(57)【要約】【課題】本発明は、安全で、且つ優れた組成物、特に抗酸化作用等を有する組成物を提供することを主な目的とする。【解決手段】単離したレスベラトロール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む、Ｓｉｒｔ１活性化剤、並びにＭｎＳＯＤ活性化剤、及び単離したレスベラトロール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む組成物、並びに抗酸化組成物を提供すること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離したレスベラトロール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを含むＳｉｒｔ１活性化剤。
【請求項２】
単離したレスベラトロール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを含むＭｎＳＯＤ活性化剤。
【請求項３】
単離したレスベラトロール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む組成物。
【請求項４】
単離したレスベラトロール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む抗酸化組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はレスベラトロールを含む剤、及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
レスベラトロールは、ブドウの果皮、赤ワインなどに含まれるポリフェノールの一種であり、赤ワインの消費が多い程、虚血性の心疾患の発生が減少するという、所謂フレンチパラドックスの原因物質ではないかといわれている。また、このようなレスベラトロールは、酸化型アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）依存型のヒストン脱アセチル化酵素であるＳＩＲＴ１を活性化し、引き続いてマンガンスーパーオキシドディスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）の発現を亢進させ、結果として細胞内の酸化ストレスを除去する働きを誘導することが明らかとなっている（非特許文献１）。
【０００３】
レスベラトロールアグリコンについては、上述のような知見があるが、レスベラトールの誘導体の生体内における効果については、何ら明らかになっていない。例えば、レスベラトロールの水溶性を向上させるために、レスベラトール配糖体が有用に用いられることが考えられ、その具体的なレスベラトロール配糖体としては、下記式（１）
【０００４】
【化１】
2012240956.tif 000002
【０００５】
に示すような、レスベラトロール−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、３Ｇ−ＲＳＶとする）、下記式（２）
【０００６】
【化２】
2012240956.tif 000003
【０００７】
に示すような、レスベラトロール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、４’Ｇ−ＲＳＶとする）等の配糖体が挙げられる。これらのレスベラトロール配糖体は、糖が配位する場所異なっており、それによって生体内における効果が異なる可能性が考えられるが明らかにはなっていない。
【０００８】
また、抗酸化作用を示す化合物は、生体内外にて異なる効果を示すことが多く、上述のレスベラトロールに至ってはレスベラトロールアグリコンが示す抗酸化作用しか明らかになっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔａｎｎｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ ＢｉｏｌＣｈｅｍ． ２０１０ Ｍａｒ１２；２８５（１１）：８３７５−８２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のように、抗酸化作用を示すとされる化合物は、細胞外での抗酸化作用の結果が、細胞内での抗酸化作用の結果と必ずしも一致しないことが多く、生体に対して効果的に抗酸化作用を示すかどうかについては明確ではなかった。殊に、レスベラトロールについては、有効な抗酸化作用を有することが知られていたが、抗酸化作用が要求される剤や組成物に用いるのに有用なレスベラトロール誘導体についての知見は何ら存在していない。
【００１１】
そこで本発明は、安全で、且つ優れた組成物、特に抗酸化作用等を有する組成物を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、レスベラトロール配糖体の中でも４’Ｇ−ＲＳＶが、レスベラトロールアグリコンよりも、優れたＨ３の脱アセチル化作用を有することを見出した。
【００１３】
さらに４’Ｇ−ＲＳＶは、他のレスベラトロール配糖体よりも、優れたＳｉｒｔ１活性化能、及びＭｎＳＯＤ発現誘導能を示すことが明らかとなった。すなわち本発明は、かかる知見に基づいて完成したものであり、下記に示す態様の発明を広く包含するものである。
【００１４】
項１  単離したレスベラトロール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む、Ｓｉｒｔ１活性化剤。
【００１５】
