(57)【要約】      （修正有）【課題】発光効率が高く、置換基を変更するだけで蛍光発光波長を大きく変化させることができる新規な化学発光性化合物及びそれから成る標識剤を提供する。【解決手段】2007238489.tif 000055のような構造を有する、化学発光性化合物。同一条件下で最適に発光させることができ、単一の反応系に関わる複数種類の物質をそれぞれ異なる化学発光性化合物で標識することにより、該複数種類の物質のそれぞれを同時に測定することが可能になる。【選択図】  図１
2007238489.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式[I]で示される構造を有する化学発光性化合物。
【化１】
2007238489.tif 000051
ただし、式中、R2、R4及びR6は、これらのうち少なくとも１つが化学発光基であり、それ以外は水素又は該化合物の発光を阻害しない任意の基であり、R1、R3、R5及びR7は、互いに独立に水素又は該化合物の発光を阻害しない任意の基であり、R8及びR9は互いに独立にフッ素、アルコキシ基又は化学発光基である（ただし、両者が同時に化学発光基ではない）。
【請求項２】
前記一般式[I]において、R8及びR9は互いに独立にフッ素又はアルコキシ基である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
前記化学発光基はR2及び／又はR6である請求項１又は２記載の化合物。
【請求項４】
前記一般式[I]中のR1ないしR7の少なくとも１つとして、発光波長調整基を有する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
前記発光波長調整基がアルキル基、アルコキシル基、アリール基、ヘテロアリール基及びこれらの誘導体から成る群より選ばれる基である請求項４記載の化合物。
【請求項６】
R1及び／又はR7が前記発光波長調整基である請求項４又は５記載の化合物。
【請求項７】
前記一般式[I]中のR1ないしR7であって前記化学発光性基、前記発光波長調整基又は水素以外の基として、結合性基を有する請求項４ないし６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
前記結合性基がアミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、チオール基、ジスルフィド基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、スクシンイミジルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、マレイミド基、ハロゲン並びにこれらの少なくともいずれかを含む基から成る群より選ばれる請求項７記載の化合物。
【請求項９】
前記化学発光基がフタルカルバジド誘導体、ジオキセタン誘導体、ロフィン誘導体、アクリジン誘導体、インドール誘導体、シュウ酸誘導体、ジフェノイル誘導体又はルシフェリン誘導体である請求項１ないし８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記化学発光基が前記一般式[I]に示されるボロンジピロメテン骨格にスペーサーを介することなく直結されている請求項１ないし９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
下記一般式[Ia]で示される構造を有する請求項１記載の化合物。
【化２】
2007238489.tif 000052
ただし、式中、R1a及びR7aは互いに独立に水素、アルキル基、アルコキシル基、ハロゲン、フェニル基若しくは置換フェニル基（置換基は１ないし５個のアルキル基、アルコキシル基又はモノ−若しくはジ−アルキルアミノ基）（ただし、R1a及びR7aの両方が同時に水素ではない）又はヘテロ芳香族基、R2aは水素、ハロゲン、末端に結合性官能基を有する置換カルボニル基若しくはアリール基、発光波長調整基、親水性基又は化学発光性基、R3a及びR5aは、互いに独立に水素又はアルキル基、R4aは、水素、アルキル基、フェニル基又は末端に結合性官能基を有する置換アルキル基若しくはアリール基である。
【請求項１２】
前記R2a並びにR3a及びR5aの定義中の結合性官能基が、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、チオール基、ジスルフィド基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、スクシンイミジルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、マレイミド基又はハロゲンであり、前記発光波長調整基がアルキル基、アルコキシル基、アリール基、ヘテロアリール基及びこれらの誘導体から成る群より選ばれる基であり、前記化学発光性基がフタルカルバジド誘導体、ジオキセタン誘導体、ロフィン誘導体、アクリジン誘導体、インドール誘導体、シュウ酸誘導体、ジフェノイル誘導体又はルシフェリン誘導体である請求項１１記載の化合物。
【請求項１３】
前記親水性基が、スルホン酸基若しくはその塩、水酸基、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、又はこれらの基の少なくともいずれか若しくはエーテル結合を１個又は複数含むアルキル基若しくはアルコキシル基である請求項１１又は１２記載の化合物。
【請求項１４】
下記一般式[Ib]で示される構造を有する請求項１１記載の化合物。
【化３】
2007238489.tif 000053
ただし、式中、R1b及びR7bは、互いに独立に炭素数１〜４のアルキル基、フェニル基又はアルコキシフェニル基（アルキル部分の炭素数は１〜１０）、R2bは水素又はスルホン酸基若しくはその塩、R3b及びR5bは互いに独立に水素又は炭素数１〜４のアルキル基、R4bは水素又は
【化４】
2007238489.tif 000054
（ただし、式中、R10及びR11は互いに独立に水素又は炭素数１〜４のアルキル基、nは１〜４の整数を示す）。
【請求項１５】
請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の化合物から成る標識剤。
【請求項１６】
互いに異なる前記発光波長調整基を有し（ただし、１種類の化学発光性化合物のみは、前記発光波長調整基を有さなくてもよい）、それによって発光波長が異なる複数種類の請求項４ないし１４のいずれか１項記載の化学発光性化合物から成る標識剤の組合せ。
【請求項１７】
前記複数の標識剤が、同一の化学発光基を有する請求項１６記載の標識剤の組合せ。
【請求項１８】
請求項１５記載の標識剤で標識した物質を反応に供し、反応後、該標識剤を発光させて該物質を測定することを含む標識物質の測定方法。
【請求項１９】
互いに異なる前記発光波長調整基を有し（ただし、１種類の化学発光性化合物のみは、前記発光波長調整基を有さなくてもよい）、それによって発光波長が異なる複数種類の請求項４ないし１４のいずれか１項に記載の化学発光性化合物を標識剤として用い、該複数の標識剤でそれぞれ標識した複数種類の物質を反応に供し、反応後、それぞれの該標識剤を発光させて前記複数種類の物質を同時に測定することを含む複数の標識物質の同時測定方法。
【請求項２０】
前記複数の標識剤が、同一の化学発光基を有する請求項１９記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学発光性化合物及びそれから成る標識剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学発光性化合物は、免疫測定をはじめ種々の分野において標識剤として広く用いられている。その多くは、ルシゲニン誘導体等の性能のよい化学発光物質とローダミン等の蛍光色素をスペーサーを介して連結しているものである（特許文献１〜１３）。しかしながら、これらの公知の化学発光性物質では、発光効率が満足できない、安定性が低い又は合成が容易ではない等の問題がある。また、公知の標識剤では、置換基を変更するだけで蛍光発光波長を大きく変化させることは困難である。一方、ボロンジピロメテン骨格を有する蛍光色素が知られている（特許文献１４）。しかしながら、ボロンジピロメテン蛍光色素を他の化学発光基と結合した化学発光性化合物は知られていない。
【０００３】
【特許文献１】国際公開公報WO98/54574
【特許文献２】特開平9-5238号公報
【特許文献３】特開平10-81659号公報
【特許文献４】特開2004-51490号公報
【特許文献５】特開2004-26665号公報
【特許文献６】特開2003-183641号公報
【特許文献７】特開2003-137824号公報
【特許文献８】特開2002-302483号公報
【特許文献９】特開2001-281257号公報
【特許文献１０】特開2001-115155号公報
【特許文献１１】特開2001-81455号公報
【特許文献１２】特開2000-245499号公報
【特許文献１３】特開2000-178550号公報
【特許文献１４】米国特許第5,723,218号公報
【特許文献１５】特開2003-379505号公報
【特許文献１６】米国特許第5,869,689号公報
【非特許文献１】A. Burghart, H. Kim, M. B. Welch, L. H. Thoresen, J. Reibenspies, K. Burgess, Journal of Organic Chemistry, 64巻7813ページ（1999年）
