(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｂリンパ球刺激因子（BLyS）タンパク質またはBLyS様ポリペプチドと結合する、特定のアミノ酸配列を含んでなる結合性ポリペプチドの提供。【解決手段】ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングから、当該結合性ポリペプチドを得て、かかる結合性ポリペプチドは、血液、組織サンプル、馴らし培地などの溶液または混合物中に含まれるBLySタンパク質またはBLyS様ポリペプチドを検出または単離に使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のアミノ酸配列：Asp-Xaa-Leu-Thr (配列番号446)(式中、XaaはPro, Ser, Thr, Phe, Leu, Tyr, CysまたはAlaである)を含んでなるＢリンパ球刺激因子(BLyS)結合性ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂリンパ球刺激因子タンパク質(BLyS)と結合するポリペプチドに関する。そのようなポリペプチドは、例えば、BLySの検出、単離および／または精製に使用することができる。本発明はまた、これらのBLyS結合性ポリペプチドをコードする核酸分子、これらの核酸を含有するベクターおよび宿主細胞、ならびに該ポリペプチドの産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂリンパ球刺激因子(BLyS)は腫瘍壊死因子（「TNF」）スーパーファミリーのメンバーであり、in vivoでもin vitroでもＢ細胞の増殖と分化を誘導する(Mooreら, Science, 285:260-263 (1999))。BLySは、その単球特異的な遺伝子およびタンパク質発現パターンならびにＢリンパ球へのその特異的受容体分布および生物学的活性により、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-13、IL-15、CD40L、CD27L(CD70)などの他のＢ細胞増殖・分化因子と区別される。BLyS発現はナチュラルキラー（「NK」）細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞上には検出されず、骨髄由来の細胞に限られる。休止している単球でのBLySの発現はインターフェロンγ（IFNγ）によりアップレギュレートされる。BLySをコードする遺伝子は染色体13q34にすでにマップされている。
【０００３】
BLySは285アミノ酸からなるタイプII膜結合型ポリペプチドおよび152アミノ酸からなる可溶性ポリペプチドとして発現される(Mooreら, 1999, 前掲)。膜結合型のBLySはアミノ酸残基47および73間にわたる推定上の膜貫通ドメインをもつ。可溶型のBLySのNH2末端は膜結合型のBLySのAla134で始まる。可溶型と膜結合型のどちらのタンパク質もホモ三量体を形成している。可溶性の組換えBLySは、マウス脾性Ｂ細胞のin vitro増殖を誘導し、かつこれらの細胞上の細胞表面受容体と結合することが見出されている(Mooreら, 1999, 前掲)。可溶性BLySをマウスに投与すると、CD45Rdull、Ly6Dbright(ThBとしても知られる)Ｂ細胞の割合が増加し、また、血清IgMおよびIgAレベルも増加することがわかった(Mooreら, 1999, 前掲)。こうして、BLySはその受容体分布においても生物学的活性においてもＢ細胞向性を示す。
【０００４】
その発現パターンと生物学的活性に基づき、BLySはＢ細胞と単球または分化したその子孫との間のシグナル交換に関与していると提案された。BLyS受容体およびリガンドの制限された発現パターンからは、BLySは、Ｔ細胞依存的抗原活性化におけるCD40およびCD40Lと同様の様式で、Ｔ細胞非依存的応答の調節因子として機能しうることが示唆される。
【０００５】
したがって、BLySと特異的に結合する分子は、BLySサイトカインの研究において、商業量および医学的に純粋な量でのBLySの製造・精製において、また、新しい治療薬と診断薬の開発において、様々な用途を見出すであろう。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、Ｂリンパ球刺激因子タンパク質（BLyS）および／またはBLyS様ポリペプチドと特異的に結合する新規なポリペプチドおよびポリペプチドのファミリーを提供する。特に、本発明は、ヒトBLyS（配列番号173および／または174）またはヒト単球上に発現されるBLyS；マウスBLyS（配列番号175および／または176）またはマウス単球上に発現されるBLyS；ラットBLyS（配列番号177、178、179および／または180に示される可溶型、あるいは、例えばラット単球の表面にある、膜結合型のいずれか）；またはサルBLyS（例えば、配列番号181および／または182のサルBLySポリペプチド、可溶型のサルBLyS、またはサル単球上に発現されるBLyS）、好ましくはヒトBLyS、のポリペプチドもしくはポリペプチド断片と特異的に結合するポリペプチドを包含する。
【０００７】
特定の好ましい実施形態において、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは高い親和性でもってBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する。他の実施形態では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと可逆的に結合する。さらに別の実施形態では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと不可逆的に結合する。
【０００８】
本発明に従う特定のポリペプチドに含まれるシステイン残基はジスルフィド結合を形成すると考えられ、このジスルフィド結合のため、これらのシステイン残基を含むポリペプチドは非還元条件下で安定したループ構造を形成するだろう。本発明の特に好適なBLyS結合性ポリペプチドは、BLySまたはBLyS様ポリペプチドと結合する安定したループ構造やその他の構造を形成するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子である。
【０００９】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号１〜12、20〜172、および186〜444（好ましくは、上記した、また、表１〜８、14、15ならびに下記の実施例２、５、６に記載する配列番号163〜172または436〜444）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなるBLyS結合性ポリペプチドに関する。ここに記載する単離されたBLyS結合性ポリペプチドの配列の解析は、テトラペプチドAsp-Xaa-Leu-Thr (配列番号446)を含むポリペプチドについての強い選択を示し、それゆえに、最も広範な形態において、本発明は、ポリペプチドAsp-Xaa-Leu-Thr (配列番号446) (式中、XaaはPro, Ser, Thr, Phe, Leu, Tyr, CysまたはAlaであり、好ましくは、ProまたはSerである)を含んでなる、BLySと結合可能なポリペプチドに関する。
【００１０】
表１〜８に示した特定のBLyS結合性ポリペプチドに基づいて、７つのコンセンサス配列（配列番号１〜７）が決定された。特定の実施形態では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドはこれらの配列を１つ以上含んでなる。そのような好適なBLyS結合性ポリペプチドには、不変のCys残基間で環状構造またはループ構造を形成する可能性があり、下記のＡ〜Ｅ（配列番号１〜５）から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなるポリペプチドが含まれる：
(A) Xl-X2-X3-Cys-X5-Phe-X7-Trp-Glu-Cys-Xll-X12-X13 (配列番号1)
(式中、
X1はAla, Asn, LysまたはSerであり;
X2はAla, Glu, Met, SerまたはValであり;
X3はAla, Asn, LysまたはPro（好ましくは、Lys）であり;
X5はPhe, TrpまたはTyr（好ましくは、Tyr）であり;
X7はProまたはTyr（好ましくは、Pro）であり;
X11はAla, Gln, His, PheまたはValであり;
X12はAsn, Gln, Gly, His, SerまたはValであり;
X13はAla, Asn, Gly, Ile, ProまたはSerである);
ただし、該ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する；
【００１１】
(B) X1-X2-X3-Cys-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Cys-X12-X13-X14 (配列番号2)
(式中、
X1はAla, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Valであるか、または存在せず;
X2はAla, Asn, Asp, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, TyrまたはValであり;
X3はAla, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、Asp）であり;
X5はAsp, Ile, LeuまたはTyr（好ましくは、AspまたはLeu）であり;
X6はArg, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, TyrまたはVal（好ましくは、GluまたはLeu）であり;
X7はHis, Leu, LysまたはPhe（好ましくは、HisまたはLeu）であり;
X8はLeu, ProまたはThr（好ましくは、ThrまたはPro）であり;
X9はArg, Asn, Gly, His, Ile, Lys, MetまたはTrp（好ましくは、Lys）であり;
X10はAla, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Ser, Trp, TyrまたはValであり;
Xl2はAsp, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Phe, Ser, Trp, TyrまたはValであり;
X13はAla, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, TyrまたはValであり;
X14はAla, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr, Valであるか、または存在しない);
ただし、該ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する；
【００１２】
(C) X1-X2-X3-Cys-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-Cys-X13-X14-X15 (配列番号3)
(式中、
X1はAla, Arg, Asn, Asp, Leu, Lys, Phe, Pro, SerまたはThrであり;
X2はAsn, Asp, Gln, His, Ile, Lys, Pro, ThrまたはTrpであり;
X3はAla, Arg, Asn, Gln, Glu, His, Phe, ProまたはThr（好ましくは、Ala）であり;
X5はAsn, Asp, Pro, SerまたはThr（好ましくは、Asp）であり;
X6はArg, Asp, Ile, Leu, Met, ProまたはVal（好ましくは、Ile）であり;
X7はAla, Ile, Leu, Pro, ThrまたはVal（好ましくは、ValまたはLeu）であり;
X8はAsn, His, Ile, Leu, Lys, PheまたはThr（好ましくは、Thr）であり;
X9はAsn, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, ProまたはThr（好ましくは、Leu）であり;
X10はArg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, Ile, Lys, Met, Pro, SerまたはTrpであり;
X11はArg, Glu, Gly, Lys, Phe, Ser, TrpまたはTyr（好ましくは、Ser）であり;
X13はGln, Glu, Ile, Leu, Phe, Pro, Ser, TyrまたはVal（好ましくは、Val）であり;
X14はAsn, Gly, Ile, Phe, Pro, Thr, TrpまたはTyrであり;
X15はAsn, Asp, Glu, Leu, Lys, Met, ProまたはThr（好ましくは、GluまたはPro）である);
ただし、該ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する；
【００１３】
(D) X1-X2-X3-Cys-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-Cys-X14-X15-X16 (配列番号4)
(式中、
X1はAsn, Asp, His, Leu, Phe, Pro, Ser, Tyrであるか、または存在せず（好ましくは、Ser）;
X2はArg, Asn, Asp, His, Phe, SerまたはTrp（好ましくは、Arg）であり;
X3はAsn, Asp, Leu, Pro, SerまたはVal（好ましくは、AsnまたはAsp）であり;
X5はAsp, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, PheまたはThrであり;
X6はHis, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, TrpまたはTyrであり;
X7はAsp, His, LeuまたはSer（好ましくは、Asp）であり;
X8はAla, Arg, Asp, Glu, Leu, Phe, ProまたはThr（好ましくは、GluまたはPro）であり;
X9はAla, Arg, AsnまたはLeu（好ましくは、Leu）であり;
Xl0はIle, Leu, Met, Pro, SerまたはThr（好ましくは、Thr）であり;
X11はAla, Arg, Asn, Gly, His, Lys, SerまたはTyrであり;
X12はAla, Arg, Asn, Gln, Leu, Met, Ser, Trp, TyrまたはValであり;
X14はAsp, Gly, Leu, Phe, TyrまたはVal（好ましくは、Leu）であり;
X15はAsn, His, Leu, ProまたはTyr（好ましくは、His、LeuまたはPro）であり;
X16はAsn, Asp, His, Phe, SerまたはTyr（好ましくは、AspまたはSer）である);
ただし、該ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する；
【００１４】
(E) X1-X2-X3-Cys-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-Cys-X16-X17-X18 (配列番号5)
(式中、
X1はArg, Asp, Gly, His, Leu, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyrであるか、または存在せず（好ましくは、Arg）;
X2はAla, Arg, Asn, Asp, Gly, Pro, Serであるか、または存在せず（好ましくは、Asn、Asp、GlyまたはPro）;
X3はArg, Asn, Gln, Glu, Gly, Lys, Met, Pro, TrpまたはVal（好ましくは、GlyまたはMet）であり;
X5はArg, Asn, Gln, Glu, His, Leu, Phe, Pro, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、Trp、TyrまたはVal）であり;
X6はArg, Asp, Gln, Gly, Ile, Lys, Phe, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、Asp）であり;
X7はAla, Arg, Asp, Glu, Gly, Leu, SerまたはTyr（好ましくは、Asp）であり;
X8はAsp, Gln, Glu, Leu, Met, Phe, Pro, SerまたはTyr（好ましくは、Leu）であり;
X9はAsp, Leu, Pro, ThrまたはVal（好ましくは、LeuまたはThr）であり;
X10はArg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、LysまたはThr）であり;
X11はAla, Arg, Asn, Gln, Glu, His, Leu, Lys, MetまたはThr（好ましくは、ArgまたはLeu）であり;
X12はAla, Asn, Gln, Gly, Leu, Lys, Phe, Pro, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、ThrまたはTrp）であり;
X13はAla, Arg, Gln, His, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、MetまたはPhe）であり;
X14はArg, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, TyrまたはVal（好ましくは、Val）であり;
X16はArg, Asp, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, SerまたはTrp（好ましくは、Met）であり;
X17はArg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Pro, Ser, TrpまたはTyr（好ましくは、Arg、HisまたはTyr）であり;
Xl8はAla, Arg, Asn, Asp, His, Leu, PheまたはTrp（好ましくは、HisまたはAsn）である);
ただし、該ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する。
【００１５】
さらなる好適な実施形態には、下記のＦおよびＧ（配列番号６および７）から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなる線状ポリペプチドが含まれる：
(F) X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12 (配列番号6)
(式中、
X1はAla, Arg, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、Gly、TyrまたはVal）であり;
X2はAla, Arg, Gln, His, Ile, Leu, Phe, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、HisまたはTyr）であり;
X3はAla, Asp, Lys, Phe, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、AspまたはTyr）であり;
X4はArg, Asp, Gln, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, TyrまたはVal（好ましくは、AspまたはGln）であり;
X5はAsp, Leu, Lys, Phe, Pro, SerまたはVal（好ましくは、LeuまたはSer）であり;
X6はHis, Ile, Leu, Pro, SerまたはThr（好ましくは、LeuまたはThr）であり;
X7はArg, Gly, His, Leu, Lys, MetまたはThr（好ましくは、LysまたはThr）であり;
X8はAla, Arg, Asn, Ile, Leu, Lys, MetまたはThr（好ましくは、LeuまたはLys）であり;
X9はAla, Asn, Arg, Asp, Glu, Gly, His, Leu, Met, Ser, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、MetまたはSer）であり;
X10はIle, Leu, Phe, Ser, Thr, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、ThrまたはLeu）であり;
XllはAla, Arg, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Pro, Ser, Thr, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、ProまたはThr）であり;
X12はArg, Asp, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、ArgまたはPro）である);
ただし、該ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する；
【００１６】
(G) X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13 (配列番号7)
(式中、
X1はAsp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, MetまたはTrp（好ましくは、GluまたはLys）であり;
X2はArg, Gln, His, Ile, LeuまたはPro（好ましくは、HisまたはPro）であり;
X3はAsp, Gly, Ile, Lys, Thr, TyrまたはVal（好ましくは、Tyr）であり;
X4はAsn, Asp, Gln, Glu, Met, Pro, SerまたはTyr（好ましくは、AspまたはGln）であり;
X5はAsn, Asp, His, Ile, Leu, Met, Pro, ThrまたはVal（好ましくは、AsnまたはThr）であり;
X6はAsp, Glu, His, Leu, Lys, ProまたはVal（好ましくは、AspまたはPro）であり;
X7はArg, Asn, Gln, His, Ile, Leu, Met, ProまたはThr（好ましくは、IleまたはPro）であり;
X8はGln, Gly, His, Leu, Met, SerまたはThr（好ましくは、LeuまたはThr）であり;
X9はAsn, Gln, Gly, His, Leu, Lys, SerまたはThr（好ましくは、Lys）であり;
X10はAla, Gly, Ile, Leu, Lys, MetまたはPhe（好ましくは、GlyまたはMet）であり;
X11はAla, Glu, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、AlaまたはThr）であり;
X12はArg, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, TyrまたはVal（好ましくは、ArgまたはHis）であり;
X13はArg, Asn, Glu, His, Ile, Ser, Thr, TrpまたはVal（好ましくは、His）である);
ただし、該ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する。
【００１７】
前記ポリペプチドはN-末端とC-末端のいずれか一方または両方に追加のアミノ酸が結合されていてもよい。
【００１８】
ループ構造を形成する可能性があるポリペプチドを含むライブラリー（すなわち、TN6、TN7、TN8、TN9、TN10およびTN12と称するライブラリー）の分離物からの配列情報および結合データを検討すると、ループ構造を形成しうる一連のBLyS結合性ポリペプチドが同定される。特定の実施形態において、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは下記のＨ〜Ｌ（配列番号８〜12）から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなる：
(H) Cys-X2-Phe-X4-Trp-Glu-Cys (配列番号8)
(式中、
X2はPhe, TrpまたはTyr（好ましくは、Tyr）であり;
X4はProまたはTyr（好ましくは、Pro）である);
【００１９】
(I) Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Cys (配列番号9)
(式中、
X2はAsp, Ile, LeuまたはTyr（好ましくは、AspまたはLeu）であり;
X3はArg, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, TyrまたはVal（好ましくは、GluまたはLeu）であり;
X4はHis, Leu, LysまたはPhe（好ましくは、HisまたはLeu）であり;
X5はLeu, ProまたはThr（好ましくは、ThrまたはPro）であり;
X6はArg, Asn, Gly, His, Ile, Lys, MetまたはTrp（好ましくは、Lys）であり;
X7はAla, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Ser, Trp, TyrまたはValである);
【００２０】
(J) Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Cys (配列番号10)
(式中、
X2はAsn, Asp, Pro, SerまたはThr（好ましくは、Asp）であり;
X3はArg, Asp, Ile, Leu, Met, ProまたはVal（好ましくは、Ile）であり;
X4はAla, Ile, Leu, Pro, ThrまたはVal（好ましくは、ValまたはLeu）であり;
X5はAsn, His, Ile, Leu, Lys, PheまたはThr（好ましくは、Thr）であり;
X6はAsn, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, ProまたはThr（好ましくは、Leu）であり;
X7はArg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, Ile, Lys, Met, Pro, SerまたはTrpであり;
X8はArg, Glu, Gly, Lys, Phe, Ser, TrpまたはTyr（好ましくは、Ser）である);
【００２１】
(K) Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Cys (配列番号11)
(式中、
X2はAsp, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, PheまたはThrであり;
X3はHis, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, TrpまたはTyrであり;
X4はAsp, His, LeuまたはSer（好ましくは、Asp）であり;
X5はAla, Arg, Asp, Glu, Leu, Phe, ProまたはThr（好ましくは、GluまたはPro）であり;
X6はAla, Arg, AsnまたはLeu（好ましくは、Leu）であり;
X7はIle, Leu, Met, Pro, SerまたはThr（好ましくは、Thr）であり;
X8はAla, Arg, Asn, Gly, His, Lys, SerまたはTyrであり;
X9はAla, Arg, Asn, Gln, Leu, Met, Ser, Trp, TyrまたはValである);
【００２２】
(L) Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-Cys (配列番号12)
(式中、
X2はArg, Asn, Gln, Glu, His, Leu, Phe, Pro, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、Trp、TyrまたはVal）であり;
X3はArg, Asp, Gln, Gly, Ile, Lys, Phe, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、Asp）であり;
X4はAla, Arg, Asp, Glu, Gly, Leu, SerまたはTyr（好ましくは、Asp）であり;
X5はAsp, Gln, Glu, Leu, Met, Phe, Pro, SerまたはTyr（好ましくは、Leu）であり;
X6はAsp, Leu, Pro, ThrまたはVal（好ましくは、LeuまたはThr）であり;
X7はArg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、LysまたはThr）であり;
X8はAla, Arg, Asn, Gln, Glu, His, Leu, Lys, MetまたはThr（好ましくは、ArgまたはLeu）であり;
X9はAla, Asn, Gln, Gly, Leu, Lys, Phe, Pro, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、ThrまたはTrp）であり;
Xl0はAla, Arg, Gln, His, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、MetまたはPhe）であり;
X11はArg, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, TyrまたはVal（好ましくは、Val）である);
ただし、前記ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する。
【００２３】
本発明のさらに好適な実施形態において、BLyS結合性ポリペプチドは下記のアミノ酸配列Ｍ（配列番号447）を含んでなる：
(M) Ala-X2-X3-X4-Asp-X6-Leu-Thr-X9-Leu-Xll-Xl2-Xl3-Xl4 (配列番号447)(式中、
X2はAsn, Ser, Tyr, Asp, Phe, Ile, Gln, His, Pro, Lys, Leu, Met, Thr, Val, Glu, Ala, Gly, CysまたはTrp（すなわち、Arg以外の任意のアミノ酸；好ましくは、Asn）であり;
X3はTrp, Glu, Lys, Cys, Leu, Ala, Arg, GlyまたはSer（好ましくは、Trp）であり;
X4はTyr, Phe, Glu, CysまたはAsn（好ましくは、Tyr）であり;
X6はPro, Ser, Thr, Phe, Leu, Tyr, CysまたはAla（好ましくは、ProまたはSer）であり;
X9はLys, Asn, Gln, GlyまたはArg（好ましくは、Lys）であり;
XllはTrp, Ser, Thr, Arg, Cys, TyrまたはLys（好ましくは、Trp）であり;
Xl2はLeu, Phe, Val, IleまたはHis（好ましくは、Leu）であり;
X13はPro, Leu, His, Ser, Arg, Asn, Gln, Thr, Val, Ala, Cys, Ile, PheまたはTyr（すなわち、Asp, Glu, Gly, Lys, MetまたはTrpではない；好ましくは、Pro）であり;
