(57)【要約】【課題】リガンド固定領域を除いた領域にアナライトが吸着してしまうことを確実に防止し、高感度に蛍光検出を行うことのできる表面プラズモン励起増強蛍光測定装置および表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体を提供すること。【解決手段】表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体であって、前記センサ構造体は、誘電体部材と、前記誘電体部材の上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上に形成されたリガンド固定領域と、前記誘電体部材上の前記リガンド固定領域を除いた領域に形成された非特異吸着防止層と、を備えたセンサ部材と、前記センサ部材上に固定され、前記リガンド固定領域上および前記非特異吸着防止層上を試料溶液が流通可能となるように構成された流路構成部材と、を少なくとも備えて成る。【選択図】図１
2012251863.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘電体部材の上面に形成された金属薄膜に、前記誘電体部材側から全反射条件となる入射角で励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させることにより、前記金属薄膜上に形成されたリガンド固定領域の蛍光物質を励起させ、これにより増強された蛍光を光検出手段にて検出するようにした表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体であって、
前記センサ構造体は、
前記誘電体部材と、前記誘電体部材の上に形成された前記金属薄膜と、前記金属薄膜上に形成された前記リガンド固定領域と、前記誘電体部材上の前記リガンド固定領域を除いた領域に形成された非特異吸着防止層と、を備えたセンサ部材と、
前記センサ部材上に固定され、前記リガンド固定領域上および前記非特異吸着防止層上を試料溶液が流通可能となるように構成された流路構成部材と、
を少なくとも備えて成ることを特徴とするセンサ構造体。
【請求項２】
前記リガンド固定領域は、前記金属薄膜上に区画形成され、
前記非特異吸着防止層は、前記金属薄膜上の前記リガンド固定領域を除いた領域に形成されていることを特徴とする請求項１に記載のセンサ構造体。
【請求項３】
前記非特異吸着防止層が、
励起された蛍光物質が生ずる蛍光と同じ波長の光を遮光することのできる遮光機能付き非特異吸着防止層であることを特徴とする請求項１または２に記載のセンサ構造体。
【請求項４】
前記非特異吸着防止層と前記誘電体部材との間に、励起された蛍光物質が生ずる蛍光と同じ波長の光を遮光する遮光層を備えることを特徴とする請求項１に記載のセンサ構造体。
【請求項５】
前記非特異吸着防止層と前記金属薄膜との間に、励起された蛍光物質が生ずる蛍光と同じ波長の光を遮光する遮光層を備えることを特徴とする請求項２に記載のセンサ構造体。
【請求項６】
前記遮光層が、前記金属薄膜と同じ材質から成ることを特徴とする請求項５に記載のセンサ構造体。
【請求項７】
前記リガンド固定領域の直下に位置する前記金属薄膜の上面から前記非特異吸着防止層の上面までの高さが、１〜２００μｍの範囲内であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のセンサ構造体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のセンサ構造体を配設してなることを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づいた表面プラズモン励起増強蛍光測定装置およびこの表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づき、例えば生体内の極微少なアナライトの検出が行われている。
表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）は、光源より照射したレーザ光（励起光）が金属薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ；attenuated total reflectance）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、光源より照射したレーザ光（励起光）が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やし（表面プラズモンの電場増強効果）、これにより金属薄膜近傍の蛍光物質を効率良く励起させ、この励起された蛍光を検出することで極微量および／または極低濃度のアナライトを検出するようにしたものである。
【０００３】
