(57)【要約】【課題】  有効な急性肝炎又は劇症肝炎の予防又は治療剤、及び喘息の予防又は治療剤を提供する。【解決手段】  パラオキソキナーゼを有効成分として含む急性肝炎又は劇症肝炎の予防又は治療剤、及び喘息の予防又は治療剤。パラオキソキナーゼはヒト血清パラオキソキナーゼ（ＰＯＮ１）が好適である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラオキソキナーゼを有効成分として含む急性肝炎又は劇症肝炎の予防又は治療剤。
【請求項２】
パラオキソキナーゼが下記の(a)又は(b)のポリペプチドである請求項１に記載の急性肝炎又は劇症肝炎の予防又は治療剤。
(a)  配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)  配列番号１において、１又は複数のアミノ酸が欠失、付加、又は置換したアミノ酸配列からなり、かつラクトナーゼ活性を有するポリペプチド
【請求項３】
注射剤である請求項１又は２に記載の急性肝炎又は劇症肝炎の予防又は治療剤。
【請求項４】
パラオキソキナーゼを有効成分として含む喘息の予防又は治療剤。
【請求項５】
パラオキソキナーゼが下記の(a)又は(b)のポリペプチドである請求項４に記載の喘息の予防又は治療剤。
(a)  配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)  配列番号１において、１又は複数のアミノ酸が欠失、付加、又は置換したアミノ酸配列からなり、かつラクトナーゼ活性を有するポリペプチド
【請求項６】
注射剤、又は吸入剤である請求項４又は５に記載の喘息の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク製剤である急性肝炎、劇症肝炎、及び喘息の予防又は治療剤に関する
【背景技術】
【０００２】
血清パラオキソキナーゼ（ＰＯＮ１）は、パラオキソキナーゼ(以下、「ＰＯＮ」と略称することがある。)と称される酵素ファミリーの代表的な酵素である。ＰＯＮに共通の活性はラクトン加水分解活性であり、ＰＯＮ１は、ラクトン、エステル、例えばパラオキソンのような有機リン酸塩等の広範囲の基質を加水分解する。
生体内のＰＯＮ１レベルと疾患との関係については多数の報告がある。
例えば、生体内では、ＰＯＮ１は、肝臓で合成され、血中では高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）粒子の上にアポＡ−Ｉと結合して存在する。ＰＯＮ１は低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化を阻害することにより、動脈硬化の進展を抑制することが知られている(非特許文献１)
また、特許文献１には、甲状腺亢進が、低い血清ＰＯＮ１活性、及び肝臓疾患と関連していることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−５０４１７７号公報(段落０１１６)
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Chem.Biol.Interact.1993、Jun;87:161-71.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、有効な急性肝炎又は劇症肝炎の予防又は治療剤、及び喘息の予防又は治療剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を得た。
(i)  コンカナバリンＡにより誘発される劇症肝炎モデル動物にＰＯＮ１を投与することにより、肝機能障害が抑制された。
(ii)  卵白オブアルブミン及び水酸化アルミニウムゲルにより誘導される喘息モデル動物にＰＯＮ１を投与することにより、喘息による炎症が抑制された。
本発明は上記知見に基づき、さらに研究を重ねて完成されたものであり、以下の急性肝炎、又は劇症肝炎の予防又は治療剤、及び喘息の予防又は治療剤を提供する。
【０００７】
項１．
パラオキソキナーゼを有効成分として含む急性肝炎又は劇症肝炎の予防又は治療剤。
項２．
パラオキソキナーゼが下記の(a)又は(b)のポリペプチドである項１に記載の急性肝炎又は劇症肝炎の予防又は治療剤。
(a)  配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)  配列番号１において、１又は複数のアミノ酸が欠失、付加、又は置換したアミノ酸配列からなり、かつラクトナーゼ活性を有するポリペプチド
項３．
注射剤である項１又は２に記載の急性肝炎又は劇症肝炎の予防又は治療剤。
項４．
パラオキソキナーゼを有効成分として含む喘息の予防又は治療剤。
項５．
パラオキソキナーゼが下記の(a)又は(b)のポリペプチドである項４に記載の喘息の予防又は治療剤。
(a)  配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)  配列番号１において、１又は複数のアミノ酸が欠失、付加、又は置換したアミノ酸配列からなり、かつラクトナーゼ活性を有するポリペプチド
項６．
