(57)【要約】【課題】皮膚と試料台とが密着した状態を維持しつつ、ラマンスペクトルの測定部位をＸ−Ｙ平面内で容易に移動させることができる装置を提供すること。【解決手段】皮膚を測定対象とする共焦点顕微ラマン分光測定装置用のプローブ３０である。プローブ３０は、ハウジング３１と、ハウジング３１内に設置され、かつレーザー光の照射及び受光を行う対物レンズ３３と、ハウジング３１に取り付けられ、かつステージ３８ａに開口部が設けられたＸＹ可動ステージ３８とを備える。対物レンズ３３が、ＸＹ可動ステージ３８の動作と独立して動作するように、ＸＹ可動ステージ３８の開口部３８ｂ内に配置されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚を測定対象とする共焦点顕微ラマン分光測定装置用のプローブであって、
前記プローブは、ハウジングと、ハウジング内に設置され、かつレーザー光の照射及び受光を行う対物レンズと、ハウジングに取り付けられ、かつステージに開口部が設けられたＸＹ可動ステージとを備え、
対物レンズが、ＸＹ可動ステージの動作と独立して動作するように、該ＸＹ可動ステージの開口部内に配置された共焦点顕微ラマン分光測定装置用のプローブ。
【請求項２】
請求項１に記載のプローブを具備し、皮膚を測定対象とする共焦点顕微ラマン分光測定装置。
【請求項３】
更に本体部を具備し、該本体部がレーザー光の光源及び分光器を備え、該光源及び該分光器がそれぞれプローブと光ファイバによって接続されている請求項２に記載の共焦点顕微ラマン分光測定装置。
【請求項４】
共焦点顕微ラマン分光測定装置を用いて皮膚の水分量を、医療行為以外の目的で測定する皮膚の水分量の測定方法であって、
前記測定装置は、ハウジングと、ハウジング内に設置され、かつレーザー光の照射及び受光を行う対物レンズと、ハウジングに取り付けられ、かつステージに開口部が設けられたＸＹステージとを備え、対物レンズが、ＸＹ可動ステージの動作と独立して動作するように、該ＸＹ可動ステージの開口部内に配置されているプローブを具備しており、
測定対象の皮膚に対物レンズが臨むように、前記プローブを皮膚に当接させた状態下にＸＹステージをＸＹ方向に移動させることで、ＸＹ方向における対物レンズの位置を固定したまま皮膚を移動させつつ皮膚の水分量を測定する皮膚の水分量の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚を測定対象とする共焦点顕微ラマン分光測定装置用のプローブに関する。また本発明は、このプローブを具備した共焦点顕微ラマン分光測定装置に関する。更に本発明は、この共焦点顕微ラマン分光測定装置を用いた皮膚の化学組成、特に水分量の測定方法（ただし医療行為を除く）に関する。
【背景技術】
【０００２】
共焦点顕微ラマン分光法によって、ヒトの皮膚内部のラマンスペクトルを測定し、このスペクトルから皮膚内部の特定部位における水分量を求められることが知られている。この方法は、(i)非侵襲で皮膚内部の化学情報が得られる、(ii)常温・常圧・含水系で測定が可能である、(iii)共焦点に起因して空間分解能が高い、といった利点を有する。
【０００３】
共焦点顕微ラマン測定では、対物レンズの焦点位置に被測定物を設置する必要がある。一般的には、三軸で可動なステージ（試料台）上に被測定物を置き、ステージの上または下に設置された対物レンズを介してレーザー光を被測定物に照射・集光する。レーザー光の焦点部位から発生するラマン散乱光を、再び同じ対物レンズを介して集光し、分光器に導き、ラマンスペクトルを得る。このとき、試料と対物レンズの間に、窓材を配置する場合と配置しない場合がある。窓材を配置し、窓剤上に試料を設置する場合、対物レンズと試料との距離を安定して保持できる特長がある。ヒト皮膚の表面は心拍・呼吸・筋肉の動きにより常にマイクロメートル単位での形状変化を繰り返している。従って、ヒト皮膚の共焦点顕微ラマン測定を行うには、光学系内に窓材を配置し、窓材によって皮膚表面と対物レンズの間の距離を一定に保持した状態で測定することが好ましい。
