(57)【要約】      （修正有）【課題】逆転写反応と増幅反応とを一連の手順で行う等温増幅方法において、逆転写反応を効率良く進行させることが可能な方法の提供。【解決手段】目的ＲＮＡ鎖の鋳型ＤＮＡ鎖への逆転写反応を行なう手順（１）と、反応溶液に光を照射して、オリゴヌクレオチドプライマーの配列中のヌクレオチドに結合された光分解性保護基を解離させる手順（２）と、鋳型ＤＮＡ鎖の増幅反応を行なう手順（３）と、を含む核酸等温増幅方法。この核酸等温増幅方法では、光分解性保護基が結合されたヌクレオチドを配列中に含むオリゴヌクレオチドプライマーは、手順（１）では光分解性保護基によって相補鎖への結合を阻害され、手順（２）において光分解性保護基が解離された後に、手順（３）で相補鎖に結合するように制御される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的ＲＮＡ鎖の鋳型ＤＮＡ鎖への逆転写反応を行なう手順と、
反応溶液に光を照射して、オリゴヌクレオチドプライマーの配列中のヌクレオチドに結合された光分解性保護基を解離させる手順と、
鋳型ＤＮＡ鎖の増幅反応を行なう手順と、を含む核酸等温増幅方法。
【請求項２】
光分解性保護基は、前記ヌクレオチドの塩基部分に結合されている請求項１記載の核酸等温増幅方法。
【請求項３】
前記光分解性保護基として、６−ニトロピペロニルオキシメチル基を用いる請求項２記載の核酸等温増幅方法。
【請求項４】
前記増幅反応がＬＡＭＰ法である請求項３記載の核酸等温増幅方法。
【請求項５】
前記光分解性保護基が結合されたヌクレオチドは、前記目的ＲＮＡ鎖から前記鋳型ＤＮＡ鎖を剥がしながら相補ＤＮＡ鎖を合成する鎖置換反応に関与するオリゴヌクレオチドプライマーの配列中に含まれている請求項４記載の核酸等温増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸等温増幅方法に関する。より詳しくは、目的ＲＮＡ鎖の鋳型ＤＮＡ鎖への逆転写反応と、鋳型ＤＮＡ鎖の増幅反応と、を一連の手順によって行う核酸等温増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸増幅方法として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法が用いられてきている。ＰＣＲ法は、（１）熱変性、（２）アニーリング、（３）伸長反応の３つの温度ステップからなる温度サイクルを繰り返すことによって、鋳型ＤＮＡ鎖の増幅を行うものである。
【０００３】
ステップ（１）の熱変性は、鋳型ＤＮＡ鎖を二本鎖から一本鎖に解離させるためのステップである。熱変性時の反応温度は、通常９４℃前後とされる。ステップ（２）のアニーリングは、一本鎖に解離した鋳型ＤＮＡ鎖にオリゴヌクレオチドプライマーを結合（アニール）させるためのステップである。アニーリング時の反応温度は、通常５０〜６０℃程度とされる。ステップ（３）の伸長反応は、オリゴヌクレオチドプライマーが結合した部分を起点として、ＤＮＡポリメラーゼによって一本鎖部分と相補的なＤＮＡを合成するステップである。伸長反応時の反応温度は、通常７２℃前後とされる。
【０００４】
また、遺伝子の発現量解析やｃＤＮＡのクローニングのため、上記のＰＣＲ法の前段反応として、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する反応を加えたＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction）法が用いられてきている。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、前段の逆転写反応と後段の増幅反応とを一連の手順で行う１ステップＲＴ−ＰＣＲ法が普及している。
【０００５】
１ステップＲＴ−ＰＣＲ法では、まず逆転写反応において、発現解析やクローニングの対象とするＲＮＡ鎖（ｍＲＮＡ）から相補的なＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）を合成する。この反応は、ＲＮＡ鎖と逆転写酵素、逆転写用のオリゴヌクレオチドプライマーを含む反応溶液を通常４２℃前後に保持することによって行われる。続いて、増幅反応では、合成されたＤＮＡ鎖を鋳型として上述したＰＣＲ反応が行なわれる。増幅反応用のプライマーには、一般に、ＲＮＡ鎖（あるいは鋳型ＤＮＡ鎖）の塩基配列のうち、逆転写用のオリゴヌクレオチドプライマーの結合部位とは異なる部位に結合するものが用いられる。
【０００６】
