【事件の表示】
　特願２０００−５８２５３７「生物工学的組織構築物およびそれを生成および使用する方法」拒絶査定不服審判事件〔平成１２年　５月２５日国際公開、ＷＯ００／２９５５３、平成１４年　９月１７日国内公表、特表２００２−５３００６９〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　本願は，平成１１年１１月１９日（パリ条約による優先権主張　平成１０年１１月１９日　平成１１年６月２４日，米国）を国際出願日とする出願であって，平成２０年７月３０日付けで拒絶理由通知書が出され，同年１１月５日に意見書及び手続補正書が提出されたが，平成２１年１１月１８日付けで拒絶査定がなされ，これに対して，平成２２年３月２３日に拒絶査定不服審判の請求がなされたものである。　
　その後，当審において，平成２４年７月３０日付で拒絶理由通知書を出したところ，平成２５年１月３１日に意見書及び誤訳訂正書が提出され，さらに，同年３月１２日付けで拒絶理由通知書（最後）が出され，同年９月１８日に，意見書及び手続補正書が提出されたものである。
　
第２　平成２５年９月１８日付け手続補正について
　平成２５年９月１８日付け手続補正（以下，「本件補正」という。）により，次のように特許請求の範囲が補正された。
（補正事項１）補正前の請求項１，７，８及び１５に「前記培養線維芽細胞が前記細胞外マトリックスの層内に含まれている線維芽細胞を包含する培養組織構築物」と記載されていたところ，「前記培養線維芽細胞が前記細胞外マトリックスの層内に含まれている
，
　
（補正事項２）補正前の請求項１９の「第一および第二の培地」を「
前記培養
　
　これは，当審の平成２５年３月１２日付け拒絶理由通知書（最後）の「第３　拒絶理由１」記載の拒絶理由を解消するためになされた補正事項であり，平成１８年法律第５５号改正附則第３条第１項によりなお従前の例によるとされる同法による改正前の特許法第１７条の２第４項第４号に規定する明りょうでない記載の釈明に該当する。
　よって，本件補正は，適法なものである。
　
第３　本願発明
　本願請求項１〜２５に係る発明は，本件補正により補正された特許請求の範囲の請求項１〜２５に記載された事項により特定される発明であると認める。
　そのうち，請求項１に係る発明は，以下の事項により特定される発明である。
「【請求項１】
　培養線維芽細胞によって合成および組立てられる細胞外マトリックスの層を産生する条件下で成長し，前記培養線維芽細胞が前記細胞外マトリックスの層内に含まれている，線維芽細胞を包含する培養組織構築物であって，
　前記細胞外マトリックスが，
　（ｉ）４分の１差の６７ｎｍ結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組織化を示す原線維性コラーゲン；
　（ｉｉ）デコリン；および
　（ｉｉｉ）グリコサミノグリカン
を包含し，そして該細胞外マトリックスが，培養条件の間，外因性マトリックス成分または合成構成員の不在下，化学的に定義された培養培地存在下で線維芽細胞を培養することによって産生されることを特徴とし，
　前記化学的に定義された培養培地は，（Ｉ）基礎栄養培地，（ＩＩ）インスリン，（ＩＩＩ）Ｌ−グルタミン又はＬ−グルタミン誘導体，および（ＩＶ）アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含み，且つ未定義の動物臓器又は組織抽出物の無い培地であり，
　前記未定義の動物臓器又は組織抽出物は，血清，下垂体抽出物，視床下部抽出物，胎盤抽出物，胚抽出物，並びにフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子である，
　培養組織構築物。」
　
第４　引用刊行物記載の事項
　平成２５年３月１２日付けで拒絶理由通知書（最後）で引用され，本願優先権主張日前に頒布された刊行物である
刊行物１：特開昭６４−１０９８３号公報
刊行物２：特開平６−１５３９３１号公報 
刊行物３：特開平７−１７８号公報 
刊行物Ａ：特表平１０−５０６５２３号公報
刊行物Ｂ：生化学辞典（第２版），株式会社東京化学同人，第２版第１刷，1990年11月22日，５０５〜５０６頁「コラーゲン」の項
刊行物Ｃ：国際公開第９７／２７３０１号
刊行物Ｄ：国際公開第９８／１８９１８号
刊行物Ｋ：国際公開第９９／５７２９７号
には，以下の事項が記載されている。
　
　また，新たに周知技術又は技術常識を示すものとして引用する
刊行物Ｌ：抗酸菌病研究所雑誌，第３９巻，第１号，昭和６２年７月，５３〜５９頁
刊行物Ｍ：特開平９−２５２７６７号公報
刊行物Ｎ：特開平７−２５５４７０号公報
刊行物Ｏ：生化学辞典（第２版），株式会社東京化学同人，第２版第１刷，1990年11月22日，３７６頁「グリコサミノグリカン」の項
刊行物Ｐ：社団法人日本生化学会編集，細胞培養技術，株式会社東京化学同人，第１版第１刷，1990年10月20日，２７〜２９頁
刊行物Ｑ：URL　http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/SAJ/Brochure/1/j_recipeccmediumguide.Par.0001.File.tmp/j_recipeccmediumguide.pdf
SIGMA-ALDRICH作成，検索日2013年10月24日
刊行物Ｒ：URL　http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/SAJ/Brochure/1/j_recipe_cc_faq.Par.0001.File.tmp/j_recipe_cc_faq.pdf
SIGMA-ALDRICH作成，検索日2013年10月24日　
には，以下の事項が記載されている。
　なお，下線は当審にて付記したものである。以下，同様である。
　
１　刊行物１（特開昭６４−１０９８３号公報）
（刊１−１）「２．特許請求の範囲
（１）
結合組織の細胞をアスコルビン酸リン酸エステル含有培地で培養し，結合組織細胞と細胞外マトリックスとからなる組織を形成せしめ，該組織を採取することを特徴とする人工組織の製造法
（２）
請求項（１）記載の方法で得られる結合組織細胞と細胞外マトリックスとからなる人工組織
　
（刊１−２）「課題を解決するための手段
　上記の事情に鑑み，本発明者は，結合組織の細胞を培養することにより増殖させる方法について種々検討したところ，培地中に，アスコルビン酸に代えてアスコルビン酸リン酸エステルを添加すると該アスコルビン酸リン酸エステルは培地中において安定であり，しかも，有効な細胞増殖促進効果，細胞分化促進効果，生体組織に近い成分からなるＥＣＭの合成促進能などを有することを見い出した。
　さらに本発明者は，長期間の結合組織の細胞の培養により，結合組織細胞とＥＣＭとからなるすぐれた人工組織が得られ，このためとりわけアスコルビン酸リン酸エステルの添加が非常に有効であることを見い出した。
　本発明者は，これらの知見に基づいてさらに鋭意研究した結果，本発明を完成した。
　すなわち，本発明は，結合組織の細胞をアスコルビン酸リン酸エステル含有培地で培養し，結合組織細胞とＥＣＭとからなる組織を形成せしめ，該組織を採取することを特徴とする人工組織の製造法，および結合組織の細胞をアスコルビン酸リン酸エステル含有培地で培養して得られる結合組織細胞とＥＣＭとからなる人工組織を提供するものである。
　
本発明方法において用いられる結合組織の細胞としては，たとえば線維芽細胞，平滑筋細胞，軟骨細胞，内皮細胞などが挙げられる。線維芽細胞としては，たとえばヒト皮膚線維芽細胞，ヒト胎児線維芽細胞，ラット皮膚線維芽細胞，鶏胚腱線維芽細胞などが挙げられる
　
（刊１−３）「培地の例としては，たとえば，
ダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディム（ＤＭＥＭ）
動物血清
などを添加するのが好ましい。
　
（刊１−４）「
かくして得られる本発明の人工組織は，通常培養容器の器壁にシート状に生成する
　
（刊１−５）「コラーゲンは細胞内でまずプロコラーゲンとして合成され，その後にプロセシングを受けてコラーゲンが形成されることが知られている。さらにコラーゲンとして，現在Ｉ型からＸＩ型までの１１種があることが知られており，その分布は細胞あるいは組織特異性を示す。又，コラーゲン分子は相互に会合し，
コラーゲン線維となり，他の細胞外マトリックス成分［酸性グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）］等と複合体を作り，ＥＣＭを形成する
　
（刊１−６）「
本発明の人工組織は，含まれる結合組織およびコラーゲン，プロコラーゲン，ＧＡＧなどからなるＥＣＭの性状および含有割合が，動物の真皮に近似するものである
　
（刊１−７）「作用および実施例
　以下に実施例を挙げて，本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１　　ヒト皮膚線維芽細胞の初代培養とその継代：
