【事件の表示】
　特願２００６−５４７７５９「多色同時測定用ルシフェラーゼ発光方法および発光試薬」拒絶査定不服審判事件〔平成１８年　６月１５日国際公開、ＷＯ２００６／０６１９８５〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　
　この出願は，平成１７年１１月２１日（優先権主張平成１６年１２月７日）を国際出願日とする出願であって，以降の手続の経緯は以下のとおりのものである。
　
　平成２３年　５月３１日付け　拒絶理由通知書
　平成２３年　８月　１日　　　意見書・手続補正書
　平成２３年１０月１８日付け　拒絶査定
　平成２４年　１月２４日　　　審判請求書・手続補正書
　平成２４年　３月　９日付け　拒絶理由通知書
　平成２４年　５月１０日　　　意見書・手続補正書・手続補足書
　平成２５年　５月２９日付け　審尋
　平成２５年　８月　２日　　　回答書
　平成２６年　２月１９日付け　拒絶理由通知書
　平成２６年　５月２３日　　　意見書・手続補正書
　
第２　本願発明の認定
　
　この出願の請求項１に係る発明は，平成２６年５月２３日付けの手続補正書により補正された特許請求の範囲，明細書及び図面（以下，「本願明細書」という。）の記載からみて，特許請求の範囲の請求項１ないし１０に記載された事項により特定されるとおりのものであると認められるところ，請求項１にかかる発明（以下,「本願発明」という。）は,次のとおりのものであると認める。
　
「緑色発光ルシフェラーゼ，橙色ルシフェラーゼ及び赤色ルシフェラーゼからなる群より選択される少なくとも２種のルシフェラーゼによる発光反応において，CoA，アデノシン三リン酸，マグネシウムイオン及び緩衝成分の存在下で，ルシフェラーゼをルシフェリンと反応させることにより，発光測定期間内の90秒間における発光強度の変動が10%以下であり，かつ発光半減期が２時間以上である少なくとも２種の発光を同時に生ぜしめることを特徴とする，ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光方法。」
　
第３　当審の拒絶理由通知で引用した刊行物に記載された事項
　
　平成２６年２月１９日付け当審の拒絶理由通知で引用した，本願の優先日前に頒布された下記の刊行物には，以下の事項が記載されている。なお，下線は当審で付与した。以下同様。
　
　刊行物１：２００３　Ｎｅｗ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｇｕｉｄｅ，（２００３），ｐ．９〜１０，“デュアルカラー・ルシフェラーゼ定量システム（ホモジニアス長時間発光タイプ）”，［online］，プロメガ株式会社，２００３年掲載，２０１４年１月３１日検索,インターネットhttp://www.promega.co.jp/jp/prometec_J/pdf/pj_ex2003/PJ-extra-02.pdf 
　刊行物２：特開２０００−３１９２８０号公報
　
１　刊行物１に記載された事項
１ａ「　
　　　」（９頁上表）
　
１ｂ「製品説明：
Chroma-Glo
TM
 Luciferase Assay Systemは，1つのサンプルに1種類の試薬を添加することにより，赤色/緑色2種類の発光（デュアル・カラー）を生成するシステムです。各Chroma-Luc
TM
 luciferasesにより生じる2色発光のフィルタリング測定により，各レポーターを区別し，事実上同時に測定することができます
特　長
●
1種類の基質を加えるだけで2種類のレポーターを測定
●相同性の高い理想的なコントロールを設定：レポーター発現に及ぼす可能性のある潜在的なRNA，タンパク質レベルでの影響を最低限に抑えるために開発された高いホモロジーを持つ赤と緑の発光を生じるルシフェラーゼ。
●処理量の増加：マルチプレートのバッチ処理および連続処理に適した
長時間発光（発光半減期：緑＞5hr, 赤＞30min
●少ないステップ数：Chroma-LucTM Reagent 1種類を培養中の細胞に直接添加し，測定するだけ。」（９頁左欄１〜下から４行）
　
１ｃ「　
　　　」（９頁右欄）
　
１ｄ「　
C
hroma-Luc
TM
 酵素の発光スペクトルと発光シグナルカイネティク
3
