(57)【要約】【課題】これまでＴＡＣＢＵＮを測定すること等により間接的に行われてきた透析膜の評価・判定を、尿毒症物質、酸化ストレス惹起物質、染色体優性多発性嚢胞腎において蓄積する物質を含む腎不全物質の検出、定量によって行うための方法を提供することにある。【解決手段】血液透析後に、被検血液試料中に存在するカチオン性物質（１−メチルアデノシン、オフタルミン酸、クレアチニン、３−メチルヒスチジン、アラントイン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒドロキシプロリン、シトルリン、メチオニンスルホキシド、非対称性ジメチルアルギニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、グアニジノコハク酸等）及びアニオン性物質（システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸、マロン酸、シトラコン酸、クエン酸、シス−アコニット酸、イソクエン酸、３−インドキシル硫酸、トランス−アコニット酸、イセチオネート、ピメリン酸、馬尿酸等）からなる腎不全物質を検出又は定量することによって透析膜を評価する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液透析後に、被検血液試料中に存在する以下のカチオン性物質及びアニオン性物質からなる群から選ばれる１種又は２種以上の腎不全物質を検出又は定量する工程、及び血液透析後の腎不全物質の検出結果又は定量結果に基づき透析膜の腎不全物質除去能を評価する工程を有することを特徴とする透析膜の評価方法。
（カチオン性物質）：クレアチニン、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、グアニジノコハク酸、シトルリン、１−メチルアデノシン、Ｎ−アセチルグルコサミン、γ−ブチロベタイン、オフタルミン酸、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、アラントイン、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ−ε−アセチルリジン、キヌレニン、シトシン、インドール−３−酢酸、ヒポタウリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、７−メチルグアニン、メチオニンスルホキシド、アスパラギン
（アニオン性物質）：イセチオネート、グルコン酸、トランス−アコニット酸、ピメリン酸、３−インドキシル硫酸、イソクエン酸、Ｎ−アセチル−β−アラニン、Ｎ−アセチルグルタミン酸、セバシン酸、４−オキソペンタン酸、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸、アジピン酸、シトラリンゴ酸、２−イソプロピルリンゴ酸、トレオン酸、馬尿酸、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸、オキサミン酸、グルタル酸、アゼライン酸、フタル酸、クエン酸、マロン酸、シトラコン酸、キナ酸、コハク酸、システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸
【請求項２】
血液透析後の腎不全物質の検出結果又は定量結果を、前記腎不全物質の血液透析前の検出結果又は定量結果と比較する工程をさらに有することを特徴とする請求項１記載の透析膜の評価方法。
【請求項３】
血液透析後の腎不全物質の検出結果又は定量結果を、正常被検体の血液試料中に存在する前記腎不全物質の検出結果又は定量結果と比較する工程をさらに有することを特徴とする請求項１記載の透析膜の評価方法。
【請求項４】
血液透析後の腎不全物質の検出結果又は定量結果を、慢性腎臓病（ＣＫＤ）の各ステージの非透析患者の血液試料中に存在する前記腎不全物質の検出結果又は定量結果と比較する工程をさらに有することを特徴とする請求項１記載の透析膜の評価方法。
【請求項５】
腎不全物質が、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質からなる群から選ばれる１種又は２種以上の尿毒症物質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の透析膜の評価方法。
（カチオン性物質）：１−メチルアデノシン、インドール−３−酢酸
（アニオン性物質）：システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸、マロン酸、シトラコン酸、３−インドキシル硫酸
【請求項６】
腎不全物質が、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質からなる群から選ばれる１種又は２種以上の酸化ストレス惹起物質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の透析膜の評価方法。
