(57)【要約】【課題】  ミッドカイン（MK）をターゲットとした子宮内膜症を予防または治療するための薬剤、並びに子宮内膜症の検査方法および検査薬を提供することを目的とする。【解決手段】  培養された子宮内膜間質細胞に及ぼすMKのマイトゲン活性を調べることにより、MKがESCの増殖を刺激することを明らかにした。また、腹腔液（PF）におけるMK濃度を評価することにより、進行子宮内膜症の女性のPFにおいてMKレベルが増加していることを明らかにした。さらに、GnRHアゴニストによる治療を受けている女性のPFにおけるMK濃度は、他の群の濃度より有意に低いことが分かった。また、MK mRNAが、腹腔骨髄由来細胞、腹膜および子宮内膜組織において発現していることを示した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分とする、子宮内膜症を予防または治療するための薬剤。
【請求項２】
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制する化合物がオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制し得るオリゴヌクレオチドが以下の（ａ）または（ｂ）である、請求項２に記載の薬剤。
（ａ）ミッドカイン遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド
（ｂ）ミッドカイン遺伝子を標的とするdsRNA
【請求項４】
ミッドカインタンパク質の機能を抑制する化合物を有効成分とする、子宮内膜症を予防または治療するための薬剤。
【請求項５】
ミッドカインタンパク質の機能を抑制する化合物がミッドカインに結合する抗体である、請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
被検者より採取した試料中のミッドカイン遺伝子の発現を測定する工程を含む、子宮内膜症の検査方法。
【請求項７】
被検者より採取した試料が腹腔液、腹腔骨髄由来細胞、腹膜組織または子宮内膜組織である、請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】
ミッドカイン遺伝子発現の測定がミッドカインタンパク質またはミッドカインタンパク質をコードしたmRNAを基に測定される、請求項６または７に記載の検査方法。
【請求項９】
抗ミッドカイン抗体を含む子宮内膜症検査用試薬。
【請求項１０】
ミッドカイン遺伝子領域にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、子宮内膜症検査用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミッドカインを抑制する化合物を有効成分として含有する子宮内膜症を予防または治療するための薬剤並びにミッドカインの発現を指標とする子宮内膜症の検査方法および検査薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮内膜症は、生殖可能年齢の女性の健康を悪化させる不可解な疾患である（Momoedaら、2002；Osugaら、2002）。この疾患の原因は、逆行性月経における子宮内膜組織片が腹腔において定着、生存および増殖することにあると広く考えられている。しかし、この仮説は、女性のほとんどに逆行性月経が認められるにも関わらず、なぜごく一部の女性のみが子宮内膜症に罹患するのかとの疑問に答えられない（Halmeら、1984）。子宮内膜症を患う女性で認められる様々な異常の中で、疾患の発症に腹腔環境の変化が極めて重要であることを、多くの証拠が示唆している（Haradaら、2001；Lebovicら、2001）。また、TNF、HGF、SCF、IFN-γのような成長因子もしくはサイトカインの濃度が、子宮内膜症の女性の腹腔液（以下PFと称す）では、健常な女性と比較して、変化することが示されている（Kogaら、2000；Osugaら、1999；Osugaら、2000；Yoshinoら、2003）。これらの物質は、細胞の生存、細胞増殖、および血管新生において様々な役割を有し、子宮内膜症の進行を刺激することが示唆されている。
【０００３】
ミッドカイン（以下MKと称す）は、細胞増殖、細胞遊走、血管新生、炎症の誘導および線維素溶解のような多面的活性を有する分子である（Muramatsu、2002；Horibaら、2000；Takadaら、1997）。細胞増殖の促進、血管新生および炎症などの機能は全て、腫瘍および子宮内膜症のような腫瘍様病変の発症において重要であることが示唆されている。実際に、多くの悪性腫瘍において高レベルのMKが報告されており、癌の発症に関係することが示唆されている（Garver, Jr.ら1994；Tsutsuiら、1993；Nakagawaら、1995；O'Brienら、1996；Koideら、1999；Aridomeら、1995；Katoら、2000；Konishiら、1999）。MKはまた、子宮内膜症においても検出され、そのレベルは健常な女性と比較して子宮内膜症の女性における正所子宮内膜細胞では高い（非特許文献１参照）。
一方、正所子宮内膜と比較して、異所子宮内膜が顕著に低レベルのMKを発現するということが知られている（非特許文献１参照）。
