(57)【要約】【課題】電位差計測法において微量サンプルで精度が高い分析手法を提供する。【解決手段】電解質溶液中のアニオンは反対電荷をもつイオン交換基との静電的な反発作用によりこれらのイオン交換樹脂やイオン交換膜中への浸入が妨げられる。さらにアニオン交換基を持つイオン交換樹脂やイオン交換膜をその隣に並べるとカチオンが反対電荷をもつイオン交換基との静電的な反発作用によりこれらのイオン交換樹脂やイオン交換膜中には浸入しにくくなる。このようにカチオン交換基またはアニオン交換基を有するイオン交換樹脂やイオン交換膜を並べることでイオンの透過を妨げる効果を発揮できると考えられる。参照電極溶液と測定溶液の間に上述したイオン交換樹脂またはイオン交換膜を積層した領域を設けることで参照電極から漏れでるイオンが測定溶液へ染みだして測定電位に与える影響を低減することが可能であると考えられる。【選択図】  図１
2012026812.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応溶液を収容する測定容器と、
該測定容器中の反応溶液と接触するように設けられた測定電極と、
測定容器中の反応溶液と接触するように設けられた参照電極と、
前記測定電極の界面電位を測定する測定手段と、を備えた電位差計測装置において、
前記反応容器に、前記参照電極と反応溶液が直接接触しないよう、間にイオン交換体を備えたことを特徴とする電位差計測装置。
【請求項２】
請求項１記載の電位差計測装置において、
前記イオン交換体が酸性及び塩基性のイオン交換体を組み合わせたものであることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項３】
請求項２記載の電位差計測装置において、
前記イオン交換体が強酸性及び強塩基性のイオン交換体を組み合わせたものであることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項４】
請求項２記載の電位差計測装置において、
前記イオン交換体が弱酸性及び弱塩基性のイオン交換体を組み合わせたものであることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項５】
請求項１記載の電位差計測装置において、
前記イオン交換体が酸性及び塩基性のイオン交換膜を組み合わせたものであることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項６】
請求項５記載の電位差計測装置において、
前記イオン交換膜が強酸性及び強塩基性のイオン交換膜を組み合わせたものであることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項７】
請求項５記載の電位差計測装置において、
前記イオン交換体が弱酸性及び弱塩基性のイオン交換膜を組み合わせたものであることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項８】
請求項１記載の電位差計測装置において、
前記イオン交換体が酸性及び塩基性のイオン交換樹脂を組み合わせたものであることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項９】
請求８記載の電位差計測装置において、
前記イオン交換膜が強酸性及び強塩基性のイオン交換樹脂を組み合わせたものであることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項１０】
請求項８記載の電位差計測装置において、
前記イオン交換体が弱酸性及び弱塩基性のイオン交換樹脂を組み合わせたものであることを特徴とする電位差計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液，尿などの生体サンプルの分析に適用できる電位差計測装置に係り、特に、微量なサンプルの測定に好適な電位差計測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液，尿等を検体として人の病気を診断する方法の一つとして、ウェットケミストリー分析法がある。これは、いわゆる溶液試薬を用いる方法であって歴史も古く、多数の項目について検出試薬も開発されており、測定機も簡易小型機から大型全自動機まで各種ある。
