(57)【要約】【課題】電子顕微鏡の観察に適用可能な一般の試料または生体細胞を置くことに用いることが可能であり、観察が容易で明瞭である電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置を提供する。【解決手段】ハウジング１１を備える。ハウジング１１は内部に収容室１２を有し、ハウジング１１の頂面と底面には収容室１２に繋がって向かい合うように同軸に位置する少なくとも一つの観察孔１３を別々に有する。観察孔１３は、薄膜１３１により封じられている。一般の試料または生体細胞を収容室１２に置くことにより、電子顕微鏡の観察に適用することが可能となる。また、ハウジング１１内に液体または気体を封じることで、液体または気体を外部へ漏洩させるという問題を解決することが可能となる。【選択図】図２
2007165271.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハウジングを備える電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置であって、
ハウジングは内部に収容室を有し、ハウジングの頂面と底面には収容室に繋がって向かい合うように同軸に位置する少なくとも一つの観察孔を別々に有し、観察孔は薄膜により封じられていることを特徴とする電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【請求項２】
観察孔の直径は、５μｍから５００μｍの間であることを特徴とする請求項１に記載の電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【請求項３】
薄膜は、収容室に近い観察孔の一端に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【請求項４】
薄膜は、少なくとも一つの端面に複数のリブを有することを特徴とする請求項３に記載の電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【請求項５】
リブは、薄膜の上に平行、交差、同心円または放射状を呈するように配置されていることを特徴とする請求項４に記載の電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【請求項６】
薄膜とハウジングは、一体成型であることを特徴とする請求項３に記載の電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【請求項７】
リブと薄膜は、一体成型であることを特徴とする請求項６に記載の電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【請求項８】
ハウジングは、一側に注入孔と、他側に流出孔とを有することを特徴とする請求項１に記載の電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【請求項９】
ハウジングを備える電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置であって、
ハウジングは少なくとも一枚の隔離板により内部が分割されて一つの収容室と少なくとも一つの気体室とを形成し、収容室の頂面と底面は隔離板に配置される少なくとも一つの観察孔を別々に有し、観察孔は収容室に繋がり、気体室は観察孔を含有し、ハウジングの頂面と底面は少なくとも一つの気孔を別々に有し、気孔と観察孔は同軸であり、気孔は薄膜により封じられ、ハウジングは気体室の一側に気圧平衡孔を少なくとも一つ有することを特徴とする電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【請求項１０】
薄膜は、気体室に近い気孔の一端に配置されていることを特徴とする請求項９に記載の電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【請求項１１】
ハウジングは、収容室の一側に注入孔と、収容室の他側に流出孔とを有することを特徴とする請求項９に記載の電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【請求項１２】
ハウジングを備える電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置であって、
ハウジングは少なくとも二枚の隔離板により内部が分割されて一つの収容室と少なくとも一つの気体室と少なくとも一つの緩衝室とを形成し、収容室の頂面と底面は隔離板に配置される少なくとも一つの観察孔を別々に有し、観察孔は収容室に繋がり、気体室は観察孔を含有し、気体室の頂面と底面は別の隔離板に配置される少なくとも一つの気孔を別々に有し、緩衝室は気孔を含有し、ハウジングの頂面と底面は少なくとも一つの外孔を別々に有し、外孔と気孔と観察孔とは同軸であり、外孔は薄膜により封じられ、ハウジングは気体室の一側に注気孔を少なくとも一つ有し、緩衝室の一側に抽気孔を少なくとも一つ有することを特徴とする電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【請求項１３】
薄膜は、緩衝室に近い外孔の一端に配置されていることを特徴とする請求項１２に記載の電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【請求項１４】
ハウジングは、収容室の一側に注入孔と、収容室の他側に流出孔とを有することを特徴とする請求項１２に記載の電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電子顕微鏡、詳しく言えば、電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
周知技術では、電子顕微鏡を操作して物体を観察する際、電子顕微鏡内の試料腔室は真空環境に限定されるため、観察対象物は非発揮性固体でなければ、観察を行うことができない。発揮性物体、例えば、液体または気体の流体物質の場合、真空試料腔室に入れられると、大量の気体が発生するため、電子束が物体を通過して回折するか、或いは、結像することができないだけでなく、顕微鏡電子銃などの高真空区域における真空度が低下するか、或いは、汚染される事態が発生し、電子顕微鏡を損壊する事態を招く。
【０００３】