X14はAsp, Glu, Asn, Val, His, Gln, Arg, Gly, Ser, Tyr, Ala, Cys, Lys, Ile, ThrまたはLeu（すなわち、Phe, Met, ProまたはTrpではない；好ましくは、Asp, ValまたはGlu）である）。
【００２４】
好適な実施形態は下記の式Ｎのコア配列を含んでなるポリペプチドである：
(N) X1-X2-Asp-X4-Leu-Thr-X7-Leu-X9-X10 (配列番号448)
(式中、
X1はTrp, Glu, Lys, Cys, Leu, Ala, Arg, GlyまたはSer（好ましくは、Trp）であり;
X2はTyr, Phe, Glu, CysまたはAsn（好ましくは、Tyr）であり;
X4はPro, Ser, Thr, Phe, Leu, Tyr, CysまたはAla（好ましくは、ProまたはSer）であり;
X7はLys, Asn, Gln, GlyまたはArg（好ましくは、Lys）であり;
X9はTrp, Ser, Thr, Arg, Cys, TyrまたはLys（好ましくは、Trp）であり;
X10はLeu, Phe, Val, IleまたはHis（好ましくは、Leu）である)。
【００２５】
本発明に従う特に好適なBLyS結合性ポリペプチドは、次のコアペプチド：
Trp-Tyr-Asp-Pro-Leu-Thr-Lys-Leu-Trp-Leu (配列番号436)
を含んでなる。
【００２６】
上記のBLyS結合性ポリペプチドは、N-およびC-末端のいずれか一方または両方に追加のアミノ酸が結合されていてもよい。
【００２７】
本発明のさらなる実施形態は、少なくとも103のポリペプチド、好ましくは、少なくとも106のポリペプチド、より好ましくは、少なくとも109またはそれ以上のポリペプチドの集団から構成され、該集団のポリペプチドが次のアミノ酸配列：
Ala-X2-X3-X4-Asp-X6-Leu-Thr-X9-Leu-X11-X12-X13-X14 (配列番号449)
(式中、
X2は任意のアミノ酸であり;
X3は任意のアミノ酸であり;
X4は任意のアミノ酸であり;
X6は任意のアミノ酸であり;
X9は任意のアミノ酸であり;
X11は任意のアミノ酸であり;
X12は任意のアミノ酸であり;
X13は任意のアミノ酸であり;
X14は任意のアミノ酸である)
を含んでなる、BLyS親和性成熟ライブラリーに関する。
【００２８】
好適なBLyS親和性成熟ライブラリーは、可変アミノ酸位置（すなわち、配列番号449における２、３、４、６、９、11、12、13および14位）が無作為に多様化されるのではなく、不均化的に所定の単一アミノ酸となるように作製される。そのようなライブラリーは、次のDNA鋳型：
GCT NNN NNN NNN GAT NNN CTT ACT NNN CTC NNN NNN NNN NNN (配列番号185)
(式中、それぞれの可変塩基(N)はA、C、GまたはTであるが、それぞれの場合に１つの塩基は所与の塩基位置で約11倍多く存在しうる)
に適合する多様なポリヌクレオチドの発現により作製することができる。そのような１つのDNA鋳型は、以下の実施例６で述べるが、DNA配列のヌクレオチドが下記の割合となるように作製される。
【００２９】
2012131816.tif 000002
【００３０】
また、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは、アミノ末端（N-末端）キャッピング基または官能基（例えば、アセチル基）をもっていてもよく、こうした基は、例えば、望ましくない反応からアミノ末端アミノ基をブロックしたり、BLyS結合性ポリペプチドを別の分子、マトリックス、樹脂もしくは固相支持体に連結させるのに有用である。本発明のBLyS結合性ポリペプチドはまた、カルボキシ末端（C-末端）キャッピング基または官能基（例えば、アミド基）をもっていてもよく、こうした基は、例えば、望ましくない反応からC-末端カルボキシル基をブロックしたり、該結合性ポリペプチドを別の分子、マトリックス、樹脂もしくは固相支持体にコンジュゲートさせるのに有用な官能基を提供する。好ましくは、N-および／またはC-末端のキャッピング基はポリペプチドリンカー分子である。本発明のBLyS結合性ポリペプチドを固相支持体またはクロマトグラフィーマトリックス材料に固定するのに有用な、特に好適なC-末端リンカー分子は、次のアミノ酸配列 Pro-Gly-Pro-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys (配列番号13) を含んでなる。もう一つの有用なC-末端リンカー、例えば、ペプチドをフルオレセイン化するためのリンカーは、Gly-Gly-Lysである（表15参照）。
【００３１】
本発明はさらに、BLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する能力を保持しながら、例えば分子の安定性を高めるまたは減ずるように、改変されているBLyS結合性ポリペプチドを包含する。本発明の改変されたBLyS結合性ポリペプチドの例は、２つのシステイン残基のうち一方が非天然アミノ酸で置換されているポリペプチドである。この非天然アミノ酸は、残りのシステイン側鎖と縮合して安定なチオエーテル橋を形成することができ、その結果、環状のBLyS結合性ポリペプチドが生成する。このような合成ペプチドの環状チオエーテル分子は、例えば、PCT国際公開WO 97/46251（参照により本明細書に組み入れるものとする）に記載されるような、当分野で公知の技法を用いてルーチンに製造することができる。
【００３２】
別の実施形態において、本発明は、マトリックス、樹脂または固相支持体に結合された、連結された、あるいは、付着された本発明のBLyS結合性ポリペプチドを提供する。ポリペプチドをマトリックス、樹脂または固相支持体に結合、連結または付着させるための技法は当分野で周知である。これらの物質に適するマトリックス、樹脂または固相支持体は、BLyS結合性ポリペプチドが普通に結合、連結または付着するものであれば、当分野で知られたどのような組成のものであってもよく、例えば、クロマトグラフィー用の樹脂やマトリックス（例えば、SEPHAROSE-4FFアガロースビーズ）、プラスチック製マイクロタイタープレートのウェルの壁面や底面（例えば、固相酵素免疫検定法(ELISA)で用いるもの）、またはシリカを基材としたバイオチップなどがあり、これらに限らない。本発明の結合性ポリペプチドを固定するための固相支持体として有用な材料には、ポリアクリルアミド、アガロース、シリカ、ニトロセルロース、紙、プラスチック、ナイロン、金属、およびこれらの組合せが含まれるが、これらに限るものではない。本発明のBLyS結合性ポリペプチドは、当分野で公知の技法を用いて、非共有結合あるいは共有結合によってマトリックス、樹脂または固相支持体に固定させることができる。好ましくは、本発明のBLyS結合性ポリペプチドを、SEPHAROSE-4FFアガロースのようなクロマトグラフィー材料に固定させる。より一層好適な実施形態では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドを、リンカー分子によってクロマトグラフィー材料に連結させる。本発明に従う好適なリンカー分子は次のアミノ酸配列 Pro-Gly-Pro-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys (配列番号13) を含むポリペプチドである。最も好ましくは、本発明のアフィニティークロマトグラフィー材料は、アミノ酸配列 Pro-Gly-Pro-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys (配列番号13) を有するポリペプチドリンカー分子によりクロマトグラフィー材料に連結された、配列番号163〜172からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むBLyS結合性ポリペプチドを含んでなる。マトリックス、樹脂または他の固相支持体に結合、連結または付着させた本発明のBLyS結合性ポリペプチドは、BLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドを検出、単離および精製する方法で用いられ、特に、アフィニティークロマトグラフィーによってBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドを精製するのに有用である。
【００３３】
特定の好ましい実施形態では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドまたは該結合性ポリペプチドを展示するファージは、天然の可溶性三量体の形をしたBLySタンパク質と不可逆的に結合する。
【００３４】
特定の好ましい実施形態では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドまたは該結合性ポリペプチドを展示するファージは、天然の可溶性三量体の形をしたBLySタンパク質と可逆的に結合する。
【００３５】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のBLyS結合性ポリペプチドをコードする単離された核酸（好ましくは、DNA）を含んでなる組成物を包含する。特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号１〜12、20〜172、および186〜444に示されるような本発明のBLyS結合性ポリペプチドをコードする。付加的な実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号１〜12、20〜172、および186〜444のアミノ酸配列を含むポリペプチドの変異体または断片をコードする。さらに付加的な実施形態では、本発明の核酸分子はBLyS結合性ポリペプチドをコードし、該核酸の相補鎖は、表１〜８および14ならびに実施例２、５および６に記載されるポリペプチド（配列番号１〜12、20〜172、および186〜444）をコードするポリヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下（例えば、6x塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(SSC)中約45℃でのフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーションと、その後の0.2xSSC/0.1% SDS中約50〜65℃での１回以上の洗浄）、高度にストリンジェントな条件下（例えば、6xSSC中約45℃でのフィルター結合核酸へのハイブリダイゼーションと、その後の0.1xSSC/0.2% SDS中約68℃での１回以上の洗浄）、または、当業者に公知のその他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする（例えば、Ausubel, F.M.ら編, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.I, Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 6.3.1-6.3.6および2.10.3を参照のこと）。
【００３６】
本発明はまた、本発明のBLyS結合性ポリペプチド（ならびにその断片および変異体）をコードする単離された核酸分子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む宿主細胞、ならびに該ベクターおよび宿主細胞を作製する方法に関する。本発明はさらに、該組換えベクターを使用して、BLyS結合性ポリペプチドを組換え法により生産することを提供する。
【００３７】
本発明のBLyS結合性ポリペプチド、核酸、形質転換宿主細胞、ならびに、遺伝子操作したウイルスおよびファージ（例えば、組換えファージ）は、BLySの検出、単離および精製を含むがこれらに限らない用途を有する。
【００３８】
本発明の別の実施形態では、BLyS結合性ポリペプチドをファージ表面に展示する組換えバクテリオファージも提供される。そのようなファージは当分野で公知の技法を用いてルーチンに作製することができ、例えば、スクリーニング試薬やBLySを検出するための試薬として有用である。
【００３９】
別の実施形態において、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは溶液中のBLySまたはBLyS様ポリペプチドを検出または単離するために使用される。この種の溶液としては、BLySまたはBLyS様ポリペプチドを水やバッファー溶液に懸濁または溶解したもの、ならびに、個体に由来する体液および／または細胞、生物学的液体、生体組織、体細胞、細胞系、組織培養物、またはBLySもしくはBLyS様ポリペプチドを含みうる他の供給源（例えば、細胞培養基、細胞抽出物、組織ホモジェネートなど）が含まれるが、これらに限定されない。生物学的液体としては、血清、血漿、リンパ液、血液、血液画分、尿、滑液、脊髄液、唾液および粘液が挙げられ、これらに限らない。
【００４０】
別の実施形態において、本発明は、溶液中に含まれるBLySタンパク質および／またはBLyS様ポリペプチドを検出する方法を提供し、この方法は、該溶液を本発明のBLyS結合性ポリペプチドと接触させ、BLyS結合性ポリペプチドへのBLySまたはBLyS様ポリペプチドの結合を検出することを含んでなる。BLyS結合性ポリペプチドは遊離であっても固定されていてもよい。好ましくは、BLyS結合性ポリペプチドは固相表面、クロマトグラフィー材料またはプラスチック製マイクロタイターアッセイプレートのウェルに固定されたポリペプチドである。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、BLySタンパク質および／またはBLyS様ポリペプチドを、それを含む溶液から単離する方法であり、この方法は、
(a)  該溶液をBLyS結合性ポリペプチドと、BLyS結合性ポリペプチドへのBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドの結合を可能にする条件下で接触させること、
(b)   BLyS結合性ポリペプチド（およびそれに結合されたBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチド）を該溶液の残部から分離すること、
を含んでなる。
【００４２】
本発明のさらなる実施形態は、BLySタンパク質および／またはBLyS様ポリペプチドを、それを含む溶液から単離する方法であり、この方法は、
(a)  該溶液をBLyS結合性ポリペプチドと、BLyS結合性ポリペプチドへのBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドの結合を可能にする条件下で接触させること、
(b)   BLyS結合性ポリペプチドとBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドとから形成された複合体を、該溶液の他の成分から分離すること、
(c)  BLyS結合性ポリペプチドをBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドから解離させること、
(d)  解離させたBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドを回収すること、
を含んでなる。
【００４３】
別の実施形態において、本発明は、BLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドを検出または単離する方法で使用するための、本発明の結合性ポリペプチドを含んでなるキットを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
定義
本発明を明確に理解しやすくするために、以下の用語を定義する：
「組換え」という用語は、非天然に改変されたまたは操作された核酸、外因性核酸でトランスフェクトされた宿主細胞、あるいは、単離された核酸（通常はDNA）の操作または宿主細胞の形質転換もしくはトランスフェクションにより、非天然に発現されるポリペプチド分子を説明するために用いられる。「組換え」は、特に、遺伝子工学的手法を用いてin vitroで構築されている核酸分子を包含する用語であり、そして分子、構築物、ベクター、細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを説明するための形容詞としての用語「組換え」の使用は、特に、天然に存在するそのような分子、構築物、ベクター、細胞、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを除外するものである。
【００４５】
「バクテリオファージ」という用語は、核酸コアと、いくつかの異なるタンパク質分子の集合により構成された防御シェルとを含む細菌ウイルスとして定義される。「バクテリオファージ」と「ファージ」は同義語であり、本明細書では相互交換可能に用いられる。
【００４６】
本明細書では「親和性リガンド」という用語が時々用いられるが、この用語は本発明のBLyS結合性ポリペプチドと同義である。
【００４７】
本明細書で用いる「BLySタンパク質」とは、膜結合型（例えば、配列番号173）と可溶型（例えば、配列番号174）の両者を含むものとする。BLySタンパク質は単量体、二量体、三量体または多量体であってよい。好ましくは、BLySタンパク質はホモ三量体である。
【００４８】
本明細書で用いる「BLyS様タンパク質」とは、天然BLyS、組換え全長BLyS、ならびに、その断片および変異体、例えば、改変されたもしくはトランケートされた天然BLySまたは組換え全長BLySを包含し、これらのBLySおよびBLyS様タンパク質はBLyS機能活性を保持するものである。本発明の組成物によって特異的に結合され得るBLySまたはBLyS断片としては、限定するものではないが、ヒトBLyS（配列番号173および／または174）またはヒト単球上に発現されるBLyS；マウスBLyS（配列番号175および／または176）またはマウス単球上に発現されるBLyS；ラットBLyS（配列番号177、178および／または180に示される可溶型と、例えばラット単球の表面上の、膜結合型）；またはサルBLyS（例えば、配列番号181および／または182のサルBLySポリペプチド、可溶型のサルBLyS、またはサル単球上に発現されるBLyS）、あるいは、それらの断片を挙げることができる。好ましくは、本発明の組成物はヒトBLyS（配列番号173および／または174）またはその断片と結合するものである。BLySおよびBLyS様ポリペプチドは、以下の活性を含むがこれらに限らない天然または全長BLySの機能活性を少なくとも１つ保持する：BLyS受容体(例えば、TACI (GenBank登録番号AAC51790)およびBCMA (GenBank登録番号NP 001183))への結合、Ｂ細胞増殖の刺激、Ｂ細胞による免疫グロブリン分泌の刺激、BLyS受容体シグナル伝達カスケードの刺激、および／または、抗BLyS抗体もしくは他のBLyS結合性ポリペプチドとの結合。BLySまたはBLyS様ポリペプチドの機能活性を調べるために用いられるアッセイは、当業者が容易に決めることができる（例えば、Mooreら, 1999,前掲に開示されたアッセイを参照のこと）。「BLyS様ポリペプチド」には、BLySの全部または一部が他のポリペプチドに融合または結合されている融合ポリペプチドも含まれる。融合ポリペプチドであるBLyS様ポリペプチドは、BLySの少なくとも１つの機能活性、好ましくは、Ｂリンパ球を刺激する能力（例えば、Mooreら, Science, 285:260-263 (1999)を参照のこと）、BLyS受容体（例えば、TACIまたはBCMA）と結合する能力、および／または、抗BLyS抗体もしくは他のBLyS結合性ポリペプチドによって結合される能力を保持する。BLyS融合ポリペプチドは、BLySの遺伝子もしくは他のポリヌクレオチドコード配列またはその断片を、他のタンパク質またはポリペプチドのコード配列と、リーディングフレームを合わせて連結させる（再結合させる）組換えDNA法により作製することができる。その後、得られる組換えDNA分子を各種のプラスミドまたはファージ発現ベクター（適切な真核または原核宿主細胞における融合タンパク質分子の発現を可能にするもの）のいずれかに挿入する。BLyS融合ポリペプチドは合成法でも半合成法でも調製することができる。
【００４９】
「BLyS標的」または「BLyS標的タンパク質」という用語が本明細書において用いられることがあるが、この用語はBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドを包含する。したがって、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは「BLyS標的タンパク質」と結合し、そのため「BLyS標的タンパク質」との結合、その検出、除去および／または精製に使用することができる。
【００５０】
本明細書中で用いる「結合性ポリペプチド」とは、別の分子、ポリペプチド、ペプチド擬似体または形質転換体と結合して複合体を形成することができるあらゆるポリペプチドを指す。
【００５１】
「BLyS結合性ポリペプチド」はBLyS標的タンパク質と結合しうる本発明の分子である。本発明のBLyS結合性ポリペプチドの非限定的な例として、本明細書に記載のアミノ酸配列（配列番号１〜12、20〜172および186〜444参照）を有するポリペプチドが挙げられる。「BLyS結合性ポリペプチド」という用語はまた、本明細書に記載の特定のアミノ酸配列（配列番号１〜12、20〜172および186〜444参照）を有するポリペプチドのBLyS結合性断片および変異体（誘導体を含む）をも包含する。本明細書に記載するアミノ酸配列の「変異体」とは、BLySと結合するが、本明細書で特定されるBLyS結合性ポリペプチドと同一のまたは類似したアミノ酸配列を必ずしも含まないポリペプチドを意味する。本明細書で特定されるBLyS結合性ポリペプチドの変異体である本発明のBLyS結合性ポリペプチドは、下記の要件の少なくとも１つを満たすものである：(a)  本明細書に開示するBLyS結合性ポリペプチド配列のアミノ酸配列（配列番号１〜12、20〜172および186〜444）に対して少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなるポリペプチド、(b)  ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドであって、該ヌクレオチド配列の相補配列が、ストリンジェントな条件下で、本明細書に開示するBLyS結合性ポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号１〜12、20〜172および186〜444のアミノ酸配列をコードする核酸配列）とハイブリダイズするもの、および／または、本明細書に開示するBLyS結合性ポリペプチド配列の、少なくとも５個のアミノ酸残基、少なくとも10個のアミノ酸残基、少なくとも15個のアミノ酸残基、もしくは少なくとも20個のアミノ酸残基からなる断片。本発明のBLyS結合性ポリペプチドはまた、様々な用途のために改変されているポリペプチドを包含するが、ただし、そのような改変がBLyS標的と結合する能力を排除しないことを条件とする。考えられる改変の具体的な例としては、C-末端またはN-末端アミノ酸の置換、あるいは、BLyS結合剤をクロマトグラフィー材料または他の固相支持体に結合させるためのペプチド鎖の伸長などがあり、これらに限らない。その他の考えられる置換として、通常はジスルフィド結合を形成している一対のシステイン残基の一方または両方を、反応性側鎖をもつ非天然のアミノ酸で置換することがあり、かかる置換は、これらのアミノ酸位置に以前のジスルフィド結合よりも安定した結合を形成することを目的としている。そのような改変型の結合性ポリペプチドもすべて、その改変型ポリペプチドがBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する能力を保持する限り、本発明のBLyS結合性ポリペプチドと見なされ、溶液中に含まれるBLySまたはBLyS様ポリペプチドを検出したり、該溶液から該ポリペプチドを単離・精製するなど、本明細書に記載の種々の方法において使用することができる。本発明のBLyS結合性ポリペプチドには、本明細書に開示する特定のBLyS結合性ポリペプチド配列（例えば、配列番号１〜12、20〜172および186〜444）の変異体も含まれ、かかる変異体は、これらのポリペプチド配列の一つに対応するアミノ酸配列を有するが、そのポリペプチド配列がBLySと結合する分子を提供する置換、付加または欠失により改変されている。したがって、BLyS結合性ポリペプチドには、一次アミノ酸配列として、特定のBLyS結合性ポリペプチド配列の全部または一部を含むポリペプチドが含まれ、例えば、該配列内の残基が機能的に等しいアミノ酸残基で置換されていて、結果的に機能的に活性のあるペプチドをもたらす改変配列などである。例えば、該配列内の１個以上のアミノ酸残基を同様の極性をもつ別のアミノ酸残基（機能的同等物として作用して、結果的にサイレント変化をもたらす）で置換することができる。該配列内のアミノ酸の保存的置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択しうる。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンがある。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンがある。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン、およびヒスチジンがある。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸とグルタミン酸がある。そのようなBLyS結合性ポリペプチドは、化学的ペプチド合成により、あるいは、BLyS結合性ポリペプチドをコードするが突然変異を起こしている核酸からの組換え生産により調製することができる。当分野で公知の突然変異誘発法はどれも使用することができ、例えば、化学的突然変異誘発法、in vitro部位特異的突然変異誘発法(Hutchinsonら, J. Biol. Chem., 253:6551 (1978))、TAB.RTM.リンカー(Pharmacia)の使用などがあるが、これらに限らない。
【００５２】
本明細書で採用され、理解されるように、２つのアミノ酸配列もしくは２つの核酸配列の相同性パーセントまたは同一性パーセントは、KarlinおよびAltschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268 (1990))のアルゴリズムをKarlinおよびAltschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993))に記載のように改変したものを用いて決定される。そのようなアルゴリズムはAltschulら(J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990))のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれる。BLASTヌクレオチド検索をNBLASTプログラムにより実行すると、本明細書に開示する核酸分子に相同なヌクレオチド配列が得られる。BLASTタンパク質検索をXBLASTプログラムにより実行すると、基準ポリペプチドに相同なアミノ酸配列が得られる。比較のためにギャップを入れたアラインメントを得るためには、Altschulら(Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997))に記載されるとおりにGapped BLASTを利用する。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを使用する場合は、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメーターを用いる。を参照のこと。あるいはまた、２つのアミノ酸配列もしくは２つの核酸配列の同一性パーセントは、いったん配列同士を最適な比較のためにアラインメントしてから（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントのために第１のアミノ酸または核酸配列の配列中にギャップを導入してから）決定することができる。その後、対応するアミノ酸位置もしくはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の１つの位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、それらの分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントはそれらの配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝重複する同一位置の数／位置の総数×100％）。ある実施形態においては、２つの配列が同じ長さである。
【００５３】
本明細書で用いる「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸残基がペプチド結合によって連結されている直鎖、分岐鎖、または環状（例えば、ループ構造を含む）のポリマーを指す。「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基のどのような特定の上限にも限定されない。かくして、本明細書に開示するアミノ酸配列を含んでなる本発明のBLyS親和性リガンドは、適切には「BLyS結合性ポリペプチド」と呼ばれる。なぜなら、かかる結合性ポリペプチドは、たとえそのような分子がペプチド結合に関与してもしなくてもよいアミノ酸以外の付加的な成分または基（例えば、N-末端および／またはC-末端のキャッピング基または官能基）を１個以上含むものであろうと、ペプチド結合により一緒に保持されるアミノ酸残基を２個以上含むからである。本発明のポリペプチドは１価、２価、３価または多価であってよく、配列番号１〜12、20〜172、および186〜444のアミノ酸配列を有するBLyS結合性ポリペプチドおよび／またはその断片もしくは変異体を１本以上含んでいてもよい。本明細書で用いる「ペプチド」という用語は「ポリペプチド」と同じ意味を有する。
【００５４】
「供給流」：  本発明のBLyS結合性ポリペプチドが結合するBLySおよびBLyS様ポリペプチドは当分野で公知の方法により調製することができ、かかる方法として、限定するものではないが、化学合成；形質転換宿主細胞による生産；天然に存在する細胞または組換えにより形質転換された細菌、酵母、真菌、昆虫細胞、植物細胞および哺乳動物細胞による培地への分泌；遺伝子操作生物（例えば、トランスジェニック哺乳動物）による生産；および非遺伝子操作生物による生産がある。BLySまたはBLyS様ポリペプチドを生産された状態のままで含むか、またはそれが生産溶液中に存在することがわかっている溶液、サンプルまたは混合物を「供給流」と呼ぶことがある。
【００５５】
「結合する」という用語は、結合性ポリペプチドが所与の標的を認識してそれと結合するという、標準的手法による測定を意味する。そのような標準的手法として、限定するものではないが、アフィニティークロマトグラフィー、平衡透析、ゲル濾過、固相酵素免疫検定法(ELISA)、FACS分析、および、直接結合測定または他の結合物質との競合アッセイのいずれかによる、結合から生じる分光学的変化（例えば、蛍光異方性を用いる）のモニタリングなどがある。
【００５６】
「特異性」とは、他の標的に比して、ある標的に対してより高い結合親和性を有する本発明の結合性ポリペプチドを指す。かくして、「BLyS標的タンパク質特異性」という用語は、BLyS標的タンパク質ではない別の分子と比べて、BLyS標的タンパク質に対してより高い親和性を有する分子を指す。
【００５７】
その他の用語は以下の本文中で必要に応じて定義される。
【００５８】
詳細な説明
