(57)【要約】      （修正有）【課題】生体臓器の機能を代替することができる程度の大きさを持つ細胞培養構造物を製造することを目的とした、生体臓器の血管網構造と同等の導管構造を内部に有する細胞培養支持体を提供する。【解決手段】生体臓器の血管網構造の鋳型を作製し、これの周囲に細胞培養支持体を充填した後に鋳型を除去することによって作製した、生体臓器と同等の導管構造を内部に導入した細胞培養支持体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトや動物の臓器や組織の血管網構造の鋳型を作製する第一工程と、前記鋳型の周囲に細胞培養支持体を充填する第二工程と、前記鋳型を除去する第三工程とを備えた、細胞培養支持体の作製方法。
【請求項２】
前記鋳型を構成する材料が天然高分子、またはその混合物あるいは誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記鋳型を構成する材料が多糖、またはその混合物あるいは誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記鋳型を構成する材料が合成高分子またはその混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
先行請求項のいずれか一項の実施により作製された細胞培養支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学、医学等の分野における細胞培養構造物を製造する際に使用する細胞培養支持体に関する。
【背景技術】
【０００２】
移植医療の著しい発展により、近年、心臓、肺、肝臓、腎臓、小腸、皮膚等の多様な臓器について臓器移植が行われるようになった。移植術後の経過も以前よりも大幅に改善され、医療の一技術としてほぼ確立された。しかしながら提供される臓器数が少ないため、実際に臓器移植が行える患者はごくわずかである。臓器移植という非常に有効な選択肢があるにもかかわらず、臓器の不足によってその恩恵を受けることのできない患者が大多数を占めており、この問題に対する早急な解決策が求められている。
【０００３】
このような背景のもと、以前より、人工代替物や細胞を培養して組織化させたものを移植医療に利用する技術が注目されている。骨や軟骨を人工物で置換する技術は既に実用段階となっているが、心臓や肝臓など複雑な機能を有する臓器を人工代替物で置換する技術はまだ研究段階にとどまっている。このような臓器に対しては培養組織の移植が有用と考えられており、近年では心筋細胞をシート状に培養し外科的に心臓の病変部位に移植することにより、心機能の改善が得られたという研究報告もある。
【０００４】
しかしながら、従来の方法では、ある臓器の機能のごく一部を補助することはできても、臓器全体を代替できるほどの機能を有する３次元的な細胞培養構造物は得られておらず、いかにして培養細胞を３次元的に組み上げるかが大きな課題となっている。上記の細胞シートを積層して３次元構造物にする試みもあるが、細胞シートの厚さが数マイクロメートル〜数十マイクロメートルときわめて薄いために、その効率は悪い。また、例えば特開２００７−３２５５４３のように、スポンジのような多孔性の細胞培養支持体を用いて３次元的な細胞培養構造物を構築する試みも多数行われているが、形成された細胞集塊が100〜200マイクロメートルを超えて大きくなると、酸素や栄養物質が細胞集塊内部の細胞まで十分に行き渡らず、結果として内部の細胞が壊死してしまう。さらにこれを防ぐため、細胞集塊内部に血管新生を誘導する試みもあるが、これもまだ十分な血管系の形成には至っていない。すなわち、既存の方法はいずれもまだ実用化できる段階とは言えない。そのため、各々の導管構造の間の距離が100〜200マイクロメートルあるいはそれ以下であるような血管網構造を、細胞培養支持体の内部に導入する技術の開発が強く望まれている。
【０００５】
さらにここ数年では、生体臓器に含まれる細胞成分のみを除去し、その細胞外マトリックスのみを取り出してこれを細胞培養支持体として利用する試みも行われている。この方法は、取り出した細胞外マトリックスに血管網構造が保持されているため、これを利用して構造体の内部まで酸素や栄養物質を供給することが可能となる。しかし、現段階ではまだ医療上使用可能な代替臓器の形成には至っておらず、またドナーの臓器に含まれる細胞外マトリックスを使用することから拒絶反応や感染のリスクが皆無ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−３２５５４３「細胞足場材料およびその製造方法」
