(57)【要約】【課題】血管内皮増殖因子受容体２型（ＫＤＲ）に対する拮抗的阻害剤として利用可能であり、また、水溶性にも優れている外因性阻害物質を新たに見出し、探索された外因性阻害物質を、ＫＤＲに対する結合を介する、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ165の細胞増殖誘起作用を効果的に阻害する、ＫＤＲに対する拮抗的阻害剤として使用する方法を提供する。【解決手段】ヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2、またはＳｅｒ49−ホスホリパーゼＡ2、特に、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）のヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2を、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ165の結合を阻害する拮抗的阻害剤として使用する。【選択図】図２
2007161639.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2、またはＳｅｒ49−ホスホリパーゼＡ2を、血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）に対する血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ−Ａ）ＶＥＧＦ165の結合を阻害する拮抗的阻害剤として使用する
ことを特徴とするヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2、またはＳｅｒ49−ホスホリパーゼＡ2の使用。
【請求項２】
Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2を、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ165の結合を阻害する拮抗的阻害剤として使用する
ことを特徴とするＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2の使用。
【請求項３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＫＤＲに対するＶＥＧＦ165の結合を利用する生理的試験系において、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2を、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ165の結合を阻害する拮抗的阻害剤として使用する
ことを特徴とする請求項２に記載のＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2、またはＳｅｒ49−ホスホリパーゼＡ2の新規な用途に関し、特には、血管内皮増殖因子受容体２型に対する拮抗的阻害剤としてのヘビ毒由来Ｌｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ−Ａ）は、血管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）と血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）において、中心的な役割を担っている。ヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子は、七つのイントロンを含んでおり、そのコード領域は八つのエキソンに分割されている。また、Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇに起因して、４種のスプライシング異性体が産生される。細胞外へ分泌される際、そのＮ末のシグナル配列が切除をうけ、それぞれアミノ酸長が、１２１、１６５、１８９、２０６のスプライシング異性体；ＶＥＧＦ121、ＶＥＧＦ165、ＶＥＧＦ189、ＶＥＧＦ206となる。具体的には、Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇの結果、ＶＥＧＦ165では、エキソン６領域が欠落しており、ＶＥＧＦ121では、エキソン６領域とエキソン７領域が欠落している。体液中に含まれるＶＥＧＦ−Ａ中において、主要なスプライシング異性体は、ＶＥＧＦ165であり、分子量２３  ｋＤａのサブユニットがジスルフィド結合によりホモダイマーを形成した糖タンパク質として存在している。このサブユニット間のジスルフィド結合は、Ｃｙｓ51、Ｃｙｓ60の二箇所で形成されており、二つのサブユニットは、アンチ・パラレル配向で連結された状態である。
【０００３】
このＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ165）ホモダイマーに対する受容体は、血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）と血管内皮増殖因子受容体１型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １；Ｆｌｔ−１）であり、さらに、ＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ165）ホモダイマーは、ニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１；ＮＰ−１）に対しても結合性を示す（非特許文献１を参照）。一方、ＶＥＧＦ121ホモダイマーは、ＫＤＲとＦｌｔ−１には結合するものの、ＮＰ−１に対する結合性は示さない。このＫＤＲとＦｌｔ−１は、血管内皮細胞表面に発現されている受容体−チロシンキナーゼ型タンパク質であり、二つのユニットからなるダイマー構造を構成している。図１に示すように、そのＮ末側の細胞外ドメインは、七つのＩｇ様ドメインで構成されており、一つの膜貫通領域によって、Ｃ末側の細胞内ドメインである、チロシンキナーゼ活性部分と連結されている。その他、ＮＰ−１も、二つのユニットからなるダイマー構造を構成しており、そのＮ末側の細胞外ドメインは、４つのＩｇ様ドメインを含んでいる。
【０００４】
加えて、ＶＥＧＦ165ホモダイマーは、ヘパリンに対する結合能を有しており、かかるヘパリンとの結合には、エキソン７とエキソン８によりコードされている、そのＣ末端の部分が関与することも判明している。実際、血管内皮細胞表面には、ダイマー構造のＫＤＲに加えて、ヘパリン様糖鎖も存在しており、ＶＥＧＦ165ホモダイマーは、エキソン１〜エキソン５によりコードされている、Ｎ末側の領域において、ＫＤＲの細胞外ドメインと結合し、同時に、エキソン７とエキソン８によりコードされている、そのＣ末端の部分は、細胞表面のヘパリン様糖鎖と結合していると想定される。図１に示すように、ＫＤＲならびにＦｌｔ−１の七つのＩｇ様ドメインのうち、ＶＥＧＦ165との結合には、第二、第三のＩｇ様ドメインが関与しており（非特許文献２、非特許文献３を参照）、一方、ＮＰ−１の４つのＩｇ様ドメインのうち、ｂ領域の二つのＩｇ様ドメインがＶＥＧＦ165との結合に関与している。
【０００５】
加えて、ＶＥＧＦ165のエキソン１〜エキソン５によりコードされている、Ｎ末側の領域部分と高い相同性を有するＶＥＧＦ様タンパク質複数が、ヘビ毒中から単離されている。血圧降下因子（ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＦ）が、Ｖｉｐｅｒａ  ａｓｐｉｓ  ａｓｐｉｓのヘビ毒素から単離され、このＨＦの一次構造（アミノ酸配列）は、ＶＥＧＦと相同性を有している（非特許文献４，非特許文献５を参照）。さらに、Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質：ｖａｍｍｉｎおよびＤａｂｏｉａ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ  ｒｕｓｓｅｌｌｉのヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質：ＶＲ−１は、ＮＰ−１、Ｆｌｔ−１に対する結合性は示さず、ＫＤＲに対して特異的な結合性を示すことが報告されている（非特許文献６を参照）。これらヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質は、ＫＤＲとの結合を介して、ＶＥＧＦ165と同様の生理的作用を発揮する。
【０００６】
他方、生体内には、ＶＥＧＦ165とＫＤＲの結合を阻害し、ＶＥＧＦ165とこれら血管内皮増殖因子受容体との結合により誘導される生理的活性を調整する内因性阻害物質が存在している。実際に、ＫＤＲの細胞外ドメインに結合し、ＶＥＧＦ165とＫＤＲの結合により誘起される血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を阻害する内因性阻害物質として、ＴＩＭＰ−３（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ−３）が報告されている（非特許文献７を参照）。このＴＩＭＰ−３は、ＶＥＧＦ165とＦｌｔ−１の結合は阻害せず、ＶＥＧＦ165とＫＤＲの結合に対して、特異的な高い阻害活性を有している。
【非特許文献１】Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｎ．  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．  Ｖｏｌ．２５，  ５８１−６１１  （２００４）
【非特許文献２】Ｗｉｅｓｍａｎｎ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．９１，  ６９５−７０４  （１９９７）
【非特許文献３】Ｓｈｉｎｋａｉ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．２７３，  ３１２８３−３１２８８  （１９９８）
【非特許文献４】Ｋｏｍｏｒｉ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｃｏｎ，  Ｖｏｌ．２８，  ３５９−３６９  （１９９０）
【非特許文献５】Ｋｏｍｏｒｉ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．３８，  １１７９６−１１８０３  （１９９９）
【非特許文献６】Ｙａｍａｚａｋｉ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．２７８，  ５１９８５−５１９８８  （２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
培養細胞表面に発現されている血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）に対する、ＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ165）ホモダイマーの結合は、当該細胞の増殖を誘導するため、種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞増殖実験系で利用されている。一方、かかるｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞増殖実験系を利用して、種々の生理的活性を有する物質の細胞増殖への作用を検証する際には、ＫＤＲのリガンドである、ＶＥＧＦ165あるいはＶＲＧＦ様タンパク質が誘起物質として利用される。また、特定の目的では、かかるＫＤＲに対するＶＥＧＦ165の結合を阻害する標準物質も使用される。具体的には、ＫＤＲと結合し、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ165の結合を阻害するが、かかる物質自体は、ＫＤＲとの結合を介して、細胞増殖を誘導する作用を発揮しない、ＫＤＲに対する拮抗的阻害剤も利用される。既に、報告されている内因性阻害物質のＴＩＭＰ−３は、このＫＤＲに対する拮抗的阻害剤として利用可能であるが、さらに、ＫＤＲに対する拮抗的阻害剤として利用可能な外因性阻害物質の探索も、当該分野の研究を進める上で解決すべき課題の一つである。
