(57)【要約】【課題】物性の低下を抑制し、飲食品・医薬品等の様々な用途に利用することができる抗酸化剤及びその製造方法を提供する。【解決手段】本発明の抗酸化剤は、ローヤルゼリーを抽出原料として亜臨界流体を用いて抽出処理して得られる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。好ましくは、実質的に発現されない程度にアレルギー性が低下されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ローヤルゼリーを抽出原料として亜臨界流体を用いて抽出処理して得られる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする抗酸化剤。
【請求項２】
実質的に発現されない程度にアレルギー性が低下されていることを特徴とする請求項１に記載の抗酸化剤。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の抗酸化剤の製造方法において、抽出原料としてのローヤルゼリーに亜臨界流体を作用させて抽出物を得る工程からなることを特徴とする抗酸化剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ローヤルゼリーを抽出原料とし、亜臨界流体を用いて得られる抽出物を有効成分として含有する抗酸化剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、ローヤルゼリーは、羽化後３〜１５日の雌のミツバチが下咽頭腺及び大腮腺から分泌する分泌物を混合して作るゼリー状の物質で、特有のタンパク質、脂肪酸及びミネラル等が含有されていることが知られている。ローヤルゼリーは、血圧降下作用、抗腫瘍作用、創傷治癒促進、抗菌作用等の種々の生理作用を有していることが知られている。よって従来より、ローヤルゼリーは、栄養価の高い健康食品のみならず、医薬品、化粧品等の用途にも用いられてきた。
【０００３】
従来より、ローヤルゼリーの機能をより優れたものとするために様々な処理が行われている。例えば、特許文献１，２に開示される方法が知られている。特許文献１は、生ローヤルゼリー等に抽出溶媒、例えば含水エタノールを添加して混合液を調製し、可溶性成分を含水エタノール中に溶解させた後、これを濾過して得られるローヤルゼリーエキスの製造方法について開示する。ローヤルゼリーエキスはデセン酸類、例えば１０−ヒドロキシデセン酸をはじめとするローヤルゼリーに特有な脂肪酸、そのエステルからなる脂質、ローヤルゼリーにのみ含有される特殊な水溶性タンパク質、アミノ酸、糖質、ミネラル等を含有している。特許文献２は、ローヤルゼリーをプロテアーゼ処理することにより得られる抗酸化剤について開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−６０４５５号公報
【特許文献２】特開２００５−２６３７８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところが、特許文献２に開示される抗酸化剤は、ローヤルゼリーをプロテアーゼ処理すると、吸湿性が上がり、物性、例えば粉末流動性、外観及び保存安定性が低下する場合があるという問題があった。
【０００６】
本発明は、ローヤルゼリーを亜臨界流体を用いて抽出処理することにより、物性の低下が抑制されるとともに、優れた抗酸化作用を発揮することを見出したことによりなされたものである。
【０００７】
本発明の目的とするところは、物性の低下を抑制し、飲食品・医薬品等の様々な用途に利用することができる抗酸化剤及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、請求項１に記載の抗酸化剤は、ローヤルゼリーを抽出原料として亜臨界流体を用いて抽出処理して得られる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【０００９】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の抗酸化剤において、実質的に発現されない程度にアレルギー性が低下されていることを特徴とする。
