(57)【要約】      （修正有）【課題】ヌクレアーゼによって細胞を剥離しうる核酸ブラシ、核酸ブラシからなる細胞培養基材の製造方法と、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いない、新たな細胞の剥離方法を提供する。【解決手段】核酸ブラシを固定化した細胞培養基材。前記核酸ブラシ表面で細胞を培養し、トリプシンではなくヌクレアーゼを作用させ、核酸ブラシ部分のみを加水分解することによる細胞の剥離方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸ブラシが固定化された細胞培養基材。
【請求項２】
前記核酸はストレプトアビチン−ビオチン結合、アビチン−ビオチン結合、共有結合、水素結合、配位結合、イオン結合、物理吸着の単独もしくは複合によって細胞培養基材の基底に固定化したことを特徴とする前記１に記載の細胞培養基材。
【請求項３】
前記核酸ブラシがヌクレアーゼによって分解され、固体基板上から切断することができることを特徴とする前記１に記載の細胞培養基材。
【請求項４】
前記のいずれか１項に記載の細胞培養基材を用いる細胞培養方法であって、前記核酸ブラシ表面に細胞を播種、接着させ培養する工程、続いてヌクレアーゼを反応させ、細胞を基板からはがし、回収する工程を含む細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は核酸ブラシの作製と、それを固定化した新規な培養基材、および該細胞培養基材を用いた細胞の培養・回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  再生医療とは細胞移植・組織移植により、これまで不可能であった変性疾患の根治を目指した革新的医療技術である。これにより事故や病気によって失われた体の細胞、組織、器官の再生や機能の回復を促すことが期待される。再生医療には対外で作製した臓器を置換するという治療法と、細胞を移植する治療法が知られており、将来の移植医療は細胞移植へと主眼が移行していくと考えられている。細胞移植の場合、実現の可能性が大きく向上し、大きな手術も必要とはされない、損傷を受けた臓器の細胞やその幹細胞、もしくは損傷を受けた臓器に存在する幹細胞の分化・増殖や血管新生を促進する物質を分泌する細胞を移植するので、注射とか点滴で細胞を体内へ導入するので、患者の負担も低く抑えることが可能である。【０００３】  骨髄間葉系幹細胞を用いたホーミング治療は、脳梗塞患者自身の骨髄幹細胞を培養し、それを静脈投与することにより脳梗塞による運動機能障害や失語症が改善する治療法である。患者の骨髄幹細胞の培養は、ヒトの細胞を扱うことができるＧＭＰ対応細胞調整室で行われた。患者から採取した細胞を通常の細胞培養によって増殖させ細胞数を増やす必要があったが、骨髄幹細胞はタンパク質分解酵素を使った培養した細胞の剥離を伴う継代での生存率は高くなく、効率よく細胞を培養する際の問題であった。【０００４】  きわめて大きな分子量を持つデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は溶媒キャスト法によってフィルム化することが可能である。しかしＤＮＡをキャスティングしただけのＤＮＡフィルムは水溶性であり、用途が限定される。そのためＤＮＡのナトリウム塩とアルキル型４級アンモニウムカチオン性脂質を混合し、不溶性のＤＮＡフィルムを作製する方法が提案された（例えば、特許文献１参照）。ＤＮＡフィルムを細胞培養用の基底膜である細胞培養膜として利用することが検討された。しかし、アルキル型４級アンモニウムカチオン性脂質を用いて作製されたＤＮＡフィルムは抗菌性及び防カビ性を有志、生体適合性がない。そのため従来のＤＮＡフィルムを細胞培養膜として利用することは不可能であった。
特許文献１：特開平８−２３９３９８号広報【０００５】  天然資源であるＤＮＡを利用して、生体親和性のある細胞培養膜を提供するために、カルシウムイオン又はマグネシウムイオンによるイオン架橋、または紫外線照射による化学架橋を行い、細胞培養に対して一定期間のみ不溶性にした方法が提案された（例えば、特許文献２参照）。イオン架橋、化学架橋したＤＮＡはヌクレアーゼによる加水分解は不可能である。また、イオン架橋したＤＮＡは３日以内に徐々に細胞培養液に溶けてしまい、長期培養には不向きである。
