(57)【要約】【課題】酵素免疫測定法において、酵素と抗体を化学的に結合することにより、酵素活性が低下すること。【解決手段】抗体と酵素補因子複合体から光刺激により酵素補因子を分離し、これを補因子を有さない酵素に供することにより、化学的結合による酵素の活性低下を起こすことなく、抗原濃度測定を行う。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーを介して酵素補因子を結合した抗体または抗体フラグメントと抗原を含む溶液を接触させる工程１と、
前記抗体と前記抗原の複合体を分離する工程２と、
前記工程２により遊離した抗体に光を照射することにより補因子を遊離する工程３と、
前記工程３の後に遊離した補因子と酵素を接触させる工程４と、
前記工程４の後に酵素と基質の反応による生成物を測定する工程５と、を備えることを特徴とする、抗原濃度測定方法。
【請求項２】
前記リンカーが、次の式（１）を含んでおり、前記酵素補因子がイオンであることを特徴とする請求項１記載の抗原濃度測定方法。
【請求項３】
前記リンカーが次の式（２）を含んでおり、前記酵素補因子が補酵素であることを特徴とする請求項１記載の抗原濃度測定方法。
【請求項４】
前記リンカーが次の式（３）を含んでおり、前記酵素補因子が補酵素であることを特徴とする請求項１記載の抗原濃度測定方法。
【請求項５】
リンカーを介して酵素補因子を結合した抗体または抗体フラグメントと抗原を含む溶液を導入する被検試料導入部と、
前記被検体試料導入部と連通した流路の下流側に位置し、前記抗体または抗体フラグメントと前記抗原の複合体を分離する分離部と、
前記分離部の下流側に位置し、前記分離部から遊離した抗体に光を照射する窓部と、
前記窓部への光照射により遊離した補因子を補足する酵素を含む酵素試薬保持部と、
前記酵素の反応を検出する検出部と、
前記検出部より下流に位置し前記被検試料導入部と前記分離部と前記窓部と前記試薬保持部と前記検出部とを連通する排気口とを備えるバイオセンサと
前記バイオセンサと接続し、前記検出部における酵素反応を検出する計測部と、前記窓部に光を照射する投光部とを備えることを特徴とする抗原濃度測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検試料中の抗原濃度を測定するための方法及びそれを用いた装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
被検試料中の抗原濃度を測定するための方法として、抗原特異的に反応する抗体を用いた免疫学的分析法は最もよく用いられる方法の一つである。免疫学的分析法には様々な測定法が存在し、例えば、酵素を抗体に連結させた試薬を用い抗原抗体反応が生じたかどうかを酵素反応により検知する酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）がある。この方法については非特許文献１、非特許文献２をはじめ多くの書籍にて紹介されている。しかしながら、酵素免疫測定法は操作が煩雑である事や反応時間が長い事が課題であり、近年、迅速検査方法として免疫クロマトグラフィーが報告されている。特許文献１、２にはクロマトグラフィー法による、セルロースメンブレン上での被測定物質測定が報告されている。これらはメンブレン上に固定化された抗体、試料液中の被測定物質、酵素で標識された抗体からなる結合体の形成を、酵素反応により検出する方法である。酵素と酵素の発色基質を反応させることで生じる発色を視認や分光器による吸光度変化として捉える。これらの方法には酵素を抗体に連結させた試薬が必要となる。一般的に抗体への酵素標識は、抗体や酵素蛋白質に含まれるアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基を介して化学的に結合することで得ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−１５３６００号公報
【特許文献２】特開２００１−１３１４４号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】石川榮治ら著「酵素免疫測定法」医学書院出版、１９７８年１２月１５日
【非特許文献２】金井泉原著「臨床検査法提要  改訂第３１版」金原出版株式会社、１９９８年９月２０日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、酵素と抗体を化学的に結合することにより、酵素活性が低下するという問題点があった。