上述のように、真空環境に制限されるため、従来の電子顕微鏡は、固体物質の構造あるいは脱水乾燥した生物細胞（例えば、原核細胞Prokaryoteの細菌または真核細胞Eukaryoteの動植物）、ウィルスなどの生物組織を試料腔室内に入れることによってのみ観察可能であり、流体試料または流体環境下で生理機能を有する細胞またはウィルスなどを観察することはできない。さらに、１気圧の流体環境下で細胞内または細胞間の様々な細胞小器官の働き、例えば、細胞核内ＤＮＡ転写（transcription）ＲＮＡ、ＲＮＡ転移（translation）タンパク質（protein）、細胞質内微小管（microtubules）などの生物化学反応過程と、神経筋肉接合（neuromuscular junction）箇所での伝導生理（physiology of transudation）制御などの生命現象過程を観察することはできない。
【０００４】
したがって、生体細胞または生体組織を内部に入れ、かつ電子顕微鏡内の観察に用いることが可能である装置が求められている。現今、一部の研究者、例えば、Cai P. L.は電子顕微鏡において提供可能な観測環境を提出している（非特許文献１参照）。その欠点は、試料室の圧力を常圧に近い状態または圧力の比較的高い状態に維持して観察と分析を進めることができず、液体が平衡した安定状態を維持するために急速に揮発してしまうことである。したがって、液体を持続的に補充することが必要である。しかし、このようなプロセスのため、観測対象物は試料の流動が頻発し、新しい試料と古い試料の混合が均質でなくなるという問題が発生するため、観測の信頼性に影響を受ける。また、大量揮発した高圧蒸気または外界から気体室に注入された高圧気体が上下極片の間の空間全体に充満しているため、電子が大量の気体分子に衝撃を与えて生成した多重散乱を深刻化させると同時に、電子ビームによる結像または電子回折の実験をスムーズに進行させることができない。かつその試料槽の設計では、液体の注入量を有効に制御できない。したがって、液体の厚さが厚くなりすぎてしまうため、電子ビームが試料を透過できなくなり、観察と分析ができなくなる。
【０００５】
また、その設計は顕微鏡の本体を分解しないと部品を装着できないものであるため、量産の可能性があまり高くない。
上述の欠点に鑑みて、本発明者は、試作と実験を繰り返した結果、前述の問題を解決可能であるだけでなく、電子顕微鏡の観察に適用可能な一般の試料または生体細胞を置くのに用いることが可能である密閉式観測環境を完成させた。
【０００６】
【非特許文献１】Cai P. L.,Microscopy & Microanalysis ８，２１，２００２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の主な目的は、電子顕微鏡の観察に適用可能な一般の試料または生体細胞を置くのに用いることが可能である電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、内部に液体または気体を注入する際に、蒸気または液体が漏洩して大量の気体を生成するという問題が発生せず、観察が容易で明瞭である電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述の目的を達成するために、本発明による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置は、ハウジングを備える。ハウジングは内部に収容室を有し、かつハウジングの頂面と底面には収容室に繋がって向かい合うように同軸に位置する少なくとも一つの観察孔を別々に有し、観察孔は薄膜により封じられる。これにより、一般の試料または生体細胞を収容室に置くことにより、電子顕微鏡の観察に適用することが可能となる。また、ハウジング内に液体または気体を封じることで、液体または気体を外部へ漏洩させるという問題を解決することが可能となる。
【０００９】
本発明の第一実施例は、ハウジング内部に収容室を形成し、かつ薄膜により収容室の上下を封じることである。
本発明の第二実施例は、ハウジング内部に収容室と、収容室の上下方に位置する気体室とを形成し、かつ薄膜により気体室の上下を封じることである。
本発明の第三実施例は、ハウジング内部に収容室、収容室の上下方に位置する気体室および二つの気体室の上下方に位置する二つの緩衝室を形成し、かつ薄膜により緩衝室の上下を封じることである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の構造と特徴を下記の三つの実施例と図面に基づき説明する。まず、図面の説明は次の通りである。
図１は、本発明の第一実施例の斜視図である。
図２は、本発明の第一実施例の断面図である。
【００１１】
図３Ａから図３Ｄは、本発明の第一実施例の薄膜状態を示す模式図である。
図４は、本発明の第一実施例の操作状態を示す模式図である。
図５は、ハウジングと蓋体と座体とを組み合わせた本発明の第一実施例の断面図である。
図６は、本発明の第二実施例の断面図である。
【００１２】
図７は、本発明の第二実施例の操作状態を示す模式図である。
図８は、本発明の第三実施例の断面図である。
図９は、本発明の第三実施例の操作状態を示す模式図である。
図１０は、試料治具を装着している第三実施例の断面図である。
【００１３】
図１から図３Ａに示すように、本発明の第一実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置１０は、ハウジング１１を備える。
ハウジング１１は、一体成型され、内部に収容室１２を有し、かつハウジング１１の頂面と底面には収容室１２に繋がって向かい合うように同軸に位置する少なくとも一つの観察孔１３を別々に有し、これらの観察孔１３は薄膜１３１により封じられる。薄膜１３１は、非結晶性炭素膜または弾性のある高分子膜などであり、厚さが１００ナノ（ｎｍ）から２０ナノ（ｎｍ）の間である。また、薄膜１３１は、収容室１２に近い観察孔１３の一端に位置する。本実施例では、薄膜１３１は外側端面に複数のリブ１３２を有し、これらのリブ１３２は相互交差するように配置されることで薄膜１３１の強度を強化可能であるため、薄膜は破れることなく、１大気圧の圧力の差に耐えることが可能となる。かつハウジング１１および薄膜１３１とこれらのリブ１３２は、周知のマイクロリソグラフィ法により一体成型することが可能である。また、観察孔１３の直径は、５μｍから５００μｍの間であり、特に、５０μｍが好ましい。また、ハウジング１１は、一側に注入孔１１１および他側に流出孔１１２を有する。
