(57)【要約】【課題】生体内において試料とパルスレーザ光との非線形相互作用を誘起するＣＡＲＳ過程を含む四光波混合過程、その他の非線形相互作用を観測するために、十分な強度のパルスレーザ光を照射する。【解決手段】試料Ａにおいて非線形相互作用を誘起する波長の異なる複数のパルスレーザ光を発生する光源部２と、該光源部２から発せられ複数のパルスレーザ光を別個に導光する複数の導光部材９，１０と、該導光部材９，１０により導光された複数のパルスレーザ光を試料Ａに照射する照射光学系４と、該照射光学系４によるパルスレーザ光の照射により試料Ａにおいて発生した非線形相互作用信号を検出する検出光学系５とを備える観察装置１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料において非線形相互作用を誘起する波長の異なる複数のパルスレーザ光を発生する光源部と、
該光源部から発せられ複数の前記パルスレーザ光を別個に導光する複数の導光部材と、
該導光部材により導光された複数の前記パルスレーザ光を試料に照射する照射光学系と、
該照射光学系による前記パルスレーザ光の照射により前記試料において発生した非線形相互作用信号を検出する検出光学系とを備える観察装置。
【請求項２】
前記導光部材が光ファイバである請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記導光部材がシングルモードファイバである請求項２に記載の観察装置。
【請求項４】
複数の前記パルスレーザ光の試料への到達時間を調節するタイミング調節部を備える請求項１に記載の観察装置。
【請求項５】
前記照射光学系に、１以上のパルスレーザ光の偏光を調整する偏光調整部を備える請求項１に記載の観察装置。
【請求項６】
複数の前記パルスレーザ光の少なくとも１つがピコ秒以下のパルス幅を有する請求項１に記載の観察装置。
【請求項７】
前記検出光学系が、試料において発生した前記非線形相互作用信号を導光するマルチモードファイバと、該マルチモードファイバにより導光された非線形相互作用信号を検出する検出器とを備える請求項１に記載の観察装置。
【請求項８】
前記導光部材の射出端が、周方向に間隔をあけて複数環状に配列されている請求項１に記載の観察装置。
【請求項９】
前記照射光学系に、複数の前記導光部材により導光されてきた複数の前記パルスレーザ光を同軸に合波させる合波手段を備える請求項１に記載の観察装置。
【請求項１０】
前記導光部材の前記射出端の半径方向外方に、前記マルチモードファイバの入射端が周方向に間隔をあけて複数環状に配列されている請求項７に記載の観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、多数種の分子を含む生体試料の化学的状態の分類や、生体試料に含まれる成分の濃度推定を行うために、生体試料の振動スペクトルを取得し、取得された振動スペクトルにおける全周波数領域の強度情報を変量として取り扱う多変量解析の手法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
また。生体試料の振動スペクトルを生体内で測定するＣＡＲＳ（コヒーレントアンチストークスラマン散乱）内視鏡装置が知られている（例えば、特許文献２参照。）。このＣＡＲＳ内視鏡装置では、ＣＡＲＳ過程を誘起する２波長のパルスレーザ光が、単一の光ファイバによって同軸に導光されるようになっている。
【０００３】
ここで、ＣＡＲＳ過程は、一般にはポンプ、ストークスおよびプローブの３本のレーザ光を試料に入射した際に誘起されるコヒーレントラマン散乱過程である。ポンプおよびストークス光のエネルギ差が試料中の分子の振動エネルギに共鳴した際に特に強度の強い散乱光（ＣＡＲＳ信号光）が発生する。このＣＡＲＳ信号光を検出することで試料の分子振動の情報を取得することができる。なお、ＣＡＲＳ過程ではポンプレーザ光自体を同時にプローブレーザ光として用いることができるため、上記ＣＡＲＳ内視鏡装置では２波長のパルスレーザ光（ポンプおよびストークスパルスレーザ光）を用いている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第６３４１２５７号明細書
