(57)【要約】【課題】光源の数をできるだけ少なくする、集積化したスポットを検出可能とする、装置の全体形状をできるだけ小さくする、複数のスポットの精度良い検出をできるだけ短時間で行う、といった課題を解決することができる光照射機構及び光照射方法を持った、光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられる測定装置の提供【解決手段】  被検物質と結合可能なプローブ物質が互いに分離された複数のスポット毎に区分されて坦持されてなる作用電極を取り付け、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられる測定装置であって、前記スポットへ光を照射する複数の光源と、  前記増感色素の光励起により生じる光電流を測定する電流計と、を備え、前記光源は前記スポットに対応する中心線の延長線上に、少なくとも各列または各行の個数設けられており、前記光源を前記中心線の延長線方向へ移動させる光源移動機構を備えていることを特徴とする測定装置。【選択図】図３
2012098252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質と結合可能なプローブ物質が複数のスポットに坦持された作用電極を取り付け、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられる測定装置であって、
前記スポットへ光を照射する複数の光源と、
前記増感色素の光励起により生じる光電流を測定する電流計と、を備え、
前記光源は前記スポットに対応する中心線の延長線上に、少なくとも各列または各行の個数設けられており、
前記光源を前記中心線の延長線方向へ移動させる光源移動機構を備えていることを特徴とする測定装置測定装置。
【請求項２】
前記光源は前記光源移動機構によって、前記光源からの光が前記スポットへ照射されない位置へ移動可能な請求項１に記載の測定装置
【請求項３】
前記光源は、ピグテールレーザーである、請求項１または２記載の測定装置
【請求項４】
前記作用電極の前記スポットが形成された面とは反対側に、スペーサーを介して設けた前記対電極とから形成されるセンサセルを互いに密着させるための押さえる押さえ部材を設け、該押さえ部材が、光励起のための光を通すための開口部または透光部を複数個備えてなる請求項１〜３のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項５】
前記押さえ部材が、前記開口部および前記透光部を除いて遮光性を有する、請求項４に記載の測定装置。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか一項に記載の測定装置を用いて、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出を行う測定方法であって、
前記光源のうち第一の光源を点灯し、前記中心線の延長線上を第一の方向へ移動しながら対応する位置の前記スポットへ光を照射する第一の光照射工程と、
前記光源のうち第二の光源を点灯し、前記中心線の延長線上を第ニの方向へ移動しながら対応する位置の前記スポットへ光を照射する第二の光照射工程と、
を少なくとも含む測定方法。
【請求項７】
前記第一の光照射工程において、前記スポットへ光が照射されない位置で前記光源を点灯させることを特徴とする請求項６に記載の測定方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光電流を用いて、ＤＮＡの検出を高精度かつ簡便に行なうための測定装置、およびそれを用いた測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中のＤＮＡを検出及び解析する遺伝子診断法が、各種病気の新たな予防および診断法として、有望視されている。このようなＤＮＡの検出を簡便かつ正確に行う技術として、以下のものが提案されている。
【０００３】
被検体ＤＮＡを、これと相補的な塩基配列を有し、かつ蛍光物質を標識されたＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、その際の蛍光シグナルを検出する、ＤＮＡの分析方法が知られている（例えば、特開平７−１０７９９９号公報（特許文献１）および特開平１１−３１５０９５号公報（特許文献２）参照）。この方法にあっては、ハイブリダイゼーションによる二本鎖ＤＮＡの形成を色素の蛍光により検出する。蛍光検出においては、プローブＤＮＡを固定化した複数の検出スポットを同一の基板に形成させることができるため、複数のプローブＤＮＡに対する特異性を一度の検出により解明することができるという長所がある。しかし、蛍光検出に必要な受光器などを含む検出装置は大型で高価であるため、ＤＮＡの検出を簡便に行なうことができない。
【０００４】
また、被検体ＤＮＡを、これと相補的な塩基配列を有し、かつ酵素を標識されたＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、酵素の活性作用を受けて気質に生ずる光学的に検知可能な変化量を測定する自動測定装置及びその検出方法が知られている（特開平６−２２５７５２号公報（特許文献３）参照）。この特開平６−２２５７５２号公報に記載の装置を用いれば、二本鎖ＤＮＡの一本鎖化、ハイブリダイゼーション、洗浄、ＤＮＡの特異的検出を行なう測光工程を全自動で行うことができるが、測光用の光学機器が必要で、検出装置が大型、高価となってしまう。
【０００５】
更に、一本鎖に変性された遺伝子サンプルを、これに相補性を有する一本鎖の核酸プローブとハイブリダイゼーションさせた後、二本鎖認識体であるインターカレータを添加して電気化学的に検出する方法が知られている（特開平５−１９９８９８号公報（特許文献４）参照）。この方法に記載の電気化学的検出方法を用いると、蛍光検出や、測光法のような光学機器が不要となるため、小型で安価な検出装置となる。しかし、複数種のプローブＤＮＡに対する検出ＤＮＡの特異性を確認するためには、１つの電極上に1種のプローブＤＮＡを固定化する必要があるため、複数の電極を設ける必要がある。また、複数の電極を同一基板上に設けたとしても、各電極ごとに電圧を印加するために各電極を導通させるための配線が必要で、二本鎖ＤＮＡの検出を簡便に行なうことができない。
【０００６】
ところで、増感色素を用いて光から電気エネルギーを発生させる太陽電池が知られている（例えば、特開平１−２２０３８０号公報（特許文献５）参照）。この太陽電池は、多結晶の金属酸化物半導体を有し、かつその表面積に広範囲にわたり増感色素の層が形成されてなるものである。
【０００７】
そして、このような太陽電池の特性を生物化学的な分析に応用しようとする試みとして、色素の光励起により生じる光電流を被検物質（ＤＮＡ、蛋白などの生体分子）の検出に利用する提案がなされている（例えば、中村他「光電変換による新しいＤＮＡ二本鎖検出法」（日本化学会講演予稿集  Vol.81ST  NO.2（2002）第947頁（非特許文献１）及び特開２００６―１１９１２８号公報（特許文献６）参照。しかし、これら提案では主にDNAをハイブリダイゼーションさせた後のチップの検出方法に関する内容で、検出時の詳細な装置構成に関する記載はなされていない。
【０００８】
また被検物質の特異的検出に色素の光励起により生じる光電流を利用する際、半導体電極基板全体と対電極は、電流計に直接接続すればよく（検出スポットごとの配線が不要）、各スポットへの光照射により、電流を検出する提案がなされている（ＷＯ０７／０３７３４１（特許文献７）参照） 。この提案においては、各スポットへの光照射においては、半導体電極上に形成された複数の検出スポットに順次照射していくこととなるが、本検出方法においては、半導体電極基板全体と電流計を接続しているため、各検出スポットにて発生する電流値を精度良く検出するために、隣接する検出スポットに光が照射されないように光照射機構を設計する必要がある。そのため、光照射機構に用いる光源には指向性の高いＬａｓｅｒまたは、指向性が低いLEDなどを使用する際は集光レンズなどを使用することとなる。本検出方法が可能な装置を設計する際には光照射機構は各検出スポットごとに光源を設置する、光源に光源が移動可能なXY移動機構を連結させて、検出スポットに順次光源を移動させる、といった方法が考えられる。しかし前者の方法では、高価なＬａｓｅｒや集光レンズを複数用意する必要があり、検出スポット間隔を狭めた集積化電極の検出には対応しにくい。また後者の方法ではＸＹ移動機構が装置の全体形状を大きくしてしまうため、装置の小型化には不向きであった。さらに前者の方法では、各スポットごとに光源を点灯していくことになり、各検出スポットの精度良い電流検出を行うには、それぞれのスポットにおいて、光源の光強度が安定するまで待機する必要があり、検出終了まで時間がかかるという課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平７−１０７９９９号公報
【特許文献２】特開平１１−３１５０９５号公報
【特許文献３】特開平６−２２５７５２号公報
【特許文献４】特開平５−１９９８９８号公報
【特許文献５】特開平１−２２０３８０号公報
【特許文献６】特開２００６―１１９１２８号公報
【特許文献７】ＷＯ０７／０３７３４１
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】中村他「光電変換による新しいＤＮＡ二本鎖検出法」（日本化学会講演予稿集  Ｖｏｌ．８１ＳＴ  Ｎｏ．２（２００２）第９４７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、今般、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた検出において、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた二本鎖DNAの特異的検出を、複数のスポットで精度良く短時間で行う知見を得た。
【００１２】
したがって、本発明は、大型の装置を用いることなく、複数のスポットを精度良く短時間で検出するという課題を解決することができる、光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられる測定装置の提供をその目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
すなわち、本発明によれば、被検物質と結合可能なプローブ物質が互いに分離された複数のスポット毎に区分されて坦持されてなる作用電極を取り付け、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出に用いられる測定装置であって、
前記スポットへ光を照射する複数の光源と、
増感色素の光励起により生じる光電流電流を測定する電流計と、を備え、
前記光源は前記スポットに対応する中心線の延長線上に、少なくとも各列または各行の個数設けられており、
前記光源を前記中心線の延長線方向へ移動させる光源移動機構を備えていることを特徴とする測定装置が提供される。
これにより、光源を一軸方向にのみ移動させることによって二次元的に配置された各スポットに光を照射することが可能となり、装置を簡略化し小型化することが可能となる。また、光源を点灯させたまま移動させることにより、短時間で精度よい検出が可能となる。
【００１４】
また、本発明によれば前記光源は前記光源移動機構によって、前記光源からの光が前記スポットへ照射されない位置へ移動可能な測定装置が提供される。
