(57)【要約】【課題】従来とは異なる方式によりＦＣＣＳにおけるクロストークを低減する蛍光分析装置および蛍光分析方法を提供する。【解決手段】蛍光分析装置は、お互いに異なる変調周波数で強度変調したレーザ光を合成して試料に一定時間照射し、レーザ光の照射を受けた第１の蛍光物質が発する第１の蛍光の蛍光信号を出力し、レーザ光の照射を受けた第２の蛍光物質が発する第２の蛍光の蛍光信号を出力する。当該装置は、第１の蛍光の蛍光信号を変調信号とミキシングすることにより第１の蛍光の強度の時系列データを算出し、第２の蛍光の蛍光信号を変調信号とミキシングすることにより第２の蛍光の強度の時系列データを算出する。更に、当該装置は、第１の蛍光の蛍光強度の時系列データと第２の蛍光の蛍光強度の時系列データとの間で相互相関関数を算出することにより、第１の測定対象物と第２の測定対象物の結合の程度を判定する。【選択図】  図１
2012173252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の測定対象物および第２の測定対象物を含む試料にレーザ光を照射することにより、前記第１の測定対象物および前記第２の測定対象物から発する蛍光を分析する蛍光分析装置であって、
前記第１の測定対象物中の第１の蛍光物質を励起する波長を有し、第１の変調周波数で強度変調された第１のレーザ光と、前記第２の測定対象物中の第２の蛍光物質を励起する波長を有し、第２の変調周波数で強度変調された第２のレーザ光とを合成したレーザ光を前記試料に照射するために一定時間出射するレーザ光出射部と、
合成した前記レーザ光の照射を受けた前記第１の蛍光物質の発する第１の蛍光を第１の受光素子で受光して第１の蛍光信号を出力し、さらに、合成した前記レーザ光の照射を受けた前記第２の蛍光物質の発する第２の蛍光を第２の受光素子で受光して第２の蛍光信号を出力する受光部と、
前記第１の蛍光信号を前記第１の変調周波数の変調信号とミキシングすることにより前記第１の蛍光の強度を表す第１の蛍光強度の成分を含む第１の処理信号を生成し、前記第２の蛍光信号を前記第１の変調周波数の変調信号とミキシングすることにより前記第２の蛍光の強度を表す第２の蛍光強度を含む第２の処理信号を生成し、前記第１の処理信号と前記第２の処理信号から前記第１の蛍光強度と前記第２の蛍光強度の前記一定時間の時系列データを算出するデータ処理部と、
前記第１の蛍光強度の時系列データと前記第２の蛍光強度の時系列データとの間で相互相関関数を算出することにより、前記第１の測定対象物と前記第２の測定対象物の結合の程度を判定する分析部と、を有することを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項２】
前記分析部は、前記相互相関関数の値が高いほど前記結合の程度は高いと判定する、請求項１に記載の蛍光分析装置。
【請求項３】
前記第１の測定対象物と前記第２の測定対象物とが結合したとき、前記第１の蛍光物質から前記第２の蛍光物質へのエネルギー移動が生じ、移動したエネルギーにより前記第２の蛍光物質が蛍光を発するように、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質は選択され、
前記第１の処理信号は、前記第１の蛍光の前記変調信号に対する位相遅れの情報を含み、
前記分析部は、前記第１の処理信号から算出される前記位相遅れの情報を用いて前記第１の蛍光の蛍光緩和時間を求め、前記第１の蛍光強度の時系列データの自己相関関数を算出することにより、前記第１の蛍光物質の前記試料中の濃度を算出し、さらに、前記第２の蛍光強度の時系列データの自己相関関数を算出することにより、前記第２の蛍光物質の前記試料中の濃度を算出し、前記第１の蛍光の前記蛍光緩和時間と、前記第１の蛍光物質の前記試料中の濃度と、前記第２の蛍光物質の前記試料中の濃度とを用いて、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質との間の結合における解離定数を算出する、請求項１または２に記載の蛍光分析装置。
【請求項４】
前記分析部は、前記第１の蛍光物質に対する前記第２の蛍光物質の濃度を変化させることにより得られる前記第１の蛍光物質の発する蛍光緩和時間の最小値と最大値を予め記録保持し、前記解離定数を算出するとき前記最小値と前記最大値を用いる、請求項３に記載の蛍光分析装置。
【請求項５】
さらに、前記試料と前記受光部との間の光路上には、前記第１の蛍光および前記第２の蛍光を前記第１の受光素子および前記第２の受光素子の前面で集束させるレンズ系と、前記第１の蛍光及び前記第２の蛍光の集束位置に設けたピンホールと、を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光分析装置。
【請求項６】
前記データ処理部は、前記第２の蛍光信号を前記第１の変調周波数の変調信号とミキシングして得られるミキシング信号から、前記第２変調周波数と前記第１の変調周波数との差分の周波数成分を抽出することにより、前記第２の処理信号を生成する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光分析装置。
【請求項７】
第１の測定対象物および第２の測定対象物を含む試料にレーザ光を照射することにより、前記第１の測定対象物および前記第２の測定対象物から発する蛍光を分析する蛍光分析方法であって、
前記第１の測定対象物中の第１の蛍光物質を励起する波長を有し、第１の変調周波数で強度変調された第１のレーザ光と、前記第２の測定対象物中の第２の蛍光物質を励起する波長を有し、第２の変調周波数で強度変調された第２のレーザ光とを合成したレーザ光を前記試料に一定時間照射し、
合成した前記レーザ光の照射を受けた前記第１の蛍光物質の発する第１の蛍光を第１の受光素子で受光して第１の蛍光信号を出力し、さらに、合成した前記レーザ光の照射を受けた前記第２の蛍光物質の発する第２の蛍光を第２の受光素子で受光して第２の蛍光信号を出力し、
前記第１の蛍光信号を前記第１の変調周波数の変調信号とミキシングすることにより前記第１の蛍光の強度を表す第１の蛍光強度の成分を含む第１の処理信号を生成し、前記第２の蛍光信号を前記変調信号とミキシングすることにより前記第２の蛍光の強度を表す第２の蛍光強度の成分を含む第２の処理信号を生成し、
前記第１の処理信号と前記第２の処理信号から前記第１の蛍光強度と前記第２の蛍光強度の前記一定時間の時系列データを算出し、
前記第１の蛍光強度の時系列データと前記第２の蛍光強度の時系列データとの間で相互相関関数を算出することにより、前記第１の測定対象物と前記第２の測定対象物の結合の程度を判定する、ことを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項８】