（カチオン性物質）：１−メチルアデノシン、オフタルミン酸、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）
（アニオン性物質）：３−インドキシル硫酸、トランス−アコニット酸、シス−アコニット酸
【請求項７】
腎不全物質が、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質からなる群から選ばれる１種又は２種以上の染色体優性多発性嚢胞腎において蓄積する物質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の透析膜の評価方法。
（カチオン性物質）：クレアチニン、３−メチルヒスチジン、アラントイン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒドロキシプロリン、シトルリン、メチオニンスルホキシド、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、グアニジノコハク酸
（アニオン性物質）：クエン酸、シス−アコニット酸、イソクエン酸、３−インドキシル硫酸、トランス−アコニット酸、イセチオネート、ピメリン酸、馬尿酸
【請求項８】
腎不全物質が、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質からなる群から選ばれる１種又は２種以上の透析難除去性物質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の透析膜の評価方法。
（カチオン性物質）：非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、インドール−３−酢酸
（アニオン性物質）：ピメリン酸、アジピン酸、馬尿酸、グルタル酸、アゼライン酸、フタル酸、マロン酸
【請求項９】
腎不全物質の検出又は定量が、キャピラリー電気泳動質量分析法で行われることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の透析膜の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、透析膜の評価方法、より詳しくは、腎不全物質の透析前後の挙動を解析することによる透析膜の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎不全患者等の腎疾患を有する患者、特に腎透析を受ける患者の数は年々増加の一途を辿り、現在２０万人の患者が維持透析療法を行っており、さらに毎年３万人以上が新たに透析導入に至っている。透析療法には、一人あたり年間約５００万円の費用がかかるため、２０万人に対して約１兆円の医療費が恒常的に必要となっている。また、近年、慢性腎臓病（Chronic Kidney Disease：ＣＫＤ）という疾患概念が提唱され、その予防・治療の重要性に対する認識が高まりを見せている。ＣＫＤはCommon Diseaseであり、糸球体濾過量（ＧＦＲ）６０未満の対象者が１９２６万人にも上ることから、ＣＫＤ対策が急務の課題となっている。以上のような状況下において、腎不全やＣＫＤ等の腎疾患の症状の予防法や、そのような症状を緩和し、透析導入を遅らせる治療法が開発されれば、患者のＱＯＬ（クオリティオブライフ）に資するだけでなく、医療費の大幅な削減が可能となり社会に大きく貢献することができる。
【０００３】
腎不全に罹患すると、健常の場合では腎臓より排泄される様々な物質が体内に蓄積する。これらの物質は、腎不全の病態を診断するマーカー物質として利用されることもある。例えば、尿中に排泄されるアルブミン等の腎疾患マーカータンパク質の増加を指標として腎疾患の検出・診断する方法等が一般的に用いられている。その他の方法として、例えば、腎疾患患者の血液中でヒトリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の濃度が上昇することを利用した腎疾患の検出方法（特許文献１参照）や、腎不全等の患者の血液中や尿中でＥＮＤＯ１８０受容体ポリペプチドの濃度が上昇することを利用した腎症の診断方法（特許文献２参照）が知られている。また、本発明者らは、キャピラリー電気泳動質量分析計（capillary electrophoresis mass spectrometry：ＣＥ−ＭＳ）を用いて腎機能低下時に蓄積し毒性を示す新規代謝性物質を網羅的に解析し、該物質を腎疾患マーカー物質として用いた腎疾患の判定方法を提唱している（特許文献３参照）。
【０００４】