【非特許文献１】Chung HW et al, Mol Hum Reprod 8, 350-355(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、MKが子宮内膜症の発症に関与することを明らかにし、MKをターゲットとした子宮内膜症を予防または治療するための薬剤、並びに子宮内膜症の検査方法および検査薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。本発明者らは、まず、子宮内膜細胞が、子宮内膜細胞由来のMKのみならず、他の起源からのMKによって刺激されると考え、培養された子宮内膜間質細胞（以下ESCと称す）に及ぼすMKのマイトゲン活性を調べることにより、MKがESCの増殖を刺激することを明らかにした。次に、PFにおけるMK濃度を評価することにより、進行子宮内膜症の女性のPFにおいてMKレベルが増加していることを明らかにした。さらに、GnRHアゴニストによる治療を受けている女性のPFにおけるMK濃度は、他の群の濃度より有意に低いことが分かった。また、MK mRNAが、腹腔骨髄由来細胞（以下PBMCと称す）、腹膜および子宮内膜組織において発現していることが判明した。
以上の知見は、MKが子宮内膜症の発症や進行に関与することを示唆している。従って、MKの阻害により、子宮内膜症を予防または治療でき、またMKの発現を指標として子宮内膜症を検査できると考えられる。
【０００６】
すなわち本発明は、以下の〔１〕〜〔４〕を含む発明を提供するものである。
〔１〕ミッドカイン遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分とする、子宮内膜症を予防または治療するための薬剤。
〔２〕被検者より採取した試料中のミッドカイン遺伝子の発現を測定する工程を含む、子宮内膜症の検査方法。
〔３〕抗ミッドカイン抗体を含む子宮内膜症検査用試薬。
〔４〕ミッドカイン遺伝子領域にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、子宮内膜症検査用試薬。
【発明の効果】
【０００７】
本発明では、子宮内膜細胞が、子宮内膜細胞由来のMKのみならず、他の起源からのMKによって刺激されることを初めて明らかにした。さらに、PF中のMKレベルは、軽度の子宮内膜症を有するまたは子宮内膜症を有しない女性と比較して、進行子宮内膜症の女性では増加することを証明し、PF中のMKが子宮内膜症の発症や進行に関与することを示した。
以上の知見に基づき、MKをターゲットとした子宮内膜症を予防または治療するための薬剤、並びにMKの発現を指標とした子宮内膜症の検査方法および検査薬を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、MK遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分とする、子宮内膜症を予防または治療するための薬剤を提供するものである。
子宮内膜症関連因子としてのMK遺伝子は、好適には、配列番号：１に示すヒトMK遺伝子を挙げることができるが、これに限定されるものではなく、MK遺伝子と同等に子宮内膜症を発生・誘導し得るタンパク質をコードした類似のDNAも「子宮内膜症関連因子」としてのMK遺伝子に含まれる。配列番号：１に記載のDNAと機能的に同等な配列は、同種由来の変異体や異種由来のMK遺伝子ホモログなどが含まれる。例えば、既に報告されているマウスMK遺伝子（Kadomatu, K., et al., Biochem. Biophy. Res. Commun., 151, 1312(1988)）は配列番号：１に記載のDNAと機能的に同等な配列の一例であり、本発明の子宮内膜症関連因子としてのMK遺伝子に含まれる。
【０００９】
このような配列番号：１に記載のDNAと機能的に同等の配列は、例えば、配列番号：１に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ子宮内膜症誘導活性を有するポリペプチドをコードしたDNAを挙げることができる。このようなDNAには、配列番号：１に記載のDNAの縮重変異体も含まれる。
【００１０】
上記配列番号：１に記載のヒト由来のMK遺伝子の調製は、ヒトcDNAライブラリーより配列番号：１に記載された配列またはその一部と相同性の高い配列を保持するクローンを選択し、選択されたクローンより回収することにより実施することができる。MK遺伝子を得るためのヒトcDNAライブラリーは、たとえば、ヒトの腎臓、ヒトの胎児の腎臓、脳、結合組織又はこれらの培養細胞由来トータルRNAに基づき構築されたものを用いることができる。また、天然から取得する以外に、配列番号：１に記載の配列に基づいてDNA合成器により合成してもよい。
【００１１】
また、配列番号：１に記載のDNAと機能的に同等の配列の調製は、ヒト以外の哺乳動物細胞（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ）由来のｃDNAライブラリーより配列番号：１記載の配列またはその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするクローンを選択することにより実施することができる。ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。例えば、ハイブリダイゼーションの条件として、好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、0.1×SSC及び0.1％SDSの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するDNAが効率的に得られると期待される。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、配列番号：１に記載のDNAと機能的に同等の配列の調製は、上述のように天然に存在するものから選抜する方法の他に、配列番号：１に記載の配列からなるDNAを適宜、遺伝子工学的に改変して調製することもできる。