請求項３に記載の発明は、請求項１又は請求項２に記載の抗酸化剤の製造方法において、抽出原料としてのローヤルゼリーに亜臨界流体を作用させて抽出物を得る工程からなることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、物性の低下を抑制し、飲食品・医薬品等の様々な用途に利用することができる抗酸化剤及びその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】試験例１のタンパク質（ペプチド成分）の分解確認試験における電気泳動後のゲル写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の抗酸化剤を具体化した実施形態を説明する。
本実施形態の抗酸化剤は、抽出原料としてローヤルゼリーを用い、亜臨界流体を用いて抽出することにより得られる抽出物を有効成分として含有する。原料のローヤルゼリーとしては、生ローヤルゼリー及び生ローヤルゼリーを凍結乾燥処理等により乾燥させて粉末化したローヤルゼリー粉末（ＦＤ−ＲＪ）のいずれも使用することができる。本実施形態において使用される生ローヤルゼリー及び乾燥ローヤルゼリーの産地は、特に限定されないが、例えば中国、台湾、日本等のアジア諸国、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、ブラジル等の南アメリカ諸国、オセアニア諸国のいずれでもよい。
【００１３】
亜臨界流体を用いた抽出法は、公知の亜臨界流体抽出装置を用いることにより実施することができる。所定温度及び圧力の条件下で亜臨界状態にした亜臨界流体と抽出原料とを接触させることにより、抽出原料から所定の成分を抽出するものである。例えば、水は、圧力２２．１２ＭＰａ、温度３７４．１５℃まで上げると液体でも気体でもない状態を示す。この点を水の臨界点といい、臨界点より低い温度・圧力の熱水を亜臨界水という。亜臨界水は、優れた成分抽出作用と加水分解作用を有する。亜臨界流体として用いる抽出剤は、水以外に、例えばエチレン、エタン、プロパン、二酸化炭素、メタノール、エタノール、及びそれらの混合物が挙げられる。これらの中で、安全性の観点から水を用いるのが最も好ましい。
【００１４】
水を用いる場合の操作温度は、好ましくは６０〜３７４℃、より好ましくは１００〜１７０℃である。操作温度が６０℃未満であると、成分抽出効率及び加水分解作用が低下するおそれがある。一方、操作温度が３７４℃を超えると褐変の発生及び臭気成分が生ずる場合があり、また、デセン酸が分解されるおそれがある。また、その操作圧力は、好ましくは１〜２２ＭＰａ、より好ましくは５〜１０ＭＰａである。抽出処理時間は、ローヤルゼリー原料の量や状態、処理温度・圧力により異なるが、予備試験等を行うことにより適宜設定される。抽出処理時間は、好ましくは０．５〜３０分、より好ましくは１〜１０分である。原料（ローヤルゼリー）の固形物と抽出剤との比率は特に限定されないが、ローヤルゼリー１質量部に対して抽出剤０．１〜１０００質量部、好ましくは１〜３０質量部である。
【００１５】
本実施形態の抗酸化剤は、優れた抗酸化作用を有するとともに、実質的に発現されない程度にアレルギー性が低下されている。具体的な配合形態としては、それらの作用効果を得ることを目的とした飲食品、医薬品及び化粧品等として適用することができる。
【００１６】
本実施形態の抗酸化剤を飲食品に適用する場合、抗酸化剤を飲食品そのものとして、又は種々の食品素材又は飲料品素材に配合して使用することができる。飲食品の形態としては、特に限定されず、液状、粉末状、ゲル状、固形状のいずれであってもよく、また剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤のいずれであってもよい。その中でも、吸湿性が抑えられることから、カプセル剤であることが好ましい。前記飲食品としては、その他の成分としてゲル化剤含有食品、糖類、香料、甘味料、油脂、基材、賦形剤、食品添加剤、副素材、増量剤等を適宜配合してもよい。
【００１７】
本実施形態の抗酸化剤を医薬品として使用する場合は、服用（経口摂取）により投与する場合の他、血管内投与、経皮投与等のあらゆる投与方法を採用することが可能である。本実施形態の抗酸化剤は経口摂取により投与されることが望ましい。剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤等が挙げられる。また、添加剤として賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。
【００１８】
