(57)【要約】【課題】未分化細胞の製造方法の提供。【解決手段】拘束された細胞を含む細胞群におけるＣＤ３４＋細胞の相対数を増加させる方法であって、（ｉ）該細胞群を、該拘束された細胞に操作可能に密着する薬剤と接触させること、ここで、該薬剤は、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、ＣＤ４分子、ＣＤ８分子、Ｔ−細胞受容体の一部もしくは全部、リガンド（固定化または遊離）、ペプチド、Ｔ−細胞受容体（ＴＣＲ）、抗体、交差反応性抗体、モノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体からなる群から選択される；および（ｉｉ）該薬剤と密着した拘束された細胞をインキュベートして、該密着の結果としてＣＤ３４＋細胞の相対数を増加させることを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
拘束された細胞を含む細胞群におけるＣＤ３４＋細胞の相対数をイン・ビトロで増加させる方法であって、
（ｉ）該細胞群を、該拘束された細胞に操作可能に密着する薬剤と接触させるステップであって、該密着は、前記拘束された細胞の表面上で、抗原の捕捉、認識または提供を媒介する受容体を密着することを含み、該受容体はＭＨＣクラスＩ抗原またはＭＨＣクラスＩＩ抗原であるステップと、
（ｉｉ）該薬剤と密着した拘束された細胞をインキュベートして、該密着の結果としてＣＤ３４＋細胞の相対数を増加させるステップと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未分化細胞の製造方法に関する。
【０００２】
特に、本発明は、より拘束された細胞（ｍｏｒｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｃｅｌｌ）からの未分化細胞の製造方法に関する。
【０００３】
さらに本発明は、新しいより拘束された細胞、すなわち、再拘束細胞（ｒｅｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｃｅｌｌ）の製造のための本発明の未分化細胞の使用に関する。
【０００４】
本発明は、また、免疫学的症状または疾患に関連する症状の緩和または免疫学的症状または疾患からの部分的もしくは完全な治療などの免疫系に対して（直接的に、または、それから得られる生成物の使用を介して間接的に）効果を有するための本発明の未分化細胞または本発明の再拘束細胞の使用にも関する。
【背景技術】
【０００５】
概論として、分化は、細胞の構造および機能が段々に拘束されて、例えばＴ細胞またはＢ細胞の形成のようにより特殊化された細胞を生じるプロセスである。したがって、細胞がより拘束されると、該細胞は、さらに分化される。
【０００６】
対照的に、逆分化（ｒｅｔｒｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）は、細胞の構造および機能があまり特殊化されていない細胞を生じるように段々に変えられるプロセスである。
【０００７】
未分化細胞は、多系譜（ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ）分化能を有する。すなわち、該未分化細胞は、２つ以上のタイプの特殊化された細胞に分化する能力を有する。未分化細胞の典型的な例は、幹細胞である。
【０００８】
対照的に、分化細胞は、多系譜分化能を有しない。分化細胞の典型的な例は、Ｔ細胞である。
【０００９】
多くの未分化細胞および分化細胞がイン・ビボで見られ、一般的な技術は、それらについての一般的な教示を充分にもっている。
【００１０】
例証として、とりわけ、ＬｅｖｉｔｔおよびＭｅｒｔｅｌｓｍａｎ １９９５（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃにより発行されたＨａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， 特に第４５−５９頁）（非特許文献１）およびＲｏｉｔｔら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｒｏｉｔｔ， Ｂｒｏｓｔｏｆｆ および Ｍａｌｅ 編 １９９６， Ｐｕｂｌ． Ｍｏｓｂｙ， 特に第１０章）（非特許文献２）が引用される。
【００１１】
しかしながら、要するに、未分化細胞の例としては、リンパ造血前駆細胞（ｌｙｍｐｈｏｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）（ＬＰＣ）が挙げられる。ＬＰＣとしては、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、リンパ系幹細胞（ＬＳＣ）および骨髄性幹細胞（ＭＳＣ）が挙げられる。ＬＳＣおよびＭＳＣは、各々、ＰＳＣの分化により形成される。したがって、ＬＳＣおよびＭＳＣは、ＰＳＣよりも拘束されている。
【００１２】
分化細胞の例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄巨核球、単球、赤血球、顆粒球、マスト細胞およびリンパ球が挙げられる。
【００１３】
Ｔ細胞およびＢ細胞は、ＬＳＣの分化により形成される。したがって、Ｔ細胞およびＢ細胞は、ＬＳＣよりも拘束されている。
【００１４】
好酸球、好塩基球、好中球、骨髄巨核球、単球、赤血球、顆粒球、マスト細胞、ＮＫおよびリンパ球は、ＭＳＣの分化により形成される。したがって、これらの細胞の各々は、ＭＳＣよりも拘束されている。
【００１５】
抗原は、未分化細胞および分化細胞と関連している。ここでは、「関連する」なる用語は、各々の抗原を発現するかもしくは発現する能力を有する細胞、または各々の抗原を提供するかもしくは提供させる能力を有する細胞、または各々の抗原からなる細胞を意味する。
【００１６】
ほとんどの未分化細胞および分化細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原および／またはクラスＩＩ抗原からなる。これらの抗原がこれらの細胞と関連している場合、それらは、クラスＩ＋および／またはクラスＩＩ＋細胞と呼ばれる。
【００１７】
未分化細胞または分化細胞と関連する各々の特異的抗原は、マーカーとして作用することができる。したがって、種々のタイプの細胞を、それらの関連する特定の抗原に基づいて、または、関連抗原の特定の組合せに基づいて、お互いに区別することができる。
【００１８】
これらのマーカー抗原の例としては、抗原ＣＤ３４、ＣＤ１９およびＣＤ３が挙げられる。これらの抗原が存在する場合、これらの個々の細胞は、各々、ＣＤ３４＋、ＣＤ１９＋およびＣＤ３＋細胞と呼ばれる。これらの抗原が存在しない場合、これらの細胞は、各々、ＣＤ３４−、ＣＤ１９−およびＣＤ３−細胞と呼ばれる。
【００１９】
より詳しくは、ＰＳＣは、ＣＤ３４＋細胞である。ＬＳＣは、ＤＲ＋、ＣＤ３４＋およびＴｄＴ＋細胞である。ＭＳＣは、ＣＤ３４＋、ＤＲ＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ７＋およびＴｄＴ＋細胞である。Ｂ細胞は、ＣＤ１９＋、ＣＤ２１＋、ＣＤ２２＋およびＤＲ＋細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ２＋、ＣＤ３＋、およびＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞である。未熟リンパ球は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞である。活性化Ｔ細胞は、ＤＲ＋細胞である。ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）は、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６＋細胞である。Ｔリンパ球は、ＣＤ７＋細胞である。白血球は、ＣＤ４５＋細胞である。顆粒球は、ＣＤ１３＋およびＣＤ３３＋細胞である。単球マクロファージ細胞は、ＣＤ１４＋およびＤＲ＋細胞である。
【００２０】
したがって、前記抗原マーカーの存在について検索することにより、ある種の細胞タイプ（例えば、細胞が未分化細胞であるか分化細胞であるか）およびその細胞タイプの特殊化（例えば、細胞がＴ細胞であるかＢ細胞であるか）を同定することが可能である。
【００２１】
逆分化の一般的概念は、新しくない。実際、１９７６年に、Ｊｏｓｅ Ｕｒｉｅｌ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６， ４２６９−４２７５， １９７６年１１月）（非特許文献３）は、このトピックについての評論を開示している；すなわち：
「逆分化は、変化した病因（物理的、化学的およびウイルス性）の有害因子に対する細胞完全性の維持について一般的な適応プロセスとして明白である。そのゲノム上でコードされている情報全体を保存すると同時に、逆分化を受けている細胞は、細胞質構造の自己遺伝子欠損のプロセスおよび遺伝子発現のより幼若なパターンへの移行により形態学的および機能的複雑さを失う。これにより、初めから異なる細胞表現型の漸進性均一化、および成人細胞において操作的な調節シグナルに対する応答性の減少が生じる。逆分化は、通常、復帰突然変異（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）が始まった、終末表現型を回復させようとする再個体発生のプロセスにより相殺される。これは、逆分化が常に細胞再生および組織修復に関連している理由を説明している。」
【００２２】
Ｕｒｉｅｌ（同書）（非特許文献３）は、次いで、報告された逆分化のケース、例えば、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）のオタマジャクシの消化管内皮細胞からの核に関連するＧｕｒｄｏｎの研究（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ［１９６６］ 第４巻，第１−４３頁． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ａｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅ および Ｂｒａｃｈｅｒ 編）（非特許文献４）、および肝臓の再生に関連するＢｒｅｓｎｉｃｋの研究（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ［１９７１］ 第６巻， 第３４７−３９１頁）（非特許文献５）を続けて検討した。
【００２３】
Ｕｒｉｅｌ（同書）（非特許文献３）は、また、イン・ビトロ培養のための単離された肝実質細胞に関係する研究についても報告した。Ｕｒｉｅｌによると、以下のとおりである：
「胎児もしくは新生児肝実質細胞についての結果、または再生している肝臓もしくは樹立した肝細胞癌からの肝実質細胞についての結果と対照的に、静止している成人肝実質細胞から永久クラス系を得るのは困難であった。」
【００２４】
Ｕｒｉｅｌ（同書）（非特許文献３）は、また、癌における明らかな逆分化についても報告した；すなわち：