【００１４】
密閉式観測環境形成装置１０に試料９９を置く方法は、液体と観察待ちの試料９９（例えば、生体細胞）をハウジング１１の注入孔１１１から収容室１３に注入し、かつ流出孔１１２により注入した液体、蒸気または気体を適当な時に流すことにより、圧力を調節することが可能である。また、流出孔１１２から液体試料を抜き出すことにより、収容室１２内の液体試料の量を制御することが可能である。また、観察待ちの試料９９が生体細胞である場合、収容室１２に培養液または蒸気を注入し、薄膜１３１または収容室１２内壁面に生体細胞の試料９９を固定する。固定方法は、薄膜１３１または収容室１２内壁面に右旋性のポリ−Ｄ−リシン（poly-d-lysine）類の細胞固定剤を塗布することである。また、本実施例は、これらのリブ１３２を交差させるように薄膜１３１の上に配置する方法（図３Ａに示す通り）の他に、図３Ｂから図３Ｄに示すように、平行、同心円または放射状で薄膜１３１の上に配置する方法を採用することも可能であり、また、薄膜１３１とリブ１３２は周知のマイクロリソグラフィ法により製造することが可能である。
【００１５】
また、図４に示すように、観察の際に、密閉式観測環境形成装置１０と試料治具９２とを組み合わせ、そして、それらを電子顕微鏡９０に置き、そののち、電子顕微鏡９０の電子ビーム（図中未表示）を二つの観察孔１３から透過させることにより、収容室１２内の試料９９を観察し、結像することが可能である。また、観察孔１３は薄膜１３１を有するため、収容室１２内の液体または蒸気は、観察孔１３からハウジング１１の外部へ漏洩或いは拡散することはなく、電子顕微鏡９０内の真空環境を破壊することもない。これにより、生体細胞試料９９または別の試料を観察する効果を達成することが可能となる。
【００１６】
図２に示すように、ハウジング１１を一体成型することが可能である。また、図５に示すように、蓋体１４と座体１５とをハウジング１１に組み合わせ、そして、試料９９を座体１５に置いた後、蓋体１４を被せ、続いて、蓋体１４と座体１５との間を接着剤（図中未表示）により接合させることが可能である。
【００１７】
また、図６に示すように、本発明の第二実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置２０は、ハウジング２１を備える。
ハウジング２１は内部に少なくとも一枚の隔離板２４を有し、本実施例では、隔離板２４は二枚である。これらの隔離板２４は、ハウジング２１の内部を分割することで、一つの収容室２２と、収容室２２の上下方に位置する二つの気体室２５とを形成する。収容室２２の頂面と底面は隔離板２４に配置される少なくとも一つの観察孔２３を別々に有し、これらの観察孔２３は収容室２２に繋がる。かつ二つの気体室２５は二つの観察孔２３を含有し、かつ気体室２５の頂面と底面は少なくとも一つの気孔２６を別々に有し、これらの気孔２６と観察孔２３は同軸である。また、これらの気孔２６は薄膜２６１により封じられ、薄膜２６１は気体室２５に近い気孔２６の一端に配置される。また、ハウジング２１は、気体室２５の一側に気圧平衡孔２５１を一つ有する。また、ハウジング２１は、収容室２２の一側に注入孔２１１と、収容室２２の他側に流出孔２１２を有する。
【００１８】
本実施例では、観察孔２３の断面構造は外が大きく、内が小さい錐状を呈し、かつ観察孔２３の壁と隔離板２４の表面は疎水または超疎水処理が施されている。例えば、直径が数百ナノ以内の柱状物（pillar）をたくさん生成し、表面に疎水性のある自己組成単分子膜（self-assembly monomolecular layer）を付けることにより、水滴と表面の接触角度（contact angle）を１５０度以上にし、水が付着しないような排水性を達成することが可能である。また、ハウジングは周知のマイクロリソグラフィにより一体成型することが可能であるため、収容室２２と気体室２５の厚さを極めて薄くするように制御することが可能である。これにより、電子ビームが気体室を透過して電子多重乱射を生成するという問題を減少させることが可能となる。また、密封式観測環境形成装置２０に観察待ちの試料９９を置く場合、液体と観察待ちの試料９９を一体成型のハウジング２１の注入孔２１１から収容室２２に注入し、注入し過ぎた試料を流出孔２１２から排出することが可能である。また、観察孔２３から漏洩した液体試料は観察孔２３壁と隔離板２４の超疎水表面により排斥され、かつハウジング２１が縦に設置されている場合、気圧平衡孔２５１から流れる。また、液体試料が観察孔２３から漏洩することを防止するために、操作の際に、所定の圧力の特定気体を気体室２５に供給し、かつ特定気体の圧力と収容室２２内の液体の圧力の差を収容室２２内の液体溶液の臨界溢漏圧力（Keller S. et., al., Journal of Food Protection ６６，１２６０，２００３）以下にするか、或いは、それと一致させるように制御することにより、注入した培養液または分析待ちの液体試料を観察孔２３から流れさせず、収容室２２内を循環流動させるように維持することが可能である。また、観察を行う場合、実験の需要に応じて培養液または分析待ちの液体試料の循環流動を停止させることが可能である。
【００１９】
また、第二実施例は、操作の際に、電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置２０と試料治具９２とを組み合わせ、そして、それらを電子顕微鏡９０に置いた後の状態が前述の第一実施例と同じである。また、図７に示すように、続いて、注入孔２１１から収容室２２に液体と試料９９（または生体細胞）を注入し、気圧平衡孔２５１から気体室２５に所定の圧力の蒸気、例えば、総圧力が１大気圧である飽和水蒸気（または未飽和水蒸気）と特定気体との混合気体を供給する。特定気体は窒素、酸素、二酸化炭素、不活性気体などのいずれでも可能であり、気体室２５内の水蒸気は収容室２２内の水の蒸発速度を抑制可能である。一方、１大気圧の特定気体を気体室２５に供給し、かつ特定気体の圧力と収容室２２内の液体の圧力の差を収容室２２内の水溶液の臨界溢漏圧力以下にするか、或いは、それと一致させるように制御することにより、収容室２２内の溶液を観察孔２３から漏洩させないように蒸気形態で気体室２５へ徐々に揮発させることが可能である。また、気圧平衡孔２５１により気体室２５内の気体と蒸気に対してバランスを調節することが可能である。