本実施形態の抗酸化剤を化粧品に適用する場合、化粧品基材に配合することにより製造することができる。化粧品の形態は、乳液状、クリーム状、粉末状などのいずれであってもよい。このような化粧品を肌に適用することにより、アレルギー性を発現することなく、抗酸化作用を得ることができる。化粧品基剤は、一般に化粧品に共通して配合されるものであって、例えば、油分、精製水及びアルコールを主要成分として、界面活性剤、保湿剤、酸化防止剤、増粘剤、抗脂漏剤、血行促進剤、美白剤、ｐＨ調整剤、色素顔料、防腐剤及び香料から選択される少なくとも一種が適宜配合される。
【００１９】
本実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
（１）本実施形態の抗酸化剤は、ローヤルゼリーを抽出原料として亜臨界流体を用いて抽出処理して得られる抽出物を有効成分として含有する。したがって、生ローヤルゼリー、凍結乾燥ローヤルゼリー粉末、又はプロテアーゼ等によって処理された酵素処理ローヤルゼリーに比べて優れた抗酸化作用を発揮する。よって、抗酸化作用を目的とした飲食品、医薬品及び化粧品等の各種分野に好ましく適用することができる。
【００２０】
（２）また、吸湿性の上昇を抑制することにより、粉末流動性、外観及び保存安定性等の物性の低下を抑制することができる。
（３）本実施形態の抗酸化剤の有効成分である抽出物は、ローヤルゼリーを抽出原料として亜臨界流体を用いて抽出処理して得られる。したがって、ローヤルゼリーの機能をより優れたものとするための処理を短時間で完了することができ、処理に伴うデセン酸類等のローヤルゼリー特有の成分の減少を抑制することができる。
【００２１】
（４）本実施形態の抗酸化剤は、実質的に発現されない程度にアレルギー性が低下されている。したがって、生ローヤルゼリー又は凍結乾燥ローヤルゼリー粉末と比べて、より一層摂取しやすく、生体適用性を向上させることができる。
【００２２】
（５）本実施形態の抗酸化剤は、天然由来の原料としてローヤルゼリーが用いられる。したがって、安全に飲食品、医薬品、又は化粧品の各種用途に適用することができる。
（６）本実施形態の抗酸化剤の有効成分である抽出物は、ローヤルゼリーを抽出原料として亜臨界流体を用いて抽出処理して得られる。これにより、味の低下を抑制することができる。
【００２３】
なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
・上記実施形態における抗酸化剤は、ヒトが摂取する飲食品及び医薬品等に対して適用することができるのみならず、家畜の飼料にサプリメント、栄養補助食品、医薬品等として配合してもよい。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例を挙げ、前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜試験例１：亜臨界抽出の条件検討＞
（亜臨界抽出処理）
本試験例で使用する亜臨界抽出処理を行うための装置は直径６．５ｃｍ×長さ２１ｃｍのステンレス管からなる反応容器、該反応容器内の温度を所定温度に設定可能なヒーター装置、及び反応容器内の圧力を所定圧力に設定可能な圧力調整装置を備えてなる。反応処理操作は、まず反応容器内に原料と窒素ガスを封入後、ヒーター及び圧力調整装置により、所定の温度及び圧力を設定し、攪拌しながら処理が開始される。次に、反応容器内を一定温度に保ち亜臨界処理が実施される。最後に、水冷により直ちに反応容器内が冷却され、試料を反応容器から取り出すことにより完了する。
【００２５】
下記表１に示される処理条件に従って抽出処理を行った。具体的には、まず中国産の凍結乾燥ローヤルゼリー粉末２０ｇに純水１８０ｍＬを攪拌混合することにより溶解液を調製した。かかる溶解液を原料として亜臨界抽出装置の反応容器内に投入し、表１に示される各抽出条件になるよう加圧及び加熱した。表１に示される抽出条件で所定時間経過後、冷却し、４０℃になったところで、抽出物を反応容器から取り出した。各抽出物を試験試料として、下記に示される方法に従い、デセン酸類の含有量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたタンパク質の分解度について評価した。
【００２６】
（デセン酸類の測定方法）
各試験試料のローヤルゼリーの有効成分であるデセン酸類の含有量について測定した。コントロールとして、亜臨界抽出前の凍結乾燥ローヤルゼリー粉末についても併せて測定した。
