【事件の表示】
　特願２０１０−１７９３７８「ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインＡ様蛋白質の生産方法」拒絶査定不服審判事件〔平成２２年１１月　４日出願公開、特開２０１０−２４６５６９〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯
　本願は、特許法第４１条に基づく優先権主張を伴う２００５年７月１日（優先日　平成１６年７月６日）を国際出願日とする特願２００６−５２８８６７号の一部を、平成２２年８月１０日に新たな出願としたものであって、平成２５年５月２４日に手続補正書が提出され、同年９月９日付けで拒絶査定がされたところ、同年１２月１７日に拒絶査定不服審判の請求がなされるとともに、同日付けで手続補正書が提出されたものである。
　
第２　補正却下の決定
［補正却下の決定の結論］
　平成２５年１２月１７日付けの手続補正を却下する。
　
［理由］
１．補正の内容
　平成２５年１２月１７日付けの手続補正（以下、「本件補正」という）は、拒絶査定不服審判の請求と同時にしたものであって、補正前の請求項１と補正後の請求項１の記載は次のとおりである。
　
補正前：「【請求項１】プロテインＡ様蛋白質、または、その配列の任意の一部分から構成されイムノグロブリン結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、およびその配列に作動可能に連結されたブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌で機能しうるプロモーターを含み、発現した該蛋白質がＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを示す、ＤＮＡ。」
　
補正後：「【請求項１】
Ｘドメインを含まない
Ｘドメインを除く
　
２．補正の適否
　上記補正後の請求項１は、補正前の「プロテインＡ様蛋白質」、「その配列の任意の一部分」という特定事項を、それぞれ、「
Ｘドメインを含まない
Ｘドメインを除く
　そこで、補正後の請求項１に係る発明（以下、「本願補正発明」という）が、平成１８年改正前特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定を満たすものであるか（特許出願の際独立して特許を受けることができるものであるか）について検討する。
　　
（１）本願補正発明
　本願補正発明は、上記１．に「補正後」として記載したとおりのものである。
　
（２）引用例の記載事項
　拒絶理由において引用文献１として引用された、本願の優先日前に頒布された刊行物である特開昭６２−１１１６８８号公報（以下、「引用例１」という。）には、以下の事項が記載されている。
　
ア　「４．プロテインＡ様物質の遺伝子を含有する組み換えプラスミドであって，
（ａ）ベクター，
（ｂ）λplac5ＤＮＡのラクトースオペロンのプロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ領域，および
（ｃ）該プロモーターの制御下にあるプロテインＡ様物質の遺伝子，
を有する組み換えプラスミド。
・・・
７．前記プロテインＡ様物質の遺伝子が，プロテインＡ様物質の活性部分（IgGのFc−結合能力を有する部分）のＮ末端あるいはＣ末端のアミノ酸にシステインを付加せしめたことを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の組み換えプラスミド。 
８．前記プロテインＡ様物質の遺伝子が，次のポリアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する特許請求の範囲第７項に記載の組み換えプラスミド。 
 ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKC 
 ここで， 
 　Ａ；アラニン，Ｃ；システイン，Ｄ；アスパラギン酸，Ｅ；グルタミン酸，Ｆ；フェニルアラニン，Ｇ；グリシン，Ｈ；ヒスチジン，Ｉ；イソロイシン，Ｋ；リジン，Ｌ；ロイシン，Ｍ；メチオニン，Ｎ；アスパラギン，Ｐ：プロリン，Ｑ；グルタミン，Ｒ；アルギニン，Ｓ；セリン，Ｙ；チロシン　を意味する。」（特許請求の範囲）
　
イ　「プロテインＡの形状は，一般の球状蛋白質に比べて摩擦係数が高く，固有粘度が高いことから，比較的細長く伸びた分子形をしているらしい。その構造は，４つの相同性の高いサブユニット（Ｎ末端のものから順に，Ｄ，Ａ，ＢおよびＣと一般に命名され，各サブユニットは約60個のアミノ酸残基から構成される）とアミノ酸残基約150個から構成されるＣ末端サブユニットとからなる。上記４つのサブユニットＤ，Ａ，ＢおよびＣは、それぞれ、免疫グロブリン（IgG）１分子を該IgGのFc部分で結合する能力を有する。」（４頁左下欄最終行〜右下欄１１行）
