(57)【要約】【課題】    膜の微粒子除去能を確定する性能試験および使用後の膜が微粒子除去性能においてあらかじめ設定内であることを確認す非破壊法の完全性試験の非水系で実施する新しい方法と該試験に適用させる試験試薬と該試薬を製造する方法を提供する。【解決手段】    平均粒子径１３〜２００ｎｍの水酸化第２鉄コロイド粒子と該コロイド粒子を安定させるためのｐＨが２．５〜４．０であることを特徴とする非水溶液を試験液として粒子除去性能を測定する。試験液を他の物質に接触させた際の該コロイド粒子を安定させるために界面活性剤を使用する事でコロイド粒子の安定化を増加させる。この水酸化第２鉄コロイド粒子の粒子径を核としての小径の水酸化第２鉄コロイドと界面活性剤濃度の混合比で制御して作製した非水溶液を用いて膜の粒子除去性能を評価する【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子除去膜の完全性試験用および微粒子除去性能試験用の非水溶液において、平均粒子径１０〜２００ｎｍの非晶性の水酸化第２鉄コロイド粒子を鉄換算で１００ｐｐｍ含みかつ第１鉄イオン濃度が０．１ｐｐｍ以下であることを特徴とする非水溶液および該コロイドの平均粒径を調整するのに際して該コロイドの核としては１０ｎｍ以下の小径の３価の鉄イオン微粒子を作製しさらに界面活性剤の添加により粒子径を制御することを特徴とする完全性試験用および微粒子除去性能試験用非水溶液の製法。
【請求項２】
請求項１において該コロイド粒子の濃度が鉄換算で２００ｐｐｍ以上であり、平均粒子径が１０ｎｍ以上で１００ｎｍ未満であることを特徴とする非水溶液を作製するために３価の鉄イオンとして塩化第２鉄の水溶液を採用し、界面活性剤としてはドデシル硫酸ナトリウム（略してＳＤＳ，ＳＬＳ）利用してｐＨを２．５〜３．５に制御することを特徴とする非水溶液の調製方法。
【請求項３】
請求項１において非水溶液とは下記の溶媒を主成分として含むことを特徴とする溶液。
ヘキサン、ヘプタン、オクタン、
【請求項４】
請求項２における非水溶液でコロイド粒子をコロイド粒子以外の物質に接触した際の安定化に寄与する成分が下記物質より選定されることを特徴とする完全性試験用非水溶液。
ポリエチレングリコール，ポリビニルアルコール，ポリビニルピロリドン，陽イオン界面活性剤，非イオン界面活性剤。
【請求項５】
請求項１，３において完全性試験と微粒子除去性能試験とが膜試験後の膜の用途に対応して孔拡散技術あるいは孔拡散・濾過技術あるいは濾過技術で行われる試験であることを特徴とする試験用非水溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微粒子除去を目的とした平均孔径５ｎｍ以上３００ｎｍ以下の高分子多孔膜を使用後または使用前に行う膜の完全性試験または膜のウイルス除去および微粒子除去の性能試験に供する非水溶液とその製法に関する。除去対象とする微粒子とはウイルスや細菌などの感染性粒子あるいはタンパク凝集体，タンパクと他の分子との複合化した凝集体や無機粒子である。これらの微粒子を膜によって除去する技術を提供したりあるいはその技術を適切に利用したりする際には、膜の供給側は膜の微粒子除去性能を評価（この評価試験を性能試験と略称）したり、あるいは膜の使用者側は膜が微粒子除去性能を設計通り製造工程中で維持し使用されたことを確認する完全性試験を実施することが必要である。
【０００２】
従来は、この種の膜は水溶液に対して使用されるのが一般である。しかし、気体中からの感染性微粒子の除去あるいは非水系液体（例、有機溶媒や食用油）からの感染性微粒子の除去が必要となっている。特にナノテクノロジーの進展は、種々の流体内部に未知の感染性微粒子の存在の可能性が生まれている。このような非水性の流体から膜を用いて、これらの微粒子を除去する試みがなされている。この場合、非水系で微粒子の除去性能を確認する必要があり、また非水系で膜が使用される場合には非水系で膜の完全性試験を行う必要がある。ここで非水系とは溶液中の水濃度が１０％以下である溶液を意味する。
