(57)【要約】【課題】  ヒストンタンパク質のグリコシル化を検出することを可能とする方法、並びに当該方法に用いられる抗体を提供すること。【解決手段】  核内においてヒストン（ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４）がグリコシル化（Ｏ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化）されていること、特に、ヒストンＨ２ＢにおいてはＮ−アセチルグルコサミン化される部位が、９１番目のセリン残基、１１２番目のセリン残基、及び１２３番目のセリン残基であることを見出した。さらに、ヒストンＨ２Ｂのグリコシル化された部位に結合する抗体を作製し、更に解析した結果、このグリコシル化がＨＢＰを介した細胞外グルコース濃度に依存するものであり、このグリコシル化の亢進によって、ヒストンＨ２Ｂのユビキチン化やヒストンＨ３のメチル化が誘導され、ひいてはＰＧＫ１遺伝子等の転写を活性化させることをも見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｂ）の工程を含む、ヒストンタンパク質のグリコシル化を検出するための方法
（ａ）ヒストンタンパク質を含む試料を調製する工程
（ｂ）前記試料において、グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する工程。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｂ）の工程を含む、グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出することを特徴とする、血清グルコース量を評価するための方法
（ａ）ヒストンタンパク質を含む試料を調製する工程
（ｂ）前記試料において、グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する工程。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｂ）の工程を含む、グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出することを特徴とする、メタボリックシンドロームを検査するための方法
（ａ）ヒストンタンパク質を含む試料を調製する工程
（ｂ）前記試料において、グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する工程。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、メタボリックシンドロームに対する医薬品候補化合物をスクリーニングするための方法
（ａ）ヒストンタンパク質を含む試料を調製する工程
（ｂ）前記試料に被験化合物を接触させる工程
（ｃ）被験化合物を接触させた前記試料におけるグリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する工程
（ｄ）被験化合物を接触させない場合と比較して、（ｃ）で検出されたグリコシル化されたヒストンタンパク質の量を減少させる化合物を選択する工程。
【請求項５】
前記検出は、前記ヒストンタンパク質のグリコシル化された部位に結合する抗体を用いることを特徴とする、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記グリコシル化がＮ−アセチルグルコサミン化である、請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒストンタンパク質が、ヒストンＨ２Ａ及びヒストンＨ２Ｂからなる群から選択される少なくとも一のタンパク質である、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒストンタンパク質がヒストンＨ２Ｂであり、前記部位が、９１番目のセリン残基、１１２番目のセリン残基、及び１２３番目のセリン残基からなる群から選択される少なくとも一のセリン残基である、請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記グリコシル化がＮ−アセチルグルコサミン化であり、前記ヒストンタンパク質がヒストンＨ２Ｂであり、且つ前記部位が１１２番目のセリン残基である、請求項１〜８のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ヒストンタンパク質のグリコシル化された部位に結合する抗体
【請求項１１】
前記グリコシル化がＮ−アセチルグルコサミン化である、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記ヒストンタンパク質が、ヒストンＨ２Ａ及びヒストンＨ２Ｂからなる群から選択される少なくとも一のタンパク質である、請求項１０又は１１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記ヒストンタンパク質がヒストンＨ２Ｂであり、前記部位が、９１番目のセリン残基、１１２番目のセリン残基、及び１２３番目のセリン残基からなる群から選択される少なくとも一のセリン残基である、請求項１０〜１２のうちのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記ヒストンタンパク質がヒストンＨ２Ｂであり、前記部位が１１２番目のセリン残基であり、且つ前記グリコシル化がＮ−アセチルグルコサミン化である、請求項１０〜１３のうちのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のうちのいずれか一項に記載の抗体を有効成分とする、ヒストンタンパク質のグリコシル化を検出するための薬剤。
【請求項１６】
請求項１０〜１４のうちのいずれか一項に記載の抗体を有効成分とする、血清グルコース量を評価するための薬剤。
【請求項１７】
請求項１０〜１４のうちのいずれか一項に記載の抗体を有効成分とする、メタボリックシンドロームを検査するための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストンタンパク質のグリコシル化を検出するための方法、並びに当該方法に用いられる抗体に関する。より詳しくは、本発明は、ヒストンタンパク質のグリコシル化を検出するための方法、並びに、ヒストンタンパク質のグリコシル化を指標とした、血清グルコース量の評価するための方法、メタボリックシンドロームを検査するための方法、及びメタボリックシンドロームに対する医薬品候補化合物をスクリーニングするための方法に関する。さらに、本発明は、ヒストンタンパク質のグリコシル化された部位に結合する抗体、並びに、前記抗体を有効成分とする、ヒストンタンパク質のグリコシル化を検出するための薬剤、血清グルコース量を評価するための薬剤、及びメタボリックシンドロームを検査するための薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマチン構造は転写を促進するために再構成、すなわち多数の非ヒストンタンパク質を用いたＤＮＡのメチル化と同様に、ヒストンにおける様々な修飾によって制御されることが知られている（非特許文献１〜５）。このような化学修飾において、ヒストンの翻訳後修飾はクロマチン再編成のための重要な決定因子として明らかになっており、可逆的なヒストン修飾の特異的な組み合わせは、一般に「ヒストンコード」と呼ばれ、クロマチンの活性状態に影響を及ぼしていることも知られている（非特許文献６）。この特異的な組み合わせは後成的（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ）に生じ、安定的であるにも関わらず、これらのいくつかは細胞外状態及び細胞活性に応答して一時的に再構成される（非特許文献７〜８）。現段階では、クロマチン再編成において８種の修飾の効果が証明されている（非特許文献６）。そのうち、ヒストン末端の特異的残基におけるヒストンのアセチル化、メチル化、ユビキチン化は遺伝子の発現制御と関連している（非特許文献９〜１０）。すなわち、ユークロマチン化（ｅｕｃｈｒｏｍａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ）における遺伝子発現の誘導は一般的に、ヒストンＨ３の高アセチル化（ｈｙｐｅｒａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）に伴うヒストンＨ３の４番目のリシン残基（Ｈ３Ｋ４）及び３６番目のリシン残基（Ｈ３Ｋ３６）におけるメチル化と同時に起こる。これに対して、Ｈ３Ｋ９及びＨ３Ｋ２７のメチル化はヒストンの脱アセチル化に続くクロマチン不活性化（ヘテロクロマチン化）の誘因となる。転写開始に合わせた動的で可逆的なヒストンのメチル化及びアセチル化は、転写伸長過程及び転写終了過程においても重要である（非特許文献８）。さらに、これらの修飾に加え、ヒストンＨ２Ｂの１２０番目のリシン残基におけるモノユビキチン化（Ｈ２Ｂ−Ｋ１２０−ｕｂ）は転写後修飾の開始過程に不可欠であることが近年証明された（非特許文献１１）。このような転写制御におけるヒストン修飾の重要性と一致して、ヒストンの修飾を導入／除去する、機能的に対立した酵素のどちらもＤＮＡ結合転写因子の転写共制御因子（ｃｏ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）として機能することが知られている（非特許文献１２〜１４）。
【０００３】
しかしながら、基本的な転写に関連したヒストン修飾の分子レベルでの理解は不十分であり、特にＨ２Ｂ−Ｋ１２０−ｕｂと他のヒストン修飾との分子的関連については明らかになっていなかった。
【０００４】
一方、前述のようなヒストン修飾と同様に、タンパク質のＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）化は可逆的な現象であることが知られている（非特許文献１５〜１６）。修飾反応は二つの酵素、Ｏ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＯＧＴ）及びＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化酵素（ＯＧＡ）により触媒され、これらの修飾は細胞質タンパク質及び核タンパク質の両方において検出されている。Ｎ−アセチルグルコサミン部分はヘキソサミン生合成経路（ＨＢＰ）によりサイトゾルにおいて生成されるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから得られる。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの最初の供給源が細胞外グルコースであるため、タンパク質のＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化の程度は細胞外グルコース濃度及び細胞内のＨＢＰ活性と共に変動することも明らかとなっている。
【０００５】
しかしながら、タンパク質に結合しているＮ−結合型ポリサッカライド鎖とは異なり、Ｏ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン部分の生理的な役割はほとんど知られていない。特に、エネルギー代謝（及びその異常）に関係するものとしてモノグリコシル化の重要性が示唆されているが（非特許文献１７〜１８）、精密な検出系がなかったため、未解決のままであった。特に、タンパク質のＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化の質量分析測定はイオン化過程において構造が破壊されてしまうため阻まれていた（非特許文献１９）。さらに、この修飾は低分子量及び中性電荷であり、ゲル電気泳動においてスモールシフトとなってしまうため、検出することが困難であった。そのため、特異的抗体による免疫検出以外に、本可逆的修飾を精密に評価する分析方法は存在しない（非特許文献２０〜２１）。しかしながら、抗体の特異的認識は結合したタンパク質の三次元構造に影響を受けるため、抗体を全てのＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化タンパク質に対応して用いることはできなかった。それでもなお、近年の質量分析によるアプローチの改善に伴って、鍵となる細胞内イベントに関与しているモノグリコシル化タンパク質の機能的特性評価により、Ｏ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化タンパク質の生理学的重要性が示されている。さらに本発明者は、Ｈ３Ｋ４メチル転移酵素であるＭＬＬ５がＯＧＴの基質であることを見出し、これにより核タンパク質のＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化が、クロマチンの再編成における生命維持に重要な修飾であるということを実証した（非特許文献２２〜２３）。
【０００６】
このように、ＯＧＴがヒストン修飾酵素の糖修飾を介して転写制御に寄与していることは実証されているが、ヒストンと糖修飾（グリコシル化）との直接的な関連性は未だ明らかになっていなかった。また、Ｏ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化は細胞外のグルコース濃度に依存するため、核内の糖修飾反応と糖尿病を始めとする代謝性疾患（メタボリックシンドローム）との関連性は、未だ明らかになっていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２００６年、２０巻、１１号、１４０５ページ
【非特許文献２】Ｌｉら、Ｃｅｌｌ、２００７年、１２８巻、４号、７０７ページ
【非特許文献３】Ｓｔｒａｈｌら、Ｎａｔｕｒｅ、２０００年、４０３巻、６７６５号、４１ページ
【非特許文献４】Ｚｈａｎｇら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２００１年、１５巻、１８号、２３４３ページ
【非特許文献５】Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓら、Ｃｅｌｌ、２００７年、１２８巻、４号、６９３ページ
