(57)【要約】【課題】カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＰ−糖タンパク質を提供すること。【解決手段】本発明は、カニクイザルＰ−糖タンパク質およびカニクイザル特異的アミノ酸を含む関連Ｐ−糖タンパク質、ならびにこれらのポリペプチドをコードする核酸に関する。本発明はまた、カニクイザルＰ−糖タンパク質のフラグメントおよび生物学的に機能的な改変体を含む。本発明はさらに、このようなカニクイザルＰ−糖タンパク質の核酸およびポリペプチドを用いる方法、特に、薬物のバイオアベイラビリティを決定するための方法およびカニクイザルＰＧＰのインヒビターをスクリーニングするための方法に関する。カニクイザルＰＧＰの発現または機能を阻害することによって、カニクイザルＰＧＰ活性を阻害するカニクイザルＰＧＰインヒビターがまた、含まれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＰ−糖タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｐ−糖タンパク質（ＰＧＰ；多剤トランスポーター、ＭＤＲ１としてもまた公知）は、ＡＢＣトランスポータースーパーファミリーのメンバーであり、そしてヒトの腸、肝臓および他の組織で発現される。この酵素は、細胞膜を渡って低分子を輸出する流出ポンプとしてはたらく。数年間、高レベルのＰＧＰ発現が癌化学療法に対する腫瘍耐性に関する機構であることが知られている。ＰＧＰの腸発現は、このトランスポーターの基質である薬物分子の経口バイオアベイラビリティに影響を及ぼし得る。ＰＧＰは、流出薬物を効率的に腸管腔へ戻し得、このようにして循環へ侵入する薬物の量を減少する。
【０００３】
ＰＧＰとの相互作用の測定は、特定の薬物が低いまたは高いバイオアベイラビリティを示す理由のより良い理解を提供し得る。ＰＧＰとの相互作用は、極性が与えられた細胞系における薬物輸送の直接的アッセイまたは薬物刺激ＡＴＰａｓｅ活性および蛍光基質輸送の阻害のような間接的アッセイのいずれかを用いて研究され得る。
【０００４】
従って、上記の薬物アッセイにおける使用のための、さらなるＰＧＰポリペプチド（好ましくは、これは、ヒトＰＧＰに密接に関連する）に関する必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＰ−糖タンパク質をコードする核酸が、ここで、同定され、単離され、クローン化され、そして配列決定された。このＰＧＰは、ヒトＰＧＰと非常に関連している（高い割合の同一性を有する）。本発明は、単離された核酸分子、これらの分子の特有のフラグメント、上記のものを含む発現ベクター、およびこれらの分子を用いてトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。本発明はまた、単離されたポリペプチドならびに薬物輸送を減少する上記の核酸およびポリペプチドのインヒビターを提供する。このＰＧＰの核酸およびポリペプチドは、薬物のバイオアベイラビリティを評価するためのアッセイ、ならびにこの薬物の最適化または発見のためのアッセイにおいて有用である。さらに、上記のものは、ＰＧＰ活性によって特徴付けられる状態の診断または処置において使用され得、そしてＰＧＰ活性を増加または減少するための治療的に有用である方法に使用され得る。
【０００６】
本発明の１つの局面に従って、（ａ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列をコードする核酸分子、（ｂ）（ａ）の対立遺伝子改変体、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補体からなる群より選択される単離された核酸分子が提供される。特定の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号２または配列番号４をコードする。他の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号２または配列番号４のヌクレオチド配列を含む。
【０００７】
本発明の別の局面に従って、配列番号２のアミノ酸１２、２４、３０、７４、７８、８６、８９、９０、９１、９２、９５、９７、９９、１０２、１０３、１０４、１８５、３２４、３６３、５１８、６３５、６５０、６５６、６５９、６７７、７３０、７３８、７４２、７４５、７６１、７６５、８３５、８５１、９２１、９６７、１００３、１０２７、１０３８、１０４８、１１０３、１１２８、１１６８および１２７７ならびに配列番号４のアミノ酸９３、９４および９５からなる群より選択されるカニクイザルＰ−糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を含む、単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント（ここで、Ｐ−糖タンパク質は、カニクイザルＰ−糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸以外はヒトＰ−糖タンパク質に同一である）が提供される。特定の実施形態において、ヒトＰ−糖タンパク質は、配列番号５および配列番号６の群から選択される。
【０００８】
本発明のさらに別の局面に従って、配列番号２のアミノ酸３、６、８、１０、１３、１７、１９、２０、２１、２６、３０、３６、３８、４８、５２、５６、６４、７４、７８、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９８、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１１０、１１３、１４５、１９０、１９７、２１０、２３１、３１９、３２４、３２７、３４５、３６３、３９５、４５１、４５５、４５６、４６８、４７３、４９４、５１８、５３０、６３１、６４１、６４２、６４８、６５０、６５５、６５６、６６４、６６５、６７２、６７３、６７４、６７５、６８３、６８７、６８９、６９１、６９２、６９４、７０１、７０５、７１５、７２９、７３０、７３４、７４２、７４３、７４５、７５４、７５７、７６５、８３５、９１２、９１８、９２１、９４０、９４１、９４４、９６６、９６７、９６８、９７０、９７２、９８１、１００８、１０１５、１０２３、１０２４、１０４８、１０９３、１０９６、１１０３、１１２８、１１４２、１１４６、１１４７、１１５６、１１６０、１１６３、１１６６、１２５０および１２７１ならびに配列番号４のアミノ酸９３および９４からなる群より選択されるカニクイザルＰ−糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を含む、単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント（ここで、Ｐ−糖タンパク質は、カニクイザルＰ−糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸以外はイヌＰ−糖タンパク質に同一である）が提供される。いくつかの実施形態において、イヌＰ−糖タンパク質は、配列番号７および配列番号８の群から選択される。
【０００９】
好ましい実施形態において、単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントは、配列番号２、配列番号２のフラグメント、配列番号４および配列番号４のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに他のポリペプチドとしては、上記のイヌＰＧＰポリペプチド、ヒトＰＧＰポリペプチドおよびカニクイザルＰＧＰポリペプチドの組み合わせが挙げられる。
【００１０】
本発明のさらに他の実施形態に従って、上記の単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする単離された核酸分子が提供される。さらに、プロモーターに作動可能に連結された上記の単離された核酸分子を含む発現ベクター、ならびにこの発現ベクターを用いて形質転換されたかまたはトランスフェクトされた宿主細胞が含まれる。
【００１１】
本発明の別の局面において、単離されたＰＧＰポリペプチドを選択的に結合する因子が、提供される。好ましくは、この因子は、本明細書中に提供されるもの以外はヒトＰ−糖タンパク質またはイヌＰ−糖タンパク質に結合しない。特定の実施形態において、この因子は、ポリペプチド、好ましくはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）2抗体フラグメントおよびＣＤＲ３領域を含む抗体フラグメントからなる群より選択されるものである。上記の単離された核酸分子に選択的に結合する因子、好ましくは単離された核酸分子に選択的に結合するアンチセンス核酸分子がまた提供される。
【００１２】
本発明の別の局面に従って、化合物のバイオアベイラビリティを予測するための方法が提供される。この方法は、第１のＰ−糖タンパク質による試験化合物の膜貫通輸送を測定する工程、この第１のＰ−糖タンパク質および第２のＰ−糖タンパク質によるこの試験化合物の膜貫通輸送を比較し、この試験化合物のバイオアベイラビリティを予測する工程であって、ここで、第１のＰ−糖タンパク質および第２のＰ−糖タンパク質による相対的な輸送量または輸送速度が、この試験化合物のバイオアベイラビリティの予測である工程、を包含する。特定の実施形態において、第１のＰ−糖タンパク質は、イヌＰ−糖タンパク質および霊長類Ｐ−糖タンパク質からなる群より選択され、好ましくは上記のポリペプチドのうちの１つである。他の実施形態において、この第２のＰ−糖タンパク質は、ヒトＰ−糖タンパク質である。
【００１３】
本発明のさらに他の局面において、哺乳動物細胞においてＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を阻害するための方法が、提供される。この方法は、哺乳動物細胞を、この哺乳動物細胞におけるＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を阻害するのに効果的な量の上記因子のうちの１つと接触させる工程を包含する。
【００１４】
被験体中の因子のバイオアベイラビリティを増加するための方法がまた、本発明に含まれる。この方法は、そのような処置が必要な被験体に、薬物のバイオアベイラビリティを増加するのに有効な量で上記因子のうちの１つを投与する工程を包含する。このインヒビターは、この薬物を投与する前またはこの薬物と同時に投与され得る。
【００１５】
細胞中のＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を増加するための方法がまた、提供される。この方法は、この細胞を、上記核酸分子からなる群より選択される分子とこの細胞におけるＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を増加するに有効な量で接触させる工程を包含する。この細胞は、Ｐ−糖タンパク質が発現される条件下で接触され得る。
【００１６】
本発明のなお別の局面に従って、Ｐ−糖タンパク質トランスポーター活性と関連する疾患の処置において有用な薬理学的因子に関するリード化合物を同定するための方法が提供される。この方法は、本明細書中に提供されるようなＰ−糖タンパク質を含む、細胞または他の膜包囲空間を提供する工程；この細胞または他の膜包囲空間を、候補薬理学的因子の非存在下でＰ−糖タンパク質トランスポーター活性の第１の量をもたらす条件下で、この候補薬理学的因子と接触させる工程；および、Ｐ−糖タンパク質トランスポーター活性に対する該薬理学的因子の効果の尺度として、Ｐ−糖タンパク質トランスポーター活性の第２の量を決定する工程であって、ここで、第１の量よりも少ないＰ−糖タンパク質トランスポーター活性の第２の量は、候補薬理学的因子がＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を減少する薬理学的因子に関するリード化合物であることを示し、そしてここで、第１の量よりも多いＰ−糖タンパク質トランスポーター活性の第２の量は、候補薬理学的因子がＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を増加するする薬理学的因子に関するリード化合物であることを示す工程、を包含する。この方法は、検出可能な化合物でこの細胞または他の膜包囲空間を充填する工程であって、ここで、この化合物は、Ｐ−糖タンパク質トランスポーター活性の尺度として検出される工程をさらに包含し得る。
【００１７】
Ｐ−糖タンパク質を選択的に結合する化合物を同定するための方法がまた、含まれる。この方法は、本明細書中に提供されるＰ−糖タンパク質を化合物と接触させる工程、およびこの化合物のＰ−糖タンパク質への結合を決定する工程を包含する。この方法は、このＰ−糖タンパク質のＰ−糖タンパク質トランスポーター活性に対する化合物の効果を決定する工程、またはこのＰ−糖タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性に対する化合物の効果を決定する工程をさらに包含し得る。
【００１８】
本発明に従って提供されるさらなる方法は、Ｐ−糖タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性を決定するための方法を含む。この方法は、上記に提供されるような宿主細胞またはその膜画分を、試験薬物と接触させる工程、およびこのＰ−糖タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性を測定する工程を包含する。特定の実施形態において、このＡＴＰａｓｅ活性を測定する工程は、異なる時間に少なくとも２回実施される。Ｐ−糖タンパク質による化合物の膜貫通輸送を決定するための方法がまた、提供される。この方法は、上記に提供される宿主細胞またはその膜画分を、試験薬物と接触させる工程、および頂端側（ａｐｉｃａｌ）から側底側（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ）の方向および側底側から頂端側の方向からなる群より選択される少なくとも１つの輸送方向の傾斜条件下において、試験薬物の輸送を測定する工程を包含する。特定の実施形態において、この試験薬物の輸送を測定する工程は、異なる時間に少なくとも２回実施される。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の局面は、より詳細に以下に記載される。
【００２０】
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、カニクイザルＰ−糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号２は、配列番号１によってコードされるカニクイザルＰ−糖タンパク質のアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号３は、配列番号１と比較して９ヌクレオチド挿入を有するカニクイザルＰ−糖タンパク質対立遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号４は、配列番号３によってコードされるカニクイザルＰ−糖タンパク質対立遺伝子のアミノ酸配列であり、３アミノ酸挿入を有する。
【００２４】
配列番号５は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１４７５８を有するヒトＰ−糖タンパク質のアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号６は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０１６５３５またはＮＭ＿０００９２７を有するヒトＰ−糖タンパク質のアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号７は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０４５０１６を有するイヌＰ−糖タンパク質のアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号８は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０９２８１０を有するイヌＰ−糖タンパク質のアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号９は、ヒトＰＧＰヌクレオチド配列に基づくプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号１０は、ヒトＰＧＰヌクレオチド配列に基づくプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号１１は、ヒトＰＧＰヌクレオチド配列に基づくプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号１２は、カニクイザルＰＧＰヌクレオチド配列に基づくプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号１３は、カニクイザルＰＧＰヌクレオチド配列に基づくプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号１４は、Ｔ７プロモーターヌクレオチド配列に基づくプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号１５は、カニクイザルおよびヒトのＰＧＰヌクレオチド配列に基づくプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列番号１６は、カニクイザルおよびヒトのＰＧＰヌクレオチド配列に基づくプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列番号１７は、カニクイザルＰＧＰヌクレオチド配列に基づくプライマーのヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列番号１８は、カニクイザルＰＧＰヌクレオチド配列に基づくプライマーのヌクレオチド配列である。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）  単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列をコードする核酸分子、
（ｂ）（ａ）の対立遺伝子改変体、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の相補体、
からなる群より選択される、単離された核酸分子。