「多くの腫瘍の生化学的表現型は、肝発癌現象の前新生物期の間、・・・未熟に向かう復帰突然変異の類似変化を示し、細胞は、逆分化する。」
【００２５】
逆分化についてのより最近の発見としては、Ｍｉｎｏｒｕ Ｆｕｋｕｄａの研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ［１９８１］ 第４１巻， 第４６２１−４６２８頁）（非特許文献６）が挙げられる。Ｆｕｋｕｄａは、腫瘍促進性ホルボールエステル、１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）の使用により、Ｋ５６２ヒト白血病細胞の細胞表面糖タンパク質プロフィルの特異的な変化をひき起こした。Ｆｕｋｕｄａによると、ＴＰＡは、Ｋ５６２ヒト白血病細胞を逆分化段階に誘導すると思われた。
【００２６】
また、Ｈａｓｓら（Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ［１９９１］ 第２巻， 第５４１−５４８頁）（非特許文献７）は、ホルボールエステルの不在下でのＴＰＡ分化したＵ−９３７白血病細胞の３２〜３６日間の長期培養により逆分化のプロセスが生じること、および逆分化した細胞が基質から分離され、増殖を再開したことを報告した。
【００２７】
逆分化の別のケースは、ＣｕｒｔｉｎおよびＳｎｅｌｌの研究（Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ［１９８３］ 第４８巻， 第４９５−５０５頁）（非特許文献８）である。これらの研究者は、ジエチルニトロサミン誘発肝発癌現象の間に生じる酵素的変化および部分肝切除後の肝臓再生を正常な肝臓分化と比較した。これらの研究者は、分化の段階を追っての逆転と似ていた発癌現象の間の酵素活性の変化を見いだした。これらの研究者によると、それらの結果は、基礎をなす逆分化プロセスが肝発癌現象および肝臓再生の両方のプロセスに共通していることを示唆している。
【００２８】
より最近では、Ｃｈａｓｔｒｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ［１９８５］ 第１８８巻， 第２号， 第２８１０−２８１１頁）（非特許文献９）は、ヒト大腸癌性サブクローンＨＴ２９−１８の逆分化について報告した。
【００２９】
さらに最近では、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（Ｌｅｕｋａｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ［１９９４］ 第１８巻， 第１２号， 第９２９−９３３頁）（非特許文献１０）は、リポ多糖類（ＬＰＳ）による処置によりマクロファージ様細胞に分化した単一のラット骨髄単球性白血病細胞由来の逆分化細胞系（ＲＤ−１）の樹立について報告した。
【００３０】
現在の解釈によると、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ． 発行． １９８３）の第９１１頁（非特許文献１１）の第９１１頁およびさらに最近ではＬｅｖｉｔｔおよびＭｅｒｔｅｌｓｍａｎ（非特許文献１）に見られる教示により立証されているように、ＰＳＣのような幹細胞は、以下の４つの特徴を有する：
ｉ．未分化細胞である。すなわち、最終的に分化されない；
ｉｉ．制限なく分割する能力を有する；
ｉｉｉ．前記分化細胞などの分化した子孫を生じる能力を有する；
ｉｖ．分割すると、各々の娘は、選択の自由を有する：その親と同様のＰＳＣとして維持することができるか、または、終末分化に不可逆的に誘導する経路に入ることができる。
最後の資格、すなわち、当該技術分野における一般的な教示によると、未分化細胞は、より拘束された細胞に分化すると、逆分化することができないということを理解すべきである。Ｕｒｉｅｌ（同書）（非特許文献３）、Ｆｕｋｕｎｄａ（同書）（非特許文献６）、Ｈａｓｓら（同書）（非特許文献７）、ＣｕｒｔｉｎおよびＳｎｅｌｌ（同書）（非特許文献８）、Ｃｈａｓｔｒｅら（同書）（非特許文献９）、ならびにＫｏｂａｙａｓｈｉら（同書）（非特許文献１０）は、あるタイプの分化細胞を逆分化したが、これらの細胞が同一系譜に拘束されたままであった場合には、それらは、未分化細胞に逆分化しなかったので、この解釈は、これらの研究者の教示によってさえ支持された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００３１】
【非特許文献１】ＬｅｖｉｔｔおよびＭｅｒｔｅｌｓｍａｎ １９９５（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃにより発行されたＨａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， 特に第４５−５９頁）
【非特許文献２】Ｒｏｉｔｔら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｒｏｉｔｔ， Ｂｒｏｓｔｏｆｆ および Ｍａｌｅ 編 １９９６， Ｐｕｂｌ． Ｍｏｓｂｙ， 特に第１０章）
【非特許文献３】Ｊｏｓｅ Ｕｒｉｅｌ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６， ４２６９−４２７５， １９７６年１１月）
【非特許文献４】Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ［１９６６］ 第４巻，第１−４３頁． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ａｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅ および Ｂｒａｃｈｅｒ 編
【非特許文献５】Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ［１９７１］ 第６巻， 第３４７−３９１頁
【非特許文献６】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ［１９８１］ 第４１巻， 第４６２１−４６２８頁
【非特許文献７】Ｈａｓｓら（Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ［１９９１］ 第２巻， 第５４１−５４８頁）
【非特許文献８】Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ［１９８３］ 第４８巻， 第４９５−５０５頁
【非特許文献９】Ｃｈａｓｔｒｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ［１９８５］ 第１８８巻， 第２号， 第２８１０−２８１１頁）
【非特許文献１０】Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（Ｌｅｕｋａｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ［１９９４］ 第１８巻， 第１２号， 第９２９−９３３頁）
【非特許文献１１】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ． 発行． １９８３）の第９１１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
したがって、本発明以前の技術の状態によると、より拘束された細胞から、幹細胞などの未分化細胞を形成することはできなかったと思われた。しかしながら、本発明は、この確信が誤っており、より拘束された細胞から未分化細胞を形成することができることを示す。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
かくして、第１の態様によると、本発明は、より拘束された細胞を、このより拘束された細胞を未分化細胞に逆分化させる薬剤と接触せさることからなる、未分化細胞の製造方法を提供するものである。
【００３４】
第２の態様によると、本発明は、より拘束された細胞を、このより拘束された細胞を未分化細胞に逆分化させる薬剤と接触させ、次いで、該未分化細胞を再拘束細胞に拘束することからなる方法を提供するものである。
【００３５】
「再拘束細胞」なる用語は、未分化細胞から誘導された細胞、すなわち新しいより拘束された細胞を意味する。
【００３６】
第３の態様によると、本発明は、本発明の方法により生産された未分化細胞を提供するものである。
【００３７】
第４の態様によると、本発明は、医薬としてのまたは医薬の調製における本発明の方法により生産された未分化細胞を提供するものである。
【００３８】
第５の態様によると、本発明は、免疫学的障害または疾患の治療薬の製造における本発明の方法により生産された未分化細胞の使用を提供するものである。
【００３９】
第６の態様によると、本発明は、本発明の方法により生産された再拘束細胞を提供するものである。
【００４０】
第７の態様によると、本発明は、医薬としてのまたは医薬の調製における本発明の方法により生産された再拘束細胞を提供するものである。
【００４１】
第８の態様によると、本発明は、免疫学的障害または疾患の治療薬の製造における本発明の方法により生産された再拘束細胞の使用を提供するものである。
【００４２】
第９の態様によると、本発明は、より拘束された細胞を未分化細胞に逆分化させることができる薬物を付着している、より拘束された細胞を提供するものである。
【００４３】
第１０の態様によると、本発明は、ＣＤ１９＋およびＣＤ３＋細胞を提供するものである。
【００４４】
かくして、最も広い意味では、本発明は、より拘束された細胞から未分化細胞を形成する能力を有するという非常に驚くべき発見に基づいている。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明は、より拘束された細胞から未分化細胞を製造し、次いで、これらの未分化細胞を、障害の治療のためのイン・ビトロもしくはイン・ビボまたはその組合せで薬物として、または、該薬物を調製するために使用することが可能であるので、非常に好都合である。
【００４６】
本発明は、また、初期のより拘束された細胞を修正または除去するために、または、その生成物を修正または除去するために、逆分化により製造された未分化細胞を新しい分化細胞のような再拘束細胞に拘束することができるので、好都合である。
【００４７】
好ましくは、より拘束された細胞は、ＭＨＣクラスＩ＋および／またはＭＨＣクラスＩＩ＋未分化細胞に逆分化する能力を有する。
【００４８】
好ましくは、より拘束された細胞は、幹細胞抗原からなる未分化細胞に逆分化する能力を有する。
【００４９】
好ましくは、より拘束された細胞は、ＣＤ３４＋未分化細胞に逆分化する能力を有する。
【００５０】
好ましくは、より拘束された細胞は、リンパ造血前駆細胞に逆分化する能力を有する。
【００５１】
好ましくは、より拘束された細胞は、多能性幹細胞に逆分化する能力を有する。
【００５２】
未分化細胞は、抗原発現、捕捉または認識に関係がある成分からなってもよい。好ましくは、未分化細胞は、ＭＨＣクラスＩ＋および／またはＭＨＣクラスＩＩ＋細胞である。
【００５３】
好ましくは、未分化細胞は、幹細胞抗原からなる。
【００５４】
