(57)【要約】【課題】  小細胞肺癌に対する特異性が高く、肺腺癌等の非小細胞肺癌と小細胞肺癌との識別能に優れた、新たな小細胞肺癌マーカー及びその検出手段を提供し、これにより、肺癌治療方針の的確性を高める。【課題手段】              硫酸化糖鎖により修飾された、IGFBPL1タンパク質、GOLM1タンパク質、またはAPLP1タンパク質を小細胞肺癌マーカーとし、被験者の血清等の試料から、これら小細胞肺癌マーカーの分離、検出あるいはさらに定量を行う。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸化糖鎖により修飾された、IGFBPL1タンパク質、GOLM1タンパク質、またはAPLP1タンパク質。
【請求項２】
硫酸化糖鎖がIGFBPL1タンパク質のアミノ酸配列における１６６番目のアミノ酸、GOLM1タンパク質のアミノ酸配列における１０９番目のアミノ酸、あるいはAPLP1タンパク質のアミノ酸配列における４６１番目のアミノ酸に結合していることを特徴とする、上記請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
硫酸化糖鎖が以下のI〜IVのいずれかの構造式で表される非還元末端構造を有することを特徴とする上記請求項１または２に記載のタンパク質。
【化１】
2012121820.tif 000011
（上記式Ｉ〜ＩＶ中のＡｃはアセチル基を表す。）  
【請求項４】
上記請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質からなる小細胞肺癌マーカー。
【請求項５】
検体試料から請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質を分離、検出又は定量する手段を伴う方法であって、該手段が少なくとも等電点と分子量の相違に基づき分離、検出又は定量する手段であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質の分離、検出又は定量方法。
【請求項６】
分離、検出あるいは定量が等電点電気泳動とSDS-PAGE電気泳動を組み合わせた２次元電気泳動によることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の方法において、さらに、分子間相互作用に基づくタンパク質識別手段を伴うことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質の分離、検出又は、定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硫酸化糖鎖を有するタンパク質、及び該タンパク質からなる肺癌マーカー及びその分離、検出、定量に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞は、正常細胞と共通する多くの物質と共に、正常細胞はほとんど産生しない物質を産生することが知られている。この物質を測定することにより、一部の癌細胞や癌患者の存在、特性を診断することが可能となっている。癌細胞が異常に多量に産生する物質には、癌遺伝子産物及び、増殖因子などがあり、細胞の癌化・増殖・進展に寄与している。また、癌胎児性抗原やホルモン、酵素などの産生も細胞の癌化の特性と考えられている。従って、癌細胞に特徴的なこれらの物質、いわゆる腫瘍マーカーのいずれかを充分な感度で測定できれば、その癌の診断が可能となる。これまで腫瘍マーカーとして実際に利用されてきたものには、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＡ１２５などの胎児性癌抗原、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、酸性フォスファターゼ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）などの酵素類、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）、カルシトニン（ＣＴ）などのホルモン関連物質などの測定系がある。しかしながら、これらの測定系を用いた癌患者血清の陽性率は高くなく、癌でありながら既存の腫瘍マーカーは陰性である場合も多く、健常人・良性疾患患者血清でも偽陽性になってしまうなど特異性に大きな問題があり、悪性疾病を立証することはできなかった。
【０００３】
肺癌に関しては、神経内分泌細胞に由来する小細胞肺癌と、他の上皮腫瘍である非小細胞肺癌に区別されており、治療法としては、基本的に、前者については初期の段階を除き、化学療法、放射線療法が検討され、後者については、末期を除き手術療法が検討され、治療方針の検討に際し、小細胞肺癌と非小細胞肺癌の識別は極めて重要である。