【非特許文献２】M. A. T. Rogers, Journal of the Chemical Society, 1943年, 596ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、発光効率が高く、置換基を変更するだけで蛍光発光波長を大きく変化させることができる新規な化学発光性化合物及びそれから成る標識剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ボロンジピロメテン骨格を有する蛍光色素に化学発光基を結合させることにより、発光効率が高く、ボロンジピロメテン骨格に結合している置換基を変更するだけで蛍光発光波長を大きく変化させることができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、下記一般式[I]で示される構造を有する化学発光性化合物を提供する。
【０００７】
【化１】
2007238489.tif 000003
ただし、式中、R2、R4及びR6は、これらのうち少なくとも１つが化学発光基であり、それ以外は水素又は該化合物の発光を阻害しない任意の基であり、R1、R3、R5及びR7は、互いに独立に水素又は該化合物の発光を阻害しない任意の基であり、R8及びR9は互いに独立にフッ素、アルコキシ基又は化学発光基である（ただし、両者が同時に化学発光基ではない）。  
【０００８】
また、本発明は、上記本発明の化学発光性化合物から成る標識剤を提供する。さらに本発明は、互いに異なる前記発光波長調整基を有し、それによって発光波長が異なる複数種類の上記本発明の化学発光性化合物から成る標識剤の組合せを提供する。さらに、本発明は、上記本発明の標識剤で標識した物質を反応に供し、反応後、該標識剤を発光させて該物質を測定することを含む標識物質の測定方法を提供する。さらに、本発明は、互いに異なる前記発光波長調整基を有し、それによって発光波長が異なる複数種類の上記本発明の化学発光性化合物を標識剤として用い、該複数の標識剤でそれぞれ標識した複数種類の物質を反応に供し、反応後、それぞれの該標識剤を発光させて前記複数種類の該物質を同時に測定することを含む複数の標識物質の同時測定方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、発光効率が高く、置換基を変更するだけで蛍光発光波長を大きく変化させることができる新規な化学発光性化合物及びそれから成る標識剤が提供された。本発明の化学発光性化合物で採用したボロンジピロメテン骨格は、発光効率が高く、特に、本発明の好ましい態様では、化学発光基をボロンジピロメテン骨格にスペーサーを介することなく直接結合させるのでより一層発光効率を高めることができる。また、本発明の化学発光性化合物では、ボロンジピロメテン骨格上の置換基、好ましくは単一の置換基を変更することにより、他の構造が同一であっても蛍光発光波長を大きく変化させることができる。ボロンジピロメテン骨格上に任意の置換基を導入することは常法により容易に行うことができるので、本発明により、蛍光発光波長の異なる複数の化学発光性化合物を容易に合成することができる。そして、これらは、変更された置換基以外の構造、特に反応により化学発光する化学発光基が同一であってよいので、これらの複数の化学発光性物質は、同一条件下で最適に発光させることができる。このため、単一の反応系に関わる複数種類の物質をそれぞれ異なる本発明の化学発光性化合物で標識することにより、該複数種類の物質のそれぞれを同時に測定することが可能になる。これにより、例えば、免疫測定等において、複数種類の異なる被検物質を同時に測定することが可能となり、したがって、本発明により新たな測定手法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
上記の通り、本発明の化学発光性化合物は、上記一般式[I]で示される構造を有する。一般式[I]中、R2及びR6は、これらのうち少なくとも１つが化学発光基であり、それ以外は水素又は該化合物の発光を阻害しない任意の基であり、R1、R3、R4、R5及びR7は、互いに独立に水素又は該化合物の発光を阻害しない任意の基であり、R8及びR9は互いに独立にフッ素、アルコキシ基又は化学発光基である（ただし、両者が同時に化学発光基ではない）。前記化学発光基はR2及び／又はR6であるものが好ましい。
【００１１】
化学発光基は、化学反応により発光する構造を有する基である。本発明の化学発光性化合物では、該化学発光基が発する光によりボロンジピロメテン部分が蛍光を発し、この蛍光が測定される。したがって、化学発光基は、必ずしも可視光を発光するものである必要はなく、ボロンジピロメテン部分を励起して蛍光を発せさせることができる光を発するものであればいずれのものをも採用することができる。このような化学発光基としては、この分野において標識剤として用いられているものであればいずれのものをも用いることができ、種々のものが公知ないしは周知である。好ましい例として、フタルカルバジド誘導体、ジオキセタン誘導体、ロフィン誘導体、アクリジン誘導体、インドール誘導体、シュウ酸誘導体、ジフェノイル誘導体又はルシフェリン誘導体を挙げることができ、これらはいずれもこの分野において周知である。これらの化学発光基は、それぞれ以下の一般式で示されるものである。
【００１２】
【化２】
2007238489.tif 000004
【００１３】
【化３】
2007238489.tif 000005
【００１４】
【化４】
2007238489.tif 000006
【００１５】
【化５】
2007238489.tif 000007
【００１６】
【化６】
2007238489.tif 000008
【００１７】
【化７】
2007238489.tif 000009
【００１８】
【化８】
2007238489.tif 000010
【００１９】
なお、上記各一般式において、Ｒは、互いに独立して水素、アルキル基、アリール基、ハロゲン、アルコキシ、アリールアルキル、シクロアルキル、アシル、ホルミル、シアノ、アルケニル、ヘテロアリール、モノ−又はジ−アルキルアミノなどの置換基であり、各一般式における１つのＲは、ボロンジピロメテン骨格に直接又はスペーサーを介して結合される。なお、アルキル基又はアルキル基部分を含む基の中のアルキル基の炭素数は通常１〜１０程度である。また、本明細書及び請求の範囲において単に「アルキル基」という場合には直鎖状アルキル基及び分枝状アルキル基の両者が包含される。アルコキシル基についても同様である。なお、上記したフタルカルバジド誘導体において、４つのＲのうちのいずれかが-NRaRb(式中、RaRbは互いに独立して水素又はアルキル基）がルミノール誘導体である。
【００２０】
上記した各種化学発光基のうち、発光量子収率が高く、ボロンジピロメテン骨格へのカップリング合成が可能な原料フタル酸が容易に合成できるフタルヒドラジド誘導体が好ましい。
【００２１】
なお、上記した化学発光基は、各化合物において通常１種類のものを１個又は複数個用いることが好ましいが、複数種類のものを結合してもよい。また、化学発光基は、アルキレン基等のスペーサーを介してボロンジピロメテン骨格に結合させることもできるが、化学発光基をできるだけボロンジピロメテン骨格に近づけることにより、ボロンジピロメテン部分から発せられる蛍光の強度を大きくするために、化学発光基はスペーサーを介することなく直接ボロンジピロメテン骨格に結合させることが好ましい。ボロンジピロメテン骨格を蛍光色素として選択したことにより、化学発光基を容易に直結させることができる。
【００２２】
ボロンジピロメテン部分は、そのボロンジピロメテン骨格が蛍光を発するので、R1ないしR7のうち、上記化学発光基以外の基は特に限定されるものではなく、水素又は化合物の発光を阻害しない任意の基であってよい。任意の基としては、後述する発光波長調整基、結合性基及び極性基を挙げることができる。これらのいずれにも該当しないものとしては、上記のとおり、水素又は化合物の発光を阻害しない任意の基であればよいが、水素原子及び炭素数１〜４のアルキル基を好ましい例として挙げることができる。
【００２３】
本発明の化学発光性化合物の重要な特徴の１つとして、ボロンジピロメテン骨格に結合している置換基を変更することにより、他の部分を変更しなくても蛍光発光の波長を大きく変化させることができるということがある。この特徴を利用すべく、R1ないしR7の少なくとも１つとして発光波長調整基を有することが好ましい。ここで、「発光波長調整基」は、この基を結合させることにより、この基を結合していない場合と比較して蛍光の発光波長が変化する基を意味する。発光波長調整基としては、それをボロンジピロメテン骨格に結合させることによりボロンジピロメテン部分が発する蛍光の波長が、発光波長調整基を有さない化合物の蛍光波長と比べて変化する基であれば特に限定されず、また、ボロンジピロメテン骨格は、その置換基により影響を受けて多かれ少なかれ蛍光波長が変化するので、発光波長調整基は任意の基であってよい。もっとも、単一の基を変更することによって比較的大きく蛍光波長が変化することが好ましく、特に発光波長調整基を有さない場合と比べて長波長側に蛍光波長が変化することが好ましいので、発光波長調整基の好ましい例としてアルキル基、アルコキシル基、アリール基、ヘテロアリール基及びこれらの誘導体を挙げることができる。ここで、アルキル基又はアルコキシル基中のアルキル部分の炭素数は１〜１０が好ましい。また、アリール基としては、フェニル基及びナフタレン基が好ましく、ヘテロアリール基としては、フェニル基及びナフタレン基中の１個又は複数の炭素原子が窒素、酸素及び／又はイオウで置換された基が好ましい。また、アルキル基又はアルコキシル基の誘導体としては、これらの基を構成する１又は複数の炭素原子に結合している水素原子が、ハロゲン、シアノ基、アルコキシル基、アミノ基、水酸基、モノ−若しくはジ−アルキルアミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、チオール基、ジスルフィド基等の基で置換されたものが好ましく、これらの置換基中のアルキル部分の炭素数は１〜１０が好ましく、１〜６がさらに好ましい。また、上記アルキル基又はアルコキシル基を構成する１個又は複数の炭素原子が、酸素、イオウ及び窒素の少なくともいずれかで置換された基も上記アルキル基又はアルコキシル基の誘導体として好ましい。また、前記アリール基又はヘテロアリール基の誘導体としては、これらの基を構成する１又は複数の炭素原子に結合している水素原子が、ハロゲン、シアノ基、アルコキシル基、アミノ基、水酸基、モノ−若しくはジ−アルキルアミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、チオール基、ジスルフィド基等の基で置換されたものが好ましく、これらの置換基中のアルキル部分の炭素数は１〜１０が好ましく、１〜６がさらに好ましい。