【０００３】
ウェットケミストリー分析法では試薬は安定性を考慮していくつかの群に分けておき、溶解，調製時に混合することもできるし、試薬添加の手順をいくつかのステップに分けることも可能である。更に、測定検体の数に応じて、適量の試薬を溶解，調製しておくことができるので、１測定当り試薬コストも少なくて済む。試薬など多数の溶液の取扱いを組み合わせて自動化することは複雑で厄介ではあるが、臨床検査機器の開発は歴史もあり、社会的な要請も高かったので、既に大・中・小いずれの処理能力を必要とする分野についても、ウェットケミストリー分析法を用いた効率良い生化学自動分析装置が開発，実用化されている。
【０００４】
生化学自動分析装置には測定原理として主に生体試料の定量分析は検体と試薬を反応させてその反応液の吸光度変化を測定する比色法が用いられている。比色法では測定液が入った分光セルに特定の波長を有する光を当てて特定の成分に対する吸光度を測定することで生体試料中の成分を定量することができる。
【０００５】
比色法以外では検体と酸化還元性試薬を加えた反応試薬と反応させて酸化還元試薬の酸化還元反応に伴う電流を測定する手法と化学反応に伴い変化する電極の界面電位を測定する手法である電気化学的計測法などがある。これらの手法は光学系が不要なので測定システムが小型になる利点がある。これらの技術は、特許文献１，非特許文献１などに記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３３８７９２６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Donald T. Sawyer, Andrzej Sobkowiak and Julian L.Roberts,Jr.著  「電気化学測定法の基礎」丸善株式会社  ２００３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
検体量の微量化や測定液量の微量化を目指す場合、比色法では分光セルの微小化が考えられるが、分光セルの微小化による吸光度測定の感度低下を考慮する必要がある。つまり分光セルの微小化のために短くするセルの光路長には感度低下を避けるために長さの下限があり、現状では最低測定液量が５０μＬ程度に限られてくる。また、電流計測法では測定液量の減少に伴い含まれる測定対象物質の絶対量が減り電流値が減少するため感度が低下する。一方、電位差計測法では電極電圧は原理的に測定液量に依存しないため微量化の可能性が高いと考えられる。
【０００９】
本発明の目的は電位差計測法において微量サンプルで精度が高い分析手法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
電位差計測法では検体試料と反応試薬溶液を含む２液以上の溶液を用いた電位差計測法において、下記ネルンスト式
Ｅ＝Ｅ０＋ＲＴ／ｎＦ×ｌｎ（Ｃｏｘ／Ｃｒｅｄ）
Ｅ：電極表面の電位、Ｅ０：酸化還元物質の標準電位、Ｒ：気体定数、Ｔ：温度、ｎ：化学反応における電子数、Ｆ：ファラデー定数、Ｃｏｘ：酸化還元物質の酸化型濃度、Ｃｒｅｄ：酸化還元物質の還元型濃度
が成り立つことが知られている。上記式より目的とする対象物と試薬との化学反応に伴い酸化還元物質が酸化型から還元型へ変化するためＣｏｘ／Ｃｒｅｄの比率から系の電位変化を求めて目的反応物の濃度に相関させることができる。ネルンスト式では電位差は温度と濃度の関数なので測定液量は原理的には無関係である。
【００１１】
電位差計測法では測定液中に測定電極と対に参照電極を組み合わせることで測定電極中の界面電位を測定する。測定液中に参照電極の先端にある接合部（ジャンクション）から内部液が極微量漏れ出すことで測定液との電気的な接続をとり測定用電極との間の電位差を計測する。検体量の微量化や測定液量の微量化を目指す際、測定液量そのものが少ない場合は内部液に用いられる塩水溶液の極微量の漏れでも漏れ出した塩による電位に対する影響が顕著に現れる。漏れ出し量は参照電極の構造や材料によって異なり、特に接合部の材料に大きく関わっていると考えられている。
【００１２】
