(57)【要約】      （修正有）【課題】培養細胞を使用した高効率的なタンパク質の製造方法の提供。【解決手段】ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）又は該化合物のアルカリ金属塩を添加した培地を使用して細胞を培養することによって、高効率的なタンパク質増産方法。細胞が外部遺伝子を導入したチャイニーズハムスター卵巣細胞由来の細胞であり、ＰＱＱの培地中の濃度が０．０１から２５０μＭであることを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で表される化合物又は該化合物のアルカリ金属塩を添加した培地を使用して細胞を培養することを特徴とするタンパク質増産方法。
【化１】
2012029580.tif 000006
【請求項２】
前記細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞由来の細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が外部遺伝子を導入した細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記式（１）で表される化合物の培地中の濃度が０．０１から２５０μＭであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は培養細胞を使用したタンパク質増産の技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明で取り扱うピロロキノリンキノンは式（１）で表される構造の化合物（フリー体）又は該化合物の塩を取り扱う。
【化１】
2012029580.tif 000002
このピロロキノリンキノン（以下、ＰＱＱと記す）は、有機化学的合成法（非特許文献１）又は発酵法（特許文献１）などの方法により得ることができる。
【０００３】
ＰＱＱは新しいビタミンの可能性があることが提案されて（例えば、非特許文献２参照）、健康補助食品、化粧品などに有用な物質として注目を集めている。さらには細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母に存在し、補酵素として重要な働きを行っている。また、ＰＱＱについて近年までに細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防治療作用、創傷治癒作用、抗アレルギー作用、逆転写酵素阻害作用およびグリオキサラーゼＩ阻害作用−制癌作用など多くの生理活性が明らかにされている。
【０００４】
これまでにＰＱＱを繊維芽細胞の培養液に添加することでＤＮＡの合成、増殖に効果があることが知られている（非特許文献３，４）。しかし、それ以外の細胞においての効果は知られておらず、また、有用タンパク質の生産に対する効果も知られていない。また、ミトコンドリアを活性化するとされ、ランゲルハンス島の組織での効果は知られている（特許文献２）。しかし、培養細胞における外来からの遺伝子をつかって形質を変化させた細胞に対する効果は知られていない。
【０００５】
培養細胞を使った有用タンパク質の製造は生化学、分子生物学、医学、薬学の分野で重要な技術であり、抗体医薬の生産方法としても使用されている。特にチャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞をはじめとして、遺伝子組換えを行った細胞を使ってのタンパク質の生産が行われている。そのため、この細胞におけるタンパク質生産性の向上は重要である。これまでにＰＱＱのＣＨＯ細胞でのタンパク質製造に関する効果については知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１−２１８５９７号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／０２５２４７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＪＡＣＳ、第103巻、第5599〜5600頁（1981）
【非特許文献２】nature, vol422, 24April, 2003, p832
【非特許文献３】Life Science, Vol 52, p1902-1915 (1993)
【非特許文献４】Int. J. Molecular Med., vol 19, 765-770 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
培養細胞を使用する高効率的なタンパク質の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１）式（１）で表される化合物又は該化合物のアルカリ金属塩を添加した培地を使用して細胞を培養することを特徴とするタンパク質増産方法。
【化２】
2012029580.tif 000003
２）前記細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞由来の細胞であることを特徴とする１）に記載の方法。
３）前記細胞が外部遺伝子を導入した細胞であることを特徴とする１）に記載の方法。
４）前記式（１）で表される化合物の培地中の濃度が０．０１から２５０μＭであることを特徴とする１）〜３）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により培養細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞を使用する高効率的なタンパク質の製造方法を提供可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】蛍光強度結果
