(57)【要約】【課題】特定の化学物質を、高感度かつ高精度に検出すること。【解決手段】化学物質受容体１０１と、Ｇタンパク質１０６と、Ｇタンパク質連動型カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．４のうち、１４３番目のセリンをスレオニンに改変させたイオンチャネル１１０とを株化細胞に発現させる。カリウムイオンチャンネルを通じた細胞内へのカリウムイオン流入による、イオン電流の変化を測定することにより、標的となる化学物質１０３を高感度で高精度に検出することができる。【選択図】図２
2012228181.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学物質受容体を発現させるプラスミドと、
Ｇタンパク質連動型カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．４のうち、１４３番目のセリンをスレオニンに改変した改変型カリウムイオンチャネルを発現させるプラスミドと、
Ｇタンパク質を発現させるプラスミドと、
を調製する工程と、
調製された３種類のプラスミドを混合して株化細胞に導入する工程と、
を有する、
前記化学物質受容体と、
前記改変型カリウムイオンチャネルと、
前記Ｇタンパク質と、
を共発現させた脂質二重膜の産生方法。
【請求項２】
前記Ｇタンパク質が、前記化学物質受容体と前記改変型カリウムイオンチャネルそれぞれと高親和性を持つように設計されたキメラＧタンパク質である、請求項１に記載の脂質二重膜の産生方法。
【請求項３】
化学物質を検知可能とする方法であって、
化学物質受容体と、
Ｇタンパク質連動型カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．４の１４３番目のセリンをスレオニンに改変した改変型カリウムイオンチャネルと、
Ｇタンパク質と、
を株化細胞の脂質二重膜に共発現させ、
カリウムイオンの株化細胞内への流入によって発生する電流変化を測定することにより、前記化学物質を検知可能とする方法。
【請求項４】
前記Ｇタンパク質が、前記化学物質受容体と前記改変型カリウムイオンチャネルそれぞれと高親和性を持つように設計されたキメラＧタンパク質である、請求項３に記載の化学物質を検知可能とする方法。
【請求項５】
化学物質受容体と、
Ｇタンパク質連動型カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．４の１４３番目のセリンをスレオニンに改変した改変型カリウムイオンチャネルと、
Ｇタンパク質と、
を脂質二重膜に共発現させた細胞であって、
前記化学物質受容体は、化学物質が結合したときに、Ｇタンパク質のサブユニットを放出し、
前記改変型カリウムイオンチャネルは、放出されたＧタンパク質のサブユニットと結合したときに、細胞外のカリウムイオンを細胞内へと輸送する、細胞。
【請求項６】
前記Ｇタンパク質が、前記化学物質受容体と前記改変型カリウムイオンチャネルそれぞれと高親和性を持つように設計されたキメラＧタンパク質である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法であって、
前記脂質二重膜は、化学物質受容体と、Ｇタンパク質連動型カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．４の１４３番目のセリンをスレオニンに改変した改変型カリウムイオンチャネルと、Ｇタンパク質とを具備しており、
前記脂質二重膜は、表側にカリウムイオンを有しており、
前記方法は、
化学物質を前記脂質二重膜の表側から供給し、前記化学物質受容体にＧタンパク質のサブユニットを放出させ、前記放出されたＧタンパク質のサブユニットが前記改変型カリウムイオンチャネルに結合することによって前記脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する工程、
を有する、方法。
【請求項８】
前記Ｇタンパク質が、前記化学物質受容体と前記改変型カリウムイオンチャネルそれぞれと高親和性を持つように設計されたキメラＧタンパク質である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
脂質二重膜を用いて化学物質を検知または定量する方法であって、
前記脂質二重膜は、化学物質受容体と、Ｇタンパク質連動型カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．４の１４３番目のセリンをスレオニンに改変した改変型カリウムイオンチャネルと、Ｇタンパク質とを具備しており、
前記脂質二重膜は、表側にカリウムイオンを有しており、
前記方法は、
前記脂質二重膜の表側にカリウムイオンを有する溶液を供給する工程、
検知または定量される化学物質を前記脂質二重膜の表側からさらに供給し、前記化学物質受容体にＧタンパク質のサブユニットを放出させ、前記放出されたＧタンパク質のサブユニットが前記改変型カリウムイオンチャネルに結合することによって前記脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する工程、
