓｉａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４、９９（１９９６）により記述されたようなＡＰＰの６７０／６７１のスウェーデン型突然変異を担持するマウス；Ｓｔａｕｆｅｎｂｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４、１３２８７−１３２９２（１９９７）；Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ−Ｐｉｅｒｒａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４、１３２８７−１３２９２（１９９７）；Ｂｏｒｃｈｅｌｔら、Ｎｅｕｒｏｎ  １９、９３９−９４５（１９９７））を包含する。同一のスクリーニングアプローチは、上述された、Ａβのフラグメント、Ａβの類似物およびＡβを包含するより長いペプチドのような他の潜在的作用物質で使用することができる。
【０１０５】
ｂ．他の斑成分
他のアミロイド斑成分に向けられる免疫学的応答は、アミロイド疾患における斑沈着の予防、妨害もしくは低下においてもまた有効であることができることが真価をみとめられる。こうした成分は、原線維の少ない成分であることができるか、または、斑中の原線維もしくは原線維形成を伴うことができるが、但し、身体中に遍在する、もしくはアミロイド沈着物に対し比較的非特異的である成分は、一般に治療の標的としての使用によりあまり適さない。
【０１０６】
従って、特定の斑成分に対する免疫応答を誘導する作用物質がアミロイド疾患の治療もしくはその進行の予防で有用であることが、本発明のさらなる一発見である。本節は、数種の例示的アミロイド斑関連分子の背景を提供する。単独で、または、上述された原線維成分もしくは下述される他の非原線維形成性成分のいずれかに対する免疫原性の治療的組成物と組み合わせでの、これらの分子のいずれかに対する免疫応答の誘導は、本発明に従い、付加的な抗アミロイド治療レジメンを提供する。また、本明細書に記述されるようなこうした斑成分に基づく受動的免疫感作レジメンも、本発明の部分を形成する。
【０１０７】
例として、シヌクレインは、アポリポタンパク質に構造的に類似であるがしかしとりわけシナプス前端末の近傍のニューロンの細胞質中で見出されるタンパク質である。α、βおよびγシヌクレインと命名される最低３形態の該タンパク質が存在する。最近、αおよびβシヌクレインが、ある種のアミロイド疾患、とりわけアルツハイマー病におけるアミロイド沈着物の核形成に関与していることが示された。（Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｄ．Ｆ．ら、ＴＩＮＳ  ２１（６）：２４９−２５５、１９９８）。より具体的には、αおよびβシヌクレインのＮＡＣドメインのフラグメント（残基６１−９５）が、アルツハイマー病患者のアミロイド斑から単離されており；事実、このフラグメントは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）での可溶化後に不溶性のまま留まるプラークの約１０％を含んで成る。（Ｇｅｏｒｇｅ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｎｅｗｓ  １：１２−１７、１９９５）。さらに、完全長のαシヌクレインおよびそのＮＡＣフラグメントの双方が、インビトロでβアミロイドペプチドの不溶性アミロイドへの凝集を加速することが報告されている。（Ｃｌａｙｔｏｎ、上記）。
【０１０８】
アミロイド斑に関連する付加的成分は非ペプチド成分を包含する。例えば、パールカンおよびパールカン由来のグリコサミノグリカンは、アルツハイマー病、ならびに糖尿病に関連するアミリン斑を包含する他のＣＮＳおよび全身性のアミロイドーシスのＡβを含有するアミロイド斑中に存在する、大型のヘパリン硫酸プロテオグリカンである。これらの化合物はＡβ原線維形成を高めることが示されている。パールカンのコアタンパク質およびグリコサミノグリカン鎖の双方がＡβへの結合に参画していることが示されている。付加的なグリコサミノグリカン、とりわけデルマタン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸およびペントサンポリ硫酸は、多様な型のアミロイド斑中で普遍的に見出され、そして、原線
維形成を高めることもまた示されている。デキストラン硫酸もまたこの特性を有する。この増強は、該分子を脱硫酸化する場合に有意に低下される。特定のグリコサミノグリカンそれら自身を包含する硫酸化された形態のグリコサミノグリカンに対し向けられる免疫原性の治療薬は、一次もしくは二次のいずれかの治療として、本発明の付加的な一態様を形成する。こうした分子、ならびにこうした分子を含有する適切な治療的組成物の製造は、当業者の熟練内にある。
【０１０９】
２．受動免疫応答を誘導する作用物質
本発明の治療薬は、原線維ペプチドもしくはアミロイド斑の他の成分に特異的に結合する、抗体のような免疫試薬もまた包含する。こうした抗体はモノクローナルもしくはポリクローナルであることができ、そして標的とされるべきアミロイド疾患の型に一致する結合特異性を有する。治療的組成物および治療レジメンは、斑の特定の原線維もしくは非原線維成分上の単一の結合ドメインもしくはエピトープに向けられる抗体を包含することができるか、あるいは、同一の成分上の２種もしくはそれ以上のエピトープに向けられる抗体、または斑の複数の成分上のエピトープに向けられる抗体を包含することができる。
【０１１０】
例えば、本発明の支持において実施される実験において、本明細書の実施例ＸＩに詳述されるとおり、８  １／２ないし１０  １／２月齢のＰＤＡＰＰマウスに、ポリクローナル抗Ａβ４２もしくはＡβペプチドの特定のエピトープに対し調製されたモノクローナル抗Ａβ抗体、または生理的食塩水の腹腔内（ｉ．ｐ．）注入を与えた。これらの実験において、循環する抗体濃度をモニターし、そして、抗体が作成された特定の抗原に関して１：１０００より大きい循環する抗体濃度を維持するのに必要とされるように、追加抗原刺激の注入を与えた。対照と比較して、総Ａβレベルの低下が、抗体で処理されたマウスの皮質、海馬および小脳領域中で観察され；最高の低下はこれらの研究においてポリクローナル抗体で処理されたマウスで表された。
【０１１１】
本発明の支持において実施されたさらなる実験において、予測的エクスビボアッセイ（実施例ＸＩＶ）を使用して、ＮＡＣと称されるシヌクレインのフラグメントに対する抗体の消失を試験した。シヌクレインはアミロイド斑関連タンパク質であることが示されている。ＮＡＣに対する抗体を、アミロイド斑および小膠細胞を含有する脳組織サンプルと接触させた。ウサギ血清を対照として使用した。その後のモニタリングは、抗体の活性を消失させることを暗示する、斑の数および大きさの顕著な減少を示した。
【０１１２】
これらのデータから、アルツハイマー病および他のアミロイド疾患に関連するアミロイド斑の負荷を、ＡβペプチドのエピトープもしくはシヌクレインのＮＡＣフラグメントに対し向けられる免疫試薬（アミロイド斑の負荷を低下させるのに有効である）の投与により大きく減少させることができることが明らかである。広範な抗体をこうした組成物中で使用することができることがさらに理解される。解離された形態に結合することなく凝集された形態のＡβに特異的に結合する抗体は、凝集された形態に結合することなく解離された形態に特異的に結合する抗体がそうであるように、本発明での使用に適する。他の適する抗体は、凝集された形態および解離された形態の双方に結合する。いくつかのこうした抗体は、天然に存在する長い形態のＡβ（すなわちＡβ４２およびＡβ４３）に結合することなく、天然に存在する短い形態のＡβ（すなわちＡβ３９、４０もしくは４１）に結合する。いくつかの抗体は、短い形態に結合することなく長い形態に結合する。いくつかの抗体は、完全長のアミロイド前駆体タンパク質に結合することなくＡβに結合する。いくつかの抗体は、約１０6、１０7、１０8、１０９もしくは１０10Ｍ-1より大きいもしくはそれに等しい結合親和性でＡβに結合する。
【０１１３】
ポリクローナル血清は、典型的に、Ａβの長さに沿っていくつかのエピトープに結合する抗体の混合された集団を含有する。モノクローナル抗体は、コンホメーション的もしく
は非コンホメーション的エピトープであることができるＡβ内の特定のエピトープに結合する。いくつかのモノクローナル抗体は、Ａβの残基１−２８（天然のＡβの最初のＮ末端残基を１と呼称する）以内のエピトープに結合する。他のモノクローナル抗体はＡβの残基１−１０をもつエピトープに結合する。Ａβの残基１−１６をもつエピトープに結合するモノクローナル抗体もまた存在する。他のモノクローナル抗体はＡβの残基１−２５をもつエピトープに結合する。いくつかのモノクローナル抗体は、Ａβのアミノ酸１−５、５−１０、１０−１５、１５−２０、２５−３０、１０−２０、２０、３０、もしくは１０−２５内のエピトープに結合する。抗体の予防および治療効力は、実施例に記述されるトランスジェニック動物モデルの手順を使用して試験することができる。
【０１１４】
より一般的には、本明細書に提供される教示から、実務者は、本明細書に記述される組成物を使用して、本明細書の２節に記述される疾患のような他のアミロイド疾患に特徴的な原線維タンパク質もしくはペプチドに向けられる抗体、ならびに他のアミロイド成分に対する抗体を設計、製造および試験することができる。
【０１１５】
ａ．免疫グロブリンの一般的特徴
基本的な抗体構造単位はサブユニットの四量体を含んで成ることが既知である。各四量体はポリペプチド鎖の２個の同一の対より構成され、各対は１個の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１個の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識の原因である約１００ないし１１０もしくはそれ以上のアミノ酸の可変領域を包含する。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能の原因である定常領域を定義する。
【０１１６】
軽鎖はκもしくはλ鎖のいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δもしくはε鎖として分類され、そして抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと定義する。軽鎖および重鎖内では、可変領域および定常領域が約１２もしくはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、重鎖は約１０より多いアミノ酸の「Ｄ」領域もまた包含する。（一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、レイヴァン  プレス（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８９）、第７章（全部の目的上そっくりそのまま引用により組み込まれる）を参照されたい）。
【０１１７】
各軽／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。従って、無傷の抗体は２個の結合部位を有する。二機能性もしくは二特異性の抗体においてを除き、２個の結合部位は同一である。鎖は、全部、相補性決定領域もしくはＣＤＲともまた呼ばれる３個の超可変領域により結合される比較的保存された枠組み領域（ＦＲ）の同一の一般的構造を表す。各対の２本の鎖からのＣＤＲは枠組み領域により整列され、特定のエピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖双方がドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含んで成る。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（国立保健研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、メリーランド州ベセスダ、１９８７および１９９１）、もしくはＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
【０１１８】
ｂ．非ヒト抗体の産生
非ヒトモノクローナル抗体の産生（例えば、マウス、モルモット、ウサギもしくはラット）は、例えばＡβもしくは他の原線維成分のような斑成分で動物を免疫感作することにより達成することができる。ＡβもしくはＡβの免疫原性のフラグメントを含んで成るよ
り長いポリペプチド、またはＡβに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体もまた使用することができる。例えばＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨＰ  ＮＹ、１９８８）（全部の目的上引用により組み込まれる）を参照されたい。こうした免疫原は、天然の供給源から、ペプチド合成により、もしくは組換え発現により得ることができる。場合によっては、免疫原を、下述されるような担体タンパク質と融合もしくは別の方法で複合体形成されて投与することができる。場合によっては、免疫原をアジュバントとともに投与することができる。下述されるようないくつかの型のアジュバントを使用することができる。フロイントの完全アジュバント、次いで不完全アジュバントが、実験動物の免疫感作に好ましい。ウサギもしくはモルモットが、ポリクローナル抗体の作成に典型的に使用される。マウスはモノクローナル抗体の作成に典型的に使用される。抗体を、免疫原への特異的結合についてスクリーニングする。場合によっては、抗体を、免疫原の特定の領域への結合についてさらにスクリーニングする。例えば、免疫原としてＡβペプチドの場合、スクリーニングは、Ａβペプチドの欠失突然変異体の集合物への抗体の結合を測定すること、およびどの欠失突然変異体が抗体に結合するかを決定することにより達成することができる。結合は、例えばウェスタンブロットもしくはＥＬＩＳＡにより評価することができる。抗体への特異的結合を示す最小のフラグメントが抗体のエピトープを定義する。あるいは、エピトープの特異性は、試験抗体および参照抗体が成分への結合について競争する競争アッセイにより決定することができる。試験抗体および参照抗体が競争する場合には、それらは、同一のエピトープ、もしくは一方の抗体の結合が他方の結合を妨害する、十分に近接したエピトープに結合する。
【０１１９】
Ｃ．キメラおよび人化抗体
キメラおよび人化抗体は、マウス、またはキメラもしくは人化抗体の構築の出発原料を提供する他の非ヒトの抗体に同一もしくは類似の結合特異性および親和性を有する。キメラ抗体は、その軽鎖および重鎖遺伝子が、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから典型的には遺伝子工学により構築されている抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変（Ｖ）セグメントを、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４のようなヒトの定常（Ｃ）セグメントに結合することができる。従って、典型的なキメラ抗体は、マウス抗体からのＶもしくは抗原結合ドメイン、およびヒト抗体からのＣもしくはエフェクタードメインより成るハイブリッドタンパク質である。
【０１２０】
人化抗体は、実質的にヒト抗体からの可変領域の枠組み残基（アクセプター抗体と命名される）および実質的にマウス抗体からの相補性決定領域、（ドナー免疫グロブリンと称される）を有する。Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、ならびに国際特許出願第ＷＯ  ９０／０７８６１号明細書、米国特許第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，５３０，１０１号、およびＷｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号明細書（全部の目的上そっくりそのまま引用により組み込まれる）を参照されたい。定常領域（１種もしくは複数）もまた、存在する場合には、実質的にもしくは完全にヒト免疫グロブリンからである。ヒトの可変ドメインは、通常、その枠組み配列が、ＣＤＲが由来したマウスの可変領域ドメインとの高程度の配列の同一性を表すヒト抗体から選ばれる。重鎖および軽鎖の可変領域の枠組み残基は、同一もしくは異なるヒト抗体配列由来であることができる。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であることができるか、もしくは、数種のヒト抗体のコンセンサス配列であることができる。Ｃａｒｔｅｒら、国際特許出願第ＷＯ  ９２／２２６５３号を参照されたい。ヒトの可変領域の枠組み残基からのある種のアミノ酸が、ＣＤＲのコンホメーションおよび／もしくは抗原への結合に対するそれらの可能な影響に基づき、置換のため選択される。こうした可能な影響の検討は、模型を作ること、特定の位置のアミノ酸の特徴の検査、または特定のアミノ酸の置換もしくは突然変異誘発の影響の経験的観察による。
【０１２１】
例えば、あるアミノ酸が、マウスの可変領域の枠組み残基と選択されたヒトの可変領域の枠組み残基との間で異なる場合、ヒトの枠組みアミノ酸を、通常、該アミノ酸が：
（１）抗原を直接非共有結合する、
（２）ＣＤＲ領域に隣接する、
（３）ＣＤＲ領域と別の方法で相互作用する（例えば、ＣＤＲ領域の約６Ａ以内である）、もしくは
（４）ＶＬ−ＶＨ界面に参画する
ことが合理的に期待される場合は、マウスの抗体からの同等な枠組みアミノ酸により置換するべきである。
【０１２２】
置換のための他の候補は、その位置でヒト免疫グロブリンにとって異常であるアクセプターのヒト枠組みアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の同等の位置、もしくはより典型的なヒト免疫グロブリンの同等の位置からのアミノ酸で置換することができる。置換のための他の候補は、その位置でヒト免疫グロブリンにとって異常であるアクセプターのヒト枠組みアミノ酸である。人化免疫グロブリンの可変領域の枠組みは、通常、ヒトの可変領域の枠組み配列もしくはこうした配列のコンセンサスに対し最低８５％の配列の同一性を示す。
【０１２３】
ｄ．ヒト抗体
Ａβに対するヒト抗体は、下述される多様な技術により提供される。いくつかのヒト抗体が、実施例ＸＩで記述されるマウスモノクローナルのもののような特定のマウス抗体と同一のエピトープ特異性を有するように、競争結合実験もしくは別の方法により選択される。ヒト抗体はまた、免疫原としてＡβのフラグメントのみを使用すること、および／もしくはＡβの欠失突然変異体の集合物に対する抗体をスクリーニングすることにより、特定のエピトープ特異性についてもスクリーニングすることができる。
【０１２４】
（１）トリオーマの方法論
基本的アプローチ、およびこのアプローチでの使用のための一例示的細胞融合パートナー、ＳＰＡＺ−４は、Ｏｅｓｔｂｅｒｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：３６１−３６７（１９８３）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇ、米国特許第４，６３４，６６４号明細書；およびＥｎｇｌｅｍａｎら、米国特許第４，６３４，６６６号明細書（それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用により組み込まれる）により記述されている。この方法により得られる抗体産生細胞系は、それらが３種の細胞、すなわち２種のヒトおよび１種のマウスから由来されるためトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）と呼ばれる。最初に、マウス骨髄腫系統をヒトＢリンパ球と融合させて、Ｏｅｓｔｂｅｒｇ、上記により記述されるＳＰＡＺ−４細胞系のような非抗体産生性の異種発生性ハイブリッド細胞を得る。その後、該異種発生性細胞を、免疫感作されたヒトＢリンパ球と融合させて抗体産生トリオーマ細胞系を得る。トリオーマは、ヒト細胞から作成された通常のハイブリドーマより安定に抗体を産生することが見出されている。
【０１２５】
免疫感作されたＢリンパ球は、ヒトドナーの血液、脾、リンパ節もしくは骨髄から得る。特定の抗原もしくはエピトープに対する抗体が望ましい場合、免疫感作にその抗原もしくはそのエピトープを使用することが好ましい。免疫感作はインビボもしくはインビトロのいずれかであることができる。インビボ免疫感作には、Ｂ細胞を、典型的には、Ａβ、そのフラグメント、Ａβもしくはフラグメントを含有するより大きなポリペプチド、またはＡβに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体で免疫感作されたヒトから単離する。いくつかの方法では、Ｂ細胞を、抗体療法が最終的に投与されるべきである同一の患者から単離する。インビトロ免疫感作には、Ｂリンパ球を、典型的には、１０％ヒト血漿を補充されたＲＰＭＩ−１６４０（Ｅｎｇｌｅｍａｎ、上記を参照されたい）のような培地中
で７〜１４日の期間の間、抗原に曝露する。
【０１２６】
免疫感作されたＢリンパ球を、公知の方法により、ＳＰＡＺ−４のような異種発生性のハイブリッド細胞に融合させる。例えば、細胞を、約３７度Ｃで約５〜１０分間、ＭＷ  １０００−４０００の４０〜５０％ポリエチレングリコールで処理する。細胞を融合混合物から分離し、そして所望のハイブリッドについて選択的な培地（例えばＨＡＴもしくはＡＨ）中で繁殖させる。必要とされる結合特異性を有する抗体を分泌するクローンを、Ａβもしくはそのフラグメントに結合する能力についてトリオーマ培地をアッセイすることにより同定する。所望の特異性を有するヒト抗体を産生するトリオーマを、限界希釈技術によりサブクローニングし、そして培地中でインビトロで成長させる。その後、得られたトリオーマ細胞系を、Ａβもしくはそのフラグメントを結合する能力について試験する。
【０１２７】
トリオーマは遺伝子的に安定であるが、それらは非常に高レベルで抗体を産生しない。発現レベルは、抗体遺伝子をトリオーマから１種もしくはそれ以上の発現ベクターにクローン化すること、および、当該技術分野で公知の方法に従って、ベクターを標準的な哺乳動物、細菌もしくは酵母の細胞系に形質転換することにより増大させることができる。
【０１２８】
（２）トランスジェニックの非ヒト哺乳動物
Ａβに対するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の最低１セグメントをコードするトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を有する非ヒトトランスジェニック哺乳動物からもまた産生することができる。通常、こうしたトランスジェニック哺乳動物の内在性の免疫グロブリンの遺伝子座は機能的に不活性化されている。好ましくは、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座のセグメントは、重鎖および軽鎖成分の再配列されない配列を包含する。内在性の免疫グロブリン遺伝子の不活性化、および外来性の免疫グロブリン遺伝子の導入の双方は、標的を定められた相同的組換えもしくはＹＡＣ染色体の導入により達成することができる。この方法から生じるトランスジェニック哺乳動物は、免疫グロブリン成分の配列を機能的に再配列し、そして内在性の免疫グロブリン遺伝子を発現することなく、ヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされる多様なアイソタイプの抗体のレパートリーを発現することが可能である。これらの特性を有する哺乳動物の産生および特性は、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、国際特許出願第ＷＯ  ９３／１２２２７号明細書（１９９３）；米国特許第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、同第５，８１４，３１８号、同第５，７８９，６５０号、同第５，７７０，４２９号、同第５，６６１，０１６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，５６９，８２５号，同第５，５４５，８０６号明細書、Ｎａｔｕｒｅ  １４８、１５４７−１５５３（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、８２６（１９９６）、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、国際特許出願第ＷＯ  ９１／１０７４１号明細書（１９９１）（それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用により組み込まれる）により詳細に記述される。トランスジェニックマウスはこの点に関してとりわけ適する。抗Ａβ抗体は、ＬｏｎｂｅｒｇもしくはＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、上記により記述されるようなトランスジェニックの非ヒト哺乳動物を、Ａβもしくはそのフラグメントで免疫感作することにより得る。モノクローナル抗体は、例えば、慣習的なＫｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎの技術を使用して、こうした哺乳動物からのＢ細胞を適する骨髄腫細胞系に融合することにより製造する。ヒトポリクローナル抗体は、免疫原性の作用物質で免疫感作されたヒトからの血清の形態でもまた提供することができる。場合によっては、こうしたポリクローナル抗体は、親和性試薬としてＡβもしくは他の免疫原アミロイドペプチドを使用する親和性精製により濃縮することができる。
【０１２９】
（３）ファージディスプレイ法
ヒト抗Ａβ抗体を得るためのさらなる一アプローチは、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）により概説される一般的プロトコルに従って、
ヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。例えば、トリオーマの方法論について記述されたとおり、こうしたＢ細胞を、Ａβ、フラグメント、Ａβもしくはフラグメントを含有するより長いポリペプチド、または抗イディオタイプ抗体で免疫感作されたヒトから得ることができる。場合によっては、こうしたＢ細胞は抗体治療を最終的に受領するべきである患者から得る。Ａβもしくはそのフラグメントのような目的のアミロイド成分のエピトープに結合する抗体を選択する。その後、こうした抗体（もしくは結合するフラグメント）をコードする配列をクローン化しかつ増幅する。Ｈｕｓｅにより記述されるプロトコルは、ファージディスプレイ技術と組み合わせでより効率的にされる。例えば、Ｄｏｗｅｒら、国際特許出願第ＷＯ  ９１／１７２７１号明細書およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、国際特許出願第ＷＯ  ９２／０１０４７号、米国特許第５，８７７，２１８号、同第５，８７１，９０７号、同第５，８５８，６５７号、同第５，８３７，２４２号、同第５，７３３，７４３号および同第５，５６５，３３２号明細書（それらのそれぞれは全部の目的上そっくりそのまま引用により組み込まれる）を参照されたい。これらの方法においては、メンバーがそれらの外側表面上に異なる抗体を表示するファージのライブラリーを製造する。抗体は通常、ＦｖもしくはＦａｂフラグメントとして表示される。所望の特異性をもつ抗体を表示するファージを、Ａβペプチドもしくはそのフラグメントに対する親和性濃縮により選択する。
【０１３０】
ファージディスプレイ法の一変形物において、選択されたマウス抗体の結合特異性を有するヒト抗体を製造することができる。Ｗｉｎｔｅｒ、国際特許出願第ＷＯ  ９２／２０７９１号明細書を参照されたい。この方法において、選択されたマウス抗体の重鎖もしくは軽鎖いずれかの可変領域を出発原料として使用する。例えば、軽鎖可変領域を出発原料として選択する場合、メンバーが同一の軽鎖可変領域（すなわちマウスの出発原料）および異なる重鎖可変領域を表示するファージライブラリーが構築される。重鎖可変領域を、再配列されたヒト重鎖可変領域のライブラリーから得る。目的の成分に対する強い特異的結合を示すファージ（例えば、最低１０8、および好ましくは最低１０9Ｍ-1）を選択する。その後、このファージからのヒト重鎖可変領域が、さらなるファージライブラリーを構築するための出発原料として作用する。このライブラリーにおいて、各ファージは、同一の重鎖可変領域（すなわち第一のディスプレイライブラリーから同定される領域）および異なる軽鎖可変領域を表示する。軽鎖可変領域は、再配列されたヒト可変軽鎖領域のライブラリーから得る。再度、アミロイドペプチド成分に対する強い特異的結合を示すファージを選択する。これらのファージは、完全にヒトの抗アミロイドペプチド抗体の可変領域を表示する。これらの抗体は、通常、マウスの出発原料に同一もしくは類似のエピトープ特異性を有する。
【０１３１】
ｅ．定常領域の選択
キメラ、人化もしくはヒトの抗体の重鎖および軽鎖の可変領域を、ヒト定常領域の少なくとも一部分に連結することができる。定常領域の選択は、部分的に、抗体依存性の補体および／もしくは細胞に媒介される毒性が望ましいかどうかに依存する。例えば、アイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ３は補体活性を有し、また、アイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４は有しない。アイソタイプの選択は、脳中への抗体の通過にもまた影響を及ぼすことができる。軽鎖定常領域はλもしくはκ鎖であることができる。抗体は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含有する四量体として、別個の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖとして、もしくは重鎖および軽鎖の可変ドメインがスペーサーにより連結される一本鎖抗体として発現することができる。
【０１３２】
ｆ．組換え抗体の発現
キメラ、人化およびヒト抗体は、典型的に、組換え発現により産生する。組換えポリヌクレオチド構築物は、典型的に、天然に関連したもしくは異種のプロモーター領域を包含する、抗体鎖のコーディング配列に操作可能に連結された発現制御配列を包含する。好ま
しくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換もしくはトランスフェクションすることが可能なベクター中の真核生物プロモーター系である。ベクターが適切な宿主中に組込まれれば、宿主を該ヌクレオチド配列の高レベル発現、ならびに交差反応する抗体の収集および精製に適する条件下で維持する。
【０１３３】
これらの発現ベクターは、典型的に、エピソームもしくは宿主の染色体ＤＮＡの組込み部分のいずれかとして宿主生物体中で複製可能である。普遍的には、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にする選択マーカー（例えばアンピシリン耐性もしくはヒグロマイシン耐性）を含有する。
【０１３４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、本発明のＤＮＡ配列のクローニングにとりわけ有用な１種の原核生物宿主である。酵母のような微生物もまた発現に有用である。サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は好ましい酵母宿主であり、適するベクターは発現制御配列、複製開始点、終止配列などを所望のとおり有する。典型的なプロモーターは３−ホスホグリセレートキナーゼおよび他の解糖酵素を包含する。誘導可能な酵母のプロモーターは、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソチトクロームＣ、ならびに麦芽糖およびガラクトースの利用を司る酵素からのプロモーターを包含する。
【０１３５】
哺乳動物細胞は、免疫グロブリンもしくはそのフラグメントをコードするヌクレオチドセグメントを発現するための好ましい宿主である。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ、（ＶＣＨ  パブリッシャーズ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、ニューヨーク、１９８７）を参照されたい。無傷の異種タンパク質を分泌することが可能な多数の適する宿主細胞系が当該技術分野で開発されており、そして、ＣＨＯ細胞系、多様なＣＯＳ細胞系、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞および骨髄腫細胞系を包含する。これらの細胞のための発現ベクターは、複製開始点、プロモーター、エンハンサーのような発現制御配列（Ｑｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル酸化部位および転写ターミネーター配列のような必要なプロセシング情報部位を包含することができる。好ましい発現制御配列は、内在性の遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなど由来のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照されたい。
【０１３６】
あるいは、抗体コーディング配列は、トランスジェニック動物のゲノム中への導入およびトランスジェニック動物の乳中でのその後の発現のために、（例えば、米国特許第５，７４１，９５７号、同第５，３０４，４８９号、同第５，８４９，９９２号明細書（全部はそっくりそのまま引用により本明細書に組み込まれる）に記述される方法に従って）トランスジーン中に組込むことができる。適するトランスジーンは、カゼインもしくはβラクトグロブリンのような乳腺特異的遺伝子からのプロモーターおよびエンハンサーとの操作可能な連結で、軽鎖および／もしくは重鎖のコーディング配列を包含する。
【０１３７】
目的のＤＮＡセグメントを含有するベクターを、細胞宿主の型に依存して、公知の方法により宿主細胞に移入することができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核生物細胞に普遍的に利用される一方、リン酸カルシウム処理、電気穿孔法、リポフェクション、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）もしくはウイルスに基づくトランスフェクションを、他の細胞宿主に使用することができる。哺乳動物細胞を形質転換するのに使用される他の方法は、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔法および微小注入法の使用を包含する（全般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい）。トランスジェニック動物の産生のためには、トランスジーンを受精卵母細胞に微小注入することができるか、もしくは胚幹細胞のゲノム中に組込むことができ、そしてこうした細胞の核を除核卵母細胞に移入することができる。
【０１３８】
抗体は、発現されれば、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを包含する当該技術の標準的手順に従って精製することができる（全般的に、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（シュプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク、１９８２）を参照されたい）。
【０１３９】
４．他の治療薬
本方法での使用のための治療薬は、Ａβペプチドのような斑成分に結合するＴ細胞もまた包含する。例えば、Ｔ細胞は、昆虫細胞系からヒトＭＨＣクラスＩ遺伝子およびヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子を発現させることによりＡβペプチドに対し活性化することができ、それにより空の複合体が細胞の表面上に形成され、そしてＡβペプチドに結合することができる。該細胞系と接触されたＴ細胞は、該ペプチドに対し特異的に活性化されたようになる。Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３１４，８１３号明細書を参照されたい。ＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する昆虫細胞系は、ＣＤ４  Ｔ細胞を活性化するのに同様に使用することができる。
【０１４０】
５．担体タンパク質
免疫応答を誘導するためのいくつかの作用物質は、アミロイド沈着物に対する免疫応答を誘導するのに適切なエピトープを含有するが、しかし免疫原性であるには小さすぎる。この状況で、ペプチド免疫原を適する担体に連結して免疫応答を導き出すのを助けることができる。適する担体は、血清アルブミン、ＫＬＨ、免疫グロブリン分子、チログロブリン、卵アルブミン、破傷風トキソイド、またはジフテリア、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、コレラもしくはＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）のような他の病原性細菌からのトキソイド、または弱毒化されたトキシン誘導体を包含する。他の担体は、複数のＭＨＣ対立遺伝子（例えば全部のヒトＭＨＣ対立遺伝子の最低７５％）に結合するＴ細胞エピトープを包含する。こうした担体はときに「普遍的Ｔ細胞エピトープ」として当該技術分野で既知である。普遍的Ｔ細胞エピトープの例は：
インフルエンザヘマグルチニン：ＨＡ307-319  ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号１）
ＰＡＤＲＥ（普遍的残基が太字にされる）  ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号２）マラリアＣＳ：Ｔ３エピトープ  ＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶ（配列番号３）
Ｂ型肝炎表面抗原：ＨＢｓＡｇ19-28  ＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩ（配列番号４）
熱ショックタンパク質６５：ｈｓｐ６５153-171  ＤＱＳＩＧＤＬＩＡＥＡＭＤＫＶＧＮＥＧ（配列番号５）
カルメット−ゲラン菌  ＱＶＨＦＱＰＬＰＰＡＶＶＫＬ（配列番号６）
破傷風トキソイド：ＴＴ830-844  ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号７）
破傷風トキソイド：ＴＴ947-967  ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号８）
ＨＩＶ  ｇｐ１２０  Ｔ１：  ＫＱＩＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡ．（配列番号９）
を包含する。
【０１４１】
免疫応答を刺激するもしくは高めるための他の担体は、ＩＬ−１、ＩＬ−１αおよびβペプチド、ＩＬ−２、γＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン、ならびにＭＩＰ１αおよびβならびにＲＡＮＴＥＳのようなケモカインを包含する。免疫原性の作用物質はまた、Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ、国際特許出願第ＷＯ  ９７／１７６１３号および同第ＷＯ  ９７／１７６１４号明細書に記述されるとおり、組織を横切る輸送を高めるペプチドに連結することもできる。
【０１４２】
免疫原性の作用物質は、化学的架橋により担体に連結することができる。免疫原を担体に連結するための技術は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネ
ート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を使用するジスルフィド結合の形成を包含する（ペプチドがスルフヒドリル基を欠く場合、これはシステイン残基の付加により提供することができる）。これらの試薬は、それら自身と１種のタンパク質上のペプチドシステイン残基との間にジスルフィド結合を、また、リシン上のε−アミノもしくは他のアミノ酸中の他の遊離のアミノ基によりアミド結合を創製する。多様なこうしたジスルフィド／アミド形成剤が、Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．６２、１８５（１９８２）により記述される。他の二官能性のカップリング剤はジスルフィド結合よりむしろチオエーテルを形成する。これらのチオエーテル形成剤の多くが商業的に入手可能であり、そして６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸および２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸の反応性エステルを包含する。カルボキシル基は、スクシンイミドもしくは１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリウム塩とそれらを組み合わせることにより活性化することができる。
【０１４３】
免疫原性ペプチドは、担体（すなわち異種ペプチド）との融合タンパク質として発現させることもまたできる。免疫原性のペプチドを、そのアミノ末端、そのカルボキシ末端もしくは双方で担体に連結することができる。場合によっては、免疫原性ペプチドの複数の反復配列が融合タンパク質中に存在することができる。場合によっては、免疫原性ペプチドは、例えば該ペプチドのＮおよびＣ双方の末端で複数のコピーの異種ペプチドに連結することができる。いくつかの担体ペプチドは、該担体ペプチドに対するヘルパーＴ細胞応答を誘導するよう作用する。誘導されたヘルパーＴ細胞は、順に、担体ペプチドに連結された免疫原性ペプチドに対するＢ細胞応答を誘導する。
【０１４４】
本発明のいくつかの作用物質は、ＡβのＮ末端フラグメントがそのＣ末端で担体ペプチドに連結される融合タンパク質を含んで成る。こうした作用物質においては、ＡβのフラグメントのＮ末端残基が融合タンパク質のＮ末端残基を構成する。従って、こうした融合タンパク質は、ＡβのＮ末端残基が遊離の形態にあることを必要とするエピトープに結合する抗体の誘導において有効である。本発明のいくつかの作用物質は、１コピーもしくはそれ以上の担体ペプチドにＣ末端で連結されたＡβのＮ末端セグメントの複数の反復配列を含んで成る。こうした融合タンパク質中に組込まれたＡβのＮ末端フラグメントは、ときにＡβ１−３で開始しかつＡβ７−１１で終わる。Ａβ１−７、Ａβ１−３、１−４、１−５および３−７がＡβの好ましいＮ末端フラグメントである。いくつかの融合タンパク質は、縦列のＡβの異なるＮ末端セグメントを含んで成る。例えば、融合タンパク質は、Ａβ１−７、次いでＡβ１−３、次いで異種ペプチドを含むことができる。
【０１４５】
いくつかの融合タンパク質においては、ＡβのＮ末端セグメントがそのＮ末端で異種担体ペプチドに融合される。同一の多様性のＡβのＮ末端セグメントを、Ｃ末端融合物でとのように使用することができる。いくつかの融合タンパク質はＡβのＮ末端セグメントのＮ末端に連結された異種ペプチドを含んで成り、これは順に縦列でＡβの１個もしくはそれ以上の付加的Ｎ末端セグメントに連結される。
【０１４６】
本発明での使用に適する融合タンパク質のいくつかの例を下に示す。これらの融合タンパク質のいくつかは、米国特許第５，１９６，５１２号、欧州特許第３７８，８８１号および同第４２７，３４７号明細書に記述されるような破傷風トキソイドのエピトープに連結されたＡβのセグメントを含んで成る。いくつかの融合タンパク質は、米国特許第５，７３６，１４２号明細書に記述された担体ペプチドに連結されたＡβのセグメントを含んで成る。いくつかの異種ペプチドは普遍的Ｔ細胞エピトープである。いくつかの方法において、投与のための作用物質は、単に、直線状の配置で異種セグメントに連結されたＡβセグメントとの単一の融合タンパク質である。いくつかの方法において、作用物質は、式２xにより表される融合タンパク質の多量体であり、ここでｘは１−５からの整数である
。好ましくは、ｘは１、２もしくは３であり、２が最も好ましい。ｘが２である場合、こうした多量体は、ＭＡＰ４（米国特許第５，２２９，４９０号明細書を参照されたい）と称される好ましい配置で連結された４個の融合タンパク質を有する。Ａβのエピトープに下線がつけられる。
【０１４７】
ＭＡＰ４の配置を下に示し、ここで、Ｎ末端およびリシンの側鎖アミンの双方でペプチド合成を開始することにより、分枝状構造が生じられる。リシンが配列中に組込まれかつ分枝することを可能にされる回数に依存して、生じる構造は複数のＮ末端を提示することができる。本例では、４個の同一のＮ末端が分枝状のリシン含有コア上に生じられている。こうした多重性はコグネイトのＢ細胞の応答性を大きく高める。
【０１４８】
【化２】
2012102131.tif 000007
【０１４９】
融合タンパク質の他の例（Ａβの免疫原性のエピトープが太字にされる）は
【０１５０】
【化３】
2012102131.tif 000008
【０１５１】
を包含する。
【０１５２】
受動免疫感作での使用のためのＡβに対する抗体の生成で使用されるべき免疫原を生成させるために、同一もしくは類似の担体タンパク質および連結方法を使用することができる。例えば、担体に連結されたＡβもしくはフラグメントを、Ａβに対するモノクローナル抗体の産生において実験動物に投与することができる。
【０１５３】
６．治療薬をコードする核酸
アミロイド沈着物に対する免疫応答は、選択されたペプチド免疫原、もしくは抗体および受動免疫感作に使用されるそれらの成分鎖をコードする核酸の投与によってもまた誘導することができる。こうした核酸はＤＮＡもしくはＲＮＡであることができる。免疫原をコードする核酸セグメントは、典型的には、患者の意図された標的細胞中で該ＤＮＡセグメントの発現を可能にする、プロモーターおよびエンハンサーのような調節要素に連結される。免疫応答の誘導に望ましいような、血液細胞中での発現のためには、軽鎖もしくは重鎖免疫グロブリン遺伝子からのプロモーターおよびエンハンサー要素、またはＣＭＶの主要な中初期プロモーターおよびエンハンサーが、発現を指図するのに適する。連結された調節要素およびコーディング配列は、しばしば、ベクター中にクローン化される。二本鎖抗体の投与のためには、２本の鎖は同一もしくは別個のベクターにクローン化することができる。
【０１５４】
レトロウイルス系（例えば、ＬａｗｒｉｅとＴｕｍｉｎ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３、１０２−１０９、１９９３を参照されたい）；アデノウイルス
ベクター（例えば、Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７、５９１１、１９９３を参照されたい）；アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９、１８６７、１９９４を参照されたい）、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスを包含するポックス族からのウイルスベクター、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルス（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０、５０８−５１９、１９９６を参照されたい）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（米国特許第５，６４３，５７６号明細書を参照されたい）由来のもののようなアルファウイルス属からのウイルスベクター、ならびに水疱性口内炎ウイルス（国際特許出願第ＷＯ  ９６／３４６２５号明細書を参照されたい）およびパピローマウイルス（Ｏｈｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６、３２５−３３３、１９９５）；Ｗｏｏら、国際特許出願第ＷＯ  ９４／１２６２９号明細書およびＸｉａｏとＢｒａｎｄｓｍａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２４、２６３０−２６２２、１９９６）のようなラブドウイルスを包含する多数のウイルスベクター系が利用可能である。
【０１５５】
免疫原をコードするＤＮＡ、もしくはそれを含有するベクターを、リポソーム中にパッケージングすることができる。適する脂質および関係する類似物は、米国特許第５，２０８，０３６号、同第５，２６４，６１８号、同第５，２７９，８３３号および同第５，２８３，１８５号明細書により記述される。免疫原をコードするベクターおよびＤＮＡを、微粒子担体に吸着もしくはそれと会合させることもまたでき、それらの例は、ポリメチルメタクリレートポリマーならびにポリラクチドおよびポリ（ラクチドコグリコリド）を包含する。例えばＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏ  Ｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照されたい。
【０１５６】
遺伝子治療ベクターもしくは裸のＤＮＡは、典型的には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、鼻内、胃、皮内、筋肉内、皮下もしくは頭蓋内注入）または局所適用（例えば米国特許第５，３９９，３４６号明細書を参照されたい）による個々の患者への投与により、インビボで送達させることができる。こうしたベクターは、ブピバカインのような促進剤をさらに包含する（米国特許第５，５９３，９７０号明細書）。ＤＮＡはジーンガン（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）を使用してもまた投与することができる。ＸｉａｏとＢｒａｎｄｓｍａ、上記を参照されたい。免疫原をコードするＤＮＡを、微視的金属ビーズの表面上に沈殿させる。微小発射体をショック波もしくは膨張するヘリウムガスで加速し、そして数細胞層の深さまで組織に浸透する。例えば、アグラシータス  インク（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ，Ｉｎｃ．）（ウィスコンシン州ミドルトン）により製造されるアクセル［Ａｃｃｅｌ］（商標）遺伝子送達装置が適する。あるいは、化学的もしくは機械的刺激を用いてＤＮＡを皮膚上に単にスポットすることにより、裸のＤＮＡを血流中に皮膚を通過させることができる（国際特許出願第ＷＯ  ９５／０５８５３号明細書を参照されたい）。
【０１５７】
さらなる一変形物において、免疫原をコードするベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引物、組織生検）もしくは普遍的ドナー造血幹細胞のような細胞にエクスビボで送達させ、次いで通常はベクターを組込んだ細胞についての選択後に、細胞を患者に再埋植することができる。
【０１５８】
７．消失活性についての抗体のスクリーニング
実施例ＸＩＶは、アミロイド沈着物の消失における活性についての抗体のスクリーニング方法を記述する。アミロイド沈着物に対する活性についてスクリーニングするために、アルツハイマー病の脳組織のようなアミロイドーシスの患者からの組織サンプル、もしくは特徴的なアミロイドの病理学を有する動物モデルを、インビトロで、小膠細胞のようなＦｃ受容体を担持する食細胞および試験中の抗体と培地中で接触させる。食細胞は、一次培養物、またはＢＶ−２、Ｃ８−Ｂ４もしくはＴＨＰ−１のような細胞系であることができる。これらの成分を顕微鏡スライドガラス上で組み合わせて顕微鏡でのモニタリングを
助長するか、もしくは、複数の反応をマイクロタイター皿のウェル中で平行して実施することができる。こうした形式においては、別個の縮小型の顕微鏡スライドガラスを別個のウェル中に据え付けることができるか、もしくは、ＡβのＥＬＩＳＡ検出のような非微視的検出形式を使用することができる。好ましくは、一連の測定値は、反応が進行する前の基礎値から開始するインビトロ反応混合物中のアミロイド沈着物の量、および反応の間の１種もしくはそれ以上の試験値から構成される。抗原は、例えば、Ａβもしくはアミロイド斑の他の成分に対する蛍光で標識された抗体で染色することにより検出することができる。染色に使用される抗体は、消失活性について試験されている抗体と同一であってもなくてもよい。アミロイド沈着物の反応の間の基礎に関する低下は、試験中の抗体が消失活性を有することを示す。こうした抗体は、アルツハイマー病および他のアミロイド形成性疾患の予防もしくは治療において有用であることがありそうである。上述されたとおり、本発明の支持において実施された実験は、こうしたアッセイを使用して、シヌクレインのＮＡＣフラグメントに対する抗体が、アルツハイマー病に特徴的なアミロイド斑を消失させるのに有効であることを示した。
【０１５９】
Ｄ．抗アミロイド治療レジメンに敏感に反応する患者
