(57)【要約】【課題】  核酸の塩基配列中の特定の位置のメチルシトシンを、核酸の損傷無く、簡便かつ高感度で、選択性良く定量する手法を提供する。【解決手段】  塩基配列中の測定対象とする部位のシトシン（あるいはメチルシトシン）のみを塩基二本鎖内で不対状態とし、その後、当該二本鎖に対する抗メチルシトシン抗体の結合量を測定する。  これにより、測定対象とするメチルシトシンは、二重螺旋の外向きとなりうる運動性を獲得できるために、嵩高い抗体とも結合可能となる。これに対し、不対状態でないメチルシトシンは、相補塩基との対合により二重螺旋の内向きとなるため、嵩高い抗体と結合できない。  この抗体の嵩高さを利用することで、メチルシトシンの検出に選択性を付与し、特定の部位の塩基のメチル化状態のみを検出することができる。【選択図】  図１
2012230019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の塩基配列中に含まれる特定の位置のシトシンがメチル化しているか否かを判別する方法であって、測定対象となるシトシン以外の配列に塩基対を形成させることにより、測定対象のシトシンの運動性を確保した後、該核酸への抗メチルシトシン抗体の結合量によって、測定対象のシトシンがメチル化しているか否かを判別することを特徴とする方法。
【請求項２】
測定対象となるシトシンの運動性を確保する方法として、測定対象のシトシンを含む一本鎖核酸と、該シトシンがバルジ構造内に配置されるように設計された一本鎖核酸との間で二重螺旋構造を形成させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
測定対象となるシトシンの運動性を確保する方法として、測定対象のシトシンを含む一本鎖核酸と、該シトシンと塩基対を形成すべき箇所がグアニン以外に設計された一本鎖核酸間で二重螺旋構造を形成させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
測定対象となるシトシンの運動性を確保する方法として、測定対象のシトシンを含む一本鎖核酸が自己相補鎖を有し、かつ、該シトシンが該自己相補鎖の対合により形成されるループ領域に位置するように設計されていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗メチルシトシン抗体の結合量を測定する際に、西洋わさびペルオキシターゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを標識した2次抗体と抗メチルシトシン抗体を反応させ、吸光度測定により測定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗メチルシトシン抗体の結合量を測定する際に、ビオチン化した抗IgG抗体と抗メチルシトシン抗体を反応させ、さらにアビジン化したアセチルコリンエステラーゼを反応させ、電気化学発光法により測定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
測定対象となるシトシンと塩基対を形成する箇所が不対となるように設計された一本鎖核酸と、抗メチルシトシン抗体を組み合わせて構成したメチル化核酸検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸中に含まれるメチル化シトシンを検出する生体分子検出技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
エピジェネティックスの一例であるゲノムのメチル化修飾は、大腸菌から植物、脊椎動物まで広範囲にわたる生物種で見られ、様々な生命現象に関係していることが明らかになりつつある。特に哺乳類では、個体発生や細胞分化、がん化などの観点からも重要な研究領域になってきており、遺伝子のプロモーター領域にあるCpGアイランドのメチル化により、癌抑制遺伝子が不活性化されることが、１９９３年にRB遺伝子によって見いだされた。以降、さまざまな腫瘍細胞においてもCpG配列のメチル化は多くの癌抑制遺伝子のサイレンス機構となっている事が確認されており、今や、遺伝子突然変異、染色体欠失に並ぶ、第三の癌抑制遺伝子を不活性化する新たな機構（すなわち発癌機構）として、近年注目されている。メチルシトシンは発現情報を含んだいわば第５番目の塩基として位置づけられており、遺伝子プロモーターをはじめとした様々な遺伝子領域におけるDNAメチル化情報（シトシンのメチル化の量と配列位置）を計測することは、例えば、発癌の原因や機構における分子レベルの解明をもたらすだけでなく、それらの知見は臨床応用に直結した診断、治療指針となりうることが期待されるため、非常に重要である。
【０００３】
一般的に知られているメチルシトシン検出法は、2種類に大別できる。１つは、亜硫酸水素塩を用いてメチル化してないシトシンをウラシルへ加水分解するbisulfite法であり、もう１つは、メチル化感受性酵素を用いた制限酵素法である。