近年、核酸増幅方法として、温度サイクルの繰り返しを要せず、より簡便な等温増幅と呼ばれる方法が用いられるようになっている。例えば、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法では、オリゴヌクレオチドプライマー、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、核酸モノマー等の試薬と鋳型核酸鎖を混合し、一定温度（６５℃付近）で保温することによって反応が進行する。
【０００７】
本発明に関連して、非特許文献１には、光分解性保護基を結合したチミンを塩基配列中に含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応を制御する方法が記載されている。この方法では、光分解性保護基として、紫外線照射によって解離する６−ニトロピペロニルオキシメチル基（6-nitropiperonyloxymethyl: ＮＰＯＭ）が用いられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】"Light-triggered polymerase chain reaction" Chem. Commun., 2008, 462-464
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
等温増幅方法においても、逆転写反応と増幅反応とを一連の手順で行う１ステップＲＴ−ＬＡＭＰ法などが普及している。しかし、ＬＡＭＰ法では、ＰＣＲ法と異なり、後段の増幅反応が一定温度で進行する。そのため、１ステップＲＴ−ＬＡＭＰ法では、逆転写酵素による逆転写反応と同時に鎖置換型ＤＮＡ合成酵素による増幅反応が進行してしまい、逆転写反応の効率が低下してしまうことが知られている。逆転写反応の効率が低下すると、増幅反応において鋳型となる核酸鎖量が減少するため、遺伝子発現量の解析精度の低下やクローニング効率の低下の要因となる。
【００１０】
そこで、本発明は、逆転写反応と増幅反応とを一連の手順で行う等温増幅方法において、逆転写反応を効率良く進行させることが可能な方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題解決のため、本発明は、目的ＲＮＡ鎖の鋳型ＤＮＡ鎖への逆転写反応を行なう手順（１）と、反応溶液に光を照射して、オリゴヌクレオチドプライマーの配列中のヌクレオチドに結合された光分解性保護基を解離させる手順（２）と、鋳型ＤＮＡ鎖の増幅反応を行なう手順（３）と、を含む核酸等温増幅方法を提供する。
この核酸等温増幅方法では、光分解性保護基が結合されたヌクレオチドを配列中に含むオリゴヌクレオチドプライマーは、手順（１）では光分解性保護基によって相補鎖への結合を阻害され、手順（２）において光分解性保護基が解離された後に、手順（３）で相補鎖に結合するように制御される。
この核酸等温増幅方法において、前記光分解性保護基は、ヌクレオチドの塩基部分に結合されることが好ましく、例えば６−ニトロピペロニルオキシメチル基が用いられる。
また、前記増幅反応は、ＬＡＭＰ法とできる。この場合、光分解性保護基が結合されたヌクレオチドは、前記鋳型ＤＮＡ鎖から前記目的ＲＮＡ鎖を剥がしながら相補ＤＮＡ鎖を合成する鎖置換反応に関与するオリゴヌクレオチドプライマーの配列中に含まれていることが好適となる。
【００１２】
本発明において、「核酸等温増幅反応」には、温度サイクルを伴わない各種核酸増幅反応が含まれる。等温増幅反応としては、例えば、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法やＳＭＡＰ（SMartAmplification Process）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（登録商標）、ＴＲＣ（transcription-reverse transcription concerted）法、ＳＤＡ（strand displacement amplification）法、ＴＭＡ（transcription-mediated amplification）法、ＲＣＡ（rolling circle amplification）法等が挙げられ、核酸の増幅を目的とする等温反応が広く包含されるものとする。また、これらの核酸増幅反応には、リアルタイム（ＲＴ）−ＬＡＭＰ法などの核酸鎖の増幅とともに増幅された核酸鎖の定量を伴う反応も含まれ得る。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、逆転写反応と増幅反応とを一連の手順で行う等温増幅方法において、逆転写反応を効率良く進行させることが可能な方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】目的ＲＮＡ鎖とオリゴヌクレオチドプライマーの配列を説明する図である。
