(57)【要約】【課題】安全性が高くヒト皮膚から製造される中枢神経疾患を治療するための細胞の提供。【解決手段】ヒト皮膚から細胞を含む組織を採取する組織採取工程：前記工程で得られた組織を、タンパク質分解酵素を含む酵素溶液中に浸漬する酵素溶液浸漬工程：前記酵素溶液浸漬工程で得られた組織を、タンパク質分解酵素阻害剤を含む阻害剤溶液に浸漬する阻害剤溶液浸漬工程及び：以上の工程で得られた細胞を培養する培養工程：により得られる神経系疾患を治療するための細胞の製造方法であって、前記阻害剤溶液としては、前記タンパク質分解酵素を阻害するのに必要とされるよりも過剰のタンパク質分解酵素阻害剤を含むものを用い、前記培養工程では、無血清培地を用い、また、栄養支持細胞を用いることなく、更に培養中に、培養に用いられている培地に新しい培地を添加してからその一部を除去して行う方法で培地交換を行うこと、を特徴とする方法を提供する。【選択図】図５
2012029684.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト皮膚から細胞を含む組織を採取する組織採取工程：
前記工程で得られた組織を、タンパク質分解酵素を含む酵素溶液中に浸漬する酵素溶液浸漬工程：
前記酵素溶液浸漬工程で得られた組織を、タンパク質分解酵素阻害剤を含む阻害剤溶液に浸漬する阻害剤溶液浸漬工程及び：
以上の工程で得られた細胞を培養して治療用培養細胞を得る培養工程：
により得られる神経系疾患を治療するための細胞の製造方法であって、
前記阻害剤溶液浸漬工程では、酵素溶液浸漬工程における酵素溶液中のタンパク質分解酵素を阻害するのに必要とされるよりも過剰のタンパク質分解酵素阻害剤を含む阻害剤溶液を用い、
前記培養工程では、動物由来血清、脳由来物質、牛由来タンパク質、及び動植物由来アレルゲン物質を実質的に含まず、無血清培地を用い、また、栄養支持細胞を用いることなく、更に培養中に培地交換を行い、その培地交換は、培養に用いられている培地に新しい培地を添加してからその一部を除去して行うこと、
を特徴とする神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項２】
酵素溶液浸漬工程は０〜３７℃の温度範囲で実施される請求項１に記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項３】
阻害剤溶液浸漬工程において阻害剤溶液中のタンパク質分解酵素阻害剤の量が、酵素溶液浸漬工程で用いたタンパク質分解酵素を阻害するのに必要な理論量の２〜１０倍である請求項１又は２に記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項４】
酵素溶液浸漬工程におけるタンパク質分解酵素がデスパーゼ、トリプシン又はコラゲナーゼ又はそれらの混合物であり、阻害剤浸漬工程におけるタンパク質分解酵素阻害剤がトリプシン阻害剤又はコラゲナーゼ阻害剤を含むタンパク質分解酵素阻害剤である請求項１から３のいずれかに記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項５】
酵素溶液浸漬工程において２種類以上の酵素溶液に順に浸漬されることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項６】
阻害剤溶液浸漬工程後、さらに、未消化の残渣組織のみを回収し、前記酵素溶液浸漬工程で用いたタンパク質分解酵素と異なるタンパク質分解酵素を含む酵素溶液中に浸漬する、残渣酵素溶液浸漬工程を含み、
残渣酵素処理溶液浸漬工程で得られる細胞を、阻害剤溶液浸漬工程で得られる細胞と共に、培養工程に供することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項７】
残渣酵素溶液浸漬工程が０〜３７℃の温度範囲で実施される請求項５に記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項８】
残渣酵素溶液浸漬工程で用いられる酵素溶液中のタンパク質分解酵素が、コラゲナーゼである請求項５又は６に記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項９】
培養工程で用いる培地には、タンパク質分解酵素阻害剤が０．０１２５重量％以上２．５重量％の範囲で添加されている請求項１から８のいずれかに記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項１０】
培養工程で用いる培地には、細胞増殖促進剤としてインシュリン、トランスフェリン、セレニウム、エタノールアミン、脂質、ビタミンＣ及びビタミンＣ誘導体から選ばれる１種又は２種以上が１〜２００００ｎＭｏｌ／Ｌの範囲で添加されている請求項１〜９のいずれかに記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項１１】
培養工程で用いる培地には、ＫＧＦが０．１〜１００ｎｇ／Ｌの範囲で添加されている請求項１から１０のいずれかに記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項１２】
培養工程で用いる培地には、細胞毒となる活性酸素より発生するラジカルを除くラジカルスカベンジャーとして、還元グルタチオン、ビタミンＥ、ビタミンＥ誘導体、カタラーゼ、及びＳＯＤから選ばれた１種又は２種以上が１〜１０００ｎＭｏｌ／Ｌの範囲で添加されている請求項１から１１のいずれかに記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項１３】
培養工程で用いる培地には、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦ-α、ＥＧＦ、ＦＧＦ-２、活性型ビタミンＤ、塩化リチウム、アクチビン、ＣＣＬ−２７、及び２−メルカプトエタノールから選ばれた１種又は２種以上が１ｎＭｏｌ／Ｌ〜０．１ｍＭｏｌ／Ｌの範囲で添加されている請求項１から１２のいずれかに記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項１４】
前記培養工程において、培養開始からはじめの培地交換まで３〜１０日後培養することを特徴とする請求項１から１３のいずれかに記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項１５】
前記培養工程において、培養後、酵素処理を施すことなく、浮遊する細胞のみを採取することを特徴とする請求項１から１４のいずれかに記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項１６】
前記培養工程において、コラーゲン、ゼラチン、ポリ―Ｄ，Ｌ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン、ポリ−Ｌ−オルニチン等のコーティング剤で処理した接着培養皿、通常接着培養皿、あるいは非接着培養皿のいずれか１以上を使用することを特徴とする請求項１から１５のいずれかに記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項１７】
前記培養工程において、培養細胞をさらに、３−Ｏ−ｍｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ又はＲＯＣＫ阻害剤を含む培地を含む無血清培地中で乾燥、凍結乾燥、又は凍結保存することを特徴とする請求項１から１６のいずれかに記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。 
【請求項１８】
前記培養工程において、培養した細胞をＮｅｓｔｉｎ染色して確認することを特徴とする請求項１から１７のいずれかに記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項１９】
前記培養工程後、さらに、神経幹細胞を含む神経系細胞に分化させる工程を含む請求項１から１８のいずれかに記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項２０】
皮膚はヒトの頭頸部・顔面の部位からのものを使用する請求項１から１９のいずれかに記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項２１】
神経系疾患が中枢神経疾患、脊髄損傷あるいは脳腫瘍である請求項１から２０のいずれかに記載の神経系疾患を治療するための細胞の製造方法。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれかの方法により得られる細胞を有効成分として含有する神経系疾患を治療するための薬剤。
【請求項２３】