【０００３】
本発明は膜の非破壊型の微粒子除去性能試験および完全性試験用に供する非水溶液を与えさらに該非水溶液の製法を提供する。該非水溶液中には除去対象とする感染状微粒子に対応する指定された大きさ（通常、直径：プリオン用１０ｎｍ，ウィルス用２０ｎｍ，マイコプラズマ用８０ｎｍ，細菌用では３００ｎｍ）をもつ微粒子を含み、その微粒子が安定に分散していなくてはならず通常１２週間以上は平均の粒径は変化しないことが必要である。
【背景技術】
【０００４】
膜分離技術は分離に要するエネルギーが小さいこと、温和な条件での分離であることにより生物資源を利用する分野に利用されている。特にバイオ医薬品や飲食品分野の精製工程では多用されている。これらの分野での膜技術は、感染性粒子（ウイルス，細菌，プリオンなど）を除去するなどの安全性対策上不可欠である。実際に市場ではウイルス除去膜や除菌用フィルターとして膜を用いた濾過技術（膜濾過技術と略称）としてバイオ医薬品の製造工程で利用され、この分野では使用後の膜の完全性試験が義務付けられている。
【０００５】
従来より提案された膜の完全性試験法には、ウィルス除去と細菌除去に関して直接法と間接法との二種類がある。例えばウィルス除去に関して直接法とはある特定の大きさを持つ微粒子を同じ大きさのウイルスのモデル物質とみなし、この微粒子を分散した水溶液を用いた膜の微粒子除去性能を測定する試験法意味する。完全性試験の定義から膜としては使用直後の膜でなくてはならない。ウィルス除去に関して実際に使われている微粒子は金コロイド粒子である。（特許文献１）一方、性能試験は膜の使用前に膜のメーカーが行う除去性能試験であり、この金コロイド粒子を用いる場合には膜の性能試験の直接法に分類される。性能試験の直接法において技取り検査では金コロイド粒子が採用されているが全数検査での直接法は開発されていない。この方法が破壊型の直接法であるため全数検査の性能試験としては不適である。金コロイド粒子は水溶液中に分散している。すなわち従来の直接法での安全性試験は除去対象物質が水に分散している場合にのみ適用できる。非水媒体での直接法での安全性試験法は提案さえない。
【０００６】
間接法による完全性試験では微粒子の除去性能を測定する代りに、孔特性に関連した物性値を測定することによって間接的に使用後の膜についての微粒子の除去性能が設定された基準以上であることを確認する試験法である。たとえば膜中の孔を介して２種の液体相を接触させた際に生じる界面張力が既知であれば２液体の一方を加圧して最初に加圧された液体が孔を通過する瞬間の圧力を測定すれば最大孔径が定まる。この圧力が所定の圧力以上であることによって膜中の最大の孔の大きさが設定された孔径内であることが原理上確認できる（特許文献２）。この方法では膜の孔特性が膜の浸漬媒体の種類によらず同一であるとする仮定を前提としている。
【０００７】
間接法での実際の測定では一定の膜間差圧を与えた際の液体の膜透過速度を測定する場合が多い（特許文献２）。しかしこの方法では界面張力が重要であるため使用後の膜の洗浄と測定時の温度制御が必要であり、しかも測定後の膜は測定時に使用していた液体で汚染される。また界面張力の大きな液体（例、水など）の場合には膜への負荷圧力が大きくなるため完全性試験によって孔が力学的に変形あるいは破壊される。したがってこの方法も破壊試験となるため全数検査が必要な性能試験としては使えない。膜の平均孔径が小さくなるほど間接法の適用が難しくなる。
【０００８】
全数検査で性能試験としての非破壊の間接法の例として、孔を介しての気体と液体との表面張力を利用して最大径またはその近傍の孔を上述の液／液界面での間接法の場合と類似の気／液界面での気体の透過速度を測定する検査法も実際の膜の製造現場では利用されている。しかしこの方法では膜としては乾燥状態であることが必要であり、かつ膜間差圧も数気圧〜十数気圧必要なためこの方法は膜ユーザーの行う完全性試験には使えない。