　
ウ　「プロテインＡはIgGの抗原に対する親和力を大きく損なうことなくIgGに結合する能力を有するため，種々の診断および基礎研究の試験系における免疫吸着体として広く用いられている」（５頁左上欄３〜６行）
　
エ　「本発明は，上述したような従来のプロテインＡ様物質の製造法およびそれにより生産されたプロティンＡ様物質の問題点を解決するために，スタフィロコッカスのような病原性を有する危険な微生物を原料とすることなく，担体に結合しやすい高純度のプロテインＡ様物質を量産することを意図して完成されたものである。」（５頁左下欄１〜７行）
　
オ　「実施例3：プロテインＡ様物質の遺伝子断片の結合
　実施例２で塩基配列の確認されたオリゴデオキシリボヌクレオチドの各断片を第2図に従って，T4DNAリガーゼを用いて以下の方法により結合させた。・・・
　
実施例4：プラスミドベクターの構築
　プロテインＡ様物質の遺伝子を組み込むためのλplac5ＤＮＡラクトースオペロンのプロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ領域を有するプラスミドヘクターを以下のようにして構築した。・・・
　
実施例5：プロテインＡ様物質の遺伝子を導入した組み換えプラスミドの構築
　実施例4で得られたプラスミドベクターに実施例3で得られたプロテインＡ様物質のＤＮＡ配列を組み込んだ組み換えプラスミドを以下のようにして構築した。・・・
　
実施例6：組み換えプラスミドによるエセリシア　コリー　K-12株　HB101の形質転換
　・・・CaCl2処理されたエセリシア　コリー　K-12株HB101と先に得た組み換えプラスミドＤＮＡの溶液とを０℃にて混合・・・。
　　
実施例10：エセリシア・コリー　K12　SPA-FcによるプロテインＡ様物質の生産及びその精製 
　プロテインＡ様物質ＤＮＡが組み込まれた組み換えプラスミドを保有するエセリシア・コリー　K12  SPA-Fcを・・・増殖させた。・・・エセリシア・コリー　K-12 SPA-Fcは少なくとも細胞１個あたり3×105分子のプロテインＡ様物質を生成していることがわかった。」（１２頁左上欄下から３行〜１５頁右下欄最終行） 
 　 
 カ　「実施例13：プロテインＡ様物質固定化不活性カラムによるIgGの分画−1 
　実施例11で得られたカラムをpH8.0のリン酸緩衝液で平衡化し，これに，２倍に稀釈されたマウス血清をチャージした。IgM，IgAおよびIgEは溶出液中に定量的に回収された。IgG1，IgG2a，IgG2bはそれぞれpH6.0-7.0，4.5-5.0，3.5-4.0で順に溶出され，プロティンＡを固定化したカラムとほぼ同様の挙動を示した。しかしながら，実施例11で得られたプロティンＡ様物質固定化不活性カラムの吸着容量は約30〜40mg／mlであり，市販品のプロティンA−セファロースCL-4B（ファルマシア製）のヒトIgGに対する吸着容量が約12〜15mg／mlであるのに比べ，約３倍の吸着容量を有していた。」（１６頁左下欄１４行〜右下欄８行）　
　
キ 「
」（図２）
　
　上記アの記載から、引用例１には、以下の発明が記載されていると認められる。
「プロテインＡ様物質の遺伝子を含有する組み換えプラスミドであって、
（ａ）ベクター、
（ｂ）λplac5ＤＮＡのラクトースオペロンのプロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ領域、および
（ｃ）該プロモーターの制御下にあるプロテインＡ様物質の遺伝子、
を有する組み換えプラスミド。」（以下、「引用発明」という。）
　
　拒絶理由において引用文献５として引用された、本願の優先日前に頒布された刊行物である特開平６−２９６４８５号公報（以下、「引用例５」という。）には、以下の事項が記載されている。
　
ク　「【０００２】
【従来の技術】一般に、遺伝子組換え技術を利用した異種蛋白質の生産は、大腸菌を宿主として利用している。しかし、大腸菌は生産した異種蛋白質を菌体内に蓄積するため、生産量が制限され、異種蛋白質の回収、精製操作が煩雑になる等の問題点がある。また、異種蛋白質を菌体外に分泌することを特徴とする枯草菌を利用した異種蛋白質生産系も確立されたが、分泌された異種蛋白質が枯草菌由来のプロテアーゼの作用により分解され、その蓄積量は著しく少ないという問題点に直面している。