本発明はBLySのための新規な結合性分子を提供する。そのような結合性分子は、組織中、または溶液もしくは系中に含まれるBLySまたはBLyS様ポリペプチドの効率的な検出および単離を可能にする。本明細書に開示するBLyS結合性ポリペプチドは、BLyS標的を固定化するためにも使用され、また、BLyS標的タンパク質を含む溶液または系からそれを分離する手段を提供する。本発明の好適な結合性分子は高い親和性（すなわち、低濃度で作用）でもってBLySと結合する。
【００５９】
BLyS結合性ポリペプチド
本発明は、Ｂリンパ球刺激因子タンパク質(BLyS)および／またはBLyS様ポリペプチドと特異的に結合する新規なポリペプチドならびにポリペプチドのファミリーを提供する。特に、本発明は、ヒトBLyS（配列番号173および／または174）またはヒト単球上に発現されるBLyS；マウスBLyS（配列番号175および／または176）またはマウス単球上に発現されるBLyS；ラットBLyS（配列番号177、178、179および／または180に示される可溶型、あるいは、例えばラット単球の表面にある、膜結合型のいずれか）；またはサルBLyS（例えば、配列番号181および／または182のサルBLySポリペプチド、可溶型のサルBLyS、またはサル単球上に発現されるBLyS）、好ましくはヒトBLyS、のポリペプチドもしくはポリペプチド断片と特異的に結合するポリペプチドを包含する。
【００６０】
特定の好ましい実施形態において、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは高い親和性でもってBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する。他の実施形態では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと可逆的に結合する。さらに別の実施形態では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと不可逆的に結合する。
【００６１】
ポリペプチドに含まれるシステイン残基はジスルフィド結合を形成すると考えられ、このジスルフィド結合のため、これらのシステイン残基を含むポリペプチドは非還元条件下で安定したループ構造を形成するだろう。本発明の特に好適なBLyS結合性ポリペプチドは、BLySまたはBLyS様ポリペプチドと結合する安定したループ構造やその他の構造を形成するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子である。
【００６２】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号１〜12、20〜172、および186〜444（好ましくは、上記した、また、表１〜８、14、15ならびに下記の実施例２、５、６に記載する配列番号163〜172または436〜444）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなるBLyS結合性ポリペプチドに関する。ここに記載する単離されたBLyS結合性ポリペプチドの配列の解析は、テトラペプチドAsp-Xaa-Leu-Thr (配列番号446)を含むポリペプチドについての強い選択を示し、それゆえに、最も広範な形態において、本発明は、ポリペプチドAsp-Xaa-Leu-Thr (配列番号446) (式中、XaaはPro, Ser, Thr, Phe, Leu, Tyr, CysまたはAlaであり、好ましくは、ProまたはSerである)を含んでなる、BLySと結合可能なポリペプチドに関する。
【００６３】
表１〜８に示した特定のBLyS結合性ポリペプチドに基づいて、７つのコンセンサス配列（配列番号１〜７）が決定された。特定の実施形態では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドはこれらの配列を１つ以上含んでなる。そのような好適なBLyS結合性ポリペプチドには、不変のCys残基間で環状構造またはループ構造を形成する可能性があり、下記のＡ〜Ｅ（配列番号１〜５）から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなるポリペプチドが含まれる：
(A) Xl-X2-X3-Cys-X5-Phe-X7-Trp-Glu-Cys-Xll-X12-X13 (配列番号1)
(式中、
X1はAla, Asn, LysまたはSerであり;
X2はAla, Glu, Met, SerまたはValであり;
X3はAla, Asn, LysまたはPro（好ましくは、Lys）であり;
X5はPhe, TrpまたはTyr（好ましくは、Tyr）であり;
X7はProまたはTyr（好ましくは、Pro）であり;
X11はAla, Gln, His, PheまたはValであり;
X12はAsn, Gln, Gly, His, SerまたはValであり;
X13はAla, Asn, Gly, Ile, ProまたはSerである);
ただし、該ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する；
【００６４】
(B) X1-X2-X3-Cys-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Cys-X12-X13-X14 (配列番号2)
(式中、
X1はAla, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Valであるか、または存在せず;
X2はAla, Asn, Asp, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, TyrまたはValであり;
X3はAla, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、Asp）であり;
X5はAsp, Ile, LeuまたはTyr（好ましくは、AspまたはLeu）であり;
X6はArg, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, TyrまたはVal（好ましくは、GluまたはLeu）であり;
X7はHis, Leu, LysまたはPhe（好ましくは、HisまたはLeu）であり;
X8はLeu, ProまたはThr（好ましくは、ThrまたはPro）であり;
X9はArg, Asn, Gly, His, Ile, Lys, MetまたはTrp（好ましくは、Lys）であり;
X10はAla, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Ser, Trp, TyrまたはValであり;
Xl2はAsp, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Phe, Ser, Trp, TyrまたはValであり;
X13はAla, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, TyrまたはValであり;
X14はAla, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr, Valであるか、または存在しない);
ただし、該ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する；
【００６５】
(C) X1-X2-X3-Cys-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-Cys-X13-X14-X15 (配列番号3)
(式中、
X1はAla, Arg, Asn, Asp, Leu, Lys, Phe, Pro, SerまたはThrであり;
X2はAsn, Asp, Gln, His, Ile, Lys, Pro, ThrまたはTrpであり;
X3はAla, Arg, Asn, Gln, Glu, His, Phe, ProまたはThr（好ましくは、Ala）であり;
X5はAsn, Asp, Pro, SerまたはThr（好ましくは、Asp）であり;
X6はArg, Asp, Ile, Leu, Met, ProまたはVal（好ましくは、Ile）であり;
X7はAla, Ile, Leu, Pro, ThrまたはVal（好ましくは、ValまたはLeu）であり;
X8はAsn, His, Ile, Leu, Lys, PheまたはThr（好ましくは、Thr）であり;
X9はAsn, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, ProまたはThr（好ましくは、Leu）であり;
X10はArg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, Ile, Lys, Met, Pro, SerまたはTrpであり;
X11はArg, Glu, Gly, Lys, Phe, Ser, TrpまたはTyr（好ましくは、Ser）であり;
X13はGln, Glu, Ile, Leu, Phe, Pro, Ser, TyrまたはVal（好ましくは、Val）であり;
X14はAsn, Gly, Ile, Phe, Pro, Thr, TrpまたはTyrであり;
X15はAsn, Asp, Glu, Leu, Lys, Met, ProまたはThr（好ましくは、GluまたはPro）である);
ただし、該ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する；
【００６６】
(D) X1-X2-X3-Cys-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-Cys-X14-X15-X16 (配列番号4)
(式中、
X1はAsn, Asp, His, Leu, Phe, Pro, Ser, Tyrであるか、または存在せず（好ましくは、Ser）;
X2はArg, Asn, Asp, His, Phe, SerまたはTrp（好ましくは、Arg）であり;
X3はAsn, Asp, Leu, Pro, SerまたはVal（好ましくは、AsnまたはAsp）であり;
X5はAsp, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, PheまたはThrであり;
X6はHis, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, TrpまたはTyrであり;
X7はAsp, His, LeuまたはSer（好ましくは、Asp）であり;
X8はAla, Arg, Asp, Glu, Leu, Phe, ProまたはThr（好ましくは、GluまたはPro）であり;
X9はAla, Arg, AsnまたはLeu（好ましくは、Leu）であり;
Xl0はIle, Leu, Met, Pro, SerまたはThr（好ましくは、Thr）であり;
X11はAla, Arg, Asn, Gly, His, Lys, SerまたはTyrであり;
X12はAla, Arg, Asn, Gln, Leu, Met, Ser, Trp, TyrまたはValであり;
X14はAsp, Gly, Leu, Phe, TyrまたはVal（好ましくは、Leu）であり;
X15はAsn, His, Leu, ProまたはTyr（好ましくは、His、LeuまたはPro）であり;
X16はAsn, Asp, His, Phe, SerまたはTyr（好ましくは、AspまたはSer）である);
ただし、該ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する；
【００６７】
(E) X1-X2-X3-Cys-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-Cys-X16-X17-X18 (配列番号5)
(式中、
X1はArg, Asp, Gly, His, Leu, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyrであるか、または存在せず（好ましくは、Arg）;
X2はAla, Arg, Asn, Asp, Gly, Pro, Serであるか、または存在せず（好ましくは、Asn、Asp、GlyまたはPro）;
X3はArg, Asn, Gln, Glu, Gly, Lys, Met, Pro, TrpまたはVal（好ましくは、GlyまたはMet）であり;
X5はArg, Asn, Gln, Glu, His, Leu, Phe, Pro, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、Trp、TyrまたはVal）であり;
X6はArg, Asp, Gln, Gly, Ile, Lys, Phe, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、Asp）であり;
X7はAla, Arg, Asp, Glu, Gly, Leu, SerまたはTyr（好ましくは、Asp）であり;
X8はAsp, Gln, Glu, Leu, Met, Phe, Pro, SerまたはTyr（好ましくは、Leu）であり;
X9はAsp, Leu, Pro, ThrまたはVal（好ましくは、LeuまたはThr）であり;
X10はArg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、LysまたはThr）であり;
X11はAla, Arg, Asn, Gln, Glu, His, Leu, Lys, MetまたはThr（好ましくは、ArgまたはLeu）であり;
X12はAla, Asn, Gln, Gly, Leu, Lys, Phe, Pro, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、ThrまたはTrp）であり;
X13はAla, Arg, Gln, His, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、MetまたはPhe）であり;
X14はArg, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, TyrまたはVal（好ましくは、Val）であり;
X16はArg, Asp, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, SerまたはTrp（好ましくは、Met）であり;
X17はArg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Pro, Ser, TrpまたはTyr（好ましくは、Arg、HisまたはTyr）であり;
Xl8はAla, Arg, Asn, Asp, His, Leu, PheまたはTrp（好ましくは、HisまたはAsn）である);
ただし、該ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する。
【００６８】
さらなる好適な実施形態には、下記のＦおよびＧ（配列番号６および７）から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなる線状ポリペプチドが含まれる：
(F) X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12 (配列番号6)
(式中、
X1はAla, Arg, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、Gly、TyrまたはVal）であり;
X2はAla, Arg, Gln, His, Ile, Leu, Phe, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、HisまたはTyr）であり;
X3はAla, Asp, Lys, Phe, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、AspまたはTyr）であり;
X4はArg, Asp, Gln, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, TyrまたはVal（好ましくは、AspまたはGln）であり;
X5はAsp, Leu, Lys, Phe, Pro, SerまたはVal（好ましくは、LeuまたはSer）であり;
X6はHis, Ile, Leu, Pro, SerまたはThr（好ましくは、LeuまたはThr）であり;
X7はArg, Gly, His, Leu, Lys, MetまたはThr（好ましくは、LysまたはThr）であり;
X8はAla, Arg, Asn, Ile, Leu, Lys, MetまたはThr（好ましくは、LeuまたはLys）であり;
X9はAla, Asn, Arg, Asp, Glu, Gly, His, Leu, Met, Ser, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、MetまたはSer）であり;
X10はIle, Leu, Phe, Ser, Thr, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、ThrまたはLeu）であり;
XllはAla, Arg, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Pro, Ser, Thr, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、ProまたはThr）であり;
X12はArg, Asp, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、ArgまたはPro）である);
ただし、該ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する；
【００６９】
(G) X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13 (配列番号7)
(式中、
X1はAsp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, MetまたはTrp（好ましくは、GluまたはLys）であり;
X2はArg, Gln, His, Ile, LeuまたはPro（好ましくは、HisまたはPro）であり;
X3はAsp, Gly, Ile, Lys, Thr, TyrまたはVal（好ましくは、Tyr）であり;
X4はAsn, Asp, Gln, Glu, Met, Pro, SerまたはTyr（好ましくは、AspまたはGln）であり;
X5はAsn, Asp, His, Ile, Leu, Met, Pro, ThrまたはVal（好ましくは、AsnまたはThr）であり;
X6はAsp, Glu, His, Leu, Lys, ProまたはVal（好ましくは、AspまたはPro）であり;
X7はArg, Asn, Gln, His, Ile, Leu, Met, ProまたはThr（好ましくは、IleまたはPro）であり;
X8はGln, Gly, His, Leu, Met, SerまたはThr（好ましくは、LeuまたはThr）であり;
X9はAsn, Gln, Gly, His, Leu, Lys, SerまたはThr（好ましくは、Lys）であり;
X10はAla, Gly, Ile, Leu, Lys, MetまたはPhe（好ましくは、GlyまたはMet）であり;
X11はAla, Glu, His, Ile, Leu, Met, Ser, Thr, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、AlaまたはThr）であり;
X12はArg, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, TyrまたはVal（好ましくは、ArgまたはHis）であり;
X13はArg, Asn, Glu, His, Ile, Ser, Thr, TrpまたはVal（好ましくは、His）である);
ただし、該ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する。
【００７０】
前記ポリペプチドはN-末端とC-末端のいずれか一方または両方に追加のアミノ酸が結合されていてもよい。
【００７１】
ループ構造を形成する可能性があるポリペプチドを含むライブラリー（すなわち、TN6、TN7、TN8、TN9、TN10およびTN12と称するライブラリー）の分離物からの配列情報および結合データを検討すると、ループ構造を形成しうる一連のBLyS結合性ポリペプチドが同定される。特定の実施形態において、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは下記のＨ〜Ｌ（配列番号８〜12）から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、からなる：
(H) Cys-X2-Phe-X4-Trp-Glu-Cys (配列番号8)
(式中、
X2はPhe, TrpまたはTyr（好ましくは、Tyr）であり;
X4はProまたはTyr（好ましくは、Pro）である);
【００７２】
(I) Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Cys (配列番号9)
(式中、
X2はAsp, Ile, LeuまたはTyr（好ましくは、AspまたはLeu）であり;
X3はArg, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, TyrまたはVal（好ましくは、GluまたはLeu）であり;
X4はHis, Leu, LysまたはPhe（好ましくは、HisまたはLeu）であり;
X5はLeu, ProまたはThr（好ましくは、ThrまたはPro）であり;
X6はArg, Asn, Gly, His, Ile, Lys, MetまたはTrp（好ましくは、Lys）であり;
X7はAla, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Ser, Trp, TyrまたはValである);
【００７３】
(J) Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Cys (配列番号10)
(式中、
X2はAsn, Asp, Pro, SerまたはThr（好ましくは、Asp）であり;
X3はArg, Asp, Ile, Leu, Met, ProまたはVal（好ましくは、Ile）であり;
X4はAla, Ile, Leu, Pro, ThrまたはVal（好ましくは、ValまたはLeu）であり;
X5はAsn, His, Ile, Leu, Lys, PheまたはThr（好ましくは、Thr）であり;
X6はAsn, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, ProまたはThr（好ましくは、Leu）であり;
X7はArg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, Ile, Lys, Met, Pro, SerまたはTrpであり;
X8はArg, Glu, Gly, Lys, Phe, Ser, TrpまたはTyr（好ましくは、Ser）である);
【００７４】
(K) Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Cys (配列番号11)
(式中、
X2はAsp, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, PheまたはThrであり;
X3はHis, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, TrpまたはTyrであり;
X4はAsp, His, LeuまたはSer（好ましくは、Asp）であり;
X5はAla, Arg, Asp, Glu, Leu, Phe, ProまたはThr（好ましくは、GluまたはPro）であり;
X6はAla, Arg, AsnまたはLeu（好ましくは、Leu）であり;
X7はIle, Leu, Met, Pro, SerまたはThr（好ましくは、Thr）であり;
X8はAla, Arg, Asn, Gly, His, Lys, SerまたはTyrであり;
X9はAla, Arg, Asn, Gln, Leu, Met, Ser, Trp, TyrまたはValである);
【００７５】
(L) Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-Cys (配列番号12)
(式中、
X2はArg, Asn, Gln, Glu, His, Leu, Phe, Pro, Trp, TyrまたはVal（好ましくは、Trp、TyrまたはVal）であり;
X3はArg, Asp, Gln, Gly, Ile, Lys, Phe, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、Asp）であり;
X4はAla, Arg, Asp, Glu, Gly, Leu, SerまたはTyr（好ましくは、Asp）であり;
X5はAsp, Gln, Glu, Leu, Met, Phe, Pro, SerまたはTyr（好ましくは、Leu）であり;
X6はAsp, Leu, Pro, ThrまたはVal（好ましくは、LeuまたはThr）であり;
X7はArg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、LysまたはThr）であり;
X8はAla, Arg, Asn, Gln, Glu, His, Leu, Lys, MetまたはThr（好ましくは、ArgまたはLeu）であり;
X9はAla, Asn, Gln, Gly, Leu, Lys, Phe, Pro, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、ThrまたはTrp）であり;
Xl0はAla, Arg, Gln, His, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, TrpまたはTyr（好ましくは、MetまたはPhe）であり;
X11はArg, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, TyrまたはVal（好ましくは、Val）である);
ただし、前記ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する。
【００７６】
本発明のさらに好適な実施形態において、BLyS結合性ポリペプチドは下記のアミノ酸配列Ｍ（配列番号447）を含んでなる：
(M) Ala-X2-X3-X4-Asp-X6-Leu-Thr-X9-Leu-Xll-Xl2-Xl3-Xl4 (配列番号447)
(式中、
X2はAsn, Ser, Tyr, Asp, Phe, Ile, Gln, His, Pro, Lys, Leu, Met, Thr, Val, Glu, Ala, Gly, CysまたはTrp（すなわち、Arg以外の任意のアミノ酸；好ましくは、Asn）であり;
X3はTrp, Glu, Lys, Cys, Leu, Ala, Arg, GlyまたはSer（好ましくは、Trp）であり;
X4はTyr, Phe, Glu, CysまたはAsn（好ましくは、Tyr）であり;
X6はPro, Ser, Thr, Phe, Leu, Tyr, CysまたはAla（好ましくは、ProまたはSer）であり;
X9はLys, Asn, Gln, GlyまたはArg（好ましくは、Lys）であり;
XllはTrp, Ser, Thr, Arg, Cys, TyrまたはLys（好ましくは、Trp）であり;
Xl2はLeu, Phe, Val, IleまたはHis（好ましくは、Leu）であり;
X13はPro, Leu, His, Ser, Arg, Asn, Gln, Thr, Val, Ala, Cys, Ile, PheまたはTyr（すなわち、Asp, Glu, Gly, Lys, MetまたはTrpではない；好ましくは、Pro）であり;
X14はAsp, Glu, Asn, Val, His, Gln, Arg, Gly, Ser, Tyr, Ala, Cys, Lys, Ile, ThrまたはLeu（すなわち、Phe, Met, ProまたはTrpではない；好ましくは、Asp, ValまたはGlu）である）。
【００７７】
好適な実施形態は下記の式Ｎのコア配列を含んでなるポリペプチドである：
(N) X1-X2-Asp-X4-Leu-Thr-X7-Leu-X9-X10 (配列番号448)
(式中、
X1はTrp, Glu, Lys, Cys, Leu, Ala, Arg, GlyまたはSer（好ましくは、Trp）であり;
X2はTyr, Phe, Glu, CysまたはAsn（好ましくは、Tyr）であり;
X4はPro, Ser, Thr, Phe, Leu, Tyr, CysまたはAla（好ましくは、ProまたはSer）であり;
X7はLys, Asn, Gln, GlyまたはArg（好ましくは、Lys）であり;
X9はTrp, Ser, Thr, Arg, Cys, TyrまたはLys（好ましくは、Trp）であり;
X10はLeu, Phe, Val, IleまたはHis（好ましくは、Leu）である)。
【００７８】
本発明に従う特に好適なBLyS結合性ポリペプチドは、次のコアペプチド：
Trp-Tyr-Asp-Pro-Leu-Thr-Lys-Leu-Trp-Leu (配列番号436)
を含んでなる。
【００７９】
上記のBLyS結合性ポリペプチドは、N-およびC-末端のいずれか一方または両方に追加のアミノ酸が結合されていてもよい。
【００８０】
また、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは、アミノ末端（N-末端）キャッピング基または官能基（例えば、アセチル基）をもっていてもよく、こうした基は、例えば、望ましくない反応からアミノ末端アミノ基をブロックしたり、BLyS結合性ポリペプチドを別の分子、マトリックス、樹脂もしくは固相支持体に連結させたりするのに有用である。本発明のBLyS結合性ポリペプチドはまた、カルボキシ末端（C-末端）キャッピング基または官能基（例えば、アミド基）をもっていてもよく、こうした基は、例えば、望ましくない反応からC-末端カルボキシル基をブロックしたり、該結合性ポリペプチドを別の分子、マトリックス、樹脂もしくは固相支持体にコンジュゲートさせたりするのに有用な官能基を提供する。好ましくは、N-および／またはC-末端のキャッピング基はポリペプチドリンカー分子である。本発明のBLyS結合性ポリペプチドを固相支持体またはクロマトグラフマトリックス材料に固定するのに有用な、特に好適なC-末端リンカー分子は、次のアミノ酸配列 Pro-Gly-Pro-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys (配列番号13) を含んでなる。もう一つの有用なC-末端リンカー、例えば、ペプチドをフルオレセイン化するためのリンカーは、Gly-Gly-Lysである（表15参照）。
【００８１】
本発明はさらに、BLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと結合する能力を保持しながら、例えば分子の安定性を高めるまたは減ずるように、改変されているBLyS結合性ポリペプチドを包含する。本発明の改変されたBLyS結合性ポリペプチドの例は、２つのシステイン残基のうち一方が非天然アミノ酸で置換されているポリペプチドである。この非天然アミノ酸は、残りのシステイン側鎖と縮合して安定なチオエーテル橋を形成することができ、その結果、環状のBLyS結合性ポリペプチドが生成する。このような合成ペプチドの環状チオエーテル分子は、例えば、PCT国際公開WO 97/46251（参照により本明細書に組み入れるものとする）に記載されるような、当分野で公知の技法を用いてルーチンに製造することができる。
