【事件の表示】
　上記当事者間の特許第３９７４４４１号「核酸の合成方法」の特許無効審判事件についてされた平成２３年　７月２５日付け審決に対し、知的財産高等裁判所において請求項１、２に係る発明に対する部分の審決取消しの判決（平成２３年（行ケ）第１０２７５号、平成２４年１０月３１日）があったので、審決が取り消された部分の請求項に係る発明についてさらに審理のうえ、次のとおり審決する。
【結　論】
　訂正を認める。
　本件審判の請求は、成り立たない。
　審判費用は、請求人の負担とする。
【理　由】
第１　手続の経緯
　本件特許第３９７４４４１号（以下、「本件特許」という。）は、平成１１年１１月８日（優先権主張平成１０年１１月９日）にした特願２０００−５８１２４８号の一部を平成１４年４月１２日に新たな特許出願（特願２００２−１１０５０５号）としたもので、平成１９年６月２２日に特許権の設定の登録がされたものである。 
　これに対して、請求人は、平成２２年１０月２５日に、請求項１〜１０に係る発明についての特許を無効とする審決を求めて特許無効審判を請求した。
　平成２３年７月２５日に、「本件審判請求は、成り立たない。」との審決（以下、「１次審決」という。）がされた。
　これに対し、請求人は、審決の取消訴訟を提起し（平成２３年（行ケ）第１０２７５号）、知的財産高等裁判所は、平成２４年１０月３１日に、「特許庁が無効２０１０−８００１９７号事件について平成２３年７月２５日にした審決のうち、特許第３９７４４４１号の請求項１及び２に係る発明についての審判請求は成り立たないとの部分を取り消す。」との判決（以下、「本件判決」という。）をし、最高裁判所において上記判決に対する上告を棄却する旨及び上告審として受理しない旨の決定（平成２５年（行ツ）第４６号及び平成２５年（行ヒ）５５号）がされ、上記判決は確定した。これに伴い、１次審決のうち、請求項３〜１０に係る発明に対する１次審決は確定した（当該請求項３〜１０に対する審決は、後述の（参考）を参照のこと。）。 
　その後、被請求人は、平成２６年４月２８日に訂正の請求の申立てをし、平成２６年５月２３日に訂正請求書を提出し、同日付けで上申書を提出した。
　平成２６年５月３０日に請求人に訂正請求書を送付し弁駁を求めたところ、請求人から応答はなかった。
　
第２　訂正の可否に対する判断 
 １．平成２６年５月２３日付け訂正請求の内容  
　被請求人が平成２６年５月２３日に提出した訂正請求書による訂正請求によって求める訂正（以下、「本件訂正」という。）は、本件特許の願書に添付した明細書（以下、「本件特許明細書」という。）の記載を、同訂正請求書に添付した明細書のとおりに訂正することを求めるものであって、以下の訂正事項１及び２からなるものと認められる（下線部は訂正箇所である）。 
 　 
 （１）訂正事項１ 
　本件特許公報の特許請求の範囲の請求項１において
「【請求項１】 
 以下の工程を含む１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法。
ａ）同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールすることができる領域Ｆ１を３′末端に備え、この領域Ｆ１がＦ１ｃにアニールすることによって、塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成することができる核酸を与える工程、
ｂ）Ｆ１ｃにアニールしたＦ１の３′末端を合成起点として相補鎖合成を行う工程、 
ｃ）領域Ｆ２ｃに相補的な配列からなるＦ２を３′末端に含むオリゴヌクレオチドをアニールさせ、これを合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って、工程ｂ）で合成された相補鎖を置換する工程、 
ｄ）工程ｃ）で置換され塩基対結合が可能となった相補鎖における任意の領域に相補的な配列を３′末端に含むポリヌクレオチドをアニールさせ、その３′末端を合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って、工程ｃ）で合成された相補鎖を置換する工程」 
とあるのを、
「【請求項１】 
 以下の工程
ａ）〜ｄ）
ａ）
以下の工程i)〜iv)によって第２の核酸として提供される、
i) 前記Ｆ２ｃに相補的な塩基配列Ｆ２を持つ領域の５′側に前記Ｆ１ｃと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチドの領域Ｆ２を鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃにアニールさせる工程、
ii) オリゴヌクレオチドのＦ２を合成起点とし、鋳型に相補的な塩基配列を持つ第１の核酸を合成する工程、
iii) 前記鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃの更に３′側の任意の領域Ｆ３ｃにアニールするオリゴヌクレオチドＦ３を合成起点とする鎖置換相補鎖合成を行うことにより、工程ii)で合成された第１の核酸の任意の領域を塩基対結合が可能な状態とする工程、
iv) 工程iii)における第１の核酸の塩基対結合を可能とした領域に相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドをアニールさせ、それを合成起点として第２の核酸を合成し、前記合成起点より更に３′側の任意の領域Ｒ３ｃにアニールするオリゴヌクレオチドＲ３を合成起点とした鎖置換相補鎖合成を行うことにより、その３′末端のＦ１を塩基対結合が可能な状態とする工程
ｂ）Ｆ１ｃにアニールしたＦ１の３′末端を合成起点として相補鎖合成を行う工程、ｃ）領域Ｆ２ｃに相補的な配列からなるＦ２を３′末端に含むオリゴヌクレオチドをアニールさせ、これを合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って、工程ｂ）で合成された相補鎖を置換する工程、 
ｄ）工程ｃ）で置換され塩基対結合が可能となった相補鎖における任意の領域に相補的な配列を３′末端に含むポリヌクレオチドをアニールさせ、その３′末端を合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って、工程ｃ）で合成された相補鎖を置換する工程。」
と訂正する。 
 　 
（２）訂正事項２
　本件特許公報の特許請求の範囲の請求項３を削除し、訂正前の請求項４〜１０の請求項番号をそれぞれ、３〜９と訂正するとともに、訂正前の請求項４が引用していた「請求項３」を「請求項１」と、訂正前の請求項５及び７が引用していた「請求項４」を「請求項３」と、訂正前の請求項６が引用していた「請求項３〜５」を「請求項１、３または４」と、訂正前の請求項９が引用していた「請求項８」を「請求項７」と、訂正前の請求項１０が引用していた「請求項８または９」を「請求項７または８」と訂正する。
　
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無、及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否 
（１）訂正事項１
　訂正前の請求項１は、工程ａ）について、「同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールすることができる領域Ｆ１を３′末端に備え、この領域Ｆ１がＦ１ｃにアニールすることによって、塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成することができる核酸を与える工程」と記載しており、核酸の提供方法については特定されていなかったところ、訂正事項１は、核酸が、訂正前の請求項３に以下のように記載されていた工程i)〜iv)によって第２の核酸として提供される方法であることを特定するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
　また、工程i)〜iv)を追加したことにより、１行目の「以下の工程を含む」という記載が不明りょうとなることから、「以下の工程
ａ）〜ｄ）
　よって、訂正事項１は、特許請求の範囲の減縮及び明りょうでない記載の釈明を目的とするものである。
　そして、訂正事項１は、訂正前の請求項３の記載を追加するものであるから、実質上特許請求の範囲を拡張し又は変更するものではなく、特許明細書又は図面に記載した事項の範囲内においてなされたものである。
　
（訂正前の請求項３）
「【請求項３】 
 工程ａ）における核酸が、以下の工程によって提供される第２の核酸である請求項１に記載の方法。 
 i) 前記Ｆ２ｃに相補的な塩基配列Ｆ２を持つ領域の５′側に前記Ｆ１ｃと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチドの領域Ｆ２を鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃにアニールさせる工程、 
 ii) オリゴヌクレオチドのＦ２を合成起点とし、鋳型に相補的な塩基配列を持つ第１の核酸を合成する工程、 
 iii) 前記Ｆ２ｃの更に３′側の任意の領域Ｆ３ｃにアニールするオリゴヌクレオチドＦ３を合成起点とする鎖置換相補鎖合成を行うことにより、工程ii)で合成された第１の核酸の任意の領域を塩基対結合が可能な状態とする工程、 
 iv) 工程iii)における第１の核酸の塩基対結合を可能とした領域に相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドをアニールさせ、それを合成起点として第２の核酸を合成し、前記合成起点より更に３′側の任意の領域Ｒ３ｃにアニールするオリゴヌクレオチドＲ３を合成起点とした鎖置換相補鎖合成を行うことにより、その３′末端のＦ１を塩基対結合が可能な状態とする工程」
　
（２）訂正事項２
　訂正事項２は、訂正事項１に伴い訂正前の請求項３を削除し、請求項を繰り上げたことによる引用関係を整合させたものであり、明りょうでない記載の釈明を目的とするものである。
　そして、訂正事項２は特許明細書又は図面に記載した事項の範囲内でなされたものであり、さらに、実質上特許請求の範囲を拡張し又は変更するものでもない。
　
３．むすび  
 　以上のとおり、本件訂正は、特許法第１３４条の２第１項ただし書各号に掲げる事項を目的とするものであり、同条第５項において読み替えて準用する第１２６条第３項〜第５項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
 　なお、平成２６年８月２５日に提出した承諾書により、訂正請求書に添付した訂正明細書、特許請求の範囲のとおり訂正を請求することについて、通常実施権者の承諾を得られたと認められ、本件訂正は、特許法第１３４条の２第５項において準用する特許法第１２７条の要件を満たしている。
　
第３　本件発明 
　上記第２のとおり、本件訂正は認められたので、本件発明は、本件訂正により訂正された明細書の特許請求の範囲の請求項１〜９に記載された以下のとおりのものである。（以下、「本件発明１」、「本件発明２」等という。） 
「【請求項１】
　以下の工程ａ）〜ｄ）を含む１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法。
ａ）以下の工程i)〜iv)によって第２の核酸として提供される、同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールすることができる領域Ｆ１を３′末端に備え、この領域Ｆ１がＦ１ｃにアニールすることによって、塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成することができる核酸を与える工程、
i) 前記Ｆ２ｃに相補的な塩基配列Ｆ２を持つ領域の５′側に前記Ｆ１ｃと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチドの領域Ｆ２を鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃにアニールさせる工程、 
ii) オリゴヌクレオチドのＦ２を合成起点とし、鋳型に相補的な塩基配列を持つ第１の核酸を合成する工程、
iii) 前記鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃの更に３′側の任意の領域Ｆ３ｃにアニールするオリゴヌクレオチドＦ３を合成起点とする鎖置換相補鎖合成を行うことにより、工程ii)で合成された第１の核酸の任意の領域を塩基対結合が可能な状態とする工程、 
iv) 工程iii)における第１の核酸の塩基対結合を可能とした領域に相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドをアニールさせ、それを合成起点として第２の核酸を合成し、前記合成起点より更に３′側の任意の領域Ｒ３ｃにアニールするオリゴヌクレオチドＲ３を合成起点とした鎖置換相補鎖合成を行うことにより、その３′末端のＦ１を塩基対結合が可能な状態とする工程 
ｂ）Ｆ１ｃにアニールしたＦ１の３′末端を合成起点として相補鎖合成を行う工程、
ｃ）領域Ｆ２ｃに相補的な配列からなるＦ２を３′末端に含むオリゴヌクレオチドをアニールさせ、これを合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って、工程ｂ）で合成された相補鎖を置換する工程、 
ｄ）工程ｃ）で置換され塩基対結合が可能となった相補鎖における任意の領域に相補的な配列を３′末端に含むポリヌクレオチドをアニールさせ、その３′末端を合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って、工程ｃ）で合成された相補鎖を置換する工程。
【請求項２】 
　工程ｄ）において、合成起点が領域Ｒ１ｃにアニールすることができる同一鎖上の３′末端に存在する領域Ｒ１であり、Ｒ１がＲ１ｃにアニールすることによって塩基対結合が可能な領域Ｒ２ｃを含むループが形成される請求項１に記載の方法。 
【請求項３】 
 工程iii)の塩基対結合を可能とする領域がＲ２ｃであり、前記Ｒ２ｃの５′側に存在する領域をＲ１ｃとしたとき、工程iv)におけるオリゴヌクレオチドが、前記Ｒ２ｃに相補的な塩基配列Ｒ２を持つ領域の５′側に前記Ｒ１ｃと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチドである請求項１に記載の方法。
【請求項４】 
　反応に用いる各オリゴヌクレオチドと鋳型におけるその相補領域との融解温度が、同じストリンジェンシーの下で次の関係にある請求項３に記載の方法。
 （Ｆ３ｃ／Ｆ３およびＲ３ｃ／Ｒ３）≦（Ｆ２ｃ／Ｆ２およびＲ２ｃ／Ｒ２）≦（Ｆ１ｃ／Ｆ１およびＲ１ｃ／Ｒ１）
【請求項５】 
　鋳型となる核酸がRNAであり、工程ii)における相補鎖合成を逆転写酵素活性を持つ酵素で行う請求項１、３または４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】 
　次の工程を繰り返すことによる１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の増幅方法。 
 Ａ）請求項３に記載の方法によって３′末端と５′末端において、それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互いに相補的な塩基配列がアニールしたときに両者の間に塩基対結合が可能となるループが形成される鋳型を提供する工程、 
 Ｂ）同一鎖にアニールさせた前記鋳型の３′末端を合成起点として相補鎖合成を行う工程、
 Ｃ）前記ループのうち３′末端側に位置するループ内に相補的な塩基配列を３′末端に含むオリゴヌクレオチドを、ループ部分にアニールさせ、これを合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って、工程Ｂ）で合成された相補鎖を置換してその３′末端を塩基対結合が可能な状態とする工程、および
 Ｄ）工程Ｃ）において３′末端を塩基対結合が可能な状態とした鎖を工程Ａ）における新たな鋳型とする工程 
【請求項７】 
　以下の要素を含む、１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成用キット。
　領域Ｆ３ｃ、領域Ｆ２ｃ、および領域Ｆ１ｃを３′側からこの順で含む鋳型核酸に対し、
 i) 前記Ｆ２ｃに相補的な塩基配列Ｆ２を持つ領域の５′側に前記Ｆ１ｃと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチド、
 ii) i)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
 iii) 前記Ｆ３ｃに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド、
 iv) i)のオリゴヌクレオチドを合成起点として合成された相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃの３′側に位置する領域Ｒ３ｃに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド、
 v) 鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するDNAポリメラーゼ、および
 vi) 要素v)の基質となるヌクレオチド
【請求項８】 
　ii)のオリゴヌクレオチドが、i)のオリゴヌクレオチドを合成起点として合成された相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃとその５′側に位置する領域Ｒ１ｃに対し、前記Ｒ２ｃに相補的な塩基配列Ｒ２を持つ領域の５′側に前記Ｒ１ｃと同じ塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチドである請求項７に記載のキット。 
【請求項９】 
 請求項７または８に記載のキットに、更に付加的に核酸合成反応の生成物を検出するための検出剤を含む、標的塩基配列の検出用キット。」 
 
第４　当事者の主張の概要
１．請求人の主張の概要
　請求人が主張する無効理由の概要は、次のとおりであり、甲第１号証〜甲第３２号証（以下、「甲１」〜「甲３２」ということがある。）を提出している。
　
　なお、訂正により訂正前の請求項３が訂正後の請求項１に組み込まれ、訂正前の請求項４〜１０は訂正後の請求項３〜９に繰り上がることになったため、以下の両当事者の主張は、訂正後の請求項１〜９に置き換えている。
　
（１）無効理由１
　本件発明１〜９は、甲１〜甲７に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。　
（２）無効理由２
　本件発明１〜９は、本件出願前（優先日前）に出願され、かつ本件出願後に出願公開された甲８に記載の発明と同一であるから、特許法第２９条の２の規定により特許を受けることができない。
（３）無効理由３、４
　本件発明１、５、７及び９は、特許法第３６条第６項第１号及び同条第４項に規定する要件を満たしていない。
　
＜証拠方法＞ 
 甲第１号証：THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.266、 No.21、 pp.14031-14038、 1991 
 甲第１号証の２：甲第１号証の抄訳（平成２３年５月２７日付手続補正書） 
 甲第１号証の３：Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.79、 pp.724-728、 1982 
 甲第２号証：“DNA REPLICATION SECOND EDITION”、 ARTHUR KORNBERG、TANIA A BAKR、 W.H.FREEMAN AND COMPANY、1992　 pp.700-704 pp.713-716. 
 甲第２号証の２：甲第２号証の抄訳 
 甲第２号証の３：“DNA REPLICATION SECOND EDITION”、 ARTHUR KORNBERG、TANIA A BAKER、 W.H.FREEMAN AND COMPANY、 1992 pp.492-493 pp.504. 
