(57)【要約】【課題】迷光を低減することでＡＦ光のみを高感度で検出し、焦点維持の能力を向上させた焦点維持装置、及び、この焦点維持装置を有する顕微鏡装置を提供する。【解決手段】顕微鏡装置４０に用いられる焦点維持装置１０は、光源部２０から放射されたフォーカス光を対物レンズ４１を介して標本に照射するとともに、この標本で反射したフォーカス光をＱＰＤ５０に導くフォーカス光学系３０と、ＱＰＤ５０から出力される検出信号に基づいて、対物レンズ４１と標本との相対位置関係を変化させることで、対物レンズ４１の焦点面を標本の所定の位置に維持する制御部６０と、を有し、標本の反射面に対するフォーカス光の入射角度はブリュースター角である。【選択図】図１
2012189659.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡装置の対物レンズの焦点面を標本の所定の位置に維持する焦点維持装置であって、
光源部から放射されたフォーカス光を前記対物レンズを介して前記標本に照射するとともに、前記標本で反射した前記フォーカス光を光検出部に導くフォーカス光学系と、
前記光検出部から出力される検出信号に基づいて、前記対物レンズと前記標本との相対位置関係を変化させることで、前記対物レンズの焦点面を前記標本の所定の位置に維持する制御部と、を有し、
前記標本の反射面に対する前記フォーカス光の入射角度はブリュースター角であることを特徴とする焦点維持装置。
【請求項２】
前記光源部は、
前記フォーカス光を放射する光源と、
前記光源から放射された前記フォーカス光を略平行光束にするコリメートレンズと、
前記略平行光を通過させる開口部が形成されたマスクと、を有することを特徴とする請求項１に記載の焦点維持装置。
【請求項３】
前記フォーカス光の前記反射面への入射角度がブリュースター角となるような、前記対物レンズの瞳における前記光軸からの前記フォーカス光の入射高を形成するために、前記マスクの前記開口部の前記光軸からの高さを設定することを特徴とする請求項２に記載の焦点維持装置。
【請求項４】
前記マスクの前記開口部は円形形状に形成されており、当該開口部にガウシアンフィルタが取り付けられていることを特徴とする請求項２または３に記載の焦点維持装置。
【請求項５】
前記フォーカス光学系は、平行平面板を有し、
前記フォーカス光の前記反射面への入射角度がブリュースター角となるような、前記対物レンズの瞳における前記光軸からの前記フォーカス光の入射高を形成するために、前記フォーカス光の主光線に対して所定の角度で前記平行平面板が配置されることを特徴とする請求項２に記載の焦点維持装置。
【請求項６】
前記光源部は、
前記フォーカス光を放射する光源と、
前記光源から放射された前記フォーカス光を導くファイバと、
前記ファイバから放射された前記フォーカス光を略平行光束にするコリメートレンズと、を有し、
前記フォーカス光の前記反射面への入射角度がブリュースター角となるような、前記対物レンズの瞳における前記光軸からの前記フォーカス光の入射高を形成するために、前記ファイバ及び前記コリメートレンズの配置位置を設定することを特徴とする請求項１に記載の焦点維持装置。
【請求項７】
前記光源部は、
フォーカス光を放射する光源と、
前記光源から放射された前記フォーカス光を導くファイバと、
前記ファイバから放射された前記フォーカス光を略平行光束にするコリメートレンズと、
前記コリメートレンズから出射した前記フォーカス光を反射して前記フォーカス光学系に導くミラーと、を有し、
