(57)【要約】【課題】より有効な、樹状細胞の機能賦活化剤、機能の賦活化した樹状細胞の製造方法などを提供すること。【解決手段】イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、樹状細胞の機能賦活化剤；樹状細胞またはその前駆細胞を該賦活化剤を添加した培地で培養することを含む、機能の賦活化した樹状細胞を製造する方法；該方法により製造された、機能の賦活化した樹状細胞；該細胞を含有する癌の予防・治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、樹状細胞の機能賦活化剤。
【請求項２】
イソロイシン、ロイシンおよびバリンを有効成分とする、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
イソロイシン、ロイシンおよびバリンの重量比が、１：１．５〜２．５：０．８〜１．７であることを特徴とする、請求項２に記載の剤。
【請求項４】
バリンを有効成分とする、請求項１に記載の剤。
【請求項５】
医薬である、請求項１〜４のいずれかに記載の剤。
【請求項６】
感染症の予防・治療用である、請求項５に記載の剤。
【請求項７】
感染症が特発性細菌性腹膜炎である、請求項６に記載の剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の樹状細胞の機能賦活化剤を、樹状細胞の機能賦活化のための使用に関する事項を記載した記載物とともに包装したパッケージ。
【請求項９】
イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸を含有し、樹状細胞の機能賦活化のために用いるものである旨の表示を付した食品。
【請求項１０】
摂取量が、一日あたりイソロイシン０．５〜３０．０ｇ、ロイシン１．０〜６０．０ｇ、バリン０．５〜３０．０ｇである、請求項９に記載の食品。
【請求項１１】
イソロイシン、ロイシンおよびバリンを含有する、請求項９に記載の食品。
【請求項１２】
摂取量が、イソロイシン、ロイシンおよびバリン全体の換算で一日あたり２〜５０ｇである、請求項１１に記載の食品。
【請求項１３】
バリンを含有する、請求項９に記載の食品。
【請求項１４】
摂取量が、一日あたりバリン０．５〜３０．０ｇである、請求項１３に記載の食品。
【請求項１５】
食品が保健機能食品またはダイエタリーサプリメントである、請求項９〜１４のいずれかに記載の食品。
【請求項１６】
保健機能食品が特定保健用食品または栄養機能食品である、請求項１５に記載の食品。
【請求項１７】
イソロイシン、ロイシンおよびバリンを含有する食品を、樹状細胞の機能賦活化のための使用に関する事項を記載した記載物とともに包装したパッケージ。
【請求項１８】
バリンを含有する食品を、樹状細胞の機能賦活化のための使用に関する事項を記載した記載物とともに包装したパッケージ。
【請求項１９】
機能の賦活化した樹状細胞を製造する方法であって、樹状細胞またはその前駆細胞を請求項１〜４のいずれかに記載の剤を添加した培地で培養することを含む方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法により製造された、機能の賦活化した樹状細胞。
【請求項２１】
請求項２０に記載の細胞を含有する、癌の予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞の機能賦活化剤、樹状細胞の機能賦活化に有効な食品に関する。本発明は機能の賦活化した樹状細胞を用いる癌の予防・治療分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ：ＤＣ）は、抗原提示細胞として未感作ヘルパーＴ細胞や細胞障害性Ｔ細胞などを活性化し、またＢ細胞や、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞にも作用し、自然免疫系、獲得免疫系において中心的役割を果たしている。樹状細胞は最も強力な抗原提示細胞として注目されており、生体防御において重要な役割を果たすと考えられている。よって樹状細胞に機能異常が起こると免疫系に重大な破綻が起こると考えられる。例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者では樹状細胞の前駆細胞の数が減少しており、これが免疫不全をきたす１つの要因になっている可能性がある（非特許文献１）。
【０００３】
肝硬変患者では、免疫系の機能が低下していることが、従来より指摘されている。樹状細胞の機能も低下することが知られており、このことはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）やＢ型肝炎ウイルスが、樹状細胞の機能を抑制することも原因の１つと考えられている（非特許文献２）。また、肝硬変患者では、樹状細胞の機能が低下することにより、特発性細菌性腹膜炎などの感染症を併発することが多い。また、Ｃ型肝炎ウイルスによる肝硬変患者の肝移植において、移植肝に高頻度にＣ型肝炎が再発することが知られているが、樹状細胞の機能低下と再発率が関連していることが知られている（非特許文献３）。一方、肝硬変患者では、病状が進行するにつれて血中各種アミノ酸のバランスが崩れ、分岐鎖アミノ酸（イソロイシン、ロイシン、バリン：ＢＣＡＡ）が低下し、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン：ＡＡＡ）が上昇することが知られている。