小細胞肺癌では、セロトニン、ＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）、カルシトニン、ＧＲＰ（ガストリン放出ペプチド）などの各種ペプチドホルモン類の産生が知られ、また、ＡＰＵＤ系の細胞または、腫瘍に特徴的なＬ−ドパ・デカルボキシラーゼ（Ｌ−ｄｏｐａ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）活性の高いこと、神経細胞に特徴的な神経特異的エノラーゼ（ｎｅｕｒｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｎｏｌａｓｅ）、クレアチンキナーゼＢＢ活性が高いことが報告されている。
【０００４】
小細胞肺癌のマーカーとして現在使用されているものには神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、カルシトニン（ＣＴ）などがあるが、小細胞肺癌患者の陽性率は充分なものではない。ＧＲＰは、１９７８年ＭｃＤｏｎａｌｄらがブタ胃組織より単離したガストリン分泌促進作用を有する２７個のアミノ酸よりなる脳腸ペプチドである。小細胞肺癌細胞内で生物活性を持つＧＲＰ(１−２７)と活性のないＣ末端側フラグメントであるｐｒｏＧＲＰ（３１−１２５、３１−１１８、３１−１１５）とに切断され、細胞外に等モルで放出される。活性を有するＧＲＰは血中で速やかに分解されるが、非活性部分は比較的安定であり、この３種の分子種に共通した構造であるｐｒｏＧＲＰ（３１−９８）を遺伝子組み換え技術で作成し、これを抗原として特異的に結合する抗体を用いる測定法が確立された（非特許文献１参照）。現在では、ｐｒｏＧＲＰが小細胞肺癌の最も信頼されるマーカーとして利用されている。しかし、ｐｒｏＧＲＰの測定は、採血後、血清の室温放置等の不適切な取扱により急速に消失するため、速やかに血清分離し、−２０℃で凍結保存しなければならない。保存条件が悪ければ、本来高値でも低値と測定されてしまうという問題がある。これらのことから、新たな小細胞肺癌のマーカーが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Miyake,Y.et.al.Cancer  Res.1994,54,2136-2140
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記課題は、小細胞肺癌に対する特異性が高く、肺腺癌等の非小細胞肺癌と小細胞肺癌との識別能に優れた、新たな小細胞肺癌マーカー及びその検出手段を提供し、これにより、肺癌治療方針の的確性を高め、有効な治療を行う点にある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、小細胞肺癌細胞と非小細胞肺癌細胞における遺伝子の発現量を比較し、両者の間に、硫酸基転移酵素遺伝子の発現量に差違を有する知見を得るとともに、さらに研究を続け、ついに、小細胞肺癌細胞が産生する３種のタンパク質が硫酸化糖鎖を有し、この硫酸化糖鎖修飾タンパク質が、小細胞肺癌に特異的であり、小細胞肺癌マーカーになり得ることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００８】
（１）硫酸化糖鎖により修飾された、IGFBPL1タンパク質、GOLM1タンパク質、またはAPLP1タンパク質。
（２）硫酸化糖鎖がIGFBPL1タンパク質のアミノ酸配列における１６６番目のアミノ酸、GOLM1タンパク質のアミノ酸配列における１０９番目のアミノ酸、あるいはAPLP1タンパク質のアミノ酸配列における４６１番目のアミノ酸に結合していることを特徴とする、上記（１）に記載のタンパク質。
（３）硫酸化糖鎖が以下のI〜IVのいずれかの構造式で表される非還元末端構造を有することを特徴とする上記（１）または（２）に記載のタンパク質。
【化１】
2012121820.tif 000002
（上記式Ｉ〜ＩＶ中のＡｃはアセチル基を表す。）  
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質からなる小細胞肺癌マーカー。
（５）検体試料から請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質を分離、検出又は定量する手段を伴う方法であって、該手段が少なくとも等電点と分子量の相違に基づき分離、検出又は定量する手段であることを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のタンパク質の分離、検出又は定量方法。
（６）分離、検出あるいは定量が等電点電気泳動とSDS-PAGE電気泳動を組み合わせた２次元電気泳動によることを特徴とする、上記（５）に記載の方法。
