(57)【要約】【課題】母乳中に含まれる多様なサイトカイン／ケモカインのレベルと、アトピー性皮膚炎の発症との関連性を明らかにし、これに基づき、母乳中サイトカイン／ケモカイン値に基づく乳児アトピー性皮膚炎の発症予知方法を提供すること。【解決手段】乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定する方法であって、（１）当該乳児が摂取する初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３及びＭＩＰ−１αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカイン、或いは当該乳児が摂取する成熟乳中のＩＬ−１α、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２及びＭＩＰ−１αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインの濃度を測定すること；及び（２）（１）において測定したサイトカイン又はケモカインの濃度と、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクとを相関付けることを含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定する方法であって、
（１）当該乳児が摂取する初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３及びＭＩＰ−１αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカイン、或いは当該乳児が摂取する成熟乳中のＩＬ−１α、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２及びＭＩＰ−１αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインの濃度を測定すること；及び
（２）（１）において測定したサイトカイン又はケモカインの濃度と、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクとを相関付けること
を含む、方法。
【請求項２】
乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定する方法であって、
（１）当該乳児が摂取する初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３、或いは成熟乳中のエオタキシン、ＩＦＮ−α２及びＩＬ−１αの濃度を測定すること；及び
（２）（１）において測定したサイトカイン又はケモカインの濃度と、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクとを相関付けること
を含む、方法。
【請求項３】
抗ヒトＩＬ−１β抗体、抗ヒトＩＬ−１α抗体、抗ヒトＩＬ−４抗体、抗ヒトＩＬ−６抗体、抗ヒトＩＬ−７抗体、抗ヒトＩＬ−１２ｐ４０抗体、抗ヒトＩＬ−１３抗体、抗ヒトエオタキシン抗体、抗ヒトＧ−ＣＳＦ抗体、抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体、抗ヒトＩＦＮ−α２抗体及び抗ヒトＭＩＰ−１α抗体からなる群から選択される少なくとも１つの抗体を含む、乳児が摂取する初乳又は成熟乳中のサイトカイン又はケモカイン濃度に基づき、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定するための診断薬。
【請求項４】
抗ヒトＩＬ−６抗体、抗ヒトＩＬ−１２ｐ４０抗体及び抗ヒトＩＬ−１３抗体を含む抗体の組み合わせ、或いは抗ヒトエオタキシン抗体、抗ヒトＩＦＮ−α２抗体及び抗ヒトＩＬ−１α抗体を含む抗体の組み合わせを含む、請求項３記載の診断薬。
【請求項５】
被検物質が、初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３又はＭＩＰ−１α、或いは成熟乳中のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２又はＭＩＰ−１αの濃度を抑制し得るか否か、或いは成熟乳中のＩＬ−１α濃度を上昇させ得るか否か評価すること、及び
初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３又はＭＩＰ−１α、或いは成熟乳中のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２又はＭＩＰ−１αの濃度を抑制した被検物質、或いは成熟乳中のＩＬ−１α濃度を上昇させた被検物質を、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症を予防する物質として選択すること
を含む、乳児のアトピー性皮膚炎の発症を予防する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、母乳中サイトカイン／ケモカイン値に基づく乳児アトピー性皮膚炎の発症予知方法、及びそれに使用する診断薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
母乳栄養は、乳児におけるアトピー性皮膚炎（ＡＤ）等の多くのアレルギー性疾患の発症に関連する１つの因子である。２００１年における１７の過去の研究のメタ解析は、生後３カ月間の母乳栄養が、アトピー性皮膚炎の成立に対して防御的な効果を有することを示している（非特許文献１）。しかしながら、１つの報告は、母乳栄養は防御的効果がないことを報告しており（非特許文献２）、他の報告はアトピー性皮膚炎を発症するリスクを増加させることを示唆している（非特許文献３及び４）。従って、母乳栄養がアトピー性皮膚炎の発症から乳児を予防したことを示した研究は１つもない。母乳栄養はアトピー性皮膚炎を予防するかもしれないが、母乳栄養とアトピー性皮膚炎の発症との間の関係が確証されているとはいえない。アトピー性皮膚炎及び他のアレルギー性疾患に関連する母乳栄養の効果についての研究が結論を見ていない理由の１つは、母乳の構成因子の複雑さ、及び乳児における腸環境と免疫系との間の相互作用の複雑さにあるであろう。
【０００３】
ヒト母乳は、多様なサイトカイン／ケモカインを含有する（非特許文献５）。それらのレベルは、母親のアレルギー状態等によって、個々の女性の間で大きく異なっている（非特許文献６〜１１）。特に重要なのは、ヒト母乳中に存在するいくつかのサイトカインは、胃において消化されず、むしろ乳児の消化管においてその生物学的な活性を維持するという事実である（非特許文献５及び１２）。母乳を介して免疫調節作用を発揮するかもしれない多くの炎症性及び抗炎症性サイトカインが母乳中に含有されていることを考えると、母乳に含まれる幾つかのサイトカイン／ケモカインは乳児のアトピー性皮膚炎の発症を予防するように作用すると考えられているが、他のサイトカイン／ケモカインは、逆に作用するかもしれない。
【０００４】
近年、多くの研究者が母乳栄養のアレルギー関連効果を明らかにするため、母乳サイトカインを調べている。何人かの研究者が、母乳中に含有される特定のサイトカインがアレルギー疾患の成立に関連している可能性を示している（非特許文献１３及び１４）。しかしながら、これらの研究の結果は明確なものではない。また、過去の研究は異なる時期に採取した母乳を使用している。アトピー性皮膚炎に関連する初乳及び成熟乳の双方におけるサイトカイン／ケモカインを調べた研究はほとんどない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Gdalevich M, Mimouni D, David M, Mimouni M. Breast-feeding and the onset of atopic dermatitis in childhood: a systematic review and meta-analysis of prospective studies. J Am Acad Dermatol. 2001;45(4):520-527.
【非特許文献２】Ludvigsson JF, Mostrom M, Ludvigsson J, Duchen K. Exclusive breastfeeding and risk of atopic dermatitis in some 8300 infants. Pediatr Allergy Immunol. 2005;16(3):201-208.