好ましくは、未分化細胞は、ＣＤ３４＋未分化細胞である。
【００５５】
好ましくは、未分化細胞は、リンパ造血前駆細胞である。
【００５６】
好ましくは、未分化細胞は、多能性幹細胞である。
【００５７】
より拘束された細胞は、抗原発現、捕捉または認識に関係がある成分からなってもよい。好ましくは、より拘束された細胞は、ＭＨＣクラスＩ＋および／またはＭＨＣクラスＩＩ＋細胞である。
【００５８】
好ましくは、該薬剤は、より拘束された細胞の細胞外に作用する。
【００５９】
好ましくは、より拘束された細胞は、薬剤により操作可能に密着可能な（ｅｎｇａｇｅａｂｌｅ）受容体からなる（該薬剤は、該受容体に操作可能に密着する（ｅｎｇａｇｅ））。
【００６０】
好ましくは、受容体は、細胞表面受容体である。
【００６１】
好ましくは、受容体は、α−成分および／またはβ−成分からなる。
【００６２】
好ましくは、受容体は、相同領域を有するβ−鎖からなる。
【００６３】
好ましくは、受容体は、少なくともＨＬＡ−ＤＲのβ−鎖の相同領域からなる。
【００６４】
好ましくは、受容体は、相同領域を有するα−鎖からなる。
【００６５】
好ましくは、受容体は、少なくともＨＬＡ−ＤＲのα−鎖の相同領域からなる。
【００６６】
好ましくは、薬剤は、受容体に対する抗体である。
【００６７】
好ましくは、薬剤は、受容体に対するモノクローナル抗体である。
【００６８】
好ましくは、薬剤は、ＨＬＡ−ＤＲのβ−鎖の相同領域に対する抗体、好ましくは、モノクローナル抗体である。
【００６９】
好ましくは、薬剤は、ＨＬＡ−ＤＲのα−鎖の相同領域に対する抗体、好ましくは、モノクローナル抗体である。
【００７０】
好ましくは、薬剤は、生物学的応答調節剤と共に用いられる。
【００７１】
好ましくは、生物学的応答調節剤は、アルキル化剤である。
【００７２】
好ましくは、アルキル化剤は、シクロホスファミドであるか、または、シクロホスファミドからなる。
【００７３】
１つの好ましい具体例では、より拘束された細胞は、分化細胞である。
【００７４】
好ましくは、より拘束された細胞は、Ｂ細胞またはＴ細胞のいずれか１つである。
【００７５】
別の好ましい具体例では、より拘束された細胞は、より成熟した未分化細胞である。
【００７６】
１つの好ましい具体例では、未分化細胞が再拘束細胞に拘束された場合、再拘束細胞は、逆分化前のより拘束された細胞と同一の系譜のものである。
【００７７】
別の好ましい具体例では、未分化細胞が再拘束細胞に拘束された場合、再拘束細胞は、逆分化前のより拘束された細胞と異なる系譜のものである。
【００７８】
好ましくは、再拘束細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞または顆粒球のいずれか１つである。
【００７９】
好ましくは、該方法は、イン・ビトロ方法である。
【００８０】
好ましくは、薬剤は、ＭＨＣ遺伝子発現を調節し、好ましくは、この場合、該薬剤は、ＭＨＣ Ｉ＋および／またはＭＨＣ ＩＩ＋発現を調節する。
【００８１】
該薬剤は、より拘束された細胞を未分化細胞に逆分化させるために、このより拘束された細胞に操作可能に密着する。これに関して、より拘束された細胞の未分化細胞への逆分化のための薬剤は、より拘束された細胞との直接的な密着（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）または間接的な密着において作用する。
【００８２】
直接的密着の例は、より拘束された細胞が、Ｂ細胞上で見いだされるもののような相同領域（一般的に、同一または類似の配列を有することが判明している領域）を有するβ−鎖のような、その細胞表面上に少なくとも１つの細胞表面受容体を有する場合および薬剤が該細胞表面受容体に直接的に密着する場合である。別の例は、より拘束された細胞が、Ｔ細胞上で見られるもののような相同領域を有するα−鎖のような、その細胞表面上に細胞表面受容体を有する場合および該薬剤が細胞表面受容体に直接的に密着する場合である。
【００８３】
間接的な密着の例は、より拘束された細胞がその細胞表面上に少なくとも２つの細胞表面受容体を有する場合であり、薬剤の、受容体のうちの１つとの密着は、他の受容体に影響を及ぼし、次いで、より拘束された細胞の逆分化を誘発する。
【００８４】
より拘束された細胞の未分化細胞への逆分化のための薬剤は、化学化合物または組成物である。しかしながら、好ましくは、該薬剤は、より拘束された細胞の表面上で細胞表面受容体を密着させる能力を有する。例えば、好ましい薬剤としては、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、ＣＤ４分子、ＣＤ８分子、Ｔ−細胞受容体の一部もしくは全部、リガンド（固定化または遊離）、ペプチド、Ｔ−細胞受容体（ＴＣＲ）、抗体、交差反応性抗体、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の１つ以上が挙げられる。
【００８５】
薬剤が抗体、交差反応性抗体、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体である場合、好ましくは、該薬剤は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原のβ鎖、ＭＨＣ ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ鎖、ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ抗原のα鎖、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のα鎖、ＭＨＣクラスＩＩ抗原もしくはＭＨＣクラスＩ抗原のαおよびβ鎖のうちのいずれか１つ以上に対する抗体、交差反応性抗体、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体のうちのいずれか１つ以上である。適切な抗体の例は、ＣＲ３／４３（ダコ（Ｄａｋｏ）より供給された）である。
【００８６】
より拘束された細胞は、未分化細胞から誘導されたかまたは誘導可能な細胞である。
【００８７】
かくして、１つの具体例では、より拘束された細胞は、未分化細胞でもある。したがって、例証として、未分化細胞は、リンパ系幹細胞または骨髄幹細胞であることができ、未分化細胞は、多能性幹細胞である。
【００８８】
別の好ましい具体例では、より拘束された細胞は、ＣＦＣ−Ｔ細胞、ＣＦＣ−Ｂ細胞、ＣＦＣ−エオシン細胞、ＣＦＣ−バス（Ｂａｓ）細胞、ＣＦＣ−バス細胞、ＣＦＣ−ＧＭ細胞、ＣＦＣ−ＭＥＧ細胞、ＢＦＣ−Ｅ細胞、ＣＦＣ−Ｅ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好酸球、好塩基球、好中球、単球、骨髄巨核細胞または赤血球などの分化細胞であり；未分化細胞は、骨髄幹細胞、リンパ系幹細胞または多能性幹細胞である。
【００８９】
より拘束された細胞が分化細胞である場合、好ましくは、該分化細胞は、Ｂリンパ球（活性化または非活性化）、Ｔリンパ球（活性化または非活性化）、マクロファージ単球系譜からの細胞、クラスＩまたはクラスＩＩ抗原を発現させる能力を有する有核細胞、クラスＩまたはクラスＩＩ抗原を発現させることができる細胞、または除核細胞（すなわち、赤血球のような核を含有しない細胞）である。
【００９０】
別の好ましい具体例は、分化細胞は、各々、ＣＤ５６および／またはＣＤ１６細胞表面受容体を発現する、大きな顆粒状リンパ球、ヌルリンパ球、およびナチュラルキラー細胞からなる細胞のグループのいずれか１つから選択される。
【００９１】
分化細胞は、除核細胞の核形成により形成されてもよい。
【００９２】
薬剤は、より拘束された細胞内で細胞内に作用してもよい。しかしながら、好ましくは、薬剤は、より拘束された細胞の細胞外に作用する。
【００９３】
好ましい具体例では、薬剤は、より拘束された細胞の表面上に存在する受容体に操作可能に密着する。該受容体は、より拘束された細胞により発現させられる能力を有する受容体のように、より拘束された細胞により発現される。
【００９４】
好ましくは、受容体は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩまたはクラスＩＩ抗原である。好ましい具体例では、細胞表面受容体は、ＨＬＡ−ＤＲ受容体、ＤＭ受容体、ＤＰ受容体、ＤＱ受容体、ＨＬＡ−Ａ受容体、ＨＬＡ−Ｂ受容体、ＨＬＡ−Ｃ受容体、ＨＬＡ−Ｅ受容体、ＨＬＡ−Ｆ受容体、またはＨＬＡ−Ｇ受容体のいずれか１つである。
【００９５】
さらに好ましい具体例では、細胞表面受容体は、ＨＬＡ−ＤＲ受容体である。
【００９６】
好ましくは、接触工程は、薬剤を以下のものの１つ以上と密着させることからなる：クラスＩ抗原のα−鎖の相同領域、クラスＩＩ抗原のα−鎖相同領域、ＣＤ４細胞表面受容体、ＣＤ８細胞表面受容体、リンパ球の存在下でのクラスＩＩ抗原のβ−鎖の相同領域、リンパ球の存在下でのクラスＩ抗原のα−鎖の相同領域、またはリンパ球の存在下でのクラスＩＩ抗原のα−鎖の相同領域。
【００９７】
好ましくは、接触工程は、生物学的応答調節剤の存在下で生じる。
【００９８】
好ましくは、生物学的応答調節剤は、免疫調節剤、成長因子、サイトカイン、細胞表面受容体、ホルモン、核酸、ヌクレオチド配列、抗原またはペプチドなどの調節剤の１つ以上である。
【００９９】
本発明の好ましい具体例では、未分化細胞は、次いで、分化細胞のような再拘束細胞に拘束される。
【０１００】
再拘束細胞は、未分化細胞が誘導された、より拘束された細胞と同一の系譜のものである。
【０１０１】
別法としては、再拘束細胞は、未分化細胞が誘導された、より拘束された細胞と異なる系譜のものである。
【０１０２】
さらに、本発明は、未分化細胞を再拘束細胞に拘束し、次いで、再拘束細胞を骨髄腫に縮合させることを含む、本発明の未分化細胞の製造方法を包含する。これは、抗体または抗原またはホルモンなどの多量の所望の生産物をイン・ビトロで発現させる。
【０１０３】
本発明の他の態様は、以下のものを含む：
【０１０４】
より拘束された細胞から未分化細胞を製造するための本発明の薬物のいずれか１つの使用。
【０１０５】
Ｂ−リンパ球またはＴ−リンパ球からモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体または特異的抗体のいずれか１つを製造するための本発明の方法により生産される未分化細胞；マクロファージ単球系譜からの細胞；クラスＩまたはクラスＩＩ抗原を発現する能力を有する核形成細胞；クラスＩまたはクラスＩＩ抗原を発現させる能力を有する細胞；除核細胞；断片化細胞；またはアポプティック（ａｐｏｐｔｉｃ）細胞の使用。
【０１０６】
Ｂ−リンパ球からエフェクターＴ−リンパ球を生産するための（逆もまた同様）本発明の方法により生産された未分化細胞の使用。
【０１０７】
Ｂ−リンパ球、Ｔ−リンパ球からなるかもしくはこれから調製される医薬、マクロファージ単球系譜からの細胞、クラスＩもしくはクラスＩＩ抗原を発現する能力を有する核形成細胞、クラスＩもしくはクラスＩＩ抗原を発現させる能力を有する細胞、または除核細胞のいずれか１つ以上を生産するための本発明の方法により生産される未分化細胞の使用。
【０１０８】
本発明は、前記使用を利用するプロセス、およびかかるプロセスから製造された生成物または組成物も包含する。