【０００８】
本発明は、かかる課題に対する一つの解決手段を提供するものであり、本発明の目的は、ＫＤＲに対する拮抗的阻害剤として利用可能であり、また、水溶性にも優れている外因性阻害物質を新たに見出し、探索された外因性阻害物質を、ＫＤＲに対する結合を介する、ＶＥＧＦ165の細胞増殖誘起作用を効果的に阻害する、ＫＤＲに対する拮抗的阻害剤として使用する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質：ｖａｍｍｉｎおよびＶＲ−１を先に見出し、ＫＤＲに対する結合能、特に、結合速度定数：ｋassは、ＶＥＧＦ165と比較して、ｖａｍｍｉｎは顕著に優れていることも確認した（特開２００５−１１０５０８号公報を参照）。まず、発明者らは、この特徴を利用して、ｖａｍｍｉｎとＫＤＲとの特異的結合に対して、高い阻害能を示し、また、該阻害活性は、ＫＤＲに対する被験物質の結合に起因することを検証することが可能な、阻害物質のスクリーング系を構築した。この阻害物質のスクリーング系を利用して、各種のヘビ毒中に、ｖａｍｍｉｎとＫＤＲとの特異的結合に対して、高い阻害能を示す物質が存在するか否かの検討を行った。その結果、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎｍｏｕｔｈ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）由来のヘビ毒中に、ｖａｍｍｉｎとＫＤＲとの特異的結合に対して、高い阻害能を示す物質が含まれていることを見出した。かかるＥａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎｍｏｕｔｈ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）由来のヘビ毒中に含まれる阻害物質は、実際に、ＫＤＲの細胞外ドメインと結合することによって、ｖａｍｍｉｎとＫＤＲとの特異的結合を阻害していることも検証した。このＥａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎｍｏｕｔｈ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）由来のヘビ毒中に含まれる阻害物質を、カラム・クロマトグラフ法により単離・精製したところ、還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、見掛けの分子量１６．８ｋＤａの高い塩基性のタンパク質として、単離された。この分子量１６．８ｋＤａのＥａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎｍｏｕｔｈ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）のヘビ毒由来のタンパク質に、仮に、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来の「ＫＤＲ結合性タンパク質：ＫＤＲ−ｂｐ（ＫＤＲ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」の名称を付した。そのアミノ酸配列を特定するため、Ｎ末端側のアミノ酸配列、ならびに、リシンのＣ末側において、ペプチド鎖を切断するｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｌｙｓ−Ｃ消化によって調製される一群のペプチド断片のアミノ酸配列を、アミノ酸配列分析によって決定した。また、該ＫＤＲ−ｂｐの分子量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析法により測定した。この実測された分子量ならびに、Ｎ末端側のアミノ酸配列、ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｌｙｓ−Ｃ  消化で得られる、一群のペプチド断片のアミノ酸配列に基づき、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のヘビ毒中に含まれる既知のタンパク質との対比を行った。その対比の結果、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2について既に報告されているアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＰＳＳＮＡＭ）から算出される分子量（Ｍｗ＝１３，９４７）と前記実測された分子量（Ｍｗobs.＝１３，７８３．７）とは略一致しており、また、図２に示すように、Ｎ末端側のアミノ酸配列、ｅ��ｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｌｙｓ−Ｃ  消化で得られる、一群のペプチド断片のアミノ酸配列ともに、対応していることが判明した。すなわち、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＫＤＲ−ｂｐは、既に報告されているＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2と同一のタンパク質であることが判明した。
【００１０】
また、かかるＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2と同様に、公知のＴｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2である、ＢＰ−Ｉ（ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ）とＢＰ−II（ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  II）も、ＫＤＲの細胞外ドメインと結合することによって、ｖａｍｍｉｎとＫＤＲとの特異的結合を阻害する機能を有することをも見出した。これらの結果に基づき、既にアミノ酸配列が公表されている、公知のヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2、ならびにＳｅｒ49−ホスホリパーゼＡ2に関して、アミノ酸配列の相同性、その三次元構造の類似性を考慮した結果、いずれも、ＫＤＲの細胞外ドメインとの結合能を有すると推断されることも見出した。
【００１１】
以上の知見に加えて、本発明者らは、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＫＤＲ−ｂｐ、すなわち、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2は、それ自体は、ＫＤＲと結合することによって、細胞増殖を誘導する機能は無く、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ165の結合を効果的に阻害する、ＫＤＲに対する拮抗的阻害剤として使用可能であることをも検証して、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、
本発明は、ヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2、ならびにＳｅｒ49−ホスホリパーゼＡ2の新規な用途の発明であり、
ヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2、またはＳｅｒ49−ホスホリパーゼＡ2を、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ165の結合を阻害する拮抗的阻害剤として使用する方法である。
【００１３】
本発明の一形態は、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2の新規な用途の発明であり、具体的には、
Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2を、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ165の結合を阻害する拮抗的阻害剤として使用する方法である。
【００１４】
特には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＫＤＲに対するＶＥＧＦ165の結合を利用する生理的試験系において、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2を、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ165の結合を阻害する拮抗的阻害剤として使用する方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明にかかるヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2、またはＳｅｒ49−ホスホリパーゼＡ2を、ＫＤＲのリガンド：ＶＥＧＦ165に対する拮抗的阻害剤として使用する方法、例えば、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2を、ＫＤＲのリガンド：ＶＥＧＦ165に対する拮抗的阻害剤として使用する方法は、該Ｌｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2自体は、血管内皮細胞に対して、何らの細胞毒性を示さず、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ165の結合により誘起される細胞増殖を阻害する、ＫＤＲに対する拮抗的阻害物質であるため、該Ｌｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2自体の生理的作用に起因する影響を考慮することなく、ＫＤＲに対する拮抗的阻害剤として好適に利用できる。特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＫＤＲに対するＶＥＧＦ165の結合を利用する生理的試験系において、該Ｌｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2自体の生理的作用に起因する影響を考慮することなく、ＫＤＲに対する拮抗的阻害剤として好適に利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下に、本発明をより詳しく説明する。
【００１７】
本発明においては、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ165の結合を拮抗的阻害するために、ヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2、あるいはＳｅｒ49−ホスホリパーゼＡ2を使用する。
【００１８】