【特許文献２】米国特許第７４１４７２９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＣＡＲＳ過程を誘起する２波長のパルスレーザ光の両方を単一の光ファイバによって導光する場合には、光ファイバ内におけるエネルギ密度が増大するため、不要の非線形相互作用が光ファイバ内において誘起されて波長変換が起こるため、不要な波長成分が生じてしまうという不都合がある。その結果、本来、生体試料によるＣＡＲＳ過程を誘起することを目的としているパルスレーザ光に対して、光学フィルタ等を用いて前記不要な波長成分を除去する必要が生じ、ＣＡＲＳ過程に寄与するパルスレーザ光の強度が損なわれてしまうという不都合がある。さらに、強いＣＡＲＳ信号を得るためにレーザパワーを増大させようとしても、光ファイバの非線形性によって不要な波長変換が起こるため十分な強度のパルスレーザ光を導光することができないという不都合がある。ここで、ファイバ内で誘起される非線形相互作用は非共鳴四光波混合過程（例えば、自己位相変調）ＳＲＳ（誘導ラマン散乱）等のパルスレーザ光の波長が変換されてしまう過程を意味している。
【０００６】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体内において試料とパルスレーザ光とによって誘起されるＣＡＲＳ過程を含む四光波混合過程およびその他の非線形相互作用を観測するために、十分な強度のパルスレーザ光を照射することができる観察装置を提供することを目的としている。なお、試料とパルスレーザ光とによって誘起される四光波混合過程としてはＣＡＲＳ（コヒーレントアンチストークスラマン散乱）、ＣＳＲＳ（コヒーレントストークスラマン散乱）、ＳＲＳ（誘導ラマン散乱）、ＩＲＳ（逆ラマン散乱）ＩＳＲＳ（インパルシブ誘導ラマン散乱）等の過程が挙げられる。また、その他の非線形相互作用としてはＳＨＧ（第二高調波発生）、ＳＦＧ（和周波発生）、ＤＦＧ（差周波発生）、高次高調波発生、高次ラマン散乱等の過程が挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、試料において非線形相互作用を誘起する波長の異なる複数のパルスレーザ光を発生する光源部と、該光源部から発せられ複数の前記パルスレーザ光を別個に導光する複数の導光部材と、該導光部材により導光された複数の前記パルスレーザ光を試料に照射する照射光学系と、該照射光学系による前記パルスレーザ光の照射により前記試料において発生した非線形相互作用信号を検出する検出光学系とを備える観察装置を提供する。
【０００８】
本発明によれば、光源部において発生した波長の異なる複数のパルスレーザ光が、複数の導光部材によって別個に導光され、照射光学系によって試料に照射されることにより、試料において発生した非線形相互作用信号が検出光学系により検出される。試料に照射される前に導光部材によって導光される複数のパルスレーザ光は、同一の導光部材に入射されないので、導光部材内においてエネルギ密度が過度に増大することが防止され、不要の非線形相互作用が導光部材内において誘起される不都合の発生を未然に防止することができる。その結果、十分な強度のパルスレーザ光を用いて試料とパルスレーザ光との非線形相互作用を誘起させることができ、四光波混合過程等の非線形相互作用を容易に観察することが可能となる。
【０００９】
上記発明においては、前記導光部材が光ファイバであってもよい。
また、上記発明においては、前記導光部材がシングルモードファイバであってもよい。
また、上記発明においては、複数の前記パルスレーザ光の試料への到達時間を調節するタイミング調節部を備えていてもよい。
このようにすることで、タイミング調節部の作動により、波長の異なる複数のパルスレーザ光の試料に同時に到達させたり、適当な時間ずらして到達させたりすることができ、試料とパルスレーザ光との非線形相互作用をより効果的に発生させることができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記照射光学系に、１以上のパルスレーザ光の偏光を調整する偏光調整部を備えていてもよい。