前記結合の程度の判定では、前記相互相関関数の値が高いほど前記結合の程度は高いと判定する、請求項７に記載の蛍光分析方法。
【請求項９】
前記第１の測定対象物と前記第２の測定対象物とが結合したとき、前記第１の蛍光物質から、前記第２の蛍光物質へのエネルギー移動が生じ、移動したエネルギーにより前記第２の蛍光物質が蛍光を発するように、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質は選択され、
前記第１の処理信号は、前記第１の蛍光の前記変調信号に対する位相遅れの情報を含み、
前記第１の処理信号および前記第２の処理信号を生成するとき、前記第１の処理信号を用いて前記第１の蛍光の蛍光緩和時間を求め、前記第１の蛍光強度の時系列データの自己相関関数を算出することにより、前記第１の蛍光物質の前記試料中の濃度を算出し、さらに、前記第２の蛍光強度の時系列データの自己相関関数を算出することにより、前記第２の蛍光物質の前記試料中の濃度を算出し、前記第１の蛍光の前記蛍光緩和時間と、前記第１の蛍光物質の前記試料中の濃度と、前記第２の蛍光物質の前記試料中の濃度とを用いて、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質との間の結合における解離定数を算出する、請求項７または８に記載の蛍光分析方法。
【請求項１０】
前記第１の蛍光物質に対する前記第２の蛍光物質の濃度を変化させることにより得られる前記第１の蛍光物質の発する蛍光緩和時間の最小値と最大値を予め記録保持し、前記解離定数を算出するとき前記最小値と前記最大値を用いる、請求項９に記載の蛍光分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第１の測定対象物および第２の測定対象物を含む試料にレーザ光を照射することにより、前記第１の測定対象物および前記第２の測定対象物の発する蛍光を分析する蛍光分析装置および蛍光分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、医療、創薬、食品産業におけるポストゲノム関連技術として、タンパク質の機能解析が重要となっている。特に、細胞の作用を解析するために、生細胞における生体物質であるタンパク質と、他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用（結合、分離）の研究が必要である。
このようなタンパク質の他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用について、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）現象を利用して解析することが最近行われている。すなわち、数ナノメータの領域での分子間相互作用を蛍光を用いて検出する。このようなＦＲＥＴ現象を利用した検出は、主に顕微鏡システムを用いて行われる。
【０００３】
例えば、Ｃ末端標識タンパク質を用いて、タンパク質−分子間相互作用を簡便、迅速かつ高感度に測定する方法が知られている（特許文献１）。具体的には、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を起こす組み合わせの一方の蛍光物質でＣ末端が標識されたタンパク質と、ＦＲＥＴを起こす組み合わせの他方の蛍光物質で標識された分子とを溶液中で接触させて、Ｃ末端標識タンパク質と標識された分子との相互作用に基づく、二つの蛍光物質のＦＲＥＴによる蛍光値を測定する。
【０００４】
また、ストークスシフトの小さい蛍光分子を利用して、ホモＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）に基づいた蛍光指示薬を提供するために、分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化させる標的配列のＮ末端側とＣ末端側に実質的に同一の蛍光特性を有する蛍光分子成分を結合させた蛍光指示薬が知られている（特許文献２）。
【０００５】
また、蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ：Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy）において、異なる蛍光分子で別々にラベル化された２つの測定対象分子に関するＦＣＣＳのクロストーク成分を低減する方法が知られている（非特許文献１）。当該方法は、具体的には、異なる蛍光分子でラベル化された２つの測定対象分子に対して２つのレーザ光で照射するとき、２つのレーザ光の照射を交互に切り替えることにより行う。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−５３４１６号公報
【特許文献２】特開２００４−１８７５４４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】“Cross-talk-free Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy by the Switching Method”,Yasuo Takahashi et al., CELL STRUCTURE AND FUNCTION 33,  p.143-150,2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上記特許文献１，２では、いずれもＦＲＥＴにおけるドナー蛍光分子からアクセプタ蛍光分子へのエネルギー移動を検出するために、蛍光強度を計測し、エネルギーを奪われたドナー蛍光分子の蛍光強度の減少と、エネルギーの移動を受けたアクセプタ蛍光分子の蛍光強度の増加を計測し、分子間の相互作用の有無を判定することを前提としている。このため、上記特許文献１，２では、分子間の相互作用は定性的な評価しかできない。
一方、ドナー蛍光分子がレーザ光の照射を受けて吸収したエネルギーに対する、ドナー蛍光分子からアクセプタ蛍光分子へ移動したエネルギーの割合を表すＦＲＥＴ効率を分子間相互作用の強さの評価に用いる場合、ＦＲＥＴ効率はドナー蛍光分子およびアクセプタ蛍光分子の濃度に応じて変動するため、分子間相互作用の強さの定量的評価に用いることはできない。
【０００９】
一方、分子相互間相互作用を検出する方法として用いるＦＣＣＳ法では、上記非特許文献１の方法を用いて、ＦＣＣＳのクロストーク成分を低減することができる。これにより、蛍光の相互相関関数を用いて、分子間相互作用の強さの評価を行うことができるが、定量的評価に用いることはできない。
