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　特願２００６−５２３５２７「グルカゴン様ペプチドの精製」拒絶査定不服審判事件〔平成１７年　３月　３日国際公開、ＷＯ２００５／０１９２６２、平成１９年　９月１３日国内公表、特表２００７−５２６２３５〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
１．出願の経緯・本願発明
　本願は、平成１６年８月１８日を国際出願日（パリ条約による優先権主張外国庁受理２００３年８月２１日　デンマーク、２００３年８月２５日　米国）とする出願であって、その請求項１に係る発明は、平成２６年６月４日付手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項１に記載された、以下のとおりのものである。 
　
「グルカゴン様ペプチドを、グルカゴン様ペプチドおよび少なくとも１の関連する不純物を含む組成から精製するための逆相高速液体クロマトグラフィプロセスである方法であって、溶出に使用される溶媒が、pH4〜pH10の範囲にpH緩衝化され、前記溶媒が、pHの可動域が、当該溶出工程の間中、設定値から+/-1.0pH単位よりも大きくなるのを防ぐようにpH緩衝化された溶媒であり、前記溶媒がアルコールを20％w/w〜60％w/wの濃度で含み、前記関連する不純物は、標的とするグルカゴン様ペプチドと構造上の類似点を持つ不純物であり、切断された形態、伸長された形態、脱アミノ酸化形態、不適当な折りたたみ形態、望まれないグリコシル化を有する形態、酸化形態、ラセミ化により得られる形態、ペプチド鎖内のアミノ酸が欠失している形態、ペプチド鎖内に余分なアミノ酸を有する形態、および所望ではない他の残基においてアシル化が生じた形態から成る群から選択される、グルカゴン様ペプチドを精製する方法。」（以下、「本願発明」という。）
　
２．引用例
　当審の拒絶の理由で引用文献１として引用された本願優先日前の２００３年７月３１日に頒布された刊行物である米国特許出願公開第２００３／０１４４４７１号明細書（以下、「引用例」という。）には、
(i)「実施例２
　二価または三価金属イオンの存在または不在における EEAHK(配列番号1)-Arg３４GLP-1（７−３７）のアシル化
　GLP-1類似体を実施例１に記載した通りに作成した。当該発酵ブロスを遠心分離によって不純物を取り除き、2620mLの上清を7900mLに希釈し、pHをpH3.1 に調整した。最終伝導率は 4.9 mS/cm であった。100mLのファルマシア・ストリームライン(登録商標)(Pharmacia StreamlinR) SP コード no.17-0993-05 充填した 2.6ｘ100cm のカラムを平衡状態に保ち、当該製造業者の推奨(ファルマシアパンフレット 18-1124-26、膨張ゲル吸着、原理と方法)に従って 0.025M クエン酸塩緩衝液 pH3.1を用いて流動化し、続いて 0.5M トリスベースにより 0.5ml/min の流れで溶出した。GLP-1類似体を含むフラクションは分析 RP-HPLCにより、希 H２SO４ で pH7.4の0.010M トリス、0.015M Na２SO４ 中の CH３CN の勾配を用いて確認した。プールした試料の量は、361mgのGLP-1類似体を含む 100mLであり、その
純度は 72.4％
試料は更に調製用 RP-HPLC により精製された。バッファー系は、Aバッファー、0.010M トリス、0.015M Na
２
SO
４
および20％エタノール v/v 希 H
２
SO
４
で pH7.5、並びに 70％のエタノールからなる B バッファーからなる。90mg GLP1 類似体に対応するアリコートを、マケレイ−ネイゲル(Macherey-Nagel),D,から入手したヌクレオシル(Nucleosil)300Å、7μm、C4を充填した HPLC カラム(250 x 20)mm に添加し、10%B で平衡状態に置き、当該試料を10%Bから90%B までの直線勾配(linear gradient)で、総量 720mLで、流出速度は毎分 6mLで溶出した。
最終純度は 98％
　
(ii)「実施例１
　Ｎ末が伸長された Arg３４GLP-1（７−３７）の発現
