(57)【要約】【課題】がんゲノム解析において、従来の解析結果における１塩基変異の誤認を簡便に除去し、計算機に負荷をかけずに１塩基変異解析の精度を向上させる技術を開発する。【解決手段】本発明は、（１）大規模シーケンシングで得られた対象配列を参照配列と照合して、割り付けるステップと、（２）前記対象配列を前記参照配列と比較して、該参照配列と整列させて、１塩基変異かｉｎｄｅｌ変異かの第１の判断を行うステップと、（３）第１の判断で１塩基変異と判断された対象配列について、１塩基変異と判断された塩基以外の塩基配列が参照配列と一致するタグの数を計数するステップと、（４）前記タグ数が２個または３個以上のとき、１塩基変異であるとする第２の判断を行うステップと、（５）第２の判断の１塩基変異を出力するステップとを含む、がんゲノム解析における大規模塩基配列解析方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんゲノム解析における大規模塩基配列解析方法であって、
（１）大規模シーケンシングで得られた対象配列をＢｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ変換を用いるアライメント法により参照配列と照合して、割り付けるステップと、
（２）前記対象配列を前記参照配列と比較して、該参照配列と整列させて、１塩基変異かｉｎｄｅｌ変異かの第１の判断を行うステップと、
（３）第１の判断で１塩基変異と判断された対象配列について、１塩基変異と判断された塩基以外の塩基配列が参照配列と一致するタグの数を計数するステップと、
（４）前記タグ数が２個または３個以上のとき、１塩基変異であるとする第２の判断を行うステップと、
（５）第２の判断の１塩基変異を出力するステップとを含むことを特徴とする、がんゲノム解析における大規模塩基配列解析方法。
【請求項２】
前記ステップ（４）において、前記タグ数が３個又は４個以上のとき、１塩基変異であるとする第２の判断を行うことを特徴とする、請求項１に記載のがんゲノム解析における大規模塩基配列解析方法。
【請求項３】
前記ステップ（４）において、前記タグ数が４個又は５個以上のとき、１塩基変異であるとする第２の判断を行うことを特徴とする、請求項２に記載のがんゲノム解析における大規模塩基配列解析方法。
【請求項４】
前記ステップ（４）において、前記タグ数が５個又は６個以上のとき、１塩基変異であるとする第２の判断を行うことを特徴とする、請求項３に記載のがんゲノム解析における大規模塩基配列解析方法。
【請求項５】
がんゲノム解析における大規模塩基配列解析プログラムであって、
（１）大規模シーケンシングで得られた対象配列をＢｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ変換を用いるアライメント法により参照配列と照合して、割り付けるステップと、
（２）前記対象配列を前記参照配列と比較して、該参照配列と整列させて、１塩基変異かｉｎｄｅｌ変異かの第１の判断を行うステップと、
（３）第１の判断で１塩基変異と判断された対象配列について、１塩基変異と判断された塩基以外の塩基配列が参照配列と一致するタグの数を計数するステップと、
（４）前記タグ数が２個または３個以上のとき、１塩基変異であるとする第２の判断を行うステップと、
（５）第２の判断の１塩基変異を出力するステップとを含むステップをコンピュータに実行させることを特徴とする、がんゲノム解析における大規模塩基配列解析プログラム。
【請求項６】
請求項４に記載のプログラムを実行することを特徴とするコンピュータ。
【請求項７】
がんゲノム解析における大規模塩基配列解析装置であって、
（１）大規模シーケンシングで得られた対象配列をＢｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ変換を用いるアライメント法により参照配列と照合して、割り付けるマッピング部と、
（２）前記対象配列を前記参照配列と比較して、該参照配列と整列させて、１塩基変異かｉｎｄｅｌ変異かの第１の判断を行う第１の塩基変異抽出部と、
（３）第１の判断で１塩基変異と判断された対象配列について、１塩基変異と判断された塩基以外の塩基配列が参照配列と一致するタグの数を計数するタグ数カウント部と、
（４）前記タグ数が２個または３個以上のとき、１塩基変異であるとする第２の判断を行う第２の塩基変異抽出部と、