以上の通り、腎疾患の早期判定方法の開発は進んでいるものの、腎不全が進行した患者にとって、尿毒症を防止するための方法は人工透析のみである。透析評価に用いられてきた指標の代表的なものは、ＴＡＣＢＵＮである。これは、血液中の尿素を血中尿素窒素（ＢＵＮ）として測定し、１週間の透析中および非透析時のＢＵＮを時間的に平均した値であり、この値が６５ｍｇ／ｄｌ以下であれば透析が順調に行われていると考えられている。しかし、尿素は尿毒症物質ではないため、透析による尿毒症防止を直接的に評価する指標にはなり得ない。実際、人工透析を長期間にわたり行うことにより、尿毒症物質が徐々に蓄積されていき、動脈硬化、貧血、心不全、骨病変、アミロイドーシス等の合併症が顕れる。しかしながら、人工透析によって腎不全物質がどのように挙動するかは、これまで調べられておらず、長期透析患者における合併症発症のメカニズムや、透析膜の種類ごとの腎不全物質除去能には不明な点が多かった。
【０００５】
なお、ＣＥ−ＭＳとは近年開発された、少量のサンプルから５００種類以上の物質を同時測定できる新たなシステムである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−１４６９８０号公報
【特許文献２】特表２００７−５１９３９４号公報
【特許文献３】特願２００９−２０５０３３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、これまでＴＡＣＢＵＮを測定すること等により間接的に行われてきた透析膜の評価を、尿毒症物質、酸化ストレス惹起物質、染色体優性多発性嚢胞腎において蓄積する物質を含む腎不全物質の検出、定量によって行うための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、High performance biocompatible dialyzerを用い、４時間／回、週３回の標準的な血液透析を行っている慢性維持透析患者１１名の透析前後の血清に対し、ＣＥ−ＭＳにてメタボローム解析を行った。その結果、本発明者らがすでに報告した腎機能低下に伴い蓄積する腎不全物質に対し、透析前後の血清中濃度（μＭ）をもとに血液透析による除去率を算出した。さらに、本発明者らは、腎不全物質に含まれる尿毒症物質、酸化ストレス惹起物質、及び、染色体優性多発性嚢胞腎において蓄積する腎不全物質を同定し、それらの透析前後における挙動を解明した。さらに、本発明者らは、腎不全物質量をＣＫＤの各ステージの非透析患者と比較することにより、腎不全物質の量がどのＣＫＤステージに相当するかを評価した。その結果本発明者らは、予想に反して腎不全物質の中には従来の透析膜では十分に除去できないものが含まれていることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は（１）血液透析後に、被検血液試料中に存在する以下のカチオン性物質及びアニオン性物質からなる群から選ばれる１種又は２種以上の腎不全物質を検出又は定量する工程、及び血液透析後の腎不全物質の検出結果又は定量結果に基づき透析膜の腎不全物質除去能を評価する工程を有することを特徴とする透析膜の評価方法に関する。
（カチオン性物質）：クレアチニン、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、グアニジノコハク酸、シトルリン、１−メチルアデノシン、Ｎ−アセチルグルコサミン、γ−ブチロベタイン、オフタルミン酸、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、アラントイン、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ−ε−アセチルリジン、キヌレニン、シトシン、インドール−３−酢酸、ヒポタウリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、７−メチルグアニン、メチオニンスルホキシド、アスパラギン
（アニオン性物質）：イセチオネート、グルコン酸、トランス−アコニット酸、ピメリン酸、３−インドキシル硫酸、イソクエン酸、Ｎ−アセチル−β−アラニン、Ｎ−アセチルグルタミン酸、セバシン酸、４−オキソペンタン酸、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸、アジピン酸、シトラリンゴ酸、２−イソプロピルリンゴ酸、トレオン酸、馬尿酸、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸、オキサミン酸、グルタル酸、アゼライン酸、フタル酸、クエン酸、マロン酸、シトラコン酸、キナ酸、コハク酸、システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸
【００１０】
