(57)【要約】      （修正有）【課題】リアルタイム逆転写酵素重合反応を用いた癌診断のための情報提供方法及びこのための癌診断用キットを提供する。【解決手段】癌が疑われる患者の血液から得た細胞（赤血球を除くすべての細胞）から全長ＲＮＡを分離し、サイトケラチン１９、Ｋｉ６７、ならびにＴＢＰをそれぞれ増幅可能なプライマー対及びプローブからなる群より選択された１つ以上のプライマー対及びプローブを用いて、リアルタイムＰＣＲを行い。前記増幅された量を正常人に対して増幅された量と比較するステップを含む癌診断のための情報提供方法。【選択図】図１
2012244989.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）癌が疑われる患者の血液から得た細胞から全長ＲＮＡを分離するステップと、
ｂ）前記分離された全長ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するステップと、
ｃ）前記合成されたｃＤＮＡを、サイトケラチン１９を増幅可能なプライマー対及びプローブ、Ｋｉ６７を増幅可能なプライマー対及びプローブ、ならびにＴＢＰを増幅可能なプライマー対及びプローブからなる群より選択された１つ以上のプライマー対及びプローブを用いて、リアルタイムＰＣＲを行うステップと、
ｄ）前記発現した量を正常人に対して発現した量と比較するステップとを含むことを特徴とする、癌診断のための情報提供方法。
【請求項２】
前記発現した量を正常人に対して発現した量と比較するステップは、標準またはカットオフ値によって行われることを特徴とする、請求項１に記載の癌診断のための情報提供方法。
【請求項３】
前記カットオフ値が、サイトケラチン１９に対してＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）が３４．０であることを特徴とする、請求項２に記載の癌診断のための情報提供方法。
【請求項４】
前記サイトケラチン１９を増幅可能なプライマー対が、配列番号１及び２に記載され、
プローブが、配列番号３に記載された塩基配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の癌診断のための情報提供方法。
【請求項５】
前記Ｋｉ６７を増幅可能なプライマー対が、配列番号４及び５に記載され、プローブは、配列番号６に記載された塩基配列を有することを特徴とする、請求項１〜４の何れか一項に記載の癌診断のための情報提供方法。
【請求項６】
前記ＴＢＰを増幅可能なプライマー対が、配列番号７及び８に記載され、プローブは、配列番号９に記載された塩基配列を有することを特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の癌診断のための情報提供方法。
【請求項７】
サイトケラチン１９を増幅可能な配列番号１及び２に記載のプライマー対及び配列番号３に記載のプローブと、
Ｋｉ６７を増幅可能な配列番号４及び５に記載のプライマー対及び配列番号６に記載のプローブと、
ＴＢＰを増幅可能な配列番号７及び８に記載のプライマー対及び配列番号９に記載のプローブとからなる群より選択された１つ以上のプライマー対及びプローブを含むことを特徴とする、癌診断のためのプライマー対及びプローブ。
【請求項８】
請求項７に記載のプライマー対及びプローブを含むことを特徴とする、癌診断用組成物。
【請求項９】
前記癌が、乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、大腸癌、肺癌、すい臓癌、胃癌、卵素癌、血液癌、肝臓癌、前立腺癌、または頭頸部癌であることを特徴とする、請求項８に記載の癌診断用組成物。
【請求項１０】
前記癌は、転移性癌であることを特徴とする、請求項８に記載の癌診断用組成物。
【請求項１１】
請求項８に記載の組成物を含むことを特徴とする、癌診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアルタイム重合反応を用いた癌診断のための情報提供方法及びこのための癌診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、現在、韓国で死亡率１位を占めているほど重要な疾病であって、癌発生者数は年々増加しており、２００８年の韓国国内の癌発生率は、１０万人あたり３００人以上に達している（Ｊｅｍａｌ，Ａ．；Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．；Ｘｕ，Ｊ．；Ｗａｒｄ，Ｅ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１０．ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ２０１０，６０，（５），２７７−３００）．
初期の癌の場合、簡単な手術や薬物治療によってほとんどの悪性腫瘍を治癒することができるが、転移が起きた場合は、その治療が非常に難しくなり、また、患者の予後と５年後の生存率も減少している。このような転移性腫瘍の場合、初期の固形癌に存在する癌細胞が元の病変を起こした部位から剥がれてきて、リンパ節や循環血液あるいは骨髄を通して他の臓器に定着し、転移性癌を誘発するようになる。このように循環血液に存在する癌細胞を血中腫瘍細胞という（Ｒｏｓｓ，Ｊ．Ｓ．；Ｓｌｏｄｋｏｗｓｋａ，Ｅ．Ａ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ２００９，１３２，（２），２３７−４５）。
