(57)【要約】【課題】リグノセルロース系バイオマスを含む基質混合物から、高収率でキシロースを製造できる糖化溶液の製造方法を提供する。【解決手段】リグノセルロース系バイオマスを基質として含む基質混合物を、微生物が産生した糖化酵素で処理することにより前記基質混合物から糖化溶液を得る。前記糖化酵素は、アクレモニウム属、トリコデルマ属、ペニシリウム属、アスペルギルス属、サーモアスカス属の菌類と、クロストリジウム属、バチルス属の真正細菌とからなる群から選ばれるいずれか１以上の微生物由来の第１の糖化酵素と、サーモトーガ・マリチマ由来の第２の糖化酵素との混合物である。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロース系バイオマスを基質として含む基質混合物を、微生物が産生した糖化酵素で処理することにより前記基質混合物から糖化溶液を得る糖化溶液の製造方法において、
前記糖化酵素は、アクレモニウム属、トリコデルマ属、ペニシリウム属、アスペルギルス属、サーモアスカス属の菌類と、クロストリジウム属、バチルス属の真正細菌とからなる群から選ばれるいずれか１以上の微生物由来の第１の糖化酵素と、サーモトーガ・マリチマ由来の第２の糖化酵素との混合物であることを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化溶液の製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の糖化溶液の製造方法において、前記基質混合物をアンモニア水で処理して得られた糖化前処理物に前記糖化酵素を添加して基質・糖化酵素混合物を調製するときに、前記基質・糖化酵素混合物中の基質濃度が、１０〜２６質量％の範囲であることを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化溶液の製造方法。
【請求項３】
請求項２記載の糖化溶液の製造方法において、前記基質・糖化酵素混合物中の前記第１の糖化酵素の濃度が０．１〜１０質量％の範囲であり、前記第２の糖化酵素の濃度が、０．０６〜０．２質量％の範囲であることを特徴とするリグノセルロース系バイオマスの糖化溶液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグノセルロース系バイオマスの糖化溶液の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、基質として、稲藁等のリグノセルロース系バイオマスを、微生物が産生する糖化酵素により糖化し、得られた糖を発酵させることによりエタノールを製造する方法が知られている。前記リグノセルロース系バイオマスは、セルロース又はヘミセルロースにリグニンが強固に結合した構成を備えている。そこで前記糖化には、前記リグノセルロース系バイオマスを前処理し、該リグノセルロース系バイオマスに含まれるリグニンを解離し、又は該リグノセルロース系バイオマスを膨潤させた糖化前処理物が用いられている。
【０００３】
尚、本願では、「解離」との用語は、セルロース又はヘミセルロースとリグニンとの結合の少なくとも一部を切断することを意味する。又、「膨潤」との用語は、液体の侵入によって結晶性セルロースを構成するセルロース若しくはヘミセルロースに空隙を生じ、又はセルロース繊維の内部に空隙を生じて、該結晶性セルロースが膨張することを意味する。
【０００４】
前記従来のエタノールの製造方法では、前記糖化酵素が高価であるので、前記糖化前処理物に含まれる前記基質を低濃度とし、該糖化酵素の使用量を低減することが行われている。ところが、前記糖化前処理物に含まれる前記基質を低濃度とすると、このような糖化前処理物から得られる糖化溶液も低濃度になり、ひいては該糖化溶液を発酵させて得られるエタノールも低濃度となる。この結果、得られたエタノールを濃縮するために蒸留する際に、蒸留に要する時間及び熱エネルギーが増加するという問題がある。
【０００５】
前記問題を解決するために、前記糖化前処理物に含まれる前記基質を高濃度とすると共に、前記糖化酵素の使用量を増加させ、高濃度のエタノールを得ることが考えられる。この場合には、高価な前記糖化酵素の使用量が増加しコスト増となるため、前記エタノールの製造方法の全体としてのコストを低減する必要がある。
【０００６】
前記エタノール製造方法におけるコスト低減の一方策として、前記リグノセルロース系バイオマスの糖化処理を効率化することが考えられる。
【０００７】
