(57)【要約】【課題】簡便な操作で正確にＭＰＮ３本法により腸炎ビブリオを検出する方法を提供する。【解決手段】検出可能な遊離性基を有するβ−グルコシダーゼ基質及びグラム陽性菌抗菌物質を含有する液体培地に検体を添加して得られた試料溶液を、傾斜プレートに３つの０．１mlウェル、３つの１mlウェル、３つの１０mlウェル及び１つの廃液だめウェルをもつデバイスに流し、次いで腸炎ビブリオのＩＳＯ４８３１の表を使用したＭＰＮ３本法によるＭＰＮ値を算出することを特徴とする腸炎ビブリオの検出法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出可能な遊離性基を有するβ−グルコシダーゼ基質及びグラム陽性菌抗菌物質を含有する液体培地に検体を添加して得られた試料溶液を、傾斜プレートに３つの０．１mlウェル、３つの１mlウェル、３つの１０mlウェル及び１つの廃液だめウェルをもつデバイスに流し、次いで腸炎ビブリオのＩＳＯ４８３１の表を使用したＭＰＮ３本法によるＭＰＮ値を算出することを特徴とする腸炎ビブリオの検出法。
【請求項２】
検出可能な遊離性基を有するβ−グルコシダーゼ基質が、色原体化合物又は蛍光性化合物を遊離し得るβ−グルコピラノシド又はその塩である請求項１記載の腸炎ビブリオの検出法。
【請求項３】
グラム陽性菌抗菌物質が、バンコマイシン、リストセチン及びこれらの塩から選ばれるものである請求項１又は２記載の腸炎ビブリオの検出法。
【請求項４】
前記液体培地が、検出可能な遊離性基を有するβ−グルコシダーゼ基質を０．２〜０．５ｇ／Ｌ含有するものである請求項１〜３のいずれか１項記載の腸炎ビブリオの検出法。
【請求項５】
前記液体培地が、グラム陽性菌抗菌物質を０．０００１〜１ｇ／Ｌ含有するものである請求項１〜４のいずれか１項記載の腸炎ビブリオの検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品等の検体中の腸炎ビブリオを簡便かつ正確に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００１年、腸炎ビブリオ食中毒防止のための水産食品に係る規格および基準が設けられた。その基準は製品１ｇ当たりの最確数（ＭＰＮ）１００以下と規定されている（非特許文献１）。
検査方法は検体に９倍量の３％食塩加ＰＢＳを加えストマッキング処理したものを１０倍段階希釈し、検体0.1g分、0.01ｇ分、0.001ｇ分を３本ずつのアルカリペプトン水に接種し、３７℃、一夜培養後、各試験管からＴＣＢＳ寒天培地あるいは発色酵素基質含有培地に一白金耳を画線塗抹し典型集落を確認し、陽性試験管本数よりISO4831のＭＰＮ３本法の表を使用してＭＰＮを算出する（非特許文献２〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−１６６９７９号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】腸炎ビブリオ食中毒防止対策のための水産食品に係る規格及び基準の設定に関する薬事・食品衛生審議会の答申について薬食審第１２１号、平成13年5月13日、厚生労働省ホームページ
【非特許文献２】食品衛生検査指針  微生物編  厚生労働省監修  社団法人  日本食品衛生協会  135-137頁、2004年6月30日。
【非特許文献３】食品衛生検査指針  微生物編  厚生労働省監修  社団法人  日本食品衛生協会  201-213頁、2004年6月30日。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このようにＭＰＮ法は１検体当たり少なくとも９本の試験管を必要とし、すべてにおいて培養、移植が必要であり、非常に煩雑な方法である。
従って本発明の課題は、簡便な操作で正確にＭＰＮ３本法により腸炎ビブリオを検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、ＭＰＮ法の操作を簡便にし、かつ正確に腸ビブリオを検出すべく種々検討した結果、本出願人が先に特許出願した菌測定用プレート（特許文献１）を用い、かつ検体接種用培地としてβ−グルコシダーゼが基質とグラム陽性菌抗菌物質とを含有する液体培地を用いることにより、簡便かつ正確にＭＰＮ３本法による最確数測定が可能になることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、検出可能な遊離性基を有するβ−グルコシダーゼ基質及びグラム陽性菌抗菌物質を含有する液体培地に検体を添加して得られた試料溶液を、傾斜プレートに３つの０．