【０００３】
血中腫瘍細胞は、一次的な腫瘍組織から剥がれてきて、血流に乗って循環する少数の腫瘍細胞をいい、これらは、血液中を循環しながら二次的な部位に転移性腫瘍を引き起こすことがある。したがって、このような血中腫瘍細胞の診断は、初期の癌患者において転移の有無を判別するのに有用である。一般的に、転移性癌を有する患者の経過は不良で治療への反応が良くなく、手術後の予後も悪いことが知られていることから、このような血中腫瘍細胞の診断は、患者において後で転移性癌に発展し得るか否かを判断するのに役立つことができ、患者の経過や予後の判別において良いマーカーとなっている（Ｍｅｎｇ，Ｓ．；Ｔｒｉｐａｔｈｙ，Ｄ．；Ｆｒｅｎｋｅｌ，Ｅ．Ｐ．；Ｓｈｅｔｅ，Ｓ．；Ｎａｆｔａｌｉｓ，Ｅ．Ｚ．；Ｈｕｔｈ，Ｊ．Ｆ．；Ｂｅｉｔｓｃｈ，Ｐ．Ｄ．；Ｌｅｉｔｃｈ，Ｍ．；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｓ．；Ｅｕｈｕｓ，Ｄ．；Ｈａｌｅｙ，Ｂ．；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｌ．；Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｔ．Ｐ．；Ｈｅｒｌｙｎ，Ｄ．；Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ，Ｌ．Ｗ．；Ｆｅｈｍ，Ｔ．；Ｔｕｃｋｅｒ，Ｔ．Ｆ．；Ｌａｎｅ，Ｎ．；Ｗａｎｇ，Ｊ．；Ｕｈｒ，Ｊ．Ｗ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｏｒｍａｎｃｙ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ２００４，１０，（２４），８１５２−６２；Ｐａｃｈｍａｎｎ，Ｋ．，Ｌｏｎｇｔｉｍｅ  ｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ２００５，１１，（１５），５６５７；ａｕｔｈｏｒ  ｒｅｐｌｙ５６５７−８）。
【０００４】
また、癌細胞の場合、一般の細胞とは異なり、顕著に速い細胞の分化速度を示す。そのため、細胞分裂時に使用されるマーカーを用いて、より速い分化速度を示した場合、どのような疾病や疾患を有しているかがわかる。
【０００５】
現在、転移性腫瘍の診断方法は、リンパ節侵潤による検査法や、ＭＲＩ、ＰＥＴのような映像装置を用いた癌細胞の存在の有無に関して診断が行われている。しかし、このような検査法の場合、すでに転移して定着した場合にのみ可能であるという欠点があった。しかしながら、血中腫瘍細胞の有無を検査することにより、転移が発生していない初期の癌患者の中から転移の可能性がある患者を診断することにより、癌患者に対する予後管理が慎重に行われることが可能である。
【０００６】
血中腫瘍細胞を診断する方法としては、血球細胞と癌細胞との表面抗原の差による抗原抗体検査法が主となっている。癌細胞の表面には、血球細胞とは区別される上皮性抗原を有している。このような抗原は、ほとんどが上皮細胞に存在する抗原であって、血管の内壁や血球細胞には存在しないという特性がある。このような抗原のうち、特に、サイトケラチン１９（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  １９）の場合、乳癌や、膀胱癌、子宮頸癌、大腸癌、肺癌、すい臓癌、胃癌などで発現することが知られている（Ｋａｒａｎｔｚａ，Ｖ．，Ｋｅｒａｔｉｎｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｍｅｒｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２０１１，３０，（２），１２７−３８）。そのため、現在、サイトケラチン１９抗原を用いて血中腫瘍細胞を診断する方法が利用されている。現在利用されている検査法としては、Ｖｅｒｉｄｅｘ社製のＣｅｌｌＳｅａｒｃｈが最も多く用いられているが、この方法は、蛍光標識された抗体を用いて、抗原−抗体結合反応によってＥｐＣＡＭ陽性かつＣＤ４５陰性である細胞を判別した後、パンサイトケラチン（Ｐａｎ−Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）抗体を用いて血中癌細胞の有無を検査する方法である（Ａｌｌａｒｄ，Ｗ．Ｊ．；Ｍａｔｅｒａ，Ｊ．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｃ．；Ｒｅｐｏｌｌｅｔ，Ｍ．；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｍ．Ｃ．；Ｒａｏ，Ｃ．；Ｔｉｂｂｅ，Ａ．Ｇ．；Ｕｈｒ，Ｊ．Ｗ．；Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎ，Ｌ．Ｗ．，Ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｃｉｒｃｕｌａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｏｆ  ａｌｌ  ｍａｊｏｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ２００４，１０，（２０），６８９７−９０４）。しかしながら、現在、韓国国内ではこの技術が導入されておらず、高価な機械が必要であるという欠点があった。また、現在開発されているＲＴ−ＰＣＲに基づいて血中腫瘍細胞を診断する方法は、電気泳動を行うことで増幅産物のバンドを確認するものであるため、特異度が低下し、実験過程が複雑になり、定量的な結果を導き出しにくいという面がある。したがって、本発明者らは、このような技術を代替するために、抗原抗体反応ではない、ｍＲＮＡをターゲットとして、簡便かつ定量的な結果を導き出すことができる新規方法のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法に基づく血中腫瘍細胞の診断方法を見出した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記の問題を解決し、上記の必要性によってなされたものであって、その目的は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法に基づく血中腫瘍細胞の診断方法を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、血中腫瘍細胞の診断用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的を達成するために、本発明は、ａ）癌が疑われる患者の血液から得た細胞（赤血球を除くすべての細胞）から全長ＲＮＡ（Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）を分離するステップと、ｂ）前記分離された全長ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するステップと、ｃ）前記合成されたｃＤＮＡを、サイトケラチン１９を増幅可能なプライマー対及びプローブ、Ｋｉ６７を増幅可能なプライマー対及びプローブ、ならびにＴＢＰを増幅可能なプライマー対及びプローブからなる群より選択された１つ以上のプライマー対及びプローブを用いて、リアルタイムＰＣＲを行うステップと、ｄ）前記増幅された量を正常人に対して増幅された量と比較するステップとを含む癌診断のための情報提供方法を提供する。
【００１０】
一般的に用いられる全長ＲＮＡを分離する方法及びこれよりｃＤＮＡを合成する方法は、公知の方法によって実施可能であり、この過程に関する詳細な説明は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＮｏｏｎａｎ，Ｋ．Ｆ．等に開示されており、本発明の参照として援用できる。
【００１１】
本発明のプライマーは、ホスホルアミダイト固体支持体法、またはその他広く公知された方法を利用して化学的に合成することができる。このような核酸配列はまた、当該分野において公知の多くの手段を用いて変形させることができる。このような変形の非制限的な例としては、メチル化、「キャップ化」、天然ヌクレオチド１つ以上の同族体への置換、及びヌクレオチド間の変形、例えば、荷電されていない連結体（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）または荷電された連結体（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）への変形がある。核酸は、１つ以上の付加的な共有結合された残基、例えば、蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート化剤（例えば、金属、放射性金属、鉄、酸化性金属など）、及びアルキル化剤を含有することができる。本発明の核酸配列はまた、検出可能なシグナルを直接または間接的に提供できる標識を用いて変形させることができる。標識例としては、放射性同位元素、蛍光性分子、ビオチンなどがある。
【００１２】
本発明の方法において、前記増幅された標的配列（サイトケラチン１９、Ｋｉ６７などの遺伝子）は、検出可能な標識物質で標識できる。一実現例において、前記標識物質は、蛍光、燐光、化学発光団、または放射性を発する物質であり得るが、これらに限定されない。好ましくは、前記標識物質は、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フィコエリトリン  （ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ローダミン、リサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）Ｃｙ−５またはＣｙ−３であり得る。標的配列の増幅時、プライマーの５’−末端及び／または３’末端にＣｙ−５またはＣｙ−３を標識してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行うと、標的配列が検出可能な蛍光標識物質で標識できる。