【０００４】
分子生物学的アプローチにより、遊離アミノ酸は生理活性物質や細胞の構成成分となるのみならず、それ自体が生理活性を有しており、様々な細胞機能の発現において重要な役割を果たすことが解明されつつある。例えば、分岐鎖アミノ酸は肝硬変患者で好中球の食作用を改善することおよびＮＫ活性を改善しうることが報告されている（非特許文献４）。
【０００５】
また、樹状細胞は、生体内での免疫応答のみならず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化誘導して免疫療法（養子免疫療法など）に用いるなど、その有用性が注目されている。樹状細胞の活性化には、様々なサイトカインが関与している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで樹状細胞を分化させる方法としては、末梢血から採取した単核球や未熟な樹状細胞をＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦなどのサイトカインを用いて分化させる方法が知られているが、これらのサイトカインは高価であり、生体に適用するには副作用の問題が生じる。したがって、樹状細胞を活性化させる有効かつ安全な方法の開発が望まれている。
【非特許文献１】Blood、Vol.98、p906 (2001)
【非特許文献２】Lancet Infect Dis.、Vol.5、p296-p304 (2005)
【非特許文献３】Transplant Proc.、Vol.37、p3951-3956 (2005)
【非特許文献４】Hepatology Research、Vol.29、p207-p211 (2004)
【非特許文献５】J.Gen.Virol.、Vol.87、p1-10 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、安価で副作用の少ない有効な樹状細胞の機能賦活化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物が、樹状細胞の機能を賦活化することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、樹状細胞の機能賦活化剤；
（２）イソロイシン、ロイシンおよびバリンを有効成分とする、上記（１）に記載の剤；
（３）イソロイシン、ロイシンおよびバリンの重量比が、１：１．５〜２．５：０．８〜１．７であることを特徴とする、上記（２）に記載の剤；
（４）バリンを有効成分とする、上記（１）に記載の剤；
（５）医薬である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の剤；
（６）感染症の予防・治療用である、上記（５）に記載の剤；
（７）感染症が特発性細菌性腹膜炎である、上記（６）に記載の剤；
（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の樹状細胞の機能賦活化剤を、樹状細胞の機能賦活化のための使用に関する事項を記載した記載物とともに包装したパッケージ；
（９）イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸を含有し、樹状細胞の機能賦活化作用を有するものであることを特徴とし、樹状細胞の機能賦活化のために用いるものである旨の表示を付した食品；
（１０）摂取量が、一日あたりイソロイシン０．５〜３０．０ｇ、ロイシン１．０〜６０．０ｇ、バリン０．５〜３０．０ｇである、上記（９）に記載の食品；
（１１）イソロイシン、ロイシンおよびバリンを含有する、上記（９）に記載の食品；
（１２）摂取量が、イソロイシン、ロイシンおよびバリン全体の換算で一日あたり２〜５０ｇである、上記（１１）に記載の食品；
（１３）バリンを含有する、上記（９）に記載の食品；
（１４）摂取量が、一日あたりバリン０．５〜３０．０ｇである、上記（１３）に記載の食品；
（１５）食品が保健機能食品またはダイエタリーサプリメントである、上記（９）〜（１４）のいずれかに記載の食品；
（１６）保健機能食品が特定保健用食品または栄養機能食品である、上記（１５）に記載の食品；
（１７）イソロイシン、ロイシンおよびバリンを含有する食品を、樹状細胞の機能賦活化のための使用に関する事項を記載した記載物とともに包装したパッケージ；
（１８）バリンを含有する食品を、樹状細胞の機能賦活化のための使用に関する事項を記載した記載物とともに包装したパッケージ；
（１９）機能の賦活化した樹状細胞を製造する方法であって、樹状細胞またはその前駆細胞を上記（１）〜（４）のいずれかに記載の剤を添加した培地で培養することを含む方法；
（２０）上記（１９）に記載の方法により製造された、機能の賦活化した樹状細胞；
（２１）上記（２０）に記載の細胞を含有する、癌の予防・治療剤；
（２２）癌を予防および／または治療する方法であって、以下の工程：
（ａ）樹状細胞またはその前駆細胞を上記（１）〜（４）のいずれかに記載の剤を添加した培地で培養する工程、
