(57)【要約】【課題】  共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡による光計測を用いた走査分子計数法に於いて、観測されるべき試料溶液毎に光学調整を行う必要のない構成を提供すること。【解決手段】本発明の発光粒子からの光を検出し分析する技術は、顕微鏡の対物レンズのレンズ表面に試料溶液を載置し、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を移動させながら、試料溶液内の発光粒子からの光を検出し、これにより、光検出領域内を横切る発光粒子を個別に検出し、発光粒子のカウンティングや発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する光分析装置であって、
先端のレンズ表面に前記試料溶液を保持することが可能な対物レンズと、
前記光学系の光路を変更することにより前記対物レンズの先端のレンズ表面に保持された前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、
前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記発光粒子の各々からの信号を個別に検出する信号処理部と
を含むことを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１の装置であって、前記光検出領域移動部が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて前記光検出領域の位置を移動することを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項１の装置であって、前記信号処理部が、前記個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数することを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１の装置であって、前記信号処理部が前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定することを特徴とする装置。
【請求項５】
請求項１の装置であって、前記対物レンズのレンズ表面の周縁に前記試料溶液を保持するための枠部材が設けられていることを特徴とする装置。
【請求項６】
請求項１の装置であって、前記対物レンズのレンズ表面の周縁に撥水処理が施されていることを特徴とする装置。
【請求項７】
請求項１の装置であって、前記対物レンズのレンズ表面へ前記試料溶液を導入する導入装置が設けられていることを特徴とする装置。
【請求項８】
請求項１の装置であって、更に、前記対物レンズのレンズ表面の前記試料溶液の蒸発を防止する部材を有することを特徴とする装置。
【請求項９】
請求項１の装置であって、更に、前記対物レンズのレンズ表面に於いて液体が存在しているか否かを検出する検出器を有することを特徴とする装置。
【請求項１０】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
対物レンズの先端のレンズ表面に前記試料溶液を載置する過程と、
前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光を検出する過程と、
前記検出された光から個々の発光粒子からの信号を個別に検出する過程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１０の方法であって、更に、前記個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して前記光検出領域の位置の移動中に検出された前記発光粒子の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１０の方法であって、更に、前記検出された発光粒子の数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析装置及び方法に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の光分析を可能にする装置及び方法に係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光等であってよい。
【背景技術】
【０００２】
近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１−３、非特許文献１−３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域−コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が為される。また、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity  Distribution  Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４、非特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon  Counting  Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。またその他に、特許文献６、７に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献８は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。
【０００３】
特に、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−０９８８７６
【特許文献２】特開２００８−２９２３７１
【特許文献３】特開２００９−２８１８３１
【特許文献４】特許第４０２３５２３号
【特許文献５】国際公開２００８−０８０４１７
【特許文献６】特開２００７−２０５６５
【特許文献７】特開２００８−１１６４４０
【特許文献８】特開平４−３３７４４６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】金城政孝、蛋白質  核酸  酵素  Vol.４４、No.９、１４３１−１４３８頁  １９９９年
【非特許文献２】エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４−２２４頁
【非特許文献３】加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１−２７７頁