【非特許文献６】Ｃａｍｐｏｓら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ、２００９年、４３巻、５５９ページ
【非特許文献７】Ｂｈａｕｍｉｋら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２００７年、１４巻、１１号、１００８ページ
【非特許文献８】Ｓｈｉら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ、２００７年、８巻、１１号、８２０ページ
【非特許文献９】Ｂｅｒｇｅｒ，ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、４４７巻、７１４３号、４０７  ページ
【非特許文献１０】Ｗｅａｋｅら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ、２００８年、２９巻、６号、６５３ページ
【非特許文献１１】Ｋｉｍ，ら、Ｃｅｌｌ  、２００９年、１３７巻、３号、４５９ページ
【非特許文献１２】Ｆｕｊｉｋｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ、２００５年、２４巻、２２号、３８８１ページ
【非特許文献１３】Ｙｏｋｏｙａｍａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ、２０１０年８月、１５巻、８号、８６７ページ
【非特許文献１４】Ｓａｗａｔｓｕｂａｓｈｉら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２００９年、２４巻、２号、１５９ページ
【非特許文献１５】Ｈａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、４４６巻、７１３９号、１０１７ページ
【非特許文献１６】Ｌｏｖｅら、Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ、２００５年１１月、２００５巻、３１２号、ページ  ｒｅｖｉｅｗ１３
【非特許文献１７】Ｄｅｎｔｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８年、３１９巻、５８６８号、１４０２ページ
【非特許文献１８】Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２００８年、４５１巻、７１８１号、９６４ページ
【非特許文献１９】Ｃｈａｌｋｌｅｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００９年、１０６巻、２２号、８８９４ページ
【非特許文献２０】Ｋｈｉｄｅｋｅｌら、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ、２００７年、３巻、６号、３３９ページ
【非特許文献２１】Ｔｅｏら、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ、２０１０年、６巻、５号、３３８ページ
【非特許文献２２】Ｆｕｊｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２００９年、４５９巻、７２４５号、４５５ページ
【非特許文献２３】Ｃｈｉｋａｎｉｓｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２０１０年、３９４巻、４号、８６５ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヒストンタンパク質と糖修飾との直接的な関係を明らかにし、これによりヒストンタンパク質における糖修飾を検出することを可能とする方法を提供することにある。さらなる本発明の目的は、ヒストンタンパク質の糖修飾を検出することが可能な抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、核内においてヒストン（ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４）がグリコシル化（Ｏ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化）されていること、特に、ヒストンＨ２ＢにおいてはＮ−アセチルグルコサミン化される部位が、９１番目のセリン残基、１１２番目のセリン残基、及び１２３番目のセリン残基であることを見出した。さらに、本発明者らは、ヒストンＨ２Ｂのグリコシル化された部位に結合する抗体を作製し、当該グリコシル化の機序につき更に研究を重ねた結果、このグリコシル化がＨＢＰを介した細胞外グルコース濃度に依存するものであり、このグリコシル化の亢進によって、ヒストンＨ２Ｂのユビキチン化やヒストンＨ３のメチル化が誘導され、ひいてはＰＧＫ１遺伝子等の転写を活性化させることをも見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）以下の（ａ）〜（ｂ）の工程を含む、ヒストンタンパク質のグリコシル化を検出するための方法
（ａ）ヒストンタンパク質を含む試料を調製する工程
（ｂ）前記試料において、グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する工程。
（２）以下の（ａ）〜（ｂ）の工程を含む、グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出することを特徴とする、血清グルコース量を評価するための方法
（ａ）ヒストンタンパク質を含む試料を調製する工程
（ｂ）前記試料において、グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する工程。
（３）以下の（ａ）〜（ｂ）の工程を含む、グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出することを特徴とする、メタボリックシンドロームを検査するための方法
（ａ）ヒストンタンパク質を含む試料を調製する工程
（ｂ）前記試料において、グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する工程。
（４）以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、メタボリックシンドロームに対する医薬品候補化合物をスクリーニングするための方法
（ａ）ヒストンタンパク質を含む試料を調製する工程
（ｂ）前記試料に被験化合物を接触させる工程
（ｃ）被験化合物を接触させた前記試料におけるグリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する工程
（ｄ）被験化合物を接触させない場合と比較して、（ｃ）で検出されたグリコシル化されたヒストンタンパク質の量を減少させる化合物を選択する工程。
（５）前記検出は、前記ヒストンタンパク質のグリコシル化された部位に結合する抗体を用いることを特徴とする、（１）〜（４）のうちのいずれかに記載の方法。
（６）前記グリコシル化がＮ−アセチルグルコサミン化である、（１）〜（５）のうちのいずれかに記載の方法。
（７）前記ヒストンタンパク質が、ヒストンＨ２Ａ及びヒストンＨ２Ｂからなる群から選択される少なくとも一のタンパク質である、（１）〜（６）のうちのいずれかに記載の方法。
（８）前記ヒストンタンパク質がヒストンＨ２Ｂであり、前記部位が、９１番目のセリン残基、１１２番目のセリン残基、及び１２３番目のセリン残基からなる群から選択される少なくとも一のセリン残基である、（１）〜（７）のうちのいずれかに記載の方法。
（９）前記グリコシル化がＮ−アセチルグルコサミン化であり、前記ヒストンタンパク質がヒストンＨ２Ｂであり、且つ前記部位が１１２番目のセリン残基である、（１）〜（８）のうちのいずれかに記載の方法。
（１０）ヒストンタンパク質のグリコシル化された部位に結合する抗体。
（１１）前記グリコシル化がＮ−アセチルグルコサミン化である、（１０）に記載の抗体。
（１２）前記ヒストンタンパク質が、ヒストンＨ２Ａ及びヒストンＨ２Ｂからなる群から選択される少なくとも一のタンパク質である、（１０）又は（１１）に記載の抗体。
（１３）前記ヒストンタンパク質がヒストンＨ２Ｂであり、前記部位が、９１番目のセリン残基、１１２番目のセリン残基、及び１２３番目のセリン残基からなる群から選択される少なくとも一のセリン残基である、（１０）〜（１２）のうちのいずれかに記載の抗体。
（１４）前記ヒストンタンパク質がヒストンＨ２Ｂであり、前記部位が１１２番目のセリン残基であり、且つ前記グリコシル化がＮ−アセチルグルコサミン化である、（１０）〜（１３）のうちのいずれかに記載の抗体。
（１５）（１０）〜（１４）のうちのいずれかに記載の抗体を有効成分とする、ヒストンコアのグリコシル化を検出するための薬剤。
（１６）（１０）〜（１４）のうちのいずれかに記載の抗体を有効成分とする、血清グルコース量を評価するための薬剤。
（１７）（１０）〜（１４）のうちのいずれかに記載の抗体を有効成分とする、メタボリックシンドロームを検査するための薬剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明において、ヒストンタンパク質がグリコシル化されること、および当該グリコシル化がされる部位が同定された。これによりヒストンタンパク質のグリコシル化を検出することが可能となり、ひいては、当該グリコシル化に関連する疾患の検査や治療薬の開発を行うことが可能となった。また、本発明の抗体の提供により、当該グリコシル化の検出や当該疾患の検査を簡便に行うことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＨｅｌａＳ３細胞由来クロマチンからのＮ−アセチルグルコサミン化糖タンパク質の精製スキーム、並びに、１ｇ／Ｌ（Ｌｏｗ）グルコース含有ＤＭＥＭ及び４．５ｇ／Ｌ（Ｈｉｇｈ）グルコース含有ＤＭＥＭにおいて培養したＨｅＬａＳ３細胞におけるＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン量をウェスタンブロッティング（ＷＢ）により分析した結果を示す概略図である。
【図２】ＷＧＡレクチン及びα−Ｏ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン（α−ＧｌｃＮＡｃ、ＲＬ２）抗体を用いた精製の結果を示す、銀染色を施したゲルの写真である。なお図中、「Ｉｎ」はクロマチン抽出物を示し、ＷＧＡの「Ｅ」はＷＧＡレクチンアガロースカラムからの溶出画分を示し、ＷＧＡの「Ｒ」はＷＧＡレクチンアガロースカラムの残留画分を示す。また、ＩｇＧ１はα−ＧｌｃＮＡｃに対する陰性対照であり、ＩｇＧ１及びα−ＧｌｃＮＡｃにおける♯１、♯２、及び♯３は、各々各抗体を用いて精製した際の１回目（ＧｌｃＮＡｃ−Ｏ−Ｓｅｒと共に溶出）、２回目（ＧｌｃＮＡｃ−Ｏ−Ｓｅｒと共に溶出）、及び３回目（酸性条件で溶出）の溶出画分を示す。
【図３】精製されたＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン糖タンパク質をＤＡＶＩＤバイオインフォマティクスデータベースを用いて機能別に分類した結果を示す円グラフである。
【図４】精製されたＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン糖タンパク質をウェスタンブロッティングにより分析した結果を示す写真である。
【図５】組み換えＯＧＴタンパク質（ｒｅｃ．ＯＧＴ）精製の結果を示す、ＣＢＢ染色を施したゲルの写真である。図５中、矢印はＯＧＴタンパク質を指し示す。
【図６】組み換えヒストンタンパク質を用いたインビトロＯＧＴ分析の結果を示す写真である。図６中の上段は、ＵＤＰ−［３Ｈ−］ＧｌｃＮＡｃ及び組み換えＯＧＴによって放射性標識化（Ｎ−アセチルグルコサミン化）された各組み換えヒストンタンパク質を検出したオートラジオグラフィー（Ａｕｔｏ）を示し、下段は各組み換えヒストンタンパク質を検出した、ＣＢＢ染色が施されたゲルの写真（ＣＢＢ）を示す。
【図７】組み換えＭＬＬ５タンパク質を用いたインビトロＯＧＴ分析の結果を示す写真である。図７中の左側は、ＵＤＰ−［３Ｈ−］ＧｌｃＮＡｃ及び組み換えＯＧＴによって放射性標識化（Ｎ−アセチルグルコサミン化）されたＭＬＬ５を検出したオートラジオグラフィー（Ａｕｔｏ）を示し、右側はＭＬＬ５を検出した、ＣＢＢ染色が施されたゲルの写真（ＣＢＢ）を示す。
【図８】インビトロにおいて再構成したヒストン８量体を用いたインビトロＯＧＴ分析の結果を示す写真である。図６中の上段は、ＵＤＰ−［３Ｈ−］ＧｌｃＮＡｃ及び組み換えＯＧＴ（ｒｅｃ．ＯＧＴ）によって放射性標識化（Ｎ−アセチルグルコサミン化）された組み換えヒストンＨ２Ｂを検出したオートラジオグラフィー（Ａｕｔｏ）を示し、下段は各組み換えヒストンタンパク質を検出した、ＣＢＢ染色が施されたゲルの写真（ＣＢＢ）を示す。
【図９】Ｈｅｌａ細胞（Ｈｕｍａｎ）及びショウジョウバエ（Ｆｌｙ）由来のヒストン８量体のＮ−アセチルグルコサミン化のインビトロＯＧＴ分析の結果を示す写真である。図９中の上段は、ＵＤＰ−［３Ｈ−］ＧｌｃＮＡｃ及び組み換えＯＧＴによって放射性標識化（Ｎ−アセチルグルコサミン化）された組み換えヒストンＨ２Ｂを検出したオートラジオグラフィー（Ａｕｔｏ）を示し、下段は各組み換えヒストンタンパク質を検出した、ＣＢＢ染色が施されたゲルの写真（ＣＢＢ）を示す。
【図１０】インビトロでＮ−アセチルグルコサミン化したヒストン８量体（０．５μｇ）をトリプシンで消化し、ＷＧＡレクチン結合磁性ビーズである程度濃縮して、上清（第一及び第三カラム）及び溶出液（第二及び第四カラム）をＬＣ−ＥＴＤ−ＭＳ／ＭＳに供した、ヒストン８量体におけるＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミンの識別過程の概略図である。
【図１１】Ｎ−アセチルグルコサミン化ペプチドのＥＴＤ−ＭＳ／ＭＳスキャン（２３４９．４３ｍ／ｚ）の結果を示す、スペクトル図である。なお、図中に示したアミノ酸の番号は最初のメチオニンから数えたアミノ酸の番号である。
【図１２】Ｎ−アセチルグルコサミン化ペプチドのＥＴＤ−ＭＳ／ＭＳスキャン（ｍ／ｚ７３１．６０８０（３＋））の結果、すなわちモノＧｌｃＮＡｃが９１番目のセリンを介して結合しているＨ２Ｂの７８〜９４アミノ酸からなるペプチドを示すスペクトル図である。なお、図中に示したアミノ酸の番号は最初のメチオニンから数えたアミノ酸の番号である。