前記リグノセルロース系バイオマスの細胞壁を構成するセルロースやヘミセルロースを加水分解し、グルコースやキシロース等の単糖を製造する方法として、糖化酵素を用いる方法等が知られている。このとき、複数の糖化酵素を組み合わせて用いることが効果的であることが知られている（例えば特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−１７１９５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、リグノセルロース系バイオマスを糖化酵素を用いて糖化する場合、キシロースの生成量が増加するにつれて糖化酵素の活性が阻害され、結果として、キシロースの収率が低くなるという不都合がある。
【００１０】
本発明は、かかる不都合を解消して、リグノセルロース系バイオマスを含む基質混合物から、高収率でキシロースを製造できる糖化溶液の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
かかる目的を達成するために、本発明のリグノセルロース系バイオマスの糖化溶液の製造方法は、リグノセルロース系バイオマスを基質として含む基質混合物を、微生物が産生した糖化酵素で処理することにより前記基質混合物から糖化溶液を得る糖化溶液の製造方法において、前記糖化酵素は、アクレモニウム属、トリコデルマ属、ペニシリウム属、アスペルギルス属、サーモアスカス属の菌類と、クロストリジウム属、バチルス属の真正細菌とからなる群から選ばれるいずれか１以上の微生物由来の第１の糖化酵素と、サーモトーガ・マリチマ由来の第２の糖化酵素との混合物であることを特徴とする。
【００１２】
第１の糖化酵素は、アクレモニウム属、トリコデルマ属、ペニシリウム属、アスペルギルス属、サーモアスカス属の菌類や、クロストリジウム属、バチルス属の真正細菌のいずれか１以上の微生物が生産するセルラーゼ又はセミヘルラーゼを含む。
【００１３】
本発明の糖化溶液の製造方法によれば、糖化酵素として、前記第１の糖化酵素であるセルラーゼ、ヘミセルラーゼと、前記第２の糖化酵素との混合物を用いることにより、基質としてのリグノセルロース系バイオマスを効率よく糖化し、高濃度のキシロース含む糖化溶液を製造することができる。
【００１４】
本発明の糖化溶液の製造方法においては、前記基質混合物をアンモニア水で処理して得られた糖化前処理物に前記糖化酵素を添加して基質・糖化酵素混合物を調製する。このとき、前記基質・糖化酵素混合物中の基質濃度が、１０〜２６質量％の範囲であることが好ましい。１０質量％よりも低い基質濃度では生産物である糖化溶液の糖濃度が低くなり、その後のアルコール発酵と精製との効率が低くなるためである。また、基質濃度を２６質量％を超える濃度にすることは技術的に困難である。
【００１５】
本発明の糖化溶液の製造方法においては、前記基質・糖化酵素混合物中の前記第１の糖化酵素の濃度が０．１〜１０質量％の範囲であり、前記第２の糖化酵素の濃度が、０．０６〜０．２質量％の範囲であることが好ましい。前記第１の糖化酵素の濃度が０．１質量％未満であるときには、前記基質を十分に糖化することができず、１０質量％を超えてもそれ以上の効果は得られにくいからである。前記第２の糖化酵素の濃度が０．０６質量％未満または０．２質量％を超えると、前記第１の糖化酵素に添加して前記基質を糖化するときに、優れた効果が得られないことがある。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】第１の糖化酵素または第２の糖化酵素の相対活性値とキシロース濃度との関係を示すグラフ。
【図２】第１の糖化酵素に対する第２の糖化酵素の相対活性値とキシロース濃度との関係を示すグラフ。
【図３】キシロースの生成量と第１の糖化酵素に対する第２の糖化酵素の添加量との関係を示すグラフ。
【図４】本発明の製造方法により得られる糖化溶液に含まれるキシロースの生成量を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
次に、添付の図面を参照しながら本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。
【００１８】
本実施形態の糖化溶液の製造方法は、リグノセルロース系バイオマスを基質として含む基質混合物を、微生物が産生した糖化酵素で処理するときに、前記糖化酵素として、アクレモニウム属、トリコデルマ属、ペニシリウム属、アスペルギルス属、サーモアスカス属の菌類と、クロストリジウム属、バチルス属の真正細菌とからなる群から選ばれるいずれか１以上の微生物由来の第１の糖化酵素と、サーモトーガ・マリチマ由来の第２の糖化酵素との混合物を用いる。