【０００３】一方、鵜▲高▼らは、バチルス属細菌バチルス・ブレビス４７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ４７）（ＦＥＲＭ  Ｐ−７２２４）を宿主とする異種蛋白質生産系を確立し、提案した（例えば、特開昭６０−５８０７４号、同６２−２０１５８３号公報参照）。バチルス・ブレビス４７は菌体外に多量の蛋白質を生産し、菌体外プロテアーゼ活性が弱い特徴をもち、遺伝子組換え技術を利用した異種蛋白質の生産に於いて、大腸菌、枯草菌の欠点を克服した優れた宿主として注目されている。
【０００４】鵜▲高▼らは、バチルス・ブレビス４７を用いてα−アミラーゼ（特開昭６２−２０１５８３号公報、H.Yamagata et.al.,J.Bacteriol 169,1239（1987）参照）やブタペプシノーゲン（鵜▲高▼重三、日本農芸化学会昭６２年度大会講演要旨集ｐ８３７−８３７、塚越規弘、日本農芸化学会誌６１，６８（１９８７）参照）等の分泌生産に成功している。さらに鵜▲高▼らは、バチルス・ブレビス４７に比べ菌体外プロテアーゼ活性が著しく低い新規バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓＨＰＤ３１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７、Ｈ１０２株と同一菌株である）（特開昭６３−５６２７７号公報参照）を分離し、異種蛋白質生産の宿主として利用している。
【０００５】かかる生産系をヒト上皮細胞増殖因子（ｈＥＧＦ）に適用すると、バチルス・ブレビス４７（１５mg／Ｌ）に対して約１５倍の高効率でｈＥＧＦの生産することが見い出されている（特開平２−３１６８２号公報参照）。また、発現ベクターの最適化によりその生産量は、最高１．２ｇ／Ｌにも達している（Ｓ．Ｅｂｉｓｕら、Biosci.Biotech.Biochem.,56(5),812-813,1992参照）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】前記のように、バチルス・ブレビスを宿主として用いる異種蛋白質の分泌生産系は大腸菌、枯草菌と比べ非常に効率のよい系であることが認識されている。しかしながら、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１を始めとする従来既知のバチルス属細菌を宿主として用いた異種蛋白質生産系であっても、ヒト成長ホルモン（以下、「ｈＧＨ」と略記する場合もある）、インターロイキン２（以下、「ＩＬ２」と略記する場合もある）等の特定の異種蛋白質の生産に適用すると菌体外に分泌されたそれらの蛋白質が宿主自体のプロテアーゼ活性により分解を受け、その蓄積量が著しく低下するとの問題が生じており、産業上、より安定に異種蛋白質を蓄積する宿主が求められている。
【０００７】したがって、本発明の目的は、従来既知のバチルス・ブレビスに比べて菌体外プロテアーゼ活性が有意に低い変異バチルス・ブレビスを提供することである。この変異バチルス・ブレビスは、代表的な例として、ｈＧＨ及びＩＬ２の生産に適する菌株である。」（【０００２】〜【０００７】段落）
　
ケ　「【００１４】前述のように本発明の変異菌株は、遺伝子組換え用の宿主菌として有利に使用することができる。したがって、その有用性は以下の使用例によって確認できるであろう。まず、本発明の宿主菌を形質転換するのに使用するｈＧＨまたはＩＬ２をコードするＤＮＡを含有する発現プラスミドを調製する。発現プラスミドは、バチルス・ブレビスで機能するプロモーターを含有しているものが好ましい。
【００１５】プロモーターの具体的なものとしては、例えば前記バチルス・ブレビス４７及び同ＨＰＤ３１のプロモーター領域を含有するＤＮＡを挙げることができる。プロモーター領域を含有するＤＮＡは、上記プロモーター以外に、ＳＤ配列、翻訳開始コドンなどを有していることが必要であり、さらに主要菌体外蛋白質遺伝子の一部を含んでいてもよい。」（【００１４】及び【００１５】段落）
　
コ　「
」（表１）
　
サ　「【００３６】ゼラチン−ＰＡＧＥは０．５％ゼラチン、７．５％アクリルアミドの濃度で、E.Strydom らの方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 24, 214-217 (1986)) に従って行った。蛋白質分解酵素はゼラチンの分解により生ずるクリアバンドにより検出した。その結果を示す図１より、変異株バチルス・ブレビス３１−ＯＫでは、培養上清に存在する主要な蛋白質分解酵素が欠失していた。」（【００３６】段落）　
　