前記フォーカス光の前記反射面への入射角度がブリュースター角となるような、前記対物レンズの瞳における前記光軸からの前記フォーカス光の入射高を形成するために、前記ミラーの配置位置を設定することを特徴とする請求項１に記載の焦点維持装置。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の焦点維持装置を有することを特徴とする顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、焦点維持装置及び顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、焦点維持装置を持つ顕微鏡装置が市場を拡大しつつある。常に標本に合焦し続ける焦点維持装置は、長時間のタイムラプス観察や試薬投与に伴う観察画像のボケやユレを効果的に除去することができる。焦点維持の手法の一つとして、アクティブ方式がある。この手法は、標本（カバーガラスなど）に照射したフォーカス光（以下「ＡＦ光」と呼ぶ）の反射から、標本のｚ軸方向の位置（対物レンズの光軸方向位置）を検出する（例えば、特許文献１参照）。具体的には、反射光を光検出器で検出し、この光検出器上での光強度分布よりｚ軸方向の位置情報を算出する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−３２３０９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上述したようなアクティブ方式の焦点維持装置の場合、ＡＦ光以外の望まない光（迷光）が光検出器に混入すると、光検出器上での光強度分布がＡＦ光本来の形状から変化し、正確なｚ軸方向の位置を算出することが困難になるという課題があった。この迷光の要因としては対物レンズの端面における反射が挙げられる。これは、広帯域な光スペクトルに対して高反射率の反射防止膜を付与することは容易ではないためである。従って、迷光を除去し、高精度で焦点維持を達成する手法の確立が求められている。例えば、スリット像を投影してその中心部を遮光することにより、対物レンズ中心部からの反射の影響を低減する方法があるが、対物レンズの周辺部からの反射光は考慮されていない。
【０００５】
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、アクティブ方式の焦点維持装置において、迷光を低減することでＡＦ光のみを高感度で検出し、焦点維持の能力を向上させるように構成された焦点維持装置、及び、この焦点維持装置を有する顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するために、本発明に係る焦点維持装置は、顕微鏡装置の対物レンズの焦点面を標本の所定の位置に維持する焦点維持装置であって、光源部から放射されたフォーカス光を対物レンズを介して標本に照射するとともに、この標本で反射したフォーカス光を光検出部に導くフォーカス光学系と、光検出部から出力される検出信号に基づいて、対物レンズと標本との相対位置関係を変化させることで、対物レンズの焦点面を標本の所定の位置に維持する制御部と、を有し、標本の反射面に対するフォーカス光の入射角度はブリュースター角であることを特徴とする。
【０００７】
このような焦点維持装置において、光源部は、フォーカス光を放射する光源と、光源から放射されたフォーカス光を略平行光束にするコリメートレンズと、略平行光を通過させる開口部が形成されたマスクと、を有することが好ましい。
【０００８】
また、このような焦点維持装置は、フォーカス光の反射面への入射角度がブリュースター角となるような、対物レンズの瞳における光軸からのフォーカス光の入射高を形成するために、マスクの開口部の光軸からの高さを設定することが好ましい。
【０００９】
また、このような焦点維持装置において、マスクの開口部は円形形状に形成されており、当該開口部にガウシアンフィルタが取り付けられていることが好ましい。
【００１０】
また、このような焦点維持装置において、フォーカス光学系は、平行平面板を有し、フォーカス光の反射面への入射角度がブリュースター角となるような、対物レンズの瞳における光軸からのフォーカス光の入射高を形成するために、フォーカス光の主光線に対して所定の角度で平行平面板が配置されることが好ましい。
【００１１】