１mlウェル、３つの１mlウェル、３つの１０mlウェル及び１つの廃液だめウェルをもつデバイスに流し、次いで腸炎ビブリオのＩＳＯ４８３１の表を使用したＭＰＮ３本法によるＭＰＮ値を算出することを特徴とする腸炎ビブリオの検出法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明方法によれば、検体を液体培地に接種後、専用のデバイスに流すだけでＭＰＮ３本法による腸炎ビブリオのＭＰＮ値（最確数）が測定できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明方法に使用するデバイスの例の平面図を示す。
【図２】本発明方法に使用するデバイスの例の断面図を示す。
【図３】本発明方法と従来のＭＰＮ法の相関性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の腸炎ビブリオの検出法に用いる液体培地は、検出可能な遊離性基を有するβ−グルコシダーゼ基質及びグラム陽性菌抗菌性物質を含有する。
【００１１】
本発明に用いる液体培地に用いられる検出可能な遊離性基を有するβ−グルコシダーゼ基質とは、β−グルコシダーゼの作用によって色原体化合物、蛍光性化合物等の検出可能な化合物を培地中に遊離するものであり、例えば色原体化合物又は蛍光性化合物とβ−グルコースとが結合した化合物すなわち、色原体化合物又は蛍光性化合物を遊離し得るβ−グルコピラノシド又はその塩であればよい。腸炎ビブリオの類縁菌であるビブリオ・アルギノリティカスやビブリオ・コレラは、β−グルコシダーゼを分泌しないのに対し、腸炎ビブリオはβ−グルコシダーゼを分泌するので、このβ−グルコシダーゼ基質は、腸炎ビブリオによって分解され、色原体化合物、蛍光性化合物等の検出可能な化合物を遊離するため、腸炎ビブリオは色原体化合物に基づく着色コロニー、蛍光性化合物に基づく蛍光コロニー等の検出可能なコロニーを形成する。具体的なβ−グルコシダーゼ基質としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−β−グルコシド、青色）、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＭＡＧＥＮＴＡ−β−グルコピラノシド、赤紫）、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（赤紫）、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ピンク）、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド、４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、３−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、３−インドキシル−β−グルコピラノシドトリハイドレート、ｎ−ヘプティル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド等が挙げられ、このうち鑑別性の点から５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−β−グルコシド）が好ましい。
【００１２】
かかるβ−グルコシダーゼ基質の液体培地中の含有量は、基質により異なるが、０．０１〜１０ｇ／Ｌ、特に０．０１〜０．５ｇ／Ｌであるのが検出性の点で好ましい。
【００１３】
グラム陽性菌抗菌物質は、検体中のグラム陽性菌の生育を阻害する目的で培地に添加される。これにより、ビブリオ属等を含むグラム陰性菌のみが生育し得ることとなる。当該グラム陽性菌抗菌物質としては、バンコマイシン、リストセチン、及びこれらの塩等が挙げられ、このうち、培地中における安定性の点からバンコマイシン又はその塩が好ましい。
【００１４】
グラム陽性菌抗菌物質の液体培地中の含有量は、グラム陽性菌の生育が阻害される量であればよく、用いる抗菌物質の種類によって異なるが、０．０００１〜１ｇ／Ｌ、特に０．００１〜０．１ｇ／Ｌが好ましい。
【００１５】