この用途において、好適に使用されるヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2には、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎｍｏｕｔｈ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）のヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2、さらには、Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓ由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2である、ＢＰ−Ｉ（ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ）とＢＰ−II（ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  II）が含まれる。加えて、ヘビ毒由来のＳｅｒ49−ホスホリパーゼＡ2も、ヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2と同様にホスホリパーゼ活性を示さず、そして、ＫＤＲに対する拮抗的阻害剤としての利用可能性を有している。この用途に対する利用可能性を有する、Ｓｅｒ49−ホスホリパーゼＡ2には、例えば、Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒由来のＡｍｍｏｄｙｔｉｎ  Ｌが含まれる（Ｋｒｉｚａｊ，  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．２０２，  １１６５−１１６８  （１９９１）を参照）。なお、該Ｓｅｒ49−ホスホリパーゼＡ2のＫＤＲ細胞外ドメインへの結合能（親和性）に関しては、ＫＤＲ−ＩｇＧに対する解離定数Ｋｄ＝１．３３×１０-8  Ｍを与えるものである。
ホスホリパーゼ活性を示さない、ヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2、あるいはＳｅｒ49−ホスホリパーゼＡ2は、神経毒性はないが、筋肉組織の損傷を引き起こすＭｙｏｔｏｘｉｎとして作用する。このヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2は、塩基性タンパク質であり、ｐＨ７近傍では、その多くは、ダイマーの形態で存在している。加えて、ヘパリンとの結合能を有している。該ヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2のアミノ酸配列、例えば、下記の「共通的な配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」：
ＳＬＦＥＬＧＫＭＩＬ  ＱＥＴＧＫＮＰＡＫＳ  ＹＧＬＹＧＣＮＣＧＶ      ３０
ＧＧＲＧＫＰＫＤＡＴ  ＤＲＣＣＹＶＨＫＣＣ  ＹＫＫＬＴＤＣＤＰＫ      ６０
ＫＤＲＹＳＹＳＷＫＮ  ＫＴＩＶＣＧＥＮＮＰ    ＣＬＫＥＬＣＥＣＤ      ９０
ＫＡＶＡＩＣＬＲＥＮ  ＬＤＴＹＮＫＫＹＫＩ    ＹＬＫＰＦＣＫＫＡ    １２０
ＤＡＣ                                                            １２４
において、このヘパリン結合部位は、そのＣ末領域、特には、１０６番目〜１１９番目の領域であることが報告されている（Ｌｏｍｏｎｔｅ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｃｏｎ  Ｖｏｌ．４２  ８８５−９０１（２００３）を参照）。さらに、Ｍｙｏｔｏｘｉｎとしての作用部位に関しても、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2のＣ末領域、具体的には、下記のアミノ酸配列：
ＳＶＬＥＬＧＫＭＩＬ  ＱＥＴＧＫＮＡＩＴＳ  ＹＧＳＹＧＣＮＣＧＷ      ３０
ＧＨＲＧＱＰＫＤＡＴ  ＤＲＣＣＦＶＨＫＣＣ  ＹＫＫＬＴＤＣＮＨＫ      ６０
ＴＤＲＹＳＹＳＷＫＮ  ＫＡＩＩＣＥＥＫＮＰ  ＣＬＫＥＭＣＥＣＤＫ      ９０
ＡＶＡＩＣＬＲＥＮＬ  ＤＴＹＮＫＫＹＫＡＹ  ＦＫＬＫＣＫＫＰＤＴ    １２０
Ｃ                                                                  １２１
において、前記ヘパリン結合部位に相当する、「ＫＫＹＫＡＹＦＫＬＫＣＫＫ」の部分アミノ酸配列中に存在することが示唆されている。
図４に示すように、実際に、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓのヘビ毒由来のＫＤＲ−ｂｐ（Ｌｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2）は、ヒトの血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）の細胞外ドメインに対する結合性を有し、加えて、ヒトの血管内皮増殖因子受容体１型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １；Ｆｌｔ−１）の細胞外ドメインに対する結合性をも有している。一方、図５に示すように、ＫＤＲ−ｂｐは、免疫グロブリン：ＩｇＧに対しても、弱い結合性を示す。従って、少なくとも、ＫＤＲ、Ｆｌｔ−１の細胞外ドメインを構成している、Ｉｇ様ドメインのいずれかと、ＫＤＲ−ｂｐとが相互作用することにより、結合がなされていることが判る。すなわち、ＫＤＲ−ｂｐは、ＶＥＧＦ165に作用して、ＫＤＲやＦｌｔ−１への結合能を低下させるのではなく、ＫＤＲ、Ｆｌｔ−１の細胞外ドメインと結合することによって、ＫＤＲ、Ｆｌｔ−１に対するＶＥＧＦ165の結合を競争的に阻害していることが確認される。
【００１９】
一方、ニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１：ＮＰ−１）の細胞外ドメインも、Ｉｇ様ドメインで構成されているが、図４に示すように、ＫＤＲ−ｂｐは、実質的に、ＮＰ−１の細胞外ドメインに対する結合性は示さない。
本発明にかかる用途発明で利用される、ヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2は、既に公知となっているタンパク質であり、それぞれ、天然の起源であるヘビ毒から、単量体タンパク質として、多段のカラム・クロマトグラフィーを用いて、単離・精製することができる。具体的には、文献（Ｌｏｍｏｎｔｅ，  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｃｏｎ  Ｖｏｌ．４２  ８８５−９０１（２００３））ならびに、該文献に収録されている参照文献の開示に従って、天然の起源であるヘビ毒から、目的とする当該ヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2を単離・精製することができる。
【００２０】
加えて、ヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2を、宿主大腸菌において、組換え発現に利用可能な発現系も、既に文献（Ｗａｒｄ，  Ｒ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  Ｖｏｌ．２１，  １３４−１４０  （２００１））に報告されている。従って、該ヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2をコードするＤＮＡを利用し、前記ヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2の組換え発現系を適用して、対応する組換えタンパク質として、作製ならびに精製を行うこともできる。なお、該ヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2は、本来、分泌用のシグナル・ペプチドをＮ末に有する前駆体タンパク質として産生され、このシグナル・ペプチドを切除された、成熟タンパク質として、分泌されている。対応する組換えタンパク質は、成熟タンパク質のＮ末に、「Ｍｅｔ−Ａｌａ−」のような余剰のアミノ酸配列を付加し、宿主内で発現することができる。
【００２１】
例えば、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓのヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2（ＫＤＲ−ｂｐ）を、凍結乾燥されている当該ヘビ毒から単離・精製する工程においては、下記実施例１に記載する、二段のカラム・クロマトグラフィー精製法を利用することができる。
【００２２】
この二段のカラム・クロマトグラフィー精製法では、先ず、当該ヘビ毒の凍結乾燥品１００μｇを、２０  ｍＭ  イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ  ６．０）１０ｍＬ中に溶解して、濃度１０μｇ／ｍＬの粗ヘビ毒溶液を調製する。
【００２３】
（工程１）  初段目のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム・クロマトグラフィー
予め、２０  ｍＭ  イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ  ６．０）によって平衡した、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（１．６ｃｍφ×１０ｃｍ（Ｌ））に、流速：２ｍＬ／ｍｉｎで、前記粗ヘビ毒溶液をアプライする。カラムからのタンパク質の溶出は、前記緩衝液中のＮａＣｌ濃度を１Ｍまでの線形勾配の条件で行う。流速：２ｍＬ／ｍｉｎで、１４カラム容量を溶出し、各溶出画分２ｍＬ中に含まれるＫＤＲ−ｂｐの含有量を、下記のｖａｍｍｉｎとＫＤＲ−Ｉｇとの結合に対する阻害活性をＥＬＩＳＡ法を利用して評価する。阻害活性を示す画分を、ＫＤＲ−ｂｐ含有画分としてプールする。
【００２４】
プールされた、ＫＤＲ−ｂｐ含有画分は、２０  ｍＭ  イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）に透析して、脱塩を行う。この透析処理液を、次段の精製に用いる。
【００２５】
（工程２）  二段目のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム・クロマトグラフィー
予め、２０  ｍＭ  イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）によって平衡した、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（１．６ｃｍφ×１０ｃｍ（Ｌ））に、流速：２ｍＬ／ｍｉｎで、前段の透析処理液をアプライする。カラムからのタンパク質の溶出は、前記緩衝液中のＮａＣｌ濃度を１Ｍまでの線形勾配の条件で行う。流速：２ｍＬ／ｍｉｎで、１４カラム容量を溶出し、各溶出画分２ｍＬ中に含まれるＫＤＲ−ｂｐの含有量を、下記のｖａｍｍｉｎとＫＤＲ−Ｉｇとの結合に対する阻害活性をＥＬＩＳＡ法を利用して評価する。阻害活性を示す画分を、ＫＤＲ−ｂｐ含有画分としてプールする。
【００２６】
プールされた、ＫＤＲ−ｂｐ含有画分は、２０  ｍＭ  イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）に透析して、脱塩を行う。この透析処理液を、精製済ＫＤＲ−ｂｐ含有溶液として用いる。
【００２７】
最終的に、精製済ＫＤＲ−ｂｐ含有溶液中に含まれるＫＤＲ−ｂｐを凍結乾燥により回収し、精製評品とする。
【００２８】
