(57)【要約】【課題】本発明は、効率的に、かつ高精度に行なうことができる遺伝子チップを使用した蛍光画像検出方法、蛍光画像検出基板、装置、プログラムおよび記録媒体に関する。【解決手段】蛍光画像検出基板上に固定されている複数のプローブ物質と、蛍光物質で標識化されたターゲット物質とを蛍光画像検出基板上で反応させ、反応後の反応生成物の蛍光の蛍光画像を測定することにより、プローブ物質とターゲット物質との反応を検出する蛍光画像検出方法において、各プローブ物質は、幾何パターン状に蛍光画像検出基板に固定されており、反応後に各プローブ物質に対して幾何パターンと蛍光強度の相関を検出する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光画像検出基板上に固定されている複数のプローブ物質と、蛍光物質で標識化されたターゲット物質とを前記蛍光画像検出基板上で反応させ、前記反応後の反応生成物の蛍光の蛍光画像を測定することにより、前記プローブ物質と前記ターゲット物質との反応を検出する蛍光画像検出方法において、前記複数のプローブ物質からなる少なくとも一つのプローブパッドが幾何パターン状となるように前記蛍光画像検出基板に固定し、前記蛍光画像を測定することを特徴とする蛍光画像検出方法。
【請求項２】
前記プローブパッドが二つ以上ある場合、前記プローブパッドをアレイ状に前記蛍光画像検出基板に固定する請求項１に記載の蛍光画像検出方法。
【請求項３】
前記プローブパッドが二つ以上ある場合、前記プローブパッドを重ねて前記蛍光画像検出基板に固定する請求項１に記載の蛍光画像検出方法。
【請求項４】
前記反応後に前記各プローブ物質に対して蛍光強度の分布と幾何パターン分布を相関検出する請求項１乃至３のいずれかに記載の蛍光画像検出方法。
【請求項５】
前記幾何パターン状とは、擬似ランダム符号または直交コードを適用したパターンである請求項１乃至４のいずれかに記載の蛍光画像検出方法。
【請求項６】
前記幾何パターン状とは、等間隔のピッチ幅を有する縞状パターンである請求項１乃至５のいずれかに記載の蛍光画像検出方法。
【請求項７】
前記幾何パターン状とは、２次元コードを適用したパターンである請求項１乃至６のいずれかに記載の蛍光画像検出方法。
【請求項８】
前記擬似ランダム符号、前記直交コード、前記２次元コードおよび前記縞状パターンにおいて、前記プローブ物質が固定されている箇所と前記プローブ物質が固定されていない箇所とを有する請求項１乃至７のいずれかに記載の蛍光画像検出方法。
【請求項９】
前記幾何パターンが前記縞状パターンである場合、前記相関検出のかわりにフーリエ変換を行なう請求項１、６または８に記載の蛍光画像検出方法。
【請求項１０】
前記プローブ物質は、プローブＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体もしくはたんぱく質である請求項１乃至９のいずれかに記載の蛍光画像検出方法。
【請求項１１】
前記ターゲット物質は、ターゲットＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体もしくはたんぱく質である請求項１乃至１０のいずれかに記載の蛍光画像検出方法。
【請求項１２】
前記プローブ物質が、前記プローブＤＮＡであって、かつ、前記ターゲット物質が前記ターゲットＤＮＡである場合、前記反応とは、ハイブリダイゼーションである請求項１乃至１１のいずれかに記載の蛍光画像検出方法。
【請求項１３】
少なくとも一面にプローブ物質が複数固定されている蛍光画像検出基板であって、前記複数のプローブ物質からなる少なくとも一つのプローブパッドが幾何パターン状となるように固定することを特徴とする蛍光画像検出基板。
【請求項１４】
前記プローブパッドが二つ以上ある場合、前記プローブパッドをアレイ状に固定する請求項１３に記載の蛍光画像検出基板。
【請求項１５】
前記プローブパッドが二つ以上ある場合、前記プローブパッドを重ねて固定する請求項１３に記載の蛍光画像検出基板。
【請求項１６】
前記幾何パターン状とは、擬似ランダム符号または直交コードを適用したパターンである請求項１３乃至１５のいずれかに記載の蛍光画像検出基板。
【請求項１７】
前記幾何パターン状とは、等間隔のピッチ幅を有する縞状パターンである請求項１３または１６に記載の蛍光画像検出基板。
【請求項１８】
前記幾何パターン状とは、２次元コードを適用したパターンである請求項１３乃至１７のいずれかに記載の蛍光画像検出基板。
【請求項１９】
前記擬似ランダム符号、前記直交コード、前記２次元コードおよび前記縞状パターンにおいて、前記プローブ物質が固定されている箇所と前記プローブ物質が固定されていない箇所とを有する請求項１３乃至１８のいずれかに記載の蛍光画像検出基板。
【請求項２０】
前記プローブ物質は、プローブＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体もしくはたんぱく質である請求項１３乃至１９のいずれかに記載の蛍光画像検出基板。
【請求項２１】
励起光を照射する光源と、蛍光画像検出基板上に幾何パターン状に固定されている少なくとも一つのプローブパッド中の複数のプローブ物質と、蛍光物質で標識化されたターゲット物質とを反応させ、前記反応後に反応生成物に前記励起光を照射し、前記蛍光物質の励起した蛍光強度の分布を観測し、観測した前記蛍光強度の分布を電気信号に変換し、前記電気信号を増幅する光検出部と、該光検出部により増幅された前記電気信号を相関検出する相関検出部と、該相関検出部により相関検出した前記電気信号を入出力するデータ入出力部と、を備えた蛍光画像検出器であって、前記データ入出力部は、外部情報を入力・記憶し、入力・記憶した前記外部情報を前記相関検出部に転送し、前記相関検出部は、転送された前記外部情報をもとに幾何パターン分布を構成し、前記電気信号と前記幾何パターン分布との相関を検出することを特徴とする蛍光画像検出器。
【請求項２２】
前記プローブパッドが二つ以上ある場合、前記プローブパッドをアレイ状に前記蛍光画像検出基板に固定する請求項２１に記載の蛍光画像検出器。
【請求項２３】
前記プローブパッドが二つ以上ある場合、前記プローブパッドを重ねて前記蛍光画像検出基板に固定する請求項２１に記載の蛍光画像検出器。
【請求項２４】
前記幾何パターン状とは、擬似ランダム符号または直交コードを適用したパターンである請求項２１乃至２３のいずれかに記載の蛍光画像検出器。
【請求項２５】
前記幾何パターン状とは、等間隔のピッチ幅を有する縞状パターンである請求項２１乃至２４のいずれかに記載の蛍光画像検出器。
【請求項２６】
前記幾何パターン状とは、２次元コードを適用したパターンである請求項２１乃至２５のいずれかに記載の蛍光画像検出器。
【請求項２７】
前記擬似ランダム符号、前記直交コード、前記２次元コードおよび前記縞状パターンにおいて、前記プローブ物質が固定されている箇所と前記プローブ物質が固定されていない箇所とを有する請求項２１乃至２６のいずれかに記載の蛍光画像検出器。
【請求項２８】
前記幾何パターンが前記縞状パターンである場合、前記相関検出のかわりにフーリエ変換を行なう請求項２１乃至２７のいずれかに記載の蛍光画像検出器。
【請求項２９】
前記プローブ物質は、プローブＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体もしくはたんぱく質である請求項２１乃至２８のいずれかに記載の蛍光画像検出器。
【請求項３０】
前記ターゲット物質は、ターゲットＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体もしくはたんぱく質である請求項２１乃至２９のいずれかに記載の蛍光画像検出器。
【請求項３１】
前記プローブ物質が、前記プローブＤＮＡであって、かつ、前記ターゲット物質が前記ターゲットＤＮＡである場合、前記反応とは、ハイブリダイゼーションである請求項２１乃至３０のいずれかに記載の蛍光画像検出器。
【請求項３２】
前記外部情報とは、前記蛍光画像検出基板の大きさ、前記プローブパッドの大きさ、前記各プローブ物質の前記幾何パターンの大きさ、適用した前記幾何パターンである請求項２１乃至３１のいずれかに記載の蛍光画像検出器。