【０００４】
皮膚等の被測定物を窓材に当接させた状態で対物レンズ側から観察すると、皮膚表面と窓材が光学的に密着した部位が、黒いスポット（本明細書においては、便宜上「黒色部」と言う。）として観察される。このとき黒色部として観測されない領域（本明細書においては、便宜上「白色部」と言う。）は、皮膚表面と窓材表面の間に空気層が存在する領域である。白色部では、光学収差や界面での光の散乱が生じるため、白色部を介して皮膚にレーザーを照射した場合、感度の低下と空間分解能の低下が生じる。そこで良好な測定結果を得るためには、黒色部を介してレーザーを皮膚内に照射する必要がある。しかし皮膚表面には微小な凸凹を有しているため、窓材に皮膚を当接させても、そのごく一部でしか光学的に密着した部位（黒色部）が発生しない。そこでこの黒色部とレーザー照射部を一致させるための機構が、皮膚のラマン測定では必要となる。
【０００５】
この解決策としては以下の４種の方法が今までに考えられている。第１の方法は、黒色部がレーザー照射部と一致するまで、皮膚を窓材に繰り返し当接させる方法である。しかしこのような作業はたいへん煩雑である。特に洗浄後自然乾燥させた皮膚の場合、皮膚表面の水分・油分の減少により、黒色部の発生量が激減するため、黒色部とレーザー照射部が一致させるには、被験者の負担が過重である。
第２の方法は、対物レンズを水平方向に移動させることにより、レーザー照射部を黒色部に移動させることである。市販の皮膚用ラマン分光装置、例えばRiver Diagnostic社のSkin Analyzerが採用している方法である。しかしこの方法は共焦点光学系を維持しながら対物レンズを移動させる必要がある。そのためには、複雑かつ高精度な位置制御機構を採用する必要があるので、装置の小型化や可搬化が難しい。
第３の方法は、ガルバノミラーを採用し、レーザー光の焦点位置を水平方向に移動させることにより、レーザー照射部を黒色部に移動させることである。この方法は特許文献１に記載されている。しかしガルバノミラーは複雑かつ高精度な位置制御機構となるので、対物レンズの移動と同様に装置の小型化や可搬化が難しい。
さらに第４の方法として、本出願人は先に、被測定物と窓材との間の空気層（白色部）を埋めるための、分子内にＣ−Ｈ結合した水素原子を含有しない化合物を含む、測定温度で液体のコンタクト剤を配することを提案した（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−２４４２５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載の手法によれば、被測定物表面と窓材との間の光学的接触を簡便にかつ広い面積で成立させることができるので、被測定物内部の水分量測定を容易に行うことが可能になる。しかしこの手法では、コンタクト剤の屈折率が皮膚の屈折率とは完全には一致しないため、コンタクト剤無しに黒色部を直接測定する場合と比べて、屈折率の不一致による収差に基づく、空間分解能の低下と感度の低下が避けられない。
【０００８】
したがって本発明の課題は、ラマン分光を用いた皮膚の水分量の測定装置において、高感度、高空間分解能、高い可搬性、小型、操作が簡便かつ被験者への負担が少ないといった要件を満たす装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、皮膚を測定対象とする共焦点顕微ラマン分光測定装置用のプローブであって、
前記プローブは、ハウジングと、ハウジング内に設置され、かつレーザー光の照射及び受光を行う対物レンズと、ハウジングに取り付けられ、かつステージに開口部が設けられたＸＹ可動ステージとを備え、
