(57)【要約】【課題】様々な夾雑物の存在下でも容易に目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応による核酸合成を行うことができる核酸合成用酵素組成物及び該組成物を用いた核酸合成法を提供する。【解決手段】本発明の目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応による核酸合成用酵素組成物は、ＣＤ及びＤＮＡポリメラーゼを含有する。本発明の核酸合成法は、本発明の核酸合成用酵素組成物と、目的遺伝子を含む反応溶液と、を混合し、上記目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応を行う方法である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロデキストリン及びＤＮＡポリメラーゼを含有する、目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応による核酸合成用酵素組成物。
【請求項２】
上記組成物中の上記シクロデキストリンの含有量が、１〜１００ｍＭである請求項１記載の核酸合成用酵素組成物。
【請求項３】
上記シクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、２位置換シクロデキストリン、及び６位糖置換シクロデキストリンの１種又は２種以上である請求項１又は２記載の核酸合成用酵素組成物。
【請求項４】
上記ＤＮＡポリメラーゼのイオン性界面活性剤に対する耐性が増強された請求項１乃至３のいずれかに記載の核酸合成用酵素組成物。
【請求項５】
更に、スクロース及びベタインの１種又は２種以上を含有する請求項１乃至４のいずれかに記載の核酸合成用酵素組成物。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の核酸合成用酵素組成物と、目的遺伝子を含む溶液と、を混合し、上記目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応を行う核酸合成法。
【請求項７】
上記反応溶液は、フェノール類、カルボニル化合物及びイオン性界面活性剤の１種又は２種以上を含有する請求項６記載の核酸合成法。
【請求項８】
上記イオン性界面活性剤は、アニオン性界面活性剤である請求項７記載の核酸合成法。
【請求項９】
上記反応溶液中の上記イオン性界面活性剤の含有量が、０．０１〜０．５質量％である請求項７又は８記載の核酸合成法。
【請求項１０】
更に、スクロース及びベタインの１種又は２種以上を添加する請求項６乃至９のいずれかに記載の核酸合成法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応による核酸合成、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（以下、「ＰＣＲ法」という。）等の遺伝子増幅法に用いることができる核酸合成用酵素組成物に関する。本発明は、該組成物を用いた核酸合成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の研究において、目的遺伝子を鋳型としたデオキシリボヌクレオチド類（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ、以下、これらを総称して「ｄＮＴＰ」という。）の鎖伸長反応により核酸を合成する方法が、様々な目的で利用されている。かかる方法として、例えば、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法が挙げられる。ＰＣＲ法に代表される遺伝子増幅法では、通常、目的遺伝子とプライマーとをアニールし、次いで、ｄＮＴＰの存在下、ＤＮＡポリメラーゼによる合成反応（鎖伸長反応）を行う。この過程を繰り返すことにより、目的遺伝子を増幅し、特定の核酸を得ることができる。
【０００３】
目的遺伝子は通常、生体試料等の様々な試料から抽出して得られる。しかし、目的遺伝子を抽出する際、得られた抽出液には、目的遺伝子以外の莢雑物が含まれているのが通常である。かかる莢雑物の中には、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸合成反応を抑制又は阻害する成分が含まれていることある。よって、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸合成反応では、かかる莢雑物をできる限り取り除く必要がある。しかし、精製を繰り返しても、莢雑物を完全に取り除くことは困難であり、また、煩雑な精製工程を経る必要がある。
【０００４】
従来、夾雑物による核酸合成反応の抑制を軽減する試料の前処理方法が提案されている。例えば、特許文献１には、アニオン性界面活性剤を含むＤＮＡ抽出液にシクロデキストリン（以下、「ＣＤ」という。）を添加し、次いでＤＮＡポリメラーゼを添加することにより、ＤＮＡのＰＣＲ及び制限酵素サイトに対する活性が維持され、ＲＣＲが進行することが記載されている。特許文献２には、血液等の試料を用いて遺伝子増幅法を行う場合、遺伝子増幅反応液にデキストランサルフェイトを添加する方法が開示されている。特許文献３には、反応系にポリアミン（エチレンジアミン等）を添加することにより、莢雑物による核酸合成の抑制を軽減する核酸合成方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，７０５３４５号公報
【特許文献２】特開２００８−２０００５２号公報
【特許文献３】特開平６−２７７６０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、様々な夾雑物の存在下でも容易に目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応により核酸を合成することができる核酸合成用酵素組成物を提供することである。本発明の目的は、該組成物を用いた核酸合成法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応による核酸合成用酵素組成物は、ＣＤ及びＤＮＡポリメラーゼを含有する。本発明の核酸合成法は、本発明の核酸合成用酵素組成物と、目的遺伝子を含む溶液と、を混合し、上記目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応を行う核酸合成法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の組成物及び核酸合成法によれば、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸合成反応を抑制する夾雑物が存在していても、目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応が進行し、核酸を合成することができる。よって、従来の方法で必須であった煩雑な精製工程を経る必要がなく、簡易に核酸合成を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１のアガロースゲル電気泳動図である。
【図２】実施例２のアガロースゲル電気泳動図（Ａ）並びに実施例３のアガロースゲル電気泳動図（Ｂ及びＣ）である。
【図３】実施例４のアガロースゲル電気泳動図である。
【図４】実施例５のアガロースゲル電気泳動図である。
【図５】実施例６のアガロースゲル電気泳動図である。
【図６】実施例７のＰＣＲサイクルにおける蛍光強度をプロットしたグラフである。
【図７】実施例９のアガロースゲル電気泳動図である。
【図８】実施例１０のアガロースゲル電気泳動図である。
【図９】実施例１１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動図である。
【図１０】実施例１１のアガロースゲル電気泳動図である。
【図１１】実施例１２の４色蛍光チャート図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（１）核酸合成用酵素組成物
本組成物は、シクロデキストリン（ＣＤ）を含有することにより、目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応を抑制する夾雑物が存在していても、反応が進行し、核酸を合成することができる。これは、ＣＤにより、ＤＮＡポリメラーゼの高温安定性の増加及び夾雑物の有効濃度低減効果（夾雑物がＣＤの分子内に包摂されることにより、反応溶液中で遊離状態で存在する該夾雑物の濃度が低減すること。）により、ＤＮＡポリメラーゼの夾雑物に対する耐性が高められるためと考えられる（この説明は、発明者の推測である。従って、この説明は、何ら本発明を定義する記載ではない。）。尚、「目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応による核酸合成」とは、目的遺伝子を鋳型とし、ｄＮＴＰを基質として、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーからの鎖伸張反応により核酸を合成する方法であればよい。
