(57)【要約】【課題】飽和脂肪酸を多量に含む高脂肪食を摂取したときに、筋肉細胞組織へのインスリン依存的及び／又は非インスリン依存的な糖の取り込みの低下を微量の添加で抑制可能なグルコース取り込み促進剤を提供する。【解決手段】本発明のグルコース取り込み促進剤は、有効成分としてアラキドン酸を含有する。このグルコース取り込み促進剤は、特にインスリン抵抗性を改善する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラキドン酸を有効成分として含有するグルコース取り込み促進剤。
【請求項２】
インスリン抵抗性を改善する、請求項１に記載のグルコース取り込み促進剤。
【請求項３】
請求項１又２に記載のグルコース取り込み促進剤を含有する油脂組成物。
【請求項４】
飽和脂肪酸を含有する、請求項３に記載の油脂組成物。
【請求項５】
前記アラキドン酸の飽和脂肪酸に対するモル比率は、０．０１〜３である、請求項４に記載の油脂組成物。
【請求項６】
ラード、牛脂、パーム核油、ヤシ油、米油、天然油脂のグリセロール骨格の１，２，３位の少なくとも一位に化学的又は生化学的手法により飽和脂肪酸を結合させた加工油脂からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の油脂組成物。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか一項に記載の油脂組成物を用いて製造した加工食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコース取り込み促進剤及びその用途に関し、より詳細には、筋肉細胞組織への非インスリン依存的及び／又はインスリン依存的な糖取り込みの低下を抑制する機能を有するグルコース取り込み促進剤、それを含有する油脂組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
先進諸国では、糖尿病の罹患者数が増大している。糖尿病による高血糖状態の持続は、網膜症、白内障や血管新生緑内障による失明、腎臓病、神経障害、冠動脈、能動脈や手足での動脈硬化症等の合併症を引き起こす。腎臓病では人工透析治療が必要になる。このように、糖尿病は、患者のＱＯＬを著しく損ない、また医療コストを多大に引き上げる。
【０００３】
糖尿病は、発症に自己免疫機序が関与すると考えられている１型糖尿病と、カロリーの過剰摂取や運動不足に基づく肥満状態の継続により発症する２型糖尿病とに大別される。患者の大部分は２型糖尿病に属する。
【０００４】
２型糖尿病を発症する要因として、インスリン抵抗性がある。インスリンは、膵臓のランゲルハンス島から分泌される、グルコース（以下、単に糖ということがある）の代謝や脂質の代謝に関わるホルモンである。インスリンは、血糖値を適正値に保つために、肝臓に蓄えたグリコーゲンの糖への分解を抑制する、肝臓や筋肉中の糖からグリコーゲンへの合成を促進する、血糖を筋肉細胞や脂肪細胞へ運搬する、脂肪細胞中の糖から脂肪への合成を促進する等の機能を有する。糖尿病の患者は、健常人と比べて同じ量のインスリンを投与しても血糖値が下がりにくく、また軽症糖尿病患者よりも重症糖尿病患者の方が下がりにくい。これらの事実から、インスリンが効きにくい状態をインスリン抵抗性と称して、２型糖尿病の主要因子とされている。
【０００５】
インスリン抵抗性の有無を簡便に調べるため、ＨＯＭＡ−ＩＲ値（Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｍｏｄｅｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ−Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、インスリン抵抗性指数）が測定される。この指標は、以下の数式：
【数１】
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により求めることができる。日本人の統計では、ＨＯＭＡ−ＩＲ値が２以上であるとインスリン抵抗性があり、４以上であると強いインスリン抵抗性があるとされる。
【０００６】
インスリン抵抗性の発症は、食生活、運動、不規則な生活等に左右される。食事の中でも、脂質は、炭水化物やタンパク質と比較して単位重量当たりの熱量が大きいため優れたエネルギー源となる反面、過剰摂取によるエネルギー過多になり易いため、食生活に基づく２型糖尿病予防の重要な因子である。一方で、脂質は、必須脂肪酸の供給源であり、また脂溶性ビタミンの吸収を助けるという生理的意義を有する。よって、脂質の摂取を闇雲に抑えることは好ましくない。
【０００７】