スポットへ光が照射されない位置まで光源が移動可能となることによって、この位置で光源を点灯させ光強度を安定させることが可能となる。
【００１５】
また、本発明によれば、前記光源は、ピグテールレーザーである測定装置が提供される。
光源としてピグテールレーザーを利用することにより、指向性の高い光を照射することが可能となり、近隣のスポットへの意図しない光照射を低減することができる。これにより、ノイズ電流を低減することが可能となる。
【００１６】
また、本発明によれば、前記作用電極の前記スポットが形成された面とは反対側に、前記センサセルを互いに密着させるために押さえる押さえ部材を設け、該押さえ部材が、光励起のための光を通すための開口部または透光部を複数個備えてなる測定装置が提供される。
これにより、センサセルを密着させながら、光源から各スポットへ光を照射することが可能となる。各スポットへ照射される光が安定することにより、発生する光電流も安定して検出することが可能となる。
【００１７】
また、本発明によれば、前記押さえ部材が、前記開口部および前記透光部を除いて遮光性を有する測定装置が提供される。
これにより、スポットへ光を照射する場合に、近隣のスポットへ光が漏れてしまい、想定外の光電流が発生することを抑制することができる。また、光源が移動中に複数のスポットに光が照射され、不必要な光電流が発生することも抑制できる。
【００１８】
また、本発明によれば、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出を行う測定方法であって、
前記光源のうち第一の光源を点灯し、前記中心線の延長線上を第一の方向へ移動しながら対応する位置の前記スポットへ光を照射する第一の光照射工程と、
前記光源のうち第二の光源を点灯し、前記中心線の延長線上を第ニの方向へ移動しながら対応する位置の前記スポットへ光を照射する第二の光照射工程と、
を少なくとも含む測定方法が提供される。
これにより、第一の方向と逆方向の第二の方向に移動させながら光を照射することによって、一度の往復移動によって、二つの異なる中心線の延長線上に存在するスポットへの光照射が可能となり、測定時間が短縮できる。
【００１９】
また、本発明によれば、前記光照射工程において、前記スポットへ光が照射されない位置で前記光源を点灯させる測定方法が提供される。
これにより、スポットへ光が照射されない位置で光源を点灯させることにより光強度を安定させ各スポットへ安定した光を照射することが可能となり、発生する光電流も安定して検出することが可能となる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、同一面に被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を複数固定した各作用電極上への光照射を列又は行ごとにそれぞれの光源を点灯させ、各光源の光強度を安定させる回数を減らして連続して行うため、検出時間を大幅に短縮することが可能となる。
また複数の光源の数を列又は行の数に減らすことができ、１軸の移動機構で全検出スポットに光を照射することが可能であるため、装置の全体形状も小さくすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の測定装置の一例を示す上面図である。
【図２】本発明に使用する配管図を示す図であり、（ａ）はセンサセル１内へ被検物質を直接注入する場合を、（ｂ）はセンサセル１の上流側で被検物質を含むサンプルを注入する場合を示す図である。
【図３】本発明における移動型光源３とセンサセル１を示す模式図である。
【図４】本発明における移動型光源３の各部材のタイムチャートである。
【図５】本発明における移動型光源３の移動の様子を模式的に示した図であり、（ａ）はａ軸のスポットへの光照射開始前を、（ｂ）はａ軸のスポットへの光照射の様子を、（ｃ）ａ軸のスポットへの光照射終了後を、それぞれ示す図である。
【図６】本発明に使用するセンサセル１の一例を示す図であり、図６（ａ）は作用電極の構成図、図６（ｂ）は作用電極取付前、図６（ｃ）は作用電極を取り付ける際の状態図、図６（ｄ）は作用電極取付後の状態図、図６（ｅ）は作用電極と対電極とを固定して流路が形成されたセンサセルの構成図、図６（ｆ）は図６（ｄ）の側面図をそれぞれ示す。
【図７】本発明に使用するセンサセル１内の流体の流れ方を示す図であり、図７（ａ）は光源側から見たセンサセル１の断面図、図７（ｂ）は側面図である。
【図８】本発明に使用する温度調整機構の別態様の一例を示す上面図および断面図である。
【図９】流体誘導機能をもつセンサセル基材であるスペーサーの一例を示す断面図であり、（ａ）は、センサセル１内へ被検物質を直接注入する場合を、（ｂ）はセンサセルの上流側で被検物質を含むサンプルを注入する場合を示す図である。
【図１０】本発明に使用するセンサセル１の第二態様の一例を示す図である。
【図１１】被検物質が一本鎖の核酸であり、プローブ物質が前記核酸に対して相補性を有する一本鎖の核酸である場合における、被検物質のプローブ物質への固定化工程を示す図であり、（ａ）は被検物質が予め増感色素で標識されてなる場合を、（ｂ）は二本鎖の核酸にインターカレーション可能な増感色素を添加した場合をそれぞれ示す。
【図１２】被検物質がリガンドであり、媒介物質が受容体蛋白質分子であり、プローブ物質が二本鎖の核酸である場合における、被検物質のプローブ物質への固定化工程を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
測定装置
本発明による装置および検出方法の基本的な特徴をまず図面を用いて説明する。被検物質の特異的検出に、色素の光励起により生じる光電流を利用した測定装置は、基本構成として、図１に示すように、センサセル１と、センサセル１へ流体を供給するための流体供給手段２と、センサセル１内に設けた作用電極の電子受容層上に設けたプローブ物質を担持しているスポット３２３へと光を照射するための移動型光源３と、光励起によって生じた電流を検出するための電流計４と、被検物質と作用電極上に設けた特異的に結合するプローブ物質とを反応させるためのハイブリダイゼーション反応や結合反応後光励起によって生じる光電流を検出するために使用する電解液等を保持する溶液保持部５と、センサセル１内に設けた反応および検出時の温度調整機能を制御する温度調整制御部６と、電源７と、装置内の温度上昇を防止するファン８とを備えてなる。図の装置にあっては、流体供給手段２としてシリンジポンプ２０を使用しており、スウィッチングバルブ２１が連結されている。センサセル１や流体供給手段２、移動型光源３、電流計４、温度調整制御部６、電源７等は端子４１にそれぞれ接続されている。センサセル１は、後記するように電子受容層上に被検物質と結合可能なプローブ物質が互いに分離された複数のスポット３２３毎に区分されて坦持されている。。複数のスポット３２３を形成することによって、複数の測定を同時に行うことが可能となる。
【００２３】
図２は流体供給手段を基にした流路構成の配管図を示す図である。図２（ａ）はセンサセル１内へ被検物質を含むサンプルを直接注入する場合を、（ｂ）はセンサセル１の上流側で被検物質を含むサンプルを注入する場合を示す図である。
【００２４】
図２（ａ）には、流体供給手段として、シリンジポンプ２０に連通したスウィッチングバルブ２１は、ハイブリダイゼーション反応溶液タンク５１と、その後の洗浄に使用する反応後洗浄溶液タンク５２と、電流検出に使用するための電解液タンク５３と、電流測定後のセンサセル１内や各配管を洗浄するための測定後洗浄溶液タンク５４と、流体として空気を使用する場合の大気への開放口に連結するエア供給口２２と、被検物質を含むサンプルを注入する注入口１０１を設けたセンサセル１と、そして廃液タンク５６と配管でそれぞれ接続されている。また、廃液タンク５６は、センサセル１に設けた流体排出口１４とも配管で接続されている。
【００２５】
被検物質を含むサンプルをセンサセル上流側で注入する態様の配管を図２（ｂ）に示す。この構成にあっては、流体供給手段としてのシリンジポンプ２０に連通したスウィッチングバルブ２１は、ハイブリダイゼーション後の洗浄に使用する反応後洗浄溶液タンク５２と、電流検出に使用するための電解液タンク５３と、電流測定後のセンサセル１内や各配管を洗浄するための測定後洗浄溶液タンク５４と、被検物質を含むサンプルを注入する注入口２３と、流体として空気を使用する場合の大気への開放口に連結するエア供給口２２と、センサセル１に設けた流体供給口１５と、そして廃液タンク５６と配管でそれぞれ接続されている。また、廃液タンク５６は、センサセル１に設けた流体排出口１４とも配管で接続されている。
【００２６】
そして、図２（ａ）および（ｂ）の構成にあってはともに、スイッチングバルブ２１を各配管へ切り替えることよって、センサセルへの各流体の供給、排出を行う。また、ハイブリダイゼーション反応溶液タンク５１やその後の洗浄に使用する反応後洗浄溶液タンク５２、検出のための電解液タンク５３のそれぞれは、設定温度に保持されるよう温度調整機構を有することがより好ましい。電流測定後のセンサセル１内洗浄のための測定後洗浄溶液タンク５４には、洗浄溶液としてアルコールや水等が準備される。洗浄性能や廃液処理等を考慮すると、エタノールと水の複数のタンクを設けることが好ましい。
【００２７】
図１および図２（ａ）の装置構成において、被検物質のハイブリダイゼーション反応および検出を説明する。まず、ハイブリダイゼーション反応溶液タンク５１から反応溶液が、センサセル１内に供給される。次に、センサセル１に設けたサンプル供給口１０１から、ハイブリダイゼーション反応させるための被検物質を供給し、設定温度に温度調整されたセンサセル１内で、作用電極上に設けた被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質とハイブリダイゼーション反応を行う。その後、未結合の物質を洗浄するための洗浄溶液が洗浄溶液タンク５２から供給される。
【００２８】
このときの洗浄は、プローブ物質に結合した被検物質は結合したままで、未結合物質のみを取り除く必要がある。そこで、洗浄溶液には界面活性剤を配合させることが好ましい。ただし、センサセル１内の作用電極上で反応、検出を行うために作用電極上に設けたプローブ上に洗浄流体の供給、排出に伴って発生する気泡が残存すると作用電極表面での反応ムラが発生する可能性があるため気泡の発生および残存には留意が必要である。洗浄効率を勘案すると、ハイブリダイゼーション後に使用する洗浄溶液として、界面活性剤を０．００１％以上１０％以下の洗浄溶液を使用することが好ましい。
【００２９】
洗浄後、センサセル１内から排出口１０２より洗浄溶液を排出し、次に電解液が電解液タンク５３から供給され、ハイブリダイゼーション溶液より低い温度で調整されたセンサセル１内に移動型光源３から光が照射され、光励起に伴う電流値の測定がなされる。
【００３０】
図３に移動型光源３の模式図を示す。移動型光源３は、ピグテールレーザーを発する光源８０１、８０２、８０３を先端に備えたレーザー取付アーム８１０と、そのレーザー取付アーム８１０を１軸方向に移動させるための光源移動機構８２０とから構成されている。このとき光源８０１は、図中にａ軸として示されるスポット３２３と対応する中心線の延長線上に位置する。同様に、光源８０２、８０３はそれぞれ、スポット３２３と対応するｂ軸、ｃ軸上に位置している。
光源は光励起可能な波長の光を照射できるものであればよく、ピグテールレーザー以外にも様々なものが利用できる。なお、光源として利用するものは、照射する光が指向性を有するものであることが好ましい。また、光励起の為に用いられる特定の波長のみを照射できることが好ましい。
