(57)【要約】【課題】質量分析における配糖体のイオン化に特異性を持ち、イオン化効率を上昇させるとともに、個々の配糖体をバランスよくイオン化するイオン化支援剤及び質量分析方法を提供する。【解決手段】本発明の質量分析用イオン化支援剤は、酸化鉄からなるコアを有した第１機能性ナノ微粒子の第１懸濁液と、酸化マンガンからなるコアを有した第２機能性ナノ微粒子の第２懸濁液と、を混合させてなる。イオン化支援対象物質には、配糖体の群（複数の配糖体）が含まれる。第１懸濁液と第２懸濁液との混合比率が、各々の飽和溶液の容量比率で、３：７〜９：１であることが好ましい。このイオン化支援剤を利用した質量分析方法を実行することにより、複数の配糖体を効率的にかつバランスよく検出することが可能になる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化鉄からなるコアを有した第１機能性ナノ微粒子の第１懸濁液と、
酸化マンガンからなるコアを有した第２機能性ナノ微粒子の第２懸濁液と、
を混合させてなる質量分析用イオン化支援剤であって、
前記微粒子は、前記コアを覆うアモルファスシリカネットワークからなるシェルと、
前記シェルの表面に共有結合的に導入された官能基と、を有し、かつ
イオン化支援対象物質が配糖体の群を含むことを特徴とするイオン化支援剤。
【請求項２】
前記第１懸濁液と前記第２懸濁液とは共に飽和溶液であり、かつ、
前記第１懸濁液を１００重量部とした場合に前記第２懸濁液が４２〜９００重量部となるように混合されていることを特徴とする請求項１記載のイオン化支援剤。
【請求項３】
前記第１機能性ナノ微粒子に導入された前記官能基は、アミノ基及び水酸基の少なくともいずれか一つを含み、かつ、
前記第２機能性ナノ微粒子に導入された前記官能基は、アミノ基及び水酸基の少なくともいずれか一つを含むことを特徴とする請求項１又は２記載のイオン化支援剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のイオン化支援剤を配糖体に近接させる工程と、
前記イオン化支援剤に近接した前記配糖体にレーザーを照射し、前記配糖体のイオン化を支援する工程と、
を含むことを特徴とする質量分析方法。
【請求項５】
前記配糖体がＯ−グリコシド結合を有することを特徴とする請求項４に記載の質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配糖体のイオン化に特異性を持つイオン化支援剤及びこれを使用した質量分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学、医療、ゲノム創薬などの分野においては、生体組織や細胞内のタンパク質などの構造解析に加え、オミクスなどの網羅的解析を行いたいという要求が高まっている。こうした要求に応えるものとして質量分析が挙げられ、これを実行する質量分析装置は、試料に微小径のレーザーを照射し、その試料に分布する生体分子をイオン化し、発生したイオンの質量を分析する装置である。
【０００３】
こうした質量分析装置では分析を行うために試料を何らかの方法でイオン化する必要があり、イオン化の手法としては、従来より、イオン化支援剤（マトリクス）フリーの２次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）や、高分子物質も測定可能な、マトリクス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）が知られているが、どちらの手法も、以下に示す問題点を有している。ＳＩＭＳではイオン化支援剤を使用せずに検出が可能なものの、イオン化可能な質量数の制限があり、プロテオミクスなど分子量が大きな生体試料を対象とする分析では利用しにくい点である。一方、ＭＡＬＤＩでは、低分子量の物質を測定できない点である。また、本発明者らは、ＭＡＬＤＩでは、分析対象物質に種々の物質が含まれていた場合に、既存のマトリクスが物質選択的なイオン化を行うことが出来ない（つまり、全ての物質をイオン化してしまう）という点も問題視している。
【０００４】