このＫＤＲ−ｂｐ精製評品に関して、そのタンパク質純度の検定と、分子量の確認を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析法を利用して行う。具体的には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により、単一タンパク質に由来する各種のイオン種を測定し、当該タンパク質の実測された平均分子量：Ｍｗobs.を特定する。Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓのヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2に関しては、そのアミノ酸配列は、公表されており、該アミノ酸配列に基づき、当該タンパク質の分子量：Ｍｗを算定する。算定された分子量：Ｍｗ（Ｍｗ＝１３，９４７）と、当該タンパク質の実測された平均分子量：Ｍｗobs.（Ｍｗobs.＝１３，７８３．７）と比較し、測定誤差（１％）以内の相違しかないことを確認する。仮に、他のタンパク質が混在すると、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析で測定されるスペクトル中、当該タンパク質に由来するイオン種以外に、他のタンパク質に由来するイオン種も観測される。この他のタンパク質に由来するイオン種の有無、あるいは、当該タンパク質に由来するイオン種に対する強度比率に基づき、他のタンパク質混入の有無、その混入比率を評価できる。従って、タンパク質純度の検定では、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析法を利用して、他のタンパク質混入が見出されないことを確認する。
【実施例】
【００２９】
以下に、具体例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。ここに示す具体例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら具体例に限定されるものではない。
【００３０】
下記する具体例では、
各ヘビ毒中に、ＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎとＫＤＲとの結合を阻害する成分の有無を確認する一次スクリーニング手順、
一次スクリーニングで選別された、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎｍｏｕｔｈ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）のヘビ毒中に含まれるのＫＤＲ−ｂｐを単離・精製する手順、
該Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＫＤＲ−ｂｐの部分アミノ酸配列決定、ペプチド鎖全体の分子量の決定、ならびに、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓのヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2であることを確認、
該Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＫＤＲ−ｂｐの各種受容体に対する結合能の評価、
ＫＤＲに対するＶＥＧＦ165の結合により誘起される血管内皮細胞増殖に対する、該Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＫＤＲ−ｂｐの拮抗的阻害活性の評価
の各項目に関して、より具体的に説明を行う。
【００３１】
１．各ヘビ毒中に、ＶＥＧＦ様タンパク質；ｖａｍｍｉｎとＫＤＲとの結合を阻害する成分の有無を確認する一次スクリーニング
（ｉ）ｖａｍｍｉｎとＫＤＲとの結合阻害アッセイ法
表１に示すように、Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒由来のＶＥＧＦ様タンパク質：ｖａｍｍｉｎは、ＶＥＧＦ165と比較しても、ＫＤＲに対する結合能は優っている（特開２００５−１１０５０８号公報を参照）。
【００３２】
【表１】
2007161639.tif 000003
【００３３】
この特長を利用して、ＫＤＲと結合して、ＶＥＧＦ165とＫＤＲとの結合を競争的に阻害する物質のスクリーニングに代えて、ｖａｍｍｉｎのＫＤＲに対する特異的な結合を阻害する物質のスクリーニング法を採用した。この阻害物質スクリーニング法では、ＫＤＲ自体は、細胞膜結合型受容体分子であるため、ヒトＩｇＧの重鎖、軽鎖の可変領域を、ＫＤＲの細胞外ドメインを構成する七つのＩｇ様ドメイン部分（ＫＤＲD1-7）で置き換えた、キメラ型ＩｇＧ抗体分子：ＫＤＲ−ＩｇＧを受容体として利用している。このＫＤＲ−ＩｇＧは、ヒトＩｇＧの定常領域をそのＣ末部分として保持しており、酵素標識−坑ヒトＩｇＧ抗体（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）をこのヒトＩｇＧの定常領域へ反応させる。ヒトＩｇＧの固定領域に反応した、酵素標識−坑ヒトＩｇＧ抗体の量は、当該標識酵素の酵素活性に基づき検出するＥＬＩＳＡ法を利用して、定量される。
【００３４】
従って、ｖａｍｍｉｎをＥＬＩＳＡプレート上に固定化し、液相中に含まれるＫＤＲ−ＩｇＧを、ｖａｍｍｉｎとＫＤＲの細胞外ドメイン（ＫＤＲD1-7）との結合により、ＥＬＩＳＡプレート上に結合させ、前記ＥＬＩＳＡ法を用いて、ｖａｍｍｉｎと結合したＫＤＲ−ＩｇＧの量を定量する。
【００３５】
被験物質は、ｖａｍｍｉｎ固定化したＥＬＩＳＡプレート上の液相中に、ＫＤＲ−ＩｇＧとともに添加し、所定温度、所定時間インキュベートする。その際、液相中のＫＤＲ−ＩｇＧのＫＤＲD1-7に対して被験物質が結合し、ＫＤＲ−ＩｇＧに存在する細胞外ドメイン（ＫＤＲD1-7）に対する、ｖａｍｍｉｎの結合を阻害すると、結果的に、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化されるＫＤＲ−ＩｇＧ量が減少する。あるいは、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化されているｖａｍｍｉｎに対して被験物質が結合し、ＫＤＲ−ＩｇＧに存在する細胞外ドメイン（ＫＤＲD1-7）に対する、ｖａｍｍｉｎの結合を阻害すると、結果的に、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化されるＫＤＲ−ＩｇＧ量が減少する。
【００３６】
その他、ＥＬＩＳＡプレート上にｖａｍｍｉｎとの結合を介して固定化されているＫＤＲ−ＩｇＧのＩｇＧ部分に対して被験物質が結合し、ＫＤＲ−ＩｇＧのＩｇＧ定常領域に対する酵素標識−坑ヒトＩｇＧ抗体の反応を阻害すると、ＥＬＩＳＡ法で検出される酵素標識−坑ヒトＩｇＧ抗体の量は減少する。
【００３７】
この阻害アッセイ法では、主に、上記の三種の機構のいずれかに関与する「阻害物質」の有無のスクリーニングを可能としている。
【００３８】
具体的には、１０ｎＭのｖａｍｍｉｎ溶液を用いて、ＥＬＩＳＡプレート上にｖａｍｍｉｎを固定化する。次いで、該ＥＬＩＳＡプレート表面を、１％ＢＳＡ含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて、ＢＳＡによる表面ブロッキング処理を施す。同緩衝液中に、ＫＤＲ−ＩｇＧを５ｎＭ、被験試料を所定濃度で溶解したサンプル溶液を、該ＥＬＩＳＡプレート表面に注ぎ、室温で６０分間インキュベートする。その後、サンプル溶液を除去し、該ＥＬＩＳＡプレート表面を同緩衝液で二度洗浄する。
【００３９】
その後、定法に従って、酵素標識−坑ヒトＩｇＧ抗体を利用するＥＬＩＳＡ法によって、該ＥＬＩＳＡプレート表面にｖａｍｍｉｎとの結合を介して固定化されている、ＫＤＲ−ＩｇＧの量を測定する。
【００４０】
なお、ＫＤＲ−ＩｇＧは、市販元：Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ，  ＵＳＡ）から入手し、ｖａｍｍｉｎは、特開２００５−１１０５０８号公報に開示される手法に従って、Ｖｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒から精製評品を調製した。また、酵素標識−坑ヒトＩｇＧ抗体（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、汎用されている酵素標識抗体試薬であり、市販品を利用した。
【００４１】
（ii）ｖａｍｍｉｎとＫＤＲとの結合を阻害する成分を含有するヘビ毒の一次スクリーニング
被験試料として、各ヘビ毒の凍結乾燥物を使用し、該ヘビ毒中にｖａｍｍｉｎのＫＤＲに対する特異的な結合を阻害する物質の有無を、上記のスクリーニング法により調べる。
【００４２】
計２９種のヘビ毒について、該一次スクリーニングを行ったところ、ＫＤＲ−ＩｇＧのＫＤＲD1-7に対して被験物質が結合し、ＫＤＲ−ＩｇＧに存在する細胞外ドメイン（ＫＤＲD1-7）に対する、ｖａｍｍｉｎの結合を阻害する機能を示す物質を含有するヘビ毒数種が見出された。
【００４３】
例えば、ＫＤＲに対する結合性を有するＶＥＧＦ様タンパク質を含有するヘビ毒、すなわち、ｖａｍｍｉｎを含んでいるＶｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒、ＶＲ−１を含んでいるＤａｂｏｉａ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ  ｒｕｓｓｅｌｌｉのヘビ毒は、この一次スクリーニングにおいて選別される。
【００４４】
これらＫＤＲに対する結合性を有するＶＥＧＦ様タンパク質とは相違するが、ＫＤＲ−ＩｇＧとｖａｍｍｉｎとの結合を阻害する機能を有する「阻害物質」を含んでいると、推定されるヘビ毒も、この一次スクリーニングにおいて選別される。
【００４５】
この一次スクリーニングにおいて選別されたヘビ毒数種のうち、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎｍｏｕｔｈ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）のヘビ毒について、阻害活性の濃度依存性を評価した結果を、図３に示す。なお、該Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎｍｏｕｔｈ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）のヘビ毒は、市販元：Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｐｅｐｔｉｌｅ  Ｚｏｏ  （Ｓｌａｄｅ，  ＫＹ，  ＵＳＡ）から凍結乾燥体の形態で購入したものである。
【００４６】
図３には、該Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎｍｏｕｔｈ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）のヘビ毒（ＡＰ）に加えて、上記ｖａｍｍｉｎを含んでいるＶｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒（ＶＡ）、ＶＲ−１を含んでいるＤａｂｏｉａ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ  ｒｕｓｓｅｌｌｉのヘビ毒（ＤＲ）、ならびに、Ｐｓｅｕｄｅｃｈｉｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓのヘビ毒（ＰＡ）に関して、各ヘビ毒を種々の濃度で添加した際、上記ＥＬＩＳＡ法により検出される標識酵素由来の酵素活性を示す。
【００４７】
該Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎｍｏｕｔｈ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）のヘビ毒（ＡＰ）を添加すると、該ヘビ毒の添加濃度依存的に、検出される標識酵素由来の酵素活性の低下が観測されている。検出される酵素活性が５０％低下する添加濃度：Ｉ50は、図３に示す結果から、該Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎｍｏｕｔｈ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）のヘビ毒（ＡＰ）について、Ｉ50≒１０μｇ／ｍＬと見積もられる。
【００４８】