【００３１】
レーザー取付アーム８１０が、一軸方向に移動することにより、作用電極３２０上に設けられたスポット３２３に順次、光が照射され、電流値を検出することが出来る。このとき、作用電極３２０上にスポット３２３が行と列を成すように略矩形状に集合して設けられていることが好ましい。このようにスポット３２３を設けることによって、移動型光源３の移動を効率よく行うことができる。
【００３２】
以下に光の照射について詳細に説明する。図４に各部材のタイムチャートを、図５に各動作時における移動型光源３とセンサセル１の模式図を示す。
まず、図５（ａ）に示すように、光源８０１、８０２、８０３から照射されるレーザーが作用電極３２０上であってスポットが設けられていないＡの位置に照射される位置まで、光源移動機構８２０によってレーザー取り付けアーム８１０を移動させる。この状態は図４のタイムチャート中、ａで示したタイミングである。このタイミングで、光源８０１を点灯し、光強度を安定させる。
光強度が安定後、図５（ｂ）に示すように光源移動機構８２０を一定時間動作させ、光源８０１から照射されるレーザーが作用電極３２０上のスポット位置Ｂ−ａの地点まで来るように、レーザー取付アーム８１０を移動させる。これにより光源８０１からのレーザー光はスポットＢ−ａに照射される。同様にして、光源移動機構８２０を一定時間ずつ動作させて、Ｂ−ａからＥ−ａまでレーザー取付アーム８１０を図中に矢印で示したように右方向へ順次移動させ、ａ軸上に存在する各スポットにレーザー光を照射する。
【００３３】
その後、図５（ｃ）に示すようにレーザー取付アーム８１０を光源８０１、８０２、８０３から照射されるレーザーが作用電極３２０上であってスポットが設けられていないＦの位置に照射される位置まで移動する。ここで、図４のタイムチャート中、ｂで示すように光源８０１を消灯するとともに、光源８０２を点灯し光強度を安定させる。
【００３４】
光強度安定後、光源移動機構８２０を逆方向に動作させて、レーザー取付アーム８１０を図中左方向へ移動させることによって、光源８０２からのレーザー光をスポットＦ−ｂからＢ−ｂまで順次照射する。その後、レーザー取付アーム８１０を光源８０１、８０２、８０３から照射されるレーザーが作用電極３２０上であってスポットが設けられていないＡの位置に照射される位置まで移動する。ここで図４のタイムチャート中ｃで示すように、光源８０２を消灯するとともに、光源８０３を点灯し、光強度を安定させる。光強度が安定後、光源移動機構８２０を正方向に動作させることによりレーザー取付アーム８１０を図中右方向へ移動させることによって、光源８０３からのレーザー光をｃ−Ｂからｃ−Ｅまでの各スポットに照射する。
【００３５】
以上の手順により、光源を一軸方向にのみ移動させることによって、作用電極上に二次元的に複数設けられたスポットに対して光を照射させることが可能となる。また、各検出スポットにおける光照射の際のレーザーが連続して点灯したまま電流測定を行えるため、検出スポットごとに点灯する装置と比較して安定した検出が可能となる。
なお、ここではスポットが３行４列に配置された例を示したが、スポットの数はこれに限られるものではない。例えば、３行５列や３行６列などスポットの数を増やすことも可能である。この場合、それぞれの列もしくは行に対応する数だけ、光源を用意すればよい。
【００３６】
測定終了後、センサセル１内の電解液は、シリンジポンプによって廃液タンク５６に排出される。センサセル１内に残存する電解液を洗浄するために、洗浄溶液タンク５４から、洗浄溶液が複数回供給され、対電極表面を含めたセンサセル１内を洗浄する。測定終了後にセンサセル１内を洗浄することにより、対電極は交換せずに作用電極の交換のみで連続して次の反応と検出を行うことができる。この構成にあっては、直接被検物質を含むサンプルをセンサセル１内に注入することによって他の配管内にサンプルが接触しないため、複数回の反応、検出を行う装置構成において、コンタミネーションの発生を防止でき安定した検出を行うことができる。
【００３７】
次に、図２（ｂ）の構成において、被検物質のハイブリダイゼーション反応と検出を説明する。まず、被検物質はハイブリダイゼーション用の溶液と装置注入前にサンプルチューブ内で混合する。その後、注入口２３に被検物質を含むハイブリダイゼーション溶液を注入し、シリンジポンプによってセンサセル１内に流入する。その後、図２（ａ）と同様の処理を行うことができる。この構成にあっては、装置にハイブリダイゼーション反応溶液タンク５１を設けずにすむため、装置がコンパクトになる。
【００３８】
本発明におけるセンサセル１の構成を、図６Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦに示す。図６Ａは作用電極ケースの構成図、図６Ｂは作用電極ケース取付前、図６Ｃは作用電極ケースを取り付ける際の状態図、図６Ｄは作用電極ケース取付後の状態図、図６Ｅは作用電極ケースと対電極とを固定して流路が形成されたセンサセルの構成図、および図６Ｆは図６Ｄの上面図をそれぞれ示す。
【００３９】
本発明において用いられる作用電極３２０は、図６Ａに示すように、導電性基材３２１と、その上に増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容層３２２とを備えた電極であり、電子受容層側が流路に露出するように配置される。この電子受容層３２２は、被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を担持したスポット３２３を備えている。そして、作用電極は光励起のための光を容易に電子受容層に照射できるように透光性を有していることが好ましい。その作用電極の流路側にセンサセル基材としてスペーサー３３０が配置され、作用電極受け部材３２４ａと作用電極蓋部材３２４ｂからなる作用電極ケース３２４に収納されている。スペーサー３３０は、作用電極上で発生する電流をとりだすためのコンタクトプローブ用の開口部３３１を両端部に有している。作用電極受け部材３２４ａは、光を透過させるための空間３２５と作用電極ケース位置決めピン穴３２６を有している。作用電極蓋部材３２４ｂは、対電極とスペーサーとを面接させるための空間３２７とコンタクトプローブ用の開口部３０５とを有している。そして、作用電極受け部材３２４ａと作用電極蓋部材３２４ｂの両部材は、作用電極受け部材３２４ａに設けたビス受け３２９の位置に固定用ビス３２８にて固定され、作用電極ケース３２４を形成する。
【００４０】
センサセル１の形成を、図６Ｂ、Ｃ、ＤおよびＦを用いて以下に説明する。まず、作用電極３２０の電子受容層が形成された面とは反対側に、作用電極３２０とスペーサー３３０と対電極３５０とを、互いに密着させるための押さえ部材が設けられる。この押さえ部材は、作用電極に接して設けられる押さえ部材カバー３１０と、温度調整機構として設けた作用電極ヒータ３１２を備えていることが好ましい。押さえ部材カバー３１０は、光励起のための光を通すための透光部３１１を複数個備えており、かつ両側面に設けた作用電極ヒータ３１２の熱が全面にわたって均一になるよう、熱伝導性の高い部材からなることが好ましい。透光部３１１の代わりに、開口部を設けてもよい。具体的には、アルミ、S45C等が使用でき、強度、耐久性等を考慮するとアルミが好ましい。そして、この押さえ部材は、装置本体に設けられたセンサセル台座３０１に固定されて設けられた、押さえ部材ステージ３０２によって装置に固定される。また、押さえ部材ステージ３０２は、押さえ部材カバーの熱が外部に逃げないような材質からなることが好ましい。このような構成とすることによって、押さえ部材カバー全面に熱が均等に伝わり、作用電極上での反応、検出が設定温度に維持され、精度のよい測定が可能となる。
【００４１】
次に、作用電極を装置に取り付ける状態を図６Ｃに示す。作用電極３２０は、スペーサー３３０とともに作用電極ケース３２４に内包されたまま、作用電極ガイド部材３０６に沿って押さえ部材固定ステージ３０２側に移動する。そして、作用電極ケース位置決めピン３０３に従って位置決めされ、仮固定される。仮固定後の状態を図６Ｄに示す。
【００４２】
次に、図６Ｅに示されるように、センサセル形成時に、対極側ステージ３０７をシャフト３１３に沿って移動させ、作用電極ケースに接合させ、対極ステージ３０７に設けたスナップ錠３０８と押さえ部材ステージ３０２のスナップ錠受け具３０９とを固定して、センサセル１が完成する。
【００４３】
センサセル１には、作用電極３２０と対電極３５０とが、開口部を有したスペーサー３３０を介して対向して設けられており、その結果流路が形成されている。そして、作用電極３２０、対電極３５０、スペーサー３３０の少なくとも一つに、当該流路に連通する流体の供給口１０３を備え、その供給口１０３とは異なる位置に排出口１０４と、光励起によって生じた電流を取り出すためのコンタクトプローブ３０４とを供えている。ここで、流路とは、センサセル１内で被検物質が作用電極上に設けたプローブ物質と特異的に結合するハイブリダイゼーションを行うための溶液や洗浄液、温度調整用流体、更に光電流を検出する際に使用する電解質含有溶液等の流体を流し、かつ収容できるための空間である。
【００４４】
対電極３５０には、流路を形成する面とは反対の面に接するように第二の温度調整機構として、対電極ヒーター３５１が設けられている。流路内の流体を短時間で温度調整するには、対電極３５０と作用電極３２０の両方に温度調整機構を設けることが好ましい。センサセル１内を作用電極３２０及び対電極３５０の双方から温度調整することによって、センサセル１内を素早く、かつムラなく均一に温度調整することが可能となり、作用電極３２０側に設けたプローブへ特異的に結合した増感色素の光電効率が向上する。
【００４５】
図６Ｆに示すように、作用電極ヒーター３１２は、光源からスポット３２３へ照射される光を遮らないように、押さえ部材の両端に設けられ、中央に開口部を有するように配置される。ここでいう開口部とは光が透過するための領域であり、作用電極ヒータ３１２の一部がくりぬかれた形でもよく、図６Ｆに示したような複数の作用電極ヒーターが離間した領域も含む意味に用いる。作用電極ヒーター３１２の配置は光源からスポット３２３へ照射される光を遮らない位置であれば、これ以外の場所に配置してもよい。また、開口部を設ける他に、透光部を設けることによって、光照射を行えるように構成してもよい。ここでいう透光部とは、光を透過する部材で構成された部分を指す。更に、作用電極温度センサ３１４は、光源からスポット３２３へ照射される光を遮らないように、スポット間に配置している。
【００４６】
この温度調整機構は、ハイブリダイゼーションと検出時の双方において温度調整を行うものであり、温度設定を室温より高く設定する場合には、少なくとも加温することができる機構が必要である。具体的には、加温用のヒーターとしてはセラミックヒーター等が利用でき、測温抵抗体、温調器等を用いて温度調整する機構とする。また、本発明の好ましい態様によれば、設定温度への上昇時間の短縮、温度制御精度を考慮して、加温用のヒーター及び、温度検出が可能な測温抵抗体いずれも、前記対電極及び作用電極に直接接触させる、又は熱伝導性が高い部材を介して、接触させることが好ましい。更に、センサセル１内すなわちプローブDNAが固定化された作用電極表面の温度と、測温抵抗体が示す温度を予め確認し、温度データを補正することにより、センサセル１内すなわちプローブDNAが固定化された作用電極表面の温度制御精度をさらに向上させることが好ましい。
【００４７】