参照電極が測定溶液に接すると同時に参照電極の接合部から参照電極の内部液（一般に飽和塩化カリウム水溶液を使用）に含まれるイオンが測定溶液中に拡散する。拡散したイオンが測定用の電極表面に達するに従い電位は変動していくが、測定溶液量が漏れイオンに比べて過剰量であるならば極わずかの漏れイオンの影響は測定電位変動としては検出されにくい。測定液量を例えば１０μＬ程度にまで微量化する場合、参照電極からの漏れイオン量は極わずかであり測定時間がたとえ１分であったとしても電位への影響は無視できなくなると考えられる。このような漏れイオンによる影響を受けにくくするには参照電極からの漏れイオンの拡散を制限できればよい。
【００１３】
イオンは正又は負の電荷を帯びているため周囲に同様な正負の電荷が存在するとイオンの電荷と周囲の電荷との間で静電的なクーロン力が生じる。カチオンの場合周囲に同符号の正電荷があると反発力が生じ負電荷では吸引力が生じる。同様にアニオンの場合は同符号の負電荷では反発力、正電荷では吸引力が生じる。電解質溶液をカチオン交換基を持つイオン交換樹脂やイオン交換膜に接触させた場合、電解質溶液中のカチオンは異符号電荷のイオン交換基との静電的相互作用によりイオン交換基のカチオンとの間でイオン交換が起きる。一方電解質溶液中のアニオンは反対電荷をもつイオン交換基との静電的な反発作用によりこれらのイオン交換樹脂やイオン交換膜中への浸入が妨げられる。さらにアニオン交換基を持つイオン交換樹脂やイオン交換膜をその隣に並べるとカチオンが反対電荷をもつイオン交換基との静電的な反発作用によりこれらのイオン交換樹脂やイオン交換膜中には浸入しにくくなる。このようにカチオン交換基またはアニオン交換基を有するイオン交換樹脂やイオン交換膜を並べることでイオンの透過を妨げる効果を発揮できると考えられる。
【００１４】
参照電極溶液と測定溶液の間に上述したイオン交換樹脂またはイオン交換膜を積層した領域を設けることで参照電極から漏れでるイオンが測定溶液へ染みだして測定電位に与える影響を低減することが可能であると考えられる。イオン交換体から構成される緩衝領域を設けることでイオン交換がおこり無視できないような液間電位が発生することも懸念される。そのため実際のサンプル測定の際には最初にサンプルを含まない試薬のみでの測定を実施後、サンプルが試薬と反応した溶液を測定しこれらの差分（変化分）を算出することで反応のみに対応した結果を得ることが可能である。
【００１５】
以上により本発明では参照電極の内部液漏洩による電位変動を防ぐために参照電極と測定溶液の間にイオン交換体から構成される緩衝領域を設けたことを特徴とした。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると検体試料と反応試薬溶液を含む２液以上の溶液を用いた電位差計測法において測定液量が微量であっても電位変動が少ない高精度の電位差計測法を実現し、検体試料中の測定対象物の濃度を正確に定量できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】測定セルの一例を示すブロック図である（実施例１）。
【図２】イオン交換膜の配置を示す図である（実施例２）。
【図３】イオン交換樹脂の配置を示す図である（実施例３）。
【図４】測定セルのマルチチャンネル構成例を示すブロック図である（実施例４）。
【図５】測定装置を示すブロック図である（実施例５）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
計測セル模式図
図１は本発明による計測セルの一例を示すブロック図である。測定用電極１，測定液２，イオン透過膜３，イオン交換体４，参照電極液層５，参照電極６，参照電極用リード線７から構成される。測定用電極１は金などの貴金属やカーボンからなる電極を用いることができる。また、測定液中の夾雑物の影響を低減するために電極表面に酸化還元物質を固定化しても良い。酸化還元物質としてはフェロセン，ピリジン，ピリミジンなどが使用できる。参照電極６は測定液２に接触した測定用電極１上での電位変化を安定に測定するために基準となる電位を与える。
【実施例２】
【００２０】
イオン交換膜での電位安定性
参照電極が測定溶液に接すると同時に参照電極の接合部から参照電極の内部液（一般に飽和塩化カリウム水溶液を使用）に含まれるイオンが測定溶液中に拡散する。拡散したイオンが測定用の電極表面にまで達するに従い電位は変動していくが、測定溶液量が漏れイオンに比べて過剰量であるならば極わずかの漏れイオンの影響は測定電位変動としては検出されにくい。測定液量を微量化する場合、参照電極からの漏れイオン量はわずかであったとしても電位への影響は無視できなくなると考えられる。このような漏れイオンによる影響を受けにくくするには参照電極からの漏れイオンの拡散を制限すればよいと考えられる。