【００１１】
ＣＤは、数分子のＤ−グルコースがα（１→４）グルコシド結合によって結合した環状オリゴ糖であり、その分子内に空孔を有する。上記ＣＤの種類及び構造には限定はない。上記ＣＤとして具体的には、例えば、α−ＣＤ（グルコース骨格が６個）、β−ＣＤ（グルコース骨格が７個）、及びγ−ＣＤ（グルコース骨格が８個）が挙げられる。
【００１２】
上記ＣＤには、分子中のＤ−グルコースに含まれるヒドロキシル基が他の基により修飾されたＣＤ誘導体（例えば、α−ＣＤ誘導体、β−ＣＤ誘導体又はγ−ＣＤ誘導体）も含まれる。上記他の基の数には特に限定はない。上記他の基の数は、上記ＣＤを構成するＤ−グルコース中、通常１〜３、更に好ましくは１〜２である。また、上記他の基の位置には特に限定はない。通常、上記他の基の位置は、上記ＣＤを構成するＤ−グルコースの２位、３位及び６位のうちの１又は２以上であり、好ましくは２位及び／又は６位である。上記ＣＤ誘導体は、通常のＤ−グルコースと修飾Ｄ−グルコースとで構成されていてもよく、修飾Ｄ−グルコースのみで構成されていてもよい。
【００１３】
上記他の基としては、例えば、各種官能基及び糖が挙げられる。該官能基としては、例えば、アルキル基（例えば、メチル基及びエチル基等の炭素数１〜４、好ましくは１〜３のアルキル基）、カルボキシル基、メトキシカルボニル基、ヒドロキシアルキル基（例えば、ヒドロキシメチル基及びヒドロキシエチル基等の炭素数１〜４、好ましくは１〜３のヒドロキシ基、ホルミル基、及びアセチル基の１種又は２種以上が挙げられる。
【００１４】
上記糖は、単糖類、二糖類、三糖類及び多糖類のいずれでもよい、上記糖として通常は、単糖類及び二糖類の１種又は２種以上が挙げられる。上記単糖類として具体的には、例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、リボース、キシロース及びが挙げられる。上記二糖類として具体的には、例えば、マルトース、トレハロース、コージービオース、ニゲロース、イソマルトース、ソホロース、ラミナリビオース、セロビオース、ゲンチオビオース、ラクトース、スクロース、パラチノース、メリビオース、ルチノース、プリメベロース及びツラノースが挙げられる。上記三糖類として具体的には、例えば、マルトトリオース、イソマルトトリオース、パノース、セロトリオース、マンニノトリオース、ソラトリオース、メレジトース、プランテオース、ゲンチアノース、ウンベリフェロース、ラクトスクロース及びラフィノースが挙げられる。上記多糖類として具体的には、例えば、各種オリゴ糖類（キシロオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マルトオリゴ糖及びイソマルトオリゴ糖等）が挙げられる。上記糖に含まれるヒドロキシル基の一部又は全部は、他の基で修飾されていてもよい。該他の基の種類は、上記の説明が妥当する。
【００１５】
上記ＣＤ誘導体として、例えば、上記ＣＤを構成するＤ−グルコースの２位又は６位が上記他の基で置換されたＣＤ誘導体（２位又は６位置換ＣＤ、例えば、２位又は６位置換α又はβ−ＣＤ）が挙げられる。上記６位置換ＣＤとして具体的には、例えば、上記ＣＤを構成するＤ−グルコースの６位が上記糖（好ましくは単糖類及び二糖類）で置換されたＣＤ誘導体（６位糖置換ＣＤ、例えば、６位糖置換α又はβ−ＣＤ）が挙げられる。上記ＣＤ誘導体としてより具体的には、例えば、２−ヒドロキシエチルβ−ＣＤ、６−Ｏ−Ｄ−グルコシル−α−ＣＤ、６−Ｏ−Ｄ−グルコシル−β−ＣＤ、６−Ｏ−α−マルトシル−β−ＣＤが挙げられる。
【００１６】
上記ＣＤとして好ましくは、α−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤ、２位置換ＣＤ及び６位糖置換ＣＤの１種又は２種以上である。これらを用いると、高濃度の夾雑物（例えば、ＳＤＳ等のイオン性界面活性剤）が存在していても、目的遺伝子の遺伝子増幅反応が進行し、核酸を合成することができるので好ましい。
【００１７】
上記ＣＤは１種単独で用いてもよく、２種以上を用いてもよい。例えば、α−ＣＤ、β−ＣＤ及びγ−ＣＤのうちのいずれか１つを用いてもよく、２種以上を用いてもよい。また、ＣＤ誘導体の１種又は２種以上を用いてもよい。更に、ＣＤの１種又は２種以上と、ＣＤ誘導体の１種又は２種以上と、を用いてもよい。
【００１８】
本組成物中の上記ＣＤの割合には特に限定はない。本組成物中の上記ＣＤの割合は通常、１〜１０００ｍＭ、好ましくは３〜１５０ｍＭ、更に好ましくは５〜４０ｍＭである。また、本組成物中の上記ＣＤの割合は、１〜１００ｍＭ、３〜１００ｍＭ、又は５〜５０ｍＭの範囲とすることができる。
【００１９】
本組成物は、ＤＮＡポリメラーゼを含有する。上記ＤＮＡポリメラーゼは、ｄＮＴＰを基質として、プライマーからの鎖伸張反応により核酸を合成することができる限り、その種類、構造及び由来には特に限定はない。上記ＤＮＡポリメラーゼとして通常、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法で用いられている公知のＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。上記ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、及びＴｔｈＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。また、上記ＤＮＡポリメラーゼは、天然のＤＮＡポリメラーゼ又は人工的な変異を加えた改良型ＤＮＡポリメラーゼでもよい。該改良型ＤＮＡポリメラーゼとして具体的には、例えば、自然変異体選抜又は遺伝子工学により１つ以上のアミノ酸置換変異を導入した改良型ＤＮＡポリメラーゼ、酵素処理又は遺伝子工学的改変により分子の一部を欠損させた改良型ＤＮＡポリメラーゼ、化学修飾した改良型ＤＮＡポリメラーゼ、並びに人工的に他の酵素その他のタンパク質と融合させた改良型ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。また、上記ＤＮＡポリメラーゼは、ホットスタートＰＣＲ法用に抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体と混合したＤＮＡポリメラーゼでもよい。上記ＤＮＡポリメラーゼは、１種単独でもよく、異なるＤＮＡポリメラーゼの２種以上を用いてもよい。
【００２０】
本組成物は通常、溶媒中に上記ＣＤ及びＤＮＡポリメラーゼを含有する。該溶媒には特に限定はない。溶媒の種類及び組成は適宜設定することができる。上記溶媒は通常、公知の核酸合成法で用いられているｐＨ緩衝液を用いることができる。
【００２１】
本組成物は、他の成分を含有していてもよい。例えば、本組成物は、各種塩類（ＭｇＣｌ２及びＫＣｌ等）、プライマー、ｄＮＴＰ、及びジデオキシヌクレオチド類（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ、以下、これらを総称して「ｄｄＮＴＰ」という。）の１種又は２種以上を含んでいてもよい。上記プライマー、ｄＮＴＰ、及びｄｄＮＴＰは、放射性同位元素（３Ｈ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ等）、安定同位元素（１５Ｎ、１８Ｏ、等）、蛍光物質（ＦＩＴＣ、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５，ＢｉｇＤｙｅ等）、及びその他標識化合物（ビオチン、ジゴキシゲニン、など）の１種又は２種以上により標識されていてもよい。
【００２２】
（２）核酸合成法
上記反応溶液は、目的遺伝子を含む限り、その内容には特に限定はない。例えば、上記反応溶液として、目的遺伝子を含む生体由来試料をそのまま用いてもよい。上記生体由来試料として具体的には、例えば、動植物細胞、細菌、酵母、ウイルス、動植物組織、並びに動植物由来の体液及び排泄物が挙げられる。また、上記生体由来試料を前処理して上記反応溶液を調製してもよい。例えば、目的遺伝子を含む試料について、適宜公知の方法による精製により、夾雑物を除去してもよい。より具体的には、例えば、上記生体由来試料にイオン性界面活性剤を添加し、細胞膜、細胞壁及びタンパク質を変性又は破壊して除去することにより、目的遺伝子を含む試料を得ることができる。上記反応溶液は、化学修飾処理及び酵素処理等により、天然の遺伝子構造を改変した遺伝子又は人工的に合成した遺伝子を用いて調製してもよい。
【００２３】
