(57)【要約】【課題】哺乳動物、特に哺乳動物成体の海馬においてニューロン新生を促進する手段を提供することを目的とする。【解決手段】フラボノイドを有効成分として含む、哺乳動物において海馬のニューロン新生を促進するための組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラボノイドを有効成分として含む、哺乳動物において海馬のニューロン新生を促進するための組成物。
【請求項２】
フラボノイドを有効成分として含む、哺乳動物において海馬のニューロン新生を必要とする疾患または症状を治療または予防するための組成物。
【請求項３】
前記フラボノイドがカテキン類である、請求項１または２項記載の組成物。
【請求項４】
前記哺乳動物が成体である、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
経口投与用製剤の形態である、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
フラボノイドを含む、哺乳動物の海馬におけるニューロン新生を促進するための食品。
【請求項７】
フラボノイドを含む、哺乳動物における記憶力増進または脳の老化防止のための食品。
【請求項８】
前記フラボノイドがカテキン類である、請求項６または７記載の食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物において海馬のニューロン新生を促進するための組成物および食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
1998年11月、スウェーデンのイエーテボリにあるサールグレンスカ大学病院のエリクソンと米国ソーク生物学研究所のゲージらは、大人の脳の中でも、少なくとも、記憶と学習に重要な海馬において、ニューロンが日常的に新生しているという驚くべき発見を発表した（非特許文献１）。40年以上前から、他のおとなの哺乳動物（マウスやラットなど）の研究で、成体の脳がニューロンを生み出していることが報告されてきたが（非特許文献２）、この結果がヒトの脳でもニューロンが新生していることを示すサインであるとは、長く認識されてはこなかった。なぜなら、サルなどの霊長類において、これまでニューロン新生を示す証拠は得られていなかったからである。エリクソンとゲージらの研究に触発され、大型のサル（マカクザル）で、ニューロン新生の証拠が得られたのは1999年になってからであった（非特許文献３および４）。
【０００３】
これまでに、大人の脳内においてニューロンが新生している部位について、非常に精力的な研究が進められてきた。他の哺乳動物（マウス、ラットやサル）では、におい感覚を伝達する嗅球において、GABA陽性の介在性ニューロンが盛んに入れ替わっていることが立証されている。しかし、ヒトにおいては、今のところ嗅球でのニューロン新生は確認されていない。
【０００４】
成体の海馬において誕生した新生ニューロンは、歯状回の顆粒細胞として機能することが知られている（非特許文献５）。新生ニューロンは、嗅内野皮質からの投射（貫通線維）を受け神経情報を受容し、苔状線維をCA3領域に伸ばしCA3錐体細胞との間にシナプス結合を形成する。CA3領域では、錐体ニューロンが記憶形成を担うリカレント結合を形成することが知られている。そのため、新生ニューロンが記憶形成の過程に関わっていることが論じられている（非特許文献６）。海馬体からの出力は、(1)海馬采を経て脳弓へと至る経路と、(2)嗅内野皮質を経て大脳新皮質の各領域と連結する経路が知られている。新生ニューロンは確実に海馬回路に機能的に組み込まれている。
【０００５】
成体海馬においては歯状回の最内層部位に分裂を繰り返す神経幹細胞が存在していることが示唆されてきた。ただし、胎生期の脳内で神経幹細胞が分裂しているのは脳室の周囲から形成される脳室周囲層のみであり、なぜ海馬歯状回では、脳室周囲層でもないにも拘らず、一生涯にわたり神経幹細胞が生存しているかについて今のところ明確な結論を得ていない。胎生期におけるニューロン新生とのアナロジーから、この部位においてもラジアルグリア様の細胞が神経幹細胞としてはたらいていることが推測された。アルバレズ−ブィラらは、グリア細胞にのみ感染する巧妙なウイルスベクターを使用した実験によって、海馬歯状回においてもラジアルグリア様細胞が神経幹細胞として機能していることを立証した（非特許文献７）。
【０００６】