特許文献２：国際公開第２００８／１５３０６３（ＷＯ，Ａ１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  従来、継代によって培養した細胞を培養基材から剥離する際に、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いているが、タンパク質分解酵素であるトリプシンは細胞の接着性タンパク質を分解するだけでなく、細胞表層にあるタンパク質も加水分解してしまうため、細胞そのものにダメージを与える。ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞においては通常の継代のときの生存率は数パーセントとかなり小さいことが知られている。そこで、細胞表層のタンパク質を分解しない細胞の剥離技術の開発が求められていた。本発明は、ヌクレアーゼによって細胞を剥離しうる核酸ブラシ、核酸ブラシからなる細胞培養基材の製造方法と細胞の剥離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明者らは、上記課題を解決するために、トリプシンを用いない剥離法として核酸ブラシを固定化した培養基材を考えた。核酸ブラシ表面で細胞を培養し、トリプシンではなくヌクレアーゼを作用させ、核酸ブラシ部分のみを加水分解することにより、容易に細胞を剥離することが可能になる。細胞表層には核酸は提示されていないことからヌクレアーゼが細胞にダメージを与えることは無いと期待され、高い生存率が得られる。【０００８】  本発明は、以下の構成により達成される。
１．核酸ブラシが固定化された細胞培養基材。
２．前記核酸ブラシが１本鎖、２本鎖、３本鎖、４本鎖を特徴とする前記１に記載の細胞    培養基材。
３．前記核酸ブラシがストレプトアビチン−ビオチン結合、アビチン−ビオチン結合、共    有結合、水素結合、配位結合、イオン結合、物理吸着の単独もしくは複合によって細    胞培養基材の基底に固定化したことを特徴とする前記１に記載の細胞培養基材。
４．前記核酸ブラシに細胞の接着性を向上することを目的とした細胞接着性ペプチド、コ    レステロール、カルキシル基、アミノ基などを有することを特徴とする前記１に記載    の細胞培養基材。
５．前記核酸ブラシ表面に細胞の接着性を向上することを目的としたコラーゲン、ポリリ    シン、ゼラチン、フィブロネクチンなどをコートしたことを特徴とする前記１に記載    の細胞培養基材。
６．前記核酸ブラシがヌクレアーゼによって分解され、固体基板上から切断することがで    きることを特徴とする前記１に記載の細胞培養基材。
７．前記のいずれか１項に記載の細胞培養基材を用いる細胞培養方法であって、前記核酸    ブラシ表面に細胞を播種、接着させ培養する工程、続いてヌクレアーゼを反応させ、    細胞を基板からはがし、回収する工程を含む細胞培養方法。
【発明の効果】
【０００９】  本発明によれば、継代の際に細胞にダメージを与えない新規培養基材を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施例１における３３量体からなる核酸ブラシ上でのＨｅＬａ細胞の培養写真である。（ａ）ＨｅＬａ細胞播種から７２時間後の写真、（ｂ）酵素反応により核酸ブラシを切断し、細胞を剥離した後の培養基材の写真、（ｃ）剥離したＨｅＬａ細胞を再播種した３５ｍｍディッシュの写真。
【図２】本発明の実施例２における３３量体とその相補鎖からなる核酸ブラシ上でのＨｅＬａ細胞の培養写真である。（ａ）ＨｅＬａ細胞播種から７２時間後の写真、（ｂ）酵素反応により核酸ブラシを切断し、細胞を剥離した後の培養基材の写真、（ｃ）剥離したＨｅＬａ細胞を再播種した３５ｍｍディッシュの写真。
【図３】本発明の実施例３における３３量体とコレステロール修飾されたその相補鎖からなる核酸ブラシ上でのＨｅＬａ細胞の培養写真である。（ａ）ＨｅＬａ細胞播種から７２時間後の写真、（ｂ）酵素反応により核酸ブラシを切断し、細胞を剥離した後の培養基材の写真、（ｃ）剥離したＨｅＬａ細胞を再播種した３５ｍｍディッシュの写真。
