(57)【要約】      （修正有）【課題】セルラーゼを使用してセルロース系バイオマスを糖化する工程を含むエタノールの製造方法において、セルロース系バイオマスを効率良く利用する方法の提供。【解決手段】β−グルコシダーゼ遺伝子、キシロース代謝関連遺伝子としてキシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子及び高浸透圧応答７（HOR7）遺伝子の発現制御領域により発現制御されるかたちで導入されたβ−キシロシダーゼ遺伝子がゲノムに導入された組換え酵母、および、該組換え酵母をセルラーゼ製剤を含むセルロース及び/又はヘミセルロース含有培地に培養する工程と、上記セルロース及び/又はヘミセルロース含有培地からエタノールを回収する工程とを含むエタノールの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−グルコシダーゼ遺伝子、キシロース代謝関連遺伝子及びβ−キシロシダーゼ遺伝子がゲノムに導入された組換え酵母。
【請求項２】
上記β−キシロシダーゼ遺伝子は、Aspergillus oryzae由来のβ−キシロシダーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
【請求項３】
上記β−グルコシダーゼ遺伝子及びβ−キシロシダーゼ遺伝子は、細胞表層提示型遺伝子として導入されたことを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
【請求項４】
上記キシロース代謝関連遺伝子は、キシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
【請求項５】
高次倍体の酵母を宿主として上記遺伝子を導入したことを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
【請求項６】
上記β−キシロシダーゼ遺伝子は、高浸透圧応答７（HOR7）遺伝子の発現制御領域により発現制御されるかたちで導入されたことを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか一項記載の組換え酵母を、セルラーゼ製剤を含むセルロース及び/又はヘミセルロース含有培地に培養する工程と、上記セルロース及び/又はヘミセルロース含有培地からエタノールを回収する工程とを含むエタノールの製造方法。
【請求項８】
上記セルロース及び/又はヘミセルロース含有培地は、セルロース系バイオマスを由来のセルロースを更に含有することを特徴とする請求項７記載のエタノールの製造方法。
【請求項９】
上記培養する工程は、セルロース及び/又はヘミセルロースの糖化とエタノール発酵とを行う工程であることを特徴とする請求項７記載のエタノールの製造方法。
【請求項１０】
上記培養する工程は、エタノール発酵の至適温度範囲で実施することを特徴とする請求項７記載のエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定の遺伝子を導入した組換え酵母及び当該組換え酵母を利用したエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロース系バイオマスは、エタノール等の有用なアルコールや有機酸の原料として有効に利用されている。セルロース系バイオマスを利用したエタノール製造において、エタノール生産量を向上させるため、基質として５単糖のキシロースを利用できる酵母が開発されている（特許文献１及び２）
一方、セルロース系バイオマスを利用したエタノール製造において、糖化と同時にエタノール発酵を行うことで、エタノールの生産効率を向上できる。例えば、エタノール発酵を担う酵母に対して、糖化関連酵素を付与する技術が知られている（特許文献３、４及び非特許文献１）。
【０００３】
セルロース系バイオマスを利用したエタノール製造では、エタノール生産量や生産効率を向上させるため、上述した酵母の使用と同時に、セルラーゼ製剤等の酵素製剤をセルロース系バイオマスを含む培地に添加するといった手法が考えられている。しかしながら、上述した酵母を使用してセルロース系バイオマスからエタノールを製造する場合、セルラーゼ製剤等の酵素製剤を添加しても、エタノール生産量を向上させることができなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０００−５０９９８８号公報
【特許文献２】特表２００８−５０６３８３号公報
【特許文献３】特開２００８−１９３９３５号公報
【特許文献４】特開２０１０−０３５５５６号公報
【非特許文献１】S. Katahira et al., Appl. Environ. Microbiol. Sept. 2004, p. 5407-5414