【００２０】
また、第二実施例では、気孔２６は薄膜２６１を有するため、気体室２５内の蒸気または液体は気孔２６からハウジング２１の外部へ拡散することはなく、電子顕微鏡９０内の真空環境を破壊することもない。これにより、生体細胞または別の試料９９を観察する効果を達成することが可能となる。
【００２１】
また、図８に示すように、本発明の第三実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置３０は、ハウジング３１を備える。
ハウジング３１は内部に少なくとも二枚の隔離板３４を有し、本実施例では、隔離板３４は四枚である。これらの隔離板３４は、ハウジング３１の内部を分割することで、一つの収容室３２と、収容室３２の上下方に位置する二つの気体室３５と、二つの気体室３５の上下方に位置する二つの緩衝室３７とを形成する。収容室３２の頂面と底面は隔離板３４に配置される少なくとも一つの観察孔３３を別々に有し、これらの観察孔３３は収容室３２に繋がる。二つの気体室３５は二つの観察孔３３を含有し、かつ上方に位置する気体室３５の頂面は隔離板３４に配置される気孔３６を有し、下方に位置する気体室３５の底面は隔離板３４に配置される気孔２６を有する。二つの緩衝室３７はこれらの気孔３６を含有し、かつハウジング３１の頂部と底部は外孔３８を別々に有する。これらの外孔３８と気孔３６と観察孔３３とは、同軸である。また、これらの外孔３８は薄膜３８１により封じられ、薄膜３８１は緩衝室３７に近い外孔３８の一端に配置される。また、ハウジング３１は、気体室３５の一側に注気孔３５１を少なくとも一つ有し、緩衝室３７の一側に抽気孔３７１を有する。また、ハウジング３１は、収容室３２の一側に位置する注入孔３１１と、収容室３２の他側に位置する流出孔３１２とを有する。
【００２２】
電子顕微鏡用の密封式観測環境形成装置３０に観察待ちの試料９０を置く場合、液体と観察待ちの試料９９をハウジング３１の注入孔３１１から収容室３２に注入する。操作の際、所定の圧力の特定気体を気体室３５に供給し、かつ特定気体の圧力と収容室３２内に注入した液体の圧力の差を収容室３２内の液体溶液の臨界溢漏圧力以下にするか、或いは、それと一致させるように制御するため、液体試料を観察孔３３から漏洩させることを防止することが可能である。続いて、二つの緩衝室３７から気体を持続的に抜き出すように維持する。
【００２３】
また、第三実施例は、操作の際に、電子顕微鏡９０に置いた後の状態が前述の第一実施例と同じである。また、図８と図９に示すように、続いて、注入孔３１１から収容室３２に液体と試料９９または生体細胞を注入し、注気孔３５１から気体室３５に所定の圧力の蒸気、例えば、総圧力が１大気圧である飽和水蒸気（または未飽和水蒸気）と特定気体との混合気体を供給する。特定気体は窒素、酸素、二酸化炭素、不活性気体などのいずれでも可能であり、気体室３５内の水蒸気は収容室３２内の水の蒸発速度を抑制可能である。一方、１大気圧の特定気体を気体室３５に供給し、かつ特定気体の圧力と収容室３２内の水溶液の圧力の差を収容室３２内の水溶液の臨界溢漏圧力以下にするか、或いは、それと一致させるように制御することにより、収容室３２内の液体溶液を観察孔３３から漏洩させないように蒸気形態で気体室３５へ徐々に揮発させ、気体室３５内の気体と蒸気を二つの気孔３６から二つの緩衝室３７へ拡散させることが可能である。続いて、二つの緩衝室３７から気体を持続的に抜き出せば、気体室３５から二つの緩衝室３７に拡散した蒸気と気体を二つの緩衝室３７に残留させずに抜き出すことが可能である。また、観察の際に、電子顕微鏡９０の電子ビームをこれらの外孔３８と気孔３６と観察孔３３から透過させることにより、収容室３２内の試料９９（または生体細胞）を観察することが可能である。
【００２４】
前述の第三実施例では、緩衝室３７を上下方に別々に位置するのは説明のための例に過ぎないため、本発明の範囲を限定することができない。観察の需要に応じて上下方に多層の緩衝室を配置するのは本発明の同等の変化に属すると考えられるため、本発明の請求範囲に属するべきである。
【００２５】
また、図９に示すように、本実施例は、主な構造と試料治具９２（Specimen Holder）をまとめて結合させることで、気体室３５’と、緩衝室３７’と、試料治具９２のボックス９４から形成される収容室９２’とを組み合わせることが可能である。使用方法は、前述の第三実施例と同じであるため、説明を省く。
【００２６】
また、図１０に示すのは、前述の第三実施例のように二つの緩衝室３７”と、試料治具９２のボックス９４”から形成される収容室３２”および気体室３５”と、試料治具９２とを組み合わせる実施状態である。ボックス９４”は周知のマイクロリソグラフィ法により一体成型することが可能であるため、気体室３５”の厚さが極めて薄くなり、電子ビームが気体室を透過して電子多重乱射を生成するという問題を減少させることが可能となる。また、本実施状態のほうが前述の第三実施例により掲示される状態より緩衝室が一つ多いため、気体室３５”の気体圧力を圧力がさらに高い環境になるように操作することが可能となる。
【００２７】
前述の三つの実施例は本発明が例を挙げ、薄膜を異なる位置に配置している状態を掲示するものであるため、本発明の範囲を限定することができない。第三実施例による構造（図８に示す通り）を例とする場合、薄膜を外孔に配置することが可能であるだけでなく、観察孔と気孔のいずれか一つに薄膜を配置するか、或いは、観察孔、気孔または外孔などの任意の二つに薄膜を配置することも可能であるため、同様に両側密封の効果を果たし、前述の実施例と同じ効果と操作方法を有することが可能である。
【００２８】
前述の実施例により掲示される薄膜の配置位置は説明のための例に過ぎないため、収容室、気体室または緩衝室などのいずれか一つに近い一端であるとは限らない。したがって、同等の変化は本発明の請求範囲に属するべきである。
また、前述の実施例では、収容室３２は生体細胞試料９９を置くのに用いることが可能であり、生体細胞試料９９は収容室３２の壁面または内側壁面に固定することが可能である。また、第一実施例に示すように、生体細胞試料９９は、観察孔１３に配置される薄膜１３１に固定することも可能である。
【００２９】
上述の通り、本発明の長所は次の通りである。
一、試料または生体細胞の観察に用いる環境を提供可能である。本発明は、収容室に一般の試料または生体細胞を置くことにより、電子顕微鏡の観察に適用することが可能であるため、周知の技術のように生体細胞を観測することができないという問題を解決することが可能となる。