近年、このような表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づいた表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（以下、ＳＰＦＳ装置ともいう）の開発が進められており、例えば特許文献１や特許文献２などにその技術開示がなされている。
【０００４】
このようなＳＰＦＳ装置２００は、図８に示したように、まず誘電体部材１０２の上面に金属薄膜１０４が形成されており、さらにこの金属薄膜１０４上にリガンド固定領域１０６を有するセンサ部材１０８と、このセンサ部材１０８の上に固定され、リガンド固定領域１０６と、金属薄膜１０４上のリガンド固定領域１０６を除いた領域との上を、試料溶液が流通可能となる流路１１０を構成する流路構成部材１１２と、から成るセンサ構造体１００を備えている。
【０００５】
そして、センサ構造体１００の誘電体部材１０２側には、金属薄膜１０４に向かって励起光１１４を照射する光源１１６と、光源１１６から照射され金属薄膜１０４で反射した反射光１１８を受光する受光手段１２０が設けられている。
【０００６】
一方、センサ構造体１００の流路構成部材１１２側には、リガンド固定領域１０６で捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光１２２を受光する光検出手段１２４が設けられている。
【０００７】
なお、流路構成部材１１２と光検出手段１２４との間には、蛍光１２２を効率よく集めるための集光部材１２６と、蛍光１２２以外に含まれる光を除去し、必要な蛍光１２２のみを選択する波長選択機能部材１２８が設けられている。
【０００８】
そして、ＳＰＦＳ装置２００の使用においては、まず金属薄膜１０４上のリガンド固定領域１０６にリガンドを固定しておき、流路１１０内に目的となるアナライトを含有してなる試料溶液を流入させてリガンドにアナライトを捕捉させ、さらに捕捉されたアナライトを蛍光物質で標識する。
【０００９】
そしてこの状態で、光源１１６より誘電体部材１０２に励起光１１４を照射し、この励起光１１４が共鳴角θ１で金属薄膜１０４に入射することで、金属薄膜１０４上に粗密波（表面プラズモン）を生じさせる。
【００１０】
なお、金属薄膜１０４上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光１１４と金属薄膜１０４中の電子振動とがカップリングし、反射光１１８の光量減少が生ずるため、受光手段１２０で受光される反射光１１８のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ、粗密波（表面プラズモン）が生ずる共鳴角θ１を得ることができる。
【００１１】
この粗密波（表面プラズモン）を生ずる現象により、金属薄膜１０４上のリガンド固定領域１０６の蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光１２２の光量が増大することとなる。
【００１２】
この増大した蛍光１２２を、集光部材１２６および波長選択機能部材１２８を介して光検出手段１２４で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができるようになっている。
【００１３】
このようなＳＰＦＳ装置２００は、特に生体分子間などの微細な分子活動を観察するのに好適である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特許第３２９４６０５号公報
【特許文献２】特開２００６−２０８０６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ところで、上述したような従来のＳＰＦＳ装置２００では、流路１１０内に目的となるアナライトを含有してなる試料溶液を流入させてリガンド固定領域１０６のリガンドにアナライトを捕捉させる際において、アナライトがリガンド固定領域１０６を除いた領域、つまりリガンド固定領域１０６を除いた金属薄膜１０４上の領域に、ある程度吸着してしまう場合がある。
【００１６】
このようにリガンド固定領域１０６を除いた領域にアナライトが吸着してしまうと、検出感度が低下してしまうこととなる。例えばアナライトが極僅かで有る場合には、アナライトがリガンドで捕捉されず、蛍光検出がなされないおそれも有り、更なる検出精度向上が望まれている。
【００１７】
本発明はこのような現状に鑑みなされたものであって、リガンド固定領域を除いた領域にアナライトが吸着してしまうことを確実に防止し、高感度に蛍光検出を行うことのできる表面プラズモン励起増強蛍光測定装置および表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、前述したような従来技術における問題点を解決するために発明されたものであって、
本発明のセンサ構造体は、
誘電体部材の上面に形成された金属薄膜に、前記誘電体部材側から全反射条件となる入射角で励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させることにより、前記金属薄膜上に形成されたリガンド固定領域の蛍光物質を励起させ、これにより増強された蛍光を光検出手段にて検出するようにした表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体であって、