請求項１から２１のいずれかの方法により得られる細胞を用いて薬剤をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ヒト皮膚組織から得られる細胞を培養して得られる、神経系疾患を治療するための細胞の製造方法に関し、また、前記方法により得られる細胞を含有する神経系疾患を治療するための薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症、脳梗塞、頭部外傷、アルツハイマー病を含む認知症、パーキンソン病等の中枢神経疾患、Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ（グリオブラストーマ、膠芽腫）などの脳腫瘍、あるいは脊髄損傷といった、神経の異常あるいは損傷が原因となる疾患（以降、神経系疾患という）の治療は、これまでは経口あるいは注射による投薬、もしくは外科的治療によって行われてきた。しかしながら、それらはいずれも対処療法であり、根本的な治療には中枢神経の再生が不可欠である。このため、神経系疾患等の治療の方法として、神経細胞を用いた再生療法が期待される。神経細胞はそれ自身、増殖能を持たないため、再生のための神経細胞を得るには、神経細胞に分化することができ、増殖能を有する神経幹細胞が必要である。なお、神経幹細胞の定義については諸説があるが、本明細書中では、神経細胞に分化する能力を有し、増殖能力を有する細胞を神経幹細胞と定義する。
【０００３】
これまで、動物では中枢神経又は神経節から神経幹細胞を採取して培養で増やした例がある。しかし、採取の際、神経傷害が大きく、ヒトから神経幹細胞を採取することはできない。
【０００４】
一方、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）やｉＰＳ細胞から神経幹細胞を誘導することができる。しかし、これらの細胞は移植後、癌化する可能性が高いことが知られ、危険性が高い。特に神経系においては免疫応答が低いため、細胞を移植することによって癌化する可能性は高い。したがって、これらの細胞から誘導した神経幹細胞は治療には適さない。
【０００５】
また、最近、骨髄から得た体性幹細胞を神経幹細胞に誘導して神経疾患の治療に用いる方法の開発が試みられている。しかし、それらの細胞は間葉系細胞であるため、上皮系細胞である神経幹細胞への転換率が低く、治療に必要な細胞数を確保することが困難である。
【０００６】
さらに、鼻の臭粘膜からは神経幹細胞が得られて中枢神経疾患の治療に用いられているが、臭粘膜は組織が狭小なため治療に必要とする充分な細胞数が得られ難い（非特許文献１４）。
【０００７】
現在、成体の各臓器に存在する幹細胞は、その各々の臓器を修復するばかりでなく、他の臓器に傷害が大きい時には、その傷害臓器に移行して（非特許文献１１、非特許文献２１）その臓器の細胞に変換して修復を行うと考えられている。したがって、成体幹細胞は種々の細胞に分化できる多分化能を有している。一方、神経堤由来幹細胞は発生期に神経堤から遊離して種々の臓器に移行して、その臓器の幹細胞となる（非特許文献１６）。特に皮膚では、真皮、毛根バルジ部位、毛乳頭、毛乳頭周囲血管の４ヶ所に分散して神経堤由来幹細胞が存在している（非特許文献１２、非特許文献１６）。これらの中には神経幹細胞のマーカーであるＮｅｓｔｉｎが陽性である細胞群があり、神経幹細胞が含まれると考えられる。したがって、皮膚組織由来の幹細胞には神経幹細胞が含まれ、これらを集めて培養で安全に増やすことができれば、中枢神経疾患、脊髄損傷あるいは脳腫瘍を治療するための治療用培養細胞を得ることができると考えられる（非特許文献１５）。
【０００８】
実際これまでに、ヒトの皮膚（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献１９）、毛根（非特許文献１）、包皮（非特許文献２、非特許文献６）や頭皮（非特許文献３）から細胞を採取し神経幹細胞を培養する方法が報告されている。しかし、いずれも培養の際に、ウシなどの血清を含むｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍが使用されていたり、外来の細胞をフィーダー細胞として用いられており、それら由来の成分やウィルスが混入する危険性があり望ましいものではない。また、包皮は若年者由来のものしか報告はなく、患者が高齢の場合、あるいは女性の場合には適応できない。
【０００９】
無血清培地で行っている報告はあるものの（非特許文献９、非特許文献２０）、非特許文献９は５９歳までのヒトの皮膚から細胞を採取しており、高齢者に由来する皮膚からの細胞での成功例はない。脳梗塞は７０歳代で発症ピークを迎え、その他の中枢神経疾患の患者も高齢者が多いことから、この報告では不十分である。また、非特許文献２０は組織酵素処理が簡便である上、組織から表皮、毛根を除いている為、最初の採取時に細胞を充分に採っていない。したがって、得られる細胞数は少なく、最終的に数回に及ぶ移植治療に適さない。
【００１０】
また、これまで、皮膚組織由来の細胞から培養により得られる細胞を用いて、神経損傷モデルなどに移植して、治療有用性を確認した例はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｈｏｎｇ Ｙｕ、 ｅｔ ａｌ．: Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ． Ａｍ Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ． ２００６、 １６８（６）:１８７９−１８８８．
【非特許文献２】Ｊｅａｎ Ｇ． Ｔｏｍａ、 ｅｔ ａｌ．: Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｋｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５;２３:７２７−７３７．
【非特許文献３】Ｄａｎｉｅｌ Ｔｚｕ−ｂｉＳｈｉｈ、 ｅｔ ａｌ．: Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｃａｌｐ ｔｉｓｓｕｅ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５;２３:１０１２−１０２０．
【非特許文献４】Ａｌｅｘｉｓ Ｊｏａｎｎｉｄｅｓ、 ｅｔ ａｌ．: Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ: ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ｓｋｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｌａｎｃｅｔ ２００４;３６４:１７２−７８．
【非特許文献５】Ｍａｒｚｉａ Ｂｅｌｉｃｃｈｉ、 ｅｔ ａｌ．: Ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｍｉｇｒａｔｅ ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ． ７７:４７５−４８６ （２００４）
【非特許文献６】Ｉａｎ Ａ． ＭｃＫｅｎｚｉｅ、 ｅｔ ａｌ．: Ｓｋｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ Ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｊｕｒｅｄ ａｎｄ ｄｙｓｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２００６・２６（２４）:６６５１−６６６０．
【非特許文献７】Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｊ． Ｂｒｅｗｅｒ: Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈ． ７１（１９９７） １４３−１５５．
【非特許文献８】Ｂａｒｂａｒａ Ｚａｖａｎ、 ｅｔ ａｌ．: Ｎｅｕｒａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｉｐｏｓｅ ａｎｄ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔｉｓｓｕｅｓ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｒｅｓ． ３２（１）:４７−５４（２０１０）．
【非特許文献９】Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｅ． Ｗｏｎｇ、 ｅｔ ａｌ．: Ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｃａｎ ｂｅ ｔｒａｃｅｄ ｂａｃｋ ｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｉｎｅａｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｓｋｉｎ． Ｊ．Ｃ．Ｂ． １７５（６）:１００５−１０１５、２００６．
