(57)【要約】      （修正有）【課題】核偏極現象の消失の遅いＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬を提供する。【解決手段】１個以上の水素原子が結合している炭素原子を１個以上含有し、かつ当該炭素原子のそれぞれの上の水素原子の少なくとも一部が重水素で置換されている有機化合物を含むＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１個以上の水素原子が結合している炭素原子を１個以上含有し、かつ当該炭素原子のそれぞれの上の水素原子の少なくとも一部が重水素で置換されている有機化合物を含むＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
【請求項２】
前記炭素原子の少なくとも一部のそれぞれの上の水素原子の全てが重水素で置換されていることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
【請求項３】
前記炭素原子の全てのそれぞれの上の水素原子の全てが重水素で置換されていることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
【請求項４】
前記炭素原子の少なくとも一部が１３Ｃに置換されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
【請求項５】
前記炭素原子の全てが１３Ｃに置換されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
【請求項６】
前記有機化合物が代謝関連物質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
【請求項７】
前記有機化合物がグルコースであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
【請求項８】
重水中で用いられる請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
【請求項９】
トレーサーまたは造影剤である請求項１〜８のいずれかに記載のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
【請求項１０】
ＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬としての、１個以上の水素原子が結合している炭素原子を１個以上有し、かつ当該炭素原子のそれぞれの上の水素原子の少なくとも一部が重水素に置換されている有機化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
核磁気共鳴（ＮＭＲ：Nuclear Magnetic Resonance）分光法は、例えばＭＲＩ診断法として医療分野でも応用されている重要な分光法であるが、赤外分光法、および紫外可視分光法等の分光法と比較して、測定感度が低いという問題がある。
近年、この問題を、超偏極技術によって克服する試みが行われている。
超偏極技術としては、例えば、１２９Ｘｅ、または３Ｈｅ等の希ガスを用いる手法、パラ水素添加法、及び動的核偏極法（ＤＮＰ）などが挙げられる。
【０００３】
中でもＤＮＰ法は、１３Ｃ核、１５Ｎ核、２９Ｓｉ核の核磁気共鳴の感度を大幅に改善する技術として注目されている。
とりわけ１３Ｃ核の検出では、Ｓ／Ｎ比で数千倍程度の感度の改善ができることが知られており、細胞内代謝のような迅速な生体内反応の検出、更には疾患の検出等への応用が期待されている。
しかし、感度の良い炭素種が四級炭素（例、ピルビン酸のカルボニル炭素）に限定されるために、細胞内糖代謝実験等への応用に使用できる試薬としては、［１−１３Ｃ］−ピルビン酸のように代謝下流域の物質のみに限られる。
例えば、細胞内代謝実験のターゲットとして最も注目されている１３Ｃ−グルコースはＴ１緩和時間が短く、これにより偏極の消失が極めて速いので、ＮＭＲ測定時には大部分の偏極が消失してしまっている。また、偏極率も低い。これらの理由から、１３Ｃ−グルコースはＤＮＰ−ＮＭＲ分光法による測定には不向きであることが知られており、代替試薬として［２−１３Ｃ］−フルクトースが注目されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋａｙｖａｎ  Ｒ．  Ｋｅｓｈａｒｉら、Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ、２００９年、１３１、ｐ．１７５９１−１７５９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記したことから明らかなように、ＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬は、非常に限定されているのが、現状である。
従って、本発明は、多種多様なＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記の課題を解決を達成すべく、鋭意研究した結果、炭素原子に結合している水素を重水素で標識することによって、核偏極現象の消失を遅くできることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、下記の項に記載する側面等を提供するものである。
項１．  １個以上の水素原子が結合している炭素原子を１個以上含有し、かつ当該炭素原子のそれぞれの上の水素原子の少なくとも一部が重水素で置換されている有機化合物を含むＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