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、特に、セルラーゼ製剤を使用してセルロース系バイオマスを糖化する工程を含むエタノールの製造方法において、セルロース系バイオマスを効率良く利用することができる組換え酵母及び当該組換え酵母を利用したエタノールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、セルラーゼ製剤を使用してセルロース系バイオマスを糖化する工程を含むエタノールの製造方法において、セルラーゼ製剤に含まれるキシロシダーゼ活性が微弱であること、これに起因して糖化が十分に進行しないことを明らかにした。また、本発明者らは、キシロース代謝関連遺伝子とβ−グルコシダーゼ遺伝子を導入した酵母と比較して、当該酵母に更にβ−キシロシダーゼ遺伝子を導入した場合には、セルロース系バイオマスの糖化を促進し、エタノールの生産性が大幅に向上することを見いだし本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は以下を包含する。
【０００８】
（１）β−グルコシダーゼ遺伝子、キシロース代謝関連遺伝子及びβ−キシロシダーゼ遺伝子がゲノムに導入された組換え酵母。
（２）上記β−キシロシダーゼ遺伝子は、Aspergillus oryzae由来のβ−キシロシダーゼ遺伝子であることを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
【０００９】
（３）上記β−グルコシダーゼ遺伝子及びβ−キシロシダーゼ遺伝子は、細胞表層提示型遺伝子として導入されたことを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（４）上記キシロース代謝関連遺伝子は、キシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子であることを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
【００１０】
（５）高次倍体の酵母を宿主として上記遺伝子を導入したことを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（６）上記β−キシロシダーゼ遺伝子は、高浸透圧応答７（HOR7）遺伝子の発現制御領域により発現制御されるかたちで導入されたことを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
【００１１】
（７）（１）〜（６）いずれかに記載の組換え酵母を、セルラーゼ製剤を含むセルロース及び/又はヘミセルロース含有培地に培養する工程と、上記セルロース及び/又はヘミセルロース含有培地からエタノールを回収する工程とを含むエタノールの製造方法。
（８）上記セルロース及び/又はヘミセルロース含有培地は、セルロース系バイオマスを由来のセルロースを更に含有することを特徴とする（７）記載のエタノールの製造方法。
【００１２】
（９）上記培養する工程は、セルロース及び/又はヘミセルロースの糖化とエタノール発酵とを行う工程であることを特徴とする（７）記載のエタノールの製造方法。
（１０）上記培養する工程は、エタノール発酵の至適温度範囲で実施することを特徴とする（７）記載のエタノールの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る組換え酵母は、キシロオリゴ糖を加水分解してキシロースとする活性と、キシロースを資化してエタノールとする活性を有する。このため、本発明に係る組換え酵母を利用することで、セルラーゼ製剤によるセルロース及び/又はヘミセルロースの糖化を促進することができ、エタノールの生産性を大幅に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】pHPDC1-xylAfAG、pHHOR7-xylAfAG及びpHTDH2-xylAfAGを作製する工程を示す図である。
【図２】TX1株について、キシロオリゴ糖の分解特性を示す特性図である。
【図３】TX3410株について、キシロオリゴ糖の分解特性を示す特性図である。
【図４】TX3411株について、キシロオリゴ糖の分解特性を示す特性図である。
【図５】TX3412株について、キシロオリゴ糖の分解特性を示す特性図である。
【図６】TX1株、TX3410株、TX3411株及びTX3412株のエタノール生産性を示す特性図である。
【図７】TX3411株、OC2-HUT株、OC2-XR-XDH-HK株及びTX1株についてPNPG活性を測定した結果を示す特性図である。
【図８】TX3411株、OC2-HUT株、OC2-XR-XDH-HK株及びTX1株を培養し、エタノールの生産量を経時的に測定した結果を示す特性図である。
【図９】TX3411株、OC2-HUT株、OC2-XR-XDH-HK株及びTX1株を、酵素使用量等を変更して培養し、エタノールの生産量を経時的に測定した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。
＜組換え酵母＞
本発明に係る組換え酵母は、β−グルコシダーゼ遺伝子、キシロース代謝関連遺伝子及びβ−キシロシダーゼ遺伝子がゲノムに導入されている。これらβ−グルコシダーゼ遺伝子、キシロース代謝関連遺伝子及びβ−キシロシダーゼ遺伝子が発現することにより、本発明に係る組換え酵母は、β−グルコシダーゼ活性、キシロース代謝活性及びβ−キシロシダーゼ活性を有することとなる。
【００１６】
ここでβ−グルコシダーゼ活性とは、糖のβ-グリコシド結合を加水分解する反応を触媒する活性を意味する。すなわち、β−グルコシダーゼは、セロビオース等のセロオリゴ糖をグルコースに分解することができる。また、キシロース代謝活性とは、詳細を後述するが、キシロースを資化して、宿主となる酵母が本来的に有するエタノール発酵の代謝経路を利用してエタノールを生成する活性を意味する。さらに、β−キシロシダーゼ活性とは、キシロビオース等のキシロオリゴ糖を加水分解してキシロースとする反応を触媒する活性を意味する。