その後、ネスチンP-GFPマウス（神経幹細胞マーカーであるネスチンのプロモーター制御下でGFPを発現するマウス)を用いて、海馬に存在する神経幹細胞の諸性質が次々に明らかにされた。成体の海馬において、幹細胞としての性質を強く保有するtype-1細胞から、ニューロンとしての性質を部分的に持ち分裂を繰り返すtype-2細胞が分化し、そして最終的には分裂が停止した新生ニューロンが発生することが明らかとなっている。終末分化からわずか10日後に、新生ニューロンはその軸索をCA3領域に伸ばしていることが示されている。
【０００７】
海馬新生ニューロンの生理機能についての研究は、まだ始まったばかりではあるが、薬剤投与やX線照射などで新生ニューロンだけを除去した実験の結果から、海馬新生ニューロンには、空間学習機能（非特許文献８）や、不安感に対する抵抗性（非特許文献９）、を高めるはたらきがあることが示唆されている。海馬回路は脳弓を経て感情のコントロールに寄与する視床下部と密接に連結していることが知られており、海馬の活動が高まるとコルチゾール産生にかかわるHPA軸(hypothalamus-Pituitary-Adrenal gland：視床下部-脳下垂体-副腎)の活動が低下することがわかっている。
【０００８】
また、加齢に伴い、海馬新生ニューロンの数が激減することが報告されている（非特許文献３）。そのため、特に中高齢者において、海馬新生ニューロンの数をうまく増やすことができれば、加齢に伴う脳機能の低下（記憶力の低下やうつ状態の増加）を防ぐことができるのではないかと大いに期待されており、一般的な関心もきわめて高い。
【０００９】
そこで、成体海馬において、新生ニューロンの数を増加させるための諸条件について、特に小動物を用いて非常に精力的に研究が展開されている。学習行動により新生ニューロンの数が増加する点、また神経伝達物質受容体に対する薬剤が作用を持つことから、海馬回路の活動が直接的あるいは間接的にニューロン新生の過程にはたらきかけていることが推測されている。
【００１０】
【非特許文献１】Eriksson, P. S. et al., Nature Med., 4:1313-1317, 1998
【非特許文献２】Altman, J. & Das, G. D. , J. Comp. Neurol., 124: 319-335, 1965
【非特許文献３】Gould, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 5263-5267, 1999
【非特許文献４】Kornack, D. R. & Rakic, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 5768-5773, 1999
【非特許文献５】van Praag, H. et al., Nature, 415: 1030-1034. 2002
【非特許文献６】Marr D., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 262: 23-81. 1971
【非特許文献７】Seri, B. et al., J. Neurosci., 21: 7153-7160. 2001
【非特許文献８】Shors, T.J. et al. Nature, 410: 372-376. 2001
【非特許文献９】Santarelli, L. et al., Science, 301: 805-809. 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、哺乳動物、特に哺乳動物成体の海馬においてニューロン新生を促進する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、フラボノイドを哺乳動物に投与することにより、フラボノイドを投与しない場合と比較して、ニューロン新生が促進されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）フラボノイドを有効成分として含む、哺乳動物において海馬のニューロン新生を促進するための組成物。
（２）フラボノイドを有効成分として含む、哺乳動物において海馬のニューロン新生を必要とする疾患または症状を治療または予防するための組成物。
（３）前記フラボノイドがカテキン類である、（１）または（２）記載の組成物。
（４）前記哺乳動物が成体である、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）経口投与用製剤の形態である、（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）フラボノイドを含む、哺乳動物の海馬におけるニューロン新生を促進するための食品。
（７）フラボノイドを含む、哺乳動物における記憶力増進または脳の老化防止のための食品。