【００１０】
そこで、本発明は、従来とは異なる方式によりＦＣＣＳにおけるクロストークを低減する蛍光分析装置および蛍光分析方法を提供し、これに加えて、測定対象物間の分子間相互作用を定量的に評価することができる蛍光分析装置および蛍光分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様は、第１の測定対象物および第２の測定対象物を含む試料にレーザ光を照射することにより、前記第１の測定対象物および前記第２の測定対象物から発する蛍光を分析する蛍光分析装置である。当該装置は、
前記第１の測定対象物中の第１の蛍光物質を励起する波長を有し、第１の変調周波数で強度変調された第１のレーザ光と、前記第２の測定対象物中の第２の蛍光物質を励起する波長を有し、第２の変調周波数で強度変調された第２のレーザ光とを合成したレーザ光を前記試料に照射するために一定時間出射するレーザ光出射部と、
合成した前記レーザ光の照射を受けた前記第１の蛍光物質の発する第１の蛍光を第１の受光素子で受光して第１の蛍光信号を出力し、さらに、合成した前記レーザ光の照射を受けた前記第２の蛍光物質の発する第２の蛍光を第２の受光素子で受光して第２の蛍光信号を出力する受光部と、
前記第１の蛍光信号を前記第１の変調周波数の変調信号とミキシングすることにより前記第１の蛍光の強度を表す第１の蛍光強度の成分を含む第１の処理信号を生成し、前記第２の蛍光信号を前記第１の変調周波数の変調信号とミキシングすることにより前記第２の蛍光の強度を表す第２の蛍光強度を含む第２の処理信号を生成し、前記第１の処理信号と前記第２の処理信号から前記第１の蛍光強度と前記第２の蛍光強度の前記一定時間の時系列データを算出するデータ処理部と、
前記第１の蛍光強度の時系列データと前記第２の蛍光強度の時系列データとの間で相互相関関数を算出することにより、前記第１の測定対象物と前記第２の測定対象物の結合の程度を判定する分析部と、を有する。
【００１２】
その際、前記分析部は、前記相互相関関数の値が高いほど前記結合の程度は高いと判定する、ことが好ましい。
【００１３】
また、前記第１の測定対象物と前記第２の測定対象物とが結合したとき、前記第１の蛍光物質から前記第２の蛍光物質へのエネルギー移動が生じ、移動したエネルギーにより前記第２の蛍光物質が蛍光を発するように、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質は選択される。この場合、前記第１の処理信号は、前記第１の蛍光の前記変調信号に対する位相遅れの情報を含み、前記分析部は、前記第１の処理信号から算出される前記位相遅れの情報を用いて前記第１の蛍光の蛍光緩和時間を求め、前記第１の蛍光強度の時系列データの自己相関関数を算出することにより、前記第１の蛍光物質の前記試料中の濃度を算出し、さらに、前記第２の蛍光強度の時系列データの自己相関関数を算出することにより、前記第２の蛍光物質の前記試料中の濃度を算出し、前記第１の蛍光の前記蛍光緩和時間と、前記第１の蛍光物質の前記試料中の濃度と、前記第２の蛍光物質の前記試料中の濃度とを用いて、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質との間の結合における解離定数を算出する、ことが好ましい。
【００１４】
この場合、前記分析部は、前記第１の蛍光物質に対する前記第２の蛍光物質の濃度を変化させることにより得られる前記第１の蛍光物質の発する蛍光緩和時間の最小値と最大値を予め記録保持し、前記解離定数を算出するとき前記最小値と前記最大値を用いる、ことが好ましい。
【００１５】
さらに、当該装置は、前記試料と前記受光部との間の光路上には、前記第１の蛍光および前記第２の蛍光を前記第１の受光素子および前記第２の受光素子の前面で集束させるレンズ系と、前記第１の蛍光及び前記第２の蛍光の集束位置に設けたピンホールと、を有する、ことが好ましい。
【００１６】
また、前記データ処理部は、前記第２の蛍光信号を前記第１の変調周波数の変調信号とミキシングして得られるミキシング信号から、前記第２変調周波数と前記第１の変調周波数との差分の周波数成分を抽出することにより、前記第２の処理信号を生成する、ことが好ましい。
【００１７】
さらに本発明の別の一態様は、第１の測定対象物および第２の測定対象物を含む試料にレーザ光を照射することにより、前記第１の測定対象物および前記第２の測定対象物から発する蛍光を分析する蛍光分析方法である。当該方法は、
前記第１の測定対象物中の第１の蛍光物質を励起する波長を有し、第１の変調周波数で強度変調された第１のレーザ光と、前記第２の測定対象物中の第２の蛍光物質を励起する波長を有し、第２の変調周波数で強度変調された第２のレーザ光とを合成したレーザ光を前記試料に一定時間照射し、
合成した前記レーザ光の照射を受けた前記第１の蛍光物質の発する第１の蛍光を第１の受光素子で受光して第１の蛍光信号を出力し、さらに、合成した前記レーザ光の照射を受けた前記第２の蛍光物質の発する第２の蛍光を第２の受光素子で受光して第２の蛍光信号を出力し、
前記第１の蛍光信号を前記第１の変調周波数の変調信号とミキシングすることにより前記第１の蛍光の強度を表す第１の蛍光強度の成分を含む第１の処理信号を生成し、前記第２の蛍光信号を前記変調信号とミキシングすることにより前記第２の蛍光の強度を表す第２の蛍光強度の成分を含む第２の処理信号を生成し、
前記第１の処理信号と前記第２の処理信号から前記第１の蛍光強度と前記第２の蛍光強度の前記一定時間の時系列データを算出し、
前記第１の蛍光強度の時系列データと前記第２の蛍光強度の時系列データとの間で相互相関関数を算出することにより、前記第１の測定対象物と前記第２の測定対象物の結合の程度を判定する、ステップを有する。
【００１８】
その際、前記結合の程度の判定では、前記相互相関関数の値が高いほど前記結合の程度は高いと判定する、ことが好ましい。
【００１９】
また、前記第１の測定対象物と前記第２の測定対象物とが結合したとき、前記第１の蛍光物質から、前記第２の蛍光物質へのエネルギー移動が生じ、移動したエネルギーにより前記第２の蛍光物質が蛍光を発するように、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質は選択される。この場合、前記第１の処理信号は、前記第１の蛍光の前記変調信号に対する位相遅れの情報を含む。前記第１の処理信号および前記第２の処理信号を生成するとき、前記第１の処理信号を用いて前記第１の蛍光の蛍光緩和時間を求める。また、前記第１の蛍光強度の時系列データの自己相関関数を算出することにより、前記第１の蛍光物質の前記試料中の濃度を算出し、さらに、前記第２の蛍光強度の時系列データの自己相関関数を算出することにより、前記第２の蛍光物質の前記試料中の濃度を算出する。前記第１の蛍光の前記蛍光緩和時間と、前記第１の蛍光物質の前記試料中の濃度と、前記第２の蛍光物質の前記試料中の濃度とを用いて、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質との間の結合における解離定数を算出する、ことが好ましい。
