(57)【要約】【課題】  口腔の全細菌数を減少させるばかりでなく、口腔の常在の細菌種の割合を増やすとともに有害な細菌種の割合を減らすよう細菌叢を変化させることができ、又、食品成分を剤として使用することで安全性が高く、この剤の効果を高めるような性質を持ち、特定細菌種への選択性を高めることが可能な簡易な口腔の細菌叢を変化させる方法と口腔細菌叢改善剤提供すること。【解決手段】  カフェインを含有する加温された液で、口腔内を暴露、或いは口腔内に通過させ、口腔の全細菌数を減少させるばかりでなく、常在の細菌種の割合を増やし、有害な細菌種の割合を減らす。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カフェインを０．０２ｗｔ％以上の濃度で含有し、５０℃以上、６０℃以下に加温された液で、口腔内を３０秒間以上暴露し、細菌種間の生存率に差をつけることで、細菌叢を変化させることを特徴とする口腔の細菌叢を変化させる方法。
【請求項２】
カフェインを０．０２ｗｔ％以上の濃度で含有し、５０℃以上、６５℃以下に加温された液を、口腔内に通過させることにより、細菌種間の生存率に差をつけて細菌叢を変化させることを特徴とする口腔の細菌叢を変化させる方法。
【請求項３】
請求項１又は請求項２記載の口腔の細菌叢を変化させる方法において、
上記カフェインは０．０２ｗｔ％以上であって０．６ｗｔ％以下の濃度であることを特徴とする口腔の細菌叢を変化させる方法。
【請求項４】
カフェインを０．０２ｗｔ％以上の濃度で含有していることを特徴とする口腔細菌叢改善剤。
【請求項５】
請求項４記載の口腔細菌叢改善剤において、
上記カフェインは０．０２ｗｔ％以上であって０．６ｗｔ％以下の濃度であることを特徴とする口腔細菌叢改善剤。
【請求項６】
請求項４記載の口腔細菌叢改善液において、
５０℃以上、６５℃以下に加温されていることを特徴とする口腔細菌叢改善液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、口腔の細菌叢を変化させる方法と口腔細菌叢改善剤に係り、特に、ヒト口腔の細菌叢を変化させることを主な目的とし、細菌の生存率を低下させると同時に、常在の細菌種とう蝕原因細菌や歯周病細菌などの有害な細菌種の生存率の低下の状態に差をつけることにより、常在の細菌種を優位にして細菌叢を改善し、口腔をより清潔にすることができるように工夫したものに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト口腔の細菌叢では、「Ｓｔｏｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ」（以下、「Ｓ．ｍｉｔｉｓ」という。）が最も優勢な常在の細菌種（非特許文献１）であり、口腔内の細菌数のおよそ８割を占めるといわれている。Ｓ．  ｍｉｔｉｓなどのレンサ球菌は、「過酸化水素を産生することによって、病原微生物の侵入や定着を抑制していると考えられている」（非特許文献２〜３）。したがって、Ｓ．  ｍｉｔｉｓなどの口腔に常在な細菌種の割合を増やすよう口腔の細菌叢を変化させることは、口腔の衛生状態において重要な意義を持つ。しかし、Ｓ．  ｍｉｔｉｓは、加齢によりその割合が低下するといわれている（非特許文献２、４）。
なお、「Ｓｔｏｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ」（以下、「Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ」という。）なども多く検出される常在の細菌種（非特許文献５）であり、プロバイオティクスに用いられる細菌種である。
【０００３】
一方、口腔の疾病には、主に「う蝕」や「歯周病」などがあり、これらは細菌を原因していることは周知の事実である。さらに、これらの細菌は、近年問題となっており、唾液などを誤嚥して発症する高齢者の誤嚥性肺炎患者から検出される細菌種（非特許文献６）としても知られている。なお、誤嚥性肺炎の起因菌には、日和見感染菌やＳ．  ｍｉｔｉｓと同じ属の「Ｓｔｏｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ」（以下、「Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ」という。）、β溶血性を示すアンギノサスグループのレンサ球菌など（非特許文献７）がある。これらの細菌種の割合を低下させるよう細菌叢を変化させることは、口腔の衛生状態を改善する上で重要である。
【０００４】
細菌叢の変化に関しては、プロバイオティクス（特許文献１〜８）、有害な細菌種の抑制（特許文献９〜１６）、有益な細菌種の増殖と有害な細菌種の抑制（特許文献１７〜１９）、細菌叢の除去（特許文献２０）などに関する剤や方法が提案されている。