前記脂質二重膜の裏側に輸送されたカリウムイオンの濃度の変化を測定する工程、
前記カリウムイオンの濃度の変化に基づいて前記化学物質を検知または定量する工程
を有する、方法。
【請求項１０】
前記Ｇタンパク質が、前記化学物質受容体と前記改変型カリウムイオンチャネルそれぞれと高親和性を持つように設計されたキメラＧタンパク質である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高感度で化学物質を検出することが可能である細胞、脂質二重膜の産生方法に関する。また、本発明は、電流変化を測定することにより、高感度で化学物質を検知可能とする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高感度でかつ特異性の高い化学物質センサを作成するためには、生体に存在する化学物質受容体を利用するのが効率的な方法である。生体由来の受容体を利用した化学物質センサ作成方法としては、目的の受容体と関連して動作する膜タンパク質を分子生物学的手法によって細胞に発現させ、受容体と膜タンパク質との間に発生する内因性シグナルパスウエーを利用して、化学物質を検出するというものがあった（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。
【０００３】
図１に示すように、生体の細胞膜には、（１）化学物質受容体（レセプター）１０１、（２）化学物質受容体１０１に保持され、細胞内側（図１では細胞膜１０５の下側）に存在する３つのサブユニットＧα（符号１０６）、Ｇβ（符号１０７）、Ｇγ（符号１０８）からなるＧタンパク質、（３）細胞膜１０５を貫通するカリウムイオンチャンネル１０２が存在する。例えば、神経伝達物質などの化学物質１０３が、化学物質受容体１０１の細胞外側（図１では細胞膜１０５の上側）に結合すると、Ｇタンパク質は、Ｇβ（符号１０７）およびＧγ（符号１０８）の２つのサブユニットを放出する。これら２つのサブユニットは分解せず、保持された状態で細胞内を移動し、カリウムイオンチャネル１０２に到達する。
【０００４】
Ｇβ（符号１０７）およびＧγ（符号１０８）の２つのサブユニットがカリウムイオンチャネル１０２に到達すると、カリウムイオンチャネル１０２が開き、細胞外の体液に含まれるカリウムイオン１０４（Ｋ＋）を細胞内へと移動させる。通常、細胞外のカリウムイオンの濃度は、細胞内のカリウムイオン濃度よりも高いので、カリウムイオンチャネル１０２が開かれると、イオン濃度勾配等により、細胞内のカリウムイオン濃度が上昇する。
【０００５】
Ｇタンパク質連動型カリウムイオンチャネル（ＧＩＲＫ）としては、ＧＩＲＫ１〜４の４種類が知られている。ここで、Ｇタンパク質連動型カリウムイオンチャネル（ＧＩＲＫ）は、内向き整流性カリウムチャネル（Ｋｉｒ）の１種でＫｉｒの方が一般的であるから、本明細書ではＧＩＲＫ４をＫｉｒ３．４として表記する。非特許文献２には、Ｋｉｒ３．１の１３７番目のフェニルアラニン（Ｆ）をセリン（Ｓ）に置換したＧタンパク質連動型カリウムイオンチャネル（＝Ｋｉｒ３．１（Ｆ１３７Ｓ））またはＫｉｒ３．４の１４３番目のセリン（Ｓ）をスレオニン（Ｔ）に置換したＧタンパク質連動型カリウムイオンチャネル（＝Ｋｉｒ３．４（Ｓ１４３Ｔ））、アセチルコリン受容体、および天然Ｇタンパク質を脂質二重膜上に分散させ、アセチルコリンが受容体と結合することによる脂質二重膜内外のカリウムイオン濃度の変化を電気的に測定することが開示されている。
【０００６】
また、特許文献４には、Ｍ２ムスカリン受容体を発現するＨＥＫ細胞に、Ｋｉｒ３．１、Ｋｉｒ３．４およびＧタンパク質のもととなるｐｃＤＮＡ−Ｇαｉ、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｓ、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｑのいずれかを組み込み、アセチルコリンが受容体と結合することによってカリウムイオン濃度の変化を電気的に測定することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許３７７２１８８号公報
【特許文献２】特表２００１−５０１０９７号公報
【特許文献３】特表２００６−５２６９８２号公報
【特許文献４】特表２００７−５２５１７０号公報（特に[０２４５]〜[０２４９]）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J.L. Leaney et al., The G protein α subunit has a key role in determining the specificity of coupling to, but not the activation of, G protein-gated inwardly rectifying K+ channels. J. Biol. Chem. 275(2): 921-929 (2000).
