(57)【要約】【課題】分散安定性に優れ、特に、生体導入用として有用な微細炭素繊維分散体を提供する。【解決手段】炭素繊維が、全体の０．００１〜３０質量％の割合で、ポリエチレングリコール中に分散されてなることを特徴とする炭素繊維分散体である。ポリエチレングリコールに直接微細炭素繊維を添加して振とうを加えてやることによって、非常に安定にかつ良好に炭素繊維が分散され、しかもその後、これを例えば各種媒体、特に水等の水性媒体にて希釈しても、微細炭素繊維はこれら媒体中においても安定に微分散された状態を長時間保ち得ることから、特に生体導入用途において好適な炭素繊維分散体となる。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素繊維が、全体の０．００１〜３０質量％の割合で、ポリオール中に分散させてなることを特徴とする炭素繊維分散体。
【請求項２】
ポリオールが、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールからなる群から選ばれてなる少なくとも１つである請求項１に記載の炭素繊維分散体。
【請求項３】
炭素繊維が、全体の０．００１〜３０質量％の割合となるように、さらに水性媒体にて希釈されてなることを特徴とする請求項１または２に記載の炭素繊維分散体。
【請求項４】
生体導入用として用いられることを特徴とする請求項1〜３のいずれか１つに記載の前記炭素繊維分散体。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１つに記載の炭素繊維分散体を、実験動物の組織ないし器官内に導入することで、炭素繊維を定量的に実験動物の体内に留置し、以後の実験動物の状態を経過観察することを特徴とする炭素繊維の安全評価方法。
【請求項６】
外科的手技により実験動物の頸部を切開して気道を確保し、炭素繊維分散体を気道に注入することによって、当該実験動物の肺内に炭素繊維を導入した後、術部を縫合し、その後、当該実験動物の状態を経過観察するものである請求項５に記載の炭素繊維の安全性評価方法。
【請求項７】
外科的手技により実験動物の皮膚を切開し、炭素繊維分散体を皮下に注入することによって、当該実験動物の皮下組織に炭素繊維を埋植した後、術部を縫合し、その後、当該実験動物の状態を経過観察するものである請求項５に記載の炭素繊維の安全性評価方法。
【請求項８】
実験動物がマウスである請求項５〜７のいずれか１つに記載の炭素繊維の安全性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細炭素繊維分散体に関するものである。詳しく述べると、本発明は、分散安定性に優れ、特に、生体導入用として有用な微細炭素繊維分散体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、カーボンナノチューブ（以下、「ＣＮＴ」とも記する。）に代表されるカーボンナノ構造体などの微細炭素繊維が注目されている。
【０００３】
カーボンナノ構造体を構成するグラファイト層は、通常では規則正しい六員環配列構造を有し、その特異な電気的性質とともに、化学的、機械的および熱的に安定した性質を持つ物質である。このような微細炭素繊維は、各種工業的用途における応用の他、薬学、医学的用途等においてもその応用が期待されるところである。
【０００４】
しかしながら、一方で、このような微細炭素繊維は、生成時点で既に塊になってしまい、例えば、生理食塩水等の溶媒中に分散させようとしても、安定に均一分散させることが困難であり、微細炭素繊維を微細粒子として、生体内へ導入することが困難であった。
【０００５】
なお、特許文献１には、化粧料用途として、各種繊維をポリオール中に分散させてなる組成物が示されているが、外用適用を目的としたものであって、繊維としても、広く各種の繊維種を含むものであって、その分散特性を目的としたものではない。
【０００６】
また、最近、アスベストが原因となる肺気腫等の健康被害の問題が大きく取り上げられており、微細炭素繊維に関しても、その用途が広がるにつれ、このような安全性の面を実証する必要性が生じている。このため、例えば、微細炭素繊維を浮遊させた雰囲気中に、マウス等の実験動物を所定時間入れ、呼気によって実験動物の肺内へ微細炭素繊維を入れることが試みられているが、うまく肺内へと微細炭素繊維を導入することができず、また、導入することができたとしても、その導入量を一定量とすることが困難で、このような安全性の評価は困難を極めるものであった。
【特許文献１】特開２０００−３４４６２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明は、分散安定性に優れ、特に、生体導入用として有用な微細炭素繊維分散体を提供することを課題とするものである。
【０００８】
本発明はまた、微細炭素繊維の安全性の評価方法として、確立された実験方法を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決する本発明は、炭素繊維が、全体の０．００１〜３０質量％の割合で、ポリオール中に分散させてなることを特徴とする炭素繊維分散体である。
【００１０】
本発明はまた、ポリオールが、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールからなる群から選ばれてなる少なくとも１つである上記炭素繊維分散体を示すものである。
【００１１】
本発明はさらに、炭素繊維が、全体の０．００１〜３０質量％の割合となるように、さらに水性媒体にて希釈されてなることを特徴とする上記炭素繊維分散体を示すものである。
【００１２】
本発明はさらにまた、生体導入用として用いられることを特徴とする前記炭素繊維分散体である。
【００１３】
上記課題を解決する本発明はまた、上記炭素繊維分散体を、実験動物の組織ないし器官内に導入することで、炭素繊維を定量的に実験動物の体内に留置し、以後の実験動物の状態を経過観察することを特徴とする炭素繊維の安全評価方法である。
【００１４】
本発明はまた、外科的手技により実験動物の頸部を切開して気道を確保し、上述した炭素繊維分散体を気道に注入することによって、当該実験動物の肺内に炭素繊維を導入した後、術部を縫合し、その後、当該実験動物の状態を経過観察するものである炭素繊維の安全性評価方法を示すものである。