【００２０】
前記第１の蛍光物質に対する前記第２の蛍光物質の濃度を変化させることにより得られる前記第１の蛍光物質の発する蛍光緩和時間の最小値と最大値を予め記録保持し、前記解離定数を算出するとき前記最小値と前記最大値を用いる、ことが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本実施形態の蛍光分析装置および蛍光分析方法によれば、従来とは異なる方式によりＦＣＣＳにおけるクロストークを低減することができ、これに加えて、測定対象物間の分子間相互作用を定量的に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本実施形態の蛍光分析装置の概略構成図である。
【図２】本実施形態の蛍光分析装置のレーザ光出射部の構成図である。
【図３】本実施形態の蛍光分析装置のデータ処理部を説明する図である。
【図４】本実施形態の蛍光分析装置のデータ処理部の構成図である。
【図５】本実施形態の蛍光分析装置の分析部の構成図である。
【図６】（ａ），（ｂ）は、試料中の測定対象分子の挙動と蛍光強度と相互相関関数を説明する図である。
【図７】（ａ）〜（ｃ）は、試料中の測定対象分子の挙動と自己相関関数を説明する図である。
【図８】本実施形態の蛍光分析方法のフローの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の蛍光分析装置および蛍光分析方法を、本実施形態に基づいて詳細に説明する。
【００２４】
（蛍光分析装置の概要）
図１は、本実施形態の蛍光分析装置（以降、装置という）１０の概略構成図である。
装置１０は、第１の測定対象分子および第２の測定対象分子を含む試料１２にレーザ光を照射することにより、第１の測定対象分子および第２の測定対象分子を標識化した蛍光分子が発する蛍光を分析する。蛍光の分析では、第１の測定対象分子と第２の測定対象分子が結合する程度を判定するとともに、第１の測定対象分子および第２の測定対象分子を標識化した蛍光分子間の結合における解離定数ＫdをＦＲＥＴが生じた蛍光の測定結果から算出する。解離定数Ｋdは、第１の測定対象分子と第２の測定対象分子に標識として用いる蛍光分子の濃度に依存しない値であり、標識に用いた蛍光分子間の結合の程度を定量的に表しているので、分子間相互作用の強さとして好適に用いることができる。
なお、第１の測定対象分子と第２の測定対象分子の標識として用いる蛍光分子は、第１の測定対象分子と第２の測定対象分子が分子結合をして離間距離が数ｎｍ以下になるとき、ＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を起こし、移動したエネルギーにより蛍光を発するように選択された蛍光分子である。ＦＲＥＴが発生するには、ＦＲＥＴによるエネルギーを提供するドナー蛍光分子となる蛍光分子の蛍光放射波長帯域が、ＦＲＥＴによるエネルギーの提供を受けるアクセプタ蛍光分子となる蛍光分子のエネルギー吸収の波長帯域とが一部分で重なっていること、および、両蛍光分子の配向（双極子モーメントの向き）が適切であることが条件である。したがって、本実施形態で用いるドナー蛍光分子およびアクセプタ蛍光分子として、上記条件を備えるものが選択される。以降では、第１の測定対象分子を標識するための第１の蛍光分子をドナー蛍光分子とし、第２の測定対象分子を標識するための第２の蛍光分子をアクセプタ蛍光分子とする。
【００２５】
装置１０は、ドナー蛍光分子で標識された第１の測定対象分子とアクセプタ蛍光分子で標識された第２の測定対象分子を含む試料１２をプレパラート１４に載せて、ドナー蛍光分子を励起するレーザ光とアクセプタ蛍光分子を励起するレーザ光を合成したレーザ光を用いて試料１２を照射する。このとき、ドナー蛍光分子を励起するレーザ光は、第１の変調周波数で強度変調され、アクセプタ蛍光分子を励起するレーザ光は、第２の変調周波数で変調される。
装置１０は、試料１２の発する蛍光を、ドナー蛍光分子の蛍光波長帯域とアクセプタ蛍光分子の蛍光波長帯域に分けて受光し、ドナー蛍光信号とアクセプタ蛍光信号を出力する。
装置１０は、ドナー蛍光信号およびアクセプタ蛍光信号をいずれも第１の変調周波数の変調信号を用いて検波することにより、ドナー蛍光分子の蛍光強度の時系列データと蛍光緩和時間を求め、アクセプタ蛍光分子の蛍光強度の時系列データを求める。更に装置１０は、ドナー蛍光分子の蛍光強度の時系列データとアクセプタ蛍光分子の蛍光強度の時系列データとの相互相関関数を求め、求めた相互相関関数を用いて、第１の測定対象分子と第２の測定対象分子の結合の程度を判定する。
さらに、装置１０は、求めたドナー蛍光分子が発する蛍光の蛍光緩和時間と、ドナー蛍光分子の蛍光強度の時系列データから算出されるドナー蛍光分子の試料１２中の濃度と、アクセプタ蛍光分子の蛍光強度の時系列データから算出されるアクセプタ蛍光分子の試料１２中の濃度と、を用いて、ドナー蛍光分子とアクセプタ蛍光分子との間の結合における解離定数Ｋdを求める。
【００２６】
（蛍光分析装置）
装置１０は、図１に示すように、レーザ光出射部１６と、受光部１８と、データ処理部２０と、分析部２４と、を主に有する。この他に、装置１０は、ダイクロイックミラー２６，２７と、対物レンズ２８と、フィルター３０，３２と、ピンホール３４，３６を、レーザ光及び蛍光の光路上に光学素子として有する。
【００２７】
レーザ光出射部１６は、第１の測定対象分子中のドナー蛍光分子を励起する波長を有し、第１の変調周波数ｆ1で強度変調されたレーザ光Ｌ1と、第２の測定対象分子中のアクセプタ蛍光分子を励起する波長を有し、第２の変調周波数ｆ2（＝ｆ1＋Δｆ）で強度変調されたレーザ光Ｌ2を合成したレーザ光を一定時間出射する。図２は、レーザ光出射部１６のブロック構成図である。
レーザ光出射部１６は、レーザ光源３８ａ，３８ｂと、レーザドライバ４０ａ，４０ｂと、発振回路４２と、ミラー４４と、ダイクロイックミラー４６と、を有する。レーザ光源３８ａは、可視光のレーザ光Ｌ1、例えば４４５ｎｍの波長のレーザ光を出射する半導体レーザ光源であり、ドナー蛍光分子を励起する。レーザ光源３８ｂは、可視光のレーザ光Ｌ2、例えば４７３ｎｍの波長のレーザ光を出射する半導体レーザ光源であり、アクセプタ蛍光分子を励起する。
【００２８】