また、本発明は、（２）血液透析後の腎不全物質の検出結果又は定量結果を、前記腎不全物質の血液透析前の検出結果又は定量結果と比較する工程をさらに有することを特徴とする上記（１）に記載の透析膜の評価方法や、（３）血液透析後の腎不全物質の検出結果又は定量結果を、正常被検体の血液試料中に存在する前記腎不全物質の検出結果又は定量結果と比較する工程をさらに有することを特徴とする上記（１）記載の透析膜の評価方法や、（４）血液透析後の腎不全物質の検出結果又は定量結果を、慢性腎臓病（ＣＫＤ）の各ステージの非透析患者の血液試料中に存在する前記腎不全物質の検出結果又は定量結果と比較する工程をさらに有することを特徴とする上記（１）記載の透析膜の評価方法に関する。
【００１１】
さらに、本発明は、（５）腎不全物質が、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質からなる群から選ばれる１種又は２種以上の尿毒症物質であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の透析膜の評価方法に関する。
（カチオン性物質）：１−メチルアデノシン、インドール−３−酢酸
（アニオン性物質）：システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸、マロン酸、シトラコン酸、３−インドキシル硫酸
【００１２】
また、本発明は、（６）腎不全物質が、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質からなる群から選ばれる１種又は２種以上の酸化ストレス惹起物質であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の透析膜の評価方法に関する。
（カチオン性物質）：１−メチルアデノシン、オフタルミン酸、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）
（アニオン性物質）：３−インドキシル硫酸、トランス−アコニット酸、シス−アコニット酸
【００１３】
さらに、本発明は、（７）腎不全物質が、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質からなる群から選ばれる１種又は２種以上の染色体優性多発性嚢胞腎において蓄積する物質であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の透析膜の評価方法に関する。
（カチオン性物質）：クレアチニン、３−メチルヒスチジン、アラントイン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒドロキシプロリン、シトルリン、メチオニンスルホキシド、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、グアニジノコハク酸
（アニオン性物質）：クエン酸、シス−アコニット酸、イソクエン酸、３−インドキシル硫酸、トランス−アコニット酸、イセチオネート、ピメリン酸、馬尿酸
【００１４】
また、本発明は、（８）腎不全物質が、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質からなる群から選ばれる１種又は２種以上の透析難除去性物質であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の透析膜の評価方法に関する。
（カチオン性物質）：非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、インドール−３−酢酸
（アニオン性物質）：ピメリン酸、アジピン酸、馬尿酸、グルタル酸、アゼライン酸、フタル酸、マロン酸
【００１５】
さらに、本発明は、（９）腎不全物質の検出又は定量が、キャピラリー電気泳動質量分析法で行われることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載の透析膜の評価方法に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の透析膜の評価方法によると、透析前後における腎不全物質の挙動と性質を介した透析膜の評価が可能となり、これまでは直接的には尿毒症に関与しない物質に基づき透析膜の性能評価を行っていたのに対し、尿毒症物質、酸化ストレス惹起物質、染色体優性多発性嚢胞腎発症において蓄積する物質、及び透析難除去性物質等の腎不全物質の挙動に基づき透析膜の性能評価ができる。本発明の透析膜の評価方法は、透析膜における腎不全物質除去能の判定や、優れた透析膜のスクリーニングに適用することができ、その結果、より尿毒症発症を低減させることのできる高性能の透析膜を開発することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＡＤＭＡに関して、透析患者の仮想ｅＧＦＰ値算出のための換算式を示す図である。
【図２】γ−ブチロベタインに関して、透析患者の仮想ｅＧＦＰ値算出のための換算式を示す図である。
【図３】細胞毒性試験の結果を示す図である。
【図４】ＲＯＳアッセイの結果を示す図である。アスタリスクはコントロールに対するＰ＜０．０５の有意差を示す。
