(57)【要約】【課題】フロー方式でありながら高速且つ高感度で、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質との反応を検出又は測定する方法及び装置を提供する。【解決手段】センサチップのセンサ面に沿って一方向に移動させた被験物質をセンサチップのセンサ面に沿って反対方向に移動させる工程を含む、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質との反応を検出又は測定する方法、及びセンサ面を有するセンサチップと  被験物質を前記センサ面に沿って一方向に移動させる移動手段と、を備え、前記移動手段は、前記センサチップのセンサ面に沿って一方向に移動させた被験物質を前記センサチップのセンサ面に沿って反対方向にも移動可能である、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質との反応を検出又は測定する装置。【選択図】図１
2012198045.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
センサチップのセンサ面に沿って一方向に移動させた被験物質をセンサチップのセンサ面に沿って反対方向に移動させる工程を含む、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質との反応を検出又は測定する方法。
【請求項２】
センサチップのセンサ面に沿って一方向に移動させた被験物質をセンサチップのセンサ面に沿って反対方向に移動させる工程を含む、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質との反応を促進させる方法。
【請求項３】
前記検出又は測定を表面プラズモン共鳴分析、水晶発振子マイクロバランス分析、干渉分光分析、電気化学分析、蛍光分析、又は酵素反応分析により行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記被験物質の移動を両方向で同じ速度で行う、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記工程をセンサチップのセンサ面に沿って送液した被験物質を含む溶液をセンサチップのセンサ面に沿って吸液することにより行う、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記被験物質を含む溶液の送液及び吸液を圧力駆動型ポンプ又は電気浸透流ポンプを用いて行う、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
センサ面を有するセンサチップと
被験物質を前記センサ面に沿って一方向に移動させる移動手段と、を備え、
前記移動手段は、前記センサチップのセンサ面に沿って一方向に移動させた被験物質を前記センサチップのセンサ面に沿って反対方向にも移動可能である、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質との反応を検出又は測定する装置。
【請求項８】
前記移動手段が被験物質を両方向で同じ速度で移動可能である、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記移動手段が被験物質を含む溶液を前記センサ面に沿って送液する手段である、請求項７又は８に記載の装置。
【請求項１０】
前記送液手段が圧力駆動型ポンプ又は電気浸透流ポンプである、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
表面プラズモン共鳴測定装置である、請求項７〜１０のいずれかに記載の装置。
【請求項１２】
水晶発振子マイクロバランス測定装置である、請求項７〜１０のいずれかに記載の装置。
【請求項１３】
干渉分光測定装置である、請求項７〜１０のいずれかに記載の装置。
【請求項１４】
電気化学測定装置である、請求項７〜１０のいずれかに記載の装置。
【請求項１５】
蛍光測定装置である、請求項７〜１０のいずれかに記載の装置。
【請求項１６】
酵素反応測定装置である、請求項７〜１０のいずれかに記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質との反応を高速且つ高感度に検出又は測定する方法及び装置に関する。また、本発明は、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質との反応を促進させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床診断の分野においては、腫瘍マーカーやサイトカイン等の微量な生体物質を高感度 且つ迅速に検出する分析技術が求められている。