また、このような焦点維持装置において、光源部は、フォーカス光を放射する光源と、この光源から放射されたフォーカス光を導くファイバと、このファイバから放射されたフォーカス光を略平行光束にするコリメートレンズと、を有し、フォーカス光の反射面への入射角度がブリュースター角となるような、対物レンズの瞳における光軸からのフォーカス光の入射高を形成するために、ファイバ及びコリメートレンズの配置位置を設定することが好ましい。
【００１２】
また、このような焦点維持装置において、光源部は、フォーカス光を放射する光源と、光源から放射されたフォーカス光を導くファイバと、ファイバから放射されたフォーカス光を略平行光束にするコリメートレンズと、コリメートレンズから出射したフォーカス光を反射してフォーカス光学系に導くミラーと、を有し、フォーカス光の反射面への入射角度がブリュースター角となるような、対物レンズの瞳における光軸からのフォーカス光の入射高を形成するために、ミラーの配置位置を設定することが好ましい。
【００１３】
また、本発明に係る顕微鏡装置は、上述の焦点維持装置のいずれかを有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る焦点維持装置及びこの焦点維持装置を有する顕微鏡装置を以上のように構成すると、迷光を低減することができ、ＡＦ光のみを高感度で検出して焦点維持の能力を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】第１の実施形態に係る焦点維持装置及び顕微鏡装置の構成を示す説明図である。
【図２】標本面でのＡＦ光の状態を示す説明図であって、（ａ）は入射光の偏光状態を示し、（ｂ）は反射面でのＡＦ光の偏光状態を示し、（ｃ）は対物レンズの射出瞳に対するＡＦ光のビームプロファイルを示す。
【図３】ＡＦ光の偏光状態を示す説明図である。
【図４】対物レンズによるＡＦ光の結像面と標本面との関係を示す説明図であって、（ａ）は結像面と標本面とが一致している場合を示し、（ｂ）は標本面が結像面より奧側にある場合を示し、（ｃ）は標本面が結像面より手前側にある場合を示す。
【図５】対物レンズの射出瞳面におけるＡＦ光のビームプロファイルを示す説明図であって、（ａ）はＡＦ光がブリュースター角で入射する範囲を示し、（ｂ）はＳ偏光のＡＦ光のみが反射する範囲を示し、（ｃ）は焦点維持能力を付与するための範囲を示す。
【図６】マスク位置でのＡＦ光の光線高を説明するための説明図である。
【図７】第２の実施形態での、対物レンズの射出瞳に対するＡＦ光のビームプロファイルを示す説明図である。
【図８】第２の実施形態での、ＡＦ光の偏光状態を示す説明図である。
【図９】第３の実施形態に係る焦点維持装置及び顕微鏡装置の構成を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
［第１の実施形態］
以下、本発明の好ましい実施形態について図面を参照して説明する。まず、本実施形態に係る焦点維持装置の構成について説明する。この焦点維持装置１０は、ＬＥＤやＬＤ等の光源２１を有する光源部２０からのＡＦ光を、フォーカス光学系３０を用いて顕微鏡装置４０の対物レンズ４１に導き、この対物レンズ４１を介して標本に照射し、その反射光を４分割ダイオード５０（円状の領域が４分割され、各領域にＰＤ（フォトダイオード）が配置された光検出素子であって、以下、「ＱＰＤ５０」と呼ぶ）で構成される光検出部で検出することで、対物レンズ４１に対する標本のｚ軸方向位置を検出するものである。なお、以降の説明において、対物レンズ４１の焦点面を標本の所定の位置に維持するためにＡＦ光を反射させる面を「標本面Ｏ」と呼ぶ。
【００１７】
この焦点維持装置１０の光源部２０は、光源２１、この光源２１から放射されたＡＦ光（例えば、赤外光）を略平行光束に変換するコリメートレンズ２２、及び、このＡＦ光の標本面Ｏに対する入射角がブリュースター角となるようにビームプロファイルを変化させるマスク２３から構成される。なお、マスク２３には開口部２３ａが形成されており、コリメートレンズ２２で略平行になった光束（ビームプロファイル）Ｌ０を光軸から所定の距離だけ離れた光束（ビームプロファイル）Ｌ１に変化させ、対物レンズ４１の光軸に沿ってフォーカス光学系３０に入射させるように構成されている。