（ｂ）上記工程（ａ）で培養した細胞に癌抗原を認識させる工程、および
（ｃ）上記工程（ｂ）で抗原認識した樹状細胞を対象に投与する工程、
を含む方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により提供される、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする樹状細胞の機能賦活化剤は、樹状細胞の機能を賦活化するために用いられる。本発明の賦活化剤は、アミノ酸を有効成分とすることから、安全性が高く副作用がほとんどないため、医薬品として極めて有利である。
また、本発明の賦活化剤における有効成分であるイソロイシン、ロイシンおよびバリンの３種類の分岐鎖アミノ酸は、安全性の確立した物質であることから、本発明の賦活化剤は安全性が高く、従って医薬用途に限らず、食品への利用が可能である。
さらに、本発明の賦活化剤を添加した培地で製造された樹状細胞は、機能が賦活化しているので、免疫療法などに用いるのに非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、樹状細胞の機能賦活化剤（以下、本発明の賦活化剤）を提供する。
【００１１】
本明細書において「樹状細胞の機能」とは、樹状細胞の抗原提示細胞としての機能、サイトカインの産生能等をいい、具体的にはＴリンパ球活性化能をいう。「樹状細胞の機能賦活化」とは、抗原提示した樹状細胞によるＴリンパ球の増殖作用をいう。「樹状細胞の機能賦活化」は、後述の実施例に記載しているように、ＭＬＲ（Mixed Leukocyte Reaction）ａｓｓａｙによるリンパ球増殖能の上昇あるいはＦＡＣＳによる樹状細胞の表現型の変化を測定する等、公知の方法により確認できる（非特許文献５）。
【００１２】
本発明の有効成分（分岐鎖アミノ酸）である、イソロイシン、ロイシン及びバリンは、それぞれ、Ｌ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体のいずれも使用可能であるが、好ましくは、Ｌ−体、ＤＬ−体であり、さらに好ましくは、Ｌ−体である。
また、イソロイシン、ロイシン及びバリンは、それぞれ、遊離体のみならず、塩の形態でも使用することができる。塩の形態としては、酸付加塩や塩基との塩等を挙げることもでき、イソロイシン、ロイシン及びバリンの医薬品として許容される塩を選択することが好ましい。
イソロイシン、ロイシン及びバリンにそれぞれ付加して医薬として許容される塩を形成する酸としては、例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸等の無機酸；酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、モノメチル硫酸等の有機酸が挙げられる。
イソロイシン、ロイシン及びバリンの医薬として許容される塩を形成する塩基の例としては、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム等の金属の水酸化物又は炭酸化物、あるいはアンモニア等の無機塩基；エチレンジアミン、プロピレンジアミン、エタノールアミン、モノアルキルエタノールアミン、ジアルキルエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機塩基が挙げられる。
【００１３】
本発明の賦活化剤は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸を有効成分として含有する。本発明の賦活化剤は、特にバリンを有効成分として含有することが好ましい。本発明の賦活化剤が、イソロイシン、ロイシンおよびバリンを含有する場合、かかる３種のアミノ酸の配合比は、それぞれ重量比で、通常、１：１．５〜２．５：０．８〜３．０の範囲であり、特に好ましくは１：１．９〜２．２：１．１〜１．３の範囲である。この範囲をはずれると、有効な作用効果が得難くなる。
【００１４】
本発明の賦活化剤は、医薬などとして有用であり、その投与対象としては、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）が挙げられる。なお、ヒト以外の哺乳動物に適応する場合、本発明の賦活化剤の摂取量は、動物の体重もしくは大きさに応じて適宜加減すればよい。
【００１５】
ここで、本発明の賦活化剤について、医薬として用いる場合の投与形態は特に限定されないが、経口投与、直腸投与、注射、輸液による投与等の一般的な投与経路を経ることが出来る。経口投与の剤形としては、顆粒剤、細粒剤、粉剤、被覆錠剤、錠剤、坐剤、散剤、（マイクロ）カプセル剤、チュアブル剤、シロップ、ジュース、液剤、懸濁剤、乳濁液など、また注射剤としては静脈直接注入用、点滴投与用、活性物質の放出を延長する製剤などの医薬製剤一般の剤型を採用することができる。
【００１６】
これらの医薬の調製は、常法により製剤化することによって行われる。製剤上の必要に応じて、薬理学的に許容し得る各種の製剤用物質を配合することができる。製剤用物質は製剤の剤型により適宜選択することができるが、例えば、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等が挙げられる。更に、製剤用物質を具体的に例示すると、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及びその他の糖類、タルク、牛乳蛋白、ゼラチン、澱粉、セルロース及びその誘導体、動物及び植物油、ポリエチレングリコール、及び溶剤、例えば滅菌水及び一価又は多価アルコール、例えばグリセロール等を挙げることができる。