非特許文献１（Ｍａｒｅｋ  Ｓｔｒａｃｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ）によれば、インスリン抵抗性は、セラミド（スフィンゴミエリンシグナル経路の第二メッセンジャー）の細胞内形成と関係すること、インスリン抵抗性は、骨格筋細胞内の総セラミド含量と相関すること、そして、パルミチン酸からなるセラミドと最も強く相関することを開示する。
【０００８】
本発明者らは、マウスに高脂肪食を１６週間摂取させて慢性的肥満状態のマウスを作製した。このマウスは、インスリン抵抗性を惹起する動物モデルとなる。この動物モデルを用いた試験（参考例１参照）によって、高脂肪食の摂取により惹起されるインスリン抵抗性は、飼料に添加された油脂の種類で異なることを確認している。
【０００９】
上記動物実験モデルの基礎となる細胞試験（本明細書の参考例２〜４）に示すように、ラード等に多く含まれるパルミチン酸やステアリン酸のような飽和脂肪酸は、骨格筋細胞への非インスリン依存的な糖の取り込み量を著しく減少させる。さらに、インスリン処理しても糖の取り込み量があまり増えないことから、飽和脂肪酸の摂取によってインスリン感受性が損なわれる（すなわち、インスリン抵抗性が誘導される）。
【００１０】
上記インスリン抵抗性の誘導は、本明細書の比較例１に示すように、不飽和脂肪酸であるα−リノレン酸の同時摂取により抑制される。しかし、この抑制のためには、多量のα−リノレン酸で置換するか、又は添加が必要となる。
【００１１】
特許文献１（油脂組成物）には、トリグリセリド１０．１〜９４．９重量％、モノグリセリド０．１〜３０重量％及び構成脂肪酸の１５〜９０重量％が炭素数２０未満のω３系不飽和脂肪酸であるジグリセリドを５〜５９．９重量％を含有する油脂組成物にインスリン抵抗性改善作用があることが開示されている。当該ジグリセリドのω３系不飽和脂肪酸の好適な例がα−リノレン酸である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００２−１３８２９７
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００４，ｖｏｌ．５３，ｎｏ．５，１２１５−１２２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、高脂肪食、特に飽和脂肪酸を多量に含む高脂肪食を摂取したときに、筋肉細胞組織へのインスリン依存的及び／又は非インスリン依存的なグルコース取り込みの低下を微量の添加で抑制可能なグルコース取り込み促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、特定の高度不飽和脂肪酸は、飽和脂肪酸との低濃度の共存において飽和脂肪酸によるインスリン依存的及び／又は非インスリン依存的な糖取り込みの低下を抑制することを見出して、本発明に至った。すなわち、本発明は、有効成分としてアラキドン酸を含有するグルコース取り込み促進剤を提供する。本明細書において、「アラキドン酸」という用語は、アラキドン酸自身の他に、アラキドン酸を構成脂肪酸とする化合物を含む意味で使用する。
【００１６】
従来、アラキドン酸の効能については、一般に免疫系の調節や妊娠後期の胎児や出生直後の乳児の健全な発育に必要とされることや、抗疲労作用（特開２００９−７３７４７）や血管の老化防止作用（特開２００９−２１９５００）が公知である。しかし、グルコース取り込み促進作用、すなわち、筋肉細胞組織へのインスリン依存的及び／又は非インスリン依存的な糖の取り込みの低下を抑制することは全く知られていない。
【００１７】
本発明は、また、上記グルコース取り込み促進剤を含有する油脂組成物を提供する。
【００１８】
上記油脂組成物は、特に飽和脂肪酸を含有する場合に産業用の利用価値が高まる。本明細書において、「飽和脂肪酸」という用語は、飽和脂肪酸自身の他に、構成脂肪酸として飽和脂肪酸を含む化合物を含む意味で使用する。
【００１９】
特に上記油脂組成物は、前記アラキドン酸の飽和脂肪酸に対するモル比率は、０．０１〜３であることが好ましい。
【００２０】
上記油脂組成物には、例えばラード、牛脂、パーム油、パーム核油、ヤシ油等の元来飽和脂肪酸含量の多い油脂に加え、大豆油、菜種油、コーン油、米油等の液状油を水素添加して得た加工油脂、並びにこれらをエステル交換処理して製造した油脂があり、さらに、前記に例示した油脂を分別した油脂がある。上記油脂組成物は、これらの油脂からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む。
【００２１】