レーザドライバ４０ａ，４０ｂは、レーザ光Ｌ1，Ｌ2の出射および強度を制御する駆動信号を生成し、レーザ光源３８ａ，３８ｂに提供する。
発振回路４２は、発振器を有し、変調周波数ｆ1の変調信号および変調周波数ｆ2の変調信号をレーザドライバ４０ａ，４０ｂに提供する。発振回路４２は、変調周波数ｆ1の変調信号と、変調周波数ｆ2の変調信号を別々に生成するために発振器を２つ備える。
レーザ光源３８ａ，３８ｂのレーザ光Ｌ1，Ｌ2は、変調周波数ｆ1の変調信号および変調周波数ｆ2の変調信号に基づいて制御されるので、レーザ光Ｌ1，Ｌ2はそれぞれ、変調周波数ｆ1，ｆ2で強度変調される。ダイクロイックミラー４６は、波長に応じて反射、透過特性が変化し、レーザ光Ｌ1を透過し、レーザ光Ｌ2を反射する素子である。
レーザ光Ｌ2は、レーザ光源１６ｂから出射したのち、ミラー４４で反射され、さらに、ダイクロイックミラー４６で反射され、ダイクロイックミラー４６を透過したレーザ光Ｌ1と合成されて、１つのレーザ光Ｌとなってレーザ光出射部１６から出射する。
【００２９】
レーザ光出射部１６から試料１２に至るレーザ光Ｌの光路上には、図１に示すように、ダイクロイックミラー２６と、対物レンズ２８とが設けられる。試料１２から蛍光が受光部１８（１８ａ，１８ｂ）で受光されるまでの光路上には、対物レンズ２８と、ダイクロイックミラー２６，２７と、フィルター３０，３２と、ピンホール３４，３６とが設けられる。すなわち、レーザ光Ｌおよび蛍光は、ダイクロイックミラー２６と試料１２との間の光路上をお互いに逆方向に進む。
【００３０】
対物レンズ２８は、レーザ光Ｌを試料１２中の一点に集束させるために用いられる。レーザ光Ｌを集束させるのは、後述するようにＦＣＳ（Fluorescence Correlation Spectroscopy）やＦＣＣＳ（Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy）を用いて蛍光の分析を行うためである。集束したレーザ光Ｌのサイズは、例えば、直径０．４μｍ程度である。また、レーザ光Ｌによる蛍光の計測可能な奥行き方向の長さＬを１〜２μｍ程度（焦点深度の上限を１μｍ）とする。すなわち、装置１０は、第１の測定対象分子および第２の測定対象分子の揺らぎ運動に基く蛍光強度の時系列データの変動を用いて、第１の測定対象分子および第２の測定対象分子の結合の程度や解離定数Ｋdを算出するために、レーザ光Ｌにおける蛍光の測定範囲を極めて狭くする。
また、対物レンズ２８を通過した蛍光は、ダイクロイックミラー２６を透過し、さらにダイクロイックミラー２７で蛍光の波長に応じて蛍光は透過あるいは反射され、ピンホール３２，３６で集束するように設けられている。すなわち、装置１０は共焦点光学系を有する。このため、蛍光は高いＳＮ比で受光される。
ダイクロイックミラー２６は、レーザ光Ｌを反射し、試料１２から発する蛍光を透過するように、波長に対する反射及び透過特性が設定されている。ダイクロイックミラー２７は、ダイクロイックミラー２６を透過した蛍光のうち、ドナー蛍光分子が発するドナー蛍光を透過し、アクセプタ蛍光分子が発する蛍光を反射するように、波長に応じた反射及び透過特性が設定されている。
フィルター３０は、ドナー蛍光分子が発するドナー蛍光を受光部１８ａで受光できるように透過し、フィルター３２は、アクセプタ蛍光分子が発する蛍光を受光部１８ａで受光できるように透過する。すなわち、フィルター３０，３２は、ドナー蛍光分子およびアクセプタ蛍光分子が発する蛍光を分離する。
【００３１】
受光部１８ａ，１８ｂは、ドナー蛍光分子が発する蛍光と、アクセプタ蛍光分子が発する蛍光をそれぞれ別々に受光する受光素子を有する。受光素子には、例えば、光電子増倍管あるいはアバランシェフォトダイオードが用いられる。
受光部１８ａは、ドナー蛍光分子が発する蛍光を受光することにより、ドナー蛍光信号を出力し、受光部１８ｂは、アクセプタ蛍光分子が発する蛍光を受光することにより、アクセプタ蛍光信号を出力する。
【００３２】
データ処理部２０は、図３に示すように、受光部１８ａから出力されたドナー蛍光信号を処理するドナーデータ処理部２０ａと受光部１８ｂから出力されたアクセプタ蛍光信号を処理するアクセプタデータ処理部２０ｂと、を有する。データ処理部２０は、ハードウェアで構成された回路と、ソフトウェアで構成されたソフトウェアモジュールとを有する。すなわち、データ処理部２０の一部は、ＣＰＵ等のプロセッサと、ＲＡＭやＲＯＭ等のメモリと、を有し、メモリに記憶されたプログラムをプロセッサが起動することにより、ソフトウェアモジュールが生成される。例えば、後述するＦＦＴ変換部６０ａ，６２ａ（６０ｂ，６２ｂ）と、位相遅れ算出部６４ａ（６４ｂ）と、蛍光強度算出部６６ａ（６６ｂ）と、がソフトウェアモジュールに対応する。
ドナーデータ処理部２０ａ，アクセプタデータ処理部２０ｂのそれぞれは、同じ構成および機能を有し、受光部１８から出力されたドナー蛍光信号、アクセプタ蛍光信号と、レーザ光出射部１６で生成された変調周波数ｆ1の変調信号とを用いて、ドナー蛍光、アクセプタ蛍光の変調信号に対する位相遅れ角度を算出し、さらに、ドナー蛍光分子、アクセプタ蛍光分子が発する蛍光の蛍光強度の時系列データを算出する。
従って、以降では、ドナーデータ処理部２０ａを中心に説明する。「（  ）」は、アクセプタ処理部２０ｂに関する符号及び内容を示す。
ドナーデータ処理部２０ａ（２０ｂ）は、ドナー蛍光信号（アクセプタ蛍光信号）を変調周波数ｆ1の変調信号とミキシングするミキサ５０ａ（５０ｂ）と、発振回路４２から出力された変調信号の位相を９０度シフトする９０度移相器５４ａ（５４ｂ）と、ＡＤ変換器５６a，５８ａ（５６ｂ，５８ｂ）と、ＦＦＴ変換部６０ａ，６２ａ（６０ｂ，６２ｂ）と、位相遅れ算出部６４ａ（６４ｂ）と、蛍光強度算出部６６ａ（６６ｂ）と、を有する。
【００３３】
ミキサ５０ａ（５０ｂ）は、ドナー蛍光信号（アクセプタ蛍光信号）と、９０度移相器５４ａ（５４ｂ）により位相が９０度シフトした変調周波数ｆ1の変調信号とミキシングする。
ミキサ５２ａ（５２ｂ）は、ドナー蛍光信号（アクセプタ蛍光信号）と変調周波数ｆ1の変調信号とミキシングする。
ＡＤ変換器５６ａ（５６ｂ）は、ミキサ５０ａ（５０ｂ）で得られた処理信号をデジタルデータに変換し、さらに、ＦＦＴ変換部６０ａ（６０ｂ）は、デジタルデータをＦＦＴ処理し、ミキシングされた信号のＤＣ成分の時系列データと、周波数Δｆにおける時系列データを抽出する。周波数Δｆは、第１の変調周波数ｆ1と第２の変調周波数ｆ2（＝ｆ1＋Δｆ）の差分周波数である。
また、ＡＤ変換器５８ａ（５８ｂ）は、ミキサ５２ａ（５２ｂ）で得られた処理信号をデジタルデータに変換し、さらに、ＦＦＴ変換部６２ａ（６２ｂ）は、デジタルデータをＦＦＴ処理し、ミキシングされた信号のＤＣ成分の時系列データと、周波数Δｆにおける時系列データを抽出する。