 甲第２号証の４：甲第２号証の３の抄訳 
 甲第３号証：ＷＯ　９６／０１３２７ 
 甲第３号証の２：甲第３号証の訳文 
 甲第４号証：ＷＯ　９７／０４１３１ 
 甲第４号証の２：甲第４号証の抄訳 
 甲第５号証：特表平７−２８９２９８号公報 
 甲第６号証：「バイオ実験イラストレイテッド　３＋　本当にふえるＰＣＲ」秀潤社、１９９８年６月１日発行 
 甲第７号証：特開平２−５８６４号公報 
 甲第８号証：特開２０００−３７１９４号公報 
 甲第８号証の２：甲第８号証の優先権証明書 
 甲第９号証：Nucleic Acids Research、2000、Vol.28、No.12、e63 
 甲第９号証の２：甲第１０号証の抄訳 
 甲第１０号証：平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の、原告栄研化学株式会社による平成２２年２月１日付け第４準備書面 
 甲第１１号証：平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の、原告栄研化学株式会社による平成２２年２月１８日付け第５準備書面） 
 甲第１２号証：平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の、原告栄研化学株式会社による平成２２年７月７日付け第７準備書面 
 甲第１３号証：平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の、原告栄研化学株式会社による平成２２年９月２９日付け技術説明資料 
 甲第１４号証：無効２００８−８００２９３（特許第３８９７８０５号特許無効審判事件）の、請求人栄研化学による平成２１年８月７日付け技術説明資料 
 甲第１５号証：無効２００８−８００２９３（特許第３８９７８０５号特許無効審判事件）の、請求人栄研化学による平成２１年９月１８日付け上申書 
 甲第１６号証：平成２１年（行ケ）第１０４２０号事件の、原告栄研化学株式会社による平成２２年３月１日付け第１準備書面 
 甲第１７号証：平成２１年（行ケ）第１０４２０号事件の、原告栄研化学株式会社による平成２２年８月２３日付け第３準備書面 
 甲第１８号証：平成２１年（行ケ）第１０４２０号事件の、原告栄研化学株式会社による平成２２年９月８日付け技術説明資料 
 甲第１９号証：平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の、原告栄研化学株式会社による平成２１年１０月５日付け第２準備書面 
 甲第２０号証：特願２００１−５７５１７１の、出願人栄研化学株式会社による平成２３年３月７日付け意見書 
 甲第２１号証：特願２００１−５７５１７１の審査経過における、平成２３年１月４日付け発送拒絶理由通知 
 甲第２２号証：特願２００１−５７５１７１の出願経過書類 
 甲第２３号証：平成17年（行ケ）10207号審決取消請求事件の判決文 
 甲第２４号証：請求人による平成２３年５月１１日付け口頭審理説明資料 
 甲第２５号証：無効２０１０−８００１９５（特許第３３１３３５８号無効審判事件）、無効２０１０−８００１９７（特許第３９７４４４１号無効審判事件）及び無効２０１０−８００１９８（特許第４１３９４２４号無効審判事件）の、被請求人栄研化学による平成２３年５月１１日付け口頭審理技術説明資料 
 甲第２６号証：東京化学同人「分子細胞生物学辞典」第２版　８０７頁（「ヘアピンループ」の解説の頁）、平成９年（１９９７年）３月１０日　第1版第１刷発行 
 甲第２７号証：被請求人栄研化学作成のＷｅｂサイト「ＬＡＭＰ法の原理」（http://loopamp.eiken.co.jp/lamp/principle.htmlからダウンロード［ダウンロード日：平成２３年（２０１１年）５月１９日］）
甲第２８号証：平成２４年（行サ）第１００４４号事件上告理由書の第１、３及び８〜１１頁
甲第２９号証：平成２４年（行ノ）第１００６４号事件上告受理申立理由書の第１、３及び８〜１１頁
甲第３０号証：平成２４年（行サ）第１００４４号事件上告理由書及び平成２４年（行ノ）第１００６４号事件上告受理申立理由書における乙第２号証の２
甲第３１号証：平成２４年（行サ）第１００４４号事件上告理由書及び平成２４年（行ノ）第１００６４号事件上告受理申立理由書における乙第２号証の３
甲第３２号証：平成２４年（行サ）第１００４４号事件上告理由書及び平成２４年（行ノ）第１００６４号事件上告受理申立理由書における乙第２号証の１６
　
 ２．被請求人の主張の概要
　被請求人は、請求人の主張する無効理由１〜４はいずれも理由がないと主張し、乙第１号証〜乙第８号証（以下、「乙１」〜「乙８」ということがある）を提出している。
　
＜証拠方法＞ 
 乙第１号証：「生化学辞典　第３版」第１刷１９９８年１０月８日、株式会社東京化学同人発行 
 乙第２号証：特願平１１−１７９０５６の審査経過における平成１５年１２月２４日付手続補正書 
 乙第３号証：特願平１１−１７９０５６の審査経過における平成１６年２月２７日起案の拒絶理由通知書 
 乙第４号証：特願平１１−１７９０５６の審査経過における平成１６年９月２日付意見書 
 乙第５号証：特願平１１−１７９０５６の審査経過における平成１７年１月１１日起案の拒絶査定 
 乙第６号証：特願平１１−１７９０５６の審査経過における平成１７年４月１８日付出願取下書 
 乙第７号証：平成２３年５月１１日付被請求人技術説明資料 
 乙第８号証：タカラバイオ株式会社のウェブサイト（http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100003529）のプリントアウト 
 　 
第５　当審の判断
１．審理対象
　第１に示したように、「本件審判請求は成り立たない。」との１次審決に対し、本件判決は、１次審決のうち、請求項１及び２に係る発明に対する部分の審決を取り消したものであり、本件判決の確定に伴い、請求項３〜１０に係る発明に対する１次審決は確定したので、本審決は、審決が取り消された部分の請求項１及び２に係る発明についての特許を審理の対象とする。
　
２．本件発明について
（１）本件明細書の記載について
　本件明細書には、以下の事項が記載されている。
　「【００１３】【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、新規な原理に基づく核酸の合成方法を提供することである。より具体的には、低コストで効率的に配列に依存した核酸の合成を実現することができる方法を提供することである。すなわち、単一の酵素を用い、しかも等温反応条件の下でも核酸の合成と増幅を達成することができる方法の提供が、本発明の課題である。更に本発明は、公知の核酸合成反応原理では達成することが困難な高い特異性を実現することができる核酸の合成方法、並びにこの合成方法を応用した核酸の増幅方法の提供を課題とする。」 
 　 
 　「【００１６】【発明の実施の形態】本発明において合成の目的としている１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸とは、１本鎖上に互いに相補的な塩基配列を隣り合せに連結した核酸を意味する。更に本発明においては、相補的な塩基配列の間にループを形成するための塩基配列を含まなければならない。本発明においては、この配列をループ形成配列と呼ぶ。そして本発明によって合成される核酸は、実質的に前記ループ形成配列によって連結された互いに相補的な塩基配列で構成される。・・・」 
 　 
 　「【００２１】・・・へアピンループを形成させて自身を鋳型(template)とする相補鎖合成反応の報告は多いが、本発明においてはヘアピンループ部分に塩基対結合を可能とする領域を備えており、この領域を相補鎖合成に利用している点において新規である。・・・」
 　 
 　「【００２３】本発明の特徴となっている、３′末端に同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールすることができる領域Ｆ１を備え、この領域Ｆ１が同一鎖上のＦ１ｃにアニールすることによって、塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成することができる核酸は、様々な方法によって得ることができる。もっとも望ましい態様においては、次の構造を持ったオリゴヌクレオチドを利用した相補鎖合成反応に基づいてその構造を与えることができる。 
 【００２４】すなわち本発明において有用なオリゴヌクレオチドとは、少なくとも以下の２つの領域Ｘ２およびＸ１ｃとで構成され、Ｘ２の５′側にＸ１ｃが連結されたオリゴヌクレオチドからなる。 
 Ｘ２：特定の塩基配列を持つ核酸の領域Ｘ２ｃに相補的な塩基配列を持つ領域 
 Ｘ１ｃ：特定の塩基配列を持つ核酸における領域Ｘ２ｃの５′側に位置する領域Ｘ１ｃと実質的に同じ塩基配列を持つ領域」 
 　 
 　「【００３６】本発明による核酸の合成方法において有用な上記オリゴヌクレオチドを利用し、鎖置換活性を持ったDNAポリメラーゼと組み合わせて合成を行う反応について、基本的な原理を図５−６を参考にしながら以下に説明する。上記オリゴヌクレオチド（図５におけるＦＡ）は、まずＸ２（Ｆ２に相当）が鋳型となる核酸にアニールし相補鎖合成の起点となる。図５においてはＦＡを起点として合成された相補鎖がアウタープライマー（Ｆ３）からの相補鎖合成（後述）によって置換され、１本鎖（図５−Ａ）となっている。得られた相補鎖に対して更に相補鎖合成を行うと、このとき図５−Ａの相補鎖として合成される核酸の３′末端部分は、本発明によるオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を持つ。つまり、本発明のオリゴヌクレオチドは、その５′末端部分に領域Ｘ１ｃ（Ｆ１ｃに相当）と同じ配列を持つことから、このとき合成される核酸の３′末端部分はその相補配列Ｘ１（Ｆ１）を持つことになる。図５は、Ｒ１を起点として合成された相補鎖がアウタープライマーＲ３を起点とする相補鎖合成によって置換される様子を示している。置換によって３′末端部分が塩基対結合が可能な状態となると、３′末端のＸ１（Ｆ１）は、同一鎖上のＸ１ｃ（Ｆ１ｃ）にアニールし、自己を鋳型とした伸長反応が進む（図５−Ｂ）。そしてその３′側に位置するＸ２ｃ（Ｆ２ｃ）を塩基対結合を伴わないループとして残す。このループには本発明によるオリゴヌクレオチドのＸ２（Ｆ２）がアニールし、これを合成起点とする相補鎖合成が行われる（図５−Ｂ）。このとき、先に合成された自身を鋳型とする相補鎖合成反応の生成物が、鎖置換反応によって置換され塩基対結合が可能な状態となる。 
 【００３７】本発明によるオリゴヌクレオチドを１種類、そしてこのオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖を鋳型として核酸合成を行うことが可能な任意のリバースプライマーを用いた基本的な構成によって、図６に示すような複数の核酸合成生成物を得ることができる。図６からわかるとおり、(D)が本発明において合成の目的となっている１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸である。他方の生成物(E)は、加熱変性などの処理によって１本鎖とすれば再び(D)を生成するための鋳型となる。また２本鎖状態にある核酸である生成物(D)は、もしも加熱変性などによって１本鎖にされた場合、もとの２本鎖とはならずに高い確率で同一鎖内部でのアニールが起きる。なぜならば、同じ融解温度(Tm)を持つ相補配列ならば、分子間(intermolecular)反応よりも分子内(intramolecular)反応のほうがはるかに優先的に進むためである。同一鎖上でアニールした生成物(D)に由来する１本鎖は、それぞれが同一鎖内でアニールして(B)の状態に戻るので、更にそれぞれが１分子づつの(D)と(E)を与える。これらの工程を繰り返すことによって、１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸を次々に合成していくことが可能である。１サイクルで生成される鋳型と生成物が指数的に増えていくので、たいへん効率的な反応となる。 
 【００３８】ところで図５−(A)の状態を実現するためには、はじめに合成された相補鎖を少なくともリバースプライマーがアニールする部分において塩基対結合が可能な状態にしなければならない。このステップは任意の方法によって達成することができる。すなわち、最初の鋳型に対して本発明のオリゴヌクレオチドがアニールする領域Ｆ２ｃよりも更に鋳型上で３′側の領域Ｆ３ｃにアニールするアウタープライマー（Ｆ３）を別に用意する。このアウタープライマーを合成起点として鎖置換型の相補鎖合成を触媒するポリメラーゼによって相補鎖合成を行えば、本発明の前記Ｆ２ｃを合成開始点として合成された相補鎖は置換され、やがてＲ１がアニールすべき領域Ｒ１ｃを塩基対結合が可能な状態とする（図５）。鎖置換反応を利用することによって、ここまでの反応を等温条件下で進行させることができる。」
　
　　「【００３９】アウタープライマーを利用する場合には、Ｆ２ｃからの合成よりも後にアウタープライマー（Ｆ３）からの合成が開始される必要がある。最も単純な方法はインナープライマーの濃度をアウタープライマーの濃度よりも高くすることである。具体的には、通常２〜５０倍、望ましくは４〜１０倍の濃度差でプライマーを用いることにより、期待どおりの反応を行わせることができる。またアウタープライマーの融解温度(Tm)をインナープライマーのＸ１（Ｆ１やＲ１に相当）領域のTmより低くなるように設定することによって合成のタイミングをコントロールすることもできる。すなわち、（アウタープライマーＦ３：Ｆ３ｃ）≦（Ｆ２ｃ／Ｆ２）≦（Ｆ１ｃ／Ｆ１）、あるいは（アウタープライマー／鋳型における３′側の領域）≦（Ｘ２ｃ：Ｘ２）≦（Ｘ１ｃ：Ｘ１）である。なおここで（Ｆ２ｃ／Ｆ２）≦（Ｆ１ｃ／Ｆ１）としたのは、Ｆ２がループ部分にアニールするよりも先にＦ１ｃ／Ｆ１間のアニールを行わせるためである。Ｆ１ｃ／Ｆ１間のアニールは分子内の反応なので優先的に進む可能性が高い。しかしより望ましい反応条件を与えるためにTmを考慮することには意義がある。同様の条件は、リバースプライマーの設計においても考慮すべきであることは言うまでもない。このような関係とすることにより、確率的に理想的な反応条件を達成することができる。融解温度(Tm)は、他の条件が一定であればアニールする相補鎖の長さと塩基対結合を構成する塩基の組み合わせによって理論的に算出することができる。したがって当業者は、本明細書の開示に基づいて望ましい条件を容易に導くことができる。
　【００４０】更にアウタープライマーのアニールのタイミングを調整するために、コンティギュアス  スタッキング(contiguous stacking)と呼ばれる現象を応用することもできる。コンティギュアス  スタッキングとは、単独ではアニールすることができないオリゴヌクレオチドが２本鎖部分に隣接することによってアニールが可能となる現象である(Chiara Borghesi-Nicoletti et.al. Bio Techniques 12, 474-477(1992)。つまり、アウタープライマーをＦ２ｃ（Ｘ２ｃ）に隣接させ、単独ではアニールできないように設計しておくのである。こうすれば、Ｆ２ｃ（Ｘ２ｃ）がアニールしたときに初めてアウタープライマーのアニールが可能となるので、必然的にＦ２ｃ（Ｘ２ｃ）のアニールが優先されることになる。この原理に基づいて、一連の反応にプライマーとして必要なオリゴヌクレオチドの塩基配列を設定した例が実施例に記載されている。なお、この工程は加温による変性や、DNAヘリカーゼによって達成することもできる。
　【００４１】Ｆ２ｃ（Ｘ２ｃ）を持つ鋳型核酸がRNAの場合には、異なる方法により図５−(A)の状態を実現することもできる。たとえば、このRNA鎖を分解してしまえば、Ｒ１は塩基対結合が可能な状態となる。すなわち、Ｆ２をRNAのＦ２ｃにアニールさせ、逆転写酵素によってDNAとして相補鎖合成を行う。次いで鋳型となったRNAをアルカリ変性やDNA/RNA２本鎖のRNAに作用するリボヌクレアーゼによる酵素処理によって分解すれば、Ｆ２から合成したDNAは１本鎖となる。DNA/RNA２本鎖のRNAを選択的に分解する酵素には、RNaseHや、一部の逆転写酵素が備えているリボヌクレアーゼ活性を利用することができる。こうして塩基対結合を可能としたＲ１ｃにリバースプライマーをアニールさせることができる。したがってＲ１ｃを塩基結合可能な状態とするためのアウタープライマーが不要となる。
　【００４２】あるいは逆転写酵素が備えている鎖置換活性を利用して、先に述べたアウタープライマーによる鎖置換を行うこともできる。この場合は逆転写酵素のみで反応系を構成することができる。すなわち、RNAを鋳型として、そのＦ２ｃにアニールするＦ２からの相補鎖合成、更にその３′側に位置するＦ３ｃにアニールするアウタープライマーＦ３を合成起点とする相補鎖合成と置換とが、逆転写酵素で可能となる。逆転写酵素がDNAを鋳型とする相補鎖合成反応を行うものであれば、置換された相補鎖を鋳型としてそのＲ１ｃにアニールするＲ１を合成起点とする相補鎖合成、そして３′側に位置するＲ３ｃにアニールするＲ３を合成起点とする相補鎖合成と置換反応をも含めてすべての相補鎖合成反応が逆転写酵素によって進行する。あるいは、与えられた反応条件の下で逆転写酵素にDNA/DNA鎖の置換活性が期待できないときには、先に述べた鎖置換活性を持ったDNAポリメラーゼを組み合わせて用いても良い。以上のように、RNAを鋳型として第１の１本鎖核酸を得るという態様は、本発明における望ましい態様を構成する。逆に、鎖置換活性を有し、逆転写酵素活性を併せ持つBca DNA ポリメラーゼのようなDNAポリメラーゼを利用しても、同様にRNAからの第１の１本鎖核酸の合成のみならず、以降のDNAを鋳型とする反応も同一の酵素によって行うことができる。
　【００４３】さて、以上のような反応系は前記リバースプライマーとして特定の構造を持つものを利用することによって、本発明に固有の様々なバリエーションをもたらす。もっとも効果的なバリエーションについて以下に述べる。すなわち、本発明のもっとも有利な態様においては、前記リバースプライマーとして、〔５〕に述べたような構成からなるオリゴヌクレオチドを用いるのである。〔５〕のオリゴヌクレオチドとは、すなわちＦ２をプライマーとして合成される相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃをＸ２ｃとし、Ｒ１ｃをＸ１ｃとするオリゴヌクレオチドである。このようなリバースプライマーの利用により、ループの形成とこのループ部分からの相補鎖合成と置換という一連の反応が、センス鎖とアンチセンス鎖（フォーワード側とリバース側）の両方で起きるようになる。その結果、本発明による１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法の合成効率が飛躍的に向上すると共に、一連の反応を等温で実施可能とするものである。以下に、この態様をまとめた図１−図３に基づき、具体的に説明する。
　【００４４】以下の態様においては、本発明に基づくオリゴヌクレオチドとして２種類を用意する。これを説明のためにＦＡとＲＡと名づける。ＦＡとＲＡを構成する領域は、以下のとおりである。
　【００４５】ここで、Ｆ２は鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃに相補的な塩基配列である。またＲ２はＦ２をプライマーとして合成される相補鎖に含まれる任意の領域Ｒ２ｃに相補的な塩基配列である。Ｆ１ｃとＲ１ｃはそれぞれ、Ｆ２ｃおよびＲ２ｃのそれぞれ下流に位置する任意の塩基配列である。ここでＦ２−Ｒ２間の距離は任意であって良い。相補鎖合成を行うDNAポリメラーゼの合成能力にも依存するが、好適な条件では1kbp程度の長さであっても十分に合成が可能である。より具体的には、Bst DNAポリメラーゼを用いた場合、F2/R2c間で800bp、望ましくは500bp以下の長さであれば確実に合成される。温度サイクルを伴うPCRでは、温度変化ストレスによる酵素活性の低下が長い塩基配列の合成効率を下げるとされている。本発明における望ましい態様では、核酸増幅工程における温度サイクルが不要となるので、長い塩基配列であっても合成、ならびに増幅を確実に達成することができる。
　【００４６】まず鋳型となる核酸に対してＦＡのＦ２をアニールさせ、これを合成起点として相補鎖合成を行う。以下、図１の(4)にいたるまでは先に説明した本発明の基本的な態様（図５）と同様の反応工程となっている。図１の(2)でＦ３としてアニールしている配列は、先に説明したアウタープライマーである。このプライマーを合成起点として鎖置換型の相補鎖合成を行うDNAポリメラーゼで行うことにより、ＦＡから合成した相補鎖は置換され、塩基対結合が可能な状態となる。
　【００４７】(4)でＲ２ｃが塩基対結合が可能な状態となったところで、リバースプライマーとしてのＲＡがＲ２ｃ／Ｒ２の組み合わせでアニールする。これを合成起点とする相補鎖合成は、ＦＡの５′側末端であるＦ１ｃに至る部分まで行われる。この相補鎖合成反応に続いて、やはり置換用のアウタープライマーＲ３がアニールし、鎖置換を伴って相補鎖合成を行うことにより、ＲＡを合成起点として合成された相補鎖が置換される。このとき置換される相補鎖は、ＲＡを５′側に持ちＦＡに相補的な配列が３′末端に位置する。