上記反応溶液は、上記目的遺伝子以外の他の成分を含んでいてもよい。該他の成分として、例えば、有機化合物が挙げられる。より具体的には、例えば、界面活性剤、アルカロイド、アミノ酸（α−アミノ酸及びε−アミノカプロン酸等の人工合成アミノ酸）、フェノール類、カルボニル化合物（ケトン及びアルデヒド、例えばホルムアルデヒド）、金属キレート剤（フェナントロリン等）が挙げられる。上記界面活性剤は非イオン性、陽イオン性及び陰イオン性のいずれでもよい。上記界面活性剤として、通常、陰イオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びデオキシコール酸ナトリウム）が挙げられる。上記反応溶液はＣＤを含有していてもよく、含有していなくてもよい。
【００２４】
上記のように、一般に、細胞膜、細胞壁及びタンパク質を変性又は破壊して除去するために、目的遺伝子を含む試料に各種成分が添加される。該成分として、例えば、フェノール及びイオン性界面活性剤（ＳＤＳ等）が用いられる。また、目的遺伝子を含む試料には、その由来によって、種々が夾雑物として混在していることがある。そして、このような夾雑物の存在下でＤＮＡポリメラーゼによる核酸合成反応を行うと、反応が抑制又は阻害されることがある。例えば、反応系にＳＤＳが存在すると、これがタンパク質の変性剤となり、ＤＮＡポリメラーゼを失活させてしまうことにより、反応が抑制又は阻害されることがある。従来、目的遺伝子を含む試料を得た後、更に有機溶媒抽出、アルコール沈殿、シリカカラム精製、陰イオン交換カラム精製及び超遠心分画等の方法で精製した後で、遺伝子増幅反応を行っていた。方法にもよるが、通常、精製には１０ステップ以上の工程が必要であり、煩雑である。これに対して本合成法によれば、上記夾雑物の存在下でも目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応が進行し、核酸を合成することができる。
【００２５】
上記目的遺伝子は、本合成法において鋳型となる遺伝子である。上記目的遺伝子の種類、構造及び由来には特に限定はない。上記目的遺伝子はＤＮＡでもＲＮＡ由来のｃＤＮＡでもよい。上記目的遺伝子は、一本鎖でもよく、二本鎖でもよい。上記目的遺伝子は、動植物細胞、細菌、酵母、その他の生物、及びウイルス由来の遺伝子でもよい。更に、上記目的遺伝子は、化学修飾処理及び酵素処理等により、天然の遺伝子構造を改変した遺伝子並びに人工的に設計・合成した遺伝子でもよい。
【００２６】
上記反応溶液の溶媒には特に限定はない。上記目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応より核酸を合成することができる限り、溶媒の種類及び組成は適宜設定することができる。上記溶媒は通常、公知の核酸合成法で用いられているｐＨ緩衝液を用いることができる。
【００２７】
通常、遺伝子増幅反応等の目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応は、各種塩類（ＭｇＣｌ２及びＫＣｌ等）、プライマー、及びｄＮＴＰの存在下で行われる。本合成法において、これらの添加方法には特に限定はない。これらは予め本発明の組成物又は上記反応溶液に添加してもよく、本発明の組成物及び上記反応溶液を混合後、添加してもよい。尚、上記プライマーの内容には特に限定はない。上記プライマーは１本鎖でもよく、２本鎖でもよい。上記プライマーは公知の方法により合成してもよく、生物から単離して得てもよく、市販品を用いてもよい。更に、本合成法では、必要に応じて上記各成分以外の成分を反応系に含んでいてもよい。上記各成分以外の成分としては、例えば、ｄｄＮＴＰが挙げられる。上記プライマー、ｄＮＴＰ、及びｄｄＮＴＰは、放射性同位元素（３Ｈ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ等）、安定同位元素（１５Ｎ、１８Ｏ、等）、蛍光物質（ＦＩＴＣ、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５，ＢｉｇＤｙｅ等）、及びその他標識化合物（ビオチン、ジゴキシゲニン、など）の１種又は２種以上により標識されていてもよい。
【００２８】
本合成法は、本発明の組成物及び上記反応溶液を混合し、上記目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応により核酸を合成することができる限り、その内容には特に限定はない。具体的内容は、公知の遺伝子増幅反応の手順をそのまま適用することができる。例えば、ＰＣＲ法では、（１）目的遺伝子の熱変性、（２）プライマーのアニーリング、（３）伸長反応を経て、目的遺伝子の特定の配列を増幅することができる。本発明の核酸合成でもこの手順をそのまま適用することができる。例えば、本合成法として具体的には、（１）上記反応溶液と本発明の組成物とを混合する工程と、（２）上記反応液中の上記目的遺伝子を熱変性する工程と、（３）プライマー及びｄＮＴＰの存在下、プライマーのアニーリング及び鎖伸長反応を行う工程と、を有する方法が挙げられる。上記目的遺伝子の熱変性と上記反応溶液と本発明の組成物との混合の順番には限定はなく、いずれを先行してもよい。
【００２９】
本合成法において、反応条件には特に限定はない。上記目的遺伝子の増幅により核酸を合成することができる限り、反応条件は適宜設定することができる。反応条件として、公知の遺伝子増幅反応の反応条件をそのまま、又は適宜変更して適用することができる。
【００３０】
本合成法において、「目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応を行う核酸合成法」とは、上記目的遺伝子を鋳型とし、ｄＮＴＰを基質として、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーからの鎖伸張反応により核酸を合成する方法であればよい。よって、本合成法は、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法、即ち、目的遺伝子の増幅反応により反応産物を得ることを直接の目的とする場合だけでなく、他の目的のために、目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応により核酸を合成する場合も含む。よって、本合成法には、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法だけでなく、定量的な遺伝子増幅方法及び遺伝子増幅による遺伝子型判定も含まれる。また、本合成法には、鎖伸長反応により核酸を得られる限り、遺伝子増幅を伴わない核酸合成反応も含まれる。
【００３１】
本合成法は、通常、ＰＣＲ法に適用されるが、それ以外の遺伝子増幅反応にも適用することができる。例えば、Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ法）、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（ＬＡＭＰ法）、及びＩＣＡＮ法にも適用することができる。
【００３２】
本合成法は、定量的な遺伝子増幅方法（リアルタイム定量ＰＣＲ法等）として利用することができる。天然物由来のＤＮＡ混成試料中又はｃＤＮＡ混成試料中の特定の遺伝子量を見積もる方法として、定量的な遺伝子増幅方法が利用されている。定量的な遺伝子増幅方法では、反応中のＤＮＡ合成速度及び一定サイクル実施後の合成ＰＣＲ産物の量を指標として、目的遺伝子量を推定する。よって、定量的な遺伝子増幅反応では、ＤＮＡポリメラーゼの基本性能維持が強く求められる。本合成法によれば、ＤＮＡ合成速度及び最終的な合成量への影響は低い。即ち、本合成法によれば、夾雑物の存在下でも、ＤＮＡポリメラーゼの基本性能を維持しつつ、遺伝子を増幅することができる。
【００３３】
本合成法は、遺伝子型判定として利用することができる。例えば、特定の目的遺伝子を薬剤耐性ベクターで相同組み換えにより置き換えた遺伝子破壊株と、非相同組み換えにより薬剤耐性のみを獲得した野生型組み換え体を仕分けるために、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅方法を用いて遺伝子型判定が行われる。同様に、病原菌・ウイルス感染の判定、家族性遺伝形質の判定、及び遺伝子組み換え作物の判定等の目的で、ＰＣＲ法等の遺伝子増幅方法を用いて遺伝子型判定が行われる。そして、上記のように、かかる遺伝子増幅方法を行うには、通常、ＤＮＡ精製のために煩雑な精製工程を経る必要がある。しかも、工程数が増えれば、試料同士の交差汚染の可能性が高まる。一方、本合成法によれば、かかる煩雑な精製工程を経ることなく遺伝子増幅反応を行うことができ、試料同士の交差汚染の可能性も低いことから、簡易な遺伝子型判定として利用することができる。例えば、本合成法によれば、候補の細胞の培養液をイオン性界面活性剤（ＳＤＳ等）を含む溶液に懸濁し、加熱（煮沸処理等）して粗ＤＮＡ試料を得て、該粗ＤＮＡ試料を用いて目的遺伝子の増幅反応を行い、遺伝子型を判定することができる。