そのような分子間相互作用検出に用いられる方法としては、ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)、FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy)等の酵素反応や蛍光を利用するイムノアッセイ法に加え、表面プラズモン共鳴(SPR: Surface Plasmon Resonance)法、水晶発振子マイクロバランス(QCM: Quartz Crystal Microbalance)法、干渉分光法、電気化学法などがある。この中で、表面プラズモン共鳴、水晶発振子マイクロバランス、干渉分光、及び電気化学を検出原理とする装置は、酵素や蛍光分子で標識することなく、物質間の相互作用を直接的に検出可能であることから、高速化や低コスト化が可能であり、POCT (Point of care testing)デバイスとして期待できる。一方で、これらの装置から得られる検出限界濃度の下限は一般的に数十ng/mLであり、POCTデバイスとしては感度的に不十分と言われている。
【０００３】
物質間相互作用の検出感度を決定する要素の１つとして、プローブとなる分子(以後“リガンド”と呼称する)を固定化した表面に対して、パートナーとなる対象分子(以後“アナライト”と呼称する)を含んだ溶液を反応させる際の“接触時間”が挙げられる。一般的にELISAやFCS等の分析装置では、静止したアナライト溶液をリガンド表面に対して接触させる反応方式(以後“浸漬方式”と呼称する)を用いている。浸漬方式では、反応に使用するアナライト溶液の量が固定されるため、接触時間を自由に上昇できる。接触時間の上昇は相互作用時の信号変化量の上昇に結びつき、これは検出感度の向上に繋がる。しかしながら、リガンド-アナライト間の反応進行に伴いアナライト溶液の濃度が徐々に低下することから、その反応効率は時間依存的に低くなり、このことが課題となっている。
【０００４】
これに対して、表面プラズモン共鳴等の分析装置では、通常はマイクロ流路(フローセル)を用いて、常に一定濃度のアナライト溶液を供給する反応方式(以後“フロー方式” と呼称する)が使用される。この方式では、上述したアナライト溶液の濃度低下を軽減できることから、反応効率は高く、より短時間で反応を進行させることが可能である。ただし、アナライト溶液を高速流で流すことは膨大量のサンプル消費に繋がり、現実的なイムノアッセイの反応方式としては、技術的な課題が残る。
【０００５】
分野は異なるがDNAチップ等の分析チップの分野では、基板の凹部内に微粒子を存在させてハイブリダイゼーションの際に該微粒子を移動させることにより、反応液の撹拌効率を増大させて検出感度を向上させる方法が報告されている(特許文献１)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2008-89414号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、フロー方式でありながら高速且つ高感度で、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質との反応を検出又は測定する方法及び装置を提供することを目的とする。また、本発明は、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質との反応を促進させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、図１に示すように同じアナライト溶液をセンサ表面上で往復送液させることによって、上記目的を達成することができるという知見を得た。本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の検出又は測定方法及び装置並びに反応を促進させる方法を提供するものである。
【０００９】
(I) 検出又は測定方法、反応を促進させる方法
(I-1) センサチップのセンサ面に沿って一方向に移動させた被験物質をセンサチップのセンサ面に沿って反対方向に移動させる工程を含む、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質との反応を検出又は測定する方法。
(I-2) センサチップのセンサ面に沿って一方向に移動させた被験物質をセンサチップのセンサ面に沿って反対方向に移動させる工程を含む、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質との反応を促進させる方法。
(I-3) 前記検出又は測定を表面プラズモン共鳴分析、水晶発振子マイクロバランス分析、干渉分光分析、電気化学分析、蛍光分析、又は酵素反応分析により行う、(I-1)に記載の方法。
(I-4) 被験物質の移動を両方向で同じ速度で行う、(I-1)〜(I-3)のいずれかに記載の方法。
(I-5) 前記工程をセンサチップのセンサ面に沿って送液した被験物質を含む溶液をセンサチップのセンサ面に沿って吸液することにより行う、(I-1)〜(I-4)のいずれかに記載の方法。
