【事件の表示】
　特願２００８−５５７３８１「質量分析法を用いて異性体を識別するための方法」拒絶査定不服審判事件〔平成１９年　９月１３日国際公開、ＷＯ２００７／１０３１２４、平成２１年　８月　６日国内公表、特表２００９−５２８５４４〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　本願は、平成１９年３月２日（パリ条約による優先権主張　２００６年３月２日　米国）を国際出願日とする外国語国際特許出願であって、平成２４年４月１０日付けで拒絶の理由が通知され、これに対して、同年６月７日に意見書及び手続補正書が提出され、同年８月７日付けで最後の拒絶の理由が通知され、これに対して、同年１１月１３日に意見書が提出されたが、平成２５年１月７日付けで拒絶査定がなされ、同査定の謄本は同月１５日に請求人に送達された。　これに対して、同年５月１５日に拒絶査定不服審判の請求がなされ、同時に手続補正がなされたものである。
　
第２　平成２５年５月１５日付けの手続補正についての補正却下の決定
［補正却下の決定の結論］
　平成２５年５月１５日付けの手続補正（以下、「本件補正」という。）を却下する。
　
［理由］
　１　本件補正について
　本件補正により、特許請求の範囲の請求項１の記載は、平成２４年６月７日に提出された手続補正書により補正された補正後の請求項１に記載された
「　【請求項１】
　ジメチルアルギニン異性体を識別する方法であって、
　試料をイオン化してイオンを生成すること、
　質量電荷比（ｍ／ｚ）が、あるｍ／ｚ範囲内にあるイオンを選択すること、
　前記選択したイオンを分裂させて娘イオンを生成すること、ならびに
　非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）に固有のｍ／ｚにおける娘イオンｍ／ｚ信号および対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）に固有のｍ／ｚにおける娘イオンｍ／ｚ信号の一方または両方を検出することによって、前記試料中のＡＤＭＡおよびＳＤＭＡの一方または両方を検出することを含み、
　前記試料をイオン化する前に前記試料をクロマトグラフィー分離に供しない、方法。」から、
　
「 【請求項１】
　
試料中の非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）および対称性
（ＳＤＭＡ）
　試料をイオン化して
、ＡＤＭＡおよび／またはＳＤＭＡが存在する場合には、ＡＤＭＡ親イオンおよびＳＤＭＡ親
であって、ここで、前記試料は、前記イオン化の前にクロマトグラフィー分離を受けない、試料をイオン化して親イオンを生成すること
　質量電荷比（ｍ／ｚ）が、
ＡＤＭＡ親イオンとＳＤＭＡ親イオンを分離するために適した
親
　前記選択した
親
　非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）に固有
の
の
異性体
　
前記方法はさらに、前記試料中で、ジメチルアルギニン異性体と、クレアチニン、ホモシステイン、オルニチン、カルニチンおよびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の生体分子とを同時に検出することを含む
　そして、この補正は、「試料をイオン化してイオンを生成すること」について「
ＡＤＭＡおよび／またはＳＤＭＡが存在する場合には、ＡＤＭＡ親イオンおよびＳＤＭＡ親
前記試料中で、ジメチルアルギニン異性体と、クレアチニン、ホモシステイン、オルニチン、カルニチンおよびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の生体分子とを同時に検出することを含む
　そこで、次に、本件補正後の特許請求の範囲の請求項１に係る発明（以下、「本件補正発明」という。）が特許出願の際独立して特許を受けることができるものであるか否か（同法第１７条の２第５項において読み替えて準用する同法第１２６条第６項の規定に違反しないか）について検討する。
　
　２　本件補正発明の独立特許要件についての検討
　（１）本件補正発明について
　本件補正発明は、平成２５年５月１５日に提出された手続補正書により補正された補正後の請求項１に記載されたものである（上記１参照）。
　上記の請求項１の発明特定事項のうち、「試料中の非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）および対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）異性体を識別する方法」及び「非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）に固有の娘イオンｍ／ｚ信号および対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）に固有の娘イオンｍ／ｚ信号の一方または両方を検出することによって、前記試料中のＡＤＭＡおよびＳＤＭＡ
異性体
　以上のとおりであるから、本件補正発明の要旨は、
「 【請求項１】
　試料中の非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）および対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）を識別する方法であって、
　試料をイオン化して、ＡＤＭＡおよび／またはＳＤＭＡが存在する場合には、ＡＤＭＡ親イオンおよびＳＤＭＡ親イオンを生成することであって、ここで、前記試料は、前記イオン化の前にクロマトグラフィー分離を受けない、試料をイオン化して親イオンを生成すること、
　質量電荷比（ｍ／ｚ）が、ＡＤＭＡ親イオンとＳＤＭＡ親イオンを分離するために適したｍ／ｚ範囲内にある親イオンを選択すること、
　前記選択した親イオンを分裂させて娘イオンを生成すること、ならびに
　非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）に固有の娘イオンｍ／ｚ信号および対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）に固有の娘イオンｍ／ｚ信号の一方または両方を検出することによって、前記試料中のＡＤＭＡおよびＳＤＭＡの一方または両方を検出することを含み、
　前記方法はさらに、前記試料中で、ジメチルアルギニン異性体と、クレアチニン、ホモシステイン、オルニチン、カルニチンおよびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の生体分子とを同時に検出することを含む、方法。」にあるものと認める。
　
　（２）引用例
　原査定の拒絶の理由に引用され、本願の優先権主張日（以下、単に、「本願優先日」という。）前である２００５年１２月２９日（http://www.clinchem.org/content/52/3/488参照）に公表された刊行物であるMARTENS-LOBENHOFFER J. et al，Fast and Efficient Determination of Arginine, Symmetric Dimethylarginine, and Asymmetric Dimethylarginine in Biological Fluids by Hydrophilic-Interaction Liquid Chromatography-Electrospray Tandem Mass Spectrometry，Clinical Chemistry，２００６年，52, No.3，Pages 488-493（以下、「引用例」という。）には、次の事項が記載されている。
　
　ア　４８８頁左欄１行〜右欄５行
「Background: Nitric oxide is synthesized from the amino acid Arg by the enzyme endothelial nitric oxide synthase, which is competitively inhibited by the arginine metabolite asymmetric dimethylarginine (ADMA). In this way, increased concentrations of ADMA lead to reduced nitric oxide production associated with a range of cardiac diseases. Research in this field requires the measurement of Arg and of ADMA and its closely related substance, symmetric dimethylarginine (SDMA).