治療に敏感に反応する患者は、疾患の危険にさらされているがしかし症状を示さない個体、ならびにアミロイドーシスの症状を現在示している患者を包含する。アルツハイマー病の場合には、彼もしくは彼女が十分に長く生きている場合に、事実上いかなる者もアルツハイマー病に罹る危険にさらされている。従って、本方法は、被験体患者の危険のいかなる評価に対する必要もなく、一般的集団に予防的に投与することができる。本方法は、アルツハイマー病、もしくは他の遺伝性アミロイド疾患のいずれかの既知の遺伝的危険を有する個体にとりわけ有用である。こうした個体は、この疾患を経験した親族を有する者、および遺伝子もしくは生化学的マーカーの分析によりその危険が決定される者を包含する。アルツハイマー病に対する危険の遺伝子マーカーは、ＡＰＰ遺伝子中の突然変異、とりわけ、それぞれハーディ（Ｈａｒｄｙ）型およびスウェーデン型突然変異と称される、位置７１７ならびに位置６７０および６７１の突然変異を包含する（Ｈａｒｄｙ、ＴＩＮＳ、上記を参照されたい）。危険の他のマーカーは、プレセニリン（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）遺伝子ＰＳ１およびＰＳ２、ならびにアポＥ４中の突然変異、ＡＤの家族歴、高コレステロール血症もしくはアテローム硬化症である。現在アルツハイマー病に罹っている個体は、特徴的な痴呆、ならびに上述された危険因子の存在から認識することができる。加えて、ＡＤを有する個体を同定するための多数の診断試験が利用可能である。これらは、ＣＳＦタウおよびＡβ４２のレベルの測定を包含する。上昇されたタウおよび減少されたＡβ４２のレベルはＡＤの存在を意味する。アルツハイマー病に罹っている個体は、実施例の節で論考されるとおり、ＭＭＳＥもしくはＡＤＲＤＡ基準によってもまた診断することができる。
【０１６０】
無症候性の患者においては、治療はいかなる年齢（例えば、１０、２０、３０歳）でも開始することができる。しかしながら、通常、患者が４０、５０、６０もしくは７０歳に達するまで治療を開始することは必要でない。治療は、典型的には、時間の期間にわたって複数の用量を必要とする。治療は、本明細書の実施例ＩおよびＩＩに記述される線に沿って、時間にわたって抗体、または治療薬（例えばＡβペプチド）に対する活性化されたＴ細胞もしくはＢ細胞応答をアッセイすることによりモニターすることができる。応答が下落する場合、追加抗原刺激の投薬量が指示される。潜在的なダウン症候群の患者の場合、治療は、母親に治療薬を投与することにより妊娠中に、もしくは出生直後に開始することができる。
【０１６１】
他の形態のアミロイドーシスは、該疾患の特定の偏向（ｐｒｅｄｉｌｅｃｔｉｏｎ）が疑われない限り、しばしば診断されずに進行する。一主症状は、他の器官の関与の兆候もまた有する中年ないし高齢の患者における心もしくは腎疾患の存在である。心電図の低電
位もしくは極端な軸偏位、および肥厚された心室組織が心の関与を暗示することができる。蛋白尿は腎の関与の症状である。患者の身体検査により肝腫大が検出される場合は、肝の関与もまた疑うことができる。末梢性ニューロパシーもまた、ある形態のアミロイドーシスにおいて普遍的な出来事であり；体位性低血圧を特徴とする自律性ニューロパシーもまた見出されることができる。不確定の起源の進行性ニューロパシーを伴ういかなる者においても、アミロイドーシスを疑うべきである。組織生検法を使用して該疾患の決定的な診断を行うことができ、ここでは冒された器官（１種もしくは複数）が利用可能である。全身性アミロイドーシスについては、吸引された脂肪パッドもしくは直腸生検サンプルを使用することができる。生検材料をコンゴーレッドで染色し、陽性のサンプルは偏光された光学顕微鏡下で澄んだ黄緑色の複屈折を表す。
【０１６２】
Ｅ．治療レジメン
予防的応用においては、製薬学的組成物もしくは医薬を、特定の疾患に影響されやすい、そうでなければその危険にさらされている患者に、該危険を除外もしくは低下させる、または該疾患の発症を遅延させるのに十分な量で投与する。治療的応用においては、組成物もしくは医薬を、こうした疾患が疑われる、もしくは既にこうした疾患に罹っている患者に、該疾患およびその合併症の症状を治癒させる、もしくは少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与する。これを達成するのに十分な量を、治療的もしくは製薬学的有効用量と定義する。予防および治療双方のレジメンにおいて、作用物質は、通常、十分な免疫応答が達成されるまで数個の投薬量で投与する。典型的には、免疫応答をモニターし、そして免疫応答が弱まることを開始した場合に、反復される投薬量を与える。
【０１６３】
上述された病状の治療のための本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるかもしくは動物であるか、投与される他の医薬、および治療が予防的であるかもしくは治療的であるか、を包含する多くの多様な因子に依存して変動する。通常、患者はヒトであるが、しかし、プリオンタンパク質に関連する狂牛病のようないくつかの疾患においては、患者はウシのような非ヒトの哺乳動物であることができる。治療投薬量は安全性および有効性を至適化するように決定される必要がある。免疫原の量は、アジュバントもまた投与されるかどうかに依存し、アジュバントの非存在下では一般により多い投薬量が必要とされる。特定の製剤の免疫原性に依存して、投与のための免疫原の量は、患者あたり１μｇから５００μｇまで、そしてより通常はヒトの投与について注入あたり５から５００μｇまで変動することができる。ときに、注入あたり０．５〜５ｍｇというより高用量を使用する。典型的には、最低約１０、２０、５０もしくは１００μｇを各ヒト注入に使用する。注入のタイミングは、１日１回から年１回、１０年に１回まで大きく変動することができ、免疫原の連続的「後押し（ｂｏｏｓｔ）」がいくぶん好ましい。一般に、本明細書に提供される教示に従えば、有効投薬量は、患者から液体サンプル（一般的には血清サンプル）を得ること、ならびに、当該技術分野で公知かつ測定されるべき特定の抗原に容易に適合させうる方法を使用して、免疫原に対し発生された抗体の力価を測定することにより、モニターすることができる。理想的には、サンプルは最初の投与前に採取し；その後のサンプルは各免疫感作後に採取かつ力価測定する。一般に、１００倍の血清希釈物で対照もしくは「バックグラウンド」レベルより最低４倍より大きい検出可能な力価を提供する用量もしくは投与スケジュールが望ましく、ここで、バックグラウンドは、対照血清もしくはＥＬＩＳＡアッセイでのプレートのバックグラウンドに関して定義する。本発明に従えば、最低１：１０００もしくは１：５０００の力価が好ましい。
【０１６４】
ある投薬量の免疫原を与えるいずれかの所定の日において、投薬量は通常、アジュバントもまた投与される場合に患者あたり約１μｇより大きく、そして好ましくは患者あたり１０μｇより大きく、また、アジュバントの非存在下では患者あたり少なくとも１０μｇより大きく、そして通常は患者あたり１００μｇより大きい。本発明に従って選択される
個々の免疫原の用量は、本明細書に提供される教示とともに採用される標準的投与および力価測定方法に従って決定する。典型的なレジメンは、免疫感作、次いで、６週間間隔のような時間間隔での追加抗原刺激の注入より成る。別のレジメンは、免疫感作、次いで１、２および１２ヶ月後の追加抗原刺激の注入より成る。別のレジメンは生涯にわたって２ヶ月ごとの注入を必要とする。あるいは、追加抗原刺激の注入は、免疫応答をモニターすることにより示されるように不定期であることができる。
【０１６５】
抗体での受動免疫感作のためには、投薬量は宿主体重１ｋｇあたり約０．０００１から１００ｍｇまで、そしてより通常は０．０１ないし５ｍｇ／ｋｇの範囲にわたる。例えば、投薬量は１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重であることができる。例示的一治療レジメンは、２週間ごとに１回、もしくは１ヶ月に１回、もしくは３ないし６ヶ月ごとに１回、投与を必要とする。いくつかの方法においては、異なる結合特異性をもつ２種もしくはそれ以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合には投与される各抗体の投薬量は示される範囲内にある。抗体は通常、複数の機会に投与する。単一投薬量の間の間隔は、週単位、月単位もしくは年単位であることができる。間隔はまた、患者におけるＡβに対する抗体の血中濃度を測定することにより示されるとおり不規則であることもできる。あるいは、抗体は持続性放出製剤として投与することができ、この場合、より少なく頻繁な投与が必要とされる。投薬量および頻度は患者における抗体の半減期に依存して変動する。一般に、ヒト抗体は最長の半減期を示し、次いで人化抗体、キメラ抗体、そして非ヒト抗体である。投薬量および投与の頻度は、治療が予防的であるかもしくは治療的であるかに依存して変動する可能性がある。予防的応用においては、比較的低投薬量を時間の長い期間にわたって比較的頻繁でない間隔で投与する。若干の患者は、彼らの生涯の残りの間、治療を受領することを継続する。治療的応用においては、比較的短い間隔での比較的高投薬量が、疾患の進行が抑制もしくは停止されるまで、および好ましくは患者が疾患の症状の部分的もしくは完全な改善を示すまで、ときに必要とされる。その後、患者に予防的レジメンを投与することができる。
【０１６６】
免疫原をコードする核酸の用量は、患者あたり約１０ｎｇから１ｇまで、１００ｎｇないし１００ｍｇ、１μｇないし１０ｍｇ、もしくは３０〜３００μｇのＤＮＡの範囲にわたる。感染性のウイルスベクターの用量は、投与あたり１０から１００もしくはそれ以上のビリオンで変動する。
【０１６７】
免疫応答を誘導するための作用物質は、予防的および／もしくは治療的治療のため非経口、局所、静脈内、経口、皮下、腹腔内、鼻内もしくは筋肉内の手段により投与することができる。免疫原性の作用物質の典型的な投与経路は、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）もしくは皮下（ｓ．ｃ．）であるが、とは言え他の経路も同等に有効であることができる。筋肉内注入は腕もしくは脚の筋肉で最も典型的に実施される。いくつかの方法においては、作用物質を、沈着物が蓄積している特定の組織に直接注入する（例えば頭蓋内注入）。筋肉内注入もしくは静脈内注入が抗体の投与に好ましい。いくつかの方法においては、特定の治療的抗体を頭蓋中に直接注入する。いくつかの方法においては、抗体を、持続性放出組成物、もしくはメディパッド［Ｍｅｄｉｐａｄ］（商標）装置のような装置として投与する。
【０１６８】
本発明の作用物質は、場合によっては、アミロイド形成性疾患の治療で少なくとも部分的に有効である他の作用物質とともに投与することができる。アミロイド沈着物が脳中に存在するアルツハイマー病およびダウン症候群の場合には、本発明の作用物質を、血液−脳関門を横切る本発明の作用物質の通過を増大させる他の作用物質とともに投与することもまたできる。さらに、１種以上のアミロイド成分に対する免疫応答を惹起するよう設計された免疫原を含んで成る治療カクテルもまた、１種の斑成分に対し向けられる抗体および異なる斑成分に向けられる免疫原の組み合わせがそうであるように、本発明により企図
される。
【０１６９】
ペプチドのような本発明の免疫原性の作用物質は、ときにアジュバントとともに投与される。免疫応答を導き出すために、Ａβのようなペプチドとともに多様なアジュバントを使用することができる。好ましいアジュバントは、応答の質的な形態に影響を及ぼす免疫原中のコンホメーション変化を引き起こすことなく、免疫原に対する固有の応答を増強する。好ましいアジュバントは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（商標））（英国特許第２２２０２１１号明細書（ＲＩＢＩ  イムノケム  リサーチ  インク（ＲＩＢＩ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）、モンタナ州ハミルトン、現在はコリクサ（Ｃｏｒｉｘａ）の一部）を参照されたい）を包含する。スティミュロン［Ｓｔｉｍｕｌｏｎ］（商標）ＱＳ−２１は、南米で見出されたシャボンノキ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の木の樹皮から単離されたトリテルペン配糖体もしくはサポニンである（Ｋｅｎｓｉｌら、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＰｏｗｅｌｌとＮｅｗｍａｎ編、プレナム  プレス（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９５）中；米国特許第５，０５７，５４０号明細書、（アキラ  バイオファーマシューティカルズ（Ａｑｕｉｌａ  ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、マサチューセッツ州フラミンガム）を参照されたい）。他のアジュバントは、場合によってはモノホスホリルリピドＡのような免疫刺激剤と組み合わせでの（スクアレンもしくはラッカセイ油のような）水中油乳剤である（Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６、８６−９１（１９９７）を参照されたい）。別のアジュバントはＣｐＧである（国際特許出願第ＷＯ  ９８／４０１００号明細書）。あるいは、Ａβをアジュバントに結合することができる。しかしながら、こうした結合は、それに対する免疫応答の性質に影響を及ぼすようにＡβのコンホメーションを実質的に変えるべきでない。アジュバントは、有効成分を含む治療的組成物の一成分として投与することができるか、または、治療的作用物質の投与と別個に、その前に、それに付随して、もしくはその後に投与することができる。
【０１７０】
アジュバントの好ましい一分類は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムのようなアルミニウム塩（明礬）である。こうしたアジュバントは、ＭＰＬもしくは３−ＤＭＰ、ＱＳ−２１、ポリグルタミン酸もしくはポリリシンのようなポリマー性もしくは単量体のアミノ酸のような他の特定の免疫刺激剤とともにもしくはそれらを伴わずに使用することができる。アジュバントの別の分類は水中油乳剤製剤である。こうしたアジュバントは、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルクサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）テラミド［ｔｈｅｒａｍｉｄｅ］（商標）、もしくは他の細菌の細胞壁成分）のような他の特定の免疫刺激剤とともにもしくはそれらを伴わずに使用することができる。水中油乳剤は、（ａ）モデル１１０Ｙ微小流動化装置（マイクロフルイディックス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）、マサチューセッツ州ニュートン）のような微小流動化装置を使用してミクロン以下の粒子からなる粒子に処方された、５％スクアレン、０．５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０および０．５％スパン（Ｓｐａｎ）８５を含有する（場合によっては多様な量のＭＴＰ−ＰＥを含有する）ＭＦ５９（国際特許出願第ＷＯ  ９０／１４８３７号明細書）、（ｂ）ミクロン以下の粒子からなる乳剤に微小流動化されたかもしくはより大きな粒子径の乳剤を生じるようボルテックス攪拌されたかのいずれかの、１０％スクアレン、０．４％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、５％プルロニックブロックトポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、ならび
に（ｃ）２％スクアレン、０．２％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ、二ミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）より成る群からの１種もしくはそれ以上の細菌の細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（デトックス［Ｄｅｔｏｘ］（商標））を含有するリビ［Ｒｉｂｉ］（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）、（リビ  イムノケム（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、モンタナ州ハミルトン）を包含する。好ましいアジュバントの別の分類は、スティミュロン［Ｓｔｉｍｕｌｏｎ］（商標）（ＱＳ−２１；アキラ（Ａｑｕｉｌａ）、マサチューセッツ州フラミンガム）のようなサポニンアジュバント、もしくはイスコム（ＩＳＣＯＭ）（免疫刺激複合体）およびイスコマトリックス（ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）のようなそれから生じられた粒子である。他のアジュバントは、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）ならびに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなサイトカインを包含する。こうしたアジュバントは、一般的に商業的供給源から入手可能である。
【０１７１】
アジュバントは、単一の組成物として免疫原とともに投与することができるか、または、免疫原の投与の前、それに付随して、もしくはその後に投与することができる。免疫原およびアジュバントは、同一のバイアル中に包装かつ供給することができるか、もしくは、別個のバイアル中に包装しそして使用前に混合することができる。免疫原およびアジュバントは、典型的には、意図された治療的応用を示すラベルを伴い包装する。免疫原およびアジュバントを別個に包装する場合、包装は、典型的には、使用前の混合についての指示を包含する。アジュバントおよび／もしくは担体の選択は、アジュバントを含有する製剤の安定性、投与経路、投与スケジュール、ならびにワクチン投与されている種に対する該アジュバントの効力のような因子に依存する。ヒトでは、好ましい製薬学的に許容できるアジュバントは、適切な調節体によるヒト投与について承認されているものである。ヒトのためのこうした好ましいアジュバントの例は、明礬、ＭＰＬおよびＱＳ−２１を包含する。場合によっては、２種もしくはそれ以上の異なるアジュバントを同時に使用することができる。好ましい組み合わせ剤は、ＭＰＬを含む明礬、ＱＳ−２１を含む明礬、ＱＳ−２１を含むＭＰＬ、ならびに一緒の明礬、ＱＳ−２１およびＭＰＬを包含する。また、場合によっては明礬、ＱＳ−２１およびＭＰＬのいずれか、ならびにそれらの全部と組み合わせで、フロイントの不完全アジュバントを使用することもできる（Ｃｈａｎｇら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３２、１７３−１８６（１９９８））。
【０１７２】
本発明の作用物質は、しばしば、有効な治療的作用物質および多様な他の製薬学的に許容できる成分を含んで成る製薬学的組成物として投与される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１９版、１９９５）を参照されたい。好ましい形態は、意図される投与様式および治療の応用に依存する。組成物は、所望の製剤に依存して、製薬学的に許容できる非毒性の担体もしくは希釈剤（これらは、動物もしくはヒトの投与のための製薬学的組成物を処方するのに普遍的に使用されるベヒクルと定義される）もまた包含することができる。希釈剤は、組み合わせ剤の生物学的活性に影響を及ぼさないように選択する。こうした希釈剤の例は、蒸留水、生理学的リン酸緩衝生理的食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液およびハンクス溶液である。加えて、製薬学的組成物もしくは製剤は、他の担体、アジュバント、もしくは非毒性の非治療的、非免疫原性の安定剤などもまた包含することができる。
【０１７３】
製薬学的組成物は、タンパク質、キトサンのような多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、および（ラテックスで官能性化されたセファロース、アガロース、セルロースなどのような）コポリマー、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、ならびに（油の小滴もしくはリポソームのような）脂質凝集物のような大型のゆっくりと代謝される巨大分子もまた含有することができる。加えて、これらの担体は免疫刺激剤（すなわちアジュバント）
として機能することができる。
【０１７４】
非経口投与のためには、本発明の作用物質を、水、油、生理的食塩水、グリセロールもしくはエタノールのような滅菌の液体であることができる製薬学的担体を含む生理学的に許容できる希釈剤中の物質の溶液もしくは懸濁剤の注入可能な投薬量として投与することができる。加えて、湿潤もしくは乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が組成物中に存在することができる。製薬学的組成物の他の成分は、石油、動物、植物もしくは合成起源のもの、例えばラッカセイ油、ダイズ油および鉱物油である。一般に、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールのようなグリコールは、とりわけ注入可能な溶液に好ましい液体担体である。抗体は、有効成分の持続性放出を可能にするような様式で処方することができるデポー注入もしくは埋込製剤の形態で投与することができる。例示的一組成物は、ＨＣｌでｐＨ６．０に調節された、５０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌより成る水性緩衝液中で処方された５ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体を含んで成る。
【０１７５】
典型的には、組成物は、液体の溶液もしくは懸濁液のいずれかとして注入可能物（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ）として製造され；注入前に液体のベヒクル中の溶液もしくは懸濁剤に適する固体の形態もまた製造することができる。製剤は、上で論考されたとおり、高められたアジュバント効果のために、リポソーム、またはポリラクチド、ポリグリコリドもしくはコポリマーのような微小粒子中で乳化もしくはその中に被包化することもまたできる（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９、１５２７（１９９０）およびＨａｎｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８、９７−１１９（１９９７）を参照されたい）。本発明の作用物質は、有効成分の持続性もしくは拍動性の放出を可能にするような様式で処方することができるデポー注入もしくは埋込製剤の形態で投与することができる。
【０１７６】
他の投与様式に適する付加的製剤は、経口、鼻内および肺の製剤、坐剤、ならびに経皮適用を包含する。
【０１７７】
坐剤のためには、結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングリコールもしくはトリグリセリドを包含し；こうした坐剤は、０．５％ないし１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤は、製薬学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロースおよび炭酸マグネシウムのような賦形剤を包含する。これらの組成物は、溶液、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続性放出製剤もしくは散剤の形態をとり、そして１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の有効成分を含有する。
【０１７８】
局所適用は経皮もしくは皮内送達をもたらすことができる。局所投与は、コレラトキシンまたはその解毒された誘導体もしくはサブユニット、あるいは他の類似の細菌のトキシンとの作用物質の共投与により助長することができる（Ｇｌｅｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１、８５１（１９９８）を参照されたい）。共投与は、混合物、または化学的架橋もしくは融合タンパク質としての発現により得られる連結された分子として成分を使用することにより達成することができる。
【０１７９】
あるいは、経皮送達は、皮膚貼付剤を使用して、もしくはトランスフェロソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）（Ｐａｕｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５、３５２１−２４（１９９５）；Ｃｅｖｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６８、２０１−１５（１９９８））を使用して達成することができる。
【０１８０】
Ｆ．診断の方法
本発明は、アルツハイマー病に罹っているもしくはそれが疑われる患者におけるＡβペプチドに対する免疫応答の検出方法を提供する。該方法は、患者に投与されている１クールの治療をモニターするのにとりわけ有用である。該方法は、症候性の患者での治療的治療、および無症候性の患者での予防的治療の双方をモニターするのに使用することができる。該方法は、能動免疫感作（例えば、免疫原の投与に応答して産生される抗体）および受動免疫感作（例えば投与された抗体のレベルを測定すること）の双方をモニターするのに有用である。
【０１８１】
１．能動免疫感作
幾つかの方法は、作用物質のある用量を投与する前に、患者の免疫応答の基準線値を決定し、そしてこれを処置後の免疫応答の値と比較する必要がある。免疫応答の値において、有意な上昇（すなわち、同じサンプルの繰り返し測定で、典型的な許容される実験誤差より大きく、そのような測定の平均から１標準偏差で表されるような）は、陽性の処置結果を示す（すなわち、その作用物質の投与が免疫応答を達成したか、または増した）。免疫応答の値が有意に変化しないか、または減少するならば、陰性の処置結果を示す。一般に、免疫原性作用物質を用いた最初の処置のコースを受けている患者は、連続的な投薬で免疫応答の上昇を示すと予想され、これは最終的には安定水準に達する。作用物質の投与は一般に、免疫応答が上昇している間、続けられる。安定水準への到達は、処置の投与を中断できるか、または投薬用量または頻度を低下できることを示すものである。
【０１８２】
