(57)【要約】  【課題】  有機酸生産能力が向上した酵母株と、その酵母株を用いてなる有機酸の製造法を提供する。  【解決手段】  ＰＤＲ１３をコードするＤＮＡの一部が欠失、置換または挿入等の変異を有する染色体ＤＮＡを保持する、有機酸生成酵素をコードする遺伝子を組み込んだ酵母株と、その有機酸生成酵素をコードする遺伝子を組み込んだ酵母株を糖質存在下で培養し、培養物中に該酵素により生成する有機酸を蓄積させ、該培養物から該有機酸を採取することを特徴とする有機酸の製造法を提供する。  【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒートショックプロテイン７０タンパク質と同一あるいは相同性を有するタンパク質をコードする染色体ＤＮＡ上の遺伝子であり、そのＤＮＡ配列の一部が変異を有する染色体ＤＮＡを保持することおよび／またはエーティーピーシンテース（ＡＴＰａｓｅ）領域を含むタンパク質をコードする遺伝子を保持することを特徴とする酵母株。
【請求項２】
染色体ＤＮＡ配列が、欠失、挿入または置換変異により遺伝子がコードするタンパク質の一部分のみに翻訳せしめる変異ＤＮＡ配列となっていることを特徴とする請求項１記載の酵母株。
【請求項３】
遺伝子がＰＤＲ１３遺伝子であることを特徴とする請求項１または２記載の酵母株。
【請求項４】
ＰＤＲ１３遺伝子の塩基配列において、少なくともＣ末端側のアミノ酸３９残基を翻訳せしめない変異ＤＮＡ配列を染色体ＤＮＡ上に有する請求項３記載の酵母株。
【請求項５】
ヒートショックプロテイン７０タンパク質と同一あるいは相同性を有するタンパク質であって、その一部が欠失したタンパク質を産生することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の酵母株。
【請求項６】
産生したタンパク質がエーティーピーシンテース（ＡＴＰａｓｅ）領域を含むことを特徴とする請求項５記載の酵母株。
【請求項７】
ヒートショックプロテイン７０タンパク質と相同性を有するタンパク質がＰＤＲ１３タンパク質であって、当該欠失部分がＰＤＲ１３タンパク質の少なくともＣ末端側の３９アミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項５または６記載の酵母株。
【請求項８】
有機酸生成酵素をコードする遺伝子が導入されてなる請求項１〜７のいずれかに記載の酵母株。
【請求項９】
有機酸生成酵素が乳酸脱水素酵素であることを特徴とする請求項８記載の酵母株。
【請求項１０】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する請求項１〜９のいずれかに記載の酵母株。
【請求項１１】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母が、サッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項１０記載の酵母株。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の酵母株を糖質存在下で培養し、培養物中に酵素により生成する有機酸を蓄積させ、該培養物中から該有機酸を採取することを特徴とする有機酸の製造法。
【請求項１３】
有機酸が乳酸であることを特徴とする請求項１２記載の有機酸の製造法。
【請求項１４】
有機酸がピルビン酸であることを特徴とする請求項１２記載の有機酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機酸の生産能力が向上した酵母株と、その酵母株を用いてなる有機酸の製造法に関するもである。
【背景技術】
【０００２】
近年、資源循環型社会構築に向け、生物資源由来の材料を用いた工業原料生産が盛んに行われている。その中で生物由来材料である乳酸を用いたポリ乳酸は、優れた性質を持つポリマーとして注目されており、その原料となる乳酸をいかに安価に供給するかが課題となっている。
【０００３】
乳酸の生産は、ラクトバチラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属やラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に代表される乳酸菌によって主に実施されているが、乳酸を培養液中に多量に蓄積させるためには、乳酸菌が酸性条件下で生育しないため、炭酸カルシウムやアンモニア、あるいは水酸化ナトリウムなどの中和剤を添加した培養を行わなければならず、中和工程や精製工程に多大なコストを要している。
【０００４】
一方、酸性条件下で生育可能な酵母株を用いた有機酸の製造法が、複数、提案されている（特許文献１〜３および非特許文献１、２参照。）。これらの提案によれば、本来乳酸生成能を持たない酵母に乳酸生成酵素遺伝子を導入し、乳酸を生産させることにより、中和操作を軽減し、低コストな乳酸製造工程を構築することが可能である。さらに、酵母株による乳酸を始めとする有機酸の生産能力を、遺伝子組み換え等の技術を用いて向上させることにより、より安価な有機酸の製造法を構築することが可能である。
【０００５】
遺伝子変異による有機酸生産能力の向上した微生物としては、エスケリッチア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）においてＦ０Ｆ１−エーティーピーシンテース（Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ）をコードする遺伝子を高発現させることにより、有機酸生産能力が向上することが知られている（非特許文献３、４参照。）が、特定の遺伝子変異に起因して有機酸生産能力が向上した酵母株、および酵母株において有機酸生産能力に関与する遺伝子は知られていない。