（項目２）  前記単離された核酸分子が配列番号２をコードする、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目３）  前記単離された核酸分子が配列番号４をコードする、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目４）  前記単離された核酸分子が配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目５）  単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、配列番号２のアミノ酸１２、２４、３０、７４、７８、８６、８９、９０、９１、９２、９５、９７、９９、１０２、１０３、１０４、１８５、３２４、３６３、５１８、６３５、６５０、６５６、６５９、６７７、７３０、７３８、７４２、７４５、７６１、７６５、８３５、８５１、９２１、９６７、１００３、１０２７、１０３８、１０４８、１１０３、１１２８、１１６８および１２７７ならびに配列番号４のアミノ酸９３、９４および９５からなる群より選択されるカニクイザルＰ−糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を含み、ここで、該Ｐ−糖タンパク質は、カニクイザルＰ−糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸以外はヒトＰ−糖タンパク質に同一であり、そしてここで、該Ｐ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントは、少なくとも１０アミノ酸長である、単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。
（項目６）  前記ヒトＰ−糖タンパク質が、配列番号５および配列番号６の群から選択される、項目５に記載の単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。
（項目７）  単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、配列番号２のアミノ酸３、６、８、１０、１３、１７、１９、２０、２１、２６、３０、３６、３８、４８、５２、５６、６４、７４、７８、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９８、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１１０、１１３、１４５、１９０、１９７、２１０、２３１、３１９、３２４、３２７、３４５、３６３、３９５、４５１、４５５、４５６、４６８、４７３、４９４、５１８、５３０、６３１、６４１、６４２、６４８、６５０、６５５、６５６、６６４、６６５、６７２、６７３、６７４、６７５、６８３、６８７、６８９、６９１、６９２、６９４、７０１、７０５、７１５、７２９、７３０、７３４、７４２、７４３、７４５、７５４、７５７、７６５、８３５、９１２、９１８、９２１、９４０、９４１、９４４、９６６、９６７、９６８、９７０、９７２、９８１、１００８、１０１５、１０２３、１０２４、１０４８、１０９３、１０９６、１１０３、１１２８、１１４２、１１４６、１１４７、１１５６、１１６０、１１６３、１１６６、１２５０および１２７１ならびに配列番号４のアミノ酸９３および９４からなる群より選択されるカニクイザルＰ−糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸を含み、ここで、該Ｐ−糖タンパク質は、カニクイザルＰ−糖タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸以外はイヌＰ−糖タンパク質に同一であり、そしてここで、該Ｐ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントは、少なくとも１０アミノ酸長である、単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。
（項目８）  前記イヌＰ−糖タンパク質が、配列番号７および配列番号８の群から選択される、項目７に記載の単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。
（項目９）  項目５または項目７に記載の単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、ここで、該ポリペプチドまたはそのフラグメントのアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号２のフラグメント、配列番号４および配列番号４のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列である、単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメント。
（項目１０）  項目５〜９のいずれかに記載の単離されたＰ−糖タンパク質ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする、単離された核酸分子。
（項目１１）  プロモーターに作動可能に連結された、項目１に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
（項目１２）  プロモーターに作動可能に連結された、項目１０に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
（項目１３）  項目１１に記載の発現ベクターを用いて形質転換されたかまたはトランスフェクトされた、宿主細胞。
（項目１４）  項目１２に記載の発現ベクターを用いて形質転換されたかまたはトランスフェクトされた、宿主細胞。
（項目１５）  ヒトＰ−糖タンパク質を結合セズ、項目５に記載の単離されたポリペプチドを選択的に結合する因子。
（項目１６）  前記因子がポリペプチドである、項目１５に記載の因子。
（項目１７）  項目１６に記載の因子であって、ここで、前記ポリペプチドは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ）2抗体フラグメントおよびＣＤＲ３領域を含む抗体フラグメントからなる群より選択される、因子。
（項目１８）  項目１または項目１０に記載の単離された核酸分子を選択的に結合する因子であって、ここで、該因子は、配列番号１のヌクレオチド８８〜１１１またはヌクレオチド１００〜１１７からなる核酸分子を結合しない、因子。
（項目１９）  化合物のバイオアベイラビリティを予測する方法であって、該方法は、以下：
第１のＰ−糖タンパク質による試験化合物の膜貫通輸送を測定する工程、
該第１のＰ−糖タンパク質および第２のＰ−糖タンパク質による該試験化合物の膜貫通輸送を比較し、該試験化合物のバイオアベイラビリティを予測する工程であって、ここで、該第１のＰ−糖タンパク質および該第２のＰ−糖タンパク質による相対的な輸送量または輸送速度は、該試験化合物のバイオアベイラビリティを予測する、工程、
を包含する、方法。
（項目２０）  前記第１のＰ−糖タンパク質が、イヌＰ−糖タンパク質および霊長類Ｐ−糖タンパク質からなる群より選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）  前記第１のＰ−糖タンパク質が、項目５または項目７に記載のポリペプチドである、項目１９に記載の方法。
（項目２２）  前記第２のＰ−糖タンパク質が、ヒトＰ−糖タンパク質である、項目１９に記載の方法。
（項目２３）  哺乳動物細胞中のＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を阻害するための方法であって、該方法は、該哺乳動物細胞を、該哺乳動物細胞におけるＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を阻害するに有効な量の項目１８に記載の因子と接触させる工程を包含する、方法。
（項目２４）  被験体中の薬物のバイオアベイラビリティを増加するための方法であって、該方法は、このような処置が必要な被験体に、薬物のバイオアベイラビリティを増加するに有効な量で項目１８に記載の因子を投与する工程を包含する、方法。
（項目２５）  インヒビターが前記薬物を投与する前に投与される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）  インヒビターが前記薬物と同時に投与される、項目２４に記載の方法。
（項目２７）  細胞中のＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を増加するための方法であって、該方法は、該細胞を、項目１に記載の核酸分子および項目１０に記載の核酸分子からなる群より選択される分子と、該細胞におけるＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を増加するに有効な量で接触させる工程を包含する、方法。
（項目２８）  Ｐ−糖タンパク質トランスポーター活性と関連する疾患の処置において有用な薬理学的因子に関するリード化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
項目５または項目７に記載のＰ−糖タンパク質を含む、細胞または他の膜包囲空間を提供する工程；
該細胞または他の膜包囲空間を、候補薬理学的因子の非存在下でＰ−糖タンパク質トランスポーター活性の第１の量をもたらす条件下で、該候補薬理学的因子と接触させる工程；
該Ｐ−糖タンパク質トランスポーター活性に対する該薬理学的因子の効果の尺度として、Ｐ−糖タンパク質トランスポーター活性の第２の量を決定する工程であって、ここで、該第１の量よりも少ないＰ−糖タンパク質トランスポーター活性の第２の量は、該候補薬理学的因子がＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を減少する薬理学的因子に関するリード化合物であることを示し、そしてここで、該第１の量よりも多いＰ−糖タンパク質トランスポーター活性の第２の量は、該候補薬理学的因子がＰ−糖タンパク質トランスポーター活性を増加する薬理学的因子に関するリード化合物であることを示す、工程、
を包含する、方法。
（項目２９）  項目２８に記載の方法であって、該方法は、検出可能な化合物で前記細胞または他の膜包囲空間を充填する工程であって、ここで、該化合物は、前記Ｐ−糖タンパク質トランスポーター活性の尺度として検出される工程をさらに包含する、方法。
（項目３０）  Ｐ−糖タンパク質を選択的に結合する化合物を同定するための方法であって、
項目５または項目７に記載のＰ−糖タンパク質を化合物と接触させる工程、
該化合物の該Ｐ−糖タンパク質への結合を決定する工程、
を包含する、方法。
（項目３１）  前記Ｐ−糖タンパク質のＰ−糖タンパク質トランスポーター活性に対する前記化合物の効果を決定する工程をさらに包含する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）  前記Ｐ−糖タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性に対する前記化合物の効果を決定する工程をさらに包含する、項目３０に記載の方法。
（項目３３）  Ｐ−糖タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性を決定するための方法であって、該方法は、以下：
項目１２もしくは項目１４に記載の宿主細胞、またはその膜画分を、試験薬物と接触させる工程、および
該Ｐ−糖タンパク質のＡＴＰａｓｅ活性を測定する工程、
を包含する、方法。
（項目３４）  前記ＡＴＰａｓｅ活性を測定する工程が、異なる時間に少なくとも２回実施される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）  Ｐ−糖タンパク質による化合物の膜貫通輸送を決定するための方法であって、該方法は、以下：
項目１２または項目１４に記載の宿主細胞、またはその膜画分を、試験薬物と接触させる工程、および
頂端側から側底側の方向および側底側から頂端側の方向からなる群より選択される少なくとも１つの輸送方向の傾斜条件下において、該試験薬物の輸送を測定する工程、
を包含する、方法。
（項目３６）  前記試験薬物の輸送を測定する工程が、異なる時間に少なくとも２回実施される、項目３５に記載の方法。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、１つの局面において、カニクイザルのＰ−糖タンパク質（本明細書中でカニクイザルＰＧＰという）をコードするｃＤＮＡの同定を含む。カニクイザルＰＧＰのヌクレオチド配列は、配列番号１および配列番号３として示され、そしてカニクイザルＰＧＰのアミノ酸配列は、配列番号２および配列番号４として示される。カニクイザルＰＧＰの対立遺伝子改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号３および配列番号４）は、それぞれ９ヌクレオチドおよび３アミノ酸の挿入を有するが、さもなければ配列番号１および配列番号２と同一である。密接に関連したヒトＰＧＰは、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号Ｍ１４７５８として寄託された。本明細書中に示されるポリペプチドのほとんどがヒトＰＧＰに同一であるが、カニクイザルＰＧＰは、いくつかの単一のアミノ酸差異およびヒトＰＧＰに約３６〜５８％同一である約１９〜３４アミノ酸のＮ末端ドメインを有する。上記（配列番号３および４）でいわれる対立遺伝子改変体に存在する挿入物は、このカニクイザル特異的ドメインの末端付近に位置される。驚くことに、ヒトアミノ酸配列とは異なるカニクイザルＰＧＰのＮ末端ドメインは、カニクイザルアミノ酸配列およびヒトアミノ酸配列がさもなくば１００％同一である分子の一部に位置される。Ｐ−糖タンパク質の非常に高度に保存されたタンパク質ドメインにおける、種でのこの差異は、全く予想されない。
【００３９】
本発明は、１つの局面において、カニクイザルＰＧＰ核酸およびポリペプチド、ならびにこれらが関する治療を含む。本発明はまた、前述の核酸およびポリペプチド；前述の核酸の相補体；および前述の核酸およびポリペプチドに選択的に結合する分子の、単離された機能的に等価な改変体、有用なアナログおよびフラグメントを含む。
【００４０】
本発明のカニクイザルＰＧＰ核酸およびポリペプチドは単離される。本明細書中で核酸に関して使用される場合、用語「単離された（される）」は：（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってインビトロで増幅された（される）；（ｉｉ）クローニングによって組換え的に産生された（される）；（ｉｉｉ）切断およびゲル分離によるように精製された（される）；または（ｉｖ）例えば、化学合成によって合成された（される）、ことを意味する。単離された核酸は、当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術によって容易に操作可能であるものである。従って、５’制限部位および３’制限部位が公知であるベクターまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が開示されたベクターに含まれるヌクレオチド配列は、単離されたと認識されるが、その天然の宿主中にそのネイティブな状態で存在する核酸配列は、単離されたと認識されない。単離された核酸は、実質的に精製され得るが、実質的に精製される必要はない。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター内に単離された核酸は、その核酸の存在する細胞中にその物質のほんの少しのパーセントを含み得るという点で純粋ではない。しかし、この用語が本明細書中で使用される場合、このような核酸は、単離された（される）である。なぜなら、当業者に公知の標準技術によって容易に操作可能であるからである。本明細書中で使用される場合、単離された核酸は、天然に存在する染色体ではない。
【００４１】
ポリペプチドに関して本明細書中で使用される場合、「単離された（される）」は、そのネイティブの環境から分離され、そしてその同定または使用を可能にするに十分な量で存在することを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関していわれる場合、単離された（される）は、例えば：（ｉ）発現クローニングによって選択的に産生された（される）、または（ｉｉ）クロマトグラフィーまたは電気泳動によるように精製された（される）、ことを意味する。単離されたタンパク質またはポリペプチドは、実質的に純粋であり得るが、実質的に純粋である必要はない。用語「実質的に純粋」は、タンパク質またはポリペプチドが、その意図された使用に実用的および適切である範囲で、天然にかまたはインビボの系で見出され得る他の物質が本質的にないことを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、当該分野において周知の技術によって産生され得る。単離されたタンパク質は薬学的調製物中に薬学的に受容可能なキャリアと混合され得るので、タンパク質は、調製物の少ない重量％のみを含み得る。にもかかわらず、タンパク質は、生存系において関与し得る物質から分離された（すなわち、他のタンパク質から単離された）という点で、単離された（される）である。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、カニクイザルＰＧＰ核酸は、単離された核酸分子をいう。これは、カニクイザルＰＧＰポリペプチドをコードする。このような核酸分子は、配列番号２および配列番号４ならびにこれらのフラグメントの配列を含む、カニクイザルＰＧＰポリペプチドをコードする。核酸分子は、配列番号１および配列番号３の核酸配列、ならびに、遺伝コードの縮重に起因するコドン配列において配列番号１および配列番号３の配列とは異なる核酸配列を含む。本発明のカニクイザルＰＧＰ核酸はまた、前述の核酸および前述の核酸のフラグメントの対立遺伝子を含む。このようなフラグメントは、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして、使用され得る。好ましいカニクイザルＰＧＰ核酸は、配列番号１または配列番号３の核酸配列を含む。前述の核酸の相補体はまた、本発明によって含まれる。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「カニクイザルＰＧＰ活性」は、細胞膜を横切って低分子を運び出すＰＧＰポリペプチドの能力をいう。カニクイザルＰＧＰ活性を阻害する分子（アンタゴニスト）は、ＰＧＰを介して低分子の運び出しを阻害するものであり、そしてカニクイザルＰＧＰ活性を増加する分子（アゴニスト）は、ＰＧＰを介して低分子の運び出しを増加するものである。カニクイザルＰＧＰ活性における変化は、細胞からの蛍光化合物の流出を含む、本明細書中に記載されるようなアッセイによって測定され得る。