【００１７】
これらβ−グルコシダーゼ遺伝子、キシロース代謝関連遺伝子及びβ−キシロシダーゼ遺伝子のうち、β−グルコシダーゼ遺伝子及びβ−キシロシダーゼ遺伝子は、それぞれ細胞表層提示型遺伝子として導入されることが好ましい。ここで、細胞表層提示型遺伝子とは、当該遺伝子がコードするタンパク質が細胞の表層にディスプレイされるように発現するように改変された遺伝子である。例えば、細胞表層提示型β−グルコシダーゼ遺伝子とは、β−グルコシダーゼ遺伝子と細胞表層局在タンパク質遺伝子とを融合した遺伝子である。細胞表層局在タンパク質とは、酵母の細胞表層に固定され、細胞表層に存在するタンパク質をいう。例えば、凝集性タンパク質であるα-またはａ-アグルチニン、ＦＬＯタンパク質などが挙げられる。一般に細胞表層局在タンパク質は、N末端側に分泌シグナル配列及びC末端側にGPIアンカー付着認識シグナルを有している。分泌シグナルを有する点では分泌性タンパク質と共通しているが、細胞表層局在タンパク質はGPIアンカーを介して細胞膜に固定されて輸送される点が分泌性タンパク質と異なる。細胞表層局在タンパク質は、細胞膜通過の際、GPIアンカー付着認識シグナル配列が選択的に切断され、新たに突出したC末端部分でGPIアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼC（PI-PLC）によりGPIアンカーの根元部分が切断される。ついで、細胞膜から切り離されたタンパク質は細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に局在する（例えば、特開２００６−１７４７６７号公報参照）。
【００１８】
β−グルコシダーゼ遺伝子
β−グルコシダーゼ遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、Aspergillus aculeatus由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子（Murai et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:4857-4861）を挙げることができる。その他にも、β−グルコシダーゼ遺伝子としては、Aspergillus oryzae由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子、Clostridium cellulovorans由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子及びSaccharomycopsis fibligera由来のβ−グルコシダーゼ遺伝子等を利用することができる。
【００１９】
キシロース代謝関連遺伝子
キシロース代謝関連遺伝子とは、キシロースをキシリトールに変換するキシロースリダクターゼをコードするキシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロースをリン酸化してキシルロース5-リン酸を生成するキシルロキナーゼをコードするキシルロキナーゼ遺伝子を含む意味である。なお、キシルロキナーゼにより生成されたキシルロース5-リン酸は、ペントースリン酸経路に入り代謝されることとなる。
【００２０】
酵母ゲノムに導入されるキシロース代謝関連遺伝子としては、特に限定されないが、Pichia stipitis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、Saccharomyces cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子を挙げることができる（Eliasson A. et al., Appl. Environ. Microbiol, 66:3381-3386及びToivari MN et al., Metab. Eng.3:236-249参照）。その他にも、キシロースリダクターゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子を利用することができる。キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を利用することができる。キシルロキナーゼ遺伝子としては、Pichia stipitis由来のキシルロキナーゼ遺伝子を利用することもできる。なお、ストレプトマイセスムリナスクラスター由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子等を利用することもできる。
【００２１】
β−キシロシダーゼ遺伝子
β−キシロシダーゼ遺伝子は、キシロオリゴ糖を加水分解してキシロースとする反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。β−キシロシダーゼ遺伝子としては、特に限定されず、如何なる生物種由来の遺伝子であっても使用することができる。
【００２２】