【０００６】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ   ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＰＤＲ１３遺伝子の塩基配列、および該遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、既に知られている（非特許文献５参照。）。また、サッカロマイセス・セレビシエにおいて、ＤＲ１３をコードする遺伝子領域の欠失は宿主の薬剤耐性能力を低下させること、およびグルコースの資化能力が低下することは知られている（非特許文献６参照。）が、ＰＤＲ１３タンパク質とサッカロマイセス・セレビシエの有機酸生産能力との関係は知られていない。
【特許文献１】特開２００１−２０４４６８号公報
【特許文献２】特表２００１−５１６５８４号パンフレット
【特許文献３】特開２００３−２５９８７８号公報
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド  アンド  エンバイロンメンタル  マイクロバイオロジー）、７１、１９６４（２００５）
【非特許文献２】Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド  アンド  エンバイロンメンタル  マイクロバイオロジー）、７１、２７８９（２００５）
【非特許文献３】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  サイエンス  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ）、１００、８２５（２００３）
【非特許文献４】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  サイエンス  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ）、１０１、２２３５（２００４）
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ（サイエンス）、３０、２０７７（１９９４）
【非特許文献６】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（モレキュラー  アンド  セルラー  バイオロジー）、１８、１１４７（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、遺伝子工学的手法を用いて有機酸生産能力が向上した酵母株を作出し、該酵母株を用いた効率的な有機酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明においては、遺伝子工学的手法を用いて変異処理を施した酵母株の中から、有機酸生産能力が向上した酵母株を探索した結果、有機酸生産能力の向上をもたらす遺伝子変異を同定した。該遺伝子変異を有する酵母株を利用することにより、上記課題を解決するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明によれば、下記の（１）〜（１４）に記載の構成にかかる発明を提供することができる。
【００１０】
（１）ヒートショックプロテイン７０タンパク質と同一あるいは相同性を有するタンパク質をコードする染色体ＤＮＡ上の遺伝子であり、そのＤＮＡ配列の一部が変異を有する染色体ＤＮＡを保持することおよび／またはエーティーピーシンテース（ＡＴＰａｓｅ）領域を含むタンパク質をコードする遺伝子を保持することを特徴とする酵母株。
【００１１】
（２）染色体ＤＮＡ配列が、欠失、挿入または置換変異により前記の遺伝子がコードするタンパク質の一部分のみに翻訳せしめる変異ＤＮＡ配列となっている前記（１）記載の酵母株。
【００１２】
（３）遺伝子がＰＤＲ１３遺伝子である前記（１）または（２）記載の酵母株。
【００１３】
（４）ＰＤＲ１３遺伝子の塩基配列において、少なくともＣ末端側のアミノ酸３９残基を翻訳せしめない変異ＤＮＡ配列を染色体ＤＮＡ上に有する前記（３）記載の酵母株。
【００１４】
（５）ヒートショックプロテイン７０タンパク質と同一あるいは相同性を有するタンパク質であって、その一部が欠失したタンパク質を産生する前記（１）〜（４）のいずれかに記載の酵母株。
【００１５】
（６）産生したタンパク質がエーティーピーシンテース（ＡＴＰａｓｅ）領域を含む前記（５）記載の酵母株。
【００１６】
（７）ヒートショックプロテイン７０タンパク質と相同性を有するタンパク質がＰｄｒ１３タンパク質であって、当該欠失部分がＰｄｒ１３タンパク質の少なくともＣ末端側の３９アミノ酸残基を含む前記（５）または（６）記載の酵母株。
【００１７】
（８）有機酸生成酵素をコードする遺伝子が導入されてなる前記（１）〜（７）のいずれかに記載の酵母株。
【００１８】
（９）有機酸生成酵素が、乳酸脱水素酵素である前記（８）記載の酵母株。
【００１９】
（１０）酵母がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する前記（１）〜（９）のいずれかに記載の酵母株。
【００２０】
（１１）サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母が、サッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である前記（１０）記載の酵母株。
【００２１】
（１２）前記（１）〜（１１）のいずれかに記載の酵母株を糖質存在下で培養し、培養物中に酵素により生成する有機酸を蓄積させ、該培養物中から該有機酸を採取することを特徴とする有機酸の製造法。