【００４４】
本発明のカニクイザルＰＧＰ核酸の対立遺伝子は、慣用的な技術によって同定され得る。例えば、カニクイザルＰＧＰの対立遺伝子は、ｃＤＮＡライブラリーとストリンジェントな条件下で、配列番号１または配列番号３のフラグメントを少なくとも含むプローブをハイブリダイズすること、および陽性クローンを選択することによって単離され得る。従って、本発明の１つの局面は、カニクイザルＰＧＰポリペプチドをコードする核酸配列およびストリンジェントな条件下で配列番号１または配列番号３からなる核酸分子にハイブリダイズする核酸配列である。本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、当業者が精通するパラメーターをいう。核酸ハイブリダイゼーションパラメーターは、このような方法を編集する参考文献中（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９、または、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出され得る。より特定には、本明細書中で使用される場合、ストリンジェントな条件は、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％  ポリビニルピロリドン、０．０２％  ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ７）、０．５％  ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で６５℃でのハイブリダイゼーションをいう。ＳＳＣは、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム／０．１５Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７）であり；ＳＤＳは、ドデシル硫酸ナトリウムであり；およびＥＤＴＡは、エチレンジアミン３酢酸である。ハイブリダイゼーション後、その上にＤＮＡが転写される膜は、２×ＳＳＣで室温にて洗浄され、次いで、室温〜６８℃までの０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳで洗浄される。
【００４５】
同程度のストリンジェンシーを生じる、使用され得る他の条件、試薬、などが存在する。当業者は、このような条件に精通しており、従って、本明細書中で示されない。しかし、当業者が、これらの条件を、本発明のカニクイザルＰＧＰ核酸の対立遺伝子の明瞭な同定を可能にする様式で操作し得ることは明白である。当業者はまた、このような分子の発現のための細胞およびライブラリーのスクリーニング、次いで慣用的な単離、引き続く適切な核酸分子の単離および配列決定についての方法論に精通している。
【００４６】
カニクイザルＰＧＰ核酸についてのスクリーニングにおいて、サザンブロットは、放射活性なプローブとともに前述のストリンジェントな条件を使用して実施され得る。ＤＮＡが最終的に転写された膜の洗浄後に、この膜は、放射活性なシグナルを検出するためにＸ線フィルムに対して置かれ得る。
【００４７】
本発明のカニクイザルＰＧＰ核酸はまた、ネイティブな物質中に存在する核酸に対して代替的なコドンを含む縮重核酸を含む。例えば、セリン残基は、コドンＴＣＡ、ＡＧＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴおよびＡＧＣによってコードされる。これら６つのコドンの各々は、セリン残基をコードする目的について等価である。従って、セリンをコードする核酸トリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）のいずれもが、伸長するカニクイザルＰＧＰポリペプチドにセリン残基を組み込むための、インビトロまたはインビボでタンパク質合成装置を指向するために使用され得る。同様に、他のアミノ酸残基をコードする核酸トリプレットとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧおよびＣＣＴ（プロリンコドン）、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡおよびＡＧＧ（アルギニンコドン）、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧおよびＡＣＴ（スレオニンコドン）、ＡＡＣおよびＡＡＴ（アルギニンコドン）；ならびにＡＴＡ、ＡＴＣおよびＡＴＴ（イソロイシンコドン）。他のアミノ酸残基は、多様なヌクレオチド配列によって同様にコードされ得る。従って、本発明は、遺伝コードの縮重に起因するコドン配列において、生物学的に単離された核酸とは異なる縮重核酸を含む。
【００４８】
本発明はまた、改変された核酸分子を提供する。これは、１つ以上のヌクレオチドの付加、置換および欠失を含む。好ましい実施形態において、これらの改変されなかった核酸分子および／またはこれら核酸分子がコードするポリペプチドは、改変された核酸分子および／またはポリペプチドの少なくとも１つの活性または機能（例えば、トランスポーター活性など）を保持する。特定の実施形態において、改変された核酸分子は、改変されたポリペプチド、好ましくは、本明細書中の他の場所で記載されるような保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。改変された核酸分子は、改変されない核酸分子に構造的に関し、好ましい実施形態において、改変されない核酸分子に十分に構造的に関し、その結果、改変された核酸分子および改変されない核酸分子は、当業者に公知のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００４９】
例えば、単一のアミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする改変された核酸分子は、調製され得る。これらの核酸分子の各々は、本明細書中で記載されるような遺伝コードの縮重に対応するヌクレオチド変化を除いて、１、２または３ヌクレオチド置換を有し得る。同様に、２アミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする改変された核酸分子は、例えば２〜６ヌクレオチド変化を有して調製され得る。これらのような多数改変された核酸分子は、当業者によって容易に想像され得、例えば、アミノ酸２および３、２および４、２および５、２および６などをコードするコドン中のヌクレオチド置換を含む。前述の実施例において、２アミノ酸の各組合せは、改変された核酸分子ならびにアミノ酸置換をコードするヌクレオチド置換のセット中に含まれる。さらなる置換（すなわち、３以上）、付加、または欠失（例えば、停止コドンもしくはスプライシング部位の導入によって）を有するポリペプチドをコードするさらなる核酸分子はまた、調製され得、そして当業者によって容易に想像されるように本発明によって含まれる。前述の核酸またはポリペプチドのいずれもが、本明細書中に開示される核酸および／またはポリペプチドに対する構造的な関係または活性の保持について慣用的な実験によって試験され得る。
【００５０】
本発明はまた、配列番号１および配列番号３の単離されたフラグメントを提供する。これらのフラグメントは、このような核酸を同定するためのサザンブロット分析におけるプローブとして使用され得るか、またはこれらを利用するＰＣＲのような増幅アッセイにおいて使用され得る。より小さいフラグメントは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２２、２５、３０、４０、５０または７５およびこれらの間の全ての整数のヌクレオチドを含むフラグメントであり、例えば、核酸増幅手順についてのプライマーとして有用である。当業者に公知であるように、２００、２５０、３００、４００以上のヌクレオチドのような大きいプローブは、サザンブロットのような特定の使用に好ましいが、小さいフラグメントは、ＰＣＲのような使用に好ましい。フラグメントはまた、抗体を作製するかまたはポリペプチドフラグメントの結合を決定するための融合タンパク質を産生するために使用され得る。同様に、フラグメントは、例えば、抗体の調製、免疫アッセイなどにおいて有用なカニクイザルＰＧＰポリペプチドの融合されないフラグメントを産生するために利用され得る。前述の核酸フラグメントはさらに、カニクイザルＰＧＰ核酸およびポリペプチドの発現を阻害するためのアンチセンス分子として、以下により詳細に記載されるように、特に治療目的に使用され得る。
【００５１】
本発明はまた、カニクイザルＰＧＰの機能的に等価な改変体を含む。これは、カニクイザルＰＧＰの１以上の機能的な特性を残す改変体核酸およびポリペプチドを含む。好ましくは、このような改変体は、カニクイザル特異的Ｎ末端ドメイン（例えば、配列番号２のアミノ酸８６〜１０４または配列番号４のアミノ酸８６〜１０１）を含む。例えば、改変体は、分子を輸送する能力を保持するカニクイザルＰＧＰの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含む融合タンパク質を含む。なお他の機能的に等価な改変体は、配列番号２または配列番号４の配列に対するアミノ酸の短縮、欠失、点変異または付加を含み、これらは、配列番号２または配列番号４の機能を保持する。機能的に等価な改変体はまた、除去されたかまたは別のＰ−糖タンパク質からの同様のドメインによって置換されたＮ末端の一部を有するカニクイザルＰＧＰ（例えば、「ドメイン交換（ｓｗａｐｐｉｎｇ）」改変体）を含む。他の機能的に等価な改変体は、このような改変体を調製する方法と同様に、当業者に公知である。機能的に等価な改変体の活性は、本明細書中および他の種のＰ−糖タンパク質を使用するアッセイを記載した参考文献中に提供される方法を使用して決定され得る。このような改変体は、カニクイザルＰＧＰの輸送機能を結合および／または調節する化合物の同定についてのアッセイにおいて、薬物のバイオアベイラビリティを評価するために、そして輸送活性が要求されるカニクイザルＰＧＰの部分を決定するためにとりわけ有用である。
【００５２】
非機能的である改変体はまた、上記されるように調製され得る。このような改変体は、例えば、トランスポーター活性を試験する実験におけるネガティブコントロールとして有用である。
【００５３】
１つの実施形態において、カニクイザルＰＧＰ核酸は、真核生物細胞または原核生物細胞内にカニクイザルＰＧＰ核酸の発現を指向する遺伝子発現配列に作動可能に連結される。「遺伝子発現配列」は、任意の調節核酸配列（例えば、プロモーター配列またはプロモーター−エンハンサー組合わせ（これは、作動可能に連結されるカニクイザルＰＧＰ核酸の効果的な転写および翻訳を容易にする））である。遺伝子発現配列は、例えば、哺乳動物またはウイルスのプロモーター（例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター）であり得る。構成的哺乳動物プロモーターとしては、以下の遺伝子についてのプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β−アクチンプロモーターおよび他の構成的プロモーター。真核生物細胞に構成的に機能するウイルスプロモーターの例示としては、以下が挙げられる：例えば、シミアンウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニーマウス白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）由来のプロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター。他の構成的プロモーターは、当業者に公知である。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターはまた、誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、特定の金属イオンの存在下で転写および翻訳を促進するように誘導される。他の誘導性プロモーターは、当業者に公知である。
【００５４】
一般には、遺伝子発現配列は、必要ならば、それぞれ転写の開始および翻訳の開始に関与する、５’非転写配列および５’非翻訳配列（例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列など）を含む。特に、このような５’非転写配列は、作動可能に連結されたカニクイザルＰＧＰ核酸の転写制御についてのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。遺伝子発現配列は、必要ならば、所望される場合エンハンサー配列または上流のアクチベーター配列を含む。
【００５５】
カニクイザルＰＧＰ核酸配列および遺伝子発現配列は、これらが共有結合されてこの遺伝子発現配列の影響下または制御下でカニクイザルＰＧＰコード配列を転写および／または翻訳する方向に置かれる場合、「作動可能に連結される（された）」といわれる。カニクイザルＰＧＰ配列が機能的タンパク質に翻訳されることが所望される場合、２つのＤＮＡ配列は、５’遺伝子発現配列中のプロモーターの誘導がカニクイザルＰＧＰ配列の転写を生じる場合、および２つのＤＮＡ配列の間の連結の特性が以下ではない場合、作動可能に連結されるといわれる：（１）フレームシフト変異の導入を生じる、（２）カニクイザルＰＧＰ配列の転写を指向するプロモーター領域の能力を緩衝する、または（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質中に翻訳される能力を緩衝する。従って、遺伝子発現配列がカニクイザルＰＧＰ核酸配列の転写を影響し得その結果生じる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得る場合、遺伝子発現配列は、カニクイザルＰＧＰ核酸配列に作動可能に連結される。
【００５６】
本発明のカニクイザルＰＧＰ核酸分子およびカニクイザルＰＧＰポリペプチド（以下に記載されるカニクイザルＰＧＰインヒビターを含む）は、真核生物細胞または原核生物細胞に単独でかまたはベクターと組合わせて送達され得る。その最も広い意味において、「ベクター」は、以下を容易にし得る任意のビヒクルである：（１）標的細胞へのカニクイザルＰＧＰ核酸またはポリペプチドの送達、（２）標的細胞によるカニクイザルＰＧＰ核酸またはポリペプチドの取り込み、または（３）標的細胞でのカニクイザルＰＧＰ核酸またはポリペプチドの発現。好ましくは、減少した分解を伴う、カニクイザルＰＧＰ核酸分子もしくはポリペプチドの標的細胞へのベクター輸送は、ベクターの非存在を生じる分解の範囲に関する。必要ならば、「標的リガンド」は、ベクターに付着して、その標的リガンドに対する同属のレセプター（例えば、レセプター、抗体によって認識される抗原）をその表面上に発現する細胞に選択的にベクターを送達し得る。この様式において、ベクター（カニクイザルＰＧＰ核酸またはカニクイザルＰＧＰポリペプチドを含む）は、特定の細胞に選択的に送達され得る。一般には、本発明において有用なベクターは、２つのクラスに分けられる：生物学的ベクターおよび化学的／物理的ベクター。生物学的ベクターは、標的細胞へのカニクイザルＰＧＰ核酸の送達、標的細胞によるカニクイザルＰＧＰ核酸の取り込みについてより有用である。化学的／物理的ベクターは、標的細胞へのカニクイザルＰＧＰ核酸またはカニクイザルＰＧＰタンパク質の送達、標的細胞によるカニクイザルＰＧＰ核酸またはカニクイザルＰＧＰタンパク質の取り込みについてより有用である。
【００５７】
生物学的ベクターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：プラスミド、ファージミド、ウイルス、本発明の核酸配列の挿入または組み込みによって操作されたウイルスまたは細菌の供給源由来の他のビヒクル、および本発明の核酸配列に連結され得る遊離核酸フラグメント。ウイルスベクターは、生物学的ベクターの好ましい型であり、以下のウイルス由来の核酸配列を含むがこれらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルスのようなレトロウイルス；Ｈａｒｖｅｙマウス肉腫ウイルス；マウス哺乳動物腫瘍ウイルス；ラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス；アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；ポックスウイルス；レトロウイルス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；およびポリオウイルス。当該分野において名前はないが公知である他のベクターは、容易に利用され得る。
【００５８】
好ましいウイルスベクターは、必須ではない遺伝子が目的の遺伝子と置換されている、非細胞傷害性真核生物ウイルスベースである。非細胞傷害性ウイルスは、レトロウイルスを含み、このウイルスの生活環は、引き続くプロウイルスの宿主細胞のＤＮＡへの組み込みを有する、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写を含む。一般には、レトロウイルスは、複製欠損（すなわち、所望のタンパク質の合成を指向し得るが、感染性粒子を製造し得ない）である。このような遺伝的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボで高効率の遺伝子導入について一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的プロトコール（プラスミドへの外因性遺伝物質の組み込み工程、プラスミドでのパッケージング細胞株のトランスフェクション工程、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生工程、組織培養培地からのウイルス粒子の回収工程、およびウイルス粒子での標的細胞の感染工程を包含する）は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃ．Ｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）およびＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．編、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”第７巻、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）に提供される。
【００５９】
