(57)【要約】      （修正有）【課題】想定品種の複数の米粒中に混入した異品種の米粒割合を短時間で判定する方法を提供する。【解決手段】被検査用の複数の米粒サンプルを粉砕した米粒粉砕物からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡを増幅してこれをマイクロチップ電気泳動法に掛けた際に検出されたピークから、想定品種と異品種の各ピーク及びピーク強度値をそれぞれ特定する。即ち、前記ＤＮＡを増幅する際に複数の米粒品種に対して共通位置（塩基サイズb.p.）にピークが検出されるように設計した前記ポジティブプライマーを添加して検出されるピーク（陽性対照）のピーク強度値と、異品種のピーク強度値との割合（除算値）を算出するとともに、除算値と異品種混入割合との関係を表した検量線を予め求めておいて、該検量線に基づいて、前記算出した除算値に対応する値（異品種混入割合）を判定するものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
想定品種の米粒に異品種の米粒が混入した複数の米粒サンプルを粉砕し、該米粒粉砕物からＤＮＡを抽出するＤＮＡ抽出工程と、
該ＤＮＡ抽出工程によって抽出されたＤＮＡに複数の品種に対して共通のピークを検出するように設計したポジティブプライマーと米粒の品種特有の塩基配列部位のみに結合する複数の対合プライマーとを添加してＰＣＲ法を行うＤＮＡ増幅工程と、
該ＤＮＡ増幅工程によって増幅されたＰＣＲ産物を基にしてマイクロチップ電気泳動法を行い、該マイクロチップ電気泳動法によって検出されたピークの中から前記想定品種が示すピークを除いて異品種のピークを特定する異品種ピーク検出工程と、
該異品種ピーク検出工程によって特定された異品種ピークのピーク強度値と前記ポジティブプライマーの添加によって検出されるポジティブコントロールのピーク強度値とをそれぞれ求めるピーク強度値検出工程と、
該ピーク強度値検出工程によって検出された異品種ピーク強度値を前記ポジティブコントロールのピーク強度値で除算する除算工程と、
前記対合プライマーごとに予め求めておいた、前記除算値と異品種混入割合との関係を示す検量線に基づいて、前記除算工程で算出した除算値における異品種混入割合を判定する異品種混入割合判定工程と、
を有することを特徴とする米粒中における異品種混入割合算出方法。
【請求項２】
前記ポジティブプライマーは、配列表における配列番号１３と配列番号１４とを一対にしたプライマーであることを特徴とする請求項１に記載の米粒中における異品種混入割合算出方法。
【請求項３】
前記対合プライマーは、配列表における、配列番号１と配列番号２、配列番号３と配列番号４、配列番号５と配列番号６、配列番号７と配列番号８、配列番号９と配列番号１０、配列番号１１と配列番号１２、をそれぞれ一対にしてなるプライマーを用いてなることを特徴とする請求項１又は請求項２のいずれかに記載の米粒中における異品種混入割合算出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米粒のデオキシリボ核酸（以下「ＤＮＡ」という）に基づいて米粒の品種判別を行う技術に係り、特に、所定品種の米粒中に混入した異品種の米粒の割合を算出する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、米粒からＤＮＡを抽出して米粒の品種を判定する技術としては、例えば、本願発明者による特許文献１が知られている。該特許文献１による品種判定方法は、一粒の米粒について品種を判定するものである。この特許文献１の品種判定方法は、被検査米粒の一粒を粉砕し、この米粒粉砕物から公知のＣＴＡＢ（cetyl-trimethyl-ammoniumbromide）法（以下「ＣＴＡＢ法」という）によってＤＮＡを抽出し、この後、抽出された前記ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）に対し、品種の識別に有用な識別バンドとなる塩基配列部位のみに結合する一対からなる対合プライマーを添加してＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）法（以下「ＰＣＲ法」という）を行い、前記塩基配列部位が増幅されたＰＣＲ産物を得る。