(57)【要約】      （修正有）【課題】医薬として生体に適用でき、かつ、磁場によって目的の領域に誘導可能な粒径を持った金属サレン錯体化合物を提供する。【解決手段】結晶粒径が１μｍ以下であり、かつ、１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下の結晶粒径が全体の７０％以上である、金属サレン錯体化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶粒径が１μｍ以下であり、かつ、１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下の結晶粒径が全体の７０％以上である、金属サレン錯体化合物。
【請求項２】
下記構造式（Ｉ）化合物からなる、請求項１記載の金属サレン錯体化合物。
（Ｉ）
2012131737.tif 000009
N,N’-Bis(salicylidene)ethylenediamine metal
Ｍは、Fe、Cr、Mn、Co、Ni、Mo、Ru、Rh、Pd、W、Re、Os、Ir、Pt、Nd、Sm、Eu、又は、Gdである。
【請求項３】
請求項１又は２記載の金属サレン錯体化合物を含有する抗腫瘍薬剤。
【請求項４】
請求項１又は２記載の金属サレン錯体化合物を含有する注射剤。
【請求項５】
個体に適用する際当該個体の目的領域に磁場を供給し、当該目的領域に前記金属サレン錯体化合物を誘導する、請求項３記載の注射剤。
【請求項６】
金属サレン錯体化合物を急冷条件下で結晶化する、金属サレン錯体化合物の製造方法。
【請求項７】
サレンに金属化合物を反応させ、次いで、加熱状態の反応物を急冷することにより前記金属サレン錯体の結晶粒子を得る、請求項５記載の金属サレン錯体化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属サレン錯体化合物及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に薬剤は生体内に投与され患部に到達し、その患部局所において薬理効果を発揮することで治療効果を引き起こすが、薬剤が患部以外の組織（つまり正常組織）に到達しても治療にはならない。
【０００３】
したがって、いかにして効率的に患部に薬剤を誘導するかが重要である。薬剤を患部に誘導する技術はドラッグ・デリバリと呼ばれ、近年研究開発が盛んに行われている分野である。このドラッグ・デリバリには少なくとも二つの利点がある。一つは患部組織において十分に高い薬剤濃度が得られることである。薬理効果は患部における薬剤濃度が一定以上でないと生じず、低い濃度では治療効果が期待できない。
【０００４】
二つめは薬剤を患部組織のみに誘導して、正常組織への副作用を抑制することができる。
【０００５】
このようなドラッグ・デリバリが最も効果を発揮するのが抗がん剤によるがん治療である。抗がん剤は細胞分裂の活発ながん細胞の細胞増殖を抑制するものが大半であるため、正常組織においても細胞分裂の活発な組織、例えば骨髄あるいは毛根、消化管粘膜などの細胞増殖を抑制する。
【０００６】
このため抗がん剤の投与を受けたがん患者には貧血、抜け毛、嘔吐などの副作用が発生する。これら副作用は患者にとって大きな負担となるため、投薬量を制限しなければならず、抗がん剤の薬理効果を十分に得ることが出来ないという問題がある。
【０００７】
この抗悪性腫瘍薬の中で、アルキル系抗悪性腫瘍薬は、核酸蛋白などにアルキル基（-CH2-CH2-）を結合させる能力をもつ抗がん剤の総称である。DNAをアルキル化してDNA複製を阻害し、細胞死をもたらす。この作用は細胞周期に無関係に働きG0期の細胞にもおよび、増殖が盛んな細胞に対する作用が強く、骨髄、消化管粘膜、生殖細胞、毛根などに障害を与えやすい。
【０００８】
また、代謝拮抗系抗悪性腫瘍薬は、核酸や蛋白合成過程の代謝物と類似の構造をもつ化合物であり、核酸合成を阻害するなどして細胞を障害し、分裂期の細胞に特異的に作用する。