【００２１】
参照電極から漏れ出す内部溶液のイオンは濃度勾配に従い測定溶液に拡散していくが拡散速度を抑えるために本発明では測定溶液と参照電極の間にイオン交換体から構成される緩衝領域を設けた。イオン交換体４にはアニオン交換体及びカチオン交換体を使用し、各々の交換体を積層して用いる。参照電極から漏れ出したイオンは参照電極液層に染みだした後、イオン透過膜３を通ってイオン交換体に達する。アニオンは一部はアニオン交換体に結合されているアニオン交換基でイオン交換されるが、残りは隣接したカチオン交換体にカチオン交換基が結合されているためアニオンの透過が妨げられる。一方カチオンはアニオン交換体にアニオン交換基が結合されているため透過が妨げられる。一部のカチオンは隣接したカチオン交換体に結合されているカチオン交換基でイオン交換される。このようにして参照電極から漏れ出したイオンはイオン交換体により透過が妨げられるためイオン透過膜８から測定液２への流れ込みを抑えることができる。
【００２２】
イオン結合を形成しているカチオン，アニオンのいずれかが、それと同符号の他種イオンと交換することをイオン交換という。イオン交換する能力を有する固体で、正の電荷を持ちアニオンを捕捉するものをアニオン交換体、負の電荷を持ちカチオンを捕捉するものをカチオン交換体という。イオン交換体はイオン結合を形成できる官能基を有しており、カチオン交換基としてスルホン酸基，カルボキシル基，アニオン交換基ではアミノ基，アンモニウム基などである。
【００２３】
アニオン交換基は強塩基型と弱塩基型の２種類の型がある。強塩基型のイオン交換基はアンモニウム基であり、水中で強く解離して強塩基性の性質をもつ。同様にカチオン交換体の交換基は強酸型と弱酸型の２種類の型がある。強酸型のイオン交換基はスルホン酸基であり、水中で強く解離して強酸性の性質をもつ。
【００２４】
一方、弱酸型又は弱塩基型の強弱の程度はプロトンの解離定数Ｋａで表し、化学便覧などで調べることができる。Ｋａ値が小さいほど程度は弱いとみなされる。弱酸型であるカルボキシル基のＫａは化合物によって異なるが例えば安息香酸では６.６×１０-5（２５℃）、弱塩基型であるアミノ基のＫａは例えばトリエチルアミンがプロトンで４級化したものは１.８×１０-11（２５℃）となる。
【００２５】
本発明に使用できるイオン交換体はイオン交換膜とイオン交換樹脂に大別できる。アニオン交換体とカチオン交換体を交互に積層する必要があるためイオン交換膜では貼りあわせるが、イオン交換樹脂ではアニオン交換樹脂とカチオン交換樹脂は混合しないように各々別々の容器に入れてイオン透過性の膜を介して接触させる（図２，図３）。
【００２６】
アニオン交換体の交換基は強塩基型と弱塩基型の２種類の型がある。強塩基型はアンモニウム塩のトリメチルアミン型（化合物１）とジメチルエタノール型（化合物２）に分けられる。弱塩基型はアミンを（化合物３）に示す。
【００２７】
【化１】
2012026812.tif 000003
【００２８】
【化２】
2012026812.tif 000004
【００２９】
【化３】
2012026812.tif 000005
【００３０】
塩基性の程度は弱塩基型＜ジメチルエタノール型＜トリメチル型となりイオン交換能力が異なる。
【００３１】
カチオン交換体のカチオン交換基はスルホン酸の強酸型（化合物４）とカルボキシルの弱酸型（化合物５）がある。
【００３２】
【化４】
2012026812.tif 000006
【００３３】
【化５】
2012026812.tif 000007
【００３４】
以上に挙げたイオン交換基を有するイオン交換膜又はイオン交換樹脂を組み合わせて用いることができる。
【００３５】
測定溶液中のイオン以外の物質が上記イオン交換膜又はイオン交換樹脂中に浸入してイオン交換基などに吸着することを防ぐためにイオン交換体と参照電極液又は測定溶液はイオン透過膜で隔てられる。イオン透過膜には参照電極の接合部に用いられているような材料を使用することができる。一般的には多孔質セラミック，多孔質バイコールガラス，セラミックフリット，石英，セルロースパルプ，ガラスフリット、などである。
