(57)【要約】【課題】  本発明は、複数の抗体が結合していても凝集しにくい複合体を提供することを目的とする。【解決手段】  ２個以上４個以下の下記一般式（１）で表される化合物と、アビジン部とからなる複合体。2012006846.tif 000006  （ただし、一般式（１）のＡは抗体部であり、一般式（１）のビオチニル基はアビジン部の結合サイトと結合している。アビジン部はアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンのいずれかである。ｎは１から１０のいずれかの整数である）【選択図】  図１
2012006846.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２個以上４個以下の下記一般式（１）で表される化合物と、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンのいずれかであるアビジン部とからなる複合体。
【化１】
2012006846.tif 000005
（ただし、一般式（１）のＡは抗体部であり、一般式（１）のビオチニル基は前記アビジン部の結合サイトと結合している。ｎは１から１０のいずれかの整数である）
【請求項２】
前記複合体がさらに、信号発生物質を有することを特徴とする請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記信号発生物質が前記アビジン部に結合していることを特徴とする請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記抗体部Ａが、一本鎖抗体であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
前記抗体部Ａが、配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の複合体。
【請求項６】
請求項２乃至５のいずれかの複合体と分散媒とを有することを特徴とする造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複合体及び前記複合体を有する造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
病変部位に存在する抗原（病変マーカーなど）を検出するために、その抗原に特異的に結合する抗体に信号発生物質を結合させた化合物を用いた造影剤が知られている。また、抗体を複数有する抗原結合能力の高い化合物を用いた造影剤も知られている。なお、信号発生物質の代わりに治療用薬剤を抗体に結合させた治療剤も知られている。
【０００３】
ここで、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンは、４つのサブユニットを有しており、各サブユニットは１分子のビオチンと強固に結合する。
【０００４】
そこで、特許文献１には、薬学的作用物質が結合したストレプトアビジンに、ビオチンとストレプトアビジンの結合を介して、一本鎖抗体が４つ結合した、抗原結合能力の高い化合物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００４−５２４０２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、特許文献１に記載の四量体は、一本鎖抗体とビオチンとの間にリンカー分子がない。そのため、ビオチンに複数結合している一本鎖抗体同士の距離が近く、一本鎖抗体同士が凝集してしまうおそれがある。その結果、この四量体は抗原結合能力が低くなるおそれがある。
【０００７】
本発明は、上記課題に鑑みなされたものであり、複数の抗体が結合していても、凝集しにくい複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る複合体は、
２個以上４個以下の下記一般式（１）で表される化合物と、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンのいずれかであるアビジン部とからなる。
【０００９】
【化１】
2012006846.tif 000003
【００１０】
（ただし、一般式（１）のＡは抗体部であり、一般式（１）のビオチニル基は前記アビジン部の結合サイトと結合している。ｎは１から１０のいずれかの整数である）
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、複数の抗体が結合していても凝集しにくい複合体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本実施形態に係る複合体を示す模式図である。
【図２】本発明の実施例１において、発現タンパク質の精製前後におけるゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例１において、精製された四量体化ｓｃＦｖ（１）のゲルろ過クロマトグラムを示す図である。
【図４】本発明の実施例１において、四量体化ｓｃＦｖ（１）３ｎＭ〜２０ｎＭについてのセンサーグラムを示す図である。
【図５】四量体化ｓｃＦｖ（１）を投与したときのマウス全身の蛍光強度の経時変化画像を示す図である。
【図６】ＩｇＧを投与したときのマウス全身の蛍光強度の経時変化画像を示す図である。
【図７】ｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖＣ１０を投与したときのマウス全身の蛍光強度の経時変化画像を示す図である。
【図８】下記式（２）で表される化合物とストレプトアビジンの複合体を投与したときのマウス全身の蛍光強度の経時変化画像を示す図である。