【０００９】
本発明でいう膜分離技術とは（１）圧力差を物質移動の駆動力として孔径と粒子径との関係で物質を分離する膜濾過技術と、（２）濃度差を物質移動の駆動力とし、分子あるいは粒子自体の持つ熱運動性（いわゆるブラウン運動の激しさ）の差を利用した分離と膜中の孔の径と粒子径との関係で生じるふるい効果によって分離する孔拡散技術と（３）半透膜をへだてた濃度差を物質移動の駆動力として、膜と物質との親和力差と膜素材高分子の熱運動性（ミクロブラウン運動の激しさ）で生じる自由体積の空間部の大きさと分子の大きさとの差で分子を分離する拡散透析技術とを意味する。
【００１０】
従来から提案されていた直接法あるいは間接法の完全性試験法ではいずれの方法でも使用後の膜を洗浄して完全性試験の正確度を高めなくてはならない現状である。その理由は直接法では（Ａ）採用されている微粒子が金コロイド粒子であること，（Ｂ）膜分離技術として膜濾過技術を採用しているためである。（Ａ）の理由は金コロイド粒子とタンパク質との相互作用が強く（特にグロブリンとは吸着する）膜表面や内部の孔にタンパクが残存すると見掛上微粒子除去能は増加するためである。（Ｂ）の理由は濾過により膜表面には濃度分極により水溶液中の溶解成分が高濃度に局在化し、また膜中の孔には微粒子が目詰まりを起こして残留しているためである。しかも従来技術はすべて膜が水溶液中で利用されることを前提としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００５−４０７５６
【特許文献２】特開１７−１３２２１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
一度微粒子除去用として使用された膜に対して再生処理した膜が再び微粒子除去用として再利用することができるがどうかを決定する試験法を開発することができればこの分野での膜の再利用の道が開ける。従来、膜を使用した後に行われる完全性試験では、この試験自体が膜の孔構造を破壊するものと考えが定着していた。すなわち微粒子除去用としての膜の再利用が可能になるにはまず完全性試験法が非破壊試験であることが必要である。膜の供給側である膜の製造者は非破壊型試験で間接法による性能試験を行っているが、この場合には性能試験後の膜の表面および内部が清浄で未使用状態と同一の状態であることか必要である。性能試験では膜の状態が未使用状態を前提としているためこの方法は完全性試験としては利用できないとされている。結局は適切な完全性試験法がないため膜はシングルユースであるとする膜の製造者の指導に従っているのが現状である。空気や油などの非水媒体中の感染性微粒子の除去膜については完全性試験法がなく、再利用の道は皆無の状況下にある。
【００１３】
本発明では非破壊試験で、しかも直接法による試験用の非水溶液を提供することにより、膜の微粒子除去用としての再使用の可能性を阻外する上述の問題を解決する。すなわち本発明の第１の特徴は微粒子除去を目的とした膜に対して膜製造者が行う使用前の膜の直接法の除去性能試験と膜の使用者が行う使用後の膜の完全性試験との共通の試験用非水溶液を与える点にある。直接法でかつ非破壊型の試験法であるためには、非水溶液中には試験後に簡単に除去できる特定の大きさを持つ微粒子を分散していることが必要である。また試験法としては濾過法よりも孔拡散法の方が膜中の粒子除去が容易なために望ましい。同じ理由で膜の使用方法も孔拡散法が望ましい。従来微粒子除去を目的とした膜分離技術は膜濾過法のみであったため孔拡散法が開発されるまで膜の再生使用の可能性はなかったといえる。
【００１４】