（８）前記フラボノイドがカテキン類である、（６）または（７）記載の食品。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、哺乳動物、特に哺乳動物成体の海馬においてニューロン新生を促進する手段が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明者らは、フラボノイドの一種であるカテキン類をマウスに経口投与することにより、海馬においてニューロン新生が促進されることを見出した。本発明は上記知見に基づくものである。従って、一実施形態において本発明は、フラボノイドを有効成分として含む、哺乳動物において海馬のニューロン新生を促進するための組成物に関する。
【００１６】
窒素原子を含まない天然有機化合物にはC5単位を基本とするテルペノイド、カロテノイドのほかにC3を基本とする物質群があり、本明細書においてフラボノイドは、そのなかでC6-C3-C6の構造をもつものを総称した化合物群をさす。フラボノイドには、カテキン類、フラボン、イソフラボン、フラバノン、イソフラバノン、アントシアニジン、ロイコアントシアニジン、カルコン、ベンジリデンクマラノンおよびこれらの誘導体が含まれる。誘導体には配糖体が包含される。これらは単独で用いても組み合わせて用いてもよい。
【００１７】
フラボンおよびこれらの誘導体には、アピゲニン、クリシンおよびルテオリンが含まれるがこれらに限定されない。フラボノールおよびこれらの誘導体には、ガランギン、クエルセチン、ルチン、ケンフェロール、ミリセチン、イソクエルシトリン、ミリシトリンおよびモリンが含まれるがこれらに限定されない。カテキン類およびこれらの誘導体にはカテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキンガレートおよびエピガロカテキンガレートが含まれるがこれらに限定されない。フラバノンおよびこれらの誘導体には、ナリンゲニン、ナリンギン、ヘスペレチンおよびヘスペリジンが含まれるがこれらに限定されない。アントシアニジンおよびこれらの誘導体には、シアニジン、シアニン、デルフィニジン、デルフィニン、ペラルゴニジンおよびペラルゴニンが含まれるがこれらに限定されない。
【００１８】
本発明においては、フラボノイドとしてカテキン類またはその配糖体を用いるのが好ましい。カテキン類は、カテコールとも称され、３‐ヒドロキシフラバンのポリヒドロキシ誘導体をさし、（＋）−カテキン、（−）−エピカテキン、（＋）−ガロカテキン、（−）−エピガロカテキン、（−）−カテキンガレート、（−）−エピカテキンガレート、（−）−ガロカテキンガレートおよび（−）−エピガロカテキンガレートが包含される。好ましくは（＋）−カテキンを用いる。これらは単独で用いても組み合わせて用いてもよい。
【００１９】
フラボノイドは、当技術分野で通常用いられる方法により調製することができ、また、市販のものを用いてもよい。例えば、カテキン類は、特にカメリア属に属する植物より抽出することができる。カメリア属に属する植物として、茶節としての茶、タリエンシス、イラワジエンシス等、ツバキ節としてのヤブツバキ、ユキツバキ、鳳山椿、サルウィンツバキ、ビタルディ等、カワリバツバキ節としてのフルフラセア、グランサミアナ等、サザンカ節のサザンカ、オレイフェラ、キッシー等、ヒメサザンカ節、ヤナギバサザンカ節等が挙げられる。例えば、上記植物から得られる葉、茎、木部、樹皮、根、実、種子のいずれか、またはこれらの２種類以上の混合物もしくはそれらの粉砕物から、水、熱水、有機溶媒、含水有機溶媒またはこれらの混合物などにより抽出することにより調製できる。特に、茶生葉またはその乾燥物から水、熱水、有機溶媒、含水有機溶媒、これらの混合物などを用いて抽出される抽出物自体、または必要に応じて精製して得られる精製物として得ることが好ましい。
【００２０】
カテキン類の精製物に関しては、特公平1-44232号公報、特公平2-12474号公報、特公平2-22755号公報、特開平4-20589号公報、特開平5-260907号公報、特開平8-09178号公報などに記載された方法により製造することができる。例えば茶葉を上記の溶媒で抽出して得られた抽出物を、有機溶媒分画や吸着樹脂などを用いて所望の程度に精製することができる。茶以外の植物から抽出する場合も、茶の場合と同様の方法により実施すればよい。また市販のものを用いてもよい。
【００２１】
また、その他のフラボノイドについても、対象とするフラボノイドを含有する植物から、上記と同様に調製することができる。
【００２２】