この後、該ＰＣＲ産物を電気泳動法（アガロース電気泳動法）にかけて品種特有の識別バンドを検出し、品種判定を行うものである。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−７３６５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、米粒の品種判定を科学的に判定する方法は、市場に流通する精米の品種表示が不正であるか否かを分析するうえで有用であり、昨今注目されている。しかしながら、上記の品種判定方法は、米粒（被検査米粒）を一粒単位で品種判定するものであるため、例えば、想定品種（精白米の包装袋などに表示された品種）とされる複数の米粒群の中に前記想定品種以外の異品種の米粒が混入しているか否か、また、その混入した異品種の米粒の割合を調査する際には、該調査・測定に係る作業時間が長時間になるという問題点があった。
そこで、本発明は、上記問題点にかんがみ、想定品種の複数の米粒中に、異品種の米粒が混入する割合を短時間に判定することができる米粒中における異品種混入割合算出方法を提供することを技術的課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するため、請求項１の発明により、
想定品種の米粒に異品種の米粒が混入した複数の米粒サンプルを粉砕し、該米粒粉砕物からＤＮＡを抽出するＤＮＡ抽出工程と、
該ＤＮＡ抽出工程によって抽出されたＤＮＡに複数の品種に対して共通のピークを検出するように設計したポジティブプライマーと米粒の品種特有の塩基配列部位のみに結合する複数の対合プライマーとを添加してＰＣＲ法を行うＤＮＡ増幅工程と、
該ＤＮＡ増幅工程によって増幅されたＰＣＲ産物を基にしてマイクロチップ電気泳動法を行い、該マイクロチップ電気泳動法によって検出されたピークの中から前記想定品種が示すピークを除いて異品種のピークを特定する異品種ピーク検出工程と、
該異品種ピーク検出工程によって特定された異品種ピークのピーク強度値と前記ポジティブプライマーの添加によって検出されるポジティブコントロールのピーク強度値とをそれぞれ求めるピーク強度値検出工程と、
該ピーク強度値検出工程によって検出された異品種ピーク強度値を前記ポジティブコントロールのピーク強度値で除算する除算工程と、
前記対合プライマーごとに予め求めておいた、前記除算値と異品種混入割合との関係を示す検量線に基づいて、前記除算工程で算出した除算値における異品種混入割合を判定する異品種混入割合判定工程と、
を含む技術的手段を講じた。
【０００６】
前記請求項１の方法によると、
被検査用の複数の米粒サンプルを粉砕した米粒粉砕物からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡを増幅してこれをマイクロチップ電気泳動法に掛けた際に検出されたピークから、想定品種と異品種の各ピーク及びピーク強度値をそれぞれ特定する。前記ＤＮＡを増幅する際には、複数の米粒品種に対して共通位置（塩基サイズb.p.）にピークが検出されるように設計したポジティブプライマーを添加する。本発明は、前記ポジティブプライマーの添加によって検出されるピーク（ポジティブコントロール＝ポジコン）のピーク強度値と異品種のピーク強度値との間に相対的な比例関係があるとの知見を見出し、この知見を利用して異品種混入割合を判定するものである。そのため、異品種混入割合を判定する際は、前記ポジコンのピーク強度値と異品種ピーク強度値との割合である前記除算値を算出するとともに、除算値と異品種混入割合との関係を表した検量線を予め求めておいて、該検量線に基づいて、前記算出した除算値に対応する値（異品種混入割合）を判定するものである。
【０００７】
