(57)【要約】【課題】本発明は炎症性眼表面疾患の予防ないし治療剤の提供を目的とする。【解決手段】チオレドキシンスーパーファミリーのポリペプチドを有効成分とする炎症性眼表面疾患の予防ないし治療剤を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトチオレドキシンを除くチオレドキシンスーパーファミリーのポリペプチドを有効成分とする炎症性眼表面疾患の予防ないし治療剤。
【請求項２】
前記炎症性眼表面疾患が、慢性炎症眼又は急性炎症眼である請求の範囲第１項に記載の予防ないし治療剤。
【請求項３】
前記慢性炎症眼が、Stevens-Johnson症候群、眼類天疱瘡、熱・化学外傷、特発性幹細胞欠乏症、外胚葉形成異常、難治性角結膜上皮症からなる群より選択されるいずれか一つである請求の範囲第２項に記載の予防ないし治療剤。
【請求項４】
前記急性炎症眼が、熱・化学外傷、角膜感染症、周辺部角膜潰瘍、モーレン潰瘍、角膜外傷、角膜フリクテン、角膜手術後からなる群より選択されるいずれか一つである請求の範囲第２項に記載の予防ないし治療剤。
【請求項５】
目薬、ゲル又は軟膏の形状であり、薬学的に許容される賦形剤も含有する請求の範囲第１項乃至第４項いずれかに記載の予防ないし治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は炎症性眼表面疾患の予防ないし治療剤に関し、詳しくはチオレドキシンスーパーファミリーに属するポリペプチド類（以下、「ＴＲＸｓ」と略記する）を有効成分とする炎症性眼表面疾患の予防ないし治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
眼表面における炎症反応を抑制するため実用化されている薬物としては、ステロイド系と、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）に分かれるが、いずれも大きな問題をかかえている。
ステロイド系点眼剤は、消炎作用が非常に強力な反面、重篤な副作用が多発することが欠点であり、副作用として感染症の増悪、感染症誘発、創傷治癒の遅延、白内障、緑内障、下垂体、副腎系機能抑制などが起こる。
また、投薬を中止すると投薬前より炎症が増悪するリバウンド現象が起こることも大きな欠点である（特許文献１）。
非ステロイド系抗炎症剤は、ステロイドほど多彩で重篤な副作用はないが、効力が物足りないことが大きな欠点である。又、何れのＮＳＡＩＤｓも角膜上皮に対する細胞毒性を有しており、点眼等の方法により局所使用を行うと上皮欠損という副作用を生ずる恐れがある。これらはプロスタグランジン産生を抑制することで消炎作用を発揮する。
従って、炎症性疾患誘発の引き金をひくリンパ球のはたらきを抑制しないので、対症療法にとどまり根本的な治療につながらないことも欠点である（特許文献２）。
以上より、これら難治性の炎症性眼表面疾患（例えばStevens-Johnson症候群）に対し、効果が高く副作用の少ない予防ないし治療剤の開発が強く望まれていた。
【０００３】
一方、チオレドキシン（Thioredoxin；ＴＲＸ）は、その活性部位配列：−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−：の２つのシステイン残基間でのジスルフィド／ジチオール交換反応による酸化還元（レドックス）活性を有する１２ｋＤａの多機能ペプチドである（非特許文献１）。チオレドキシンは、リボヌクレオチドリダクターゼに対する水素イオン供与体、デオキシリボヌクレオチドの合成に重要な酵素として大腸菌から単離されて以来、多くの原核生物、真核生物から単離同定されてきた。
成人Ｔ細胞白血病誘導因子（ＡＤＦ）は、本発明者らがＨＴＬＶ−１に感染したＴリンパ球によって産生されるＩＬ−２受容体誘導因子として最初に同定したもので、ヒトチオレドキシンである。細胞内チオレドキシンはラジカル消去や、activator protein−1や、nuclear factor−κＢなどのレドックスに関する転写因子の制御に重要な役割を果たしている（非特許文献２）。
ヒトチオレドキシンは、p38 mitogen activating protein kinase（ＭＡＰＫ）やapoptosis signal regulating kinase−1（ＡＳＫ−１）のシグナル伝達を制御する。