現在最も一般的に用いられているbisulfite法は、試料となる核酸にbisulfite処理を行なうとメチルシトシンは変換されず、シトシンのみがウラシルに変換されることを利用した方法である（特許文献１および2）。Bisulfite処理後、PCRを行い、シーケンシングするとウラシルはチミンとして検出され、メチルシトシンはシトシンとして検出される。処理前後で生じるシトシンとチミン(ウラシル)の差異から、メチル化の有無や位置を決定することが出来る。しかしながら、bisulfite法の欠点は、シーケンスの操作が煩雑であることや、完全修飾に長時間の反応時間を要すこと（一般的には十数時間）、またその処理により塩基配列の非特異的切断反応が起こり、サンプルの断片化が進行することが多く、手法の改善が求められている。
制限酵素法は、メチル化感受性酵素と、非感受性酵素を用いる方法であり、測定対象となるシトシンがメチル化されているとメチル化感受性酵素による切断が起こりにくいことを利用した方法である。制限酵素により切断した酵素のフラグメント鎖長を電気泳動等で測定することにより、メチル化部位を決定する。（例えば、特許文献３）しかしながら、測定対象となるシトシンがメチルしているか否かを検出するために、制限酵素の組み合わせを選択する必要がある。測定対象によっては、最適な制限酵素の組み合わせが存在せず、すべての塩基配列に適応できない。
Bisulfite法と制限酵素法の両者共に、メチルシトシンを直接検出するものではなく、シトシンに対する酵素やbisulfiteの反応性の減少を検出することにより、シトシンのメチル化を検出するという間接的な手法である。
【０００４】
近年、DNAの塩基配列の中のメチルシトシンに結合するオスミウム錯体により、塩基配列の中のメチルシトシンと複合体を形成させることでメチルシトシンを直接標識させ、さらにそのオスミウム錯体に電気化学的活性基や蛍光標識を導入することで、シトシンのメチル化を検出する手法が報告されている（非特許文献１）。この方法は、従来のbisulfite法でのメチル化解析と比べ短時間で終了することができ、また遺伝子サンプルの切断などの損傷が起こらない点に利点を有する。しかしながら、不可逆的な標識であり、またチミンもメチルシトシンと同様に標識されるため、チミンとの選択性を付与するための工夫が必要になってくる。
また、抗メチルシトシン抗体を用いたメチルシトシンの定量方法が報告されている（特許文献４）。この方法によれば、目的核酸に抗メチルシトシン抗体を作用させ、その抗体の結合量から、簡便かつ迅速にメチルシトシンを定量可能である（非特許文献２）。しかしながら、抗体を用いたメチルシトシンの定量では、目的核酸に含まれるメチルシトシンの総量を測定することは可能であるものの、塩基配列中のどのシトシンがメチル化されているのかは分からない。遺伝子の発現にはシトシンのメチル化頻度とともに、どのシトシンがメチル化されているかが極めて重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2006-238701
【特許文献２】特開2004-008217
【特許文献３】特開2006-149334
【特許文献４】特許3854943
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal  of  the  American  Chemical  Society  (2007)  5612-5620.
【非特許文献２】Analytical  Chemistry  (2009)  Volume  81,  7885-7891.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上述した核酸の塩基配列中の特定の位置のメチルシトシンを、核酸の損傷無く、簡便かつ高感度で、選択性良く定量する手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者等は、抗メチルシトシン抗体は2重螺旋内でグアニンと塩基対を形成したメチルシトシンを認識出来ないが、塩基対を形成していないメチルシトシンを認識可能であることを見いだした。これは、抗体の分子量は150  kDa程度と核酸の二重螺旋の半径に比べ遙かに嵩高いために二重螺旋構造を形成した内向きのメチルシトシンを認識できないためである。この特性を利用することにより、測定対象とすべきシトシンのみについてメチル化されているか否かを判断することができ、測定対象外のシトシンのメチル化の状態に影響を受けない、選択的な測定を実現することができる。
すなわち、塩基配列中の測定対象とする部位のシトシン（あるいはメチルシトシン）のみを塩基二本鎖内で不対状態とし、その後、当該二本鎖に対する抗メチルシトシン抗体の結合量を測定することにより、測定対象とする部位のシトシンのメチル化状態を知ることが可能になる。
より具体的には、測定対象とする部位のシトシンのみを二本鎖内で不対状態とするために、測定対象とするシトシンを二本鎖において形成されるバルジ構造やループ構造内に配置させたり、測定対象とするシトシンと塩基対を形成すべき位置の塩基をシトシンやアデニン、またはチミン（すなわち、シトシンに対しミスマッチ）としたりする。
