(57)【要約】【課題】癌組織に代わる検査材料として血液を用いることができるK-ras遺伝子変異の検出法を提供する【解決手段】被験体の血液、血漿、血清からなる群から選ばれるいずれかの血液サンプルから循環DNAを抽出する工程、フォワードプライマー、リバースプライマー、K-rasのコドン12及びコドン13を含むPNAプローブを、抽出した循環DNAに作用させてPCR反応を行い、K-rasのコドン12及びコドン13の変異の有無を検出する工程を含む、K-ras遺伝子の変異を検出する方法。【選択図】図１
2012135290.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の血液、血漿、血清からなる群から選ばれるいずれかの血液サンプルから循環DNAを抽出する工程、フォワードプライマー、リバースプライマー、K-rasのコドン12及びコドン13を含むPNAプローブを、抽出した循環DNAに作用させてPCR反応を行い、K-rasのコドン12及びコドン13の変異の有無を検出する工程を含む、K-ras遺伝子の変異を検出する方法。
【請求項２】
循環DNAに対しPNAプローブを含む条件と含まない条件の両方で循環DNAのPCRを行い、これらの結果を用いてK-rasのコドン12及び13の変異の有無の検出を行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記PNAプローブが以下の配列：
5’ TACGCCACCAGCTCC 3’
を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載の方法により被験体のK-rasのコドン12及びコドン13の変異の有無を検出し、分子標的薬の治療感受性を評価する方法。
【請求項５】
K-rasのコドン12及びコドン13の変異の有無を検出するためのキットであり、以下の配列のフォワードプライマー、リバースプライマー、K-rasのコドン12及びコドン13を含むPNAプローブ：
フォワードプライマー配列：5’ TGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTT 3’；
リバースプライマー配列：5’ ATCGTCAAGGCACTCTTGCCTAC 3’；
PNAプローブ配列：5’ TACGCCACCAGCTCC 3’
を含むことを特徴とする、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、PNA（Peptide Nucleic Acid）プローブを用いたK-rasコドン12・コドン13部位の遺伝子変異を高感度に検出する方法、キットに関する。また本発明は、前記遺伝子変異の有無を調べることにより、分子標的薬の治療感受性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌の治療として抗EGFR 抗体による治療の普及に伴い、癌組織内のK-ras遺伝子変異のある症例では抗EGFR 抗体の治療効果がほとんどないことが明らかになっている。患者の癌組織が入手可能な場合は標準的な遺伝子解析法であるダイレクトシークエンス法により解析し、治療感受性の評価が可能である。しかしながら、治療対象となる大腸がん再発患者では、解析対象となる癌部の保存組織が劣化していることや、初期治療を行った施設から解析対象となる組織が入手出来ないこと等、他院からの患者を治療する化学療法専門診療科−腫瘍内科では、癌部の組織評価が出来ない治療対象症例が50％以上も存在すると考えられている。この様な場合には、癌組織に代わる検査材料として血液が利用できれば、治療感受性を判断出来るため、適正治療を行う事が可能となる。
【０００３】
抗EGFR 抗体の治療薬では、再発切除不能例などが適応となっていることから、初発癌組織と再発癌組織の遺伝子変異の状態が違った場合に初発組織を用いて評価すると治療感受性予測を誤る可能性がある。この様な場合も、患者の現在の癌の変異の状態を反映させたかたちで治療感受性を判断出来るため、より適正な治療を行う事が可能となる。
【０００４】
また、治療患者において血液中の本遺伝子を検出・解析する事が可能になる事で治療効果の追跡や、再発の早期発見に繋げるという事も期待される。
【０００５】
遺伝子解析法としては、癌組織を検査材料とした場合、ダイレクトシークエンス法が標準法であるが、検出感度は約20%である。血液を検査材料とした場合、血液中に存在する大量の循環DNAに含まれるとされる、癌由来のごく微量のDNAより遺伝子変異を検出しなければならず、要求される検出感度は1%以上と非常に高感度であるため、従来のダイレクトシークエンス法で遺伝子変異を検出することは到底困難である。高感度な遺伝子変異の解析方法として、PNA（Peptide Nucleic Acid）を用いて、変異DNAを特異的に増幅する手法であるPNA-Clamping法が報告されている（非特許文献１）。