【００１７】
本発明の賦活化剤を医薬として使用する場合の投与量は、対象患者の年齢、体重もしくは病態、剤形、又は投与方法などによっても異なるが、成人（体重６０ｋｇとして）１日あたり、イソロイシン０．５〜３０．０ｇ、ロイシン１．０〜６０．０ｇ、バリン０．５〜３０．０ｇを目安とする。一般の成人の場合、好ましくは、一日量として、イソロイシン２．０〜１０．０ｇ、ロイシン３．０〜２０．０ｇ、バリン２．０〜１０．０ｇ、より好ましくは、イソロイシン２．５〜３．５ｇ、ロイシン５．０〜７．０ｇ、バリン３．０〜４．０ｇであり、アミノ酸の全体量としては１日あたり２．０ｇ〜５０．０ｇ程度が好ましい。上記１日あたりの量は一度にもしくは数回に分けて投与することができる。食前、食後、食間を問わない。また投与期間は特に限定されない。
【００１８】
本発明の有効成分である分岐鎖アミノ酸の投与量（摂取量）について算出する際、その値は、本発明が目的とする疾患の治療又は予防等の目的で使用される薬剤の有効成分の量として前記の算定方法が決められているので、これとは別目的で、例えば、通常の食生活の必要から、あるいは別の疾患の治療目的のために、摂取又は投与される分岐鎖アミノ酸については、前記算定に含める必要はない。
例えば、通常の食生活から摂取される１日あたりの分岐鎖アミノ酸の量を、前記本発明における有効成分の１日あたりの投与量から控除して算定する必要はない。
【００１９】
本発明の有効成分であるイソロイシン、ロイシン及びバリンは、それぞれが単独で、若しくは任意の組み合わせで製剤に含有されていてもよく、又は全てが１種の製剤中に含有されていてもよい。別途製剤化して投与する場合、それらの投与経路、投与剤形は同一であっても、異なっていてもよく、また各々を投与するタイミングも、同時であっても別々であってもよい。併用する薬剤の種類や効果によって適宜決定する。即ち、本発明の医薬は、複数の分岐鎖アミノ酸を同時に含有する製剤であってもよく、又、それぞれを別途製剤化して併用するような併用剤であってもよい。これらの形態全てを包含するものである。特に、同一製剤中に全ての分岐鎖アミノ酸を含有する態様が、簡便に投与できて好ましい。
【００２０】
本発明において、「重量比」とは、製剤中のそれぞれの成分の重量の比を示す。例えば、イソロイシン、ロイシン及びバリンの各有効成分を１つの製剤中に含めた場合には、個々の含有量の比であり、各有効成分のそれぞれを単独で又は任意の組み合わせで複数製剤中に含めた場合には、各製剤に含められる各有効成分の重量の比である。
【００２１】
また本発明において、実際の投与量の比は、投与対象（例えば、患者など）あたりの各有効成分１回投与量あるいは１日投与量の比である。例えば、イソロイシン、ロイシン及びバリンの各有効成分を１つの製剤中に含め、それを投与対象に投与する場合には、重量比が投与量比に相当する。各有効成分を単独で又は任意の組み合わせで複数の製剤中に含めて投与する場合には、１回あるいは１日投与した各製剤中の各有効成分の合計量の比が重量比に相当する。
【００２２】
本発明の医薬には、他の薬剤、例えば、抗がん剤、抗ウイルス剤、抗生物質、肝臓病用剤、免疫抑制剤などを配合してもよい。
【００２３】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンは既に、医薬・食品分野において広く用いられていて、安全性は確立している。例えば、これらのアミノ酸を１：２：１．２の比で含有する製剤の急性毒性（ＬＤ５０）は、マウスの経口投与において１０ｇ／ｋｇ以上である。
【００２４】
本発明においては、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、樹状細胞の機能賦活化剤には、樹状細胞の機能賦活化に使用することができる、または使用すべきであることを記載した記載物を含む、商業的パッケージも含まれる。
【００２５】
本発明の賦活化剤は、樹状細胞の機能を賦活化する。樹状細胞の機能の賦活化は、免疫機能の賦活化と密接に関連するため、本発明の賦活化剤は、免疫関連疾患の予防および／または治療にも有用である。免疫関連疾患としては、感染症（菌血症、肺炎、尿路感染症、特発性細菌性腹膜炎、特発性細菌性膿胸、細菌性髄膜炎、敗血症、結核性腹膜炎など）等が挙げられる。肝硬変の患者においては、樹状細胞の機能が低下することにより種々の感染症及び特発性細菌性腹膜炎を併発する頻度が高い。従って、本発明の賦活化剤は樹状細胞の機能を賦活化するため、肝硬変患者における種々の感染症及び特発性細菌性腹膜炎の予防および／または治療に有用である。
また、Ｃ型肝硬変患者に肝移植を行った場合、移植肝に高頻度に肝炎ウイルスが再発することが知られているが、樹状細胞の機能を賦活化させておくことで肝炎ウイルスの再発の予防に有用である。
【００２６】
また、本発明はイソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸を含有し、樹状細胞の機能の賦活化のために用いるものである表示を付した食品（以下、本発明の食品）を提供する。