（５）第２の判断の１塩基変異を出力する塩基変異出力部とを含むことを特徴とする、がんゲノム解析における大規模塩基配列解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はがんゲノム解析における大規模塩基配列解析方法、プログラム及び装置に関し、具体的には、がんゲノム解析で得られた大規模塩基配列データにおける１塩基変異（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ、ＳＮＶ）同定の誤認を軽減する機能を備えた、大規模塩基配列解析方法、プログラム及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムＤＮＡの塩基配列などの網羅的解析を短時間で達成するために、数億個の断片化されたＤＮＡの塩基配列を１回の作業で超並列的に解読する大規模シーケンシング技術が実用化されている。前記大規模シーケンシング技術によって得られた大量の塩基配列の１次データは、参照配列とコンピュータプログラムによって照合され、塩基１個ずつ参照配列と対応するように整列（アライメント）され、参照配列と異なる塩基が変異として認識される。ここで、参照配列は、ゲノムプロジェクトで確立され、公表された配列である。変異の誤認を防ぐために、現在多くの大規模シーケンス法においては、参照配列上のそれぞれの塩基１個に対し、大規模シーケンシング用ＤＮＡシーケンサーから得られるＤＮＡ断片の配列（以下、「タグ」という。）数十個以上を比較することとしている。すなわち、図７に示すとおり、（１）タグ（両端各３０〜１００塩基）の塩基配列を決定し、（２）得られた各タグを参照配列と照合し、（３）参照配列と異なる塩基を変異とするものである。
【０００３】
大規模塩基配列データを解析して、対象配列上にある１塩基変異を判定するソフトウェアとして現在周知慣用されているのは、米国ブロード研究所（Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国）が開発したゲノム解析ツールキット（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｋｉｔ、以下、「ＧＡＴＫ」という。）である（非特許文献１）。ＧＡＴＫは、大規模シーケンシングで得られた塩基配列データと、公表された参照配列とに基づいて１塩基変異を同定するソフトウェアであり、図８に示すように、ＧＡＴＫの対象配列データを参照配列に割り付ける（マッピング）ステップと、前記対象配列データを参照配列と比較するステップと、タンパク質コード配列（ＣＤＳ）領域とそれ以外の領域とを選別するステップとを含む。
【０００４】
ＧＡＴＫプログラムによる１塩基変異判断において、塩基の挿入又は欠失による変異（以下、「ｉｎｄｅｌ変異」という。）が対象配列中に存在するとき、当該変異をｉｎｄｅｌ変異ではなく１塩基変異として参照配列と整列させると、当該変異の最も５’側の塩基は１塩基変異として認識されるが、該塩基の３’側の配列は１塩基変異の集積として誤って判断されてしまうことがある。図９及び図１０は変異配列に３塩基の欠失がある場合における１塩基変異誤認の例である。１塩基変異の誤認は取得した塩基配列データの末端近くに欠失が位置する際に特に生じやすい。
【０００５】
ＧＡＴＫプログラムでは、ｉｎｄｅｌ変異なのに１塩基変異と誤認される問題を回避するための改良が継続している。例えば、１塩基変異が狭い範囲に集中する場合や、対象配列データの品質が低い場合にその旨の注記を付する（フラッギング）機能が追加された。しかしかかる機能を実行するためには、１次データを大量に処理する必要があり、計算機にかかる負荷が大きく、特にがんゲノム解析のように、多数検体を一度に扱う際に迅速に結果を出すうえで不利である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＭｃＫｅｎｎａ、Ａ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０：１２９７（２０１０）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、がんゲノム解析において、従来のＧＡＴＫプログラムを用いる解析結果における１塩基変異の誤認を簡便に除去し、計算機に負荷をかけずに１塩基変異解析の精度を向上させる技術を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、がんゲノム解析における大規模塩基配列解析方法を提供する。本発明のがんゲノム解析における大規模塩基配列解析方法は、（１）大規模シーケンシングで得られた対象配列をＢｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ変換を用いるアライメント法により参照配列と照合して、割り付けるステップと、（２）前記対象配列を前記参照配列と比較して、該参照配列と整列させて、１塩基変異かｉｎｄｅｌ変異かの第１の判断を行うステップと、（３）第１の判断で１塩基変異と判断された対象配列について、１塩基変異と判断された塩基以外の塩基配列が参照配列と一致するタグの数を計数するステップと、（４）前記タグ数が２個または３個以上のとき、１塩基変異であるとする第２の判断を行うステップと、（５）第２の判断の１塩基変異を出力するステップとを含む。
