(57)【要約】【課題】  人体に安全であり、天然からのノイラミニダーゼ阻害物を簡易に製造する。【解決手段】  ネギの葉から含水アルコールなどの親水性有機溶媒で抽出製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネギの葉から含水エタノールで抽出製造するノイラミニダーゼ阻害物及び製造法。
【請求項２】
ネギの葉から低級アルコールやアセトンなどで抽出製造するノイラミニダーゼ阻害物及び製造法。
【請求項３】
請求項１及び２での物質を含有するノイラミニダーゼ阻害効果を有する食品やドリンク。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、生化学、医学、医療の分野で、細菌やウイルスが産生する酵素ノイラミニダーゼの活性を阻害する物質及びその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】  ノイラミニダーゼ（別名シアリダーゼ、アシルノイラミニルヒドロラーゼ）は、糖の一種であるノイラミン酸（別名シアル酸）のグリコシド結合を切断する糖加水分解酵素である。ノイラミン酸は人や微生物の細胞表面などに存在する糖であり、特に人の細胞糖鎖を構成する主要な糖である。ノイラミニダーゼ阻害物質はノイラミニダーゼ酵素活性の働きを抑制する作用をもつものである。ノイラミニダーゼ阻害物質は、病気の治療や予防、その研究などに用いられるものである。【０００３】  ノイラミニダーゼは動物や微生物、ウイルスに存在するが、有名なのは細菌ではサルモネラ菌、コレラ菌やクロストリジウム属（破傷風菌、ボツリヌス菌、ウエルシュ菌など）など、ウイルスではインフルエンザウイルス、センダイウイルス、ニューカッスル病ウイルスなどである。これらの細菌やウイルスは病原性があり、ヒトや動物に対してしばしば重篤な病気を引起こす。【０００４】  これらの細菌は身近なところでは食中毒の原因となるが、ノイラミニダーゼ阻害物質は、感染、発症予防に対して非常に効果的なツールであると思われる。また、ウイルスに関しては、現在、抗ウイルス剤の開発は大変難しく、ウイルスに対する効果的な治療は困難な状況にある。特にインフルエンザウイルスは急性呼吸器疾患の主な原因となり、インフルエンザ脳症など死に至る病気をも引起こすが、インフルエンザウイルスは変異しやすく、薬剤耐性ができやすい。インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルスが人に感染し、感染細胞から放出されて他の細胞に感染する際に関与しているが、変異しやすいインフルエンザウイルスも、このノイラミニダーゼの活性部位のみは変異しにくいと言われており、インフルエンザウイルスの新しい治療法としてノイラミニダーゼ阻害剤が有望視され、いくつか開発されている。ノイラミニダーゼ阻害剤は、呼吸器部位における粘液中のウイルス感染を阻害し、早期治療に有効と考えられている。【０００５】  この感染機構の研究から開発された薬剤としては、２−デオキシ−２，３−デヒドロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸およびその誘導体や４−グアノジノ−２−デオキシ−２，３−デヒドロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、リレンザ（商品名）、タミフル（商品名）などがある。【０００６】  また、ノイラミニダーゼにより赤血球の膜を破壊し、そこから侵入し、溶血させる作用を有するウイルスの存在が報告されている。このウイルスの感染防御ためにもノイラミニダーゼ阻害物質は求められている。さらに、人の細胞の表面にはノイラミン酸が存在するので、細胞の研究、特にガン細胞の研究などに対してノイラミニダーゼ阻害物質は非常に有益なツールとして用いられることが予測される。【０００７】  既に、ノイラミニダーゼ阻害活性物質の製造法は、化学合成法や微生物を用いた製造法が知られている。微生物としては、スタフィロコッカス、アクチノミセスやストレプトミセスが用いられている。しかし、これらの微生物が産生するノイラミニダーゼ阻害物質は、その活性が低く、抽出、分離操作が非常に煩雑であるという欠点がある。又、化学合成法による製造法は、活性や合成の収率が低いという欠点をもっている。近年、インフルエンザの治療薬として用いられている化合物もあるが、副作用の危険性が報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  本発明は、人体に対して安全であり、無害なノイラミニダーゼ阻害物質を提供するものである。また、従来の微生物による発酵法や化学合成法による製造での、収率の悪さ、製造の複雑さ等の欠点を克服し、簡単にかつ大量に生産し得る方法で、工業的に実施するのに有利な製造方法を提供するためになされたものである。【０００９】  また、ノイラミニダーゼ阻害効果を有する、手軽に日常的に摂取可能な食品やドリンクなどが求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  ノイラミニダーゼ阻害物質をネギの葉を含水エタノールや低級アルコール、アセトンなどの親水性有機溶媒にて抽出し、その後、水などにより再抽出することにより得る。また、このようにして得られた物質を食品やドリンクなどに添加する。