【００２７】
本発明の食品が含有する分岐鎖アミノ酸である、イソロイシン、ロイシン及びバリンは、それぞれ、Ｌ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体のいずれも使用可能であるが、好ましくは、Ｌ−体、ＤＬ−体であり、さらに好ましくは、Ｌ−体である。
また、イソロイシン、ロイシン及びバリンは、それぞれ、遊離体のみならず、塩の形態でも使用することができる。塩の形態としては、酸付加塩や塩基との塩等を挙げることもでき、イソロイシン、ロイシン及びバリンの医薬品として許容される塩を選択することが好ましい。
イソロイシン、ロイシン及びバリンにそれぞれ付加して医薬として許容される塩を形成する酸としては、例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸等の無機酸；酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、モノメチル硫酸等の有機酸が挙げられる。
イソロイシン、ロイシン及びバリンの医薬として許容される塩を形成する塩基の例としては、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム等の金属の水酸化物又は炭酸化物、あるいはアンモニア等の無機塩基；エチレンジアミン、プロピレンジアミン、エタノールアミン、モノアルキルエタノールアミン、ジアルキルエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機塩基が挙げられる。
【００２８】
本発明の食品は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸を含有する。本発明の食品は、特にバリンを含有することが好ましい。本発明の食品が、イソロイシン、ロイシンおよびバリンを含有する場合、かかる３種のアミノ酸の配合比は、それぞれ重量比で、通常、１：１．５〜２．５：０．８〜３．０の範囲であり、特に好ましくは１：１．９〜２．２：１．１〜１．３の範囲である。この範囲をはずれると、有効な作用効果が得難くなる。
【００２９】
本発明の「食品」としては、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸を含む一般的な食品形態であれば如何なるものでも良い。例えば、適当な風味を加えてドリンク剤、例えば清涼飲料、粉末飲料とすることもできる。具体的には、例えば、ジュース、牛乳、菓子、ゼリー、ヨーグルト、飴等にイソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸を混ぜて飲食することができる。
また、このような食品を、保健機能食品またはダイエタリーサプリメントとして提供することも可能である。この保健機能食品には、特定保健用食品および栄養機能食品なども含まれる。特定保健用食品は、例えば、樹状細胞の機能賦活化など、特定の保健の目的が期待できることを表示できる食品である。また、栄養機能食品は、１日あたりの摂取目安量に含まれる栄養成分量が、国が定めた上・下限値の規格基準に適合している場合その栄養成分の機能の表示ができる食品である。ダイエタリーサプリメントには、いわゆる栄養補助食品または健康補助食品などが含まれる。本発明において、特定保健用食品には、樹状細胞の機能賦活化などの用途に用いるものであるという表示を付した食品、さらには、かかる用途に用いるものである旨を記載した書類（いわゆる能書き）などをパッケージとして包含する食品なども含まれるものとする。
さらに、本発明の食品を濃厚流動食や、食品補助剤として利用することも可能である。食品補助剤として使用する場合、例えば錠剤、カプセル、散剤、顆粒、懸濁剤、チュアブル剤、シロップ剤等の形態に調製することができる。本発明における食品補助剤とは、食品として摂取されるもの以外に栄養を補助する目的で摂取されるものをいい、栄養補助剤、サプリメントなどもこれに含まれる。
【００３０】
なお、「濃厚流動食」とは、１ｋｃａｌ／ｍｌ程度の濃度に調整され、長期間の単独摂取によっても著しい栄養素の過不足が生じないよう、各栄養素の質的構成が十分考慮され、１日の栄養所要量を素に設計された総合栄養食品（液体状食品）である。
【００３１】
食品として摂取する場合、摂取量は摂取対象の症状、年齢、体重、剤形、摂取方法等によって異なるが、成人（体重６０ｋｇとして）１日あたり、イソロイシン０．５〜３０．０ｇ、ロイシン１．０〜６０．０ｇ、バリン０．５〜３０．０ｇを目安とする。一般の成人の場合、好ましくは、一日量として、イソロイシン２．０〜１０．０ｇ、ロイシン３．０〜２０．０ｇ、バリン２．０〜１０．０ｇ、より好ましくは、イソロイシン２．５〜３．５ｇ、ロイシン５．０〜７．０ｇ、バリン３．０〜４．０ｇであり、アミノ酸の全体量としては１日あたり２．０ｇ〜５０．０ｇ程度が好ましい。本発明の食品において、上記１日あたりの量を一度にもしくは数回に分けて摂取することができる。また摂取期間は特に限定されない。
【００３２】
イソロイシン、ロイシン、及びバリンは既に、医薬・食品分野において広く用いられていて、安全性は確立している。例えば、これらのアミノ酸を１：２：１．２の比で含有する製剤の急性毒性（ＬＤ５０）は、マウスの経口投与において１０ｇ／ｋｇ以上である。