【図４】本発明の実施例４における３３量体からなる核酸ブラシ上にコラーゲンコートした培養基材上でのＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養写真である。（ａ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞播種から４８時間後の写真、（ｂ）酵素反応により核酸ブラシを切断し、細胞を剥離した後の培養基材の写真、（ｃ）剥離したＮＩＨ３Ｔ３細胞を再播種した３５ｍｍディッシュの写真。
【発明を実施するための最良な形態】
【００１１】  以下本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１２】  本発明の細胞培養基材は固定化した核酸ブラシを細胞培養の足場材として用いるものであって、細胞へのダメージがトリプシンよりも少ないヌクレアーゼにより核酸を切断することができることを特徴としている。以下、本発明をさらに詳しく説明する。
【００１３】（核酸）
本発明で使用される核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の末端にビオチンが修飾されたものである。これの代わりにリボ核酸（ＲＮＡ）を用いてもよい。
【００１４】（培養基材の作製）
本発明の培養基材の作製では、基板上のストレプトアビジンに前記のビオチン修飾されたＤＮＡを結合させることで核酸ブラシを用いる。ＤＮＡの長さは３量体以上２０００００量体以下であれば、塩基配列、１本鎖、２本鎖、３本鎖、４本鎖に限定されない。ＤＮＡの固定化の密度は１．０×１０５分子／ｃｍ２以上１．０×１０１４分子／ｃｍ２以下であれば特に限定されない。
【００１５】  用いる基板はストレプトアビジンコートされた９６穴プレート等を用いる。ただし表面にストレプトアビジンが固定化されていれば、その素材や形状は特に限定されるものではない。
【００１６】（細胞の培養方法）
得られた培養基材に細胞を播種する場合には、洗浄を行ったのち培地を入れ、細胞を播種し、３７℃で所定時間培養する。
【００１７】  洗浄は細胞培養で用いるＰＢＳ溶液を用いる。ただし細胞腫によるので特に限定されるわけではない。
【００１８】（細胞の剥離方法）
本発明の培養基材からＤＮＡヌクレアーゼを用いて細胞を剥離し、回収、再播種する方法について説明する。
【００１９】  培養基材での細胞の培地を洗い流し、ＤＮＡヌクレアーゼを３７℃で反応させ、細胞を基材からはがす。
【００２０】  ＤＮＡヌクレアーゼはＤＮＡをランダムに加水分解し、ＤＮＡを断片化する。少量で十分に反応し、長時間反応させることでほぼすべてのＤＮＡが分解し細胞がより多く回収することができる。
【００２１】  トリプシンを用いないことで、細胞にダメージを与えない。
【００２２】  回収した細胞を再播種し、再び３７℃で所定時間培養する。
【００２３】  細胞の活性については、例えば、損傷細胞から出る乳酸脱水酵素活性を測定することで、細胞障害性や細胞死を定量することができる。
【実施例】
【００２４】  以下、本発明の実施例によりさらに具体的に説明する。【００２５】製造例１
ストレプトアビジンコートの９６穴プレートＲｅａｃｔｉ−ＢｉｎｄＴＭ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ｃｏａｔｅｄ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ（ＰＩＥＲＣＥ）と、５’−ビオチン修飾ＤＮＡ（５’−ｂｉｏｔｉｎ−（ＧＴＣＣＴ）２ＣＧＡ（ＧＴＣＣＴ）２ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−３’（３３ｍｅｒ））（システムサイエンス）１０−７Ｍを用いて、バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．２Ｍ  ＮａＣｌ）中で３０分反応させた。反応後バッファーで洗浄し、核酸ブラシを作製した。【００２６】製造例２
製造例１において、５’−ビオチン修飾ＤＮＡ（５’−ｂｉｏｔｉｎ−（ＧＴＣＣＴ）２ＣＧＡ（ＧＴＣＣＴ）２ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−３’（３３ｍｅｒ））（システムサイエンス）と相補鎖ＤＮＡ（５’−ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ−３’（１０ｍｅｒ）（システムサイエンス）の等モル量を用いて核酸ブラシを得た。【００２７】製造例３