本発明は、また、上記油脂組成物を用いて製造した食品を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
パーム油並びに液状油を水素添加して製造する硬化油は、飽和脂肪酸含量が高いため、酸化安定性に優れるという特性や常温で固体である特性を利用して、様々な食品に利用されており、加工食品の製造においては欠く事ができない。しかし、昨今の研究により、飽和脂肪酸の過剰摂取がインスリン抵抗性発症に繋がることが指摘されている（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  （１９９７），４０，４３０−４３８）。有効成分としてアラキドン酸を含有する本発明のグルコース取り込み促進剤によれば、飽和脂肪酸に高度不飽和脂肪酸の一種であるアラキドン酸を共存させることで、飽和脂肪酸による非インスリン依存的なグルコース取り込み量の減少を抑制し、そしてまた、飽和脂肪酸によるインスリン依存的なグルコース取り込みの減少を回復させ、その結果として、血糖値の上昇を抑えることが可能である。
【００２３】
本発明のグルコース取り込み促進剤は、１型糖尿病及び２型糖尿病のいずれの予防や回復にも有効なことが期待される。しかも、本発明のグルコース取り込み促進剤は、α−リノレン酸のような不飽和脂肪酸と比較して一桁低い濃度で同等の効果を奏する点で優れ、産業上の利用性も非常に高い。
【００２４】
飽和脂肪酸を含有する油脂組成物に本発明のグルコース取り込み促進剤を添加することで、飽和脂肪酸による非インスリン依存的及び／又はインスリン依存的なグルコース取り込みの減少を回復させることができる。そのような油脂組成物は、ラード、牛脂、パーム核油、ヤシ油、米油、天然油脂のグリセロール骨格の１，２，３位の少なくとも一位に化学的又は生化学的手法により飽和脂肪酸を結合させた加工油脂等を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】各種濃度のパルミチン酸で２４時間処理したＬ６細胞で発現したインスリン受容体タンパク質を、ウエスタンブロット法により検出した結果である。インスリン受容体タンパク質の発現量は、パルミチン酸の濃度に依存して減少している。
【図２】０．７５ｍＭのパルミチン酸で８〜１６時間処理したＬ６細胞で発現したインスリン受容体タンパク質を、ウエスタンブロット法で検出した結果である。インスリン受容体タンパク質の発現量は、パルミチン酸の処理時間に依存して減少している。
【図３】０．７５ｍＭのパルミチン酸で１４時間処理したＬ６細胞で発現したグルコーストランスポーター−４（ＧＬＵＴ４）タンパク質を、ウエスタンブロット法で検出した結果である。ＧＬＵＴ４タンパク質の発現量は、パルミチン酸処理により減少している。
【図４】パルミチン酸がＬ６細胞の糖取り込みに及ぼす影響を、インスリン処理無し（□）及び１００ｎＭインスリン処理（■）の二種類について調べたグラフである。□バーが示すように、パルミチン酸は、インスリン非依存的な糖取り込みを処理時間に依存して減少させる。また、■バーが示すように、パルミチン酸未処理では、インスリン刺激により、糖の取り込み量が６０％増したが、８時間処理では、インスリン刺激による糖取り込み量の増加は２０％に留まり、さらに１０時間処理では、インスリン刺激による糖取り込み量の増加が認められなかった。
【図５】各種脂肪酸がＬ６細胞の糖取り込みに及ぼす影響を、インスリン処理無し（□）及び１００ｎＭインスリン処理（■）の二種類について調べたグラフである。各種脂肪酸でのＬ６細胞の処理時間は１４時間である。パルミチン酸（参考例２）及びステアリン酸（参考例３）でＬ６細胞を処理すると、Ｌ６細胞の非インスリン依存的な糖の取り込みを著しく減少させ、インスリン処理による糖取り込みの増加（インスリン感受性）も低下させた。パルミチン酸及びステアリン酸の共存（参考例４）は、非インスリン依存的糖取り込み及びインスリン感受性を著しく低下させた。一方、パルミチン酸とα−リノレン酸の共存（比較例１）は、非インスリン依存的糖取り込みをパルミチン酸無処理レベルあるいはそれ以上に高め、そして、インスリン感受性の低下を抑制した。パルミチン酸とアラキドン酸の共存（実施例１）は、非インスリン依存的な糖取り込み量の減少を抑制し、そして、パルミチン酸によるインスリン依存的な糖の取り込みの減少を回復させた。