ところで、近年、直径１．３〜３ｎｍのサイズの磁気超ナノ微粒子を機能化し、生きた細胞、組織内に導入する技術が開発されている（特許文献１）。また、ナノ微粒子を用いて生体試料のイオン化が可能なナノ微粒子レーザー脱離イオン化法（ｎａｎｏ−ＰＡＬＤＩ）と呼ばれた手法も既に提案されている（特許文献２）。また、マコーレート様構造をとり、その二酸化ケイ素に官能基が結合している形を成している新規機能性微粒子を、金属塩化物水溶液と一般のシランカップリング剤とをアルカリ条件にて混合することによって作製できること、及び、この微粒子がイオン化支援剤としても適用され得ることが提案されている（特許文献３）。なお、分析対象物質として、蛋白質、ペプチド、核酸、糖、脂質などの生体物質や、合成低分子化合物、合成ポリマーなどが挙げられる。
【０００５】
しかしながら、既に提案された従来のｎａｎｏ−ＰＡＬＤＩにおいても、ＭＡＬＤＩ同様に、物質選択的なイオン化についての検討はなされていない。また、分析対象として、イオン化しやすい物質とイオン化しにくい物質とが存在しており、各物質のイオン化効率をバランスよく適度に調節できるものではなかった。
【０００６】
ところで、種々の薬理活性を持つ配糖体は、医薬品の候補化合物、リード化合物と目されている重要な天然化合物であり、様々な種類が存在する。しかしながら、これらの配糖体は植物原料中の含有量が低い。そこで、植物原料中に含まれる複数の種類の配糖体（配糖体の群）のみを選択的にバランス良くイオン化（検出）したいという要望があった。しかしながら、特許文献２等で既に提案された機能性微粒子による従来のｎａｎｏ−ＰＡＬＤＩでは、（１）配糖体群を全てイオン化することができない。また、従来のｎａｎｏ−ＰＡＬＤＩでは、（２）配糖体群のうち幾つかの配糖体を仮にイオン化できたとしても、検出される各配糖体のイオン化効率の大きさは夫々同等のレベルではなく、偏りが存在していることが多かった。加えて、従来のｎａｎｏ−ＰＡＬＤＩでは、（３）分析対象に配糖体を含む場合には、そのイオン化効率は全体的に低く、その改善の必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２６９７７０号公報
【特許文献２】特開２００８−１７０３２６号公報
【特許文献３】特開２００８−２６１８３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、質量分析における配糖体のイオン化に特異性を持ち、イオン化効率を上昇させるとともに、個々の配糖体をバランスよくイオン化するイオン化支援剤、及びこれを使用した質量分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、異なる機能性ナノ微粒子からなる懸濁液の混合物を用いてｎａｎｏ−ＰＡＬＤＩ質量分析を行うことで、（１）数種の配糖体のイオン化効率を全体的に上昇させ得ること、（２）個々の機能性微粒子からなる懸濁液単独でイオン化支援した場合にイオン化しづらい配糖体であっても、混合物にすることで予測と反して当該配糖体を効率良くイオン化できること、つまり、配糖体群のみを選択的にバランスよくイオン化して微量な配糖体を検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（態様１）
酸化鉄からなるコアを有した第１機能性ナノ微粒子の第１懸濁液と、
酸化マンガンからなるコアを有した第２機能性ナノ微粒子の第２懸濁液と、
を混合させてなる質量分析用イオン化支援剤であって、
前記微粒子は、前記コアを覆うアモルファスシリカネットワークからなるシェルと、
前記シェルの表面に共有結合的に導入された官能基と、を有し、かつ
イオン化支援対象物質が配糖体の群を含むことを特徴とするイオン化支援剤。
（態様２）
前記第１懸濁液と前記第２懸濁液とは共に飽和溶液であり、かつ、
前記第１懸濁液を１００重量部とした場合に前記第２懸濁液が４２〜９００重量部となるように混合されていることを特徴とする態様１記載のイオン化支援剤。
（態様３）
前記第１機能性ナノ微粒子に導入された前記官能基は、アミノ基及び水酸基の少なくともいずれか一つを含み、かつ、