【００２２】
（１３）有機酸が乳酸である前記（１２）記載の有機酸の製造法。
【００２３】
（１４）有機酸がピルビン酸である前記（１２）記載の有機酸の製造法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、有機酸生成酵素が導入され有機酸生産能力が向上した酵母株が得られ、その酵母株を用いて効率的に有機酸を製造することができる。本発明においては、有機酸生成酵素が導入された酵母株に対して、さらにＰＤＲ１３タンパク質を部分的に生産させることで、有機酸の生産性を向上させることができ、生産時間の短縮化によりコスト低減を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の酵母株は、ヒートショックプロテイン７０（以下、Ｈｓｐ７０と略すことがある。）タンパク質と同一あるいは相同性を有するタンパク質をコードする染色体ＤＮＡ上の遺伝子であり、その染色体ＤＮＡ配列の一部が変異を有する染色体ＤＮＡを保持することおよび／またはＡＴＰａｓｅ領域を含むタンパク質をコードする遺伝子を保持することを特徴とする酵母株である。
【００２６】
Ｈｓｐ７０タンパク質とは、シャペロンタンパク質ファミリーの１つの総称であり、酵母株におけるＨｓｐ７０としては、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＢ１およびＳＳＢ２などが挙げられる。また、Ｈｓｐ７０タンパク質と相同性を有するタンパク質としては、ＫＡＲ２、ＳＳＣ１、ＥＣＭ１０、ＳＳＥ２およびＳＳＱ１などが挙げられるが、本発明におけるＨｓｐ７０タンパク質と相同性を有するタンパク質とは、これらに限定されるものではない。
【００２７】
また、本発明の有機酸の製造法は、前記の酵母株を糖質存在下で培養し、培養物中に酵素により生成する有機酸を蓄積させ、該培養物中から該有機酸を採取することを特徴とする有機酸の製造法である。
【００２８】
本発明の有機酸の製造法において用いられる酵母株（微生物）は、有機酸生成酵素を発現する能力をもつ酵母株であり、好ましくはＰＤＲ１３タンパク質を部分的に生産する酵母株であればいずれの酵母株であってもよく、より好ましくはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母株などを挙げることができる。
【００２９】
上記サッカロマイセス属に属する酵母株としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などを好ましく挙げることができる。サッカロマイセス・セレビシエとしては、配列番号１で表されるＤＮＡが変異した染色体ＤＮＡを有するサッカロマイセス・セレビシエを挙げることができる。
【００３０】
ＰＤＲ１３タンパク質を部分的に生産する酵母株は、ＰＤＲ１３タンパク質をコードする遺伝子に変異が生じているために、当該遺伝子がコードするタンパク質の一部分のみを生産する酵母株であればいずれの酵母株でもよく、該変異としては、例えば、酵母株のＰＤＲ１３タンパク質をコードする染色体ＤＮＡの一部が欠損している変異、および該タンパク質のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失または置換された変異などを挙げることができる。
【００３１】
本発明において、ＰＤＲ１３タンパク質をコードする染色体ＤＮＡの一部が欠損しているとは、該染色体ＤＮＡの塩基配列において、少なくともＣ末端側の３９アミノ酸残基を翻訳せしめない変異を有する変異ＤＮＡを挙げることができる。ＰＤＲ１３タンパク質のアミノ酸配列において、少なくともＣ末端側の３９アミノ酸が欠失した変異とは、ＰＤＲ１３タンパク質をコードする染色体ＤＮＡに対し、部位特異的変異導入法により導入可能な数のアミノ酸が欠失した変異をいう。
【００３２】
部位特異的変異の導入は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ,  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ,  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ,  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ,  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）やＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（メソッズ  イン  エンザイモロジー）等に記載の方法に準じて行うことができる。部位特異的変異の導入は、具体的には、変異を挿入しようとするＤＮＡを適当なベクターにクローニングし、該クローン化ＤＮＡに対して変異処理を施すことにより行うことができる。例えば、変異を入れようとする箇所にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドに対して塩基置換を施し、該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ポリメラーゼ反応により変異ＤＮＡを合成することによる変異導入方法が挙げられるが、本発明における変異導入方法はこれに限定されるものではない。
【００３３】
