(57)【要約】【課題】光ファイバー技術を応用して蛍光を確実に集光し、所望のアナライトを高精度に検出することができ、また励起光の共鳴角を制御することなく簡単に所望のアナライトの検出を行うことのできる光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置およびこれに用いられるプラズモン励起センサを提供すること。【解決手段】光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサであって、前記プラズモン励起センサは、内部に金属微粒子が分散された円柱状の誘電体部材からなるコア部と、前記コア部の外側に同心円状に設けられ、蛍光色素で標識されたアナライトを捕捉する反応層を内表面に有するクラッド部と、から少なくとも構成された光ファイバー構造であって、前記コア部の一方側端部に光源より励起光を照射し、前記金属微粒子の電場を増強させて前記反応層の蛍光色素を励起させ、これにより増強された蛍光を光検出手段で検出するよう構成されている。【選択図】図１
2012026924.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサであって、
前記プラズモン励起センサは、
内部に金属微粒子が分散された円柱状の誘電体部材からなるコア部と、
前記コア部の外側に同心円状に設けられ、蛍光色素で標識されたアナライトを捕捉する反応層を内表面に有するクラッド部と、
から少なくとも構成された光ファイバー構造であって、
前記コア部の一方側端部に光源より励起光を照射し、前記金属微粒子の電場を増強させて前記反応層の蛍光色素を励起させ、これにより増強された蛍光を光検出手段で検出するよう構成されていることを特徴とするプラズモン励起センサ。
【請求項２】
前記金属微粒子が、ナノワイヤーまたはナノコロイドであることを特徴とする請求項１に記載のプラズモン励起センサ。
【請求項３】
前記コア部と前記クラッド部との界面に隙間が形成されており、
前記隙間内に検体試料溶液が充填されるよう構成されていることを特徴とする請求項１または２に記載のプラズモン励起センサ。
【請求項４】
前記クラッド部の外側に、同心円状に被覆層が形成されていることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のプラズモン励起センサ。
【請求項５】
前記コア部および前記クラッド部の、励起光が照射される一方側端部に、ダイクロイックミラーが配設されていることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のプラズモン励起センサ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のプラズモン励起センサと、
前記プラズモン励起センサにおける前記コア部および前記クラッド部の、一方側端部に設けられ、励起光を照射する光源と、
前記コア部および前記クラッド部の、他方側端部に設けられ、前記増強された蛍光色素を検出する光検出手段と、
を少なくとも備えることを特徴とする光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づいた光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置およびこの光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、ナノメートルレベルなどの微細領域中で電子と光とが共鳴することにより、高い光出力を得る現象（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Surface Plasmon Resonance）現象）を応用し、例えば生体内の極微少なアナライトの検出を行うようにした表面プラズモン共鳴装置（以下ＳＰＲ装置とする）が用いられている。
【０００３】
このようなＳＰＲ装置１００は、図５に示したように、誘電体部材１０６の上面に金属薄膜１０２が形成されており、この金属薄膜１０２上に所定のリガンドを固定した固定層１０４が形成されている。
【０００４】
さらに、誘電体部材１０６の下方側には、金属薄膜１０２に向かって励起光１１０を照射する光源１０８を備え、さらに光源１０８から照射され、金属薄膜１０２で反射した金属薄膜反射光１１４を受光する受光手段１１２が備えられている。
【０００５】
そして、ＳＰＲ装置１００の使用において、固定層１０４に特定のアナライトを含んだ検体試料溶液を流し、この状態で誘電体部材１０６の下方より金属薄膜１０２に向かって励起光１１０を共鳴角１１６で照射し、さらに金属薄膜１０２に反射した金属薄膜反射光１１４を受光手段１１２で受光する。
【０００６】
なお、金属薄膜１０２に向かって共鳴角１１６で励起光１１０を照射すると、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）が生じ、この際、励起光１１０と金属薄膜１０２中の電子振動とがカップリングして、金属薄膜反射光１１４の光量減少が生ずる。
【０００７】
この現象は、アナライトの有無によって共鳴角１１６が変わってくるため、アナライトを含まない試料溶液を固定層１０４に流したときの共鳴角１１６を予め調べておけば、共鳴角１１６が異なった場合に所定のアナライトを有すると判断できることとなる。これにより、所定のアナライトが検体試料溶液中に含有されているか否かを知ることができる。