【００３４】
本合成法は、遺伝子増幅以外の目的で用いられる核酸合成法にも適用することができる。該方法としては、例えば、サンガー法シーケンス反応、ピロシーケンス反応、バイサルファイトシーケンス反応、各種物質（放射性同位元素、安定同位元素、蛍光物質、ビオチン、ジゴキシゲニン、など）によるＤＮＡ標識反応、上記目的遺伝子への部位特異変位導入反応、ＤＮＡの末端平滑化反応、ＤＮＡ平滑末端への１塩基付加反応（ＤＮＡ末端アデニン付加反応ほか）、化学合成オリゴＤＮＡからの人工遺伝子合成反応が挙げられる。これらの反応条件には特に限定はなく、上記目的遺伝子と本発明の組成物より核酸を合成することができる限り、反応条件は適宜設定することができる。
【００３５】
本合成法によれば、同一試料を用いて、夾雑物の精製工程を経ることなく、タンパク質分析及び核酸合成法を行うことができる。即ち、本合成法によれば、タンパク質組成分析に用いる試料と、遺伝子増幅による核酸合成に用いる試料とを共通化することができる。生体成分のタンパク質の分離精製又はタンパク質の組成分析若しくは免疫化学的解析の前処理のために、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が行われている。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用の試料には、通常、高濃度のＰＣＲ酵素阻害物質（例えば、ＳＤＳ、２−メルカプトエタノール及び各種生体成分）が含まれている。よって通常、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用の試料を、そのままＰＣＲ法等の遺伝子増幅方法による遺伝子型・遺伝子量判定に転用することはできない。一方、本合成法では、かかるＰＣＲ酵素阻害物質の存在下でも遺伝子増幅反応を行うことができる。本合成法によれば、タンパク質分析に用いる試料と、遺伝子増幅方法に用いる試料とを共通化することができる。その結果、両方の分析を必要とする基礎実験で、抽出作業にかかる手間及び費用を削減できる。また、医学検体、法医学試料及び考古学試料等の分野において、貴重な生体試料の節約が可能になる。
【００３６】
同一試料を用いて、タンパク質分析及び核酸合成法を行う方法として具体的には、（１）目的遺伝子及びタンパク質を含む試料に界面活性剤を作用させる調製工程と、（２）上記調製工程により得られた調製物の一部を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う電気泳動工程と、（３）イオン性界面活性剤を含有する上記調製物の一部又は残部及び本発明の組成物を混合し、ＤＮＡポリメラーゼにより上記目的遺伝子を鋳型とする鎖伸長反応を行う核酸合成工程と、を有する方法が挙げられる。この方法では、同一の調製物を用いて上記電気泳動工程及び上記核酸合成工程を行えばよい。よって、上記電気泳動工程及び上記核酸合成工程の順番には特に限定はない。また、上記核酸合成工程において、上記調製物の一部又は残部からイオン性界面活性剤を除去する精製工程を経る必要はない。
【００３７】
上記調製工程において、上記界面活性剤の種類及び構造には特に限定はない。上記界面活性剤は、イオン性界面活性剤でもよく、非イオン性界面活性剤でもよい。該イオン性界面活性剤は、陽イオン性及び陰イオン性のいずれでもよい。上記イオン性界面活性剤として、通常、陰イオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）が挙げられる。また、イオン性界面活性剤の代替として、非イオン性界面活性剤とイオン性物質（例えば、クマシーブリリアントブルーＧ２５０）を組み合わせて使用してもよい。
【００３８】
上記電気泳動工程は、上記調製物の一部を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う限り、その具体的内容及び手順には特に限定はない。該工程の内容は、公知のポリアクリルアミドゲル電気泳動によるタンパク質分析法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）の内容及び手順で行うことができる。
【００３９】
上記核酸合成工程では、上記調製物の一部又は残部及び本発明の組成物を混合し、ＤＮＡポリメラーゼにより鎖伸長反応を行う。該工程の内容は、上記の本発明の核酸合成法の内容が妥当する。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。尚、本発明は、実施例に示す形態に限られない。本発明の実施形態は、目的及び用途等に応じて、本発明の範囲内で種々変更することができる。
【００４１】
＜実施例１＞ＣＤ含有酵素組成物を用いた核酸合成（Ｉ）
ＤＮＡポリメラーゼとして、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（バイオアカデミア製）を用いた。基本酵素液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１０ｍＭ，ｐＨ８．３、ＫＣｌ；５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２；１．５ｍＭ、ｄＮＴＰ；０．２ｍＭ、ＤＮＡポリメラーゼ；０．０２５ユニット／μｌ（反応時終濃度））に、表１に示す各種ＣＤ（１０ｍＭ）を添加し、ＣＤ含有酵素組成物（以下、「ＣＤ組成物」という。）を調製した。また、ＣＤに代えて、０．５％ｗ／ｖのツイーン２０を加えた酵素組成物を調製した。
【００４２】
本実施例では、ハンセヌラ酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  ＪＣＭ３６２０）ＷＲ１遺伝子（２．３ｋｂ）の遺伝子増幅反応を採用した。鋳型ＤＮＡとしてハンセヌラ酵母ゲノムＤＮＡを用いた。オリゴＤＮＡプライマーとして、ハンセヌラＷＲ１遺伝子特異的プライマーペアＷＲ１−２２８Ｆｗ（配列番号１、５’−ＧＧＣＧＡＴＡＴＡＣＡＴＴＧＡＡＡＧＧＴＡＡＡＴＡＡＧＧＧ−３’、Ｔｍ；６７．１℃）及びｗｒ１−９６ｒｖ（配列番号２、５’−ＧＴＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＡＡＴＡＴＴＧＧＣＣＧＴ−３’、Ｔｍ；６８．８℃）を用いた。尚、以下の実施例では、特段の記載がない限り、「ハンセヌラゲノムＤＮＡ」及び「ハンセヌラＷＲ１プライマーペア」は、本実施例の「ハンセヌラ酵母ゲノムＤＮＡ」及び「ハンセヌラＷＲ１遺伝子特異的プライマーペア」を意味する。上記ＣＤ組成物に、上記ハンセヌラ酵母ゲノムＤＮＡ（終濃度０．０２ｎｇ／μｌ）及び上記ハンセヌラＷＲ１遺伝子特異的プライマーペア（各０．５μＭ（終濃度））を加えた。次いで、上記ＣＤ組成物に、ＳＤＳ（終濃度；０．０１％及び０．０５％）を加えて、混合液を調製した。尚、対照として、ＳＤＳを添加しない混合液を調製した。
【００４３】
上記混合液（２５μｌ）の入ったチューブをサーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製「２７２０サーマルサイクラー」）に設置し、ＰＣＲを行った。サーマルプログラムは以下の（Ａ）〜（Ｄ）に設定した。
（Ａ）９４℃５分の熱処理
（Ｂ）３５回のＰＣＲサイクル（変性９５℃２０秒、アニーリング６０℃２０秒、伸長反応７２℃２分３０秒）
（Ｃ）７２℃２分の追加伸長
（Ｄ）４℃で冷却保存
【００４４】
反応終了後、上記混合液と体積比１／５の比重増加色素液（スクロース；３０％ｗ／ｖ、エチレンジアミン四酢酸；１２ｍＭ、Ｔｒｉｓ；４０ｍＭ，ｐＨ７．５、ブロモフェノールブルー；０．１２％ｗ／ｖ）とを混合した。この混合液（５μｌ）を、０．７％アガロースゲル電気泳動（ＴＢＥ電気泳動緩衝液（Ｔｒｉｓ；８９ｍＭ、エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム；２ｍＭ、ホウ酸；１１３ｍＭ）、電圧６Ｖ／ｃｍ、４０分間）及び臭化エチジウム染色に供した。電気泳動後、ＷＲ１遺伝子がＰＣＲ増幅された２．３ｋｂの蛍光バンドが観察できれば、ＰＣＲは成功したと判定した。一方、上記蛍光バンドが視認限界以下で観察できない場合は、ＰＣＲが失敗したと判定した。以上の結果を図１及び表１に示す。
【００４５】
【表１】
2012010666.tif 000003
【００４６】