【００８２】
別の実施形態において、本発明は、マトリックス、樹脂または固相支持体に結合された、連結された、あるいは、付着された本発明のBLyS結合性ポリペプチドを提供する。ポリペプチドをマトリックス、樹脂または固相支持体に結合、連結または付着させるための技法は当分野で周知である。これらの物質に適するマトリックス、樹脂または固相支持体は、BLyS結合性ポリペプチドが普通に結合、連結または付着するものであれば、当分野で知られたどのような組成のものであってもよく、例えば、クロマトグラフィー用の樹脂やマトリックス（例えば、SEPHAROSE-4FFアガロースビーズ）、プラスチック製マイクロタイタープレートのウェルの壁面や底面（例えば、固相酵素免疫検定法(ELISA)で用いるもの）、またはシリカを基材としたバイオチップなどがあり、これらに限らない。本発明の結合性ポリペプチドを固定するための固相支持体として有用な材料には、ポリアクリルアミド、アガロース、シリカ、ニトロセルロース、紙、プラスチック、ナイロン、金属、およびこれらの組合せが含まれるが、これらに限るものではない。本発明のBLyS結合性ポリペプチドは、当分野で公知の技法を用いて、非共有結合あるいは共有結合によってマトリックス、樹脂または固相支持体に固定させることができる。好ましくは、本発明のBLyS結合性ポリペプチドを、SEPHAROSE-4FFアガロースのようなクロマトグラフィー材料に固定させる。より一層好適な実施形態では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドを、リンカー分子によってクロマトグラフィー材料に連結させる。本発明に従う好適なリンカー分子は次のアミノ酸配列 Pro-Gly-Pro-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys (配列番号13) を含むポリペプチドである。最も好ましくは、本発明のアフィニティークロマトグラフィー材料は、アミノ酸配列 Pro-Gly-Pro-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys (配列番号13) を有するポリペプチドリンカー分子によりクロマトグラフィー材料に連結された、配列番号163〜172からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むBLyS結合性ポリペプチドを含んでなる。マトリックス、樹脂または他の固相支持体に結合、連結または付着させた本発明のBLyS結合性ポリペプチドは、BLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドを検出、単離および精製する方法で用いられ、特に、アフィニティークロマトグラフィーによってBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドを精製するのに有用である。
【００８３】
特定の好ましい実施形態では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドまたは該結合性ポリペプチドを展示するファージは、天然の可溶性三量体の形をしたBLySタンパク質と不可逆的に結合する。
【００８４】
特定の好ましい実施形態では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドまたは該結合性ポリペプチドを展示するファージは、天然の可溶性三量体の形をしたBLySタンパク質と可逆的に結合する。
【００８５】
本発明のBLyS結合性ポリペプチドは高い親和性でもってBLyS標的タンパク質と結合する。特定の実施形態では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは、５×10-2M、10-2M、５×10-3M、10-3M、５×10-4M、10-4M、５×10-5M、または10-5M以下の解離定数つまりKDでBLyS標的タンパク質と結合する。より好ましくは、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは、５×10-9M、10-9M、５×10-10M、10-10M、５×10-11M、10-11M、５×10-12M、10-12M、５×10-13M、10-13M、５×10-14M、10-14M、５×10-15M、または10-15Mより小さいかまたはそれに等しい解離定数つまりKDでBLyS標的タンパク質と結合する。
【００８６】
特定の好ましい実施形態においては、本発明のBLyS結合性ポリペプチドはBLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと可逆的に結合して、特定の放出条件下で、結合したBLySタンパク質を活性形態（好ましくは、天然の可溶性三量体の形態）で放出する。特定の実施形態では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは、10-10s-1、５×10-9s-1、10-9s-1、５×10-8s-1、10-8s-1、５×10-7s-1、10-7s-1、５×10-6s-1、10-6s-1、５×10-5s-1、10-5s-1、５×10-4s-1、10-4s-1、５×10-3s-1、10-3s-1、５×10-2s-1、10-2s-1、５×10-1s-1、または10-1s-1より大きいかまたはそれに等しいオフ速度(off-rate)つまりkoffでBLyS標的タンパク質と結合する。
【００８７】
KDおよびオフ速度を決定するための結合実験はいくつかの条件下で行うことができ、例えば、限定するものではないが、[pH6.0, 0.01% Tween 20]、[pH6.0, 0.1% ゼラチン]、[pH5.0, 0.01% Tween 20]、[pH9.0, 0.1% Tween 20]、[pH6.0, 15%エチレングリコール, 0.01% Tween 20]、[pH5.0, 15%エチレングリコール, 0.01% Tween 20]、および [pH9.0, 15%エチレングリコール, 0.01% Tween 20]などである。これらの溶液を調製するためのバッファーは当業者によって容易に決定することができ、最終溶液の所望pHに大きく依存する。低pH溶液（＜pH5.5）は、例えば、クエン酸バッファー、グリシン-HClバッファー、またはコハク酸バッファー中に調製する。高pH溶液は、例えば、トリス-HCl、リン酸バッファー、または重炭酸ナトリウムバッファー中に調製する。例えば、最適なpHおよび／または塩濃度を測定することを目的としてKDおよびオフ速度を決定するために、いくつかの条件を用いてもよい。
【００８８】
特定の実施形態において、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは、好ましくは天然の可溶性三量体の形をした、BLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと可逆的に結合する。
【００８９】
好適な実施形態では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは、天然の可溶性三量体形態のBLySとのみ可逆的に結合する。
【００９０】
特定の実施形態において、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは、好ましくは天然の可溶性三量体の形をした、BLySおよび／またはBLyS様ポリペプチドと不可逆的に結合する。
【００９１】
好適な実施形態では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは、天然の可溶性三量体形態のBLySとのみ不可逆的に結合する。
【００９２】
いくつかのスクリーニングまたはアッセイ法では、単離されたBLyS結合性ポリペプチドを使う代わりに、特定のBLyS結合性ポリペプチドを展示する組換えバクテリオファージを使用することが可能で、より便利である。そのような方法には、ファージに基づくELISAプロトコルおよび結合性ポリペプチドを展示するファージのクロマトグラフィー材料への固定化が含まれる。かかるスクリーニングアッセイおよび手順は当分野でルーチンであり、本発明の組換えバクテリオファージを使用する方法に容易に適合させることができる。
【００９３】
本発明はまた、BLySとの結合について、本明細書に開示するBLyS結合性ポリペプチド（例えば、配列番号163〜168のアミノ酸配列を有するポリペプチド）の結合を競合的に阻害するBLyS結合性ポリペプチドを包含する。競合的阻害は当分野で公知のどのような方法で測定してもよく、例えば、本明細書に記載する競合結合アッセイを用いる。好ましい実施形態において、該ポリペプチドは、本明細書に開示するBLyS結合性ポリペプチド（例えば、配列番号163〜168のアミノ酸配列を有するポリペプチド）のBLySへの結合を、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、または少なくとも50％だけ競合的に阻害する。より好ましい実施形態では、BLyS結合性ポリペプチドは、本明細書に開示するBLyS結合性ポリペプチド（例えば、配列番号163〜168のアミノ酸配列を有するポリペプチド）の天然の可溶性三量体形態のBLySへの結合を、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも60％、または少なくとも50％だけ競合的に阻害する。
【００９４】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のBLyS結合性ポリペプチドをコードする単離された核酸（好ましくは、DNA）を含む組成物を包含する。特定の実施形態では、本発明の核酸分子は配列番号１〜12、20〜172、および186〜444に示された本発明のBLyS結合性ポリペプチドをコードする。さらなる実施形態では、本発明の核酸分子は配列番号１〜12、20〜172、および186〜444のアミノ酸配列を有するポリペプチドのポリペプチド変異体または断片をコードする。さらに追加の実施形態では、本発明の核酸分子は、BLyS結合性ポリペプチドをコードし、該核酸の相補鎖が表１〜８ならびに実施例２および５に記載されるポリペプチド（配列番号１〜12、20〜172、および186〜444）をコードするポリヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下（例えば、6x塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム(SSC)中約45℃でのフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーションと、その後の0.2xSSC/0.1% SDS中約50〜65℃での１回以上の洗浄）、高度にストリンジェントな条件下（例えば、6xSSC中約45℃でのフィルター結合核酸へのハイブリダイゼーションと、その後の0.1xSSC/0.2% SDS中約68℃での１回以上の洗浄）、または、当業者に公知のその他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする（例えば、Ausubel, F.M.ら編, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.I, Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 6.3.1-6.3.6および2.10.3を参照のこと）。
【００９５】
本発明はまた、本発明のBLyS結合性ポリペプチド（ならびにその断片および変異体）をコードする単離された核酸分子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む宿主細胞、ならびに該ベクターおよび宿主細胞を作製する方法に関する。本発明はさらに、該組換えベクターを使用して、BLyS結合性ポリペプチドを組換え法により生産することを提供する。
【００９６】
本発明のBLyS結合性ポリペプチド、核酸、形質転換宿主細胞、ならびに、遺伝子操作したウイルスおよびファージ（例えば、組換えファージ）は、BLySの検出、単離および精製を含むがこれらに限らない用途を有する。
【００９７】
本発明の別の実施形態では、BLyS結合性ポリペプチドをファージ表面に展示する組換えバクテリオファージも提供される。そのようなファージは当分野で公知の技法を用いてルーチンに作製することができ、例えば、スクリーニング試薬やBLySを検出するための試薬として有用である。
【００９８】
BLyS結合性ポリペプチドの生産と修飾
本発明のBLyS結合性ポリペプチドは当業界で公知の化学合成法、半合成法、および組換えDNA法で生産することができる。
【００９９】
特定の実施形態においては、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは当業界で公知の化学的もしくは半合成的方法によって生産される(Kelleyら, 「遺伝子工学の原理と方法(Genetic Engineering Principles and Methods)」中, Setlow, J.K.編,(Plenum Press, NY., 1990), 第12巻, pp.1-19; Stewartら, 「固相ペプチド合成(Solid-Phase Peptide Synthesis)」 W.H.Freeman Co., San Francisco, 1989を参照のこと)。これらの方法の１つの利点は、非天然アミノ酸残基をBLyS結合性ポリペプチドの配列内に組み入れることができることである。
【０１００】
好ましい実施形態においては、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは化学的に合成される(例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149(1963); Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5132(1985)を参照のこと)。例えば、固相法でポリペプチドを合成し、樹脂から切り離し、分取高速液体クロマトグラフィーで精製することができる(例えばCreighton, 「タンパク質：構造と分子的性質(Proteins:Structures and Molecular Properties)」(W.H.Freeman and Co., N.Y., 1983), pp.50-60を参照のこと)。またBLyS結合性ポリペプチドはペプチド合成機を用いて合成することもできる。合成ポリペプチドの組成はアミノ酸分析もしくは配列決定分析で確認することができる(例えば、エドマン分解法：Creighton, 「タンパク質：構造と分子的性質(Proteins:Structures and Molecular Properties)」(W.H.Freeman and Co., N.Y., 1983), pp.34-49を参照のこと)。さらに、所望により、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは非古典的アミノ酸もしくは化学的アミノ酸類似体を含むものとすることができ、それは化学合成の際に本発明のBLyS結合性ポリペプチド中に置換もしくは付加として慣例的に導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定はされないが、通常のアミノ酸のD-異性体、2,4-ジアミノ酪酸、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸(4Abu)、2-アミノ酪酸(Abu)、6-アミノヘキサン酸(ε-Ahx)、2-アミノイソ酪酸(Aib)、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン(bAla)、フルオロアミノ酸、デザイナー(designer)アミノ酸、例えばβ-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸、および一般のアミノ酸類似体が挙げられる。さらに、そのようなアミノ酸はD体(右旋性)もしくはL体(左旋性)とすることができる。
【０１０１】
固相ペプチド合成は推定上のポリペプチドのカルボキシ(C)末端で保護アミノ酸を適切な樹脂へカップリングさせることによって開始され、その樹脂はC末端アミノ酸のカルボキシル基と反応して後に容易に切断される結合を形成するもので、例えばクロロメチル樹脂、ブロモメチル樹脂などのハロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、アミノメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂またはt-アルキルオキシカルボニルヒドラジド樹脂が挙げられる。α-アミノ保護基を、例えば塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸(TFA)で除去し、中和を例えばTEAで行った後、合成の次のサイクルへ進めることができる。次いで残存するα-アミノ酸および、必要に応じて側鎖が保護されたアミノ酸を順次所望の順番で縮合によってカップリングさせて樹脂に連結された中間化合物を得る。あるいは、伸長しつつある固相のポリペプチド鎖に付加する前に、いくつかのアミノ酸を互いにカップリングさせてオリゴペプチドを形成させておくことができる。
【０１０２】
2つのアミノ酸間の、または1つのアミノ酸とペプチドとの間、またはペプチドとペプチドとの間の縮合は当業界で公知の縮合方法に従って行うことができ、そのような方法としては、限定はされないが、アジド法、混合酸無水物法、DCC(ジシクロヘキシルカルボジイミド)法、活性型エステル法(p-ニトロフェニルエステル法、BOP[ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート]法、N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル法)、ならびにウッドワード(Woodward)試薬 K法が挙げられる。
【０１０３】
ペプチドの化学合成に通常行われる方法は、適切な保護基もしくはキャッピング基を用いて種々のアミノ酸残基の反応性側鎖基をその部位で保護もしくはキャッピング(ブロッキング)し、それはそのポリペプチド鎖が完全に組み立てられた後に最終的に除去される。また通常行われる方法は、アミノ酸もしくは断片のα-アミノ基を、その本体がそのカルボキシル基の位置で反応する間、保護もしくはキャッピングし、その後にα-アミノ保護基を選択的に除去してその位置で引き続き反応が起こるようにすることである。従って、合成の間に中間化合物が生産され、それにはペプチド鎖中に各アミノ酸残基が所望の配列で並べられて含まれ、様々なそれらの残基は側鎖保護基もしくはキャッピング基を有している。次いで、アミノ酸側鎖上のこれらの保護基もしくはキャッピング基は、精製後に所望の産物が生産されるように、実質的に同時に除去される。
【０１０４】
アミノ酸中に見出されるα-およびε-アミノ側鎖基のための典型的な保護基、キャッピング基、もしくはブロッキング基としては例えば、ベンジルオキシカルボニル(Z)、イソニコチニルオキシカルボニル(iNOC)、O-クロロベンジルオキシカルボニル[Z(NO2)]、p-メトキシベンジルオキシカルボニル[Z(OMe)]、t-ブトキシカルボニル(Boc)、t-アミイオキシカルボニル(t-amyioxycarbonyl:Aoc)、イソボルニルオキシカルボニル、アダマチルオキシカルボニル、2-(4-ビフェニル)-2-プロピルオキシカルボニル(Bpoc)、9-フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)、メチルスルホニルエトキシカルボニル(Msc)、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、2-ニトロフェニルスルフェニル(NPS)、ジフェニルホスフィノチオイル(Ppt)、ジメチルオホスフィノチオイル(Mpt)などが挙げられる。
【０１０５】
アミノ酸のカルボキシル基のための保護基、キャッピング基、もしくはブロッキング基としては例えば、ベンジルエステル(OBzl)、シクロヘキシルエステル(Chx)、4-ニトロベンジルエステル(ONb)、t-ブチルエステル(Obut)、4-ピリジルメチルエステル(OPic)などが挙げられる。また、必要に応じて特定のアミノ酸、例えばアルギニン、システイン、およびセリンなどの側鎖基が適切な保護基で保護されていることが通常は望ましい。例えば、アルギニンのグアニジノ基は、ニトロ、p-トルエンスルホニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、p-メトキシベンゼンスルホニル、4-メトキシ-2,6-ジメチルベンゼンスルホニル(Mds)、1,3,5-トリメチルフェニルスルホニル(Mts)などで保護することができる。システインのチオール基は、p-メトキシベンジル、トリフェニルメチル、アセチルアミノメチルエチルカルバモイル、4-メチルベンジル、2,4,6-トリメチルベンジル(Tmb)などで保護することができ、セリンのヒドロキシル基はベンジル、t-ブチル、アセチル、テトラヒドロピラニルなどで保護することができる。
【０１０６】
所望のアミノ酸配列が完成した後、中間体ポリペプチドは樹脂支持体から試薬、例えば液状HFおよび1種以上のチオ-含有スカベンジャーなどを用いた処理によって除去されるが、このような試薬は樹脂および残存している側鎖保護基のすべてからペプチド分子を切り離す。HFで切断した後、そのタンパク質配列をエーテルで洗い、多量の希酢酸中に移し、pHを水酸化アンモニウムで約8.0に調整し攪拌する。pHを調整すると該ポリペプチドは所望のコンホメーション配置を取る。
【０１０７】
例示としてであって限定するものではないが、本発明のポリペプチドは下記のとおりに化学的に合成し精製することができる：ペプチドはRainin Symphony Multiplex Peptide Synthesizerを用いてN-α-9-フルオレニルメチルオキシカルボニル、すなわちFmoc固相ペプチド合成化学を利用することによって合成することができる。1個のアミノ酸をペプチド-樹脂伸長鎖へとカップリングさせるために用いられる標準的なサイクルには、一般的に：(1)ペプチド-樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)で30秒間、3回洗い；(2)アミノ末端上のFmoc保護基をDMF中の20%のピペリジンで2回、各15分間洗うことで脱保護することによって除去し、そのプロセスの間にペプチド-樹脂間の定着が起こることを防止するために10秒間に1秒間、反応容器に窒素をバブリング(bubbling)させて、混合を行う；(3)ペプチド-樹脂をDMFで30秒間、3回洗う；(4)ペプチド-樹脂へのアミノ酸のカップリングを、適切なアミノ酸のFmoc誘導体の250mM溶液と活性化剤混合物の等量を添加することによって行うが、その活性化剤混合物は400mM N-メチルモルホリンと250mM (2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-4))-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)をDMF中に含むものからなる；(5)その溶液を45分間混合させる；および(6)ペプチド-樹脂をDMFで30秒間、3回洗うことが含まれる。所望のペプチドを生産するためにこのサイクルを必要に応じて適切なアミノ酸を順番に用いて繰り返すことができる。このサイクルプログラムの例外としては、アミノ酸のカップリングがそれらの疎水性性質のために困難であることが予測される場合、もしくは合成の間にヘリックス形成に関与することが予測される場合である。それらの場合には、上述のサイクルは対象のアミノ酸を「二重カップリング(double couple)」させるため、最初の45分間のカップリングステップの完了直後に2回目のステップ4を繰り返すという改変を加えることができる。さらに、ペプチド合成の初回カップリングステップにおいて、より効率的なカップリングを行う目的で、初回のDMFでの洗浄での混合時間を延長して30秒間3回の洗浄の替わりに15分間を3回の洗浄を行って樹脂を膨潤させることができる。
【０１０８】
ペプチド合成後、ペプチドは樹脂から下記の方法で切り離すことができる：(1)ペプチド-樹脂をDMFで30秒間3回洗う；(2)アミノ末端上のFmoc保護基をDMF中の20%のピペリジンで2回、各15分間洗うことによって除去する；(3)ペプチド-樹脂をDMFで30秒間、3回洗う；ならびに(4)95%のトリフルオロ酢酸(TFA)、2.4%の水、2.4%のフェノール、および0.2%のトリイソプロピルシランからなる切断用カクテルをペプチド-樹脂と2時間混合し、次いで、切断用カクテル中のペプチドを樹脂からろ過して取り、2倍量のエチルエーテルを添加して溶液からペプチドを沈殿させる。具体的には、ペプチドを単離するためにエーテル-ペプチド溶液を−20℃で20分間置き、次いで6,000 x Gで5分間遠心分離してペプチドをペレットとし、そのペプチドをエチルエーテルで3回洗って残存している切断カクテルの成分を除去することができる。最終的なペプチド産物を、0.1%のTFAからなる一次溶媒および80%のアセトニトリルと0.1%のTFAからなる溶出バッファーを用いて逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)で精製することができる。次いで精製したペプチドは凍結乾燥して粉末とすることができる。
【０１０９】
他の特定の実施形態においては、本明細書に記載のBLyS結合性ポリペプチドの分枝バージョン(version)が提供され、それは例えば、BLyS結合性ポリペプチド配列内の1個以上のアミノ酸を、1つ以上のアミノ酸とペプチド結合を形成することのできる遊離の側鎖を有するアミノ酸もしくはアミノ酸類似体と置換することによって提供される(従って「分枝」を形成することができる)。
【０１１０】
分枝したペプチドは、天然のもしくは合成のいずれのアミノ酸を、ペプチド鎖中の天然のもしくは合成のいずれのアミノ酸と、共有結合で連結させるための当業界で公知のいかなる方法でも調製することができ、そのペプチド鎖は、ペプチド鎖に共有結合で結合させようとするアミノ酸上のアミノ基もしくはカルボキシル基と反応することのできる側鎖基を有する。とりわけ、遊離のアミノ側鎖基を有するアミノ酸、例えば限定はされないが、ジアミノ酪酸、リシン、アルギニン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、およびシトルリンなどをペプチド中に組み入れて、あるアミノ酸がこれらのアミノ酸とともに、例えば、その残基の遊離のアミノ側鎖基とペプチド結合を形成することによって、分枝を形成させることができる。あるいは、遊離のカルボキシル側鎖基を有するアミノ酸、例えば限定はされないが、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびホモシトルリンなどをペプチド中に組み入れて、あるアミノ酸がこれらのアミノ酸とともに、例えば、その残基の遊離のカルボキシル側鎖基とペプチド結合を形成することによって、分枝を形成させることができる。分枝を形成するアミノ酸はペプチド鎖中のあるアミノ酸の側鎖基といかなるタイプの共有結合でも連結することもでき、そのような結合としては、限定はされないが、ペプチド結合、エステル結合、およびジスルフィド結合が挙げられる。特定の1実施形態においては、上述のものなどの分枝点を形成することのできるアミノ酸は、BLyS結合性ポリペプチド配列を含んでいるペプチド内部のBLyS結合性ポリペプチドの残基と置換される。
【０１１１】
分枝したペプチドは当業界で公知のいかなる方法によっても調製することができる。例えば、限定はしないが、分枝ペプチドは下記のとおり調製することができる：(1)ペプチド鎖の主鎖から分枝するアミノ酸はNα-t-ブチルオキシカルボニル(Boc)で保護されたアミノ酸のペンタフルオロフェニル(Opfp)エステルとして購入することができ、この分枝アミノ酸が付着されることとなる主鎖内の残基はN-Fmoc-α-γ-ジアミノ酪酸とすることができる；(2)Bocで保護されたアミノ酸のジアミノ酪酸とのカップリングは、各前駆体5gをDMF 150mLならびにピリジン2.25mLおよびジメチルアミノピリジン50mg含有のフラスコ中に添加し、その溶液を24時間混合することによって行われる；(3)次いでそのペプチドをカップリング反応物150mLから抽出することができるが、その抽出は反応物をジクロロメタン(dichlormethane；DCM)400mLおよび0.12N HCl 200mLと1Lの分液漏斗中で混合し、相の分離を起こさせ、底部の水相を保存し、上部の層を0.12N HCl 200mLでさらに2回再抽出して行う；(4)ペプチドを含有している溶液に硫酸マグネシウム2〜5gを添加して脱水し、硫酸マグネシウムをろ過して除き、残留溶液を蒸発させて容量を約2〜5mLとすることができる；(5)次いでそのジペプチドに酢酸エチルおよび次に2倍量のヘキサンを添加して沈殿させ、次いでろ過して集め、冷ヘキサンで2回洗う；および(6)その結果得られたろ液を凍結乾燥して所望のジペプチドの軽粉末形態を得ることができる。この方法で調製された分枝ペプチドは分枝の位置のアミノ酸がジアミノ酪酸で置換されているだろう。ジアミノ酪酸以外のアミノ酸もしくはアミノ酸類似体での置換を含む分岐ペプチドは、上述の方法と類似の方法で、N-Fmocをカップリングした形態のアミノ酸もしくはアミノ酸類似体を用いて調製することができる。
【０１１２】
好ましい1実施形態においては、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは環状ペプチドである。環状化は、例えば、限定はされないが、2個のシステイン残基間のジスルフィド結合を介して、もしくはアミド連鎖を介して行うことができる。例えば、限定はされないが、ジスルフィド架橋の形成は(1)精製したペプチドを0.01M 酢酸アンモニウム, pH7.5中に0.1〜0.5mg/mLの濃度で溶解し；(2)この溶解したペプチドに0.01M フェリシアン化カリウムを溶液の色が淡黄色となるまで滴下添加し、その溶液を24時間混合する；(3)環状ペプチドを濃縮して溶液5〜10mLとし、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)でそのペプチドを再精製し、最後にそのペプチドを凍結乾燥することによって達成できる。該ペプチドが2つの適切な位置のシステイン残基を含有していないような特定の1実施形態においては、システイン残基を、アミノ末端および/もしくはカルボキシ末端および/または内部に、その環状化しようとするペプチドが、その残基がジスルフィド架橋を形成しうる間隔となるように2個のシステイン残基を含有するように導入することができる。あるいは、環状ペプチドは、例えば限定はされないが、下記のプロトコールを用いてアミド連鎖を生成して得ることができる：アリルで保護されたアミノ酸、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、もしくはグルタミンなどを第1のアミノ酸としてペプチド中に組み込み、次いで残りのアミノ酸をカップリングする。アリル保護基はペプチド-樹脂を、5%の酢酸および2.5%のN-メチルモルホリンを含有するクロロホルム溶液中でテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)溶液と2時間混合することによって除去することができる。ペプチド-樹脂を、DMF中の0.5%のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)および0.5%のナトリウムジエチルジチオカバメートで3回洗うことができる。ペプチド鎖上のアミノ末端のFmoc基は、DMF中の20%のピペリジンで2回、各15分インキュベートして除去し、DMFで3回、各30秒間洗うことができる。活性化剤混合物、DMF中のN-メチルモルホリンおよびHBTUをカラム上に置き、遊離のアミノ末端を、アリル基の除去によって生じたカルボキシル基とカップリングさせてペプチドを環状化することができる。そのペプチドを樹脂から上述の化学的ペプチド合成の一般的説明で述べたとおり切断し、そのペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)で精製することができる。環状化しようとするペプチドがアリルで保護されたアミノ酸を含有していないような特定の1実施形態においては、アリルで保護されたアミノ酸を、そのペプチドの配列中のアミノ末端、カルボキシ末端、またはペプチド内部に、そのペプチドが環状化されうるように、導入することができる。