【非特許文献１０】Ｎｏｒｉｙｕｋｉ Ｓｅｔａ ＆ Ｍａｓａｔａｋａ Ｋｕｗａｔａ: Ｈｕｍａｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ａｓ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ． Ｋｅｉｏ Ｊ Ｍｅｄ ５６（２）:４１−４７、２００７．
【非特許文献１１】Ｄｏｕｇｌａｓ Ｗ． Ｌｏｓｏｒｄｏ ｅｔ ａｌ．: Ａ ｂｉｇ ｐｒｏｍｉｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｅｒｙ ｓｍａｌｌ: Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＥＳ−ｌｉｋｅ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ． Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ． ２００９ Ｊｕｎｕａｒｙ ６;５３（１）:１０−１２．
【非特許文献１２】Ｙａｓｕｙｕｋｉ Ａｍｏｈ、 Ｒｏｂｅｒｔ Ｍ． Ｈｏｆｆｍａｎ、ｅｔ ａｌ．:Ｎｅｓｔｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｎｕｄｅ ｍｏｕｓｅ ｆｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５;６５:（１２）５３５２−５７．
【非特許文献１３】Ｆｅｄｅｒｉｃａ Ｐｉｓａｔｉ、 ｅｔ ａｌ．: Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｖｅｓｓｅｌ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ、 ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ、 ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ． Ｃａｃｅｒ Ｒｅｓ ６７;（７）、３０５４−６３．２００７．
【非特許文献１４】Ｗａｙｎｅ Ｍｕｒｒｅｌｌ、 ｅｔ ａｌ．: Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｍｕｃｏｓａ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ２３３:４９６−５１５、２００５．
【非特許文献１５】Ｓｙｅｄ Ａｍｅｅｒ Ｂａｓｈａ Ｐａｓｐａｌａ、 ｅｔ ａｌ．: Ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ＆ ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ−Ｔｈｅ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ．  Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｍｅｄ Ｒｅｓ １３０、３７９−３９１、２００９．
【非特許文献１６】Ｍａｒｉａｎｎａ Ｄｅｌｆｉｎｏ−Ｍａｃｈｉｎ ＆ Ｒｏｂｅｒｔ Ｎ． Ｋｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．: Ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｆｉｅｌｄ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ２３６:３２４２−３２５４、２００７．
【非特許文献１７】Ｋａｒｌ Ｊ． Ｌ． Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ、 Ｊｅａｎ Ｇ． Ｔｏｍａ ａｎｄ Ｆｒｅｄａ Ｄ． Ｍｉｌｌｅｒ: Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｋｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．  Ｐｈｉｌ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ．  Ｂ  （２００８）  ３６３：１８５−１９８．
【非特許文献１８】Ｙａｓｕｍａｓａ Ｋｕｒｏｄａ ＆ Ｍａｒｉ Ｄｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．: Ｕｎｉｑｕｅ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ． ＰＮＡＳ  １０７、８６３９−８６４３、２０１０
【非特許文献１９】Ｍａｈｏ Ｋａｎｏｈ、 ｅｔ ａｌ．: Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈａｉｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｒｋｅｒ ｎｅｓｔｉｎ ｉｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ａｎｄ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｔｕｍｏｒｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ２００８;１８（５）:５１８−２３．
【非特許文献２０】Ｎａｎｃｙ Ｅｒｎｓｔ、 ｅｔ ａｌ．: Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ、 ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ、 ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｓｔｉｎ＋ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍｉｓ． Ｅｘｐ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ２０１０ＤＯＩ: １０．１１１１/ｊ．１６００−０６２５．２００９．０１０４１．ｘ
【非特許文献２１】Ｋｏｄａ Ｍ、ｅｔ ａｌ．:Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ （Ｇ−ＣＳＦ） ｍｏｂｉｌｉｚｅｓ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｉｎｊｕｒｅｄ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ２００７;１１４９:２２３−３１．
【非特許文献２２】Ｐａｇｌｉａ Ｄ、 ｅｔ ａｌ．: Ｌｅｕｋｅａｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １９９６;１３４（５）:８１７−２３．
【非特許文献２３】Ｓｕｆａｎ Ｗｕ、 ｅｔ ａｌ．: Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄ ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｊｕｒｅｄ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ． ２００３;７２（３）:３４３−５１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ヒト皮膚から、安全性の高い方法で、神経系疾患を治療するための細胞を製造する方法が求められていた。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法では、ヒトの組織の中でもとりわけ採取しやすい皮膚から神経系疾患の治療用細胞を得ることができる。本発明の方法では、高齢者の皮膚からであっても治療用細胞を得ることができる。本発明の方法によれば、多数の神経系疾患の治療用細胞を得ることができる。本発明の方法では、培養の際に、血清・脳下垂体抽出物・栄養細胞やアレルゲンを用いることなく、安全性の高い治療用細胞を得ることができる。また、本発明の治療用細胞は、凍結あるいは凍結乾燥することにより、保存することが可能であり、保存、運搬などが非常に簡便に行うことが出来る。さらに、本発明の方法で得られた細胞は、実際にラットの脊髄損傷モデルを治癒することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】培養法の概要図（実験例１）
