(57)【要約】【課題】滅菌性を担保しながら最終生成物による治療効果を向上する。【解決手段】生体組織を消化することにより該生体組織から生体由来細胞を分離させて細胞懸濁液を生成する分解処理部２と、細胞懸濁液を収容する遠心分離容器１０を揺動軸線回りに揺動可能に支持するアーム１３ａと、アーム１３ａを揺動軸線から離れた所定の軸線回りに回転させる回転部１３ｂとを有し、細胞懸濁液を遠心分離により濃縮する細胞濃縮部３と、該細胞濃縮部３において細胞懸濁液中の生体由来細胞の収量を増加させる収量増加部とを備え、収量増加部は、アーム１３ａが静止した状態の遠心分離容器１０に隣接する位置に設けられている細胞分離装置１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織を消化することにより該生体組織から生体由来細胞を分離させて細胞懸濁液を生成する分解処理部と、
前記細胞懸濁液を収容する遠心分離容器を揺動軸線回りに揺動可能に支持するアームと、前記アームを前記揺動軸線から離れた所定の軸線回りに回転させる回転部とを有し、前記細胞懸濁液を遠心分離により濃縮する細胞濃縮部と、
該細胞濃縮部において前記細胞懸濁液中の前記生体由来細胞の収量を増加させる収量増加部とを備え、
前記収量増加部は、前記アームが静止した状態の前記遠心分離容器に隣接する位置に設けられている細胞分離装置。
【請求項２】
前記細胞懸濁液に含まれる生体由来細胞の数を計測する細胞数計測手段と、
該細胞数計測手段により計測された前記生体由来細胞の数の情報に基づいて、前記収量増加部を制御する制御部とを備える請求項１に記載の細胞分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分離装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体から採取した脂肪組織から幹細胞などを含む脂肪由来細胞を分離する装置が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００５／０１２４８０号
【特許文献２】米国特許公開第２００９／０３０４６４４号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の装置を用いて脂肪由来細胞を分離したときに、処理の過程で脂肪由来細胞の機能が低下した状態になる。したがって、最終生成物である細胞濃縮物を装置から回収してそのまま治療に用いても、迅速に十分な治療効果を得ることが難しいという問題がある。分離後の脂肪由来細胞を装置から取り出してから別途、賦活化などの処理をすることも考えられる。しかし、それまで装置内で滅菌性が担保されていた脂肪由来細胞に異物の混入を招く可能性がある。さらに、処理工程、特に、治療の使用前に脂肪由来細胞を洗浄・濃縮するために必要である遠心分離の回数が増えることによって脂肪由来細胞をむしろ弱らせてしまう可能性がある。
【０００５】
特許文献２では、処理過程で細胞を刺激することにより、細胞の活性化または収量の増加を図っている。しかしながら、刺激のタイミングによっては細胞の活性が処理中に再び低下してしまう可能性があるという問題がある。
【０００６】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、滅菌性を担保しながら最終生成物による治療効果を最大化することができる細胞分離装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、生体組織を消化することにより該生体組織から生体由来細胞を分離させて細胞懸濁液を生成する分解処理部と、前記細胞懸濁液を収容する遠心分離容器を揺動軸線回りに揺動可能に支持するアームと、前記アームを前記揺動軸線から離れた所定の軸線回りに回転させる回転部とを有し、前記細胞懸濁液を遠心分離により濃縮する細胞濃縮部と、該細胞濃縮部において前記細胞懸濁液中の前記生体由来細胞の収量を増加させる収量増加部とを備え、前記収量増加部は、前記アームが静止した状態の前記遠心分離容器に隣接する位置に設けられている細胞分離装置を提供する。
【０００８】