特に、β−キシロシダーゼ遺伝子としては、Aspergillus oryzae由来のxylA遺伝子、Aspergillus nidulans由来のxlnD遺伝子、Aspergillus niger由来のxlnD遺伝子、Trichoderma reesei由来のbxlI遺伝子等を使用することができる。
【００２３】
一例として、Aspergillus oryzae由来のxylA遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号１に示し、xylA遺伝子によりコードされるβ−キシロシダーゼのアミノ酸配列を配列番号２に示す。なお、本発明においてβ−キシロシダーゼ遺伝子としては、配列番号１の塩基配列を有するものに限定されず、配列番号２のアミノ酸配列に対して80%以上の類似性、好ましくは90%以上の類似性、より好ましくは95%以上の類似性を有するアミノ酸配列を有し、β−キシロシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を使用してもよい。ここで、塩基配列間の類似性は、FASTAやBLASTといった相同性検索ソフトウェアをデフォルトの設定で算出することができる。
【００２４】
また、所定のタンパク質がβ−キシロシダーゼ活性を有するか否かは、キシロビオース等のキシロオリゴ糖を含む反応溶液に当該タンパク質を添加し、キシロースの生成量を測定することで評価できる。
【００２５】
組換え酵母の作製
上述したβ−グルコシダーゼ遺伝子、キシロース代謝関連遺伝子及びβ−キシロシダーゼ遺伝子を宿主となる酵母ゲノムに導入することにより、本発明に係る組換え酵母を作製することができる。
【００２６】
上述した遺伝子を導入する際には、各遺伝子をそれぞれ多コピーで導入することが好ましい。各遺伝子をそれぞれ多コピーで導入する方法としては、特に限定されないが、例えば、複数の選抜マーカーを有する酵母のホモタリック性を利用した方法を適用することができる。特開２００９−３４０３６号公報において、ホモタリック性を有する酵母を利用して、簡便にゲノムへの多コピー遺伝子導入が可能となるといった技術を開示した。例えば、特開２００９−３４０３６号公報で開示された方法及び形質転換用酵母を利用することで、上述した各遺伝子を多コピーで導入することができる。
【００２７】
ホモタリック性を有する酵母とは、ホモタリックな酵母と同義である。ホモタリック性を有する酵母としては、特に限定されず、如何なる酵母をも使用することができる。ホモタリック性を有する酵母としては、Saccharomyces cerevisiae OC-2株（NBRC2260）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。その他にもホモタリック性を有する酵母としては、アルコール酵母（台研396号、NBRC0216）（出典：「アルコール酵母の諸特性」酒研会報、No37、p18-22(1998.8)）、ブラジルと沖縄で分離したエタノール生産酵母（出典：「ブラジルと沖縄で分離したSaccharomyces cerevisiae野生株の遺伝学的性質」日本農芸化学会誌、Vol.65、No.4、p759-762(1991.4)）及び180（出典「アルコール発酵力の強い酵母のスクリーニング」日本醸造協会誌、Vol.82、No.6、p439-443(1987.6)）を挙げることができる。また、ヘテロタリックな表現型を示す酵母においても、HO遺伝子を発現可能に導入することによってホモタリック性を有する酵母として使用することができる。すなわち、本発明において、ホモタリック性を有する酵母とは、HO遺伝子を発現可能に導入された酵母も含む意味である。
【００２８】
なかでも、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、従来ワイン醸造の場面で利用されてきた安全性を確認されている菌株であるため好ましい。また、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、後述する実施例で示したように、高糖濃度の条件下におけるプロモーター活性が優れた菌株であるため好ましい。特にSaccharomyces cerevisiae OC-2株は、高糖濃度条件においてピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーター活性が優れているため好ましい。
【００２９】
また、導入する遺伝子のプロモーターとしては、特に限定されないが、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（HOR7）のプロモーターなどが利用可能である。なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターが下流の目的遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。
【００３０】
すなわち、上述した遺伝子は、発現を制御するプロモーターやその他の発現制御領域とともに、ホモタリック性を有する酵母のゲノムに導入してもよい。または、上述した遺伝子若しくはその細胞表層提示型遺伝子は、ホモタリック性を有する酵母のゲノムに本来的に存在する遺伝子のプロモーターやその他の発現制御領域により発現制御されるように導入してもよい。特に、ホモタリック性を有する酵母における高浸透圧応答７（HOR7）遺伝子のプロモーターを含む発現制御領域の下流に、すなわち、当該発現制御領域により発現制御されるように上述した遺伝子を導入することが好ましい。
