(57)【要約】【課題】  従来よりも特異性および反応性が向上し、かつ免疫測定試薬用途にも使用可能なタグペプチド、および前記ペプチドを用いたタンパク質の精製・検出方法を提供すること。【解決手段】  Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）のうち環状部分ペプチド１６アミノ酸からなるオリゴペプチド、または前記オリゴペプチドのうち、少なくとも連続した１０アミノ酸からなるペプチド、をタグペプチドとして用い、前記タグペプチドを付加したタンパク質と前記タグペプチドを認識する物質により前記タンパク質を精製・検出することにより、前記課題を解決することができた。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる、タンパク質を精製・検出するのに有用なオリゴペプチド。
【請求項２】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドのうち、少なくとも連続した１０アミノ酸からなる、タンパク質を精製・検出するのに有用なオリゴペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のオリゴペプチドを付加したタンパク質と、前記ペプチドを認識する物質とを用いた、タンパク質の精製・検出方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、請求項１または２に記載のオリゴペプチドを遺伝子工学的に付加することで得られたタンパク質である、請求項３に記載の精製・検出方法。
【請求項５】
前記タンパク質が、請求項１または２に記載のオリゴペプチドを化学的に付加することで得られたタンパク質である、請求項３に記載の精製・検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を高感度に検出するためのタグペプチド、およびそれを用いたタンパク質の精製・検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学的に発現させたタンパク質の精製・検出や、担体への固定化を簡便に行なうための技術として、前記タンパク質を発現させる際に、タグペプチドとよばれる、前記ペプチドを認識する物質（例えば抗体など）と特異的に結合可能なペプチドを、前記タンパク質に付加した状態で発現後、前記ペプチドを認識する物質を用いて精製・検出・固定化を行なう方法が知られている。
【０００３】
従来から知られているタグペプチドの例として、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＦＬＡＧタグ（特許文献１および２）、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＭｙｃタグ（非特許文献１）、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＨｉｓタグ（特許文献３および４）、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＥタグ、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＨＡタグ、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＴ７タグ、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるＰｋタグ、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＨＳＶタグ、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＶＳＶ−Ｇタグ、などの正常細胞内には本来存在しない、ウイルス、ファージ、癌遺伝子由来のタンパク質の部分領域や、同じアミノ酸配列の繰り返しからなる、１０アミノ酸程度のペプチドがあげられる。前記例示した９種類のタグペプチドの中で、ＦＬＡＧタグ（配列番号１）は高性能なタグとして知られている。しかしながら、近年の実験の高感度化に伴い、特異性および反応性がさらに向上したタグペプチドが要求されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許４７０３００４号公報
【特許文献２】特許２６６５３５９号公報
【特許文献３】特開昭６３−２５１０９５号公報
【特許文献４】米国特許５３１０６６３号公報
【特許文献５】特開２００９−２４０３００号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．、５（１２）、３６１０−３６１６（１９８５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