　宿主株 ME1719 は二倍体株であり、2 つのアスパラギン酸プロテアーゼ活性を欠く表現型を有する。１つは、一または二塩基アミノ残基のＣ末側を切断するYPS1(以前は YAP3 と称した)(Egel-Mitani ら、YEAST 6: 127-137，1990)であり、もう１つはPEP4、例えば、プロテアーゼ B、カルボキシペウチダーゼ Y、アミノペプチダーゼ I、RNase、アルカリホスファターゼ、酸トレハラーゼ、及びエキソポリホスファターゼなどの他のプロテアーゼの活性にかかわる液胞系プロテアーゼ Aである。　・・・（途中省略）・・・
　プラスミドＤＮＡを次に、酵母株 ME1719 に形質転換し、酵母形質転換体をMUPD 選択プレート上で２回単離した。酵母細胞を5mLMUPD 培地中で３日間、30℃で培養し、培養上澄をHPLCとMALDI-MS(Matrix Assisted Laser Desorption/Inonisation Mass Spectrometry) によって分析した。」（第６頁右欄下から第７行〜第７頁左欄下から第９行）、
　
(iii)「酵母においては、異質ポリペプチドの発現は、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む適切な発現ベクターを用いる酵母細胞の形質転換の後に、多くの種類のポリペプチド、例えば、インスリンおよびインスリン前駆体、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド並びにその類似体などについて既に成功している。
　しかしながら、組換え宿主において限られた大きさの蛋白質またはポリペプチドを発現する際に共通する問題は、宿主生物により産生された蛋白質分解酵素による当該発現産物のタンパク質分解である。
　従って、当該単離された産物は、所望のポリペプチドの、異なるアミノ酸鎖長を有する種類の不均一な混合物である可能性がある。酵母における不均一なポリペプチドの産生で遭遇する別の問題は、低収率であり、恐らくは、細胞内コンパートメント内と細胞膜での両方における、当該ポリペプチド内部での異常なプロセッシングによって生じた蛋白質分解の進行に帰因するものである。酵母は、酵母蛋白質の処理に使用される多くのプロテアーゼ、例えば、二塩基アミノ酸配列のＣ末側で切断する Kex2pおよびYps1pや、Kex2P による内部蛋白質分解性の消化(endoproteolytic digestion)の後に残った塩基性アミノ酸を消化するカルボキシペプチダーゼ Kex1p や、X-Ala または X-Pro で切断する Ste13pまたは Dap2p などを含む。
　幾つかのポリペプチド、例えば、約 10 から約 100 アミノ酸鎖を有し、ジスルフィド結合を持たず、または２，３のジスルフィド結合のみを有し、および／または塩基性アミノ酸の豊富なポリペプチドなど、例えば、β‐エンドルフィン、グルカゴンおよびグルカゴン様ペプチドなどは特に、形質転換された宿主細胞において発現される際には、細胞内および細胞外蛋白分解の影響を受け易く、それらの短鎖の開放およびジスルフィド安定化構造がないために、エンドプロテアーゼ分解だけでなく、N及びＣ末端で蛋白質分解を受け、均一でない産物になる。」（第１頁左欄第２３行〜左欄下から第３行）、と記載されている。
　
　上記引用例記載事項(i)には「GLP-1類似体を実施例１に記載した通りに作成した。」と記載され、実施例１が記載された上記引用例記載事項(ii)には、GLP-1類似体であるＮ末が伸長された Arg３４GLP-1（７−３７）をコードする核酸を含むプラスミドＤＮＡで酵母株 ME1719 を形質転換し、酵母形質転換体を培地中で培養したことが記載されているから、上記引用例記載事項(i)の実施例２には、GLP-1類似体であるEEAHK(配列番号1)- Arg３４GLP-1（７−３７）をコードする核酸を含む発現プラスミドで形質転換した酵母細胞を培養した発酵ブロスを、遠心分離して上清をゲル吸着クロマトにより精製したところ、GLP-1類似体を含むフラクションの純度が７２．４％であり、この試料をさらに逆相高速液体クロマトグラフィ（以下、「ＲＰ−ＨＰＬＣ」という。）で精製すると、最終純度が９８％のGLP-1類似体が得られたことが記載されている。また、上記ＲＰ−ＨＰＬＣの「バッファー系は、Aバッファー、0.010M トリス、0.015M Na２SO４および20％エタノール v/v 希 H２SO４で pH7.5、並びに 70％のエタノールからなる B バッファーからなる。　・・・（途中省略）・・・　 HPLC カラム(250 x 20)mm に添加し、10%B で平衡状態に置き、当該試料を10%Bから90%B までの直線勾配(linear gradient)で、総量 720mLで、流出速度は毎分 6mLで溶出した。」という記載から、溶出に使用した溶媒は、pH７．５でpH緩衝化された溶媒であり、計算すると、アルコールを２５％w/w〜６５％w/wの濃度で含むものである。また、上記ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した７２．４％の純度のGLP-1類似体を含むフラクションは、GLP-1類似体を酵母細胞で発現させたものであるから、GLP-1類似体及び少なくとも１の関連する不純物を含む組成物である。