前記センサ構造体は、
前記誘電体部材と、前記誘電体部材の上に形成された前記金属薄膜と、前記金属薄膜上に形成された前記リガンド固定領域と、前記誘電体部材上の前記リガンド固定領域を除いた領域に形成された非特異吸着防止層と、を備えたセンサ部材と、
前記センサ部材上に固定され、前記リガンド固定領域上および前記非特異吸着防止層上を試料溶液が流通可能となるように構成された流路構成部材と、
を少なくとも備えて成ることを特徴とする。
【００１９】
このように非特異吸着防止層を有するセンサ構造体であれば、検出対象となるアナライトが含有された試料溶液を流路内に流入させた際に、リガンド固定領域を除いた領域にアナライトが誤って吸着してしまうことを確実に防止することができる。
したがって、アナライトをリガンド固定領域に集中させることができる。
【００２０】
また、本発明のセンサ構造体は、
前記リガンド固定領域は、前記金属薄膜上に区画形成され、
前記非特異吸着防止層は、前記金属薄膜上の前記リガンド固定領域を除いた領域に形成されていることを特徴とする。
【００２１】
このように金属薄膜上の一部にリガンド固定領域を形成し、金属薄膜上の残り部分又はその残り部分と固定化されたリガンドの周縁とを覆うように、リガンド固定領域を除いた領域の金属薄膜上に非特異吸着防止層を形成すれば、金属薄膜とリガンド固定領域とを精度よく位置合わせして形成する必要がなく、金属薄膜を誘電体部材上に形成する領域を制限する部材を特に用いなくても誘電体部材のほぼ全域にわたって簡易に金属薄膜を形成することもできる。
【００２２】
さらに、非特異吸着防止層として、例えばリガンド固定領域に対応する部分に貫通孔を備えたシート状部材を金属薄膜上に配置することで簡易にセンサ構造体を得ることもできる。
【００２３】
また、本発明のセンサ構造体は、
前記非特異吸着防止層が、
励起された蛍光物質が生ずる蛍光と同じ波長の光を遮光することのできる遮光機能付き非特異吸着防止層であることを特徴とする。
このように遮光機能付き非特異吸着防止層であれば、励起された蛍光物質が生ずる蛍光と同じ波長の誘電体部材などから生ずる自家蛍光を遮光することができる。
【００２４】
また、本発明のセンサ構造体は、
前記非特異吸着防止層と前記誘電体部材との間に、励起された蛍光物質が生ずる蛍光と同じ波長の光を遮光する遮光層を備えることを特徴とする。
【００２５】
或いは、本発明のセンサ構造体は、
前記非特異吸着防止層と前記金属薄膜との間に、励起された蛍光物質が生ずる蛍光と同じ波長の光を遮光する遮光層を備えることを特徴とする。
このように遮光層を設ければ、励起された蛍光物質が生ずる蛍光と同じ波長の誘電体部材などから生ずる自家蛍光を遮光することができる。
【００２６】
また、本発明のセンサ構造体は、
前記遮光層が、前記金属薄膜と同じ材質から成ることを特徴とする。
このように構成すれば、金属薄膜形成時に遮光層となる部分も同時に成膜させることができ、製造に要する工程を簡素化させることができる。
【００２７】
また、本発明のセンサ構造体は、
前記リガンド固定領域の直下に位置する前記金属薄膜の上面から前記非特異吸着防止層の上面までの高さが、１〜２００μｍの範囲内であることを特徴とする。
【００２８】
このような高さの範囲内とすれば、リガンド固定領域にアナライトを含有する試料溶液を流入させた際に、非特異吸着防止層上からリガンド固定領域との間に段差を生じても、試料溶液を流路内で確実に混合させることができ、リガンドにアナライトを確実に捕捉させることができる。
【００２９】
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置は、
上記いずれかに記載のセンサ構造体を配設してなることを特徴とする。
このようなセンサ構造体を用いれば、アナライトをリガンド固定領域に集中させてシグナルを向上させることができるので、高精度に蛍光検出を行うことができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、金属薄膜上のリガンド固定領域を除いた領域に非特異吸着防止層を設けたので、リガンド固定領域を除いた領域にアナライトが吸着してしまうことを確実に防止し、高感度に蛍光検出を行うことのできる表面プラズモン励起増強蛍光測定装置および表面プラズモン励起増強蛍光測定装置に用いられるセンサ構造体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本発明の実施形態１によるセンサ構造体を用いたＳＰＦＳ装置の概略図である。
【図２】図２は、本発明の実施形態１によるセンサ構造体の概略図である。
【図３】図３は、本発明の実施形態１によるセンサ構造体の概略図である。
【図４】図４は、本発明の実施形態２におけるセンサ構造体の概略図である。
【図５】図５は、本発明の実施形態２におけるセンサ構造体の概略図である。
【図６】図６は、本発明の実施形態２におけるセンサ構造体の概略図である。