　Methods: We quantified Arg, ADMA, and SDMA in human plasma, human urine, and cell culture supernatant by HPLC-electrospray tandem mass spectrometry. Sample preparation required only protein precipitation. Separation was by liquid chromatography on a 150 × 3 mm silica column with an isocratic mobile phase consisting of water-acetonitrile-trifluoroacetic acid-propionic acid (10:90:0.025:1 by volume). The chromatographic run time was 7 min.
　Results: The chromatograms were interference-free in all matrices. In the low-concentration quality-control samples, the interassay CVs in plasma were 4.7% for Arg, 7.7% for ADMA, and 4.9% for SDMA. Similar values were obtained in urine and cell culture supernatants. The calibration functions were linear and covered the ranges of healthy and pathologic samples.
　Conclusion: The new method requires neither derivatization nor complete chromatographic separation between ADMA and SDMA for quantification of the 3 metabolites, has calibration functions that are independent of the sample matrix, and provides measured concentrations that agree with those reported in the literature.」
（当審訳）「背景：一酸化窒素が酸化窒素合成酵素によってアミノ酸アルギニンから合成される。そしてそれはアルギニン代謝産物の非対称性ジメチルアルギニン（ADMA）によって競合阻害を受ける。 こういうわけで、 ADMA の濃度の増加が、一定の範囲の心臓疾患と結び付けられる一酸化窒素生成物の減少を導く。 この分野の研究において、 アルギニン、そして ADMA、その密接な関連物質である対称性ジメチルアルギニン（SDMA）の測定を必要とする。
　方法：我々は、HPLC-エレクトロスプレータンデム質量分析法によってヒト血漿、ヒト尿、および細胞培養上清中のArg、ADMAおよびSDMAを定量化した。試料調製は、タンパク質の沈殿を必要とした。分離は、水 - アセトニトリル - トリフルオロ酢酸 - プロピオン酸（体積10:90:0.025:1）からなるアイソクラティック移動相を150×3mmのシリカカラム上で液体クロマトグラフィーであった。クロマトグラフィーの運転時間は7分であった。
　結果：クロマトグラムはすべてのマトリクスで無干渉でした。低濃度の品質管理サンプルでは、血漿中のアッセイ間CVはArgが4.7％、ADMAのための7.7％、およびSDMAのための4.9％でした。同様の値は、尿および細胞培養上清でも得られた。校正関数は、直線的であったし、健康と病理学的サンプルの範囲をカバーした。
　結論：3代謝物の定量化のため、誘導体化もADMAとSDMAの間の完全なクロマトグラフ分離も必要としない新しい方法は、サンプルマトリックスから独立しているキャリブレーション機能を備えており、文献で報告されたものと一致する測定濃度を提供する。」
　
　イ　４８９頁左欄５〜３１行
　「A broad range of methods for the determination of Arg, ADMA, and SDMA have been published in recent years. Many of these methods rely on derivatization of these compounds with o-phthalaldehyde, separation by reversed-phase HPLC, and fluorescence detection (12)(13)(14)(15). This approach requires laborious sample preparation and long HPLC separation times to remove endogenous interferences and to achieve separation of the structurally similar compounds ADMA and SDMA. The need for complicated sample clean-up can be avoided with the combination of HPLC separation with mass spectrometric detection. Nevertheless, to achieve separation of the very polar analytes on reversed-phase columns, a derivatization step must still be included, limiting the throughput of these methods (16)(17). Methods in which the analytes were separated in their underivatized forms have also been reported (18)(19). In both types of methods, however, ADMA and SDMA must be separated completely by chromatographic means, and neither method type uses an isotopic labeled analog as an internal standard (IS). They therefore are prone to incorrect quantification results caused by uncontrolled ion suppression in unknown samples.