【００１８】
また、フォーカス光学系３０は、光源部２０側から順に、光源部２０から放射されたＡＦ光を直線偏光に変換する第１の偏光子３１、この第１の偏光子３１を透過したＡＦ光の略半分を透過し、残りを反射させるハーフミラー３２、後述する機能を有するオフセットレンズ３３、及び、顕微鏡装置４０を構成する対物レンズ４１の像側に配置され、光源部２０から放射されたＡＦ光を反射して対物レンズ４１に導くとともに、標本面Ｏで反射されたＡＦ光を焦点維持装置１０に導くダイクロイックミラー３４を有している。この顕微鏡装置４０において、標本面Ｏに照射される照明光及びこの標本面Ｏから出射する信号光（例えば、照明光により励起された蛍光）はダイクロイックミラー３４を透過する。ここで、ダイクロイックミラー３４を透過した信号光は図示しない第２対物レンズに導かれ、標本の像が結像される。また、この焦点維持装置１０のフォーカス光学系３０のダイクロイックミラー３４とハーフミラー３２との間には、ダイクロイックミラー３４で反射された標本面ＯからのＡＦ光（反射光）の偏光軸を回転させるλ／２板３５が配置されており、さらに、この反射光がハーフミラー３２で反射する方向に、第２の偏光子３６及び結像レンズ３７が配置されている。なお、ＱＰＤ５０は、結像レンズ３７の焦点面上に配置されている。また、光検出部はＱＰＤ以外に、ラインＣＭＯＳ、ラインＣＣＤ、ＰＤアレイなどを用いることもできる。
【００１９】
このような焦点維持装置１０において、光源２１から射出したＡＦ光は、コリメートレンズ２２により略平行光束Ｌ０に変換された後、マスク２３によりビームプロファイルが光軸から所定の距離だけ離れた光束Ｌ１になり、第１の偏光子３１に入射する。この第１の偏光子３１を透過した光束Ｌ１は、図３（ａ）に示すように、４５°の方向（第１及び第３象限に振動する方向）の直線偏光に変換される。その後、ハーフミラー３２を透過し、オフセットレンズ３３により曲率変化を受け、さらにダイクロイックミラー３４により照明光と合波され、対物レンズ４１に導かれる。そして、対物レンズ４１によって集光されたＡＦ光は、標本面Ｏに対してブリュースター角で入射する。なお、以降の説明において、光軸方向をｚ軸方向とし、このｚ軸方向に直交する面内で水平方向をｘ軸方向、垂直方向をｙ軸方向とする。
【００２０】
標本面（反射面）ＯにおけるＡＦ光の反射の様子を図２に示す。光源部２０の直後に配置された第１の偏光子３１により、図２（ａ）に示すようなｘ軸及びｙ軸のそれぞれに対して４５°の方向に直線偏光した光束Ｌ１が対物レンズ４１に入射する。この偏光状態は振幅の等しいｘ軸方向の直線偏光と、ｙ軸方向の直線偏光との合成であると考えることができる。光束Ｌ１が対物レンズ４１により標本面Ｏに集光される際、図２（ｂ）に示すように、ｘ軸方向の直線偏光はＰ偏光に、ｙ軸方向の直線偏光はＳ偏光にそれぞれ対応する。上述のようにこの標本面Ｏに対してブリュースター角で入射した光束Ｌ１は、反射により、Ｐ偏光成分がゼロとなるので、反射光の偏光はＳ偏光、つまりｙ軸方向の直線偏光となる（この光束をＬ２とする）。この光束Ｌ２の様子を図２（ｃ）及び図３（ｂ）に示す。
【００２１】
標本面Ｏで反射した光束Ｌ２は、再び対物レンズ４１を通過し、ダイクロイックミラー３４で反射され、オフセットレンズ３３を通過して略平行光束に戻り、さらに、λ／２板３５を通過する。このλ／２板３５は、図３（ｅ）に示すように、Ｓ偏光の光束Ｌ２の振動方向に対して反時計回りに２２．５°傾いた角度に速軸あるいは遅軸のいずれかが一致するように軸が調整されている。これにより、ＡＦ光は、ｘ−ｙ座標の第２及び第４象限に振動する４５°の直線偏光に変換される（この光束をＬ３とする）。ここで、λ／２板３５を透過した光束Ｌ３の振動方向は、第１の偏光子３１を通過した後の光束Ｌ１の振動方向に対して直交している（図３（ｃ））。なお、λ／２板３５は、その有効径がビーム径と略同一であることが望ましい。これは、余分な光（光源部２０から標本面Ｏに向かう光束Ｌ１や対物レンズ４１で反射した光）がλ／２板３５に入射しないようにするためである。