そして、また、本発明にあっては、被検物質を含むサンプルを直接供給口１０１よりセンサセル１内に供給し、サンプル供給後は、栓１０２を用いてサンプル供給口１０１を閉鎖する。
【００４８】
図７に本発明のセンサセル１内の流体の流れ方を示す。図７（ａ）は光源側から見たセンサセルの断面図、図７（ｂ）は側面図である。ハイブリダイゼーション溶液、その後の洗浄流体、および電流検出のための電解液等の流体は、各流体に連通した配管からセンサセル流路の底部に設けた流体供給口１０３より導入される。その後、流体は底部よりセンサセル１内部へと満たされ、各反応や洗浄、検出完了後上部の流体排出口１０４より配管へと導出され排出される。この構成にあっては、流体は、底部より導入され上部へと排出されるため、作用電極３２０に設けた、被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質が担持されたスポット３２３と確実に接触する。これにより、反応ムラや検出時の電解液接触不良による電流検出エラー等が防止できる。
【００４９】
図８に本発明の別の態様の温度調整機構の構成を示す。この態様の温度調整機構は、対電極を構成する際に、対電極基材５０１上に熱電対５０２を成膜し、その上に導電性薄膜５０３をスパッタ等により成膜してなる構成を有する。熱電対には、熱電対と対電極基材との接点５０４において接続された導線５０５が接続され、設定温度になるよう、温度調整機によって制御がなされる。このとき、対電極基材５０１はセンサセルとして、作用電極（図示せず）、スペーサー５０６、流体供給口５０７、流体排出口５０８、および押さえ部材（図示せず）によって流路を構成する必要がある。このため、対電極基材５０１は、押さえ部材による応力変形のない材質よりなる必要があり、例えばガラスやＳＵＳ、耐熱性に優れる樹脂（PEEK、ポリカーボネート）等が利用できる。さらに、対電極全体に温度ムラが商事ないよう、熱伝導性の高い材料を選択することがより望ましく、例えばＳＵＳの利用が好ましい。導電性薄膜としては、Ｐｔやカーボン等が利用され、対電極基材と同様の理由によりＰｔが好ましい。
【００５０】
また、本発明による、センサセルの別の態様の構成を図９に示す。このセンサセルは、押さえ部材と、作用電極７０１と、スペーサー７０２と、対極７０３とからなり、対極には流体供給口７０５と流体排出口７０６とが設けられてなる。そして、当該押さえ部材として、作用電極上に設けたプローブ物質に対応するスポット３２３ごとに光を照射できるようそれぞれスポット３２３に対応した開口部を有する、金属板７０９、蓋部材７１２、および金属板７０９に接続して温度調整部材としてヒーター７０７を内部に有している。金属板７０９と蓋部材７１２との間にはバネダンパー７１０が設置され、金属板７０９と蓋部材７１２との間に断熱するための空間７０８を形成している。この押さえ部材を、対電極側のベース７１５に固定部材７１３によって固定することにより、作用電極７０１とスペーサー７０２と対極７０３とが接続され、流路を形成するよう構成される。対極の流路側と反対面には、プローブ物質固定化部分の投影面に対応する部分に温度調整部材としてのヒーター７０７が面接して設けられている。このヒーター７０７は流体供給と排出のための流路を設けたベース７１５に内包されており、かつ押さえ部材に設けられたヒーターと同様に、外部との熱を断熱するための空間７０８が形成されている。蓋部材を貫通するコンタクトプローブ７０４は、押さえ部材を固定することによって作用電極に接続され、光電流の取り出しを行うよう構成されている。熱伝導効率の高い金属板とヒーターとを当接し、設定温度が全面均一となった金属板と作用電極とを面接して設けることにより、ハイブリダイゼーション時と検出時の設定温度が異なる温度設定においても作用電極上のプローブ固定化部分近傍の温度調整が短時間でより正確に行うことができる。
【００５１】
本発明の好ましい態様によれば、ハイブリダイゼーション後の光電流を検出するに際し、検出のための電解質を含有する検出溶液の送液前に、温度調整用流体を供給することが好ましい。センサセル１内の作用電極上に設けたプローブ物質に結合した増感色素を利用する光電流検出方式においては、検出時のセンサセル１内の温度を均一とすることで、光電効率や導電性基材の抵抗が電流値へ与える影響を抑えることができる。また、光電流を検出する際に、センサセル１内が調整された温度調整用流体で満たされることで、センサセル１内を均一に温度調整することができ、安定した光電流検出を行うことが可能となる。
【００５２】
上記態様において、温度調整用流体として空気を利用する場合には、室温より高温に設定されたセンサセル１内に、流体供給用ポンプを用いて空気を供給する。また、温度調整用流体として、ハイブリダイゼーション後の未結合の被検物質を洗浄するための洗浄用試薬や光電流を検出する際に利用する電解液を利用してもよい。
【００５３】
本発明の好ましい様態によれば、ハイブリダイゼーション後の光電流を検出するに際し、ハイブリダイゼーション工程よりも低い温度で光電流を検出することが好ましい。これにより、増感色素の光電効率と作用電極の導電性基板の電子効率が上昇する。通常、ハイブリダイゼーションは、室温よりも高い温度での反応が主である。ハイブリダイゼーション後、センサセル１内の温度を低くする場合には、自然放冷となるよう加温機能を停止したり、センサセル１内に温度調整用流体を供給したり、また強制的に冷却する機能を有する機構を設けてもよく、またそれらを組み合わせてもよい。自然放冷となるよう加温機能を停止する場合には、それ以外に更にセンサセル１内へ温度調整用流体を供給することが短時間でかつセンサセル１内の温度が一定となるため好ましい。
【００５４】
本発明の好ましい様態によれば、ハイブリダイゼーション工程の前にも、温度調整用流体を供給することが好ましい。これにより、ハイブリダイゼーション工程の効率を上昇させることができる。このとき、温度調整用流体としては、空気、被検物質を含むサンプル溶液、ハイブリダイゼーション反応溶液などを利用することができる。
【００５５】
本発明の好ましい様態によれば、光電流検出工程において、センサセル１内の温度を一定に保持することが好ましい。これにより、光電効率や導電性基材の抵抗が電流値へ与える影響を抑えることができ、安定した電流測定を行うことができる。
【００５６】
本発明の好ましい態様によれば、センサセル基材は、流体を確実にセンサセル１内から排出するための流体誘導機能を設けた構成を有する。図８に、本発明の流体誘導機能をもつセンサセル基材であるスペーサー３３０の断面図を示し、（ａ）は、センサセル１内へ被検物質を直接注入する場合であって、注入口１０１が設けられた態様のスペーサーを、（ｂ）はセンサセルの上流において被検物質を含むサンプルを注入する場合に用いられるスペーサー３３０を示す図である。このような構成とすることによって、センサセル１内に供給された流体に対する強制的な流路ができ、センサセル１内の流体の交換がより効率よく確実に行うことができる。具体的には、流路を形成するスペーサー３３０の開口部の下流側に向かうにつれ、流路断面積を絞った構成であることが好ましい。より好ましくは、センサセル１内に設けた流体供給口１０３から作用電極上に設けたプローブを固定化したスポット３２３部分までは流路断面積を大きくし、スポット３２３部分より下流側には流路断面積を小さくする。この構成により、センサセル１内に供給する流体として空気と溶液を使用する場合において、センサセル１内での流体交換時に特に空気がセンサセル１内に残っても、スポット３２３部分には確実に次の流体が満たされて置換される。そのため、温度ムラがなくなり、電流検出時の測定値のばらつきによる影響が低減される。
【００５７】
本発明の好ましい様態によれば、作用電極、対電極、および／またはセンサセル基材を互いに密着させるように押さえる押さえ部材を備え、温度調整機構がこの押さえ部材に設けられていることが好ましい。このような構成にあっては、センサセルの各構成部材を押さえつけて密着させてあるため、電解液等の液の漏れを効果的に防止することができる。それと同時に、温度調整機構とセンサセルも密着させることが可能となり、効率的に温度調整を行うことが可能となる。
【００５８】
本発明の好ましい態様によれば、押さえ部材が、作用電極より熱伝導率の高い材質で構成される。この構成により、作用電極への熱の伝達が早くなり、温度調整機構による温度調整を早く均一に行うことが可能となる。
【００５９】
本発明の好ましい態様によれば、押さえ部材が、ねじ、ばね、および磁石からなる群から選択される少なくとも一種の固定手段を更に備えてなり、固定手段を介して押さえ部材、作用電極、対電極、および／またはセンサセル基材に着脱可能に固定されてなる。この結合手段を用いることにより、セルの各構成部材をより強力に密着させることが可能となり、センサセル１内の溶液を確実に保持することができる。加えて、上記結合手段は容易に各部材を容易に取り外すことができるため、作用電極等の交換やメンテナンス等を簡単に行うことができる。
【００６０】
本発明の好ましい態様によれば、押さえ部材は、開口部および透光部以外の部分を遮光するものであることが好ましい。この構成により、開口部および透光部に光源からの光が照射された際に他の開口部および透光部への光の漏洩による照射対象以外の被検物質に起因する光電流の発生を確実に防止でき、被検物質固有の正確な光電流値の検出が可能となる。
【００６１】
本発明の好ましい態様によれば、前記押さえ部材の開口部または透光部の外側に光源を備えてなることが好ましい。この構成により、ハイブリダイゼーション反応後のセンサセルを検出のために移動することなく光電流を検出することが可能となる。
【００６２】
本発明の好ましい態様によれば、前記押さえ部材が、前記開口部または透光部を複数個有し、かつ前記開口部および透光部を除いて遮光性を有するものであり、前記複数個の開口部または透光部の各々に対して前記複数個の光源が個別に設けられるの。この構成によれば、作用電極上に設けた被検物質の結合した複数のプローブ固定化部に対応した位置に複数個の光源が設けられているため、先の光源移動する態様と比較して、駆動手段を持たずに、電解質含有溶液等複数の流体を供給する接続部や流体保持部を備えたセンサセルは固定したまま検出を行うことができる。
【００６３】
本発明の好ましい態様によれば、前記作用電極と前記対電極との間隔は０．１〜３ｍｍであることが好ましい。センサセル容量は、ハイブリダイゼーション反応を行う際には被検物質量が少量で行うことが好ましいが、作用電極上に設けたプローブ物質への固体表面に対する溶液の拡散効率を考慮すると溶液量は一定量以上必要となる。この構成によれば、同一センサセル１内で、短時間でハイブリダイゼーション反応を完了させることができ、確実に光電流検出が可能となる。
【００６４】
本発明の好ましい態様によれば、増感色素の光励起により生じる光電流を用いた被検物質の特異的検出が、前記被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を表面に固定した作用電極と対極とが絶縁スペーサーを介して流路を形成したセンサセル１内に増感色素の結合した被検物質を含む試料液を供給する工程と、前記試料液を前記作用電極に接触させて、前記プローブ物質に前記被検物質を直接または間接的に温度調整下で特異的に結合させ、該結合により前記増感色素を前記作用電極に固定させるハイブリダイゼーション工程と、前記センサセル１内を洗浄する工程と、前記センサセル１内に電解液を供給する工程と、前記作用電極に光を照射して先の特異的に結合させる工程とは異なる温度で前記増感色素を光励起させる工程と、光励起された増感色素から前記作用電極への電子移動に起因して前記作用電極と前記対電極との間に流れる光電流を検出する工程とからなる測定方法であることが好ましい。この測定方法を用いることによって、ハイブリダイゼーション工程に適した温度で制御されたセンサセル１内の温度を検出に適した温度へと変化させることができるため、被検物質の特異的検出における検出精度を向上させることが可能となる。また、ハイブリダイゼーション工程と光電流検出工程とを同一センサセル１内で行えるために、作業性を大幅に向上させることが可能となる。