ただし、これらの提案の多くは、特定細菌種の増減を比較するのみで、常在の細菌種に対する影響を検証しているものは少ない。また、プロバイオティクスにおいては、これのみでは口腔細菌叢の改善は難しいとの考え（非特許文献２）が示されている。さらに、有害な細菌種を抑制する場合、常在の細菌種をより強く抑制しまうと、結果として細菌叢は有害な細菌種が優勢になっている可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１８９７０９号公報
【特許文献２】特開平１１−１６９１６７号公報
【特許文献３】特開平０５-００４９２７号公報
【特許文献４】特表２００５-５１７４３９号公報
【特許文献５】特表２００３−５３４３６２号公報
【特許文献６】米抄２００５／００７４４１６号公報
【特許文献７】米抄２００３／０１７０１８４号公報
【特許文献８】米抄２００２／００１２６３７号公報
【特許文献９】特開２００３−０８９６４１号公報
【特許文献１０】特開２００２−１２８６９７号公報
【特許文献１１】特開平１１−０６０４５５号公報
【特許文献１２】特開平１０−２９１９２０号公報
【特許文献１３】特開平０５−３１０５４４号公報
【特許文献１４】特表２００７-５２３８９１号公報
【特許文献１５】特表２００７-５０９９２７号公報
【特許文献１６】米抄２００６／０１１０４４７号公報
【特許文献１７】特開２００５−３２０２７５号公報
【特許文献１８】特開平０８−１７５９４７号公報
【特許文献１９】特開平０８−１７５９４６号公報
【特許文献２０】特開２０００−１３９９６２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｍｉｔｈ  他、Ｏｒａｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、  ８、１−４、１９９３年
【非特許文献２】前田  他、歯薬療法、２５（３）、６１−６８、２００６年
【非特許文献３】Ｈｉｌｌｍａｎ  他、Ａｒｃｈ．  Ｏｒａｌ．  Ｂｉｏｌ．、３０、７９１−７９５、１９８５年
【非特許文献４】Ｍｏｒｉｔａ  他、Ｏｒａｌ．  Ｍｉｃｒｏ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９、３８６−３８９、２００４年
【非特許文献５】Ｔａｐｐｕｎｉ  他、Ｊ．  Ｄｅｎｔ．  Ｒｅｓ．、７２、３１−３６、１９９３年
【非特許文献６】Ｂａｒｔｌｅｔｔ  他、Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、５６、２０２−２０、１９７４年
【非特許文献７】花田、口腔内細菌と誤嚥性肺炎. セミナー  わかる！摂食・嚥下リハビリテーション、医歯薬出版、ｐｐ．１４−２５、２００５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記従来の構成によると次のような問題があった。
すなわち、従来の方法によると、口腔の全細菌数を減少させることはできるが、常在の細菌種の割合を増やすとともに有害な細菌種の割合を減らすように細菌叢を変化させることはできず、それらを可能にする方法や剤が求められていた。
なお、それらの方法においては、安全で、剤の効果を高めるような性質を持ち、特定細菌種への選択性を高める簡易な手法が望ましい。
【０００８】
本発明はこのような点に基づいてなされたもので、その目的とするところは、口腔の全細菌数を減少させるばかりでなく、口腔の常在の細菌種の割合を増やすとともに有害な細菌種の割合を減らすよう細菌叢を変化させることができ、又、食品成分を剤として使用することで安全性が高く、この剤の効果を高めるような性質を持ち、特定細菌種への選択性を高めることが可能な簡易な口腔の細菌叢を変化させる方法と口腔細菌叢改善剤提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、細菌種の生存率を指標とした探索を試み、設定した温度範囲に加温されたお茶などの成分であるカフェインを用いることにより、細菌の生存率を低下させるとともに、口腔常在の細菌種の生存率を低下させるが、有害な細菌種の生存率をより低下させることを見出し、本発明を成すに至った。
すなわち、請求項１による口腔の細菌叢を変化させる方法は、カフェインを０．０２ｗｔ％以上の濃度で含有し、５０℃以上、６０℃以下に加温された液で、口腔内を３０秒間以上暴露し、細菌種間の生存率に差をつけることで、細菌叢を変化させることを特徴とするものである。
又、請求項２による口腔の細菌叢を変化させる方法は、カフェインを０．０２ｗｔ％以上の濃度で含有し、５０℃以上、６５℃以下に加温された液を、口腔内に通過させることにより、細菌種間の生存率に差をつけて細菌叢を変化させることを特徴とするものである。
又、請求項３による口腔の細菌叢を変化させる方法は、請求項１又は請求項２記載の口腔の細菌叢を変化させる方法において、上記カフェインは０．６ｗｔ％以下の濃度であることを特徴とするものである。
又、請求項４による口腔細菌叢改善剤は、カフェインを０．０２ｗｔ％以上の濃度で含有していることを特徴とするものである。