【００１５】
本発明はまた、外科的手技により実験動物の皮膚を切開し、上述炭素繊維分散体を皮下に注入することによって、当該実験動物の皮下組織に炭素繊維を埋植した後、術部を縫合し、その後、当該実験動物の状態を経過観察するものである炭素繊維の安全性評価方法を示すものである。
【００１６】
本発明はさらに、実験動物がマウスである炭素繊維の安全性評価方法である。
【発明の効果】
【００１７】
上記課題を解決するため本発明者らは鋭意検討の結果、ポリエチレングリコール等のポリオールに直接微細炭素繊維を添加して攪拌ないし振とうを加えてやることによって、簡単に、非常に安定にかつ良好に炭素繊維が分散され、しかもその後、これを例えば各種媒体、特に水等の水性媒体にて希釈しても、微細炭素繊維はこれら媒体中においても安定に微分散された状態を長時間保ち得ることを見出し、本発明に到達したものである。なお、これは、予めポリオール成分を水性媒体中に添加してなる系に、微細炭素繊維を分散させた場合と比較して、その微分散性および分散安定性の面で明らかに異なる挙動を示すものであり、また、従来公知のように、例えば界面活性剤等の分散剤ないし分散安定剤を使用せずとも良好な分散系が得られることから、特に生体導入用途において、有利である。
【００１８】
さらに、本発明の炭素繊維の安全性評価方法においては、上記したような分散性に優れた炭素繊維分散体を用いるため、実験動物の組織ないし器官内へ、炭素繊維を定量的かつ安全に導入することができる。特に、マウスのような小動物を用いた場合に、直接実験動物の気道中に注入して炭素繊維を肺内に導入しても、気道で炭素繊維が詰まり注入直後に実験動物が窒息死してしまうようなことは生じ難く、術後において長期間実験動物を生存させることが可能となるため、所定量の炭素繊維を実験動物の肺内へ導入し、その後の経過を観察することが可能となる。このため、炭素繊維の安全性を評価する上で、極めて優れた方法となるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を好ましい実施形態に基づき詳細に説明する。
【００２０】
＜炭素繊維分散体＞
本発明に係る炭素繊維分散体は、炭素繊維を全体の０．００１〜３０質量％の割合で、ポリオール中に分散させてなることを特徴とするものである。
【００２１】
Ａ）分散媒
本発明において、分散媒としてのポリオールとしては、公知のように、少なくとも２つのフリーなヒドロキシ基を含む有機化合物が種々含まれ、具体的には、例えば、プロピレングリコール、ブチレングリコール、イソプレングリコール、ペンチレングリコール、ヘキシレングリコール、グリセロール、パンテノール、ポリエチレングリコール、例えば、平均分子量が１８０〜１００００程度のポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、例えば、平均分子量が６０〜２００程度のポリプロピレングリコール等を挙げることができる。
【００２２】
このうち好ましくは、ポリエチレングリコール、特に、平均分子量が１９０〜１５００程度のポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールが望ましい。なお、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールは、生体安全性の面からも好ましい分散媒である。
【００２３】
また、分散媒の粘度としては、特に限定されるものではないが、２５℃±５℃条件下において、液状であることが望ましい。
【００２４】
Ｂ）炭素繊維
次に、本発明において用いられる炭素繊維としては、特に限定されるものではなく、従来公知の各種のものが用いられ得るが、代表的には、主として、炭素の六員環配列構造を有する構造体であって、この構造体の三次元のディメンションのうち少なくとも１つの寸法がナノメートルの領域にある、たとえば、０．４〜１５０ｎｍ程度、好ましくは１５〜１００ｎｍの微細炭素繊維である。
【００２５】
この炭素の六員環配列構造としては、シート状のグラファイトグラフェンシートを例示することができ、さらには、たとえば、炭素の六員環に五員環もしくは七員環が組み合わされた構造等をも含むことができる。
【００２６】
より具体的には、微細炭素繊維としては、たとえば、一枚のグラフェンシートが筒状に丸まってできる直径数ｎｍ程度の単層カーボンナノチューブや、筒状のグラフェンシートが軸直角方向に積層した多層カーボンナノチューブ（多壁カーボンナノチューブ）、単層カーボンナノチューブの端部が円錐状で閉じたカーボンナノホーン、このカーボンナノホーンが直径１００ｎｍ程度の球状の集合体となったカーボンナノホーン集合体等を例示することができる。さらに、炭素の六員環配列構造を有するカーボンオニオン等や、炭素の六員環配列構造中に五員環が導入されたフラーレンやナノカプセル等が包含される。なお、本発明においてこれらの微細炭素繊維は、上記したような種類の単独体とすることも、あるいは、２種以上の混合体とすることも可能である。
【００２７】
このような微細炭素繊維の製造方法としては、高温の（６００℃〜１３００℃）反応炉内に、触媒金属と、気体状もしくは液状の炭素含有化合物とを投入し、反応炉領域中で互いを接触させることにより、原料を熱分解または触媒分解して炭素とし、この炭素を成長させるＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition）法が挙げられる。
【００２８】
また、上記ＣＶＤ法とは、触媒の導入方法で異なるもので、予め金属微粒子を担体に担持させ固体として反応炉内に導入しておき、該反応炉に気体状もしくは液状の炭素含有化合物を導入し、予め導入され担体に担持されている金属微粒子と接触させることで微細炭素繊維を得るＣＣＶＤ（Catalytic Chemical Vapor Deposition）法が挙げられる。
【００２９】
