(57)【要約】【課題】  異なる液体界面で順次送液する溶液間の拡散を防ぐことで感度の低下を抑制し、液滴中に含まれる検体を検出するセンサを提供する。【解決手段】  溶媒中に懸濁した検体を検出するための検体検出用チップであって、前記溶媒の液滴を搬送するための搬送用電極を有する搬送用基板と、前記搬送用基板に対向する対向基板と、前記液滴が通過する、前記基板搬送用基板と前記対向基板との間に形成された流路と、前記流路の一部に設けられた、リガンドが固定化された固定部を備え、前記固定部に前記液滴が滞留することによって検体の検出を行うことを特徴とする検体検出用チップ。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶媒中に懸濁した検体を検出するための検体検出用チップであって、
前記溶媒の液滴を搬送するための搬送用電極を有する搬送用基板と、
前記搬送用基板に対向する対向基板と、
前記液滴が通過する、前記基板搬送用基板と前記対向基板との間に形成された流路と、
前記流路の一部に設けられた、リガンドが固定化された固定部を備え、
前記固定部に前記液滴が滞留することによって検体の検出を行うことを特徴とする検体検出用チップ。
【請求項２】
前記搬送用電極は、前記液滴のぬれ性を変化させる搬送用電極であって、
前記液滴のぬれ性を変化させることにより前記液滴が搬送されることを特徴とする請求項１記載の検体検出用チップ。
【請求項３】
前記搬送用電極は、表面波を発生させる搬送用電極であって、
前記液滴が前記表面波によって搬送されることを特徴とする請求項１記載の検体検出用チップ。
【請求項４】
前記搬送用電極は複数であって、前記搬送用電極の各面積は、前記固定部の面積よりも大きいことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の検体検出用チップ。
【請求項５】
前記流路は、少なくとも一部が疎水性膜で覆われており、
前記固定部は前記疎水性膜で覆われていないことを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに記載の検体検出用チップ。
【請求項６】
前記検体検出用チップは、前記液滴の量を制御する液滴制御手段を更に備え、
前記液滴制御手段は、前記液滴が前記搬送用基板と接する面積が、前記固定部の面積よりも大きくなるように前記液滴の量を制御するものであることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれかに記載の検体検出用チップ。
【請求項７】
請求項１から請求項６のいずれかに記載の検体検出用チップと、検体を光学的に検出する検出手段を備えることを特徴とする検体検出用センサ。
【請求項８】
請求項１から請求項６のいずれかに記載の検体検出用チップと、検体を電気的に検出する少なくとも１つの検出電極を備えることを特徴とする検体検出用センサ。
【請求項９】
前記流路は、少なくとも一部が疎水性膜で覆われており、
前記固定部及び前記検出電極が疎水性膜で覆われていないことを特徴とする請求項８記載の検体検出用センサ。
【請求項１０】
前記搬送用電極は複数であって、前記搬送用電極の各面積は、前記検出電極および前記固定部の面積よりも大きいことを特徴とする請求項８または請求項９に記載の検体検出用センサ。
【請求項１１】
請求項６に記載の検体検出用チップを備え、
前記検体検出用チップに配置された前記液滴制御手段は、前記液滴が前記搬送用基板と接する面積が、前記検出電極および前記固定部の面積より大きくなるように前記液滴の量を制御するものであることを特徴とする請求項８記載の検体検出用センサ。
【請求項１２】
検体が懸濁した溶媒の液滴を電気的に制御して流路内を搬送する工程と、
前記流路の一部に設けられた、リガンドが固定化された固定部に、前記液滴を滞留させて、前記検体と前記リガンドを反応させる工程と、
前記検体を検出する工程を含む検体検出方法であって、
前記流路は、前記溶媒の液滴を搬送するための搬送用電極を有する搬送用基板と、前記搬送用基板に対向する対向基板との間に形成されており、
前記液滴が前記搬送用基板と接する面積が、前記固定部が流路に面する面積よりも大きくなるように、前記液滴が搬送されることを特徴とする検体検出方法。
【請求項１３】
前記液滴の量を制御する工程を含む請求項１２記載の検体検出方法。
【請求項１４】
前記搬送する工程では、前記液滴のぬれ性を変化させることによって前記液滴が搬送されることを特徴とする請求項１２記載の検体検出方法。
【請求項１５】
前記搬送する工程では、表面波によって前記液滴が搬送されることを特徴とする請求項１２記載の検体検出方法。
【請求項１６】
前記検体は、検出電極を用いて電気的に検出され、
前記液滴が前記搬送用基板と接する面積が、前記固定部および前記検出電極の面積よりも大きくなるように前記液滴が搬送されることを特徴とする請求項１２から請求項１５のいずれかに記載の検体検出方法。
【請求項１７】
前記検出電極は、少なくとも作用電極、及び参照電極により形成されていることを特徴とする請求項１６記載の検体検出方法。
【請求項１８】
前記作用電極及び参照電極は、前記液滴と同時に接触できるように配置されていることを特徴とする請求項１７記載の検体検出方法。
【請求項１９】
前記検出電極は、作用電極、参照電極及び対向電極により形成されていることを特徴とする１６記載の検体検出方法。
【請求項２０】