哺乳動物は、温血脊椎動物をさし、例えば、ヒトおよびサルなどの霊長類、ラット、マウスおよびウサギなどのげっ歯類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコならびにイヌなどが包含される。本発明は、霊長類、特にヒトの海馬におけるニューロン新生の促進に有効である。本発明はまた、哺乳動物成体の海馬におけるニューロン新生の促進に有効である。成体とは、個体発生を完成した個体、すなわち幼生期以後において生殖可能となってからの時期の個体をさす。
【００２３】
ニューロンは、細胞体とそれから出る突起とをあわせた神経系の構造的および機能的単位をいう。細胞体は核とその周囲の細胞質とからなり、また突起には通常、短い樹状突起と長い軸索(軸索突起)の２種類がある。海馬におけるニューロンは、顆粒細胞と称される。本発明は、海馬歯状回におけるニューロン新生において特に有効である。
【００２４】
ニューロン新生は、神経幹細胞の分化によりニューロンが新たに生成することを意味する。ニューロン新生はまた、その新生したニューロンによって、海馬に新しい神経回路が追加されることをも意味する。
【００２５】
従来のニューロンに比べ、新生ニューロンの場合は細胞外環境からの影響を非常に受けやすく、分化後半数以上の細胞が死滅するとされている。この細胞死を食い止めることができる物質の探索が特に求められている。
【００２６】
海馬は、大脳の側脳室下角の底面に突出する、大脳皮質の一部をいう。本明細書において海馬には、海馬采、歯状回および海馬支脚が包含される。海馬ニューロンは他の部位のニューロンに比べ可塑性（変化する性質）が高く、記憶の形成を担うニューロンであるとされている。そして、海馬新生ニューロンは、海馬ニューロンに比べさらに可塑性が高いことが示されている。
【００２７】
ニューロン新生は、当技術分野で通常用いられる方法により確認することができる。そのような方法としては、ポリシアル酸（PSA：神経細胞接着分子NCAMの糖鎖）に対する抗体を用いた免疫組織化学法（Seki T. et al., J. Neurosci. 13:2351-2358,1993)、ブロモデオキシウリジン（BrdU：チミジン類似物質）標識法（Kuhn HG, et al., J. Neurosci. 16:2027-2033, 1996、Erikkson PS. Nat Med 4:1313-1317, 1998）、NeuN免疫組織化学法およびCalbindin染色法（Erikkson PS. Nat Med 4:1313-1317, 1998）などが挙げられる。
【００２８】
PSA抗体を用いた免疫組織化学法は、新生した顆粒細胞が発達する時に、ポリシアル酸を特異的に発現することを利用するものである。BrdU標識法は、BrdUを哺乳動物に注射すると細胞分裂時にBrdUが核に取り込まれるので、この取り込まれたBrdUを免疫組織学的に確認する方法であり、分裂細胞を確認することができる。NeuN免疫組織化学法は、脊椎動物の中枢神経系においてニューロンの核中に存在しインビトロでDNAと結合するニューロン特異性核タンパク質（NeuN）を確認するものであり、NeuNはニューロンの発生中、早期から出現することから、これを免疫染色によって確認することにより、いち早く新生ニューロンを識別することができる。
【００２９】
BrdU＋NeuN二重標識法は、海馬の新生ニューロンを調べる免疫組織化学評価法として最も一般的であり、信頼性が高い。この方法を用いて、運動などにより海馬新生ニューロン数が増加すること（van Praag, H. et al., Nature, 415: 1030-1034. 2002）などが示されてきている。
【００３０】
BrdU+Calbindin染色法によって、機能的に成熟した新生ニューロンを識別することができる。そのため最も信頼性の高い方法である。中高齢者の海馬において、新生ニューロンが存在していることが示されているが、この際にもBrdU+Calbindin染色法によって評価されている（Erikkson PS. Nat Med 4:1313-1317, 1998）。
【００３１】
上記ニューロン新生の確認において用いられる免疫学的手法については、一般的な方法を用いることができる（Stites et al., Basic and Clinical Immunology、Appleton & Lange, Norwalk, CT(1994)、Mishell and Shiigi et al., Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Co., New York(1980))。
【００３２】
本発明者らは、フラボノイドを投与することにより哺乳動物の海馬のニューロン新生が促進されることを見出したことから、本発明はまた、フラボノイドを有効成分として含む、哺乳動物において海馬のニューロン新生を必要とする疾患または症状を治療または予防するための組成物に関する。