　成人前腕より無菌的に約１０ｍｍ２の皮膚をメスで切りとり，抗生物質（２５０μｌのファンギゾン，５０mg/lジヒドロストレプトマイシンおよび５０mg/lペニシリンＧ）を含むＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−O）で洗浄後，カミソリで１ｍｍ２角に細切し培養皿に入れ，１０分間乾燥させた後，
１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−１０）
実施例２　　アスコルビン酸−２−リン酸エステル（Ａｓ−２−Ｐ）添加培地を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養における増殖促進とコラーゲン合成の促進（第１図）：
　実施例１で得られた細胞を直径３．５ｃｍの培養皿（ファルコン社製，米国）に播種し，上記の培養液中に０．１−１．０ｍＭのＡｓ−２−Ｐを加え（●，○），合計３週間，３７℃で５％炭酸ガス−９５％空気中で培養した。対照として，一部の実験はＡｓ−２−Ｐを添加しなかった。培地は週に２度各濃度のＡｓ−２−Ｐを含む新鮮な培地に交換し計３週間培養を続けた。一部の実験（◇，◆）では，最初１週間，Ａｓ−２−Ｐを加えないで培養し，その後０．１ｍＭのＡｓ−２−Ｐを加えてさらに２週間培養した。３週間の培養において最後の２４時間に３Ｈ−プロリン（１０μＣｉ／ｍｌ）とＡｓ−２−Ｐ（０．１ｍＭ）を含むＤＭＥＭ−１０で培養し，培養上清と細胞を一緒に合わせた。その後畑らの方法［バイオケミストリー（Biochemistry）１９，１６９（１９８０）］に従ってプロテアーゼフリーの細菌由来コラゲナーゼ［バイオケミストリー（Biochemistry）１０，９８８（１９７１）］によって分解される３Ｈ−プロリンの取込みによってコラーゲン合成速度を測定した（第１図Ａ）。
　また，３週間の培養の後，培養上清を除去し，細胞層を１mlのトリス溶液（０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１１Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で洗った後，１mlの冷トリクロロ酢酸（１０％）を加えて細胞を集め，畑らの方法［ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジー（J. Cell. Physiol），１２２，３３３（１９８５）］により蛍光法によりＤＮＡ含量の測定を行った（第１図Ｂ）。
　第１図Ａにみられる様に，Ａｓ−２−Ｐ添加３週間培養により，最後の１日だけＡｓ−２−Ｐ添加培養した場合に比べ，コラーゲン合成率は２倍に上昇した。また，アスコルビン酸ナトリウム（ＡｓＮａ）添加の場合は，０．２ｍＭ以上ではコラーゲン合成を阻害したが，Ａｓ−２−Ｐでは１ｍＭ添加でも阻害は全く認めらなかった。
　第１図Ｂにみられる様に，Ａｓ−２−Ｐ存在下３週間培養することにより，培養皿当たりのＤＮＡ量は４倍増加した。また，最後の２週間のみＡｓ−２−Ｐを添加培養するだけでもＤＮＡ量増加がみられることは，Ａｓ−２−Ｐが細胞接着の段階にだけ促進効果を及ぼしているのではなく，細胞増殖にも促進的に作用していることを示している。
　同様にＡｓ−２−Ｐの効果は，健康人の皮膚組織細胞だけでなく，各種の結合組織における疾患を有する患者皮膚線維芽細胞においても，また胎児の肺の線維芽細胞においても認められた。」（５頁左下欄９行〜６頁右上欄１９行）
　
（刊１−８）「実施例３　Ａｓ−２−Ｐ添加培地を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養により産生されるプロコラーゲンとコラーゲン（第２図）；
　
実施例１で得られた細胞を実施例２と同じ方法で培養
　残りの半分を用いて，１００μｇ／ｍｌのペプシンを加え，５℃　６時間処理を行った。その後ｐＨを８に上げてペプシンを不活化し，ペプスタチン添加後透析し，コラーゲン画分とした。
　・・・（略）・・・
　凍結乾燥したプロコラーゲンとコラーゲンサンプルを
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在，または非存在下にＳＤＳ−５％ＰＡＧＥ
第２図中のコラーゲンの型は次のとおりであった。α１（Ｉ），α２（Ｉ），α１（III）およびα１（Ｖ）
　
（刊１−９）「さらに，Ａｓ−２−Ｐ添加培地を用いたヒト皮膚線維芽細胞を実施例２〜４と同様に培養し，電子顕微鏡を用いて観察したところ，粗面小胞体とゴルジ装置の発達を認め，さらに細胞の周りにＧＡＧ−タンパクの複合体であるプロテオグリカンおよびコラーゲン線維の著しい沈着が認められた。
　また，細胞増殖促進とＥＣＭの発達に基くと思われる細胞の多層化が明瞭であった。
　
実施例２〜４にみられたＡｓ−２−Ｐ添加培養によるヒト皮膚線維芽細胞のこれらの変化，すなわち細胞増殖の促進，コラ一ゲン様物質合成の促進，プロコラーゲンからコラーゲンへのプロセシングの促進，コラーゲン分子間の架橋の促進，細胞層へのコラーゲンと生体組織に多く存在する種類のプロテオグリカンの合成，蓄積と沈着およびこれらを裏付ける電子顕微鏡的観察の結果は，すべて皮膚線維芽細胞の培養においてＡｓ−２−Ｐが添加されることにより生体組織に近い形の組織形成が促進されていることを示すものである
　
（刊１−１０）「また以下に示すとおり，結合組織の細胞を肝細胞など皮膚以外の臓器細胞とコカルチャーすることにより，生体組織に類似する組織を製造することができる。
実施例５
　細胞の分離と培養：
　肝細胞はジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー，１２２，３３３（１９８５）に記載された二段階灌流法によってウィスター雄性ラット（体重：２３０−２７０ｇ）から分離した。細胞（２．５×１０５）を直径３５−ｍｍプラスティク培養皿（約１０ｃｍ２）またはあらかじめ線維芽細胞を培養した培養皿に蒔き，１０％ＦＣＳ，インスリン１０−６Ｍ，デキサメサゾン１０−５Ｍ，Ａｓ−２−Ｐ　　２×１０−４Ｍ，Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸　１０−２Ｍ，フンギゾン（０．２５mg/l），ペニシリン（５０mg/l），ストレプトマイシン（５０mg/l）を添加したウィリアムス培地Ｅ中，５％ＣＯ２／９５％空気存在下３７℃で培養した。培地は播種後１日目および２日目に交換し，その後１週間に２度交換した。また培地交換時にＥＧＦ（２０ng/ml）を加えた。
・・・（略）・・・
　培養中の肝細胞と線維芽細胞の代謝活性：
　２日間デキサメサゾン
，インスリン，
１０％ＦＣＳ添加ウィリアムス培地Ｅ
　
同じ条件下で培養した腱線維芽細胞は活発にコラーゲンを合成し，２日間の添加物含有ウィリアムス培地Ｅ中での培養により，全蛋白質合成に対するコラーゲン合成の相対速度は，６．１４±０．１０％であった
　肝細胞と線維芽細胞を２日間コカルチャーするとＤＮＡ含量から調べた細胞数は，二種の細胞を独立して培養した時の合計細胞数と同数であった。全細胞数はコカルチャーにおいて高かったが，コラーゲン感受性放射活性により調べた各培養皿あたりのコラーゲン合成は，線維芽細胞の単独培養時に比べ低かった。線維芽細胞はアルブミンを全く産生しなかったが，アルブミンの生産量は，肝細胞の単独培養時に比べ，コカルチャー時に高かった（第４図ＢおよびＣ）。この事実は二種の細胞間の代謝相互作用の存在を示している。３０日間の培養により，細胞数およびコラーゲン合成は増加するが，線維芽細胞単独３０日間培養時に比べて低かった。アルブミン量は２日間培養時の７５％であったが，依然として肝細胞をプラスティク皿で培養して得られた最大値よりも高かった（第４図Ｃ）。この事実もまた肝細胞と線維芽細胞との間の相互作用の存在を示している。」（７頁右下欄５行〜８頁右下欄末行）
　
（刊１−１１）「従来の技術
　種々の細胞は分化の過程で，コラーゲン，プロテオグリカンをはじめとする組織特異的な
細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）を合成し
　
（刊１−１２）「最近ではコラーゲンが，今迄考えられていなかった
肝実質細胞の様な上皮細胞によっても産生されることが判ってきた
　
（刊１−１３）「
ここでいう人工組織は，人工皮膚
人工肝臓形成
　
（刊１−１４）「本発明の人工組織を人工皮膚に形成させる場合，例えば所望により，
上記で得られるシート状の人工組織上に対象動物から分離した表皮細胞を播いて培養することにより増殖させ，表皮様構造を形成させ，表皮および真皮からなる人工皮膚を製造することができる
　
（刊１−１５）　第２図
　
２　刊行物２（特開平６−１５３９３１号公報）
（刊２−１）「【０００６】
ＦＢＳなどの動物の血清を用いることのさらなる欠点は，需要の増加により供給が不安定となり，価格の上昇変動が起こることである