　【００４８】さて、こうして置換された１本鎖核酸の３′側には、同一鎖上のＦ１ｃに相補的な配列Ｆ１が存在する。Ｆ１は、同一分子内に並ぶＦ１ｃに速やかにアニールし、相補鎖合成が始まる。３′末端（Ｆ１）が同一鎖上のＦ１ｃにアニールするときに、Ｆ２ｃを含むループが形成されている。このループ部分は塩基対結合が可能な状態で維持されていることは、図２-(7)からも明らかである。Ｆ２ｃに相補的な塩基配列を持つ本発明のオリゴヌクレオチドＦＡは、このループ部分にアニールして相補鎖合成の起点となる(7)。ループ部分からの相補鎖合成は、先に開始したＦ１からの相補鎖合成の反応生成物を置換しながら進む。その結果、自身を鋳型として合成された相補鎖は、再び３′末端において塩基対結合が可能な状態となる。この３′末端は、同一鎖上のＲ１ｃにアニールしうる領域Ｒ１を３′末端に備えており、やはり同一分子内の速やかな反応により両者は優先的にアニールする。こうして、先に説明したＦＡを鋳型として合成された３′末端からの反応と同様の反応が、この領域でも進行する。結果として、本発明による１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸は次々と相補鎖合成と置換とを継続し、その３′末端Ｒ１を起点とする伸長を続けることになる。３′末端Ｒ１の同一鎖へのアニールによって形成されるループには常にＲ２ｃが含まれることから、以降の反応で３′末端のループ部分にアニールするのは常にＲ２を備えたオリゴヌクレオチド（すなわちＲＡ）となる。
　【００４９】一方、自分自身を鋳型として伸長を継続する１本鎖の核酸に対して、そのループ部分にアニールするオリゴヌクレオチドを合成起点として相補鎖合成される核酸に注目すると、ここでも本発明による１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成が進行している。すなわち、ループ部分からの相補鎖合成は、たとえば図２−(7)においては、ＲＡに達した時点で完了する。そして、この核酸の合成によって置換された核酸が相補鎖合成を開始（図３−(8)）すると、やがてその反応はかつて合成起点であったループ部分に達して再び置換が始まる。こうしてループ部分から合成を開始した核酸も置換され、その結果同一鎖上にアニールすることができる３′末端Ｒ１を得る（図３−(10)）。この３′末端Ｒ１は同一鎖のＲ１ｃにアニールして相補鎖合成を開始する。さて、この反応のＦとＲを読みかえれば、図２−(7)で起きている反応と同じである。したがって図３−(10)に示す構造は、自身の伸長と新たな核酸の生成を継続する新しい核酸として機能することができる。
　【００５０】なお図３−(10)に示す核酸から開始する核酸の合成反応は、ここまで述べてきたものとは逆に常に３′末端Ｆ１を合成起点とする伸長となる。すなわち本発明においては、１つの核酸の伸長に伴って、これとは別に伸長を開始する新たな核酸を供給しつづける反応が進行する。更に鎖が伸長するのに従い、末端のみならず、同一鎖上に複数のループ形成配列がもたらされる。これらのループ形成配列は、鎖置換合成反応により塩基対形成可能な状態となると、オリゴヌクレオチドがアニールし、新たな核酸の生成反応の基点となる。末端のみならず鎖の途中からの合成反応も組み合わされることにより、さらに効率のよい増幅反応が達成されるのである。以上のようにリバースプライマーとして本発明に基づくオリゴヌクレオチドＲＡを組み合わせることによって、伸長とそれに伴う新たな核酸の生成が起きる。更に本発明においては、この新たに生成した核酸自身が伸長し、それに付随する更に新たな核酸の生成をもたらす。一連の反応は、理論的には永久に継続し、きわめて効率的な核酸の増幅を達成することができる。しかも本発明の反応は、等温条件のもとで行うことができる。
　【００５１】このとき蓄積する反応生成物は、Ｆ１−Ｒ１間の塩基配列とその相補配列が交互に連結された構造を持つ。ただし繰り返し単位となっている配列の両端には、Ｆ２−Ｆ１（Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ）、またはＲ２−Ｒ１（Ｒ２ｃ−Ｒ１ｃ）の塩基配列で構成される領域が連続している。たとえば図３−(9)では、５′側から（Ｒ２−Ｆ２ｃ）−（Ｆ１−Ｒ２ｃ）−（Ｒ１−Ｆ１ｃ）−（Ｆ２−Ｒ２ｃ）という順序で連結された状態となる。これは、本発明に基づく増幅反応が、オリゴヌクレオチドを合成起点としてＦ２（またはＲ２）から開始し、続いて自身の３′末端を合成起点とするＦ１（またはＲ１）からの相補鎖合成反応によって伸長するという原理のもとに進行しているためである。」
　
　　「【００５４】したがって、PCRのような温度サイクルは必要無い。なおここでいう安定な塩基対結合とは、反応系に存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が相補鎖合成の起点を与えうる状態を意味する。安定な塩基対結合をもたらす望ましい条件は、たとえば融解温度(Tm)以下に設定することである。一般に融解温度(Tm)は、互いに相補的な塩基配列を持つ核酸の50%が塩基対結合した状態となる温度とされている。融解温度(Tm)以下に設定することは本発明の必須の条件ではないが、高度な合成効率を達成するためには考慮すべき反応条件の一つである。鋳型とすべき核酸が２本鎖である場合には、少なくともオリゴヌクレオチドがアニールする領域を塩基対結合が可能な状態とする必要がある。そのためには一般に加熱変性が行われるが、これは反応開始前の前処理として１度だけ行えば良い。」
　
　　「【００６７】本発明による核酸の合成方法を支えているのは、鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するDNAポリメラーゼである。上記反応中には、必ずしも鎖置換型のポリメラーゼを要しない反応ステップも含まれてはいる。しかし、構成試薬の単純化、そして経済性の点で、１種類のDNAポリメラーゼを利用するのが有利である。この種のDNAポリメラーゼには、以下のようなものが知られている。また、これらの酵素の各種変異体についても、それが配列依存型の相補鎖合成活性と鎖置換活性を有する限り、本発明に利用することができる。ここで言う変異体とは、酵素の必要とする触媒活性をもたらす構造のみを取り出したもの、あるいはアミノ酸の変異等によって触媒活性、安定性、あるいは耐熱性を改変したもの等を示すことができる。
Bst DNAポリメラーゼ
Bca(exo-)DNAポリメラーゼ
DNA ポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント
Vent DNAポリメラーゼ
Vent(Exo-)DNAポリメラーゼ（Vent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）
DeepVent DNAポリメラーゼ
DeepVent(Exo-)DNAポリメラーゼ（DeepVent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）
Φ29ファージDNAポリメラーゼ
MS-2ファージDNAポリメラーゼ
Z-Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造）
KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡績）
【００６８】これらの酵素の中でもBst DNAポリメラーゼやBca(exo-)DNAポリメラーゼは、ある程度の耐熱性を持ち、触媒活性も高いことから特に望ましい酵素である。本発明の反応は、望ましい態様においては等温で実施することができるが、融解温度(Tm)の調整などのために必ずしも酵素の安定性にふさわしい温度条件を利用できるとは限らない。したがって、酵素が耐熱性であることは望ましい条件の一つである。また、等温反応が可能とは言え、最初の鋳型となる核酸の提供のためにも加熱変性は行われる可能性があり、その点においても耐熱性酵素の利用はアッセイプロトコールの選択の幅を広げる。」
 　 
　　「【００７１】本発明による核酸の合成方法、あるいは増幅方法に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキットとして供給することができる。具体的には、本発明のために、相補鎖合成のプライマーとして、あるいは置換用のアウタープライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、相補鎖合成の基質となるdNTP、鎖置換型の相補鎖合成を行うDNAポリメラーゼ、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、更に必要に応じて合成反応生成物の検出のために必要な試薬類で構成されるキットが提供される。特に、本発明の望ましい態様においては、反応途中で試薬の添加が不要なことから、１回の反応に必要な試薬を反応容器に分注した状態で供給することにより、サンプルの添加のみで反応を開始できる状態とすることができる。発光シグナルや蛍光シグナルを利用して、反応生成物の検出を反応容器のままで行えるようなシステムとすれば、反応後の容器の開封を全面的に廃止することができる。・・・」
　
 　「【００７４】本発明の望ましい態様によれば、1本の核酸鎖上に塩基対結合が可能な多数のループがもたらされる。このことは、核酸１分子に多数のプローブがハイブリダイズ可能なことを意味しており、感度の高い検出を可能とする。また感度のみならず、たとえば凝集反応のような特殊な反応原理に基づく核酸の検出方法を可能とするものでもある。」 
 　 
 　「【００７８】【実施例】〔実施例１〕 M13mp18内の領域の増幅 
 M13mp18を鋳型として、本発明による１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法を試みた。実験に使用したプライマーは、M13FA、M13RA、M13F3、そしてM13R3の４種類である。M13F3とM13R3は、それぞれM13FAとM13RAを合成起点として得られた第１の核酸を置換するためのアウタープライマーである。・・・ 
 【００７９】・・・ 
 【００８０】このようなプライマーによって、M13mp18の領域F1cからR1cにいたる領域とその相補的な塩基配列とが、F2cを含むループ形成配列を挟んで１本鎖上に交互に連結した核酸が合成される。これらのプライマーによる本発明による核酸の合成方法のための反応液組成を以下に示す。 
 【００８１】 
 反応液組成（２５μL中） 
 20mM Tris-HCl pH8.8 
 10mM KCl 
 10mM (NH4)2SO4 
 6mM MgSO4 
 0.1% Triton X-100 
 5% ジメチルスルホキシド(DMSO) 
 0.4mM dNTP 
 プライマー： 
 800nM M13FA／配列番号：１ 
 800nM M13RA／配列番号：２ 
 200nM M13F3／配列番号：３ 
 200nM M13R3／配列番号：４ 
 ターゲット：M13mp18 dsDNA ／配列番号：５ 
 反応：上記反応液を９５℃で５分間加熱し、ターゲットを変性させて１本鎖とした。反応液を氷水上に移し、Bst DNA ポリメラーゼ(NEW ENGLAND BioLabs)を４U 添加し、６５℃で１時間反応させた。反応後、８０℃１０分間で反応を停止し再び氷水上に移した。 
 反応の確認：上記反応液の５μL に１μLのloading bufferを添加し、２％アガロースゲル（0.5% TBE）を使って、１時間、80mVで電気泳動した。分子サイズマーカーとして、XIV(100bp ladder、 Boehringer Mannheim製)を使用した。泳動後のゲルをSYBR Green I (Molecular Probes、Inc.)で染色して核酸を確認した。結果は図８に示すとおりである。各レーンは次のサンプルに対応している。 
 1. XIV size marker 
 2. 1fmol M13mp18 dsDNA 
 3. targetなし 
 【００８２】レーン３では未反応のプライマーが染色されている以外にバンドは確認されなかった。レーン２はターゲットが存在する場合、低サイズのバンドのラダーと高サイズでのスメアな染色、およびゲル内でほとんど泳動されていないバンドとして生成物が確認された。低サイズのバンドのうち、290bp、450bp付近のバンドは、それぞれ本発明の合成反応により予想される産物である、配列番号：１１および配列番号：１２が２本鎖となったもの（図２−(7)および図２−(10)が２本鎖となったものに相当）および配列番号：１３（図３−(9)にある長い１本鎖に相当）とサイズが一致することから、反応が予想されるとおりに進行していることが確認された。高サイズのスメアなパターン、および泳動されていないバンドは、本反応が基本的に連続的な反応であることから、反応産物が一定のサイズにはならないこと、そして部分的な１本鎖、あるいは２本鎖の複合体を形成した複雑な構造をともなっているため、結果としてこのような泳動結果を与えるものと考えられた。」 
 　 
 　「【０１１０】・・・すなわち、本発明に基づくオリゴヌクレオチドを鋳型鎖とその相補鎖に対して適用することによって、１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸が連続して合成されるようになる。この反応は、原理的には合成に必要な出発材料が枯渇するまで続き、その間にループ部分から合成を開始した新たな核酸を生成し続ける。こうして、ループにアニールしたオリゴヌクレオチドからの伸長が、長い１本鎖核酸（すなわち、複数組の相補的な塩基配列が連結したもの）の伸長のための３′-OHを供給する鎖置換を行う。一方、長い１本鎖の３′-OHは自身を鋳型とする相補鎖合成反応を行うことによって自身の伸長を達成すると同時に、ループから合成開始した新たな相補鎖の置換を行う。このような増幅反応工程が、高い特異性を維持しながら等温条件下で進行する。」 　 
 「
図１
図２
図３
」
　「
図５
図６
 」 
 　 
３．無効理由２（特許法第２９条の２違反）について
（１）先願明細書の記載について
　平成１０年６月２４日が優先権主張日であり、平成１２年２月８日に出願公開された特願平１１−１７９０５６号の願書に最初に添付された明細書及び図面である先願明細書（甲８）には、以下の事項が記載されている。
　「【請求項１２】特定の核酸配列を非直線的に増幅するためのプロセスであって、以下の工程：該特定の核酸配列、該特定の核酸配列ついての第１の初期プライマーまたは核酸構築物であって、該第１の初期プライマーまたは核酸構築物が、以下の２つのセグメント：（Ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性の第１の伸長をし得る、セグメント、および、（Ｂ）第２のセグメントであって、（ｉ）該第１のセグメントに実質的に非同一であり、そして（ｉｉ）該特定の核酸配列の第２の部分に実質的に同一であり、（ｉｉｉ）該第２のセグメントの相補的配列に結合し得、そして（ｉｖ）第２のプライマー伸長が生成されて第１のプライマー伸長を置換するように、均衡または限定サイクリング条件下で、続く第２のプライマーまたは核酸構築物の第１のセグメントの、該特定の核酸配列の該第１の部分への結合を提供し得る、セグメント、を含む；ならびに、該特定の核酸配列の相補体に対する続く初期プライマーまたは核酸構築物であって、該続く初期プライマーまたは該核酸構築物が、以下の２つのセグメント、（Ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性の第１の伸長をし得る、セグメント、および、（Ｂ）第２のセグメントであって、（ｉ）該第１のセグメントに実質的に非同一であり、（ｉｉ）該特定の核酸配列の第２の部分に実質的に同一であり、（ｉｉｉ）該第２のセグメントの相補的配列に結合し得、そして（ｉｖ）第２のプライマー伸長が生成され、そして第１のプライマー伸長を置換するように、均衡または限定サイクリング条件下で、続くプライマーの第１のセグメントの、該特定の核酸配列の該第１の部分への結合を提供し得る、セグメント、を含む：ならびに基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素；を提供する工程：ならびに、均衡または限定サイクリング条件下で、該基質、緩衝液、またはテンプレート依存性重合化酵素の存在下で、該特定の核酸配列および該新規プライマーまたは核酸構築物をインキュベートし；それにより、該特定の核酸配列を非線形に増幅する、工程、を包含する、プロセス。」 
 　 
 　「【００１３】【発明が解決しようとする課題】本発明は、核酸増幅、核酸配列決定、および重要な特徴（例えば、低減した熱力学的安定性）を有する独特の核酸の生成に有用かつ応用可能である新規のプロセスを提供することを目的とする。」 
　
　「【００７４】本発明はまた、特定の核酸配列を非直線的に増幅するプロセスを提供する。このプロセスにおいて、増幅されることが求められている目的の特定の核酸配列、第１初期プライマーまたは目的の特定の核酸配列のための核酸構築物、後続の初期プライマーまたは目的の特定の核酸配列の相補体に対する核酸構築物、ならびに基質、緩衝液、およびテンプレート依存性ポリマー化酵素が提供される。第１初期プライマーまたは核酸構築物は、２つのセグメントを含む。第１セグメント（Ａ）は独特であり、（ｉ）特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能であると特徴づけられる。第２セグメントもまた独特であり、以下の４つの特徴で特徴づけられる。第１に、それは、（ｉ）第１セグメントと実質的に同一でない。第２に、それは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分と実質的に同一である。第３に、第２セグメントは、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得る。第４に、第２セグメントは、（ｉｖ）均衡または限定サイクル条件下で、第２プライマーの第１セグメントまたは核酸構築物の、特定の核酸配列の第１部分への続く結合を提供し得る。この方法において、第１プライマー伸長を置換するために、第２プライマー伸長を生成する。後続の初期プライマーまたはこの特定の核酸配列の相補体に対する核酸構築物はまた、２つのセグメントを含む。第１セグメント（Ａ）は、（ｉ）特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能であると特徴づけられる。第２セグメント（Ｂ）は、以下の４つの特徴で独特に特徴づけられる。第１に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉ）第１セグメントと実質的に同一でない。第２に、それは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分と実質的に同一である。第３に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得る。第４に、それは、（ｉｖ）均衡または限定サイクル条件下で、後続のプライマーの第１セグメントの、特定の核酸配列の第１部分への後続の結合を提供し得る。このような条件下およびこの方法において、第１プライマー伸長を置換する第２プライマー伸長が生成される。このプロセスを行うために、特定の核酸配列および新規のプライマーまたは核酸構築物が、基質、緩衝液、およびテンプレート依存性ポリマー化酵素の存在下で、均衡または限定サイクル条件下で、インキュベートされる；それにより、目的の特定の核酸配列が非直線的に増幅される。」
 　 
 　「【００９２】本発明の特定の局面において、新規のプライマーおよび核酸構築物が開示され、これらは、新規のプライマーまたは核酸構築物の少なくとも１つのセグメントが、適切な条件下で二次構造形成し得るという固有の特徴を有する。本発明において、二次構造の形成は、結合部位の再生を提供し得、その結果それらは、上記の外側調節因子のいずれも必要とせずに、新規のプライマーまたは核酸構築物の複数の結合および伸長のために使用され得る。」 
 　 
 　「【０１０３】（１つのステムループ形成プライマーとの直線的増幅）本発明の１つの局面において、特定の核酸配列の直線的増幅は、均衡または限定サイクリング条件下で、少なくとも２つのセグメントを有する新規の単一のプライマーまたは新規の単一の核酸構築物の使用によって行われる。・・・新規のプライマーおよび核酸構築物の第１セグメントは、標的核酸配列に存在する配列に実質的に相補的である配列を含む。新規のプライマーまたは核酸構築物の第２セグメントは、標的核酸に存在する配列に実質的に同一である配列を含む。新規の核酸構築物は、第１セグメントおよび第２セグメントの１つ以上のコピーを有し得る。新規のプライマーまたは核酸構築物のテンプレート依存性伸長は、自己ハイブリダイゼーションによって形成されるステムループ構造、ならびに新規のプライマーまたは核酸構築物を含む配列に同一または相補的でない伸長配列を有する産物を作製し得る。 