本発明の第２の特徴は、非水溶液中に水非晶性の酸化第２鉄コロイド粒子を分散させている点である。水酸化第２鉄コロイド粒子はほとんど無定形であるため、試験後に膜中に残存しても酸等により簡単に溶解除去できる。水酸化第２鉄コロイド粒子にすることにより非水中の３価の鉄イオン濃度および２価の鉄イオン濃度を０．１ｐｐｍ以下に低下させることは可能である。透析によりさらに３価の鉄イオン濃度をさげることも可能である。２価の鉄イオンの減少はコロイド粒子の安定性に寄与するのみでなく完全性試験の感度を高める。水酸化鉄コロイド粒子を乾燥すると脱水や酸化状態が変化し、結晶化が進み、コロイド粒子は酸への溶解速度が著しく低下する。そのため試験後の粒子除去が困難となり破壊型の試験法となり好ましくない。水酸化第２鉄コロイド粒子を無定形状態に保持させておくことも重要である。
【００１５】
本発明のコロイド粒子の形状の際にその核を与える水酸化第２鉄コロイド粒子を作製するには第２鉄塩を溶解した非水溶液中に塩基性物質を添加するか、該非水溶液を５０℃以上に加熱すれば良い。ＰＨの制御下でコロイド粒子を安定化させるためにはｐＨの範囲を５以下に、長期の安定にはｐＨ２．５〜４．０に制御しておくことが必要である。塩基性物質としては苛性ソーダやアンモニアが適する。また、核となる水酸化第２鉄コロイド粒子の径を１０ｎｍ以上で７０ｎｍ以下に設定することが粒子径や磁性と結晶性を決定する重量な変数である。非水系の溶媒として膜を溶解または膨潤させない溶媒であることも必要である。具体的にはドライクリーニングで使用されている溶媒であり、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタンである。
【００１６】
本発明の第３の特徴は水酸化第２鉄コロイドの平均粒子径を１３〜２００ｎｍの特定値に設定している点と水酸化第２鉄の濃度が鉄換算で１００ｐｐｍ以上である点である。微粒子除去を目的とする膜の微粒子の具体的な種類として、細菌，マイコプラズマ，リケッチャ，クラミジア，ウイルス，プリオンその他タンパクの会合体や無機粒子等がある。これらの微粒子を除去する性能を膜が有することを確認するには、その対象とする微粒子径より小さな水酸化鉄コロイド粒子の膜除去性能によって確定される。プリオンの大きさは約１０ｎｍ、最小ウイルスの大きさが２０ｎｍであることが明らかになりつつあり、平均粒子径が１０ｎｍ以上であることは完全性試験の目的にかなう。この水酸化鉄コロイド粒子の膜除去機構は粒子径のみに依存するふるい効果や粒子径に依存する拡散効果であることが必要である。他の効果、例えば吸着効果によって除去される場合には膜の界面特性や微粒子界面の特性によって除去性能が変化するためである。すなわち試験法としては、除去性能に対して理論上予測性を持たなくてはならない。そのためにはふるい効果や拡散効果で粒子を除去する性能を確定し、他の除去機構が付与される場合には除去性能はふるい機構のみの場合の値以上となることが必要である。コロイド粒子の濃度は完全性試験の感度を支配するので重要であり、高い検出感度が要求される。ウィルス除去用では２００ｐｐｍは必要である。検出感度の上昇と鉄イオン濃度を別途測定していれば該濃度は１００ｐｐｍ以上であれば良い。
【００１７】
除去対象のウイルスがＨＩＶ（粒径１００ｎｍ）等のレトロウィルス，あるいは細菌類，マイコプラズマ，リケッチャ，クラミジアであれば粒径８０ｎｍの水酸化鉄コロイド粒子を、Ｃ型肝炎ウイルス（粒径３５ｎｍ）あるいはＢ型肝炎ウイルス（４２ｎｍ）であれば粒子径２０ｎｍのコロイド粒子を、プリオン（１０ｎｍ）については粒子径１０ｎｍを試験用水溶液に含まれるコロイド粒子の径として設定する。除去対象微粒子よりもわずかに小さいコロイド粒子を試験用の水溶液を用いることにより完全性試験および性能試験の信頼度が高くなる。
【００１８】