本発明で用いる液体培地には、腸炎ビブリオの生育を促進し、他の菌の生育を抑制することによって、さらに正確に腸炎ビブリオを検出する目的で、無機塩類及び／又は糖類を含有させるのが好ましい。ここで無機塩類としては、塩化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム等の無機酸金属塩；クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸金属塩等が挙げられる。このうち、塩化ナトリウム等の無機酸金属塩は、腸炎ビブリオが好塩性細菌であるため、生育を促進するうえで特に好ましい。また、他の無機塩類は、胆汁末、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等の胆汁酸又はその塩と併用することによりビブリオ属以外のグラム陰性菌の生育を抑制するため好ましい。ここで、塩化ナトリウム等の無機酸金属塩は本発明培地中に１．００〜５０．０ｇ／Ｌ、特に５．００〜３０．０ｇ／Ｌ含有するのが好ましい。有機酸金属塩は、本発明培地中に０．０１〜５０．０ｇ／Ｌ、特に０．５０〜２５．０ｇ／Ｌ含有するのが好ましい。また胆汁酸又はその塩は、本発明培地中に０．００１〜１０．００ｇ／Ｌ、特に０．１０〜３．００ｇ／Ｌ含有するのが好ましい。
【００１６】
糖類としては、単糖類及びオリゴ糖類が使用でき、例えばラクトース、シュークロース（白糖）、キシロース、セロビオース、マルトース等が挙げられる。これらの糖類の添加により、腸炎ビブリオ以外の菌によって前記β−グルコシダーゼ基質が利用されてしまうのを防止でき、より正確な検出が可能となるため、好ましい。これら糖類は、本発明培地中に１．００〜５０ｇ／Ｌ、特に５〜３０ｇ／Ｌ含有させるのが好ましい。
【００１７】
また、本発明の培地には、ペプトン、酵母エキス、獣肉エキス、魚肉エキス等の栄養成分を含有させるのが好ましい。さらに、ピルビン酸ナトリウム、硫酸塩等を添加することもできる。また、腸炎ビブリオは、アルカリ条件下でよく生育するので、本発明培地にはpHを８．０〜９．０にするためのアルカリ剤を含有するのが好ましい。アルカリ剤としては、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、ほう酸ナトリウム、３−［（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパン−スルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸、シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノ−プロパンスルホン酸等が挙げられる。
【００１８】
本発明の検出方法に用いられる検体とは、食品、水、海水、臨床検体、海水汚泥などの環境検体が挙げられる。
【００１９】
前記の液体培地に検体を添加し、試料溶液とする。検体の添加量は、通常１００mlであるが、少なくとも３３．３mlあれば検出するのに十分である。
【００２０】
得られた試料溶液は、特許文献１記載の傾斜プレートに３つの０．１mlウェル、３つの１mlウェル、３つの１０mlウェル及び廃液だめウェルを有するデバイスに流す。このデバイスの例の平面図及び断面図を図１及び図２に示す。
【００２１】
プレート１の上面は、傾斜しており、試料溶液が流れるようになっている。
試料溶液は、プレートの上流部から流す。そうすると、試料溶液は整流部２によりせき止められ、一部がスリット部から流れ出し、０．１ml容の各ウェル３に均等に流れる。整流部２は複数のスリット部を有する板状物である。試料溶液は、ウェル３を満たした後、１ml容のウェル４に流れ、これを満たし、さらに１０ml容のウェル５に流れ、これを満たし、全てのウェルが満たされた後の試料溶液は廃液だめ６に貯まる。
【００２２】
試料溶液をこのように注入した後、培養する。培養後、測定対象菌の増殖または所定の反応が認められたウェル数を陽性管数とし、ＩＳＯ０４８３１の最確数表より試料１００mlまたは１００ｇ中の菌数を求める。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を、実施例等を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等になんら限定されるものではない。
【００２４】
（１）培地の作製
培地組成を表１に示した。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
１００mlの本発明培地を１００本作製し、これに腸炎ビブリオが３〜１１００ｃｆｕ／１００mlになるように腸炎ビブリオを接種した擬似検体を作製した。
