(57)【要約】【課題】例えば、動物用飼料添加物として利用されているメチオニン等の含硫α-アミノ酸化合物の新たな製造法等を提供すること。【解決手段】特定の含硫アミノアルコール化合物（化１）に、下記の形質転換体等を作用させる工程を含むことを特徴とする含硫α-アミノ酸化合物（化２）の製造法。＜形質転換体＞（Ａ）化１を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物（化３）に変換する能力（能力Ａ）を有する酵素の遺伝子が微生物細胞内に導入された形質転換体と、化３を対応する化２に変換する能力（能力Ｂ）を有する酵素の遺伝子が導入された形質転換体との両者の形質転換体（Ｂ）能力Ａを有する酵素の遺伝子と能力Ｂを有する酵素の遺伝子との両遺伝子が微生物細胞内に導入された形質転換体（Ｃ）能力Ａと能力Ｂとの両者の能力を有する酵素の遺伝子が微生物細胞内に導入された形質転換体【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2012010673.tif 000011
（式中、Ｒ１は水素、炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数６〜２０のアリール基を表す。）
で示される含硫アミノアルコール化合物に、下記のいずれかの形質転換体の菌体又はその菌体処理物を作用させる工程を含むことを特徴とする、一般式（２）
【化２】
2012010673.tif 000012
（式中、Ｒ１は前記と同じ意味を表す。）
で示される含硫α-アミノ酸化合物の製造法。
＜形質転換体＞
（Ａ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体との両者の形質転換体
（Ｂ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドと、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとの両者のポリヌクレオチドが微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体
（Ｃ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体
【請求項２】
形質転換体が、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体であり、且つ、当該酵素が、下記のアミノ酸配列のいずれかを有する酵素であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
ｂ）配列番号２若しくは配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、且つ、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、且つ、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列
【請求項３】
含硫アミノアルコール化合物及び含硫α-アミノ酸化合物におけるＲ１が、炭素数１〜５のアルキル基であることを特徴とする請求項１又は２記載の製造法。
【請求項４】
含硫アミノアルコール化合物及び含硫α-アミノ酸化合物におけるＲ１が、メチル基であることを特徴とする請求項１又は２記載の製造法。
【請求項５】
微生物細胞内において機能可能なプロモーターと一般式（１）
【化３】
2012010673.tif 000013
（式中、Ｒ１は水素、炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数６〜２０のアリール基を表す。）
で示される含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡを含むことを特徴とする組換えベクター。
【請求項６】
前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが、配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡであることを特徴とする請求項５記載の組換えベクター。
【請求項７】
請求項５又は６記載の組換えベクターが微生物細胞に導入されて得られた形質転換体。
【請求項８】
微生物細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項５又は６記載の組換えベクターを微生物細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法。
【請求項１０】
一般式（１）
【化４】
2012010673.tif 000014
（式中、Ｒ１は水素、炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数６〜２０のアリール基を表す。）
で示される含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換するための触媒としての、下記のいずれかの形質転換体の菌体又はその菌体処理物の使用。
＜形質転換体＞
（Ａ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体との両者の形質転換体
（Ｂ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドと、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとの両者のポリヌクレオチドが微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体
（Ｃ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体
【請求項１１】
形質転換体が、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体であり、且つ、当該酵素が、下記のアミノ酸配列のいずれかを有する酵素であることを特徴とする請求項１０記載の使用。
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
ｂ）配列番号２若しくは配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、且つ、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、且つ、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列
【請求項１２】
形質転換体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体であることを特徴とする請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１３】
含硫アミノアルコール化合物におけるＲ１が、炭素数１〜５のアルキル基であることを特徴とする請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１４】
含硫アミノアルコール化合物におけるＲ１が、メチル基であることを特徴とする請求項１０又は１１記載の使用。
【請求項１５】
一般式（１）
【化５】
2012010673.tif 000015
（式中、Ｒ１は水素、炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数６〜２０のアリール基を表す。）
で示される含硫アミノアルコール化合物に、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素を作用させる工程を含むことを特徴とする、一般式（２）
【化６】
2012010673.tif 000016
（式中、Ｒ１は前記と同じ意味を表す。）
で示される含硫α-アミノ酸化合物の製造法。
【請求項１６】
一般式（１）
【化７】
2012010673.tif 000017
（式中、Ｒ１は水素、炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数６〜２０のアリール基を表す。）
で示される含硫アミノアルコール化合物に、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素を作用させる工程、及び、前記工程で生成させた対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素を作用させる工程を含むことを特徴とする、一般式（２）
【化８】
2012010673.tif 000018
（式中、Ｒ１は前記と同じ意味を表す。）
で示される含硫α-アミノ酸化合物の製造法。
【請求項１７】
含硫アミノアルコール化合物及び含硫α-アミノ酸化合物におけるＲ１が、炭素数１〜５のアルキル基であることを特徴とする請求項１５又は１６記載の製造法。
【請求項１８】
含硫アミノアルコール化合物及び含硫α-アミノ酸化合物におけるＲ１が、メチル基であることを特徴とする請求項１５又は１６記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、含硫α−アミノ酸化合物の製造法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、含硫α-アミノ酸化合物の一つであるメチオニンは、動物用飼料添加物として利用されている。当該化合物を製造するには、アクロレインとメチルメルカプタンとを反応させて３−メチルチオプロピオンアルデヒドにし、これをさらに青酸、アンモニア及び二酸化炭素と反応させて５−（２−メチル−メルカプトエチル）−ヒダントイン（メチオニンヒダントイン）にする。最終的にこれをアルカリにより加水分解してアルカリ金属メチオニン酸塩にし、次いで酸、例えば硫酸又は炭酸を用いて中和することによってメチオニンを遊離させる（例えば、特許文献１等参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭５５−１０２５５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記製造法は、青酸及びアクロレインをＣ１−又はＣ３−構成要素として使用するが、これらの原料化合物の取り扱いには充分な管理やそれに適合する設備等が必要である。
そこで、例えば、メチオニン等の含硫α-アミノ酸化合物の新たな製造法が期待されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、このような状況下鋭意検討を行った結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．  一般式（１）
【０００６】
【化１】
2012010673.tif 000002
（式中、Ｒ１は水素、炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数６〜２０のアリール基を表す。）
で示される含硫アミノアルコール化合物（以下、化合物（１）と記すこともある。）に、下記のいずれかの形質転換体（以下、本形質転換体と記すこともある。）の菌体又はその菌体処理物を作用させる工程を含むことを特徴とする、一般式（２）
【０００７】
【化２】
2012010673.tif 000003
（式中、Ｒ１は前記と同じ意味を表す。）
で示される含硫α-アミノ酸化合物（以下、化合物（２）と記すこともある。）の製造法（以下、本発明製造法と記すこともある。）；
＜形質転換体＞
（Ａ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素（以下、本酵素（Ａ）と記すこともある。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（以下、本ポリヌクレオチド（Ａ）と記すこともある。）が微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体（以下、本形質転換体（Ａ）と記すこともある。）と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素（以下、本酵素（Ｂ）と記すこともある。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（以下、本ポリヌクレオチド（Ｂ）と記すこともある。）が微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体（以下、本形質転換体（Ｂ）と記すこともある。）との両者の形質転換体
（Ｂ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ａ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ａ））と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｂ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ｂ））との両者のポリヌクレオチドが微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体（以下、本形質転換体（ＡＢ）と記すこともある。）
（Ｃ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素（以下、本酵素（Ｃ）と記すこともある。）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（以下、本ポリヌクレオチド（Ｃ）と記すこともある。）が微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体（以下、本形質転換体（Ｃ）と記すこともある。）
２．  形質転換体が、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｃ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ｃ））が微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体（即ち、本形質転換体（Ｃ））であり、且つ、当該酵素が、下記のアミノ酸配列のいずれかを有する酵素であることを特徴とする前項１記載の製造方法；
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
ｂ）配列番号２若しくは配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、且つ、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、且つ、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列
３．  含硫アミノアルコール化合物及び含硫α-アミノ酸化合物におけるＲ１が、炭素数１〜５のアルキル基であることを特徴とする前項１又は２記載の製造法；
４．  含硫アミノアルコール化合物及び含硫α-アミノ酸化合物におけるＲ１が、メチル基であることを特徴とする前項１又は２記載の製造法；
５．  微生物細胞内において機能可能なプロモーターと一般式（１）
【０００８】
【化３】
2012010673.tif 000004
（式中、Ｒ１は水素、炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数６〜２０のアリール基を表す。）
で示される含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｃ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ｃ））とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡを含むことを特徴とする組換えベクター；
６．  前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが、配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡであることを特徴とする前項５記載の組換えベクター；
７．  前項５又は６記載の組換えベクターが微生物細胞に導入されて得られた形質転換体；
８．  微生物細胞が大腸菌であることを特徴とする前項７記載の形質転換体；
９．  前項５又は６記載の組換えベクターを微生物細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法；
１０．  一般式（１）
【０００９】
【化４】
2012010673.tif 000005
（式中、Ｒ１は水素、炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数６〜２０のアリール基を表す。）
で示される含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換するための触媒としての、下記のいずれかの形質転換体の菌体又はその菌体処理物の使用；
＜形質転換体＞