【図１３】Ｎ−アセチルグルコサミン化ペプチドのＥＴＤ−ＭＳ／ＭＳスキャン（ｍ／ｚ５８８．０６２０（４＋））の結果、すなわちモノＧｌｃＮＡｃが１１２番目のセリンを介して結合しているＨ２Ｂの９５〜１１４アミノ酸からなるペプチドを示すスペクトル図である。なお、図中に示したアミノ酸の番号は最初のメチオニンから数えたアミノ酸の番号である。
【図１４】Ｎ−アセチルグルコサミン化ペプチドのＥＴＤ−ＭＳ／ＭＳスキャン（ｍ／ｚ４９１．９０９０（３＋））の結果、すなわちモノＧｌｃＮＡｃが１２３番目のセリンを介して結合しているＨ２Ｂの１１５〜１２６アミノ酸からなるペプチドを示すスペクトル図である。なお、図中に示したアミノ酸の番号は最初のメチオニンから数えたアミノ酸の番号である。
【図１５】インビトロＮ−アセチルグルコサミン化Ｈ２Ｂの定量的ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すスペクトル図である。
【図１６】表１に記載のＨ２Ｂペプチドライブラリーを用いたＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミンサイトのスキャン結果を示す。なお、図１６中上段は、Ｈ２Ｂペプチドにおける位置を示しており、下段において、縦軸は類似するＡｌａ変異体（ｍｕｔａｎｔ）のコントロールペプチドを基準として標準化した量を示す。
【図１７】インビトロＮ−アセチルグルコサミン化Ｈ２Ｂ部分ペプチド（１０１〜１１５アミノ酸）の定量的ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すスペクトル図である。
【図１８】インビトロＮ−アセチルグルコサミン化Ｈ２Ｂ部分ペプチド（１１１〜１２５アミノ酸）の定量的ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示すスペクトル図である。
【図１９】インビボＯＧＴ分析に用いた組み換えＨ２Ｂ変異体を示す図である。
【図２０】Ｎ末端尾部（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔａｉｌ）が欠損しているアフリカツメガエル由来のＨ２Ｂ組み換え欠失体（Ｈ２Ｂ△（デルタ）Ｎ）を用いたインビボＯＧＴ分析の結果を示す。図２０中の上段は、ＵＤＰ−［３Ｈ−］ＧｌｃＮＡｃ及び組み換えＯＧＴによって放射性標識化（Ｎ−アセチルグルコサミン化）された各ヒストンＨ２Ｂを検出したオートラジオグラフィー（Ａｕｔｏ）を示し、下段は各ヒストンＨ２Ｂを検出した、ＣＢＢ染色が施されたゲルの写真（ＣＢＢ）を示す。
【図２１】セリン／スレオニンをアラニンに置換したヒト由来のＨ２Ｂ組み換え変異体を用いたインビボＯＧＴ分析の結果を示す。図２１中の上段は、ＵＤＰ−［３Ｈ−］ＧｌｃＮＡｃ及び組み換えＯＧＴによって放射性標識化（Ｎ−アセチルグルコサミン化）された各ヒストンＨ２Ｂを検出したオートラジオグラフィー（Ａｕｔｏ）を示し、下段は各ヒストンＨ２Ｂを検出した、ＣＢＢ染色が施されたゲルの写真（ＣＢＢ）を示す。
【図２２】セリン／スレオニンをアラニンに置換したヒト由来のＨ２Ｂ組み換え変異体を用いたを用いたインビボＯＧＴ分析の結果を示す。図２２中の上段は、ＵＤＰ−［３Ｈ−］ＧｌｃＮＡｃ及び組み換えＯＧＴによって放射性標識化（Ｎ−アセチルグルコサミン化）された各ヒストンＨ２Ｂを検出したオートラジオグラフィー（Ａｕｔｏ）を示し、下段は各ヒストンＨ２Ｂを検出した、ＣＢＢ染色が施されたゲルの写真（ＣＢＢ）を示す。
【図２３】Ｈ２ＢのＣ末端のαへリックス（αＣ）のアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。図２３中、黒色でラベルした「S」（１１２番目及び１２３番目のセリン残基）はＮ−アセチルグルコサミン化サイトを示し、ラベルした「K」（１２０番目のリシン残基）はユビキチン化サイトを示す。
【図２４】ヌクレオソームにおけるＨ２ＢのＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミンサイト及びユビキチン化サイトの位置を示すヌクレオソームの構造図である。なお図２４中の白色のリボンはαＣへリックスを示す。
【図２５】抗原として用いた、１１２番目のセリンがＮ−アセチルグルコサミンされたヒストンＨ２Ｂの部分ペプチド（配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド）を示す図である。
【図２６】ＥＬＩＳＡによる、α−Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ抗体（抗ヒストンＨ２Ｂ  Ｓｅｒ１１２  ＧｌｃＮＡｃ  抗体）の評価の結果を示すグラフである。なお、陰性対照にはＮ−アセチルグルコサミン化されていないヒストンＨ２Ｂの部分ペプチド（ＣＫＨＡＶＳＥＧＴＫ）を用いた。
【図２７】インビトロでＮ−アセチルグルコサミン化したヒストンＨ２Ｂ及びヒストンＨ２Ａ（各々０．５μｇ）を用いたウェスタンブロッティング解析による結果を示す写真である。
【図２８】ＨｅＬａ細胞に由来するクロマチン抽出物についてα−Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ抗体を用いたウェスタンブロッティング解析による結果を示す写真である。矢印はヒストンＨ２Ｂタンパク質を示し、アスタリスクは非特異的バンドを示す。
【図２９】グルコース刺激後のヒストンＨ２ＢにおけるＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化及びユビキチン化の経時変化をウェスタンブロッティングにより分析した結果を示す写真である。
【図３０】グルコース刺激後のヒストンＨ２ＢにおけるＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化及びユビキチン化の経時変化を解析した結果を示すグラフである。なお、ウェスタンブロッティングのバンドの強度はＩｍａｇｅＪプログラムにより定量した。
【図３１】ＯＧＴに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＯＧＴ）の配列、及び組み換えレトロウィルスの構造、並びに組み換えレトロウィルスの感染及び選択を示す、概略図である。
【図３２】ｓｈＲＮＡによるＯＧＴノックダウンの効率をウェスタンブロッティングによって分析した結果を示す写真である。なお、陰性対照としてルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＬｕｃ）を用いた。
【図３３】Ｈ２ＢのＮ−アセチルグルコサミン化のグルコース依存性アップレギュレーションに対する、ＯＧＴノックダウンの影響をウェスタンブロッティングにより分析した結果を示す写真である。
【図３４】ＨｅＬａ細胞におけるＨ２ＢのＮ−アセチルグルコサミン化及びユビキチン化のグルコース依存性アップレギュレーションに対する、ＯＧＴノックダウンの影響をウェスタンブロッティングにより分析した結果を示す写真である。
【図３５】グルコース非含有（Ｃｏｎｔ．）、１ｍＭ  ピルビン酸（Ｐｙｒ）、１０ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ、若しくは４．５ｇ／Ｌ−グルコース（Ｇｌｃ）含有ＤＭＥＭ、又は４．５ｇ／Ｌ−グルコース（Ｇｌｃ）含有ＤＭＥＭ及び／又はＨＢＰ阻害剤（６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−Ｌ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ（１００Ｍ、ＤＯＮ）若しくはａｚａｓｅｒｉｎｅ（１００Ｍ、ＡＺＡ））含有ＤＭＥＭを用いて培養したＨｅＬａ細胞におけるＨ２ＢのＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン量をウェスタンブロッティングにより分析した結果を示す写真である。
【図３６】ＨｅＬａ細胞におけるＨ２ＢのＮ−アセチルグルコサミン化及びユビキチン化のグルコース依存性アップレギュレーションに対する、Ｈ２ＢのＡＡ変異（Ｎ−アセチルグルコサミン化に必須のアミノ酸（Ｓ１１２及びＴ１２２）をアラニンに置換したヒストンＨ２Ｂ）をウェスタンブロッティングにより分析した結果を示す写真である。
【図３７】ヒストンＨ２Ｂ（ＷＴ）又はＨ２ＢのＡＡ変異と、ＢＲＥ１Ａとの相互作用を共免疫沈降法及びウェスタンブロッティングにより分析した結果を示す写真である。
【図３８】ヒストンＨ２Ｂ（ＷＴ）とＢＲＥ１Ａとのグルコース依存的な相互作用を共免疫沈降法及びウェスタンブロッティングにより分析した結果を示す写真である。なお、図中「ｃｏｎｔ．」はグルコース枯渇条件下での結果を示し、「Ｇｌｃ」はグルコース添加条件下での結果を示す。
【図３９】組み換えユビキチンリガーゼ（ｒｅｃ．Ｅ１、ｒｅｃ．ＲＡＤ６Ａ、ｒｅｃ．ＢＲＥ１Ａ／１Ｂ  複合体）の精製の結果を示す、ＣＢＢ染色が施されたゲルの写真を示す。矢印は各々所望の組み換えユビキチンリガーゼを指し示す。
【図４０】Ｈ２Ｂと、組み換えＥ１−ＲＡＤ６Ａ−ＢＲＥ１Ａ／１Ｂユビキチンリガーゼとを用いたインビトロユビキチン化アッセイをウェスタンブロッティングにより分析した結果を示す写真（中段及び下段）、並びにそれを数値化したグラフ（上段）を示す。
【図４１】Ｎ−アセチルグルコサミン化Ｈ２Ｂを用いたインビトロユビキチン化アッセイを、α−Ｈ２Ｂ−Ｋ１２０−ｕｂ及びα−Ｈ２Ｂ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した結果を示す写真（中段及び下段）、並びにそれを数値化したグラフ（上段）を示す。
【図４２】ｓｘｃ／ｏｇｔの機能欠失型変異型を有する系統のハエ（ｓｘｃ１）又は野生型ハエ（＋／＋）と、Ｉｎ（１）Ｗｍ４ｈ系統のハエとを交配させ、ＰＥＶ（班入り位置効果）におけるヒストン修飾を、交配で得られた子孫の眼の色の領域によって解析した結果を示す、ハエの複眼の写真である。
【図４３】図４２に示した各ハエの複眼における波長４８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定した結果を示すグラフである。なお、３回の独立した測定によって得られた平均値を標準誤差とともに示す。
【図４４】ハエの野生型多糸染色体を、ＤＡＰＩ、α−Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ抗体、又はα−Ｈ３Ｋ４ｍｅ２抗体（抗ヒストンＨ３の４番目のジメチル化リシン抗体）により免疫染色した結果を示す顕微鏡写真である。図中緑色に発光している部分はα−Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ抗体により染色された部分を示し、図中赤色に発光している部分はα−Ｈ３Ｋ４ｍｅ２抗体により染色された部分を示し、図中青色に発光している部分はＤＡＰＩにより染色された部分を示す。また「Ｍｅｒｇｅ」はこれら染色写真を重ね合わせたものである。なお、ヒストンＨ３の４番目のジメチル化リシンは転写活性型クロマチン領域のマーカーであり、ＤＡＰＩはＤＮＡを染色する。
【図４５】図４４に示したハエの野生型多糸染色体の一部を拡大して観察した結果を示す顕微鏡写真である。また「Ｍｅｒｇｅ［ＤＡＰＩ（−）］」は、α−Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ抗体による免疫染色の写真と、α−Ｈ３Ｋ４ｍｅ２抗体による免疫染色の写真とを重ね合わせたものである。
【図４６】ハエの野生型多糸染色体を、ＤＡＰＩ、α−Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ抗体、又はα−Ｈ３Ｋ９ｍｅ２抗体（抗ヒストンＨ３の９番目のジメチル化リシン抗体）により免疫染色した結果を示す顕微鏡写真である。図中緑色に発光している部分はα−Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ抗体により染色された部分を示し、図中赤色に発光している部分はα−Ｈ３Ｋ９ｍｅ２抗体により染色された部分を示し、図中青色に発光している部分はＤＡＰＩにより染色された部分を示す。また「Ｍｅｒｇｅ」はこれら染色写真を重ね合わせたものである。なお、ヒストンＨ３の９番目のジメチル化リシンは転写抑制型クロマチン領域のマーカーであり、ＤＡＰＩはＤＮＡを染色する。
【図４７】図４６に示したハエの野生型多糸染色体の一部を拡大して観察した結果を示す顕微鏡写真である。また「Ｍｅｒｇｅ［ＤＡＰＩ（−）］」は、α−Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ抗体による免疫染色の写真と、α−Ｈ３Ｋ９ｍｅ２抗体による免疫染色の写真とを重ね合わせたものである。
【図４８】ＤＡＰＩ又はα−Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ抗体を用いた免疫染色によるＮ−アセチルグルコサミン化Ｈ２Ｂの細胞内分布の解析結果を示す顕微鏡写真である。「Ｍｅｒｇｅ」はＤＡＰＩによる染色写真とα−Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ抗体による染色写真とを重ね合わせたものである。
【図４９】Ｎ−アセチルグルコサミン化Ｈ２Ｂサイトのゲノムワイド分布解析の結果を示す円グラフである。
【図５０】ＨｅＬａ細胞から得た全ＲＮＡを用いてマイクロアレイにより解析した、Ｎ−アセチルグルコサミン化Ｈ２Ｂサイトと各遺伝子における転写活性との相関を示すグラフである。
【図５１】ＴＳＳ（転写開始位置）及びＴＴＳ（転写終了位置）の近傍、又はＣｈＩＰ領域の遺伝子全体における平均プロファイルを示すグラフである。
【図５２】Ｈ２ＢのＮ−アセチルグルコサミン化サイトにおける転写因子（ＨＮＦ４）結合部位を示す図である。なお、表記はＴＲＡＮＳＦＡＣライブラリによる。
【図５３】Ｈ２ＢのＮ−アセチルグルコサミン化サイトにおける転写因子（ＣＯＵＰＴＦ）結合部位を示す図である。なお、表記はＴＲＡＮＳＦＡＣライブラリによる。