（７）上記（５）又は（６）に記載の方法において、さらに、分子間相互作用に基づくタンパク質識別手段を伴うことを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のタンパク質の分離、検出又は、定量方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の硫酸化糖鎖修飾タンパク質は、小細胞肺癌の特異的マーカーであり、これを利用した判定方法はより確度の高い小細胞肺癌の判定（診断、検査）を可能とする。また、本発明の小細胞肺癌マーカーは、例えば血清中に分泌されるため、非浸襲的且つ簡便に小細胞肺癌を判定（診断、検査）することが可能である。さらに本発明の硫酸化糖鎖修飾タンパク質は安定であり、本発明の硫酸化糖鎖修飾タンパク質を標的とする様々な肺ガン検査薬あるいは検査方法を新たに提供することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の硫酸化糖鎖修飾タンパク質をペプチド化し、各ペプチドについてMS/MS-イオンサーチ法を用いて同定した結果を示す図
【図２】本発明の硫酸化糖鎖修飾タンパク質における硫酸化糖鎖の構造を、多段階タンデム質量分析計により解析した結果を示す図
【図３】本発明の硫酸化糖鎖修飾タンパク質を、等電点およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ２次元電気泳動により、分離、検出した結果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、Insulin-like  growth  factor  binding  protein-like1(IGFBPL1)、Golgi  membrane  protein  1(GOLM1)、あるいはAmyloid  beta(A4)precursor-like  protein  1(APLP1)が硫酸化糖鎖により修飾されたタンパク質に関するものであり、これらはいずれも新規物質である。
【００１２】
IGFBPL1タンパク質は、Ｎ末端より１６６番目のアスパラギンに、GOLM1は、Ｎ末端より１０９番目のアスパラギンに、APLP1は、Ｎ末端より４６１番目のアスパラギンにそれぞれＮ結合型糖鎖を有しているが、本願の硫酸化糖鎖修飾タンパク質は、これらのＮ結合型糖鎖が硫酸化されていることが構造上の特徴である。
このように硫酸化されたＮ結合型糖鎖の非還元末端構造は、以下のＩ〜ＩＶに示される。
【００１３】
【化１】
2012121820.tif 000003
（上記式Ｉ〜ＩＶ中のＡｃはアセチル基を表す。）
【００１４】
本発明のこれら硫酸化糖鎖修飾タンパク質は、肺腺癌等の非小細胞肺癌にはみられず、小細胞肺癌に特異的であり、小細胞肺癌マーカーとして有用である。
上記硫酸化糖鎖修飾タンパク質の分離、製造には、等電点の相違と分子量の相違に基づく分離、検出手段を組み合わせた手段が有効であり、また、さらに抗体あるいはレクチン等による分子間相互作用に基づくタンパク質識別手段を併用することが好ましい。例えば、まず、ヒト小細胞肺癌細胞株を培養し、培養上清をIGFBPL1、GOLM1、あるいはAPLP1に対する各抗体を用いて濃縮する。ついで、硫酸化糖鎖により修飾されたIGFBPL1、GOLM1、あるいはAPLP1と硫酸化修飾されていないこれらタンパク質とを分離するが、これには、硫酸基によりタンパク質の等電点が、硫酸基を有していない上記タンパク質に比べ酸性側に傾くことを利用した等電点電気泳動が有効であり、該等電点電気泳動とＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動とを組み合わせた２次元電気泳動を用いて製造することができる。
【００１５】
以下に各タンパク質の等電点を示す
【表１】
2012121820.tif 000004
【００１６】
濃縮に使用する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、市販のものも使用できる。また濃縮法自体周知の方法を用いることができ、例えば、上記タンパク質に対する抗体を担持した磁気ビーズをヒト小細胞肺癌細胞の培養上清と接触させ、該抗体と培養上清中のタンパク質とを反応させて、該ビーズを回収し、抗体と結合したタンパク質を溶離させればよい。
また、このほかIGFBPL1、GOLM1、あるいはAPLP1をコードする遺伝子をＣＨＯ細胞に導入し、それぞれに対する抗体で濃縮後、硫酸基転移酵素を用いてこれらのタンパク質に結合する糖鎖に硫酸基を付与することによっても得ることができる。
【００１７】