【非特許文献２】Michel Vivaudouu et al,"Probing the G-Protein Regulation of GIRK1 and GIRK4, the Two Subunits of the Kach Channel, Using Functional Homomeric Mutants", Jounal of Biological Chemistry, Vol.272, No.50, pp.31553-31560, (1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１や特許文献２に開示されている化学物質の検出方法は、内因性シグナルパスウエーを発生させるために必要な膜タンパク質が複数存在し、受容体と膜タンパクを同時に細胞膜上に発現させることが困難であるという課題を有している。また、非特許文献２に開示されている方法で得られるアセチルコリン受容体、Ｇタンパク質連動型カリウムイオンチャネル、およびＧタンパク質を分散させた脂質二重膜も、化学物質に対する検出感度は充分とは言えない。
【００１０】
本発明は、上記従来の課題を解決するものであり、化学物質を検出するために必要最小限の膜タンパクを細胞膜上に同時に発現させることにより、従来よりも効率よく化学物質を検出することを可能とする方法、そのような方法に使用する細胞、およびそのような方法に使用する脂質二重膜の産生方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、化学物質受容体と、Ｇタンパク質連動型カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．４の１４３番目のセリンをスレオニンに改変した改変型カリウムイオンチャネル（Ｋｉｒ３．４（Ｓ１４３Ｔ））と、Ｇタンパク質を発現させるプラスミドと、を株化細胞の脂質二重膜に共発現させ、この脂質二重膜内外のイオン電流を測定することにより、特定の化学物質を感度よく検知可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
具体的に、本発明は、
化学物質受容体を発現させるプラスミドと、
Ｇタンパク質連動型カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．４のうち、１４３番目のセリンをスレオニンに改変した改変型カリウムイオンチャネルを発現させるプラスミドと、
Ｇタンパク質を発現させるプラスミドと、
を調製する工程と、
調製された３種類のプラスミドを混合して株化細胞に導入する工程と、
を有する、
前記化学物質受容体と、
前記改変型カリウムイオンチャネルと、
前記Ｇタンパク質と、
を共発現させた脂質二重膜の産生方法に関する。
【００１３】
また、本発明は、
化学物質を検知可能とする方法であって、
化学物質受容体と、
Ｇタンパク質連動型カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．４の１４３番目のセリンをスレオニンに改変した改変型カリウムイオンチャネルと、
Ｇタンパク質と、
を株化細胞の脂質二重膜に共発現させ、
カリウムイオンの株化細胞内への流入によって発生する電流変化を測定することにより、前記化学物質を検知可能とする方法に関する。
【００１４】
また、本発明は、
化学物質受容体と、
Ｇタンパク質連動型カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．４の１４３番目のセリンをスレオニンに改変した改変型カリウムイオンチャネルと、
Ｇタンパク質と、
を脂質二重膜に共発現させた細胞であって、
前記化学物質受容体は、化学物質が結合したときに、Ｇタンパク質のサブユニットを放出し、
前記改変型カリウムイオンチャネルは、放出されたＧタンパク質のサブユニットと結合したときに、細胞外のカリウムイオンを細胞内へと輸送する、細胞に関する。
【００１５】
また、本発明は、
脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する方法であって、
前記脂質二重膜は、化学物質受容体と、Ｇタンパク質連動型カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．４の１４３番目のセリンをスレオニンに改変した改変型カリウムイオンチャネルと、Ｇタンパク質とを具備しており、