【００１３】
また、放射性物質を用いた標識は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの実行時、３２Ｐまたは３５Ｓなどのような放射性同位元素をＰＣＲ反応液に添加すると、増幅産物が合成されるとともに、放射性が増幅産物に混入され、増幅産物が放射性で標識できる。標的配列を増幅するために用いられた１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを使用することができる。
【００１４】
標識は、当業界において通常実施される多様な方法、例えば、ニックトランスレーション（ｎｉｃｋ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）法、ランダムプライミング法  （Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｏｏｋｌｅｔ，“Ａｍｅｒｓｈａｍ”（１９８９））、及びマキサム・ギルバート法（Ｍａｘａｍ  ＆  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９（１９８６））によって実施できる。標識は、蛍光、放射能、発色測定、重量測定、Ｘ線回折、または吸収、磁気、酵素的活性、質量分析、結合親和度、混成化高周波、ナノクリスタルによって検出可能なシグナルを提供する。
【００１５】
本発明の一態様によれば、本発明においては、ＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルで発現レベルを測定するようになる。このために、前記サイトケラチン１９、Ｋｉ６７、及びＴＢＰ遺伝子に特異的に結合する新規なプライマー対及び蛍光標識されたプローブが要求され、本発明において、特定の塩基配列で特定された当該プライマー及びプローブを使用することができるが、これらに限定されず、これらの遺伝子に特異的に結合して検出可能なシグナルを提供することでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行えるものであれば制限なく使用可能である。前記において、ＦＡＭ及びＢＨＱ１は、蛍光染料を意味する。
【００１６】
本発明に適用されるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、当業界において通常使用される公知の過程によって実施可能である。
【００１７】
ｍＲＮＡの発現レベルを測定するステップは、通常のｍＲＮＡの発現レベルを測定できる方法であれば制限なく使用可能であり、使用したプローブ標識の種類に応じて、放射性測定、蛍光測定、または燐光測定によって実施できるが、これらに限定されない。増幅産物を検出する方法の一つとして、蛍光測定法は、プライマーの５’−末端にＣｙ−５またはＣｙ−３を標識してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行うと、標的配列が検出可能な蛍光標識物質で標識され、このように標識された蛍光は、蛍光測定器を用いて測定することができる。また、放射性測定法は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの実行時、３２Ｐまたは３５Ｓなどのような放射性同位元素をＰＣＲ反応液に添加して増幅産物を標識した後、放射性測定器、例えば、ガイガーカウンター（Ｇｅｉｇｅｒ  ｃｏｕｎｔｅｒ）または液体シンチレーションカウンター（ｌｉｑｕｉｄ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて放射性を測定することができる。
【００１８】
本発明の好ましい一実現例によれば、前記リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって増幅されたＰＣＲ産物に蛍光標識されたプローブが付着して、特定波長の蛍光を発するようになり、増幅と同時に、リアルタイムＰＣＲ装置の蛍光測定器で本発明における遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルをリアルタイムで測定し、測定された値が計算されてＰＣを介して視覚化され、検査者は容易にその発現程度を確認することができる。
【００１９】
本発明の一実現例において、前記増幅された量を正常人に対して増幅された量と比較するステップは、標準またはカットオフ値によって行われることが好ましく、前記カットオフ値は、Ｃｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）が３４．０であることがより好ましいが、これに限定されない。
【００２０】
本発明の他の実現例において、前記サイトケラチン１９を増幅可能なプライマー対は、配列番号１及び２に記載され、プローブは、配列番号３に記載された塩基配列を有することが好ましく、前記Ｋｉ６７を増幅可能なプライマー対は、配列番号４及び５に記載され、プローブは、配列番号６に記載された塩基配列を有することが好ましく、前記ＴＢＰを増幅可能なプライマー対は、配列番号７及び８に記載され、プローブは、配列番号９に記載された塩基配列を有することが好ましいが、これに限定されない。
【００２１】