チオレドキシンが細胞外に放出され、サイトカインまたはケモカイン作用を示すこと（非特許文献３）、更には細胞外ＴＲＸが細胞内へ移行すること（非特許文献４）が本発明者らによって報告されてきた。
しかしながら、ＴＲＸｓと炎症性眼表面疾患との関連性、並びにＴＲＸｓの眼表面における炎症抑制作用、即ち、炎症性眼表面疾患の予防ないし治療薬としての作用効果については、未だ報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−０９２３８３号公報
【特許文献２】特開平０９−２９５９３５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Redox regulation of cellular activation Ann.Rev.Immunol.1997;15:351-369
【非特許文献２】AP-1 transcriptional activity is regulated by a direct association between thioredoxin and Ref-1 PNAS.1997;94:3633-3638
【非特許文献３】Circulating thioredoxin suppresses lipopolysaccharide-induced neutrophil chemotaxis PNAS.2001; 98: 15143-15148
【非特許文献４】Redox-sensing release of thioredoxin from T lymphocytes with negative feedback loops J.Immunol.2004;172:442-448
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、炎症性眼表面疾患に対して効果が高く、副作用の少ない予防ないし治療剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らはＴＲＸｓの新たな作用、即ち、眼表面における炎症抑制作用を解明し、炎症性眼表面疾患の予防ないし治療剤として有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、請求項１にかかる発明は、ヒトチオレドキシンを除くチオレドキシンスーパーファミリーのポリペプチドを有効成分とする炎症性眼表面疾患の予防ないし治療剤に関する。
請求項２にかかる発明は、前記炎症性眼表面疾患が、慢性炎症眼又は急性炎症眼である請求の範囲第１項に記載の予防ないし治療剤に関する。
請求項３にかかる発明は、前記慢性炎症眼が、Stevens-Johnson症候群、眼類天疱瘡、熱・化学外傷、特発性幹細胞欠乏症、外胚葉形成異常、難治性角結膜上皮症からなる群より選択されるいずれか一つである請求の範囲第２項に記載の予防ないし治療剤に関する。
請求項４にかかる発明は、前記急性炎症眼が、熱・化学外傷、角膜感染症、周辺部角膜潰瘍、モーレン潰瘍、角膜外傷、角膜フリクテン、角膜手術後からなる群より選択されるいずれか一つである請求の範囲第２項に記載の予防ないし治療剤に関する。
請求項５にかかる発明は、目薬、ゲル又は軟膏の形状であり、薬学的に許容される賦形剤も含有する請求の範囲第１項乃至第４項いずれかに記載の予防ないし治療剤に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るチオレドキシンスーパーファミリーのポリペプチドを有効成分とする予防ないし治療剤は眼表面における炎症を強く抑制することから炎症性眼表面疾患に対し有効である。
本発明によれば体内でも発現する内因性のチオールタンパクであるチオレドキシンを有効成分とする為、副作用の心配がない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】高濃度のＴＲＸが確認できた涙液サンプルについてのウエスタン・ブロッティング法による検討結果を示す。
【図２】正常の角膜上皮層における免疫組織染色による染色像である。
【図３】高濃度のＴＲＸが確認できた涙液サンプルについての免疫組織染色法による実験結果を示す。
【図４】高濃度のＴＲＸが確認できた涙液サンプルについての免疫組織染色法による実験結果を示す。