【図５】ＲＯＳアッセイの結果を示す図である。アスタリスクはコントロールに対するＰ＜０．０５の有意差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の透析膜の評価方法としては、血液透析後に、被検血液試料中に存在する以下のカチオン性物質及びアニオン性物質からなる群から選ばれる１種又は２種以上の腎不全物質を検出又は定量する工程、及び血液透析後の腎不全物質の検出結果又は定量結果に基づき透析膜の腎不全物質除去能を評価する工程を有する方法であれば特に制限されない。
（カチオン性物質）：クレアチニン、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、グアニジノコハク酸、シトルリン、１−メチルアデノシン、Ｎ−アセチルグルコサミン、γ−ブチロベタイン、オフタルミン酸、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、アラントイン、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ−ε−アセチルリジン、キヌレニン、シトシン、インドール−３−酢酸、ヒポタウリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、７−メチルグアニン、メチオニンスルホキシド、アスパラギン
（アニオン性物質）：イセチオネート、グルコン酸、トランス−アコニット酸、ピメリン酸、３−インドキシル硫酸、イソクエン酸、Ｎ−アセチル−β−アラニン、Ｎ−アセチルグルタミン酸、セバシン酸、４−オキソペンタン酸、シス−アコニット酸、ホモバニリン酸、アジピン酸、シトラリンゴ酸、２−イソプロピルリンゴ酸、トレオン酸、馬尿酸、Ｎ−アセチルアスパラギン酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシマンデル酸、オキサミン酸、グルタル酸、アゼライン酸、フタル酸、クエン酸、マロン酸、シトラコン酸、キナ酸、コハク酸、システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸
【００１９】
さらに、血液透析後の被検血液試料中に存在する腎不全物質の検出結果又は定量結果を、血液透析前の被検血液試料中に存在する腎不全物質の検出結果又は定量結果と比較することにより、透析によりどの程度腎不全物質が除去できるかを評価する工程を有することが好ましい。血液透析前の被検血液試料中に存在する腎不全物質量は患者ごとに異なるが、この工程により患者ごとの個人差を補正しうる腎不全物質の除去率に基づき、透析膜の評価を行うことが可能になる。
【００２０】
また、血液透析後の被検血液試料中に存在する腎不全物質の検出結果又は定量結果を、正常被検体の血液試料中に存在する腎不全物質の検出結果又は定量結果と比較する工程を含んでもよい。この工程により、透析後の腎不全物質量を、より健常者の血中腎不全物質量に近づけることのできる透析膜と評価することができる。
【００２１】
また、血液透析後の腎不全物質の検出結果又は定量結果を、慢性腎臓病（ＣＫＤ）の各ステージの非透析患者の血液試料中に存在する前記腎不全物質の検出結果又は定量結果と比較する工程を含んでもよい。ＣＫＤの各ステージは、糸球体濾過量（ＧＦＲ）又は推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）によって定義されるＣＫＤ診療のための指標であり、ステージ１［ＧＦＲ（ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）≧９０］：腎障害は存在するが、ＧＦＲは正常又は亢進；ステージ２［ＧＦＲ（ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）６０〜８９］：腎障害が存在し、ＧＦＲ軽度低下；ステージ３［ＧＦＲ（ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）３０〜５９］：腎障害が存在し、ＧＦＲ中等度低下；ステージ４［ＧＦＲ（ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）１５〜２９］：腎障害が存在し、ＧＦＲ高度低下；ステージ５［ＧＦＲ（ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）＜１５］：腎不全・透析期；の５ステージに分類される。
【００２２】
本発明者らは、４１名の非透析ＣＫＤ患者のＣＥ−ＭＳ解析により、各ステージの非透析ＣＫＤ患者について腎不全物質の血清中濃度を定量した（Hypertens Res in press）。非透析ＣＫＤ患者の腎不全物質の血清中濃度とｅＧＦＲから求められた、腎不全物質血清中濃度とｅＧＦＲとの換算式を用いて、血液透析後の各腎不全物質の血清中濃度が非透析患者ではどの程度のｅＧＦＲに相当するかを算出できる。さらに、得られた仮想のｅＧＦＲをもとに、腎不全物質濃度をＣＫＤステージに分類することができる。この工程を含むことより、透析膜を段階的に評価・判定することができる。