【０００７】したがって，細胞の生長および生物学的に活性な産物の生産を支持するための代替の培地補助剤の開発が強く望まれている。」
　
（刊２−２）「【００２７】
インスリンはすべての種類の細胞に対して成長因子として働くことが知られており，いくつかの無血清培地において添加剤として用いられている
　
３　刊行物３（特開平７−１７８号公報）
（刊３−１）「【０００２】
【従来の技術】従来，
動物細胞の培養には牛胎仔血清添加培地が使用されてきたが，当該培地は高価であり，且つロット間のばらつきがある
　
４　刊行物Ａ（特表平１０−５０６５２３号公報）
（刊Ａ−１）「背景情報
　PG-IIあるいはPG-40としても知られる
デコリン(decorin)は，線維芽細胞によって産生される小さなプロテオグリカンである
　
５　刊行物Ｂ（生化学辞典（第２版），株式会社東京化学同人，第２版第１刷，1990年11月22日，５０５〜５０６頁「コラーゲン」の項）
（刊Ｂ−１）「コラーゲン[collagen]　動物の結合組織を構成する主要タンパク質成分である。多細胞動物には必ず存在する。・・・（略）・・・三重らせんは３本のポリペプチド鎖(各鎖をコラーゲンではα鎖とよぶ)がそれぞれは左巻きのらせん構造を形成し，各鎖は互いにゆるく右巻きのらせん状になっている(コイルドコイルあるいは超らせん)。超らせんの部分はアミノ酸残基数×290pmの長さで直径が1.4nmの棒状になる。・・・（略）・・・
ポリペプチド鎖(α鎖)の種類には25種が知られている。α１(Ｉ)とか,α2(IV)などとよぶ。・・・（略）・・・コラーゲンタンパク質ファミリーは
1)特異的な横紋構造(67nmの周期構造)を有する線維を形成する分子群;Ｉ型，III型，Ｖ型(主として軟骨以外の組織)，II型，XI型(軟骨組織)
　
６　刊行物Ｃ（国際公開第９７／２７３０１号）
　なお，翻訳は，対応日本出願の公表特許公報である特表２０００−５０３８４２号公報によるものである。
（刊Ｃ−１）「４．５コラーゲン
　膠原性タンパク質は，ECMの主要な成分である（BornsteinおよびSage，1980）。ほとんどのコラーゲンは，前駆体分子として細胞内で合成され，そしてECMまたは他のコラーゲンリッチな組織（例えば，軟骨）への分泌および取り込みの前に広範な翻訳後プロセッシングを受ける（RamachandranおよびReddi，1976）。今日まで，１８より多くの異なる型のコラーゲンが定義されており，そしてそれらは，５つの群に大雑把に分類されている(VanderrestおよびGarrone．1991）。これらの群は:
　1）
４分の１ずつずれて配列する原線維(quarter-staggered fibril）に関与するI，II，III，V，およびXI型コラーゲン
　２）断続性３重ヘリックスと原線維結合性のXII，XIV，およびIX型コラーゲン；
　３）シートを形成するIV，VIII，およびX型コラーゲン；
　４）数珠繋ぎになったフィラメントを形成するVI型コラーゲン；および
　５）固定した原線維を形成するVII型コラーゲン，である。
皮膚におけるコラーゲンネットワークは，主にI型およびIII型コラーゲンからなる。Dcnは，トランスフォーミング成長因子β活性（TGFβ）を阻害し得（Yamaguchiら，1990），そして補体成分C1qを不活化し得（Krumdieckら，1992），そしてこれらの相互作用を介して抗炎症剤として作用すると考えられている。」（明細書４９頁２０行〜５０頁７行）
　
７　刊行物Ｄ（国際公開第９８／１８９１８号）
　なお，翻訳は対応日本出願の公表特許公報である特表２００１−５０２５４８号公報によるものである。
（刊Ｄ−１）「タンパク質のコラーゲンファミリーは，例えば皮膚，骨，腱，軟骨及び血管の主要な線維状の成分を形成する，哺乳動物において最も豊富なタンパク質を表す。各コラーゲンタンパク質は，三重らせんタンパク質構造内に折り畳まれる（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n繰り返し配列によって特徴付けされる３つのポリペプチド鎖(α鎖)からなる。Ｉ型コラーゲン(皮膚，腱，骨及び角膜中に典型的に見出される)は，α１(Ｉ)及びα２(Ｉ)[すなわち，α１(Ｉ)2α２(Ｉ)]と称される２つの型のポリペブチド鎖からなり，一方，ＩＩ型[α１(ＩＩ)３]及びＩＩＩ型[α１(ＩＩＩ)３]のような他のタイプのコラーゲンは，３つの全く同じポリペプチド鎖を有する。
これらのコラーゲンタンパク質は，
細胞外のマトリックス内に混入され，線維を形成するため自発的に集合する
　
８　刊行物Ｋ（国際公開第９９／５７２９７号）
　なお，翻訳は，対応日本出願の公表特許公報である特表２００２−５１３５８３号公報の段落【００２９】によるものである。
（刊Ｋ−１）「（培地添加剤）
無血清培地には，１以上のホルモン（例えば，インスリン，トランスフェリン，上皮増殖因子，ヒドロコルチゾンなど）が頻繁に補充される
　
９　刊行物Ｌ（抗酸菌病研究所雑誌，第３９巻，第１号，昭和６２年７月，５３〜５９頁）
（刊Ｌ−１）「
すでに幾つかの研究室から，ヒト線維芽細胞の無血清完全合成培養液が発表されている
　
（刊Ｌ−２）「ＩＩ．ヒト線維芽細胞の無血清培養
II-1 　WI-38細胞
　WI-38細胞は,Wistar Institute (Philadelphia)で, 1965年に培養樹立されたヒト胎児肺由来線維芽細胞である6).この細胞の低血清下のコロニー形成に有効な
MCDB-104
7)
培地を無血清培養用の培地に用いた
インシュリン(5μｇ/ml)，
が，この細胞の維持に有効であることがわかり，これらを加えた培養液を，MCDB-ITDとした
　
（刊Ｌ−３）
　
　（５６頁　表３）
　
１０　刊行物Ｍ（特開平９−２５２７６７号公報）
（刊Ｍ−１）「【０００４】しかし，血清含有培地を使用する際には以下の様な問題があった。
(1)　血清自体が高価なためコスト高となる。
(2)　血清にはロット差があり，再現性のある培養には不利である。
(3)　産生物の培養上清からの精製が困難となる。
(4)　
ウイルスやマイコプラズマの汚染源となる恐れがある
【０００５】このような現状に鑑みて，培地中の血清濃度を減少させる方法が検討されている。しかし，血清濃度の減少によって細胞はその増殖性を著しく低下させるか死滅し，所望の細胞生成物（例えば，蛋白質）の収量が著しく減少するなどの問題があり，培地中の血清濃度の減少は困難であった。」
（当審注：「(1)」〜「(4)」は，それぞれ，○の中に数字を入れた文字を表す。）
　
（刊Ｍ−２）「【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは，上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果，インスリン，ペプトンおよびトランスフェリンを含有させた培地を用いることにより，細胞を十分に増殖させることができ，かつ細胞の順化工程がなくとも細胞が生育でき，アルブミンを含まないために蛋白質の分離精製が容易にできること，
またこの無血清培地を用いることにより蛋白質を大量に生産できることを見出して本発明を完成した
【００１２】即ち，
第１番目の発明は，インスリン
を含有させることを特徴とする無血清培地である
　
１１　刊行物Ｎ（特開平７−２５５４７０号公報）
（刊Ｎ−１）「【０００２】
【従来の技術】近年，
動物細胞の培養技術
【０００３】このため，
物質生産を目的とした細胞培養においては，血清を添加しない無血清培地を使用することが多かった。血清に代わる物質としては，
インシュリン
使用される
　
１２　刊行物Ｏ（生化学辞典（第２版））
（刊Ｏ−１）「
グリコサミノグリカン
遊離状態またはタンパク質と結合して，広く結合組織に存在するアミノ糖を含む一群の
酸性多糖
　
１３　刊行物Ｐ（細胞培養技術）
（刊Ｐ−１）
（２７〜２９頁）
　
１４　刊行物Ｑ（URL　http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/SAJ/Brochure/1/j_recipeccmediumguide.Par.0001.File.tmp/j_recipeccmediumguide.pdf）
（刊Ｑ−１）「じっけんレシピ
〜培地の紹介〜
詳しい組成はWEBサイトより組成表（Formulation）をご覧ください。
＜
ダルベッコ改変イーグル培地
DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium
1959年に
DulbeccoがMEM培地を改変したもの
　
１５　刊行物Ｒ（URL　
http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/SAJ/Brochure/1/j_recipe_cc_faq.Par.0001.File.tmp/j_recipe_cc_faq.pdf）
（刊Ｒ−１）「Q6. L-グルタミンや重炭酸ナトリウムの不含の理由
A6. 