前記脂質二重膜は、表側にカリウムイオンを有しており、
前記方法は、
化学物質を前記脂質二重膜の表側から供給し、前記化学物質受容体にＧタンパク質のサブユニットを放出させ、前記放出されたＧタンパク質のサブユニットが前記改変型カリウムイオンチャネルに結合することによって前記脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する工程、
を有する、方法に関する。
【００１６】
また、本発明は、
脂質二重膜を用いて化学物質を検知または定量する方法であって、
前記脂質二重膜は、化学物質受容体と、Ｇタンパク質連動型カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．４の１４３番目のセリンをスレオニンに改変した改変型カリウムイオンチャネルと、Ｇタンパク質とを具備しており、
前記脂質二重膜は、表側にカリウムイオンを有しており、
前記方法は、
前記脂質二重膜の表側にカリウムイオンを有する溶液を供給する工程、
検知または定量される化学物質を前記脂質二重膜の表側からさらに供給し、前記化学物質受容体にＧタンパク質のサブユニットを放出させ、前記放出されたＧタンパク質のサブユニットが前記改変型カリウムイオンチャネルに結合することによって前記脂質二重膜の表側から裏側にカリウムイオンを輸送する工程、
前記脂質二重膜の裏側に輸送されたカリウムイオンの濃度の変化を測定する工程、
前記カリウムイオンの濃度の変化に基づいて前記化学物質を検知または定量する工程
を有する、方法に関する。
【００１７】
前記Ｇタンパク質は、前記化学物質受容体と前記改変型カリウムイオンチャネルそれぞれと高親和性を持つように設計されたキメラＧタンパク質であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、目的の化学物質を高感度、かつ、高精度に検出することができる。また、本発明によれば、目的とする化学物質を検知するための脂質二重膜を容易に産生することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】細胞表面の脂質二重膜における、化学物質の存在によるカリウムイオンの細胞内への輸送を説明する概念図である。
【図２】本発明の実施の形態１における、化学物質の存在によるカリウムイオンの細胞内への輸送を説明する概念図である。
【図３】本発明の実施の形態２における、化学物質の存在によるカリウムイオンの細胞内への輸送を説明する概念図である。
【図４】化学物質受容体、改変型カリウムイオンチャンネル、およびキメラＧタンパク質を株化細胞に共発現させる方法の基本原理を説明する概念図である。
【図５】実施例および比較例１のＨＥＫ２９３細胞について、イソプロテレノールによるイオン電流の変化を示すグラフである。
【図６】実施例、比較例２および比較例３のＨＥＫ２９３細胞について、イソプロテレノールによるイオン電流の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下本発明の実施の形態について、適宜図面を参照しながら説明する。
【００２１】
（実施の形態１）
図２は、本発明の実施の形態１における、化学物質の存在によるカリウムイオンの細胞内への輸送を説明する概念図である。図１との相違点は、カリウムイオンチャンネルが、Ｇタンパク質連動型カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．４のうち、１４３番目のセリンをスレオニンに改変したカリウムイオンチャネル１１０（Ｋｉｒ３．４（Ｓ１４３Ｔ））であることである。
【００２２】
通常、カリウムチャネルは２種類のタンパク質から構成されるヘテロマーであり、従来技術（非特許文献１）ではヘテロマーをカリウムイオンチャネルとして使用している。しかしながら、改変型カリウムイオンチャネル１１０では、１種類のタンパク質によって有効なイオンチャネルが構成されている。
【００２３】
また、図２において、改変型カリウムイオンチャネル１１０は、化学物質受容体１０１とＧタンパク質１０６と有機的に関連してシグナルパスウエーを構成している。目的となる化学物質１０３が化学物質受容体１０１に結合すると、Ｇタンパク質１０６が活性化されてＧＤＰ１０７をＧＴＰに置換し、改変型カリウムイオンチャネル１１０のチャネル部を開口させて、カリウムイオン１０４が細胞内に流入する。カリウムイオン１０４の流入によって発生する電流変化を測定すれば、化学物質１０３の有無を検出することが可能となる。
