(57)【要約】【課題】  常温状態での保存で、皮膚繊維芽細胞に発生した活性酸素の消去に優れた効果がある抗酸化剤及び皮膚に対する病態改善剤を得る。【解決手段】  白金及びパラジウムをコロイドの形で混合することにより、皮膚繊維芽細胞に対する抗酸化剤として、これを常温で長期保存しても皮膚繊維芽細胞に発生した活性酸素が安定して消去され、この抗酸化剤を皮膚病態改善剤として用いることにり、内因性活性酸素に起因する皮膚病態が改善される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
白金及びパラジウムをコロイドの形で混合したことを特徴とする皮膚繊維芽細胞に対する抗酸化剤。
【請求項２】
請求項１に記載の抗酸化剤を含有する皮膚病態改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚繊維芽細胞に発生した活性酸素を消去する抗酸化剤及び皮膚に対する病態改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素が生体の疾患を引き起こす原因の一つであることが判明して以来、この活性酸素を分解消去する物質の研究がなされている。そのなかで、白金コロイドは活性酸素を消去する能力があると考えられており、有用な抗酸化物質として注目を集めており、白金コロイドは、医薬の分野でその利用について数多く提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−１３４２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のように、白金コロイドに活性酸素を消去する能力があると考えられ、医薬の分野でその利用について数多く提案されているものの、その反応機構として電子移動が想定されてはいるが、その詳細は必ずしも明らかとなっていない。特に、試験によれば、常温で保存した白金コロイドを皮膚繊維芽細胞に対する抗酸化剤として使用したところ、活性酸素の消去に殆ど効果がないことが判明した。
そこで、本発明者らは試験研究を重ねた結果、白金及びパラジウムをコロイドの形で混合して抗酸化剤としたとき、これを常温で長期保存しても皮膚繊維芽細胞に発生した活性酸素の消去に優れた効果があることを見出し、本発明を成すに至った。
【０００５】
本発明の目的とするところは、常温状態での保存で、皮膚繊維芽細胞に発生した活性酸素の消去に優れた効果がある抗酸化剤及び皮膚に対する病態改善剤を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題を達成するために、請求項１に記載の発明は、皮膚繊維芽細胞に対する抗酸化剤であって、白金及びパラジウムをコロイドの形で混合したことを特徴とする。
【０００７】
請求項２に記載の発明は、皮膚病態改善剤であって、前記請求項１に記載の抗酸化剤を用いたことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
請求項１に記載の皮膚繊維芽細胞に対する抗酸化剤によれば、白金及びパラジウムをコロイドの形で混合したので、これを常温で長期保存しても皮膚繊維芽細胞に発生した活性酸素の消去に安定した効果を得ることができる。
【０００９】
請求項２に記載の皮膚病態改善剤によれば、前記請求項１に記載の抗酸化剤を用いたので、内因性活性酸素に起因する皮膚病態を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明に係る抗酸化剤である試料１，２と比較の試料３〜７による細胞内活性酸素消去を試験した結果を示すグラフである。
【図２】は比較の試料７を投与したＳＯＤ１未欠損マウスの皮膚組織切片の皮膚厚を示す光学顕微鏡写真である。
【図３】は図２の説明図である。
【図４】は比較の試料７を投与したＳＯＤ１欠損マウスの皮膚組織切片の皮膚厚を示す光学顕微鏡写真である。