これにより、測定対象とするメチルシトシンは、二重螺旋の外向きとなりうる運動性を獲得できるために、嵩高い抗体とも結合可能となる。この抗体の嵩高さを利用することで、メチルシトシンの検出に選択性を付与し、特定の部位の塩基のメチル化状態のみを検出できるようにすることが本発明の重要な要素となっている。
【０００９】
本発明による特定部位のメチルシトシンの検出は、以下のような手順で行われる。
（１）目的試料である一本鎖核酸と、別途一本鎖核酸との間で二重螺旋構造を形成させる。
この際に、二重螺旋構造を形成させるための一本鎖核酸の塩基配列としては、二重螺旋構造を形成するに十分な程度相補的な配列を有しながらも、測定対象とするシトシン（もしくはメチルシトシン）と塩基対を形成しないような塩基配列が必要である。
具体的には、測定対象とするシトシン（もしくはメチルシトシン）が二重螺旋形成時に、バルジ構造内に配置されるような塩基配列にする方法がある。もしくは、測定対象とするシトシン（もしくはメチルシトシン）と塩基対を形成すべき位置の塩基をミスマッチ（つまり、アデニン、シトシンもしくはチミン）とした一本鎖核酸と二重螺旋構造を形成させる。もしくは、一本鎖のみであっても、自己相補配列を有し、当該自己相補鎖により二重螺旋構造を形成させた際に、測定対象とするシトシン（もしくはメチルシトシン）がループ構造内に配置されるような一本鎖核酸とすることも可能である。
いずれにしても、測定対象とするシトシン（もしくはメチルシトシン）がグアニンと水素結合対を形成していない状態であり、測定対象外のメチルシトシンがグアニンと水素結合対を形成している状態とする。これにより、測定したいシトシン（もしくはメチルシトシン）は塩基対を形成していないために、二重螺旋の外側を向いている頻度が高くなる。一方、測定したくない配列部分は塩基対を形成しているため、二重螺旋の内側を向いている頻度が高くなり、抗体に認識されない状態となる。
（２）メチルシトシンに結合する抗メチルシトシン抗体を測定試料溶液に加える。
これにより、塩基対を形成せず二重螺旋構造の外向きのメチルシトシンは、抗メチルシトシン抗体と結合する。しかしながら、測定対象外のメチルシトシンは、グアニンと塩基対を形成し二重螺旋構造の内側を向いているために、抗メチルシトシン抗体と結合できない。
（３）核酸中のメチルシトシンに結合した抗メチルシトシン抗体量を検出することにより、メチルシトシンの量を測定する。
抗メチルシトシン抗体の検出は、従来のイムノアッセイ法に用いられてきた一般的手法を幅広く用いることが可能である。例えば、酵素（西洋わさびペルオキシターゼやアルカリフォスファターゼが一般的に良く用いられる）を標識した2次抗体を導入して、吸光度を測定することにより検出が可能である。また、抗メチルシトシン抗体を予め上記酵素で標識しておいても良い。また、抗メチルシトシン抗体をビオチン化しておき、アビジン化した酵素を導入しても良い。また、蛍光標識した2次抗体やアビジンを使用することも可能である。放射性同位体を標識物として用いることも可能である。
【００１０】
すなわち、本出願は、具体的には、以下の発明を提供するものである。
〈１〉核酸の塩基配列中に含まれる特定の位置のシトシンがメチル化しているか否かを判別する方法であって、測定対象となるシトシン以外の配列に塩基対を形成させることにより、測定対象のシトシンの運動性を確保した後、該核酸への抗メチルシトシン抗体の結合量によって、測定対象のシトシンがメチル化しているか否かを判別することを特徴とする方法。
〈２〉測定対象となるシトシンの運動性を確保する方法として、測定対象のシトシンを含む一本鎖核酸と、該シトシンがバルジ構造内に配置されるように設計された一本鎖核酸との間で二重螺旋構造を形成させることを特徴とする、〈１〉に記載の方法。
〈３〉測定対象となるシトシンの運動性を確保する方法として、測定対象のシトシンを含む一本鎖核酸と、該シトシンと塩基対を形成すべき箇所がグアニン以外に設計された一本鎖核酸間で二重螺旋構造を形成させることを特徴とする、〈１〉に記載の方法。
〈４〉測定対象となるシトシンの運動性を確保する方法として、測定対象のシトシンを含む一本鎖核酸が自己相補鎖を有し、かつ、該シトシンが該自己相補鎖の対合により形成されるループ領域に位置するように設計されていることを特徴とする、〈１〉に記載の方法。
〈５〉抗メチルシトシン抗体の結合量を測定する際に、西洋わさびペルオキシターゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを標識した2次抗体と抗メチルシトシン抗体を反応させ、吸光度測定により測定することを特徴とする、〈１〉に記載の方法。
〈６〉抗メチルシトシン抗体の結合量を測定する際に、ビオチン化した抗IgG抗体と抗メチルシトシン抗体を反応させ、さらにアビジン化したアセチルコリンエステラーゼを反応させ、電気化学発光法により測定することを特徴とする、〈１〉に記載の方法。