【００３３】
本発明においては、イソロイシン、ロイシンおよびバリンから選ばれる少なくとも一種の分岐鎖アミノ酸を含有する食品には、樹状細胞の機能賦活化に使用することができる、または使用すべきであることを記載した記載物を含む、商業的パッケージも含まれる。
【００３４】
本発明の食品は、樹状細胞の機能を賦活化する。樹状細胞の機能の賦活化は、免疫機能の賦活化と密接に関連するため、本発明の食品は、免疫関連疾患の予防にも有用である。免疫関連疾患としては、感染症（菌血症、肺炎、尿路感染症、特発性細菌性腹膜炎、特発性細菌性膿胸、細菌性髄膜炎、敗血症、結核性腹膜炎など）等が挙げられる。肝硬変の患者においては、樹状細胞の機能が低下することにより種々の感染症及び特発性細菌性腹膜炎を併発する頻度が高い。従って、本発明の食品は樹状細胞の機能を賦活化するため、肝硬変患者における種々の感染症及び特発性細菌性腹膜炎の予防に有用である。
また、Ｃ型肝硬変患者に肝移植を行った場合、移植肝に高頻度に肝炎ウイルスが再発することが知られているが、樹状細胞の機能を賦活化させておくことで肝炎ウイルスの再発の予防に有用である。
【００３５】
本発明はまた、本発明の賦活化剤を用いて機能の賦活化した樹状細胞を製造する方法（以下、本発明の製造方法）を提供する。
【００３６】
本発明の製造方法では、生体から分離した樹状細胞またはその前駆細胞が、本発明の賦活化剤を添加した培地で培養される。生体としては、例えば温血動物、好ましくは哺乳動物が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられ、好ましくは、マウス、ラット、サル、ヒト等が挙げられる。樹状細胞またはその前駆細胞は、好ましくは末梢血より分離される。前駆細胞としては、ＣＤ１４＋単核球、ＣＤ３４＋造血幹細胞等が挙げられ、好ましくは、ＣＤ１４＋単核球等が挙げられ、該前駆細胞は生体から自体公知の方法により調製される。
【００３７】
本発明の製造方法における培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地とし、本発明の賦活化剤を添加することにより調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＥａｇｌｅＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地が挙げられる。培地は、例えば、血清（例えば、ＦＣＳ）、血清代替物（例えば、knockout Serum Replacement（ＫＳＲ）、Chemically-defined Lipid concentrated（Gibco社製）、Glutamax（Gibco社製））、脂肪酸又は脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含むことができる。好ましくは、培地はＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地がよい。
【００３８】
培養培地中の本発明の賦活化剤の含有量は、イソロイシン１ｍｇ／ｌ〜２ｇ／ｌ、ロイシン１ｍｇ／ｌ〜２ｇ／ｌ、バリン１ｍｇ／ｌ〜２ｇ／ｌとなるように調製する。好ましくは、イソロイシン２０ｍｇ／ｌ〜５００ｍｇ／ｌ、ロイシン２０ｍｇ／ｌ〜５００ｍｇ／ｌ、バリン２０ｍｇ／ｌ〜５００ｍｇ／ｌである。
【００３９】
本発明の製造方法における培養温度、ＣＯ２濃度、培養時間等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。培養時間は、例えば約１日〜１４日、好ましくは約６日間である。
【００４０】
本発明の製造方法により製造された樹状細胞は、抗原提示能力などの機能が賦活化しているため、免疫療法、免疫関連疾患の予防および／または治療などに用いることができる。免疫療法としては癌に対する免疫療法などが、免疫関連疾患としては、感染症（菌血症、肺炎、尿路感染症、特発性細菌性腹膜炎、特発性細菌性膿胸、細菌性髄膜炎、敗血症、結核性腹膜炎など）等が挙げられる。
【００４１】
従って、本発明は、本発明の製造方法により製造された樹状細胞を有効成分として含有してなる、癌の予防・治療剤を提供する。本発明の癌の予防・治療剤は、患者に投与すること等により、メラノーマ、白血病、甲状腺癌、肝癌、膵癌、大腸癌、肺癌、胃癌、胆嚢・胆管癌、乳癌、子宮癌等の癌の予防・治療に有用に用いることができる。
【００４２】
例えば、癌患者血液から、樹状細胞またはその前駆細胞を採取し、本発明の方法により当該患者由来の樹状細胞を製造する。そして、該樹状細胞を癌特異的抗原ペプチドまたは破壊した癌細胞とともに培養することにより、癌に対する免疫誘導能力を増強した後で当該患者に投与することで、癌を予防・治療することが出来る。癌抗原ペプチドとしては、癌患者自身の癌組織の溶解物あるいは既知の抗原ペプチドを合成して使用することができる。
【００４３】
本発明の癌の予防・治療剤は、常套手段に従って、有効量の樹状細胞を医薬として許容される担体と混合する等して、通常は、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることが出来る。本発明の癌の予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などと配合してもよい。