別の方法では、免疫応答の対照値（すなわち、平均および標準偏差）が対照群について決定される。典型的には対照群の個体は前処置を受けなかった。治療薬を投与された後に測定された患者の免疫応答の値は、次に対照値と比較される。対照値に対して有意な上昇（例えば、平均から１標準偏差よりも大きい）は、陽性の処置結果を示す。有意な上昇がないか、または減少のシグナルは、陰性の処置結果を示す。作用物質の投与は一般に、対照値に対して免疫応答が上昇している間は続行される。前記のように、対照値に比べて安定水準に達すると、処置の投与を中断できるか、または投薬用量または頻度を低下できることの指標である。
【０１８３】
別の方法では、免疫応答の対照値（例えば平均および標準偏差）は、治療薬での処置を受け、そしてその免疫応答が処置に応答して安定水準に達した個体の対照群から決定される。患者の免疫応答の測定値は、対照値と比較される。患者で測定されたレベルが対照値と有意に異ならないならば（例えば、１標準偏差より大きい）、処置を中断することができる。患者のレベルが対照値よりも有意に下ならば、作用物質の投与の続行が認められる。その患者のレベルが対照値よりも低いままならば、処置計画の変更、例えば異なるアジュバントの使用を示しているのかもしれない。
【０１８４】
別の方法では、現在処置は受けていないが、既に処置のコースを受けたことがある患者を、処置の再開が必要であるかどうかを決定するために免疫応答をモニタリングする。患者の免疫応答の測定値は、患者が以前に達成した免疫応答の値と、前の処置コースの後に比較できる。以前の測定に比べて有意な減少（すなわち、同じサンプルの繰り返し測定で、典型的な許容誤差範囲よりも大きい）は、処置を再開できることを示している。あるいは患者の測定値を、処置のコースを受けた後の患者群で決定した対照値（平均に標準偏差を加えた）と比較することができる。あるいは患者の測定値を、疾患の症状がないままの予防的に処置した患者群または疾患の特徴の改善を示す治療的に処置した患者の群の対照値と、比較することができる。すべての場合で、対照レベルに対して有意な低下（すなわち、標準偏差よりも大きい）は、患者の処置を再開すべきであることを示す。
【０１８５】
分析用の組織サンプルは、典型的には患者に由来する血液、血漿、血清、粘膜もしくは脳脊髄液である。サンプルは任意の形態のＡβペプチドのような目的とするアミロイド成
分に対する免疫応答の指標について分析する。免疫応答は、Ａβペプチドのような目的の成分に特異的に結合する例えば抗体またはＴ-細胞の存在から決定することができる。Ａβに特異的な抗体を検出するELISA法は、実施例の部に記載し、そして他のペプチド抗原に応用することができる。反応性Ｔ-細胞を検出する方法は、当該技術分野では周知である。
【０１８６】
２．受動免疫感作
一般に、受動免疫感作をモニタリングする手順は、上記の能動免疫感作をモニタリングする手順と同様である。しかし受動免疫感作後の抗体プロフィールは、典型的には抗体濃度の即座のピーク、続いて指数的減少を示す。さらなる投薬用量なしで、この減少は投与した抗体の半減期に依存して、数日から数カ月の期間内に前処置レベルに達する。例えばヒトの抗体の中には半減期が20日の単位のものもある。
【０１８７】
幾つかの方法では、患者のＡβに対する抗体の基準線測定は投与前に行い、第二測定はピーク抗体レベルを決定するためにその後すぐに行い、そして１以上のさらなる測定を抗体レベルの減少をモニタリングするための間隔で行う。抗体のレベルが基準線または予め定めた割合のピーク低下基準線（例えば、50％、25％または10％）に達した時、さらなる抗体の用量を投与する。幾つかの方法では、ピークまたは続いて測定されるバックグラウント未満のレベルを、既に定めた参照レベルと比較して、他の患者に有益な予防的または治療的処置計画を構成する。測定される抗体レベルが参照レベルよりも有意に低いならば（例えば、平均から処置の利益を享受する患者群の参照値の１標準偏差を引いたものより低い）、抗体のさらなる用量の投与を示している。
【０１８８】
３．診断キット
本発明はさらに、上記の診断法を行うための診断キットを提供する。典型的には、そのようなキットはＡβのようなアミロイド班成分に対する抗体に特異的に結合する、またはその成分に特異的なＴ−細胞と反応する作用物質を含む。キットは、標識も含むことができる。Ａβに対する抗体を検出するために、標識は典型的には標識された抗-イディオタイプ抗体の状態である。抗体の検出には、作用物質をマイクロタイター皿のウェルのような固体相に予め結合して供給することができる。反応性Ｔ-細胞の検出には、増殖性の応答を測定する標識は3H-チミジンとして供給することができる。またキットは、典型的にはキットの使用について指示するラベルを含む。このラベルはＡβに対する抗体またはＡβと反応性のＴ-細胞のレベルと測定したラベルのレベルを相関させるチャートまたは他の対応する型（regime）を含んでもよい。用語ラベルとは、製造、輸送、販売または使用の任意の時にキットに付けられた、または関連する記載または記録されたデータを称する。例えば、用語ラベルには広告用リーフレットおよび小冊子、包装材料、使用説明書、オーディオまたはビデオカセット、コンピューターディスク、ならびにキットに直接印字された記載を包含する。
【実施例】
【０１８９】
実施例
I．アルツハイマー病(ＡＤ)に対するＡβの予防的効能
これらの実施例は、アルツハイマー様の神経病状を発症し易い717位（APP717V→F)での突然変異を有するAPPを過剰発現しているトランスジェニックマウスへのＡβ42ペプチドの投与を説明する。これらのマウス(PDAPPマウス）の作出および特性は、Games et al.,Nature、同上に記載されている。これらの動物はそれらのヘテロ接合体状態で、6月齢から先にＡβを沈着し始める。15月齢までに、それらはアルツハイマー病に見られるものに等しいＡβ沈着のレベルを表す。PDAPPマウスには凝集したＡβ42（凝集Ａβ42）またはリン酸緩衝化生理食塩水を注射した。凝集したＡβ42は、Ａβの多くのエピトープに対する抗体を誘導できる能力から選択した。
【０１９０】
Ａ．方法
１．マウスの起源
30匹のPDAPP異質メスマウスを、無作為に以下の群に分けた：10匹のマウスには凝集Ａβ42を注射し（１匹は移動中に死亡した）、５匹はPBS/アジュバントまたはPBSを注射し、そして10匹は未注射対照であった。５匹のマウスには血清アミロイドタンパク質（SAP）の配列から誘導したペプチドを注射した。
【０１９１】
２．免疫原の調製
凝集Ａβ42の調製：２ミリグラムのＡβ42（USペプチド社：ロットK-42-12）を、0.9mlの水に溶解し、そして0.1mlの10×PBSを加えて１mlとした。これをボルテックスで混合し、そして37℃で一晩、インキューベーションし、この条件下でペプチドが凝集した。使用しなかったＡβは乾燥した凍結乾燥粉末として次に注射するまで−20℃で保存した。
【０１９２】
注射についてそのような市販のペプチドを使用する時、乾燥重量は塩重量を含んでもよく；本明細書中の実施例で報告する重量は特に示さない限り、塩の重量を含む。ペプチドの正確な質量は、既知の組成物と組み合わせた窒素測定のような調製物の標準的アッセイを使用して決定することができる。
【０１９３】
３．注射の準備
各注射には、マウスあたりPBS中に100μgの凝集Ａβ42を、初回の免疫感作には１：１で完全フロイントアジュバント（CFA）と最終容量400μlのエマルションに乳化し、続いて同量の免疫原の追加免疫は、完全フロイントアジュバント（IFA）中で２週間目に行った。IFA中さらに２回の用量を１カ月の間隔で与えた。後の免疫感作は１カ月の間隔で500μlのPBS中で行った。注射は腹腔内（i.p.）に送達された。
【０１９４】
PBSの注射は同じスケジュールに従い、そしてマウスにはPBS/アジュバントの１：１の混合物をマウスあたり400μlで、またはマウスあたり500μlのPBSを注射した。SAP注射は、注射あたり100μgの用量を使用して同様に同じスケジュールに従った。
【０１９５】
４．マウス採血の滴定、組織プレパレーションおよび免疫組織化学
上記の方法は、以下の一般的な材料および方法に記載する。
【０１９６】
Ｂ．結果
PDAPPマウスに、凝集したＡβ42（凝集Ａβ42）、SAPペプチドまたはリン酸緩衝化生理食塩水のいずれかを注射した。PDAPPマウスの群は、注射しない陽性対照としても残した。凝集Ａβ42に対するマウスの力値は、４回目の追加免疫から１カ月おきに、マウスが１年齢になるまでモニタリングした。マウスを13カ月目に屠殺した。調査したすべての時点で、９匹のうちの８匹の凝集Ａβ42マウスが、高い抗体力価を生じ、これは一連の注射を通して高いままであった（1/10000よりも高い力価）。９匹目のマウスは低いが、約1/1000の測定可能な力価であった（図１、表１）。SAPP-注射マウスは、この免疫原について1:1,000〜1:30,000の力価を有し、１匹のマウスだけが1:10,0000を越えた。
【０１９７】
【表３】
2012102131.tif 000009
【０１９８】
PBS-処置マウスの血清は、凝集Ａβ42に対して６、10および20カ月目に滴定した。1/100希釈で、PBSマウスは凝集Ａβ42に対して滴定した時、１つのデータ点でバックグラウンドの４倍を越えただけで、それ以外はすべての時点でバックグラウンドより４倍少なかった（表３）。SAP-特異的応答は、すべての力価が300未満のこのような時点はすべて、無視することができた。
【０１９９】
凝集Ａβ1-42処置群の９匹のうちの７匹のマウスが、それらの脳内に検出可能なアミロイドが無かった。対照的に、SAPおよびPBS群のマウスに由来する脳組織は、海馬ならびに前頭および帯状束皮質に多数のアミロイド沈着を含んだ。沈着のパターンは未処置対照のパターンに類似し、歯状回の外側分子層のような脆弱なサブ領域の特徴的な関与があった。Ａβ1-42注射群からの１匹のマウスには、海馬に限定されたアミロイド負荷量の大きな減少があった。単離した斑は別のＡβ1-42処置マウスで確認された。
【０２００】
海馬中のアミロイド負荷量の定量的な画像分析では、Ａβ42(AN1792)-処置動物で劇的な減少が達成されたことが証明された（図２）。PBS群(2.22％)および未処置対照群（2.65％）のアミロイド負荷量の中央値は、AN1792で免疫感作した群よりも有意に大きかった（0.00％、ｐ＝0.0005）。対照的に、SAPペプチド(SAPP)で免疫感作した群の中央値は5.74％であった。未処置、対照マウスに由来する脳組織は、海馬ならびに夾板骨後皮質に、Ａβ-特異的モノクローナル抗体(mAb)3D6で視覚化される多数のＡβアミロイド沈着を含んだ。同様なアミロイド沈着パターンが、SAPPまたはPBSで免疫感作したマウスでも見られた（図２）。さらにこれらの３つの後者の群には、すべての３つのこのような群で歯状回の外側分子層のような、ＡＤで古典的に見られる脳の脆弱なサブ領域の特徴的な関与があった。
【０２０１】
Ａβ沈着を含まなかった脳は、典型的にはPDAPPマウスでヒトのAPP抗体8E5を用いて視覚化される神経炎局面も無かった。残りの群（SAP-注射、PBSおよび非注射マウス）の脳のすべてが、未処置PDAPPマウスに典型的な多数の神経炎局面を有した。少数の神経炎局面が、AN1792で処置した１匹のマウスに存在し、そして異栄養性の神経突起の１クラスタ
ーがAN1792で処置した第二マウスで見られた。海馬の画像分析および図３で見られるように、PBS受容体と比較して(中央値0.28％、ｐ＝0.0005）、AN1792-処置マウスにおける異栄養性の神経突起のほとんどの排除が実質的に示された（中央値0.00％）。
【０２０２】
斑が関係する炎症の星状細胞増加症の兆候も、Ａβ1-42注射群の脳には存在しなかった。他の群のマウスに由来する脳は、豊富な、しかもクラスターとなったＡβ斑が関係するグリオーシスに典型的なGFAP-陽性星状細胞を含んだ。GFAP-反応したスライドのサブセットを、Ａβ沈着の位置を定めるためにチオフラビンSによりカウンター染色した。GFAP-陽性の星状細胞は、SAP、PBSおよび未処置対照でＡβ斑に関連した。そのような関連は、斑−陰性のＡβ1-42処置マウスでは見られず、一方、最小の斑が関係するグリオーシスはAN1792で処置した１匹のマウスで確認された。
【０２０３】
図４に示す夾板骨後皮質に関する画像分析は、星状細胞増加症の減少がAN1792で処置した群について1.56％の中央値で有意であるが、SAPペプチド、PBSで免疫感作した群または未処置では６％より大きい中央値と確認された（ｐ＝0.0017）。
【０２０４】
Ａβ1-42およびPBS-注射マウスのサブセットからの証拠は、斑が関係するMHCII免疫反応性がＡβ1-42注射マウスでは存在しないことを示し、Ａβ-関連炎症反応の欠如と一致した。
【０２０５】
マウス脳の切片も、MAC-1、細胞表面タンパク質に特異的なモノクローナル抗体に特異的なmAbと反応した。MAC-1（CD11b)はインテグリンファミリーの員であり、そしてCD18とのヘテロ二量体として存在する。CD11b/CD18複合体は単球、マクロファージ、好中球およびナチュラルキラー細胞上に存在する（Mak and Simard）。脳内に存在するMAC-1-反応性細胞型は、MAC-1と免疫反応した切片中の類似する表現型的形態に基づきミクログリアであろう。斑が関係するMAC-1標識は、PBS対照群と比べてAN1792で処置したマウスの脳では低く、Ａβが誘導した炎症応答の欠如と一致することが分かった。
【０２０６】
Ｃ．結論
Ａβ1-42-注射マウスの脳におけるＡβ斑の欠如および反応性ニューロンおよび膠状の変化は、それらの脳内に沈着したアミロイドが無いか、または極めて少なく、そしてグリオーシスおよび神経炎的な病状といった病理学的な結末は存在しないことを示していた。Ａβ1-42で処置したPDAPPマウスは、本質的に対照の非トランスジェニックマウスと同じ病状の欠如を示す。したがってＡβ1-42の注射は脳組織からヒトＡβの沈着の予防または除去に、そして続いてニューロンおよび炎症変性的変化の排除に高度に効果的である。すなわちＡβペプチドの投与は、ＡＤの防止に予防的および治療的利益の両方を有することができる。
【０２０７】
II．投与量応答実験
５週齢のメスのスイス ウェブスターマウス群（１群あたりＮ＝６）を、腹腔中に投与したCFA/IFA中に配合した300、100、33、11、3.7、1.2、0.4または0.13μgのＡβで免疫感作した。３回の用量を隔週の間隔で、続いて４回目を１カ月後に与えた。第一用量はCFAで乳化し、そして残りの用量はIFAで乳化した。動物は抗体力価を測定するために、２回目の投与から始めて各免疫感作から４〜７日後に採血した。11、33または300μgの抗原で免疫感作した３群のサブセットの動物は、さらに免疫原製剤の投与量範囲にわたり抗体応答の減少をモニタリングするために、４回目の免疫感作後から４カ月間、およそ１カ月の間隔で採血した。これらの動物は実験開始後７カ月目に５回目の最終免疫感作を受けた。動物はAN1792に対する抗体応答を測定し、そして毒性学的分析を行うために１週間後に屠殺した。
【０２０８】
減少する用量応答は、300から3.7μgで観察され、２つの低い用量では応答が無かった。平均抗体力価は、11〜300μgの抗原を３回投与後に約１：1000、４回投与後に約１:10,000である（図５を参照にされたい）。
【０２０９】
抗体力価はすべてについて劇的に上昇したが、最低の投与量群は３回目の免疫感作後に５-から25-倍の範囲でGMTが上昇した。低い抗体応答は、0.4μgの受容体でも検出できた。1.2および3.7μgの群は約1000のGMTに匹敵する力価を有し、そして最高から４つの用量は約25,000のGMTに一緒に集まったが、33μgの投与量群が3000の低いGMTであった。４回目の免疫感作後、力価の上昇はほとんどの群でより緩和であった。検出できる抗体が無い0.14μgの受容体から、36,000のGMTの11μgの受容体まで、0.14μgから11μgのより低い抗原投与量群の範囲で明らかな用量応答があった。ここでも、11〜300μgの４つの最高の投与量群の力価は、一緒になった。このように２回の免疫感作後、抗原用量に依存する抗体力価は、0.4〜300μgの広い範囲にわたった。第３の免疫感作までに、４つの最高の投与量の力価はすべて同等であり、そしてそれらはさらなる免疫感作後も安定水準のままであった。
【０２１０】
４回目の免疫感作から１カ月後、300μgの群で力価は免疫感作から５日後の血液からの測定値よりも２-から３-倍高かった（図６）。この観察は、ピークの既住性抗体応答が免疫感作から５日後よりも遅れて生じることを示唆している。この時点でより緩和な（50％）上昇が33μgの群で見られた。300μgの用量群は最後の投与から２カ月後に、GMTが約70％まで鋭く減少した。さらに１カ月後、この傾斜は45％(100μg)、および33および11μgで約14％と弱くなった。すなわち、免疫感作を終了した後の循環している抗体力価傾斜の速度は、ピーク応答の後に最初の月で鋭く傾斜し、続いてその後によりゆるやかな減少速度の２つの局面で現れる。
【０２１１】
抗体力価およびこれらのスイス ウェブスターマウスの反応の動力学は、平行する様式で免疫感作した若いヘテロ接合性PDAPPトランスジェニックマウスのも のと類似する。ヒトで免疫応答を誘導するために効果的な投薬用量は、典型的にはマウスで効果的な投薬用量に類似する。
【０２１２】
III．安定したＡＤに対する治療的効力のスクリーニング
このアッセイは、加齢マウスにおけるＡＤの神経病理学的特徴を停止または好転する活性について、免疫原性作用物質を試験するために計画する。42アミノ酸長のＡβ（AN1792）を用いた免疫感作を、PDAPPマウスの脳にすでにアミロイド斑が存在する時点で開始した。
【０２１３】
この実験を行った期間に、未処置PDAPPマウスはＡＤに見られるものに似た多数の神経変性的変化を生じる（Games et al.、同上およびJohnson-Wood et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,1550-1555(1997)）。アミロイド斑中へのＡβの沈着は、異栄養性の神経突起と呼ばれる迷走性の軸索および樹状突起要素から成る変性的なニューロン応答が付随する。異栄養性の神経突起に取り囲まれ、そしてそれを含むアミロイド沈着は、神経炎症性局面と呼ぶ。ＡＤおよびPDAPPマウスの両方において、異栄養性の神経突起は顕著な球状構造を有し、APPおよび細胞骨格成分を認識する抗体パネルと免疫反応性であり、そして超微細構造レベルで複雑な細胞下の変性的変化を表す。これらの特徴は、PDAPP脳において疾患に関連する選択的かつ再現性のある神経炎症性局面の形成の測定を可能とする。PDAPP神経炎症性局面の異栄養性のニューロン成分は、ヒトAPPに特異的な抗体(モノクローナル抗体8E5）を用いて容易に視覚化され、そしてコンピューターによる画像分析で容易に測定可能である。したがって、アミロイド斑形成に及ぼすAN1792の効果を測定することに加えて、我々はこの処置が神経炎症性のジストロフィーの発生に及ぼす効果を監視した。
【０２１４】
星状細胞およびミクログリアは、ニューロン傷害の程度に応答し、そして影響を与える非−ニューロン細胞である。GFAP-陽性星状細胞およびMHC II-陽性ミクログリアはＡＤで通常観察され、それらの活性化は疾患の重篤度を増す。したがって我々はAN1792-処置マウスにおける反応性星状細胞増加症および小膠細胞症の発生も監視した。
【０２１５】
Ａ．材料および方法
チャールズ リバー（Charles River）から得た48匹の、11〜11.5月齢のヘテロ接合性のメスPDAPPマウスを無作為に２群に分けた：24匹のマウスは100μgのAN1792で免疫感作し、そして24匹のマウスはPBSで免疫感作した（それぞれフロイントアジュバントと合わせた）。AN1792およびPBS群は再度、それらが〜15月齢に達した時に分けた。15月齢で、各AN1792-およびPBS-処置動物のおよそ半分を安楽死させ（それぞれｎ＝10および９）、残りは〜18カ月で終了するまで免疫感作を受け続けた（それぞれｎ＝９および12）。全部で８匹の動物（５匹のAN1792および３匹のPBS）が、実験中に死亡した。免疫感作した動物に加えて、１年齢（ｎ＝10）、15月齢（ｎ＝10）および18月齢（ｎ＝10）の未処置PDAPPマウスを、脳内のＡβおよびAPPレベルをELISAで測定するために比較に含め；１年齢の動物も免疫組織化学的分析に含めた。
【０２１６】
方法は外に示さない限り、実施例１の通りである。AN1792のUSペプチドロット12およびカリフォルニアペプチドロットME0339を使用して、15カ月時点以前に投与する６回の免疫感作用の抗原を調製した。カリフォルニアペプチドロットME0339およびME0439は、15から18カ月の間に３回のさらなる免疫感作投与に使用した。
【０２１７】
免疫感作には、200μlPBS中の100μgのAN1792またはPBS単独を、完全フロイントアジュバント（CFA)または不完全フロイントアジュバント（IFA)またはPBSに、400μlの最終用量で1:1（容量／容量）に乳化した。初回免疫感作は、アジュバントとしてCFAを用いて送達し、次の４回の投与量はIFAを用いて与えられ、そして最後の４回の投与量はアジュバント無しのPBSのみを用いて与えられた。全部で９回の免疫感作を、７カ月間にわたり２週間のスケジュールで最初の３回の投与量を、続いて４週間の間隔で残りの注射を与えた。15月齢で安楽死させた４カ月の処置群は、最初の６回の免疫感作を受けただけであった。
【０２１８】
Ｂ．結果
１．アミロイド負荷量に及ぼすＡβ(AN1792)処置の効果
定量的な画像分析により決定した皮質のアミロイド負荷量に及ぼすAN1792処置の結果を図７に示す。皮質のアミロイド負荷量の中央値は、未処置の12月齢PDAPPマウス群では0.28％であり、実験の開始でマウスの斑の負荷量を表す値であった。18カ月で、アミロイド負荷量はPBS-処置マウスで17-倍を超えて4.87％まで増加し、一方、AN1792-処置マウスはわずか0.01％のアミロイド負荷量に大きく減少し、12カ月の未処置および15-および18-カ月の両PBS-処置群よりも顕著に低かった。このアミロイド負荷量は、15-(96％の減少；ｐ＝0.003）および18-カ月（＞99％減少；ｐ＝0.0002）の両AN1792受容体で、有意に減少した。
【０２１９】
典型的には、PDAPPマウスの皮質アミロイド沈着は、前頭および夾板骨後皮質（RSC）から始まり、そして腹−側方向へ進行して側頭−エントルヒナル（entorhinal）皮質（EC)を含む。ほぼAN1792が最初に投与された時期である12月齢のマウスのECにはアミロイドはほとんど見いだされないか、または見いだされななかった。AN1792処置から４カ月後、アミロイド沈着はRSCでは大きく減少し、そして進行的なECの関与はAN1792処置により完全に排除された。後者の観察はAN1792が 、通常は側頭および側頭皮質を襲うアミロイドの進行を完全に止め、しかもRSC中の沈着を停止させるか、あるいは好転させることを示した。
【０２２０】
AN1792処置がPDAPPマウスの皮質アミロイド負荷量の発生に及ぼす甚大な効果は、さらに18-カ月までの７カ月間処置された群で示された。皮質アミロイドのほぼ完全な不在がAN1792-処置マウスで見られ、拡散した斑が全体的に欠如し、しかも緻密な沈着が減少した。
【０２２１】
２．Ａβ(AN1792)-処置に関連する細胞的および形態学的変化
Ａβ-陽性細胞群は、典型的にはアミロイド沈着を含む脳の領域で見いだされた。注目すべきは、AN1792受容体の幾つかの脳で、皮質アミロイド斑がほとんど無いか、または全く見られなかったことであった。Ａβ免疫反応性の大部分が、大きな小葉または凝集細胞体を含む細胞内に含まれるようであった。表現型的には、これらの細胞は活性化されたミクログリアまたは単球に似ていた。それらは活性化された単球およびミクログリア（MHCIIおよびCD11b)により発現されるリガンドを認識する抗体と免疫反応性であり、そして場合により血管の壁および管腔に付随していた。ＡβおよびMHCII-特異的抗体で標識した近-隣切片の比較により、これらの細胞の類似パターンが両クラスの抗体により認識されたことが明らかとなった。AN1792-処置脳の詳細な調査により、MHCII-陽性細胞はこのような動物内に残る限定されたアミロイド付近に限られていることが明らかとなった。使用した固定条件下で、細胞はＴ細胞（CD3、CD3e）またはＢ細胞（CD45RA、CD45RB）リガンドまたは白血球共通抗原（CD45）を認識する抗体と免疫反応性ではなかったが、単球と交差反応するロイコシアリン（CD43）を認識する抗体と反応性であった。そのような細胞はPBS-処置マウスでは見いだされなかった。
【０２２２】
PDAPPマウスは、海馬歯状回の外側分子層に重いアミロイド沈着を一定して発生する。この沈着はパーホラント（perforant)経路、ＡＤで古典的にアミロイド斑を含む領域下に明らかなすじを形成する。PBS-処置マウスにおけるこれらの沈着の特徴的な出現は、未処置PDAPPマウスですでに特徴つけられたものと似ていた。アミロイド沈着は連続的バンド内に拡散および緻密化した斑の両方から成った。対照的に、AN1792-処置マウスに由来する多数の脳では、このパターンは劇的に変化した。海馬のアミロイド沈着はすでに拡散したアミロイドを含まず、そしてバンド化したパターンは、完全に破壊された。代わりに抗-Ａβ抗体と反応性の多数の異常な点状構造が存在し、これらの幾つかはアミロイドを含有する細胞らしかった。
【０２２３】
MHCII-陽性細胞は、AN1792-処置動物の細胞外アミロイド付近に観察されることが多かった。Ａβ-陽性細胞とアミロイドとの会合パターンは、AN1792-処置マウスに由来する幾つかの脳で大変類似した。このような単球性細胞の分布は、アミロイド沈着の近位に限定され、そしてＡβ斑が無い他の脳の領域には全く存在しなかった。
【０２２４】
MHCII-およびMACI-標識切片の定量的画像分析では、海馬におけるMACI反応性の測定を用いて、有意に達したPBS群に比較して、AN1792-処置マウスのRSCおよび海馬中で免疫反応性が上昇する傾向を明らかとした。
【０２２５】
これらの結果は、斑を持つ脳の領域中のアミロイドの活発な細胞性除去を示している。
【０２２６】
３．Ａβレベルに及ぼすAN1792効果：ELISA測定
（ａ）皮質レベル
未処置PDAPPマウスでは、12カ月時点の皮質中の全Ａβの中央値レベルは1,600ng/gであり、これが15カ月までに8,700ng/gに増大した（表４）。18カ月で値は22,000ng/gであり、実験期間中に10倍以上に上昇した。PBS-処置動物は8,600ng/gの全Ａβを15カ月で有し、これは18カ月で19,000ng/gに上昇した。対照的に、AN1792-処置動物は15カ月の時点(1,600ng/g)で、PBS-免疫感作群よりも全Ａβが81％少なかった。有意に少ない（ｐ＝0.0001
）全Ａβ（5,200ng/g)は、18カ月でAN1792およびPBS群を比較した時に見いだされ（表４）、存在する場合のＡβに72％の減少を表す。同様な結果がＡβ42の皮質レベルを比較した時に得られ、すなわちAN1792-処置群はより少ないＡβ42を含むが、この場合、AN1792とPBS群との間の差異は15カ月(ｐ＝0.04）および18カ月（ｐ＝0.0001、表４）の両方で有意であった。
【０２２７】