上記したＰＤＲ１３タンパク質をコードするＤＮＡの一部が欠損した変異を有する酵母株の該ＤＮＡが、野生型株のＰＤＲ１３タンパク質をコードするＤＮＡの一部を欠損しているか否かは、該酵母株と親株のＰＤＲ１３タンパク質をコードするＤＮＡ領域をポリメラーゼ  チェイン  リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（以下、ＰＣＲと略すことがある。）により増幅させ、その増幅サイズを比較することにより確認することができる。上記の親株とは、上記変異処理に供した元株のことをいい、親株は野生型の微生物であっても、産業上有用な改良を施された変異株、細胞融合株、遺伝子組み換え技術を用いて造成した組み換え株であってもよい。
【００３４】
導入する有機酸生成酵素をコードする遺伝子は、酵母株において生産されうる酵素をコードするＤＮＡであれば特に限定されないが、該酵素の活性が強化された有機酸生成酵素をコードするＤＮＡが好ましい。酵素活性が強化された有機酸生成酵素をコードするＤＮＡとしては、部位特異的変異導入法を用いた変異手法によって得られる該酵素活性が強い有機酸生成酵素をコードするＤＮＡ、強力なプロモーターの支配下に該酵素をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡなどを挙げることができる。
【００３５】
ＰＤＲ１３タンパク質をコードする遺伝子の一部が変異を有する酵母株の製造法としては、［１］酵母株の染色体ＤＮＡ上にトランスポゾンによる挿入変異を施した遺伝子変異株ライブラリーを用いて、該ライブラリーから親株より有機酸生産能力が向上した株を選択する方法、［２］相同組み換え法などを用いて、ＰＤＲ１３タンパク質をコードする遺伝子の一部が欠損した酵母株を製造する方法、および［３］相同組み換え法などを用いて、ＰＤＲ１３タンパク質のアミノ酸配列において少なくともＣ末端側の３９アミノ酸残基が翻訳されない欠失、置換もしくは挿入等の変異を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを染色体上に有する微生物を製造する方法などが挙げられる。
【００３６】
上記の［１］の方法でいう親株とは、上記遺伝子変異処理に供した元株のことをいい、親株は野生型株の酵母株であっても、産業上有用な改良を施された変異株、細胞融合株あるいは遺伝子組み換え技術を用いて造成した組み換え株であってもよい。
【００３７】
上記の［１］の遺伝子変異ライブラリーの作製法としては、イースト  エムティーエヌプラスミド  コレクション（Ｙｅａｓｔ  ｍＴｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（オープン  バイオシステムズ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製）を用いて提供されるトランスポゾン配列挿入ゲノムライブラリーより、トランスポゾン配列が挿入されたＤＮＡ断片を制限酵素処理により調製した後、該ＤＮＡ断片を二回相同組み換えにより染色体ＤＮＡに導入することで遺伝子変異ライブラリーを構築する方法が挙げられる。
【００３８】
上記の遺伝子変異ライブラリーをスクリーニングソースとして用い、トランスポゾン配列挿入部位を同定することにより、明確に限定された遺伝子領域への挿入変異が有機酸生産能力に及ぼす影響を観察することができる。
【００３９】
上記ライブラリーからの有機酸生産能力が向上した酵母株を選択する方法としては、該ライブラリーの各菌株に有機酸生成酵素をコードする遺伝子の発現プラスミドを導入して得られる形質転換株を培養し、生成した有機酸を定量する方法を挙げることができる。培養時間の経過と共に有機酸の蓄積が多いほど、有機酸の生成量が多いと考えられる。
【００４０】
有機酸生成酵素としては、例えば、乳酸脱水素酵素などを挙げることができる。具体的な乳酸脱水素酵素としては、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  Ｓａｐｉｅｎｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、Ｌ−ｌｄｈ―ｈと略す。）またはボス・トウラス（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、Ｌ−ｌｄｈ−ｂと略す。）に、コードされるタンパク質からなる酵素を挙げることができる。
【００４１】
図１は、本発明で用いられるｌｄｈ−ｂ発現用プラスミドｐＴＲＳ５７の構造を示す図であり、図２は、本発明で用いられるプラスミドｐＴＲＳ１１の構築図である。
【００４２】
Ｌ−ｌｄｈ遺伝子の発現様式としては、遺伝子を発現させることができるプロモーターの支配下に該遺伝子が連結されていれば、染色体への導入による発現またはプラスミドによる発現など特に限定されないが、プラスミドによる発現を微生物としてサッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いる場合は、例えば、Ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  １プロモーターの支配下に、Ｌ−ｌｄｈ−ｂ遺伝子を連結した遺伝子構造をｐＲＳ４２４に連結したマルチコピー発現プラスミドｐＴＲＳ５７（図１）、Ｌ−ｌｄｈ―ｈ遺伝子をｐＴＲＳ１１（図２）に連結したマルチコピー発現プラスミドｐＴＲＳ４８を挙げることができる。
【００４３】
ライブラリーの各菌株にｐＴＲＳ５７を常法に従い導入して形質転換株を取得し、該形質転換株および形質転換に供した親株をそれぞれ培養することにより生成する乳酸の生成量を測定することにより、親株より乳酸の生産能力が向上した菌株を選択することができる。
【００４４】
