(57)【要約】【課題】限外濾過膜を使用せずに分解液中から酵素を回収して再利用することを含む発酵方法の提供。【解決手段】出発溶液中の生分解性樹脂を酵素により分解して分解液を生成する分解液生成工程、及び、前記分解液を発酵させる工程を含む発酵方法、または前記分解液生成工程、及び、前記分解液を発酵させる工程を同時に行う発酵方法であって、生成された分解液または発酵後の液に前記酵素に分解性を有する材料からなる酵素回収物質を添加して分解液中の酵素を捕集させ、その酵素回収物質を新たな出発溶液に添加し、酵素回収物質から放出された酵素を新たな分解液生成工程に再利用することを含む、前記発酵方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
出発溶液中の生分解性樹脂を酵素により分解して分解液を生成する分解液生成工程、及び、前記分解液を発酵させる工程を含む発酵方法、または前記分解液生成工程、及び、前記分解液を発酵させる工程を同時に行う発酵方法であって、生成された分解液または発酵後の液に前記酵素に分解性を有する材料からなる酵素回収物質を添加して分解液中の酵素を捕集させ、その酵素回収物質を新たな出発溶液に添加し、酵素回収物質から放出された酵素を新たな分解液生成工程に再利用することを含む、前記発酵方法。
【請求項２】
酵素を捕集した酵素回収物質が、新たな出発溶液中で該物質が捕集した酵素で分解されることにより酵素を放出する、請求項１記載の発酵方法。
【請求項３】
酵素回収物質が発酵原料から構成され、酵素分解後に発酵原料となる請求項１又は２記載の発酵方法。
【請求項４】
酵素回収物質による酵素の捕集を前記酵素の酵素活性が低下した温度で行い、新たな出発溶液中への酵素の放出を前記酵素が酵素活性を示す温度で行う、請求項１〜３のいずれか１項記載の発酵方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素に分解性を有する材料からなる酵素回収物質を使用して酵素を再利用する発酵方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、バイオマス資源からエタノールを回収したり、メタン発酵を行ってメタンを回収するなど、様々な物質からエネルギー性物質を回収し、燃料等のエネルギー資源としてこれを有効利用する試みがなされている。
これらは、食品加工残さや食品廃棄物、さらには飼料作物がなどから行われる他、近年では、乳酸系の生分解性物質を含む有機系廃棄物をメタンガス発酵させてメタンガスを回収する方法など、生分解性樹脂などと一緒に発酵を行うことをも行われている。
上記の方法は、例えば、酵素分解槽中でセルロースを含む飼料作物、食料加工残さやポリ乳酸等の酵素分解性材料を含む溶液に分解酵素を加えて糖、乳酸等に分解した後、この溶液を発酵槽に移動させて、エタノール発酵、乳酸発酵、メタン発酵等を行ってエネルギー性物質を回収することにより行われる。ここで、酵素分解性材料を分解槽で酵素分解した後に発酵槽へ移す際に、分解槽で用いた酵素も分解物と共に発酵槽へ流れるため、次回以降の酵素分解性材料の分解を行う際には、分解槽に酵素を再度追加する必要があり、高価な酵素に掛かるコストの点で問題があった。
【０００３】
分解槽において酵素を有効利用する方法としては、限外濾過膜を使用して分解溶液中から酵素を回収する方法などが報告されている（特許文献１）。しかしながら、限外濾過膜を使用する方法では、濾過膜に不純物等が詰まることによる処理速度の低下や、膜再生等のメンテナンスのコストなどの問題点があった。また、別の方法として酵素が付着しているリグノセルロース原料の分解残さを新たな分解工程において再利用する方法が報告されている（特許文献２）。しかしながら、この方法は、セルロース繊維を含む紙など限定された原料の懸濁液の分解残さをそのまま再利用するものであり、他の分解性材料、その分解残さを使用する場合の材料や分解条件に対して汎用性のある他の再利用法を使用する新たな分解、発酵方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６３−１３７６９１号公報
【特許文献２】特開２０１０−９８９５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、限外濾過膜を使用せずに分解液中から酵素を回収して再利用することを含む発酵方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、酵素に分解性を有する材料からなる酵素回収物質を使用して分解液から酵素を回収し、該物質を新たな分解に使用する方法とすることによって上記課題を解決するものである。