【表４】
2012102131.tif 000010
【０２２８】
（ｂ）海馬レベル
未処置PDAPPマウスでは、12月齢で全Ａβの海馬レベルの中央値は15,000ng/gであり、これは15カ月で51,000ng/g、そしてさらに18カ月で81,000ng/gにまで上昇した（表５）。同様に、PBS免疫感作マウスは、15カ月および18カ月でそれぞれ40,000ng/gおよび65,000ng/gの値を示した。AN1792免疫感作動物は、少ない全Ａβを表し、特に15カ月および18カ月の時点でそれぞれ25,000ng/gおよび51,000ng/gであった。18カ月のAN1792-処置群の値は、PBS処置群よりも有意に低くかった（ｐ＝0.0105；表５）。Ａβ42の測定では同じ結果のパターンを与え、すなわちAN1792-処置群のレベルは、18カ月の評価でPBS群よりも有意に低かった（それぞれ39,000ng/g対57,000ng/g；ｐ＝0.002）（表３）。
【０２２９】
【表５】
2012102131.tif 000011
【０２３０】
（ｃ）小脳レベル
12カ月の未処置PDAPPマウスでは、全Ａβの小脳レベルの中央値は15ng/gであった（表６）。15カ月で、この中央値は28ng/gに上昇し、そして18カ月までに35ng/gまで上昇した。PBS-処置動物は15カ月で21ng/g、そして18カ月で43ng/gの全Ａβ値の中央値を示した。AN1792-処置マウスは15カ月で22ng/gの全Ａβを有し、そして18カ月で対応するPBS群よりも有意に低い（ｐ＝0.002）全Ａβ（25ng/g)を有することが見いだされた（表６）。
【０２３１】
【表６】
2012102131.tif 000012
【０２３２】
４．APPレベルに及ぼすAN1792処置の効果
APP-αおよび完全長のAPP分子は、両方ともＡβ配列の全部または一部を含み、すなわちAN1792-が向けられる免疫応答の生成により影響を受け得る可能性がある。今日までの研究では、PDAPPマウスに神経病状が増えるとAPPレベルのわずかな上昇が記録された。皮質では、APP-αが18カ月の時点でAN1792-処置対PBS-処置で19％まで減少したことを除き、APP-α／FL(完全長)またはAPP-αのいずれのレベルも本質的には変化しなかった。18カ月のAN1792-処置APP値は、12カ月および15カ月の未処置ならびに15カ月のPBS群の値とは有意に異ならなかった。すべての場合て、APP値はPDAPPマウスで正常に見られる範囲内に留まった。
【０２３３】
５．神経変性的およびグリオティック(Gliotic)な病状に及ぼすAN1792処置の効果
神経炎症性局面の負荷量は、PBS群に比較してAN1792-処置マウスの前頭皮質において15月齢（84％；ｐ＝0.03）および18月齢（55％；ｐ＝0.01）の両方で有意に減少した（図８）。神経炎症性局面の負荷量の中央値は、15月齢から18月齢の間でPBS群において0.32％から0.49％へと増加した。これは15月齢および18月齢の群で、それぞれ0.05％および0.22％の神経炎症性局面負荷量の中央値を有するAN1792群における神経炎症性局面の発生の大きな減少とは好対照であった。
【０２３４】
AN1792を用いた免疫感作は十分に寛容であり、しかも反応性の星状細胞増加症も、両15月齢（56％；ｐ＝0.011）および18月齢（39％；ｐ＝0.028）でPBS群と比べた時、AN1792-処置したマウスのRSCで有意に減少したようだ（図９）。PBS群の星状細胞増加症のパーセントの中央値は、15カ月から18カ月の間で4.26％から5.21％へと増加した。AN1792-処置は両時点での星状細胞増加症の発生を、それぞれ1.89％および3.2％まで抑制した。これは神経網が除去プロセスにより損傷されなかったことを示唆している。
【０２３５】
６．抗体応答
上記のように、11月齢のヘテロ接合性PDAPPマウス（Ｎ＝24）は、フロイントアジュバントで乳化した100μgのAN1792で、０、２、４、８、および12週に一連の５回の免疫感作を腹腔内に投与され、そして６回目はPBSのみ（フロイントアジュバント無し）の免疫感作を16週に受けた。陰性対照として、平行した24匹の月齢を合わせたトランスジェニックマウスの組が、同じアジュバントで乳化され、そして同じスケジュールで送達されるPBSでの免疫感作を受けた。動物は２回目の投与から出発して各免疫感作から３〜７日以内に採血した。AN1792に対する抗体応答は、ELISAにより測定した。AN1792で免疫感作した動物に関する幾何平均力価（GMT）は、２回目、３回目および最後（６回目）の投与後にそれぞれ約1,900、7,600そして45,000であった。６回目の免疫感作後に対照動物のＡβ特異的抗体は測定しなかった。
【０２３６】
約１／２の動物はさらに３カ月間、約20、24および27週に免疫感作を受ける処置を行っ
た。これらの各投与量はフロイントアジュバントを含まないPBS賦形剤単独で送達された。平均抗体力価はこの期間中、変化しないままだった。実際には、抗体力価は５回目から９回目の注射を網羅する期間に対応する４回目から８回目の採血にわたり、安定であるように見えた。
【０２３７】
AN1792処置マウスの血清中に検出されるＡβ-特異的抗体が免疫感作により誘導されたかどうかを決定することは、沈着した脳アミロイドにも関連し、AN1792-およびPBS-処置マウスの切片のサブセットを、マウスIgGに特異的な抗体と反応させた。PBS群とは対照的に、AN1792-処置脳内のＡβ斑は内因性のIgGに覆われていた。この２群の間の差異は、15-および18-カ月の両群で見られた。これらのマウスには重度のアミロイド負荷量が存在するにもかかわらず、特に目立ったのはPBS群の標識が無かったことであった。これらの結果は、合成のＡβタンパク質を用いた免疫感作が、アミロイド斑中のＡβをインビボで認識し、そして結合する抗体を生成することを示す。
【０２３８】
７．細胞性免疫応答
脾臓を９匹のAN1792-免疫感作マウスおよび12匹のPBS-免疫感作した18月齢のPDAPPマウスから、９回目の免疫感作から７日後に摘出した。脾細胞を単離し、そして72時間、Ａβ40、Ａβ42またはＡβ40-1（逆順序のタンパク質）の存在下で培養した。マイトジェンCoAを陽性対照として役立てた。最適な応答は＞1.7μMタンパク質で得られた。すべての９匹のAN1792-処置動物に由来する細胞は、Ａβ1-40またはＡβ1-42タンパク質のいずれかに応答して増殖し、両方のタンパク質について等レベルで取り込まれた（図１０、上パネル）。Ａβ40-1逆タンパク質には反応しなかった。対照動物からの細胞は、いずれのＡβタンパク質にも応答しなかった(図１０、下パネル）。
【０２３９】
Ｃ．結論
この実験の結果は、現存するアミロイド沈着を有するPDAPPマウスのAN1792免疫感作が、進行性のアミロイド沈着を遅らせ、そして防止し、そして結果的に加齢したPDAPPマウスの脳内の神経病理学的変化を遅らせることを示す。AN1792を用いた免疫感作は、通常はアミロイドーシスに圧倒される構造上のアミロイド発生を本質的に停止する。すなわちＡβペプチドの投与は、ＡＤの処置に治療的利益を有する。
【０２４０】
IV．Ａβフラグメントのスクリーニング
９〜11月齢の100匹のPDAPPマウスを、APPおよびＡβの９種の異なる領域で免疫感作し、どのエピトープが効力のある応答をもたらすかを決定した。９種の異なる免疫原および１つの対照を、上記のようにi.p.注射した。免疫原は４種のヒトＡβペプチド結合物1−12、13−28、32−42、1-5を含み、すべてヒツジ抗-マウスIgGにシステイン連結を介してカップリングした；APPポリペプチドアミノ酸592-695、凝集したヒトＡβ1-40および凝集したヒトＡβ25-35および凝集した齧歯類Ａβ42。凝集したＡβ42およびPBSは、それぞれ陽性および陰性対照として使用した。１つの処置群あたり10匹のマウスを使用した。力価は上記のようにモニタリングし、そしてマウスは注射から４カ月の終わりに安楽死させた。組織化学、Ａβレベルおよび毒性学分析は死後に測定した。
【０２４１】
Ａ．材料および方法
１．免疫原の調製
結合したＡβペプチドの調製：４種のヒトＡβペプチド結合物（それぞれがヒツジ抗-マウスIgGに結合したアミノ酸残基1-5、1-12、13-28および33-42）は、架橋試薬スルホ-EMCSを使用してＡβペプチドに加えた人工的なシステインを通してカップリングすることにより調製した。Ａβペプチド誘導体は、以下の最終アミノ酸配列を用いて合成した。各々の場合で、挿入したシステイン残基の位置は、下線で示した。Ａβ13−28ペプチド誘導体も、示したカルボキシル末端システイン前に２つのグリシン残基を有した。
【０２４２】
【化４】
2012102131.tif 000013
【０２４３】
カップリング反応を調製するために、10mgのヒツジ抗-マウスIgG（ジャクソン イムノリサーチ ラボラトリーズ:Jackson ImmunoResearch Laboratories）を、10mM ホウ酸ナトリウムバッファー、pH8.5に対して一晩透析した。透析した抗体を次いでアミコン（Amicon）のCentriprepチューブを使用して２mLの容量に濃縮した。10mg スルホ-EMS。
【０２４４】
[N(γ-マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド](モレキュラー サイエンス社:Molecular Science Co.)を、１mLの脱イオン水に溶解した。40-倍のモル過剰のスルホ-EMCSを撹拌しながらヒツジ抗-マウスIgGに滴下し、そして溶液をさらに10分間撹拌した。活性化したヒツジ抗-マウスIgGを精製し、そしてバッファーは0.1M NaPO4、5mM EDTA、pH6.5により平衡化した10mLのゲル濾過カラム(ピアス ケミカルズ((Pierce Chemicals)から得たピアス Presto Column）を通すことにより交換した。280nmの吸収により同定した抗体含有画分をプールし、そして吸光係数としてODあたり1.4mgを使用して約１mg/mLの濃度に希釈した。40-倍モル過剰なＡβペプチドを20mLの10mM NaPO4、pH8.0に溶解したが、Ａβ33−42ペプチドに関しては10mgを最初に0.5mLのDMSOに溶解し、そして次いで10mM NaPO4バッファーで20mLに希釈した。ペプチド溶液をそれぞれ10mLの活性化ヒツジ抗-マウスIgGに加え、そして室温で４時間、振盪した。生成した結合物は、アミコンのCentriprepチューブを使用して10mL未満の最終容量に濃縮し、そして次いでPBSに対して透析して、バッファーを交換し、そして遊離ペプチドを除去した。結合物は滅菌のために0.22μm-孔サイズのフィルターを通し、そして１mgの画分に分け、そして-20℃で凍結保存した。結合物の濃度は、BCAタンパク質アッセイ（ピアス ケミカルズ）を使用してウマIgGを標準曲線として用いて決定した。結合は、活性化ヒツジ抗-マウスIgGに対して結合ペプチドの分子量の増加により証明された。Ａβ1-5ヒツジ抗マウス結合物は２つの結合のプールであり、残りは１つの調製物に由来した。
【０２４５】
２．凝集Ａβペプチドの調製
ヒト1-40（AN1528：カリフォルニアペプチド社、ロット ME0541）、ヒト1-42（AN1792：カリフォルニアペプチド社、ロット ME0339およびME0439）、ヒト25-35および齧歯類1-42（カリフォルニアペプチド社、ロット ME0218）ペプチドは、-20℃で乾燥して保存しておいた凍結乾燥粉末から、各組の注射物の調製に新たに可溶化した。この目的には、２mgのペプチドを0.9mlの脱イオン水に加え、そして混合物をボルテックス混合して、比較的均一な溶液または懸濁液を作成した。４つの中のAN1528が、この段階で可溶性の唯一のペプチドであった。100μlの10×PBSのアリコート（1×PBS:0.15M NaCl、0.01M リン酸ナトリウム、pH7.5）を次いで加え、この時点でAN1524が沈殿し始めた。懸濁液を再度ボルテックス混合し、そして翌日使用するために37℃で一晩、インキューベーションした。
【０２４６】
pB×6タンパク質の調製：pB×6（100アミノ酸のバクテリオファージMS-2ポリメラーゼN-末端リーダー配列、続いてAPP(βAPP）のアミノ酸592-695から成る融合タンパク質）をコードする発現プラスミドを、Oltersdorf et al.,J.Biol.Chem.265,4492-4497(1990)に
より記載されているように構築した。プラスミドを大腸菌（E.coli）にトランスフェクトし、そしてタンパク質をプロモーターの誘導により発現させた。細菌は８M 尿素中で溶菌させ、そしてpB×6を調製用SDS PAGEにより部分精製した。pB×6を含有する画分は、ウサギ抗-pB×6ポリクローナル抗体を使用してウエスタンブロットにより確認し、プールし、アミコンCentriprepチューブを使用して濃縮し、そしてPBSに対して透析した。クマーシーブルー染色したSDS PAGEにより推定される調製物の純度は、約５〜10％であった。
【０２４７】
Ｂ．結果および考察
１．実験計画
９-ないし11月齢の100匹のオスおよびメスのヘテロ接合性PDAPPトランスジェニックマウスを、チャールズリバーラボラトリーおよびタコニックラボラトリー（Taconic Laboratory）から得た。マウスは、フロイントアジュバントと組み合わせた異なる領域のＡβまたはAPPで免疫感作される10群に分けられた。動物はできるかぎり群内の性別、月齢、血統および供給源を合わせるように分割した。免疫原はヒト起源の配列1-5、1-12、13-28および33-42に由来する４種のＡβペプチドを含み、各々がヒツジ抗-マウスIgGに結合していた；４種の凝集したＡβペプチド、ヒト1-40（AN1528)、ヒト1-42（AN1792)、ヒト25-35、および齧歯類1-42；ならびに融合ポリペプチド、pB×6として設計し、APPアミノ酸残基592-695を含む。10番目の群は対照としてアジュバントと組み合わせたPBSで免疫感作した。
【０２４８】
各免疫感作には、初回免疫感作用に、100μgの各Ａβペプチド（200μlのPBS中）、または200μgのAPP誘導体pB×6（同じ容量のPBS中）またはPBS単独を、1:1(容量:容量)の完全フロイントアジュバント(CFA)で400μlの最終容量に乳化し、続いて不完全フロイントアジュバント（IFA）中に同量の免疫原の追加免疫感作を次の４回の投与に、そして最後の投与はPBSを用いた。免疫感作は、最初の３回の投与量は隔週のスケジュールで、次にその後は毎月、腹腔内に送達された。抗体力価を測定するために、動物は２回目の投与後から始めて、各免疫感作から４〜７日後に採血された。動物は最終投与から約１週間後に安楽死させた。
【０２４９】
２．脳内のＡβおよびAPPレべル
種々のＡβペプチドまたはAPP誘導体での免疫感作から約４カ月後に、塩類−潅流動物から脳を摘出した。１つの半球は免疫組織化学分析に調製し、そして２つ目はＡβおよびAPPレべルの定量に使用した。種々の形態のβアミロイドペプチドおよびアミロイド前駆体タンパク質の濃度を測定するために、半球を切開し、そして海馬、皮質および小脳領域のホモジネートを５M グアニジンで調製した。これらを希釈し、そしてアミロイドおよびAPPのレベルは、ELISA形式で既知濃度のＡβペプチドまたはAPPの一連の標準希釈物と比較することにより定量した。
【０２５０】
PBSで免疫感作した対照群に関する全Ａβの中央値濃度は、皮質よりも海馬で5.8倍高かった（皮質の4,221ng/gに対して24,318ng/gの海馬の中央値）。対照群の小脳中の中央値レベル（23.4ng/g組織）は、海馬よりも約1,000倍低かった。これらのレベルはこの月齢のヘテロ接合性PDAPPトランスジェニックマウスについて以前に報告したレベルと同様であった（Johnson-Woods et al.,1997,同上）。
【０２５１】
皮質に関して、処置群のサブセットは対照群とは有意に異なる全Ａβの中央値およびＡβ1-42レベルを有し（ｐ＜0.05）、これらの動物は図１１に示すようにAN1792、齧歯類Ａβ1-42またはＡβ1-5ペプチド結合物を受容した。これらの処置群について全Ａβの中央値レベルは、対照に比べてそれぞれ75％、79％および61％まで減少した。いかなる群にも脳内の皮質領域にＡβ-特異的抗体力価とＡβレベルとの間に識別できる相関はなかった。
【０２５２】
海馬では、AN1792処置に関連した全Ａβの中央値の減少（46％、ｐ＝0.0543）は、皮質で観察されるよりも大きかった（75％、ｐ＝0.0021）。しかし減少の規模は皮質よりも海馬で一層大きく、皮質で正味3,171ng/g組織の減少に対して海馬では正味11,186ng/g組織の減少であった。齧歯類Ａβ1-42またはＡβ1-5を受けた動物群については、全Ａβレベルの中央値は、それぞれ36％および26％まで減少した。しかし群のサイズが小さいこと、および両群内の動物毎のアミロイドペプチドレベルの高い可変性を考慮すると、このような減少は有意ではなかった。Ａβ1-42レベルを海馬で測定した時、処置が誘導した減少が有意しなったものはなかった。すなわち皮質中のより小さいＡβ負荷量から、この領域での変化は処置効果のより敏感な指標である。皮質中でELISAにより測定されるＡβレベルの変化は同様であるが、免疫組織化学的分析からの結果とは同一ではない（以下を参照のこと）。
【０２５３】
全Ａβは、ＡＤ病により典型的には最も影響を受けることが小さい小脳でも測定した。種々のＡβペプチドまたはAPP誘導体で免疫感作したいずれの群のＡβ濃度の中央値も、脳のこの領域において対照群と異ならなかった。この結果は、処置によりＡβの非病理学的レベルは影響を受けないことを示唆している。
【０２５４】
APP濃度は、処置および対照マウスに由来する皮質および小脳中でELISAでも決定した。２種の異なるAPPアッセイを使用した。第１はAPP-α/FLと呼び、APP-アルファ（α、Ａβ配列内が開裂されたAPPから分泌した）、およびAPPの完全長の形態（FL）を認識し、一方２つ目は、APP-αのみを認識する。処置群のサブセットでは処置が関係するＡαの減少とは対照的に、APPのレベルが対照動物と比較してすべての処置で変化しなかった。これらの結果は、Ａβペプチドでの免疫感作がAPPを減らさず；むしろ処置効果がＡβに特異的であることを示す。
【０２５５】
要約すると、全ＡβおよびＡβ1-42レベルは皮質中でAN1792、齧歯類Ａβ1-42またはＡβ1-5結合物を用いた処置により有意に減少した。海馬では、全ＡβがAN1792処置でのみ有意に減少した。海馬、皮質または小脳領域における他の処置が関与するＡβまたはAPPレベルの変化は、有意ではなかった。
【０２５６】
２．組織化学的分析
組織化学的分析用に６群のサブセットに由来する脳を調製した、Ａβペプチド結合物Ａβ1-5、Ａβ1-12およびＡβ13-28で免疫感作した３群；完全長のＡβ凝集物AN1792およびAN1528で免疫感作した２群、およびPBSで処置した対照群。これらの群からの脳切片中のアミロイド負荷量の画像分析の結果を、図１２に示す。３つの処置群対対照動物の皮質領域中で、アミロイド負荷量には有意な減少があった。アミロイド負荷量の最大の減少はAN1792を受けた群で観察され、ここで平均値は97％まで減少した（ｐ＝0.001）。有意な減少はAN1528（95％、ｐ＝0.005）およびＡβ1-5ペプチド結合物（67％、ｐ＝0.02）で処置した動物でも観察された。
【０２５７】
ELISAによる全ＡβまたはＡβ1-42の定量および画像分析によるアミロイド負荷量により得られた結果は、ある程度異なった。AN1528による処置は、定量的な画像分析により測定した時に皮質アミロイド負荷量のレベルに有意な影響を与えたが、ELISAにより測定した時の同じ領域の全Ａβ濃度には影響がなかった。このような２つの結果の差異は、アッセイの特異性によるものだろう。画像分析は斑中の不溶性のＡβ凝集物のみを測定する。対照的に、ELISAは可溶性および不溶性の両方、単量体および凝集物のすべてのＡβの形態を測定する。疾患の病状は不溶性の斑が関連するＡβの形態であると考えられているので、画像分析法が処置の効果を明らかにするためにより感度がある。しかしELISAはより迅速で容易なアッセイであり、スクリーニングの目的には大変有用である。さらにELISA
はＡβの処置が関連する減少を、全Ａβよりも斑に関連してより大きく明らかにすることができる。
【０２５８】
処置動物の免疫感作により誘導されたＡβ−特異的抗体が、脳に沈着したアミロイドと反応したかどうかを決定するために、処置動物および対照マウスに由来する切片のサブセットを、マウスIgGに特異的な抗体と反応させた。PBS群とは対照的に、Ａβペプチド結合物Ａβ1-5、Ａβ1-12およびＡβ13-28；および完全長Ａβ凝集物AN1792およびAN1582で免疫感作した動物については、Ａβ-含有斑は内因性のIgGに覆われた。他のＡβペプチドまたはAPPペプチドpB×6で免疫感作した動物に由来する脳はこのアッセイで分析しなかった。
【０２５９】
３．抗体力価の測定
マウスは２回目の免疫感作から始めて全部で５回、各免疫感作から４〜７日後に採血した。抗体力価はＡβ1-42で被覆したプラスチック製のマルチ-ウェルプレートを使用を用いたサンドイッチELISAを使用してＡβ1-42結合抗体として測定した。図１３に示すように、ピーク抗体力価は４種の免疫感作製剤について４回目の投与後に誘導され、AN1792-特異的抗体の最大力価が誘導された：AN1792（ピークGMT:94,647）、AN1528（ピークGMT:88,231）、Ａβ1-12結合物（ピークGMT:47,216）および齧歯類Ａβ1-42（ピークGMT:10,766）。これらの群の力価は５およ６回目の投与後にいくぶん減少した。残りの５種の免疫原については、ピーク力価に５または６回目の投与後に到達し、そしてこれらは４種の最高の力価群よりも大変低い規模であった：Ａβ1-5結合物（ピークGMT:2,356）、pB×6（ピークGMT:1,986）、Ａβ13-28結合物（ピークGMT:1,183）、Ａβ33-42結合物（ピークGMT:658）、Ａβ25-35結合物（ピークGMT:125）。ホモロガスペプチドに対する抗体力価も同じELISAサンドイッチ形式を使用して、免疫原のサブセットについて測定し、このような群をＡβ1-5、Ａβ13-28、Ａβ25-35、Ａβ33-42および齧歯類Ａβ1-42で免疫感作した。ホモロガスな免疫原に対する抗体力価が約２倍高い齧歯類Ａβ1-42免疫原に関する力価を除き、これらの力価はＡβ1-42に対して測定した力価とおよそ同じであった。個々の動物のAN1792-特異的抗体力価の規模、または処置群の平均値は、皮質内のＡβの減少として測定された効力とは相関しなかった。
【０２６０】
４．リンパ球増殖的応答
Ａβ-依存的なリンパ球増殖を、最後の６回目の免疫感作から約１週間後に回収した脾臓細胞を使用して測定した。新しく回収した細胞（105／ウェル）を、５μMの刺激濃度のＡβ1-40の存在下で、５日間培養した。10群のうちの７群からのサブセットの細胞も、逆ペプチドＡβ40-1の存在下で培養した。陽性対照として、さらなる細胞をＴ細胞マイトジェン（PHA）と培養し、そして陰性対照として、細胞をペプチドを加えずに培養した。
【０２６１】
大部分の動物に由来するリンパ球は、PHAに応答して増殖した。Ａβ40-1逆ペプチドに対する有意な応答はなかった。より大きな凝集したＡβペプチド、AN1792、齧歯類Ａβ1-42およびAN1528で免疫感作した動物に由来する細胞は、Ａβ1-40で刺激した時にしっかりと増殖し、最高のcpmはAN1792の受容体であった。Ａβ1-12結合物、Ａβ13-28結合物およびＡβ25-35で免疫感作した各群からの１動物は、Ａβ1-40に応答して増殖した。Ａβ1-5結合物、Ａβ33-42結合物pB×6またはPBSを受けた残りの群には、Ａβが刺激した応答を有する動物はいなかった。 これらの結果を以下の表７にまとめる。
【０２６２】
【表７】
2012102131.tif 000014
【０２６３】
これらの結果は、AN1792およびAN1528が強力なＴ細胞応答、最も多くはCD4+表現型を刺激することを示す。Ａβ1-5で免疫感作した動物においてＡβ特異的Ｔ細胞応答の不存在は、CD4+Ｔ細胞により認識されるペプチドのエピトープが通常は約15アミノ酸長であるが、より短いペプチドが低い効率で機能できるので、驚くことではない。すなわち４種の結合物ペプチドに対するヘルパーＴ細胞エピトープの大部分が、Ａβ領域ではなくIgG結合物パートナー中にあるらしい。この仮説は各処置群中の動物について、大変低い増殖応答の発生率に支持される。Ａβ1-5結合物は脳内でＡβレベルを有意に下げることに効果的であるので、Ａβ-特異的Ｔ細胞の明らかな不存在で、このペプチドによる免疫感作により誘導された鍵となるエフェクター免疫応答は、抗体となるだろう。
【０２６４】
すべてのＡβ残基を含むAPPアミノ酸592-695を包含する融合ペプチドpB×6からのＴ-細胞の欠如および低い抗体応答は、この特別な調製物の悪い免疫原性によるものかもしれない。Ａβ25-35凝集物の悪い免疫原性は、ペプチドが小さすぎて抗体応答を誘導するために役立つ良いＴ細胞エピトープを含まないからであろう。このペプチドがキャリアータンパク質と結合すれば、おそらくより免疫原性となるだろうと思われる。
【０２６５】
V．受動防御用のポリクローナル抗体の調製
125匹の非-トランスジェニックマウスをＡβにアジュバントを加えて免疫感作し、そして４〜５カ月で安楽死させた。血液を免疫感作したマウスから集めた。IgGは他の血液成分から分離した。免疫原に特異的な抗体は、アフィニティクロマトグラフィーにより部分精製した。マウスあたり約0.5〜１mgの免疫原に特異的な抗体が得られ、全部で60〜120mgとなった。
【０２６６】
VI．Ａβに対する抗体による受動免疫感作
７〜９月齢のPDAPPマウス群の各々を、以下に示すようにPBS中に0.5mgのポリクローナル抗-Ａβまたは特異的抗-Ａβモノクローナルを用いて注射した。すべての抗体調製物は低いエンドトキシンレベルを有するように精製した。モノクローナルはマウスにＡβのフラグメントまたはＡβのより長い形態を注射し、ハイブリドーマを調製し、そしてＡβの他の非重複フラグメントに結合することなくＡβの所望のフラグメントに特異的に結合する抗体のハイブリドーマをスクリーニングすることにより、フラグメントに対して調製することができる。
【０２６７】
【表８】
2012102131.tif 000015
【０２６８】
マウスは、Ａβ42または他の免疫原に対してELISAにより定めた1/1000より大きいELISA力価により測定される循環抗体濃度を維持するために、４カ月の期間中、必要こ応じてip注射された。力価は上記のようにモニタリングし、そしてマウスは注射の６カ月の終わりに安楽死させた。組織化学、Ａβレベルおよび毒性学は、死後に行った。１群あたり10匹のマウスを使用した。受動免疫感作に関するさらなる実験は、以下の実施例XIおよびXIIに記載する。
【０２６９】
VII．様々なアジュバントの比較
この実施例は、CFA、alumおよび水中油型エマルションおよびMPLを免疫応答を刺激する能力について比較する。