前記第２機能性ナノ微粒子に導入された前記官能基は、アミノ基及び水酸基の少なくともいずれか一つを含むことを特徴とする態様１又は２記載のイオン化支援剤。
（態様４）
態様１〜３のいずれかに記載のイオン化支援剤を配糖体に近接させる工程と、
前記イオン化支援剤に近接した前記配糖体にレーザーを照射し、前記配糖体のイオン化を支援する工程と、
を含むことを特徴とする質量分析方法。
（態様５）
前記配糖体がＯ−グリコシド結合を有することを特徴とする態様４に記載の質量分析方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のイオン化支援剤は、特定の機能性ナノ微粒子を混合させてなるものであり、個々の微粒子単独ではイオン化させにくい配糖体成分を効率良くイオン化させることができる。つまり、本発明のイオン化支援剤は、配糖体のイオン化に特異性を持ち、質量分析の際に種々の配糖体成分を検出することができる。
【００１２】
また、公知のイオン化支援剤でイオン化しやすい配糖体成分と、イオン化しにくい配糖体成分とが試料中に混在している時でも、本発明のイオン化支援剤は双方の成分をバランスよくイオン化して、検出することができる。また、配糖体以外の物質が試料中に共存していても、配糖体以外の成分のイオン化を抑制しながら配糖体成分のみを重点的かつ選択的にイオン化することができる。従って、植物原料中の微量な配糖体類を、ｎｇ／ｍｌオーダーで微量検出することが可能となる。これは生体内のホルモン濃度と同程度であり、生体試料中での配糖体も検出することができる。生理活性作用を有する配糖体の代謝解析に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】配糖体混合液の検出のために本発明の微粒子混合物を適用した場合のＭＳスペクトルを示す。（実施例１及び比較例１）
【図２】配糖体混合液の検出の際の微粒子混合比率とＭＳスペクトルの相対強度との関係を示す。（実施例２）
【図３】配糖体混合液の検出のために既知のマトリックス（ＤＨＢ）を適用した場合のＭＳスペクトルを示す。（比較例２）
【図４】ペプチド混合液の検出のために本発明の微粒子混合物を適用した場合のＭＳスペクトルを示す。（比較例３）
【図５】ペプチド混合液の検出の際の微粒子混合比率とＭＳスペクトルの相対強度との関係を示す。（比較例４）
【図６】配糖体とペプチドとの混合溶液の検出のために本発明の微粒子混合物又は既知のマトリックスを適用した場合のＭＳスペクトルを示す。（実施例３及び比較例５）
【図７】配糖体とペプチドとの混合溶液の検出の際の微粒子混合比率とＭＳスペクトルの相対強度との関係を示す。（実施例４）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に本発明を詳細に説明するが、これらの記載は本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１５】
（１）機能性ナノ微粒子
まず、本発明のイオン化支援剤を調製するためには、異なる種類の機能性ナノ微粒子を用意する。個々の機能性ナノ微粒子は、湿式沈殿法を用いて調製することができる（特許文献１）。例えば、以下の式で与えられる磁気超ナノ微粒子［ｘＭ（ＯＨ）２・ｙＳｉＯ２］が挙げられる。ここで、ｘＭ（ＯＨ）２はコア成分を、ｙＳｉＯ２はシェル成分を表す。なお、詳しくは、シェル成分はコア成分の表面上に形成されるＳｉ−Ｏの層である。
【００１６】
【数１】
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【００１７】
上記式中、Ｍは遷移金属を示し、具体的にはＦｅまたはＭｎである。ＸはＦ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉから選ばれるハロゲン元素を示す。ｐは２または３、ｎは０から９までの整数、ｍは９または０である。ｘおよびｙはともに１未満の正数である。磁性を発揮するコアおよびその表面修飾層としてのシェルの役割分担の観点から、ｘ＞ｙ、かつ、ｘ／ｙとしては、通常１〜１００、好ましくは２〜２０程度の範囲から選定される。