【００２４】
カリウムイオンチャンネルとして改変型カリウムイオンチャンネル１１０を用いることにすれば、細胞表面（脂質二重膜）に発現させる膜タンパク質が３種類しか必要でないため、効率よく細胞膜上に発現させることができる。
【００２５】
（実施の形態２）
図３は、本発明の実施の形態２における、化学物質の存在によるカリウムイオンの細胞内への輸送を説明する概念図である。図２との相違点は、Ｇタンパク質が化学物質受容体１０１と改変型カリウムイオンチャネル１１０それぞれと高親和性を持つように設計されたキメラＧタンパク質４１１であることである。キメラＧタンパク質４１１は、化学物質受容体高親和性部位４１２を有する。
【００２６】
キメラＧタンパク質４１１には、化学物質受容体１０１および改変型カリウムイオンチャネル１１０の双方に高親和性がある部位（化学物質受容体高親和性部位４１２）が存在するため、より協調されたシグナルパスウエーが期待できるため、効率のよい検出を行うことが可能となる。
【００２７】
なお、化学物質受容体１０１は、ホルモン受容体であっても良い。また、神経伝達物質受容体、フェロモン受容体、嗅覚受容体や味覚受容体であっても良い。
【００２８】
［実施例］
次に、本発明の実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００２９】
（基本原理）
化学物質受容体、改変型カリウムイオンチャンネル（Ｋｉｒ３．４（Ｓ１４３Ｔ））、およびキメラＧタンパク質を株化細胞の表面（脂質二重膜）に共発現させる方法の基本原理を、図４に示す。なお、図４では、化学物質受容体としてβ１アドレナリン受容体を発現させている。
【００３０】
それぞれの膜タンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅し、それをクローニングする。そして、それぞれの膜タンパク質をコードするｃＤＮＡを組み込んだ発現プラスミドを調製する。次に、３種類の発現プラスミドをベクターとして株化細胞（ＨＥＫ２９３）内へ導入することにより、株化細胞表面の脂質二重膜に、３種類の膜タンパク質を共発現させる。
【００３１】
株化細胞の１つであるＨＥＫ２９３細胞に、次に示す方法で構築した発現プラスミド３種類を導入し、化学物質受容体、改変型カリウムイオンチャンネル、およびキメラＧタンパク質を共発現させた。
【００３２】
＜１．改変型カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．４（Ｓ１４３Ｔ）の発現プラスミド作成＞
改変型カリウムイオンチャンネルＫｉｒ３．４（Ｓ１４３Ｔ）は、内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ３．４を部分的に変異させて構築した。ラット内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ３．４（ｒＫｉｒ３．４）は、ラット心臓由来のＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いて２断片に分けて増幅した。プライマーはそれぞれrat-Kir3.4(+)115（配列番号１）とrat-Kir3.4(-)981（配列番号２）、rat-Kir3.4(+)815（配列番号３）とrat-Kir3.4(-)1472（配列番号４）を用いた。
【００３３】
得られた断片はクローニングベクターにサブクローニングした。変異の導入は、Nhe-Kz-rKir3.4(+)1（配列番号５）、rKir3.4(-)620(A603T)（配列番号６）、rKir3.4(+)604（配列番号７）、rKir3.4(-)981（配列番号２）を用いてオーバーラップ・エクステンション法によって行った。得られた断片はクローニングベクターにサブクローニングした。それらをそれぞれNheIとEcoRI、EcoRIとXhoIで処理し、あらかじめNheIとXhoIで処理した発現ベクターにライゲーションし、発現プラスミドplasmid(rKir3.4(S143T))を得た。
【００３４】
＜２．β１アドレナリン受容体(rβ1R)の発現プラスミド作成＞