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ott H et al.、Nature Medicine、2008年、第14巻、第2号、第213-221頁
【非特許文献２】Uygun BE et al.、Nature Medicine、2010年、第16巻、第7号、第814-820頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記のような問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、臓器全体を代替する目的に利用できる程の大きさの細胞培養構造物であっても内部の細胞が壊死に至らないように、内部に細密な血管網構造を有する細胞培養支持体を構築することを課題とする。この血管網構造を経由して、支持体内部まで酸素や栄養物質を十分に供給することが可能になると期待される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者が提案している方法は、生体臓器が有する血管網構造をそのまま利用することによって、上記課題を解決する。すなわち、生物より摘出した臓器を利用して血管網構造の鋳型を作製し、生体組織を除去した後、この鋳型の周囲に細胞支持体を作製した上で鋳型を除去することにより、内部に生体臓器の血管網構造と同等の導管構造を有する細胞支持体を得る。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る細胞培養支持体の製造方法によれば、従来の技術では作製が困難であった、ヒトや動物の臓器が有する血管網構造と同等の導管構造を内部に有する３次元的な細胞培養支持体を作製することが可能となる。このようにして作製した細胞培養支持体に細胞を播種した後、その血管網構造に培地や血液を灌流しながら培養して組織を構築させることにより、細胞集塊の内部まで酸素や栄養物質を供給できるようになるため、生体臓器の機能を代替することが可能な大きさの３次元的な細胞培養構造物を作製することができると期待される。また、細胞外マトリックスなど臓器を構成する物質を直接利用するわけではないため、拒絶反応や感染のリスクは低減すると期待される。
【００１１】
本発明に係る細胞培養支持体を用いて作製された細胞培養構造物は、再生医療などへの利用に適する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の細胞培養支持体は、生体臓器の血管網構造と同等の細密な導管構造を有する細胞培養構造物をin vitroまたはin vivoで作製するためのものである。対象となる臓器や組織は血管網構造を有していれば、特に制限はない。また用いる材料の種類も、後述する条件を備えていれば特に制限はない。以下、本発明の細胞培養支持体の一実施態様について説明する。
【００１３】
［方法の概要］
初めに、本発明の方法の概要を手順に沿って説明する。まず、目的の臓器に接続する太い血管より、臓器内の血管内腔を十分に満たす量の生理食塩水を注入して血液を除去する。続いて同様の方法で、鋳型となる材料１を血管内腔に注入する。注入が終了したら、血管内部を材料１で満たした状態で材料１を硬化させる。以下、この硬化した材料１を鋳型と呼称する。こうして血管内腔を鋳型で満たした臓器を、材料２に包埋する。この材料２は、臓器全体の外形の形状を保持するとともに、各工程中に鋳型の形態を安定に保持するための支持体としても機能する。以下、これを外枠と呼称する。なお、求める細胞培養支持体の外形が元の臓器や組織と一致する必要がない場合は、材料２による外枠の作製は省略可能である。続いて、鋳型および外枠を残して臓器を除去する。得られた鋳型および外枠から成る構造物を十分に洗浄した後、鋳型の周囲に細胞培養支持体を構成する材料３を充填し、これを硬化させる。その後、材料３を残して鋳型および外枠を除去し、材料３から成る細胞培養支持体を得る。
【００１４】
以下、各材料に必要な特性と、各工程の詳細について説明する。
【００１５】
［材料１］
鋳型の材料１は、流体として血管内に注入できること、毛細血管内まで十分に入り込む程度に低粘度であること、簡便な方法で形態を維持するために十分な強度を有する固体またはゲルとなること、組織の溶解および細胞培養支持体の作製の工程で物性または形状に好ましくない影響を受けないこと、得られた細胞培養支持体に好ましくない影響を与えない方法で容易に除去できることが必要である。
【００１６】
［材料２］
外枠の材料２は、組織の溶解、鋳型の除去および細胞培養支持体の作製の工程で物性または形状に好ましくない影響を受けないことが必要である。
【００１７】
［材料３］