【００２２】
λ／２板３５により偏光状態に変化を受けたＡＦ光（光束Ｌ３）は、ハーフミラー３２により反射されて第２の偏光子３６を通過する。このとき、第２の偏光子３６の透過軸は、光束Ｌ３の偏光方向に一致しているため、この光束Ｌ３は透過する。一方、迷光（例えば対物レンズ４１で反射した光）は、偏光方向が光束Ｌ１とほぼ一致している。そのため、第２の偏光子３６の透過軸は光束Ｌ１に直交することとなり、このような迷光は第２の偏光子３６を透過することができない。そして、第２の偏光子３６を透過した光束Ｌ４は、結像レンズ３７によりラインセンサ５０上に集光される。このようにして、迷光を除去し、焦点維持に必要なＡＦ光（標本面Ｏで反射したＡＦ光）のみを高感度で検出することができる。
【００２３】
なお、オフセットレンズ３３は、対物レンズ４１の焦点面に対してＡＦ光の結像位置をｚ軸方向にずらす機能を有している。すなわち、光源部２０から放射されてコリメートレンズ２２により略平行光束となったＡＦ光がオフセットレンズ３３を通過した後も略平行光束である場合は、対物レンズ４１により結像するＡＦ光の位置は対物レンズ４１の焦点面に略一致する。一方、このオフセットレンズ３３を射出したＡＦ光が発散光である場合は、ＡＦ光の結像位置は対物レンズ４１の焦点面より奥側（対物レンズ４１から離れる方向）に移動し、オフセットレンズ３３を射出したＡＦ光が収束光である場合は、ＡＦ光の結像位置は対物レンズ４１の焦点面より手前側（対物レンズ４１に近づく方向）に移動する。このように、対物レンズ４１の焦点面に対してＡＦ光の結像位置を光軸方向にずらす（オフセットする）ことにより、対物レンズ４１の焦点は標本内の所望の位置に合焦させながら、対物レンズ４１の焦点面とは異なる位置（例えば、標本を覆うプレートガラスと標本との境界面（上述の「標本面Ｏ」））でＡＦ光を反射させて焦点の維持を行うことができる。
【００２４】
オフセットレンズ３３で規定されるＡＦ光の結像位置に標本面Ｏがあれば、つまり、焦点ずれがなければ、図４（ａ）に示すように結像レンズ３７に入射する光束Ｌ４は平行光であり、ＱＰＤ５０の中心に結像する。しかし、図４（ｂ），（ｃ）に示すように、焦点ずれが生じると、ＱＰＤ５０上での光強度分布が変化する。例えば、図４（ｂ）のように、標本面Ｏと対物レンズ４１が離れると、結像レンズ３７に入射する光束Ｌ４が収束光になる。そのため、ＱＰＤ５０よりも手前で結像し、ＱＰＤ５０上では左にずれる。一方、図４（ｃ）のように、標本面Ｏと対物レンズ４１が近づくと、結像レンズ３７に入射する光束Ｌ４が発散光になる。そのため、ＱＰＤ５０よりも奥で結像し、ＱＰＤ５０上では右にずれる。このように、ＱＰＤ５０から出力される検出信号に基づいて、焦点ずれを像面上での像の位置ずれとして検出し、図４（ａ）の状態を保持するように制御部６０で対物レンズ４１又は標本を光軸方向に移動させてフィードバック制御を行うことで焦点維持を達成できる。
【００２５】
この手法を実現するために、前述したブリュースター照明用のマスク２３は、図５（ｃ）の形状である必要がある。なお、この図５は、マスク２３の開口部２３ａの位置を、対物レンズ４１の射出瞳面Ｐ０と、開口部２３ａを通過した光束Ｌ１の径との関係で表している。対物レンズ４１の射出瞳面Ｐ０において、標本面ＯへのＡＦ光の入射角がブリュースター角となるＡＦ光の分布は図５（ａ）となる。この状態では平均化の効果により、入射光と反射光の偏光状態は変化しない。これは入射面が多数存在するためである。これに対し、図５（ｂ）では入射面は１つ（ｘ軸方向）のみである。ｘ軸方向に振動する光がＰ偏光、ｙ軸方向に振動する光がＳ偏光となり、この光がブリュースター角で標本面Ｏに入射することにより、反射光の偏光はＳ偏光のみとなる。このブリュースター照明にさらに焦点維持能力を付与するために、図５（ｃ）のような照明パターンを用いる。
【００２６】
ここで、屈折率ｎ1の媒質を進む光線が屈折率ｎ2の媒質との界面に入射するときに、その入射角がブリュースター角θBrewとなるためには、以下の条件式（ａ）を満足する必要がある。