【０００９】
また、抗腫瘍性抗生物質は、微生物によって産生される化学物質であり、ＤＮＡ合成抑制、ＤＮＡ鎖切断などの作用を持ち抗腫瘍活性を示す。
【００１０】
また、微小管阻害薬は、細胞分裂の際に紡錘体を形成したり、細胞内小器官の配置や物質輸送など、細胞の正常機能の維持に重要な役割を果たしている微小管に直接作用することで抗腫瘍効果を示す。微小管阻害剤は細胞分裂が盛んな細胞や神経細胞などに作用を及ぼす。
【００１１】
また、白金製剤は、DNA鎖または鎖間結合あるいはＤＮＡ蛋白結合を作ってＤＮＡ合成を阻害する。シスプラチンが代表的薬剤であるが腎障害が強く、多量の補液が必要とされる。
【００１２】
また、ホルモン類似薬系抗悪性腫瘍薬は、ホルモン依存性の腫瘍に対して有効である。男性ホルモン依存性の前立腺がんに対して女性ホルモンを投与したり抗男性ホルモン剤を投与したりする。
【００１３】
また、分子標的薬は、それぞれの悪性腫瘍に特異的な分子生物学的特徴に対応する分子を標的とした治療法である。
【００１４】
また、トポイソメラーゼ阻害薬は、DNAに一時的に切れ目を入れてDNA鎖のからまり数を変える酵素である。トポイソメラーゼＩは、環状DNAの一方の鎖に切れ目を入れ、もう一方の鎖を通過させた後、切れ目を閉じる酵素であり、トポイソメラーゼ阻害薬ＩＩは環状DNAの２本鎖両方を一時的に切断し、その間を別の２本鎖DNAを通過させ、再び切れ目をつなぎ直す酵素である。
【００１５】
さらに、非特異的免疫賦活薬は、免疫系を活性することによってがん細胞の増殖を抑制する。
【００１６】
ドラッグ・デリバリの具体的な手法としては、例えば、担体（キャリア）を用いたものがある。これは患部に集中しやすい担体に薬剤を載せて、薬剤を患部まで運ばせようというものである。
【００１７】
担体として有力視されているのが磁性体であり、薬剤に磁性体である担体を付着させ、磁場によって患部に集積される方法が提案されている（例えば、特開２００１−１０９７８号公報参照）。
【００１８】
しかしながら、磁性体担体をキャリアとして使用する場合、経口投与が困難なこと、担体分子が一般に巨大であること、担体と薬剤分子との間の結合強度、親和性に技術的な問題があることがわかり、そもそも実用化が困難であった。
【００１９】
そこで、本発明者は、有機化合物の基本骨格に対して、正又は負のスピン電荷密度付与する側鎖が結合され、全体として外部磁場に対して磁気共有誘導される範囲の適性を持ち、人体や動物に適用された際に、体外からの磁場によって局所的に磁場が与えられている領域で保持され、元来保有している医薬効果を前記領域において発揮するようにした、局所治療薬を提案した（ＷＯ２００８/００１８５１号公報）。同公報には、このような薬剤として、鉄サレン錯体が記載されている。特開２００９−１７３６３１号公報には、鉄サレン錯体を含有する抗腫瘍薬剤が開示されている。
【００２０】
さらに、本願の発明者は、金属サレン錯体に医薬分子等を結合して、磁場によって、個体の目的の領域に誘導できることを提案した（ＷＯ  ２０１０/０５８２８０号公報）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】特開２００１−１０９７８号公報
【特許文献２】ＷＯ２００８/００１８５１号公報
【特許文献３】特開２００９−１７３６３１号公報
【特許文献４】ＷＯ  ２０１０/０５８２８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明が鋭意検討したところ、金属サレン錯体の粒径が小さいと必要な磁性が発揮できず、一方、金属サレン錯体の粒径が大きいと毛細血管内を通過することができないという課題がある。そこで、本発明は、医薬として生体に適用でき、かつ、磁場によって目的の領域に誘導可能な粒径を持った金属サレン錯体化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