新規のタグペプチドを検討する際、タグペプチドの原理から考えると、一見いかなるアミノ酸配列からなるペプチドでも、その配列を特異的に認識する物質（抗体など）があれば、タグペプチドとして使用できると思われる。しかしながら、現実的にタグペプチドとして産業上で使用することを考えた場合、タグペプチドの配列を決定することは容易ではない。その理由として、タグペプチドを付加したタンパク質を特異的に精製・検出するには、前記タグペプチドのアミノ酸配列が通常の実験系で使用されるタンパク質のアミノ酸配列の中に含まれないことはもちろん、それに類似するアミノ酸配列も存在しないことが必要なためである。仮に前記タグペプチドのアミノ酸配列と相同的な配列または類似の配列のタンパク質が実験系に存在すると，タグペプチドを付加したタンパク質の特異的な検出ができなくなってしまう。
【０００７】
新規に考案したタグペプチドのアミノ酸配列に対して相同的な配列または類似の配列があるかを確認するには、ＢＬＡＳＴといったデータベースを用いた相同性検索により可能である。しかしながら、タグペプチドを認識する物質（例えば抗体）が、前記タグペプチドのアミノ酸配列と類似した配列からなるペプチドに対してどの程度の交差反応性があるかを推測するのは困難であり、また前記データベースに未登録のタンパク質に対する交差反応性については予測がさらに困難である。そのため、従来から知られているタグペプチドは、ウイルス、ファージ、または癌遺伝子由来といった、正常細胞に本来存在しないタンパク質の部分領域からなるペプチドや、Ｈｉｓタグ（配列番号３）のように同じアミノ酸配列の繰り返しといった、天然に存在する確率の低いアミノ酸配列からなるペプチドが用いられてきた。
【０００８】
ならば、本来タンパク質には組み込まれないアミノ酸や低分子有機化合物をタグとして用いればよいのではないかと思われるが、実際には交差反応性の原因はアミノ酸の一次配列だけではなく、配列特異的ではない静電的相互作用や疎水的相互作用などの影響で起こることもある。つまり、天然に存在しないような物質をタグとして使用することは、かえって交差反応性の予測を困難にする可能性がある。また、前記アミノ酸や有機化合物をタグとする場合、タグを遺伝子工学的にタンパク質へ付加するのが困難という新たな問題が発生する。
【０００９】
さらに、タグペプチドを免疫測定試薬用途に用いる場合、検体中に含まれる各種成分は検体間で異なるため、検体ごとにタグペプチドに対し異なる影響を与える可能性もある。つまり、たとえ産業上有効なタグペプチドが設計できても、前記タグペプチドがそのまま免疫測定試薬用途に用いることができるとは限らない。設計したタグペプチドを免疫測定試薬用途で使用可能かどうかを判断するには、非常に多数の検体を評価するしかないが、タグペプチドの有用性を確かめる目的で、非常に多数の検体を評価することは事実上極めて困難である。
【００１０】
そこで本発明の目的は、従来よりも特異性および反応性が向上し、かつ免疫測定試薬用途にも使用可能なタグペプチド、および前記タグペプチドを用いたタンパク質の精製・検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を鑑み発明者が鋭意検討した結果、これまでに報告例がなく、かつ免疫測定試薬用途においても使用可能なタグペプチドを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明の第一の態様は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる、タンパク質を精製・検出するのに有用なオリゴペプチドである。
【００１３】
また本発明の第二の態様は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドのうち、少なくとも連続した１０アミノ酸からなる、タンパク質を精製・検出するのに有用なオリゴペプチドである。
【００１４】
また本発明の第三の態様は、前記第一または第二の態様に記載のオリゴペプチドを付加したタンパク質と、前記ペプチドを認識する物質とを用いた、タンパク質の精製・検出方法である。
【００１５】
また本発明の第四の態様は、前記タンパク質が、前記第一または第二の態様に記載のオリゴペプチドを遺伝子工学的に付加することで得られたタンパク質である、前記第三の態様に記載の精製・検出方法である。
【００１６】
また本発明の第五の態様は、前記タンパク質が、前記第一または第二の態様に記載のオリゴペプチドを化学的に付加することで得られたタンパク質である、前記第三の態様に記載の精製・検出方法である。
【００１７】
以降、本発明について詳細に説明する。
【００１８】
タンパク質を精製・検出するのに有用なタグペプチドには、
（１）融合させるタンパク質に与える影響を少なくするためにアミノ酸の長さが短いこと、
（２）類似した配列が存在せず特異性が高いこと、
（３）ペプチドに対する親和性の高い物質が存在すること、