本発明によれば、分解処理部において生成された生体由来細胞を含む細胞懸濁液が、細胞濃縮部において濃縮されることにより、生体組織から生体由来細胞を抽出することができる。
この場合に、収量増加部によって生体由来細胞の収量が増加された濃縮液が最終生成物として回収されるので、該最終生成物による治療効果を最大化することができる。
【０００９】
上記発明においては、前記細胞懸濁液に含まれる生体由来細胞の数を計測する細胞数計測手段と、該細胞数計測手段により計測された前記生体由来細胞の数の情報に基づいて、前記収量増加部を制御する制御部とを備えていてもよい。
このようにすることで、生体由来細胞の数に応じたより適切な条件で収量増加部により細胞懸濁液を処理し、生体由来細胞の収量をより効果的に増加させることができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、滅菌性を担保しながら最終生成物による治療効果を最大化することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞分離装置の全体構成図である。
【図２】図１の細胞分離装置の遠心分離機の構成を示す図である。
【図３】図２の遠心分離機に使用される遠心分離容器の構成を示す図である。
【図４】図２の遠心分離機に設けられている受け部を示す図である。
【図５】細胞数計測部の構成と、該細胞数計測部により脂肪由来細胞の数を計測する方法を説明する図である。
【図６】細胞数計測部により細胞塊の３次元形状を計測する方法を説明する図である。
【図７】細胞刺激部の構成を示す図であり、ヒータおよび温度センサの配置を示している。
【図８】図７に示したヒータおよび温度センサの配置の変形例を示す図である。
【図９】図７に示したヒータおよび温度センサの配置のもう１つの変形例を示す図である。
【図１０】細胞刺激部の変形例を示す図である。
【図１１】受け部の変形例を示す図である。
【図１２】受け部のもう１つの変形例を示す図である。
【図１３】細胞刺激部の配置の変形例を示す図である。
【図１４】細胞数計測部の変形例を示す図である。
【図１５】細胞数計測部の構成のもう１つの変形例を示す図である。
【図１６】細胞数計測部の構成のもう１つの変形例を示す図である。
【図１７】細胞数計測部の配置の変形例を示す図である。
【図１８】細胞数計測部の配置のもう１つの変形例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明の一実施形態に係る細胞分離装置１について図面を参照して説明する。
本実施形態に係る細胞分離装置１は、図１に示されるように、脂肪組織（生体組織）を消化する分解処理部２と、該分解処理部２において生成された細胞懸濁液を濃縮する細胞濃縮部３と、分解処理部２、細胞濃縮部３、洗浄液バッグ４および廃液バッグ５を接続する搬送経路６と、各部２，３および搬送経路６の動作を制御する制御部７とを備えている。
【００１３】
分解処理部２は、生体内から吸引するなどして採取した脂肪組織と、該脂肪組織を分解する消化酵素液とを、図示しない撹拌装置によって収集容器８内で撹拌する。これにより、脂肪組織から、該脂肪組織に結合していた脂肪由来細胞（生体由来細胞）が分離させられ、消化酵素液内に脂肪由来細胞が浮遊した細胞懸濁液が生成されるようになっている。収集容器８の底面８ａは一方向に傾斜し、該底面８ａの最下位置から細胞懸濁液が排出されるようになっている。符号８ｂは、消化された脂肪組織の残渣などの比較的大きな不純物が細胞懸濁液とともに排出されるのを防止するフィルタである。
【００１４】
細胞濃縮部３は、遠心分離機９と、後述するように、該遠心分離機９に支持された遠心分離容器１０内の脂肪由来細胞の数を計測する細胞数計測部(細胞数計測手段)１１および脂肪由来細胞に刺激を与える細胞刺激部（収量増加部）１２とを備えている。
遠心分離機９は、図２に示されるように、アーム１３ａを有する回転軸部材１３と、アーム１３ａに支持され遠心分離容器１０が設置されるバケット１４と、回転軸部材１３をその略中心軸線回りに回転させるモータ（回転部）１３ｂとを備え、回転軸部材１３にはバケット１４の底部を受ける受け部１５が一体に設けられている。