【００２４】
発光波長調整基としては、ベンゾクラウン、N-アリールアザクラウン、アミド基等の、分子認識や化学反応によって電子構造が変わり発光波長の変わる置換基を用いることもできる。
【００２５】
ボロンジピロメテン蛍光色素の蛍光波長は、一般式[I]中のR1及びR7に結合する置換基の種類により大きく影響されるので、上記した発光波長調整基は、R1及び／又はR7であることが好ましい。また、発光波長調整基は複数個結合させることができ、異なる種類の発光波長調整基を１つのボロンジピロメテン骨格に結合させることもできる。もっとも、後で詳しく説明する、複数種類の被検物質を同時測定するために複数種類の化学発光標識剤を用いる場合には、各標識剤は同じ条件下で化学発光反応に供することが好都合であるので、各標識剤の化学発光基を同一のものにすることが好ましい。
【００２６】
一般式[I]中のR1ないしR7の少なくとも１つとして、結合性基を有することが好ましい。ここで、結合性基は、他の化合物に結合させるために利用できる基を意味する。化学発光標識剤は、タンパク質、ポリペプチド、糖等の生体関連物質に結合されることが多いため、結合性基としては、これらの生体関連物質との結合に好都合な、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、チオール基、ジスルフィド基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、スクシンイミジルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル基、マレイミド基等を好ましい例としてあげることができる。なお、これらの基は、他の化合物との結合のために用いることができればよいので、これらの基の少なくともいずれかを含む任意の基（例えば、アミノアルキル基等）も結合性基として利用することができる。なお、結合性基は、１つあれば足り、また、結合部位を１つに特定するためにも１つであることが通常好ましいが、２個以上の結合性基を含んでいてもよい。
【００２７】
さらに、必要に応じ、R1ないしR7の少なくとも１つとして、溶解性を調整する基を含ませてもよい。化学発光標識剤は、水系で用いられることが多いので、化学発光性化合物の親水性を高めて水系中での溶解性を向上させることが望まれる場合には、R1ないしR7の少なくとも１つとして親水性基を含ませてもよい。このような親水性基としては、スルホン酸基若しくはその塩、水酸基、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、又はこれらの基の少なくともいずれか若しくはエーテル結合を１個又は複数含むアルキル基（炭素数は１〜４が好ましい）若しくはアルコキシル基（炭素数は１〜４が好ましい）等を例示することができるがこれらに限定されるものではない。また、このような親水性の基は上記した結合性基、発光波長調整基等と兼用させてもよい。
【００２８】
一般式[I]中、R8及びR9は互いに独立にフッ素、アルコキシル基又は上記した化学発光性基であり、好ましくは互いに独立にフッ素又はアルコキシル基であり、アルコキシル基の炭素数は１〜６が好ましい。
【００２９】
本発明の化学発光性化合物の好ましい例として、下記一般式[Ia]で示される構造を有する化合物を挙げることができる。
【００３０】
【化９】
2007238489.tif 000011
【００３１】
ただし、式中、R1a及びR7aは互いに独立に水素、アルキル基、アルコキシル基、ハロゲン、フェニル基若しくは置換フェニル基（置換基は１ないし５個のアルキル基、アルコキシル基又はモノ−若しくはジ−アルキルアミノ基）（ただし、R1a及びR7aの両方が同時に水素ではない）又はヘテロ芳香族基、R2aは水素、ハロゲン、末端に結合性官能基を有する置換カルボニル基若しくはアリール基、上記発光波長調整基、上記親水性基又は上記化学発光性基、R3a及びR5aは、互いに独立に水素又はアルキル基、R4aは、水素、アルキル基、フェニル基又は末端に結合性官能基を有する置換アルキル基若しくはアリール基である。なお、これらの置換基中のアルキル基又はアルキル基部分の炭素数は１〜１０が好ましい。また、R1a及びR7aの定義中の「ヘテロ芳香族基」としては、フラン、チオフェン等を好ましい例として挙げることができる。一般式[Ia]中、フタルカルバジド誘導体部分が化学発光基、R1a及びR7aが発光波長調整基（ただし、水素以外の場合）、R3a及びR5aが水素又は任意の置換基、R4aが水素若しくは任意の置換基又は結合性基に該当する。
【００３２】
上記一般式[Ia]で示される構造を有する化合物の中でも、さらに、下記一般式[Ib]で示される構造を有する化合物が好ましい。
【００３３】
【化１０】
2007238489.tif 000012
【００３４】
ただし、式中、R1b及びR7bは、互いに独立に炭素数１〜４のアルキル基、フェニル基又はアルコキシフェニル基（アルキル部分の炭素数は１〜１０）、R2bは水素又はスルホン酸基若しくはその塩、R3b及びR5bは互いに独立に水素又は炭素数１〜４のアルキル基、R4bは水素又は
【００３５】
【化１１】
2007238489.tif 000013
（ただし、式中、R10及びR11は互いに独立に水素又は炭素数１〜４のアルキル基、nは１〜４の整数を示す）。
【００３６】
なお、本願出願人は先に、本発明と類似した化学発光性化合物に係る発明を特許出願している（特願2005-129094)。この先願発明と比較した場合、本発明では、化学発光性基の結合位置が、先願発明に具体的な開示のない特定の位置に限定されており、それに起因して、(1)発光波長が幅広い範囲に亘る種々の化合物を提供できる、(2)特許文献１５などに記載された公知のボロンジピロメテン化合物を公知の方法で合成した後、上記化学発光性基を結合することにより本発明の化合物を容易に合成することができる、(3)合成に際し、分枝アルコキシル基のような嵩高な基がなくても凝集が起きず、合成が可能であるので、伸盛衰が高く、極性溶媒でも均一に分散して自己消光しにくい、標識剤として用いた場合に定量製の高い化合物を容易に合成できる、(4)結合性基を容易にR4（必要ならばR2にも）等に導入できる、といった利点を有する。
【００３７】
本発明の化学発光性化合物は、必要に応じて上記した置換基を結合させたボロンジピロメテン骨格に化学発光基を結合させることにより製造することができる。ボロンジピロメテン骨格及び化学発光基はそれぞれ公知であり、その製造方法も公知であるので、本発明の化学発光性化合物は、通常の化学合成により容易に製造することができ、そのいくつかの具体例が下記実施例に詳細に記載されている。
【００３８】
例えば、上記一般式[Ib]に示される本発明の好ましい化合物は、次のような合成ルートにより合成することができる。なお、下記の合成ルートに示す化学式において、R2は一般式[Ib]中のR4bの置換基中のR10及びR11に対応し、R1は一般式[Ib]中のR3b及びR5bに対応し、Arは一般式[Ib]中のR1b及びR7bに対応する。
【００３９】
【化１２】
2007238489.tif 000014
2007238489.tif 000015
【００４０】
市販されている4-ヒドロキシベンズアルデヒド（III: R2 = H）若しくは2,6-ジメチル -4-ヒドロキシベンズアルデヒド（III: R2 = CH3）を、市販されているN-(2-ブロモエチル)フタルイミド（VI）と塩基存在下DMF中で反応させるとベンズアルデヒド誘導体Vが生成する。このVと、市販されている2,4-ジメチルピロール（VI: Ar = CH3, R1 = CH3）若しくはBurgessらの手法（非特許文献１）で合成した2-アリールピロール（VI: Ar = Ph or 4-MeO-Ph, R1 = H）の塩化メチレン溶液に、トリフルオロ酢酸・2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン（DDQ）を順次加えると、ジピロメテン誘導体VIIが生成する。このVIIにトリエチルアミン存在下トルエン中でトリフルオロボランジエチルエーテル錯体を加え還流すると、ボロンジピロメテン誘導体VIIIが生成する。このVIIIを、特許文献１６と同様の手法で、クロロホルム中N-ブロモスクシンイミドと反応させると、臭素付加物IXが生成する。なおこの反応でNBSの等量を制御することにより臭素二付加体も容易に合成することが出来る。さらに、市販されている4-ブロモ無水フタル酸（XII）とビス(ネオペンチルグリコラート)ジボロン（XIII）から２段階で合成されるフタルイミドボロン酸エステルXと、IXとを鈴木カップリング反応で直結することで、ボロンジピロメテン-フタルイミド誘導体XIが生成する。最後に、XIをヒドラジンで処理することで、フタルイミドからフタルヒドラジドへの変換とアミノ基の保護基の脱保護が同時に起こり、ラベル化（結合性基の導入）が可能な本発明の化学発光色素IIが生成する。なお臭素二付加体には、R2aの位置に別途置換基をカップリングすることにより、ラベル化部位の導入・発光波長の調整・溶解性の調整が可能である。
【００４１】
【化１３】
2007238489.tif 000016
【００４２】