が要求される。そこで、前記要求を満たすペプチドを鋭意検討した結果、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の環状部分の１６アミノ酸（配列番号１０、以下ＢＮＭと略す）がタグペプチドとして有用であることを見出した。
【００１９】
ＢＮＰは３２アミノ酸からなる環状ペプチドである。健常人における血漿中ＢＮＰ濃度は２０ｐｇ／ｍＬ以下と極めて低いが、慢性および急性心不全患者では重症度に応じて著しく増加し、ＢＮＰの測定により心不全の病態の把握に重要な意義を持っていることから、近年極めて多くの検体が測定されている。通常ＢＮＰは、ＢＮＰのＣ末端を認識する抗体と環状部分を認識する抗体でＢＮＰを挟み込むサンドイッチ法で測定されている。配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＭは、
（１）アミノ酸の長さが比較的短く、
（２）ＢＮＭと交差反応性を有する物質の存在が否定されており、
（３）親和性および特異性の高い物質が存在する、
ためタグペプチドとして有用である。
【００２０】
ＢＮＭを認識する抗体を使ったＢＮＰの測定系は、すでに免疫測定試薬として上市（例えば、東ソー社製Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ（ＢＮＰ））されている。つまり、これまでに非常に多数の検体が測定されているが、原因不明の交差反応などの問題は発生していない。このことは、ＢＮＭまたはそれと類似した配列を有するタンパク質およびペプチドは検体中には存在しないか、または存在しても測定に影響を与える濃度ではないことを意味している。以上より、ＢＮＭは特異性の高いタグペプチドとして有用であることを示唆しており、免疫測定試薬用途で有効に使用できるのはもちろん、通常の実験においても特異性や反応性の高いタグペプチドとして利用可能である。さらに、ＢＮＭに対する親和性および特異性の高い物質として、前述の上市された免疫測定試薬でも使用されている、ＢＮＭを認識する抗体が存在する。そのため、ＢＮＭはタグペプチドとして有用であり、ＢＮＭを付加したタンパク質とＢＮＭを認識する抗体とを用いることで、特異性が高く、高感度な検出が可能である。
【００２１】
ＢＮＭをタグペプチドとして用いる際、検体（血液）に含まれるＢＮＰにより、ＢＮＭを付加したタンパク質とＢＮＭを認識する物質との結合性に影響を与えるおそれが考えられた。そこで試料中に存在するＢＮＰによる、ＢＮＭを付加したタンパク質とＢＮＭを認識する物質との結合に与える影響について考察した。
【００２２】
まず試料中に存在するＢＮＰであるが、臨床上はＢＮＰ濃度が非常に高いと判定された試料（血清）でも、１０００ｐｇ／ｍＬを上回ることはない（なお、健常人は数ｐｇ／ｍＬ程度である）。ＢＮＰの分子量は３４６４であるので、モル濃度としては最大でも０．２９ｐｍｏｌ／ｍＬとなる。免疫測定（例えば、ＥＬＩＳＡ測定）で使用する試料を、１測定（１ウェル）当たり、緩衝液で２倍希釈した試料１５０μＬ使用すると仮定した場合、１測定（１ウェル）当たり最大０．０２１７５ｐｍｏｌのＢＮＰが持ち込まれることになる。
【００２３】
一方、ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ社製マキシソープ、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．４４２４０４）に固定化できるＢＮＭ認識抗体（ＢＮＭを認識する物質）量を見積もると、前記ＥＬＩＳＡプレートの吸着容量が６５０ｎｇ／ｃｍ２（カタログ記載値）、ウエルあたりの面積が２．７ｃｍ２（カタログ記載値）であることから、１ウェルあたり１７７５ｎｇの抗体を固定化できる。抗体の分子量を１５００００と仮定した場合、固定化される抗体のモル数は１１．７ｐｍｏｌとなる。なお、前記抗体には抗原結合サイトが２箇所あるので、反応に関与できる結合部位で考えると、２３．４ｐｍｏｌとなる。
【００２４】
つまり、たとえ試料中のＢＮＰの全てがＢＮＭ認識抗体と結合していても、抗原結合サイト（２３．４ｐｍｏｌ）はＢＮＰ（０．０２１７５ｐｍｏｌ）の約１０００倍量存在するため、ほとんどの結合サイトは残っており、実質、測定系への影響はないと考えられる。しかしながら測定系により、抗体や抗原の濃度、ブロッキング剤、緩衝液の条件などが異なるため、測定系を新たに構築した際は、大過剰のＢＮＰを測定系に添加し、どの程度の濃度で影響がではじめるかを確認したほうがよい。
【００２５】
ＢＮＭをタグペプチドとして利用することで、ＢＮＭを付加したタンパク質をアフィニティー精製することができる。アフィニティー精製は、適切な担体に、ＢＮＭを認識する物質をＢＮＭを付加したタンパク質との結合性を保持した状態で結合させたものを用いて精製すればよい。ＢＮＭを認識する物質としては、ＢＮＭを認識するモノクローナル抗体・ポリクローナル抗体・抗血清が例示できるが、ロット間差の考慮が不要なモノクローナル抗体が、安定的な精製ができる点で好ましい。ＢＮＭを認識する物質と結合したＢＮＭを付加したタンパク質の溶出は、通常ｐＨを変化させて溶出すればよいが、ｐＨ変化に対して不安定なタンパク質を精製する場合は大過剰のＢＮＭを添加して溶出させてもよい。