L-グルタミンは粉状だと安定ですが，溶液状になると不安定になります
4℃では失活が進み，2週間ほどしか保存できません
　　
第５　刊行物１記載の発明
１　刊行物１で使用されている略語について
ＥＣＭ：細胞外マトリックス（摘記（刊１−１１））
ＧＡＧ：酸性グリコサミノグリカン（摘記（刊１−５））
Ａｓ−２−Ｐ：アスコルビン酸−２−リン酸エステル（摘記（刊１−７））
ＤＭＥＭ：ダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディム（摘記（刊１−３））
ＤＭＥＭ−１０：１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ（摘記（刊１−７））
ＦＣＳ：牛胎児血清（摘記（刊１−７））
α１及びα２：α鎖の種類（摘記（刊１−８））
（Ｉ）〜（Ｖ）：コラーゲンの型（摘記（刊１−８））
　
２　刊行物１の請求項２に記載の発明
　刊行物１の特許請求の範囲の請求項２（摘記（刊１−１））は，請求項１の引用を解除すると，「結合組織の細胞をアスコルビン酸リン酸エステル含有培地で培養し，結合組織細胞と細胞外マトリックスとからなる組織を形成せしめ，該組織を採取することを特徴とする，結合組織細胞と細胞外マトリックスとからなる人工組織。」
と整理される。
　
３　結合組織の細胞について
　摘記（刊１−２）に「本発明方法において用いられる結合組織の細胞としては，たとえば線維芽細胞，平滑筋細胞，軟骨細胞，内皮細胞などが挙げられる。線維芽細胞としては，たとえばヒト皮膚線維芽細胞，ヒト胎児線維芽細胞，ラット皮膚線維芽細胞，鶏胚腱線維芽細胞などが挙げられる。」と記載されている。
　そして，本願明細書の実施例２において，「実施例１で得られた細胞」（摘記（刊１−７））が使用され，この「実施例１で得られた細胞」は，「ヒト皮膚線維芽細胞」の継代培養細胞（摘記（刊１−７））である。
　そうすると，刊行物１の特許請求の範囲に記載された「結合組織の細胞」は，本願明細書の実施例２においては，ヒト皮膚線維芽細胞の継代培養細胞が使用されていることが分かる。
　
４　アスコルビン酸リン酸エステル含有培地について
　この発明の具体的な培養条件として実施例２には，「実施例１で得られた細胞を直径３．５ｃｍの培養皿（ファルコン社製，米国）に播種し，上記の培養液中に０．１−１．０ｍＭのＡｓ−２−Ｐを加え（●，○），合計３週間，３７℃で５％炭酸ガス−９５％空気中で培養した。」（摘記（刊１−７））と記載され，ここに記載の「上記の培養液」とは，「１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−１０）」（摘記（刊１−７））を意味する。
　そうすると，培地は，１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ（ダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディム）に０．１−１．０ｍＭのＡｓ−２−Ｐ（アスコルビン酸リン酸エステル）を添加したものを使用していることが分かる。
　
５　結合組織細胞と細胞外マトリックスとからなる人工組織について
　摘記（刊１−９）において「実施例２〜４にみられたＡｓ−２−Ｐ添加培養によるヒト皮膚線維芽細胞のこれらの変化，すなわち細胞増殖の促進，コラ一ゲン様物質合成の促進，プロコラーゲンからコラーゲンへのプロセシングの促進，コラーゲン分子間の架橋の促進，細胞層へのコラーゲンと生体組織に多く存在する種類のプロテオグリカンの合成，蓄積と沈着およびこれらを裏付ける電子顕微鏡的観察の結果は，すべて皮膚線維芽細胞の培養においてＡｓ−２−Ｐが添加されることにより生体組織に近い形の組織形成が促進されていることを示すものである。」と記載されており，電子顕微鏡的観察の結果，生体組織に近い形の組織形成が促進されていることを確認している。
　さらに，摘記（刊１−６）に「本発明の人工組織は，含まれる結合組織およびコラーゲン，プロコラーゲン，ＧＡＧなどからなるＥＣＭの性状および含有割合が，動物の真皮に近似するものである。」と記載されているように，コラーゲン，プロコラーゲン，ＧＡＧ（酸性グリコサミノグリカン）などからなるＥＣＭ（細胞外マトリックス）の性状および含有割合が，動物の真皮に近似することも確認している。
　
６　コラーゲンの種類について
　摘記（刊１−８）に「実施例１で得られた細胞を実施例２と同じ方法で培養」「第２図中のコラーゲンの型は次のとおりであった。α１（Ｉ），α２（Ｉ），α１（III）およびα１（Ｖ）：α１またはα２はコラーゲンを構成するα鎖の種類を示し，Ｉ〜Ｖはコラーゲンの型を示す。Ｐｒｏ，Ｐｎ，Ｐｃはプロコラーゲン，Ｐｎコラーゲン，Ｐｃコラーゲンを示す。β，γはコラーゲン２本もしくは３本のα鎖間で架橋が起った成分を示している。」と記載されているから，「実施例１で得られた細胞を実施例２と同じ方法で培養」したものは，α１（Ｉ），α２（Ｉ），α１（III）およびα１（Ｖ）が含まれていることが分かる。
　
７　人工組織の生成に使用される培養容器について
　摘記（刊１−４）に「かくして得られる本発明の人工組織は，通常培養容器の器壁にシート状に生成する。従って，このまま有利に人工組織として使用することができ，所望によりエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）などの剥離剤を用いてシート状に分離することができる。」と記載されているから，通常培養容器の器壁に人工組織が生成するものであることが分かる。
　
８　種々のプロテオグリカンについて
　摘記（刊１−９）に「実施例２〜４にみられたＡｓ−２−Ｐ添加培養によるヒト皮膚線維芽細胞のこれらの変化，すなわち細胞増殖の促進，コラ一ゲン様物質合成の促進，プロコラーゲンからコラーゲンへのプロセシングの促進，コラーゲン分子間の架橋の促進，細胞層へのコラーゲンと生体組織に多く存在する種類のプロテオグリカンの合成，蓄積と沈着およびこれらを裏付ける電子顕微鏡的観察の結果は，すべて皮膚線維芽細胞の培養においてＡｓ−２−Ｐが添加されることにより生体組織に近い形の組織形成が促進されていることを示すものである。」と記載されている。
　電子顕微鏡観察により，実施例２によるヒト皮膚繊維芽細胞の培養を行うと，生体組織に存在する種々のプロテオグリカンが合成され，蓄積され，沈着することが確認されている。
　
９　小括
　刊行物１の請求項２に記載の発明に，刊行物１記載の実施例２を中心とした上記「３」〜「８」記載の事項を加味して整理すると，刊行物１には次の発明（以下，「引用発明」という。）が記載されていると認められる。
「ヒト皮膚線維芽細胞の継代培養細胞をアスコルビン酸リン酸エステル及び１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディムで培養し，培養容器の器壁に該細胞と細胞外マトリックスとからなる組織を形成せしめ，該組織を採取することを特徴とする当該細胞と細胞外マトリックスとからなる人工組織であって，該人工組織は，生体組織に存在する種々のプロテオグリカンが合成され，蓄積され，沈着しており，コラーゲン，プロコラーゲン，酸性グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）などからなる細胞外マトリックスの性状および含有割合が，動物の真皮に近似し，コラーゲンの型はα１（Ｉ），α２（Ｉ），α１（III）およびα１（Ｖ）が含まれている人工組織。」
　
第６　対比
　本願発明と引用発明を対比する。
１　「４分の１差の６７ｎｍ結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組織化を示す原線維性コラーゲン」について
　引用発明の「コラーゲン」の線維の構造の詳細は不明であり，本願発明の「４分の１差の６７ｎｍ結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組織化を示す原線維性コラーゲン」とは，「原線維性コラーゲン」という点で共通する。
　
２　「デリコン」について
　本願発明の「デコリン」とは，本願優先権主張日前から，細胞外マトリックスの成分であることは，技術常識である。
　そして，「デコリン」は，例えば，刊行物Ａの摘記（刊Ａ−１）に記載のように，線維芽細胞によって産生されるプロテオグリカンの一種であることも技術常識である。