(I-6) 前記被験物質を含む溶液の送液及び吸液を圧力駆動型ポンプ又は電気浸透流ポンプを用いて行う、(I-5)に記載の方法。
(I-7) 被験物質の移動を電気的な引力を駆動力とする方法により行う、(I-1)〜(I-4)のいずれかに記載の方法。
【００１０】
(II) 検出又は測定装置
(II-1) センサ面を有するセンサチップと
被験物質を前記センサ面に沿って一方向に移動させる移動手段と、を備え、
前記移動手段は、前記センサチップのセンサ面に沿って一方向に移動させた被験物質を前記センサチップのセンサ面に沿って反対方向にも移動可能である、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質との反応を検出又は測定する装置。
(II-2) 前記移動手段が被験物質を両方向で同じ速度で移動可能である、(II-1)に記載の装置。
(II-3) 前記移動手段が被験物質を含む溶液を前記センサ面に沿って送液する手段である、(II-1)又は(II-2)に記載の装置。
(II-4) 前記送液手段が圧力駆動型ポンプ又は電気浸透流ポンプである、(II-3)に記載の装置。
(II-5) 前記移動手段が電気的な引力を駆動力とする手段である、(II-1)又は(II-2)に記載の装置。
(II-6) 表面プラズモン共鳴測定装置である、(II-1)〜(II-4)のいずれかに記載の装置。
(II-7) 水晶発振子マイクロバランス測定装置である、(II-1)〜(II-4)のいずれかに記載の装置。
(II-8) 干渉分光測定装置である、(II-1)〜(II-4)のいずれかに記載の装置。
(II-9) 電気化学測定装置である、(II-1)〜(II-4)のいずれかに記載の装置。
(II-10) 蛍光測定装置である、(II-1)〜(II-4)のいずれかに記載の装置。
(II-11) 酵素反応測定装置である、(II-1)〜(II-4)のいずれかに記載の装置。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法及び装置は、フロー方式のメリットである相互作用の反応効率(反応進行の速度)の上昇と浸漬方式のメリットであるリガンド表面に対するアナライト溶液の接触時間(相互作用に伴う信号変化)の上昇の両方式のメリットを併せ持っている。更に本発明の方法及び装置は、サンプルの必要量は従来法とほぼ同じであり貴重なサンプルを有効活用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の方法(サイクリックリバース法：Cyclic Reverse method)の概略を示す図である。
【図２】本発明の方法と従来法のSPR信号値を示すグラフである。従来法+接触時間大：一方向のみに送液が可能な従来型のフローシステムを用いて、従来法よりも流速(アナライト溶液の送液速度)を遅くしてアナライト溶液がリガンド表面に接触する時間(接触時間)を長くした方法を指す。理論的には、リガンド表面にアナライト溶液が接触している時間が長ければ長いほど相互作用の反応が進行する(平衡状態に近づく)。従来法+流速大：一方向のみに送液が可能な従来型のフローシステムを用いて、従来法よりも流速(アナライト溶液の送液速度)を速くしてリガンド表面に対するアナライト分子の供給率を上げることで、反応効率を上げる方法である。マイクロ流路系におけるリガンド表面に対するアナライト分子の供給率は、流速に相関することから、流速が上昇すると理論的に反応効率が上昇する。
【図３】実施例で使用したフローシステムの概略図である。
【図４】本発明の方法と従来法のSPR信号値を示すグラフである。
【図５】本発明の方法のAFPの接触時間とSPR信号値の関係を示すグラフである。
【図６】本発明の方法のAFP結合信号値の再現性を示すグラフである。
【図７】本発明の方法と従来法のAFP濃度とSPR信号値の関係を示すグラフである。
【図８】各条件の本発明の方法と従来法のSPR信号値を示すグラフである。
【図９】従来法のAFP結合信号値の再現性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
検出又は測定方法、反応を促進させる方法
本発明の一つの実施態様は、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質との反応を検出又は測定する方法であって、センサチップのセンサ面に沿って一方向に移動させた被験物質をセンサチップのセンサ面に沿って反対方向に移動させる工程を含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明の他の実施態様は、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質との反応を促進させる方法であって、センサチップのセンサ面に沿って一方向に移動させた被験物質をセンサチップのセンサ面に沿って反対方向に移動させる工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
