(57)【要約】【課題】マトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤を提供すること、さらに詳しくは、表皮細胞からの伝達物質ＴＮＦ−α、ＩＬ−６などの放出を抑制、及び／又はＴＧＦ−βを促進することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤及び／又はコラーゲン産生促進剤を提供すること。【解決手段】フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールは、表皮細胞における紫外線による伝達物質ＴＮＦ−α、ＩＬ−６などの放出を抑制、及び／又はＴＧＦ−βを促進することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤及び／又はコラーゲン産生促進剤であることを見出した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤及び／又はコラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを有効成分とすることにより、表皮細胞からの伝達物質ＴＮＦ−α、及び／又はＩＬ−６の放出を抑制することを特徴とする請求項１に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤。
【請求項３】
フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを有効成分とすることにより、表皮細胞からの伝達物質ＴＧＦ−βを促進することを特徴とする請求項１に記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項４】
請求項１から請求項３の何れかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤及び／又はコラーゲン産生促進剤を用いたしわ改善用の化粧料組成物。
【請求項５】
フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを０．０００００１〜１０重量％含有する請求項４に記載の化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明はフコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤及び／又はコラーゲンの産生促進剤、及びそれらを含む化粧料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】  皮膚は、常に外界にさらされており、加齢とともにしわ、タルミ、くすみ、色素沈着などが生じる。外界にさらされた皮膚に生じるこれらの変化は主に光老化によるものであるといわれている。【０００３】  紫外線は、マトリックス線維の分解を促進するマトリックスメタロプロテアーゼなどのコラゲナーゼと病態との関係について多くの知見が得られている。真皮においては紫外線照射により線維芽細胞においてマトリックスメタロプロテアーゼの産生が誘導され、その結果、真皮マトリックスの主成分であるコラ−ゲンやエラスチンなどの分解が促進され、皮膚の老化が進行することが知られている。【０００４】  このような紫外線による皮膚の光老化を抑制するために種々の研究がなされてきた。全トランス型のレチノイン酸の塗布が光老化の症状の改善に有効であることが広く知られているほか、アニリン誘導体等や特定の植物エキスを利用して紫外線露光に起因するＤＮＡ損傷を防止する方法（特許文献１及び２）、スルフヒドリル基を有する化合物及びジスルフィド結合を有する化合物を利用する方法（特許文献３）、乳清タンパク質を利用する方法（特許文献４）活性酸素消去作用を有する柿蒂抽出物を利用する方法（特許文献５）などが見出されてきた。【０００５】  ところで、従来、紫外線照射による線維芽細胞における機能低下に関するメカニズムについては、真皮の線維芽細胞に対して紫外線が直接ダメージを与えることにより、コラ−ゲン合成能が低下するとともに、マトリックスメタロプロテアーゼなどのコラゲナーゼの発現が誘導され、コラーゲンやエラスチンなどの細胞外マトリックス成分の分解が促進されるとされてきた。【０００６】  近年は、表皮細胞と線維芽細胞の相互の情報伝達の重要性が提示されている。例えば、光老化に係わる報告ではないが、角化細胞、線維芽細胞及び他の皮膚細胞などの間の細胞対細胞の連絡を仲介する成長及び分化ホルモン、放出ホルモン、神経伝達物質などの内因性化学物質の合成を促す信号発信化合物としてアンドログラホリドという物質がある。アンドログラホリド及び／又はその誘導体等を含有するスキンケア組成物及び／又は美容組成物（特許文献６）が内因性化学物質の生合成及び／又はバイオ活性を誘発及び促進することが報告されている。