特定の適用についての別の好ましいウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損であるように操作され得、そして広範な範囲の細胞型および種を感染し得る。これは、利点（例えば、熱安定性および脂質溶媒安定性；多様な系統の細胞における高頻度の形質転換；および複数の一連の形質転換を可能にする重複感染阻害の欠失）をさらに有する。すでに報告されるように、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的様式でヒト細胞性ＤＮＡ中に組み込まれ得、これにより、挿入性変異の可能性および挿入された遺伝子の発現の可変性を最小化し得る。さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択的圧力の非存在下で１００パッセージを超える組織培養を継代した。このことは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みは、比較的安定な事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外様式で機能し得る。
【００６０】
発現について必要な要素を全て含む発現ベクターは、市販されており、そして当業者に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。細胞は、一般的に、カニクイザルＰＧＰポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体をコードする異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）の細胞への形質導入によって操作される。この異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）は、転写要素の作動可能な制御下に置かれ、宿主細胞での異種ＤＮＡの発現を可能にする。
【００６１】
哺乳動物細胞におけるｍＲＮＡ発現についての好ましい系は、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）のような系である。ｐＲｃ／ＣＭＶは、Ｇ４１８耐性を与える遺伝子のような選択マーカー（安定にトランスフェクトされた細胞株の選択を容易にする）およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター配列を含む。さらに、ｐＣＥＰ４ベクターは（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、霊長類細胞株またはイヌ細胞株における発現について適切である。これは、多コピーの染色体外要素としてプラスミドの維持を容易にする、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）複製起点を含む。別の発現ベクターは、インビトロでの効率的な転写を刺激するポリペプチド延長因子１αのプロモーターを含むｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドである。このプラスミドは、ＭｉｓｈｉｚｕｍａおよびＮａｇａｔａ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５３２２，１９９０）に記載され、トランスフェクション実験におけるその使用は、例えば、Ｄｅｍｏｕｌｉｎ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：４７１０−４７１６，１９９６）によって開示される。なお別の好ましい発現ベクターは、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔによって記載されるアデノウイルスであり、Ｅ１タンパク質およびＥ３タンパク質を欠損する（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０，１９９２）。
【００６２】
生物学的ベクターに加えて、化学的／物理的ベクターは、カニクイザルＰＧＰ核酸またはポリペプチドを標的細胞に送達してそれにより取り込みを容易にするために使用され得る。本明細書中で使用される場合、「化学的／物理的ベクター」は、単離されたカニクイザルＰＧＰ核酸またはポリペプチドを細胞に送達し得る、細菌性供給源またはウイルス性供給源由来の分子以外の天然の分子または合成分子をいう。
【００６３】
本発明の好ましい化学的／物理的ベクターは、膠様分散系である。膠様分散系は、水中油乳濁液、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系を含む。本発明の好ましい膠様系は、リポソームである。リポソームは、インビボまたはインビトロでの送達ベクターとして有用である人工膜ビヒクルである。これは、サイズが０．２〜４．０μの範囲である巨大な多層状のビヒクル（ＬＵＶ）が巨大分子を包囲し得ることを示した。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンは、水性の内部に包囲され得、そして生物学的に活性な形態で細胞中に送達され得る（Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，第６巻第７７頁（１９８１））。リポソームが効果的な核酸輸送ベクターであるためには、１以上の以下の特性が存在すべきである：（１）生物学的活性の保持を有する、目的の核酸の高効率での包囲；（２）非標的細胞に比べて、標的細胞に対する優先的および実質的な結合；（３）ビヒクルの水性内容物の標的細胞細胞質への高効率での送達；ならびに（４）遺伝情報の正確かつ効果的な発現。
【００６４】
リポソームは、特異的なリガンド（例えば、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質）へのリポソームの連結によって特定の組織に標的化され得る。特定の細胞へリポソームを標的化するために有用であり得るリガンドは、特定の細胞型または組織型に依存する。さらに、ベクターが核酸を包囲する場合、ベクターは、カニクイザルＰＧＰ核酸を宿主細胞の核へ指向する核標的化ペプチドと連結され得る。
【００６５】
リポソームは、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTMおよびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥTMとしてＧｉｂｃｏ  ＢＲＬから市販される。これらは、Ｎ−［１−（２，３
ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）のようなカチオン性脂質で形成される。リポソームを作製するための方法は、当該分野において公知であり、そして多くの刊行物に記載されている。
【００６６】
標的細胞によるカニクイザルＰＧＰ核酸の取り込みを容易にするために使用され得る他の例示的組成物としては、リン酸カルシウムおよび細胞内輸送の他の化学的メディエーター、マイクロインジェクション組成物、エレクトロポーレーションならびに（例えば、カニクイザルＰＧＰ核酸を標的細胞染色体内の予め選択された位置に組み込むための）相同組換え組成物が挙げられる。
【００６７】
本発明はまた、いわゆる発現キットを包含し、これは、技術者が所望の発現ベクターを調製することを可能にする。このような発現キットは、以前議論されたコード配列の少なくとも別個の部分を含む。必要とされる、以前に述べられた配列が含まれる限り、所望の場合、他の成分が添加され得る。
【００６８】
本発明は、発現ベクターにおけるカニクイザルのＰＧＰ  ｃＤＮＡ配列の使用、ならびに宿主細胞および細胞株（これらは、原核（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、または真核（例えば、ＣＯＳ細胞、酵母発現系および、昆虫細胞における組換えバキュロウイルス発現）である）をトランスフェクトすることを包含する。哺乳動物細胞（例えば、ヒト、ブタ、ヤギ、霊長類など）が、特に有用である。それらは、広範な種々な型であり得、そして始原細胞および細胞株を含む。特定の例としては、腸細胞および肝細胞が挙げられる。この発現ベクターは、適切な配列（すなわち、前記されるそれらの核酸）が、プロモーターに作動可能に連結されることを必要とする。
【００６９】
本発明はまた、配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列およびそれらのフラグメントを含む、単離されたカニクイザルのＰＧＰポリペプチド（これは、上記カニクイザルのＰＧＰ核酸によりコードされる）を提供する。カニクイザルのＰＧＰポリペプチドはまた、対立遺伝子、機能的に等価な改変体およびアナログ（１、２、３、４、５、またはそれ以上のアミノ酸により、開示されたカニクイザルのＰＧＰポリペプチド由来のアミノ酸配列において変化するそれらの非対立遺伝子ポリペプチド）を包含し、但し、このようなポリペプチドは、カニクイザルのＰＧＰ活性を保持する。非機能的改変体もまた、本発明により包含され；これらは、輸送体機能のアンタゴニストとして、アッセイにおけるネガティブコントロールとしてなどに有用である。このような対立遺伝子、改変体、アナログおよびフラグメントは、アッセイの成分として含む種々の目的のための、例えば、単独または融合タンパク質として有用である。
【００７０】
ポリペプチドのフラグメントは、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドの異なる機能的能力、特に種々の分子の輸送体として保持するそれらのフラグメントである。カニクイザルのＰＧＰポリペプチドのフラグメントにおいて保持され得る他の機能的能力としては、抗体との相互作用および他のポリペプチドとの相互作用（例えば、タンパク質複合体において見出される）が挙げられる。当業者は、カニクイザルのＰＧＰの機能的能力を保持するフラグメントを選択するための方法において十分に精通する。このフラグメントの機能的能力の確認は、標準的な方法に従って、フラグメントの合成および能力を試験することにより行われ得る。例えば、カニクイザルのＰＧＰフラグメントの輸送体活性を試験するために、分子輸送体が、測定され得る細胞において、フラグメントを挿入または発現する。当該分野において標準的であるこのような方法が、本明細書中にさらに記載される。
【００７１】
本発明は、上記のカニクイザルのＰＧＰポリペプチドの改変体を包含する。本明細書中に記載されるように、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドの「改変体」は、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドの主なアミノ酸配列に対する１つ以上の改変を含むポリペプチドである。カニクイザルのＰＧＰ改変体を作製する改変は、種々の理由のためにカニクイザルのＰＧＰポリペプチドに対して作製され得、これは以下を含む：１）カニクイザルのＰＧＰポリペプチドの活性（例えば、輸送）を低減するかまたは除去すること；２）カニクイザルのＰＧＰポリペプチドの特性（例えば、発現系におけるタンパク質安定性またはタンパク質−タンパク質結合の安定性）を増強すること；３）カニクイザルのＰＧＰポリペプチドに対する新規の活性または特性（例えば、抗原エピトープの添加または検出可能部分の添加）を提供すること；または４）アミノ酸置換が分子輸送体活性に影響するかまたはしないことを確立すること、を含む。カニクイザルのＰＧＰポリペプチドに対する改変は、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドをコードする核酸に対して代表的に作製され、そしてアミノ酸部分または非アミノ酸部分の欠失、点変異、短縮、アミノ酸置換および付加が挙げられ得る。あるいは、改変は、例えば、切断、リンカー分子の付加、検出可能部分の付加（例えば、ビオチン）、脂肪酸の付加などにより、ポリペプチドに直接作製され得る。改変はまた、カニクイザルのＰＧＰアミノ酸配列の全てまたは１部を含む融合タンパク質を含む。当業者は、タンパク質配列における変化のタンパク質構造に関する効果を予測するための方法に精通し、従って、公知の方法に従って、改変体カニクイザルのＰＧＰを「設計」し得る。このような方法の１つの例は、ＤａｈｉｙａｔおよびＭａｙｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：８２−８７，１９９７に記載され、これにより、タンパク質は、新規に設計され得る。方法は、ポリペプチド配列の１つの部分のみを変更するために公知のタンパク質に適用され得る。ＤａｈｉｙａｔおよびＭａｙｏの計算方法を適用することにより、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドの特異的な改変体が提案され、そして改変体が所望の構造を保持するか否かを決定することが試験される。
【００７２】
改変体としては、特に、その生理学的活性に関連しないポリペプチドの特徴を変更するために改変されるカニクイザルのＰＧＰポリペプチドが挙げられる。例えば、システイン残基は、所望しないジスルフィド結合を防ぐために置換され得るかまたは欠失され得る。同様に、特定のアミノ酸は、発現系におけるプロテアーゼによるタンパク質分解を除去することにより、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドの発現を増強するために変化され得る（例えば、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母発現系における二塩基性アミノ酸残基）。
【００７３】
カニクイザルのＰＧＰポリペプチドをコードする核酸の変異は、コード配列のアミノ酸読み取り枠を好ましくは保存し、そして２次構造（例えば、ヘアピンまたはループ）を形成するためにハイブリダイズしそうな核酸における領域（これは、改変体ポリペプチドの発現に対して有害であり得る）を好ましくは作製しない。
【００７４】
変異は、アミノ酸置換を選択することによるか、またはこのポリペプチドをコードする核酸において選択される部位の無作為な変異誘発により作製され得る。次いで、改変体ポリペプチドは、どの変異体が所望の特性を有する改変体ポリペプチドを提供するかを決定するために発現され、そして１つ以上の活性について試験される。さらなる変異体が、ポリペプチドのアミノ酸配列に関してサイレントであるが、特定の宿主における翻訳のために好ましいコドンを提供する改変体に対して（または、非改変体カニクイザルのＰＧＰポリペプチド）に対して作製され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける核酸の翻訳のために好ましいコドンが、当業者に周知である。なお他の変異が、このポリペプチドの発現を増強するためにカニクイザルのＰＧＰ遺伝子またはｃＤＮＡクローンの非コード配列に対して作製され得る。
【００７５】
カニクイザルのＰＧＰポリペプチドの改変体の活性は、改変体カニクイザルのＰＧＰポリペプチドをコードする遺伝子を、細菌または哺乳動物発現ベクターへクローニングし、適切な宿主細胞中にこのベクターを導入し、改変体カニクイザルのＰＧＰポリペプチドを発現し、そして本明細書中に開示されるようなカニクイザルのＰＧＰポリペプチドの機能的能力について試験することにより、試験され得る。例えば、改変体カニクイザルのＰＧＰポリペプチドは、以下の例に示されるように、分子輸送体（例えば、流出）を提供する能力について試験され得る。他の改変体ポリペプチドの調製は、他の活性の試験に好まれ得、これは当業者に公知である。
【００７６】
当業者はまた、保存的アミノ酸置換が、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドにおいて、前述のポリペプチドの機能的に等価な改変体（すなわち、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドの機能的能力を保持する改変体）を提供するために作製され得る。本明細書中で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が作製されるポリペプチドに特徴的な、相対的な電荷または相対的なサイズを変更しないアミノ酸置換をいう。改変体は、このような方法を集めた参考文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏａｒｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）において見出されるような、当業者に公知のポリペプチド配列を変更するための方法に従って、調製され得る。カニクイザルのＰＧＰポリペプチドの例示的な機能的に等価な改変体としては、配列番号２または配列番号４の保存的アミノ酸置換が挙げられる。アミノ酸の保存的置換は、以下の群内のアミノ酸の中で作製される置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００７７】
カニクイザルのＰＧＰの機能的に等価な改変体を産生するためのカニクイザルのＰＧＰポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、代表的に、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、配列番号１または３）の変更により作製される。このような置換は、当業者に公知の種々の方法により作製され得る。例えば、アミノ酸置換は、Ｋｕｎｋｅｌの方法（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４８８−４９２、１９８５）に従って、ＰＣＲ指向性変異、部位指向性変異誘発により、またはカニクイザルのＰＧＰポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成により作製される。カニクイザルのＰＧＰポリペプチドの機能的に等価なフラグメントの活性が、化合物の膜貫通輸送を媒介するために、変更されたカニクイザルのＰＧＰポリペプチドをコードする遺伝子を、細菌性発現ベクターまたは哺乳動物発現ベクター中にクローニングし、このベクターを適切な宿主細胞中に導入し、この変更されたカニクイザルのＰＧＰポリペプチドを発現し、そしてカニクイザルのＰＧＰポリペプチドの能力を試験することにより、試験され得る。化学的に合成されるペプチドが、機能について直接試験され得る。
【００７８】