【非特許文献４】カスク他３名、米国科学アカデミー紀要  １９９９年、９６巻、13756‐13761頁（P.  Kask,  K.  Palo,  D.  Ullmann,  K.  Gall  PNAS  96,  13756-13761  (1999)）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術では、計測される光は、蛍光一分子又は数分子から発せられた光であるが、その光の解析に於いて、時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎの算出等の統計的処理が実行され、個々の蛍光分子等からの光の信号を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの光分析技術に於いては、複数の蛍光分子等からの光の信号が統計的に処理され、蛍光分子等について統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの光分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するレベル、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているレベルである必要がある。実際、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の蛍光分子等の濃度は、典型的には、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であり、１ｎＭを大幅に下回るときには、蛍光分子等がコンフォーカル・ボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献６〜８に記載の蛍光分子等の検出方法では、蛍光強度のゆらぎの統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の蛍光分子等が１ｎＭ未満であっても蛍光分子等の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している蛍光分子等の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。
【０００７】
そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料がＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度、数密度又はその他の特性を定量的に検出することが可能となる。
【０００８】
ところで、一般に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡を用いた試料溶液内の発光粒子の光計測に於いては、試料溶液は、底面がガラスプレート（カバーガラス又はスライドガラス）にて構成された容器（プレパラート）へ分注され、プレパラートが対物レンズの上方又は下方に配置される。従って、対物レンズと試料溶液内の光検出領域との間の光路（照明光又は励起光、試料溶液内から発せられる光の光路）は、ガラスプレートを通過することとなる。その場合、ガラスの屈折率と試料溶液の屈折率との違いに起因して、試料溶液内での集光状態がガラスプレートの厚みによって変化するので、使用するガラスプレートの厚みに合わせて、集光状態が適切な状態となるように対物レンズの補正環又はその他の光学系の位置の調整（光学調整）を実施する必要がある。この点に関し、ガラスプレートの厚みには、同一の規格の製品に於いても、公差の範囲内でばらつきがあり得るので、実際に光計測を行う際には、新たなガラスプレートを使用する度に、異なるプレパラートの計測を実行する度に、或いは、ガラスプレートの質によってはガラスプレートの位置を変更する度に、光学調整が繰り返されることとなる。従って、例えば、複数のプレパラートを用いて、複数の試料溶液についての光計測を行って、それらの結果を比較する際には、全てのプレパラートについての集光状態が実質的に同一となるように、使用するプレパラート毎に光学調整を行う必要があるところ、かかる光学調整は、非常に手間と労力と時間を要する。
【０００９】
かくして、本発明の主な課題は、上記の特願２０１０−０４４７１４にて提案された新規な光分析技術を更に発展させるべく、特に、観測されるべき試料溶液毎に上記の如き光学調整を行う必要のない新規な光分析装置及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、上記の課題は、一つの態様に於いて、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出し分析する光分析装置であって、先端のレンズ表面に試料溶液を保持することが可能な対物レンズと、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより対物レンズの先端のレンズ表面に保持された試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された発光粒子の各々からの信号を個別に検出する信号処理部とを含むことを特徴とする装置によって達成される。かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。なお、本明細書に於いて、「信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。
【００１１】
上記の本発明に於いては、走査分子計数法と同様に、基本的な構成に於いて、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光検出領域からの光の検出が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出される。かかる構成に於いて、本発明では、特に、試料溶液が対物レンズのレンズ表面（所謂、「先玉」の表面）に直接載置される。かかる構成によれば、対物レンズと試料溶液内の光検出領域との間の光路が、ガラスプレートを通過することはなくなり、一旦、光学調整を完了すれば、光学系の変更がない限り、試料溶液を交換しても（ただし、試料溶液の屈折率は、実質的に変化がない場合）、実質的に集光状態に変化はなく、従って、光学調整を繰り返す必要がなくなる。
【００１２】
また、上記の構成に於いて、更に、信号処理部は、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数するようになっていてよい（発光粒子のカウンティング）。かかる構成によれば、発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量とを組み合わせることにより、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を算出するようになっていてもよい。また、上記の本発明に於いては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、検出対象となる発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなく安定した状態にて、光の計測が可能である（試料溶液中に振動や流れが作用すると、粒子の物性的性質が変化する可能性がある。）。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の場合と同様に微量（数μＬ〜数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。
【００１３】