 【０１０４】この産物は、図１に例示される、連続する一連の以下の工程によって、形成され得る。新規のプライマーまたは核酸構築物のテンプレート依存性伸長は、この新規のプライマーまたは核酸構築物の第２セグメントを含む配列に相補的である伸長部分配列において生成する。これらの自己相補性領域は、テンプレートに結合しままであり得るか、または自己相補性構造を形成し得る。二次構造の形成は、テンプレートからの、伸長した新規のプライマーの第１セグメントの全てまたは一部の除去を提供し得る。このことは、別の初期プライマーが、テンプレートからの新規の第１伸長プライマーの除去の前に、テンプレート配列に結合することを可能にする。テンプレート上の第２プライマーの伸長は、テンプレートからの第１伸長プライマーの置換を導き得る。このことは、伸長プライマーの分離が、別の結合および伸長反応のためのテンプレートの使用の前に常に起こる先行技術とは対照的である。これらの手段によって、単一のテンプレートは、均衡条件下で、２つ以上の初期事象を提供し得る。さらに、この方法は、全ての温度が伸長産物およびそのテンプレートのＴｍのものを下回る、限定サイクル条件下で使用され得る。連続するプロセスにおいて、新規の第２伸長プライマーにおける二次構造の形成は、新規の第３プライマーの結合および続く伸長を提供し得る。このようにして、変性条件の非存在下において、本発明の新規のプロセスは、核酸テンプレートの単鎖からの多重プライミング、伸長、および遊離事象を提供し得る。さらに、これらの工程の全ては、均衡条件下で、同時および連続的に起こり得る。」 
 　 
 　「【０１０６】新規の伸長プライマーおよび核酸構築物の、自己相補性構造を形成する能力は、適切な条件下で実現化され得る。先行技術は、その特徴が短い相補性オリゴヌクレオチドの会合および解離が、温度、塩条件、塩基含有量、および相補配列の長さによって決定される平衡反応として生じることを示している。・・・相補性ＤＮＡの大きな方の鎖は、広範な条件にわたって容易に解離しない安定な立体配置における２本鎖分子として存在するが、それらは、鎖間結合の一時的および局在した弛緩を形成することが周知である。用語「呼吸」は、水素結合のこの局在化破壊を説明するために使用されている。パリンドローム配列を含む２本鎖ＤＮＡ分子における二次元構造を作製する「呼吸」のための経路は、Ａ．ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＴ．Ａ．Ｂａｋｅｒによって、「ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版」（１９９２）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ． ＮＹ、ＮＹ（その内容を本明細書中で参考として援用する）に記載されている。 
 【０１０７】本発明において、上記のように、線状２本鎖分子のセグメントの、鎖内ステムループ構造への転移は、プライマー開始事象を、伸長プライマーのそのテンプレートからの分離の前に起こることを可能にし得る。これらの２つの構造の間の平衡は、多数の要因に依存する。第１に、首尾良いプライマー結合のために、標的に結合する初期プライマーのセグメントは、反応に使用される温度で、安定なプライミングが可能であるように適切な長さおよび塩基組成でなければならない。第２に、初期プライマーの伸長後に自己ハイブリダイゼーションに関与するプライマーのセグメントは、適切な長さおよび塩基組成でなければならず、その結果伸長されたプライマーのテンプレートからの部分解離は、十分に安定な二次構造の形成（すなわち、ステムループ構造のステム）を可能にし得る。」
 　 
　　「【０１１２】本発明はまた、特定の核酸配列を非直線的に増幅するためのプロセスを提供する。非直線的増幅は、以下の成分または試薬を提供する最初の工程を含む：増幅されることが求められる目的の特定の核酸配列、特定の核酸配列のための第１初期プライマーまたは核酸構築物、この特定の核酸配列の相補体に対する続く初期プライマーまたは核酸構築物、ならびに適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素。記載したばかりの第１初期プライマーまたは核酸構築物は、２つのセグメントを含む。第１に、２つの規定された特徴を有する第１セグメント（Ａ）が存在する。それは、（ｉ）この特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能である。第１初期プライマーの第２セグメントは、４つの規定された特徴を有する。第１に、それは、（ｉ）第１セグメント（Ａ）と実質的に同一でない。第２に、それは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分と実質的に同一である。第２セグメントの第３の特徴は、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得るその能力である。第２セグメントの第４の特徴は、（ｉｖ）均衡または限定サイクル条件下で、第２プライマーまたは核酸構築物の第１セグメントの、特定の核酸配列の第１部分への続く結合を提供するためのその能力である。このような条件下で、第２プライマー伸長が生成されて、第１プライマー伸長を置換する。
　【０１１３】続く初期プライマーまたは核酸構築物に関して、このエレメントは２つのセグメント、第１セグメント（Ａ）および第２セグメント（Ｂ）を含む。第１セグメント（Ａ）は、（ｉ）特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そしてそれは、（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能である。４つの特徴は、第２セグメント（Ｂ）を規定する。第１に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉ）第１セグメントと実質的に同一でない。第２に、それは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分と実質的に同一である。第３に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得る。第２セグメント（Ｂ）の第４の特徴は、（ｉｖ）均衡または限定サイクル条件下で、続くプライマーの第１セグメントの、特定の核酸配列の第１部分への続く結合を提供するその能力である。このような条件下で、第２プライマー伸長が生成され、そしてそれは第１プライマー伸長を置換する。このプロセスの第２工程は、特定の核酸配列および新規のプライマーまたは核酸構築物を、適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素の存在下で、均衡または限定サイクル条件下で、インキュベートすることを含む。それにより、目的の特定の核酸配列は、非直線的に増幅される。」
　
 　「【０１３１】非直線的増幅産物は、均衡または限定条件下で、連続した一連の以下の工程によって、新規のプライマーおよび標準的なプライマーによって合成され得る。新規のプライマーは標的鎖に結合し、そして新規の単一プライマーとの直線的増幅について以前に記載されるのと、同じ一連の伸長、二次構造形成、プライマー結合部位の再生、第２結合、第２伸長、およびテンプレートからの第１伸長プライマーの分離が存在する。新規の伸長プライマーは、他方の新規のプライマーの連続する結合および伸長によって置換されるので、これらの１本鎖産物は標準的なプライマーに結合し得、そしてそれらを伸長させて、完全な２本鎖アンプリコンを作製し得る。この潜在的な一連の事象を、図２に示す。得られる２本鎖構造は一方の鎖において新規のプライマーについてのプライマー結合部位に相補的な配列と、および他方の鎖において新規のプライマーについてのプライマー結合部位に同一の配列と隣接する各鎖自己相補配列を含む。この結果として、各鎖は、アンプリコンの一方の末端で、ステムループ構造を形成し得る。次いで、１本鎖ループ構造におけるプライマー結合部位の露出は、図１において以前に示した同じプロセスによって、さらなる一連のプライマー結合および置換反応をもたらし、それにより均衡または限定サイクル条件下で、目的の配列の非直線的増幅の生成を可能にする。・・・」 
 　 
 　「【０１３３】非直線的増幅産物はまた、均衡または限定サイクル条件下で、２つの第１セグメントおよび１つの第２セグメントを含む新規の核酸構築物によって合成され得る。第１セグメントの各々は、核酸の鎖またはその相補体に相補的であり、そして第２セグメントは、第１セグメントの１つの伸長後に、二次構造を形成し得る。この構築物は、一対の相補的な潜在的ステムループ構造を有する産物を作製し得る。この産物は、連続する一連の以下の工程によって形成され得る。新規の構築物の１つの第１セグメントおよび１つの第２セグメントは、新規の単一プライマーによる直線的増幅について以前に記載されているのと同様の連続する一連の結合、伸長、二次構造形成、プライマー結合部位の再生、第２結合、第２伸長、および鎖分離工程を行い得る。さらに、この合成の産物は、一連の結合および伸長工程のためのテンプレートとして、新規のプライマーおよび標準的なプライマーでの非直線的増幅について上に記載されているような他方の第１セグメントによって使用され得る。これらの工程が作製し得る潜在的な一連の異なる形態は、図３および４に与えられる。この新規の構築物が潜在的に行い得る一連の事象は、以前に記載されたのと同じであり、そして図４に示される最終産物は、ともに結合したプライマーの２つの５′末端を有する図２の最終産物の位相的等価体である。」 
 　 
 　「【０１４４】これらの特徴によって、適切な標的分子の一方の鎖の存在は、新規の単一プライマーを非直線的増幅し得る自己複製核酸に変換し得る。本発明の新規の単一プライマーは、標的に結合し得、そして伸長のためのテンプレートとしてそれを利用する。・・・ 
 【０１４５】標的核酸の適切な鎖の存在によって直線状の新規のプライマーからこのような形態を合成するのに使用され得る一連の工程は、図９、１０、および１１に示される。新規のプライマーはテンプレートに結合し得、そして伸長して、図９の工程２の構造を形成し得る。」 
 　 
 　「【０１５６】・・・上記の鎖配置で２つの第１、第２、および第３セグメントを有する構築物の例は、図１３および図１５に与えられる。本発明のこの局面において使用される構築物は、図９、１０、および１１に例示された以前の局面に関連する。・・・それにより、図１３および１５の工程３は、単一テンプレート分子が、１つのみではなく２つの３′末端の伸長に使用されることを除いて、図９の工程２に等しい。・・・」 
 　 
 　「【０１５９】（反応の単純化および反応産物）本発明を含む全ての増幅において、反応の間にも起こり得る副反応が存在する。これらは、高分子量産物の複雑な多様性を形成し得る。それらは、所望の配列の合成の効率またはこれらの配列の検出の効率のいずれかを減少する点において有害であり得る。合成の効率の減少は、副反応が、所望の配列の合成の量を、ポリメラーゼおよび基質資源についての競合によって減少する場合に起こり得る。副反応はまた、適切な配列が合成されるが、反応のいくつかの工程に阻害的な二次構造にある場合、効率を減少し得る。このことは、プライマーの結合または伸長のいずれかを妨害する構造によって起こり得る。後者の場合において、プライムされたテンプレートを使用できないことに起因して、そして酵素が結合するが進行し得ない場合のポリメラーゼ活性の欠失にも起因して、効率が失われ得る。不適切な二次構造もまた、適切な配列の検出における問題を生じ得る。」 
 　 
 　「【０１７６】本発明はさらに、上記の種々のプロセスにおける使用のために組成物およびキットを意図しそして包含する。」 
 　 
 　「【０１７８】【実施例】（実施例１ ５３℃および６３℃でのＢｓｔポリメラーゼによるＰＣＲ産物の等温増幅） 
 （ｉ）ＨＢＶプラスミドＤＮＡのＰＣＲ増幅 
 ＨＢＶマイクロタイタープレートアッセイ・・・からのＨＢＶポジティブコントロールを、ＰＣＲによる増幅のための標的として使用した。・・・１ｕｌのＨＢＶ標的、１×ＰＥ緩衝液・・・、４ｍＭのＭｇＣｌ2、２５０ｕｍのｄＮＴＰ、６単位のアンプリサーム（Ａｍｐｌｉｔｈｅｒｍ）・・・ならびに１０ピコモルのＨＢＶオリゴプライマーＦＣおよびＲＣからなる５０ｕｌのＰＣＲ反応を実施した。 
 ＦＣ配列＝５′−ＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡ ＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧ ＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡ ＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ ＧＣＧＧＣＧＴＴＴ−３′ 
 ＲＣ配列＝５′−ＴＣＣＴＣＴＡＡＴＴ ＣＣＡＧＧＡＴＣＡＡ ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧ ＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡ ＴＧＧＴＣＣＣＧＴＡ−３′。 
 【０１７９】この実施例において、ＦＣプライマーの３′末端における
２９塩基
３０塩基
 【０１８０】（ｉｉ）ＰＣＲ産物の分析 
 増幅は、０．５ｕｇ／ｍｌの臭化エチジウムの存在下で、０．５×ＴＢＥ緩衝液を用いて流した４％Ｍｅｔａｐｈｏｒアガロースゲル・・・中の１０ｕｌのサンプルのゲル電気泳動によってアッセイした。ＵＶ照射下で、３つのバンドが出現し、それらはＤＮＡサイズマーカーによる判定で、長さがおよそ２１０、１８０、および１７０ｂｐであった。２１０ｂｐに対応するバンドは、予想された線状ＰＣＲ産物であり、そしておそらく他の２つのバンドは、同じサイズのアンプリコンに対応しており、ここで、二次構造が一方または両方のいずれかの末端上で形成され、それによってそれらの効果的な移動度が変化している。 
 【０１８１】（ｉｉｉ）ＰＣＲ産物の等温増幅 
 上記のＰＣＲ産物の種々の希釈物５ｕｌは、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液・・・、２００ｕＭのｄＮＴＰ、２０ピコモルの正方向および逆方向プライマー、８単位のＢｓｔポリメラーゼ・・・からなる１００ｕｌの反応混合物中で使用された。正方向プライマーはＦＣまたはＬＦＣのどちらかであり、逆方向プライマーはＲＣまたはＬＲＣのどちらかであった。ＦＣおよびＲＣプライマーの配列は上記に示した。ＬＦＣおよびＬＲＣプライマーは、ＦＣおよびＲＣプライマーだけの第１のセグメントに対応する配列を有している。そのような配列は以下のとおりである： 
 ＬＦＣ＝５′−ＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ ＧＣＧＧＣＧＴＴＴ−３′ 
 ＬＲＣ＝５′−ＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡ ＴＧＧＴＣＣＣＧＴＡ−３′。 
 【０１８２】インキュベーションは、３０分、１８０分、もしくは終夜のインキュベーションであった。反応温度は５３℃もしくは６３℃のどちらかであった。３０分反応したものは２％アガロースゲルを用いてゲル電気泳動で分析した；１８０分反応したものは４％Ｍｅｔａｐｈｏｒアガロースを用いて分析した。 
 【０１８３】この分析結果を図１７に示す。３０分インキュベーションの後に取り出したサンプルの最初の組の中で、ＰＣＲ産物の１０-2希釈物だけが５３℃でいくらかの合成を示すが、６３℃からの反応物は、１０-2、１０-3および１０-4希釈物で合成を示している。これらのデータは、合成量は加えた標的ＤＮＡの量に依存するということを示している。１８０分の合成の後に取り出されたサンプルの組では、実質的により多くの合成が行われている。これらの反応の生成物は、分離したパターンを形成する一連のバンドである。これは、通常ＰＣＲで見られる単一の分離したバンド、またはＰＣＲ増幅の後でＬＣおよびＲＣプライマーを用いて以前に見られた２つもしくは３つのバンドと対照をなしている。この複数のバンドは、おそらく、アンプリコンをプライマーおよびテンプレートとして機能させる二次構造の存在に起因し得るか、またはストランドスイッチングの徴候であり得る。５３℃で３時間インキュベーションした後、標的が少しもないようなコントロールでさえ、実質的な合成の証拠を示している。しかし、標的テンプレートを有するすべての５３℃の反応物に見られる、単一の標的依存性パターンが存在し、そして標的なしのコントロールに存在するパターンは実質的に異なることが留意され得る。これはおそらく標的が合成を開始した経路が異なっていることに起因する。６３℃でインキュベーションしたものは、全てのテンプレート希釈物で実質的な合成を示し、そして同じパターンが５３℃の反応によって生成されることを証明する。しかし、本実施例においては、６３℃では、標的非依存性増幅の証拠はない。１０-5の希釈でさえ実質的な量の合成があるということは、この系が実質的な増幅をし得ることを示している。終夜のインキュベーションもまたゲルによって分析され、そして３時間インキュベーションと同じパターンおよび同じ量を示した（データ表示なし）。」 
 　 
 　「【０１８４】（実施例２ ＨＢＶ配列の等温増幅の時間経過／感度） 
 （ｉ）増幅 
 Ｅｃｏ Ｒ１であらかじめ消化されたＨＢＶプラスミドＤＮＡを、等温増幅のテンプレートとして使用した。ＤＮＡ混合物は、 ＦＣおよびＲＣプライマーがそれぞれ４０ｐＭ、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液・・・および４×１０6、４×１０4、または０ ＨＢＶ分子を含む１００ｕｌからなった。これらはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ・・・製のサーモサイクラーモデル４８０を使用して５分間で９４℃まで熱した。次いで装置を６３℃で４８０分セットした。ブロックを６３℃に調節した後、酵素混合物２５ｕｌを含有する個々のチューブをサーモサイクラーブロックの中に置いた。それぞれの酵素混合物チューブは、４単位のＢｓｔポリメラーゼ・・・、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液・・・、および４００ｕＭのｄＮＴＰを含有した。ＤＮＡ混合物、および酵素混合物を６３℃に調節した後、２５ｕｌのサンプルをそれぞれのＤＮＡ混合物から採取し、合計容量がそれぞれ５０ｕｌになるようにそれぞれの酵素混合物チューブに加えた。ＤＮＡ混合物のそれぞれのチューブ用として、３件のサンプルを採取した。それぞれのＤＮＡ濃度用についてひとつのサンプルを、２、４、および８時間後に６３℃のブロックの外に取り出した。 
 【０１８５】（ｉｉ）増幅のアッセイ 
 標的依存性増幅と標的非依存性増幅とを区別するために、マイクロタイタープレートアッセイを標的特異的配列の存在を検出するために使用した。このアッセイ用に使用される試薬および説明書は、ＬＣおよびＲＣプライマーによって作られたアンプリコンに特異的なプレートおよびシグナルプローブを置換して、ＥＮＺＯ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ・・・製のＨＢＶマイクロタイタープレートアッセイから得られた。 
 【０１８６】（ｉｉｉ）マイクロタイタープレートの調製 
 ・・・これらのプレートに使用した捕獲オリゴヌクレオチドの配列は、ＦＣおよびＲＣプライマーの間にあるＨＢＶの領域に由来し、そして以下のとおり記載される： 
 ５′−ＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴ ＴＡＴＴＧＧＴＴＣＴ ＴＣＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＧＴＡＴ−３′。 
 【０１８７】・・・ 
 【０１８８】（ｉｖ）プローブの調製 
 増幅のためのプライマーとして使用されるＲＣオリゴヌクレオチドは、プレートアッセイのためのシグナルプローブとしても使用される。ＲＣオリゴヌクレオチド１００ｕＭのＴ−テーリングは、ＥＮＺＯ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ・・・からの末端テーリングキットの使用によって達成された。テーリングしたＲＣオリゴヌクレオチド２６ｕｌを、シグナルプローブ緩衝液・・・１２．８ｍｌと混合した。 
 【０１８９】ｅ）反応物からのサンプルを用いたマイクロタイタープレートアッセイの結果を以下に示す： 
 ２時間 ４時間 ８時間 
 １×１０6標的 ０．４１３ １．４９１ １．４１９ 
 １×１０4標的 ０．２０３ ０．０９８ １．０１７ 
 標的なし ０．０８６ ０．０８５ ０．０６３ 
 上記に見られるように、生成物の量は、初期の標的の量および反応が進行する時間量の両方と関係があった。標的がないときに形成された任意の生成物から発生したシグナルもなかった。またこのアッセイでは１．４以上の値は飽和値であり、そして生成物の量は、はるかに大きくなり得る。・・・」 
 　 
　　「
図１
図２
図３
」
　　「
図１３
 」
　　「
図１４
」 
 　 
（２）「二次構造」の意義について
　先願明細書にいう「二次構造」とは、前記【０１０４】及び図１の記載によれば、ステムループ構造と同義であり、図１マル３〜マル５、図２マル１及びマル３〜マル５並びに図３マル１、マル３及びマル４において、領域Ｃ−Ｂ′−Ｃ′、領域Ｃ−Ｂ−Ｃ′、領域Ｅ−Ｆ′−Ｅ′及び領域Ｅ−Ｆ−Ｅ′により形成されるループ部分を意味するものと認められる。
　
（３） 等温増幅に使用されたＦＣプライマー及びＲＣプライマーの構成について