ｐＴＲＳ５７を有する形質転換株の培養は、乳酸脱水素酵素が発現する培養法であれば特に限定されないが、ｐＴＲＳ５７を有するサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の場合は、例えば、ＳＣ−Ｔｒｐ培地［２０ｇ／ｌ  グルコース、６．７ｇ／ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ディフコ社製）、Ｄｒｏｐ―ｏｕｔ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（シグマ社製）］を前培養の培地として用いて一晩培養後、得られた培養液を終濃度が１％になるように、ＳＣ−Ｔｒｐ培地に接種して培養する方法をあげることができる。
【００４５】
培養液中の有機酸濃度はＨＰＬＣを用いる方法で定量することができ、例えば、培養液を遠心分離して培養液上清を調整し、該上清を分析サンプルとして有機酸分析用陰イオン交換カラムを用い、電気伝導度を測定することで培養液の、例えば、乳酸やピルビン酸等の有機酸濃度を定量することができる。
【００４６】
同一時間培養したとき、親株より高い乳酸生産性を示す株を選択することにより、親株より有機酸生産能力が向上した菌株を取得することができる。
【００４７】
上記方法にて取得される有機酸生産能力が向上した酵母株としては、ＰＤＲ１３タンパク質をコードする遺伝子（以下、ＰＤＲ１３遺伝子と略すことがある。）へのトランスポゾンＤＮＡ断片の挿入を染色体ＤＮＡ上に有するサッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を挙げることができる。
【００４８】
上記の［２］の方法としては、直鎖ＤＮＡによる染色体上の相同組み換えが可能な酵母株を用いる方法を挙げることができる。直鎖ＤＮＡとしては、例えば、ＴＲＰ１遺伝子の両端にＰＤＲ１３遺伝子の内部または近傍の配列と相同性を有するＤＮＡを配置した直鎖ＤＮＡを挙げることができる。
【００４９】
該直鎖ＤＮＡを、直鎖ＤＮＡによる染色体上の相同組み換えが可能な酵母株に常法により導入し、トリプトファン要求性回復株を選択することにより、ＰＤＲ１３遺伝子部分欠失酵母株を取得することができる。
【００５０】
上記の［３］の方法としては、ＰＤＲ１３遺伝子に、部位特異的変異を導入することにより、該遺伝子がコードするアミノ酸配列において、少なくともＣ末端側の３９アミノ酸残基が翻訳されない欠失、置換もしくは挿入されたアミノ酸配列をコードする変異型遺伝子を取得し、相同組み換え法を用いることにより、ＰＤＲ１３遺伝子が変異型ＰＤＲ１３遺伝子に置換された染色体ＤＮＡを有する酵母株を製造する方法などを挙げることができる。
【００５１】
本発明の有機酸の製造法に用いられる酵母株は、上記の方法で製造されるＰＤＲ１３タンパク質を部分的に生産する酵母株に、有機酸生成酵素をコードする遺伝子を遺伝子組み換え等の手法を用いて導入することにより製造することができるが、該酵母株がすでに目的とする有機酸生成酵素をコードする遺伝子を有している場合は、必ずしも該遺伝子を導入する必要はない。
【００５２】
また、本発明の有機酸の製造法は、ＰＤＲ１３をコードするＤＮＡの一部が欠失、置換または挿入等の変異を有する染色体ＤＮＡを保持する酵母株であり、かつ有機酸生成酵素をコードする遺伝子を組み込んだ酵母株を糖質存在下で培養し、培養物中に該酵素により生成する有機酸を蓄積させ、該培養物から該有機酸を採取することを特徴とする有機酸の製造方法に関する。
【００５３】
本発明の有機酸の製造法に用いられる酵母株の培養は、以下に記載した通常の方法に従って行うことができる。本発明の有機酸の製造法に用いられる酵母株を培養する培地は、該酵母株が資化しうる炭素源、窒素源および無機塩類等を含有し、該酵母株の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いても良い。
【００５４】
炭素源としては、該酵母株が資化しうるものであればよく、グルコース、フルクトース、シュークロース、これらを含有する糖蜜、デンプンおよびデンプン加水分解物などの炭水化物を用いることができる。
【００５５】
また、窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティーブリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物および各種醗酵菌体消化物等を用いることができる。
【００５６】
また、無機塩としては、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅および炭酸カルシウムなどを用いることができる。
【００５７】
前記の炭素源は、培養開始時に一括して添加してもよいし、培養中分割してあるいは連続的に添加することもでき、好ましくは５０ｇ／ｌ〜１５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
【００５８】
培養は、振とう培養もしくは撹拌培養などで行い、好気的条件下、微好気条件下または嫌気的条件下で行うことができる。培養温度は２５〜３５℃が好ましく、培養時間は、通常２４時間〜５日間である。培養中のｐＨは、２．５〜５．０に保持することが望ましい。ｐＨの調整は、アルカリ溶液、アンモニアおよび炭酸カルシウムなどを用いて行うことができる。
【００５９】
本発明により生成された有機酸は、培養終了後、培養物から菌体などの沈殿物を除去し、イオン交換処理法、濃縮法および塩析法などを併用することにより、培養物から目的とする有機酸を単離し精製することができる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例をもって本発明の実施の態様を説明するが、これらは単なる例示であり本発明を何等制限するものではない。
【００６１】
（実施例１）  トランスポゾン配列挿入による遺伝子変異株ライブラリーの作製