ラット心臓由来のＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いて２断片に分けて増幅した。プライマーはそれぞれrat-beta1(+)1（配列番号１６）とrat-beta1(-)1050（配列番号１７）、rat-beta1(+)941（配列番号１８）とrat-beta1(-)1401（配列番号１９）を用いた。得られた断片は、それぞれクローニングベクターにサブクローニングした。得られた２つのベクターを鋳型にして、さらにＰＣＲ反応を行った。プライマーはそれぞれEcoRI-Kz-rat-beta1(+)1（配列番号２０）とrat-beta1(-)1050（配列番号１７）、rat-beta1(+)941（配列番号１８）とrat-beta1(-)term-Sal（配列番号２１）を用いた。
【００３５】
得られた２つの断片は、クローニングベクターにサブクローニングした。それらクローニングベクターを、それぞれEcoRIとHindIII、HindIIIとSalIで処理し、あらかじめEcoRIとSalIで処理した発現ベクターにライゲーションし、β１アドレナリン受容体発現プラスミドplasmid(rβ1R)を得た。
【００３６】
＜３．キメラＧタンパク質の発現プラスミド作成＞
改変型カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．４（Ｓ１４３Ｔ）とβ１アドレナリン受容体(rβ1R)の両方に高親和性を持つように変異を導入したキメラＧタンパク質を発現させるプラスミドを作成した。
【００３７】
マウス脾臓由来のＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いて２断片に分けて増幅した。そして、クローニングしてきたＧｉタンパク質のｃＤＮＡに変異を導入した。Ｇｉタンパク質のクローニングの際のプライマーは、それぞれmGi(+)111（配列番号８）とmGi(-)994（配列番号９）、mGi(+)685（配列番号１０）とmGi(-)1445（配列番号１１）を用いた。
【００３８】
得られた２つの断片は、クローニングベクターにサブクローニングした。得られた２つのベクターを鋳型とし、さらにＰＣＲ反応により変異導入を行った。プライマーは、それぞれEco-Kz-mGi(+)1（配列番号１２）とmGi(-)cDNA640（配列番号１４）、mGi(+)cDNA628（配列番号１３）とmGi-Gs13(-)term（配列番号１５）を用いた。得られた断片は、それぞれクローニングベクターにサブクローニングした。それらクローニングベクターを、それぞれEcoRIとBamHI、BamHIとEcoRIで処理し、あらかじめEcoRIで処理した発現ベクターにライゲーションし、発現プラスミドplasmid(Gi/s13)を得た。
【００３９】
＜４．ＨＥＫ２９３細胞への発現プラスミド導入＞
10％ＦＢＳ（インビトロジェン）、30units/mLペニシリン（明治製菓）、30mg/mL硫酸スプレプトマイシン（明治製菓）を含むＤＭＥＭ培地（インビトロジェン）中で培養したＨＥＫ２９３細胞に、上述した改変型カリウムチャネル発現プラスミドplasmid(rKir3.4(S143T))、β１アドレナリン受容体発現プラスミドplasmid(rβ1R)、およびキメラＧタンパク質発現プラスミドplasmid(Gi/s13)を同時に導入した。３種類の発現プラスミド導入の24〜48時間後に、後述するカリウムイオンの株化細胞内への流入によって発生する電流変化を測定した。
【００４０】
なお、表１に実験１で使用したプライマーの塩基配列を示す。
【００４１】
【表１】
2012228181.tif 000003
【００４２】
［比較例１］
実施例で作成した３種類の膜タンパク質を共発現させた細胞表面の脂質二重膜との比較のため、非特許文献１に示されている方法に従って、改変型カリウムイオンチャネルの代わりに天然カリウムイオンチャネルをＨＥＫ２９３細胞へ導入した。天然カリウムチャネルは２種類のタンパク質のヘテロマーであるため、マウス内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ３．１とＫｉｒ３．２Ａを用いて発現させた。そして、それ以外は実施例と同様にして、β１アドレナリン受容体（ｒβ１Ｒ）、およびキメラＧタンパク質とを共発現させた。
【００４３】
＜天然カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．１（ｍＫｉｒ３．１）またはＫｉｒ３．２Ａ（ｍＫｉｒ３．２Ａ）発現プラスミドの作製＞
