(57)【要約】【課題】間葉系幹細胞をより効率的に増殖させるための技術を提供すること。【解決手段】タクロリムスを含む培地中で間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞の製造方法。タクロリムスを含む、間葉系幹細胞の増殖促進剤。間葉系幹細胞及びタクロリムスを含む、間葉系幹細胞培養物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タクロリムスを含む培地中で間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項２】
該培地中のタクロリムス濃度が０．１〜１０ｎＭである、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
該培地中のタクロリムス濃度が０．１〜４０ｎＭである、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
該培地中のタクロリムス濃度が２０〜４０ｎＭである、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
間葉系幹細胞がヒト間葉系幹細胞である、請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
タクロリムスを含む、間葉系幹細胞の増殖促進剤。
【請求項７】
間葉系幹細胞及びタクロリムスを含む、間葉系幹細胞培養物。
【請求項８】
培養物中のタクロリムス濃度が０．１〜１０ｎＭである、請求項７記載の培養物。
【請求項９】
該培養物中のタクロリムス濃度が０．１〜４０ｎＭである、請求項７記載の培養物。
【請求項１０】
該培養物中のタクロリムス濃度が２０〜４０ｎＭである、請求項９記載の培養物。
【請求項１１】
間葉系幹細胞がヒト間葉系幹細胞である、請求項７記載の培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞の増殖促進剤、間葉系幹細胞の増殖方法及び間葉系幹細胞の培養物に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は、哺乳類の骨髄等に存在し、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞等に分化する幹細胞として知られている。間葉系幹細胞は、その多分化能故に、多くの組織の再生医療のための移植材料として注目されている。すなわち、間葉系幹細胞を用いて、従来の治療方法では再生しなかった、疾病や障害により失った組織を再生し、機能を回復させる「細胞移植による再生医療」である。具体的には、例えば、下肢虚血（ビュルガー病）患者に対する骨髄間葉系幹細胞の移植、歯周病患部への骨髄間葉系幹細胞の移植、変形性関節症患者に対する骨髄間葉系幹細胞の移植等の治療が開始または計画されている。
【０００３】
しかしながら、間葉系幹細胞のポピュレーションは、極めて小さく、ひとつの個体から採取できる量は僅かである。また、間葉系幹細胞は、通常ＦＣＳ等の血清を含む培地中で接着培養することにより増殖するが、間葉系幹細胞の増殖のスピードは比較的緩やかである。従って、大量の間葉系幹細胞が必要な再生医療を実施するのに十分な数の間葉系幹細胞を培養するためには、長期間間葉系幹細胞を培養する必要がある。
【０００４】
一方、タクロリムスは、ストレプトミセス・ツクバエンシス（Streptomyces tsukubaensis）の培養物から単離・精製された公知の免疫抑制剤である（特許文献１）。タクロリムスは、臓器移植または骨髄移植を行った患者の拒絶反応を抑制する医薬として使用されている。また、タクロリムスはアトピー性皮膚炎治療薬、関節リウマチ治療薬等としても用いられている。
【０００５】
特許文献２には、タクロリムスが軟骨誘導作用を有することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６２−２７７３２１号公報
【特許文献２】特開２００４−２５４６５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、間葉系幹細胞をより効率的に増殖させるための技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意検討の結果、免疫抑制剤として使用されているタクロリムスが、間葉系幹細胞の増殖を促進する効果を有することを見出し、更に検討を重ね、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］タクロリムスを含む培地中で間葉系幹細胞を培養することを含む、間葉系幹細胞の製造方法。