項２．  前記炭素原子の少なくとも一部のそれぞれの上の水素原子の全てが重水素で置換されていることを特徴とする前記項１に記載のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
項３．  前記炭素原子の全てのそれぞれの上の水素原子の全てが重水素で置換されていることを特徴とする前記項１に記載のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
項４．  前記炭素原子の少なくとも一部が１３Ｃに置換されていることを特徴とする前記項１〜３のいずれかに記載のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
項５．  前記炭素原子の全てが１３Ｃに置換されていることを特徴とする前記項１〜３のいずれかに記載のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
項６．  前記有機化合物が代謝関連物質であることを特徴とする前記項１〜４のいずれかに記載のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
項７．  前記有機化合物がグルコースであることを特徴とする前記項１〜４のいずれかに記載のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
項８．  重水中で用いられる前記項１〜７のいずれかに記載のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
項９．  トレーサーまたは造影剤である前記項１〜８のいずれかに記載のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬。
項１０．  ＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬としての、１個以上の水素原子が結合している炭素原子を１個以上有し、かつ当該炭素原子のそれぞれの上の水素原子の少なくとも一部が重水素に置換されている有機化合物の使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬は、偏極の消失が遅く、かつ化合物として多様な構造を有し得るので、細胞内代謝のような迅速な生体内反応の検出、更には疾患の検出等への応用などにおける、種々のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析に好適に使用できる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書中で用いられる化合物名は、特に記載の無い限り、同位元素で置換又は標識された化合物を包含することを意図して用いられる。「標識され」とは、化合物のある位置の同位体比が、天然存在比に比べて多いことを意味する。同位体で標識された化合物は、ある構成原子が同位体で置換された化合物（以下、同位体置換化合物と称する場合がある）と、その同位体の存在比が天然存在比である化合物（以下、天然化合物と称する場合がある）との混合物であり、標識された化合物を含有することは、すなわち、ある構成原子が同位体置換化合物を含有することを包含する。
本明細書中、水素原子とは、特に記載の無い限り、１Ｈおよびその同位体（例、２Ｈ（重水素））を意味する。
水素原子における、１Ｈの存在比は、９９．９８５％であり、２Ｈの天然存在比は、０．０１５％である。
本明細書中、炭素原子とは、特に記載の無い限り、１２Ｃおよびその同位体（例、１３Ｃ）を意味する。
炭素原子における、１２Ｃの存在比は９８．９０％であり、１３Ｃの天然存在比は１．１０％である。
【００１０】
本発明のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬は、１個以上の水素原子が結合している炭素原子を１個以上含有し、かつ当該炭素原子のそれぞれの上の水素原子の少なくとも一部が重水素に置換されている有機化合物を含む。
【００１１】
本発明のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬は、このような重水素置換有機化合物に加えて、同位体元素のみにおいて当該重水素置換有機化合物と異なる化合物、特にその天然化合物を含有してもよい。
【００１２】
本発明のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬中の置換有機化合物の量は、核偏極現象の消失をより遅くする観点からは、置換有機化合物と天然化合物との合計量に基づいて、好ましくは２０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上、更に好ましくは９０重量％以上、特に好ましくはほぼ１００重量％である。
【００１３】
核偏極現象の消失をより遅くする観点からは、概して、有機化合物において、（全炭素原子に結合している全重水素原子の数）／（全炭素原子に結合している全水素原子の数）の比率が高いことが好ましい。
【００１４】
具体的には、核偏極現象の消失をより遅くする観点からは、前記有機化合物中の任意の１個の炭素に焦点を絞り、それに結合している水素原子について考える場合、（炭素原子に結合している重水素原子の数）／（炭素原子に結合している水素原子の数）の比率が高いことが好ましく、この比率が１００％であることが特に好ましい。言い換えれば、前記炭素原子の少なくとも一部のそれぞれの上の水素原子の全てが重水素原子で置換されていることが好ましい。ことが好ましい。
【００１５】
更に、核偏極現象の消失をより遅くする観点からは、１個以上の水素原子が結合している炭素原子の集団について考える場合、その上の水素原子の全てが重水素原子で置換されている炭素原子の割合が高いことが更に好ましく、前記水素原子の全てのそれぞれの上の水素原子の全てが重水素原子で置換されていることが、最も好ましい。言い換えれば、炭素原子に結合している全ての水素が重水素で置換されてることが、最も好ましい。