【０１１３】
さらに、ある特定の実施形態においては、本発明のBLyS結合性ポリペプチドがアミノ末端(N末端)および/もしくはカルボキシ末端(C末端)キャッピング基を有するかもしくは保持したものとして生産されることが好ましく、そのキャッピング基は使用中にN末端もしくはC末端のアミノ酸を望ましくない化学反応から保護することができるか、または結合性ポリペプチドをさらにコンジュゲーションもしくは操作することを可能にすることができ、例えばその結合性ポリペプチドをクロマトグラフ用の支持体樹脂もしくはマトリックスとコンジュゲートさせる、またはその結合性ポリペプチドと樹脂もしくは支持体とをつなぐために別のペプチドにコンジュゲートさせることができる。そのようなN末端基およびC末端基はまた、結合性ポリペプチドを標識する、もしくはタグを付するために用いることができ、それによって結合している複合体を検出する、もしくは結合性ポリペプチドの位置(BLyS標的タンパク質に結合しているのか、またはしていないのか)を、例えば分離方法の何らかの時点で、示すことができる。従って、検出もしくは分離法で用いるための最終形態で合成された本発明のBLyS結合性ポリペプチドはN末端および/もしくはC末端キャッピング基を含有し得る。本発明の結合性ポリペプチド中に存在しうるもしくは保持しうる特に好ましいN末端キャッピング基は、アセチル基(Ac)である。本発明の結合性ポリペプチド中に存在しうるもしくは保持しうる、特に好ましいC末端キャッピング基は、アミド基である。さらに好ましい1実施形態においては、本発明のBLyS結合性ポリペプチドはN末端キャッピング基としてアセチル基を有し、かつC末端キャッピング基としてアミド基を有するものである。
【０１１４】
本発明のBLyS結合性ポリペプチドはまた、ペプチド合成を業務としている企業(例えば、BACHEM Bioscience, Inc., King of Prussia, PA; Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, MA)によって商業的に調製されたものとすることができる。
【０１１５】
本発明のBLyS結合性ポリペプチドをコードする核酸配列は当業界で周知の技法を用いて生産および単離することができる。1例では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドをコードする核酸は、BLyS結合性ポリペプチドのアミノ酸配列についての知識に基づいて化学的に合成される(好ましくはその配列はそのポリペプチドが発現されることとなる宿主系に最適なコドンとしたものである)。別の1例では、BLyS結合性ポリペプチドをコードする核酸は、発現ライブラリー(例えば、ファージディスプレイライブラリー)をスクリーニングしてBLyS結合性ポリペプチドを発現しているファージを同定し、その同定したライブラリーのメンバーからBLyS結合性ポリペプチドコード核酸配列を単離(例えば、そのポリペプチドコード配列にフランキングするプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法を介して)することによって得られる。
【０１１６】
本発明はまた、本発明のBLyS結合性ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでいるベクター、その組換えベクターで遺伝子操作された、もしくは別の手段で本発明のポリペプチドを生産するように操作された宿主細胞、およびBLyS結合性ポリペプチドもしくはその断片の組換えによる、または化学的もしくは合成技法による生産にも関する。
【０１１７】
従って、本発明では、BLyS結合性ポリペプチドはまた、組換え発現技法によっても得ることができる(例えば、Sambrookら, 1989, 「分子クローニング、実験室マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)」, 第2版、Glover, D.M.(編), (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989);「DNAクローニング：実際的なアプローチ(DNA Cloning:A Practical Approach)」(MRL Press, Ltd., Oxford, U.K., 1985), 第I,II巻を参照のこと)。
【０１１８】
組換えBLyS結合性ポリペプチドを生産させるために、BLyS結合性ポリペプチドをコードする核酸配列はプロモーターと機能しうる形で連結され、その配列からBLyS結合性ポリペプチドが生産されることとなる。例えば、ベクターを細胞中に導入することができ、その細胞中でそのベクターもしくはその一部分が発現され、BLyS結合性ポリペプチドが生産される。好ましい1実施形態においては、RNAポリメラーゼの供給源がDNA依存性RNAポリメラーゼであれば該核酸はDNAであるが、またポリメラーゼの供給源がRNA依存性RNA ポリメラーゼであれば、または逆転写酵素が細胞中に存在しているかもしくは提供されて、DNAをRNAから生産する場合には、該核酸をRNAとすることができる。そのようなベクターは、それが所望のRNAを生産することとなるように転写されうるものである限りは、エピソームに留まることができ、または染色体に組み込まれたようにすることができる。そのようなベクターは当業界において標準的な組換えDNA技術法によって構築することができる。ベクターとしては、バクテリオファージ、プラスミド、ウイルス、レトロウイルス、または当業界で公知のその他のものとすることができ、それらは細菌、真菌、植物、昆虫もしくは哺乳動物の細胞中での複製および発現に用いられる。レトロウイルスベクターは複製能のあるもの、もしくは複製が欠失しているものとすることができる。後者の場合には、ウイルスの増殖は通常は補足性を有する宿主細胞中でのみ起こるだろう。ベクター構築物の宿主細胞中への導入は当業界で公知の技法によって行うことができ、そのようなものとしては、限定はされないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、陽イオン性脂質介在トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、感染またはその他の方法が挙げられる。そのような方法は、例えば、Davisら,「分子生物学の基礎的方法(Basic Methods In Molecular Biology)」(1986)などの多数の標準的な実験室マニュアルに述べられている。
【０１１９】
通常は、組換え発現ベクターには複製起点、および宿主細胞の形質転換を可能とする、例えば、大腸菌(E.coli)のアンピシリン耐性遺伝子およびS.セレビシアエ(S. cerevisiae)のTRP1遺伝子などの選択マーカー、ならびに下流の構造配列の転写を指令する高度に発現される遺伝子由来のプロモーターが含まれるだろう。そのようなプロモーターは、数ある中で解糖系酵素、例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、a因子、酸性ホスファターゼ、もしくは熱ショックタンパク質をコードするオペロン由来のものとすることができる。異種の構造配列は適切な相で翻訳開始および終結配列、および好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔もしくは細胞外培地への分泌を指令することのできるリーダー配列を有する形でアセンブルされる。任意で、その異種配列は、所望の特性を備えた、N末端の同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができ、その所望の特性とは、例えば、発現された組換え産物の安定化もしくは精製の単純化である。
【０１２０】
1実施形態においては、本発明のBLyS結合性ポリペプチドをコードする核酸は、適切な異種の調節エレメント(例えば、プロモーターもしくはエンハンサー)、例えば、少数の例を挙げると、λファージPLプロモーター、大腸菌(E.coli)のlac、trp、phoA、およびtacプロモーター、SV40初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスのLTRのプロモーターなどと、機能しうる形で連結されている。その他の適切なプロモーターも当業者であればわかるであろう。
【０１２１】
示したとおり、発現ベクターには好ましくは少なくとも1種の選択マーカーが含まれるだろう。そのようなマーカーとしては、真核細胞の培養ではジヒドロ葉酸レダクターゼ、G418、もしくはネオマイシン耐性、大腸菌(E.coli)およびその他の細菌の培養ではテトラサイクリン、カナマイシン、もしくはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、限定はされないが、大腸菌(E.coli)、ストレプトミセス(Streptomyces)、およびネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)細胞；酵母細胞(例えば、サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)、もしくはピキア・パストリス(Pichia pastoris)(ATCC寄託番号201178))などの真菌細胞；ショウジョウバエ(Drosophila)S2およびスポドプテラ(Spodoptera)Sf9細胞などの昆虫細胞；CHO、COS、293、NSO、およびBowes黒色腫細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。上述の宿主細胞用として適切な培地および培養条件は当業界で公知である。
【０１２２】
宿主細胞は、哺乳動物細胞(例えば、ヒト由来細胞)などの高等真核細胞、もしくは酵母細胞などの下等真核細胞とすることができ、または、宿主細胞は細菌細胞などの原核細胞とすることができる。宿主株は、挿入された本発明のBLySポリペプチドをコードする核酸配列の発現をモジュレートする、または所望の特定な様式でBLyS結合性ポリペプチドを修飾およびプロセシングするものを選択することができる。特定のプロモーターからの発現は特定の誘導物質の存在によって増強することができる；このようにして遺伝子操作されたポリペプチドの発現を制御することができる。さらに、種々の宿主細胞はタンパク質の翻訳および翻訳後のプロセシングならびに改変(例えば、リン酸化、切断)のための特性と特定の機構を有している。発現された外来タンパク質の所望の改変とプロセシングを確保するために適切な細胞系を選択することができる。宿主細胞内での発現のための適切なベクターとプロモーターの選択は周知の方法であり、発現ベクターの構築、そのベクターの宿主内への導入、宿主内での発現のために必要な技法は当業界では慣例的な技術である。
【０１２３】
細菌での使用に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造的DNA配列と適切な翻訳開始および終結シグナルとを機能しうるリーディング相中に、機能的プロモーターと共に挿入することによって構築される。そのベクターは好ましくは、ベクターの維持を確実にし、および、所望により宿主内での増幅を提供するために、1種以上の表現型選択マーカーおよび1個の複製起点を含んでなるだろう。形質転換のための適切な原核生物宿主としては、他のものも選択することができるが、大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌、ならびにシュードモナス(Pseudomonas)、ストレプトミセスおよびブドウ球菌(Staphylococcus)属内の様々な種が挙げられる。非限定的な例ではあるが、代表的なものとして、細菌での使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターであるpBR322(ATCC 37017)の遺伝子エレメントを含んでなる市販のプラスミド由来の選択マーカーと細菌性の複製起点を含んでなるものとすることができる。そのような市販のベクターとしては、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)、およびGEM1(Promega Biotec, Madison, WI, USA)が挙げられる。これらのpBR322「骨格」セクションは適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。ベクターの中で細菌で使用するために好ましいものとしては、pHE4-5(ATCC寄託番号209311)およびそれの変異体、pQE70、pQE60、およびpQE-9(これらはQIAGEN Inc.から入手できる)；pBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratageneから入手できる)；およびptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(これらはPharmaciaから入手できる)がある。酵母系で用いるために好ましい発現ベクターとしては、限定はされないが、pYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZα、pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K、およびPAO815(これらはすべてInvitrogen, Carlsbad, CAから入手できる)が挙げられる。好ましい真核生物ベクターとしては、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、およびpSG(これらはStratageneから入手できる)；pSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVL(Pharmaciaから入手できる)がある。その他の適切なベクターについては、当業者であれば容易にわかるであろう。
【０１２４】
適切な宿主株を形質転換し、その宿主株を適切な細胞密度まで増殖させた後、適切な手段(例えば、温度シフトもしくは化学的誘導)で選択プロモーターを誘導させ、細胞をさらなる期間培養する。細胞を、典型的には遠心分離して回収し、物理的もしくは化学的手段で破壊し、その結果得られる粗抽出物をさらに精製するために保持する。
【０１２５】
タンパク質の発現に用いる微生物細胞は、都合のよい任意の方法で破壊することができ、そのような方法としては、凍結-融解サイクル、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用が含まれ、そのような方法は当業者に周知である。
【０１２６】
1実施形態においては、酵母のピキア・パストリスが真核生物系でのBLyS結合性ポリペプチドの発現に用いられる。ピキア・パストリスはメチロトローフ酵母でメタノールを唯一の炭素源として代謝することができる。メタノール代謝経路の主要ステップは、O2を用いたメタノールからホルムアルデヒドへの酸化である。この反応はアルコールオキシダーゼという酵素によって触媒される。メタノールを唯一の炭素源として代謝するために、ピキア・パストリスは高レベルのアルコールオキシダーゼを生成しなければならないが、それは部分的には、アルコールオキシダーゼのO2に対する親和性が比較的低いことによるものである。その結果、主な炭素源としてメタノールに依存している増殖培地中では、2つのアルコールオキシダーゼ遺伝子(AOX1)のうちの一方のプロモーター領域が非常に活性である。メタノールの存在下でAOX1遺伝子から生産されたアルコールオキシダーゼはピキア・パストリス中の可溶性タンパク質の総量の約30%まで含む。Ellisら, Moll. Cell. Biol., 5:1111-21(1985); Koutzら, Yeast, 5:167-77(1989); Tschoppら, Nucl. Acids Res., 15:3859-76(1987)を参照のこと。このように、例えば本発明のBLyS結合性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの異種コード配列は、AOX1調節配列のすべてもしくは一部分の転写調節下で、メタノールの存在下で培養させたピキア酵母中で極めて高いレベルで発現される。
【０１２７】
1例においては、本明細書に示すとおり、プラスミドベクターpPIC9Kが本発明のBLyS結合性ポリペプチドをコードするDNAのピキア酵母系内での発現に用いられ、本質的には、「ピキアプロトコール：分子生物学における方法(Pichia Protocols:Methods in Molecular Biology)」, D.R.HigginsとJ.Cregg編(The Humana Press, Totowa, N.J., 1998)に述べられているとおりである。この発現ベクターは多重クローニング部位の上流に位置するピキア・パストリスアルカリホスファターゼ(PHO)分泌シグナルペプチド(すなわち、リーダー)に連結された強力なAOX1プロモーターによって、本発明のBLyS結合性ポリペプチドの発現と分泌を可能にする。
【０１２８】
当業者であれば容易に理解されるとおり、提示された発現構築物が、必要に応じてインフレームのAUGを含む転写、翻訳、分泌(所望により)などのための適切な位置にあるシグナルを提供するものである限りは、pPIC9Kの替わりにpYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZα、pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、およびPAO815など、他の多数の酵母ベクターを用いることができる。
【０１２９】
1実施形態においては、例えば、本発明のBLyS結合性ポリペプチドをコードする核酸などの異種コード配列の高レベルの発現は、本発明の異種核酸配列を発現ベクター、例えばpGAPZもしくはpGAPZαなどへクローニングし、メタノール不在下で酵母培養物を増殖させることによって行うことができる。
【０１３０】
本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、そのベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増加される。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を増加させる通常は約10〜300bpのDNAのシス作用性エレメントである。例としては、複製起点の100bp〜270bp後期側にあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【０１３１】
組換えタンパク質を発現するために種々の哺乳動物細胞培養系も用いることができる。哺乳動物発現系の例としては、サルの腎臓線維芽細胞のCOS-7系(これはGluzman(Cell, 23:175(1981))によって記載されている)ならびに適合性ベクターを発現することのできるその他の細胞系、例えば、C127、3T3、CHO、293、NSO、HeLa、およびBHK細胞系が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにまたリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位および受容部位、転写終結配列、および5'フランキング非転写配列で任意に必要なものをも含むだろう。SV40スプライス由来のDNA配列、およびポリアデニル化部位は必要とされる非転写遺伝子エレメントを提供するために用いることができる。
【０１３２】
本明細書に記載の宿主細胞は、従来の方法で該組換え配列によってコードされる遺伝子産物を生産させるために用いることができる。あるいは、無細胞翻訳系も本発明のDNA構築物由来のRNAを用いて本発明のポリペプチドを生産させるために用いることができる。
【０１３３】
本発明のポリペプチドは、改変された形態、例えば融合タンパク質(ペプチド結合を介して異種タンパク質配列(異なるタンパク質の)と連結されたポリペプチドを含んでなる)などで発現もしくは合成することができ、そのようなポリペプチドには、分泌シグナルのみならず、さらなる異種機能的領域をも含むことができる。そのような融合タンパク質は、本発明のポリヌクレオチドと所望のアミノ酸配列をコードする所望の核酸配列とを当業界で公知の方法によって適切なリーディングフレーム中でお互いに連結し、当業界で公知の方法によってその融合タンパク質産物を発現させることによって作製することができる。あるいは、そのような融合タンパク質はタンパク質合成技法、例えばペプチド合成機を用いて作製することができる。このように、例えば、追加のアミノ酸からなる領域、特に荷電したアミノ酸をポリペプチドのN末端に付加して、精製中の、またはその後の取り扱いと保管中の、宿主細胞における安定性と持続性を改善することができる。また、ペプチド部分をそのポリペプチドに付加して精製を容易にすることができる。そのような領域はそのポリペプチドの最終調製の前に除去することができる。特にポリペプチドにペプチド部分を付加して分泌もしくは排出を生じさせること、安定性を改善すること、ならびに精製を容易にすることは、当業界ではよく知られた、慣例的な技法である。特にヘキサヒスチジンポリペプチドについては言及しておくが、これは特に例えばpQEベクター(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)で提供されるタグが例としてあげられるが、多数のものが市販されている。Gentzら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86:821-824(1989)に記載されているとおり、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の都合のよい精製を提供する。精製に有用なその他のペプチドタグとしては、限定はされないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応するヘマグルチニン「HA」タグ(Wilsonら, Cell, 37:767(1984))、および「フラッグ(flag)」タグ(DYKDDDDK(配列番号183),Stratagene, La Jolla, CA)が挙げられる。
【０１３４】
1実施形態においては、本発明のBLyS結合性ポリペプチドをコードする核酸をpelB ペクチン酸リアーゼシグナル配列と融合させてグラム陰性細菌中でのそのようなポリペプチドの発現と精製の効率を向上させることができる。米国特許第5,576,195号および第5,846,818号を参照すればよく、これらの内容は本明細書にその全体を参照により組み入れる。
【０１３５】
本発明のポリペプチドには、化学合成法の産物、組換え技法で原核生物もしくは真核生物宿主から生産された産物が含まれ、そのような宿主としては例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞が挙げられる。組換え生産法に用いる宿主の如何によって、本発明のポリペプチドは糖鎖が付加されるか、もしくは付加されない場合がある。さらに、本発明のポリペプチドには場合によって宿主が介在するプロセスの結果として、開始修飾メチオニン残基も含まれうる。
【０１３６】
本発明は合成もしくは翻訳中もしくはその後に、例えば糖鎖付加、アセチル化、ベンジル化、リン酸化、アミド化、PEG化、ホルミル化、既知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子との連結、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、PEG化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、ユビキチン化などによって修飾されるBLyS結合性ポリペプチドを包含する。(例えば、Creigton, 「タンパク質：構造と分子的性質(Proteins : Structures and Molecular Properties)」, 第2版 (W.H.Freeman and Co. N.Y., 1992); 「翻訳後のタンパク質の共有結合による修飾(Postranslational Covalent Modification of Proteins)」, Johnson編(Academic Press, New York, 1983), pp.1-12; Seifterら, Meth. Enzymol., 182:626-646(1990); Rattanら, Ann. NY Acad. Sci., 663:48-62(1992)を参照のこと)。特定の実施形態においては、該ペプチドはN末端でアセチル化され、および/またはC末端でアミド化されたものである。
【０１３７】
さらに別の実施形態においては、相互作用する能力のある、例えばポリペプチド中の2個のシステイン残基などの残基を2個以上含有する本発明のBLyS結合性ポリペプチドは、酸化条件下、またはこれらの残基の相互作用を促進するその他の条件下(例えば、ジスルフィド架橋形成)で処理することができる。
【０１３８】
さらに、本発明に包含されるBLyS結合性ポリペプチドの修飾には、例えば、既知の技法で行われる非常に多数の化学的修飾のいずれのものも含まれ、そのようなものとしては限定はされないが、臭化シアンでの特異的な化学的切断、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝的合成などが挙げられる。
【０１３９】
本発明に包含される翻訳後/合成後の修飾としてはさらに、例えば、N結合型もしくはO結合型炭化水素鎖、N末端もしくはC末端のプロセシング、アミノ酸骨格への化学的部分の付加、N結合型もしくはO結合型炭化水素鎖の化学的修飾、および原核生物宿主細胞での発現の結果としてのN末端メチオニン残基の付加もしくは欠失が挙げられる。
【０１４０】
本発明によって提供されるものとしてはまた、さらに別の利点、例えば親和性の増加、オフ速度(off-rate)、溶解性、安定性、およびin vivoもしくはin vitroでのポリペプチドの循環時間の低減、または免疫原性の低減などをもたらすことができる本発明のBLyS結合性ポリペプチドの化学修飾された誘導体がある(米国特許第4,179,337号を参照のこと)。誘導体化のための化学的部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール/プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーから選択することができる。該ポリペプチドは分子内のランダムな位置で、または分子内のあらかじめ定めた位置で修飾することができ、付加される化学的部分を1、2、3個もしくはそれ以上含むことができる。
【０１４１】
該ポリマーはどのような分子量でもよく、分枝したものもしくは分枝していないものとすることができる。ポリエチレングリコールについては、取り扱いと製造の容易性から好ましい分子量は約1kDa〜約100kDaである(「約」という用語はポリエチレングリコールの調製において、示した分子量よりも重い分子がいくらかあり、軽い分子がいくらかあるだろうことを示している)。所望の治療プロファイルの如何によって(例えば、所望の徐放性の持続時間、もしあるとすれば生物学的活性に及ぼす影響、取り扱いの容易性、抗原性の程度もしくは欠如、およびその他のポリエチレングリコールの治療用タンパク質もしくは類似体に及ぼす既知の影響)、他のサイズを用いることができる。例えば、ポリエチレングリコールの平均分子量は、約200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000、もしくは100,000kDaであってよい。
【０１４２】
上述のとおり、該ポリエチレングリコールは分枝構造を有するものとすることができる。分枝ポリエチレングリコールについては、例えば、米国特許第5,643,575号; Morpurgoら, Appl. Biochem. Biotechnol., 56:59-72(1996); Vorobjevら, Nucleosides Nucleotides, 18:2745-2750(1999); およびCalicetiら, Bioconjug. Chem., 10:638-646(1999)に述べられており、これらの各々の開示は本明細書に参照により組み入れる。
【０１４３】
該ポリエチレングリコール分子(もしくはその他の化学的部分)は該ポリペプチドの機能的ドメインに及ぼす影響を考慮してBLyS結合性ポリペプチドへ付着させなければならない。当業者が利用しうる付着方法は多数あり、例えば、EP 0 401 384(PEGをG-CSFにカップリングさせるもの)が挙げられるが(本明細書に参照により組み入れる)、Malikら, Exp. Hematol., 20:1028-1035(1992)(トレシルクロリド(tresyl chloride)を用いたGM-CSFのPEG化について報告したもの)をも参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは、反応基、例えば遊離のアミノ基もしくはカルボキシル基を介してアミノ酸残基と共有結合で結合することができる。反応基はそれに対して活性化ポリエチレングリコール分子が結合しうるものである。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基としては、例えば、リシン残基およびN末端アミノ酸残基が挙げられうる；遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびC末端アミノ酸残基が挙げられうる。スルフヒドリル基もポリエチレングリコール分子を付着させるための反応基として用いることができる。好ましい1実施形態においては、ポリエチレングリコール分子は、例えばN末端もしくはリシン側鎖のアミノ基への付着などで、アミノ基に付着される。
【０１４４】
上記で示唆したとおり、ポリエチレングリコールは、多数あるアミノ酸残基のいずれかとの連結を介してポリペプチドに付着させることができる。例えば、ポリエチレングリコールは、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、もしくはシステイン残基への共有結合を介してポリペプチドと連結することができる。ポリエチレングリコールを、該ポリペプチドの特定のアミノ酸残基(例えば、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、もしくはシステイン)と、または該ポリペプチドの2つ以上のタイプのアミノ酸残基(例えば、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、およびそれらの組み合わせ)に付着させるためには1種以上の反応化学を利用することができる。
【０１４５】
N末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望される場合もある。説明としてポリエチレングリコールを用いると、種々のポリエチレングリコール分子(分子量、分枝などによって)、反応混合物中のポリエチレングリコール分子のポリペプチド分子に対する比率、行おうとするPEG化反応のタイプ、および選択されたN末端PEG化ポリペプチドを得るための方法から選択することができる。N末端PEG化調製物を得るための方法(すなわち、必要に応じてこの部分を他のモノPEG化部分から分離すること)は、PEG化ポリペプチド分子の集団からN末端がPEG化された物質を精製することによるものでありうる。タンパク質の選択的N末端修飾は、ある特定のタンパク質の誘導体化に利用しうる第一級アミノ基の種々のタイプの反応性に差があること(リシン対N末端)を利用した還元的アルキル化によって行うことができる。適切な反応条件下では実質的にN末端でのタンパク質の選択的な誘導体化がカルボニル基を含んでいるポリマーを用いて行える。