【請求項３３】
前記擬似ランダム符号、前記直交コードまたは前記２次元コードを適用して前記プローブ物質を前記蛍光画像検出基板に固定している場合、前記外部情報として、さらに、前記プローブ物質が固定されている箇所と前記プローブ物質が固定されていない箇所の総数、前記各プローブ物質の大きさを入力する請求項２１乃至２４、２６、２７、２９乃至３２のいずれかに記載の蛍光画像検出器。
【請求項３４】
前記縞状パターンを適用して前記プローブ物質を蛍光画像検出基板に固定している場合、前記外部情報として、さらに、前記プローブ物質が固定されている箇所と前記プローブ物質が固定されていない箇所の総数、前記ピッチ幅を入力する請求項２１乃至２３、２５、２８乃至３２のいずれかに記載の蛍光画像検出器。
【請求項３５】
蛍光画像検出基板上に幾何パターン状に固定されている少なくとも一つのプローブパッド中の複数のプローブ物質と、蛍光物質で標識化されたターゲット物質とを反応させ、前記反応後に反応物に前記励起光を照射し、前記蛍光物質の励起した蛍光強度の分布を観測し、観測した前記蛍光強度の分布を電気信号に変換し、前記電気信号を増幅するステップと、該ステップにより増幅された前記電気信号を、予め入力した外部情報を読み取るステップと、該ステップにて入力した前記外部情報をもとに幾何パターン分布を構成するステップと、前記電気信号と前記外部情報との相関を検出するステップと、該ステップにより得られた相関度を出力・表示するステップと、を備えた蛍光画像検出方法をコンピュータに実行させることを特徴とするプログラム。
【請求項３６】
前記プローブパッドが二つ以上ある場合、前記プローブパッドをアレイ状に前記蛍光画像検出基板に固定する請求項３５に記載のプログラム。
【請求項３７】
前記プローブパッドが二つ以上ある場合、前記プローブパッドを重ねて前記蛍光画像検出基板に固定する請求項３５に記載のプログラム。
【請求項３８】
前記幾何パターン状とは、擬似ランダム符号または直交コードを適用したパターンである請求項３５乃至３７のいずれかに記載のプログラム。
【請求項３９】
前記幾何パターン状とは、等間隔のピッチ幅を有する縞状パターンである請求項３５乃至３８のいずれかに記載のプログラム。
【請求項４０】
前記幾何パターン状とは、２次元コードを適用したパターンである請求項３５乃至３９のいずれかに記載のプログラム。
【請求項４１】
前記擬似ランダム符号、前記直交コード、前記２次元コードおよび前記縞状パターンにおいて、前記プローブ物質が固定されている箇所と前記プローブ物質が固定されていない箇所とを有する請求項３５乃至４０のいずれかに記載のプログラム。
【請求項４２】
前記幾何パターンが前記縞状パターンである場合、前記相関検出のかわりにフーリエ変換を行なう請求項３５乃至４１のいずれかに記載のプログラム。
【請求項４３】
前記プローブ物質は、プローブＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体もしくはたんぱく質である請求項３５乃至４２のいずれかに記載のプログラム。
【請求項４４】
前記ターゲット物質は、ターゲットＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体もしくはたんぱく質である請求項３５乃至４３のいずれかに記載のプログラム。
【請求項４５】
前記プローブ物質が、前記プローブＤＮＡであって、かつ、前記ターゲット物質が前記ターゲットＤＮＡである場合、前記反応とは、ハイブリダイゼーションである請求項３５乃至４４のいずれかに記載のプログラム。
【請求項４６】
前記外部情報とは、前記蛍光画像検出基板の大きさ、前記プローブパッドの大きさ、前記各プローブ物質の前記幾何パターンの大きさである請求項３５乃至４５のいずれかに記載のプログラム。
【請求項４７】
前記擬似ランダム符号、前記直交コードまたは前記２次元コードを適用して前記プローブ物質を前記蛍光画像検出基板に固定している場合、前記外部情報として、さらに、前記プローブ物質が固定されている箇所と前記プローブ物質が固定されていない箇所の総数、前記各プローブ物質の大きさを入力する請求項３５乃至３８、４０、４１、４３乃至４４のいずれかに記載のプログラム。
【請求項４８】
前記縞状パターンを適用して前記プローブ物質を蛍光画像検出基板に固定している場合、前記外部情報として、さらに、前記プローブ物質が固定されている箇所と前記プローブ物質が固定されていない箇所の総数、前記ピッチ幅を入力する請求項３５乃至３７、３９、４２乃至４４のいずれかに記載のプログラム。
【請求項４９】
請求項３５乃至４８のいずれかに記載されたプログラムを記録したことを特徴とするコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、効率的に、かつ、高精度に行なうことができる蛍光画像検出基板（遺伝子チップ等）を使用した蛍光画像検出方法、蛍光画像検出基板を使用する蛍光画像検出器、プログラムおよび記録媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子構造解析の進歩はめざましいものがあり、ヒトの遺伝子構造をはじめとして、多数の遺伝子構造が明らかにされてきている。このような遺伝子構造の解析には、蛍光の性質を利用したＤＮＡチップ法や蛍光抗体法等がよく用いられている。
【０００３】
ＤＮＡチップ法とは、スライドガラス等の蛍光画像検出基板上に予め配列の分かっているＤＮＡ断片等のプローブ物質を蛍光画像検出基板にアレイ状に複数並べておき、未知のＤＮＡ断片等のターゲット物質とハイブリダイゼーションさせることによって得られるハイブリダイゼーションシグナルを解析することによりＤＮＡの塩基配列を解析・決定する方法である。ＤＮＡチップ法は、簡便かつ迅速に塩基配列の解析をすることができ、遺伝子発現のモニタリングや、既知塩基配列における変位の同定を行なうことができることから、医療分野への応用等急速に開発・応用化が進んでおり、例えば、特許文献１には、ＤＮＡチップ法を応用した動脈硬化の検出・診断方法を提案している。
【０００４】
ＤＮＡチップ法にてＤＮＡ構造解析を行なうには、プローブ物質を調整し、プローブ物質を蛍光画像検出基板上にスポットし固定する工程と、その後ターゲット物質を調整してハイブリダイゼーションを行ない、ハイブリダイゼーションシグナルを検出する工程とからなる。
【０００５】
ハイブリダイゼーションシグナルの検出には蛍光物質が利用され、主として解析ソフトを使用して画像を解析・算出する。この際、プローブ物質のスライドガラス上への固定においては、各プローブ物質を順にアレイ状に蛍光画像検出基板上に配置し、蛍光強度が最大のスポットに対応するＤＮＡを検出する方法が一般的に利用されている。
【０００６】
蛍光抗体法とは、ＤＮＡチップ法と同様に、蛍光物質を利用して、細胞にある抗原または抗体の所在を調べ、ウイルス感染の有無を検査する方法である。蛍光抗体法は、簡便かつ迅速に検査を行なうことができ、抗核抗体、抗ＤＮＡ抗体（クリシディア法）、抗胃壁細胞抗体、抗平滑筋抗体、抗ミトコンドリア抗体、抗好中球細胞質抗体等の自己免疫性疾患検査や、ＥＢウィルス、風疹ウィルス抗体、ヘルペスウィルス抗体（抗原）、サイトメガロウィルス抗体、クラジミアトラコマティス抗体（抗原）、クラジミアシッタシ抗体（抗原）、エンドトキシン、トキソプラズマ抗体、ＦＴＡ−ＡＢＳ等の感染症検査や、癌の組織診断等に用いられており、例えば、特許文献２では、蛍光抗体法を利用したクモ膜下出血の検出、検査方法を提案している。
【０００７】
蛍光抗体法は、直接蛍光抗体法と間接蛍光抗体法に分類され、直接蛍光抗体法は、被験者の細胞、組織等（プローブ物質）を蛍光画像検出基板上に固定する工程と、蛍光物質で標識化された抗体を反応させ、反応後の蛍光を観測する工程とからなる。間接蛍光抗体法は、被験者の細胞、組織等（プローブ物質）を蛍光画像検出基板上に固定する工程と、蛍光物質で標識化されていない抗体を反応させる工程と、蛍光物質で標識化されていない抗体を反応させた後、蛍光物質で標識化されている抗体とさらに反応させ、反応後の蛍光を観測する工程とからなる。