前記作用電極、参照電極及び対向電極は、前記液滴と同時に接触できるように配置されていることを特徴とする請求項１９記載の検体検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体中に含まれる特定の微量物質のみを分離、検出するための検体検出用センサに関し、特に、液滴を利用する検体検出用センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、環境や医療分野にて、サンプル中に含まれる複合物質から特定の物質（以下、検体と記す）を検出するために、さまざまな方法が用いられてきた。近年では、Ｍｉｃｒｏ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）やラボチップ（Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ）と呼ばれる分析装置が開発されている。
【０００３】
特許文献１には、基板部、光硬化性樹脂製流路、光透過性のあるカバー基板より構成されたマイクロ流路デバイスであって、基板部とカバー基板との間に未硬化性樹脂を充填した後に、光硬化反応によって流路パターンを形成することにより、マイクロ流路を一体に構成するマイクロ流路デバイスが提案されている。また、特許文献２には、酵素を標識として用いて基質溶液を呈色させて、当該色の変化を測定する酵素免疫分析システムをマイクロチップ内に集積化する酵素免疫分析チップが提案されている。
【０００４】
これらのデバイスでは、デバイス内に設けられた反応部や検出部へ、サンプルや反応溶液を順次送液する必要があるため、ポンプや、流路内での液体を制御するためのバルブ、毛管力などを利用した送液手段が用いられる。
【０００５】
さらに非常に少量の液体または液滴を運ぶ方法として、圧電体膜に高周波信号を印加して表面波（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｗａｖｅ）を励振することを利用する方法、液滴と基板の間に電位差を与えて、液滴の基板に対する見掛けの濡れ性を変化させることを利用するエレクトロウェッティング（Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｗｅｔｔｉｎｇ、Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｗｅｔｔｉｎｇ  Ｏｎ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ）、静電場によって電場の強い部分もしくは弱い部分へ液滴を移動させる誘電泳動（Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）などの方法を用いたデバイスも提案されている。（特許文献３、４参照）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００３−０６２８２３号公報（平成１５年７月３１日公開）
【特許文献２】特開２００３−２８５２９８号公報（平成１５年１０月７日公開）
【特許文献３】特開２００５−１３０８５１号公報（平成１７年５月２６日公開）
【特許文献４】特開２００８−１３４１５２号公報（平成２０年６月１２日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記特許文献１及び特許文献２に示されたデバイスを用いて、サンプル中に含まれる様々な物質（以下、複合物質と記す）から検体のみを検出する場合、たとえば、先に流したサンプル溶液と、次に流した反応溶液との界面（液／液界面）で各々の溶液の拡散が起き、界面において溶液の濃度が変化し、正確に検体を検出できないといった問題が生じる。また、デバイス内に設けられた反応部及び検出部へ溶液を順次送液するためのポンプなどが必要となるため、装置自体が大掛かりになる。
【０００８】
一方、上記特許文献３及び特許文献４に示されるような、拡散しない液滴を用いた搬送デバイスは、検査試薬が少量ですむ、反応時間が短縮されるなどのメリットはあるものの、リガンドを固定化しない反応または検出に用途が限られ、リガンドを固定化した場合は、液滴の搬送を阻害する虞がある。
【０００９】
図１３は、液滴、基板、気体あるいは液滴と交じり合わない液体との間の接触角について示した図である。液滴９０は、液滴９０と基板９１の間の界面張力９３、液滴９０と気体、あるいは液滴と混じり合わない液体９２との間の界面張力９４、基板９１と気体、あるいは液滴と混じり合わない液体９２との間の界面張力９５の３つの力が釣り合って形作られる。
【００１０】
液滴９０を搬送する場合、電気的制御を行っていない時の接触角は高いことが望ましいが、検体検出用デバイスを構成する固定部や検出部は液滴搬送に適した表面状態ではなく、それぞれの材料に依存した表面状態になっている。固定部や検出部の接触角がその他の流路面よりも低い、つまり基板に対して液滴が濡れやすい表面状態の場合、液滴９０はその場に留まりやすく、搬送することが困難になる。
【００１１】
そこで、液滴９０の搬送を容易にするために、流路の表面を疎水性に保つ必要があるが、リガンドが固定化された部分（固定部）は、サンプルと反応させる必要があるため、その表面を疎水性にすることができない。このため、流路に面した固定部の状態が疎水性である他の部分と異なってしまうため、液滴９０の搬送が円滑に行えず、また、流路の表面の疎水性が低下することによって、電圧印加時の流路表面状態の変化が小さくなったり、流路表面の摩擦が大きくなったりするために、液滴９０の搬送が困難になる。このような事情から、サンプルとして液滴９０を用いて、リガンドを固定化し、サンプル中の複合物質から所望の検体を検出する有効なデバイスは、いまだ実用化されていない。
【００１２】