【図９】四量体化ｓｃＦｖ（１）投与をしたときとＩｇＧ投与時を投与したときの蛍光強度の比（Ｔ／Ｂ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の実施形態について以下に説明する。
【００１４】
本実施形態に係る複合体は、２個以上４個以下の下記一般式（１）で表される化合物と、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンのいずれかであるアビジン部とからなる。
【００１５】
【化２】
2012006846.tif 000004
【００１６】
（ただし、一般式（１）のＡは抗体部であり、一般式（１）のビオチニル基は前記アビジン部の結合サイトと結合している。ｎは１から１０のいずれかの整数である）
【００１７】
ここで、本実施形態に係る複合体は、抗体部Ａを複数有する多量体であるため、抗体部Ａを１つのみ有する場合に比べて、抗原に結合しやすい。
【００１８】
さらに、本実施形態に係る複合体は、上記の一般式（１）で表される化合物（以下、化合物（１）と略すことがある）を有している。化合物（１）はポリエチレングリコールを有しているため、水分子との親和性が高い。そのため、抗体部同士の間に水分子が存在しやすく、抗体部同士の距離が近くなりにくい。その結果、抗体部同士が凝集しにくい。
【００１９】
本実施形態に係る複合体の一例について、図１を用いて説明する。
【００２０】
本実施形態の一例は、抗体部１０１と上記の一般式（１）で表される化合物（１）１０２とアビジン部１０４と信号発生物質１０５とからなる複合体である。そして化合物（１）１０２のビオチニル基１０３がアビジン部１０４の有する４つの結合サイトに結合し、信号発生物質１０５がアビジン部に結合している。この複合体は４つの抗体部１０１を有するため、抗体を１つのみ有する化合物に比べて、抗原に結合しやすい。また、化合物（１）はポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ、以下、ＰＥＧと略すことがある）を有するため、水分子が集まりやすく、抗体部同士の距離が近づきにくくなる。結果として、抗体部同士の凝集を抑制することができ、抗原結合能力の低下を抑制することができる。さらに、ＰＥＧは生体適合性が高いことが知られているため、本実施形態に係る複合体は生体内に投与する場合に好ましく用いられる。
【００２１】
また、信号発生物質１０５を有するため、抗原部位を特異的に検出する造影剤としての利用が可能である。さらに、信号発生物質１０５がアビジン部に結合しているため、複数の抗体部１０１が立体傷害となり、信号発生分子と、周囲の物質（生体内では、血清アルブミンや酵素などのタンパク質）との相互作用を減らすことができる。その結果、信号発生物質１０５から発せられる信号の低下を抑制することができる。
【００２２】
（抗体部）
本明細書において、抗体部とは抗体を有するポリペプチドである。抗体とは、特定の分子（抗原）に応答して免疫系により誘発されるイムノグロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）ファミリーのタンパク質の総称であり、その抗原に結合する性質をもつ。イムノグロブリンファミリーとしては、例えばイムノグロブリンＧ（ＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ、以下ＩｇＧと略すことがある）などが挙げられる。ここで、抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。なお、抗体部は抗体以外にも、抗原結合能力を損なわない範囲で、任意のアミノ酸を有していてもよい。
【００２３】
また、抗体は全抗体に限定されず、抗体フラグメントであってもよい。抗体フラグメントとは、特定の分子に結合する性質を維持したまま低分子化された、抗体の誘導体を指す。抗体フラグメントとしてはＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン単独、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン単独、ＶＨとＶＬの複合体、あるいはラクダ化ＶＨドメイン、または抗体の相補正決定領域（ＣＤＲ）を含むポリペプチド、抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域と軽鎖可変（ＶＬ）領域とをペプチドからなるリンカーで連結したポリペプチドである一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ、以下ｓｃＦｖと略すことがある）などが挙げられる。抗体フラグメントは、全抗体に比べ、分子サイズが小さいため、高い組織浸透性や早いクリアランス速度を有する事から診断剤あるいは造影剤に好適に利用される。
【００２４】
なお、抗体フラグメントとして、一本鎖抗体が好ましい。なぜなら、一本鎖抗体は、各種抗原に対応して安価に簡便に作製することができ、なおかつ、全抗体や一本鎖抗体以外の抗体フラグメントと比べて分子量が小さいため、体外へ速やかに排泄されやすく、又病変部位に到達しやすいからである。そのため、一本鎖抗体は病変部位の検出、又は治療に好適に用いられる。
【００２５】
一本鎖抗体としては、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドからなることが好ましい。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ  （配列番号１）
【００２６】
