(57)【要約】【課題】ＩＰＧゲルとＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとを接続する際のゲル間の反発や変形による二次元電気泳動の分離パターンの再現性の低下の問題を解決する。【解決手段】下記の二次元電気泳動システムのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに使用される濃縮ゲルからなる電気泳動用分離媒体であって、前記電気泳動用分離媒体（２）のアクリルアミド固形分濃度（アクリルアミドモノマーおよび架橋剤の合計固形分濃度）が、３．５〜２．５ｗ／ｖ％であることを特徴とする電気泳動用分離媒体。前記二次元電気泳動システム：固定化ｐH勾配ゲルを用いた等電点に基づく分離およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いた分子量に基づく分離を、自動的に連続して行なう二次元電気泳動システム。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の二次元電気泳動システムのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに使用される濃縮ゲルからなる電気泳動用分離媒体であって、
前記電気泳動用分離媒体のアクリルアミド固形分濃度（アクリルアミドモノマーおよび架橋剤の合計固形分濃度）が、３．５〜２．５ｗ／ｖ％であることを特徴とする電気泳動用分離媒体。
前記二次元電気泳動システム：固定化ｐH勾配ゲルを用いた等電点に基づく分離およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いた分子量に基づく分離を、自動的に連続して行なう二次元電気泳動システム。
【請求項２】
前記アクリルアミドモノマーと架橋剤の質量比が、前者：後者として２９．２：０．８〜２９．５：０．５の範囲にあることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用分離媒体。
【請求項３】
さらに、分子量が４００００以上のポリアクリルアミド以外の水溶性高分子を含むことを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用分離媒体。
【請求項４】
前記水溶性高分子がポリビニルアルコールまたはポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項３に記載の電気泳動用分離媒体。
【請求項５】
前記水溶性高分子の固形分濃度が０．０１〜０．５質量％である請求項３に記載の電気泳動用分離媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動用分離媒体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、遺伝子やタンパク質を分離するための方法として電気泳動法が知られている。電気泳動法とは、核酸やタンパク質などの分離分析対象を、その移動速度等の違いに基づいて分離する方法である。特に分離試料を、電解質を含むゲル中に導入し、ゲルの両端に電圧をかけることで分離する方法が一般的である。
【０００３】
タンパク質混合物を分離する際に広く普及している方法のひとつとしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法と呼ばれる方法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）がある。タンパク質をSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)でコートすることにより電荷を持たせ、ポリアクリルアミドゲル中を移動させ、タンパク質のサイズにより分離するという方法である。
泳動はサンプルの導入後、陰極、陽極の両電極とゲル媒体とを電極用バッファー溶液で接触させ電流を流すことにより行われる。電流を流し始めるとタンパク質は陰極から陽極に向かってゲル中を移動し始め、その分子量が小さいほど速く移動する。
【０００４】
またＳＤＳ−ＰＡＧＥでは通常濃縮ゲルと呼ばれる低アクリルアミド濃度のゲルと、分離ゲルと呼ばれる高アクリルアミド濃度のゲルとを使用する。濃縮ゲルのアクリルアミド固形分濃度（アクリルアミドモノマーおよび架橋剤の合計固形分濃度）は通常4 w/v%であり、分離ゲルのアクリルアミド固形分濃度は、7-20w/v%程度であって、実験者がどのような分子量範囲で分離を行いたいかで該固形分濃度が決定されるものである。
【０００５】
またタンパク質の電気的性質により分離する、ＩＥＦ分離と呼ばれる方法がある。ゲル中に酸性度勾配を付与したゲルを用いタンパク質試料を導入した後電流を流すことで、ゲル中の酸性度とタンパク質等電点がつりあったところで平衡状態となる。そのためタンパク質はゲル中の酸性度によって分離されることになる。ＩＥＦ分離を行うゲル媒体は、酸性度勾配が付与されたゲルであり、ＩＰＧゲル（固定化pH勾配ゲル）と呼ばれる。
【０００６】
上記のようなＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦ分離を連続して実行する二次元電気泳動と呼ばれる方法がある。タンパク質混合物を、サンプルの等電点と分子量の二つの物理量によって分離することになり多量のサンプルからタンパク質を一度に分離できる方法である。
【０００７】
しかしながら二次元電気泳動には二つの欠点がある。ひとつは作業工程が複雑で必要時間が長いこと。二つ目は作業工程の複雑さから来る再現性の低さである。
【０００８】
それに対して特許文献１には全自動二次元電気泳動システムについての記載がある。ストライプ上に形成されたＩＰＧゲルを樹脂板に貼り付けて移動させることが出来るシステムで、サンプル導入、膨潤、平衡化等の工程を経た後、ＩＰＧゲルが自動でＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルに接続され、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥの工程を開始するシステムである。このシステムでは作業が人の手を介さないため、作業による実験間の誤差を小さくすることが出来る。
【０００９】