【００３３】
海馬のニューロン新生を必要とする疾患または症状は、海馬においてニューロン新生が促進されることにより治癒または改善する疾患または症状、その症状が緩和、減少または消滅する疾患または症状、ならびにその発生を抑制または防止することができる疾患または症状をさす。そのような疾患または症状としては、脳機能の障害が挙げられる。海馬は記憶の形成や抗うつ作用を担っていることから、特に記憶にかかわる機能の障害およびうつ症状を有する障害、およびこれらの障害と病理生理学的に関連する症状が包含される。具体的には、アルツハイマー病およびその他の痴呆症、パーキンソン病、ハンチントン病、うつ病、不安症、神経外傷性疾患、軽度認知症（MCI:マイルドコグニティブインペアメント）、記憶障害、脳梗塞後の精神症状（うつ症状や記憶障害）、（交通事故後などの）高次脳機能障害、（短時間の心臓停止による）虚血性海馬障害などが挙げられる。神経外傷性疾患には、例えば手術によって引き起こされる開口性または貫通性の頭部外傷、または例えば頭部領域への損傷によって引き起こされる閉鎖性頭部外傷障害の双方が含まれる。
【００３４】
薬剤投与やＸ線照射などで新生ニューロンだけを除去した実験の結果から、海馬新生ニューロンには、空間学習機能（Shors, T.J. et al., Nature, 410: 372-376. 2001）や、不安感に対する抵抗性（Santarelli, L. et al., Science, 301: 805-809. 2003）を高める働きがあることが示唆されている。また、海馬歯状回における成体ニューロン新生が、海馬回路の可塑性を高めていることも示されている。また、加齢に伴い、海馬新生ニューロンの数が激減することも報告されている（Gould, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 5263-5267, 1999）。そのため、特に中高齢者において、海馬新生ニューロンの数をうまく増やすことができれば、加齢に伴う脳機能の低下（記憶力の低下やうつ状態の増加）、ひいては痴呆症を予防または治療することができると考えられる。
【００３５】
特にアルツハイマー病患者において、海馬でのニューロン新生が増加していることを示唆する患者脳を用いた研究結果が提出されている（Jin K. Peel AL. Mao XO. Xie L. Cottrell BA. Henshall DC. Greenberg DA. Increased hippocampal neurogenesis in Alzheimer's disease. [Journal Article] Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101(1):343-7, 2004 Jan 6）。また、脳梗塞後には、海馬でのニューロン新生が増加することが動物実験の結果から示唆されている。
【００３６】
本発明の組成物は、患者の病態、投与の部位および方法、投与のスケジュール、患者の年齢、性別、体重およびその他の因子を考慮に入れて投与される。本発明の組成物は、様々な方法で投与し得る。本発明の組成物は、通常、フラボノイドおよび好ましくは薬学的に許容される担体を含む製剤として調製される。組成物は、経口により、非経口により、例えば、皮下に、静脈内に、動脈内に、筋肉内に、腹腔内に、および鼻腔内に投与される。
【００３７】
薬学的に許容される担体とは、一般的に、本発明の有効成分とは反応しない、不活性の、無毒の、固体または液体の、増量剤、希釈剤またはカプセル化材料等をいい、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、植物性油などの溶媒または分散媒体などが挙げられる。
【００３８】
通常、脳内に有効成分を送達することは困難であるが、本発明者らは、驚くべくことに、フラボノイドの経口投与により、海馬においてニューロン新生を促進できることを見出した。従って、本発明の組成物は、好ましくは経口投与製剤の形態である。当該形態としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤などが挙げられる。
【００３９】