〈７〉測定対象となるシトシンと塩基対を形成する箇所が不対となるように設計された一本鎖核酸と、抗メチルシトシン抗体を組み合わせて構成したメチル化核酸検出キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、従来のメチルシトシン検出法であるbisulfite法において必要とされたウラシルへの変換反応時間やPCR時間が不要であり、また、本発明における抗体の反応時間はこれらに比べ短いために、総測定時間を短縮できる。また、bisulfite法では核酸サンプルの断片化が進行することが多いが、本発明の方法では、抗体の結合を利用しているために、原理上、目的核酸の損傷は一切起こらない。
また、本発明は、従来のオスミウム酸を使う方法と異なり、チミンに対する選択性も高く、正確かつ簡便にメチルシトシンを計測可能である。また、オスミウム酸による標識反応は不可逆的な反応であるのに対し、本発明の方法は、pHを3程度に低下させることにより、抗体を解離させることも可能であるため、可逆の反応である。
また、本発明は、従来の抗メチルシトシン抗体を用いた測定法ではメチルシトシンの量的情報しか得ることが出来なかったのに対し、本発明者らの重要な知見である不対塩基の選択的検出を利用することにより、配列中の任意の位置のシトシンがメチル化しているか否かを知ることが可能であり、メチルシトシンの検出に1塩基レベルでの高い位置選択性を付与することができる。
このように、本発明は、塩基配列中のメチルシトシンについて、量的情報だけでなく、位置情報も、正確かつ簡便に取得することが可能であるという優れた効果を有している。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の測定法により、測定対象とするメチルシトシンをバルジ構造内に配置して測定する手順を示す模式図。
【図２】本発明の測定法により、測定対象とするメチルシトシンを不対にして測定する手順を示す模式図。
【図３】本発明の測定法により、測定対象とするメチルシトシンを1本鎖のループ構造内に配置して測定する手順を示す模式図。
【図４】実施例1による、メチルシトシンの測定結果。
【図５】実施例1における、メチルシトシン測定時の二重螺旋構造を示す模式図である。
【図６】実施例2による、メチルシトシンの測定結果。
【図７】実施例2における、メチルシトシン測定時の二重螺旋構造を示す模式図。
【図８】実施例6による、メチルシトシンの測定結果。
【図９】実施例6において、メチルシトシンを測定した際に作成したスキャッチャードプロット。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明では、二重螺旋構造を形成させた核酸中のメチル化シトシンを測定するにあたり、測定したいシトシン（もしくはメチルシトシン）を意図的に不対とすることで、任意のシトシン（もしくはメチルシトシン）のみに対して抗体が結合するか否かを測定している。二重螺旋構造を形成させるには、2本の1本鎖核酸をハイブリダイゼーションさせる方法が一般的である。また、1本鎖核酸のみにおいても、自己相補鎖配列を有していれば二重螺旋を形成するので、これも利用可能である。
【００１４】
2本の1本鎖核酸をハイブリダイゼーションさせる方法としては、一方の1本鎖核酸をマイクロプレートに固定し、固相化させて測定を行う方法がある。予め、図1−1の様に目的核酸（Target  DNA）と二重螺旋を形成する1本鎖核酸（Probe  DNA）を固定化する。このProbe  DNAの配列は、メチルシトシンを含むTarget  DNAと相補的な配列を有しながらも、測定対象のシトシン（もしくはメチルシトシン）と対になるグアニンはProbe    DNAには存在しないように設計されている。なお、固定化する基材としては金属、炭素、ガラス、高分子等の固体材料が広く利用される。例えばポリスチレンを基材とする場合にはProbe分子を含む溶液を数時間から一昼夜滴下しておくことにより吸着・固定化することが可能である。また、核酸の末端をアミノ化あるいはチオール化することにより共有結合で基材と固定することも可能である。
次いで、メチルシトシンを含むTarget  DNAを導入し、二重螺旋構造を形成させ、図１−2の状態とする。二重螺旋構造を形成させるには、従来知られている手法を幅広く用いることが出来る。一般的にはpH6.5~7.5の中性のリン酸バッファやトリスバッファ中で行うことが多い。温度は一般的に溶解温度（Tm値）よりも１０℃程度低い温度で行う。図1-2の例では、Target  DNA中の測定対象のメチルシトシンがバルジ構造内に配置されるように、Probe  DNAが設計されている。
図１−2の状態となった固定化Probeを洗浄し、未反応のTarget  DNAを除去した後、抗メチルシトシン抗体をProbe  DNA  -  Target  DNA間で形成された二重螺旋構造へ加えることで、不対のメチルシトシンのみに抗メチルシトシン抗体を結合させる。通常、抗メチルシトシン抗体は中性付近のバッファで溶解させ、この溶液を加えて1時間程度室温で静置する。これにより、図１−3の様な二重螺旋-抗体複合体が形成される。