この特許文献１に記載のシステムではＩＰＧゲルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルに機械的に押し込む形式をとっている。その際、ＩＰＧもしくはＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルの接続面での変形等の問題等があって、泳動結果が波打ち、スポット位置が再現しないという傾向があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−６４８４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ＩＰＧゲルを用いた等電点に基づく分離およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いた分子量に基づく分離を自動的に連続して行なう二次元電気泳動システムを用いた場合において、ＩＰＧゲルとＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとを接続する際のゲル間の反発や変形による二次元電気泳動の分離パターンの再現性の低下の問題を解決することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
請求項１に記載の発明は、下記の二次元電気泳動システムのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに使用される濃縮ゲルからなる電気泳動用分離媒体であって、
前記電気泳動用分離媒体のアクリルアミド固形分濃度（アクリルアミドモノマーおよび架橋剤の合計固形分濃度）が、３．５〜２．５ｗ／ｖ％であることを特徴とする電気泳動用分離媒体である。
前記二次元電気泳動システム：固定化ｐH勾配ゲルを用いた等電点に基づく分離およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いた分子量に基づく分離を、自動的に連続して行なう二次元電気泳動システム。
アクリルアミド固形分濃度が上記範囲にある場合、一般に市販されているＩＰＧゲルとＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとが二次元電気泳動システムにおいて外部機械的な接続を施されても、ＩＰＧゲル、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのどちらにも大きな変形が生じず、安定した電気泳動結果を得られる。
【００１３】
請求項２に記載の発明は、前記アクリルアミドモノマーと架橋剤の質量比が、前者：後者として２９．２：０．８〜２９．５：０．５の範囲にあることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用分離媒体である。この構成によれば、なお一層の再現性でもって電気泳動結果が安定する。
【００１４】
請求項３に記載の発明は、さらに、分子量が４００００以上のポリアクリルアミド以外の水溶性高分子を含むことを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用分離媒体である。この構成によれば、アクリルアミドゲルの固形分濃度が小さく、かつ架橋剤濃度が小さい場合であっても、ゲルの形状が保たれ、実験操作を容易に行うことができる。
【００１５】
請求項４に記載の発明は、前記水溶性高分子がポリビニルアルコールまたはポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項３に記載の電気泳動用分離媒体である。これらのポリマーを使用すれば、電気泳動に対する影響が無く、好ましい。
【００１６】
請求項５に記載の発明は、前記水溶性高分子の固形分濃度が０．０１〜０．５質量％である請求項３に記載の電気泳動用分離媒体である。この構成によれば、電気泳動結果に及ぼす影響がさらに抑制され、好適である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ＩＰＧゲルを用いた等電点に基づく分離およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いた分子量に基づく分離を自動的に連続して行なう二次元電気泳動システムを用いた場合において、ＩＰＧゲルとＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとを接続する際のゲル間の反発や変形による二次元電気泳動の分離パターンの再現性の低下の問題が解決される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＩＰＧゲルとＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとが外部機械により垂直に接続される際の構造を説明するための図である。
【図２】ＩＰＧゲルとＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとが外部機械により水平に接続される際の構造を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の電気泳動用分離媒体は、固定化ｐH勾配ゲルを用いた等電点に基づく分離およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いた分子量に基づく分離を自動的に連続して行なう二次元電気泳動システムに用いられ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに使用される濃縮ゲルからなる。
本発明で用いる二次元電気泳動システムでは、ＩＰＧゲル上で等電点に基づく電気泳動を行った後、一次元目のゲルが取り付けられたチップは二次元目用ゲル(ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル)に移動し、外部機械によりＩＰＧゲルと濃縮ゲルとが機械的に接触する。
【００２０】
この濃縮ゲルとＩＰＧゲルの接触の方法には大きく分けて２つある。
ひとつはＩＰＧゲルとＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルが垂直に接続される図１のような場合と、ＩＰＧゲルとＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルが水平に接続される図２のような場合である。