また、ヨクイニンエキス、クロレラエキス、トルメンチラエキス及びフコキサンチン及び／又はフコキサンチノールは表皮細胞での成長因子の一つである血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の過剰な産生を抑制し、血管新生を抑制することによって種々の皮膚疾患を予防すること（特許文献７および８）が報告されている。【０００７】  表皮細胞と線維芽細胞のクロストークの一つとして、紫外線照射された表皮細胞が線維芽細胞に対してマトリックスメタロプロテアーゼ−１発現を亢進すること、また、マトリックスメタロプロテアーゼ−１を活性化する因子を分泌することが強く示唆されたという報告がある（非特許文献１）。【０００８】  一方、フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールについては、皮膚外用剤に配合された例が報告されているが（特許文献８〜１１）、フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールについて、紫外線に照射された表皮細胞からの伝達物���の放出が抑制及び／又は促進され、その結果、線維芽細胞でのマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生が効果的に阻害される効果及び／又は線維芽細胞でのコラーゲン産生が促進される効果についての報告はこれまでにない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平０９−２３５２５６号公報
【特許文献２】特開２００８−２４７８５４号公報
【特許文献３】特開２００２−０４７１７８号公報
【特許文献４】特表２００２−５２９３８７号公報
【特許文献５】特開２００６−０８３０７０号公報
【特許文献６】特開２００３−５１６９５０号公報
【特許文献７】特開２００７−０７７１０４号公報
【特許文献８】特開２００８−００１６２３号公報
【特許文献９】特開２０１０−２０９０２３号公報
【特許文献１０】特許第３７７０５８８号公報
【特許文献１１】特許第４５６９３１２号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  （２００８）  １２８  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ１−２８４，ｐｏｓｔｅｒ  １１７７．
【非特許文献２】Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）  １５９：５５０−５５６
【非特許文献３】Ｅｕｒ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  （２０１０）  ２３１：１６３−１６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】１）表皮細胞からのマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生を抑制する伝達物質の放出を抑制するマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤を提供することを目的とする。
２）表皮細胞からのコラーゲン合成を促進する伝達物質の産製を促進するコラーゲン合成促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤及び／又はコラーゲン産生促進剤。【００１３】フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを有効成分とすることにより、表皮細胞からの伝達物質ＴＮＦ−α、及び／又はＩＬ−６の放出を抑制することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤。【００１４】フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを有効成分とすることにより、表皮細胞からの伝達物質ＴＧＦ−βを促進することを特徴とするコラーゲン産生促進剤。【００１５】マトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤及び／又はコラーゲン合成促進剤を用いたしわ改善用の化粧料組成物。【００１６】フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを０．０００００１〜１０重量％含有する化粧料組成物。
【発明の効果】