本発明の組成物はさらに医薬分野において慣用の添加剤を含んでいてもよい。そのような添加剤には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤などがあり、必要に応じて使用できる。長時間作用できるように徐放化するためには、既知の遅延剤等でコーティングすることもできる。賦形剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、軽質無水ケイ酸、ゼラチン、結晶セルロース、ソルビトール、タルク、デキストリン、デンプン、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム等が使用できる。結合剤としては、例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、エタノール、エチルセルロース、カゼインナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天、精製水、ゼラチン、デンプン、トラガント、乳糖、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ロウ類等が挙げられる。抗酸化剤としては、トコフェロール、没食子酸エステル、ジブチルヒドロキシトルエン (BHT)、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、アスコルビン酸等が挙げられる。必要に応じてその他の添加剤や薬剤、例えば制酸剤（炭酸水素ナトリウム、炭酸マグネシウム、沈降炭酸カルシウム、合成ヒドロタルサイト等）、胃粘膜保護剤（合成ケイ酸アルミニウム、スクラルファート、銅クロロフィリンナトリウム等）を加えてもよい。
【００４０】
本発明の組成物は、徐放性皮下インプラントの形態で、または標的送達系（例えば、モノクローナル抗体、ベクター送達、イオン注入、ポリマーマトリックス、リポソームおよびミクロスフェア）の形態で、非経口で患者に投与してもよい。
【００４１】
本発明の組成物の投与量は、投与方法、年齢、症状等により適宜決定することができるが、フラボノイドの質量に換算して、1日あたり、体重1kgあたり、経口投与で、通常1〜500mg、好ましくは10〜100mg、非経口投与で、通常1〜100mg、好ましくは1〜50mgである。
【００４２】
本発明の組成物におけるフラボノイドの含有量は、上記投与量を達成するように適宜決定できる。例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤およびカプセル剤等の場合は、通常0.01〜50質量％、好ましくは0.1〜10質量％の量でフラボノイドを含む。
【００４３】
本発明はまた、フラボノイドを含む、哺乳動物の海馬におけるニューロン新生を促進するための食品に関する。上記のとおり、海馬は記憶力の形成にかかわるとともに、海馬におけるニューロン新生は、加齢に伴う脳機能の低下を防止できることから、本発明はまた、フラボノイドを含む、記憶力増進または脳の老化防止のための食品に関する。
【００４４】
本発明の食品におけるフラボノイドの配合量もまた、組成物の場合と同様に、上記投与量を達成するように適宜決定できる。
【００４５】
本発明の食品の形態は特に制限されず、飲料も包含され、健康食品や機能性食品も包含される。具体的には、茶および茶飲料、ならびに細粒、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、流動食等の各種製剤形態の食品が挙げられる。製剤形態の食品は、適当な賦形剤（例えば、でん粉、加工でん粉、乳糖、ブドウ糖、水等）を加えた後、慣用の手段を用いて製造することができる。さらに、本発明の食品は、スープ類、ジュース類、乳飲料、ココア飲料、ゼリー状飲料などの液状食品、プリン、ヨーグルトなどの半固形食品、パン、菓子、うどんなどの麺類、クッキー、チョコレート、キャンディ、せんべいなどの菓子、ふりかけ、バター、ジャムなどのスプレッド類等の形態もとりうる。
【００４６】
本発明の食品には、種々の食品添加物、例えば、酸化防止剤、香料、各種エステル類、有機酸類、有機酸塩類、無機酸類、無機酸塩類、無機塩類、色素類、乳化剤、保存料、調味料、甘味料、酸味料、果汁エキス類、野菜エキス類、花蜜エキス類、pH調整剤、品質安定剤などの添加剤を単独、あるいは併用して配合してもよい。
【００４７】
また、本発明の組成物および食品は、各種ビタミン類（例えば、ビタミンC、ビタミンE、ビタミンB12、ビタミンB2、ビタミンB1、β−カロチン、アスタキサンチン等）、ミネラル類（例えば、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛等）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、イチョウ葉エキス、ワインポリフェノール 、テアフラビン、シソ油、DHA（ドコサヘキサエン酸）等の機能性成分などを適宜含むことができる。
【００４８】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されない。