【００１２】
子宮内膜症関連因子としてのMKポリペプチドは、好ましくは、配列番号：１に記載のDNAがコードするMKポリペプチドを挙げることができるが、これに限定されるものではなく、配列番号：１に記載のDNAがコードするMKポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、子宮内膜症誘導活性を有するポリペプチドを含めることができる。
【００１３】
上記MKと機能的に同等なポリペプチドは、通常、MKとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも50％以上の同一性、好ましくは75％以上の同一性、さらに好ましくは85％以上の同一性、さらに好ましくは95％以上の同一性を指す。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)などによって決定することができる。
【００１４】
MKのアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドもまた本発明に含まれる。変異するアミノ酸数は、通常、30アミノ酸以内であり、好ましくは15アミノ酸以内であり、より好ましくは5アミノ酸以内（例えば、3アミノ酸以内）であり、さらに好ましくは2アミノ酸以内である。これら変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えば、アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
【００１５】
本発明におけるMK遺伝子の発現を抑制する化合物の一つとしては、MK遺伝子の発現を抑制し得るヌクレオチドを挙げることができる。
MK遺伝子の発現を抑制し得るヌクレオチドの第一の態様としては、MK遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１の塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：１の塩基配列中の連続する少なくとも15個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも15個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００１６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的となるMK DNA又はmRNAの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、オリゴヌクレオチドと配列番号：１に示される塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、1 又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。
【００１７】
MK遺伝子発現を抑制し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドの分子設計については、例えば、MK mRNAの一次配列を基に、最小のエネルギーを持つ二次構造をコンピュータープログラムで予測する。この予測される二次構造に基づいて、塩基対を作らないループ部分をアンチセンスオリゴヌクレオチド配列候補として選択することができる。一例を示せば、ヒトMKのmRNA（GenBank Accession No. M69148：Tsutsui J. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:792-797, 1991）の二次構造予測をコンピュータ解析により行うと、（ヒトMK mRNA配列の塩基番号15番目から32番目に基づく）（配列番号：２）、および5'末端近傍でループを作らない配列に対応するアンチセンスDNA、（ヒトMK mRNA配列の塩基番号1番目から18番目に基づく）（配列番号：３）を設計することができる。
配列番号：２   5’−AGGGTGAGGAGGAGGAAG−3’
配列番号：３   5’−GAAGCCTCGGTGCTGCAT−3’
【００１８】
しかし、本発明のオリゴヌクレオチドは上記具体的に示された配列に限定されるものではなく、配列番号：１の配列に基づいて、適宜設計することができる。そして、設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド配列がMKの発現抑制活性を有するか否かの判定は、次の通り行うことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を持つ物質を、MKを合成分泌している細胞に投与し、培養液中に分泌されるMKを免疫生化学的に定量する。MKの免疫生化学的定量法としては酵素免疫法（Muramatsu, H. et al.：J. Biochem., 119：1171-1175, 1996）あるいはSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後のウェスタンブロッティング（Muramatsu, H. et al.：Dev. Biol., 159；392-402， 1993）そしてデンシトメーターによる定量がある。この定量によりMK遺伝子産物の産生を低下させ得るアンチセンスオリゴヌクレオチドはMKの遺伝子発現を抑制し得るものとして選択することができる。
【００１９】