【００１８】
個々の機能性ナノ微粒子は、酸化鉄（Ｆｅ−Ｏ）または酸化マンガン（Ｍｎ−Ｏ）からなるコアを覆うアモルファスシリカネットワークからなるシェルを調製する工程と、このシェルの表面に共有結合的に官能基を導入する工程との二段階の工程を経た手法により調製することができる。調製された機能性微粒子の平均粒子径は、３０ｎｍ以下であればよいが、好ましくは１〜２０ｎｍである。
【００１９】
なお、この最初の工程では、コア成分の表面では、Ｓｉ−Ｏが非晶質（アモルファス）状態のネットワークを形成するため、コア成分全体がＳｉ−Ｏの層に被覆された状態となる。これがナノ微粒子のシェル成分となる。ここで作られたシェル成分は、後述の官能基を共有結合的に導入するために用いられる。
【００２０】
導入される官能基は、シェルの表面に導入された後、さらに配糖体と複合体を形成できるように反応性または親和性を有するものであればいかなるものでもよいが、本発明者らの経験に依れば、配糖体のイオン化目的には、アミノ基、水酸基又はこれらの組合せが好ましい。特に、酸化鉄（Ｆｅ−Ｏ）からなるコア成分を有したナノ粒子に導入される官能基は、糖との親和性において、アミノ基が望ましく、酸化マンガン（Ｍｎ−Ｏ）からなるコア成分を有したナノ粒子に導入される官能基も、同じ理由でアミノ基が望ましい。
【００２１】
官能基は、例えばシランカップリング剤を介して共有結合的に導入できる。特に、シランカップリング剤は、分析対象物質と複合体を形成できるような反応性または親和性を有する官能基を有しているのが好ましく、特に、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ、また、本明細書ではＡＰＴＥＳとも呼ぶ。）又は３−アミノプロピルトリメトキシシラン（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）が好ましい。
【００２２】
また、二段階の工程を経て微粒子を調製する上述の方法とは別に、水溶性金属塩の水溶液とシランカップリング剤をアルカリ条件下で混合する一段階の工程のみで微粒子を調製する方法（特許文献３）を用いても良い。アルカリ条件下とはｐＨ７を超えるｐＨであればよいが、好ましくはｐＨ１０〜１２である。
【００２３】
水溶性金属塩としては、コア金属の塩であって水に溶解して金属イオンを生じさせるものであればよく、例えば、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏなどが挙げられる。
【００２４】
また、シランカップリング剤は、それ自身が有する官能基（例えば、アミノ基）に加えてシラノール基を有するため、水酸基も導入される。なお、上述した３−アミノプロピルトリエトキシシラン、または３−アミノプロピルトリメトキシシランは、それ自体が水中でアルカリ性を示すために金属塩水溶液に混ぜるだけで良い。
【００２５】
水溶性金属塩の水溶液とシランカップリング剤をアルカリ条件下で混合させることによって得られた微粒子は、ＦｅＣｌ２を用いて、マコーレート様構造を有する微粒子を調製することも可能である。
【００２６】
（２）異種の機能性ナノ微粒子の混合
（１）で合成された機能性ナノ微粒子を、夫々、溶液に懸濁し、懸濁液（好ましくは飽和溶液）を調製する。ナノ微粒子を懸濁する溶液は、微粒子本体や官能基を分解・変性させないものであれば、特に規定されるものではないが、好ましくは、メタノールやエタノール等のアルコール、または、水溶液に懸濁させるのが良い。特にアルコールを使用した場合は、微粒子のコア成分は疎水性の金属酸化物で構成される一方、微粒子表面上のアミノ基や水酸基がアルコールに対して親和性を示すため、アルコール中で微粒子が凝集せず、よく懸濁されるため、さらに好ましい。本発明では、配糖体の検出に適した、酸化鉄（Ｆｅ−Ｏ）を含んだコアを有した機能性ナノ微粒子（第１の微粒子）の飽和溶液と、酸化マンガン（Ｍｎ−Ｏ）を含んだコアを有した機能性ナノ微粒子の飽和溶液と、を用意し、これらを混合する。分析対象となる種々の配糖体を特異的にバランスよくイオン化するためには、後述するように両方の飽和溶液を所定の容量比で混合することが望ましい。容量比率としては、酸化鉄を含んだ飽和溶液が１０％〜７０％であり、かつ、酸化マンガンのナノ微粒子の飽和溶液が３０％〜９０％の範囲がよい。言い換えれば、第１の微粒子（コア成分がＦｅ−Ｏ）を含んだ飽和溶液を１００重量部とした場合に第２の微粒子（コア成分がＭｎ−Ｏ）を含んだ飽和溶液が４２〜９００重量部となるように混合されていることが好ましい。