【特許文献１】特開２００５−１６８４９８号公報
【特許文献２】特開２００５−１５１８５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、ＤＮＡチップ法および蛍光抗体法において、サンプル中のハイブリダイゼーションまたは反応（以下、ハイブリダイゼーションと抗原、抗体による反応等を総称して「反応」という）していないＤＮＡ、抗原、抗体等からの蛍光がノイズの原因となる場合がある。そのため、通常、蛍光画像検出基板を洗浄してから反応していないＤＮＡ、抗原、抗体等を洗浄して取り除く作業を必要とし、作業効率の低下が問題となっていた。また、上述したＤＮＡチップ法および蛍光抗体法において、サンプル濃度が薄い場合、観測される蛍光強度は微弱である。そのため、蛍光強度がバックグラウンドのノイズに埋もれてしまい、誤検出が発生するという問題もあった。さらに、プローブ同士が重なってしまった場合、蛍光画像の識別をすることが困難であるため、プローブ同士が重なったチップは、不良品として扱われ、歩留りの低下も問題となっていた。さらに、プローブの数が増大すると基板の面積が大きくなり、反応の均一性の確保が困難となったり、必要なサンプル量が増加するという問題もあった。
【０００９】
本発明は、上述したような問題を解決するためになされたものであり、本発明の目的は、ＤＮＡチップ法および蛍光抗体法を改良し、より効率的かつ高精度に行なう方法、その方法に使用する基板、装置、プログラムおよび記録媒体を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、サンプル濃度が薄くても誤検出等を防止できる蛍光画像検出方法であって、本発明の目的は、蛍光画像検出基板上に固定されている複数のプローブ物質と、蛍光物質で標識化されたターゲット物質とを蛍光画像検出基板上で反応させ、反応後の反応生成物の蛍光の蛍光画像を測定することにより、プローブ物質とターゲット物質との反応を検出する蛍光画像検出方法において、前記複数のプローブ物質からなる少なくとも一つのプローブパッドが幾何パターン状となるように前記蛍光画像検出基板に固定し、前記蛍光画像を測定することによって、効果的に達成される。
【００１１】
また、本発明の上述した目的は、プローブパッドが二つ以上ある場合、プローブパッドをアレイ状に蛍光画像検出基板に固定することによって、或はプローブパッドが二つ以上ある場合、プローブパッドを重ねて蛍光画像検出基板に固定することによってより効果的に達成される。
【００１２】
さらに、本発明の上記目的は、反応後に各プローブ物質に対して蛍光分布と幾何パターン分布を相関検出することによって、或は幾何パターン状とは、擬似ランダム符号または直交コードを適用したパターンであることによって、或は幾何パターン状とは、等間隔のピッチ幅を有する縞状パターンであることによって、或は幾何パターン状とは、２次元コードを適用したパターンであることによって、或は擬似ランダム符号、直交コード、２次元コードおよび縞状パターンにおいて、プローブ物質が固定されている箇所とプローブ物質が固定されていない箇所とを有することによって、或は幾何パターンが縞状パターンである場合、相関検出のかわりにフーリエ変換を行なうことによって、或はプローブ物質が、プローブＤＮＡであって、かつ、ターゲット物質がターゲットＤＮＡである場合、反応とは、ハイブリダイゼーションであることによって、より効果的に達成される。
【００１３】
本発明は、プローブ物質が重なっても蛍光画像の識別を行なうことができる蛍光画像検出基板を提供することを目的とし、本発明の目的は、少なくとも一面にプローブ物質が複数固定されている蛍光画像検出基板であって、複数のプローブ物質は、少なくとも一つのプローブパッドを構成するように幾何パターン状に固定されていることによって効果的に達成される。
【００１４】
また、本発明の上記目的は、プローブパッドが二つ以上ある場合、プローブパッドをアレイ状に固定することによって、或はプローブパッドが二つ以上ある場合、プローブパッドを重ねて固定することによって、或は幾何パターン状とは、擬似ランダム符号または直交コードを適用したパターンであることによって、或は幾何パターン状とは、等間隔のピッチ幅を有する縞状パターンであることによって、或は幾何パターン状とは、２次元コードを適用したパターンであることによって、或は擬似ランダム符号、直交コード、２次元コードおよび縞状パターンにおいて、プローブ物質が固定されている箇所とプローブ物質が固定されていない箇所とを有することによって、より効果的に達成される。
【００１５】
本発明は、サンプル濃度が薄くても誤検出をすることなく蛍光画像を検出することができる蛍光画像検出器を提供することを目的とし、本発明の目的は、励起光を照射する光源と、蛍光画像検出基板上に幾何パターン状に固定されている少なくとも一つのプローブパッド中の複数のプローブ物質と、蛍光物質で標識化されたターゲット物質とを反応させ、反応後に反応生成物に励起光を照射し、蛍光物質の励起した蛍光強度の分布を観測し、観測した蛍光強度の分布を電気信号に変換し、電気信号を増幅する光検出部と、光検出部により増幅された電気信号を相関検出する相関検出部と、相関検出部により相関検出した電気信号を入出力するデータ入出力部と、を備えた蛍光画像検出器であって、データ入出力部は、外部情報を入力・記憶し、入力・記憶した外部情報を相関検出部に転送し、相関検出部は、転送された外部情報をもとに幾何パターン分布を構成し、電気信号と幾何パターン分布との相関を検出することによって効果的に達成される。
【００１６】
また、本発明の上記目的は、プローブパッドが二つ以上ある場合、プローブパッドをアレイ状に蛍光画像検出基板に固定することによって、或はプローブパッドが二つ以上ある場合、プローブパッドを重ねて蛍光画像検出基板に固定することによって、或は幾何パターン状とは、擬似ランダム符号または直交コードを適用したパターンであることによって、或は幾何パターン状とは、等間隔のピッチ幅を有する縞状パターンであることによって、或は幾何パターン状とは、２次元コードを適用したパターンであることによって、或は擬似ランダム符号、直交コード、２次元コードおよび縞状パターンにおいて、プローブ物質が固定されている箇所とプローブ物質が固定されていない箇所とを有することによって、或は幾何パターンが縞状パターンである場合、相関検出のかわりにフーリエ変換をすることによって、或はプローブ物質が、プローブＤＮＡであって、かつ、ターゲット物質がターゲットＤＮＡである場合、反応とは、ハイブリダイゼーションであることによって、より効果的に達成される。
【００１７】
さらに、本発明の上記目的とは、外部情報とは、蛍光画像検出基板の大きさ、プローブパッドの大きさ、各プローブ物質の幾何パターンの大きさ、適用した幾何パターンであることによって、或は擬似ランダム符号、直交コードまたは２次元コードを適用してプローブ物質を蛍光画像検出基板に固定している場合、外部情報として、さらに、プローブ物質が固定されている箇所とプローブ物質が固定されていない箇所の総数、各プローブ物質の大きさを入力することによって、或は縞状パターンを適用してプローブ物質を蛍光画像検出基板に固定している場合、外部情報として、さらに、プローブ物質が固定されている箇所とプローブ物質が固定されていない箇所の総数、ピッチ幅を入力することによって、より効果的に達成される。
【００１８】
本発明は、蛍光画像検出方法をコンピュータに実行させるプログラムを提供させることを目的とし、本発明の目的は、蛍光画像検出基板上に幾何パターン状に固定されている少なくとも一つのプローブパッド中の複数のプローブ物質と、蛍光物質で標識化されたターゲット物質とを反応させ、反応後に反応物に励起光を照射し、蛍光物質の励起した蛍光強度の分布を観測し、観測した蛍光強度の分布を電気信号に変換し、電気信号を増幅するステップと、ステップにより増幅された電気信号を、予め入力した外部情報を読み取るステップと、ステップにて入力した外部情報をもとに幾何パターン分布を構成するステップと、電気信号と外部情報との相関を検出するステップと、ステップにより得られた相関度を出力・表示するステップと、を備えた蛍光画像検出方法をコンピュータに実行させることによって、効果的に達成される。
