(57)【要約】      （修正有）【課題】培地から細胞を効率的に濃縮・分離するための濃縮・分離槽の提供。【解決手段】微細気泡により培地から細胞を濃縮・分離する、濃縮・分離槽及び濃縮・分離装置。前記濃縮・分離槽又は濃縮・分離装置を用いる濃縮・分離方法、及び前記濃縮・分離槽又は濃縮・分離装置を用いて細胞から有用資源を製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地から細胞を濃縮・分離する濃縮・分離槽であって、下部に微細気泡供給手段を有し、微細気泡により前記細胞が分離槽の上方へ運搬されることで濃縮・分離されることを特徴とする、濃縮・分離槽。
【請求項２】
前記微細気泡が、マイクロバブル又はナノバブルである、請求項１に記載の濃縮・分離槽。
【請求項３】
細胞培養手段も有する、請求項１又は２に記載の濃縮・分離槽。
【請求項４】
前記細胞が藻類の細胞である、請求項１〜３に記載の濃縮・分離槽。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の濃縮・分離槽を２個以上連結してなる、細胞の濃縮・分離装置。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の濃縮・分離槽又は請求項５に記載の濃縮・分離装置を用いる、細胞の濃縮・分離方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の濃縮・分離槽又は請求項５に記載の濃縮・分離装置を用いて、炭化水素又は糖類から選択される、前記細胞が産生する有用資源を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培地から細胞を効率的に濃縮・分離するための濃縮・分離槽、当該濃縮・分離槽を連結してなる濃縮・分離装置、前記濃縮・分離槽又は濃縮・分離装置を用いる濃縮・分離方法、及び前記濃縮・分離槽又は濃縮・分離装置を用いて細胞から有用資源を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物細胞が産生する産物から得られる有用資源、特にバイオエナジーは、近年、地球温暖化又は埋蔵資源の枯渇等の問題から注目を集めている。この有用資源の中でも、微細藻類が産生する炭化水素又は多糖類は、食料又は飼料を原料とせず、大量培養が可能であることから、工業的利用の期待が高い。
【０００３】
これら細胞の工業的利用のためには、安価に大量培養及び回収できることが必要となるが、従来の方法では、大量培養した際、特に回収及び／又は脱水工程に費用がかかることが問題となっている。例えば、遠心分離法により細胞と培地の分離をする場合、工業的スケールの大量の培地（例えば、数十リットル〜数百リットル、又はそれ以上）を遠心分離するには、培養濃度や細胞の種類に応じた設定操作が煩雑であり、電力及び設備にかかるコストの観点から非現実的である。また、自然沈降法は、沈降までの時間の損失、培養濃度や細胞の種類による制御の困難さ、回収の不十分さが問題となる。さらに、凝集剤を添加して沈降又は浮上させる回収方法は、回収した細胞に凝集剤が混入するだけでなく、細胞回収後の培地中に凝集剤が残存するために培地の再利用ができず、ランニングコストが増大するだけでなく、凝集体を形成した細胞を濾過膜などで回収する場合には、形成する凝集体の大きさがその回収率に影響を及ぼすこともある。
【０００４】
細胞の中でも藻類は増殖によりコロニーを形成して大きくなるが、藻類増殖速度のばらつきにより、投入した藻類の量に対して十分な量の増殖した藻類の回収ができず、結果として有用産物の回収量が減少することがある。しかしながら、従来の方法では、藻類の増殖速度にばらつきがある場合でも、まとめて一度に回収することしかできなかった。
【０００５】
有用資源を産生する細胞、特に藻類の培養は、１）増殖期、及び２）有用資源産生期の２段階に分けることができる。この各々の段階に適する培地の組成は異なることが知られており、効率的な有用資源の産生のためには、段階に応じて培養培地組成を交換する必要がある。しかしながら従来法で培地交換を行うためには、既述の回収に伴うそれぞれの問題点に加え、たとえば凝集剤添加による回収方法では、回収後のさらなる培養段階のために凝集剤を除去するための工程が必要となりランニングコストが増大する。つまり、従来法では、２以上の培養段階で組成の異なる培地交換を、簡易で安価な方法で行うことができなかった。
【０００６】
また細胞の中には、外環境に存在する物質や他の生物の影響を受け、生育や有用産物の産生に影響を受けるものもある。しかし従来法では、分離及び／又は培地交換を、簡易な密閉系の装置で行うことができなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−２５７６２号公報