　よって，刊行物１記載の「プロテオグリカン」と，本願発明の「デコリン」とは，「プロテオグリカン」という点で共通する。
　
３　「グリコサミノグリカン」について
　刊行物Ｏの摘記（刊Ｏ−１）によると，グリコサミノグリカンは，酸性多糖である。
　引用発明の「酸性グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）」は，上記技術常識を参酌すると，酸性多糖であるグリコサミノグリカンの性質が酸性であることを強調しているものと解され，本願発明の「グリコサミノグリカン」に相当するものといえる。
　
４　「培養線維芽細胞」について
　引用発明の「ヒト皮膚線維芽細胞の継代培養細胞」は，本願発明の「培養線維芽細胞」に相当する。
　
５　「細胞外マトリックスが線維芽細胞を培養することによって産生される条件下で成長」することについて
　引用発明の特定事項から「ヒト皮膚線維芽細胞の継代培養細胞」を「アスコルビン酸リン酸エステル及び１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディム」という培地からなる培養条件で培養されることにより「培養容器の器壁に該細胞と細胞外マトリックスとからなる組織」が形成されることが理解される。
　そうすると，引用発明の「ヒト皮膚線維芽細胞の継代培養細胞」を「アスコルビン酸リン酸エステル及び１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディム」という培地からなる培養条件下で，「培養容器の器壁に該細胞と細胞外マトリックスとからなる組織」を形成することは，下記「６（２）化学的に定義された培養培地について」で言及する培養培地の組成に関する相違を除き，本願発明の「培養線維芽細胞によって合成および組立てられる細胞外マトリックスの層を産生する条件下」に相当する。
　
６　「外因性マトリックス成分または合成構成員の不在下」及び「化学的に定義された培養培地存在下」について
（１）「外因性マトリックス成分または合成構成員の不在下」について
　本願明細書の段落【００２９】に，
「本発明の培養組織構築物は，組織構築物の形成のための，
網目構成員のような合成または生体吸収性構成員に依存しない
と記載されている。
　この記載からすると，本願発明でいう「合成構成員」とは，網目を作るような合成の構成員であることが理解される。
　
　他方，刊行物１記載の実施例（摘記（刊１−７）及び摘記（刊１−８））において，外因性マトリックス成分または合成構成員は使用されていない。
　また，引用発明の特定事項に，外因性マトリックス成分または合成構成員は存在しない。
　以上ことからすると，引用発明において「外因性マトリックス成分または合成構成員」は使用されていないと解される。
　
　以上のことから，引用発明の「ヒト皮膚線維芽細胞の継代培養細胞」を「アスコルビン酸リン酸エステル及び１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディム」という培地からなる培養条件下で，「培養容器の器壁に該細胞と細胞外マトリックスとからなる組織」を形成することと，本願発明の「該細胞外マトリックスが，培養条件の間，外因性マトリックス成分または合成構成員の不在下，化学的に定義された培養培地存在下で線維芽細胞を培養することによって産生されること」とは，下記「６（２）　化学的に定義された培養培地について」で言及した培地組成の相違があるから，「該細胞外マトリックスが，培養条件の間，外因性マトリックス成分または合成構成員の不在下，培養培地存在下で線維芽細胞を培養することによって産生されること」で共通する。
　
（２）化学的に定義された培養培地について
　本願発明の「化学的に定義された培養培地」とは，本願発明の特定事項によれば，「前記化学的に定義された培養培地は，（Ｉ）基礎栄養培地，（ＩＩ）インスリン，（ＩＩＩ）Ｌ−グルタミン又はＬ−グルタミン誘導体，および（ＩＶ）アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含み，且つ未定義の動物臓器又は組織抽出物の無い培地であり，
　前記未定義の動物臓器又は組織抽出物は，血清，下垂体抽出物，視床下部抽出物，胎盤抽出物，胚抽出物，並びにフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子である」と定義されている。
　よって，本願発明の「化学的に定義された培養培地」には，
（Ｉ）基礎栄養培地，
（ＩＩ）インスリン，
（ＩＩＩ）Ｌ−グルタミン又はＬ−グルタミン誘導体，および
（ＩＶ）アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体
が成分として含まれ，かつ，血清等の未定義の動物臓器又は組織抽出物を含まないものである。
　そこで，本願発明の「化学的に定義された培地」に含まれる成分と，引用発明の「アスコルビン酸リン酸エステル及び１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディム」に含まれる成分を個々に対比する。
　
ア　基礎栄養培地について　
　引用発明の「ダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディム」は，本願発明の「（Ｉ）基礎栄養培地」に相当する成分を含む。
　
イ　インスリン
　引用発明の「アスコルビン酸リン酸エステル及び１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディム」には，本願発明の「（ＩＩ）インスリン」は含まれていない。
　
ウ　グルタミン
　刊行物Ｐの摘記（刊Ｐ−１）には，ＭＥＭ及びＤＭＥＭと称される培地が記載されている。これは，摘記（刊Ｐ−１）２９頁の脚注によると，「ＭＥＭ：イーグル最少必須培地」「ＤＭＥＭ：ダルベッコ変法イーグル培地」と記載されている。
　他方，刊行物Ｑの摘記（刊Ｑ−１）によると，「ダルベッコ改変イーグル培地，DMEM;DME；Dulbecco's Modified Eagle's Medium」とされ，これは「DulbeccoがMEM培地を改変したもの」とされている。
　そうすると，刊行物Ｐ記載のＤＭＥＭとは，ダルベッコが，ＭＥＭ，すなわち，イーグル最少必須培地を改変した培地を意味するものと理解され，引用発明の「ダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディム」に相当する。
　
　そこで，刊行物ＰのＤＭＥＭの組成をみると，Ｌ−グルタミンが584.0mg/l添加されており，引用発明の「ダルベコズ・モディファイド・イーグルズ・ミニマル・エッセンシャル・メディム」に，本願発明の「（ＩＩＩ）Ｌ−グルタミン又はＬ−グルタミン誘導体」が含まれていることは明白である。
　
　なお，市販のＤＭＥＭには，グルタミン不含有のものも販売されているが，これは，「L-グルタミンは粉状だと安定ですが，溶液状になると不安定になります。-20℃保存では2年間ほど安定ですが，4℃では失活が進み，2週間ほどしか保存できません。」（摘記（刊Ｒ−１））との理由による。グルタミン不含有のＤＭＥＭを使用する場合，培養開始直前に刊行物Ｐの摘記（刊Ｐ−１）に記載の組成となるべくＬ−グルタミンが添加されることとなる。
　
エ　アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体
　引用発明の「アスコルビン酸リン酸エステル」は，アスコルビン酸誘導体の一種であるから，引用発明の「アスコルビン酸リン酸エステル」は，本願発明の「（ＩＶ）アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体」に相当する。
　
オ　未定義の動物臓器又は組織抽出物の無い培地について
　本願発明の「未定義の動物臓器又は組織抽出物」とは，「血清，下垂体抽出物，視床下部抽出物，胎盤抽出物，胚抽出物，並びにフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子」と特許請求の範囲で定義されている。