本明細書において、上記の本発明の方法を「サイクリックリバース法」と称している。また、上記「センサチップに固定化された物質」はリガンドのことを、上記「被験物質」はアナライトのことをそれぞれ意味している。
【００１７】
図１に示すようにセンサチップのセンサ面に沿って被験物質を往復移動させることにより、リガンド表面に対するアナライト溶液の接触時間(相互作用に伴う信号変化)を上昇させることが可能となり、検出感度を向上させることができる。図２では、本発明の方法(サイクリックリバース法)が、順方向に1度だけアナライトを流す通常の送液法である従来法と比べて結合信号が向上していることが示されている。このように、本発明の方法は、フロー方式と浸漬方式の両方のメリット(反応効率、接触時間の上昇)を有している。更に本発明の方法は、サンプルの必要量は従来法とほぼ同じである。
【００１８】
本発明におけるセンサチップとは、有機分子や無機分子の間の相互作用を信号に変換し、被験物質を測定又は検出するものを意味する。当該センサチップでは、調査対象の物質を基板上のセンサ面に固定化し、当該物質と相互作用する物質を選択的に測定又は検出する。
【００１９】
センサチップに使用する基板の素材は分析方法等により適宜決定されるが、表面プラズモン共鳴分析を行う場合には、例えば光学ガラス、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー等が使用される。
【００２０】
センサチップのセンサ面は金属膜であることが好ましく、金属膜は上記基板上に形成される。金属膜を構成する金属としては、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、特に金が好ましい。センサチップを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、金属膜を構成する金属は、表面プラズモン共鳴が生じ得るものであれば良い。金属膜の膜厚は分析方法等により適宜設定されるが、表面プラズモン共鳴分析を行う場合は、45〜50 nmが好ましい。金属膜の形成は常法によって行うことができ、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等が挙げられる。
【００２１】
本発明のセンサチップの金属膜の表面は、疎水性高分子化合物若しくはデキストランやリン脂質等の親水性高分子化合物でコーティングされているか、又は自己組織化膜などの疎水性若しくは親水性の有機薄膜を有することが好ましい。このような疎水性高分子化合物若しくは親水性高分子化合物でコーティングされているか、又は疎水性若しくは親水性の有機薄膜を有するセンサチップの表面には、物質を固定化することができる官能基として、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、カルボニル、エポキシ又はビニル基が含まれているか又は含むように誘導体化されていることが好ましい。カルボキシル基を有する場合は、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド塩酸の水溶液で処理することにより、反応性エステル化することが可能であり、ここに調査対象の物質を共有結合的に固定化することができる。また、上述の高分子化合物や有機薄膜等を有するセンサチップの表面が、ビオチン、アビジン結合性ペプチド、ニトリロ三酢酸などの化合物で誘導体化されていれば、ここに調査対象の物質をアビジンタンパク質を介して、又は非共有結合的に固定化することができる。
【００２２】
本発明のセンサチップのセンサ面に固定される物質としては、特に限定されないが、例えば、抗体(IgG、IgM、IgA、IgE、IgD、IgY)、酵素、タンパク質、ペプチド、レセプター、微生物、ウイルス、細胞、核酸(DNA、RNA)、レクチン、糖鎖、脂質、低分子化合物、機能性高分子、モレキュラーインプリントポリマーなどが挙げられる。
【００２３】
センサチップのセンサ面に固定される物質がタンパク質又は核酸である場合、その固定化は、当該物質の又は当該物質に結合したアミノ基、チオール基、アルデヒド基、ビオチン、ヒスチジンタグ等を利用し、金属膜上の官能基に共有結合的又は非共有結合的に結合させることにより行うことができる。
【００２４】
本発明のセンサチップのセンサ面に被験物質を接触させることによって、当該センサ面に固定化されている物質と相互作用する物質を検出又は測定することができる。当該被験物質としては、特に限定されないが、例えば、センサ面に固定化された物質と相互作用する可能性のある物質(例えば、抗体が固定されている場合は抗原、レセプターが固定されている場合はリガンド)が挙げられる。
【００２５】