【０１４６】
上述のとおり、本発明のポリペプチドのPEG化はかなり多数の手段によって達成できる。例えば、ポリエチレングリコールはタンパク質に直接的、もしくは介在リンカーによってのいずれかで付着させることができる。ポリエチレングリコールをタンパク質にリンカーなしで付着させるシステムは、Delgadoら, Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys., 9:249-304(1992); Francisら, Intern. J. of Hematol., 68:1-18(1998); 米国特許第4,002,531号; 米国特許第5,349,052号; WO 95/06058; およびWO 98/32466に述べられており、これらの各々の開示は本明細書に参照により組み入れる。
【０１４７】
介在リンカーなしにポリペプチドのアミノ酸残基へポリエチレングリコールを直接的に付着させるシステムの１つは、トレシル化(tresylated)MPEGを用いるものであるが、それはトレシルクロリド(ClSO2CH2CF3)を用いてモノメトキシポリエチレングリコール(MPEG)を修飾することによって生産される。タンパク質をトレシル化MPEGと反応させると、ポリエチレングリコールはポリペプチドのアミン基へ直接的に付着される。このように、本発明は、本発明のポリペプチドを2,2,2-トリフルオロエタンスルホニル基を有するポリエチレングリコール分子と反応させることによって生産されるポリペプチド-ポリエチレングリコールコンジュゲートを含んでいる。
【０１４８】
またポリエチレングリコールはポリペプチドに多数の様々な介在リンカーを用いて付着させることもできる。例えば、米国特許第5,612,460号(これはその開示の全体を本明細書中に参照により組み入れる)は、ポリエチレングリコールをポリペプチドに連結するためのウレタンリンカーについて開示している。またポリエチレングリコールがポリペプチドにリンカーによって付着されているポリペプチド-ポリエチレングリコールコンジュゲートは、ポリペプチドとMPEG-スクシニミジルスクシネート、1,1'-カルボニルジイミダゾールで活性化したMPEG、MPEG-2,4,5-トリクロロフェニルカーボネート、MPEG-p-ニトロフェノールカーボネート、および種々のMPEG-スクシネート誘導体などの化合物との反応によって生産することもできる。その他の多数のポリエチレングリコール誘導体、およびポリエチレングリコールをポリペプチドに付着させる反応化学は、WO 98/32466に述べられており、その開示全体は本明細書中に参照により組み入れる。本明細書に記載の反応化学を用いて生産したPEG化BLyS結合性ポリペプチド産物は本発明の範囲内に含まれる。
【０１４９】
また本発明の各ポリペプチドに付着されるポリエチレングリコール部分の数(すなわち、置換の程度)は変えることができる。例えば、本発明のPEG化ポリペプチドは、平均して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、17、20個もしくはそれ以上のポリエチレングリコール分子と連結することができる。同様にして、置換の程度の平均も例えば、ポリペプチド1分子あたりポリエチレングリコール部分1〜3、2〜4、3〜5、4〜6、5〜7、6〜8、7〜9、8〜10、9〜11、10〜12、11〜13、12〜14、13〜15、14〜16、15〜17、16〜18、17〜19、もしくは18〜20個などの範囲内にありうる。置換の程度を測定するための方法は、例えば、Delgadoら, Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys., 9:249-304(1992)で論じられている。
【０１５０】
BLyS結合性ポリペプチド多量体、コンジュゲート、および融合物
本発明は多価のBLyS結合性ポリペプチドを包含する。BLyS結合性ポリペプチドは単量体、二量体、三量体、もしくはより高次な多量体とすることができる。好ましい1実施形態においては、多価のBLyS結合性ポリペプチドはホモ三量体である。別の好ましい1実施形態においては、ホモ三量体のBLyS結合性ポリペプチドは単一のホモ三量体BLySと結合する。
【０１５１】
別の好ましい1実施形態においては、単量体もしくは多量体のBLyS結合性ポリペプチドは別のポリペプチドもしくはその他の化合物とコンジュゲートする。例えば、BLyS結合性ポリペプチドは放射性化合物、もしくはその他の毒性化合物とコンジュゲートさせて、BLySを発現している細胞を標的として破壊させることができる。
【０１５２】
本発明はまた、1個以上のBLyS結合性ポリペプチドと1個以上の非BLyS結合性ポリペプチドもしくはその他の化学的部分とを含んでなるヘテロ多量体をも包含する。そのようなヘテロ多量体は、単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、もしくはより高次の多量体とすることができる。ヘテロBLyS結合性多量体はBLySを発現している細胞、および異種の非BLyS結合性ポリペプチドもしくはその他の化学的部分に対する受容体を、標的とし、結合し、阻害し、および/もしくは応答を活性化するために用いることができる。そのような活性化される応答としては例えば、アポトーシス、もしくはその他の生物学的および化学的に介在された形態の細胞の破壊が挙げられうる。またヘテロBLyS結合性多量体を用いて、BLySを発現している細胞を標的として所望の分子もしくは化合物をその細胞に導入することができる。例えば、ヘテロBLyS結合性多量体は、放射性化合物もしくはその他の毒性化合物とコンジュゲートさせてBLySを発現している細胞を死滅させることができる。別の1例として、ヘテロBLyS結合性およびアデノウイルス結合性多量体は、BLySを発現している細胞を特異的に標的としてアデノウイルスが介在する遺伝子治療をその細胞中に導入するために用いうる。
【０１５３】
BLyS結合性ポリペプチド多量体は当業界で公知の方法を用いてホモ多量体およびヘテロ多量体として融合もしくはコンジュゲートすることができる。好ましい1実施形態においては、BLyS結合性ポリペプチドはホモ多量体として連結され、それの1個もしくは複数のリンカーは各BLyS結合性ポリペプチドが同時に個々のBLyS分子と結合しうるのに十分な長さと柔軟性を与えている。別の好ましい1実施形態においては、BLyS結合性ポリペプチドはヘテロ多量体として連結され、それの1個もしくは複数のリンカーは各BLyS結合性ポリペプチドが同時に個々のBLyS分子と結合しうるのに十分な長さと柔軟性を与え、異種のポリペプチドもしくは化学的部分は同時にそれの標的と結合することができる。適切なリンカー分子の多数の例については当業界で公知である。(例えば、Todorovskaら, J. Immunol. Methods, 248(1-2):47-66(2001); Mehvar, J. Control Release, 69(1):1-25(2000); Francisら, Int. J. Hematol., 68(1):1-18(1998)を参照のこと)。特定の実施形態においては、該リンカーは次のものからなる群から選択されるメンバーである：(a)ペプチドリンカー；(b)グルタメートリンカー；および(c)ポリエチレングリコールリンカー。本発明の方法に従って用いられるリンカーの長さは当業界で公知の技法を用いて慣例的に測定することができる。特定の実施形態においては、リンカーは5〜60オングストロームの長さである。他の実施形態においては、リンカーは10〜50、10〜40、10〜30、もしくは10〜20オングストロームの長さである。さらに別の実施形態においては、リンカーは約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、もしくは100オングストロームの長さである。この文脈で「約」とは、列挙した長さおよび/もしくはそれより数オングストローム(5、4、3、2、もしくは1オングストローム)長いもしくは短い長さのものを含んでいる。他の実施形態においては、リンカーは少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、もしくは100オングストロームの長さである。
【０１５４】
好ましい1実施形態においては、BLyS結合性ポリペプチドはヒト血清アルブミン(HA)と融合させることができる。例えば、米国特許出願第09/833,245号、2001年4月12日出願、を参照すればよく、これは本明細書に参照により組み入れる。1実施形態においては、該アルブミン融合タンパク質はN末端部分としてHA、およびC末端部分としてBLyS結合性ポリペプチドを含んでなるものである。別の1実施形態においては、該アルブミン融合タンパク質はC末端部分としてHA、およびN末端部分としてBLyS結合性ポリペプチドを含んでなるものである。
【０１５５】
他の実施形態においては、該アルブミン融合タンパク質はアルブミンのN末端およびC末端の双方に融合させたBLyS結合性ポリペプチドを有している。好ましい1実施形態においては、N末端およびC末端に融合させたBLyS結合性ポリペプチドが同一のBLyS結合性ポリペプチドである。別の好ましい1実施形態においては、N末端およびC末端で融合させたBLyS結合性ポリペプチドは異なるBLyS結合性ポリペプチドである。別の好ましい1実施形態においては、それぞれBLyS結合性ポリペプチドはHAのN末端もしくはC末端のいずれかに融合され、異なる(非BLyS結合性)ポリペプチドがC末端もしくはN末端のいずれかに融合されている。
【０１５６】
BLyS結合性ポリペプチドがHAのN末端および/もしくはC末端に融合されているアルブミン融合タンパク質に加えて、また本発明のBLyS結合性ポリペプチド/アルブミン融合タンパク質はBLyS結合性ポリペプチドをHAの１つもしくは複数の内部領域に挿入することによって生産することもできる。例えば、HA分子のタンパク質の配列内には、α-ヘリックスの末端部から開始部までの間に多数のループもしくはターンが存在しており、それはジスルフィド結合によって安定化されている(米国特許出願第09/833,245号の図9〜11を参照のこと)。HAの結晶構造から決定されたループ(米国特許出願第09/833,245号の図13)(PDB識別名 1AO6、1BJ5、1BKE、1BM0、1E7E〜1E7I、および1UOR)は、その大部分が分子の本体の外へと延ばす。これらのループは、治療的活性を有するペプチド(特に機能的であるために二次構造が必要なもの)もしくは治療用タンパク質の挿入もしくは内部の融合に有用であり、本質的には特定の生物学的活性を有するアルブミン分子が生成される。
【０１５７】
その内部に本発明の結合性ポリペプチドが挿入されて本発明のアルブミン融合タンパク質を生成しうるヒトアルブミン構造中のループとしては次のものが挙げられる：Val54-Asn61、Thr76-Asp89、Ala92-Glu100、Gln170-Ala176、His247-Glu252、Glu266-Glu277、Glu280-His288、Ala362-Glu368、Lys439-Pro447、Val462-Lys475、Thr478-Pro486、およびLys560-Thr566。より好ましい実施形態においては、本発明のポリペプチドは、成熟ヒト血清アルブミン(配列番号445)のVal54-Asn61、Gln170-Ala176、および/もしくはLys560-Thr566ループ中に挿入される。
【０１５８】
特定の実施形態においては、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは、放射性金属イオン(そのようなイオンとしては限定はされないが111In、177Lu、90Y、166Ho、および153Smが挙げられる)をポリペプチドとコンジュゲートさせるために有用な大環状キレート化剤に付着される。好ましい1実施形態においては、本発明のBLyS結合性ポリペプチドに付着した大環状キレート化剤と会合した放射性金属イオンは111Inである。別の好ましい1実施形態においては、本発明のBLyS結合性ポリペプチドに付着した大環状キレート化剤と会合した放射性金属イオンは90Yである。特定の実施形態においては、大環状キレート化剤は、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸(DOTA)である。他の特定の実施形態においては、DOTAが1個のリンカー分子を介して本発明のBLyS結合性ポリペプチドに付着している。DOTAをポリペプチドとコンジュゲートさせるために有用なリンカー分子の例は当業界では一般的に知られている−例えば、DeNardoら, Clin. Cancer Res., 4(10):2483-90(1998); Petersonら, Bioconjug. Chem., 10(4):553-7(1999); およびZimmermanら, Nucl. Med. Biol., 26(8):943-50(1999)を参照されたい。これらはそれらの全体を本明細書中に参照により組み入れる。さらに、米国特許第5,652,361号および第5,756,065号は、抗体にコンジュゲートさせることのできるキレート化剤、およびそのキレート化剤の作製法と使用法について開示しているものであるが、これらはそれらの全体を本明細書中に参照により組み入れる。米国特許第5,652,361号および第5,756,065号はキレート化剤を抗体とコンジュゲートさせることに焦点を当ててはいるが、当業者であれば、キレート化剤を他のポリペプチドとコンジュゲートさせるためにそれらに開示されている方法を適用することは容易にできるであろう。
【０１５９】
本発明のBLyS結合性ポリペプチドは既知の方法によって回収し精製することができるが、そのような方法としては、限定はされないが、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。最も好ましいのは、高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)を精製に用いることである。
【０１６０】
BLyS結合性ポリペプチドは検出可能な標識を用いて修飾することもでき、そのような標識としては限定はされないが、BLyS標的の検出と単離のための、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放射金属、非放射性常磁性金属イオン、および親和性標識が挙げられる。検出可能な物質は、本発明のポリペプチドと直接的に、もしくは当業界で公知の技法を用いて中間物(例えば当業界で公知のリンカーなど)を介して間接的に、カップリングもしくはコンジュゲートさせることができる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、もしくはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチン、およびアビジン/ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ビオチン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、もしくはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としてはルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；適切な放射性物質の例としては、放射性金属イオン、例えば、213Biなどのα放射体、またはその他の放射性同位元素、例えばヨウ素(131I、125I、123I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(115mIn、113mIn、112In、111In)、およびテクネチウム(99Tc、99mTc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、および117Tinなどが挙げられる。
【０１６１】
特定の1実施形態においては、本発明のBLyS結合性ポリペプチドはビオチンで標識される。
【０１６２】
本発明の結合性ポリペプチドと組換えバクテリオファージの使用
本明細書に記載のBLyS結合性ポリペプチドは、溶液中のBLyS標的タンパク質の検出、単離、もしくは除去に特に有用である。そのような溶液は、BLySおよび/もしくはBLyS様ポリペプチドを水もしくは水性バッファー中に含む単純な分散液もしくは溶液とすることができ、または、例えば血液およびその他の体液、組織ホモジネート、細胞抽出物、もしくは生検サンプルなどのより複雑な溶液、およびBLySもしくはBLyS様ポリペプチドを含有する細胞培養培地とすることができる。体液としては、限定はされないが、血清、血漿、リンパ液、血液、血液の画分、尿、滑液、髄液、唾液、および粘液が挙げられる。
【０１６３】
1実施形態においては、本発明は溶液中のBLySタンパク質および/もしくはBLyS様ポリペプチドを検出するための方法を提供し、その方法は、溶液を本発明のBLyS結合性ポリペプチドと接触させ、BLyS結合性ポリペプチドに対するBLySもしくはBLyS様ポリペプチドの結合を検出することを含んでなるものである。BLyS結合性ポリペプチドは遊離の状態とすることができ、または固定化された状態とすることもできる。好ましくは、BLyS結合性ポリペプチドは固体表面もしくはクロマトグラフ材料、またはプラスチックのマイクロタイターアッセイディッシュのウエル上に固定化されたポリペプチドである。
【０１６４】
本発明の別の1実施形態は、BLySタンパク質および/もしくはBLyS様ポリペプチドを、それを含有する溶液から単離する方法であり、その方法は：
(a) その溶液を、BLySおよび/もしくはBLyS様ポリペプチドがBLyS結合性ポリペプチドと結合しうる条件下でBLyS結合性ポリペプチドと接触させ、
(b) BLySおよび/もしくはBLyS様ポリペプチドを回収する、
ことを含んでなる。
【０１６５】
本発明のさらに別の1実施形態は、BLySタンパク質および/もしくはBLyS様ポリペプチドを、それを含有する溶液から単離する方法であり、その方法は：
(a) その溶液を、BLySおよび/もしくはBLyS様ポリペプチドがBLyS結合性ポリペプチドと結合しうる条件下でBLyS結合性ポリペプチドと接触させ、
(b) BLyS結合性ポリペプチドとBLySおよび/もしくはBLyS様ポリペプチドとによって形成される複合体(単一もしくは複数)を溶液中の他の成分から分離する、
ことを含んでなる。
【０１６６】
好ましくは、このような方法にはさらに次のステップをも含める：
(c) BLyS結合性ポリペプチドをBLySおよび/もしくはBLyS様ポリペプチドから解離させ、そして
(d) 解離したBLySおよび/もしくはBLyS様ポリペプチドを回収する。
【０１６７】
本発明はまた、BLySおよび/もしくはBLyS様ポリペプチドを検出する方法、もしくは単離する方法で使用するための、本発明の結合性ポリペプチドを含むキットをも提供する。
【０１６８】
本発明に従えば、BLyS標的タンパク質の検出もしくは単離は、BLyS標的タンパク質を含有する溶液をBLyS結合性ポリペプチドと接触させることを含んでなるものである。特定の適用の如何によって、BLyS結合性ポリペプチドは溶液中に遊離の状態とすることができ、または固相支持体もしくはクロマトグラフ材料上に固定化された状態とすることができる。BLyS標的タンパク質と結合性ポリペプチドとの間の結合が可能となるように十分な時間をかけ、溶液中もしくは混合物中の非結合性成分を除去もしくは洗い流す。次いで結合性ポリペプチドとBLyS標的タンパク質との間の結合性複合体の形成の検出は、例えば結合性ポリペプチド上の標識(それは結合性複合体の1成分である)からのシグナルを検出することによって行うことができる。標識は標準的な方法によって検出しうるシグナルを生じるような標識であればいかなるものでもよく、そのようなものとしては、蛍光標識、放射性化合物、もしくは基質と反応して検出可能なシグナルを生ずる酵素などがある。そのような適切な標識については上述している。本発明のファージ結合性ポリペプチド、すなわちその表面にBLyS結合性ポリペプチドを展示している組換えファージは、BLySおよび/もしくはBLyS様ポリペプチドと複合体を形成することができ、その複合体は反応試験管中で沈殿物もしくは沈降物として検出でき、それは沈殿させた後もしくは遠心分離後に視覚的に検出しうる。あるいは、サンドイッチタイプのアッセイを用いることができ、そのアッセイではBLyS結合性ポリペプチドは固相支持体上、例えばプラスチック管もしくはウエルなどの上に固定化されるか、またはアガロースビーズなどのクロマトグラフ支持体マトリックス上に固定化され、次いで、BLyS標的を含むと予想される溶液を固定化された結合性ポリペプチドと接触させ、非結合性物質もしくは成分を除去もしくは洗い流す。
【０１６９】
本発明の結合性ポリペプチドは、BLySおよび/もしくはBLyS様ポリペプチドの検出および/もしくは単離をアフィニティークロマトグラフィー法で行うのに特に有用である。従来法のクロマトグラフィーのいずれでも利用することができる。好ましくは、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは例えばクロマトグラフィーカラムにパッキングするのに適した固相支持体上に固定される。次いで固定化されたBLyS結合性ポリペプチド親和性リガンドを、結合性ポリペプチド/BLyS(もしくはBLyS様ポリペプチド)複合体の形成に都合のよい条件下で、ローディングするか、もしくは供給流と接触させることができる。非結合性物質を洗い流すことができる。適切な洗浄条件の例は当業者であれば容易に定めることができ、そのような条件の例としては、限定はされないが、[PBS/0.01%のTween 20, pH7.2]および[1M NaCl/10mM Tris, pH7.5]が挙げられる。Tris洗浄バッファーがおそらく好ましいが、それはリン酸塩が50%のエチレングリコール中で沈殿することができるからである。一般的には、限定するものではないが、洗浄バッファーはpH7.0であり、任意で0.0〜1.5MのNaClを含んでいるが、より好ましくは1M NaClを含む。さらに、洗浄バッファーは任意で緩和な界面活性剤、例えば、Tween 20、Tween 80、もしくはNP-80などを含有することができる。BLySもしくはBLyS様ポリペプチドはBLyS結合性ポリペプチドから、結合性複合体の解離に好都合な溶液条件を導入することによって溶出することができる。適切な溶出液は当業者であれば容易に定めることができ、そのような溶出液としては、限定はされないが、[50%のエチレングリコール/100mM NaOAc]が挙げられる。非限定的な例示としては、本発明の目的に有用な溶出バッファーは、40〜60%のエチレングリコール、好ましくは50%のエチレングリコール；および50〜100mMのNaOAcでpH4〜pH7の範囲のもの、より好ましくはpH4〜pH6、最も好ましくはpH4.5〜pH5.5のものを含有する。好ましくは、ファーストフロー(fast flow)アフィニティークロマトグラフィー技法を分子の結合のために用い、それから精製されたBLySもしくはBLyS様ポリペプチドを溶出する。
【０１７０】
あるいは、BLyS標的を含有する溶液とBLyS結合性ポリペプチドとを混合し、次いでBLyS標的と結合性ポリペプチドとの複合体を単離することによるバッチクロマトグラフィーを行うことができる。このタイプの分離を行うための多数の方法が知られている。例えば、結合性ポリペプチドをビーズなどの固相支持体上に固定化し、次いでろ過によって供給流からBLyS標的とともに分離することができる。別の1例においては、BLyS結合性ポリペプチドはそれ自体の親和性タグ、例えばポリHisテイルもしくはストレプトアビジン結合領域などで修飾し、それを用いて、固定化した金属アフィニティークロマトグラフ樹脂もしくはストレプトアビジンをコーティングした基質を用いて複合体を形成させた後、結合性ポリペプチドを単離することができる。分離後は、BLyS標的を溶出条件下で結合性ポリペプチドから放出させ、精製された形態で回収することができる。
【０１７１】
BLySもしくはBLyS様ポリペプチドを生産する方法により、通常供給流中のBLySもしくはBLyS様ポリペプチドが得られるが、供給流にはさらに不純物(BLyS標的との関係で)が含まれる。本発明の目的の1つは、BLyS結合性ポリペプチドおよびBLyS結合性ポリペプチドを含んでなる調製物(アフィニティークロマトグラフィー媒体もしくは表面など)を生産することであり、これらによって供給流からのBLyS標的タンパク質の迅速で高度に特異的な精製が可能となる。本明細書の方法で得られたBLyS結合性ポリペプチドは、特定の供給流からBLyS標的タンパク質を単離するために、当業界で公知の条件および技法を用いて、もしくは慣例的に改変して、容易に適合させることができる。BLySの別の代替生産方法を用いる場合には、同じレベルの精製を達成するために、異なる供給流を生産すること、BLyS結合性ポリペプチドおよび/もしくは条件の異なるセットが必要となる場合がある。BLyS結合性ポリペプチドおよび/もしくは条件の新たなセットは、本明細書に概説した方法に従って、もしくはそれを改変して、そうでなければ当業界で公知の方法によって、容易に得ることができる。
【０１７２】
キット
また本発明は、BLySの存在のスクリーニングおよび/または液体、例えば体液(例えば、血液、血清、もしくは滑液)中のBLyS濃度の定量に有用でありうるアッセイキットをも対象としたものである。
【０１７３】
本発明の特定の1実施形態においては、アッセイキットは、本発明のBLyS結合性ポリペプチドの1個以上の容器、および任意で、BLyS標的/BLyS結合性ポリペプチド相互作用の存在もしくはその不在を測定するための検出手段を含んでなるものを意図している。キットはさらに任意で、例えば対照もしくは標準として用いることのできるBLySタンパク質を含んでいる。BLyS結合性ポリペプチドは、遊離の状態、または宿主細胞の表面もしくはバクテリオファージの表面上に発現させたものとすることができる。
【０１７４】
特定の1実施形態においては、BLyS結合性ポリペプチドもしくはBLySタンパク質のいずれかが標識される。本明細書でさらに述べるとおり、本発明には様々な標識を用いることができ、そのような標識としては限定はされないが、従来の手段によって認識ユニットをビオチンへコンジュゲートさせることが挙げられる。あるいは、標識は、例えば、発蛍光団(fluorogen)、酵素、エピトープ、色素原、もしくは放射性核種を含んでなるものとすることができる。好ましくは、ビオチンが共有結合でBLyS結合性ポリペプチドもしくはBLySタンパク質のいずれかにコンジュゲートされる。好ましくはBLyS結合性ポリペプチドは固相支持体上に固定化される。その標識を検出するために用いる検出手段は、標識の性質の如何によって変わり、当業界で公知のいかなる手段でもよく、例えば、放射性核種を検出するためのフィルム；酵素の存在を検出するための検出可能なシグナルを生ずる酵素基質；エピトープの存在を検出するための抗体、その他が挙げられる。
【０１７５】
BLyS結合性分子をスクリーニングするための方法
本発明はまた、BLySと結合するポリペプチドおよび非ポリペプチドを同定するためのスクリーニング方法、およびそれによって同定されたBLyS結合性分子をも包含する。
【０１７６】
この方法は下記のステップを含んでなる：
(a) BLySタンパク質もしくはBLyS様タンパク質を複数の分子と接触させ；および
(b) BLySタンパク質もしくはBLyS様タンパク質と結合する分子を同定する。
【０１７７】
BLySタンパク質もしくはBLyS様タンパク質を複数の分子と接触させるステップは多数の方法で行うことができる。たとえば、BLySタンパク質もしくはBLyS様タンパク質を固相支持体上に固定化し、複数の分子を含有する溶液をその固定化したBLySタンパク質もしくはBLyS様タンパク質と接触させることが考えられうる。このような方法はアフィニティークロマトグラフィー法と同種のものであり、その方法では親和性マトリックスは固定化されたBLySタンパク質もしくはBLyS様ポリペプチドを含んでなるものである。BLySタンパク質もしくはBLyS様ポリペプチドに対する選択的親和性を有する分子は親和性選択によって精製することができる。固相支持体の性質、BLySタンパク質もしくはBLyS様ポリペプチドの固相支持体への付着のプロセス、溶媒、および親和性による単離もしくは選択の条件は、大部分は従来から用いられてきたものであり、当業者には周知である。
【０１７８】
あるいは、複数の種類のポリペプチドを、ポリペプチドのサブセットもしくは個々のポリペプチドを含んでなる実質的な分離画分へと分離することもできる。例えば、複数の種類のポリペプチドを、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、もしくは当業者に公知のポリペプチドを分離するための類似の方法によって分離することができる。個々のポリペプチドはまた、形質転換した宿主細胞によってその外表面上もしくはその周辺で発現されるような方法(例えば、組換えファージ)で生産させることができる。次いで、個々の単離体をBLySタンパク質もしくはBLyS様ポリペプチドによって「プロービング」することができ、それは任意で発現に必要な誘導物質の存在下で行うことができ、それによってBLySタンパク質もしくはBLyS様タンパク質と個々のクローンとの間の選択的親和性相互作用が起こっていればそのことを測定できる。BLySタンパク質もしくはBLyS様タンパク質を、個々のポリペプチドを含んでなる各画分と接触させる前に、さらに都合よく行うためにそのポリペプチドをまず固相支持体に移すことができる。そのような固相支持体は、単にニトロセルロースもしくはナイロン製のものなどのフィルター膜の一片でよい。このようなやり方で、陽性のクローンを発現ライブラリーの形質転換された宿主細胞の集合から同定することができ、それはBLySタンパク質もしくはBLyS様タンパク質に対して選択的親和性を有するポリペプチドをコードするDNA構築物を持ったものである。さらに、BLySタンパク質もしくはBLyS様タンパク質に対して選択的親和性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は従来の手段で直接的に決定することができ、または、該ポリペプチドをコードするDNAのコード配列はより都合よく決定することができる場合が多い。次いで、その一次配列を対応するDNA配列から推定することができる。アミノ酸配列がそのポリペプチド自体から決定されるものである場合には、マイクロシークエンシング(microsequencing)技法を用いることができる。そのシークエンシング技法には、質量分析が含まれうる。
【０１７９】
特定の状況下では、選択的親和性相互作用の存在を測定もしくは検出しようと試みる前に、結合してないBLySタンパク質もしくはBLyS様タンパク質、あるいは結合してないポリペプチドを、BLySタンパク質もしくはBLyS様タンパク質と複数の種類のポリペプチドとの混合物から洗い流すことが望ましいかもしれない。そのような洗浄ステップは、BLySタンパク質もしくはBLyS様タンパク質または複数の種類のポリペプチドが固相支持体に結合している場合には特に望ましい場合がある。
【０１８０】