　刊行物１には，実施例を含め，「下垂体抽出物，視床下部抽出物，胎盤抽出物，胚抽出物，並びにフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子」についての言及はないから，引用発明がこれらを含んでいないことは明白であるが，引用発明には「１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）」が含まれているから，本願発明の「未定義の動物臓器又は組織抽出物の無い培地」とはいえない。
　
７　「前記培養線維芽細胞が前記細胞外マトリックスの層内に含まれている線維芽細胞を包含する培養組織構築物」について
　引用発明の「人工組織」は，「ヒト皮膚線維芽細胞の継代培養細胞」の培養の結果生じたものであるから，本願発明の「培養組織構築物」に相当する。
　
　引用発明の「当該細胞と細胞外マトリックスとからなる人工組織であって，該人工組織は，生体組織に存在する種々のプロテオグリカンが合成され，蓄積され，沈着しており，コラーゲン，プロコラーゲン，酸性グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）などからなる細胞外マトリックスの性状および含有割合が，動物の真皮に近似し，コラーゲンの型はα１（Ｉ），α２（Ｉ），α１（III）およびα１（Ｖ）が含まれている人工組織」は，摘記（刊１−９）において「実施例２〜４にみられたＡｓ−２−Ｐ添加培養によるヒト皮膚線維芽細胞のこれらの変化，すなわち細胞増殖の促進，コラ一ゲン様物質合成の促進，プロコラーゲンからコラーゲンへのプロセシングの促進，コラーゲン分子間の架橋の促進，
細胞層へのコラーゲン
　加えて，引用発明の「当該細胞と細胞外マトリックスとからなる人工組織」が，動物の真皮に近似した，生体組織に近い形の組織形態であるなら，細胞外マトリックスの層にヒト皮膚線維芽細胞が含まれるような組織形態となっていることは明白である。
　よって，引用発明の「当該細胞と細胞外マトリックスとからなる人工組織」は，本願発明の「前記培養線維芽細胞が前記細胞外マトリックスの層内に含まれている線維芽細胞を包含する培養組織構築物」に相当するということができる。
　
８　小括
　以上のことを総合すると，両発明の間には，次の（一致点）並びに（相違点１）〜（相違点３）がある。
　
（一致点）
「培養線維芽細胞によって合成および組立てられる細胞外マトリックスの層を産生する条件下で成長し，前記培養線維芽細胞が前記細胞外マトリックスの層内に含まれている，線維芽細胞を包含する培養組織構築物であって，
　前記細胞外マトリックスが，
　（ｉ）原線維性コラーゲン；
　（ｉｉ）プロテオグリカン；および
　（ｉｉｉ）グリコサミノグリカン
を包含し，
　そして該細胞外マトリックスが，培養条件の間，外因性マトリックス成分または合成構成員の不在下，培養培地存在下で線維芽細胞を培養することによって産生されることを特徴とし，
　前記化学的に定義された培養培地は，（Ｉ）基礎栄養培地，（ＩＩＩ）Ｌ−グルタミン又はＬ−グルタミン誘導体，および（ＩＶ）アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含む培地である，
　培養組織構築物。」
　
（相違点１）
　原線維性コラーゲンが，本願発明では「（ｉ）４分の１差の６７ｎｍ結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組織化を示す原線維性コラーゲン」であるのに対して，引用発明に含まれる「コラーゲン」の構造は不明である点。
　
（相違点２）
　プロテオグリカンが，本願発明では「デコリン」であるのに対して，引用発明では「生体組織に存在する種々のプロテオグリカン」である点。
　
（相違点３）
　培養培地が，本願発明では，「化学的に定義された培養培地」であり，その成分に「（ＩＩ）インスリン」を含み，「未定義の動物臓器又は組織抽出物の無い培地」，すなわち，「前記未定義の動物臓器又は組織抽出物は，血清，下垂体抽出物，視床下部抽出物，胎盤抽出物，胚抽出物，並びにフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子」の無い培地であり，当該培地により「該細胞外マトリックス」が産生されるものあるのに対して，引用発明では，培養培地にインスリンを含んでおらず，また，牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む培養培地で細胞外マトリックスが産生されるものである点。
　
第７　検討
１　相違点１について
　コラーゲンの構造について，以下のような技術常識が本願優先権主張日から知られている。
（１）技術常識について
ア　[コラーゲンＩ型，ＩＩＩ型，Ｖ型の原線維は，６７ｎｍ周期線維である]
　上記行物Ｂの摘記（刊Ｂ−１）に，「1)特異的な横紋構造(67nmの周期構造)を有する線維を形成する分子群;Ｉ型，III型，Ｖ型(主として軟骨以外の組織)，II型，XI型(軟骨組織)」と記載されており，コラーゲンＩ型，ＩＩＩ型，Ｖ型の原線維が，６７ｎｍの周期構造の線維を形成することは技術常識である。
　
イ　[コラーゲンＩ型，ＩＩＩ型及びＶ型の原線維は，４分の１ずつずれて配列する線維である]
　例えば，刊行物Ｃの摘記（刊Ｃ−１）に「４分の１ずつずれて配列する原線維(quarter-staggered fibril）に関与するI，II，III，V，およびXI型コラーゲン」と記載されているように，コラーゲンＩ，ＩＩ，ＩＩＩ，Ｖ，およびＸＩ型の原線維は，４分の１ずつずれて配列する線維であることは，技術常識である。
　
ウ　[コラーゲンＩ型とＩＩＩ型の原線維は，ポリペプチド鎖が自発的に集合して形成される]　
　例えば，刊行物Ｄの摘記（刊Ｄ−１）に「Ｉ型コラーゲン(皮膚，腱，骨及び角膜中に典型的に見出される)は，α１(Ｉ)及びα２(Ｉ)[すなわち，α１(Ｉ)2α２(Ｉ)]と称される２つの型のポリペブチド鎖からなり，一方，ＩＩ型[α１(ＩＩ)３]及びＩＩＩ型[α１(ＩＩＩ)３]のような他のタイプのコラーゲンは，３つの全く同じポリペプチド鎖を有する。」と記載のように，コラーゲンＩ型は，α１(Ｉ)と２つのα２(Ｉ)で表される３つのポリペプチド鎖が集合したものであり，コラーゲンＩＩＩ型は，[α１(ＩＩＩ)３]のように３つの全く同じポリペプチド鎖が集合したものであることは技術常識である。
　そして，摘記（刊Ｄ−１）に「これらのコラーゲンタンパク質は，哺乳動物組織において，それらが構造的な役割を有し，且つ発展途上の組織において，それらが指導的な役割を有する，細胞外のマトリックス内に混入され，線維を形成するため自発的に集合する。」と記載のように，自発的にポリペプチド鎖が集合する性質を有するものである。
　
エ　小括　
　皮膚に含まれるコラーゲンＩ型（α１(Ｉ)と２つのα２(Ｉ)のポリペプチド鎖で構成）とＩＩＩ型（３つのα１(ＩＩＩ)のポリペプチド鎖で構成）の原線維は，４分の１ずつずれて配列する６７ｎｍ周期線維であり，原線維となるため各々のポリペプチド鎖が自発的に集合することは，本願優先権主張日前から技術常識となっていたことが理解される。　
　　
（２）　引用発明の「コラーゲン」について
ア　[４分の１差の６７ｎｍ結合パターンを示す原線維について]
　引用発明の「コラーゲン」は，刊行物１の摘記（刊１−９）に「さらに，Ａｓ−２−Ｐ添加培地を用いたヒト皮膚線維芽細胞を実施例２〜４と同様に培養し，電子顕微鏡を用いて観察したところ，粗面小胞体とゴルジ装置の発達を認め，さらに細胞の周りにＧＡＧ−タンパクの複合体であるプロテオグリカンおよびコラーゲン線維の著しい沈着が認められた。」と記載されており，コラーゲン線維を確認している。
　さらに，「
本発明の人工組織は
コラーゲン
などからなるＥＣＭの性状および含有割合が，動物の真皮に近似するものである
　
　それを裏付けるように，摘記（刊１−８）には，「
第２図中のコラーゲンの型は次のとおりであった。α１（Ｉ），α２（Ｉ），α１（III）およびα１（Ｖ）
　これは，「ジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在，または非存在下にＳＤＳ−５％ＰＡＧＥ」（摘記（刊１−８））の条件で調べられたものであるから，Ｓ−Ｓ結合を切る作用のあるジチオスレイトールの存在又は非存在下で，ポリペプチド鎖のサブユニットを解離させる作用のあるＳＤＳの存在下で行われている。