【００１９】
前記基質混合物を形成する基質であるリグノセルロース系バイオマスとしては、稲藁が好適に用いられる。前記基質混合物は、酵素処理の効率を上げるために、あらかじめセルロースを解離又は膨潤させる処理を施して、糖化前処理物としておくことが好ましい。そのための方法としては、例えば、アンモニア水で処理する方法が挙げられる。
【００２０】
本実施形態の糖化溶液の製造方法においては、前記第１の糖化酵素に、前記第２の糖化酵素を添加した混合物を用いることにより、基質の分解を促進し、より高濃度のキシロースを含む糖化溶液を得ることができる。
【００２１】
前記第２の糖化酵素としては、サーモトーガ・マリチマの生産するβ−キシロシダーゼが好適に用いられる。
【００２２】
サーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼとしては、サーモトーガ・マリチマのキシロシダーゼをコードするＤＮＡをＰＣＲ増幅して大腸菌中に遺伝子として機能するようにクローニングして発現させ、精製したものを用いることができる。
【００２３】
大腸菌発現用プロモータとしては、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシドで誘導されるプロモータを用いたが他の誘導性プロモータや構成的プロモータも生産に支障がない限り使用できる。また、生産する宿主も大腸菌に限定されず、枯草菌等の他の細菌、酵母・糸状菌等の真菌類、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）等の動物細胞等によりキシロシダーゼを生産してもよい。遺伝子をクローニングして大腸菌中で発現させたキシロシダーゼを用いることもできるが、クローニングせず、サーモトーガ・マリチマが生産するキシロシダーゼを調製して用いることも可能である。
【００２４】
サーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼは、前記第１の糖化酵素に比較してキシロースによる活性阻害を受けにくい。次に、この点について説明するために、生成物による活性阻害実験として、サーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼ（株式会社耐熱性酵素研究所製）と、対照として市販のキシラナーゼ（アクセルラーゼＸＹ（商品名）、ジェネンコア社製）とを用いて、反応生成物であるキシロースの濃度による酵素活性に対する影響を調べた。
【００２５】
前記生成物による活性阻害実験では、まず、基質としての１ｍＭ４−ニトロフェニルβ-Ｄ−キシロピラノシド、０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）からなる反応液と、該反応液に、それぞれ０．２５質量％、０．５質量％、１質量％、２質量％、５質量％、１０質量％の濃度のキシロースを加え、試料溶液を調製した。
【００２６】
前記反応液及び前記各試料溶液を５０℃に加温した後、前記反応液及び前記各試料溶液にサーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼあるいは前記市販のキシラナーゼをそれぞれ１．３×１０−２Ｕ／ｍｌあるいは１．１×１０−２Ｕ／ｍｌとなるように加え、５０℃、１０分間保温した後、前記反応液及び前記各試料溶液の２倍量の０．２５Ｍ炭酸ナトリウム溶液を加え、反応停止及び発色反応を行った。尚、１Ｕは４−ニトロフェニルβ−Ｄ−キシロピラノシドを基質に、１分間に１μｍｏｌの４−ニトロフェノールを産生する酵素量と定義する。
【００２７】
次に、分光光度計により前記反応液及び前記各試料溶液の４２０ｎｍの吸光度を測定し、サーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼあるいは前記市販のキシラナーゼの活性を求めた。
【００２８】
前記各試料溶液におけるサーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼあるいは前記市販のキシラナーゼの活性を、前記反応液（キシロース添加なし）におけるサーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼあるいは前記市販のキシラナーゼの活性をそれぞれ１としたときの相対活性として図１に示す。
【００２９】