なお、Ｐｓｅｕｄｅｃｈｉｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓのヘビ毒（ＰＡ）に関しては、添加濃度２００μｇ／ｍＬ以下の範囲では、検出される酵素活性の低下を引き起こしていない。
【００４９】
２．一次スクリーニングで選別された、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎｍｏｕｔｈ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）のヘビ毒中に含まれる阻害物質の単離・精製
【００５０】
一次スクリーニングで選別された、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎｍｏｕｔｈ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）のヘビ毒中に含有されている、ｖａｍｍｉｎとＫＤＲとの結合を阻害する成分の単離・精製を、下記の手順で行った。
【００５１】
（ｉ）阻害活性を有するタンパク質の単離・精製
まず、該ヘビ毒中に含有される阻害成分は、可溶性タンパク質と推定されるため、カラム・クロマトグラフ法を応用し、各タンパク質を分離し、目的の阻害活性を示すタンパク質の特定を進める。
【００５２】
該ヘビ毒中に含まれる、阻害活性を有するタンパク質の単離・精製は、クロマトグラフィー装置：ＦＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍと、評価装置：ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とを使用して、４℃で行う。各クロマトグラフィー・カラムの溶出画分に含まれる、タンパク質濃度の測定は、２８０  ｎｍの吸光度測定によって行う。
【００５３】
Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎｍｏｕｔｈ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）由来の凍結乾燥ヘビ毒から、阻害活性を有するタンパク質の精製は、以下の二段階のクロマトグラフィー工程によって実施した。仮に、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎｍｏｕｔｈ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）由来の「阻害活性を有するタンパク質」に、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来の「ＫＤＲ結合性タンパク質：ＫＤＲ−ｂｐ（ＫＤＲ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」の名称を付した。
【００５４】
この二段のカラム・クロマトグラフィー精製法では、先ず、当該ヘビ毒の凍結乾燥品１００μｇを、２０  ｍＭ  イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ  ６．０）１０ｍＬ中に溶解して、濃度１０μｇ／ｍＬの粗ヘビ毒溶液を調製した。
【００５５】
（工程１）  初段目のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム・クロマトグラフィー
予め、２０  ｍＭ  イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ  ６．０）によって平衡した、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（１．６ｃｍφ×１０ｃｍ（Ｌ））に、流速：２ｍＬ／ｍｉｎで、前記粗ヘビ毒溶液をアプライする。カラムからのタンパク質の溶出は、前記緩衝液中のＮａＣｌ濃度を１Ｍまでの線形勾配の条件で行う。流速：２ｍＬ／ｍｉｎで、１４カラム容量を溶出し、各溶出画分２ｍＬ中に含まれるＫＤＲ−ｂｐの含有量を、下記のｖａｍｍｉｎとＫＤＲ−Ｉｇとの結合に対する阻害活性をＥＬＩＳＡ法を利用して評価した。阻害活性を示す画分を、ＫＤＲ−ｂｐ含有画分としてプールする。
【００５６】
なお、初段目のカラム・クロマトグラフィーにおいて、阻害活性を示す画分は、溶出液中のＮａＣｌ濃度  ０．５０ｍＭ〜  ０．５３ｍＭの範囲であった。
【００５７】
プールされた、ＫＤＲ−ｂｐ含有画分は、２０  ｍＭ  イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）に透析して、脱塩を行う。この透析処理液を、次段の精製に用いる。
【００５８】
（工程２）  二段目のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム・クロマトグラフィー
予め、２０  ｍＭ  イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）によって平衡した、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（１．６ｃｍφ×１０ｃｍ（Ｌ））に、流速：２ｍＬ／ｍｉｎで、前段の透析処理液をアプライする。カラムからのタンパク質の溶出は、前記緩衝液中のＮａＣｌ濃度を１Ｍまでの線形勾配の条件で行う。流速：２ｍＬ／ｍｉｎで、１４カラム容量を溶出し、各溶出画分２ｍＬ中に含まれるＫＤＲ−ｂｐの含有量を、下記のｖａｍｍｉｎとＫＤＲ−Ｉｇとの結合に対する阻害活性をＥＬＩＳＡ法を利用して評価する。阻害活性を示す画分を、ＫＤＲ−ｂｐ含有画分としてプールする。
【００５９】
なお、二段目のカラム・クロマトグラフィーにおいて、阻害活性を示す画分は、溶出液中のＮａＣｌ濃度  ０．３８ｍＭ〜  ０．４２ｍＭの範囲であった。
【００６０】
プールされた、ＫＤＲ−ｂｐ含有画分は、２０  ｍＭ  イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）に透析して、脱塩を行う。この透析処理液を、精製済ＫＤＲ−ｂｐ含有溶液として用いる。
【００６１】
最終的に、精製済ＫＤＲ−ｂｐ含有溶液中に含まれるＫＤＲ−ｂｐを凍結乾燥により回収し、精製評品とする。
（ii）精製済ＫＤＲ−ｂｐのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
また、図２（Ａ）に、ＫＤＲ−ｂｐ精製評品について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、含有されるタンパク質の分子量を測定した結果を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、ＫＤＲ−ｂｐ精製評品は、還元剤を添加した還元条件下（Ｒ）では、１６．８  ｋＤａに一本のバンドを示し、一方、非還元条件下（ＮＲ）では、１６．８  ｋＤａを下限とし、約１９  ｋＤａまでの間に連続している不鮮明なバンドを示している。従って、該ＫＤＲ−ｂｐ精製評品中には、単一のタンパク質が含まれていることが確認され、また、非還元条件下（ＮＲ）において、連続している不鮮明なバンドを与えることから、高い塩基性のタンパク質であると判断される。
３．Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＫＤＲ−ｂｐの部分アミノ酸配列決定、ペプチド鎖全体の分子量の決定
上記のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において、ＫＤＲ−ｂｐは、見掛けの分子量１６．８  ｋＤａを示す、高い塩基性タンパク質であると判断されたので、実際に、アミノ酸配列の解析を行った。また、該ＫＤＲ−ｂｐのアミノ酸配列の解析結果に基づき、既に報告されているＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓのヘビ毒由来のタンパク質とアミノ酸配列の対比を行い、該ＫＤＲ−ｂｐが既知のタンパク質か否かの確認を行った。
【００６２】
（ｉ）ＫＤＲ−ｂｐのアミノ酸配列解析
該ＫＤＲ−ｂｐは、高い塩基性タンパク質であると判断されたため、Ｎ末端側のアミノ酸配列、ならびに、含まれるＣｙｓに還元アルキル化処理を施したＳ−アルキル化ペプチド鎖をエンドプロテアーゼ  Ｌｙｓ−Ｃを用いて酵素消化し、得られるペプチド断片のアミノ酸配列の解析を行った。
常法に従い、該ＫＤＲ−ｂｐを、還元アルキル化した（Ｙａｍａｚａｋｉ，  Ｙ．等，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４１，  １１３３１−１１３３７  （２００２）参照）。凍結乾燥した該Ｓ−アルキル化ペプチド鎖を、エンドプロテアーゼ  Ｌｙｓ−Ｃで、２４時間３７℃で消化し、断片化した。前記エンドプロテアーゼ酵素消化で得られる、各ペプチド断片を、プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７３Ａ，  ４７７，  Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＰＰＳＱ−２１Ａ）によって分析した。Ｎ末端のピロリドン環の開環は、メタノール・塩酸で行った（Ｋａｗａｓａｋｉ，  Ｉ．等，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４８，  ５４６−５５６  （１９７２）参照）。このエンドプロテアーゼ  Ｌｙｓ−Ｃ酵素消化されたベプチド断片は、２０個以上存在しており、Ｌｙｓを少なくとも、２０個以上含んでおり、塩基性タンパク質であることが確認された。
【００６３】
また、別途、凍結乾燥したＳ−アルキル化ペプチド鎖（２５０  ｐｍｏｌ）を、４０℃で２時間、３Ｎ  ＨＣｌ／ＭｅＯＨで処理し、そのＮ末アミノ酸配列を、プロテインシークエンサーで分析した。
(ii）既に報告されているＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓのヘビ毒由来のタンパク質とのアミノ酸配列の対比
これらエンドプロテアーゼ酵素消化で得られる、各ペプチド断片のアミノ酸配列、Ｎ末アミノ酸配列の解析に基づき、既に報告されているＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓのヘビ毒由来のタンパク質とアミノ酸配列の対比を行った。
【００６４】
測定されたＮ末アミノ酸配列は、Ｎ末端にＭｅｔを含んでなく、該ＫＤＲ−ｂｐは、分泌される際、シグナル・ペプチド部分を切除され、成熟タンパク質となっていることが確認された。既に報告されているＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓのヘビ毒由来のタンパク質中から、高い塩基性を有する成熟タンパク質であるという条件に合致し、解析されたＮ末アミノ酸配列を有するものをデータベース中で検索したところ、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓのヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2が選択された。
【００６５】
エンドプロテアーゼ酵素消化で得られる、各ペプチド断片のアミノ酸配列、Ｎ末アミノ酸配列の解析結果と、報告されているＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓのヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＰＳＳＮＡＭ）との照合を行ったところ、図２の（Ｂ）に示すように、対応していることが確認された。
【００６６】