【０００６】
非特許文献２は、２００μＬのサンプル量でＲＥ−ＰＣＲ法を用いて検出した場合、K-ras DNAの遺伝子変異の検出は、尿で（９５％）、血清（３５％）、血漿（４０％）であると報告している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Giljeら, J Mol Diagn. 2008 Jul;10(4):325-31. Epub 2008 Jun 13
【非特許文献２】Ann N Y Acad Sci. Auther manuscript; available in PMC 2008 November 25
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、癌組織に代わる検査材料として血液を用いることができるK-ras遺伝子変異の検出法を提供することを課題とする。
【０００９】
上記の課題を解決するため、本発明者は鋭意検討を重ねた結果、PNA-Clamping法とダイレクトシークエンスを組み合わせた、PNA-Clampingシークエンス法の検出感度が0.001%まで遺伝子変異を検出することを見出し、癌患者の血漿から抽出した循環DNAを用いて、K-ras遺伝子変異が検出でき、分子標的薬の治療感受性を評価できることを証明した。
【００１０】
すなわち本発明は、以下からなる。
１．  被験体の血液、血漿、血清からなる群から選ばれるいずれかの血液サンプルから循環DNAを抽出する工程、フォワードプライマー、リバースプライマー、K-rasのコドン12及びコドン13を含むPNAプローブを抽出した循環DNAに作用させてPCR反応を行い、K-rasのコドン12及びコドン13の変異の有無を検出する工程を含む、K-ras遺伝子の変異を検出する方法。
２．  循環DNAに対しPNAプローブを含む条件と含まない条件の両方で循環DNAのPCRを行い、これらの結果を用いてK-rasのコドン12及びコドン13の変異の有無の検出を行う、前記１．に記載の方法。
３．  前記PNAプローブが以下の配列：
5’ TACGCCACCAGCTCC 3’
を有することを特徴とする、前記１．または前記２．に記載の方法。
４．  前記１、２又は３に記載の方法により被験体のK-rasのコドン12及びコドン13の変異の有無を検出し、分子標的薬の治療感受性を評価する方法。
５．  K-rasのコドン12及びコドン13の変異の有無を検出するためのキットであり、以下の配列のフォワードプライマー、リバースプライマー、K-rasのコドン12及びコドン13を含むPNAプローブ：
フォワードプライマー配列：5’ TGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTT 3’；
リバースプライマー配列：5’ ATCGTCAAGGCACTCTTGCCTAC 3’；
PNAプローブ配列：5’TACGCCACCAGCTCC 3’
を含むことを特徴とする、キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、患者の癌組織が入手可能でない場合でも、分子標的薬の治療感受性を評価することができるため、これまであった多くの分子標的薬の治療感受性を評価できなかった患者の評価をすることができ、更なる大腸癌患者が正しい判断のもとで分子標的薬の恩恵を受けることができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】K-ras変異測定の概略を示す。
【図２】希釈検出感度の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のK-ras変異の高感度測定のフローを図１に示す。
【００１４】
血液サンプル（血液、血漿、血清）から常法に従い分離された循環DNAに対し、PNA-Clamping法により、変異型K-rasを検出する。
【００１５】
K-rasの変異は、Exon2のコドン12及びコドン13のいずれかの変異である。例えばコドン12のGly（野生型、GGT）は、変異型になるとAla（GCT）、Asp（GAT）、Arg（CGT）、Cys（TGT）、Ser(AGT)、Val（GTT）などになる。
【００１６】