　拒絶理由において引用文献７として引用された、本願の優先日前に頒布された刊行物であるBIO INDUSTRY,1992,Vol.9,No.2,p.23-31（以下、「引用例７」という。）には、以下の事項が記載されている。
　
シ　「異種遺伝子の発現，その生産物の分泌には，B.brevisで高発現，効率的分泌がなされているその主要な菌体外タンパク質，すなわち細胞壁タンパク質の遺伝子を活用することにした。そのために細胞壁タンパク質（ＣＷＰ）の遺伝子をクローン化し，その遺伝子の近傍も含めて塩基配列を決定した後，転写開始部位（プロモーター領域）の解析などを行った。その結果，期待通り本遺伝子には強力なプロモーター，リボソーム結合部位と２つの翻訳開始部位，およびシグナルペプチドをコードする配列が見出された。そこで，これらを含むＤＮＡ断片を上述の各種プラスミドに挿入して発現・分泌ベクターとした（図１）１），７）。異種遺伝子をそのＣＷＰシグナル配列に直結して構築したプラスミドでB.brevisを形質転換すれば，異種タンパク質の効率よい生産が期待できる。」（２５頁左欄１７〜３３行）
　
ス　「これまで述べてきたB.brevisによる生産技術で，数々の異種タンパク質の効率的生産に成功している。これまでの成果をまとめて示したのが表１である。」（２５頁右欄２５〜２８行）
　
セ　「　
」（図１）
　
ソ　「　
」（表１）
　
（３）対比
　上記（２）オの記載によれば、引用発明の組み換えプラスミドは、エセリシア・コリー（大腸菌）を宿主として形質転換するものであり、得られた形質転換体は、プロテインＡ様物質を生成するのであるから、引用発明の「λplac5ＤＮＡのラクトースオペロンのプロモーター」は、細菌であるエセリシア・コリー（大腸菌）で機能するプロモーターであるといえ、引用発明の「プロテインＡ様物質の遺伝子」は「プロテインＡ様物質をコードするＤＮＡ」である。
　
　そうすると、本願補正発明と引用発明との間の一致点、相違点は、以下のようになる。
　
一致点： 「プロテインＡ様物質をコードするＤＮＡ、およびその配列に作動可能に連結された細菌で機能しうるプロモーターを含むＤＮＡ。」
　
相違点１： プロテインＡ様物質が、本願補正発明においては「Ｘドメインを含まないプロテインＡ様蛋白質、または、その配列のＸドメインを除く任意の一部分から構成されイムノグロブリン結合活性を有する蛋白質」と特定されているのに対し、引用発明においてはかかる特定がない点。
　
相違点２：本願補正発明においては、細菌で機能しうるプロモーターが「ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属」細菌で機能しうるもので、「発現した該蛋白質がＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを示す」と特定されているのに対し、引用発明においては、細菌で機能しうるプロモーターがエセリシア・コリー（大腸菌）で機能しうる「λplac5ＤＮＡのラクトースオペロンのプロモーター」であり、さらにβガラクトシダーゼ領域も有するが、「発現した該蛋白質がＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを示す」との特定はない点。
　
（４）相違点についての検討
ア　相違点１について
　引用例１には、引用発明の組み換えプラスミドが有するプロテインＡ様物質として、上記（２）アの特許請求の範囲８に示されたアミノ酸配列を有するものが記載されているところ、このアミノ酸配列は、本願発明の図１に示されたプロテインＡのアミノ酸配列のうちのＢドメインの配列のＣ末端にＣを付加したものであり、引用例１（上記（２）オ及びカ）においては、当該アミノ酸配列及びこれと対応する遺伝子の塩基配列が記載された図２（同キ）に従って作成した遺伝子から、エセリシア・コリー（大腸菌）を宿主としてプロテインＡ様物質を実際に発現させ、IgGに吸着することも確認されているから、引用例１に記載された当該アミノ酸配列のプロテインＡ様物質は、本願補正発明における「Ｘドメインを除く任意の一部分から構成されイムノグロブリン結合活性を有する蛋白質」に含まれるものである。そうすると、相違点１は実質的な相違点とはいえない。
　本願補正発明における「Ｘドメインを含まないプロテインＡ様蛋白質」についても、以下、検討する。