（Ａ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ａ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ａ））が微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体（即ち、本形質転換体（Ａ））と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｂ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ｂ））が微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体（即ち、本形質転換体（Ｂ））との両者の形質転換体
（Ｂ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ａ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ａ））と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｂ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ｂ））との両者のポリヌクレオチドが微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体（即ち、本形質転換体（ＡＢ））
（Ｃ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｃ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ｃ））が微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体（即ち、本形質転換体（Ｃ））
１１．  形質転換体が、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｃ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ｃ））が微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体（即ち、本形質転換体（Ｃ））であり、且つ、当該酵素が、下記のアミノ酸配列のいずれかを有する酵素であることを特徴とする前項１０記載の使用；
ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
ｂ）配列番号２若しくは配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、且つ、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列
ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、且つ、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列
１２．  形質転換体が、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体であることを特徴とする前項１０又は１１記載の使用；
１３．  含硫アミノアルコール化合物におけるＲ１が、炭素数１〜５のアルキル基であることを特徴とする前項１０又は１１記載の使用；
１４．  含硫アミノアルコール化合物におけるＲ１が、メチル基であることを特徴とする前項９又は１０記載の使用；
１５．  一般式（１）
【００１０】
【化５】
2012010673.tif 000006
（式中、Ｒ１は水素、炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数６〜２０のアリール基を表す。）
で示される含硫アミノアルコール化合物（即ち、化合物（１））に、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｃ））を作用させる工程を含むことを特徴とする、一般式（２）
【００１１】
【化６】
2012010673.tif 000007
（式中、Ｒ１は前記と同じ意味を表す。）
で示される含硫α-アミノ酸化合物（即ち、化合物（２））の製造法；
１６．  一般式（１）
【００１２】
【化７】
2012010673.tif 000008
（式中、Ｒ１は水素、炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数６〜２０のアリール基を表す。）
で示される含硫アミノアルコール化合物（即ち、化合物（１））に、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ａ））を作用させる工程、及び、前記工程で生成させた対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｂ））を作用させる工程を含むことを特徴とする、一般式（２）
【００１３】
【化８】
2012010673.tif 000009
（式中、Ｒ１は前記と同じ意味を表す。）
で示される含硫α-アミノ酸化合物（即ち、化合物（２））の製造法；
１７．  含硫アミノアルコール化合物及び含硫α-アミノ酸化合物におけるＲ１が、炭素数１〜５のアルキル基であることを特徴とする前項１５又は１６記載の製造法；
１８．  含硫アミノアルコール化合物及び含硫α-アミノ酸化合物におけるＲ１が、メチル基であることを特徴とする前項１５又は１６記載の製造法；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、メチオニン等の含硫α-アミノ酸化合物の新たな製造法等を提供することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書に記載される発明は記載されている特定の方法論、プロトコ−ル、及び、試薬に限定されず、可変であると考えられる。また、本明細書で用いる用語は単に特定の実施形態を記載するためのものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではないと考えられる。
特に断りの無い限り、本明細書で用いる全ての技術用語、及び、化学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者に共通に理解されているものと同じ意味を持つ。本発明を実施又は試験する上で、本明細書に記載されているものと同様又は同等の方法、及び、材料のいずれを用いてもよいが、以下、好ましい方法、装置、及び、材料を記載する。
【００１６】
以下、更に詳細に本発明を説明する。
本発明製造法は、一般式（１）
【００１７】
【化９】
2012010673.tif 000010
（式中、Ｒ１は水素、炭素数１〜８のアルキル基又は炭素数６〜２０のアリール基を表す。）
で示される含硫アミノアルコール化合物（即ち、化合物（１））に、下記のいずれかの形質転換体（即ち、本形質転換体）の菌体又はその菌体処理物を作用させる工程を含む。
＜形質転換体＞
（Ａ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ａ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ａ））が微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体（即ち、本形質転換体Ａ）と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｂ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ｂ））が微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体（即ち、本形質転換体（Ｂ））との両者の形質転換体
（Ｂ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ａ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ａ））と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｂ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ｂ））との両者のポリヌクレオチドが微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体（即ち、本形質転換体（ＡＢ））
（Ｃ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｃ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ｃ））が微生物細胞内に導入されて得られた形質転換体（即ち、本形質転換体（Ｃ））
【００１８】
ここで、化合物（１）及び化合物（２）において、Ｒ１で示される「炭素数１〜８のアルキル基」としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基を挙げることができる。また、Ｒ１で示される「炭素数６〜２０のアリール基」としては、例えば、フェニル基、トリル基、ナフチル基等が挙げられる。
好ましいＲ１としては、例えば、炭素数１〜８のアルキル基が挙げられる。より好ましいＲ１としては、例えば、炭素数１〜５のアルキル基等が挙げられる。さらに好ましいＲ１としては、メチル基が挙げられる。
【００１９】
本発明製造法において用いられる触媒としての本形質転換体の菌体又はその菌体処理物を得る方法について説明する。
第一の方法として、
（Ａ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ａ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ａ））を、通常の遺伝子工学的手法を用いて微生物細胞内に導入することによって本形質転換体（Ａ）を調製し、更に前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｂ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ｂ））を、通常の遺伝子工学的手法を用いて微生物細胞内に導入することによって本形質転換体（Ｂ）を調製することにより、所望の両者の形質転換体（即ち、本形質転換体（Ａ）及び本形質転換体（Ｂ））が得られる。
【００２０】
また、第二の方法として、
（Ｂ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ａ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ａ））と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｂ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ｂ））との両者のポリヌクレオチドを、通常の遺伝子工学的手法を用いて微生物細胞内に導入することによって調製することにより、所望の形質転換体（即ち、本形質転換体（ＡＢ））が得られる。
【００２１】
また、第三の方法として、
（Ｃ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｃ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ｃ））を、通常の遺伝子工学的手法を用いて微生物細胞内に導入することによって調製することにより、所望の形質転換体（即ち、本形質転換体（Ｃ））が得られる。
尚、本願明細書において、本酵素（Ａ）と本酵素（Ｂ）と本酵素（Ｃ）とを総じて本酵素ということもある。また、本ポリヌクレオチド（Ａ）と本ポリヌクレオチド（Ｂ）と本ポリヌクレオチド（Ｃ）とを総じて本ポリヌクレオチドということもある。また、本形質転換体（Ａ）と本形質転換体（Ｂ）と本形質転換体（Ｃ）とを総じて本形質転換体ということもある。
【００２２】
本形質転換体の外来遺伝子導入に係る調製方法について説明する。
本酵素としては、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ａ））、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｂ））、及び、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｃ））を挙げることができる。
【００２３】
まずは、本酵素（Ａ）としては、例えば、下記のアミノ酸配列のいずれかを有する酵素を挙げることができる。
ａ）アルコール脱水素酵素（即ち、アルコールを酸化してアルデヒドにする反応を触媒する酵素）が有するアミノ酸配列
ｂ）アルコール脱水素酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、且つ、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列。
ｃ）アルコール脱水素酵素が有するアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、且つ、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
【００２４】
次いで、本酵素（Ｂ）としては、例えば、下記のアミノ酸配列のいずれかを有する酵素を挙げることができる。
ａ）アルデヒド脱水素酵素（即ち、アルデヒドを酸化してカルボン酸にする反応を触媒する酵素）が有するアミノ酸配列
ｂ）アルデヒド脱水素酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、且つ、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
ｃ）アルデヒド脱水素酵素が有するアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、且つ、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列
【００２５】
次いで、本酵素（Ｃ）としては、例えば、下記のアミノ酸配列のいずれかを有する酵素を挙げることができる。
ａ）アルコール・アルデヒド脱水素酵素（即ち、アルコールを酸化してアルデヒドにする反応、及び、アルデヒドを酸化してカルボン酸にする反応の両反応を触媒する酵素）が有するアミノ酸配列
ｂ）アルコール・アルデヒド脱水素酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、且つ、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列
ｃ）アルコール・アルデヒド脱水素酵素が有するアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、且つ、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列
ｄ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
ｅ）配列番号２若しくは配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列であって、且つ、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列
ｆ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、且つ、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列
【００２６】
本ポリヌクレオチドとしては、
（Ａ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ａ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ａ））、
（Ｂ）前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｂ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ｂ））、及び、
（Ｃ）前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｃ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ｃ））
を挙げることができる。
尚、本ポリヌクレオチド（Ｃ）としては、具体的には例えば、配列番号２で示される塩基配列（ウマ肝臓由来の酵素の遺伝子が有する塩基配列）からなるＤＮＡ、配列番号５で示される塩基配列（ウマ肝臓由来の酵素が有するアミノ酸配列に含まれるアミノ酸に対応するコドンとして大腸菌において使用頻度の高いコドンを選択することによって設計された塩基配列）からなるＤＮＡ等を挙げることができる。
【００２７】
本ポリヌクレオチドは、例えば、天然の遺伝子であってもよく、又は、天然の遺伝子に変異を導入（部位特異的変異導入法、突然変異処理等）することにより作出された遺伝子であってもよい。天然の遺伝子を検索する場合には、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ａ））の産生能を有する微生物、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｂ））の産生能を有する微生物、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｃ））の産生能を有する微生物等を対象にすればよい。
