(57)【要約】【課題】  植物性油成分の、測定対象である酵素の活性化の全てを簡便に測定する方法を提供する。【解決手段】  簡便な前処置、すなわち、例えばTween20等の乳化剤を直接Jatropha等の植物性油成分又はそれに由来する油脂成分、例えばBDF、に添加して超音波処理した後、測定対象である酵素の活性化を測定することにより、従来のHPLC法を経る方法では測定できなかった、酵素の活性化の全量を簡便に測定することができるものであり、好ましくは、乳化剤に非イオン界面活性剤を用いることにより、電気泳動法を用いて、その強度を簡便に測定できる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物油成分中の測定対象とする酵素の活性化を測定する方法において、植物油成分に直接乳化剤を添加して超音波処理し、得られた乳化物を用いて酵素の活性化を測定することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記植物油成分が、ジャトロファ（Jatropha）油又はジャトロファ（Jatropha）油由来の油脂成分であり、前記酵素がプロテインキナーゼＣ（PKC）である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記活性化の測定方法が、酵素と該酵素に特異的な基質とを反応させて産出された生成物を電気泳動し、その反応の強度を測定する方法であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記乳化剤が、非イオン界面活性剤であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物油成分中の測定対象とする酵素の活性化の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジャトロファ（Jatropha）は大きな熱帯林の灌木であり、種子の仁に含有されるJatropha油は、非食用のバイオディーゼル燃料(以下、「BDF」とする。）原料の一つとしての検討がなされている（特許文献１、非特許文献１）。
しかしながら、Jatropha油中には、毒性成分であるホルボールエステル類（Phorbol  esters）（以下、「PEs」とする。）が含まれており、PEsは下剤的作用以外に皮膚刺激性があるのみでなく、腫瘍促進作用（発がんプロモーター作用）が知られている。
【０００３】
高速液体クロマトグラフィー（以下、「HPLC」とする。）によれば、Jatrophaの仁には、通常、12-desoxy-16-hydroxyphorbol(DHPB)を含むPEsの４つのピークが、合計０．８７〜３．３２ｍｇ／ｇ（TPA：12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate換算）濃度で含有される（非特許文献２）。
このHPLCによる測定法によれば、これらのPEsは、BDFの製造工程である、水、酸、アルカリ、メチルエステル化、熱処理等によっては完全に除去又は変性できないことが知られている。
【０００４】
一方、前述のPEsの発がんプロモータ作用とは、PEsがプロテインキナーゼＣ(以下、「PKC」とする。）に結合してPKCを活性化する作用であり、Jatropha油中のPEsの毒性を測定するために、その毒性の本質である「PKCの活性化」を、in  vitroに測定することが行われている。
図３は、その方法を模式的に示す図であり、キナーゼ反応後の溶液を、アガロースゲル上で電気泳動し、移動したペプチド基質のバンドの位置を確認する方法であり、PKCのキナーゼ反応により、ペプチド基質は、リン酸化されるため、電荷が＋１から−１に変化して移動する。サンプルのキナーゼ反応溶液とともに、コントロールとして精製酵素のキナーゼと基質のみ(Background)をアガロースゲルに加えて電気泳動し、蛍光標識ペプチド基質のバンドの移動をトランスイルミネーター(紫外光)により確認する。
【０００５】
しかしながら、従来、Jatropha油、又は、例えばBDFのような、Jatropha油由来の油脂成分の「PKCの活性化」を測定するには、PEsと考えられる成分をHPLCなどで分画した後、測定していたために、多大な時間と資源が必要であるばかりでなく、「PKCの活性化」の全てを正確に測定することができなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】再表２００８−１０５５１８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】岩田「バイオディーゼル燃料と化石ディーゼル燃料及びそれらからの排出物の初期リスク評価」日本リスク研究学会第22回年次大会講演論文集221〜226頁
【非特許文献２】Wink  M,  Grimm  C,  Koschmieder  C,  Sporer  F,  Bergeot  O(2000).  Sequestration  of  phorbolesters  by  the  aposematically  coloured  bug  Pachycoris  klugii  (Heteroptera:Scutelleridae)  feeding  on  Jatropha  curcas  (Euphorbiaceae).  Chemoecology  10:179-184.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