当業者に周知の種々の方法論が、単離されたカニクイザルのＰＧＰ分子を得るために利用され得る。ポリペプチドは、クロマトグラフィー手段または免疫学的認識により、このポリペプチドを天然に産生する細胞から精製され得る。あるいは、発現ベクターは、このポリペプチドの産生を引き起こすために細胞に導入され得る。別の手段において、ｍＲＮＡ転写物が、コードされたポリペプチドの産生を引き起こすために、細胞に微小注入されてもよいし、またはその他の手段で細胞導入されてもよい。無細胞系抽出物（例えば、網状赤血球溶解産物系）におけるｍＲＮＡの翻訳もまた、ポリペプチドを産生するために使用され得る。当業者はまた、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドを単離するための公知の手段に容易に従い得る。これらとしては、免疫クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび免疫親和性クロマトグラフィーが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７９】
本明細書中に記載されるような発明は、多数の使用を有し、そのいくつかは、その他で本明細書中に記載される。例えば、本発明は、例えば、標準的なプロトコールを使用して単離され得る多量のポリペプチドを産生するための組換え核酸の発現により、カニクイザルのＰＧＰポリペプチド分子の単離を可能にする。別の例として、カニクイザルのＰＧＰ遺伝子の単離は、カニクイザルのＰＧＰが、分子輸送のアッセイのための方法（例えば、薬物のバイオアベイラビリティ研究）において使用されることを可能にする。これらの方法は、この薬物のバイオアベイラビリティを決定または予測するための方法として、最初の種のＰＧＰ（例えば、カニクイザルの、イヌ）による薬物の輸送を、他の種のＰＧＰ（例えば、ヒト）による薬物の輸送に対する比較において、決定することを含む。従って、薬物の代謝における動物研究全体の結果が、薬物のＰ糖タンパク質輸送の、相対的速度または量の点で評価され得る。例えば、イヌに投与される薬物が、優れた経口バイオアベイラビリティおよびイヌＰＧＰによる低い輸送を有する場合、ヒトＰＧＰによる輸送もまた低い場合に、ヒトにおける薬物の経口バイオアベイラビリティは優れていることが予測され得る。逆に、ヒトＰＧＰによる薬物の輸送が高い場合、次いで、薬物のバイオアベイラビリティは、低いことが予測される。
【００８０】
本発明はまた、カニクイザルのＰＧＰ核酸分子またはペプチドに選択的に結合する因子ならびに本明細書中に記載されるようなポリペプチドおよび核酸の改変体およびフラグメントに結合する因子を包含する。この因子は、カニクイザルのＰＧＰ、およびアンチセンス核酸に結合するポリペプチドを含み、この両方が、以下により詳細に記載される。この因子は、カニクイザルのＰＧＰ活性を阻害または増大し得る（それぞれ、アンタゴニストおよびアゴニスト）。
【００８１】
この因子のいくつかは、インヒビターである。カニクイザルのＰＧＰインヒビターは、細胞膜を横切る分子のカニクイザルのＰＧＰ媒介輸送を阻害する因子である。流出アッセイは、カニクイザルのＰＧＰインヒビターが、カニクイザルのＰＧＰ活性を阻害する能力を有するか否か、およびこの阻害が選択的であるか否かを、スクリーニングおよび／または決定するために実施され得る。流出の例示的アッセイは、実施例において、以下に記載される。
【００８２】
１つ実施形態において、カニクイザルのＰＧＰインヒビターは、細胞におけるカニクイザルのＰＧＰ（または他の種のＰＧＰ）の発現を低減するために、カニクイザルのＰＧＰ核酸分子に選択的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。これは、実質的に任意の医学的条件において所望され、ここで、ＰＧＰ輸送活性の低減は、例えば、細胞における細胞傷害性因子の維持を増加するために所望される。
【００８３】
本明細書中に使用される場合、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」は、生理学的条件下で、特定の遺伝子を含むＤＮＡまたはその遺伝子のｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズし、そしてそれにより、その遺伝子の転写および／またはそのｍＲＮＡの翻訳を阻害する、オリゴヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、改変されたオリゴヌクレオチド、または改変されたオリゴデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを記載する。このアンチセンス分子が設計され、その結果、標的遺伝子または転写物とのハイブリダイゼーションに関して、標的遺伝子の転写または翻訳を仲介する。当業者は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドの正確な長さおよびその標的との相補性のその程度は、選択された特定の標的に依存し、これは、この標的の配列およびその配列を含む特定の塩基を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、構築されかつ配置され、その結果、生理学的条件下で、標的と選択的に結合する（すなわち、生理学的条件下で、標的細胞における任意の他の配列に対してより多く、標的配列に実質的にハイブリダイズする。配列番号１もしくは３、または対立遺伝子もしくはホモログゲノム配列および／もしくはｃＤＮＡ配列に基づいて、当業者は、本発明に従って、使用のために多数の適切なアンチセンス分子のいずれかを容易に選択し、かつ合成し得る。阻害に関して、十分選択的であり、かつ強力であるために、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドが、この標的に相補的である、少なくとも１０、およびより好ましくは、少なくとも１５の保存的塩基を含むべきであるが、特定の場合、７塩基長と同じくらい短い改変されたオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして首尾よく使用された（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４０−８４４、１９９６）。最も好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０〜３０塩基の相補的な配列を含む。その遺伝子またはｍＲＮＡ転写物の任意の領域に対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドが選択され得るが、好ましい実施形態において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｎ末端部位または５’上流部位（例えば、翻訳開始部位、転写開始部位、またはプロモーター部位）に対応する。さらに、３’上流領域が、標的化され得る。ｍＲＮＡスプライシングに対する標的化もまた、当該分野において使用されていたが、代替のｍＲＮＡスプライシングが生じる場合、あまり好まれ得ない。さらに、このアンチセンスは、好ましくは、ｍＲＮＡ２次構造が期待されない部位（例えば、Ｓａｉｎｉｏら、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１４（５）：４３９−４５７、１９９４を参照のこと）およびポリペプチドが結合することが期待されない部位に、好ましくは、標的化される。従って、本発明はまた、配列番号１または３を含むカニクイザルのＰＧＰ核酸に対応する対立遺伝子または相同なｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた提供する。
【００８４】
実施形態の１つの組において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「天然の」デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組み合わせからなり得る。つまり、あるネイティブなヌクレオチドの５’末端および別のネイティブなヌクレオチドの３’末端が、ホスホジエステルヌクレオシド内連結を介して、天然の系として共有結合され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、手動または自動合成により実施され得る、当該分野で認識される方法により、調製され得る。それらはまた、ベクターにより、組換え的に産生され得る。
【００８５】
しかし、好ましい実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、「改変された」オリゴヌクレオチドを含み得る。つまり、このオリゴヌクレオチドは、これらが、これらの標的にハイブリダイズすることを妨げないが、それらの安定性または標的化を増強するか、またはその他に、それらの治療的有効性を増強する多数の方法で改変され得る。
【００８６】
本明細書中で使用されるような、用語「改変されたオリゴヌクレオチド」は、（１）そのヌクレオチドの少なくとも２つが、合成ヌクレオシド内連結（すなわち、１つのヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチドの３’末端との間のホスホジエステル連結以外の連結）を介して共有結合され、そして／または（２）核酸と通常会合しない化学基が、このオリゴヌクレオチドに共有結合されたオリゴヌクレオチドを記載する。好ましい合成ヌクレオシド内連結は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、ホスフェートエステル、アルキルホスホロチオエート（ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラミデート、カルバメート、カルボネート、ホスフェートトリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。
【００８７】
用語「改変されたオリゴヌクレオチド」はまた、共有結合的に、改変された塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。例えば、改変されたオリゴヌクレオチドは、３’位置のヒドロキシル基以外および５’位置のリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合される骨格糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。従って、改変されたオリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含み得る。さらに、改変されたオリゴヌクレオチドは、リボースの代わりに、アラビノースのような糖を含み得る。従って、本発明は、生理学的条件下で、薬学的に受容可能なキャリアと一緒に、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドをコードする核酸と相補的であり、そしてそれとハイブリダイズする改変されたアンチセンス分子を含む薬学的調製物を、企図する。
【００８８】
カニクイザルのＰＧＰを結合する因子はまた、結合ペプチド、ならびにカニクイザルのＰＧＰポリペプチドおよびカニクイザルのＰＧＰポリペプチドを含む複合体に結合する他の分子を含む。この結合分子がインヒビターである場合、この分子は、カニクイザルのＰＧＰに結合し、その活性を阻害する。カニクイザルのＰＧＰ結合因子が、カニクイザルのＰＧＰに結合するか否かを決定するために、任意の公知の結合アッセイが使用され得る。例えば、この結合因子は、表面に固定され得、次いで標識されたカニクイザルのＰＧＰポリペプチドと接触され得る。次いで、カニクイザルのＰＧＰ結合因子と相互作用するカニクイザルのＰＧＰの量またはカニクイザルのＰＧＰ結合因子に結合しない量は、カニクイザルのＰＧＰ結合因子が、カニクイザルのＰＧＰに結合するか否かを決定するために定量され得る。
【００８９】
カニクイザルのＰＧＰ結合因子は、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドに選択的または優先的に結合する多数のサイズおよび型の分子、ならびにカニクイザルのＰＧＰポリペプチドおよびそれらの結合パートナーの両方の複合体を含む。これらの分子は、種々の供給源に由来し得る。例えば、カニクイザルのＰＧＰ結合因子は、固定された形態において、またはファージディスプレイライブラリーとして、溶液中で容易に調製され得る変性ペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより提供され得る。１つ以上のアミノ酸を含むペプチドのコンビナトリアルライブラリーもまた、合成され得る。ペプチド合成部分および非ペプチド合成部分のライブラリーが、さらに合成され得る。
【００９０】
ファージディスプレイが、本発明にしたがった有用な結合ペプチドを同定することにおいて特に有効であり得る。簡潔には、ファージライブラリー（例えば、ｍ１３、ｆｄ、またはλファージを使用する）を調製し、従来の方法を使用して、４〜約８０個のアミノ酸残基由来の挿入物をディスプレイする。この挿入物は、例えば、完全に変性したか、または偏ったアレイを示し得る。次いで、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドに結合するファージ保有挿入物を選択し得る。このプロセスは、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドに結合するファージの再選択のいくつかのサイクルを介して繰り返され得る。繰り返されるラウンドは、特定の配列を保有しているファージの富化に導く。ＤＮＡ配列分析は、発現されたポリペプチドの配列を同定するために行われ得る。カニクイザルのＰＧＰポリペプチドに結合する配列の最小の線形部分が、決定され得る。１つ以上のさらなる変性残基をその上流または下流に加えた最小の線形部分の一部または全てを含む挿入物を含む偏ったライブラリーを使用して、この手順を繰り返し得る。酵母ツーハイブリッドスクリーニング法はまた、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドに結合するポリペプチドを同定するために使用され得る。従って、本発明のカニクイザルのＰＧＰポリペプチドまたはそのフラグメントが、ペプチドライブラリー（ファージディスプレイライブラリーを含む）をスクリーニングするために、本発明のカニクイザルのＰＧＰポリペプチドのペプチド結合パートナーを同定かつ選択するために、使用され得る。このような分子は、記載されるように、スクリーニングアッセイのために、精製プロトコールのために、カニクイザルのＰＧＰの機能と直接干渉するために、および当業者に明らかである他の目的のために使用され得る。
【００９１】
従って、本発明は、一般的に、薬理学的因子または異常なＰＧＰ活性と関連する状態の処置に有用である因子についてのリード化合物ならびにそこで同定される化合物および因子を同定する有効な方法を提供する。一般的に、スクリーニング方法は、カニクイザルのＰＧＰを介した分子の輸送を阻害または増強する化合物についてのアッセイを包含する。このような方法は、化合物の、自動化されたハイスループットスクリーニングに適合される。このような方法の例は、米国特許第５，４２９，９２１号において記載される。
【００９２】
薬理学的因子についての種々のアッセイが、提供され、これには、標識されたインビトロタンパク質結合アッセイ、検出可能な分子を使用した流出アッセイなどが含まれる。例えば、タンパク質結合スクリーニングが、カニクイザルのＰＧＰへの候補薬理学的因子の結合を迅速に調べるために使用される。この候補薬理学的因子は、例えば、コンビナトリアルペプチドライブラリーに由来し得る。このようなアッセイのための従来の試薬は、当該分野で公知である。流出の例示的細胞ベースアッセイは、検出可能に標識された分子の流出が生じ得る条件下で、候補薬理学的因子と、カニクイザルのＰＧＰを有する細胞とを接触することを含む。特定の条件は、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｓｈａｒｏｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５８：５７１−５８６、１９９９およびそこで引用される参考文献に記載される。候補薬理学的因子の存在における流出の低減は、この候補薬理学的因子が、カニクイザルのＰＧＰの流出活性を低減することを示す。候補薬理学的因子の存在における流出の増加は、候補薬理学的因子が、カニクイザルのＰＧＰの流出活性を増大することを示す。
【００９３】
本発明の方法において使用されるカニクイザルのＰＧＰは、単離されたポリペプチドとして（ここで候補薬理学的因子の結合が、測定されるべきである）、またはカニクイザルのＰＧＰポリペプチドを含む細胞または他の膜で包囲された空間として、アッセイ混合物に添加され得る。後者のアッセイ構成において、細胞または他の膜で包囲された空間は、予め装填されるポリペプチドとして、または核酸としてカニクイザルのＰＧＰを含み得る（例えば、カニクイザルのＰＧＰを含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞）。本明細書中に記載されたアッセイにおいて、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドが、組換え的に産生され得るか、または生物学的抽出物から単離され得るが、好ましくは、インビトロで合成される。カニクイザルのＰＧＰポリペプチドは、別のポリペプチド（例えば、タンパク質−タンパク質結合を提供もしくは増強するか、またはアッセイ条件下で、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドの安定性を増強することが可能なポリペプチド）との、カニクイザルのＰＧＰポリペプチドの融合物を含むキメラタンパク質を含む。カニクイザルのＰＧＰポリペプチドに融合されたポリペプチドまたはそのフラグメントはまた、例えば、免疫学的認識によるか、または蛍光標識により、融合タンパク質を容易に検出する手段を提供し得る。
【００９４】
アッセイ混合物はまた、候補薬理学的因子を含む。代表的には、複数のアッセイ混合物が、種々の濃度に対して異なる応答を得るために、異なる因子の濃度と平行して行われる。代表的に、これらの濃度の１つは、ネガティブコントロール（すなわち、因子のゼロ濃度で、または、アッセイ検出の限度以下の因子の濃度で）として働く。候補因子は、多数の化学クラスを含むが、代表的に、それらは有機化合物である。好ましくは、候補薬理学的因子は、小さい有機化合物であり、すなわち、それらは、５０より大きいが、約２５００未満の分子量を有する化合物）である。候補因子は、ポリペプチドと構造的な相互作用に必要である官能基の化学基を含み、そして代表的には、少なくとも１つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの官能基の化学基およびより好ましくは少なくとも３つの官能基の化学基を含む。この候補因子は、１つ以上の上記同定された官能基で置換された環状炭素または複素環式構造および／または芳香族構造もしくは多芳香族構造を含み得る。候補因子はまた、生体分子（例えば、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上記の誘導体もしくは構造的アナログ、またはそれらの組み合わせなど）であり得る。この因子が核酸である場合、この因子は、代表的にはＤＮＡまたはＲＮＡ分子であるが、非天然結合またはサブユニットを有する改変された核酸もまた、企図される。