【００３１】
また、上述した遺伝子を導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
【００３２】
なお、細胞表層型β−グルコシダーゼ遺伝子及び細胞表層型β−キシロシダーゼ遺伝子についても、上述した材料及び方法を適用して酵母ゲノムに導入することができる。細胞表層型遺伝子を導入した酵母は、いわゆるアーミング酵母である。アーミング酵母とは、細胞表層局在タンパク質と種々の機能性タンパク質（酵素・抗原・抗体・レポータータンパク質など）やペプチドを融合させ、細胞表層にディスプレイさせることにより、通常の酵母では有していない新しい機能を有する、あるいは元来有している機能を増強した酵母細胞のことをいう。また、細胞表層とは、細胞膜・細胞壁ならびにその間の空間であるペリプラズムのことであり、これらの層を利用し上記の様な要件を満たす酵母細胞をアーミング酵母という。すなわち、細胞表層型にβ−グルコシダーゼ及びβ−キシロシダーゼを提示する酵母は、アーミング酵母の創製について詳述された公開特許公報（特開平11-290078、ＷＯ02/085935）基づいて創製することができる。
【００３３】
＜エタノール製造＞
以上で説明した組換え酵母は、β−キシロシダーゼ遺伝子（好ましくは細胞表層提示型β−キシロシダーゼ遺伝子）を導入しているため、β−キシロシダーゼ活性を示すことができる。すなわち、当該組換え酵母は、培地に含まれるキシロビオース等のキシロオリゴ糖を加水分解してキシロースを生成することができる。また、当該組換え酵母は、キシロース代謝関連遺伝子を導入しているため、キシロースを資化してエタノールを生成することができる。したがって、当該組換え酵母は、培地に含まれるキシロオリゴ糖からキシロースを生成するとともに、培地に含まれるキシロース及び生成したキシロースを資化してエタノールを生成することができる。
【００３４】
当該組換え酵母は、上述のようにキシロース生成能とエタノール生成能を有するため、セルロース及び/又はヘミセルロースを含有する培地を使用した、いわゆる同時糖化発酵処理に利用することが好ましい。ここで、同時糖化発酵処理とは、セルロース系バイオマスを糖化する工程とエタノール発酵工程とを区別せずに同時に実施する処理を意味する。なお、同時糖化発酵処理に先立って、セルロース系バイオマスに対して従来公知の前処理を施しても良い。前処理としては、特に限定されないが、例えば、リグニンを微生物によって分解する処理や、セルロース系バイオマスの粉砕処理等を挙げることができる。
【００３５】
糖化方法としては、特に限定されないが、セルラーゼやヘミセルラーゼ等のセルラーゼ製剤を利用する酵素法等を挙げることができる。セルラーゼ製剤は、セルロース鎖及びヘミセルロース鎖の分解に関与する複数の酵素を含んでおり、エンドグルカナーゼ活性、エンドキシラナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、グルコシダーゼ活性及びキシロシダーゼ活性等の複数の活性を示す。セルラーゼ製剤としては、特に限定されないが、例えば、Trichoderma reeseiや、Acremonium cellulolyticusなどが生産するセルラーゼを挙げることができる。セルラーゼ製剤としては、市販されているものを使用しても良い。
【００３６】
同時糖化発酵処理では、セルロース系バイオマス（前処理後であってもよい）を含む培地にセルラーゼ製剤と上述した組換え微生物とを加え、所定の温度範囲で当該組換え酵母を培養する。培養温度としては特に限定されないが、エタノール発酵の効率を考慮して25〜45℃とすることができ、30〜40℃とすることが好ましい。また、培養液のpHを4〜6とすることが好ましい。また、培養に際して、攪拌や振とうしてもよい。
【００３７】
後述の実施例に示すように、同時糖化発酵処理に使用するセルラーゼ製剤は、セルロース鎖及びヘミセルロース鎖の分解に関与する複数の酵素活性のうちβ−キシロシダーゼ活性が低い。β−キシロシダーゼの反応至適温度は約70℃であるため、培養温度近傍ではその酵素活性が約1/3程度に低下することが報告されている。すなわち、従来、セルラーゼ製剤を用いて同時糖化発酵処理を行う場合、セロビオース等のキシロオリゴ糖の加水分解が不十分であり、キシランやヘミセルロースを十分にキシロースとしてエタノール発酵に利用できていなかった。しかしながら、本発明において、上述した組換え酵母を使用しているため、セルラーゼ製剤による糖化、特にキシロースの生成量を向上させることができる。その結果、上述した組換え酵母を利用した同時糖化発酵処理では、より多くのキシロースを利用することができエタノールの生産性が向上することとなる。
【００３８】
本発明に係る組換え酵母を利用したエタノールの製造方法では、同時糖化発酵処理の後、培地からエタノールを回収する。エタノールの回収方法は、特に限定されず、従来公知のいかなる方法も適用することができる。例えば、上述したエタノール発酵が終了した後、固液分離操作によってエタノールを含む液層と、組換え酵母や固形成分を含有する固層とを分離する。その後、液層に含まれるエタノールを蒸留法によって分離・精製することで、純度の高いエタノールを回収することができる。なお、エタノールの精製度は、エタノールの使用目的にあわせて適宜調整することができる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