本発明は、上記の各問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、順次搬送される溶液（液滴）間の拡散を防いだ状態で、感度の低下を抑制しながら、固定化されたリガンドによって送液の安定性が阻害されることを防止しつつ、液滴中に含まれる検体を検出可能な検体検出用チップ、それを用いたセンサ、及び検体検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に係る検体検出用チップは、溶媒中に懸濁した検体を検出するための検体検出用チップであって、前記溶媒の液滴を搬送するための搬送用電極を有する搬送用基板と、前記搬送用基板に対向する対向基板と、前記液滴が通過する、前記基板搬送用基板と前記対向基板との間に形成された流路と、前記流路の一部に設けられた、リガンドが固定化された固定部を備え、前記固定部に前記液滴が滞留することによって検体の検出を行うことを特徴とする。
【００１４】
また、前記搬送用電極は、前記液滴のぬれ性を変化させる搬送用電極であって、前記液滴のぬれ性を変化させることにより前記液滴が搬送されることを特徴としてもよい。また、前記搬送用電極は、表面波を発生させる搬送用電極であって、前記液滴が前記表面波によって搬送されることを特徴としてもよい。
【００１５】
また、前記搬送用電極は複数であって、前記搬送用電極の各面積は、前記固定部の面積よりも大きいことを特徴としてもよい。また、前記流路は、少なくとも一部が疎水性膜で覆われており、前記固定部は前記疎水性膜で覆われていないことを特徴としてもよい。また、前記検体検出用チップは、前記液滴の量を制御する液滴制御手段を更に備え、前記液滴制御手段は、前記液滴が前記搬送用基板と接する面積が、前記固定部の面積よりも大きくなるように前記液滴の量を制御するものであることを特徴としてもよい。
【００１６】
本発明にかかる検体検出用センサは、上記のいずれかに記載の検体検出用チップと、検体を光学的に検出する検出手段を備えることを特徴とする。また、本発明に係る検体検出用センサは、上記のいずれかに記載の検体検出用チップと、検体を電気的に検出する少なくとも１つの検出電極を備えることを特徴としてもよい。また、前記流路は、少なくとも一部が疎水性膜で覆われており、前記固定部及び前記検出電極が疎水性膜で覆われていないことを特徴としてもよい。
【００１７】
また、前記搬送用電極は複数であって、前記搬送用電極の各面積は、前記検出電極および前記固定部の面積よりも大きいことを特徴としてもよい。また、上記に記載の検体検出用チップを備え、前記検体検出用チップに配置された前記液滴制御手段は、前記液滴が前記搬送用基板と接する面積が、前記検出電極および前記固定部の面積より大きくなるように前記液滴の量を制御するものであることを特徴としてもよい。
【００１８】
本発明に係る検体検出方法は、検体が懸濁した溶媒の液滴を電気的に制御して流路内を搬送する工程と、前記流路の一部に設けられた、リガンドが固定化された固定部に、前記液滴を滞留させて、前記検体と前記リガンドを反応させる工程と、前記検体を検出する工程を含む検体検出方法であって、前記流路は、前記溶媒の液滴を搬送するための搬送用電極を有する搬送用基板と、前記搬送用基板に対向する対向基板との間に形成されており、前記液滴が前記搬送用基板と接する面積が、前記固定部が流路に面する面積よりも大きくなるように、前記液滴が搬送されることを特徴とする。
【００１９】
また、前記液滴の量を制御する工程を含むことを特徴としてもよい。また、前記搬送する工程では、前記液滴のぬれ性を変化させることによって前記液滴が搬送されることを特徴としてもよい。また、前記搬送する工程では、表面波によって前記液滴が搬送されることを特徴としてもよい。また、前記検体は、検出電極を用いて電気的に検出され、前記液滴が前記搬送用基板と接する面積が、前記固定部および前記検出電極の面積よりも大きくなるように前記液滴が搬送されることを特徴としてもよい。
【００２０】
また、前記検出電極は、少なくとも作用電極、及び参照電極により形成されていることを特徴としてもよい。また、前記作用電極及び参照電極は、前記液滴と同時に接触できるように配置されていることを特徴としてもよい。
【００２１】
また、前記検出電極は、作用電極、参照電極及び対向電極により形成されていることを特徴としてもよい。また、前記作用電極、参照電極及び対向電極は、前記液滴と同時に接触できるように配置されていることを特徴としてもよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の検体検出用センサによれば、順次搬送される異なる溶液（液滴）の界面における溶液の拡散を防いだ状態で、感度の低下を抑制し、固定化されたリガンドによって搬送の安定性が阻害されることを防止し、かつ、液滴中に含まれる検体を検出することができるセンサを実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施形態１にかかる検体検出用センサの断面図である。
【図２】実施形態１にかかる検体検出用センサに液滴を送液したときの、検体検出用センサの断面図である。
【図３】実施形態１にかかる検体検出用センサに液滴を送液したときの、検体検出用センサの斜視図である。
【図４】実施形態１にかかる検体検出用センサに液滴を送液したときの、検体検出用センサの平面図である。
【図５】液滴、搬送用電極、固定部、及び検出電極の関係を示した図である。
【図６】３電極方式の検出電極と固定部を示した図である。
【図７】ＥＬＩＳＡ法を用いて検体を検出する手順を示したフローチャートである。
【図８】実施形態２にかかる検体検出用センサに液滴を送液したときの、検体検出用センサの断面図である。
【図９】実施形態２にかかる検体検出用センサに液滴を送液したときの、検体検出用センサの断面図である。
【図１０】実施形態３にかかる検体検出用センサに液滴を送液したときの、検体検出用センサの断面図である。
【図１１】実施形態４にかかる検体検出用センサに液滴を送液したときの、検体検出用センサの断面図である。