注射剤、又は吸入剤である項４又は５に記載の喘息の予防又は治療剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、急性肝炎、特に劇症肝炎を効果的に予防、又は治療できる医薬が提供された。
劇症肝炎は有効な内科的治療法が確立していない。血漿交換、ステロイド、グルカゴン・インシュリン療法など一応治療法と呼ばれるものはあるが、致死率が高く、有効な治療法は存在しないのが現状である。
肝炎の症状としては倦怠感、食欲不振、吐き気、発熱、黄疸等が現れるが、肝炎が発生して６ヶ月以内のものを特に急性肝炎と呼び、急性肝炎の症状発現後８週間以内に高度の肝細胞機能障害に基づく肝性昏睡II度以上の脳症を来たし、プロトロンビン時間４０％以下を示す場合を劇症肝炎と呼んでいる。
【０００９】
一般的に急性肝炎から劇症肝炎への過程は、急激な肝細胞破壊による肝合成機能の低下、それに続く肝解毒代謝機能の低下の順を追って進行する。肝細胞の大量かつ急激な破壊は強い倦怠感、食欲不振などの自覚症状となって現れ、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）等のトランスアミナーゼの値とＬＤＨ（Lactate dehydrogenase）値の上昇とともに黄疸が発症する。また肝解毒代謝機能の低下により肝性昏睡IまたはII度の神経症状が現れるので、診断には脳波検査も重要である。
ＰＯＮの投与により、高度の肝細胞破壊による肝合成機能低下や、高度の肝細胞破壊による肝解毒代謝機能低下が抑制される。これが臨床検査値に反映されて、肝機能マーカーであるＡＬＴ、ＡＳＴ、ＬＤＨの上昇が効果的に抑制される。また、劇症肝炎患者の生存率が向上する。
【００１０】
また本発明によれば、喘息を効果的に予防、又は治療できる医薬が提供された。
喘息は、「喘息予防・管理ガイドライン２００６」によれば、成人喘息は気道の慢性炎症と種々の程度の気道狭窄と気道過敏性の亢進、そして、臨床的には繰り返し起こる咳、喘鳴、呼吸困難で特徴づけられる。気道炎症には、好酸球、T細胞、マスト細胞などの炎症細胞、気道上皮細胞、線維芽細胞をはじめとする気道構成細胞、および種々の液性因子が関与する。持続する気道炎症は、気道障害とそれに引き続く気道構造の変化を惹起し、非可逆性の気道制限をもたらし、気道過敏症を亢進させる。
ＰＯＮの投与により、喘息による気道炎症が抑制され、具体的には、肺炎症部位の白血球数、特に好酸球数の増加が効果的に抑制される。
さらに、本発明の医薬は実質的に副作用を起こさない安全なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１，４，６で得られたＰＯＮ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルを示す図である。
【図２】実施例１，４，６で得られたＰＯＮ１のウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
ＰＯＮ
本発明の急性肝炎又は劇症肝炎の予防又は治療剤、及び喘息の予防又は治療剤は、有効成分として、ＰＯＮを含む。ＰＯＮには、ＰＯＮ１(血清パラオキソキナーゼ)、ＰＯＮ２、ＰＯＮ３等が含まれる。また、ＰＯＮの由来は特に制限されないが、ヒト由来ＰＯＮが好ましい。
中でも、ヒトＰＯＮ１が好ましく、(a)配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は(b) 配列番号１において、１又は複数のアミノ酸が欠失、付加、又は置換したアミノ酸配列からなり、かつラクトナーゼ活性を有するポリペプチドがより好ましい。
「１又は複数」は、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらにより好ましくは１〜３個、さらにより好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個である。
【００１３】
本発明において、ラクトナーゼ活性を有することは、γ-チオブチロラクトンを加水分解する活性を有することをいう。
具体的には、γ−ブチロラクトンの加水分解により生成する４−メルカプト酪酸の生成を、４−メルカプト酪酸と５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）との反応生成物である５−チオ−２−ニトロ安息香酸を４５０ｎｍにおける吸光度の変化を指標に検出することにより確認できる。
より具体的には、ホモシステインチオラクトナーゼ活性測定キット「Ａｌｆｒｅｓａ  Ａｕｔｏ  ＨＴＬａｓｅ」（アルフレッサファーマ社）を用いた測定方法において、ホモシステインチオラクトナーゼ活性が確認された場合に、ラクトナーゼ活性ありと判定する。
【００１４】
ＰＯＮは種々の哺乳動物の血漿、肝臓、腎臓、肺および脳の内膜等から、公知のタンパク質精製方法を組み合わせて精製することができる。また、配列番号１のアミノ酸配列からなるヒトＰＯＮ１は、ヒト血漿から精製でき、或いは化学合成できる。さらに、後掲の実施例に示す通り、組換えＰＯＮ１遺伝子を用いて細胞培養により生産することもできる。
【００１５】
医薬製剤