【非特許文献３】Benn CS, Wohlfahrt J, Aaby P, Westergaard T, Benfeldt E, Michaelsen KF, et al. Breastfeeding and risk of atopic dermatitis, by parental history of allergy, during the first 18 months of life. Am J Epidemiol. 2004;160(3):217-223.
【非特許文献４】Pesonen M, Kallio MJ, Ranki A, Siimes MA. Prolonged exclusive breastfeeding is associated with increased atopic dermatitis: a prospective follow-up study of unselected healthy newborns from birth to age 20 years. Clin Exp Allergy. 2006;36(8):1011-1018.
【非特許文献５】Field CJ. The immunological components of human milk and their effect on immune development in infants. J Nutr. 2005;135(1):1-4.
【非特許文献６】Bottcher MF, Jenmalm MC, Bjorksten B, Garofalo RP. Chemoattractant factors in breast milk from allergic and nonallergic mothers. Pediatr Res. 2000;47(5):592-597.
【非特許文献７】Bottcher MF, Jenmalm MC, Garofalo RP, Bjorksten B. Cytokines in breast milk from allergic and nonallergic mothers. Pediatr Res. 2000;47(1):157-162.
【非特許文献８】Laiho K, Lampi AM, Hamalainen M, Moilanen E, Piironen V, Arvola T, et al. Breast milk fatty acids, eicosanoids, and cytokines in mothers with and without allergic disease. Pediatr Res. 2003;53(4):642-647.
【非特許文献９】Prokesova L, Lodinova-Zadnikova R, Zizka J, Kocourkova I, Novotna O, Petraskova P, et al. Cytokine levels in healthy and allergic mothers and their children during the first year of life. Pediatr Allergy Immunol. 2006;17(3):175-183.
【非特許文献１０】Rigotti E, Piacentini GL, Ress M, Pigozzi R, Boner AL, Peroni DG. Transforming growth factor-beta and interleukin-10 in breast milk and development of atopic diseases in infants. Clin Exp Allergy. 2006;36(5):614-618.
【非特許文献１１】Marek A, Zagierski M, Liberek A, Aleksandrowicz E, Korzon M, Krzykowski G, et al. TGF-beta(1), IL-10 and IL-4 in colostrum of allergic and nonallergic mothers. Acta Biochim Pol. 2009;56(3):411-414.
【非特許文献１２】Calhoun DA, Lunoe M, Du Y, Staba SL, Christensen RD. Concentrations of granulocyte colony-stimulating factor in human milk after in vitro simulations of digestion. Pediatr Res. 1999;46(6):767-771.
【非特許文献１３】Kalliomaki M, Ouwehand A, Arvilommi H, Kero P, Isolauri E. Transforming growth factor-beta in breast milk: a potential regulator of atopic disease at an early age. J Allergy Clin Immunol. 1999;104(6):1251-1257.
【非特許文献１４】Oddy WH, Halonen M, Martinez FD, Lohman IC, Stern DA, Kurzius-Spencer M, et al. TGF-beta in human milk is associated with wheeze in infancy. J Allergy Clin Immunol. 2003;112(4):723-728.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
母乳中の多様なサイトカイン／ケモカインの存在と、母乳を摂取した乳児におけるアトピー性皮膚炎の発症との間の可能性のある関連性は、非常に興味深い。幾つかのサイトカインやケモカインがネットワークにおいて機能し、乳児免疫系の異常な活性化を統合することにより、アトピー性皮膚炎に関連するかもしれない。なぜなら、多様なサイトカイン／ケモカインがアトピー性皮膚炎の病態に寄与しているので、アトピー性皮膚炎の成立に影響を与える母乳中の個々のサイトカインやケモカインをバラバラに評価するのは効率的でない。従って、多くの種類の母乳サイトカイン／ケモカインの量を同時に評価することは価値あることである。
【０００７】
本発明の目的は、母乳中に含まれる多様なサイトカイン／ケモカインのレベルと、アトピー性皮膚炎の発症との関連性を明らかにし、これに基づき、母乳中サイトカイン／ケモカイン値に基づく乳児アトピー性皮膚炎の発症予知方法、及びそれに使用する診断薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討したところ、６ヶ月齢において、アトピー性皮膚炎を発症している乳児が摂取した母乳と、コントロール乳児が摂取した母乳との間には、初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３及びＭＩＰ−１αの濃度、及び成熟乳中のＩＬ−１α、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２及びＭＩＰ−１αの濃度に有意差があることを見出した。ロジスティック回帰分析により、高レベルの初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３、及び高レベルの成熟乳中のエオタキシン及びＩＦＮ−α２、且つ低レベルの成熟乳中のＩＬ−１αは、ＡＤの発症にとってリスク因子であることが示された。成熟乳中のエオタキシン、ＩＦＮ−α２及びＩＬ−１αを包含するケモカイン／サイトカインの濃度を特定のカットオフポイントに設定することにより、非常に高い受動者動作特性曲線（ＲＯＣ）下面積を有する乳児アトピー性皮膚炎予想モデルを構築することができた。これらの知見に基づき、更に検討を重ねた結果、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定する方法であって、