上記抗体あるいは抗体フラグメントの例として、ＥＧＦＲファミリー、ＶＥＧＦファミリー、ＶＥＧＦＲファミリー、ＰＳＡ、ＣＥＡ、マトリックスメタロプロテアーゼファミリー、ＥＧＦファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリー、エンドグリン、又はＭＵＣファミリーからなる群より選ばれた病変マーカーに結合する抗体、さらにはＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２、以下ＨＥＲ２と略すことがある）に結合する抗体、ガン胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ、以下ＣＥＡと略すことがある）に結合する抗体などを挙げることができる。
【００２７】
ここで、病変部位で多く発現する抗原の例として、ＨＥＲ２やＣＥＡを挙げることができる。なお、ＨＥＲ２はＥｒｂＢ２、ｃ−Ｅｒｂ−Ｂ２、ｐ１８５ＨＥＲ２といわれることもある。ＨＥＲ２はＥＧＦＲファミリーであり、チロシンキナーゼ型受容体の一つである。ＨＥＲ２は乳癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、肺癌などの腺癌で遺伝子増幅及び過剰発現するタンパク質である。ＣＥＡは、糖タンパク質であり、内胚葉由来の消化系上皮腺がん、および乳がんや非小細胞肺がんなどにおいて多く発現している。
【００２８】
なお、抗体又は抗体フラグメントは、ヒト、マウス、ラット、ラクダ、鳥、等、由来は問わず、さらにはキメラ体であってもよい。
【００２９】
（アビジン部）
本実施形態において、アビジン部とは、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンのいずれかであり、いずれも４つのサブユニットを有している。各サブユニットはビオチニル基と強固に結合することのできる、結合サイトを有する。そのため、アビジン部とビオチニル基の結合を介して二量体、三量体あるいは四量体を形成することができる。なお、本明細書において、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンとは、その誘導体も含む。
【００３０】
（信号発生物質）
本明細書において、信号発生物質とは、外部から電磁波（光）、音響波、超音波などのエネルギーを受けて、あるいは、電場、磁場などの影響を受けて、放射性信号、磁場信号、超音波信号、蛍光信号などの物理的な信号を発生する物質を意味する。あるいは、外部からエネルギーを受けることなく自ら上記の物理的な信号を発生する物質を意味する。信号発生物質は原子、分子でもよいし、複数の原子、複数の分子からなる錯体、複合体、粒子などであってもよい。例えば、放射性ハロゲン、放射性同位元素、常磁性金属イオン、酸化鉄粒子、金ナノ粒子、マイクロバブル、蛍光性化合物、燐光性化合物などが挙げられる。
【００３１】
信号発生物質を有していることにより、病変部位とその他の部位とのコントラストを強調するための造影剤としての利用が可能である。
【００３２】
自ら放射性信号を発生する分子として例えば、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒおよび８２Ｂｒなどの放射性ハロゲンが挙げられる。また、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、２０３Ｐｂ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１６１Ｔｂ、７２Ａｓ、１１３ｍＩｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、５２Ｆｅ、５２ｍＭｎ、５１Ｃｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、７７Ａｓ、９０Ｙ、１６９Ｅｒ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１０９Ｐｄ、１６５Ｄｙ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７２Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、４７Ｓｃ、１４０Ｌａ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２５Ａｃ、２２３Ｒａ、２２４Ｒａ、２２７Ｔｈなどの放射性同位元素を用いることも可能である。
【００３３】
磁場の影響を受けて、磁場信号を発生する分子として例えば、Ｇｄ３＋、Ｆｅ３＋、Ｅｕ３＋、Ｄｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｙｂ３＋、Ｍｎ２＋などが挙げられる。
【００３４】