つに分けたCHO細胞集団それぞれにpCBR-Control Vector（カタログ番号E1421），pCBG68-Control Vector（カタログ番号E1441），pCBG99-ControlVector（カタログ番号E1461）をトランスフェクションした。
パネルB：Chroma-Glo
TM
 Reagentにより，サンプルを溶解し，発光を開始した（1サンプルに100μl/ウェル）。試薬添加後5分から120分までの間，1回あたり0.5秒間の測光を繰り返した
　
２　刊行物２に記載された事項　
２ａ「【０００２】
【従来の技術】
ホタルルシフェリンは，ホタルルシフェラーゼによる発光反応の基質であり，酸素，ATP，およびマグネシウムイオンの存在下に酸化されて発光する
　　　　　　　　　　・・・・・
【０００５】しかしながら，
ホタルルシフェラーゼとホタルルシフェリンはどちらも不安定な物質である
【０００６】
一般的に酵素とその基質が共存する状態では，それぞれが単独で存在するよりも安定性が向上することはよく知られた事実である。ホタルルシフェラーゼとホタルルシフェリンが共存する場合の安定化技術としては，安定化剤としてポリオールを添加し，pHを5.5から7.4としたホタルルシフェラーゼ・ホタルルシフェリンの水溶液[1]が知られている
　　　　　　　　　　・・・・・
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決すべき課題は，新たなホタルルシフェリンの安定化方法
　
２ｂ「【００４７】
その他必要に応じて，公知の安定化剤や，発光増強剤等も添加することが可能である
発光増強剤としてはコエンザイムA
　
２ｃ「【要約】
【目的】溶液中のホタルルシフェリンの安定性を向上させる。
【構成】溶液中のホタルルシフェリンをシクロデキストリンに包接させることを特徴とするホタルルシフェリンの安定化方法。アダマンタン誘導体を添加することによる包接したホタルルシフェリンの包接解除方法。ならびにこの方法を用いた安定なホタルルシフェリン溶液と生物発光試薬キット。」
　
第４　当審の判断
　
１　刊行物１に記載された発明
　
　刊行物１は，デュアルカラー・ルシフェラーゼ定量システムである「Chroma-GloTM Luciferase Assay System  Chroma-LucTM Series Reporter Vectors」（１ａ）に関し記載するものであり，これは，「1つのサンプルに1種類の試薬を添加することにより，赤色／緑色2種類の発光（デュアル・カラー）を生成するシステム」である（１ｂ）。
　この赤色／緑色2種類の発光（デュアル・カラー）を生成するシステムは，各Chroma-LucTM luciferasesにより生じる「赤色／緑色２種類」の２色発光を「事実上同時に測定することができる」（１ｂ）発光方法といえる。　
　そして，上記システムの「1つのサンプルに1種類の試薬を添加すること」につき，このアッセイシステムの操作概要図（１ｃ）を見ると，Chroma-GloTM基質にChroma-GloTM緩衝液を加えてChroma-GloTM試薬とし，これに検体を添加して混合し，赤色／緑色の２種類の発光を同時に生ぜしめていることが記載されている。　
　さらに，刊行物１の１ｂには，発光半減期は，赤色が３０分以上，緑色が５時間以上であることが記載されている。
　
　そうすると，刊行物１には，
　
「Chroma-GloTM基質にChroma-GloTM緩衝液を加えてChroma-GloTM試薬とし，これに検体を添加して混合し，ルシフェラーゼにより赤色／緑色２種類の発光（発光半減期は，赤色が３０分以上，緑色が５時間以上）を同時に生成させる発光方法。」
　
の発明（以下，「引用発明」という。）が記載されていると認められる。
　
２　本願発明と引用発明との対比
　
（１）引用発明の「ルシフェラーゼにより赤色／緑色2種類の発光」「を同時に生成させる発光方法」は，ルシフェラーゼとその基質であるルシフェリンとの反応によるものであるから，本願発明の「緑色発光ルシフェラーゼ，橙色ルシフェラーゼ及び赤色ルシフェラーゼからなる群より選択される少なくとも２種のルシフェラーゼによる発光反応において」「少なくとも２種の発光を同時に生ぜしめることを特徴とする，ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光方法」に包含される。