本発明の装置の信号処理部の処理に於いて、逐次的な光検出部からの信号から１つの発光粒子が光検出領域に入ったか否かの判定は、光検出部にて検出された時系列の信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有する信号が検出されたときに、１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。
【００１４】
また、上記の本発明の装置に於いて、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更可能となっていてよい。当業者に於いて理解される如く、発光粒子から検出される光の態様は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、一つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、一つの発光粒子からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更可能となっていることが好ましい。
【００１５】
更に、本発明の装置に於いて、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、検出対象となる発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の装置は、光検出領域が発光粒子の存在位置を通過したときにその発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、発光粒子の存在を表す信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの発光粒子を一つの（発光粒子の存在を表す）信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、本発明の装置は、光検出領域の移動速度が適宜変更可能であるよう構成されていることが好ましい。
【００１６】
光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
【００１７】
更に、上記の構成に於いて、対物レンズのレンズ表面に試料溶液を確実に保持可能とするための構造が設けられていてよい。そのような構造としては、例えば、対物レンズのレンズ表面の周縁に試料溶液を保持するための枠部材が設けられるか、或いは、対物レンズのレンズ表面の周縁に撥水処理が施されてよい。かかる構成によれば、後述の実施形態に於いて説明されている如く、試料溶液を、容易に、対物レンズのレンズ表面の略中央領域に留まらせることが可能となり、有利である。
【００１８】
また、上記の構成に於いて、対物レンズのレンズ表面に試料溶液を導入するための導入装置が設けられていると有利である。導入装置としては、例えば、試料溶液を滴下するべく対物レンズの上方の所定の位置にピペットの先端を案内するガイド部材などであってよい。対物レンズのレンズ表面は、典型的には、直径数ｍｍ以下の比較的小さい領域である。従って、上記の如き導入装置が備えられていると、実験操作が簡便に且つ速やかに実行することが可能となる。
【００１９】
更にまた、上記の構成に於いて、好適には、対物レンズのレンズ表面に載置される試料溶液の蒸発を防止する部材が設けられてよい。対物レンズのレンズ表面に載置される試料溶液の量は、極めて微量であり、また、通常の形状の対物レンズの周囲は、開放されているので、顕微鏡等の光学系の設置される実験室など、比較的乾燥した場所では、蒸発しやすい。そこで、上記の如く、対物レンズの先端付近に於いて、蓋の如き部材を被せることにより、レンズ表面の試料溶液の蒸発を防止できるようになっていることが好ましい。
【００２０】
また更に、上記の構成に於いて、対物レンズのレンズ表面に於いて液体が載置しているか否かを検出する検出器が設けられていてよい。既に触れた如く、対物レンズのレンズ表面に載置される試料溶液の量は、極めて微量であるので、実験者が肉眼で観察する際に、レンズ表面に試料溶液が存在しているか否かを容易に判断しにくい場合がある。そこで、上記の如く、載置された液体の有無、即ち、対物レンズのレンズ表面に於いて液体が存在しているか否かを検出する検出器が設けられていることが好ましい。かかる検出器は、具体的には、後述の如く、対物レンズから出射した光の反射光（戻り光）の強度変化を捉えるための光学系及び光検出器を用いることにより、実現可能である。（レンズ表面の液体の有無により、戻り光の強度が変化するので、かかる強度変化により、液体の有無が判別できる。）。例えば、複数の試料溶液についての光計測を実行する際、或る溶液を対物レンズのレンズ表面に載置して計測を終了した後、次の試料溶液の光計測を実行する際には、既にレンズ表面に在る溶液を完全に除去する必要がある。その際、上記の検出器が備えられていると、非常に便利である。
【００２１】
上記の本発明の装置によれば、上記の如く、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出を行って個々の発光粒子からの信号を個別に検出する走査分子計数法に於いて、複数の試料溶液の計測を行う場合でも光学調整を繰り返す必要のない新規な光分析方法が実現される。かくして、本発明の共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法は、対物レンズの先端のレンズ表面に試料溶液を載置する過程と、顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光を検出する過程と、検出された光から個々の発光粒子からの信号を個別に検出する過程とを含むことを特徴とする。
【００２２】
かかる方法に於いても、個別に検出された発光粒子からの信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数する過程及び／又は検出された発光粒子の数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程が含まれていてよい。また、光検出領域の位置を移動する過程に於いて、光検出領域の位置が所定の速度にて或いは発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されるようになっていてよく、光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて設定されるようになっていてよい。更に、信号処理過程に於いては、１つの発光粒子が光検出領域に入ったことは、検出された時系列の信号の形状に基づいて、例えば、所定の閾値より大きい強度を有する信号を検出したときに判定されてよい。また更に、上記の本発明の方法に於いて、対物レンズとしては、そのレンズ表面周縁に試料溶液を保持するための枠部材を設けられたもの、或いは、そのレンズ表面周縁に撥水処理が施されているものが用いられてよく、対物レンズのレンズ表面へ試料溶液を導入する導入装置、対物レンズのレンズ表面の試料溶液の蒸発を防止する部材及び／又は対物レンズのレンズ表面に於いて液体が載置しているか否かを検出する検出器が用いられてよい。
【００２３】
本発明による光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
【発明の効果】
【００２４】
