(57)【要約】      （修正有）【課題】高等真核生物におけるミトコンドリアの膜に局在するタンパク質であるＤＡＰＩＴ（diabetes-associated protein in insulin-sensitive tissues）タンパク質を特異的に認識する、高感度のポリクローナル抗体、及びその作製方法の提供。【解決手段】大腸菌タンパク質発現システムを利用し、大腸菌で発現させた特定の配列のアミノ酸からなるポリペプチドを抗原としてポリクローナル抗体を作製することにより、ＤＡＰＩＴタンパク質を特異的に認識する、ポリクローナル抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌で発現させた、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる組換えポリペプチドを抗原として用いることにより得られる、ＤＡＰＩＴタンパク質を特異的に認識するポリクローナル抗体。
【請求項２】
ヒトＤＡＰＩＴ遺伝子を大腸菌で発現させて得られる配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原としてウサギに注射して免疫し、その後免疫したウサギの血清を得ることを特徴とする、ＤＡＰＩＴタンパク質を特異的に認識するポリクローナル抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＤＡＰＩＴを免疫原として得られたポリクローナル抗体や、その製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＡＰＩＴ（diabetes-associated protein in insulin-sensitive tissues；別名ＵＳＭＧ５（up-regulated during skeletal muscle growth 5）や、ＡＧＰとも呼ばれる）は、ストレプトゾトシン投与による糖尿病モデルラットの骨格筋や心筋などのインスリン感受性組織において発現が減少する因子として同定された、糖尿病関連タンパク質である（非特許文献１）。また、ＤＡＰＩＴはミトコンドリア膜においてＡＴＰ合成酵素に結合していることが明らかになっている（非特許文献２、３）。
【０００３】
従来の技術では、ＤＡＰＩＴタンパク質配列にタグ配列を付加した人工タンパク質を細胞内で強制的に発現し、そのタグに対する抗体で強制発現したＤＡＰＩＴタンパク質を検出することができたが、この方法では、内在性のＤＡＰＩＴタンパク質を検出することはできなかった。そこで、１４アミノ酸や１５アミノ酸からなるペプチドを抗原としてニワトリやウサギに免疫し、ＤＡＰＩＴタンパク質を認識する抗体の作製が試みられたが、いずれもその特異性や検出感度が不十分であり、内在性のＤＡＰＩＴタンパク質を認識するには不十分であるなどの問題があった（非特許文献２、３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Paivarinne et al., Acta Diabetologica, 38, 83-86 (2001)
【非特許文献２】Meyer et al., Molecular & Cellular Proteomics, 6, 1690-1699 (2007)
【非特許文献３】Chen et al., FEBS Letters, 581, 3145-3148 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、高等真核生物におけるミトコンドリアの膜に局在するタンパク質であるＤＡＰＩＴタンパク質を特異的に認識する、高感度のポリクローナル抗体や、その製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、配列番号１に示されるアミノ酸からなるペプチドを、大腸菌タンパク質発現システムを利用して作製して抗原とし、かかる抗原を用いてポリクローナル抗体を作製することにより、ＤＡＰＩＴタンパク質を特異的に認識する、高感度のポリクローナル抗体を提供できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は大腸菌で発現させた、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる組換えポリペプチドを抗原として用いることにより得られる、ＤＡＰＩＴタンパク質を特異的に認識するポリクローナル抗体に関する。
【０００８】
また、本発明はヒトＤＡＰＩＴ遺伝子を大腸菌で発現させて得られる配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原としてウサギに注射して免疫し、その後免疫したウサギの血清を得ることを特徴とする、ＤＡＰＩＴタンパク質を特異的に認識するポリクローナル抗体の製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、特異性が非常に高く、ＤＡＰＩＴタンパク質以外のタンパク質には反応しない、抗ＤＡＰＩＴポリクローナル抗体を提供することができる。また、本発明の手法によって特異性の高い抗ＤＡＰＩＴポリクローナル抗体を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】作製した抗ＤＡＰＩＴポリクローナル抗体の抗体価をＥＬＩＳＡ法により検定した結果を示す図である。０１、０２は２羽のウサギを、免疫前は免疫前のウサギの血清を、全採血は免疫後のウサギの抗血清のサンプルを表す。
【図２】ウェスタンブロッティングにおいて作製した抗ＤＡＰＩＴポリクローナル抗体が、ＨｅＬａ細胞のＤＡＰＩＴタンパク質を特異的に検出できることを示した図である。Cytosolは細胞質画分を、mitochondriaはミトコンドリア画分を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者は、配列番号１に示されるヒトＤＡＰＩＴタンパク質を抗原としてウサギに免疫することにより、特異性が高く感度が高いポリクローナル抗体を作製することができることを見いだした。以下、本発明の実施の形態についてさらに具体的に説明する。
【００１２】