Given these shortcomings of existing techniques, we sought to develop a new high-throughput method for measuring Arg, ADMA, and SDMA in biological fluids such as plasma, urine, or cell culture supernatants.  」
（当審訳）「Arg 、 ADMA と SDMA の測定のための広範囲な方法が近年発表されました。 これらの方法の多くが、化合物のオルトフタルアルデヒトの誘導体形成及び逆相HPLCによる分離と蛍光検出によっている。 このアプローチは、面倒な試料調整と、内因性の干渉を取り除くこと、そして、構造上類似の化合物 であるADMA と SDMA の分離を達成するための長い HPLC 分離時間を必要とする。複雑なサンプルクリーンアップの必要性は、質量分析検出を備えたHPLC分離の組み合わせで回避することができる。それにもかかわらず、逆相カラムにおける極性物質の分離を達成するために 、これらの方法のスループットを制限する、誘導体形成ステップが、いまだ含まれていなければならない。 分析物質 が 非誘導形式で分離される方法は、同じく報告されている。 しかしながら、両方のタイプの方法において、 ADMA と SDMA は完全にクロマトグラフ手段によって分離されなければならず、そしていずれのタイプも、内部水準（IS）として、同位体標準類似体を使用する。 その結果、それらは、未知のサンプルで制御されていないイオン抑制によって起こされた正しくない定量結果となりやすい。
　従来技術のこれらの欠点を考えて、我々は、血漿、尿、あるいは細胞培養上清のような生体液における Arg 、 ADMA と SDMA を測るための新しい高スループットの方法を開発しようと努めました。」
　
　ウ　４８９頁左欄３３〜４３行
「INSTRUMENTATION
For the HPLC separation we used an Agilent 1100 system (Waldbronn). The analytical column was a 125 × 3 mm Nucleosil 100-5 silica column (Macherey-Nagel), which was protected by a Phenomenex SecurityGuard system equipped with a 4 × 2 mm silica filter insert. The analytes were detected by a Thermo Finnigan TSQ Quantum Discovery Max triple quadrupole mass spectrometer equipped with an electrospray ion (ESI) source. We performed instrument control, data collection, and analysis with the Thermo Xcalibur software package, revision 1.4.」
（当審訳）
「器具
HPLC 分離のために我々は Agilent １１００システム（Waldbronn）を使いました。 分析カラムは、４×２ｍｍのシリカフィルター挿入体を備えるPhenomenex SecurityGuard システムによって保護された、１２５×３ｍｍの Nucleosil １００-5シリカカラム(Macherey-Nagel)でした。分析物質は、エレクトロスプレイイオン源を備える Thermo Finnigan TSQ クァンタムディスカバリーマックス、トリプル４重極質量分析計により検出された。我々は、Thermo Xcalibur ソフトウェアパッケージ、ver１.４により装置制御、データ収集及び分析を実行しました。」
　
　エ　４８９頁右欄下から１２行〜最下行
「SAMPLE PREPARATION
The sample preparation procedure was almost identical for plasma, urine, and cell culture supernatants. To 100 μL of a plasma or cell culture supernatant sample, we added 20 μL of the IS solution (460 μmol/L 13C6-Arg and 45 μmol/L 2D6-ADMA in water). The respective sample volumes for urine were 50 μL plus 50 μL of IS solution. The samples were then mixed with 900 μL of the HPLC mobile phase B, which consisted of 1 L of acetonitrile mixed with 0.25 mL of trifluoroacetic acid (TFA), and 10 mL of propionic acid. Precipitated proteins were separated by centrifugation at 10 000g for 5 min.  」
（当審訳）
「サンプル調整
サンプル調製手順は、血漿、尿、細胞培養上清について、ほぼ同様であった。血漿または細胞培養上清サンプル100μLに、我々は、IS溶液（460μｍ/Lの13C6-Argおよび水中の45μｍ/Lの2D6-ADMA）を20μLを追加しました。尿のためのそれぞれのサンプル量は50μLのプラス溶液50μLだった。次いで、試料をトリフルオロ酢酸0.25mLの（TFA）、及びプロピオン酸を10mLのアセトニトリルと混合した1 LからなるHPLC移動相Bの900μLと混合した。沈殿したタンパク質を、5分間、10000グラムの遠心分離により分離した。」
　
　オ　４９０頁左欄１〜３３行
CHROMATOGRAPHIC CONDITIONS AND MASS SPECTROMETER SETTINGS
The injection volumes of the prepared samples into the HPLC system were 10 μL for plasma extracts and 5 μL for urine and cell culture supernatant extracts. The same chromatographic conditions were used for plasma, urine, and cell culture supernatants. Mobile phase A consisted of 1 L of water mixed with 0.25 mL of TFA and 10 mL of propionic acid; mobile phase B was as described above. Separation of the analytes was accomplished by isocratic elution with 10% mobile phase A and 90% mobile phase B at a flow rate of 0.5 mL/min and a column temperature of 30 °C. Under these conditions, the retention times were 4.3 min for Arg and its IS (13C6-Arg), 4.7 min for SDMA, and 4.9 min for ADMA and its IS (2D6-ADMA).
The effluent of the HPLC column was directed to the ESI source of the mass spectrometer for the 3-6.5 min portion of the run time; otherwise, it was directed to the waste container. The settings of the ESI source were as follows: sheath gas, 32 (arbitrary units); auxiliary gas, 20 (arbitrary units); needle voltage, +4.5 kV; and capillary temperature, 300 ℃. Under these conditions, the ESI source produced single charged adduct ions in the form [M+H]+. No dimers or other adduct ions of the analytes were observed.