総じて、本発明によれば、所謂「走査分子計数法」に於いて、計測の実行される試料溶液を変更する度に、光学調整をやり直す必要がなくなり、実験に要する手間、労力及び時間が短縮されることが期待される。例えば、複数の試料溶液についての光計測を行って、それらの結果を比較する際にも、試料溶液を変更しても、対物レンズ及びその他の光学系の状態を変更しない限り、試料溶液内での集光状態が実質的に同一であるので、光学調整に要した手間と時間が省略できることとなる。
【００２５】
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１（Ａ）は、本発明の光分析技術を実現する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。
【図２】図２は、本発明による対物レンズのレンズ表面に試料溶液を載置する構成に於ける種々の形態を模式的に表した図である。（Ａ）対物レンズのレンズ表面の周縁に枠部材を設けた例。（Ｂ）対物レンズのレンズ表面の周縁に撥水処理を施した例。（Ｃ）対物レンズの先端付近に試料溶液の蒸発を防止するための蓋部材を配置した例。（Ｄ）対物レンズのレンズ表面への試料溶液の滴下を容易にするガイド部材が設けられた例。（Ｅ）対物レンズのレンズ表面に於ける試料溶液の有無を確認するための構成の例。
【図３】図３（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明による走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。
【図４】図４は、本発明に従って実行される光検出・分析の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。
【図５】図５（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図５（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。
【図６】図６は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。
【図７】図７は、従来の蛍光強度のゆらぎを算出する光分析技術に於いて得られるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例であり、（Ａ）は、試料内の粒子の濃度が、十分な計測精度が与えられる程度である場合であり、（Ｂ）は、（Ａ）の場合よりも大幅に試料内の粒子の濃度が低い場合である。
【符号の説明】
【００２７】
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
５ａ…ハーフミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…試料溶液
１０…光線
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１８…コンピュータ
１９…光検出器
２０…枠部材
２２…撥水処理面
２４…蓋部材
２６…ガイド部材
２８…ピペット
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００２９】
光分析装置の構成
本発明は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置により実現可能である。図１（Ａ）を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の頂部のレンズ表面には、数μＬ〜数十μＬの試料溶液の液滴９が直接に載置され、対物レンズ８から出射したレーザー光１０は、試料溶液の液滴９中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過する。なお、当業者に於いて知られている如く、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、焦点面以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される。コンフォーカル・ボリュームに於いては、典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となり、その実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。かくして、ピンホール１３を通過した光は、バリアフィルター１４を透過し、そこに於いて特定の波長帯域の光成分のみに選択された後、マルチモードファイバー１５に導入されて、対応する光検出器１６ａに到達する。光検出器１６は、逐次到来する光の強度を時系列の電気信号に変換して、コンピュータ１８へ送信し、かくして、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられ、これにより、１つの発光粒子からの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出可能となる。
【００３０】
また、上記の光分析装置の光学系に於いて、更に、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動経路は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。
【００３１】
観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、観測対象物となる発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらから光をその波長によって別々に検出できるようになっていてよい。
【００３２】
ところで、上記の本発明による光分析装置に於いては、試料溶液は、マイクロプレート等の試料容器に分注されるのではなく、対物レンズのレンズ表面に直接載置される。また、図１（Ｃ）に描かれている如く、対物レンズの焦点領域（光検出領域）が試料溶液の液滴９内に位置するように、試料溶液の液滴９は、対物レンズのレンズ表面の略中央に位置され、且つ、或る程度の高さを有するよう保持される必要がある。そこで、上記の如く、試料溶液の液滴９を対物レンズのレンズ表面の略中央に保持し易くするための構成が設けられてよい。そのような構成として、例えば、図２（Ａ）に模式的に例示されている如く、対物レンズ８のレンズ表面の周縁に枠部材２０が取り付けられ、試料溶液の液滴９の位置決めが為されるようになっていてよい。また、別の構成として、図２（Ｂ）に模式的に例示されている如く、対物レンズ８のレンズ表面の周縁に撥水処理（例えば、疎水性材料の被覆又は疎水性材料薄膜の貼着）が施された領域２２が形成され、試料溶液の液滴９が対物レンズ８のレンズ表面周縁に拡がらずに、対物レンズ８のレンズ表面の略中央に留まり易くなっていてよい。
【００３３】
更に、上記の如く、試料溶液の液滴９が対物レンズのレンズ表面に液滴９が載置される際、対物レンズの上方が開放されていると、試料溶液の液滴９の蒸発が問題となる。特に、光学顕微鏡の設置される場所は、光学系の保護のため、比較的乾燥している場合がある。そのような場合、レンズ表面の微量の液滴９に於いて、光計測時間が比較的短くても、有意な水分の蒸発が生じ、このことに計測結果が影響され得る。そこで、図２（Ｃ）に例示されている如く、試料溶液の液滴９の蒸発防止のための蓋部材２４が対物レンズ８の先端付近を覆うように取り付けられてよい。