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ   ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＮＢＲＣ１０５０５株のゲノムＤＮＡ上に存在するＰｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  １（以下、ＰＤＣ１遺伝子と略す。）遺伝子座を欠失した遺伝子組み換え株（以下、ｐｄｃ１Δ０株と略す。）を二回相同組み換えを用いて作出した。ｐｄｃ１Δ０株は、以下のようにして作出した。ＮＢＲＣ１０５０５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号3および4で表される塩基配列からなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより、ＰＤＣ１遺伝子の５’上流約５００塩基対を含む配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片を増幅した。また、配列番号６および７で表される塩基配列からなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより、ＰＤＣ１遺伝子の３’下流５００塩基対を含む配列番号８で表される塩基配列からなるDNA断片を増幅した。ＰＣＲは、宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用いて、ゲノムＤＮＡ１０ｎｇ、各プライマー１０ｐｍｏｌを含む反応液ＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃の温度で１０分間保温後、９４℃の温度で３０秒間、５５℃の温度で３０秒間、７２℃の温度で１分３０秒間のサイクルを２５回繰り返した後、７２℃の温度で４分間保温する条件で行った。増幅したＤＮＡ断片は、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｐｒｅｐ  ＰＣＲ  Ｋｌｅｅｎ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて精製した。増幅した２種類の該ＤＮＡ断片を等量混合し、該混合液を鋳型として、配列番号３および７で表される塩基配列からなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより、ＰＤＣ１遺伝子の５’上流５００塩基対と３’下流５００塩基対が連結した配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用いて、鋳型とするＤＮＡ断片各１０ｎｇ、各プライマー１０ｐｍｏｌを含む反応液ＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃で１０分間保温後、９４℃の温度で３０秒間、５５℃の温度で３０秒間、７２℃の温度で１分３０秒間のサイクルを２５回繰り返した後、７２℃の温度で４分間保温する条件で行った。増幅したＤＮＡ断片の精製は、上記記載の方法に準じた。該ＤＮＡを制限酵素Ｋｐｎ  Ｉで処理し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＲＳ４１６に連結した（以下、ＰＤＣ１−ｐＲＳ４１６と略す。）。ＰＤＣ１−ｐＲＳ４１６プラスミドＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ  ＲＶで消化し、該ＤＮＡ断片１００ｎｇを用いてＮＢＲＣ１０５０５株を形質転換した。形質転換は、ＹＥＡＳＴＭＡＫＥＲ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は、付属のプロトコールに従った。宿主とするＮＢＲＣ１０５０５株は、ウラシル合成能を欠損した株であり、ウラシル非添加培地上で、二回組み換えにより該ＤＮＡ断片が染色体上に挿入された株を選択することができる。得られた形質転換体を、５−フルオロオロチン酸を１ｇ／ｌの濃度で含むＳＣ培地に塗布し、生育してきた形質転換体のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１０および１１で表される塩基配列からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、ＰＤＣ１遺伝子が欠失した株を選��した。ＰＣＲは、上記記載の方法に従った。
【００６２】
次に、ｐｄｃ１Δ０株を、ｐＴＲＳ５７プラスミドＤＮＡ１０ｎｇを用いて形質転換した。形質転換は、ＹＥＡＳＴＭＡＫＥＲ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は、付属のプロトコールに従った。宿主とするｐｄｃ１Δ０株は、トリプトファン合成能を欠損した株であり、ｐＴＲＳ５７プラスミドＤＮＡ上にあるＴＲＰ１遺伝子の働きにより、トリプトファン非添加培地上でｐＴＲＳ５７を有した形質転換体を選択できる。
【００６３】
次に、ｐＴＲＳ５７プラスミドＤＮＡにより形質転換された株を宿主として、Ｙｅａｓｔ  ｍＴｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）より調製したトランスポゾンライブラリーを制限酵素Ｎｏｔ  Ｉで処理し、得られるＤＮＡ断片を用いて形質転換した。形質転換はＹＥＡＳＴＭＡＫＥＲ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた酢酸リチウム法により行った。詳細は、付属のプロトコールに従った。宿主とするｐｄｃ１Δ０株はウラシル合成能を欠損した株であり、トランスポゾンを構成する配列上にあるＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上で染色体ＤＮＡ上にトランスポゾン配列の挿入が行われた形質転換体を選択することができる。
