(57)【要約】【課題】  ヒトの神経細胞を簡便かつ安定的に培養することは困難であり、結果的に神経系の有害性を簡単に検出できないといった課題がある【解決手段】  神経様に分化したPC１２細胞を被験水に所定期間暴露する工程と、当該所定期間経過後に、前記神経様に分化したＰＣ１２細胞の生存率を測定する工程とを有することを特徴とする水質評価方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経様に分化したPC１２細胞を被験水に所定期間暴露する工程と、
当該所定期間経過後に、前記神経様に分化したＰＣ１２細胞の生存率を測定する工程とを有することを特徴とする水質評価方法。
【請求項２】
請求項１に記載の水質評価方法において、
前記神経様に分化したPＣ１２細胞は、NGF含有の培地で培養されかつ樹状突起を有することを特徴とする水質評価方法。
【請求項３】
請求項１に記載の水質評価方法において、
前記生存率の測定は、色素法、コロニー形成試験法、ＭＴＴ法試験法のいずれかの試験法により測定されることを特徴とする水質評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水質を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、水の安全性評価は水道水や排水、水質汚濁基準に関する分析が主であり、物理化学的分析法を利用している。物理化学的分析法は、水に含まれる化学物質成分を濃縮・抽出・精製した後にクロマトグラフィー（ガス・液体・イオン）あるいはそれらと質量分析計を組み合わせて機器分析する手法で、前処理方法が極めて煩雑な上に、測定しようとする化学物質ごとに操作手順が異なるため、あらゆる種類の化学物質について網羅的に分析する場合には多大な労力とコストが必要である。主な分析項目は、残留塩素や色度、濁度などの水道法10項目、飲料水50項目、ヒト健康保護に関する環境基準36項目などであり、このように成分分析法は、水に含まれる既知の有害性物質の濃度を明らかにする方法である。
【０００３】
しかしながら、水は様々な物質が溶け込んでいる混合物であり、含まれる各物質（金属や化学物質）が混合された状態にある場合、相互作用により新たな産物を生じ、それらの人健康への有害性は不明である。また新たな相互作用物質が生じる関係から、本来の測定すべき物質の量が減り、正確な値の測定ができない場合も考えられる。また水が混合物である以上、各有害物質の積算によって、より大きな有害性が生じる場合もある。このため、成分分析では人の健康に対する有害性の程度について直接的に評価はできない。このため、物質を特定せずに人に対する健康影響を直接把握・評価する方法が必要である。
【０００４】
この問題を解決する技術として、生体や細胞を利用した評価技術（バイオアッセイ）が存在する。バイオアッセイは、個々の化学物質を分離分析することなく、生体に対する化学物質の有害性を、生体応答に対する影響（成長性や増殖性、細胞傷害性）として捉える方法である。環境水の評価例として代表的なものは、米国・水質浄化法（Clean Water Act）のもとでの水質基準による排水規制：WET(Whole Effluent Toxicity)規制があり、魚・ミジンコ・藻類を用いて、排水流域内の環境水の総体的な有害性を評価している（非特許文献１、２）。これ以外は、環境水中に含まれる個々の有害化合物等を対象に、OECD(Organization for Economic Co-operation and Development：経済協力開発機構)における生態影響試験や、微生物や実験動物を用いた化学物質や毒物の試験が一般的に用いられている（非特許文献３）。
【０００５】
一方、医薬品、化粧品の安全性試験では実験動物に加えて培養細胞が多用されている。その場合、細胞種によって有害性の現れ方や程度が異なることがある（特許文献１）。その要因としては、細胞の由来や分化による性質の違いが挙げられる。GHS（Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals）による分類において、化学物質によっては身体に暴露した場合、特異的に悪影響を受ける臓器が特定されている。特定の臓器に作用するのであれば、その臓器の性質を持つ細胞を用いれば、他の細胞を用いるより感度が高くなることが予想される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−１３３４５２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms.  Fifth Edition, Unites States Environmental Protection Agency, October 2002.