　引用例１の上記（２）イの記載によれば、プロテインＡのアミノ酸残基約150個から構成されるＣ末端サブユニット以外の部分がIgGのFc部分と結合する能力を有することが認められ、同ウ及びエの記載によれば、プロテインＡはこのIgGに結合する能力を有するために免疫吸着体として用いられること、及び、引用発明が担体に結合しやすい高純度のプロテインＡ物質の量産を意図したものであることが認められる。ここで、プロテインＡのうち、IgGに結合するドメインがＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣであり、IgGに結合しないドメインがＸドメインであることは、周知である（審尋において引用文献８として引用した特表２０００−５００６４９号公報の３頁１６〜１８行、本願明細書の先行技術文献欄（【００１１】）において非特許文献３として引用されているUhlen, M.ら．J. Bio. Chem., 1984, 259:1695-1702の1695頁右欄９〜１４行、1696頁Fig2の説明、及び1699頁左欄１１〜１２行を参照のこと）。
　そうすると、引用例１において、上記（２）アの特許請求の範囲８に記載された特定のアミノ酸配列で示されるプロテインＡ様物質に代えて、IgGの結合に必要ない部分であるＸドメインを含まないプロテインＡ様蛋白質を用いてみることは、当業者が容易に想到することである。
　
イ　相違点２について
　引用例５の上記（２）ク〜サの記載によれば、以下のことが認められる。
（ア）遺伝子組換え技術を利用した異種蛋白質の生産において、大腸菌を宿主とする場合には、生産した異種蛋白質を菌体内に蓄積するため、生産量が制限され、異種蛋白質の回収、精製操作が煩雑になるという問題があり、異種蛋白質を菌体外に分泌する枯草菌を宿主とする場合には、分泌された異種蛋白質が枯草菌由来のプロテアーゼの作用により分解され、その蓄積量は著しく少ないという問題があったこと、
（イ）バチルス・ブレビス４７は、菌体外に多量の蛋白質を生産し、菌体外プロテアーゼ活性が弱いため、上記の問題点を克服した優れた宿主として注目されていること、
（ウ）バチルス・ブレビス４７に比べて菌体外プロテアーゼ活性が著しく低いバチルス・ブレビスＨＰＤ３１も知られていること、
（エ）バチルス・ブレビスＨＰＤ３１等であっても、異種蛋白質の生産に適用すると菌体外に分泌された蛋白質が宿主自体のプロテアーゼ活性により分解を受け、蓄積量が著しく低下するとの問題が生じるため、菌体外プロテアーゼ活性が有意に低い変異菌株としてバチルス・ブレビス３１−ＯＫを作成したこと、
（オ）このバチルス・ブレビス３１−ＯＫでは、培養上清に存在する主要な蛋白質分解酵素が欠失していることを確認したこと、
（カ）上記変異菌株を宿主とする際に使用する発現プラスミドは、バチルス・ブレビスで機能するプロモーター、具体的にはバチルス・ブレビス４７，同ＨＰＤ３１のプロモーター領域を含有するＤＮＡ、を含有しているものが好ましいこと。
　そして、引用例７には、B.brevisの細胞壁タンパク質（ＭＷＰ）遺伝子に、強力なプロモーター、リボゾーム結合部位、シグナルペプチドをコードする配列部分が存在し、これらを用いて構築したプラスミドでB.brevisを形質転換すれば、様々な異種蛋白質を効率よく生産できることが記載されている（上記（２）シ〜ソ）。
　
　そうすると、遺伝子組換え技術を利用して異種蛋白質であるプロテインＡを生産することについて記載した引用例１においても、上記（ア）に記載の問題があることは自明であるから、かかる問題を解決するため、引用例５に記載されたバチルス・ブレビス４７やＨＰＤ３１、さらにこれを改良した３１−ＯＫを宿主として用いることとし、それに伴い、引用発明における、エセリシア・コリー（大腸菌）で機能するλplac5ＤＮＡのラクトースオペロンのプロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ領域に代えて、異種蛋白質の効率よい生産ができると引用例７に記載されている、バチルス・ブレビス（これが「ブレビバチルス属の細菌」であることは、本願明細書の【００４０】段落から明らかであり、また、International Journal of Systematic Bacteriology,1996,Vol.46,No.4,p.939-946に記載されているように周知でもある）で機能するプロモーターを用い、異種蛋白質の分解が抑制される結果「発現した該蛋白質がＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを示す」ようにすることは、当業者が容易に想到することである。
　
（５）審判請求人の主張について
　審判請求人は、平成２６年２月６日付けで補正された審判請求書及び平成２６年８月２５日付け回答書において、以下ア〜エのように主張する。
　