また、請求項２の発明により、前記ポジティブプライマーは、配列表における配列番号１３と配列番号１４とを一対にしたプライマーとする技術的手段を講じた。品種の判別は、前記マイクロチップ電気泳動法を行って得られたピークのうち、該マイクロチップ電気泳動法の出力の横軸である、ＤＮＡ増幅サイズ（ｂ.ｐ.）の所定の範囲内にピークが何本どの位置に検出されるかによって行われるが、請求項２の前記ポジティブプライマーによれば、前記所定範囲の下限値（例えば、100ｂ.ｐ.）に前記ポジティブコントロールピークを検出するように塩基配列が設計してある。このため、ポジティブプライマーの濃度や添加量などを調整してポジティブコントロールのピーク強度を大きくすることにより、前記下限値付近にノイズとして検出される非特異産物のピークとの区別が明確になるので、前記下限値（ロアーマーカー）が明確になる。
【０００８】
さらに、請求項３の発明により、前記対合プライマーは、配列表における、配列番号１と配列番号２、配列番号３と配列番号４、配列番号５と配列番号６、配列番号７と配列番号８、配列番号９と配列番号１０、配列番号１１と配列番号１２、をそれぞれ一対にしてなるプライマーを用いるという技術的手段を講じた。これにより、上記対合プライマーを使用することで、前記ＤＮＡ増幅工程において、本発明の効果を得るための好適な作用を得ることができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、被検査用の米粒サンプルを一粒ずつ品種判定して異品種の混入割合を判定（算出）するのではなく、複数の米粒を基にして一度に異品種の混入割合を判定することができるので、判定に掛かる作業時間を短時間にすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明における想定品種とは、市場に流通している精白米の包装袋などに表示された品種のことを示す。以下、本発明の実施形態について、図１に示した本発明の異品種混入割合算出方法のフローチャートを参照しながら説明する。
【００１１】
米粒サンプルの準備：
実施例の被検査用（原料）の米粒サンプルとして、「コシヒカリ」（想定品種）に「想定品種以外の異品種である、きらら３９７」を約９％混入させたものを５０グラム（数十グラム）用意し、これを粉砕し、この粉砕物から取り出した０．１グラム（少量）を測定試料（以下「米粒粉砕物」という）とした。
【００１２】
ＤＮＡ抽出工程（Ｓ１）：
前記米粒粉砕物を基にして、ＤＮＡ抽出工程を行う。該ＤＮＡ抽出工程は、一般的に用いられている前記ＣＴＡＢ法によって行う。該ＣＴＡＢ法は、所定の容器（チューブ）にビーズを入れ、粉砕装置（倉敷紡績株式会社製：サンプル粉砕装置＜SH-100＞）を使って潰し、さらに、植物用細胞溶解試薬（主成分：Tris，EDTA，NaCl，CTAB）を数ｍＬ添加して１時間加熱し、米粒の植物細胞を溶解する。この後、前記容器をＤＮＡ自動分離装置（倉敷紡績株式会社製：核酸自動分離装置、型式：ＰＩ−２４）にセットする。そして、植物用蛋白変成試薬（主成分：SDS，その他界面活性剤）を数ｍＬ添加・攪拌して米粒の蛋白質を変性させ、この後、植物用蛋白変成試薬（主成分：クロロホルム（90％））を数ｍＬ添加・攪拌し、米粒の脂質を溶出する。次いで、植物用除蛋白試薬（主成分：酢酸カリウム）を数ｍＬ添加・攪拌した後、遠心作用を与えてクロロホルムと植物残渣等を含むペレットを形成し、上澄液の移液をスムーズにする。
【００１３】
次に、核酸複合体沈殿試薬（主成分：Tris，EDTA，CTAB）を予め数ｍＬ入れた回収容器に、前記上澄液を移して攪拌し、ＣＴＡＢ−ＤＮＡ複合体を形成する。この後、遠心作用を与えた後、前記上澄液を廃棄する。次いで、核酸再溶解試薬（主成分：NaCl）を数ｍＬ添加・攪拌し、ＣＴＡＢ−ＤＮＡ複合体を解離させる。次に、沈殿試薬（主成分：イソプロパノール（90％以上））を数ｍＬ添加・攪拌及び遠心作用を順次与え、ＤＮＡを沈殿させる。この後、再度、前記上澄液を廃棄する。さらに、洗浄試薬（主成分：エタノール（70％以下），イソプロパノール）を数ｍＬ添加し、攪拌及び遠心作用を与えてＤＮＡの洗浄を行う。そして、再々度、前記上澄液を廃棄し、最後に遠心分離により乾燥し、鋳型ＤＮＡを得る。
【００１４】