【００２６】
発現させるタンパク質にＢＮＭを付加する方法として、遺伝子工学的方法で付加する方法があげられる。具体的には、発現させるタンパク質のＮ末端側、Ｃ末端側または内部にＢＮＭをコードするポリヌクレオチドを付加すればよい。なお、発現させるタンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にＢＮＭを付加する際、発現させるタンパク質のＮ末端側またはＣ末端側の直後にＢＮＭを付加してもよいし、発現させるタンパク質との相互作用を避けるための任意のリンカーペプチドを介してＢＮＭを付加してもよい。前記リンカーペプチドの一態様として、配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるフレキシブルなリンカーペプチドが例示できるが、前記配列に限定されるものではない。発現させるタンパク質にＢＮＭを付加する別の方法として、化学的に付加する方法があげられる。前記方法の一態様として、発現させるタンパク質とＳＭＣＣ（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）などの試薬とを反応させることで前記タンパク質にマレイミド基を導入後、ＢＮＭと反応させて、ＢＮＭを化学的に導入する方法があげられるが、発現させるタンパク質とＢＮＭとの結合方法に特に限定はなく、例えば、ポリエチレングリコールやポリエチレンイミンなどの高分子を介して付加してもよいし、マレイミド基以外の官能基を介して化学的に付加してもよい。マレイミド基以外の官能基としては、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、ヒドラジド（ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）、ヒドロキシメチルホスフィン（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）、イミドエステル（ｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）、イソシアネート（ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ）、ブロモアセテート（ｂｒｏｍｏ  ａｃｅｔａｔｅ）、ＮＨＳエステル（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）、ピリジルジスルフィド（ｐｙｒｉｄｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）等があげられる。
【００２７】
ＢＮＭは、前述したタンパク質の精製・検出目的のほかに、タンパク質の担体への固定化目的で使用することもできる。タンパク質を直接水不溶担体に固定化すると、立体構造の変化がおきやすく、活性が失われる場合が多い。そこで、ＢＮＭを認識する物質を水不溶性担体に固定化しておき、前記固定化担体にＢＮＭを付加したタンパク質を固定化させる方法を採用することにより、立体構造の変化がおきにくい状態で担体に固定化することができる。
【００２８】
免疫測定試薬でしばしば問題になるのは、異好性抗動物抗体である。たとえば、ウサギ由来ポリクローナル抗体（抗原認識）と抗ウサギ抗体（水不溶性担体に固定化）とが反応系の中に含まれる場合、測定検体の中に抗ウサギ抗体が存在すると、検体中の抗ウサギ抗体により、本来想定している量のウサギ由来ポリクローナル抗体が水不溶性担体に捕捉されなくなり、正確な測定値が得られなくなってしまう。そこで、ウサギポリクローナル抗体にＢＮＭを付加し、水不溶性担体に抗ＢＮＭ抗体（ＢＮＭを認識する抗体）を固定化することで、異好性抗動物抗体の影響をなくした測定系が構築できる。
【００２９】
なお、ＢＮＭは配列番号１０に記載の１６アミノ酸からなるオリゴペプチドであるが、ＢＮＭを認識する物質である、ＢＮＭと特異的に結合する抗体（ＢＮＭ認識抗体）についてエピトープマッピングを行なった結果、ＢＮＭ認識抗体はＢＮＭの全アミノ酸配列を認識するのではなく、ＢＮＭのうち連続した９または１０アミノ酸配列を認識していることが判明している（実施例６）。そのため、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＭのうち、少なくとも１０アミノ酸（すなわち連続した１０アミノ酸以上）からなるオリゴペプチドであれば、タグペプチドとしてＢＮＭと同等の有用性があるといえる。なお、前記オリゴペプチドはＢＮＭ（配列番号１０）よりもアミノ酸の長さが短くなっているため、ＢＮＭ（配列番号１０）全長と比較し、付加するタンパク質への影響がより低減することが予想できる点で、好ましいといえる。