【実施例】
【００４９】
実施例１  マウスへのカテキン投与
実験にはクローズコロニー系のマウスであるICR（三協ラボサービス株式会社より購入）を使用した。マウスにBrdU（和光社）を投与する場合は、7 mM NaOH / 0.9 % NaClに溶かし、50 mg / 1 kg (体重)の濃度で生後８週齢のマウスへ腹腔内注射により行った。全ての実験は東京大学大学院新領域創成科学研究科動物実験ガイドライン下に行った。
【００５０】
BrdUを投与したマウスを2群に分け（各群につき7頭ずつ）、一方にカテキン（（＋）−カテキン）を含む水溶液（0.05%: 500mg/1L）、他方には普通の水を給水ボトルから与え、えさ(NMF飼料、オリエンタル酵母社製)とともに自由摂取させ、2週間飼育した。
【００５１】
実施例２  凍結切片作成
これらのマウスに麻酔をかけた後（20mg/1kgネンブタールの腹腔内への注射）、肋骨の下縁にハサミを入れ、腹部を横に3cmほど切り、横隔膜を肋骨沿いに切開し、その両端から肋骨を切り胸壁を裏返して開腹開胸し、心臓を露出させた。25号の翼状針を左心室に入れ、25ml程のPBSを左心室よりシリンジにより灌流した。右心耳より流れ出る灌流液が透明になったのを確認後、固定液（4%パラホルムアルデヒド/PBS（NaCl 137mM;  Na2HPO4 8.1mM; KCl 2.68mM; KH2PO4 1.47mM）溶液）に切り替え15ml程灌流した。頭部を切断し、開頭し、同組成の1mlの固定液に入れ、4℃で一晩後固定を行った。その後、1mlの30%シュークロース/TBS（NaCl 137mM; KCl 2.68mM; Tris 25mM）に入れ替え、沈むまで4℃で浸漬（約2日間）、置換させた。
【００５２】
コンパウンド（Tissue Tek O.C.T. Compound （SAKURA社））を小さな容器（クリオモルド2号（Miles社））に入れ、30%シュークロース内にあった脳を、小脳をサジタルに剃刀等で切り落としてコンパウンド内に入れた。気泡を先の鋭いピンセットなどで取った後、試料台にもコンパウンド（前述の物と同じ）をつけて、容器と試料台を張り合わせ、クライオスタット（HM505E（MICRON社））で-20℃で凍結した。その後、クライオスタットにセットし、40μmの厚さにコロナルにスライスした。スライスされた切片はPBS内にて解凍させた。場合によっては切片をcryoprotection溶液内で、-20℃で保存した。
【００５３】
実施例３  免疫組織化学
以下の反応は浮遊法で行い、反応は抗体反応以外はマイクロプレートに約1ml程度の溶液を入れシーソーシェーカーでゆすりながら行った。抗体反応は容積500μlのPCRチューブに300μlの溶液を入れて行った。また、バッファーはTBSまたはPBSを用いた。作成された切片はプレトリートとして0.5% Triton / TBSにて室温30分間浸漬後、ブロッキングバッファー（以下、同組成。3% NGS / 0.1% Trton / TBS）内で室温１時間以上ブロッキングを行った。その後、一次抗体をブロッキングバッファーで希釈し、4℃で一晩非常に穏やかに揺すりながら、切片に対し一次抗体反応を行った。切片をTBSで10分×3回洗浄した後、二次抗体をブロッキングバッファーで希釈し、室温で2時間、二次抗体反応を行った。二次抗体後の切片は、一次抗体後と同様に、TBSにより10分間×3回室温下で洗浄した。BrdU抗体反応を行う場合は、プレトリートとして塩酸処理賦活法を行った。その場合のプロトコールは、ブロッキングの前に10 mM 1N HClで37℃で30分（この反応のみ揺らさず）反応後、ホウ酸バッファー (pH8.5: 50mM ホウ酸: 12mM テトラホウ酸ナトリウム)で室温10分処理、TBSで10分×2回室温下で洗浄し、その後ブロッキングを行った。
【００５４】
使用した一次抗体（希釈倍率; poly/mono（会社名））は以下の通りである：
抗BrdU抗体 (1:200; rat monoclonal（Oxford Biotechnology社）)
抗NeuN抗体 (1:1000; mouse monoclonal (Chemicon社))
二次抗体（希釈倍率（会社名））として、以下に挙げるものなどを使用した：
抗mouse IgG Alexa 488-conjigated抗体 （1:1000 (Molecular Probes社)）
抗rat IgG Rhodamine conjugated抗体 (1:200 (Jackson ImmunoResearch社))
【００５５】
実施例４  新生ニューロン数の計測