対物レンズが、ＸＹ可動ステージの動作と独立して動作するように、該ＸＹ可動ステージの開口部内に配置された共焦点顕微ラマン分光測定装置用のプローブを提供するものである。
【００１０】
また本発明は、前記のプローブを具備し、皮膚を測定対象とする共焦点顕微ラマン分光測定装置を提供するものである。
【００１１】
更に本発明は、共焦点顕微ラマン分光測定装置を用いて皮膚の水分量を、医療行為以外の目的で測定する皮膚の水分量の測定方法であって、
前記測定装置は、ハウジングと、ハウジング内に設置され、かつレーザー光の照射及び受光を行う対物レンズと、ハウジングに取り付けられ、かつステージに開口部が設けられたＸＹステージとを備え、対物レンズが、ＸＹ可動ステージの動作と独立して動作するように、該ＸＹ可動ステージの開口部内に配置されているプローブを具備しており、
測定対象の皮膚に対物レンズが臨むように、前記プローブを皮膚に当接させた状態下にＸＹステージをＸＹ方向に移動させることで、ＸＹ方向における対物レンズの位置を固定したまま皮膚を移動させつつ皮膚の水分量を測定する皮膚の水分量の測定方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、測定対象となる皮膚とプローブとが密着した状態を維持しつつ、ラマンスペクトルの測定部位をＸ−Ｙ平面内で容易にマイクロメートル単位で移動させることができるラマン分光測定装置が提供される。また可搬性の高い小型のラマン分光測定装置が提供される。更に本発明によれば、測定時における被験者の負担が少ないラマン分光測定装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の共焦点顕微ラマン分光測定装置の一実施形態を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の共焦点顕微ラマン分光測定装置のプローブにおけるＸＹ可動ステージ付近の要部を、試料台を取り外した状態で拡大して示す模式図である。
【図３】図３（ａ）及び（ｂ）は、図１に示す共焦点顕微ラマン分光測定装置を用いてヒトの皮膚のラマンスペクトルを測定する方法を示す模式図である。
【図４】図４は、実施例１における皮膚と試料台の接触面の光学顕微鏡像である。
【図５】図５は、実施例１で測定されたヒトの前腕内側部のラマンスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下本発明を、その好ましい実施形態に基づき図面を参照しながら説明する。図１には、本発明の共焦点顕微ラマン分光測定装置の一実施形態が模式的に示されている。同図に示す共焦点顕微ラマン分光測定装置１０は、本体部２０とプローブ３０とに大別される。本体部２０とプローブ３０とは、可撓性を有する２本の光ファイバ４０ａ，４０ｂによって接続されている。したがってプローブ３０は、本体部２０を固定した状態で、該本体部２０とは独立して可動・可搬になっている。
【００１５】
本体部２０は、レーザー光の光源２１を備えている。また本体部２０は、分光器２２を備えている。これら光源２１及び分光器２２としては、従来の共焦点顕微ラマン分光測定装置に備えられているものと同様のものを特に制限なく用いることができる。更に本体部２０は、図示していないが、電子回路から構成されている制御部も備えている。制御部は、光源２１のオン・オフを行ったり、分光器２２で分光されたラマンスペクトルの解析、並びに解析結果の表示及び記憶等を行ったりする機能を有している。そのような制御部の構成は、従来の共焦点顕微ラマン分光測定装置に備えられている制御部と同様のものである。
【００１６】
プローブ３０はハウジング３１を有している。ハウジング３１は、プローブ３０の外形をなしており、プローブ３０を構成する主要部材は該ハウジング３１内に収容されている。例えばハウジング３１内には２つのレンズ３２ａ，３２ｂが配置されている。これらのうち、レンズ３２ａは、光ファイバ４０ａを介して本体部２０の光源２１と光学的に接続されている。一方、レンズ３２ｂは、光ファイバ４０ｂを介して本体部２０の分光器２２と光学的に接続されている。