【０００６】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、抗体へ酵素の化学的な修飾を行う事のない酵素免疫測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記従来の問題点を解決するために、鋭意研究の結果、抗体と酵素補因子複合体から光刺激により酵素補因子を分離し、これを補因子を有さない酵素に供することにより、化学的結合による酵素の活性低下を起こすことなく、抗原濃度測定を行うという発想に至り、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明の抗原濃度測定法は、
リンカーを介して酵素補因子を結合した抗体または抗体フラグメントと抗原を含む溶液を接触させる工程１と、
前記抗体と前記抗原の複合体を分離する工程２と、
前記工程２により遊離した抗体に光を照射することにより補因子を遊離する工程３と、
前記工程３の後に遊離した補因子と酵素を接触させる工程４と、
前記工程４の後に酵素と基質の反応による生成物を測定する工程５と、
を備えることを特徴とする。
【０００９】
また、前記抗体フラグメントには、Ｆａｂ、ｓｃＦＶなどの抗体の部分構造を含み、抗原抗体様結合をする分子を用いることができる。
【００１０】
また、本発明の抗原濃度測定方法は、前記リンカーが、スピロピラン分子を含んでおり、前記酵素補因子がイオンであることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明の抗原濃度測定方法は、前記リンカー光開裂基を含んでおり、前記酵素補因子が補酵素であることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の抗原濃度測定方法は、
リンカーを介して酵素補因子を結合した抗体または抗体フラグメントと抗原を含む溶液を導入する被検試料導入部と、
前記被検試料導入部と連通した流路の下流側に位置し、前記抗体または抗体フラグメントと前記抗原の複合体を分離する分離部と、
前記分離部の下流側に位置し、前記分離部から遊離した抗体に光を照射する窓部と、
前記窓部への光照射により遊離した補因子を補足する酵素を含む酵素試薬保持部と、
前記酵素の反応を検出する検出部と、
前記検出部より下流に位置し前記被検試料導入部と前記分離部と前記窓部と前記試薬保持部と前記検出部とを連通する排気口とを備えるバイオセンサと
前記バイオセンサと接続し、前記検出部における酵素反応を検出する計測部と、前記窓部に光を照射する投光部と、を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、化学的修飾により酵素を抗体に結合するのではなく、酵素の補因子を結合するため酵素の活性低下を起こすことがない。さらに、抗原抗体反応終了後に光刺激で補因子を遊離し、酵素との複合体を再形成させることで酵素反応量による抗原濃度測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の抗原濃度測定方法の測定フローを示す図
【図２】発明を実施するための形態にかかるバイオセンサの分解構成図
【図３】発明を実施するための形態にかかる抗原測定装置の構成図
【図４】実施の形態１において、光照射によるイオン遊離を示した図
【図５】実施の形態２において、光照射によるＰＱＱ遊離を示した図
【図６】実施の形態２において、光照射によるＦＡＤ遊離を示した図
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
【００１６】
（実施の形態１）
図１は、本発明における抗原濃度測定方法の測定フローである。
【００１７】
まず、被検試料として抗原を含む溶液と、リンカーを介して補因子を修飾した抗体を用意する。これら混合した後（工程１）、抗原抗体複合体と、抗原と結合していない抗体を分離する（工程２）。この分離工程には、抗原と結合していない抗体のみに結合する分子を固定化した不溶性担体を使用する。前記抗原と結合していない抗体のみに結合する分子としては、抗体に対する抗原を使用することができるが、これに限らず同様の機能を有する分子を使用することができる。次に分離した抗原抗体複合体に対し、光を照射して抗体に修飾された補因子を遊離させる（工程３）。次に遊離した補因子と、補因子を有さない酵素を混合し、酵素に補因子を結合する（工程４）。前記補因子を有さない酵素はアポ型酵素と呼ばれ、補因子を結合した酵素はホロ型酵素と呼ばれる。アポ型酵素は酵素基質が共存していても基質と反応することが出来ないが、ホロ型酵素は基質と反応することができる。したがって、工程４により補因子との結合により反応性を有する酵素が産生する。次に酵素と同液中に酵素基質を配し、酵素反応量を測定する。