［２］該培地中のタクロリムス濃度が０．１〜１０ｎＭである、［１］記載の製造方法。
［３］該培地中のタクロリムス濃度が０．１〜４０ｎＭである、［１］記載の製造方法。
［４］該培地中のタクロリムス濃度が２０〜４０ｎＭである、［３］記載の製造方法。
［５］間葉系幹細胞がヒト間葉系幹細胞である、［１］記載の製造方法。
［６］タクロリムスを含む、間葉系幹細胞の増殖促進剤。
［７］間葉系幹細胞及びタクロリムスを含む、間葉系幹細胞培養物。
［８］培養物中のタクロリムス濃度が０．１〜１０ｎＭである、［７］記載の培養物。
［９］該培養物中のタクロリムス濃度が０．１〜４０ｎＭである、［７］記載の培養物。
［１０］該培養物中のタクロリムス濃度が２０〜４０ｎＭである、［９］記載の培養物。
［１１］間葉系幹細胞がヒト間葉系幹細胞である、［７］記載の培養物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、間葉系幹細胞を効率的に増殖することができる。従って、本発明は、間葉系幹細胞を用いた再生医療において、間葉系幹細胞の大量かつ安定的な供給に資する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ラット骨髄（ＢＭ）又は脂肪組織（ＡＴ）由来間葉系幹細胞の増殖へのＦＫ５０６の効果を示す。
【図２】ヒト骨髄（ＢＭ）又は脂肪組織（ＡＴ）由来間葉系幹細胞の増殖へのＦＫ５０６の効果を示す。
【図３】ヒト骨髄（ＢＭ）又は脂肪組織（ＡＴ）由来間葉系幹細胞の増殖へのタクロリムス（ＦＫ５０６）の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．間葉系幹細胞の製造方法
本発明の間葉系幹細胞の製造方法は、タクロリムスを含む培地中で間葉系幹細胞を培養することを特徴とする。本発明の製造方法においては、タクロリムスを含む培地中で間葉系幹細胞を培養することにより、既存の間葉系幹細胞から新たな間葉系幹細胞を製造する。従って、本発明の製造方法は、間葉系幹細胞の増殖方法、あるいは間葉系幹細胞の増殖促進方法でもある。タクロリムスを用いることによって、間葉系幹細胞の増殖が増強されるため、本発明の製造方法によれば、高い効率で、間葉系幹細胞を製造することができる。タクロリムスを含む培地中で間葉系幹細胞を培養することにより、間葉系幹細胞を間葉系幹細胞としての能力を保持したまま、高い効率で増殖させることが可能となる。本明細書において、間葉系幹細胞としての能力を保持したままの間葉系幹細胞の増殖を「増幅」という。
【００１３】
「間葉系幹細胞」とは、未分化の状態で増殖し、骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪芽細胞の全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞又はその前駆細胞の集団を広義に意味する。
【００１４】
本発明の製造方法において用いられる間葉系幹細胞は、脊椎動物由来の細胞であれば特に限定されない。該脊椎動物としては、例えば、哺乳動物、鳥、魚、両生類および爬虫類が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、オーストリッチ、エミュ、ダチョウ、ホロホロ鳥、ハト等を挙げることができる。脊椎動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはげっ歯類（ラット等）又は霊長類（ヒト等）である。
【００１５】
生体においては、間葉系幹細胞は骨髄、末梢血、臍帯血、脂肪組織中に低頻度で存在する。間葉系幹細胞は、これらの組織から公知の方法で単離又は精製することが出来る。「単離または精製」とは、天然に存在する状態とは異なる状態に人為的に置かれること、例えば、天然に存在する状態から、目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。例えば、ヒト間葉系幹細胞は、パーコールグラディエント法により骨髄液から単離することができる（Hum. Cell, vol.10, p.45-50, 1997）。或いは、骨髄穿刺後の造血幹細胞等の培養、継代によりヒト間葉系幹細胞を単離することができる（Journal of Autoimmunity, 30 (2008) 163-171）。
【００１６】