即ち、本発明は、出発溶液中の生分解性樹脂を酵素により分解して分解液を生成する分解液生成工程、及び、前記分解液を発酵させる工程を含む発酵方法であって、生成された分解液に前記酵素に分解性を有する材料からなる酵素回収物質を添加して分解液中の酵素を捕集させ、その酵素回収物質を新たな出発溶液に添加し、酵素回収物質から放出された酵素を新たな分解液生成工程に再利用することを含む、前記発酵方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、分解酵素を再利用することによる分解槽への酵素の追加量を削減できることに加え、酵素混入による発酵阻害の抑制が可能となり、低コストで高効率の発酵方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】酵素回収試験において溶液中の酵素（ＣＬＥ）濃度を測定するために作成した、ＣＬＥ濃度と吸光度の検量線を示す。
【図２】酵素分解試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の発酵方法は、出発溶液中の生分解性樹脂を酵素により分解して分解液を生成する分解液生成工程、及び、前記分解液を発酵させる工程を含む。上記の工程は、いずれも当業者が通常の知識に基づいて行うことが可能であり、特に限定されるものではない。
【００１０】
前記生分解性樹脂は、生分解性を有する樹脂であればよく、例えば化学合成系樹脂、微生物系樹脂、天然物利用系樹脂などが挙げられる。具体的には、脂肪族ポリエステル、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、セルロース類、澱粉類などが挙げられる。脂肪族ポリエステルとしては、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）樹脂及びその誘導体、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）樹脂及びその誘導体、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）及びその誘導体、ポリエチレンアジペート（ＰＥＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリテトラメチレンアジペート、ジオールとジカルボン酸の縮合物などが挙げられる。セルロース類としては、例えばセルロース、リグノセルロース、ヘミセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、アセチルセルロースなどが挙げられる。これらは単独での使用、共重合体での使用、２種以上を組み合わせての使用でもよい。共重合体を形成する成分としては、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、オクタンジオール、ドデカンジオール、ネオペンチルグリコール、グリセリン、ペンタエリスリトール、ソルビタン、ビスフェノールＡ、ポリエチレングリコールなどの多価アルコール；シュウ酸、コハク酸、アジピン酸、セバシン酸、グルタル酸、デカンジカルボン酸、シクロヘキサンジカルボン酸、テレフタル酸、イソフタル酸、アントラセンジカルボン酸などのジカルボン酸；グリコール酸、L-乳酸、D-乳酸、ヒドロキシプロピオン酸、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシ吉草酸、ヒドロキシカプロン酸、マンデル酸、ヒドロキシ安息香酸などのヒドロキシカルボン酸；グリコリド、カプロラクトン、ブチロラクトン、バレロラクトン、ポロピオラクトン、ウンデカラクトンなどのラクトン類などが挙げられる。
【００１１】
また、上記生分解性樹脂と、汎用化学樹脂、添加剤との混合体であってもよい。ここで添加剤としては可塑剤、熱安定剤、光安定剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、難燃剤、着色剤、顔料、フィラー、無機充填剤、離型剤、耐電防止剤、香料、滑剤、発泡剤、抗菌・抗カビ剤、核形成剤などが挙げられる。
【００１２】
生分解性樹脂は、好ましくはポリ乳酸樹脂である。ポリ乳酸樹脂としては、乳酸を重合して得られるポリエステル樹脂であれば特に限定されず、ポリ乳酸のホモポリマー、コポリマー、ブレンドポリマーなどであってもよい。