一方、上記硫酸化糖鎖修飾されたタンパク質は、小細胞肺癌患者の血清、生検組織、気管支肺胞洗浄液、胸水には硫酸化糖鎖により修飾されたIGFBPL1、GOLM1、あるいはAPLP1が含まれているのに対し、例えば肺腺がん患者あるいは健常者の血清、生検組織、気管支肺胞洗浄液、胸水中に含まれるIGFBPL1、GOLM1、あるいはAPLP1の糖鎖は硫酸化されていないか、あるいは硫酸化されていたとしても極めて少量である。したがって、被験者の血清中等に、硫酸化糖鎖修飾IGFBPL1、GOLM1、あるいはAPLP1が有意に検出される場合は、小細胞肺癌を強く疑うことができ、本発明の硫酸化糖鎖修飾タンパク質は小細胞肺癌マーカーとして利用できる。
【００１８】
このような血清等からの硫酸化糖鎖修飾タンパク質の分離、検出においては、上記製造法が応用でき、等電点の相違と分子量の相違に基づく分離、検出手段を組み合わせた手段が好ましく用いられ、さらに抗体あるいはレクチン等による分子間相互作用に基づくタンパク質識別手段を併用することが好ましい。このような分子間相互作用に基づくタンパク質識別手段は、例えば、血清等の検体試料中の硫酸化糖鎖修飾タンパク質を予め濃縮したり、あるいは硫酸化糖鎖修飾タンパク質を検出する際に有効である。
さらに具体的には、例えば、被験者の血清をIGFBPL1、GOLM1、あるいはAPLP1に対する抗体等を使用して濃縮した後、上記等電点電気泳動とＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を組み合わせた２次元電気泳動を用いて分離後、該タンパク質に対する抗体を用いることで容易に検出することができる。
【００１９】
また、このほかIGFBPL1、GOLM1、あるいはAPLP1に対する抗体等を使用して濃縮した試料を蛍光標識後、キャピラリー電気泳動、マイクロチップ電気泳動を用いることによっても容易に分離・検出することができる。また、IGFBPL1、GOLM1、あるいはAPLP1に対する抗体を蛍光標識した抗体を試料と混合した後、キャピラリー電気泳動、マイクロチップ電気泳動を用いることによっても容易に分離・検出することができる。さらに、この２次元電気泳動スポットの蛍光染色色素による蛍光強度、キャピラリー電気泳動、マイクロチップ電気泳動における該タンパク質の蛍光強度を測定すれば、硫酸化糖鎖修飾タンパク質を定量でき、その被験者の重篤度もある程度知ることが可能である。上記製造法によって得られた硫酸化糖鎖修飾タンパク質は、このような検出、定量における標準物質として、例えば検量線の作成等に使用できる。
【００２０】
本発明の硫酸化糖鎖修飾タンパク質は、該タンパク質を標的とする試薬あるいは試薬キットさらには新たな検出定量法を開発するために有用であり、このような試薬、試薬キットあるいは検出定量法により得られたデータは小細胞肺癌の正確な診断に役立てることができる。
試薬としては、例えば、硫酸化された該タンパク質を特異的に検出できる抗体、該タンパク質の分離・検出に有用なレクチン、該タンパク質の標準品およびその蛍光標識体、等が挙げられ、また、試薬キットとしては、該タンパク質の標準品、該タンパク質特異抗体、２次抗体、発色基質からなる該タンパク質の定量用ELISAキット、蛍光標識された該タンパク質の特異抗体、該タンパク質の標準品からなるキャピラリー電気泳動またはマイクロチップ電気泳動による該タンパク質の定量分析用キット、蛍光標識された該タンパク質の標準品、蛍光標識試薬、該タンパク質の特異抗体からなるキャピラリー電気泳動またはマイクロチップ電気泳動による該タンパク質の定量分析用キット、等が挙げられる。
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
実施例１
〈小細胞肺癌と非小細胞肺癌の遺伝子発現プロファイル〉
・細胞株ｃＤＮＡ合成
１０ｃｍディッシュで培養した肺癌培養細胞株、すなわち小細胞肺癌３種（H2171,  H524,  H526）と非小細胞肺癌として肺腺癌３種（H358,  H1975,  LX-1）の細胞試料を、PBS（日水製薬社製ダルベッコＰＢＳ(-)）で細胞を洗浄後に市販RNA抽出キット（キアゲン社製RNeasy  plus  miniキット）を用いて抽出物を培養細胞トータルRNAとした。培養細胞トータルRNA4μｇを出発材料として、市販ｃＤＮＡ合成キット（キアゲン社製ＱｕａｎｔｉｔｅｃｔＲＴキット）を用いて調製したｃＤＮＡを培養細胞ｃＤＮＡとした。
【００２２】
・硫酸基転移酵素遺伝子発現レベルの定量PCR解析