製剤は、通常、非経口投与剤とすればよいが、経口投与剤とすることもできる。本発明の医薬の有効成分はタンパク質であるから、剤型は、吸収され易い非経口投与剤が好ましく、注射剤がより好ましい。また、喘息の予防又は治療剤の場合は、吸入剤も好ましい。
非経口投与剤としては、注射剤、吸入剤、貼付剤、坐剤などが挙げられる。
【００１６】
＜注射剤＞
注射剤としては、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などが挙げられる。注射剤は、ＰＯＮを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液（注射剤用担体）に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが挙げられる。適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられる。溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
注射剤中のＰＯＮの含有量は、ＰＯＮの乾燥重量に換算して、例えば約0.01μg／mL 〜1g／mL、好ましくは約0.1μg／mL 〜500mg／mL、より好ましくは約1μg／mL 〜200mg／mLとすればよい。
【００１７】
＜貼付剤＞
貼付剤としては、ＰＯＮを含む基剤を支持体に支持させた硬膏剤、パップ剤、テープ剤、プラスター剤等が挙げられる。基剤としては、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、カラギーナン、マンナン、アガロース、デキストリン、カルボキシメチルデンプン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、メトキシエチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プルラン等のポリマー類；白色ワセリン、黄色ワセリン、パラフィン、セレシンワックス、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；ゲル化炭化水素（例えば、商品名プラスチベース、ブリストルマイヤーズスクイブ社製）；ステアリン酸等の高級脂肪酸；セタノール、オクチルドデカノール、ステアリルアルコール等の高級アルコール；ポリエチレングリコール（例えば、マクロゴール4000等）；プロピレングリコール、グリセリン、ジプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、濃グリセリン等の多価アルコール；モノオレイン酸エステル、ステアリン酸グリセリド等の脂肪酸エステル類；リン酸緩衝液などが挙げられる。さらに、溶解補助剤、無機充填剤、pH調節剤、保湿剤、防腐剤、粘稠剤、酸化防止剤、清涼化剤などの添加剤が添加されていてもよい。
基剤中のＰＯＮの含有量は、ＰＯＮの乾燥重量に換算して、例えば約0.01 〜40重量％、好ましくは約0.1 〜20重量％、より好ましくは約0.5 〜10重量％とすればよい。
【００１８】
＜吸入剤＞
吸入剤としては、エアゾール剤、吸入用粉末剤、吸入用液剤（例えば、吸入用溶液、吸入用懸濁剤等）、カプセル状吸入剤等が挙げられる。吸入用液剤は用時に水または他の適当な媒体に溶解または懸濁させて使用する形態であってもよい。
吸入剤は常法に従い製造できる。例えば、ＰＯＮを乾燥粉末または液状にして、吸入噴射剤、担体、又はその両者に配合し、適当な吸入容器に充填することにより製造される。ＰＯＮを粉末化する場合、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム等とともに微粉末にし、均一な混合物にするか、造粒して粉末剤を調製することができる。また、ＰＯＮを液状にする場合、水、生理食塩液、バッファー等の液状担体に溶解すればよい。
噴射剤としては、従来公知の噴射剤、例えば、代替フロン、液化ガス噴射剤（例えば、フッ化炭化水素、液化石油、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル等）、圧縮ガス（例えば、可溶性ガス（例えば、炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等）、不溶性ガス（例えば、窒素ガス等）などが用いられる。
【００１９】
吸入剤には、さらに、必要に応じて添加剤を配合してもよい。添加剤としては、吸入用液剤の場合は、防腐剤（塩化ベンザルコニウム、パラベン等）、着色剤、緩衝化剤（リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、濃グリセリン等）、増粘剤（例えば、カリボキシビニルポリマー等）、吸収促進剤等が挙げられる。また、吸入用粉末剤の場合は、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等）、矯味剤（例えば、クエン酸、メントール、グリチルリチンアンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉末等）、結合剤（例えば、デンプン、デキストリン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、白糖等）、賦形剤（例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット、マルトース、セルロース等）、着色剤、保存剤（例えば、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等）、安定化剤（例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム等）、吸収促進剤（胆汁酸塩、キトサン等）等が挙げられる。