また、本発明は、サイトケラチン１９を増幅可能な配列番号１及び２に記載のプライマー対及び配列番号３に記載のプローブと、Ｋｉ６７を増幅可能な配列番号４及び５に記載のプライマー対及び配列番号６に記載のプローブと、ＴＢＰを増幅可能な配列番号７及び８に記載のプライマー対及び配列番号９に記載のプローブとからなる群より選択された１つ以上のプライマー対及びプローブを含む癌診断のためのプライマー対及びプローブを提供する。
【００２２】
さらに、本発明は、前記本発明のプライマー対及びプローブを含む癌診断用組成物を提供する。
【００２３】
本発明の一実現例において、前記癌は、乳癌、膀胱癌、子宮頸癌、大腸癌、肺癌、すい臓癌、胃癌、卵素癌、血液癌、肝臓癌、前立腺癌、または頭頸部癌であることが好ましいが、これらに限定されない。
【００２４】
また、本発明は、前記本発明の組成物を含む癌診断用キットを提供する。
【００２５】
本発明の他の態様によれば、前記診断キットは、逆転写重合酵素反応を行うために必要な必須要素を含むことを特徴とする癌診断用キットであり得る。逆転写重合酵素反応キットは、前記本発明の遺伝子に対する特異的な各々のプライマー対を含むことができる。プライマーは、各マーカー遺伝子の核酸配列に特異的な配列を有するヌクレオチドであって、約７ｂｐ〜５０ｂｐの長さ、より好ましくは、約１０ｂｐ〜３０ｂｐの長さであり得、より好ましくは、配列番号１及び２で表示される新規なプライマー対及び配列番号３で表示される蛍光標識されたプローブ、配列番号４及び５で表示される新規なプライマー対及び配列番号６で表示される蛍光標識されたプローブ、ならびに／または配列番号７及び８で表示される新規なプライマー対及び配列番号９で表示される蛍光標識されたプローブを含むことができる。
【００２６】
その他、逆転写重合酵素反応キットは、テストチューブまたは別の適したコンテーナ、反応緩衝液（ｐＨ及びマグネシウム濃度は多様である）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ−ポリメラーゼ及び逆転写酵素のような酵素、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ抑制剤ＤＥＰＣ処理水（ＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ）、滅菌水などを含むことができる。
【００２７】
本発明において、「癌診断のための情報提供方法」という用語は、診断のための予備的段階であって、癌診断のために必要な客観的な基礎情報を提供するもので、医者の臨床学的判断または所見は除外される。
【００２８】
「プライマー」という用語は、短い自由３末端水酸化基を有する核酸配列で、相補的な鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）と塩基対を形成することができ、鋳型鎖をコピーするための開始地点としての機能を果たす短い核酸配列を意味する。プライマーは、適切な緩衝溶液及び温度で重合反応（すなわち、ＤＮＡ重合酵素または逆転写酵素）のための試薬及び異なる４つのヌクレオシドトリホスフェートの存在下で、ＤＮＡ合成が開始できる。本発明のプライマーは、各マーカー遺伝子特異的なプライマーで、７個〜５０個のヌクレオチド配列を有するセンス及びアンチセンス核酸である。プライマーは、ＤＮＡ合成の開始点として作用するプライマーの基本的性質を変化させないという追加の特徴を混入することができる。
【００２９】
「プローブ」という用語は、単連鎖核酸分子であり、標的核酸配列に相補的な配列を含む。
【００３０】
「リアルタイム逆転写重合酵素反応（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）」という用語は、逆転写酵素を用いてＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写させた後に作られたｃＤＮＡを鋳型とし、標的プライマーと標識を含む標的プローブを用いて、ターゲットを増幅するとともに、増幅されたターゲットに標的ブローブの標識で発生する信号を定量的に検出する分子生物学的重合方法である。
【００３１】
以下、本発明を説明する。
【００３２】
本発明者らは、癌患者から１チューブの血液を採取して、血中腫瘍細胞の有無を検査することにより、以前に用いられていた映像装置では検出できなかった現在転移性癌の可能性がある患者を判別可能な検査法を提供しようとする。特に、上皮性抗原であるサイトケラチン１９と細胞分裂マーカーであるＫｉ６７のｍＲＮＡを用いた遺伝子増幅方法を利用するため、蛋白質を検出する方法に比べて目に見えない程度の量も検出できるという利点を提供し、抗原抗体反応を利用しないことから、割安な検査方法を提供することができる。
【００３３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３４】
各々の細胞株（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）からのサイトケラチン１９とＫｉ６７の発現の有無の確認