【００６５】
本発明の好ましい態様によれば、光電流検出工程をハイブリダイゼーション工程より低い温度で行う。より好ましくは、光電流検出工程は、ハイブリダイゼーション工程よりも３℃以上低い温度で行うことが好ましく、２０℃以上７０℃いかで行うことが好ましい。この温度設定は、光電流検出に必要な光電効率と導電性基材の電子伝達に関連する抵抗値とを考慮して最適な温度から決定される。このような温度範囲とすることにより、測定精度の高い検出を行うことができる。
【００６６】
電解質含有溶液
本発明において用いられる電解質含有溶液は、電解質と、非プロトン性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも一種の溶媒と、所望により添加物とを含んでなることが好ましい。電解質は、含水性基材中を自由に移動して増感色素、作用電極、および対電極との間で電子の授受に関与できるものであれば限定されず、幅広い種類の電解質が使用可能である。好ましい電解質は、光照射により励起された色素に電子を供与するための還元剤（電子供与剤）として機能できる物質であり、そのような物質の例としては、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、ヨウ化カルシウム（ＣａＩ２）、ヨウ化リチウム（ＬｉＩ）、ヨウ化アンモニウム（ＮＨ４Ｉ）、テトラプロピルアンモニウムヨージド（ＮＰｒ４Ｉ）、チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、ヒドロキノン、Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］・３Ｈ２Ｏ、フェロセン−１，１’−ジカルボン酸、フェロセンカルボン酸、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、トリエチルアミン、チオシアネートアンモニウム、ヒドラジン（Ｎ２Ｈ４）、アセトアルデヒド（ＣＨ３ＣＨＯ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＴＭＰＤ）、Ｌ−アスコルビン酸、亜テルル酸ナトリウム（Ｎａ２ＴｅＯ３）、塩化鉄(II)四水和物（ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）、ＥＤＴＡ、システイン、トリエタノールアミン、トリプロピルアミン、ヨウ素を含むヨウ化リチウム（Ｉ／ＬｉＩ）、トリス(2-クロロエチル)リン酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエタノールアミン、二酸化チオ尿素、（ＣＯＯＨ）２、ＨＣＨＯ、およびこれらの組合せが挙げられ、より好ましくは、ＮａＩ、ＫＩ、ＣａＩ２、ＬｉＩ、ＮＨ４Ｉ、テトラプロピルアンモニウムヨージド（ＮＰｒ４Ｉ）、チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）、および亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、およびこれらの混合物であり、さらに好ましくは、テトラプロピルアンモニウムヨージド（ＮＰｒ４Ｉ）である。溶媒は、非プロトン性溶媒、プロトン性溶媒、またはそれらの混合物である。すなわち、水を主体に緩衝液成分を混合した極性溶媒系のもの、および非プロトン性の極性溶媒を用いることができる。非プロトン性の極性溶媒としては、アセトニトリルなどのニトリル類、炭酸プロピレンや炭酸エチレンなどのカーボネート類、１，３−ジメチルイミダゾリノンや３−メチルオキサゾリノン、ジアルキルイミダゾリウム塩などの複素環化合物やジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、スルホランなどを用いることができる。電解質媒体に含まれる溶媒は、複数の種類を混合して用いることができ、実使用上、検出対象に応じて溶媒組成を適宜変更可能である。
【００６７】
洗浄溶液
本発明の好ましい様態によれば、ハイブリダイゼーション工程後に、未結合の物質を洗浄するために洗浄溶液が複数回供給され、スポット３２３を洗浄することが好ましい。これにより、未結合物質を取り除き、スポット３２３上のプローブ物質に結合した被検物質のみを残存させることが可能となる。
【００６８】
本発明の好ましい様態によれば、ハイブリダイゼーション後用いられる洗浄溶液には、界面活性剤を配合させることが好ましく、より好ましくは界面活性剤を０．００１％以上１０％以下配合させる。界面活性剤を０．００１％以上配合することにより、洗浄効率を上昇させることができるようになる。界面活性剤を１０％以下とすることで、センサセル１内の作用電極上で反応、検出を行うために作用電極上に設けたプローブ上に洗浄流体の供給、排出に伴って発生する気泡の残存を抑制でき、作用電極表面での反応ムラを抑制することができるようになる。
【００６９】
本発明の好ましい様態によれば、光電流検出工程後にも、洗浄溶液が複数回供給され対電極表面を含めたセンサセル１内を洗浄することが好ましい。測定終了後にセンサセル１内を洗浄することができるため、対電極は交換せずに作用電極の交換のみで連続して次の反応と検出を行うことができる。
【００７０】
光源
本発明において、用いられる光源としては、標識色素を光励起できる波長の光を照射できるものであれば限定されず、好ましい例としては、蛍光灯、ブラックライト、殺菌ランプ、白熱電球、低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、キセノンランプ、水銀−キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色、青、緑、赤）、レーザー（ＣＯ２レーザー、色素レーザー、半導体レーザー）、太陽光を用いることができ、より好ましくは、蛍光灯、白熱電球、キセノンランプ、ハロゲンランプ、メタルハライドランプ、ＬＥＤ（白色、青、緑、赤）、太陽光等を挙げることができる。また、必要に応じて、分光器やバンドパスフィルタを用いて特定波長領域の光のみを照射してもよい。
【００７１】
本発明の好ましい態様によれば、互いに異なる光波長で励起可能な二種以上の増感色素を用いて複数種類の被検物質を個別に検出する場合、光源から波長選択手段を介して特定波長の光を照射することにより、複数の色素を個別に励起することが可能である。波長選択手段の例としては、分光器、色ガラスフィルター、干渉フィルタ、バンドパスフィルタ等が挙げられる。また、増感色素の種類に応じて異なる波長の光を照射可能な複数の光源を用いてもよく、この場合の好ましい光源の例としては、特定波長の光が照射されるレーザー光やLEDを用いてもよい。また、作用極に光を効率よく照射するため、石英、ガラス、液体ライトガイドを用いて導光してもよい。
【００７２】
被検物質およびプローブ物質
本発明における被検物質としては、特異的な結合性を有する物質であれば限定されず、種々の物質であってよい。このような被検物質であれば、被検物質と直接または間接的に特異的に結合可能なプローブ物質を作用電極表面に担持させておくことにより、被検物質をプローブ物質に直接または間接的に特異的に結合させて検出することが可能となる。
【００７３】
すなわち、本発明にあっては、被検物質およびプローブ物質として互いに特異的に結合可能なものを選択することができる。すなわち、本発明の好ましい態様によれば、特異的な結合性を有する物質を被検物質とし、被検物質と特異的に結合する物質をプローブ物質として作用電極に担持させるのが好ましい。これにより、作用電極上に被検物質を直接、特異的に結合させて検出することができる。この態様における、被検物質およびプローブ物質の組合せの好ましい例としては、一本鎖の核酸および核酸に対して相補性を有する一本鎖の核酸の組合せ、ならびに抗原および抗体の組合せが挙げられる。
【００７４】
本発明のより好ましい態様によれば、被検物質を一本鎖の核酸とし、プローブ物質を核酸に対して相補性を有する一本鎖の核酸とするのが好ましい。この態様における被検物質の作用電極への特異的結合の工程を図８図１１（ａ）および（ｂ）に示す。これらの図に示されるように、被検物質としての一本鎖の核酸１は、作用電極６３上に担持されたプローブ物質としての相補性を有する一本鎖の核酸６４とハイブリダイズされて、二本鎖の核酸６７を形成する。
【００７５】
一本鎖の核酸を被検物質とする場合、プローブ物質である核酸と相補性部分を有していればよく、被検物質を構成する塩基対の長さは限定されないが、プローブ物質が核酸に対して１０ｂｐ以上の相補性部分を有するのが好ましい。本発明の方法によれば、２００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐの塩基対を有する比較的鎖長の長い核酸であっても、高感度にプローブ物質と被検物質の核酸同士の特異的結合形成を光電流として検出することができる。
【００７６】
被検物質としての一本鎖の核酸を含む試料液は、末梢静脈血のような血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞等の、核酸を含有する各種検体試料から、公知の方法により核酸を抽出して作製することができる。このとき、検体試料中の細胞の破壊は、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて担体を振動させることにより行なうことができる。また、核酸抽出溶液を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。核酸溶出溶液の例としては、ＳＤＳ、Triton-X、Tween-20のような界面活性剤、サポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液が挙げられる。これらの溶液を用いて核酸を溶出する場合、３７℃以上の温度でインキュベ−トすることにより、反応を促進することができる。
【００７７】
本発明のより好ましい態様によれば、被検物質とする遺伝子の含有量が微量である場合には、公知の方法により遺伝子を増幅した後検出を行なうのが好ましい。遺伝子を増幅する方法としては、ポリメラ−ゼチェインリアクション（ＰＣＲ）等の酵素を用いる方法が代表的であろう。ここで、遺伝子増幅法に用いられる酵素の例としては、ＤＮＡポリメラ−ゼ、Ｔａｑポリメラ−ゼのようなＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラ−ゼ、ＲＮＡポリメラ−ゼＩのようなＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラ−ゼ、Ｑβレプリカ−ゼのようなＲＮＡ依存型ＲＮＡポリメラ−ゼが挙げられ、好ましくは温度を調節するだけで連続して増幅を繰り返すことができる点で、Ｔａｑポリメラ−ゼを用いるＰＣＲ法である。
【００７８】