本発明の大腸菌で発現させた、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる組換えポリペプチド（以下「本発明の抗原ポリペプチド」ということもある）は、その塩基配列情報により、遺伝子工学的手法を用いて大腸菌に導入して、常法にて調製することができる。このようにして得られる本発明のポリペプチドは、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。
【００１３】
本明細書において「抗体」とは、ＤＡＰＩＴタンパク質、その断片／部分ペプチドなど（以下の抗体に関する説明では、これらを総称して、「ＤＡＰＩＴタンパク質」という）に対して特異的に結合する抗体を包含する。ここで、「特異的に結合する」とは、上記抗体のＤＡＰＩＴタンパク質に対する親和性が、他のアミノ酸配列からなるタンパク質に対する親和性と比較して実質的に高いことを意味しており、より具体的には、所定の測定装置によって、ＤＡＰＩＴタンパク質を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を上記抗体が有すること意味している。上記「高い親和性」とは、典型的には、結合定数（Ｋａ）が少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは、１０９Ｍ−１、さらにより好ましくは、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１またはそれより高い、例えば、最高で１０１３Ｍ−１またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。なお、本発明の抗ＤＡＰＩＴポリクローナル抗体は、そのクラスとして、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを含むのであってもよい。
【００１４】
本発明の抗ＤＡＰＩＴポリクローナル抗体の製造方法としては、本発明の抗原ポリペプチドを抗原として作製される抗体であれば特に制限されないが、以下の例を挙げることができる。まず、本発明の抗原ポリペプチドを免疫用の動物に免疫する。免疫用の動物としては、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ、ブタ、ヤギ、ヒツジなどを挙げることができるが、中でもウサギが好ましい。抗原の動物１匹当たりの投与量は、動物の体の大きさに合わせて適宜調節することができるが、ウサギの場合でアジュバントを用いないときは０．１〜１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１０〜１０００μｇを好適に例示することができる。上記アジュバントとしては、特に制限されるものではないが、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等を例として挙げることができる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行うことができ、免疫の間隔や回数は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは５日〜５週間間隔、さらに好ましくは１〜３週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜６回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜６０日後に、抗血清を得る。血清中の抗体価は、価酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法、放射性免疫測定（ＲＩＡ）法等で測定し、抗血清を得る時期を適宜調製することができる。得られた抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、単独又はこれらの方法を組み合わせて抗体を精製することができる。
【００１５】
本発明の抗体は必要に応じて標識物質により標識することができ、上記標識物質としては、例えば、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）ローダミン、フィコエリトリン、フルオレスカミン等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ、３Ｈ等の放射性物質や、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素を挙げることができる。また、本発明の抗体と、マーカータンパク質／マーカーペプチドとを融合させた融合タンパク質を作製することもでき、上記マーカータンパク質／マーカーペプチドとしては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ルシフェラーゼ（luciferase）等の蛍光タンパク質や、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグなどを挙げることができる。これらの標識化抗体を用いることにより、ＤＡＰＩＴタンパク質の生体内における局在や濃度を検討することができるほか、ＤＡＰＩＴタンパク質の機能解析を行うこともできる。上記標識化抗体を用いた免疫学的測定方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウエスタンブロット法、免疫沈降法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００１６】
また、本発明のＤＡＰＩＴポリクローナル抗体を用いることにより、糖尿病の判定や糖尿病治療薬のスクリーニングが可能となる。例えば、糖尿病判定方法としては、（ａ）検体の骨格筋、心筋等のインスリン感受性組織及び非インスリン感受性組織のタンパク質を抽出してサンプルを調整する工程；（ｂ）本発明の抗ＤＡＰＩＴポリクローナル抗体を用いて工程（ａ）のサンプル中のＤＡＰＩＴタンパク質の量を測定し、総タンパク質量あたりのＤＡＰＩＴタンパク質の量を算出する工程；（ｃ）インスリン感受性組織におけるＤＡＰＩＴタンパク質の発現量が、非インスリン感受性組織におけるＤＡＰＩＴタンパク質の量より少ない場合に糖尿病と判定する工程；を含む方法を挙げることができ、糖尿病治療薬のスクリーニング方法としては、（ａ）ストレプトゾトシン投与による糖尿病モデル実験動物に被検物質を投与する工程；（ｂ）前記糖尿病モデル実験動物から骨格筋、心筋等のインスリン感受性組織及び非インスリン感受性組織を検体として採取し、タンパク質を抽出してサンプルを調整する工程；（ｃ）本発明の抗ＤＡＰＩＴポリクローナル抗体を用いて工程（ａ）のサンプル中のＤＡＰＩＴタンパク質の量を測定し、総タンパク質量あたりのＤＡＰＩＴタンパク質の量を算出する工程；（ｄ）インスリン感受性組織におけるＤＡＰＩＴタンパク質の発現量が、非インスリン感受性組織におけるＤＡＰＩＴタンパク質の量より多い、あるいは同等の場合に糖尿病治療薬と判定する工程；を含む方法を挙げることができる。