【００４４】
このようにして得られる製剤を、例えば、ヒト等の上述の哺乳動物に対して、点滴、局所投与等により投与することができる。
【００４５】
本発明の樹状細胞の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、通常、成人の患者（体重６０ｋｇとして）においては、例えば非経口投与の場合、一日につき１×１０６細胞〜１×１０９細胞個程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇあたりに換算した量を投与することができる。
【００４６】
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００４７】
以下の実施例によって本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００４８】
試験例１
健常人、慢性Ｃ型肝炎／肝硬変患者の末梢血より磁気ビーズにてＣＤ１４＋単球を採取した。本研究では培地中のアミノ酸濃度の正確な評価が必要であるため、独自の培地（アミノ酸非含有Ｄ−ＭＥＭ培地＋２０種類のアミノ酸＋各種添加剤）を調製し、２０種類全てのアミノ酸を含む培地をＦｕｌｌ培地（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ：ＣＣＭ）と定義しｃｏｎｔｒｏｌとして用いた。またＦｕｌｌ培地のアミノ酸組成を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定し、理論値と実測値に差がないことを確認した。
【００４９】
ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αを加えたＦｕｌｌ培地で、ＣＤ１４＋単球を５日間培養し、５日目にＬＰＳを添加し２４時間追加培養した。樹状細胞への分化はＦＡＣＳを用いて、ＣＤ１４−、ＣＤ４０＋、ＣＤ８０＋、ＣＤ８３＋、ＣＤ８６＋、ＨＬＡＤＲ＋であることにより確認し、樹状細胞への分化が可能な系を確立した。
【００５０】
Ｆｕｌｌ培地から１種類のアミノ酸が除去された培地（ｅｘ．ΔＧｌｙ、ΔＡｌａ、ΔＳｅｒ、ΔＴｈｒ、ΔＣｙｓ、ΔＭｅｔ、ΔＧｌｎ、ΔＡｓｎ、ΔＧｌｕ、ΔＡｓｐ、ΔＶａｌ、ΔＬｅｕ、ΔＩｌｅ、ΔＰｈｅ、ΔＴｙｒ、ΔＴｒｐ、ΔＬｙｓ、ΔＡｒｇ、ΔＨｉｓ、ΔＰｒｏ計２０種類）、数種類のアミノ酸をセットで除去した培地（ｅｘ．ΔＢＣＡＡ（ΔＶａｌ、ΔＬｅｕ、ΔＩｌｅ）、ΔＡＡＡ（ΔＰｈｅ、ΔＴｙｒ、ΔＴｒｐ）、ΔａＡＡ（ΔＧｌｕ、ΔＡｓｐ）、ΔｂＡＡ（ΔＬｙｓ、ΔＡｒｇ、ΔＨｉｓ）、ΔｅＡＡ（ΔＴｈｒ、ΔＭｅｔ、ΔＶａｌ、ΔＬｅｕ、ΔＩｌｅ、ΔＰｈｅ、ΔＴｒｐ、ΔＬｙｓ、ΔＨｉｓ）、ΔｎｅＡＡ（ΔＧｌｙ、ΔＡｌａ、ΔＳｅｒ、ΔＣｙｓ、ΔＧｌｎ、ΔＡｓｎ、ΔＧｌｕ、ΔＡｓｐ、ΔＴｙｒ、ΔＡｒｇ、ΔＰｒｏ）、ΔｓＡＡ（ΔＣｙｓ、ΔＭｅｔ）、ΔＮＨ２ＡＡ（ΔＧｌｎ、ΔＡｓｎ）計８種類）、全てのアミノ酸を除去した培地（Ｚｅｒｏ培地）、Ｆｕｌｌ培地（ＣＣＭ）の計３０種類の培地にてＣＤ１４＋単球を培養した。なお、Ｆｕｌｌ培地、ΔＢＣＡＡ培地、ΔＶａｌ培地、ΔＬｅｕ培地、ΔＩｌｅ培地の各培地におけるアミノ酸含有量を表１に示す。６日目に放射線照射後、ＣＤ４＋Ｔ−ｃｅｌｌを加えＦｕｌｌ培地（ＣＣＭ）下で更に４日間共培養し １０日目にＭＴＴ ａｓｓａｙにてリンパ球増殖能を測定した。ＢＣＡＡに注目すると分岐鎖アミノ酸除去培地（ΔＢＣＡＡ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ）除去培地（ΔＶａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）除去培地（ΔＬｅｕ）はＦｕｌｌ培地（ＣＣＭ）と比較して有意にリンパ球増殖能が低下した(図１)。すなわちこれらの除去培地で培養して分化させた樹状細胞との共培養では、リンパ球の活性化が弱かったことを示しており、単球由来樹状細胞のＣＤ４＋リンパ球刺激能（抗原提示能）が低下していることが考えられる。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
培養６日目に、ＦＡＣＳを用いて樹状細胞の表現型(ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６)を測定した。ΔＢＣＡＡでは有意にＣＤ８３、ＣＤ８６が低下した（図３）。更にΔＶａｌでＣＤ８３、ＣＤ８６の低下傾向を認めるが、ΔＬｅｕ、ΔＩｌｅでは認めなかった。２ ｃｏｌｏｒ染色でΔＢＣＡＡ、ΔＶａｌでは成熟樹状細胞の割合が低下していることが分かった。
培養６日目の樹状細胞回収率を測定すると（トリパンブルー、ＦＡＣＳ）、ΔＢＣＡＡ、ΔＶａｌ、ΔＬｅｕいずれも１０％程度低下した。
【００５３】
Ｖａｌｉｎｅ、Ｌｅｕｃｉｎｅについて、除去（Δ）、×１（Ｆｕｌｌ）、×２、×３、×５、×１０の濃度勾配をつけて同様な方法で健常人・Ｃ型肝硬変患者樹状細胞のＣＤ１４＋単球を培養した(図２)。Ｖａｌｉｎｅについては、健常人・患者いずれも３倍濃度（×３）まで濃度依存的（ｄｏｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）にリンパ球の増殖能は増加し、３倍濃度で最大となった(図２（Ｂ）)。