本発明の好ましい態様によれば、上記増幅時に特異的に核酸を増感色素で標識することが出来る。一般的には、５’末端側を増感色素標識したＰＣＲプライマーを用いて遺伝子増幅することで、増感色素が標識された被検物質が得られる。他に、増感色素で標識されたｄＵＴＰやアミノアリル修飾ｄＵＴＰを取り込ませることにより、核酸を増感色素で標識することができる。アミノアリル修飾ｄＵＴＰを取り込ませた場合、次のカップリング段階において、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（N-hydroxysuccinimide）により活性化された増感色素が修飾ｄＵＴＰと特異的に反応し、均一に増感色素で標識された被検物質が得られる。
【００７９】
本発明の好ましい態様によれば、上記のようにして得られた核酸の粗抽出液あるいは精製した核酸溶液をまず９０〜９８℃、好ましくは９５℃以上の温度で熱変性を施し、一本鎖核酸を調製することができる。また、アルカリ変性を行わせて、一本鎖核酸を調整することができる。
【００８０】
本発明にあっては、被検物質とプローブ物質が間接的に特異的に結合するものであってもよい。すなわち、本発明の別の好ましい態様によれば、特異的な結合性を有する物質を被検物質とし、この被検物質と特異的に結合する物質を媒介物質として共存させ、この媒介物質と特異的に結合可能な物質をプローブ物質として作用電極に担持させるのが好ましい。これにより、プローブ物質に特異的に結合できない物質であっても、媒介物質を介して作用電極上に間接的に特異的に結合させて検出することができる。この態様における、被検物質、媒介物質、およびプローブ物質の組合せの好ましい例としては、リガンド、このリガンドを受容可能な受容体蛋白質分子、およびこの受容体蛋白質分子と特異的に結合可能な二本鎖の核酸の組合せが挙げられる。リガンドの好ましい例としては、外因性内分泌攪乱物質（環境ホルモン）が挙げられる。外因性内分泌撹乱物質とは、受容体蛋白質分子を介してＤＮＡに結合し、その遺伝子発現に影響して毒性を生じる物質であるが、本発明の方法によれば、被検物質によりもたらされる受容体等のタンパク質のＤＮＡに対する結合性を簡便にモニタリングすることができる。この態様における被検物質の作用電極への特異的結合の工程を図１２に示す。図１２に示されるように、被検物質としてのリガンド１００は、まず、媒介物質である受容体蛋白質分子１０１に特異的に結合する。そして、リガンドが結合された受容体蛋白質分子１０３が、プローブ物質としての二本鎖の核酸１０４に特異的に結合する。
【００８１】
本発明によれば、１つのプローブ物質に対し、異なる入手経路に由来する複数の同一被検物質を同時に反応させ、サンプルの由来による被検物質量の差異を判断することにより、目的とする入手経路に由来する被検物質を定量することも可能である。具体的な適用例としては、マイクロアレイ上での競合的ハイブリダイゼーションによる発現プロフィール解析が挙げられる。これは、細胞間での特定遺伝子の発現パターンの差異を解析するため、別々の蛍光色素で標識された被検物質を、同一プローブ物質に対して競合的にハイブリダイゼーションを行わせるものである。本発明においては、このような手法を用いることにより、細胞間での発現差異解析が電気化学的に行えるという、従来に無い利点が得られる。
【００８２】
増感色素
本発明にあっては、被検物質の存在を光電流で検出するために、増感色素の共存下、プローブ物質に被検物質を直接または間接的に特異的に結合させて、該結合により増感色素を作用電極に固定させる。そのために、本発明にあっては、図１１（ａ）および図１２に示されるように被検物質９１あるいは媒介物質１０１に予め増感色素９２で標識しておくことができる。また、図１１（ｂ）に示されるように被検物質およびプローブ物質の結合体９６（例えばハイブリダイゼーション後の二本鎖核酸）にインターカレーション可能な増感色素９８を用いる場合には、試料液に増感色素を添加することにより、プローブ物質に増感色素を固定させることができる。
【００８３】
本発明の好ましい態様によれば、被検物質が一本鎖の核酸の場合、被検物質１分子につき増感色素を一つ標識するのが好ましい。一本鎖の核酸における標識位置は、容易に被検物質とプローブ物質の特異的な結合を形成させる観点から、一本鎖の核酸の５’’末端または３’末端のいずれかの位置とするのが好ましく、標識工程をさらに簡便にする観点から被検物質の５’末端とするのがさらに好ましい。
【００８４】
また、本発明の別の好ましい態様によれば、被検物質１分子あたりの増感色素担持量を高める為、被検物質１分子につき増感色素を２つ以上標識するのが好ましい。これにより、電子受容物質の形成された作用電極における単位比表面積あたりの色素担持量をより多くすることができ、より高感度に光電流応答を観測することができる。
【００８５】
本発明に用いる増感色素は、光励起に応じて作用電極に電子を放出可能な物質であり、光源の照射による光励起状態への遷移が可能であり、かつ励起状態から作用電極に電子注入できる電子状態を採りうるものであればよい。したがって、用いる増感色素は、作用電極、特に電子受容層との間において上記電子状態をとることができるものであればよいことから、多種の増感色素が使用可能であり、高価な色素を使用する必要がない。
【００８６】
複数の被検物質の個別検出を行う態様にあっては、各々の被検物質に標識する増感色素は、それぞれ異なる波長の光で励起できるものであればよく、例えば、照射光の波長を選択することにより各被検物質を個別に励起できればよい。例えば、複数の被検物質に対応する複数の増感色素を用い、各増感色素毎に異なる励起波長の光を照射すると、複数のプローブが同一スポット３２３上であっても個別に信号を検出することが可能となる。本発明において、被検物質の数は限定されないが、光源から照射される光の波長と増感色素の吸収特性を考慮すると、１〜５種類が適当であろう。この態様において使用可能な増感色素は、照射光の波長領域内において光励起しさえすればよく、必ずしもその吸収極大が該波長領域にある必要はない。なお、特定波長における増感色素の光吸収反応の有無は、紫外可視スペクトロフォトメーター（例えば、島津製作所社製、ＵＶ−３１５０）を用いて測定することができる。
【００８７】
増感色素の具体例としては、金属錯体や有機色素が挙げられる。金属錯体の好ましい例としては、銅フタロシアニン、チタニルフタロシアニン等の金属フタロシアニン；クロロフィルまたはその誘導体；ヘミン、特開平１−２２０３８０号公報や特表平５−５０４０２３ 号公報に記載のルテニウム、オスミウム、鉄及び亜鉛の錯体（例えばシス−ジシアネート−ビス（２、２’−ビピリジル−４、４’−ジカルボキシレート）ルテニウム（II））、ユーロピウム錯体があげられる。有機色素の好ましい例としては、メタルフリーフタロシアニン、９−フェニルキサンテン系色素、シアニン系色素、メタロシアニン系色素、カルボシアニン系色素、キサンテン系色素、トリフェニルメタン系色素、アクリジン系色素、オキサジン系色素、クマリン系色素、メロシアニン系色素、ロダシアニン系色素、ポリメチン系色素、インジゴ系色素等が挙げられる。また、増感色素の別の好ましい例としては、ＧＥヘルスケアライフサイエンス社製のＣｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５、Ｃｙ９；モルキュラープローブ社製のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ３５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４０５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４３０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０；Ｄｙｏｍｉｃｓ社製のＤＹ−６１０、ＤＹ−６１５、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６３６、ＥＶＯｂｌｕｅ１０、ＥＶＯｂｌｕｅ３０、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６５０、ＤＹ−６５１、ＤＹＱ−６６０、ＤＹＱ−６６１が挙げられる。
【００８８】
二本鎖核酸にインターカレーション可能な増感色素の好ましい例としては、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイドが挙げられる。このような増感色素を用いる場合、核酸のハイブリダイゼーション後に試料液に添加するだけで増感色素で標識された二本鎖核酸が形成されるので、予め一本鎖の核酸を標識する必要が無い。
【００８９】
作用電極およびその製造
本発明に用いられる作用電極は、上記プローブ物質を表面に備えた電極であり、プローブ物質を介して固定された増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電極である。したがって、作用電極の構成および材料は、使用される増感色素との間で上記電子移動が生じるものであれば限定されず、種々の構成および材料であってよい。
【００９０】
本発明の好ましい態様によれば、作用電極が増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる電子受容層を有し、この電子受容層の表面にプローブ物質が備えられてなるのが好ましい。また、本発明のより好ましい態様によれば、作用電極が導電性基材をさらに含んでなり、この導電性基材上に電子受容層が形成されてなるのが好ましい。この態様の電極は図１１および図１２に示される。図１１および図１２に示される作用電極９３は、導電性基材９５と、この導電性基材９５上に形成され、電子受容物質を含んで成る電子受容層９６とを備えてなる。そして、電子受容層９６の表面にプローブ物質９４が担持される。
【００９１】
本発明における電子受容層９６は、プローブ物質９４を介して固定された増感色素が光励起に応じて放出する電子を受容可能な電子受容物質を含んでなる。すなわち、電子受容物質は、光励起された標識色素からの電子注入が可能なエネルギー準位を取り得る物質であることができる。ここで、光励起された標識色素からの電子注入が可能なエネルギー準位（Ａ）とは、例えば、電子受容性材料として半導体を用いる場合には、伝導帯（コンダクションバンド：CB）を意味する。すなわち、本発明に用いる電子受容物質は、このＡの準位が、増感色素のLUMOのエネルギー準位よりも卑な準位、換言すれば、増感色素のＬＵＭＯのエネルギー準位よりも低いエネルギー準位を有するものであればよい。
【００９２】
本発明の好ましい態様によれば、電子受容物質は、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化ニオブ、チタン酸ストロンチウム、酸化インジウム、インジウム-スズ複合酸化物（ＩＴＯ）、フッ素がドープされた酸化スズ（ＦＴＯ）からなる群から選択される少なくとも一種であることが好ましい。、最も好ましくはTiO2、インジウム−スズ複合酸化物（ＩＴＯ）またはフッ素がドープされた酸化スズ（ＦＴＯ）をもちいることができる。ＩＴＯおよびＦＴＯは電子受容層のみならず導電性基材としても機能する性質を有するため、これらの材料を使用することにより導電性基材を用いることなく電子受容層のみで作用電極として機能させることができる。
【００９３】
電子受容物質として半導体を用いる場合、その半導体は単結晶および多結晶のいずれであってもよいが、多結晶体が好ましく、さらに緻密なものよりも多孔性を有するものが好ましい。これにより、比表面積が大きくなり、被検物質および増感色素を多く吸着させて、より高い感度で被検物質を検出することができる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、電子受容層が多孔性を有しており、各孔の径が３〜１０００ｎｍであるのが好ましく、より好ましくは、１０〜１００ｎｍである。