【図６】パルミチン酸０．７５ｍＭに各種濃度のアラキドン酸を共存させた場合のＬ６細胞の糖取り込みに及ぼす影響を、インスリン処理無し（□）及び１００ｎＭインスリン処理（■）の二種類について調べたグラフである。アラキドン酸は、濃度１０μＭ以上で、パルミチン酸によるインスリン非依存的な糖取り込み量の減少を濃度依存的に抑制した。そして、アラキドン酸は、濃度７５μＭまでは、パルミチン酸によるインスリン依存的な糖の取り込みの減少を濃度依存的に回復させた。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下に、本発明の実施態様を詳細に説明する。本発明のグルコース取り込み促進剤は、有効成分としてアラキドン酸を含有する。アラキドン酸は、分子式Ｃ２０Ｈ３２Ｏで示され、４個の二重結合を含む２０個の炭素鎖からなるカルボン酸であり、ｎ−６系不飽和脂肪酸に分類される。本発明に使用するアラキドン酸は、アラキドン酸自身の他に、アラキドン酸を構成脂肪酸とする化合物であってもよく、例えば構成脂肪酸の少なくとも一部がアラキドン酸であるトリグリセリド、グリセリン脂肪酸エステル、リン脂質、糖脂質、エステル等；アラキドン酸とアルコール（メタノール、エタノール等）とのエステル；アラキドン酸塩等が挙げられる。
【００２７】
本発明に使用するアラキドン酸の入手方法は特に制限されない。例えばアラキドン酸を構成成分とするトリグリセリドを産生する能力を有する微生物（例えばＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属糸状菌）を工業的に培養する方法等である。本発明は、市販のアラキドン酸を使用可能である。
【００２８】
本発明のグルコース取り込み促進剤は、有効成分としてのアラキドン酸以外に、食品分野の添加剤として公知のものを特に制限なく使用可能である。その具体例としては、不飽和脂肪酸（ｎ−９、ｎ−７、ｎ−６、ｎ−３系不飽和脂肪酸等）、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、ビタミン、アミノ酸、懸濁化剤、粘稠剤、溶解補助剤、抗酸化剤、可塑剤、界面活性剤、アルコール類、甘味料、矯味剤、酸味料、香料、着色剤等が挙げられる。
【００２９】
本発明のグルコース取り込み促進剤の形態は特に制限がない。例えば、液剤、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。
【００３０】
本発明のグルコース取り込み促進剤の有効成分としてのアラキドン酸の含有量は、使用方法によって適宜調整されるが、通常、０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜８０重量％、特に好ましくは１〜５０重量％である。
【００３１】
本発明のグルコース取り込み促進剤の使用量は、アラキドン酸の飽和脂肪酸に対するモル比率に換算して、通常、０．０１〜３であり、好ましくは０．０１〜０．２であり、より好ましくは０．０３〜０．１である。モル比率が０．０１より低すぎると、飽和脂肪酸による非インスリン依存的及び／又はインスリン依存的グルコース取り込み抑制を緩和することができない場合がある。一方、モル比率が３より高すぎても、使用量に見合った抑制が得られないだけでなく、アラキドン酸の過剰摂取による弊害（例えばアラキドン酸の酸化による生体内酸化ストレスの増大等）が出てくる可能性がある。
【００３２】
本発明のグルコース取り込み促進剤の使用方法は特に限定するものではないが、飽和脂肪酸の入った油脂組成物や食品を使用する際にその添加剤として摂取することでより産業上の利用価値がある。本発明のグルコース取り込み促進剤の使用時期は、飽和脂肪酸を含む食事の前、中、後のいずれでもよいが、好ましくは摂取と同時である。
【００３３】
本発明は、また、グルコース取り込み促進剤を含有する油脂組成物を提供する。特に飽和脂肪酸の含有量が高い油脂組成物にグルコース取り込み促進剤を添加することで、飽和脂肪酸による糖の取り込みの低下を確実に緩和することができる。
【００３４】
本発明のグルコース取り込み促進剤の油脂組成物への添加は、飽和脂肪酸の含量が、通常、２０重量％以上、特に４０重量％以上の油脂組成物において特に有効である。
【００３５】
油脂組成物におけるアラキドン酸の含量は、飽和脂肪酸に対するモル比率で換算して、通常、０．０１〜３であり、好ましくは０．０１〜０．２であり、より好ましくは０．０３〜０．１である。モル比率が０．０１より低すぎると、飽和脂肪酸による非インスリン依存的及び／又はインスリン依存的なグルコース取り込み抑制を緩和することができない場合がある。一方、モル比率が３より高すぎても、添加量に見合った緩和がなく、アラキドン酸の過剰添加による弊害が出る場合がありえる。
【００３６】
本発明の油脂組成物は、飽和脂肪酸を多く含んでいるラード、牛脂、パーム核油、ヤシ油、米油、天然油脂のグリセロール骨格の１，２，３位の少なくとも一位に化学的又は生化学的手法により飽和脂肪酸を結合させた加工油脂（エステル交換油、分別油、硬化油等）を含む場合に、効果が顕著である。
【００３７】