非特許文献１に示されている内向き整流性カリウムチャネルは、２種類のカリウムチャネルＫｉｒ３．１とＫｉｒ３．２Ａより構成されている。マウス内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ３．１（ｍＫｉｒ３．１）を作成する発現プラスミドplasmid(mKir3.1)は、実施例と同様の方法で作製した。
【００４４】
マウス内向き整流性カリウムチャネルＫｉｒ３．２Ａ  （ｍＫｉｒ３．２Ａ） は、マウス脳由来のＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いて２断片に分けて増幅した。プライマーは、それぞれmKir3.2A-F417R（配列番号３０）とmKir3.2A-R1317R（配列番号３１）、mKir3.2A-F1079R（配列番号３２）とmKir3.2A-R1843R（配列番号３３）を用いた。得られた断片は、それぞれクローニングベクターにサブクローニングした。
【００４５】
得られた２つのベクターを鋳型にして、さらにＰＣＲ反応を行った。プライマーは、それぞれmKir3.2A-5’_XhoI（配列番号３４）とmKir3.2A-R698_EcoRI（配列番号３５）、mKir3.2A-F687_EcoRI（配列番号３６）とmKir3.2A-3’_NotI（配列番号３７）を用いた。得られた断片は、それぞれクローニングベクターにサブクローニングした。それらクローニングベクターを、それぞれXhoIとEcoRI、EcoRIとNotIで処理し、あらかじめNheIとNotIで処理した発現ベクターにライゲーションし、発現プラスミドplasmid(mKir3.2A)を得た。
【００４６】
なお、表２に比較例で使用したプライマーの配列を示す。
【００４７】
【表２】
2012228181.tif 000004
【００４８】
（カリウムイオン電流の電気生理学的測定）
実施例および比較例で作製したＨＥＫ２９３細胞について、細胞内外で発生するカリウムイオン電流を、パッチ固定法の全細胞膜電位固定様式で測定した。電流の測定には、EPC9パッチクランプ増幅器およびパルスソフトウエア（ヘカ社製）を用いた。電流のパッチピペット電極の内部抵抗は２〜４ＭΩで、次の細胞内溶液を満たした。すなわち、１００ｍＭ  酢酸カリウム、５ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ 塩化マグネシウム、２ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＡＴＰマグネシウム塩、０．０１ｍＭ  ＧＴＰナトリウム塩、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．３）よりなる溶液である。細胞外溶液は１２０ｍＭ  塩化ナトリウム、２０ｍＭ  塩化カリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、２ｍＭ 塩化カルシウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．４）である。
【００４９】
（アドレナリン作用薬によるカリウムイオン電流の変化：１）
膜電位を-90ｍＶに固定した状態で、細胞内に流れ込む電流をモニターしながら、アドレナリン作用薬の１つであるイソプロテレノール（シグマ）のカリウムイオン電流に対する影響を調べた。イソプロテレノールが含まれない細胞外溶液を還流している状態で測定した電流をベースラインとし、その後電磁バルブによって３０ｎＭイソプロテレノールを含む細胞外溶液に置換した時の電流変化を測定した。
【００５０】
図５は、実施例および比較例１の３種類の膜タンパク質を共発現させたＨＥＫ２９３細胞について、イソプロテレノールによるイオン電流の変化を示すグラフである。比較例の場合、イソプロテレノールが含まれていない細胞外溶液を還流した場合では０．９３±０．４１ｎＡ（平均±標準誤差）の電流が流れているのに対し、イソプロテレノール３０ｎＭを含んだ細胞外溶液に置換すると２．２２±０．４６ｎＡへの増加が見られた。一方、実施例の場合では、イソプロテレノールによって０．４２±０．０８ｎＡから３．９３±０．５３ｎＡへと大きくイオン電流が増加する現象が見られた。また、イソプロテレノールの有無での比率をオン・オフ比として計算すると、比較例では２．４倍の変化であるに対し、実施例では９．３倍となった。
【００５１】
以上より、実施例で作製された細胞（脂質二重膜）は、比較例で作製された細胞（脂質二重膜）と比較して、同じ濃度の化学物質に対して大きな電流値の変化を検出することが可能であり、また、オン・オフ比も増大することから、検出感度も顕著に高いことが示された。