ＤＮＡ増幅工程（Ｓ２）：
次に、前記鋳型ＤＮＡを基にして、ＤＮＡ増幅工程を行う。該ＤＮＡ増幅工程も、一般的に用いられている前記ＰＣＲ法によって行う。該ＰＣＲ法を行うにあたっては、まず、所定の容器内に、下記表１に示した組成からなる調製液を数十μＬ調製する。
（表１）
滅菌水
１０×ＰＣＲバッファー（100mM-Tris HCL(pH8.3)，500mM-KCL）
ＭｇＣｌ2
ｄＮＴＰミックス（各２．５mM）
第１対合プライマー（配列番号１）フォワード側
第１対合プライマー（配列番号２）リバース側
第２対合プライマー（配列番号３）フォワード側
第２対合プライマー（配列番号４）リバース側
第３対合プライマー（配列番号５）フォワード側
第３対合プライマー（配列番号６）リバース側
第４対合プライマー（配列番号７）フォワード側
第４対合プライマー（配列番号８）リバース側
第５対合プライマー（配列番号９）フォワード側
第５対合プライマー（配列番号１０）リバース側
第６対合プライマー（配列番号１１）フォワード側
第６対合プライマー（配列番号１２）リバース側
ポジティブプライマー（配列番号１３）フォワード側
ポジティブプライマー（配列番号１４）リバース側
鋳型ＤＮＡ溶液
Ｔａｑポリメラーゼ（5U/μＬ）
【００１５】
上記各対合プライマー（配列番号）の塩基配列は、以下のとおりである。
（化１）
gaacaattac  tccctcggtt  ctata      （配列番号１）
（化２）
gcatgagcgg  catgacagaa            （配列番号２）
（化３）
cactgtaact  tttgtaagtt  acactg      （配列番号３）
（化４）
tcccccgttc  aatgagaagc  t          （配列番号４）
（化５）
cctcttgtat  cctgtccccc  tc          （配列番号５）
（化６）
agttggcacg  tggtgcagaa            （配列番号６）
（化７）
gcatccatcc  tggcctagcg  ctgtata    （配列番号７）
（化８）
gcaggtcgaa  aacacacaga  acgatac  （配列番号８）
（化９）
cgctccatgc  acacatgagc  tag       （配列番号９）
（化１０)
cctatgctgt  gatcttgtag  tgc        （配列番号１０）
（化１１)
catgccacat  cgtcagagca  ctcg      （配列番号１１）
（化１２)
gtgcaatcca  ttgctgaata  ag        （配列番号１２）
（化１３)
ggactaccaa  ccccagctac            （配列番号１３）
（化１４)
ccagctgggt  atcctaggag  a          （配列番号１４）
【００１６】
上記のように、前記調製液の組成においては、ポジティブプライマーを使用する。該ポジティブプライマーは、後述するマイクロチップ電気泳動システムで解析した際に、複数の品種において共通のピークが検出されるように塩基配列を設計したものである。本実施例のポジティブプライマーは、ピーク検出範囲の下限値（ロアーマーカー）である例えば１００塩基サイズ（ｂ.ｐ.）にピーク（ポジティブコントロール）が検出されるように塩基配列を設計するとともに、１００塩基サイズ付近にノイズとして多数検出される異品種米粒（非特異産物）のピークとの区別を明確するために、濃度及び添加量を調整してピーク強度値を大きくしてある。また、前記６種類（第１〜第６）の対合プライマーは、反応があれば、それぞれ異なる塩基サイズ（図１における横軸）においてピークが現れるように塩基配列が設計してある。
【００１７】
なお、上記調製液においては、再現性を確保するため、添加する前記ポジティブプライマー及び対合プライマーの濃度及び添加量については常に所定量にしておき、検出されるピークの各強度値の大小が相対的に上下することはあっても、隣り合ったピークの強度値が逆転しないようにしておく必要がある。