【００２８】
このような酵素の産生能を有する微生物を探索するための対象母集団となる微生物としては、例えば、アルカリジェネス(Alcaligenes)属に属する微生物、バシラス（Bacillus）属に属する微生物、シュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物、ロドバクター（Rhodobacter）属に属する微生物及びロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物からなる群より選ばれる１以上の微生物を挙げることができる。
【００２９】
また、このような酵素の産生能を有する微生物を探索するための対象母集団となる微生物としては、下記の微生物群から選ばれる１以上の微生物を挙げることができる。
＜微生物群＞
アルカリジェネス・デニトリフィカンス(Alcaligenes denitrificans)、アルカリジェネス・エウトロパス(Alcaligenes eutrophus)、アルカリジェネス・ファエカリス(Alcaligenes faecalis)、アルカリジェネス・エスピー(Alcaligenes sp.)、アルカリジェネス・キシロソキシダンス(Alcaligenes xylosoxydans)、バシラス・アルベイ（Bacillus alvei）、バシラス・バディウス（Bacillus badius）、バシラス・ブレビス（Bacillus brevis）、バシラス・セレウス（Bacillus cereus）、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バシラス・ファーマス（Bacillus firmus）、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バシラス・モリタイ（Bacillus moritai）、バシラス・プミルス（Bacillus pumilus）、バシラス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）、バシラス・サチルス（Bacillus subtilis）、バシラス・バリダス（Bacillus validus）、シュードモナス・デニトリカンス（Pseudomonas denitrificans）、シュードモナス・フィクセレクタ（Pseudomonas ficuserectae）、シュードモナス・フラギ（Pseudomonas fragi）、シュードモナス・メンドーシナ（Pseudomonas mendocina）、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）、シュードモナス・オバリス（Pseudomonas ovalis）、シュードモナス・シュードアルカリジェネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・プトレファシエンス（Pseudomonas putrefaciens）、シュードモナス・リボフラビナ（Pseudomonas riboflavina）、シュードモナス・ストラミネア（Pseudomonas straminea）、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）、シュードモナス・タバシ（Pseudomonas tabaci）、シュードモナス・タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）、シュードモナス・ベシキュラリス（Pseudomonas vesicularis）、ロドバクター・スファエロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、ロドコッカス・グロベルルス（Rhodococcus groberulus）、ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodochrous）およびロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）
【００３０】
更に、このような酵素の産生能を有する微生物を探索するための対象母集団となる微生物としては、例えば、下記の微生物群から選ばれる１以上の微生物を挙げることができる。
＜好ましい微生物群＞
アルカリジェネス・デニトリフィカンス(Alcaligenes denitrificans)JCM5490、アルカリジェネス・エウトロパス(Alcaligenes eutrophus)ATCC43123、アルカリジェネス・ファエカリス(Alcaligenes faecalis)IFO12669、アルカリジェネス・エスピー(Alcaligenes sp.)IFO14130、アルカリジェネス・キシロソキシダンス(Alcaligenes xylosoxydans)IFO15125t、アルカリジェネス・キシロソキシダンス(Alcaligenes xylosoxydans)IFO15126t、バシラス・アルベイ（Bacillus alvei）IFO3343ｔ、バシラス・バディウス（Bacillus badius）ATCC14574t、バシラス・ブレビス（Bacillus brevis）JCM2503t、バシラス・セレウス（Bacillus cereus）JCM2152t、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）JCM2257t、バシラス・ファーマス（Bacillus firmus）JCM2512t、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）ATCC27811、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）IFO12197、バシラス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）IFO12200t、バシラス・モリタイ（Bacillus moritai）ATCC21282、バシラス・プミルス（Bacillus pumilus）IFO12092t、バシラス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）IFO3341、バシラス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）IFO3526、バシラス・サチルス（Bacillus subtilis）ATCC14593、バシラス・サチルス（Bacillus subtilis）ATCC15841、バシラス・サチルス（Bacillus subtilis）IFO3108、バシラス・サチルス（Bacillus subtilis）IFO3132、バシラス・サチルス（Bacillus subtilis）IFO3026、バシラス・サチルス（Bacillus subtilis）IFO3037、バシラス・サチルス（Bacillus subtilis）IFO3108、バシラス・サチルス（Bacillus subtilis）IFO3134、バシラス・バリダス（Bacillus validus）IFO13635、シュードモナス・デニトリカンス（Pseudomonas denitrificans）IAM1426、シュードモナス・デニトリカンス（Pseudomonas denitrificans）IAM1923、シュードモナス・フィクセレクタ（Pseudomonas ficuserectae）JCM2400t、シュードモナス・フラギ（Pseudomonas fragi）IAM12402、シュードモナス・フラギ（Pseudomonas fragi）IFO3458t、シュードモナス・メンドーシナ（Pseudomonas mendocina）IFO14162、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）IFO13583t、シュードモナス・オバリス（Pseudomonas ovalis）IFO12688、シュードモナス・シュードアルカリジェネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）JCM5968ｔ、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）IFO12996、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）IFO14164t、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）IFO3738、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）IFO12653、シュードモナス・プトレファシエンス（Pseudomonas putrefaciens）IFO3910、シュードモナス・リボフラビナ（Pseudomonas riboflavina）IFO13584t、シュードモナス・ストラミネア（Pseudomonas straminea）JCM2783t、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）IFO14055、シュードモナス・タバシ（Pseudomonas tabaci）IFO3508、シュードモナス・タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）IFO3460、シュードモナス・ベシキュラリス（Pseudomonas vesicularis）JCM1477t、ロドバクター・スファエロイデス（Rhodobacter sphaeroides）ATCC17023、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）IFO12320、ロドコッカス・グロベルルス（Rhodococcus groberulus）ATCC15076、ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC15076、ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC15610、ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC19067、ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC19149、ロドコッカス・ロドクラ��ス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC19150、ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC21197、ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC21199、ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodochrous）JCM3202ｔ、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ATCC19070、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ATCC19071及びロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ATCC19148
【００３１】
これら菌株は天然から分離してもよいし、各菌株保存機関より購入することにより容易に入手することができる。
このような菌株を購入できる各菌株保存機関として、例えば、下記の菌株保存機関を挙げることができる。
【００３２】
１．IFO（Institute of Fermentation Osaka：財団法人  醗酵研究所）
現在は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  生物遺伝資源部門（NBRC）で取り扱い可能であり、入手に際しては http://www.nbrc.nite.go.jp/NBRC2/NBRCDispSearchServlet?lang=jp にアクセスすればよい。
２．ATCC（American Type Culture Collection）
住商ファーマインターナショナル株式会社  ATCC事業グループで取り扱い可能であり、入手に際しては http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC.html にアクセスすればよい。
３．JCM（理化学研究所微生物系統保存施設 (Japan Collection of Microorganisms, JCM) 
現在は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター (RIKEN BRC) 微生物材料開発室に移管されている。入手に際しては http://www.jcm.riken.go.jp/JCM/aboutJCM_J.shtml にアクセスすればよい。
４．IAMカルチャーコレクション
現在は、IAMカルチャーコレクション保存菌株のうち、細菌、酵母、糸状菌の場合には独立行政法人 理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（JCM）に、また微細藻類の場合には独立行政法人 国立環境研究所微生物系統保存施設（NIES）に移管されている。入手に際しては http://www.jcm.riken.go.jp/JCM/aboutJCM_J.shtml、http://mcc.nies.go.jp/aboutOnlineOrder.do にアクセスすればよい。
【００３３】
尚、このような酵素の産生能を有する微生物を探索する場合には、具体的には例えば、試験管に滅菌済み培地５ｍｌを入れ、これに各菌株保存機関より購入することにより入手された菌体又は土壌中から純粋分離することにより調製された菌体を植菌する。これを３０℃で好気条件下、振盪培養する。培養終了後、遠心分離により菌体を回収することにより、生菌体を得る。ねじ口試験管に０．１Ｍ、Ｔｒｉｓ-グリシンバッファー（ｐＨ１０）を２ｍｌ入れ、これに上記の生菌体を加えた後、懸濁する。当該懸濁液に、メチオニノール等の含硫アミノアルコール化合物、及び／又は、１−アミノ−３−（メチルチオ）プロピルアルデヒド等の含硫α−アミノアルデヒド化合物を２ｍｇ添加した後、得られた混合物を３０℃で３〜７日間振盪させる。
反応終了後、反応液を１ｍｌサンプリングする。当該サンプリング液から菌体を除去した後、生成した１−アミノ−３−（メチルチオ）プロピルアルデヒド等の含硫α−アミノアルデヒド化合物、及び／又は、メチオニン等の含硫α−アミノ酸化合物の量を液体クロマトグラフィーにより分析する。
このようにして、前記含硫アミノアルコール化合物が有するヒドロキシル基を優先的に酸化する能力、及び／又は、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物が有するアルデヒド基を優先的に酸化する能力を有する微生物を選抜する。
次いで、選抜された微生物から目的の反応、即ち、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ａ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ａ））、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｂ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ｂ））、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｃ））のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（即ち、本ポリヌクレオチド（Ｃ））を選抜すればよい。
【００３４】
本ポリヌクレオチドのうち、本ポリヌクレオチド（Ａ）は、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有している。また、本ポリヌクレオチド（Ｂ）は、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有している。また、本ポリヌクレオチド（Ｃ）は、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有している。
【００３５】