【発明の効果】
【００１１】  本発明で得られたノイラミニダーゼ阻害物質は、常用される食品から得られるものであり、その後の化学合成化学修飾処理などを施してないので、人体に対して安全である。また、製造法も極めて簡易である。
【課題を実施するための最良の形態】
【００１２】  以下、本発明についてその好ましい様態をあげ、より具体的に述べる。
【００１３】  材料となるネギ（学名：Ａｌｌｉｕｍ  ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ  Ｌ．）は、ユリ科植物であり、ネブカネギ、シモニタネギ、ヤグラネギ、ワケギ、葉ネギなど通常食用されているものが用いられる。
【００１４】  本発明において、ネギの葉をネギから適宜切断、分離する。ネギ葉は通常、水洗し、水切りを行う。その後、貯蔵が短期間であるなら、冷蔵保存を、長期間であるなら冷凍保存する。または、凍結乾燥処理を行い、保存してもよいし、品質が劣化しない程度に乾燥処理し保存してもよい。
【００１５】  葉を適宜切断し、葉の重量の２〜１０倍量の含水エタノールと一緒にジューサーやブレンダーなどの破砕機に加え、金属刃などの高速回転を利用した機械的剪断力によりネギの葉を破砕する。このときの含水エタノールのエタノール濃度は５０〜１００％（Ｖ／Ｖ）の範囲が用いられるが、エタノールの場合は濃度が７０％（Ｖ／Ｖ）のとき、効率などの点から最も好ましい。この際、予めネギは細断したほうが破砕効率がよい。大きな葉の繊維が目で確認されなければ、破砕終了である。次にこの破砕物を搾汁やろ過や遠心、またはこれらの組み合わせなどにより、不溶分を除去し、搾汁液を得る。再び、これらの残渣を回収し、含水エタノールを加え、破砕処理し、同様にろ過などにより搾汁液を集め、最初の搾汁液と一緒にしてもよい。次に、これらの含水エタノールを蒸発溜去して、当該発明物質が得られる。
【００１６】  この物質の精製法としては様々あるが、エタノールを溜去した固形分を水に溶解する方法でもよい。また、別の精製法としては、エタノールを溜去した固形分をブタノールと水にて分配し、ブタノール画分を集め、ブタノールを溜去し、残った固形分をヘキサンや酢酸エチルで洗浄してもよい。また、各種、化学処理やカラムクロマト処理などが用いられる。
【００１７】  また、上記のネギの葉を破砕するときに、含水エタノールの替わりに含水プロパノール、含水イソプロパノールなどの低級アルコールや含水アセトンなどの親水性有機溶媒を使用する方法も用いられる。葉の重量の２〜１０倍量の有機溶媒を用い、同様に機械的剪断力などにより破砕する。その際の使用する有機溶媒の濃度は、種類により濃度は異なるが、おおよそ３０〜９０％の範囲である。
【００１８】  このようにして製造されたノイラミニダーゼ阻害物質を食品やドリンクなどに添加する。添加する形態は、得られた形状そのままや、または、粉末化基材を添加し粉末化を行ったり、液状、油状など用途に応じて適用できる。また、添加される食品やドリンクは種類は問わず、生鮮食品以外であれば添加可能である。
【００１９】  以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これは単に例示の目的で述べるものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
【実施例１】
【００２０】  市販のネブカネギを購入後、水洗し、水切りした。緑色の葉の部分を茎から切り離し、葉の部分を５０ｇ得、はさみで１〜２ｃｍに切断した。これを市販のミキサー（ＭＸ２５０５０；ブラウンジレットジャパンインコーポレイテッド社製）に入れ、７０％（Ｖ／Ｖ）エタノール３００ｍｌを加え、９０秒間金属刃を高速回転し、破砕した。次に、日本薬局方のガーゼ３０ｃｍ×３０ｃｍを５枚重ねし、破砕液をガーゼにて少量ずつ濾しながら、手で搾った。搾った溶液をガラスろ過器でろ過した。このろ液の含水エタノールを溜去するためロータリーエバポレーターで、乾固するまで３０℃で減圧濃縮した。この乾固固形物に蒸留水を５０ｍｌ加え、超音波洗浄器中にて溶解した。この溶液を遠心分離機にて３，２００回転、１０分間遠心し、水不溶分を除去した。上清をロータリーエバポレーターで、乾固するまで４０℃で減圧濃縮した。収量は２．３ｇであった。【００２１】  ノイラミニダーゼ酵素反応阻害活性について。【００２２】  ５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）中にて、基質として１ｍＭ（終濃度０．５ｍＭになる）２’−（４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸アンモニウム（マルキンバイオ製）１５０μｌ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（細菌名）由来のノイラミニダーゼ（シグマ社製、アメリカ）溶液を２５μｌ、上記で得られた７０％エタノール抽出物を適宜各濃度で加え、総量３００μｌにて酵素反応を行った。酵素反応は、酵素反応の結果遊離する４−メチルウンベリフェロンを分光蛍光光度計（Ｆ−４５００；日立製作所社製）で励起波長（ＥＸ）３６５ｎｍ、蛍光波長（ＥＭ）４５０ｎｍの蛍光強度を計測することにより求めた。その結果、酵素活性を５０％阻害するＩＣ５０は６８ｐｐｍであった。