又、請求項５による口腔細菌叢改善剤は、請求項４記載の口腔細菌叢改善剤において、上記カフェインは０．６ｗｔ％以下の濃度であることを特徴とするものである。
又、請求項６による口腔細菌叢改善剤、請求項４記載の口腔細菌叢改善液において、５０℃以上、６５℃以下に加温されていることを特徴とするものである。
【００１０】
以上述べたように本願の請求項１記載の発明による口腔の細菌叢を変化させる方法によれば、５０℃以上、６０℃以下に加温された食品成分であり、安全性の高いと考えられるカフェインが、濃度０．０２ｗｔ％以上含まれる液に３０秒間以上暴露し、細菌数を減少させるとともに、常在の細菌種と有害な細菌種の生存率に差をつけることで、常在の細菌種を優位にするよう細菌叢を変化させることができる。
又、請求項２記載の発明による口腔の細菌叢を変化させる方法によれば、請求項１と同様に５０℃以上、６５℃以下に加温されたカフェイン濃度０．０２ｗｔ％以上含まれる液を、口腔の目的部位に通過させることにより、細菌数を減少させるとともに、常在の細菌種と有害な細菌種の生存率に差をつけて細菌叢を変化させることができる。
又、請求項３による口腔の細菌叢を変化させる方法は、請求項１又は請求項２記載の口腔の細菌叢を変化させる方法において、上記カフェインは０．０２ｗｔ％以上であって０．６ｗｔ％以下の濃度であるので、ヒトの健康に害を及ぼすこともない。
又、請求項４による口腔細菌叢改善剤によれば、カフェインを０．０２ｗｔ％以上の濃度で含有しているので、それを所定の条件下で使用することにより、口腔内の細菌叢を改善することができる。
又、請求項５による口腔細菌叢改善剤は、請求項４記載の口腔細菌叢改善剤において、上記カフェインは０．０２ｗｔ％以上であって０．６ｗｔ％以下の濃度であるので、ヒトの健康に害を及ぼすこともない。
又、請求項６による口腔細菌叢改善剤によれば、カフェインを０．０２ｗｔ％以上であって０．６ｗｔ％以下の濃度で含有し、５０℃以上、６５℃以下に加温されているので、それを所定の条件下で使用することにより、口腔内の細菌叢を改善することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の一実施の形態を説明する。
まず、カフェインは、世界で天然カフェインとして年間３０００トンから４０００トンが製造されるといわれている。日本では、茶などから抽出精製される。
【００１２】
本発明における方法において使用するカフェインは、洗口液又は飲料の液中に含有される状態にある。これらの液は、カフェインを０．０２ｗｔ％以上を含有し、５０℃から６５℃に加温される。
【００１３】
洗口液による実施の場合、液は５０℃から６０℃の範囲に加温され、口腔内に３０秒間以上暴露する。好ましくは、液の温度が、使用する者ごとに体感される温度で、熱さなどの苦痛を許容できる温度よりも低い温度の範囲において、高温であることが必要である。又、好ましくは、暴露時には口腔内でよく振とうされることが必要である。又、暴露の後、洗口液は吐き出す。液中のカフェインの濃度は、好ましくは、０．６ｗｔ％以内で、この範囲において高濃度であることが必要である。
ただし、洗口液量とカフェイン濃度の関係において求められる全カフェイン量は、暴露時に誤飲した場合、ヒトの健康に危害を及ぼさないことを想定した量であることが必要である。又、本暴露において、使用する者がカフェインの苦味を感じるときは、これを低減する成分の含まれることが好ましい。
【００１４】
飲料により実施する場合、液は５０℃から６５℃に加温され、洗口液と同様の方法により実施するか、若しくは、目的部位に通過させながら飲料する方法で実施する。
【００１５】
飲料により実施する場合であって、洗口と同じ方法で実施するとき、液温は、好ましくは５０℃から６０℃に加温され、暴露後の液は吐き出すか、若しくは飲料する。暴露の後に飲料するときは、飲料の液量とカフェイン濃度の関係により求められる全カフェイン量及び他に日常的に摂取しているカフェイン量との合計は、ヒトの健康に危害を及ぼさないことを想定した量であることが必要である。
【００１６】
飲料により実施する場合であって、目的部位に繰り返し通過させながら飲料する方法で実施するとき、液は好ましくは５０℃から６５℃の範囲に加温されることが必要である。又、液の温度は、使用する者の体感温度により熱さによる苦痛を許容できる温度よりも低い温度の範囲において、高温に加温されることが好ましい。飲料の液量とカフェイン濃度の関係により求められる全カフェイン量及び他に日常的に摂取しているカフェイン量との合計が、ヒトの健康に危害を及ぼさないことを想定した量であることが必要である。
【００１７】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００１８】