【００５２】
［比較例２］
改変型カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．４（Ｓ１４３Ｔ）をさらに改変したＫｉｒ３．４（Ｓ１４３Ｔ、Ｔ１４９Ｓ／Ｋｉｒ３．４の１４３番目のセリンをスレオニン、１４９番目のスレオニンとセリンにそれぞれ置換したもの）を、実施例と同様にしてＨＥＫ２９３細胞の細胞膜上に発現させ、比較例２の細胞とした。Ｋｉｒ３．４（Ｓ１４３Ｔ、Ｔ１４９Ｓ）を発現させるプラスミドは、以下の手順で構築した。
【００５３】
改変型カリウムイオンチャネルの発現プラスミドplasmid(rKir3.4(S143T))を鋳型として、rKir3.4(-)620(A603T)（配列番号３８）とrKir3.4(+)604(A621T)（配列番号３９）を用いたオーバーラップ・エクステンション法により変異を導入し、発現プラスミドplasmid(rKir3.4(S143T))の際と同様の手法により発現プラスミドplasmid(rKir3.4(S143T,T149S))を構築した。
【００５４】
［比較例３］
改変型カリウムイオンチャネルＫｉｒ３．４（Ｓ１４３Ｔ）をさらに改変したＫｉｒ３．４（Ｓ１４３Ｔ、Ｔ１４９Ｓ、Ｇ１７５Ｎ／Ｋｉｒ３．４の１４３番目のセリンをスレオニン、１４９番目のスレオニンとセリン、１７５番目のグリシンをアスパラギンにそれぞれ置換したもの）を、実施例と同様にしてＨＥＫ２９３細胞の細胞膜上に発現させ、比較例３の細胞とした。Ｋｉｒ３．４（Ｓ１４３Ｔ、Ｔ１４９Ｓ、Ｇ１７５Ｎ）を発現させるプラスミドは、以下の手順で構築した。
【００５５】
発現プラスミドplasmid(rKir3.4(S143T,T149S))を鋳型として、rKir3.4(-)731(C699T)（配列番号４０）とrKir3.4(+)701（配列番号４１）を用いたオーバーラップ・エクステンション法により変異を導入し、前記発現プラスミドplasmid(rKir3.4(S143T))の際と同様の手法により発現プラスミドplasmid(rKir3.4(S143T,T149S,G175N))を構築した。
【００５６】
なお、表３に比較例２および３で使用したプライマーの配列を示す。
【表３】
2012228181.tif 000005
【００５７】
（アドレナリン作用薬によるカリウムイオン電流の変化：２）
実施例および比較例１と同様に、イソプロテレノールのカリウムイオン電流に対する影響を調べた。実施例、比較例２、および比較例３のＨＥＫ２９３細胞について、イソプロテレノールに対するイオン電流の変化を比較したグラフを、図６に示す。実施例のＨＥＫ２９３細胞では、イソプロテレノール３０ｎＭによって、検出電流が０．４２±０．０８ｎＡから３．９３±０．５３ｎＡへと大きく変化した。
【００５８】
それに対し、比較例２のＨＥＫ２９３細胞では、検出電流が０．０６±０．０１ｎＡから０．１８±０．０４ｎＡにしか変化しなかった。また、比較例３のＨＥＫ２９３細胞でも、検出電流が０．０６±０．０１ｎＡから０．１９±０．０８ｎＡしか変化せず、Ｋｉｒ３．４（Ｓ１４３Ｔ）以外の改変型カリウムイオンチャネルを使った場合は、検出電流の変化は非常に小さかった。
【００５９】
よって、本発明の方法によって構築された細胞は、類似する改変型カリウムイオンチャネルを発現させた細胞センサよりも、化学物質を高効率に検出可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、標的となる化学物質を高精度、かつ、高感度で検出しうる化学物質センサを実現することが可能である。
【符号の説明】
【００６１】
１０１  化学物質受容体
１０２  天然型カリウムイオンチャネル
１０３  化学物質
１０４  カリウムイオン
１０５  細胞膜
１０６  Ｇタンパク質
１０７  ＧＤＰ
１１０  改変型カリウムイオンチャネル
４１１  Ｇタンパク質（カリウムイオンチャネル高親和性型）
４１２  化学物質受容体高親和性部位
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年4月12日(2010.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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