(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳類、特にヒトの造血幹細胞の維持増幅を促進する因子、及びこの因子を用いた造血幹細胞を体外および体内で維持増幅する技術の提供。【解決手段】造血幹細胞の維持増幅を促進する因子は、膜タンパク質Thsd1/Tmtspから成る。無血清培地で、Thsd1/Tmtsp又はその一部分やThsd1/Tmtspの変異体や誘導体の存在下で造血幹細胞を培養したり、Thsd1/Tmtspやその一部分等を添加し造血幹細胞をフィーダー細胞と共培養したり、Thsd1/Tmtspやその誘導体等をフィーダー細胞に発現させて造血幹細胞を共培養することにより、造血幹細胞を分化させることなく効率よく体外で維持増幅できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜タンパク質Thsd1/Tmtspから成る哺乳動物の造血幹細胞を維持増幅を促進する因子。
【請求項２】
配列番号１若しくは配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１若しくは配列番号３に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、哺乳動物の造血幹細胞の維持や増幅を促進させる能力を持つタンパク質から成る哺乳動物の造血幹細胞の維持や増幅を促進する因子。
【請求項３】
膜タンパク質Thsd1/Tmtspの細胞膜外領域ペプチドから成る哺乳動物の造血幹細胞の維持増幅を促進する因子。
【請求項４】
前記膜タンパク質Thsd1/Tmtspが、配列番号１若しくは配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１若しくは配列番号３に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、哺乳動物の造血幹細胞を維持増幅する能力を有するタンパク質である請求項３に記載の因子。
【請求項５】
前記細胞膜外領域のペプチドが、ヒト膜タンパク質Thsd1/Tmtsp（配列番号３）のアミノ酸番号１〜４１３（１〜２４はシグナルペプチドで成熟タンパク質では切断される）のペプチド、又はヒト以外の膜タンパク質Thsd1/Tmtspの場合にはこれらに相当する細胞膜外領域ペプチドである請求項３又は４に記載の因子。
【請求項６】
前記哺乳動物がヒトである請求項１〜５のいずれか一項に記載の因子。
【請求項７】
哺乳動物の造血幹細胞を請求項１〜６のいずれか一項に記載の因子の存在下で、無血清培地で培養することから成る造血幹細胞の維持増幅方法。
【請求項８】
少なくとも１種の造血因子又は細胞刺激因子の存在下及び血清非存在下で培養を行なう請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物がヒトである請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記因子を培地に添加する請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記因子を培地に添加し、前記造血幹細胞をフィーダー細胞と無血清培地で共培養する請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記造血幹細胞を、前記因子を発現するフィーダー細胞と無血清培地で共培養する請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記フィーダー細胞が無血清下で生存可能なヒト由来細胞である請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項７〜１３のいずれかの方法によって増幅された造血幹細胞。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の維持増幅を促進する因子を含み、血清を含まない造血幹細胞培養用の培地。
【請求項１６】
更に、フィーダー細胞を含む請求項１５に記載の培地。
【請求項１７】
更に、少なくとも１種の造血因子又は細胞刺激因子を含む請求項１５又は１６に記載の培地。
【請求項１８】
前記フィーダー細胞が無血清下で生存可能なヒト由来細胞である請求項１６に記載の培地。
【請求項１９】
(１)〜（４）のいずれかのタンパク質又はペプチドをコードするDNAが導入されたフィーダー細胞。
（１）膜タンパク質Thsd1/Tmtsp
（２）配列番号１若しくは配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１若しくは配列番号３に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、哺乳動物の造血幹細胞の維持増幅能を有するタンパク質