一般に、生体試料にはタンパク質に代表されるように、化学組成が類似しかつ立体構造も極端に異ならない多種類の分子種が含まれている。この様な分子種は通常のラマン分光やＣＡＲＳ分光法では観測するスペクトルの強度パターン（スペクトル線形）が略同一となるためにスペクトル上で分離が困難となる。しかし、前記照射光学系に、１以上のパルスレーザ光の偏光を調整する偏光調整部を備えることにより、偏光調整部の作動により１以上のパルスレーザ光の偏光を調整してスペクトル線形を異ならせて観察を行うことができる。
また、上記発明においては、複数の前記パルスレーザ光の少なくとも１つがピコ秒以下のパルス幅を有していてもよい。
【００１１】
また、上記発明においては、前記検出光学系が、試料において発生した前記非線形相互作用信号を導光するマルチモードファイバと、該マルチモードファイバにより導光された非線形相互作用信号を検出する検出器とを備えていてもよい。
マルチモードファイバを使用することにより、より多くの非線形相互作用信号を導光することができ、より明確な観察を行うことができる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記導光部材の射出端が、周方向に間隔をあけて複数環状に配列されていてもよい。
このようにすることで、導光部材の射出端から射出されるパルスレーザ光を輪帯照明として用いることができ、ＮＡを増大させて集光スポットを小さくし、分解能を向上することができるという利点がある。
【００１３】
また、上記発明においては、前記照射光学系に、複数の前記導光部材により導光されてきた複数の前記パルスレーザ光を同軸に合波させる合波手段を備えていてもよい。
また、上記発明においては、前記導光部材の前記射出端の半径方向外方に、前記マルチモードファイバの入射端が周方向に間隔をあけて複数環状に配列されていてもよい。
このようにすることで、マルチモードファイバによる集光効率を増大させ、観察時間の短縮、精度の向上を図ることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、生体内において試料とパルスレーザ光との非線形相互作用を誘起するＣＡＲＳ過程を含む四光波混合過程、その他の非線形相互作用を観測するために、十分な強度のパルスレーザ光を照射することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施形態に係る観察装置を示す全体構成図である。
【図２】図１の観察装置の導光部におけるシングルモードファイバの射出端およびマルチモードファイバの入射端の配置例を示す図である。
【図３】図１の観察装置の変形例における照射光学系を示す図である。
【図４】図１の観察装置の他の変形例における照射光学系を示す図である。
【図５】図１の観察装置の変形例を示す全体構成図である。
【図６】図１の観察装置の他の変形例における照射光学系を示す図である。
【図７】図１の観察装置の他の変形例におけるシングルモードファイバの射出端およびマルチモードファイバの入射端の配置例を示す図である。
【図８】図１の観察装置の他の変形例におけるシングルモードファイバの射出端およびマルチモードファイバの入射端の配置例を示す図である。
【図９】図８のＢ−Ｂ断面における照射光学系を示す図である。
【図１０】図８のＣ−Ｃ断面における検出光学系の一部を示す図である。
【図１１】図１の観察装置の他の変形例におけるシングルモードファイバの射出端およびマルチモードファイバの入射端の配置例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の一実施形態に係る観察装置について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１は、図１に示されるように、波長の異なる複数のパルスレーザ光を発生する光源部２と、該光源部２から発せられたパルスレーザ光を導光する細長い導光部３と、該導光部３により導光されたパルスレーザ光を集光して試料Ａに照射する照射光学系４と、該照射光学系４によるパルスレーザ光の照射により試料において発生した非線形相互作用信号を検出する検出光学系５とを備えている。
【００１７】
光源部２は、２つの光源６，７を備えている。各光源６，７は、試料Ａ内の所望の分子振動に由来する非線形相互作用を誘起するように設定された異なる波長のパルスレーザ光をそれぞれ発生するようになっている。また、光源部２には、２つの光源６，７から発せられたパルスレーザ光が同時に試料Ａに到達するように到達時間を調節するタイミング調節部８が設けられている。