【図２】吸光度結果
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明で取り扱う培養細胞は動物細胞由来のもので、タンパク質の生産に使用される細胞としては付着性細胞は勿論、浮遊性細胞のいずれにも用いることができ、動物由来の各種細胞の培養による生理活性物質の生産が可能である。例えば、繊維芽細胞、上皮性細胞、リンパ球系細胞、これらの形質転換細胞、ハイブリドーマなどが挙げられる。好ましくはチャイニーズハムスター卵巣細胞由来のＣＨＯ細胞である。該細胞由来の変異株も当然有用で、CHO-DHFR-, CHO-K1, CD-CHOのような細胞も有効である。
【００１３】
タンパク質を生産する為の細胞の培養方法は、特に限定されるものではなく、通常の動物細胞の培養方法で行うことが出来る。例えば、マルチウエルプレート、ペトリ皿、組織培養フラスコ、ローラーボトル、スピナーフラスコ、ジャーファーメンターや、マイクロキャリヤー、ホローファイバーなどを用い、使用する細胞に適した増殖用の培地で培養してタンパク質を生産させることができる。生産するタンパク質は特に限定されず、使用する細胞が生産するものであればよい。生産するタンパク質は遺伝子操作により、細胞に生産させるようにしたものが産業として重要であり、より好ましい。タンパク質は細胞内に蓄積、または分泌型どちらでもよく、抗体、酵素、ホルモン、蛍光タンパクのような機能性を有したものが生産される。これらのタンパク質は細胞に一過性の遺伝子として使用されてもよく、また、持続型のプラスミド、またはゲノムへの組み込み、人工染色体としてコードされていればよい。
【００１４】
本発明で使用するＰＱＱは式（１）で表される化合物（フリー体）又は該化合物のアルカリ金属塩であればよく特に限定されない。特に入手しやすい、フリー体、ジナトリウム体、ジカリウム体が使用しやすい。これを通常培養する際の培地成分に添加することでタンパク質の生産量を増加させることができる。
【００１５】
添加量は生産性を考慮して必要な量を選択すればよいが、通常、培地中のＰＱＱのモル濃度が０．０１から２５０μＭであることが好ましい。これよりも添加量が少ない場合、効果は小さくなり、また、高すぎる場合は細胞に対して毒性が生じる危険がある。添加する際のｐＨは、培地と同じになるように添加するのが好ましく、緩衝作用を有する培地や緩衝液で希釈して添加するのが好ましい。
【００１６】
添加する培地は特に制限がないが、例えば、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地の他、ＢＭＥ培地(BASAL MEDIUM EAGLE)、およびＤＭＥ培地(DULBECCO'S MODIFIED EAGLE'S MEDIUM)やＩＭＤＭ培地(ISCOVE'S MODIFIED DULBECCO'S MEDIUM)のようなＢＭＥの改変培地、またインビトジェン社の無血清用培地であるＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ、ＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴ、ＣＤ−ＤＧ４４培地、ＣＤ  ２９３, ２９３ SFMII等が挙げることができる。これらの培地に血清を添加して使用することも、また、血清なしで行うことも可能である。
【００１７】
これらの培地は、ＣａＣｌ2、ＭｇＳＯ4、ＫＣｌ、ＫＮＯ3、ＮａＨＣＯ3、ＮａＣｌ、ＮａＨ2ＰＯ4、およびＮａ2Ｏ3Ｓｅ等の無機塩類、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、およびＬ−バリン等のアミノ酸類、Ｄ−ビオチン、塩化コリン、葉酸、ミオーイノシトール、ニコチンアミド、Ｄ−パントテン酸カルシウム、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、およびビタミンＢ１２等のビタミン類の他、更にＤ−グルコース等の糖類などの炭水化物を含むものであり、その他必要に応じてＨＥＰＥＳ等の緩衝成分、フェノールレッド、ピルビン酸塩等を含んで成るものである。
【００１８】
前述した添加物の他に、ヌクレオシド類、２−ケトグルタル酸（２−オキソグルタル酸）、フルクトース、ガラクトース、グリセロリン酸、クエン酸、エタノールアミン、パラアミノ安息香酸、ＦｅＳＯ4やヘミン等の含鉄化合物、ベンズアミジン、プトレッシン、オレイン酸やリノール酸等の不飽和脂肪酸類等の公知の細胞増殖促進剤を組み合せることができる。更に、細菌やマイコプラズマ汚染を防ぐために、ストレプトマイシン、ナイスタチン、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、レボフロキサシン等の抗菌剤を組み合せることもできる。
【００１９】
これらの培地にＰＱＱを添加し、細胞に適した温度、通常は３７℃で培養することでＰＱＱを添加しない場合と比較して、細胞が作り出すたんぱく質を増産することができる。本発明の方法で作り出したタンパク質はその用途に合わせて精製を行うことも可能である。当然、用途によっては精製せずに使用することも可能である。ＰＱＱの含む培地は熱に安定であるならばオートクレーブ処理されてもよく、血清を含む熱に弱い組成物である場合、フィルター滅菌を行えばよい。ＰＱＱはアミノ酸やたんぱく質と反応しやすいため、化学的に異なる物質に変化している可能性が高い。しかし、本発明の目的に合致する機能を培地に添加することでタンパク質増産に関する機能を維持していれば何ら問題がない。本発明ではＰＱＱを添加すればよく、培地成分との反応は生じても問題がない。