また、コドン13のGly（野生型、GGC）は、変異型になるとAla（GCC）、Asp（GAC）、Arg（CGC）、Cys（TGC）、Ser(AGC)、Val（GTC）などになる。Exon2のコドン12とコドン13の両方を変異している被験体も頻度は低いが存在する。このような被験体でも本発明によれば変異を容易に検出できる。
【００１７】
本発明では、上記のようなコドン12とコドン13の変異に対応するPNAプローブを設計して用いる。PNAは、コドン12及びコドン13の両方を含みその前後にいくつかの配列を有するプローブである。PNAプローブは、例えば野生型配列で設計することができる。PNAプローブが野生型配列に結合するとリバースプライマーが結合できず、野生型の配列の増幅阻害が起きるため、変異型配列だけが増幅される。
【００１８】
本発明では、血液サンプルから抽出した循環DNA中のK-ras遺伝子ＤＮＡの野生型の配列に対してＰＮＡプローブを結合（クランピング）させる。ここで、K-ras遺伝子ＤＮＡが変異型であれば、野生型配列に対応するＰＮＡプローブが結合できないため、変異配列のみが増幅される。この場合、フォワードプライマーとリバースプライマーの間でコドン12及びコドン13を含むExon2の配列がPCRにより増幅され、これをダイレクトシークエンシングにより検出する。
【００１９】
ＰＮＡ（ペプチド核酸）とは、ＤＮＡ／ＲＮＡ類似の構造をもつが、リン酸結合ではなく、ペプチド結合で骨格を形成しており、ＤＮＡ／ＲＮＡ鎖の相補的配列を有する塩基配列部分に特異的に強く結合（クランピング）し、低イオン強度で結合でき、塩基配列の選択性が高い、ヌクレアーゼやプロテアーゼなどに耐性を有するなどの特徴を有している。
【００２０】
本発明で使用するフォワードプライマーとリバースプライマーは、Exon2のコドン12，13を挟む位置にあり、かつリバースプライマーの3’末端がPNAプローブの3’末端と重なるように設計された1対のプライマーセットであればよく、その配列は特に限定されない。フォワードプライマーとリバースプライマーの長さは、15〜40塩基程度、好ましくは18〜36塩基程度、より好ましくは20〜32塩基程度である。好ましいフォワードプライマーとリバースプライマーの配列を以下に示す。
・フォワードプライマー配列：5’ TGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTT 3’
・リバースプライマー配列：5’ ATCGTCAAGGCACTCTTGCCTAC 3’
循環DNAの抽出・精製は、QIAamp Circulating Nucleic Acid Kitのような市販のキットを用いて行うことができる。
【００２１】
次に、精製された循環DNAは、PNAプローブ、フォワードプライマー、リバースプライマーなどを用いてPCR(特にリアルタイムPCR)を行う。このとき、変異配列のみを検出するPNAプローブ含有マスターミックスと、変異配列及び野生型配列をシークエシングにより検出できるPNAプローブ不含マスターミックスの両方を用いてPCR(特にリアルタイムPCR)を行うことにより、両方の結果を比較して、K-rasのコドン12及び13の変異の有無を検出を行うことで、高感度に検出することができる。リアルタイムPCRは、SYBR Green等による蛍光検出を行うことができる。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例及び比較例を用いてより詳細に説明する。
【００２３】
（実施例１）
対象は2009 年9 月から12 月で、順天堂大学附属練馬病院での大腸癌治療前症例7 名（男性4 名女性3 名，平均年齢65 歳）より血液を採取し、血液から分離した血漿より循環DNAを抽出し、PNA-Clampingシークエンス法によりK-ras遺伝子変異を検討した。7症例のうち、3症例より、それぞれGly12Val、Gly12Ser、Gly13Asp変異が検出され、それぞれの遺伝子変異は癌組織から検出された変異と一致した。また、遺伝子変異が検出されなかった症例では、癌組織で遺伝子変異は検出されなかったため、血液の結果と癌組織の結果が100%一致した。
【００２４】
２）検体の採取
血液が5 mL以上採血された。
【００２５】
３）DNA抽出
血液を遠心分離（１３００×ｇ, ２０分）し、3 mL以上の血漿を分離する。分離した血漿より、QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（QIAGEN）を用いてDNAを抽出し、25 μLの循環DNAとした。
【００２６】
４）PNA-Clampingシークエンス