【非特許文献２】Short-term Methods for Estimating the Chronic Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater Organisms Fourth Edition, Unites States Environmental Protection Agency, October 2002.
【非特許文献３】生体影響試験ハンドブック、日本環境毒性学会編、朝倉出版、２００３年(ｐ88-95・ｐ256-258)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来の生態系における水質評価（魚による水環境評価試験）はあくまでも魚に対する健康リスクを調べたものであり、人との種間差が大きいため、結果を人健康へ直接あてはめることは難しい。
また、水のように「未知の混合物」が含まれる被験物質への培養細胞の適用例は極めて少ない。また細胞種によって有害性の現れ方や程度が異なるといった問題も残されている。
【０００９】
また、地下水汚染などで問題となっているクロム・ヒ素・鉛に共通の特定標的臓器として、中枢神経系が挙げられるが、これらの有害性を検出するために、ヒト神経細胞を培養して使用することが考えられる。
しかしながら、ヒトの神経細胞を簡便かつ安定的に培養することは困難であり、結果的に神経系の有害性を簡単に検出できないといった課題がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するための本発明の一例としては、神経有害物質を含む水の有害性評価に対して、神経様に分化したPC12細胞を適用し、被験水を細胞に処理して、PC12細胞の生死を指標に有害性を検出する評価方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
神経有害物質を含む水の有害性評価では、ヒト由来ではないが、ヒトと同じ哺乳類であるラット由来のPC12細胞を用いることで、ヒトの神経細胞と異なり一般的な培養方法で安定的に培養することがでる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】分化したPC12細胞を用いた神経有害性物質を含む水質評価の手順を説明するフロー図である。
【図２】汚染地下水の評価結果に基づく細胞有害性を示すグラフである。
【図３】汚染地下水の評価結果に基づく細胞有害性を示すグラフである。
【図４】汚染地下水の評価結果に基づく細胞有害性を示すグラフである。
【図５】汚染地下水の評価結果に基づく細胞有害性を示すグラフである。
【図６】細胞数の違いによる汚染地下水の評価結果に基づく細胞有害性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
(実施例１)
以下に添付図面を参照して、本発明の実施形態を説明する。なお、この実施の形態は一例にすぎず、本発明を限定するものではない。
図１は本発明に関わる分化したPC12細胞を用いた神経有害性物質を含む水質評価の手順を説明するフロー図であり、S1〜S4の4工程で構成される。
【００１４】
＜S1：細胞の維持と分化＞
PC12細胞の維持は、通常の哺乳類細胞培養法により培養できる。培養液はウマ血清とウシ胎児血清を含むRPMI1640を使用した。
神経様分化は、神経成長因子（Nerve Growth Factor：以下NGFと示す）を予め、0.1％ウシ血清アルブミン含有リン酸バッファー（Phosphate Buffered Saline pH7.4）で溶解し、培地交換と継代時に培地に添加した。NGF含有の培地で1週間以上培養し、樹状突起が伸びたものを分化したPC12細胞とし、NGF添加条件で継代を週2回行った。
【００１５】
＜S2：被験水からの培養液調製＞
細胞を暴露する被験水は、適宜濃縮操作を行った後に0.22μmのフィルターでろ過し、滅菌を行う。濃縮作業は必須ではないが、明らかな高濃度汚染地域でない限り、濃縮水を含めた希釈系列で評価することが望ましい。次に、粉末培地を溶解してpHを7.2に調整し、液体培養液を調製する。