【０００８】
一方、このような表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を応用した表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づき、ＳＰＲ装置１００よりもさらに高精度にアナライト検出を行えるようにした表面プラズモン増強蛍光測定装置（以下、ＳＰＦＳ装置２００とする）も開発されている（例えば特許文献１，２）。
【０００９】
このようなＳＰＦＳ装置２００は、図６に示したように、まず誘電体部材２０６の上面に金属薄膜２０２が形成されており、さらにこの金属薄膜２０２上に、蛍光色素で標識されたアナライトを捕捉する反応層２０４が形成されたプラズモン励起センサ２１８を備えている。
【００１０】
そして、プラズモン励起センサ２１８の誘電体部材２０６側には、金属薄膜２０２に向かって励起光２１０を照射する光源２０８と、光源２０８から照射され金属薄膜２０２で反射した金属薄膜反射光２１４を受光する受光手段２１２が設けられている。
【００１１】
一方、プラズモン励起センサ２１８の反応層２０４側には、反応層２０４で捕捉されたアナライトを標識した蛍光色素が発する蛍光２２０を受光する光検出手段２２２が設けられている。
【００１２】
なお、反応層２０４と光検出手段２２２との間には、蛍光２２０を効率よく集光するための集光部材２２４と、蛍光２２０以外に含まれる光を除去し、必要な蛍光２２０のみを選択する波長選択機能部材２２６が設けられている。
【００１３】
そして、ＳＰＦＳ装置２００の使用においては、金属薄膜２０２上に、あらかじめ蛍光色素で標識されたアナライトが捕捉された反応層２０４を形成しておき、この状態で光源２０８より誘電体部材２０６内に励起光２１０を照射し、この励起光２１０が共鳴角２１６で金属薄膜２０２に入射することで、金属薄膜２０２上に粗密波（表面プラズモン）を生ずるようになっている。
【００１４】
なお、金属薄膜２０２上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光２１０と金属薄膜２０２中の電子振動とがカップリングし、金属薄膜反射光２１４の光量減少が生ずるため、受光手段２１２で受光される金属薄膜反射光２１４のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ、粗密波（表面プラズモン）が生ずる共鳴角２１６を得ることができる。
【００１５】
そして、この粗密波（表面プラズモン）を生ずる現象により、金属薄膜２０２上の反応層２０４の蛍光色素が効率良く励起され、これにより蛍光色素が発する蛍光２２０の光量が増大することとなる。
【００１６】
この増大した蛍光２２０を、集光部材２２４および波長選択機能部材２２６を介して光検出手段２２２で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができるようになっている。
【００１７】
近年、ＳＰＲ装置１００やＳＰＦＳ装置２００の更なる精度向上に向けた技術開発が盛んに行われている。
例えば、ＳＰＲ装置１００においては、光ファイバー技術を応用し、入射角度を変化させる機構、または様々な角度成分を含む光源を含み、誘電体部材（プリズム）を用いる必要が無く、小型で簡易としたＳＰＲ装置１００が開示されている（例えば、特許文献３〜５）。
【００１８】
また、微粒子を光ファイバー表面に結合させ、共鳴角シフト構造が不要で、誘電体部材（プリズム）を用いる必要が無く、小型で簡易な構造で微量成分の検出が可能な局在プラズモンセンサ技術も開示されている（例えば、特許文献６）。
【００１９】
このような光ファイバー技術を応用した光ファイバー型ＳＰＲ装置３００は、図７に示したように、励起光３１０の伝送部分であり誘電体部材３０６から成るコア部３１８と、励起光３１０を全反射させるとともに励起光３１０が外部に漏れ出すことを防止するクラッド部３２０と、からなる２重構造の光ファイバー３２２を備えている。
【００２０】
そして、光ファイバー３２２の一方側端部は、コア部３１８が露出されており、このコア部３１８の外表面に金属薄膜３０２が設けられ、さらにその外側には、特定のリガンドを固定する固定層３０４が形成されている。
【００２１】
そして、光ファイバー３２２の他方側端部には、コア部３１８に励起光３１０を照射するための光源３０８が設けられ、一方側端部には、金属薄膜３０２に反射した金属薄膜反射光３１４を受光する受光手段３１２が設けられている。
【００２２】
このような光ファイバー型ＳＰＲ装置３００の使用においては、まず固定層３０４に所定のアナライトを含有した検体試料溶液を流して、固定層３０４で所定のアナライトを捕捉する。
【００２３】
そしてこの状態で、コア部３１８の誘電体部材３０６に励起光３１０を共鳴角３１６で照射し、コア部３１８の外側の金属薄膜３０２に反射した金属薄膜反射光３１４を受光手段３１２で受光することで、検体試料溶液中にアナライトが含有されているか否かを知ることができるようになっている。
【００２４】