これを洗浄し、未反応の抗メチルシトシン抗体を除去した後、抗メチルシトシン抗体を検出するための抗IgG抗体（2次抗体）を導入し、1時間程度反応させる。2次抗体には予め標識となる西洋わさびペルオキシターゼなどを修飾しておく。これにより、図1-4の様な複合体が形成される。
未反応の2次抗体を洗浄により除去した後、標識酵素の基質を加える。西洋わさびペルオキシターゼを標識した2次抗体の場合には、3,3',  5,5'-tetramethyl-benzidene  (TMB)を加えて発色させる。塩酸などで標識酵素の反応を停止した後、450  nmの吸光度を測定することによりTarget  DNA中に含まれるメチルシトシンの内、Probe  DNAと塩基対を形成しなかったメチルシトシンの定量が可能である。
【００１５】
図2-は、測定対象となるメチルシトシンがバルジ構造内ではなく、単なる不対塩基として存在する場合の模式図である。測定対象となるシトシンを不対にするには、対になるべきProbe  DNAの塩基をグアニン以外（図2中の例ではシトシン）とする。これにより、測定対象のシトシンやメチルシトシンを二重螺旋構造の外向きにすることが可能である。その後の、抗メチルシトシン抗体による結合量の測定は、上述と同様である。
【００１６】
図3は、本発明の方法を用いて、1本鎖核酸中のメチル化シトシンを測定する方法の模式図である。自己相補鎖を形成しない1本鎖核酸単独では、配列内に存在するすべてのメチルシトシンを検出する。しかしながら、自己相補鎖を有する配列では、塩基対を形成したメチルシトシンを抗体は認識できない。よって、図3に示すように、自己相補鎖内でループ領域にあるメチルシトシンを選択的に検出することが可能である。
【００１７】
以上の説明は、抗メチルシトシン抗体を用いて塩基配列中の特定の位置のシトシンのメチル化の有無を検出する方法について行ったが、本発明のメチルシトシンの検出原理はその他のメチル化塩基をはじめとする各種修飾塩基についても同様に適用できることは明らかであり、例えば６−メチルアデニンであれば抗メチルアデニン抗体を用いることにより、同様に、塩基配列中の特定の位置のアデニンのメチル化の有無を検出することができる。
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。ただし本発明は以下の実施例にのみに限定されるものではない。
【実施例】
【００１８】
実施例１．
本実施例では、本発明によってメチルシトシンが定量的に測定可能であることを確認した実験結果を示す。先ず、市販のDNA固定化用９６ウエルマイクロプレートキット（住友ベークライト社製、BS-61601）を用いて、目的核酸を捕捉するための5種類の一本鎖核酸(Probe  1,  Probe  2,  Probe  3,  Probe  4,  Probe  5)の固定化行った。おのおのの塩基配列は、Probe  1は5'-  GAA  GTC  AAC  AGG  ACG  GAC  GCC  GCG  CAA  -3'、  Probe  2は5'-  GAA  GTC  AAC  AGG  AC    GAC  GCC  GCG  CAA  -3'、  Probe  3は5'-  GAA  GTC  AAC  AGG  A  AC  GCC  GCG  CAA  -3'、Probe  4は5'-  GAA  GTC  AAC  AGGC  GCC  GCG  CAA  -3'、Probe  5は5'  -  GAA  GTC  AAC  AGGCC  GCG  CAA  -3'であり、5’末端をアミノ化してある。固定化は、各一本鎖核酸を100nM  に希釈し、おのおの100μLずつ加え（計10  pmol固定）、80℃で2時間加熱、乾燥させることにより固定化した。300μLの蒸留水で2回洗浄し、過剰の核酸を除去した。その後、測定対象の核酸としてTarget1をマイクロプレートに１００μＬずつ入れた。Target1の塩基配列は、5'-  TTG  CGC  GGC  GTC  CGT  CCT  GTT  GAC  TTC  -3'であり、5‘末端から13塩基目のシトシンの５位をメチル化してある。なお、Target1はダルベッコリン酸バッファ緩衝液を用いて希釈系列を作製し、マイクロプレートの各ウエルに10,  2,  1,  0.4,0.2,  0.1,0.01,  0  pmol導入した。その後、37℃で1時間反応させ、二重螺旋構造を形成させた。その後、300μLのバッファで2回洗浄した。
さらに、0.5μg/mLの抗メチルシトシン抗体（Aviva  systems  biology社製,  クローンコード33D3）を50μLずつ加え、37℃で1時間反応させた。バッファで洗浄した後、0.5  μg／ｍLのペルオキシターゼ標識抗IgG抗体(abcam社製,  Rabbit  polyclonal  to  mouse  IgG  (HRP))を50μLずつ加え、37℃で30分反応させた。バッファで洗浄した後、3,3',5,5'-tetramethylbenzidineを加え、遮光室温で10分反応させた。その後、２N塩酸溶液を50μLずつ加え、酵素反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Biorad社製）により450nmの吸光度を測定した。