また上記「オリゴヌクレオチド」という用語は、DNAおよびRNAのデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド構造のような天然に存在するオリゴマーの核酸部分、ならびに天然に存在する核酸に結合する能力のある人工アナログの両方を包含する。人工アナログとしては、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体、モルホリノ修飾体、逆向きチミジン修飾体等が挙げられる。したがって、上記設計されたオリゴヌクレオチドは必要に応じて、これらいずれかにより修飾されてもよい。こうした修飾体は既に開発されており、既に開発されている修飾体を本発明の子宮内膜症治療薬に応用してもよい。例えば、モルホリノ修飾体は特開2003-210170に、ホスホロチオエート修飾体は特開2002-142778に、逆向きチミジン修飾体は特開2003-210171に開示されている。
【００２０】
これら修飾体のうちホスホジエステル結合したオリゴヌクレオチドは、血清でまたは細胞内部でヌクレアーゼの作用を特に受けやすい。そのため本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの好適な態様としては、ヌクレアーゼ抵抗性であるホスホロチオエート結合あるいはメチロホスホネート結合したアナログなどである（Stein et al., Cancer Research 48: 2659, 1998）。
なお、このようなオリゴヌクレオチドの人工アナログは、当業者らに周知の方法、例えば、市販の機械およびPerkin-Elmer/Applieds Biosystem（Foster City, CA）より入手できる試薬を用いる方法によって調製することができる。
【００２１】
本発明の他の態様において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドそのものの形態でなくともよく、例えば、発現ベクターなどに搭載させた発現構築物として標的細胞を感染させた後にアンチセンスRNA分子として生成させてもよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ-L-リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、0.1〜100mg/kg、好ましくは0.1〜50mg/kgの範囲で投与することができる。
【００２２】
MK遺伝子の発現を抑制するヌクレオチドの第二の態様としては、MK遺伝子を標的としたdsRNAが挙げられる。
「MK遺伝子を標的としたdsRNA」とは、MK遺伝子の発現をRNA干渉（RNAi）により抑制し得るdsRNAを意味する。MK遺伝子発現をRNAiで抑制するためのdsRNAは、一方の鎖は少なくともMK mRNAと相補する配列を備える。発現抑制し得る部位であれば、MK mRNAのいずれの領域において相補関係を有してもよい。また、この相補性は、RNAiを誘導しMK遺伝子発現を抑制し得る限り、完全である必要はなく、標的配列との間で数塩基程度のミスマッチを有しても良い。
【００２３】
dsRNAは、人工的に合成されたdsRNAそのもの、あるいは発現ベクターにより哺乳動物細胞内で発現させたdsRNAの双方の形態を採用することができる。
dsRNAを人工的に合成し、哺乳動物細胞に導入する場合、発現ベクターからdsRNAを発現させる場合のいずれの場合にも、長鎖dsRNAによる哺乳動物細胞への細胞毒性を考慮する必要がある。そのため、人工的に合成したdsRNA（以下「合成dsRNA」という）、発現により生成されるdsRNAのいずれも、鎖長は例えば19〜30塩基対とすることがよいが、これよりも長いdsRNAであっても細胞毒性を与えないものであれば用いることができる。
上記MK mRNAを標的としたdsRNAは、生体内でMK mRNAと対合し、生体内の酵素によりMK mRNAの切断を誘導する。そのため、MKのmRNAからタンパク質への翻訳を阻害し、結果としてMKの発現を抑制し、子宮内膜症発症を抑制することが可能となる。
【００２４】
本発明の第二の側面として、MKタンパク質の機能を抑制する化合物を有効成分とする、子宮内膜症を予防または治療するための薬剤が提供される。
MKの機能を抑制する化合物としては、MKに結合する抗体が挙げられる。
MKの作用を抑え得る既に開発されている抗MK抗体（Muramatsu H. et al., Dev. Biol. 159: 392-402, 1993）を本発明の子宮内膜症治療・予防用に応用してもよい。また、ヒトMKに対するモノクローナル抗体も開発されており（特開2002-085058）、これを応用してもよい。しかし、本発明の抗体はこれら既に報告されている抗体に限定されるものではなく、後述の検査方法において説明する抗MK抗体の作製方法により作製された抗MKポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いることもできる。
【００２５】
また、治療剤に使用するMK抗体は組み換え型抗体や改変抗体を用いることも有効である。組み換え型抗体としては、例えば、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んでこれを宿主に導入し、遺伝子組み換え技術を用いて産生させた組み換え型抗体を用いることができる（例えば、Borrebaeck C. A. K. & Larrick J. W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990）。改変抗体としては、例えばキメラ抗体、ヒト型化抗体が使用できる。キメラ抗体は、ヒト抗体以外の抗体V領域をコードするDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し、産生させることにより得ることができる（EP 125023, PCT WO96/02576）。