なお、一般にＣＶＤ法においては、触媒金属が使用され、as grownな微細炭素繊維においては、これら金属ないし金属イオンが微細炭素繊維に含まれている場合がある。本発明に係る炭素繊維分散体を、例えば、生体導入用としてあるいは生体ないし組織と接触する可能性のある製品の調製用に用いる場合には、このような金属ないし金属イオンによる毒性の可能性があるため、微細炭素繊維製造後において、例えば、熱処理、例えば、１５００〜３０００℃、より好ましくは２０００〜３０００℃で熱処理することによって、これら金属成分を極力除去してなる炭素繊維を用いることが望ましい。
【００３０】
その他、微細炭素繊維を得る製造方法としては、低圧のアルゴンガスや水素ガスの雰囲気下、２本のグラファイト電極を軽く接触させた後、数ｍｍ程度離した状態で、電圧を印加し、電極間にアーク放電を生じさせることで、グラファイト電極を昇華させ微細炭素繊維を得るアーク放電法や、金属触媒を混合したグラファイトに対して可視パルス・レーザー光を照射し、該グラファイトを蒸発させることで微細炭素繊維を得るレーザー蒸発法等さまざまな製造方法を挙げることができるが、上記したような微細炭素繊維を得ることができる製造方法であれば、いずれのものであってもよい。
【００３１】
なお、このような生体導入用等の用途においては、使用する微細炭素繊維を、例えば、蒸気滅菌、あるいはエチレンオキサイド、ホルムアルデヒド等を用いた化学滅菌、紫外線滅菌、放射線滅菌等適当な方法を用いることによって、予め滅菌処理しておくことが望ましい。
【００３２】
Ｃ）炭素繊維分散体の調製方法
本発明の炭素繊維分散体は、上述したような炭素繊維を所定量、分散媒であるポリオール中に配合し、攪拌ないし振とう処理することによって調製することが可能である。
【００３３】
このようなポリオール中に配される炭素繊維の量としては、組成物全体の０．００１〜３０質量％、より望ましくは、０．００１〜１０質量％程度である。配合量が、０．００１〜３０質量％の範囲内にあると、十分な量の炭素繊維が微分散状態で含まれた安定した分散体が良好な流動性を有しつつ形成されるためである。
【００３４】
攪拌ないし振とう処理の方法としては、特に限定されるものではなく、公知の各種のもの、具体的には、例えば、自動式ないし手動式のシェイカー、マグネティックスターラー、超音波振動子、その他、パドルおよびブレード等の各種攪拌子を備えた攪拌機、グラインダー等を用いることで行うことができるが、このうち、特に、マグネティックスターラーを用いて分散処理を行うことが、炭素繊維自体の構造を破壊することなく、良好な分散状態を形成し得ることから望ましい。
【００３５】
本発明に係る炭素繊維分散体は、上述したようにして調製することが可能であるが、このようにして炭素繊維がポリオール中に分散された分散体は、必要に応じて、各種の媒体、特に、水性媒体中によって希釈することが可能である。このような水性媒体によって、炭素繊維が、全体の０．００１〜３０質量％の割合となるように希釈された場合であっても、得られた希釈系において、炭素繊維は微分散された状態を安定に保ち得る。
【００３６】
本発明に係る炭素繊維分散体を生体導入用として用いる場合、希釈に用いられる水性媒体としては、特に、蒸留水、脱イオン水等の水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養用血清等の生体安全性の高い媒体であることが望ましい。
【００３７】
なお、このように水性媒体中に希釈する際において、本発明に係る炭素繊維分散体に、従来公知の各種分散剤、分散安定剤等をさらに配合すること自体は可能ではあるが、このような分散剤、分散安定剤等を配合しなくとも、十分な分散安定性を発揮し得るものであり、かつまた分散剤として用いられる界面活性剤等による悪影響、例えば生体適合性などといった観点からの影響を考慮すれば、これらの分散剤、分散安定剤等は配合しない方が望ましい態様も多い。
【００３８】
＜炭素繊維分散体の用途＞
本発明に係る炭素繊維分散体は、上述したように、炭素繊維が均一に微分散しかつ安定した分散状態を呈するものであるために、種々の用途、特に生体導入用として好ましく用いられ得る。
【００３９】
生体導入用途としては、特に限定されるものではないが、後述するような炭素繊維の安全評価方法以外に、例えば、炭素繊維として、薬理学的活性物質、例えば、各種薬剤、抗体、蛍光物質等を結合ないし担持させた炭素繊維を用い、これを生体内に導入して、局所的にこれら薬理学的活性物質を付与するドラッグデリバリーシステムのキャリアとして；
炭素繊維の良好な熱伝導性を利用し、生体内の所定部位に導入後、赤外線照射等により発熱させる温熱治療用発熱媒体として；
炭素繊維分散体における微細炭素繊維の良分散性を利用して、生体内の病理部位等の局所部位の近傍部の毛細血管ないし末梢血管まで微細炭素繊維を導入し、毛細血管ないし末梢血管内部にて微細炭素繊維により血管を閉塞させ、それより先の病理部位等の局所部位を壊死除去する閉塞術に使用する材料さらにはカテーテルによる緊急止血用の栓塞材料として；
炭素繊維を放射性物質、蛍光物質等の適当な標識物質で標識化して生体内の所定部位に導入し、検知する放射線ないし化学マーカーとして；
炭素繊維の中空部に水等のプロトン保有物質を液体状態で内包させることにより、核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージングや生体の磁気共鳴画像（ＭＲＩ）装置による診断および治療に用いられる磁気共鳴用造影剤として；
炭素繊維分散体における微細炭素繊維の良分散性を利用して、再生医療などでの細胞培養の足場材料として；
などを例示することができる。
【００４０】
その他、炭素繊維の良好な生体適合性を利用し、各種医療器具、特に、生体内組織ないし細胞と接触し得る注射針、留置針、留置カテーテル、人工臓器、人工骨等の各種インプラント材等の医療器具の表面改質する目的で使用されるコーティング剤を調製する上においても好適に利用され得る。
【００４１】
＜炭素繊維の安全性評価方法＞
本発明に係る炭素繊維分散体は、上述したようにポリオールからなる分散媒中において、炭素繊維が非常に良好でかつ安定な分散性を発揮するものであるから、かなり微細な腔所内部であっても閉塞を起こすことなく安定に通過できるものである。
【００４２】
このため、本発明に係る炭素繊維分散体を用いれば、in vitro的な実験のみならず、直接、実験動物の皮下組織等の組織、あるいは肺内等の器官中に炭素繊維を導入することができ、炭素繊維の安全性評価の上で有効なin vivo的な方法が確立できるものである。