測定結果を図4に示す。Probe  2,  Probe  3,  Probe  4,  Probe  5を固定化したウエルでは、導入した測定対象であるTarget1の量の増加に伴い吸光度の増加を確認することが出来た。一方、Probe1を固定化したウエルではTarget1の量増加に伴う吸光度の増加は観測されなかった。これは、Probe  2,  Probe  3,  Probe  4,  Probe  5では測定対象のメチルシトシンがバルジ構造内に配置されるようにprobeが設計されているの対し、Probe1ではこのようなバルジ構造がなく、完全相補鎖のためである。図5に、Probe  1,Probe  2,  Probe  3,  Probe  4,  Probe  5とTarget  1が二重螺旋構造を形成した際の模式図を示す。Target1とProbe1は完全相補鎖であるため図5-1の様な二重螺旋構造を形成しており、メチルシトシンはグアニンと水素結合対を形成している。抗体の分子量は150kDa程度と嵩高いため二重螺旋構造内部のメチルシトシンとは結合できない。他方、Probe2,  Probe  3,  Probe  4,  Probe  5を用いた際には、Target1とは、おのおの図5-2，5-3，5-4，5-5に示すようなバルジ構造を有する2本鎖を形成している。バルジ構造内のメチルシトシンは水素結合対を形成していないため、2本鎖の外を向いている確率が高く、抗体と結合可能である。本実験では、バルジの大きさを、1塩基、3塩基、5塩基、7塩基と変えて実験を行ったが、いずれも良好な応答を得ることが出来、完全相補鎖との差異を観測することが出来た。
【００１９】
実施例２．
本実施例では、目的とするシトシンのみが、メチル化しているか否かを判別する測定対象となっていることを確認した検出例について述べる。実施例1と同様に目的核酸を捕捉するための一本鎖核酸(Probe  2。塩基配列は実施例1のProbe2と同じ)の固定化行った。300μLの蒸留水で2回洗浄し、過剰のDNAを除去した。その後、測定対象のDNAとしてTarget1,  Target  2,  Target  3,  Target  4をマイクロプレートに１００μＬずつ入れた。
Target1,  Target  2,  Target  3,  Target  4はすべて同じ配列（5'-  TTG  CGC  GGC  GTC  CGT  CCT  GTT  GAC  TTC  -3'）であるが、シトシンのメチル化の箇所が異なる。Target  1では、5‘末端から13塩基目のシトシンをメチル化してある。Target  2では、5‘末端から4塩基目のシトシンをメチル化してある。Target  3では、5‘末端から4塩基目と13塩基目の2箇所のシトシンをメチル化してある。Target  4では、メチル化したシトシンを含んでいない。Target1,  Target  2,  Target  3,  Target  4はダルベッコリン酸バッファ緩衝液を用いて希釈系列を作製し、マイクロプレートの各ウエルに10,  2,  1,  0.4,0.2,  0.1,0.01,  0  pmol導入した。その後、37℃で1時間反応させ、2本鎖を形成させた。その後、300μLのバッファで2回洗浄した。
その後、実施例1と同様に、抗メチルシトシン抗体を50μLずつ加え、37℃で1時間反応させた。バッファで洗浄した後、ペルオキシターゼ標識抗IgG抗体を50μLずつ加え、37℃で30分反応させた。バッファで洗浄した後、3,3',5,5'-tetramethylbenzidineを加え、遮光室温で10分反応させた。その後、２N塩酸溶液を50μLずつ加え、酵素反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにより450nmの吸光度を測定した。
図6に吸光度測定の結果を示す。Target1,  Target3では目的試料量の上昇に伴い吸光度が上昇、つまりメチルシトシンが検出されている。しかしながら、Target2,  Target  4では吸光度の上昇は見られなかった。これは、測定目的のシトシンがメチル化しているか否かを選択的に判別しているためである。具体的には、図7において説明する。Target1では、Probe2との二重螺旋構造形成時に目的とするシトシンがバルジ構造内に配置されており、この部分が抗体によって認識されている。しかしながら、Target2はメチルシトシンを含んでいるものの、そのメチルシトシンはバルジ内に配置されていないために抗体によって認識されない。よって吸光度の上昇は見られず、位置選択的に検出できていることが確認できた。Target3ではメチルシトシンを2箇所有しているが、Target1と同等の大きさの応答を得ており、2倍の応答が出ることは無かった。つまり、バルジ構造内にある目的のメチルシトシンのみを選択的に検出しており、非目的対象のメチルシトシンを測定していない。Target4では、目的とするDNA内にメチルシトシンを含んでいないために検出されない。本実施例が示すように、本発明の方法によれば、核酸中の目的箇所のシトシンがメチル化されているか否かを選択的に検出が可能である。たとえ目的箇所以外がメチル化されていても測定結果に影響を与えないので、極めて位置依存性が高く、選択的な検出が可能である。