The [M+H]+ ions were analyzed in the multiple-reaction monitoring mode of the mass spectrometer. Fragmentation took place at a collision gas pressure of 1.5 mTorr, with argon used as collision gas. The observed multiple-reaction monitoring transitions were m/z 175.2→70.1 for Arg, m/z 181.2→74.1 for its IS (13C6-Arg), m/z 203.2→172.1 for SDMA, m/z 203.2→46.1 for ADMA, and m/z 209.2→70.1 for its IS (2D6-ADMA).  」
（当審訳）
「クロマトグラフィ条件と質量分析計設定
　HPLCシステムへの準備された試料の注入量は血漿抽出物10μL、尿及び細胞培養上清は5μLであった。同じクロマトグラフィー条件が、血漿、尿、細胞培養上清のために使用された。移動相AはTFA0.25mLのプロピオン酸（10mL）で混合し、1Lの水からなる;移動相Bはすでに説明したとおりであった。分析物の分離は、0.5mL／分の流速および30℃のカラム温度で10％移動相Aおよび90％移動相Bで定組成溶離することにより達成された。　これらの条件下で、保持時間は、ArgとそのIS（13C6-アルギニン）が4.3分、SDMAが4.7分であり、ADMAとそのIS（2D6-ADMA）が4.9分であった。
　HPLCカラムの流出液は、実行時の3〜6.5分間部分が質量分析計のESI源に向けられ、それ以外の部分は、廃棄物容器に向けられた。ESI源の設定は次のとおりであった。：シースガス、32（任意単位）;補助ガス、20（任意の単位）;ニードル電圧、+4.5 kV;およびキャピラリー温度300℃。　
これらの条件下では、ESI源は、フォーム[M+H]+の単一荷電付加イオンを生成した。分析物のいかなる二量体または他の付加物イオンは観察されなかった。[M+H]+イオンは、質量分析計の多重反応モニタリングモードで分析された。断片化は、衝突ガスとしてアルゴンを用い、1.5ミリトルの衝突ガス圧力で行われた。観測された複数の反応モニタリングの遷移は、Arg　m/z　175.2→70.1、そのＩＳ（13C6-アルギニン）　m/z　181.2→74.1、SDMA　m/z　203.2→172.1、ADMA　m/z　203.2→46.1、そのIS（2D6-ADMA）　m/z　209.2→70.1であった。」
　
　カ　４９０頁左欄３４行〜４９１頁２９行
　「Results and Discussion
SAMPLE PREPARATION
The only sample preparation step was the addition of mobile phase B to the samples. This procedure fulfilled 2 purposes in 1 step: precipitation of proteins and equalization of the sample composition with the HPLC system mobile phase, thereby avoiding peak distortion attributable to injection of samples with higher elution strength than the mobile phase. The easy, inexpensive, and rugged sample preparation procedure was an advantage of the assay. Because no extraction was required, no extraction losses occurred. In addition, because the analytes were separated and quantified in their native state, no derivatization reaction was necessary.
CHROMATOGRAPHY AND DETECTION
A typical chromatogram obtained from human plasma is depicted in Fig. 1 (chromatograms from urine and cell culture supernatant can be seen in Figs. 1 and 2 in the Data Supplement that accompanies the online version of this article at　http://www.clinchem.org/content/vol52/issue3/). 
The peaks in the chromatogram were sharp and symmetric, and no interferences from endogenous substances were apparent. A whole chromatographic cycle took only 8 min, which makes it possible to analyze 〜180 samples per day. Use of hydrophilic-interaction liquid chromatography led to good and stable retention of the polar substances. Furthermore, the mobile phase used in the hydrophilic-interaction liquid chromatography was very favorable for an ESI source, giving strong and stable signals (20). To achieve these chromatographic attributes, some TFA had to be added to the mobile phase. However, the ability of TFA to form gas-phase ion pairs with basic analytes is known to suppress sensitivity in ESI sources. To overcome this problem, we added an excess of weak acids such as propionic acid to the mobile phase, a method reported by Shou and Naidong (21). With the application of this “TFA-fix”, the assay was sensitive enough for use with all kinds of samples in the 3 investigated matrices.