【００１９】
また、本発明の上記目的は、プローブパッドが二つ以上ある場合、プローブパッドをアレイ状に蛍光画像検出基板に固定することによって、或はプローブパッドが二つ以上ある場合、プローブパッドを重ねて蛍光画像検出基板に固定することによって、或は幾何パターン状とは、擬似ランダム符号または直交コードを適用したパターンであることによって、或は幾何パターン状とは、等間隔のピッチ幅を有する縞状パターンであることによって、或は幾何パターン状とは、２次元コードを適用したパターンであることによって、或は擬似ランダム符号、直交コード、２次元コードおよび縞状パターンにおいて、プローブ物質が固定されている箇所とプローブ物質が固定されていない箇所とを有することによって、或は幾何パターンが縞状パターンである場合、相関検出のかわりにフーリエ変換をすることによって、或はプローブ物質が、プローブＤＮＡであって、かつ、ターゲット物質がターゲットＤＮＡである場合、反応とは、ハイブリダイゼーションであることによって、より効果的に達成される。
【００２０】
さらに、本発明の上記目的とは、外部情報とは、蛍光画像検出基板の大きさ、プローブパッドの大きさ、各プローブ物質の幾何パターンの大きさ、適用した幾何パターンであることによって、或は擬似ランダム符号、直交コードまたは２次元コードを適用してプローブ物質を蛍光画像検出基板に固定している場合、外部情報として、さらに、プローブ物質が固定されている箇所とプローブ物質が固定されていない箇所の総数、各プローブ物質の大きさを入力することによって、或は縞状パターンを適用してプローブ物質を蛍光画像検出基板に固定している場合、外部情報として、さらに、プローブ物質が固定されている箇所とプローブ物質が固定されていない箇所の総数、ピッチ幅を入力することによって、より効果的に達成される。
【００２１】
上述したプログラムを記録したことを特徴とするコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供することによっても、本発明の目的が達成される。
【００２２】
プローブ物質は、プローブＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体もしくはたんぱく質であるであることによって、或はターゲット物質は、ターゲットＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体もしくはたんぱく質であることによって、本発明の上記目的はより効果的に達成される。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の蛍光画像検出方法によれば、プローブ物質を蛍光画像検出基板上に幾何パターン化して固定し、反応後の各プローブ物質の蛍光強度と幾何パターン分布を相関検出することにより、サンプル濃度が低濃度であっても、バックグラウンドのノイズと蛍光信号のＳ／Ｎ比を向上させることができるので、誤検出を防止することができるようになった。また、相関検出を行なうことにより、蛍光強度が微弱であっても検出することができ、低コントラストの蛍光画像であっても検出することができるので、反応後の洗浄工程を省略もしくは簡便化することができるようになり、ＤＮＡチップ法および蛍光抗体法等の作業効率を向上させることができ、より迅速に、無駄のない測定ができるようになった。
【００２４】
さらに、本発明の蛍光画像検出方法によれば、プローブ物質をスポット状に固定するのではなく幾何パターン状に固定するので、反応後の蛍光画像の幾何パターンからプローブ物質を識別することができるようになった。これにより、プローブ物質同士が重なっても蛍光を測定することができるようになり、歩留りを向上させることができるようになった。
【００２５】
本発明の蛍光画像検出方法に使用する蛍光画像検出基板によれば、蛍光画像検出基板の少なくとも一面に幾何パターン化したプローブパッドを重ねて固定することにより、高密度で小面積のＤＮＡチップ法および蛍光抗体法等で使用する蛍光画像検出基板を提供することができるようになった。
【００２６】
本発明の蛍光画像検出器によれば、反応生成物の蛍光物質の励起した蛍光強度の分布を電気信号に変換してから増幅し、相関検出を行なうことによって、蛍光強度が微弱であっても検出することができるようになった。また、相関検出を行なう際、データ入出力部に予めプローブ物質の幾何パターン等の外部情報を入力・記憶させておくことにより、誤検出を防止することができ、また、プローブ物質を重ねて測定すること等ができるようになった。
【００２７】
本発明のプログラムによれば、上述した蛍光画像検出方法を効率的に、かつ、高精度に行なうことができるようになった。
【００２８】
さらに、本発明の記憶媒体によれば、記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータに読み取らせて実行することによって、上述した蛍光画像検出方法と同様な効果を得ることができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明は、蛍光画像検出基板上にプローブ物質をスポットして固定するのではなく、幾何パターン状に蛍光画像検出基板に固定してターゲット物質と反応させ、反応後、必要に応じて相関検出することを特徴とする。
【００３０】
また、プローブ物質がプローブＤＮＡの場合、蛍光画像検出基板上にプローブＤＮＡをスポットして固定するのではなく、幾何パターン状に蛍光画像検出基板に固定してターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーションし、ハイブリダイゼーション後、必要に応じて相関検出することを特徴とする。これにより、プローブ物質またはプローブＤＮＡ同士が重なっても蛍光を測定することができるようになり、蛍光強度が微弱であっても検出することができるようになる。
【００３１】
本発明において、プローブＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体もしくはたんぱく質等をプローブ物質として適用することができる。
【００３２】
また、ターゲットＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗体もしくはたんぱく質等をターゲット物質として適用することができる。
【００３３】
以下、本発明の蛍光画像検出方法、蛍光画像検出基板、蛍光画像検出器、プログラムおよび記憶媒体について詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
本発明の蛍光画像検出方法について図面を参照にしながら詳細に説明する。
【００３５】
図１は、本発明の蛍光画像検出方法の第１実施形態の手順の例を示すフローチャートである。
【００３６】
通常の蛍光画像検出方法では、プローブ物質をスライドガラス等の蛍光画像検出基板上にアレイ状にスポットして固定するが、本発明では、スポットをせずに固定位置を幾何パターン状にする（ステップ１２）。図２は、プローブ物質を幾何パターン状に固定した一例を示した図である。本発明では、プローブ物質の固定を従来のようなスポット状にするのではなく、図２の（Ａ）〜（Ｉ）に示したように、擬似ランダム符号、直交コード、縞状パターン等を適用したパターンに幾何パターン化する。図２中の黒い部分にプローブ物質を固定し、白い部分には、プローブ物質を固定せず、全体として縞状パターンの配置、擬似ランダム符号および直交コードのパターン（形状）となるようにプローブ物質を固定する。すなわち、バーコード状にプローブ物質を蛍光画像検出基板に固定する。なお、プローブ物質を固定した図２中の黒い部分とプローブ物質を固定していない白い部分全体のパターンをプローブパッドという。
【００３７】
縞状のパターン、擬似ランダム符号および直交コードは、擬似ランダム系列であり自己相関が強く、自然界に存在する可能性が低い信号パターンであり、バックグラウンド成分と相互相関が弱い符号系列である。そのため、バックグラウンドのノイズが問題となる携帯電話等の情報通信分野でデジタル拡散通信にて広く利用されている。