（３）膜タンパク質Thsd1/Tmtspの細胞膜外領域ペプチド
（４）（３）の細胞膜外領域ペプチドが、ヒト膜タンパク質Thsd1/Tmtsp（配列番号３）のアミノ酸番号１〜４１３のペプチド、又はヒト以外の膜タンパク質Thsd1/Tmtspの場合にはこれらに相当するペプチド
【請求項２０】
更に、少なくとも１種の造血因子又は細胞刺激因子をコードするDNAを導入した請求項１９に記載のフィーダー細胞。
【請求項２１】
哺乳動物の造血幹細胞を請求項１〜６のいずれか一項に記載の因子をヒト体内に投与することにより、体内で造血機能を向上あるいは改善させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、哺乳動物の造血幹細胞の維持や増幅を促進させる因子、及びこの因子を用いた体外または体内での造血幹細胞の維持増幅技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な白血病や再生不良性貧血など難治性血液疾患の治療には、骨髄移植が最も有効である。しかし、必ずしもHLA適合ドナーが見つかるわけではなく、運良く見つかっても、成人患者の移植治療には大量の骨髄細胞を採取しなければならず、ドナーにも大変なリスクが伴う。末梢血幹細胞を利用する方法もあるが、この場合もドナーに取っては、G-CSFを大量投与し幹細胞数を増加させる処置を施す際に、副作用やアフェレーシスのリスクが大きい。また、臍帯血も利用可能であるが、血球回復遅延と臍帯血中の造血幹細胞は絶対数不足で、小児への移植治療には適用されるが成人には生着不全の頻度が高く適用が困難である。このように、骨髄や臍帯血等に存在する造血幹細胞は、移植治療・再生医療に大変有効であるが、造血幹細胞の数が非常に少なく拒絶反応があるため適用できないことも多く、できてもドナーにも患者にも高いリスクが伴う。そこで、拒絶反応のない安全な造血幹細胞の体外での増幅技術の一刻も早い開発が待たれていた。
【０００３】
造血幹細胞を体外で培養増幅する技術としては、既知の造血因子やサイトカインを様々に組み合わせて、造血幹細胞を浮遊細胞として培養する方法が試みられてきた。例えば、SCF、FL、IL3、IL6、G-CSFを加えてCD34+CD38-ヒト造血幹細胞を１週間培養し２倍に増やした報告がある（非特許文献１）。また、SCF、FL、IL6、TPOを加え臍帯血CD34陽性細胞を９週間培養し、７０倍に増幅できたとする報告がある（非特許文献２）。更に、SCF、FL、TPO、IL6と可溶性IL6レセプターを加え、臍帯血CD34陽性細胞を１週間培養し４倍に増やした報告もある（非特許文献３）。また最近、この改良法で３０倍まで増幅したとされる（新聞報道）。これら造血系サイトカイン添加による体外増幅法は、本来の生体内での維持増幅環境を反映した増幅法ではなく、増幅率に限界があり血清存在の問題もあり、医療への応用は課題が残る。また、膜で分離されたマウスHess-5ストローマ細胞共存下で、SCF、FL、TPOを添加し、臍帯血CD34陽性細胞を５日間培養して、１０倍の増幅に成功した例もある（非特許文献４）。これはマウスの細胞を血清存在下で共培養させており、ウイルス感染の可能性などがあり臨床には応用できない。これら何れの方法も移植治療に適した造血幹細胞の増幅法として様々な問題点がある。まず、増幅効率が問題である。更に、造血幹細胞だけを増幅しているのではなく、分化した大多数の血液細胞中に少数の造血幹細胞が共存させる増幅法であり、非効率である上に、造血幹細胞の寿命や性状に変化をきたす可能性もある。また、ウシ血清等を培地に添加しているケースが多く、BSEを始め感染症の恐れがあり安全性に問題が残る。
【０００４】
造血幹細胞を維持増幅や自己複製を制御する未知の因子が存在する可能性も考えられ、この新規因子の探索が様々試みられて来たが、未だ誰も成功していない。過去には、Notchリガンド（JaggedやDeltaファミリー）、Tie-2リガンド（アンジオポエチン）、BMP-4などが、造血幹細胞の自己複製に重要な役割を担っていると報告されたが、これら因子単独又は組み合わせでは増幅は限定的であり、一刻も早い解決が待たれていた。2003年にWeissmanらは、昔から知られていたWntが造血幹細胞を増幅させると報告した（非特許文献５）。Daleyらが報告していたHoxB4やNotchの誘導もあり説得力がある。NusseらはWnt3aを可溶性タンパク質として純化に成功し、Wnt3a単独で、造血幹細胞を約６倍に増幅できたと報告した（非特許文献６）。しかし、Wntは造血幹細胞自体で発現しており、自己複製因子の機能として矛盾がある。また、骨髄でWnt3aは発現しておらず、主に発現しているWntメンバーも本発明者の結果とは異なる（特願2003-413662）。また、増幅率が実用化にはほど遠い上に、無血清培地ではない為分化した細胞も多く産生されており、実用化には問題がある。