【００１５】
回転軸部材１３は鉛直方向に略直立して設けられている。バケット１４は、遠心分離容器１０より若干大きく該遠心分離容器１０と略同一の形状を有し、回転軸部材１３に略直交して固定されたアーム１３ａの両端に、その底部が回転軸部材１３から離間する方向に揺動可能に支持されている。これにより、細胞懸濁液を収容した遠心分離容器１０をバケット１４に収納した状態で回転軸部材１３を回転させたときに、バケット１４および遠心分離容器１０が揺動して底部が半径方向外方に配置され、細胞懸濁液中の脂肪由来細胞が、後述するポケット部１０ｂの底部に凝集させられるようになっている。
【００１６】
遠心分離容器１０は、図３に示されるように、搬送経路６に接続された配管１０ａが内部に挿入され、該配管１０ａを介して細胞懸濁液が遠心分離容器１０内に供給されるようになっている。なお、遠心分離の際に配管１０ａが捩じれないように、配管１０ａは図示しない回転継手を介して搬送経路６に接続されている。
【００１７】
また、遠心分離容器１０の底部には、内面が窪んで形成された略半球形状のポケット部１０ｂが設けられている。配管１０ａの先端面に開口した吸引吐出口１０ｃは、ポケット部１０ｂ内の底面から離れた位置に配置されている。これにより、細胞懸濁液の遠心分離後に吸引吐出口１０ｃから上清を排出したときには、ポケット部１０ｂの底面に沈殿した細胞塊をそのまま残して上清が排出され、上清の排出後に吸引吐出口１０ｃから洗浄液を供給したときには、洗浄液の流入の勢いによって細胞塊が洗浄液内で効率的に撹拌されるようになっている。また、吸引吐出口１０ｃから吸引と吐出とを繰り返すことにより、細胞懸濁液をピペッティングして撹拌することができるようになっている。
【００１８】
受け部１５は、回転軸部材１３が回転を停止した状態においてバケット１４の底部と隣接する位置に受け面１５ａが形成されている。受け面１５ａは、図４に示されるように、回転軸部材１３に対して半径方向外方側が開放された略凹半球形状であり、バケット１４の底部に相補的な形状を有している。これにより、遠心分離の開始時および終了時においてバケット１４がその揺動を妨げられることなくスムーズに受け面１５ａから離間し、また、受け面１５ａに接近できるようになっている。
【００１９】
このときに、遠心分離終了時に位置が下がってきたバケットの底部が受け面１５ａにより確実に密着するように、バケット１４の底部および受け面１５ａに互いに引力を発生させる磁石１６が設けられている。磁石１６は、遠心分離時にバケット１４の底部に作用する遠心力よりも十分に小さい磁力を有している。磁石１６は、電磁石であり、遠心分離の終了時に作動して磁力を発生するようになっていてもよい。
【００２０】
細胞数計測部１１および細胞刺激部１２はともに、受け面１５ａに設けられている。
細胞数計測部１１は、図５に示されるように、受け面１５ａに受けられたポケット部１０ｂに向かって略水平方向に検出光Ｌを出射するともに、検出光Ｌが後方に反射または散乱された戻り光を検出する。ここで、ポケット部１０ｂの底部に細胞塊Ａが沈殿した状態で細胞数計測部１１が戻り光を検出すると、細胞塊Ａと上清Ｂとの界面で戻り光の強度が変化する。細胞数計測部１１は、この戻り光の強度の変化から細胞塊Ａの上端位置を検出し、検出した上端位置から細胞塊Ａの体積を算出し、算出した体積から脂肪由来細胞の数を算出するようになっている。
【００２１】
このときに、図６に示されるように、細胞塊Ａの上端位置が少なくとも３方向から検出されるように、少なくとも３つの位置から検出光Ｌが出射されることが好ましい。このようにすることで、細胞塊Ａの上端面の形状を３次元で検出して細胞塊Ａの体積をより高い精度で求め、細胞塊Ａに含まれる脂肪由来細胞の数をより正確に算出することができる。
【００２２】
なお、細胞数計測部１１とバケット１４内に設置された遠心分離容器１０との間の途中位置において検出光Ｌおよび戻り光が遮られることがないように、バケット１４の底部の検出光Ｌおよび戻り光が通過する位置には、これらの光を透過させる窓（図示略）が設けられている。また、バケット１４内に遠心分離容器１０を設置したときに、遠心分離容器１０の底部がバケット内から出没するように、バケット１４の底部が切断されて開放されてもよい。