最終的に、ＫＤＲ−ｂｐ精製評品について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により、単一タンパク質に由来する各種のイオン種を測定し、当該タンパク質の実測された平均分子量：Ｍｗobs.を特定した。一方、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓのヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2のアミノ酸配列に基づき、当該タンパク質の分子量：Ｍｗを算定した。算定された分子量：Ｍｗ（Ｍｗ＝１３，９４７）と、当該タンパク質の実測された平均分子量：Ｍｗobs.（Ｍｗobs.＝１３，７８３．７）と比較し、測定誤差（１％）以内の相違しかないことが確認された。
【００６７】
以上の結果に基づき、該ＫＤＲ−ｂｐは、既に報告されているＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2と同一であることが確認された。
４．Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ由来のＫＤＲ−ｂｐの各種受容体に対する結合能の評価
該ＫＤＲ−ｂｐは、上記の一次スクリーニングによって、ＫＤＲ−ＩｇＧとｖａｍｍｉｎとの結合を阻害する機能を有する「阻害物質」として選別されているが、実際に、ＫＤＲ−ＩｇＧ中に含まれる、ＫＤＲの細胞外ドメインを構成する七つのＩｇ様ドメイン部分（ＫＤＲD1-7）に結合することによって、かかる阻害活性が発揮されていることを検証した。
【００６８】
併せて、各種受容体タンパク質に対する、該ＫＤＲ−ｂｐの結合能に関して、その有無の確認を行った。
（ｉ）表面プラズモン共鳴による受容体タンパク質に対する結合性解析
ヘビ毒由来のＫＤＲ−ｂｐの各種受容体タンパク質に対する結合特性の解析を、表面プラズモン共鳴法を利用して行った。
【００６９】
表面プラズモン共鳴法による測定装置：ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００  （ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｅｗｄｅｎ）を使用して、各種受容体タンパク質に対するＫＤＲ−ｂｐの結合・解離特性を評価した。レセプター結合解析の実験は、ＨＢＳ緩衝液（１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ  ７．４，  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ３  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．００５％  ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０）を使用して、２５℃で行った。レセプター・タンパク質は、それぞれ、アミンカップリング・キット（ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｅｗｄｅｎ）で、ＣＭ４センサー・チップ上に固定した。
【００７０】
リガンド・タンパク質は、ＨＢＳ緩衝液で希釈し、所定のタンパク質濃度の溶液に調製し、２０  μＬ／ｍｉｎの流速でフロー・セルに注入した。ネガティブ・コントロールとして、ブランク・フローチャネルのシグナルを、バックグラウンド・シグナルとして、サンプル・フローチャネルのシグナルから差し引き、バックグラウンド補正を行った。結合過程では、種々のタンパク質濃度のリガンド・タンパク質溶液をセンサー・チップ上に前記流速で流入させつつ、共鳴シグナルの上昇を測定し、解離過程では、前記緩衝液をセンサー・チップ上に前記流速で流入させつつ、共鳴シグナルの減少を測定する。
【００７１】
各リガンド・タンパク質のセンサー・チップ上に固定化されているレセプター・タンパク質への結合における、結合速度定数（ｋass）、解離速度定数（ｋdiss）、最大結合量（Ｒmax）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１カーブフィッティングソフトフェア（ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｅｗｄｅｎ）を使用して、算出した。みかけの解離定数（Ｋd）は、速度論定数の比（ｋdiss／ｋass）として、前記算出値から計算した。
（ii）各種ＶＥＧＦ受容体タンパク質に対するＫＤＲ−ｂｐの結合能
まず、ＫＤＲ−ｂｐが、実際に、ＫＤＲの細胞外ドメインを構成する七つのＩｇ様ドメイン部分（ＫＤＲD1-7）に対する結合能を有するか否かの検証を行った。
【００７２】
併せて、ＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ165）ホモダイマーは、血管内皮増殖因子受容体２型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＫＤＲ）に加えて、血管内皮増殖因子受容体１型（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １；Ｆｌｔ−１）、さらには、ニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１；ＮＰ−１）に対しても結合性を示すことを考慮して、ＶＥＧＦ165が結合する、受容体タンパク質：Ｆｌｔ−１、ＮＰ−１に対するＫＤＲ−ｂｐの結合能の有無も、評価した。
【００７３】
その際、受容体タンパク質：ＫＤＲ、Ｆｌｔ−１、ＮＰ−１の何れに対しても結合能を有するＶＥＧＦ165を、陽性対照として利用している。ＫＤＲ−ｂｐに加えて、Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓのヘビ毒由来のＡｓ49−ホスホリパーゼＡ2に関しても、併せて、ＫＤＲ、Ｆｌｔ−１、ＮＰ−１に対する結合性を評価した。このＴｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓのヘビ毒由来のＡｓ49−ホスホリパーゼＡ2（Ｔｆ  ＰＬＡ2）は、ホスホリパーゼを有しており、タンパク質全体の立体構造は、ヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2と類似しているが、その生理活性に関与する領域の部分構造には、実質的な相違点が存在している。
まず、ＫＤＲの細胞外ドメインを構成する七つのＩｇ様ドメイン部分（ＫＤＲD1-7）に対するＫＤＲ−ｂｐの結合能の評価は、ＣＭ４センサー・チップ上に固定するレセプター・タンパク質として、組換え発現ＫＤＲD1-7を用いて行った。該組換え発現ＫＤＲD1-7は、市販元：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）から入手した。
【００７４】
また、Ｆｌｔ−１の細胞外ドメインに対する結合能の評価においては、Ｆｌｔ−１の細胞外ドメインを構成する七つのＩｇ様ドメイン部分のうち、六つのＩｇ様ドメイン部分（Ｆｌｔ−１D1-6）を利用した。すなわち、ＣＭ４センサー・チップ上に固定するレセプター・タンパク質として、組換え発現Ｆｌｔ−１D1-6を利用した。該組換え発現Ｆｌｔ−１D1-6も、市販元：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）から入手した。
【００７５】
一方、ＮＰ−１の細胞外ドメインに対する結合能の評価に際しては、ＮＰ−１自体は、細胞膜結合型受容体分子であるため、ヒトＩｇＧの重鎖、軽鎖の可変領域を、ＮＰ−１の細胞外ドメイン部分で置き換えた、キメラ型ＩｇＧ抗体分子：ＮＰ−１−ＩｇＧを受容体として利用している。すなわち、組換え発現ＮＰ−１−ＩｇＧを、レセプター・タンパク質として、そのＣ末部分のヒトＩｇＧの定常領域を利用して、ＣＭ４センサー・チップ上に固定する。なお、ＮＰ−１−ＩｇＧは、市販元：Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ，  ＵＳＡ）から入手した。
図４のＡは、ＣＭ４センサー・チップ上に固定したレセプター・タンパク質；ＫＤＲD1-7に対する、ヒトＶＥＧＦ165（６  ｎＭ；破線）、ＫＤＲ−ｂｐ（６０  ｎＭ；実線）、Ｔｆ  ＰＬＡ2（６０  ｎＭ；点線）の結合（１００−２２０秒の間）、解離（２２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。図４のＢは、ＣＭ４センサー・チップ上に固定したレセプター・タンパク質；Ｆｌｔ−１D1-6に対する、ヒトＶＥＧＦ165（６  ｎＭ；破線）、ＫＤＲ−ｂｐ（６０  ｎＭ；実線）、Ｔｆ  ＰＬＡ2（６０  ｎＭ；点線）の結合（１００−２２０秒の間）、解離（２２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。図４のＣは、ＣＭ４センサー・チップ上に固定したレセプター・タンパク質；ＮＰ−１−ＩｇＧに対する、ヒトＶＥＧＦ165（６  ｎＭ；破線）、ＫＤＲ−ｂｐ（６０  ｎＭ；実線）、Ｔｆ  ＰＬＡ2（６０  ｎＭ；点線）の結合（１００−２２０秒の間）、解離（２２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。
【００７６】
ＫＤＲ−ｂｐは、ＫＤＲの細胞外ドメイン部分（ＫＤＲD1-7）に対して、実際に結合能を有することが確認される。加えて、ＫＤＲ−ｂｐは、Ｆｌｔ−１の細胞外ドメイン中、少なくとも、六つのＩｇ様ドメイン部分（Ｆｌｔ−１D1-6）に対しても、ある程度の結合能を有することが確認される。一方、ＫＤＲ−ｂｐは、組換え発現ＮＰ−１−ＩｇＧに対しては、実質的な結合能を示さないと判断される。
【００７７】
一方、Ｔｆ  ＰＬＡ2は、ＫＤＲD1-7、Ｆｌｔ−１D1-6、ＮＰ−１−ＩｇＧの何れに対しても、結合能を示していない。
【００７８】
ＫＤＲ−ｂｐは、少なくとも、ＫＤＲD1-7に対して結合能を有しており、上記のｖａｍｍｉｎとＫＤＲとの結合を阻害する作用は、ＫＤＲ−ｂｐが、ＫＤＲ−ＩｇＧ中に含まれるＫＤＲの細胞外ドメイン部分（ＫＤＲD1-7）と結合する結果、ｖａｍｍｉｎとＫＤＲ−ＩｇＧとの結合が競争的に阻害される機構によって達成されている。
（iii）各種受容体タンパク質あるいはＩｇＧに対するＫＤＲ−ｂｐの結合能
ＫＤＲの細胞外ドメイン部分（ＫＤＲD1-7）、あるいは、Ｆｌｔ−１の細胞外ドメイン部分（Ｆｌｔ−１D1-7）と同様に、Ｉｇ様ドメインで構成されている細胞外ドメインを有する各種受容体タンパク質、あるいはＩｇＧに対して、ＫＤＲ−ｂｐは、結合能を有するか否かの検証を行った。
【００７９】
具体的には、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）に対する受容体タンパク質；ＦＧＦＲ１−α、ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）に対する受容体タンパク質；ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、ならびに、ヒトＩｇＧに対して、ＫＤＲ−ｂｐは、結合能を有するか否かの検証を行った。
【００８０】
ＦＧＦＲ１−α、ＰＤＧＦＲ−βは、細胞膜結合型受容体分子であるため、ヒトＩｇＧの重鎖、軽鎖の可変領域を、各受容体タンパク質の細胞外ドメイン部分で置き換えた、キメラ型ＩｇＧ抗体分子：ＦＧＦＲ１α−ＩｇＧ、ＰＤＧＦＲβ−ＩｇＧを受容体として利用している。なお、ヒトＩｇＧ、ＰＤＧＦＲ−α、ＦＧＦＲ１α−ＩｇＧ、ＰＤＧＦＲβ−ＩｇＧは、市販の組換え体を使用した。
【００８１】
図５のＡは、ＣＭ４センサー・チップ上に固定したヒトＩｇＧに対する、ＫＤＲ−ｂｐ（１００  ｎＭ；実線）、Ｔｆ  ＰＬＡ2（３０  ｎＭ；点線）の結合（０−１２０秒の間）、解離（１２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。図５のＢは、ＣＭ４センサー・チップ上に固定したＦＧＦＲ１α−ＩｇＧに対する、ｂＦＧＦ（３０  ｎＭ；破線）、ＫＤＲ−ｂｐ（３０  ｎＭ；実線）、Ｔｆ  ＰＬＡ2（３０  ｎＭ；点線）の結合（０−１２０秒の間）、解離（１２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。図５のＣは、ＣＭ４センサー・チップ上に固定したＰＤＧＦＲ−αに対する、ＰＤＦＧ−ＢＢ（１０  ｎＭ；破線）、ＫＤＲ−ｂｐ（１０  ｎＭ；実線）、Ｔｆ  ＰＬＡ2（１０  ｎＭ；点線）の結合（０−１２０秒の間）、解離（１２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。図５のＤは、ＣＭ４センサー・チップ上に固定したＰＤＧＦＲβ−ＩｇＧに対する、ＰＤＦＧ−ＢＢ（１０  ｎＭ；破線）、ＫＤＲ−ｂｐ（１０  ｎＭ；実線）、Ｔｆ  ＰＬＡ2（１０  ｎＭ；点線）の結合（０−１２０秒の間）、解離（１２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。