【００６４】
（実施例２）  乳酸生産を指標とした有機酸生産能向上酵母株のスクリーニング
実施例１にて作製した組み換え株を、ＳＣ−Ｕｒａ培地を用いて３０℃の温度で一晩振とう培養した。１０μｌの該培養液を１ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ培地に接種し、３０℃の温度で振とう培養した。培養開始４０時間後、培養液を遠心分離し、上清の乳酸濃度を測定した。乳酸の定量にはＦ−ｋｉｔ（Ｌ−乳酸）（Ｊ・Ｋインターナショナル社製）を用いた。
【００６５】
その結果、表１に示すように、親株であるｐｄｃ１Δ０株にｐＴＲＳ５７を導入した株は４０時間で３．６ｇ／ｌの乳酸を生成した。そこで、反応４０時間での乳酸の生成がｐｄｃ１Δ０（ｐＴＲＳ５７）株よりも多くなる株として、ＰＤＲ１３遺伝子にトランスポゾンが挿入された株（以下、ｐｄｒ１３：：ｍＴｎ株と略す）を選択した。
【００６６】
【表１】
2007130015.tif 000003
【００６７】
（実施例３）  ＰＤＲ１３遺伝子挿入変異株の作製と有機酸生産能の評価
ＤＮＡ塩基配列解析の結果、実施例２で取得したｐｄｒ１３：：ｍＴｎ株はトランスポゾン配列が、ゲノムＤＮＡ上のＰＤＲ１３遺伝子の開始コドンから１５９９番目と１５６０番目の塩基間に挿入されていた。ＰＤＲ１３遺伝子への挿入変異を再構築するために、ｐＲＳ４２４プラスミドＤＮＡを鋳型にし、配列番号１２および１３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、ＴＲＰ１遺伝子の５’上流に配列番号１４で示した配列、３’下流に配列番号１５で示した配列が付加したＤＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲは、宝酒造社製のＬＡ−Ｔａｑを用いて、精製プラスミドＤＮＡ１０ｎｇ、各プライマー１０ｐｍｏｌを含む反応液ＬＡ−Ｔａｑに添付の指示書に従い調製し、９４℃の温度で１０分間保温後、９４℃の温度で３０秒間、５５℃の温度で３０秒間、７２℃の温度で１分３０秒間のサイクルを２５回繰り返した後、７２℃の温度で４分間保温する条件で行った。増幅したＤＮＡ断片の精製は実施例１に記載の方法に準じた。該ＤＮＡ１０μｇを用いてｐｄｃ１Δ０株を形質転換した。形質転換は上記記載の方法に準じた。宿主とするｐｄｃ１Δ０株はトリプトファン合成能を欠損した株であり、該ＤＮＡ断片上にあるＴＲＰ１遺伝子の働きにより、トリプトファン非添加培地上でゲノムＤＮＡ上に該ＤＮＡが二回相同組み換えにより挿入された形質転換体（以下、ｐｄｒ１３＿１５９９株と略す。）を選択できる。次に、ｐｄｒ１３＿１５９９株をプラスミドｐＴＲＳ４８を用いて形質転換した。形質転換は、実施例１記載の方法に準じた。宿主とするｐｄｒ１３＿１５９９株はウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＴＲＳ４８プラスミドＤＮＡ上にあるＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＴＲＳ４８を有した形質転換体を選択できる。
【００６８】
作製した組み換え株、ｐｄｒ１３＿１５９９（ｐＴＲＳ４８）株を１０ｍｌＳＣ−Ｕｒａ培地を用いて３０℃の温度で一晩振とう培養した。１００μｌの該培養液を１０ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ培地に接種し、３０℃の温度で振とう培養した。培養開始１６時間後、２４時間後および４０時間後に培養液をそれぞれ１ｍｌサンプリングし、該培養液を遠心分離し、上清の乳酸濃度を測定した。乳酸の定量にはＦ−ｋｉｔ  （Ｌ−乳酸）（Ｊ・Ｋインターナショナル社製）を用いた。結果を表２に示す。
【００６９】
【表２】
2007130015.tif 000004
【００７０】
（実施例４）  ＰＤＲ１３遺伝子部分欠失株の作製と有機酸生産能の評価
ＰＤＲ１３遺伝子の１５６０塩基から１７１６塩基までの領域を、欠失した変異株ｐｄｒ１３＿１００株を作出し、乳酸生産性を測定した。ｐｄｃ１Δ０（ｐＴＲＳ４８）株とｐｄｒ１３＿１００（ｐＴＲＳ４８）株をＳＣ−Ｕｒａ液体培地１０ｍｌを用いて３０℃の温度で一晩振とう培養した。該培養液１００μｌを１０ｍｌの新しいＳＣ−Ｕｒａ液体培地に接種し、培養開始１６時間後、２４時間後および４０時間後にそれぞれ１ｍｌサンプリングし、乳酸の生産量を以下に示す条件を用いてＨＰＬＣで定量した。
・カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
・移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度  
・カラム温度：４５℃
その結果、表３に示すように、親株であるｐｄｃ１Δ０（ｐＴＲＳ４８）株よりも乳酸生成量が増加した。
【００７１】
【表３】
2007130015.tif 000005
【００７２】