【００２３】
細胞刺激部１２は、図７に示されるように、受け面１５ａに設けられたヒータ（以下、ヒータ１２ともいう）である。受け面１５ａには温度センサ１７も設けられている。これにより、受け面１５ａに受けられたポケット部１０ｂ内が効率良く加温され、また、ポケット部１０ｂ内の温度がより精度良く検出されるようになっている。また、温度センサ１７によって検出された温度の情報は制御部７に送信され、制御部７によってヒータ１２の温度が所定の温度に一定に保たれるように制御されるようになっている。
【００２４】
なお、図７に示したヒータ１２および温度センサ１７の配置は一例であり、適宜変更可能である。例えば、図８に示されるように、ヒータ１２を底面に設け、温度センサ１７を側面に設けてもよく、図９に示されるように、ヒータ１２と温度センサ１７の両方を側面に設けてもよい。
【００２５】
搬送経路６は、収集容器８、遠心分離容器１０、洗浄液バッグ４および廃液バッグ５を接続するチューブ１８と、該チューブ１８の途中位置に設けられたバルブＶ１〜Ｖ１０および送液ポンプ１９とを備えている。符号６ａは、チューブ１８を分岐する継手を示している。洗浄液バッグ４には、洗浄液として、例えば、乳酸リンゲル緩衝液が収容されている。
【００２６】
制御部７は、図示しない配線を介して分解処理部２、細胞濃縮部３、バルブＶ１〜Ｖ１０および送液ポンプ１９に接続され、これらの動作を予め設定された処理手順にしたがって制御するようになっている。
【００２７】
また、制御部７は、細胞濃縮部３において最後の遠心分離と上清の排出とが終了した後、細胞数計測部１１に脂肪由来細胞の数を計測させる。そして、制御部７は、細胞数計測部１１によって計測された脂肪由来細胞の数に基づいて次に行う加温処理の処理時間を決定し、決定した処理時間の間、温度センサ１７によって検出される温度が設定温度に保たれるようにヒータ１２の温度を調節するようになっている。ここで、設定温度は、脂肪由来細胞に適度な刺激を与えることができる温度、具体的には、３８〜４２℃、好ましくは４０℃に設定される。
【００２８】
また、制御部７は、加温処理を行っている間、配管１０ａによる吸引と吐出とをゆっくり繰り返させることにより、遠心分離容器１０内の脂肪由来細胞と上清との混合物である細胞濃縮物をピペッティングさせるようになっている。
【００２９】
このように構成された細胞分離装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る細胞分離装置１は、分解処理部２において脂肪組織を消化した後、生成された細胞懸濁液を搬送経路６によって細胞濃縮部３に搬送する。次に、細胞分離装置１は、細胞濃縮部３において細胞懸濁液を遠心分離した後、遠心分離容器１０内から上清を廃液バッグ５に排出する。このときに、細胞分離装置１は、ポケット部１０ｂ内に一定量の少量の上清を残して、他の上清を排出するようになっている。次に、細胞分離装置１は、洗浄液バッグ４から遠心分離容器１０に洗浄液を搬送し、遠心分離し、遠心分離容器１０内から上清を一定量だけ残して排出することにより脂肪由来細胞を洗浄する。必要に応じて洗浄が複数回行われてもよい。
【００３０】
脂肪由来細胞の洗浄の後、細胞分離装置１は、ポケット部１０ｂ内に沈殿している脂肪由来細胞の数を計測し、加温処理時間を決定する。そして、細胞分離装置１は、ヒータ１２の温度を上昇させ、ポケット部１０ｂ内を設定温度、好ましくは４０℃に保ちながら、決定した処理時間の間、ポケット部１０ｂ内の脂肪由来細胞と少量の上清とをピペッティングしながら待つ。
以上の手順により、最終生成物として脂肪由来細胞が少量の洗浄液に懸濁された細胞濃縮物がポケット部１０ｂ内に得られる。
【００３１】
このように、本実施形態によれば、脂肪由来細胞は、全ての処理が終了する直前に加温処理によって刺激されることにより賦活化される。これにより、賦活化されたばかりの高い活性を有する脂肪由来細胞の収量を増加させ、最終生成物による治療効果を向上することができるという利点がある。また、加温処理時にピペッティングを行うことにより、細胞濃縮物中の脂肪由来細胞に均一に熱を伝えて脂肪由来細胞をより効率良く賦活化することができるという利点がある。