噴霧剤中のＰＯＮの含有量は、吸入用液剤の場合は、ＰＯＮの乾燥重量に換算して、例えば約0.01μg／mL 〜1g／mL、好ましくは約0.1μg／mL 〜500mg／mL、より好ましくは約1μg／mL 〜300mg／mLとすればよい。また、吸入用粉末剤の場合は、ＰＯＮの乾燥重量に換算して、例えば約0.1 〜60重量％、好ましくは約0.5 〜40重量％、より好ましくは約1〜20重量％とすればよい。
【００２０】
＜座剤＞
坐剤は、ＰＯＮを通常用いられる坐薬用基剤と混合することにより調製される。座剤中のＰＯＮの含有量は、ＰＯＮの乾燥重量に換算して、例えば約0.01〜40重量％、好ましくは約0.1〜20重量％、より好ましくは約0.5 〜10重量％とすればよい。
【００２１】
＜経口投与剤＞
経口投与剤としては、散剤、顆粒剤、錠剤、タブレット剤、丸剤、カプセル剤、チュアブル剤、乳剤、液剤、シロップ剤などが挙げられる。固形製剤は、上記有効成分に、薬学的に許容される担体や添加剤を配合して調製される。例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、でんぷん、マンニットのような賦形剤；アラビアゴム、ゼラチン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースのような結合剤；カルメロース、デンプンのような崩壊剤；無水クエン酸、ラウリン酸ナトリウム、グリセロールのような安定剤などが配合される。さらに、ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなどでコーティングしたり、カプセル化したりしてもよい。また、液体製剤は、例えば、上記の有効成分を、水、エタノール、グリセリン、単シロップ、又はこれらの混液などに、溶解又は分散させることにより調製される。
経口投与剤中のＰＯＮの含有量は、ＰＯＮの乾燥重量で、例えば約0.1 〜60重量％、好ましくは約0.5〜40重量％、より好ましくは約1〜20重量％とすればよい。
【００２２】
使用方法
＜急性肝炎又は劇症肝炎の予防又は治療剤＞
本発明の急性肝炎又は劇症肝炎の予防又は治療剤の使用量は、対象の症状や年齢などにより異なるが、ＰＯＮの1日投与量が、乾燥重量に換算して、約1μg／kg 〜500mg／kgであることが好ましく、約0.01mg／kg 〜100mg／kgであることがより好ましく、約0.1mg／kg 〜50mg／kgであることがさらにより好ましい。
急性肝炎又は劇症肝炎の予防又は治療剤の使用対象は、急性肝炎、劇症肝炎の患者の他、これらの疾患に移行する可能性があるＡ型肝炎ウィルス又はＢ型肝炎ウィルス保菌者、薬物性肝炎患者、自己免疫性肝炎患者等が好適である。
即ち、本発明は、ＰＯＮを、哺乳動物、特に人に投与する、急性肝炎又は劇症肝炎の予防又は治療方法も包含する。
本発明において、「予防」には、発症を回避すること、発症率を抑制すること、症状の進展を抑制すること等が含まれる。また、「治療」には、治癒させること、症状を緩和又は改善すること等が含まれる。
【００２３】
＜喘息の予防又は治療剤＞
本発明の喘息の予防又は治療剤の使用量は、対象の症状や年齢などにより異なるが、ＰＯＮの1日投与量が、乾燥重量に換算して、約1μg／kg〜500mg／kgであることが好ましく、約0.01mg／kg〜100mg／kgであることがより好ましく、約0.1mg／kg〜50mg／kgであることがさらにより好ましい。
喘息の予防又は治療剤の使用対象は、気管支喘息の患者の他、喘息を発症し易いアトピー患者、急性好酸球性肺炎、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎に伴う気管支病変等が好適である。
即ち、本発明は、ＰＯＮを、哺乳動物、特に人に投与する、喘息の予防又は治療方法も包含する。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を、実施例を挙げて、より具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
〔血漿からのヒトパラオキソナーゼ１の精製〕
肝炎ウイルスその他の病原微生物を実質的に除去したヒト血漿を原料とし、ヒト血漿コーン低温エタノール分画法で画分ＩＶ−１を得た。該画分ＩＶ−１を、２〜８℃の低温室で、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液に溶解した。さらに、１２００ｇ、４℃、１０分で遠心分離を行い、上清の蛋白質成分を回収した。更に、回収した上清を３００００ｇ、４℃、５０分で遠心分離を行い、中間層の溶液層（上層：脂質層、下層：沈澱物）を回収した。