【図１２】ＩＤＴの概略平面図である。
【図１３】液滴、基板、気体の接触角を説明した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の実施の形態について以下に説明する。なお、本発明の図面において、同一の参照符号は、同一部分または相当部分を表わすものとする。
【００２５】
＜実施形態１＞
本実施形態では、免疫分析法による特定蛋白質の測定を行う。ここでは、特定蛋白質としては、メタボリックシンドロームの発症にかかわるアディポネクチンを用い、当該特定蛋白質の濃度の測定を電気化学測定法により行った。しかしながら、本発明は、これらの構成に限定されない。
【００２６】
（センサの構成）
図１は、本実施形態に係る検体検出用センサ１の断面図である。本実施形態では、液滴を搬送する方法としてエレクトロウェッティングを用いている。検体検出用センサ１は、搬送用基板１１、搬送用電極１２、誘電体膜１３、疎水性膜１４ａ、疎水性膜１４ｂ、搬送用電極を持たない基板１５、検出電極１６、固定部１７より構成される。なお、本発明において「液滴」とは、気体または極性が異なる液体などのよって分離されている液体を意図する。なお、個々の液滴の体積は、特に限定されない。
【００２７】
搬送用基板１１、及び搬送用電極を持たない基板１５としては、例えばガラス基板やＳｉ基板などを用いることができる。搬送用基板１１上には、搬送用電極１２が複数配置され、この搬送用電極１２に電圧を印加することで、液滴を搬送する。搬送用電極１２上には、誘電体膜１３が形成される。誘電体膜１３は窒化シリコン、酸化シリコン、酸化タンタル、酸化チタン、チタン酸バリウムなどから成り、誘電性を持つものである。
【００２８】
誘電体膜１３上には、疎水性膜１４ａが形成され、当該疎水性膜１４ａと向かい合うように疎水性膜１４ｂが形成されている。そして、疎水性膜１４ａと疎水性膜１４ｂとの間が液滴が搬送される空間となる。疎水性膜１４ａ及び疎水成膜１４ｂは、例えばフッ素系樹脂などから成り、水に対する親和性が低い性質を持ち、疎水性膜１４ａと疎水成膜１４ｂとは、同一材料であっても材質が近い異なる材料であっても良い。
【００２９】
疎水成膜１４ｂの上には、搬送用電極を持たない基板１５が形成される。搬送用電極を持たない基板１５には、固定部１７、及び検出電極１６が配置されている。検出電極１６は通常、２つの電極あるいは３つの電極、または複数の異なる形状の電極から構成され、これらの複数の電極はまとめて一つの検出電極１６の働きをする。当該検出電極１６によって、例えば、後述するリガンドに検体が結合したことを検知することができる。電極の材料としては主に金、白金などが用いられる。図１において、検出電極１６は、搬送用電極を持たない基板１５上に直接形成されているが、これは検出電極１６を形成する前に一旦レジストを塗布する必要があるためである。すなわち、下地が疎水性膜１４ｂの場合、レジストをはじく可能性があり、搬送用電極を持たない基板１５に検出電極１６を形成し、その後、疎水性膜１４ｂを検出電極１６の部分のみ除くようにして形成している。検出電極１６の少なくとも一部には固定部１７が配置され、固定部１７には検体と反応するリガンドが固定されている。
【００３０】
図３は、本実施形態の検体検出用センサ１の斜視図であり、図４は、本実施形態の検体検出用センサ１の平面図である。ここでは、わかりやすいように搬送用電極を持たない基板１５を省略している。搬送用電極１２は、それぞれスイッチＳＷ１、ＳＷ２、ＳＷ３に接続されており、スイッチのＯＮ／ＯＦＦにより、個々の搬送電極１２に対する電圧の印加状態を制御することができる。そして、個々の搬送用電極１２に対する電圧の印加状態を制御することによって、液滴２を移動させることができる。なお、スイッチの数は特に限定されず、必要な数だけ設けることが可能である。
【００３１】
図３及び図４においては、スイッチＳＷ２が接続状態となっている。ここで、矢印の方向に液滴を移動させたい場合は、スイッチＳＷ２を開放するとともにスイッチＳＷ３を接続する。スイッチが接続されると、電圧は液滴２の移動が観察されるまで印加され、閾値電圧を越えると液滴２は次の搬送用電極に移動する。これを繰り返すことで液滴２を目的の場所へと移動させる。電圧の印加方法はこのような直流法に限られず、交流法で行うこともできる。また、基板電極上の電位変化に応じてぬれ性が変化することから、上記電位の印加方法に限らず、電位変化を与えれば液滴２は搬送することができる。
【００３２】
図５の（ａ）及び（ｂ）は、液滴２と搬送用電極１２の関係を示した図である。搬送用電極１２の形状は、図５（ｂ）に示したような形であってもよいし、その他のどのような形でも構わない。図５（ａ）において、液滴２が疎水性膜１４ａと、あるいは疎水性膜１４ｂ、検出電極１６、及び固定部１７と接触している面２ａは、図５（ａ）に示す矢印方向、つまりほぼ真上から見たときに、図５（ｂ）に示すように、液滴２の進行方向に沿って直下の搬送用電極１２に必ず複数かかるようにする。
【００３３】
図５の（ａ）及び（ｂ）においては、面２ａは、搬送用電極１２ａ、１２ａ´、１２ｂ、１２ｂ´にかかっている。なお、搬送用電極１２ａと１２ａ´のように複数の電極で搬送用電極１２を形成している場合は、これを一つの搬送用電極とみなす。よって、図５（ｂ）の上から見たように、面２ａは、２つの電極にかかっている。本実施形態のように、搬送用電極１２と液滴２をこのよう設定することにより、液滴２の搬送が行われる。具体的な設定方法としては、たとえば、サンプルの液滴２の量、搬送用電極１２の大きさ、搬送用電極１２の配置間隔を調整するなどの方法がある。液滴２の搬送量を制御するために液滴制御手段（図示せず）を設けても良い。
【００３４】