【００１３】
また、上記生分解性樹脂を分解するのに適した酵素は、使用する具体的な生分解性樹脂や分解条件等に応じて当業者が適宜選択することが可能である。酵素は固定化していても固定化していなくてもよい。例えばリパーゼやプロテアーゼ、クチナーゼ、セルラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、当業者は上記の酵素の混合物を作製して使用することにより、分解の効率を最適化することができる。また微生物を入れ、その菌体外酵素を用いてもよく、その微生物が必要とする培地成分や栄養成分が添加されていてもよい。また、上記酵素の活性を阻害しない限り、上記以外の微生物、酵素、培地成分、栄養成分、界面活性剤、食品廃棄物等の有機性廃棄物などが添加されていてもよい。
【００１４】
分解液中に含まれる緩衝剤としては、グリシン-塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス-塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸-リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、グリシン-水酸化ナトリウム緩衝液などが挙げられる。また、固体の中和剤でもよく、例えば炭酸カルシウム、キトサン、脱プロトンイオン交換樹脂などが挙げられる。
【００１５】
分解液中で生分解性樹脂を分解する際の温度は、酵素が分解活性を示す温度であればよい。より好ましくは、０℃〜１００℃である。さらに好ましくは、２０℃〜７０℃である。また、分解の際に分解液を撹拌してもよいが、撹拌条件は特に限りはなく、分解液が均一に撹拌されればよい。
【００１６】
また、前記分解液を発酵させる工程に用いる発酵菌についても、使用する具体的な生分解性樹脂の種類等に応じて適宜選択することが可能である。例えば、分解液をメタン発酵させる場合、その用途に使用することが一般に知られる菌が使用できる。例えば（通性嫌気性菌として、クロストリジウム属（Clostridium）、バチルス属（Bacillus）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）などの炭化水素分解菌、プレクリジウム  スプマルム（Plecridium spumarum）、カズセウス  セロセヒドロゲニカス（Caduceus cellosaehydrogenicus）、のような繊維分解菌、クロストリジウム属（Clostridium）、プロテウス属（Proteus）、バクテリウム属（Bacterium）、バチルス属（Bacillus）、などのタンパク質分解菌、クロストリジウム  クルベリ（Clostridium kluyveri）、などの脂肪分解菌が挙げられる。また、絶対嫌気性細菌としては、メタノコッカス属（Methanococcus）、メタノバクテリウム属（Methanobacterium）、メタノサルシナ属（Methanosarcina）などが挙げられる。これらのメタン発酵菌は一種類以上を用いることができ、メタン発酵を続けることによって、その環境に応じてこれらの一種または複数のメタン発酵菌が作用することで反応が進行する。
メタン発酵を行う方法は特に限定はされず、湿式でも乾式でもよい。当業者が通常の知識を用いて条件等を適宜設定することができる。
エタノール発酵させる場合、用いる酵母としては、任意の酵母を用いることができる。酵母共存下での微生物起源のセルラーゼ混合物の作用により、例えば木質系バイオマス等に含まれるセルロースが糖化され、さらにエタノール発酵によりエタノールに転換される。
【００１７】
発酵は、必要により適宜攪拌を行いながら行うことができる。また、発酵の温度は特に限定はされず、発酵に適した温度を当業者が適宜設定することができるが、例えば２０〜８０℃、好ましくは３５〜５０℃、例えば３７℃とすることができる。その際、恒温槽を使用して適切な温度に保って発酵を行うことが好ましい。
また、発酵を行う処理時間は、分解した生分解性樹脂の量分解液の量や、使用するメタン菌の種類及び発酵温度に応じて、必要な時間を当業者が適宜設定することができるが、例えば１〜３０日、好ましくは１〜２０日、さらに好ましくは１〜１０日程度とすることができる。
【００１８】