【００２５】
次に回収した溶液を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）で平衡化したSuperdex 200 (GE Healthcare社製)に負荷した。次に平衡化と同様の溶液を用いて溶出を行い、UV280ｎｍ測定での１番目のピークを高分子領域画分として分取した。この溶液を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）で平衡化したPoros 50 Micron HQ（アプライドバイオシステムズ社製）に負荷し、平衡化と同様の溶液を用いて洗浄後、０．４M塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）で溶出した。次にこの溶液を分画分子量１００００の遠心式限外ろ過膜（ミリポア社製）を用いて２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）に置換した。次に２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）で平衡化したPoros 50 HS（アプライドバイオシステムズ社製）に負荷し、未吸着画分を得た。次に、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）で平衡化したCHTセラミックハイドロキシアパタイトTypeII４０μｍ（バイオラッド社製）に負荷し、平衡化と同様の溶液で洗浄後、さらに０．５M塩化ナトリウムを含む２０ｍMリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）及び０．１Mリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）で洗浄した後、０．４Mリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）で溶出を行った。次にこの溶出液を分画分子量１００００の遠心式限外ろ過膜（ミリポア社製）を用いて２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）に置換後、１ｍｌの濃縮溶液を得た。次に、NHS−activated HP 1ml（GE Healthcare社製）に抗ヒトパラオキソナーゼ１抗体（コスモバイオ社製）２００μｇを結合させ、パラオキソナーゼ１抗体カラムを作製した。次に濃縮溶液を２０ｍMリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）で平衡化したパラオキソナーゼ抗体カラムに負荷し、平衡化と同様の溶液を用いて洗浄後、２Mグリシン塩酸（ｐH３．０）で溶出し、パラオキソナーゼ１含む溶液を得た。次にこの溶液を０．５Mトリス塩酸緩衝液（ｐH９．５〜１０．５）で速やかにｐＨ６．８〜７．４に中和し、分画分子量１００００の遠心式限外ろ過膜（ミリポア社製）を用いて１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液を注入し、限外ろ過することにより、液の置換を行った。続いて、孔径０．２２μｍの無菌ろ過フィルター（ミリポア社製）を用いて無菌ろ過を行い、パラオキソナーゼ１製剤（ｐＨ：７．３，パラオキソナーゼ１蛋白含量：０．３ｍｇ／ｍＬ，液量２００μＬ）とした。
【００２６】
実施例２
〔遺伝子組換えヒトパラオキソナーゼ１の発現ベクターの構築〕
ヒトパラオキソナーゼ１遺伝子は、ヒトパラオキソナーゼ１遺伝子変異体を含む、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターをＯＰＥＮ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社より入手し（Ｃｌｏｎｅ  ＩＤ  ３０９１５１６９）、変異導入ＰＣＲ法により、正常なヒトパラオキソナーゼ１遺伝子に変換し、得た。
次に、ttgctagcccccgaccatggcgaagctg（配列番号２）の塩基配列からなるフォワードプライマー、およびttgcggccgctcattagtggtggtggtggtggtgcttttcgaactgcgggtggctccagagctcacagtaaagagc（配列番号３）の塩基配列からなるリバースプライマーを用いたＰＣＲ法により、ヒトパラオキソナーゼ１遺伝子の３’末端側にＮｈｅＩ制限酵素サイト、５’末端側に６×Ｈｉｓタグ配列、ＮｏｔＩ制限酵素サイト、および終止コドンを付加した断片を得、制限酵素ＮｈｅＩおよび制限酵素ＮｏｔＩで消化し、同じく制限酵素ＮｈｅＩおよび制限酵素ＮｏｔＩで消化した遺伝子増幅用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−（＋）−ｄｈｆｒに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、遺伝子組み換えヒトパラオキソナーゼ１発現ベクターを構築した。