本ポリヌクレオチド（Ａ）において「アルコール脱水素酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」、又は、本ポリヌクレオチド（Ｂ）において「アルデヒド脱水素酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」、又は、本ポリヌクレオチド（Ｃ）において「アルコール・アルデヒド脱水素酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））、「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons（1987-1997））等に記載されているサザンハイブリダイゼーション法において、（１）高イオン濃度下［例えば、6XSSC（900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム）が挙げられる。］に、65℃でハイブリダイズさせることにより、（Ａ）アルコール脱水素酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、（Ｂ）アルデヒド脱水素酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、又は、（Ｃ）アルコール・アルデヒド脱水素酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、とＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、また（２）低イオン濃度下［例えば、0.1 X SSC（15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウム）が挙げられる。］に、65℃で30分間保温した後でも該ハイブリッドが維持されうるようなＤＮＡをいう。
【００３６】
具体的には例えば、（Ａ）アルコール脱水素酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、（Ｂ）アルデヒド脱水素酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、又は、（Ｃ）アルコール・アルデヒド脱水素酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡにおいて、それらの塩基配列（例えば、配列番号２で示される塩基配列）からなるＤＮＡと配列相同性が８０％以上であるＤＮＡや、それらの塩基配列の一部の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ、等があげられる。かかるＤＮＡは、自然界に存在するＤＮＡの中からクローニングされたＤＮＡであっても、このクローニングされたＤＮＡの塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換または付加が人為的に導入されてなるＤＮＡであっても、人為的に合成されたＤＮＡであってもよい。
【００３７】
より具体的には例えば、配列番号２若しくは５で示される塩基配列において、１個または数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列としては、例えば、（i）配列番号２若しくは５で示される塩基配列において、１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が欠失した塩基配列、（ii）配列番号２若しくは５で示される塩基配列の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、（iii）配列番号２若しくは５で示される塩基配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が付加した塩基配列、（iv）上記（i）〜（iii）を組み合わせた塩基配列が挙げられる。
【００３８】
配列番号２若しくは５で示される塩基配列において１または数個の核酸に欠失、置換若しくは付加などの変異の生じた塩基配列を有するポリヌクレオチドは、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press (1989))、「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley & Sons (1987-1997))、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載される部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
【００３９】
また、ポリヌクレオチドに変異を導入するには、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えば、QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社）等を用いて行うことができる。
【００４０】
本ポリヌクレオチド（Ｃ）は、例えば、以下のようにして調製することができる。
【００４１】
新鮮なウマ肝臓等から通常の遺伝子工学的手法（例えば、「新  細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）に記載された方法）に準じてｃＤＮＡライブラリーを調製し、調製されたｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ及び／又は配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本ポリヌクレオチドのＤＮＡを調製することができる。
【００４２】
また、前記ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡを増幅して本ポリヌクレオチドのＤＮＡを調製することができる。
【００４３】
当該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μM、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを混合した反応液を97℃（2分間）に加熱した後、97℃(0.25分間)‐50℃(0.5分間)‐72℃（1.5分間）のサイクルを１０回、次いで97℃(0.25分間)‐55℃(0.5分間)‐72℃(2.5分間)のサイクルを２０回行い、さらに72℃で7分間保持する条件が挙げられる。
【００４４】
尚、当該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
【００４５】
また、前記ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチド等（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする５’末端側の約１４塩基程度以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）とｃＤＮＡライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩基配列に相補的な塩基配列からなる約１４塩基程度以上のオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことによっても、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡや、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本ポリヌクレオチドのＤＮＡを調製することができる。
【００４６】
上記のようにして増幅されたＤＮＡを「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、ｐCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（Pharmacia社製）、ｐKK223-3（Pharmacia社製）などが挙げられる。
【００４７】
また、本ポリヌクレオチドのＤＮＡは、例えば、微生物又はファージ由来のベクターに挿入されたＤＮＡライブラリーに配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有する約１５塩基程度以上の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして後述する条件にてハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出することによっても取得することができる。
【００４８】
染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択することができる。
【００４９】
使用されるライブラリーがプラスミドベクターを用いて作製されている場合にはコロニーハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、ライブラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入することにより形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈した後、該希釈物を寒天培地上にまき、コロニーが現われるまで培養する。
【００５０】
使用されるライブラリーがファージベクターを用いて作製されている場合にはプラークハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、宿主微生物とライブラリーのファージとを感染可能な条件下で混合し、さらに軟寒天培地と混合した後、該混合物を寒天培地上にまき、プラークが現われるまで培養する。
【００５１】
次いで、いずれのハイブリダイゼーションの場合にも、前記の培養を行った寒天培地上にメンブレンを置き、形質転換体又はファージを該メンブレンに吸着・転写させる。このメンブレンをアルカリ処理した後、中和処理し、次いでＤＮＡを該メンブレンに固定する処理を行う。より具体的には、例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、前記寒天培地上にニトロセルロースメンブレン又はナイロンメンブレン（例えば、Hybond-N+（アマシャム社登録商標））を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着・転写させる。次に、該メンブレンをアルカリ溶液（例えば１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させることによりファージＤＮＡをメンブレン上に溶出させた後、中和溶液（例えば、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝溶液ｐＨ７．５）に約５分間浸す。次いで該メンブレンを洗浄液（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間加熱することによりファージＤＮＡをメンブレンに固定する。
【００５２】
このように調製されたメンブレンを用いて、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（1989）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press等の記載に準じて行うことができる。
【００５３】
プローブに用いるＤＮＡは、放射性同位元素により標識されたものや、蛍光色素で標識されたものであってもよい。
プローブに用いるＤＮＡを放射性同位元素により標識する方法としては、例えば、Random Primer Labeling Kit（宝酒造社製）等を利用することにより、ＰＣＲ反応液中のｄＣＴＰを（α−32Ｐ）ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いるＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う方法が挙げられる。
また、プローブに用いるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には、例えば、アマシャム製のECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System等を用いることができる。
【００５４】
ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の通りに行うことができる。
４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含みドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｌ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液（好ましくは９００ｍMの塩化ナトリウム、９０ｍMのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｌ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション液）を上記のようにして作製したメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該プレハイブリダイゼーション液に前記メンブレンを浸して４２〜６５℃で１〜４時間保温する。
次いで、例えば、４５０〜９００ｍMの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポロビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液（好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液）と前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン１ｃｍ2当たり１．０×１０4〜２．０×１０6cpm相当量）とを混合した溶液をメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、該ハイブリダイゼーション溶液に浸し４２〜６５℃で１２〜２０時間保温する。
【００５５】
当該ハイブリダイゼーション後、メンブレンを取り出し、１５〜３００ｍＭの塩化ナトリウム１．５〜３０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．１〜１．０重量％のＳＤＳ等を含む４２〜６５℃の洗浄液（好ましくは１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム及び１．０重量％のＳＤＳを含む６５℃の洗浄液）等を用いて洗浄する。洗浄したメンブレンを２×ＳＳＣ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム）で軽くすすいだ後、乾燥する。このメンブレンを例えばオートラジオグラフィー等に供してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのメンブレン上の位置に相当するクローンを元の寒天培地上で特定し、これを釣菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離する。
【００５６】
このようにして得られるクローンを培養して得られる培養菌体から本ポリヌクレオチドを調製することができる。
【００５７】
また、本ポリヌクレオチドは人工合成することもできる。人工合成遺伝子の設計と合成は、細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ７「植物のＰＣＲ実験プロトコール」、95〜100頁、島本巧・佐々木卓治監修秀潤社、1997年7月1日刊行に記載される方法を参考に行うことができる。
【００５８】
具体的には例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を作成し、当該アミノ酸配列に含まれる各々のアミノ酸に対応するコドンとして発現させる微生物細胞（例えば、大腸菌）において使用頻度の高いコドンを選択することによって本ポリヌクレオチドの塩基配列を設計する。大腸菌等におけるコドン使用頻度の情報は、例えば、当業者に公知のＤＮＡデータベース（GenBank、EMBL、DDBJ等）を利用して得ることができる。また、枯草菌等を微生物細胞とし、細胞外に運搬させるために上記のアミノ酸配列にシグナル配列を付加する場合には、これを含めたタンパク質全体のアミノ酸配列を作成する。シグナル配列としては、微生物細胞由来のものであることが好ましく、例えば、細胞外へ移行するシグナルである枯草菌由来のα−アミラーゼのシグナル配列等を挙げることができる。
【００５９】
以下、具体的な実験手順を示す。
まず作成したアミノ酸配列に含まれる各アミノ酸の個数を求める。ポリヌクレオチドを発現させる微生物細胞のコドンの平均出現頻度に最も近くなるように、上記で求めた個数のアミノ酸について使用するコドンを割り当てる。なるべく同一コドンが連続しないように、それぞれのコドンの使用順番をつける。Ｎ末端側のアミノ酸から順番に、各アミノ酸について決定したコドンの順番通りに選び、そのアミノ酸残基のコドンと仮決定する。これらの手順を繰り返しＣ末端までの全アミノ酸のコドンを仮決定し、最後に終止コドンを配置する。決定されたコドンからなる人工遺伝子について、微生物細胞において遺伝子の転写を阻害する塩基配列であったり、以降の操作で使用する制限酵素が認識する塩基配列が存在しないことを確認する。このような塩基配列が存在した場合には、この塩基配列にかかるコドンを別の部分で使用したコドンと交換する。尚、遺伝子設計の際に、後の操作のために適当な制限酵素が認識する塩基配列を５’末端側および３’末端側に付加しておくことが好ましい。