【００３８】
本発明で適用する擬似ランダム符号および直交コードは、公知の種々の擬似ランダム符号及び直交コードを適用することができ、例えば、Ｍ系列（Ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｅｎｇｔｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、Ｇｏｌｄｅｎ系列符号等があげられる。
【００３９】
蛍光物質で標識化されたターゲット物質は、反応後均一にプローブ物質と結合するので蛍光画像検出基板は一様に発光する。このとき、バックグラウンド光があると、測定した発光がバックグラウンド光か、反応生成物により発せられた蛍光か否か区別することができない。本発明では、プローブ物質を予め幾何パターン化して蛍光画像検出基板上に固定することにより、蛍光強度の分布を観測したときにそのパターン化して固定したパターンと同様の形態の発光が観測されたならば、その発光はバックグラウンド光やその他のノイズによるものではなく、反応生成物により発せられた蛍光であることを区別することができる。さらに、異なるプローブ物質に対してそれぞれ異なる幾何パターンを適用すれば、異なるプローブ物質が重なっても観測された蛍光がどのプローブ物質に対応するか区別することができるようになる。
【００４０】
なお、本発明のプローブ物質の幾何パターン状による固定について、上述した１次元コードの他に、図２（Ｉ）のような２次元コードを適用することもできる。本発明では、適用することができる２次元コードは、例えば、２ＤＱＲコード、スタック型２次元コード、マトリックス型２次元コード等公知の種々の２次元コードを適用することができる。さらにコードの中に誤り訂正符号を含めることもできる。
【００４１】
縞状パターン、擬似ランダム符号、直交コードおよび２次元コードのいずれかを適用して蛍光画像検出基板上にプローブ物質を固定するかは、使用目的、使用方法に応じて適宜変更することができる。また、図２に示した以外の幾何パターンを取るようにしてもよく、直交コード等バックグラウンド光やノイズとの相関が低い幾何的配置であれば特に限定されない。
【００４２】
また、プローブパッドを幾何パターン状に固定することにより、バーコードや２ＤＱＲコード等の技術を利用して、プローブ物質のＩＤを埋めこむことができる。これにより、検出時に予め埋めこんだ情報をデコードし、反応後の蛍光を発しているプローブ物質がどのプローブに該当するか容易に識別することができる。
【００４３】
図３は、擬似ランダム符号のＭ系列を適用してプローブ物質をパターン化した一例を示した図である。例えば、２進法において「０」で表現される箇所は、プローブ物質が固定されていない箇所であり（図３の白い部分）、「１」で表現される箇所は、プローブ物質が固定されている箇所を示している（図３の黒い部分）。このような箇所（単位パターン）をひとまとまりにしたものがプローブパッドであり、プローブ物質の固定方法（プローブパッドの固定方法）は、マイクロリソグラフィー技術を利用したもの、インクジェットプリンターを利用したもの等公知の種々の方法で固定することができる。
【００４４】
Ｍ系列およびＧｏｌｄｅｎ系列直交コードのプローブ物質が固定されていない箇所（白い部分の幅）とプローブ物質を固定されている箇所の配列・設定は、プローブ物質を同じ領域に重ねて固定しない場合（第１実施形態）、バックグラウンドのノイズ成分と相関が低いものであれば特に限定されない。
【００４５】
プローブ物質が固定されていない箇所（図３の白い部分）のピッチ幅をｐ（μｍ）とすると、空間周波数が１／ｐ以外のノイズを相関検出で除去することができる。したがって、蛍光画像検出基板の大きさおよび蛍光画像測定の解像度を考慮して、ピッチ幅は可能な限り小さくすることが好ましい。また、プローブ物質が固定されている箇所（図３の黒い部分）の単位パターン数（総数）をｎとすると、Ｓ／Ｎ比はプローブ物質が固定されている箇所の単位パターン数に比例してｎ倍となり、蛍光強度は（√ｎ）倍となる。蛍光画像検出基板の大きさをＬとし、プローブ物質の固定可能な解像度をｄとすると、Ｌ／ｄの単位パターン数のプローブ物質を蛍光画像検出基板上に固定することができる。
【００４６】
縞状パターンにより固定する場合、ピッチ幅（白い部分の幅）が等間隔の縞状のパターンを適用する。ピッチ幅をｐ（μｍ）とした場合、空間周波数が１／ｐ以外のノイズを相関検出で除去することができる。したがって、ピッチ幅ｐは蛍光画像検出基板の大きさＬを考慮して、可能な限り小さくすることが好ましい。縞状パターンの単位パターン数（図２中の黒い部分の総数）をｎとすると、Ｓ／Ｎ比は縞状パターンの単位パターン数に比例してｎ倍となり、蛍光強度は（√ｎ）倍となる。プローブ物質の固定可能な解像度をｄとすると、Ｌ／２ｄの単位パターン数をとることができる。なお、蛍光画像検出基板の大きさＬの関係上、単位パターン数を増加させることができない場合であっても、蛍光強度の分布の観測のスキャン数を複数回繰り返せば、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。また、例えば２ＤＱＲコードのような２次元の配置は、（Ｌ／ｄ）２の単位パターン数のプローブ物質を蛍光画像検出基板上に固定することができる。
【００４７】
図４は、ＤＮＡチップ法等の蛍光画像検出方法において、本発明の蛍光画像検出基板の概念図を示したものである。蛍光画像検出基板１の少なくとも一面に各プローブ物質が幾何パターン状に固定されている。プローブパッド２は、プローブ物質が固定されている箇所（図４では、黒い部分）と、プローブ物質が固定されていない箇所（図４では、白い部分）とからなり、Ａ〜Ｘの２４個をアレイ状に配置し、スポット状ではなく幾何パターン状になるように固定する。本発明において、プローブパッド２は、プローブ物質が固定されている箇所と固定されていない箇所（各個所を単位パターン３という）からなる。なお、図４では、Ａ〜Ｘまで同様の幾何パターン状に蛍光画像検出基板１に固定している場合を示しているが、それぞれ異なる幾何パターン状に固定するようにしてもよい。また、必要に応じてプローブパッド２の個数を変更できることはいうまでもなく、プローブパッド２が少なくとも一つあればよい。また、例えば、図４中のＡ〜Ｈを擬似ランダム符号、Ｉ〜Ｐを直交コード、そしてＱ〜Ｘを縞状パターン等、それぞれ異なる幾何パターンを構成するように各プローブパッド２を固定することもできる。
【００４８】
また、単位パターン３のプローブ物質が固定されている箇所と固定されていない箇所の組合せは、使用目的、使用方法等に応じて適宜任意に変更することができる。
【００４９】
本発明の蛍光画像検出基板１の材質は、スライドガラス、硬質ガラス等公知の種々の材質を使用することができ、形状等は特に限定されず、試験管の内壁等に適用する等使用目的等に応じて適宜変更することができる。
【００５０】
また、詳細は後述するが、プローブパッド２同士を重ねて固定するようにしてもよい。なお、「プローブパッド２同士を重ねて固定する」とは、プローブ物質の上にプローブ物質を固定するのではなく、マクロ的なスケールで同じ領域に重ねて固定されていることを意味し、分子的なスケールではそれぞれのプローブ物質は蛍光画像検出基板１に固定されていることを意味する。
【００５１】
次に、図４に示した蛍光画像検出基板１上全体でターゲット物質と反応させる（ステップ１３）。なお、プローブ物質がプローブＤＮＡであり、かつ、ターゲット物質がターゲットＤＮＡである場合、蛍光画像検出基板１上全体でハイブリダイゼーションさせる。
【００５２】
反応後、反応生成物により発せられた蛍光強度の分布を観測する（ステップ１４）。反応生成物により発せられた蛍光が微弱である場合、蛍光強度の分布を相関検出する（ステップ１５）。なお、蛍光強度の分布を相関検出する際、後述する幾何パターン分布ｐ（ｘ）も相関検出する。
【００５３】