【０１０９】
本発明は、適切な希釈剤、担体または賦形剤と混合した、本発明の未分化細胞またはそれから得られた生成物からなる医薬を包含する。
【０１１０】
１つの好ましい具体例では、医薬は、適切な希釈剤、担体または賦形剤と混合した、本発明の未分化細胞から得られた抗体または抗原からなる。
【０１１１】
好ましくは、医薬は、癌、自己免疫疾患、血液障害、細胞もしくは組織再生、臓器再生、臓器もしくは組織移植の処置、または先天性代謝障害のいずれか１つの処置のためのである。
【０１１２】
好ましい具体例では、本発明は、遺伝子をより拘束された細胞に導入し、次いで、本発明の方法により未分化細胞を製造し、これにより、遺伝子が未分化細胞中に存在することからなる、遺伝子を未分化細胞のゲノムに導入するプロセスに関する。
【０１１３】
より好ましい具体例では、本発明は、遺伝子をより拘束された細胞のゲノムに挿入し、次いで、本発明の方法により未分化細胞を製造し、これにより、遺伝子が未分化細胞中に存在することからなる、遺伝子を未分化細胞のゲノムに導入するプロセスに関する。
【０１１４】
さらに好ましい具体例では、本発明は、遺伝子をより拘束された細胞のゲノムに挿入し、次いで、本発明の方法により未分化細胞を製造し、これにより、遺伝子が未分化細胞のゲノム中に存在することからなる、遺伝子のゲノムを未分化細胞に導入するプロセスに関する。
【０１１５】
本発明は、本発明のこれらのプロセスのいずれか１つにより製造される未分化細胞を包含する。
【０１１６】
既に記載したとおり、本発明は、適切な希釈剤、担体または賦形剤と混合した、これらのプロセスのいずれか１つにより製造された未分化細胞からなる医薬を包含する。正しくないゲノム構造を有するより拘束された細胞により生じるかまたは該細胞と関連する症状または病状を緩和するために、かかる医薬について、未分化細胞を用いて、正しいゲノム構造を有するものなど有益なより拘束された細胞を生産することができる。
【０１１７】
かくして、本発明は、また、本発明の方法により未分化細胞を形成し、未分化細胞を再拘束細胞に拘束し、これにより、細胞のゲノムおよび／または核の整列または再整列により突然変異が除去されることからなる、より拘束された細胞から後天性突然変異を除去するプロセスを提供するものでもある。
【０１１８】
好ましくは、遺伝子は、ゲノムの免疫グロブリン部位またはＴＣＲ部位に挿入される。
【０１１９】
別法としては、未分化細胞を用いて、正しくないゲノム構造を有するより拘束された細胞により生じるかまたは該細胞と関連する症状または病状を治療する実体を生産するより拘束された細胞を生産することができる。
【０１２０】
例えば、本発明を用いて、未分化細胞に逆分化したより拘束された細胞により発現される抗原に対する抗体またはＴ細胞受容体を製造することができる。これに関して、抗原は、胎児特異的抗原または交差反応胎児特異的抗原であってよい。
【０１２１】
本発明は、また、未分化細胞およびより拘束された細胞のレベルを制御するプロセスをも含む。例えば、本発明は、本発明の方法により未分化細胞を形成し、次いで、アポプトーシス遺伝子を活性化して、その死をもたらすなど未分化細胞に影響を及ぼすことからなる方法を含む。
【０１２２】
本発明の１つの好ましい具体例では、より拘束された細胞は、癌細胞ではない。本発明の別の好ましい具体例では、薬剤は、発癌性でなく、癌増殖を促進させる能力も有しない。
【０１２３】
本発明は、また、より拘束された細胞を、このより拘束された細胞を未分化細胞に逆分化させる薬剤と接触させることにより未分化細胞を製造し、次いで、所望により、該未分化細胞を再拘束細胞に拘束することからなる欠損細胞または不必要な細胞により生じる疾患または障害に罹っている患者の治療方法であって、該未分化細胞または再拘束細胞が欠損細胞または不必要な細胞に影響を及ぼして、該疾患または障害の症状を緩和するかまたは疾患または病状の患者を治療する治療方法をも包含している。
【０１２４】
要約すると、本発明は、より拘束された細胞からの未分化細胞の製造に関する。
【０１２５】
本発明は、以下の図面を参照して、例証として説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１は、本発明方法以前の細胞の顕微鏡写真である。
【図２】図２は、本発明方法により製造された細胞の顕微鏡写真である。
【図３】図３は、低倍率であるが、本発明の方法により製造された顕微鏡写真である。
【図４】図４は、本発明方法以前の細胞の顕微鏡写真である。
【図５】図５は、本発明方法により製造された細胞の顕微鏡写真である。
【図６】図６は、本発明方法により製造された細胞の顕微鏡写真である。
【実施例】
【０１２７】
Ａ．物質および方法
患者
血液試料は、Ｂ−細胞慢性リンパ球性白血病患者、抗体欠損（ＩｇＡ欠損およびＸ染色体性小児性低ガンマグロブリン血症を含む）患者、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳ症候群患者、ＣＭＶ感染患者、ホジキンリンパ腫患者、急性Ｔ−細胞白血病患者、ホジキンリンパ腫の６日齢乳児、急性Ｔ−細胞白血病患者、胚芽細胞増殖症の６日齢乳児、種々の感染および慢性症状の種々の患者、臍帯血、骨髄、および健康な供血者からの富化Ｂ−リンパ球調製物から、ＥＤＴＡを含有するラベンダートップ管中に得た。
【０１２８】
臨床条件および実験条件
血液試料に適用された種々のタイプの処置を含む患者の臨床および実験処置条件を表１に記載する。コールターカウンターを用いて白血球（ＷＢＣ）分画を得た。これらは、同表に含まれる。
【０１２９】
血液の処置
得られた血液試料をすぐに、ＨＬＡ−ＤＲ抗原（ＤＡＫＯ）のβ−鎖の相同領域に対する純粋な抗体で処理し、最長２４時間、室温で、頭−頭ローラー（ｈｅａｄ ｔｏ ｈｅａｄ ｒｏｌｌｅｒ）で混合した。まず、いくつかの試料を頭−頭ローラーで１５分間混合した後、それらを２２℃でインキュベーター中でインキュベートした。血液試料に添加したモノクローナル抗体の濃度は、血液ｍｌ当たり１０〜５０μｌを変化した。
【０１３０】
さらに、同一の濃度で他の処置を適用し、これらは、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のα−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体、クラスＩ抗原の相同領域に対するモノクローナル抗体、ＣＤ４に対するモノクローナル抗体、ＣＤ８に対するモノクローナル抗体、およびＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するＰＥコンジュゲートモノクローナル抗体の添加を含んだ。
【０１３１】
他の処置は、血液試料への、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のαおよびβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体の同時添加を含んだ。
【０１３２】
さらにまた、シクロホスファミドなどのアルキル化剤を、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対する純粋なモノクローナル抗体と合わせて血液試料に添加した。
【０１３３】
これらの処置に続いて、製造者の指示により指示されるように標識モノクローナル抗体のパネルを用いて血液試料を染色し、次いで、フローサイトメトリーを用いて分析した。
【０１３４】
モノクローナル抗体によりインキュベーション期間は、２時間、４時間、６時間、１２時間〜２４時間の範囲であった。
【０１３５】
標識抗体
以下のモノクローナル抗体を用いて、フローサイトメトリーにより細胞上の以下のマーカーを検出した：ＣＤ１９およびＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８、ＤＲおよびＣＤ３、ＣＤ５６＆１６およびＣＤ３、ＣＤ４５およびＣＤ１４、ＣＤ８およびＣＤ３、ＣＤ８およびＣＤ２８、サイマルテスト（ｓｉｍｕｌｔｅｓｔ）対照（ＩｇＧ１ ＦＩＴＣ＋ＩｇＧ２ａ ＰＥ）、ＣＤ３４およびＣＤ２、ＣＤ７およびＣＤ１３＆１３、ＣＤ１０およびＣＤ２５、ＣＤ５およびＣＤ１０、ＣＤ５およびＣＤ２１、ＣＤ７およびＣＤ５、ＣＤ１３およびＣＤ２０、ＣＤ２３およびＣＤ５７、ならびにＣＤ２５およびＣＤ４５ ＲＡ（ベクトン・アンド・デッケンソン（Ｂｅｃｔｏｎ ＆ ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）およびＤＡＫＯ）。
【０１３６】
種々の処置に付随した免疫表現型変化について説明するために、前記パネルの大部分を用いて、処置および未処置の各々の患者の血液試料を分析し、これらは、同一血液試料の異なるアリコットについて別々に行った。未処置試料および他の対照処置を染色し、同時に分析した。
【０１３７】
フローサイトメトリー
白血球を染色し、製造者の指示に従って溶解させた。負の対照バックトラッキングを含んだサイマルテスト（ｓｉｍｕｌｔｅｓｔ）またはＰＡＩＮＴ Ａ ＧＡＴＥソフトウエアー（ＢＤＳＩ）によりＦＡＣＳｃａｎ＠でフローサイトメトリー分析を行った。１０，０００〜２０，０００個の事象が得られ、リストモードファイルに保存された。
【０１３８】
形態学
形態学は、顕微鏡およびライト染色を用いて分析した。
【０１３９】
Ｂ． 結果
ＣＤ１９およびＣＤ３パネル
血液試料をＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体で処理すると、ＣＤ１９＋細胞の相対数が常に減少した。このマーカーは、ｐａｎＢ−細胞抗原である（表参照）。この抗原は、成熟の全段階で、全てのヒトＢリンパ球に存在するが、終末に分化した形質細胞には存在しない。従って、これは、Ｂ細胞が未分化細胞へ逆分化していたことを示す。
【０１４０】
同様の処理により、ＣＤ３＋細胞の相対数が、劇的なことに、特に、Ｂ−ＣＬＬ患者の血液中で増加し、常に、ＣＤ３−ＣＤ１９−細胞における相対数の増加を伴った。ＣＤ３は、全ての成熟Ｔリンパ球および６５％−８５％の胸腺細胞に存在する。このマーカーは、常にα／βまたはガンマ／デルタＴ−細胞受容体（ＴＣＲ）と関連して知られ、一緒にこれらの複合体は、細胞内部に対するシグナル変換において重要である。従って、これは、Ｂ細胞が未分化細胞に逆分化し、それから、Ｔ細胞と称する新しい分化細胞に拘束されていたことを示す。
【０１４１】
細胞の新しいクローンは、ＣＤ１９およびＣＤ３マーカー、すなわち、ＣＤ１９＋およびＣＤ３＋細胞を共同発現しているＢ−ＣＬＬ患者の処理血液において、現れた（チャート１．処理開始後２時間、６時間および２４時間の患者２、３および４参照）。他の病状の患者は、細胞のこれらのクローンの相対数の増加を示した。これらの細胞は、非常に大きく、非常に顆粒状であり、極度に高いレベルのＣＤ１９が、それらの細胞膜に発現した。ＣＤ３マーカーは、正常な成熟リンパ球に発現するのと同様なレベルにて、これらの細胞で発現されるようである。
【０１４２】
表２において、患者番号２、３および４は、実際には、同じ患者を表す番号であり、それらの説明は、単に、経時的な血液処理の効果を示すものであった（この患者の実験条件および臨床条件については表１を参照）。
【０１４３】