【図５】リアルタイムＰＣＲ（real time PCR）法によって、ＴＲＸ添加によりＩＬ−６／β-actin及びＩＬ−８／β-actinのｍＲＮＡの発現亢進が抑制されたことを示した結果である。
【図６】ＴＵＮＥＬ染色によって、ＴＲＸ添加によるアポトーシス抑制効果を証明した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において、ヒトチオレドキシン（ｈＴＲＸ）とは、配列番号１に示される１０５個のアミノ酸からなるポリペプチドを指す。
【００１２】
本発明のＴＲＸｓはヒトチオレドキシン以外に「チオレドキシンスーパーファミリー」に属するものであればよく、その活性中心に−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を有するポリペプチド類を有するものが例示される。
これらの中でも活性中心に配列−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を有するチオレドキシン又はチオレドキシン２（ミトコンドリア特異的チオレドキシン）が好ましい。
【００１３】
本発明のチオレドキシン誘導体は配列番号１のヒトチオレドキシンをもとにして公知の遺伝子工学的手法により誘導体を製造することができる。
該誘導体は配列番号１の３２位と３５位以外、好ましくは３２位〜３５位以外のアミノ酸の１又は複数個、好ましくは１又は数個が置換、欠失、付加、挿入され、且つ、眼疾患の炎症抑制活性を有するものである。
尚、配列番号２は、配列番号１の核酸配列を表す。
【００１４】
本発明に係る予防ないし治療剤の塗布方法は、特に限定されるものではなく臨床医により適宜選択される。
本発明に係る予防ないし治療剤は、目薬、ゲル又は軟膏の形状であり薬学的に許容される賦形剤も含有する局所投与用の剤形のものが好ましい。
【００１５】
本発明に係る予防ないし治療剤が適用される炎症性眼表面疾患として、特に限定されるものではないが、眼感染症（例えば角膜ヘルペス、細菌性角膜炎、細菌性結膜炎、真菌性角膜炎、アカントアメーバ角膜炎、感染性眼内炎、感染性角膜潰瘍等）、角膜外傷、角膜手術後、瘢痕性角結膜疾患（例えば、アルカリ腐食角結膜炎、Stevens-Johnson症候群、眼類天疱瘡など）、角膜潰瘍（例えば、モーレン潰瘍、慢性関節リウマチや膠原病に続発する角膜潰瘍、テリエン角膜変性、カタル性角膜潰瘍、感染性角膜潰瘍など）、ビタミンＡ欠乏による角膜 軟化症、壊死性角膜炎、神経麻痺性角膜炎、糖尿病性角膜症、乾性角結膜炎、コンタクトレンズ装着時の角結膜炎、春季カタル、結膜アレルギー、ぶどう膜炎、ベーチェット病、白内障術後炎症及び偽翼状片など様々な眼炎症性疾患を例示することができる。
特に、角結膜における炎症性疾患（例えば、Stevens-Johnson症候群、眼類天疱瘡、熱・化学外傷、角膜ヘルペス、細菌性角膜炎、細菌性結膜炎、真菌性角膜炎、アカントアメーバ角膜炎、角膜外傷、アルカリ腐食角結膜炎、角膜潰瘍、ビタミンＡ欠乏による角膜軟化症、壊死性角膜炎、神経麻痺性角膜炎、糖尿病性角膜症、乾性角結膜炎、コンタクトレンズ装着時の角結膜炎、春季カタル、結膜アレルギー等）の予防、治療に有用である。
また角膜潰瘍（上記種々の角膜潰瘍及びそれ以外の原因に起因する角膜潰瘍も含む）、特に感染性角膜潰瘍の予防、治療にも有用である。
【００１６】
本発明の予防ないし治療剤は有効成分であるチオレドキシンを単独又は通常使用される担体と共に塗布することもできる。
該担体としては、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、吸収促進剤、保湿剤、吸着剤、滑沢剤、充填剤、増量剤、付湿剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節する塩、緩衝剤等の希釈剤又は賦形剤を例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。
【００１７】
本発明の予防ないし治療剤が液剤、乳剤、懸濁剤等の眼注射剤として調製される場合、これらは殺菌され且つ涙液と等張であるのが好ましく、これらの形態に成形するに際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用できる。
尚、この場合、等張性の溶液を調整するに充分な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを本発明薬剤中に含有させてもよい。