【図５４】グルコース応答性遺伝子であるＰＧＫ１のプロモーター領域を用いたＣｈＩＰ−ｓｅｑ及びｑＰＣＲによる解析結果を示すグラフである。なお、図中上部にはＰＧＫ１のプロモーター領域、及び解析に用いたプライマーセットの位置を示した。また、ＣｈＩＰ（クロマチン免疫沈降法）は、α−Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ抗体、α−Ｈ３Ｋ４ｍｅ３抗体（抗ヒストンＨ３４番目のトリメチル化リシン抗体）、α−Ｈ２ＢＫ１２０Ｕｂ抗体、及びα−ＡｃＨ３抗体（抗アセチル化ヒストンＨ３抗体）、並びにα−Ｈ２Ｂ抗体及びα−Ｈ３抗体を用いて行った。図中各グラフの縦軸は、各領域のヒストンＨ２Ｂ又はヒストンＨ３におけるグリコシル化、ユビキチン化、又はアセチル化されているヒストンタンパク質の割合を示す。また、図中黒い棒グラフはグルコース刺激後（Ｇｌｃ）の各ヒストン修飾の割合を示し、白い棒グラフはグルコース刺激前（Ｃｏｎｔ．）の各ヒストン修飾の割合を示す。
【図５５】Ｏ−ＧｌｃＮＡｃシグナル伝達過程における、Ｎ−アセチルグルコサミン化Ｈ２Ｂの機能についての概略図である。グルコースは解糖経路から分岐したＨＢＰ（ヘキサミン生合成経路）によってＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに代謝される。ＯＧＴ活性はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの細胞内濃度に依存しているため、Ｈ２ＢのＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾の程度は細胞外グルコースを反映している。Ｎ−アセチルグルコサミン化Ｈ２Ｂは、隣接したアミノ酸残基１２０番目のリシンのユビキチン化を行うＢＲＥ１複合体の標的となる。１１２番目のセリンのＯ−ＧｌｃＮＡｃ修飾と１２０番目のリシンのユビキチン化との間の、Ｈ２ＢのＣ末端のαへリックスにおいて同時に生じる活性化は、転写開始に必要なＨ３Ｋ４メチル化といった連続的な修飾反応の引き金となる。これらシグナル伝達過程の概念を図示した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜ヒストンタンパク質のグリコシル化を検出するための方法＞
本発明のヒストンタンパク質のグリコシル化を検出するための方法は、以下の（ａ）〜（ｂ）の工程を含む、
（ａ）ヒストンタンパク質を含む試料を調製する工程
（ｂ）前記試料において、グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する工程
方法である。
【００１４】
本発明において「ヒストンタンパク質」とは、クロマチンの基本単位であるヌクレオソームを構成するコアヒストンタンパク質（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４）及びリンカーヒストンタンパク質（Ｈ１）のことをいう。本発明におけるヒストンタンパク質にはこれらのバリアント、例えばＨ２ＡＸ、Ｈ２ＡＺも含まれる。
【００１５】
本発明における「グリコシル化」とは、ヒストンに対する糖鎖修飾のことをいう。糖鎖を構成する糖の種類は特に限定されることなく、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、キシロースが挙げられる。また、修飾は特に限定されることなく、例えば、ヒストン中のセリン又はスレオニン残基に糖鎖を付加するＯ結合型グリコシル化、およびヒストン中のアスパラギン残基に糖鎖を付加するＮ結合型グリコシル化が挙げられる。
【００１６】
また、本発明において用いられる「試料」としては特に制限されることなく、例えば、細胞、組織、これらからのヒストンタンパク質を含む抽出物、または、精製または粗精製のヒストンタンパク質が挙げられる。ヒストンタンパク質を含む抽出物、または、精製または粗精製のヒストンタンパク質の調製は、公知の方法を適宜採択することにより行うことができる。例えば、後述の実施例＜Ｎ−アセチルグルコサミン化糖タンパク質の生化学的精製及び同定＞に記載の方法を挙げることができる。
【００１７】
本発明における「グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する」方法としては、前記「ヒストンタンパク質を含む試料を調製する」工程にて調製された試料における、グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出することができる方法であれば良く、公知の方法を適宜採択することができる。例えば、後述の実施例＜インビトロＮ−アセチルグルコサミン化分析（質量分析）＞に記載のような質量分析を用いた方法や、＜インビトロＮ−アセチルグルコサミン化分析（ウェスタンブロッティング解析）＞に記載のような糖鎖を構成する糖又はグリコシル化された部位に結合する抗体を用いたウェスタンブロッティングを用いた方法や、これら抗体を用いた免疫沈降法や、後述の実施例＜インビトロＮ−アセチルグルコサミン化分析（オートラジオグラフィー解析）＞に示すような、オートラジオグラフィーによりグリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する方法が挙げられる。これらの中では、検出の特異性及び簡便性の観点から、糖鎖を構成する糖又はグリコシル化された部位に結合する抗体を用いた方法であることがより好ましい。さらに、糖鎖を構成する糖に結合する抗体よりも、高い特異性をもって検出することが可能であり、またグリコシル化された部位における立体障害等の影響を受けにくいという観点から、ヒストンタンパク質のグリコシル化された部位に結合する抗体を用いる方法であることが好ましい。
【００１８】
検出されるヒストンタンパク質のグリコシル化としては特に制限されることはないが、Ｎ−アセチルグルコサミン化であることが好ましい。さらに、検出されるグリコシル化されたヒストンタンパク質としては特に制限されることはないが、グリコシル化されたヒストンＨ２Ａ及び／又はヒストンＨ２Ｂであることが好ましい。
【００１９】
検出されるグリコシル化されたヒストンタンパク質がヒストンＨ２Ｂである場合は、９１番目のセリン残基、１１２番目のセリン残基、及び１２３番目のセリン残基からなる群から選択される少なくとも一のセリン残基がグリコシル化されたヒストンＨ２Ｂであることが好ましく、１１２番目のセリン残基がＮ−アセチルグルコサミン化されたヒストンＨ２Ｂであることがより好ましい。
【００２０】
＜血清グルコース量を評価するための方法＞
後述の実施例において示すように、グリコシル化されたヒストンタンパク質の量は、ヘキソサミン生合成経路（ＨＢＰ)を介した細胞外グルコース濃度に依存していることから、ヒストンタンパク質のグリコシル化は血清グルコース量を検出するための指標となる。従って、本発明は、以下の（ａ）〜（ｂ）の工程を含む、グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出することを特徴とする、血清グルコース量を評価するための方法を提供する
（ａ）ヒストンタンパク質を含む試料を調製する工程
（ｂ）前記試料において、グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する工程。
【００２１】
本発明において「血清グルコース量」とは、血液中のグルコース量又は濃度を意味し、血糖値や血漿グルコース量をも包含している概念である。
【００２２】
検出対象とする「グリコシル化されたヒストンタンパク質」としては、ＨＢＰを介した細胞外グルコース濃度に依存してグリコシル化が亢進されるヒストンタンパク質であれば特に制限されることはないが、１型（インスリン依存性）糖尿病と発現異常（亢進）との関連が明らかになっているという観点から（「Ｆｏｌｌｉら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１０年３月２９日、５巻、３号、ｅ９９２３」及び「Ｓｕｈａｉｌら、Ｉｎｄｉａｎ  Ｌ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ、１９９０年２月、９２巻、２１〜２３ページ」参照）、ホスホグリセリン酸塩キナーゼ１（ＰＧＫ１）遺伝子由来のグリコシル化されたヒストンタンパク質であることが好ましい。
【００２３】
なお、「試料」、「ヒストンタンパク質を含む試料を調製する方法」、並びに「グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する方法」は、前記＜ヒストンタンパク質のグリコシル化を検出するための方法＞と同様である。
【００２４】
＜メタボリックシンドロームを検査するための方法＞
前述の通り、グリコシル化されたヒストンタンパク質の量は血清グルコース量を反映していることから、ヒストンタンパク質のグリコシル化を指標として、メタボリックシンドロームの検査を行うことが可能である。従って、本発明は、以下の（ａ）〜（ｂ）の工程を含む、グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出することを特徴とする、メタボリックシンドロームを検査するための方法をも提供する
（ａ）ヒストンタンパク質を含む試料を調製する工程
（ｂ）前記試料において、グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する工程。
【００２５】
本発明における「メタボリックシンドローム」とは、血清グルコース量の亢進に起因する疾患や症状であればよく、例えば、高血糖、高脂血症、高血圧、糖尿病（１型及び２型糖尿病）、動脈硬化、脳梗塞、脳卒中、心筋梗塞、心不全が挙げられる。
【００２６】
「試料」、「ヒストンタンパク質を含む試料を調製する方法」、「グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する方法」、並びに検出対象とする「グリコシル化されたヒストンタンパク質」は、前記＜ヒストンタンパク質のグリコシル化を検出するための方法＞及び＜血清グルコース量を評価するための方法＞と同様である。
【００２７】
本方法による検出の結果、グリコシル化されたヒストンタンパク質の量が対照（例えば、健常者におけるその量）よりも多い場合は、被験者は、メタボリックシンドロームに罹患している、又はその疑いがあると評価することができる。
【００２８】
＜メタボリックシンドロームに対する医薬品候補化合物をスクリーニングするための方法＞
前述の通り、グリコシル化されたヒストンタンパク質の量は血清グルコース量を反映していることから、ヒストンタンパク質のグリコシル化を指標として、メタボリックシンドロームに対する医薬開発を行うことが可能である。従って、本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、メタボリックシンドロームに対する医薬品候補化合物をスクリーニングするための方法をも提供する
（ａ）ヒストンタンパク質を含む試料を調製する工程
（ｂ）前記試料に被験化合物を接触させる工程
（ｃ）被験化合物を接触させた前記試料におけるグリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する工程
（ｄ）被験化合物を接触させない場合と比較して、（ｃ）で検出されたグリコシル化されたヒストンタンパク質の量を減少させる化合物を選択する工程。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法において、ヒストンタンパク質を含む試料に接触させる「被験化合物」としては特に制限されることはなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。
【００３０】
「試料」、「ヒストンタンパク質を含む試料を調製する方法」、「グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する方法」、検出対象とする「グリコシル化されたヒストンタンパク質」、並びに「メタボリックシンドローム」は、前記＜ヒストンタンパク質のグリコシル化を検出するための方法＞、＜血清グルコース量を評価するための方法＞、及び＜メタボリックシンドロームを検査するための方法＞と同様である。
【００３１】
なお、後述の実施例において示すように、グリコシル化されたヒストンタンパク質の量は、ヘキソサミン生合成経路（ＨＢＰ)を介した細胞外グルコース濃度を反映していることから、この量の減少は、細胞外グルコース濃度の上昇に伴うシグナル伝達の活性化が抑制されていることを意味する。また、後述の実施例において示すように、ヒストンタンパク質のグリコシル化は、糖尿病の一因とされているＰＧＫ１遺伝子等の転写を活性化することから、グリコシル化されたヒストンタンパク質の量の減少すれば、細胞外グルコース濃度の上昇に伴い異常となった遺伝子又はタンパク質の発現の正常化がもたらされ得る。
【００３２】
従って、検出の結果、被験化合物を接触させない場合と比較して、（ｃ）で検出されたグリコシル化されたヒストンタンパク質の量が減少している場合は、その被験化合物をメタボリックシンドロームに対する医薬品候補化合物として選択することができる。
【００３３】
＜ヒストンタンパク質のグリコシル化された部位に結合する抗体＞
本発明は、ヒストンタンパク質のグリコシル化された部位に結合する抗体を提供する。本発明の抗体による検出対象となる「グリコシル化」としては特に制限されることはないが、Ｎ−アセチルグルコサミン化であることが好ましい。さらに「ヒストンタンパク質」としては特に制限されることはないが、ヒストンＨ２Ａ及び／又はヒストンＨ２Ｂであることが好ましい。また、グリコシル化されたヒストンタンパク質がヒストンＨ２Ｂである場合は、ヒストンＨ２Ｂの、９１番目のセリン残基、１１２番目のセリン残基、及び１２３番目のセリン残基からなる群から選択される少なくとも一のセリン残基がグリコシル化された部位であることが好ましく、ヒストンＨ２Ｂの１１２番目のセリン残基がＮ−アセチルグルコサミン化された部位であることがより好ましい。
【００３４】