上記の方法で合成されたボロンジピロメテン-フタルイミド誘導体（XI: Ar = Ph, R1 = H, R2 = CH3）を塩化メチレン溶液中クロロスルホン酸と反応させることで、スルホン酸付加体XVIが合成できる。このXVIをXIと同様にヒドラジンで処理することで、水溶性の向上したオレンジ色化学発光色素KCB-orange2-wが生成する。
【００４３】
【化１４】
2007238489.tif 000017
【００４４】
非特許文献２記載の方法により合成された８位無置換ボロンジピロメテンXVIIを、上記のIIの合成ルートと同様の手法で処理することで、４段階で８位無置換の本発明の化学発光色素XVを合成することもできた。
【００４５】
本発明の化学発光性化合物は、化学発光標識剤として用いることができる。化学発光標識剤自体は周知であり、本発明の化学発光性化合物も従来の化学発光標識剤と同様にして用いることができる。すなわち、本発明の化学発光性化合物を、標識すべき被標識物質に結合させることにより被標識物質を標識する。本発明の化学発光性化合物が上記した結合性基を有する場合には、常法により上記結合性基を介して本発明の化学発光性化合物を被標識物質に結合する。結合性基を有さない場合には、常法により結合性基を導入した中間体を調製し、これを被標識物質と結合することができる。
【００４６】
化学発光標識剤の使用の態様は従来と全く同様であり、上記のように被標識物質を標識した後、標識した物質（本明細書において「標識物質」という）を反応に供し、必要に応じて洗浄工程等を行なった後、標識を化学発光させ、該発光を測定する。例えば、化学発光標識剤が広く用いられている免疫測定の場合、次のようにして標識剤を利用することができる。例えば、サンドイッチ法により被検試料中の標的抗原を免疫測定する場合、標的抗原に対する一次抗体を固相に結合し、これを被検試料と反応させて、被検試料中の標的抗原を固相化一次抗体に結合させる。洗浄後、化学発光標識剤で標識した第二抗体を反応させる。洗浄後、標的抗原に結合した第二抗体の化学発光標識剤を、常法に従い化学反応により化学発光させ、発光を測定する。なお、本明細書及び特許請求の範囲において「測定」には検出、定量、半定量のいずれもが包含される。標識剤の化学発光は、常法により各化学発光標識剤中の化学発光基に応じた化学反応を行なうことにより行うことができる。例えば、化学発光基の好ましい例であるフタルカルバジド誘導体を化学発光基として用いる場合には、周知の通り、触媒であるヘキサシアノ鉄(III)カリウム（フェリシアン化カリウム）の存在下、過酸化水素と反応させることにより化学発光基を発光させることができる。化学発光基からの光でボロンジピロメテン骨格が励起され、ボロンジピロメテン骨格から蛍光が発せられ、この蛍光発光を測定する。
【００４７】
本発明の有利な特徴の１つとして、上記した発光波長調整基を変更することにより、蛍光波長を識別可能な程度に大きく変化させることができるということがある。ボロンジピロメテン骨格上に置換基を結合させることは、通常の化学合成により容易に行うことができる。したがって、蛍光発光の波長が異なる複数種類の本発明の化学発光性化合物を容易に製造することができる。蛍光発光の波長が識別可能な程度に異なる複数種類の本発明の化学発光性化合物を化学発光標識剤として用いることにより、複数種類の物質をそれぞれ異なる化学発光標識剤で標識することが可能となり、ひいては、異なる複数の被検物質を同時に測定することが可能となる。例えば、上記したサンドイッチ法による免疫測定に複数種類の化学発光標識剤を用いる場合、異なる複数種類の二次抗体を蛍光波長が識別可能な程度に異なる標識剤で標識することができ、各標識剤からの発光を識別して測定することにより、複数種類の抗原を同時に免疫測定することができる。なお、用いる複数種類の標識剤は、それぞれの蛍光発光の波長が識別可能な程度に異なっていればよい（すなわち、発光波長域が全くあるいはほとんど重複しない）ので、そのうちの１つは発光波長調整基を有さないものであってもよい。すなわち、本発明は、互いに異なる前記発光波長調整基を有し（ただし、１種類の化学発光性化合物のみは、前記発光波長調整基を有さなくてもよい）、それによって発光波長が異なる複数種類の本発明の化学発光性化合物を標識剤として用い、該複数の標識剤でそれぞれ標識した複数種類の物質を反応に供し、反応後、それぞれの該標識剤を発光させて前記複数種類の該物質を同時に測定することを含む複数の標識物質の同時測定方法をも提供するものであり、また、この同時測定方法に用いられる複数の標識剤の組合せをも提供するものである。
【００４８】
従来、蛍光発光波長が互いに異なる種々の化学発光標識剤が知られているが、それらを組み合わせて用いて複数種類の被検物質を同時に測定しようとしても、各化学発光標識剤を化学発光させる反応自体や最適な反応条件が異なるため、いずれかの標識剤の測定感度が低下したり測定が煩雑になったりする問題がある。これに対し、本発明の化学発光標識剤では、化学発光基や蛍光色素の骨格部分が互いに同一で、ボロンジピロメテン骨格上の置換基のみが異なる複数種類の化学発光標識剤が利用可能であるので、化学発光基の発光反応やその最適な条件が同一である複数種類の標識剤で複数種類の物質をそれぞれ標識することが可能であるから、同一の反応により、いずれの標識剤も高感度に同時に測定することが可能である。これにより、例えば、免疫測定等において、複数種類の異なる被検物質を同時に測定することが可能となり、したがって、本発明により新たな測定手法が提供される。
【００４９】
例えば、本発明の化学発光標識剤を、DNAの塩基配列決定に用いられているジデオキシ法における標識剤として好ましく用いることができる。現在、ジデオキシ法においては、４種類のジデオキシヌクレオチドをそれぞれ異なる蛍光波長の蛍光色素で標識している。この４種類の蛍光色素に代えて、発光波長のそれぞれ異なる４種類の本発明の標識剤を用いることができる。ジデオキシ法において、蛍光色素に代えて、本発明の標識剤を用いることには、(1) 検出にレーザーなどの光源が必要なくなるので、測定装置の構造が簡単になり安価に供給できる、(2)蛍光検出に比べ、感度が少なくとも数倍は向上するので、プライマーおよび色素標識されたジデオキシヌクレオチドの量が少なくて済む上、増幅時間が短くなるので迅速に測定が行える、という利点がある。
【００５０】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５１】
本発明の化学発光性化合物KCB-lime2の合成
【００５２】
【化１５】
2007238489.tif 000018
【００５３】
Ar気流下で (1) (3.2 g, 26 mmol, 1 eq) をDMF (20 mL) に溶解し、300 mL三口フラスコに加えて攪拌した。そこにブロモエチルフタルイミド (6.5 g, 26 mmol, 1 eq) 、K2CO3 (9.0 g, 65 mmol, 2.5 eq) を加え、65 ℃で24時間攪拌した。反応終了後、放冷し、酢酸エチルを加え、有機相を3回抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；クロロホルム) で分離精製し、目的化合物 (2) (1.9 g, 収率；25.0 %) を黄褐色オイルとして得た。
【００５４】
TLC；Rf=0.15 (溶離液；クロロホルム)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 9.86 (s, CHO), 7.87 (d, J = 4 Hz, 2 H), 7.80 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.74 (d, J = 4 Hz, 2 H), 7.00 (d, J = 9 Hz, 2 H), 4.30 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.15 (t, J = 6 Hz, 2 H ). 
【００５５】
【化１６】
2007238489.tif 000019
【００５６】
300 mL三口フラスコに塩化メチレン (100 mL) を入れ、室温で30分N2バブリングした。(2) (500 mg, 1.69 mmol, 1 eq) 、2,4-ジメチルピロール (322 mg, 3.38 mmol, 2 eq) を塩化メチレン (50 mL) 溶解して加え、再び室温で30分N2バブリング後、TFA (10 drops) を加え、室温で1時間攪拌した。黄色から赤紫色に変化した。DDQ (383 mg, 1.69 mmol, 1 eq) を加え、室温で30分攪拌した。
【００５７】
反応終了後、塩化メチレンとNaHCO3 aq.を加え、有機相を抽出した。DDQをよく取り除くため、有機相をNaHCO3 aq.で4回洗浄し、さらに飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をアルミナクロマトグラフィー (溶離液；クロロホルム / 酢酸エチル = 4 / 1 ) で分離精製し、目的化合物 (3) (91.3 mg, 収率；11.9 %) を褐色固体として得た。
【００５８】
TLC；Rf=0.21 (溶離液；クロロホルム / 酢酸エチル = 4 / 1 )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.88 (dd, J = 3, 3 Hz, 2 H), 7.74 (dd, J = 3, 3 Hz, 2 H), 7.15 (d, J = 8 Hz, 2 H), 6.93 (d, J = 8 Hz, 2 H), 5.87 (s, 2 H), 4.27 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.15 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 2.33 (s, 6 H), 2.05 (s, 6 H).