【００４３】
すなわち、本発明に係る炭素繊維の安全性評価方法においては、まず、試験に供する炭素繊維を、上記したようにポリオールを用いて、炭素繊維分散体の形態に調製し、そして、実験動物の所定の組織あるいは器官内に当該炭素繊維分散体を注入することで、これら組織あるいは器官内に炭素繊維を配置し、その後当該実験動物の生存状態、組織、血液等の病理変化等を経過観察するものである。
【００４４】
本発明に係る炭素繊維分散体を用いることによって、炭素繊維導入時の実験動物への負担が大幅に軽減されるため、導入手技自体に起因する実験動物の死亡率が極めて低く抑えられ、また、炭素繊維の定量的な導入が可能となるため、確実かつ安定した評価が可能となるものである。
【００４５】
試験に供する実験動物としては、通常、用いられる任意の種類のものに対して適用することが可能である。特に限定されるわけではないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サル等を用いることが可能である。このうち、特に、豊富な既知データの存在、継代飼育の容易性、入手容易性、遺伝子操作性等の観点から、マウスを用いることが望ましい。
【００４６】
マウスとしては、特に限定されるものではないが、例えば、免疫不全マウス、特に、ＡＳＷ，Ａ／Ｈｅ，ＡＫＲ，ＢＡＬＢ／ｃ、Ｂ１０ＬＰ，Ｃ１７，Ｃ３Ｈ，Ｃ５７ＢＬ，Ｃ５７，ＣＢＡ，ＤＢＡ，ＤＤＤ，Ｉ／ｓｔ，ＮＣ，ＮＦＲ，ＮＦＳ，ＮＦＳ／Ｎ，ＮＺＢ，ＮＺＣ，ＮＺＷ，Ｐ，ＲＩＩＩ及びＳＪＬ等のヌードマウスが好ましく例示できる。
【００４７】
なお、より具体的な組織ないし器官へ導入方法としては、例えば、以下に示すように、実験動物の肺中への導入術、皮下組織への埋植術等を好ましく例示することができる。
【００４８】
すなわち、肺中への導入は、外科的手技により実験動物の頸部を切開して気道を確保し、上述した本発明に係る炭素繊維分散体を気道に注入することによって、当該実験動物の肺内に炭素繊維を導入した後、術部を縫合することによって可能である。
【００４９】
肺中への導入術においては、本発明に係る炭素繊維分散体を利用した場合、マウスのような非常に細い気道を有する動物種においても、導入された炭素繊維分散体中に含まれていた炭素繊維が極めて良好な分散性を有しているため、炭素繊維が気道等に詰まって、手技直後にマウスが窒息死してしまうといった事故が生じる可能性が極めて低い。これゆえ、所定量の炭素繊維が肺中に導入された被検体を良好な生存率をもって調製することが可能となり、炭素繊維の安全性に係る長期間にわたる動物実験が可能となるものである。
【００５０】
本発明に係る安全性評価方法においては、まず、検査しようとする炭素繊維を、全体の０．００１〜３０質量％の割合で、上述したようにポリエチレングリコール等のポリオール中に配合することにより炭素繊維分散体を調製する。
【００５１】
次いで、この炭素繊維分散体を、必要に応じて、水、生理食塩水等によって、炭素繊維が全体の０．００１〜３０質量％の割合となるように希釈する。
【００５２】
そして、試験に供する実験動物、例えば、マウスを、必要に応じて、予め麻酔処理した後、外科的手技によってその頸部を切開し、気道を確保する。
【００５３】
続いて、この気道に、注射針、例えば、マウスの場合、２７G程度の太さの注射針を穿刺し、注射針に接続されたシリンジ等より、所定量の炭素繊維分散体を導入する。なお、シリンジに接続された注射針を気道中に比較的長時間保持することによる、実験動物の窒息の可能性を低下させる上で、予め、端部の開放された留置針を気道に留置し、該留置針開口よりの実験動物の呼吸が可能としておき、呼気が肺に入らないのは炭素繊維分散体注入のわずかな時間のみとすることで、実験動物への負担を軽くすることが望ましい。
【００５４】
最後に、所定量の炭素繊維分散体の注入が終了したら、直ちに、切開部位を縫合することで、所定量の炭素繊維が肺中に導入された被検体を得る。術後、暫く、例えば、１〜２時間経過観察し、生存が確認されたら、その被検体を、その後の炭素繊維の安全性試験に供する。
【００５５】
安全性試験は、例えば、その後の所定時間毎の被検体解剖による組織観察、採取血液の分析、所定時間後の生存率、免疫性反応、病理検査、遺伝子検査、蛋白発現検査等によって行うことができる。
【００５６】
この安全性評価方法において、比較対照（コントロール）としては、特に限定されるものではないが、例えば、炭素繊維を添加していない、分散媒として使用したポリエチレングリコール等のポリオール、あるいはその水、生理食塩水等による希釈体を、前記と同様の手技により肺中に導入した実験動物を用いることができる。
【００５７】
また皮下組織への埋植術は、実験動物の適当な部位、例えば、背中等の部位の皮膚を、外科的に切開し、この切開部位の皮下に、上述した炭素繊維分散体を所定量注入し、その後、切開部位を縫合することによって行うことが可能である。
【００５８】
使用する炭素繊維分散体、術後後の経過観察、安全性試験等に関しては、上述した肺中への導入術の場合と、同様のものであるため説明を省略する。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００６０】
なお、以下において、各物性値は次のようにして測定した。
【００６１】
（１）Ｘ線回折
粉末Ｘ線回折装置（ＪＤＸ３５３２、日本電子製）を用いて、アニール処理後の炭素繊維を調べた。Ｃｕ管球で４０ｋＶ、３０ｍＡで発生させたＫα線を用いることとし、面間隔の測定は学振法（最新の炭素材料実験技術（分析・解析編）、炭素材料学会編）に従い、シリコン粉末を内部標準として用いた。
【００６２】
（２）ラマン分光分析
ラマン分光分析は堀場ジョバン・イボン社製の機器（ＬａｂＲａｍ  ８００）を使用し、アルゴンレーザの５１４ｎｍを用いて測定した。
【００６３】
（合成例１）
ＣＶＤ法によって、トルエンを原料として微細炭素繊維を合成した。
【００６４】
合成装置を図４に示す。
【００６５】
触媒としてフェロセン及びチオフェンの混合物を使用し、水素ガスの還元雰囲気で行った。トルエン、触媒を水素ガスとともに３７５℃に加熱し、生成炉に供給し、１２００℃で滞留時間８秒で反応させた。雰囲気ガスはセパレータにより分離して、循環使用した。供給ガス中の炭化水素濃度は９容量％であった。