【図５】は図４の説明図である。
【図６】は本発明に係る皮膚病態改善剤である試料８を投与したＳＯＤ１欠損マウスの皮膚組織切片の皮膚厚を示す光学顕微鏡写真である。
【図７】は図６の説明図である。
【図８】本発明に係る皮膚病態改善剤である試料８と比較の試料７を投与したマウスの皮膚組織切片の皮膚厚を測定した結果を示すグラフである。
【図９】本発明に係る皮膚病態改善剤である試料８と比較の試料７を投与したマウスの皮膚組織の皮膚重量を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明に係る皮膚繊維芽細胞に対する抗酸化剤及びこれを用いた皮膚病態改善剤の実施の形態について説明する。
【００１２】
先ず、本発明に係る皮膚繊維芽細胞に対する抗酸化剤の実施の形態について説明する。
本発明に係る皮膚繊維芽細胞に対する抗酸化剤は、白金及びパラジウムをコロイドの形で混合した。
前記白金及びパラジウムのコロイドは公知の方法で製造される。白金コロイドとパラジウムコロイドの混合比にあっては特に限定されるものではないが、白金コロイド：パラジウムコロイドが２：３であることが好ましい。
【００１３】
このようにして得られた抗酸化剤は、皮膚繊維芽細胞に発生した活性酸素を消去する。
以下、白金コロイドとパラジウムコロイドの混合物（以下、白金・パラジウム混合物という。）の皮膚繊維芽細胞に発生した活性酸素の消去活性の試験結果を示し、白金・パラジウム混合物が皮膚繊維芽細胞に発生した活性酸素を消去する作用のあることを例証する。
【００１４】
［試験１］
活性酸素を消去する活性が保たれるとされるＳＯＤ１を欠損したマウスの皮膚繊維芽細胞を用いて、白金・パラジウム混合物の皮膚繊維芽細胞に発生した活性酸素の消去活性について試験した。
【００１５】
◎供試細胞
ＳＯＤ１欠損マウス皮膚繊維芽細胞（以下、ＳＯＤ１欠損細胞という。）
ＳＯＤ１欠損細胞を以下の手順で培養する。
培養液は、α−ＭＥＭ＋５％penicillin/streptomycin＋２０％ＦＢＳ を使用する。先ず、新生児マウス（生後４〜６日目）の全身を７０％エタノールで十分に消毒し、脂肪を取り除きながら皮膚を剥離する。５０ｍｌチューブにマウス１匹分の皮膚あたり２ｍｌの０．２％Collagenaseを入れ、３７℃で１時間培養する。培養中、数回vortexをかけ混和し、Strainerで細胞混濁液を濾し取り、２，０００ｒｐｍ２分遠心する。上清を捨て、培養液（２０％ＦＢＳ  ｉｎ  α−ＭＥＭ）を加え、１％Ｏ２下で培養する。酸素濃度以外の培養環境は、ＣＯ２ ５％、３７℃とする。培養２〜３日後に凍結保存する。
【００１６】
◎評価試料
試料１．保存前の白金コロイドとパラジウムコロイドの混合液（濃度１０μＭ）
試料２．常温で３週間保存した白金コロイドとパラジウムコロイドの混合液（濃度１０          μＭ）
試料３．保存前の白金コロイド溶液（濃度１０μＭ）
試料４．常温・開放で３週間保存した白金コロイド溶液（濃度１０μＭ）
試料５．保存前のパラジウムコロイド溶液（濃度１０μＭ）
試料６．常温・開放で３週間保存したパラジウムコロイド溶液（濃度１０μＭ）
試料７．コントロール溶液（MilliQ water）
【００１７】
◎染色試薬
Dihydroethidium（ＤＨＥ）
Hoechst33342
【００１８】
◎試験方法
ＳＯＤ１欠損細胞を１×１０４  cells/wellで９６well plate に播種し（培養酸素濃度１％）、３６時間後に培養酸素濃度を２０％に変更して８時間培養し、酸化ストレスを負荷する。
このようにして得たＳＯＤ１欠損細胞に、前記した試料１〜７を個別に添加し、２０％酸素濃度でさらに１６時間培養した後、前記染色試薬を添加し、３７℃で２０分インキュベートした。
この後、洗浄してから蛍光顕微鏡で観察、撮影し、画像からＤＨＥ蛍光面積を定量し、染色での細胞数を計測することにより活性酸素の量を確認した。
【００１９】
◎試験結果