【００１７】
ハウジング３１内には更に、対物レンズ３３が配置されている。対物レンズ３３は、本体部２０の光源２１からレンズ３２ａを通じて導かれたレーザー光Ｌの光軸上に配置されている。対物レンズ３３とレンズ３２ａとの間にはバンドパスフィルタ３４が配置されている。バンドパスフィルタ３４は、特定の波長の光のみを透過させ、かつそれ以外の波長の光を反射させる機能を有している。
【００１８】
対物レンズ３３の基部にはピエゾシステム３５が取り付けられている。ピエゾシステム３５は対物レンズ３３を、図１中、符号Ｚで示す方向に前進・後退させるために用いられる。
【００１９】
ハウジング３１内には、更に反射ミラー３６及びエッジフィルタ３７が配置されている。反射ミラー３６は、被測定物から生じたラマン散乱光の光路上に配置されて、該ラマン散乱光をレンズ３２ｂへと導くものである。エッジフィルタ３７は、反射ミラー３６とレンズ３２ｂとの間に配置される。
【００２０】
ハウジング３１はその一部に開口部を有しており、該開口部にＸＹ可動ステージ３８が取り付けられている。ＸＹ可動ステージ３８は、図１中、符号Ｚで示す方向と直交する平面（Ｘ−Ｙ平面）内において移動可能なステージ３８ａを有している。ステージ３８ａ上には、窓材３９ａを備えた試料台３９が取り付けられている。
【００２１】
図２には、プローブ３０におけるＸＹ可動ステージ３８付近の要部拡大図が模式的に示されている。同図においては、試料台３９を取り外した状態が示されている。同図に示すように、ステージ３８ａには開口部３８ｂが設けられている。開口部３８ｂは、ステージ３８ａをその厚み方向に貫通している。そして、先に述べた対物レンズ３３が、開口部３８ｂ内に配置されている。対物レンズ３３は、その光軸の方向が、ＸＹ可動ステージ３８のＸ−Ｙ平面と直交するように、すなわち図２中、符号Ｚで示す方向と同方向になるように、開口部３８ｂ内に配置されている。
【００２２】
ＸＹ可動ステージ３８として公知の構造のものを特に制限なく用いることができる。例えば、ラックピニオン方式の移動機構を有し、つまみ３８ｃ，３８ｄを手動で回転させることで、Ｘ軸の方向及びＹ軸の方向にステージ３８ａを移動できる構造のものを用いることができる。あるいは駆動系にステッピングモータを用いた自動機構のものを用いることもできる。いずれの移動機構を用いる場合であっても、ＸＹ可動ステージ３８はマイクロメートル単位での移動が可能なものであることが好ましい。
【００２３】
対物レンズ３３は、ＸＹ可動ステージ３８の動作と独立して動作するようになっている。具体的には、ＸＹ可動ステージ３８の動作は上述のとおりであるところ、その動作は対物レンズ３３の動作とは連動していない。対物レンズ３３は、先に述べたピエゾシステム３５によってＺ軸方向に進退可能になっているだけであり、ステージ３８ａのＸ−Ｙ平面内における移動に追従しない構造になっている。
【００２４】
再び図１に戻ると、同図において、ＸＹ可動ステージ３８のステージ３８ａ上に取り付けられている試料台３９は、先に述べたとおり窓材３９ａを有している。窓材３９ａは、本装置１０で使用するレーザー光に対して光学的に透明な材料から構成されている。例えばガラスや石英から構成されている。窓材３９ａは、対物レンズ３３の光軸上に配置されている。窓材３９ａの外面は平坦であり、測定対象物であるヒトの肌と密着しやすくなっている。
【００２５】