処理試料におけるＣＤ１９＋ＣＤ３＋クローンは、経時的に減少し、初期レベルが２時間目、６時間目および２４時間目の未処理試料において測定されたレベルに達する。
【０１４４】
同じサイズおよび粒状の別のタイプの細胞が処理試料において検出され、これらの細胞は、それらの表面で発現した高レベルのＣＤ１９を有するが、ＣＤ３マーカーに対して陰性であり、ＦＣ受容体において豊富であった。しかしながら、これらの細胞の相対数は、時間に伴って減少することが明らかになった。興味深いことに、血液試料（２、３および４）の処理の２４時間目に、初めに血液試料の処理の２および６時間後に増加することが観察された細胞群において、ＣＤ１９−ＣＤ３−細胞の相対数が減少した。しかしながら、ＷＢＣ群のコールターカウントは、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体による血液の処理により減少した。この発見は、このタイプの処理により、コールターによって検出できないが（表１）、表面マーカーに基づいて細胞をカウントするフローサイトメトリーによって測定した場合にサイズおよび粒状について説明され得る非定形細胞が生じることを示す。さらに、これらの非定形細胞は、顕微鏡下でライト染色を用いて形態を分析することにより説明される。これらの現象のフローサイトメトリーチャートは、チャート（１、２、３および４）に示され、血液試料の処理により観察された免疫発現型変化は、ＣＤ１９＋およびＣＤ３＋リンパ球が相互に連絡された細胞群であるが、幹細胞と比較したＣＤ１９およびＣＤ３相対発現に基づいて別個のままであることを示唆すると思われる。
【０１４５】
表２において、患者番号５および６は、同じ患者を示すが、処理および未処理の血液試料の分析は、同時に経時的にモニターされた（表１参照）。
【０１４６】
Ｂ−細胞悪性腫瘍を有さない患者血液は、Ｂ−ＣＬＬ患者の血液と比較すると、類似した傾向の免疫発現型変化を示したが、その変化は、同程度ではなかった。しかしながら、これらの患者の血液中のＢ−リンパ球およびＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞の相対的および絶対的な数は、Ｂ−ＣＬＬ患者の血液中でみられた数と比較して、極度に低い。
【０１４７】
どちらもＢ細胞欠損であるＸ−結合乳児低ガンマグロブリン血症である２人の兄弟は、彼らの血液の処理によりＣＤ３＋細胞の相対数において異なる免疫発現型変化を示した。２カ月齢であり、病状が重くなかった弟は、血液の処理によりＣＤ３＋の相対数のわずかな増加を示し、それはＣＤ３−ＣＤ１９−細胞の相対数の減少を伴った。他方、２才で重症であり、比較的高い数のＤＲ抗原を発現している活性Ｔ細胞を有する兄は、血液の処理によりＣＤ３＋細胞の数の減少を示した。これら二人の患者から得られた血液試料は、極度に少量だったので、他のマーカーを使用して引き起される可能性のある他の表現型変化を測定するようなことはしなかった（表２．ＩＤ４３／ＢＤおよび０４／ＢＤ）。
【０１４８】
表２において患者９１は、血液の処理後のＣＤ３＋細胞の相対数の減少を示し、それは、ＣＤ３−ＣＤ１９−細胞の相対数の増加を伴った。しかしながら、ＣＤ４およびＣＤ８のような他の表面マーカーの分析において（表３参照）、患者は、血液中にＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞の高い相対数を有することが観察され、これは、ＤＲ抗原のβ−鎖に対するモノクローナル抗体で血液試料を処理する前に示され、これらの二重陽性細胞は、血液処理後、かなり減少した。さらに、さらなるマーカーを分析すると、ＣＤ３＋細胞の相対数が上昇したことが示された（表４参照）。
【０１４９】
健康な供血者から得られたＢ−リンパ球の豊富な他のは、ＤＲ抗原のβ−鎖に対するモノクローナル抗体で処理すると、ＣＤ３＋細胞の相対数の劇的な増加を示し、それは、常にＣＤ１９＋細胞の相対数の減少およびＣＤ１９−ＣＤ３−細胞の相対数の増加を伴った。ＣＤ４およびＣＤ８のようなマーカーを使用するさらなる分析は、これらのマーカーの相対数の付随した増加を示す。しかしながら、同一供血者のＴリンパ球の豊富な調製物は、同一のモノクローナル抗体で処理した場合、同様の変化を示さなかった。
【０１５０】
ＣＤ４およびＣＤ８パネル
ＣＤ４抗原は、ヒト免疫不全ウイルスに対する受容体である。ＣＤ４分子は、クラスＩ抗原上のＣＤ８結合部位と同様な領域であるＢ２ドメインにおいてＭＨＣクラスＩＩ抗原を結合する。ＣＤ４のクラスＩＩ抗原への結合は、抗原へのＴ細胞応答を増強し、それゆえＣＤ８のクラスＩ抗原への結合を行う。ＣＤ８抗原は、ヒトサプレッサー／細胞障害性Ｔリンパ球サブセット上ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）リンパ球のサブセットおよび大部分の正常胸腺細胞上に存在する。ＣＤ４およびＣＤ８抗原は、胸腺細胞で共同発現し、これらの細胞は、それらがＴ−リンパ球へと成熟するにつれて、どちらのマーカーも失う。
【０１５１】
ＣＤ４およびＣＤ８マーカーの分析（下記参照）にて、および表２に示された血液試料の大部分から、Ｂ−リンパ球の未分化細胞への逆分化プロセスの存在およびＴ−リンパ球へのその後の分化を支持する染色パターンが明らかになる。
【０１５２】
二重陽性細胞であるＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞は、常に、β−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体での血液試料の処理に従うことが明白であり、これらのタイプの細胞は、Ｂ−ＣＬＬ患者の処理試料の血液において著しく増加し、それは、未処理試料において全く見られなかった（表３およびチャート１、２、３および４参照）。同様の試料において、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋細胞のような単陽性細胞の相対数もまた、同時に増加することが示された。さらに、少なくともＢ−ＣＬＬの場合においてＢ細胞に相当するＣＤ４−ＣＤ８−細胞の相対数の減少は、経時的に測定すると、同一レベルのままであった未処理試料と比較して、処理試料では劇的に減少することを示した。しかしながら、処理試料中におけるＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞の相対数の経時的な測定は、二重陽性細胞の相対数の減少に付随して単陽性細胞数の増加が起こることを示した。このタイプの免疫発現型変化は、胸腺におけるＴ−リンパ球系譜の前駆細胞の胸腺発達を特徴とする（患者番号２、３、および４）。ＣＤ４抗原は、ヘルパー／インデューサーＴ−リンパ球サブセット（ＣＤ４＋ＣＤ３＋）および正常な胸腺細胞の大部分に存在する。しかしながら、この抗原は、単球の細胞表面上ならびに単球およびマクロファージの細胞質に低密度で存在する（ＣＤ３−ＣＤ４−）。
【０１５３】
ＣＤ４＋低細胞の相対数は、処理後の種々の血液試料中で、異なって影響された。このタイプの細胞の相対数は、未処理試料と比較すると、処理後のＢ−ＣＬＬ患者の血液試料中で影響されなかったようである。そのような低レベルのＣＤ４発現は、単球および非常に初期の胸腺細胞で見られる。
【０１５４】
処理後のＨＩＶ＋２５患者は、ＣＤ４およびＣＤ８を同時に発現している二重陽性細胞の数の実質的な増加を示した。一方、処理後の患者９１は、細胞のこのサブタイプの減少を示し、そのような現象の観察は、時間に依存する。ＣＤ８＋細胞の相対数は、経時的に測定すると、Ｂ−ＣＬＬ患者の未処理血液試料において増加することが観察されるが、ＣＤ４＋およびＣＤ４＋低細胞の相対数は、同時に減少することが観察された（表３ 患者２、３および４）。
【０１５５】
ＤＲおよびＣＤ３パネル
ＤＲマーカーは、単球、樹状細胞、Ｂ−細胞および活性Ｔ−リンパ球に存在する。
【０１５６】
このパネルで分析された処理および未処理試料は、血液試料をＣＤ１９およびＣＤ３マーカーで分析した場合に得られたものと同様な免疫発現型変化を示し（表２参照）、これらの抗原は、前記したように、各々、ｐａｎＢおよびＴ−細胞マーカーである。
【０１５７】
血液のモノクローナル抗体での処理は、ＤＲ＋Ｂ−リンパ球の相対数に影響し、その結果、ＤＲ＋細胞のレベルが減少するようである。対照的に、ＣＤ３＋（Ｔ−細胞）細胞の相対数は、有意に増加する（表４およびチャート参照）。さらに、活性Ｔ細胞の相対数は、Ｂ−ＣＬＬ患者の処理血液試料の大部分において増加し、これらのタイプの細胞は、他の病状の患者の処理試料において不定に影響された。さらに、ＤＲ高陽性細胞の相対数は、Ｂ−ＣＬＬ患者および、血液中のＤＲ＋ＣＤ３４＋芽球が増加した６日齢の乳児の処理血液試料における有意な数において明白となった。しかしながら、この患者の血液中に存在した芽球は、処理前および処理後にＴおよびＢ−細胞マーカーに対して陰性であったが、処理後の骨髄系譜抗原に対してより陽性になったことに注意すべきである。ＣＤ３−ＤＲ−細胞の相対数は、処理血液試料の大部分において増加し、ＣＤ３＋細胞（Ｔ−細胞）の相対数の増加に比例し、ＤＲ＋細胞（Ｂ−細胞）の相対数の減少に反比例した。
【０１５８】
ＣＤ５６＆１６およびＣＤ３パネル
ＣＤ５６＆ＣＤ１６マーカーは、細胞の不均一群、一般に大きな粒状リンパ球として知られるリンパ球のサブセット、およびナチュラルキラー（ＮＫ）リンパ球に見られる。ＣＤ１６抗原は、実質的に全ての休止ＮＫリンパ球に発現し、ある個体由来のいくつかのＣＤ３＋Ｔリンパ球に若干発現する。この抗原は、顆粒球に少量見られ、大きなアズール親和性顆粒を含有するリンパ球と結合する。ＣＤ１６抗原は、ＩｇＧ ＦＣ受容体ＩＩＩである。
【０１５９】
可変数のＣＤ１６＋リンパ球は、ＣＤ５７抗原もしくは低密度ＣＤ８抗原のいずれかか、または両方を共同発現する。ほとんどの個体では、実質的に、ＣＤ５、ＣＤ４またはＣＤ３抗原のような他のＴ−リンパ球抗原とオーバーラップしない。ＣＤ５６抗原は、本質的に全ての休止および活性ＣＤ１６＋ＮＫリンパ球に存在し、細胞のこれらのサブセットは、非主要組織適合遺伝子複合体制限細胞障害性を行う。
【０１６０】
Ｂ−ＣＬＬおよびその他の病状の患者の処理および未処理血液試料の免疫発現は、非常に顆粒状の中くらいのサイズのＣＤ５６＆ＣＤ１６を共同発現している細胞の相対数の増加を示した（表５およびチャート１、２、３および４を参照）。これらの観察はまた、ＣＤ３抗原のみを発現する（ＣＤ５６およびＣＤ１６マーカーの発現は無い）細胞、およびＣＤ５６＆ＣＤ１６およびＣＤ３マーカーを一緒に共同発現する細胞の相対数の著しい増加を伴った。
【０１６１】
表５において、患者番号２、３および４は、同一の血液試料を表すが、それぞれ２時間、６時間および２４時間（処理前および処理後）で分析している。この試料は、ＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体による血液の処理により、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６＋細胞、ＣＤ３＋細胞およびＣＤ５６＋およびＣＤ１６＋ＣＤ３＋細胞の自発的生成を引き起こすようであり、これらの観察は、常にＢ−細胞マーカー（ＣＤ１９、ＤＲ、ＣＤ５６、ＣＤ１６−ＣＤ３−）の消失を伴った。
【０１６２】