【００２７】
【数１】
2012189659.tif 000003
【００２８】
すなわち、ＡＦ光がブリュースター角の条件を満たして標本面Ｏに入射するためには、その標本面Ｏがどのような界面であるかによって異なる。例えば、ドライ対物レンズの場合、空気（ｎ1＝1）とガラス（ｎ2＝1.55）との界面を標本面Ｏとするが、このときブリュースター角θBrewは57.17°となる。一方、ガラス（ｎ1＝1.55）と細胞・水（ｎ2＝1.33）との界面を標本面Ｏとすると、ブリュースター角θBrewは40.63°となる。この角度は同様の面を標本面Ｏとした場合、液浸対物レンズや油浸対物レンズにも共通である。従って、標本面Ｏにブリュースター角でＡＦ光を入射するためには、使用する対物レンズ４１は、少なくとも40.63°以上の開口数（ＮＡ）を持つ必要がある。ここで、対物レンズ４１の最大入射角θmaxは、この対物レンズ４１のＮＡと媒質の屈折率ｎで決まり、次式（ｂ）で表される。
【００２９】
【数２】
2012189659.tif 000004
【００３０】
ドライ、液浸及び油浸対物レンズに必要なＮＡをそれぞれＮＡD、ＮＡW及びＮＡOとすると、上述の式（ｂ）より、ＮＡ＞ｎ×ｓｉｎθBrewの条件を満足することが必要となり、ＮＡD＞0.651、ＮＡW＞0.866、ＮＡO＞1.009となる。但し、媒質の屈折率は、ドライ対物レンズではｎ＝1、液浸対物レンズではｎ＝1.33、油浸対物レンズではｎ＝1.55とした。
【００３１】
また、ブリュースター照明用のマスク２３の開口部２３ａの位置は、使用する対物レンズ４１毎に変える必要がある。対物レンズ４１の射出瞳径は倍率によって大きく異なり、低倍ほど小さくなるのが一般的である。従って、対物レンズ４１毎にブリュースター角となる光線（ＡＦ光）の位置を変える必要がある。このために、マスク２３は前もって対物レンズ４１毎に最適なビーム位置を記憶しておき、対物レンズ４１が交換される度に、対物レンズ４１のＮＡ、焦点距離及び倍率情報に基づいて自動的に開口部２３ａの位置を記憶してある最適な位置に移動するように構成する。制御部６０により対物レンズ４１の種類を検出し、その対物レンズ４１の情報に基づいてマスク２３の開口部２３ａの位置を自動的に移動させるように構成しても良いし、対物レンズ４１の種類に応じて設けられたマスク２３を、対物レンズ４１の交換と同時に切り替えるように構成しても良い。
【００３２】
ここで、図６を用いて、ＡＦ光がブリュースター角の条件を満たすための、マスク２３に形成された開口部２３ａの光軸からの高さｈmaskについて説明する。図６に示すように、標本面Ｏの前後の媒質の屈折率をそれぞれｎ1、ｎ2とすると、対物レンズ４１の最大入射角θmaxは上述の式（ｂ）から次式（ｂ′）のように表される。
【００３３】
【数３】
2012189659.tif 000005
【００３４】
一方、対物レンズ４１の射出瞳Ｐ０の半径ｄは、この対物レンズ４１の焦点距離をｆｏとすると次式（ｃ）のように表される。
【００３５】
【数４】
2012189659.tif 000006
【００３６】
また、ＡＦ光がブリュースタ角θBrewで標本面Ｏに入射するための対物レンズ４１の射出瞳Ｐ０におけるＡＦ光の光軸からの光線高ｈexitを射出瞳Ｐ０の半径ｄ及び最大入射角θmaxで表すと次式（ｄ）となる。
【００３７】
【数５】
2012189659.tif 000007
【００３８】
また、オフセットレンズ３３を構成する２つのレンズの焦点距離を光源側から順にｆ1及びｆ2とすると、このオフセットレンズ３３通過後の光軸からの光線高ｈexitに対する開口部２３ａ通過後の光軸からの光線高ｈmaskの比ｒａｔｉｏは、次式（ｅ）となる。
【００３９】
【数６】
2012189659.tif 000008
【００４０】
以上より、マスク２３における光線高、すなわち、開口部２３ａの光軸からの高さｈmaskは、次式（１）を満足することが必要である。
【００４１】
【数７】
2012189659.tif 000009