　
　そうすると、引用例には、「ＧＬＰ−１類似体を、ＧＬＰ−１類似体および少なくとも１の関連する不純物を含む組成から精製するためのＲＰ−ＨＰＬＣプロセスである方法であって、溶出に使用される溶媒が、pH７．５でpH緩衝化された溶媒であり、前記溶媒がアルコールを２５％w/w〜６５％w/wの濃度で含む、ＧＬＰ−１類似体を精製する方法」の発明（以下、「引用発明」という。）が記載されていると認められる。
　
３．対比
　本願発明と引用発明とを対比すると、引用発明の「ＧＬＰ−１類似体」は、本願発明の「グルカゴン様ペプチド」に相当し、引用発明の「溶出に使用される溶媒が、pH７．５でpH緩衝化され」とは、本願発明の「溶出に使用される溶媒が、pH4〜pH10の範囲にpH緩衝化され」に相当するから、両者は、「グルカゴン様ペプチドを、グルカゴン様ペプチドおよび少なくとも１の関連する不純物を含む組成から精製するためのＲＰ−ＨＰＬＣプロセスである方法であって、溶出に使用される溶媒が、pH４〜pH１０の範囲にpH緩衝化され、前記溶媒がアルコールを２５％w/w〜６０％w/wの濃度で含む、グルカゴン様ペプチドを精製する方法」である点で共通する。
　しかしながら、両者は、（イ）pH緩衝化された溶媒のpHの可動域が、前者では、溶出工程の間中、設定値から+/-１．０pH単位よりも大きくなるのを防ぐように緩衝化されているのに対して、後者では、溶出工程の間のpHの可動域の範囲は特定されていない点、（ロ）溶出に使用される溶媒が、前者では、アルコールを２０％w/w〜６０％w/wの濃度で含むのに対して、後者では、アルコールを２５％w/w〜６５％w/wの濃度で含む点、及び、（ハ）少なくとも１の関連する不純物が、前者では、標的とするグルカゴン様ペプチドと構造上の類似点を持つ不純物であり、切断された形態、伸長された形態、脱アミノ酸化形態、不適当な折りたたみ形態、望まれないグリコシル化を有する形態、酸化形態、ラセミ化により得られる形態、ペプチド鎖内のアミノ酸が欠失している形態、ペプチド鎖内に余分なアミノ酸を有する形態、および所望ではない他の残基においてアシル化が生じた形態から成る群から選択されるものであるのに対して、後者では、そのような特定はされていない点、の３点で相違する。
　
４．当審の判断
　まず、上記（イ）の相違点については、ＲＰ−ＨＰＬＣの移動相のｐＨを一定にすることが良好な分離能のために重要であること、及び、一般には+/-１．０pH単位以内で該ｐＨを制御するとよいことは、本願優先日前既に周知の技術的事項（必要があれば、Keystone Technical Bulletin 99-06(1999)p.1-7 Keystone Scientific,Inc.、 Supelco Sigma-Aldrich Co.Technical Report,2001等参照）であり、引用発明の溶媒のｐＨの可動域を、+/-１．０pH単位以内にすることは、上記周知事項から当業者であれば容易に想到し得たことである。
　しかも、本願明細書には、本願発明における+/-１．０pH単位という数値に、臨界的意義があることは示されていないばかりか、そもそも緩衝液を用いること自体、その目的がｐＨの変動をできるだけ小さくすることであるから、引用発明においても、ｐＨの可動域を+/-１．０pH単位以内にするという数値の好適化は、当業者の通常の創作能力の発揮にすぎないものである。
　また同様に、上記（ロ）の相違点についても、本願明細書には、溶出溶媒のアルコールの濃度を２０％w/w〜６０％w/wとする、２０％及び６０％という数値に臨界的意義があることは示されていない。そもそも、引用発明における２５％w/w〜６５％w/wを、本願発明における２０％w/w〜６０％w/wとする数値範囲の変更が、数値範囲の好適化であるかどうかも不明であり、単なる数値の設定にすぎないといえる。あるいは、上記数値範囲の変更によりある程度好適化されたとしても、臨界的意義が不明である以上、この程度の数値範囲の好適化は、当業者の通常の創作能力の発揮にすぎないから、この点に格別の技術的特徴は見出せない。