Jatrophaに由来する油の毒性成分であるPEsは、下剤的作用以外に皮膚刺激性があるのみでなく、腫瘍促進作用が知られているので、その作用の活性程度を知ることはJatropha油及びJatropha油由来の油脂成分等を適正に取り扱うためには重要な情報である。また、Jatrophaに由来する油をエネルギーとして利用した時の残渣（排気ガスを含む）中の「PKCの活性化」の程度を知ることも必要である。
したがって、この「PKCの活性化」の程度を簡便に測定しなければJatropha油、又はJatropha油に由来する油脂成分、例えばBDF、を安全に取扱うことができない。
しかしながら、前述のとおり、これまではJatropha油の毒性の本質である「PKCの活性化」は、PEsと考えられる成分をHPLCなどで分画した後、in  vitroで測定しているために、多大な時間と資源が必要であり、かつ「PKCの活性化」全てを正確に測定することはできなかった。
【０００９】
本発明は、こうした現状を鑑みてなされたものであって、植物性油成分の、測定対象である酵素の活性化の全てを簡便に測定する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、簡便な前処置、すなわち、例えばTween20等の乳化剤を直接Jatrophaに由来する油に添加して超音波処理した後、PKCの活性化を市販のキットで測定する方法を用いることにより、従来のHPLC法では測定できなかったJatropha油毒性の本質である、毒性成分全体のPKCの活性化を簡便に測定することができるという知見を得た。また、乳化剤に非イオン界面活性剤を用いることにより、電気泳動法を用いて、その強度を簡便に測定できることも判明した。
【００１１】
本発明はこれらの知見に基づいて完成に至ったものであり、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］植物油成分中の測定対象とする酵素の活性化を測定する方法において、植物油成分に直接乳化剤を添加して超音波処理し、得られた乳化物を用いて酵素の活性化を測定することを特徴とする方法。
［２］前記植物油成分が、ジャトロファ（Jatropha）油又はジャトロファ（Jatropha）油由来の油脂成分であり、前記酵素がプロテインキナーゼＣ（PKC）である上記［１］の方法。
［３］前記活性化の測定方法が、酵素と該酵素に特異的な基質とを反応させて産出された生成物を電気泳動し、その反応の強度を測定する方法であることを特徴とする上記［１］又は［２］の方法。
［４］前記乳化剤が、非イオン界面活性剤であることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれかの方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、植物性油成分中の測定対象とする酵素の活性化について、その全てを簡便に測定することができる。また、乳化剤に非イオン界面活性剤を用いることにより、電気泳動法を用いて、その強度を簡便に測定できる。さらに、本発明の方法を用いて、Jatropha油又はJatropha油由来の油脂成分、例えばBDF、のPKCの活性化を測定することにより、従来のHPLC法では測定できなかった毒性の本質である、PKCの活性化について、その毒性成分全体の活性化を簡便に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】TH油（上）及びTH油由来のBDF（下）のそれぞれのHPLCクロマトグラムを示す図。
【図２】電気泳動後の写真撮影像を示す図。
【図３】PKCの活性化の測定方法を、模式的に示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、例えばTween20等の乳化剤を直接、Jatropha油などの植物性油成分、或いは、それに由来するBDFなどの油脂成分に添加して超音波処理した後、PKCの活性化を測定することを特徴とするものであり、毒性の本質であるPKCの活性化について、その毒性成分全体の活性化を測定するものである。
【００１５】
本発明の方法において、植物性油成分を乳化するのに使用される界面活性剤は、特に限定されないが、活性の測定に、電気泳動法を採用するためには、非イオン性界面活性剤が好ましい。
【００１６】
非イオン界面活性剤としては、エステル型 、エーテル型、エステルエーテル型、アルカノールアミド型、アルキルグリコシド、高級アルコール等があるが、なかでも、Tween20(=Polyoxyethylene  Sorbitan  Monolaurate)、Tween40(=Polyoxyethylene  Sorbitan  Monopalmitate)、Tween60(=Polyoxyethylene  Sorbitan  Monostearate)、Tween80(=Polyoxyethylene  Sorbitan  Monooleate)、Tween85(=Polyoxyethylene  Sorbitan  Trioleate)などのエステルエーテル型の界面活性剤が好ましく用いられる。