【００１８】
次に、表１の組成からなる調製液が入った容器をＰＣＲ装置（ＡＢＩ社製、Gene Amp PCR System 9700）にセットし、２分間９５℃で加熱して熱変性させ、さらに、熱変性（９５℃×２分）、アニーリング（６２℃×１分）及び伸長反応（７２℃×２分）を３０サイクル繰り返し、伸長反応（７２℃×４分）を行わせる。該伸長反応（７２℃×４分）の後は、前記調製液が４℃になるまで放置する。以上により、ＰＣＲ産物が得られる。
【００１９】
非特異的ピーク検出工程（異品種ピーク検出工程）（Ｓ３）：
次に、前記ＰＣＲ産物を用いて、異品種の米粒が反応して示したピークを特定する非特異的ピーク検出工程（異品種ピーク検出工程）Ｓ３を行う。該非特異的ピーク検出工程Ｓ３は、公知の装置である、マイクロチップ電気泳動システム（商品名：ＳＶ１２１０コスモアイ，日立化成工業株式会社製）を用いて解析を行う。図２は、前記ＰＣＲ産物を前記マイクロチップ電気泳動システムにセットして解析した結果である。一方、図３は、予め測定しておいた、本実施例のように上記６種の対合プライマー及びポジティブプライマーを使った際の、「コシヒカリ」（想定品種）が示すピークのパターンとポジコンを示したものである。この図３から、「コシヒカリ」は、５４８塩基サイズの位置にピークを示し、前記第２対合プライマーにのみに反応を示していることが分かる。なお、前記第２対合プライマー以下の５種類の対合プライマーについては、仮に反応があった場合には、
第１対合プライマーは１０４６塩基サイズの位置に、
第３対合プライマーは１５９６塩基サイズの位置に、
第４対合プライマーは４０９塩基サイズの位置に、
第５対合プライマーは６２６塩基サイズの位置に、
第６対合プライマーは１３５４塩基サイズとする位置に、
それぞれピークが検出されるように塩基配列が設計してある。
【００２０】
前記非特異的ピーク検出工程Ｓ３は、前記図２と図３とを基に、図２に示された複数のピークの中から、図３に示された想定品種のコシヒカリのピーク、つまり、サイズ５４８塩基に現れたピーク（特異的ピーク）をまず取り除く。取り除いた結果、本実施例では、異品種の米粒が示す異品種ピーク（以下、「非特異的ピーク」という）が三つ検出され、これにより、前記米粒サンプルには異品種の米粒が含まれていることが示される。前記異品種ピークの一つ目は、１０４６塩基サイズのピーク（以下「非特異的ピークＡ」という）であり、前記第１対合プライマーに反応を示したピークである。二つ目は１３５４塩基サイズのピーク（以下「非特異的ピークＢ」という）であり、前記第６対合プライマーに反応を示したピークである。三つ目は１５９６塩基サイズのピーク（以下「非特異的ピークＣ」という）であり、前記第３対合プライマーに反応を示したピークである（図２）。なお、図２及び図３に検出されたピークＬは、アッパーマーカーであり特異的ピーク又は非特異的ピークではない。また、図２及び図３に検出されている、前記ポジティブプライマーを添加したことによって現れるポジティブコントロール（以下「ポジコン」という）についても同様に、特異的ピーク又は非特異的ピークではない。
【００２１】
ピーク強度値検出工程（Ｓ４）：
次に、ピーク強度値検出工程は、図２に示された、前記非特異的ピークＡ，Ｂ，Ｃ及びポジコンの各ピーク強度値を検出する。検出結果は、以下のとおりである。
各ピーク強度値：
非特異的ピークＡ：５０３
非特異的ピークＢ：４１４
非特異的ピークＣ：３７８
ポジコン：３９５９
【００２２】
除算工程（Ｓ５）：
次に、除算工程として、前記ピーク強度値検出工程で検出した各ピーク強度値を基に、前記非特異的ピークＡ，Ｂ，Ｃのそれぞれのピーク強度値をポジコンのピーク強度値で除算する。この除算結果は以下のとおり。
除算結果：
（１）非特異的ピークＡの除算値
非特異的ピークＡ÷ポジコン＝５０３÷３９５９＝０．１２７
（２）非特異的ピークＢの除算値
非特異的ピークＢ÷ポジコン＝４１４÷３９５９＝０．１０５
（３）非特異的ピークＣの除算値
非特異的ピークＣ÷ポジコン＝３７８÷３９５９＝０．０９５
【００２３】
異品種混入割合判定工程（Ｓ６）：