処理前および処理後のこの血液試料の前進的な分析は、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６＋細胞のレベルが経時的に減少すること、ＣＤ３＋細胞のレベルが経時的に増加することを示した。
【０１６３】
Ｂ−ＣＬＬ患者７の血液試料は、処理および未処理試料において観察された免疫発現型変化と比較して、ＣＤ５６、ＣＤ１６およびＣＤ３抗原を発現する細胞数のいかなる変化も示さず、これは、モノクローナル抗体の添加量がＢリンパ球の数に比べて極度に少なかったためである。しかしながら、適量のモノクローナル抗体による別の場合のこの患者の血液試料の処理は、ＣＤ３＋、ＣＤ５６＋＆ＣＤ１６＋およびＣＤ５６＋およびＣＤ１６＋ＣＤ３＋細胞の相対数の有意な増加を示した。
【０１６４】
他の病状の他の患者の血液試料は、これらの細胞のレベルの不定な変化を示し、これは、処理前、処理期間の血液中に存在するＢ−リンパ球の数およびおそらく患者の臨床条件に依存すると思われる。
【０１６５】
ＣＤ４５およびＣＤ１４パネル
ＣＤ４５抗原は、末梢血、胸腺、脾臓および扁桃中のリンパ球、単球、多形核細胞、好酸球および好塩基球、ならびに骨髄中の白血球前駆体を含む全てのヒト白血球に存在する。
【０１６６】
ＣＤ１４は、７０％ないし９３％の正常な末梢血単球、７７％ないし９０％の胸膜液または腹膜液食細胞に存在する。この抗原は、顆粒球に若干発現し、非刺激リンパ球、マイトジェン−活性Ｔリンパ球、赤血球、または血小板には存在しない。
【０１６７】
ＣＤ４５抗原は、タンパク質チロシンホスファターゼのファミリーを表し、この分子は、外部刺激（抗原）と相互作用し、細胞増殖および分化の調節へ導くＳｃｒ−ファミリーメンバーを経てシグナル変換に影響する。
【０１６８】
特にＢ−ＣＬＬ患者から得られた処理血液試料におけるＤＲ抗原のβ−鎖の密着は、そのような処理がＢ−リンパ球でのＣＤ４５抗原のレベルに影響することを示唆する。ＤＲ抗原のβ−鎖の刺激により生じた全免疫発現型変化は、ＣＤ４５およびＣＤ１４発現レベルならびに前方分散および側面分散によって測定されたような形態（それぞれサイズおよび粒状）に基づいて分離され得る種々のタイプの細胞を生じさせるようであり、これらの結果は、表６およびチャート（１、２、３、４および５）に示す。
【０１６９】
処理によりＣＤ４５低細胞の相対数は（未処理試料と比較して）、有意に増加し、それゆえＣＤ４５およびＣＤ１４抗原を共同発現する細胞の相対数は増加した。このタイプの免疫発現型変化は、ＣＤ４５高細胞の相対数（未処理試料と比較して）の減少と同時に起こった。しかしながら、この後者の細胞群は、形態およびＣＤ４５発現度に基づいて、さらに分割することができる。一のタイプは、極度に大きく、チャートにある残りの細胞と比較して極度に高いレベルのＣＤ４５抗原を有した（チャート１、２、３および４参照）。経時的な処理後のこのパネル分析（表 患者２、３および４ならびにチャート参照）により、ＣＤ４５＋細胞の相対数は、始めに経時的に急激に減少し、ＣＤ４５低細胞を生じた。しかしながら、２４時間後の血液の分析は、反対の状態を示した。
【０１７０】
試料５および７は、他のＢ−ＣＬＬ患者から得られた他の試料で得られた変化とは反対の免疫発現型変化を表し、これは、この試料がモノクローナル抗体との非常に短いインキュベーション時間で分析したからである。実際、処理後の血液試料の一連の分析は、Ｂリンパ球によって調節された免疫発現型変化が発達の段階を表すので時間依存性であること、時間Ｘで測定された免疫発現型変化は、時間Ｘプラスでは同じでないだろうということ（それは一度引き起こされると固定されない）を示唆すると思われる。しかしながら、これらのタイプの変化は、体内でのより厳しい条件で起こっているにちがいなく、さもなければ免疫病理学が、結果として起こるであろう。Ｂ−細胞悪性腫瘍を有しない他の患者由来の血液試料の処理の影響は、細胞の免疫発現型の不定な変化を示し、これは、Ｂ−リンパ球がより少量で存在するからである。しかしながら、健康な供血者から得られたＢ−リンパ球の豊富なフラクションの処理は、高いＢ−リンパ球数を有するＢ−ＣＬＬで得られたのと同様な免疫発現型変化を示す。
【０１７１】
ＣＤ８およびＣＤ３パネル
ＣＤ８抗原決定因子は、クラスＩＭＨＣ分子と相互作用し、その結果、ＣＤ８＋Ｔリンパ球とその標的細胞との間の付着を増加させる。このタイプの相互作用は、休止リンパ球の活性化を増強する。ＣＤ８抗原は、タンパク質チロシンキナーゼ（ｐ５６ｉｃｋ）と結合し、次に、ＣＤ８／ｐ５６ｉｃｋ複合体がＴ−リンパ球活性化における役割を果す。
【０１７２】
Ｂ−ＣＬＬ患者から得られた血液試料の、Ｂ鎖に対するモノクローナル抗体での処理は、ＣＤ３ＣＤ８およびＣＤ３（ＣＤ４ＣＤ３に非常によく似ている）陽性細胞の相対数の有意な増加を引き起こし、したがって、より明らかに、始めに生じた二重陽性細胞が成熟Ｔ−リンパ球に発達していることを示す。これは、直接的にＣＤ１９によっておよびＤＲによって、間接的にＣＤ８−ＣＤ３−抗原によって測定することができるプロセスである。同一患者の処理血液試料の経時的な連続的な評価は、胸腺細胞発達と同一であるプロセスと一致すると思われる（表７、患者２、３および４、ならびにチャート１）。
【０１７３】
ＣＤ８＋細胞の相対数は、処理および未処理試料において経時的に増加したが、程度がより大きかったのは、未処理試料においてであった。一方、ＣＤ８＋ＣＤ３＋細胞の相対数は、未処理試料において経時的に減少した。しかしながら、ＣＤ３＋細胞の相対数は、経時的に測定すると、処理血液試料において増加し、これらのタイプの細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ３＋単陽性細胞：胸腺細胞の成熟型に大いに一致した。さらに、これらの試料は、他のパネルでも免疫発現されたので（表３、４、５および６中に前記した）、その全変化は、極度にＴリンパ球前駆体および後継体の生成においてＢ細胞に原因があることを示す。
【０１７４】
別々のアリコットでＢ−ＣＬＬ患者由来の血液試料（番号２、３および４、表１、２、３、４、５、６、７）は、処理しないか、ＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するＰＥコンジュゲートモノクローナル抗体および同モノクローナル抗体の非コンジュゲート形態で処理した。ＰＥコンジュゲートの比較によると、処理は、明らかに、ＣＤ３陽性細胞、および同血液試料を抗体の非コンジュゲート形態で処理した場合に有意なレベルで観察されたＣＤ４のような関連マーカーの相対数の変化を示す。しかしながら、表面で発現されているＤＲ抗原を有しないＣＤ４５陽性細胞数の増加は、経時的に測定した場合に示された（表８を参照）。その発見は、経時的に免疫発現した場合に未処理試料において示されたのと同様であった（表６）。さらに、ＣＤ４５低発現細胞の相対数は、経時的に減少し、その現象は、同一患者の未処理試料においても示された（経時的に測定した場合）（チャート１Ａを参照）。
【０１７５】
Ｃ． 異なる特性を有する他のモノクローナル抗体のＴ−リンパ球生成に対する影響の比較
ＣＤ１９およびＣＤ３パネル
ＤＲ抗原のα−鎖の相同領域およびＭＨＣクラスＩ抗原の相同領域に対するモノクローナル抗体による血液試料の処理により、ＣＤ３＋細胞の数が減少し、ＣＤ１９＋細胞の数が増加した。ＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体による血液試料の処理により、ＣＤ１９＋細胞の数が減少し、ＣＤ３＋細胞の数が増加した。シクロホスファミドとともに後者のモノローナル抗体で処理すると、同様な効果が現れた（表１４ Ｂ−ＣＬＬ患者５／６、２時間処理）。
【０１７６】
同じ試料におけるＣＤ１９＋およびＣＤ３＋細胞の前進的な分析により、ＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体で処理した血液中においてのみ、ＣＤ３＋の相対数の増加がさらに明らかになった（表１４ 患者５／６、処理後２４時間）。しかしながら、シクロホスファミドおよびＤＲ抗原のβ−鎖に対するモノクローナル抗体で処理した血液試料の前進的な分析（２４時間後の患者５／６ 表１４）は、正確に同じ条件下で、２時間のインキュベーション時間で観察されたものと比較して、ＣＤ１９＋およびＣＤ３＋細胞の相対数において逆転を示す。
【０１７７】
一般に、同一患者の血液試料の、ＤＲ抗原のα−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体またはクラスＩ抗原のα−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体での処理は、未処理試料と比較して、ＣＤ１９−細胞（ｐａｎＢマーカー）の相対数の増加を示す。ＣＤ１９−ＣＤ３−細胞の相対数は、ＤＲ抗原のα−鎖に対するモノクローナル抗体で処理したか、またはクラスＩ抗原に対するモノクローナル抗体で処理した血液試料中で、わずかに減少した（表１４およびチャート２、３、および４を参照）。クラスＩ抗原に対するモノクローナル抗体での、患者０９の血液試料の処理により、ＣＤ３＋細胞の相対数が増加し、ＣＤ１９＋およびＣＤ１９−ＣＤ３−細胞の相対数がわずかに減少した。しかしながら、健康な供血者から得られたＢ−リンパ球の豊富な調製物の、ＤＲ抗原のβ−鎖またはα−鎖に対するモノクローナル抗体での処理により、Ｂ−ＣＬＬ患者で得られたのと同様な免疫発現型変化が示された。
【０１７８】
ＨＩＶ＋およびＩｇＡ欠損患者の、ＤＲ抗原のβ−鎖に対するモノクローナル抗体での処理により、ＣＤ３＋細胞の相対数が増加し、ＣＤ１９＋細胞の相対数が減少した。しかしながら、同一血液試料の、クラスＩ抗原の相同領域に対するモノクローナル抗体による処理は、同様の効果を生じなかった。Ｂ−細胞欠損患者（３４／ＢＤおよび０４／ＢＤ）から得られた血液試料の処理により、ＤＲ抗原のβ−鎖、クラスＩ抗原およびＣＤ４抗原に対するモノクローナル抗体で処理した場合、不定な免疫発現型変化が示された。
【０１７９】
ＣＤ４およびＣＤ８パネル
ＣＤ１９およびＣＤ３パネル（表１４）を用いて分析された血液試料も、また、ＣＤ４およびＣＤ８パネル（表１５）で免疫発現した。どちらのパネルも、相互に一致し、確定すると思われる。Ｂ−ＣＬＬ患者（表１５、患者５／６および１０、チャート２、３および４）の血液試料をＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体と一緒に、またはこのモノクローナル抗体およびシクロホスファミドと一緒に２時間インキュベートすると、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋細胞ならびに両方のマーカーを共同発現している細胞の相対数が増加した。一方、同一試料の、ＤＲ抗原のα−鎖の相同領域またはクラスＩ抗原のα−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体による処理は、同様の効果を生じなかった。
【０１８０】