（１）当該乳児が摂取する初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３及びＭＩＰ−１αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカイン、或いは当該乳児が摂取する成熟乳中のＩＬ−１α、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２及びＭＩＰ−１αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインの濃度を測定すること；及び
（２）（１）において測定したサイトカイン又はケモカインの濃度と、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクとを相関付けること
を含む、方法。
［２］乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定する方法であって、
（１）当該乳児が摂取する初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３、或いは成熟乳中のエオタキシン、ＩＦＮ−α２及びＩＬ−１αの濃度を測定すること；及び
（２）（１）において測定したサイトカイン又はケモカインの濃度と、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクとを相関付けること
を含む、方法。
［３］抗ヒトＩＬ−１β抗体、抗ヒトＩＬ−１α抗体、抗ヒトＩＬ−４抗体、抗ヒトＩＬ−６抗体、抗ヒトＩＬ−７抗体、抗ヒトＩＬ−１２ｐ４０抗体、抗ヒトＩＬ−１３抗体、抗ヒトエオタキシン抗体、抗ヒトＧ−ＣＳＦ抗体、抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体、抗ヒトＩＦＮ−α２抗体及び抗ヒトＭＩＰ−１α抗体からなる群から選択される少なくとも１つの抗体を含む、乳児が摂取する初乳又は成熟乳中のサイトカイン又はケモカイン濃度に基づき、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定するための診断薬。
［４］抗ヒトＩＬ−６抗体、抗ヒトＩＬ−１２ｐ４０抗体及び抗ヒトＩＬ−１３抗体を含む抗体の組み合わせ、或いは抗ヒトエオタキシン抗体、抗ヒトＩＦＮ−α２抗体及び抗ヒトＩＬ−１α抗体を含む抗体の組み合わせを含む、［３］記載の診断薬。
［５］被検物質が、初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３又はＭＩＰ−１α、或いは成熟乳中のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２又はＭＩＰ−１αの濃度を抑制し得るか否か、或いは成熟乳中のＩＬ−１α濃度を上昇させ得るか否か評価すること、及び
初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３又はＭＩＰ−１α、或いは成熟乳中のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２又はＭＩＰ−１αの濃度を抑制した被検物質、或いは成熟乳中のＩＬ−１α濃度を上昇させた被検物質を、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症を予防する物質として選択すること
を含む、乳児のアトピー性皮膚炎の発症を予防する物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、母乳中サイトカイン／ケモカイン値に基づき、乳児アトピー性皮膚炎の発症リスクを高い精度で評価することが可能である。また、本発明によれば、乳児のアトピー性皮膚炎の発症を予防する候補物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】初乳中のサイトカイン及びケモカインのレベルをＡＤ群とコントロール群との間で比較した結果を示す。最小値、２５ｔｈ、５０ｔｈ、７５ｔｈ及び最大値を示した（ｎ＝試料の数）。検出限界以下の試料中のサイトカイン濃度を１．６ｐｇ／ｍｌと定義した。
【図２】成熟乳中のサイトカイン及びケモカインのレベルをＡＤ群とコントロール群との間で比較した結果を示す。最小値、２５ｔｈ、５０ｔｈ、７５ｔｈ及び最大値を示した（ｎ＝試料の数）。検出限界以下の試料中のサイトカイン濃度を１．６ｐｇ／ｍｌと定義した。
【図３】母乳サイトカイン／ケモカイン濃度による、６ヶ月齢におけるＡＤ発症の予測のためのＲＯＣ曲線。これらの曲線は、初乳中の各サイトカイン又は成熟乳中の各サイトカイン／ケモカインの標準化した値の合計値により作成した。曲線下面積を統計学的解析により決定した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定する方法
本発明は、乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定する方法であって、
（１）当該乳児が摂取する初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３及びＭＩＰ−１αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカイン、或いは当該乳児が摂取する成熟乳中のＩＬ−１α、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２及びＭＩＰ−１αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインの濃度を測定すること；及び
（２）（１）において測定したサイトカイン又はケモカインの濃度と、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクとを相関付けること
を含む、方法を提供するものである。
【００１３】
本明細書において乳児とは、新生児期以後１年までの小児を意味する。本発明の方法により、通常、生後１２ヶ月まで、好ましくは、生後６ヶ月までに、乳児がアトピー性皮膚炎を発症するリスクを判定することができる。
【００１４】
本発明の判定方法の対象者は、通常、母乳育児を受けたヒト乳児である。
【００１５】
本明細書において初乳とは、分娩後、長くとも７日間以内、好ましくは５日以内に母体より分泌される乳汁を意味する。一態様において、本発明には、分娩４〜５日後に母体より分泌される初乳が用いられる。
【００１６】
成熟乳とは、一般的には分娩から３週間以上後、好ましくは４週間以上後に母体より分泌される乳汁を意味する。本発明において用いられる成熟乳としては、好ましくは分娩２ヶ月以内に、更に好ましくは分娩１ヶ月後に母体より分泌される成熟乳である。
【００１７】
本発明の方法においては、対象乳児が摂取する初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３及びＭＩＰ−１αからなる群から選択される少なくとも１つ（好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上）のサイトカイン、或いは当該乳児が摂取する成熟乳中のＩＬ−１α、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２及びＭＩＰ−１αからなる群から選択される少なくとも１つ（好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上）のサイトカイン又はケモカインの濃度を測定する。
【００１８】
一態様において、初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３、或いは成熟乳中のエオタキシン、ＩＦＮ−α２及びＩＬ−１αの濃度が測定される。これらの特定のサイトカイン又はケモカイン濃度を組み合わせることにより、より精度の高いアトピー性皮膚炎の発症リスクの判定が期待できる。
【００１９】
ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２及びＭＩＰ−１αは、いずれも周知のサイトカイン又はケモカインである。ヒト由来のこれらのサイトカイン又はケモカインの代表的なアミノ酸配列およびそのＮＣＢＩアクセッション番号は以下の通りである。
ＩＬ−１α：NP_000566.3 region 113..271（配列番号１）
ＩＬ−１β：NP_000567.1 region 117..269（配列番号２）
ＩＬ−４：NP_000580.1 region 25..153（配列番号３）
ＩＬ−６：NP_000591.1 region 30..212（配列番号４）
ＩＬ−７：NP_000871.1 region 26..177（配列番号５）
ＩＬ−１２ｐ４０：NP_002178.2 region 23..328（配列番号６）
ＩＬ−１３：NP_002179.2 region 35..132（配列番号７）
エオタキシン：NP_002977.1 region 24..97（配列番号８）
Ｇ−ＣＳＦ：NP_000750.1 region 31..207（配列番号９）
ＧＭ−ＣＳＦ：NP_000749.2 region 18..144（配列番号１０）
ＩＦＮ−α２：NP_000596.2 region 24..188（配列番号１１）
ＭＩＰ−１α：NP_002974.1 region 24..92（配列番号１２）
【００２０】
母乳中の各サイトカイン又はケモカインの濃度は、各サイトカイン又はケモカインを特異的に認識する抗体を用いて、免疫学的手法により測定することができる。免疫学的手法としては、抗体アレイ、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色等を挙げることができる。
【００２１】
母乳は脂質が豊富なため、サイトカイン又はケモカイン濃度の免疫学的測定に際しては、あらかじめ遠心分離をし、脂質層を除去することにより得られる非脂肪ホエイを用いることが好ましい。
【００２２】
抗体による抗原Ｘの「特異的な認識」とは、抗原抗体反応における、抗体の抗原Ｘに対するアフィニティが、抗原Ｘ以外の抗原に対するアフィニティよりも強いことを意味する。本明細書において、抗原Ｘを特異的に認識する抗体を「抗Ｘ抗体」と略記する。
【００２３】
各サイトカイン又はケモカインを特異的に認識する抗体は、該サイトカイン又はケモカインやその抗原性を有する部分ペプチドを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はこれらの結合性断片である。結合性断片とは、特異的結合活性を有する前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ等が挙げられる（Exp. Opin. Ther. Patents, Vol.6, No.5, p.441-456, 1996）。抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧ又はＩｇＭであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはＩｇＧである。
【００２４】
また、抗体は、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ等）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）、ビオチンなどで標識されていてもよい。
【００２５】
上述の各サイトカイン又はケモカインを特異的に認識する抗体を、適切な支持体の上に結合して、抗体アレイとして提供してもよい。支持体としては、当該分野で通常用いられている支持体であれば特に限定されず、例えば、メンブレン（例えば、ナイロン膜）、ビーズ、ガラス、プラスチック、金属などが挙げられる。
【００２６】
次に、工程（１）において測定した初乳又は成熟乳中の各サイトカイン又はケモカイン濃度と、乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクとを相関付ける。例えば、測定された初乳又は成熟乳中の各サイトカイン又はケモカイン濃度を、アトピー性皮膚炎を発症した乳児が摂取した初乳又は成熟乳中の対応するサイトカイン又はケモカイン濃度、及びアトピー性皮膚炎を発症しない乳児が摂取した初乳又は成熟乳中の対応するサイトカイン又はケモカイン濃度と比較する。あるいは、測定された初乳又は成熟乳中の各サイトカイン又はケモカイン濃度を、あらかじめ求めておいた、アトピー性皮膚炎を発症した多数個体の乳児についての初乳又は成熟乳中の対応するサイトカイン又はケモカイン濃度の平均値、アトピー性皮膚炎を発症していない多数個体の乳児についての初乳又は成熟乳中の対応するサイトカイン又はケモカイン濃度の平均値、アトピー性皮膚炎を発症した／発症していない多数個体の乳児についての初乳又は成熟乳中の対応するサイトカイン又はケモカイン濃度の分布図などと比較してもよい。各サイトカイン又はケモカイン濃度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
【００２７】
後述の実施例に示すように、アトピー性皮膚炎を発症した乳児が摂取する初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３及びＭＩＰ−１α、並びに成熟乳中のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２及びＭＩＰ−１αの各サイトカイン又はケモカインの濃度は、アトピー性皮膚炎を発症しない乳児が摂取する初乳又は成熟乳中のそれと比較して高かった。即ち、初乳又は成熟乳中に含まれる上述の各サイトカイン又はケモカインの濃度と、当該初乳又は成熟乳を摂取する乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクとの間の正の相関に基づき、乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定することができる。例えば、初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３及びＭＩＰ−１αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカイン、或いは成熟乳中のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２及びＭＩＰ−１αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインの濃度が相対的に高い場合には、当該初乳又は成熟乳を摂取する乳児はアトピー性皮膚炎を発症する可能性が高いと判定することができる。
【００２８】
一方、後述の実施例に示すように、アトピー性皮膚炎を発症した乳児が摂取する成熟乳中のＩＬ−１α濃度は、アトピー性皮膚炎を発症しない乳児が摂取する成熟乳中のそれと比較して低かった。即ち、成熟乳中に含まれるＩＬ−１α濃度と、当該成熟乳を摂取する乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクとの間の負の相関に基づき、乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定することができる。例えば、成熟乳中のＩＬ−１α濃度が相対的に低い場合には、当該初乳又は成熟乳を摂取する乳児はアトピー性皮膚炎を発症する可能性が高いと判定することができる。
【００２９】
また、初乳又は成熟乳中の各サイトカイン又はケモカイン濃度のカットオフ値をあらかじめ設定しておき、測定された初乳又は成熟乳中の各サイトカイン又はケモカイン濃度とこのカットオフ値とを比較することによって行うこともできる。例えば、初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３及びＭＩＰ−１αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカイン、或いは成熟乳中のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２及びＭＩＰ−１αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインの濃度が前記カットオフ値以上である場合には、当該初乳又は成熟乳を摂取する乳児はアトピー性皮膚炎を発症する可能性が高いと判定することができる。また、成熟乳中のＩＬ−１α濃度が前記カットオフ値以下である場合には、当該成熟乳を摂取する乳児はアトピー性皮膚炎を発症する可能性が高いと判定することができる。