【００１７】フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを利用することで、優れたマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤とコラーゲン産生促進剤が得られる。また、フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを配合することで、皮膚のシワ、たるみ、シミ等の予防及び改善等の予防及び改善等皮膚に対して美肌効果及び抗老化効果を発揮する化粧料組成物、皮膚外用剤が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明におけるフコキサンチン及び／又はフコキサンチノールによる紫外線照射後の伝達物質を介したマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生、コラーゲン産生の仕組み。通常時と表記している部分以下の流れフコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを含まない場合であり、フコキサンナン添加時と表記している部分以下の流れはフコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを含む場合
【図２】紫外線照射後の表皮細胞における炎症性サイトカインＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現
【図３】紫外線照射後の表皮細胞における炎症性サイトカインＩＬ−６のｍＲＮＡ発現
【図４】紫外線照射後の表皮細胞におけるコラーゲン産生に関わるサイトカインＴＧＦ−βのｍＲＮＡ発現
【図５】紫外線照射後の表皮−真皮間相互作用による線維芽細胞が放出したマトリックスメタロプロテアーゼ−１前駆体（ｐｒｏＭＭＰ−１）産生量
【図６】線維芽細胞におけるフコキサンチン添加時のコラーゲン産生量
【発明を実施するための形態】
【００１９】  本発明において、伝達物質とは細胞から分泌されることにより生理活性を示すサイトカインであり、具体的にはリンパ球が産生するリンホカイン、単球・マクロファ−ジが産生するモノカイン、白血球の細胞間伝達物質としてのインターロイキン（以下ＩＬ）、造血に働くコロニ−刺激因子（ＣＳＦ）、その他腫瘍壊死因子（以下ＴＮＦ）や上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来細胞成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、形質転換成長因子（以下ＴＧＦ）など、血球系細胞、上皮細胞、線維芽細胞を含む種々の細胞から分泌される液性因子の総称である。これらは、細胞種の系列ごとに独立して機能するのではなく、種々の細胞間でサイトカインネットワ−クを形成し、相互に作用して機能している。その中で、組織に炎症刺激が加わるとＩＬ−１が産生され、引き続いてＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８などの炎症性サイトカインが誘導される。また、ＩＬ−１に正のフィ−トバック機構が働き、ＩＬ−１自身の産生が促進される。このカスケ−ドに対して、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３は、単球・マクロファ−ジの炎症性サイトカイン産生を抑制したり、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）の産生を促進することが知られている。ＴＧＦ−βは、細胞の分化・遊走・接着に密接に関与し、個体発生や組織再構築、創傷治癒、炎症・免疫、癌の浸潤・転移などの幅広い領域で重要な役割を果たしている。
【００２０】図１は、本発明におけるフコキサンチン及び／又はフコキサンチノールによる紫外線照射後の伝達物質を介したマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生、コラーゲン産生の仕組みを示す。図１の中で、通常時と表記している部分以下の流れはフコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを含まない場合、フコキサンチン添加時と表記している部分以下の流れはフコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを含む場合である。
本発明者らはこれら伝達物質の中でも、紫外線照射により表皮細胞から放出される炎症性サイトカインのうち、特にＴＮＦ−α、ＩＬ−６に対して、フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールによる産生抑制効果を確認した。
具体的には、フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールは、紫外線照射した表皮細胞の培養上清による線維芽細胞のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制作用を見出し、紫外線ダメージによるコラーゲンの分解を顕著に抑制する効果が期待できることがわかった。