【図７】図７は、本発明のセンサ構造体において流路構成部材の他の形態について説明するための概略図である。
【図８】図８は、従来のセンサ構造体を用いたＳＰＦＳ装置の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の実施形態について、図面に基づいてより詳細に説明する。
本発明の表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）は、リガンド固定領域に固定されたリガンドに捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を、確実に励起させて高感度に蛍光検出を行うものである。
【００３３】
また、本明細書中でいう「表面プラズモン」とは、広義の意味で用いられるものであって、「局在プラズモン」も含まれるものである。
さらに「リガンド固定領域を除いた領域」とは、金属薄膜上のリガンド固定領域を除いた領域の全て、およびリガンド固定領域を除いた領域の一部も含まれるものであり、「リガンド固定領域」と「リガンド固定領域を除いた領域」とは隣接しているものである。
【００３４】
＜ＳＰＦＳ装置１＞
図１に示したように本発明のＳＰＦＳ装置１は、誘電体部材１２と、誘電体部材１２の上面に形成された金属薄膜１４と、この金属薄膜１４上面に区画形成され、検出対象となるアナライトと特異的に吸着するリガンドを固定するためのリガンド固定領域１６と、さらに金属薄膜１４上のリガンド固定領域１６を除いた領域に形成された非特異吸着防止層１８と、を備えたセンサ部材２０を有している。
【００３５】
また、センサ部材２０上には、リガンド固定領域１６上およびリガンド固定領域１６を除いた領域の非特異吸着防止層１８上を試料溶液が流通可能とする流路２２を構成する流路構成部材２４が固定されており、センサ部材２０と流路構成部材２４とを合わせてセンサ構造体１０を構成している。
【００３６】
このようなセンサ構造体１０の金属薄膜１４の材質としては、好ましくは金，銀，アルミニウム，銅，および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなり、さらにこれら金属の合金からなることである。
【００３７】
このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ粗密波（表面プラズモン）による電場増強が大きくなることから金属薄膜１４に好適である。
また、金属薄膜１４の形成方法としては、例えばスパッタリング法，蒸着法（抵抗加熱蒸着法，電子線蒸着法等），電解メッキ，無電解メッキ法などが挙げられる。中でもスパッタリング法，蒸着法は、薄膜形成条件の調整が容易であるため好ましい。
【００３８】
さらに金属薄膜１４の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【００３９】
電場増強効果の観点からは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍの範囲内であることがより好ましい。
【００４０】
金属薄膜１４の厚さが上記範囲内であれば、粗密波（表面プラズモン）が発生し易く好適である。また、金属薄膜１４の大きさ（縦×横）は誘電体部材１２とリガンド固定領域１６との間に少なくとも形成されていれば特に限定されないものである。
【００４１】
なお、誘電体部材１２の上面の少なくとも一部に、誘電体部材１２の一端から他端までライン状に金属薄膜１４を形成することが、金属薄膜１４を一様な厚さで簡易に形成でき好ましい。
【００４２】
一方、誘電体部材１２としては、光学的に透明な各種の無機物，天然ポリマー，合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性，製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むことが好ましい。
【００４３】
また誘電体部材１２の形状は、図１に示したような断面略台形形状の六面体（截頭四角錐形状）に限定されるものではなく、例えば四角錐，円錐，三角錐，多角錐などの角錐形状、または截頭角錐形状などであっても良いものである。誘電体部材１２が截頭四角錐形状であれば、センサ構造体１０の高さを低く抑えることができ、ＳＰＦＳ装置１の小型化に寄与することができる。
【００４４】
さらに、センサ部材２０上に流路構成部材２４を固定する方法としては、誘電体部材１２と同じ光屈折率を有する接着剤,マッチングオイル，透明粘着シートなどを用いることが好ましい。
【００４５】
そして、センサ構造体１０の誘電体部材１２側には、誘電体部材１２内に入射され、金属薄膜１４に向かって励起光２６を照射する光源２８を備え、さらに光源２８から照射され金属薄膜１４に反射した反射光３０を受光する受光手段３２が備えられている。
【００４６】
光源２８から照射される励起光２６としてはレーザ光が好ましく、波長２００〜９００ｎｍ、０．００１〜１，０００ｍＷのＬＤレーザ、または波長２３０〜８００ｎｍ、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザが好適である。