当該液滴制御手段は、液滴２の搬送量を制御することができるものであれば、その具体的な構成は特に限定されない。例えば、当該液滴制御手段は、所定の量の液滴２を疎水成膜１４ａと疎水成膜１４ｂとの間の流路に導入するものであってもよい。この場合、液滴制御手段は、所定の体積を有する液滴を形成するための液滴作製部と、所定の体積を有する液滴を流路へ導入するためのポンプとを備え得るが、当該構成に限定されない。なお、個々の液滴の体積は搬送用電極１２の大きさ、及び搬送用電極１２の配置間隔などに基づいて、適宜設定することが可能である。
【００３５】
あるいは、搬送用基板１１と搬送用電極を持たない基板１５の配置を調整して、液滴２の搬送される空間（高さ）を決定することで設定できる。この場合、液滴２の接触面積を一定にするため、流路における搬送用基板１１と搬送用電極を持たない基板１５との間隔を一定に保つようにすることが好ましい。
【００３６】
次に検出電極１６と固定部１７について詳細に説明する。図１においては、検出電極１６及び固定部１７は搬送用電極を持たない基板１５側に作製されているが、搬送用基板１１側に作製しても構わない。また、検出電極１６及び固定部１７は、１つの流路に対して、１つ作製されてもよいし、複数作製されてもよい。検出用電極１６及び固定部１７を複数作製する場合には、検出電極１６及び固定部１７は、搬送用電極を持たない基板１５側と搬送用基板１１側とのの両方に作製されてもよいし、どちらか一方のみに作製されてもよい。また、複数設けられる検出用電極１６及び固定部１７は、同じ構成であってもよいし、異なる構成であってもよい。
【００３７】
検出電極１６、及び固定部１７の表面（流路に面した表面）は疎水性膜１４ｂで覆われていないため、液滴２を円滑に搬送するためには、検出電極１６、及び固定部１７を搬送用電極１２よりも小さく設けることが望ましい。さらに、検出電極１６、及び固定部１７は、図５（ａ）で示した液滴２が疎水性膜１４ａ、あるいは疎水性膜１４ｂと接触している面２ａよりも、小さく設けることが好ましい。これによって、例えば、リガンドと検体を効率よく反応させることができる。
【００３８】
固定部１７のリガンドに反応した検体を検出する方法として、ここでは、一般的な電気化学測定法を用いることが可能であるが、本発明はこれに限定されるものではない。電気化学測定法では２電極方式と３電極方式がある。２電極方式の場合は、作用電極と参照電極により構成されるが、正確な電位の測定には３電極方式が望ましい。
【００３９】
図６（ａ）は３電極方式の場合の検出電極１６と固定部１７を示している。検出電極１６は電気化学測定用電極の対向電極１６１、作用電極１６２、参照電極１６３から構成される。
【００４０】
対向電極１６１は作用電極１６２が電子を受け取る（または、放出する）のと同じ速さで、電子を放出する（または、受け取る）必要がある。参照電極１６３は、作用電極１６２の電位を測定・制御し、例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極などを使用すること可能である。固定部１７は作用電極１６２上にリガンドとして例えば抗体を物理吸着によって、固定化することで形成される。
【００４１】
図６（ｂ）は３電極方式の検出電極１６及び固定部１７を図５（ａ）における矢印方向から見た平面図である。図６（ｃ）は、検出電極１６及び固定部１７を拡大した平面図である。ここで、図６（ｃ）において、対向電極１６１、作用電極１６２、参照電極１６３のそれぞれの間を占める面を面１６４、面１６５とすると、対向電極１６１、作用電極１６２、参照電極１６３、面１６４、面１６５を合わせた領域を検出電極領域１６ａと規定することができる。ここで示したような３電極方式あるいは２電極方式といった複数の電極よりなる検出電極１６を用いる場合には、それぞれの電極で挟まれた面を含んだ検出電極領域１６ａは、液滴２が疎水性膜１４ａ、あるいは疎水性膜１４ｂと接触している面２ａよりも、小さく設けられることが好ましい。このようにすることで、例えば、検体がリガンドをほぼ覆うことになり、検体とリガンドを効率よく反応させることができる。また、検出電極領域１６ａは、搬送用電極１２よりも小さく設けられることが好ましい。
【００４２】
あるいは、３電極方式の場合、液滴が、作用電極、参照電極及び対向電極と同時に接触できるように配置されることが望ましい。なお、ここでいう同時に接触とは、流路内を液滴が搬送される過程において、液滴が作用電極、参照電極及び対向電極の3つの電極に、同時に接触する時間が存在することを意味する。
【００４３】
また、２電極方式の場合は、少なくとも作用電極、及び参照電極により形成され、液滴が、作用電極及び参照電極と同時に接触できるように配置されることが望ましい。なお、ここでいう同時に接触とは、流路内を液滴が搬送される過程において、液滴が作用電極及び参照電極に同時に接触する時間が存在することを意味する。
【００４４】
（検出手順）
次に、リガンドとして抗体を、検体として抗原を用い、イムノアッセイのうちのＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）を用いて検出する手順を以下に説明する。
【００４５】
図７は、ＥＬＩＳＡ法を用いて検体を検出する手順の一例を示したフローチャートである。Ｓはフローチャートにおける各ステップを表す。まず、一次抗体であるリガンドを、予め固定部１７に固定化する（Ｓ７１）。ここでは、リガンドとして一次抗体溶液（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社製  ＭＡＢ１０６５１）を用いて検出電極１６上にスポッティング後、３７℃で６０分間インキュベーションし、物理吸着固定した。なお、図６では、作用電極１６２上にリガンドを固定化しているが、これに限られるものではない。ただし、固定部１７での反応で生成された電気化学物質を作用電極で酸化還元反応させるため、固定部１７は作用電極１６２に近いことが望ましい。なお、検出電極としては、一般的なものを用いることが出来る。