図１及び表１より、Ｎｏ．１（ＣＤを含まない。）では、ＳＤＳを含まない（０％）場合には遺伝子増幅反応が進行したが（図１Ａ、レーン１）、ＳＤＳを含む場合には遺伝子増幅反応が阻害された（図１Ｂ及び図１Ｃ；レーン１）。一方、Ｎｏ．２〜９（ＣＤを含む。）では、ＳＤＳを含む場合でも遺伝子増幅反応が進行した（図１Ｂ；レーン２?９）。また、０．５％ツイーン２０を含む酵素液では、０．０５％ＳＤＳを含む反応液で遺伝子増幅反応が進行しなかった（図１Ｂ及び図１Ｃ；レーン１０）。一方、特定のＣＤ（α−ＣＤ、β−ＣＤ、２−ヒドロキシエチルβ−ＣＤ、６−Ｏ−Ｄ−グルコシル−α−ＣＤ、６−Ｏ−Ｄ−グルコシル−β−ＣＤ、６−Ｏ−α−マルトシル−β−ＣＤ）を含むＣＤ組成物を用いると、０．０５％ＳＤＳを含む反応液でも遺伝子増幅反応が進行した（図１Ｃ；レーン２、３、６〜９）。
【００４７】
＜実施例２＞ＣＤ組成物を用いた核酸合成（ＩＩ）
実施例１の基本酵素液に、１０ｍＭのα−ＣＤを加えてＣＤ組成物を調製した。上記ＣＤ組成物に、ハンセヌラゲノムＤＮＡ（終濃度０．０２ｎｇ／μｌ）及びハンセヌラＷＲ１プライマーペア（終濃度各０．５μＭ）を加えた。２倍の段階希釈により、ＳＤＳを上記ＣＤ組成物に加えて、混合液を調製した。該混合液中のＳＤＳ濃度は０．０００４〜０．４％ｗ／ｖ（反応時終濃度）である。一方、対照として、α−ＣＤを加えない混合液を調製した。
【００４８】
上記混合液（２５μｌ）の入ったチューブをサーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製「２７２０サーマルサイクラー」）に設置し、ＰＣＲを行った。サーマルプログラム"ＷＲ１"は以下の（Ａ）〜（Ｄ）に設定した。
（Ａ）９４℃５分の熱処理
（Ｂ）３５回のＰＣＲサイクル（変性９８℃１０秒、アニーリング６０℃２０秒、伸長反応７２℃２分３０秒）
（Ｃ）７２℃２分の追加伸長
（Ｄ）４℃で冷却保存
【００４９】
反応終了後、上記混合液と実施例１で用いた比重増加色素液（体積比１／５）とを混合した。この混合液（２μｌ）を、実施例１と同じ方法で、０．７％アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色に供した。電気泳動後、ＷＲ１遺伝子がＰＣＲ増幅された２．３ｋｂの蛍光バンドが観察できれば、ＰＣＲは成功したと判定した。一方、上記蛍光バンドが視認限界以下で観察できない場合は、ＰＣＲが失敗したと判定した。以上の結果を図２Ａに示す。
【００５０】
図２Ａより、ＣＤを含まない酵素組成物の場合（ＣＤ−）、ＳＤＳ濃度が０．００６３％以上では、反応が阻害された（図２Ａ；レーン１３及び１５）。一方、ＣＤ組成物の場合（ＣＤ＋）、ＳＤＳ濃度が０．０５％までの条件で反応が進行した（図２Ａ；レーン８、１０、１２、１４及び１６）。
【００５１】
＜実施例３＞ＣＤとスクロース又はベタインとの併用
実施例１の基本酵素液に、１２％ｗ／ｖ（終濃度）のスクロース及び１０ｍＭのα−ＣＤを加え、スクロース含有ＣＤ組成物（スクロース−ＣＤ組成物）を調製した。また、実施例１の基本酵素液に、１Ｍのベタイン及び１０ｍＭのα−ＣＤを加え、ベタイン含有ＣＤ組成物（ベタイン−ＣＤ組成物）を調製した。一方、対照として、実施例１の基本酵素液に、スクロース又はベタインのみを加えた酵素組成物を調製した。上記各組成物に、ハンセヌラゲノムＤＮＡ（終濃度０．０２ｎｇ／μｌ）及びハンセヌラＷＲ１プライマーペア（終濃度各０．５μＭ）を加えた。そして、実施例２と同じ方法でＳＤＳを加えてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を分析し、各反応条件でのＰＣＲの成否を判断した。その結果を図２Ｂ（スクロース−ＣＤ組成物）及び図２Ｃ（ベタイン−ＣＤ組成物）に示す。
【００５２】
図２Ｂ及びＣより、スクロース−ＣＤ組成物又はベタイン−ＣＤ組成物（ＣＤ＋）では、ＳＤＳ濃度が０．１％までの条件で反応が進行した（図２Ｂ及びＣ；レーン６）。一方、上記のように、α−ＣＤ、スクロース及びベタインを含まない酵素組成物では、ＳＤＳ濃度が０．００６３％以上では、反応が阻害された（図２Ａ；レーン１３及び１５）。また、α−ＣＤのみを含む酵素組成物では、ＳＤＳ濃度が０．０５％までの条件で反応が進行した（図２Ａ；レーン８）。以上より、ＣＤとスクロース又はベタインとを併用することにより、ＤＮＡポリメラーゼのＳＤＳ耐性が向上することが分かる。
【００５３】
＜実施例４＞改良型ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合
第１の改良型ＤＮＡポリメラーゼとして、東洋紡社製「ＫＯＤ  ＦＸ  ＤＮＡポリメラーゼ」を用いた。基本酵素液（１×ＫＯＤ  ＦＸ用ＰＣＲ緩衝液（東洋紡）、ｄＮＴＰ；０．４ｍＭ、ＤＮＡポリメラーゼ；０．０２ユニット／μｌ）に、α−ＣＤ（１０ｍＭ）を加えて、ＣＤ組成物を調製した。次いで、該ＣＤ組成物に、ハンセヌラゲノムＤＮＡ（反応時終濃度；０．０２ｎｇ／μｌ）及びハンセヌラＷＲ１プライマーペア（反応時終濃度；各０．３μＭ）を加えた。
【００５４】
第２の改良型ＤＮＡポリメラーゼとして、タカラバイオ社製「Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ」を用いた、基本酵素液（１×Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ用ＰＣＲ緩衝液（タカラバイオ）、ｄＮＴＰ；０．２ｍＭ、ＤＮＡポリメラーゼ；０．０２５ユニット／μｌ）に、α−ＣＤ（１０ｍＭ）を加えて、ＣＤ組成物を調製した。次いで、該ＣＤ組成物に、ハンセヌラゲノムＤＮＡ（反応時終濃度；０．０２ｎｇ／μｌ）及びハンセヌラＷＲ１プライマーペア（反応時終濃度；各０．３μＭ）を加えた。
【００５５】
上記各ＣＤ組成物を用いて、実施例２と同様の方法によりＰＣＲを行い、ＰＣＲの成否を判断した。２倍の段階希釈により、ＳＤＳを上記ＣＤ組成物に加えて、混合液を調製した。該混合液中のＳＤＳ濃度は０．０００８〜０．４％ｗ／ｖ（反応時終濃度）である。次いで、該混合物を用いて、サーマルプログラム"ＷＲ１"でハンセヌラＷＲ１遺伝子を増幅した。反応終了後、反応液（２μｌ）を、実施例１と同じ方法で、０．７％アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色に供した。電気泳動後、各反応条件でのＰＣＲの成否を判断した。その結果を図３に示す（図３Ａ；「ＫＯＤ  ＦＸ  ＤＮＡポリメラーゼ」の結果。図３Ｂ；「Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ」の結果）。
【００５６】
「ＫＯＤ  ＦＸ  ＤＮＡポリメラーゼ」及び「Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ」は、人為的にＳＤＳ耐性が高められた改良型ＤＮＡポリメラーゼである。図３より、「ＫＯＤ  ＦＸ  ＤＮＡポリメラーゼ」及び「Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ」を用いた場合、前者ではＳＤＳ濃度が０．０１２５％までの条件で反応が進行し（図３Ａ；レーン１１）、後者ではＳＤＳ濃度が０．００６３％までの条件で反応が進行した（図３Ｂ；レーン１３）。上記改良型ＤＮＡポリメラーゼに対し、更にα−ＣＤを添加することにより、ＳＤＳ濃度が０．１％までの条件で反応が進行した（図３Ａ及びＢ；レーン６）。
【００５７】
＜実施例５＞ＣＤ組成物中のＣＤ濃度とＳＤＳ耐性との関係
実施例１の基本酵素液に、１０ｍＭ、２０ｍＭ、及び３０ｍＭのα−ＣＤを加えてＣＤ組成物を調製した。該ＣＤ組成物に、ハンセヌラゲノムＤＮＡ（終濃度０．０２ｎｇ／μｌ）及びハンセヌラＷＲ１プライマーペア（終濃度各０．５μＭ）を加えた。次いで、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％及び０．４％（終濃度）のＳＤＳを加えて混合物を調製した。該混合物を用いて、実施例２記載の方法により、ハンセヌラＷＲ１遺伝子を増幅した。反応終了後、反応液（５μｌ）を、実施例１と同じ方法で、０．７％アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色に供した。電気泳動後、各反応条件でのＰＣＲの成否を判断した。その結果を図４に示す。
【００５８】
図４より、１０ｍＭのα−ＣＤを含むＣＤ組成物では、ＳＤＳ許容濃度が０．１％であった。一方、２０ｍＭ又は３０ｍＭのα−ＣＤを含むＣＤ組成物では、ＳＤＳ許容濃度が０．２％及び０．３％であり、ＳＤＳ許容濃度が上昇した。よって、ＣＤの濃度依存的に、ＤＮＡポリメラーゼのＳＤＳ耐性が向上することが分かる。
【００５９】
＜実施例６＞ＣＤ組成物中のＣＤ濃度と高温安定性との関係
実施例１の基本酵素液に、１０ｍＭ、２０ｍＭ、又は４０ｍＭのα−ＣＤを加えてＣＤ組成物を調製した。該ＣＤ組成物に、ハンセヌラゲノムＤＮＡ（終濃度０．０２ｎｇ／μｌ）及びハンセヌラＷＲ１プライマーペア（終濃度各０．５μＭ）を加えた。一方、対照として、ＣＤを加えない混合液を調製した。
【００６０】