【００９５】
候補因子は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む広範な種々の供給源から得られる。例えば、多数の手段が、広範な種々の有機化合物および生体分子の無作為および指向された合成に利用可能であり、これは、無作為化されたオリゴヌクレオチドの発現、合成有機コンビナトリアルライブラリー、無作為ペプチドのファージディスプレイライブラリーなどを含む。あるいは、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形態における天然の化合物のライブラリーが、利用可能であるかまたは容易に産生される。さらに、天然にそして合成的に産生されるライブラリーおよび化合物が、従来の化学的手段、物理学的手段、および生化学的手段を通じて容易に改変され得る。さらに、既知の薬理学的因子は、指向されるかまたは無作為の化学的改変（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などに供され、その因子の構造的アナログを産生し得る。
【００９６】
従って、候補因子の供給源は、公知のＰ−糖タンパク質インヒビターに基づいた分子のライブラリーであり、ここで、このインヒビターの供給源は、より多くもしくはより少ない化学的部分または異なった化学的部分を保有するように、分子の１以上の位置において変化している。アナログインヒビターのライブラリーを作成する際に分子を作製するために行なわれる構造的変化は、方向付けられるか、無作為であるか、あるいは、方向付けられるかまたは無作為の組み合わせの置換であり得るかそして／または付加であり得る。組換えライブラリーの調製の当業者は、既存のＰ−糖タンパク質インヒビターに基づいたこのようなライブラリーを容易に調製する。
【００９７】
種々の他の試薬はまた、混合物中に含まれ得る。これらとしては、塩、緩衝液、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などの試薬が挙げられ、これらは、最適なタンパク質−タンパク質および／またはタンパク質−核酸結合を容易にするために使用され得る。このような試薬はまた、反応物成分の非特異的またはバックグラウンドの相互作用を低減し得る。プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物剤などのようなアッセイの効率を改善する他の試薬もまた使用され得る。
【００９８】
前述のアッセイ材料の混合物は、候補薬学的因子の存在を除き、カニクイザルＰＧＰが、薬物としての化合物の制御量の流出を媒介する条件下でインキュベートされる。候補薬学的因子のカニクイザルＰＧＰへの結合を決定するために、混合物を結合を可能にする条件下でインキュベートする。成分の添加の順序、インキュベーション温度、インキュベーションの時間、およびアッセイの他のパラメーターは、容易に決定され得る。このような実験法は単にアッセイパラメーターの最適化を含むのではなく、アッセイの基本的な組成物をも含む。インキュベーション温度は、代表的には、約４℃と４０℃の間である。インキュベーション時間は、好ましくは、迅速な高度なスループットスクリーニングを容易にするために最小化され、そして代表的には、１分と１０時間との間である。
【００９９】
インキュベーション後、流出のレベル、またはカニクイザルＰＧＰポリペプチドと候補薬学的因子との間の特異的な結合のレベルを、使用者に利用可能な任意の簡便な方法によって検出する。細胞遊離結合型アッセイについて、分離段階はしばしば、非結合成分から結合成分を分離するために使用される。この分離段階は、種々の方法によって達成され得る。簡便には、少なくとも１つの成分が固体基板上に固定され、そこから非結合成分は簡単に分離され得る。固体基板は、広範な種々の材料から作製され得、そして広範な種々の形状（例えば、マイクロタイタープレート、マイクロビーズ、ディップスティック、ビーズ粒子など）であり得る。この基板は、好ましくは、ノイズに対するシグナル率を最大にするために、主にバックグラウンド結合を最小化するため、ならびに、分離の緩和および費用のために選択される。
【０１００】
分離は、例えば、リザーバからビーズまたはディップスティックを除去することによって、マイクロタイタープレートウェルなどのリザーバを空にするかもしくは希釈することによって、ビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラムをリンスすることによって、または洗浄溶液または溶媒を使用してろ過することによって、影響され得る。分離段階は、好ましくは、多数のリンスまたは洗浄を含む。例えば、固体支持体がマイクロタイタープレートである場合、ウェルは洗浄溶液を使用して数回洗浄され得、この洗浄溶液は、代表的には、塩、緩衝液、界面活性剤、非特異的タンパク質などの特定の結合において沈殿しないインキュベーション混合物のこれらの成分を含む。固体基板が磁性ビーズである場合、このビーズは、洗浄液を使用して１回以上洗浄され得、そして磁石を使用して単離され得る。
【０１０１】
膜貫通輸送アッセイなどの細胞ベースのアッセイのための任意の簡便な方法において、検出は影響され得る。直接的または間接的に検出可能な産物（例えば、カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）ＡＭまたはローダミン１２３のような蛍光性分子）の輸送が好ましい。細胞遊離結合アッセイについて、成分の１つは、通常、検出可能な標識を含むかまたはこれに結合される。直接的検出（例えば、放射性活性、ルミネセンス、光学または電子密度など）または間接的検出（例えば、ＦＬＡＧエピトープなどのエピトープタグ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素タグなど）を提供するような広範な種々の標識が使用され得る。この標識は、カニクイザルＰＧＰポリペプチドまたは候補薬学的因子に結合し得る。
【０１０２】
種々の方法が標識を検出するために使用され得、標識の性質および他のアッセイ成分に依存する。例えば、固体基板に結合される間かまたは固体基板から続いて分離される間、標識は検出され得る。標識は、光学密度または電子密度、放射性排出物、非放射性エネルギー伝達などを介して直接的に検出され得るかまたは抗体結合体、ストレプトアビジン結合体などを使用して間切的に検出され得る。これらの標識を検出する方法は、当該分野で周知である。
【０１０３】
カニクイザルＰＧＰ結合因子はまた、抗体であり得るかまたは機能的に活性な抗体フラグメントである。抗体は、免疫学の科学の当業者にとって周知である。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、インタクトな抗体分子だけではなく、カニクイザルＰＧＰ結合能力を保持する抗体分子のフラグメントも意味する。このようなフラグメントはまた、当該分野で周知であり、インビトロおよびインビボの両方において調節的に使用される。特に、本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性フラグメントＦ（ａｂ’）2、およびＦａｂをも意味する。インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠くＦ（ａｂ’）2およびＦａｂフラグメントは、循環からより迅速にクリアーし、そして、インタクトな抗体のより非特異的でない組織結合を有し得る（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。
【０１０４】
モノクローナル抗体は、免疫原としてカニクイザルＰＧＰまたはそのフラグメントを利用して当該分野で公知の任意の方法を使用して作成され得る。あるいは、抗体は、カニクイザルＰＧＰ活性を阻害するカニクイザルＰＧＰに特異的なポリクローナル抗体であり得る。ポリクローナル抗体の調製および使用はまた、当業者に公知である。
【０１０５】
当該分野で公知のように、抗体分子のごく一部；パラトープが、そのエピトープに対する抗体の結合に有意に関与している（一般的には、Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第７版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄを参照のこと）。ｐＦｃ’およびＦｃ領域は、例えば、相補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与していない。ｐＦｃ’領域が酵素学的に切断されているかまたはｐＦｃ’領域なしで産生された抗体、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントと命名される、は、インタクトな抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素学的に切断されたかまたはＦｃ領域なしで産生された抗体、Ｆａｂフラグメントと命名される、は、インタクトな抗体分子の抗原結合部位の１つを保持する。さらに進むと、Ｆａｂフラグメントは、共有結合した抗体軽鎖およびＦｄと示される抗体重鎖の一部からなる。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主要な決定因子であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体特異性を変更することなく１０までの異なった軽鎖と関連し得る）そしてＦｄフラグメントは単離の際、エピトープ結合能力を保持する。
【０１０６】
抗体の抗原結合部位内には、当該分野で周知のように、相補性決定領域（ＣＤＲ）が存在し、これは、抗原のエピトープおよび枠組み領域（ＦＲ）と直接的に相互作用し、この枠組み領域は、パラトープの三次構造を維持する（一般的には、Ｃｌａｒｋ，１９８６；Ｒｏｉｔｔ，１９９１を参照のこと）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄフラグメントおよび軽鎖の両方において、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲ３）によってそれぞれ分離された４つの枠組み領域が存在する（ＦＲ１からＦＲ４）。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、より特定には重鎖ＣＤＲ３が、抗体特異性について責任がある。
【０１０７】
一般的には、インタクトな抗体は、「Ｆｃ」および「Ｆａｂ」領域を含むといわれている。このＦｃ領域は、相補体活性化に関与しており、そして、抗原結合に関与していない。Ｆｃ’領域が酵素学的に切断されたかまたはＦｃ’領域なしで産生された抗体、「Ｆ（ａｂ’）2」として命名される、は、インタクトな抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素学的に切断されたかまたはＦｃ領域なしで産生された抗体、「Ｆａｂ’」フラグメントとして命名される、は、インタクトな抗体の抗原結合部位の１つを保持する。Ｆａｂ’フラグメントは、共有結合した抗体軽鎖および抗体重鎖の一部からなり、「Ｆｄ」と示される。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主要な決定因子である（単一のＦｄフラグメントは、抗体特異性を変更することなく１０までの異なった軽鎖と関連し得る）。単離されたＦｄフラグメントは、抗原エピトープに特異的に結合する能力を保持する。
【０１０８】
上記に提供されたアッセイにおいて本発明に従って有用であると同定された抗カニクイザルＰＧＰモノクローナル抗体の抗原結合Ｆａｂ’部分、ならびに関連したＦＲおよびＣＤＲ領域の配列は、当該分野で慣例的なアミノ酸配列決定方法を使用して決定され得る。哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域は、元の抗体のエピトープ特異性を保持する限り、非特異的または異種特異的抗体の対応する領域と置換され得ることが確立されている。非ヒトＣＤＲがヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合され機能的な抗体を産生する「ヒト化」抗体の開発および使用のために、この技術は有用である。カニクイザルＰＧＰ活性を阻害する非ヒト動物（例えば、マウス）抗体が同定される場合、抗体をヒト化する技術は特に有用である。これらの非ヒト化動物抗体は、本発明に従う方法において、ヒト被験体の処置における使用のためにヒト化され得る。マウス抗体をヒト化するための方法の例は、米国特許第４，８１６，５６７号、同５，２２５，５３９号、同５，５８５，０８９号、同５，６９３，７６２号および同５，８５９，２０５号において提供される。他の抗体（抗原結合能力を有するインタクトな抗体のフラグメントを含む）は、しばしば、「キメラ」抗体としていわれる。
【０１０９】
従って、当業者に明らかなように、本発明はまた、抗カニクイザルＰＧＰモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）2、およびＦａｂフラグメント；抗カニクイザルＰＧＰ抗体のＦｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列によって置換されたキメラ抗体；抗カニクイザルＰＧＰ抗体のＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同なヒトまたは非ヒト配列によって置換されたキメラＦ（ａｂ’）2フラグメント；ならびにＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同なヒトまたは非ヒト配列によって置換されたキメラＦａｂフラグメント抗体を提供する。
【０１１０】
本発明に従って、カニクイザルＰＧＰインヒビターはまた、配列番号２または４由来の「ドミナントネガティブな」ポリペプチドを含む。ドミナントネガティブなポリペプチドは、細胞性機構と相互作用することにより、活性ポリペプチドが細胞性機構と相互作用することを妨げるかまたは活性ポリペプチドと競合する、ポリペプチドの不活性な改変体であり、これによって、活性ポリペプチドの効果を減少する。例えば、リガンドと結合するが、リガンドの結合に応答してシグナルを伝達しないドミナントネガティブなレセプターは、リガンド発現の生物学的効果を減少し得る。
【０１１１】
本発明のドミナントネガティブなカニクイザルＰＧＰポリペプチドの細胞中における発現の最終結果は、分子輸送のようなＰＧＰ活性の減少である。当業者は、１つ以上のドミナントネガティブな改変体ポリペプチドを作製する標準的な変異誘発技術を使用して、カニクイザルＰＧＰポリペプチドのドミナントネガティブ改変体の能力を評価し得る。例えば、カニクイザルＰＧＰポリペプチドの本明細書中に含まれる教示を考えれば、当業者は、部位特異的変異誘発、走査変異誘発、部分的な遺伝子欠損または短縮などによって、カニクイザルＰＧＰポリペプチドの配列を改変し得る。例えば、米国特許第５，５８０，７２３号およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと。次いで、当業者は、変異誘発されたポリペプチドの集団を、カニクイザルＰＧＰ活性における減少および／またはこのような活性の保持について試験し得る。カニクイザルＰＧＰポリペプチドのドミナントネガティブな改変体を作製および試験するための方法は、当業者に明らかである。
【０１１２】
本発明の組成物の各々は、種々の治療目的または非治療目的に有用である。例えば、本発明のカニクイザルＰＧＰ核酸は、オリゴヌクレオチドプローブとして有用である。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、同一または実質的に類似の核酸配列を有するゲノムライブラリークローンまたはｃＤＮＡライブラリークローンを同定するために、本明細書中で使用される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で所望の配列にハイブリダイズし得る、適切なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセット、そのようなオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットの改変体もしくはそのフラグメントあるいはアンチセンス相補体は、当該分野で周知の手段によって合成され得（例えば、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ
ＲＮＡ，Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ編、１９８７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照のこと）、そして当該分野で公知の技術によって、その所望の配列、その改変体またはフラグメントを同定および単離するためのプローブとして使用され得る。核酸ハイブリダイゼーションおよびクローン同定の技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ（１９８９）に開示される。所望の核酸配列、あるいはその改変体またはフラグメントの検出を容易にするために（クローニング目的または配列の存在の単なる検出のいずれの目的に関わらず）、上記のプローブは、検出可能な基で標識され得る。このような検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の物質であり得る。このような物質は、核酸ハイブリダイゼーションの分野で良く開発されており、一般に、このような方法において有用な多くの標識が、本発明に適用され得る。特に有用なのは、放射性標識である。十分なシグナルを提供しそして十分な半減期を有する任意の放射性標識が、使用され得る。一本鎖の場合、オリゴヌクレオチドは、キナーゼ反応を使用して放射性標識され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドはまた、ビオチン、酵素または蛍光基のような非放射性マーカーで標識された場合にも、核酸ハイブリダイゼーションプローブとして有用である。例えば、Ｌｅａｒｙ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８０：４０４５（１９８３）；Ｒｅｎｚ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３４３５（１９８４）；およびＲｅｎｚ，Ｍ．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：８１７（１９８３）を参照のこと。