本発明の「抗体」としては、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、さらに抗体の機能的断片であってもよい。また、「抗体」には、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラスが含まれる。「ポリクローナル抗体」は、異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物である。また、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味する。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を認識するものである。本発明の抗体は、自然環境の成分から分離され、および／または回収された（即ち、単離された）抗体である。本発明において抗体の「機能的断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、標的蛋白質を特異的に認識するものを意味する。具体的には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、およびこれらの重合体などが挙げられる。
【００３５】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（標的グリコシル化ヒストンタンパク質、その部分グリコシル化ペプチド、またはこれらを発現する細胞など）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法や組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
【００３６】
ハイブリドーマ法としては、代表的には、コーラーおよびミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原（標的グリコシル化ヒストンタンパク質、その部分グリコシル化ペプチド、またはこれらを発現する細胞など）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球などである。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞またはリンパ球などに対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞およびミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、標的蛋白質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。標的蛋白質に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
【００３７】
組換えＤＮＡ法は、上記本発明の抗体またはペプチドをコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、本発明の抗体を組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ  Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７−７７５（１９９０））。本発明の抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報参照）。本発明の抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内または培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタなど）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
【００３８】
本発明の抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域およびＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ，１０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２１：３４５−３５１（２００８））。
【００３９】
改変されるアミノ酸数は、好ましくは、１０アミノ酸以内、より好ましくは５アミノ酸以内、最も好ましくは３アミノ酸以内（例えば、２アミノ酸以内、１アミノ酸）である。アミノ酸の改変は、好ましくは、保存的な置換である。本発明において「保存的な置換」とは、化学的に同様な側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換することを意味する。化学的に同様なアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られている。例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）、中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。アミノ酸配列変異体は、抗原への結合活性が対照抗体（例えば、本実施例に記載の抗体  α−Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ抗体）と同等であることが好ましい。抗原への結合活性は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、免疫染色法により評価することができる。
【００４０】
＜グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する薬剤、血清グルコース量を評価するための薬剤、及びメタボリックシンドロームを検査するための薬剤＞
前述の通り、かかるヒストンタンパク質のグリコシル化された部位に結合する抗体は、前記本発明のヒストンタンパク質のグリコシル化を検出するための方法、血清グルコース量を評価するための方法、及びメタボリックシンドロームに対する医薬品候補化合物をスクリーニングするための方法おける「グリコシル化されたヒストンタンパク質の検出」に好適に用いることができる。従って、本発明は、上記本発明の抗体を有効成分とする、グリコシル化されたヒストンタンパク質を検出する薬剤、血清グルコース量を評価するための薬剤、及びメタボリックシンドロームを検査するための薬剤を提供する。
【００４１】
本発明の薬剤の有効成分とする抗体としては、標識物質を結合させた抗体を使用することができる。当該標識を検出することにより、標的蛋白質に結合した抗体量を直接測定することが可能である。標識物質としては、抗体に結合することができ、化学的又は光学的方法に検出できるものであれば特に制限されることはなく、例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、アルカリホスファターゼ、ビオチン、及び放射性物質などが挙げられる。
【００４２】
また、標識物質を結合させた抗体を用いて標的蛋白質に結合した抗体量を直接測定する方法以外に、標識物質を結合させた二次抗体を利用する方法や二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用する方法などの間接的検出方法を利用することもできる。ここで「二次抗体」とは、上記本発明の抗体に特異的な結合性を示す抗体である。例えば、上記本発明の抗体をウサギ抗体として調製した場合には、二次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体を使用することができる。ウサギ、ヤギ、マウスなどの様々な生物種に由来する抗体に対して、使用可能な標識二次抗体が市販されており、本発明の抗体の由来する生物種に応じて、適切な二次抗体を選択し、本発明において使用することができる。二次抗体に代えて、標識物質を結合させたプロテインＧやプロテインＡなどを用いることも可能である。
【００４３】
さらに、本発明の薬剤は、抗体成分の他、組成物として許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩、などが挙げられる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
【００４４】
また、上記本発明の薬剤の他、標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、あるいは試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を組み合わせることができ、グリコシル化されたヒストンタンパク質の検出用キット等とすることもできる。また、標識されていない抗体を抗体標品とした場合には、当該抗体に結合する物質（例えば、二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡなど）を標識化したものを組み合わせることができる。さらに、グリコシル化されたヒストンタンパク質の検出用キット等には、当該キットの使用説明書を含めることができる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、各実施例は下記に記す方法に従って行った。
【００４６】
＜細胞の調製方法＞
ＨｅＬａ細胞は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで維持して以下の遺伝子導入等に供した。
【００４７】
ＦＬＡＧタグ配列を結合させたＨ２Ｂ又はその変異体を安定的に発現する細胞を調製するために、先ずは５’末端にＦＬＡＧタグ配列を結合させたＨ２ＢのｃＤＮＡ、及びその変異体をｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローニングした。Ｈ２Ｂ部分変異体のシリーズはｐＥＴ３ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、基本的な変異体作製方法に従って作製した。そして、ＨｅＬａ細胞にＦＬＡＧタグ結合Ｈ２Ｂ又は変異Ｈ２ＢをコードするｐｃＤＮＡベクターを導入し、これらのベクターを各々含む細胞を０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８の条件下で培養することで選別した。
【００４８】
また、ＯＧＴをノックダウンさせた細胞を調製するために、先ずｈＯＧＴをターゲットとしたｓｈＲＮＡ配列（５’−ＧＣＡＣＡＴＡＧＣＡＡＴＣＴＧＧＣＴＴＣＣ−３’：配列番号１）及びＲｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃをターゲットとしたｓｈＲＮＡ配列（５’−ＴＧＣＧＴＴＧＣＴＡＧＴＡＣＣＡＡＣ−３’
：配列番号２、非ターゲットコントロール）を、各々ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ−ＺｓＧｒｅｅｎベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に挿入した。さらに、レトロウイルス産生のため、構築したｓｈＲＮＡベクターをリポフェクトアミン２０００溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＰＬＡＴ−Ａ細胞に導入した。導入から２４時間後に培養培地を１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル）培地に交換し、次いで２４時間細胞を培養した。そして、ウイルスを含む培地の上清を感染に用いた。なお、感染、感染細胞の選別等は、非特許文献２２に記載の方法に従って行った。すなわち、レトロウイルス感染によってＯＧＴ−ＫＤ（ノックダウン）細胞を作成するために、６０ｍｍの培養ディッシュに１０６個の細胞を播種し、３ｍｌのレトロウイルスカクテル（１ｍｌ：調製したレトロウイルス溶液、２ｍｌ：１０％ＦＢＳ及び８ｇ／ｍＬポリブレンを含有するＤＭＥＭ培地）を用いて処理し、さらに４８時間培養した。そして、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（ＢＤ社製）分類装置を用いて、レトロウイルスに感染したｅＧＦＰ陽性の細胞を分離した。また、発現量及びノックダウンの効率は免疫ブロット及び免疫蛍光染色により確認した。
【００４９】
また、核内におけるＮ−アセチルグルコサミン化の量をコントロールするために、先ずは４．５ｇ／Ｌ  グルコース含有培地で培養し（１５分〜２４時間）、次いで、グルコースを含有しないＤＭＥＭ培地により２４時間グルコースを枯渇させることで細胞に刺激を与え、適宜次の実験に供した。
【００５０】
＜モノクローナル抗体の作製方法＞
１１２番目のセリンがＮ−アセチルグルコサミン化されたヒストンＨ２Ｂの部分ペプチド［ＣＫＨＡＶ  Ｓ（ＧｌｃＮＡｃ）  ＥＧＴＫ：配列番号３］をＭＢＬ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．に委託して合成してもらい、マウスに免疫付与するために抗原として用いた。そして、この抗原を用いてモノクローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をＯｐｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに作製してもらい、得られたハイブリドーマをＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミンペプチドと共にＥＬＩＳＡを用いて簡易的にスクリーニングし、インビトロＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化Ｈ２Ｂを用いた免疫ブロット分析により選別した。
【００５１】
＜免疫沈降及びウェスタンブロッティング＞
免疫沈降及びウェスタンブロッティング（免疫ブロット）は本発明者等の報告済みの方法に従って行った。すなわち、クロマチン成分は４サイクルの超音波処理により、核の沈殿分画から抽出した。クロマチン抽出物又はα−ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）による免疫沈澱物は、以下の抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析を行った。
α−Ｈ２Ａ、α−Ｈ２Ｂ、α−Ｈ３、α−Ｈ４（Ａｂｃａｍ社製）
α‐Ｈ２Ｂ−Ｋ１２０−ｕｂ（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）
α‐Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ（ＲＬ２又はＣＴＤ１１０．６、Ａｂｃａｍ社製）