【００３０】
一方、ＢＮＭを構成するアミノ酸のうちの一つ以上を他のアミノ酸に置換したオリゴペプチドであっても、ＢＮＭを認識する物質への結合能が極端に変化しない程度であれば、本発明のオリゴペプチドに含まれる。他のアミノ酸への置換は、公知の部位特異的変異導入法を用いて、親和性および特異性を確認しながら実施すればよい。またいくつかの変異を組み合わせることで、さらに性能を向上させることも可能である。
【発明の効果】
【００３１】
本発明は、長さが１６アミノ酸と比較的短く、これまでの実績から交差反応性を有する物質の存在が否定されており、親和性および特異性の高い物質（抗体）が存在する、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の環状部分（ＢＮＭ）、およびそれを用いたタンパク質の精製・検出方法である。精製・検出対象タンパク質のＮ末端側、Ｃ末端側もしくは内部に、遺伝子工学的にまたは化学的にＢＮＭを付加させ、それとＢＮＭを認識する物質とを結合させて精製・検出する方法により、従来知られているＨｉｓタグを用いた精製・検出方法と比較し、特異性や感度を向上させることができる。
【００３２】
なお本発明のオリゴペプチドは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＭのうち、少なくとも連続した１０アミノ酸からなるオリゴペプチドであってもよく、前記ペプチドは、ＢＮＭと比較し付加するタンパク質への影響がより低減することが予想できる点で、好ましいといえる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】実施例１で実施した、抗Ｅ２抗体へのＢＮＭ導入スキームを示すものである。
【図２】実施例３の結果を示すものである。図右側は、本ＥＬＩＳＡのアッセイフォーマットを示す。
【図３】実施例４の結果を示すものである。図右側は、本ＥＬＩＳＡのアッセイフォーマットを示す。
【図４】実施例６で用いた測定系を説明した図である。
【図５】実施例６の結果のうち、ＢＭ３３−５の抗体のエピトープマッピングを行なった結果である。図左側は、本ＥＬＩＳＡのアッセイフォーマットを示す。
【図６】実施例６の結果のうち、ＢＭ３３−１４の抗体のエピトープマッピングを行なった結果である。図左側は、本ＥＬＩＳＡのアッセイフォーマットを示す。
【図７】実施例６の結果のうち、ＢＭ３３−２７の抗体のエピトープマッピングを行なった結果である。図左側は、本ＥＬＩＳＡのアッセイフォーマットを示す。
【図８】実施例６の結果のうち、ＢＭ３３−２８の抗体のエピトープマッピングを行なった結果である。図左側は、本ＥＬＩＳＡのアッセイフォーマットを示す。
【図９】実施例６の結果のうち、ＢＭ３３−６２の抗体のエピトープマッピングを行なった結果である。図左側は、本ＥＬＩＳＡのアッセイフォーマットを示す。
【図１０】実施例６の結果のうち、５種類の抗体のエピトープマッピングの結果をまとめたものである。
【図１１】実施例７の結果を示すものである。図左側は、本ＥＬＩＳＡのアッセイフォーマットを示す。
【実施例】
【００３４】
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３５】
実施例１  ＢＮＰ環状部分ペプチド（ＢＮＭ）を付加した抗体の作製（その１）
配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の環状部分（ＢＮＭ）を付加した抗体を作製した。
（１）特許文献５に記載の方法に基づき、抗エストラジオール抗体（以下、抗Ｅ２抗体と略する）を作製した。
（２）（１）で作製した抗Ｅ２抗体とＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（ＰＩＥＲＣＥ社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．２２３２２）とを添付の説明書に従って反応後、大過剰のＢＮＭと反応させることで、ＢＮＭと共有結合した抗Ｅ２抗体を作製した（図１）。
【００３６】
実施例２  ＢＮＰ環状部分ペプチド（ＢＮＭ）認識抗体の単離
ＢＮＰ環状部分ペプチド（ＢＮＭ）を認識する抗体を以下の方法で単離した。
（１）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＭ  １０ｍｇを、マレイミドで活性化された１０ｍｇのオボアルブミン（ＰＩＥＲＣＥ社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．７７１２５）に、添付の説明書に従い結合させた。その後ＰＢＳで透析し、濃度１ｍｇ／ｍＬに調製した。