試験の結果を図１に示す。
図１から明らかなように、試験によれば、酸素濃度２０％の環境下で試料７を添加したＳＯＤ１欠損細胞に発生した活性酸素量を１００としたとき、試料１を添加したものは活性酸素量が７３．０％、試料２を添加したものは活性酸素量が８２．０％、試料３を添加したものは活性酸素量が７６．７％、試料４を添加したものは活性酸素量が９３．３％、試料５を添加したものは活性酸素量が９１．３％、試料６を添加したものは活性酸素量が９９．７％、試料７を添加したものは活性酸素量が１００％であった。
【００２０】
◎評価
上記の結果から、試料１は活性酸素の量が減少し優れた抗酸化活性を示し、試料２は、試料１に比べ活性酸素の量が僅かに多くなっているものの優れた抗酸化活性を示している。これに対し、試料３は試料１に比べ活性酸素の量が僅かに多くなっているものの優れた抗酸化活性を示しているが、試料４では、試料３に比べ活性酸素の量が遙かに多くなっており、抗酸化活性が低下したことが認められる。このことから、本発明に係る皮膚繊維芽細胞に対する抗酸化剤は、常温状態での保存でも活性酸素の消去効果は安定していることが認められる。
【００２１】
次に、本発明に係る皮膚病態改善剤の実施の形態について説明する。
本発明に係る皮膚病態改善薬品は前記の抗酸化剤を用いた。この抗酸化剤は、前記のように白金及びパラジウムをコロイドの形で混合したものからなる。
この抗酸化剤を用いた皮膚病態改善剤を皮膚病態に投与すると、皮膚病態が改善される。
以下、皮膚病態に皮膚病態改善剤を投与したときの皮膚病態の改善試験の結果を示し、皮膚病態改善剤が皮膚病態改善に優れた効果があることを例証する。
【００２２】
［試験２］
ＳＯＤ１を欠損したマウスを用いて、皮膚病態改善剤がマウスの皮膚厚及び皮膚重量に与える作用について試験した。
【００２３】
◎供試動物
ＳＯＤ１欠損マウス
ＳＯＤ１未欠損マウス
【００２４】
◎評価試料
評価試料にあっては、前記の試験１で用いた試料と同じ試料は、同じ試料番号を付した。
試料７．コントロール溶液（MilliQ water）
試料８．保存前の白金コロイドとパラジウムコロイドの混合液（濃度３．８４４２ｍＭ）
【００２５】
◎試験方法
試験開始前日にＳＯＤ１欠損マウス、ＳＯＤ１未欠損マウスの背部皮膚の毛をバリカンで毛刈り（横２ｃｍ×縦３．５ｃｍ）をしてサンプル塗布可能な状態に準備した。ＳＯＤ１欠損マウス、ＳＯＤ１未欠損マウスは、温度２３．５±０．５℃、湿度５０−６０％、照明時間８−２０時の条件下で飼育管理した。飼料は、マウス固形飼料ＣＲＦ−１（オリエンタル酵母工業製）を自由摂取で与えた。飲料水は、塩素塩酸水（ｐＨ２．５−３．０）を使用した。
１日１回（午後１時〜３時）、ＳＯＤ１欠損マウスの毛刈りした背部に試料８と試料７（２００μｌ）をピペットにより個別に背部への経皮投与を４週間行った。また、ＳＯＤ１未欠損マウスの毛刈りした背部に試料７（２００μｌ）をピペットにより個別に背部への経皮投与を４週間行った。毛刈りは毎週１回行った。
４週間の投与終了後、ＳＯＤ１欠損マウス、ＳＯＤ１未欠損マウスの皮膚厚、皮膚重量を次の手順で測定した。
先ず、マウスをエーテル麻酔し、左脇から右心室に２６Ｇ注射針を刺して心臓採血し屠殺した。次に、バリカンで背部および腹部皮膚を毛刈り後、
皮膚を剥離し組織切片を作成した。また、皮膚を穴あけパンチ（φ６ｍｍ）で打ち抜いて皮膚片を作成し、皮膚重量を測定した。
各項目の測定は、以下の方法で行った。  
【００２６】
◎背部皮膚厚測定
先ず、剥離して皮膚を横１．５ｃｍ×縦２．５ｃｍ程度に切り、台紙に貼り付けホチキスで四隅を留めた。その後２０Ｎ  Ｍｉｌｄｆｏｒｍを約２０ｍｌ加えた５０ｍｌチューブに皮膚を貼り付けた台紙を入れ、皮膚を固定して皮膚組織切片を作成した。
このようにして作成した皮膚組織切片をＨＥ染色し、光学顕微鏡下で写真撮影（×４０）し、表皮＋真皮層厚を皮膚厚として測定した。
【００２７】
◎試験結果
試験の結果を図２乃至図７に示す。