【００２７】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：島津製作所製）で分析することによって、ローヤルゼリーの有効成分であるデセン酸類として、１０−ハイドロキシデセン酸の含量を測定した。まず、１０−ハイドロキシデセン酸標品１０ｍｇをメタノールで５０ｍＬに溶解し、これを純水で適宜希釈して、標準溶液として使用した。安息香酸２５ｍｇをメタノールで５０ｍＬに溶解し、この１ｍＬを分取して、１Ｎ ＮａＯＨを１滴加え、純水で５０ｍＬにメスアップしたものを内部標準液とした。各試料を凍結乾燥してパウダーとし、その０．５ｇにエタノール１０ｍＬと１Ｎ ＮａＯＨ１ｍＬを添加した後、純水で５０ｍＬにメスアップした。この２ｍＬを分取し、内部標準液を１ｍＬ加えて純水で５０ｍＬにメスアップしたものをサンプルとした。無水リン酸２０．１８ｇ及びリン酸二水素二ナトリウム二水和物２７．３ｇを純水１９６０ｍＬに溶解し、メタノール１５４０ｍＬを加えてよく混合し、メンブレンフィルターで濾過した後、移動相として使用した。
【００２８】
ＨＰＬＣの条件：カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ（オクタデシル）−ＡＭ３０２、カラム温度：５０℃、検出器：ＵＶ２１０ｎｍ、移動相：１０ｍＭリン酸緩衝液（上述のもの）、流量：１ｍＬ／ｍｉｎ、サンプル量：１０μＬ。
【００２９】
ＨＰＬＣによるクロマトグラムから定量した１０−ハイドロキシデセン酸含量（重量％）を表１に示す。
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の分解確認試験）
ローヤルゼリー中に含まれる主要なアレルゲンである分子量５５ｋＤａタンパク質と、アレルゲンであると疑われる分子量４ｋＤａ以上５５ｋＤａ未満のタンパク質について、亜臨界抽出処理による変化をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確認した。
【００３０】
各試験試料は、３０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０−８．５、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素及び４％（ｗ／ｖ）チャップスを含むタンパク質抽出溶液を加え、撹拌し、遠心分離を行い得られた上清に、１／２量の１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、４％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、１２％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール及び適量のブロモフェノールブルーを含む２×ＳＤＳ−サンプルバッファーを加えて９５℃で１分間加熱した。その後、０．３μＬについて、厚さ０．４５ｍｍの８−２５％グラジエントポリアクリルアミドゲルを用い、全自動電気泳動システムPhastSystemTM（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。なお、分子量マーカーとして、Precision Plus Protein Standards（バイオ・ラッドラボラトリーズ社製）を用いた。電気泳動後のゲルは、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０でクマシー染色し、２５％メタノール及び７％酢酸を含む溶液で脱色した。染色及び脱色されたゲルの写真を図１に示す。
【００３１】
また、分子量５５ｋＤａの蛋白質バンド及び分子量４ｋＤａ以上５５ｋＤａ未満のタンパク質バンドをそれぞれ目視にて確認し、下記の基準によりタンパク質の分解度を評価した。結果を表１に示す。
４：バンドは消失し、目視にて確認することができない。
３：バンドはほとんど消失している。
２：バンドの残存が、僅かに確認される。
１：バンドの残存が、明瞭に確認される。
【００３２】
【表１】
2012036296.tif 000002
表１に示されるように、抽出物中の成分分析の結果、ローヤルゼリーを亜臨界抽出してもデセン酸の減少は認められなかった。
【００３３】
また、ローヤルゼリーを亜臨界抽出処理することにより、ローヤルゼリー中のタンパク質は分解、低分子化し、アレルゲン蛋白とされる分子量４ｋＤａ以上５５ｋＤａ付近のタンパク質のバンドの消失も進むことが確認された。尚、風味は、１５０℃で処理を行った試験試料２が最も優れていた。
【００３４】