本発明の方法においては、酵素を再利用することを含むため、分解液生成工程と、その後の発酵の工程は別の槽の中で行うか、または分解液生成工程と発酵工程を一つの槽の中で連続して若しくは同時に行う。例えば、二槽で行う場合、分解液生成工程を第一の槽（分解槽）で行い、生成した分解液を第二の槽（発酵槽）に移動させて発酵の工程を行うことによって、後述の酵素回収物質を使用した分解酵素の再利用を１または複数の分解槽で効率的に行うことができる。
【００１９】
本発明の方法は、前述の分解液生成工程及び発酵の工程において、さらに、生成された分解液に酵素に分解性を有する材料からなる酵素回収物質を添加して分解液中の酵素を捕集させ、その酵素回収物質を新たな出発溶液に添加し、酵素回収物質から放出された酵素を新たな分解液生成工程に再利用することを含む。
本発明において、酵素回収物質とは、分解液生成工程後の分解液中に存在する酵素を捕集することができる任意の物質を意味し、また本発明に使用される酵素回収物質は、生成された分解液に前記酵素に分解性を有し、新たな分解液生成工程の出発溶液に添加した場合に、捕集した酵素を放出できるものである。上記のような酵素回収物質を使用することにより、限外濾過膜を用いずに溶液中から酵素を効率的に回収し、かつ、酵素回収物質から酵素を分離させる工程を別途設けることなく、回収した酵素した酵素を分解の工程に再利用することができる。
【００２０】
上記の目的に使用できる酵素回収物質は、必要とされる特性を有するものを当業者が適宜選択または作製することが可能である。例えば、本発明に使用する酵素回収物質として、その捕集する酵素に分解性を有する材料（即ち、酵素の基質）からなるものを使用することができる。そのような酵素回収物質を使用することにより、酵素を捕集した前記酵素回収物質を新たな分解液生成工程の出発溶液中で、その捕集した酵素によって分解され、その結果、酵素が溶液中に放出される。放出された酵素は、新たな分解液生成工程に再利用される。また酵素回収物質が発酵原料から構成されていれば、酵素を回収し分解後に発酵原料となるため、発酵の阻害にはならない。
【００２１】
酵素を捕集した酵素回収物質は、分解液を静置又は遠心することにより、分解液から容易に分離することができる。また、必要に応じて不織布等のフィルターとして使用して分離してもよい。
【００２２】
前述の通り、本発明の方法に使用される酵素回収物質は前記酵素に分解性を有する材料からなる。従って、酵素回収物質の材料は、回収する酵素の基質であることが好ましく、そのような物質は当業者が分解酵素の種類等に応じて適宜選択することが可能である。例えば、前述の生分解性樹脂において例示した各種生分解性樹脂由来の物質、例えばポリ乳酸由来の物質を使用することができる。またセルロース等の木質バイオマスを用いてもよい。
【００２３】
本発明に使用される酵素回収物質は、好ましくは粉末体やファイバーであり、好ましくは高表面積体である。粉末体又は高表面積体の酵素回収物質とすることにより、前記酵素回収物質は分解液中で効率よく酵素を捕集し、かつ、新たな分解工程の出発溶液中で効率よく分解されて酵素を放出することができる。高表面積体は、一般に細孔性の物質とすることにより達成することが可能であり、そのような物質を得るための方法は当業者によく知られており、例えば特開２００９−１４４０１２号公報など記載されている。物質の細孔性は、酵素回収物質の内部に独立して存在するものではなく、酵素回収物質の表面から孔が連続している連続孔とすることが効率よく酵素を捕集できるので好ましい。
【００２４】
例えば、酵素回収物質の材料となるポリ乳酸等の物質を、適切な溶媒に加熱溶解した後、この溶液を冷却して前記物質を析出させ、その後、乾燥、粉砕して粉末化することにより得ることができる。このために使用される溶媒は酵素回収物質の材料の種類等に応じて当業者が選択することが可能であり、例えばアセトン、ジオキサン、水の混合物を使用することができる。溶媒に対する原料の量、溶解、析出の温度等は、原料の溶解度等に応じて適宜変更することが可能である。
本発明に使用される酵素回収物質は、０．０１ｍ2/ｇ以上の比表面積を有することが好ましく、例えば０．０５〜２０ｍ2/ｇ、好ましくは０．１〜１０ｍ2/ｇである。
【００２５】