　次に、上記（ハ）の相違点について検討する。
　酵母を宿主としてグルカゴン様ペプチドを発現させる場合、引用例記載事項(iii)に記載のように、「β‐エンドルフィン、グルカゴンおよびグルカゴン様ペプチドなどは特に、形質転換された宿主細胞において発現される際には、細胞内および細胞外蛋白分解の影響を受け易く、それらの短鎖の開放およびジスルフィド安定化構造がないために、エンドプロテアーゼ分解だけでなく、N及びＣ末端で蛋白質分解を受け、均一でない産物になる。」ことは、本願優先日前既に周知の技術的事項である。
　一方、引用例記載事項(ii)の実施例１において用いた、宿主である酵母株 ME1719 は、一または二塩基アミノ残基のＣ末側を切断するYPS1を欠損しているものの、エンドプロテアーゼ等の内在性プロテアーゼは欠損させていないから、引用例記載事項(i)の実施例２で酵母株 ME1719 で発現させたEEAHK(配列番号1)-Arg３４GLP-1（７−３７）については、Ｎ末端側は切断されず保護されると考えられる。しかしながら、上記周知事項からみて、エンドペプチダーゼ、又は、Ｃ末端側から切断するエキソペプチダーゼで、多少なりとも分解されている蓋然性が高く、引用例記載事項(i)の実施例２の７２．４％の純度の試料中には、少なくとも１の「切断された形態、伸長された形態、脱アミノ酸化形態、不適当な折りたたみ形態、望まれないグリコシル化を有する形態、酸化形態、ラセミ化により得られる形態、ペプチド鎖内のアミノ酸が欠失している形態、ペプチド鎖内に余分なアミノ酸を有する形態、および所望ではない他の残基においてアシル化が生じた形態」のものが含まれているといえる。
　さらにこのことは、例えば、特開平６−２９２５９４号公報の段落【００８０】〜【００９３】の例６において、酵母で発現させたグルカゴン（１−２９）においては、グルカゴンのＣ末端を認識する抗体に結合する量が、グルカゴンの１１−１５を認識する抗体に結合する量の半分以下であることが第１表に示されており、発現後Ｃ末端が分解され易いことからもうかがえるから、上記（ハ）の相違点は、実質的な相違とはいえない。
　また仮に、引用例記載事項(i)の実施例２の７２．４％の純度の試料中に、上記特定の不純物が含まれていないとした場合であっても、上述の如く、酵母で発現させた場合に不均一な産物となることは、引用例記載事項(iii)にも記載のように既に周知の事項であるから、引用発明の精製方法により９８％の純度のＧＬＰ−１類似体が精製できたという記載に接した当業者であれば、上記の不純物を含む組成に引用発明の精製方法を適用することは、容易に想到し得ることである。
　そして、本願発明において奏される効果についても、引用発明の精製方法から予測できない程の格別なものとはいえない。
　したがって、本願発明は、引用例の記載から当業者が容易になし得たものであり、特許法第２９条第２項の規定により、特許を受けることができない。
　
５．審判請求人の主張
　審判請求人は、平成２６年６月４日付意見書において、「引用文献１に記載の方法は、対照的に、化合物を十分に精製して、それを更なる反応段階に適用すること及び／又は特徴づけすることを開示しているにすぎません。そのような目的のためには、酵母タンパク質といった「関連しない」不純物を、主な化合物から分離することが要求されます。引用文献１には、関連する不純物を所望のペプチドから分離することを開示しておらず、また、精製しようとする組成物の中にそのような不純物が存在することさえ開示していません。精製するペプチドを作製するための宿主細胞としての酵母の使用は、精製の前後において、関連する不純物に関して何ら教示しません。引用文献１の目的が、関連する不純物からペプチドを精製することであったならば、溶出の前後における組成物の特徴づけが行われていたはずです。」と主張している。　
　しかしながら、引用文献１（引用例）には、宿主細胞として酵母を用いて発現させたグルカゴン様ペプチドを、ＲＰ−ＨＰＬＣにより不純物から精製することが記載されているのは、上記２．〜４．で述べたとおりであり、審判請求人の上記主張は採用できない。
　
６．むすび 
　以上のとおりであるから、本願請求項１に係る発明は、特許法第２９条第２項の規定により、特許を受けることができないものであるから、他の請求項に係る発明については検討するまでもなく、本願は拒絶をすべきものである。
　よって、結論のとおり審決する。