切片に残存した水分が封入剤と混在することにより後に観察する際に屈折率に影響が出ることを避ける為、目で見て濡れてない程度に切片全体を乾燥させた。切片をDABCOを入れた封入剤（IMMU-MOUNT(Shandon社)）を用いてカバーガラスで封入、余分な封入剤がガラス間から逃げるように、4℃遮光で一晩水平に静置した。その後、カバーガラスとスライドガラスをベースコートで固定した。
【００５６】
コンフォーカル顕微鏡（TCS-SP2（Leica社））により観察し、得られた各断層画像を再構築し画像を作成し、細胞数を計測した。特にそれぞれの蛍光が厳密に分かれていなければならない場合は、励起光レーザーが常に一色しか出ないsequential scanを行った。結果を以下の表１および表２、図１および２に示す。
【００５７】
【表１】
2007161606.tif 000003
【００５８】
【表２】
2007161606.tif 000004
【００５９】
表１および図１は、マウス一頭の海馬両側あたりのBrdUを有する細胞の数を表す表およびグラフであり、カテキン投与群の方が分裂した細胞が多く存在している（生存している）ことを示している。さらに表２および図２は、マウス一頭の海馬両側あたりのBrdUおよびNeuNを有する細胞の数を表す表およびグラフであり、カテキン投与群の方が新生ニューロンが多く存在している(生存している)ことを確実に示している。
【００６０】
以上の結果から、カテキン類を投与したマウス群は対照群と比較して、ニューロン新生が有意に促進されていることが示された。
【００６１】
実施例５  成熟した新生ニューロン数の計測
クローズコロニー系のマウスであるICR（三協ラボサービス株式会社より購入）を使用し、BrdU 100 mg/kg/dayを１週間投与した後、カテキン（（＋）−カテキン）50 mg/kg/day (0.5mg/ml水溶液の自由摂取)を生後8週齢のマウスへ6週間飲水投与した。
【００６２】
マウスにBrdU（和光社）を投与する場合は、7 mM NaOH / 0.9 % NaClに溶かし、100 mg / 1 kg (体重)の濃度でマウスへ腹腔内注射により行った。BrdUを投与したマウスを2群に分け（各群につき7頭ずつ）、一方にカテキン（（＋）−カテキン）を含む水溶液（0.5mg/ml水溶液）、他方には普通の水を給水ボトルから与え、えさ(NMF飼料、オリエンタル酵母社製)とともに自由摂取させ、6週間飼育した。
【００６３】
海馬新生ニューロンの生存に対する影響をBrdU、NeuNおよびCalbindin染色により検証した。凍結切片作成、免疫組織化学および細胞数の計測については、上記実施例２〜４と同様に実施した。Calbindin染色には、抗Calbindin抗体(1:500; rabbit IgG（Chemicon社）)を使用した。結果を表３〜５および図３に示す。
【００６４】
【表３】
2007161606.tif 000005
【００６５】
【表４】
2007161606.tif 000006
【００６６】
【表５】
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【００６７】
表３および図３(a)は、マウス一頭の海馬両側あたりのBrdUを有する細胞の数を表す表およびグラフであり、表４および図３(b)は、マウス一頭の海馬両側あたりのBrdUおよびNeuNを有する細胞の数を表す表およびグラフである。表５および図３(c)は、マウス一頭の海馬両側あたりのBrdUおよびcalbindinを有する細胞の数を表す表およびグラフであり、マウス一頭の海馬両側あたりの成熟した新生ニューロン数を示す。カテキン50 mg/kg/day投与によりBrdU+細胞、NeuN+細胞およびCalbindin+細胞数が増加し、カテキン投与で成熟ニューロン数が増加することが分かった。よって、カテキン類に新生ニューロン生存促進効果があることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】カテキンを投与したマウス群と対照群における、一頭あたりの分裂細胞数（BrdU投与2週間後）を示すグラフである。
【図２】カテキンを投与したマウス群と対照群における、一頭あたりの新生ニューロン数（BrdU投与2週間後）を示すグラフである。
【図３】6週間カテキンを投与したマウス群と対照群における、(a) 一頭あたりの分裂細胞数、(b) 一頭あたりの新生ニューロン数および(c) 一頭あたりの成熟した新生ニューロン数を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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