生体から単離された間葉系幹細胞は、本発明の製造方法に供される前に、適切な培地中で接着培養されていてもよい。培地としては、例えばDMEM、EMEM、RPMI-1640、F-12、α-MEM、MSC growing medium (Bio Whittaker)等が用いられる。培養温度は通常約30〜40℃の範囲であり、好ましくは約37℃である。CO2濃度は通常約1〜10％の範囲であり、好ましくは約5％である。湿度は通常約70〜100％の範囲であり、好ましくは約95〜100％である。高い分化能を維持するため、培養は２〜５継代以上はしないことが好ましい。
【００１７】
タクロリムス（化合物名：１７−アリル−１，１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザトリシクロ［２２．３．１．０４，９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン）は、下式
【００１８】
【化１】
2012210201.tif 000002
【００１９】
で表される構造を有する公知の免疫抑制剤である。タクロリムスは、例えば、特開昭６２−２７７３２１号公報に記載の方法に従って、ストレプトミセス・ツクバエンシス（Streptomyces tsukubaensis）の培養物から単離・精製することにより取得することができる。また、タクロリムスは、和光純薬等から市販されているので、これらの市販品を本発明に使用することもできる。
【００２０】
培地中に含まれるタクロリムスの濃度は、間葉系幹細胞の増殖を促進しうる濃度であれば特に限定されないが、通常０．００１〜１０００ｎＭ、好ましくは０．０１〜１００ｎＭの範囲内である。培地中のタクロリムス濃度が低すぎると間葉系幹細胞の増殖を促進するのに十分ではなくなる可能性があり、一方タクロリムス濃度が高すぎると、逆に間葉系幹細胞の増殖を阻害してしまう可能性がある。間葉系幹細胞の種差に応じて、より高い細胞増殖促進活性を奏するよう、至適なタクロリムス濃度を適宜調整することができる。例えば、ヒト間葉系幹細胞を培養する場合には、培地中に含まれるタクロリムスの濃度は、好ましくは０．１〜１０ｎＭである。ラット間葉系幹細胞を培養する場合には、培地中に含まれるタクロリムスの濃度は、好ましくは１０〜８０ｎＭである。
【００２１】
更なる態様において、ヒト間葉系幹細胞を培養する場合には、培地中に含まれるタクロリムスの濃度は、好ましくは０．１〜４０ｎＭであり、より好ましくは２０〜４０ｎＭである。
【００２２】
本発明の製造方法において用いられる培地の基礎培地は、間葉系幹細胞の維持又は培養に一般的に使用されているものを用いることができ、特に限定されないが、例えばＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９等が挙げられる。また、間葉系幹細胞培養用等に改変された培地を用いてもよく、上記基礎培地の混合物を用いてもよい。
【００２３】
本発明の製造方法において用いられる培地は血清を含んでいてもよい。血清としては、哺乳動物由来の血清であれば特に限定されないが、好ましくは上記哺乳動物由来の血清（例えばウシ胎児血清、ヒト血清等）である。また血清の代替添加物（例えばKnockout Serum Replacement (KSR)（Invitrogen社製）等）を用いてもよい。血清の濃度は特に限定されないが、通常、０．１〜３０（ｖ／ｖ）％の範囲である。
【００２４】
本発明の製造方法において用いられる培地は、自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、特に限定されないが、例えば成長因子（例えばインスリン等）、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばＬ−グルタミン等）、還元剤（例えば２−メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、ｄ−ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）等が挙げられる。当該添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。
【００２５】
本発明の製造方法によれば、タクロリムスを含む培地中で間葉系幹細胞を培養することにより、間葉系幹細胞が増殖し、既存の間葉系幹細胞から新たな間葉系幹細胞を製造する。従って、本発明の製造方法において用いられる培地は、好ましくは間葉系幹細胞の分化を誘導する因子（例えば、デキサメタゾンなどのグルココルチコイド、トランスフォーミング成長因子−βファミリーと呼ばれる因子、例えば骨形態形成タンパク質（望ましくはＢＭＰ−２あるいはＢＭＰ−４）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インヒビンＡあるいは軟骨形成刺激活性因子（ＣＳＡ）、Ｉ型コラーゲン（とりわけゲル形態にあるもの）などのコラーゲン性細胞外基質、およびレチノイン酸などのビタミンＡ類似体）を、間葉系幹細胞の分化（例えば軟骨への分化）を誘導する濃度では含まない。より好ましくは、該培地は、間葉系幹細胞の分化を誘導する因子を含まない。