使用する細菌種は、独立行政法人理化学研究所又はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから分譲を受けた。独立行政法人理化学研究所から分譲された細菌種は、それぞれの手順書に従い復元した。各細菌種は、液体窒素中に、マイクロバンク（ＰＲＯ−ＬＡＢ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ）又は、滅菌したスキムミルク液で保存した。口腔内で最も優勢な常在細菌種（非特許文献１）としては、Ｓ．  ｍｉｔｉｓ（ＪＣＭ１２９７１Ｔ）とし、他にＳ．  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  （ＪＣＭ５７０５Ｔ）を使用した。有害と考えられる細菌種としては、う蝕に関連するＳｔｏｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（ＪＣＭ５７０５Ｔ）（以下、「Ｓ．  ｍｕｔａｎｓ  」という。）、歯周病に関連するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＪＣＭ１１０１９Ｔ）（以下、「Ｂ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ  」という。）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｏｃｈｒａｃｅａ（ＪＣＭ１２９６６Ｔ）（以下、「Ｃ．  ｏｃｈｒａｃｅａ 」という。）、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（ＪＣＭ８５３２Ｔ）（以下、「Ｆ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  」という。）、及びＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ（ＪＣＭ６３２５Ｔ）（以下、「Ｐ．  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ  」という。）を使用した。
【００１９】
使用する各細菌は、Ｂａｃｔｏ（商標）ＢＲＡＩＮ  ＨＥＡＲＴ
ＩＮＦＵＳＩＯＮ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）により、細菌種ごと適切な条件で培養し、遠心分離により菌体を集めた。集められた細菌は、滅菌された生理食塩水に懸濁の後遠心分離することで洗浄し、最終的に滅菌された生理食塩水に懸濁した。懸濁液内の生菌数は、１０6から１０8ＣＦＵ／ｍｌであった。
【００２０】
各細菌の生存率は、培養法による生菌数の測定により行った。この際、使用する培地は、細菌種により、５％の羊脱繊血を含むＢａｃｔｏＴＭ  ＢＲＡＩＮ  ＨＥＡＲＴ
ＩＮＦＵＳＩＯＮ  Ａｇａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ポアメディア（登録商標）にトリプチソイ寒天培地（栄研化学株式会社）、ポアメディア（登録商標）羊血液寒天培地（栄研化学株式会社）、トリプチケースソイ羊血液寒天培地（シスメックス株式会社）を用いた。実施の操作は、好気の条件で行った。培養条件は、３７℃で、細菌種により好気、微好気、嫌気条件で２４時間から７８時間培養した。培養後は、コロニー数を計測した。生存率は、下記の数１により求めた。
ただし、操作中、時間毎に生菌数が減少する嫌気性の細菌については、時間と生菌数の関係を指数近似曲線により求めて「実施前の細菌液を希釈して測定した生菌数」を補正した。
【数１】
2012077053.tif 000002
【００２１】
下記の表１に実施例１〜８、比較例１〜７を示す。実施例１から実施例６は、洗口液としてカフェインを０．６ｗｔ％配合した生理食塩水を用い、３０秒間暴露する方法であり、加温される温度は、順に３５℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃である。
実施例７及び実施例８は、洗口液としてカフェインを０．０２ｗｔ％配合した生理食塩水を用い、３０秒間暴露する方法であり、加温される温度は、順に５０℃及び６０℃である。
比較例９及び比較例２は、洗口液としてカフェインを配合しない生理食塩水を用い、３０秒間暴露する方法であり、加温される温度は、順に５０℃及び６０℃である。
比較例３〜比較例７は、市販の洗口液により３０秒間暴露する方法であり、加温される温度は３５℃である。市販の洗口液５種類は、それぞれ「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ｄ」、「Ｅ」と仮称する。
【００２２】
実施例１〜実施例８、比較例１〜比較例７の方法において、９ｍｌの洗口液を使用し、これにＳ．  ｍｉｔｉｓの細菌液１ｍｌを加えて実施した後、生存率を求めた。
【００２３】