【００２１】またコラーゲン産生において主要なサイトカインであるＴＧＦ−βに関してフコキサンチン及び／又はフコキサンチノールによる産生促進効果を確認した。具体的には、フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを取り込ませた表皮細胞に紫外線照射すると、ＴＧＦ−βのｍＲＮＡ発現を有意に亢進することが明らかになった。このことからフコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを配合することで、優れたコラーゲン産生促進剤が得られる。
【００２２】  以上の知見から、フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールを配合することで、皮膚のしわ、たるみ等の予防及び改善等皮膚に対して美肌効果及び抗老化効果を発揮する皮膚外用剤が得られる。
【００２３】  本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤及びコラーゲン産生促進剤は、フコキサンチン及び／／又はフコキサンチノールを有効成分とする。
【００２４】  本発明において使用されるフコキサンチンは、天然物由来のものであることが望ましく、フコキサンチンを多く含む褐藻類、微細藻類等の藻類を用いることが好ましい。褐藻類、微細藻類の種類は、その盤状体中もしくは糸状体中にフコキサンチンが含まれているものであれば特に制限されず、このような藻類としては、例えば、コンブ科（Ｌａｍｉｎａｒｉａｃｅａｅ）、チガイソ科（Ａｌａｒｉａｃｅａｅ）等のコンブ目（Ｌａｍｉｎａｒｉａｌｅｓ）に属する褐藻類；  ナガマツモ科（Ｃｈｏｒｄａｃｅａｅ）、モズク科（Ｓｐｅｒｍａｔｏｃｈｎａｃｅａｅ）等のナガマツモ目（Ｃｈｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）に属する褐藻類；珪藻等の微細藻類が挙げられ、これらの藻類の盤状体もしくは糸状体が好ましい。前記褐藻類の盤状体もしくは糸状体の中でも、ナガマツモ科のオキナワモズク（Ｃｌａｄｏｓｉｐｈｏｎｏｋａｍｕｒａｎｕｓ）の盤状体又はモズク科のモズク（Ｎｅｍａｃｙｓｔｕｓｄｅｃｉｐｉｅｎｓ）の糸状体、コンブ科のコンブの盤状体もしくは糸状体、チガイソ科のワカメの盤状体もしくは糸状体、珪藻等が好ましい。本発明において、これらの植物を１種単独で、又は２種以上組み合わせて用いることができる。また、フコキサンチンを含有するこれらの植物をそのまま使用することもできるが、抽出物を本発明の有効成分として用いることができる。フコキサンチンを含む植物は乾燥、細切、破砕、粉砕等の処理に供されたものであってもよい。
【００２５】  フコキサンチンを含む抽出物は、前記する植物（又は動物）を抽出原料として、これを、そのまま或いは必要に応じて、乾燥、細切、破砕、粉砕、圧搾、煮沸或いは発酵処理したものを溶媒で抽出処理することにより取得することができる。
【００２６】  フコキサンチンを含む植物（又は動物）の抽出物の抽出処理に使用される溶媒としては、例えば、極性有機溶媒、水と極性有機溶媒の混合液等の極性溶媒を挙げることができる。また、当該極性有機溶媒としては、例えばメタノ−ル、エタノ−ル、ブタノ−ル、イソプロパノ−ル等の炭素数１〜５の低級アルコ−ル；プロピレングリコ−ル；アセトン；酢酸エチル；ヘキサン；ジクロロメタン；クロロホルム等の単独或いは２種以上の組み合わせを挙げることができる。上記極性溶媒の中で、人体への安全性と取扱性の観点から、好ましくはエタノ−ル、プロパノ−ル、ブタノ−ル等の炭素数２〜４の低級アルコ−ル；アセトン；ヘキサン又はこれらの混合物が挙げられる。さらに好ましくはエタノ−ル、アセトン、ヘキサン、又はこれらの混合物が挙げられる。
【００２７】  フコキサンチンは脂溶性である。従って、例えば、抽出溶媒として炭素数１〜５の低級アルコ−ルと水を混合して用いる場合、該混合溶液の総重量に対する炭素数１〜５の低級アルコ−ルの含有割合は、５０〜９９．９重量％程度、好ましくは７０〜９９．９重量％程度、より好ましくは９０〜９９．９重量％程度が望ましいが、フコキサンチンが抽出される限り特に限定されない。
【００２８】  抽出処理は、例えば、褐藻類等の抽出原料１重量部に対して、約５〜１００重量部の抽出溶媒を用いて行われる。また、当該抽出処理方法としては、通常用いられている植物抽出物の抽出処理方法を採用することができ、具体的には、冷浸、温浸等の浸漬法；低温、室温又は高温下で攪拌する方法；パ−コレ−ション法等が例示される。フコキサンチンを含む植物の抽出物の抽出処理の具体例として、例えば、乾燥した褐藻類の抽出原料を粉砕し、当該乾燥粉砕物１重量部に対して約５〜１００重量部の抽出溶媒を添加し、室温で撹拌しながら１〜５時間抽出を行った後、濾過や遠心分離等の常法の固液分離手段により固形分を取り除き、溶液画分を収得する方法を例示することができる。
【００２９】  上記方法で得られるフコキサンチンを含有する抽出物は液状であり、本発明には該抽出物をそのままの状態で用いることもできるが、有機溶媒が含まれている場合には減圧蒸留等により有機溶媒を取り除くことが好ましい。また必要に応じて、更に、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等の乾燥処理に供することにより水分を取り除き、乾燥品として用いることもできる。また、簡便には、上記フコキサンチンを含む抽出物として、商業的に入手できるものを使用することもできる。