【００６０】
次に、上記で設計した塩基配列を有する遺伝子の合成は、PCRを用いた長鎖DNA合成法を用いて行うことができる（島本ら、「植物のPCR実験プロトコール」、同上参照）（以下、本法をＡｓｓｅｍｂｌｙ  ＰＣＲ法と記すこともある）。当該方法では、長い合成オリゴヌクレオチドプライマーのみを使用してDNAを合成する。プライマーの対は、プライマーの各々の３’末端に約10〜12bpの相補鎖又はオーバーラップを持つように合成され、互いのプライマーを鋳型としてＤＮＡ合成を行う。プライマーの全長としては、例えば、約60〜100mer等を挙げることができる。好ましくは、例えば、約80〜100mer等が挙げられる。
【００６１】
まず、設計された塩基配列を基に、例えば、約90塩基毎にプライマーとするDNAオリゴマーを設計し、合成する。ＤＮＡオリゴマーの合成は、β−シアノエチルホスホアミダイド法によりＤＮＡ合成機を用いて行うことができる。例えば、設計した塩基配列の中央部付近から５’側約90残基上流までの塩基配列を用いて第１のＤＮＡオリゴマー設計し、合成する。次いで、第１のＤＮＡオリゴマーの３’側12残基の塩基配列を含み、この部分より遺伝子の３’下流側に90残基程度の長さの相補鎖オリゴマーを合成し、これを第２のＤＮＡオリゴマーとする。また、第１のＤＮＡオリゴマーの５’側12残基を含み、この部分より遺伝子の５’上流側に90残基程度の長さの相補鎖オリゴマーを合成し、これを第３のＤＮＡオリゴマーとする。更に、第２のＤＮＡオリゴマーの５’側（遺伝子側からみると３’側）の12残基の塩基配列を含み、この部分より遺伝子の３’下流側に第２のＤＮＡオリゴマーの相補鎖を合成し、これを第４のＤＮＡオリゴマーとする。以下同様に適当量のＤＮＡオリゴマーを合成する。目的のポリヌクレオチドがカバーできていない場合はカバーできるまで更にオリゴマーを合成する。
【００６２】
次に、これらオリゴマーを順番にＰＣＲ反応により結合する。まず第１のＤＮＡオリゴマーと第２のＤＮＡオリゴマーとをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行う。得られたＰＣＲ産物を鋳型として、第３のＤＮＡオリゴマーと第４のＤＮＡオリゴマーとをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行う。
ＰＣＲ反応は、例えば、変性温度94℃１分、アニール温度51℃１分、伸長温度72℃２分を１セットとして５サイクル反応させた後、変性温度94℃１分、アニール温度60℃１分、伸長温度72℃２分を１セットして20サイクル反応を行う。反応に使用するＤＮＡポリメラーゼは塩基の取り込みエラー率の低い酵素を使用することが好ましい。以下、前記操作を繰り返し、塩基配列を伸長し、目的の塩基配列を得る。目的の塩基配列の両端には、必要に応じて制限酵素部位を設け、常法に従いクローニングベクターに導入し、サブクローニングする。得られたクローンの塩基配列をＤＮＡシークエンサーで確認し、目的の塩基配列を有するポリヌクレオチドが得られたことを確認する。このようにして、例えば、配列番号５で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を人工合成して本ポリヌクレオチドのＤＮＡを調製することができる。
【００６３】
このようにして得られた本ポリヌクレオチドを微生物細胞で発現させるには、例えば、微生物細胞内で機能可能なプロモーターと本ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡを微生物細胞に導入する。
【００６４】
ここで、「機能可能な形で」とは、前記ＤＮＡを微生物細胞に導入することにより微生物細胞を形質転換させた際に、本ポリヌクレオチドが、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、大腸菌のラクトースオペロンのｌａｃプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター、または、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーターのように独自に改変・設計された、大腸菌内で機能可能な合成プロモーター等をあげることができる。また、ラムダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモーター、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）、アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）、中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）、α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等を挙げることができる。
【００６５】
一般的には、微生物細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなるＤＮＡを「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして組換えベクターを得ることができる。
【００６６】
用いられるベクターとしては、本ポリヌクレオチドを保持し、且つ、複製可能（例えば、微生物細胞内にてプラスミドが増殖するために必要なＤＮＡ配列、プロモーター、リボソーム結合配列、転写ターミネーター（転写終結配列）、選択マーカー遺伝子を含む。）であれば、特段の制約を受けるものではなく、それぞれの宿主に適したベクターを使用することができる。例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージ等を挙げることができる。
プラスミドＤＮＡとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119（宝酒造社製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII（東洋紡社製）、ｐCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（Pharmacia社製）、ｐKK223-3（Pharmacia社製）等のColE系プラスミド等）、放線菌由来のプラスミド（pIJ486等）、酵母由来のプラスミド（YEp13、YEp 24、Ycp50等）が挙げられる。ファージDNAとしては、λファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11等）、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡ等を挙げることができる。
尚、ベクターとしては、選択マーカー遺伝子（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子や、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、当該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択することができる。また、リボソーム結合配列としては、SD配列やKozak配列が知られており、これらの配列を変異遺伝子の上流に挿入することができる。原核生物を宿主として用いるときにはSD配列を、真核生物を宿主として用いるときにはKozak配列をPCR法等により付加してもよい。SD配列としては、大腸菌由来、ロドコッカス属細菌または枯草菌由来の配列等を挙げることができるが、所望の微生物細胞内で機能する塩基配列であれば特に限定されるものではない。例えば、16SリボゾームRNAの３’末端領域に相補的な塩基配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をDNA合成により作製してこれを利用してもよい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えば、リポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等を利用してもよい。
【００６７】
このようなベクターに本ポリヌクレオチドを組み込むには、本ポリヌクレオチドを含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、必要であれば適当なリンカーを付加した後、適当な制限酵素で切断したベクターと結合させることにより行うことができる。また、本ポリヌクレオチドを含むＤＮＡを適当な制限酵素認識配列を含むプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、増幅産物を制限酵素処理した後、適当な制限酵素で切断したベクターと結合させることによっても行うことができる。
【００６８】
このように作製した組換えベクターを微生物細胞内に導入すれば、本酵素を高度に発現する形質転換体が得られる。当該形質転換体を培養することにより、本酵素を発現させることができる。
【００６９】
微生物細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本ポリヌクレオチド又はこれを保有する組換えベクター等を微生物細胞へ導入する方法としては、用いられる微生物細胞に応じて通常使われるＤＮＡの導入方法であればよく、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載される塩化カルシウム法や、例えば、ヒートショックによる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法や、「Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System」 Bio-Rad Laboratories, (1993)等に記載されるエレクトロポレーション法等をあげることができる。
【００７０】
ここで「微生物細胞」としては、例えば、大腸菌（具体的には例えば、K12株、B株、JM109株、XL1-Blue株、C600株、W3110株）、枯草菌、酵母、カビ、ロドコッカス属細菌等の微生物を挙げることができる。好ましくは、Escherichia属、Bacillus属、Corynebacterium属、Staphylococcus属、Streptomyces属、Saccharomyces属（具体的には例えば、Saccharomyces cerevisiae）、Schizosaccharomyces属（具体的には例えば、Schizosaccharomyces pombe）、Pichia属（具体的には例えば、Pichia pastoris）、Kluyveromyces属、Aspergillus属及びRhodococcus属（具体的には例えば、Rhodococcus rhodochrousATCC 12674株、Rhodococcus rhodochrous J-1株（FERM BP-1478））に属する微生物等があげられる。
【００７１】
微生物細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本ポリヌクレオチド又はこれを保有する組換えベクター等が導入された形質転換体を選抜するには、例えば、前述のようなベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
【００７２】
得られた形質転換体が本ポリヌクレオチドを保有していることは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
【００７３】
例えば、本形質転換体の菌体を含硫アミノアルコール化合物に作用させる。反応生成物中の含硫α−アミノアルデヒド化合物及び／又は含硫α−アミノ酸化合物の量を分析することにより、得られたＤＮＡがかかる能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードすることが確認できる。
また、ＤＮＡの塩基配列を慣用の方法により配列決定することにより確認することもできる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（例えば、F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson著、Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467頁参照）等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等の市販の試薬を用いてもよい。また、適当なＤＮＡシークエンサーを利用して塩基配列を解析することもできる。
【００７４】
次に、本形質転換体の培養に係る調製方法について説明する。
本形質転換体は、炭素源、窒素源、有機塩、無機塩等を適宜含有する各種の微生物を培養するための培地を用いて培養すればよい。
【００７５】
炭素源としては、例えば、グルコ−ス、デキストリン、シュ−クロ−ス等の糖類、グリセロ−ル等の糖アルコ−ル、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１％（ｗ／ｖ）〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００７６】
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コ−ン・スティ−プ・リカ−（Corn Steep Liquor）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１％（ｗ／ｖ）〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００７７】
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
【００７８】
プロモーターとして誘導性のプロモーターと本ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡが導入されてなる形質転換体を培養する場合には、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、tacプロモーター、trcプロモーター及びlacプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと本ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡが導入されてなる形質転換体を培養する場合には、本酵素の産生を誘導するための誘導剤として、例えば、isopropyl thio-β-D-galactoside（IPTG）を培地中に少量加えることもできる。また、trpプロモーター等のインドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導されるタイプのプロモーターと本ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡが導入されてなる形質転換体を培養する場合には、本酵素の産生を誘導するための誘導剤として、例えば、ＩＡＡを培地中に少量加えることもできる。
【００７９】
培養方法としては、例えば、固体培養、液体培養（試験管培養、フラスコ培養、ジャーファーメンター培養等）が挙げられる。
培養温度及び培養液のｐＨは、本形質転換体が生育する範囲であれば特に限定されるものではないが、例えば、培養温度は約１５℃〜約４５℃、好ましくは１０℃〜３７℃の範囲、培養液のｐＨは約４〜約８の範囲を挙げることができる。培養時間は、培養条件により適宜選択することができるが、通常、約１日間〜約７日間である。
【００８０】
本形質転換体の培養物は、そのまま本発明製造方法の触媒として用いることができる。本形質転換体の培養物を用いる方法のうち、本形質転換体の菌体をそのまま用いる方法としては、例えば、（１）培養液をそのまま用いる方法、（２）培養液を遠心分離等することにより回収された菌体（必要に応じて、緩衝液又は水で洗浄した後の湿菌体）を用いる方法等を挙げることができる。
【００８１】
また本発明製造方法の触媒として、本形質転換体の培養物の処理物を用いることもできる。当該処理物としては、例えば、培養して得られた菌体を有機溶媒（アセトン、エタノール等）処理したもの、凍結乾燥処理したもの若しくはアルカリ処理したもの、又は、菌体を物理的若しくは酵素的に破砕したもの、又は、これらのものから分離・抽出された粗酵素等を挙げることができる。さらに、前記処理物には、前記処理を施した後、公知の方法により固定化処理したものも含まれる。
【００８２】
本形質転換体の培養物から本酵素を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用すればよい。例えば、次のような方法を挙げることができる。
【００８３】