【００２７】
（３）機能性ナノ微粒子混合物による質量分析
本発明によるナノ微粒子混合物を用いた質量分析方法は、分析対象物質を近接させる工程、およびレーザー照射を行うことにより前記微粒子混合物の近傍の分析対象物質のイオン化を微粒子に支援させる工程を含むものであればよい。
【００２８】
まず、上記微粒子に分析対象物質を近接させる工程を行う。ここで、微粒子と分析対象物質はレーザー照射により分析対象物質がイオン化される程度に近接させればよく、例えば、微粒子の溶液を分析対象物質またはこれを含む試料の溶液と混合すること、あるいは、微粒子を担体に固定化し、そこに分析対象物質またはこれを含む試料を添加することにより近接させることができる。質量分析に供する場合の微粒子と分析対象物質の比は特に限定されないが、好ましくは１：１０〜１０：１、より好ましくは１：３〜３：１の重量比になるように調製することが望ましい。
【００２９】
分析対象物質は、主に配糖体で、Ｏ−グリコシド結合を有する。植物の配糖体の多くが、Ｏ−グリコシド結合を有する。Ｏ−配糖体としては、アグリコン（非糖成分）の種類によって、フェノール配糖体、クマリン配糖体、フラボノイド配糖体、カルコン配糖体、アントシアニジン配糖体、アントラキノン配糖体、インドール配糖体、青酸配糖体（ニトリル配糖体）、ステロイド系配糖体、アルカロイド配糖体などがあげられる。
【００３０】
分析対象物質の配糖体は必ずしも精製された物質である必要はなく、配糖体を含む試料をそのまま微粒子に添加することによって配糖体と微粒子を近接させてもよい。配糖体を含む試料としては、配糖体を含む、植物、動物または微生物などに由来する細胞や組織や体液、またはこれらからの抽出物などの生体試料が挙げられる。また、土壌や排水などから単離された試料であってもよい。
【００３１】
例えば、微粒子混合物に細胞や組織の抽出物を添加し、細胞や組織中に含まれる配糖体の質量分析を行ってもよい。また、培養細胞や単離された組織を含む培地などの溶液中に微粒子混合物を添加してインキュベートした後に、微粒子混合物と配糖体を含む抽出物を回収して質量分析を行ってもよい。さらに、非ヒト検体に微粒子混合物を投与した後に、微粒子混合物を含む抽出物を回収して質量分析を行ってもよい。非ヒト検体としては、例えば、マウスやラットなどの実験動物が挙げられる。また、質量分析のスペクトルを特定のイオンに集束させるために、塩溶液を添加してもよい。一例として、ヨウ化ナトリウム水溶液を終濃度１０ｍＭになるように添加する方法があげられる。
【００３２】
本発明のナノ微粒子混合物を使用する質量分析方法においては、微粒子混合物が固定化された試料プレートを使用し、これに配糖体またはそれを含む試料を付着させることにより配糖体を微粒子混合物に近接させる工程を行ってもよい。例えば、膜などのシート上に用意した試料を試料プレートの上面に付着させ、試料を転写によりシートからプレートに移動させてプレート上に薄く付着させることが好ましい。このようにすれば、試料中に含まれる種々の配糖体を網羅的に質量分析することが可能である。なお、微粒子混合物が修飾された試料プレート上に、配糖体または配糖体を含有する試料を塗布してもよい。例えば、イオン化支援剤である混合溶液を質量分析専用プレートに滴下して混合溶液を乾燥（好ましくは、真空乾燥）させる。その後、試料である配糖体混合液をイオン化支援剤が乾燥した質量分析専用プレートに滴下して乾燥（好ましくは、真空乾燥）させる。なお、自然乾燥の場合、解析に不要な不純物が混入する場合があるので好ましくない。
【００３３】