【００３０】
「カットオフ値」は、その値を基準として疾患の判定をした場合に、高い診断感度（有病正診率）及び高い診断特異度（無病正診率）の両方を満足できる値である。例えば、アトピー性皮膚炎を発症した乳児で高い陽性率を示し、かつ、アトピー性皮膚炎を発症していない乳児で高い陰性率を示す、初乳又は成熟乳中の各サイトカイン又はケモカイン濃度をカットオフ値として設定することが出来る。
【００３１】
カットオフ値の算出方法は、この分野において周知である。例えば、アトピー性皮膚炎を発症した乳児及びアトピー性皮膚炎を発症していない乳児が摂取した、初乳又は成熟乳中の上述サイトカイン又はケモカイン濃度を測定し、測定された値における診断感度および診断特異度を求め、これらの値に基づき、市販の解析ソフトを使用してＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を作成する。そして、診断感度と診断特異度が可能な限り１００％に近いときの値を求めて、その値をカットオフ値とすることができる。また、例えば、検出された値における診断効率（全症例数に対する、有病正診症例と無病正診症例の合計数の割合）を求め、最も高い診断効率が算出される値をカットオフ値とすることができる。
【００３２】
尚、本発明の方法においては、対象乳児が摂取する初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３及びＭＩＰ−１αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカイン、或いは当該乳児が摂取する成熟乳中のＩＬ−１α、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２及びＭＩＰ−１αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインの濃度を測定すれば足りるが、これらのサイトカイン又はケモカインのうちの複数（例えば２以上、好ましくは３以上）の濃度を測定し、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクと相関付けることにより、より精度の高いアトピー性皮膚炎の発症リスクの判定が期待できる。
【００３３】
好ましい態様において、初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３、或いは成熟乳中のエオタキシン、ＩＦＮ−α２及びＩＬ−１αの濃度が測定される。これらの特定のサイトカイン又はケモカイン濃度の組み合わせることにより、より精度の高いアトピー性皮膚炎の発症リスクの判定が期待できる。
【００３４】
例えば、初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３の濃度が相対的に高い場合には、当該初乳を摂取する乳児はアトピー性皮膚炎を発症する可能性が高いと判定することができる。或いは、成熟乳中のエオタキシン及びＩＦＮ−α２の濃度が相対的に高く、且つ成熟乳中ＩＬ−１αの濃度が相対的に低い場合には当該成熟乳を摂取する乳児はアトピー性皮膚炎を発症する可能性が高いと判定することができる。
【００３５】
或いは、初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３濃度、或いは成熟乳中のエオタキシン、ＩＦＮ−α２及びＩＬ−１α濃度のカットオフ値をあらかじめ設定しておき、測定された初乳又は成熟乳中の各サイトカイン又はケモカイン濃度とこのカットオフ値とを比較することによって行ってもよい。初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３の濃度が、それぞれ前記カットオフ値以上である場合には、当該初乳又は成熟乳を摂取する乳児はアトピー性皮膚炎を発症する可能性が高いと判定することができる。或いは、成熟乳中のエオタキシン及びＩＦＮ−α２の濃度が、それぞれ前記カットオフ値以上であり、且つＩＬ−１α濃度が前記カットオフ値以下である場合には、当該成熟乳を摂取する乳児はアトピー性皮膚炎を発症する可能性が高いと判定することができる。
【００３６】
或いは、アトピー性皮膚炎を発症した乳児及びアトピー性皮膚炎を発症していない乳児が摂取した、初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３濃度又は成熟乳中のエオタキシン、ＩＦＮ−α２及びＩＬ−１α濃度を測定し、市販の解析ソフトを使用して、各サイトカイン濃度のデータを三分位値又は中央値にカテゴライズし、アトピー性皮膚炎の発症に対する各サイトカイン又はケモカインの独立した効果を評価する多重ロジステッィク回帰モデルを構築し、ＲＯＣ曲線を作成することにより、初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３濃度、又は成熟乳中のエオタキシン、ＩＦＮ−α２及びＩＬ−１α濃度と、乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクとの相関式を構築した上で、測定した対象乳児が摂取した初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３濃度又は成熟乳中のエオタキシン、ＩＦＮ−α２及びＩＬ−１α濃度をこの相関式に導入することにより、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを評価することができる。或いは、初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３濃度、或いは成熟乳中のエオタキシン、ＩＦＮ−α２及びＩＬ−１α濃度を標準化スコアに変換することにより、異なったスケールで測定された上記のサイトカイン及びケモカインを相対的な得点とする。初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３の得点の和、成熟乳中のエオタキシン、ＩＦＮ−α２及びＩＬ−１αの得点の和（ＩＬ−１αは、アトピー性皮膚炎を発症した乳児が摂取していた成熟母乳中で有意に低値であったことから、スコアの係数を−１とする）を変数としたＲＯＣ解析を行うことで、これらの得点が高いほど当該乳児アトピー性皮膚炎を発症するリスクが高いと評価することができる。
【００３７】
２．診断薬
本発明は、乳児が摂取する初乳又は成熟乳中のサイトカイン又はケモカイン濃度に基づき、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定するための診断薬であって、抗ヒトＩＬ−１β抗体、抗ヒトＩＬ−１α抗体、抗ヒトＩＬ−４抗体、抗ヒトＩＬ−６抗体、抗ヒトＩＬ−７抗体、抗ヒトＩＬ−１２ｐ４０抗体、抗ヒトＩＬ−１３抗体、抗ヒトエオタキシン抗体、抗ヒトＧ−ＣＳＦ抗体、抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体、抗ヒトＩＦＮ−α２抗体及び抗ヒトＭＩＰ−１α抗体からなる群から選択される少なくとも１つの抗体を含む、診断薬を提供するものである。本発明の診断薬を用いれば、上記本発明の方法により、容易に乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定することが可能となる。
【００３８】
「抗体」の定義及び態様は、上記１の項で記載した通りである。
【００３９】