まず、本形質転換体の培養物から遠心分離等により菌体を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチ−ム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルタ−濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィ−、陰イオン交換クロマトグラフィ−、疎水クロマトグラフィ−、ゲルろ過クロマトグラフィ−、金属キレ−トクロマトグラフィ−等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、本酵素を精製することができる。
クロマトグラフィ−に使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロ−ス、デキストリン又はアガロ−ス等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Q−Sepharose FF、Phenyl−Sepharose HP（商品名、いずれもアマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソ−社製）等が挙げられる。
尚、本酵素を含む画分を選抜するには、例えば、本発明における「含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力」、「含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力」、及び／又は、「含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力」の存在有無又はその程度に基づき選抜すればよい。
【００８４】
具体的な形態としては、例えば、本形質転換体の菌体、かかる菌体の処理物（例えば、無細胞抽出液、粗精製タンパク質、精製タンパク質及びこれらの固定化物等）を挙げることができる。ここで、培養物の処理物としては、例えば、凍結乾燥微生物、有機溶媒処理微生物、乾燥微生物、微生物摩砕物、微生物の自己消化物、微生物の超音波処理物、微生物抽出物、微生物のアルカリ処理物を挙げることができる。また、固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロ−ス、イオン交換樹脂等に本酵素等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギ−ナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本酵素等を閉じ込める方法）を挙げることができる。
【００８５】
尚、本形質転換体を用いた工業的な生産を考慮すれば、未処理状態の微生物を用いる方法よりも当該微生物を死滅化させた処理物を用いる方法のほうが製造設備の制限等の点から好ましい場合がある。そのための死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコ−ル、フェノ−ル、アミン、サルファイド、エ−テル、アルデヒド、ケトン、シアン、抗生物質）を挙げることができる。一般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ本酵素が有する前記の「含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力」、「含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力」、及び／又は、「含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力」を失活させず、且つ、反応系への残留、汚染等の影響が少ない処理方法を選択することが望ましい。
【００８６】
以下、更に具体的に説明する。
１．培養物の処理物（その１）
本形質転換体の培養物から菌体を回収するには、遠心分離法や膜ろ過法を用いることができる。遠心分離は、限定されるわけではないが、例えば、3,000〜4,500×g、５〜２０分間、４℃の条件で行うことができる。回収された本形質転換体を、必要に応じて、リン酸−ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液等で洗浄し、懸濁することができる。このようにして菌体懸濁液が得られる。
菌体の破砕方法としては、超音波処理、フレンチプレスやホモジナイザーによる高圧処理、ガラスビーズ等による磨砕処理、リゾチーム、セルラーゼ、ペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等を利用することができる。破砕処理は、必要に応じて氷冷下で行う。例えば、菌体懸濁液を超音波破砕機VP−15S（タイテック、日本）を用いて、出力コントロール4、DUTY CYCLE 40%、PULS、TIMER＝Bモード10sの条件で氷冷下に１〜５分、好ましくは３分間破砕すればよい。また、例えば、菌体懸濁液を100 MPa加圧条件でＮｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社製ホモジナイザーPANDA2K型を用いて破砕してもよい。
破砕後、本形質転換体の破砕物から、必要に応じて菌体の破砕残渣を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過等が挙げられる。必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。遠心分離は、限定されるわけではないが、例えば、4,000〜25,000×g、3〜45分間、４℃の条件で行うことができる。このようにして破砕物から残渣を除去すればよい。
【００８７】
２．培養物の処理物（その２）
前記の本形質転換体の破砕物や無細胞抽出液を加熱処理することにより、本酵素以外の多くのタンパク質を変性させることができる。従って、本形質転換体の破砕物又は無細胞抽出液を加熱処理することにより、本酵素液を可溶性画分として取得することができる。本酵素には、上記のように取得される本酵素液が含まれる。
ここで「加熱処理」とは、本形質転換体に由来する本酵素以外のタンパク質を変性させるために行う熱失活操作をいい、当該加熱処理の温度は好ましくは50℃以上75℃以下、さらに好ましくは60℃以上70℃以下である。加熱処理の時間は特に限定されないが、本形質転換体の破砕物や無細胞抽出液が設定温度となってから10分以上が好ましい。さらに好ましくは1時間以上5時間以下である。
例えば、加熱処理は、本形質転換体の破砕物等を試験管に入れ、所定の温度に設定したウォーターバスにおいて所定の時間インキュベートすることにより行うことができる。また、温度計を付した三ツ口フラスコに本形質転換体の破砕物等を入れ、所定の温度まで加熱し、所定の時間加熱処理を行うこともできる。
また、本発明において、本形質転換体の破砕物を加熱処理（前加熱）した後、破砕残渣を除き、その後再び加熱処理を行ってもよい。再加熱の際、亜鉛塩を存在させてもよい。
加熱処理により生じた不溶性物を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過等が挙げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して除去効率を上げることもできる。必要があれば、各種クロマトグラフィー等（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を用いて更に精製してもよい。
【００８８】
本発明製造法は、通常、水の存在下、好ましくは酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と記す。）等の補酵素の添加系で行われる。この場合の水は、緩衝液の形態であってもよい。当該緩衝液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸のアルカリ金属塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸のアルカリ金属塩や、アルカリ性の緩衝液としてＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−クエン酸、Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液等が挙げられる。
また本発明製造法は、更に疎水性有機溶媒を用いて、水と疎水性有機溶媒との存在下で行うこともできる。この場合に用いられる疎水性有機溶媒としては、例えば、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、ｎ−ブチルアルコール、ｎ−アミルアルコール、ｎ−オクチルアルコール等のアルコール類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテル等のエーテル類、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類及びこれらの混合物を挙げることができる。
また本発明製造法は、更に親水性有機溶媒を用いて、水と水性媒体との存在下で行うこともできる。この場合に用いられる親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール類、アセトン等のケトン、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類、ジメチルスルホキシド及びこれらの混合物を挙げることができる。
【００８９】
本発明製造法は、通常、水層のｐＨが３〜１１の範囲内で行われるが、反応が進行する範囲内で適宜変化させてもよい。好ましくはアルカリ側で行われることがよく、より好ましくは水層のｐＨが８〜１０の範囲内で行われることがよい。
【００９０】
本発明製造法は、通常、約０℃〜約６０℃の範囲内で行われるが、反応が進行する範囲内で適宜変化させてもよい。
【００９１】
本発明製造法は、通常、約０．５時間〜約１０日間の範囲内で行われる。反応の終点は、原料化合物である一般式（１）で示される含硫アミノアルコール化合物（即ち、化合物（１））の添加終了後、例えば、反応液中の当該一般式（１）で示される含硫アミノアルコール化合物の量を、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等により測定することにより確認することができる。
【００９２】
本発明製造法における原料化合物である一般式（１）で示される含硫アミノアルコール化合物（即ち、化合物（１））の濃度は、通常、５０％（ｗ／ｖ）以下であり、反応系中の当該一般式（１）で示される含硫アミノアルコール化合物の濃度を略一定に保つために、当該一般式（１）で示される含硫アミノアルコール化合物（即ち、化合物（１））を反応系に連続又は逐次加えてもよい。
【００９３】
本発明製造法では、必要に応じて反応系に、例えば、グルコース、シュークロース、フルクトース等の糖類、又は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００若しくはＴｗｅｅｎ６０等の界面活性剤等を加えることもできる。
【００９４】
本発明の製造方法に関して、前述の如く、本発明製造法及び本発明酵素法は、通常、水の存在下、好ましくは酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と記す。）等の補酵素の添加系で行われる。前記添加系では、含硫アミノアルコール化合物の酸化反応、又は、含硫α−アミノアルデヒド化合物の酸化反応の進行に伴い、当該ＮＡＤ＋は還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記すこともある。）に変換される。変換により生じたＮＡＤＨは、ＮＡＤＨを酸化型（ＮＡＤ＋）に変換する能力を有するタンパク質により元のＮＡＤ＋に戻すことができるので、上記方法の反応系内には、ＮＡＤＨをＮＡＤ＋に変換する能力を有するタンパク質を共存させることもできる。
【００９５】
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（即ち、ＮＡＤＨ）又はＮＡＤＰＨを、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（即ち、ＮＡＤ＋）又はＮＡＤＰ＋に変換する能力を有するタンパク質としては、具体的には例えば、乳酸脱水素酵素等を挙げることができる。
【００９６】
また、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを、ＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+に変換する能力を有するタンパク質が乳酸脱水素酵素である場合には、反応系内にピルビン酸ナトリウム等を共存させることにより当該タンパク質の活性が増強される場合もあり、例えば、反応液にこのような化合物を加えてもよい。
【００９７】
また、前記タンパク質は、酵素そのものであってもよいし、また当該酵素を持つ微生物の菌体又は当該微生物の菌体処理物の形態で反応系内に共存していてもよい。更にまた、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを、ＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを含む形質転換体又はその菌体処理物であってもよい。尚、このような菌体処理物は、前述された本形質転換体の処理物の調製法と同等な方法に準じて調製してもよい。
【００９８】
また更に、本発明製造法では、例えば、乳酸脱水素酵素等のような、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを、ＮＡＤ+又はＮＡＤＰ+に変換する能力を有するタンパク質、のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを同時に保有する形質転換体を利用してもよい。尚、このような形質転換体は、前述された本形質転換体の調製法と同等な方法に準じて調製してもよい。
【００９９】
反応液からの一般式（２）で表わされる含硫α-アミノ酸化合物の回収は、一般に知られている任意の方法で行えばよい。
例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作、イオン交換法、結晶化法等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィ−、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法を挙げることができる。
【０１００】
尚、本発明製造法により得られた一般式（２）で示される含硫アミノ酸化合物は、塩の形であってもよい。
【０１０１】
本発明は、一般式（１）で示される含硫アミノアルコール化合物（即ち、化合物（１））に、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ａ））を作用させる工程（以下、ＡＤＨ工程と記すこともある。）、及び、前記工程で生成させた対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｂ））を作用させる工程（以下、ＡＬＤＨ工程と記すこともある。）を含むことを特徴とする、一般式（２）で示される含硫α-アミノ酸化合物（即ち、化合物（２））の製造法（以下、第一の本発明酵素法と記すこともある。）を含む。
また本発明は、一般式（１）で示される含硫アミノアルコール化合物（即ち、化合物（１））に、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｃ））を作用させる工程（以下、ＡＤＨ・ＡＬＤＨ工程と記すこともある。）を含むことを特徴とする、一般式（２）で示される含硫α-アミノ酸化合物（即ち、化合物（２））の製造法（以下、第二の本発明酵素法と記すこともある。）を含む。
（尚、以下、第一の本発明酵素法と、第二の本発明酵素法とを総じて本発明酵素法と記すこともある。）
【０１０２】
本発明酵素法における含硫アミノアルコール化合物としては、好ましくは、含硫アミノアルコール化合物のＲ１が炭素数１〜８のアルキル基である化合物を挙げることができる。より好ましくは、含硫アミノアルコール化合物のＲ１が炭素数１〜５のアルキル基である化合物が挙げられる。さらに好ましくは、例えば、含硫アミノアルコール化合物のＲ１がメチル基である化合物が挙げられる。
【０１０３】
本発明酵素法において利用される、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ａ））、前記工程で生成させた対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｂ））、及び、前記含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力と、前記含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力との両者の能力を有する酵素（即ち、本酵素（Ｃ））は、市販されるものであってもよいし、上述のように、例えば、本形質転換体の培養物等から通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用してこれらの酵素を精製したものであってもよい。尚、これらの酵素のより具体的な調製方法については、上述した説明を参照すればよい。
【０１０４】