【０００９】
本発明のがんゲノム解析における大規模塩基配列解析方法の前記ステップ（４）において、前記タグ数が３個又は４個以上のとき、１塩基変異であるとする第２の判断を行う場合がある。
【００１０】
本発明のがんゲノム解析における大規模塩基配列解析方法の前記ステップ（４）において、前記タグ数が４個又は５個以上のとき、１塩基変異であるとする第２の判断を行う場合がある。
【００１１】
本発明のがんゲノム解析における大規模塩基配列解析方法の前記ステップ（４）において、前記タグ数が５個又は６個以上のとき、１塩基変異であるとする第２の判断を行う場合がある。
【００１２】
本発明は、がんゲノム解析における大規模塩基配列解析プログラムを提供する。本発明のがんゲノム解析における大規模塩基配列解析プログラムは、（１）大規模シーケンシングで得られた対象配列をＢｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ変換を用いるアライメント法により参照配列と照合して、割り付けるステップと、（２）前記対象配列を前記参照配列と比較して、該参照配列と整列させて、１塩基変異かｉｎｄｅｌ変異かの第１の判断を行うステップと、（３）第１の判断で１塩基変異と判断された対象配列について、１塩基変異と判断された塩基以外の塩基配列が参照配列と一致するタグの数を計数するステップと、（４）前記タグ数が２個または３個以上のとき、１塩基変異であるとする第２の判断を行うステップと、（５）第２の判断の１塩基変異を出力するステップとを含むステップをコンピュータに実行させる。
【００１３】
本発明のがんゲノム解析における大規模塩基配列解析プログラムの前記ステップ（４）において、前記タグ数が３個又は４個以上のとき、１塩基変異であるとする第２の判断を行う場合がある。
【００１４】
本発明のがんゲノム解析における大規模塩基配列解析プログラムの前記ステップ（４）において、前記タグ数が４個又は５個以上のとき、１塩基変異であるとする第２の判断を行う場合がある。
【００１５】
本発明のがんゲノム解析における大規模塩基配列解析プログラムの前記ステップ（４）において、前記タグ数が５個又は６個以上のとき、１塩基変異であるとする第２の判断を行う場合がある。
【００１６】
本発明は本発明のがんゲノム解析における大規模塩基配列解析プログラムを実行するコンピュータを提供する。
【００１７】
本発明はがんゲノム解析における大規模塩基配列解析装置を提供する。本発明の装置は、（１）大規模シーケンシングで得られた対象配列をＢｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ変換を用いるアライメント法により参照配列と照合して、割り付けるマッピング部と、（２）前記対象配列を前記参照配列と比較して、該参照配列と整列させて、１塩基変異かｉｎｄｅｌ変異かの第１の判断を行う第１の塩基変異抽出部と、（３）第１の判断で１塩基変異と判断された対象配列について、１塩基変異と判断された塩基以外の塩基配列が参照配列と一致するタグの数を計数するタグ数カウント部と、（４）前記タグ数が２個または３個以上のとき、１塩基変異であるとする第２の判断を行う第２の塩基変異抽出部と、（５）第２の判断の１塩基変異を出力する塩基変異出力部とを含む。
【００１８】
本発明のがんゲノム解析における大規模塩基配列解析方法、プログラム及び装置において、第１の判断で１塩基変異と判断された対象配列について、１塩基変異と判断された塩基が参照配列と異なる全てのタグ（変異タグ）の数を計数するとともに、該変異タグのうち、１塩基変異と判断された塩基以外の塩基配列が参照配列と一致するタグ（完全一致タグ）の数を計数する場合がある。がんゲノム解析では、検体にがん細胞と正常細胞とが含まれる場合がある。また検体のがん細胞は、突然変異を蓄積してより悪性になっていく過程のさまざまな段階の細胞が不均一に混在している可能性が高い。そのため、変異タグが出現する頻度は、正常細胞のように変異がヘテロ又はホモで均一な検体に比べると低い。なお、変異タグには配列決定の品質及び／又は精度に問題があるために生じる場合がある。しかし、このような問題のために生じる変異タグ、特に完全一致タグは、大規模塩基配列解析の場面で何度も再現することはほとんどない。そこで理論に拘泥することは意図しないが、完全一致タグの数が２個または３個以上であれば、その変異は１塩基変異である蓋然性が高いので、本発明において完全一致タグの数を基準として１塩基変異の誤認を軽減することができる根拠と考えられる。