【００９４】
本発明の好ましい態様によれば、電子受容層を導電性基材上に形成した状態での表面積は、投影面積に対して１０倍以上であることが好ましく、さらに１００倍以上であることが好ましい。この表面積の上限には特に限定されないが、通常１０００倍程度であろう。電子受容層を構成する電子受容物質の微粒子の粒径は、投影面積を円に換算したときの直径を用いた平均粒径で一次粒子として５〜２００ｎｍであることが好ましく、より好ましくは８〜１００ｎｍであり、さらに好ましくは２０〜６０ｎｍである。また、分散物中の電子受容性物質の微粒子（二次粒子）の平均粒径としては０．０１〜１００μｍであることが好ましい。また、入射光を散乱させて光捕獲率を向上させる目的で、粒子サイズの大きな、例えば３００ｎｍ程度の電子受容物質の微粒子を併用して、電子受容層を形成してもよい。
【００９５】
凹凸構造によって、電子受容層の表面積を大きくしてプローブ分子を多く固定化することで検出感度を上げることができる。生体分子の大きさが０．１〜２０ｎｍ程度であるため、凹凸構造により形成される細孔径は２０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下が好ましい。凹凸構造により生じる空間の入口がそれ以下であれば、比表面積は増大するが生体分子とプローブとの結合ができず、検出信号は低下する。凹凸が粗ければ表面積もあまり増えないため信号強度もそれ程上がらない。生体分子のセンシングに好適な、より好ましい範囲は５０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下である。
【００９６】
本発明の好ましい態様によれば、凸構造として、ナノスケールの柱（ピラー）を表面に規則正しく並べたピラー構造を採用するのが好ましい。その製法としては種々、知られているが、ナノメートルスケールの孔を有する陽極酸化アルミナを鋳型として用いる方法が一般的である。鋳型にセラミックのゾルを充填、熱処理した後に、エッチングによりアルミナの鋳型を除去する方法や、充填したセラミックのゾルを鋳型より離型した後に熱処理する方法がある。ピラー状のナノ構造体を製造する方法としては、特開２００４−１３０１７１で示された透明基体、透明導電層上にナノ構造体を製造する方法が挙げられる。ここでは、陽極酸化アルミナの鋳型にチタニアゾルを充填し、３００〜４００℃の熱処理を行った後に鋳型をエッチングによって除去する方法が採られている。その結果、ナノ構造体としてチタニアのナノチューブやナノワイアが形成される。
【００９７】
本発明の好ましい態様によれば、凹構造として、セラミック成分を含む無機‐有機ハイブリッド前駆体を焼成し、有機物の酸化分解により気相となるために生じる気孔を採用するのが好ましい。無機‐有機ハイブリッド前駆体は、有機金属化合物（金属アルコキシド）の酸化とそれに続く重縮合反応によって生じる金属‐酸素のネットワーク構造と有機ポリマーなどが共存するものである。また、市販の酸化チタン粒子（たとえばテイカ株式会社製アナターゼ型結晶、商品名ＡＭＴ−６００（平均粒径３０ｎｍ）など）や酸化チタン分散液に有機ポリマーなどを添加する方法もある。これらの組成については種々の提案がなされており、たとえば特開平１０‐２１２１２０号公報はグライム系溶剤（ＨＯ‐（‐ＣＨ２ＣＨ２Ｏ‐）ｎ‐Ｒ、ｎは１〜１０、Ｒはアルキル基あるいはアリール基）に酸化チタン粒子を分散させ、さらに分散助剤として有機ポリマーを加える組成が提案されている。この組成の分散液を適当な方法（ディップコーティング法、スプレーコーティング法、スピナーコーティング法、ブレードコーティング法、ローラーコーティング法、ワイパーバーコーティング法、リバースロールコーティング法）によって支持体上に塗布し、２００〜８００℃で焼成した場合、１ｃｍ２（厚さ１μｍ）あたり４０〜５０ｃｍ２の比表面積が達成されている。また、特開２００１‐２３３６１５号公報は、テトラアルコキシチタンとエチレンオキサイド、プロピレンオキサイド、エチレンオキサイドブロックコポリマーと安定化剤と溶剤とからなるゾル溶液を基板上に滴下し、基板を高速回転させることで溶剤を蒸発させ、ゲル化させることで得られる三次元構造を有する有機無機複合チタニア薄膜を、高温焼結させてブロックコポリマーを除去することで微細な三次元凹構造を達成している。さらに、有機ポリマーとしてオリゴ糖（トレハロース）を用いる方法も開示されており（特開２００４‐８３３７６号公報）、気孔率が３８〜５６％のセラミック多孔質膜が得られている。
【００９８】
このように、セラミックの微細な凹凸構造制御方法は種々提案されており、本発明に適したセラミック電極材料に応用することで、比表面積の大きい電極材料の創製が可能である。
【００９９】
本発明の好ましい態様によれば、作用電極が導電性基材をさらに含んでなり、電子受容層が導電性基材上に形成されてなるのが好ましい。本発明に使用可能な導電性基材としては、チタン等の金属のように支持体そのものに導電性があるもののみならず、ガラスもしくはプラスチックの支持体の表面に導電材層を有するものであってよい。この導電材層を有する導電性基材を使用する場合、電子受容層はその導電材層上に形成される。導電材層を構成する導電材の例としては、白金、金、銀、銅、アルミニウム、ロジウム、インジウム等の金属；炭素、炭化物、窒化物等の導電性セラミックス；およびインジウム−スズ複合酸化物、酸化スズにフッ素をドープしたもの、酸化スズにアンチモンをドープしたもの、酸化亜鉛にガリウムをドープしたもの、または酸化亜鉛にアルミニウムをドープしたもの等の導電性の金属酸化物が挙げられ、より好ましくは、インジウム-スズ複合酸化物（ＩＴＯ）、酸化スズにフッ素をドープした金属酸化物（ＦＴＯ）である。ただし、前述した通り、電子受容層自体が導電性基材としても機能する場合にあっては導電性基材は省略可能である。また、本発明において、導電性基材は、導電性を確保できる材料であれば限定されず、それ自体では支持体としての強度を有しない薄膜状またはスポット状の導電材層も包含するものとする。
【０１００】
本発明の好ましい態様によれば、導電性基材が実質的に透明、具体的には、光の透過率が１０％以上であるのが好ましく、より好ましくは５０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上である。これにより、作用電極の裏側（すなわち導電性基材）から光を照射させて、作用電極（すなわち導電性基材および電子受容層）を透過した光が増感色素を励起するようにセルを構成することができる。また、本発明の好ましい態様によれば、導電材層の厚みは、０．０２〜１０μｍ程度であるのが好ましい。さらに、本発明の好ましい態様によれば、導電性基材の表面抵抗が１００Ω／ｃｍ２以下であり、さらに好ましくは４０Ω／ｃｍ２以下であるのが好ましい。導電性基材の表面抵抗の下限は特に限定されないが、通常０．１Ω／ｃｍ２程度であろう。
【０１０１】
導電性基材上への電子受容層の好ましい形成方法の例としては、電子受容物質の分散液またはコロイド溶液を導電性支持体上に塗布する方法、半導体微粒子の前駆体を導電性支持体上に塗布し空気中の水分によって加水分解して微粒子膜を得る方法（ゾル−ゲル法）、スパッタリング法、CVD法、PVD法、蒸着法などが挙げられる。電子受容物質としての半導体微粒子の分散液を作成する方法としては、前述のゾル−ゲル法の他、乳鉢ですり潰す方法、ミルを使って粉砕しながら分散する方法、あるいは半導体を合成する際に溶媒中で微粒子として析出させそのまま使用する方法等が挙げられる。このときの分散媒としては水または各種の有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル等）が挙げられる。分散の際、必要に応じてポリマー、界面活性剤、酸、もしくはキレート剤などを分散助剤として使用してもよい。
【０１０２】
電子受容物質の分散液またはコロイド溶液の塗布方法の好ましい例としては、アプリケーション系としてローラ法、ディップ法、メータリング系としてエアーナイフ法、ブレード法等、またアプリケーションとメータリングを同一部分でできるものとして、特公昭５８−４５８９号公報に開示されているワイヤーバー法、米国特許２６８１２９４号、同２７６１４１９号、同２７６１７９１号等に記載のスライドホッパ法、エクストルージョン法、カーテン法、スピン法、スプレー法が挙げられる。
【０１０３】
本発明の好ましい態様によれば、電子受容層が半導体微粒子からなる場合、電子受容層の膜厚が０．１〜２００μｍであるのが好ましく、より好ましくは０．１〜１００μｍであり、さらに好ましくは１〜３０μｍ、最も好ましくは２〜２５μｍである。これにより、単位投影面積当たりのプローブ物質および固定される増感色素量を増加して光電流量を多くするとともに、電荷再結合による生成した電子の損失をも低減することができる。また、導電性基材１ｍ２当たりの半導体微粒子の塗布量は０．５〜４００ｇであるのが好ましく、より好ましくは５〜１００ｇである。
【０１０４】
本発明の好ましい態様によれば、電子受容物質がインジウム-スズ複合酸化物（ＩＴＯ）または酸化スズにフッ素をドープした金属酸化物（ＦＴＯ）を含んでなる場合、電子受容層の膜厚が１ｎｍ以上であるのが好ましく、より好ましくは１０ｎｍ〜１μｍである。
【０１０５】
本発明の好ましい態様によれば、半導体微粒子を導電性基材上に塗布した後に加熱処理を施すのが好ましい。これにより、粒子同士を電気的に接触させ、また、塗膜強度の向上や支持体との密着性を向上させることができる。好ましい加熱処理温度は、４０〜７００℃であり、より好ましくは１００〜６００℃である。また、好ましい加熱処理時間は１０分〜１０時間程度である。
【０１０６】
また、本発明の別の好ましい態様によれば、ポリマーフィルムなど融点や軟化点の低い導電性基材を用いる場合にあっては、熱による劣化を防止するため、高温処理を用いない方法により膜形成を行うのが好ましく、そのような膜形成方法の例として、プレス、低温加熱、電子線照射、マイクロ波照射、電気泳動、スパッタリング、ＣＶＤ、ＰＶＤ、蒸着等の方法が挙げられる。
【０１０７】
こうして得られた作用電極の電子受容層の表面にはプローブ物質が担持される。作用電極へのプローブ物質の担持は公知の方法に従い行うことができる。本発明の好ましい態様によれば、プローブ物質として一本鎖の核酸を用いる場合には、作用電極表面に酸化層を形成させておき、この酸化層を介して核酸プローブと作用電極とを結合させることにより行うことができる。このとき、核酸プローブの作用電極への固定化は、核酸の末端に官能基を導入することにより行うことができる。これにより、官能基が導入された核酸プローブはそのまま固定化反応により担体上に固定化されることができる。核酸末端への官能基の導入は、酵素反応もしくはＤＮＡ合成機を用いて行なうことができる。酵素反応において用いられる酵素としては、例えば、タ−ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラ−ゼ、ポリＡポリメラ−ゼ、ポリヌクレオチドカイネ−ス、ＤＮＡポリメラ−ゼ、ポリヌクレオチドアデニルトランスフェラ−ゼ、ＲＮＡリガ−ゼを挙げることができる。また、ポリメラ−ゼチェインリアクション（ＰＣＲ法）、ニックトランスレ−ション、ランダムプライマ−法により官能基を導入することもできる。官能基は、核酸のどの部分に導入されてもよく、３'末端、５'末端もしくはランダムな位置に導入することができる。
【０１０８】