またWnt以外の幹細胞の増幅に関与する因子も最近相次いで報告された。上野らはKirreが造血幹細胞の増幅を行うと報告した（非特許文献７、特許文献１）。しかしKirre単独で幹細胞を体外で増幅できず（未発表データ）、Walzらの報告によれば全く異なる機能を持った膜タンパク質として報告されているなど、増幅因子としての機能は曖昧である。Kirreは骨髄ストローマ細胞のみならず造血発生の時期のAGM領域でも発現を確認しているが（未発表データ）、その詳細な機能は今後の課題である。また、ISFが造血幹細胞の増幅に関与するとする報告もある（非特許文献８、９）。最近、他の増殖因子と共にアンジオポエチン様ファミリー（Angpl2、3、5または7）と、１０日間造血幹細胞を培養すると２４〜３０倍に増幅できるとも報告された（非特許文献１０）。
なお、本発明により、造血幹細胞の維持増幅を促進する因子を同定したが、これは機能不明の膜タンパク質Thsd1/Tmtspと同一であることが明らかになった。この膜タンパク質自体は極最近報告された新規遺伝子であるが（非特許文献１１）、造血幹細胞や血管内皮細胞に特異的に発現することが判明しているが、機能は全く不明の因子である。
【０００５】
【特許文献１】再公表03/018805（WO03/018805）
【非特許文献１】Conneally et al., Pro. Natl. Acad. Sci. 94, 9836-9841, 1997
【非特許文献２】Piacibello et al., Blood, 93, 3736-3749, 1999
【非特許文献３】Ueda et al., J. Clin. Iinvest. 105, 1013-1021, 2000
【非特許文献４】Kawada et al., Exp.Hematol. 27, 904-915, 1999
【非特許文献５】Reya et al., Nature 423, 409-414, 2003
【非特許文献６】Willert et al., Nature 423, 448-452, 2003
【非特許文献７】Ueno et al., Nat. Immunol. 4, 457-463, 2003
【非特許文献８】Tulin et al., J. Biol.Chem. 276, 27519-27526, 2001
【非特許文献９】Nakajima et al., Biochem.Biophys.Res.Commun.340, 35-40, 2006
【非特許文献１０】Zhang et al., Nature Medicine 12, 240-245, 2006
【非特許文献１１】Takayanagi et al., Blood in press. Feb 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
造血幹細胞を体外で培養し増幅することができれば、患者自身の骨髄（あるいは生誕時の保存臍帯血）などから少量の幹細胞を採取するだけで移植治療に充分な量の幹細胞がいつでも供給可能となり、治療がHLA適合のドナーを待つことなく安全に移植が可能となる。つまり、移植に必要な幹細胞数も確保できる上に拒絶反応のない自家移植ができるようになる。自家移植が不可能な場合も、増幅技術が確立できれば、ドナーの骨髄からの少量の細胞の採取だけで移植治療が可能となり、ドナーのリスクもなくなり骨髄バンクへのドナー登録者数も増え、ドナーが見つかるチャンスの急激な増大が期待できる。臍帯血も体外で増幅できれば、成人への治療が可能となる。このように造血幹細胞の体外での増幅技術の確立は、多くの難治性血液疾患患者の生命を救うことが可能である。また、遺伝子治療に必要な幹細胞を簡単に入手ができるようになり、レトロウイルスを用いない安全な遺伝子導入が可能となり、遺伝子治療の普及が期待できる。造血幹細胞の体外での増幅技術の開発は、難治性血液疾患患者の移植治療・再生治療及び遺伝子治療にとって緊急に解決すべき重要な技術課題となっている。また、造血幹細胞を維持増幅させる因子が同定できれば、そうした因子を必要な疾患患者体内に投与することにより、造血機能を改善したり向上させたりすることも可能となる。
即ち、本発明は、哺乳動物の造血幹細胞の維持増幅を促進する因子、及びこの因子を用いた造血幹細胞の体外または体内での増幅技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、造血幹細胞の維持増幅を促進する因子を発現していると考えられるマウス骨髄ストローマ細胞、マウス・ストローマ細胞株OP9、およびマウス繊維芽細胞C127変異株OC127clone4細胞から機能が未知の膜タンパク質を検索した。多数の完全長膜タンパク質 cDNAをRT-PCR法で単離しpcDNA3.1発現ベクターに導入し、マウス繊維芽細胞C127から樹立した亜株C127clone3細胞にトランスフェクトし遺伝子が発現しているトランスフェクタントを得た。造血幹細胞をトランスフェクタントと共に無血清培地で培養させ、造血幹細胞の増幅能を指標にアッセイし、造血幹細胞の維持増幅を促進させるcDNAを同定した。本発明者は、その配列の解析から、この遺伝子にコードされているタンパク質は、Thsd1/Tmtspと同一であることを突き止めた。本発明者は更に造血幹細胞とThsd1/Tmtspを発現するフィーダー細胞を無血清培地で共培養することにより、造血幹細胞を分化させることなく効率よく体外で増幅することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、膜タンパク質Thsd1/Tmtspから成る哺乳動物の造血幹細胞の維持増幅を促進する因子である。