【００２０】
生産したタンパク質は精製、非精製どちらでも目的に合わせて使用すればよい。タンパク質を精製する場合、よく使用される再結晶、塩析、透析、カラム精製などによればよい。
当然、タンパク質の生産性を上昇する働きがあるのであれば、酵素についてあてはまることも容易類推でき、酵素反応による代謝産物の増産も可能であることは自明である。
本発明はタンパク質の生産性を上げる効果とともにそれに関連する培養細胞での物質生産全般に有効になる可能性を秘めていることから、非常に重要な技術である。
【００２１】
本結果より、ＰＱＱを添加することにより、細胞増殖に伴うタンパク質生産の増加以上に、タンパク質の生産が増加されることが分かった。ＰＱＱがタンパク質の増産に有効である機構は明らかではないが、本発明者はタンパク質生産に有効な遺伝子を活性化させると予想しており、栄養的な機構とは異なっていると考えている。また、ミトコンドリア由来の酵素活性も上がっておらず、ミトコンドリアの活性化による効果も小さいと考えられる。
【実施例】
【００２２】
次に、実施例及び比較例をもって本発明をより詳しく説明する。ただし、本発明はこれらの例に限定されるものではない。ピロロキノリンキノンジナトリウム（ＰＱＱ−Ｎａ２）は三菱ガス化学社製、培地のα−MEMとリン酸バッファー（pH7.2）はインビトロジェン社製、抗生物質は大日本住友製薬社製、明治製菓（株）製、牛胎児血清（ＦＢＳ)はニチレイ（株）社製のものを使用した。プレートリーダーはパーキンエルマーARUO MXを使用した。
【００２３】
実施例１、比較例１
ポリジアリルアミン二酸化硫黄共重合体（以下、ＰＤＡＳと略記する。）塩酸塩の２０wt％水溶液（ＰＡＳ−９２、分子量５０００日東紡製）を用い、１０wt％水酸化ナトリウム水溶液と水を用いて中和希釈し、２mg／mL濃度のＰＤＡＳ水溶液（pＨ６．５）を調製した。
チャイニーズハムスター卵巣由来細胞 (CHO−DHFR−)用の培地はα−ＭＥＭ５００ｍｌに５０ｍｌ牛胎児血清を加え、ペニシリン１２．５ｍｇ、ストレプトマイシン１２．５ｍｇを加えた。これに所定の濃度１．５６、３．１２、６．２５、１２．５、２５、５０μＭになるようにＰＱＱ−Ｎａ２を添加した。ＰＱＱ−Ｎａ２を添加しない場合を比較例とする。
【００２４】
シャーレに付着した3.2×10６cellのＣＨＯ細胞から培地を抜き、リン酸バッファーで洗った。ここに緑色蛍光蛋白遺伝子（以下、ＧＦＰと記す）組み込みプラスミドＤＮＡ（4.7kbp）、２００μl (１００μg／mL)とＰＤＡＳ(２mg／mL)を４０μlを混合したものを加え、4分置いた。培地を加えて1時間後、細胞をトリプシンではがし、９６ウエルに細胞を6.4×104cell／wellになるように撒いた。３日間培養してプレートリーダーで蛍光強度(４８５nm励起／５３５nm蛍光)を測定した。細胞を加えていない培地の蛍光も測定した。培地の蛍光強度を差し引いた細胞由来の蛍光を図１に示す。
【００２５】
プレートから培地を抜いて２回、培地を使って洗浄し、同仁化学製Cell counting kit−８を混合した培地をくわえて処理し、1時間３７℃で反応させ、４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。その結果を図２に示す。尚、この時の吸光度は細胞濃度に比例する。
【００２６】
蛍光強度はＰＱＱの濃度が高くなるに従い増加し、緑色蛍光タンパク質の生産量が増加していることが分かる。無添加の場合と比較して、５０μＭ添加すると２．７倍に蛍光強度が上がっており、ＰＱＱが培養細胞においてタンパク質の生産に有効であることがわかる。これに対して、細胞濃度は１３％の増加にとどまっており、細胞濃度に依存しない蛍光タンパク質の増加がみられた。
【００２７】
実施例２〜４、比較例２〜４
実施例１では細胞濃度６．４×１０4cell／wellで実験を行ったのに対し、該細胞濃度を下記の表１の如く変えて実施例１と同様の実験を行った。各々実施例２〜４についてＰＱＱ−Ｎａ２を添加しない場合を比較例２〜４とする。
【表１】
2012029580.tif 000004
【００２８】
得られた蛍光強度及び吸光度結果を図１、図２に示す。また、ＰＱＱ−Ｎａ２を添加しない比較例とＰＱＱ−Ｎａ２濃度が５０μＭの時の各実施例におけるＧＦＰ発現量に相当する蛍光強度と、細胞濃度に相当する吸光度の値を表２に示す。
【表２】
2012029580.tif 000005
【００２９】
ＰＱＱ−Ｎａ２を添加しない比較例に対し、ＰＱＱ−Ｎａ２を添加した各実施例において、細胞濃度に相当する吸光度が変化していなくても、実施例1と同様に蛍光強度がＰＱＱの濃度に依存して高くなり、タンパク質の生産量が増加していることが分かる。実施例２では無添加に比較して５０μＭで５．３倍、同様にして実施例３では６倍にタンパク質の生産は増加していた。実施例４では無添加状態では培地の蛍光に隠れて検出しにくいが、ＰＱＱ濃度の増加により蛍光が強くなりタンパク質は増産されていた。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明によるタンパク質増産技術は、細胞生物学、分子生物学、生化学のような研究分野の技術としても有用であるだけでなく、医薬品の生産にも有用である。
【図１】
2012029580.tif 000007
【図２】
2012029580.tif 000008