図１において、一次元目の電気泳動が終了したＩＰＧゲル１は、ゲル保持容器６に保持されながら、外部機械により、ゲル保持容器５に保持されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの濃縮ゲル２と接触する。ＩＰＧゲル１の進行方向は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの長さ方向に対して垂直な方向であり、電解質溶液４中の濃縮ゲル２と自動的に接触する。なお符号３は分離ゲルである。
また図２において、一次元目の電気泳動が終了したＩＰＧゲル１１は、ゲル保持容器１６に保持されながら、外部機械により、ゲル保持容器１５に保持されたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの濃縮ゲル１２と接触する。ＩＰＧゲル１の進行方向は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの長さ方向と同じ方向（水平方向）であり、電解質溶液１４中の濃縮ゲル１２と自動的に接触する。なお符号１３は分離ゲルである。
【００２１】
ここで用いられる二次元電気泳動システムにおいて、ゲル以外の条件、たとえば泳動バッファー、ゲルバッファーの組成は一般的に用いられる二次元電気泳動の条件と同じである。
【００２２】
ＩＰＧゲルとしては、市販されているいずれのものも使用することができる。
例えば、GEヘルスケア社製イモビラインドライプレート  ｐＨ３−１０（厚み０．５ｍｍ）が挙げられる。ＩＰＧゲル、濃縮ゲル共に外力によって異変形を起こしやすく、その変形の状態によっては二次元電気泳動がスメアリング等を起こしスポットとして認識できなくなる等の問題が起こる。
一般に市販されているＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに使用される濃縮ゲルの固形分濃度は４ｗ／ｖ％程度であり、全自動二次元電気泳動のシステムに用いた場合、上記問題が発生するが、本発明によれば、濃縮ゲルのアクリルアミドモノマーおよび架橋剤の濃度を変更し、その強度を低下させているので、泳動結果が安定する。
【００２３】
具体的には、濃縮ゲルのアクリルアミド固形分濃度（アクリルアミドモノマーおよび架橋剤の合計固形分濃度）を、３．５〜２．５ｗ／ｖ％に設定することで、ＩＰＧゲルとＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとを接続する際のゲル間の反発や変形による二次元電気泳動の分離パターンの再現性の低下の問題を解決できる。
【００２４】
また架橋剤の濃度を変更することにより、上記効果をさらに高めることができる。具体的には、上記アクリルアミド固形分濃度において、アクリルアミドモノマー：架橋剤の質量比を２９．２：０．８〜２９．５：０．５の範囲にするのが好ましい。
【００２５】
なお、アクリルアミド固形分濃度が小さく、かつ架橋剤量比率が小さい場合にゲルの強度が低く扱いに問題が生じる場合には、ポリアクリルアミド以外の水溶性高分子を少量添加することが出来る。この際、好ましくは平均分子量が４００００以上の水溶性高分子、さらに好ましくは平均分子量が５００００〜１０００００の水溶性高分子が好適である。
この際添加する水溶性高分子は、ポリビニルアルコールまたはポリエチレングリコールが好ましい。また添加する固形分濃度は０．０１〜０．５質量％であることが好ましい。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例によりさらに説明する。
図１に示すような方法で、外部機械によりＩＰＧゲルとＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルとを外部機械により垂直に接続した。なお使用した二次元電気泳動システムは、ＩＰＧゲルを用いた等電点に基づく分離およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いた分子量に基づく分離を、全自動的に連続して行なう、市販されている二次元電気泳動システムであり、ＩＰＧゲルとしては、GEヘルスケア社製イモビラインドライプレート  ｐＨ３−１０（厚み０．５ｍｍ）を使用した。表１に示す条件で二次元目の電気泳動を１０回行い、その結果を評価した。分離ゲルのアクリルアミド固形分濃度は、１０ｗ／ｖ％とした。濃縮ゲルのモノマーはアクリルアミドとし、架橋剤はＮ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミドとした。なお表１におけるアクリルアミド固形分濃度とは、アクリルアミドとＮ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミドの合計の濃度（ｗ／ｖ％）である。架橋剤質量比とは、アクリルアミドモノマー：架橋剤の質量比である。重合は、過硫酸アンモニウムおよびテトラメチルエチレンジアミンのラジカル開始剤を用い、室温下で行った。開始剤濃度は過硫酸アンモニウム、テトラメチルエチレンジアミン共に０．１質量％である。ＰＶＡとはポリビニルアルコールを意味し、その重量平均分子量は８００００であった。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
電気泳動結果の評価
○：特に問題なし
△：スポットのテーリングが生じる。
×：スポット位置が大きくずれている。
【００２９】
表１から明らかなように、濃縮ゲルのアクリルアミド固形分濃度を本発明の範囲に設定することにより、ゲル間の反発や変形による二次元電気泳動の分離パターンの再現性の低下の問題を解決することができた。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明によれば、全自動二次元電気泳動のシステムの泳動の再現性が向上し分析の結果に信頼が得られる。そのため本発明を用いれば、医療診断など非常に再現性が要求される分野であっても対応することが可能である。
【符号の説明】
【００３１】
１：ＩＰＧゲル
２：濃縮ゲル
３：分離ゲル
４：電解質溶液
５：ゲル保持器具
６：ゲル保持器具
１１：ＩＰＧゲル
１２：濃縮ゲル
１３：分離ゲル
１４：電解質溶液
１５：ゲル保持器具
１６：ゲル保持器具
【図１】
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【図２】
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