【００５９】
【化１７】
2007238489.tif 000020
【００６０】
20 mLナスフラスコに (3) (91.3 mg, 0.20 mmol, 1 eq) をトルエン (10 mL) に溶かして入れた。次いでEt3N (0.5 mL)，BF3・Et2O (0.75 mL) を加え、室温で1 時間撹拌した。
【００６１】
反応終了後、sat.NaHCO3 aqを加えて有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；クロロホルム) で分離精製し、目的化合物 (4) (65.8 mg, 収率；65.3 %) を赤色固体として得た。
【００６２】
TLC；Rf=0.20 (溶離液；クロロホルム)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.88 (dd, J = 3, 3 Hz, 2 H), 7.74 (dd, J = 3, 3 Hz, 2 H), 7.14 (d, J = 8 Hz, 2 H), 6.98 (d, J = 8 Hz, 2 H), 5.96 (s, 2 H), 4.28 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.15 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 2.53 (s, 6 H), 1.39 (s, 6 H).
【００６３】
【化１８】
2007238489.tif 000021
【００６４】
30 mLナスフラスコに (4) (37.1 mg, 0.07 mmol, 1 eq) をクロロホルム (10 mL) に溶かて入れた。次いでNBS (13.0 mg, 0.07 mmol, 1 eq) を加え、室温で1 時間撹拌した。赤色溶液になった。
【００６５】
反応終了後、水を加えて有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；クロロホルム / ヘキサン = 3 / 1) で分離精製し、さらに分取用薄層クロマトグラフィー（溶離液；クロロホルム）で分離精製し、目的化合物 (5) (28.9 mg, 収率；67.8 %) を赤色固体として得た。
【００６６】
TLC；Rf=0.15 (溶離液；クロロホルム / ヘキサン = 3 / 1)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.89 (dd, J = 3, 3 Hz, 2 H), 7.75 (dd, J = 3, 3 Hz, 2 H), 7.13 (d, J = 8 Hz, 2 H), 6.99 (d, J = 8 Hz, 2 H), 6.01 (s, 2 H), 4.30 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.16 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 2.57 (s, 3 H), 2.55 (s, 3 H), 1.40 (s, 3 H), 1.37 (s, 3 H).
【００６７】
【化１９】
2007238489.tif 000022
【００６８】
50 mL二口フラスコに (5) (28.9 mg, 0.05 mmol, 1 eq) を1,4-ジオキサン (15 ml) に溶解し、化合物 (5') (20.2 mg, 0.07 mmol, 1.5 eq)，K2CO3 (54.2 mg, 0.4 mmol, 8 eq)を入れ、真空脱気した。次いでPd(pph3)4 (5.8 mg, 0.005 mmol, 0.1 eq) をすばやく加え、再び真空脱気し、Ar下80 ℃で1日攪拌した。
【００６９】
反応終了後、放冷し、クロロホルムと水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカクロマトグラフィー (溶離液；クロロホルム / ヘキサン = 3 / 1 ) で分離精製し、目的化合物 (6) (14.2 mg, 収率；43.0 %) を赤色固体として得た。
【００７０】
TLC；Rf=0.15 (溶離液；クロロホルム / ヘキサン = 3 / 1 )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.88 (dd, J = 3, 3 Hz, 2 H), 7.85 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7.74 (dd, J = 3, 3 Hz, 2 H), 7.62 (d, J = 1 Hz, 1 H), 7.47 (dd, J = 1, 8 Hz, 1 H), ), 7.18 (d, J = 8 Hz, 2 H), 7.00 (d, J = 8 Hz, 2 H), 6.04 (s, 1 H), 4.29 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.15 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 3.18 (s, 3 H), 2.59 (s, 3 H), 2.51 (s, 3 H), 1.43 (s, 3 H), 1.31 (s, 3 H).
【００７１】
【化２０】
2007238489.tif 000023
【００７２】
30 mLナスフラスコに (6) (7.2 mg, 0.01 mmol, 1 eq) をエタノール (10 ml) に溶解し、ヒドラジン (100 μl, 大過剰)を加えて1時間還流した。反応終了後、放冷し、氷浴中でジエチルエーテル(20 ml)を加え、さらにヘキサン(10 ml)を加え、30分放置した。赤色沈殿が析出した。沈殿をろ別し、ろ物をメタノールに溶かして減圧濃縮した。目的化合物 (KCB-lime2) (5.7 mg, 収率；100 %) を赤色固体として得た。
【００７３】
TLC；Rf=0.10 (溶離液；クロロホルム / メタノール = 9 / 1 )
ESI-MS(positive) m/z: calcd for C29H29BF2N5O3 (M+H+), 544.23; found, 543.36.
【実施例２】
【００７４】
本発明の化学発光性化合物KCB-orange2の合成
【００７５】
【化２１】
2007238489.tif 000024
【００７６】
500 mL三口フラスコにH2O (130 mL)、KOH (33.6 g)を入れ、氷冷しながら溶かした。次いで (6') (40 g, 0.33 mmol, 1 eq) を加え、60 ℃に昇温した。クロロホルム (52 mL) を3時間かけて滴下し、その後24時間還流した。茶色から赤茶色に変化した。
【００７７】
反応終了後、放冷し、氷冷しながらdil.H2SO4 (200mL) を除々に加え、酸性にした。白色固体が生成し、黄色になった。生成した固体をろ別し、得られたろ物をクロロホルムで洗浄して黄色の不純物を取り除いた。真空ポンプで乾燥後、目的化合物(7) (3.0 g, 収率；6.0 %) を白色固体として得た。
【００７８】
TLC；Rf=0.80 (溶離液；ヘキサン / 酢酸エチル = 1 / 1 = v / v )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 10.36 (s, CHO), 10.32 (s, OH), 6.53 (s, 2 H), 3.36 (s, 6 H). 
【００７９】
【化２２】
2007238489.tif 000025
【００８０】
Ar気流下で (7) (1.5 g, 10 mmol, 1 eq) をDMF (20 mL) に溶解し、100 mL三口フラスコに加えて攪拌した。そこにブロモエチルフタルイミド (3.8 g, 15 mmol, 1.5 eq) 、K2CO3 (3.5 g, 25 mmol, 2.5 eq) を加え、65 ℃で24時間攪拌した。うすい黄色から黄土色に変色した。反応終了後、放冷し、酢酸エチルを加え、有機相を3回抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；クロロホルム) で分離精製し、目的化合物 (8) (1.65 g, 収率；51.6 %) を黄色オイルとして得た。
【００８１】
TLC；Rf=0.20 (溶離液；クロロホルム)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 10.39 (s, CHO), 7.83 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.72 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 6.55 (s, 2 H), 4.27 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.11 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 2.53 (s, 6 H). 
【００８２】
【化２３】
2007238489.tif 000026
【００８３】
300 mL三口フラスコに(9) (4.5 g , 18.3 mmol, 1 eq)、フェニルボロン酸 (2.2 g, 18.3 mmol, 1 eq)、Pd(PPh3)4 (208 mg, 0.18 mmol, 0.01 eq) を入れ、次いで超音波脱気した2 N Na2CO3 aq. (10 mL, 21.9 mmol, 1.2 eq) を入れた。そこにトルエン (100 mL)、メタノール (10 ml) を加え、真空脱気し、Ar気流下80℃で72 時間攪拌した。黄色透明から赤褐色に変化した。
【００８４】
反応終了後、水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；ヘキサン / 酢酸エチル = 50 / 1 ) で分離精製し、目的化合物 (10) (2.69 g , 収率；60.4 %) を黄色透明のオイルとして得た。
【００８５】
TLC；Rf = 0.15 (溶離液；ヘキサン / 酢酸エチル = 50 / 1 , v / v )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.35 (m, 5 H), 6.90 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.23 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H), 6.20 (dd, J = 3, 3 Hz, 1 H), 6.13 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H ), 1.34 (s, 9 H).
【００８６】
【化２４】
2007238489.tif 000027
【００８７】
30 mLナスフラスコに化合物 (10) (1.16 g, 4.77 mmol, 1 eq) を入れ、THF (15 mL) に溶解した。次いで28% NaOMeメタノール溶液 (2.5 mL) を加え、室温で1 時間攪拌した。
【００８８】
反応終了後、トルエンと水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。目的化合物 (11) (509 mg, 収率；74.6 %) を茶白色固体として得た。
【００８９】
TLC；Rf = 0.15 (溶離液；ヘキサン / 酢酸エチル = 20 / 1, v / v )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.43 (s, NH), 7.38 (m, 5 H), 6.88 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H), 6.54 (dd, J = 3, 3 Hz, 1 H), 6.32 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H ).
【００９０】
【化２５】
2007238489.tif 000028
【００９１】
300 mL三口フラスコに塩化メチレン (100 mL) を入れ、室温で30分N2バブリングした。(10) (472 mg, 1.46 mmol, 1 eq) 、(11) (418 mg, 2.92 mmol, 2 eq) を塩化メチレン (50 mL) 溶解して加え、再び室温で30分N2バブリング後、TFA (10 drops) を加え、室温で1時間攪拌した。黄色から紫色に変化した。DDQ (331 mg, 1.46 mmol, 1 eq) を加え、室温で30分攪拌した。濃い紫色になった。
【００９２】
反応終了後、塩化メチレンとNaHCO3 aq.を加え、有機相を抽出した。DDQをよく取り除くため、有機相をNaHCO3 aq.で4回洗浄し、さらに飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をアルミナクロマトグラフィー (溶離液；ヘキサン / 塩化メチレン = 1 / 1 ) で分離精製し、目的化合物 (12) (447.5 mg, 収率；52.0 %) を赤色固体として得た。
【００９３】
TLC；Rf=0.21 (溶離液；ヘキサン / 塩化メチレン= 1 / 1 )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.42 (s, NH), 7.92 (d, J = 9 Hz, 4 H), 7.88 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.74 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.47 (d, J = 9 Hz, 4 H), 7.36 (m, 2 H), 6.75 (d, J = 4 Hz, 2 H), 6.66 (s, 2 H), 6.41 (d, J = 4 Hz, 2 H),4.29 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.17 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 2.12 (s, 6 H).