【００３４】
位相遅れ算出部６４ａ（６４ｂ）は、ＦＦＴ変換部６０ａ（６０ｂ）で抽出されたＤＣ成分の時系列データとＦＦＴ変換部６２ａ（６２ｂ）で抽出されたＤＣ成分の時系列データとを用いて、ドナー蛍光信号（アクセプタ蛍光信号）の、第１の変調周波数ｆ1の変調信号に対する位相の遅れを算出する。具体的には、位相遅れ算出部６４ａ（６４ｂ）は、ＦＦＴ変換部６０ａ（６０ｂ）で抽出されたＤＣ成分の時系列データを、各時間毎にＦＦＴ変換部６２ａ（６２ｂ）で抽出されたＤＣ成分の時系列データで割り算し、その結果をｔａｎの逆変換を行うことにより、ＤＣ成分における位相遅れ角度を算出する。位相遅れ算出部６４ａ（６４ｂ）は、同様に、周波数Δｆ成分における位相遅れ角度も算出する。
位相遅れ算出部６４ａ（６４ｂ）は、時系列データを処理するので、算出される位相遅れ角度も時系列データとして得られる。この場合、位相遅れ算出部６４ａ（６４ｂ）は、算出した位相遅れ角度の時系列データの平均値等を算出して、位相遅れ角度を求める。求めた位相遅れ角度は、分析部２４に送られる。
【００３５】
蛍光強度算出部６６ａ（６６ｂ）は、ＦＦＴ変換部６０ａ（６０ｂ）で抽出されたＤＣ成分、周波数Δｆの時系列データとＦＦＴ変換部６２ａ（６２ｂ）で抽出されたＤＣ成分、周波数Δｆの成分の時系列データとを用いて、ドナー蛍光（アクセプタ蛍光）の蛍光強度の時系列データを算出する。具体的には、ＦＦＴ変換部６０ａ（６０ｂ）で抽出されたＤＣ成分の時系列データＩ（ｔ）とＦＦＴ変換部６２ａ（６２ｂ）で抽出されたＤＣ成分の時系列データＲ（ｔ）としたとき、蛍光強度算出部６６ａ（６６ｂ）は、Ｐ（ｔ）＝（Ｒ（ｔ）2＋Ｉ（ｔ）2）(1/2)を算出する。蛍光強度算出部６６ａ（６６ｂ）は、同様に、周波数Δｆ成分におけるＰ（ｔ）も算出する。算出した蛍光強度の時系列データＰ（ｔ）は、分析部２４に送られる。
このように、ドナー蛍光分子とアクセプタ蛍光分子が励起されるレーザ光の変調周波数がお互いに異なるので、ドナー蛍光分子の発する蛍光と、アクセプタ蛍光分子の発する蛍光は異なる周波数で強度変調される。このため、ドナー蛍光分子の発する蛍光とアクセプタ蛍光分子の発する蛍光とが、ミキサ５０ａ（５０ｂ），５２ａ（５２ｂ）によるミキシング処理を用いて完全に分離され得る。
【００３６】
図５は、分析部２４の構成図である。
分析部２４は、ＦＣＣＳ判定部７０と、蛍光緩和時間算出部７２と、蛍光分子濃度算出部７４と、解離定数算出部７６と、を有する。
ＦＣＣＳ判定部７０は、ドナーデータ処理部２０ａで算出されたドナー蛍光分子の発する蛍光の蛍光強度の時系列データと、アクセプタデータ処理部２０ｂで算出されたアクセプタ蛍光分子の発する蛍光の蛍光強度の時系列データとの間で相互相関関数を算出することにより、第１の測定対象分子と第２の測定対象分子の結合の程度を判定する。
【００３７】
このとき、上述したように、データ処理部１８において、ミキサ５０ａ（５０ｂ），５２ａ（５２ｂ）は、ドナー蛍光分子の発する蛍光とアクセプタ蛍光分子の発する蛍光とを、ミキシング処理を用いて完全に分離することができるので、ドナー蛍光分子の発する蛍光の蛍光強度がアクセプタ蛍光分子の発する蛍光の蛍光強度の時系列データに漏れ込むことはない。このため、相互相関関数を算出することにより、第１の測定対象分子と第２の測定対象分子の結合の程度を正確に判定することができる。
【００３８】
図６（ａ）に示すように第１の測定対象分子と第２の測定対象分子が結合するとき、第１の測定対象分子と第２の測定対象分子は同じ揺らぎをするので、ドナー蛍光分子の発する蛍光の蛍光強度の時系列データとアクセプタ蛍光分子の発する蛍光の蛍光強度の時系列データとの相互相関関数を算出し、この算出結果から、第１の測定対象分子と第２の測定対象分子の結合の程度を判定することができる。
図６（ｂ）に示すように、第１の測定対象分子と第２の測定対象分子が結合しないとき、第１の測定対象分子と第２の測定対象分子は同じように揺らがないので、上記相互相関関数では値が発生しない。したがって、ＦＣＣＳ判定部７０では、相互相関関数の最大値となる値、あるいは、最大値を基準として一定の範囲（例えば最大値以下、最大値の９０％以上の範囲）内における値の平均値を用いて、第１の測定対象分子と第２の測定対象分子の結合の程度を判定することができる。すなわち、ＦＣＣＳ判定部７０は、上記相関関数の値が高いほど、結合の程度は高いと判定する。
【００３９】
蛍光緩和時間算出部７２は、位相遅れ算出部６４ａで求めたドナー蛍光分子が発する蛍光の位相遅れ角度を用いて、ドナー蛍光分子の発する蛍光の蛍光緩和時間を算出する。具体的には、ドナー蛍光分子の発する蛍光が１次緩和過程に近い挙動を示すことから、蛍光緩和時間算出部７２は、蛍光緩和時間τdを、ｔａｎ(θd)／（２πｆ1）(θdは位相遅れ角度)に従って算出する。
算出された蛍光緩和時間τdは解離定数算出部７６に送られる。
なお、蛍光強度算出部６６ａで算出された周波数Δｆの成分における蛍光強度及び位相遅れ角度の時系列データ、すなわち、アクセプタ蛍光分子を励起するレーザ光で励起されるドナー蛍光分子が発する蛍光の強度及び位相遅れ角度の時系列データは用いられない。同様に、蛍光強度算出部６６ｂで算出されたＤＣ成分における蛍光強度及び位相遅れ角度の時系列データ、すなわち、ドナー蛍光分子を励起するレーザ光で励起されるアクセプタ蛍光分子が発する蛍光の強度及び位相遅れ角度の時系列データは用いられない。
【００４０】
蛍光分子濃度算出部７４は、ドナー蛍光分子の発する蛍光の蛍光強度の時系列データの自己相関関数を算出することにより、ドナー蛍光分子の試料１２中の濃度を算出し、さらに、アクセプタ蛍光分子の発する蛍光の蛍光強度の時系列データの自己相関関数を算出することにより、アクセプタ蛍光分子の試料１２中の濃度を算出する。
図７（ａ）〜（ｃ）は、レーザ光Ｌの集束位置における第１の測定対象分子あるいは第２の測定対象分子の分子運動による揺らぎによる蛍光強度の時系列データを説明する図である。
【００４１】
上述したように、レーザ光Ｌは、対物レンズ２８により小さく集束し、その集束により作られるレーザ光Ｌの計測範囲は、例えば数フェムトリットル程度の狭い範囲である。このため、レーザ光Ｌを照射する計測範囲には、第１の測定対象分子に付いたドナー蛍光分子あるいは第２の測定対象分子についたアクセプタ蛍光分子が数１０個程度しか含まれず、ドナー蛍光分子およびアクセプタ蛍光分子の蛍光強度に時間的な揺らぎが生じる。例えば、図７（ａ）に示すように、ドナー蛍光分子あるいはアクセプタ蛍光分子が計測範囲Ｘから外に移動し、あるいは、計測範囲Ｘ内に進入する。このため、蛍光強度も、図７（ｂ）に示すように変動する。