【図２】ヌクレオチドに結合された６−ニトロピペロニルオキシメチル基（ＮＰＯＭ）の光分解反応を説明する図である。
【図３】逆転写反応におけるＤＮＡ合成反応を説明する図である。
【図４】増幅反応の初期段階におけるＤＮＡ合成反応を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序により行う。
１．第一実施形態に係る核酸等温増幅方法
（１）オリゴヌクレオチドプライマーの設計
（２）逆転写反応手順
（３）光分解性保護基の分解手順
（４）増幅反応手順
２．変形例に係る核酸等温増幅方法
【００１６】
１．第一実施形態に係る核酸等温増幅方法
本発明に係る核酸等温増幅方法は、目的ＲＮＡ鎖の鋳型ＤＮＡ鎖への逆転写反応を行なう手順（１）と、反応溶液に光を照射して、オリゴヌクレオチドプライマーの配列中のヌクレオチドに結合された光分解性保護基を解離させる手順（２）と、鋳型ＤＮＡ鎖の増幅反応を行なう手順（３）と、を含む。以下、手順（３）の増幅反応としてＬＡＭＰ法を採用したＲＴ−ＬＡＭＰ法を例として、図１〜４を参照しながら本発明に係る核酸等温増幅方法の手順を具体的に説明する。
【００１７】
（１）オリゴヌクレオチドプライマーの設計
図１は、目的ＲＮＡ鎖（ｍＲＮＡ）とオリゴヌクレオチドプライマー（以下、単に「プライマー」とも称する）の配列を模式的に示す図である。ＲＴ−ＬＡＭＰ法では、目的ＲＮＡ鎖の配列から６つの領域を選択し、４種類のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
【００１８】
各領域を、目的ＲＮＡ鎖の５´末端から順に、Ｆ３，Ｆ２，Ｆ１とＢ１ｃ，Ｂ２ｃ，Ｂ３ｃとする。目的ＲＮＡ鎖に相補的な塩基配列を有する鋳型ＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）には、これらの６つの領域に対してそれぞれ相補的な塩基配列を有するＦ３ｃ，Ｆ２ｃ，Ｆ１ｃとＢ１，Ｂ２，Ｂ３が存在する。
【００１９】
プライマーＢＩＰは、領域Ｂ１ｃ及び領域Ｂ２と同じ塩基配列を含むように設計される。また、プライマーＢ３は、領域Ｂ３と同じ塩基配列を含む。さらに、プライマーＦＩＰは、領域Ｆ１ｃ及び領域Ｆ２と同じ塩基配列を含む。プライマーＦ３は、領域Ｆ３と同じ塩基配列を含むように設計される。
【００２０】
各プライマーの鎖長は、逆転写反応及び増幅反応の反応温度に応じて、融解温度（Ｔｍ）が適当な値となるように設定される。プライマーの融解温度は、逆転写反応及び増幅反応の反応温度条件下において、各プライマーが目的ＲＮＡあるいは鋳型ＤＮＡに結合し得るような値とされる。プライマーの鎖長は、通常、２０ｍｅｒ程度とされる。
【００２１】
このうち、プライマーＢ３及びプライマーＦ３の配列中には、光分解性保護基である６−ニトロピペロニルオキシメチル基（6-nitropiperonyloxymethyl: ＮＰＯＭ）が結合されたヌクレオチドが含まれる。図中、プライマーＢ３（Ｃａｇｅｄ）及びプライマーＦ３（Ｃａｇｅｄ）として示す。
【００２２】
図２に、ヌクレオチドに結合されたＮＰＯＭの光分解反応を示す。ＮＰＯＭは、プライマーの配列中のヌクレオチドの塩基（ここでは、チミン（Ｔ））部分に結合されている。ヌクレオチドの塩基は、相補的な塩基（ここでは、アデニン（Ａ））との間での水素結合を形成するが、ＮＰＯＭが結合したヌクレオチドの塩基では、この水素結合形成に寄与する水素原子がＮＰＯＭによって置換されているため、水素結合を形成できない。このため、配列中にＮＰＯＭが結合されたヌクレオチドを含むプライマーでは、相補鎖に対する結合能が低下し、融解温度が低下する。
【００２３】
塩基に結合されたＮＰＯＭは、紫外線照射により分解され解離する。ＮＰＯＭが解離すると、ＮＰＯＭが結合されていた塩基は、相補的な塩基との間で水素結合を形成できるようになる。このため、配列中のヌクレオチドからＮＰＯＭが解離したプライマーでは、相補鎖に対する結合能が回復し、融解温度が上昇する。
【００２４】
プライマーの配列中に含まれるＮＰＯＭ結合ヌクレオチドの数は、ＮＰＯＭの解離前後でプライマーの融解温度が十分な変化を示すことにより、以下に説明する反応制御が可能である限りにおいて特に限定されない。ＮＰＯＭ結合ヌクレオチドの数は、プライマーの鎖長に応じて適当数とされ得る。平均的な鎖長（２０ｍｅｒ程度）の場合、ＮＰＯＭ結合ヌクレオチドは、１つあるいは２つとされ、３つ以上であれば十分である。