【００３０】  フコキサンチノールは、フコキサンチンが加水分解されたものである。従って、本発明において使用されるフコキサンチノールは、前記の方法によって得られたフコキサンチンを従来公知の方法に従って、加水分解して得ることができる。例えば、リパ−ゼ（Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３２，９４６−９５１，２００２）やコレステロ−ルエステラ−ゼ（ＤｒｕｇＭｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３２，２０５−２１１，２００４）などの脂質分解酵素によってフコキサンチンをフコキサンチノールに分解することができる。
【００３１】  本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤及び／又はコラーゲン産生促進剤の有効成分として、フコキサンチン及び／又はフコキサンチノールのいずれか一方を使用することもでき、またこれらを併用することもできる。
【００３２】  本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤及び／又はコラーゲン産生促進剤は、上記有効成分からなるものであっても良いが、薬学的に許容される従来公知の担体、希釈剤、賦形剤等と組み合わせて各種剤型に調製することもできる。
【００３３】  本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤及びコラーゲン産生促進剤における有効成分の総量は、０．０１〜９９重量％程度、好ましくは０．１〜９９重量％程度、より好ましくは１〜９９重量％程度である。
【００３４】  本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤及び／又はコラーゲン産生促進剤を含む外用剤には、既存のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤、コラーゲン合成促進剤、抗炎症剤、肌荒れ予防／改善剤、色素沈着予防／改善剤を配合することができる。これらの成分を併用することは、本効果の相乗効果をもたらし、本効果を損なうものではない。
【００３５】  既存の抗炎症剤としては、ステロイド系抗炎症剤（ヒドロコルチゾンなど）、非ステロイド系抗炎症剤（アスピリンなど）、消炎酵素剤（キモトリプシン）、ε−アミノカプロン酸及びその誘導体、アラントイン、塩化リゾチ−ム、グアイアズレン、グリチルレチン酸やグリチルリチン酸及びそれらの誘導体、コンドロイチン硫酸及びその誘導体、コンフリ−、各種ポリフェノ−ルなど、また、甘草エキス、アルニカエキス、オトギリソウエキス、カモミラエキス、ティ−ツリ−オイル、シコンエキス、シソエキス、シラカバエキス、ソウハクヒエキス、トウキエキス、トウキンセンカエキス、ニワトコエキス、モモ葉エキス、ヨモギエキスなどの植物エキス等が挙げられる。
【００３６】  既存の肌荒れ予防／改善剤としては、保湿剤、細胞間脂質及びその類似体、ビタミン類などが挙げられる。保湿剤としては、グリセリン、ブチレングリコ−ル、ポリエチレングリコ−ルなどの多価アルコ−ル、トレハロ−ス類、混合異性化糖、プルラン、マルト−スなどの糖類、ヒアルロン酸ナトリウム、コラ−ゲン、エラスチン、コンドロイチン硫酸ナトリウムなどの生態高分子、アミノ酸、乳酸ナトリウム、尿素、ベタイン、カモミラエキスなどの各種植物・海藻エキス等が、細胞間脂質及びその類似体としては、スフィンゴ脂質、セラミド、擬似セラミド、コレステロ−ル及びその誘導体、リン脂質及びそれらの誘導体が、ビタミン類としては、ビタミンＡ群、ビタミンＤ群、ビタミンＥ群、パントテン酸カルシウム、ビオチン、ビタミンＣ群、ニコチン酸アミド、ビタミンＢ６群及びそれらの誘導体が、トラネキサム酸及びその誘導体、カルニチン及びその誘導体などが挙げられる。
【００３７】  既存の色素沈着予防／改善剤としては、前記のビタミンＣ及びその誘導体、アルキルグリセリルエ−テル、アルブチン、イオウ、エラグ酸、カモミラエキス、コウジ酸、プラセンタエキス、ルシノ−ル、リノ−ル酸及びリノレン酸およびそれらの誘導体、ニコチン酸アミド、トラネキサム酸およびその誘導体、ビタミンＥフェルラ酸エステルなどが挙げられる。
【００３８】  本発明品の線維芽細胞のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤及び／又はコラーゲン産生促進剤を配合した外用剤には、本発明の効果を損なわない範囲で化粧品、医薬部外品等に配合される成分として流動パラフィンなどの炭化水素、植物油脂、ロウ類、合成エステル油、シリコ−ン系の油相成分、フッ素系の油相成分、高級アルコ−ル類、脂肪酸類、増粘剤、紫外線吸収剤、粉体、顔料、色材、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、多価アルコ−ル、糖、高分子化合物、生理活性成分、経皮吸収促進剤、溶媒、抗酸化剤、香料、防腐剤等を配合することができる。