製造例１において、５’−ビオチン修飾ＤＮＡ（５’−ｂｉｏｔｉｎ−（ＧＴＣＣＴ）２ＣＧＡ（ＧＴＣＣＴ）２ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−３’（３３ｍｅｒ））（システムサイエンス）と５’−コレステロール基修飾ＤＮＡ（５’−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ−３’（１０ｍｅｒ）（システムサイエンス）の等モル量を用いて核酸ブラシを得た。【００２８】製造例４
製造例１において、得られた核酸ブラシ上をコラーゲンでコートして核酸ブラシを得た。【００２９】実施例１
製造例１で得られた培養基材にＨｅＬａ細胞を３０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、７２時間培養した。
このとき用いた培地はＤＵＬＢＥＣＣＯ’Ｓ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＥＡＧＬＥ’Ｓ  ＭＥＤＩＵＭ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）を用いた。２４時間ごとに観察を行い、培養後、ＤＮＡヌクレアーゼであるＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（ＴａＫａＲａ）を反応させ、培養基材上の核酸ブラシを切断し、細胞を剥離した。回収後、３５ｍｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ）に再播種し、同様に４８時間後に観察を行った。【００３０】  製造例１で得られた培養基材にＨｅＬａ細胞を播種したところ、核酸ブラシ上に細胞が接着し、増殖が確認できた。また、培養後のヌクレアーゼ反応ではほぼすべての細胞が剥離し、かつ剥離した細胞の生存が確かめられた。【００３１】実施例２
実施例１において製造例２で得られた培養基材にＨｅＬａ細胞を播種し、７２時間培養した。
前記同様に観察を行い、核酸ブラシ上に細胞が接着し、増殖が確認できた。ＤＮＡヌクレアーゼ反応ではほぼすべての細胞が剥離した。回収した細胞を再播種し、４８時間後に再び観察し細胞の生存が確かめられた。【００３２】実施例３
実施例１において製造例３で得られた培養基材にＨｅＬａ細胞を播種し、７２時間培養した。
前記同様に観察を行い、核酸ブラシ上に細胞が接着し、増殖が確認できた。核酸ブラシが修飾されていても同様な結果が得られた。ＤＮＡヌクレアーゼ反応ではほぼすべての細胞が剥離し、回収した細胞を再播種、４８時間後に再び観察し細胞の生存が確かめられた。【００３３】実施例４
実施例１において製造例４で得られた培養基材にＮＩＨ３Ｔ３細胞を３０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、４８時間培養した。前記同様に観察を行い、核酸ブラシ上に細胞が接着し、増殖が確認できた。核酸ブラシ上にコートした基材でも前記同様の結果が得られ、また細胞腫が異なっていても接着、増殖したことが確認された。ＤＮＡヌクレアーゼ反応ではほぼすべての細胞が剥離した。回収した細胞を再播種し、４８時間後に再び観察し細胞の生存が確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【００３４】  本発明は培養基材を変えるだけで従来のトリプシン処理と同程度の作業で細胞を剥離することができるという点で革新的である。トリプシンではダメージを受けていた細胞腫でも、本酵素を用いることで高生存率となり、今後の再生医学の発展に画期的な発明であるといえる。【００３５】  本発明の培養基材を用いることで、光化学反応による選択的な細胞剥離が可能となる。
例えば培養基材に部分的に光を照射することで、その部分のみの細胞が回収することができ、１細胞の遺伝子解析等の医療分野への応用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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