【００２３】
本発明において指標とされる前述の尿毒症物質は、公知の細胞毒性試験において細胞毒性が認められ、細胞毒性試験として具体的にはヒト胃癌（renal cell adenocarcinoma）由来ＡＣＨＮ細胞に腎不全物質が入った培地を添加し、生細胞数測定試薬 Cell Count Reagent SF試薬（ナカライテスク（株）製）を用いて５０％半数致死量（ＬＣ５０）を算出する方法を好適に例示することができる。尿毒症物質のＬＣ５０は、例えば１０ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは３．５ｍＭ以下である。尿毒症物質として、具体的には公知の尿毒症物質である３−インドキシル硫酸以下のＬＣ５０値（３．０５ｍＭ以下）を示す以下のカチオン性物質及びアニオン性物質を好適に例示することができる。
（カチオン性物質）：１−メチルアデノシン、インドール−３−酢酸
（アニオン性物質）：システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸、マロン酸、シトラコン酸、３−インドキシル硫酸
【００２４】
本発明において指標とされる酸化ストレス惹起物質は、公知の酸化ストレスアッセイにおいて酸化ストレス惹起活性が認められ、酸化ストレスアッセイとして具体的にはOxiSelectTM ROS Assay Kit（Cell Biolab社製）を用いる方法を例示することができる。また、酸化ストレス惹起物質としては、１０ｍＭ以下、好ましくは３ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下、さらに好ましくは０．３ｍＭの濃度で酸化ストレスを惹起する物質を好適に例示することができ、具体的には以下のカチオン性物質及びアニオン性物質を特に好適に例示することができる。
（カチオン性物質）：１−メチルアデノシン、オフタルミン酸、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）
（アニオン性物質）：３−インドキシル硫酸、トランス−アコニット酸、シス−アコニット酸
【００２５】
本発明において指標とされる染色体優性多発性嚢胞腎において蓄積する物質は、染色体優性多発性嚢胞腎に罹患したヒト又は非ヒト動物において蓄積する物質で、染色体優性多発性嚢胞腎に罹患した非ヒト動物として染色体優性多発性嚢胞腎モデルラットであるＨａｎ：ＳＰＲＤ  Ｃｙ／＋ラットを例示することができる。染色体優性多発性嚢胞腎において蓄積する腎不全物質としては、具体的には以下のカチオン性物質及びアニオン性物質を特に好適に例示することができる。
（カチオン性物質）：クレアチニン、３−メチルヒスチジン、アラントイン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒドロキシプロリン、シトルリン、メチオニンスルホキシド、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、グアニジノコハク酸
（アニオン性物質）：クエン酸、シス−アコニット酸、イソクエン酸、３−インドキシル硫酸、トランス−アコニット酸、イセチオネート、ピメリン酸、馬尿酸
【００２６】
本発明者において指標とされる透析難除去性物質は、公知のHigh Performance Biocompatible Dialyzer等の透析膜において除去されにくい物質で、具体的には以下のカチオン性物質及びアニオン性物質を例示することができる。
（カチオン性物質）：非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、インドール−３−酢酸
（アニオン性物質）：ピメリン酸、アジピン酸、馬尿酸、グルタル酸、アゼライン酸、フタル酸、マロン酸
【００２７】
また、上記の被検血液試料としては、被検者（被検血液試料の提供者）の血液に由来する試料である限り特に制限されず、血液試料そのものであってもよいし、その血液試料から得られた血清試料や血漿試料であってもよいが、検出や定量のより高い精度を得る観点から、血漿試料を好適に例示することができる。
【００２８】
上記の本件腎疾患マーカー物質の検出又は定量方法としては、本件腎疾患マーカー物質を検出又は定量し得る限り、物理化学的方法であっても生物学的方法であってもよいが、検出感度の点で物理化学的方法を好適に例示することができ、中でも、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）やキャピラリー電気泳動質量分析計（ＣＥ−ＭＳ）等の質量分析計（ＭＳ）を用いた方法をより好適に例示することができ、少量のサンプルから数百種類以上の物質を同時測定できることから、ＣＥ−ＭＳを用いた方法を特に好適に例示することができる。