【図２】保存法検討の結果（実験例２）
【図３】Ｎｅｓｔｉｎ陽性細胞（実験例３）
【図４】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの神経系細胞への分化（実験例４）
【図５】脊髄損傷モデルでの移植治療効果（実験例５）
【図６】各群の結節の形成率（実施例６）
【図７】ＨｅＬａ  Ｓ３群で形成された結節の体積（実施例６）
【図８】各群のＨＥ染色標本および抗ＨＬＡ免疫染色標本の観察結果（実施例６）
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ヒト皮膚から細胞を含む組織を採取する組織採取工程：
前記工程で得られた組織を、タンパク質分解酵素を含む酵素溶液中に浸漬する酵素溶液浸漬工程：
前記酵素溶液浸漬工程で得られた組織を、タンパク質分解酵素阻害剤を含む阻害剤溶液に浸漬する阻害剤溶液浸漬工程及び：
以上の工程で得られた細胞を培養して治療用培養細胞を得る培養工程：
により得られる神経系疾患を治療するための細胞の製造方法であって、
前記阻害剤溶液浸漬工程では、酵素溶液浸漬工程における酵素溶液中のタンパク質分解酵素を阻害するのに必要とされるよりも過剰のタンパク質分解酵素阻害剤を含む阻害剤溶液を用い、
前記培養工程では、動物由来血清、脳由来物質、牛由来タンパク質、及び動植物由来アレルゲン物質を実質的に含まず、無血清培地を用い、また、栄養支持細胞を用いることなく、更に培養中に培地交換を行い、その培地交換は、培養に用いられている培地に新しい培地を添加してからその一部を除去して行うこと、
を特徴とする神経系疾患を治療するための細胞の製造方法を提供する。
また、本発明は前記の方法により得られる細胞を有効成分として含有する神経系疾患を治療するための薬剤を提供する。また、さらに本発明は、前記の方法により得られる細胞を用いて神経疾患の治療に有用な薬剤のスクリーニング系を提供する。
【００１６】
以下、本発明の各工程について、その詳細を説明する。
【００１７】
（組織採取工程）
本工程で採取されるヒト皮膚は、皮膚組織全層が対象であるが、特に首から上の顔面頭頸部、特にヒトの頭頸部・顔面の部位の皮膚組織が好ましい。なぜなら、首から上の皮膚組織には、幹細胞が多く含まれると推測されるためである。なお、幹細胞とは細胞分裂を経ても同じ分化能を維持する細胞を指す。本工程においては、採取した組織から脂肪組織を除き、除菌後に酵素が浸透する幅まで細切してから次の酵素溶液浸漬工程に供することができる。また、本工程で採取されるヒト皮膚の、ヒトの年齢は問わず、従来は対象となりえなかった、６０歳以上であって構わない。
【００１８】
（酵素溶液浸漬工程）
本発明の、酵素溶液浸漬工程で用いるタンパク質分解酵素としては、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、遺伝子組換え型トリプシン、ＴｒｙｐＬＥ 、デスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ）、 コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、Ｌｉｂｅｒａｓｅ、 Ａｃｃｕｔａｓｅ等、を挙げられ、これらは混合して使用してもよい。さらに市販されている酵素溶液の例として、０．１２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／０．０１％ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ社製）、ＴｒｙｐＺｅａｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｔａｂｌｅ Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、  ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｄｉｓｐａｓｅ（三光純薬）、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ−Ｉ、ＩＩ、  ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、Ｘ（和光純薬）等、あるいはこれらの混合物を挙げることができる。なお、トリプシンについては採取動物からの汚染を考慮するとＴｒｙｐＺｅａｎ  ｂｏｖｉｎｅ、  ＴｒｙｐＺｅａｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、  １×（Ｓｉｇｍａ社製）、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、  ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用が望ましい。
また、酵素溶液浸漬工程においては、２種類以上の酵素溶液に順に皮膚組織を浸漬してもよい。この場合、最も好ましいのは、最初にデスパーゼ溶液に浸漬し、次にトリプシン溶液に浸漬することである。一方、１種類のみを用いる場合であれば、トリプシンを用いることが最も好ましい。
酵素溶液中のタンパク質分解酵素濃度は、使用するタンパク質分解酵素の種類によって異なるが、通常０．００１％以上０．５％以下であり、例えば、タンパク質分解酵素がトリプシンである場合には、０．００１％以上０．２５％以下、好ましくは０．００１％以上０．１３％以下であり、酵素溶液浸漬工程は０〜３７℃の温度範囲で実施される。
【００１９】
（阻害剤溶液浸漬工程）
本工程で用いるタンパク質分解酵素阻害剤は、酵素溶液浸漬工程に用いられたタンパク質分解酵素の阻害剤が用いられ、例えば、酵素溶液浸漬工程で用いるタンパク質分解酵素がトリプシンであれば、トリプシン阻害剤が挙げられ、その例としてトリプシン阻害剤（大豆由来）、トリプシン阻害剤（ｌｉｍａ  ｂｅａｎ由来）、アプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）などを挙げることができる。入手可能な市販品の例としては、Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  （Ｓｏｙ  ｂｅａｎ）（Ｗａｋｏ社製）、Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  （ｌｉｍａ  ｂｅａｎ）（Ｓｉｇｍａ社製）、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ （Ｔａｂａｃｃｏ）（Ｓｉｇｍａ社製）等を挙げることができる。また、タンパク質分解酵素がコラゲナーゼであれば、阻害剤の例としてコラゲナーゼ阻害剤が挙げられ、さらに具体的にはエコチンが挙げられる。エコチンの市販品としては例えば、Ｅｃｏｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）がある。なお、必ずしも、酵素溶液浸漬工程で用いられた酵素すべてに対するタンパク質分解酵素阻害剤を用いる必要はなく、例えば、デスパーゼのような酵素に対しては、特にそれを阻害するためのタンパク質分解阻害酵素を用いなくとも支障をきたさない。
【００２０】
一方、本発明においては阻害剤溶液浸漬工程において血清を用いないため、特にトリプシンのように活性の高いタンパク質分解酵素は、可及的に、好ましくは完全に失活させることが必要である。このため、タンパク質分解酵素阻害剤は、少なくとも酵素溶液浸漬工程で用いた酵素溶液中のタンパク質分解酵素に対して、過剰量のタンパク質分解酵素阻害剤を含む阻害剤溶液を用いる必要がある。一方、過剰すぎるタンパク質分解酵素を含むと、その後の細胞増殖が阻害され好ましくない。
【００２１】
このような観点から、本発明において、阻害剤溶液浸漬工程でのタンパク質分解酵素阻害剤の使用量は、酵素溶液浸漬工程で用いたタンパク質分解酵素を失活させるのに必要な理論量の通常２倍以上１０倍以下、好ましくは２倍以上５倍以下、より好ましくは２倍以上３倍以下であるのがよい。タンパク質分解酵素阻害剤の使用量は理論量の２倍より少ないと、酵素溶液浸漬工程で用いたタンパク質分解酵素を必要十分な程度にまで失活させることが難しい場合があり、反対に、１０倍量を超えて使用すると、細胞増殖阻害が起こり望ましくない。
【００２２】
また、本工程において、阻害剤溶液に浸漬する際の温度は０℃以上３７℃以下、好ましくは４℃以上２５℃以下であり、浸漬時間は３０分以上６時間以下、好ましくは３０分以上２時間以下の条件がよい。また、浸漬中はスターラー等にて撹拌することが好ましい。撹拌に伴い組織から細胞が遊離するので、これを回収して培養工程に供することができる。なお、遊離した細胞は阻害剤溶液浸漬後の混合物を、遊離した細胞（遊離細胞）が通過し、かつ、未消化残渣組織が通過しないポアサイズ、例えば４０〜１００μｍ程度のメッシュを用いて濾過し、次いで、得られた濾液溶液から遠心分離等の手段で阻害剤溶液を分離除去することによって回収できる。回収された細胞には体性幹細胞が含まれ、これが次の培養工程で増殖すると考えられる。