　先願明細書の【０１７９】に記載のＦＣプライマー及びＲＣプライマーの塩基配列は、いずれも【０１７８】に記載されており、それによれば、これらの塩基数は、ＦＣプライマーが４９塩基であり、ＲＣプライマーが５０塩基であると認められる一方、【０１７９】には、ＦＣプライマーの第１セグメントが２９塩基で、第２セグメントが３０塩基である旨及びＲＣプライマーの第１セグメントが３０塩基で、第２セグメントが３０塩基である旨が記載されており、両者の塩基数の記載は、一致していない。むしろ、先願明細書の【０１８１】には、ＦＣプライマー及びＲＣプライマーの第１セグメントに対応する配列として、塩基数が１９のＬＦＣプライマー及び塩基数が２０のＬＲＣプライマーの塩基配列が記載されていることに照らすと、ＦＣプライマーの第１セグメントの塩基数は１９であり、ＲＣプライマーの第１セグメントの塩基数は２０であると認められる。したがって、【０１８１】の下線部分のうち、「２９」は「１９」の、「３０」は「２０」の誤記であり、ＰＣＲ産物の等温増幅に使用されたＦＣプライマーは、３′末端側の１９塩基対（第１セグメント）及びこれに連続する３０塩基対（第２セグメント）からなる一方、ＲＣプライマーは、３′末端側の２０塩基対（第１セグメント）及びこれに連続する３０塩基対（第２セグメント）からなるものと認められる。
　
　また、ここで、第１セグメントは、【０１７９】に記載のとおり、テンプレート（鋳型）としてＨＢＶ標的ＤＮＡ（ＨＢＶプラスミドＤＮＡ）を使用して伸長し得るものとして設計されているから、これと相補的な塩基配列と塩基対結合（アニール）を生じた場合、ＤＮＡポリメラーゼが触媒となって、ＦＣプライマー及びＲＣプライマーは、いずれも第１セグメントに隣接する３′末端を合成起点として相補鎖合成反応を開始することになる。他方、第２セグメントは、【０１７９】に記載のとおり、ＦＣプライマー又はＲＣプライマーの上記相補鎖合成反応によって合成された最初の３０塩基に相補的に設計されているから、第１セグメント及び第２セグメントは、第２セグメント及びその相補体により与えられる３０塩基対のステム並びに第１セグメント（ＦＣプライマーの場合１９塩基、ＲＣプライマーの場合２０塩基）からなるループを発生させ、これにより生成物に１個のステムループ構造（二次構造）を生じさせることになる旨が記載されているといえる。
　さらに、上記ＦＣプライマーは、【０１８１】に記載のとおり、正方向プライマーであるから、その「第１セグメント」は、図１マル１の太い矢印に記載された領域Ｂ′に対応する一方、上記ＲＣプライマーは、【０１８１】に記載のとおり、逆方向プライマーであるから、その「第１セグメント」は、図３マル１の下側の矢印に記載された領域Ｆに対応するものと認められる。また、これらのプライマーの各「第２セグメント」は、同じく領域Ｃ（ＦＣプライマー）及びＥ′（ＲＣプライマー）にそれぞれ対応するものであり、これらのプライマーの３′末端の相補鎖合成反応により生成するステムループ構造は、例えば、図１マル３の領域Ｃ−Ｂ′−Ｃ′（ＦＣプライマー）及び図３マル４の領域Ｅ−Ｆ−Ｅ′（ＲＣプライマー）により形成されるループ部分に対応するものと認められる。
　
（４） 先願明細書に記載の増幅反応について
ア． 先願明細書の記載について
　先願明細書には、【０１８１】【０１８２】に記載のとおり、ＨＢＶプラスミドＤＮＡの２１１ｂｐのＰＣＲ産物を、直前のＰＣＲで使用したＦＣプライマー及びＲＣプライマーと同じプライマー及びＢｓｔポリメラーゼを使用して、５３℃及び６３℃で３０分、１８０分又は終夜のインキュベーションを実施した旨の記載があるが、このインキュベーションについて「ＰＣＲ産物の等温増幅」という標題が付されているから、当業者は、先願明細書から、当該インキュベーションにより当該ＰＣＲ産物を鋳型とする等温増幅が行われた旨を記載していることを読み取ることができる。
　次に、上記インキュベーションによる等温増幅の結果について、先願明細書には、「これらの反応の生成物は、分離したパターンを形成する一連のバンドである。これは、通常ＰＣＲでみられる単一の分離したバンド、またはＰＣＲ増幅の後でＬＣ及びＲＣプライマーを用いて以前にみられた２つもしくは３つのバンドと対照をなしている。」との記載がある（【０１８３】）ところ、「ＰＣＲ産物の等温増幅」という標題の実験の結果が、それまでにみられた「バンドと対照をなしている。」と記載されていることに照らすと、当業者は、上記記載部分から、ＰＣＲ産物の等温増幅により、これに先立つＰＣＲ増幅（【０１７８】【０１７９】）及びこれによる産物の分析結果（【０１８０】）とは異なる独自の等温増幅反応が生じていることを読み取ることができるものといえる。
　そして、上記独自の等温増幅反応が発生した理由について、先願明細書には、「この複数のバンドは、おそらく、アンプリコンをプライマーおよびテンプレートとして機能させる二次構造の存在に起因し得る」との記載がある（【０１８３】）ところ、ここにいう「アンプリコン」とは、ＰＣＲ産物にほかならず、「二次構造」とは、前記（２）に説示のとおり、ステムループ構造を意味するものであるから、ここにいう「二次構造」（ステムループ構造）を有する「アンプリコン」（ＰＣＲ産物）とは、前記【０１８０】の記載に図１ないし３を参照すると、ＰＣＲ産物である(1)２１０ｂｐに対応するバンドで示される線状産物、(2)１８０ｂｐに対応するバンドで示される、一方の末端上で二次構造（ステムループ構造）が形成された産物、(3)１７０ｂｐに対応するバンドで示される両方の末端上で二次構造（ステムループ構造）が形成された産物（図３マル４。ダンベル型中間体）のうち、(2)及び(3)（ダンベル型中間体）を意味するものといえる。したがって、これらのＰＣＲ産物のうちダンベル型中間体に着目すると、上記記載部分は、「ダンベル型中間体をプライマー及びテンプレート（鋳型）として機能させるステムループ構造の存在」、すなわちステムループ構造が存在することによって、ＰＣＲ産物であるダンベル型中間体それ自体が、相補鎖合成により核酸を合成するプライマーであると同時にその鋳型になるという増幅反応を発生させており、これが、上記独自の等温増幅反応の理由であると説明しているものと理解することができる。
　
イ． 先願明細書の記載から理解される増幅反応の作用機序について
　先願明細書に記載の等温増幅反応の鋳型とされたＰＣＲ産物には、前記アに説示のとおり、両方の末端上で二次構造（ステムループ構造）が形成された産物（図３マル４。ダンベル型中間体）が含まれている。
　他方、上記等温増幅の際に使用されたＦＣプライマー及びＲＣプライマーは、前記（３）に説示のとおり、第１セグメント（領域Ｂ′又はＦ）が鋳型の相補的な塩基配列（領域Ｂ又はＦ′）と塩基対結合（アニール）を発生させ、第２セグメント（領域Ｃ又はＥ′）が３′末端の相補鎖合成反応によって合成された最初の３０塩基（領域Ｃ′又はＥ）に相補的になるように設計されているものである。
　さらに、Ｂｓｔポリメラーゼが鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するＤＮＡポリメラーゼであることや、ＤＮＡポリメラーゼの機能によって、部分的に２本鎖となった鋳型核酸の３′末端が鋳型核酸の１本鎖となっている部分に対して相補鎖合成を行うということは、本件優先権主張日当時、当業者の技術常識であったものと認められる。
　したがって、鋳型となる核酸としてダンベル型中間体に着目した場合、先願明細書の「アンプリコンをプライマーおよびテンプレートとして機能させる二次構造の存在に起因し得る」との前記記載、すなわちステムループ構造が存在することによって、ＰＣＲ産物であるダンベル型中間体それ自体が、相補鎖合成により核酸を合成するプライマーであると同時にその鋳型になるという増幅反応を発生させており、これが、上記独自の等温増幅反応の理由であるとの記載部分について、当業者は、上記技術常識及び先願明細書の記載から、次の増幅反応が発生していることを読み取ることが可能であるというべきである。
(ア) Ｂｓｔポリメラーゼは、鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するＤＮＡポリメラーゼであるから、鋳型であるダンベル型中間体を構成する鎖の各３′末端（例えば、図３マル４の下側の鎖の領域Ｃ′）を合成起点として、ダンベル型中間体を構成する２本の鎖の塩基対結合部分を置換しながら相補鎖合成を行うことになる。
(イ) 次に、ＦＣプライマー及びＲＣプライマーは、いずれも鋳型と塩基対結合（アニール）を発生させる第１セグメントを備えているところ、ダンベル型中間体の下側の鎖を鋳型とする場合を例にとると、ＦＣプライマーの第１セグメント（領域Ｂ′）は、鋳型となる鎖のうち、塩基対結合を生じていないループ部分（図３マル４の下側の鎖の領域Ｂ）と塩基対結合（アニール）を発生させる。そして、前記のとおり、Ｂｓｔポリメラーゼは、鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するから、ＦＣプライマーの３′末端は、ダンベル型中間体のステム部分及びそれに引き続く塩基対結合を置換しながら相補鎖合成を開始する。
(ウ) ダンベル型中間体の下側の鎖の３′末端は、塩基対結合の置換により相補鎖を合成して当該鎖の５′側末端まで到達するが、次いで、ＦＣプライマーの３′末端は、当該相補鎖を５′末端に至るまで置換して相補鎖合成を行うから、ダンベル型中間体の下側の鎖の３′末端が合成してきた塩基配列は、１本鎖となり、その結果、当該鎖は、３′末端に引き続く部分に新たなステムループ構造（３′末端側から、領域Ｅ−Ｆ′−Ｅ′となる。）を形成した上で、再び自らを鋳型として３′末端から塩基対結合の置換による相補鎖合成を開始する。他方、ＲＣプライマーは、上記新たなステムループ構造のループ部分（領域Ｆ′）に対してアニールできる領域（領域Ｆ）を第１セグメントに備えているから、当該ループ部分に塩基対結合（アニール）を発生させ、先にＦＣプライマーが行ったのと同じ塩基対結合の置換による相補鎖合成を行うことになる。こうして、ダンベル型中間体は、そのうち１本の鎖の３′末端が、Ｂｓｔポリメラーゼの触媒により塩基対結合の置換による相補鎖合成を行うことに加えて、ＦＣプライマー及びＲＣプライマーが相次いでアニールを繰り返すことで、それ自身がプライマーであると同時にテンプレート（鋳型）である増幅反応を繰り返す結果、１本鎖上に鋳型核酸の塩基配列が交互に連結された核酸が得られることになる。
　
（５） 先願明細書に記載の発明について
　以上のとおり、先願明細書には、ＰＣＲ増幅に引き続くインキュベーションにより「等温増幅」が発生した旨が記載されており、それが先行するＰＣＲ増幅とは異なる独自の増幅反応であって、その理由について「おそらく、アンプリコンをプライマーおよびテンプレートとして機能させる二次構造の存在に起因し得る」との記載があるが、当該記載は、ステムループ構造が存在することによって、ＰＣＲ産物（ダンベル型中間体を含む。）それ自体が、ＦＣプライマー及びＲＣプライマーと相俟って、塩基対結合の置換による相補鎖合成を繰り返し、核酸を合成するプライマーであると同時にその鋳型になるという増幅反応を発生させているとの趣旨に理解することができる。そして、ここでみられる塩基対結合の置換による相補鎖合成反応は、３′末端からの自己伸長反応と呼んで差し支えない。
　このように、当業者は、先願明細書の記載及び本件優先権主張日当時の技術常識に基づき、上記増幅反応の作用機序を、前記（４）イに説示したものとして理解することが可能であったものと認められるから、先願明細書には、次の発明が記載されているものと認められる。
　
先願発明：３′末端側から領域Ｂ′−Ｃという構造を有するＦＣプライマー、３′末端側から領域Ｆ−Ｅ′という構造を有するＲＣプライマー及びＢｓｔポリメラーゼを使用する等温増幅反応であって、
工程１：両方の末端にステムループ構造を有する核酸であって、３′末端側から順に領域Ｃ′−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｅ′を有する核酸（ダンベル型中間体の下側の鎖）を鋳型として、
工程２：その３′末端からの自己伸長反応により、塩基対結合を可能とする領域Ｂを備えるループを有し、その余の部分が互いに相補的な配列で塩基対結合した核酸を得、
工程３：このループにＦＣプライマーをアニールさせ、自己伸長反応を行うと同時に、上記工程２の自己伸長反応によって合成された相補的な塩基配列を置換し、その結果、上記工程２の自己伸長反応によって合成された鎖の３′末端に、塩基対結合を可能とする領域Ｆ′を備える新たなステムループ構造が形成され、
工程４：上記工程３で新たに形成された３′末端のステムループ構造からの自己伸長反応により、塩基対結合を可能とする領域Ｆ′を備えるループを有し、その余の部分が互いに相補的な配列で塩基対結合した核酸を得ると同時に、上記工程３のＦＣプライマーの自己伸長反応により合成された相補的な塩基配列を置換し、３′末端から順に、領域Ｅ−Ｆ′−Ｅ′−Ｄ′−Ｃ′−Ｂ′−Ｃである核酸を得、
工程５：上記工程４の塩基対結合を可能とする領域Ｆ′を備えるループを有する核酸に、ＲＣプライマーをアニールさせ、伸長反応を行うと同時に、上記工程４の自己伸長反応によって合成された相補的な塩基配列を置換し、その結果、上記工程４の自己伸長反応によって合成された鎖の３′末端に、塩基対結合を可能とする領域Ｆを備える新たなステムループ構造が形成され、
工程６：これら一連の、ステムループ構造の３′末端からの自己伸長反応と、その際に形成されるループへのプライマー結合に伴う自己伸長反応を繰り返すことによって、鋳型の領域Ｄとその相補的配列を有する領域Ｄ′が交互に１本鎖の核酸上に延伸する方法
　
（６）本件発明１と先願発明との対比について
ア．本件発明１及び先願発明の方法発明における目的物は、いずれも鋳型の有する領域と当該領域に相補的な配列を有する領域が交互に１本鎖の核酸上に延伸した核酸である点で一致する。
　
イ．次に、本件発明１の酵素は、「鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼ」であるが、前記１．（１）【００６７】に記載のとおり、当該ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔポリメラーゼを含む一方、先願発明の酵素は、Ｂｓｔポリメラーゼであるから、両者の酵素は、一致する。
　
ウ．また、先願発明の鋳型核酸は、３′末端側から順に領域Ｃ′−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｅ′を有するものである。そして、本件発明１の領域Ｆ１は、先願発明の領域Ｃ′に、本件発明１の領域Ｆ２ｃは、先願発明の領域Ｂに、本件発明１の領域Ｆ１ｃは、先願発明の領域Ｃに、それぞれ相当するので、先願発明の鋳型核酸は、本件発明１の「同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールすることができる領域Ｆ１を３′末端に備え、この領域Ｆ１がＦ１ｃにアニールすることによって、塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成することができる核酸」に相当する。
　しかしながら、本件発明１の核酸は、
「以下の工程i)〜iv)によって第２の核酸として提供される、
i) 前記Ｆ２ｃに相補的な塩基配列Ｆ２を持つ領域の５′側に前記Ｆ１ｃと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチドの領域Ｆ２を鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃにアニールさせる工程、 
ii) オリゴヌクレオチドのＦ２を合成起点とし、鋳型に相補的な塩基配列を持つ第１の核酸を合成する工程、
iii) 前記鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃの更に３′側の任意の領域Ｆ３ｃにアニールするオリゴヌクレオチドＦ３を合成起点とする鎖置換相補鎖合成を行うことにより、工程ii)で合成された第１の核酸の任意の領域を塩基対結合が可能な状態とする工程、 
iv) 工程iii)における第１の核酸の塩基対結合を可能とした領域に相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドをアニールさせ、それを合成起点として第２の核酸を合成し、前記合成起点より更に３′側の任意の領域Ｒ３ｃにアニールするオリゴヌクレオチドＲ３を合成起点とした鎖置換相補鎖合成を行うことにより、その３′末端のＦ１を塩基対結合が可能な状態とする工程」
ことが特定されているのに対し、先願発明には、そのような特定はなされていない。
　
エ．そして、本件発明１のプライマーは、「領域Ｆ２ｃに相補的な配列からなるＦ２を３′末端に含むオリゴヌクレオチド」であるが、この領域Ｆ２は、本件発明１の鋳型核酸の３′末端から２番目の領域Ｆ２ｃに相補的な領域である。他方、先願発明のＦＣプライマーの３′末端は、領域Ｂ′であるところ、この領域は、先願発明の鋳型核酸の３′末端から２番目の領域Ｂに相補的な領域である。そして、本件発明１では、プライマー中の領域Ｆ２の５′末端側の領域が特定されていないので、先願発明のＦＣプライマーは、本件発明１のプライマーと一致する。また、本件発明１の鋳型核酸は、３′末端側の領域Ｆ１と領域Ｆ１ｃがアニールすることにより、塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループが形成されるところ、先願発明においても、３′末端側の領域Ｃ′とＣが結合して、領域Ｂを有するループが形成されるものである点で両者は一致する。
　
オ． 本件発明１の工程ｂ）は、工程ａ）で与えられた鋳型核酸の３′末端からの自己伸長反応であり、この工程は、先願発明の工程２と一致する。
　
カ．本件発明１の工程ｃ）は、鋳型核酸のループにオリゴヌクレオチド（プライマー）がアニールし、その３′末端を合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼにより相補鎖合成を行うものであり、その際、工程ｂ）で合成された相補鎖を置換しながら相補鎖合成が進行し、その結果、工程ｂ）で合成された相補鎖の３′末端が塩基対結合可能な状態となるという工程であるところ、本件発明１と先願発明とでは、前記イ及びエに説示のとおり、使用するポリメラーゼ及びプライマーが一致するほか、本件発明１の工程ｃ）のうち、プライマーのアニールと鎖置換型の相補鎖合成及び工程ｂ）で合成された相補鎖の３′末端を塩基対結合可能な状態とする点は、いずれも先願発明の工程３に包含される。
　
キ．本件発明１の工程ｄ）は、工程ｃ）の置換により塩基対結合可能な状態となった鋳型と相補的な１本鎖の任意の領域と相補的な塩基配列を有するポリオヌクレオチドが当該領域にアニールし、そこを合成起点とした相補鎖合成が生じるものであるところ、本件発明１では、鋳型核酸が５′末端側から順に領域Ｒ１ｃ−Ｒ２−Ｒ１を備え、あるいは上記相補的な塩基配列を有するポリオヌクレオチドが自己伸長によって鋳型核酸から合成されることは、いずれも排除されていない。そして、工程ｄ）における上記「任意の領域」を鋳型核酸の領域Ｒ１に相補的な領域Ｒ１ｃとするならば、上記ポリオヌクレオチドは、３′末端側に領域Ｒ１を備え、これが当該領域Ｒ１ｃとアニールし、そこを合成起点とした相補鎖合成が生じ、その際、工程ｃ）でアニールしたプライマーの伸長反応で合成された相補鎖が置換されるが、この工程は、先願発明の工程４に包含される。
　
ク．以上のとおりであるから、本件発明１と先願発明の一致点及び相違点は以下のとおりである。
　
一致点：以下の工程ａ）〜ｄ）を含む１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法。
ａ）同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールすることができる領域Ｆ１を３′末端に備え、この領域Ｆ１がＦ１ｃにアニールすることによって、塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成することができる核酸を与える工程、
ｂ）Ｆ１ｃにアニールしたＦ１の３′末端を合成起点として相補鎖合成を行う工程、
ｃ）領域Ｆ２ｃに相補的な配列からなるＦ２を３′末端に含むオリゴヌクレオチドをアニールさせ、これを合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って、工程ｂ）で合成された相補鎖を置換する工程、 
ｄ）工程ｃ）で置換され塩基対結合が可能となった相補鎖における任意の領域に相補的な配列を３′末端に含むポリヌクレオチドをアニールさせ、その３′末端を合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って、工程ｃ）で合成された相補鎖を置換する工程。
　
相違点：本件発明１では、工程ａ）の核酸は、
「以下の工程i)〜iv)によって第２の核酸として提供される、
i) 前記Ｆ２ｃに相補的な塩基配列Ｆ２を持つ領域の５′側に前記Ｆ１ｃと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチドの領域Ｆ２を鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃにアニールさせる工程、
ii) オリゴヌクレオチドのＦ２を合成起点とし、鋳型に相補的な塩基配列を持つ第１の核酸を合成する工程、