定量ＰＣＲ法を用いて培養細胞ｃＤＮＡについて硫酸基転移酵素遺伝子の発現量を定量した。定量方法については、既報論文（Ito,Kuno,Sawaki,ほか.2009）に記載した定量PCRアレイを用いる方法に従った。培養細胞ｃDNAを鋳型として用いて、Eurogentec社製qPCRQuickGoldStar  Mastermix  PlusをPCR酵素として用いて、PCRプライマー及びプローブは定量PCRアレイに搭載されているCHST8遺伝子転写産物特異的検出セット試薬（Fプライマー；5’-tcagcctgcaggacccta-3’（配列番号７）、Rプライマー；5’-ggttccttcaagtcaccatcc-3’（配列番号８）、TaqManプローブ；ccagcag（配列番号９））及びCHST9遺伝子転写産物特異的検出セット試薬（Fプライマー；5’-caattggaaaagaattctgatgg-3’（配列番号１０）、Rプライマー；5’-cagcattgtgggagatgttg-3（配列番号１１）’、TaqManプローブ；ttcctctg（配列番号１２）を用いた。培養細胞ｃＤＮＡ試料溶液にDEPC  treated  Water（和光純薬製）を加えて２ｍＬとし、さらにPCR酵素（Eurogentec社製）２ｍＬを加えたものをPCR反応液とした。
【００２３】
遺伝子転写産物特異的検出セット試薬が配置してある定量PCRアレイ用測定プレートの各ウェルにPCR反応液７．５μＬずつを分注したのちに混和し、シール材で密封した後に遠心機を用いて１５００ｒｐｍで反応ウェル中の反応液をスピンダウンしてから、PCR反応測定装置（Roche社製LighCycler480）にセットして定量PCRアレイ反応サイクルプログラムによって測定した。定量PCRアレイ反応サイクルプログラムは、５０℃／２分、９５℃／３分の後に９５℃／１５秒、６０℃／１分２０秒を１サイクルとして５５回繰り返す。検出は測定装置付属のソフトウェアで各試料液中の標的遺伝子転写産物に由来する蛍光強度の変化を測定した後に、２次微分極大法によって数値化を施した。測定結果の数値は別途測定した標準試料の数値をもって作成した検量線に当てはめることで、測定試料中の標的遺伝子転写産物のコピー数として算出した。
【００２４】
・小細胞肺癌における硫酸基転移酵素遺伝子の発現レベル
肺癌細胞株６種について測定した硫酸基転移酵素遺伝子CHST8およびCHST9の発現レベルをトータルRNA7.5ナノグラム中に含まれる転写産物のコピー数として、表１に示したように、これらの硫酸基転移酵素遺伝子の発現レベルは小細胞肺癌由来細胞において顕著に亢進していることから、小細胞肺癌において硫酸化糖が特徴的に発現していることが強く示唆された。
【００２５】
【表２】
2012121820.tif 000005
【００２６】
〈小細胞肺癌培養細胞からの硫酸化糖タンパク質の濃縮および検出〉
・分泌タンパク質の回収
ウシ胎児血清を１０％の割合で添加したＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、ヒト小細胞肺癌培養細胞株であるＨ２１７１を培養しコンフルエントになった後、細胞を回収した（１×１０８個）。回収した細胞は、添加した血清成分が残らないように無血清培地（ＲＰＭＩ１６４０）で３回洗浄した後、１００ｍＬの無血清培地で２４時間培養した。培養細胞株Ｈ２１７１の無血清培養上清２０ｍＬを、１００ｍＬのポリエチレン製コニカルチューブに分注し、４℃に冷却後、４℃にあらかじめ冷却したアセトン６０ｍＬを加え、攪拌したのち、４℃にて２時間放置した。生じた凝集体を遠心機にて分離し、集めた。同様の操作を合計１００ｍＬの無血清培養上清にて行い、集めた沈殿物をＨ２１７１が分泌するタンパク質として使用した。
【００２７】
・還元アルキル化
得られたタンパク質を、６Ｍ塩酸グアニジンを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２．５ｍＬに溶解し、ジチオスレイトール（DTT）１０ｍｇを添加し、室温にて５時間放置した。その後、ヨードアセトアミド６０ｍｇを添加し、暗所にてさらに４５分放置した。放置後の溶液を透析キット（容量２５０μL、ＧＥヘルスケア社）に移し、１Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で３日間、１２時間おきに緩衝液を交換し、透析を行った。
【００２８】
・トリプシン消化
透析後のタンパク質溶液にウシ膵臓由来トリプシンを含む重炭酸アンモニウム緩衝液（１ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬ添加し、３７℃にて一昼夜放置した。
【００２９】
・糖ペプチドの濃縮
トリプシン消化した反応液を９８℃で５分間加熱し、トリプシンを失活させた後、室温に冷却し、試料溶液をｎ−ブタノール：エタノール：水（４：１：１）の混合液で平衡化したセファロースＣＬ−4Ｂ（１ｍＬ、ＧＥヘルスケア社）に供し、上記混合液（２０ｍＬ）にて洗浄後、５０％エタノール（１０ｍＬ）にて糖ペプチドを溶出し回収した。得られた糖ペプチド溶液を減圧濃縮後、乾燥した。
【００３０】