【００２５】
（２）逆転写反応手順
図３に、逆転写反応におけるＤＮＡ合成反応を模式的に示す。
【００２６】
まず逆転写反応では、目的ＲＮＡ鎖と反応溶液とを混合し反応温度に保持して、目的ＲＮＡ鎖から鋳型ＤＮＡ鎖を合成する。反応溶液には、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素（例えば、Ｂｓｔ酵素）、逆転写酵素（例えば、ＡＭＶ酵素）、プライマー、核酸モノマー（ｄＮＴＰ）、緩衝液（バッファー）溶質などが含まれる。
【００２７】
逆転写反応では、目的ＲＮＡ鎖の領域Ｂ２ｃにプライマーＢＩＰが結合（アニール）し、逆転写酵素によって目的ＲＮＡ鎖に相補的な鋳型ＤＮＡ鎖が合成される（図中矢印参照）。なお、図に示す目的ＲＮＡ鎖をセンス鎖としたときにアンチセンス鎖となるＲＮＡ鎖が存在する場合には、アンチセンスＲＮＡ鎖の領域Ｆ２ｃに結合したプライマーＦＩＰを起点として同様の逆転写反応が進行する。
【００２８】
逆転写反応は、所定の反応温度（例えば、４０〜６５℃）で行なわれる。反応温度は、逆転写酵素が活性を示す温度範囲内において任意の温度が選択できる。
【００２９】
プライマーＢ３（Ｃａｇｅｄ）及びプライマーＦ３（Ｃａｇｅｄ）は、配列中に含まれるＮＰＯＭ結合ヌクレオチドのために融解温度が低くなっている。そのため、プライマーＢ３及びプライマーＦ３は、逆転写反応の反応温度あるいは次に説明する増幅反応の反応温度において、そのままでは目的ＲＮＡ鎖に結合できないようにされている。
【００３０】
従って、逆転写反応手順では、目的ＲＮＡ鎖にプライマーＢＩＰ及びプライマーＦＩＰのみが結合できることとなり、これらのプライマーを起点とした目的ＲＮＡ鎖の鋳型ＤＮＡ鎖への逆転写反応が効率的に進行する。
【００３１】
（３）光分解性保護基の分解手順
逆転写反応手順の完了後、反応溶液に紫外線を照射して、プライマーＢ３及びプライマーＦ３の配列中のヌクレオチドに結合されたＮＰＯＭを分解し、解離させる。
【００３２】
ＮＰＯＭが解離すると、プライマーＢ３及びプライマーＦ３は、融解温度が上昇する。そのため、プライマーＢ３及びプライマーＦ３は、次に説明する増幅反応の反応温度において目的ＲＮＡ鎖に結合できるようになる。
【００３３】
（４）増幅反応手順
図４に、増幅反応の初期段階におけるＤＮＡ合成反応を模式的に示す。
【００３４】
増幅反応では、まず、プライマーＢＩＰの外側に、ＮＰＯＭが解離したプライマーＢ３（図中、プライマーＢ３（Ｕｎｃａｇｅｄ）として示す）が結合し、逆転写反応においてプライマーＢＩＰを起点として伸長合成された鋳型ＤＮＡ鎖を目的ＲＮＡ鎖から剥がしながら新たなｃＤＮＡが合成される（図４（Ａ）中矢印参照）。
【００３５】
アンチセンス鎖のＲＮＡ鎖が存在する場合には、プライマーＦＩＰの外側に、ＮＰＯＭが解離したプライマーＦ３が結合し、同様の鎖置換反応が進行する。以下では、簡単のため、センス鎖の反応についてのみ説明する。
【００３６】
次に、目的ＲＮＡ鎖から剥がされた、プライマーＢＩＰを起点として伸長合成された鋳型ＤＮＡ鎖の領域Ｆ２ｃにプライマーＦＩＰが結合する。プライマーＦＩＰが結合すると、プライマーＦＩＰを起点として、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素によって鋳型ＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖が合成される（図４（Ｂ）中矢印参照）。
【００３７】
続いて、プライマーＦＩＰの外側にプライマーＦ３が結合し、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素によってプライマーＦＩＰを起点として伸長合成された、鋳型ＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖を剥がしながら新たなＤＮＡ鎖が合成される（不図示）。そして、剥がされた、鋳型ＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖を増幅サイクルの起点構造として、通常のＬＡＭＰ法と同様の反応によって鋳型ＤＮＡ鎖の増幅反応が行なわれる。
【００３８】
増幅反応は、所定の反応温度（例えば、４０〜６５℃）で行なわれる。反応温度は、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素が活性を示す温度範囲内において任意の温度が選択できる。