【００３２】
また、このようにして脂肪由来細胞を賦活化するためには遠心分離容器１０内を外側からヒータ１２で加温するだけでよいので、最終生成物の滅菌性を担保することができるとともに、遠心分離などの処理回数が増えることがないので、脂肪由来細胞を健全な状態に保ったまま回収することができるという利点がある。
【００３３】
さらに、従来の細胞分離装置では、遠心分離容器１０内の細胞が凝集している位置が分からないため、細胞が凝集していない位置に刺激を与えてしまい、不活化の効率が落ちてしまう可能性があった。この課題に対して、本実施形態に係る細胞分離装置１によれば、細胞数計測部１１を備えることにより、細胞が凝集している位置を検出して確実に細胞に刺激を与えることができ、賦活化の効率を向上することができる。
【００３４】
なお、上記実施形態においては、脂肪由来細胞を加温することにより刺激することとしたが、これに代えて、超音波または赤外光を照射することにより刺激してもよい。
この場合、図１０に示されるように、ヒータ１２に代えて超音波振動子または赤外光源２０が受け面１５ａに設けられる。このようにしても、細胞濃縮物Ｃ内の脂肪由来細胞に簡便にかつ効果的に刺激を与えて脂肪由来細胞を賦活化することができる。
【００３５】
このときに、制御部７は、細胞数計測部１２によって計測された脂肪由来細胞の数に比例するように、超音波振動子または赤外光源２０から出力される超音波または赤外光の強度または出力時間を調節する。また、制御部７は、温度センサ１７によって検出された温度が所定の閾値を越えたときに、超音波または赤外光の照射を一時停止させ、温度センサ１７によって検出された温度が所定の閾値より低くなったときに超音波または赤外線の照射を再開させる。これにより、超音波または赤外線の照射により細胞濃縮物Ｃの温度が過度に上昇することを防止することができる。
【００３６】
あるいは、ポケット部１０ｂ内の細胞懸濁液の液量を測定する図示しない液量測定手段を設け、制御部７が、液量測定手段により測定された細胞懸濁液の液量に基づいて超音波または赤外光の照射条件を制御してもよい。液量測定手段としては、例えば、細胞懸濁液の液面位置を検出する光学センサ、または、細胞懸濁液の重量を測定する重量計などを用いることができる。
【００３７】
さらに、細胞刺激部１２として超音波振動子を採用する場合には、細胞濃縮物Ｃの各位置における脂肪由来細胞の密度、または、細胞濃縮物内の気泡の有無を検出する光学センサ（図示略）が設けられていてもよい。このようにすることで、細胞濃縮物Ｃに過剰な強度の超音波が照射されていないか否かを検出し、脂肪由来細胞に過度な刺激が与えられることを防ぐことができる。
【００３８】
また、上記実施形態においては、収量増加部として細胞刺激部を採用したが、収量増加部は、細胞懸濁液の中から不要な細胞を除去する構成であってもよい。例えば、収量増加部として、細胞懸濁液中の脂肪由来細胞以外の細胞と特異的に結合する抗体が表面に結合されたビーズを用いることができる。この場合、制御部７は、例えば、細胞懸濁液の液量に基づいて、遠心分離容器１０内に供給するビーズの量を調節する。
【００３９】
また、上記実施形態においては、細胞刺激部１２が、ポケット部１０ｂを覆うように回転軸部材１３と一体に設けられていることとしたが、細胞刺激部１２の配置はこれに限定されるものではなく、ポケット部１０ｂ内の細胞濃縮物に効率よく刺激を与えることができるように配置されていればよい。
【００４０】
例えば、受け部１５が、図１１に示されるように、ポケット部１０ｂが嵌る溝が形成されたコの字形状であってもよく、図１２に示されるように、ポケット部と隣接する面が緩やかな湾曲面に形成されていてもよい。また、図１３に示されるように、遠心分離機９を囲うパネル２１を設け、パネル２１の底面全面に、アーム１３ａおよび回転軸部材１３とは別体で細胞刺激部１２が設けられていてもよい。
【００４１】
また、上記実施形態においては、細胞数計測部１１が、沈殿した細胞塊Ａの体積に基づいて脂肪由来細胞の数を計測することとしたが、これに代えて、細胞濃縮物Ｃの散乱光の強度に基づいて脂肪由来細胞の数を計測してもよい。