【００６６】
合成された中間物質（第１の中間物質）の微細炭素繊維のタール含有率は１０％であった。
【００６７】
次に、この繊維を１２００℃まで昇温し、３０分保持することにより炭化水素分離処理を行い、さらに、２５００℃で高温熱処理をした。炭化水素分離及び高温熱処理工程の装置を図５に示す。
【００６８】
また、前記で説明した図１は、１２００℃での炭化水素分離処理した微細炭素繊維の電子顕微鏡写真である。この図より、微細炭素繊維を構成するグラフェンシートは連続しておらず、パッチ状であることが分かる。
【００６９】
得られた２５００℃での高温熱処理後の微細炭素繊維の電子顕微鏡写真を図２に示す。
【００７０】
この図から、特異な構造を持つ微細炭素繊維が確認できる。生成した繊維の径は、ＳＥＭの観察の結果、ある程度のばらつきがあり、１０〜６０ｎｍφ、比表面積は２９ｍ２／ｇであった。また、磁気抵抗値は、磁束密度に対して負の値を有すると共に、磁束密度の変化に対して負の傾き（磁束密度Ｂに対して一次微分量が負）を有し、ラマン分光分析で測定されたＩＤ／ＩＧは０．０５であった。
【００７１】
また、得られた微細炭素繊維をＸ線回折装置を用いて測定した。なお、比較のために黒鉛もＸ線回折装置を用いて測定した。測定結果より得られたＸ線回折チャートを図３に示すこととするが、合成例１で得られた微細炭素繊維はピーク強度が弱いため、１０倍にして比較した。
【００７２】
この結果より、得られた微細炭素繊維の面間隔は、３．３８８オングストロームであった。
【００７３】
実施例１
合成例１にて合成した炭素繊維を、ポリエチレングリコール（平均分子量１９０〜２１０）１０ｍｌに、全体の１質量％となるように配合し、マグネティックスターラを用いて、回転数１０００ｒｐｍにて３分間、攪拌処理して、炭素繊維分散体を得た。得られた炭素繊維分散体の静置５分経過後において観察した分散状態を示す外観写真および顕微鏡写真（倍率４０倍）を図６（ａ）、（ｂ）に示す。
【００７４】
実施例２
実施例１において調製された炭素繊維分散体を、蒸留水にて希釈して、炭素繊維が全体の５質量％、１０質量％、２０質量％含まれる炭素繊維分散体を得た。得られた炭素繊維分散体の静置５分経過後において観察した分散状態を示す写真を図７に示す。
【００７５】
比較例１
予め、ポリエチレングリコール（平均分子量１９０〜２１０）に対し、実施例２におけると同様の割合で、蒸留水を添加し、得られた混合液に対し、実施例２と同様の割合で、合成例１にて合成した炭素繊維を配合し、実施例１と同じ条件下でマグネティックスターラを用いて攪拌処理して、炭素繊維構造体が全体の５質量％、１０質量％、２０質量％含まれる比較用の炭素繊維分散体を得た。得られた炭素繊維分散体の静置５分経過後において観察した分散状態を示す写真を図８に示す。
【００７６】
実施例３
合成例１にて合成した炭素繊維構造体を、プロピレングリコール１０ｍｌに、全体の１質量％となるように配合し、マグネティックスターラを用いて、回転数１０００ｒｐｍにて３分間、攪拌処理して、炭素繊維分散体を得た。得られた炭素繊維分散体の静置５分経過後において観察した分散状態を示す外観写真および顕微鏡写真（倍率４０倍）を図９（ａ）、（ｂ）に示す。
【００７７】
実施例４
実施例２において調製された炭素繊維分散体を、蒸留水にて希釈して、炭素繊維構造体が全体の５質量％、１０質量％、２０質量％含まれる炭素繊維分散体を得た。得られた炭素繊維分散体の静置５分経過後において観察した分散状態を示す写真を図１０に示す。
【００７８】
比較例２
予め、プロピレンレングリコールに対し、実施例４におけると同様の割合で、蒸留水を添加し、得られた混合液に対し、実施例４と同様の割合で、合成例１にて合成した炭素繊維を配合し、実施例１と同じ条件下でマグネティックスターラを用いて攪拌処理して、炭素繊維構造体が全体の５質量％、１０質量％、２０質量％含まれる比較用の炭素繊維分散体を得た。得られた炭素繊維分散体の静置５分経過後において観察した分散状態を示す写真を図１１に示す。
【００７９】
図６〜図１１に示す結果から明らかなように、本発明に係る実施例１〜４の分散体においては、媒体中で炭素繊維構造体が凝集することなく安定に微分散していることが観察されたのに対し、比較例１および２のものは、実施例２および４と組成的にはほぼ同一であるにもかかわらず、炭素繊維構造体が水系媒体中にほとんど分散することなく凝集して界面付近に浮遊したような状態であった。
【００８０】
実施例５〜６、比較例３および参考例１
５週令の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス７５匹を、ＳＬＣより購入し、無菌動物施設にて飼育した。施設でマウスを1週間安定させ、年齢が６週令になったときに実験を開始した。マウスは４つのグループ（実施例５、６、比較例３および参考例１（比較対照）用）にランダムに分けられた。
【００８１】
手技直前にフローセンにて麻酔した後、その頸部を切開し、気道を確保し、２７Gの注射針を穿刺し、注射針に接続されたシリンジより、実施例１あるいは実施例２で調製された炭素繊維分散体を０．０５ｍｌ注入した。所定量の炭素繊維分散体の注入が終了したら、直ちに、切開部位を縫合し、所定量の炭素繊維が肺中に導入された被検体マウスを得た。
【００８２】
術後３０日経過後のマウスの生存率は、実施例１の分散体を導入した実施例３で、９６％、実施例２の分散体を導入した実施例４で９６％であり、炭素繊維を配合していないポリエチレングリコール水溶液（ポリエチレングリコール濃度は実施例２のものと同じ）を同様の手技によって気道中に注入した参考例１（比較対照群）のマウスにおける生存率９６％と、有意差はなかった。
【００８３】
さらに、所定量の炭素繊維が肺中に導入された被検体マウスをその後、長期間（２カ月以上）にわたり飼育したが、マウスの生存率は、９６％および９６％といずれも非常に高いものであった。
【００８４】
なお、試験期間経過後に、マウスを犠牲として解剖した結果、肺組織に肺気腫等の異常は見られず、合成例１で得られた炭素繊維の生体全性が確認された。
【００８５】