・シアリダーゼ処理
乾燥させた糖ペプチドに、スタフィロコッカス由来シアリダーゼ（ナカライテスク社製）を含むリン酸緩衝液（１Ｕ／ｍＬ）を１００μＬ添加し溶解させ、３７℃にて６０分放置した。
【００３１】
・カルボキシペプチダーゼＢ処理
シアリダーゼ処理した反応液を９８℃で５分間加熱し、シアリダーゼを失活させた後、室温に冷却し、カルボキシペプチダーゼＢ（シグマ社製）を含むトリス塩酸緩衝液（５０μｇ／ｍＬ）を２００μＬ添加し、３７℃にて６０分放置した。カルボキシペプチダーゼＢ処理した反応液を９８℃で５分間加熱し、カルボキシペプチダーゼＢを失活させた後、室温に冷却し、固相抽出デバイスSepPak  C18  カートリッジ（５０ｍｇ、Waters社）に供し、糖ペプチドを回収し、カルボキシル基の修飾反応に用いた。
【００３２】
・カルボキシル基の修飾
得られた糖ペプチド混合物を２．５Ｍアセトヒドラジド溶液（１００μＬ）に溶解し、３Ｍ塩酸により溶液をｐＨ２．５に調製後、２Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、「ＥＤＡＣ」と記す）を８μＬ加え、室温で３時間反応させた。
【００３３】
・試薬の除去
上記の反応終了後、試料溶液をSepPak  C18  カートリッジ（５０ｍｇ、Waters社）に供し、修飾されたペプチドを回収した。得られたペプチド混合物をｎ−ブタノール、エタノール、水の混合溶媒（４：１：１）にて膨潤させた５００μＬのSepharose  CL-4Bゲル（GEヘルスケア社）に供し、上の混合溶媒１０ｍＬにて洗浄後、５０％エタノール（５ｍＬ）、水(５ｍＬ)、６Ｍ塩酸グアニジン溶液(５ｍＬ)の順で溶出を行い、すべての溶出画分を合わせて回収した。得られた溶出画分を、凍結乾燥し、再度、SepPak  C18  カートリッジを用いて塩酸グアニジンを除去しペプチドを回収した。
【００３４】
・イオン交換クロマトグラフィーによる硫酸化糖ペプチドの濃縮
陰イオン交換カラム（TSKgel  QAE-2SW、直径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、東ソー社）を３０％アセトニトリル入りの２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したのち、前工程にて回収したペプチド混合物を供した。流速は０．７ｍＬ／分とし、最初の１０分間は平衡化に用いた緩衝液を流し、次の１０分間で直線的に塩化ナトリウムの濃度を０．７５Ｍまで上昇させた。２〜１０分までに得られた溶出液を画分１、１０〜２９分までに得られた溶出液を画分２とし、画分２を硫酸化糖ペプチド含有フラクションとして回収した。
【００３５】
・逆相ＨＰＬＣによる分離
硫酸化糖ペプチドを分離するため、上記画分２を逆相ＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣカラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ  ＱＡ、直径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、東ソー社製）を用い、移動相Ａ（０．１％ＴＦＡ）を０．７ｍＬ／分の流速で流し始め、混合する移動相Ｂ（０．１％ＴＦＡ  ｉｎ  ８０％アセトニトリル）の濃度を次の４５分間で直線的に４５％まで上昇させた。１０分から４５分までの溶出液を１．０分間隔で３５のフラクションに分画した。
【００３６】
・硫酸化糖ペプチドの検出
得られた３５フラクションをマトリクス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析計（Refleｘ  IV、ブルカー・ダルトニクス社）にて、測定した。マトリクスは２，５−ＤＨＢを用いた。第１７フラクションと第２２フラクションから負イオンモードで強いシグナルを生じる硫酸化糖ペプチドと思われる物質を検出した。それらのシグナルを表３に示す。
【００３７】
【表３】
2012121820.tif 000006
【００３８】
なお、上記表中のHex、HexNAc、Fuc、SO3は、それぞれ順にヘキソース、ヘキソサミン、フコース、硫酸基を表し、これらに付された数字は、ペプチド一分子当たりに結合している上記各基の分子数を表す。
【００３９】
〈硫酸化糖タンパク質の同定〉
・硫酸化糖ペプチドからの糖鎖の除去および糖鎖付加部位アミノ酸側鎖の化学修飾
硫酸化糖ペプチドを含むフラクション（第１７フラクションと第２２フラクション）をそれぞれ減圧乾固し、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）６μＬに溶解した。次いでペプチドＮグリカナーゼＦ（０．５ｍＵ、タカラバイオ社）を添加し、３７℃にて一昼夜静置した。その後、あらかじめ作成した３Ｍ塩酸と２．４Ｍ  Ｇｉｒａｒｄ‘ｓ  Ｔ（シグマ社）溶液（１３．５μＬ）を混合してｐＨ２．５に調整した混合液１６．５μＬを添加し、さらに４Ｍ  ＥＤＡＣを３μＬ加え、室温で３時間反応させた。
