(57)【要約】【課題】ＤＮＡマーカーを用いた抵抗性検定を利用可能にして、ジャガイモ疫病に対する抵抗性個体をＤＮＡレベルで、しかも短時間に検定できるようにすることにより、抵抗性品種育成を効率的に行うことのできる検定法を提供することにある。【解決手段】下記の特定配列で表されるＲ３遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー検定用プライマーよりなる。“５’−ＴＧＣＣＡＡＡＴＧＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＣ−３’”の２０塩基の合成プライマーと“５’−ＣＡＡＡＴＡＴＡＡＣＣＴＧＴＣＧＡＣＧ−３’”の１９塩基の合成プライマーから構成される。または、“５’−ＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＴＣＴＴＧＴＴＡ−３’”の２０塩基の合成プライマーと“５’−ＣＡＡＡＴＡＴＡＡＣＣＴＧＴＣＧＡＣＧ−３’”の１９塩基の合成プライマーから構成される。【選択図】    図２
2012055173.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１及び配列番号２、配列番号３で表されるＲ３遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカ
ー検定用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ジャガイモ栽培における最重要病害であるジャガイモ疫病に抵抗性を持つ品
種育成を効率的に進めるため、交配によって得た雑種後代の抵抗性の有無を判別する検定
法であって、特に、Ｓｏｌａｎｕｍ ｄｅｍｉｓｓｕｍ に由来するジャガイモ疫病抵抗
性遺伝子（Ｒ３）に連鎖し、ジャガイモ疫病抵抗性または罹病性を判別するＤＮＡマーカ
ーを用いたジャガイモ疫病抵抗性検定法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ジャガイモ疫病は、世界のジャガイモ栽培において最も重要な病害である。疫病は一旦発
生すると防除が困難なため、予防的な農薬散布が必要である。ジャガイモ栽培における農
薬使用の大半は、疫病発生の予防目的で行われている。減農薬栽培や環境保全型農業の推
進、薬剤費節減のためには、疫病抵抗性品種が極めて有効である。
これまでに、国内では疫病真性抵抗性遺伝子Ｒ１やＲ３を持つ抵抗性品種が多く育成され
ている。従来、品種や育成系統のジャガイモ疫病抵抗性検定は、疫病無防除栽培圃場等に
おいて、植物体への疫病菌の感染による病斑の有無によって判別している。また、切り取
った葉に接種する室内検定法がある。近年、Ｒ１遺伝子を検出するＤＮＡマーカーが、Ｒ
１遺伝子の有無の判別や交配における雑種後代からの抵抗性個体を効率良く選抜できる手
法として実用化している。しかし、Ｒ３遺伝子を検出するＤＮＡマーカーは実用化されて
いない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】「育種学研究  第１２巻  別冊１  ３９頁」日本育種学会発行  ２０１０年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来のジャガイモ疫病抵抗性検定は、無防除栽培圃場等において、植物体への疫病菌の感
染による病斑の有無によって判別する方法がなされているが、結果を得るまでに３〜４ヶ
月かかり、多くの労力と検定圃場を要する。また、無防除栽培圃場での検定は、気象や発
生する疫病菌の病原性によって影響され、検定精度が安定しない。切り取った葉に接種す
る室内検定法もあるが、スペースが限られるため、検定数に限界がある。
一方、どの疫病菌レースにも同様の抵抗性を示し、罹病するものの程度が軽い圃場抵抗性
を正確に評価するためには、疫病菌の特定のレースに対し特異的な抵抗性を示す真性抵抗
性遺伝子の遺伝子型を把握することが重要である。しかしながら、真性抵抗性遺伝子型の
判別に必要な疫病菌レースが保存されていないため、個体が持っている遺伝子型をほとん
ど判別することができない。
育種現場において、交配における雑種後代から抵抗性個体を効率良く選抜できる手法を開
発するため、疫病真性抵抗性遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカーを開発する。
育種の早期世代でのＤＮＡマーカーを用いた抵抗性個体の選抜が可能になると、今まで以
上に多くの個体を取り扱うことができ、新品種育成を効率的に行うことができる。
【０００５】
この発明は、上記のような課題に鑑み、その課題を解決すべく創案されたものであって、
その目的とするところは、ＤＮＡマーカーを用いた抵抗性検定を利用可能にして、ジャガ
イモ疫病に対する抵抗性個体をＤＮＡレベルで、しかも短時間に検定できるようにするこ
とにより、抵抗性品種育成を効率的に行うことのできる検定法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以上の目的を達成するために、この発明は、配列番号１及び配列番号２、配列番号３で表