本発明の油脂組成物には、グルコース取り込み促進剤以外に、食品分野の油脂組成物への添加剤を特に制限なく使用可能である。その具体例は、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、抗酸化剤（トコフェロール、カテキン等）、ビタミン、ミネラル、乳化剤、消泡剤（シリコーン樹脂等）、結晶抑制剤、安定剤、呈味料、香料、着色剤等が挙げられる。
【００３８】
本発明の油脂組成物の使用形態は特に制限されず、例えば、揚げ物油、サラダ油、マーガリン、バター、ショートニング、ソフトカプセル、錠剤、乳化タイプ飲料等が挙げられる。
【００３９】
本発明は、また、上記油脂組成物を用いて製造した食品を提供する。そのような例は、特に飽和脂肪酸を多く含む食品である。具体的には、高脂肪食品（ピザ、てんぷら、とんかつ、スパゲッティ、ラーメン、フライドポテト、クロワッサン、デニッシュパン）、食肉加工品（ベーコン、サラミ、ハム、ソーセージ、ハンバーグ、パテ）、魚肉練り物（かまぼこ、魚肉ソーセージ）、揚げ物（油揚げ）、ピーナッツバター、ココナッツミルク、マーガリン、フレンチドレッシング、即席加工食品（カップ麺、スープ等）、卵・乳製品（バター、各種チーズ、マヨネーズ、生クリーム）、菓子・スナック類（ケーキ、ドーナッツ、ポテトチップス、チョコレート）、サプリメント等が挙げられる。
【００４０】
本発明は、また、上記油脂組成物を用いて製造した食品を提供する。そのような例は、牛、豚、鶏、羊等の家畜用の飼料、ウサギ、ラット、マウス等の小動物用の飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等の魚介類用の飼料、並びに犬、猫、小鳥、リス等の愛玩動物の飼料が挙げられる。
【実施例】
【００４１】
以下に、実施例、比較例及び参考例を示し、本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００４２】
〔参考例１〕モデルマウスを用いたインスリン抵抗性試験
マウスに高脂肪食を長期間摂取させて慢性的肥満状態のモデルマウスを作製し、このモデルマウスで高脂肪食摂取により惹起されるインスリン抵抗性と飼料中の油脂との相関を調べた。
【００４３】
飼料は、ＡＩＮ−７６基本組成改変飼料をもとに、対照食としてコーン油を５重量％配合したもの（以下、ＳＣという）、高脂肪食群として対照食にさらにラード（株式会社Ｊ−オイルミルズ製）３０％重量％で配合したラード配合食（以下、ＨＦ−Ｌという）、及びラード１５重量％と亜麻仁油（株式会社Ｊ−オイルミルズ製）１５重量％を添加したラード・亜麻仁油配合食（以下、ＨＦ−０．５Ｆという）を作製した。ラード及び亜麻仁油の組成を表１に、そして各飼料の組成を表２に示す。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
【表２】
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【００４６】
実験動物は、生後５週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｃｒ雄性マウス（日本ＳＬＣ社より入手）３０匹を２５±２℃、明期９：００−２１：００、暗期２１：００−９：００に調節した飼育室にて１週間予備飼育した後、平均体重が等しくなるように群分けを行った。群分けしたマウスは、以下、各飼料に応じてＳＣ群、ＨＦ−Ｌ群及びＨＦ−０．５Ｌ群と呼ぶ。
【００４７】
これらの飼料を２〜３日毎に交換し、マウスに各群間における摂食量がほぼ等しくなるように１６週間摂取させた。飲水としては全群に蒸留水を自由摂取させた。飼育期間中は１週間ごとにマウスの摂餌量、摂水量、ならびに体重を測定した。
【００４８】
１６週後、同様に１５時間絶食させた後に、ネンブタール麻酔下で心臓採血することで屠殺した。マウスから両下肢の全筋肉組織を摘出後、分析時まで−８０℃下で保存した。
【００４９】
心臓採血により得た血液に２０ｍｇ／ｍｌヘパリンナトリウム水溶液を３μｌ添加し、４℃、１，５００×ｇで２０分間遠心分離することで血漿を調製し、これを用いて血糖と血漿脂質としてのトリアシルグリセロール、遊離脂肪酸、総コレステロールならびにインスリンを測定した。実験結果は、Ｔｕｋｃｙ法を用いて多群間の比較検定を行い、ｐ＜０．０５になった場合に有意差があるとみなした。
【００５０】
飼育終了時の各マウスの血糖値、血中インスリン値、ならびにこれらの値から算出したＨＯＬＩＡ―ＩＲ値を表３に示す。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