【００２７】
遺伝子増幅用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−（＋）−ｄｈｆｒは、発現ベクターとして、pcＤＮＡ3.1-(+)ベクター（invitrogen社製）にマウスdhfr発現カセットを挿入したものである。マウスdhfr遺伝子発現カセットは、pSV2-dhfr（ATCC 37146）を鋳型とし、ＰＣＲ法にてクローニングした。このとき、フォワードプライマーは、cccacgtgtcgcgacaattagtcagcaaccatagtcc (配列番号４)とし、リバースプライマーは、cccacgtgtcgcgaggacaaaccacaactagaatgc (配列番号５)とした。得られたＰＣＲ断片は、ＴＡクローニング法によりpCR-2.1ベクター（invitrogen社製）にクローニングし、Nru Iを付加したdhfr遺伝子をクローニングしたベクターpCR-2.1-dhfrを作製した。そして、得られたベクターpcDNA3.1-(+)およびベクターpCR-2.1-dhfrを制限酵素Nru Iで消化し、それぞれの断片をライゲーションして、pcDNA3.1-dhfrを作製した。
本発現ベクターは薬剤選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子発現カセットを持ち、また遺伝子増幅のためのdhfr遺伝子発現カセットを持つ。ネオマイシン耐性遺伝子に対する選択薬剤としてはジェネティシン、G418、ネオマイシン硫酸塩等が一般的に使用され、またdhfr遺伝子発現カセットを利用した遺伝子増幅のための薬剤としてはメトトレキセートが一般的に使用される。
【００２８】
実施例３
〔２９３Ｆ細胞を用いた発現〕
実施例２で得られた遺伝子組み換えヒトパラオキソナーゼ１発現ベクターを用いて、フリースタイル２９３遺伝子導入システム（インビトロジェン社）を用いて同キットの添付マニュアルに従い、一過性発現を行い、遺伝子組み換えヒトパラオキソナーゼ１を含む培養上清を作製した。なお、培養上清は、フリースタイル２９３遺伝子導入システム添付文書に準じて発現株と培地を混合培養し作製した。
【００２９】
実施例４
〔遺伝子組換えヒトパラオキソナーゼ１の発現株（２９３Ｆ細胞）培養上清からのヒトパラオキソナーゼ１含有製剤の調製〕
ヒトパラオキソナーゼ１を発現、分泌させた２９３Ｆ細胞培養上清と１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．６〜７．０）とを等量混合し、撹拌後０．４５μｍフィルター（ミリポア社製）により沈殿物を除去した。このろ過液を、あらかじめ０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）で平衡化したHis trap HP (GE Healthcare社製)に負荷した。次いで平衡化と同様の溶液を用いて洗浄を行い、０．５Ｍ塩化ナトリウム及び２５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜７．５）でさらに洗浄を行った。最後に０．５Ｍ塩化ナトリウム及び５００ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜７．５）でHis trap HP吸着画分の溶出を行った。次にHis trap HP吸着画分の溶出液を分画分子量１００００の遠心式限外ろ過膜（ミリポア社製）を用いて濃縮し、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したSuperdex２００ １６／６０（GE Healthcare社製)に負荷し、平衡化と同様の溶液を用いて溶出を行い、０．６ｍｇ／ｍLのパラオキソナーゼ１溶液を得た。続いて、孔径０．２２μｍの無菌ろ過フィルター（ミリポア社製）を用いて無菌ろ過を行い、パラオキソナーゼ１製剤とした。
パラオキソナーゼ１製剤について分析した結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
2012121870.tif 000002
このようにして得られた製剤は、そのまま注射液として用いることができる。
【００３１】
実施例５
〔ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた安定発現株の構築〕
実施例２で得られた遺伝子組換えヒトパラオキソナーゼ１発現ベクターを、エレクトロポーレーション法（ジーンパルサーＩＩ；バイオラッド社製）にて、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へ導入した。
遺伝子導入１日後から、1mg/mL濃度のG418を含む選択培地で培養し、本発現ベクターが導入された遺伝子組換えヒトパラオキソナーゼ１安定発現株を得た。次に、順次メトトレキセート濃度を上昇させた培地で選択培養を繰り返し、遺伝子増幅されたクローンである、DG44/PON1-His CL45を得た。具体的には、50nMメトトレキセート含有培地、250nMメトトレキセート含有培地、1,000nMメトトレキセート含有培地の順で濃度を上昇させ、最終的には限界希釈法によりクローン化を行った。