また、本発明は、配列番号１若しくは配列番号３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１若しくは配列番号３に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、哺乳動物の造血幹細胞の維持増幅能を有するタンパク質から成る哺乳動物の造血幹細胞の維持増幅を促進する因子である。
更に、本発明は、膜タンパク質Thsd1/Tmtspの細胞膜外領域のペプチドから成る哺乳動物の造血幹細胞の維持増幅を促進する因子である。
また、本発明は、哺乳動物の造血幹細胞を上記の増幅促進因子の存在下で、他の造血因子の存在下非存在下で無血清培地で培養することから成る造血幹細胞の体外での増幅方法である。
また、本発明は、上記の方法によって増幅された造血幹細胞である。
また、本発明は、上記の維持増幅促進因子を含み、血清を含まない造血幹細胞培養用の培地である。
また、本発明は、上記のタンパク質又はペプチドをコードするDNAが導入されたフィーダー細胞である。本発明は、更に少なくとも１種の造血因子又は細胞刺激因子をコードするDNAを導入したフィーダー細胞である。
また、本発明は、上記のタンパク質またはペプチドを患者体内に投与することにより、血液疾患や他の難治性疾患の改善や向上を行う治療方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明者は本発明の増幅促進因子が造血幹細胞の維持増幅を促進することを確認した。
本発明の増幅促進因子を用いて、造血幹細胞やThsd1/Tmtspに反応する全ての組織幹細胞や体細胞を体外で増幅し、増幅した造血幹細胞及びThsd1/Tmtspに反応する全ての組織幹細胞や体細胞を様々な難治性血液疾患や様々な組織疾患患者への移植治療、及び遺伝子治療に用いることができる。
本発明の増幅促進因子を用いて増幅した造血幹細胞及びThsd1/Tmtspに反応する全ての組織幹細胞や体細胞は、従来の骨髄移植や臍帯血移植に代わる造血幹細胞移植などに用いることができる。
また、患者あるいは他人の造血幹細胞を各種血液細胞に分化させ、それらを患者の体内に移入することにより、各種血液細胞の形成が不十分な患者を治療することができる。また、本発明の培養方法によって得られる造血幹細胞は、再生不良性貧血などの貧血を呈する骨髄低形成に起因する造血不全症を改善することができる。その他、本発明の培養方法によって得られる造血幹細胞の移植が有効な疾患としては、慢性肉芽腫症、重複免疫不全症候群、無ガンマグロブリン血症、Wiskott-Aldrich症候群、後天性免疫不全症候群(AIDS)等の免疫不全症候群、サラセミア、酵素欠損による溶血性貧血、鎌状赤血球症等の先天性貧血、Gaucher病、ムコ多糖症等のリソゾーム蓄積症、副腎白質変性症、各種の癌又は腫瘍等が挙げられる。また、増幅促進因子を必要に応じ、様々な血液疾患や難治性疾患患者に投与することにより、造血機能の改善や向上、また様々な難治性疾患の治療に用いることができる。
【００１０】
また、本発明の増幅促進因子は、造血幹細胞を未分化なまま、体内又は体外で増殖させることができるので、体外で造血幹細胞の培養・増殖方法に用いることができる他、放射線治療や制ガン剤等の化学療法剤による血球減少症の改善、リンパ球減少に起因する感染症の予防、骨髄形成不全症や骨髄抑制などの骨髄疾患の治療、白血病、高度腎障害・骨髄抑制などの骨髄疾患の治療、遺伝的疾患に由来する低血球症の治療、遺伝子治療時における組換え幹細胞の体外培養等に用いることができる。