一方、比較例３においては、注入する炭素繊維分散体として、比較例２で調製されたものを用いる以外は、実施例３〜４と同様にして、マウスに対し炭素繊維の肺中への導入を試みた。
【００８６】
その結果、分散体注入直後において、いずれのマウスも窒息によると思われる状態で死亡してしまい、所定量の炭素繊維が肺中に導入された被検体マウスを得ることはできなかった。
【００８７】
実施例７
実験方法
（炭素繊維分散体の準備）
以下の表１に示すような特性を有する4種類の炭素繊維（SWNT、MWNT-I、MWNT-II、キャップ積層CNT）を用意した。
【００８８】
なお、それぞれの調製は以下によるものである。
【００８９】
＜SWNTs＞
単層カーボンナノチューブは、触媒的CVD法と最適化された精製方法（Endo M, Hayashi T, Kim YA, Muramatu H, Ezaka M, Watts PCP, et al. The possible route to large-scale production of SWNTs through combinational techniques of substrate and floating Methods. J Nanos Nanotec 2004; 4 (1/2): 132-135.を参照のこと。）で得た。
【００９０】
＜MWNT-IおよびMWNT-II＞
直径が異なる２種類の多層カーボンナノチューブは、反応条件（反応温度、有機金属化合物の量、フロー速度）を制御した触媒的CVD法により得たサンプルから選んだ。
【００９１】
（Endo M, Kim YA, Hayashi T, Nishimura K, Matusita T, Miyashita K, et al. Vapor-grown carbon fibers (VGCFs): Basic properties and their battery application. Carbon 2001; 39:1287-1297；
Endo M, Kim YA, Hong SH, Matushita T, Takeda T, Hayashi T, et al. Structural characterization of carbon nanofibers obtained by hydrocarbon pyrolysis. Carbon 2001; 39: 2003-2010；および
Kim YA, Hayashi T, Endo M, Kaburagi Y, Tsukada T, Shan J, et al. Synthesis and structural characterization of thin multi-walled carbon nanotubes with a partially facetted cross section by a floating reactant method. Carbon 2005; In press.を参照のこと。）
なお、as grownのMWNT-IIは、黒鉛炉にてアルゴン下2800℃で構造の改善と、多環芳香族炭化水素と鉄化合物の除去のため熱処理した。
【００９２】
＜キャップ積層CNT＞
フローティング反応方法：触媒金属、助触媒として硫化水素、炭素原料として天然ガスを使用して連続工程で得た（Endo M, Kim YA, Fukai T, Hayashi T, Oshida K, Terrones M, et al. Structural characterization of cup-stacked type nanofibers with an entire hollow core. Appl Phys Lett 2002; 80 (7): 1267-1269.を参照のこと。）。
【００９３】
得られたチューブは、ユニークな形態を示す(円錐台がスタックした形態を有し、開いたエッジの外側と内部の表面の大部分で高い化学反応性を示すものである。
【００９４】
【表１】
2007161521.tif 000003
(a)多層カーボンナノチューブの直径および長さはFE-SEMにて測定し、一方、単層カーボンナノチューブの直径および長さはラマンスペクトルのＲＢＭ（radial breathing mode）により測定した。
(b)d(002) は、XRD パターンからの層間距離である。.
(c)比表面積はN2 吸収により測定された。
(d)真密度はpycnometerにて測定した。
(e)R 値は、ラマンスペクトルにおけるＤバンド強度をＧバンド強度で割った値である。 
(f)鉄含量は原子吸光法にて測定された。
(g)熱処理はアルゴン中にて行われた。
【００９５】
全ての炭素繊維サンプルは、実験に先立ち、ホルムアルデヒドガスで２４時間かけて滅菌し、室温で２４時間かけてガスを蒸発させ、背中の皮膚の下の皮下（細胞）組織に埋め込むサンプルとした。
【００９６】
次いで、炭素繊維サンプルは、それぞれ、（平均分子量１９０〜２１０）１０ｍｌに、全体の１質量％となるように配合し、マグネティックスターラを用いて、回転数１０００ｒｐｍにて３分間、攪拌処理して、炭素繊維分散体とされた。
【００９７】
（実験動物）
１８０匹のメスの BALB/cマウス（年齢５週間）をSLCより購入し、無菌動物施設にて飼育した。施設でマウスを１週間安定化させ、年齢が６週間になった時に実験を開始した。
【００９８】
マウスは、比較対照用、SWNT用、MWNT-I用、MWNT-II用、キャップ積層CNT用の５つのグループ（３０匹ずつ）にランダムに分けられた。さらに、サンプリングする日で６つのサブグループに分けた。
【００９９】
サンプリングする日：植え込み後、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月
なお、サンプリングは、心臓からの血の採取と（細胞）組織の採取とした。
【０１００】
（埋込手術）
フローセン麻酔下、各々のマウスの背中の皮膚を約１ｃｍ切開して各炭素繊維分散体を２ｍｇ皮下に埋め込んで縫合した。対照には、２ｍｌの生理的食塩水を使用した。決められたサンプリング日に、深いフルオザン麻酔下、血と組織をサンプリングした。なおサンプリングされたマウスは犠牲となっている。
【０１０１】
血は、フローサイトメトリーで測定するために心臓に穴を開けて採取し、筋層を含む皮膚組織は、病理学試験のために採取された。