各々の癌細胞に該当する細胞株を用いてサイトケラチン１９とＫｉ６７の発現の有無を確認した。各々に使用された細胞株は、乳癌細胞株の３種類（ＭＣＦ７、ＳＫＢＲ３、ＭＤＡ−ＭＢ２３１）、肺癌細胞株（Ａ５４９）、子宮頸癌細胞株（ＨｅＬａ）、卵素癌細胞株（ＳＫＯＶ３）を用い、ヒト単球細胞の細胞株（ＴＨＰ−１）を陰性対照群として用いた。
【００３５】
各細胞株の細胞数は１００，０００個に維持し、細胞株ごとのサイトケラチン１９の発現様相を調べた。その結果、乳癌細胞株と肺癌細胞株では高いサイトケラチン１９の発現様相を示していることを確認でき、卵素癌細胞株と単球細胞の細胞株ではサイトケラチン１９が発現していないことを確認できた。Ｋｉ６７の場合、すべて癌細胞化された場合に発現することを確認できた。
【表１】
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表１は、細胞株ごとのサイトケラチン１９の発現様相を示した表である。
【表２】
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表２は、細胞株ごとのＫｉ６７の発現様相を示した表である。
【００３６】
サイトケラチン１９の発現の敏感度及びカットオフ値の設定、ならびにＫｉ６７の発現の有無の確認
癌が存在しない健康な人の血液を１０ｍｌ採血して、乳癌細胞株であるＭＣＦ７を１０５から１細胞まで段階的に血液に混合して任意に血中腫瘍細胞のモデルを作った後、その敏感度を確認した。また、癌のない健康な人の血液を用いて実験上のカットオフ値を設定した。その結果、任意に作った血中腫瘍細胞モデルにおいて、１０ｍｌあたり１０個まで検出が可能であり、また、Ｃｔ値のカットオフ値は３４．０で設定することができた。
【００３７】
Ｋｉ６７の場合、ＴＢＰ（ＴＡＴＡ  ＢＯＸ  ＢＩＮＤＩＮＧ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）とＫｉ６７をそれぞれ増幅させた後、Ｃｔ値を求めて、「正常人４」を基準として発現様相を調べた。発現様相は、１．０から３．２７まで確認された。
【００３８】
本発明において、ＴＢＰは、内部対照群（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として用いたもので、Ｋｉ６７の場合、サイトケラチン１９とは異なり（サイトケラチン１９の発現の有無は、血中腫瘍細胞モデルを標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）として定量曲線を描いて相対的な細胞数を確認した）、基準を設定するためにＴＢＰを常に入れ、正常人の発現量を比較するために、正常人のＴＢＰのＣｔ値と同濃度のＤＮＡを基準としてＴＢＰとＫｉ６７を常に入れ、ＴＢＰの基準を１とした後、１０倍以上が発現した場合に陽性と判定した。
【表３】
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表３は、血中腫瘍細胞モデルの敏感度を確認した表である。
【表４】
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表４は、正常人におけるＫｉ６７の発現を示した表である。
【００３９】
転移性乳癌を有する患者における血中のサイトケラチン１９とＫｉ６７の確認
新村（シンチョン）セブランス病院から転移性乳癌を有する患者の血液を入手し、サイトケラチン１９の発現の有無を確認した。先に用いた任意の血中腫瘍細胞モデルを標準として定量曲線を描いた後、相対的な細胞数を確認した。その結果、計６名の患者のうち、１０個以上の血中腫瘍細胞が検出された患者が１名、１０個以上ではないものの、カットオフ値以下の値を示した患者が２名存在することを確認した。
【００４０】
また、Ｋｉ６７の場合も、サイトケラチン１９が多く発現した患者群において、正常人に比べて高い比率で発現することを確認できた。正常人の発現率の最大が３．２９であった点を勘案すると、「患者群４」と「患者群６」において、それぞれ高い比率でＫｉ６７が発現したことを確認できた。したがって、２つのマーカーを用いて同時に検出する場合にさらに陽性率が高められることから、転移性癌に発展し得る患者の観察により容易に使用可能である。
【表５】
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表５は、転移性乳癌患者における血中腫瘍細胞の検出表である。
【表６】
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表６は、患者群におけるＫｉ６７の発現様相を示した表である。
【００４１】
以前に知られたＲＴ−ＰＣＲ法との比較
以前に知られたＲＴ−ＰＣＲ法を用いた血中腫瘍細胞検出法との比較のために、すでに他の特許で用いられたプライマーセットとの比較実験を行った。その結果、以前に知られたプライマーセットの場合、「正常人４」の検体において、サイトケラチン１９のバンドと同じ大きさのバンドを確認することができたが、本発明に用いられたリアルタイムＰＣＲ法を用いた場合には発現の有無を確認できなかったため、新たに開発されたプライマー及びプローブセットが、以前に知られたＲＴ−ＰＣＲ法に比べてより特異度が良いことを確認でき、さらに、電気泳動を用いてバンドを確認するステップがないことから、より容易に結果を確認できるという利点を確認することができた。
【発明の効果】