本発明で使用される抗体は、MKに結合しMKの活性を阻害するかぎり、抗体の断片や修飾物であってもよい。例えば、抗体の断片として、Fab、F(ab')2、FvまたはH鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェイン Fv(scFv)が挙げられる。
【００２６】
本発明の第三の側面として、被検者より採取した試料中のMK遺伝子の発現を測定する工程を含む子宮内膜症の検査方法が提供される。
MKは後述の実施例でも説明するように、子宮内膜症の発生に関与すると考えられる。従って、患者における子宮内膜症の発生原因を調査し、患者に対して適切な処理を行うためには、子宮内膜症の検査としてMK遺伝子の発現を測定することが有用となる。
被検者より採取される試料としては、例えば、PF、PBMC、腹膜組織または子宮内膜組織などを用いることができる。
【００２７】
MK遺伝子発現の測定における第一の態様として、翻訳産物であるMKタンパク質を測定する。先ず、上述した被検者の試料よりタンパク質試料を調製する。次いで、該タンパク質試料からMKタンパク質量を測定する。測定されたタンパク質量を健常者などのMK発現量に基づいた対照値などと比較する。この比較の結果、被検者のMKタンパク質が対照に比べて有意に上昇している場合には、被験者が子宮内膜症を発症する可能性がある、または、すでに発症していると判定される。
上記MKタンパク質の測定は、SDSポリアクリルアミド電気泳動法、並びにMKタンパク質に対する抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法(ELISA)、および免疫蛍光法を例示することができる。
【００２８】
また、MK遺伝子の発現を測定するための別の方法としては、転写産物であるMK mRNAを測定する。先ず、上記被検者試料からトータルRNA試料を調製する。トータルRNAの調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。例えば、トータルRNA調製用のキット"Isogen"（ニッポンジーン社）を用いて実施することができる。次いで、該トータルRNA試料に含まれるMK mRNA量を測定する。測定されたRNAの量を対照と比較する。
【００２９】
別の態様としては、被検者試料からcDNA試料を調製する。cDNA試料の調製は、上述したトータルRNAを鋳型として、逆転写酵素を用いてcDNAの合成を行うことで実施し得る。次いで、該cDNA試料に含まれるMK cDNA量を測定する。測定されたcDNAの量を対照と比較する。
これらmRNAやcDNAを基に遺伝子発現を測定する方法としては、当業者に周知の方法、例えばノーザンブロッティング法、RT-PCR法、DNAアレイ法等を挙げることができる。
mRNAまたはcDNAの比較の結果、被検者のMKタンパクmRNAまたはcDNAのが対照に比べて有意に上昇している場合には、被験者が子宮内膜症を発症する可能性がある、または、すでに発症していると判定される。
【００３０】
本発明の第四の側面として、子宮内膜症の検査方法に用いるための検査用試薬が提供される。このような検査用試薬としては、上記検査方法に使用し得るMK遺伝子の一部配列を含むオリゴヌクレオチドを主成分とする検査薬（オリゴヌクレオチドプローブが固定された基板を含む）や、抗MK抗体を含む検査薬が挙げられる。これら抗体やオリゴヌクレオチドは、検査方法に応じて、標識が付加されていてもよい。
【００３１】
子宮内膜症の検査方法に用いるための検査用試薬における第一の態様として、抗MK抗体を含む子宮内膜症検査用試薬が挙げられる。上記検査薬としての抗MK抗体は、例えば、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、MKを検出し得る抗体であればよい。例えば、ポリクローナル抗体であれば、既に本願発明者らにより開発されている抗体を用いてもよい（Muramatsu H. et al., Dev. Biol. 159: 392-402, 1993）。モノクローナル抗体もまた既に開発されており（特開2002-085058）、これを好適に利用することができる。
【００３２】
MKに対する特異抗体の作製は、公知の方法に準じて実施することができる。モノクローナル抗体は、例えば、配列番号：１に記載のDNAがコードするヒトMKポリペプチド全体を感作抗原として、または抗原性を保持し得る長さを有する一部配列を感作抗原として用いて作製してもよい。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には、ケーラーとミルスタインの方法（Kohler G. & C. Milstein, Nature 256: 495-497, 1975）に準じて、以下のようにして作製できる。すなわち、上述したMKタンパク質またはその一部を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般には、齧歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
【００３３】
第二の態様としては、MK遺伝子領域にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む子宮内膜症検査用試薬である。