【００３４】
更にまた、対物レンズ８のレンズ表面に試料溶液の液滴９を導入するための導入装置が設けられていてよい。かかる導入装置としては、図２（Ｄ）に例示されている如く、対物レンズの上方の所定の位置ピペット２８の先端を案内するガイド部材２６であってよい。かかるガイド部材２６によれば、試料溶液を吸入したピペット２８の先端を、典型的には、対物レンズのレンズ表面の略中央に開口された孔２６ａへ挿し込み、その状態にて、試料溶液９を滴下することにより、対物レンズのレンズ表面に、図中点線にて描かれている如く、有利に試料溶液の液滴を載置することが容易となる。特に、対物レンズのレンズは、直径数ｍｍの比較的小さい領域であるので、確実に、レンズ表面の略中央に溶液を滴下することは、実験者に於いて若干の熟練が必要なところ、上記の如き導入装置が備えられていると、実験操作が簡便に且つ速やかに実行することが可能となる。
【００３５】
なお、対物レンズ８のレンズ表面に載置される液滴９は、直径数ｍｍ程度であるため、実験者が肉眼で観察する際に、レンズ表面に試料溶液が存在しているか否かを容易に判断しにくい場合がある。この点に関し、例えば、複数の試料溶液についての光計測を実行する際、或る溶液を対物レンズのレンズ表面に載置して計測を終了した後、次の試料溶液の光計測を実行する際には、既にレンズ表面に在る溶液を完全に除去する必要があるところ、実験者の肉眼で、レンズ表面の溶液が完全に除去されたか否かを確認することは、煩わしい操作となる。そこで、上記の本発明の装置に於いて、対物レンズのレンズ表面に於いて液体が載置しているか否かを検出する検出器が設けられていてよい。具体的には、レンズ表面に於ける液体の有無は、図１（Ａ）を参照して、励起光の光路に於いて、励起光の戻り光の一部を反射するハーフミラー５ａ（反射率は、５０％ではなく、更に低くてよい。）を設け、ハーフミラー５ａに於ける反射光の強度を光検出器１９にて計測することにより判定されてよい。図２（Ｅ）に例示されている如く、レンズ表面に液滴９が存在する場合、液滴９内にて、励起光の一部が反射されて、再び対物レンズ８へ戻ってくるところ、レンズ表面に液滴９が存在しない場合、液滴９内で励起光は、そのまま通り抜けることとなる。即ち、光検出器１９に於ける励起光の戻り光の強度が、液滴９の有無によって変化するので、かかる励起光の戻り光の強度を検出することで、レンズ表面に試料溶液が存在しているか否かが判定できることとなる。この構成に於いて、光検出器１９に於ける出力は、コンピュータ１８へ入力され、コンピュータ１８上で、液体の有無が表示されるようになっていてよい。（コンピュータ１８とは別装置にて、液体の有無が表示されるようになっていてもよい。）また、上記の図１、２の顕微鏡は、倒立型の顕微鏡として描かれているが、正立型の顕微鏡であってもよいことは理解されるべきである。
【００３６】
本発明の光分析技術の原理
ＦＣＳ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ等の分光分析技術では、原理的に、発光粒子の特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度が、図７（Ａ）に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし発光粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図７（Ｂ）に描かれているように、発光粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、計測中に常に一個程度の発光粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも発光粒子の濃度が大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
【００３７】
そこで、本願出願人は、特願２０１０−０４４７１４に於いて、発光粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、発光粒子の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく「走査分子計数法」を提案した。
【００３８】
走査分子計数法に於いて実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図３（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、図３（Ａ）の如く、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ〜ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図３（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図３（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、発光粒子の特性に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の特性に関する情報が取得可能である。
【００３９】
上記の「走査分子計数法」に於いて、本発明の光分析技術では、「発明の概要」の欄に記載されている如く、試料溶液が対物レンズのレンズ表面に直接に載置される。即ち、試料溶液の保持のための試料容器又はマイクロプレートなどはもはや使用されず、試料溶液と対物レンズのレンズ表面との間の光路に於いて、ガラスプレート等の光の進行方向を変化させる要素が存在しないので、光学調整、即ち、集光状態が適切な状態となるように対物レンズの補正環又はその他の光学系の位置の調整が為されると、しばしば異なる試料溶液の測定の度に繰り返されていた光学調整は、試料溶液として屈折率の大幅に異なる溶液を用いない限り、必要なくなる。かかる構成によれば、複数の試料溶液についての計測を実行する場合に、従前では、ガラスプレートの公差内での厚みのずれを補正するために実行していた光学調整が必要なくなるので、実験の手間、労力、時間を節約することが可能となる。
【００４０】
処理操作過程
図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明による光分析の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製過程、（２）試料溶液の光強度の測定処理過程、及び（３）測定された光強度の分析処理過程が実行される。図４は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理過程を示している。
【００４１】
（１）試料溶液の調製
本発明の光分析技術に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的粒子などであってよい（試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。）。また、観測対象となる粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が任意の態様にて付加された粒子であってよい。