【００３９】  抗酸化剤としては、ビタミンＥおよびその誘導体、ビタミンＣおよびその誘導体が挙げられる。
【００４０】  上記マトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制剤及び／又はコラーゲン産生促進剤の外用剤への配合量は、用途、剤型、配合目的等によって異なり、特に限定されるものではないが、一般的には、フコキサンチンの原体として、外用剤中０．０００１〜１０．０質量％が好ましく、より好ましくは０．０００１〜０．００１質量％である。また、本発明の化粧料組成物におけるフコキサンチノールの配合量は、剤型によって異なるが、例えば、０．０００００１〜１０重量％程度、好ましくは０．００００１  〜５重量％程度、より好ましくは０．００００１〜２重量％程度、より好ましくは０．００００１〜０．１重量％程度、より好ましくは０．００００１〜０．０００５重量％程度である。
【００４１】以上の内容を踏まえ、以下、３つの実施例について検証を行った。
（実施例１）は紫外線の中でも表皮に影響を与えるといわれている紫外線Ｂ波（以下ＵＶＢ）照射により表皮細胞に情報伝達物質として炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）が発現し、それをフコキサンチンが抑制するかどうかについて検証を行った。さらに、コラーゲン産生において主要なサイトカインであるＴＧＦ−βが、紫外線照射によって減少し、あらかじめフコキサンチンを細胞に添加しておくことでそれが抑制されるかどうかの確認を行った。
（実施例２）では、（実施例１）でＵＶＢ照射により表皮に発現した情報伝達物質である炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）が放出された培地を回収し、真皮の線維芽細胞に添加することで、表皮細胞と線維芽細胞のクロストークを擬似的に再現し、その結果線維芽細胞のマトリックスメタロプロテアーゼ−１の産生を抑制するかどうかを検証した。
（実施例３）では、真皮の線維芽細胞にフコキサンチンを添加することで、コラーゲンそのものの量が増加するかどうかの検証を行った。コラーゲンは、ヒトの皮膚では真皮に恒常的に存在している。
以下、試験結果では、横軸は該当行項目の有無を表している。また、図６においてフコキサンチンの行の横にμＭ単位で示しているものは、フコキサンチン添加時の終濃度を示している。なお、吸光度をＡＢＳと表記する。図２〜５のグラフ横軸に記載のＵＶＢに関しては、ＵＶＢを未照射の場合は−と示し、本文中ではＵＶＢ−と表記した。また照射した場合は＋で示し、本文中ではＵＶＢ＋と表記した。図２〜５のグラフ横軸に記載のフコキサンチンに関しては、未添加の場合は−、添加した場合は＋で示した。
【実施例１】
【００４２】  ＵＶＢ照射表皮細胞からの伝達物質ＴＮＦ−α、ＩＬ−６産生抑制作用と、ＴＧＦ−βの産生促進作用【００４３】  １．試験の概要
構成タンパクや脂質、あるいはＤＮＡが紫外線や活性酸素によって損傷を受けた表皮細胞では、多岐に渡る伝達物質が産生されることが広く知られている。
そこで、フコキサンチンがこうした伝達物質の産生を抑制するかを評価した。【００４４】  ２．実験方法
フコキサンチンが、終濃度５μＭになるように表皮細胞に添加して２４時間培養し、さらに２０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを照射して２４時間後の表皮細胞から放出された伝達物質（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β）のｍＲＮＡ発現を測定した。【００４５】  ３．結果
図２は、紫外線照射後の表皮細胞における炎症性サイトカインＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現、図３は、紫外線照射後の表皮細胞における炎症性サイトカインＩＬ−６のｍＲＮＡ発現、図４は紫外線照射後の表皮細胞におけるコラーゲン産生に関わるサイトカインＴＧＦ−βのｍＲＮＡ発現を示す。
縦軸はｍＲＮＡ発現量を示している。あらゆる細胞に恒常的に発現しているタンパクであるＧＡＰＤＨを内部標準として補正し、コントロールであるＵＶＢ−の数値を１として表した。横軸は、各群を略語で示す。ＵＶＢ＋はＵＶＢ−よりもＴＮＦ−α、ＩＬ−６のｍＲＮＡ発現を有意に亢進させた一方で、フコキサンチンはＵＶＢ＋に対してＴＮＦ−α、ＩＬ−６のｍＲＮＡ発現を有意に抑制した。また、ＴＧＦ−βに関しては、ＵＶＢ＋がＵＶＢ−に対してｍＲＮＡ発現を有意に減少させた一方で、フコキサンチンはＵＶＢ＋に対してｍＲＮＡ発現の減少を有意に抑制した。
【実施例２】
【００４６】  ＵＶＢ照射表皮細胞培養上清による線維芽細胞のマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生亢進に対する抑制作用【００４７】  １．試験の概要