【００９４】
【化２６】
2007238489.tif 000029
【００９５】
50 mLナスフラスコに (12) (447.5 mg, 0.76 mmol, 1 eq) をトルエン (20 mL) に溶かして入れた。次いでEt3N (0.5 mL)、BF3・Et2O (0.75 mL) を加え、50 ℃で30分撹拌した。
【００９６】
反応終了後、 sat.NaHCO3 aqを加えて有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；トルエン / 酢酸エチル= 20 / 1 )で分離精製し、目的化合物 (13) (436 mg, 収率；90.0 %) を紫色固体として得た。
【００９７】
TLC；Rf=0.20 (溶離液；トルエン / 酢酸エチル = 20 / 1 = v / v )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.42 (s, NH), 7.90 (d, J = 9 Hz, 4 H), 7.89 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.75 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.42 (m, 2 H), 7.17 (d, J = 9 Hz, 4 H), 6.69 (s, 2 H), 6.59 (d, J = 4 Hz, 2 H), 6.53 (d, J = 4 Hz, 2 H), 4.29 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.17 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 2.12 (s, 6 H).
【００９８】
【化２７】
2007238489.tif 000030
【００９９】
30 mLナスフラスコに (13) (282.7 mg, 0.44 mmol, 1 eq) をクロロホルム (250 mL) に溶かて入れた。次いでNBS (78.0 mg, 0.44 mmol, 1 eq) をクロロホルム(50 mL)に溶かして1時間かけて滴下し，そのまま室温で一晩撹拌した。
【０１００】
反応終了後、水を加えて有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。目的化合物 (14) (314 mg, 収率；100 %) を紫色固体として得た。
【０１０１】
TLC；Rf=0.20 (溶離液；トルエン / 酢酸エチル = 20 / 1 = v / v )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.90 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.83 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.76 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.66 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.34 (m, 6 H) , 6.70 (s, 2 H), 6.67 (d, J = 4 Hz, 1 H), 6.60 (d, J = 4 Hz, 2 H), 4.31 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.17 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 2.18 (s, 6 H).
【０１０２】
【化２８】
2007238489.tif 000031
【０１０３】
200 mL三口フラスコに (14) (314 mg, 0.44 mmol, 1 eq) を1,4-ジオキサン (50 ml) に溶解し、化合物 (5') (240 mg, 0.88 mmol, 2 eq)、K2CO3 (486 mg, 3.52 mmol, 8 eq)を入れ、真空脱気した。次いでPd(pph3)4 (46 mg, 0.04 mmol, 0.1 eq) をすばやく加え、再び真空脱気し、Ar下80 ℃で1日攪拌した。
【０１０４】
反応終了後、放冷し、クロロホルムと水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカクロマトグラフィー (溶離液；トルエン / 酢酸エチル = 9 / 1 ) で分離精製し、目的化合物 (15) (274.3 mg, 収率；78.3 %) を赤紫色粉末として得た。
【０１０５】
TLC；Rf=0.38 (溶離液；トルエン / 酢酸エチル = 9 / 1 = v / v )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.90 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.89 (s, 1 H), 7.88 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.76 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.51 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.49 (d, J = 4 Hz, 1 H), 7.41 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.37 (d, J = 4 Hz, 1 H), 7.17 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.14 (m, 6 H) , 6.77 (s, 1 H), 6.74 (s, 2 H), 6.72 (d, J = 4 Hz, 1 H), 6.63 (d, J = 4 Hz, 1 H), 4.31 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.19 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 3.11 (s, 3 H), 2.23 (s, 6 H).
【０１０６】
【化２９】
2007238489.tif 000032
【０１０７】
50mLナスフラスコに (15) (26.3 mg, 0.03 mmol, 1 eq) をエタノール (30 ml) に溶解し、ヒドラジン (100 μl, 大過剰)を加えて2時間還流した。反応終了後、放冷し、酢酸エチル / ジエチルエーテル = 1 / 1 = v / vと水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。目的化合物 (KCB-orange2) (20 mg, 収率；90.9 %) を赤紫色固体として得た。
【０１０８】
TLC；Rf =0.10 (溶離液；クロロホルム / メタノール = 9 / 1 )
【実施例３】
【０１０９】
本発明の化学発光性化合物KCB-orange2-wの合成
【０１１０】
【化３０】
2007238489.tif 000033
【０１１１】
30mL二口フラスコに (15) (19.0 mg, 0.44 mmol, 1 eq) を塩化メチレン (3ml) に溶解して-78 ℃で撹拌し、ClSO3H (1 drop)を加えてそのまま3時間撹拌した。蛍光ピンクから紫色になり、沈殿が生じた。反応終了後、NaHCO3 aq.を加えてクエンチした。赤色沈殿が生じた。
【０１１２】
沈殿をろ別し、ろ物をメタノールに溶かして溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣を分取用逆相薄層クロマトグラフィー(溶離液；メタノール) で分離精製し、目的化合物 (15') (13.3 mg, 収率；58.8 %) を赤色固体として得た。
【０１１３】
TLC；Rf=0.10 (溶離液；クロロホルム / メタノール = 9 / 1 = v / v )
ESI-MS(negative) m/z: calcd for C39H31BF2N5O6S (M-Na+), 875.22; found, 875.2.
【０１１４】
【化３１】
2007238489.tif 000034
【０１１５】
30mLナスフラスコに (15') (4.7 mg, 0.005 mmol, 1 eq) をエタノール (6 ml) に溶解し、ヒドラジン (50 μl、大過剰)を加えて30分還流した。蛍光オレンジから濃いピンクに変化した。反応終了後、放冷し、ジエチルエーテルを加え、氷冷しながら沈殿を析出させた。吸引ろ過で沈殿（赤色固体）を回収し、メタノールに溶解させて溶媒を減圧濃縮した。目的化合物 (KCB-orange2-w) (4.0 mg, 収率；100 %) を赤色固体として得た。
【０１１６】
TLC；Rf =0.05 (溶離液；クロロホルム / メタノール = 6 / 1 )
ESI-MS(negative) m/z: calcd for C39H31BF2N5O6S (M-Na+), 746.21; found, 745.8. 
【実施例４】
【０１１７】
本発明の化学発光性化合物KCB-apple2の合成
【０１１８】
【化３２】
2007238489.tif 000035
【０１１９】
300mL三口フラスコに(9) (4.5 g , 18.3 mmol, 1 eq)、4-メトキシフェニルボロン酸 (2.7 g, 18.3 mmol, 1 eq)、 Pd(PPh3)4 (208 mg, 0.18 mmol, 0.01 eq) を入れ、次いで超音波脱気した2 N Na2CO3 aq. (10 mL, 21.9 mmol, 1.2 eq) を入れた。そこにトルエン (100 mL)、メタノール (10 ml) を加え、真空脱気し、Ar気流下80℃で48 時間攪拌した。
【０１２０】
反応終了後、水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；ヘキサン / 酢酸エチル = 29 / 1 ) で分離精製し、目的化合物 (16) (2.4 g , 収率；48.1%) を無色透明のオイルとして得た。
【０１２１】
TLC；Rf = 0.15 (溶離液；ヘキサン / 酢酸エチル = 29 / 1 , v / v )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.32 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H), 7.27 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.90 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.20 (dd, J = 3, 3 Hz, 1 H), 6.13 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H ), 3.83 (s, 3 H), 1.39 (s, 9 H).
【０１２２】
【化３３】
2007238489.tif 000036
【０１２３】
50mLナスフラスコに化合物 (16) (780 mg, 2.85 mmol, 1 eq) を入れ、THF (15 mL) に溶解した。次いで28% NaOMeメタノール溶液 (2.5 mL) を加え、室温で1 時間攪拌した。うすい緑色から濃い茶色に変化した。
【０１２４】
反応終了後、トルエンと水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。目的化合物 (17) (469 mg, 収率；94.9 %) を茶白色固体として得た。
【０１２５】
TLC；Rf = 0.1 (溶離液；ヘキサン / 酢酸エチル = 29 / 1, v / v )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.30 (s, NH), 7.38 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.90 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.80 (d, J = 2 Hz, 1 H), 6.40 (s, 1 H), 6.28 (d, J = 3 Hz, 1 H ), 3.81 (s, 3 H).