（２）（１）で調製したＢＮＭ結合オボアルブミンとＦＣＡ（フロイント完全アジュバント）とを等量混合したエマルジョンを、１００μＬ／匹でマウス腹腔内に注射した（１回目の免疫）。
（３）２回目以降は、ＦＣＡをＦＩＣＡ（フロイント不完全アジュバント）に変更したほかは、（２）と同様な免疫を毎週行ない、これを３回繰り返した。
（４）免疫後のマウスから脾臓Ｂ細胞を取り出し、ミエローマ細胞株とＰＥＧ法による細胞融合を行なった。
【００３７】
前記操作により、ＢＮＭと特異的に結合する抗体（ＢＮＭ認識抗体）を産生するハイブリドーマ５種（ＢＭ３３−５、ＢＭ３３−１４、ＢＭ３３−２７、ＢＭ３３−２８、ＢＭ３３−６２）が得られた。
【００３８】
実施例３  ＢＮＰ環状部分ペプチド（ＢＮＭ）のタンパク質固定化用タグとしての評価
実施例２で得られたＢＮＭ認識抗体を用いて、ＢＮＭを付加したタンパク質の固定が可能か評価した。
（１）実施例２で得られたハイブリドーマのうち、ＢＭ３３−５を産生するハイブリドーマについて、定法により培養・精製することで、モノクローナル抗体（ＢＭ３３−５）を得た。
（２）モノクローナル抗体（ＢＭ３３−５）をＥＬＩＳＡプレートに１μｇ／ウェルで固定化し、１重量％スキムミルクでブロッキングした。
（３）ウェルを洗浄後、実施例１で得られたＢＮＭを付加した抗Ｅ２抗体（ＢＮＭ結合抗Ｅ２抗体）を１μｇ／ｍＬの濃度で調整し、当該溶液１００μＬを（２）のウェルに添加して反応させた。
（４）ウェルを洗浄後、０．１５ｍＡのエストラジオール（Ｅ２）認識アルカリホスファターゼ（Ｅ２−ＡＬＰ）をウェルに添加し、１時間反応させた。
（５）反応後、定法に従いアルカリホスファターゼ活性を測定した。
（６）比較例として、ＢＮＭ認識抗体を固定化せずブロッキング操作のみ行なったウェルについて、（３）から（５）に記載の操作を行なった。
【００３９】
結果を図２に示す。ＢＮＭ認識抗体を固定化したウェルにＢＮＭ結合抗Ｅ２抗体を添加したときが、ＢＮＭ認識抗体を固定化しなかったウェルにＢＮＭ結合抗Ｅ２抗体を添加したときと比較し、有意にシグナルが高いことから、ＢＮＭ認識抗体がＢＮＭを付加したタンパク質と特異的に結合できることを確認した。
【００４０】
実施例４  アルカリホスファターゼ標識ＢＮＭ認識抗体の作製
実施例３の（１）で得られたモノクローナル抗体（ＢＭ３３−５）を、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識キット（同仁化学社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．ＬＫ１２）を用いて、製品添付のプロトコルに従い標識することで、ＡＬＰ標識ＢＮＭ認識抗体を作製した。
【００４１】
実施例５  ＢＮＰ環状部分ペプチド（ＢＮＭ）のタンパク質検出用タグとしての評価
実施例２で得られたハイブリドーマより取得したＢＮＭ認識抗体が、ＢＮＭを付加したタンパク質を特異的に検出可能か評価した。
（１）Ｅ２−ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ：Ｅ５６３０）をＥＬＩＳＡプレートに１μｇ／ウェルで固定化し、１重量％スキムミルクでブロッキングした。
（２）ウェルを洗浄後、実施例１で得られたＢＮＭを付加した抗Ｅ２抗体（ＢＮＭ結合抗Ｅ２抗体）を１μｇ／ｍＬの濃度で調整し、当該溶液１００μＬを（１）のウェルに添加して反応させた。
（３）ウェルを洗浄後、実施例４で得られたＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）標識ＢＮＭ認識抗体（ＡＬＰ標識ＢＭ３３−５）を１０００倍希釈した溶液を１００μＬ添加し、１時間反応させた。
（４）ウェルを洗浄後、定法に従いＡＬＰ活性を測定した。
（５）比較例として、（２）で添加する抗体をＢＮＭを付加しない抗Ｅ２抗体（ＢＮＭ非結合抗Ｅ２抗体）に変更し、同様の実験を行なった。
【００４２】
結果を図３に示す。（２）でＢＮＭを付加した抗Ｅ２抗体を添加したときが、ＢＮＭを付加しない抗Ｅ２抗体を添加したときと比較し、有意にシグナルが高いことから、ＢＮＭ認識抗体を用いてＢＮＭを付加した抗体を特異的に検出できることを確認した。
【００４３】
実施例６  ＢＮＰ環状部分ペプチド（ＢＮＭ）認識抗体の認識部位の決定
実施例２で得られたハイブリドーマより取得した、５種類のＢＮＭ認識モノクローナル抗体（ＢＭ３３−５、ＢＭ３３−１４、ＢＭ３３−２７、ＢＭ３３−２８、ＢＭ３３−６２）について、エピトープマッピングを行ない、各モノクローナル抗体がＢＮＭのどの部分を認識しているか確認した。なお評価は、実施例２で得られたハイブリドーマより取得したモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡプレートのウェルに固定化し、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）でブロッキング後、ＢＮＰを反応させ、前記モノクローナル抗体と結合したＢＮＰを、ＢＮＰのＣ末端側ペプチド（ＢＮＣ）と特異的に反応する抗体（ＢＮＣ認識抗体）で検出する測定系（図４ａ）を利用して行なった。詳細を図４ｂおよび下記に示す。