通常、反応後に蛍光画像検出基板１を洗浄するが、後述する相関検出を行いノイズ成分を除去できるので、本発明においては蛍光画像検出基板１を洗浄し、浮遊したターゲット物質を取り除く工程を省略するかもしくは簡便化することができる。なお、サンプル濃度が高濃度の場合等、必要に応じて相関検出を省略することができる。
【００５４】
図５は、プローブ物質とターゲット物質との反応後に検出される蛍光強度の空間分布を示した図である。なお、説明の便宜上、プローブ物質がＭ系列で１次元に固定されている場合を説明する。
【００５５】
図５（ａ）のように、パターン方向にｘ軸をとり、図５（ｂ）のように、プローブ物質が固定されている部分は１をとり、プローブ物質が固定されていない部分では−１をとる関数（パターン信号）をｐ（ｘ）とする（以下、ｐ（ｘ）を幾何パターン分布という）。反応後に検出される蛍光強度の空間分布を図５（ｃ）のように測定信号をｓ（ｘ）とし、ｐ（ｘ）とｓ（ｘ）との相関Ｉを（数１）で計算する。
【００５６】
【数１】
2007046933.tif 000003
最後に相関Ｉが大きい値を示したプローブパッドのプローブに結合する相補的な物質が検出されたと判断する。
【００５７】
相関法を有効に機能させるためには、バックグラウンドのノイズの分布とｐ（ｘ）との相関が小さくなるようなｐ（ｘ）を選択する。反応後のターゲット物質からの蛍光強度空間分布とｐ（ｘ）の相関は高いので、バックグラウンドの影響を除去することができる。なお、２次元にパターン化した場合にも、（数４）によって、２次元分布ｐ（ｘ、ｙ）を計算することができる。これらにより、蛍光強度が弱くてもノイズと区別することができるので、ターゲット物質を検出することができるようになる。
【００５８】
【数２】
2007046933.tif 000004
縞状パターンでは、特定の空間周波数をもつため、相関検出のかわりにフーリエ変換を行なうことにより、検出感度を向上させることもできる。すなわち、ｓ（ｘ）をフーリエ変換し、予め設定した縞状パターン固有の空間周波数の強度を相関Ｉの代わりに利用することもできる。
【００５９】
ターゲット物質に複数のターゲット物質が含まれている場合、蛍光画像検出基板１上の点ｉにおけるプローブ物質ｊの面積あたりの濃度をｃ（ｉｊ）とする。ターゲット物質中に含まれるターゲット物質のうちで、ターゲット物質ｊと相補的なプローブ物質の濃度をｄ（ｊ）とする。この場合得ることができる蛍光強度分布Ｉ（ｉ）は、
【００６０】
【数３】
2007046933.tif 000005
のようになる。ここで、αは比例定数である。
【００６１】
また、（数３）をマトリックス形式で表記すると、
【００６２】
【数４】
2007046933.tif 000006
となる。｛Ｉ｝はＩ（ｉ）をｉ番目成分とするベクトル、｛ｄ｝はｄ（ｊ）をｊ番目成分とするベクトル、［Ｃ］はｃ（ｉｊ）を（ｉｊ）成分とするマトリックスである。
【００６３】
また、蛍光強度分布が得られた場合、［Ｃ］は蛍光画像検出基板１作成時に既知であるので、ターゲット物質の無次元濃度α｛ｄ｝は（数５）のように求めることができる。
【００６４】
【数５】
2007046933.tif 000007
この場合、マトリックスＣが正方でない場合や正則でない場合は適宜最小二乗法、一般逆行列等を利用して解を導出する。また、｛ｄ｝に関する制約や予め得られる情報を制約条件として最適化問題として定式化して、解を求めることもできる。例えば、濃度は正の値であり、上限値が予め得られている場合等これらの情報を制約として｛ｄ｝を決定する。
【００６５】
相関検出手段（ステップ１５）の終了後、測定を終了する（ステップ１６）。
【００６６】
図６は本発明に係る蛍光画像検出方法の第２実施形態の手順の例を示すフローチャートである。なお、上述した第１実施形態と重複する箇所の説明は省略する。
【００６７】
第２実施形態では、第１実施形態とは異なり、幾何パターン状のプローブパッド２を重ねて蛍光画像検出基板１上に固定する（ステップ２２）。
【００６８】
図７は、プローブパッド２を重ねて固定した様子を示した概念図である。従来では、異なるプローブ物質に対してもプローブパッド２は正方形や円形等のそれぞれ同じ形状であったため、プローブパッド２が重なるとどのスポットの反応生成物が発光しているのか区別することができなかったが、本発明では、プローブ物質を幾何パターン状に固定しているため、プローブパッド２を重ねて固定しても、どの反応生成物から発光しているのか容易に区別することができるようになる。
【００６９】
図７（ａ）は、従来の方法により、プローブ物質を重ねてスポットして固定した場合を示した図であり、図７（ｂ）は、その方法によりターゲット物質と反応させた後の蛍光強度の分布の観測を行なった場合の様子を示した図である。図７（ｃ）は、プローブパッド２を異なる幾何パターンを用いて重ねて固定した場合を示した図であり、図７（ｄ）は、その方法によりターゲット物質と反応させた後の蛍光強度の分布の観測を行なった場合の様子を示した図である。
【００７０】
図７（ａ）のように、Ａ〜Ｚまでの２６種類のプローブパッド２を重ねて固定した場合、図７（ｂ）のように検出され、例えば、Ｃのプローブ物質と反応した反応生成物が蛍光を発していても、従来の方法ではスポットの位置で識別を行なっているため、どのプローブ物質に対して反応した反応生成物が蛍光を発しているのか区別することができない。
【００７１】
一方、図７（ｃ）のように、プローブパッド２を異なるプローブに対して異なる幾何パターン状に重ねて固定化した場合、プローブパッド２の幾何パターンからＡ〜Ｚを識別することができるため、プローブパッド２が重なっていても、どのプローブ物質に対して反応した反応生成物が蛍光を発しているのか区別することができる。また、プローブパッドを重ねて固定することにより基板の面積を小さくすることができるので、反応の均一性の確保や必要サンプル量が少なくなる等の効果が挙げられる。
【００７２】
プローブパッド２を重ねて蛍光画像検出基板１上に固定する方法としては、例えば、図８に示すようにプローブ物質を含有する溶液を順次重ねてスポットする方法、予め同じ箇所に固定すべきプローブ物質を含有する溶液を混合させてスポットする方法等公知の種々の方法があげられる。
【００７３】
例えば、表１の試料Ａ〜試料Ｇのようにそれぞれ異なるプローブ物質を３桁の２進数で表したＩＤ番号を割り振ってパターン化する。すなわち、単位パターン数が３であるプローブパッドとなる。なお、表１中、２進法の「１」は、プローブ物質が固定されている箇所を示し、２進法の「０」は、プローブ物質が固定されていない箇所を示す。
【００７４】
【表１】
2007046933.tif 000008
蛍光画像検出基板１上に、表１中の３桁目が「１」であるプローブ物質（試料Ａ、試料Ｂ、試料Ｃ、試料Ｄ）を重ねて固定する（以下、「プローブ物質３」という）。また、プローブ物質３を固定した蛍光画像検出基板１上に、プローブ物質３と重ならないように、表１中の２桁目が「１」であるプローブ物質（試料Ａ、試料Ｂ、試料Ｅ、試料Ｆ）を重ねて固定する（以下、「プローブ物質２」という）。さらに、プローブ物質２およびプローブ物質３を固定した蛍光画像検出基板１上に、プローブ物質２およびプローブ物質３と重ならないように、表１中の１桁目が「１」であるプローブ物質（試料Ａ、試料Ｃ、試料Ｅ、試料Ｇ）を重ねて固定する（以下、「プローブ物質１」という）。
【００７５】
図９に示したように、プローブ物質１、プローブ物質２およびプローブ物質３を全て同一蛍光画像検出基板１上に固定した後、蛍光画像検出基板１上にターゲット物質と反応させる（ステップ２３）。
【００７６】
反応後、反応生成物により発せられた蛍光強度の分布を観測する（ステップ２４）。例えば、試料Ｃのプローブ物質とターゲット物質が反応したと仮定すると、反応生成物により発せられた蛍光は、試料Ｃが含まれているプローブ物質１とプローブ物質３とから蛍光を発することとなるので、表１から試料Ｃが反応したと判定することができる。蛍光強度の分布の観測（ステップ２４）後、必要に応じて蛍光強度の分布を相関検出（ステップ２５）する。
【００７７】