【０１０２】
（フローサイトメトリー）
サンプリングされた血液は、フローサイトメーター(FACS Clibur, Becton Dickinson, USA)でＴリンパ球を選別するために、CD4+抗体とCD8+抗体(BD Bioscience Pharmingen, USA)によって染色した。
【０１０３】
染色した免疫性の細胞は、CeIIQuest software (Becton Dickinson)によって解析した。
【０１０４】
（組織学と免疫）
伝統的な組織学に従い、犠牲にした後すぐに（細胞）組織は、７０％エタノール処置し、パラフィン中に組み込み、５μｍ部分にカットし、そして、ヘマトキシンとエオシンで染色した。 
【０１０５】
加えて、連続切片の１つを使い、内因性のペルオキシダーゼは、3% H2O2で１０分間ブロックし、そして、抗マウスCD45R抗体(BD Bioscience Pharmingen, USA)と抗マウスMac-3 抗体 (BD Bioscience Pharmingen, USA )を用いて室温で６０分インキュベートした。スライドは、洗浄されそして、ビチオン化ポリクロナールrat-IgG1/2a抗体(BD Bioscience Pharmingen, USA)が適用された。さらに3回リン酸緩衝液で洗浄した後、部分は、ペルオキシダーゼ−共役したストレプタビジン (BD Bioscience Pharmingen, USA)で６０分インキュベートされ、ジアミベンジジンで染色され、そしてヘマトキシンで対比染色された。
【０１０６】
（統計的分析）
有効な相違は、two-tailed student's t-test（P < 0.05.）を使って算定した。 データは、±SEを示した。
【０１０７】
実験結果
（体重）
全マウスは、試験期間中生き延びていた。また比較対照と比べて体重の変化はなかった(３ヶ月間)。
【０１０８】
従って、本発明に係る炭素繊維の安全性試験方法が有効に作用することが示された。
【０１０９】
（血液分析）
比較対照
比較対照は、CD4+Ｔ細胞の値は、植え込み後1, 2, 3 週間1ヶ月, 2ヶ月および3ヶ月でそれぞれ30.7±4.9%, 36.3±2.2%, 27.2±3.3%, 32.4±0.6%, 40.9±2.31% および 28.9±3.9%であり、CD8+Ｔ細胞の値は、 11.1±0.9%, 11.6±0.4%, 16.3±2.9%, 10.1±0.14%, 12.3±1.4% 及び7.4±0.6%であった。
【０１１０】
SWNT
SWNTの皮下埋め込み術後の抹消Ｔ細胞の経時変化を図１２に示す。SWNTを埋め込んだCD4+Ｔ細胞は、対照（埋め込んでないもの）と比べて植え込み後2 週間 46.3±2.2%) 及び 3ヶ月(44.2±3.9%)において著しく高かった（図１２（ａ））。さらに、 SWNTsのCD8+Ｔ細胞は、対照と比べて大きな減少が、植え込み後１週間 (7.5 ± 0.1%) 及び３週間 (11.0 ± 0.7%) において観測された（図１２（ｂ））。従って、SWNTs埋め込んだ組織のＴ細胞は、植え込み後1及び3週間 (3.6 ± 0.3 and 2.8 ± 0.3 各々)において、対照よりも比較的高いCD4+/CD8+値を示したことは注目すべきことである（図１２（ｃ））。
【０１１１】
抹消Ｔ細胞の変化を確認するためSWNTs 皮下埋め込み術後、 1 週間から1ヶ月までのサンプルの組織病理学的研究を行った（図１３）。１週間で、滲出性流体 (浮腫)の存在を表すルーズな（緩んだ）空間が、SWNTと組織との間で明らかに観測された。
【０１１２】
この空間は、植え込み後２週間で小さくなった。しかしながら、この期間でSWNTによる細胞浸潤が生じた。そして、植え込み後３週間で、細胞浸潤での肉芽種組織が観測された。このSWNTの塊を封入している肉芽種は、植え込み後１ヶ月で硬くなった。これゆえ、SWNTの塊中への細胞浸潤に関する証拠はなかった。おそらくこれは、SWNT自身の緻密充填構造によるものと思われる。
【０１１３】
MWNT-I
CD4+Ｔ細胞の値が、植え込み後１週間(17.8±4.9%)で著しく減少し、そして2 週間 (48.6±2.2%)で 非常に増加した（図１４（ａ））。対照と比べて、CD8+Ｔ細胞の著しい減少も同様に、植え込み後１週間 (6.9±0.5%) および３週間(8.6±0.7%)で観測された （図１４（ｂ））。従って、相対的に高いCD4+/CD8+値が 植え込み後２週間 (3.8±0.1)でのみ観測された（図１４（ｃ））。図１５に見られるようにMWNTは、水腫状の様相なしで、植え込み後１週間で細胞浸潤を生じさせた。肉芽種性の組織は、ナノチューブの塊間で、時間がたつにつれて緻密で硬くなった。 
【０１１４】
最終的に植え込み後３週間以降いくつかの粒子が貪食（phagocytose）された。
【０１１５】
MWNT-II
CD4+ Ｔ細胞の比較的に低い値が、植え込み後１週間(16.4±0.8%)および３週間(13.7±1.9%)で観測された。植え込み後２週間(53.5±0.8%)の期間では、CD4+の高い値を検出した（図１６（ａ））。CD8+Ｔ細胞においても、同様に、対照と比べて著しい減少を植え込み後１週間(8.2±0.8%) および3週間(7.8±0.9%)で観測した。その上、植え込み後３ヶ月でも、著しいCD8+Ｔ細胞の増加を生じたことは、注目すべきことである（図１６（ｂ））。従って、CD4+/CD8+ の値は、対照よりも非常に低い(2.1±0.2) であった。けれども、このサンプルでは、植え込み後２週間(4.7±0.3)で著しくCD4+/CD8+の高い値が観測された（図１６（ｃ））。MWNT-IIを植え込んだ組織の組織病理学的研究から 植え込み後１週間で滲出低下と共にわずかな細胞浸潤のみならず、わずかな肉芽種形成も観測された。細胞浸潤は、植え込み後２週間で、埋め込まれた塊の周辺に密接した。しかしながら、塊の中心スペースには、１ヶ月かけても細胞浸潤は、起こらなかった。また一方、塊は、図１７に示すように肉芽種性組織でしっかりと閉じられた。
【０１１６】
キャップ積層CNT