水酸化第２鉄コロイド粒子の粒子径は鉄塩水溶液中の核の役割を果たす水酸化第２鉄コロイド粒子と界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウムよって制御できる。３価の鉄イオン存在比が大きくなると平均粒子径は大きくなる。また界面活性剤濃度が高くなると小さくなる。残存する鉄イオン濃度を低くすることは鉄コロイド粒子を安定化させるのに望ましい。３価の鉄イオンを与える鉄塩としては塩化第２鉄が良く、あらかじめ塩化第２鉄水溶液として利用する。
【００１９】
本発明の第４の特徴はコロイド粒子を安定化させる複数の水溶性成分を含んだ非水溶液である点である。この安定化はコロイド粒子が他の材料と接触した際の安定化剤である。該水溶性成分として水素イオンの調整が容易であることとこのイオンを試験後膜中より除去するのは簡単である。コロイド粒子の保存中にはｐＨは４以下に保たれる。第１鉄イオン濃度を０．１ｐｐｍ以下にすることにより、コロイド粒子の安定化が向上し、またコロイド粒子の非晶性の保持が簡単である。コロイド粒子を用いて完全性試験を行う際に回路の素材、膜に残留するタンパク質や脂肪等に接触する。この接触時の安定性を確保するためにも界面活性剤を使用していることは良い。陽イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤がこの目的のために利用される。また接触する素材表面を親水化するためにポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールあるいはポリビニルピロニドリンが優れている。
【００２０】
完全性試験および微粒子除去性能試験とが非破壊でかつ試験前に膜を洗浄処理することなく実施する試験方法としては孔拡散技術であることが望ましい。該試験用水溶液中の水酸化第２鉄コロイドの平均粒子径が２０ｎｍで１００ｎｍ以下の範囲であることがウィルス除去用の試験としては最適であり、この際には試験の検出感度を高める必要性がある。該コロイド粒子の濃度が２００ｐｐｍ以上であることが望ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の試験用非水溶液は微粒子除去性能試験と完全性試験との両者に利用される。両試験方法の一致は膜の再生利用の道を開く。一方、現状の完全性試験の範囲においてのみ使用する場合でも従来法に比較して簡便で洗浄処理を必要としない。さらに性能試験において性能試験の直接法でかつ除去性能の検出感度として従来の金コロイド水溶液の１０〜１００倍の高い検出感度を与える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
水酸化第２鉄コロイド粒子の鉄濃度とドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）によって水酸化第２鉄コロイド粒子の大きさを設定する。このコロイド粒子にＳＤＳを含む非水溶液を混合して非水系コロイド粒子を設定した。粒子径を動的光散乱法で確定する。この水溶液を２０℃で２ヶ月間保管し、その後平均粒子径の変化を測定しても変化率は１０％以内である。
【００２３】
ミクロ相分離法で作製した再生セルロース多層構造平膜（例えば平均孔径３０ｎｍ，空孔率６５％，膜厚１８０ミクロン）の微粒子除去性能を孔拡散法で評価する。拡散液中の粒子濃度は以下のような錯体形成法を採用し、鉄イオンに換算で０．０１ｐｐｍまで測定する。試験液中の鉄イオンに換算した粒子濃度を例えば２００ｐｐｍとすると微粒子除去性能の測定は４ｌｏｇまで可能である。検出感度を限界の０．００５ｐｐｍまで高め、粒子濃度を５００ｐｐｍにすれば微粒子除去性能は５ｌｏｇまで可能である。
【００２４】
微粒子除去性能を評価した後、０．１規定の塩酸を孔拡散式平膜モジュールに充填し、３０℃で２時間ごとに内部の液を０．１規定の塩酸で置換を繰り返す。４８時間この処理により流出する鉄イオン濃度は検出限界以下となり平膜は再生される。再生後の平膜モジュールで１重量％のガンマグロブリン水溶液を孔拡散法で微粒子除去する微粒子除去およびガンマグロブリンの膜透過特性は同一製膜条件の膜で上記性能テストを行っていない膜と同一であった。