また本発明の増幅促進因子を、造血幹細胞以外の組織幹細胞を増幅させる可能性もあると考えられる。その場合、本発明の増幅促進因子を様々な組織の再生医療へ応用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の増幅促進因子は、膜タンパク質Thsd1/Tmtspである。各種データベースには、ヒト膜タンパク質Thsd1/Tmtspとして、CAH71657、BAA96553、AA088516等のアミノ酸配列、AB044385、AK096289、AL359513、NT_024524、AY358149等の塩基配列が登録されている。また、ヒトのバリアントとしてAAH63842、NP_954872、NP_061146等のアミノ酸配列、BC063842、NM_199263、NM_018676、DR000322等の塩基配列が登録されている。マウス膜タンパク質Thsd1/Tmtspとして、NP_062522，BAA92685等のアミノ酸配列、NM_019576 、NT_039455、AB039946、BB536293、BB119087、BB116704等の塩基配列が登録されている。ウシ膜タンパク質Thsd1/Tmtspとして、NP_001014967、AAX31343等のアミノ酸配列、NW_994818、NM_001014967、BT021161等の塩基配列が登録されている。ラットThsd1/TmtspとしてXM_344542の塩基配列が登録されている。本発明においては、これらのいずれをも利用することができるし、まだ単離されていない他の哺乳動物のホモログを用いることもできる。
また、本発明においては、哺乳類、特にヒトの造血幹細胞やThsd1/Tmtspに反応する全ての組織幹細胞や体細胞を維持増幅するものであれば、膜タンパク質Thsd1/Tmtspの由来は特に問わない。
【００１２】
また本発明の増幅促進因子は、配列番号１（マウス）又は配列番号３（ヒト）に示すアミノ酸配列からなるタンパク質である。これらアミノ酸の相同性は７８.６%である。
また本発明の増殖促進因子は、配列番号１若しくは配列番号３に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、好ましくはそのアミノ酸配列との相同性が90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、哺乳動物の造血幹細胞の維持増幅活性を持つ。このタンパク質の造血幹細胞の増幅能は後述する方法により測定することができる。
この哺乳動物は、マウス、ラット、ウシ、サル、ウマなどでもよいが、好ましくはヒトである。
【００１３】
また本発明の増殖促進因子は膜タンパク質であることから、その細胞膜外ドメインだけでも造血幹細胞の増幅能を持つものと考えられる。この細胞外ドメインは、ヒト膜タンパク質Thsd1/Tmtsp（配列番号３）の場合、そのアミノ酸番号１〜４１３のペプチドであるが、シグナルペプチド１〜２４は付いていなくても良く、ヒト以外の膜タンパク質Thsd1/Tmtspの場合にはこれらに相当するペプチドである。
従って本発明の増幅促進因子として、細胞膜外ドメインのペプチドを用いることができる。
本発明の増幅促進因子Thsd1/Tmtsp遺伝子の完全長、その改変体、細胞膜外などの一部分、Thsd1/Tmtspの一部又は全体とその融合タンパク質を、大腸菌などの細菌、酵母、動物細胞、カイコ等の昆虫又はその培養細胞、哺乳動物個体などで人工的に産生させて用いることが好ましい。
【００１４】
造血幹細胞は、ヒト及びマウス等の哺乳動物の臍帯血、胎児肝臓、骨髄、胎児骨髄、末梢血、サイトカインや抗癌剤の投与によって幹細胞を動員した末梢血、及び末梢血由来の細胞群等から採取することができる。これらの組織から、抗CD34抗体、抗CD133抗体、抗CD38抗体等を結合させ、磁気ビーズやセルソーターを用いて、これらの抗体の反応性により分離し造血幹細胞を取得することができる。
例えば、マウスでは、細胞分化抗原(Lineage)が陰性であり、かつc-kit及びSca-１陽性の細胞の内、CD34抗原が陰性から弱陽性の性質を示す細胞に造血幹細胞の性質が見られる。ヒト造血幹細胞のマーカーとしてはCD34抗原が知られており、特により未分化なマーカーとしてCD34陽性、CD38陰性、CD133陽性、KDR陽性、細胞分化抗原陰性等がある。また、造血幹細胞を単離することなく、ヒト又はマウス骨髄由来等の有核細胞あるいは幹細胞分画をそのまま培養に用いることもできる。また、ヒトやマウス骨髄や臍帯血や末梢血由来等の幹細胞分画としてSP(side population)細胞分画（造血幹細胞を約半分弱含み、他の組織幹細胞も含むと考えられている）を用いてもよい。
【００１５】
本発明の造血幹細胞を製造するための培養法においては、この造血幹細胞又は造血幹細胞分画を、本発明の増幅促進因子の存在下で培養する。造血幹細胞の培養は、培養用のシャーレ、フラスコ、あるいは培地組成、pHなどを機械的に制御できるバイオリアクターにおいて適当な培地を用いて行なうことができる。培地は、造血幹細胞の生存・増殖が阻害されない限り特に限定されないが、例えば、SF-02培地(三光純薬)、Opti-MEM培地(GIBCO BRL)、MEM培地(GIBCO BRL)、DMEM培地(GIBCO BRL)、IMDM培地(GIBCO BRL)、PRMI1640培地(GIBCO BRL)、RD培地(RPMI1640:DMEM = 1:1(V/V)混合培地)等を用いることができる。培地には更に、例えば、インスリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、２−メルカプトエタノール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、HEPES、モノチオグリセロール、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、各種増殖因子、各種造血因子やサイトカイン、各種抗生物質、KSR（knockout serum replacement）等を必要に応じて添加してもよい。なお、培養においては、血清非存在下で行なうことが好ましい。