試料プレートへの微粒子混合物の修飾は化学的結合による修飾であってもよいし、物理的結合による修飾であってもよい。例えば、ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ  Ｔｉｎ  Ｏｘｉｄｅ、インジウムチンオキサイド）シートなどにはＤｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｇｌｕｔａｒａｔｅなどの架橋剤を用いて化学的に固定化することができる。
【００３４】
本発明の質量分析方法においては、次に、微粒子混合物に近接させた配糖体（または微粒子混合物と配糖体が付着したプレート）にレーザー照射して配糖体のイオン化を微粒子混合物に支援させる工程を行う。この工程は市販の質量分析装置によって行うことができる。
【００３５】
試料に微小径のレーザー光が当たると、微粒子がレーザー光を吸収し、その金属酸化物から構成されている微粒子のコアと試料との相互作用により試料分子をイオン化させる。
コア成分が、鉄およびマンガンからなる各微粒子を、一定の比率で混合して、イオン化を支援することで、単一微粒子ではイオン化しにくかった配糖体のイオン化効率が上昇するとともに、個々の配糖体をバランスよくイオン化することができる。また、試料が、配糖体以外の成分との混合物の場合、配糖体以外の成分のイオン化を抑制して、配糖体を選択的にイオン化することができる。本発明のナノ微粒子混合物による質量分析方法を行えば、分析者は、多成分中の配糖体を感度良く検出することができるので、生理活性を有する配糖体を、選択的に効率よく分析することができる。
【００３６】
以上のように、本発明の配糖体用のイオン化支援剤は、上記の酸化鉄ナノ微粒子および酸化マンガンナノ微粒子を一定の比率で混合したものを含有し、質量分析に使用される。このイオン化支援剤を応用して、このイオン化支援剤の塗布及び交換が可能な検知部を備えた配糖体感知センサを提供することも可能となる。
【実施例】
【００３７】
次に本発明の具体的な実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３８】
実施例１：
（１）ナノ微粒子の調製（露出される官能基；水酸基及びアミノ基）
微粒子の調製には、単分散に微粒子が得られる湿式沈殿法を用いた。実施例１では、上述した金属塩水溶液とシランカップリング剤の材料として、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏと３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を用いて、鉄をコア成分とするマコーレート様構造を持つ第１の機能性ナノ微粒子を調製した。具体的には、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２ｇを秤量し１００ｍｌの超純水に溶解させて（終濃度１０ｍＭ）、水溶液を得た（操作１）。そして、この水溶液を室温で約１０分間、充分攪拌した（操作２）。１００ｍｌの３−アミノプロピルトリエトキシシランに混合させて６０分間反応を完結させた（操作３）。６０分間遠心分離器に掛けて上澄み液を捨てた（操作４）。超純水を注いで再分散させてから遠心分離器に掛け上澄み液を捨てた（操作５）。この操作５を数回繰り返し、沈殿物を洗浄した（操作６）。次いで、約７７℃に保持した恒温槽で乾燥後、乳鉢で微粉砕し（操作７）、鉄をコア成分とするナノ微粒子（Ｆｅ−Ｏ）を得た。この場合の仕込み比は、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ：ＡＰＴＥＳ＝１：２となるものとした。
【００３９】
鉄をコア成分とする上記ナノ微粒子（Ｆｅ−Ｏ）を調製した方法と同様な方法で、仕込み比を、ＭｎＣｌ２：ＡＰＴＥＳ＝１：２としてマンガンをコア成分とする第２の機能性ナノ微粒子（Ｍｎ−Ｏ）を得た。
【００４０】
なお、上記の方法で作製された第１ナノ微粒子及び第２ナノ微粒子のどちらの場合についても、コア成分の表面では、ＡＰＴＥＳを構成するＳｉ−Ｏが非晶質（アモルファス）状態のネットワークを形成するため、コア成分の外周にはＳｉ−Ｏの層がさらに被覆された状態となる。これが、第１ナノ微粒子（又は第２ナノ微粒子）のシェル成分となる。