【００２５】
上述のコロイド水溶液を用いて孔拡散法で完全性試験を実施する。拡散液中の水酸化第二鉄コロイド粒子濃度を測定するために拡散液中に１規定の塩酸を加えＰＨを約１に設定し、８０℃に３０分間加熱する。２０℃に冷却後、少量のチオシアン酸ナトリウムを添加し着色する。着色した後に分光光度計を用いて吸光度を測定することによりあらかじめ求めた検量線より鉄イオン濃度を決定する。この方法で測定される鉄イオン濃度は０．０１ｐｐｍ以下０．００５ｐｐｍである。
【実施例１】
【００２６】
エタノール２０ｍｌに塩化第２鉄６水和物（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）を鉄換算濃度１２００ｐｐｍを５０℃の液温で溶かし（Ａ）液とし、エタノール２０ｍｌに水酸化ナトリウム０．２７６ｍｏｌ／Ｌを６０℃で溶かし（Ｂ）液とし、それぞれ溶けたのを確認し攪拌下でＢ液にＡ液を混合し３０分間５０から６０℃で保持した（Ｃ）。次にエタノール１０ｍｌ中にＳＤＳを２６０ｍｌ中０．５％になるよう秤取り溶かした。この液をＣに攪拌下で混合し５０から６０℃は３０分間保持した（ｄ）。次にエタノール１０ｍｌ中に、ＳＤＳを２６０ｍｌ中１．０％になるよう秤取り溶かし、攪拌下で混合し５０から６０℃は３０分間保持し、攪拌下でヘキサン２１０ｍｌを混合し４０から５０℃で３０分間保持した。この液を攪拌下でｄに混合し４０から５０℃で５時間保持した。その後５０℃まで冷却させ、濾紙により濾過させた。この作製により粒子径２１ｎｍを得る事ができた。
【００２７】
これらのコロイド水溶液を２０℃で静置保存すると粒子径が大きいほど沈降が早く１００ｎｍの粒子径の溶液では１日以内で沈降が認められた。平均粒径が２０ｎｍでは１ヶ月間はまったく変化が認められず２ヶ月後のＤＬＳ測定では平均孔径２０ｎｍと変化が認められなかった。
【実施例２】
【００２８】
実施例１と同様の作製方法で得られた非水溶液にこの非水溶液中に下記の物質を添加し、コロイド粒子の安定性を確認した。
（１）ヘキサンによる稀釈と濃縮・・・稀釈倍率１０倍〜濃縮倍率１０倍で安定
（２）食塩水添加・・・食塩濃度が１，２重量％以上で不安定化
（３）卵アルブミン水溶液・・・０〜１重量％で安定
（４）牛ガンマーグロブリン・・・１０ｐｐｍ〜０．１重量％で不安定で０．２重量％以上で安定
（５）牛胸腺由来ＤＮＡ・・・５ｐｐｍ以上で不安定
【００２９】
実施例２で得られた水酸化第二鉄コロイド粒子を含む水溶液はアルブミン水溶液から膜によってウイルス除去する場合の完全性試験に適することがわかる。特に膜表面に濃縮はほとんど起らない孔拡散法で使用された膜の使用後の膜の完全性試験用として、本非水溶液は適する。グロブリンやＤＮＡを含む液を膜処理（濾過や孔拡散）した後、膜に対しては、本非水溶液を用いた完全性試験を行う前にあらかじめ膜を水と添加液とで洗浄する必要がある。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
バイオ医薬品製造工程の精製工程でウイルス等の感染性粒子を除去する膜の製造時に行う微粒子除去性能試験および膜の使用者が膜の使用状態が設定どおりであったことを確認するための完全性試験に利用される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】非水中の水酸化第２鉄コロイド粒子のモデル図
【符号の説明】
【００３２】
１：容器，２：水酸化第２鉄コロイド粒子（核），３：界面活性剤の対イオン（Ｎａ＋イオン），４：界面活性剤イオン（ドデシル硫酸イオン），５：エタノール，６：ヘキサン（溶媒）、少量の水の存在は無視している。
【図１】
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