【００５４】
試験例２
健常人、慢性Ｃ型肝炎／肝硬変患者の末梢血より磁気ビーズにて採取したＣＤ１４＋単球を用いて、試験例１と同様の方法でリンパ球増殖能の測定をくり返した。ＢＣＡＡに注目すると分岐鎖アミノ酸除去培地（ΔＢＣＡＡ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ）除去培地（ΔＶａｌ）はＦｕｌｌ培地（ＣＣＭ）と比較して有意にリンパ球増殖能が低下した(図４（Ａ）)。すなわちこれらの除去培地で培養して分化させた樹状細胞との共培養では、リンパ球の活性化が弱かったことを示しており、単球由来樹状細胞のＣＤ４＋リンパ球刺激能（抗原提示能）が低下していることが考えられる。本試験例では、ロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）除去培地（ΔＬｅｕ）の系ではリンパ球増殖能の低下傾向が見られるものの有意差が得られなかった。
【００５５】
また、健常人のＣＤ１４＋単球を用いて同様の実験を、ΔＶａｌ培地およびΔＬｅｕ培地にＶａｌおよびＬｅｕを各種濃度にて添加した条件でリンパ球増殖能を測定したところ、Ｖａｌは濃度依存的に樹状細胞に作用してリンパ球を活性化することが明らかとなった（図４（Ｂ））。さらに同一の培養条件における５日目の樹状細胞培養液中のＩＬ−１２およびＩＬ−１０のサイトカイン濃度を特異的なＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定したところ、Ｖａｌ濃度に依存して、ＩＬ−１０産生には影響を与えないが、ＩＬ−１２の産生が高まることが明らかとなった（図４（Ｃ））。ＩＬ−１２はおもにマクロファージ／樹状細胞から産生されるサイトカインであり、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化やＮＫ細胞やＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞障害活性を増強する。従って、ＩＬ−１２の産生増強は、樹状細胞の機能分化を意味するものである。また、ＩＬ−１２は抗原感作Ｔ細胞に作用して、炎症局所（癌塊を含む）への浸潤を誘導することから、抗腫瘍効果増強という観点からもその産生増強には意義がある。
【００５６】
Ｖａｌｉｎｅについて、ΔＶａｌ培地に対して濃度勾配をつけてＶａｌを添加して、同様な方法で健常人・Ｃ型肝硬変患者のＣＤ１４＋単球を培養した(図５)。Ｖａｌｉｎｅについては、健常人・患者いずれも濃度依存的（ｄｏｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）にリンパ球の増殖能は増加した（図５（Ａ））。さらにこのときに、樹状細胞培養液中のサイトカインを測定したところ、健常人（図４（Ｃ））と同様に、患者樹状細胞においてもＩＬ−１２選択的な産生増強が認められた（図５（Ｂ））。
【００５７】
以上の結果から、樹状細胞によるアロＭＬＲを指標とした定量化でリンパ球の活性化を促すことから、分岐鎖アミノ酸、とりわけＶａｌは樹状細胞の機能賦活化に有用であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】含有アミノ酸を変化させた培地におけるリンパ球増殖能を示す図である。（Ｆｕｌｌ：Ｆｕｌｌ培地、Ｚｅｒｏ：アミノ酸非含有培地、ΔＡＡＡ：フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン除去培地、ΔＢＣＡＡ：イソロイシン、ロイシンおよびバリン除去培地、ΔＩｌｅ：イソロイシン除去培地、ΔＬｅｕ：ロイシン除去培地、ΔＰｈｅ：フェニルアラニン除去培地、ΔＴｒｐ：トリプトファン除去培地、ΔＴｙｒ：チロシン除去培地、ΔＶａｌ：バリン除去培地）
【図２】各濃度のロイシン（Ａ）およびバリン（Ｂ）含有培地におけるリンパ球増殖能を示す図である。
【図３】培養０日目のＣＤ１４＋単球および培養６日目の樹状細胞の表現型を示す図である。
【図４Ａ】含有アミノ酸を変化させた培地における健常人樹状細胞のリンパ球増殖能を示す図である。（ＣＣＭ：ＣＣＭ培地、Ｚｅｒｏ：アミノ酸非含有培地、ΔＢＣＡＡ：イソロイシン、ロイシンおよびバリン除去培地、ΔＶａｌ：バリン除去培地、ΔＬｅｕ：ロイシン除去培地、ΔＩｌｅ：イソロイシン除去培地）
【図４Ｂ】含有アミノ酸濃度を変化させた培地における健常人樹状細胞のリンパ球増殖能を示す図である。（○：バリン、◆：ロイシン）
【図４Ｃ】バリンによる健常人樹状細胞のサイトカイン産生増強を示す図である。
【図５Ａ】含有バリン濃度を変化させた培地における健常人（●）およびＣ型肝硬変患者（◇）リンパ球増殖能を示す図である。
【図５Ｂ】バリンによるＣ型肝硬変患者樹状細胞のサイトカイン産生増強を示す図である。
【図２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図１】
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【図３】
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