以上の結果より、ローヤルゼリーを亜臨界抽出処理することにより、有効成分を維持しながら、生体適用性を向上させることができることが示唆された。
＜試験例２：亜臨界抽出物の物性試験＞
（比較例１）
中国産生ローヤルゼリー５０ｇに純水１５０ｍｌを加えて均一になるまで攪拌した。ｐＨを７．５に調整し、これに蛋白質分解酵素のプロテアーゼＮ（天野エンザイム社製）０．１７５ｇを添加し、５０℃で４時間反応させた。反応終了後、８０℃で３０分間加熱処理して酵素を失活させるとともに殺菌処理した。これを凍結乾燥処理することにより得られる粉末を使用した。
【００３５】
（物性の測定方法）
亜臨界抽出処理することにより得られた上記試験試料１〜６及び比較例１の各粉末５００ｍｇを秤量し、シャーレに移し均質にして室温（２５℃±３℃）、相対湿度６０±５％の雰囲気中に所定時間放置した。放置後、所定時間毎に各試料の外観・物性を観察し、以下の基準により、吸湿性の評価を行った。コントロールとして、凍結乾燥ローヤルゼリー粉末についても同様に評価を行った。結果を表２に示す。
＋＋＋＋＋  完全に固結、飴状
＋＋＋＋    完全に固結
＋＋＋      一部固結、一部粉末状
＋＋        一部ダマになるも、大半は粉末状
＋          若干のベタツキ
【００３６】
【表２】
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表２に示されるように、各試験試料の亜臨界抽出ローヤルゼリーは、比較例１の酵素処理ローヤルゼリーに比べ吸湿性及び保存安定性に優れていることが確認された。
【００３７】
＜試験例３：抗酸化活性としてのβカロチン退色試験＞
（実施例１）
試験例１における５ＭＰａ、１５０℃、１０分の条件で抽出した亜臨界抽出ローヤルゼリーの凍結乾燥した粉末を使用した。
【００３８】
亜臨界抽出ローヤルゼリーの生理活性作用である抗酸化作用をβカロチン退色試験によって比較した。主として植物の黄色色素として知られるβカロチンは、水溶液中では、自然酸化により退色が進行する。一方、この退色は、抗酸化物質を共存させることにより、進行を抑制することができる。本試験で用いる試料として、実施例１の亜臨界抽出ローヤルゼリー粉末、未処理の凍結乾燥ローヤルゼリー粉末、及び比較例１の酵素処理ローヤルゼリー粉末をそれぞれ水で希釈することにより、固形分濃度０．５ｍｇ／ｍＬの試料溶液を調製した。コントロールとして蒸留水を使用した。
【００３９】
まず、褐色フラスコ内にてβカロチン０．５ｍｇ、リノール酸２０ｍｇ、ｔｗｅｅｎ４０；２００ｍｇをクロロホルム１０ｍＬに溶解した。溶解後、蒸発乾固によりクロロホルムを除き、蒸留水１００ｍＬを加えた。この溶液４５ｍＬに０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）４ｍＬを加え、キャップ付試験管に４．９ｍＬ分注した。分注後、下記表３に示される各試料を１００μＬ添加し、吸光度（ＯＤ４７０ｎｍ）を測定した。その時の吸光度の値を０時間反応値とした。０時間反応値を測定した後、試験液は４０℃で保管し、所定時間経過後にＯＤ４７０ｎｍを測定した（ｎ＝３）。本試験系の抗酸化能の評価として、０時間の吸光度値を１００％とし、５時間後に測定される値を下記の式に当てはめることによりβカロチン残存率を算出した。結果を表３に示す。また、試料溶液自体の吸光度分を差し引くために、ブランク溶液を調製し、同様に測定した。
βカロチン残存率（％）＝｛（５時間後の吸光度の値−ブランク値）×１００｝÷（０時間反応値−ブランク値）
【００４０】
【表３】
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表３に示されるように、亜臨界抽出ローヤルゼリーは、酵素処理ローヤルゼリー及び凍結乾燥ローヤルゼリー粉末よりも高い抗酸化能が確認された。亜臨界抽出ローヤルゼリーは、凍結乾燥ローヤルゼリー粉末と比較して値が約２倍、酵素処理ローヤルゼリーと比較して値が約１．５倍に上昇していることが確認された。従って、ローヤルゼリーを亜臨界流体により抽出処理することによって得られる亜臨界抽出ローヤルゼリーは、高い抗酸化活性を有することが確認された。
【００４１】
＜試験例４：抗酸化活性としてのラジカル捕捉能試験＞