上記では試料Ａ〜試料Ｇの７種類のプローブ物質がある場合の例について説明したが、例えば１０００種類のプローブ物質の場合、２１０が１０２４となるので２進数のＩＤ番号を適用してパターン化するには、この場合、単位パターンが１０桁からなるプローブパッドを用いることができる。これにより、従来法では１０００個のアレイをもつ基板が必要であったが、本発明では、１０個の単位パターンからなる基板に高密度化できる。
【００７８】
次に、本発明の蛍光画像検出器について図面を参照にしながら詳細に説明する。なお、上述した内容と重複する箇所については説明を省略する。
【００７９】
図１４は、本発明に蛍光画像検出器の概略図である。本発明の蛍光画像検出器本体４の内部には、励起光を照射する光源５と、励起フィルター７と、蛍光を入射方向に対して垂直になるように反射させて光路を変更させるダイクロックミラー８と、ＸＹスキャナー（ガルバノスキャナー）９を介し、励起光を集光するための対物レンズ１０が収められている。
【００８０】
また、ＸＹスキャナー９のダイクロックミラー８を介して反対側に蛍光フィルター１１が設置されており、蛍光フィルター１１を透過した蛍光強度の分布を観測し、観測した蛍光強度の分布を電気信号に変換して増幅する光検出部１３と、測定データを相関検出する相関検出部１４が本体４内に収められている。
【００８１】
本体４内の光源５から励起光が照射され、コリメーターレンズ６を透過し、励起フィルター７により励起に適した波長の光が透過される。励起光は、ダイクロックミラー８により、励起光の入射方向に対して垂直に反射し、ＸＹスキャナー９を透過する。ＸＹスキャナー９を透過した励起光は対物レンズ１０で集光し、蛍光画像検出基板１に励起光を照射する。
【００８２】
プローブ物質と蛍光物質で標識化されたターゲット物質との反応による反応生成物に励起光が照射されると、蛍光物質が励起し蛍光を発する。この反応生成物により発せられた蛍光は、再度対物レンズ１０、ＸＹスキャナー９およびダイクロックミラー８を透過する。ＸＹスキャナー９のダイクロックミラー８を介して反対側に設置してある蛍光フィルター１１を反応生成物により発せられた蛍光が透過し、集光レンズ１２により集光され、光検出部１３に入射する。
【００８３】
光検出部１３により、反応生成物により発せられた蛍光強度の分布が観測され、観測した蛍光強度の分布を電気信号に変換する。この電気信号は光検出部１３で増幅され、相関検出部１４により相関検出を行なう。相関検出部１４には、データ入出力部（図示せず）を有しており、予め蛍光画像検出基板１のプローブパッドの大きさ、幾何パターンの形状等の外部情報をデータ入出力部に入力・記憶させ、データ入出力部が記憶した外部情報を相関検出部１４に転送する。相関検出部１４では、転送された外部情報をもとに幾何パターン分布を構成し、電気信号と共に相関検出を行なう。相関検出された電気信号は、データ入出力部により出力される。
【００８４】
光源５は、励起光を照射するものであれば特に限定されず、例えば、レーザー、タングステンランプ、ＬＥＤ等公知の種々の光源を使用することができる。
【００８５】
コリメーターレンズ６は、主に、光源５から出射された光をそれぞれ平行光束にするためのものであり、本発明では、公知の種々のコリメーターレンズを使用することができる。
【００８６】
励起フィルター７は、光源５から照射された励起光から、励起に適した波長の光を通過させる。励起フィルター７に励起光を透過させる前にコリンメーターレンズ６に透過させてから励起フィルター７に励起光を透過させるようにしてもよく、コリンメーターレンズ６を透過させずに励起フィルター７に直接透過させるようにしてもよい。
【００８７】
ダイクロックミラー８は、励起光の入射方向に対して垂直に反射するように設置されている。なお、図１４において、励起フィルター７、ダイクロックミラー８およびＸＹスキャナー（ガルバノスキャナー）９の光学系は、共焦点スキャナーの例を示しているが、非共焦点光学系等を適用することもできる。また、ダイクロックミラー８の代わりに通常のハーフミラー等を使用してもよく、ＸＹスキャナー９の代わりにプリズム等を使用してもよい。
【００８８】
ダイクロックミラー８およびＸＹスキャナー９を透過した励起光は、対物レンズ１０により集光され、蛍光画像検出基板１上に励起光を照射する。
【００８９】
蛍光フィルター１１は、特定の波長を有する蛍光のみを透過させる。蛍光フィルター１１は、反応生成物の発する蛍光波長によってＬＰフィルター、ＳＰフィルターおよびＢＰフィルター等適宜変更することができる。
【００９０】
集光レンズ１２は、反応生成物により発せられた蛍光を集光し、集光された蛍光は光検出部１３へ入射する。本発明で使用する集光レンズ１２は、公知の種々の集光レンズを使用することができる。
【００９１】
光検出部１３は、反応生成物により発せられた蛍光強度の分布を観測すると、電気信号に変換して増幅する。光検出部１３には、例えば、ＣＣＤ等のアレイ型検出器、光電子倍増管（ＰＭＴ）、フォトダイオード等公知の種々の増幅器を使用することができる。なお、光検出部１３にＣＣＤを使用した場合、ＸＹスキャナー９の設置を省略することができる。
【００９２】
なお、プローブパッド２が、蛍光画像検出基板１上に幾何パターン状に重ねて固定されている場合であっても、反応生成物により発せられた蛍光強度の分布を電気信号に変換・増幅する。
【００９３】
光検出部１３により増幅された電気信号は、相関検出部１４により相関検出が行なわれる。
【００９４】
相関検出部１４は、データ入出力部（図示せず）を有しており、測定前に外部情報を予めデータ入出力部に入力し、記憶させる。データ入出力部が記憶した外部情報を相関検出部１４に転送し、これをもとに幾何パターン分布を構成し、幾何パターン分布と電気信号との相関検出を行なう。相関検出された電気信号は、蛍光画像としてデータ入出力部により出力、表示される。
【００９５】
予めデータ入出力部に入力する外部情報として、例えば、蛍光画像検出基板１の各プローブパッド２の大きさ、どのような幾何パターン状に固定されているか、図４に示したようなアレイ状でプローブ物質が固定されているのか、プローブパッド２が重ねて固定されているのか等を入力する。
【００９６】
また、プローブパッド２が擬似ランダム符号または直交コード等で蛍光画像検出基板１に固定されている場合、符号もしくはコード、プローブパッド２の各単位パターン３の大きさ、単位パターン３の総数等も併せて入力する。
【００９７】
さらに、プローブパッド２が縞状パターンで蛍光画像検出基板１に固定されている場合、プローブ物質が固定されている箇所と固定されていない箇所の総数、ピッチ幅等も併せて入力する。なお、これら外部情報は、後述するプログラムや記憶媒体等に保存させることもできる。
【００９８】
図１５は、相関検出部１４の回路構成図であり、蛍光画像検出基板１の幾何パターンが縞状パターンであって、空間角振動数がωの場合に反応生成物より発せられたな蛍光をスキャンした状態を示している。相関検出における積分は、ローパスフィルター（ＬＰＦ）１５により行なう。相関検出は、幾何パターン分布ｐ（ｘ）と相関の高い信号の検出を行なう。測定信号ｓ（ｘ）に含まれる各種信号のうち、幾何パターン分布ｐ（ｘ）と相関の高い成分のみが直流となり、ローパスフィルター１５を通過することができる。パターン信号ｐ（ｘ）と相関の低い成分は、周波数が０Ｈｚ以外の交流信号に変換されるのでローパスフィルター１５により除去される。
【００９９】
また、図１６のように、幾何パターン分布ｐ（ｘ）と測定信号ｓ（ｘ）間の位相差を０°に調整し、ＰＳＤ１７に幾何パターン分布ｐ（ｘ）を入力する位相回路１６を利用することもできる。なお、相関検出は、アナログ回路を用いて行なってもよく、デジタル回路を用いて行なってもよく、コンピュータおよびソフトウェアを用いて数値的に相関解析を行なうこともできる。
【０１００】
さらに、プローブ物質の幾何パターンが縞状パターンである場合、相関検出の代わりにフーリエ変換を行ない、予め既知の縞状パターンの空間周波数を抽出するようにしてもよい。
【０１０１】
次に、本発明のプログラムについて図面を参照にしながら詳細に説明する。なお、上述した内容と重複する箇所については説明を省略する。
【０１０２】