該オリゴヌクレオチドは、MK遺伝子領域を含むDNA（正常型DNAまたは変異型DNA）に特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第2版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、MK遺伝子領域を含むDNAに対し、完全に相補的である必要はない。
【００３４】
MK遺伝子領域を含むDNAにハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブ（該プローブが固定された基板を含む）やプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーはMK遺伝子領域の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００３５】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、MK遺伝子領域を含むDNAに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも15bp以上の鎖長を有する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖DNA断片として作製することもできる。
【００３６】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの5'端を32Pでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして32P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドとして、配列番号：２または配列番号：３に記載のオリゴヌクレオチドを利用することができるが、本発明のオリゴヌクレオチドは上記具体的に示された配列に限定されるものではなく、配列番号：１の配列に基づいて、適宜設計することができる。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
１．ESCの単離、精製および培養
ESCの初代培養は、Ryan, IP et al.に記載されている方法に、多少の改変を加えた方法により、生検から調製した。子宮内膜組織をその下の柔組織から切り離し、小片に細分化し、DMEM/F12においてI型コラゲナーゼ（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）およびデオキシリボヌクレアーゼI（タカラ（Takara）、東京、日本）と共に37℃で1〜2時間インキュベートして、連続濾過を用いて分離した。細胞片を100 μmのナイロン製細胞濾過器（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、リンカーンパーク、ニュージャージー州）によって除去して、上皮腺のいくつかを70 μmのナイロン製細胞濾過器（ベクトンディッキンソン）によって除去した。濾液に残っている間質細胞を遠心によって回収し、DMEM/F12培地に再浮遊させ、100 mm皿に播種して37℃で30分間接着させた後、リン酸緩衝生理食塩液ですすぐことにより非接着上皮細胞および血球を除去した。細胞を、10％活性炭処理したFBS（ハイクローン（HyClone）、ローガン、ユタ州）および抗生物質（シグマ）を添加したDMEM/F12培地で培養した。細胞がコンフルエントに達した後、0.25％トリプシンによって細胞を解離して、遠心によって回収し、ファルコン96マルチウェルプレート（ベクトンディッキンソン）に1×104個/ウェルで播種して、加湿された5％CO2/95％空気の環境で37℃で維持した。24時間後、間質細胞集団が精製されたことを、以下の抗体（ダコ（Dako））による免疫細胞化学染色によって確認した；ビメンチン（間質細胞）、サイトケラチン（上皮細胞）およびCD45（単球および他の白血球）。間質細胞の純度は、ビメンチンに関する細胞染色が陽性であったことと、サイトケラチンおよびCD45に関する細胞染色が陰性であったことから判断して、98％以上であった。
【００３８】
２．PF試料の採取
本試験の被験者は、疼痛および／または不妊のために腹腔鏡検査を受けた年齢20〜48歳の子宮内膜症を患う女性（n＝106）および健常な女性（n＝33）の、全体で139人である。子宮内膜症は腹腔鏡および組織学の双方によって診断した。疾患の程度は、改訂アメリカ生殖医学会（r-ASRM）分類システム（アメリカ生殖医学会、1997）に従って採点した。非子宮内膜症群において、女性14人が卵胞期で、19人が黄体期であった。子宮内膜症群には、腹腔鏡検査まで3ヶ月を超える期間GnRHアゴニストによる治療を受けた女性12人を含む（GnRHa群）。GnRHa群を除く女性は全て、月経周期が規則的であった；そのうち、女性49人が卵胞期であり、45人が黄体期であった。GnRHa治療を受けていない子宮内膜症群では、子宮内膜症の状態は、軽度の子宮内膜症（r-ASRMスコア、1〜5；n＝25）、および進行子宮内膜症（r-ASRMスコア≧6、n＝69）であると分類され、軽度の子宮内膜症は疾患の開始段階であると仮定した。子宮内膜症群の女性の年齢は32.7±4.1歳（平均値±SD）であり、非子宮内膜症群の女性の年齢と本質的に同じであった（31.1±5.6歳）。本研究は、東京大学学内倫理委員会の承認を受け、試料の採取に関しては各女性から署名された同意書を得た。
【００３９】
PFは、何らかの操作技法の前にダグラス窩に導入した腹腔鏡カニューレから採取した。PFを400×gで10分間遠心して、上清をアッセイするまで-80℃で凍結保存した。腹膜および子宮内膜組織も同様に採取した。