【００４６】
次に、電気化学測定用電極全体に、非特異吸着を防ぐためのブロッキングを行う（Ｓ７２）。これは、固定部１７の表面全てがリガンド抗体で隙間なく覆われているわけではなく、隙間があるため、当該隙間に対する非特異吸着を防ぐ必要があるためである。ここでは、ブロッキング液として１％のＢＳＡ溶液を用い、検出電極１６近傍にスポッティング後、室温にて６０分間インキュベーションした。なお、ブロッキング剤としては、ＢＳＡ溶液以外に、例えば、カゼインなどが用いられるが、これらに限定されない。ブロッキング後、余分なブロッキング剤をトリス緩衝液で洗浄し、洗い流した（Ｓ７３）。なお、洗浄に用いる溶液はトリス緩衝液に限定されず、検体の検出を妨げない溶液であれば、如何なる溶液を用いてもよい。
【００４７】
次に、検出方法はここでは電気化学測定を用いるため、後ほどの工程で行われる酵素基質反応で電気化学物質を生成する酵素と基質を選択し、酵素は二次抗体にて予め標識しておく。ここで酵素としては特に限定されず、適宜、所望の酵素を用いることが可能である。例えば、上記酵素としては、ＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐａｔａｓｅ）、グルコースオキシダーゼなどを用いることが可能であって、基質としては、各々の酵素に対してｐＡＰＰ（ｐ−Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、フェリシアン化カリウムなどを用いることが可能である。酵素基質反応によって生成される電気化学活性物質としては、ｐＡＰ（パラアミノフェノール）、フェロシアン化カリウム、フェロセン、およびフェロセン誘導体を含むか、もしくはｐＡＰ、フェロシアン化カリウム、フェロセン、またはフェロセン誘導体などがある。
【００４８】
本実施の形態では、酵素の一例としてＡＬＰ、基質としてはｐＡＰＰを用いた。次に、サンプルとしてアディポネクチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社製  １０６５ＡＰ）溶液と酵素標識された二次抗体を予め混合した液滴２（抗原に酵素標識二次抗体を反応させた液滴）を固定部１７へと搬送し、一次抗体と抗原を十分に抗原抗体反応させてから液滴２を除く（Ｓ７４）。
【００４９】
本実施形態では、固定部１７に液滴を滞留させることによって検体の検出が行われる。当該滞留時間は特に限定されず、検体とリガンドとが反応（例えば、結合）できる程度の時間、滞留すればよい。
【００５０】
なお、本実施形態では抗原と二次抗体をあらかじめ混合しているが、これらを別々の液体として順次搬送しても構わない。いずれの場合も、後の工程で行われる検体検出が可能であるが、前者のようにあらかじめ抗原に酵素標識された二次抗体を混合し、反応させた液滴を用いることで、工程を簡略化することができる。
【００５１】
次に固定部１７を洗浄するため、洗浄液としてトリス緩衝液を固定部１７へ搬送し、未結合のタンパク質などを除く（Ｓ７５）。なお、洗浄に用いる溶液はトリス緩衝液に限定されず、検体の検出を妨げないよう液であれば如何なる溶液を用いてもよい。
【００５２】
次に基質液ｐＡＰＰを含有する基質溶液を固定部１７へと搬送し酵素基質反応させる（Ｓ７６）。最後に生成された電気化学物質ｐＡＰを検出電極１６で検出し、ピーク電流値のアディポネクチン濃度依存性を測定する（Ｓ７７）。検体量の測定方法としては例えば、あらかじめ検量線を作成しておき、それに基づき検体量を算出する方法などが一般的である。
【００５３】
上記のような手順で、サンプルに含まれた複合物質から所望の検体を検出することができる。なお、リガンド及びリガンドの固定化は、ここに挙げられたものに限らず、公知のものを利用できる。リガンドは、検体と反応（例えば、結合）できる物質であれば利用することができ、例えば、上記で用いた抗体以外に、ペプチド、ＤＮＡ、アプタマー、ＭＩＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ）、などが利用可能である。
【００５４】
また、リガンドの固定化には、上記で用いた物理吸着以外に、化学結合（例えば、共有結合、疎水結合、イオン結合、水素結合）、包括法などを用いることができる。さらに、検体を検出する検出方法には、上記で用いた抗原抗体反応を利用するイムノアッセイ以外に、ＤＮＡハイブリダイゼーションを利用するＤＮＡアッセイなど公知の方法が利用でき、また、これらで用いられる様々なシグナル検出手段を用いることができる。例えば、電気化学的検出法、比色検出法、蛍光検出法などである。なお、検出の際に光学的検出方法を用いる場合は、搬送用電極を持たない基板１５には透明の基板を選択する必要がある。次に蛍光法を用いた検出について説明する。
【００５５】
＜実施形態２＞
次に、本発明における実施形態２について説明する。本実施形態では、検体検出用センサ自体には検出電極を持たず、外部の検出装置等を用いて検体を検出する、あるいは、検出部が固定部と離れている点で、上記実施形態１とは異なる。
【００５６】