ESI sources are known to be susceptible to matrix effects caused by coeluting substances from biological samples. We used the experimental procedure described by Souverain et al. to investigate the matrix effects introduced by the injection of samples that had undergone the described sample preparation procedure. In short, a solution of the IS was infused continuously via a tee-union into the column effluent. While constantly monitoring the ion traces of the IS, we injected samples prepared without addition of the IS. Any ion suppression would be indicated by a decrease of the otherwise constant detector signal (see Fig. 3 in the online Data Supplement). Strong ion suppression occurred in all 3 matrices, but the effects ceased early in the chromatographic run and did not compromise quantification of the analytes. Furthermore, because we used isotopically labeled IS for Arg and ADMA, quantification of these substances was not susceptible to matrix effects. The retention time of SDMA was very close to that of ADMA; therefore, 2D6-ADMA could also serve as a reasonable IS for this compound.
  Tandem mass spectrometric (MS/MS) detection of the analytes led to signals that showed no interferences from endogenous substances. The isotopically labeled IS were 6 unified atomic mass units heavier than their unlabeled counterparts, and we observed no cross-talk between the signals. Total chromatographic separation of the pair ADMA and SDMA was not required because the MS/MS spectra gave unique signals for each. The fragment ion m/z 46.1 was related to the loss of a dimethylammonium ion, a moiety that was found only in ADMA and not in SDMA, whereas the fragment ion m/z 172.1 was related to the neutral loss of methylamine, a moiety that was present only in SDMA and not in ADMA. In observing these fragment ions, we found no cross-talk between ADMA and SDMA and vice versa. The signals of these fragment ions were not the most intense ones observed in the MS/MS spectra, but their selectivity with regard to their parent compounds rendered them advantageous. In the case of the IS D6-ADMA, no such mass spectrometric separation was necessary; therefore, the most intense transition m/z 209.2→70.1 was observed.   」
（当審訳）
「結果と考察
サンプル準備
唯一の試料調製工程は、試料に移動相Bを追加することでした。この手順は、HPLCシステム移動相におけるたんぱく質の沈殿と試料組成の均一化、それによって移動相よりも高い溶出強度のサンプルの注入に起因するピークの歪みを回避することという、ステップで２つの目的を果たした。簡単、安価、かつ堅牢なサンプル調製手順は、アッセイの利点だった。全く抽出が必要とされていないため、何の抽出損失が発生していない。付け加えるなら、分析物は分離され、そして通常の状態で定量化されたので、まったく誘導反応は必要でなかった。
　クロマトグラフィと検出
　ヒト血漿から得られた代表的なクロマトグラムを図1に示されている。 （尿および細胞培養上清からのクロマトグラムを、http://www.clinchem.org/content/vol52/issue3/で、この記事のオンライン版に伴うデータ補足の図１及び２でみることができます。）。
　クロマトグラムのピークはシャープで対称だったし、内因性物質からの干渉は見られなかった。全体のクロマトグラフィーサイクルは、一日あたりだいたい180サンプルを分析することを可能にするわずか8分を要するものであった。親水性相互作用液体クロマトグラフィーの使用は、極性物質の良好かつ安定した保持力をもたらした。また、親水性相互作用液体クロマトグラフィーに使用した移動相は、強力で安定した信号を得、ESI源のための非常に良好であった。これらのクロマトグラフの属性を達成するために、いくつかのTFAを移動相に添加する必要があった。しかしながら、基本的な検体と気相イオン対を形成するTFAの能力はESI源に感度を抑制することが知られている。この問題を克服するために、我々は、ShouとNaidongによって報告された方法、移動相に例えばプロピオン酸のような弱酸を過剰に添加した。この「TFAフィックス」を適用して、アッセイは3つの調査マトリックス中のサンプルのすべての種類で使用するための十分な感受性であった。
ESI源は、生物学的サンプルからの物質を共溶出によって引き起こされるマトリックスの影響を受けやすいことが知られている。我々は、記載されているサンプル調製手順を受けた試料の注入により導入されるマトリクス効果を調べるために、Souverainらによって記載されている実験手順を用いた。要するに、ISの溶液は、カラム流出液にT型結合を経由して連続的に注入した。常に、ISのイオン痕跡を監視しながら、我々は、ISを添加せずに調製した試料を注入した。任意のイオン抑制は、（オンラインデータ追補図3参照）その他の一定の検出信号の減少によって示されるであろう。強力なイオン抑制は、３つのマトリクスすべてに発生したが、効果は、クロマトグラフでは早期に見れなくなり、そして、分析物の定量化が損なわれることはなかった。さらに、我々は、ArgおよびADMAのため同位体標識を使用していることから、これらの物質の定量は、マトリックス効果を受けにくくした。 SDMAの保持時間は、ADMAのそれに非常に近かった。その結果、2D6-ADMAは、適正なISとしてこの分子に提供されることができる。
分析物のタンデム質量分析（MS/MS）は、内因性物質からの干渉を全く示さなかった信号をもたらした。同位体標識されているISは、信号間にクロストークの観察がされない未標識の対応よりも重い6一原子質量単位であった。 MS/MSスペクトルは、それぞれに独自のシグナルを与えたので、ADMAおよびSDMAのペアのクロマトグラフ全分離は必要なかった。フラグメントイオンのm/z 172.1がメチルアミンのニュートラルロス、ADMAでなくSDMAでだけに存在する部分に関連していたのに対し、フラグメントイオンのm/z 46.1がジメチルアンモニウムイオンのニュートラルロス、SDMAでなくADMAだけに存在する部分に関連している。これらのフラグメントイオンを観測することで、私たちは、ADMAおよびSDMA、その逆の間において、クロストークがないことが認められた。これらのフラグメントイオンの信号は、MS/MSスペクトルにおいて観察された最も強力なものではなかったが、その親分子に関する選択性は、それらに有利を与えた。内部標準 IS D6-ADMAについてでは、そのような質量分析分離は必要ではなかった。従って、最も強い遷移値m/z 209.2→70.1が観察された。」