図２は試料７を投与したＳＯＤ１未欠損マウスの皮膚組織切片の皮膚厚を示す光学顕微鏡写真、図４は試料７を投与したＳＯＤ１欠損マウスの皮膚組織切片の皮膚厚を示す光学顕微鏡写真、図６は試料８を投与したＳＯＤ１欠損マウスの皮膚組織切片の皮膚厚を示す光学顕微鏡写真であり、ＳＯＤ１欠損マウスに試料８を投与した皮膚組織切片の皮膚厚は、ＳＯＤ１未欠損マウスに試料７を投与した皮膚組織切片の皮膚厚とほぼ同じ厚さとなっていた。ＳＯＤ１欠損マウスに試料７を投与した皮膚組織切片は、ＳＯＤ１未欠損マウスに試料７を投与した皮膚組織切片の皮膚厚に比べ薄くなっていた。
図８は、皮膚組織切片の皮膚厚を画像解析により測定した結果を示すものであり、ＳＯＤ１欠損マウスに試料８を投与した皮膚組織切片の皮膚厚は１９３．９μｍ、ＳＯＤ１欠損マウスに試料７を投与した皮膚組織切片は１７０．９μｍ、ＳＯＤ１未欠損マウスに試料７を投与した皮膚組織切片の皮膚厚は２０９．１μｍであった。
【００２８】
◎皮膚重量測定
皮膚重量の測定は、剥離した皮膚を穴あけパンチ（φ６ｍｍ）で打ち抜いて作成した皮膚片４個を測定し、平均化した。  
【００２９】
◎試験結果
試験の結果を図９に示す。
図９から明らかなように、試験によれば、ＳＯＤ１欠損マウスに試料８を投与した皮膚組織切片の皮膚重量は１６．７ｍｇ、ＳＯＤ１未欠損マウスに試料７を投与した皮膚組織切片の皮膚重量は１９．４ｍｇ、ＳＯＤ１欠損マウスに試料７を投与した皮膚組織切片では１５．１ｍｇであった。
【００３０】
◎評価
上記の結果から、ＳＯＤ１未欠損マウスに試料７を投与した皮膚組織切片の皮膚厚及び皮膚重量と比較して、ＳＯＤ１欠損マウスに試料７を投与した皮膚組織切片の皮膚厚及び皮膚重量は有意に低く、また、ＳＯＤ１欠損マウスに試料８を投与した皮膚組織切片の皮膚厚及び皮膚重量は、ＳＯＤ１欠損マウスに試料７を投与した皮膚組織切片の皮膚厚及び皮膚重量に比較して有意に上昇しており、皮膚菲薄化の改善が認められる。
【００３１】
［試験３］
老齢野生型マウスを用いて、皮膚病態改善剤がマウスの皮膚創傷の治癒に与える作用について試験した。
【００３２】
◎供試動物
１７ヶ月齢のマウス
【００３３】
◎評価試料
評価試料にあっては、前記の試験１で用いた試料と同じ試料は、同じ試料番号を付した。
試料７．コントロール溶液（MilliQ water）
試料９．保存前の白金コロイドとパラジウムコロイドの混合液（濃度３８．４４２μＭ）
【００３４】
◎試験方法
試験開始日にマウス背部皮膚の毛をバリカンで毛刈り（横２ｃｍ×縦３．５ｃｍ）をしてサンプル塗布可能な状態に準備した。また、エーテル麻酔下で穴あけパンチ（φ６ｍｍ）で背部皮膚を打ち抜き、創傷を２箇所作成した。マウスは、温度２３．５±０．５℃、湿度５０−６０％、照明時間８−２０時の条件下で個別に飼育管理した。飼料は、マウス固形飼料ＣＲＦ−１（オリエンタル酵母工業製）を自由採取で与えた。飲料水は、塩素塩酸水（ｐＨ２．５−３．０）を使用した。
１日１回（午後１時−３時）、試料９と試料７（５０ｍｌ）をピペットにより各創傷部位に経皮投与をおこなった。投与期間は２週間行った。
投与開始日から隔日で創傷面積の測定を行った。
創傷面積の測定は、以下の方法で行った。
マウスにエーテル麻酔をかけ、透明シートに創傷の形をトレースした。創傷の形をスキャナで取り込み、その面積を測定した。
【００３５】
◎試験結果
試験の結果、試料７を創傷部位に経皮投与したマウスの創傷面積に比較して、試料９を創傷部位に経皮投与したマウスの創傷面積が創傷作成４日目、６日目、１２日目で有意に小さくなった。
【００３６】
◎評価
上記の結果から、試料９を創傷部位に経皮投与したマウスの創傷治癒速度の上昇が認められた。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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