この検体の一部をデバイスに流し込み全てのウェルに充填した。同時に残りの検体の１０mlを３本の５mlの３倍濃度アルカリペプトン水（ＡＰＷ）、１mlを３本の１０mlのＡＰＷ、０．１mlを３本の１０mlのＡＰＷにそれぞれ接種し、デバイス、ＡＰＷともに３７℃で一夜培養を行った。
デバイスについては青く着色した陽性ウェル数からＩＳＯ４８３１の表を使用しＭＰＮ値を算出した。一方、培養後の各ＡＰＷから一白金耳をＴＣＢＳおよび発色酵素基質培地にそれぞれ画線塗抹を行い、典型集落が確認できた試験管を陽性試験管とし、その本数からＭＰＮ値を算出した。
各方法により得られたＭＰＮ値を対数に変換し、縦軸にデバイスによる方法、横軸にＡＰＷを使用した従来法をプロットし、相関を算出した。
【００２７】
実際に本発明培地とデバイスを使用し、腸炎ビブリオの最確数を算出した結果、従来法と同等の検出能を有し、高い相関を得ることが出来ることを認め、簡易的にＭＰＮ値を計測することが出来ることを認めた。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
【表３】
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【００３０】
【表４】
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【００３１】
【表５】
2012139138.tif 000006
【００３２】
【表６】
2012139138.tif 000007
【００３３】
【表７】
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【００３４】
表２〜表７に示すように各種腸炎ビブリオ菌が従来法と同様に検出できることがわかる。図３には、本発明方法と従来のＭＰＮ３本法との相関性を示す。
【００３５】
実施例２
（１）培地の作製
それぞれβ−グルコシダーゼ基質濃度０．１５、０．２０、０．２５、０．３０および０．５０ｇ／Ｌとそれぞれ変えた１００mlの本発明培地をそれぞれ作製し、これに腸炎ビブリオが３〜１１００cfu／100mlになるように腸炎ビブリオＡＴＣＣ１７８０２株を接種した擬似検体を作製した。
この検体の全量をデバイスに流し込み全てのウェルに充填し37℃で一夜培養を行った。
培養後、各デバイスのウェルの発色を確認した。
（２）結果
【００３６】
【表８】
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【００３７】
表８よりデバイスに適応させる本発明培地ブイヨンを提供するためにはβ−グルコシダーゼ基質の濃度を、寒天培地では十分である濃度で使用すると、１０mlウェルは十分な陽性反応が確認できるが、１mlおよび０．１mlウェルでは陽性反応が薄く見づらいことを認めた。従って、容易に判定するためにはβ−グルコシダーゼ濃度を０．２０ｇ／Ｌ以上にすることが望ましいことが判明した。
【００３８】
実施例３
（１）培地の作製
基質濃度を0.20g/Lにした本発明培地ブイヨンにβ−ガラクトシダーゼ基質であるMagenta-gal(赤紫色)を0.20g/Lになるように加えた１００mlの本発明培地ブイヨンを作製し、これに腸炎ビブリオおよびビブリオバルニフィカス（Vibrio vulnificus）がそれぞれ３〜１１００cfu／１００mlになるように腸炎ビブリオATCC17802株およびVibrio vulnificusおよびを接種した擬似検体を作製した。
この検体の全量をデバイスに流し込み全てのウェルに充填し37℃で一夜培養を行った。
培養後、各デバイスのウェルの発色を確認した。
【００３９】
【表９】
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【００４０】
デバイスに適応させる本発明培地ブイヨンにβ−ガラクトシダーゼを添加することにより、V.ulnificusなどのβ−ガラクトシダーゼ陽性の病原ビブリオのＭＰＮ値だけでなく、２種類の菌のＭＰＮ値を蛍光ランプ等の器具を使わずとも同時に判定することが出来ることを認めた。
【符号の説明】
【００４１】
１  プレート
２  整流部
３  ０．１ml容のウェル
４  １mlのウェル
５  １０mlのウエル
６  廃液だめ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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