亜臨界抽出ローヤルゼリーの生理活性作用の一つである抗酸化作用をラジカル捕捉能試験によって比較した。本試験では、ラジカル状態で５１７ｎｍの極大吸収を持つＤＰＰＨ（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl）が抗酸化物質により還元されて退色することを利用するものである。本試験で用いる試料として、実施例１の亜臨界抽出ローヤルゼリー粉末、未処理の凍結乾燥ローヤルゼリー粉末、及び比較例１の酵素処理ローヤルゼリー粉末をそれぞれ水で希釈することにより、固形分濃度２．５ｍｇ／ｍＬの試料溶液を調製した。コントロールとして蒸留水を使用した。
【００４２】
まず、各試料溶液を５０μＬずつエッペンチューブに分注した。次に、ＤＰＰＨを１３．４ｍｇにエタノール２００ｍＬを加えて調製したＤＰＰＨ溶液を９５０μＬずつ加えた。その後、ボルテックスにて３秒ほど攪拌し、反応を開始させた。１０分間反応後、遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ３２００：１００００ｒｐｍ、３０秒）を行い、上清を測定に用いた。反応開始から１５分後に反応液の吸光度を測定した。測定にはプレートリーダー（μQuant：BIO-TEK INSTRUMENTS, Inc）を用いて５２０ｎｍの波長を測定した（ｎ＝３）。コントロールは、ＤＰＰＨ溶液９５０μＬに蒸留水５０μＬを混合したものを調製し、同様に測定した。試料調製液自体の吸光度を除くため、ブランクとして、ＤＰＰＨを含まない反応液としてエタノール９５０μＬと各試料溶液５０μＬを混合したものを調製し、同様に測定した。ＤＰＰＨラジカル捕捉率は以下の式より求めた。その結果を表４に示す。
ＤＰＰＨラジカル捕捉率（％）＝｛（Ａｃ−Ａｓ）／Ａｃ｝×１００
Ａｃ：コントロールの吸光度−ブランク値
Ａｓ：ＤＰＰＨ溶液添加時の吸光度−ブランク値
【００４３】
【表４】
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表４に示されるように、亜臨界抽出ローヤルゼリーは、酵素処理ローヤルゼリー及び凍結乾燥ローヤルゼリー粉末よりもＤＰＰＨラジカル捕捉率が大幅に向上した。従って、ローヤルゼリーを亜臨界流体により抽出処理することによって得られる亜臨界抽出ローヤルゼリーは、高い抗酸化活性を有することが確認された。
【００４４】
＜試験例５：抗酸化活性としての過酸化脂質形成抑制試験＞
亜臨界抽出ローヤルゼリーの生理活性作用の一つである抗酸化作用を過酸化脂質の形成抑制試験によって比較した。この試験は、脂質（リノール酸）とラジカル促進剤であるＡＡＰＨ（２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロライド）を混合して４０℃で反応させ、発生した過酸化脂質をロダン鉄法により呈色し、その吸光度から脂質の酸化の程度を評価するものである。本試験で用いる試料として、実施例１の亜臨界抽出ローヤルゼリー粉末、未処理の凍結乾燥ローヤルゼリー粉末、及び比較例１の酵素処理ローヤルゼリー粉末をそれぞれ水で希釈することにより、固形分濃度４、２、１、０．５ｍｇ／ｍＬの各試料溶液を調製した。コントロールとして蒸留水を使用した。
【００４５】
まず、褐色バイアル瓶に各濃度の試料溶液０．２５ｍＬ、試液Ａ（リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とラジカル促進剤であるＡＡＰＨの混合溶液）３．５ｍＬ、１．３％リノール酸溶液２．５ｍＬを添加、混合した。その後４０℃にて反応させ、ロダン鉄法により吸光度（５００ｎｍ）を測定した（ｎ＝２）。ロダン鉄法による測定は、反応開始前（以下０時間とする）と反応開始１４時間後（以下１４時間とする）に実施した。各濃度における脂質酸化の阻害率から、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）（ｍｇ／ｍＬ）を求めた。阻害率の計算式を下記に記す。結果を表５に示す。
【００４６】
阻害率（％）＝｛（Ａｃ−Ａｓ）／Ａｃ｝×１００
Ａｃ：Ａｃ（１４時間）−Ａｃ（０時間）
Ａｓ：Ａｓ（１４時間）−Ａｓ（０時間）
Ａｓ（ｘｈ）：ｘ時間後における試料溶液の吸光度
Ａｃ（ｘｈ）：ｘ時間後におけるコントロールの吸光度
【００４７】
【表５】
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表５に示されるように、亜臨界抽出ローヤルゼリーは、酵素処理ローヤルゼリー及び凍結乾燥ローヤルゼリー粉末よりも過酸化脂質の形成抑制作用が向上することが確認された。従って、ローヤルゼリーを亜臨界流体により抽出処理することによって得られる亜臨界抽出ローヤルゼリーは、高い抗酸化活性を有することが確認された。
【００４８】