上記混合液（２５μｌ）の入ったチューブをサーマルサイクラー（バイオラッド社製「ｉＣｙｃｌｅｒ」）に設置し、ＰＣＲを行った。サーマルプログラムは以下の（Ａ）〜（Ｄ）に設定した。但し、ＰＣＲサイクルの変性温度は、装置のグラジエントモードを使用して９５℃、９７℃、９８℃、及び９８．５℃の４条件に設定した。変性処理時間は２０秒に設定した。
（Ａ）９４℃３分の熱処理
（Ｂ）３２回のＰＣＲサイクル（変性温度グラジエントモード２０秒、アニーリング６０℃２０秒、伸長反応７２℃２分３０秒）
（Ｃ）７２℃２分の追加伸長
（Ｄ）４℃で冷却保存
【００６１】
反応終了後、上記混合液と実施例１で用いた比重増加色素液（体積比１／５）とを混合した。この混合液（５μｌ）を、実施例１と同じ方法で、０．７％アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色に供した。電気泳動後、ＷＲ１遺伝子がＰＣＲ増幅された２．３ｋｂの蛍光バンドが観察できれば、ＰＣＲは成功したと判定した。一方、上記蛍光バンドが視認限界以下で観察できない場合は、ＰＣＲが失敗したと判定した。以上の結果を図５に示す。
【００６２】
図５より、変性温度が９５℃及び９７℃では、上記基本酵素液（α−ＣＤを含まない）及びＣＤ組成物ともに、ＰＣＲが成功した（図５Ａ及びＢ）。一方、変性温度が９８℃の場合、上記基本酵素液ではＰＣＲ産物が検出されず（図５Ｃ；レーン１）、ＣＤ組成物ではＰＣＲ産物が検出された（図５Ｃ；レーン２〜４）。更に、α−ＣＤ濃度が２０ｍＭ及び４０ｍＭのＣＤ組成物を用いると、変性温度が９８．５℃でもＰＣＲ産物が検出された（図５Ｄ；レーン３及び４）。変性温度が９８℃及び９８．５℃でのＰＣＲ産物収量は、ＣＤ濃度に依存して増加した（図５Ｃ及びＤ）。一方、変性温度が９５℃及び９７℃の場合、ＣＤ濃度はＰＣＲ産物収量に影響しなかった（図５Ａ及びＢ）。
【００６３】
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼが高温で不安定になり、熱失活しやすいこと（例えば、上記基本酵素液と同等の組成の緩衝液・酵素混合液において、９５℃での活性半減期が約４０分に対し、９７．５℃での活性半減期は約５分である。）は公知の事実である。また、実施例７では、ＣＤがＤＮＡ合成速度に影響しないことが示されている。よって、本実施例より、ＣＤはＤＮＡポリメラーゼの高温安定性を濃度依存的に向上させることが分かる。
【００６４】
＜実施例７＞ＣＤ組成物の定量ＰＣＲへの適用
ＤＮＡポリメラーゼとして、タカラバイオ製「ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ」（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）を用いた。リアルタイムＰＣＲ酵素液（１×「ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ」、ハンセヌラゲノムＤＮＡ；０．０２ｎｇ／μｌ；、ＶＡＭ３−Ｆｗプライマー（配列番号３、５’−ＡＡＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＧＡＧＣＡ−３’、Ｔｍ；６１．７℃）；０．２μＭ、ＶＡＭ−３Ｒｖプライマー（配列番号４、５’−ＧＣＡＣＧＡＣＣＡＡＣＡＧＴＡＣＡＣＡＧＧ−３’、Ｔｍ；６１．６℃）；０．２μＭ、反応時終濃度）に、１０ｍＭのα−ＣＤを加え、ＣＤ組成物を調製した。２倍の段階希釈により、ＳＤＳを上記ＣＤ組成物に加えて、混合液を調製した。該混合液中のＳＤＳ濃度は０．０００４〜０．４％ｗ／ｖ（反応時終濃度）である。対照として、上記ＣＤを加えない酵素組成物を調製した。
【００６５】
リアルタイムＰＣＲ装置（タカラバイオ社製；Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、反応中の合成ＤＮＡ量（ハンセヌラ酵母ＶＡＭ３のプローブ領域のＰＣＲ産物；１５０ｂｐ）を、ＳＹＢＲ蛍光強度として常時モニタリングした。上記混合液（２５μｌ）の入ったチューブを上記リアルタイムＰＣＲ装置に設置し、ＰＣＲを行った。反応プログラムは、（Ａ）９５℃１０秒の熱処理及び（Ｂ）４０回の２ステップＰＣＲ（変性９５℃５秒、アニーリング兼伸長反応６０℃３０秒）に設定した。反応終了後、９５℃１５秒、６０℃３０秒、９５℃１５秒の熱解離反応を測定し、蛍光測定しているＰＣＲ増幅産物が１種類だけであることを確認した。対照として、上記混合液に代えて、上記リアルタイムＰＣＲ酵素液（対照１；ＣＤ及びＳＤＳを含まない）、上記ＣＤ組成物（対照２；ＣＤを含み、ＳＤＳを含まない）及び上記酵素組成物（対照３；ＣＤを含まず、ＳＤＳを含む）を用いて、同様にＰＣＲを行った。
【００６６】
リアルタイムＰＣＲ実験で得た蛍光強度（ＤＮＡ量に比例）増加曲線のうち、対照１〜３及び上記混合物（１０ｍＭのＣＤ及び０．０２５％のＳＤＳを含む）の結果を図６に示す。曲線の蛍光強度値は測定時点でのＤＮＡ量と比例し、曲線の傾き（微分値）は測定時点でのＤＮＡ合成速度と比例する。
【００６７】
図６より、ＳＤＳを含まない場合（対照１及び２）、ＣＤの添加の有無によらず、蛍光強度増加曲線はほぼ同一であった（図６；■及び○）。一方、ＣＤを含まず、ＳＤＳを含む場合（対照３）、遺伝子増幅による蛍光の増加が全く観察されなかった（図６；×）。これに対し、上記混合物（ＣＤ及びＳＤＳを含む）では、対照１及び２（ＳＤＳを含まない）とほぼ同じ蛍光強度曲線が観察された（図６；△）。この結果より、ＣＤの添加により、ＤＮＡ合成速度及び最終的なＰＣＲ合成量いずれも影響を受けないことが分かる。よって、ＣＤ組成物を用いることにより、ＤＮＡ合成速度及び最終的なＰＣＲ合成量を変化させずに、ＤＮＡポリメラーゼのＳＤＳ耐性のみを強化することができることが分かる。
【００６８】
＜実施例８＞種々の阻害物質に対するＣＤ組成物の効果
ＤＮＡポリメラーゼとして、東洋紡製「Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ」を用いた。ＰＣＲ酵素液（１×「Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ」（東洋紡製）、ｄＮＴＰ；０．２ｍＭ、ベタイン；１Ｍ、ハンセヌラゲノムＤＮＡ；０．０２ｎｇ／μｌ、ハンセヌラＷＲ１プライマーペア；各０．５μＭ、クレゾールレッド；０．００２％、ＤＮＡポリメラーゼ；０．０２５ユニット／μｌ、反応時終濃度）に、１６ｍＭの２−ヒドロキシエチルβ−ＣＤを加え、ＣＤ組成物（Ｉ）を調製した。
【００６９】
ＤＮＡポリメラーゼとして、タカラバイオ製「Ｅｘ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ」を用いた。ＰＣＲ酵素液（１×「Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ」（タカラバイオ製）、ｄＮＴＰ；０．２ｍＭ、ベタイン；１Ｍ、ハンセヌラゲノムＤＮＡ；０．０２ｎｇ／μｌ、ハンセヌラＷＲ１プライマーペア；各０．５μＭ、クレゾールレッド；０．００２％、ＤＮＡポリメラーゼ；０．０２５ユニット／μｌ、反応時終濃度）に、２０ｍＭのα−ＣＤを加え、ＣＤ組成物（ＩＩ）を調製した。
【００７０】
ＣＤ組成物（Ｉ）及び（ＩＩ）に、表２で示したＤＮＡポリメラーゼを阻害する各種阻害物質を、３倍の段階希釈濃度（反応時終濃度）で加えて混合液を調製した。
【００７１】
上記混合液を用いて、実施例２と同様の方法によりＰＣＲを行い、ＰＣＲの成否を判断した。上記混合液（２５μｌ）の入ったチューブをサーマルサイクラーに設置し、サーマルプログラム"ＷＲ１"でＰＣＲを行った。反応終了後、上記混合液（２μｌ）を直接０．７％アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色に供し（電気泳動の条件は実施例１と同じ。）、ＰＣＲの成否を判定した。
【００７２】
各種阻害物質の存在下でＰＣＲが成功した最高濃度を「許容濃度」と定義した。そして、上記ＣＤ組成物と、対照である上記ＰＣＲ酵素液（ＣＤを含まない）について、阻害物質に対する許容濃度を決定した。ＣＤによる耐性の上昇幅は、上記ＣＤ組成物の許容濃度を、上記ＰＣＲ酵素液の許容濃度で除算して求めた。尚、３倍の希釈系列では、上記ＣＤ組成物及び上記ＰＣＲ酵素液の許容濃度の違いが検出できないが、上記阻害物質の許容濃度において、上記ＣＤ組成物を用いた場合の最終的なＰＣＲ産物の収量が、上記ＰＣＲ酵素液を用いた場合の２倍以上ある場合は、わずかな効果があると判定した（表２では「＜３倍」と表記）。以上の結果を表２に示す。
【００７３】
【表２】
2012010666.tif 000004
【００７４】
表２より、上記ＣＤ組成物を用いることにより、種々の阻害物質に対する許容濃度が増加することが分かる。よって、ＣＤの添加により、種々の阻害物質に対するＤＮＡポリメラーゼの耐性が向上させることができることが分かる。
【００７５】