本発明の診断薬が、乳児が摂取する初乳中のサイトカイン又はケモカイン濃度に基づき、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定するための診断薬である場合、該診断薬は、抗ヒトＩＬ−１β抗体、抗ヒトＩＬ−６抗体、抗ヒトＩＬ−７抗体、抗ヒトＩＬ−１２ｐ４０抗体、抗ヒトＩＬ−１３抗体、及び抗ヒトＭＩＰ−１α抗体からなる群から選択される少なくとも１つ（好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上）の抗体を含む。この場合、一態様において、本発明の診断薬は、抗ヒトＩＬ−６抗体、抗ヒトＩＬ−１２ｐ４０抗体及び抗ヒトＩＬ−１３抗体を含む抗体の組み合わせを含む。上記本発明の方法により、該態様の診断薬を用いて、初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３濃度を測定することにより、高い精度で当該初乳を摂取する乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定することができる。
【００４０】
本発明の診断薬が、乳児が摂取する成熟乳中のサイトカイン又はケモカイン濃度に基づき、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定するための診断薬である場合、該診断薬は、抗ヒトＩＬ−１α抗体、抗ヒトＩＬ−４抗体、抗ヒトＩＬ−６抗体、抗ヒトＩＬ−７抗体、抗ヒトＩＬ−１２ｐ４０抗体、抗ヒトエオタキシン抗体、抗ヒトＧ−ＣＳＦ抗体、抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体、抗ヒトＩＦＮ−α２抗体及び抗ヒトＭＩＰ−１α抗体からなる群から選択される少なくとも１つ（好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上）の抗体を含む。この場合、一態様において、本発明の診断薬は、抗ヒトエオタキシン抗体、抗ヒトＩＦＮ−α２抗体及び抗ヒトＩＬ−１α抗体を含む抗体の組み合わせを含む。上記本発明の方法により、該態様の診断薬を用いて、成熟乳中のエオタキシン、ＩＦＮ−α２及びＩＬ−１α濃度を測定することにより、高い精度で当該成熟乳を摂取する乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定することができる。
【００４１】
本発明の診断薬に含まれる抗体は、通常、水もしくは適当な緩衝液（例：ＴＥバッファー、ＰＢＳなど）中に適当な濃度となるように溶解されるか、あるいは凍結乾燥された状態で提供される。
【００４２】
或いは、抗体を適切な支持体の上に結合して、抗体アレイとして提供してもよい。支持体としては、当該分野で通常用いられている支持体であれば特に限定されず、例えば、メンブレン（例えば、ナイロン膜）、ビーズ、ガラス、プラスチック、金属などが挙げられる。
【００４３】
本発明の診断薬は、免疫学的測定方法の種類に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含む診断用キットとして提供することもできる。例えば、本発明の診断薬は、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液、ＥＬＩＳＡプレート、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。
【００４４】
また、本発明の診断薬は、検量線作成のため、測定対象のサイトカイン又はケモカインを既知量含むサイトカイン又はケモカイン溶液を含んでいてもよい。この検量線作成用のサイトカイン又はケモカイン溶液は、好ましくは、測定対象のサイトカイン又はケモカインのヒト母乳（又はそのホエイ）中の溶液である。本発明の診断薬が、乳児が摂取する初乳中のサイトカイン又はケモカイン濃度に基づき、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定するための診断薬である場合、該診断薬は、測定対象のサイトカイン又はケモカインのヒト初乳（又はそのホエイ）中の溶液を検量線作成用として含み得る。本発明の診断薬が、乳児が摂取する成熟乳中のサイトカイン又はケモカイン濃度に基づき、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症リスクを判定するための診断薬である場合、該診断薬は、測定対象のサイトカイン又はケモカインのヒト成熟乳（又はそのホエイ）中の溶液を検量線作成用として含み得る。
【００４５】
これらの各構成要素は、各々別個に（あるいは可能であれば混合した状態で）水もしくは適当な緩衝液（例：ＴＥバッファー、ＰＢＳなど）中に適当な濃度となるように溶解されるか、あるいは凍結乾燥された状態で、適切な容器内に収容される。
【００４６】
３．スクリーニング方法
上述のように、アトピー性皮膚炎を発症した乳児が摂取する初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３及びＭＩＰ−１α、並びに成熟乳中のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２及びＭＩＰ−１αの各サイトカイン又はケモカインの濃度は、アトピー性皮膚炎を発症しない乳児が摂取する初乳又は成熟乳中のそれと比較して高い。また、アトピー性皮膚炎を発症した乳児が摂取する成熟乳中のＩＬ−１α濃度は、アトピー性皮膚炎を発症しない乳児が摂取する成熟乳中のそれと比較して低い。従って、被検物質が、初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３又はＭＩＰ−１α、或いは成熟乳中のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２又はＭＩＰ−１αの濃度を抑制し得るか否か評価し、或いは成熟乳中のＩＬ−１α濃度を上昇させ得るか否か評価し、初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３又はＭＩＰ−１α、或いは成熟乳中のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２又はＭＩＰ−１αの濃度を抑制した被検物質、或いは成熟乳中のＩＬ−１α濃度を上昇させた被検物質を、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症を予防する物質として選択することができる。本発明は、このような乳児のアトピー性皮膚炎の発症を予防する物質のスクリーニング方法を提供する。
【００４７】
スクリーニング方法に供される被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。食品、飲料、又はそれらの抽出物も被検物質としてまた好ましい。
【００４８】
本発明のスクリーニング方法は、被検物質の、哺乳動物への投与により行われ得る。該動物としては、例えば、哺乳動物としては、ヒト及びヒトを除く哺乳動物を挙げることが出来る。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。当該哺乳動物としては、妊娠している、又は母乳を分泌している雌性哺乳動物が好ましい。
【００４９】
例えば、被検物質を哺乳動物へ投与し、該哺乳動物が分泌する初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３又はＭＩＰ−１α、或いは成熟乳中のＩＬ−１α、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２又はＭＩＰ−１αの濃度を測定する。次いで、被検物質を投与した哺乳動物が分泌した初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３又はＭＩＰ−１α、或いは成熟乳中のＩＬ−１α、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２又はＭＩＰ−１αの濃度を、被検物質を投与していない哺乳動物が分泌した初乳又は成熟乳中の当該サイトカイン又はケモカインの濃度と比較する。濃度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。比較の結果、初乳中のＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３又はＭＩＰ−１α、或いは成熟乳中のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２又はＭＩＰ−１αの濃度を抑制した被検物質、或いは成熟乳中のＩＬ−１α濃度を上昇させた被検物質を、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症を予防する候補物質として選択する。