【００２０】
実施例３．
以下に、アセチルコリンエステラーゼ標識抗体を用いて検出を行った例を示す。実施例1において、抗メチルシトシン抗体をマイクロウエルに導入、バッファで洗浄した後、5μg/mLのビオチン化抗IgG抗体(abcam社製、Goat  polyclonal  Secondary  Antibody  to  Mouse  IgG)を50μLずつ加え、37℃で30分反応させた。その後、アビジン化アセチルコリンエステラーゼ（Cayman社製）を50μLずつ加え、室温で120分反応させた。バッファで洗浄した後、1mM  アセチルチオコリンと1mM  の5,5’-ジチオビス混合液を100μL加え、室温で90分間反応させた。その後、マイクロプレートリーダーで415nmの吸光度を測定した。
結果、実施例1と同様にProbe2,  Probe  3,  Probe  4,  Probe  5ではTarget1の量の増加に伴い、吸光度の増加が観測された。これは、本発明による抗体によるメチルシトシン検出が、西洋わさびペルオキシターゼのみでなく、従来用いられている標識酵素を幅広く用いることが可能であることを示している。
【００２１】
実施例４．
以下に、電気化学発光法により検出を行った例を示す。実施例3において、アビジン化アセチルコリンエステラーゼを反応させ、洗浄した後、1mM  アセチルチオコリンを100μL加え、室温で90分間反応させアセチルチオコリンの一部をチオコリンへと分解した。その後、チオコリンを含むアセチルチオコリン溶液を、金電極を有するフローセルへ流速２０μＬ／分で１０分間導入し、チオコリンを金電極へ濃縮させた。その後、１ｍM  のトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウムを流速２０μＬ／分で１０分間導入した。さらに、金電極の電位を０から２．０Ｖへと掃引しながら、電極表面での電気化学発光量の計測を行った。なおこれらの試料溶液の導入にはシリンジポンプ（ＣＭＡ社製）を用いた。
電極電位を０から２．０Ｖへと掃引した際には、1150mV付近に発光ピークを示し、その発光ピークは、実施例1と同様にProbe2,  Probe  3,  Probe  4,  Probe  5ではTarget1の量の増加に伴い、発光強度の増加が観測された。これは、本発明による抗体によるメチルシトシン検出が吸光度計測のみでなく、電気化学発光などの従来用いられている検出法に幅広く適用可能であることを示している。
【００２２】
実施例５．
本実施例では、自己相補鎖を有する一本鎖DNA中に含まれるメチルシトシンの検出例について述べる。本実施例では、核酸固定化用９６ウエルマイクロプレートキット（住友ベークライト社製、BS-61601）を用いて、核酸の固定化行った。まず、３‘末端をアミノ化したDNAオリゴマー(Target5)を上記キットに付属のマイクロプレートに固定化した。Target5の塩基配列は、5’-  AAC  GAA  ACG  TTT  CGA  AAG  CGC  GCG  CGC  GCG  CGC  TTT  CGA  AAC  GTT  TCG  TT  -3’であり、5’末端から25番目と27番目のシトシンがメチル化してある。固定化は、DNAオリゴマーを付属の固定化液を用いて任意の濃度に希釈し、希釈した溶液を１００μLずつ各ウエルに滴下し、８０℃、2時間オーブンで乾燥させることで行った。蒸留水３００μLで２回洗浄した後、非特異吸着を防ぐことを目的として、ブロッキング材（ピアス社製、品番37538）を３００μL加え室温で３０分間放置した。洗浄用バッファ（ダルベコリン酸緩衝液に0.05%  Tween20を加えた溶液）を用いて３００μLで２回洗浄した後、抗メチルシトシン抗体を反応させた。抗メチルシトシン抗体は、インキュベーションバッファ（ダルベコリン酸緩衝液に0.05%  Tween20と0.1%ウシ血清アルブミンを加えた溶液）で0.5μg/mLに希釈した溶液を、50μLずつ加え、３７℃で１時間反応させることにより行った。洗浄用バッファを用いて３００μLで２回洗浄した後、２次抗体を反応させた。２次抗体は、ビオチン化抗IgG抗体（Abcam社製、品番ab6788）をインキュベーションバッファで0.2μg／ｍLに希釈した溶液を用いた。洗浄用バッファを用いて３００μLで２回洗浄した後、Avidin化アセチルコリンエステラーゼ(Cayman社製、品番400045、インキュベーションバッファで希釈)  を各ウエルに50μLずつ加え、室温で２時間反応させた。３００μLで４回洗浄した後、1  mM  アセチルチオコリン(10mM  リン酸緩衝液中、pH  7.0)を100μL加えて、室温で１時間反応させアセチルチオコリンの一部をチオコリンへと分解した。その後、実施例4と同様に電気化学発光法によりメチルシトシンの検出を行った。