【０１２６】
【化３４】
2007238489.tif 000037
【０１２７】
300 mL三口フラスコに塩化メチレン (100 mL) を入れ、室温で30分N2バブリングした。(8) (436.5 mg, 1.35 mmol, 1 eq) 、(17) (469 mg, 2.7 mmol, 2 eq) を塩化メチレン (50 mL) に溶解して加え、再び室温で30分N2バブリング後、TFA (10 drops) を加え、室温で42時間攪拌した。茶色から青色に変化した。 DDQ (306.4 mg, 1.35 mmol, 1 eq) を加え、室温で30分攪拌した。濃い青色に変化した。
【０１２８】
反応終了後、塩化メチレンとNaHCO3 aq.を加え、有機相を抽出した。DDQをよく取り除くため、有機相をNaHCO3 aq.で4回洗浄し、さらに飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をアルミナクロマトグラフィー (溶離液；クロロホルム) で分離精製し、目的化合物 (18) (484.4 mg, 収率；55.2 %) を赤紫色固体として得た。
【０１２９】
TLC；Rf=0.80 (溶離液；クロロホルム)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 10.43 (s, NH), 7.87 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.85 (d, J = 9 Hz, 4 H), 7.73 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.00 (d, J = 9 Hz, 4 H), 6.67 (d, J = 4 Hz, 2 H), 6.65 (s, 2 H), 6.37 (d, J = 4 Hz, 2 H),4.28 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.11 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 3.89 (s, 6 H), 2.12 (s, 6 H). 
【０１３０】
【化３５】
2007238489.tif 000038
【０１３１】
50mLナスフラスコに(18)(484.4 mg, 0.75 mmol, 1 eq) をトルエン (10 mL) に溶かして入れた。次いでEt3N (0.5mL)，BF3・Et2O (0.75 mL) を加え、60 ℃で15分撹拌した。
【０１３２】
反応終了後、 sat.NaHCO3 aqを加えて有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；クロロホルム)で分離精製し、目的化合物 (19) (497.3 mg, 収率；95.6 %) を青色固体として得た。
【０１３３】
TLC；Rf=0.20 (溶離液；クロロホルム )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.87 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.85 (d, J = 9 Hz, 4 H), 7.73 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 6.95 (d, J = 9 Hz, 4 H), 6.68 (s, 2 H), 6.53 (d, J = 4 Hz, 2 H), 6.51 (d, J = 4 Hz, 2 H), 4.28 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.16 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 3.85 (s, 6 H), 2.56 (s, 6 H). 
【０１３４】
【化３６】
2007238489.tif 000039
【０１３５】
30mLナスフラスコに (19) (209 mg, 0.30 mmol, 1 eq) をクロロホルム (20 mL) に溶かて入れた。次いでNBS (53.4 mg, 0.30 mmol, 1 eq) をクロロホルム(20 mL)に溶かして30分かけて滴下し、そのまま室温で3時間撹拌した。 
【０１３６】
反応終了後、水を加えて有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。目的化合物 (20) (238.1 mg, 収率；100 %) を青色固体として得た。（Br2個つきもできたが、1個つきとRf値がほとんど同じで分離できないため、そのまま次の反応を進めた）
【０１３７】
TLC；Rf=0.15 (溶離液；トルエン / 酢酸エチル = 20 / 1 = v / v )
【０１３８】
【化３７】
2007238489.tif 000040
【０１３９】
100mL三口フラスコに (20) (238.1 mg, 0.31 mmol, 1 eq) を1,4-ジオキサン (50mL) に溶解し、化合物 (5') (167 mg, 0.62 mmol, 2 eq)、K2CO3 (342 mg, 2.5 mmol, 8 eq)を入れ、真空脱気した。次いでPd(pph3)4 (35.8 mg, 0.03 mmol, 0.1 eq) をすばやく加え、再び真空脱気し、Ar下80 ℃で24時間攪拌した。
【０１４０】
反応終了後、放冷し、クロロホルムと水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカクロマトグラフィー (溶離液；トルエン / 酢酸エチル = 9 / 1 ) で分離精製し、その後GPCでさらに精製し、目的化合物 (21) (108.2 mg, 収率；40.7 %) を青色固体として得た。
【０１４１】
TLC；Rf=0.10 (溶離液；トルエン / 酢酸エチル = 9 / 1 = v / v )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.90 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.88 (dd, J = 3,3 Hz, 2 H), 7.53 (d, J = 4 Hz, 2 H),  7.44(d, J = 9 Hz, 2 H), 7.18 (d, J = 8 Hz, 1 H), 6.93 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.89 (d, J = 9 Hz, 3 H), 6.73 (s, 2 H), 6.69 (s, 1 H), 6.66 (d, J = 9 Hz, 3 H), 4.30 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 4.18 (t, J = 6 Hz, 2 H ), 3.84 (s, 3 H), 3.83 (s, 3 H), 3.12 (s, 3 H), 2.21 (s, 6 H).
【０１４２】
【化３８】
2007238489.tif 000041
【０１４３】
50mLナスフラスコに (21) (17.5 mg, 0.02 mmol, 1 eq) をエタノール (40 ml) に溶解し、ヒドラジン (100 μl, 大過剰)を加えて2時間還流した。反応終了後、放冷し、酢酸エチル / ジエチルエーテル = 1 / 1 = v / vと水を加え、有機相を抽出した。水相の色がなくなるまで7回程抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をHPLC（溶離液；メタノール）にて分離精製し、目的化合物 (KCB-apple2) (14.9 mg, 収率；100 %) を青色固体として得た。
【０１４４】
TLC；Rf=0.10 (溶離液；クロロホルム / メタノール = 9 / 1 )
ESI-MS(positive) m/z: calcd for C41H37BF2N5O5 (M+H+), 728.29; found, 727.56.
【実施例５】
【０１４５】
本発明の化学発光性化合物KCB-apple3の合成
【０１４６】
【化３９】
2007238489.tif 000042
【０１４７】
200mL三口フラスコに(9) (931 mg , 3.79 mmol, 1 eq)、4-(1-ブチル -ペンチロキシ)-フェニルボロン酸 (1.0 g, 3.79 mmol, 1 eq)、 Pd(PPh3)4 (44 mg, 0.04 mmol, 0.01 eq) を入れ、次いで超音波脱気した2 N Na2CO3 aq. (10 mL, 9.46 mmol, 2.5 eq) を入れた。そこにトルエン (50 mL)、メタノール (10 ml) を加え、真空脱気し、Ar気流下80℃で22 時間攪拌した。
【０１４８】
反応終了後、水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；ヘキサン / 酢酸エチル = 80 / 1 ) で分離精製し、目的化合物 (22) (1.1 g , 収率；75.3 %) を茶色のオイルとして得た。
【０１４９】
TLC；Rf = 0.13 (溶離液；ヘキサン / 酢酸エチル = 80 / 1 , v / v )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.31 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H), 7.23 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.85 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.20 (dd, J = 3, 3 Hz, 1 H), 6.13 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H ), 4.23 (m, 1 H), 1.60 (m, 4H), 1.36 (s, 9 H), 1.32 (m, 8H), 0.89 (t, J = 7 Hz, 6H).
【０１５０】
【化４０】
2007238489.tif 000043
【０１５１】
100mLナスフラスコに化合物 (22) (1.1 g, 2.85 mmol, 1 eq) を入れ、THF (20 mL) に溶解した。次いで28% NaOMeメタノール溶液 (2.5 mL) を加え、室温で3 時間攪拌した。うすい茶色から濃い茶色に変化した。
【０１５２】
反応終了後、酢酸エチルと水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；ヘキサン / 酢酸エチル / TEA = 40 / 1 / 0.1 ) で分離精製し、目的化合物 (23) (192 mg, 収率；23.6 %) を肌色固体として得た。
【０１５３】
TLC；Rf = 0.15 (溶離液；ヘキサン / 酢酸エチル / TEA = 40 / 1 / 0.1 , v / v / v )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 8.27(s, NH), 7.33 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.87 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.73 (d, J = 2, 3 Hz, 1 H), 6.39 (dd, J = 3, 3 Hz, 1 H), 6.25 (dd, J = 3, 2 Hz, 1 H ), 4.20 (m, 1 H), 1.63 (m, 4H), 1.33 (m, 8 H), 0.89 (t, J = 7 Hz, 6H).
【０１５４】
【化４１】
2007238489.tif 000044
【０１５５】
200 mL三口フラスコにAr下 (23) (192 mg, 0.67 mmol, 2 eq)を塩化メチレン (10 mL) に溶かして入れ、(EtO)3CH (3 ml, 10.1 mmol, 30 eq)、TFA(10 drops)を加え、室温で1時間撹拌した。無色から真っ青に色が変化した。
【０１５６】
反応終了後、塩化メチレンとNaHCO3 aq.を加え、有機相を抽出した。中和した途端真っ赤になった。有機相をNaHCO3 aq.で4回洗浄し、さらに飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をアルミナクロマトグラフィー (溶離液；ヘキサン / 塩化メチレン = 8 / 1 → 1 / 1 ) で分離精製し、目的化合物 (24) (151.8mg, 収率；77.8 %) を赤色固体として得た。
【０１５７】
TLC；Rf=0.10 (溶離液；ヘキサン / 塩化メチレン = 8 / 1)
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.81 (d, J = 9 Hz, 4 H), 6.98 (d, J = 9 Hz, 4 H), 6.96 (d, J = 4 Hz, 2 H), 6.82 (s, 1 H), 6.78 (d, J = 4 Hz, 2 H ), 4.32 (m, 2 H), 1.68 (m, 8H), 1.36 (m, 16 H), 0.92 (t, J = 7 Hz, 12 H).