【００４７】
一方、センサ構造体１０の流路構成部材２４側には、リガンド固定領域１６で生じた蛍光３４を受光する光検出手段３６が設けられている。
このような光検出手段３６としては、超高感度の光電子増倍管、または多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサを用いることが好ましい。
【００４８】
また、センサ構造体１０の流路構成部材２４と光検出手段３６との間に、光を効率よく集光するための集光部材３８と、光の内で蛍光３４のみを選択するように形成された波長選択機能部材４０が設けられている。
【００４９】
集光部材３８としては、蛍光シグナルを効率よく集光するものであれば、任意の集光系を用いることができる。簡易な集光系としては、顕微鏡などで使用されている市販の対物レンズを転用することができる。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【００５０】
一方、波長選択機能部材４０としては、光学フィルタ，カットフィルタなどを用いることができる。
光学フィルタとしては、減光（ＮＤ）フィルタ，ダイアフラムレンズなどが挙げられる。
【００５１】
さらにカットフィルタとしては、外光（装置外の照明光），励起光（励起光の透過成分），迷光（各所での励起光の散乱成分），プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、センサ構造体１０の面に付着した付着物などの影響で発生する散乱光），酵素蛍光基質の自家蛍光などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば干渉フィルタ，色フィルタなどが挙げられる。
【００５２】
このようにして構成されるＳＰＦＳ装置１は、その使用において、まずセンサ構造体１０の金属薄膜１４上のリガンド固定領域１６に検出対象となるアナライトと特異的に吸着するリガンドを固定しておき、この状態で検出対象となるアナライトを含有してなる試料溶液を流路２２内に流入させてリガンドにアナライトを捕捉させる。
【００５３】
ここでアナライト検出時に用いられる検体（アナライトを含有する溶液）としては、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液，唾液，便，体腔液（髄液，腹水，胸水等）などが挙げられる。
【００５４】
また、検体中に含有されるアナライトは、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー，シグナル伝達物質，ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【００５５】
リガンドにアナライトを捕捉させた後、さらに流路２２内を洗浄し、アナライトに捕捉される蛍光物質を含んだ溶液を流路２２内に流入させることにより、蛍光物質で標識されたアナライトがリガンドに捕捉された状態とする。
【００５６】
アナライトを標識する蛍光物質としては、所定の励起光２６を照射するか、または電界効果を利用することで励起し、蛍光３４を発する物質であれば特に限定されない。なお本明細書でいう蛍光３４とは、燐光など各種の発光も含まれるものである。
【００５７】
この状態で、光源２８より誘電体部材１２内に励起光２６を照射し、この励起光２６が特定の角度（共鳴角θａ）で金属薄膜１４に入射することで、金属薄膜１４上に粗密波（表面プラズモン）を生ずるようにすることができる。
【００５８】
なお、金属薄膜１４上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光２６と金属薄膜１４中の電子振動とがカップリングし、反射光３０のシグナルが変化（光量が減少）することとなるため、受光手段３２で受光される反射光３０のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ良い。
【００５９】
ここで共鳴角θａの調整のために、角度可変部（図示せず）や光検出手段３６に入力された情報を処理するためのコンピュータ（図示せず）などを有しても良い。
なお、角度可変部（図示せず）は、サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるために受光手段３２と光源２８とを同期し、４５〜８５°の角度変更を可能とし、分解能が０．０１°以上であることが好ましい。
【００６０】
そしてこの粗密波（表面プラズモン）により、金属薄膜１４上のリガンド固定領域１６の蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光３４の光量が増大し、この蛍光３４を、集光部材３８と波長選択機能部材４０を介して光検出手段３６で収集することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる。
【００６１】