【００４２】
したがって、このような蛍光強度の時系列データの自己相関関数は、図７（ｃ）に示すように、ドナー蛍光分子を備える第１の測定対象分子あるいはアクセプタ蛍光分子を備える第２の測定対象分子の分子が小さい場合、揺らぎの速度は速くなるので、自己相関関数が一定の値を有する幅は狭くなる、すなわち自己相関関数の形状は実線から点線に、すなわち矢印Ａ方向に変化する。一方、ドナー蛍光分子を備える第１の測定対象分子あるいはアクセプタ蛍光分子を備える第２の測定対象分子の分子数が多くなると、揺らぎは小さくなるので矢印Ｂ方向に自己相関関数の形状は変化する。図７（ｃ）は、自己相関関数の理想的な形状を示しているが、実際に得られる自己相関関数においてもこの特徴は変わらない。
ここで、第１の測定対象分子に標識として取り付けられたドナー蛍光分子あるいは第２の測定対象分子に標識として取り付けられたアクセプタ蛍光分子の分子数は、蛍光強度の時系列データから求めた自己相関関数の一定の値をとるレベルＹ（図７（ｃ）参照）から１を引き、その結果の逆数が、上記レーザ光Ｌの計測範囲内にある分子数である、ことが知られている。従って、この分子数を算出することにより、ひいては、試料１２中のドナー蛍光分子の濃度の情報、アクセプタ蛍光分子の濃度の情報を算出することができる。自己相関関数から濃度の情報を算出する際、上記レベルＹから１を引き、その結果の逆数に予め設定された定数を乗算することにより、濃度の情報が得られる。
すなわち、蛍光分子濃度算出部７４は、ドナー蛍光分子の発する蛍光の蛍光強度の時系列データの自己相関関数から一定の値となるときの自己相関関数の値を算出し、この値から１を減算し、その結果の逆数を求めることにより、ドナー蛍光分子の濃度の情報を求める。同様に、蛍光分子濃度算出部７４は、アクセプタ蛍光分子の発する蛍光の蛍光強度の時系列データについて、上記処理を行うことにより、アクセプタ蛍光分子の濃度の情報を求める。
こうして求められたドナー蛍光分子、アクセプタ蛍光分子の濃度の情報は、解離定数算出部７６に送られる。
【００４３】
解離定数算出部７６は、蛍光緩和時間算出部７２で求められたドナー蛍光分子の発する蛍光の蛍光緩和時間と、ドナー蛍光分子の試料１２中の濃度の情報と、アクセプタ蛍光分子の試料１２中の濃度の情報とを用いて、ドナー蛍光分子とアクセプタ蛍光分子の解離定数Ｋdを下記式（１）に沿って算出する。
【００４４】
【数１】
2012173252.tif 000003
ここで、αおよびΚFRETは、下記式（２），（３）に従って算出される。ＣDは求めたドナー蛍光分子の試料１２中の濃度の情報であり、ＣAは求めたアクセプタ蛍光分子の試料１２中の濃度の情報である。
【００４５】
【数２】
2012173252.tif 000004
【００４６】
【数３】
2012173252.tif 000005
ここで、τ＊Dは、蛍光緩和時間算出部７２で求められたドナー蛍光分子の発する蛍光の蛍光緩和時間τdであり、τDは、アクセプタ蛍光分子がなくドナー蛍光分子単体で計測されたときの蛍光緩和時間である。また、τDは、ドナー蛍光分子に対するアクセプタ蛍光分子の濃度を変化させることにより得られるドナー蛍光分子の発する蛍光緩和時間の最大値でもある。τDminは、ドナー蛍光分子に対するアクセプタ蛍光分子の濃度を変化させることにより得られるドナー蛍光分子の発する蛍光緩和時間の最小値である。また、ωは２πｆ1である。τD及びτDminは、分析部２４の図示されないメモリに予め記録保持されたものである。このようなτD及びτDminは、例えば、ドナー蛍光分子に対するアクセプタ蛍光分子の濃度を変化させることにより、ドナーの蛍光緩和時間の最大値及び最小値として求めることができる。
なお、τDminは、ドナー蛍光分子に対してアクセプタ蛍光分子の濃度は高く、ドナー蛍光分子のすべてがアクセプタ蛍光分子とＦＲＥＴを通してエネルギー移動を行うときのドナー蛍光分子の発する蛍光の蛍光緩和時間である。
【００４７】
（式（１），(３)の導出）
このような解離定数Ｋdの算出式は、以下のような考えに基く。
ドナー蛍光分子は、アクセプタ蛍光分子との間でＦＲＥＴが発生せず、励起したエネルギーを放出して蛍光を発するドナー蛍光分子と、励起したエネルギーをアクセプタ蛍光分子との間でＦＲＥＴを通して放出するドナー蛍光分子とを、（１−ΚFRET）：ΚFRETの個数で含む。ここで、蛍光の発光過程およびＦＲＥＴによるエネルギー移動の緩和過程が１次緩和過程に従うとしたとき、アクセプタ蛍光分子との間でＦＲＥＴが生じずにエネルギーを放出して蛍光を発するドナー蛍光分子の速度定数をｋDとし、アクセプタ蛍光分子との間でＦＲＥＴが生じエネルギーを放出するドナー蛍光分子の速度定数を（ｋD＋kt）とすることができる。ktは、ＦＲＥＴによるＦＲＥＴによるエネルギー移動の速度定数である。
したがって、ドナー蛍光分子の発する蛍光およびエネルギー移動の伝達関数は、下記式（４）のように１次緩和過程のラプラス形式で表される。式（４）の右辺の第１項がＦＲＥＴ発生に基くエネルギー移動の緩和過程の項であり、第２項がＦＲＥＴの発生しない蛍光の発光過程の項である。
【００４８】
【数４】
2012173252.tif 000006
【００４９】
一方、上記式ΚFRETは、ＦＲＥＴが発生するドナー蛍光分子濃度をＣDAとすると、
ＣDA  ＝  ΚFRET・ＣD
と表すことができる。
また、解離定数Ｋdは、以下のように定義されるので、
Ｋd  ＝  ＣDfree・ＣAfree／ＣDA＝（ＣD−ＣDA）・（ＣA−ＣDA）／ＣDA
合わされる。ＣDfree，ＣAfreeは、ドナー蛍光分子及びアクセプタ蛍光分子が結合しておらず、ＦＲＥＴが発生しないドナー蛍光分子及びアクセプタ蛍光分子の濃度を表す。したがって、上記解離定数Ｋdの式を書き改めることにより、上記式（１）を導出することができる。
【００５０】
一方、上記式（４）中の速度定数ｋDを１／τD（τDはドナー蛍光分子単体の蛍光緩和時定数）と表し、速度定数（ｋD＋kt）を１／τDminと表すことができるので、周波数応答の形式（ｓ＝ｊω、ω＝２πｆ1）で下記式（５）のように表される。
【００５１】
【数５】
2012173252.tif 000007
【００５２】
上記式（５）の周波数応答の位相遅れから求められる蛍光緩和時間が、蛍光緩和時間算出部７２で求められるドナー蛍光分子の発する蛍光の蛍光緩和時間τ*Dに等しい。このため、この関係を用いて、上記式（３）を求めることができる。
すなわち、本実施形態は、ドナー蛍光分子の発する蛍光の発光過程とＦＲＥＴによるエネルギー移動の過程を１次緩和過程で表し、かつ、蛍光強度の時系列データの自己相関関数から算出されるドナー蛍光分子及びアクセプタ蛍光分子の濃度を算出することにより、ＦＲＥＴの発生するときのドナー蛍光分子とアクセプタ蛍光分子の解離定数Ｋdを算出することができる。