＜実施例９＞ＣＤ組成物の酵母遺伝子破壊株の遺伝子型判定への適用
パン酵母チオレドキシンをコードするＴＲＸ１遺伝子を破壊するため、ＴＲＸ１遺伝子と相同な領域と、薬剤耐性遺伝子カセットとからなる遺伝子破壊ベクターΔｔｒｘ１：：ＫａｎＭＸを作製した。同様に、ＴＲＸ２遺伝子破壊用の遺伝子破壊ベクターΔｔｒｘ２：：ＫａｎＭＸを作製した。酵母親株ＡＨ１０９及びＮＭＹ５１（いずれもＴＲＸ１及びＴＲＸ２については野生型）のコンピテントセルを作製し、上記各遺伝子破壊ベクターで形質転換した。遺伝子破壊株の候補として、抗生物質Ｇ４１８に耐性のコロニーを、Ｇ４１８含有ＹＰＡＤ寒天培地（ペプトン；２％、イースト抽出物；１％、グルコース；２％、アデニン；４０ｍｇ／ｌ、寒天；２％、Ｇ４１８；２００ｍｇ／ｌ）で選抜した。
【００７６】
ＫａｎＭＸ遺伝子に由来するＧ４１８耐性の遺伝子破壊候補株を、Ｇ４１８含有ＹＰＡＤ培地（上記Ｇ４１８含有ＹＰＡＤ寒天培地から寒天を除いて調製した培地）に接種し、３０℃で一晩培養した。ＴＥ＋ＳＤＳ溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１０ｍＭ，ｐＨ８．０、ＥＤＴＡ−Ｎａ３；１ｍＭ，ｐＨ８．０、ＳＤＳ；０．５％）５０μｌを分注した９６穴ＰＣＲプレートに、培養液各５μｌを移した。次いで、該ＰＣＲプレートを耐熱性フィルムでシールして、サーマルサイクラーにより９５℃で５分間加熱した。加熱終了後、プレートミキサー（タイテック「Ｍ−ＢＲ−０２２」）に上記ＰＣＲプレートを移し、最高速で３０秒間激しく撹拌した。更に、９６プレート遠心機（クボタ「ＰｌａｔｅＳｐｉｎ」）で、７００×ｇ、５分間遠心し、得られた上澄みを遺伝子破壊候補株の粗抽出ＤＮＡ試料とした。
【００７７】
ＤＮＡポリメラーゼとして、ＢＩＯＬＩＮＥ社製「Ｈｙｂｒｉｐｏｌ  ＤＮＡポリメラーゼ」を用いた。また、反応緩衝液として、ＢＩＯＬＩＮＥ社製「Ｈｙｂｒｉｐｏｌ用反応緩衝液」を用いた。基本酵素液（１×反応緩衝液、ｄＮＴＰ；０．２ｍＭ、ＭｇＣｌ２；１．５ｍＭ、クレゾールレッド；０．０２％ｗ／ｖ、ＤＮＡポリメラーゼ；０．０２５ユニット／μｌ）に、スクロース及びα−ＣＤを加えた（スクロース；１２％ｗ／ｖ、α−ＣＤ；１０ｍＭ、反応時終濃度）。次いで、ＴＲＸ１遺伝子増幅用プライマーペア（配列番号５；５’−ＧＣＴＧＣＴＡＣＣＡＡＣＧＣＴＡＡＧＣＡＡＴＡＡＧ−３’、配列番号６；５’−ＡＴＣＴＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＧＧＴＣＴＴＧＡ−３’）各０．２５μＭを加えてＣＤ組成物（Ｉ）を調製した。また、ＴＲＸ２遺伝子増幅用プライマーペア（配列番号７；５’−ＡＡＡＣＣＧＴＴＧＧＣＧＧＣＧＴＧＡ−３’、配列番号８；５’−ＧＧＡＡＧＴＴＧＡＣＡＣＴＧＡＴＧＧＡＡＡＡＴＴＡＡＣＣ−３’）各０．２５μＭを加えてＣＤ組成物（ＩＩ）を調製した。
【００７８】
上記ＣＤ組成物（Ｉ）及び（ＩＩ）に、上記粗抽出ＤＮＡ試料（体積比１／２０）を加え、終濃度０．０２５％ＳＤＳ及び０．５％ｖ／ｖ酵母培養液を含む状態でＰＣＲを行った。サーマルサイクラーとして、バイオラッド社製「ｉＣｙｃｌｅｒ」を用いた。サーマルプログラム"ＴＲＸ"は以下の（Ａ）〜（Ｃ）に設定した。
（Ａ）９４℃５分の前処理
（Ｂ）３７回のＰＣＲサイクル（変性９８℃１０秒、アニーリング５５℃２０秒、伸長反応７２℃１分３０秒）
（Ｃ）７２℃５分の後処理
【００７９】
反応終了後、反応液（３μｌ）を直接０．７％アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色に供した（電気泳動の条件は実施例１と同じ。）。蛍光観察で検出されるバンドの有無で、ＰＣＲの成否を判定した。ＴＲＸ１遺伝子の遺伝子型は、アガロースゲル電気泳動で検出されるＰＣＲ産物の分子サイズで判定した。ＰＣＲ産物の分子サイズが１．１ｋｂなら野生型ＴＲＸ１保持株、ＰＣＲ産物の分子サイズが２．４ｋｂなら染色体ＤＮＡへのベクター挿入によるＴＲＸ１遺伝子破壊株（Δｔｒｘ１：：ＫａｎＭＸ）と判定した。同様に、ＴＲＸ２遺伝子の遺伝子型も判定した。ＰＣＲ産物の分子サイズが１．２ｋｂなら野生型ＴＲＸ２保持株、ＰＣＲ産物の分子サイズが２．５ｋｂならＴＲＸ２遺伝子破壊株（Δｔｒｘ２：：ＫａｎＭＸ）と判定した。その結果を図７に示す。
【００８０】
図７より、Ｇ４１８耐性候補株（図７；Ａ１〜Ａ１２、Ｃ１、Ｃ３〜Ｃ１２）２３株中、２２株でＴＲＸ１遺伝子判定及びＴＲＸ２遺伝子判定で良好にＰＣＲが進行した（図７）。よって、ＣＤ組成物を用いることにより、簡易に酵母の遺伝子型判定を行うことができることが分かる。
【００８１】
＜実施例１０＞ＣＤ組成物を用いたＲＣＡ法による核酸増幅反応
プラスミドｐＹＮ２８０を保持する大腸菌ＤＨ５αをＴＥバッファーに懸濁した（１００ｍｇ菌湿重量／ｍｌ）。この懸濁液にＳＤＳを０．５％（終濃度）加え、９５℃で１５分加熱後、氷上で急冷し、鋳型ＤＮＡを調製した。精製済みのｐＹＮ２８０（終濃度４ｎｇ／μｌ）も同様に処理した。
【００８２】
ＤＮＡポリメラーゼとして、ニッポンジーン社製「ＣｓａＤＮＡポリメラーゼ」を用いた。また、反応緩衝液として、ニッポンジーン社製Ｃｓａ反応緩衝液を用いた。基本酵素液（１×Ｃｓａ反応緩衝液、ｄＮＴＰ；０．２５ｍＭ、プライマーオリゴＤＮＡ；０．１μＭ、ＤＮＡポリメラーゼ；０．４ユニット／μｌ、反応時終濃度）に、１０ｍＭ（終濃度）のα−ＣＤを添加し、ＣＤ組成物を調製した。対照として、上記基本酵素液（α−ＣＤを含まない）を用いた。上記プライマーオリゴＤＮＡは、ｐＹＮ２８０に相補的な配列からなるＳｃＧＡＰ４（配列番号９；５‘−ＧＧＧＡＧＧＧＣＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡ−３’）又はｐＹＥＳ２ｔｅｒｍ（配列番号１０；５‘−ＡＡＧＡＣＧＧＴＡＧＧＴＡＴＴＧＡＴＴＧＴＡＡＴＴＣＴＧ−３’）を用いた。上記ＣＤ組成物に上記鋳型ＤＮＡ（体積比１／２０）を加え、最終的なＲＣＡ反応液を調製した。該ＲＣＡ反応液には、ＳＤＳが０．０２５％（終濃度）含まれている。
【００８３】
上記ＲＣＡ反応液（２５μｌ）を６０℃で１２０分処理し、ＣｓａＤＮＡポリメラーゼによるＲＣＡ反応を行った。反応終了後、該反応液と実施例１で用いた比重増加色素液とを混合した。この混合液（５μｌ）を、実施例１と同じ方法で０．７％アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色に供した。電気泳動後、ＲＣＡ反応に由来する高分子ＤＮＡが検出できるか否かで、ＲＣＡ反応の成否を判断した。その結果を図８に示す。
【００８４】
図８より、上記基本酵素液（α−ＣＤを含まない）では、鋳型ＤＮＡとして大腸菌溶解液及び精製ｐＹＮ２８０のいずれを用いた場合でも、ＲＣＡ反応が成功しなかった（レーン１、３、５及び７）。一方、上記ＣＤ組成物では、いずれの場合でも、ＲＣＡ反応が成功した（レーン２、４、６及び８）。
【００８５】
＜実施例１１＞同一試料を用いたタンパク質分析及び核酸合成法
１．５ｍｌマイクロチューブに、ＴＲＸ１遺伝子を遺伝子破壊ベクターで置き換えたパン酵母ＹＤ１２６５４株の菌体１０ｍｇ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料調製用バッファー（ＳＤＳ；２％ｗ／ｖ、グリセロール；１０％ｖ／ｖ、２−メルカプトエタノール；２％ｖ／ｖ）５００μｌを加え懸濁した。次いで、φ０．５ｍｍガラスビーズ１００μｌを加え、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで３０秒間激しく攪拌することにより、菌体からタンパク質、ＤＮＡ及びその他の生体成分を抽出した。抽出液を９５℃で５分間加熱し、タンパク質の変性及びＳＤＳ化を行った。反応終了後、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで５秒撹拌して溶液を均一化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料（Ｉ）を調製した。上記菌体に代えて、ＴＲＸ２遺伝子破壊株のパン酵母ＹＤ１４８３９株の菌体を用いる他は、同一の手順により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料（ＩＩ）を調製した。
【００８６】
ＤＮＡポリメラーゼとして、バイオアカデミア社製「ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ」を用いた。基本酵素液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１０ｍＭ，ｐＨ８．３、ＫＣｌ；５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２；１．５ｍＭ、ｄＮＴＰ；０．２ｍＭ、ＤＮＡポリメラーゼ；０．０２５ユニット／μｌ、反応時終濃度）に、スクロース及びＣＤを加えた（スクロース；１２％ｗ／ｖ、α−ＣＤ；２０ｍＭ、反応時終濃度）。次いで、実施例９で用いたＴＲＸ２遺伝子増幅用プライマーペア各０．２５μＭを加えてＣＤ組成物を調製した。