図８は、本実施形態に係る検体検出用センサ１ａにサンプルの液滴２を送液したときの断面図である。本実施形態では、液滴２を搬送する方法としてエレクトロウェッティングを用いている。搬送用基板１１には、搬送用電極１２が複数配置され、その上部に誘電体膜１３、疎水性膜１４ａが順に形成され、疎水性膜１４ａ上に固定部１７としてリガンドが固定化されている。また、搬送用電極をもたない基板１５には、流路側に疎水性膜１４ｂが形成されている。搬送用基板１１と搬送用電極をもたない基板１５の間には液滴２が配置されている。液滴２と搬送用電極１２の関係は、実施形態１で説明した内容と同様である。また、固定部１７の部分は疎水性膜１４ａがないため、固定部１７を搬送用電極１２よりも小さく設けることが好ましい。さらに、固定部１７は、図５（ａ）で示した液滴２が疎水性膜１４ａ、あるいは疎水性膜１４ｂと接触している面２ａよりも、小さく設けることが好ましい。これは、リガンドと検体を効率よく反応させるためである。なお、図８では固定部１７は搬送用基板１１側に作製されているが、搬送用電極をもたない基板１５側に作製されても良い。
【００５７】
検出装置２６における検出方法としては、例えば、一般的な蛍光検出を用いることができる。この場合、液滴２へ励起光３１を入れて、当該液滴２から発せられる蛍光３２を検出することで特定物質のみを検出することができる。なお、検出電極２６は上記構成に限定されず、電気化学的検出法、比色検出法、蛍光検出法などに基づいた構成を、適宜、使用することが可能である。
【００５８】
固定部１７はリガンド（例えば、抗体）を物理吸着によって、固定化することで形成される。リガンドとして抗体、検体として抗原を用い、図７に示した手順により、具体的には次のように検出を行うことができる。
【００５９】
まず、一次抗体であるリガンドを、予め固定部１７に固定化する（Ｓ７１）。次に、非特異的な吸着を防ぐためのブロッキングを行う（Ｓ７２）。これは、固定部１７の全てがリガンド抗体で隙間なく覆われているわけではなく、隙間があるため、当該隙間に対する非特異吸着を防ぐ必要があるためである。なお、ブロッキング剤としては、例えば、ＢＳＡ、カゼインなどが用いられる。
【００６０】
ブロッキング後、余分なブロッキング剤を洗浄によって洗い流す（Ｓ７３）。ここで、検出方法は蛍光測定を用いるため、後ほどの工程で行われる酵素基質反応で蛍光物質を生成する酵素と基質を選択し、酵素は二次抗体によって予め標識しておく。ここで酵素としては例えば、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、基質としてはＡＤＨＰ（１０−Ａｃｅｔｙｌ−３，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ）、ＱｕａｎｔａＢｌｕ（登録商標）などが用いられるがこれらに限定されない。例えば、上記酵素としては、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）などを用いることが可能であって、基質としては、Ａｍｐｌｅｘ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などを用いることが可能である。
【００６１】
次に、検体である抗原を含んだサンプル液と酵素標識された二次抗体を予め混合した液滴２（抗原に酵素標識二次抗体を反応させた液滴）を固定部１７へと搬送する。一次抗体と抗原を十分に抗原抗体反応させてから液滴を除く（Ｓ７４）。次に、固定部１７を洗浄するため、洗浄液を固定部１７へ搬送し、未結合のタンパク質などを除く（Ｓ７５）。次に基質液を固定部１７へと搬送し酵素基質反応を生じさせる。必要であればこのとき、酵素基質反応停止剤を用いて、酵素基質反応を停止させてもよい（Ｓ７６）。最後に酵素基質反応によって生成された蛍光物質に対して励起光３１を照射して、その結果生じる蛍光３２を検出することで、検体量を測定する（Ｓ７７）。
【００６２】
なお、図８では励起光３１を固定部１７の上部から照射し、蛍光３２を検出する構成になっているが、上部以外から照射、検出することももちろん可能である。また、図８の構成は蛍光分析に基づく構成であるが、一般的な比色分析に基づく構成にすることも可能である。比色分析の場合、例えば、ＨＲＰ酵素に対して発色基質ＯＰＤ（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ）、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚｉｄｅｎｅ）などを用いて吸光度から検体量を知ることができる。あるいは、酵素としてペルオキシダーゼに対して、発色基質ＴＭＢ、ＯＰＤ、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム塩）を用いることができる。
【００６３】
また、本実施形態では、検体検出用センサ１ａには、検出部を備えない構成として説明したが、図９に示すように検出手段１６´が、固定部１７と別に設けられてもよい。検出手段１６´は、流路外、例えば、搬送用電極をもたない基板１５に併設して設けられても構わない。
【００６４】
＜実施形態３＞
次に、本発明における実施形態３について説明する。本実施形態では、搬送用電極が液滴２を挟んで上下両側に配置されている点で、上記実施形態１、実施形態２とは異なる。このように、２つの搬送用電極を用いることによって、電極のプラス極とマイナス極を１枚の基板に作り込まなくてもよいため、基板の作製が容易になるとともに、搬送用電極の制御が容易になる。
【００６５】
図１０は、本実施形態に係る検体検出用センサ１ｃにサンプルの液滴２を送液したときの断面図である。本実施形態では、液滴２を搬送する方法としてエレクトロウェッティングを用いている。搬送用基板１１には、搬送用電極１２が複数配置され、その上部に誘電体膜１３、疎水性膜１４ａが順に形成され、疎水性膜１４ａ上に固定部１７としてリガンドが固定化されている。また、上部基板１８には、上部電極１２０、疎水性膜１４ｂが流路に向かって順に形成されている。
【００６６】