ＤＲ抗原のβ−鎖に対するモノクローナル抗体およびシクロホスファミドで２時間および２４時間インキュベートして得られた免疫発現型の傾向を比較すると、ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞の相対数における逆の変化が明らかになり（表１５、２時間および２４時間のＢ−ＣＬＬ患者５／６）、かかる変化は、同一血液試料がＣＤ１９およびＣＤ３パネル（表１４同患者）で分析された場合に得られたのと一致した。後者の発見は、未分化細胞がＴ−リンパ球またはＢ−リンパ球に分化することができる場合、その後の分化が可逆的であることを示す。
【０１８１】
ＤＲおよびＣＤ３パネル
ＤＲおよびＣＤ３（表１６）パネルで得られた免疫発現型変化は、２時間分析で、ＤＲ抗原のベータ−もしくはアルファ−側の相同領域に対するモノクローナル抗体、またはクラスＩ抗原に対するモノクローナル抗体、またはＤＲ抗原のβ−鎖に対するモノクローナル抗体およびシクロホスファミドによる同一血液試料の処理の後の、ＣＤ１９およびＣＤ３パネル、ならびにＣＤ４およびＣＤ８パネル（表１４および１５、ならびにチャート２、３および４）で得られた発見を確認する。
【０１８２】
結果から、ＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体は、非常にＤＲ＋細胞からのＣＤ３陽性細胞の生産を促す能力を有することが明らかであろう。
【０１８３】
さらに、ＤＲ抗原のα−鎖の密着またはシクロホスファミドと共にその分子のβ−側の密着（インキュベーション時間を長くした）を含むような処理は、ＣＤ１９＋細胞またはＤＲ＋細胞の相対数の増加を促進した。
【０１８４】
ＣＤ５６＆１６およびＣＤ３パネル
血液試料、特に高いＢ−リンパ球数を有するＢ−ＣＬＬ患者の血液試料の、ＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体での処理により、ＣＤ５６＆１６陽性細胞の相対数が増加した。
【０１８５】
これらの患者において、ＣＤ３＋およびＣＤ５６＋ならびにＣＤ１６＋ＣＤ３＋細胞の相対数もまた、β−鎖に対するモノクローナル抗体での血液試料の処理の後に増加し、これは、同一血液試料をＣＤ３およびＣＤ１９ならびにＤＲおよびＣＤ３パネルで分析した場合に同一試料で示された先の観察結果を確かなものとした。
【０１８６】
ＣＤ４５およびＣＤ１４パネル
ＤＲ抗原のβ−またはアルファ−鎖に対するモノクローナル抗体または、β−鎖に対するモノクローナル抗体およびシクロホスファミド、またはクラスＩ抗原に対するモノクローナル抗体で処理した血液試料もまた、ＣＤ４５およびＣＤ１４パネルで分析した（表１８）。ＣＤ４５低、ＣＤ４５高およびＣＤ４５中の描写は、恣意的である。血液試料５／６の、ＤＲ抗原のβ−鎖に対するモノクローナル抗体、またはこのモノクローナル抗体およびシクロホスファミドでの処理（２時間）は、ＣＤ４５＋低細胞を生じ、ＣＤ４５＋中細胞の相対数を増加させた。しかしながら、前者の処理は、ＣＤ４５＋高細胞の相対数を増加させ、後者の処理は、ＣＤ４５＋中細胞の相対数を減少させ、これらの変化は、時間に依存することが明らかになった。
【０１８７】
クラスＩ抗原に対するモノクローナル抗体で処理した、患者５／６および１０（Ｂ−ＣＬＬ）の血液試料は、ＣＤ４５＋中細胞の相対数の減少を示し、未処理試料と比較して、同一処理後の血液試料０９およびＨＩＶ＋において同様の観察結果が示された。ＨＩＶ＋およびＩｇＡ／Ｄ患者の血液試料をクラスＩ抗原に対するモノクローナル抗体で処理すると、未処理試料またはＤＲ抗原のβ−鎖に対するモノクローナル抗体で処理した試料と比較して、ＣＤ４５＋低細胞の相対数が増加した。しかしながら、これらの患者の血液試料は、ＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体での処理によるＣＤ４５＋中細胞の相対数の減少を示した。中ＣＤ４５＋細胞は、クラスＩ抗原に対するモノクローナル抗体処理後のＩｇＡ／Ｄ患者の血液試料中で増加した。極度に大きく、非常顆粒状であり、ＣＤ４５抗原を高レベルで発現している細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原のＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体で処理した血液試料において示された（チャート１、２、３、４および５参照）。
【０１８８】
Ｄ８およびＣＤ２８パネル
ＣＤ２８抗原は、およそ６０％ないし８０％の末梢血Ｔ（ＣＤ３＋）リンパ球、５０％のＣＤ８＋Ｔリンパ球および５％の未熟ＣＤ３−胸腺細胞に存在する。胸腺細胞成熟の間、ＣＤ２８抗原発現は、ほとんどのＣＤ４＋ＣＤ８＋未熟胸腺細胞での低密度から事実上全ての成熟ＣＤ３＋、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋胸腺細胞での高密度へ増加する。細胞活性化は、さらにＣＤ２８抗原密度を増加させる。ＣＤ２８の発現もまた、ＣＤ８＋リンパ球を二つの機能群に分割する。ＣＤ８＋ＣＤ２８＋リンパ球は、同種抗原−特異的細胞毒性を媒介し、それは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩに制限されている。細胞増殖の抑制は、ＣＤ８＋ＣＤ２８＋サブセットによって媒介される。ＣＤ２８抗原は、細胞付着分子であり、活性Ｂリンパ球に存在するＢ７／ＢＢ−１抗原のリガンドとして機能する。
【０１８９】
Ｂ−ＣＬＬ患者（表１９、患者５／６および８）の血液試料をＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体で処理すると、ＣＤ８＋、ＣＤ２８＋およびＣＤ８＋ＣＤ２８＋細胞の相対数が増加し、全てのその他のタイプの処理では、増加しなかった。
【０１９０】
ＣＤ３４およびＣＤ２パネル
ＣＤ３４抗原は、未熟造血前駆細胞および骨髄中の全ての造血コロニー形成細胞に存在し、それは、単分化能の（ＣＦＵ−ＧＭ，ＢＦＵ−Ｅ）および多能性の前駆体（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ，ＣＦＵ−ＭｉｘおよびＣＦＵ−ｂｌａｓｔ）を含む。ＣＤ３４もまた、間質細胞前駆体で発現する。正常な骨における末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）＋Ｂ−およびＴ−リンパ系前駆体は、ＣＤ３４−である。ＣＤ３４抗原は、ＣＤ３３抗原を発現するがＣＤ１４およびＣＤ１５抗原を欠損する初期の骨髄細胞、およびＣＤ７１抗原を発現し、かすかにＣＤ４５抗原を発現する初期の赤血球細胞に存在する。ＣＤ３４抗原もまた、毛細管内皮細胞およびおよそ１％のヒト胸腺細胞で見られる。正常な末梢血リンパ球、単球、顆粒球および血小板は、ＣＤ３４抗原を発現しない。ＣＤ３４抗原密度は、初期の造血前駆細胞で最も高く、該細胞の成熟につれて減少する。該抗原は、完全に分化した造血細胞には存在しない。
【０１９１】
拘束されていないＣＤ３４＋前駆細胞は、ＣＤ３８−、ＤＲ−であり、ＣＤ７１、ＣＤ３３、ＣＤ１０およびＣＤ５のような系譜−特異的抗原を欠損しており、一方、系譜−拘束されたＣＤ３４＋細胞は、高密度でＣＤ３８抗原を発現する。
【０１９２】
ほとんどのＣＤ３４−細胞は、相互に、ＣＤ４５ＲＯまたはＣＤ４５ＲＡ抗原のいずれかを発現する。およそ６０％の急性Ｂ−リンパ性白血病および急性骨髄性白血病は、ＣＤ３４抗原を発現する。該抗原は、慢性リンパ性白血病（ＢまたはＴ系譜）またはリンパ腫では発現されない。ＣＤ２抗原は、Ｔリンパ球およびナチュラルキラーリンパ球（ＮＫ）のサブセットに存在する。
【０１９３】
結果は、チャート２、３および５に示す。
【０１９４】
ＤＲ抗原のβ−鎖または同抗原のα−鎖に対するモノクローナル抗体での処理後のＢ−ＣＬＬ患者の血液試料の分析（表２０、患者５／６、２時間）により、前者の抗体での処理後、ＣＤ３４＋およびＣＤ３４−ＣＤ２＋細胞の相対数の著しい増加が明らかになった。同血液試料は、他のマーカーに対して、前記したパネル（表１４ないし１９を参照）で免疫発現されたので、ここで観察されたＣＤ３４＋およびＣＤ３４＋ＣＤ２−細胞の相対数の増加は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋、ＣＤ８＋ＣＤ３＋およびＣＤ４＋ＣＤ３＋単陽性（ＳＰ）細胞の相対数の増加と同時に起こると思われる。さらに、唯一、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖の密着であろうと思われるこれらの発見は、該プロセスがＢリンパ球退行を経てＴ−リンパ球を生じていることを直接支持する。
【０１９５】
２４時間後の同様の処理の分析により、ＣＤ３４＋細胞は、レベルが減少して、Ｔリンパ球の相対数がさらに増加すると思われた。始めにＴ−リンパ球生成を引き起こした逆分化のプロセスは、逆転して、Ｂ−リンパ球生成を引き起こすことができる。前者の現象は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖に対するモノクローナル抗体およびシクロホスファミドと一緒の２時間インキュベーション時間で観察され、一方、後者のプロセスは、同一試料を同一処理で２４時間インキュベーション時間で示された（チャート２）。
【０１９６】
ＨＩＶ＋患者（表２０患者ＨＩＶ＋）の血液試料をＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖に対するモノクローナル抗体で処理すると、ＣＤ３４＋およびＣＤ２＋ＣＤ３４＋細胞の相対数が著しく増加し、同様に、同一血液試料をＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖に対するモノクローナル抗体および同抗原のα−鎖に対するモノクローナル抗体で処理した。しかしながら、この血液試料の、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のα−鎖に対するモノクローナル抗体での処理は、ＣＤ３４＋細胞のレベルに影響しなかった。そのとき白血病について調べられ、血液中に非常に高い不定形細胞（芽球）数を有した６日齢の乳児から得られた血液試料（ＢＢ／ＳＴ表２０）を、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖に対するモノクローナル抗体、または同抗原のα−鎖に対するモノクローナル抗体、または一緒に添加した両モノクローナル抗体で処理すると、その結果、以下の免疫発現型変化が起こった。
【０１９７】
未処理血液試料の分析により、ＣＤ３４＋およびＤＲ＋細胞の相対数は、著しく増加し、β−鎖に対するモノクローナル抗体での処理により、ＣＤ３４＋細胞の相対数は、さらに増加したが、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のα−鎖に対するモノクローナル抗体での処理、または一緒に添加した場合の該分子のαおよびβ−鎖に対するモノクローナル抗体での処理により、減少が示された。しかしながら、後者の処理により、ＣＤ３４＋ＣＤ２＋細胞の相対数が増加し、同一血液試料をＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖に対するモノクローナル抗体のみで処理した場合にその反対のことが起こった。同一患者の２４時間後の処理および未処理血液アリコットの分析で、ＣＤ３４＋の相対数は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖に対するモノクローナル抗体での処理で非常に高いレベルで維持されたことを除いて、前記した全ての処理で減少した。後者の処理で、２４時間後、ＣＤ３４＋ＣＤ２＋細胞の相対数が減少し続けた。