【００４０】
・試薬の除去
０．１％ＴＦＡにて平衡化したピペットチップ型固相抽出デバイスＺｉｐＴｉｐ  Ｃ１８（ミリポア社）を用いて、上記のカルボン酸修飾反応液の吸液排液を１０回繰り返した。その後、０．１％ＴＦＡにてＺｉｐＴｉｐを５回洗浄し、最後に０．１％ＴＦＡを含む８０％アセトニトリル溶液でＺｉｐＴｉｐから修飾されたペプチドを回収した。
【００４１】
・化学修飾ペプチドのＬＣ／ＭＳショットガン分析
試料ペプチドを０．１％ギ酸で希釈し、LC/MSショットガン分析した。このとき試料を高度に濃縮し、高感度に検出するため、ダイレクトナノフローポンプを基礎とするナノＬＣシステム（流速100nl/min）を利用した。インジェクトしたペプチドは脱塩を目的としたトラップカラム(逆相C18シリカゲル系の担体)上に一旦捕集し、０．１％ギ酸水溶液で洗浄後、同じ樹脂を詰めたスプレーチップ型フリットレス微小カラム（内径0.15mm×50mm  L）を用い、有機溶媒(0-35％アセトニトリル)の濃度グラジェント法で分離した。溶出液はエレクトロスプレーインターフェースを介してイオン化して、直接質量分析機に導入した。質量分析はデータ依存モードで最大２つのイオンを選択しながら、衝突誘起解離（CID）によるタンデム質量分析を行った。
【００４２】
・ＭＳ／ＭＳ−イオンサーチ法によるペプチドの検索
第１７フラクションより２つ、第２２フラクションより１つ得られたMS/MSスペクトル（図１）はＭＳ装置に付属する解析ソフトウェアで、個々にスムージング、中心化処理を行ってピークリスト化し、このデータを元にタンパク質アミノ酸配列データベースを用いたMS/MSイオンサーチ法で、ペプチドを同定した。検索エンジンにはマトリックスサイエンス社のMascotを用いた。以下の検索条件のパラメータを用いた。使用した断片化法：セミトリプシン、ミスクリーベージ許容数：１、固定した修飾：システインのカルバミドメチル化、アセトヒドラジド化（ペプチドC末端カルボキシル基、及びアスパラギン酸、グルタミン酸の側鎖カルボキシル基）、変動的な修飾：Ｇｉｒａｒｄ‘ｓ  Ｔ(修飾によって増加する質量計算値よりプロトン１つ分の質量を減じた値を設定、アスパラギン側鎖)、MSスペクトルの許容誤差：５００ｐｐｍ、MS/MSスペクトルの許容誤差：０．５Ｄａ。
【００４３】
・糖ペプチドの同定
上述の条件で検索し、得られた結果より、下記の同定確認処理を行った。
（１）同定の確からしさのスコア（偶然の一致の確率：Expect値）が０．０５以下であること。
（２）同定に寄与したフラグメントイオンの数が４つ以上であること。
（３）誤差（ppm）が系統的誤差より大きくずれていないこと（質量誤差が０．５Ｄａ以下であること）。
（４）同定されたペプチドにコンセンサス配列（Asn-Xaa-[Ser/Thr]、XaaはProでない）があり、その数以下のAsn修飾（Ｇｉｒａｒｄ‘ｓ  Ｔ）があること。
これらの条件を満たす糖ペプチドを３つ同定した。（図1）
【００４４】
・糖鎖付加部位の同定
Ｇｉｒａｒｄ‘ｓ  Ｔ修飾したペプチドから得られる質量分析シグナル（表３）と表１に示した硫酸化糖ペプチドのシグナルから、どの硫酸化糖タンパク質のどの部位のアミノ酸側鎖に、どのような硫酸化糖鎖が結合していたかを決定した。表４中GTで示される位置が硫酸化糖鎖結合位置である。肺癌細胞株より同定した硫酸化糖タンパク質IGFBPL1、GOLM1、APLP1のアミノ酸配列も併せて示す。これらタンパク質における硫酸化糖鎖が結合していた糖鎖付加部位のアミノ酸は強調文字及び下線で示される。
【００４５】
【表４】
2012121820.tif 000007
【００４６】
【化２】
2012121820.tif 000008
【００４７】
【化３】
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【００４８】
【化４】
2012121820.tif 000010
【００４９】
〈硫酸化糖鎖の解析〉
・硫酸化糖鎖の回収
硫酸化糖タンパク質IGFBPL1に結合していた糖鎖の一つを、多段階タンデム質量分析により構造解析するため、糖鎖を遊離し回収した。逆相ＨＰＬＣによって分離した第１７フラクションをペプチドＮグリカナーゼＦにて処理した反応液を、ｎ−ブタノール、エタノール、水の混合溶媒（４：１：１）にて膨潤させた１００μＬのSepharose  CL-4Bゲル（GEヘルスケア社）に供し、この混合溶媒２ｍＬで洗浄後、５０％エタノール（１ｍＬ）にて糖鎖を溶出した。
【００５０】
・硫酸化糖鎖の標識