【００４２】
（２）試料溶液の光強度の測定
本実施形態の走査分子計数法による光強度の測定処理過程では、ミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら、光強度の測定が為される（図４−ステップ１００）。操作処理に於いて、まず、試料溶液の液滴９が対物レンズ８のレンズ表面に載置される。その際、光検出器１９の出力を参照して、試料溶液の液滴９が確実に対物レンズ８のレンズ表面の略中央領域に載置されているか否かが確認されてよい。また、好適には、試料溶液の液滴９の載置の確認後、図２（Ｃ）の如く、蓋部材２４が対物レンズ上部に取り付けられる。次いで、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順、励起光を光検出領域に照射する手順（必要な場合のみ）及び光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射（必要な場合のみ）及び光強度の計測が開始される。計測が開始されると、まず、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、光源２から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射されると共に、ミラー偏向器１７がミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、試料溶液の液滴９内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に受光した光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８は、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ  ＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
【００４３】
光検出領域の位置の移動速度に関して、走査分子計数法に於いて、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出を、定量的に精度よく実行するために、好適には、光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定される。光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図５（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化（発光粒子からの光を表す信号）を特定することが困難となる。そこで、好適には、図５（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域ＣＶを略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが、図５（Ｃ）最上段に例示されている如く励起光強度分布と略同様の略釣鐘状となって、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
【００４４】
具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径ｒの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δτは、平均二乗変位の関係式
（２ｒ）２＝６Ｄ・Δτ      …（１）
から、
Δτ＝（２ｒ）２／６Ｄ      …（２）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２ｒ／Δτ＝３Ｄ／ｒ      …（３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０−１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、ｒが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
【００４５】
一つの試料溶液についての光強度の測定が終了し、別の試料溶液についての光強度の測定を行う場合には、典型的には、対物レンズに載置されている試料溶液は完全に除去される。その際、光検出器１９の出力を参照して、試料溶液の液滴９が対物レンズ８のレンズ表面から除去されているか否かが確認されてよい。
【００４６】
（３）光強度の分析
上記の処理により試料溶液中の発光粒子の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、光強度データ上に於ける発光粒子からの光に対応する信号の検出が実行される。
【００４７】
（ｉ）発光粒子に対応する信号の検出
時系列の光強度データに於いて、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図５（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する（図５（Ｃ）最上段参照）。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ２／ａ２）      …（４）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（４）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。）
【００４８】
時系列光強度データからの発光粒子の一括的な検出を行う処理方法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ（図５（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図４−ステップ１１０、図５（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法等により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ  ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
【００４９】
次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図５（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
【００５０】
しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が発光粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図５（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図６左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図６右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。
【００５１】