この方法で提供される複数の分子は、種々のライブラリー、例えば、ランダムもしくはコンビナトリアルペプチドもしくは非ペプチドライブラリーなどによって提供され、それらのライブラリーをBLySと特異的に結合する分子についてスクリーニングすることができる。用いることができる当業界で公知の多数のライブラリーがあり、それらとしては例えば、化学合成ライブラリー、組換えライブラリー(例えば、ファージディスプレイライブラリー)、およびin vitroでの翻訳に基づくライブラリーが挙げられる。化学合成ライブラリーの例については、Fodorら, Science, 251:767-773(1991); Houghtenら, Nature, 354:84-86(1991); Lamら, Nature, 354:82-84(1991); Medynski, Bio/Technology, 12:709-710(1994); Gallopら, J. Medicinal Chemistry, 37(9):1233-1251(1994); Ohlmeyerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10922-10926(1993); Erbら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11422-11426 (1994); Houghtenら, Biotechniques, 13:412(1992); Jayawickremeら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:1614-1618(1994); Salmonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11708-11712(1993); PCT 公開第WO 93/20242号;ならびにBrennerおよびLerner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5381-5383(1992)中に述べられている。
【０１８１】
ファージディスプレイライブラリーの例は、ScottおよびSmith, Science, 249:386-390(1990); Devlinら, Science, 249:404-406(1990); Christianら, J. Mol. Biol., 227:711-718(1992); Lenstra, J. Immunol. Meth., 152:149-157(1992); Kayら, Gene, 128:59-65(1993); およびPCT国際公開第WO 94/18318号(1994年8月18日付)中に述べられている。
【０１８２】
in vitroでの翻訳に基づくライブラリーとしては、限定はされないが、PCT国際公開第WO 91/05058号(1991年4月18日付); およびMattheakisら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9022-9026(1994)中に述べられているものが挙げられる。
【０１８３】
非ペプチドライブラリーの例としては、ベンゾジアゼピンライブラリー(例えば、Buninら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4708-4712(1994)を参照のこと)を適応して用いることができる。またペプトイド(peptoid)ライブラリー(Simonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371(1992)を参照のこと)も用いることができる。用いうるライブラリーの別の例としては、ペプチド中のアミド官能基が過メチル化されて化学的に転換されたコンビナトリアルライブラリーを生成したものが挙げられ、それはOstreshら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11138-11142(1994))によって述べられている。
【０１８４】
本発明に有用な非ペプチドライブラリーの多様性はきわめて大きい。例えば、EckerおよびCrookeは、Bio/Technology, 13:351-360(1995)で、種々のライブラリーの基本を成す化学種としてベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ピペラジンジオン、ビフェニル、糖類似体、β-メルカプトケトン、アリール酢酸、アシルピペリシン、ベンゾピラン、クバン、キサンチン、アミンイミド、およびオキサゾロンを列挙している。
【０１８５】
非ペプチドライブラリーは、おおまかに２つのタイプ：修飾されたモノマーおよびオリゴマーに分類することができる。修飾されたモノマーライブラリーは、比較的単純な骨格構造をとり、それに様々な官能基が付加される。その骨格は既知の有用な薬理活性を有する分子であることが多い。例えば、骨格はベンゾジアゼピン構造とすることができる。
【０１８６】
非ペプチドオリゴマーライブラリーは、モノマーの配列によって異なる新しい分子形状を創出するように集められた、多数のモノマーを利用する。用いられたモノマー単位には、カルバメート、ピロリノンおよびモルホリノがある。ペプトイドはα炭素ではなくαミノ基に側鎖が結合しているペプチド様オリゴマーであるが、これが非ペプチドオリゴマーライブラリーのもう１つのバージョンの基本となる。第１の非ペプチドオリゴマーライブラリーは１種類のモノマーを利用しており、したがって反復主鎖を含有した。最近のライブラリーは２種類以上のモノマーを使用するため、それによってライブラリーにさらに柔軟性が与えられる。
【０１８７】
ライブラリーのスクリーニングは、よく知られた様々な方法のいずれかによって達成することができる。例えば、下記の参考文献を参照されたい（ペプチドライブラリーのスクリーニングを発表している）：ParmleyおよびSmith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol., 251:215-218; ScottおよびSmith, 1990, Science, 249:386-390; Fowlkesら、1992, Bio Techniques, 13:422-427; Oldenburgら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5393-5397; Yuら、1994, Cell, 76:933-945; Staudtら、1988, Science, 241:577-580; Bockら、1992, Nature, 355:564-566; Tuerkら、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6988-6992; Ellingtonら、1992, Nature, 355:850-852; 米国特許第5,096,815号、米国特許第5,225,409号および米国特許第5,198,346号、いずれもLadnerら; RebarおよびPabo, 1993, Science, 263:671-673; およびPCT国際公開WO 94/18318。
【０１８８】
特定の実施形態において、BLySに結合する分子を同定するスクリーニングは、ライブラリーのメンバーを、固相に固定化されたBLySタンパク質またはBLyS様タンパク質と接触させることによって実施することができる。このようなスクリーニング法は、「パニング」法と称されるが、例えばParmleyおよびSmith, 1988, Gene, 73:305-318; Fowlkesら、1922, Bio Techniques, 13:422-427; PCT国際公開WO 94/18318;および本文に引用された参考文献に記載されている。
【０１８９】
別の実施形態では、酵母において相互作用タンパク質を選択する２ハイブリッド系（FieldsおよびSong, 1989, Nature, 340:245-246; Chienら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582）を用いて、BLySまたはBLyS様タンパク質に特異的に結合する分子を同定することができる。
【０１９０】
BLyS標的タンパク質と結合する能力をもつ新しい結合成分を得るための別のスクリーニング法は、競合アッセイを用いるものであるが、このアッセイではBLyS標的を本発明のBLyS結合性ポリペプチド（好ましくは、標識したもの）に結合させた後、この複合体を１以上の試験成分と接触させる。本明細書に開示された既知のBLyS結合性物質の存在下でBLyS標的との結合について効果的に拮抗することができる試験成分が、良好な新BLyS結合成分となるであろう。
【０１９１】
BLyS標的タンパク質と特異的に結合するポリペプチドは、好都合なことに、あらゆるペプチドライブラリーから選択することができる。こうしたライブラリーには、ランダムペプチドライブラリー、コンビナトリアルペプチドライブラリー、またはバイアスをかけたペプチドライブラリーがある。本明細書で使用される「バイアスをかけた」(biased)という用語は、ライブラリーを作製する方法を操作して、結果として得られる分子コレクション（この場合ペプチドであるが）の多様性を支配する１以上のパラメーターを制限することを意味する。
【０１９２】
したがって、真にランダムなペプチドライブラリーは、ペプチドの所定の位置に特定のアミノ酸を見いだす確率が20種のアミノ酸すべてについて同じであるようなペプチドコレクションをもたらすと考えられる。しかしながら、例えばリシンが５アミノ酸ごとに存在すること、あるいはデカペプチドライブラリーの4、8および9位がアルギニンのみを含むように確定すること、を特定することによって、ライブラリーにバイアスを導入することができる。安定なループ構造を示すように設計されたライブラリーに関しては、ペプチド配列は２つの不変のシステイン残基を包含するように設計され、他のすべてのアミノ酸位置はシステイン残基を除く１以上のアミノ酸残基とすることができる（後述の実施例１を参照されたい）。明らかに、様々なタイプのバイアスを考慮することができ、本発明はどのような特定のバイアスにも限定されない。さらに、本発明は、例えばファージディスプレイペプチドライブラリー、およびDNA挿入断片を保持するラムダファージベクターを含んでなるDNA構築物を利用したライブラリーといった、特定のタイプのペプチドライブラリーを包含する。
【０１９３】
前述のように、BLyS結合性分子がポリペプチドである場合には、このポリペプチドは約6から60個未満までのアミノ酸残基を有することができるが、約6から約10個までのアミノ酸残基が望ましく、最も望ましいのは約6から約22個までである。別の実施形態においては、BLyS結合性ポリペプチドは15〜100個の範囲のアミノ酸を有し、または20〜50個のアミノ酸を含有する。
【０１９４】
選択されたBLyS結合性ポリペプチドは、上記のように化学合成または組換え発現によって調製することができる。
【０１９５】
本明細書に開示した特定のBLyS結合性ポリペプチドは、特定のあらかじめ選択された結合特性を示すBLyS結合性ポリペプチドを同定するファージディスプレイ法によって単離された。これらのBLyS結合性ポリペプチドは、はじめに、９種のファージディスプレイライブラリー、すなわちファージ表面に外来組換えポリペプチドを発現するように形質転換された組換えバクテリオファージの集団、をスクリーニングすることによって単離された。BLySのような特定の標的に対する新規ポリペプチド結合部分を単離するために、例えばファージディスプレイ法を使用するといったペプチドライブラリーのスクリーニングは特に有利である。というのは、非常に数多く（例えば、5×109）の結合可能性のある化合物を試験することができ、好結果の結合性物質を短時間で単離することができるためである。
【０１９６】
可能性のある結合性ポリペプチドのファージライブラリーを作製し、BLyS結合性ポリペプチドであるそのライブラリーのメンバーを求めてスクリーニングするために、ライブラリーで展示されるポリペプチドの構造鋳型として機能する候補結合ドメインを選択する。ファージライブラリーはこのような鋳型すなわち「親結合ドメイン」のポリペプチド類似体からなっている。親結合ドメインは、天然に存在するポリペプチド分子または合成のタンパク質もしくはポリペプチド、またはタンパク質のポリペプチド領域もしくはドメインである。親結合ドメインは、親結合ドメインと標的タンパク質との既知の相互作用に関する知見に基づいて選択することができるが、これは絶対に重要というわけではない。実際、親結合ドメインが標的に対して親和性を有することは不可欠ではない。なぜならば、非常に多数のポリペプチド類似体（「ライブラリー」）をそこから生じさせることができる構造を提供することを、目的としているためである。このポリペプチド類似体の多様性は、BLyS標的タンパク質に関して望ましい結合・放出特性（および選択された何か他の特性）を示す１以上の結合性ポリペプチドを包含すると考えられる。
【０１９７】
親結合ドメインとして機能する正確なポリペプチドに関する知見、または親結合ドメインが属するタンパク質またはドメインのクラスに関する知見は、BLyS結合性タンパク質がBLyS標的タンパク質と最適に結合する条件、ならびにBLyS結合性ポリペプチドがBLyS標的タンパク質を最適に放出する条件を決定するうえで有用であると考えられる。同様に、結合ドメインおよびBLyS標的タンパク質間の既知の相互作用を考慮して、例えば結合および／または放出条件下で相互作用を助けるように、結合および／または放出条件を選択することができ、あるいは、そうした既知の相互作用を考慮することなく、選択することもできる。また、望ましい結合および／または放出条件を考慮に入れて親結合ドメインを選択することができるが、そうでない選択も可能である。ライブラリーの結合ドメイン類似体が、提案されたまたは所望の結合もしくは放出条件下で不安定ならば、有用な結合性ポリペプチドはまったく得られないことが理解されよう。
【０１９８】
親結合ドメインを選択するときに、最も重要な考慮すべき事項は、いかにしてその類似体ドメインをBLyS標的タンパク質に提示するか、すなわち、どのような形でBLyS標的とポリペプチド類似体を相互に接触させるか、である。好ましい実施形態においては、例えば、ポリペプチド類似体をコードする合成DNAを、M13ファージのような微生物の表面に該ドメインを展示させる複製可能な遺伝子パッケージに挿入することによって、ポリペプチド類似体を生成することができる。これに用いられる方法は、Kayら、Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual(Academic Press, Inc.; San Diego 1996)および米国特許第5,223,409号（Ladnerら）に記載され、参考として本明細書に含めるものとする。ファージディスプレイライブラリーを作製するために、構造化されていない直鎖状のペプチドではなく、親結合ドメインまたは鋳型として構造化されたポリペプチドを使用することが望ましい。タンパク質ドメインもしくはポリペプチド分子の表面残基の変異は通常、タンパク質の全体的な構造もしくは一般的な性質（例えば、大きさ、安定性および変性温度）にはほとんど影響がない；ところが同時に、表面残基の変異は分子の結合特性に大いに影響を及ぼす可能性がある。ポリペプチドセグメントがより強固に拘束されているほど、特定の標的と結合しにくくなる。しかしながら、結合しさえすれば、その結合はより強固で、より特異的となる可能性が高い。したがって、親ポリペプチドが構造性を有するような親結合ドメインを選択することが望ましく、ひいては、ライブラリーのポリペプチド類似体のために、ある程度堅固なフレームワーク内で拘束されている構造を選択することが望ましい。
【０１９９】
ドメイン類似体のライブラリーを作製するための鋳型または親ドメインとして使用されるタンパク質ドメインは、比較的小さなタンパク質またはポリペプチドからなるペプチド分子であることが望ましい。低分子量ポリペプチドは、高分子量タンパク質よりもいくつかの利点を提供する：第１に、結合部位当たりの質量が減少する。低分子量の非常に安定なタンパク質ドメイン、例えばKunitzドメイン（〜7キロダルトン、kDa）、Kazalドメイン（〜7kDa）、Cucurbida maximaトリプシンインヒビター（CMTI）ドメイン（〜3.5kDa）、およびエンドセリン（〜2kDa）は、抗体（150kDa）または一本鎖scFv抗体（30kDa）よりもはるかに高いグラム当たりの結合を示すと考えられる。第2に、非特異的結合に利用される分子表面が少ないため、非特異的結合が低下する。第3に、低分子量ポリペプチドは、もっと大きなタンパク質や抗体には実行不可能な方法で、独自の結合部位を有するように操作することができる。例えば、低分子量タンパク質およびポリペプチドは、クロマトグラフィーマトリックスへの連結に適した部位にだけリシンを有するように操作することができる。これは抗体には実行不可能である。第4に、拘束されたポリペプチドの構造は、あるフレームワークから別のフレームワークに移すときに（構造ドメインはそのままで）、その機能性を維持する可能性が高い。例えば、結合ドメイン構造は、ファージ上に展示されるような、ライブラリーでのディスプレイのために用いられるフレームワークから、該展示フレームワークから分離されたもしくはクロマトグラフィー基体に固定化された単離タンパク質へと移し変えできる可能性が高い。
【０２００】
特定の実施形態では、本発明のBLyS結合性ポリペプチドは固定化される。本発明のBLyS結合性ポリペプチド分子は、例えばクロマトグラフィーの支持体に固定化されて、有効なBLyS分離またはアフィニティークロマトグラフィー媒体を形成する。固定化された本発明のBLyS結合性ポリペプチドは、溶液からBLyS標的タンパク質を検出、単離または除去するという用途があるが、それらに限定されない。例えば、マトリックス、樹脂、または支持体に固定化できるBLyS結合性ポリペプチド分子を生成する１つの方法は、適当な結合ドメイン鋳型を選択することにより、クロマトグラフィー樹脂または基体にBLyS結合性ポリペプチドを共有結合させてアフィニティー樹脂を形成するために利用できる１個以上のアミノ酸を有するBLyS結合性ペプチド分子を生成させることを伴う。同様に、ペプチド分子のN-末端アミノ基またはC-末端カルボキシル基は、これを不活性にするキャッピング基、または支持体との結合を可能にする官能基を付加することによって修飾することができる。例えば、タンパク質ドメインのC-末端カルボキシル基は、アルデヒド官能性基体または他のアミン反応性基体と反応させるために、アミドまたはヒドラジド（-NH-NH2）基に変換することができる。この方法は好ましい。本発明のBLyS結合性ポリペプチド分子をクロマトグラフィー材料に結合するために有用な、BLyS結合性ポリペプチドのもう１つの好ましい修飾は、アミノ酸配列Pro-Gly-Pro-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys（配列番号13）を含んでなる、もしくは同配列からなる、ポリペプチドリンカーである。
【０２０１】
本発明に含まれるBLyS結合性ポリペプチドを得るためのスクリーニング法の非限定的な例では、ファージディスプレイライブラリーにおけるファージは、固相支持体上に固定化されたBLyS標的タンパク質と接触させて、これと結合させることが可能である。非結合性ポリペプチドを展示するファージは、BLyS標的タンパク質と結合したファージから分離される。当技術分野で公知の様々な技法のいずれかを応用して、結合したファージを固定化BLySタンパク質から解離させて、さらにそのファージおよび／またはその核酸成分を回収し、かつ／または増幅することができる。こうした方法を用いて、集団の中でおよそ2千万に１つのBLyS結合性ファージを同定することができる。1〜2千万またはそれ以上の可能性のある結合性ペプチド分子をそれぞれ展示するライブラリーは、高親和性BLyS結合性ポリペプチドを探しだすために迅速にスクリーニングされる。
【０２０２】
スクリーニングの回を重ねるごとに、有効な結合性ポリペプチドのみが残るまで集団の多様性が低下し、すなわちこのプロセスが収束する。一般的に、ファージディスプレイライブラリーは、いくつかの密接に関連した結合性ポリペプチド（１千万のうち、10〜50の異なる結合性ポリペプチド）を含有するものである。収束の兆候には、密接に関連した配列の増大した結合性（ファージ力価で測定）および回収が含まれる。結合性ポリペプチド分子の最初の1セットが同定された後、その配列情報を利用して、例えばBLySの異なった型（例えばBLySの膜型および可溶性型）とその断片の識別、または供給流におけるBLySと、密接に関連した不純物との識別といった、さらに他に望ましい性質を有するメンバーに対してバイアスをかけた別のライブラリーを設計することができる。
【０２０３】
このような方法によって、多数の可能性のある結合性ポリペプチドをスクリーニングすることが可能になるばかりでなく、実際上、結合・溶出サイクルを反復し、特定の基準に合致したポリペプチド類似体を展示するファージをスクリーニングするための第２のバイアスをかけたライブラリーを構築することができる。上記の方法を用いて、バイアスのかかったポリペプチド類似体ライブラリーをスクリーニングし、スクリーニング条件下でBLyS標的タンパク質に対して強固に結合する、すなわち高い親和性を有するメンバーを明らかにすることができる。
【０２０４】
本発明において、標的BLySタンパク質分子はビオチン化後、ストレプトアビジンをコートした磁性粒子に結合させた。異なる設計の９種のファージディスプレイライブラリーを、固定化BLySと結合する能力についてスクリーニングした。各ライブラリーは、M13ファージが展示する、異なる長さと全体構造を有する多様性に富んだペプチドを特徴とした：TN6/6と称するライブラリー（2×108変異体）は、ヘキサマーループ構造を形成するために内部に２つの不変システインを有する、多様性に富んだ12-merを展示した。TN7/4と称するライブラリー（2.3×109変異体）は、ヘプタマーループ構造を形成するために内部に２つの不変システインを有する、多様性に富んだ13-merを展示した。TN8/9と称するライブラリー（5×109変異体）は、オクタマーループ構造を形成するために内部に２つの不変システインを有する、多様性に富んだ14-merを展示した。TN9/4と称するライブラリー（3.2×109変異体）は、ノナマーループ構造を形成するために内部に２つの不変システインを有する、多様性に富んだ16-merを展示した。TN10/9と称するライブラリー（2.5×109変異体）は、デカマーループ構造を形成するために内部に２つの不変システインを有する、多様性に富んだ16-merを展示した。TN12/1と称するライブラリー（1.4×109変異体）は、ドデカマーループ構造を形成するために内部に２つの不変システインを有する、多様性に富んだ18-merを展示した。約2×108の多様なアミノ酸配列を有するSubstrate Phage Library #2と称するライブラリーは、13の連続したアミノ酸からなる展示ポリペプチド内に直鎖状のペプチド多様化領域を含むように設計され、その展示ペプチド設計では、システイン以外のあらゆるアミノ酸残基を各位置に存在させた。最後に、それぞれPhD 7およびPhD 12という２つの市販の直鎖状ファージディスプレイライブラリーもスクリーニングした（New England Biolabs）。PhD 7ライブラリーは直鎖状ランダム配列7-merを展示し、PhD 12ライブラリーはランダム配列12-merを展示した。
【０２０５】
BLyS結合性ファージをPhD 7以外のすべてのファージから単離して集めた。
【０２０６】
ライブラリースクリーニングから単離した配列を分析した後、BLyS結合性ペプチドのいくつかのファミリーが規定された（上記コンセンサス配列A-GおよびH-Lを参照されたい）。第１回スクリーニングから得たBLyS結合性「ヒット」のアミノ酸配列を表１〜８（下記）に示す。
【０２０７】
BLyS標的に対してさらに一層高い親和性を有するBLyS結合性ポリペプチドを得るために、PhD 12ライブラリーの高親和性の多様な例を基をもとにして、特殊化したライブラリー、すなわちBLyS親和性成熟ライブラリー、を作製した（実施例6参照）。このライブラリーは、BLySに高い親和性を示す可能性の高いポリペプチドが多く含まれる集団を与えるように設計された。このようなライブラリーからの選択は、可溶性BLySの可溶性溶離液または他のBLyS結合性ポリペプチドとの長期の競合によって、BLySに対して最も高い親和性を有するポリペプチド以外のすべてを排除するように実施された。親和性成熟ライブラリーの４回のスクリーニングから、高親和性BLyS結合性ポリペプチドの大ファミリーが単離され、それらのアミノ酸配列を表14（下記）に示す。
【０２０８】
本発明のBLyS結合性ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドを含んでなるファージは、上記のようにBLySおよびBLyS様ポリペプチドを検出し単離することを包含する用途を有するが、用途はこれに限定されない。
【実施例】
【０２０９】
本発明によるBLyS結合性ポリペプチドの単離およびその使用は、下記でさらに説明される。下記の実施例に含まれる特定のパラメーターは、発明の実施を説明することを意図したものであり、決して本発明の範囲を限定するために提示されるのではない。
【０２１０】
実施例１：  ファージディスプレイライブラリーのスクリーニング
96ウェルプレートと比べて結合能が優れているため、スクリーニング時に標的を提示するために、ストレプトアビジンをコートした磁性ビーズ（Dynal M-280）を選択した。ビーズのビオチン化抗体に対する結合能は、製造業者が記載するとおりビーズmg当たり5〜10μgであった。本研究および次のスクリーニングのために、ビーズ1mgあたり5μgのビオチン化組換えBLyS（Human Genome Science, Inc.より入手）が割り当てられた。このビオチン化BLySの量は、ビーズの飽和に関して、標的の10倍過剰に相当する。未結合のBLySを洗浄して除去した。Mab 16C9（マウス抗BLyS、Human Genome Science）一次抗体、および二次抗体としてヤギ抗マウスHRPコンジュゲートを用いて検出することによって、結合したビオチン化BLySを確認した。関連性のないモノクローナル抗体（抗TNFα）を用いて、非特異的結合の対照とするため別の1セットのビーズを探査した。呈色試薬TMBを使用し、アッセイをOD 630 nmで読み取った。
【０２１１】
9種のライブラリー、TN6/6、TN7/4、TN8/9、TN9/4、TN10/9、TN12/1、Substrate Phage Library #2、PhD7、およびPhD12を、BLyS結合性物質を求めてスクリーニングした。これらのライブラリーの構成は下記の通りである：
TN6/6ファージディスプレイライブラリーは、Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa（配列番号14）の構造を有するポリペプチド鋳型に基づいてループ構造を形成する可能性をもつ、多様性に富んだペプチドを展示する組換えM13ファージから構成され、2.0×108のペプチド多様性を提供した。
【０２１２】
TN7/4ファージディスプレイライブラリーは、Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa（配列番号15）の構造を有するポリペプチド鋳型に基づいてループ構造を形成する可能性をもつ、多様性に富んだペプチドを展示する組換えM13ファージから構成され、2.3×109のペプチド多様性を提供した。
【０２１３】
TN8/9ファージディスプレイライブラリーは、Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa（配列番号16）の構造を有するポリペプチド鋳型に基づいてループ構造を形成する可能性をもつ、多様性に富んだペプチドを展示する組換えM13ファージから構成され、5×109のペプチド多様性を提供した。
【０２１４】
TN9/4ファージディスプレイライブラリーは、Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa（配列番号17）の構造を有するポリペプチド鋳型に基づいてループ構造を形成する可能性をもつ、多様性に富んだペプチドを展示する組換えM13ファージから構成され、3.2×109のペプチド多様性を提供した。
【０２１５】
TN10/9ファージディスプレイライブラリーは、Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa（配列番号18）の構造を有するポリペプチド鋳型に基づいてループ構造を形成する可能性をもつ、多様性に富んだペプチドを展示する組換えM13ファージから構成され、2.5×109のペプチド多様性を提供した。
【０２１６】
TN12/1ファージディスプレイライブラリーは、Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa（配列番号19）の構造を有するポリペプチド鋳型に基づいてループ構造を形成する可能性をもつ、多様性に富んだペプチドを展示する組換えM13ファージから構成され、1.4×109のペプチド多様性を提供した。
【０２１７】
Substrate Phage Library #2は、約80アミノ酸からなるポリペプチド挿入断片を展示する組換えM13ファージから構成されるが、このポリペプチドは２つのストレプトアビジン結合ドメイン、13アミノ酸からなる直鎖状の多様性に富んだセグメント（Cys以外のすべてのアミノ酸を各位置に配置することが可能である）、およびXa因子切断部位を有し、これらはペプチドリンカーで連結された。このライブラリーは、2×108展示ポリペプチドの多様性を提供した。
【０２１８】
ライブラリーPhD7およびPhD12は、ランダム化された直鎖状7-および12-アミノ酸ペプチドを展示する組換えM13ファージから構成されるが、これらは市販品をNew England Biolabsから購入した。
【０２１９】
各回のスクリーニングの前に、5等分したストレプトアビジンビーズにライブラリーを添加して10分間結合させておくことによって、ファージライブラリーまたはファージライブラリープールから、ストレプトアビジンビーズに結合可能なファージを枯渇させた。枯渇させたライブラリーをストレプトアビジン磁気ビーズ上のビオチン化BLySに添加し、室温で1時間結合させた。1回目のスクリーニングのために、最初からプールされていたPhD7およびPhD12以外のすべてのライブラリーは、別々にしておいた。結合後、ビーズを7回洗浄し、結合しているファージをクエン酸緩衝溶液とともにpH2.0で10分間インキュベートして、溶出した。溶出されたファージを2 M Tris-HCl pH 8.0で中和し、大腸菌XL-1 Blue MRF’に感染させた。感染した細胞を大きな寒天平板に塗布し、当技術分野で公知の標準的なファージ技法を用いて、次回の出発材料を産生させた。スクリーニングの回ごとに、回収されたインプットの比率をそれぞれのライブラリー（ライブラリープール）について算出した。これは、回収されたファージ数を初発ファージ数で割ったものに等しい。インプットの回収率が全ファージの1×10-2に達した後は、スクリーニングのそれ以上の回数を重ねなかった。2回目のスクリーニングのためのプールAは、TN6/6、TN7/4およびTN8/9の1回目のアウトプットの混合物である。2回目のためのプールBは、TN9/4、TN10/9およびTN12/1の1回目のアウトプットの混合物である。プールAおよびプールBについての2回目のスクリーニング後、インプットの回収率は1×10-2と同等またはそれより大であったので、それ以上の回数を重ねなかった。Substrate Phage Library #2およびPhDプールに関しては、3回目のスクリーニングが必要であった。
【０２２０】
スクリーニングの終わりに、それぞれのファージ分離株をランダムに選択して、ELISAによってBLySへの結合を調べた。同分離株をDNA配列解析に供し、展示されたペプチドのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を特定した。また、分離株は、CHO上清およびSf9上清（Human Genome Sciences, Incから提供された）の供給流中で組換えBLySと結合する能力についても調べた。
【０２２１】
各分離株は、標準ELISA法によってBLySとの結合について調べたが、この場合、結合ファージはモノクローナル抗ファージ抗体/HPRコンジュゲートを用いて検出した。TNライブラリープールAおよびプールBから分離されたファージの約90%が、ストレプトアビジン単独に対するバックグラウンド結合を超えて3×から12×までの範囲のBLySに対する結合シグナルを有していた。Substrate Phage Libraryからのファージ分離株は、同様であるがやや低い結合シグナルを示した。
【０２２２】