【００５０】
一態様において、被検物質を哺乳動物へ投与し、該哺乳動物が分泌する初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３濃度を測定する。次いで、被検物質を投与した哺乳動物が分泌した初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３の濃度を、被検物質を投与していない哺乳動物が分泌した初乳中ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３の濃度と比較する。濃度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。比較の結果、初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３の濃度を抑制した被検物質を、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症を予防する候補物質として選択する。
【００５１】
一態様において、被検物質を哺乳動物へ投与し、該哺乳動物が分泌する成熟乳中のエオタキシン、ＩＦＮ−α２及びＩＬ−１α濃度を測定する。次いで、被検物質を投与した哺乳動物が分泌した成熟乳中のエオタキシン、ＩＦＮ−α２及びＩＬ−１αの濃度を、被検物質を投与していない哺乳動物が分泌した成熟乳中のエオタキシン、ＩＦＮ−α２及びＩＬ−１αの濃度と比較する。濃度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。比較の結果、成熟乳中のエオタキシン及びＩＦＮ−α２の濃度を抑制し、且つＩＬ−１αの濃度を上昇させた被検物質を、当該乳児のアトピー性皮膚炎の発症を予防する候補物質として選択する。
【００５２】
本発明のスクリーニング方法によって得られ得る乳児のアトピー性皮膚炎の発症を予防する候補物質は、医薬品開発のための候補化合物とすることができる。また、医薬として製剤化することにより、乳児のアトピー性皮膚炎を予防するために、母体に適用される医薬組成物とすることができる。或いは、乳児のアトピー性皮膚炎を予防するために、母体が摂取するための食品組成物とすることもできる。
【００５３】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００５４】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
患者及び方法
コホート及び試験対象者
２００７年１月から２００８年５月にかけて、川鉄千葉病院において５００人の新生児の前向き誕生コホート（prospective birth cohort）をセットアップした。すべての参加者は、その乳児が生まれる前にアンケートを受けた。親のアレルギー疾患及び多様な曝露についてのデータを取得した。親は、湿疹に関する症状に主に焦点をあてたアンケートに答えた。乳児が６カ月齢のときに、少なくとも２ヶ月間にわたり痒い湿疹を有する乳児をアトピー性皮膚炎と定義した。６カ月アンケートに対する完全回答率は７３％であった。６カ月齢においてアトピー性皮膚炎（ＡＤ）を発症した乳児は５１人で、そこから４９人のＡＤ（＋）対象者を選択した。母乳の欠失のため、５１人のＡＤの乳児のうちの２人は研究対象から除いた。４９人のＡＤ（−）対象を、ＡＤ及び他のアレルギー疾患（喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、及び花粉症）の母体歴に関する差異がないように、ランダムに選択した。４９人のＡＤ（＋）乳児のうちの２０人、及び４９人のＡＤ（−）乳児のうちの２０人は、１カ月齢まで主に母乳栄養であり、他の乳児は、混合栄養であった。母乳の凍結ストックを多重サイトカインアッセイに付した。妊娠の経過は全ての女性において正常であった。アレルギー疾患の履歴を除き、母体は他の医学的問題を有していなかった。ＡＤ（＋）乳児とＡＤ（−）乳児との間、及び２群の母体間に背景の有意な差はなかった（表１）。全ての参加者は、研究に参加することの書面によるインフォームドコンセントを提供した。本研究は、千葉大学大学院医学研究院の倫理委員会により許可されたものである。
【００５６】
【表１】
2012233777.tif 000002
【００５７】
母体及び乳児の特徴。母体の年齢、出産歴、妊娠前のＢＭＩ、妊娠中のＢＭＩ、妊娠期間及び出生時体重をＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定により解析した。他の特徴は、Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓカイ二乗検定により解析した。
【００５８】
母乳のサンプリング及び保存
母乳試料を生後４〜５日及び分娩１カ月後に採集し、長期保存のために−８０℃にて凍結した。母乳試料を試験する前に素早く融解し、１００００×ｇにて１０分間遠心分離した。脂質層の除去後、非脂肪ホエイをピペットで抽出した。
【００５９】
多重解析
母乳中のサイトカイン及びケモカインを、２６個のサイトカイン及びケモカインのそれぞれに対する抗体で被覆されたポリスチレンビーズを含有する、ミリポアから購入した多重キットのついたＢｉｏ−Ｐｌｅｘ懸濁アレイシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄラボラトリー）により測定した。この技術が有利な点は、試料中の１００検体にものぼる同時測定のためにわずか２５μｌの試料しか必要ないことである。２６サイトカイン［ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−α２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、エオタキシン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）−１α、ＭＩＰ−１β、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１、及びインターフェロンガンマ誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）］についての多重解析を、初乳及び成熟乳について行った。母乳試料を室温にて融解し、９６穴フィルター底プレートにｄｕｐｌｉｃａｔｅで加えた。ビーズをウェルに加えて、プレートシェーカー上で室温にて１時間インキュベートした。ウェルを、フィルター底を通してバキュームすることにより洗浄後、抗体コンジュゲートを加え、さらに１時間撹拌を続けた。ストレプトアビジン−フィコエリスリンをウェルに加え、最終撹拌インキュベーションを行った。プレートを前述の様に洗浄し、１００μｌのシース液をウェルに加え、ウェルを読んだ。全ての解析対象についての標準曲線及び品質コントロールをプレート上で行った。サイトカインが結合したビーズの中間値蛍光強度を、５パラメーター論理的モデルを使用して、濃度（ｐｇ／ｍｌ）に変換した。全てのサイトカイン及びケモカインについて、キットの検出限界は、３．２ｐｇ／ｍｌであり、キットの最大検出限界は、１００００ｐｇ／ｍｌであった。
【００６０】
統計学的解析