このような構成を有する本発明のＳＰＦＳ装置１は、上記したセンサ構造体１０が、非特異吸着防止層１８を有しており、この点において特に特徴的である。
以下、このような非特異吸着防止層１８を有するセンサ構造体１０について詳細に説明する。
【００６２】
＜センサ構造体１０＞
［実施形態１］
図１および図２に示したように、本発明のセンサ構造体１０は、金属薄膜１４上に区画形成されたリガンド固定領域を除いた領域に、非特異吸着防止層１８が形成されている。
【００６３】
このような非特異吸着防止層１８としては、アナライトの非特異吸着を防止することが出来れば如何なるものであっても良く、例えば金属薄膜１４上のリガンド固定領域を除いた領域にテフロン（登録商標）テープを貼付したり、ＢＳＡやカゼインなどのタンパク質を含有した溶液や日油株式会社製の各種のリン脂質類似合成ポリマーを含んだ溶液を塗布して設けたりすることが好ましい。
【００６４】
なお、非特異吸着防止層１８が金属薄膜１４上に形成されると、非特異吸着防止層１８とリガンド固定領域１６との境界において段差が生じ、非特異吸着防止層１８とリガンド固定領域１６とで凹部４４が形成されてしまうこととなる。
【００６５】
このような段差による凹部４４は、流路２２内にアナライトを含有する試料溶液を流入させた際に、この段差により生ずる凹部４４内で試料溶液の流れが生じ難くなるおそれがあるため、本来であれば望ましくない。
【００６６】
しかしながら本発明者は、非特異吸着防止層１８を下記のような範囲で設定すれば、試料溶液の流れが凹部４４内でも確実に生じ、リガンド固定領域１６のリガンドに、確実にアナライトを捕捉させることができることを見出した。
【００６７】
すなわち、リガンド固定領域１６の直下に位置する金属薄膜１４の上面から非特異吸着防止層１８の上面までの高さＴ１を、好ましくは１〜２００μｍの範囲内、より好ましくは１〜１００μｍの範囲内、さらに好ましくは１〜５０μｍの範囲内に設定すれば、流路２２内にアナライトを含有した試料溶液を流入させた際に、非特異吸着防止層１８上からリガンド固定領域１６上までに段差を生じても、試料溶液が流路２２内で確実に混合され、リガンドにアナライトを確実に捕捉させることができる。
【００６８】
なお高さＴ１は、低ければ低いほど試料溶液の流路２２内での混合を、より確かなものとすることができるため、可能な限り低く設定することが好ましい。
また図中の符号Ｔ２は、流路２２の高さである。流路２２の高さＴ２は５０〜５００μｍの範囲内とすることが好ましい。さらに流路２２の幅は１〜３ｍｍの範囲内とすることが好ましい。
【００６９】
さらにアナライトを含有する試料溶液の流量は１〜５００００μｌ／ｍｉｎの範囲内、流速は５．５６×１０-5〜２．７８ｍ／ｓの範囲内とすることが好ましい。
このように設定することで、上記段差により生ずる凹部４４内においても試料溶液の流れが確実に生じ、リガンドにアナライトを確実に捕捉させることができる。
【００７０】
このようなセンサ構造体１０では、リガンド固定領域１６を除いた領域に非特異吸着防止層１８を有することで、アナライトがリガンド固定領域１６を除いた領域に吸着してしまうことを確実に防止することができる。
【００７１】
なお、非特異吸着防止層１８は、図２に示したセンサ構造体１０のように、リガンド固定領域１６を除いた領域の全面に形成されていても良いが、図３に示したセンサ構造体１０のように、部分的に形成されていても良いものである。本実施形態１においては、リガンド固定領域１６と非特異吸着防止層１８とが隣接しているとともに、リガンド固定領域１６を非特異吸着防止層１８が取り囲むようになっている。
【００７２】
このように、本発明のセンサ構造体１０によれば、金属薄膜１４上のリガンド固定領域を除いた領域に非特異吸着防止層１８を設けることにより、リガンド固定領域を除いた領域にアナライトが吸着してしまうことを確実に防止することができる。
【００７３】
したがって、ＳＰＦＳ装置１にこのようなセンサ構造体１０を用いれば、リガンド固定領域１６にアナライトを集中させ、高精度に蛍光検出を行うことができる。
【００７４】
［実施形態２］
図４〜図７に示したセンサ構造体は、図１〜図３に示したセンサ構造体と基本的には同様の構成であるので、同一の構成部材には同一の参照番号を付して、その詳細な説明を省略する。
【００７５】
図４〜図７に示したセンサ構造体１０は、金属薄膜１４上のリガンド固定領域１６を除く領域に非特異吸着防止層１８が形成されていることに加え、励起された蛍光物質が生ずる蛍光３４と同じ波長の光を遮光する遮光機能を備えている点で、上記した実施形態１と異なっている。
【００７６】
まず図４に示したセンサ構造体１０では、非特異吸着防止層１８が励起された蛍光物質が生ずる蛍光３４と同じ波長の光を遮光する遮光機能付き非特異吸着防止層１８ａとなっている。
【００７７】
通常の非特異吸着防止層１８との違いとしては、非特異吸着防止層１８の基材を、励起された蛍光物質が生ずる蛍光３４と同じ波長の光を遮光することのできる基材としている点である。
【００７８】