【００２６】
本発明の製造方法における、その他の細胞培養条件は、細胞培養技術において通常用いられている培養条件を用いることができる。例えば、培養温度は通常約３０〜４０℃の範囲であり、好ましくは約３７℃が例示される。ＣＯ２濃度は通常約１〜１０％の範囲であり、好ましくは約５％が例示される。湿度は通常約７０〜１００％の範囲であり、好ましくは約９５〜１００％が例示される。
【００２７】
本発明の製造方法において、間葉系幹細胞の継代間隔、希釈率は、培養条件や動物種差により適宜設定されるが、通常、２〜１０日間隔で、１／２〜１／１０倍希釈で細胞が継代される。
【００２８】
本発明の製造方法を用いれば、間葉系幹細胞としての能力を維持した状態で、効率的に、間葉系幹細胞を増殖させ、新たな間葉系幹細胞を得ることが可能であるので、間葉系幹細胞を用いた再生医療において、間葉系幹細胞の大量かつ安定的な供給に資する。
【００２９】
上述のように、タクロリムスを含む培地中で間葉系幹細胞を培養することにより、間葉系幹細胞が増殖する。従って、本発明は、上記培養操作により得られる、間葉系幹細胞及びタクロリムスを含む、間葉系幹細胞培養物をも提供する。
【００３０】
培養物とは、組織や細胞を培養することにより得られる結果物をいう。
【００３１】
本発明の培養物に関連する各用語の定義及び態様は、上記本発明の製造方法について記載したものと同一である。
【００３２】
本発明の培養物は、このましくは上述の本発明の製造方法において記載して詳述したタクロリムスを含む培地を含有する。
【００３３】
該培地は、好ましくは間葉系幹細胞の分化を誘導する因子（例えば、デキサメタゾンなどのグルココルチコイド、トランスフォーミング成長因子−βファミリーと呼ばれる因子、例えば骨形態形成タンパク質（望ましくはＢＭＰ−２あるいはＢＭＰ−４）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インヒビンＡあるいは軟骨形成刺激活性因子（ＣＳＡ）、Ｉ型コラーゲン（とりわけゲル形態にあるもの）などのコラーゲン性細胞外基質、およびレチノイン酸などのビタミンＡ類似体）を、間葉系幹細胞の分化（例えば軟骨への分化）を誘導する濃度では含まない。より好ましくは、該培地は、間葉系幹細胞の分化を誘導する因子を含まない。
【００３４】
好ましい態様において、本発明の培養物は、ヒト間葉系幹細胞及び０．１〜１０ｎＭのタクロリムスを含有する。
【００３５】
他の好ましい態様において、本発明の培養物は、ラット間葉系幹細胞及び１０〜８０ｎＭのタクロリムスを含有する。
【００３６】
また、本発明は、タクロリムスを含む、間葉系幹細胞の増殖促進剤に関する。本発明の剤を含む培地を用いて、上記本発明の製造方法により間葉系幹細胞を培養することにより、間葉系幹細胞の増殖効率が飛躍的に上昇する。また、本発明の剤を、従来行われている間葉系幹細胞の培養培地に添加することにより、間葉系幹細胞の増殖効率が飛躍的に上昇する。
【００３７】
本発明の剤は、タクロリムスのみからなっていてもよいが、更に生理学的に許容される担体（例えば、生理的な等張液（生理食塩水、上述の基礎培地、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）を含む等張液等）、賦形剤、防腐剤、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、結合剤、溶解補助剤、非イオン性界面活性剤、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、保存剤、酸化防止剤、上述の添加物など）を含む組成物として提供することもできる。
【００３８】
本発明の剤に含まれるタクロリムスの含有量は、本発明の剤が本発明の製造方法に用いられる培地に添加されるなどして用いられた場合に、該培地中のタクロリムス濃度が、間葉系幹細胞の増殖を促進するのに十分な濃度含まれるように構成されていることが好ましい。
【００３９】
本発明の剤は、等張な水溶液、あるいは粉末等の状態で、上記本発明の製造方法に用いる培地に添加されるなどして用いられる。あるいは本発明の剤は、上記本発明の製造方法に用いられる培地であってもよい。