フリーラジカルは悪性腫瘍、心疾患、脳血管疾患等の種々の疾患の原因因子と考えられている。フリーラジカルを除去する作用を有する亜臨界抽出ローヤルゼリーはそれらの疾患の予防及び治療のための有効な成分になり得る。したがって、フリーラジカル除去能の発揮を目的とする健康食品、化粧品及び医薬品等の有効成分として好適に配合することができる。
【００４９】
＜試験例６：抗原性試験＞
亜臨界抽出ローヤルゼリーの抗原性を評価する目的から、亜臨界抽出ローヤルゼリー及び凍結乾燥ローヤルゼリーを水酸化アルミニウムゲルとともにマウスの腹腔内に免疫し、その抗体産生応答に関し、ＰＣＡ反応を用いて比較した。
【００５０】
（使用動物）
本試験には、感作動物として５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを日本ＳＬＣ社より入手して使用した。また、ＰＣＡ反応には６週齢の雄性ＩＣＲマウスを日本ＳＬＣ社より入手して使用した。動物は室温２３±１℃、相対湿度５５±１０％、照明時間１２時間／日（８：００〜２０：００）の条件で、日本クレア社製の固形飼料ＣＥ−２を与えて飼育し、飲料水は水道水を自由に摂取させた。入荷後、１週間の予備飼育を行い、健康状態に異常を認めない動物を試験に用いた。
【００５１】
（試験試料）
試験試料として、実施例１の亜臨界抽出ローヤルゼリー、及び未処理の凍結乾燥ローヤルゼリーを使用した。陽性対象として卵白アルブミン（ＯＶＡ）（Ｓｉｇｍａ社製：ＧｒａｄｅＶ）を使用した。
【００５２】
（免疫スケジュール）
実施例１の亜臨界抽出ローヤルゼリー、及び未処理の凍結乾燥ローヤルゼリーの場合はそれぞれ０．３ｍｇ、陽性対象のＯＶＡの場合は１０μｇと、水酸化アルミニウムゲル２ｍｇをＢＡＬＢ／ｃマウス（１群５〜６匹）の腹腔内（０．３ｍＬ／マウス）に１週間隔で２回免疫し、最終感作の１週間後に採血して血清を分離し、測定まで−３０℃に保存した。
【００５３】
（ＰＣＡ反応による力価測定）
雄性ＩＣＲマウスの背中の毛を刈った後、各希釈抗血清を皮内注射した（約３０μＬ／ｓｉｔｅ）。１時間後に抗原（亜臨界抽出ローヤルゼリー及び未処理の凍結乾燥ローヤルゼリーの場合はそれぞれ１．５ｍｇ、ＯＶＡの場合は０．４５ｍｇ）とエバンスブルー色素１．５ｍｇ（５％溶液）の混合液（生理食塩液に溶解）を静脈内投与した（０．３ｍｌ／マウス，ｉ．ｖ．）。３０分後に背部皮膚を剥離し、皮膚裏側より皮内注射した部位の青染斑の有無を観察した。本試験では、各抗血清につき２匹のＩＣＲマウスを用いて反応を観察し、いずれかの最大陽性反応を示した抗血清の希釈倍率をその抗体力価とした。試験は（１）各群の等量ずつプールした抗血清を用いた測定、（２）各個体別に抗血清を用いて測定（亜臨界抽出ローヤルゼリー及び凍結乾燥ローヤルゼリーの各群のみ）の２回実施した。各群の等量ずつプールした抗血清を用いたＰＣＡ反応の結果を表６に、各個体別に抗血清を用いたＰＣＡ反応の結果を表７に示す。
【００５４】
【表６】
2012036296.tif 000007
【００５５】
【表７】
2012036296.tif 000008
表６に示されるように、ＯＶＡ群は８０倍まで陽性反応を示した。実施しなかったが、その抗体力価は１６０倍以上であると推測され、本試験の感作条件でもＩｇＧ抗体の検出には十分であると考えられた。亜臨界抽出ローヤルゼリーと凍結乾燥ローヤルゼリーの比較では、凍結乾燥ローヤルゼリーが１６倍まで陽性反応がみられたのに対して、亜臨界抽出ローヤルゼリーは２倍希釈でも陽性反応はなく、抗原性の弱いことが示唆された。
【００５６】
表７に示されるように、凍結乾燥ローヤルゼリーは３／５例が反応した。１例の最大希釈倍率は６４倍であり、平均するとプールした抗血清の１６倍とほぼ一致すると考えられる。これに対して亜臨界抽出ローヤルゼリーは５例全例が４倍希釈では反応しなかった。以上のことから亜臨界抽出ローヤルゼリーは凍結乾燥ローヤルゼリーに比べ、極めて抗原性の弱いことが考えられた。
【００５７】
以上により、亜臨界抽出ローヤルゼリーを有効成分とする抗酸化剤は、生体に適用される飲食品、医薬品、及び化粧品等の各分野において、より一層適用しやすいものであることが直接確認された。
【００５８】
次に、上記実施形態及び別例から把握できる技術的思想について、以下に追記する。（ａ）ローヤルゼリーを亜臨界流体により抽出して得られる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする低アレルゲン化ローヤルゼリー。
【図１】
2012036296.tif 000009