酵素反応量の測定は、使用する酵素と基質の種類により適宜選択することができるが、例えばアルカリフォスファターゼであればｐ−ニトロホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−ホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム、ファーストレッド／ナフトールなどの発色しうる基質を用い、酵素反応により生じる発色を分光器による吸光度変化として捉えることができる。また、アルカリフォスファターゼの基質としてナフチルホスフェイト、アスコルビン酸リン酸エステル(特開平８−４３３４８）を用いれば、酵素反応生成物を電流測定することができる。また、グルコース酸化還元酵素であれば、基質としてグルコースと共にフェリシアン化カリウムなどの電子伝達化合物を用い、酵素反応により生じる還元型電子伝達化合物を電流測定することができる。
【００１８】
前記リンカーを介して補因子を修飾した抗体は、化１によるスピロピラン分子によりリンカー形成し構築する。スピロピランは光刺激により、スピロピラン構造（閉環体）とメロシアニン構造体（開環体）へと変化することが知られている（図４）。液中に金属の陽イオンが溶存していると、メロシアニン構造における酸素原子は、電子密度が高いために、この部位で、陽イオンである金属イオンと錯形成を生じる（特開２００７−２６８４４４）。この錯形成はメロシアニン構造体が可視光（  ＞  ４２０ｎｍ、好ましくは５２０ｎｍ）照射によりスピロピラン構造体に戻ると解消する。抗体とスピロピラン分子の結合は例えば、チオール基を有するスピロピラン分子（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ９  ＶＯＬ．  １２５，  ＮＯ．  ２４，  ２００３  ７１７５）と、マレイミド基を導入した抗体とチオール基を介して結合することにより作製することができる。このチオール基と抗体の結合試薬にはｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅａｇｅｎｔｓとして市販されている試薬を使用できる（同仁化学研究所（株））。
【００１９】
【化１】
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【００２０】
このように構築したスピロピラン分子によりリンカー形成した抗体と二価の金属イオンを混合し、３６０ｎｍの光照射する。その後、暗所で透析あるいは限外ろ過により抗体と結合していないイオンを除くことで、補因子であるイオンを修飾した抗体を得ることができる。イオンを補因子とする多くの酵素が知られており、例えば、亜鉛を補因子とする酵素として、アルコール脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、ロイシンアミノペプチダーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、スーパーオキシドジムスターゼ、アルカリフォスファターゼ、グルタミン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、炭酸脱水素酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、カルボキシペプチダーゼなどがある。また、ＰＱＱグルコース脱水素酵素はカルシウムを補因子とする。鉄を補因子とする酵素として、カタラーゼ、ニトロゲナーゼ、シトクロム、ヒドロゲナーゼがあり、マグネシウムを補因子とする酵素としてはグルコース６フォスファターゼ、ヘキソキナーゼがある。また、ウレアーゼはＮｉを、グルタチオンペルオキシダーゼはＳｅ、シトクロムｃオキシダーゼはＣｕを補因子とするなど多種類の酵素がある。本発明において酵素およびイオンの種類に制限はないが、アルカリフォスファターゼ、ＰＱＱグルコース脱水素酵素が特に望ましい。これら酵素は酵素１分子当りの活性が高く、測定にかかる時間を短縮できることが期待されるためである。
【００２１】
図２は、発明を実施するための形態にかかるバイオセンサの分解構成図である。本発明のバイオセンサは基板１１、流路壁２、カバー１３、遮光カバー１４からなり、基板１１とカバー１３の間は流路壁２により中空構造を有する。中空構造はすなわち試料を充填するための空間であり、その形状は適宜設計すればよいが、例えば直方体であることが望ましい。前記中空構造の内壁を形成する材料は、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）やポリカーボネート等のポリマーフィルム、ガラスなどを用いる事ができる。流路壁２は、接着剤などの樹脂、両面テープなどを用いて形成することができ、その材質に制限はない。