尚、図１において、サーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼは「ＴＭ」、前記市販のキシラナーゼは「ＡｃｃＸＹ」として示す。
【００３０】
図１に示すように、サーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼ、前記市販のキシラナーゼとも、キシロース濃度が高くなるにつれて相対活性が低下する傾向が見られるが、活性阻害の程度はサーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼの方が少ない。
【００３１】
次に、前記市販のキシラナーゼに対するサーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼの相対活性を図２に示す。
【００３２】
図２に示すようにサーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼは、前記市販のキシラナーゼに比べ、キシロース濃度が２質量％以上では２．５倍〜３倍以上の活性を有している。
【００３３】
次に、本発明の実施例を示す。
【実施例】
【００３４】
本実施例では、次のようにして稲藁の糖化実験を行った。
【００３５】
まず、自然乾燥させた稲藁をカッターミルで粉砕した後、直径３ｍｍのスクリーンフィルタを通過させ粉砕稲藁を作成した。次に、粉砕稲藁を２５質量％−アンモニア水と質量比１：４で混合し、８０℃の温度に８時間保持して反応させた後、自然乾燥によりアンモニア分離糖化前処理物としてのアンモニア処理稲藁を調製した。
【００３６】
次に、アンモニア処理稲藁を酢酸緩衝液（ｐＨ４）に懸濁し、得られた懸濁液にアクレモニウム属微生物由来の糖化酵素（明治製菓社製、商品名：アクレモニウムセルラーゼ）を、その有効タンパク質濃度が全量に対して１．１質量％となるように添加し、さらにサーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼ（株式会社耐熱性酵素研究所製）を、その有効タンパク質濃度が全量に対して所定量となるように添加して、基質・糖化酵素混合物を調製した。前記基質・糖化酵素混合物は、前記基質の終濃度が１０質量％または２６質量％となるようにした。
【００３７】
次に、前記基質・糖化酵素混合物を５０℃で３日間、糖化反応させ、糖化溶液を得た。得られた糖化溶液中のキシロースの濃度を、バイオラッド社製カラム（商品名：ＨＰＸ−８７Ｐ）を用い、高速液体クロマトグラフィによって定量した。サーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼを変量したときに生成したキシロースの濃度を、図３に示す。
【００３８】
次に、前記アクレモニウム属微生物由来の糖化酵素に代えて、トリコデルマ属微生物由来の糖化酵素（ジェネンコア社製、商品名：ＧＣ２２０）を用い、その有効タンパク質濃度が基質・糖化酵素混合物の全量に対して０．９質量％となるように添加した以外は、前記アクレモニウム属微生物由来の糖化酵素の場合と全く同一にして、糖化溶液を得た。
【００３９】
得られた糖化溶液中のキシロースの濃度を、バイオラッド社製カラム（商品名：ＨＰＸ−８７Ｐ）を用い、高速液体クロマトグラフィによって定量した。サーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼを変量したときに生成したキシロースの濃度を、図３に示す。
【００４０】
尚、前記各糖化酵素の有効タンパク質濃度は、プロテインアッセイＣＢＢ溶液（商品名、ナカライテスク株式会社製）を用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により測定することができる。
【００４１】
また、図３（ａ）は前記基質・糖化酵素混合物における前記基質の終濃度が２６質量％の場合を示し、図３（ｂ）は前記基質の終濃度が１０質量％の場合を示す。また、図３において、サーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼは「ＴＭ」、アクレモニウム属微生物由来の糖化酵素は「アクレモ」、トリコデルマ属微生物由来の糖化酵素は「ＧＣ２２０」として示す。
【００４２】
図３から、基質濃度が１０質量％又は２６質量％の場合、アクレモニウム属微生物由来の糖化酵素又はトリコデルマ属微生物由来の糖化酵素に、サーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼを添加して糖化反応を行わせることにより、アクレモニウム属微生物由来の糖化酵素又はトリコデルマ属微生物由来の糖化酵素を単独で用いる場合よりもキシロースの生成量が増加することが明らかである。