α−ＯＧＴ（Ｓｉｇｍａ社製）
α−ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ社製）
α‐Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ（図２５〜２７において示した、Ｏｐｅｒｏｎ社に発注して作製した抗体）
α−ＭＬＬ５（Ｎ）（Ｏｐｅｒｏｎ社製、非特許文献２２  参照）
α−ＲＮＦ２０／ＢＲＥ１Ａ（Ｂｅｔｈｙｌ社製）。
【００５２】
＜組み換えタンパク質の作製＞
組み換えタンパク質の調製は非特許文献１１及び１２に記載されている方法に従って行った。すなわち、組み換えＦＬＡＧ−ＯＧＴ，ＦＬＡＧ−Ｅ１，ＦＬＡＧ−ＢＲＥ１Ａ／Ｂ複合体はバキュロウイルスを用いて発現させ、α−ＦＬＡＧ  Ｍ２アガロース（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた免疫沈降を主とする精製により単離した。組み換え６×Ｈｉｓ−ＲＡＤ６Ａはバクテリアにおいて発現させ、ＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｉｃｋｅｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いてある程度単離した。溶出液は溶出液：ＢＣ０［２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０％（ｖ／ｖ）  グリセロール，ｐＨ７．９］が１：２０になるように希釈し、Ｒｓｏｕｒｃｅ  Ｑ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてリニア濃度勾配（０〜０．５Ｍ  ＫＣｌ）により分画した。
【００５３】
組み換えアフリカツメガエルヒストンＨ２Ｂ及びその変異体の調製は本発明者等の報告済みの方法に従って行った。すなわち、これらのタンパク質をＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）において単独に発現させ、これらの封入体を簡易的に分画した。沈殿したヒストンはＤＭＳＯ及び７Ｍ  グアニジウム−ＨＣｌに可溶化させ、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を通してさらに精製し、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に結合させた。結合したヒストンはリニア濃度勾配（０．１〜０．４Ｍ  ＮａＣｌ、７Ｍウレアバッファー）により溶出した。
【００５４】
＜Ｎ−アセチルグルコサミン化糖タンパク質の生化学的精製及び同定＞
Ｏ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン糖タンパク質を精製するために、１５μｇのα−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ（ＲＬ２）抗体（Ａｂｃａｍ社製）は０．５ｍＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｈｅｅｐ  α−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に製品の説明書に従って固定した。
【００５５】
ＨｅＬａ細胞からのクロマチン抽出物（０．５ｇタンパク質）は基本的に非特許文献１４に記載の方法に準じて調製した。すなわち、クロマチン沈殿物は１ｍＭストレプトゾトシン（ＳＴＺ）含有バッファーを用いて調整した核抽出物の残留物として得られ、ミクロコッカスヌクレアーゼ（ＭＮａｓｅ）バッファー［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１Ｍ  ＫＣｌ，０．１％（ｖ／ｖ）  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ，０．３Ｍ  スクロース，１ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ，０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ，１ｍＭ  ＳＴＺ，ｐＨ７．９］に再懸濁した。３Ｕ／ｍＬ  ＭＮａｓｅを加えた後、試料を３０分室温において継続的にホモジナイズしながらインキュベートし、その後５ｍＭ  ＥＧＴＡ及び５ｍＭ  ＥＤＴＡを加えることで反応を止めた。２０００×ｇで３０分間、４℃において遠心した後、上清（クロマチン抽出物）を得た。
【００５６】
得られたクロマチン抽出物をＷＧＡレクチンアガロースカラム（Ｖｅｃｔｏｒ社製）に通し、その流出分画をさらに前記α−Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ抗体を固定化したビーズと混合し、４℃において８時間攪拌した。バッファーＤ［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１Ｍ  ＫＣｌ，０．０５％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０，１０％（ｖ／ｖ）  グリセロール，１ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ，０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ，１ｍＭ  ＳＴＺ，ｐＨ７．９］を用いて３回洗浄した後、糖タンパク質を、０．４ｍｇ／ｍＬのＧｌｃＮＡｃ−Ｏ−Ｓｅｒ（ＭＢＬ）を加えたバッファーＤを用いて２回溶出し（ｅｌｕｔｉｏｎ＃１及び＃２）、最後に０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）を用いて溶出した（ｅｌｕｔｉｏｎ＃３）。溶出されたタンパク質はメタノール−クロロホルム沈殿により脱塩し、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）により消化し、自動ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ装置（Ｃ１８  ＥＳＩ逆相カラムを配管した（ＬＣ  ａｓｓｉｓｔ）Ｚａｐｌｏｕｓ  ｎａｎｏ−ＬＣ  （ＡＭＲ）、Ｆｉｎｎｅｇａｎ  ＬＴＱ  ｉｏｎ−ｔｒａｐ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  （Ｔｈｅｒｍｏ））にロードした。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータはＴｈｅｒｍｏ  ＢｉｏＷｏｒｋｓ  （Ｔｈｅｒｍｏ）及びＳＥＱＵＥＳＴ  （Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて処理し、タンパク質を同定した。同定されたタンパク質は“ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ”（ＤＡＶＩＤ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ６．７  （ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／））を用いて更に解析した。
【００５７】
＜インビトロＮ−アセチルグルコサミン化分析（ウェスタンブロッティング解析）＞
組み換えＯＧＴはフリーのヒストン、インビトロ会合ヒストン８量体と共にインキュベートした。Ｈ２ＢのＮ−アセチルグルコサミン化の効率はα−Ｏ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン（ＲＬ２）抗体を用いたＷＢにより分析した。
【００５８】
＜インビトロＮ−アセチルグルコサミン化分析（オートラジオグラフィー解析）＞
組み換えＦＬＡＧ−ＯＧＴタンパク質（０．５μｇ）を０．５μｇの組み換えヒストン及び０．２ｍＭ（０．２μＣｉ）のＵＤＰ−［３Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）と共に２５μＬの反応液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，ｐＨ７．５）において２４時間、３７℃でインキュベートした。反応液はＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、ＰＶＤＦ膜にブロットし、ＥＮ３ＨＡＮＣＥ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ社製）を吹き付けた後にオートラジオグラフィーにより解析した。
【００５９】
また、ヒトＨｅｌａ細胞及びハエＳ２細胞由来のコアヒストン八量体（０．５μｇ）と、組み換えＯＧＴタンパク質（０．５μｇ）及びＵＤＰ−［３Ｈ−］ＧｌｃＮＡｃ（０．２μＣｉ）とを、３７℃で１０時間反応させた。得られた反応物は前記同様ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、そしてメンブレン上に電気転写を行った。反応したヒストン八量体はＣＤＤ染色により可視化し、オートラジオグラフィー解析に供した。
【００６０】
＜インビトロＮ−アセチルグルコサミン化分析（質量分析）＞
組み換えヒストン（１μｇ）又はインビトロにおいて再構成した組み換えヒストン８量体（１μｇ）は、組み換えＦＬＡＧ−ＯＧＴにより、２５μＬ反応液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ，１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，ｐＨ７．５）において２４時間、３７℃でＮ−アセチルグルコサミン化した。反応液はナノ−ＬＣ  ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析装置（ＺＯＲＢＡＸ  ３００ＳＢ−Ｃ１８  カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を配管した１１００  ｎａｎｏＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、ｍｉｃｒＯＴＯＦ  （Ｂｒｕｋｅｒ））を用いて解析した。また、反応液をトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）により分断し、ＭＢ−ＬＡＣ  ＷＧＡ  ｋｉｔ（Ｂｒｕｋｅｒ社製）を用いて糖ペプチドの精製を行った。濃縮糖ペプチドはナノ−ＬＣ  ＥＳＩ−ＥＴＤイオントラップ質量分析装置（ＺＯＲＢＡＸ  ３００ＳＢ−Ｃ１８（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を配管したＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ１２００  Ｎａｎｏ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）、ａｍａＺｏｎ  ＥＴＤ（Ｂｒｕｋｅｒ社製））を用いて解析した。
【００６１】
＜インビトロユビキチン化分析＞
Ｎ−アセチルグルコサミン化ヒストン（１μｇ）は、Ｅ１（０．１μｇ）、ＲＡＤ６  （０．２μｇ）、ＢＲＥ１複合体（０．５μｇ）、ユビキチン（３μｇ）を用いて、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４ｍＭ  ＡＴＰにおいて、２４時間、３７℃でユビキチン化した。そして、得られた反応生成物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって展開し、ウェスタンブロッティング分析に供した。
【００６２】
＜ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ及びＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ＞
ＣｈＩＰ及びＣｈＩＰ−Ｓｅｑライブラリーの構築は「Ｈｅら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２０１０年、４２巻、４号、３４３〜３４７ページ」に記載の方法に従って行った。また、得られたライブラリーは、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて塩基配列（３５塩基対）を決定した。さらに、ライブラリー中の興味ある断片は、特異的プロモータセットとＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＴＰ８００（ＴＡＫＡＲＡ社製）とＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（ＴＡＫＡＲＡ社製）とを用いたｑＰＣＲにより定量した。なお、特異的プロモータセットは下記の通りである。
（Ｆｏｒ  ｐｅａｋ  １０８２ＰＧＫ１遺伝子）
５’−ＣＧＧＡＣＧＴＧＡＣＡＡＡＣＧＧＡＡＧ−３’
：配列番号４
５’−ＣＴＡＴＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＡＴＣ−３’
：配列番号５
（ＰＧＫ１遺伝子のエクソン３）
５’−ＡＣＡＡＴＧＧＡＧＣＣＡＡＧＴＣＧＧＴＡＧ−３’
：配列番号６
５’−ＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＴＴＧＡＧ−３’
：配列番号７
（ＰＧＫ１遺伝子のエクソン５）
５’−ＣＣＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡＡＡＡＴＡＧＡＡＧ−３’
：配列番号８
５’−ＴＧＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＡＡＡＧＣＡＴＣ−３’
：配列番号９
（ＰＧＫ１遺伝子のエクソン７）
５’−ＡＧＴＴＧＣＡＧＡＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＣＴＣ−３’
：配列番号１０
５’−ＴＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＴＴＴＧＴＴＴＣＣ−３’