そして、光ファイバー型ＳＰＲ装置３００と同じように、光ファイバー技術を応用した光ファイバー型ＳＰＦＳ装置の開発も望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】特許第３２９４６０５号公報
【特許文献２】特開２００６−２０８０６９号公報
【特許文献３】特許第２９３８９７３号公報
【特許文献４】特許第３２３１６７５号公報
【特許文献５】特許第３５９２０６５号公報
【特許文献６】特開２００５−１８１２９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
しかしながら、ＳＰＦＳ装置は、ＳＰＲ装置とは測定方法が全く異なるため、光ファイバー技術を応用することが困難である。
ＳＰＲ装置においては、基本的に共鳴角、すなわち金属薄膜から反射されずに局在場光となった成分が最大となる角度を求めることで、アナライトの誘電率と存在量の変化を測定できる。
【００２７】
光ファイバー型ＳＰＲ装置においては、一方の側端部から種々の角度で入射された光がコア部を通って反対側の側端面に設置された受光手段に到達する透過光量変化を測定することで、同様に共鳴角を測定することが可能であり、原理的にＡＴＲ（全反射減衰）に近い。
【００２８】
また図７に示した光ファイバー型ＳＰＲ装置３００のように、誘電体部材３０６の外表面に金属薄膜３０２が形成された構造を、ＳＰＦＳ装置に適用させた場合、アナライト検出の際に発生する蛍光を検出するための光検出手段が光ファイバーの外側に必要であり、光ファイバーの特徴である小型で簡易なシステムにはならない。
【００２９】
さらに、微粒子を用いた局在プラズモンセンサでは、伝搬光から局在場光への変換効率が上がらないため感度が上がらないことが知られている。
また、光ファイバー型ＳＰＲ装置３００においては、コア部３１８の誘電体部材３０６中に励起光３１０を照射する際、共鳴角３１６とするための角度制御が必要であるが、この制御は非常に困難であり、改善が求められていた。
【００３０】
本発明はこのような現状に鑑みなされたものであって、光ファイバー技術を応用して蛍光を確実に集光し、所望のアナライトを高精度に検出することができる光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置およびこれに用いられるプラズモン励起センサを提供することを目的とする。
【００３１】
また本発明は、励起光の共鳴角を制御することなく簡単に所望のアナライトの検出を行うことのできる光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置およびこれに用いられるプラズモン励起センサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
本発明は、前述したような従来技術における問題点を解決するために発明されたものであって、
本発明のプラズモン励起センサは、
光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置に用いられるプラズモン励起センサであって、
前記プラズモン励起センサは、
内部に金属微粒子が分散された円柱状の誘電体部材からなるコア部と、
前記コア部の外側に同心円状に設けられ、蛍光色素で標識されたアナライトを捕捉する反応層を内表面に有するクラッド部と、
から少なくとも構成された光ファイバー構造であって、
前記コア部の一方側端部に光源より励起光を照射し、前記金属微粒子の電場を増強させて前記反応層の蛍光色素を励起させ、これにより増強された蛍光を光検出手段で検出するよう構成されていることを特徴とする。
【００３３】
このように構成すれば、励起光がプラズモン励起センサの外に漏れ出すことがないため、励起光の利用効率が高く、Ｓ／Ｎ比を向上させて、高精度にアナライトの検出を行うことができる。
【００３４】
また、上記センサ構造において金属微粒子が実質的に導通するような近接した状態であり、かつ光の透過性を確保する構造にすることで通常の局在プラズモンセンサと同様に入射角度制御は不要であり、一方で金属微粒子を伝わりながら、金属微粒子の界面で電場増強が生じるため、局在プラズモンでは達成できない局在場光の伝搬が可能な光の通り道（コア）と、センシングした蛍光の通り道（クラッド）を分離することができる。さらにコア内で光路長も長く取れるため、光の利用効率も著しく高くできる。
【００３５】
このため、励起光の共鳴角を見つける必要がなく、簡単な構造で高感度に所望のアナライト検出を行うことができる。
さらに、このような構成であれば、金型で一体的に樹脂成形が可能であるため、製造が容易であり、製造コストを抑えることができる。
【００３６】
また、本発明のプラズモン励起センサは、
前記金属微粒子が、ナノワイヤーまたはナノコロイドであることを特徴とする。
このようにナノワイヤーまたはナノコロイドであれば、コア部材に励起光を照射した際に、光の透過を妨げることがないため、確実にナノワイヤーまたはナノコロイドの表面で表面プラズモンを生じ、蛍光を励起させて所望のアナライト検出を行うことができる。
【００３７】
中でも特にナノワイヤーであれば、誘電体部材中でナノワイヤーが長さ方向に重なり、かつ金属粒子密度あたりの透過率を高く保てるため、表面プラズモンを確実に生じさせることができる。
【００３８】
また、本発明のプラズモン励起センサは、