　
　キ　４９２頁左欄下から１３行〜右欄２０行
　「In conclusion, our new method for the determination of Arg, ADMA, and SDMA in biological fluids is easy, fast, and rugged. Furthermore, it is less expensive than conventional assays using HPLC with fluorometric detection because of its minimal use of consumables and the short analysis time, which compensates for the expensive instrumentation. A newly developed ELISA measures only ADMA, is expensive, and shows poor correlation with results obtained by chromatographic methods (25); it therefore does not seem to be a viable alternative. In our method, hydrophilic-interaction liquid chromatography makes it possible for the first time to achieve substantial and stable retention for Arg, ADMA, and SDMA in their underivatized form by use of an HPLC mobile phase that is favorable for the ion-forming process in an ESI source. This feature makes possible intense and stable MS signals. In combination with the easy sample preparation without solid-phase extraction or derivatization, only minor adjustments are needed to apply this method to different matrices, such as human plasma, urine, or cell culture supernatants. The use of isotopically labeled analogs as IS for Arg and ADMA enables precise quantification. In the case of SDMA, an isotopically labeled IS is not available at this time, but the retention time, which is very close to that of ADMA, makes it possible to use the IS 2D6-ADMA for SDMA as well. The MS/MS detection provides interference-free chromatograms for all analytes in all matrices. A unique feature of our method is that neither derivatization nor complete chromatographic separation between ADMA and SDMA is required. As such, the proposed method could be a useful addition to the repertoire of techniques for the analysis of methylated arginines and Arg.」
（当審訳）
「結論として、体液中のArg、ADMAおよびSDMAの検出のための私達の新しい方法は、簡単、高速で、かつ頑丈である。さらに、この方法は、最小の消耗品の使用で高価な器具類を補う短い分析時間であることから、従来のHPLCを用いた蛍光検出アッセイよりも安価である。新しく開発されたADMAだけを測定するELISAは高価であり、クロマトグラフィー法で得られた結果と乏しい相関を示す。したがって、実行可能な代替ではない。私たちの手法では、親水性相互作用液体クロマトグラフィーは、ESIのイオン形成プロセスに有利なHPLC移動相を使用することにより、その誘導体化されていない形でのArg、ADMAおよびSDMAのための実質的かつ安定的な保持を達成することを初めて可能にした。　この特徴は、強い、安定したMSシグナルを可能とします。固相抽出または誘導体化することなく簡単にサンプル調製と組み合わせて、わずかな調整が、ヒト血漿、尿、又は細胞培養上清などの異なるマトリクスにこの方法を適用するために必要とされる。 ArgおよびADMAにそのまま同位体標識された類似体の使用は、正確な定量が可能になります。 SDMAのケースでは、この時点で同位体標識は利用できないですが、ADMAのそれに非常に近い保持時間は、2D6-ADMAをSDMA用に使用することが可能となる。MS/MS検出はすべてのマトリクスにおいて、全ての分析試料について干渉のないクロマトグラムを提供する。本手法の独特な特徴は、誘導体化や、ADMAおよびSDMAの間の完全なクロマトグラフィー分離のどちらも必要とされないことである。このように、提案手法では、メチル化アルギニンおよびArgの分析のための手法のレパートリーに役立つ可能性がある。」
　
（３）引用発明について
　ア　引用例には、ADMA の濃度の増加が、一定の範囲の心臓疾患と結び付けられる一酸化窒素生成物の減少を導くことから、心臓疾患の分野の研究において、 アルギニン、そして ADMA、その密接な関連物質である対称性ジメチルアルギニン（SDMA）の測定が必要であること、 HPLC-エレクトロスプレータンデム質量分析法によってヒト血漿、ヒト尿、および細胞培養上清中のArg、ADMAおよびSDMAを定量化（クロマトグラフィーの運転時間は7分）をした結果、誘導体化もADMAとSDMAの間の完全なクロマトグラフ分離も必要とせずに測定濃度を提供することができたこと（上記（２）ア）、及び、ADMAの従来の測定方法では、ADMA と SDMA は完全にクロマトグラフ手段によって分離されなければならず測定時間に長い時間を要したが、引用例記載の方法は、これらの欠点を解消するために開発されたこと（上記（２）イ）が読み取れるから、引用例に記載された測定方法は、「ヒト血漿、ヒト尿、血液、細胞培養上清中のジメチルアルギニンの２つの異性体である非対称性ジメチアルギニン（ADMA）と対称性ジメチルアルギニン（SDMA）定量化するために従来は、ADMAとSDMAとの完全な分離を必要とするため長時間の測定時間がかかっていた課題を解決するためののものであることが記載されているといえる。