されるＲ３遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー検定用プライマーよりなる。
ここで、配列番号１は“５’−ＴＧＣＣＡＡＡＴＧＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＣ−３’”の２
０塩基の合成プライマーから構成され、配列番号２は“５’−ＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡ
ＴＣＴＴＧＴＴＡ−３’”の２０塩基の合成プライマーから構成され、配列番号３は“５
’−ＣＡＡＡＴＡＴＡＡＣＣＴＧＴＣＧＡＣＧ−３’”の１９塩基の合成プライマーから
構成される。
【０００７】
疫病真性抵抗性遺伝子Ｒ１を持つ品種「アトランチック」と、Ｓｏｌａｎｕｍ ｄｅｍｉ
ｓｓｕｍ に由来する疫病真性抵抗性遺伝子Ｒ３を持つことが知られているコナフブキ由
来の「Ｋ９７０３１−９５」のＦ１雑種から、Ｒ１遺伝子を持たない９７個体を選抜し、
疫病菌レース０株を用いた接種検定を行った。遊走子形成率３０％以下の１０個体及び７
０％以上の１０個体から抽出したＤＮＡをそれぞれ等量ずつ混ぜて抵抗性混合ＤＮＡ試料
及び罹病性混合ＤＮＡ試料とした。Ｒ３ａ遺伝子領域の一部を増幅するプライマーセット
（Ｒ３ａ−ＦとＲ３ａ−Ｒ）を設計・合成し、これを用いたＰＣＲの増幅産物を制限酵素
で消化するＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析を行い、抵抗性混合ＤＮＡ試料に特異的なＤＮＡバンド
（ＣＡＰＳマーカーバンド）を得た。「Ｋ９７０３１−９５」および「アトランチック」
からプライマーセット（Ｒ３ａ−ＦとＲ３ａ−Ｒ）を用いてＰＣＲ増幅し、増幅断片をＴ
Ａクローニングによりクローン化した。制限酵素ＴａｑＩで消化されるクローン断片と消
化されないクローン断片の塩基配列を比較して、Ｒ３遺伝子に特異的なＤＮＡ断片のみを
増幅するプライマーセット（Ｒ３ＳＰ-Ｓ１とＲ３ＳＰ−Ａ４）並びに（Ｒ３ＳＰ−Ｓ２
とＲ３ＳＰ−Ａ４）を設計・合成した（図１）。プライマーセット（Ｒ３ＳＰ-Ｓ１とＲ
３ＳＰ−Ａ４）で増幅されるＤＮＡ断片はＲ３−４００、プライマーセット（Ｒ３ＳＰ−
Ｓ２とＲ３ＳＰ−Ａ４）で増幅されるＤＮＡ断片はＲ３−３００と命名した。
【発明の効果】
【０００８】
Ｆ１集団の疫病抵抗性有無が、従来の無防除栽培圃場における検定に比べ、短期間で精度
良く判別できるようになった。また、圃場検定や接種検定は、実施時期が栽培期間中に限
られていたが、本法を用いることでジャガイモが栽培されていない時期でも検定が可能と
なったことから、今まで以上に多くの個体を取り扱うことができ、新品種育成を効率的に
行うことができる。
開発したＤＮＡマーカーを使うことで、Ｒ３遺伝子を持つ抵抗性品種・系統を特定できる
ので、交配親が有している疫病抵抗性遺伝子を考慮した交配計画を立てることができ、圃
場抵抗性品種や疫病真性抵抗性遺伝子を集積した品種の育成に活用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｒ３遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー検定用プライマー配列を示す図である。
【図２】品種・系統におけるＲ３遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー（Ｒ３−４００並びにＲ３−３００）の検出（矢印で表示）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
〔バイレショＤＮＡ抽出法（ＣＴＡＢ-ＬｉＣｌ法）〕
（１）５０ｍｇ組織を１．５ｍｌチューブに入れ、ペッスルですりつぶす。
（２）１７５μｌの２％ＣＡＴＢ液と１７５μｌの８Ｍ ＬｉＣｌを加えて、撹拌する。
（３）５５℃、５分間インキュベート（時々撹拌する）。
（４）３５０μｌ クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加えて、１０分
間振盪する。
（５）１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。
（６）上澄み３００μｌを新しい１．５ｍｌチューブに移す。
（７）２１０μｌの冷イソプロパノールを加えて、優しく撹拌する。
（８）−３０℃で１５分間放置する。
（９）１２，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離する。
（１０）１ｍｌの７０％冷エタノールを加えて、すぐに吸い出す。
（１１）１ｍｌの冷エタノールを加えて、すぐに吸い出す。
（１２）遠心濃縮機で５分間乾燥する。
（１３）５０μｌの滅菌水（１０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡを含む）を加え、５５℃で溶
解する。
【００１１】
〔抽出ＤＮＡ濃度測定〕