本発明の方法においては、酵素回収物質による酵素の捕集を前記酵素の酵素活性の低下した温度で行い、新たな出発溶液中への酵素の放出を前記酵素が酵素活性を示す温度で行うことにより、酵素回収物質による酵素の捕集及び放出を、各工程に適した条件下で行い、酵素の再利用を効率的に行うことが可能となる。上記の酵素活性は、酵素が本来使用される条件下における活性に基づいて相対的に低下していれば十分であり、また、そのための温度は使用する酵素の種類等により適宜設定することが可能である。例えば、酵素としてCryptococcus sp. S-2由来リパーゼ（独立行政法人酒類総合研究所：特開2004-73123））粉末を使用して分解液生成工程を行った場合、その後、酵素回収物質を添加する際に分解液の温度を調整して酵素の捕集を４〜２５℃、例えば２０℃で行い、また、次回の分解工程における出発溶液への酵素の放出を、３５〜４５℃、例えば３５℃で行うことが可能である。
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
各種物質を使用して溶液中からの酵素の回収を行い、それをポリ乳酸フィルムの分解試験において使用した。
＜使用材料＞
酵素回収物質の原料として以下を使用した。
- ポリ乳酸（PLA）はnatureworks社製4032D(d乳酸1.4%)を用いた。
- ポリエチレンテレフタレート（PET）は新光合繊社製5015Wを用いた。
- 炭酸カルシウムは白石工業株式会社製brilliant1500を用いた。
【００２７】
＜フィルムの作製＞
ペレットを200℃(PLA)、または270℃(PET)で5分間融解後、80-100kgf／cm2の圧力で加熱加圧（ホットプレス）し、フィルムを作製した。
【００２８】
＜粉体の作製＞
得られたフィルム（PLA、PET）を凍結粉砕機で粉末化し、粉末サンプルとした。
【００２９】
＜PLA高表面積体粉末の作製＞
25mlバイアル瓶にPLAフィルム0.4g、アセトン7.37ml、ジオキサン1.58ml、水1.05mlを加え、80℃で溶解させた。該溶解液をテフロン（登録商標）シャーレに全量滴下し、放冷し、高表面積体を得た。得られた高表面積体を40℃で一晩真空乾燥させ、凍結粉砕機で粉末化し、連続孔を有するPLA高表面積体粉末とした。
【００３０】
＜比表面積の測定＞
バイアル瓶に粉末サンプルを入れ、常温で５時間真空乾燥した。乾燥後の粉末サンプルをフローソーブII２３００型（島津製作所）を用いてＢＥＴ一点法により測定した。キャリアーガスは３０％窒素、７０％アルゴンの混合ガスを使用した。
【００３１】
＜酵素濃度の検量線作製＞
CLE酵素液の作製
CLE酵素はCryptococcus sp. S-2由来リパーゼ（独立行政法人酒類総合研究所：特開2004-73123））粉末を用いた。0.0005、0.0125、0.05、0.5mg/ml濃度に調整し分光光度計（島津製作所製の分光光度計UV-160A）、吸光度（280nm）を測定し、検量線を引いた（図１）。この検量線に基づいて、後続の酵素回収試験の各サンプルの酵素濃度を計算した。
【００３２】
＜酵素回収試験＞
25mlバイアル瓶に0.5mg/mlのCLE酵素液10ml、酵素回収物質として各種粉末50mgを加え、スターラー（20℃、5分）で攪拌した。液を20mlのファルコンチューブに移し遠心（20℃、4000rpm、3分）で固液分離した。回収した液の吸光度を測定し、酵素回収物質への酵素回収率を求めた。酵素回収率は（初期の酵素濃度―回収した液の酵素濃度）/初期の酵素濃度×100で求めた。
【００３３】
＜回収酵素を用いた酵素分解試験＞
25mlバイアル瓶にpH7、60mMリン酸緩衝液10ml、酵素回収物質、PLAフィルムを加え、45℃で分解試験を行った。2日後と5日後にフィルムを取り出し４５℃オーブンで一晩乾燥させ、重量を測定した。フィルムの分解量は（初期のフィルム重量）―（取り出し乾燥後のフィルム重量）で求めた。
結果を以下の表及び図２に示す。
【００３４】
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【００３５】
上記の表及び図２からは、炭酸カルシウムは酵素を十分に吸着できず、酵素回収物質として使用できないことが理解される。また、ＣＬＥ酵素に対して酵素分解性を有しないＰＥＴ粉末を使用した場合は酵素放出量が低下するため、基質の分解性が低下することが理解される。さらに、図２のＰＬＡ粉末体とＰＬＡ高表面積体粉末体を比較すると、高表面積体である方が酵素回収率と放出速度が速いため、初期の分解速度が速いことが理解される。
【図１】
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【図２】
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