Ｓ．  ｍｉｔｉｓ  の生存率を表１に示す。細菌叢を変化させるとき、細菌数を減らすとともに、口腔内に常在し、最優勢の細菌であるＳ．  ｍｉｔｉｓ  が生存していなければならないと考えられる。よって、最初の評価は、口腔に常在で最優勢とされるＳ．  ｍｉｔｉｓ  の生存率が低下し、かつ生存が確認できた方法を適（○）、生存率が上昇するか、生存が確認できなかった方法を不適（×）とした。比較例３、比較例５、比較例６、比較例７は、Ｓ．  ｍｉｔｉｓ  の生存が確認できず、口腔中の常在の細菌の割合を低下させる危険があると考えられる。同じカフェイン濃度０．６ｗｔ％での実施を比較すると、実施例１では、Ｓ．  ｍｉｔｉｓ  の生存率を若干低下させたが、実施例２では逆に生存率を上昇させ、実施例３〜実施例６では生存率を低下させた。よって、加温される温度が５０℃からの暴露が、適当な温度である。ただし、実施例６の加温される温度６５℃では、Ｓ．  ｍｉｔｉｓ  の生存率が極端に小さい値のため、３０秒間の暴露時間では適当でない。このため、請求項１における加温される温度は、５０℃から６０℃が適当である。また、暴露時間が短い場合、細菌の生存率は上昇すると考えられる。よって、目的部に通過させるため暴露時間の短い請求項２では、加温される温度が６５℃でも適当である。さらに、５０℃及び６０℃に加温されたカフェイン濃度０．０２ｗｔ％の実施例及びカフェインを配合しない比較例においても、Ｓ．  ｍｉｔｉｓ  の生存が確認できた。
【００２４】
実施例１〜実施例８、比較例１、比較例２までの結果及び３５℃、暴露時間０秒における生存率１００％について、生存率を目的変数、温度、カフェイン濃度及び暴露時間を目的変数として変数増加法により変数選択−重回帰分析したころ、下記の数２が得られ、Ｓ．  ｍｉｔｉｓ  の生存率は、カフェイン濃度及び暴露時間は変数として組み込まれず、温度のみ組み込まれた。このことから、口腔の最優勢の常在細菌Ｓ．  ｍｉｔｉｓ  の生存率は、カフェイン濃度と暴露時間の影響を強く受けないことが判明した。
ただし、細菌の生存率は重回帰式により表現されるとは限らず、本式は統計的な有意性を確認するためのものである。
【数２】
2012077053.tif 000003
【表１】
2012077053.tif 000004
【００２５】
Ｓ．  ｍｉｔｉｓ  の生存率を低下させ、かつ生存が確認できた実施例３、実施例５、実施例７、実施例８、比較例１〜比較例７の方法において、９ｍｌの洗口液を使用し、これに口腔に常在でプロバイオティクスに用いられるＳ．  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  の細菌液１ｍｌを加えて実施した後、生存率を求めた。
【００２６】
Ｓ．  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  の生存率を表２に示す。
ただし、方法は上記と同じであるので、表中に条件は付さない。細菌叢を変化させるとき、細菌数を減らすとともに、口腔内に常在し、プロバイオティクスに用いられるＳ．  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  が生存しているのが好ましい。よって、評価は、生存率が低下し、かつ生存が確認できた方法を適（○）、生存率が上昇するか、生存が確認できなかった方法を不適（×）とした。比較例３、比較例５〜比較例７は、Ｓ．  ｍｉｔｉｓ  同様Ｓ．  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  の生存が確認できず、口腔中の常在の細菌の割合を低下させる危険がある。比較例３、比較例５〜比較例７は、口腔の常在細菌２菌種の生存率が、いずれも０であったので、以降の検証からは除外した。
【表２】
2012077053.tif 000005
【００２７】
実施例３から比較例２までの結果及び３５℃、暴露時間０秒における生存率１００％について、Ｓ．ｍｉｔｉｓ  と同様に生存率を目的変数、温度、カフェイン濃度及び暴露時間を目的変数として変数増加法により変数選択−重回帰分析したころ、下記の数３が得られ、Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  の生存率は、カフェイン濃度及び暴露時間は変数として組み込まれず、加温される温度のみ組み込まれた。このことから、口腔の常在細菌Ｓ．  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  の生存率は、Ｓ．ｍｉｔｉｓと同様にカフェイン濃度と暴露時間の影響を強く受けないことが判明した。
【数３】
2012077053.tif 000006
【００２８】
実施例３、実施例５、実施例７、実施例８、比較例１、比較例２、比較例４の方法において、９ｍｌの洗口液を使用し、これにう蝕の原因となるＳ．  ｍｕｔａｎｓ  細菌液１ｍｌを加えて実施した後、生存率を求めた。
【００２９】
Ｓ．  ｍｕｔａｎｓ  の生存率を下記の表３に示す。
ただし、方法は上記と同じであるので表中に条件は、付さない。また、上記に示した口腔に常在で最優勢とされるＳ．  ｍｉｔｉｓ  の生存率をあわせて併記した。細菌叢を変化させるとき、細菌数を減らすとともに、口腔に常在の細菌Ｓ．  ｍｉｔｉｓ  よりも有害な細菌の生存率をより多く低下させる必要がある。よって、評価は、下記の数４により算出された数値に関して、表４のように評価した。なお、特に不良となった実施例は、当該有害細菌を増加させてしまう可能性があるため、次の実施からは除外した。