【００３６】
強酸型と強塩基型および弱酸型と弱塩基型のイオン交換膜を組み合わせて図１及び図２に示す測定セルとイオン交換膜を用いて測定電位の変動を検討した結果を表１に示す。強酸型イオン交換膜はアストム社  ネオセプタＣＭＸ、強塩基型イオン交換膜は同じくアストム社  ネオセプタＡＭＸを用いた。弱酸型イオン交換膜は旭硝子社  ＨＳＦ、弱塩基型イオン交換膜は同じく旭硝子社  ＡＡＶを用いた。本実験で用いた測定条件は以下の通りである。
【００３７】
参照電極：ＢＡＳ社  ＲＥ−１Ｃ
作用電極：ＢＡＳ社  リングディスク電極Ａｕ
イオン透過膜：多孔質バイコールガラス
参照電極液：飽和  塩化カリウム水溶液
測定液：１０ｍＭフェリシアン化カリウムと１０ｍＭ  フェロシアン化カリウムの濃            度比は１００：１
測定液量：１０μＬ
測定値：測定液を測定電極上に添加後、参照電極を測定液に浸せき直後から１分間に            おける電位の変動をｍＶ／分で示した。
【００３８】
イオン交換膜を用いることで電位変動が抑えられることが示された。
【００３９】
【表１】
2012026812.tif 000008
【実施例３】
【００４０】
イオン交換樹脂での電位安定性
強酸型と強塩基型および弱酸型と弱塩基型のイオン交換樹脂を組み合わせて図１及び図３に示す測定セルとイオン交換膜を用いて測定電位の変動を検討した結果を表２に示す。強酸型イオン交換樹脂は三菱化学社  ダイヤイオンＳＫ１Ｂ、強塩基型イオン交換樹脂は同じく三菱化学社  ダイヤイオンＳＡ１０Ａを用いた。弱酸型イオン交換樹脂は三菱化学社  ＷＫ１０、弱塩基型イオン交換樹脂は同じく三菱化学社  ＷＡ１０を用いた。本実験で用いた測定条件は以下の通りである。
【００４１】
参照電極：ＢＡＳ社  ＲＥ−１Ｃ
作用電極：ＢＡＳ社  リングディスク電極Ａｕ
イオン透過膜：多孔質セラミック
参照電極液：飽和  塩化カリウム水溶液
測定液：１０ｍＭフェリシアン化カリウムと１０ｍＭ  フェロシアン化カリウムの濃
度比は１００：１
測定液量：１０μＬ
測定値：測定液を測定電極上に添加後、参照電極を測定液に浸せき直後から１分間に
おける電位の変動をｍＶ／分で示した。
【００４２】
イオン交換樹脂を用いることで電位変動が抑えられることが示された。
【００４３】
【表２】
2012026812.tif 000009
【実施例４】
【００４４】
マルチチャンネル
図４は本発明による計測セルの一例を示すブロック図で、図１に示した計測セルを基板上に複数個並べて多項目または多検体測定に対応したものである。測定用電極１，測定液２，イオン透過膜３，８，イオン交換体４，参照電極液層５，基板１３から構成される。測定用電極１は金などの貴金属やカーボンからなる電極を用いることができる。また、測定液中の夾雑物の影響を低減するために電極表面に酸化還元物質を固定化しても良い。酸化還元物質としてはフェロセン，ピリジン，ピリミジンなどが使用できる。参照電極は１個で各計測セルに対応する。
【実施例５】
【００４５】
計測装置模式図
図５は本発明による計測装置の一例を示すブロック図である。測定用電極１，測定液２，参照電極６，制御装置１４，データ処理装置１５から構成される。データ処理装置１５は測定用電極１で取得した信号をデータ処理して試料中の測定対象物の濃度を計算する。測定用電極１は金などの貴金属やカーボンからなる電極を用いることができる。また、測定液中の夾雑物の影響を低減するために電極表面に酸化還元物質を固定化しても良い。酸化還元物質としてはフェロセン，ピリジン，ピリミジンなどが使用できる。参照電極６は測定液２に接触した測定用電極１上での電位変化を安定に測定するために基準となる電位を与える。
【符号の説明】
【００４６】
１  測定用電極
２  測定液
３，１２  イオン透過膜
４  イオン交換体
５  参照電極溶液層
６  参照電極
７  参照電極用リード線
８  アニオン交換膜
９  カチオン交換膜
１０  アニオン交換体
１１  カチオン交換体
１３  基板
１４  制御装置
１５  データ処理装置
【図１】
2012026812.tif 000010
【図２】
2012026812.tif 000011
【図３】
2012026812.tif 000012
【図４】
2012026812.tif 000013
【図５】
2012026812.tif 000014