【００２３】
（残渣酵素浸漬工程）
阻害剤溶液浸漬工程後、さらに、未消化の残渣組織のみを回収し、タンパク質分解酵素を含む酵素溶液中に浸漬する、残渣酵素溶液浸漬工程を設けることができる。残渣酵素浸漬工程に用いられるタンパク質分解酵素については、上述と同様の酵素を用いることができるが、好ましくは前記酵素溶液浸漬工程で用いたタンパク質分解酵素と異なるものが用いられる。例えば酵素溶液浸漬工程で用いたタンパク質分解酵素がデスパーゼとトリプシンであれば、残渣酵素浸漬工程で用いる酵素としてコラゲナーゼを例示できる。酵素処理の好ましい温度範囲は０〜３７℃で、より好ましくは４℃以上３０℃以下である。また浸漬時間は好ましくは０．１時間以上２４時間以下であり、より好ましくは１６時間以上２４時間以下である。残渣は酵素溶液浸漬後、必要に応じ、さらなる未消化残渣がもしあれば、これを除去し、遠心分離等の手段で酵素溶液を分離除去し、細胞を回収し、回収された細胞は、阻害剤溶液浸漬工程で得られる細胞と共に、培養工程に供される。もし未消化残渣が生じれば、残渣酵素浸漬工程を繰り返し行ってもよい。その場合は同じ反応条件であっても異なる反応条件であってもよい。
なお、コラゲナーゼ後の残渣酵素浸漬工程の後、酵素活性阻害処理は行っても行わなくてもよい。行う場合は、用いたタンパク質分解酵素に適した酵素活性阻害剤を用いられ、例えばコラゲナーゼを用いていた場合にはエコチンを酵素活性阻害剤として例示できる。なお、酵素活性阻害処理を行うかどうかは、例えば皮膚組織を採取した患者の年齢などを基準に判断することが可能である。
【００２４】
（培養工程）
本発明の培養工程では、危険因子である動物＆ヒト由来血清、脳由来物質、牛由来タンパク質、及び動植物由来アレルゲン物質を実質的に含まない培地を用い、また、栄養支持細胞は用いない。
【００２５】
ここで危険因子について説明する。動物由来血清とはヒト血清、サル血清、ウシ胎児血清、ウシ血清、ブタ血清、ウマ血清、ロバ血清、ニワトリ血清、ウズラ血清、羊血清、ヤギ血清、イヌ血清、ネコ血清、ウサギ血清、ラット血清、モルモット血清及びマウス血清であり、脳由来物質とは脳下垂体抽出物、脳抽出物、及び脳由来抽出脂質であり、牛由来タンパク質とはウシの体を構成する全てのタンパク質、特にアルブミン、ゼラチンであり、また、動植物由来アレルゲン物質とはピーナッツ、そば、甲殻類、小麦、牛乳及び鶏卵等に由来する物質で、アナフィラキシー等のアレルギーを惹起するおそれのあるものである。ただし、牛由来タンパク質とはウシの体を構成する全てのタンパク質、特にアルブミン、ゼラチン及び酵素である。ただし、ｐｙｒｏｇｅｎを含まないような組換え体はこの限りでない。
【００２６】
また一般的な細胞培養には、多くの場合マウス胎児由来繊維芽細胞、３Ｔ３細胞、皮膚線維芽細胞（ｓｋｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＳＴＯ細胞、ＢＲＬ細胞、ＳＬ−１０細胞等といった細胞を栄養支持細胞として用いるが、本発明においては、このような外来の栄養支持細胞を用いない。その結果、得られる細胞の安全性が高く保たれる。
【００２７】
また、培地は、基本的には危険因子を実質的に含まない細胞培養用の培地であれば何でもよいが、好ましくは、ＭＣＤＢ１５１培地、ＭＣＤＢ１５３培地、 ＭＣＤＢ１５６培地（Ｓｉｇｍａ社製、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｄｅｄｉｎｅｄ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等の基本培地に、タンパク質分解阻害剤、細胞増殖促進剤、細胞毒となる活性酸素より発生するラジカルを除くラジカルスカベンジャー等の細胞培養上好適な培地添加剤添加するのがよい。
【００２８】
ここで、培地添加剤として添加されるタンパク質分解酵素阻害剤については、上記の阻害剤溶液浸漬工程で用いられるＳｏｙ  ｂｅａｎ由来タンパク質分解酵素阻害剤を始めとして、ｌｉｍａ  ｂｅａｎ由来タンパク質分解酵素阻害剤、遺伝子組換えアプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）、遺伝子組換えＥｃｏｔｉｎ等を例示することができ、その使用量は、通常０．０１２５重量％以上２．５重量％以下の範囲であるのがよい。０．０１２５重量％より少ないと培地添加剤として添加する添加効果に乏しく、反対に、２．５重量％を超えて添加してもあまり添加効果の向上が見られない。Ｅｃｏｔｉｎに関しては１０μＭ以上２００μＭ未満が好ましい。
【００２９】
また、培地添加剤として添加される細胞増殖促進剤としては、例えば、ＫＧＦ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：ＦＧＦ７）、インシュリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、トランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、セレニウム（Ｓｅｌｅｎｉｕｍ）、エタノールアミン（Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、脂質、ビタミンＣ及びビタミンＣ誘導体等を挙げることができ、これらはその１種のみを添加してもよく、また、２種以上を添加してもよい。これらのうちＫＧＦ以外の物質は好ましくはそれぞれが１〜２００００ｎＭｏｌ／Ｌの範囲で添加され、ＫＧＦは好ましくは０．１〜１００ｎｇ／Ｌの範囲で添加される。なお、上記の脂質としては、例えば、アラキドン酸、コレステロール、ＤＬ−ａ−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ−ａｃｅｔａｔｅ、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、Ｔｗｅｅｎ：８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（Ｓｉｇｍａ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社等より入手できる）等から選ばれた１種又は２種以上の混合物を例示することができる。
【００３０】
更に、倍地添加剤として添加されるラジカルスカベンジャーとしては、例えば、還元グルタチオン（Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、ビタミンＥ、ビタミンＥ誘導体、カタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ）、ＳＯＤ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）等を挙げることができ、これらはその１種のみを添加してもよく、また、２種以上を添加してもよい。これらは好ましくは１〜１０００ｎＭｏｌ/Ｌの範囲で添加される。
【００３１】
本発明において、基本培地に添加される培地添加剤としては、上記のもの以外に、ＴＧＦ−α（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ−２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−２）、活性型ビタミンＤ、塩化リチウム、アクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）、ＣＣＬ−２７（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ  ２７）、２−メルカプトエタノール、 ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）阻害剤のＦａｓｕｄｉｌやＹ−２７６３２等を挙げることができ、これらはその１種のみを添加してもよく、また、２種以上を添加してもよい。これらは通常の範囲の添加量が用いられ、好ましい添加量の範囲は１ｎＭｏｌ／Ｌ〜０．１ｍＭｏｌ／Ｌである。
【００３２】
細胞は培養開始時においては１×１０４〜６/ｃｍ２又は１×１０２〜６/ｍｌとなるように細胞培養容器に播種し、３７℃にてＣＯ２インキュベータ内で培養する。本発明の培養工程では、培養開始からはじめの培地交換まで３から１０日間培養することが好ましい。さらには、本発明の培養工程では、馴化培養を行うことが好ましい。一般的に、細胞培養の際は数日ごとに培地の全交換を行うが、馴化培養とは培地交換時に細胞の造った細胞自身を養う成分を保持させる培養法をいう。具体的には、馴化培養においては、培養に用いられている培地をすべて除いて新しい培地に取り替えるのではなく、あらかじめ新しい培地を添加してから、培地を全く除去しないか、培地全体の一部を除去して行うことにより培地を交換する。この際、新しい培地を添加した後に、しばらく培養を行ってから、一部除去を行ってもよいし、新しい培地の添加や培地の除去は複数回に分けて行ってもよい。また、このような培地交換は、培養開始後の始めての培養交換の際に行ってもよいし、また、２回目以後の培地交換の際に行ってもよいし、その両方で行ってもよい。