搬送用基板１１と上部基板１８の間には液滴２が配置されている。液滴２と搬送用電極１２の関係は、実施形態１で説明した内容と同様である。また、固定部１７の表面（流路側）には疎水性膜１４ａがないため、固定部１７を搬送用電極１２よりも小さく設けることが好ましい。さらに、固定部１７は、図５（ａ）で示した液滴２が疎水性膜１４ａ、あるいは疎水性膜１４ｂと接触している面２ａよりも、小さく設けることが好ましい。これは、リガンドと検体を効率よく反応させるためである。検出電極１６´は、固定部１７とは別に設けられ、流路外、例えば、上部基板１８に併設して設けることができる。なお、図１０では固定部１７は搬送用基板１１側に作製されているが、上部基板１８側に作製されても良い。
【００６７】
電圧は搬送用基板１１に形成されている搬送用電極１２と上部基板１８に形成されている上部電極１２０の間に印加される。上部電極１２０を接地電位とし、搬送させたい方向に隣接する搬送用電極に電圧を印加する。なお、上部電極１２０は、１つの電極として形成されてもよく、複数の電極として形成されてもよい。
【００６８】
図１０においては、スイッチＳＷ２が接続状態となっている。ここで、矢印の方向に液滴２を移動させたい場合は、スイッチＳＷ２を開放するとともにスイッチＳＷ３を接続する。スイッチが接続されると、電圧は液滴２の移動が観察されるまで印加され、閾値電圧を越えると液滴２は次の搬送用電極に移動する。これを繰り返すことで液滴２を目的の場所へと移動させる。電圧の印加方法はこのような直流法に限られず、交流法で行うこともできる。また、基板電極上の電位変化に応じてぬれ性が変化することから、上記電位の印加方法に限らず、電位変化を与えれば液滴２は搬送することができる。
【００６９】
なお、上記で示した構成は、上記実施形態１で示したような固定部１７と検出電極１６が同じ場所に設けられている構成や、実施形態２で説明した検出手段１６´を本構成に含めず、検出装置２６にて検出する構成にも適用可能である。
【００７０】
＜実施形態４＞
次に、本発明における実施形態４について説明する。本実施形態では、表面波（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｗａｖｅ）を用いて液滴を搬送する点で、上記実施形態１〜３とは異なる。このように表面波を用いることにより、流路全体に複数の電極を設ける必要が無くなり、コストを削減することができる。なお、液滴のぬれ性を変化させる搬送用電極と、表面波を発生させる搬送用電極を併用することも可能である。
【００７１】
図１１は、本実施形態に係る検体検出用センサ１ｄにサンプルの液滴２を送液したときの断面図である。搬送用基板１１には、圧電体膜１９、搬送用電極ＩＤＴ（ＩｎｔｅｒＤｉｇｉｔａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）２０が形成され、表面波を励振する。圧電体膜１９は、例えばＬｉＮｂＯ３などから構成され、電界を印加すると変形するという働きがある。なお、圧電体膜１９が疎水性ではない場合は、圧電体膜１９上に疎水性膜を備えることが望ましい。
【００７２】
図１２は、搬送用電極ＩＤＴ２０を図１１における矢印方向から見た平面図である。搬送用電極ＩＤＴ２０は、図１２に示すような櫛型状の電極となっており、この櫛型の小電極２０１にまとめて電圧をかけられるように大電極２０２が接続されている。大電極２０２から小電極２０１に電圧をかけられると、小電極２０１で表面波を励振する。圧電体膜１９上に形成された搬送用電極ＩＤＴ２０に高周波信号を印加すると、電極間に電界が発生し、弾性表面波が励振され、当該弾性表面波が圧電体膜１９上を伝搬していく。この伝搬面上に液滴２があると、液滴中に縦波が放射され、液滴２の搬送が可能となる。また、圧電体膜１９には、固定部１７、検出電極１６が形成され、検出電極１６の少なくとも一部には固定部１７としてリガンドが固定化されている。表面波が液滴２に放射されることによって液滴２は固定部１７及び検出電極１６へと搬送される。この場合の検出方法も上記実施形態と同様に実施できる。
【００７３】
以上、各実施形態で示した方法により、リガンドを固定化し、液滴を用いて検体検出を行う際に、固定化したリガンドの影響により、送液の安定性が阻害されることを防止しつつ、液滴中に含まれる検体を検出するセンサを実現することができた。
【符号の説明】
【００７４】
１、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ  検体検出用センサ
１１  搬送用基板
１２、１２ａ、１２ａ´、１２ｂ、１２ｂ´  搬送用電極
１２０  上部電極
１３  誘電体膜
１４ａ、１４ｂ  疎水性膜
１５  搬送用電極をもたない基板
１６  検出電極
１６´  検出手段
１７  固定部
１８  上部基板
１９  圧電体膜
２０  搬送用電極ＩＤＴ
２６  検出装置
３１  励起光
３２  蛍光
１６１  対向電極
１６２  作用電極
１６３  参照電極
２０１  小電極
２０２  大電極
ＳＷ１、ＳＷ２、ＳＷ３  スイッチ
【図１】
2012150098.tif 000003
【図２】
2012150098.tif 000004
【図３】
2012150098.tif 000005
【図４】
2012150098.tif 000006
【図５】
2012150098.tif 000007
【図６】
2012150098.tif 000008
【図７】
2012150098.tif 000009
【図８】
2012150098.tif 000010
【図９】
2012150098.tif 000011
【図１０】
2012150098.tif 000012
【図１１】
2012150098.tif 000013
【図１２】
2012150098.tif 000014
【図１３】
2012150098.tif 000015