【００１６】
１個以上の重水素原子が結合している炭素原子においては、１３Ｃで置換されていなくてもよく、置換されていてもよいが、感度をより高くする観点からは、１３Ｃで置換されていることが好ましい。更に、１３Ｃに置換されている炭素原子の割合が高いことが好ましく、全ての炭素原子が１３Ｃに置換されていることが特に好ましい。
【００１７】
ここで、１個の炭素原子に焦点を絞って考えた場合、感度をより高くする観点からは、隣接する炭素原子の数が少ない炭素原子を置換することが、効果的である。
【００１８】
前記有機化合物としては、代謝関連物質が好ましい。
なかでも、解糖系またはトリカルボン酸サイクルの基質または中間体等が好ましく、解糖系の上流の基質または中間体がより好ましく、グルコースが特に好ましい。
このような化合物としては、糖、アミノ酸、ペプチド、有機酸、アシル化合物、および脂肪酸等が挙げられる。
前記有機化合物の分子量は、特に限定されないが、通常、５０〜１０００程度である。
【００１９】
前記有機化合物として具体的には、例えば、１，２，３，４，５，６，６’−重水素化Ｄ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ−Ｃ−ｄ７）、炭素−１３ユニラベル化１，２，３，４，５，６，６’−重水素化Ｄ−グルコース（Ｕ−１３Ｃ６−Ｄ−Ｇｌｃ−Ｃ−ｄ７）、およびＤ−［３−１３Ｃ，３，３，３−２Ｈ3］ピルビン酸等が挙げられる。
【００２０】
前記有機化合物は、フリー体であってもよく、生理学的に許容される塩であってもよい。また、前記有機化合物は、水和物等の溶媒和物であってもよい。
【００２１】
前記有機化合物は、放射性同位体を製造するための、公知の化学的方法および／または生物的方法（例、酵素を用いる方法）によって合成することができるが、一部の化合物は、市販品にて入手できる。
【００２２】
本発明のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬は、偏極の消失が遅いので、トレーサーまたは造影剤として、細胞内代謝のような迅速な生体内反応の検出、更には疾患の検出等への応用などにおける、種々のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析に好適に使用できる。
【００２３】
本発明のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬は［１−１３Ｃ］−ピルビン酸等の従来のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬と同様に、トレーサーまたは造影剤などとして、用いることができる。すなわち、例えば、本発明のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬を動物（例、ヒト、サル、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ウサギなどの哺乳動物）に投与するか、またはこのような動物に由来する組織、細胞もしくは酵素に接触させ、その結果得られる被検体物をＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析に付することができる。
ここで、本発明のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬は、化合物として多様な構造を有し得るので、従来のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬に比べて、広範な目的に対してそれぞれ適当な本発明のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬を選択して使用することができる。
【００２４】
ＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析は、［１−１３Ｃ］−ピルビン酸等の従来のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬と同様に、常法に従って行えばよい。
具体的には、例えば、被検体物をトリチルラジカル（例、ＯＸ６３）のような偏極誘発剤とともに、水およびガラス化剤（例、グリセロール）の混合物中に投入し、冷却してガラス化し、次いで、マイクロウエーブを照射して、核偏極を誘起させる。その後、キレート剤（例、エチレンジアミン４酢酸）を含有する水を加えて昇温および溶解させ、次いでＮＭＲ装置に移送して分析する。
このような核偏極の操作は市販の装置を使用して行うことができる。
【００２５】
ここで、常法において用いられる水に換えて重水を用いることにより、更に偏極の消失を遅くすることができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例によって、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