【数４】
2012077053.tif 000007
【表３】
2012077053.tif 000008
【表４】
2012077053.tif 000009
【００３０】
市販洗口液Ｂによる方法では、Ｓ．  ｍｕｔａｎｓ  に関して評価は「特に不良」となり、口腔常在細菌よりもう蝕にかかる細菌を優位にしてしまう可能性がある。したがって、次の実施から除外した。カフェインを含まない生理食塩水による方法では、良（○）であったが、カフェインを含有した方法でより計算値Ａが大きかった。よって、本発明におけるカフェイン濃度０．０２ｗｔ％以上の濃度は、Ｓ．  ｍｕｔａｎｓ  に対して有効であり、３０秒以上の暴露において５０℃から６０℃の範囲はＳ．  ｍｕｔａｎｓ  に対して有効である。さらに、温度６０℃、カフェイン濃度０．６ｗｔ％の実施例５−３は、Ｓ．ｍｉｔｉｓの生存率が最も低く、計算値Ａも小さいことから、加温される温度及びカフェイン濃度がより高い方法がより有効となる。
【００３１】
実施例３、実施例５、実施例７、実施例８、比較例１、比較例２までＳ．  ｍｕｔａｎｓの生存率の結果及び温度３５℃、暴露時間０秒における生存率１００％について、生存率を目的変数、温度、カフェイン濃度及び暴露時間を目的変数として変数増加法により変数選択−重回帰分析し、下記の数５が得られ、Ｓ．  ｍｕｔａｎｓ  の生存率は、暴露時間が変数として組み込まれず、カフェイン濃度及び温度が組み込まれた。このことから、カフェイン濃度の影響を強く受けない口腔常在のＳ．  ｍｉｔｉｓ  及びＳ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓと異なりＳ．  ｍｕｔａｎｓの生存率は、温度とカフェイン濃度の影響も強く受けていることが判明した。
【数５】
2012077053.tif 000010
【００３２】
実施例３、実施例５、実施例７、実施例８、比較例１、比較例２の方法において、９ｍｌの洗口液を使用し、これに歯周病の原因となるＢ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ  、Ｃ．  ｏｃｈｒａｃｅａ  、Ｆ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  及びＰ．  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ  の細菌液１ｍｌをそれぞれ加えて実施した後、生存率を求めた。
【００３３】
歯周病菌に関する実施については、Ｂ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ  、Ｃ．  ｏｃｈｒａｃｅａ  、Ｆ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  及びＰ．  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ  の順に、それぞれの結果を表５、表６、表７及び表８に示す。評価は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓと同様の方法で行った。Ｂ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ  では、全ての実施例で良（○）又は特に良（◎）であった。Ｃ．  ｏｃｈｒａｃｅａ  では、比較例１−５を除いた実施例全てで良（○）であった。カフェインを含まない比較例１−５のみ不良（△）となったため、カフェインを含有する方法がより適切であった。Ｆ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  では、実施例７−６及び比較例１−６を除いた実施例で、良（○）又は特に良（◎）であった。比較例１−５、実施例７−６及び比較例１−６の結果は、カフェイン量が少量で定温であるものが不適の範囲に入ったことから、温度が高い温度で、カフェイン濃度が高いことが好ましい。Ｐ．  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ  では、全てが良（○）又は特に良（◎）であった。このとき、５０℃よりも６０℃の実施例で、評価の結果が特に良かったことから、高い温度であることの適性が確認できた。
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【００３４】