電極電位を０から２．０Ｖへと掃引した際には、1150mV付近に発光ピークを示した。これは、Target5では自己相補鎖を形成させた際に、メチルシトシンが自己相補鎖内のループ構造内に配置され、グアニンと水素結合対を形成していないためである。このように、1本鎖のみであっても目的とするシトシン（もしくはメチルシトシン）がループ内に配置する場合には、検出が可能である。
【００２３】
実施例６．
本実施例では、二重螺旋構造形成時に、測定対象のメチルシトシンと水素塩基対を形成すべき位置の塩基をチミンとすることでメチルシトシンを不対にした実施例を示す。実施例1と同様に、目的核酸を捕捉するための2種類の一本鎖核酸(Probe  6およびProbe  7)をマイクロプレートに固定化した。Probe  6の塩基配列は、5'-  ACA  GAG  CCT  AAA  AAG  GAC  AAA  AAG  AAA  AAG  -3'であり、目的試料核酸とは完全相補鎖である。Probe  7の塩基配列は、5'-  ACA  GAG  CCT  AAA  AAG  GAC  AAA  AAT  AAA  AAG  -3'であり、Probe6との違いは、5‘末端から24番目の塩基がチミンである。その後、測定対象の核酸として、Target  ６をマイクロプレートに１００μＬずつ入れた。なおTarget  ６の塩基配列は5'-  CTT  TTT  CTT  TTT  GTC  CTT  TTT  AGG  CTC  TGT  -3'であり、5‘末端から7塩基目のシトシンをメチル化してある。Target６とProbe6は完全相補鎖であるが、Probe7とはメチルシトシンの部分が不対となる。Target  ６はダルベッコリン酸バッファ緩衝液を用いて希釈し、マイクロプレートの各ウエルに10  pmol導入した。その後、37℃で1時間反応させ、二重螺旋構造を形成させた。その後、300μLのバッファで2回洗浄した。
その後、2,  1,  0.5,  0.2,  0.1,  0.05,  0.02,  0μg/mLに希釈した抗メチルシトシン抗体を250μLずつ加え、37℃で24時間反応させた。バッファで洗浄した後、ペルオキシターゼ標識抗IgG抗体を50μLずつ加え、37℃で30分反応させた。バッファで洗浄した後、3,3',5,5'-tetramethylbenzidineを加え、遮光室温で10分反応させた。その後、２N塩酸溶液を50μLずつ加え、酵素反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにより450nmの吸光度を測定した。
図8に吸光度測定の結果を示す。大過剰の抗体を導入することにより、完全相補鎖であるProbe  6に於いても吸光度の上昇が見られる。しかしながら、不対構造を有するProbe7の方がProbe6に比べ十分に有意差のある大きな応答を得ることが可能であった。本結果は、抗体の量に依存せず、測定対象となるシトシンがメチル化しているか否かを判別可能であることを示している。
図9に、Probe  6及びProbe  7と二重螺旋構造を形成した核酸への抗メチルシトシン抗体の解離定数（Kd）を算出するためのスキャッチャードプロットを作成した結果を示す。スキャッチャードプロットの傾きから、完全相補鎖のProbe6と二重螺旋構造を形成したTarget６への抗体のKdは75  nMであり、測定対象となるシトシンが不対であるProbe7と二重螺旋構造を形成したTarget６への抗体のKdは96  nMであった。また、最大結合量（Bmax）はProbe6と二重螺旋構造を形成したときに比べ、Probe7と二重螺旋構造を形成したときの方が1.3倍大きかった。この差を利用することによりシトシンがメチル化しているか否かを判別可能である。
【符号の説明】
【００２４】
１  固相化用基材
２  Probe  DNA
３  Target  DNA
４  測定対象のメチルシトシン
５  測定対象外のメチルシトシン
６  抗メチルシトシン抗体
７  酵素標識2次抗体
８  測定対象のメチルシトシンとミスマッチになる塩基
【図１】
2012230019.tif 000003
【図２】
2012230019.tif 000004
【図３】
2012230019.tif 000005
【図４】
2012230019.tif 000006
【図５】
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【図６】
2012230019.tif 000008
【図７】
2012230019.tif 000009
【図８】
2012230019.tif 000010
【図９】
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【配列表】
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