遺伝子組換えヒトパラオキソナーゼ１を含む培養上清は、２Ｌ培養槽又は１５Ｌ培養槽を用いて、DG44/PON1-His CL45とＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＳＡＦＣ社製）を混合培養し作製した。
【００３２】
実施例６
〔遺伝子組換えヒトパラオキソナーゼ１の発現株（ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞）培養上清からのヒトパラオキソナーゼ１含有製剤の調製〕
ヒトパラオキソナーゼ１を発現、分泌させたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞培養上清を０．４５μｍフィルター（ミリポア社製）により沈殿物を除去した。このろ過液を、あらかじめ０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）で平衡化したNi Sepharose HP (GE Healthcare社製)に負荷した。次いで平衡化と同様の溶液を用いて洗浄を行い、０．５Ｍ塩化ナトリウム及び３５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜７．５）でさらに洗浄を行った。最後に０．５Ｍ塩化ナトリウム及び５００ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜７．５）を用いて溶出を行った。Ni Sepharose HP吸着画分の溶出液は分画分子量１００００の遠心式限外ろ過膜（ミリポア社製）を用いて２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）に置換後、２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したCHTセラミックハイドロキシアパタイトTypeII４０μｍ（バイオラッド社製）に負荷した。次に、未吸着画分及び１M塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜７．５）溶出画分を分画分子量１００００の遠心式限外ろ過膜（ミリポア社製）を用いて２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）に置換後、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８〜７．４）で平衡化したPoros 50 HS（アプライドバイオシステムズ社製）に負荷した。次に未吸着画分を分画分子量１００００の遠心式限外ろ過膜（ミリポア社製）を用いて濃縮し、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したSuperdex２００ １６／６０（GE Healthcare社製)に負荷した。平衡化と同様の溶液を用いて溶出を行い、溶出液を分画分子量１００００の遠心式限外ろ過膜（ミリポア社製）を用いてパラオキソナーゼ１を３．９ｍｇ／ｍL含有するまで濃縮した。次に、孔径０．２２μｍの無菌ろ過フィルター（ミリポア社製）を用いて無菌ろ過を行い、パラオキソナーゼ１製剤とした。
パラオキソナーゼ１製剤について分析した結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
2012121870.tif 000003
このようにして得られた製剤は、そのまま注射液として用いることができる。
【００３４】
実施例７
〔精製結果〕
実施例１，４および６で得られたパラオキソナーゼ１について、非還元又は還元サンプルについて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド５−２０％均一ゲルで電気泳動を行い、銀染色又はCBB染色を行った。その結果を図１に示す。
また、実施例１，４および６で得られたパラオキソナーゼ１製剤について、本サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にゲル上の蛋白質をＰＶＤＦ膜（ATTO社製）に転写し、マウス抗ヒトパラオキソナーゼ１抗体（BML社製）を用いて一次反応を行った。次いで、ＨＲＰ標識した抗マウスイムノグロブリン抗体（KPL社製）を用いて二次反応を行い、TMB法により発色させた。その結果を図２に示す。
図１および図２に示されるとおり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで染色された蛋白質は、共に抗ヒトパラオキソナーゼ１抗体と反応した。
【００３５】
実施例８
〔劇症肝炎に対する予防・治療効果の確認〕