【００２９】
以下実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により制限されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
透析患者の解析
High Performance Biocompatible Dialyserを用い、４時間／回、週３回の標準的な血液透析を行っている慢性維持透析患者１１名の透析前後の血清に対しＣＥ−ＭＳにてメタボローム解析を行った。患者の背景を表１に示す。なお、使用したHigh Performance Biocompatible Dialyserは、ＡＰＳ−１５ＳＡ（旭化成クラレメディカル社製：患者１、６、９、１１）、ＶＰＳ−１５ＨＡ（旭化成クラレメディカル社製：患者２、３、４）、ＡＰＳ−１８ＳＡ（旭化成クラレメディカル社製：患者５、７、８）、ＦＤＸ−１５０ＧＷ（日機装社製：患者１０）である。
【００３１】
【表１】
2012112785.tif 000002
【００３２】
患者から血漿サンプルを採取し、内標準物質を調整したメタノール溶液を添加して撹拌し、さらにクロロホルムを加えて撹拌し、４６００ｇで５分間遠心分離した後、上清を限外ろ過フィルター（分画分子量５０００）にとり、４℃、９１００ｇで２時間遠心分離した後、ろ液を遠心濃縮してＣＥ−ＴＯＦＭＳにて測定を行った。その際、３１２種類の陽イオンと１９３種類の陰イオンを網羅的に同時測定した。その結果から、腎不全物質を定量した（表２、表３）。
【００３３】
【表２】
2012112785.tif 000003
【００３４】
【表３】
2012112785.tif 000004
【００３５】
１．除去率
本発明者らがすでに報告した腎機能低下に伴い蓄積する腎不全物質（Hypertens Res in press）のうち４８物質（カチオン性物質２１、アニオン性物質２７）に対し、透析前後の血清中濃度（μＭ）をもとに血液透析による除去率を算出した。除去率は（透析前濃度−透析後濃度）／透析前濃度×１００（％）で算出した。また透析により除去が有意に行われているかをPaired-t testで検定した。
【００３６】
２．血清中濃度の非透析ＣＫＤ患者との比較
本発明者らは、４１名の非透析ＣＫＤ患者のＣＥ−ＭＳ解析により、各ステージの非透析ＣＫＤ患者について腎不全物質の血清中濃度を定量した（Hypertens Res in press）。その結果得られた非透析ＣＫＤ患者における腎不全物質の血清中濃度とｅＧＦＲの散布図から求められた近似式を用い、患者を非透析患者と仮定したときに、腎不全物質ごとに血清中濃度からｅＧＦＲ値を算出した（すなわち近似式のｙに血清中濃度の値を代入し方程式を解きｘを求めた）。さらに得られた仮想のｅＧＦＲをもとにＣＫＤステージ分類を示した。以下にＡＤＭＡ及びγ−ブチロベタインを例として示す。
【００３７】
例１）ＡＤＭＡ
透析前は平均２．８μＭ、透析後は平均１．５μＭとなっている（表２）。換算式（図１）ではｅＧＦＲを０としてもＡＤＭＡ濃度は０．６９５７μＭとなり、透析前後の濃度はいずれもｅＧＦＲ換算でマイナスの値となる。これは、透析患者におけるＡＤＭＡ濃度が、非透析ＣＫＤ患者でｅＧＦＲが０になったと仮定した場合よりも高値であることを意味する。このように血清中濃度が非透析ＣＫＤ患者でのｅＧＦＲ＝０換算値よりも高い場合、ＣＫＤステージは便宜上Ｈｉｇｈと示した。逆に、透析患者における腎不全物質濃度が非透析ＣＫＤ患者で想定される値より低い場合、ＣＫＤステージ分類では便宜上Ｌｏｗと示した。
【００３８】
例２）γ−ブチロベタイン
透析前は平均４．９μＭ、透析後は平均１．９μＭとなっている（表２）。換算式（図２）より透析前後の血清中濃度のｅＧＦＲ換算は−６６．４→４０．４、ＣＫＤステージはＨｉｇｈ→３となる。
【００３９】
解析の結果、透析前後に関わらず常に非透析ＣＫＤ患者より高値である透析難除去性物質（透析前後に関わらずＣＫＤステージがＨｉｇｈ）である以下のカチオン性物質及びアニオン性物質が同定された。
（カチオン性物質）：非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、インドール−３−酢酸
（アニオン性物質）：ピメリン酸、アジピン酸、馬尿酸、グルタル酸、アゼライン酸、フタル酸、マロン酸
【実施例２】
【００４０】
細胞毒性試験