【００４２】
本発明は、癌患者から１チューブの血液を採取して、血中腫瘍細胞の有無を検査することにより、以前に用いられていた映像装置では検出できなかった現在転移性癌の可能性がある患者を判別することができ、特に、上皮性抗原であるサイトケラチン１９と細胞分裂マーカーであるＫｉ６７のｍＲＮＡを用いた遺伝子増幅方法を用いるため、蛋白質を検出する方法に比べて目に見えない程度の量も検出することができ、抗原抗体反応を利用しないことから、割安な検査方法を提供することができる。なお、以前に知られたＲＴ−ＰＣＲ法に比べてより特異度が良いことを確認することができ、さらに、電気泳動を用いてバンドを確認するステップがないことから、より容易に結果を確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】細胞株ごとのサイトケラチン１９の発現の有無を示す図であり、Ａ；ＭＣＦ７、Ｂ；ＳＫＢＲ３、Ｃ；ＭＤＡ−ＭＢ２３１、Ｄ；Ａ５４９、Ｅ；ＨｅＬａ、Ｆ；ＳＫＯＶ３、Ｇ；ＴＨＰ−１、Ｈ；ブランク対照群を示す。
【図２】細胞株ごとのＫｉ６７の発現様相を示す図であり、Ａ；ＭＣＦ７、Ｂ；ＳＫＢＲ３、Ｃ；ＭＤＡ−ＭＢ２３１、Ｄ；Ａ５４９、Ｅ；ＨｅＬａ、Ｆ；ＳＫＯＶ３、Ｇ；ＴＨＰ−１、Ｈ；ブランク対照群を示す。
【図３】転移性乳癌患者におけるサイトケラチン１９の検出を示す図であり、赤色の四角形；標準曲線（Ｂｌｏｏｄ＋ＭＣＦ７  １０５−１）、青色の四角形；患者群を示す。
【図４】サイトケラチン１９のＲＴ−ＰＣＲ法の特異度及び敏感度の確認を示す図であり、乳癌細胞であるＭＣＦ７を、健康な人の血液１０ｍｌに１０５から１細胞まで段階的に希釈して実験をした結果、１細胞まで検出が可能であった。また、各癌細胞の細胞株で発現様相を確認した結果、単球細胞では発現していないことを確認し、各々の癌細胞の細胞株ではサイトケラチン１９のバンドを確認することができた。(1)ＴＨＰ−１（単球細胞）、(2)ＳＫＯＶ３（卵素癌細胞株）、(3)ＨｅＬａ  （子宮頸癌細胞株）、(4)〜(6)乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＣＦ７、ＳＫＢＲ３）、(7)ブランク対照群で、また、患者群（Ｐ１−Ｐ６）の場合においても、６個全体の検体からサイトケラチン１９のバンドが確認され、正常人（Ｎ１−Ｎ４）においても、１検体からバンドが確認された。
【図５】既存の方法と現在の方法におけるプライマーの位置を確認した図であり、赤色は、既存の方法で用いたプライマーの位置（５１６−６７５）、青色は、今回の方法で用いたプライマーの位置（１０１２−１１０７）、緑色は、今回の方法で用いたプローブの位置（１０３７−１０５９）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下、非限定的な実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示するためのものとして記載されたものであって、本発明の範囲は、下記の実施例によって制限されるものではない。
【００４５】
実施例１：患者の血液からの細胞の分離
癌患者の静脈から血液をＥＤＴＡチューブに採取する。上皮細胞からの汚染を防止するために、最初に採取した５ｍｌは捨て、後で採取した１０ｍｌを検査法に使用する。患者の血液からｍＲＮＡの損傷を防止するために、血液採取後４時間以内に初の実験過程である赤血球の溶解過程を開始しなければならない。血液から赤血球を溶解するためには、ＮＨ４Ｃｌ１５４ｍＭ、ＫＨＣＯ３９ｍＭ、ＥＤＴＡ０．１ｍＭが含まれた赤血球溶解溶液で５倍の容積を入れ、ボルテックス後、常温で１０分間静置後、１０分間、４℃、６００ｇで遠心分離を行い、上澄液は注意して捨てる。余分の赤血球を除去するために、１０ｍｌのＲＢＣ溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を入れ、５分間、氷に静置させた後、２分間、４℃、３０００ｒｐｍで遠心分離を再度行い、上澄液を注意して捨て、１ｍｌのＰＢＳを入れ、ペレットを再浮遊させた後、血中にある自由核酸を除去するために、ＲＮａｓｅ  Ａ（１００μｇ／ｍｌ）を５分間処理する。
【００４６】
実施例２：分離された細胞からの全長ＲＮＡの分離
再浮遊させたペレットを再度、２分間、４℃、３０００ｒｐｍで遠心分離を行い、上澄液はピペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）で捨てた後、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）１ｍｌを入れ、製造業者のプロトコールによって全長ＲＮＡを分離した。
【００４７】
実施例３：分離された全長ＲＮＡからのｃＤＮＡの作製及びリアルタイムＰＣＲの実行
１）ｃＤＮＡ合成
分離された全長ＲＮＡ２μｇ、ランダムプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）  ０．２５μｇ、ｄＮＴＰ（Ｃｏｓｍｏ  ｇｅｎｅ  ｔｅｃｈ社製）２５０μＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）５０ｍＭ、ＫＣｌ７５ｍＭ、ＭｇＣｌ２３ｍＭ、ＤＴＴ８ｍＭとＭＭＬＶ逆転写重合酵素２００ユニット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加し、最終容積が２０μｌとなるようにＤＥＰＣ処理されたＤＷを入れてよく混ぜた後、合成反応液を、サーモサイクラー（ＡＢＩ）で、２５℃で１０分、３７℃で５０分、７０℃で１５分間反応させて、ｃＤＮＡを合成する。