上記のステップ１３０〜１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。なお、時系列光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
【００５２】
（ii）発光粒子濃度の決定
更に、検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されてもよい（ステップ１６０−発光粒子のカウンティング）。また、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とから試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度が決定される（ステップ１７０）。
【００５３】
光検出領域の通過した領域の総体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に基づいて理論的に算定されてもよいが、実験的に、例えば、発光粒子の濃度が既知の溶液（対照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、発光粒子の検出及びカウンティングを行うことにより検出された発光粒子の数と、対照溶液の発光粒子の濃度とから決定されるようになっていてよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度Ｃの対照溶液について、対照溶液の発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ      …（５）
により与えられる。また、対照溶液として、発光粒子の複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、発光粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の濃度ｃは、
ｃ＝ｎ／Ｖｔ      …（６）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な発光粒子についての濃度Ｃと発光粒子の数Ｎとの関係（式（５））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
【００５４】
かくして、上記の本発明によれば、光検出領域により試料溶液中にて走査して発光粒子を個別に検出する走査分子計数法に於いて、試料溶液中の発光粒子のカウンティング、濃度の決定等が可能となる。
【００５５】
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
【実施例１】
【００５６】
試料溶液として、リン酸緩衝液（０．１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７を含む）中に、蛍光色素ＡＴＴＯ６３３を、濃度が１ｐＭ、１０ｐＭ及び１００ｐＭとなるように、溶解した溶液をそれぞれ調製した。次に、調製した試料溶液３０μＬを、光分析装置の対物レンズのレンズ表面に直接に載置し、光学調整を行った。なお、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ２０（オリンパス株式会社）を用いた。励起光は、１ｍＷの６３３ｎｍのレーザー光とし、検出波長帯域は、バンドパスフィルターを用いて、６６０−７１０ｎｍの波長帯域とした。光の測定に於いては、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の各々の試料溶液について、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。試料溶液中に於ける光検出領域は、１５ｍｍ／秒の移動速度にて移動させた。また、ＢＩＮ  ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、２秒間とした。
【００５７】
光強度の測定後、上記の「（３）（ｉ）発光粒子に対応する信号の検出」に記載された処理手順に従って、各試料溶液について取得された時系列のフォトンカウントデータから時系列データ中にて検出された発光粒子からの光を表す信号を計数した。ステップ１１０に於けるデータの移動平均法によるスムージングに於いては、一度に平均するデータ点は９個とし、移動平均処理を５回繰り返した。また、ステップ１４０のフィッティングに於いては、時系列データに対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、ピーク幅（半値全幅）、相関係数を決定した。更に、ステップ１５０に於ける判定処理では、下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
ピーク強度＞１．０［ｐｃ／１０μｓ］        …（Ａ）
相関係数＞０．９５
を満たすパルス信号のみを発光粒子に対応する信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないパルス信号はノイズとして無視し、発光粒子に対応する信号であると判定された信号の数を「パルス数」として計数した。
【００５８】
なお、比較対照のために、底面にガラスプレートを有する試料容器に上記の試料溶液５０μＬを注入したプレパラートを用いた測定も上記と同様に行った。（その場合、試料溶液毎に、ガラスプレートの厚みを確認して、光学調整を行う必要がある。）
【００５９】
各試料溶液についての３回の測定に於けるパルス数の平均値と標準偏差は、以下の通りであった。
【表１】
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上記の結果に於いて、対物レンズのレンズ表面に試料溶液を載置した場合（対物レンズ上）に於いても、パルス数の平均値は、発光粒子濃度に対応して増大した。このことにより、本発明に従って、対物レンズのレンズ表面に試料溶液を載置して光計測を行う場合に於いても、発光粒子の個別の検出及び濃度の検出が可能であることが示された。なお、対物レンズのレンズ表面に試料溶液を載置した場合の結果が、試料容器を用いた結果（ガラスプレート上）と異なるのは、実効的な光検出領域の大きさが、両者で異なるためであると考えられる。
【００６０】
かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、上記の本発明によれば、対物レンズのレンズ表面に試料溶液を直接に載置する態様にて走査分子計数法による光計測及び分析が可能となる。本発明に於いては、光学調整を試料溶液が変わる毎に実行する必要はなく、従って、実験操作に要する手間、労力及び時間が節約可能となる。また、本発明は、発光粒子の信号を個別に検出して、その濃度等が検出可能となるので、試料溶液中の発光粒子濃度が、ＦＣＳ等の光分析技術で要求される濃度域よりも低くても、発光粒子の検出が可能であり、かかる特徴は、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合に有利であろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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