また、通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。
【００１８】
本発明の予防ないし治療剤が液状製剤である場合は、凍結保存または凍結乾燥等により水分を除去して保存してもよい。
凍結乾燥製剤は、使用時に注射用蒸留水等を加え、再度溶解して使用される。
さらに、本発明に係る予防ないし治療剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤等や他の医薬品を含有させて調製することもできる。
【００１９】
ＴＲＸファミリーに属するポリペプチドの有効量は、当業者が従来の技術を参考に容易に決定することができるが、例えば１回あたり、０．００１ｍｇ−０．１ｇ程度、好ましくは０．０１−１０ｍｇ程度、より好ましくは０．１−１０ｍｇ程度である。
これを１日あたり１回又は数回に分けて塗布等することができるが、各種製剤の形態、患者の性別、年齢、疾患の程度に合わせて適宜調節することが好ましい。
【００２０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
眼表面疾患を有する４０眼を対象とし、炎症の有無や性質により非炎症眼（腫瘍性疾患など７眼）、急性炎症眼（熱・化学外傷、感染症など１２眼）、慢性炎症眼（Stevens-Johnson症候群など１８眼）の、熱・化学外傷後などの持続性炎症（３眼）の４グループに分類した。
対照には眼疾患を有さない３３眼を用いた。
詳細は以下の表１のとおりである。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
〔１．涙液の採取方法〕
前記各グループから涙液サンプルを、１μＬ ディスポーザブルタイプのキャピラリー・マイクロピペッタ（Microcaps, Drummond Scientific Co., USA）を用いてスリット・ランプ観測下で直接、局部麻酔なしで採取した。
眼球刺激を最小限にすべく、薄暗いライトを使用し、瞼縁に接触せず、非刺激性に眼表面から涙液採取を行った。
涙液サンプル収集に際し、要した時間は片眼あたり数十秒（１分以内）で行った。
本研究において採取された全涙液サンプルは必要最小限度量である１μＬ以上である。
全涙液サンプルは、直に前記ガラスキャピラリー・マイクロピペッタ添付のスモールポンプを使用して、直接、微量遠心機用チューブに入れ遠心した。
尚、以下の検討を行う迄、涙液サンプルは−８０℃の冷凍庫（サンヨー社製）に保管した。
【００２４】
〔２．ＥＬＩＳＡ法による検討〕
前記７３眼からの涙液（〔表１〕における眼表面疾患を有する４０眼、並びに対照として眼疾患を有さない３３眼）について、涙液中のＴＲＸをＥＬＩＳＡ法にて定量した。
ＥＬＩＳＡ法は、チオレドキシンＥＬＩＳＡキット（ELISA kit for human thioredoxin）（レドックス・バイオサイエンス社製）を用い、添付のプロトコールに従った。
各検体について少なくとも３回、測定を行い、測定値は平均値±標準誤差（ＳＤ）で示した。測定値の統計的解析は、ダンカン法（Duncan's test）で行った。
その結果、涙液中のＴＲＸ発現量は、非炎症眼 １７１．９±１２１．３（ｎｇ／ｍＬ, 平均±ＳＤ）、急性炎症眼 ７１５．２±３７１．９（ｎｇ／ｍＬ, 平均±ＳＤ）、慢性炎症眼 ２８１６．２±１９２３．１（ｎｇ／ｍＬ, 平均±ＳＤ）、熱、化学外傷後の持続性炎症 ５９４３．１±２５２０．８（ｎｇ／ｍＬ, 平均±ＳＤ）、正常眼 １６４．３±１０４．８ ｉｎ ｂａｓａｌ ｔｅａｒｓ(Ｎ＝２２) ８０．８±５１．４（ｎｇ／ｍＬ, 平均±ＳＤ）ｉｎ ｒｅｆｌｅｘ ｔｅａｒｓ（ｎｇ／ｍＬ, 平均±ＳＤ）であり、慢性持続炎症眼で著しく高濃度のＴＲＸを検出した（表２）。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
〔３．ウェスタンブロット法〕
前記高濃度のＴＲＸが確認できた涙液、即ち、Ｎｏ．３８３、Ｎｏ．３７６、Ｎｏ．３７７、Ｎｏ．３７５について、ウェスタンブロット法による検討を行った（図１）。
使用する抗体としては、抗ヒトチオレドキシンモノクローナル抗体（レドックス・バイオサイエンス社製）を０．５μｇ／ｍＬ用い、定法に従った。