【００４０】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００４１】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４２】
[実施例１]
Ｌｕｃ  Ｔｇラットの脂肪組織（ＡＴ）及び骨髄（ＢＭ）から間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）を単離した。
得られた間葉系幹細胞を２０％血清含有ＤＭＥＭ（通常培地）に分散し、Ｎｕｎｃ社製の６穴プレートに播種し（ＡＴ−ＭＳＣｓ：６．６×１０４個／ｍｌ、ＢＭ−ＭＳＣｓ：２．５×１０４個／ｍｌ）、３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。２４時間後に、表示した濃度（１０、２０、４０、又は８０ｎＭ）のＦＫ５０６（タクロリムス）（和光純薬）を含む、又は含まない前記通常培地に交換し、ＩＶＩＳにて輝度を測定した（Ｄａｙ０）。引き続き間葉系幹細胞を培養し、毎日ＩＶＩＳにて輝度を測定した。Ｄａｙ０の輝度の値を１００％としたときの相対値として、各測定日における細胞数を算出した。
【００４３】
ＦＫ５０６の添加により、間葉系幹細胞の増殖が促進した（図１）。
【００４４】
[実施例２]
ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＴ−ＭＳＣｓ）（継代数６）、及びヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣｓ）（継代数６）を、１０％血清含有α−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）（通常培地）に分散し、Ｎｕｎｃ社製の６穴プレートに播種し（２．０×１０４個／ｍｌ）、３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。２４時間後に、各ウェルの細胞をトリプシン（ＧＩＢＣＯ）で剥がした。この時点（Ｄａｙ０）で得られた細胞の数を１００％とした。得られた細胞を、表示した濃度（０．１、１、１０、又は１００ｎＭ）のＦＫ５０６（タクロリムス）を含む、又は含まない前記通常培地を入れた新たなプレートに移し、引き続き培養した。２４時間毎に、細胞をトリプシンで剥がし、細胞数を測定し、Ｄａｙ０での細胞数に対する相対値を算出した。
【００４５】
０．１〜１０ｎＭのＦＫ５０６の添加により、間葉系幹細胞の増殖が促進した（図２）。一方、１００ｎＭのＦＫ５０６の添加では、細胞数はＦＫ５０６を添加しなかったときとほぼ同等であった。従って、ヒト間葉系幹細胞の増殖を促進するためのＦＫ５０６の適切な濃度は、０．１〜１０ｎＭの範囲であることが示唆された。
【００４６】
［実施例３］
Ｃａｍｂｒｅｘ社（日本代理店ＴａＫａＲａ社）から購入したヒトＢＭ−ＭＳＣｓとヒトＡＴ−ＭＳＣｓをｎｕｎｃ社製の６穴細胞皿に播種した。尚、使用した培養液は１０％血清含有α−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）である。培養液とは別にタクロリムス（アステラス社）を指定濃度になるように添加した。タクロリムス（アステラス社）は、終濃度０ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、８０ｎＭ、又は１００ｎＭで使用した。１〜３日培養後、ＴａＫａＲａ社製のＰＢＳ（−）で各６穴培養皿を３回洗浄し（室温）、ＧＩＢＣＯ社製のトリプシン溶液にて各細胞を培養皿より剥離し、アシスト社製の１５ｍＬ遠心チューブに細胞を回収した。室温・１０００ｒｐｍ・５分間の遠心操作により、遠心チューブの底に細胞を沈め、アスピレーターにて上澄み液を破棄した。指で弾いて細胞塊を解し、培養液を加えて数回ピペット操作にて更に細胞を解し、血球計算盤で細胞数を測定した。
【００４７】
１０〜４０ｎＭのタクロリムスの添加により、間葉系幹細胞の増殖が促進した（図３）。特に、２０ｎＭ及び４０ｎＭにおいて、間葉系幹細胞の増殖が顕著に促進された。一方、８０ｎＭ及び１００ｎＭのＦＫ５０６の添加では、細胞数はＦＫ５０６を添加しなかったときとほぼ同等であった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明によると、間葉系幹細胞を効率的に増殖することができる。従って、本発明は、間葉系幹細胞を用いた再生医療において、間葉系幹細胞の大量かつ安定的な供給に資する。
【図１】
2012210201.tif 000003
【図２】
2012210201.tif 000004
【図３】
2012210201.tif 000005