【００１８】
タイミング調節部８は、２つの光源６，７を電気的に同期させてもよいし、２つの光源６，７から発せられるパルスレーザ光の伝播光路長を操作することにより、到達時間を調節することにしてもよい。
【００１９】
導光部３は、例えば、内視鏡の鉗子チャネルに沿って内視鏡の挿入部の基端側から先端側まで挿入することができる細長い形状を有し、並列に配置された２本のシングルモードファイバ（導光部材）９，１０と１本のマルチモードファイバ１１とを備えている。
導光部３の先端側において、シングルモードファイバ９，１０の射出端９ａ，１０ａとマルチモードファイバ１１の入射端１１ａとは、例えば、図２に示されるように配置されている。
【００２０】
各シングルモードファイバ９，１０の基端側には、カップリングレンズのような結合器１２，１３を介して光源部２の別個の光源６，７が接続されている。また、マルチモードファイバ１１の基端側にも、カップリングレンズのような結合器１４を介して波長分解器１５と光検出器１６とが接続されている。
【００２１】
照射光学系４は、導光部３の先端側に配置され、導光部３の各シングルモードファイバ９，１０を介して導光されてきたパルスレーザ光をそれぞれ略平行光に集光するコリメート光学系と、不要光を除去するフィルタ１９，２０と、パルスレーザ光を集光する集光光学系２１とを備えている。
【００２２】
検出光学系５は、試料Ａに複数の波長のパルスレーザ光が照射されることにより、試料Ａにおいて発生した非線形相互作用信号を集光する上述した集光光学系２１と、試料Ａにおいて散乱または反射して戻るパルス光を除去するパルス光カットフィルタ２２と、上記マルチモードファイバ１１と、上記波長分解器１５と、上記光検出器１６とを備えている。マルチモードファイバ１１により導光されてきた非線形相互作用信号を波長分解器１５により波長分解して光検出器１６により検出することで、試料Ａ内において発生した非線形相互作用をスペクトル観察することが可能となる。
【００２３】
このように構成された本実施形態に係る観察装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１を用いて試料Ａの非線形相互作用を観察するには、光源部２の２つの光源６，７から発生させた異なる波長のパルスレーザ光を結合器１２，１３によって２つのシングルモードファイバ９，１０の基端側にそれぞれ入射させる。シングルモードファイバ９，１０によって先端側まで導光されたパルスレーザ光は、コリメート光学系１７，１８によって略平行光とされた後に集光光学系２１によってその焦点位置に集光される。
【００２４】
２つのパルスレーザ光は、試料Ａに集光されることにより、試料Ａにおいて非線形相互作用を発生させるように設定されているので、試料Ａ内の焦点位置Ｐ近傍において非線形相互作用信号が発生する。発生した非線形相互作用信号は、前方方向へ伝播するが、生体試料においては散乱・反射が起こるため、焦点Ｐを含む領域Ｒにおいて前記非線形相互作用信号光が後ろ側方向へ散乱される。この非線形相互作用信号光は集光光学系２１により集光され、導光部３のマルチモードファイバ１１の入射端に入射される。
【００２５】
そして、マルチモードファイバ１１によって導光された非線形相互作用信号は、結合器１４によって結合されている波長分解器１５によって波長分解され、光検出器１６により検出されることにより、非線形相互作用のスペクトル観察を行うことができる。
【００２６】
この場合において、本実施形態に係る観察装置１によれば、波長の異なる２つのパルスレーザ光が別個のシングルモードファイバ９，１０によって導光された後に、照射光学系４によって試料Ａ内に集光されるので、同一のシングルモードファイバ９，１０内に２つのパルスレーザ光が同時に入射されずに済み、シングルモードファイバ９，１０内におけるエネルギ密度を過度に増大させずに済むという利点がある。
【００２７】
その結果、シングルモードファイバ９，１０内においては、不要な非線形相互作用が発生せず、導光したパルスレーザ光の大部分を、試料Ａ内において非線形相互作用を発生させるために有効に利用することができ、効率的に非線形相互作用を発生させることができる。