なお、分析部２４は、コンピュータのメモリに記憶されたプログラムを実行することにより生成されるソフトウェアモジュールが用いられて構成される。なお、データ処理部２０および分析部２４は、１つのコンピュータによって作られるソフトウェアモジュールと専用装置で構成することもできる。
【００５３】
（蛍光分析方法）
図８は、本実施形態の蛍光分析法のフローを示す図である。
まず、レーザ光出射部１６は、レーザ光Ｌ1とレーザ光Ｌ2とを合成したレーザ光Ｌを試料１２に一定時間照射する（ステップＳ１０）。このとき、レーザ光Ｌ1は、変調周波数ｆ1で強度変調され、レーザ光Ｌ2は、変調周波数ｆ2で強度変調されている。
次に、受光部１８ａはドナー蛍光分子の発する蛍光を受光し、受光部１８ｂはアクセプタ蛍光分子の発する蛍光を受光する（ステップＳ２０）。このとき、受光部１８ｂでは、ドナー蛍光分子が発する蛍光の一部を漏れ込み光として受光する。すなわち、受光部１８ｂの出力する受光信号は変調周波数ｆ1の成分を含む。
【００５４】
次に、データ処理部２０は、ドナー蛍光信号を変調周波数ｆ1の変調信号とミキシングすることによりＤＣ成分にドナー蛍光分子の発する蛍光の強度の成分を含む第１の処理信号を生成し、アクセプタ蛍光信号を変調周波数ｆ1の変調信号とミキシングすることにより周波数Δｆにおいてアクセプタ蛍光分子の発する蛍光の強度の成分を含む第２の処理信号を生成する。
【００５５】
さらに、データ処理部２０は、生成した第１の処理信号を用いて、ドナー蛍光分子の発する蛍光の上記変調信号に対する位相遅れを算出する。また、データ処理部２０は、第１の処理信号と第２の処理信号からＦＦＴ変換器６０ａ，６２ａ（６０ｂ，６２ｂ）を通してドナー蛍光分子の蛍光強度とアクセプタ蛍光分子の蛍光強度の時系列データを算出する（ステップＳ３０）。
【００５６】
この後、分析部２４は、ステップＳ３０で算出したドナー蛍光分子の蛍光強度の時系列データとアクセプタ蛍光分子の蛍光強度の時系列データとの間の相互相関関数を算出する。この算出結果により、分析部２４は、ドナー蛍光分子を標識として付着した第１の測定対象分子とアクセプタ蛍光分子を標識として付着した第２の測定対象分子との間の結合の程度を判定する（ステップＳ４０）。判定結果は、図示されないプリンタやディスプレイに出力される。判定では、相互相関関数の値が高いほど結合の程度は高いと判定される。分析部２４は、また、データ処理部２０で生成した第３の処理信号を用いてドナー蛍光分子の発する蛍光の蛍光緩和時間を求める。
【００５７】
さらに、分析部２４は、ステップＳ３０で算出したドナー蛍光分子の蛍光強度の時系列データの自己相関関数を算出することにより、ドナー蛍光分子の試料１２中の濃度を算出し、さらに、アクセプタ蛍光分子の蛍光強度の時系列データの自己相関関数を算出することにより、アクセプタ蛍光分子の試料１２中の濃度を算出する。分析部２４は、求めたドナー蛍光分子の蛍光緩和時間と、ドナー蛍光分子の試料１２中の濃度と、アクセプタ蛍光分子の試料１２中の濃度とを用いて、ドナー蛍光分子とアクセプタ蛍光分子との間の結合における解離定数Ｋdを上記式（１）〜（３）に従って算出する（ステップＳ５０）。解離定数Ｋdが上記式（１）〜（３）に従って算出されるとき、τD，τDminが用いられる。このτD，τDminは、ドナー蛍光分子に対するアクセプタ蛍光分子の濃度を変化させることにより得られるドナー蛍光分子の発する蛍光緩和時間の最大値と最小値であり、分析部２４の図示されないメモリに予め記録保持されたものである。
【００５８】
以上のように、本実施形態では、データ処理部１８のミキサは、ドナー蛍光分子の発する蛍光とアクセプタ蛍光分子の発する蛍光とを、ミキシング処理を用いて完全に分離することができるので、ドナー蛍光分子の発する蛍光の蛍光強度がアクセプタ蛍光分子の発する蛍光の蛍光強度の時系列データに漏れ込むことはない。このため、ＦＣＣＳにおけるクロストークを低減することができ、その結果相互相関関数を用いて、第１の測定対象分子と第２の測定対象分子の結合の程度を正確に判定することができる。
【００５９】
また、本実施形態の分析部２４は、ドナー蛍光分子の発する蛍光の蛍光強度の時系列データからドナー蛍光分子の濃度を算出し、アクセプタ蛍光分子の発する蛍光の蛍光強度の時系列データからアクセプタ蛍光分子の濃度を算出することができるので、解離定数Ｋdを算出することができる。
【００６０】
その際、ドナー蛍光分子に対するアクセプタ蛍光分子の濃度を変化させることにより得られるτD，τDminを予め記録保持するので、解離定数Ｋdを容易に算出することができる。
なお、本実施形態の蛍光分析方法では、解離定数Ｋdを算出するステップＳ５０まで行うが、ステップＳ４０の判定で終了することもできる。この場合、標識に用いる蛍光分子は、ＦＲＥＴが生じるドナー蛍光分子およびアクセプタ蛍光分子の組み合わせを用いなくてもよい。少なくとも異なる蛍光であることが識別できる蛍光分子を用いればよい。
また、本実施形態では、ドナー蛍光分子を標識とした第１の測定対象分子と、アクセプタ蛍光分子を標識とした第２の測定対象分子とが懸濁された溶液を試料１２とすることができる他、試料１２を生細胞や生体物質とし、試料１２中の対象分子を測定対象とすることもできる。
【００６１】
以上、本発明の蛍光分析装置及び蛍光分析方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【符号の説明】
【００６２】
１０  蛍光分析装置
１２  試料
１４  プレパラート
１６  レーザ光出射部
１８，１８ａ，１８ｂ  受光部
２０  データ処理部
２４  分析部
２６，２７，４６  ダイクロイックミラー
２８  対物レンズ
３０，３２  フィルター
３４，３６  ピンホール
３８ａ，３８ｂ  レーザ光源
４０ａ，４０ｂ  レーザドライバ
４２  発振回路
４４  ミラー
５０ａ，５０ｂ  ミキサ
５４ａ，５４ｂ  ９０度移相器
５６a，５８ａ，５６ｂ，５８ｂ  ＡＤ変換器
６０ａ，６２ａ，６０ｂ，６２ｂ  ＦＦＴ変換部
６４ａ，６４ｂ  位相遅れ算出部
６６ａ，６６ｂ  蛍光強度算出部
７０  ＦＣＣＳ判定部
７２  蛍光緩和時間算出部
７４  蛍光分子濃度算出部
７６  解離定数算出部
【図１】
2012173252.tif 000008
【図２】
2012173252.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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