【０２７０】
Ａ．材料および方法
１．実験計画
エルム ヒル ブリーディング ラボラトリーズ(Elm Hill Breeding Laboratories)（チェルムスフォード、マサチューセッツ州）から得た100匹の６週齢のメスHartley種モルモットを、種々のアジュバントと組み合わせたAN1792またはそれらのパルミトイル化誘導体で免疫感作するために10群に分けた。７群がａ）PBS、ｂ）フロイントアジュバント、ｃ）MPL、ｄ）スクアレン、ｅ）MPL／スクアレン、ｆ）低用量のalumまたはｇ）高用量のalum（300μgAN1792)と組み合わせたAN1792（特定しない限り33μg）の注射を受けた。２群はAN1792のパルミトイル化誘導体（33μg）の注射をａ）PBSまたはｂ）スクアレンと組み合わせて受けた。最後に10番目の群は、抗原およびさらなるアジュバント無しでPBSのみを受けた。フロイントアジュバントを受ける群は、最初の投与量をCFAで乳化し、そして残る４投与量はIFAで乳化した。抗原は高投与量のalum群を除きすべての群で33μgの用量で投与され、高用量のalum群は300μgのAN1792を受けた。注射はCFA/IFAには腹腔内に、そしてすべての他の群については右および左側の後脚四頭筋に交互に筋肉内投与した。最初の３回の投与は隔週のスケジュールで、続いて毎月の間隔で与えた。抗体力価を測定するために血液は２回目の投与後から開始して各免疫感作から６〜７日後に採血した。
【０２７１】
２．免疫原の調製
２mgのＡβ42(カリフォルニア ペプチド ロットME0339）を、0.9mlの脱イオン水に加え、そして混合物をボルテックス混合して比較的な懸濁液を作成した。100μlの10×PBSの
アリコート（1×PBS、0.15M NaCl、0.01M リン酸ナトリウム、pH7.5）を加えた。この懸濁液を再度ボルテックス混合し、そして翌日使用するために37℃で一晩、インキューベーションした。未使用のＡβ1-42は-20℃で凍結乾燥した粉末として乾燥剤と一緒に保存した。
【０２７２】
パルミトイル化したAN1792の誘導体は、ジメチルホルムアミドに溶解した無水パルミチン酸をAN1792のアミノ末端残基にカップリングにさせた後、樹脂から、付いているペプチドをフッ化水素酸を用いた処理により取り出した。
【０２７３】
完全フロイントアジュバント(CFA)を用いて免疫原性の配合用量を調製するために（群２）、初回免疫感作には33μgのAN1792（200μlのPBS中）を、1:1(容量:容量)のCFAで400μlの最終容量に乳化した。続く免疫感作には、抗原を不完全フロイントアジュバント（IFA）を用いて同様に乳化した。
【０２７４】
群５および８については、MPLを用いて配合用量を調製するために、凍結乾燥粉末（リビ イムノケミリサーチ社、ハミルトン、マサチューセッツ州）を0.2％の水性トリエチルアミンに加え、１mg/mlの最終濃度とし、そしてボルテックス混合した。混合物を65〜70℃に30秒間加熱して、わずかに不透明で均一なミセルの懸濁液を作成した。溶液は各組の注射に新しく調製した。群５の各注射には、33μgのAN1792(16.5μlのPBS中）、50μgのMPL(50μl)および162μlのPBSを、使用直前にホウ珪酸試験管中で混合した。
【０２７５】
低い水中油型のエマルションを用いて配合用量を調製するために、PBS中のAN1792を５％スクアレン、0.5％ Tween80、PBS中の0.5％Span85に加えて、250μl中に33μgの濃度のAN1792の最終単回投与量に達した（群６）。混合物は、エマルションの液滴が顕微鏡下で見た時に1.0μm直径の標準ラテックスビーズのおよそ等しい直径になるまで、２つのチャンバーを持つ手で持つデバイス（two-chambered hand-held device）に15〜20回通すことにより乳化した。生成した懸濁液は不透明な乳白色であった。エマルションは各々の一連の注射のために新たに調製した。群８に関しては、0.2％トリエチルアミン中のMPLを投与量あたり50μgの濃度でスクアレンおよび上記のような乳化のための界面活性剤混合物に加えた。パルミトイル化誘導体（群７）については、33μgのパルミトイル-NH-Ａβ-1-42をスクアレンに加え、そしてボルテックス混合した。Tween80およびSpan85を次いでボルテックス混合しながら加えた。混合物をPBSに加えて５％スクアレン、0.5％Tween80、0.5％Span85の最終濃度に到達し、そして混合物を上記のように乳化した。
【０２７６】
alumを用いて配合用量を調製するために（群９および１０）、PBS中のAN1792をAlhydrogel（水酸化アルミニウムゲル、アキュレート（Accurate）、ウエストベリー、ニューヨーク州）に加えて、250μlの最終投与量中に５mgのalumあたり、33μg(低投与量、群９）または300μg（高投与量、群10）の濃度に到達した。懸濁液をRTで４時間、穏やかに混合した。
【０２７７】
３．抗体力価の測定
モルモットは、２回目の免疫感作から始めて免疫感作から６〜７日後に全部で４回採血した。Ａβ42に対する抗体力価は、一般材料および方法に記載したようにELISAにより測定した。
【０２７８】
４．組織プレパレーション
約14週後、すべてのモルモットはCO2を投与することにより安楽死させた。脳脊髄液を集め、そして脳を摘出し、そして３つの脳領域（海馬、皮質および小脳）を切開し、そしてELISAを使用して全Ａβタンパク質濃度を測定するために使用した。
【０２７９】
Ｂ．結果
１．抗体応答
免疫感作後にAN1792に対する抗体応答として測定した時、種々のアジュバントに広い範囲の効力があった。図１４に示すように、AN1792をPBS中で投与した時、２または３回の免疫感作後に抗体は検出されず、そして無視できる応答が４および５回目の投与後にたった約45の幾何平均力価(GMT)で検出された。o/w型エマルションは３回の投与後にわずかな力価を誘導し（GMT 255）、これは４回目の投与後も維持され（GMT 301）、そして最終投与で落ちた（GMT 54）。alumに結合したAN1792に関して明らかな抗原投与量応答があり、すべての時点で300μgが33μgよりも免疫原性であった。抗体応答のピークで、４回目の免疫感作後に、２つの投与量の差異はGMTで約1940（33μg）および3400（300μg）であった。MPLを加えた33μgのAN1792に対する抗体応答は、alumに結合したほぼ10倍高い用量の抗原(300μg)用量で生成された応答に大変類似した。MPLをo/w型エマルションに加えると、配合物の効力はMPLを単なるアジュバントとした場合に比べて最大75％まで減少した。AN1792のパルミトイル化誘導体は、PBS中で投与した時に完全に非免疫原性であり、そしてo/w型エマルション中に存在する時に、３回目そして４回目の採血について340および105のGMTのわずかな力価を与えた。最高の抗体力価は、フロイントアジュバントで生成され、約87,000のピークGMTであり、次に最も効力のある配合物MPLおよび高用量AN1792/alumのGMTよりもほぼ30倍大きい値であった。
【０２８０】
この実験で確認された最も有望なアジュバントは、MPLおよびalumである。これら２つの中で、MPLはalumで得られるものと同じ抗体力価を生成するために必要な抗原用量が、10倍低いので好ましい。応答は抗原かつ／またはアジュバントの用量を増すことにより、ならびに免疫感作スケジュールを至適化することにより上昇させることができる。o/w型エマルションはAN1792には大変弱いアジュバントであり、そしてMPLアジュバントにo/w型エマルションを加えることにより、MPL単独の固有のアジュバント活性が減少した。
【０２８１】
２．脳内のＡβレベル
約14週で、モルモットに深く麻酔をかけ、脳脊髄液(CFS)を引き抜き、そしてフロイントアジュバント（群２）、MPL（群５）、高投与量、300μgのAN1792を含むalum（群１０）、およびPBSを免疫感作した対照群（群３）の動物のサブセットから脳を摘出した。Ａβペプチドのレベルを測定するために、１つの海馬を切開し、そして海馬、皮質および小脳領域のホモジネートを５M グアニジンで調製した。これらを希釈し、そしてELISA形式で一連の既知濃度のＡβ標準タンパク質の希釈物と比較することにより定量した。海馬、皮質および小脳中のＡβタンパク質のレベルは、これらの配合物により誘導されるＡβに対する広い範囲の抗体応答にもかかわらず、すべての４群で大変類似した。約25ng/g組織の平均Ａβレベルは海馬で、皮質で21ng/g、そして小脳で12ng/gが測定された。すなわちＡβに対する高い循環抗体力価の存在は、ほぼ３カ月間、これらの動物の幾匹かで脳内の全Ａβレベルを変化させなかった。CFS中のＡβレベルも群間でほぼ同様であった。内因性Ａβに及ぼすAN1792免疫感作の大きな効果の欠如は、免疫応答がＡβの病理学的状態の形成に集中していることを示す。
【０２８２】
VIII．マウスにおける種々のアジュバントに対する免疫応答
６週齢のメスのスイス ウェブスターマウスを１群あたり10〜13匹でこの実験に使用した。免疫感作は200μlの投与量で０、14、28、60、90および20日に皮下に与えた。PBSはバッファーとしてすべての配合に使用した。動物はELISAによる抗体力価の分析のために、２回目の投与後から開始して各免疫感作から７日後に採血した。各群の処置計画を表９にまとめる。
【０２８３】
【表９】
2012102131.tif 000016
【０２８４】
群８については、アジュバントおよび抗原を含まなかった。
【０２８５】
各群のＡβ42に対する抗体のELISA力価を、以下の表１０に示す。
【０２８６】
【表１０】
2012102131.tif 000017
【０２８７】
この表は、最高の力価が群４、５および１８で得られ、ここでアジュバントは125μgのMPL、50μgのMPLおよびMPLを加えたQS-21であった。
【０２８８】
IX．種々のアジュバントの治療的効力
治療的効力の実験は、Ａβに対する免疫応答を強化し、そして脳内のアミロイド沈着の免疫性除去を誘導するアジュバントの能力を決定するために、ヒトの使用において適するアジュバントの組を用いて、PDAPPトランスジェニックマウスで行った。
【０２８９】
180匹のオスおよびメスの7.5〜8.5月齢のヘテロ接合性PDAPPトランスジェニックマウスを、チャールズリバーラボラトリーズから得た。マウスは種々のアジュバントと組み合わせたAN1792またはAN1528で免疫感作する群あたり15〜23匹の動物を含む９群に分けた。動物は群内でできるだけ性別、月齢および動物の血統を合わせるように分配した。アジュバントにはalum，MPLおよびQS-21を含み、各々を両抗原と合わせ、そしてAN1792のみと合わせたフロイントアジュバント（FA）を含んだ。さらなる群は保存剤チメロサールを加え、アジュバントを含まないPBSバッファー中に配合したAN1792で免疫感作した。９群目は陰性対照としてPBS単独で免疫感作した。
【０２９０】
凝集したＡβペプチドの調製：ヒトＡβ1-40（AN1528；カリフォルニア ペプチド社、ナパ、カリフォルニア州；ロット ME0541）およびヒトＡβ1-42（AN1792；カリフォルニア ペプチド社；ロット ME0439）ペプチドは、-20℃で乾燥して保存しておいた凍結乾燥粉末から、各組の注射物の調製に新たに可溶化した。この目的のために、２mgのペプチドを0.9mlの脱イオン水に加え、そして混合物をボルテックス混合して、比較的均一な溶液
または懸濁液を作成した。AN1792とは対照的に、AN1528はこの段階で可溶性であった。100μlの10×PBSのアリコート（1×PBS:0.15M NaCl、0.01M リン酸ナトリウム、pH7.5）を次いで加え、この時点でAN1528が沈殿し始めた。懸濁液を再度ボルテックス混合し、そして翌日使用するために37℃で一晩、インキューベーションした。
【０２９１】
alumを用いて配合用量を調製するために（群１および５）、PBS中のＡβペプチドをAlhydrogel（２％の水性水酸化アルミニウムゲル、サルジェント社（Sargent Inc.）、クリフトン、ニュージャージー州）に加えて、１mgのalumあたり100μgのＡβペプチド濃度に到達した。10×PBSを加えて、１×PBS中に200μlの最終投与量とした。次いで懸濁液は注射前にRTで約４時間、穏やかに混合した。
【０２９２】
MPLを用いて配合用量を調製するために（群２および６）、凍結乾燥粉末（リビ イムノケミリサーチ社、ハミルトン、マサチューセッツ州：ロット67039-E0896B）を0.2％の水性トリエチルアミンに加え、１mg/mlの最終濃度とし、そしてボルテックス混合した。混合物を65〜70℃に30秒間加熱して、わずかに不透明で均一なミセルの懸濁液を作成した。溶液は４℃に保存した。各組の注射には、投与(50μlのPBS中）あたり100μgのペプチド、投与量(50μl)あたり50μgのMPLおよび投与量あたり100μlのPBSを、使用直前にホウ珪酸試験管中で混合した。
【０２９３】
QS-21を用いて配合用量を調製するために（群３および７）、凍結乾燥粉末（アクイラ:Aquila、フラミンガム、マサチューセッツ州：ロットA7018R）をPBS、pH6.6〜6.7に加えて、１mg/mlの最終濃度とし、そしてボルテックス混合した。溶液を-20℃で保存した。各組の注射には、用量あたり100μgのペプチド(50μlのPBS中）、用量あたり25μgのQS-21(25μlのPBS中)および用量あたり125μlのPBSを、使用直前にホウ珪酸試験管中で混合した。
【０２９４】
フロイントアジュバントを用いて配合用量を調製するために（群４）、初回免疫感作には100μgのAN1792（200μlのPBS中）を、1:1(容量:容量)で完全フロイントアジュバント(CFA)と400μlの最終容量に乳化した。続く免疫感作には、抗原を不完全フロイントアジュバント（IFA）を用いて同様に乳化した。アジュバントalum、MPLまたはQS-21を含む配合には、投与量あたり100μgのAN1792またはAN1528を200μlPBSの最終投与量でalum（投与量あたり１mg）またはMPL（投与量あたり50μg）と合わせ、そして肩甲骨の間に皮下接種により送達した。FAを受ける群については、100μgのAN1792をを、1:1(容量:容量)の完全フロイントアジュバント(CFA)で400μlの最終容量に乳化し、そして初回の免疫感作には腹腔内に送達し、続いて５回の投与には不完全フロイントアジュバント（IFA）中の同量の免疫原を追加免疫感作した。アジュバントを含まないAN1792を受ける群には、10μgのAN1792を最終容量50μlのPBS中で５μgのチメロサールと合わせ、そして皮下で送達した。９番目の対照群は皮下送達された200μlのPBSのみ受けた。免疫感作は最初の３回の投与については隔週のスケジュールで与え、次いでその後は毎月のスケジュールで、０、16、28、56、85および112日に与えた。動物は抗体力価を測定するために、２回目の投与後に初めて各免疫感作から６〜７日後に採血した。動物は最終投与から約１週間後に安楽死させた。結果は脳内のＡβおよびAPPレベルのELISAアッセイにより、そして脳切片内のアミロイド斑の存在の免疫組織化学的評価により測定した。さらにＡβ-特異的抗体力価、およびＡβ依存的増殖およびサイトカイン応答を決定した。
【０２９５】
表１０は、Ａβ1-42に対する最高の抗体がFAおよびAN1792により誘導されることを示し、その力価は４回目の免疫感作後にピークとなり（ピークGMT：75,386）、そして最後の６回目の免疫感作までには59％まで減少した。AN1792を含むMPLにより誘導されたピーク平均力価は、FA（ピークGMT：28,867）での生成よりも62％低く、そしてまた３回目の投与後の免疫感作スケジュールの初期に到達し、続いて６回目の免疫感作後にはピークの28
％まで減少した。AN1792と合わせたQS-21で生成し たピーク平均力価(GMT：1,511）は、MPLにより得られた価よりも約５倍低かった。さらに応答の動力学は、ピーク応答に達するまでにさらなる免疫感作が必要とされたので、ゆっくりとしていた。alum-結合AN1792により生成された力価は、QS-21で得た価よりもわずかに大きく、そして応答の動力学はより急速であった。チメロサールを含むPBS中で送達されたAN1792については、力価の頻度およびサイズがPBS単独よりもかろうじて大きかった。MPLおよびAN1528で生成したピーク力価（ピークGMT 3099）は、AN1792を用いた価よりも約９倍低かった。alum-結合AN1792は大変悪い免疫原であり、低い力価が数匹の動物に生じただけであった。PBS単独で免疫感作した対照動物に観察された抗体応答は無かった。
【０２９６】
【表１１】
2012102131.tif 000018
【０２９７】
ELISAにより決定される12月齢のマウスにおける皮質アミロイド負荷量に及ぼす種々のアジュバントを用いたAN1792またはAN1528処置、あるいはチメロサールの結果を図１５に示す。PBS対照PDAPPマウスでは、12カ月での皮質中の全Ａβの中央値レベルは1,817ng/gであった。顕著なＡβの減少レベルは、CFA/IFAを加えたAN1792、alumを加えたAN1792、MPLを加えたAN1792およびAN1792を加えたQS-21で処置したマウスで観察された。減少はCFA/IFAを加えたAN1792についてのみ、ｐ＜0.05レベルで統計的に有意に達した。しかし実施例IおよびIIIに示すように、免疫感作がＡβレベルの減少に及ぼす効果は、15カ月および18カ月のマウスで実質的に大きくなった。すなわちさらに配合物、特にalumを加えたAN1792、MPLを加えたAN1792およびQS-21を加えたAN1792の組成物は、より高齢のマウスの処置により陽性の効果を提供するだろう。対照的に、保存剤チメロサールを加えたAN1792は、
PBS処置マウスとおよそ同じＡβの中央値レベルを示した。同様な結果がＡβ42の皮質レベルを比較した時に得られた。PBS対照におけるＡβの中央値レベルは、1624ng/gであった。403、1149、620および714の中央値レベルの顕著な減少が、それぞれCFA/IFAを加えたAN1792、alumを加えたAN1792、MPLを加えたAN1792およびQS-21を加えたAN1792で観察され、減少はCFA/IFAを加えたAN1792処置群について統計的に有意であった（ｐ＝0.05）。AN1792チメロサール処置マウスにおける中央値レベルは、1619ng/gＡβ42であった。
【０２９８】
X．毒性分析
実施例II、IIIおよびVIIに記載の実験の終わりに、組織病理学的調査のために組織を集めた。さらに血液学および臨床化学を、実施例IIIおよびVIからの最終血液サンプルについて行った。脳、肺、リンパ、胃腸管、肝臓、腎臓、甲状腺および生殖巣を含む主な器官のほとんどを評価した。散発性の損傷が実験動物に見られたが、AN1792処置と未処置動物間で影響を受けた組織または損傷の重篤度のいずれにも明らかな差異はなかった。PBS-処置または未処置動物に比較して、AN-1528-免疫感作動物に記録された独特な組織病理理学的損傷はなかった。また実施例VIでアジュバント群とPBS処置群との間で臨床化学的なプロフィールにおいて差異は無かった。実施例VIではPBS処置動物に比べてAN1792とフロイントアジュバントで処置した動物間で、幾つかの血液学的パラメーターに有意な上昇があったが、これらの効果の型は、フロイントアジュバントの処置から予想され、そして腹膜炎を伴い、そしてAN1792処置からの悪い効果は示していない。毒性学的評価の一部ではないが、PDAPPマウスの脳の病状を効力の終点の一部として徹底的に評価した。脳の形態学に及ぼす処置に関連した悪影響の兆候はいずれの実験にも無かった。これらの結果は、AN1792の処置が十分に耐容され、そして少なくとも実質的に副作用が無いことを示している。
【０２９９】
XI．抗-Ａβ抗体を用いた治療的処置
この章に記載する実験は、ヘテロ接合性トランスジェニックマウスの脳内で、Ａβの沈積を抑制するためのＡβに対する種々のモノクローナルおよびポリクローナル抗体の能力を試験するために行った。
【０３００】
Ａ．実験１
１．実験計画
8.5〜10.5月齢の６匹のオスおよびメスのヘテロ接合性PDAPPトランスジェニックマウスは、チャールズリバーラボラトリーから得た。マウスはＡβに対する種々の抗体で処置する６群に分けた。動物はできる限り群内の動物の性別、月齢、血統および供給源を合わせるように分配した。図１０に示すように、抗体には４種のマウスＡβ-特異的モノクローナル抗体、2H3（Ａβ残基1-12に向けられた）、10D5（Ａβ残基1-16に向けられた）、266（Ａβ残基13-28に向けられ、そして単量体には結合するが、凝集したAN1792には結合しない）、21F12（Ａβ残基33-42に向けられた）を含んだ。５番目の群は、Ａβ-特異的ポリクローナル抗体画分（凝集したAN1792による免疫感作により生じた）で処置した。陰性対照群は抗体を含まない希釈物PBSのみを受けた。
【０３０１】
モノクローナル抗体を、約10mg/kgの容量で注射した（マウスは50gと想定された）。注射は７日毎に平均1000より高い抗-Ａβ力価を維持するために腹腔内投与した。mAb266はこのアッセイで捕捉抗原として使用した凝集したAN1792にはよく結合しないので低い力価が測定されたが、同じ投与スケジュールをこの群でも維持した。モノクローナル抗体2H3を受けた群は、抗体がインビボで急速に除去されすぎたので、最初の３週間内に中止した。動物は各抗体力価を測定するために、各投与前に採血された。処置は６カ月間、全部で196日間にわたり続行した。動物は最終投与から１週間後に安楽死させた。
【０３０２】
【表１２】
2012102131.tif 000019
【０３０３】
２．材料および方法 
ａ．抗体の調製
抗-Ａβポリクローナル抗体は、２群の動物から集めた血液から調製した。第１群は、６〜８週齢の100匹のメスのスイス ウェブスターマウスから成った。それらは、０、15および29日にCFA/IFAと合わせた100μgのAN1792で免疫感作した。４回目の注射は、1/2の用量のAN1792を36日に与えた。動物は42日の屠殺時に全採血し、血清を調製し、そして血清をプールして全部で64mlとした。第２群はPDAPPマウスと同系であるが、ヒトAPP遺伝子に関しては非トランスジェニックな24匹の６〜９週齢のメスから成った。それらは０、14、28および56日にCFA/IFAと合わせた100μgのAN1792で免疫感作した。これらの動物も63日の屠殺時に全採血し、血清を調製し、そして全14mlの血清をプールした。血清の２ロットをプールした。抗体画分は連続して２回の50％飽和硫酸アンモニウム沈殿を使用して精製した。最後の沈殿物をPBSに透析し、そしてエンドトキシンについて試験した。エンドトキシンのレベルは１EU/mgで未満あった。
【０３０４】
抗-Ａβモノクローナル抗体は腹水から調製した。流体は最初に濃硫酸デキストランナトリウムを氷冷腹水に氷上で撹拌しながら加えて脱脂して0.238％の最終濃度とした。濃CaCl2を次いで撹拌しながら加えて64mMの最終濃度とした。この溶液を10,×000gで遠心し、そしてペレットを捨てた。上清は等容量の飽和硫酸アンモニウムを滴下しながら氷上で撹拌した。溶液を再度10,×000gで遠心し、そして上清を捨てた。ペレットを再懸濁し、そして20mM Tris-HCl、0.4M NaCl、pH7.5に対して透析した。この画分をファルマシア（Pharmacia）FPLC Sepharose Ｑカラムに添加し、そして0.4Mから0.275M NaCl(20mM Tris-HCl、pH7.5中）の逆勾配から溶出した。
【０３０５】
抗体ピークは280nmの吸収により同定し、そして適切な画分をプールした。精製した抗体調製物はBCA法を使用してタンパク質濃度を、そしてSDS-PAGEを使用して純度を測定した。このプールもエンドトキシンについて試験した。エンドトキシンのレベルは１EU/mgで未満あった。力価は、100未満の力価を25の力価として任意に割り当てた。
【０３０６】
３．脳内のＡβおよびAPPレベル
種々の抗-Ａβ抗体調製物を用いた処置からおよそ６カ月後、塩類の潅流後に動物から脳を摘出した。１つの半球は免疫組織化学的分析のために調製し、そして２つ目はＡβおよびAPPレベルの定量に使用した。βアミロイドペプチドおよびアミロイド前駆体タンパク質（APP）の種々の形態の濃度を測定するために、半球を切開し、そして海馬、皮質および小脳領域のホモジネートを５M グアニジンで調製した。これらは連続的に希釈して、ELISA形式で一連の既知濃度のＡβペプチドまたはAPPの希釈物と比較することにより、アミロイドペプチドまたはAPPのレベルを定量した。
【０３０７】
ELISAにより測定した皮質および海馬のホモジネート中の全ＡβおよびＡβ1-42のレベル、ならびに小脳中の全Ａβのレベルを、それぞれ表１１、１２および１３に示す。PBSを接種した対照群の全Ａβの中央値濃度は、皮質よりも海馬で3.6倍高かった（皮質の17,818ng/gと比較して、海馬組織は63,389ng/gの中央値）。対照群の小脳中の中央値レベル（30.6ng/g組織）は、海馬中よりも2,000倍多かった。これらのレベルはこの月齢のヘテロ接合性PDAPPトランスジェニックマウスで我々が以前に報告した値と同様である（Johnson-Wood et al.,1997）。
【０３０８】
皮質については、１つの処置群が対照群とは有意に異なる（ｐ＜0.05）Ａβ1-42として測定されたＡβレベル中央値を有し、これらの動物は表１３に示すポリクローナル抗-Ａβ抗体を受容した。Ａβ1-42の中央値レベルは、この処置群に関する対照と比べて65％まで減少した。Ａβ1-42の中央値レベルは、１つのさらなる処置群において対照と比べて55％まで減少し、これらの動物はmAb 10D5を投与された（ｐ＝0.0433）。
【０３０９】
【表１３】
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【０３１０】
海馬では、ポリクローナル抗-Ａβ抗体を用いた処置に関連する全Ａβの減少パーセント中央値（50％、ｐ＝0.0055）は、皮質で観察された値よりも大きくなかった（65％）（表１４）。しかし、海馬での減少の絶対的規模は皮質のほぼ３倍大きく、正味の減少は海馬の31,683ng/g組織 対 皮質の11,658ng/g組織であった。全ＡβではなくＡβのよりアミロイド形成性状態のＡβ1-42のレベルとして測定した時、ポリクローナル抗体を用いて達成された減少が有意であった（ｐ＝0.0025）。mAb 10D5および266を用いて処置した群の
中央値レベルは、それぞれ33％および21％まで減少した。
【０３１１】
【表１４】
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【０３１２】
全Ａβは、小脳でも測定した（表１５）。ポリクローナル抗-Ａβおよび266抗体を投与したそれらの群は、有意な全Ａβレベルの減少を示し（それぞれ43％および46％、ｐ＝0.