サンプルとして１，２，３，４，５，６，６’−重水素化Ｄ−グルコース（Ｄ−［１，２，３，４，５，６，６−２Ｈ７］グルコース）（Ｄ−Ｇｌｃ−Ｃ−ｄ７）  １０ｍｇ、偏極誘発剤ＯＸ６３を水４０μＬおよびガラス化剤としてのグリセロール２０μＬの混合物に可溶化し、オックスフォード・インストゥルメント社製ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＲ用核偏極装置ＨｙｐｅｒＳｅｎｓｅ（商品名）（３．３５Ｔ）において、３．５ミリバール（ｍｂａｒ）圧力下１．４ケルビン（Ｋ）に冷却し、周波数９３．９８８ギガヘルツ（ＧＨｚ）出力１００ミリワット（ｍＷ）のマイクロウエーブを１時間照射し核偏極を誘起した。１８９℃１０バール（ｂａｒ）に加熱昇温した０．０２５％エチレンジアミン４酢酸を含む水３ｍＬを加えて、サンプル固体を溶解させ、３００ＭＨｚ  ＮＭＲ装置に移送した。６０度パルス（５．６マイクロ秒）を照射する１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル１スキャン測定を１２０回行い、シグナル強度の減衰を観測した。対象としてＤ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ）  １０ｍｇ、１−重水素化Ｄ−グルコース（Ｄ−［１−２Ｈ１］グルコース）（Ｄ−Ｇｌｃ−１−ｄ）  １０ｍｇ、２−重水素化Ｄ−グルコース（Ｄ−［２−２Ｈ１］グルコース）（Ｄ−Ｇｌｃ−２−ｄ）  １０ｍｇ、６，６−重水素化Ｄ−グルコース（Ｄ−［６，６−２Ｈ２］グルコース）（Ｄ−Ｇｌｃ−６，６−ｄ２）  １０ｍｇを同じ実験を行った場合に約５秒後にシグナルが観測されなくなるのに対して、Ｄ−Ｇｌｃ−Ｃ−ｄ７では２０秒程度までシグナルが観測された。
【００２８】
実施例２
サンプルとして炭素−１３ユニラベル化１，２，３，４，５，６，６’−重水素化Ｄ−グルコース（Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ，１，２，３，４，５，６，６−２Ｈ７］グルコース）（Ｕ−１３Ｃ６−Ｄ−Ｇｌｃ−Ｃ−ｄ７）  １ｍｇ、偏極誘発剤ＯＸ６３を水１３μＬおよびガラス化剤としてのグリセロール７μＬの混合物に可溶化し、オックスフォード・インストゥルメント社製ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＲ用核偏極装置ＨｙｐｅｒＳｅｎｓｅ（商品名）（３．３５Ｔ）において、３．５ミリバール（ｍｂａｒ）圧力下１．４ケルビン（Ｋ）に冷却し、周波数９３．９８８ギガヘルツ（ＧＨｚ）出力１００ミリワット（ｍＷ）のマイクロウエーブを１時間照射し核偏極を誘起した。１８９℃、１０バール（ｂａｒ）に加熱昇温した０．０２５％エチレンジアミン４酢酸を含む水３ｍＬを加えて、サンプル固体を溶解させ、３００ＭＨｚ  ＮＭＲ装置に移送した。６０度パルス（５．６マイクロ秒）を照射する１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル１スキャン測定を１２０回行い、シグナル強度の減衰を観測した。対照として炭素−１３ユニラベル化Ｄ−グルコース（Ｕ−１３Ｃ６−Ｄ−Ｇｌｃ）（Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ］グルコース）  １ｍｇを同じ実験を行った場合に５秒後にシグナルが観測されなくなるのに対して、Ｕ−１３Ｃ６−Ｄ−Ｇｌｃ−Ｃ−ｄ７では４０秒程度までシグナルが観測された。
【００２９】
実施例３
サンプルとしてＵ−１３Ｃ６−Ｄ−Ｇｌｃ−Ｃ−ｄ７  １ｍｇ、偏極誘発剤ＯＸ６３を重水１３μＬおよびガラス化剤としてのグリセロール７μＬの混合物に可溶化し、オックスフォード・インストゥルメント社製ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＲ用核偏極装置ＨｙｐｅｒＳｅｎｓｅ（商品名）（３．３５Ｔ）において、３．５ミリバール（ｍｂａｒ）圧力下１．４ケルビン（Ｋ）に冷却し、周波数９３．９８８ギガヘルツ（ＧＨｚ）出力１００ミリワット（ｍＷ）のマイクロウエーブを１時間照射し核偏極を誘起した。１８９℃、１０バール（ｂａｒ）に加熱昇温した０．０２５％エチレンジアミン４酢酸を含む重水３ｍＬを加えて、サンプル固体を溶解させ、３００ＭＨｚ  ＮＭＲ装置に移送した。６０度パルス（５．６マイクロ秒）を照射する１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル１スキャン測定を１２０回行い、シグナル強度の減衰を観測した。Ｕ−１３Ｃ６−Ｄ−Ｇｌｃ−Ｃ−ｄ７では５０秒程度までシグナルが観測され、２の実験よりもシグナルの減衰が抑制された。
【００３０】
実施例４
サンプルとして３−炭素−１３ラベル化３，３，３−重水素化ピルビン酸ナトリウム（Ｄ−［３−１３Ｃ，３，３，３−２Ｈ3］ピルビン酸ナトリウム）  １ｍｇ、偏極誘発剤ＯＸ６３を水１３μＬおよびガラス化剤としてのグリセロール７μＬの混合物に可溶化し、オックスフォード・インストゥルメント社製ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＭＲ用核偏極装置ＨｙｐｅｒＳｅｎｓｅ（商品名）（３．３５Ｔ）において、３．５ミリバール（ｍｂａｒ）圧力下１．４ケルビン（Ｋ）に冷却し、周波数９３．９８８ギガヘルツ（ＧＨｚ）出力１００ミリワット（ｍＷ）のマイクロウエーブを１時間照射し核偏極を誘起した。１８９℃、１０バール（ｂａｒ）に加熱昇温した０．０２５％エチレンジアミン４酢酸を含む水３ｍＬを加えて、サンプル固体を溶解させ、３００ＭＨｚ  ＮＭＲ装置に移送した。６０度パルス（５．６マイクロ秒）を照射する１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル１スキャン測定を６０回行い、シグナル強度の減衰を観測した。対照としてピルビン酸ナトリウム１０ｍｇを同じ実験を行った場合には、３位の炭素シグナルが５秒後に観測されなくなるのに対して、Ｄ−［３−１３Ｃ，３，３，３−２Ｈ3］ピルビン酸ナトリウムでは６０秒以上シグナルが観測された。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析用試薬は、偏極の消失が遅く、かつ化合物として多様な構造を有し得るので、トレーサーまたは造影剤として、細胞内代謝のような迅速な生体内反応の検出、更には疾患の検出等への応用などにおける、種々のＤＮＰ−ＮＭＲ分光法分析に好適に使用できる。