本発明の方法では、センサチップのセンサ面に沿って一方向に移動させた被験物質をセンサチップのセンサ面に沿って反対方向に移動させることにより、被験物質とセンサ面に固定化された物質との接触時間を長くし、結果として検出感度を顕著に向上させることが可能となる。センサチップのセンサ面に沿って一方向(又はその反対方向)への移動を１回の移動とすると(即ち、往復の移動は２回の移動となる)、当該移動は通常2回以上、好ましくは6回以上、より好ましくは10回以上、特に好ましくは15回以上である。本発明の方法により表面プラズモン共鳴分析を行う場合は、通常の順方向への１回の移動と比べSPR信号(即ち、検出感度)を好ましくは10倍以上、より好ましくは100倍以上に高めることができる。また、検出限界濃度の下限を、好ましくは数ng/ml以下、より好ましくは数百pg/ml以下とすることができる。
【００２６】
本発明の方法において、被験物質の一方向への移動とその反対方向への移動の速度は同じであることが好ましい。ここで同じ速度とは、厳密に同一の速度であることを意味しておらず、各速度が±3μL/min、好ましくは±1μL/minの相違があっても良い。
【００２７】
本発明の方法において被験物質の移動は、例えば、センサチップのセンサ面に沿って被験物質を含む溶液を送液及び吸液することにより行うことができる。このような送液及び吸液は、例えばシリンジポンプ、ピストンポンプ、ペリスタポンプ、ギヤポンプ、MEMSポンプ等の圧力駆動型ポンプ、電気浸透流ポンプなどを用いて行うことができる。この場合、送液又は吸液を行う速度は、10〜200μL/min程度が好ましく、10〜60μL/min程度がより好ましい。
【００２８】
また、本発明の方法における被験物質の移動は、被験物質を含む溶液を移動させることなく、被験物質のみを移動させることにより行っても良い。そのような方法としては、電気的な引力を駆動力とする方法(例えば、電気泳動法)、磁気的な引力を駆動力とする方法(被験物質が磁性体であるか、又は被験物質が磁性体で標識されている場合に限られる)などにより行うことができる。
【００２９】
本発明の方法における検出又は測定に使用する分析手法としては、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質の検出又は測定が可能である方法であれば特に限定されないが、例えば、表面プラズモン共鳴分析、水晶発振子マイクロバランス分析、干渉分光分析、電気化学分析、蛍光分析、酵素反応分析などが挙げられる。中でも、本発明の方法における検出又は測定は、表面プラズモン共鳴分析により好適に行うことができる。
【００３０】
表面プラズモン共鳴とは、金属表面の自由電子と電磁波(光)との相互作用によって生じる共鳴現象であり、被験対象の物質を酵素や蛍光分子で標識する必要が無いため簡便な手法として注目されている。表面プラズモン共鳴を利用したセンサには、伝搬型表面プラズモン共鳴センサと局在型表面プラズモン共鳴センサとがある。伝搬型表面プラズモン共鳴センサの例としては、ガラス等の透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属薄膜層の表面近傍に位置する誘電体(試料や溶液等)の屈折率に依存して変化する現象を利用したものがある。被験物質が、センサチップの金属薄膜層の表面に固定化された物質と結合(相互作用)するものであれば、その結合によりセンサチップの金属薄膜層の表面近傍の屈折率が変化する。この屈折率は被験物質の時間依存的な結合反応や解離反応に伴って変化するので、このときの反射光の強度を測定することで物質間の相互作用をリアルタイム且つ定量的に分析することができる。
【００３１】
検出又は測定装置
本発明の装置は、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質との反応を検出又は測定する装置であって、
センサ面を有するセンサチップと
被験物質を前記センサ面に沿って一方向に移動させる移動手段と、を備え、
前記移動手段は、前記センサチップのセンサ面に沿って一方向に移動させた被験物質を前記センサチップのセンサ面に沿って反対方向にも移動可能であることを特徴とする。
【００３２】
本発明の装置は、フロー方式のメリットである相互作用の反応効率(反応進行の速度)の上昇と浸漬方式のメリットであるリガンドに対するアナライトの接触時間(相互作用に伴う信号変化)の上昇の両方式のメリットを有している。更に本発明の装置は、サンプルの必要量が従来法とほぼ同じである。
【００３３】
本発明の装置は、上記方法を実現するための装置であり、センサチップ、被験物質等は前述するものと同様である。
【００３４】
本発明の装置は、上記移動手段が被験物質を両方向で同じ速度で移動可能であることが好ましい。ここで同じ速度とは、厳密に同一の速度であることを意味しておらず、各速度が±3μl/min、好ましくは±1μl/minの相違があっても良い。
【００３５】