【００８２】
ＫＤＲ−ｂｐは、ＰＤＧＦＲ−α、ＦＧＦＲ１α−ＩｇＧ、ＰＤＧＦＲβ−ＩｇＧに対しては、実質的な結合能を示さないと判断される。但し、ヒトＩｇＧに対しては、ＫＤＲ−ｂｐは、若干の結合能を示している。一方、Ｔｆ  ＰＬＡ2は、ヒトＩｇＧ、ＰＤＧＦＲ−α、ＦＧＦＲ１α−ＩｇＧ、ＰＤＧＦＲβ−ＩｇＧの何れに対しても、結合能を示していない。
（iv）各種ＶＥＧＦ受容体タンパク質に対するＫＤＲ−ｂｐの結合の速度定数
表２に、ＫＤＲ−ｂｐが結合能を有することが判明した、ＫＤＲ−ＩｇＧ、ＫＤＲD1-7、Ｆｌｔ−１D1-6、ならびに、ヒトＩｇＧとの結合形成における、ＫＤＲ−ｂｐの結合速度定数（ｋass）、解離速度定数（ｋdiss）を算出した値と、計算されたみかけの解離定数（Ｋd）を示す。
【００８３】
その他、Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓのヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2である、ＢＰ−Ｉ（Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ）、ＢＰ−II（Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  II）も、ＫＤＲD1-7に対する結合能を有し、さらに、Ｆｌｔ−１D1-6に対しても、若干の結合能を有することが判明した。ＢＰ−Ｉ（またはＢＰ−II）とＫＤＲD1-7との結合形成における、ＢＰ−Ｉの結合速度定数（ｋass）、解離速度定数（ｋdiss）を算出した値と、計算されたみかけの解離定数（Ｋd）を、表２に併せて示す。
【００８４】
同時に、Ｖｉｐｅｒａ  a.  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒由来の公知のＳｅｒ49−ホスホリパーゼＡ2：Ａｍｍｏｄｙｔｉｎ  Ｌ（Ｋｒｉｚａｊ，  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．２０２，  １１６５−１１６８  （１９９１）；  Ｇｕｂｅｎｓｅｋ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｅｒｉｏｄ．  Ｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．８２，  ４４３−４４７  （１９８０）を参照）を精製し、該Ｓｅｒ49−ホスホリパーゼＡ2；Ａｍｍｏｄｙｔｉｎ  Ｌの標品についても、ＫＤＲ細胞外ドメインへの結合能（親和性）に関して、評価した結果を表２に併せて示す。該Ａｍｍｏｄｙｔｉｎ  Ｌは、ＫＤＲ−ＩｇＧに対する解離定数Ｋｄ＝１．３３×１０-8  Ｍを与えるものである。
【００８５】
【表２】
2007161639.tif 000004
【００８６】
なお、Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓのヘビ毒由来のＢＰ−IIは、ＢＰ−Ｉと実質的に等しい速度論パラメーターを有している。
従って、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓのヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2（ＫＤＲ−ｂｐ）と同様に、Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ｆｌａｖｏｖｉｒｉｄｉｓのヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2である、ＢＰ−Ｉ、ＢＰ−IIも、ＫＤＲの細胞外ドメイン部分（ＫＤＲD1-7）と結合することによって、ｖａｍｍｉｎとＫＤＲ−ＩｇＧとの結合を競争的に阻害すると判断される。
５．ＫＤＲの細胞外ドメイン部分（ＫＤＲD1-7）を有するＫＤＲ−ＩｇＧ対する、ＫＤＲ−ｂｐとヒトＶＥＧＦ165の競争的結合
（ｉ）ＫＤＲ−ｂｐとヒトＶＥＧＦ165とによる、ＫＤＲに対する競争的結合
ＫＤＲ−ｂｐとＫＤＲとの結合は、ヒトＶＥＧＦ165とＫＤＲとの結合によって阻害することを検証する。
【００８７】
具体的には、２０ｎＭのＫＤＲ−ｂｐ溶液を用いて、ＥＬＩＳＡプレート上にＫＤＲ−ｂｐを固定化する。次いで、該ＥＬＩＳＡプレート表面を、１％ＢＳＡ含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて、ＢＳＡによる表面ブロッキング処理を施す。同緩衝液中に、ＫＤＲ−ＩｇＧを５ｎＭ、組換え発現ヒトＶＥＧＦ165を所定濃度で溶解したサンプル溶液を、該ＥＬＩＳＡプレート表面に注ぎ、室温で６０分間インキュベートする。その後、サンプル溶液を除去し、該ＥＬＩＳＡプレート表面を同緩衝液で二度洗浄する。
【００８８】
その後、定法に従って、酵素標識−坑ヒトＩｇＧ抗体を利用するＥＬＩＳＡ法によって、該ＥＬＩＳＡプレート表面にＫＤＲ−ｂｐとの結合を介して固定化されている、ＫＤＲ−ＩｇＧの量を測定する。
【００８９】
図６に示すように、組換え発現ヒトＶＥＧＦ165の添加濃度依存的に、検出される標識酵素由来の酵素活性の低下が観測されている。すなわち、組換え発現ヒトＶＥＧＦ165とＫＤＲ−ＩｇＧの結合と、ＫＤＲ−ｂｐとＫＤＲ−ＩｇＧの結合とは、競争的であることが確認される。
【００９０】
（ii）ヒトＶＥＧＦ165とＫＤＲとの結合に対するＫＤＲ−ｂｐの競争的阻害
ＫＤＲ−ｂｐは、ｖａｍｍｉｎとＫＤＲとの結合に加えて、ヒトＶＥＧＦ165とＫＤＲとの結合をも競争的に阻害することを検証する。
【００９１】
具体的には、２０ｎＭのヒトＶＥＧＦ165溶液を用いて、ＥＬＩＳＡプレート上にヒトＶＥＧＦ165を固定化する。次いで、該ＥＬＩＳＡプレート表面を、１％ＢＳＡ含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて、ＢＳＡによる表面ブロッキング処理を施す。同緩衝液中に、ＫＤＲ−ＩｇＧの５ｎＭ、ＫＤＲ−ｂｐ精製済評品を所定濃度で溶解したサンプル溶液を、該ＥＬＩＳＡプレート表面に注ぎ、室温で６０分間インキュベートする。その後、サンプル溶液を除去し、該ＥＬＩＳＡプレート表面を同緩衝液で二度洗浄する。
【００９２】
その後、定法に従って、酵素標識−坑ヒトＩｇＧ抗体を利用するＥＬＩＳＡ法によって、該ＥＬＩＳＡプレート表面にとの結合を介して固定化されている、ＫＤＲ−ＩｇＧの量を測定する。
【００９３】
図７のＡに示すように、ＫＤＲ−ｂｐの添加濃度依存的に、検出される標識酵素由来の酵素活性の低下が観測されている。すなわち、組換え発現ヒトＶＥＧＦ165とＫＤＲ−ＩｇＧの結合を、ＫＤＲ−ｂｐは競争的に阻害していることが確認される。検出される酵素活性が５０％低下する添加濃度：Ｉ50は、図７のＡに示す結果から、ヒトＶＥＧＦ165とＫＤＲ−ＩｇＧの結合に対する阻害活性は、ＫＤＲ−ｂｐに関して、Ｉ50≒２×１０-6Ｍと見積もられる。
【００９４】
また、ｖａｍｍｉｎについても、１０ｎＭのｖａｍｍｉｎ溶液を用いて、ＥＬＩＳＡプレート上にｖａｍｍｉｎを固定化する。次いで、該ＥＬＩＳＡプレート表面を、１％ＢＳＡ含有Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて、ＢＳＡによる表面ブロッキング処理を施す。同緩衝液中に、ＫＤＲ−ＩｇＧを５ｎＭ、ＫＤＲ−ｂｐ精製済評品を所定濃度で溶解したサンプル溶液を、該ＥＬＩＳＡプレート表面に注ぎ、室温で６０分間インキュベートする。その後、サンプル溶液を除去し、該ＥＬＩＳＡプレート表面を同緩衝液で二度洗浄する。
【００９５】
その後、定法に従って、酵素標識−坑ヒトＩｇＧ抗体を利用するＥＬＩＳＡ法によって、該ＥＬＩＳＡプレート表面にとの結合を介して固定化されている、ＫＤＲ−ＩｇＧの量を測定する。
【００９６】
図７のＢに示すように、ＫＤＲ−ｂｐの添加濃度依存的に、検出される標識酵素由来の酵素活性の低下が観測されている。すなわち、ｖａｍｍｉｎとＫＤＲ−ＩｇＧの結合を、ＫＤＲ−ｂｐは競争的に阻害していることが確認される。検出される酵素活性が５０％低下する添加濃度：Ｉ50は、図７のＢに示す結果から、ｖａｍｍｉｎとＫＤＲ−ＩｇＧの結合に対する阻害活性は、ＫＤＲ−ｂｐに関して、Ｉ50≒２×１０-6Ｍと見積もられる。
【００９７】
６．ヒトＶＥＧＦ165により誘起される血管内皮細胞増殖に対するＫＤＲ−ｂｐの抑制作用
ＫＤＲ−ｂｐは、ヒトＶＥＧＦ165のＫＤＲに対する結合を競争的に阻害するため、ヒトＶＥＧＦ165により誘起される血管内皮細胞増殖を、ＫＤＲ−ｂｐは濃度依存的に抑制することを検証する。
【００９８】
無血清条件下において培養したヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、３０００細胞／ｗｅｌｌで播種し、ＫＤＲ−ｂｐを種々の添加濃度で添加した培地中、ヒトＶＥＧＦ165を１ｎＭで添加した条件、あるいは、無添加条件で３日間培養する。その後、生細胞数をＴｅｔｒａ  Ｃｏｌｏｒ  Ｏｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｊａｐａｎ）を用いて、評価する。
【００９９】
図８中、ヒトＶＥＧＦ165無添加条件で培養した際の生細胞数の指標Ａ405-545を、○印で示し、また、ヒトＶＥＧＦ165を１ｎＭで添加した条件で培養した際の生細胞数の指標Ａ405-545を、●印で示す。ヒトＶＥＧＦ165無添加条件で培養した際、培養後の生細胞数はＫＤＲ−ｂｐの添加濃度に依存していない。すなわち、この添加濃度範囲では、ＫＤＲ−ｂｐは、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対する細胞毒性を示さないと判断される。
【０１００】
一方、ヒトＶＥＧＦ165を１ｎＭで添加した条件で培養した際、ヒトＶＥＧＦ165無添加条件で培養した場合と比較すると、ヒトＶＥＧＦ165により誘起される血管内皮細胞増殖効果によって、培養後の生細胞数は多くなる。しかしながら、このヒトＶＥＧＦ165により誘起される血管内皮細胞増殖効果は、ＫＤＲ−ｂｐの添加濃度に依存して、抑制を受けている。この条件において、ヒトＶＥＧＦ165により誘起される血管内皮細胞増殖効果を半減させるＫＤＲ−ｂｐの添加濃度は、約２×１０-7Ｍと見積もられる。
【０１０１】
無血清条件下において培養したヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、３０００細胞／ｗｅｌｌで播種し、ＫＤＲ−ｂｐを種々の添加濃度で添加した培地中、ヒトＶＥＧＦ165を１ｎＭで添加した条件、あるいは、無添加条件で３日間培養する。併行して、無血清条件下において培養したヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、３０００細胞／ｗｅｌｌで播種し、ＫＤＲ−ｂｐを種々の添加濃度で添加した培地中、ウシ胎児血清を５％添加した条件、あるいは、無添加条件で３日間培養する。その後、生細胞数をＴｅｔｒａ  Ｃｏｌｏｒ  Ｏｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｊａｐａｎ）を用いて、評価する。
【０１０２】