【００１６】
本発明の増幅促進因子を、造血幹細胞の培養時に可溶性タンパク質（ペプチド）として、あるいは種々の化合物と共に不溶性タンパク質（ペプチド）として添加し、あるいは、培養容器に直接固定あるいは種々のタンパク質（ペプチド）等の担体を介して共有結合あるいは非共有結合で固定化して、無血清培地で造血幹細胞（Thsd1/Tmtspで増幅可能な種々の組織幹細胞や体細胞）を体外で増幅することができる。
【００１７】
本発明において、造血幹細胞を維持増幅するにあたり、本発明の増幅促進因子を単独で用いるだけでなく、少なくとも１種の造血因子やサイトカイン又は細胞刺激因子を共存させて作用させることにより、より効率の良い造血幹細胞を体外で増幅することができる。
この造血因子やサイトカイン又は細胞刺激因子は、造血細胞に自己複製や増殖などの刺激を与える因子をいい、例えば、Wnt（wingless/int-1）ファミリー、SCF（幹細胞成長因子；stem cell factor）、TPO（トロンボポエチン）、IL-3（インターロイキン−３）、IL-6（インターロイキンー６）、sIL6R（可溶性IL-6レセプター）、IL-11（インターロイキン−１１）、GM-CSF（顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子；granulocyte/macrophage colony-stimulating factor）、G-CSF（顆粒球コロニー刺激因子；granulocyte colony-stimulating factor）、TGF-β（トランスフォーミング成長因子−β）、MIP-1α、Flt3/Flk2-リガンド（FL）、Flk2/Flk3リガンド、EPO（エリスロポエチン）、Notchリガンド（Jaggedファミリー、Deltaファミリー）、Tie2リガンド（アンジオポエチン）、BMP4、bFGF、オンコスタチンM、EGF、LIF、アンジオポエチン様ファミリー、等が挙げられるが、ここに記載したものだけに限定しない。
【００１８】
特に、本発明者らが既に発見したWnt2やWnt5aなどのWntは、細胞分化を抑制するか、増殖を相乗的に増幅させる役割を果たす因子として働いていると思われるため（特許出願2003-413662）、有効な細胞刺激因子であると考えられる。
本発明の造血幹細胞及びThsd1/Tmtspに反応する全ての組織幹細胞や体細胞を増幅するための培養法においては、本発明の増幅促進因子Thsd1/Tmtspを培地に添加してもよいし、本発明の増幅促進因子Thsd1/Tmtspを培地に添加しフィーダー細胞と共培養してもよいし、本発明の増幅促進因子Thsd1/Tmtspを様々な担体を介して或いは介さずにシャーレ等培養器（装置）に付着あるいは共有結合させて培養してもよい、また本発明の増幅促進因子Thsd1/Tmtspを発現するフィーダー細胞と共培養してもよい。
この増幅促進因子Thsd1/Tmtspを発現するフィーダー細胞は、本発明の増幅促進因子Thsd1/Tmtspのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号２ないし４等）を発現ベクターに導入し、この組換え体をフィーダー細胞にトランスフェクトすることにより得ることができる。このベクターとしては、pcDNA3.1など動物細胞で発現させることができるベクターなら何でも利用することができる。
【００１９】
培地に添加する造血因子又は細胞刺激因子の濃度は、通常約1ng/ml〜約100ng/ml、好ましくは約5ng/ml〜約50ng/ml、より好ましくは約5ng/ml〜約30ng/mlである。
【００２０】
本発明の造血幹細胞を製造するために、造血幹細胞をフィーダー細胞と共培養することは必須ではないが、フィーダー細胞としては、無血清培養が可能な線維芽細胞（C127亜株であるC127clone3、無血清で培養可能としたL929やNIH/3T3の亜株等）、無血清培養可能な他の株化細胞（JCT-19、JCT-12、COS7等）、胎児由来細胞、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、前脂肪細胞、骨髄ストローマ細胞等を用いてもよく、また株化された様々なヒトや種々の動物細胞や昆虫細胞を用いてもよい。また、無血清下で生存可能なヒト由来細胞を用いることが好ましく、ヒト由来細胞としてヒト口腔内上皮細胞などの患者由来の一次培養体細胞を用いることが更に好ましい。特に無血清培地で培養が可能となった細胞株や、ヒト特に患者から採取した一次培養細胞を無血清培地で用いることが最も好ましい。無血清培養が不可能な患者を含むヒト由来の一次培養細胞の場合は、患者またはヒトの血清を添加して培養してもよい。