本発明において被験物質の移動手段は、例えば、被験物質を含む溶液を前記センサ面に沿って送液する手段であり、そのような送液手段としては、例えばシリンジポンプ、ピストンポンプ、ペリスタポンプ、ギヤポンプ、MEMSポンプ等の圧力駆動型ポンプ、電気浸透流ポンプなどが挙げられる。
【００３６】
また、本発明の装置における被験物質の移動手段は、被験物質を含む溶液を移動させることなく、被験物質のみを移動させる手段であっても良い。そのような移動手段としては、電気的な引力を駆動力とする手段(例えば、電気泳動)、磁気的な引力を駆動力とする手段(被験物質が磁性体であるか、又は被験物質が磁性体で標識されている場合に限られる)などが挙げられる。
【００３７】
本発明の装置が有する分析手段としては、センサチップに固定化された物質と相互作用する物質の検出又は測定が可能である手段であれば特に限定されないが、例えば、表面プラズモン共鳴測定、水晶発振子マイクロバランス測定、干渉分光測定、電気化学測定、蛍光測定、酵素反応測定などが挙げられる。中でも、表面プラズモン共鳴測定が好適に使用される。表面プラズモン共鳴測定装置には、伝搬型表面プラズモン共鳴測定装置と局在型表面プラズモン共鳴測定装置とがある。本発明の装置を伝搬型表面プラズモン共鳴測定装置とする場合は、更に上記センサチップに対して光を照射する光照射手段と上記センサチップからの反射光を受光する受光手段を備えていることが望ましい。
【００３８】
伝搬型表面プラズモン共鳴測定装置としては、例えば、プリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態(即ち、全反射減衰の状態)を検出する光検出手段とを備えてなるものが挙げられる。
【００３９】
種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させても良いし、又は光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態で又は発散光状態で入射させても良い。前者の場合、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実験例等になんら限定されるものではない。
【００４１】
本実施例に用いたフローシステムでは、TECAN社製シリンジポンプ(型式：XLP6000)にTECAN社製の500μlシリンジを装着したものをセンサ表面へ送液するために用いた。また、サンプルの吸引/吐出にはTECAN社製シリンジポンプ(型式：XLP6000)にTECAN社製の250μlシリンジを装着したものでサンプルの吸引/吐出の制御を行った。サンプル選択用バルブにはFLOM社の1-12方切り替えバルブ(型式：413-117)を用いた。サンプル切換バルブにはFLOM社の6方切り替えバルブ(型式：413-03)を用いた。本実施例に用いたフローシステムの概略図を図３に示す。
【００４２】
・センサチップへの抗体の固定化(試験例１〜５に共通する方法)
カルボキシル末端を有するチオール試薬であるカルボキシ−ＥＧ６−ウンデカンチオール(同仁化学研究所)とヒドロキシル末端を有するチオール試薬であるヒドロキシ−ＥＧ３−ウンデカンチオール(同仁化学研究所)を1:3の割合で混合したエタノール溶液(総チオール濃度1 mM)中にセンサチップを24時間浸漬することで、センサ表面の金膜上に自己組織化膜を形成した。次に、このセンサ表面を50 mMのＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び200 mMのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ′−エチルカルボジイミド塩酸の混合溶液(GE Healthcare)を用いて10分間処理することにより、表面のカルボキシル基を反応性エステル化した。続いて、酢酸緩衝液によりpH 5.0に調製したポリクローナル抗α-フェトプロテイン抗体(以下、Anti-AFPとする)(Monosan)の溶液を10分間添加することで、Anti-AFPを表面に対して共有結合させた。最後に、1 Mのエタノールアミン溶液(GE Healthcare)を10分間添加することで、残存する反応性エステルをブロッキングした。
【００４３】
接触時間の測定方法
接触時間は、ランニングバッファを水、サンプルをPBSにしたとき、SPRシグナルが水からPBSに変化したときを開始時間、PBSから水に変化したときを終了時間にしたときの実測値である。時間はアプリケーション内の時間軸を使用した。
【００４４】
試験例１
図４は、サイクリックリバース法(本発明の方法)と従来法のそれぞれの手法で得られたSPR信号値を比較した結果である。どちらの手法においても、Anti-AFP (Monosan)を固定化したセンサチップに対して、100 ng/mLのα-フェトプロテイン(以下、AFPとする)(森永生科学研究所)溶液を160μL添加した。測定時の流速は20μL/minであり、ランニング緩衝液は、0.005%(v/v)のTween20 (CALBIOCHEM)を含んだPBSバッファー(1.5 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4 pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)(ナカライテスク)を用いた。