表３に示すとおり、血糖値は、ＳＣ群に対してＨＦ−Ｌ群のみが有意な高値を示し、亜麻仁油置換のＨＦ−０．５Ｌ群ではＳＣ群に対して有意差がなかった。また、ＨＦ−０．５Ｆ群の血糖値は、ＨＦ−Ｌ群のそれに対して有意な低値を示した。
【００５３】
ＨＦ−Ｌ群の血中インスリン値が６５．４μＩＵ／ｍｌであったのに対し、ＨＦ−０．５Ｆ群の値は２７．９μＩＵ／ｍｌとなり、血中インスリン値においても、ＨＦ−Ｌ群がＳＣ群に対して有意な上昇を示したのに対し、亜麻仁油で置換したＨＦ−０．５Ｆ群は、ＳＣ群との間に有意差がなかった。また、ＨＦ−０．５Ｆ群の値は、ＨＦ−Ｌ群の値に対して有意な低値となった。
【００５４】
血糖値とインスリン値から算出したＨＯＭＡ−ＩＲ値は、インスリン値と同様の傾向を示し、ＨＦ−Ｌ群がＳＣ群に対して有意な高値を示したのに対し、亜麻仁油で置換したＨＦ−０．５Ｆ群はＳＣ群に対して有意差がなかつた。さらに、ＨＦ−０．５Ｆ群の値は、ＨＦ−Ｌ群の値に対して有意に低く、ラードを亜麻仁油で置換することでインスリン抵抗性発症の程度が軽微になることがわかった。
【００５５】
〔参考例２〕
（１）Ｌ６細胞のインスリン受容体発現に対する飽和脂肪酸の影響
インスリン受容体タンパク質は、インスリンと結合することによって糖の細胞内取り込みとグリコーゲン合成を開始させるシグナル伝達を開始させる。グルコーストランスポーター−４（ＧＬＵＴ４）は、インスリンの刺激を受けて細胞質から細胞膜上に移動してインスリン依存的なグルコースを取り込みに関与することが知られている。これらのタンパク質の発現量の減少は、インスリン抵抗性の直接的な原因となる。そこで、ラードに多量に含まれるパルミチン酸のＬ６細胞におけるインスリン受容体タンパク質及びのＧＬＵＴ４の発現量に対する影響を、以下の細胞培養試験で評価した。
【００５６】
（細胞培養）
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＥａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（以下、ＭＥＭと略す）培地内で、ラット骨格筋由来のＬ６細胞株を３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。Ｌ６細胞を６０ｍｍφのディッシュに播種し、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地でセミコンフルーエント状態まで培養した。この培地を、２％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地に置換し、さらに８日間培養することにより、筋管細胞へと分化させた。この筋管細胞をタンパク質発現の解析に供した。
【００５７】
（脂肪酸処理）
２％ＦＢＳと２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＭＥＭ培地へ、パルミチン酸（株式会社フナコシより入手）のエタノール溶液を培地中のエタノール含量が１ｖｏｌ％となるように添加した後、超音波処理により分散させた。このパルミチン酸を含む培地中で、分化したＬ６細胞（筋管細胞）を８〜２４時間培養した。
【００５８】
（ウエスタンブロッティング）
パルミチン酸で処理したＬ６細胞を可溶化することにより、細胞溶解液を調製した。この溶解液をウエスタンブロッティング法にかけて、インスリン受容体タンパク質及びＧＬＵＴ４タンパク質を検出した。
【００５９】
図１に、０．３７５〜１．５ｍＭのパルミチン酸で２４時間処理したＬ６細胞中に発現したインスリン受容体タンパク質のウエスタンブロッドを示す。また、ローディング量の校正用にβ−アクチンを同様に検出した。図１から、筋管細胞でのインスリン受容体タンパク質の発現量は、パルミチン酸の濃度依存的に減少したことがわかる。
【００６０】
図２に、０．７５ｍＭのパルミチン酸で８〜１６時間処理したＬ６細胞中に発現したインスリン受容体タンパク質のウエスタンブロッドを示す。また、ローディング量の校正用にβ−アクチンを同様に検出した。図２から、筋管細胞でのインスリン受容体タンパク質の発現量は、０．７５ｍＭのパルミチン酸の処理時間依存的に減少したことがわかる。
【００６１】
図３に、０．７５ｍＭのパルミチン酸で１４時間処理したＬ６細胞中に発現したＧＬＵＴ４タンパク質のウエスタンブロッドを示す。また、ローディング量の校正用にβ−アクチンを同様に検出した。図３から、筋管細胞でのＧＬＵＴ４タンパク質の発現量は、パルミチン酸処理により減少したことがわかる。
【００６２】
（２）パルミチン酸処理によるＬ６細胞への糖取り込みの影響
飽和脂肪酸であるパルミチン酸は、濃度及び処理時間依存的に、インスリン受容体の発現量を低下させることを確認したので、パルミチン酸処理により、インスリン依存的又は非インスリン依存的なＬ６細胞の糖取り込みが抑制させるかを調べた。