【０１１３】
さらに、カニクイザルＰＧＰ核酸の相補体が、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして有用であり得る。例えば、これは、カニクイザルＰＧＰ「ノックアウト」表現型を誘導するために、このアンチセンスオリゴヌクレオチドを動物に送達することによる。遺伝子発現をブロックするためのアンチセンスＲＮＡプローブの投与は、Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３３：８０１−８０２（１９８８）に議論される。
【０１１４】
あるいは、本発明のカニクイザルＰＧＰ核酸は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。「トランスジェニック動物」は、細胞内に人工的に挿入されたＤＮＡを含む細胞を有する動物であり、ＤＮＡは、その細胞から発生する動物のゲノムの一部となる。好ましいトランスジェニック動物は、霊長類、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌおよびネコである。トランスジェニック実験に適切な動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｌｉｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）などの標準的な商業的供給源から入手され得る。特定の疾患に関連する特定の特性を有するトランスジェニック動物は、それらの疾患に対する種々の薬物および処置方法の影響を研究するために使用され得、従って、多くのヒト疾患の研究の遺伝モデルとして機能し得る。従って、本発明は、細胞膜を通過する分子の輸送に関与する障害の研究のためのモデルとしての、カニクイザルＰＧＰノックアウト動物およびトランスジェニック動物の使用を意図する。当業者に公知の種々の方法が、本発明に関連するトランスジェニック動物の作製に利用可能である。
【０１１５】
内因性ＰＧＰ／ＭＤＲ１の不活性化または置換は、胚性幹細胞を使用する相同組換え系によって達成され得る。ＰＧＰ-/-ノックアウト表現型を有する、得られたトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、カニクイザルＰＧＰについてトランスジェニックにされ得、そしてカニクイザルＰＧＰのモジュレーター（アゴニストまたはアンタゴニスト／インヒビター）としての化合物のスクリーニングのモデルとして使用され得る。この様式で、このような治療薬物が同定され得る。
【０１１６】
さらに、カニクイザルＰＧＰの正常または変異体バージョンを生殖系列に挿入し、カニクイザルＰＧＰの正常または変異体形態を構成的または誘導的に発現するトランスジェニック動物を作製し得る。これらの動物は、細胞におけるカニクイザルＰＧＰの役割および機能を規定するための研究において有用である。
【０１１７】
本発明の組成物はまた、治療目的に有用である。従って、本発明は、哺乳動物細胞においてカニクイザルＰＧＰ活性を阻害するための方法を包含する。本発明はさらに、細胞におけるカニクイザルＰＧＰ活性を減少または増加するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、哺乳動物細胞に、その哺乳動物細胞の分子輸送を阻害するのに有効な量のカニクイザルＰＧＰの核酸またはポリペプチドを接触させる工程を包含する。このような方法は、例えば、薬物耐性および薬物バイオアベイラビリティの減少に関与する機構を解明する目的のために、インビトロで有用である。
【０１１８】
本発明はまた、細胞または被験体においてＰＧＰ発現を増加するための方法を包含する。カニクイザルＰＧＰの量は、細胞または被験体における膜貫通輸送を増加するのに有効な量の本発明のＰＧＰ核酸またはＰＧＰポリペプチドを、細胞に接触させるかまたは被験体に投与することによって、このような細胞または被験体において増加され得る。ＰＧＰ活性の増加は、本明細書中に記載のアッセイ（例えば、膜貫通輸送のアッセイ）によって測定され得る。
【０１１９】
本発明の調製物は、有効量で投与され得る。有効量とは、単独でかまたはさらなる用量と共に、所望の応答を生成する薬学的調製物の量である。もちろん、このような量は、処置される特定の状態、その状態の重篤度、個々の患者のパラメーター（年齢、身体的条件、サイズおよび体重を含む）、処置の継続時間、併用治療（もしあれば）の特性、特定の投与経路、およびこのような医療従事者の知識および技術内の因子に依存する。最大用量（すなわち、正確な医学的判断に従う、最も高い安全用量）が使用されることが、一般的に好ましい。しかし、患者が、医学的理由、心理学的理由または実質的に任意の他の理由のために、より低用量または許容可能な用量を要求し得ることは、当業者に理解される。
【０１２０】
一般に、活性化合物の用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日である。５０〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量が適切であり、そして１日あたり１回または数回で投与される。より低い用量は、他の投与形態（例えば、静脈内投与）から生じる。被験体における応答が適用した初回用量で不十分である場合には、より高い用量（すなわち、異なるより局在化した送達経路による、効果的なより高い用量）が、患者の耐性が許容する程度に使用され得る。１日あたり複数回の用量が、適切な全身の化合物レベルを達成するために意図されるが、化合物が、徐放性医薬または持続放出医薬として調製される場合には、より少数回の用量が与えられる。
【０１２１】
投与される場合、本発明の薬学的調製物は、薬学的に受容可能な量でかつ薬学的に受容可能な組成物において適用され得る。このような調製物は、塩、緩衝化剤、保存剤、適合性のキャリア、および必要に応じて他の治療剤を、慣用的に含み得る。医薬において使用される場合、塩は、薬学的に受容可能であるが、薬学的に受容可能でない塩が、その薬学的に受容可能な塩を調製するために都合よく使用され、そして本発明の範囲から排除されない。このような薬理学的かつ薬学的に受容可能な塩としては、以下の酸から調製される塩が挙げられるが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。また、薬学的に受容可能な塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩）として調製され得る。
【０１２２】
本発明に従う有用なカニクイザルＰＧＰインヒビターまたはカニクイザルＰＧＰの核酸およびポリペプチドは、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアと合わせられ得る。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、ヒトへの投与に適切な、１以上の適合性の固体充填剤または液体充填剤、希釈剤あるいは包囲物質を意味する。用語「キャリア」とは、適用を容易にするために活性成分と合わせられる、有機成分または無機成分（天然性または合成性）を示す。薬学的組成物の成分は、所望の薬学的効力を実質的に損なう相互作用が存在しない様式で、本発明の分子と、および互いに、混合され得る。
【０１２３】
薬学的組成物は、適切な緩衝化剤を含み得、これらとしては、酢酸（塩）；塩クエン酸（塩）；およびリン酸（塩）が挙げられる。
【０１２４】
薬学的組成物はまた、必要に応じて、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールのような、適切な保存剤を含み得る。
【０１２５】
種々の投与経路が利用可能である。もちろん、選択される特定の様式は、選択される特定の化合物、処置される状態の重篤度、および治療効力に必要とされる投薬に依存する。一般的に言うと、本発明の方法は、医学的に受容可能な任意の投与様式を使用して行われ、この様式は、臨床的に受容可能でない有害な効果を引き起こすことなく効果的なレベルの活性化合物を生成する任意の様式を意味する。このような投与様式としては、経口経路、直腸経路、局所経路、鼻内経路、経皮（ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ）経路または非経口経路が挙げられる。用語「非経口」とは、皮下、静脈内、髄腔内、筋内または注入が挙げられる。静脈内経路または筋内経路が、特にではないが、長期の治療および予防に適切である。
【０１２６】
薬学的組成物は、単位投薬形態で都合よく存在し得、そして薬学分野で周知の任意の方法によって調製され得る。全ての方法は、活性因子を、１以上の補助的成分を構成するキャリアと会合させる工程を包含する。一般に、組成物は、活性化合物を、液体キャリア、細粒固体キャリアまたは両方と、均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて、生成物を形付けることによって調製される。
【０１２７】
経口投与に適切な組成物は、個別の単位（例えば、カプセル剤、錠剤、ロゼンジ）として存在して、これらは各々、所定の量の活性化合物を含む。他の組成物としては、水性の液体または非水性の液体（例えば、シロップ、エリキシルまたはエマルジョン）中の懸濁液が挙げられる。
【０１２８】
非経口投与に適切な組成物は、都合よくは、カニクイザルＰＧＰインヒビターまたはカニクイザルＰＧＰの核酸およびポリペプチドの滅菌水性調製物を含み、この調製物は、好ましくは、レシピエントの血液と等張性である。この水性調製物は、適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を使用して、公知の方法に従って処方され得る。滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌の注射可能な溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液）であり得る。使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒としては、とりわけ、水、リンゲル溶液、および等張性の塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌の不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として都合よく使用される。この目的のために、任意の無菌の（ｂｌａｎｄ）不揮発性油が使用され、これには、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドが挙げられる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸が、注射剤の調製物に使用され得る。経口投与、皮下投与、静脈内投与、髄腔内投与、筋内投与などに適切なキャリア処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに見い出され得る。
【０１２９】
他の送達系としては、時限放出（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅ）、遅延放出（ｄｅｌａｙｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）または持続放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）送達系（例えば、上記で議論される生物学的／化学的ベクター）が挙げられ得る。このような系は、活性化合物の繰り返しの投与を回避し得、これが、被験体および主治医に対する簡便性を増加する。多くの型の放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。長期持続放出移植片の使用が所望され得る。本明細書中で使用される長期放出とは、その移植片が、少なくとも３０日間、そして好ましくは６０日間、治療レベルの活性成分を送達するように構築および配置されることを意味する。長記持続放出移植片は、当業者に周知であり、そしてこれらには、上記の放出系のいくらかが含まれる。
【０１３０】
本発明は、以下の実施例を参照してより完全に理解される。しかし、これらの実施例は、本発明の実施形態を例示するために単に意図され、本発明の範囲を限定すると解釈されない。
【０１３１】
（実施例）
（実施例１：カニクイザルＰ−糖タンパク質の単離）
ｃＤＮＡライブラリーを、標準的なプロトコールに従って、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ｍＲＮＡを使用して調製した。ヒトＰ−糖タンパク質ＤＮＡプローブを用いて、Ｐ−糖タンパク質クローンについて、このライブラリーをスクリーニングした。クローンを、標準的な手順に従って、単離し、精製し、そして配列決定した。
【０１３２】
（ライブラリーの調製）
カニクイザル肝臓由来のカスタムλＺＡＰ  ＩＩ  ｃＤＮＡライブラリーは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅによって調製された。このテンプレートを用いて、クローン７２／７３および７９／７７  １５００を得た。
【０１３３】
サルが、ヒトＰＧＰに対して実質的な相同性を示すと予期して、初回プライマーを、ヒトＰＧＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ１４７５８）から設計した。プライマーはまた、λＺＡＰ  ＩＩベクター配列に基づいた。後期のプライマーを、サル配列またはサル／ヒト配列の組み合わせに基づいて設計した。使用されたすべてのプライマーを以下に列挙する。
【０１３４】
【表１】
2012065671.tif 000002
すべてのＰＣＲ反応を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ９７００サーモサイクラーを使用して実施した。ＰＣＲ産物を、アガロースゲルにおいて分析し、そして有望なバンドを、製造業者の指示に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。これらのバンドを、ｐＣＲ２．１中に連結し、そして製造業者の指示に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇプロトコールを使用してＩＮＶａＦに形質転換した。白色コロニーを拾い、そして制限消化によって分析した。製造業者の指示に従ってＰｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、有望なクローンからＤＮＡを調製し、そしてＡＢＩ  ３７７シークエンサーで配列決定した。
【０１３５】
（クローン７２／７３）
プライマーｐｓ０７２およびｐｓ０７３を用いて、約１．８ｋｂのフラグメントを、Ｋｌｅｎｔａｑを使用する３８サイクルのＰＣＲ（９４℃にて５分間；次いで、９４℃にて３０秒間、６３℃にて４５秒間、７２℃にて６０秒間の３８サイクル；７２℃にて７分間で終了）後に得た。これを、ｍ１３Ｆおよびｍ１３Ｒプライマーを使用して配列決定した。さらなる配列決定プライマーであるｐｓ０７４およびｐｓ０７５を、得られた配列に基づいて設計した。これにより、ヒトＰＧＰ  １５５３〜３３６１に対応する、配列決定された合計約１．８５ｋｂが生じた。
【０１３６】
（クローン７９／７７Ｃ１５００）
プライマーｐｓ０７９およびｐｓ０７７を用いて、約１．５ｋｂのフラグメントを、Ｋｌｅｎｔａｑを使用する３８サイクルのＰＣＲ（９４℃にて５分間；次いで、９４℃にて３０秒間、６３℃にて４５秒間、７２℃にて６０秒間の３８サイクル；７２℃にて７分間で終了）後に得た。これを、プライマーとしてｍ１３Ｆおよびｍ１３Ｒを使用して配列決定した。さらなる配列決定プライマーであるｐｓ０８０およびｐｓ０８１を、得られた配列に基づいて設計した。ヒトｐｇｐ
３１０２〜４５２５に対応する配列が得られた。この配列は、カニクイザルＰＧＰ  ｃＤＮＡについての停止コドンを含んだ。
【０１３７】
（クローン７０／７８Ｃ）
ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＲＮＡ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを、製造業者に従って使用して、カニクイザル肝臓由来の総ＲＮＡを調製した。一本鎖ｃＤＮＡをこのＲＮＡから、製造業者の指示に従ってＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｋｉｔを使用して調製した。これを、クローン７０／７８Ｃについてのテンプレートとして使用した。プライマーｐｓ０７０およびｐｓ０７８を用いて、約１．０ｋｂのフラグメントを肝臓ｃＤＮＡから、Ｋｌｅｎｔａｑを使用する３８サイクルのＰＣＲ（９４℃にて５分間；次いで、９４℃にて３０秒間、６５℃にて４５秒間、７２℃にて６０秒間の３８サイクル；７２℃にて７分間で終了）後に得た。これを、プライマーとしてｍ１３Ｆおよびｍ１３Ｒを使用して配列決定した。ヒトｐｇｐに対応する配列が得られた。この配列は、ヒトｐｇｐ  ６７０〜１６３８に対応する。
【０１３８】
（クローン８８／Ｕ７５０）
ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＲＮＡ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔを、製造業者の指示に従って使用して、カニクイザル肝臓由来の総ＲＮＡを調製した。ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＳＭＡＲＴ  Ｒａｃｅ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、このＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを調製した。このキットに提供されたＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒおよび遺伝子特異的プライマー（ｐｓ０８８）をこのテンプレートと共に、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２
Ｔａｑを使用する４０サイクルのＴｏｕｃｈｄｏｗｎ  ＰＣＲ（９４℃にて５分間：次いで、９４℃にて３０秒間、７２℃にて１２０秒間、９４℃にて３０秒間の５サイクル；９４℃にて３０秒間、７０℃にて４５秒間、７２℃にて１２０秒間の５サイクル；９４℃にて３０秒間、６８℃にて４５秒間、７２℃にて１２０秒間の３０サイクル；７２℃にて７分間で終了）に用いた。７５０ヌクレオチドのフラグメントが得られ、ｍ１３Ｆおよびｍ１３Ｒプライマーで配列決定された。これは、開始コドンを含むｃＤＮＡの５’末端を表した。これは、ヒト配列２７５〜７７５（ヒト配列についての開始コドンは、４３３位である）に対する良好な相同性を示した。