項２  単離したレスベラトロール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む、ＭｎＳＯＤ発現誘導剤。
【００１６】
項３  単離したレスベラトロール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む、組成物。
【００１７】
項４  単離したレスベラトロール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む、抗酸化組成物
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
レスベラトロール−４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（４’Ｇ−ＲＳＶ）
本発明の４’Ｇ−ＲＳＶは、下記式（２）
【００１９】
【化３】
2012240956.tif 000004
【００２０】
に示される化合物である。４’Ｇ−ＲＳＶは幾何異性体として、シス体及びトランス体が存在するが、トランス体が本発明の４’Ｇ−ＲＳＶとして好ましい。
【００２１】
本発明の４’Ｇ−ＲＳＶの単離方法は、化学合成による方法であっても、天然に存在する動植物から抽出する方法であってもよい。若しくは、天然物、又はその抽出物を原料として、発酵等の生物合成、又は化学合成の工程を経て単離する方法であってもよい。中でも環境や動物への安全性の観点から、化学合成の工程を経る方法は好ましくない。
【００２２】
上述の原料となる天然物として、具体的にはブドウ、ピーナッツ、カカオマス等の植物の表皮を挙げることができる。好ましくは、ピーナッツである。例えば、ピーナッツ表皮の乾燥体１ｇ当たり通常は１〜５ｍｇ程度の４’Ｇ−ＲＳＶが含まれる。
【００２３】
上記の天然物由来の４’Ｇ−ＲＳＶは、上記の植物の表皮うち少なくとも一種を原料として単離すればよい。具体的な単離方法の一例として、上記原料をそのまま、或いは必要に応じて乾燥、細切、破砕、粉砕、圧搾、煮沸あるいは発酵処理した処理物に対して、溶媒を加えて４’Ｇ−ＲＳＶを抽出する方法が挙げられる。
【００２４】
溶媒としては、例えばアセトン、エタノール、ヘキサン、クロロホルム等が挙げられ、中でも、抽出効率の観点からアセトン、又はエタノールを用いることが好ましい。溶媒の使用量は、上記原料に１重量部に対して通常２〜１００重量部程度とすればよく、より好ましくは１０〜５０重量部程度である。
【００２５】
具体的な抽出方法は、冷浸、温浸等の浸漬法；低温、室温、又は高温条件下で撹拌する方法；パーコレーション法等が挙られる。抽出の後、ろ過や遠心分離等の通常の固液分離手段を用いて固相画分を取り除いて得られる液体画分を、４’Ｇ−ＲＳＶを含む抽出物とすればよい。得られた抽出物そのものを、本発明の単離した４’Ｇ−ＲＳＶとしてもよいが、必要に応じて得られた抽出物に対して減圧蒸留等の処理を施し、有機溶媒成分を取り除いて得られるものを本発明の単離した４’Ｇ−ＲＳＶとしてもよい。更に、必要に応じて乾燥、濃縮等の処理に供して乾燥物や濃縮物としてもよい。
【００２６】
また、得られた抽出物を精製の工程に供して、本発明の単離した４’Ｇ−ＲＳＶとしてもよい。具体的な精製方法として、ＨＰＬＣシステム等を用いた、公知のカラムクロマトグラフィー法による方法等が挙げられる。このような方法にて用いるカラムの種類としては、シリカカラム、ＯＤＳカラム等が挙げられ、中でもシリカカラムが好ましい。
【００２７】
Ｓｉｒｔ１活性化剤、及びＭｎＳＯＤ発現誘導剤
本発明のＳｉｒｔ１活性化剤、及びＭｎＳＯＤ発現誘導剤は、上述の４’Ｇ−ＲＳＶを含む。本発明のＳｉｒｔ１活性化剤も、ＭｎＳＯＤ発現誘導剤も、上述の４’Ｇ−ＲＳＶそのものであっても、他の成分を含有したものであってもよい。
【００２８】
後者の場合、Ｓｉｒｔ１活性化剤、及びＭｎＳＯＤ発現誘導剤に含有される４’Ｇ−ＲＳＶの割合は、これらの剤に対して通常０．００１〜９９重量％程度とすればよく、より好ましくは１０〜９０％程度である。
【００２９】
上述の４’Ｇ−ＲＳＶを細胞に対して作用させると、細胞内のＳｉｒｔ１が活性化し、ヒストンＨ３の脱アセチル化が生じ、それに伴ってＭｎＳＯＤの発現が亢進され、結果として細胞内に酸化ストレスを低減させる機能を有するＭｎＳＯＤが、著量に蓄積することになる（図１）。すなわち、本発明のＳｉｒｔ１活性化剤、及びＭｎＳＯＤ発現誘導剤は、細胞内における抗酸化の用途に用いることができる。Ｓｉｒｔ１、及びＭｎＳＯＤのより詳細な機能等については、非特許文献１に記載の通りである。
【００３０】
本発明のＳｉｒｔ１活性化剤、及びＭｎＳＯＤ発現誘導剤による効果は、それぞれ細胞内のＳｉｒｔ１活性化の度合い、及び細胞内のＭｎＳＯＤ発現誘導の度合いによって確認することもできるが、上述のようにＳｉｒｔ１の活性化、及びＭｎＳＯＤの活性化は共に細胞内での抗酸化作用を上昇させるので、酸化ストレスに起因する細胞死の抑制、ひいては老化防止作用、アンチエイジング作用等によって確認することもできる。
【００３１】
本発明のＳｉｒｔ１活性化剤、及びＭｎＳＯＤ発現誘導剤は、動物個体を対象として使用することが可能である。使用対象とする動物個体は、特に限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、イタチ等のホ乳類動物に対して、より好ましい抗酸化作用、老化防止作用、アンチエイジング作用を示す。さらに好ましい使用対象はヒトである。
【００３２】