（１）２ｍｌ Ｌｏｗ  Ｒａｎｇｅ（Ａ）液（０．１μｇ／ｍｌ Ｈ３３２５８、０．２Ｍ
ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．４）をガラスセル
に入れ、「ＺＥＲＯ」を押し、０点調整を行う。
（２）λＤＮＡ液（１００μｇ／ｍｌ）を２μｌ加えて撹拌し、「ＣＡＬＩＢ」を押し、
「ｌ」「０」「０」と入力後、「ＥＮＴＥＲ」を押す。
（３）Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ終了後、ガラスセルの液を捨て、新しい２ｍｌ Ｌｏｗ  
Ｒａｎｇｅ（Ａ）液を入れ、「ＺＥＲＯ」を押し０点調整後、抽出ＤＮＡサンプルの２μ
ｌを加えて撹拌し、濃度を測定する。
ここで、使用機器は、ＤｙＮＡ Ｑｕａｎｔ ２００（Ｈｏｅｆｅｒ社）を用いた。
【００１２】
〔ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー反応液組成〕
１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ
（ＭｇＣｌ２  ｆｒｅｅ）         １０μｌ（最終濃度：１×）
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２                      ８μｌ（最終濃度：２ｍＭ）
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ       ８μｌ（最終濃度：０．２ｍＭ）
５０μＭ Ｒ３ＳＰ−Ｓ１
またはＲ３ＳＰ−Ｓ２                   １μｌ（最終濃度：０．５μＭ）
５０μＭ Ｒ３ＳＰ−Ａ４                  １μｌ（最終濃度：０．５μＭ）
５ｕｎｉｔｓ／μｌ Ｅｘ Ｔａｑ       ０．５μｌ（最終量：２．５ｕ）
鋳型ＤＮＡ（５ｎｇ／μｌ）             １０μｌ（最終量：５０ｎｇ）
滅菌水                             ６１．５μｌ                        
計                       １００μｌ
ここで、使用試薬は、タカラバイオ社のＴａＫａＲａ Ｅｘ ＴａｑＴＭを用いた。
【００１３】
〔ジャガイモ疫病抵抗性遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー反応温度条件〕
９４℃３分を１サイクル
９４℃３０秒→５３℃３０秒→７２℃１分を３５サイクル
７２℃５分を１サイクル
【００１４】
〔電気泳動〕
（１）アガロース０．４２ｇを耐熱ビンに入れ、１×ＴＡＥ Ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ、２０ｍＭ 氷酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）３０ｍｌを加えて電子レンジ
で加熱し撹拌しながら完全に溶かす。
（２）溶液の温度が約４０℃に冷えたら、ゲルトレイに注ぎコームを差し込む。ゲルが固
まったら泳動槽にセットする。
（３）Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（０．２５％ ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ、
０．２５％ ｘｙｌｅｎ  ｃｙａｎｏｌ ＦＦ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、３０％グリセロール）
１μｌ取り、ＰＣＲ反応させたチューブに直接加えて混合し、そこから５μｌ取る。
（４）５μｌのサンプルを泳動槽にセットしたアガロースゲルの注入穴に静かに注入する
。
（５）１００Ｖで３０分間電気泳動後、０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド（臭化エ
チジウム）を含む１×ＴＡＥ  Ｂｕｆｆｅｒに浸して３０分間ゆっくり振盪し、ゲルをト
ランスイルミネーターにのせ、紫外線を照射してカメラで撮影する。
【実施例】
【００１５】
「アトランチック」と「Ｋ９７０３１−９５」のＦ１雑種において、接種検定結果とＲ３
−４００並びにＲ３−３００の有無との間には８３．５％の相関が認められた（表１）。
【００１６】
【表１】
2012055173.tif 000003
【００１７】
ジャガイモ４８品種・系統における疫病菌レース０株接種による遊走子のう形成率とＲ３
−４００並びにＲ３−３００の有無を検討したところ、１５品種・系統でＲ３−４００並
びにＲ３−３００が検出された。（表２、図２）。
【００１８】
【表２】
2012055173.tif 000004
【配列表フリーテキスト】
【００１９】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
【図１】
2012055173.tif 000005
【図２】
2012055173.tif 000006
【配列表】
2012055173000001.app