具体例としては、励起された蛍光物質が生ずる蛍光３４と同じ波長の光を遮光することができるよう色付けされたテフロン（登録商標）テープを用いることで、非特異吸着防止機能に加えて遮光機能も備えることができる。
【００７９】
また、非特異吸着防止層１８に遮光機能を備える別の方法として、遮光材が含有された非特異吸着防止層１８を用いても良い。
この場合には、例えば非特異吸着防止層１８の原材料中に予め遮光材を混入させておき、これを金属薄膜１４上に塗布して成膜するようにすれば良い。ここで遮光材としては、例えばカーボンブラック等の顔料や染料の他、金属微粒子などを用いることができる。
【００８０】
さらに非特異吸着防止層１８に遮光機能を備える別の方法として、図５に示したように非特異吸着防止層１８と金属薄膜１４との間に、励起された蛍光物質が生ずる蛍光３４と同じ波長の光を遮光する遮光層４２を備えるようにしても良い。
【００８１】
このような遮光層４２は、例えば金属材料を塗布することで形成することができる。
遮光層４２の材質としては、光透過性の低い金属被膜、例えばクロム，チタン，モリブデン，スズ，酸化鉄，酸化カドミウム，硫化カドミウムなど、反射率の高い膜材料、例えば銀，アルミニウム，ロジウム，及びそれらの合金などを用いることができる。
【００８２】
ここで遮光層４２の厚みとしては、５ｎｍ以上とすることが好ましい。
なお、遮光層４２を金属薄膜１４と同じ金属材料で形成しても良く、この場合には、図６に示したように金属薄膜１４の成膜の際に、リガンド固定領域１６を除いた領域の金属薄膜１４だけを部分的に厚く形成することで、リガンド固定領域１６を除いた領域の金属薄膜１４に遮光層４２としての機能を持たせるようにすることができる。
【００８３】
このように、本発明のセンサ構造体１０が、非特異吸着防止機能に加えて遮光機能を有していれば、リガンド固定領域１６にアナライトを集中させることができるとともに、励起された蛍光物質が生ずる蛍光と同じ波長の光を遮光することができ、これにより誘電体部材１２などから生ずる自家蛍光を遮光することができる。
【００８４】
したがって、実施形態２のセンサ構造体１０を用いて蛍光検出を行えば、リガンド固定領域１６にアナライトを集中させてシグナルを高めることができるとともに、ノイズを低減させることができるため、Ｓ／Ｎ比を向上させ、実施形態１のセンサ構造体を用いた場合よりもさらに高感度に蛍光検出を行うことができる。
【００８５】
以上、本発明のセンサ構造体１０およびこれを用いたＳＰＦＳ装置１について説明したが、本発明は上記の形態に限定されるものではなく、例えば図７に示したように流路構成部材２４を複数の部材２４ａ，２４ｂから構成しても良いなど、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能なものである。
【００８６】
例えば、遮光層４２は、励起された蛍光物質が生じる蛍光３４と同じ波長の光を遮光するように構成したが、それ以外の波長の光を遮光するように構成してもよく、少なくとも蛍光３４と同じ波長の光を遮光するように構成することが好ましい。
【００８７】
また、誘電体部材１２上に固定される流路構成部材２４は、必ずしも非特異吸着防止層１８上に固定される必要はなく、金属薄膜１４に対して接着固定されてもよく、また誘電体部材１２に対して接着固定されてもよい。各種溶液が流路２２から漏出することを簡単且つ確実に防止する上で、流路構成部材２４を非特異吸着防止層１８に対して接着固定することが特に好ましい。
【実施例】
【００８８】
［実施例１］
図２に示した本発明のセンサ構造体１０において、リガンド固定領域１６の直下に位置する金属薄膜１４の上面から非特異吸着防止層１８の上面までの高さＴ１を５０μｍとし、流路２２の高さＴ２を５０μｍとしたセンサ構造体１０を用意した。
【００８９】
また、図８に示した従来のセンサ構造体１００において、流路の高さを１００μｍとしたセンサ構造体１００を用意した。
２つのセンサ構造体のそれぞれの流路内に、流量３０００μｌ／ｍｉｎ、流速０．１６７ｍ／ｓでアナライトが含有された試料溶液を流入させ、さらにアナライトを蛍光物質で標識し、この状態でＳＰＦＳ装置による蛍光検出を行った際のアッセイシグナル（ｃｏｕｎｔ/ｓｅｃ）を、ＣＣＤイメージセンサを用いて測定した。
【００９０】
非特異吸着防止層１８を有する本発明のセンサ構造体１０では、アッセイシグナル（ｃｏｕｎｔ/ｓｅｃ）が５００，０００であるのに対し、非特異吸着防止層１８を有しない従来型のセンサ構造体１００では、アッセイシグナル（ｃｏｕｎｔ/ｓｅｃ）が２５０，０００であり、本発明のセンサ構造体１０を用いれば、アッセイシグナルを従来よりも向上させることができることが確認された。
【００９１】
［実施例２］
図２に示したセンサ構造体１０において、リガンド固定領域１６の直下に位置する金属薄膜１４の上面から非特異吸着防止層１８の上面までの高さＴ１を５０μｍとし流路２２の高さＴ２を１００μｍとしたもの、高さＴ１を１００μｍとし流路高さＴ２を１００μｍとしたもの、高さＴ１を２００μｍとし高さＴ２を１００μｍとしたもの、高さＴ１を２５０μｍとし高さＴ２を１００μｍとしたものの、合計４種類のセンサ構造体を用意した。