次に、本実施形態の装置１０の使用方法を、ヒトの肌の水分量の測定を例にとり説明する。図３（ａ）に示すように、測定対象の皮膚Ｓに対物レンズ３３が臨むように、プローブ３０における窓材３９ａを皮膚に当接させる。そして、ＸＹ可動ステージ３８を駆動させ、窓材３９ａと皮膚表面とが密着した部位（黒色部）がレーザースポットと重なる位置に調整する。この状態下に、皮膚Ｓに向けてレーザー光を照射する。レーザー光は、皮膚の表面から所定の深さの位置に焦点が合うように焦点距離が調節される。照射するレーザー光の波長及び入射角に特に限定はない。例えば、被測定物がヒトの皮膚の場合、波長は４００〜１０６４ｎｍが好ましく、６００〜８００ｎｍが一層好ましい。対物レンズ３３によるレーザー光の集光過程を無視した場合の、皮膚Ｓの表面に対するレーザー光の入射角は０〜６０度が好ましく、０〜３０度が一層好ましい。ここでの入射角は、皮膚Ｓの表面に対して垂直な法線からの角度とする。
【００２６】
使用する対物レンズ３３の倍率及び開口数（Ｎ．Ａ．）に、特に限定はない。例えば、被測定物がヒトの皮膚の場合、より高空間分解能での測定を行う場合には、倍率は４０倍〜１００倍が好ましく、開口数は０．７〜１．５が好ましい。水平方向及び深さ方向により広範囲の測定を行う場合は、倍率は２０倍〜６０倍が好ましく、開口数は０．２〜０．７が好ましい。
【００２７】
レーザー光の焦点が合った部位からのラマン散乱光は、対物レンズ３３で受光され、バンドバスフィルタ３４、反射ミラー３６、エッジフィルタ３７及びレンズ３２ｂ等の光学系を通過して、本体部２０の分光器２２へと送られる。そして分光器２２においてラマンスペクトルが測定される。
【００２８】
次に、ピエゾシステム３５を制御することで、対物レンズ３３をＺ軸方向に進退させ、Ｘ−Ｙ平面内の同一箇所において深さ方向で異なる位置におけるラマンスペクトルを測定する。
【００２９】
引き続き、プローブ３０におけるＸＹ可動ステージ３８を駆動させて、図３（ｂ）に示すように、ステージ３８ａ及びそれに取り付けられている試料台３９をＸ軸方向及び／又はＹ軸方向に移動させる。この移動に伴って、試料台３９の窓材３９ａに密着している皮膚Ｓも移動する。つまり、窓材３９ａに当接している皮膚Ｓは、窓材３９ａと皮膚Ｓとの摩擦力によって、試料台３９の移動に追従する。しかし、対物レンズ３３は、試料台３９及びそれが取り付けられているＸＹ可動ステージ３８の動作とは独立して動作するものなので、試料台３９が移動しても対物レンズ３３は移動しない。図３（ａ）と図３（ｂ）との対比から明らかなように、ＸＹ可動ステージ３８が動作しても、対物レンズ３３の位置は動作の前後において同じになっている。つまり本装置１０を用いると、Ｘ−Ｙ平面内における対物レンズ３３の位置を固定したまま皮膚をＸ−Ｙ平面内で、マイクロメートル単位で移動させることができる。その結果、レーザー光が焦点を結ぶ位置が、Ｘ−Ｙ平面内で相対的に移動し、新たな測定部位においてレーザー光が焦点を結ぶことになる。その新たな測定部位においてＺ軸方向のラマンスペクトルを測定する。このことは、対物レンズを移動させる機構を採用していた従来の技術とは対照的である。
【００３０】
以上の動作を繰り返すことで、Ｘ−Ｙ平面内の所定の面積の領域におけるラマンスペクトルを三次元的に得ることができる。得られたラマンスペクトルを分析することで、皮膚の水分量を見積もることができる。また、ピエゾシステム３５を駆動させない場合には、ある深さの部位におけるＸ−Ｙ平面内の所定の面積の領域におけるラマンスペクトルを二次元的に得ることができる。
【００３１】
ラマンスペクトルから水分量を算出する手順の一例を以下に示す。
(i)ヒトのかかとの角層を剥離し、脂質と脂溶性成分を抽出後、五酸化リンを用いて完全に乾燥させる。
(ii)角層の乾燥後の質量を秤量後、調湿容器内に入れ、角層を吸湿させる。
(iii)吸湿した角層についてラマンスペクトルの測定及び角層の秤量を行い、含水量とラマンスペクトルの信号強度比（３４００ｃｍ-1付近のＯＨ伸縮振動の信号強度と、２９００ｃｍ-1付近のＣＨ伸縮振動の強度比）を算出する。
(iv)前記の(iii)で算出した含水量とラマンスペクトルの信号強度比の関係に基づき、実際に測定したヒトの皮膚のラマンスペクトルから水分量を算出する。
【００３２】