【０１９８】
これらの結果は、β−鎖を経たＨＬＡ−ＤＲ抗原の密着が、ＣＤ２＋ＣＤ３４＋プールから、またはＢ−ＣＬＬ患者のＢ−リンパ球のようなより成熟したタイプの細胞からのＣＤ３４＋細胞の生産を促進することを示し、これらの結果は、このタイプの処理が逆分化を促進することを示す。しかしながら、２４時間後の血液試料の免疫発現は、これらのタイプの細胞が別の系譜全体において存在すると思われ、この場合、細胞がＣＤ７およびＣＤ１３＆３３パネルで処理された血液試料の分析で観察された骨髄系譜に存在するか、またはむしろ、それら自身を該骨髄系譜に拘束すると思われることを示唆する。
【０１９９】
形態は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体での処理で、Ｂ−ＣＬＬのＢ−リンパ球および健康な個体（ＣＤ１９ビーズを用いる）の豊富なフラクションの免疫発現型特徴を変化させる。これらは、Ｂ−リンパ球の形態の変化を伴った。Ｂ−リンパ球は、未処理血液スミア中で、スライドガラスでのコロニー形成が、顆粒球、単球、多数の原始様細胞および有核赤血球によって代わられることが観察された。有糸分裂像または有意な細胞死は、処理または非処理血液スミア中で観察されなかった。
【０２００】
表２０の結果もまた、本発明方法によると、より成熟した未分化細胞の逆分化によって未分化細胞を調製することが可能であるというさらに重要な発見を証明する。
【０２０１】
Ｄ． 顕微鏡写真
前記したような抗原試験に加えて、本発明の方法を、顕微鏡を用いて視覚的に行った。
【０２０２】
この点において、図１は、本発明の方法以前の分化したＢ細胞の顕微鏡写真である。図２は、本発明の方法（ここでは、薬剤は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体であった）に従って、Ｂ細胞の逆分化によって形成された未分化細胞の顕微鏡写真である。該未分化細胞は、暗く染色された細胞凝集群である。図３は、同未分化細胞の顕微鏡写真であるが、より低い倍率で拡大した。
【０２０３】
図１ないし３は、したがって、本発明の方法によるＢ細胞の未分化幹細胞への逆分化を視覚的に示す。
【０２０４】
図４は、本発明の方法以前の分化したＢ細胞の顕微鏡写真である。図５は、本発明に従って（ここで使用した薬剤は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体であった）、Ｂ細胞の逆分化によって形成された未分化細胞の顕微鏡写真である。また、未分化細胞は、暗く染色された細胞凝集群である。図６は、図５の同未分化細胞から分化した顆粒球の形成の顕微鏡写真である。
【０２０５】
従って、図４ないし６は、本発明の方法によって、Ｂ細胞が未分化幹細胞へ逆分化し、次いで、その未分化細胞が、最初の分化細胞とは異なる系譜である新たな分化細胞に拘束されることを視覚的に証明する。
【０２０６】
本発明の方法によってＴ細胞が未分化幹細胞へ逆分化し、次いで、その未分化細胞が、最初の分化細胞とは異なる系譜である新たな分化細胞に拘束されることもまた、顕微鏡によって追跡された。
【０２０７】
Ｅ． 概要
要するに、該実施例は、幹細胞の発生において利用され得るＴおよびＢリンパ球の発生および発達に関係する非常に興味深い発見を明らかにし、およそ数時間で末梢血試料中でのリンパ造血に影響する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの実験を記述する。
【０２０８】
高Ｂリンパ球数を伴うＢ−細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）患者から得られた末梢血試料の、クラス−ＩＩ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体での処理は、単陽性（ＳＰ）Ｔ−リンパ球および、同時に共同発現される胸腺細胞マーカーＣＤ４およびＣＤ８抗原に対して二重陽性であるその前駆体の相対数の著しい増加を引き起こした。しかしながら、これらの現象は、常に、Ｂ−リンパ球の相対数の有意な減少を伴った。これらの観察は、同一血液試料をクラス−ＩＩ抗原のα−鎖の相同領域またはクラス−Ｉ抗原の相同領域に対するモノクローナル抗体で処理した場合には示されなかった。
【０２０９】
Ｂ−細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者から得られた全血の、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のＢ鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体での処理は、Ｔ−リンパ球生成を引き起こすと思われた。この事象は、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーを共同発現している二重陽性細胞の出現、ＣＤ３４を発現している細胞の出現およびそれに付随する単陽性ＣＤ４＋ＣＤ３＋およびＣＤ８＋ＣＤ３＋リンパ球の相対数の増加によってマークされた。さらに、かかる細胞の発生において生じた免疫発現型変化は、特に経時的に測定した場合に、胸腺細胞発達について例証されたものと一致した。
【０２１０】
全血をＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体と一緒に２時間インキュベートして生じた二重陽性細胞（ＤＰ）のパーセントは、経時的に減少し、これらの事象は、同時に、および遅れても、単陽性ＣＤ４＋ＣＤ３＋およびＣＤ８＋ＣＤ３細胞のパーセントの増加を伴った。ＴＣＲαおよびβ鎖もまた、これらのタイプの細胞で発現された。
【０２１１】
Ｂ−リンパ球は、常に、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＩｇＭおよびＤＲのようなマーカーを失うことが観察され、これは、ＣＤ３４＋およびＣＤ３４＋ＣＤ２＋細胞の出現、ＣＤ７＋細胞の増加、ＣＤ８＋ＣＤ２８＋およびＣＤ２８＋細胞の増加、ＣＤ２５＋細胞の増加、ＣＤ１０＋およびＣＤ３４＋細胞ならびにＣＤ３４＋およびＣＤ１９＋細胞の出現、ＣＤ５＋細胞およびＣＤ４５抗原を低レベルで発現している細胞の増加と同時に起こった。これらの変化は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体での血液の処理が原因であった。
【０２１２】
処理前のＢ−ＣＬＬ患者の血液における白血球の大部分はＢリンパ球であったので、かかる処理と関連した免疫発現型変化は、Ｂリンパ球の逆分化およびその後の拘束（すなわち、再拘束）と一致する。さらに、シクロホスファミドおよびＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖に対するモノクローナル抗体での処理後にＴ−リンパ球になることを促されたＢ−ＣＬＬ患者のＢ−リンパ球は、インキュベーションを延長してこの処理をした後、Ｂ−リンパ球に逆戻りすることができた。
【０２１３】
ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖に対するモノクローナル抗体で処理した試料の、ＣＤ１６＆５６およびＣＤ３およびＣＤ８およびＣＤ３パネルでの分析で、これらのマーカーを発現している細胞の相対数は、ＣＤ１９およびＣＤ３およびＤＲおよびＣＤ３のようなパネルで測定したものと一致した増加において、着々と増加する。比濁分析および免疫電気泳動を用いたＨＩＶ感染患者の処理および未処理試料の上清の研究により、ＩｇＧレベルの増加が明らかになり、それは、Ｂ−細胞が形質細胞段階を経たにちがいないことを示す。前記した全ての細胞の相対数の増加もまた、ＣＤ５６＆１６抗原を非常に多数発現している中サイズの非常に顆粒状の細胞の出現を伴った。極度に大きく、非常に顆粒状の他の細胞が一時的に観察され、これらは、ＣＤ３４に対して陽性であり、ＣＤ４ＣＤ８マーカーに対して二重陽性であった。他の一過性の細胞もまた観察され、これらは、大きくかつ顆粒状であり、ＣＤ３およびＣＤ１９受容体に対して陽性であった。Ｂ−リンパ球の大部分に存在するＣＤ２５は、失われ、常に数の増加が観察された新たに形成されたＴ−リンパ球によって発現されるようになった。
【０２１４】
ＣＤ２８＋ＣＤ８＋およびＣＤ２８＋細胞は、Ｂ−ＣＬＬ患者の全血の、ＤＲ抗原のＢ鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体での処理後に現れた。これらの発見は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体での血液の処理に起因した。
【０２１５】
この方法で生じたＴ−リンパ球生成は、健康な供血者の末梢血、臍帯血、骨髄、ＨＩＶ＋患者およびＡＩＤＳ患者を包含する様々な感染患者、健康な供血者の血液試料から得られたＢリンパ球の豊富なフラクション、ＩｇＡ欠損患者および様々な他の病状の他の患者においても観察された。さらに、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体で処理したＢ−ＣＬＬ患者二人の試料における骨髄マーカーの分析は、ＣＤ１３およびＣＤ３３のような骨髄マーカーを発現している細胞の相対数の有意な増加を示した。これらのマーカーは、ＣＤ５６＆１６またはＣＤ７抗原と共同発現された。しかしながら、Ｔ−リンパ球マーカーを有しており、骨髄抗原を有していないＣＤ７＋細胞の相対数は、細胞の別の群で観察された。これらの個々の観察は、未処理試料において、またはクラスＩ抗原もしくはＨＬＡ−ＤＲ抗原のα−鎖の相同領域に対するモノクローナル抗体で処理した試料において、見られなかった（チャート２＆３を参照）。これらの最終結果は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のβ−鎖を経て一度引き起こされたＢ−リンパ球は、Ｔ−リンパ球前駆細胞に退行することができるだけでなく、骨髄系譜および赤血球系譜にも存在し得ることを示唆する。
【０２１６】
本発明の方法によって生産される幹細胞は、いずれの組織の幹細胞でもあってよく、必ずしもリンパ造血前駆細胞に限定されないことに注意すべきである。
【０２１７】
本発明の他の変形例は、当事者には明白であろう。
【０２１８】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３−１】
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【表２３−２】
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【表２４】
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【表２５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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