【０１５８】
【化４２】
2007238489.tif 000045
【０１５９】
50 mLナスフラスコに (24) (150 mg, 0.26 mmol, 1 eq) をトルエン (15 mL) に溶かして入れた。次いでEt3N (0.5 mL)，BF3・Et2O (0.75 mL) を加え，100 ℃で30分撹拌した。
【０１６０】
反応終了後、 sat.NaHCO3 aqを加えて有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；トルエン / ヘキサン = 1 / 1 )で分離精製し、目的化合物 (25) (162 mg, 収率；100 %) を青色固体として得た。
【０１６１】
TLC；Rf=0.25  (溶離液；トルエン / ヘキサン = 1 / 1 = v / v )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.88 (d, J = 9 Hz, 4 H), 7.18 (s, 1 H), 7.06 (d, J = 4 Hz, 2 H), 6.91 (d, J = 4 Hz, 2 H), 6.63 (d, J = 4 Hz, 2 H ), 4.27 (m, 2 H), 1.67 (m, 8H), 1.35 (m, 16 H), 0.90 (t, J = 7 Hz, 12 H).
【０１６２】
【化４３】
2007238489.tif 000046
【０１６３】
30 mLナスフラスコに (25) (45.6 mg, 0.07 mmol, 1 eq) をクロロホルム (10 mL) に溶かして入れた。次いでNBS (13 mg, 0.07 mmol, 1 eq) を加え，室温で1時間撹拌した。 
【０１６４】
反応終了後、水を加えて有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶離液；ヘキサン / トルエン = 2 / 1 )で分離精製し、目的化合物 (26) (12.5 mg, 収率；24.2 %) を青色固体として得た。
【０１６５】
TLC；Rf=0.15 (溶離液；ヘキサン / トルエン = 2 / 1 = v / v )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.87 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.60 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.15 (s, 1 H), 7.14 (d, J = 4 Hz, 1 H), 7.09 (s, 1 H), 6.92 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.88 (d, J = 9 Hz, 2 H ), 6.71 (d, J = 4 Hz, 1 H ), 4.26 (m, 2 H), 1.65 (m, 8H), 1.33 (m, 16 H), 0.90 (t, J = 7 Hz, 12 H).
【０１６６】
【化４４】
2007238489.tif 000047
【０１６７】
50 mL 二口フラスコに (26) (12.7 mg, 0.02 mmol, 1 eq) を1,4-ジオキサン (10 mL) に溶解し、化合物 (5') (7.37 mg, 0.03 mmol, 1.5 eq)、K2CO3 (20 mg, 0.14 mmol, 8 eq)を入れ、真空脱気した．次いでPd(pph3)4 (2.3 mg, 0.002 mmol, 0.1 eq) をすばやく加え、再び真空脱気し、Ar下80 ℃で24時間攪拌した。
【０１６８】
反応終了後、放冷し、クロロホルムと水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカクロマトグラフィー (溶離液；トルエン / 酢酸エチル = 8 / 1 ) で分離精製し、その後GPCでさらに精製し、目的化合物 (27) (5.0 mg, 収率；35.2 %) を青色光沢固体として得た。
【０１６９】
TLC；Rf=0.15 (溶離液；トルエン / 酢酸エチル = 8 / 1 = v / v )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.90 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.67 (s, 1 H), 7.59 (d, J = 7 Hz, 1 H), 7.37 (d, J = 9 Hz, 2 H), 7.28 (s, 1 H), 7.24 (m, 1 H), 7.20 (s, 1 H), 7.14 (d, J = 7 Hz, 1 H), 6.90 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.84 (d, J = 9 Hz, 2 H), 6.75 (d, J = 4 Hz, 2 H), 4.25 (m, 2 H),  3.15 (s, 3 H), 1.65 (m, 8 H), 1.34 (m, 16 H), 0.90 (t, J = 7 Hz, 12 H).
【０１７０】
【化４５】
2007238489.tif 000048
【０１７１】
50 mLナスフラスコに (27) (4.6 mg, 0.006 mmol, 1 eq) をエタノール (10 ml) に溶解し、ヒドラジン (100 μl, 大過剰)を加えて1時間還流した。
【０１７２】
反応終了後、放冷し、1N HCl aq. とジエチルエーテルを加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。目的化合物 (KCB-apple3) (3.3 mg, 収率；71.7 %) を青色固体として得た。 
【０１７３】
TLC；Rf=0.10 (溶離液；クロロホルム / メタノール = 9 / 1 )
【実施例６】
【０１７４】
本発明の化学発光性化合物KCB-lime3の合成
【０１７５】
【化４６】
2007238489.tif 000049
【０１７６】
50 mL 二口フラスコに (28) (40 mg, 0.12 mmol, 1 eq) を1,4-ジオキサン (30 mL) に溶解し、化合物 (5') (49.2 mg, 0.18 mmol, 1.5 eq)、K2CO3 (132.7 mg, 0.96 mmol, 8 eq)を入れ、真空脱気した。次いでPd(pph3)4 (11.6 mg, 0.01 mmol, 0.1 eq) をすばやく加え、再び真空脱気し、Ar下80 ℃で20時間攪拌した。
【０１７７】
反応終了後、放冷し、クロロホルムと水を加え、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカクロマトグラフィー (溶離液；ヘキサン / クロロホルム = 1 / 1 ) で分離精製し、その後GPCでさらに精製し、目的化合物 (29) (28.5 mg, 収率；58.3 %) を赤色固体として得た。
【０１７８】
TLC；Rf=0.15 (溶離液；ヘキサン / クロロホルム = 1 / 1 = v / v )
1H-NMR (300MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ 7.90 (d, J = 8 Hz, 1 H),  7.73 (d, J = 1 Hz, 1 H), 7.57 (dd, J = 8, 1 Hz, 1 H), 7.17 (s, 1 H), 6.14 (s, 1 H), 3.21 (s, 3 H), 2.58 (s, 3 H), 2.54 (s, 3 H), 2.29 (s, 3 H), 2.25 (s, 3 H).
【０１７９】
【化４７】
2007238489.tif 000050
【０１８０】
50 mLナスフラスコに (29) (9.2 mg, 0.02 mmol, 1 eq) をエタノール (15 mL) に溶解し、ヒドラジン (100 μL, 大過剰)を加えて3時間還流した。
【０１８１】
反応終了後、放冷し、1N HCl aq. とジエチルエーテルを加え、有機相を3回抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥剤をろ別して溶媒を減圧濃縮した。目的化合物 (KCB-lime3) (4.0 mg, 収率；43.5 %) を赤色固体として得た。
【０１８２】
TLC；Rf=0.10 (溶離液；クロロホルム / メタノール = 9 / 1 )
【実施例７】
【０１８３】
化学発光実験
新規に合成されたKCB-lime2、orange2、apple2について発光実験を行った。発光色およびスペクトルの比較として、市販されているABEI（アミノブチルエチルイソルミノール）も同様の反応条件で測定した。発光色は、KCB約10-4 M（ABEIは約10-2 M）のエタノール溶液約3 mLに30%過酸化水素水：10%水酸化ナトリウム水溶液=20:1の溶液0.3mLと1 mMのフェリシアンカリウム水溶液0.3mLを順次加え、激しく攪拌し、OLYMPUS CAMEDIA C-760を用いて２秒のシャッタースピードで撮影した。化学発光スペクトルは、1cm角の石英製蛍光セルにKCB約10-5 M（ABEIは約10-3 M）のエタノール溶液約2.5 mLを入れ、30%過酸化水素水：10%水酸化ナトリウム水溶液=20:1の溶液0.5mLと1 mMのフェリシアンカリウム水溶液0.3mLを勢い良く注ぎ込み、日立蛍光分光器F-4500を用いて毎分1200nmのスキャンレートで測定した。
【０１８４】
結果を図１に示す。図１に示すように、本発明の化合物であるKCBシリーズの３種の化合物は、公知の色素ABEIと比較してピークが鋭く、ノイズが少なく、かつ、３種類の化合物の発光波長のピークが明瞭に分離していた。なお、目視観察の結果、lime2は黄緑、orange2は橙色、apple2は赤色であり、肉眼でも色は明瞭に区別できた。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】本発明の実施例で作製した本発明の化合物の化学発光波長のスペクトルを公知の色素と比較して示す図である。
【図１】
2007238489.tif 000056