本実施例では、Saccharomyces cerevisiae OC-2株にヒスチジン要求性、ウラシル要求性及びトリプトファン要求性を付与したOC2-HUT株を使用した。このOC2-HUT株の作製方法については、特開２０１０−０３５５５６号公報に詳述されている。本実施例では、このOC2-HUT株に対して、２コピーの細胞表層提示型β−グルコシダーゼ遺伝子、２コピーのキシロース代謝関連遺伝子及び２コピーの細胞表層提示型β−キシロシダーゼ遺伝子を導入した。
【００４０】
＜プラスミドの作製＞
細胞表層提示型β−グルコシダーゼ遺伝子を導入する際には、pABGL-PDC1P（HIS3マーカー）を制限酵素AscIで線状化したプラスミドを使用した。プラスミドpABGL-PDC1Pについては、特開２０１０−０３５５５６号公報に詳述されている。
【００４１】
キシロース代謝関連遺伝子を導入する際には、pIUX1X2Xk(URA3マーカー)を制限酵素NcoIで線状化したプラスミドを使用した。プラスミドpIUX1X2Xkについては、S. Katahira et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 72: 1136-1143に開示されており、キシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子がそれぞれGAPDHプロモーターの制御下に発現可能に導入されたプラスミドである。
【００４２】
また、本実施例では、細胞表層提示型β−キシロシダーゼ遺伝子を導入する際に使用する、プロモーターの異なる３種類のプラスミド（pHPDC1-xylAfAG、pHHOR7-xylAfAG及びpHTDH2-xylAfAG）を作製した。これらプラスミドの作製手順を図１に示す。
【００４３】
先ず、S. Katahira et al., Appl. Environ. Microbiol. Sept. 2004, p. 5407-5414に開示されたpCUSxylAfを鋳型とし、一対のプライマーBssHII-EcoRI-NotI_GLAss_fw及びBssHII_3'AGterm_rvを用いたPCRにより、シグナルペプチド（図中「s.s」）と、Aspergillus oryzae由来のβ−キシロシダーゼ遺伝子（XylA）と、FLAGタグと、3'-half α-agglutininとをこの順で含む3893bpのDNA断片を増幅した。得られたDNA断片とStratagene社製のpRS403とをそれぞれBssHIIで処理し、その後、これらを連結することで、プラスミドpRS403-xylAfAGを作製した。
【００４４】
一方、S. cerevisiae YPH449株のゲノムDNAを鋳型とし、一対のプライマーEcoRI_PDC1_fw及びNotI_PDC1_rvを用いたPCRにより、PDC1プロモーターを含む約650bpのDNA断片を増幅した。同様に、一対のプライマーEcoRI_HOR7_fw及びNotI_HOR7_rvを用いたPCRにより、HOR7プロモーターを含む約1000bpのDNA断片を増幅した。同様に、一対のプライマーEcoRI_TDH2_fw及びNotI_TDH2_rvを用いたPCRにより、HOR7プロモーターを含む約1000bpのDNA断片を増幅した。
【００４５】
これらプロモーターを含む３種類のDNA断片を、それぞれEcoRI及びNotIで処理した。得られた３種のDNA断片を、EcoRI及びNotIで処理したプラスミドpRS403-xylAfAGにそれぞれライゲーションし、３種類のプラスミドpHPDC1-xylAfAG、pHHOR7-xylAfAG及びpHTDH2-xylAfAGを作製した。
なお、以下に本実施例で使用したプライマーの塩基配列を示した。
【００４６】
【表１】
2012065604.tif 000002
【００４７】
＜形質転換＞
まず、AscI処理したプラスミドpABGL-PDC1PをOC2-HUT株に形質転換し、SD＋ウラシル＋ヒスチジンプレートで選択した。得られた形質転換株は染色体の片側にプラスミド断片が導入されているため胞子形成後トリプトファン原栄養株を分離することでpABGL-PDC1Pが2コピー導入された組換え株を作製した。
【００４８】
次に、NcoI処理したプラスミドpIUX1X2Xkを上記組換え株に形質転換した。形質転換にはFrozen-EZ Yeast Transformation II(Zymo Research社)を使用した。選択プレートはSDプレートを用い、形質転換により得られたコロニーをSD＋ヒスチジンプレートで選択した。同様に胞子形成後、ウラシル原栄養株を分離することで上記組換え株にpIUX1X2XKが2コピー導入された組換え株を作製した。
【００４９】
最後に、NdeIで線状化したpHPDC1-xylAfAG、pHHOR7-xylAfAG又はpHTDH2-xylAfAGを上記株に形質転換した。そして、同様に、ヒスチジン原栄養株を取得した。こうしてOC2-HUT株を宿主として2コピーのpABGL-PDC1P及び2コピーのpIUX1X2XKが導入され、更に2コピーのpHPDC1-xylAfAGが導入されたTX3410株、2コピーのpHHOR7-xylAfAGが導入されたTX3411株及び2コピーのpHTDH2-xylAfAGが導入されたTX3412株を作製した。