ＫＤＲ−ｂｐを添加せず、ヒトＶＥＧＦ165を１ｎＭで添加した条件における、培養後の生細胞数（陽性対照）、ＫＤＲ−ｂｐを添加せず、ヒトＶＥＧＦ165を無添加条件における、培養後の生細胞数（陰性対照）を、それぞれ、ヒトＶＥＧＦ165により誘起される血管内皮細胞増殖効果１００％、０％として、ＫＤＲ−ｂｐを種々の添加濃度で添加した際のヒトＶＥＧＦ165により誘起される血管内皮細胞増殖効果を算定する。
【０１０３】
同様に、ＫＤＲ−ｂｐを添加せず、ウシ胎児血清を５％添加した条件における、培養後の生細胞数（陽性対照）、ＫＤＲ−ｂｐを添加せず、ウシ胎児血清無添加条件における、培養後の生細胞数（陰性対照）を、それぞれ、ウシ胎児血清添加により誘起される血管内皮細胞増殖効果１００％、０％として、ＫＤＲ−ｂｐを種々の添加濃度で添加した際のウシ胎児血清添加により誘起される血管内皮細胞増殖効果を算定する。
【０１０４】
図９中、ウシ胎児血清を５％添加した条件で培養した際の血管内皮細胞増殖効果を、○印で示し、また、ヒトＶＥＧＦ165を１ｎＭで添加した条件で培養した際の血管内皮細胞増殖効果を、●印で示す。この条件において、ヒトＶＥＧＦ165により誘起される血管内皮細胞増殖効果を半減させるＫＤＲ−ｂｐの添加濃度は、約２×１０-7Ｍと見積もられる。一方、この添加濃度範囲では、ＫＤＲ−ｂｐは、ウシ胎児血清添加により誘起される血管内皮細胞増殖効果に対して、何らの抑制作用をも示さないと判断される。
【０１０５】
すなわち、ＫＤＲ−ｂｐは、ヒトＶＥＧＦ165のＫＤＲに対する結合を競争的に阻害するため、ヒトＶＥＧＦ165により誘起される血管内皮細胞増殖を、濃度依存的に抑制していると判断される。
【０１０６】
７．ＫＤＲ−ｂｐのヘパリン結合能
Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓのヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2は、そのＣ末にヘパリン結合性部位を有することが報告されており、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓのヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2であると同定したＫＤＲ−ｂｐも実際にヘパリン結合能を有することを検証する。
【０１０７】
表面プラズモン共鳴法による測定装置：ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００  （ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｅｗｄｅｎ）を使用して、ヘパリンに対するＫＤＲ−ｂｐの結合・解離特性を評価した。ヘパリン結合能解析の実験は、ＨＢＳ緩衝液（１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ  ７．４，  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ３  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．００５％  ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０）を使用して、２５℃で行った。ビオチン化ヘパリンを、ＳＡセンサー・チップ上に固定した。
【０１０８】
図１０は、ＳＡセンサー・チップ上に固定したビオチン化ヘパリンに対する、ＫＤＲ−ｂｐ（６０  ｎＭ；実線）、Ｔｆ  ＰＬＡ2（６０  ｎＭ；点線）の結合（１００−２２０秒の間）、解離（２２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。
【０１０９】
ＫＤＲ−ｂｐは、ヘパリンに対して、実際に結合能を有することが確認される。なお、ＫＤＲ−ｂｐのヘパリンに対する結合過程の、みかけの解離定数（Ｋd）は、Ｋd＝４．５×１０-9Ｍと算定された。
【０１１０】
一方、この条件では、Ｔｆ  ＰＬＡ2は、ヘパリンに対して結合能を示さないと判断される。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明にかかるＫＤＲに対する拮抗的阻害剤としてのヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2の使用、特に、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓのＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2の使用は、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ165の結合を利用するｉｎ  ｖｉｔｒｏの生理的試験系において、血管内皮細胞に対して、何らの細胞毒性を示さず、ＫＤＲに対するＶＥＧＦ165の結合により誘起される細胞増殖を阻害することを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１は、各種のＶＥＧＦ受容体と、その細胞外ドメインの構成を模式的に示す図である。
【図２】図２のＡは、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎｍｏｕｔｈ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）のヘビ毒から単離・精製されたＫＤＲ結合性タンパク質（ＫＤＲ−ｂｐ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示している。挿入されているＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果において、各レーンは、ＮＲ：非還元下、Ｒ：還元下の泳動結果を示す。図２のＢは、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓのヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2について報告されているアミノ酸配列と、ＫＤＲ−ｂｐのＮ末側アミノ酸配列、エンドプロテアーゼ  Ｌｙｓ−Ｃを用いて酵素消化されたペプチド断片のアミノ酸配列との一致部分を示し、ＫＤＲ−ｂｐを当該ヘビ毒由来のＬｙｓ49−ホスホリパーゼＡ2と同定する根拠を示す。
【図３】図３は、ｖａｍｍｉｎとＫＤＲ−ＩｇＧとの結合を阻害する活性を示す物質を含有する各種ヘビ毒と、その阻害能の濃度依存性を示すグラフである。ＶＡ：ｖａｍｍｉｎを含んでいるＶｉｐｅｒａ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓ  ａｍｍｏｄｙｔｅｓのヘビ毒；ＤＲ：ＶＲ−１を含んでいるＤａｂｏｉａ  ｒｕｓｓｅｌｌｉ  ｒｕｓｓｅｌｌｉのヘビ毒；ＡＰ：ＫＤＲ−ｂｐを含んでいるＥａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｔｔｏｎｍｏｕｔｈ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ  ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）のヘビ毒；ＰＡ：ｖａｍｍｉｎとＫＤＲ−ＩｇＧとの結合を阻害する活性を示さない、Ｐｓｅｕｄｅｃｈｉｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓのヘビ毒（ＰＡ）。
【図４】図４のＡは、ＣＭ４センサー・チップ上に固定された組換え発現ＫＤＲD1-7（ＫＤＲの細胞外ドメインを構成する七つのＩｇ様ドメイン部分に相当する）に対する、ヒトＶＥＧＦ165（６  ｎＭ；破線）、ＫＤＲ−ｂｐ（６０  ｎＭ；実線）、Ｔｆ  ＰＬＡ2（６０  ｎＭ；点線）の結合（１００−２２０秒の間）、解離（２２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。図４のＢは、ＣＭ４センサー・チップ上に固定された組換え発現Ｆｌｔ−１D1-6（Ｆｌｔ−１の細胞外ドメインを構成する七つのＩｇ様ドメイン中、六つのＩｇ様ドメイン部分に相当する）に対する、ヒトＶＥＧＦ165（６  ｎＭ；破線）、ＫＤＲ−ｂｐ（６０  ｎＭ；実線）、Ｔｆ  ＰＬＡ2（６０  ｎＭ；点線）の結合（１００−２２０秒の間）、解離（２２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。図４のＣは、ＣＭ４センサー・チップ上に固定さらたＮＰ−１−ＩｇＧに対する、ヒトＶＥＧＦ165（６  ｎＭ；破線）、ＫＤＲ−ｂｐ（６０  ｎＭ；実線）、Ｔｆ  ＰＬＡ2（６０  ｎＭ；点線）の結合（１００−２２０秒の間）、解離（２２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。
【図５】図５のＡは、ＣＭ４センサー・チップ上に固定されたヒトＩｇＧに対する、ＫＤＲ−ｂｐ（１００  ｎＭ；実線）、Ｔｆ  ＰＬＡ2（３０  ｎＭ；点線）の結合（０−１２０秒の間）、解離（１２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。図５のＢは、ＣＭ４センサー・チップ上に固定されたＦＧＦＲ１α−ＩｇＧに対する、ｂＦＧＦ（３０  ｎＭ；破線）、ＫＤＲ−ｂｐ（３０  ｎＭ；実線）、Ｔｆ  ＰＬＡ2（３０  ｎＭ；点線）の結合（０−１２０秒の間）、解離（１２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。図５のＣは、ＣＭ４センサー・チップ上に固定されたＰＤＧＦＲ−αに対する、ＰＤＦＧ−ＢＢ（１０  ｎＭ；破線）、ＫＤＲ−ｂｐ（１０  ｎＭ；実線）、Ｔｆ  ＰＬＡ2（１０  ｎＭ；点線）の結合（０−１２０秒の間）、解離（１２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。図５のＤは、ＣＭ４センサー・チップ上に固定されたＰＤＧＦＲβ−ＩｇＧに対する、ＰＤＦＧ−ＢＢ（１０  ｎＭ；破線）、ＫＤＲ−ｂｐ（１０  ｎＭ；実線）、Ｔｆ  ＰＬＡ2（１０  ｎＭ；点線）の結合（０−１２０秒の間）、解離（１２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。
【図６】図６は、組換え発現ヒトＶＥＧＦ165の添加濃度に依存した、ＫＤＲ−ｂｐとＫＤＲ−ＩｇＧの結合における結合形成量の低下を示す図である。
【図７】図７のＡは、ＫＤＲ−ｂｐの添加濃度に依存した、組換え発現ヒトＶＥＧＦ165とＫＤＲ−ＩｇＧの結合における結合形成量の低下を示す図である。図７のＢは、ＫＤＲ−ｂｐの添加濃度に依存した、ｖａｍｍｉｎとＫＤＲ−ＩｇＧの結合における結合形成量の低下を示す図である。
【図８】図８は、ヒトＶＥＧＦ165により誘起される血管内皮細胞増殖を、ＫＤＲ−ｂｐは濃度依存的に抑制すること示す図である。図８中、ヒトＶＥＧＦ165無添加条件で培養した際の生細胞数の指標Ａ405-545を、○印で示し、また、ヒトＶＥＧＦ165を１ｎＭで添加した条件で培養した際の生細胞数の指標Ａ405-545を、●印で示す。
【図９】図９は、ヒトＶＥＧＦ165により誘起される血管内皮細胞増殖、ならびに、ウシ胎児血清添加により誘起される血管内皮細胞増殖に対する、ＫＤＲ−ｂｐの抑制作用の有無を示す図である。図９中、ウシ胎児血清を５％添加した条件で培養した際の血管内皮細胞増殖効果を、○印で示し、また、ヒトＶＥＧＦ165を１ｎＭで添加した条件で培養した際の血管内皮細胞増殖効果を、●印で示す。
【図１０】図１０は、ＳＡセンサー・チップ上に固定したビオチン化ヘパリンに対する、ＫＤＲ−ｂｐ（６０  ｎＭ；実線）、Ｔｆ  ＰＬＡ2（６０  ｎＭ；点線）の結合（１００−２２０秒の間）、解離（２２０秒以降）の各過程における共鳴信号変化を対比して示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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