【００４１】
（２）異なる機能性ナノ微粒子の混合
（１）で得られた酸化鉄（Ｆｅ−Ｏ）をコア成分とする第１の機能性ナノ微粒子および酸化マンガン（Ｍｎ−Ｏ）をコア成分とする第２の機能性ナノ微粒子の粉末を、各々メタノール０．５ｍｌに懸濁し、ナノ微粒子析出物を有するナノ微粒子飽和液を調製した。このＦｅ−Ｏ微粒子を含んだ飽和溶液（以下、Ｆｅ−Ｏ溶液とも呼ぶ。）とＭｎ−Ｏ微粒子を含んだ飽和溶液（以下、Ｍｎ−Ｏ溶液とも呼ぶ。）とを容量比１：１で混合した。
【００４２】
（３）配糖体混合液の調製
配糖体は、ジンセノサイドＲｇ１，  Ｒｅ，  Ｒｂ１（Ｒｇ１：分子量８０１．０、Ｒｅ：分子量９４７．２、Ｒｂ１：分子量１１０９．３、終濃度が各３３ｐｍｏｌ／μｌまたは６６ｐｍｏｌ／μｌ）をメタノールで溶解し、ヨウ化ナトリウム水溶液を終濃度１０ｍＭになるように添加し、配糖体混合液とした。
【００４３】
（４）ナノ微粒子混合物による質量分析
Ｆｅ−Ｏ溶液とＭｎ−Ｏ溶液との混合溶液を質量分析専用プレート（商品名：Ｖ７００８１３、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社）に１μＬ滴下し真空乾燥させた。乾燥後、（３）で調製した配糖体混合液１μＬを質量分析専用プレートに滴下し真空乾燥させた。その後、質量分析装置（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ−ＲＰ；  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社）によりサンプル検出を行った。なお、質量分析装置の設定条件として、Ｌｉｎｅａｒ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅモードで加速電圧を２０ｋＶ、Ｄｅｌａｙ  ｔｉｍｅを６００ｎｓとした。マススペクトルを図１（Ａ）に示す。ここで、縦軸は相対強度を示す。各ジンセノサイドがナトリウム付加体としてバランスよく、イオン化された。
【００４４】
比較例１：個々の微粒子飽和溶液
実施例１の混合溶液と比較するために、実施例１で調製したＦｅ−Ｏ溶液と、Ｍｎ−Ｏ溶液とを夫々単独で用いて、実施例１と同様に、質量分析を行った。Ｆｅ−Ｏ溶液を使用した場合では、図１（Ａ）に示すように、他の配糖体成分に比べＲｂ１のイオン化効率が低下した。一方、単独のＭｎ−Ｏ溶液を使用した場合では、図１（Ａ）に示すように、微粒子混合物に比べ、各配糖体成分のイオン化効率は全体的に著しく低下した。なお、図１（Ｂ）に大きく拡大した図を示す。
【００４５】
実施例２：Ｆｅ−ＯとＭｎ−Ｏとの混合比率
Ｆｅ−ＯおよびＭｎ−Ｏの各ナノ微粒子の調製は、実施例１と同様に行った。両者のナノ微粒子混合物の調製では、各飽和溶液を、容量比において、Ｆｅ−Ｏを０〜１００％まで１０％刻みで、Ｍｎ−Ｏを１００〜０％まで１０％刻みで、混合液を調製した。実施例１と同様に、３種類のジンセノサイドを用いて、同じ条件で質量分析を行った。各ジンセノサイドのマススペクトルの、相対強度を図２に示す。Ｍｎ−Ｏの微粒子３０％〜９０％、Ｆｅ−Ｏの微粒子１０％〜７０％の範囲において、微粒子単独よりも、ジンセノサイドの３種ともイオン化効率が上昇した。
【００４６】
比較例２：マトリックス支援型質量分析（ＭＡＬＤＩ）
実施例１のナノ微粒子の代わりに、マトリックスとして、２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＨＢ）を用いた。配糖体は、三種類のジンセノサイドＲｇ１、Ｒｅ、Ｒｂ１（終濃度が各６６ｐｍｏｌ／μｌ）をメタノールで溶解し、ヨウ化ナトリウム水溶液を終濃度２０ｍＭになるように添加し、配糖体混合液とした。該マトリックス飽和溶液と上記配糖体混合液を容量比で、１：１の割合で混合した物を質量分析専用プレート（Ｖ７００８１３：  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社）に１μＬ滴下し自然乾燥させ共結晶体を調製した。その後、実施例１と同様にジンセノサイド混合液の質量分析をＬｉｎｅａｒ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅモードで行い、サンプル解析を行った。結果を図３（Ａ）に示す。三つのジンセノサイドを同時にイオン化するが、Ｒｂ１に対して、Ｒｇ１及びＲｅのイオン化効率が悪く、実施例１のｎａｎｏ−ＰＡＬＤＩ法の結果（図１（Ａ）及び図３（Ｂ）を参照）に比してイオン化のバランスが悪かった。