前記コア部とクラッド部との界面に隙間が形成されており、
前記隙間内に検体試料溶液が充填されるよう構成されていることを特徴とする。
【００３９】
このようにコア部とクラッド部の界面の隙間に検体試料溶液が充填されるようにすれば、この隙間が流路の替わりとなるため、特に流路を形成する必要がなく、製造が容易である。
【００４０】
また、本発明のプラズモン励起センサは、
前記クラッド部の外側に、同心円状に被覆層が形成されていることを特徴とする。
このようにクラッド部の外側に被覆層が設けられていれば、反応層で生じた蛍光以外のノイズ成分を防止することができるため、所望のアナライト検出を高精度に行うことができる。
【００４１】
また、本発明のプラズモン励起センサは、
前記コア部およびクラッド部の励起光が照射される一方側端部に、ダイクロイックミラーが配設されていることを特徴とする。
【００４２】
このようにダイクロイックミラーが設けられていれば、反応層で生じた蛍光が光源側に戻ってしまうことを防止できるため、確実に蛍光を検出して所望のアナライト検出を高精度に行うことができる。
【００４３】
また、本発明の光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置は、
上記のいずれかに記載のプラズモン励起センサと、
前記プラズモン励起センサにおける前記コア部およびクラッド部の一方側端部に設けられ、励起光を照射する光源と、
前記コア部およびクラッド部の他方側端部に設けられ、前記増強された蛍光色素を検出する光検出手段と、
を少なくとも備えることを特徴とする。
【００４４】
このような光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置であれば、上記したプラズモン励起センサにより、光源より励起光を照射する際の角度制御が不要であり、また光の利用効率が高く、Ｓ／Ｎ比を向上させて、高精度に所望のアナライト検出を行うことができる。
【発明の効果】
【００４５】
本発明によれば、光ファイバー技術を応用するとともに、励起光の邪魔にならないよう、コア部材中に金属微粒子を含有させ、この金属微粒子に表面プラズモンを生じさせて反応層の蛍光を増強させるようにしたので、蛍光を確実に集光し、所望のアナライトを高精度に検出することができる光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置およびこれに用いられるプラズモン励起センサを提供することができる。
【００４６】
また、励起光の共鳴角を制御することなく簡単に所望のアナライトの検出を行うことのできる光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置およびこれに用いられるプラズモン励起センサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、本発明の光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定（ＳＰＦＳ）装置の実施例における概略図である。
【図２】図２は、図１に示した光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定（ＳＰＦＳ）装置におけるプラズモン励起センサのＡ−Ａ線による断面図である。
【図３】図３は、本発明の光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定（ＳＰＦＳ）装置の他の実施例における概略図である。
【図４】図４は、図３に示した光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定（ＳＰＦＳ）装置におけるプラズモン励起センサのＢ−Ｂ線による断面図である。
【図５】図５は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置の基本的な構造を示した概略図である。
【図６】図６は、表面プラズモン増強蛍光測定（ＳＰＦＳ）装置の基本的な構造を示した概略図である。
【図７】図７は、光ファイバー型表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置の基本的な構造を示した概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
以下、本発明の実施の形態について、図面に基づいてより詳細に説明する。
図１は、本発明の光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置の実施例における概略図、図２は、図１に示した光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置におけるプラズモン励起センサのＡ−Ａ線による断面図である。
【００４９】
本発明の光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置およびこれに用いられるプラズモン励起センサは、光ファイバー技術を応用して蛍光を確実に集光し、所望のアナライトを高精度に検出することができ、また励起光の共鳴角を制御することなく簡単に所望のアナライトの検出を行うことのできるものである。
【００５０】