　第２図の「Ｂ　コラーゲン［−ＤＴＴ］」（摘記（刊１−１５）），すなわち，ジチオスレイトールの非存在下かつサブユニット解離作用のあるＳＤＳ存在下で，コラーゲンＩ型を構成するα１（Ｉ）とα２（Ｉ）のみが検出されている。これは，Ｉ型コラーゲンがＳ−Ｓ結合を有さないという技術常識に合致するものであり，ＳＤＳの存在によりコラーゲンＩ型は直ちに解離し，コラーゲンＩ型を構成するα１（Ｉ）とα２（Ｉ）が検出されることとなる。
　また，ＳＤＳでサブユニットを解離してもコラーゲンＩＩＩ型を構成するα１（III）は，検出されていない。これは，コラーゲンＩＩＩ型が，Ｓ−Ｓ結合を有するとの技術常識に合致するものである。すなわち，ＳＤＳでサブユニットを解離したとしても遊離のＳ−Ｓ結合が切れないためα１（III）が検出されることはない。さらに，引用発明の「細胞外マトリックス」に，サブユニットが集合してコラーゲンＩＩＩ型となっていない遊離のα１（III）が含まれていないことも意味する。
　第２図の「Ｂ　コラーゲン［＋ＤＴＴ］」（摘記（刊１−１５）），すなわち，ジチオスレイトールの存在下かつサブユニット解離作用のあるＳＤＳ存在下では，コラーゲンＩＩＩ型を構成するα１（III）が検出されていることから，Ｓ−Ｓ結合が切れたためα１（III）が検出されたと解される。
　上記第２図の「Ｂ　コラーゲン［−ＤＴＴ］」（摘記（刊１−１５））の結果と併せれば，α１（III）は，遊離の状態で引用発明の「細胞外マトリックス」に含まれているものではなく，集合した状態，すなわち，コラーゲンＩＩＩ型となって含まれていることを強く示唆するものである。
　
　また，これら引用発明のコラーゲン原線維を構成するポリペプチド鎖「α１（Ｉ），α２（Ｉ），α１（III）」は，上記「（１）ウ　[コラーゲンＩ型とＩＩＩ型の原線維は，ポリペプチド鎖が自発的に集合して形成される]」に記した技術常識に照らせば，自発的に集合して原線維となることは明らかであり，これらのポリペプチド鎖が検出されたと言うことは，引用発明において，α１(Ｉ)と２つのα２(Ｉ)のポリペプチド鎖で構成されるコラーゲンＩ型，３つのα１（III）のポリペプチド鎖で構成されるＩＩＩ型の原線維が自発的に形成されていることは明白である。
　
　そして，上記「（１）イ　[コラーゲンＩ型，ＩＩＩ型及びＶ型の原線維は，４分の１ずつずれて配列する線維である]」に記した技術常識に照らせば，自発的に集合したコラーゲンの型のうち，コラーゲンＩ型及びＩＩＩ型の原線維は，４分の１ずつずれて配列する６７ｎｍ周期線維となる。
　
　そうすると，引用発明の「コラーゲン」の「α１（Ｉ）」，「α２（Ｉ）」，「α１（III）」のポリペプチド鎖は，自発的に集合しコラーゲンＩ型及びＩＩＩ型の原線維となって「細胞外マトリックス」に含まれていることは明白であって，本願発明の「（ｉ）４分の１差の６７ｎｍ結合パターンを示す原線維」に相当するものが含まれていることは明らかである。
　
イ　[原線維束の包装組織化について]
　摘記（刊１−９）において「実施例２〜４にみられたＡｓ−２−Ｐ添加培養によるヒト皮膚線維芽細胞のこれらの変化，すなわち細胞増殖の促進，コラ一ゲン様物質合成の促進，プロコラーゲンからコラーゲンへのプロセシングの促進，コラーゲン分子間の架橋の促進，細胞層へのコラーゲンと生体組織に多く存在する種類のプロテオグリカンの合成，蓄積と沈着およびこれらを裏付ける
電子顕微鏡的観察の結果は
生体組織に近い形の組織形成が促進されていることを示すものである
　よって，引用発明の「コラーゲン」も，生体組織に近い形の組織形成，すなわち，「原線維束の包装組織化」がなされていると理解するのが自然である。
　
（３）小括
　以上のことを総合すると，引用発明の「コラーゲン」は，４分の１差の６７ｎｍ結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組織化を示す原線維性コラーゲンとなっていると解するのが自然であって，相違点１は，実質的に相違点ではない。
　
２　相違点２について
　刊行物Ａの（刊Ａ−１）に「デコリン(decorin)は，線維芽細胞によって産生される小さなプロテオグリカンである。」と記載されているように，デコリンは線維芽細胞によって生産される成分である。また，細胞外マトリックスの成分であることも技術常識である。
　引用発明の「該人工組織は，生体組織に存在する種々のプロテオグリカンが合成され，蓄積され，沈着して」いるものであり，種々のプロテオグリカンが合成されている。そして，引用発明は「ヒト皮膚線維芽細胞の継代培養細胞」を使用するものであるから，前記「種々のプロテオグリカン」の一種としてデコリンが生産されていると解するのが自然である。
　よって，相違点２は，実質的に相違点ではない。
　
３　相違点３について
（１）インシュリンの添加について
　従来より，血清には，価格変動や供給不安があること（刊行物２の摘記（刊２−１）参照。），ロット間でばらつきがあること（刊行物３の摘記（刊３−１）参照。），ウイルスやマイコプラズマの感染源となること（刊行物Ｍの摘記（刊Ｍ−１））等の欠点があることが知られており，本願優先権主張日前から無血清培地で培養することが周知の課題となっていた。
　
　そして，無血清で培養する際，全ての細胞に対して成長因子として働く作用のあるインスリンを無血清培地に添加することは周知の事項であった（刊行物２の摘記（刊２−２），刊行物Ｋの摘記（刊Ｋ−１），刊行物Ｌの摘記（刊Ｌ−２），刊行物Ｍの摘記（刊Ｍ−２）及び刊行物Ｎの摘記（刊Ｎ−１）参照。）。
　
　さらに，刊行物１において，「２日間デキサメサゾン，
インスリン，
１０％ＦＣＳ添加ウィリアムス培地Ｅ
　
同じ条件下で培養した腱線維芽細胞は活発にコラーゲンを合成し，２日間の添加物含有ウィリアムス培地Ｅ中での培養により，全蛋白質合成に対するコラーゲン合成の相対速度は，６．１４±０．１０％であった
と記載されており，血清の入った培地であるが，腱線維芽細胞の培養において，インスリンを添加した培地で，細胞外マトリックスの成分であるコラーゲンの合成が盛んなることを確認しており，インスリンの添加によりコラーゲン合成が妨げられることなく，促進されることが分かる。
　
　そうすると，引用発明において，無血清で培養すべく，周知のインスリンを添加する程度のことは，当業者が何の困難性もなくなし得たことといえる。
　
（２）細胞外マトリックスの産生について
　無血清培地で，蛋白質等の物質生産を行うことは，本願優先権主張日前から普通に行われている周知の事項（例えば，刊行物Ｍの摘記（刊Ｍ−２）及び刊行物Ｎの摘記（刊Ｎ−１））であり，無血清培地でも蛋白質等の物質生産できることは技術常識となっていた。
　そして，線維芽細胞を無血清で培養することは，刊行物Ｌに記載のように，古くから行われており，無血清で培養できることは技術常識であった。
　
　無血清培地で細胞外マトリックスが必ず産生されるとまでは分からないとしても，引用発明のごとく血清添加培地では細胞外マトリックスが産生されており，かつ，無血清培地でも物質生産ができるという上記技術常識に照らせば，細胞外マトリックスが産生されるかもしれないという期待を当業者に抱かせることは明らかである。
　そして，本願発明は，引用発明において，無血清で培養すべく，周知のインスリンを添加し，細胞外マトリックスが無血清培地で期待どおり産生されることを確かめることで，相違点３に記載の本願発明の特定事項のごとくしたものであって，細胞外マトリックスが産生されることを確かめることは，当業者が何の創作性もなくなし得る単なる確認事項にすぎない。
　
４　本願発明の効果について
　本願発明の効果は，刊行物１並びに上記周知の技術的事項及び技術常識に基づき当業者が予測し得るものであって，格別顕著な効果とはいえない。
　
５　請求人の主張について
　請求人は，平成２５年９月１８日付け意見書において次のように主張する。
（主張１）「刊行物１では，牛胎児血清等の動物血清を添加することが好ましい旨が記載されていることに鑑みれば（３頁右下欄１行〜１２行，「刊１−３」），刊行物１は無血清培地で培養することを阻害しています。」（２頁末行〜３頁２行）
　
（主張２）「培地の組成は，細胞培養を成功させるために重要な要素であり，ある培地で細胞培養が成功したとしても，他の培地でも同様に細胞培養が成功するとは限らないところ，刊行物１には，インスリンを添加した無血清培地で培養しても，牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む培地で培養した場合と同様に，人工組織を得ることができることについての技術的知見は全く存在しません。