可能性のあるプロセス供給流において、BLyS標的を認識するBLyS結合性ポリペプチドの能力を評価するために、ファージの結合性を２つの供給流において測定した：BLySを加えたCHOおよびSf9上清。標準条件であるPBS＋TweenではなくCHO上清またはSf9上清のいずれかにおいて、ファージをBLySと結合させた。他のすべての洗浄ステップは標準ELISA条件と同様であった。PBS＋Tween、CHO上清、およびSf9上清におけるBLyS結合性ポリペプチドとBLySとの結合は、すべての条件下で極めて類似していた。いくつかの単離されたBLyS結合性ポリペプチドはCHO上清において最大50%の結合低下を示した。Sf9上清においてBLySと結合する単離されたBLyS結合性ポリペプチドは、標準条件下での結合と有意な差はなかった。PhDおよびSubstrate Phage Libraryで単離されたペプチドも、供給流において比較した。注目すべきことに、こうした単離ペプチドのいくつかは標準条件よりも供給流においてより高い結合を示した。
【０２２３】
展示されたペプチドのアミノ酸配列は、ファージ分離株のDNA挿入断片の配列決定から導かれた。ファージ分離株から得られた配列データはライブラリーごとにグループ分けし、類似性の程度によって分類された。BLyS結合性ファージ分離株のペプチドを下記の表１〜８に示す。これらのペプチドは、ファージディスプレイ融合／ペプチドをコードする遺伝子の様々な領域にわたるDNA配列の翻訳に相当する。
【０２２４】
【表１】
2012131816.tif 000003
【０２２５】
【表２】
2012131816.tif 000004
【０２２６】
【表３】
2012131816.tif 000005
【０２２７】
【表４】
2012131816.tif 000006
【０２２８】
【表５】
2012131816.tif 000007
【０２２９】
【表６】
2012131816.tif 000008
【０２３０】
【表７】
2012131816.tif 000009
【０２３１】
【表８】
2012131816.tif 000010
【０２３２】
いくつかの基準に基づいて、さらに特徴を明らかにするために少数のファージ分離株を選択したが、その基準とは、ELISAシグナルの強さ（すなわち、10分後にOD630≧0.8）、同一の配列が発見される回数、および反復配列モチーフの存在である。選択されたファージ分離株の特徴の一部を下記に示す。分離株に何回も見いだされる配列モチーフに下線を付している。
【０２３３】
2012131816.tif 000011
【０２３４】
BLyS結合性ポリペプチドをBLyS精製のための親和性リガンドとして利用できる、可能性のある溶出条件を見いだすために、様々な放出条件（下記参照）を調べた。放出研究のために、ストレプトアビジン上に固定化されたビオチン化BLySを含有するウェルに一定数のファージを加えた。ファージを結合させた後、それぞれのファージ分離株を次に、様々なバッファーを用いて5分間の洗浄を2回行うことによってウェルから「溶出」させた。ウェルを標準洗浄バッファーで洗浄し、結合したファージを標準的なファージELISAで検出した。溶出条件は、低いpHでの放出を基にして選択されたが、これはスクリーニング時に用いられた機序であり、さらに別の溶出条件が、BLyS産物が少なくとも数時間は安定であることが分かっている条件に基づいて選択された。様々な溶出条件は、PBS pH 7.0、クエン酸緩衝溶液pH 5.0、クエン酸緩衝溶液pH 3.0、クエン酸緩衝溶液pH 2.0、1M グアニジンpH 7.0、および1M尿素pH7.0とした。ファージ分離株の一部の結合は標準条件下（PBS pH 7.0）で減少した。これは、これらの実験がそれ以前のすべての実験で用いられた細菌の一晩培養上清ではなく濃縮されたファージ調製物で行われたために生じたのかもしれない。ファージの濃縮に使用されるポリエチレングリコールは、こうした分離株の結合を妨げると考えられている。このような放出研究のために選択されたファージ分離株の最初のシグナルは、OD630nmが0.5以上であった。全体として、結合しているファージを放出させるために1M尿素pH7.0が最適のバッファーであると思われた。
【０２３５】
実施例２：  BLyS結合性ポリペプチドのSepharose-4FFビーズへの固定化
上記の結果に基づいて、6種の展示ファージ配列を以後の研究のために選択した：
TN7-01-A08（配列番号27）、TN8-01-B07（配列番号31）、TN10-01-F05（配列番号78）、TN12-01-H05（配列番号89）、PhD-02-C04（配列番号128）、およびPhD-02-C12（配列番号110）。適当なBLyS親和性リガンドを開発するために、同定された展示ペプチドは、わずかな修飾を加えて、製造供給メーカーに注文して合成された：
ファージディスプレイ鋳型の多様性に富んだ領域に対応する配列の最初のアミノ酸に遊離アミンが残されるのを避けるために、リーダーの２つのアミノ酸をそれぞれの結合性ペプチドのN末端に付加した；N-末端をアセチル化して、ペプチドが当該位置を介してクロマトグラフィーマトリックスに固定化されるのを防止した；C末端リンカーを付加した（すなわち、-PGPEGGGK；配列番号13）；さらに、ペプチドに内在するすべてのリシンを次の基でブロックした：ivDde（すなわち、1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキサ-1-イリデン)-3-メチルブチル-L-リシン）。この基は、合成し終わったペプチドでは完全な状態であるが、固定化もしくはフルオレセイン標識化後には除去される。別の修飾として、内部にリシンを有するペプチドはまた、C-末端ヒドラジド官能基を付して合成したが、これは活性化アルデヒドクロマトグラフィー媒体に固定化可能である。
【０２３６】
ペプチドをリガンド濃度2μmol/mlとなるようにNHS-活性化Sepharose-4 Fast Flowアガロース媒体（Pharmacia）に固定化した。媒体上のペプチドの実際のリガンド濃度は0.76μmol/mlから1.98μmol/mlの範囲であったが、これは固定化されたペプチドのアミノ酸分析によって定量された。１つを除くすべてのペプチドが100mM KH2PO4／150mM NaCl／0.05% Tween 20、pH 7.5という水性条件で固定化された。溶解性の理由により、ペプチドDX217（下記表9を参照されたい）は、30%ジメチルホルムアミド(DMF)／100mM KH2PO4／150mM NaCl／0.05% Tween 20、pH 7.5中で固定化された。固定化反応は室温で2時間進行させ、次にpH 7.5バッファーで短時間洗浄した。さらにFast Flow Sepharose媒体を室温で一晩撹拌しておき、残存するNHSエステルを加水分解した後、媒体を洗浄して未結合ペプチドをすべて除去した。2%ヒドラジン／DMF溶液を用いてivDde-リシンを含有するリガンドを脱ブロックした。次に媒体を水性バッファーでさらに洗浄し、カラムに充填するまで4℃で保存した。表9は、合成ペプチドの配列および測定されたアガロ−ス媒体上のそれらの濃度を示す。
【０２３７】
【表９】
2012131816.tif 000012
【０２３８】
BLyS-リガンド親和性の定量（方法の概略）
合成ペプチドとBLyS（溶液中、遊離）との間の解離定数を蛍光異方性（FA）によって測定した。この実験では、フルオレセイン標識ペプチドの濃度を一定に保ち、BLySタンパク質濃度を変化させた。観察される異方性の変化を非線形回帰によって下記の方程式に当てはめて、見かけのKDを得た。
【０２３９】
2012131816.tif 000013
式において：
robs =観察された異方性、rfree =遊離ペプチドの異方性、rbound =結合ペプチドの異方性、KD =解離定数、BLyS =全BLyS濃度、およびP =全フルオレセイン標識ペプチド濃度。
【０２４０】
ウェル当たり10〜20μlの容量中に50nMフルオレセイン標識ペプチドおよび様々な濃度のBLySを含有する結合反応を、384ウェルマイクロプレートで行った。反応は、Tecan Polarion 蛍光偏光プレートリーダーを用いてアッセイした。100μM 非標識ペプチドの存在下および非存在下で、50nMフルオレセイン標識ペプチドおよび1〜2μM BLySを用いて、ペプチド間相互の競合に関する実験を行った。一次結合バッファー[15mMクエン酸ナトリウム、120mM NaCl、0.01% Tween 20]を用いてpH6.0で、さらに200mM 炭酸水素ナトリウム、125mM 塩化ナトリウムを用いてpH9.0で、KD測定値へのpHの影響を検討した。BLyS結合性ポリペプチドの解離定数を測定した他のバッファーには下記がある：[pH 6.0, 0.01% Tween]、[pH 6.0, 0.1%ゼラチン]、[pH 5.0, 0.01% Tween]、[pH 9.0, 0.1% Tween]、[pH 6.0, 15%エチレングリコール、0.01% Tween]、[pH 5.0, 15%エチレングリコール、0.01% Tween]、および[pH 9.0, 15%エチレングリコール、0.01% Tween]。６種のペプチドのすべて（DX212、DX214、DX216、DX217、DX219、およびDX221）がほぼ同等の親和性をもって溶液中のBLySに結合した（KD = 0.4〜3μM）。相互競合に関する実験は、すべてのペプチドが、BLyS結合性に対して互いに競合することを実証したが、これはすべてのペプチドがBLyS上の同一部位に結合することを示唆する。
【０２４１】
実施例３：  固定化されたBLyS結合性ポリペプチドのクロマトグラフィーによるスクリーニング
6種のアフィニティー媒体のクロマトグラフィー性能を評価するために逆相分析アッセイを用いた。
【０２４２】
6種のアフィニティー媒体（Sepharose-4 Fast Flowに結合しているBLyS結合性ポリペプチド）および対照カラム（加水分解NHS-Sepharose-4 Fast Flow）を3×50 mmガラス製Omnifitカラム（350μl）に充填した。すべてのカラムは、Watson/Marlow 101 ruペリスタル型ポンプを用いて、200μl/min（170cm/hr）で試験した。このような構成装置は、制約なしに、数多くの洗浄、タンパク質および溶出の条件を使用することを可能にした。検出は、Waters Millenniumワークステーションに接続したWaters 2487 UV/VIS検出器を用いて、214 nmおよび280 nmで行った。
【０２４３】
PBS/0.01%Tween 20, pH 7.2中30μｇ/mlの精製BLySを用いた初期スクリーニングでは、対照カラムの素通り画分で65%の回収率を示した（合計で1 ml, 30μg）。しかしながら、同様に実験した場合、すべてのカラムが溶液から定量的にBLySを結合したが、タンパク質を放出しないことが直ちに判明した。そこで、考えられうる多数の溶出条件で試験し、BLySの放出を214 nmおよび280 nmでモニターした。UV吸収に基づいてBLySの溶出が予想される画分を集め、確認のため逆相クロマトグラフィーで分析した。試験した条件を表10（下記）に示す。
【０２４４】
【表１０】
2012131816.tif 000014
【０２４５】
DX214、DX216、DX217、DX219、およびDX221アフィニティー媒体で作られたカラムは、pH 2のバッファー（30mM H3PO4/150mM NaCl, pH 2）の存在下でBLySを放出するにすぎない。これらのカラムからの回収率は30%から65%であった。これに対して、DX212アフィニティー媒体は、50%エチレングリコール、pH 4（50%エチレングリコール／100mM酢酸ナトリウム、pH 4）を用いた、または50%エチレングリコール、pH 5（50%エチレングリコール／100mM酢酸ナトリウム、pH 5）を用いた溶出で、良好な回収率でBLySを放出した。
【０２４６】
溶出条件がBLySを天然の三量体型に維持することに有効であるかどうかを判定するために、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いて、天然のBLyS、ならびにpH2および50%エチレングリコール／100 mM酢酸ナトリウム、pH 5の両方に曝したBLySをアッセイした。pH 2でのインキュベーション後のBLySのSEC分析から、２つの新ピークの存在が明らかになったが、これらのサイズは見かけ上の多量体および単量体型に相当し、天然型の三量体の証拠はなかった。50%エチレングリコール中でのインキュベーションの結果は、16%の多量体であったが、そのほかは三量体を維持した。50%エチレングリコール（pH 5.0）でDX212カラムから溶出された物質に関するその後のSECの結果は、多量体を示さなかった。
【０２４７】
実施例４：  細胞培養上清からのBLySの捕捉
細胞培養上清からBLySを精製するDX212、DX219、およびDX214アフィニティーカラムの能力を調べた。CHOおよびSf9細胞系由来の凍結融解細胞培養上清にBLySを約40μg/mlスパイクした。およそ100μgのBLyS（合計2.5 ml）を各カラムにローディングした。Sf9素通りサンプル中のBLySレベルは逆相HPLCアッセイで検出できなかった。溶出バッファー[50%エチレングリコール、100mM酢酸ナトリウム、pH 5.0]でBLySを溶出した。この実験から得られたBLySタンパク質の回収率は、29.4%から完全回収までの範囲であり、純度は76%から96.5%の間であった。
【０２４８】
実施例５：  他のBLyS結合性ペプチドの合成
ひとたび有望なBLyS結合性ポリペプチドが単離されたならば、１個または数個のアミノ酸残基を置換させ、付加し、あるいはポリペプチドから欠失することによって、そのペプチドの改良を行うことができる。アミノ酸置換は保存的または非保存的とすることができる。保存的アミノ酸置換には、例えば、芳香族残基（例えば、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）を相互に置換、疎水性残基（例えば、ロイシン、イソロイシンおよびバリン）を相互に置換、極性残基（例えばグルタミンおよびアスパラギン）を相互に置換、酸性残基（例えばアルギニン、リシンおよびヒスチジン）を相互に置換、および小残基（例えばアラニン、セリン、スレオニン、メチオニンおよびグリシン）を相互に置換することが挙げられる。さらに、非古典的アミノ酸、化学的アミノ酸類似体、または化学修飾した古典的アミノ酸を、置換または付加として本発明のBLyS結合性ポリペプチドに導入することができる。非古典的アミノ酸には、通常のアミノ酸のD-異性体、2,4-ジアミノ酪酸（Dbu）、4-アミノ酪酸（bAbu）、2-アミノ酪酸（Abu）、6-アミノヘキサン酸（イプシロン-Ahx）、2-アミノイソ酪酸（Aib）、3-アミノイソ酪酸（bAib）、3-アミノプロパン酸（bAla）、オルニチン（Orn）、ノルロイシン（Nle）、ノルバリン（Nva）、3-ヒドロキシプロリン（3Hyp）、4-ヒドロキシプロリン（4Hyp）、サルコシン（MeGly）、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えばβ-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸）、および一般にアミノ酸類似体があるが、それに限定されない。一例として、DX212の配列を基にして4つの修飾ペプチドを設計した：
1．Ac-AGK(Ac)EPCYFYWECAVSGPGPEGGGK（配列番号169）--内部リシン側鎖のアセチル化；
2．Ac-AGREPCYFYWECAVSGPGPEGGGK（配列番号170）--アルギニン置換；
3．Ac-AGQEPCYFYWECAVSGPGPEGGGK（配列番号171）--グルタミン置換；
4．Ac-AGNleEPCYFYWECAVSGPGPEGGGK（配列番号172）--ノルロイシン置換。
【０２４９】
実施例６：  BLyS結合性ポリペプチドの親和性成熟
高親和性のBLyS結合性ポリペプチドを同定するために、14残基のうち5カ所に一定のアミノ酸残基を有する14-mer直鎖状ペプチド鋳型配列を中心として、BLyS親和性成熟ライブラリー（BLyS Affinity Maturation Library: BAML）を設計した。不変の5残基のうち3残基は、拘束されたペプチドライブラリーおよび直鎖状ペプチドライブラリーの両方から単離された高度に保存されたDxLTテトラペプチドアミノ酸モチーフ（配列番号446）に相当する。この14-merの設計は、残りの9位置のそれぞれでアミノ酸の変更を可能としたが、これらの位置のそれぞれで特定のアミノ酸が優先して選択された。新たに単離されたペプチドのBLySに対する結合親和性の分析を、直接および間接ファージELISAならびに蛍光異方性によって評価した。
【０２５０】
BAMLは、1位（Ala）、5位（Asp）、7位（Leu）、8位（Thr）および10位（Leu）に確定された残基を有する14-mer直鎖状（拘束されない）鋳型ペプチド配列に基づいて設計された。BAML鋳型における3〜14位のアミノ酸配列は、PhD 12直鎖状ポリペプチドライブラリーから単離された結合性ポリペプチドに最もよく類似している（上記表7を参照されたい）。1位の残基（Alaに確定）および2位の残基（可変）は、BLyS結合性配列の長さおよび提示を延長するために含められた。5〜8位は拘束されたペプチドライブラリーおよび直鎖状ペプチドライブラリーの両方から単離されたペプチドに見いだされるDxLTモチーフに相当する（上記表1〜8を参照されたい）。疎水性アミノ酸（L, M, I, AおよびG）がもとの単離ペプチドの85%で10位に見いだされたので、単離ペプチドの42%に存在するLeu残基をBAML鋳型ペプチドのその位置に定めた。
【０２５１】
表11は14-mer  BAML鋳型配列の設計を示す。
【０２５２】
【表１１】
2012131816.tif 000015
【０２５３】
表11を参照すると、大文字は鋳型の1, 5, 7, 8,および10位の特定された残基を示す。小文字は、その位置に望ましいアミノ酸を示すが、14-merをコードする多様性に富んだDNA鋳型の設計は、これらの位置でいくつかの配列変化を可能にする。
【０２５４】
表12はBAMLペプチドを生成させるために用いられる多様性に富んだDNA鋳型の設計を示す。
【０２５５】
【表１２】
2012131816.tif 000016
【０２５６】
表12を参照すると、BAML 14-mer鋳型において確定されているアミノ酸に対するヌクレオチドコード配列は大文字で示す。多様性に富んだDNA鋳型における「e」、「j」、「q」および「z」の文字は、それぞれ、各位置に対するインプットdNTP中に存在するヌクレオシド塩基の特定の混合物を表す：
j = 79%グアニン、7%シトシン、7%アデニン、7%チミン
q = 7%グアニン、79%シトシン、7%アデニン、7%チミン
e = 7%グアニン、7%シトシン、79%アデニン、7%チミン
z = 7%グアニン、7%シトシン、7%アデニン、79%チミン
このDNA鋳型のコドンは、配列番号184に示す各位置で、コードされる変更可能なアミノ酸を望ましいアミノ酸に変えるように設計された（表11、小文字）。ファージ分離株を後で配列決定すると、どの特定位置でも、望ましい残基が44%から70%の頻度で存在することが分かった。
【０２５７】
DNA鋳型に適合する合成DNA配列を大規模PCRで増幅した。増幅されたDNAはM13ファージ発現ベクター（MANPベクター、Dyax Corp., Cambridge, MA）に挿入するために制限酵素で消化し、この挿入断片を有するベクターを用いてエレクトロポレーションによってM13ファージを形質転換し、BAMLを作製した。組換えファージを集め、PEG沈澱によって精製し、力価を測定した。BAMLにおいて1.6×109形質転換体から、全体で3.2×1013PFUが増幅された。
【０２５８】
BAMLのスクリーニング
表13に概略したように、元のBAMLライブラリーから始める２段階競合法を用いて、4回のスクリーニングを行い、最も親和性の高いBLyS結合性ポリペプチドをBAMLから単離した。スクリーニングの前に、増幅したBAMLをSeradynストレプトアビジン-コート磁気ビーズ（MG-SA, Seradyn, Indianapolis, IN）と接触させて、ビーズ結合性ファージおよびストレプトアビジン結合性ファージを除去した。
【０２５９】
BAMLをスクリーニングするために、ファージを、200μl PBS, pH 7.4, Tween-20(0.1%)中にビオチン化BLyS（b-BLyS）を含む溶液中でインキュベートし、ファージ／b-BLyS結合複合体を作製した。第1の競合ステップで、非標識BLyS（1〜2μM）を溶液中のファージ／b-BLyS結合複合体混合物に添加し、1〜20時間インキュベートした（表13参照）。非標識BLySとインキュベートした後に溶液中に残存するファージ／b-BLyS複合体を短時間（回転装置上で10分）のMG-SAストレプトアビジンビーズ（50μl）とのインキュベーションによって捕捉した。ストレプトアビジンビーズ上にファージ／b-BLyS複合体を捕捉した後、結合していない画分を除去し、ビーズを1ml PBS-Tween 20で15〜20回洗浄した後、第2の競合ステップを行った。1回目の競合ステップから得られたファージ／非標識BLyS複合体のみを集め、ビーズに捕捉されたファージ／b-BLyS複合体とともに２回目のスクリーニングのためのインプットファージ画分として用いたが、その後の各回のスクリーニングにおいては、さらなるスクリーニングのために第1競合ステップの後、ビーズに結合したファージのみを集め、ファージ／非標識BLyS複合体は廃棄した。
【０２６０】
第2競合ステップに関しては、競合ペプチドは上記の初期スクリーニングでPhD 12ライブラリーから単離されたBLyS結合性ポリペプチドに基づいたポリペプチド（DX221;配列番号168）とした。第1競合インキュベーションステップ後に集められた、ストレプトアビジンに結合しているファージ／b-BLyS複合体を、300μl PBS-Tween-20(0.1%)中の50μM DX221 BLyS結合性ポリペプチド（KD = 3μM）の溶液で連続的に希釈した。DX221とともにファージ／b-BLyS複合体の一連の短時間インキュベーション（１回のスクリーニング当たり3〜4、1時間）を行った後、一晩（O/N）（1、2および4回目）から3日間（3回目）の最後のインキュベーションを行った（表13）。4回目の第2競合ステップでは、DX221とのインキュベーションの前に67nM BLySとの1時間のインキュベーションを行った。4回目でDX221競合ステップ後に残存するストレプトアビジンビーズに結合したファージ／b-BLyS結合複合体をさらに分析するために集めた。
【０２６１】
【表１３】
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【０２６２】
ELISA分析
2、3および4回目の上記スクリーニングから得られた約400のBAML分離株を直接および間接ファージELISAアッセイによって分析した。
【０２６３】
間接ファージELISAについては、Immulon-2HBプレート（Dynex Technologies, Inc., Chantilly, VA）を、PBSで希釈した1μg/ml Immunopureストレプトアビジン（Pierce, Rockford, IL）100μlでコートした。連続10倍希釈したb-BLyS（0〜0.1μg/ml PBS溶液）100μlをストレプトアビジンでコートしたウェルに固定化した（37℃、1時間）。洗浄後、個々のファージプラークを感染させた大腸菌の1〜25μlの一晩培養物を適当なウェルに加え、1時間インキュベートし、続いてPBS-Tween-20で10回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗M13抗体（PBS-Tween-20中に1:10,000）をウェルに添加し（室温、30分）、呈色試薬TMBを使用して、プレートをOD630nmで読み取った。
【０２６４】
固定化されたBLySに結合している個々のファージ分離株は、配列を決定し、その配列を分析した。BAML BLyS結合性14-mer展示ペプチドのユニーク配列を表14に示す。
【０２６５】
ペプチドの分析は、１つのモチーフ：W3YDPLTKLWL12（配列番号436）（下付添え字は14-mer展示ペプチド配列におけるアミノ酸位置を示す）の前後に、有意な配列「崩壊」(collapse)を示す。この最も多数のコアモチーフは、元のBAML鋳型に由来する4つの確定された残基、すなわち5位のAsp(D)、7位のLeu(L)、8位のThr(T)、および10位のLeu(L)、を含む。さらに元のBAML鋳型配列に由来する6個の望ましい残基のうち5個がこのモチーフに含まれていた（表11参照）。
【０２６６】
4回目の分離株の73%(197のうち143)がこのコアモチーフ（配列番号436）を含んでいた。10-merコアモチーフ内の単一残基の置換が4位（Y→F）と12位（L→F、I、またはV）に集中し、12位の置換はLeuに代わる疎水性残基であった。
【０２６７】
残りの変更可能な３カ所の残基について（すなわち2、13および14）、選択はそれほど厳密なものではなかったが、ある程度の優先性は明らかで、ライブラリーに組み込まれているか、選択の回を重ねても存続しているかのいずれかである。例えば、4回目の分離株において、51%が2位にAsnを含み、77%が13位にProを含み、さらに32%が14位にAspを含んでいた。14位におけるVal(27%)またはGlu(19%)の存在は、BAMLの14位でのこれらの理論的な割合（それぞれ4%）と比較して、4回目の分離株ではもっとも高度に選択されたものに入る。
【０２６８】
表14の配列は、コア配列（配列番号436）からの相違の程度にしたがってグループ分けされている。
【０２６９】
【表１４】
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【０２７０】
BAML分離株のELISAシグナルのほとんどすべてが、初期スクリーニングで単離されたものより高かった（実施例1参照）。比較のために、ペプチド453-01-B07（配列番号31）（KD = 700nM）を参照（陽性対照）として用いた。陰性対照のMAEX（挿入断片を持たないM13ファージ）は、試験したいかなる濃度でも、b-BLySと結合しなかった。
【０２７１】
直接ファージELISAに関しては、測定されたシグナルは、規定数のファージが様々な濃度のb-BLySと結合する能力を反映する。直接ファージELISAアッセイによって試験したペプチドは、間接ファージELISAアッセイで測定されたBLySに対する高い親和性に基づいて選択された。このアッセイのために、Immulon-2HBプレートを0または1000ngの抗Fd抗体（Sigma, St Louis, MO）でコートした。洗浄（PBS-Tween-20）後、ファージ希釈液を添加して有効な抗体を飽和させ、1時間インキュベートして、洗浄し、次に100μlのb-BLyS 10倍希釈液（0〜1μg/ml）とともに室温で1時間インキュベートした。ストレプトアビジン-HRP（PBS-Tween-20中に1:1000；Endogen, Woburn, MA）をウェルに添加し、1時間インキュベートして、TMBで発色させ、OD 630nmで読み取った。
【０２７２】
蛍光異方性によるBAMLペプチドのKDの測定
配列解析によって同定された10-merコア構造モチーフもしくはそのモチーフの１カ所が変異した変異体を有するいくつかのペプチドを、短いGly-Gly-Lysリンカー配列を伴って合成し、そのC末端リシンをフルオレセインで標識した。これらのペプチドを下記の表15に示すが、これらは、BLySに関する解離定数を決定するために、固相合成法によって合成された。DX815およびDX876ポリペプチドはDX814（配列番号186）から2つのN末端アミノ酸の欠失、またはコアペプチド（３〜12位）のN末端およびC末端の2つのアミノ酸の欠失によって誘導された。DX816、DX817、DX819およびDX822は他のBAML単離物（それぞれ、配列番号189、309、353、327）に対応する。DX818は配列番号340の単離物に対応するが、ただし2位のMetがAsnに置換されている。いくつかのBLyS結合性BAMLペプチドのKDを蛍光異方性によって測定したが、これは前述のように行った。-GGKリンカーを持たないDX822の配列（配列番号327を参照）は、BAML鋳型配列（表11参照）に一致する。DX822に見いだされるBAMLコンセンサス配列は、初期スクリーニングで単離されたもっとも親和性の高い結合性ペプチドの１つ（453-01-B07、配列番号31）と比較して、結果的にBLySへの結合親和性を10倍以上高めた。
【０２７３】
【表１５】
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【０２７４】
BAML単離ペプチドの解析により、2位の配列保存（BAML鋳型では可変、表11参照）が失われたことが明らかになった。BAML配列における1位と2位のN末端残基がBLySとの結合に必要であるかどうかを調べるために、3〜14残基のみを含むDX814のトランケート型（DX815；表15参照）を合成し、蛍光異方性によって分析した。DX815に関するKDはDX814と区別がつかなかったので、1位と2位の残基はBLySに対する高親和性結合に必要でないことが示唆された。さらに最小コア（残基1〜10, DX876）までDX814をトランケートすると、KDは171nMに増加したが、これは14-merの13位のProおよび／または14位のAspが高親和性BLyS結合性に寄与することを示す。その位置でのDX816におけるValの置換はKDにほとんど影響しなかった（表15参照）。BLyS結合性ポリペプチドDX221（Ac-WTDSLTGLWFPDGGPGPEGGGK; KD = 3μM; 配列番号168）を、配列が最も近いBAMLペプチド（DX816、Ac-ANWYDPLTKLWFPDGGK; KD = 69nM; 配列番号443）と比較すると、4位（T→Y）、6位（S→P）、および9位（G→K）の3カ所で相違が見られたが、このことはこれらの残基が結合親和性に寄与することを示す。
【０２７５】
合成されたBAMLペプチドは、一次分離株由来のペプチド（実施例1参照）よりも2桁低い、ナノモル値域のKD値を示した。フェニルアラニン置換（F4→Y4；F12→L12；表17）は、もっとも多く見られるコア配列のマイナーな変異であるが、こうした変化は合成ペプチドの解離定数に有意な影響を与えることはできなかった。しかしながら、11位の変化（W11→S11；DX818）は、結果として、親和性がDX814と比べて約10倍低下した。
【０２７６】
上の記述を受けて、あらゆる溶液中または溶液からのBLySもしくはBLyS様ポリペプチド（BLyS標的タンパク質）の検出または分離を可能にするアフィニティー結合性ポリペプチドにとって重要な特徴を正しく認識することができる。ある特定の溶液または供給流に適合した、本発明の結合性ポリペプチドに関する追加の実施形態および別法が、先の記述を研究することによって明らかとなるであろう。例えば、上記で検討されたBLyS結合性ポリペプチドと結合しているスペーサーまたはリンカーはどれも、本発明のさらなるBLyS結合性ポリペプチドを生成するために、除去または置換することが可能である。また、in vivo治療への応用に適した、非常に親和性の高いポリペプチドBLyS標的結合物質は、例えば、BAMLから単離されたペプチドの中から選択することにより、類似のポリペプチドを同様に厳密な条件下でBAMLもしくは他のペプチドライブラリーから選択することにより、または、上記のポリペプチド結合分子（例えば、BLyS結合性に寄与する重要な構造モチーフを有するもの）を設計することにより、調製することができる。このような実施形態および明白な別法はいずれも、上記の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲に含めるものとする。
【０２７７】
前記の文献はすべて、その全体を参考として本明細書に組み入れるものとする。
【配列表】
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