この場合、脂肪由来細胞を洗浄して上清を排出し、ピペッティングして脂肪由来細胞と少量の上清とを懸濁した後に、細胞数計測部１１は、図１４に示されるように、受け面１５ａからポケット部１０ｂに向けて検出光Ｌ’を照射し、該検出光Ｌ’の散乱光を検出する。このときの散乱光の強度は、細胞濃縮物Ｃ中の脂肪由来細胞の密度に比例するので、細胞数計測部１１は、検出した散乱光の強度に基づいて脂肪由来細胞の数を算出することができる。
【００４２】
また、上記実施形態で採用した細胞数計測部１１の構成は一例であり、この構成に限定されるものではない。例えば、図１５に示されるように、細胞数計測部１１は、受け面１５ａに設けられたカメラ１１ａと、バケット１４に設けられたメモリ１１ｂとからなり、カメラ１１ａで撮影した画像内の細胞塊Ａの高さ位置をメモリ１１ｂで測定し、測定した高さ位置から細胞数を算出してもよい。このとき、カメラ１１ａで遠心分離容器１０内およびメモリ１１ｂを撮影できるように、適宜バケット１４の一部を透明部材から構成したりバケット１４の一部に穴を形成したりすることができる。
【００４３】
あるいは、図１６に示されるように、脂肪由来細胞が懸濁された状態でバケット１４に付された格子状の線１１ｃをカメラ１１ａで撮影してもよい。この場合、細胞懸濁液の濃度によって線１１ｃの見え方が変化することから、脂肪由来細胞数を計測することができる。
【００４４】
また、細胞数計測部１１は、図１７に示されるように、パネル２１と受け面１５ａとに設けられても良く、図１８に示されるように、パネル１２に２つ設けられても良い。細胞数計測部１１をパネル２１に設ける場合、遠心分離機９の回転が停止したときに、細胞数計測部１１と遠心分離容器１０との位置がずれる可能性がある。したがって、回転停止時にアーム１３ａが細胞数計測部１１に対して所定の位置で停止するように、モータ１３ｂにブレーキを設けてもよく、あるいはアーム１３ａを逆回転させて停止位置を調節してもよい。
【００４５】
また、上記実施形態においては、細胞刺激部１２と細胞数計測部１１との配置は適宜変更可能である。具体的には、細胞刺激部１２と細胞数計測部１１をともにアーム１３ａと一体に設けてもよく、細胞刺激部１２をアーム１３ａと一体に設け細胞数計測部１１をパネル２１に設けてもよく、細胞刺激部１２をパネル２１に設け細胞数計測部１１をアーム１３ａと一体に設けてもよい。
また、細胞数計測部１１として、フローサイトメトリ、粒度分布測定装置または濁度計を用いることもできる。
【符号の説明】
【００４６】
１  細胞分離装置
２  分解処理部
３  細胞濃縮部
４  洗浄液バッグ
５  廃液バッグ
６  搬送経路
７  制御部
８  収集容器
８ａ  底面
８ｂ  フィルタ
９  遠心分離機
１０  遠心分離容器
１０ａ  配管
１０ｂ  ポケット部
１０ｃ  吸引吐出口
１１  細胞数計測部（細胞数計測手段）
１１ａ  カメラ
１１ｂ  メモリ
１１ｃ  格子状の線
１２  細胞刺激部（収量増加部）、ヒータ
１３  回転軸部材
１３ａ  アーム
１３ｂ  モータ（回転部）
１４  バケット
１５  受け部
１５ａ  受け面
１６  磁石
１７  温度センサ
１８  チューブ
１９  送液ポンプ
２０  超音波振動子または赤外光源
２１  パネル
Ａ  細胞塊
Ｂ  上清
Ｃ  細胞濃縮物
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2012010663.tif 000012
【図１１】
2012010663.tif 000013
【図１２】
2012010663.tif 000014
【図１３】
2012010663.tif 000015
【図１４】
2012010663.tif 000016
【図１５】
2012010663.tif 000017
【図１６】
2012010663.tif 000018
【図１７】
2012010663.tif 000019
【図１８】
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