【実施例２】
【００２３】  市販のネブカネギを購入後、水洗し、水切りした。緑色の葉の部分を茎から切り離し、葉の部分を１００ｇ得、はさみで１〜２ｃｍに切断した。これを市販のミキサー（ＭＸ２５０５０；ブラウンジレットジャパンインコーポレイテッド社製）に入れ、７０％（Ｖ／Ｖ）エタノール３００ｍｌを加え、９０秒間金属刃を高速回転し、破砕した。次に、日本薬局方のガーゼ３０ｃｍ×３０ｃｍを５枚重ねし、破砕液をガーゼにて少量ずつ濾しながら、手で搾った。搾った溶液をガラスろ過器でろ過した。このろ液の含水エタノールを溜去するためロータリーエバポレーターで、乾固するまで３０℃で減圧濃縮した。この乾固固形物にブタノール３０ｍｌと水３０ｍｌを加え、分液ロートにて分配し、ブタノール相を集めた。この分配操作を３回繰り返し、ブタノール相を一緒にし、ロータリーエバポレーターで、乾固するまで３０℃で減圧濃縮した。乾固固形物の緑の着色がなくなるまで、酢酸エチルで繰り返し洗浄後、風乾し、ノイラミニダーゼ阻害物を得た。収量は０．１ｇであった。【００２４】  ノイラミニダーゼ酵素反応阻害活性について。【００２５】  （１）５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）中にて、基質として１ｍＭ（終濃度０．５ｍＭになる）２’−（４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸アンモニウム（マルキンバイオ製）１５０μｌ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（細菌名）由来のノイラミニダーゼ（シグマ社製、アメリカ）溶液を２５μｌ、上記で得られたノイラミニダーゼ阻害物を適宜各濃度で加え、総量３００μｌにて酵素反応を行った。酵素反応は、酵素反応の結果遊離する４−メチルウンベリフェロンを分光蛍光光度計（Ｆ−４５００；日立製作所社製）で励起波長（ＥＸ）３６５ｎｍ、蛍光波長（ＥＭ）４５０ｎｍの蛍光強度を計測することにより求めた。その結果、酵素活性を５０％阻害するＩＣ５０は１６ｐｐｍであった。【００２６】  （２）５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中にて、基質として１ｍＭ（終濃度０．５ｍＭになる）２’−（４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸アンモニウム（マルキンバイオ製）１５０μｌ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（細菌名）由来のノイラミニダーゼ（シグマ社製、アメリカ）溶液を２５μｌ、上記で得られたノイラミニダーゼ阻害物を適宜各濃度で加え、総量３００μｌにて酵素反応を行った。酵素反応は、酵素反応の結果遊離する４−メチルウンベリフェロンを分光蛍光光度計（Ｆ−４５００；日立製作所社製）で励起波長（ＥＸ）３６５ｎｍ、蛍光波長（ＥＭ）４５０ｎｍの蛍光強度を計測することにより求めた。その結果、酵素活性を５０％阻害するＩＣ５０は０．１５％であった。【００２７】  （３）５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中にて、基質として１ｍＭ（終濃度０．５ｍＭになる）２’−（４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸アンモニウム（マルキンバイオ製）１５０μｌ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（細菌名）由来のノイラミニダーゼ（シグマ社製、アメリカ）溶液を２５μｌ、上記で得られたノイラミニダーゼ阻害物を適宜各濃度で加え、総量３００μｌにて酵素反応を行った。酵素反応は、酵素反応の結果遊離する４−メチルウンベリフェロンを蛍光光度計（Ｆ−４５００；日立製作所社製）で励起波長（ＥＸ）３６５ｎｍ、蛍光波長（ＥＭ）４５０ｎｍの蛍光強度を計測することにより求めた。その結果、酵素活性を５０％阻害するＩＣ５０は０．６１％であった。【００２８】  （４）５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中にて、基質として１ｍＭ（終濃度０．５ｍＭになる）２’−（４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸アンモニウム（マルキンバイオ製）１５０μｌ、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ，Ｈｉｔｃｈｅｒ  Ｂ１  ｓｔｒａｉｎ由来のノイラミニダーゼ（シグマ社製、アメリカ）溶液を２５μｌ、上記で得られたノイラミニダーゼ阻害物を適宜各濃度で加え、総量３００μｌにて酵素反応を行った。酵素反応は、酵素反応の結果遊離する４−メチルウンベリフェロンを蛍光光度計（Ｆ−４５００；日立製作所社製）で励起波長（ＥＸ）３６５ｎｍ、蛍光波長（ＥＭ）４５０ｎｍの蛍光強度を計測することにより求めた。その結果、酵素活性を５０％阻害するＩＣ５０は０．５３％であった。