遮光カバー１４は、可視光を通さない素材であれば制限はなく、遮光性ＰＥＴやポリプロピレンやポリエチレン、アルミニウムなどの金属薄膜などを用いることができる。前記中空構造内部には、被検試料導入部１、分離部３、検出１０が形成され、カバー１３の下流側には排気口１１が形成されている。これにより被検試料導入部１を上流側、排気口１１を下流側とする流路構造となっている。当該流路への被検体試料導入は、毛細管力を用いて行うことができる。分離部３には抗原結合分子８が固定化されている。分離部３は多孔性担体であり毛細管現象を生じる形状・素材を用いることができるが、例えばニトロセルロースメンブレンはタンパク質等を固定し易いため好ましい。この多孔質担体は基板１２とカバー１３の間に隙間無く設置するために、糊、接着剤などで貼り付けることが望ましい。検出部を形成する基板１２上には対極５、参照極６、作用極７ならなる電極が配置され、さらに試薬担持部９が配置される。電極の作製には、スパッタリングや蒸着を用いることができ、電極素材には、金や銀などを用いることができる。試薬担持部９には酵素及び酵素基質、フェリシアン化カリウムを含む試薬が担持される。前記試薬には緩衝液が含まれていてもよい。また、カバー１３の検出部上面を覆う領域が窓部４である。後述の投光部１６から照射される光をくまなく照射するために、検出部を全て含むように設計することが望ましい。また、カバー１３の窓部４には照射される光を透過するために透明度の高い材料を用いる。
【００２２】
図３は、本発明を実施するための形態にかかる抗原測定装置の構成図である。図２で示したバイオセンサと、バイオセンサの対極４、参照極５、作用極６に連結された計測部１５と、バイオセンサの窓部４へ光を照射する投光部６から形成される。
【００２３】
次に、上記のように構成したバイオセンサの使用方法について、ヒトアルブミン測定を例に説明する。上述の方法に従い、スピロピラン分子を結合したヒトアルブミン抗体（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４５９号の産生細胞株より産生される抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体（以下、２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１と記す））と塩化カルシウム溶液を混合し、３６０ｎｍの光を照射する。遮光状態で透析を行うことにより、スピロピランに結合していない塩化カルシウムを除くことでリンカーを介して補因子を修飾した抗体を用意する。また、分離部には、抗体結合分子としてＨＳＡを固定化しておく。試薬担持部には、ＥＤＴＡを含む緩衝液による透析によりカルシウムイオンを除いたＰＱＱグルコース脱水素酵素と、グルコース、およびフェリシアン化カリウムを含む試薬を配置する。前記ヒトアルブミン抗体と抗原であるヒトアルブミン（ＨＳＡ）を含む被検試料を混合し、バイオセンサの被検試料導入口に点着する。毛細管力によりチップ内を流れ、分離部に到達した被検試料の中の、ＨＳＡと結合していない抗体は、分離部に固定されたＨＳＡと結合する。一方ＨＳＡと結合した抗体は分離部を通り抜け、検出部に到達する。検出部で５２０ｎｍの光を照射することで抗体からカルシウムイオンを遊離させた後、酵素反応により産生するフェロシアン化カリウムを＋２５０〜４００ｍＶ  ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌにて電流値測定することで測定する。このようにして電流値を計測し、あらかじめ作成しておいた検量線（電流値と抗原濃度の相関式）にて変換することで抗体濃度を知ることができる。
【００２４】
（実施の形態２）
実施の形態２について、詳細を説明する。但し、本発明は実施の形態１で述べた免疫センサ装置と類似しているため、違いを中心に記載する。
【００２５】
図１に示した、本発明における抗原濃度測定方法の測定フローは実施の形態２においても同様である。
【００２６】
リンカーを介して補因子を修飾した抗体は、化２あるいは化３のリンカーを形成し構築する。補因子としては補酵素PQQ（化４）、補酵素FAD（化５）あるいは補酵素FAD誘導体（化６）を使用する。
【００２７】
【化２】
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【００２８】
【化３】
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【００２９】
【化４】
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【００３０】
【化５】
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【００３１】