また、シングルモードファイバ９，１０内のエネルギ密度を過度に増大させないので、マルチプレックス測定のためのより高い尖頭値を有する広帯域のフェムト秒パルスレーザ光も伝送することが可能となり、内視鏡観察下でのマルチプレックスＣＡＲＳ光観察を行うことができる。
【００２８】
また、２つのパルスレーザ光を別個のシングルモードファイバ９，１０によって導光することにより、各パルスレーザ光の試料Ａへの入射角度を個別に設定することができる。これにより位相整合条件を満たすように最適な入射角度を選定することができ、効率的に非線形相互作用を発生させることができる。
【００２９】
さらに、本実施形態に係る観察装置１によれば、コリメート光学系１７，１８によって略平行光とした２つのパルスレーザ光を集光光学系２１によって同一の焦点位置に集光させるので、２つのパルスレーザ光を合波させる光学系が不要であり、簡易に構成することができるという利点がある。
【００３０】
なお、本実施形態に係る観察装置１においては、図１において、コリメート光学系１７，１８および集光光学系２１を単レンズによって表示したが、これに限定されるものではなく、複数のレンズの組み合わせにより構成してもよいし、反射光学系によって構成してもよい。また、シングルモードファイバ９，１０のコア径を異ならせてもよい。また、マルチモードファイバ１１に代えてシングルモードファイバを採用してもよい。
【００３１】
また、本実施形態に係る観察装置１においては、図３に示されるように、照射光学系４のコリメート光学系１７，１８とフィルタ１９，２０との間に、偏光子あるいは波長板のような偏光調整部２３，２４を設け、マルチモードファイバ１１の入射端１１ａとパルス光カットフィルタ２２との間にも偏光子あるいは波長板のような偏光調整部２５を設けることにしてもよい。このようにすることで、試料Ａに入射させる２つのパルスレーザ光の偏光方向を調節することができ、内視鏡観察下において、偏光ＣＡＲＳスペクトル観察を行うことができる。また、ＣＡＲＳ以外の非線形相互作用についても同様に偏光観察を行うことができる。
【００３２】
例えば、偏光ＣＡＲＳスペクトル観察の場合には、２つのパルスレーザ光の偏光方向のなす相対角度（α）が７１．６°近傍であり、偏光調整部２５の透過偏光方向と一方のパルスレーザ光の偏光方向とのなす相対角度（β）が６３．４°近傍であることが好ましい。このようにすることで、２つのパルスレーザ光の入射により試料において非線形相互作用が発生した結果生じる非共鳴ＣＡＲＳ成分を効率よく抑制することができ、スペクトル観察を精度よく行うことができる。
【００３３】
また、相対角度α，βをそれぞれ上述した角度近傍で変化させて観察してもよい。これにより、スペクトル線形を顕著に異ならせて観察を行うことができる。
他の非線形相互作用信号光を検出して行うスペクトル観察の場合にも、非共鳴成分を効率よく抑制するための偏光配置およびスペクトル線形を顕著に異ならせるための偏光配置を設定して観察することが好ましい。
【００３４】
また、本実施形態においては、照射光学系４が、２つのパルスレーザ光を試料Ａに集光させ、かつ、試料Ａからの非線形相互作用信号光を集光するために共通の集光光学系２１を有する例を示したが、これに限定されるものではない。すなわち、図４に示されるように、コリメート光学系１７，１８に代えて、正のパワーを有する集光光学系２６，２７をその光軸が焦点位置Ｐを通過するように傾斜させて配置し、集光光学系２６，２７によって２つのパルスレーザ光を試料Ａに直接集光することにしてもよい。
【００３５】
この場合に、集光光学系２１は、非線形相互作用信号光を集光するためのみに使用することにしてもよい。
また、この場合に、シングルモードファイバ９，１０の射出端９ａ，１０ａは、パルスレーザ光が集光光学系２６，２７の光軸に沿って射出されるように傾斜させることにしてもよい。
【００３６】
非同軸で射出されたパルスレーザ光を共通の集光光学系２１によって集光する本実施形態の場合には、各パルスレーザ光に対して独立の集光光学系２６，２７を用いることにより、色収差を低減して、焦点位置におけるスポット径の最適化を容易に行うことができるという利点がある。
【００３７】