培養は、通常、３３〜３９℃、好ましくは３７℃、３〜６％ＣＯ２、好ましくは５％ＣＯ２の条件下で、５〜５０日間行なう。
【００２１】
造血幹細胞の維持増幅は通常細胞表面抗原を指標に確認することができる。例えば、ヒト造血幹細胞のマーカーとしては、少なくともCD34抗原陽性、好ましくはCD34抗原陽性、CD38抗原陰性、CD133陽性、KDR陽性、細胞分化抗原陰性等であることをヒト造血幹細胞の指標として用いることができる。造血幹細胞の存在を確認する手段として放射線照射マウス（NOD/SCIDマウス等）を用いた移植実験系又はin vitroのコロニー形成法を用いてもよい。放射線照射マウスを用いた移植実験系では、放射線照射し造血系に障害を与えたマウス（レシピエント）に、他のマウス（ドナー）から分離した骨髄細胞や造血幹細胞含有画分を移植し、移植後、レシピエント由来とドナー由来の造血系細胞の割合（キメリズム）を指標に、長期骨髄再構築能を有する造血幹細胞の存在を確認する。コロニー形成法において、造血幹細胞を種々の血液細胞が出現できるように種々のサイトカインを添加した培地にて培養すると、分化方向の決定された造血前駆細胞は、小数あるいは、単一な分化系列の細胞しか含まないコロニーを形成するが、多分化能を持つ造血幹細胞は、複数の分化系列の血液細胞を含むコロニーを形成することができる。特に、赤血球を含む混合コロニー（CFU-Emix）を形成することが、ヒトでは造血幹細胞の指標とされている。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【００２２】
本発明者は先ず、C127clone3細胞株とOC127clone4細胞株を樹立した。マウス繊維芽細胞C127細胞を5% Knockout serum replacement(KSR)と0.5%ウシ胎児血清（FCS）入りDMEM培地（低血清培地）で培養可能としたC127細胞亜株から、限定希釈法によって多数のクローン化C127細胞亜株を作成した。各クローン化C127細胞亜株を造血幹細胞と１週間共培養し、造血幹細胞を維持したりせず自発的増幅も促進しない細胞株をスクリーニングした。その結果、造血幹細胞の増幅アッセイのフィーダー細胞としてバックグランドが殆どない最適な細胞株としてC127clone3を樹立した。逆に、造血幹細胞と共培養した時に、自発的に造血幹細胞を維持増幅させる能力を持つ変異株も選択した。その結果、ヒト造血幹細胞の維持増幅を刺激する変異株としてOC127clone1とOC127clone4を樹立した。C127clone3、OC127clone1、OC127clone4は、本発明の為に新たに樹立された細胞株である。
【００２３】
本発明者は、新たな造血幹細胞の増幅因子を単離するために、ヒト造血幹細胞を増幅することができるマウス・ストローマ細胞株OP9、マウス骨髄ストローマ細胞、およびOC127clone4に多く発現している膜タンパク質をcDNAマイクロアレイ解析法によって探索した。機能が未知の膜タンパク質をコードしている数多くの遺伝子の中から、造血幹細胞に関与する可能性が考えられた遺伝子を選定し、それらの完全長cDNAをヒトまたはマウス骨髄細胞cDNAライブラリーからPCRによって（あるいはヒトまたはマウス骨髄細胞RNAからRT-PCR法によって）単離し、pcDNA3.1発現ベクターにクローニングした。必要に応じて、市販のcDNAを購入しpcDNA3.1発現ベクターに再構築した。塩基配列を確認後、マウス繊維芽細胞C127から新たに樹立したC127clone3にリポフェクトアミン2000を用いてトランスフェクションし、各cDNAを発現しているG418耐性C127clone3のトランスフェクタントを得た。
ヒト造血幹細胞は、ヒト臍帯血の有核細胞から超高速自動細胞解析分取装置(FACS)(ベックマン・コールター社製EPICS ALTRA HyPerSort)を用いてCD34陽性CD38陰性細胞をソーティングして単離するか、ヒトCD34陽性細胞分離キット（ダイナルバイオテク社製Dynabeads M-450 CD34）を用いて単離した。何れの方法でも90％以上の純度で造血幹細胞を得た。VybrantDiOで造血幹細胞を蛍光標識して、造血幹細胞の増幅アッセイに用いた。