上記領域欠損株は以下のようにして作製した。ｐＲＳ４２４プラスミドＤＮＡを鋳型にし、配列番号１２および１６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、ＴＲＰ１遺伝子の５’上流に配列番号１４で示した配列、３’下流に配列番号１７で示した配列が付加したＤＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲおよび増幅ＤＮＡ断片の精製は、実施例１記載の方法に準じた。該ＤＮＡ１μｇを用いてｐｄｃ１Δ０株を形質転換した。形質転換は上記記載の方法に準じた。宿主とするｐｄｃ１Δ０株はトリプトファン合成能を欠損した株であり、該ＤＮＡ断片上にあるＴＲＰ１遺伝子の働きにより、トリプトファン非添加培地上でゲノムＤＮＡ上に該ＤＮＡが二回相同組み換えにより挿入された形質転換体（以下、ｐｄｒ１３＿１００株と略す。）を選択することができる。次に、ｐｄｒ１３＿１００株をプラスミドｐＴＲＳ４８を用いて形質転換した。形質転換は（実施例１）記載の方法に準じた。宿主とするｐｄｒ１３＿１００株はウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＴＲＳ４８プラスミドＤＮＡ上にあるＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＴＲＳ４８を有した形質転換体を選択することができる。
【００７３】
（実施例５）  ＰＤＲ１３遺伝子部分欠失株の作製と有機酸生産能の評価
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＢＲＣ１０５０５株のゲノムＤＮＡ上に存在するＰＤＣ１遺伝子をＴＲＰ１遺伝子と置換した株（以下、Δｐｄｃ１株と略す。）を二回相同組み換え法を用いて作出した。Δｐｄｃ１株は、以下のようにして作製した。ｐＲＳ４２４プラスミドＤＮＡを鋳型にし、配列番号１８および１９で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲによりＴＲＰ１遺伝子の５’上流に配列番号２０で示した配列、３’下流に配列番号２１で示した配列が付加したＤＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲおよび増幅ＤＮＡ断片の精製は、上記記載の方法に準じた。該ＤＮＡ１μｇを用いてＮＢＲＣ１０５０５株を形質転換した。形質転換は実施例１記載の方法に準じた。宿主とするＮＢＲＣ１０５０５株はトリプトファン合成能を欠損した株であり、該ＤＮＡ断片上にあるＴＲＰ１遺伝子の働きにより、トリプトファン非添加培地上でゲノムＤＮＡ上に該ＤＮＡが二回相同組み換えにより挿入されたΔｐｄｃ１株を選択することができる。
【００７４】
次に、ｐＲＳ４２３プラスミドＤＮＡを鋳型にし、配列番号１２および１６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いたＰＣＲにより、ＨＩＳ３遺伝子の５’上流に配列番号１４で示した配列、３’下流に配列番号１７で示した配列が付加したＤＮＡ断片を増幅させた。ＰＣＲおよび増幅ＤＮＡ断片の精製は、実施例１記載の方法に準じた。該ＤＮＡ１μｇを用いて、Δｐｄｃ１株を形質転換した。形質転換は実施例１記載の方法に準じた。宿主とするΔｐｄｃ１株はヒスチジン合成能を欠損した株であり、該ＤＮＡ断片上にあるＨＩＳ３遺伝子の働きにより、ヒスチジン非添加培地上でゲノムＤＮＡ上に該ＤＮＡが二回相同組み換えにより挿入された形質転換体（以下、Δｐｄｒ１３
１００株と略す。）を選択することができる。次に、Δｐｄｒ１３  １００株を、プラスミドｐＴＲＳ４８を用いて形質転換した。形質転換は実施例１記載の方法に準じた。宿主とするΔｐｄｒ１３  １００株はウラシル合成能を欠損した株であり、ｐＴＲＳ４８プラスミドＤＮＡ上にあるＵＲＡ３遺伝子の働きにより、ウラシル非添加培地上でｐＴＲＳ４８を有した形質転換体を選択することができる。
【００７５】
作製した組み換え株、Δｐｄｒ１３  １００（ｐＴＲＳ４８）株を、１０ｍｌＳＣ−Ｕｒａ培地を用いて３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１０ｍｌの該培養液を１００ｍｌのＳＣ−Ｕｒａ培地に接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養した。１００ｍｌの該培養液を２．０ＬのＳＣ−Ｕｒａ培地に接種し、３０℃の温度でミニジャーファーメンターを用いて培養し有機酸の生産量を定量した。ミニジャーファーメンターを用いた培養は、以下の条件に従った。
・醗酵装置：Ｂｉｏｎｅｅｒ−Ｎ（丸菱バイオエンジ社製）
・培養温度：３０℃
・通気量：０．５ｖｖｍ
・撹拌速度：８００ｒｐｍ
・ｐＨ：５．０
・中和剤：２Ｎ  ＮａＯＨ溶液
その結果、表４および５に示すように、親株であるΔｐｄｃ１（ｐＴＲＳ４８）株よりも乳酸およびピルビン酸の生成量が増加した。
【００７６】
【表４】
2007130015.tif 000006
【００７７】
【表５】
2007130015.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の酵母株は、有機酸生成酵素が導入され有機酸生産能力が向上した酵母株であり、その酵母株を用いて効率的に有機酸を製造することができる。本発明においては、有機酸生成酵素が導入された酵母株に対して、さらにＰＲＤ１３タンパク質を部分的に生産させることにより、有機酸の生産性を向上させることができ、生産時間の短縮化によりコスト低減を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、本発明で用いられるｌｄｈ−ｂ発現用プラスミドｐＴＲＳ５７の構造を示す図である。
【図２】図２は、本発明で用いられるプラスミドｐＴＲＳ１１の構築図である。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
配列番号３−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工ＤＮＡ配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
2007130015.tif 000008
【図２】
2007130015.tif 000009
【配列表】
2007130015000001.app