第一の本発明酵素法におけるＡＤＨ工程は、通常、水の存在下、好ましくは酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と記す。）等の補酵素の添加系で行われる。この場合の水は、緩衝液の形態であってもよい。当該緩衝液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸のアルカリ金属塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸のアルカリ金属塩や、アルカリ性の緩衝液としてＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−クエン酸、Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液等が挙げられる。
また第一の本発明酵素法におけるＡＤＨ工程は、更に疎水性有機溶媒を用いて、水と疎水性有機溶媒との存在下で行うこともできる。この場合に用いられる疎水性有機溶媒としては、例えば、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、ｎ−ブチルアルコール、ｎ−アミルアルコール、ｎ−オクチルアルコール等のアルコール類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテル等のエーテル類、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類及びこれらの混合物を挙げることができる。
また第一の本発明酵素法におけるＡＤＨ工程は、更に親水性有機溶媒を用いて、水と水性媒体との存在下で行うこともできる。この場合に用いられる親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール類、アセトン等のケトン、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類、ジメチルスルホキシド及びこれらの混合物を挙げることができる。
【０１０５】
第一の本発明酵素法におけるＡＤＨ工程は、通常、水層のｐＨが３〜１１の範囲内で行われるが、反応が進行する範囲内で適宜変化させてもよい。好ましくはアルカリ側で行われることがよく、より好ましくは水層のｐＨが８〜１０の範囲内で行われることがよい。
【０１０６】
第一の本発明酵素法におけるＡＤＨ工程は、通常、約０℃〜約６０℃の範囲内で行われるが、反応が進行する範囲内で適宜変化させてもよい。
【０１０７】
第一の本発明酵素法におけるＡＤＨ工程は、通常、約０．５時間〜約１０日間の範囲内で行われる。反応の終点は、原料化合物である一般式（１）で示される含硫アミノアルコール化合物（即ち、化合物（１））の添加終了後、例えば、反応液中の当該一般式（１）で示される含硫アミノアルコール化合物の量を、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等により測定することにより確認することができる。
第一の本発明酵素法における原料化合物である一般式（１）で示される含硫アミノアルコール化合物（即ち、化合物（１））の濃度は、通常、５０％（ｗ／ｖ）以下であり、反応系中の当該一般式（１）で示される含硫アミノアルコール化合物の濃度を略一定に保つために、当該一般式（１）で示される含硫アミノアルコール化合物（即ち、化合物（１））を反応系に連続又は逐次加えてもよい。
【０１０８】
第一の本発明酵素法におけるＡＤＨ工程では、必要に応じて反応系に、例えば、グルコース、シュークロース、フルクトース等の糖類、又は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００若しくはＴｗｅｅｎ６０等の界面活性剤等を加えることもできる。
【０１０９】
第一の本発明酵素法におけるＡＬＤＨ工程は、通常、水の存在下、好ましくは酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と記す。）等の補酵素の添加系で行われる。この場合の水は、緩衝液の形態であってもよい。当該緩衝液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸のアルカリ金属塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸のアルカリ金属塩や、アルカリ性の緩衝液としてＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−クエン酸、Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液等が挙げられる。
また第一の本発明酵素法におけるＡＬＤＨ工程は、更に疎水性有機溶媒を用いて、水と疎水性有機溶媒との存在下で行うこともできる。この場合に用いられる疎水性有機溶媒としては、例えば、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、ｎ−ブチルアルコール、ｎ−アミルアルコール、ｎ−オクチルアルコール等のアルコール類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテル等のエーテル類、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類及びこれらの混合物を挙げることができる。
また第一の本発明酵素法におけるＡＬＤＨ工程は、更に親水性有機溶媒を用いて、水と水性媒体との存在下で行うこともできる。この場合に用いられる親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール類、アセトン等のケトン、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類、ジメチルスルホキシド及びこれらの混合物を挙げることができる。
【０１１０】
第一の本発明酵素法におけるＡＬＤＨ工程は、通常、水層のｐＨが３〜１１の範囲内で行われるが、反応が進行する範囲内で適宜変化させてもよい。好ましくはアルカリ側で行われることがよく、より好ましくは水層のｐＨが８〜１０の範囲内で行われることがよい。
【０１１１】
第一の本発明酵素法におけるＡＬＤＨ工程は、通常、約０℃〜約６０℃の範囲内で行われるが、反応が進行する範囲内で適宜変化させてもよい。
【０１１２】
第一の本発明酵素法におけるＡＬＤＨ工程は、通常、約０．５時間〜約１０日間の範囲内で行われる。反応の終点は、反応液中の前記対応する含硫α−アミノ酸化合物の量を、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等により測定することにより確認することができる。
第一の本発明酵素法における原料化合物である前記の対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物の濃度は、通常、５０％（ｗ／ｖ）以下であり、反応系中の当該対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物の濃度を略一定に保つために、当該対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物を反応系に連続又は逐次加えてもよい。
【０１１３】
第一の本発明酵素法におけるＡＬＤＨ工程では、必要に応じて反応系に、例えば、グルコース、シュークロース、フルクトース等の糖類、又は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００若しくはＴｗｅｅｎ６０等の界面活性剤等を加えることもできる。
【０１１４】
第二の本発明酵素法におけるＡＤＨ・ＡＬＤＨ工程は、通常、水の存在下、好ましくは酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と記す。）等の補酵素の添加系で行われる。この場合の水は、緩衝液の形態であってもよい。当該緩衝液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸のアルカリ金属塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸のアルカリ金属塩や、アルカリ性の緩衝液としてＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−クエン酸、Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液等が挙げられる。
また第二の本発明酵素法におけるＡＤＨ・ＡＬＤＨ工程は、更に疎水性有機溶媒を用いて、水と疎水性有機溶媒との存在下で行うこともできる。この場合に用いられる疎水性有機溶媒としては、例えば、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、ｎ−ブチルアルコール、ｎ−アミルアルコール、ｎ−オクチルアルコール等のアルコール類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテル等のエーテル類、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類及びこれらの混合物を挙げることができる。
また第二の本発明酵素法におけるＡＤＨ・ＡＬＤＨ工程は、更に親水性有機溶媒を用いて、水と水性媒体との存在下で行うこともできる。この場合に用いられる親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール類、アセトン等のケトン、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類、ジメチルスルホキシド及びこれらの混合物を挙げることができる。
【０１１５】
第二の本発明酵素法におけるＡＤＨ・ＡＬＤＨ工程は、通常、水層のｐＨが３〜１１の範囲内で行われるが、反応が進行する範囲内で適宜変化させてもよい。好ましくはアルカリ側で行われることがよく、より好ましくは水層のｐＨが８〜１０の範囲内で行われることがよい。
【０１１６】
第二の本発明酵素法におけるＡＤＨ・ＡＬＤＨ工程は、通常、約０℃〜約６０℃の範囲内で行われるが、反応が進行する範囲内で適宜変化させてもよい。
【０１１７】
第二の本発明酵素法におけるＡＤＨ・ＡＬＤＨ工程は、通常、約０．５時間〜約１０日間の範囲内で行われる。反応の終点は、原料化合物である一般式（１）で示される含硫アミノアルコール化合物（即ち、化合物（１））の添加終了後、例えば、反応液中の当該一般式（１）で示される含硫アミノアルコール化合物の量、または、反応液中の前記対応する含硫α−アミノ酸化合物の量を、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等により測定することにより確認することができる。
第二の本発明酵素法における原料化合物である一般式（１）で示される含硫アミノアルコール化合物（即ち、化合物（１））の濃度は、通常、５０％（ｗ／ｖ）以下であり、反応系中の当該一般式（１）で示される含硫アミノアルコール化合物の濃度を略一定に保つために、当該一般式（１）で示される含硫アミノアルコール化合物（即ち、化合物（１））を反応系に連続又は逐次加えてもよい。
【０１１８】
第二の本発明酵素法におけるＡＤＨ・ＡＬＤＨ工程は、必要に応じて反応系に、例えば、グルコース、シュークロース、フルクトース等の糖類、又は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００若しくはＴｗｅｅｎ６０等の界面活性剤等を加えることもできる。
【０１１９】
本発明酵素法において、反応液からの一般式（２）で示される含硫α−アミノ酸化合物（即ち、化合物（２））の回収は、一般に知られている任意の方法で行えばよい。
例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作、イオン交換法、結晶化法等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィ−、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法を挙げることができる。
【０１２０】
尚、本発明製造法により得られた一般式（２）で示される含硫アミノ酸化合物は、塩の形であってもよい。
【実施例】
【０１２１】
次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明する。
【０１２２】
実施例１  （本ポリヌクレオチドを有するプラスミドの合成法）
Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＰＣＲ法を用いて、５’末端にNcoIサイトを、３’末端にXbaIサイトを付加した配列番号５で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を人工遺伝子合成業者（北海道システムサイエンス株式会社）に依頼して合成した。合成されたＤＮＡ断片を２種類の制限酵素（NcoI及びXbaI）により２重消化し、次いで、得られた２重消化された約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドベクターｐＴｒｃ９９A（Pharmacia社製）を２種類の制限酵素（NcoI及びXbaI）により２重消化し、次いで、得られた２重消化されたＤＮＡ断片を精製した。
このようにして得られた２種類の精製させたＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションした後、得られたライゲーション液で大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から３コロニーを無作為に選抜した。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養した（３７℃、２４時間）。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。
尚、取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を、NcoIとXbaIとの２種類の制限酵素により２重消化した後、２重消化されたＤＮＡ断片をゲル電気泳動することにより、当該取り出されたプラスミドの全てには前記約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。（以下、当該プラスミドをプラスミドｐＴｒｃＡＤＨと記すこともある。）
【０１２３】
このようにして得られたプラスミドｐＴｒｃＡＤＨを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３７℃、２４時間）。得られた培養液を遠心分離することにより、本形質転換体の菌体を得た。
【０１２４】
実施例２  （本酵素を産生する大腸菌形質転換体を用いた含硫アミノアルコール化合物からの含硫α−アミノ酸化合物の製造例）
実施例１で得られた本形質転換体（即ち、プラスミドｐＴｒｃＡＤＨを有する大腸菌ＤＨ５α株）とプラスミドベクターｐＴｒｃ９９A（Pharmacia社製）を有する大腸菌ＤＨ５α株とを５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ）に接種し、これを各々振盪培養した（３７℃、２４時間）。得られた各々の培養液を遠心分離することにより、各々の湿菌体約０．６ｇを得た。得られた各々の湿菌体を０．２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９）１０ｍｌに懸濁した後、懸濁液中の菌体を、ガラスビーズを用いて破砕することにより、各々の無細胞抽出液約６ｍｌを得た。得られた各々の無細胞抽出液１ｍｌずつを混合して得られた混合液２ｍｌ中に、ＤＬ−メチオニノール（Sigma社製）２ｍｇ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母社製）１ｍｇ、ピルビン酸ナトリウム（ナカライテスク社製）４ｍｇ、乳酸脱水素酵素２５ユニット（オリエンタル酵母社製）を添加し、３０℃で２４時間攪拌した。
反応終了後、反応液を０．６ｍｌサンプリングした。当該サンプリング液から浮遊物を除去した後、生成したメチニオニンの量を液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、反応に用いたＤＬ−メチオニノールの量に対してメチニオニンは１４．３％生成していることが確認できた。尚、対照実験での結果は、実施例３に記載した。
（含量分析条件）
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（４．６ｍｍφ×１５ｃｍ、３μｍ）（Ｉｍｔａｋｔ社製）
移動相：Ａ液  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液  メタノール
時間(分)  Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０      １００：０
１０    １００：０
２０      ５０：５０
２５      ５０：５０
２５.１  １００：０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２２０ｎｍ
【０１２５】
実施例３  （本酵素を産生する大腸菌形質転換体を用いた含硫アミノアルコール化合物からの含硫α−アミノ酸化合物の製造例（対照実験））