　
（２）引用発明の「Chroma-GloTM基質にChroma-GloTM緩衝液を加えてChroma-GloTM試薬とし，これに検体を添加して混合し，ルシフェラーゼにより・・発光・・を・・生成させる」について，ルシフェラーゼによる発光は，ＡＴＰ，マグネシウムイオン及び酸素の存在下で，ルシフェラーゼをその基質であるルシフェリンと反応させることにより生じるものであり，該発光反応にはこれらの成分が必要であることは，刊行物２の記載（２ａ【０００２】）からも明らかなように，本願優先日前，周知事項である。
　それ故，引用発明の「Chroma-GloTM基質にChroma-GloTM緩衝液を加えてChroma-GloTM試薬とし，これに検体を添加して混合し，ルシフェラーゼにより・・発光・・を・・生成させる」際には，ＡＴＰ，マグネシウムイオン及び酸素の存在下で，ルシフェラーゼをルシフェリンと反応させている状態となることは明白である。
　そうすると，引用発明の「Chroma-GloTM基質にChroma-GloTM緩衝液を加えてChroma-GloTM試薬とし，これに検体を添加して混合し，ルシフェラーゼにより・・発光・・を・・生成させる」ことと，本願発明の「CoA，アデノシン三リン酸，マグネシウムイオン及び緩衝成分の存在下で，ルシフェラーゼをルシフェリンと反応させる」こととは，アデノシン三リン酸，マグネシウムイオン及び緩衝成分の存在下で，ルシフェラーゼをルシフェリンと反応させる点で共通する。
　
（３）本願発明の「発光測定期間内の90秒間における発光強度の変動が10%以下」について，引用発明の「発光方法」がかかる特性を具備するか明らかでない。
　
　したがって，両者は，　
　
「緑色発光ルシフェラーゼ，橙色ルシフェラーゼ及び赤色ルシフェラーゼからなる群より選択される少なくとも２種のルシフェラーゼによる発光反応において，アデノシン三リン酸，マグネシウムイオン及び緩衝成分の存在下で，ルシフェラーゼをルシフェリンと反応させることにより，少なくとも２種の発光を同時に生ぜしめることを特徴とする，ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光方法。」
　
である点で一致し，以下の点で相違するといえる。
　
　相違点：本願発明では，２種のルシフェラーゼによる発光反応を「CoA」の存在下で行っており，「発光測定期間内の90秒間における発光強度の変動が10%以下であ」り，かつルシフェラーゼの発光半減期が「２時間以上」であるのに対し，引用発明では，２種のルシフェラーゼによる発光反応を「CoA」の存在下で行っているか明らかでなく，「発光測定期間内の90秒間における発光強度の変動が10%以下」であるのかも明らかでなく，かつ発光半減期が「緑色は５時間以上であるが赤色は３０分以上」である点。
　
３　判断
　
（１）相違点について
ア　「CoA」について
　発光強度の増強を図ることは，検出感度増強等のために必要なことであり，本願優先日前周知の課題であったといえ，刊行物２に「発光増強剤としてはコエンザイムＡ」（２ｂ）と記載されているように，CoAを発光増強剤として用いることは，本願優先日前周知事項であった。
　
イ　「発光測定期間内の90秒間における発光強度の変動が10%以下であ」り，かつルシフェラーゼの発光半減期が「２時間以上」であることについて
　発光半減期の長い定量システムの構築は，本願優先日前周知の課題であった。例えば，刊行物１記載のデュアルカラー・ルシフェラーゼ定量システムの特徴として，刊行物１には「●処理量の増加：マルチプレートのバッチ処理および連続処理に適した長時間発光（発光半減期：緑＞5hr，赤＞30min）」（１ｂ）と記載され，長時間の発光が求められていることは明らかである。特に，赤色の発光半減期は，刊行物１の１ｃのグラフから明らかなように，緑色のそれより短く，当業者であれば赤色の発光半減期をより延長しようとすると思うものといえる。
　
　また，測定期間中に変動の少ない発光系が望まれることもいうまでもないことである。