サンプルは左から、ポジティブ・コントロールとして、ＴＲＸ蛋白１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬを、涙液サンプルとして、Ｎｏ．３８３、Ｎｏ．３７６、Ｎｏ．３７７、Ｎｏ．３７５の検体をそれぞれアプライした。
Ｎｏ．３８３は、眼類天疱瘡（Ocular pemphigoid）の涙液サンプルで、ＥＬＩＳＡ法による定量において、ＴＲＸの蛋白濃度は２４１１．７ｎｇ／ｍｌ（涙液サンプル２μＬ中、４．８ｎｇのＴＲＸ蛋白）であった。
Ｎｏ．３７６は、熱外傷後（Thermal burn）の涙液サンプルで、ＥＬＩＳＡ法による定量において、ＴＲＸの蛋白濃度は１１２０．４ｎｇ／ｍｌ（涙液サンプル４μＬ中、４．５ｎｇのＴＲＸ蛋白）であった。
Ｎｏ．３７７は、眼類天疱瘡（Ocular pemphigoid）の涙液サンプルで、ＥＬＩＳＡ法による定量において、ＴＲＸの蛋白濃度は２２２１．９ｎｇ／ｍｌ（涙液サンプル２μＬ中、４．４ｎｇのＴＲＸ蛋白）であった。
Ｎｏ．３７５は、眼類天疱瘡（Ocular pemphigoid）の涙液サンプルで、ＥＬＩＳＡ法による定量において、ＴＲＸの蛋白濃度は７４９９．６ｎｇ／ｍｌ（涙液サンプル１μＬ中、７．５ｎｇのＴＲＸ蛋白）であった。
ウェスタンブロット法による検討の結果、ＴＲＸのバンドがはっきりと確認でき（図１）、前記ＥＬＩＳＡ法による定量結果と合致する結果を得ることができた。
【００２７】
〔４．免疫組織染色法〕
免疫組織染色法による検討を行った。
免疫組織染色法による実験条件は以下のとおりである。
・反応条件
固定液 ：ザンボニ液 ４℃ ５分
洗浄 ： ＰＢＳ ５分 ３回
ブロッキング： １％ ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳ、 室温 ２０分
一次抗体 ：抗ヒトチオレドキシンモノクローナル抗体（レドックス・バイオ
サイエンス社製）を１．０ｇ／ｍＬ（３０００倍希釈）
１％ ＢＳＡに希釈、室温、１時間
洗浄 ：ＰＢＳ ５分 ３回
二次抗体 ：Alexa Fluor 488 goat Anti mouse IgG 1μg/mL（２０００倍希釈）
Invitogen Corp., Carlsbad, CA, USA
１％ ＢＳＡに希釈、室温、１時間
洗浄 ： ＰＢＳ ５分 ３回
封入 ： VECTASHIELD with Propidium Iodide
（vector Laboratories,Inc.Burlingame,CA,USA）
【００２８】
図２は正常（Normal）角膜の上皮層における免疫組織染色法による染色像である。
図３は、角膜を覆う瘢痕性の上皮層における免疫組織染色法による染色像である。
慢性持続炎症眼の一つであるStevens-Johnson症候群（Stevens-Johnson syndrome）は、正常（Normal conjunctival epithelium）のものと比較して格段にＴＲＸが発現していることが確認された（図３）。
眼類天疱瘡（Ocular pemphigoid）においては、瘢痕性の上皮層中、特に最表層で局所的にＴＲＸの発現が亢進していることが確認された（図３）。
これらの結果は、上記ＥＬＩＳＡ法による検討結果と一致した。
【００２９】
図４は、図３と同様、角膜を覆う瘢痕性の上皮層における免疫組織染色法による染色像で、併せて、対応する（患者の）眼表面の病態を示した図である。
尚、上述したＥＬＩＳＡ法による定量において、Stevens-Johnson症候群の検体では、涙液サンプル中、９３７．３ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＲＸ蛋白が、眼類天疱瘡の検体では、涙液サンプル中、２６６９．３ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＲＸ蛋白が確認されている。
【００３０】
以上より、ＴＲＸは眼表面の急性あるいは慢性炎症時に上皮層で発現することが示され、酸化ストレスと炎症の制御に関与していることが示唆された。
【実施例２】
【００３１】
以下、「培養ヒト角膜上皮細胞に対するチオレドキシンの作用」、並びに「チオレドキシンによる炎症抑制効果」を証明する実験を示す。
〔１．培養細胞について〕
使用した細胞：
（ａ）ＳＶ−４０ 不死化ヒト角膜上皮細胞
（ｂ）培養ヒト角膜上皮細胞（クラボウ社より購入）