＜光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定（ＳＰＦＳ）装置１０＞
図１に示したように、本発明の光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置（以下、光ファイバー型ＳＰＦＳ装置とする）１０は、まず金属微粒子１２が分散された円柱状の誘電体部材１６からなるコア部３８と、このコア部３８の外側に同心円状に設けられ、内表面に蛍光色素を担持したアナライトを捕捉するための反応層１４を有するクラッド部４０と、から少なくとも構成された光ファイバー構造のプラズモン励起センサ１８を有している。
【００５１】
ここでコア部３８を構成する誘電体部材１６の材質としては、光学的に透明な各種の無機物，天然ポリマー，合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性，製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むことが好ましい。
【００５２】
また、この誘電体部材１６中に分散される金属微粒子１２としては、ナノワイヤーまたはナノコロイドを用いることが好ましい。
中でもナノワイヤーは、誘電体部材１６中で長さ方向に重なるため、表面プラズモンを確実に生じさせるのに好適である。
【００５３】
ここでナノコロイドの粒子径としては２０〜５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
一方、ナノワイヤーの長辺長さとしては１〜１００μｍの範囲内であることが好ましく、また短辺長さとしては１０〜５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。なお、長辺と短辺のアスペクト比については５〜１００の範囲内であることが好ましい。
【００５４】
さらにこのような金属微粒子１２の材質としては、プラズモンを発生する金属、好ましくは金，銀，アルミニウム，銅，および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは銀からなり、さらにこれら金属の合金から成ることである。上記した金属は、酸化に対して安定であり、かつ粗密波（表面プラズモン）による電場増強が大きくなることから金属微粒子１２に好適である。
【００５５】
また、誘電体部材１６中に金属微粒子１２を分散させたコア部３８を製造する方法としては、例えば誘電体部材１６の原料である樹脂材を溶融し、ここに金属微粒子１２を入れて混ぜ合わせ金型で成形すれば良い。
【００５６】
一方、クラッド部４０は、コア部３８を構成する誘電体部材１６の屈折率よりも低く設定されていること以外は、基本的に同じ材質を用いることができ、プラスチック材料としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレートなどのポリエステル類、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン、環状オレフィン系樹脂などのポリオレフィン類、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなどのビニル系樹脂、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリサルホン（ＰＳＦ）、ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）などを用いることができる。
【００５７】
無機材料としては、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）等を用いることができる。
また、化学的安定性，製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）が好ましく、取り扱い易さおよびコストの点から、ポリエチレンテレフタレート、アクリル樹脂、トリアセチルセルロースを含むことが好ましい。
【００５８】
このようなクラッド部４０は、管状のクラッド部４０を成形しておき、この内表面に反応層１４を設けることで簡単に製造が可能である。
そしてこのクラッド部４０内に、コア部３８を挿入することで、図２に示したようにコア部３８に対してクラッド部４０が同心円状に配設されたプラズモン励起センサ１８が得られる。
【００５９】
なお、このときコア部３８とクラッド部４０との間は、隙間３４が生ずるようになっており、両部の位置決めについては、別途位置決め用の部材（図示せず）を設けて固定したり、コア部３８の両端部にフランジ部（図示せず）を形成し、このフランジ部とクラッド部４０とを接続するようにするなど、如何なる固定方法であっても良いものである。
【００６０】
ここでコア部３８とクラッド部４０との間に設けられた隙間３４は、後述するように流路としての役割をなし、ここに所望のアナライトを含んだ検体試料溶液が充填されることで、反応層１４のリガンドにアナライトが捕捉されるようになっている。
【００６１】
ここで検体試料溶液に用いられる検体としては、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液，唾液，便，体腔液（髄液，腹水，胸水等）などが挙げられる。