前記目的を達成するために、本発明は、結晶粒径が１μｍ以下であり、かつ、１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下の結晶粒径が全体の７０％以上である、金属サレン錯体化合物であることを特徴とする。
【００２４】
金属サレン錯体化合物の粒径が１μｍを越えると、金属サレン錯体化合物が毛細血管を通過できないおそれがある。金属サレン錯体化合物の粒径が１００ｎｍ未満であると、磁気誘導に必要な強磁性が十分でない。一方、５００ｎｍを越えると、毛細血管に対する金属サレン錯体化化合物の流通性十分でない。粒径が１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下の粒子が全体の７０％未満であると、毛細血管の通過のための特性が低い粒子の割合が増加してしまう。粒径は、２００ｎｍ以上４００ｎｍ以下が好ましく、特に、粒径が２５０ｎｍ以上３５０ｎｍ以下であることが好ましい。
【００２５】
金属サレン錯体化合物とは、サレンを配位子とする金属錯体全般をいい、さらに、例えば、ＷＯ  ２０１０/０５８２８０号公報に記載のその誘導体をも含む。誘導体には、金属サレン錯体と医薬分子との結合体を含む。
【００２６】
金属サレン錯体化合物として好適な例は下記構造式（Ｉ）に記載の化合物（金属サレン錯体）である。
（Ｉ）
2012131737.tif 000002
N,N’-Bis(salicylidene)ethylenediamine metal
Ｍは、Fe、Cr、Mn、Co、Ni、Mo、Ru、Rh、Pd、W、Re、Os、Ir、Pt、Nd、Sm、Eu、又は、Gdである。
【００２７】
本発明の鉄サレン錯体化合物の結晶粒径は、鉄サレン錯体化合物の結晶化を水冷など急速に行うことによって得られる。
【００２８】
本発明の金属サレン錯体化合物の医薬適用は、静脈注射剤としてのものが代表的である。代表的処方例としては、溶媒は生理食塩水であり、懸濁剤又は乳濁剤を使用してもよい。本発明の金属サレン錯体化合物は、既述の先行技術に記載されているように、抗癌剤としての用途、医薬分子と結合して医薬分子のドラッグデリバリーのためのキャリアとして用途を有している。その他、MRI用診断役としての用途も有する。
【００２９】
本発明の金属サレン錯体化合物を個体（人又は動物）に適用する際、患部器官、患部組織が存在する目的領域に磁場（５００ｍＴから１Ｔ（１０００ｍＴ））を供給することにより、金属サレン錯体化合物を目的領域に誘導することができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、医薬として生体に適用でき、かつ、磁場によって目的の領域に誘導可能な粒径を持った金属サレン錯体化合物を提供することを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の実施例に係る鉄サレン錯体化合物結晶の電顕写真である。
【図２】本発明の実施例に係る鉄サレン錯体化合物結晶の粒径分布に係るグラフである。
【図３】本発明の比較例に係る鉄サレン錯体化合物結晶の電顕写真である。
【図４】本発明の比較例に係る鉄サレン錯体化合物結晶の粒径分布に係るグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
実施例１：金属サレン錯体(鉄サレン)の製造
Step 1:
2012131737.tif 000003
【００３３】
4-nitrophenol (25g, 0.18mol)、hexamethylene tetramine (25g, 0.18mol)、polyphosphoric acid (200ml)の混合物を１時間１００℃で攪拌した。その後、その混合物を500mlの酢酸エチルと１Lの水の中に入れ、完全に溶解するまで攪拌した。さらにその溶液に400mlの酢酸エチルを追加で加えたところその溶液は２つの相に分離し、水の相を取り除き、残りの化合物を塩性溶剤で２回洗浄し、無水Mg2SO4で乾燥させた結果、compound 2が１７ｇ（収率57%）合成できた。