【化６】
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【００３２】
化２のオルトニトロカルボニル基のうち、ニトロ基のオルト位に配意したアルキル基の炭素原子（化１中A）と共有結合する形で、例えば抗体との結合にはマレイミド基を介して抗体のSH基と複合体を合成できる。また、補酵素PQQと複合体を合成でき、全体構造の例を図５の左図で示す。図５中Rは抗体の意味である。o-ニトロベンジルカルボニル基は３５０nm光照射により、開裂することが知られている。したがって、図５に示すように、o-ニトロベンジルカルボニル基がo-ニトロベンジルカルボニル基に開裂するに伴い、PQQが放出される。
【００３３】
また、化３分子は、例えば、特開２００７−２９１００５記載の方法にて、Ｂｉｓ（１２−（４−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｏｘｙｄｏｄｅｃｙｌ）  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅとして合成し、これにより、光架橋基を介してスクシンイミジルエステルを提示した分子として調整することができる。この分子中のチオール基とマレイミド基を導入した抗体を結合することにより、抗体との複合体を作製することができ、また、スクシンイミド基を介してFADのアミノ基と結合することができる。全体構造の例を図６で示す。図６中Rは抗体の意味である。この複合体は３６５nm光照射により開裂し、FADが放出される。本発明において使用できる酵素および補酵素の種類は、前記リンカーとの結合ができるものであれば制限はないが、中でもＰＱＱとPQQグルコース脱水素酵素、FADとグルコースオキシダーゼが好ましい。これら酵素は酵素１分子当りの活性が高く、測定にかかる時間を短縮できることが期待されるためである。
【００３４】
実施の形態２にかかるバイオセンサ、および抗原測定装置は実施の形態１と同様である。
【００３５】
次に、実施の形態２におけるバイオセンサの使用方法について、ヒトアルブミン測定を例に説明する。上述の方法に従い、補酵素PQQを結合したヒトアルブミン抗体（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４５９号の産生細胞株より産生される抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体（以下、２Ｆ１３Ｆ１１Ｇ１１と記す））を用意する。また、分離部には、抗体結合分子としてＨＳＡを固定化しておく。試薬担持部には、透析により補酵素を除いたＰＱＱグルコース脱水素酵素と、グルコース、およびフェリシアン化カリウムを含む試薬を配置する。前記ヒトアルブミン抗体と抗原であるヒトアルブミン（ＨＳＡ）を含む被検試料を混合し、バイオセンサの被検試料導入口に点着する。毛細管力によりチップ内を流れ、分離部に到達した被検試料の中の、ＨＳＡと結合していない抗体は、分離部に固定されたＨＳＡと結合する。一方ＨＳＡと結合した抗体は分離部を通り抜け、検出部に到達する。検出部で３５０ｎｍの光を照射することで抗体からPQQを遊離させた後、酵素反応により産生するフェロシアン化カリウムを＋２５０〜４００ｍＶ  ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌにて電流値測定することで測定する。このようにして電流値を計測し、あらかじめ作成しておいた検量線（電流値と抗原濃度の相関式）にて変換することで抗体濃度を知ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によれば、化学的修飾により酵素を抗体に結合するのではなく、酵素の補因子を結合するため酵素の活性低下を起こすことなく酵素免疫測定方法を行うことができる。さらに、抗原抗体反応終了後に光刺激で補因子を遊離し、酵素との複合体を再形成させることで酵素反応量による抗原濃度測定を行うことができる。そのため、抗原濃度を測定するバイオセンサにおいて高感度な測定方法を提供すると考えられる。
【符号の説明】
【００３７】
１  被検試料導入部
２  流路壁
３  分離部
４  窓部
５  対極
６  参照極
７  作用極
８  抗体結合分子
９  試薬保持部
１０  検出部
１１  排気口
１２  基板
１３  カバー
１４  遮光カバー
１５  計測部
１６  投光部
１７  抗原濃度測定装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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