また、検体試料溶液中に含有されるアナライトは、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー，シグナル伝達物質，ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【００６２】
さらにアナライトを標識させるために用いられる蛍光色素としては、所定の励起光２０を照射するか、または電界効果を利用することで励起し、蛍光２６を発する物質であれば、特に限定されない。なお本明細書でいう蛍光２６とは、燐光など各種の発光も含まれるものである。
【００６３】
本発明において蛍光色素は、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する機能をなすものである。ここで、「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
【００６４】
このような蛍光色素は、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであっても良い。一般に、単色比色計（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ）よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。
【００６５】
蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられる。
【００６６】
さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。
【００６７】
これらのファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。
【００６８】
【表１】
2012026924.tif 000003
また蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えばＥｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も本発明に用いられ得る。
【００６９】
希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ3+が挙げられる。
【００７０】
そしてこのようなプラズモン励起センサ１８の一方側端部には、コア部３８内に励起光２０を照射するための光源２２が設けられている。
光源２２から照射される励起光２０としてはレーザ光が好ましく、波長２００〜９００ｎｍ、０．００１〜１，０００ｍＷのＬＤレーザ、または波長２３０〜８００ｎｍ、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザが好適である。
【００７１】
一方、プラズモン励起センサ１８の他方側端部には、反応層１４で増強された蛍光色素が発する蛍光２６を検出する光検出手段２８が設けられている。
なお、光検出手段２８に入力された情報を処理するためのコンピュータ（図示せず）などを有することも可能である。
【００７２】
このようにして構成される光ファイバー型ＳＰＦＳ装置１０は、その使用において、まず所定のリガンドが固定された反応層１４を有するプラズモン励起センサ１８を用意する。
【００７３】
そして、プラズモン励起センサ１８のコア部３８とクラッド部４０との間に設けられた隙間３４内に、所望のアナライトを含んだ検体試料溶液を充填し、反応層１４のリガンドにアナライトが捕捉されるようにする。次いで捕捉されたアナライトを付着させて蛍光標識するようにする。
【００７４】
なお、リガンドにアナライトが捕捉される際に、アナライトが蛍光色素で標識されていれば、１回で反応層１４に、蛍光色素で標識されたアナライトが捕捉されることとなる。
そして、プラズモン励起センサ１８の一方側端部に励起光２０を照射するための光源２２を配設するとともに、他方側端部に反応層１４で生じた蛍光２６を検出するための光検出手段２８を配設し、光ファイバー型ＳＰＦＳ装置１０の準備がなされる。
【００７５】
この状態において、コア部３８の一方側端部に光源２２より励起光２０を照射すると、コア部３８の誘電体部材１６中の金属微粒子１２表面で表面プラズモンが生じ、これにより反応層１４のアナライトに捕捉された蛍光２６が励起されて、蛍光２６の光が増大される。
【００７６】
なお、光ファイバー型ＳＰＲ装置３００では、光源３０８より照射される励起光３１０を共鳴角３１６で照射する必要があったが、本発明の光ファイバー型ＳＰＦＳ装置１０では、局在プラズモンの構造であるため、励起光２０を共鳴角で入射する必要がなく、作業手順が少なく取り扱いが容易である。
【００７７】
そして、この増大された蛍光２６を、光検出手段２８で検出することにより、所望のアナライト検出ができる。
なお、蛍光２６検出の際には、コア部３８の他方側端部にマスク３０を配設することで、蛍光２６のみを検出できるようすることが好ましい。
【００７８】
また、反応層１４の外側に同心円状に被覆層３２を形成しておけば、蛍光２６以外の光がノイズとなって光検出手段２８で検出されてしまうことを極力防止することができる。
さらに、プラズモン励起センサ１８の一方側端部にダイクロイックミラー３６を設ければ、反応層１４で生じた蛍光２６が光源２２側に戻ってしまうことを防止できる。