　この点について，引用発明の「緑色」の発光強度の変動を精査すると，刊行物１の（１ｃ）に摘記されているパネルBから発光測定期間内の90秒間における発光強度の最も大きな変動を示す領域の変動％を計算すると，０分から約１３分の間の領域が最大の変動を示す領域であり，この間に１００％から約１０４％にまで変化していることから，引用発明の「緑色」の発光の変動は，最大でも，約０．４６％／９０秒であることが分かる。
　そうすると，引用発明の「緑色」の「ルシフェラーゼ」の「発光」については，本願発明の「発光測定期間内の90秒間における発光強度の変動が10%以下であり，かつ発光半減期が２時間以上」という要件を満たすものといえる。
　他方，引用発明の「赤色」の発光強度の変動を精査すべく同様の計算をすると，刊行物１のパネルB（１ｃ）からより，０分から約２１分の間の領域が最大の変動を示す領域であり，この間に１００％から約７８％にまで変化をしていることから，引用発明の「緑色」の発光の変動は，最大でも約１．５７％／９０秒であることが分かる。
　そうすると，引用発明の「赤色」の「ルシフェラーゼ」の「発光」については，本願発明の「発光測定期間内の90秒間における発光強度の変動が10%以下」という要件は満たすものの，半減期の要件は満たしていない。
　
　ここで，発光半減期が長くかつ測定期間中に変動の少ない赤色ルシフェラーゼとして，鉄道虫赤色ルシフェラーゼがあることは，以下に示す刊行物Ａ（拒絶査定時の引用文献２），Ｂの記載より明らかなように，本願優先日前，周知事項であった。
　特に，刊行物Ａの図４より，鉄道虫赤色ルシフェラーゼの発光半減期は２時間以上であり，最も変動が激しい０分から１時間までのデータをみても，90秒間における発光強度の変動は１％以下であることが分かる。さらに，刊行物Ｂの図５より，鉄道虫赤色ルシフェラーゼの発光半減期は１０時間以上であり，最も変動が激しい０分から１時間までのデータをみても，90秒間における発光強度の変動は１％以下であることも分かる。
　
ウ　小括
　以上ア，イより，発光強度を増強し，発光半減期が長く測定期間中変動の少ない定量システムを構築するため，引用発明において，緑色ルシフェラーゼに比べ赤色ルシフェラーゼの発光半減期が短いことから，該赤色ルシフェラーゼを発光半減期が長くかつ測定期間中の変動の少ない周知の鉄道虫赤色ルシフェラーゼに置換し，かつ発光増強剤として周知のCoAを適用することで，相違点に記載の本願発明の特定事項のごとくすることは，当業者が容易になし得たことである。
　
　刊行物Ａ：国際公開第２００４／０９９４２１号（拒絶査定時の引用文献２）
「実施例３
　哺乳類細胞内で発現した
鉄道虫由来赤色，緑色発光タンパク
赤色，緑色発光タンパク共に，同じような時間経過で活性減少が認められ，細胞内でのそれぞれの酵素の半減期は約３．５時間であった
　
「　
　」（図４）
　
　刊行物Ｂ：特開２００４−３３３４５７号公報
「【００２６】
緑色発光鉄道虫ルシフェラーゼおよび赤色発光鉄道虫のルシフェラーゼの発現大腸菌を個別に培養したもの１００ｍＬを集菌し，緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）５ｍＬに懸濁し，緑色発光鉄道虫ルシフェラーゼ溶液と
赤色発光鉄道虫のルシフェラーゼ溶液を得た
　
「【図面の簡単な説明】　　　　・・・・・
【図５】ウミボタルルシフェラーゼ，緑色発光鉄道虫ルシフェラーゼおよび
赤色発光鉄道虫ルシフェラーゼの基質添加後の発光強度変化
　
「　
　」（図５）
　
（２）本願発明の効果について
　本願発明の効果は，刊行物１及び２及び上記周知の技術的事項から当業者が予測し得る程度のものであって，格別顕著なものとはいえない。
　
４　まとめ
　
　したがって，本願発明は，その優先日前に頒布された刊行物１，２に記載された発明及び本願優先日前の周知事項に基いて当業者が容易に発明をすることができたものであるから，特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　
第５　むすび
　
　以上のとおり，本願発明は特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるから，その余について言及するまでもなく，この出願は，拒絶すべきものである。
　
　よって，結論のとおり審決する。