【００１９】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、大規模な再計算を施すことなく欠失マッピングの誤りに起因する誤った１塩基変異判断を簡便に除去しデータ処理の迅速性を増すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】１塩基変異の誤認により、各タグにおいて近傍の複数の塩基が１塩基変異として認識される例を示す模式図。
【図２】本発明の大規模塩基配列解析方法及びプログラムのフロー・チャート。
【図３】本発明の実施例の解析手順を示す模式図。
【図４】本発明の実施例の解析手順を示す模式図。
【図５】本発明の実施例の解析手順を示す模式図。
【図６】本発明の実施例の完全一致タグ数による判断の的中率を示す表。
【図７】従来技術の大規模塩基配列解析方法の１塩基変異判断手法を示す模式図。
【図８】従来技術の大規模塩基配列解析方法の１塩基変異判断手法を示す模式図。
【図９】従来技術による１塩基変異誤認の説明図。
【図１０】従来技術による１塩基変異誤認の説明図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下に説明する本発明の実施例は、例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【００２３】
従来技術の大規模塩基配列解析用プログラムでは、１塩基変異と判断した塩基以外の塩基配列が参照配列と一致するタグは「完全一致タグ」と判断され、当該タグにその旨の注記が付される。ここで、本当はｉｎｄｅｌ変異であるのに、１塩基変異と誤った判断が行われると、各タグにおいて近傍の複数の塩基が１塩基変異として認識される可能性が高い（図１を参照せよ。）。これに対し、本当の１塩基変異の場合には、近傍の複数の塩基が１塩基変異として認識される現象が起こることは少ない。したがって、ｉｎｄｅｌ変異であるのに、１塩基変異と誤って判断された塩基では完全一致タグの数が減少する。そこで、ある塩基について１塩基変異と判断したときに、完全一致タグが１本又は０本しかなければ、その判断は誤りであると考えてよい。このように、完全一致タグ数を指標にスクリーニングを行うと、従来技術の大規模塩基配列解析用プログラムの１塩基変異判断結果を利用して、１塩基変異の誤認を除去することができる。このスクリーニングは計算負荷が極めて小さく、汎用のパーソナルコンピュータの能力で十分に対応できる。以下、詳細に説明する。
【００２４】
図２に示すように、本発明の大規模塩基配列解析用プログラムは、第１のステップにおいて、従来技術を用いて大規模塩基配列データから１塩基変異を検出する。具体的には、図３に示すように、大規模塩基配列データをＢｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ変換を用いるアライメント法（ＢＷＡ、Ｌｉ，Ｈ．及びＤｕｒｂｉｎ，Ｒ．、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２５：１７５４（２００９））を用いてマッピングし、配列アライメント／マップ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｎｇｍｅｎｔ／ｍａｐ、ＳＡＭ）フォーマットを利用するソフトウェアパッケージであるｓａｍｔｏｏｌｓ（Ｌｉ，Ｈ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２５：２０７８（２００９））を用いて前処理を行い、ＧＡＴＫを用いて１塩基変異又はｉｎｄｅｌ変異をコールすることにより１塩基変異を検出する。本発明の大規模塩基配列解析用プログラムの第２のステップでは、１塩基変異の検出結果から完全一致タグ数の情報を出力する。続いて第３のステップにおいて、完全一致タグ数が２本以上の１塩基変異を抽出し、これを第４のステップにおいて、ｉｎｄｅｌ変異を１塩基変異とする誤認の少ない１塩基変異として出力する。具体的には、図４に示すように、大規模塩基配列データをコンセンサスＣＤＳ（ＣＣＤＳ）領域上のものに絞る。そして、ＧＡＴＫにより各位置のタグを取得する。ここでは、例えば図５に示すように、大規模塩基配列データに位置情報を与え、ＧＡＴＫ  ＰｉｌｅＵｐを用いて与えた位置部分の塩基とＱＶ値を出力し、ｐｅｒｌスクリプトを用いてタグ数やＱＶ値の和を出力する。一方、ＧＡＴＫ  ＰｒｉｎｔＲｅａｄｓを用いて与えた位置部分のＳＡＭファイルを出力し、ｐｅｒｌスクリプトを用いて完全一致タグを数える。その後、アノテーション、フィルタリングを行うことで、誤認の少ない１塩基変異を出力する。
【００２５】
以上のように、本発明の大規模塩基配列解析用プログラムは、大規模シーケンシングによるデータから１塩基変異を検出するステップと、１塩基変異の検出結果から１塩基変異と判定された塩基以外の塩基配列が参照配列と一致するタグ数の情報を出力するステップと、前記タグ数が２本以上の１塩基変異を抽出するステップとを備えたものであるので、大規模な再計算を施すことなく欠失マッピングの誤りに起因する誤った１塩基変異予測を簡便に除去しデータ処理の迅速性を増すことができる。