特に、Tween20は、タンパク質の可溶化に用いられるマイルドな界面活性剤であり、ウェスタンブロッティングにおいて、メンブレンへのタンパク質の非特異的結合を防御するものとして知られている。
本発明で用いる界面活性剤の濃度は、添加する植物性油脂又はBDFに対して、０．０１〜５０質量％である。
【００１７】
本発明の方法では、植物油脂成分に直接乳化剤を添加して超音波処理し、得られた乳化物を用いて酵素の活性化を測定する。活性化の測定方法は特に限定されないが、植物油脂成分が、Jatropha油又はJatropha油由来のBDFである場合、その毒性の本質であるPKCの活性化を測定する。このPKCの活性化の測定については、前述の図３に示す公知の方法が好ましく用いられる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
［BDF油］
タイ産の種子を搾油したJatropha油を水酸化カリウムを触媒とするアルカリ触媒法(山根浩二  「バイオディーゼル  -天ぷら鍋から燃料タンクへ-」、東京図書出版会、2007年 参照)により製造した。
【００１９】
［HPLCによるPEsの測定］
上記のTH油及びBDF中のPhorbol  estersを、非特許文献１に記載の手法に従って、高速液体クロマトグラフィー（HPLC），カラム(LiChrospher（登録商標）100,endcapped  5μm,250×4mm,temperature  of  45℃)で分離して測定した。流量は１．３ｍＬ／分であった。
Phorbol  estersは、溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ）と溶媒Ｂ（ＣＨ３ＣＮ：アセトニトリル)の異なった溶媒の勾配で溶出させた．４０％Ｂと６０％Ａで開始し、Ｂを７５％に１５分で増加し、Ｂを次の２０分で１００％にした。スペクトルはPhoto  Diode  Arrayで検出した。
【００２０】
図１は、TH油（上）及びTH油由来のBDF（下）のそれぞれのHPLCクロマトグラムである。
12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA：シグマアルドリッチジャパン株式会社)を標準物質とした。Phorbol  esters  peaks面積はTPA換算濃度(等価)として変換した。
TH(タイ産)油では非特許文献１に相当するPhorbol  esters化合物のpeaksは、ＵＶ２８０ｎｍで２３〜２５分に４peaks出現し、TPA換算濃度では２．３５μｇ／ｍｇであった。
TH油のBDFではＵＶ２８０ｎｍで２３〜２５分に出現したPhorbol  esters化合物のpeaksは２peaksで、TPA換算濃度では０．３１μｇ／ｍｇであったが、２３分より前にＡからＧの新たな７peaksが出現した。
HPLCの測定結果によれば、BDF化により、PEsの元の４peaksは７．６分の１に減少している結果となった。
【００２１】
［植物油脂成分の乳化］
非イオン性界面活性剤Tween20を、上記BDF油及び下記の各種植物油脂に１％添加し、超音波で２分間処理した。
・TH油（タイ産Jatropha油）
・TZ油（タンザニア産Jatropha油）
【００２２】
［キナーゼ反応］
下記の各反応液を30℃の恒温槽で２分間インキュベートした。その後、各反応液にPKC（２．５μｇ／ｍＬ  in  PKC  dilution  buffer）を４μＬ加え、さらに３０℃で３０分間インキュベートを行った。その後、９５℃で１０分間インキュベートすることにより反応を止めた。
（１）乳化された植物油脂成分１〜１０μＬ
（２）PKC  Reaction  ５×Buffer*  ５μＬ
（３）C1  Peptide（０．４μｇ／μＬ  in  water）**  ５μＬ
（４）Peptide  Protection  Solution  １μＬ
（５）滅菌蒸留水９〜１０μＬ 
*  PKC  Reaction  5×Buffer：100mM  HEPES（pH7.4），6.5mM  CaCl2，5mM  DTT，50mM  MgCl2，5mM  ATP
**  C1  Peptideの配列：PLSRTLSVAAK
【００２３】
［電気泳動によるリン酸化ペプチドの分離・同定］
前記の各反応液に１μLの８０％グリセロールを加えた後、０．８％アガロースゲルで電気泳動（バッファー組成：５０ｍＭ  Tris-HCl（ｐＨ８．０））を行った。
泳動後、ＵＶ照射下で写真を撮影した。
【００２４】
［結果］
図２は、電気泳動後の写真撮影像であり、Phosphorylatedの強さ（白くなるとシグナルが強くなる）を示している。
シグナルの強さをレーン３のTH（タイ産）のJatropha油とレーン２のBDF油（BDF化した油）と比較すると、BDF化によりPKCの活性化が１／１０００以下になることが容易に推定できる。他のレーンは比較対照である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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