【００７９】
このように、本発明の光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定装置１０およびこれに用いられるプラズモン励起センサ１８は、上記したように光ファイバー技術を応用するとともに、励起光２０の邪魔にならないよう、コア部材３８中に金属微粒子１２を含有させ、この金属微粒子１２に表面プラズモンを生じさせて反応層１４の蛍光２６を増強させるようにしたので、蛍光２６を確実に集光し、所望のアナライトを高精度に検出することができる。
【００８０】
また、励起光２０の共鳴角を制御することなく簡単に所望のアナライトの検出を行うことができる。
次に、図３および図４に示した光ファイバー型ＳＰＦＳ装置１０は、本発明の第２の実施例における概略図である。
【００８１】
図３および図４に示した光ファイバー型ＳＰＦＳ装置１０は図１および図２に示した第１の実施例の光ファイバー型ＳＰＦＳ装置１０と基本的には同じ構成であるので、同じ構成部材には同じ参照番号を付してその詳細な説明を省略する。
【００８２】
図３および図４に示した光ファイバー型ＳＰＦＳ装置１０は、コア部３８とクラッド部４０との間に隙間３４を生じさせる替りに、コア部３８とクラッド部４０との境界面に流路４２が形成されている点で、実施例１と異なっている。
【００８３】
このような構成を有するプラズモン励起センサ１８は、コア部３８とクラッド部４０との境界面に設けられた流路４２以外の箇所は接触して固定されているため、両部を固定する部材が必要なく製造も容易である。
【００８４】
なおこの場合には、コア部３８である誘電体部材１６を、例えばプラスチック材料をガラス転移点以上の温度で流動化するか有機溶剤を加えて溶解させた後、金属ナノワイヤーを加えて混錬させて均一に分散させた後、円筒上の金型あるいは枠で成形してコア部３８を作製する。
【００８５】
別途中空で流路の入口、出口を有し、かつコア部３８との接合部を有する誘電体材料の成形物を製造し、コア部３８と端面で接続することで本発明のプラズモン励起センサ１８を製造できる。
【実施例】
【００８６】
＜銀ナノワイヤーの製造例＞
非特許文献１（Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２００２，１４，８３３〜８３７）に記載の方法を参考に、還元剤としてエチレングリコール（ＥＧ）を、形態制御剤兼保護コロイド剤としてポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：ＰＶＰ：平均分子量１３０万、アルドリッチ社製）を使用し、かつ核形成工程と粒子成長工程とを分離して粒子形成を行い、銀ナノワイヤー分散液を調製した。
【００８７】
＜核形成工程＞
反応容器内で１６０℃に保持したＥＧ液１００ｍｌを攪拌しながら、硝酸銀のＥＧ溶液（硝酸銀濃度：１．０モル／ｌ）２．０ｍｌを、一定の流量で１分間かけて添加した。
【００８８】
その後、１６０℃で１０分間保持しながら銀イオンを還元して銀の核粒子を形成した。続いて、ＰＶＰのＥＧ溶液（ＰＶＰ濃度：３．０×１０-1モル／ｌ）１０．０ｍｌを一定の流量で１０分間かけて添加した。
【００８９】
＜粒子成長工程＞
上記核形成工程を終了した後の核粒子を含む反応液を、攪拌しながら１６０℃に保持し、硝酸銀のＥＧ溶液（硝酸銀濃度：１．０×１０-1モル／ｌ）１００ｍｌと、ＰＶＰのＥＧ溶液（ＰＶＰ濃度：３．０×１０-1モル／ｌ）１００ｍｌを、ダブルジェット法を用いて一定の流量で１２０分間かけて添加した。
【００９０】
粒子成長工程において、３０分毎に反応液を採取して電子顕微鏡で確認したところ、核形成工程で形成された核粒子が、時間経過に伴ってワイヤー状の形態に成長しており、粒子成長工程における新たな微粒子の生成は認められなかった。
【００９１】
最終的に得られた銀ナノワイヤーについて、電子顕微鏡写真を撮影し、３００個の銀ナノワイヤー粒子像の短軸方向および長軸方向の粒径を測定して算術平均を求めた。短軸方向の平均粒径は１５０ｎｍ、長軸方向の平均長さは7０μｍであった。
【００９２】
＜脱塩水洗工程＞
上記粒子形成工程を終了した反応液を室温まで冷却した後、分画分子量０．２μｍの限外濾過膜を用いて脱塩水洗処理を施すとともに、溶媒をエタノールに置換した。最後に液量を１００ｍｌまで濃縮して銀ナノワイヤーのＥｔＯＨ分散液を調製した。
【００９３】
この銀ナノワイヤーＥｔＯＨ分散液とウレタンアクリレート（ＰＲ−２０２：三菱化成社製、屈折率１．５８）の２５％メチルイソブチルケトン溶液を銀ナノワイヤーの濃度が１％になるように混合して分散液を作製した。
【００９４】
＜コア部（３８）の製造例＞
上記銀ナノワイヤーの分散液を、直径が５ｍｍで長さが３０ｃｍの円筒状ステンレス製容器の一方に蓋をして流し込み、容器を立てて８０℃の乾燥器に一昼夜入れて溶剤を除去し、銀ナノワイヤーを含有したプラスチック性のコア部（３８）を成形した。
【００９５】
＜クラッド部（４０）の製造例＞
ＰＭＭＡ（三菱レーヨン社製アクリペット、屈折率１．４９）を内径６ｍｍ、外形７ｍｍで端面にコア部（３８）との接続部を有し、長さが５ｃｍである円筒を成型し、流路の入口、出口の穴を加工した。
【００９６】
＜光ファイバー型ＳＰＦＳ装置（１０）の製造例＞