歯周病菌を用いた各実施例の結果については、Ｓ．  ｍｕｔａｎｓと同様に、変数選択−重回帰分析し、Ｂ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ  、Ｃ．  ｏｃｈｒａｃｅａ  、Ｆ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  及びＰ．  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ  の順に、それぞれ下記の数６、数７、数８及び数９を得た。実施した全ての歯周病菌において、変数として温度及びカフェイン濃度が組み込まれ、歯周病菌においてもＳ．  ｍｕｔａｎｓ  と同様に両者の併用による有効性の確認できた。また、Ｂ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ  及びＦ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  は変数として暴露時間が組み込まれた。
【数６】
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【数７】
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【数８】
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【数９】
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【００３５】
Ｓ．  ｍｕｔａｎｓ、Ｂ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ  、Ｃ．  ｏｃｈｒａｃｅａ  、Ｆ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  及びＰ．  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ  の計算値Ａについて、実施例ごとの平均は、実施例３が−４９、実施例５が−６９、実施例７が−３０、実施例８が−６９、比較例１が−１、比較例２が−５４となった。３０秒間の暴露において、加温される温度が５０℃のとき、カフェイン濃度０．０ｗｔ％、０．０２ｗｔ％及び０．６ｗｔ％の順に、計算値Ａは−１、−３０、−４９となり本発明におけるカフェイン濃度の範囲を含めることで、カフェインを含まないものよりも明らかに低い数値を示しており、有効である。加温される温度が６０℃のとき、カフェイン濃度０．０ｗｔ％、０．０２ｗｔ％及び０．６ｗｔ％の順に、計算値Ａは−５４、−６９、−６９となり本発明におけるカフェイン濃度の範囲を含めることで、カフェインを含まないものよりも低い数値を示しており、有効である。よって、う蝕及び歯周病に関連する細菌種において、請求項１における、カフェインを０．０２ｗｔ％以上の濃度で含有し、５０℃以上、６０℃以下に加温された液で、口腔内を３０秒間以上暴露し、細菌種間の生存率に差をつけることで、細菌叢を変化させる方法は有効である。
【００３６】
請求項２記載の発明における、口腔の目的部位に通過させる方法については、暴露時間が短く、実験操作上各細菌種の生存率の実測は困難である。細菌の生存率は重回帰式により表現されるとは限らないが、重回帰式により取り込まれた変数が各細菌種の生存率に特に影響を及ぼしていることは明確である。求められた重回帰式の数２、数５から数９までの中で、暴露時間が変数として組み込まれたのは、Ｂ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ  及び  Ｆ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  の２細菌種のみである。これらの回帰係数は定数項に比較して小さいため、暴露時間が短ければこの影響も少ないこととなる。したがって、暴露時間が変数として組み込まれなかった細菌種においては、暴露時間の影響は更に少ないこととなる。よって、３０秒間よりも短い時間の暴露においても、実施例１から比較例７の生存率の相対的な相違は、変わらないものと推察される。したがって、口腔の目的部位に通過させる方法における、カフェイン濃度０．０２ｗｔ％以上で、加温される温度５０℃以上から６０℃以下は有効である。
【００３７】
請求項２記載の発明における加温される温度の６５℃については、始めに、求められた重回帰式の数２、数５から数９までの加温される温度の回帰係数により比較した。すなわち、Ｓ．ｍｉｔｉｓ  の加温される温度の回帰係数２．２１よりも、有害な細菌種の回帰係数が大きければ、より強く加温される温度の影響を受けることとなり、計算値Ａはより低い値を示す。Ｓ．ｍｉｔｉｓ  の加温される温度の回帰係数よりも大きな回帰係数を示す細菌種は、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ  の２．３９、Ｆ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  の６．８３及びＰ．  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ  の３．８１である。よって、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ  、Ｆ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  及びＰ．  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ  において、加温される温度が６５℃でも口腔の目的部位に通過させる方法は有効である。