【００３９】
本発明に係る核酸等温増幅方法では、プライマーＢ３（及びプライマーＦ３）の配列中のヌクレオチドにＮＰＯＭを結合することによって、逆転写反応手順においてプライマーＢ３（Ｃａｇｅｄ）が目的ＲＮＡ鎖に結合しないように制御できる（図３参照）。また、光分解性保護基の分解手順において、プライマーＢ３の配列中のヌクレオチドに結合したＮＰＯＭを解離させることで、増幅反応手順においてのみプライマーＢ３（Ｕｎｃａｇｅｄ）が目的ＲＮＡ鎖に結合するように制御できる（図４（Ａ）参照）。
【００４０】
逆転写反応手順においてプライマーＢ３が目的ＲＮＡ鎖に結合すると、プライマーＢＩＰを起点として伸長されている鋳型ＤＮＡ鎖が、プライマーＢＩＰの外側に結合したプライマーＢ３を起点として伸長合成されてくるｃＤＮＡによって剥がされてしまう。また、目的ＲＮＡ鎖に非特異的に吸着したプライマーＢ３によって、プライマーＢＩＰを起点とした鋳型ＤＮＡ鎖の合成が阻害されるおそれもある。これらはいずれも逆転写反応の反応効率を低下させる要因となる。
【００４１】
本発明に係る核酸等温増幅方法では、ＮＰＯＭの結合・解離を制御することで、増幅反応においてのみプライマーＢ３が目的ＲＮＡ鎖に結合するようにできる。従って、上記のような逆転写反応手順においてプライマーＢ３が目的ＲＮＡ鎖に結合することに起因して生じる逆転写反応効率の低下を防止することが可能である。
【００４２】
２．変形例に係る核酸等温増幅方法
第一の実施形態に係る核酸等温増幅方法では、プライマーＢ３（及びプライマーＦ３）の配列中にのみ、ＮＰＯＭが結合されたヌクレオチドが含まれる場合を例に説明した。ＮＰＯＭが結合されたヌクレオチドは、プライマーＢＩＰ（及びプライマーＦＩＰ）にも含まれていてよいが、プライマーＢ３に含まれるＮＰＯＭ結合ヌクレオチドの数は、プライマーＢＩＰに含まれるＮＰＯＭ結合ヌクレオチドの数よりも多くされる必要がある。すなわち、プライマーＢ３は、プライマーＢＩＰよりも多くのＮＰＯＭ結合ヌクレオチドを含むことにより、プライマーＢＩＰよりも融解温度が低くされる必要がある。この場合、逆転写反応手順の反応温度をプライマーＢ３の融解温度よりも高くすることで、プライマーＢ３が目的ＲＮＡ鎖に結合しないように制御できる。また、増幅反応手順の反応温度をＮＰＯＭが解離したプライマーＢ３の融解温度よりも低くすることで、光分解性保護基の分解手順後の増幅手順においては、プライマーＢ３が目的ＲＮＡ鎖に結合するように制御できる。
【００４３】
また、第一の実施形態に係る核酸等温増幅方法では、光分解性保護基としてＮＰＯＭを用いる場合を例に説明した。光分解性保護基は、プライマーの配列中のヌクレオチドの塩基部分に結合され、該塩基と相補的な塩基との間の水素結合形成を阻害し得るものであり、光の照射によって分解されて該阻害を解除可能なものであれば特に限定されないものとする。また、光分解性保護基が結合される塩基はチミン（Ｔ）に限定されず、使用する保護基に応じてアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）であってもよい。
【００４４】
さらに、光分解性保護基に替えて、光に応答して立体構造（シス‐トランス）が変換する光応答性物質を用いることもできる。光応答性物質としては、例えば、核酸の二本鎖形成の光制御への利用が報告されているアゾベンゼンを採用できる（"Photoregulation of DNA triplex formation by azobenzene." J Am Chem Soc. 2002, Vol.124, No.9, p.1877-83参照）。アゾベンゼンをヌクレオチドの塩基部分あるいはヌクレオチドの鎖状構造部分（五炭糖とエステル結合）に結合し、その立体構造を光照射によって変換することで、塩基対間の水素結合を可逆的に不安定化あるいは安定化することができる。従って、アゾベンゼンを結合したプライマーでは、立体構造の変換前後でプライマーの融解温度を変化させることができ、光分解性保護基を結合したプライマーと同様の反応制御が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明に係る核酸等温増幅方法によれば、逆転写反応を効率良く進行させることにより、遺伝子の発現量解析やクローニングにおいて高い精度や効率を実現することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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