なお、パルスレーザ光の光軸を傾斜させる手段として、シングルモードファイバ９，１０の射出端９ａ，１０ａを傾斜させ、かつ、集光光学系２６，２７を傾斜させたが、いずれか一方によって行ってもよい。また、射出端９ａ，９ｂを傾斜させるために、シングルモードファイバ９，１０自体の設置角度を傾斜させてもよい。
【００３８】
また、本実施形態においては、シングルモードファイバ９，１０をパルスレーザ光の照射用のみに使用したが、これに代えて、図５に示されるように、試料Ａにおいて発生した非線形相互作用信号光の一部をシングルモードファイバ９，１０を介して導光部３の基端側まで導光し、検出することにしてもよい。この場合には、光源６，７と結合器１２，１３との間に、ダイクロイックミラー等の分岐部２８，２９を設け、シングルモードファイバ９，１０を介して導光されてきた非線形相互作用信号光を分岐部２８，２９で分岐して、結合器１４により、マルチモードファイバ１１を介して導光されてきた非線形相互作用信号光と合波させればよい。
【００３９】
このようにすることで、パルスレーザ光を導光するためのシングルモードファイバ９，１０を利用して、より多くの非線形相互作用信号光を検出することができ、より精度の高い観察を行うことができるという利点がある。
なお、シングルモードファイバ９，１０を介して導光されてきた非線形相互作用信号光を、結合器１４により、マルチモードファイバ１１を介して導光されてきた非線形相互作用信号光と合波することなく、別個に検出してもよい。
【００４０】
また、本実施形態においては、パルスレーザ光を１カ所の固定焦点に集光させることとしたが、これに代えて、図６に示されるように、パルスレーザ光の焦点位置Ｐを光軸に直交する方向に移動させることにしてもよい。図６に示される例では、シングルモードファイバ９，１０の射出端９ａ，１０ａおよびマルチモードファイバ１１の入射端１１ａを同期させて傾斜させるように往復移動させている。往復移動は、例えば、図示しないピエゾ素子のようなアクチュエータによって行うことができる。
【００４１】
このようにすることで、焦点位置Ｐを走査させることができ、焦点位置Ｐと非線形相互作用信号光の強度とを対応づけて記憶することにより、非線形相互作用を画像として取得することができる。
なお、シングルモードファイバ９，１０の射出端９ａ，１０ａおよびマルチモードファイバ１１の入射端１１ａを同期して走査させることに代えて、コリメート光学系１７，１８の位置や角度を偏向することにより、パルスレーザ光を走査させてもよい。
【００４２】
また、本実施形態においては２本のシングルモードファイバ９，１０によって波長の異なる２つのパルスレーザ光を導光することとしたが、これに代えて、図７に示されるように、３本以上のシングルモードファイバ９，１０を交互に周方向に並べて円環状に配列してもよい。波長の異なるパルスレーザ光を導光するシングルモードファイバ９，１０をそれぞれ複数本にすることにより、１本当たりのシングルモードファイバ９，１０によって伝送されるパルスレーザ光のエネルギ密度を低減することができ、シングルモードファイバ９，１０内において発生する非線形相互作用信号光を低減することができる。
【００４３】
さらに、図７に示されるように、シングルモードファイバ９，１０の射出端９ａ，１０ａを円環状に配列することにより、図２の場合と比較して集光光学系２１の開口数を有効に使用することができ、実効開口数を増大させることができる。さらに、円環状配列を採用することによって照明が輪帯状となるため、前記実効開口数における瞳径全体を用いたときと比較して、エアリーディスク内スポット径は小さくなる。集光スポット径を小さくすることで、非線形相互作用を効率的に発生させることができるとともに空間分解能を高めることができるという利点がある。
【００４４】
また、本実施形態においては、図８〜図１０に示されるように、照射光学系４にミラー３０およびダイクロイックミラー３１を設けることにより、一方のパルスレーザ光を他方のパルスレーザ光と同軸に合波して試料Ａに照射することにしてもよい。
図９は図８のＢ−Ｂ断面、図１０は図８のＣ−Ｃ断面での光路を示す図である。
【００４５】
このようにすることで、２つのパルスレーザ光に試料Ａにおける合焦調整をミラー３０およびダイクロイックミラー３１によって行うことができ、シングルモードファイバ９，１０やコリメート光学系１７，１８の位置を調整する場合と比較して調整を容易にすることができるという利点がある。