【００３４】
Step 2: 
2012131737.tif 000004
【００３５】
Compound 2 (17g, 0.10mol) compound 2 (17g, 0.10mol), acetic anhydride (200ml),  H2SO4 (少々)を室温で１時間攪拌させた。得られた溶液は、氷水（２L）の中に0.5時間混ぜ、加水分解を行った。得られた溶液をフィルターにかけ、大気中で乾燥させたところ白い粉末状のものが得られた。酢酸エチルを含む溶液を使ってその粉末を再結晶化させたところ、２４ｇのCompound 3（収率76%）の白い結晶を得ることができた。
【００３６】
Step 3: 
2012131737.tif 000005
【００３７】
compound 3 (24g, 77mmolとメタノール(500ml)に10%のパラジウムを担持したカーボン(2.4g)の混合物を一晩  1.5気圧の水素還元雰囲気で還元した。終了後、フィルターでろ過したところ茶色油状のcompound 4 (21g)が合成できた。
【００３８】
Step 4, 5: 
2012131737.tif 000006
【００３９】
無水ジクロメタン(DCM) (200ml)にcompound 4 (21g, 75mmol), di(tert-butyl) dicarbonate (18g, 82mmol)を窒素雰囲気で一晩攪拌した。得られた溶液を真空中で蒸発させた後、メタノール(100ml)で溶解させた。その後、水酸化ナトリウム(15g, 374mmol)と水(50ml)を加え、5時間還流させた。その後冷却し、フィルターでろ過し、水で洗浄後、真空中て乾燥させたところ茶色化合物がえられた。得られた化合物は、シリカジェルを使ったフラッシュクロマトグラフィーを２回行うことで、10gのcompound 6（収率58%）が得られた。
【００４０】
Step 6:
2012131737.tif 000007
【００４１】
無水エタノール400mlの中にcompound 6 (10g, 42mmol)を入れ、加熱しながら還流させ、無水エタノール20mlにエチレンジアミン(1.3g, 21mmol)を0.5時間攪拌しながら数滴加えた。そして、その混合溶液を氷の容器に入れて冷却し15分間かき混ぜた。その後、200mlのエタノールで洗浄しフィルターをかけ、真空で乾燥させたところcompound 7(サレン)が8.5g （収率82%）で合成できた。
【００４２】
Step 7:
2012131737.tif 000008
【００４３】
無水メタノール(50ml)の中にcompound 7(8.2g,16mmol)、triethylamine (22ml,160mmol)をいれ、10mlメタノールの中にFeCl3(2.7g,16mmol)を加えた溶液を窒素雰囲気下で混合した。室温窒素雰囲気で１時間混合したところ茶色の化合物が得られた。得られた化合物を８０℃まで加熱し、次いで、室温水又は氷水による水冷等の急冷（冷却速度：10−30℃/分）後ろ過し、濾過された結晶を真空中で乾燥させた。得られた結晶をジクロロメタン400mlと、塩性溶液（テトラヒドロフラン）とで、それぞれ２回洗浄した後、Na2SO4で乾燥させ、さらに、真空中で乾燥させたところcomplex A（鉄サレン錯体（Ｒ＝Ｈ））を得た。この化合物をジエチルエーテルとパラフィンの溶液中で再結晶させ、結晶を高速液化クロマトグラフィーで測定したところ純度95%以上のcomplex A5.7g（収率62%）を得た。再結晶も既述と同様に急冷条件下で行われることが好ましい。結晶粒の粒径を本発明の範囲に制御するのは、再結晶の際の冷却条件が重要である。なお、Step7の反応を加熱下で行ってもよい。この場合、得られた化合物の加熱は不要である。
【００４４】