【００４５】
結果としては、サイクリックリバース法を用いることで、リガンドであるAnti-AFPとアナライトであるAFPとの接触時間が約12倍に上昇し、その結果SPR信号値が約7倍に増幅した。サイクリックリバース法のSPRセンサグラム(SPR信号値の時間軸に対するプロットを“SPRセンサグラム”と呼ぶ)上に規則的に確認できるFIN状の信号成分は、送液方向の切り替わりのタイミングと同調して出現したことから、マイクロ流路内の圧力変動に起因するSPR信号のベースラインシフトと考えられる。これはサイクリックリバース法の特有の現象であり、我々はこの信号成分を“Response FIN”と命名した。Response FINの出現が測定結果に影響がないことは次の試験例２の結果で実証されている。
【００４６】
［従来法の測定条件］
・アナライト      ：100 ng/mL AFP溶液(ランニング緩衝液で希釈)
・アナライト添加量：160μL
・流速            ：20μL/min
・接触時間        ：6 min
［サイクリックリバース法の測定条件］
・アナライト      ：100 ng/mL AFP溶液(ランニング緩衝液で希釈)
・アナライト添加量：160μL
・流速            ：20μL/min
・接触時間        ：77 min
【００４７】
試験例２
図５は、サイクリックリバース法(本発明の方法)を用いて、センサチップに固定化されたAnti-AFPに対して100 ng/mLのAFP溶液を繰り返し接触させたときのSPR信号値と接触時間の関係を示したものである。測定時の流速は20〜80μL/minとし、ランニング緩衝液は、0.005%(v/v)のTween20 (CALBIOCHEM)を含んだPBSバッファー(1.5 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4 pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)(ナカライテスク)を用いた。本試験例は、試験例１とは異なり、異なる流速や接触時間で取得した複数回の検討結果をまとめたグラフである。その結果、確かに接触時間の上昇に伴いSPR信号値が増大する事が確認できた。
【００４８】
［サイクリックリバース法の測定条件］
・アナライト      ：100 ng/mL AFP溶液(ランニング緩衝液で希釈)
・アナライト添加量：160μL
・流速            ：20〜80μL/min
・接触時間        ：4〜77 min
・再生溶液        ：グリシン-HCl pH 2.0
【００４９】
試験例３
図６は、サイクリックリバース法(本発明の方法)を用いて、センサチップに固定化されたAnti-AFPに対して100 ng/mLのAFP溶液を繰り返し接触させたときの繰り返し再現性を評価した結果である。ランニング緩衝液は、0.005%(v/v)のTween20 (CALBIOCHEM)を含んだPBSバッファー(1.5 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4 pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)(ナカライテスク)を用いた。
【００５０】
結果として、繰り返し再現性の指標であるCV値は1.0%と非常に高いことが確認できた。一方、従来法から算出したAFP検出のCV値も1%付近(参考例１)であったことから、サイクリックリバース法の繰り返し再現性が、従来法と比べて遜色ないことが確認できた。
【００５１】
［サイクリックリバース法の測定条件］
・アナライト      ：100 ng/mL AFP溶液(ランニング緩衝液で希釈)
・アナライト添加量：160μL
・流速            ：60μL/min
・接触時間        ：32 min
・再生溶液        ：グリシン-HCl pH 2.0
【００５２】
試験例４
図７は、従来法(測定条件は試験例１と同じ)によるSPR信号値のAFP濃度依存曲線と、サイクリックリバース法(本発明の方法)を用いたときのSPR信号値を重ねたものである。サイクリックリバース法は、10 ng/mLと100 ng/mLのAFP溶液において実施した。AFP溶液の添加量は160μL、測定時の流速は20μL/minとし、ランニング緩衝液は、0.005%(v/v)のTween20 (CALBIOCHEM)を含んだPBSバッファー(1.5 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4 pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)(ナカライテスク)を用いた。サイクリックリバース法を用いることで、100 ng/mLのAFP溶液では約7倍、10 ng/mLのAFP溶液では約140倍のSPR信号値の上昇を確認できた。