【００３０】
二、電子顕微鏡を損壊する事態が発生しない。本発明は、収容室に液体または気体を注入する場合、薄膜の配置により収容室内の蒸気または液体を漏洩させることを防止することが可能であるため、観察が容易で明瞭になるだけでなく、電子顕微鏡を損壊する事態が発生しない。
本発明により掲示されるユニットは説明のための例に過ぎず、本発明の範囲を限定することができないため、本発明の請求範囲に基づいて同等の変化と運用をすることは本発明の請求範囲に属するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の第一実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置を示す斜視図である。
【図２】本発明の第一実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置を示す断面図である。
【図３Ａ】本発明の第一実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置の薄膜状態を示す模式図である。
【図３Ｂ】本発明の第一実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置の薄膜状態を示す模式図である。
【図３Ｃ】本発明の第一実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置の薄膜状態を示す模式図である。
【図３Ｄ】本発明の第一実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置の薄膜状態を示す模式図である。
【図４】本発明の第一実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置の操作状態を示す模式図である。
【図５】本発明の第一実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置のハウジングと蓋体と座体とを組み合わせた状態を示す断面図である。
【図６】本発明の第二実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置を示す断面図である。
【図７】本発明の第二実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置の操作状態を示す模式図である。
【図８】本発明の第三実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置を示す断面図である。
【図９】本発明の第三実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置の操作状態を示す模式図である。
【図１０】本発明の第三実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置の試料治具を装着している状態を示す断面図である。
【符号の説明】
【００３２】
１０  電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置、１１  ハウジング、１２  収容室、１３  観察孔、１４  蓋体、１５  座体、２０  電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置、２１  ハウジング、２２  収容室、２３  観察孔、２４  隔離板、２５  気体室、２６  気孔、３０  電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置、３１  ハウジング、３２  収容室、３２’  収容室、３２”  収容室、３３  観察孔、３４  隔離板、３５  気体室、３５’  気体室、３５”  気体室、３６  気孔、３７  緩衝室、３７’  緩衝室、３７”  緩衝室、３８  外孔、９０  電子顕微鏡、９２試料治具、９４  ボックス、９４’  ボックス、９９  試料、１１１  注入孔、１１２  流出孔、１３１  薄膜、１３２  リブ、２１１  注入孔、２１２  流出孔、２５１  圧力平衡孔、２６１  薄膜、３１１  注入孔、３１２  流出孔、３５１  注気孔、３７１  抽気孔、３８１  薄膜
【図１】
2007165271.tif 000003
【図２】
2007165271.tif 000004
【図３Ａ】
2007165271.tif 000005
【図３Ｂ】
2007165271.tif 000006
【図３Ｃ】
2007165271.tif 000007
【図３Ｄ】
2007165271.tif 000008
【図４】
2007165271.tif 000009
【図５】
2007165271.tif 000010
【図６】
2007165271.tif 000011
【図７】
2007165271.tif 000012
【図８】
2007165271.tif 000013
【図９】
2007165271.tif 000014
【図１０】
2007165271.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月18日(2006.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
ハウジングを備える電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置であって、
ハウジングは内部に液体室を有し、ハウジングの頂面と底面には液体室に繋がって向かい合うように同軸に位置する少なくとも一つの観察孔を別々に有し、観察孔は薄膜により封じられていることを特徴とする電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
薄膜は、液体室に近い観察孔の一端に配置され、二つの薄膜の距離は１０μm以下であることを特徴とする請求項１に記載の電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９】
ハウジングを備える電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置であって、