【００３３】
細胞培養の際の細胞培養容器としては、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレートなどが挙げられる。これらの容器は細胞との接着性を向上させるために、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン、ポリＬオルニチンなどの細胞支持用基質でコーティングされてもよい。逆に、細胞を非接着で培養させる場合、培養底面にｐｏｌｙＨＥＭＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ３９３２）でコーテングするか、ＨｙｄｒｏＣｅｌｌ（セルシード社）のような接着しない細胞培養容器を用いてもよい。
【００３４】
培養された細胞は、全てを回収して治療用細胞として用いてもよいが、培養後、酵素処理を施すことなく、浮遊する細胞のみを採取することにより、より神経幹細胞の割合の高い細胞群を得ることができる。
【００３５】
培養直後に細胞を用いられない場合は、乾燥、凍結、あるいは凍結乾燥することにより保存することができる。この際、培養された細胞の保存の生存率を挙げる保存成分は検討することができる。すなわち、種々の保存液に培養細胞を浸漬し、そのまま乾燥させ、３日間室温にて保存後４日目に水を加えて細胞を元の状態に戻し、その生死をＭＴＴ法で観察・測定して判定し、効果のある保存液成分を決定することができる。なお、本願発明者らは、特に、上記で得られた細胞を、３−Ｏ−ｍｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ並びにＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）阻害剤のＦａｓｕｄｉｌやＹ−２７６３２等を乾燥又は凍結乾燥又は凍結保存することにより、有効に保存できることを見出している。 
【００３６】
また、培養された細胞が神経幹細胞かどうかは特有マーカーによる免疫染色により観察することができる。また、本発明の培養工程で培養された細胞を神経系の細胞に分化させる条件で培養して神経細胞、Ａｓｔｒｏｃｙｔｅへ分化転換させ、Ｎｅｓｔｉｎ、ｂｅｔａＩＩＩ  ｔｕｂｌｉｎ、  ＧＦＡＰに対する抗体による免疫染色で観察できる。この分化転換がなされれば神経幹細胞が存在していることが証明される。
【００３７】
（神経系疾患）
本発明の神経系疾患は、神経の異常あるいは損傷が原因となる疾患をいい、その例としては、脊髄損傷、多発性硬化症、脳梗塞、頭部外傷、アルツハイマー病を含む認知症、パーキンソン病等の中枢神経疾患、Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ（膠芽腫）などの脳腫瘍を挙げることができる。
【００３８】
（投与方法）
本発明の方法で得られる神経系疾患を治療するための細胞は、神経系の疾患を持つ患者の患部にＭＲＩ造影による脳内直接投与、あるいは、血管に点滴による静脈注射して、あるいは第四脳室等の実質脳組織外の脳内注入、あるいは腰椎穿刺法による脊髄内投与により投与することができる。
（スクリーニング方法）
本発明の方法で得られる神経系疾患を治療するための細胞は、神経系の疾患の治療に用いるための薬剤のスクリーニングに用いることができる。すなわち、本発明の方法で得られる細胞の培養中に、薬剤候補のライブラリーなどを投与し、細胞の増殖を促進あるいは、減退させるもの、あるいは特定の効果を示すものを、神経系の疾患の治療薬の候補とすることができる。
【実施例】
【００３９】
実施例の理解のために本実施例で採用された手順を図１に示す。
【実施例１】
【００４０】
（組織の採取）  
６３歳女性の美容整形手術時に顔部から切除廃棄された約１ｃｍ２のヒト皮膚組織の全層部分を用いて、毛根が存在する箇所を残して皮下及び真皮結合組織を可及的に滅菌した鋏とピンセットで除去し、更に鋏で１〜２×１０ｍｍ２程度に短冊状に細切して細切組織を得た。得られた細切組織をペニシリン１０００ｕ/ｍｌ及びストレプトマイシン１ｍｇ/ｍｌを含むＣａイオン及びＭｇイオン不含等張燐酸緩衝液（ＰＢＳ（−））に３回浸漬して除菌した。以下の操作は全て無菌状態で行われた。
【００４１】
（酵素溶液浸漬工程１）
次いで予め４℃に冷却したデスパーゼ溶液（２５ｕ／ｍｌ  Ｄｉｓｐａｓｅ／ＰＢＳ（−））２０ｍｌ中に浸漬し、４℃に維持して一晩静置し、採取組織の酵素処理を行った。
【００４２】
（酵素溶液浸漬工程２）
酵素処理後の組織を遠心分離してデスパーゼ溶液を除いた後、直ちにＴｒｙｐＺｅａｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、  １×（Ｓｉｇｍａ社製）をＰＢＳ（−）にて５倍希釈し、１０μＭ Ｙ２７６３２を入れた１０ｍｌの溶液中に入れ、３７℃下に２０分間置いた。
【００４３】
（阻害剤溶液浸漬工程）
酵素剤処理後、直ちに１０ｍｌの０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｓｏｙ  ｂｅａｎ  ／ＰＢＳ（−）を加え攪拌して酵素反応を阻害した。この混合溶液をポアサイズ１００μｍのメッシュで濾過して未消化組織を除き、得られた濾過溶液を遠心分離（１０００  ｒｐｍ、  ５分）して溶液を除き、ペレット状態で細胞を得、これを第一細胞とし、一部を採取し細胞数を計測した。その数は７×１０５であった。
【００４４】
（残渣酵素溶液浸漬工程）
メッシュ上に残った残渣組織を直ちに２０ｍｌの０．５％  コラゲナーゼ/ ２．５ｍＭＣａＣｌ２／Ｍｅｄｉｕｍに入れ、磁気回転子の入ったビーカーに移す。このビーカーを反転装置付きのスターラー上に乗せ低速で反転を繰り返しながら室温下で攪拌させる。時々組織の消化状態を観察し、完全に組織が見えなくなったら終了させる。約２時間で組織は見えなくなった。この溶液をポアサイズ１００μｍのメッシュで濾過して未消化組織を除き、得られた濾過溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分）して溶液を除き、ペレット状態で細胞を得、これを第ニ細胞とし、一部を採取し細胞数を計測した。その数は１×１０７であり、第一細胞の約１０倍の細胞が得られた。
【００４５】
（培養工程）
培養皿として細胞培養用皿（１００ｍｍ）とＰｒｉｍａｒｉａ（６ウェルプレート）（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製）とＨｙｄｒｏＣｅｌｌ（６ウェルプレート）（セルシード社製）を用い、また、培地として下記の組成の細胞培養培地を１００ｍｍ培養用皿には１０ｍｌを用い６ウェルプレートには２．５ｍｌ／ウェルを用い、上記の阻害剤溶液浸漬工程で得られた細胞と残渣酵素溶液浸漬工程で得られた細胞とを混合しを約１×１０５／ｃｍ２の密度で播種して３７℃でＣＯ２インキュベータ中で培養した。
細胞培養培地は以下のとおり調製された。すなわち、基本培地のＭＣＤＢ１５３培地（Ｓｉｇｍａ社製商品名：Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標） Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）中に、インシュリン（１０ｍｇ/Ｌ）、トランスフェリン（５．５ｍｇ／Ｌ）、セレニウム（６．７μｇ／Ｌ）、エタノールアミン（２ｍｇ／Ｌ）、ビタミンＣ（Ｌ−Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｅｍｉｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｓａｌｔ）（５０μｇ/Ｌ）、ＫＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、脂質（脂肪酸混合物、アラキドン酸：２０μｇ／Ｌ; コレステロール：２．２ｍｇ／Ｌ; ＤＬ−ａ−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ−ａｃｅｔａｔｅ:７００μｇ／Ｌ;リノール酸：１００μｇ／Ｌ;  リノレン酸：１００μｇ／Ｌ；  ミリスチン酸：１００μｇ／Ｌ；オレイン酸:１００μｇ／Ｌ; パルミトレイン酸：１００μｇ／Ｌ；パルミチン酸：１００μｇ／Ｌ；ステアリン酸：１００μｇ／Ｌ；  Ｔｗｅｅｎ８０：２２ｍｇ／Ｌ；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８：１０００ ｍｇ／Ｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）、Ｂ−２７（−ＶＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加して調製した。