【００９２】
４種類のセンサ構造体のそれぞれの流路２２内にアナライトを含有した試料溶液を流入させ、非特異吸着防止層１８とリガンド固定領域１６との段差により形成された凹部４４内の試料溶液の流れが、高さＴ１の違いによって、どのように変化するか実験を行った。
【００９３】
なお、流路２２内に流入させた試料溶液は、流量３０００μｌ／ｍｉｎ、流速０．１６７ｍ／ｓとした。
高さＴ１を５０μｍとし高さＴ２を１００μｍとしたセンサ構造体１０では、非特異吸着防止層１８とリガンド固定領域１６とで形成された凹部４４内の試料溶液の流量が７５０μｌ／ｍｉｎであり、充分な反応を生ずるだけの流量が得られることが確認された。
【００９４】
次いで高さＴ１を１００μｍとし高さＴ２を１００μｍとしたセンサ構造体１０では、非特異吸着防止層１８とリガンド固定領域１６とで形成された凹部４４内の試料溶液の流量が４２９μｌ／ｍｉｎであり、充分な反応を生ずるだけの流量が得られることが確認された。
【００９５】
さらに高さＴ１を２００μｍとし高さＴ２を１００μｍとしたセンサ構造体１０では、非特異吸着防止層１８とリガンド固定領域１６とで形成された凹部４４内の試料溶液の流量が３００μｌ／ｍｉｎであり、充分とはいえないものの反応を生ずるだけの流量が得られることが確認された。
【００９６】
一方、高さＴ１を２００μｍを超えた高さ（例えば２５０μｍ以上）とし高さＴ２を５０μｍから５００μｍの間で幾つか振ってみたところ、非特異吸着防止層１８とリガンド固定領域１６とで形成された凹部４４内に試料溶液の一部が滞留することが時折見受けられる場合があった。
【００９７】
よって、リガンド固定領域１６の直下に位置する金属薄膜１４の上面から非特異吸着防止層１８の上面までの高さＴ１をせいぜい２００μｍ以下とすることが、反応を生ずる充分な流量が得られ、より高感度な蛍光検出を実現する上で好ましい。
【００９８】
［実施例３］
図４に示した、非特異吸着防止層１８が励起された蛍光物質が生ずる蛍光３４と同じ波長の光を遮光する遮光機能付き非特異吸着防止層１８ａとなっている本発明のセンサ構造体１０において、リガンド固定領域１６の直下に位置する金属薄膜１４の上面から非特異吸着防止層１８の上面までの高さＴ１を５０μｍとし、流路の高さＴ２を５０μｍとしたセンサ構造体１０を用意した。
【００９９】
また、図８に示した従来のセンサ構造体１００において、流路高さを１００μｍとしたセンサ構造体１００を用意した。
２つのセンサ構造体のそれぞれの流路内に、流量３０００μｌ／ｍｉｎ、流速０．１６７ｍ／ｓでアナライトが含有された試料溶液を流入させ、さらにアナライトを蛍光物質で標識し、ＳＰＦＳ装置による蛍光検出を行った際の光学ブランク（ノイズ）を調べた。
【０１００】
非特異吸着防止層１８および遮光機能を有する本発明のセンサ構造体１０では、光学ブランク（ｃｏｕｎｔ/ｓｅｃ）が６，０００であるのに対し、非特異吸着防止層１８および遮光機能を有しない従来のセンサ構造体１００では、光学ブランク（ｃｏｕｎｔ/ｓｅｃ）が１０，０００であり、本発明のセンサ構造体１０では、誘電体部材への入射光由来の自家蛍光を遮光して光学ブランクを低減させることができることが確認された。
【符号の説明】
【０１０１】
１・・・表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
１０・・・センサ構造体
１２・・・誘電体部材
１４・・・金属薄膜
１６・・・リガンド固定領域
１８・・・非特異吸着防止層
１８ａ・・遮光機能付き非特異吸着防止層
１８ｂ・・遮光材が含有された非特異吸着防止層
２０・・・センサ部材
２２・・・流路
２４・・・流路構成部材
２４ａ・・流路構成部材
２４ｂ・・流路構成部材
２６・・・励起光
２８・・・光源
３０・・・反射光
３２・・・受光手段
３４・・・蛍光
３６・・・光検出手段
３８・・・集光部材
４０・・・波長選択機能部材
４２・・・遮光層
４４・・・凹部
Ｔ１・・リガンド固定領域の直下に位置する金属薄膜の上面から非特異吸着防止層の上面までの高さ
Ｔ２・・流路の高さ
θａ・・共鳴角
１００・・・センサ構造体
１０２・・・誘電体部材
１０４・・・金属薄膜
１０６・・・リガンド固定領域
１０８・・・センサ部材
１１０・・・流路
１１２・・・流路構成部材
１１４・・・励起光
１１６・・・光源
１１８・・・反射光
１２０・・・受光手段
１２２・・・蛍光
１２４・・・光検出手段
１２６・・・集光部材
１２８・・・波長選択機能部材
２００・・・表面プラズモン励起増強蛍光測定装置（ＳＰＦＳ装置）
θ１・・共鳴角
【図１】
2012251863.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2012251863.tif 000007
【図６】
2012251863.tif 000008
【図７】
2012251863.tif 000009
【図８】
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