本発明のＳｉｒｔ１活性化剤、及びＭｎＳＯＤ発現誘導剤の動物個体に対する使用量は、動物個体の体重、年齢、性別、投与形態、所望する効果の程度等によって適宜設定することが可能である。具体的な使用量は、内用の形態であれば、有効成分である４’Ｇ−ＲＳＶの量に換算して、通常０．５〜５００ｍｇ／ｋｇ／日程度の量とすればよく、外用の形態であれば、同じく４’Ｇ−ＲＳＶの量に換算して、皮膚１ｃｍ２あたり通常２．５〜５００ｍｇ程度の量で使用すればよい。
【００３３】
上述のように、本発明のＳｉｒｔ１活性化剤、及びＭｎＳＯＤ発現誘導剤に含まれる４’Ｇ−ＲＳＶは、経皮による適用となる外用、内服又は摂取による適用となる内用等の形態で使用されることによって抗酸化効果、ひいては老化防止効果、アンチエイジング効果等を発揮するので、本発明の４’Ｇ−ＲＳＶは組成物に配合して使用される。
【００３４】
組成物
本発明の単離した４’Ｇ−ＲＳＶを含む組成物における４’Ｇ−ＲＳＶの配合割合は、当該組成物が抗酸化作用、老化防止作用、アンチエイジング作用等を示す量とすればよく、該組成物の形態、用途等に応じて適宜調整されるが、通常は組成物の総量に対して、０．００１〜９９重量％程度とすればよい。
【００３５】
上述のように、本発明の単離した４’Ｇ−ＲＳＶを含む組成物は、Ｓｉｒｔ１活性化剤、及びＭｎＳＯＤ発現誘導剤と同様に抗酸化の作用を示すことが期待できるため、抗酸化組成物として特に有用である。そして、本発明の組成物は、上述のＳｉｒｔ１活性化剤、及びＭｎＳＯＤ発現誘導剤と同様に動物個体を対象として使用することも可能である。
【００３６】
使用対象とする動物個体は、特に限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、イタチ等のホ乳類動物に対して、より好ましい抗酸化作用を示す。さらに好ましくはヒトである。特に、本発明の組成物は抗酸化作用が期待できるので、飲食品又は化粧料の分野において、抗酸化、老化防止、アンチエイジング等を所望するヒトに、好ましく用いられる。また、医薬品の分野においては、後述するような酸化ストレス等に関与する疾病の治療及び/又は予防が必要であるヒトに、好ましく用いられる。
【００３７】
以下に、本発明の単離した４’Ｇ−ＲＳＶを含む組成物の使用態様について、化粧料、医薬品、及び飲食品を例に挙げて説明する。
【００３８】
化粧料
化粧料において、抗酸化作用、老化防止作用、アンチエイジング作用等に有効な量の４’Ｇ−ＲＳＶと共に、香粧学的に許容される担体や添加剤等を配合することにより、抗酸化用、老化防止用の化粧料組成物が提供される。
【００３９】
すなわち、本発明の化粧料組成物は上述の４’Ｇ−ＲＳＶを有効成分として含有する。当該化粧用組成物は、Ｓｉｒｔ１を活性化し、ＭｎＳＯＤの発現を亢進させて細胞内の酸化ストレスを抑制する作用を効果的に発揮し、抗酸化作用、老化防止作用、アンチエイジング等の効果が期待され、特に紫外線などの光によって引き起こされる老化防止効果やアンチエイジング効果が期待されるので、例えば、老化防止用化粧料、アンチエイジング用化粧料等に有用である。
【００４０】
当該化粧料組成物の形状については特に制限されないが、例えば、ペースト状、ローション状、ムース状、ジェル状、ゼリー状、液状、乳液状、懸濁液状、クリーム状、軟膏状、シート状、エアゾール状、スプレー状等が挙げられる。また、当該化粧料組成物の形態についても、制限されるものではないが、例えば、ファンデーション、頬紅、白粉等のメイクアップ化粧料；化粧水、乳液、クリーム、ローション、オイル及びパック等の基礎化粧料；洗顔料、クレンジング、ボディ洗浄料等の皮膚洗浄料；マッサージ剤、清拭剤；清浄剤；入浴剤等が挙げられる。
【００４１】
このような化粧料組成物の適用量は、適用対象者の性別や年齢、該組成物の適用形態、期待される効果等に基づいて適宜設定することができ、例えば４’Ｇ−ＲＳＶの量に換算して、皮膚１ｃｍ２あたり、通常２．５〜５００ｍｇ程度の量とすればよい。
【００４２】
このような化粧料組成物における４’Ｇ−ＲＳＶの配合割合は、上述した割合の範囲内で適宜設定すればよいが、化粧料組成物の総量に対して、４’Ｇ−ＲＳＶが０．００１〜９９重量％程度となる割合とすればよく、好ましくは１０〜９０％程度である。
【００４３】
医薬品
医薬の分野では、抗酸化作用、老化防止作用、アンチエイジング効果等に有効な量の上述の４’Ｇ−ＲＳＶと共に、薬学的に許容される担体や添加剤を配合することにより、抗酸化用、老化防止用、アンチエイジング用等の医薬組成物が提供される。すなわち、本発明の医薬組成物は上述の４’Ｇ−ＲＳＶを有効成分として含有する。
【００４４】
当該医薬組成物における４Ｇ’−ＲＳＶの配合割合は、適用形態や適用量等に応じて、適宜設定すればよいが、該組成物の総量に対して、４Ｇ’−ＲＳＶが０．００１〜９９．９重量％程度となる割合とすればよく、好ましくは１０〜９０重量％程度である。
【００４５】
当該医薬組成物は、Ｓｉｒｔ１を活性化し、ＭｎＳＯＤの発現を亢進させて細胞内の酸化ストレスを抑制する作用を効果的に発揮するので、細胞内の酸化ストレスの地蓄積によって惹起される疾病や症状の予防及び／又は治療薬として有用である。具体的には、肥満、心不全、筋ジストロフィー、糖尿病、前糖尿病状態、動脈硬化症、高脂血症、自己免疫疾患（ループスエリテマトーデス、関節リウマチ、結節性多発動脈炎、皮膚筋炎、混合性結合織病、強皮症、シェーグレン症候群、ベーチェット病、側頭動脈炎、重症筋無力症、ギランバレー症候群、多発性硬化症、原田病、白斑、天疱瘡、類天疱瘡、慢性腎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎等）、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン病、脳出血、脳梗塞、心筋梗塞、黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、アレルギー性皮膚炎、慢性膵炎、腎硬化症、肝硬変等が例示される。なお、当該医薬組成物には、医薬品及び医薬部外品の双方が含まれる。