培養開始に際しては、７日目までは培地交換をすることなく１/３の割合で培地を添加しつつ馴化培養を行い、その後に３日毎に培地を半交換しながら培養を行った。この培地交換では、古い培地を遠心し、その半量を捨て、残った半量の培地と遠心でペレットとなった細胞を混ぜて新しい培地の入った培養皿に戻した。７０％コンフルエンスに達するまで１４日間を要した。
【００４６】
（培養された細胞の調製）
培養された細胞をＹ−２７６３２（１０μＭ）に３０分間接触後ＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、２ｍｌのＴｒｙｐＺｅａｎを加えて、室温３分間酵素処理を行い、その後直ちに２倍量のトリプシン阻害剤溶液（０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （Ｓｏｙ ｂｅａｎ）/ＭＣＤＢ１５３; Ｔｒｙｐｓｉｎの２．４倍モル濃度）４ｍｌを加えて酵素阻害をしてから、培養された細胞を細胞培養用皿からセルスクレーパーを用いて剥がした。
【実施例２】
【００４７】
（保存法の検討）
実施例１で培養された細胞を保存する方法を検討するため、一部を、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに継代培養した。細胞がコンフルエントに達して、接着した単層細胞の上にｓｐｈｅｒｅ細胞群が出現した。この時点で、ウェルプレートに培地を１００μｌ/ｗｅｌｌ加え、表１に記載する１から２４の各候補保存液（１は培地のみ）を１００μｌ/ｗｅｌｌ入れた。このプレートを室温で安全キャビネット中でフタを取り、安全キャビネットを送風状態にして４日間乾燥状態を続けた。４日目に滅菌蒸留水を１番ウェルに１００μｌ/ｗｅｌｌ入れ、他のウェルには２００μｌ/ｗｅｌｌ入れた。３０分後にＭＴＴ試薬を１２５μｌ/ｗｅｌｌ入れ、ＣＯ２インキュベータ中で４時間置いた。その染色性を位相差顕微鏡で観察すると、発色した細胞はｓｐｈｅｒｅ細胞群のみであることが明らかとなった。ウェル中の残存する液体をピペットで慎重に除き、そこにＳＤＳ−ＤＭＦ溶液を入れ一晩置き、形成された色素を溶解した。溶解液の５７０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。その結果、８と１４の保存液を用いたもので、ＭＴＴ反応により生存が確認された（図２）。したがって、３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅが保存に有効に用いられることが分った。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
（培養された細胞の保存など）
上記のとおり調製された細胞を遠心管に集めて遠心し、ペレットを治療用細胞とした。ペレットはそのまま又は凍結若しくは凍結乾燥して治療用細胞として用いることができる。凍結保存はセル・リザーバー１（フナコシ）のような無血清保存液を用いて、その中にＹ−２７６３２（１０μＭ）と３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ（０．３Ｍ）を入れて凍結保存することが望ましい。
【実施例３】
【００５０】
（Ｎｅｓｔｉｎ発現細胞の同定）
上記で得られた細胞中の神経幹細胞の有無を同定するために、Ｎｅｓｔｉｎの発現を、抗体染色によって観察した。詳細には、次のとおり行った。すなわち、２枚の培養皿の上記固定細胞の固定液を除去後、０．３％過酸化水素水/４０％メタノール液に一晩浸漬して内因性のペルオキシダーゼをブロッキングした。次に１％ ＢＳＡ/ＰＢＳ（−）液で１０分間３回、細胞を洗浄した。洗浄後、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００/１％ＢＳＡ/１０％ＦＣＳ/ＰＢＳ（−）液に室温で４５分間、細胞を浸漬して細胞膜に穴を開けた。再度、１％ ＢＳＡ/ＰＢＳ（−）液で１０分間３回、細胞を洗浄した後、１次抗体として、抗Ｈｕｍａｎ Ｎｅｓｔｉｎモノクロナール・マウス抗体（Ｒ＆Ｄ）を１％ＢＳＡ/１０％ＦＣＳ/ＰＢＳ（−）液で希釈したもので浸漬し、一晩４℃で保存した。もう１枚の培養皿は抗体を入れない１％ＢＳＡ/１０％ＦＣＳ/ＰＢＳ（−）液で同様に処理した。以下工程からは両培養皿の処理法は同様に行った。１次抗体処理後、１％ ＢＳＡ/ＰＢＳ（−）液で５分間３回、細胞を洗浄した。次に抗マウスＩｇＧビオチン化抗体の希釈液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ: Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ ｋｉｔ）で室温で暗所に１時間浸漬した。次に１％ ＢＳＡ/ＰＢＳ（−）液で５分間３回、細胞を洗浄した後、ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ: Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ ｋｉｔ）に１時間浸漬した。次に水で１０倍希釈したＰＢＳ（−）液に１０分浸漬した。次に直前に調製したＤＡＢ溶液（Ｓｉｇｍａ社製）を細胞に浸漬し、直ちに位相差顕微鏡下で反応の進行を観察した。約３分後充分反応が進んだので流水にて反応を停止させた。以上の結果、１次抗体を加えなかったｗｅｌｌの細胞は全て陰性を示したが、１次抗体を加えた培養皿上の細胞は陽性を示した。図３にＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ｎｅｓｔｉｎ抗体染色した結果を示す。Ｎｅｓｔｉｎは神経幹細胞を染色する。この結果、ほとんどの細胞がＮｅｓｔｉｎ陽性を示し、得られた細胞のうち、神経幹細胞の割合が非常に高いことがわかった。
【実施例４】
【００５１】
（神経系細胞への誘導）
実施例３で検出された細胞が、さらなる培養で神経細胞に誘導されることの確認を行った。この実験ではＨｕｍａｎ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ ＳＣ０１１）を用いて行った。まず、実施例１で培養された細胞をポリ−Ｌ−オルニチンとフィブロネクチンの両者でコートされた１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに２．４×１０５/ｗｅｌｌ播種した。播種から２日後に培地交換し、更に３日後に培地をＭａｉｎｔｅｎａｎｃｅ培地とＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ培地に切り替えた。翌日にはＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ培地のみ細胞に神経様の軸索状のものが出現した。誘導培地に切り替えて２日後にはＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ培地の細胞の増殖が激しくなったので、翌日の３日後に４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅで固定して培養を停止した。それぞれのｗｅｌｌに対して、Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ培地使用ｗｅｌｌでは抗ヒトＮｅｓｔｉｎ抗体（図４中Ａ４、Ｂ１）で、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ培地使用ｗｅｌｌでは抗ヒトＧｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）抗体（Ｂ２、Ｃ１）と抗Ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｅｔａ−ＩＩＩ Ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（Ｂ３、Ｃ３）で免疫染色を行った。その結果、ｗｅｌｌの全ての細胞が陽性に染色された。特にＧＦＡＰ陽性が非常に強く染色された（Ｂ２、Ｃ１）。なお、図４中、Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＢ４のウェルについては、抗体を加えない対照である。