電磁波のエネルギーを受けて、蛍光信号を発生する分子としては蛍光色素が挙げられるが、その中でも人体の透過性の比較的高い近赤外蛍光色素が好ましい。近赤外蛍光色素の例としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社  登録商標）７５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７９０、Ｖｉｖｏｔａｇ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社  登録商標）６８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｖｉｖｏｔａｇ−Ｓ（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ社  登録商標）６８０、Ｖｉｖｏｔａｇ−Ｓ７５０、ＡｍｉｎｏＳＰＡＲＫ（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ社  登録商標）６８０、ＡｍｉｎｏＳＰＡＲＫ７５０（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ，  Ｉｎｃ．）、ＤｙＬｉｇｈｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社  登録商標）６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ７５０、Ｄｙｌｉｇｈｔ８００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）、ＩＲＤｙｅ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社  登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ８００ＲＳ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．）、Ｃｙ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ社  登録商標）５．５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）などが挙げられる。
【００３５】
特に本実施形態に係る信号発生物質として、下記の式（２）で表される化合物である、サクシニミジルエステル反応性色素が好ましい。なぜなら、この色素は、吸収極大波長及び蛍光極大波長が近赤外波長領域にあるからである。
【００３６】
電磁波のエネルギーを受けて、音響信号を発性する物質として、酸化鉄粒子、金ナノ粒子、金ナノロッド、上記近赤外蛍光色素などが挙げられる。酸化鉄粒子を構成する酸化鉄はＦｅ３Ｏ４（マグネタイト）、γ−Ｆｅ２Ｏ３（マグヘマイト）、またはこれらの混合物を用いることができる。
【００３７】
（治療用薬剤）
本実施形態に係る複合体は、治療用薬剤をさらに有していてもよい。本実施形態に係る複合体は、治療用薬剤を有していることにより、病変部位周辺に治療用薬剤を到達させることのできる治療薬としての利用が可能である。
【００３８】
（抗体部Ａとの結合部位）
上記一般式（１）において、抗体部Ａはマレイミド基と結合している。マレイミド基は抗体部の任意の箇所に結合することができる。好ましくは、抗体部のシステインに結合する場合である。これは、マレイミド基はシステインの有するチオール基と強固に結合することができるからである。
【００３９】
また、マレイミド基は、抗体部のＣ末端に結合することが好ましい。これは、抗原結合部位に近い、抗体部のＮ末端に結合した場合、抗体部の抗原結合能力を損なうおそれがあるからである。
【００４０】
（信号発生物質あるいは治療用薬剤とアビジン部の結合）
信号発生物質はアビジン部に結合していることが好ましい。信号発生物質がアビジン部に結合している場合、抗体部Ａの立体障害により、信号発生物質は外部環境から物理的に遮蔽されるからである。その結果、外部環境に存在する血清タンパク質や酵素などの生体内分子と信号発生物質との相互作用が低減し、信号発生物質の機能が損なわれにくい。なお、信号発生物質とアビジン部との結合の様式は特に限定されず、直接結合していてもよいし、リンカー分子を介して間接的に結合していてもよい。
【００４１】
同様に、治療用薬剤はアビジン部に結合していることが好ましい。抗体部Ａの立体傷害によって、治療用薬剤は生体内のさまざまなタンパク質などとの相互作用が減り、治療用薬剤の薬剤としての機能が損なわれにくい。
【００４２】
なお、信号発生物質は、アビジン部の有する官能基の一部に、従来周知の反応によって結合させることができる。例えば、アビジン部の有する官能基がカルボキシル基の場合は、カルボキシル基と反応性を示すアミノ基、チオール基あるいはヒドロキシル基を有する信号発生分子を結合させることができる。そして、アミノ基の場合には、アミノ基と反応性を示すカルボキシル基、スルホン酸基、ヒドロキシスクシンイミド基、アルデヒド基、チオール基、イソチオシアネート基、グリシジル基を有する信号発生物質を結合させることができる。ヒドロキシル基やチオール基の場合には、それらの基と反応性を示すカルボキシル基、スルホン酸基、ハロゲン、ジスルヒド、マレイミド基を有する信号発生物質を結合させることができる。
【００４３】
信号発生物質が金属または同位元素の場合は、カルボキシル基、ホスホン酸基またはスルホン酸基を有する残基で置換された、ジエチレントリアミンもしくはポリアミン大員環から誘導されるキレート基をアビジン部に修飾し、その後、金属または放射性同位元素をキレート化できる。
【００４４】
（造影剤）
本実施形態に係る造影剤は、上記本実施形態に係る多量体化合物と分散媒とを有する。
【００４５】
ここで、分散媒とは、本実施形態に係る多量体化合物を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水などが挙げられる。本実施形態に係る造影剤は、上記本実施形態に係る多量体化合物をこの分散媒に予め分散させておいてもよいし、本実施形態に係る多量体化合物と分散媒とをキットにしておき、生体内に投与する前に多量体化合物を分散媒に分散させて使用してもよい。
【００４６】
（病変部位・病変マーカーの検出方法）