iii) 前記鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃの更に３′側の任意の領域Ｆ３ｃにアニールするオリゴヌクレオチドＦ３を合成起点とする鎖置換相補鎖合成を行うことにより、工程ii)で合成された第１の核酸の任意の領域を塩基対結合が可能な状態とする工程、
iv) 工程iii)における第１の核酸の塩基対結合を可能とした領域に相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドをアニールさせ、それを合成起点として第２の核酸を合成し、前記合成起点より更に３′側の任意の領域Ｒ３ｃにアニールするオリゴヌクレオチドＲ３を合成起点とした鎖置換相補鎖合成を行うことにより、その３′末端のＦ１を塩基対結合が可能な状態とする工程」
ものであるのに対し、先願発明では、そのような特定はなされていない点。
　
ケ．相違点について
　先願発明では、工程３における、ＦＣプライマーの自己伸長反応によって合成された相補的な塩基配列の置換に当たって、本件発明１の工程iii)の「前記鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃの更に３′側の任意の領域Ｆ３ｃにアニールするオリゴヌクレオチドＦ３」に相当するプライマー（ＯＰ）及び工程iv)の「前記合成起点より更に３′側の任意の領域Ｒ３ｃにアニールするオリゴヌクレオチドＲ３」に相当するプライマー（ＯＰ）を使用していない。
　したがって、本件発明１は、先願明細書に記載された発明ではない。
　
コ．本件発明２について
　本件発明２は、本件発明１に更に他の構成要件を付加したものであるところ、本件発明１は、先願明細書に記載された発明ではないから、本件発明２も、先願明細書に記載された発明とはいえない。
　
サ．請求人の主張について
　 請求人は、先願明細書の図１３及び１４に記載のプライマーが本件発明１のＦ３及びＲ３の各オリゴヌクレオチド（ＯＰ）に該当する旨を主張する。
　そこで検討すると、先願明細書の図１３マル１には、３′末端側からから領域ｃ’ｄ’ｂａｃ’を有するプライマーと、３′末端側から領域ｇ’ｈ’ｆｅｇ’を有するプライマーとが、両者の５′末端同士で結合した２つの３′末端を有するプライマーが記載されており、図１３マル２には、このプライマーが、５′末端側から領域ａ〜ｈを有する鋳型核酸にアニールした図が記載されている。そして、図１３マル３では、相補鎖合成が進行した図が示され、図１３マル４では、伸長した鎖が鋳型から分離された図が示されている。しかしながら、分離された鎖を示す図１３マル４には、領域ｆ’ｅ’しか示されておらず、それに引き続くべき領域ｄ′以下が記載されていないことに照らすと、これらの図において、上記プライマーのうち領域ｇ’ｈ’からの伸長は、これらの領域が合成された後に鋳型の領域ｅに対する相補鎖（領域ｅ′）が合成された時点で停止しており、当該プライマーからの別の伸長鎖を鋳型から分離させているものとは認められない。したがって、図１３には、先の工程で合成された相補鎖を鋳型から分離するという機能を有するＯＰが記載されているものとは認められない。図１４についても、相補鎖合成が途中で停止しており、図１３の場合と同様に、ＯＰが記載されているということはできない。
　したがって、請求人の上記主張を採用することはできない。
　
（７）小括
　以上のとおり、請求人の主張に理由があるとはいえず、本件発明１及び２についての特許は、特許法第２９条の２の規定に違反してされたものとはいえない。
　
４．無効理由１（特許法第２９条第２項違反）について
（１）甲１の記載について
　甲１（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.266, No.21, pp.14031-14038, 1991）には、以下の事項が記載されている。 
 「観察に基づき、スナップバック（snap-back）ＤＮＡ合成における増幅に対し、図８のモデルを提案する。 
 　工程１　Ｔ４ホロ酵素が、スナップバック機構により、直鎖ｓｓＤＮＡ鋳型を複製する。この反応の生成物は、長い２本鎖のヘアピンであり、それは、出発物質である直鎖ｓｓＤＮＡに対して相同である。 
 　工程２　ｕｖｓＸタンパク質が、工程１における直鎖ｓｓＤＮＡ分子と２本鎖ヘアピン生成物との間の結合を触媒する。ｕｖｓＸタンパク質（６）によって触媒されるＤＮＡ分岐点移動の、５′から３′への方向性（ｓｓＤＮＡへの侵入に関する）により、前記ｓｓＤＮＡの３′末端は、Ｄ-ループ構造に組み込まれ、そこで、ＤＮＡ複製を開始できる状態を保つ（脚注６：ヘアピン構造領域におけるループ部分の２重鎖は、直鎖ｓｓDNAと非相同的であり、このため、３′末端の対合が困難になっている）。 
 　工程３および４　このように開始されるＤＮＡ合成により、Ｄ-ループ中間体を、ダイマー長の直鎖２本鎖に分解し、前記直鎖２本鎖は複製開始ＤＮＡ合成における鋳型としてもよい（工程５）。 
 　工程５及び６　ｕｖｓＸタンパク質が直鎖ｓｓＤＮＡ分子（出発物質）と２本鎖の二量体中間体の相同性タンパク質との間のシナプシスを触媒し、ＤＮＡ合成を開始する。ＤＮＡバブル移動機構（１３）によるこの鋳型の複製によって、内部相補的であり、急速に復元するダイマー長の直鎖ｓｓＤＮＡ分子が生じる。 
 　工程７　この生成物の復元によって、工程１と同一のヘアピン構造が形成される。そして、これらの生成物は新たなＤＮＡ合成に用いてもよく、それによって、これらの生成物は増幅される。」（１４０３７頁右欄２８行〜５４行） 
 　 
 「図８　Ｔ４ｕｖｓＸタンパク質の複製開始活性に基づく、前記タンパク質によるスナップバック（snap-back）ＤＮＡ合成の増幅モデル。ｕｖｓＸが触媒する、直線ｓｓＤＮＡプライマー／テンプレートと、スナップバック複製のｄｓＤＮＡ産物との再結合が、スナップバック産物と同じ配列を持つ２倍の長さの二重鎖を産生するＤＮＡ合成を開始する。このテンプレートにおける再結合で開始されたＤＮＡ合成は、スナップバック産物の産生を増幅させる。詳細は、ディスカッションを参照。」（１４０３７頁左欄１行〜８行） 
 　　 
 「図８　 
 」 
 　 
 「最後に、snap-backのＤＮＡ合成反応は、比較的シンプルな、試験管内システムにおいて、高い精度のＤＮＡポリメラーゼを用いて実施されるＤＮＡの等温増幅プロセスの一例である。」（１４０３８頁右欄１３行〜１６行）
　
（２）甲２の記載について 
　甲２（“DNA REPLICATION SECOND EDITION”, ARTHUR KORNBERG,TANIA A BAKR, W.H.FREEMAN AND COMPANY,1992 pp.700-704, pp.713-716, pp.492-493 pp.504)には、以下の事項が記載されている。 
 　「一般に、自律的ウイルスは、mRNAの相補鎖をカプシドに包んでいる。一方、AAVは、(+)鎖と(−)鎖のどちらかを同じ頻度で別々の粒子としてパッケージしている。このウイルス粒子からの放出時に、相補鎖は直鎖状二重鎖を形成するようにアニールできる。パルボウイルスのDNAの鎖端は、自己アニーリングによるさまざまなヘアピン構造を形成できるように反転して末端繰り返し配列を持っている（図19-6）。」（７０１頁１行〜６行）
 　 
 　「図19-6　AAVの提案モデル。A、A’、B、B’などの文字は、末端繰り返し配列を示している。(1) ウイルス鎖。鎖の形成しうる四つの末端構造のうち、三つは大括弧内に示されている。(2)　ヘアピンループは、相補鎖合成を開始し、二本鎖複製型をつくる。（右の直線分画におけるBとCの間の距離は、左の折り返し型の距離と同じであるはずである。）ニック（矢印）は、親鎖の３′端の反対側に起こる。(3)　ニックとニックからの鎖伸長反応の結果、ヘアピンの転移がおこる。(4) 末端ヘアピンの再構成により、どちらかの末端にひとしく３′プライマー末端が作られる。(5) その３′プライマー末端からの(DNAが)合成されることで、1ユニット分の長さのゲノムが置換される。(6)　1ラウンドの置換合成反応が完了することにより、置換された一本鎖が（（この鎖は）ステップ1記載にあるように、相補鎖合成のスタート準備ができている）、そして、ヘアピン転移反応と鎖置換反応の他のラウンドが起こりうる二本鎖分子（（この鎖は）ステップ2の初めに記載）が、結果として生じる。（Berns KI, Hauswirth WW (1982) ウイルスDNAの構成と複製（カプランA編）。CRC出版、クリーブランド、25ページ）」（７０１頁図19-6の説明） 
 　 
 　「末端配列は、ヘアピンのプライミングとヘアピンループの転移のための基礎となる（図19-6）42。AAVの各々の鎖における四つの可能な末端配列の組み合わせは同じ割合で見つかっており、このことは、末端配列の特定の方向性には、バイアスがないということを示している。反転は、ウイルス粒子のAAV鎖の３′末端に起こらないので、複雑な複製も出るが推測できる。 
 　親と子孫の双方の細胞内複製中間体43における末期のクロス結合分子は、５′端配列を複製するための末端ヘアピン鎖からの（複製）開始とヘアピンループの転移メカニズムに一致している。双方の鎖の合成が、５′から３′方向の鎖置換機構による継続的伸長反応によって起こる。感染したウイルスの一本鎖からの親の複製型（DNA分子）の初期合成におけるように、置換された一本鎖は、カプシドに包まれるか、または、相補鎖の合成によって、複製型にもどされ、リサイクルされる（図19-6）。」（７０２頁２１行〜３４行）
 　 
 　「図19-6 
 」 
 　 
 　「図19-12　牛痘ウイルスDNAの複製モデル。一方の端のループ領域で開始する複製は、ヘアピンループ機構により、そこから直線状のゲノムが遊離してサイクルが回るところのコンカテマーをつくるために一方向的に進行する（左の経路）。両端から始まる複製は、直線状ゲノムを直接産生する（右の経路）[After Moss B (1990) in Virology (Fields BN, Knipe DM, eds.). Raven Press, New York, p2079]」（７１６頁図19-12の説明） 
 　 
 　「適切な時間に、いくつかの場所で鋳型環が開くことが完全な二本鎖を作るのに必要とされる。おそらく、パリンドローム配列が折り返して、最終的に環状ウイルスの子孫DNA分子を作るヘアピンを作る。ニッキングと結合酵素は、ゲノムを完成させるための分子内結合の原因となるものかもしれない。」（７１６頁１行〜５行） 
 　 
（３）甲３の記載について
　甲３（ＷＯ　９６／０１３２７）には、以下の事項が記載されている。
 　「本発明は、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸標的配列の増幅方法であって、標的配列と特異的にハイブリダイズできる部分（３′）、及び少なくとも１つの逆方向反復配列を含む部分（５′）からなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を利用することを特徴とする方法に関する。」（４頁２８行〜３５行） 
 　 
 　「逆方向反復配列（またはパリンドローム配列ともいう）により、ヘアピン形状の二本鎖構造を形成するための自己プライミングが可能になる。」（５頁２９行〜３２行） 
 　 
 　「実際、熱撹拌の効果により、ＤＮＡの二本鎖の末端のパリンドローム配列は、２つの形成の間の動的平衡にある：すなわち、通常の二本鎖⇔二本ヘアピンである（図5h及び5i）。 
 　ＤＮＡポリメラーゼは、二本ピンに折り曲げられた鎖の一方の末端３′に結合され、かつ折り曲げられた末端をプライマーとして用いて、鎖の一方の複製を開始することができる（図5j）。ＤＮＡポリメラーゼは、そうすることで、相補的鎖を移動させ、かつ２つの鎖は温度上昇を行うことを必要とせず、このようにして分離される（図5j）。このステップから、鎖の一方は、新規なプライマーP2とハイブリダイズして、新規な複製サイクルを開始することができる（図5f）。他方は、各サイクルで、その長さは理論上二倍になるサイズの増大を受ける（図5k、5l、5m）。 
 　反応の間中一定に維持される反応温度は、プライマーのハイブリダイゼーション、広げた形状及びヘアピン状に折り曲げられた形状の間の逆方向反復配列の平衡、及び他方で選択したポリメラーゼによる鎖の伸長を可能にするように選択される。一般的に、この温度は、45-75℃であり、好ましくは50-65℃である。」（７頁３１行〜８頁２０行） 
 　 
 「図５　 
」 
　
（４）甲４の記載について
　甲４（ＷＯ　９７／０４１３１）には、以下の事項が記載されている。 
 　「他の好ましい態様において、図17に示す通り、ヘアピンDNAは、標的ポリヌクレオチド上でのプライマー（プローブ）の伸長によって得られる。AからＤの領域の一本鎖の標的ポリヌクレオチドを、パネルＡに示す。前記プローブの３′末端は、前記標的ポリヌクレオチドの領域Ａに相補的な配列である。前記プローブの５′末端は、前記標的ポリヌクレオチドの領域Ｂと同一の配列である。前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖の場合、それを、一本鎖の標的を産生するために変性させる。その後、前記プローブを前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる（図17、パネルＡ）。そして、少なくとも前記標的ポリヌクレオチドの領域Ｄの５′末端に伸長させた状態で、前記プローブを鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼに接触させる（図17、パネルＢ）。変性は、図Ｃ（注：「パネルＣ」の誤記と思われる。）の伸長生成物を産生する鎖分離を引き起こす。この伸長生成物は、５′ 末端が牧杖形状をしており、プライマーＤを用いて増幅できる。前述のとおり、前記プライマーＤは、図17、パネルＤに示す生成物を産生するために、伸長生成領域Ｄ’に相補的である。」（２３頁５行〜２３行） 
 　 
 　「図１７　 
 」 
　
（５）甲５の記載について
　甲５（特開平７−２８９２９８号公報）には、以下の事項が記載されている。 
 　「【目的】 好熱性ポリメラーゼおよび好熱性制限エンドヌクレアーゼの両方が同一の反応混合物中で効率的に機能する等温鎖置換増幅法（好熱ＳＤＡ）の温度条件および反応条件を提供する。 
 【構成】 本発明は、通常のＳＤＡより広い温度範囲（３７−７０℃）で実施しうる好熱ＳＤＡを提供する。好熱ＳＤＡに好ましい温度範囲は５０−７０℃である。特定の好熱性制限エンドヌクレアーゼがＳＤＡに要求される半修飾された制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位をニックし、次いでその部位から解離しうることが見出された。さらに特定の好熱性ポリメラーゼはそのニックから伸長させ、一方では下流の鎖を置換しうることが見出された。これらの知見から、好熱ＳＤＡは通常のＳＤＡ酵素系につき従来可能であったものより高い温度で実施しうるため、向上した特異性および効率、減少した非特異的バックグラウンド増幅、ならびに潜在的に向上した増幅生成物収率を有する。さらに、変性温度で安定な酵素を用いる場合、二本鎖標的の初期の熱変性後に別個の工程で酵素を添加する必要性が除かれる。」 
 　 
 　「【請求項５】 標的配列を含む二本鎖フラグメントが下記を含む方法により生成する、請求項４に記載の方法： 
 ａ）標的配列を含む核酸フラグメントに第１および第２増幅プライマーを結合させ、第１および第２増幅プライマーは核酸フラグメントの対向鎖上の標的配列の３′側に結合し； 
 ｂ）フラグメント上の第１および第２増幅プライマーを伸長させ、これにより、第１増幅プライマーの第１伸長生成物および第２増幅プライマーの第２伸長生成物を産生させ； 
 ｃ）第１および第２バンパープライマーを伸長させることにより第１および第２伸長生成物を置換し、そして； 
 ｄ）置換された第１および第２伸長生成物に対する相補鎖を誘導デオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下に合成し、これによりＳＤＡによって増幅しうる標的配列を含む二本鎖フラグメントが生成する。」 
 　 
 　「【０００９】バンパー（ｂｕｍｐｅｒ）プライマーまたはエクスターナル（ｅｘｔｅｒｎａｌ）プライマーは、増幅プライマーより上流で標的配列にアニールし、従ってバンパープライマーの伸長によって下流の増幅プライマーおよびその伸長生成物が置換される。バンパープライマーの伸長は、増幅プライマーの伸長生成物を置換するための１方法であるが、加熱も適している。」 
 　 
 　「【００１４】ＳＤＡによって増幅するための標的は、標的配列を切断しないエンドヌクレアーゼで、より大型核酸をフラグメント化することによって調製しうる。しかし一般に、ＳＤＡ反応におけるニッキングのために選ばれる制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を有する標的核酸を、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら（１９９２．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，前掲、および米国特許第５、２７０、１８４号明細書（本明細書に参考として引用する）の記載に従って製造することが好ましい。簡単に述べると、標的配列が二本鎖である場合、４つのプライマーがそれにハイブリダイズする。２つのプライマー（Ｓ1およびＳ2）はＳＤＡ増幅プライマーであり、２つのプライマー（Ｂ1およびＢ2）はエクスターナルまたはバンパープライマーである。Ｓ1およびＳ2は、標的配列をフランキングする二本鎖核酸の対向鎖に結合する。Ｂ1およびＢ2は、それぞれＳ1およびＳ2の５′側（すなわち上流）の標的配列に結合する。次いでエキソヌクレアーゼ欠如ポリメラーゼを用いて、３種類のデオキシヌクレオシドトリホスフェートおよび少なくとも１種類の修飾デオキシヌクレオシドトリホスフェート（たとえば２′−デオキシアデノシン−５′−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）“ｄＡＴＰαＳ”）の存在下に、４つのプライマーすべてを同時に伸長させる。これによりＳ1およびＳ2の伸長生成物は、Ｂ1およびＢ2の伸長によって元の標的配列鋳型から置換される。置換された増幅プライマーの一本鎖伸長生成物は対向する増幅およびバンパープライマーの結合の標的となり（たとえばＳ1の伸長生成物はＳ2およびＢ2に結合する）、次の伸長および置換のサイクルの結果、それぞれの末端に半修飾された制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を備えた２つの二本鎖核酸フラグメントが得られる。これらはＳＤＡによる増幅に適した基質である。ＳＤＡの場合と同様に、標的生成反応の各段階は同時かつ連続的に起こり、ＳＤＡにおける制限酵素によるニッキングに必要な認識／開裂部位を末端に備えた標的配列が生成する。ＳＤＡ反応のすべての成分が既に標的生成反応に存在するので、標的配列は自動的に生成し、かつ連続的にＳＤＡサイクルに入り、そして増幅される。」 
 　 
 「図１ 
 」 
　
（６）本件発明１と甲１に記載された発明の対比
　前記（１）の甲１の記載によれば、甲１には、「Ｔ４ホロ酵素がスナップバック機構により中央にヘアピン構造を有する長い２本鎖ＤＮＡを合成し、これに当該２本鎖ＤＮＡに相同な直鎖ｓｓＤＮＡがｕｖｓＸリコンビナーゼの作用によって侵入し、当該直鎖ｓｓＤＮＡがプライマーとして機能して鎖置換型の相補鎖合成を行うことによる、ｕｖｓＸリコンビナーゼの組換え反応に依存する、Ｔ４ホロ酵素を用いたスナップバックＤＮＡ増幅機構」が記載されている（以下、「引用発明１」という。）。
　
　本件発明１と引用発明１を対比すると、両者は、鋳型となる核酸から新たな核酸を合成する方法である点で一致する。
　請求人は、引用発明１におけるヘアピン構造が本件発明１のループ部分に相当し、同じく直鎖ｓｓＤＮＡがプライマー（オリゴヌクレオチド）に相当する旨主張する。
　しかしながら、本件発明１の工程ａ）で提供される第２の核酸のループ部分（ループ形成配列）は、３′末端に領域Ｆ１−Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃの塩基配列で構成されるものであり、当該領域は、本件発明１における工程ｃ）以下を実現させる上で不可欠の構成である。そして、本件発明１では、工程ａ）の第２の核酸は、ＴＰ及びＯＰを用いた「工程i)〜iv)」によって提供されるものであることが特定されている。
　一方、引用発明１のヘアピン構造は、本件発明１のループ形成配列における領域Ｆ２ｃに相当する部分を欠くものであるし、引用発明１のヘアピン構造は、Ｔ４ホロ酵素のスナップバック機構により生ずるものであって、ＴＰ及びＯＰを用いて提供されるものではない。
　したがって、引用発明１におけるヘアピン構造は、本件発明１のループ部分に相当するということはできない。
　そうすると、本件発明１が「同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールすることができる領域Ｆ１を３′末端に備え、この領域Ｆ１がＦ１ｃにアニールすることによって、塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成することができる核酸を与える工程（工程ａ））」を有するものであって、当該核酸は、
「以下の工程i)〜iv)によって第２の核酸として提供される