（ｃ）培養ヒト角膜上皮細胞（アメリカアイバンクの角膜から培養して増やしたヒト角膜上皮細胞）
上記（ａ）乃至（ｃ）に係る培養細胞を、非働化した牛胎児血清１５％、Ｌ−グルタミン２００ｍＭ、β−メルカプトエタノール５０ｍＭ、ｒｍＩＬ−３１００ｐＭ含有ＲＰＭＩの培地１０ｍｌを２５ｃｍ２Ｔフラスコに流し入れて培養した。
１週間目に中フラスコに移し３０ｍｌの培地を添加した後、さらに２週間目に中フラスコに継代して培養を継続した。
【００３２】
〔２．炎症性サイトカインの発現〕（図５参照）
以下の実験手順により、炎症性サイトカインによる検討を行った。
１）培地を１％血清、或いは無血清に変換して、１２well plateに６０万cellづつ播種した。
２）翌日、培地をＰＢＳに置換して紫外線（ＵＶ）を５０ｍＪ照射した。
即ち、紫外線照射によって、上記（ａ）乃至（ｃ）に係る培養細胞に急性炎症を起こさせた。
３）照射直後にＴＲＸを１０００μｇ／ｍｌ添加した。
４）４時間後にＲＮＡを回収して、ＩＬ−６／β-actinおよびＩＬ−８／β-actinのｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲ（real time PCR）法にて定量した。
【００３３】
ＵＶ照射後４時間に、ＩＬ−６／β-actinのｍＲＮＡおよびＩＬ−８／β-actinのｍＲＮＡについて、著しい発現亢進を認められたが、ＴＲＸ添加群ではＩＬ−６／β-actinのｍＲＮＡおよびＩＬ−８／β-actinのｍＲＮＡの発現亢進が抑制された（図５（Ａ）及び（Ｂ））。
【００３４】
角膜上皮細胞において、紫外線照射後に炎症性サイトカインであるＩＬ−６およびＩＬ−８の発現が亢進し、この発現亢進は紫外線暴露後の急性角膜上皮障害と関連するとされている（「Kennedy M, Kim KH, Harten B, Brown J, Planck S, Meshul C, Edelhauser H, Rosenbaum JT, Armstrong CA, Ansel JC. Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1997 Nov;38(12):2483-91.」参照）。
従って、本実験により、ＴＲＸ添加によって紫外線照射後のＩＬ−６／β-actin及びＩＬ−８／β-actinの発現亢進が抑制されたことから、ＴＲＸは眼表面の炎症を抑制する作用があることが証明された。
【００３５】
〔３．ＴＵＮＥＬ染色法による検討（アポトーシス）〕（図６参照）
以下の実験手順により、ＴＵＮＥＬ染色法によるアポトーシスの検討を行った。
１）培地を１％ 血清あるいは無血清に変換して、スライドチェンバーに細胞を播種した。
２）翌日、培地をＰＢＳに置換して紫外線（ＵＶ）を５０ｍＪ照射した。
即ち、紫外線照射によって、上記（ａ）乃至（ｃ）に係る培養細胞に急性炎症を起こさせた。
３）紫外線（ＵＶ）照射直後にＴＲＸを１０００μｇ／ｍｌ添加した。
４）紫外線（ＵＶ）照射８時間後にグルタールアルデヒドで細胞を固定し、ＴＵＮＥＬ染色を行った。
【００３６】
紫外線非照射では、ＴＵＮＥＬ陽性細胞をほとんど認めないのに対して、紫外線照射後８時間では、上皮細胞にアポトーシスが生じ、ＴＵＮＥＬ染色に染まる細胞が多数確認された。
ＴＲＸ添加群（５０ｍＪ ＴＲＸ(+)）では、ＴＵＮＥＬ染色陽性細胞を少数認めたのみであった。
即ち、最も細胞が若いときに行ったＴＵＮＥＬ染色では、ＴＲＸ １０００μｇ／ｍｌの条件がきれいにアポトーシスを抑制していた。
また今回の実験で紫外線照射が角膜上皮細胞のアポトーシスを誘導したが、ＴＲＸは紫外線照射によるアポトーシス誘導を抑制した。
このことから、ＴＲＸは角膜上皮細胞のアポトーシスを抑制する作用があることが示された。
【００３７】
以上、上述の（ａ）乃至（ｃ）３種類の培養ヒト角膜上皮細胞を用いたが、細胞や培地の違いがあっても同様の結果が得られた。
従って、本発明に係るチオレドキシンスーパーファミリーのポリペプチドを有効成分とする予防ないし治療剤は、眼表面における炎症を強く抑制することから、炎症性眼表面疾患に対し有効であることが証明された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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