この結果は、培養細胞のほぼ１００％が３日間でＭａｉｎｔｅｎａｎｃｅ培地中でＮｅｓｔｉｎ陽性を示し、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ培地中で同様の日数でＮｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｅｔａ−ＩＩＩ Ｔｕｂｕｌｉｎ陽性の神経細胞（Ｎｅｕｒｏｎ）とＧＦＡＰ陽性の星状膠細胞（Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）に分化していた。染色性からＡｓｔｒｏｃｙｔｅに最も多く分化していたと考えられる。以上の結果から、上記で得られる細胞は神経系細胞に分化できることが示された。
【実施例５】
【００５２】
（ラット脊髄損傷モデルへの培養細胞移植による治療有効性の検証）
６０歳と７５歳のヒトより形成手術で得られた剰余皮膚を実施例１と同じ方法で培養して細胞を得た。６０歳のヒトの皮膚から得られた細胞は継代２代目を７５歳のヒトから得られた細胞は継代１代目を移植用に用いた。細胞を培養皿から剥離するには、酵素Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＧＩＢＣＯ Ａ１１１０５）を用いた。各細胞とも１００ｍｍ 培養皿１枚を合計２枚の細胞を混合して、その一部を錘で脊髄損傷を作製し免疫抑制剤を投与されたラットに損傷後１週間後に、脊髄損傷部位に１×１０５細胞を含む２０ｕｌの培養液を注入移植した。対照群のラットには同量の培養培地のみを移植するｓｈａｍ ｏｐｅｒａｔｉｏｎを行った。細胞移植群は５匹、対照群は４匹のラットを実験に用いた。精髄損傷の治療効果は動物の動きをビデオ装置で観察して点数化するＢＢＢ Ｓｃｏｒｅ法で測定した。結果を図５に示す。図中、横軸は移植後の日数、縦軸はＢＢＢ  Ｓｃｏｒｅを示す。実線は上記細胞を移植した結果、点線は対照の結果を示し、＊はＳｔｕｄｅｎｔ  Ｔ  ｔｅｓｔによる有意差検定の結果Ｐ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１であることを示す。投与後３日から対照群に比較して細胞移植群はＢＢＢ ｓｃｏｒｅで２点差の付く統計的に有意な効果（Ｐ＜０．０５）を示した。移植後３５日を過ぎると、対照群に比較して細胞移植群はＢＢＢ ｓｃｏｒｅで４点差の付く統計的に有意な効果（Ｐ＜０．００１）を示した。非特許文献２３によれば骨髄間質細胞による移植では有意差が出るまで２週間かかっており、これに比べ劇的に早く、３日での効果が見られた。しかも非特許文献２３では骨髄間質細胞移植では４週間経過しても、有意差はＰ＜０．０５であるが、本発明の細胞は同時期にＰ＜０．００１とより優位であった。この結果は本発明で得られる細胞が神経系疾患の治療に非常に効果的であることを示している。
【実施例６】
【００５３】
（安全性の評価）
動物及び試験方法
実験にはＮＯＤ／Ｓｈｉ‐ｓｃｉｄ，ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ（登録商標）系統のマウス（６週齢、メス、公益財団法人  実験動物中央研究所）を用いた。１週間の馴化期間の後、汎用群分けシステム（株式会社ヴィジョンズ）を用いて、可能な限り体重の平均値が等しくなるようにして３群に群分けした。それぞれの群のマウスの右側腹部に、実施例１と同じ方法で培養した細胞（細胞Ａとする）、陰性対照物質としての培養液、陽性対照細胞としてのＨｅＬａ  Ｓ３（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）をそれぞれシリンジ（マイジェクター（登録商標）、針仕様：２７Ｇ）により移植（いずれも０．２ｍＬ/個体）した。それぞれの群を細胞Ａ群（１０個体）、培養液群（１０個体）、ＨｅＬａ  Ｓ３群（５個体）とする。なお、細胞Ａは、実施例１と同じ方法で培養した細胞を３系統用意し、α‐ＭＥＭ培地にそれぞれ１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで懸濁し、空気を含まないように２ｍｌのクライオチューブに分注した。分注のおよそ３時間後、α‐ＭＥＭ培地を除いて培養培地液で再懸濁し、３系統を等量の細胞数ずつ混合して５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液を調製し、移植まで４℃にて保存し、調整開始後２時間以内に移植を行った。なお、直前に計測した３系統を混合した検体の移植後の生存率は７５％であった。
それぞれの群のマウスは、「公益財団法人実験動物中央研究所・本所における動物実験の実施基準」及び「公益財団法人実験動物中央研究所・本所における実験動物の飼育管理に関する作業基準」に準拠して移植から１３週飼育し、一般状態観察、体重測定及び結節の観察・サイズ測定を週１回行った。結節を観察する際は、被験物質移植部位を指で触診し、硬い感触のある場合に結節の形成が確認されたものとし、長径（Ｌ）と短径（Ｗ）をノギスで測定した。結節体積（Ｖ）は「ヌードマウスと抗癌剤評価」（野村達次、櫻井欽夫、稲葉實  編著、蟹書房、１９９１年６月） の腫瘍体積簡易計算式を用い、計算式Ｖ＝ＬＷ２／２で算出した（単位は長径と短径はｍｍ、体積はｍｍ３）。なお、ＨｅＬａ  Ｓ３群の個体は、観察期間中に結節重量（比重を１として体積より計算）が体重の１／１０を超えたことが確認されたため、第５週〜第８週の時点で人道的エンドポイントとして観察を終了し安楽死処分した。培養液群及び細胞Ａ群は第１３週をもって予定観察期間を終了し安楽死処分した。
安楽死処分の際、マウスはイソフルラン麻酔下で全放血により安楽死させ、胸腔内、腹腔内諸臓器を観察した。また移植部位皮膚を皮下組織を含めて採材し、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定した。ホルマリン固定標本は常法にてパラフィン包埋後薄切しＨＥ染色、抗ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ）免疫染色を行い、光学顕微鏡で観察した。
【００５４】
結果
結節の形成率を図６に示す。ＨｅＬａ  Ｓ３群においては、移植後３週で１００％（５／５例）の個体に結節の形成が認められたが、培養液群及び細胞Ａ群では観察終了時まで結節の形成は認められなかった。ＨｅＬａ  Ｓ３群で形成された結節の体積を図７に示す。結節は全て、安楽死処分するまで連続して体積増加を示した。
体重測定の結果を表２に示す。培養液群と細胞Ａ群の間に差はなかった。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
剖検時に観察された所見を表３に示す。ＨｅＬａ  Ｓ３群では全例で移植部位皮下に結節の形成が認められた。培養液群及び細胞Ａ群では、移植部位皮下に加え胸腔内及び腹腔内諸臓器に結節形成等の腫瘍化を示唆する所見は認められなかった。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
各群ＨＥ染色標本及び抗ＨＬＡ免疫染色標本の観察結果を、それぞれ表４、表５に示す。また、代表的な写真を図８に示す。なお、図中、濃いグラデーションで表されているのがヘマトキシリンで染色された部分、薄いグラデーションで表されているのがエオシンで染色された部分である。ＨｅＬａ  Ｓ３群の移植部位に形成された結節はＨＥ染色標本において低分化型癌の組織像を示し、かつ抗ＨＬＡ反応陽性であった。培養液群の移植部位皮下組織は、ＨＥ染色標本において著変は認められず、抗ＨＬＡ反応は陰性であった。細胞Ａ群の移植部位皮下組織では、６／１０例にＨＥ染色標本で線維増殖が認められた。当該例の隣接切片において、同部位に抗ＨＬＡ反応を示す細胞が観察された。
【００５９】
【表４】
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【００６０】
【表５】
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【００６１】
考察
ＨｅＬａ  Ｓ３群の全例で結節が形成された。この結節は連続した体積増加を示し低分化型癌の組織像と共に抗ＨＬＡ反応陽性を示したため、移植ＨｅＬａ  Ｓ３細胞に由来する腫瘍であると判断された。
細胞Ａ群では病理組織検査により６／１０例に抗ＨＬＡ反応陽性を示す繊維増殖が確認され、移植細胞が残存したものと判断された。しかし、全観察期間を通じて全例で結節の形成は認められず、病理組織検査におけるＨＥ染色像において過形成変化あるいは腫瘍性変化を示す所見は認められなかった。この結果は、本試験の条件下では細胞Ａは造腫瘍性を示さないことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図３】
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【図４】
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【図８】
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