【特許文献２】特開２００９−１９５１６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、培地で培養した細胞を、培地から選択的且つ効率的に分離するとともに、２以上の培養段階で組成の異なる培地の交換を、簡易な手段で行うための装置及び／又は方法が必要とされている。
そこで本発明は、この必要とされる細胞の分離のための装置及び／又は方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、細胞懸濁液を含む槽に微細気泡を供給することにより、前記細胞が槽内で速やかに上方に運搬されることを見出し、本発明を為すに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、培地から細胞を濃縮・分離する分離槽であって、下部に微細気泡供給手段を有し、微細気泡により前記細胞が濃縮・分離槽の上方へ運搬されることで濃縮・分離されることを特徴とする分離槽に関する。
【００１１】
本発明はまた、濃縮・分離槽を２個以上連結してなる、細胞の濃縮・分離装置に関する。
【００１２】
本発明はまた、前記濃縮・分離槽又は濃縮・分離装置を用いる細胞の濃縮・分離方法、及び前記濃縮・分離槽又は濃縮・分離装置を用いて細胞から有用資源を製造する方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
よって、本発明により、従来法よりも効率的、汎用的且つ低コストであり、また従来法と異なり任意のタイミングで迅速に細胞を濃縮・分離することができる。
【００１４】
本発明により、１の培養工程において（１）微細気泡供給の開始及び培養細胞の回収と（２）微細気泡供給の停止及び残存細胞の培養開始、とを繰り返すことにより、培養細胞を任意のタイミングで選択的に回収し、培養槽内の細胞密度を培養に適するバランスに維持することができる。
【００１５】
本発明により、凝集剤を添加せずに細胞を濃縮・分離できるため、回収した細胞に不純物が混入することを回避でき、さらに培地を再利用することもできる。
【００１６】
本発明の分離槽又は分離装置を用いて培養することにより、細胞から高効率的に炭化水素や多糖類等の有用資源を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の濃縮・分離槽の模式図を示す。
【図２】図２は、培養手段を同一の槽に有する濃縮・分離槽を２つ連結した濃縮・分離装置の模式図を示す。
【図３】図３は、濃縮・分離槽と培養槽が別の槽であり、２個の培養槽及び２個の濃縮・分離槽を連結した濃縮・分離装置の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１．濃縮・分離槽
本明細書で使用される「濃縮・分離槽」は、球形、半球形、円筒系、円錐形、逆円錐形、正方形、直方体等の定形であっても、これらの任意の形状の組み合わせであっても、又は不定形であってもよい。容量は、内部容量が、１Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌ、７００Ｌ、８００Ｌ、９００Ｌ、１０００Ｌ、又はそれ以上であってもよい。素材は、培養液の液性、光合成の効率、設置場所、清掃の容易さによって様々な選択肢があり得る。場合によっては、内部と外部の素材が異なってもよい。素材の具体的な例としては、例えば、ガラス、アクリル、ポリエチレン、ビニル樹脂、ポリカーボネート等が挙げられる。当該濃縮・分離槽は繰り返し使っても、数回又は１回で取り替え可能なものでもよい。
【００１９】
濃縮・分離槽は、細胞培養手段を有していてもよい。本明細書で使用される「細胞培養手段」とは、細胞を培養するためのあらゆる機能を有する手段を意味し、例えば、培養槽であり、当該培養槽は、攪拌装置、振動装置、温度制御装置、ｐＨ調節装置、濁度測定装置、光制御装置、ＣＯ2等の特定気体濃度測定装置及び圧力測定装置から選択される１又は複数の装置を有してもよい。当該培養槽は濃縮・分離槽と同一の槽であっても、濃縮・分離槽とは別の槽であってもよい。濃縮・分離槽と別の槽である場合、適切な手段、例えば流路等により連結されていてもよい。
【００２０】
本明細書で使用される「微細気泡」なる用語は、平均直径がマイクロメートル、ナノメートル、又はピコメートルオーダーの気泡（いわゆる、マイクロバブル、ナノバブル、又はピコバブル）のことを言う。当該微細気泡の直径は、適切なマイクロバブル、ナノバブル、又はピコバブルの気泡径測定装置により決定されてもよい。あるいは、その供給装置のカタログに示される値を考慮して決定してもよい。本発明で使用される微細気泡の好ましい直径は、例えば０．０１〜２００μｍ、より好ましくは０．１〜１００μｍ、さらに好ましくは１〜５０μｍであってよい。本明細書で使用される微細気泡の直径の好ましい範囲は、分離する細胞又はコロニーの大きさより小さく、微細気泡として存在できる直径より大きいことが好ましい。したがって、例えば分離する細胞の大きさが１００μｍ以上の場合、供給する微細気泡の直径は、１００μｍ未満、好ましくは７０μｍ未満、より好ましくは５０μｍ未満、例えば、１μｍ〜５０μｍ、５μｍ〜５０μｍ、１０μｍ〜５０μｍであってよい。例えば分離する細胞の大きさが１０μｍ〜５０μｍである場合、供給する微細気泡の直径は、例えば５０μｍ未満、好ましくは２０μｍ未満、好ましくは１０μｍ未満、より好ましくは５μｍ未満、さらにより好ましくは１μｍ未満、さらにより好ましくは１００ｎｍ未満であってよい。