【００４２】
なお、オフセットレンズ３３を有しない焦点維持装置の場合には、光線高の比ｒａｔｉｏの項を省略する（式（１）において１とする）ことで対応できる。
【００４３】
またマスク２３の開口部２３ａでは、ブリュースター角で標本面Ｏに入射する光線のみを通過させるために、この開口部２３ａのｘ軸方向の大きさ（径）は可能な限り小さくすることが好ましい。また、偏光度の高い（直線）偏光を得るために、開口部２３ａのｙ軸方向の大きさ（径）も可能な限り小さくすることが好ましい。従って、マスク２３の開口部２３ａの径は小さくすることが好ましい。また、この開口部２３ａによる回折の影響を除去したければ、この開口部２３ａの形状を円形にし、さらに、この開口部２３ａにガウシアンフィルタを取り付けると良い。また、マスク２３の開口部２３ａは、オフセットレンズ３３のオフセット量毎に、上述の条件式（１）に基づいて、最適な位置に移動することが望ましい。
【００４４】
なお、焦点ずれを検出する方法として、光源２１からの平行光束の径を略半分にして標本面Ｏに投射するナイフエッジ（半月集光）法を用いることも可能であり、半月マスクとブリュースター照明用のマスク２３とを切り替えられるように構成することも可能である。
【００４５】
［第２の実施形態］
第１の実施形態においては、焦点維持装置１０において光源部２０から放射されたＡＦ光を標本面Ｏに導き、また、この標本面Ｏで反射したＡＦ光をＱＰＤ５０に導くために、フォーカス光学系３０にハーフミラー３２を用いた場合について説明したが、偏光ビームスプリッタを用いることも可能である。
【００４６】
偏光ビームスプリッタの透過・反射面の位置を図１のハーフミラー３２の透過・反射面の位置と同じに配置したとすると、第１の偏光子３１の透過軸が前述したｙ軸方向になるように配置して、図８（ａ）に示すようなｙ軸に沿った方向（第１の実施形態の場合に対してＡＦ光の振動方向が反時計回りに４５°ずれている）に直線偏光した光束Ｌ１を対物レンズ４１へ入射させる必要がある。また、対物レンズ４１の射出瞳Ｐ０におけるＡＦ光（入射光束Ｌ１及び反射光束Ｌ２）の位置も反時計回りに４５°ずれる必要がある。つまり、入射面（図７のＰ０における光束Ｌ１と光束Ｌ２とを含み、かつｚ軸に平行な面）と、入射光束の振動方向とが４５°の角度をなす必要がある。
【００４７】
ここで、光束Ｌ１は、振幅の等しいｙ軸に対して±４５°の方向のそれぞれの直線偏光の合成であると考えることができ、光束Ｌ１が対物レンズ４１により標本面Ｏに集光される際、図７、図８（ｂ）に示すように、ｙ軸に対して反時計回りに４５°(＋４５°)方向の直線偏光は、Ｓ偏光に、ｙ軸に対して時計回りに４５°（−４５°）方向の直線偏光はＰ偏光にそれぞれ対応している。
【００４８】
標本面Ｏに対してブリュースター角で入射した光束Ｌ１は、反射により、Ｐ偏光成分がゼロとなるので、反射光の偏光はＳ偏光となる（この光束をＬ２とする）。この光束Ｌ２の様子を図７及び図８（ｂ）に示す。光束Ｌ２は、再び対物レンズ４１を通過し、ダイクロイックミラー３４で反射され、オフセットレンズ３３を通過して略平行光束に戻り、さらに、λ／２板３５を通過する。このλ／２板３５は、図８（ｅ）に示すように、Ｓ偏光の光束Ｌ２の振動方向に対して反時計回りに２２．５°傾いた角度に速軸あるいは遅軸のいずれかが一致するように軸が調整されている。これにより、ＡＦ光は、ｘ軸方向に振動する直線偏光に変換される（この光束をＬ３とする）。ここで、λ／２板３５を透過した光束Ｌ３の振動方向は、第１の偏光子３１を通過した後の光束Ｌ１の振動方向に対して直交している（図８（ｃ））。なお、λ／２板３５は、その有効径がビーム径と略同一であることが望ましい。これは、余分な光（光源部２０から標本面Ｏに向かう光束Ｌ１や対物レンズで反射した光）がλ／２板３５に入射しないようにするためである。
【００４９】