プラスミドベクターｐＴｒｃ９９A（Pharmacia社製）を有する大腸菌ＤＨ５α株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び０．１ｍＭのＩＰＴＧを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ）に接種し、これを振盪培養した（３７℃、２４時間）。得られた培養液を遠心分離することにより、湿菌体約０．６ｇを得た。得られた湿菌体を０．２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９）１０ｍｌに懸濁した後、懸濁液中の菌体を、ガラスビーズを用いて破砕することにより、無細胞抽出液を約６ｍｌ得た。得られた無細胞抽出液２ｍｌ中に、ＤＬ−メチオニノール（Sigma社製）２ｍｇ、ＮＡＤ＋（オリエンタル酵母社製）１ｍｇ、ピルビン酸ナトリウム（ナカライテスク社製）４ｍｇ、乳酸脱水素酵素２５ユニット（オリエンタル酵母社製）を添加し、３０℃で２４時間攪拌した。
反応終了後、反応液を０．６ｍｌサンプリングした。当該サンプリング液から浮遊物を除去した後、生成したメチニオニンの量を液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、反応に用いたＤＬ−メチオニノールは１００％残存していることが確認できた。
（含量分析条件）
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（４．６ｍｍφ×１５ｃｍ、３μｍ）（Ｉｍｔａｋｔ社製）
移動相：Ａ液  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液  メタノール
時間(分)  Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０      １００：０
１０    １００：０
２０      ５０：５０
２５      ５０：５０
２５.１  １００：０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２２０ｎｍ
【０１２６】
実施例４  （本ポリヌクレオチドを有するプラスミドの合成法）
配列番号１で示されるアミノ酸配列に対応するforwardプライマーとreverseプライマーとを約４０ｂｐの長さずつに切り分ける形でそれぞれ３０本のプライマーを合成する。合成されたプライマーを以下の条件でＡｓｓｅｍｂｌｙ  ＰＣＲ法を行う。
【０１２７】
［反応液組成］
dNTP(各2.5mM-mix)    1μl
プライマーmix(250μM)    0.5μl
5xbuffer(with MgCl)    10μl
enz.expandHiFi (5U/μl)    0.5μl
超純水    38μl
【０１２８】
上記組成の反応液が入った容器をＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００にセットした後、９４℃（３０秒間）‐５２℃（３０秒間）‐６８℃（３０秒間）のサイクルを５５回行う。
【０１２９】
反応終了後、反応液をテンプレートにして再び以下の反応条件でＰＣＲを行う。９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃（３０秒間）‐５３℃（３０秒間）‐６８℃（１．５分間）のサイクルを３０回行った。このとき、５’末端にNcoIサイトを付加した配列番号６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーと、５’末端にXbaIサイトを付加した配列番号７で示されるオリゴヌクレオチドプライマーとを使用する。
【０１３０】
［反応液組成］
テンプレート    1μl
dNTP(各2.5mM-mix)    1μl
プライマー(250μM)    各0.5μl
5xbuffer(with MgCl)    10μl
enz.expandHiFi (5U/μl)    0.5μl
超純水    36.5μl
【０１３１】
その後、ＰＣＲ反応液を一部とりアガロースゲルで精製して得られたＤＮＡ断片に、２種類の制限酵素（ＮｃｏＩ及びＸｂａＩ）を加えることにより、約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を２重消化する。次いで、得られた２重消化された約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製する。
一方、プラスミドベクターｐＴｒｃ９９A（Pharmacia社製）を２種類の制限酵素（NcoI及びXbaI）により２重消化し、次いで、得られた２重消化されたＤＮＡ断片を精製する。
このようにして得られた２種類の精製ＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションした後、得られたライゲーション液で大腸菌ＤＨ５α株を形質転換する。
得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地で培養し、生育してきたコロニーの中から３コロニーを無作為に選抜する。選抜されたコロニーをそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（２ｍｌ）に接種し、試験管中で振盪培養する（３７℃、２４時間）。それぞれの培養菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出す。
尚、取り出されたプラスミドのそれぞれの一部を、NcoIとXbaIとの２種類の制限酵素により２重消化した後、２重消化されたＤＮＡ断片をゲル電気泳動することにより、当該取り出されたプラスミドの全てには前記約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が挿入されていることを確認する。（以下、当該プラスミドをプラスミドｐＴｒｃＡＤＨと記すこともある。）
【０１３２】
このようにして得られたプラスミドｐＴｒｃＡＤＨを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換する。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（１００ｍｌ）に接種し、振盪培養した（３７℃、２４時間）。得られた培養液を遠心分離することにより、本形質転換体の菌体を得る。
【０１３３】
実施例５  （本発明製造法による、含硫アミノアルコール化合物からの含硫α-アミノ酸化合物の製造例）
ねじ口試験管に０．１Ｍ、Tris-塩酸（ｐＨ９）を２ｍｌ入れ、これに、本酵素として(a)アルコール脱水素酵素（馬肝臓由来）（Sigma社製）及び(b)アルデヒド脱水素酵素（酵母由来）（Sigma社製）を加え、更にピルビン酸ナトリウム（ナカライテスク社製）４ｍｇ、ＮＡＤ＋０．６ｍｇ及び乳酸脱水素酵素（和光純薬社製）０．２５ｍｇを加えて混合した。得られた混合液に、原料となるＤＬ−メチオニノール（Sigma社製）を２ｍｇ添加した後、得られた混合物を３０℃で２２時間振盪した。
反応終了後、反応液を０.５ｍｌサンプリングした。当該サンプリング液から菌体を除去した後、生成したメチオニンの量を液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、メチオニンを収率２３％で得た。
（含量分析条件）
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（４．６ｍｍφ×１５ｃｍ、３μｍ）（Ｉｍｔａｋｔ社製）
移動相：Ａ液  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液  メタノール
時間(分)  Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０      １００：０
１０    １００：０
２０      ５０：５０
２５      ５０：５０
２５.１  １００：０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２２０ｎｍ
【０１３４】
実施例６  （本発明製造法による、含硫アミノアルコール化合物からの含硫α-アミノ酸化合物の製造例） 
ねじ口試験管に０．１Ｍ、Tris-塩酸（ｐＨ９）を２ｍｌ入れ、これに、本酵素としてアルコール脱水素酵素（馬肝臓由来）（Sigma社製）を加え、更にピルビン酸ナトリウム（ナカライテスク社製）４ｍｇ、ＮＡＤ＋０．６ｍｇ及び乳酸脱水素酵素（和光純薬社製）０．２５ｍｇを加えて混合した。得られた混合液に、原料となるＤＬ−メチオニノール（Sigma社製）を２ｍｇ添加した後、得られた混合物を３０℃で２２時間振盪した。
反応終了後、反応液を０.５ｍｌサンプリングした。当該サンプリング液から菌体を除去した後、生成したメチオニンの量を液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、メチオニンを収率１７％で得た。
（含量分析条件）
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（４．６ｍｍφ×１５ｃｍ、３μｍ）（Ｉｍｔａｋｔ社製）
移動相：Ａ液  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液  メタノール
時間(分)  Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０      １００：０
１０    １００：０
２０      ５０：５０
２５      ５０：５０
２５.１  １００：０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２２０ｎｍ
【０１３５】
参考例１  （含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する微生物の探索）
試験管に滅菌済み培地（１Ｌの水に、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、肉エキス３ｇ、硫酸アンモニウム０．２ｇ、リン酸２水素カリウム１ｇ及び硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇを加えた後、ｐＨを７．０に調整したもの）５ｍｌを入れ、これに、各菌株保存機関より購入することにより入手された菌体又は土壌中から純粋分離することにより調製された菌体を植菌する。これを３０℃で好気条件下、振盪培養する。培養終了後、遠心分離により菌体を回収することにより、生菌体を得る。ねじ口試験管に０．１Ｍ、Ｔｒｉｓ-グリシンバッファー（ｐＨ１０）を２ｍｌ入れ、これに上記の生菌体を加えた後、懸濁する。当該懸濁液に、メチオニノールを２ｍｇ添加した後、得られた混合物を３０℃で３〜７日間振盪させる。
反応終了後、反応液を１ｍｌサンプリングする。当該サンプリング液から菌体を除去した後、生成した１−アミノ−３−（メチルチオ）プロピルアルデヒドの量を液体クロマトグラフィーにより分析する。
このようにして、含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノアルデヒド化合物に変換する能力を有する微生物を選抜する。
（含量分析条件）
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（４．６ｍｍφ×１５ｃｍ、３μｍ）（Ｉｍｔａｋｔ社製）
移動相：Ａ液  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液  メタノール
時間(分)  Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０      １００：０
１０    １００：０
２０      ５０：５０
２５      ５０：５０
２５.１  １００：０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２２０ｎｍ
【０１３６】
参考例２  （含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する微生物の探索）
試験管に滅菌済み培地（１Ｌの水に、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、肉エキス３ｇ、硫酸アンモニウム０．２ｇ、リン酸２水素カリウム１ｇ及び硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇを加えた後、ｐＨを７．０に調整したもの）５ｍｌを入れ、これに、各菌株保存機関より購入することにより入手された菌体又は土壌中から純粋分離することにより調製された菌体を植菌する。これを３０℃で好気条件下、振盪培養する。培養終了後、遠心分離により菌体を回収することにより、生菌体を得る。ねじ口試験管に０．１Ｍ、Ｔｒｉｓ-グリシンバッファー（ｐＨ１０）を２ｍｌ入れ、これに上記の生菌体を加えた後、懸濁する。当該懸濁液に、１−アミノ−３−（メチルチオ）プロピルアルデヒドを２ｍｇ添加した後、得られた混合物を３０℃で３〜７日間振盪させる。
反応終了後、反応液を１ｍｌサンプリングする。当該サンプリング液から菌体を除去した後、生成したメチオニンの量を液体クロマトグラフィーにより分析する。
このようにして、含硫α−アミノアルデヒド化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する微生物を選抜する。
（含量分析条件）
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（４．６ｍｍφ×１５ｃｍ、３μｍ）（Ｉｍｔａｋｔ社製）
移動相：Ａ液  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液  メタノール
時間(分)  Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０      １００：０
１０    １００：０
２０      ５０：５０
２５      ５０：５０
２５.１  １００：０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２２０ｎｍ
【０１３７】
参考例３  （含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する微生物の探索）
試験管に滅菌済み培地（１Ｌの水に、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、肉エキス３ｇ、硫酸アンモニウム０．２ｇ、リン酸２水素カリウム１ｇ及び硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇを加えた後、ｐＨを７．０に調整したもの）５ｍｌを入れ、これに、各菌株保存機関より購入することにより入手された菌体又は土壌中から純粋分離することにより調製された菌体を植菌する。これを３０℃で好気条件下、振盪培養する。培養終了後、遠心分離により菌体を回収することにより、生菌体を得る。ねじ口試験管に０．１Ｍ、Ｔｒｉｓ-グリシンバッファー（ｐＨ１０）を２ｍｌ入れ、これに上記の生菌体を加えた後、懸濁する。当該懸濁液に、メチオニノールを２ｍｇ添加した後、得られた混合物を３０℃で３〜７日間振盪させる。
反応終了後、反応液を１ｍｌサンプリングする。当該サンプリング液から菌体を除去した後、生成したメチオニンの量を液体クロマトグラフィーにより分析する。
このようにして、含硫アミノアルコール化合物を対応する含硫α−アミノ酸化合物に変換する能力を有する微生物を選抜する。
（含量分析条件）
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（４．６ｍｍφ×１５ｃｍ、３μｍ）（Ｉｍｔａｋｔ社製）
移動相：Ａ液  ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液  メタノール
時間(分)  Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０      １００：０
１０    １００：０
２０      ５０：５０
２５      ５０：５０
２５.１  １００：０
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２２０ｎｍ
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
本発明により、メチオニン等の含硫α-アミノ酸化合物の新たな製造法等を提供することが可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【０１３９】
配列番号３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５
ウマ肝臓由来の酵素が有するアミノ酸配列に含まれるアミノ酸に対応するコドンとして大腸菌において使用頻度の高いコドンを選択することによって設計された塩基配列からなる人工合成遺伝子のポリヌクレオチド
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【配列表】
2012010673000001.app