【００１６】
＜S3：被験水による細胞処理（暴露）＞
S1で継代培養されている細胞を一定量播種し、その後、被験水で作られた培養液を添加して培養を続け、24〜96時間、細胞を暴露する。
【００１７】
＜S4：有害性評価＞
S3の細胞処理後に細胞の生存率を求め、有害性を評価する。細胞生存率の測定には従来法を用いることができる。細胞の生存率の測定には細胞膜の透過性を指標として調べる色素法、増殖能を調べるコロニー形成試験法、ＭＴＴ（メチルチアゾールテトラゾリウム）がミトコンドリアの酸化的リン酸化能に伴い還元、分解される現象を利用して細胞の生存率を出すＭＴＴ法試験法などが利用できる。
【００１８】
例えばニュートラルレッド法の場合、ニュートラルレッド含む培養液に交換し、さらに2〜3時間培養することで、細胞にニュートラルレッドを取り込ませ、取り込み量を測定する。取り込み量を測定するためには、通常、以下の後処理を行う。すなわち、ニュートラルレッド含む培養液を除去後、塩化カルシウム含有ホルマリン溶液（例えば、塩化カルシウム1％含有1％ホルマリン溶液）を添加して培養細胞を固定し、さらに上清を除去することによって、細胞に取り込まれないニュートラルレッドを除去し、ついで酢酸含有エタノール（例えば、酢酸1％含有50％エタノール）を添加することによって、生細胞に取り込まれたニュートラルレッドを抽出する。該抽出液に含まれるニュートラルレッドの量は常法、例えば比色法や分光光度法等によって測定すればよいが、分光光度計を用いて吸光度、例えば540nmにおける吸光度を測定する方法が簡便である。
【００１９】
ニュートラルレッドは可溶性の色素で、生細胞のみ細胞内に取り込むことが出来る物質である。毒性によって細胞増殖が抑制された場合、あるいは細胞死が誘発され細胞数が減少した場合には、ニュートラルレッドの取り込みが減少する。したがって、洗浄後に細胞に取り込まれたニュートラルレッドを測定することで、対照群に対する相対的な生細胞数を推定することができ、被験水の有害性を判定することが可能である。
【００２０】
以下に、本発明の分化したPC12細胞を用いた神経有害性物質を含む水の評価法と結果ついて説明するが、本発明は以下の適用例に限定されるものではない。
（適用例1）
＜被験水の培養液調製＞
模擬的に作製した被験水を用い、細胞有害性を検出した例を示す。
地下水汚染物質であるクロムを用いて、細胞有害性を評価した。模擬水は純水に二クロム酸カリウムを溶解して作製し、それを用いて培地を作製した。クロムの濃度は化合物の分子量から換算して算出した。S1で継代培養されている神経細胞様に分化したPC12細胞と比較対照として、NGFを添加せずに培養した未分化のPC１２細胞と一般的な培養細胞であるヒト肝臓がん由来細胞HepG2を用いた。
【００２１】
＜細胞処理＞
分化したPC12細胞・未分化のPC12細胞・HepG2細胞を96ウェルの培養プレートに、1×104cells/100μLとなるように細胞を播種する。その後、模擬被験水のクロム濃度が0（コントロール）と0.3mg/Lになるように調整し、37℃、5％ CO2環境下で24時間培養した。
【００２２】
＜細胞有害性評価＞
ニュートラルレッド・アッセイにより生細胞数を測定し、対照培養液の生細胞数を100％とした相対細胞生存率を算出した。
【００２３】
具体的には、被験水で調製した培養液を除去し、150μg/ｍｌの濃度でニュートラルレッド含む培地に交換し、さらに2〜3時間培養することで、細胞にニュートラルレッドを取り込ませた。その後、ニュートラルレッド含む培養液を除去し、塩化カルシウム1％含有1％ホルマリン溶液を添加して培養細胞を固定し、さらに上清を除去することによって、細胞に取り込まれないニュートラルレッドを除去し、ついで酢酸1％含有50％エタノールを添加することによって、生細胞に取り込まれたニュートラルレッドを抽出した。分光光度計を用いて540nmにおける吸光度を測定し、抽出液に含まれるニュートラルレッドの量を測定した。ニュートラルレッド法では、生細胞のみが細胞内にニュートラルレッドを取り込むため、ニュートラルレッドの吸光度を生細胞数とみなすことができる。対照培養液の吸光度を100％として相対値を求め、被験水処理群の相対生存率を求めた。