細胞培養支持体の材料３は、鋳型除去および外枠除去の工程で、細胞培養に影響するような物理的および化学的な影響を受けないことが必要である。また材料３の種類は、将来培養する細胞の種類にも依存する。材料２および材料３の種類や培養する細胞の種類によっては、材料３の充填と同時に細胞を播種することも可能である。
【００１８】
［鋳型の作製］
血管網構造の鋳型は、目的の臓器や組織に接続する太い血管から材料１を注入し、これを硬化させることによって行う。注入時の速度や圧力は、目的の臓器や組織を損傷しないよう、また毛細血管を含む血管内腔全体に材料１が入り込むように調節する。
【００１９】
［組織の溶解］
生体組織を除去する工程においては、その方法が材料１より成る鋳型および材料２より成る外枠の形状を変化させないことが条件となる。具体的には強酸または強アルカリによる溶解、酵素による分解、界面活性剤による溶解、超音波による破砕、熱による焼灼などの方法およびこれらの組み合わせが利用可能である。
【００２０】
［鋳型の除去］
鋳型除去の工程は、鋳型を細胞培養支持体内部から確実に除去しうること、細胞培養支持体の物性または形状に望ましくない影響を与えないことが条件となる。具体的な方法は鋳型の材料として用いた物質に依存する。
【実施例】
【００２１】
以下に、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【００２２】
摘出したニワトリの心臓に対し、まず大静脈を結紮し、右心房に留置針を留置した。そこからまず生理食塩水を用手的に注入して肺動脈からの脱血を確認し、続いて材料１として2%アルギン酸ナトリウム水溶液を用手的に注入した後、留置針を抜去して肺動脈を結紮した。次に、左心房に留置針を留置し、そこから同様に生理食塩水、続いて2%アルギン酸ナトリウム水溶液を用手的に注入して大動脈からの脱血を確認した後、留置針を抜去して左心房壁を縫合閉鎖した。最後に大動脈に留置針を留置し、ここから逆行性に生理食塩水および2%アルギン酸ナトリウム水溶液を用手的に注入し、冠動静脈の怒張と右心房からの十分な量の溶液の流出を確認した後、留置針を抜去、大動脈を結紮し、心腔および血管内腔を2%アルギン酸ナトリウム水溶液で満たした心臓を得た。
【００２３】
心臓を1.5%塩化カルシウム水溶液に浸漬し、まずこれを90℃で1時間加熱し、滅菌するとともに組織の蛋白質を変性させた。その後、24時間静置して血管内のアルギン酸ナトリウムをアルギン酸カルシウムとして完全にゲル化させた。その後、材料２として90℃に加熱した3%アガロース水溶液を調製し、これに心臓を浸漬して冷却することにより、心臓をアガロースゲルより成る外枠に包埋した。外枠を扱いやすい大きさ・形状に成形し、さらに組織を速やかに除去する目的で心基部を覆っている外枠を切除した。続いて、加温した蛋白分解酵素・塩化カルシウムの混合水溶液に浸漬して心臓の組織を溶解させ、さらに超音波照射により組織を破砕した。これを繰り返すことにより、鋳型および外枠を残して組織を完全に除去した。得られたアルギン酸カルシウムゲルおよびアガロースゲルより成る構造物を、1.5%塩化カルシウム水溶液で24時間以上洗浄した。
【００２４】
心臓組織のあった間隙に材料３として0.3%コラーゲン水溶液を充填し、37℃で30分静置してゲル化させた。得られた構造物をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）水溶液に24時間以上浸漬し、アルギン酸カルシウムゲルを完全にゾル化させた。続いて血管網構造の内腔にＥＤＴＡ水溶液を緩徐に注入し、アルギン酸ゾル水溶液を流出させた。外枠を除去し、外形はニワトリの心臓とほぼ同一で内部にニワトリの心臓とほぼ同等の血管網構造を有するコラーゲンゲルを得た。血管網構造に墨汁を注入した後に切片とし、光学顕微鏡下で観察したところ、得られた血管網構造の最も細い部分の内径は約10マイクロメートル、導管構造間の間隙は数十マイクロメートルであることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明の方法では、細胞培養支持体の内部に生体臓器が有するものと同等の血管網構造を導入することができる。これにより、支持体の内部まで酸素や栄養物質を供給することができるため、これらの不足の結果生じる細胞の壊死を防ぐことが可能となると期待される。これにより、生体臓器と同等の機能を有する細胞培養構造物を人工的に作製することができるようになる可能性がある。したがって本発明の方法は、移植医療のほか、新しい薬剤や医療機器の開発における特定臓器に対する有効性や安全性の評価などに用いる臓器の作製にも利用可能である。また、臓器に含まれる細胞外マトリックスを直接利用する方法と異なり、細胞培養支持体の材料も選択可能であるため、特定の機能を付与した材料からなる細胞培養支持体を作製することも容易である。