【００３８】
Ｂ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ  及びＣ．  ｏｃｈｒａｃｅａ  の回帰係数は、それぞれ１．２４及び１．７７である。加温される温度が６５℃を推定すると、６０℃の生存率からの計算で、Ｂ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ  がカフェイン濃度０．０２ｗｔ％で生存率４０％、０．６ｗｔ％で生存率３５％、Ｃ．  ｏｃｈｒａｃｅａ  がカフェイン濃度０．０２ｗｔ％で生存率３３％、０．６ｗｔ％で生存率５２％となる。実測値は異なるが、相対的な比較であるので、Ｓ．ｍｉｔｉｓも同様に計算すると、カフェイン濃度０．０２ｗｔ％で生存率５９％、０．６ｗｔ％で生存率７６％となり、いずれの条件においてもＳ．  ｍｉｔｉｓの生存率は、Ｂ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ  及びＣ．  ｏｃｈｒａｃｅａ  の生存率よりも高い。したがって、Ｂ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ  及びＣ．  ｏｃｈｒａｃｅａ  において、加温される温度が６５℃でも口腔の目的部位に通過させる方法は有効である。
【００３９】
なお、比較例８から９、実施例９から実施例１７では、Ｓ．ｍｉｔｉｓ  、Ｓ．  ｍｕｔａｎｓ、Ｂ．  ｆｒａｇｉｌｉｓ  、Ｃ．  ｏｃｈｒａｃｅａ  、Ｆ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  及びＰ．  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ  に関して、通過時間を１秒間として、数２、数５から数９の重回帰式により計算した生存率を求めた。この生存率から数４により計算値Ａを算出し、平均値を求め、評価した。
ただし、生存率の推定値が負値となったものは、０．０％と補正した。
結果及び評価は表９に示す。各細菌種の生存率は、必ずしも重回帰式に従うことはないが、本評価においても、上記の結果を裏付けるものとなった。評価は、全ての実施例で良（○）又は特に良（◎）となった。ただし、加温される温度が３５℃では、Ｓ．ｍｉｔｉｓ  の生存率が１００％を超えており、Ｆ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  及びＰ．  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ  の生存率では、カフェインを含まない方法及びカフェイン濃度０．０２ｗｔ％で同様に１００％を超え、Ｓ．ｍｉｔｉｓにおける４５℃の実施例１−２でも１００％を超えていた。このため、３５℃から４５℃の実施においては、Ｓ．ｍｉｔｉｓの生存率を高めるリスクが上がると考えられ、適当でない。さらに、同じカフェイン濃度における温度毎の計算値Ａを比較すると、４５℃と５０℃の差は１０前後あり、５０℃より高い温度では、このような大きな差は認められない。よって、５０℃より高い温度で生存率の差を大きくせしめていることとなる。したがって、本発明の請求項２における加温される温度の５０℃以上は、有効である。５０℃から６５℃の範囲において、計算値Ａの平均は、加温される温度が高いほど低値を示した。よって、本発明における加温される温度の６５℃は有効であり、より高い温度であることが望ましい。また、同じ温度に加温された場合、カフェイン濃度０．０２ｗｔ％では、カフェインを含まないときに比べて、全て低い値を示した。また、カフェイン濃度０．６ｗｔ％による方法では、０．０２ｗｔ％の同じ温度の計算値Ａよりも低い値を示しており、濃度が高いほど有効性が増していることがわかる。よって、本発明の請求項２におけるカフェイン濃度０．０２ｗｔ％以上は有効である。
【表９】
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【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の口腔の細菌叢を変化させる方法と口腔細菌叢改善液は、口腔の全細菌数を減少させるばかりでなく、口腔の常在の細菌種の割合を増やし、有害な細菌種の割合を減らすよう細菌叢を変化させるもので、食品成分を剤として使用することで安全性が高く、この剤の効果を高めるような性質を持ち、特定細菌種への選択性を高める簡易な方法を提供できる。
【００４１】
本発明の口腔の細菌叢を変化させる方法と口腔細菌叢改善液は、カフェインを含む洗口液の使用方法、或いは飲料の使用に応用が可能で、細菌叢を変化させることで、口腔内を清潔にできる。