【００６３】
（細胞培養）
ラット骨格筋由来のＬ６細胞株を５％ＣＯ２下で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ培地内で、３７℃で培養した。Ｌ６細胞を９６穴マルチプレートに４×１０３セル／ウエル播種し、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地でセミコンフルーエント状態まで培養した。この培地を、２％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地に置換し、さらに５日間培養することにより、筋管細胞へと分化させた。
【００６４】
（脂肪酸処理）
２％ＦＢＳと２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＭＥＭ培地へ、各種脂肪酸のエタノール溶液を培地中のエタノール含量が１ｖｏｌ％となるように添加した後、超音波処理により分散させた。０．７５ｍＭのパルミチン酸を含む培地中で、分化したＬ６細胞（筋管細胞）を０〜１６時間培養した。
【００６５】
（Ｌ６細胞への糖取り込み量の測定）
Ｌ６細胞の糖の取り込み量の測定は、Ｙａｍａｍｏｔｏらの方法（Ａｎ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｔｏ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｅ  ２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｅ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０４，２，２０１０，２３８−２４０、及びＡ  ｎｏｎｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ，  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  Ｌ６  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｉｎ  ａ  ９６−ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００６，３５１，１，１３９−４５）に従った。具体的には、上記のパルミチン酸で処理したＬ６細胞を、２％ＦＢＳ及び２％ＢＳＡを含むＭＥＭ培地で洗浄した後、０．２％ＢＳＡを含むＭＥＭ培地に置換して、１８時間培養し、脱感作させた。
【００６６】
上記脱感作させたＬ６細胞を、０．１％ＢＳＡを含むＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｈｅｐｅｓ（以下、ＫＲＰＨと略す）緩衝液で洗浄後、２デオキシグルコース（以下、２ＤＧという）と０．１％ＢＳＡを含むＫＲＰＨ緩衝液で２０分間培養した。
【００６７】
また、インスリン刺激による糖取り込みの改善を調べるため、上記脱感作させたＬ６細胞にインスリン１００ｎＭを４時間作用させた後、０．１％ＢＳＡを含むＫＲＰＨ緩衝液で洗浄後、２ＤＧと０．１％ＢＳＡを含むＫＲＰＨ緩衝液で２０分間培養した。
【００６８】
インスリン無処理又は処理したＬ６細胞を、それぞれ、０．１％ＢＳＡを含むＫＲＰＨ緩衝液で洗浄後、０．１Ｎ  ＮａＯＨで可溶化した。細胞内に存在するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ＮＡＤ（Ｐ）＋及び酵素類を分解させるため、凍結融解処理と熱処理（８５℃×４０分間）を行った。０．１Ｎ塩酸で中和後、１５０ｍＭｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  （ＴＥＡ）を添加して、測定用試料を得た。測定用試料に発色試薬を添加し、１時間反応させた後、蛍光プレートリーダー（Ｅｘ：５３０ｎｍ、Ｅｍ：５７０ｎｍ）を用いて２ＤＧ量を測定した。２ＤＧ量は、パルミチン酸で処理しなかった細胞の２ＤＧ取り込み量に対する相対値で表した。
【００６９】
図４に、パルミチン酸がＬ６細胞の糖取り込みに及ぼす影響を、インスリン処理無し（□）及び１００ｎＭインスリン処理（■）の二種類について調べたグラフを示す。図４の□バーが示すように、パルミチン酸は、非インスリン依存的な糖の取り込みを処理時間依存的に減少させた。
【００７０】
また、図４の■バーが示すように、パルミチン酸で処理しなかった細胞（処理時間０）では、インスリン刺激により、糖の取り込み量が６０％増した。一方、パルミチン酸の８時間処理では、インスリン刺激による糖取り込み量の増加は２０％に留まった。さらに、１０時間処理では、インスリン刺激による糖取り込み量の増加が認められなかった。