表皮が紫外線によってダメージを受けると、数種の炎症性サイトカインが発現する。それらのサイトカインは真皮へと分泌され、線維芽細胞内に発現するマトリックスメタロプロテアーゼ−１のｍＲＮＡ発現を促進し、マトリックスメタロプロテアーゼ−１前駆体（以下ｐｒｏＭＭＰ−１）を産生する（非特許文献２及び３）。ｐｒｏＭＭＰ−１はその後、セリンプロテアーゼ群を中心としたさまざまな酵素により活性化され、活性型のマトリックスメタロプロテアーゼ−１となるが、マトリックスメタロプロテアーゼ−１の活性化には種々のプロテアーゼが複雑に関わっており、サイトカインからの直接的な影響を受けたマトリックスメタロプロテアーゼ−１の産生を確認するには、ｐｒｏＭＭＰ−１を測定するのが適していると考えられる。
そこで、こうした損傷を受けた表皮細胞からの伝達物質の産生抑制を経由した、間接的な線維芽細胞からのマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生抑制について評価すべく、その前駆体であり、紫外線照射後に産生されたサイトカインからの影響を受けて産生が亢進されるｐｒｏＭＭＰ−１をフコキサンチンが抑制するかどうかの評価を行った。【００４８】  ２．実験方法
フコキサンチンが、終濃度５μＭになるように表皮細胞に添加して２４時間培養し、さらに２０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを照射して２４時間後に回収した表皮細胞培養上清を線維芽細胞に添加した。２４時間培養後における線維芽細胞からのｐｒｏＭＭＰ−１産生量は、ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。【００４９】  ３．結果
図５は、紫外線照射後の表皮−真皮間相互作用による線維芽細胞が放出したマトリックスメタロプロテアーゼ−１前駆体（ｐｒｏＭＭＰ−１）産生量を示す。
縦軸は、ｐｒｏＭＭＰ−１濃度を示している。（ｎｇ／ｍＬ）ＵＶＢ＋はＵＶＢ−に対してｐｒｏＭＭＰ−１の産生量が有意に亢進され、フコキサンチンはＵＶＢ＋に対してｐｒｏＭＭＰ−１の産生量を有意に抑制された。このことから、フコキサンチンは、ＵＶＢ照射した表皮細胞培養上清による線維芽細胞のｐｒｏＭＭＰ−１の産生亢進に対する抑制作用が認められ、フコキサンチンが表皮細胞からの伝達物質の産生抑制を経由した、間接的な線維芽細胞からのマトリックスメタロプロテアーゼ−１産生を抑制することが示唆された。
【実施例３】
【００５０】  真皮線維芽細胞を用いたコラーゲン産生試験【００５１】  １．試験の概要
シリウスレッドは、コラーゲンに特異的に結合する。その性質を利用して、線維芽細胞の培養上清に産生されたコラーゲン量を、フコキサンチン添加時および未添加時において測定した。【００５２】  ２．実験方法
線維芽細胞に終濃度１μＭ、５μＭになるようにフコキサンチンを添加して７２時間培養した。培養上清を回収し、２５％硫酸アンモニウムで３倍量にした後、さらに２４時間、４℃で培養した。４００００ｇで３０分間室温にて超遠心分離し、上清を捨て、０．５Ｍ酢酸で溶かしたものをコラーゲンペレットとした。エッペンチューブに１００μＬのコラーゲン溶液を採り、０．５Ｍ酢酸に溶かした５０μＭシリウスレット溶液で全量１ｍＬにして振とう後、３０分間室温でインキュベートした。これを３００００ｇで３０分間室温にて超遠心分離し、上清を捨てた後、ペレットを０．１ＮのＫＯＨ  １ｍＬに溶かして１５分間室温でインキュベートしたものをサンプルとして、５４０ｎｍで吸光度（ＡＢＳ）を測定した。コラーゲンの存在量が多いほどより高い吸光度を示す。【００５３】  ３．結果
図６は線維芽細胞におけるフコキサンチン添加時のコラーゲン産生量を示す。
縦軸は吸光度（ＡＢＳ）、横軸は各群を示しており、未添加群、フコキサンチン１μＭ添加群、５μＭ添加群を示している。未添加群に対してフコキサンチンは、濃度依存的にコラーゲン産生を促進し、１μＭ添加時には約４．５％、５μＭ添加時には約１８．６％コラーゲン産生を促進した。【００５４】値は平均値±標準誤差で示しｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡとＦｉｓｈｅｒ’ｓ  ＰＬＳＤ  ｔｅｓｔを用いて有意差の判定を行った。有意水準はｐ＜０．０５もしくはｐ＜０．０１とし、図中に示した。（異なる記号（ａ、ｂ、ｃ）のついた条件間に有意差あり）
【産業上の利用可能性】
【００５５】  本発明品を配合した外用剤に係る化粧料の剤型は任意であり、化粧水、ロ−ション、乳液、クリ−ム、パック、軟膏、分散液、固形物、ム−ス等の任意の剤型をとることができる。また、用途としては、化粧料の他、皮膚外用剤、医薬用軟膏等に好適に使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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