ハウジングは少なくとも一枚の隔離板により内部が分割されて一つの液体室と少なくとも一つの気体室とを形成し、液体室の頂面と底面は隔離板に配置される少なくとも一つの観察孔を別々に有し、観察孔は液体室に繋がり、気体室は観察孔を含有し、ハウジングの頂面と底面は少なくとも一つの気孔を別々に有し、気孔と観察孔は同軸であり、気孔は薄膜により封じられ、ハウジングは気体室の一側に気圧平衡孔を少なくとも一つ有することを特徴とする電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
ハウジングは、液体室の一側に注入孔と、液体室の他側に流出孔とを有することを特徴とする請求項９に記載の電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１２】
ハウジングを備える電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置であって、
ハウジングは少なくとも二枚の隔離板により内部が分割されて一つの液体室と少なくとも一つの気体室と少なくとも一つの緩衝室とを形成し、液体室の頂面と底面は隔離板に配置される少なくとも一つの観察孔を別々に有し、観察孔は液体室に繋がり、気体室は観察孔を含有し、気体室の頂面と底面は別の隔離板に配置される少なくとも一つの気孔を別々に有し、緩衝室は気孔を含有し、ハウジングの頂面と底面は少なくとも一つの外孔を別々に有し、外孔と気孔と観察孔とは同軸であり、外孔は薄膜により封じられ、ハウジングは気体室の一側に注気孔を少なくとも一つ有し、緩衝室の一側に抽気孔を少なくとも一つ有することを特徴とする電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１４】
ハウジングは、液体室の一側に注入孔と、液体室の他側に流出孔とを有することを特徴とする請求項１２に記載の電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明の主な目的は、電子顕微鏡の観察に適用可能な一般の試料または生体細胞を置くのに用いることが可能である電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、内部に液体を注入する際に、液体が漏洩或いは揮発して大量の気体を生成するという問題が発生せず、観察が容易で明瞭である電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置を提供することである。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
上述の目的を達成するために、本発明による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置は、ハウジングを備える。ハウジングは内部に液体室を有し、かつハウジングの頂面と底面には液体室に繋がって向かい合うように同軸に位置する少なくとも一つの観察孔を別々に有し、観察孔は薄膜により封じられる。これにより、一般の試料または生体細胞を液体室に置くことにより、電子顕微鏡の観察に適用することが可能となる。また、ハウジング内に液体を封じることで、液体を外部へ漏洩或いは揮発させるという問題を解決することが可能となる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明の第一実施例は、ハウジング内部に液体室を形成し、かつ薄膜により液体室の上下を封じることである。
本発明の第二実施例は、ハウジング内部に液体室と、液体室の上下方に位置する気体室とを形成し、かつ薄膜により気体室の上下を封じることである。
本発明の第三実施例は、ハウジング内部に液体室、液体室の上下方に位置する気体室および二つの気体室の上下方に位置する二つの緩衝室を形成し、かつ薄膜により緩衝室の上下を封じることである。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
図１から図３Ａに示すように、本発明の第一実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置１０は、ハウジング１１を備える。
ハウジング１１は、一体成型され、内部に液体室１２を有し、かつハウジング１１の頂面と底面には液体室１２に繋がって向かい合うように同軸に位置する少なくとも一つの観察孔１３を別々に有し、これらの観察孔１３は薄膜１３１により封じられる。薄膜１３１は、非結晶性炭素膜または弾性のある高分子膜などである。また、薄膜１３１は、液体室１２に近い観察孔１３の一端に位置する。かつ二つの薄膜１３１の距離は１０μm以下である。本実施例では、薄膜１３１は外側端面に複数のリブ１３２を有し、これらのリブ１３２は相互交差するように配置されることで薄膜１３１の強度を強化可能であるため、薄膜は破れることなく、１大気圧の圧力の差に耐えることが可能となる。かつハウジング１１および薄膜１３１とこれらのリブ１３２は、周知のマイクロリソグラフィ法により一体成型することが可能である。また、観察孔１３の直径は、５μｍから５００μｍの間であり、特に、５０μｍが好ましい。また、ハウジング１１は、一側に注入孔１１１および他側に流出孔１１２を有する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
密閉式観測環境形成装置１０に試料９９を置く方法は、液体と観察待ちの試料９９（例えば、生体細胞）をハウジング１１の注入孔１１１から液体室１３に注入し、かつ流出孔１１２により注入した液体を適当な時に流すことにより、圧力を調節することが可能である。また、流出孔１１２から液体試料を抜き出すことにより、液体室１２内の液体試料の量を制御することが可能である。また、観察待ちの試料９９が生体細胞である場合、液体室１２に培養液を注入し、薄膜１３１または液体室１２内壁面に生体細胞の試料９９を固定する。固定方法は、薄膜１３１または液体室１２内壁面に右旋性のポリ−Ｄ−リシン（poly-d-lysine）類の細胞固定剤を塗布することである。また、本実施例は、これらのリブ１３２を交差させるように薄膜１３１の上に配置する方法（図３Ａに示す通り）の他に、図３Ｂから図３Ｄに示すように、平行、同心円または放射状で薄膜１３１の上に配置する方法を採用することも可能であり、また、薄膜１３１とリブ１３２は周知のマイクロリソグラフィ法により製造することが可能である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