ア　米国特許７６９１６０８号公報では、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインとＸドメインの一部を含むタンパク質を大腸菌で発現させたことが記載され、Ｘドメインの一部を含むことの意義として、プロテインＡ分子のフォールディング及び安定性が改善できると記載されている。この記載から、２００７年の時点でも、ブレビバチルス以外の微生物を使用する限りは、プロテインＡを分解することなく生産するためにＸドメインが必要と考えられていたことが理解できる。安定化のためにＸドメインが必要という当業者の技術常識を踏まえると、未分解で完全長のプロテインＡ様蛋白質の製造という課題を解決するために、引用例１に記載のプロテインＡ様蛋白質にＸドメインを付加して発現させることが必要となり、Ｘドメインを含まないプロテインＡ様蛋白質には想到できない。
　
イ　本願発明で最も大きな課題である構造の同一性について、引用例２〜７には、宿主のタンパク質分解活性を抑制して、活性を有する異種タンパク質を発現することが記載されているが、引用例２〜７では活性を有していれば部分的に分解されても問題とはならない。・・・引用例２〜７では精製した後でなければ活性を検討できず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一バンドを得ることもできず、ブレビバチルス属菌株で異種タンパク質を製造しても分解を回避できていない。
　
ウ　Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ　４７株であっても、実際には細胞外に微弱なタンパク質分解活性が残存しており、改善されたＨＰＤ３１株等であっても、実際には細胞外の分解活性が確認されている（国際公開第２００５／０４５００５号の図２，３）。引用文献５では、菌体外プロテアーゼ活性が低いＨＰＤ３１株であっても、菌体外に分泌されたタンパク質が宿主自体のプロテアーゼ活性により分解を受け、その蓄積量が著しく低下するとの問題があったこと、この課題を解決するために、さらにプロテアーゼを欠損させた３１−ＯＫ株を作製しているが、ＨＰＤ３１株よりもタンパク質分解活性が低下してはいるものの、依然として１／４のプロテアーゼ活性は残存することが示されている。高発現を目的に培養時間を延長すれば、３１−ＯＫ株を使用しても、発現したタンパク質の分解が元のＨＰＤ３１株と同程度にまで進んでしまうことになる。このようにプロテアーゼを欠損した株でも十分とはいえないので、特に高い品質が要求されるプロテインＡの生産のための宿主として、ブレビバチルス属細菌は、大腸菌と同様に使用できないとしか予想できない。公知のブレビバチルス属菌株であっても、どのような蛋白質にも適用できないことが理解できる。
　
エ　本願明細書の図９では、本願発明のＤＮＡを含む実施例６のブレビバチルス属細菌の培養液を遠心分離して菌体を除去しただけで、さらに精製を行わなくても、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色の結果、明確なプロテインＡの単一バンドが確認されている。本願発明では、Ｘドメインを含まないプロテインＡと、ブレビバチルス属細菌との特異的な組合せにより、はじめて、長時間培養しても未分解の完全長のタンパク質を発現できるという効果を奏する。引用例からこの効果を予想することはできない。
　
　上記主張について検討する。
　
アについて
　上記（４）アで述べたように、引用例１においては、実際にＸドメインを含まないプロテインＡ様物質を大腸菌で発現させているのであるから、引用例１に接した当業者が、Ｘドメインを含まないプロテインＡ様蛋白質に想到できないとはいえない。請求人が指摘する本願優先日後に発行された米国特許公報は、この判断を左右するものではない。
　
イについて
　上記（４）イで述べたように、引用例５においては、宿主自体のプロテアーゼ活性により異種タンパク質の蓄積量が少なくなるという問題を解決するためにプロテアーゼ活性を実質的に有さないバチルス・ブレビス変異株を使用しているのであって、発現されたタンパク質が分解されていても問題にならないとか、分解を回避できないとの請求人の主張は根拠がない。
　
ウについて
　上記（４）イで述べたように、引用例５には、プロテアーゼ活性が低い従来のバチルス・ブレビス株よりもさらにプロテアーゼ活性が有意に低いバチルス・ブレビスＯＫ−３１株を作成し、これがタンパク質分解酵素を欠失していることを確認したことが記載されているから、この株を宿主として用いれば、発現したタンパク質の分解が相当程度抑制できることを当業者は当然に期待するのであり、この株がプロテインＡの生産のための宿主として使用できないと解するのは妥当でない。
　
エについて