循環DNA 5 μL を、5X HF Buffer  5 μL、dNTP(2mM each) 2.5 μL、プライマーミックス(F,R 5mM each) 0.3 μL、PNAプローブ(12.5 mM) 1 μL、SYBR Green I(1:2000) 0.8 μL、HF DNA Polymerase(2U/ mL) 0.2 μL、dH2O 10.2 μLからなるマスターミックスに加える。PNAプローブを加えないマスターミックスも同様に用意する。Sequence Detection System（Life Technologies）を用いて、98℃ 30秒を1サイクルの後、98℃ 10秒、76℃ 10秒、62℃ 10秒、72℃ 20秒を40サイクル、95℃15秒、60℃15秒、95℃15秒を1サイクル行い変異特異的に増幅を行う。反応溶液をTE Buffer 1×を用いて、3倍希釈して5  μLをExo SAP-IT（GE Healthcare）に加え、Verifi（Life Technologies）で37℃15分、85℃15分の反応を行い、PCR精製産物とした。PCR精製産物を鋳型として、ダイレクトシークエンスを行い、Gly12Val、Gly12Ser、Gly13Asp変異を同定した。
【００２７】
なお、プライマーとPNAプローブは、以下のものを用いた。
野生型PNAプローブ：5’ TACGCCACCAGCTCC 3’
フォワードプライマー：5’ TGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTT 3’
リバースプライマー：5’ ATCGTCAAGGCACTCTTGCCTAC 3’
【００２８】
５）分子標的薬治療効果の評価
遺伝子変異の検出結果に基づき、分子標的薬の使用の可否を判断し、予測通りの治療効果が得られた。
【００２９】
（実施例２）
PNA-Clampingシークエンス法を用いて、細胞株DNAについて、野生型DNAを用いて段階希釈し、変異検出感度を確認した。細胞株についてGly12Val変異混入率0.001%(100,000倍希釈)までの変異の検出が確認された。
【００３０】
下記の試薬を用いた。K-ras増幅用プライマーとプローブおよび測定条件については、阻害物質の多い血液で高感度に検出できる至適条件を確立した。
・PCRプライマー：カスタムオリゴヌクレオチドプライマー（SIGMA-Aldrich社）
・フォワードプライマー配列：TGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTT
・リバースプライマー配列：ATCGTCAAGGCACTCTTGCCTAC
・PNAプローブ：カスタムオリゴヌクレオチドプローブ（バイオロジカ社）
・PNAプローブ配列：TACGCCACCAGCTCC
・PCR反応：Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（Finzyme社）、SYBR Green I（Invitrogen社）
・PCR精製：ExoSAP-IT（GE Healthcare社）
・SEQ反応：BigDye Terminator v1.1（Life Technologies社）
・SEQ精製：Wizard Magnesil SEQ Clean Up System（Promega社）
下記の条件検討を行い、変異混入率0.001%(100,000倍希釈)という高感度な遺伝子変異の検出条件を見出した。
１．増幅プライマーのうち、フォワードプライマーについては、8種類の候補を検討し、最適な1種類のプライマーを選考した。
２．SYBR Green Iの量について、文献の指定量ではPCR増幅に阻害的に作用していると考えられたため、4つの条件より最適な量を見出した。
３．フォワード・リバースプライマーの量について、検出感度を最大限に維持し、且つ非特異的増幅を抑えるように5つの条件より最適な量を決定した。
４．非特異的増幅を極力抑えるために反応のアニーリング温度を2つの条件より決定した。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明により、患者の癌組織が入手可能性でない場合でも、分子標的薬の治療感受性を評価することができるため、これまであった多くの分子標的薬の治療感受性を評価できなかった患者の評価をすることができ、更なる大腸癌患者が正しい判断のもとで分子標的薬の恩恵を受けることができるようになるため、医療に大きく貢献できる。
【００３２】
血漿と組織のK-ras変異解析の結果
【００３３】
【表１】
2012135290.tif 000003
【図１】
2012135290.tif 000004
【図２】
2012135290.tif 000005
【配列表】
2012135290000001.app