【００４７】
比較例３：ナノ微粒子混合物によるペプチドの質量分析
実施例１と同様にして、Ｆｅ−Ｏ溶液とＭｎ−Ｏ溶液とを１：１で混合した。この混合液に、二種のペプチド（Ｂｌａｄｙｋｉｎｉｎ１−７；分子量７５７．４、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ；分子量１２９６．０）を各々終濃度が１０ｐｍｏｌ／μｌとなるように混合し、ヨウ化ナトリウム水溶液を終濃度が１０ｍＭになるように添加し、ペプチド混合液とした。このペプチド混合液に対して実施例１と同様な質量分析を行った。また、Ｆｅ−Ｏ溶液又はＭｎ−Ｏ溶液の単独溶液に二種類のペプチドとヨウ化ナトリウム水溶液とを混合・添加して、同様な質量分析を行った。これらの結果を図４に示す。微粒子混合溶液は、ペプチドを効率的にイオン化することはなく、Ｂｌａｄｙｋｉｎｉｎ１−７、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉは、Ｎａ存在下でイオン化されなかった。また、個々の微粒子溶液においても、二種類のペプチドをイオン化しなかった。
【００４８】
比較例４：ペプチドの質量分析におけるナノ微粒子混合比率
比較例３のペプチド混合液を用いて、実施例２と同様に、微粒子の混合比率を変化させた時の結果を図５に示す。対照として、ＭＡＬＤＩ（マトリックス：ＤＨＢ）法を用いた時の値を示した。二種のペプチドは、微粒子の混合比率を変化させても、ほとんどイオン化しなかった。
【００４９】
実施例３：配糖体とペプチドとの混合液
実施例１の配糖体混合液と、比較例３のペプチド混合液を混合し、５種類の成分からなる混合液を調製した（Ｒｇ１：分子量８０１．０、Ｒｅ：分子量９４７．２、Ｒｂ１：分子量１１０９．３、終濃度が各３３ｐｍｏｌ／μｌＢｌａｄｙｋｉｎｉｎ１−７；分子量７５７．４、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ；分子量１２９６．０、終濃度１０ｐｍｏｌ／μｌ）。配糖体とペプチドとの混合液に対して、実施例１と同様のナノ微粒子混合溶液（Ｍｎ−ＯとＦｅ−Ｏとの混合比率は９：１）を用いて質量分析を行った。この結果を図６の上段に示す。三種のジンセノサイドは、イオン化されたが、ペプチドはイオン化されなかった。つまり、配糖体のみをイオン化する選択的なイオン化がされた。
【００５０】
比較例５：
実施例３の配糖体・ペプチド混合液を用いて、ＭＡＬＤＩ（マトリックス：ＤＨＢ）法で質量分析を行った。この結果を図６の下段に示す。配糖体よりもペプチドの方が、イオン化効率が良かった。
【００５１】
実施例４：
実施例３の配糖体・ペプチド混合液を用いて、実施例２と同様に、微粒子の混合比率を変化させた時の結果を図７に示す。比較対照として、ＭＡＬＤＩ（マトリックス：ＤＨＢ）法を用いた時の値を示した（図中、横軸左端の結果を参照）。三種のジンセノサイド（図中、黒塗りの各符号を参照）のイオン化効率が上昇したが、微粒子溶液の混合比率を変化させても、ペプチド（図中、白抜きの各符号を参照）については、ほとんどイオン化しなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明のイオン化支援剤及びこれを使用した質量分析方法は、配糖体の選択的なイオン化を支援する。従って、生理活性を有する微量な配糖体を検出することができるため、植物などの生細胞や組織などの試料に含まれる配糖体代謝物の解析に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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