造血幹細胞の増幅アッセイには、C127clone3トランスフェクタントを0.5%FCSと5%KSRおよび1 mg/ml G418を含むDMEMで80%コンフルエントになるまで培養後、5%KSRのみを含んだ無血清DMEM培地に交換し、蛍光標識したヒト造血幹細胞と共培養することにより行った。１週間ほど培養後、蛍光標識した造血幹細胞が増えているトランスフェクタントを探索した。再現性を確認し、ヒト造血幹細胞を維持増幅する能力のある遺伝子（配列番号１）は、機能が不明なマウスThsd1/Tmtsp（Thsd1と命名されていたが後にTmtspと命名するグループが現れたので、ここでは併記した）であることが判明した。マウスThsd1/Tmtsp遺伝子は851アミノ酸から成るタイプI型膜タンパク質をコードしているが、血管内皮細胞と造血幹細胞に主に発現していることが判明したばかりで、生理機能は未だ不明の遺伝子である。
【実施例２】
【００２４】
マウスThsd1/Tmtsp遺伝子（配列番号４）を発現しているC127clone3トランスフェクタントをフィーダー細胞として、一定数の蛍光標識した（あるいは、していない）ヒト造血幹細胞を5%KSR含有無血清DMEM培地で共培養した。数日後から２週間に渡り培地を交換しながら（必要に応じて継代しながら）培養し、定期的に蛍光および光学顕微鏡で観察して、増幅しつつある造血幹細胞の写真を撮影した。コントロールとして、トランスフェクションしていないC127clone3細胞（Thsd1/Tmtspは内在的に殆ど発現していない）や、全く造血幹細胞を維持増幅する効果のないことが分かっている他の膜蛋白質遺伝子（ここではヒトItm2a cDNA）を発現させたC127clone3トランスフェクタントをフィーダー細胞として用いて、同数のヒト造血幹細胞を共培養した。造血幹細胞はC127clone3細胞の下に一部潜り込んでいる様子が観察されたが、殆どはC127clone3と同じ平面で付着細胞として増幅していることが観察できた。造血幹細胞は始め浮遊細胞として共培養を始めるが、直ぐに付着して増幅することが観察され、浮遊している造血幹細胞は直ぐになくなることが判明した。コントロールでは多少始めのうちは維持されて生存する造血幹細胞が観察されるが、暫く経つと蛍光物質（造血幹細胞の死骸）は残るが生存している造血幹細胞は観察されなくなった。その結果を図１に示す。
【００２５】
マウスThsd1/Tmtsp遺伝子発現C127clone3トランスフェクタントと蛍光標識した（あるいは、していない）ヒト造血幹細胞を一定期間共培養後、ヒトCD34陽性細胞を単離し、増幅した造血幹細胞を定量的にカウントした。コントロールとして、トランスフェクションしていないC127clone3細胞や、Itm2a遺伝子発現C127clone3トランスフェクタントを用いて、同様に同数のヒト造血幹細胞を共培養し、造血幹細胞数の変化を定量的にカウントした。造血幹細胞の増幅因子として考えられているヒトSCF存在下および非存在下でも培養し比較したが、SCF単独では造血幹細胞を増幅させることはできず、Thsd1/Tmtsp発現下でも相乗効果は全く観察されなかった。コントロールでは、造血幹細胞はほとんど増幅せず８日後には殆ど生存していなかった。分化マーカー（Lineage）陽性細胞や浮遊する血液細胞は観察されなかったので、造血幹細胞だけが増幅していると考えられた。増幅効率としては１０日で１００倍程度まで増幅していると概算できた。
【実施例３】
【００２６】
マウスThsd1/Tmtsp遺伝子（配列番号１）のヒト・ホモログをRT-PCRによってヒト骨髄細胞より単離し、pcDNA3.1に導入した。ヒトThsd1/Tmtsp遺伝子（配列番号３）はマウスとアミノ酸配列で78.6%同一であった。
このヒトThsd1/Tmtsp遺伝子を発現したC127Clone3トランスフェクタントをフィーダー細胞として、ヒト臍帯血由来CD34陽性細胞を、実施例２および３と同様に増幅アッセイを行ったが、マウスThsd1/Tmtsp発現トランスフェクタントと同じ増幅能が観察された。マウスThsd1/Tmtsp及びヒトThsd1/Tmtspでもヒト造血幹細胞を維持し増幅することができた。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】増幅した造血幹細胞を示す写真（X 400）である。C127clone3細胞（A）、Itm2a発現C127clone3トランスフェクタント（B）、Thsd1/Tmtsp発現C127clone3トランスフェクタント（C）と蛍光標識したヒト造血幹細胞（CD34陽性細胞）を８日間共培養し、蛍光顕微鏡で写真撮影した。白く光って見えるのが増幅したヒト造血幹細胞。AおよびBでは、生きている造血幹細胞は殆ど観察されない（蛍光物質は残っているが細胞の死骸である）。Cでは生きた造血幹細胞が無数に観察できる。
【図１】
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【配列表】
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