（１）実施例２で得られたハイブリドーマより取得した、ＢＮＭ認識モノクローナル抗体を、ＥＬＩＳＡプレートに１μｇ／ウェルで固定化し、３重量％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）でブロッキングした。
（２）ウェルを洗浄後、配列番号１０および１２から２３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを１μｇ／ｍＬの濃度で調整し、当該溶液１００μＬを（１）のウェルに添加して反応させた。
（３）ウェルを洗浄後、濃度１μｇ／ｍＬのＢＮＰ溶液１００μＬを添加し反応させ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を標識したＢＮＣ認識抗体（ＢＣ２３−１１）で検出した。
【００４４】
図４ｂの測定系において、ウェルに結合したＢＮＭ認識モノクローナル抗体と、（２）で添加したオリゴペプチドとに結合性があれば、（３）においてＢＮＰと結合できなくなるため、本測定系によって固定化抗体の抗原認識部位を解析することができる。各抗体について各オリゴペプチドとの結合性をまとめたものを図５から図９に示す。なお、図５から図９において、各グラフの結果は上段から、
配列番号１２（ＣＦＧＲＫＭＤＲＩＳ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のうち１番目から９番目までのアミノ酸のＮ末端側にシステインが結合）に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを用いたときの結果、
配列番号１３（ＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のうち１番目から１０番目までのアミノ酸）に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを用いたときの結果、
配列番号１４（ＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のうち２番目から１１番目までのアミノ酸）に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを用いたときの結果、
配列番号１５（ＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のうち３番目から１２番目までのアミノ酸）に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを用いたときの結果、
配列番号１６（ＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のうち４番目から１３番目までのアミノ酸）に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを用いたときの結果、
配列番号１７（ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のうち５番目から１４番目までのアミノ酸）に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを用いたときの結果、
配列番号１８（ＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のうち６番目から１５番目までのアミノ酸）に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを用いたときの結果、
配列番号１９（ＲＩＳＳＳＳＧＬＧＣ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のうち７番目から１６番目までのアミノ酸）に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを用いたときの結果、
配列番号２０（ＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のうち５番目から１５番目までのアミノ酸）に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを用いたときの結果、
配列番号２１（ＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のうち４番目から１５番目までのアミノ酸）に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを用いたときの結果、