【００４６】
また、本実施形態においては、波長の異なる２つのパルスレーザ光を使用する例を示したが、これに代えて、波長の異なる３つのパルスレーザ光を使用してもよい。
例えば、２つのパルスレーザ光のエネルギ差が特定の振動数と一致し、３つ目のパルスレーザ光の波長を芳香族アミノ酸の吸収帯に近づけるように条件設定することにより、前記アミノ酸を含んだタンパク質を強調して観察することができる。
【００４７】
さらに例えば、４００ｎｍの領域のヘムタンパク質の強い吸収波長領域に３つ目のパルスレーザ光の波長を近づければ、ヘムに由来する振動スペクトルを測定することができる。
さらに例えば、紫外領域のペプチドカルボニル基の吸収帯に３つ目のパルスレーザ光の波長を近づければ、アミド変角モードやα炭素に結合した水素原子の面内変角振動モードによるラマンバンドが強く観測される。これらの振動モードはタンパク質の高次構造情報を含んでおり、個々のタンパク質の特徴を示す。
【００４８】
すなわち、種々のタンパク質の混合物において、特定のタンパク質のもつ特徴、つまり芳香族アミノ酸の含有率・量やヘムの有無あるいは高次構造情報によって、その特定のタンパク質のスペクトルが他のタンパク質のスペクトルと区別可能となる。したがって、３つ目のパルスレーザ光の波長を適宜選択することにより、スペクトル線形を変化させることができる。
【００４９】
また、例えば、２つのパルスレーザ光のエネルギ差が特定の振動数と共鳴する条件で、３つ目のパルスレーザ光に所望の時間遅延を与えて試料に入射させることで、時間分解観察を行うことができる。非共鳴バックグラウンドは、３つのパルスを同時に入射させるために引き起こされるため、３つ目のパルスレーザ光に所定の時間遅延を与えて照射することで、この非共鳴バックグラウンドの発生を低減できるという利点がある。
【００５０】
また、本実施形態においては、図１１に示されるように、試料における非線形相互作用信号光を導光するマルチモードファイバ１１を複数本配置してもよい。これにより、非線形相互作用信号光の集光効率を増大させることができ、スペクトル取得時間を短縮することができるとともに、観察の精度を向上することができるという利点がある。
【００５１】
また、本実施形態においては、光源６，７とシングルモードファイバ９，１０との間に、負の群速度分散を発生させる分散補償器（図示略）を配置してもよい。このようにすることで、導光部材、集光光学系の分散およびサンプル自体のもつ分散を打ち消すことが可能となり、試料内の焦点位置におけるパルスレーザ光のパルス幅を最適化することができ、非線形相互作用信号光の強度を向上させることができるという利点がある。
【００５２】
さらに、分散補償器で予め負分散を与えることにより、導光部材を伝播する単位時間あたりのレーザ強度が減少し、本発明の効果を向上することができる。また、パルス巾最適化は、例えば、試料内の焦点位置においてフーリエ変換限界パルスを生じさせることで、実現してもよい。この分散補償器には例えば負の群速度分散（ＧＶＤ）効果を有するファイバを用いてもよい。これを用いることで空間光学系を排除して高効率で導光部材にカップリングして導光する光強度の低減を抑制することが可能となる。
【００５３】
また、本実施形態においては、試料Ａにおいて発生した非線形相互作用信号光をマルチモードファイバ１１によって導光部３の基端側まで導いた後に光検出器１６により検出することとしたが、これに代えて、光検出器１６を導光部の先端に配置して、検出された電気信号を導光部の基端側まで導くことにしてもよい。
【符号の説明】
【００５４】
Ａ  試料
１  観察装置
２  光源部
４  照射光学系
５  検出光学系
８  タイミング調節部
９，１０  シングルモードファイバ（導光部材）
９ａ，１０ａ  射出端
１１  マルチモードファイバ
１１ａ  入射端
１６  光検出器（検出器）
２３，２４，２５  偏光調整部
３１  ダイクロイックミラー（合波手段）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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