実験用に８週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールス・リバー社製）を４０匹準備した。実施例６で調製した遺伝子組換えヒトパラオキソナーゼ１を１００ｍｇ／ｋｇ（ＰＯＮ１100mg／kg投与群；ｎ＝６）、１０ｍｇ／ｋｇ（ＰＯＮ１10mg／kg投与群；ｎ＝６）、１ｍｇ／ｋｇ（ＰＯＮ１1mg／kg投与群；ｎ＝６）、０．１ｍｇ／ｋｇ（ＰＯＮ１0.1mg/kg投与群；ｎ＝４）および０．０１ｍｇ／ｋｇ（ＰＯＮ１0.01mg／kg投与群；ｎ＝６）の各用量で、静脈内に単回投与した。その１０分後に、ＰＯＮ１投与群計２８匹と他の６匹（対照群）の計３４匹に、劇症肝炎惹起剤としてコンカナバリンＡＴｙｐｅIV（Sigma社製）１５ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内に単回投与した。また、ヒトパラオキソナーゼ１製剤もコンカナバリンＡも投与しなかったマウス６匹を正常群とした。
【００３６】
コンカナバリンＡを投与してから８時間後に炭酸ガス麻酔下で腹部大動脈より採血して血漿を得た。この血漿中の肝機能障害の指標であるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）を測定し、それぞれ平均±標準誤差を算出した。ＡＬＴ及びＡＳＴに関する統計学的解析は、正常群に対する対照群の発症と、対照群に対するＰＯＮ１投与群の効果について、それぞれt検定とDunnett検定を用いて統計処理によって行った。危険率5％未満を有意差ありと判定した。
結果を表３に示す。
【００３７】
【表３】
2012121870.tif 000004
【００３８】
表３に示されるとおり、対照群では、ＡＬＴおよびＡＳＴの増加が正常群と比較して有意に認められた。しかし、対照群で認められた肝機能の高度の障害は、ＰＯＮ１投与各群で顕著に、かつ有意に抑制された。この実験により、ヒトパラオキソナーゼ１製剤による劇症肝炎の予防及び治療効果が確認された。ヒトパラオキソナーゼ１製剤投与群において、ヒトパラオキソナーゼ１製剤投与によると思われる副作用は見られなかった。
【００３９】
実施例９
〔喘息に対する予防・治療効果の確認〕
実験用に６週齢雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本チャールス・リバー社製）を２８匹準備した。そのうちの２２匹に、喘息モデル作製のためDay 0およびDay 14に、0.5 mg卵白アルブミン（以下OVA、シグマ社製）と20 mg/mL水酸化アルミニウムゲル（和光純薬社製）混合溶液を0.1 mg OVA/200 μL/マウスの用量で腹腔内投与した。続いてDay 21〜24に、50 mg/mL OVA溶液（リン酸緩衝液で溶解）を、超音波式ネブライザ（NE-U17、オムロン社）を使用し、20分間吸入投与した。
実施例６で調製した遺伝子組換えヒトパラオキソナーゼ１を１ｍｇ／ｋｇ（ＰＯＮ１1mg／kg投与群；ｎ＝６）および０．１ｍｇ／ｋｇ（ＰＯＮ１0.1mg／kg投与群；ｎ＝６）の各用量で、Day 21〜24においてOVA溶液吸入30分前に静脈内投与した。また、市販喘息薬であるアイピーディドライシロップ（トシル酸スプラタスト；大鵬薬品工業社製）も５０ｍｇ／ｋｇ（市販薬50mg／kg投与群；ｎ＝４）の用量で、Day 21〜24においてOVA溶液吸入30分前に経口投与した。また、ヒトパラオキソナーゼ１製剤もOVA溶液も処置しなかったマウス６匹を正常群とした。
【００４０】
動物実験開始後Day 25に、動物を炭酸ガス麻酔多量吸入による屠殺後に気管支を切開し、気管支より肺胞内に0.5 mL生理食塩液を経気管注入・回収する操作を4回繰り返し、肺胞内洗浄液（以下BALF）を回収した。BALFは遠心（1100 rpm、10 min、4℃）し、沈殿物は0.1 mL RPMI 1640培地（無血清）を加え撹拌し、白血球数および好酸球数測定用とした。BALF中血球懸濁液について、白血球数を動物用自動血球計数装置（MICROS abc LC-152、堀場製作所社製）で測定した。また、BALF塗抹標本を作製し、白血球百分率より好酸球数を算出した。
白血球数および好酸球数に関する統計学的解析は、正常群に対する対照群の発症と、対照群に対するＰＯＮ１投与群または市販薬群の効果について、それぞれt検定とDunnett検定を用いて統計処理によって行った。危険率5％未満を有意差ありと判定した。
結果を表４に示す。
【００４１】
【表４】
2012121870.tif 000005
【００４２】
表４に示されるとおり、対照群では、白血球数および好酸球数の有意な増加が正常群と比較して認められた。しかし対照群で認められた白血球および好酸球の高度な遊走は、ＰＯＮ１投与各群で顕著に、かつ有意に抑制され、あるいは抑制傾向を示した。この実験により、ヒトパラオキソナーゼ１製剤による喘息の予防及び治療効果が確認された。
また、同様に市販薬50mg／kg投与群にも有効性が見られた。
ヒトパラオキソナーゼ１製剤投与群において、ヒトパラオキソナーゼ１製剤投与によると思われる副作用は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
ＰＯＮは、急性肝炎又は劇症肝炎の予防又は治療剤、及び喘息の予防又は治療の有効成分として好適に使用できる。
【図１】
2012121870.tif 000006
【図２】
2012121870.tif 000007
【配列表】
2012121870000001.app