　刊行物２及び３は，血清には，価格変動や供給不安があること及びロット間でばらつきがあること等の欠点が有ることを指摘しているに過ぎず，あらゆる細胞が，血清含有培地と同様に，無血清培地でも培養することができることについての技術的知見は全く存在せず，まして，血清含有培地と同様に，無血清培地で培養することにより，細胞と細胞外マトリックスとからなる組織が形成されることについて何らも触れられていません。・・・（略）・・・
　かかる刊行物１〜３の記載に鑑みれば，刊行物２及び３の記載より，本願優先権主張日前から無血清培地での培養が周知の課題となっていたとしても，当業者は，牛胎児血清等の動物血清を添加することが好ましいことが記載されている刊行物１において，血清含有培地に替えて，インスリン含有無血清培地により培養した場合に，細胞と細胞外マトリックスとからなる組織が形成されると予測することは全くあり得ず，その結果，当業者は，刊行物１において，血清含有培地に替えて，インスリン含有無血清培地により培養することを想起することは全くあり得ません。」（３頁３〜２８行）
　
（１）　（主張１）についての検討
　刊行物１においては，（主張１）で摘記されているように「牛胎児血清等の動物血清を添加することが好ましい」と記載があるだけであり，好ましいとは，添加することが必須であることを意味するものではない。
　また，刊行物１の特許請求の範囲にも血清の有無は記載されいない。
　以上のことからすると，刊行物１には，血清を加えない態様も包含されると理解されるから，前記刊行物１の記載事項が阻害要因となり得ないことは明白である。
　仮に，刊行物１において血清を添加することが求められているとしても，上記「第７　３（１）インシュリンの添加について」で述べたように，血清には，価格変動や供給不安があること（刊行物２の摘記（刊２−１）参照。），ロット間でばらつきがあること（刊行物３の摘記（刊３−１）参照。），ウイルスやマイコプラズマの感染源となること（刊行物Ｍの摘記（刊Ｍ−１））等の欠点があることが本願優先権主張日前から知られており，引用発明において，無血清とする強い動機があるといえる。
　
（２）　（主張２）についての検討　
　請求人は「ある培地で細胞培養が成功したとしても，他の培地でも同様に細胞培養が成功するとは限らない」と主張するが，刊行物Ｌの摘記（刊Ｌ−１）に「すでに幾つかの研究室から，ヒト線維芽細胞の無血清完全合成培養液が発表されている3〜5)。」と記載されているように，刊行物Ｌが頒布された昭和６２年の段階で，線維芽細胞が無血清培地で培養できることは周知の事項となっていた。
　したがって，請求人の指摘する事項は，阻害要因となり得ない。
　
　また，請求人は，刊行物１〜３には，インスリンを添加した無血清培地で培養しても，牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む培地で培養した場合と同様に，人工組織を得ることができることについての技術的知見は全く存在しない旨を主張する。この点については，上記「第７　３（２）細胞外マトリックスの産生について」で言及したとおりである。加えて述べるなら，請求人の主張するとおりの技術的知見は存在しないとしても，当該人工組織を得ることができないという技術的知見も存在しない。
　
　上記「第７　（１）インシュリンの添加について」で言及したように，血清には，価格変動や供給不安があること（刊行物２の摘記（刊２−１）参照。），ロット間でばらつきがあること（刊行物３の摘記（刊３−１）参照。），ウイルスやマイコプラズマの感染源となること（刊行物Ｍの摘記（刊Ｍ−１））等の欠点があることが知られており，本願優先権主張日前から無血清培地で培養することが周知の課題となっており，引用発明を無血清で培養しようとする強い動機があったものといえる。
　そして，請求人の主張するように，無血清培地で人工組織を得ることができることについての技術的知が全く存在しないとしても，引用発明のごとく血清添加培地では細胞外マトリックスが産生されており，かつ，無血清培地でも物質生産ができるという上記技術常識に照らせば，細胞外マトリックスが産生されるかもしれないという期待を当業者に抱かせることは明らかである。
　かえって，「インスリン含有無血清培地により培養した場合に，細胞と細胞外マトリックスとからなる組織が形成される」か否か不明であることは，試して確かめてみようとする動機となることはあっても，阻害要因となり得ない。
　しかも，期待のとおり，細胞外マトリックスが形成されたのであるから，何等予想外の結果がもたらされたものではない。
　
　なお，請求人は，「
インスリン含有
　しかしながら，本願明細書には，他の成長因子等を加えずに，インシュリンのみを基本培地に加えたような実施例は存在しない。
　例えば，本願明細書の段落【０１１９】〜【０１２５】に，
「【０１１９】
　実施例１５：化学的に限定した培地中でのヒト新生児包皮繊維芽細胞による　
　　　　　コラーゲンマトリックスのＩｎ　Ｖｉｔｒｏ形成
　実施例１で述べた操作を用いてヒト新生児包皮繊維芽細胞を増殖させた。細胞を３．０ｘ１０6／ｍｌ濃度になるように再懸濁し，６穴トレーの０．４ミクロンポアサイズの２４ｍｍ直径組織培養用挿入体に３．０ｘ１０6細胞／ＴＷ（６．６ｘ１０5細胞／ｃｍ2）の濃度で接種した。この実施例では，細胞は全て化学的に限定した培地で培養した。
　　　【０１２０】
　培地の組成は，ＤＭＥＭおよびＨａｍｓ　Ｆ−１２培地（Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の３：１混合物，４ｍＭ　ＧｌｕｔａＭＡＸ−１ＴＭ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）および以下の添加物を含む；５ｎｇ／ｍｌ　
ヒトリコンビナント表皮成長因子
トランスフェリン
　　　【０１２１】
　
上記基礎培地に加え，以下の条件で下記の添加物を加えた
　　　【０１２２】
　1．　 ５μｇ／ｍｌ　インスリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ　Ｏ），０．４μｇ／ｍｌ　ハイドロコーチゾン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），および０．０５％　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
　　　【０１２３】
　2．　 ５μｇ／ｍｌ　インスリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ　Ｏ）および０．４μｇ／ｍｌ　ハイドロコーチゾン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
　　　【０１２４】
　3．　 ３７５μｇ／ｍｌ　インスリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ　 ，ＭＯ）および６μｇ／ｍｌ　ハイドロコーチゾン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【０１２５】
　サンプルはホルマリンで固定しヘマトキシリンおよびエオジンで光学顕微鏡用の染色をした。組織学的な観察評価で，ＰＥＧのない条件２でもＰＥＧが存在する条件１とかなり同様なマトリックスを形成することが証明された。構造物のコラーゲン含量を生化学的に測定すると，ＰＥＧが存在する条件１では１６８．７±７．９８μｇ／ｃｍ2；ＰＥＧのない条件２では１７０．８８±９．０７μｇ／ｃｍ2，と両方でほとんど同量の値を示した。
高濃度のインスリンとハイドロコーチゾンを含む条件３では，他の２つの条件よりも早い時点でコラーゲンを含んでマトリックスの発現が大きいことが示された
と記載されているが，基礎培地に市販の無血清培地に加えられているトランスフェリン，表皮成長因子が加えられており，更にハイドロコーチゾンも添加されている。インスリンを単独で添加したものではないから，特定の実施例における効果にすぎない。
　
第８　結語
　以上のとおり，本願発明は，刊行物１に記載された発明並びに周知の技術的事項及び技術常識に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　したがって，本願は，他の請求項に係る発明について検討するまでもなく拒絶すべきものである。
　よって，結論のとおり審決する。