また、図４に示すように、観察の際に、密閉式観測環境形成装置１０と試料治具９２とを組み合わせ、そして、それらを電子顕微鏡９０に置き、そののち、電子顕微鏡９０の電子ビーム（図中未表示）を二つの観察孔１３から透過させることにより、液体室１２内の試料９９を観察し、結像することが可能である。また、観察孔１３は薄膜１３１を有するため、液体室１２内の液体は、観察孔１３からハウジング１１の外部へ漏洩或いは揮発することはなく、電子顕微鏡９０内の真空環境を破壊することもない。これにより、生体細胞試料９９または別の試料を観察する効果を達成することが可能となる。また二つの薄膜１３１の距離は１０μｍ以下であるため、液体室１２において観察可能な高さが極めて低い（即ち液体層が極めて薄い）。従って電子顕微鏡の電子ビームを透過させ、確実に結像させることが可能となる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
また、図６に示すように、本発明の第二実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置２０は、ハウジング２１を備える。
ハウジング２１は内部に少なくとも一枚の隔離板２４を有し、本実施例では、隔離板２４は二枚である。これらの隔離板２４は、ハウジング２１の内部を分割することで、一つの液体室２２と、液体室２２の上下方に位置する二つの気体室２５とを形成する。液体室２２の頂面と底面は隔離板２４に配置される少なくとも一つの観察孔２３を別々に有し、これらの観察孔２３は液体室２２に繋がる。かつ二つの気体室２５は二つの観察孔２３を含有し、かつ気体室２５の頂面と底面は少なくとも一つの気孔２６を別々に有し、これらの気孔２６と観察孔２３は同軸である。また、これらの気孔２６は薄膜２６１により封じられ、薄膜２６１は気体室２５に近い気孔２６の一端に配置される。また、ハウジング２１は、気体室２５の一側に気圧平衡孔２５１を一つ有する。また、ハウジング２１は、液体室２２の一側に注入孔２１１と、液体室２２の他側に流出孔２１２を有する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本実施例では、観察孔２３の断面構造は外が大きく、内が小さい錐状を呈し、かつ観察孔２３の壁と隔離板２４の表面は疎水または超疎水処理が施されている。例えば、直径が数百ナノ以内の柱状物（pillar）をたくさん生成し、表面に疎水性のある自己組成単分子膜（self-assembly monomolecular layer）を付けることにより、水滴と表面の接触角度（contact angle）を１５０度以上にし、水が付着しないような排水性を達成することが可能である。また、ハウジングは周知のマイクロリソグラフィにより一体成型することが可能であるため、液体室２２と気体室２５の厚さを極めて薄くするように制御することが可能である。これにより、電子ビームが気体室を透過して電子多重乱射を生成するという問題を減少させることが可能となる。また、密封式観測環境形成装置２０に観察待ちの試料９９を置く場合、液体と観察待ちの試料９９を一体成型のハウジング２１の注入孔２１１から液体室２２に注入し、注入し過ぎた試料を流出孔２１２から排出することが可能である。また、観察孔２３から漏洩した液体試料は観察孔２３壁と隔離板２４の超疎水表面により排斥され、かつハウジング２１が縦に設置されている場合、気圧平衡孔２５１から流れる。また、液体試料が観察孔２３から漏洩することを防止するために、操作の際に、所定の圧力の特定気体を気体室２５に供給し、かつ特定気体の圧力と液体室２２内の液体の圧力の差を液体室２２内の液体溶液の臨界溢漏圧力（Keller S. et., al., Journal of Food Protection ６６，１２６０，２００３）以下にするか、或いは、それと一致させるように制御することにより、注入した培養液または分析待ちの液体試料を観察孔２３から流れさせず、液体室２２内を循環流動させるように維持することが可能である。また、観察を行う場合、実験の需要に応じて培養液または分析待ちの液体試料の循環流動を停止させることが可能である。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
また、第二実施例は、操作の際に、電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置２０と試料治具９２とを組み合わせ、そして、それらを電子顕微鏡９０に置いた後の状態が前述の第一実施例と同じである。また、図７に示すように、続いて、注入孔２１１から液体室２２に液体と試料９９（または生体細胞）を注入し、気圧平衡孔２５１から気体室２５に所定の圧力の蒸気、例えば、総圧力が１大気圧である飽和水蒸気（または未飽和水蒸気）と特定気体との混合気体を供給する。特定気体は窒素、酸素、二酸化炭素、不活性気体などのいずれでも可能であり、気体室２５内の水蒸気は液体室２２内の水の蒸発速度を抑制可能である。一方、１大気圧の特定気体を気体室２５に供給し、かつ特定気体の圧力と液体室２２内の液体の圧力の差を液体室２２内の水溶液の臨界溢漏圧力以下にするか、或いは、それと一致させるように制御することにより、液体室２２内の溶液を観察孔２３から漏洩させないように蒸気形態で気体室２５へ徐々に揮発させることが可能である。また、気圧平衡孔２５１により気体室２５内の気体と蒸気に対してバランスを調節することが可能である。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
また、図８に示すように、本発明の第三実施例による電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置３０は、ハウジング３１を備える。
ハウジング３１は内部に少なくとも二枚の隔離板３４を有し、本実施例では、隔離板３４は四枚である。これらの隔離板３４は、ハウジング３１の内部を分割することで、一つの液体室３２と、液体室３２の上下方に位置する二つの気体室３５と、二つの気体室３５の上下方に位置する二つの緩衝室３７とを形成する。液体室３２の頂面と底面は隔離板３４に配置される少なくとも一つの観察孔３３を別々に有し、これらの観察孔３３は液体室３２に繋がる。二つの気体室３５は二つの観察孔３３を含有し、かつ上方に位置する気体室３５の頂面は隔離板３４に配置される気孔３６を有し、下方に位置する気体室３５の底面は隔離板３４に配置される気孔２６を有する。二つの緩衝室３７はこれらの気孔３６を含有し、かつハウジング３１の頂部と底部は外孔３８を別々に有する。これらの外孔３８と気孔３６と観察孔３３とは、同軸である。また、これらの外孔３８は薄膜３８１により封じられ、薄膜３８１は緩衝室３７に近い外孔３８の一端に配置される。また、ハウジング３１は、気体室３５の一側に注気孔３５１を少なくとも一つ有し、緩衝室３７の一側に抽気孔３７１を有する。また、ハウジング３１は、液体室３２の一側に位置する注入孔３１１と、液体室３２の他側に位置する流出孔３１２とを有する。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