【００４６】
当該医薬組成物は、内用的に適用されても、また外用的に適用されても、上述した所望の作用を発揮することができる。故に、当該医薬組成物は、内服剤；静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射及び腹腔内注射等の注射剤；経粘膜適用剤、経皮適用剤等の製剤形態で使用することができる。
【００４７】
当該医薬組成物の剤型としては、適用形態に応じて適宜設定されるが、一例として、錠剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形製剤；液剤、乳剤、懸濁剤等の液状製剤；軟膏剤、ゲル剤等の半固形製剤が挙げられる。
【００４８】
当該医薬組成物の適用量は、適用対象者の性別や年齢、該組成物の適用形態、期待される効果等に基づいて適宜設定することができ、例えば、４Ｇ’−ＲＳＶの量に換算して、通常１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日程度の量で適用すればよい。
【００４９】
飲食品
飲食品の分野では、細胞における抗酸化作用、老化防止作用、アンチエイジング効果等を生体内で発揮するのに有効な量の４Ｇ’−ＲＳＶを飲食品素材として各種飲食品に配合することにより、細胞内のＳｉｒｔ１を活性化し、ＭｎＳＯＤの発現を亢進させて細胞内の酸化ストレスを抑制する作用を効果的に発揮する飲食品組成物を提供することができる。
【００５０】
すなわち本発明は、飲食品の分野において、抗酸化、老化防止、又はアンチエイジングを目的とした飲食品組成物を提供することができる。当該飲食品組成物としては、一般の食品の他、特定保健用食品（条件付き特定保健用食品を含む）、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品等を挙げることができる。
【００５１】
当該飲食品組成物として、より具体的には、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料；アイスクリーム、かき氷等の冷菓；ガム、チョコレート、飴、錠菓、スナック菓子、ゼリー、ジャム、クリーム等の菓子類；そば、うどん、即席麺等の麺類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、マヨネーズ、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、サラダ、惣菜、漬物、パン、シリアル等を例示できる。例えば、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品等の場合であれば、粉末、顆粒、カプセル、トローチ、タブレット、シロップ等の形態のものであってもよい。
【００５２】
従来、４Ｇ’−ＲＳＶは上述のようにブドウ、ピーナッツ、カカオマス等の表皮に含まれていることが知られているが、通常の飲食慣習における範囲での摂取量は、上述した抗酸化作用、老化防止作用、アンチエイジング作用等を得るには十分な量ではない。また、過剰な量の４Ｇ’−ＲＳＶを摂取することは、その量に見合った効果が得られず経済的問題があり、ほかには人体への予期されない悪影響が懸念されるので好ましくない。
【００５３】
このような観点から、当該飲食品組成物の摂取量は、４Ｇ’−ＲＳＶの量に換算して、通常０．１〜０．５ｍｇ/日程度とすればよい。このような範囲の摂取量を満たすように適宜設定することで、飲食品組成物に含有させる４Ｇ’−ＲＳＶの量を確定させることができる。また上記の４Ｇ’−ＲＳＶの配合量は、飲食品組成物に対して換算すると、通常０．００１〜９９重量％程度となり、好ましくは１０〜９０重量％程度である。
【００５４】
本発明の４’Ｇ−ＲＳＶは、抗酸化作用、老化防止作用、アンチエイジング作用等を効果的に発揮でき、生体内の酸化ストレスを防ぐ効果が期待されるので、抗酸化用、老化防止用、アンチエイジング用等の飲食品添加剤としても有用である。
【００５５】
上記の抗酸化用、老化防止用、アンチエイジング用等の飲食品添加剤への４’Ｇ−ＲＳＶの配合量は、該剤当り、通常０．００１〜９９重量％程度となり、好ましくは１０〜９０重量％程度である。また、該剤は具体的には飲食品の摂取時又は食事等の調理時に好適に用いることができ、摂取量は上述の飲食品組成物の摂取量と同程度にすればよい。
【発明の効果】
【００５６】
本発明の組成物に含有される単離した４’Ｇ−ＲＳＶは、ブドウ、ピーナッツ、カカオマスの表皮等に含まれる成分である。すなわち、当該４’Ｇ−ＲＳＶは、従来から食品として摂取されてきた天然成分の一種であり、人体に対する安全性が確認されている。特に、本発明の単離した４’Ｇ−ＲＳＶは、ＲＳＶや他の配糖体である３Ｇ−ＲＳＶよりも細胞毒性が低いという性能を有するので、飲食品、医薬品、化粧料などの分野に好ましく用いることができる。
【００５７】
そして、本発明の組成物に含有される単離された４’Ｇ−ＲＳＶは、Ｓｉｒｔ１活性化能、ＭｎＳＯＤ発現誘導能を有することから、細胞において抗酸化の効果をもたらす。従って、ヒト等の動物に適用することによって、アンチエイジング効果、老化防止効果等を与えることが可能となる。
【００５８】