【００４３】
また、アクレモニウム属微生物由来の糖化酵素又はトリコデルマ属微生物由来の糖化酵素に添加するサーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼの量を、前記基質・糖化酵素混合物の全量に対して０．０６〜０．２質量％の範囲とすることにより、キシロースの生成量について優れた効果が得られることが明らかである。
【００４４】
次に、前記アンモニア処理稲藁を酢酸緩衝液（ｐＨ４）に懸濁し、得られた懸濁液に所定量の糖化酵素を添加すると共に、前記基質の終濃度が２６質量％となるようにして、基質・糖化酵素混合物を調製した。
【００４５】
次に、前記基質・糖化酵素混合物を５０℃で３日間、糖化反応させ、糖化溶液を得た。得られた糖化溶液中のキシロースの濃度を、バイオラッド社製カラム（商品名：ＨＰＸ−８７Ｐ）を用い、高速液体クロマトグラフィによって定量した。
【００４６】
前記糖化酵素としては、次のものを用いた。
（１）前記基質・糖化酵素混合物の全量に対して０．２質量％のサーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼ（株式会社耐熱性酵素研究所製）。
（２）前記基質・糖化酵素混合物の全量に対して１．１質量％のアクレモニウム属微生物由来の糖化酵素（明治製菓社製、商品名：アクレモニウムセルラーゼ）。
（３）前記基質・糖化酵素混合物の全量に対して０．２質量％の前記サーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼと、前記基質・糖化酵素混合物の全量に対して１．１質量％の前記アクレモニウム属微生物由来の糖化酵素との混合物。
（４）前記基質・糖化酵素混合物の全量に対して０．９質量％のトリコデルマ属微生物由来の糖化酵素（ジェネンコア社製、商品名：ＧＣ２２０）。
（５）前記基質・糖化酵素混合物の全量に対して０．２質量％の前記サーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼと、前記基質・糖化酵素混合物の全量に対して０．９質量％のトリコデルマ属微生物由来の糖化酵素との混合物。
【００４７】
結果を図４に示す。尚、図４において、サーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼは「ＴＭ」、アクレモニウム属微生物由来の糖化酵素は「アクレモ」、トリコデルマ属微生物由来の糖化酵素は「ＧＣ２２０」として示す。
【００４８】
図４から、前記糖化酵素として、前記サーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼと、前記アクレモニウム属微生物由来の糖化酵素との混合物を用いた場合には、前記サーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼ又は、前記アクレモニウム属微生物由来の糖化酵素をそれぞれ単独で用いた場合の総和以上のキシロースを生成させることができることが明らかである。
【００４９】
また、前記糖化酵素として、前記サーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼと、前記トリコデルマ属微生物由来の糖化酵素との混合物を用いた場合には、前記サーモトーガ・マリチマ由来のβ−キシロシダーゼ又は前記トリコデルマ属微生物由来の糖化酵素を、それぞれ単独で用いた場合の総和以上のキシロースを生成できることが明らかである。
【００５０】
本実施例から、前記糖化酵素として、前記アクレモニウム属微生物由来の糖化酵素または前記トリコデルマ属微生物由来の糖化酵素に、β−キシロシダーゼを添加することにより、キシロースの糖化が促進されることが明らかである。これは、前記リグノセルロース系バイオマスにおいて、セルロースと絡み合って存在しているヘミセルロースの分解が促進されることを意味している。ヘミセルロースの分解が促進されると、前記セルロースとヘミセルロースとの絡み合いがほぐれ、セルラーゼがセルロース表面に吸着し易くなると考えられるので、セルロースの分解が促進されることも期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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