統計学的解析を、ＳＰＳＳプログラム（ｖ．１９．０．，  ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．）を用いて行った。母体及び乳児の特徴の比較は、Ｐｅａｓｏｎ’ｓカイ二乗検定及びＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−検定により評価した。多様なサイトカイン／ケモカインのデータは、正規分布とはならないので、ノンパラメトリック検定を用いた。群間の差は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  検定で解析し、＜０．０５の確率水準を統計学的に有意とした。更に、母乳サイトカイン／ケモカインの濃度のデータをカテゴライズし、アトピー性皮膚炎の発症に対する異なる母乳サイトカイン／ケモカインの独立した効果を評価する多重ロジスティック回帰モデルを構築した；結果を、９５％信頼区間（ＣＩｓ）を有するオッズ比により表した。受動者動作特性曲線（ＲＯＣ）曲線を作成し、どの程度母乳サイトカイン／ケモカインによりアトピー性皮膚炎の発症を予測し得るか評価した。
【００６１】
結果
ＡＤ及びコントロール群における、サイトカイン／ケモカインプロファイル
母乳サイトカイン／ケモカイン濃度は大幅に広がった。初乳においては、ＡＤ群におけるＩＬ−１β、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３値陽性の頻度は、コントロール群におけるＩＬ−１β、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３値陽性のそれよりも大きかった（カイ二乗検定、それぞれ、Ｐ＜０．００１、＜０．００１、及び０．０２８、表２）。
【００６２】
【表２】
2012233777.tif 000003
【００６３】
初乳中のサイトカインプロファイル。陽性結果は、検出限界を超える濃度の上記サイトカインを意味する。２群間の陽性サイトカイン値の発生可能性をカイ二乗検定により調べた。
【００６４】
成熟ミルクにおいては、ＡＤ群におけるＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＭＩＰ−１α値陽性の頻度は、コントロール群のそれよりも大きかった（カイ二乗検定、それぞれ、Ｐ＜０．００１、０．０３８、０．０１４、０．０２２、＜０．００１及び＜０．００１、表３）。ほとんどの初乳試料でＩＬ−８、ＭＣＰ−１及びＩＰ−１０の濃度は、検出限度を超えており、幾つかの成熟乳サンプルにおけるＭＣＰ−１及びＩＰ−１０濃度が検出限度を超えていた。持ち越しミルクの量の欠失のため、これらの試料のほとんどについて再測定をすることができなかったので、更なる解析から除外した。これらのケモカインについての統計学的解析は行わなかった。
【００６５】
【表３】
2012233777.tif 000004
【００６６】
成熟乳中のサイトカインプロファイル。陽性結果は、検出限界を超える濃度の上記サイトカインを意味する。２群間の陽性サイトカイン値の発生可能性をカイ二乗検定により調べた。
【００６７】
初乳中のサイトカイン／ケモカインのレベルの比較
母乳中のサイトカイン／ケモカインのレベルと、６か月齢におけるＡＤの発症との間の関係を調べるため、６カ月齢のときにＡＤを発症した乳児が摂取した母乳中のサイトカイン／ケモカインレベルと、その時点でＡＤを発症していない乳児が摂取した母乳中のサイトカイン／ケモカインレベルを比較した（以下、それぞれ、ＡＤ群及びコントロール群と呼ぶ）。図１に示すように、初乳において、母乳サイトカイン／ケモカインの中央値濃度の重要な差異は、以下の通りであった：ＡＤ群の乳児が摂取した初乳において、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３及びＭＩＰ−１αの濃度が、コントロール群と比較して高かった（（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、それぞれＰ＜０．００１、０．００５、０．０２４、＜０．００１、０．０１８及び０．０２９）。
【００６８】
成熟乳中のサイトカイン／ケモカインレベルの比較
成熟乳における、母乳サイトカイン及びケモカインの中央値濃度の有意な差異は、以下の通りである：ＡＤ群の乳児が摂取した成熟乳中のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α２及びＭＩＰ−１αの濃度が、コントロール群のそれと比較して高かった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、それぞれ、Ｐ＜０．００１、０．０１８、０．０２５、０．０１５、＜０．００１、＜０．００１、＜０．００１、＜０．００１及び＜０．００１、図２）。一方、ＡＤ群の成熟乳中のＩＬ−１αのレベルは、コントロール群と比較して低かった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、Ｐ＝０．００５、図２）。
【００６９】
母乳サイトカイン／ケモカインの多変量ロジスティック回帰解析
母乳サイトカイン／ケモカインのレベル（三分位値又は中央値に分類したもの）と、乳児のＡＤ予後との間の相関の結果を表４に示す。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
ロジスティック解析を、初乳（ａ）及び成熟乳（ｂ）中の異なるサイトカイン及びケモカインについて行った。ＯＲ、異なるサイトカイン／ケモカインについて調整したオッズ比；ＣＩ、信頼区間。
【００７２】
乳児ＡＤのリスクは、初乳中のＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３のレベルと相関していた。表４ａに示すように、乳児ＡＤのリスクは、３．６２７のオッズ値（ＯＲ）及び１．０４−１２．６５の信頼区間（ＣＩ）で、中レベルのＩＬ−６において上昇し、８．２５１のオッズ値（ＯＲ）及び２．１９４−３１．０３の信頼区間（ＣＩ）で、高レベルのＩＬ−６において上昇した。乳児ＡＤのリスクは、６．１２５のＯＲ（ＣＩ  １．３０１−２８．８２８）で、中レベルのＩＬ−１２ｐ４０において上昇し、１１．６７９のＯＲ（ＣＩ  ３．６４−３７．８５）で、高レベルのＩＬ−１２ｐ４０において上昇した。また、乳児ＡＤのリスクは、３．６２７のＯＲ（ＣＩ  １．０４−１２．６５）で、高レベルのＩＬ−１３において上昇した。更に、乳児ＡＤのリスクは、成熟乳中のｅｏｔａｘｉｎ、ＩＦＮ−α２及びＩＬ−１αのレベルと相関した。表４（ｂ）に示されるように、乳児ＡＤのリスクは、高レベルのｅｏｔａｘｉｎ及びＩＦＮ−α２において、それぞれ７８．２２５のＯＲ（ＣＩ  ７．９５７−７６９．６４３）及び１５．２５１のＯＲ（ＣＩ  ２．５７７−９０．２４８）で、上昇した。一方、乳児ＡＤのリスクは、高レベルのＩＬ−１αにおいて、０．０３５のＯＲ（ＣＩ  ０．００５−０．２６８）で減少した。
【００７３】
ＲＯＣ解析による母乳サイトカイン／ケモカインバイオマーカーの評価
ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１３を含む初乳サイトカイン、又はエオタキシン、ＩＦＮ−α２及びＩＬ−１αを含む成熟乳サイトカイン／ケモカインについてＲＯＣ曲線を作成した。初乳における母乳サイトカインの濃度によるＡＤ発症の予測は有意であり、０．８０２の曲線下面積を達成した（９５％  ＣＩ  ０．７１１−０．８９２、Ｐ＜０．００１）。また、成熟乳におけるサイトカイン／ケモカインの濃度による予測も有意であり、０．８８８の曲線下面積を達成した（９５％  ＣＩ  ０．８１４−０．９６３，  Ｐ＜０．００１）。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明によれば、母乳中サイトカイン／ケモカイン値に基づき、乳児アトピー性皮膚炎の発症リスクを高い精度で評価することが可能である。また、本発明によれば、乳児のアトピー性皮膚炎の発症を予防する候補物質をスクリーニングすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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