【００２６】
以下、より具体的な実施例に基づいて説明する。
【実施例１】
【００２７】
肺がん組織（１検体）の全エクソンの大規模シーケンシングを行い、ＧＡＴＫプログラムで判定された１塩基変異のうち、「がんに特異的な体細胞性変異」かつ「遺伝子変異がコードするタンパク質のアミノ酸置換を伴う変異」として１５１箇所の塩基を抽出し、参照配列に照合したデータと比較した。
【００２８】
１  材料と方法（ＤＮＡサンプルと全エクソンシーケンス）
国立がん研究センター倫理審査委員会の承認のもと、文書による同意を得た患者の肺がんメタノール固定パラフィン包埋標本より、癌部組織がレーザーマイクロダイセクション法により選択的に回収された後、ＥＺ１  ＤＮＡ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（キアゲン社）によりゲノムＤＮＡが抽出された。また組織学的にがん細胞が認められなかった同一症例の非癌部組織からも同様にＤＮＡが抽出された。抽出されたゲノムＤＮＡのエクソン部分３７．６  ＭｂがＳｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｌｌ  Ｅｘｏｎ  Ｋｉｔ（アジレントテクノロジー社）により濃縮され、ライブラリが作成され、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘ（イルミナ社）を用い両端から塩基７５個の配列決定反応が行われた。
【００２９】
２  アラインメント、１塩基変異コール、マッピングデータとの比較
Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘで得られたショートリード配列は、アラインメントプログラムＢＷＡ（Ｌｉ，Ｈ．及びＤｕｒｂｉｎ，Ｒ．、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２５：１７５４（２００９））を用い、参照ゲノムＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９にマッピングされた後、
Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ＞＝６０，
Ｂａｓｅ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｖａｌｕｅ  ＞＝３０，
Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  Ｓｃｏｒｅ  ＞＝５０
という条件を満たすデータについてＧＡＴＫプログラム（ＧＡＴＫ  Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ）を用い、１塩基変異コールが行われた。コールされた１塩基変異について、ＧＡＴＫ  ＰｒｉｎｔＲｅａｄｓ，  ＰｉｌｅＵｐを用い、目的部分のＳＡＭファイルが出力され、ＱＶ＞＝３０で完全一致したタグ数がカウントされた。癌部ＤＮＡで得られた１塩基変異から非癌部で見られた１塩基変異と一致するものを除いて、差分１５１箇所が体細胞性変異として判定された。Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒで得られたデータはＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ  ＤＮＡシーケンスモジュール（イルミナ社）を用いて視覚化され、上記で得られた１塩基変異判定結果との一致が目視で確認された。
【００３０】
３  結果
照合データ上で明らかにｉｎｄｅｌ変異を１塩基変異と誤認したと判定されたＧＡＴＫプログラムの予測結果を「誤った判断」とし、明らかに１塩基変異とみなされるものを「正しい判断」とした。完全一致タグ数が１本以上の１塩基変異候補を採択した場合の陽性的中率（スクリーニングで除去される誤った判断の１塩基変異数／誤った判断の１塩基変異総数）は７６．９％、陰性的中率（スクリーニングで除去されない正しい判断の１塩基変異数／正しい判断の１塩基変異総数）は９７．６％であった。完全一致タグ数の基準を変動させた際の陽性的中率、陰性的中率の推移は図６のとおりである。特に完全一致タグ数が２本以上の場合に好適な陽性的中率が得られることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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