本実施形態に係る複合体を個体に投与、又は個体より得られた試料に添加し、信号を検出することにより、該個体中もしくは個体より得られた試料中の病変マーカーの存否を検出することができる。また、病変マーカーの存否から病変マーカーを産生する病変部位の存否を検出することもできる。
【００４７】
（製造方法）
本実施形態に係る複合体の製造方法について説明する。
【００４８】
本実施形態に係る複合体は、まず、上記抗体部を用意する。抗体部は市販のものを用いてもよいし、アミノ酸１つ１つを連結して作製してもよいし、大腸菌などで培養することで作製してもよい。
【００４９】
次に、上記一般式（１）で表される化合物のうち、抗体部Ａを除いた化合物を用意する。
抗体部Ａを除いた化合物は、市販のものを用いてもよいし、合成してもよい。そして、この化合物と抗体部とを結合させることで、上記一般式（１）で表される化合物を得る。
【００５０】
次に、上記一般式（１）で表される化合物をアビジン部の有する結合サイトに結合させる。
【００５１】
このようにして、本実施形態に係る複合体を製造することができる。
【００５２】
なお、この複合体に信号発生物質を結合させることが好ましく、この複合体のアビジン部に信号発生物質を結合させることがさらに好ましい。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明の実施例について説明する。なお、以下の実施例では具体的な試薬や反応条件を挙げてはいるが、種々の変更が可能であり、それらもまた本発明の範囲に包摂されるものとする。従って以下の実施例は、本発明の理解を助けることが目的であり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【００５４】
（ｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖＣ１０の調製）
はじめに、ＨＥＲ２へ結合するＩｇＧの可変領域の遺伝子配列を基に、ｓｃＦｖの遺伝子断片を作製した。
【００５５】
作製した遺伝子のカルボキシル末端には、精製のためにヒスチジンが６残基連続したＨｉｓ６ｔａｇおよび、リンカー結合のためのシステイン残基を配置した。この遺伝子断片を挿入したプラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて大腸菌（ＢＬ２１株）を形質転換し、発現用菌株を得た。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地４ｍＬで一晩培養した後、全量を、２５０ｍＬの２×ＹＴ−Ａｍｐ培地に添加し、２８℃、１２０ｒｐｍで８時間振とう培養した。その後、終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、以下ＩＰＴＧと略すことがある）を添加し、２８℃で１２〜２０時間培養を続けた。ＩＰＴＧ誘導した大腸菌を８０００×ｇ、３０分、４℃で遠心分離することで集菌し、上清の培養液を回収した。得られた培養液に８０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、塩析によりタンパク質を沈殿させた。塩析操作した溶液を２時間〜１晩４℃で静置した後、８０００×ｇ、３０分、４℃で遠心分離することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ／５００ｍＭＮａＣｌ緩衝液２０ｍＬで溶解し、１Ｌの同緩衝液へ３回透析した。透析後のタンパク質溶液を、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ（Ｒ）Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を充填したカラムへ添加し、Ｎｉイオンを介した金属キレートアフィニティークロマトグラフィーのゲル電気泳動によって精製した。精製して得た物資のアミノ酸配列は以下の通りであった。
ＭＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣ  （配列番号２）
【００５６】
このアミノ酸配列で表されるポリペプチドのことを以下では、ｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖＣ１０と略すことがある。
【００５７】
この発現したタンパク質、ｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖＣ１０を精製する前後の物質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２に示した。レーン１は、分子量マーカー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）  Ｈｉｓ−Ｔａｇ  スタンダード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））、レーン２は精製前のタンパク溶液、レーン３は精製後のｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖＣ１０タンパク質溶液である。この結果より、ｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖＣ１０はシングルバンドを示し分子量は約２８ｋＤａであることを確認した。
【００５８】
（四量体化ｓｃＦｖ（１）の調製）