0033およびｐ＝0.0184）、そして10D5で処置した群はほぼ有意な減少を示した（29％、ｐ＝0.0675）。
【０３１３】
【表１５】
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【０３１４】
APP濃度も、抗体-処置および対照、PBS-処置マウスに由来する皮質および小脳でELISAにより決定した。２つの異なるAPPアッセイを使用した。第１に、APP-α/FLと名付けたアッセイは、APP-アルファ（α、Ａβ配列内で開裂されたAPPからの分泌形)、およびAPPの完全長形態（FL）を認識し、一方２番目のアッセイはAPP-αのみを認識する。処置が関係するＡβの減少とは対照的に、処置群のサブセットでは、対照動物と比較してすべての処置においてAPPのレベルがほとんど変らなかった。これらの結果は、Ａβ抗体を用いた免疫感作が、APPを減らさずにＡβを減らすことを示している。
【０３１５】
まとめると、ＡβレベルはAN1792に対するポリクローナル抗体で処置した動物の皮質、海馬および小脳で有意に減少した。程度は低いがＡβ1-42のアミノ末端領域、特にアミノ酸1-16および13-28に対するモノクローナル抗体も有意な処置効果を示した。
【０３１６】
４．組織化学的分析：
PBS、ポリクローナルＡβ42、21F12、266および10D5処置群のマウスに由来する脳のサブセット中のＡβ-免疫応答性斑の形態を、Ａβ42を用いた標準的な免疫感作手順に従った以前の実験と定量的に比較した。
【０３１７】
アミロイド斑の程度および出現の両方において最大の変化は、ポリクローナルＡβ42抗体で免疫感作した動物で生じた。アミロイド負荷量の減少、衰退する斑の形態および細胞
性のＡβ免疫反応性は、標準的な免疫感作手順により生じた効果に極めて似ていた。これらの観察は、全ＡβおよびＡβ42の両方で有意な減少がポリクローナルＡβ42抗体の投与により達成されたELISAの結果を支持している。
【０３１８】
同様な定量的評価で、10D5群におけるアミロイド斑も数および外観が減少し、幾つかの細胞性Ａβ免疫反応性の証拠を示す。21F12および266群をPBS対照と比較した時、主要な差異は見られなかった。
【０３１９】
５．抗体力価の測定：
各群からの３つの無作為に選択したマウスのサブセットから、各腹腔内接種の直前に全部で30匹から採血した。抗体力価は一般材料および方法で詳細に記載しように、Ａβ1-42を被覆したプラスチック製のマルチ−ウェルプレートを使用したサンドイッチELISAでＡβ1-42結合抗体として測定した。各採血の平均力価は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体 10D5および21F12については、図１６〜１８にそれぞれ示す。ポリクローナル抗体調製物について、この期間にわたる力価は平均約1:1000を越え、そして10D5-および21F12-処置動物よりもこのレベルはわずかに高かった。
【０３２０】
６．リンパ球増殖応答：
Ａβ-依存的なリンパ球増殖を、最後の抗体注入から８日後に回収した脾細胞を使用して測定した。新しく回収した細胞（105／ウェル）を、５μMの刺激濃度のＡβ1-40の存在下で、５日間培養した。陽性対照として、さらなる細胞をＴ細胞マイトジェン（PHA）と培養し、そして陰性対照として、細胞はペプチドを加えずに培養した。
【０３２１】
種々の抗-Ａβ抗体で受動免疫感作した高齢のPDAPPマウスに由来する脾細胞は、インビトロでAN1792を用いて刺激し、そして増殖およびサイトカイン応答を測定した。これらのアッセイの目的は、受動免疫感作が抗原提示を可能にするかどうか、すなわちAN1792に特異的なＴ細胞応答をプライミング（priming）するかどうかを決定することであった。AN1792-特異的増殖またはサイトカイン応答が、抗-Ａβ抗体で受動免疫感作したマウスで観察された。
【０３２２】
Ｂ．実験２
第２実験では、抗体10D5による処置を繰り返し、そして２つのさらなる抗-Ａβ抗体、モノクローナル抗体3D6（Ａβ1-5）および16C11（Ａβ33-42）を試験した。対照群はPBSまたは無関係なアイソタイプが合った抗体（TM2a）のいずれかを受けた。マウスは以前の実験よりも老いており（11.5〜12月齢のヘテロ接合性）、それ以外は実験計画は同じであった。ここでも６カ月間の処置後に、10D5は斑の負荷量をPBSまたはアイソタイプが合った抗体対照のいずれに対しても80％以上減少させた（ｐ＝0.003）。Ａβに対する他の抗体の１つ、3D6は同等に効果的であり、86％の減少を生じた（ｐ＝0.003）。対照的に、ペプチドに対する第３抗体、16C11は斑の負荷量に効果を及ぼすことができなかった。同様な知見は、Ａβ42ELISA測定を用いて得られた。これらの結果は、Ａβペプチドに対する抗体応答がＴ細胞免疫の不存在下で、PDAPPマウスのアミロイド沈着を減少させるために十分であるが、すべての抗-Ａβ抗体に効力があるわけではないことを示している。Ａβのアミノ酸1-5または3-7を含んで成るエピトープに対する抗体が特に効力を有する。
【０３２３】
これらの実験は、受動的に投与されたＡβに対する抗体がアルツハイマー病のマウスモデルにおいて斑の沈着の程度を減少させることを示した。適度な血清濃度（25〜70μg/ml）に保持される時、抗体はβ-アミロイド斑を修飾する(decorate）ために十分なレベルでCNSへの接近を獲得した。CNSへ抗体が入ることは、PDAPPマウスでエバンス ブルー(Evans
Blue）により測定される脈管透過性が上昇しなかったので、血管−脳バリアの異常な漏れによるものではなかった。さらに、老いたPDAPPマウスの脳実質中の抗体濃度は非トラ
ンスジェニックマウスでの濃度と同じであり、血清中0.1％の抗体濃度を表した（アイソタイプに関係なく）。
【０３２４】
Ｃ．実験３：抗体結合のモニタリング
Ａβに対する抗体がCNS中で実際に作用できたのかどうかを決定するために、実施例XIIの終わりに塩類を潅流したマウスから摘出した脳を、末梢に投与した抗体の存在について調査した。非固定の凍結保持脳切片をマウス免疫グロブリン（ヤギ抗-マウスIgG-Cy3）に対する蛍光試薬に暴露した。10D5および3D6群の脳内の斑は、抗体により強く修飾され、一方16C11群には染色がなかった。完全な程度の斑の沈着を明らかにするために、各脳の連続切片を最初に抗-Ａβ抗体と免疫反応させ、そして次に２次試薬と反応させた。末梢投与後に10D5および3D6は、CNS内のほとんどの斑への接近を得た。斑の付加量は16C11群に比べてこのような処置群で大いに減少した。これらのデータは、末梢に投与した抗体がアミロイド除去を直接引き起こす（trigger）ことができる場所のCNSへ入ることができることを示す。16C11も斑に接近できるが、斑には結合できなかったらしい。
【０３２５】
XII．ヒト個体の予防および処置
ヒトでの安全性を決定するために、単回投与のフェイズI試験を行う。治療薬は効力が予想される約0.01のレベルから始めて、効果的なマウス投薬用量の約10倍のレベルに達するまで３の因子で増加させることにより、異なる患者に対して投薬用量を増して投与する。
【０３２６】
フェイズII試験は、治療効力を決定するために行う。アルツハイマーの可能性についてアルツハイマー病および関連障害随伴基準（ADRDA）を使用して定めた初期から中期アルツハイマー病の患者を選択する。適当な患者はミニ-精神-状態試験(MMSE)において12〜26点の範囲である。他の選択基準は、患者が試験期間中に生存し、そして妨害するかもしれない併用薬剤の使用といった複雑化する問題が無いことである。患者の機能の基準線評価は、MMSEおよびアルツハイマー病状態および機能を持つ患者を評価するための総合的尺度であるADASのような古典的な精神測定を使用して行う。このような精神的尺度はアルツハイマー症状の進行の測定を提供する。適当な定性的生活尺度も処置をモニタリングするために使用できる。疾患の進行はMRIによりモニタリングすることもできる。患者の血液プロフィールも、免疫原-特異的抗体およびＴ-細胞応答のアッセイを含め、モニタリングすることができる。
【０３２７】
基準線測定の後、患者は処置を受け始める。彼らは無作為化され、そして治療薬またはプラセボのいずれかを用いて盲検的様式で処置される。患者は少なくとも６カ月毎に監視される。効力はプラセボ群に対して処置群の進行における有意な減少により決定する。
【０３２８】
第２フェイズII試験は、非アルツハイマー病の初期の記憶喪失（時折、加齢による記憶障害（AAMI）とも呼ばれるが）、または軽度の認知障害（MCI）から、ADRDA基準により定められる恐らくはアルツハイマー病への転換を評価するために行う。アルツハイマー病への転換の高い危険性を持つ患者は、記憶喪失の初期の兆候または前−アルツハイマー病の総合的症状に付随する他の困難について参照群をスクリーニングすることにより非臨床的群から、アルツハイマー病の家系から、遺伝的危険因子、年齢、性別およびアルツハイマー病について高い危険性を示すことが分かっている他の特徴から選択する。MMSEおよびADASを含む適当な測定基準の基準線採点が、より正常な群を評価するために設計された他の測定基準と一緒に集められる。これらの患者群は適当な群に分割し、プラセボを薬剤を含む投与選択肢に対して比較する。これらの患者群は約６カ月の間隔で追跡され、そして各患者の終点は、彼または彼女が観察の終了時にADRDA基準により定められるアルツハイマー病の可能性を好転させているかどうかである。
【０３２９】
XIII．一般材料および方法
１．抗体力価の測定
マウスは尾の静脈に小さい傷を作ることにより採血し、そして約200μlの血液をミクロ遠心管に集めた。モルモットは最初に後膝領域の毛を剃り、18ゲイジ針を使用して中足骨静脈に傷をつけ、そして血液をミクロ遠心管に集めることにより採血した。血液は室温（RT）で１時間凝固させ、ボルテックス混合し、次いで14,000×gで10分間遠心して、血清から凝固物を分離した。次いで血清を清浄なミクロ遠心管に移し、そして滴定するまで４℃で保存した。
【０３３０】
抗体力価は、ELISAにより測定した。96-ウェルマイクロタイタープレート(コスター(Costar) EIAプレート）は、10μg/mlのＡβ42またはSAPPあるいは他の抗原のいずれかを含む100μlの溶液（ウェルコーティングバッファー:0.1M リン酸ナトリウム、pH8.5，0.1％アジ化ナトリウム)で個別の報告にそれぞれ記載されているように被覆し、そしてRTで一晩保持した。ウェルを吸引し、そして血清を検体希釈液（0.014M リン酸ナトリウム、pH7.4、0.15M NaCl、0.6％ウシ血清アルブミン、0.05％チメロサール）で1/100希釈から始めてウェル加えた。サンプルの３倍づつ７回の連続希釈物をプレートに直接作成して、最終的に1/218,700の希釈物を作成した。この希釈物を被覆したプレートウェル中でRTにて１時間インキューベーションした。次いでプレートを４回、0.05％Tween 20を含むPBSで洗浄した。２次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗-マウスIg（ベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim）から得た）をウェルに100μlの1/3000希釈物（検体希釈液中）として加え、そしてRTで１時間インキューベーションした。プレートを再度４回、PBS、Tween 20で洗浄した。色原体を発色させるために、100μlのSlow TMB（ピアスケミカルズから得た3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)を各ウェルに加え、そしてRTで15分間インキューベーションした。反応は25μlの２M H2SO4を添加することにより停止した。次に色の強度を、モレキュラー デバイスイズ(Molecular Devices)のVmaxで読んだ（450nm〜650nm）。
【０３３１】
力価は血清の相互の希釈として定め、最大ＯＤの1/2を与えた。最大ＯＤは、一般に大変高い力価の場合（この場合は、最大ＯＤを確立するために、より高い初期の希釈が必要であった）を除き最初の1/100希釈から取られた。50％点が２つの希釈の間に落ちたら、直線的外挿入を行って最終力価を算出した。幾何平均抗体力価を算出するために、100未満の力価は任意に25の力価に割り当てた。
【０３３２】
２．リンパ球増殖アッセイ
マウスにイソフルランで麻酔をかけた。脾臓を摘出し、そして10％熱−不活性化ウシ胎児血清を含む５mlのPBS（PBS-FBS）で２回洗浄し、そして50℃のCentriconユニット(ダコ社(Daco A/S)、デンマーク）中、1.5mlのPBS-FBSで10秒間、100rpmでMedimachine(ダコ）にて均質化し、続いて100ミクロン孔サイズのナイロンメッシュを通して濾過した。脾細胞を15mlのPBS-FBSで１回洗浄し、次いで200×gで５分間遠心することによりペレットとした。赤血球はペレットを５mLのバッファー(0.15M NH4Cl、１M KHCO3、0.1M NaEDTA、pH7.4を含む)中にRTで５分間、再懸濁することにより溶解した。次いで白血球は上記のように洗浄した。新しく単離した脾細胞（ウェルあたり105細胞)を、96-ウェルのU-底組織培養-処理マイクロタイタープレート（コーニング(Corning)、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）中、2.05mM L グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび10％熱−不活性化FBSを補充したRPMI1640培地（JHR バイオサイエンスイズ（Biosciences）、レネキサ、カンザス州）に３連で準備して、37℃で96時間培養した。種々のＡβペプチド、Ａβ1-16、Ａβ1-40、Ａβ1-42またはＡβ40-1逆配列タンパク質も、４段階で５〜0.18マイクロモルの範囲の用量で加えた。対照ウェル中の細胞は、タンパク質を加えずにコンカナバリンＡ(ConA)(シグマ(Sigma)、カタログ#C-5275、１マイクログラム／ml）で培養した。細胞は3H-チミジン（イリノイ州、アーリントンのアマーシャム社（Amersham Corp.
）から得た１μCi／ウェル）を最後の24時間適用した。次いで細胞をUniFilterプレート上に回収し、そしてTop Count Microplate シンチレーション カウンターでカウントした（パッカード ルンスツルメンツ(Packard Instruments)、ダウナーズ グローブ、イリノイ州)。結果は分あたりに不溶性高分子中に取り込まれた放射活性のカウントとして示す（cpm）。
【０３３３】
４．脳組織プレパレーション
麻酔後に脳を摘出し、そして１つの半球を免疫組織化学分析用に調製し、一方３つの脳領域（海馬、皮質および小脳）を別の半球から切開し、そして種々のＡβタンパク質およびAPP形態の濃度を特異的ELISAを用いて測定するために使用した（Johnson-Wood et al.、同上）。
【０３３４】
ELISA用の組織を10容量の氷-冷グアニジンバッファー(5.0M グアニジン-HCl、50mM Tris-HCl、pH8.0）中で均質化した。ホモジネートはAdams Nutator（フィッシャー:Fisher）を使用してRTにて３〜４時間、ゆるやかに撹拌しながら混合し、次いでＡβおよびAPPの定量前に−20℃で保存した。事前の実験では、被検体はこの保存条件下で安定であり、そして合成Ａβタンパク質（バッケム：Bachem）はマウスの同腹子に由来する対照脳組織のホモジネートに注射した（spiked）時、定量的に回収された（Johnson-Wood et al.、同上）。
【０３３５】
５．Ａβレベルの測定
脳のホモジネートを氷冷カゼイン希釈液（0.25％カゼイン、PBS、0.05％アジ化ナトリウム、20μg/ml アプロチニン、５mM EDTA pH8.0、10μg/ml ロイペプチン）で1:10に希釈し、そして16,000×gで４℃にて20分間遠心した。合成Ａβタンパク質標準（1-42アミノ酸）およびAPP標準は、最終組成物に0.5Mグアニジンおよび0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むように調製した。「全」ＡβサンドイッチELISAは、捕捉抗体としてＡβのアミノ酸13-28に特異的なモノクローナル抗体モノクローナル抗体266、レポーター抗体としてＡβのアミノ酸1-5に特異的なビオチン化モノクローナル抗体3D6（Johnson-Wood et al.）を利用する。3D6モノクローナル抗体は分泌されたAPPまたは完全長APPを認識せず、アミノ末端アスパラギン酸を含むＡβ種のみを検出する。このアッセイは〜50ng/ml（11nM)の感度の下限を有し、そして１ng/mlの濃度まで内因性のマウスＡβタンパク質との交差反応を示さない（Johnson-Wood et al.、同上）。
【０３３６】
Ａβ1-42特異的サンドイッチELISAは、捕捉抗体としてＡβのアミノ酸33-42に特異的なmＡβ21F12を利用する。このアッセイにも約125μg/ml（28μM、Johnson-Wood et al.)の感度の下限を有するビオチン化mＡβ3D6をレポーター抗体として使用する。ＡβELISAには、100μlのmＡβ266（10μg/mlで）またはmＡβ21F12（５μg/mlで）のいずれかを、RTで一晩インキューベーションすることにより96-ウェルのイムノアッセイプレート（コスター）に被覆した。溶液を吸引除去し、そしてウェルは200μlの0.25％ヒト血清アルブミンをPBSバッファーに少なくともRTで１時間、加えることによりブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、そしてプレートを使用するまで4℃で乾燥保存した。プレートは洗浄バッファー［Tris-緩衝化生理食塩水(0.15M NaCl、0.01M Tris-HCl、pH7.5)に0.05％Tween20を加えた］で使用前に再水和した。サンプルおよび標準をウェルあたり100μlの３連のアリコートで加え、そして次いで４℃で一晩インキューベーションした。プレートを少なくとも３回、アッセイの各工程間で洗浄バッファーを用いて洗浄した。カゼインアッセイバッファー（0.25％カゼイン、PBS、0.05％Tween 20、pH7.4）中に0.5μg/mlに希釈したビオチン化mＡβ 3D6を加え、そしてウェル中でRTにて１時間、インキューベーションした。カゼインアッセイバッファーで1:4000に希釈したアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合物（カリフォルニア州、バーリンガムのベクター(Vector)から得たアビジン−HRP）をウェルにRTで１時間加えた。比色基質、Slow TMB-ELISA（ピアス）を加え、
そしてRTで15分間反応させ、その後に酵素反応を25μlの2N H2SO4を加えることにより停止した。反応生成物はモレキュラー デバイスイズのＶmaxを、450nmおよび650nmの異なる吸収で測定することにより定量した。
【０３３７】
６．APPレベルの測定
２種類のAPPアッセイを利用した。第一は、APP-α/FLと呼ばれ、APP-アルファ(α）およびAPPの完全長(FL)形態の両方を認識する。第二アッセイは、APP-αに特異的である。APP-α/FLアッセイは、Ａβの最初の12アミノ酸を含む分泌したAPPを認識する。レポーター抗体(2H3)はα-クリップ-部位に特異的ではないので、APP695のアミノ酸612-613間で起こる（Esch et al.,Science 248,1122-1124(1990)；このアッセイは完全長APP(APP-FL)も認識する。脳のAPP-FLのホモジネートを消費させるために、APP-FLの細胞質テイルに固定化したAPP抗体を使用した予備実験では、APP-α/FLの約30〜40％がFLであることを示唆している(データは示さず）。APP-α/FLおよびAPP-αアッセイの両方のための捕捉抗体は、mAb 8E5であり、APP695形態のアミノ酸444〜592に対して生じた（Games et al.、同上）。APP-α/FLアッセイ用のレポーターmAbは、APP695のアミノ酸597〜608に特異的なmAb 2H3であり（Johnson-Wood et al.、同上）、そしてAPP-αアッセイ用のレポーター抗体は、APPのアミノ酸605〜611に対して生じたmAb 16H9のビオチン化誘導体である。APP-α/FLアッセイの感度の下限は約11ng/ml(150pM)であり(Johnson-Wood et al.)、そしてAPP-α特異的アッセイの下限は22ng/ml(0.3nM)である。両APPアッセイについて、mAb 8E5を96-ウェルEIAプレートのウェルにmAb 266について記載したように被覆した。精製した組換え分泌APP-αを、APP-αアッセイおよびAPP-α/FLアッセイの参照標準として使用した（Esch et al.,同上）。５M グアニジン中の脳のホモジネートサンプルを、ELISA検体希釈液（0.014M リン酸バッファー、pH7.4、0.6％ウシ血清アルブミン、0.05％チメロサール、0.5M NaCl、0.1％NP40）に1:10で希釈した。それらを次いで0.5M グアニジンを含有する検体希釈液で1:4に希釈した。希釈したホモジネートを次いで16,000×ｇでRTにて15秒間遠心した。APP標準およびサンプルを、プレートに２連のアリコートで加え、そしてRTで1.5時間インキューベーションした。ビオチン化レポーター抗体 2H3または16H9をサンプルとRTで１時間インキューベーションした。検体希釈液で１:1000に希釈したストレプトアビジン−アリカリホスファターゼ（ベーリンガー マンハイム:Boehringer Mannheim）を、ウェル中でRTで１時間インキューベーションした。蛍光基質、4-メチル-ウンベリフェリル-ホスフェートをRTで30分間インキューベーションに加え、そしてプレートをCytofluor tm 2350蛍光計(ミリポア:Millipore)で365nmの励起および450nmの発光で読んだ。
【０３３８】
７．免疫組織化学
脳は40Cで３日間、４％パラホルムアルデヒド（PBS中)で固定し、そして次に１〜７日間、４℃で１％パラホルムアルデヒド、PBS中に切開するまで保存した。40ミクロン厚の冠状面区分をビブラトーメ(vibratome)上でRTにて切断し、そして免疫組織化学処理前に、低温保護下（リン酸塩バッファー中の30％グリセロール、30％エチレングリコール）に−20℃で保存した。各脳について、背側海馬のレベルで連続する240μmの間隔により各々が分けられた６つの切片を、以下の1つの抗体と一晩インキューベーションした：(1)PBSおよび１％ウマ血清中に２μg/ml濃度に希釈されたビオチン化抗-Ａβ（mAb、3D6、ヒトＡβに特異的）；または(2)PBSおよび1.0％ウマ血清中に３μg/ml濃度に希釈された、ヒトAPPに特異的なビオチン化mAb 8E5；または(3）0.25％TritonX-100および１％ウマ血清（Tris-緩衝化生理食塩水、pH7.4（TBS）中）で1:500に希釈された、グリアの原線維性酸性タンパク質に特異的なmAb（GFAP;シグマケミカル社）；または(4)0.25％TritonX-100および１％ウサギ血清（TBS中）で1:100に希釈された、CD11b、MAC-1抗原に特異的なmAb；または(5)0.25％TritonX-100および１％ウサギ血清（TBS中）で1:100に希釈された、MHC II抗原に特異的なmAb(ファミンゲン)；または(6)PBS中の１％ウサギ血清で1:100に希釈された、CD43に特異的なmAb(ファミンゲン)または(7)PBS中の１％ウサギ血清で1:100に希釈された、CD45RAに特異的なラットmAb(ファミンゲン)；または(8)PBS中の１％ウサギ血清
で1:100に希釈された、CD45RBに特異的なラットモノクローナルＡβ(ファミンゲン)；または(9)PBS中の１％ウサギ血清で1:100に希釈された、CD45に特異的なラットモノクローナルＡβ(ファミンゲン)；または(10)PBS中の１％ウサギ血清で1:100に希釈された、CD3eに特異的なビオチン化ポリクローナルハムスターＡβ(ファミンゲン)または(11)PBS中の１％ウサギ血清で1:200に希釈された、CD3に特異的なラットmAb（セロテック；Serotec）；または(12)１％正常ウマ血清を含有する１次抗体を欠くPBS溶液。
【０３３９】
上記１、２および６〜１２に掲げた抗体溶液と反応させた切片は、1.0％TritonX-100、0.4％過酸化水素（PBS中）でRTにて20分間前処理し、内因性のペルオキシダーゼをブロックした。それらを次いで１次抗体と4℃で一晩インキューベーションした。3D6または8E5またはCD3e mAbと反応させた切片は、次いでRTで１時間、PBS中で1:75に希釈したキット成分“Ａ”および“Ｂ”を含む西洋ワサビペルオキシダーゼ−アビジン−ビオチン−複合体（Vector Elite Standard キット、ベクターラボズ(Vector Labs）、ベーリンガム、カリフォルニア州）と反応させた。CD45RA、CD45RB、CD45、CD3に特異的な抗体および１次抗体を含まないPBS溶液と反応した切片を、RTで１時間、PBSで1:75に希釈したビオチン化抗-ラットIgG(ベクター)と、またはPBSで1:75に希釈したビオチン化抗-マウスIgG(ベクター)と、それぞれインキューベーションした。切片を次いでRTで１時間、PBS中で1:75に希釈したキット成分“Ａ”および“Ｂ”を含む西洋ワサビペルオキシダーゼ-アビジン-ビオチン-複合体と反応させた（Vector Elite Standard キット、ベクターラボズ、ベーリンガム、カリフォルニア州）。
【０３４０】