λ／２板３５により偏光状態に変化を受けたＡＦ光（光束Ｌ３）は、ハーフミラー３２により反射されて第２の偏光子３６を通過する。このとき、第２の偏光子３６の透過軸は、光束Ｌ３の偏光方向に一致しているため、この光束Ｌ３は透過する。一方、迷光（例えば対物レンズ４１で反射した光）は、偏光方向が光束Ｌ１とほぼ一致している。そのため、第２の偏光子３６の透過軸は光束Ｌ１に直交することとなり、このような迷光は第２の偏光子３６を透過することができない。
【００５０】
［第３の実施形態］
第１及び第２の実施形態に係る焦点維持装置１０では、ＡＦ光の標本面Ｏに対する入射角をマスク２３の開口部２３ａの位置（対物レンズ４１の光軸に直交する面内での位置）で調整するように構成した場合について説明したが、図９に示す焦点維持装置１００のように、光源としてファイバ２１０から射出する光を用い、対物レンズ４１の光軸に対してこのファイバ２１０を偏芯させることにより、標本面Ｏに対するＡＦ光の入射角を変化させることができる。この焦点維持装置１００における光源部２００は、図示しない光源からの光を導くファイバ２１０と、ファイバ２１０の射出端から射出されたＡＦ光を略平行光束に変換するコリメートレンズ２２０と、コリメートレンズ２２０を透過したＡＦ光を対物レンズ４１の光軸に沿ってフォーカス光学系３０に入射させるミラー２３０と、から構成される（第１の実施形態に係る焦点維持装置１０と同一の構成については同一の符合を付し、詳細な説明を省略する）。この図９に示す焦点維持装置１００では、対物レンズ４１の光軸に対してファイバ２１０を偏芯させる代わりに、ミラー２３０を偏芯させることによりＡＦ光の光軸に対する高さを変化させて標本面Ｏに対してブリュースター角で入射するように構成している。なお、ミラー２３０を用いずに、コリメートレンズ２２０から出射したＡＦ光を直接フォーカス光学系３０に入射させる場合には、ファイバ２１０の射出端及びコリメートレンズ２２０を一体に対物レンズ４１の光軸に対して偏芯させるように構成する。
【００５１】
この第３の実施形態に係る焦点維持装置１００によれば、光源部２００にマスクは不要となる。このとき、ビーム径が大きくなりすぎないように、焦点距離の短いコリメートレンズ２２０を用いてコリメートする必要がある。
【００５２】
なお、第１の実施形態から第３の実施形態以外に、光源部２０から放射されたＡＦ光を標本面Ｏに対してブリュースター角で入射させるために、第１の実施形態に記載の焦点維持装置１０のフォーカス光学系３０の第１の偏光子３１とダイクロイックミラー３４との間（より好ましくは、第１の偏光子３１とオフセットレンズ３３との間）に光源部から放射されたＡＦ光の主光線に対して所定の角度をなすように平行平面板を配置してもよい。ＡＦ光の主光線と平行平面板とのなす角を変化させることにより、平行平面板を出射したＡＦ光の光軸に対する高さを変化させることができる。
【００５３】
以上のように、ＡＦ光を標本面Ｏに対してブリュースター角で入射するように構成することにより、焦点維持に必要なＡＦ光（標本面Ｏで反射したＡＦ光）の信号強度のみを高感度で検出することができるので、焦点維持装置１０，１００による対物レンズ４１の焦点位置の維持制度を向上させることができる。
【符号の説明】
【００５４】
１０  焦点維持装置    ２０  光源部    ２１  光源    ２２  コリメートレンズ
２３  マスク    ２３ａ  開口部    ３０  フォーカス光学系
４０  顕微鏡装置    ４１  対物レンズ
５０  ＱＰＤ（光検出部）    ６０  制御部
１００  焦点維持装置    ２００  光源部    ２１０  ファイバ
２２０  コリメートレンズ    ２３０  ミラー
【図１】
2012189659.tif 000010
【図２】
2012189659.tif 000011
【図３】
2012189659.tif 000012
【図４】
2012189659.tif 000013
【図５】
2012189659.tif 000014
【図６】
2012189659.tif 000015
【図７】
2012189659.tif 000016
【図８】
2012189659.tif 000017
【図９】
2012189659.tif 000018