：配列番号１１
（ＰＧＫ１遺伝子のエクソン９）
５’−ＧＡＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＧＧＴＣＣＴＧＴＧ−３’
：配列番号１２
５’−ＡＡＧＴＧＧＣＴＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＣ−３’
：配列番号１３
（ＰＧＫ１遺伝子の転写終了位置（ＴＴＳ）
５’−ＡＧＧＡＧＡＡＴＧＧＣＧＴＧＡＡＣＣＴＧ−３’
：配列番号１４
５’−ＣＡＣＡＣＡＴＧＧＧＴＡＴＧＣＴＣＴＴＴＡＴＧＣ−３’
：配列番号１５
なお、各プライマーセットとＰＧＫ１遺伝子との対応関係は図５４に示した。
【００６３】
（実施例１）
＜核内におけるＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化糖タンパク質の探索＞
クロマチン再編成に寄与する未知の核内のＮ−アセチルグルコサミン化糖タンパク質を探索するために、Ｏ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化部位を検出することができる特異的抗体を用いた免疫アフィニティー精製を行った。すなわち、タンパク質のＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化は過剰にＮ−アセチルグルコサミン前駆体が存在することでひき起こされるため、先ず、ＨｅＬａ細胞を高グルコース条件で培養し、かかる細胞からクロマチン抽出物を調製し、過剰なＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化が生じていることを抗Ｏ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミンモノクローナル抗体（ＲＬ２抗体）を用いたウェスタンブロッテッィングにより確認した（図１  参照）。次いで、かかるクロマチン抽出物を、ＷＧＡアガロースカラムと、固定化抗Ｏ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミンモノクローナル（ＲＬ２）抗体をコートした磁性ビーズとを用いて、段階的に精製した（図２  参照）。そして、かかる精製物をトリプシンにより消化し、トリプシン処理したペプチドについて、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−マススペクトル（ＭＳ）／ＭＳ分析によりプロテオーム解析を行った。既に報告されている、ＲＮＡプロセッシング、翻訳、核内輸送において機能するＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン糖タンパク質を含む、全部で２８４の因子が確認された（図３  参照）。
【００６４】
一方、前記精製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開し、銀染色を用いて分析することにより、ヒストン８量体を構成するヒストンタンパク質もＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン糖タンパク質になり得ることが明らかになった（図２  参照）。また、ＲＬ２抗体を用いて内在性のヒストンを検出することはできなかったが（図には示していない）、ヒストン８量体を構成するＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン糖タンパク質の存在はウェスタンブロッティングによる分析からも明らかになった（図４  参照）。
【００６５】
（実施例２）
＜精製ヒストンのＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化＞
ＯＧＴは、核内でタンパク質のＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化をすることが知られている唯一の酵素であるため（「Ｄｏｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００４年、２７９巻、３号、１５７７ページ」  参照）、ヒストンタンパク質はＯＧＴの基質であるかどうかを検証した。先ず、組み換えヒトＯＧＴ（図５  参照）及びヒストンタンパク質（図６下段  参照）を用いて、インビトロ酵素分析を行った。得られた結果を図６に示す。図６に示した結果から明らかなように、ヒストンＨ２Ａ及びＨ２Ｂ、ヒストンＨ２Ａ変異体（Ｈ２Ａ．Ｘ及びＨ２Ａ．Ｚ）は、既に本発明者等によってＯＧＴの基質であることが明らかであるＭＬＬ５（図７  参照）と同様に、ＯＧＴによってインビトロでグリコシル化されることが明らかになった。
【００６６】
次に、ヒストンを修飾する酵素の基質特異性は、８量体中に存在しているヒストンタンパク質と、単サブユニットで存在しているヒストンタンパク質とでは異なるため、ヒストン８量体をを用いて、インビトロ酵素分析を行った。得られた結果を図８及び図９に示す。図８及び図９に示した結果から明らかなように、ヒストン８量体においては、ヒストンＨ２Ｂがヒストン８量体の表面に露出し、ＯＧＴによってグリコシル化された（図８  参照）。また、会合したショウジョウバエ由来のヒストン８量体においても、ヒストンＨ２ＢがＮ−アセチルグルコサミン化されることが明らかになり（図９  参照）、ヒストンＨ２ＢのＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン修飾は後生動物においても起こることが実証された。
【００６７】
（実施例３）
＜ヒストンＨ２Ｂにおける、ＯＧＴによるＮ−アセチルグルコサミン化サイトの探索＞
次に、ＯＧＴに媒介されるモノサッカライド付加部分の共通配列は分かっておらず（非特許文献１９  参照）、関連するデータベースの検索が不可能であったため（「Ｋａｌｅｅｍら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２００８年、１０３巻、３号、８３５ページ」  参照）、二つの異なるアプローチ（質量分析及びＨ２Ｂペプチドライブラリを用いたインビトロＯＧＴ分析）によって、Ｈ２Ｂタンパク質におけるＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化サイトの位置を決定することにした。
【００６８】
先ず、質量分析によって、Ｎ−アセチルグルコサミン化Ｈ２Ｂヒストン８量体の電子移動解離（ＥＴＤ）−ＭＳ／ＭＳにより、理論的質量値から＋２０３Ｄａ（Ｎ−アセチルグルコサミン部分の期待質量）シフトした位置に９１番目のセリン、１１２番目のセリン及び１２３番目のセリンのピークがあることが明らかになった（図１０〜１４  参照）。また、四重極（Ｑ）−ＴＯＦ  ＭＳ評価において、ジ−又はトリ−部分（Ｎ−アセチルグルコサミン化部分）と定量的に比較するとモノサッカライドの付加が影響を与えているようにも見えるが（図１５  参照）、ＯＧＴは同時に最大３つのＮ−アセチルグルコサミンをヒストンＨ２Ｂに転移することができることが明らかになった。
【００６９】
次に、Ｈ２Ｂペプチドライブラリを用いたインビトロＯＧＴ分析Ｈ２Ｂの全長をカバーする１５ｍｅｒのペプチドアレイを用いたインビトロＯＧＴ（表１  参照）により、Ｈ２ＢのＣ末端のαへリックス（αＣ）における１０１〜１１５又は１１１〜１２５アミノ酸残基で、２つのピークが観察された（図１６  参照）。しかしながら、１０１〜１１５ペプチドのピークは、１１１〜１２５ペプチドにおけるピークより十分に大きかった。これは、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析によると、より大きな１０１〜１１５ペプチドにおけるピークは、単一の部分（Ｎ−アセチルグルコサミン化部分）を有しているためであると考えられる（図１７〜１８  参照）。これらの結果より、Ｈ２Ｂの第一のＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化部位は１１２番目のセリンであることが示唆された。
【００７０】
【表１】
2012083193.tif 000002
【００７１】
そして、１１２番目のセリンがＮ−アセチルグルコサミン化される部位であることを実証するため、ヒストンＨ２Ｂの変異体を大腸菌にて発現させ、インビトロのＯＧＴアッセイに供した。ヒストンＨ２Ｂテール（ｔａｉｌ、尾部）のセリン/スレオニン残基を各々アラニンに置換した変異体においては、１１２番目のセリンの置換体及び１２２番目のスレオニンの置換体を除いては、グリコシル化の程度は減少しなかった（図１９〜図２２  参照）。
【００７２】
しかしながら、前述の通り、ＥＴＤ−ＭＳ／ＭＳ分析では１２２番目のスレオニンはグリコシル化されそうにはなく、これらヒストンＨ２Ｂの２つの残基は後世動物において保存されており（図２３  参照）、さらにヒストンＨ２Ｂタンパク質のα−へリックスにおいて構造上２つの残基は近接していることから（「Ｌｕｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年、３８９巻、６６４８号、２５１ページ」、図２４  参照）、ヒストンＨ２Ｂタンパク質の１１２番目のセリンのＮ−アセチルグルコサミン化（Ｈ２Ｂ  Ｓ１１２  ＧｌｃＮＡｃ）にはこのスレオニン残基は、おそらくはＯＧＴの足場として機能するために必須であるということが示唆された。
【００７３】
（実施例４）
＜ヒストンＨ２Ｂタンパク質の１１２番目のセリンのＮ−アセチルグルコサミン化された部位に結合する抗体の作製及びその評価＞
既存のＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミンを検出する抗体では内在性のＨ２Ｂ−Ｓ１１２のグリコシル化を検出することはできなかったので（データは示していない）、生細胞におけるＨ２Ｂの１１２番目のセリンのＮ−アセチルグルコサミン化を観察するために、１１２番目のセリンがＮ−アセチルグルコサミン化されたＨ２Ｂペプチドに対するいくつかの抗体を作製した。得られたモノクローナル抗体からＨ２Ｂ−Ｓ１１２のＮ−アセチルグルコサミン化を高精度で特異的に検出できるものを選択し、これを以降の分析に用いた（以降、α−Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃとも称する。図２５〜２７  参照）。先ず、通常のＨｅＬａ細胞の培養条件において、Ｈ２Ｂの１１２番目のセリンはある程度Ｏ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化されることが確認された（図２８  参照）。次に、培養培地をグルコース枯渇培地にすると、急速に脱グルコシル化がひき起こされることが明らかになった（図２８  参照）。一方、グルコースを徐々に補給するとＨ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ量は回復するも明らかになった（図２９  参照）。特に、このようなグルコース濃度に応答したＨ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ量の変化はＨｅＬａ細胞の細胞倍化時間よりも早いものであることが明らかになった（図２９及び図３０  参照）。
【００７４】
（実施例５）
＜Ｈ２ＢＮ−アセチルグルコサミン化とＨ２Ｂモノユビキチン化との関連の有無についての検証＞
次に、ヒストン修飾は相互に影響を及ぼしあってクロマチン状態を決定するため、Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃの他のヒストン修飾への影響を調べた。すなわち、従来のモノユビキチン化に関する報告から（「Ｓｕｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、４１８巻、６８９３号、１０４ページ」、「Ｍｉｎｓｋｙら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００８年、１０巻、４号、４８３ページ」  参照）、Ｈ２Ｂの１１２番目のセリン残基の近傍において（図２４  参照）、Ｈ２Ｂの１２０番目のリシンを分析対象として選択した。また、酵母菌におけるデータはグルコース及び他の糖質はＨ２Ｂの１２０番目のリシンのユビキチン化（Ｈ２Ｂ−Ｋ１２０−ｕｂ）をひき起こすことを示唆している（Ｄｏｎｇら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００４年、２７９巻、３号、１５７７ページ  参照）。そこで、グルコース枯渇条件で２４時間培養を行った細胞において、Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ量を増加するためのグルコース処理した後に、ユビキチン化を観察して経時的解析を行った。得られた結果を図２９及び３０に示す。図２９及び３０に示した結果から明らかなように、ＲＬ２免疫反応タンパク質として検出される、全タンパク質のＮ−アセチルグルコサミン化の段階的増加及びＨ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ量の明確な増加は２時間後に観察された。また、Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ量の有意な上昇の６時間後、Ｈ２Ｂ−Ｋ１２０−ｕｂ量の明確なアップレギュレーションが観察された。
【００７５】
次に、Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃとＨ２Ｂ−Ｋ１２０−ｕｂとの相関について、ＯＧＴに対する短いヘアピンＲＮＡｉ構造（図３１〜３３  参照）を用いたＯＧＴノックダウン実験によりさらに検討した。得られた結果を図３４に示す。図３４に示した結果から明らかなように、ノックダウンＨｅＬａ細胞において、クロマチンにおけるＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン量はＨ２Ｂ−Ｋ１２０−ｕｂ量の減少と共に減少した（図３４  参照）。従って、ＨｅＬａ細胞において、Ｈ２Ｂの１１２番目のセリンのグリコシル化がＨ２Ｂの１２０番目のリシンのモノユビキチン化を促進することが明らかになった。
【００７６】
（実施例６）