前節により精製したｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖＣ１０を、２０倍量のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）によって、４時間、２５℃で還元した。この還元型ｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖＣ１０を、３５倍量のＭａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．社製）及び、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ１１−Ｂｉｏｔｉｎと、２時間、２５℃で反応させた。反応後、ＰＤ−１０カラムを用いて、各溶液から過剰量のＭａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔｉｎを除去した。その結果、ｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖＣ１０のＣ末端のシステインにＭａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔｉｎが結合した物質（以下、ｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖ−ＰＥＧ２−Ｂと略すことがある）と、ｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖＣ１０のＣ末端のシステインにＭａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ１１−Ｂｉｏｔｉｎが結合した物質（以下、ｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖ−ＰＥＧ１１−Ｂと略すことがある）を回収できた。
【００５９】
次にストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、以下ＳＡと略すことがある）を、４〜２０倍量の割合で上記の式（２）で表される化合物と混合し、１時間、２５℃で反応させた。反応後、ＰＤ−１０カラムを用いて、溶液から過剰量の上記式（２）で表される化合物を除去した。その結果、上記式（２）で表される化合物が結合したＳＡ（以下、標識化ＳＡと略すことがある）が得られた。
【００６０】
作製したｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖ−ＰＥＧ２−Ｂと標識化ＳＡを６：１の割合で混合し、４時間、４℃で反応させた。同様に、作製したｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖ−ＰＥＧ１１−Ｂと標識化ＳＡを６：１の割合で混合し、４時間、４℃で反応させた。
【００６１】
反応させた各複合体溶液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムへ添加し、ゲルろ過クロマトグラフィーによって精製した。
【００６２】
その結果、１個の標識化ＳＡに対して、４個のｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖ−ＰＥＧ２−Ｂが結合した複合体（以下、四量体化ｓｃＦｖ（１）と略すことがある）及び、１個の標識化ＳＡに対して、４個のｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖ−ＰＥＧ１１−Ｂが結合した複合体（以下、四量体化ｓｃＦｖ（２）と略すことがある）が得られた。
【００６３】
（クロマトグラフィーによる精製）
精製した四量体化ｓｃＦｖ（１）をクロマトグラフィーで精製した結果を図３に示した。図中で、黒線は波長２８０ｎｍにおける吸光度、灰色線は波長７００ｎｍにおける吸光度を示す。精製した四量体化ｓｃＦｖ（１）は、溶出体積１２．２ｍＬにシングルピークを示し分子量は約１７０ｋＤａであることを確認した。
【００６４】
（四量体化ｓｃＦｖ（１）のバイオセンサー分析）
調製した四量体化ｓｃＦｖ（１）と抗原であるＨＥＲ２との相互作用をＢｉａｃｏｒｅ  Ｘシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により表面プラズモン共鳴を利用して分析した。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＥｒｂＢ２／Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社製）をメーカーの推奨に従って、ＣＭ−５チップ表面のカルボキシメチルデキストラン鎖へのアミンカップリングにより第１フローセルに固定化した。固定化量は、約１０００ＲＵ（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）であった。一方、第２フローセル表面は活性化後、注入を行う際のリファレンスとして用いる為に非活性化した四量体化ｓｃＦｖ（１）をＰＢＳ−Ｔ（２．６８ｍＭＫＣｌ／１３７ｍＭＮａＣｌ／１．４７ｍＭＫＨ２ＰＯ４／１ｍＭＮａ２ＨＰＯ４／０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０  ｐＨ７．４）に透析し、１０〜１００ｎＭの一連の５つの異なる濃度に希釈して流速２０μＬ／分で両フローセルへ注入した。測定時間は、注入時間（結合）１２０秒、注入停止後経過時間（解離）１２０秒であり、フローセル表面の洗浄は１サンプル測定毎に５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液を用いてセンサーグラムがベースラインに戻るまで適量注入した。結合速度論解析実験においては、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０．２ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）の１：１ラングミュアフィッティングモデルを用いてセンサーグラムを分析した。図４に結果のセンサーグラムを示した。ここで、二点鎖線は３ｎＭ、一点鎖線は７ｎＭ、実線は１２．５ｎＭ、点線は２０ｎＭで得られた結果をそれぞれ表している。示された結合曲線から四量体化ｓｃＦｖ（１）はＨＥＲ２と結合し、その解離平衡定数（ＫＤ）は０．０２６ｎＭであると算出することができた。ｓｃＦｖの親抗体であるＩｇＧのＫＤは１ｎＭ程度であることから、ｓｃＦｖとＳＡを有効なリンカーを介して四量体化することで、抗原であるＨＥＲ２との結合がおよそ４０倍上昇した。