【００７１】
〔参考例３〕ステアリン酸処理によるＬ６細胞への糖取り込みの影響
参考例２（２）において、パルミチン酸０．７５ｍＭに代えて、飽和脂肪酸のステアリン酸（株式会社フナコシより入手）０．７５ｍＭで１４時間処理した以外は、同様の手順で、糖の取り込み試験を行った。その結果を表４及び図５に、パルミチン酸０．７５ｍＭの場合とともに示す。
【００７２】
図５から、ステアリン酸処理についても、パルミチン酸と同様の糖取り込みの影響が見られた。すなわち、この飽和脂肪酸もまた、Ｌ６細胞の非インスリン依存的な糖の取り込みを著しく減少させた。そして、インスリン刺激による糖取り込みの増加（インスリン感受性）も低下させた。
【００７３】
〔参考例４〕パルミチン酸及びステアリン酸処理によるＬ６細胞への糖取り込みの影響
参考例２（２）において、パルミチン酸０．７５ｍＭにステアリン酸０．７５ｍＭを加えた以外は、同様の手順で、糖の取り込み試験を行った。その結果を表４及び図５に示す。
【００７４】
図５から、ステアリン酸は、パルミチン酸のＬ６細胞に対する影響を憎悪させた。すなわち、飽和脂肪酸の共存は、非インスリン依存的糖取り込み及びインスリン感受性を著しく低下させた。
【００７５】
〔比較例１〕パルミチン酸及びα−リノレン酸処理によるＬ６細胞への糖取り込みの影響
【００７６】
参考例２（２）において、パルミチン酸０．７５ｍＭにα−リノレン酸（株式会社フナコシより入手）を０．７５ｍＭ共存させた以外は同様の手順で、糖の取り込み試験を行った。その結果を表４及び図５に示す。
【００７７】
図５から、α−リノレン酸は、パルミチン酸のＬ６細胞に対する影響を緩和させた。すなわち、パルミチン酸とα−リノレン酸の共存は、非インスリン依存的糖取り込みをパルミチン酸無処理レベルあるいはそれ以上に高め、そして、インスリン感受性の低下を抑制した。
【００７８】
〔実施例１〕パルミチン酸及びアラキドン酸処理によるＬ６細胞への糖取り込みの影響
参考例２（２）において、パルミチン酸０．７５ｍＭにアラキドン酸（株式会社フナコシより入手）を７５μＭ共存させた以外は同様の手順で、糖の取り込み試験を行った。その結果を表４及び図５に示す。
【００７９】
図５から、パルミチン酸にアラキドン酸を共存させることで、非インスリン依存的な糖取り込み量の減少を抑制し、そして、パルミチン酸によるインスリン依存的な糖の取り込みの減少を回復させた。比較例１のα−リノレン酸と対比しても、アラキドン酸が１桁低い濃度で同等の効果を示したことは、アラキドン酸のグルコース取り込み促進剤としての優位性を証明している。
【００８０】
【表４】
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※：非インスリン依存的糖取り込みは、Ｌ６細胞の脂肪酸処理無しの２ＤＧ糖取り込み量を１．０とした相対値で示す。
※※：インスリン感受性低下抑制効果は、Ｌ６細胞の脂肪酸処理無しの２ＤＧ糖取り込み量を１．０とした相対値で示す。
【００８１】
〔実施例２〜５〕パルミチン酸の存在下、各種濃度のアラキドン酸処理によるＬ６細胞への糖取り込みの影響
参考例２（２）において、パルミチン酸０．７５ｍＭにアラキドン酸を表２に示す濃度範囲で共存させた以外は同様の手順で、糖の取り込み試験を行った。その結果を、表５及び図６に示す。
【００８２】
【表５】
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※：非インスリン依存的糖取り込みは、Ｌ６細胞の脂肪酸処理無しの２ＤＧ糖取り込み量を１．０とした相対値で示す。
※※：インスリン感受性低下抑制効果は、Ｌ６細胞の脂肪酸処理無しの２ＤＧ糖取り込み量を１．０とした相対値で示す。
【００８３】
表５及び図６から、アラキドン酸は、濃度１０μＭ以上で、パルミチン酸によるインスリン非依存的な糖取り込み量の減少を濃度依存的に抑制した。そして、アラキドン酸は、濃度７５μＭまでは、パルミチン酸によるインスリン依存的な糖の取り込みの減少を濃度依存的に回復させた。アラキドン酸の下限は、パルミチン酸０．７５ｍＭに対して好ましくは１０μＭ（モル比率０．０１３）、より好ましくは２５μＭ（０．０３）であり、アラキドン酸の上限は、パルミチン酸０．７５ｍＭに対して好ましくは１００μＭ（モル比率０．１３）、より好ましくは７５μＭ（モル比率０．１）であることが判明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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