前記コア部（３８）とクラッド部（４０）を組み合わせ、一方の端面の接続部をプラスチック部材で封止して固定し、さらに他方の端面にダイクロイックミラー（３６）を設け、光源（２２）と光検出手段（２８）を接続して本発明の光ファイバー型ＳＰＦＳ装置（１０）を作製した。
【００９７】
＜一次抗体の固定化＞
１．４ｍｇ／ｍｌ抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（６Ｄ２、ミクリ免疫研究所（株）製）を１時間流路内に循環させて一次抗体を物理吸着で固定した。
【００９８】
＜標識二次抗体の作製＞
「ＦＩＴＣ」標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体の調製
抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（６Ｄ２、２．５ｍｇ／ｍｌ、ミクリ免疫研究所（株）製）を、市販のＦＩＴＣ７ラベリングキットにより調製した。
【００９９】
［光ファイバー型ＳＰＦＳ装置（１０）による測定例］
表２に示したＡＦＰの所定量を３０分間流した後、標識二次抗体を３０分流した後バッファーで洗浄置換を行い、信号測定を行った。
一方、ＡＦＰを含まず測定した信号をブランクとした。
【０１００】
【表２】
2012026924.tif 000004
【０１０１】
［ＬＰＦＳ（局在プラズモン）装置による測定例］
粒径４０ｎｍのコロイド金（田中貴金属社製）溶液１０ｇにポリビニルアルコールＰＶＡ１１７（クラレ社製）２ｇ、硬化剤トリアジン０．１ｇを加えた後、透明ガラス基板上に塗布し８０℃で乾燥して局在プラズモンセンサ基板を作成した。
【０１０２】
この基板に流路を付し、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（信越シリコーン社製）を用いて１次抗体をアミンカップリングで固定化し、表３に示したＡＦＰの所定量を流して反応させた後洗浄し、更に標識２次抗体と反応させ、その後洗浄を行った。偏光板を通して垂直に６３０ｎｍのＬＤで露光し、カットフィルターを付してフォトマルチプライヤで検出を行った。
一方、ＡＦＰを含まず測定した信号をブランクとした。
【０１０３】
【表３】
2012026924.tif 000005
【０１０４】
以上のように、本発明の光ファイバー型ＳＰＦＳ装置１０は励起光の入射角度調整をすることなく、簡易で小型の有益なバイオセンサであること、また表２および表３の結果から、例えばＬＰＦＳ（局在プラズモン）装置に比べても高感度であり高精度検出可能なバイオセンサであることが確認された。
【０１０５】
また更に、本発明の光ファイバー型ＳＰＦＳ装置１０は、従来のＳＰＦＳ装置のように励起光が近赤外程度の波長域で、高屈折率ガラスを使用しないと測定のダイナミックレンジを確保できないといった制約がなく、設計の自由度が向上できるものである。
【０１０６】
以上、本発明における光ファイバー型ＳＰＦＳ装置１０およびこれに用いられるプラズモン励起センサ１８の好ましい形態について説明したが、本発明は上記の形態に限定されるものではなく、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能なものである。
【符号の説明】
【０１０７】
１０・・・光ファイバー型表面プラズモン増強蛍光測定（ＳＰＦＳ）装置
１２・・・金属微粒子
１４・・・反応層
１６・・・誘電体部材
１８・・・プラズモン励起センサ
２０・・・励起光
２２・・・光源
２６・・・蛍光
２８・・・光検出手段
３０・・・マスク
３２・・・被覆層
３４・・・隙間
３６・・・ダイクロイックミラー
３８・・・コア部
４０・・・クラッド部
４２・・・流路
１００・・・表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置
１０２・・・金属薄膜
１０４・・・固定層
１０６・・・誘電体部材
１０８・・・光源
１１０・・・励起光
１１２・・・受光手段
１１４・・・金属薄膜反射光
１１６・・・共鳴角
２００・・・表面プラズモン増強蛍光測定（ＳＰＦＳ）装置
２０２・・・金属薄膜
２０４・・・反応層
２０６・・・誘電体部材
２０８・・・光源
２１０・・・励起光
２１２・・・受光手段
２１４・・・金属薄膜反射光
２１６・・・共鳴角
２１８・・・プラズモン励起センサ
２２０・・・蛍光
２２２・・・光検出手段
２２４・・・集光部材
２２６・・・波長選択機能部材
３００・・・光ファイバー型表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置
３０２・・・金属薄膜
３０４・・・固定層
３０６・・・誘電体部材
３０８・・・光源
３１０・・・励起光
３１２・・・受光手段
３１４・・・反射光
３１６・・・共鳴角
３１８・・・コア部
３２０・・・クラッド部
３２２・・・光ファイバー
【図１】
2012026924.tif 000006
【図２】
2012026924.tif 000007
【図３】
2012026924.tif 000008
【図４】
2012026924.tif 000009
【図５】
2012026924.tif 000010
【図６】
2012026924.tif 000011
【図７】
2012026924.tif 000012