電子顕微鏡用の密封式観測環境形成装置３０に観察待ちの試料９０を置く場合、液体と観察待ちの試料９９をハウジング３１の注入孔３１１から液体室３２に注入する。操作の際、所定の圧力の特定気体を気体室３５に供給し、かつ特定気体の圧力と液体室３２内に注入した液体の圧力の差を液体室３２内の液体溶液の臨界溢漏圧力以下にするか、或いは、それと一致させるように制御するため、液体試料を観察孔３３から漏洩させることを防止することが可能である。続いて、二つの緩衝室３７から気体を持続的に抜き出すように維持する。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
また、第三実施例は、操作の際に、電子顕微鏡９０に置いた後の状態が前述の第一実施例と同じである。また、図８と図９に示すように、続いて、注入孔３１１から液体室３２に液体と試料９９または生体細胞を注入し、注気孔３５１から気体室３５に所定の圧力の蒸気、例えば、総圧力が１大気圧である飽和水蒸気（または未飽和水蒸気）と特定気体との混合気体を供給する。特定気体は窒素、酸素、二酸化炭素、不活性気体などのいずれでも可能であり、気体室３５内の水蒸気は液体室３２内の水の蒸発速度を抑制可能である。一方、１大気圧の特定気体を気体室３５に供給し、かつ特定気体の圧力と液体室３２内の水溶液の圧力の差を液体室３２内の水溶液の臨界溢漏圧力以下にするか、或いは、それと一致させるように制御することにより、液体室３２内の液体溶液を観察孔３３から漏洩させないように蒸気形態で気体室３５へ徐々に揮発させ、気体室３５内の気体と蒸気を二つの気孔３６から二つの緩衝室３７へ拡散させることが可能である。続いて、二つの緩衝室３７から気体を持続的に抜き出せば、気体室３５から二つの緩衝室３７に拡散した蒸気と気体を二つの緩衝室３７に残留させずに抜き出すことが可能である。また、観察の際に、電子顕微鏡９０の電子ビームをこれらの外孔３８と気孔３６と観察孔３３から透過させることにより、液体室３２内の試料９９（または生体細胞）を観察することが可能である。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
また、図９に示すように、本実施例は、主な構造と試料治具９２（Specimen Holder）をまとめて結合させることで、気体室３５’と、緩衝室３７’と、試料治具９２のボックス９４から形成される液体室９２’とを組み合わせることが可能である。使用方法は、前述の第三実施例と同じであるため、説明を省く。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
また、図１０に示すのは、前述の第三実施例のように二つの緩衝室３７”と、試料治具９２のボックス９４”から形成される液体室３２”および気体室３５”と、試料治具９２とを組み合わせる実施状態である。ボックス９４”は周知のマイクロリソグラフィ法により一体成型することが可能であるため、気体室３５”の厚さが極めて薄くなり、電子ビームが気体室を透過して電子多重乱射を生成するという問題を減少させることが可能となる。また、本実施状態のほうが前述の第三実施例により掲示される状態より緩衝室が一つ多いため、気体室３５"の気体圧力を圧力がさらに高い環境になるように操作することが可能となる。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
前述の実施例により掲示される薄膜の配置位置は説明のための例に過ぎないため、液体室、気体室または緩衝室などのいずれか一つに近い一端であるとは限らない。したがって、同等の変化は本発明の請求範囲に属するべきである。
また、前述の実施例では、液体室３２は生体細胞試料９９を置くのに用いることが可能であり、生体細胞試料９９は液体室３２の壁面または内側壁面に固定することが可能である。また、第一実施例に示すように、生体細胞試料９９は、観察孔１３に配置される薄膜１３１に固定することも可能である。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
二、電子顕微鏡を損壊する事態が発生しない。本発明は、液体室に液体を注入する場合、薄膜の配置により液体室内の液体を外部へ漏洩或いは揮発させることを防止することが可能であるため、観察が容易で明瞭になるだけでなく、電子顕微鏡を損壊する事態が発生しない。
本発明により掲示されるユニットは説明のための例に過ぎず、本発明の範囲を限定することができないため、本発明の請求範囲に基づいて同等の変化と運用をすることは本発明の請求範囲に属するべきである。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
１０  電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置、１１  ハウジング、１２  液体室、１３  観察孔、１４  蓋体、１５  座体、２０  電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置、２１  ハウジング、２２  液体室、２３  観察孔、２４  隔離板、２５  気体室、２６  気孔、３０  電子顕微鏡用の密閉式観測環境形成装置、３１  ハウジング、３２  液体室、３２’  液体室、３２”  液体室、３３  観察孔、３４  隔離板、３５  気体室、３５’  気体室、３５”  気体室、３６  気孔、３７  緩衝室、３７’  緩衝室、３７”  緩衝室、３８  外孔、９０  電子顕微鏡、９２試料治具、９４  ボックス、９４’  ボックス、９９  試料、１１１  注入孔、１１２  流出孔、１３１  薄膜、１３２  リブ、２１１  注入孔、２１２  流出孔、２５１  圧力平衡孔、２６１  薄膜、３１１  注入孔、３１２  流出孔、３５１  注気孔、３７１  抽気孔、３８１  薄膜