i) 前記Ｆ２ｃに相補的な塩基配列Ｆ２を持つ領域の５′側に前記Ｆ１ｃと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチドの領域Ｆ２を鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃにアニールさせる工程、 
ii) オリゴヌクレオチドのＦ２を合成起点とし、鋳型に相補的な塩基配列を持つ第１の核酸を合成する工程、
iii) 前記鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃの更に３′側の任意の領域Ｆ３ｃにアニールするオリゴヌクレオチドＦ３を合成起点とする鎖置換相補鎖合成を行うことにより、工程ii)で合成された第１の核酸の任意の領域を塩基対結合が可能な状態とする工程、 
iv) 工程iii)における第１の核酸の塩基対結合を可能とした領域に相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドをアニールさせ、それを合成起点として第２の核酸を合成し、前記合成起点より更に３′側の任意の領域Ｒ３ｃにアニールするオリゴヌクレオチドＲ３を合成起点とした鎖置換相補鎖合成を行うことにより、その３′末端のＦ１を塩基対結合が可能な状態とする工程」
ものであるとの構成を有するのに対し、引用発明１にはこのような点は特定されていないことは、両者の実質的な相違点である（以下、「相違点Ａ」という。）。
　また、本件発明１においてアニールされるオリゴヌクレオチドは、３′末端側のループ内の領域Ｆ２ｃ部分に相補的な塩基配列部分（領域Ｆ２）を含むもので、当該領域Ｆ２部分が当該領域Ｆ２ｃ部分にアニールするというものであり、かつ、当該オリゴヌクレオチドの構成及びそれに基づくアニールの方法は、いずれも工程ｃ）以下を実現させる上で不可欠の構成である一方、引用発明１は、既存の２本鎖ＤＮＡに相同な直鎖ｓｓＤＮＡがｕｖｓＸリコンビナーゼの組換え反応に依存して侵入するというものであって、アニールされる直鎖ｓｓＤＮＡの構成及びアニール（侵入）の方法が、いずれも本件発明１とは相違するというほかない。
　したがって、引用発明１における直鎖ｓｓＤＮＡは、本件発明１のオリゴヌクレオチドに相当するということはできず、むしろ、本件発明１が上記のようなオリゴヌクレオチド、すなわち、「領域Ｆ２ｃに相補的な配列からなるＦ２を３′末端に含むオリゴヌクレオチドをアニールさせ（工程ｃ））」るとの構成を有するのに対し、引用発明１が「当該２本鎖ＤＮＡに相同な直鎖ｓｓＤＮＡがｕｖｓＸリコンビナーゼの作用によって侵入」するとの構成を有することは、両者の実質的な相違点である（以下、「相違点Ｂ」という。）。
　
（７）判断
ア．相違点Ａについて
　引用発明１におけるヘアピン構造は、Ｔ４ホロ酵素のスナップバック機構により生ずるものであって、本件発明１のループ形成配列における領域Ｆ２ｃに相当する部分を欠くものであるから、構成として自己完結しているものであって、甲１には、鋳型となる核酸から新たな核酸を合成するに当たって、本件発明１の相違点Ａに係る構成を採用させるに足りる示唆ないし動機付けが見当たらない。また、技術分野を同じくする他の文献にも、この点に関する示唆ないし動機付けは見当たらない。
　
イ．相違点Ｂについて
　引用発明１は、既存の２本鎖ＤＮＡに相同な直鎖ｓｓＤＮＡがｕｖｓＸリコンビナーゼの組換え反応に依存して侵入するというものであって、相補鎖の置換を開始するための方法としては、本件発明１における塩基対結合の相補性を利用したアニールと全く異なる原理に基づくものであるから、甲１には、鋳型となる核酸から新たな核酸を合成するに当たって、引用発明１の相違点Ｂに係る構成に代えて、本件発明１の相違点Ａに係る構成を前提とした本件発明１の相違点Ｂに係る構成を採用させるに足りる示唆ないし動機付けが見当たらない。また、技術分野を同じくする他の文献にも、この点に関する示唆ないし動機付けは見当たらない。
　
（８）甲２〜７について
 　甲２に記載された発明は、種々のウイルスの生体内におけるＤＮＡ複製機構を明らかにすることを課題とするものであり、例えば、アデノ随伴ウイルスの増幅機構は、図19-6に詳述されているが、３′末端と５′末端の双方にループが形成された１本鎖核酸（鋳型）において、その３′末端から自己を鋳型とする相補鎖合成が開始され、二本鎖の複製型が一旦形成され、その親鎖の３′端の反対側でニックが生じ、ニックからの伸長反応の結果、ヘアピン構造への転移が生じ、末端ヘアピンの再構成によって、どちらかの末端に３′末端が形成され、当該末端からの自己を鋳型とする相補鎖合成によって、次の新しい鋳型が提供されるというものである。 
 　ところが、３′末端側に位置するループ部分にプライマーをアニールさせることは甲２のどこにも記載されていない。 
 　甲３に記載された発明は、ヘアピン構造を形成し得るプライマーを使用し、核酸を等温増幅する方法の提供を課題とするものであり、二本鎖ＤＮＡの末端にあるパリンドローム配列は動的平衡によってヘアピン構造を形成し、折り曲げられた末端はプライマーとして機能し、自己を鋳型とする相補鎖合成を行って、核酸の伸長反応が継続的に生じるこというものである。 
 　この甲３にも、３′末端側に位置するループ部分にプライマーをアニールさせることはどこにも記載されていない。 
 　甲４に記載された発明は、単一のプライマーを用いて、ヘアピン構造を有する核酸を増幅することを課題とするものであり、その詳細は、図１７に示されるとおり、標的ポリヌクレオチドの領域Ａに相補的な配列と、標的ポリヌクレオチドの領域Ｂと同一の配列を有するプライマー（ＴＰ）を標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、３′末端からの伸長反応によって伸長生成物を生じさせ、これを熱変性によって鎖分離し、該伸長生成物が５′末端にヘアピン構造を形成した後に、ＰＣＲプライマー（Ｄ）をハイブリダイズさせ、該生成物を増幅するというものである。 
 　この甲４に記載される、標的ポリヌクレオチドの領域Ａに相補的な配列と、標的ポリヌクレオチドの領域Ｂと同一の配列を有するプライマーは、ＴＰと構造は同じではあるが、これを３′末端側に位置するループ部分にプライマーをアニールさせることはどこにも記載されていない。 
 　請求人はこの点について、図１７Ｄの核酸分子のループに、図１７ＡのＴＰがアニールして伸長可能であることは自明であり、これは、本件発明１の「１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の増幅方法」及び工程ｃ）（鎖置換を除く）に該当することを主張しているが、単一のプライマーを用いての増幅を意図している、プライマーＤを用いた増幅工程において、図１７ＡのＴＰを存在させることが何ら記載されていないのであるから、図１７ＡのＴＰがアニールして伸長可能であることは自明であるとしても、本件発明１の工程ｃ）に相当するものが記載されていることにならない。 
　甲５に記載された発明は、１対のバンパープライマー（ＯＰ）を用いて等温増幅反応を行うというものであり、３′末端側に位置するループ部分にプライマーをアニールさせることは甲５のどこにも記載されていない。
 　 
　このように、これら甲２〜５にも、甲１と同様に、３′末端側に位置するループ部分にプライマーをアニールさせること（本件発明１の工程ｃ）に相当するもの。）は記載されていない。
　また、甲６及び７にも、この点は記載されていない。　 
　したがって、甲１〜甲７に記載された発明を、どのように組合わせたとしても、本件発明１には到達できず、本件発明１は、これらの発明から当業者が容易に発明することができないというべきものである。 
　
（９）小括
　よって、本件発明１は、甲１〜甲７に記載された発明に基づき、当業者が容易に発明をすることができたものとは認められない。
　また、本件発明２は、本件発明１を引用する発明であるところ、甲１〜甲７に記載された発明に基づいて本件発明１を当業者が容易に発明をすることができなかった以上、同じく容易に発明をすることができなかったものというべきである。
　以上のとおり、本件発明１及び２についての特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものとはいえない。
　
５．無効理由３、４（特許法第３６条第６項第１号及び同条第４項違反）について
（１）実施可能要件について
ア．本件発明１及び２について
　本件明細書の前記１．（１）【００３６】〜【００３８】【００４４】〜【００４７】には、本件発明１の工程i)〜iv)によって第２の核酸として、工程ａ）の核酸を提供する方法について、具体的に記載されており、かつ、そこに記載の具体例は、いずれも一般的な技術に基づくものであるから、本件出願日当時の技術常識に照らして、当業者が実施可能であると認められる。
　次に、本件発明１の工程ｂ）、工程ｄ）のうち相補鎖合成を行うこと及び工程ii)それ自体は、ＤＮＡポリメラーゼの機能によって、部分的に２本鎖となった鋳型核酸の３′末端が鋳型核酸の１本鎖となっている部分に対して相補鎖合成を行うということであって、本件出願日当時の当該分野における技術常識にほかならない（甲２参照）。
　本件発明１の工程ｃ）のうち、既存の核酸のループ形成配列（領域Ｆ２ｃ）と相補的な塩基配列（領域Ｆ２）を有するオリゴヌクレオチドをループ部分にアニールさせることそれ自体は、ループ部分に塩基対結合を生じていない塩基配列が存在すれば発生し得ることであるし、当該工程ｄ）のうちポリヌクレオチドをアニールさせること並びに工程i)、iii)及びiv)のうちオリゴヌクレオチドをアニールさせることそれ自体も、アニールさせる部分がループ部分でないだけであるから、これらもまた、本件出願日当時の当業者の技術常識であったものと認められる。また、上記工程ｃ）及びｄ）並びにiii)及びiv)のうち、特定のＤＮＡポリメラーゼが触媒となって、他の核酸にアニールしたオリゴヌクレオチドの３′末端（プライマー）が塩基対結合の置換による相補鎖合成反応を示すことは、本件明細書でも多数の既存のＤＮＡポリメラーゼが鎖置換型ポリメラーゼとして紹介されていること（前記１．（１）【００６７】【００６８】）から、やはり本件出願日当時の当業者の技術常識であったものと認められる。
　以上に加えて、本件発明２は、本件発明１に他の構成が追加されたものであるが、これらの追加された各構成は、前記１．（１）に記載の本件明細書の記載によれば、いずれも既存ないし既知の技術に立脚するものと認められ、当該各構成を実施することが本件発明２の場合において不可能であると認めるに足りる証拠もないから、いずれも、本件明細書の記載及び本件出願日当時の技術常識に照らして当業者が実施可能であるものといえる。
　
イ．よって、本件発明１及び２は、いずれも本件明細書の記載及び本件出願日当時の技術常識に照らして当業者が実施可能なものであるといえる。
　
（２）サポート要件について
　本件明細書は、前記１．（１）【００３６】〜【００３８】【００４４】〜【００４７】に記載のとおり、本件発明１の工程i)〜iv)によって第２の核酸として、工程ａ）の核酸を提供する方法について記載した上で、本件発明１及び２について、前記１．（１）【００３９】〜【００４３】【００４８】〜【００５１】にその作用機序及び技術的思想に関する詳細な説明を記載しており、これらの記載は、いずれも当業者が本件発明の課題を解決できると認識できるものであると認められる。
　
（３）請求人の主張について
　請求人は、本件発明１では、フォワードプライマーとしてＴＰを用い、リバースプライマーとしてはＰＣＲプライマーが用いられており、２つのＴＰが使用されていないから、図６（Ｄ）（Ｅ）のような核酸ができ上がり、加熱変性を利用しなければ、それ以上の合成反応を進めることはできないと主張する。
　
　しかしながら、本件明細書には、フォワードプライマーとしてＴＰを用い、リバースプライマーとしてＰＣＲプライマーを用いた核酸の合成方法が記載されているから（上記【００３７】）、この点を問題として、実施可能要件又はサポート要件違反を指摘する主張は、そもそも失当である。
　また、本件特許公報の段落【００６８】にもあるように、本件発明は、「等温反応が可能とは言え、最初の鋳型となる核酸の提供のためにも加熱変性は行われる可能性があ」るというものであり、本件発明において、加熱変性などの処理を行って鋳型核酸を得ることが完全に排除されているわけではないから、請求人の上記主張は採用できない。
　
 （４）小括 
 　以上のとおり、本件発明１は、発明の詳細な説明に記載されたものであり、当業者がその実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されたものである。したがって、本件発明１に係る発明についての特許は、特許法第３６条第６項第１号及び同条第４項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものとはいえない。
 　 
 第５　むすび 
 　以上まとめると、本件発明１及び２について、請求人が申し立てた無効理由は、いずれも理由がないものであるから、本件請求項１及び２に係る発明についての特許を無効にすることはできない。
　審判に関する費用については、特許法第１６９条第２項の規定で準用する民事訴訟法第６１条の規定により、請求人が負担すべきものとする。
　 
　よって、結論のとおり審決する。 
　
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
（参考）本件特許無効審判事件の平成２３年７月２５日付け審決
　
　　　　　　　　　　　　審決 
 無効２０１０−８００１９７ 
　
 神奈川県横浜市鶴見区小野町７５−１ 
 請求人 株式会社 ダナフォーム 
　
 京都市下京区中堂寺南町１３４京都リサーチパーク１号館３０１号室 辻丸国際特許事務所 
 代理人弁理士 辻丸 光一郎 
　
 京都市下京区中堂寺南町１３４ 京都リサーチパーク１号館３０１号室辻丸国際特許事務所 
 代理人弁理士 中山 ゆみ 
　
 京都府京都市下京区中堂寺南町１３４ 京都リサーチパーク１号館３０１号室 辻丸国際特許事務所 
 代理人弁理士 吉田 玲子 
 京都府京都市下京区中堂寺南町１３４ 京都リサーチパーク１号館３０１号室 辻丸国際特許事務所 
 代理人弁理士 伊佐治 創 
 大阪府大阪市中央区北浜３丁目６番１３号 日土地淀屋橋ビル６階 
 代理人弁護士 山上 和則 
 大阪府大阪市中央区北浜３丁目６番１３号 日土地淀屋橋ビル６階 
 代理人弁護士 藤川 義人 
　
 大阪府大阪市中央区北浜３丁目６番１３号 日土地淀屋橋ビル６階 
 代理人弁護士 清水 良寛 
　
 大阪府大阪市中央区北浜３丁目６番１３号 日土地淀屋橋ビル６階 
 代理人弁護士 雨宮 沙耶花 
　
 東京都台東区台東４丁目１９番９号 
 被請求人 栄研化学 株式会社 
　
 東京都千代田区平河町２丁目４番１４号 平河町ＫＳビル２階 永島・安國・磯田特許事務所 
 代理人弁理士 磯田 志郎 
　
 東京都千代田区平河町２丁目４番１４号 平河町ＫＳビル２階 永島・安國・磯田特許事務所 
 代理人弁護士 永島 孝明 
　
 東京都千代田区平河町２丁目４番１４号 平河町ＫＳビル２階 永島・安國・磯田特許事務所 
 代理人弁護士 安國 忠彦 
　
 東京都千代田区平河町２丁目４番１４号 平河町ＫＳビル２階 永島・安國・磯田特許事務所 
 代理人弁護士 明石 幸二郎 
　
 東京都千代田区平河町２丁目４番１４号 平河町ＫＳビル２階 永島・安國・磯田特許事務所 
 代理人弁護士 永島 友悟 
　
 東京都千代田区大手町２−２−１ 新大手町ビル３３１〜３４０ 
 代理人弁理士 浅村 皓 
　
 東京都千代田区大手町２−２−１ 新大手町ビルヂング３３１−３４０ 浅村内外特許事務所 
 代理人弁理士 池田 幸弘 
　
 東京都千代田区大手町２−２−１ 新大手町ビル３３１〜３４０ 
 代理人弁護士 浅村 昌弘 
　
 東京都千代田区大手町２−２−１ 新大手町ビル３３１ （業）浅村特許事務所 
 代理人弁理士 渡邉 義敬 
  
 　上記当事者間の特許第３９７４４４１号発明「核酸の合成方法」の特許無効審判事件について、次のとおり審決する。 
 結　論 
 　本件審判の請求は、成り立たない。 
 　審判費用は、請求人の負担とする。 
 理　由 
 第１　手続の経緯 
 　 
 　被請求人は，平成１１年１１月８日に，発明の名称を「核酸の合成方法」とする特願２０００−５８１２４８号を特許出願（優先権主張平成１０年１１月９日）し，平成１４年４月１２日にその一部を新たな出願とした特願２００２−１１０５０５号を特許出願したものであって，平成１９年６月２２日に，特許庁から特許第３９７４４４１号として設定登録を受けた。 
 　これに対して，請求人から平成２２年１０月２５日付で請求項１〜１０に係る発明についての特許に対して，無効審判の請求がなされたところ，その後の手続の経緯は，以下のとおりである。 
 　 
 答弁書（被請求人）：平成２３年１月１７日 
 口頭審理陳述要領書（請求人）：平成２３年４月２７日 
 上申書（請求人）：平成２３年４月２８日 
 上申書（請求人）：平成２３年５月１１日 
 口頭審理：平成２３年５月１１日 
 上申書（被請求人）：平成２３年５月２７日 
 上申書（請求人）：平成２３年５月２７日 
 手続補正書（請求人）：平成２３年５月２７日（甲１号証の和訳を追加） 
 　 
 第２　本件発明 
 　 
 　本件特許第３９７４４４１号の請求項１〜１０に係る発明は，その特許請求の範囲の請求項１〜１０に記載された次のとおりのものと認める(以下，「本件発明１〜１０」という。)。 
 　 
 「【請求項１】 
 以下の工程を含む１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法。 
 ａ）同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールすることができる領域Ｆ１を3'末端に備え，この領域Ｆ１がＦ１ｃにアニールすることによって，塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成することができる核酸を与える工程， 
 ｂ）Ｆ１ｃにアニールしたＦ１の3'末端を合成起点として相補鎖合成を行う工程， 
 ｃ）領域Ｆ２ｃに相補的な配列からなるＦ２を3'末端に含むオリゴヌクレオチドをアニールさせ，これを合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って，工程ｂ）で合成された相補鎖を置換する工程， 
 ｄ）工程ｃ）で置換され塩基対結合が可能となった相補鎖における任意の領域に相補的な配列を3'末端に含むポリヌクレオチドをアニールさせ，その3'末端を合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って，工程ｃ）で合成された相補鎖を置換する工程 
 【請求項２】 
 工程ｄ）において，合成起点が領域Ｒ１ｃにアニールすることができる同一鎖上の3'末端に存在する領域Ｒ１であり，Ｒ１がＲ１ｃにアニールすることによって塩基対結合が可能な領域Ｒ２ｃを含むループが形成される請求項１に記載の方法。 
 【請求項３】 
 工程ａ）における核酸が，以下の工程によって提供される第２の核酸である請求項１に記載の方法。 
 i) 前記Ｆ２ｃに相補的な塩基配列Ｆ２を持つ領域の5'側に前記Ｆ１ｃと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチドの領域Ｆ２を鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃにアニールさせる工程， 
 ii) オリゴヌクレオチドのＦ２を合成起点とし，鋳型に相補的な塩基配列を持つ第１の核酸を合成する工程， 
 iii) 前記Ｆ２ｃの更に3'側の任意の領域Ｆ３ｃにアニールするオリゴヌクレオチドＦ３を合成起点とする鎖置換相補鎖合成を行うことにより，工程ii)で合成された第１の核酸の任意の領域を塩基対結合が可能な状態とする工程， 
 iv) 工程iii)における第１の核酸の塩基対結合を可能とした領域に相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドをアニールさせ，それを合成起点として第２の核酸を合成し，前記合成起点より更に3'側の任意の領域Ｒ３ｃにアニールするオリゴヌクレオチドＲ３を合成起点とした鎖置換相補鎖合成を行うことにより，その3'末端のＦ１を塩基対結合が可能な状態とする工程 
 【請求項４】 
 工程iii)の塩基対結合を可能とする領域がＲ２ｃであり，前記Ｒ２ｃの5'側に存在する領域をＲ１ｃとしたとき，工程iv)におけるオリゴヌクレオチドが，前記Ｒ２ｃに相補的な塩基配列Ｒ２を持つ領域の5'側に前記Ｒ１ｃと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチドである請求項３に記載の方法。 
 【請求項５】 
 反応に用いる各オリゴヌクレオチドと鋳型におけるその相補領域との融解温度が，同じストリンジェンシーの下で次の関係にある請求項４に記載の方法。 
 （Ｆ３ｃ／Ｆ３およびＲ３ｃ／Ｒ３）≦（Ｆ２ｃ／Ｆ２およびＲ２ｃ／Ｒ２）≦（Ｆ１ｃ／Ｆ１およびＲ１ｃ／Ｒ１） 
 【請求項６】 
 鋳型となる核酸がRNAであり，工程ii)における相補鎖合成を逆転写酵素活性を持つ酵素で行う請求項３〜５のいずれかに記載の方法。 
 【請求項７】 
 次の工程を繰り返すことによる１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の増幅方法。 