以上のとおり、本装置１０を用いれば、窓材３９ａと皮膚Ｓとの密着した状態を維持しつつ、ラマンスペクトルの測定部位をＸ−Ｙ平面内で容易に移動させることができる。しかも、本装置１０ではプローブ３０が本体部２０とは別体になっており、かつ該プローブ３０の小型化が容易で可搬性が良好なので、ヒトの身体のいずれの部位にも容易に該プローブ３０を当接させることができる。したがって、ラマンスペクトルの測定中における被験者の身体的な負担を軽減させることができる。
【００３３】
本発明の装置１０及びそれを用いた皮膚の水分量の測定方法は、角層の膨潤の評価に基づく化粧品や医薬品の開発及び化粧品の対面販売における適切な化粧品の選択などの医療行為以外の目的で好適に用いられる。
【００３４】
以上、本発明をその好ましい実施形態に基づき説明したが、本発明の前記の実施形態に制限されない。例えば前記実施形態においては、装置１０の本体部２０とプローブ３０とを、光ファイバ４０ａ，４０ｂを介して光学的に接続したが、これに代えて、プローブ３０を本体部２０に直接取り付けてもよい。
【００３５】
また本発明の装置１０を用いたラマンスペクトルの測定に際しては、皮膚と試料台３９の窓材３９ａとの間に、特許文献１に記載されているコンタクト剤を介在させて、皮膚と窓材３９ａとの間の光学的接触面積をより広めることによって、コンタクト剤を介在させない場合よりも広い領域の皮膚の水分量等を測定するようにしてもよい。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。しかしながら本発明の範囲は、かかる実施例に制限されない。
【００３７】
〔実施例１〕
図１に示す構成の共焦点顕微ラマン分光測定装置を作製した。顕微ラマン分光装置（商品名：ナノファインダー  フレックス、東京インスツルメンツ製）に、透過穴型ＸＹステージ（駿河精機製、型番：Ｂ２７−１００ＣＲ）を取り付けた。更に、透過穴型ＸＹステージ上に、アルミニウムブロック製の皮膚測定用試料台を取り付けた。試料台の中央部に窓穴を設け、該窓穴の上部にガラス製の窓材（厚さ１７０μｍ）を取り付けた。このようにして得られた装置を用いて以下の方法でヒトの皮膚のラマンスペクトルを測定した。
【００３８】
（１）測定条件：励起波長；６７１ｎｍ
試料上でのレーザー出力；２０ｍＷ
（２）対物レンズ；１００倍、ＮＡ１．３、Ｗ．Ｄ．１６０μｍ
１点当たりの露光時間：１秒
【００３９】
皮膚測定用試料台に２０代男性の前腕内側部を載せた。皮膚と試料台の当接面の光学顕微鏡像を図４に示す。視野中央にレーザースポットが存在し、レーザースポットと皮膚密着部（図４内の黒色部）が重なるように、ＸＹステージを駆動させて皮膚密着部をＸＹ方向に移動させた。
【００４０】
ピエゾシステムによってレーザースポットをＺ軸方向に移動させながら、ラマンスペクトルを測定した。スキャン間隔は２μｍとした。測定したラマンスペクトルを図５に示す。図５は、下から上にラマンスペクトルを深さ方向に並べて、オフセット表示したものである。２９００ｃｍ-1付近に、主にタンパク質に由来するＣＨ伸縮のピーク確認できた。また、３４００ｃｍ-1付近に、主に水に由来するＯＨ伸縮のピークが確認できた。ＯＨ伸縮／ＣＨ伸縮の比を深さ方向に比較すると、深さ方向に向けてＯＨ伸縮／ＣＨ伸縮の比の値が大きくなっていることが分かった。このことは、皮膚の内部ほど水分量が多いことを示している。
【符号の説明】
【００４１】
１０  ラマン分光測定装置
２０  本体部
２１  光源
２２  分光器
３０  プローブ
３１  ハウジング
３３  対物レンズ
３５  ピエゾシステム
３８  ＸＹ可動ステージ
３８ａ  ステージ
３８ｂ  ステージ開口部
３９  試料台
３９ａ  窓材
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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