　イ　そして、引用例の方法においては、HPLC分離をAgilent １１００システムにおいて分析カラムは、４×２ｍｍのシリカフィルター挿入体を備えるPhenomenex SecurityGuard システムによって保護された１２５×３ｍｍの Nucleosil １００-５シリカカラムで行い、その後、エレクトロスプレイイオン源を備える Thermo Finnigan TSQ クァンタムディスカバリーマックス、トリプル４重極質量分析計を用いて定量検出を行うこと（上記（２）ウ）、ＨＰＬＣの実験に用いた条件下での保持時間は、ArgとそのIS（13C6-アルギニン）が4.3分、SDMAが4.7分であり、ADMAとそのIS（2D6-ADMA）が4.9分であり、HPLCカラムの流出液の実行時の3〜6.5分間部分が質量分析計のESI源に注入されたこと、及び、ESI源は、フォーム[M+H]+の単一荷電付加イオンを生成し、[M+H]+イオンは、質量分析計の多重反応モニタリングモードで分析され、断片化は、衝突ガスとしてアルゴンを用い1.5ミリトルの衝突ガス圧力で行われ、その結果観測された複数の反応モニタリングの遷移は、Arg　m/z　175.2→70.1、SDMA m/z　203.2→172.1、ADMA　m/z　203.2→46.1であり、それぞれの質量遷移により定量化されたこと（上記（２）オ）、ここで、フラグメントイオンのm / z 172.1がメチルアミンのニュートラルロス部分に関連し、フラグメントイオンのm / z 46.1はジメチルアンモニウムイオンのニュートラルロス部分に関連すること（上記（２）カ）が記載されているから、引用例には、HPLCとMS/MSの組み合わせで分析を行うこと、HPLCカラムからArg、SDMA及びADMAが流出する部分のカラム流出液のみをESI源に注入してイオン化し、ADMA、SDMAについて共通するm/z203.2の親イオンと、その親イオンをそれぞれ断片化して、ADMAはそのフラグメントイオンのm/z/４６．１により、SDMAはそのフラグメントイオンのm/z１７２．１によりそれぞれの定量化を行う検出方法が記載されているといえる。
　ウ　そして、親水性相互作用液体クロマトグラフィーの使用が、極性物質の良好かつ安定した保持力をもたらし強力で安定した信号を得、ESI源のための非常に良好であったこと、分析物のタンデム質量分析（MS / MS）は、内因性物質からの干渉を全く示さなかった信号をもたらし、MS / MSスペクトルは、それぞれに独自のシグナルを与えたので、ADMAおよびSDMAのペアのクロマトグラフ全分離を必要としないこと（上記（２）カ）についても記載されている。
　エ　上記（２）アないしキの記載事項および上記アないしウによれば、引用例には以下の発明が記載されているものと認めることができる。
「HPLCとMS/MSの組み合わせにより高速で、ヒト血漿、ヒト尿、細胞培養上清中のArg、ADMAとSDMAの定量検出をする方法であって、ヒト血漿、ヒト尿、細胞培養上清をHPLCに注入し、HPLCカラムの流出液のArg、DMA、ADMAが流出する時間を含む部分のみをESI源に注入してイオン化し、MS/MSにより、m/zが203.2の分子を選択して、その親イオンを断片化し、SDMAについてはm/zが46.1のフラグメントイオンにより、ADMAについてはm/zが172.1フラグメントイオンにより定量化を行うようにした方法」の発明（以下、「引用発明」という。）
　
 　（４）対比
　ア　本件補正発明と引用発明とを対比すると、引用発明の「ヒト血漿、ヒト尿、細胞培養上清中のArg、ADMAとSDMAの定量検出をする方法」は、ADMA及びSDMAをそれぞれ定量検出できるものであり、その結果両者の存在を識別することが可能であることは技術常識から自明のことであるといえるから、本件補正発明の「試料中の非対称性ジメチルアルギニン（ADMA）及び非対称性ジメチルアルギニン（SDMA）を識別する方法」に相当する。
　イ　引用発明の「HPLCカラムの流出液のArg、SDMA、ADMAが流出する時間を含む部分のみをESI源に注入してイオン化」することと、本件補正発明の「試料をイオン化して、ADMAおよび／またはSDMAが存在する場合には、ADMA親イオンおよびSDMA親イオンを生成することであって、ここで、前記試料は、前記イオン化の前にクロマトグラフィー分離を受けない、試料をイオン化して親イオンを生成すること」とは、共に、「試料をイオン化して、ADMAおよび／またはSDMAが存在する場合には、ADMA親イオンおよびSDMA親イオンを生成することであって、試料をイオン化して親イオンを生成すること」である点で共通する。
　ウ　そして、引用発明の「MS/MSにより、m/zが203.2の分子を選択して、その親イオンを断片化し、SDMAについてはm/zが46.1のフラグメントイオンにより、ADMAについてはm/zが172.1フラグメントイオンにより定量化を行う」ことは、本件補正発明の「質量電荷比がADMA親イオン、SDMA親イオンを分離するために適したm/z範囲内にある親イオンを選択」し、「選択した親イオンを分裂させて娘イオンを生成し」、「非対称性ジメチルアルギニン（ADMA)に固有の娘イオンm/z信号および対称性ジメチルアルギニン（SDMA）に固有の娘イオンm/z信号の一方または両方を検出することによって、前記試料のADMAおよびSDMAの一方または両方を検出する」ことに相当する。
　エ　引用発明の「Arg、SDMA,ADMAを定量化する」ことと、本件補正発明の、「試料中で、ジメチルアルギニン異性体と、クレアチニン、ホモシステイン、オルニチン、カルニチンおよびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の生体分子とを同時に検出すること」とは、共に、「試料中で、ジメチルアルギニン異性体と生体分子とを同時に検出する」点で共通する。
　オ　してみると、本件補正発明と引用発明とは、つぎの一致点で一致し、相違点において相違する。
 
＜一致点＞
　試料中の非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）および対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）を識別する方法であって、
　試料をイオン化して、ＡＤＭＡおよび／またはＳＤＭＡが存在する場合には、ＡＤＭＡ親イオンおよびＳＤＭＡ親イオンを生成すること、
　質量電荷比（ｍ／ｚ）が、ＡＤＭＡ親イオンとＳＤＭＡ親イオンを分離するために適したｍ／ｚ範囲内にある親イオンを選択すること、
　前記選択した親イオンを分裂させて娘イオンを生成すること、ならびに
　非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）に固有の娘イオンｍ／ｚ信号および対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）に固有の娘イオンｍ／ｚ信号の一方または両方を検出することによって、前記試料中のＡＤＭＡおよびＳＤＭＡの一方または両方を検出し、
　試料中で、ジメチルアルギニン異性体と生体分子とを同時に検出することを含む方法」
　
＜相違点１＞
　本件補正発明が、「試料は、前記イオン化の前にクロマトグラフィー分離を受けない」のに対して、引用発明は「ヒト血漿、ヒト尿、細胞培養上清はHPLCに注入し、HPLCカラムの流出液がイオン化」されるものである点
 
＜相違点２＞
　本件補正発明は、「前記試料中で、ジメチルアルギニン異性体と、クレアチニン、ホモシステイン、オルニチン、カルニチンおよびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の生体分子とを同時に検出することを含む」ものであるのに対して、引用発明は、「ヒト血漿、ヒト尿、視細胞培養上清中のアルギニンを同時に検出する」ものである点
             
　（５）判断
　ア　相違点１について検討する。
　引用発明においては、ヒト血漿、ヒト尿、細胞培養上清をHPLCに注入し、HPLCカラムの流出液のArg、SDMA、ADMAが流出する時間を含む部分のみをESI源に注入してイオン化している。