従って、本発明の単離した４’Ｇ−ＲＳＶを含む組成物はそれぞれ抗酸化、老化防止、アンチエイジング等の用途を目的として、飲食品、医薬品、化粧料の分野に用いることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ＲＳＶが関与する生体内の機能を説明する図
【図２】本発明の実施例にて用いた３Ｇ−ＲＳＶ、及び４’Ｇ−ＲＳＶの逆相ＨＰＣＬによる分離を確認するチャート。
【図３】ＤＰＰＨを用いたＲＳＶ、３Ｇ−ＲＳＶ、及び４’Ｇ−ＲＳＶのラジカル消去活性試験。
【図４】ＲＳＶ、３Ｇ−ＲＳＶ、及び４’Ｇ−ＲＳＶによるヒストンＨ３脱アセチル化を確認する実験。（Ａ）実験スキームを示す模式図。（Ｂ）実験結果を定量化し、解析した結果を示すグラフ。（Ｃ）ヒストンＨ３の脱アセチル化を確認するために行ったＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ像。
【図５】ＲＳＶ、３Ｇ−ＲＳＶ、及び４’Ｇ−ＲＳＶによるＭｎＳＯＤタンパク質の発現量の亢進を確認する実験。（Ａ）実験スキームを示す模式図。（Ｂ）実験結果を定量化し、解析した結果を示すグラフ。（Ｃ）ＭｎＳＯＤタンパク質の発現量の亢進を確認するために行った免疫染色像。
【図６】ＲＳＶ、３Ｇ−ＲＳＶ、及び４’Ｇ−ＲＳＶによるＭｎＳＯＤタンパク質の発現量の亢進を確認する実験。（Ａ）実験スキームを示す模式図。（Ｂ）実験結果を定量化し、解析した結果を示すグラフ。（Ｃ）ＭｎＳＯＤタンパク質の発現量の亢進を確認するために行ったＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ像。
【図７】ＲＳＶ、３Ｇ−ＲＳＶ、及び４’Ｇ−ＲＳＶによる細胞増殖に及ぼす影響を確認する実験。（Ａ）実験スキームを示す模式図。（Ｂ）実験結果を定量化し、解析した結果を示すグラフ。（Ｃ）細胞増殖を確認するために行った細胞のＨｅｃｈｓｔ染色像。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。但し、本発明が以下に示す実施例に限定されないのは言うまでも無い。
【実施例】
【００６１】
＜実験手法等＞
（１）実施例にて使用したレスベラトロール
実施例にて用いたＲＳＶ配糖体は、下記の方法によって作製した。Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）基本培地に、３％のｓｕｃｒｏｓｅ、終濃度が１ｐｐｍとなるように２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄを添加した液体培地（１００ｍｌ）に、新鮮重量２０ｇの植物培養細胞を移植し、２５℃、１２０ｒｐｍで４日間振とう培養した。その後、ＤＭＳＯ（１００μｌ）に溶解させた４０μｍｏｌのレスベラトロール（東京化成）を投与し、同条件下で２日間培養した。
【００６２】
培養後、ナイロンメッシュで培地と培養細胞とにろ別し、培地部は水飽和ｎ−ブタノールで分配抽出し、細胞部はホモジナイズしたのちメタノールで静置抽出した。それぞれ有機相を減圧下濃縮しメタノールで５．０ｍｌに調製しサンプルとした。
【００６３】
得られたサンプルを逆相ＨＰＬＣにて分析し、変換物を確認した。この変換物を分取ＨＰＬＣで単離・精製し、ＬＣ／ＭＳおよびＮＭＲを用いて構造解析を行った。
【００６４】
ＨＰＬＣによる分離パターンを図２に示す。図から明らかなように、上記の方法によって、二種の化合物が分離・製造され、これらの解析からそれぞれ３Ｇ−ＲＳＶ、及び４’Ｇ−ＲＳＶであることが明らかとなった。
【００６５】
（２）実施例にて使用した細胞及び培養方法
マウス由来の筋肉芽細胞であるＣ２Ｃ１２細胞は、１０％のＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ)と１％のａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｍｉｘｅｄ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）を含む高グルコースのＤ−ＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ）を用いて３７℃、５％の二酸化炭素の環境下にて培養した。
【００６６】
新生仔ラット単離心筋細胞であるｎｅｏｎａｔａｌ  ｒａｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ（ＮＲＶＭ）は、生後３日以内の新生仔ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）の心筋を単離し、ハサミで心房を除去後、残った心室に当る組織を細切りした後にコラゲナーゼ溶液（０．０５％のＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Ｗａｋｏ）をＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＰＢＳ）に溶解した液）に加え、Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  Ｓｈａｋｅｒ（ＩＮＮＯＶＡ  ４２００、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）を用いて、８０ｒｐｍ、３７℃で９０分間振とうした。その後、ＮＲＶＭ細胞を４℃のＰＢＳ＋（１．２５ｍＭのＣａＣｌ２；ＰＢＳ溶解液）に移し７分間ピペッティングした後、ナイロンメッシュを用いろ過して回収した。