このグループのCD4+Ｔ細胞の変化は、対照と比べて植え込み後１週間(18.2±1.4%)高い値であり、そして 2 週間 (53.5±0.8%) および3ヶ月(40.1±3.2%)では、ほとんど２倍だった（図１８（ａ））。一方、対照と比べて、植え込み後 1週間(6.6±0.6%) と3週間 (6.6±0.9%)で、CD8+Ｔ細胞の突然の減少が観察された（図１８（ｂ））。 従って、植え込み後２週間(4.2±0.1)、３週間 (3.3±0.3)および3ヶ月 (4.8±0.5)で CD4+/CD8+の高い値が得られた（図１８（ｃ））)。図１９に示すようにこのチューブは、植え込み後１週間の早い段階で水腫状の様相とともにわずかな細胞浸潤を引き起こした。時間が経過したとき、肉芽種性組織は、チューブの塊の間で小さくそして硬くになった。 分散性の高いチューブ(くもの巣状)は、塊状のチューブよりも低い細胞浸潤を生じることは、注目に値する。
【０１１７】
（Mac-3抗体とCD45R抗体を用いた免疫組織化学的調査の比較）
図２０にCNT埋め込み１週間後の抗マウスMac-3抗体を用いたマクロファージの組織断面の免疫組織化学的様相を示した。SWNTとMWNT-IにおけるよりもMWNT-IIとCSNTにおいて、Mac-3に関しより陽性の細胞が観測された。
【０１１８】
陽性の強さの順は、以下のとおりであったMWNT-II = CSNT > MWNT-I > SWNT。
【０１１９】
図２１に、植え込み１ヵ月後のMac-3抗体を用いた免疫組織化学的様相を表示した。より多くの数の陽性細胞が、SWNTの物質の周囲に見られることが明らかとなった。SWNTの肉芽種性組織は、部分的にある程度はマクロファージの成分から成っており、そして、食細胞は観察されなかった。けれども、MWNT-Iにおける肉芽種性組織上で、Mac-3陽性細胞は、SWNTより少なかった。自己凝集した塊状物質の狭いスペース中で、陽性細胞を観察することができた。食細胞的様相がMWNT-II（図２１（ｄ））とCSNT（図２１（ｅ））で観測されたことはとても興味深いことであった。
【０１２０】
（植え込み後３ヶ月の後期における肉芽種形成の比較） 
この実験処方(植え込み後３ヶ月)の後期での、肉芽種様相の違いと埋め込まれたCNTの配置を図２２に示す。肉芽種は、植え込み後３ヶ月の時点で、すべてのサンプルにおいて発現していたが、その肉厚は付着した物質によって異なっていた。特に、 SWNTにおける肉厚は、他のものより大きかった。しかしながら、塊状のCNTへの細胞浸潤の程度は、CSNT、MWNT-II、MWNT-Iの順で増加した。加えて、肉芽種の間にゆるい境界線が存在し、そして埋め込んだ物質は、特にMWNT-Iが見つかった。剖検の結果、すべてのマウスにおいて、脾臓、肝臓、腎臓、肺、心臓および大脳皮質で、何ら炭素物質は、見つからなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】合成例において得られた微細炭素繊維の中間体の透過電子顕微鏡写真である。
【図２】合成例において得られた微細炭素繊維の透過電子顕微鏡写真である。
【図３】合成例において得られた微細炭素繊維のＸ線回折チャートである。
【図４】合成例において用いた合成装置を模式的に示す図である。
【図５】合成例において用いた高温熱処理装置を模式的に示す図である。
【図６】実施例１において得られた炭素繊維分散体における炭素繊維の分散状態を示す外観写真（ａ）および顕微鏡写真（ｂ）である。
【図７】実施例２において得られた炭素繊維分散体の分散状態を示す写真である。
【図８】比較例１において得られた炭素繊維分散体の分散状態を示す写真である。
【図９】実施例３において得られた炭素繊維分散体における炭素繊維の分散状態を示す外観写真（ａ）および顕微鏡写真（ｂ）である。
【図１０】実施例４において得られた炭素繊維分散体の分散状態を示す写真である。
【図１１】比較例２において得られた炭素繊維分散体の分散状態を示す写真である。
【図１２】SWNTの皮下埋め込み術後の抹消Ｔ細胞の経時変化を示すグラフである。
【図１３】SWNT皮下埋め込み術後、1週間から1ヶ月までの細胞組織の状態を示す写真である。
【図１４】MWNT-Iの皮下埋め込み術後の抹消Ｔ細胞の経時変化を示すグラフである。
【図１５】MWNT-Iの皮下埋め込み術後、1週間から1ヶ月までの細胞組織の状態を示す写真である。
【図１６】MWNT-IIの皮下埋め込み術後の抹消Ｔ細胞の経時変化を示すグラフである。
【図１７】MWNT-IIの皮下埋め込み術後、1週間から1ヶ月までの細胞組織の状態を示す写真である。
【図１８】キャップ積層CNTの皮下埋め込み術後の抹消Ｔ細胞の経時変化を示すグラフである。
【図１９】キャップ積層CNTの皮下埋め込み術後、1週間から1ヶ月までの細胞組織の状態を示す写真である。
【図２０】CNT埋め込み１週間後の抗マウスMac-3抗体を用いたマクロファージの組織断面の状態を示す写真である。
【図２１】CNT埋め込み１週間後の抗マウスMac-3抗体を用いたマクロファージの組織断面の状態を示す写真である。
【図２２】CNT埋め込み３ヶ月後の、肉芽種様相の違いと埋め込まれたCNTの配置示す写真である。
【図３】
2007161521.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
2007161521.tif 000014
【図８】
2007161521.tif 000015
【図９】
2007161521.tif 000016
【図１０】
2007161521.tif 000017
【図１１】
2007161521.tif 000018
【図１３】
2007161521.tif 000019
【図１５】
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【図１７】
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【図１９】
2007161521.tif 000022
【図２０】
2007161521.tif 000023
【図２１】
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【図２２】
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