【００４８】
２）リアルタイムＰＣＲの実行
リアルタイムＰＣＲの反応物の組成は、２５ｍＭのＴＡＰＳ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭの２−メルカプトエタノール、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１ユニットのＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社製）と、フォワード（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーとリバース（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーをそれぞれ１ｐｍｏｌｅ入れ、プローブも１ｐｍｏｌｅ入れ、合成されたｃＤＮＡを２μｌ入れて、最終容積が２０μｌとなるようにする。各々のプライマー及びプローブの塩基配列は、次のとおりである。
【００４９】
サイトケラチン１９のプライマー及びプローブ（増幅産物９６ｂｐ）
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’ＧＡＴＧＡＧＣＡＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＴＡ−３’（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’ＴＣＴＴＣＣＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴＴＣＡＴ−３’（配列番号２）
プローブ：５’ＦＡＭ−ＣＴＧＣＧＧＣＧＣＡＣＣＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＴ−ＢＨＱ１−３’（配列番号３）
Ｋｉ６７のプライマー及びプローブ
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’ＴＡＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧＧＧＡＡＴＡＣＣＴＴＴＧ−３（配列番号４）  
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’ＡＧＧＣＡＡＧＴＴＴＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡＧＴＴＣＡ−３（配列番号５）  
プローブ：５’ＦＡＭ−ＧＧＣＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴＴＧＧＴＧＧＧＣＡ−ＢＨＱ１−３（配列番号６）  
ＴＢＰのプライマー及びプローブ
Ｆｏｒｗａｒｄ：５’ＣＡＣＡＧＴＧＡＡＴＣＴＴＧＧＴＴＧＴＡＡＡＣＴＴＧＡ−３（配列番号７）  
Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’ＡＡＡＣＣＧＣＴＴＧＧＧＡＴＴＡＴＡＴＴＣＧ−３（配列番号８）  
プローブ：５’ＦＡＭ−ＡＡＧＡＣＣＡＡＴＧＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＣＧＡ−ＢＨＱ１−３（配列番号９）  
ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ７５００Ｆａｓｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて、変性温度９４℃で５分間１回行い、変性温度９５℃で３０秒、アニーリング温度５５℃で２０秒のサイクルを４０回繰り返して行った。また、各々のアニーリング過程後、蛍光を測定する過程を追加して、各サイクルごとに増加する蛍光値を測定した。
【００５０】
実施例４：結果の分析
各実験の結果は、７５００  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ２．０．４（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて分析した。サイトケラチン１９の場合、正常人の血液１０ｍｌに、乳癌細胞であるＭＣＦ７を１０５から１細胞まで段階的に希釈して、相対的な定量曲線を描いて、相対的な血中腫瘍細胞の量をＣｔ値を用いて測定することができた。Ｋｉ６７の場合、正常人の血液で発現するＫｉ６７の発現量を基準として患者群のＫｉ６７の発現量を比較定量して発現率を調べた。このとき、ハウスキーピング遺伝子であるＴＢＰの発現量を基準として各々のＫｉ６７の発現量を比較した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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