溶出させた糖鎖は住友ベークライト社のＢｌｏｔＧｌｙｃｏキット中の糖鎖標識試薬であるN-((aminooxy)acetyl)tryptophanylarginine  methyl  ester(aoWR)を用いて標識した。減圧乾固した糖鎖を酢酸とアセトニトリルの混合溶媒（１：５０）に溶解し、２０ｍＭ  aoWRを１０μＬ加え、８０℃で１時間加熱した。乾燥した試料に５０μＬの純水を加え標識した糖鎖を得た。
【００５１】
・試薬の除去
標識した糖鎖の溶液（５０μＬ）に、アセトニトリル（９５０μＬ）を加え、混合した。住友ベークライト社のＢｌｏｔＧｌｙｃｏキット中の「クリーンアップカラム」に混合溶液を通し、アセトニトリル６００μＬで洗浄した後、カラムに吸着した標識糖鎖を純水５０μＬで溶出した。
【００５２】
・多段階タンデム質量分析
標識した糖鎖を１ｍｇ／ｍＬ濃度の2,5-Dihydroxybenzoic  acid溶液に溶解させた。この糖鎖溶液をブルカー・ダルトニクス社のアンカーチッププレートに滴下し乾燥させ、同社のＲｅｆｌｅｘ  ＩＶにより質量分析を行った。フラクション１７と２２の両方で得られたマススペクトルのなかで最もシグナル強度が高いフラクション１７のｍ／ｚ  ２３７７のシグナルを島津製作所のＭＡＬＤＩ−イオントラップ飛行時間型質量分析計ＡＸＩＭＡ  Resonanceを用いて多段階タンデム質量分析に供した。ｍ／ｚ  ２３７７のＭＳ２で得られたプロダクトイオンのなかで、ｍ／ｚ  １９４５をＭＳ３に供した。コアフコース構造を有することを示すシグナルｍ／ｚ  １５８１、硫酸化LacdiNAｃ構造を示すシグナルｍ／ｚ  ４８５が検出された。さらにこのｍ／ｚ  ４８５をＭＳ４に供し、末端のＮアセチルガラクトサミンの４位が硫酸化されていることを示すｍ／ｚ  １８１、１９９を検出した（図２）。
【００５３】
実施例２
〈２次元電気泳動を用いた硫酸化糖タンパク質の分離、検出〉
・電気泳動に用いる試料の調製
無血清培地で２４時間培養した肺癌細胞株（小細胞肺癌H2171、非小細胞肺癌H1355)の培養上清をAmicon  Ultra-154  centrifugal  filter  units(10kDaカットオフ、ミリポア社)で１０倍濃縮した試料に、TCA(トリクロロ酢酸)を最終濃度が１０％になるように加え、タンパク質を沈殿させた。アセトンで３回以上洗浄し残留TCAを除去し乾燥した。得られたタンパク質にゲル膨潤液(8M尿素、2％  Triton X-100、20mM  DTT、0.5％両性担体、ブロモフェノールブルー色素)を加えて溶解した。
【００５４】
・２次元電気泳動
調製したタンパク質溶液に、固定化pH勾配ゲルImmobiline  DryStrip(7cm、pH6―11、GEヘルスケア社)を浸しIPGphor  III(GEヘルスケア社)を用いて１次元目の電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをDTT次にヨードアセトアミドを含む平衡緩衝溶液で平衡化させた後、Protean  II(ATTO社)を利用して１２．５％ポリアクリルアミドで２次元目の電気泳動を行った。
【００５５】
・抗体を用いたタンパク質の検出
泳動後のゲルをPVDF膜(GEヘルスケア社)に転写させた。PBS-T(日水製薬社のダルベッコPBS(-)粉末,0.1%  Tween)に溶解した５％スキムミルクを用いて、タンパク質が転写された膜を室温で１時間ブロッキング処理を施した。PBS-Tで１０分間の洗浄を３回行った後、IGFBPL1に対する市販の一次抗体(Biotinylated  Anti-human  IGFNP-L1  Antibody,R&D  SYSTEMS  BAF3877)を１時間反応させた。PBS-Tで１０分間の洗浄を３回行った後、２次抗体HRP-conjugated  streptavidin(1:3000  dilution,GEヘルスケア社)を１時間反応させた。PBS-Tで１０分間の洗浄を３回行った後、Western  Lightning  Chemiluminescence  Reagent  Plus(パーキンエルマー社)を用いてHRPの酵素反応を行い、得られたシグナルを化学発光用フィルム（Hyperfilm  ECL、GEヘルスケア社)に現像し、小細胞肺癌と非小細胞肺癌の細胞株由来の培養上清に存在しているタンパク量(IGFBPL1)について比較解析を行った。その結果、図３に示すように、小細胞肺癌由来の硫酸化されたIGFBPL1は非小細胞肺癌由来と比較し、より酸性側（左側）にスポットが検出された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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