PBMCは、周知の方法で採取した（Yoshinoら、2003）。簡単に説明すると、採取したPFを200×gで5分間遠心して、上清を除去した。細胞沈降物をリン酸緩衝生理食塩液（PBS）に再浮遊させて、フィコール-パック（アマシャムバイオサイエンシズ（Amersham Biosciences）、アップサラ、スウェーデン）に重層して、150×gで30分間遠心した。PBMCを界面から回収した。
【００４０】
３．細胞増殖アッセイ
細胞増殖アッセイは、本発明者らが先に報告した方法で実施した（Tangら、2002）。バイオトラック細胞増殖ELISAシステム（アマシャムバイオサイエンシズ）を用いて製造元の説明書に従って、DNAへの5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）取り込みを測定することによって、ESCの増殖に及ぼすMKの作用を調べた。簡単に説明すると、ESCをファルコン96マルチウェルプレートに1×104個/ウェルの密度で、異なる濃度（0、10、100および1000 ng/ml）のMKと共に培養培地100 μlにおいて播種した。24時間後、BrdU溶液100 μlを加えて37℃でさらに2時間インキュベートした。 培養培地を除去した後、細胞を固定して、固定液200 μl/ウェルを加えてDNAを変性させた。ペルオキシダーゼ標識抗BrdU抗体は、新たに合成された細胞DNAに取り込まれたBrdUに結合した。その後の基質反応によって免疫複合体を検出し、得られた色をディジスキャンマイクロプレートリーダー（ASYSハイテクGmbH、オイゲンドルフ、オーストリア）において450 nmで読み取った。
【００４１】
４．MKの測定
PFにおけるMK濃度は、明治乳業（小田原、日本）から寄贈され、またはセルシグナルズ（Cell Signals、横浜、日本）所用の酵素結合イムノアッセイ（EIA）を用いて決定した。このEIAの検出限界は、0.1 ng/ml/試料であった。
【００４２】
５．RNA抽出、MK mRNAの逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）
RNイージーミニキット（キアゲン（QIAGEN）、ヒルデン、ドイツ）を用いて、総RNAをPBMC、腹膜、および子宮内膜組織から抽出した。RT-PCRは、レバー・トラ・ダッシュ（東洋紡、東京、日本）を用いて行った。総RNA 1 μgを全量20 μl中で逆転写して、ヒトMK配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いてcDNAを増幅した。ヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）プライマー（東洋紡、東京、日本）を用いて、RNAの質および量を確認した。320 bp断片を増幅するために、MKプライマー（センス、5’-CCTGCAACTGGAAGAAGGAG-3’（配列番号：４）；アンチセンス、5’-AGCAGACAGAAGGCACTGGT-3’（配列番号：５））を選択した。MKおよびGAPDHの増幅に関するPCR条件は、98℃で10秒、60℃で2秒および74℃で20秒を30サイクルであった。PCR産物を、エチジウムブロマイドを用いるアガロースゲル電気泳動によって分析した。それぞれのPCR産物を、QIAEX IIゲル抽出キット（キアゲン）によって精製し、ABI PRISM（商標）310遺伝子アナライザ（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いてその同一性を確認した。
【００４３】
６．統計分析
ANOVAを用いて培養細胞のBrdU取り込みを比較した。PF中のMKのデータは、中央値と四分位数間範囲（IQR）として記述した。マン-ホイトニー検定を用いてPF中のMK濃度を比較した。p<0.05は、統計学的に有意であると考えられる。
【００４４】
〔実施例１〕
培養されたESCに及ぼすMKのマイトゲン活性を、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）取り込みを測定することによって調べた。子宮内膜症を患う女性または健常な女性のPFにおけるMK濃度と、GnRHアゴニストにより治療中の女性の場合の濃度を、特異的酵素イムノアッセイを用いて測定した。PBMC、腹膜および子宮内膜組織におけるMK mRNAの発現を、RT-PCRによって評価した。
ESCにおけるDNA合成に及ぼすMKの作用を図1に示す。DNAへのBrdU取り込みは、100および1000 ng/mlのMKによって有意に増加した。1000 ng/mlのMKはBrdU取り込みレベルを対照の125％まで増強した。
【００４５】
調べたPF試料は全て、アッセイ限度を超える検出可能な濃度のMKを含んでいた。軽度の子宮内膜症（I期）を患う女性のPF中のMK濃度（0.93 ng/ml、0.87〜1.17；中央値、IQR）は、健常な女性のMK濃度と実質的に同じであった（0.97 ng/ml、0.67〜1.27）。従って、本発明者らは、健常な女性と軽度の子宮内膜症を患う女性のデータとを合わせて、進行子宮内膜症（II、III、およびIV期）（r-ASRMスコア≧6）の女性のデータと比較した。図2に示すように、進行子宮内膜症の女性のPFにおけるMK濃度（1.21 ng/ml、0.80〜2.27）は、健常な女性および軽度の子宮内膜症である女性のMK濃度（0.96 ng/ml、0.67〜1.26、p<0.05）より有意に高かった。GnRHアゴニスト治療を受けている女性のMK濃度は、他の二群の濃度より有意に低かった（p<0.001）。PF中のMK濃度を月経期に従って比較すると、黄体期の濃度（1.32 ng/ml、0.72〜2.21）は、卵胞期の濃度（0.95 ng/ml、0.68〜1.24、p<0.05）より有意に高かった。