【実施例】
【００１７】
［抗原の準備・抗血清の回収］
ヒトＤＡＰＩＴの配列はＧｅｎｂａｎｋ（ＣＡＣ８１２４３）より入手し、ＨｅＬａ細胞からillustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit（GE Healthcare社製）を用いて抽出したｍＲＮＡを鋳型として、配列番号１に示されるアミノ酸配列のヒトＤＡＰＩＴ遺伝子をＰＣＲ法により増幅、分離した。このＤＮＡ配列をｐＥＴベクター（メルク社製）に組み込み、ｐＥＴシステム（メルク社製）により大腸菌でタンパク質を発現させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により目的の配列番号１に示される５８アミノ酸からなるタンパク質を単離した。このタンパク質（１ｍｇ）を日本白色種ウサギ２匹に週１回、全６回注射して免疫した後、最終の免疫から１週間後にその全血を採取し、血清を全回収した。この抗血清には保存料として０．０９％のアジ化ナトリウムを加えた。
【００１８】
［抗体価の検定］
抗体価の検定はＥＬＩＳＡ法により行った。この方法は、９６穴プレートに抗原ペプチドを固相化し、血清（免疫前ウサギ血清と免疫後のウサギ抗血清の希釈系列（１００倍、５００倍、２，５００倍、１２，５００倍、６２，５００倍、血清なし））を反応させ、洗浄後、ＰＯＤ（Peroxidase）標識抗ウサギ抗体（ＭＢＬ社製、ＣＯＤＥ４５８）と反応させた。これを洗浄後、TMB One Solution（プロメガ社製）にて呈色反応を行い、反応停止後、４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定することで検定をおこなった。４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）の測定値を表１に、そのグラフを図１に示す。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
その結果、２羽のウサギ（０１又は０２）いずれから採取した免疫前の血清も、いずれの希釈倍率においても抗体価は見られなかったが、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として免疫した２羽のウサギ（０１又は０２）から採取した抗血清を用いた場合（全採血）は、希釈倍率に依存した抗体力価が見られ、希釈倍率１２，５００においても希釈倍率１００〜２，５００程度の高い抗体力価を保持していることが確認された。この結果から、本発明の方法を用いることによって、抗ＤＡＰＩＴポリクローナル抗体を作製することができることが示された。
【００２１】
［ウェスタンブロッティングによる単離ミトコンドリアのＤＡＰＩＴタンパク質の検出］
作製した抗ＤＡＰＩＴポリクローナル抗体を用いて、ウェスタンブロッティングによってＤＡＰＩＴタンパク質を検出した。ＨｅＬａ細胞よりPallotti F, L. G. (2007) Methods Cell Biol. 80, 3-44に記載の方法を用いて細胞質画分及びミトコンドリア画分を単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）法によりポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分子量で分離した。このタンパク質をポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜（Bio-Rad社製）に転写させ、ブロッキング液（２％ ECL Advancea blocking agent in TNT（GE Healthcare社製））でブロッキングした後、一次抗体として抗ＤＡＰＩＴポリクローナル抗体を反応させた。一次抗体は上記の抗血清をブロッキング液でそれぞれ５，０００倍、１０，０００倍、５０，０００倍に希釈して用いた。ＴＮＴで洗浄後、１０万倍に希釈したＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識抗ウサギ抗体を二次抗体として用い、検出はECL Advancea（GE Healthcare社製）により蛍光検出した（図２）。
【００２２】
その結果、ミトコンドリア画分（mitochondria）のレーンにのみ、一次抗体が反応したバンドが一本だけ検出され、その分子量はＤＡＰＩＴタンパク質の分子量に相当した。ＤＡＰＩＴタンパク質はミトコンドリアに局在し、細胞質へは局在していないタンパク質であるので、作製した抗ＤＡＰＩＴポリクローナル抗体が確かにＤＡＰＩＴタンパク質のみを特異的に検出していることを示している。また、全ての希釈倍率において、希釈倍率５０，０００倍の一次抗体を用いた場合にも強くＤＡＰＩＴタンパク質のバンドが検出されていることは、本発明の抗ＤＡＰＩＴポリクローナル抗体が高い感度をもつ抗体であることを示している。すなわち、本発明の方法によって作製された本発明の抗ＤＡＰＩＴポリクローナル抗体が、高い親和性と特異性を持つことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
ＤＡＰＩＴは、細胞内エネルギー生産制御にとどまらず、糖尿病に関与することが既に報告されている。従って、本発明の抗ＤＡＰＩＴポリクローナル抗体は疾患基礎研究での用途にとどまらず、疾患マーカーとしての研究への応用も期待され、診断薬として用いることにより、疾患マーカーの測定キットとしての工業化も可能である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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