【００６７】
回収した細胞は、１０％のＦＢＳ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ）と１％のａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｍｉｘｅｄ  ｓｔｏｃｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）を含む低グルコースのＤ−ＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ）を１０ｍｌ加えておいた１００ｍｍディッシュ（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に移し、３７℃、５％の二酸化炭素中で１時間培養した。この操作で、ディッシュ底面に接着する線維芽細胞を除去した後、ＮＲＶＭを１２−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）に播き、１０％のＦＢＳ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ）と１％のａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｍｉｘｅｄ  ｓｔｏｃｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）を含む低グルコースのＤ−ＭＥＭ培地（Ｗａｋｏ）を用いて３７℃、５％の二酸化炭素中で培養した。分離された細胞は抗Ｍｙｏｓｉｎ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ抗体を用いた免疫染色によって確認を行った。単離されたＮＲＶＭの純度はおおよそ８０〜９０％だった。
【００６８】
（３）実施例にて使用した抗体
本実験で使用した抗体を下記の表１にて示す。
【００６９】
【表１】
2012240956.tif 000005
【００７０】
（４）ＤＰＰＨラジカル消去活性試験
１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ  ｒａｄｉｃａｌ（ＤＰＰＨ）は、５１７ｎｍに特異的な吸収波長を有している。ラジカルが抗酸化物質などによって奪われると、５１７ｎｍの吸収が減少する。この反応を利用し、ラジカルの消去率を測定し、測定値から５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出し、抗酸化活性の比較を行った。ＤＰＰＨをメタノールで溶解し、０．１５ｍＭに調整した。精製したＲＳＶとＲＳＶ配糖体（３Ｇ−ＲＳＶ及び４’Ｇ-ＲＳＶ）はエタノール、もしくは水で２ｍＭの濃度に調整し、さらに２倍ずつ希釈し１／２〜１／５１２の希釈系列を作製した。ＤＰＰＨメタノール溶液と各濃度のサンプルを５００μｌずつ混合して攪拌し、室温・暗所にて３０分間反応させ、分光光度計で５１７ｎｍの吸収を測定した。ラジカル消去活性は、コントロール(試料として、サンプルを溶解させた溶媒を加えたもの)の吸光度を１００％とし、サンプルを用いて測定したときの吸光度と比較してラジカル消去率を算出した。
【００７１】
（５）Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ
培養したＣ２Ｃ１２細胞に、上記のＲＳＶとＲＳＶ配糖体（３Ｇ−ＲＳＶ及び４’Ｇ−ＲＳＶ）を１００μＭの濃度で１８時間予め処理し、その後に酸化ストレスを細胞に与える為、１００μＭのＡＡ（アンチマイシンＡ）で６時間の処理を行った。
【００７２】
処理後の細胞をＰＢＳで洗浄し、引き続いて４℃のＣｅｌｌＬｙｔｉｃＴＭＭ  Ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＩＧＭＡ）にプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）とホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）を加えた溶液を用いて細胞を溶解した。細胞溶解液を超音波破砕し、４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心を行った。そして、遠心後の細胞溶解液の上清に４×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、９８℃、３分間でインキュベーションして電気泳動用サンプルとした。
【００７３】
引き続いて、電気泳動用サンプルを、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、電気泳動後のポリアクリルアミドゲルをＩｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ  ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）へ転写した。
【００７４】
転写後のｍｅｍｂｒａｎｅは、５％スキムミルクを加えたＴＢＳＴ溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（Ｗａｋｏ)）に浸して室温で３０分間ブロッキング処置を行った後に１次抗体４℃にて一晩行った。処理後のｍｅｍｂｒａｎｅは、Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ)を用いて、各１５分間、４回繰返して洗浄を行い、続いて２次抗体処理を室温で１時間行った。１次抗体処理ごと同様に、Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ)で１５分間の洗浄を４回行った。