切片はRTで0.01％過酸化水素、0.05％ 3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)中にて発色させた。GFAP-、MAC-1-およびMHCII-特異的抗体とのインキューベーションのための切片は、0.6％過酸化水素によりRTで前処理し、内因性のペルオキシダーゼをブロックし、そして１次抗体と共に４℃で一晩インキューベーションした。GFAP抗体と反応した切片を、RTで１時間、TBSで1:200に希釈したウマで作成したビオチン化抗-マウスIgG（ベクターラボラトリーズ；Vectastain Elite ABCキット）と反応させた。次いで切片を１時間、TBSで1:1000に希釈したアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体（ベクターラボラトリーズ；Vectastain Elite ABCキット）と反応させた。１次抗体としてMAC-1またはMHCII-特異的モノクローナル抗体とインキューベーションした切片は、続いてRTで１時間、TBSで1:200に希釈したウサギで作成したビオチン化抗-ラットIgGと反応させ、続いて１時間、TBSで1:1000に希釈したアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体とインキューベーションした。GFAP-、MAC-1-およびMHCII-特異的抗体とインキューベーションした切片は、次いでRTで0.05％DAB、0.01％過酸化水素、0.04％塩化ニッケル、TBSを用いて、それぞれ４および11分間処理することにより視覚化した。
【０３４１】
免疫標識した切片をスライドガラスに乗せ（VWR、Superfrostスライド）、一晩風乾し、Propar(アナテック:Anatech）に浸し、そしてマウンティング媒質としてPermount（フィッシャー）を使用してカバースリップをかぶせた。
【０３４２】
Ａβ斑をカウンター染色するために、GFAP-陽性切片のサブセットをSuperfrostスライドに乗せ、そして免疫組織化学的処理後に水性１％Thioflavin S(シグマ)中に７分間インキューベーションした。切片を次いで脱水し、そしてPropar中で清浄化し、そしてPermountを用いてカバースリップをかぶせた。
【０３４３】
８．画像分析
ニコン（Nikon) Microphot-FX 顕微鏡をCCDビデオカメラおよびソニー(Sony) Trinitronモニターに連結したVideometric 150 Image System（オンコール社（Oncor,Inc.)、ゲチスバーグ、メリーランド州）を、免疫反応スライドの定量に使用した。切片の画像はビデオ緩衝器に保存し、そして免疫標識された構造により占有される総ピクセル領域を選択し
、そして計算するために色-および飽和-に基づく閾値を決定した。各切片について、海馬は手で外形を書き、そして海馬により占有される総ピクセル領域を算出した。パーセントアミロイド負荷量は以下のように測定した：（mAb 3D6と免疫反応性のＡβ沈着を含む海馬領域の画分)×100。同様に、パーセント神経炎負荷量は以下のように測定した：（モノクローナル抗体 8E5と反応性のジストロフィー軸索を含む海馬領域の画分)×100。Simple
32 ソフトウェア アプリケーションプログラムを操作するC-Imaging System（コンピックス社（Compix,Inc)、クランベリータウンシップ、ペンシルベニア州）をニコンMicrophot-FX 顕微鏡に光学カメラを介して連結し、そしてGFAP-陽性星状細胞およびMAC-1-およびMHCII-陽性ミクログリアにより占有される夾板骨後皮質の割合を定量するために使用した。免疫反応した切片の画像は、ビデオ緩衝器に保存し、そして免疫標識した細胞により占有される総ピクセル領域を選択し、そして算出するためにモノクロムに基づく閾値を決定した。各切片について、夾板骨後皮質(RSC）を手で外形を描き、そしてRSCにより占有される総ピクセル領域を算出した。パーセント星状細胞増加症は、以下のように定めた：（GFAP-反応性星状細胞により占有されるRSCの画分）×100。同様に、パーセント小膠細胞症は、以下のように定めた：（MAC-1-またはMHCII-反応性ミクログリアにより占有されるRSCの画分）×100。すべての画像分析に関して、背側海馬のレベルで６つの切片（各々が連続する240μmの間隔で分かれている）を各動物について定量した。すべての場合で、動物の処置状況は観察者には知らされていない。
【０３４４】
XIV．アミロイド沈着に対する抗体の活性に関するエクスビボスクリーニングアッセイ
抗体の斑除去に及ぼす効果を調査するために、初代ミクログリア細胞をPDAPPマウスまたはヒトＡＤ脳の非固定の凍結保持切片と培養するエクスビボアッセイを樹立した。ミクログリア細胞は、新生児DBA/2Nマウス（１〜３日）の大脳皮質から得た。皮質は50μg/mlのDNaseI(シグマ(Sigma))を含むHBSS--（ハンクスバランス塩溶液、シグマ)中で機械的に切開した。解離した細胞を100μm細胞ステイナー(ファルコン:Falcon）で濾過し、そして1000rpmで５分間遠心した。ペレットを成長培地に再懸濁し（高グルコースDMEM、10％FBS、25ng/ml GM-CSF）、そして細胞をT-75プラスチック培養フラスコあたり２個の脳密度でまいた。７〜９日後、フラスコを軌道シェーカー上で200rpmにて、37℃で２時間回転させた。細胞懸濁液を1000rpmで遠心し、そしてアッセイ媒質中に再懸濁した。
【０３４５】
PDAPPマウスまたはヒトAD脳（死後間隔＜３時間）の10-μmの凍結保持切片を、ポリ-リシンを被覆したガラスカバースリップ上で解凍し、そして24ウェル組織培養プレート中に置いた。カバースリップは、H-SFM（ハイブリドーマ-無血清培地、ギブコ(Gibco)-BRL）、１％FBS、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび５ng/ml rmGM-CSF（Ｒ＆Ｄ）から成るアッセイ媒質で２回洗浄した。対照または抗-Ａβ抗体を２×濃度（最終５μg/ml）で１時間加えた。次いでミクログリア細胞を0.8×106細胞／mlアッセイ媒質の密度でまいた。培養は加湿インキュベーター（37℃、５％CO2）中で24時間以上維持した。インキューベーションの終わりに、カルチャーを４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして0.1％Triton-X100で透過した。切片をビオチン化3D6、続いてストレプトアビジン/Cy3結合物（ジャクソン イムノリサーチ）により染色した。外因性のミクログリア細胞を核染色により視覚化した（DAPI）。カルチャーを逆転蛍光顕微鏡（ニコン（Nicon）、TE300）で観察し、そして顕微鏡写真をSPOTソフトウェア（ダイアグノスティック インスツルメンツ(Diagnostic instruments）を使用して、SPOTデジタルカメラで取った。ウエスタンブロット分析に関しては、カルチャーを８M尿素で抽出し、還元トリシンサンプルバッファー中で1:1に希釈し、そして16％トリシンゲル（ノベックス(Novex））に乗せた。イモビロン（immobilon)上に移した後、ブロットを５μg/mlのpabＡβ42、続いてHRP-結合化抗-マウス抗体に暴露し、そしてECL(アマーシャム(Amersham)で現像した。
【０３４６】
アッセイを抗体16C11（インビボで効力の無い、Ａβに対する抗体の１つ）の存在下でPDAPP脳切片で行った時、β-アミロイド斑は完全なまま残り、そして食作用は観察されな
かった。対照的に、隣接する切片を10D5の存在下で培養した時、アミロイド沈着は大部分が無くなり、そしてミクログリア細胞はＡβを含有する多数の食作用小胞を示した。同一の結果がＡＤ脳切片でも得られた；10D5はＡＤ斑の食作用を誘導したが、16C11は効果的ではなかった。さらに、アッセイではマウスまたはヒトのミクログリアに細胞のいずれか、およびＡβに対するマウス、ウサギまたは霊長類の抗体で行った時に匹敵する結果を提供した。
【０３４７】
表１６は、Ａβに対する幾つかの抗体を用いて得られた結果を示し、受動輸送実験においてエクスビボアッセイで食作用を誘導し、そしてインビボの斑の負荷量を減少させる抗体の能力を比較する。16C11および21F12は凝集した合成Ａβペプチドに高い親和力で結合し、これらの抗体は非固定脳切片中のβ-アミロイド斑と反応することができず、エクスビボアッセイで食作用を引き出すことができず、そしてインビボで効力的ではなかった。Ａβに対する10D5、3D6およびポリクローナル抗体は、すべてのこれらの測定で活性であった。22C8抗体は、１および７位のアスパラギン酸がイソ-アスパラギン酸に置き換えられた自然なＡβの同族形態により強く結合する。これらの結果は、インビトロの効力がCNS中の斑の直接的な抗体が媒介する除去によることを示し、そしてエクスビボのアッセイがインビボの効力を予報することを示す。
【０３４８】
同じアッセイを使用して、NACと呼ばれるシヌクレインのフラグメントに対する抗体の除去を試験した。シヌクレインは、アミロイド斑に付随するタンパク質であることが示された。NACに対する抗体はアミロイド斑を含む脳組織サンプル、ミクログリア細胞と前のように接触させる。ウサギの血清を対照として使用した。続くモニタリングでは、抗体の除去活性を示す斑の数およびサイズの著しい減少を示した。
【０３４９】
【表１６】
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【０３５０】
共焦点顕微鏡を使用して、Ａβがエクスビボアッセイ中に内面化したことを確認した。対照抗体の存在下で、外因性ミクログリア細胞は、組織上の共焦点板に残り、Ａβを含む食作用小胞は無く、そして斑は切片内こ完全に残った。10D5の存在下で、ほとんどすべての斑材料が外因性ミクログリア細胞内の小胞に含まれた。内面化されたペプチドの運命を決定するために、10D5処理カルチャーを８M尿素で様々な時点で抽出し、そしてウエスタンブロット分析により調査した。１時間の時点で、食作用は未だに起こっていない時、Ａβに対するポリクローナル抗体との反応で強い４kDバンド（Ａβペプチドに対応する）が明らかとなった。Ａβ免疫反応性は、１日で減少し、そして３日までに無くなった。すな
わち抗体性のＡβの食作用はその分解を導く。
【０３５１】
エクスビボアッセイにおける食作用がFc-媒介であるかどうかを決定するために、抗-Ａβ抗体3D36のF(ab')2フラグメントを調製した。F(ab')2フラグメントはそれらが斑と反応するための完全な能力を保持するが、ミクログリア細胞による食作用を引き出す（trigger)ことができなかった。さらに全抗体での食作用は、マウスFcレセプターに対する試薬(抗-CD16/32)により遮断された。これらのデータは、Ａβのインビボ除去がFc-レセプターが媒介する食作用を通して起こることを示している。
【０３５２】
XV．抗体の血管脳バリアの通過
本明細書に記載するこの実験は、静脈内注射された後に抗体が脳を通る能力を提供し、そして正常またはPDAPPマウスの抹消組織へ静脈内注射された後に脳に送達された抗体の濃度を測定する手段を提供するために行った。
【０３５３】
PDAPPまたは対照正常マウスは、0.9％ NaClを潅流した。脳領域（海馬または皮質）を切開し、そして急速に冷凍した。脳は0.1％トライトン＋プロテアーゼインヒビター中で均質化した。免疫グロブリンが抽出物中でELISAにより検出された。捕捉試薬としてFab'2ヤギ抗-マウスIgGを、RIAプレート上に被覆した。血清または脳抽出物を１時間インキューベーションした。アイソタイプを抗-マウスIgG1-HRPまたはIgG2a-HRPまたはIgG2b-HRP（カルタグ:Caltag）で検出した。アイソタイプにかかわらず抗体はCNSに、血中に見られる濃度の1:1000で存在した。例えば、IgG1の濃度が血中のIgG2aの３倍である時、脳にもIgG2aの３倍で存在し、両方ともそれぞれの血中レベルの0.1％で存在する。この結果はトランスジェニックおよび非トランスジェニックマウスの両方で観察されるので、PDAPPで独自に血管脳バリアを漏れたのではなかった。
【０３５４】
前述の発明は理解を明確する目的で詳細に記載してきたが、特定の修飾が前記の特許請求の範囲内で実施できることは明らかである。本明細書に引用したすべての公報および特許明細書は、それぞれが個別に記載しているものと同じ程度で、すべての目的のためにそれらの全部を引用により本明細書に編入する。また、限定されるものではないが、本発明の主たる態様または特徴を以下に挙げる。
【０３５５】
態様１：患者においてアミロイド成分に対する免疫応答を誘導するのに有効な作用物質および製薬学的賦形剤を含んで成る製薬学的組成物。
【０３５６】
態様２：アミロイド成分が原線維ペプチドもしくはタンパク質である、態様１記載の製薬学的組成物。
【０３５７】
態様３：アミロイド成分が、血清アミロイドＡタンパク質（アポＳＳＡ）、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、アポＡＩ、トランスチレチン、リゾチーム、フィブローゲンα鎖、ゲルゾリン、シスタチンＣ、アミロイドβタンパク質前駆体（β−ＡＰＰ）、β2ミクログロブリン、プリオン前駆体タンパク質（ＰｒＰ）、心房性ナトリウム利尿因子、ケラチン、島アミロイドポリペプチド、ペプチドホルモンおよびシヌクレイン（これらの突然変異体タンパク質、タンパク質フラグメントおよびタンパク質分解ペプチドを包含する）より成るタンパク質もしくはペプチドより成る群から選択される原線維前駆体タンパク質由来である、態様２記載の製薬学的組成物。
【０３５８】
態様４：前記作用物質が、原線維前駆体タンパク質に関して、前記原線維タンパク質もしくはペプチドにより形成される新エピトープに対し向けられる免疫応答を誘導する、態様３記載の製薬学的組成物。
【０３５９】
態様５：前記アミロイド成分が、ＡＡ、ＡＬ、ＡＴＴＲ、ＡアポＡ１、Ａｌｙｓ、Ａｇｅｌ、Ａｃｙｓ、Ａβ、ＡＢ2Ｍ、ＡＳｃｒ、Ａｃａｌ、ＡＩＡＰＰおよびシヌクレイン−ＮＡＣフラグメントより成る群から選択される、態様３記載の製薬学的組成物。
【０３６０】
態様６：前記作用物質が、ＡＡ、ＡＬ、ＡＴＴＲ、ＡアポＡ１、Ａｇｅｌ、Ａｃｙｓ、Ａβ、ＡＢ2Ｍ、ＡＳｃｒ、Ａｃａｌ、ＡＩＡＰＰおよびシヌクレイン−ＮＡＣフラグメントより成る群から選択される、態様５記載の製薬学的組成物。
【０３６１】
態様７：前記組成物が、最低２種の異なるアミロイド成分に対する免疫原性の応答を誘導するのに有効な作用物質を含んで成る、態様１記載の製薬学的組成物。
【０３６２】
態様８：前記作用物質が担体タンパク質に連結されたペプチドである、態様１記載の製薬学的組成物。
【０３６３】
態様９：組成物がアジュバントを包含する、態様１ないし８のいずれかに記載の製薬学的組成物。
【０３６４】
態様１０：前記アジュバントが、ＱＳ２１、モノホスホリル脂質、明礬およびフロイントのアジュバントより成る群から選択される、態様９記載の製薬学的組成物。
【０３６５】
態様１１：哺乳動物被験体におけるアミロイド沈着を特徴とする障害に特徴的なアミロイド成分に対する免疫応答を生じさせるのに有効な投薬量の作用物質を該被験体に投与することを含んで成る、前記障害の予防もしくは治療方法。
【０３６６】
態様１２：前記アミロイド成分が原線維タンパク質もしくはペプチドである、態様１１記載の方法。
【０３６７】
態様１３：前記免疫応答が、血清アミロイドＡタンパク質（アポＳＳＡ）、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、アポＡＩ、トランスチレチン、リゾチーム、フィブローゲンα鎖、ゲルゾリン、シスタチンＣ、アミロイドβタンパク質前駆体（β−ＡＰＰ）、β2ミクログロブリン、プリオン前駆体タンパク質（ＰｒＰ）、心房性ナトリウム利尿因子、ケラチン、島アミロイドポリペプチド、ペプチドホルモンおよびシヌクレイン（これらの突然変異体タンパク質、タンパク質フラグメントもしくはペプチドを包含する）より成る群から選択される前駆体タンパク質由来の原線維成分に向けられる、態様１２記載の方法。
【０３６８】
態様１４：前記作用物質が、前記前駆体タンパク質に関して、前記アミロイド成分により形成される新エピトープに対し向けられる免疫応答を誘導する、態様１３記載の方法。
【０３６９】
態様１５：前記アミロイド成分が、ＡＡ、ＡＬ、ＡＴＴＲ、ＡアポＡ１、Ａｌｙｓ、Ａｇｅｌ、Ａｃｙｓ、Ａβ、ＡＢ2Ｍ、ＡＳｃｒ、Ａｃａｌ、ＡＩＡＰＰおよびシヌクレイン−ＮＡＣフラグメントより成る群から選択される、態様１３記載の方法。
【０３７０】
態様１６：前記作用物質が、ＡＡ、ＡＬ、ＡＴＴＲ、ＡアポＡ１、Ａｇｅｌ、Ａｃｙｓ、Ａβ、ＡＢ2Ｍ、ＡＳｃｒ、Ａｃａｌ、ＡＩＡＰＰおよびシヌクレイン−ＮＡＣフラグメントより成る群から選択される、態様１５記載の方法。
【０３７１】
態様１７：前記作用物質が、最低２種の異なるアミロイド成分に対する免疫原性の応答を誘導するのに有効である、態様１１記載の方法。
【０３７２】
態様１８：前記投与することが、最低２種のアミロイド原線維成分を投与することを包含する、態様１７記載の方法。
【０３７３】
態様１９：前記作用物質が担体タンパク質に連結されたペプチドである、態様１１記載の方法。
【０３７４】
態様２０：前記投与することがアジュバントをさらに包含する、態様１１−１９のいずれかに記載の方法。
【０３７５】
態様２１：前記アジュバントが、ＱＳ２１、モノホスホリル脂質、明礬およびフロイントのアジュバントより成る群から選択される、態様２０記載の方法。
【０３７６】
態様２２：前記免疫学的応答が、前記アミロイド成分に関して、最低１：１０００の血清力価を特徴とする、態様１１記載の方法。
【０３７７】
態様２３：前記血清力価が、前記原線維成分に関して最低１：５０００である、態様２２記載の方法。
【０３７８】
態様２４：前記免疫学的応答が、処理前の対照の血清サンプル中で測定された免疫反応性の血清レベルより約４倍より高いより大きいものに相当する免疫反応性の血清量を特徴とする、態様１１記載の方法。
【０３７９】
態様２５：前記免疫反応性の血清量が約１００倍の血清希釈物で測定される、態様２４記載の方法。
【０３８０】
態様２６：選択されたアミロイド成分に対する免疫反応性の患者の血清量を測定することを含んで成り、かつ、基準線対照レベルの血清の免疫反応性の最低４倍の免疫反応性の患者の血清量が、アミロイド障害に関して改善された状態の予後を示すものとする、アミロイド障害のための治療を受けている患者の予後の決定方法。
【０３８１】
態様２７：前記選択されたアミロイド成分に対する前記免疫反応性の患者の血清量が、最低約１：１０００の血清力価を特徴とする、態様２６記載の方法。
【０３８２】
態様２８：前記選択されたアミロイド成分に対する前記免疫反応性の患者の血清量が、最低１：５０００の血清力価を特徴とする、  態様２７記載の方法。
【０３８３】
態様２９：患者のアミロイド沈着物中に存在するアミロイド成分に特異的に結合する抗体もしくは抗体フラグメントの有効投薬量を患者に投与することを含んで成る、患者におけるアミロイド沈着物を特徴とする疾患の予防もしくは治療方法。
【０３８４】
態様３０：前記アミロイド成分が原線維成分である、態様２９記載の方法。
【０３８５】
態様３１：前記抗体もしくは抗体フラグメントが、前記原線維成分のエピトープに結合する、態様３０記載の方法。
【０３８６】
態様３２：抗体もしくは抗体フラグメントが、前記原線維成分の前駆体に結合することなく前記原線維成分に特異的に結合する、態様３１記載の方法。
【０３８７】
態様３３：抗体が、原線維成分のエピトープで免疫感作されたヒト由来のＢ細胞から調製された前記原線維成分に対するヒト抗体である、態様３０記載の方法。
【０３８８】
態様３４：前記アミロイド原線維成分が、血清アミロイドＡタンパク質（アポＳＳＡ）、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、アポＡＩ、トランスチレチン、リゾチーム、フィブローゲンα鎖、ゲルゾリン、シスタチンＣ、アミロイドβタンパク質前駆体（β−ＡＰＰ）、β2ミクログロブリン、プリオン前駆体タンパク質（ＰｒＰ）、心房性ナトリウム利尿因子、ケラチン、島アミロイドポリペプチド、ペプチドホルモンおよびシヌクレイン（これらの突然変異体タンパク質、タンパク質フラグメントもしくはペプチドを包含する）より成る群から選択される前駆体タンパク質由来である、態様３０記載の方法。
【０３８９】
態様３５：前記アミロイド原線維成分が、ＡＡ、ＡＬ、ＡＴＴＲ、ＡアポＡ１、Ａｌｙｓ、Ａｇｅｌ、Ａｃｙｓ、Ａβ、ＡＢ2Ｍ、ＡＳｃｒ、Ａｃａｌ、ＡＩＡＰＰおよびシヌクレイン−ＮＡＣフラグメントより成る群から選択される、態様３４記載の方法。
【０３９０】
態様３６：前記投与することが、最低２種のアミロイド原線維成分を結合する抗体を投与することを包含する、態様２９記載の方法。
【０３９１】
態様３７：前記有効投薬が、処理前の対照の血清サンプル中で測定された前記アミロイド成分に対する免疫反応性の血清レベルより最低約４倍より高い前記成分に対する免疫反応性の血清量の患者におけるレベルを特徴とする、態様２９記載の方法。
【０３９２】
態様３８：抗体もしくは抗体フラグメントが担体とともに製薬学的組成物として投与される、態様２９記載の方法。
【０３９３】
態様３９：抗体もしくは抗体フラグメントが、腹腔内に、経口で、皮下に、筋肉内に、鼻内に、局所に、もしくは静脈内に投与される、態様２９記載の方法。
【０３９４】
態様４０：抗体が、最低１種の抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを患者に投与することにより投与され、かつ、ポリヌクレオチドが患者中で発現されて抗体鎖を産生させる、態様２９記載の方法。
【０３９５】
態様４１：ポリヌクレオチドが抗体の重鎖および軽鎖をコードし、このポリヌクレオチドが患者中で発現されて重鎖および軽鎖を産生させる、態様４０記載の方法。
【０３９６】
態様４２：抗体もしくは抗体フラグメントが、最低６ヶ月の期間にわたって多数回投薬により投与される、態様２９記載の方法。
【０３９７】
態様４３：抗体が持続性放出組成物として投与される、態様２９記載の方法。
【０３９８】
態様４４：アミロイド沈着物中に存在するアミロイド成分に特異的に結合する、有効投薬量の抗体もしくは抗体フラグメントを含んで成る、患者における前記沈着物を特徴とする疾患の予防もしくは治療のための製薬学的組成物。
【０３９９】
態様４５：前記アミロイド成分が原線維成分である、態様４４記載の製薬学的組成物。
【０４００】
態様４６：前記抗体が前記原線維成分のエピトープに結合する、態様４５記載の製薬学的組成物。
【０４０１】
態様４７：抗体が、前記原線維成分の前駆体に結合することなく前記原線維成分に特異的に結合する、態様４６記載の製薬学的組成物。
【０４０２】
態様４８：抗体が、原線維成分のエピトープで免疫感作されたヒトからのＢ細胞から調製された前記原線維成分に対するヒト抗体である、態様４６記載の製薬学的組成物。
【０４０３】
態様４９：前記アミロイド原線維成分が、血清アミロイドＡタンパク質（アポＳＳＡ）、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、アポＡＩ、トランスチレチン、リゾチーム、フィブローゲンα鎖、ゲルゾリン、シスタチンＣ、アミロイドβタンパク質前駆体（β−ＡＰＰ）、β2ミクログロブリン、プリオン前駆体タンパク質（ＰｒＰ）、心房性ナトリウム利尿因子、ケラチン、島アミロイドポリペプチド、ペプチドホルモンおよびシヌクレイン（これらの突然変異体タンパク質、タンパク質フラグメントもしくはペプチドを包含する）より成る群から選択される前駆体タンパク質由来である、態様４５記載の製薬学的組成物。
【０４０４】
態様５０：前記アミロイド原線維成分が、ＡＡ、ＡＬ、ＡＴＴＲ、ＡアポＡ１、Ａｌｙｓ、Ａｇｅｌ、Ａｃｙｓ、Ａβ、ＡＢ2Ｍ、ＡＳｃｒ、Ａｃａｌ、ＡＩＡＰＰおよびシヌクレイン−ＮＡＣフラグメントより成る群から選択される、態様４９記載の製薬学的組成物。
【０４０５】
態様５１：前記組成物が、最低２種のアミロイド原線維成分を結合する抗体もしくは抗体フラグメントを包含する、態様４４記載の製薬学的組成物。
【０４０６】
態様５２：前記有効投薬量が、処理前の対照の血清サンプル中で測定された前記アミロイド成分に対する免疫反応性の血清レベルより最低約４倍より高い、前記成分に対する免疫反応性の患者血清中のレベルを生じさせるのに有効な抗体もしくは抗体フラグメントの量を特徴とする、態様４４記載の製薬学的組成物。
【０４０７】
態様５３：製薬学的組成物が担体を包含する、態様４４記載の製薬学的組成物。
【０４０８】
態様５４：製薬学的組成物が、腹腔内に、経口で、皮下に、筋肉内に、鼻内に、局所に、もしくは静脈内で投与のため処方される、態様４４記載の製薬学的組成物。
【０４０９】
態様５５：製薬学的組成物が、患者中で抗体鎖を発現するのに有効な最低１種の抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを包含する、態様４４記載の製薬学的組成物。
【０４１０】
態様５６：ポリヌクレオチドが抗体の重鎖および軽鎖をコードし、このポリヌクレオチドが患者中で重鎖および軽鎖を産生するための発現が可能である、態様５５記載の製薬学的組成物。
【０４１１】
態様５７：前記製薬学的組成物が持続性放出組成物として処方される、態様４４記載の製薬学的組成物。
【産業上の利用可能性】
【０４１２】
本発明は、患者におけるアミロイド成分の沈着物を特徴とする疾患の予防もしくは治療に有効であるため、例えば、医薬製造業において利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2012102131.tif 000035
【図１３】
2012102131.tif 000036
【図１４】
2012102131.tif 000037
【図１５Ａ】
2012102131.tif 000038
【図１５Ｂ】
2012102131.tif 000039
【図１５Ｃ】
2012102131.tif 000040
【図１５Ｄ】
2012102131.tif 000041
【図１５Ｅ】
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【図１６】
2012102131.tif 000043
【図１７】
2012102131.tif 000044
【図１８】
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【配列表】
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