図１６は、本発明のプログラムの処理の流れを示したフローチャートである。ステップ３２からステップ３６までが本発明のプログラムに相当し、本発明の蛍光画像検出器でｊｐｅｇ等のデジタル画像データとプローブ物質の幾何パターン等の情報をもとにコンピュータで相関度を解析する。
【０１０３】
本発明のプログラムの動作は、まず、プローブ物質とターゲット物質との反応生成物により発せられた蛍光強度の分布を観測し、光検出部１３により電気信号に変換し、増幅する（ステップ３２）。
【０１０４】
反応生成物により発せられた蛍光強度の分布を観測し、電気信号に変換・増幅した後、予めデータ入出力部により入力、記憶させたプローブ物質の幾何パターンに関する外部情報を読み取る（ステップ３３）。具体的には、プローブ物質は、どのような幾何パターンで蛍光画像検出基板１に固定されているか、プローブ物質が重なって蛍光画像検出基板１に固定されているか否かを判断する。プローブ物質を重ねて固定している場合、どの単位パターン３が蛍光を発しているか確認して読み取る。
【０１０５】
また、プローブ物質が擬似ランダム符号または直交コード等で蛍光画像検出基板１に固定されている場合、プローブパッド２の各単位パターン３の大きさ、単位パターン３の総数等も併せて確認して読み取る。
【０１０６】
さらに、プローブ物質が縞状パターンで蛍光画像検出基板１に固定されている場合、プローブ物質が固定されている箇所と固定されていない箇所の総数、ピッチ幅等も併せて確認して読み取る。
【０１０７】
ステップ３３の終了後、読み取った外部情報をもとにプローブ物質の幾何パターン分布を構成する（ステップ３４）。
【０１０８】
プローブ物質の幾何パターン分布の構成後、相関検出を行ない（ステップ３５）、相関度を出力、表示を行なう（ステップ３６）。
【０１０９】
上述した一連の処理は、ハードウェアにより実行させることもできるが、ソフトウェアにより実行させることもできる。一連の処理をソフトウェアにより実行させる場合には、そのソフトウェアを構成するプログラムが専用のハードウェアに組み込まれているコンピュータ、またはプログラムをインストールすることで、プログラムの機能を実行することが可能なコンピュータ等に記録媒体等からインストールされるようにすることもできる。
【０１１０】
また、本発明のプログラムを、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納することもできる。記録媒体とは、例えば、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤ等の可搬媒体や、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＨＤ等の固定媒体、あるいは、ＬＡＮ、インターネット等のネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線等のようなプログラムを保持する公知の種々の通信媒体を含む。
【０１１１】
コンピュータが読み取ったプログラムを実行することにより、上述した一連の処理を実行するだけでなく、そのプログラムの指示に基づき、コンピュータ上で稼働しているＯＳ（オペレーティングシステム）が実際の処理の一部または全部を行い、その処理によって上述した一連の処理を実現するようにもできる。
【０１１２】
さらに、記憶媒体から読み取られたプログラムが、コンピュータに挿入された機能拡張ボードやコンピュータに接続された機能拡張ユニットに備えられたメモリーに書込まれた後、そのプログラムの指示に基づき、その機能拡張ボードや機能拡張ユニットに備わるＣＰＵ等が実際の処理の一部または全部を行い、その処理によって上述した一連の処理を実行するようにもできる。
【実施例】
【０１１３】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１１４】
蛍光画像検出基板１に蛍光色素（フルオレセイン溶液）を図１０（Ａ）のような縞模様のパターンで印刷した。縞模様のピッチ幅ｐは０．２ｍｍで、単位パターン数を３０本とした（以下、実施例１という）。また、図１０（Ｂ）に示すように、比較例として、実施例１と同じ条件で矩形領域に均一に蛍光色素を印刷した。実施例１と比較例をバックグランド光が強く、かつ、励起光が弱い劣悪な条件で蛍光強度を顕微鏡で測定した。なお、測定の際には、カットオフ波長５００ｎｍのフィルターで励起光を遮断した。
【０１１５】
測定結果を図１１に示す。画像の階調は、２５６階調である。白色が蛍光強度０を示し、黒色が蛍光強度が強いことを示している。
【０１１６】
蛍光強度の分布を図１３に示す。図１２にデータスキャン位置を示す。Ａ−Ａ´がパターン上の分布を表す。Ｂ−Ｂ´は従来法の均一なパッド上の分布を表す。Ｃ−Ｃ´は蛍光色素が固定していない領域の検出光の分布を表す。
【０１１７】
表２に、実施例によって得られたシグナルとノイズのパワーとＳ／Ｎ比を比較例とともに示す。
【０１１８】
【表２】
2007046933.tif 000009
従来法ではＳ／Ｎ比が０．１３程度であるのに対し、本発明では、７．１３となり、約５５倍Ｓ／Ｎ比が向上することが確認された。このことにより、本発明は、バックグラウンドのノイズと蛍光信号のＳ／Ｎ比を向上させることができるので、誤検出を防止することができることがわかる。また、相関検出を行なうことにより、蛍光強度が微弱であってもシグナルを誤検出することなく検出することができることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】本発明の第１実施形態の手順の例を示すフローチャートである。
【図２】プローブ物質をパターン化して配置する一例を示した図である。
【図３】Ｍ系列を適用して、プローブ物質をパターン化した場合の蛍光画像検出基板の一部を抜き出した図である。
【図４】本発明のＤＮＡチップ蛍光画像検出基板の概念図である。
【図５】（ａ）：幾何的にパターン化したプローブ物質を示した図である。（ｂ）：幾何的にパターンしたものを関数とした図である。（ｃ）：蛍光強度の空間分布である。
【図６】本発明の第２実施形態の手順の例を示すフローチャートである。
【図７】（ａ）：従来の方法を用いてプローブ物質を重ねて固定した場合を示した図である。（ｂ）：（ａ）の方法により蛍光検出を行なった場合の様子を示した図である。（ｃ）：幾何的にパターン化したプローブ物質を重ねて固定した場合を示した図である。（ｄ）：（ｃ）の方法により蛍光検出を行なった場合の様子を示した図である。
【図８】プローブ物質を含有する溶液を順次重ねてスポットする方法を示した図である。
【図９】プローブ物質を重ねてハイブリダイゼーションを行なう場合を示した図である。
【図１０】（Ａ）：実施例で使用した、印刷した縞模様のパターンを示した図である。（Ｂ）比較例のパターンを示した図である。
【図１１】実施例で得られた蛍光画像を示した図である。
【図１２】蛍光強度分布のデータをスキャンしたスキャン位置を示した図である。
【図１３】蛍光強度分布を示すグラフである。
【図１４】蛍光画像検出器の概略図である。
【図１５】相関検出部の蛍光をスキャンした場合の回路構成例を示した図である。
【図１６】相関検出部において、パターン信号（ｘ）と測定信号ｓ（ｘ）の位相回路を示した図である。
【図１７】本発明のプログラムの処理を示したフローチャートである。
【符号の説明】
【０１２０】
１      蛍光画像検出基板
２      プローブパット
３      単位パターン
４      本体
５      光源
６      コリメーターレンズ
７      励起フィルター
８      ダイクロックミラー
９      ＸＹスキャナー（ガルバノスキャナー）
１０    対物レンズ
１１    蛍光フィルター（吸収フィルター）
１２    集光レンズ
１３    光検出部
１４    相関検出部
１５    ローパスフィルター（ＬＰＦ）
１６    位相回路
１７    ＰＳＤ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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