　ここで、引用発明は、HPLCカラムの流出液をArg、SDMA、ADMAが流出する時間を含む部分のみESI源に注入していること、そして、引用例の「HPLCシステム移動相におけるたんぱく質の沈殿と試料組成の均一化、それによって移動相よりも高い溶出強度のサンプルの注入に起因するピークの歪みを回避することという、１ステップで２つの目的を果たした」、「親水性相互作用液体クロマトグラフィーの使用が、極性物質の良好かつ安定した保持力をもたらし強力で安定した信号を得、ESI源のための非常に良好であった」（上記（２）カ）との記載に照らせば、引用発明においてイオン化の前にHPLCを行うのは、主に試料の精製および目的物質の濃縮を目的としているものと解される。
　また、引用例には、引用発明の方法を用いた場合に、「分析物のタンデム質量分析（MS/MS）は、内因性物質からの干渉を全く示さなかった信号をもたらし、MS/MSスペクトルは、それぞれに独自のシグナルを与えたので、ADMAおよびSDMAのペアのクロマトグラフ全分離を必要としない」こと（上記（２）カ）が記載されており、引用発明の方法においてMS/MSによりADMAとSDMAをそれぞれ定量化するにあたっては、ADMA及びSDMAを分離せず、すなわち同時に注入したとしても定量化が可能であることが示されているのであるから、ADMAとSDMAとを試料をクロマトグラフを用いて分離することなくADMAとSDMAの両者を識別して、その検出を行うことが可能であることは、当該記載から当業者であれば容易に予測し得ることというべきである。　  
　そして、イオン源として静電噴霧法（ESI）を用いた質量分析器に試料を注入する際に、分離手段を用いずに試料溶液をシリンジポンプなどにより直接イオン源に導入して分析することができることはすでに技術常識であるところ（必要であれば、原査定の拒絶の理由において引用された特開２０００−１１１５２６号公報の段落【００４８】参照）、引用発明のイオン化手段も、同じESI源であることからすれば、引用発明の方法において試料を直接イオン化することが可能であることは当該技術常識から明らかである。
　以上のことからすると、引用発明において、試料のイオン化のまえにHPLCを行うか否かは、分析試料中の目的物質以外の成分の多寡や分析試料中に含有される目的物質濃度などの条件に応じて当業者が選択すべき程度のものであるというべきである。　　
　なお、本願の発明の詳細な説明においても、その段落【００５８】において「注入口は、毛管カラム液体クロマトグラフィ源であっても、あるいはマトリックス支援レーザ離脱において使用されるような直接プローブまたはステージであってもよい。」と記載されていること、段落【００８２】に記載された、イオン化の前に事前のクロマトグラフィー分離（たとえば（予備HPLC）なしで直接質量分析計に直接注入した実施例１においては、分析試料はADMAおよびSDMAを等モル濃度で「スパイク」したあらかじめその濃度が分析のために調整されたものであること、使用されている質量分析器は、市販のものであり、その分析条件も通常の条件が開示されているだけであって、本件補正発明において、クロマトグラフィー分離を用いずに直接試料を質量分析器に注入して分析可能とするための特段の技術的工夫は見受けられないことからも、引用発明において、HPLCを行わずに、試料を直接質量分析器に注入するようにすることの格別の困難性はないものというべきである。
　以上のとおりであるから、上記相違点１は、分析試料の条件に応じて当業者が適宜選択し得る程度のことである。
　イ　相違点２について検討する。
　タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）により、アシルカルチニンのような生体分子の存在を検出したり定量化したりできることは、本願優先日前に周知のことであるから（例えば、原査定の拒絶の理由において引用された.TERADA N et al，Measurement of carnitine precursors, ε-trimethyllysine and γ-butyrobetaine in human serum by tandem mass spectrometry，Journal of Chromatography B，1999年，Vol.731, No.1，Pages 89-95の要約には、「Using tandem mass spectrometry, all members of the carnitine family, free carnitine, acylcarnitines, γ-butyrobetaine, ε-trimethyllysine can be analyzed in 0.1 ml of serum.」（タンデム質量分析法を用いて、カルニチンファミリー、遊離カルニチン、アシルカルニチン、γ-ブチロベタイン、ε-トリメチルのすべてのメンバーは、血清の0.1ミリリットルで分析することができます。）との記載や、国際公開２００５／２１７７９号のＥＸＡＭＰＬＥ１等を参照）、引用発明において、アシルカルチニンをあわせて検出するようにすることは、当業者が適宜なし得る程度のことである。
　ウ　そして、本件補正発明の効果は、引用発明および周知技術から当業者が予測し得る程度のものであって、格別のものとはいえない。
　エ　以上のとおりであり、本件補正発明は、引用発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　
（６）まとめ
　上記のとおり、本件補正発明は、特許出願の際に独立して特許を受けることができるものであるということはできないから、本件補正は、平成１８年改正前特許法第１７条の２第５項において読み替えて準用する同法第１２６条第６項の規定に違反するものであり、同法第１５９条第１項において読み替えて準用する同法第５３条第１項の規定により却下すべきものであるから、上記補正却下の決定の結論のとおり決定する。
　
第３　本願発明について
　１　本願発明
　本件補正（平成２５年５月１５日付けの手続補正）は、上記のとおり却下されたので、本願の請求項１に係る発明（以下「本願発明」という。）は、平成２４年６月７日に提出された手続補正書により補正された補正後の請求項１に記載された次のとおりのものである。
「　【請求項１】
　ジメチルアルギニン異性体を識別する方法であって、
　試料をイオン化してイオンを生成すること、
　質量電荷比（ｍ／ｚ）が、あるｍ／ｚ範囲内にあるイオンを選択すること、
　前記選択したイオンを分裂させて娘イオンを生成すること、ならびに
　非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）に固有のｍ／ｚにおける娘イオンｍ／ｚ信号および対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）に固有のｍ／ｚにおける娘イオンｍ／ｚ信号の一方または両方を検出することによって、前記試料中のＡＤＭＡおよびＳＤＭＡの一方または両方を検出することを含み、
　前記試料をイオン化する前に前記試料をクロマトグラフィー分離に供しない、方法。」
　２　引用例
　原査定の拒絶の理由に引用された上記第２の２（２）において提示した引用例の記載事項および引用発明は、上記第２の２（２）および（３）において記載したとおりである。
　
　３　対比・判断
　上記第２の１の本件補正についてで説示したように、本件補正発明は、本願発明を減縮したものであるから、本願発明は、上記第２の２において検討した本件補正発明を包含する。
　そうすると、本願発明は、本件補正発明と同様に、引用発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
　 　 
　４　むすび 
　以上のとおり、本願発明は、本願優先日前に頒布された引用例に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。 
　したがって、その余の請求項に係る発明について論及するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。
　よって、結論のとおり審決する。