細胞毒性試験を、ヒト胃癌（renal cell adenocarcinoma）由来ＡＣＨＮ細胞を用いて行った。対数増殖期にある細胞を５０００細胞／ウェルの濃度になるように計数し、９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μＬずつ播き、炭酸ガスインキュベーター内で２４時間前培養した。その後、腎不全物質を各ウェルに目的の濃度になるように添加し、炭酸ガスインキュベーター内で４８時間培養した後の生細胞数を計数した。生細胞数の計数は、生細胞数測定試薬 Cell Count Reagent SF試薬（ナカライテスク（株）製）を各ウェルに１０μＬずつ添加し、炭酸ガスインキュベーター内で１−４時間呈色反応を行い、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍ（参照波長６００ｎｍ以上）の吸光度を測定することで行った。各腎不全物質に関して５０％半数致死量（ＬＣ５０）を算出した結果を図３に示す。
【００４１】
細胞毒性試験の結果、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質が、公知の尿毒症物質である３−インドキシル硫酸以下のＬＣ５０値（３．０５ｍＭ以下）を示した。
（カチオン性物質）：１−メチルアデノシン、インドール−３−酢酸
（アニオン性物質）：システイン−Ｓ−硫酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸、マロン酸、シトラコン酸、３−インドキシル硫酸
【実施例３】
【００４２】
活性酸素種（ＲＯＳ）アッセイ
酸化ストレス惹起物質を同定するため、ＲＯＳアッセイを行った。ＲＯＳアッセイは、OxiSelectTM ROS Assay Kit（Cell Biolab社製）を用いて行った。１×１０４ｋ個のヒト腎癌由来ＡＣＨＮ細胞を９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに播き、炭酸ガスインキュベーター内で２４時間前培養した。翌日細胞をダルベッコＰＢＳで３回洗浄した後１ｍＭの２’，７’−Dichlorodihydrofluorescin diacetate（ＤＣＦＨ−ＤＡ）で１時間前処理を行った。さらにダルベッコＰＢＳで３回洗浄し、ＤＣＦＨ−ＤＡで負荷した細胞を各腎不全物質が入った培地で１時間培養した。１時間後、マイクロプレートリーダーを用い、励起波長４８０ｎｍ、放射［発光］波長５３０ｎｍの蛍光を測定した（図４、図５）。その結果、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質が、コントロールと比較して有意に蛍光強度が高かった。
（カチオン性物質）：１−メチルアデノシン、オフタルミン酸、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）
（アニオン性物質）：３−インドキシル硫酸、トランス−アコニット酸、シス−アコニット酸
【実施例４】
【００４３】
染色体優性多発性嚢胞腎において蓄積する腎不全物質の同定
１４週齢の野生型ラット（ｎ＝５）、及び、藤田保健衛生大学から入手した１４週齢の染色体優性多発性嚢胞腎モデルラット（Ｈａｎ：ＳＰＲＤ  Ｃｙ／＋ラット、ｎ＝５）から血漿サンプルを採取し、内標準物質を調整したメタノール溶液を添加して撹拌し、さらにクロロホルムを加えて撹拌し、４６００ｇで５分間遠心分離した後、上清を限外ろ過フィルター（分画分子量５０００）にとり、４℃、９１００ｇで２時間遠心分離した後、ろ液を遠心濃縮してＣＥ−ＴＯＦＭＳにて測定を行った。その際、６９種類の陽イオンと５９種類の陰イオンを網羅的に同時測定し、Ｃｙ／＋ラットにおいて野生型ラットと比較して有意に（Ｐ＜０．０５）蓄積する腎不全物質を同定した（表４）。
【００４４】
【表４】
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【００４５】
その結果、以下のカチオン性物質及びアニオン性物質が、染色体優性多発性嚢胞腎において蓄積する腎不全物質であることが示された。
（カチオン性物質）：クレアチニン、３−メチルヒスチジン、アラントイン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、ヒドロキシプロリン、シトルリン、メチオニンスルホキシド、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、グアニジノコハク酸
（アニオン性物質）：クエン酸、シス−アコニット酸、イソクエン酸、３−インドキシル硫酸、トランス−アコニット酸、イセチオネート、ピメリン酸、馬尿酸
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明により、尿毒症及び酸化ストレス惹起、並びに、染色体優性多発性嚢胞腎発症に関与する物質の挙動に基づき透析膜の性能評価ができる。その結果、より尿毒症発症を低減させることのできる高性能の透析膜を開発することが可能になり、長期透析患者のＱＯＬ向上につながる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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