【００５０】
〔実施例２〕
本実施例では、実施例１で作製したTX3410株、TX3411株及びTX3412株並びに比較のためのTX1株について、キシロオリゴ糖の分解特性を評価した。
【００５１】
試験は以下のように行った。20％（w/w）のキシロオリゴ糖95p（サントリー社製）、1%（w/w）のyeast extract及び2%（w/w）のbacto peptoneを含む培養液に、菌体濃度がOD660=4となるように各株を接種した。なお、培養液は60mlとし、100mlのフラスコ容器を使用した。培養温度を37℃とし、150rpmで振盪しながら培養を行った。
【００５２】
反応開始時、反応開始から6時間、24時間、30時間及び48時間後の培養液に含まれるエタノール、キシロース、キシロビオース及びキシロトリオースの濃度を測定した。
【００５３】
比較のためのTX1株を用いた試験の結果を図２に示す。図２から判るように、培養開始から24時間程度で培地に含まれるキシロースを完全に消費しており、エタノールの生産量も増加していない。これはTX1株にはβ−キシロシダーゼ活性がないため、キシロビオースやキシロトリオースをキシロースへ分解できないことを示している。
【００５４】
また、TX3410株、TX3411株及びTX3412株を用いた試験の結果を、それぞれ図３、４及び５に示す。図３乃至５に示すように、培養開始から４８時間を経過しても培地中のキシロビオース及びキシロトリオースは減少し、キシロースは増加していることが判る。これは、TX3410株、TX3411株及びTX3412株に導入された細胞表層提示型β−キシロシダーゼ遺伝子が機能し、これらTX3410株、TX3411株及びTX3412株がβ−キシロシダーゼ活性を有することを示している。また、図３乃至５から判るように、TX3410株、TX3411株及びTX3412株を用いた場合は、TX1株を用いた場合と比較してエタノールの生産量も大幅に向上している。これは、TX3410株、TX3411株及びTX3412株に導入されたキシロース代謝関連遺伝子が機能しており、上述したβ−キシロシダーゼ活性により生産されたキシロースがエタノール発酵に利用されていることを示している。
【００５５】
さらに、図３乃至５に示した結果を比較すると、図５に示したTX3411株を使用した場合にエタノールの生産量が最も優れることが判る。すなわち、細胞表層提示型β−キシロシダーゼ遺伝子の発現を制御するプロモーターとしては、HOR7プロモーターを使用することが好ましい。HOR7プロモーターを使用することで、細胞表層提示型β−キシロシダーゼ遺伝子をより高発現でき、エタノール生産性を向上させることができる。なお、図２乃至５に示した結果から、TX1株、TX3410株、TX3411株及びTX3412株のエタノール生産性についてまとめて比較した結果を図６に示した。
【００５６】
〔実施例３〕
本実施例では、TX3411株を代表例として使用し、セルロース系バイオマスの同時糖化発酵のモデル系におけるPNPG活性を検討した。なおPNPG活性は、β-グルコシダーゼ活性の指標である。すなわち、β-グルコシダーゼがPNPGを基質としてp-nitrophenolとD-glucoseを生成するので、p-nitrophenol量を測定することでβ-グルコシダーゼ活性を検証することができる。なお、PNPG活性は、下記の条件で１分間に１マイクロモルのp-nitrophenolを生成する酵素量を１Uと定義した。
【００５７】
測定に使用する試薬は下記の通りである。
・0.1M 酢酸緩衝液 pH5.0（25℃）
・20mM PNPG水溶液（603ｍｇのPNPGを100ｍｌの蒸留水に溶解）
・0.2M Na2CO3溶液（21.2gの無水炭酸ナトリウムを蒸留水1lに溶解）
測定の手順は、先ず試験管に反応混液（1.0mlの0.1M酢酸緩衝液及び0.5mlのPNPG水溶液）を調整し、37℃で約５分間予備加温した。次に、希釈した培養液を0.5ml加え、反応を開始した。次に、37℃で正確に15分間反応させた後、Na2CO3溶液2mlを加え、反応を停止した。次に、反応液における400nm吸光度を測定した。盲検は反応液を37℃で15分間放置後、Na2CO3溶液2mlを加えて混和し、次いで酵素溶液0.5ｍｌを加えて調整した。
【００５８】
なお、本実施例では、TX3411株と比較するため、OC2-HUT株、OC2-HUT株にプラスミドpIUX1X2Xkのみを導入したOC2-XR-XDH-HK株及びTX1株についても同様にPNPG活性を測定した。本実施例では、培地組成：4%(w/w)のKCフロック、4%(w/w)のBirchwood xylan、1%(w/w)のyeast extract、2%(w/w)のbacto peptone(w/w) 及び3%(w/w)のセルラーゼ製剤（NS50013）の培地を使用した。菌体濃度がOD660=6となるように各株を接種した。なお、培養液は30mlとし、100mlのフラスコ容器を使用した。培養温度を37℃とし、80rpmで振盪しながら培養を行った。
【００５９】