【００６５】
同様に、四量体化ｓｃＦｖ（２）についてもＨＥＲ２への結合を確認した。そして、その解離平衡定数（ＫＤ）は１ｎＭであると算出することができた。ＰＥＧ２リンカーがＰＥＧ１１リンカーより有利であった理由は、リンカーが長くなることによりｓｃＦｖの配向性が低下してＨＥＲ２へ結合しにくくなったためであると考えられる。
【００６６】
（四量体化ｓｃＦｖ（１）を用いたｉｎ  ｖｉｖｏイメージング）
（担癌部位での蛍光強度の変化）
ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング実験においては、雌の非近交系ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（購入時６週齢）（日本エスエルシー株式会社）を用いた。マウスに担癌させる前の１週間、標準的な食餌、寝床を用い、自由に食餌および飲料水を摂取できる環境下でマウスを順応させた。イメージング実験の約２週間前に２×１０６個のＮ８７ヒト胃癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−５８２２）を、マウスの左肩に皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全て定着しており、マウスの体重は１７〜２２ｇであった。担癌させたマウスを、投与する物質別に４つのグループに分けた。そして、下記（ｉ）から（ｉｖ）をそれぞれ２００μＬのＰＢＳ溶液としてマウスの尾部に静脈注射した。
（ｉ）（ｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖ−ＰＥＯ２）４−ＳＡ  ４０μｇ
（ｉｉ）親抗体であるＩｇＧ  １００μｇ
（ｉｉｉ）ｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖＣ１０  １８μｇ
（ｉｖ）上記式（２）で表される化合物とストレプトアビジンの複合体
ここで用いたＩｇＧは上記式（２）で表される化合物を用いて予め１分子あたり平均４個の近赤外蛍光色素を結合させた。同様にｈｕ４Ｄ５ｓｃＦｖＣ１０は、上記式（２）で表される化合物を用いて予め１分子あたり平均０．６個の近赤外蛍光色素を結合させておいた。
【００６７】
投与後いかなる視覚的問題も無いことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。上記の物質を投与したマウスの全身蛍光像を、ＩＶＩＳ（登録商標）（ＸＥＮＯＧＥＮ社製）  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ社製）を用いて、投与１５分後、１時間後、３時間後、５時間後、７時間後、１日後、２日後に撮影し、マウス全身の蛍光強度を測定した。なお、ＩｇＧについては、５時間後、１日後、２日後のマウス全身の蛍光強度を測定した。結果を図５、６、７、８に示した。○で囲んだ位置が癌細胞を移植した部位である。
【００６８】
図５から図８によって、次のことがわかった。まず、四量体化ｓｃＦｖ（１）を投与したマウスにおいては、投与３時間後から担癌部位特異的に蛍光強度が上昇した。これに対してＩｇＧを投与したマウスにおいては、１日後および２日後から担癌部位の検出が可能となった。ｓｃＦｖおよび上記式（２）で表される化合物を投与したマウスにおいては、Ｎ８７ヒト胃癌細胞担癌部位に特異的な蛍光強度の上昇が確認されなかった。
【００６９】
（四量体化ｓｃＦｖ（１）と全抗体（ＩｇＧ）の性能比較）
マウスに四量体化ｓｃＦｖ（１）を投与してから５時間後における、担癌部位（Ｔｕｍｏｒ）とバックグラウンド（マウスの太腿の付け根部位）（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）の蛍光強度の比（Ｔ／Ｂ）を計算した。同様にＩｇＧについても５時間後におけるＴ／Ｂを計算した。これらの結果を図９に示す。図中の１は四量体化ｓｃＦｖ（１）のＴ／Ｂを、２はＩｇＧのＴ／Ｂをそれぞれ表す。
【００７０】
ＩｇＧに比較して四量体化ｓｃＦｖ（１）は有意にＴ／Ｂの値が大きく、プローブ投与後短時間で明瞭に担癌部位を検出できることを確認した。
【符号の説明】
【００７１】
１０１  抗体部
１０２  化合物（１）
１０３  ビオチニル基
１０４  アビジン部
１０５  信号発生物質
【図１】
2012006846.tif 000007
【図２】
2012006846.tif 000008
【図３】
2012006846.tif 000009
【図４】
2012006846.tif 000010
【図５】
2012006846.tif 000011
【図６】
2012006846.tif 000012
【図７】
2012006846.tif 000013
【図８】
2012006846.tif 000014
【図９】
2012006846.tif 000015