本発明の好ましい態様によれば、核酸プローブの作用電極への固定化のため官能基として、アミン、カルボン酸、スルホン酸、チオール、水酸基、リン酸等が好適に使用できる。また、本発明の好ましい態様によれば、核酸プローブを作用電極に強固に固定化するためには、作用電極と核酸プローブの間を架橋する材料を使用することも可能である。そのような架橋材料の好ましい例としては、シランカップリング剤、チタネートカップリング剤や、ポリチオフェン、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリアニリン等の導電性ポリマーが挙げられる。
【０１０９】
本発明の好ましい態様によれば、核酸プロ−ブの固定化を物理吸着という、より簡単な操作で効率よく行うことも可能である。電極表面への核酸プロ−ブの物理吸着は、例えば、以下のように行なうことができる。まず、電極表面を、超音波洗浄器を用いて蒸留水およびアルコ−ルで洗浄する。その後、電極を核酸プロ−ブを含有する緩衝液に挿入して核酸プロ−ブを担体表面に吸着させる。
【０１１０】
また、核酸プローブの吸着後、ブロッキング剤を添加することにより、非特異的な吸着を抑制することができる。使用可能なブロッキング剤としては、核酸プローブが吸着していない電子受容層表面のサイトを埋めることができ、かつ電子受容物質に対して化学吸着あるいは物理吸着等により吸着可能な物質であれば限定されないが、好ましくは化学結合を介して吸着可能な官能基を有する物質である。例えば、酸化チタンを電子受容層として用いる場合における好ましいブロッキング剤の例としては、カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基、水酸基、アミノ基、ピリジル基、アミド等の酸化チタンに吸着可能な官能基を有する物質が挙げられる。
【０１１１】
本発明の好ましい態様によれば、作用電極上にプローブ物質が互いに分離された複数の領域毎に区分されて担持されてなり、光源による光照射が各領域に対して個別に行われるのが好ましい。これにより、複数の試料を一枚の作用電極上で測定することができるので、ＤＮＡチップの集積化等が可能となる。本発明のより好ましい態様によれば、作用電極上にプローブ物質が担持された、互いに分離された複数の領域がパターニングされており、光源から照射される光でスキャニングしながら、各領域の試料について被検物質の検出または定量を一度の操作で連続的に行うことが好ましい。
【０１１２】
本発明のより好ましい態様によれば、作用電極上の互いに分離された複数の領域の各領域に複数種類のプローブ物質を担持させることができる。これにより、領域の個数に、各領域毎のプローブ物質の種類数を乗じた数の、多数のサンプルの測定を同時に行うことができる。
【０１１３】
本発明のより好ましい態様によれば、作用電極上の互いに分離された複数の領域の各領域毎に異なるプローブ物質を担持させることができる。これにより、区分された領域の数に相当する種類数のプローブ物質を担持させることができるので、多種類の被検物質の測定を同時に行うことができる。
【０１１４】
対電極
本発明に用いられる対電極は、電解質媒体に接触させた場合に作用電極との間に電流が流れることができるものであれば特に限定されず、ガラス、プラスチック、セラミックス、SUS等の支持体に、金属もしくは導電性の酸化物を蒸着したものが使用可能である。また、対電極としての金属薄膜を５μｍ以下、好ましくは３ｎｍ〜３μｍの範囲の膜厚になるように、蒸着やスパッタリングなどの方法により形成して作成することもできる。対電極に使用可能な材料の好ましい例としては、白金、金、パラジウム、ニッケル、カーボン、ポリチオフェン等の導電性ポリマー、酸化物、炭化物、窒化物等の導電性セラミックス等が挙げられ、より好ましくは、白金、カーボンであり、最も好ましくは白金である。これらの材料は電子受容層の形成方法と同様の方法により薄膜形成が可能である。
【実施例】
【０１１５】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本発明による装置および方法を用いて、ｐ５３遺伝子の検出を行った。作用電極側に完全一致プローブを固定化した。それぞれの塩基配列は下記の通りとした。
完全一致プローブ：5'- TGTAGGAGCTGCTGGTGCA -3'（配列番号１）
このプローブとハイブリダイゼーションさせるターゲットＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲによるターゲットＤＮＡ増幅に用いたプライマーは下記の通りとした。
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：5’-Cy5-GATATTGAACAATGGTTCACTGAAGAC-3’（配列番号２）
【０１１６】
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：5’-GCCCCTCAGGGCAACTGAC-3’  （配列番号３）
５’末端側がＣｙ５標識してあるＦｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒを用いて増幅するため、ターゲットＤＮＡ１分子あたりＣｙ５色素が１分子標識されている。
【０１１７】
作用電極用のガラス基材として、フッ素をドープした酸化スズ（F-SnO2：FTO）コートガラス（ＡＧＣファブリテック株式会社製、U膜、シート抵抗：12Ω/□、形状：７５ｍｍ×２６ｍｍ）を用意した。このガラス基材をアセトン中で15分間、続いて超純水中で15分間超音波洗浄を施して、汚れおよび残存有機物の除去を行った。このガラス基材を０．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液中で15分間振盪させた。その後、水酸化ナトリウムの除去のために超純水中での5分間の振盪洗浄を水を入れ替えて3回行った。ガラス基材を取り出して空気を吹き付けて残水を飛散させた後、ガラス基材を無水メタノールに浸漬させて脱水した。
【０１１８】
９５%メタノール5%超純水を溶媒として、3-アミノプロピルトリメトキシシラン（APTMS）を０．２ｖｏｌ%となるように加え、室温下で5分間の攪拌を行って、カップリング処理用の溶液を調製した。このカップリング処理用溶液に上記ガラス基材を浸漬させ、ゆっくりと１５分間振盪させた。次いで、ガラス基材を取り出し、メタノール中での３分間の振盪をメタノールを入れ替えて3回行い、余剰なカップリング処理用溶液を除く操作を行った。その後、ガラス基材を１１０℃で30分間保持してカップリング剤をガラス基材に結合させた。ガラス基材を室温下で冷却した後、1０μMに調製し、９５℃で１０分間保持した後、直ちに氷上に移して１０分間保持してDNAを変性させた完全一致鎖のプローブDNA（１９mer）を、マイクロアレイヤー（フィルジェン株式会社製LT-BA、スポットピン径＝１．５ｍｍ）にて、3スポットずつスポットの中心間隔が５ｍｍとなるようスポットした。その後、９５℃で３分保持して溶媒を蒸発させ、UVクロスリンカー（UVP社CL−１０００型）で１２０ｍＪの紫外光を照射して、プローブDNAをガラス基材に固定化した。それから、０．２％ＳＤＳ溶液中で５分間振盪洗浄を３回繰り返し、さらに超純水で５分間振盪洗浄を３回繰り返した。このガラス基材を沸騰水に２分間浸漬させて取り出した後、空気を吹き付けて残水を飛散させた。続いて、ガラス基材を4℃の無水エタノールに1分間浸漬させて脱水し、空気を吹き付けて残留エタノールを飛散させた。こうして、プローブＤＮＡ固定化作用電極を得た。
【０１１９】
このプローブＤＮＡ固定化電極を作用電極として、図１に示す装置に図６（ａ）に示す作用電極ケースに収納して設置し、センサセル１を構成した。スペーサー３３０として内部に開口部を有する膜厚０．５ｍｍのシリコンシートを設置した。このスペーサーは作用電極と対電極との接触による短絡を防ぐための機能も備えている。そして、センサセルからの流体排出口付近ではセンサセル１内での空気と溶液との置換が行われやすいようプローブが固定化されている部分より下流側は流路が狭くなった構造となっている。なお、対電極には、白金電極としてステンレス（ＳＵＳ316）表面に白金薄膜をスパッタリングにより形成したものを使用した。また、押さえ部材３１０には、検出スポット３２３への光照射用の開口部３１１が設けられている。このスペーサーを介して対電極と作用電極となるプローブ固定化電極が対向して配置され、対極とスペーサーと作用電極からなるセンサセルとが構成されている。そして、このセンサセルはスペーサー開口部と両電極によって形成される流路を有するフローセル構造となっている。また、この流路に接続する対極に設けた流体供給口と流体排出口とが形成されている。流体供給口は、センサセル１内へと流体を供給するためのポンプに接続された配管チューブが接続され、流体排出口にはセンサセル１内へと供給された流体を排出するための配管チューブが接続されている。
【０１２０】
次に、Ｃｙ５標識されたターゲットＤＮＡ溶液５０μＬと、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．２Ｍ  ＮａＯＨのアルカリ変性溶液５０μＬとを混合して室温で５分間保持し、二本鎖ＤＮＡをアルカリ変性によって一本鎖ＤＮＡにする。この溶液に、ハイブリダイゼーション設定温度で温度調整されたハイブリダイゼーション希釈液である５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液３５０μＬと、アルカリ溶液を中和させるための０．２Ｍ  ＨＣｌ中和液５０μＬを添加して混合する。この混合後の溶液４５０μＬをセンサセル１内へと送液して１０分間、35℃でセンサセル１内温度を保持して、作用電極上に固定化したプローブＤＮＡとハイブリダイゼーションを行わせる。このとき、センサセル１内にハイブリダイゼーション溶液を送液する前には、温度調整部材であるセラミックヒーター、温調器、測温抵抗体を用いてセンサセル１内をハイブリダイゼーション設定温度で保持しておく。１０分間経過後、ハイブリダイゼーション溶液をポンプ  を用いて、空気を供給してセンサセル１内の溶液を完全に排出する。次に、ハイブリダイゼーションを行わなかった余剰のターゲットＤＮＡ等を洗浄するために、０．５×ＳＳＣ／０．０１％ＳＤＳ溶液をセル容量の６倍量センサセル１内へ送液する。その後、電解質含有溶液をセンサセル１内へと送液する。電解質含有溶液には、０．４Ｍのテトラプロピルアンモニウムヨージド（ＮＰｒ４Ｉ）水溶液を使用した。センサセル１内部は検出温度に温度制御し、電解質含有溶液を送液してセンサセル１内を満たして光電流を検出した。
【０１２１】
光電流検出はセンサセル１の押さえ部材に並行して設けられた１軸ステージに取り付けた光源（波長：６５８nm、光径：約０．２ｍｍ、出力４０ｍＷ）を移動させながら作用電極上のプローブDNA固定化スポットに順次5秒ずつ照射し、また、押さえ部材の開口部間で観察される電流値（すなわち、光が遮られて作用電極に照射されない状態での電流値）をベース電流値とし、各スポット由来の光電流値とその直前のベース電流値との差分を観察値として、各スポットの光電流値として記録した。
【０１２２】
各スポット由来の光電流値とその直前のベース電流値との差分を各プローブＤＮＡについてまとめた結果（N=3）を表１に示す。なお、各スポット由来の光電流値及びベース電流値は、各中心部の点5点の平均をそれぞれ値として算出している。得られた表１の電流値より、精度よい検出が確認された。
【０１２３】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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