【００２１】
本明細書で使用される微細気泡を発生させる手段としては、例えば、高圧化で液体に気体を溶解させて減圧により再気泡化させる加圧減圧法、あるいは液体の渦流を作り出し、その中に気体を巻き込み、ファン等により剪断又は粉砕させる気液剪断法がある。具体的な装置としては、例えば、マイクロバブル発生装置（（株）アスプ製）がある。当該微細気泡供給手段は、流路等の連結手段により分離槽と連結していても、分離槽に直接設置されていてもよい。分離槽と微細気泡供給手段が連結手段で連結されている場合、微細気泡供給手段１つに対して、分離槽が１つであっても、複数であってもよい。
【００２２】
本発明の分離槽は、上部に任意にオーバーフローチェンバーを備え付けてもよい。分離槽内の培地量（液量）を調整することにより、分離槽上方に運搬された細胞をオーバーフローチェンバーで回収することもできる。当該チャンバーで回収した細胞をそのまま取り出しても、次の培養槽又は分離槽に送達してもよい。
【００２３】
本明細書で使用される「流路」は、密閉系であっても、開放系であってもよいが、好ましくは密閉系であり、２個以上の分離槽又は培養槽を連結する場合使用する。このとき、流路の途中に、細胞を一時的に溜める、あるいは不純物を除去するための任意のタンクを設けてもよい。
【００２４】
本発明の実施態様としては、例えば以下のものがある。
（１）大型装置：長さ約５０ｍ、断面積約１ｍ2、ポリエチレン製の培養槽を屋外のプールに設置し、日光照射下、目的細胞を培養し、微細気泡によりこれを濃縮・分離する。
（２）連結型装置：高さ約２ｍ、断面積約0.4ｍ2、アクリル製の培養槽兼濃縮・分離槽を２つ用意し、第一槽を培養槽、第二槽を有用資源産生槽とし、第一槽の藻類回収用出口と、第二槽の藻類投入口をポリエチレン製流路で連結する。第一槽に微細気泡を供給することにより濃縮・分離した藻類を、流路を通して第二槽に移動させ、所定期間経過後、第二槽に微細気泡を供給することにより、目的細胞を濃縮・分離する。
【００２５】
２．細胞
本明細書で使用される「細胞」には、真正細菌又は古細菌等の原核生物、及び藻類、原生動物、植物、菌又は動物等の真核生物の全ての細胞が含まれる。当該細胞は、好ましくは藻類、植物、菌の細胞であり、特に藻類の細胞である。本明細書で使用される「藻類」には、藍藻類、原核緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クリプト藻類、渦鞭毛藻類、黄金色藻類、珪藻類、褐藻類、黄緑藻類、ハプト藻類、ラフィド藻類（緑色鞭藻類）、クロララクニオン藻類、ミドリムシ藻類、プラシノ藻類、緑藻類、車軸藻類などがあり、好ましくは、微細藻類とよばれる、珪藻類、褐藻類、ユーグレナや緑藻類がある。本発明に適する藻類としては、好ましくは、ボトリオコッカス、スピルリナ、ミクロキスティス・エルギノーサ、スオイルリナ、ユーグレナ、シゾキトリウムがある。
【００２６】
一般的に細胞の培養工程には、細胞数が時間に対して対数的に増殖する対数増殖期と、対数増殖期後の定常期がある。例えば藻類の場合、光合成及び増殖用培地の栄養素により対数的に増殖する増殖期と、有用資源を産生する有用資源産生期に分けることができる。好ましくは増殖期と有用資源産生期で培地を交換することが望ましい。
【００２７】
本明細書で使用される「培地」は、細胞の培養に適する、様々な培地を選択できる。本明細書で使用される培地は液体である。例えば藻類の培地としては、淡水産藻類用の培地（例えば、ＡＦ６培地、Ｃ培地、ＵＲＯ培地、ＶＴン培地等）、又は海産藻類用培地（ＥＳＭ培地、f/2培地、ＩＭＲ培地、ＭＮＫ培地等）がある。藻類の増殖期に好ましい培地は、上記培地より窒素成分を極力除いたものである。
【００２８】
細胞には増殖によりその大きさが変化するものがある。例えばある藻類は、増殖によりコロニーを形成する。当該藻類は、単細胞藻類（培養開始時）は、数μｍ〜10μｍ程度の大きさであり、コロニーを形成することにより、数十μｍ〜100μｍ、又はそれ以上の大きさとなる。よって本発明の分離槽及び分離装置を用いて、大きさにより、コロニー形成細胞と未形成細胞を分離することもできる。また、例えばコロニーを形成しない藻類では、増殖後に糸状菌等を利用することにより藻類細胞を集合させ、微細気泡により培地から濃縮・分離することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、有用資源の純度を高め、培地の再利用をするためにも、無機凝集剤又は有機凝集剤等の凝集剤は使用しない。