【００５３】
［従来法の測定条件］
・アナライト      ：10 ng/mL〜1μg/mL AFP溶液(ランニング緩衝液で希釈)
・アナライト添加量：160μL
・流速            ：20μL/min
・接触時間        ：6 min
［サイクリックリバース法の測定条件］
・アナライト      ：10 ng/mL、100 ng/mL AFP溶液(ランニング緩衝液で希釈)
・アナライト添加量：160μL
・流速            ：20μL/min
・接触時間        ：77 min
【００５４】
試験例５
図８は、サイクリックリバース法(本発明の方法)を用いて、センサチップに固定化されたAnti-AFPに対して10 ng/mLのAFP溶液を反応させたときの接触時間と流速を同時に変化させたときの結果である。AFP溶液の添加量は160μLとし、ランニング緩衝液は、0.005%（v/v）のTween20 (CALBIOCHEM)を含んだPBSバッファー(1.5 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4 pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)(ナカライテスク)を用いた。
【００５５】
結果として、接触時間が最も長い条件４(接触時間47 min)において、SPR信号値が従来法の約140倍になることが確認できた。
【００５６】
［従来法の測定条件］
・アナライト      ：10ng/mL AFP溶液（ランニング緩衝液で希釈）
・アナライト添加量：160μL
・流速            ：20μL/min
・接触時間        ：6 min
［サイクリックリバース法・条件１の測定条件］
・アナライト      ：10 ng/mL AFP溶液（ランニング緩衝液で希釈）
・アナライト添加量：160μL
・流速            ：80μL/min
・接触時間        ：26 min
［サイクリックリバース法・条件２の測定条件］
・アナライト      ：10 ng/mL AFP溶液（ランニング緩衝液で希釈）
・アナライト添加量：160μL
・流速            ：60μL/min
・接触時間        ：32 min
［サイクリックリバース法・条件３の測定条件］
・アナライト      ：10 ng/mL AFP溶液（ランニング緩衝液で希釈）
・アナライト添加量：160μL
・流速            ：40μL/min
・接触時間        ：43 min
［サイクリックリバース法・条件４の測定条件］ 
・アナライト      ：10 ng/mL AFP溶液（ランニング緩衝液で希釈）
・アナライト添加量：160μL
・流速            ：20μL/min
・接触時間        ：77 min
【００５７】
参考例１
図９は、従来法を用いて、センサチップに固定化されたAnti-AFPに対して1μg/mLのAFP溶液を繰り返し接触させたときの繰り返し再現性を評価した結果である。ランニング緩衝液は、0.005%(v/v)のTween20 (CALBIOCHEM)を含んだPBSバッファー(1.5 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4 pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl)(ナカライテスク)を用いた。
【００５８】
結果として、繰り返し再現性の指標であるCV値は1.0%という値が確認できた。
【００５９】
［従来法の測定条件］
・アナライト      ：1μg/mL AFP溶液(ランニング緩衝液で希釈)
・アナライト添加量：120μL
・流速            ：20μL/min
・接触時間        ：4 min
・再生溶液        ：グリシン-HCl pH 2.0
【図１】
2012198045.tif 000003
【図２】
2012198045.tif 000004
【図３】
2012198045.tif 000005
【図４】
2012198045.tif 000006
【図５】
2012198045.tif 000007
【図６】
2012198045.tif 000008
【図７】
2012198045.tif 000009
【図８】
2012198045.tif 000010
【図９】
2012198045.tif 000011