【００７５】
最後に、製造元のプロトコールに従い、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｍｅｍｂｒｅｎｅ上の発光反応を行った後に、ＬＡＳ−１０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ)を用いて発光反応に基づくＢｌｏｔ像を取得した。得られたＢｌｏｔ像は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ；ＮＩＨ）を用いて定量化した。
【００７６】
（６）免疫染色
培養したＣ２Ｃ１２細胞を、１２ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈに入れたＡｔｅｌｏ  Ｃｅｌｌ(R)  ＩＰＣ−３０  Ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ（ＫＯＫＥＮ）でコートしたガラスディスク上に播種し、１２時間、３７℃、５％の二酸化炭素中にインキュベーションし、細胞がガラスプレートに付着させた。ガラスディスク上への細胞の付着を確認した後に、１００μＭの濃度のＲＳＶ又はＲＳＶ配糖体（３Ｇ−ＲＳＶ及び４’Ｇ−ＲＳＶ）にて処理し、１８時間後に１００μＭのＡＡを加え、さらに６時間インキュベーションを行った。
【００７７】
処理後の細胞は４％パラホルムアルデヒド溶液で固定した後に、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ-１００を含むブロッキングソリューション（３％のウシ血清アルブミンコーンフラクションＶ（Ｗａｋｏ）、1％のｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍ（Ｗａｋｏ）；ＰＢＳ溶解液）にて室温で３０分処置した後、４℃で一晩１次抗体処理を行った。その後、ＰＢＳで１５分間、４回洗浄を行った後に、室温で４時間、２次抗体処理を行い１次抗体処理後と同様に洗浄した。
【００７８】
その後、核を染色するためにＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｗａｋｏ）を用いて、室温で３０分間処理し、ＰＢＳで１５分間、２回洗浄をおこなった後に、共焦点レーザー蛍光顕微鏡（ＺＥＩＳＳ／Ｒａｄｉａｎ）にて撮影を行った。画像はＩｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ）を用いて定量化した。
【００７９】
（７）統計処理
各実験は３回以上行い，得られたデータはＯｎｅ  Ｗａｙ  Ｒｅｐｅａｔｅｄ  Ｍｅａｓｕｒｅｓ  ＡＮＯＶＡを用いて統計的有意差検定を行い、Ｐ＜０．０５をもって有意差ありとした。なお、細胞免疫染色においては、各投与群で細胞数が２０個以上５０個未満の視野を２４視野を任意に選択して観察し、得られた数値を統計処理に用いた。
【００８０】
＜実験結果＞
（１）ＤＰＰＨラジカル消去活性
ＲＳＶが有する抗酸化活性が、ＲＳＶ配糖体とすればどのように変化するのかを検討する為に、ＤＰＰＨラジカル消去活性試験を行った。結果を図３に示す。
【００８１】
ＲＳＶもしくはＲＳＶ糖誘導体（３Ｇ−ＲＳＶ又は４’Ｇ−ＲＳＶ）の抗酸化活性を、ＤＰＰＨの吸光度の減少で測定し、最大にラジカルを消去する濃度の半分の濃度（半分阻害濃度（ＩＣ５０））で還元能を解析した。すると、ＲＳＶでは７９μＭ、３Ｇ−ＲＳＶでは１１０μＭだったが、４’Ｇ−ＲＳＶでは２５０μＭ以上であった。従って、４’Ｇ−ＲＳＶはＲＳＶ及び３Ｇ−ＲＳＶよりも顕著なＤＰＰＨラジカル消去活性を示さないことが明らかとなった。即ち、インビトロにおいて、４’Ｇ−ＲＳＶは、顕著な抗酸化作用を示さないことが明らかとなった。
【００８２】
（２）ＲＳＶとＲＳＶ配糖体のヒストンＨ３脱アセチル化活性
ＲＳＶはＳＩＲＴ１を活性化してヒストンの脱アセチル化を促進することが分かっているので（非特許文献１、図１を参照）、ＲＳＶ配糖体がヒストンＨ３の脱アセチル化を促進するかどうかを検討した。
【００８３】
それぞれ１００μＭの濃度のＲＳＶとＲＳＶ配糖体でＣ２Ｃ１２細胞を１８時間処置した後、１００μＭの濃度のＡＡ（アンチマイシンＡ）で６時間処置して酸化ストレスを細胞に与えた後、アセチル化されたヒストンＨ３量と全ヒストンＨ３量をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇにより検討した（図４（Ａ）に示す実験スキームを参照。）。その結果を図４（Ｂ）及び（Ｃ）に示す。
【００８４】
コントロール群（図中、ＡＡ示される。以下同様。）に対して、ＲＳＶ処置群と４’Ｇ−ＲＳＶ処置群が有意なアセチル化ヒストンＨ３の減少を示し、さらに４’Ｇ−ＲＳＶがＲＳＶに比べ有意にヒストンＨ３の脱アセチル化を促進させることが確認された。一方、３Ｇ−ＲＳＶ処置群ではコントロール群に対し、ヒストンＨ３の脱アセチル化の促進作用は確認できなかった。
【００８５】
（３）ＲＳＶとＲＳＶ配糖体のＭｎＳＯＤ発現亢進作用の比較
ＲＳＶ及びＲＳＶ配糖体によるＭｎＳＯＤの発現量の亢進の有無を、抗ＭｎＳＯＤ抗体を用いた抗体免疫染色法及びＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法にて確認した。
【００８６】
３−１)抗体免疫染色法