【００２９】
本明細書で使用される「有用資源」は、細胞が産生するあらゆる有用資源のことを言い、具体的には、例えば、燃料、食料、医療品、及びその他の工業用品又は生活用品として必要な有用資源やその原料のことを言う。当該有用資源には、樹脂、燃料又は界面活性剤糖のもととなる炭化水素、糖類、タンパク質、アミノ酸等がある。例えば藻類の産生する有用資源としては、有機炭素源を利用して産生した炭化水素や多糖類がある。具体的には、炭化水素として、直鎖又は分岐鎖型の任意に置換されたアルキル、アルケニル又はアルキニルがあり、より具体的にはボトリオコッセン等がある。多糖類としては、フコースを含む多糖類等があり、天然色素としてカロチノイドがある。
【００３０】
前記藻類は、その乾燥重量当たり、当該有用資源を、少なくとも10％、少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、さらにより好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、さらにより好ましくは少なくとも98％、さらにより好ましくは少なくとも99％、最も好ましくは少なくとも100％産生することができる。
【００３１】
４．作用及び運転方法
（１）濃縮・分離装置
本発明の実施態様である濃縮・分離槽の作用及び運転方法を示す。培養した細胞を含む培地を濃縮・分離槽に投入する。細胞は培地中で懸濁状態であるか、一部その重みで沈殿するが、分離槽下部の微細気泡供給手段より微細気泡を供給すると、その微細気泡により細胞が上方に運搬されて濃縮され、これを回収することで培地から効率的に分離することができる。微細気泡の供給は、連続的に行っても、パルスとして間隔を空けて行ってもよい。上方に運搬され濃縮された細胞は、すくい取っても、適切な回収手段により回収してもよい。細胞分離後の培地は再利用することができる。
【００３２】
（２）培養槽兼濃縮・分離装置
本発明の別の実施態様である培養槽兼濃縮・分離装置の作用及び運転方法を示す。培養する細胞及び培地を投入し培養を開始する。当該培養中、適切な装置により、温度調節、濃度調節、攪拌、ｐＨ調節、培地の追加等の条件調整や、サンプリング等のモニタリングを行ってもよい。培養の完了後又は途中で、前述の通り、濃縮・分離槽下部の微細気泡供給手段より微細気泡を供給する。１つの培養工程で、微細気泡の供給と細胞の培養を交互に複数回行ってもよい。この場合、例えば増殖により大きくなった細胞のみを、微細気泡の供給により選択的に培養槽の上方に運搬し必要に応じて回収することで、上方に運搬されなかった残りの増殖不十分な藻類を追加の培養で増殖させることもできる。当該回収した細胞はオーバーフローチャンバーに一時的に溜めてから回収しても、そのまま回収しても、次の工程で使用するために別の装置に連結した流路で送達されてもよい。
【００３３】
（３）連結型濃縮・分離装置
本発明のさらに別の実施態様である連結型濃縮・分離装置の作用及び運転方法を示す。濃縮・分離槽及び／又は培養槽を複数個連結する場合、適切な流路で連結する。濃縮・分離槽と培養槽の連結の順序は様々な組み合わせがあり得る。例えば、第一の濃縮・分離槽は培養手段を同一の槽に有する濃縮・分離槽であり、第二の濃縮・分離槽は培養手段を持たないものであってもよい。本態様は、第一の槽と第二の槽で培地を交換する際に好ましい。
【実施例】
【００３４】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００３５】
微細気泡と通常気泡の比較
１．装置
実験装置は図１に示す濃縮・分離槽と同一の槽に培養手段を有する培養槽兼濃縮・分離槽を使用した。培養槽兼濃縮・分離槽は、直径0.1ｍ、高さ１ｍ、容量３０Ｌ、アクリル製を用いた。気泡の供給は、（１）微細気泡供給装置（バイクロバブル発生装置（株）アスプ製）を用い、比較例として（２）通常気泡供給装置（エアーポンプ、（株）イワキ製）を用いた。
【００３６】
２．条件
培養槽に、ＡＦ６培地を２０Ｌ、及び藻類（ボトリオコッカス属（筑波大学から入手））を１０Ｌ投入し、光照射下、２０日間培養し、藻類を増殖させた。その後、微細気泡供給装置により微細気泡を供給した。通常気泡供給装置を用いる場合は、エアーポンプにより通常気泡を供給した。
【００３７】
３．結果
気泡供給後の目視の様子、藻類濃縮の有無、藻類回収の可否、藻類の乾燥重量に対する炭化水素の回収率を以下の表１に示す。
【００３８】
【表１】
2012016316.tif 000002
【図１】
2012016316.tif 000003
【図２】
2012016316.tif 000004
【図３】
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