鉄サレン錯体以外の金属錯体を用いる場合には、FeCl3の代わりに鉄以外の金属の塩化物M Cl3を利用すればよい。なお、鉄サレン錯体以外のMnサレン錯体、Crサレン錯体、Coサレン錯体に、外部磁場によって誘導できる程度の磁性があることは、本願出願人の特願２００９−１７７１１２号公報において示されたとおりである。そして、金属鉄サレン錯体などが抗腫瘍作用を有することも特開２００９−１７３６３１号公報において明らかである。
【００４５】
実施例２：粒径の測定
次に、再結晶化後の結晶粒の粒径の測定を行う。先ず、結晶を２ｇ程度計量し、乳鉢で約３０分すりつぶす。すりつぶしたものを回収し、重量を再度計量して、溶媒（生理食塩水）の希釈量を決定し、この希釈量の溶媒で希釈する。その際の、結晶粒の濃度は、２０ｍＭである。
【００４６】
次に、50mlチューブに移し、溶媒20mlをいれ、超音波で粉砕する。これを、肉眼的に粒が見えなくなるまで攪拌しながら行う。次に、正確な希釈量（実際に静脈注射する濃度：９．２５ｍＭ）に薄め、40μmのcell strainer（BD Falcon）を用い、濾過をする。
【００４７】
濾過した結果得られた結晶粒の粒径の測定は電顕画像を用いて行った。使用装置及び条件等は次の通りである。
【００４８】
装置: 透過型電子顕微鏡（日立製  H-7100FA）
条件： 加速電圧  100ｋV
試料調整：分散法（乳鉢ですりつぶした後、純粋を加えTEMでグリッドに分散させた）
粒度分布測定ソフトウエァ：Image-Pro plus (Media ctbermetrics, MD, U.S.A.)
測定対象：TEM写真における鉄サレン錯体分子のトレース像
【００４９】
以上の測定を複数のサンプル（サンプル数436）について行った。各サンプルについて２回結晶粒径を測定した。その結果、平均粒径は300ｎｍであり、標準偏差は300であった。図１は、代表的サンプルの電顕写真である。図２は粒径分布である。図２によれば、粒径が1μｍ以下であり、かつ、粒径が100ｎｍ以上500ｎｍ以下の粒子が全体の70％以上であることが確認できた。結晶は針状を呈していた。
【００５０】
比較例１：粒径の測定
結晶及び再結晶を空冷で行い、粒径を測定した（サンプル数140）。その結果、平均粒径は450ｎｍであり、標準偏差は360であった。図３は代表的サンプルの電顕写真である。図４は粒径分布である。これによれば、粒径が1μｍを越える結晶が存在し、かつ、粒径が100ｎｍ以上500ｎｍ以下の粒子が全体の70％未満であることが確認できた。
【００５１】
実施例２：磁性の確認
実施例１で得られた粒径の結晶が、強磁性を持つことを確認した。実施例１で得られた粒径の結晶について、Quantum  Design  MPMS７を用いて磁場―磁化曲線を測定したところ、−２６８℃から３７℃まで強磁性体特有のヒステリシスループが現れ強磁性体であることを確認した。
【００５２】
次に、丸型シャーレの中にメラノーマ細胞（clone M3）を細胞培養し、そのあと鉄サレンを均等にふりかけた。その後、磁束密度240ｍTのボタン磁石をシャーレの下に２４時間おいた。その結果、ボタン磁石の縁に沿って、メラノーマ細胞が死滅しているのが確認された。
【００５３】
比較例２：磁性の確認
約５０ｎｍの粒径の鉄サレン錯体をQuantum  Design  MPMS７を用いて磁場―磁化曲線を測定したところ、−２６８℃から３７℃まで超常磁性体特有のヒステリシスループが現れ超常磁性体であることを確認した。
【００５４】
実施例３：毛細血管の通過性
実施例１で得られた鉄サレン錯体は閉塞しない。生理食塩水に溶かした9.25mMの濃度の鉄サレンをマウスの尾静脈に投与しても血管閉塞は起こらない。比較例１で得られた鉄サレン錯体では閉塞が起こる。生理食塩水に溶かした9.25mMの濃度の鉄サレンをマウスの尾静脈に投与後、５秒後に肺にて血管閉塞が起こり、マウスは死亡した。
【図１】
2012131737.tif 000010
【図２】
2012131737.tif 000011
【図３】
2012131737.tif 000012
【図４】
2012131737.tif 000013