反応開始時、反応開始から6時間、24時間、30時間及び48時間後の培養液についてPNPG活性を測定した。その結果を図７に示す。図７から判るように、細胞表層提示型β−グルコシダーゼ遺伝子を導入したTX1株及びTX3411株は、培養開始から経時的にPNPG活性が高くなっている。これに対して、β−グルコシダーゼ遺伝子を有しないOC2-HUT株及びOC2-XR-XDH-HK株においては、僅かなPNPG活性しか検出されなかった。これらOC2-HUT株及びOC2-XR-XDH-HK株を培養した際に検出されたPNPG活性は、培地に添加されたセルラーゼ製剤によるものと考えられる。TX3411株は、TX1株のPNPG活性よりは低いものの、セルラーゼ製剤によるβ−グルコシダーゼ活性と比較すると約４倍のPNPG活性を有しており、優れたβ−グルコシダーゼ活性を示すことが明らかとなった。したがって、TX3411株のみならず、実施例１で作製したTX3410株及びTX3412株についても、同時糖化発酵に適した特性を有することが示された。
【００６０】
〔実施例４〕
本実施例では、TX3411株を代表例として使用し、セルロース系バイオマスの同時糖化発酵のモデル系におけるエタノール生産量を検討した。なお、本実施例では、実施例４に記載した条件で、TX3411株、OC2-HUT株、OC2-XR-XDH-HK株及びTX1株を培養し、エタノールの生産量を経時的に測定した。結果を図８に示す。
【００６１】
図８から判るように、TX3411株は、セルロース系バイオマスの同時糖化発酵のモデル系においてもTX1株よりも約20％高いエタノール生産性を達成することができた。すなわち、細胞表層提示型β−キシロシダーゼを導入することで、実際の同時糖化発酵処理においてもエタノール生産性を向上できることが明らかとなった。なお、OC2-HUT株を使用した場合、培養液にセルラーゼ製剤を含有しているにも拘わらず、殆どエタノールを生産することができなかった。これは、セルラーゼ製剤は、その至適温度である50℃を大きく下回る温度（37℃）ではセルラーゼ活性が顕著に低下するためであると考えられる。よって、実際の同時糖化発酵処理では、セルラーゼ製剤に加えてβ−キシロシダーゼ遺伝子及びβ−グルコシダーゼ遺伝子を導入したキシロース資化性を有する組換え酵母を利用することが好ましいと言える。
【００６２】
一方、OC2-XR-XDH-HK株を使用した場合、培養開始から48時間で0.41％のエタノールが生産されていた。これは、OC2-HUT株に導入されたキシロース代謝関連遺伝子によりキシロースからのエタノール生産が可能になったことを示している。TX3411株を使用した場合、培養開始から48時間で0.75％のエタノールが生産されていたことから、OC2-HUT株に対してキシロース代謝関連遺伝子のみを導入した場合と比較して、細胞表層提示型β−キシロシダーゼ遺伝子と細胞表層提示型β−グルコシダーゼ遺伝子を更に導入することで、エタノール生産量が82％向上したこととなる。
【００６３】
〔実施例５〕
本実施例では、TX3411株を代表例として使用し、セルロース系バイオマスの同時糖化発酵のモデル系における酵素使用量低減効果を酵素使用量とエタノール生産量に基づいて検討した。なお、本実施例では、比較のためにOC2-HUT株、OC2-XR-XDH-HK株及びTX1株についても酵素使用量とエタノール生産量との関係を計算した。
【００６４】
本実施例では、酵素使用量を下記表のように変更した以外は実施例４に記載した培地及び培養条件でTX3411株、OC2-HUT株、OC2-XR-XDH-HK株及びTX1株した。また、経時的にエタノールの生産量を測定した。
【００６５】
【表２】
2012065604.tif 000003
【００６６】
表２に示した試験区１〜７について経時的にエタノールの生産量を測定した結果を図９に示す。また、培養開始から48時間経過した時点におけるエタノールの生産量を測定し、単位生成エタノールあたりの酵素使用量を計算した結果を表３に示す。
【００６７】
【表３】
2012065604.tif 000004
【００６８】
図９及び表３から判るように、TX3411株を用いた場合（試験区５〜７）は、他の試験区と比較して酵素使用量を低減できることが明らかとなった。特にOC2-XR-XDH-HK株を使用した場合（試験区３）と比較すると、試験区６では酵素使用量を約60%以上削減できることが判る。本実施例で示したTX3411株のみならず、実施例１で作製したTX3410株及びTX3412株についても、同時糖化発酵に際して酵素量を低減させることができ、低コストに同時糖化発酵処理に使用できることが示された。
【図１】
2012065604.tif 000005
【図２】
2012065604.tif 000006
【図３】
2012065604.tif 000007
【図４】
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【図５】
2012065604.tif 000009
【図６】
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【図７】
2012065604.tif 000011
【図８】
2012065604.tif 000012
【図９】
2012065604.tif 000013
【配列表】
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