配列番号２２（ＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のうち３番目から１５番目までのアミノ酸）に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを用いたときの結果、
配列番号２３（ＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳＧＬＧ、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のうち２番目から１５番目までのアミノ酸）に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを用いたときの結果、
ＢＮＭ全長（配列番号１０）を用いたときの結果、
配列番号１０および１２から２３に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを添加しないとき（ｐｅｐｔｉｄｅ−）の結果、
をそれぞれ示している。図５から図９の結果から得られた、各抗体における認識部位をまとめたものを図１０に示す。図１０において各抗体が認識しているアミノ酸配列を下線で示している。図１０に示すように、抗体は配列番号１０に記載のＢＮＭの１６アミノ酸全長を認識しているのではなく、配列番号１０に記載のアミノ酸のうち連続する９または１０アミノ酸を認識していることがわかる。したがって、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＭのうち、少なくとも連続した１０アミノ酸からなるオリゴペプチドであれば、タグペプチド、すなわちタンパク質を精製・検出するのに有用であることがわかる。
【００４５】
実施例７  従来のタグペプチドとの性能比較
タグペプチドとして従来より広く利用されているＨｉｓタグ（配列番号３）との性能を比較した。
（１）抗ＢＮＭ抗体（実施例２で得られたハイブリドーマより取得した、ＢＮＭ認識モノクローナル抗体）または抗Ｈｉｓ抗体（Ｒｏｃｈｅ社製、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．１９２２４１６）をＥＬＩＳＡプレートに１μｇ／ウェルで固定化し、３重量％ＢＳＡでブロッキングした。
（２）ウェルを洗浄後、Ｎ末端をビオチン化した配列番号２４（抗ＢＮＭ抗体使用時）または２５（抗Ｈｉｓ抗体使用時）に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを図１１に記載の濃度で反応させた。なお、配列番号２４のＮ末端側８アミノ酸は配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるリンカーペプチドであり、Ｃ末端側１５アミノ酸は配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＭのうち、１番目のフェニルアラニンから１５番目のグリシンまでのアミノ酸からなるオリゴペプチドである。また、配列番号２５のＮ末端側８アミノ酸は配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるリンカーペプチドであり、Ｃ末端側６アミノ酸はＨｉｓタグである。
（３）ウェルを洗浄後、アルカリホスファターゼで標識されたストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＡＬＰ）を１μｇ／ｍＬの濃度で調整し、当該溶液１００μＬを（２）のウェルに添加して反応させた。
（４）反応後、定法に従いアルカリホスファターゼ活性を測定した。
【００４６】
結果を図１１に示す。図１１の結果から、タグペプチドとして従来より広く用いられているＨｉｓタグ結合ビオチン−抗Ｈｉｓ抗体（αＨＩＳ）の組み合わせよりも、ＢＮＭ結合ビオチン−抗ＢＮＭ抗体の組み合わせのほうが、特に抗ＢＮＭ抗体にＢＭ３３−５またはＢＭ３３−１４を用いたとき、タグペプチドを付加したタンパク質を高感度に検出できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＰの環状部分ペプチドをタンパク質に付加することで、タンパク質の高純度な精製および高感度な検出を可能とする。これは免疫測定試薬に用いるタンパク質の固定化および検出に極めて有効な方法である。なお、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＢＮＰの環状部分ペプチドのうち、少なくとも連続した１０アミノ酸からなるオリゴペプチドであれば、前記高純度な精製および高感度な検出が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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