　本願明細書の実施例６及び図９の記載によれば、実施例５で作成したＳＰＡ’をコードするＤＮＡとＭＷＰのＰ２プロモーターを含むプラスミドで形質転換したバチルス・ブレビス３１−ＯＫの培養液から、菌体を除去して、定法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色することにより、単一バンドが検出されたことが認められる。
　ここで用いられているブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株は、本願明細書の【００３４】段落に、「ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４５７３）（特開平６−２９６４８５号公報参照）」と、引用例５を参照して記載されているうえ、請求人が提示する国際公開第２００５／０４５００５号の２頁４段落及び６頁４〜６行に、非特許文献１として記載されている、International Journal of Systematic Bacteriology,1996,Vol.46,No.4,p.939-94（前記（４）イで周知事実をいうために示した文献と同じ）に、B.brevisはBrevibacillesに再分類されたことが記載されている（要約参照）ことから、引用例５に記載のバチルス・ブレビス３１−ＯＫ株と同一のものであると認められる。そして、ＣＢＢ染色の検出限界は8-16ngとされており、銀染色に比べると検出限界が高くない（低温科学，2009, Vol.67, p.359-371の367頁右欄6.a.5.1の3〜5行及び368頁6.1.5.3の1〜3行）。
　そうすると、バチルス・ブレビス３１−ＯＫにごくわずかのプロテアーゼ活性が残存していることにより検出限界以下の分解物が発生しても、ＣＢＢ染色によっては検出できないのであるから、本願明細書の実施例６及び図９に示された結果は、特定のプロモーターと特定の宿主細胞を用いてプロテインＡ様蛋白質を発現させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢ染色した場合において、分解物が全く生じないことを示すものではなく、単に分解物が検出できなかったことを示すにすぎないと解するのが相当である。
　本願補正発明は、含まれるプロモーターも形質転換する際に用いる宿主も具体的に特定されていない、ＤＮＡ自体の発明であるから、実施例６及び図９に示された結果は、そもそも、本願補正発明全体の効果であるとは認められない。そして、上記ウで述べたとおり、バチルス・ブレビスＯＫ−３１株を用いれば、発現したタンパク質の分解が相当程度抑制できることは当業者が当然期待することであり、請求人が主張する効果は、引用例５の記載から当業者が予想可能な効果にすぎない。
　
３．小括
　以上検討したところによれば、本願補正発明は、引用例１、５及び７に基いて当業者が容易に発明をすることができたものであり、特許法第２９条第２項の規定により特許出願の際独立して特許を受けることができないものである。
　よって、本件補正は、平成１８年改正前特許法第１７条の２第５項において準用する同法第１２６条第５項の規定に違反してなされたものであるから、同法第１５９条第１項において読み替えて準用する同法第５３条第１項の規定により却下すべきものである。
　
第３　本願発明について
１．本願発明
　平成２５年１２月１７日付け手続補正は上記のとおり却下されたので、本願の請求項１〜８に係る発明は、平成２５年５月２４日付け手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項１〜８に記載された発明特定事項により特定されるものであるところ、その請求項１に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、上記第２　１．に「補正前」として記載したとおりのものである。　
　
２．本願発明の進歩性について
　上記第２　２．で述べたとおり、本願補正発明は本願発明の特定事項の一部を限定したものであるから、本願発明は本願補正発明を包含するものであることが明らかである。
　そして、上記第２　３．で述べたとおり、本願補正発明は引用例１、５及び７に基いて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、本願補正発明を包含する本願発明も、同様に、引用例１、５及び７に基いて当業者が容易に発明をすることができたものである。
　
第４　まとめ
　以上のとおり、本願の請求項１に係る発明は特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないから、本願は、その余の請求項について論及するまでもなく、拒絶すべきものである。
　よって、結論のとおり審決する。