【００２４】
図２に示す通り、クロムは神経有害性物質であるので、神経様に分化したPC12細胞を用いることで、未分化のPC12細胞や、毒性試験等でよく使用されるHepG2細胞より生存率は低く、クロムの細胞有害性を高感度に検出できることが確認された。
【００２５】
（適用例２）
適用例1と同様に模擬的に作製した被験水を用い、有害性を検出した例を示す。
地下水汚染物質であるヒ素を用いて、細胞有害性を評価した。模擬水は純水に亜ヒ酸ナトリウムを溶解して作製した。被験水の培養液調製、細胞処理、細胞有害性評価手順は適用例1と同様に行った。ただし、ヒ素濃度は0（コントロール）と1mg/Lになるように調整した。
【００２６】
図３に示す通り、ヒ素はクロムと同様に神経有害性物質であるので、神経様に分化したPC12細胞を用いることで、未分化のPC12細胞やHepG2細胞より生存率は低く、ヒ素の場合でも細胞有害性を高感度に検出できることが確認された。
【００２７】
（適用例3）
適用例1と同様に模擬的に作製した被験水を用い、有害性を検出した例を示す。
地下水汚染物質である鉛を用いて、細胞有害性を評価した。模擬水は純水に酢酸鉛を溶解して作製した。被験水の培養液調製、細胞有害性評価手順は適用例1と同様に行った。ただし、被験水の培養液調製において、細胞処理の播種する細胞数を2×103 cells/100μLで行い、鉛濃度は0（コントロール）と80mg/Lになるように調整し、暴露時間は96時間で行った。
【００２８】
図４に示す通り、鉛はヒ素やクロムと同様に神経有害性物質であるので、神経様に分化したPC12細胞を用いることで、未分化のPC12細胞より生存率は低く、鉛の場合でも細胞有害性を高感度に検出できることが確認された。
【００２９】
（適用例4）
適用例1と同様に模擬的に作製した被験水を用い、本発明の特徴を確認した例を示す。
地下水汚染物質であるが、特定標的部位に神経を含まない亜鉛を用いて、細胞有害性を評価した。模擬水は純水に硫酸亜鉛を溶解して作製した。被験水の培養液調製、細胞処理、細胞有害性評価手順は適用例1と同様に行った。ただし、亜鉛濃度は0（コントロール）と20mg/Lになるように調整した。
【００３０】
図５に示す通り、亜鉛はヒ素やクロムと異なり、神経有害性物質ではないので、神経様に分化したPC12細胞を用いても、未分化のPC12細胞やHepG2細胞と比較して、生存率があまり変わらなかった。すなわち、神経が標的部位でない物質の場合、分化したPC１２細胞における細胞有害性が高感度になることはなく、神経が標的部位である場合のみ、分化したPC１２細胞における細胞有害性の感度が特異的に高く検出できるという本発明の特徴が確認された。
【００３１】
（適用例５）
適用例1と同様に模擬的に作製した被験水を用い、有害性を検出するのに適した細胞数を検討した例を示す。
地下水汚染物質である鉛を用いて、細胞有害性を評価した。模擬水は純水に酢酸鉛を溶解して作製した。被験水の培養液調製、細胞有害性評価手順は適用例1と同様に行った。ただし、細胞処理の播種する細胞数を、1×103・2×103・5×103・1×104・5×104 cells/100μLにし、鉛濃度は80mg/L、暴露時間は96時間で行った。
【００３２】
図６に示す通り、細胞数が少ない方が細胞有害性を高感度に検出できることが確認された。
【００３３】
上述したような本願発明および適用例によって、ヒト由来ではないが、ヒトと同じ哺乳類であるラット由来のPC12細胞を用いることで、ヒトの神経細胞と異なり一般的な培養方法で安定的に培養することができることが確認された。
また、PC１２細胞はNGFを培地に添加することで簡単に分化させることできる。
さらに、神経細胞モデルとして使用されてきた実績があるPC12細胞を用いることで、神経有害性物質を含む水の有害性評価に対し、高感度に検出できるという利点がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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