【０１３９】
（完全ｃＤＮＡのアセンブリ）
（クローンＡＢ）
クローン８８／Ｕ７５０を、ＮａｅＩ／ＳａｃＩで消化した。３３９ヌクレオチドのフラグメントを、ゲルにおいて単離し、そして製造業者の指示に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。クローン７０／７８Ｃを、ＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、９１６ヌクレオチドのフラグメントを、ゲルにおいて単離し、そして製造業者の指示に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。これらを、ｐＵＣ１９  ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ／ＳＡＰ中に一緒に連結した。
【０１４０】
（クローンＣＤ）
クローン７２／７３を、ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで消化した。１．６ｋｂのフラグメントを、ゲルにおいて単離し、そして製造業者の指示に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。クローン７９／７７Ｃ１５００を、ＫｐｎＩ／ＤｒａＩで消化した。１．１ｋｂのフラグメントを、ゲルにおいて単離し、そして製造業者の指示に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。これらを、ｐＵＣ１９  ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ／ＳＡＰ中に連結した。
【０１４１】
（完全ｃＤＮＡ）
クローンＡＢを、ＨｉｎｃＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化した。１．３ｋｂのフラグメントを、ゲルにおいて単離し、そして製造業者の指示に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。
【０１４２】
クローンＣＤを、ＥｃｏＲＩ／ＥｈｅＩで消化した。５．２ｋｂのフラグメントを、ゲルにおいて単離し、そして製造業者の指示に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。
【０１４３】
これらを一緒に連結し、製造業者の指示に従ってＳＣＳ−１コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換した。有望なクローンを、制限消化によって同定した。最終的なクローンの正体を、配列決定によって確認した。
【０１４４】
カニクイザルＰ−糖タンパク質のヌクレオチド配列を、配列番号１として表す。このコード配列は、ヌクレオチド１００〜３９４０からなり、１２８０アミノ酸のポリペプチド（配列番号２）を生成する。
【０１４５】
個々のカニクイザルのライブラリー由来のさらなるクローンの配列決定によって、ｃＤＮＡ中における予想外の９塩基対挿入物を含む多型性の存在が示された。この多型性は、同一個体のサル由来のゲノム配列中においても存在する。この多型性は、アミノ酸９２の後ろに３つのアミノ酸の挿入を生じた。この対立遺伝子改変体のヌクレオチド配列を、配列番号３として表す。このコード配列は、ヌクレオチド１００〜３９４９からなり、１２８３アミノ酸のポリペプチド（配列番号４）を生成する。プラスミドｐＵＣ１９中にクローン化されたカニクイザルＰＧＰ  ｃＤＮＡ（配列番号３）を、ＡＴＣＣに寄託した（受託番号ＰＴＡ−８０９）。
【０１４６】
（実施例２：カニクイザルＰ−糖タンパク質の活性）
（材料および方法）
カニクイザルＰＧＰ  ｃＤＮＡ（配列番号３）を、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するベクター中のＬＬＣ−ＰＫ１細胞のクローン化集団中に導入する。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓから得て、そして７％胎仔ウシ血清を補充した培地１９９中で増殖した。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を、トランスフェクション前に再クローン化して、細胞集団の均質性を確証する。簡潔には、カニクイザルＰＧＰ  ｃＤＮＡを、ｐ２２２ＣＭＶベクター中に組み込む。このベクターは、エプスタインバーウイルスについてのＯｒｉＰ配列およびＥＢＮＡ−１遺伝子産物に基づいたｐ２２０．２エピソームベクター系に由来する（Ｓｕｇｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３、１９８５；Ｙａｔｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．）３１３：８１２−８１５、１９８５）。ＰＧＰ  ｃＤＮＡを、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期プロモーターの制御下におく。このベクターは、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与する。細胞（０．４ｍＬ中）およびＤＮＡ（１０〜２０μｇ）を、２ｍｍギャップ（ｇａｐ）細胞、１００Ｖ、２５００μＦキャパシタンスおよび７２ｏｈｍ抵抗を使用して、ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  ｃｅｌｌ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ｍｏｄｅｌ  ６００を用いるエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。エレクトロポレーション後、細胞を、１０％コンフルエンスでマルチウェルプレート（４８ウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）にプレーティングした。トランスフェクションの１〜２日後、ハイグロマイシンＢを、最終濃度４００〜６００μｇ／ｍｌで導入する。細胞に、２〜４日おきに再給餌し、そして４００〜６００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ中で６〜８日間増殖させ、この時点で野生型細胞のバルクを剥離した。ハイグロマイシンＢを、１００μｇ／ｍｌまで減少させ、そしてこの濃度のハイグロマイシンＢ中で維持する。１４〜１８日後、このウェルを検査し、そして単一コロニーを含むウェルをトリプシン処理し、そしてバルク培養物へとスケールアップする。ＰＧＰの発現を、ＴｒａｎｓｗｅｌｌｓTM中のビンブラスチン（０．１ｕＭ）輸送の分極（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）によって測定する。
【０１４７】
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞に基づく輸送研究を、２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌｓTM（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３４１５）中で実施する。ＴｒａｎｓｗｅｌｌｓTMを、側底側空間に０．６ｍＬ培地を添加し、そして頂端側空間に０．１ｍＬ培地を添加することによって調製する。細胞を、１挿入物あたり４×１０4細胞で播種し（代表的に０．０５ｍＬ〜０．１５ｍＬ中）、２〜４日おきに新鮮培地で再給餌し、そして播種後４〜８日目に輸送研究に使用する。輸送アッセイを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳで緩衝化したハンクス平衡生理食塩水（ＨＢＳＳ）中で実施する（ｐＨ７〜７．２）。細胞単層を、輸送アッセイにおいて使用する前に、ＨＢＳＳでリンスする。輸送を、頂端側から側底側（Ａ→Ｂ）および側底側から頂端側（Ｂ→Ａ）の方向の両方の傾斜条件下で測定する。１回の決定につき、少なくとも二連の単層を使用する。所望される時点で、サンプルを、レシーバーチャンバー（頂端側チャンバーまたは側底側チャンバー）から回収する。輸送された化合物の量の定量は、ＵＶまたは質量分析検出での液体シンチレーション計数（ビンブラスチン）またはＨＰＬＣによる。
【０１４８】
カニクイザルＰＧＰ  ｃＤＮＡを、バキュロウイルスベクターを用いて、昆虫細胞中で発現させる。（Ｓａｒｋａｄｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：４８５４−４８５８、１９９２）の方法に従って、膜を調製し、そして使用まで−８０℃で保存する。ＡＴＰａｓｅアッセイを、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて実施する。アッセイを、（Ｓａｒｋａｄｉら、１９９２、およびＤｒｕｅｋｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３０：１７３−１７７、１９９５）の方法の改変版を使用して実施する。
【０１４９】
９６ウェルプレートの各ウェルについての詳細な方法は、以下を包含する：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＭＥＳ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭジチオトレイトール、および５ｍＭアジ化ナトリウムを含有する緩衝液中に４０μｇ膜、２０μＭベラパミル（ポジティブコントロール）または試験薬物、および３〜５ｍＭ  ＭｇＡＴＰを含む０．０６ｍｌの反応混合物を、３７℃で２０分間インキュベートする。１００μＭオルトバナジン酸ナトリウムを含む最初の反応混合物を、並行してアッセイする。オルトバナジン酸塩は、ヌクレオチド結合部位にＭｇＡＤＰを補足することによって、ＰＧＰを阻害する。従って、オルトバナジン酸塩の存在下で測定されるＡＴＰａｓｅ活性は、非ＰＧＰ  ＡＴＰａｓｅ活性を表し、そしてオルトバナジン酸塩なしで生成された活性から差し引かれて、バナジン酸塩感受性ＡＴＰａｓｅ活性を生成し得る。３０μｌの１０％ＳＤＳ＋消泡剤Ａの添加によって、反応を停止する。２つのさらなる反応混合物（オルトバナジン酸塩＋および−）（しかし、ＭｇＡＴＰを含まない）もまた調製し、そして他のものと共にインキュベートし、次いで、ＳＤＳおよびＭｇＡＴＰを補充して、時間＝０分目の反応を表す。インキュベーションに次いで、１５ｍＭ酢酸亜鉛：１０％アスコルビン酸（１：４）中の３５ｍＭモリブデン酸アンモニウムを２００μｌ添加し、そしてさらに２０分間３７℃にてインキュベートする。無機ホスフェートの遊離を、８００ｎｍでのその吸光度によって検出し、そしてホスフェートの検量線に対してこの吸光度を比較することによって、定量する。
【０１５０】
リガンド結合アッセイおよび蛍光色素取り込みの阻害を測定するためのアッセイを、Ｓｈａｒｏｍら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５８：５７１−５８６、１９９９）によって記載されたように実施する。
【０１５１】
（Ｉ．ＬＬＣ−ＰＫ１細胞における安定なＰＧＰ発現）
カニクイザルＰＧＰの機能的発現を、ビンブラスチンの輸送の分極によって測定する。コントロール細胞は、代表的に、１と３との間のＢ→Ａ／Ａ→Ｂ比を示す。ＰＧＰトランスフェクト細胞は、より高い比率を示す。ｃＤＮＡ由来のカニクイザルの発現は安定である。
【０１５２】
（ＩＩ．ＰＧＰ膜におけるＡＴＰａｓｅ活性の活性化）
ＡＴＰａｓｅアッセイの刺激によって、薬物とＰＧＰとの任意の相互作用の濃度依存性の迅速な測定が提供される。遊離の無機ホスフェートを、マイクロタイタープレート形式で実施される単純な分光光度学的アッセイによって測定する。複数の薬物濃度を試験することによって、ＰＧＰに対する薬物の親和性を推定すること、およびその応答の飽和が観察されたか否かを推定することが可能となる。
【０１５３】
（ＩＩＩ．細胞単層を横断する薬物輸送）
ＡＴＰａｓｅアッセイは、直接的には、薬物輸送を測定しない。ＡＴＰａｓｅ活性と実際の輸送との間の一致を試験するために、薬物の輸送速度を、コントロールＬＬＣ−ＰＫ１およびカニクイザルＰＧＰ細胞単層において測定する。各薬物濃度について、４つの測定をなす：
Ａ：Ａ→Ｂ      コントロール細胞
Ｂ：Ｂ→Ａ      コントロール細胞
Ｃ：Ａ→Ｂ      ＰＧＰ細胞
Ｄ：Ｂ→Ａ      ＰＧＰ細胞。
【０１５４】
輸送の分極を、コントロール細胞（Ｂ／Ａ）およびＰＧＰ細胞（Ｄ／Ｃ）において算出する。ＰＧＰの内因的活性（ＩＡ）を、コントロール細胞と比較してＰＧＰ細胞中でＰＧＰがＢ→Ａ輸送を容易にした量（Ｄ−Ｂ）と、コントロール細胞と比較してＰＧＰ細胞中でＰＧＰがＡ→Ｂ輸送を妨害した量（Ａ−Ｃ）との合計として算出する。ＰＧＰの内因的クリアランスを、非飽和条件下の線のスロープを算出することか、または飽和が観察された場合に算出された見かけ上のＫｍおよびＶｍａｘ値からのいずれかによって、濃度依存性データのプロットから算出する。内因的クリアランスを、ｍＬ／ｍ2／分として表す。
【０１５５】
ＡＴＰａｓｅデータは、有用な濃度応答データを表す。例えば、いくつかの化合物についての見かけ上のＫｍ値は、ＡＴＰａｓｅと輸送系との間で良好な一致する。しかし、他の薬物はＡＴＰａｓｅ活性を活性化するが、ＰＧＰによる輸送は検出可能ではない。少なくとも、ＡＴＰａｓｅアッセイは、下回るとＰＧＰによる輸送に対する応答が薬物濃度に対して線形となる濃度範囲を同定し得る。これは、ＰＧＰの内因的クリアランスを測定するための実験設計の単純化を可能にし、これは、大量の化合物を試験する場合に重要な考慮事項となる。
【０１５６】
（ＩＶ．バイオアベイラビリティ）
バイオアベイラビリティ研究を、２つ以上の異なるＰＧＰ型を用いる上記アッセイの１つ以上を実施することによって行う。異なるＰＧＰ型は、異なる種（例えば、イヌおよびヒト、カニクイザルおよびヒト、イヌおよびカニクイザルなど）により得るか、または同一種の異なる対立遺伝子であり得る。これらのアッセイの結果を比較して、異なる種の個体または異なるＰＧＰ対立遺伝子を発現する個体における薬物のバイオアベイラビリティを決定または測定する。１つの決定の結果はまた、過去の（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ）コントロールとして、例えば、ＡＴＰａｓｅまたは輸送に関して以前に決定された値に対して比較され得る。
【０１５７】
前述の特許、特許出願、および参考文献の各々がここに、本明細書中で参考として援用される。本発明を、特定の実施形態に関して記載してきたが、多くの改変および変更が、本発明の意図から逸脱することなく当業者によってなされ得ることが理解されるべきである。このような改変、変更、および等価物は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
(配列表）
【数１】
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【数２】
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【数３】
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【数４】
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【数５】
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【数６】
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【数７】
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【数８】
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【数９】
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【数１０】
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【数１１】
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【数１２】
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【数１３】
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【数１５】
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【数１６】
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【数１７】
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【数１８】
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【数１９】
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【数２０】
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【数２１】
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【数２２】
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【数２３】
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【数２４】
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【数２５】
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【数２６】
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【数２７】
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【数２８】
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【数２９】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2012065671000001.pdf