次に、前記異品種混入割合判定工程は、前記除算値と検量線（後述）とを用いて異品種の混入割合を判定する。前記検量線は、前記第１〜第６の対合プライマーごとに予め求めるものである。前記検量線の作成は、まず、単一の対合プライマーに、前記ポジティブプライマーを混入した前記調製液（前記ＤＮＡ増幅工程（Ｓ２））を作り、当該調製液に対してピークが検出されない品種１とピークが検出される品種２とを予め求めておく。そして、前記品種１（ピークが検出されない）に品種２（ピークを検出する）を１０％，２０％，３０％・・・の割合でそれぞれ混入させた各米粒サンプルを用意し、該各米粒サンプルにおける品種２のピーク及びポジコンの各ピーク強度値から前記除算値を演算し、前記品種２の混入割合が異なる各米粒サンプルとその該除算値との関係から検量線が作成される。これと同様にして、他の単一の対合プライマーについても検量線を予め求めておく。図４の（１）は、前記非特異的ピークＡを検出した第１対合プライマーの検量線とその寄与率Ｒ2を示す。図５の（１）は、非特異的ピークＢを検出した第６対合プライマーの検量線とその寄与率Ｒ2を示す。さらに、図６の（１）は、非特異的ピークＣを検出した第３対合プライマーの検量線とその寄与率Ｒ2を示す。これらの第１、第６、第３の対合プライマーの各検量線と、その各非特異的ピークＡ，Ｂ，Ｃの除算値とに基づいて異品種の混入割合を判定すると、以下の結果となる。
（１）第１対合プライマーの検量線（図４）によると、非特異的ピークＡの除算値０．１２７に対する異品種混入割合は、９％。
（２）第６対合プライマーの検量線（図５）によると、非特異的ピークＢの除算値０．１０５に対する異品種混入割合は、８％。
（３）第３対合プライマーの検量線（図６）によると、非特異的ピークＣの除算値０．０５９に対する異品種混入割合は、８％。
【００２４】
以上のことから、非特異的ピークＡにおける異品種混入割合は９％、非特異的ピークＢにおける異品種混入割合は８％、非特異的ピークＣにおける異品種混入割合は８％、と求められたことから、本実施例の米粒サンプル（被検査用の米粒群）の異品種混入割合は、前記最低値から最高値の範囲内である、８％〜９％と判定するものである。この判定結果は、本実施例の米粒サンプルとした「コシヒカリ」（想定品種）に約９％の「想定品種以外の異品種である、きらら３９７」を混入したものと一致する。
【００２５】
また、本発明における異品種混入割合の判定は、上記のように最高値から最低値の範囲内とするだけでなく、最高値と最低値の平均値としてもよい。さらに、本実施例においては、非特異的ピークは三本検出されたが、米粒サンプルによってはこれが３本以外になることもある。このように非特異的ピークの検出数が３本以外であったとしても、問題はなく、前述と同様の工程によって異品種混入割合の判定を行えばよい。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の米粒中の異品種混入割合判定方法を説明するフローチャート。
【図２】実施例において、「コシヒカリ」（想定品種）に「その他の異品種（きらら３９７）」を添加した米粒サンプルをマイクロチップ電気泳動法にかけた結果。
【図３】実施例において、「コシヒカリ」をマイクロチップ電気泳動法にかけた結果。
【図４】（１）は、第１対合プライマーにおける検量線。（２）は同検量線を用いて異品種混入割合を判定した実施例。
【図５】（１）は、第６対合プライマーにおける検量線。（２）は同検量線を用いて異品種混入割合を判定した実施例。
【図６】（１）は、第３対合プライマーにおける検量線。（２）は同検量線を用いて異品種混入割合を判定した実施例。
【符号の説明】
【００２７】
Ｓ１  ＤＮＡ抽出工程
Ｓ２  ＤＮＡ増幅工程
Ｓ３  非特異的ピーク検出工程（異品種ピーク検出工程）
Ｓ４  ピーク強度値検出工程
Ｓ５  除算工程
Ｓ６  異品種混入割合判定工程
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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