図3に示すように、MK mRNAの発現は、PBMC、腹膜、および子宮内膜組織において320 bpで明確なバンドとして検出された。
【００４６】
本発明において、本発明者らは、MKがESCの増殖を刺激することを示した。さらに、PF中のMKレベルは、軽度の子宮内膜症を患う女性または健常な女性と比較して、進行子宮内膜症の女性では増加した。
興味深いことに、子宮内膜症の女性における正所子宮内膜細胞は、健常な女性と比較して高いレベルのMKを発現する（Chungら、2002）。しかし、同時に、異所子宮内膜病変は、正所子宮内膜と比較してMKの有意に低いレベルを発現することも証明された（Chungら、2002）。本発明者らの知見は、MKが疾患の開始および進行の双方を促進することを考慮すれば、このジレンマを解決するために何らかの役に立つかも知れない。特に、異所子宮内膜以外の他の起源に由来するMKは、疾患の進行に関与する可能性があるが、正所子宮内膜において増加したMKは非常に初期段階の子宮内膜症における逆流子宮内膜細胞の定着および生存に役立つ可能性がある。
【００４７】
最近の報告から、マウスの腹腔損傷モデルにおいてMKが腹腔内癒着を刺激することが示されている（Inohら、2004）。子宮内膜症は疾患の進行に伴って腹腔内癒着を形成しやすいことを考慮すると、MKはまた癒着の形成にも関与する可能性がある。
PFにおけるMK起源は広く分布しているように思われる。本発明者らのRT-PCR分析は、MKがPBMC、腹膜および子宮内膜組織において発現されることを証明した。さらに、排卵時に放出される卵胞液中のMKは、卵胞液が大量のMKを含むことから、PFにおけるMKの一部を構成すると仮定される（Ohyamaら、1994）。卵胞液中のMK濃度が高いことは、PF中のMKが卵胞期と比較して黄体期では増加しているという知見を部分的に説明する可能性がある。
【００４８】
本研究における顕著な知見は、GnRHa治療を受けている女性のMKレベルは、進行子宮内膜症および軽度の子宮内膜症を患う女性または健常な女性と比較して有意に低いということである。エストラジオールは、子宮内膜上皮細胞においてMK mRNA発現を誘導することが報告された（Zhangら、1995）。MK遺伝子（Ueharaら、1992）のプロモーター領域に存在するいくつかのERE半パリンドロームモチーフ（Katoら、1992）が、エストラジオールの作用を引き起こすことが示唆された（Zhangら、1995）。GnRHa治療によって誘導される低エストロゲン状態は、様々な細胞においてMKの遺伝子転写を抑制する可能性がある。さらに、GnRHa治療によって引き起こされた無排卵は、PFにおけるMKレベルを抑制して、腹腔への卵胞液の流入を妨害するように関与しうる。
【００４９】
MKは、線維芽細胞、腫瘍細胞、およびケラチノサイトを含むいくつかの細胞を増殖させることが示されている（Inazumiら、1997；Muramatsu and Muramatsu、1991；Muramatsuら、1993）。しかし、MKの作用機序は、増殖因子シグナルを伝達することができる明確に定義されたMK受容体がないことから、あまり明確ではない（Muramatsu、2002）。このように、MKが子宮内膜細胞を刺激するメカニズムを解明することは現時点では困難であるように思われる。とは言え、MKが疾患の発症を刺激することを考慮すれば、MK阻害剤により、子宮内膜症を治療することができると考えられる。マウス直腸癌細胞では、MKに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、腫瘍の形成を抑制することが示されている（Takeiら、2001）。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】培養ESCのMK誘発増殖を示す図である。ESCの増殖に及ぼすMKの作用を、細胞増殖ELISAを用いることによって、BrdUのDNAへの取り込みを測定することによって調べた。ESCを異なる濃度のMKによって24時間処置した。値は1試料あたり5個ずつの平均値±SEMである。示したデータは、異なるESC調製物を用いた3実験の代表である。*；p<0.05、**；p<0.001（いずれも対照に対して）。
【図２】健常な女性、軽度の子宮内膜症を患う女性（r-ASRMスコア、0〜5、n＝58）、進行子宮内膜症を患う女性（r-ASRMスコア、≧6、n＝69）、およびGnRHアゴニストによって治療した女性（GnRHa、n＝12）のPFにおけるMK濃度を示す図である。四角の枠は、第一四分位（25％）から第三四分位（75％）までの距離を表し、四角の中の水平線は中央値を表す。バーは下限での10パーセンタイルおよび上限での90パーセンタイルを表す。
【図３】PBMC、腹膜および子宮内膜組織におけるMK mRNAの発現を示す写真である。骨髄由来細胞、腹膜、および子宮内膜組織から単離した総RNAを逆転写して、MKのプライマーを用いてPCRによって増幅した。GAPDHの増幅を用いてRNAの質および量を確認した。レーン1〜3：PF中の骨髄由来細胞。レーン4〜6：腹腔組織。レーン7〜9：子宮内膜組織。レーン10：cDNAを含まない陰性対照。レーン11：DNA分子量マーカー。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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