【００８７】
上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料（Ｉ）及び（ＩＩ）各０．５〜１２μｌを、Ｌａｅｍｍｌｉ法のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、タンパク質を分離した。電気泳動終了後、ポリアクリルアミドゲルをクマシーブリリアントブルーＧ（アトーＥＺ社製；「ｓｔａｉｎ  Ａｑｕａキット」）で染色し、酵母のタンパク質を検出した。その結果を図９に示す。
【００８８】
一方、上記ＣＤに容積比２、４、８及び１６％の上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料（Ｉ）又は（ＩＩ）を加え、熱処理９４℃５分、３５サイクルのＰＣＲ（変性９８℃１０秒、アニーリング６０℃２０秒、伸長７２℃３分）を行った。反応終了後、反応液（５μｌ）を直接０．７％アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウム染色に供し（電気泳動の条件は実施例１と同じ。）、ＰＣＲの成否を判定した。具体的には、ＰＣＲ産物の分子サイズが１．２ｋｂなら野生型ＴＲＸ２保持株、ＰＣＲ産物の分子サイズが２．５ｋｂなら染色体ＤＮＡへのベクター挿入によるＴＲＸ２遺伝子破壊株（Δｔｒｘ２：：ＫａｎＭＸ）と判定した。その結果を図１０に示す（Ａ；ＹＤ１２６５４株、Ｂ；ＹＤ１４８３９株）。
【００８９】
ＳＤＳを含有する酵母由来の試料を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、通常通りタンパク質組成の分析ができた（図９）。また、同一のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料を用いてＰＣＲを行ったところ、該試料が４％ｖ／ｖ以下でＰＣＲ産物が生じ、遺伝子増幅が確認された（図１０）。この時の反応系中の阻害物質の反応時終濃度は、ＳＤＳが０．０８％ｗ／ｖ、２−メルカプトエタノールが０．０８％ｖ／ｖ、酵母菌体が０．８ｍｇ湿重量／ｍｌであった。ＰＣＲ産物の分子サイズから、ＹＤ１２６５４株（対照、ＴＲＸ１遺伝子破壊株）のＴＲＸ２遺伝子は野生型（ＴＲＸ２、図１０の４％Ａ及び２％Ａ）、ＹＤ１４８３９株のＴＲＸ２遺伝子はベクター挿入型破壊型（Δｔｒｘ２：：ＫａｎＭＸ）と判定できた（図１０の４％Ｂ及び２％Ｂ）。以上より、同一試料を用いて、夾雑物を除去する精製工程を経ることなく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質分析及びＰＣＲによる遺伝子増幅を行うことができることが分かる。
【００９０】
＜実施例１２＞ＣＤ組成物を用いた改変サンガー法ＤＮＡシーケンス反応
ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及び蛍光標識ジデオキシヌクレオチド類（ｄｄＮＴＰ）の混成組成物として、アプライドバイオシステムズ社製「ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ」を用いた。ダイターミネータシーケンス酵素液（０．５×「ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ」、０．５×アプライドバイオシステムズ社製「ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１＆ｖ３．１  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」緩衝液、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）プラスミドＤＮＡ；０．０４μｇ／μｌ、Ｍ１３（−２１）プライマー（配列番号１１、５’−ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’、Ｔｍ；６１．７℃）；０．２４μＭ）に、１０ｍＭのα−ＣＤを加え、ＣＤ組成物を調製した。更に、上記ＣＤ組成物にＳＤＳを加え（終濃度０．０１％）、最終的なダイターミネータシーケンス反応液とした。対照として、該反応液に代えて、上記ダイターミネータシーケンス酵素液（対照１；ＣＤ及びＳＤＳを含まない）、上記ＣＤ組成物（対照２；ＣＤを含み、ＳＤＳを含まない）及び上記ダイターミネータシーケンス酵素液（対照３；ＣＤを含まず、ＳＤＳを含む）を用いた。
【００９１】
上記ダイターミネータシーケンス反応液（１０μｌ）の入ったチューブをサーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製「２７２０サーマルサイクラー」）に設置し、サーマルサイクルシーケンス反応を行った。サーマルプログラムは以下の（Ａ）〜（Ｃ）に設定した。
（Ａ）９６℃１分の熱処理
（Ｂ）２５回のサーマルサイクル（変性９６℃１０秒、アニーリング５０℃５秒、シーケンス反応６０℃２分）
（Ｃ）４℃で冷却保存
【００９２】
反応終了後、上記反応液（１０μｌ）に、７．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液５μｌ及びエタノール３７．５μｌを加えて混合した。次いで、この混合液を室温で５分間静置した後、１５，０００回転５分間の遠心で、シーケンス反応産物をエタノール沈殿として回収した。更に、７０％ｖ／ｖエタノールで沈殿を洗浄後、再度１５，０００回転１分間の遠心で、沈殿を回収した。この沈殿を室温で５分間乾燥させた後、アプライドバイオシステムズ社製「ＨｉＤｉホルムアミド」１８μｌに溶解した。次いで、蛍光シーケンス反応産物を９５℃で５分間変性させ、１本鎖ＤＮＡに解離させた。
【００９３】
変性させた蛍光シーケンス反応産物を、アプライドバイオシステムズ社製「３７３０ＤＮＡアナライザ」を用いたキャピラリー電気泳動によりサイズ分離し、付属ソフトで分離パターンを解析した。キャピラリー電気泳動の条件は、アプライドバイオシステムズ社製５０ｃｍキャピラリー、アプライドバイオシステムズ社製ＰＯＰ７ポリマー、１×アプライドバイオシステムズ社製３７３０泳動緩衝液、泳動プロトコル"ＦａｓｔＳｅｑＰＯＰ７"で行った。蛍光分離パターンの波形解析は、ＫＢベースコーラープロトコル"ＢＤｖ３"で行った。電気泳動後、４色蛍光の分離パターンをｒａｗ  ｓｉｇｎａｌとして４色蛍光チャート図にプロットした。
【００９４】
蛍光分離パターン（ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）が検出できれば、ダイターミネータサイクルシーケンス反応が成功したと判定した。この場合、更に蛍光波形中の各蛍光ピークの蛍光強度を詳細に解析し、シーケンス産物の生成量を評価した。また、蛍光波形中の各蛍光ピークの移動時間を詳細に解析し、キャピラリー電気泳動への影響を評価した。一方、蛍光分離パターンが検出できない場合、ダイターミネータサイクルシーケンス反応が失敗したと判定した。
【００９５】
ＫＢベースコーラープロトコル"ＢＤｖ３"を用いた波形解析により、信頼性値（ＱＶ）が２０以上の状態で、連続して解読できた塩基数を計測した。以上の結果を図１１に示す。図１１Ａ〜Ｃは、対照１〜３の結果を示す。図１１Ｄは、上記ダイターミネータシーケンス反応液の結果を示す。
【００９６】
図１１より、ＳＤＳを含まない場合（対照１及び２）、ＣＤの添加の有無によらず、蛍光分離パターン（ｒａｗ  ｓｉｇｎａｌ）が観測された（図１１Ａ及びＢ）。一方、ＣＤを含まず、ＳＤＳを含む場合（対照３）、サイクルシーケンス反応産物による蛍光分離パターンが全く観察されなかった（図１１Ｃ）。これに対し、上記ダイターミネータシーケンス反応液（ＣＤ及びＳＤＳを含む）では、対照１及び２（ＳＤＳを含まない）とほぼ同じ蛍光強度及び移動時間の蛍光分離パターンが観察された（図１１Ｄ）。また、上記ダイターミネータシーケンス反応液由来の蛍光分離パターンの波形解析により、対照１及び２と同様に、信頼性値（ＱＶ）が２０以上の状態で連続して、約８５０ベースの塩基配列を解読することが出来た。一方、対照３では、蛍光自体が検出できないため、塩基配列は全く解読できなかった。よって、ＣＤ組成物を用いることにより、蛍光ｄｄＮＴＰを含むシーケンス反応産物の収量及びＤＮＡ塩基配列決定能力を変化させずに、ＤＮＡポリメラーゼのＳＤＳ耐性のみを向上させることができることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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