＜Ｈ２Ｂの１１２番目のセリンのＮ−アセチルグルコサミン化及び１２０番目のリシンのモノユビキチン化と、細胞外グルコース及び細胞間ヘキソサミン生合成経路との相関についての検証＞
前述のＨ２Ｂの１１２番目のセリンのＮ−アセチルグルコサミン化及び１２０番目のリシンのモノユビキチン化は、どのような糖の代謝経路に依存しているのかを検証するために、前述のグルコース（Ｇｌｃ）の代わりに、ピルビン酸（Ｐｙｒ）又はグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を添加して、実施例５に記載と同様の分析を行った。得られた結果を図３５に示す。図３５に示した結果から明らかなように、ピルビン酸ではなく、グルコサミンがＨ２ＢのＮ−アセチルグルコサミン化を亢進させることができたため、他のＮ−アセチルグルコサミン化タンパク質のように、Ｈ２Ｂの１１２番目のセリンのＮ−アセチルグルコサミン化はＨＢＰ経路に依存していることが示唆された。
【００７７】
この点について更に解明するために、ＨＢＰ経路をブロックする二つの阻害剤（ＤＯＮ及びＡＺＡ）をグルコースよってひき起こされるＨ２Ｂの１１２番目のセリンのグリコシル化において検証した。得られた結果を図３５に示す。図３５に示した結果から明らかなように、どちらの阻害剤もグリコシル化を低下させた。特に、Ｈ２Ｂの１１２番目のセリンのグリコシル化が低下する条件下では、Ｈ２Ｂ−Ｋ１２０−ｕｂ量もまたダウンレギュレートされた。
【００７８】
また、ＯＧＴによるＮ−アセチルグルコサミン化に必須のアミノ酸（Ｓ１１２及びＴ１２２）をアラニンに置換したＡＡ変異Ｈ２Ｂを用いて同様の試験を行った。得られた結果を図３６に示す。図３６に示した結果から明らかなように、この変異体の過剰発現においては、Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ量及びＨ２Ｂ−Ｋ１２０−ｕｂ量のグルコース応答性が消失していた。ＯＧＴによるタンパク質のＮ−アセチルグルコサミン化はＨＢＰを介した細胞外グルコースから供給される細胞内のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ量に依存するという本発明者等による先の報告（非特許文献２２及び２３  参照）と併せて、これらの結果より、Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃ量はＨ２Ｂ−Ｋ１２０−ｕｂ量と同様に細胞外グルコース濃度とＨＢＰ経路の状態との両方に応じて変動することが明らかになった。
【００７９】
従って、ＨＢＰを介した細胞外グルコース濃度の上昇に依存して、ＯＧＴの酵素活性は亢進され、次いでヒストンのグリコシル化は亢進されるので、グリコシル化されたヒストンタンパク質は血清グルコース量の検出指標になる得ることも明らかとなった。
【００８０】
（実施例７）
＜Ｈ２ＢのＮ−アセチルグルコサミン化からＨ２Ｂのユビキチン化に至る分子的機序の解析＞
生細胞内で見られる、Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃに続いて生じるＨ２Ｂ−Ｋ１２０−ｕｂの分子的機序を解析した。Ｅ３リガーゼに媒介されるユビキチン化のための標識として、糖タンパク質と結合しているサッカライドにおけるＮ−アセチルグルコサミン部分が提供されることが示されていることから（「Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、４１８巻、６８９６号、４３８ページ」  参照）、我々はＨ２ＢユビキチンＥ３リガーゼがＮ−アセチルグルコサミン化Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２に集積されることの可能性を検討した。すなわち、Ｈ２Ｂの１２０番目のリシン部位にモノユビキチン化をもたらすことがインビトロにおいて証明されている、Ｈ２ＢのＥ３リガーゼ、ＢＲＥ１Ａ／１Ｂ複合体を用いて分析した。得られた結果を図３７及び図３８に示す。図３７及び図３８に示した結果から明らかなように、ＨｅＬａ細胞においてＢＲＥ１Ａと標識化ヒストンＨ２Ｂの共免疫沈降が観察された。一方、標識化ＡＡ変異Ｈ２ＢはＢＲＥ１Ａと結合しなかった（図３７  参照）。また、この内在性ＢＲＥ１Ａと内在性ヒストンＨ２Ｂとの結合はグルコース枯渇（ｃｏｎｔ．）により減少した一方で、グルコースの添加（Ｇｌｃ）後に急速に回復した（図３８  参照）。
【００８１】
さらに、生体内におけるこれらの結果を確かめるために、インビトロで得たＮ−アセチルグルコサミン化組み換えＨ２Ｂタンパク質、並びに、組み換えＥ１、ＲＡＤ６Ａ（Ｅ２）、及びＢＲＥ１Ａ／１Ｂ複合体（Ｅ３）を用いてインビトロユビキチン化分析を行った。得られた結果を図４１に示す。図４１に示した結果から明らかなように、ＢＲＥ１複合体が存在しなくとも、Ｅ１及びＲＡＤ６ＡによってＨ２Ｂ−Ｋ１２０はある程度モノユビキチン化された。このユビキチン化はＥ３  ＢＲＥ１Ａ／１Ｂ  複合体（図３９及び図４０  参照）の存在下において有意に促進された。また、これらの条件下において、１１２番目のセリンがＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化されているＨ２Ｂは、より効率よくモノユビキチン化されることが明らかになった（図４１  参照）。従って、Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２のＮ−アセチルグルコサミンがＨ２Ｂ−Ｋ１２０のモノユビキチン化を促進するユビキチンホロリガーゼを固定していることが示唆された。
【００８２】
（実施例８）
＜真正染色質領域とＨ２Ｂ  Ｓ１１２  ＧｌｃＮＡｃサイトとの相関についての検証＞
ＯＧＴが転写の共活性化の構成要素であるという本発明者らの以前の報告から（非特許文献２３  参照）、Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃがクロマチンの活性化に関係していることが推測されるので、先ず、遺伝的アプローチ（白色遺伝子座がヘテロクロマチンに近接すると眼色がモザイクパターンを示すショウジョウバエ変異体（Ｉｎ（１）Ｗｍ４ｈ）における班入り位置効果の多様化（ＰＥＶ））を利用したＰＥＶシステムにより（「Ｚｈａｏら、Ｃｅｌｌ、２００８年、２９巻、１号、９２ページ」  参照）、ＯＧＴ変異体において、クロマチン再構成におけるＯＧＴの生理的役割を検証した。得られた結果を図４２及び図４３に示す。図４２及び図４３に示した結果から明らかなように、ＯＧＴの機能欠損変異体［ｓｕｐｅｒ  ｓｅｘ  ｃｏｍｂ  （ｓｘｃ１）］（「Ｇａｍｂｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９年、３２５巻、５９３６号、９３ページ」及び「Ｓｉｎｃｌａｉｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００９年、１０６巻、３２号、１３４２７ページ」  参照）とかけあわせると、白色眼の遺伝子型が観察されたことから、ＯＧＴはクロマチンの不活性化を抑制することが明らかになった。
【００８３】
次に、クロマチン状態におけるＨ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃの機能をより直接的に評価するために、我々はクロマチンの状態を示すマーカーを用いて、ハエの多糸染色体上のクロマチンにおける局在を調べた。得られた結果を図４４〜４８に示す。図４４〜４８に示した結果から明らかなように、Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃの領域は、Ｈ２Ｂ−Ｋ１２０−ｕｂと同様に、Ｈ３Ｋ９  ｍｅ２（ヒストンＨ３のジメチル化された９番目のリシン）の領域よりもよりＨ３Ｋ４  ｍｅ２（ヒストンＨ３のジメチル化された４番目のリシン）の領域と重なっていた（図４４〜４７  参照）。また、Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃサイトはＨｅＬａ細胞において、真正染色質領域に濃縮されていた（図４８  参照）。従って、少なくともハエの多糸染色体上では、Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃはクロマチンの不活性化よりもむしろクロマチンの活性化をサポートしていることが明らかになった。
【００８４】
さらに、Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃのクロモソームレベルでの役割をより明らかにするために、α−Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃポリクローナル抗体を用いたクロマチン免疫沈降法によりＨｅＬａ細胞のゲノムワイド位置解析及び濃縮ＤＮＡ断片のハイスループットシークエンシングを行った。得られた結果を図４９〜５２に示す。図４９〜５２に示した結果から明らかなように、Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃの濃縮は１０８８染色体領域において広範囲に分散しており、それらの半分は識別されたＲｅｆｇｅｎｅｓの位置の１０ｋｂ以内に位置していた（図４９  参照）。また、Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃは主に遺伝子本体をカバーしていたが、プロモーター及び隣接する下流領域においてもその存在が確認された。そして、遺伝子発現マイクロアレイの解析においては、識別されたＲｅｆｓｅｑ遺伝子の半分以上において転写活性が確認された（図５０  参照）。また、メタ遺伝子座におけるＨ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃシグナルの平均プロファイル解析により、Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃシグナルは転写開始位置（ＴＳＳ）において濃縮され、転写終了位置（ＴＴＳ）まで維持されることが明らかになった（図５１  参照）。Ｓｅｑｐｏｓ及びＴＲＡＳＦＡＣモチーフ解析によると、グリコシル化濃縮領域はＨＮＦ４やＣＯＵＰＴＦｓのようなエネルギー代謝に関連する多くの転写因子の結合モチーフ（転写因子結合サイトのコンセンサス配列）を含んでいることが確認された（表２、図５２及び図５３  参照）。
【００８５】
【表２】
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【００８６】
（実施例９）
＜ＰＧＫ１遺伝子における転写制御とＨ２Ｂ  Ｓ１１２  ＧｌｃＮＡｃサイトとの相関についての検証＞
次に、前述のゲノムワイド位置解析の正当性を検証するために、ホスホグリセリン酸塩キナーゼ１（ＰＧＫ１）遺伝子をＲｅｆｓｅｑ遺伝子から選択し、ヒストン修飾解析を行った。すなわち、この遺伝子のプロモーターはＨＮＦ４結合部位を有し、そのプロモータ機能はグルコースに反応性を示すことが知られていることから（データは示していない）、プロモータ領域におけるヒストンＨ２Ｂの修飾を調べた。得られた結果を図５４に示す。図５４に示した結果から明らかなように、高濃度グルコース処理の後、Ｈ２Ｂ−Ｓ１１２−ＧｌｃＮＡｃは１２時間以内に急速に増加し、それに続いてＨ２Ｂ−Ｋ１２０−ｕｂ及びＨ３Ｋ４のメチル化が急速に増加した。
【００８７】
従って、図５５に示すように、ＨＢＰを介した細胞外グルコース濃度の上昇に依存して、ＯＧＴの酵素活性は亢進され、次いでＰＧＫ１遺伝子等におけるヒストンのグリコシル化が亢進される。また、かかるグリコシル化ヒストンの亢進は、ヒストンＨ２Ｂの１２０番目のリシンのユビキチン化、ヒストンＨ３の４番目のリシンのメチル化を誘導し、ひいてはＰＧＫ１遺伝子等の転写を活性化させることが明らかになった。
【００８８】
また「Ｆｏｌｌｉら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１０年３月２９日、５巻、３号、ｅ９９２３」及び「Ｓｕｈａｉｌら、Ｉｎｄｉａｎ  Ｌ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ、１９９０年２月、９２巻、２１〜２３ページ」参照）に示されているように、ＰＧＫ１遺伝子の発現異常（亢進）と１型（インスリン依存性）糖尿病との関連性は明らかになっているため、ヒストンタンパク質のグリコシル化を指標とした糖尿病等のメタボリックシンドロームに対する医薬品候補化合物のスクリーニングを行うことも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
以上説明したように、本発明により、ヒストンタンパク質のグリコシル化の検出が可能となり、さらには、当該ヒストンタンパク質のグリコシル化を指標として、血清グルコース量の評価、メタボリックシンドロームの検査、及びメタボリックシンドロームに対する医薬品候補化合物のスクリーニングが可能となった。従って、本発明は、ヒストンタンパク質のグリコシル化と関係する生体内の機序の解明などを目的とする研究の他、糖尿病等のメタボリックシンドロームの検査や治療薬の開発等の医療分野において利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００９０】
配列番号１〜２
＜２２３＞  ｓｈＲＮＡの標的配列
配列番号３
＜２２３＞  Ｏ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミン化
配列番号４〜１５
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号１６〜６１
＜２２３＞  人工的に合成されたポリペプチドの配列
配列番号６７〜８５
＜２２３＞  転写因子結合サイトのコンセンサス配列
配列番号６７、６８、７０、７３、７４、７６、８０、８３、及び８４
＜２２３＞  ｎは任意の塩基を示す
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2012083193.tif 000019
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【配列表】
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