Ｃ２Ｃ１２細胞を、それぞれ１００μＭの濃度のＲＳＶ又はＲＳＶ配糖体（４’Ｇ−ＲＳＶ及び３Ｇ−ＲＳＶ）で１８時間処置し、その後１００μＭの濃度のＡＡを６時間作用させた。（図５（Ａ）に示す実験スキームを参照。）。処理後の細胞は４％パラホルムアルデヒドで固定し、免疫染色法によりＭｎＳＯＤの発現量を比較検討した。結果を図５（Ｂ）及び（Ｃ）に示す。
【００８７】
コントロール群に対して、ＲＳＶ処置群と４‘Ｇ−ＲＳＶ処置群が、有意なＭｎＳＯＤ染色の増加を示し、さらに４’Ｇ−ＲＳＶはＲＳＶよりも顕著に強いＭｎＳＯＤ誘導能をもつことが判明した。一方で、３Ｇ−ＲＳＶ処置群では、ＭｎＳＯＤ染色の程度はコントロール群とほぼ同程度であり、ＭｎＳＯＤ発現量の亢進作用は確認できなかった。
【００８８】
３−２)Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法
ＭｎＳＯＤの細胞免疫染色法の結果から、ＲＳＶと４‘Ｇ−ＲＳＶがＭｎＳＯＤの発現量を亢進させる効果を有することが明らかとなった。そこで、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法を用いて、タンパク質レベルでのＭｎＳＯＤの発現量の増加を確認した。
【００８９】
ＭｎＳＯＤの免疫染色法と同様に処置した細胞（図６（Ａ）に示す実験スキームを参照。）をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法に供した結果、図６（Ｂ）及び（Ｃ）に示すように、コントロール群に対してＲＳＶ処置群と４‘Ｇ−ＲＳＶ処置群が有意なＭｎＳＯＤの発現量の増加を示し、４’Ｇ−ＲＳＶ処置群ではＲＳＶ処置群に比べさらに強い発現誘導能が示された。一方で、３Ｇ−ＲＳＶ処置群ではＭｎＳＯＤの発現量の増加は確認できなかった。
【００９０】
（４）ＲＳＶとＲＳＶ配糖体の細胞増殖能への作用
ＲＳＶは癌細胞などの細胞の増殖を抑制する効果が知られている。すでに、筋芽細胞であるＣ２Ｃ１２の増殖を、ＲＳＶが抑制することを見出されており、ＲＳＶとＲＳＶ配糖体（３Ｇ−ＲＳＶ及び４’Ｇ−ＲＳＶ）のＣ２Ｃ１２細胞の増殖に対する作用を比較検討した。それぞれ３０μＭの濃度のＲＳＶ及びＲＳＶ配糖体でＣ２Ｃ１２細胞を２４時間処置した後、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色し、細胞数を計測した（図７（Ａ）に示す実験スキームを参照。）。結果を図７（Ｂ）及び（Ｃ）に示す。
【００９１】
ＲＳＶと４’Ｇ−ＲＳＶはＣ２Ｃ１２細胞の増殖をともに抑制したが、４’Ｇ−ＲＳＶはＲＳＶに比較してその増殖抑制能は有意に低かった。一方、３Ｇ−ＲＳＶには細胞増殖抑制能はみられなかった。
【００９２】
以上の実験結果から、４’Ｇ−ＲＳＶは、ＲＳＶよりも有意にヒストンＨ３脱アセチル化を誘導し、また、ＲＳＶよりも有意にＭｎＳＯＤの発現誘導を引き起こす作用を有することが明確となった。従って、図１に示す模式図を参照すれば、４’Ｇ−ＲＳＶはＲＳＶよりも顕著にＳｉｒｔ１遺伝子を活性化することが理解される。
【００９３】
さらに、４’Ｇ−ＲＳＶはＲＳＶよりも細胞増殖抑制効果が薄いことから、細胞への毒性が低いことが明確となった。
【図１】
2012240956.tif 000006
【図２】
2012240956.tif 000007
【図３】
2012240956.tif 000008
【図４】
2012240956.tif 000009
【図５】
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【図６】
2012240956.tif 000011
【図７】
2012240956.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成23年6月16日(2011.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
【図１】ＲＳＶが関与する生体内の機能を説明する図。
【図２】本発明の実施例にて用いた３Ｇ−ＲＳＶ、及び４’Ｇ−ＲＳＶの逆相ＨＰＬＣによる分離を確認するチャート。
【図３】ＤＰＰＨを用いたＲＳＶ、３Ｇ−ＲＳＶ、及び４’Ｇ−ＲＳＶのラジカル消去活性試験。
【図４】ＲＳＶ、３Ｇ−ＲＳＶ、及び４’Ｇ−ＲＳＶによるヒストンＨ３脱アセチル化を確認する実験。（Ａ）実験スキームを示す模式図。（Ｂ）実験結果を定量化し、解析した結果を示すグラフ。（Ｃ）ヒストンＨ３の脱アセチル化を確認するために行ったＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ像。
【図５】ＲＳＶ、３Ｇ−ＲＳＶ、及び４’Ｇ−ＲＳＶによるＭｎＳＯＤタンパク質の発現量の亢進を確認する実験。（Ａ）実験スキームを示す模式図。（Ｂ）実験結果を定量化し、解析した結果を示すグラフ。（Ｃ）ＭｎＳＯＤタンパク質の発現量の亢進を確認するために行った免疫染色像。
【図６】ＲＳＶ、３Ｇ−ＲＳＶ、及び４’Ｇ−ＲＳＶによるＭｎＳＯＤタンパク質の発現量の亢進を確認する実験。（Ａ）実験スキームを示す模式図。（Ｂ）実験結果を定量化し、解析した結果を示すグラフ。（Ｃ）ＭｎＳＯＤタンパク質の発現量の亢進を確認するために行ったＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ像。
【図７】ＲＳＶ、３Ｇ−ＲＳＶ、及び４’Ｇ−ＲＳＶによる細胞増殖に及ぼす影響を確認する実験。（Ａ）実験スキームを示す模式図。（Ｂ）実験結果を定量化し、解析した結果を示すグラフ。（Ｃ）細胞増殖を確認するために行った細胞のＨｅｃｈｓｔ染色像。