 Ａ）請求項４に記載の方法によって3'末端と5'末端において，それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え，この互いに相補的な塩基配列がアニールしたときに両者の間に塩基対結合が可能となるループが形成される鋳型を提供する工程， 
 Ｂ）同一鎖にアニールさせた前記鋳型の3'末端を合成起点として相補鎖合成を行う工程， 
 Ｃ）前記ループのうち3'末端側に位置するループ内に相補的な塩基配列を3'末端に含むオリゴヌクレオチドを，ループ部分にアニールさせ，これを合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って，工程Ｂ）で合成された相補鎖を置換してその3'末端を塩基対結合が可能な状態とする工程，および 
 Ｄ）工程Ｃ）において3'末端を塩基対結合が可能な状態とした鎖を工程Ａ）における新たな鋳型とする工程 
 【請求項８】 
 以下の要素を含む，１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成用キット。 
 領域Ｆ３ｃ，領域Ｆ２ｃ，および領域Ｆ１ｃを3'側からこの順で含む鋳型核酸に対し， 
 i) 前記Ｆ２ｃに相補的な塩基配列Ｆ２を持つ領域の5'側に前記Ｆ１ｃと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチド， 
 ii) i)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド， 
 iii) 前記Ｆ３ｃに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド， 
 iv) i)のオリゴヌクレオチドを合成起点として合成された相補鎖における任意の領域Ｒ２ 
 ｃの3'側に位置する領域Ｒ３ｃに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド， 
 v) 鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するDNAポリメラーゼ，および 
 vi) 要素v)の基質となるヌクレオチド 
 【請求項９】 
 ii)のオリゴヌクレオチドが，i)のオリゴヌクレオチドを合成起点として合成された相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃとその5'側に位置する領域Ｒ１ｃに対し，前記Ｒ２ｃに相補的な塩基配列Ｒ２を持つ領域の5'側に前記Ｒ１ｃと同じ塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチドである請求項８に記載のキット。 
 【請求項１０】 
 請求項８または９に記載のキットに，更に付加的に核酸合成反応の生成物を検出するための検出剤を含む，標的塩基配列の検出用キット。」 
 　 
 　以下，本審決書では，下記のように用語を統一する。 
 　本件特許公報の段落【００２４】に記載のプライマー（図１〜３，５〜６のＦＡ又はＲＡに相当）を，「ＴＰ」（ターンバックプライマー）という。 
 　本件特許公報の段落【００３６】に記載のプライマー（図１〜３，５〜６のＦ３又はＲ３に相当）を，「ＯＰ」（アウタープライマー）という。 
 　本件特許公報の段落【００３６】に記載のプライマー（図５〜６のＲ１に相当）を，「ＰＣＲプライマー」という。 
 　 
 第３　当事者の主張の要点 
 　 
 １　請求人の主張 
 　本件特許には，特許法第２９条第２項（無効理由１），同法第２９条の２（無効理由２）及び同法第３６条第６項第１号及び同条第４項（無効理由３，４）の四つの無効理由（特許法第１２３条第１項第２号及び第４号）がある（審判請求書の３頁）。（以下，便宜上，順序を変更する。） 
 　 
 （１）特許法第２９条の２違反（無効理由２） 
 ア　本願の優先日より前の優先日を有する特願平１１−１７９０５６号の願書に最初に添付した明細書又は図面（甲８）には，ループにプライマーをアニールさせ，前記プライマーの伸長反応を生起させることが記載されており（特に図２），甲８には，ループの3'末端からの伸長反応が明確に記載されていないが，ループの3'末端からの伸長反応は周知技術であるため，実質的には記載されており，記載されていないとしても，この相違は微差である。したがって，本件発明１は，甲８に記載された発明である（審判請求書の６９頁）。 
 　そして，ループの3'末端からの自己伸長反応は，本件発明の特徴的部分ではなく，本件出願時の周知技術に過ぎないから，ループの3'末端からの自己伸長反応の記載の有無という差異は，微差にすぎない（陳述要領書の１４〜１７頁）。 
 　また，甲８における前記反応を行えば，本件発明１に記載の反応が必ず起きる。仮に，本件特許が有効に成立したまま維持されると，１対のＴＰを用いた反応を先に開示した甲８の出願人は，自己の発明である１対のＴＰを用いた反応を行った場合，本件特許の侵害となってしまう。このような事態は，先願主義を採用した日本国特許法の趣旨に反するものである。この観点からも，本件発明は，先願に記載の発明と同一のものと判断すべきである（陳述要領書の３７頁）。 
 　さらに，本件発明１の工程ａ）〜ｄ）は，同じ反応条件下で同時進行的に起こる一連の反応であるから，それぞれを「工程」として明確に区別できるものではなく，同じ反応物質（鋳型とプライマー）を用いて同様の反応条件で反応させれば，同じ反応の起こるのは当然である（平成２３年５月２７日付上申書の３５頁）。 
 　 
 イ　甲８の段落【０１０６】【０１０７】には，「呼吸」という現象を述べるために，甲２が引用されている。この「呼吸」という現象が，甲８の図３のマル２とマル３の平衡状態を示すことは明らかである。さらに，甲２の図19-6を参照すると，工程「３」及び「４」に動的平衡反応が記載されており，工程「５」に，ループの3'末端からの自己伸長反応が記載されている。すなわち，甲２には，動的平衡反応を説明する図の中に自己伸長反応が一体的に記載されており，動的平衡反応が自己伸長反応につながることは明確である。このように，甲８には，ループの3'末端からの自己伸長反応が実質的に記載されているといえる（陳述要領書の１９〜２１頁）。 
 　甲８には，甲２について「その内容を本明細書中で参考として援用する」等と記載されており，この記載は，甲８に記載されている発明の技術内容を理解するために，甲２の全ての記載を参酌できることを示している。このことから見ても，甲２の同図に記載されているループの3'末端からの自己伸長反応は，実質的に甲８に記載されているといえる（陳述要領書の１７〜２２頁）。 
 　特許法２９条の２の先願明細書に記載されている発明の技術内容を理解するに当たって，先願明細書に明示的記載がなくても，周知技術を参酌し得ることは，平成17年（行ケ）10207号事件において判示されている。したがって，甲８に記載されている発明の技術内容を理解するために，甲２の全体，特に図19-6を参酌し得ることは，甲８の記載から見ても，前記判決から見ても，当然である。さらに，甲２に記載されている，ループの3'末端からの自己伸長反応が，周知技術であることは，甲２がいわゆる教科書であることから明らかである。したがって，甲８に，ループの３'末端からの自己伸長反応についての明示的記載がなくても，当業者であれば，甲８の図２，図３等に記載の反応において，甲２と同様，ループの3'末端からの自己伸長反応が起こることを理解できる（陳述要領書の２２〜２４頁）。 
 　　 
 ウ　増幅中間体の3'末端からの自己伸長反応が起こると，増幅産物のサイズ（分子量）は，増幅中間体の約２倍になる。甲８の図１７における電気泳動写真をみると，様々なサイズの増幅産物のバンドが確認されている。当業者であれば，このような様々なサイズのバンドが現れたことから，自己伸長反応が起こったと当然に認識する。さらに，「Ａ　３０分インキュベーション」と「Ｂ　１８０分インキュベーション」を対比すると，時間の経過により，分子量が多くなっていることから，自己伸長反応が起こっていると解釈する。すなわち，同図の電気泳動写真によれば，甲８には，自己伸長反応が記載されていると考えるのが，科学的に正しい解釈である（陳述要領書の２５〜２６頁）。 
 　被請求人は，図１７のＡとＢとでは，ゲル組成が異なるため，分子量が増大しているとはいえないと主張するが，増幅産物のサイズを確認する場合，分子サイズマーカーを用いるので，ゲルの組成を変えても問題なく分子量を判定できる。したがって，甲８の図１７のＡとＢとを比較して，後者の方が分子量が増大していると解釈することに何の問題もない。また，図１７Ａにおいてラダーなバンドが出来ていること（特に鋳型量が多いもの）から，当業者であれば，図１７Ｂと対比しなくても，当然に分子量が多くなっている（自己伸長反応が起きている）と理解する（平成２３年５月２７日付上申書の３６〜３７頁）。 
 　さらに，被請求人は，５３℃で３時間インキュベートしたものは，標的が少しもないようなコントロールでさえ，実質的な合成の証拠を示していると主張するが，被請求人が引用した箇所の直後に，標的なしのコントロールの場合は別の経路による合成が起きていることが合理的に説明されている。甲８の実施例全体を読めば，自己伸長反応が起こっていることは明らかである（平成２３年５月２７日付上申書の３５〜３６頁）。 
 　 
 エ　甲８には，「この複数のバンドは，おそらく，アンプリコンをプライマーおよびテンプレートとして機能させる二次構造の存在に起因し得るか，またはストランドスイッチングの徴候であり得る。」（段落【０１８３】）と記載されている。甲８において，アンプリコンの二次構造はステムループを意味することは明らかであり，「プライマー」とは，テンプレートにアニールして，その3'末端からの伸長反応を起こすものを意味するから，「アンプリコンをプライマーとして機能させる二次構造」とは，増幅産物の3'側のループの3'末端から自己をテンプレートとした伸長反応を意味することは明らかであり，さらに，「アンプリコンをテンプレートとして機能させる二次構造」とは，増幅産物の3'側のループにプライマーがアニールして伸長反応が起きることを意味することは明らかである。このように，甲８の実施例には，（ａ）ループの3'末端からの自己伸長反応，及び（ｂ）ループにアニールしたプライマーからの伸長反応，の２つの反応が記載されている（陳述要領書の２７〜２８頁）。 
 　 
 オ　別件の平成21年（行ケ）第10420号事件において，本件審判の被請求人は，甲８と本件発明１ないし１０との関係について，「増幅反応において共通する」と主張し，甲８には，本件発明１ないし１０と同一の発明が記載されていることを，被請求人自身が認めている（甲１０〜１３）（審判請求書の６６〜６９頁）。 
 　また，本件特許公報には，「へアピンループを形成させて自身を鋳型(template)とする相補鎖合成反応の報告は多い」（９頁１８〜１９行），「3'末端に同一鎖上の塩基配列に相補的な配列を持たせ，末端でへアピンループを形成させる方法が公知である(Gene 71,29-40,1988)。このようなへアピンループからは，自身を鋳型とした相補鎖合成が行われ，相補的な塩基配列で構成された１本鎖の核酸を生成する。」（５頁１１〜１４行）とあり，これらの記載は，3'末端からの自己伸長反応が周知技術であることを示している。さらに，3'末端からの自己伸長反応が甲８に記載されているに等しい事項であることを示す被請求人自身の主張がある（甲１７〜１９）。被請求人は，特許法２９条の２の無効理由２において争点となるのは，甲８の当初明細書等に記載された発明の内容であり，それは，甲８の優先日（平成１０年６月２４日）時点において，その当時の技術常識を備えた当業者が，その技術的知識に基づき，甲８の当初明細書等から客観的に把握できるものに限られると主張するが，本件優先日以前においても，3'末端からの自己伸長反応がすでに周知であったことは，被請求人自身が認めていることであり，甲１７〜１９から分かる通り，被請求人は，本件特許の開示内容とは無関係に，本件審判事件の甲８に3'末端からの自己伸長反応が記載されていると認めているから，このような主張は成り立たない（陳述要領書の２８〜３４頁）。 
 　 
 カ　甲８には，核酸の両端にループが形成された増幅反応中間体（ダンベル型中増幅間体）が記載されているから，本件発明２は，甲８に記載された発明である。そして，甲８には，ＯＰの変形例があり，甲５にあるようにＯＰは周知技術であるから，ＯＰは実質的に記載されており，記載されていないとしても，その相違は微差である。したがって，本件発明３〜４は，甲８に記載された発明である。甲８には，ＴＰ及びＯＰの融解温度の具体的な関係について記載が無いが，融解温度に関する記載はあり，プライマーの設計において融解温度（Ｔｍ）を考慮することは周知であるから，本件発明５は，甲８に記載された発明である。甲８には，鋳型核酸がＲＮＡである場合に，逆転写酵素を用いる旨の記載があるから，本件発明６は，甲８に記載された発明である。甲８には，ＯＰの変形例があり，甲５にあるようにＯＰは周知技術であるから，本件発明７は，甲８に記載された発明である。甲８には，二つのＴＰを用いた核酸合成方法が記載され，また，核酸合成用のキットに関する記載もあるから，本件発明８〜９は，甲８に記載された発明である。甲８には，核酸合成反応の生成物を検出するための検出剤が記載されているから，本件発明１０は，甲８に記載された発明である（審判請求書の６９〜７２頁）。 
 　 
 （２）特許法第２９条第２項違反（無効理由１） 
 ア　甲１の図８のステップ７で生成される一本鎖核酸において，互いに相補的な配列が，ループを形成する配列を介して連結されており，本件発明１の「１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法」に該当する。また，同図の説明において，直線ｓｓＤＮＡがプライマーであることが記載されており，直線ｓｓＤＮＡが，本件発明１の工程ｃ）のループにアニールするオリゴヌクレオチド（プライマー）に該当する。そして，同図において，ステップ２で，プライマーの3'末端が，二本鎖ヘアピン生成物のループにアニールし，ステップ３で，前記プライマーの伸長反応により二本鎖ヘアピン生成物の二本鎖部分（ステム部分）を置換しており，これらのステップ２及び３は，本件発明１の工程ｃ）に該当する（審判請求書の４０〜４１頁）。 
 　してみると，甲１に記載の発明は，ループの3'末端からの伸長反応が記載されていない点で，本件発明１と相違する（審判請求書の６０頁，陳述要領書の３頁により訂正）。 
 　しかし，この相違点は，甲２又は３にあるように周知技術であり，また，本件明細書にあるように（本件特許公報９頁１８〜２１行），ループにプライマーをアニールさせて伸長させることが本件発明１の特徴的な構成であり，このことは甲１に記載されている。そして，甲１はuvsXタンパク質により，プライマーをループにアニールさせているが，甲１の３から明らかなように，uvsXタンパク質がなくても，フリーループを形成すれば，１本鎖となったループにプライマーがアニールすることは周知技術である。さらに，本件発明１では，本件発明の効果が得られない部分を含んでいる。 
 　したがって，甲１に，甲２又は３の周知技術を適用することにより，当業者であれば，本件発明１に容易に想到し得る。また，甲１ないし甲３に，甲４を適用することにより，当業者であれば，本件発明１に容易に想到し得る（審判請求書の６０〜６１頁）。 
 　 
 イ　甲２の図19-6の「６」の上側の一本鎖核酸は，同図の１から５までの複製反応で合成された両端にループを持つ一本鎖核酸であるから，本件発明１の「１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法」に相当する。同図の「１」には，3'端にループが形成された一本鎖核酸が記載され，これは，本件発明１の工程ａ）に該当する。同図の「５」では，ループの3'端からの自己伸長反応が記載され，これは本件発明１の工程ｂ）に該当する。同図の「６」の上側の一本鎖核酸は，同図の「５」の自己伸長反応で置換されて一本鎖となり，その3'末端がループを形成し，そのループが自己伸長反応可能であるから，本件発明１の工程ｄ）に該当する。（審判請求書の４４頁）。 
 　また，甲３の図５ｊの一番下側に記載の一本鎖分子は，両端にループが形成されているから，本件発明１の「１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法」に該当する。また，図５ｉには，ループの3'末端からの自己伸長反応が記載されているから，これは，本件発明１の工程ａ）及びｂ）に該当する。そして，図５の一番下側に記載の一本鎖核酸分子の3'末端において，ループが形成され，そのループから自己伸長反応が起きているから，これは，本件発明１の工程ｄ）に該当する。（審判請求書の４８頁）。 
 　してみると，甲２又は甲３に記載の発明は，ループにアニールしたプライマーの伸長反応が記載されていない点で，本件発明１と相違するが，前記相違点は，甲１に記載されているから，甲２又は甲３に甲１を適用することにより，本件発明１に，当業者であれば容易に想到し得る（審判請求書の６１頁，陳述要領書の４頁により訂正）。 
 　甲１には，「等温増幅」という効果に関する記載があり，この記載は甲１に甲２及び甲３を組合わせる「示唆」すなわち動機付けとなり得る記載である（陳述要領書の１０頁）。 
 　被請求人は，甲１は二本鎖ヘアピンの１本鎖分子の「侵入」により，ループが形成されているのであり，ループ部分へのプライマーのアニールが開示されておらず，またその動機付けもないと主張するが，「侵入」であるから「アニール」でないとする理由が不明である（平成２３年５月２７日付の上申書の６頁）。 
 　さらに，被請求人は，甲１は生体内（in vivo）の増幅機構モデルに関し，試験管内（in vitro）で目的の核酸領域を特異的に増幅させる本件発明とは相違すると主張するが，甲１には，当該反応を試験管内（in vitro）で行う旨の記載があるから，被請求人の主張は成り立たない。仮に，増幅反応の場として生体内のみが記載され，試験管内が記載されていなかったとしても，生体内で起こる反応を試験管内に適用してみることは当業者が適宜なし得ることである（平成２３年５月２７日付上申書の８〜９頁）。 
 　 
 ウ　甲４の図１７Ａ〜１７Ｄには，ＴＰとＰＣＲプライマーを用いた増幅反応が記載されている。すなわち，鋳型配列にアニールしたＴＰが伸長し，鋳型から剥離したＴＰ伸長鎖の3'側にＰＣＲプライマーがアニールして伸長するという一連の反応が記載されており，本件発明１と相違するのは，ＴＰ伸長鎖及びＰＣＲプライマーの伸長鎖の鋳型からの剥離が変性で実施されている点であり，その他は，本件発明１と全て共通する。したがって，甲４には，本件発明１の「１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法」，工程ａ），工程ｂ），工程ｃ）（相補鎖の置換を除く），工程ｄ）（相補鎖の置換を除く）が記載されている（審判請求書の５０〜５１頁）。 
 　また，等温条件下での鎖置換反応は，甲１ないし甲３に記載のように周知である。さらに言えば，甲５の等温増幅において，鎖置換活性を持ったＤＮＡポリメラーゼの使用は周知である。したがって，甲４に，周知技術である甲１ないし甲３（必要に応じて甲５）を適用することにより，当業者であれば，本件発明１に容易に想到し得る（審判請求書の６１〜６２頁）。 
 　 
 エ　甲１ないし甲３に，甲４を適用することにより，本件発明１に，当業者であれば容易に想到し得る（審判請求書の６１頁）。 
 　 
 オ　甲２又は甲３には，一本鎖となった3'末端が分子内自己アニールによりループを形成して伸長反応の合成起点となることが記載されているから，甲１に甲２又は甲３，或いは，甲２又は甲３に甲１を適用することにより，本件発明２に，当業者であれば容易に想到し得る。また，ＴＰは，甲４に記載され，ＯＰは甲５に記載されているように周知であるから，甲４において，変性に代えて，ＯＰを用いることにより，3'末端にループが形成された鋳型核酸を合成することは容易である。さらに，そのループにＴＰがアニールし，これを合成起点として鎖置換相補鎖合成反応が進むことも自明のことであるから，甲１ないし甲５を組み合わせることにより，当業者であれば本件発明３に容易に想到し得る。さらに，甲４では，一つのＴＰを用いているが，甲５のように，一対のプライマーとして同一のプライマーを２個使用することは周知技術であるから，甲１ないし甲５及び周知技術を組み合わせることにより，当業者であれば本件発明４，９に容易に想到し得る。そして，プライマーの設計において，融解温度（Ｔｍ）を考慮することは，甲６にあるように周知技術であから，甲１ないし甲６及び周知技術を組み合わせることにより，当業者であれば本件発明５に容易に想到し得る。また，鋳型核酸がＲＮＡの場合，逆転写酵素を使用することは，甲７に記載のように周知技術であるから，甲１ないし甲７及び周知技術を組み合わせることにより，当業者であれば本件発明６に容易に想到し得る。さらに，ループにアニールしたプライマーからの伸長反応は甲１に記載され，ループの3'末端からの伸長反応は甲２及び甲３に記載されているように周知技術であり，ＯＰは甲５に記載されているから，甲１ないし甲３及び甲５並びに周知技術を組み合わせることにより，本件発明７に，当業者であれば容易に想到し得る。そして，甲４にはＴＰが記載され，甲５にあるようにＯＰは周知技術であるから，甲１ないし甲５及び周知技術を組み合わせることにより，本件発明８に，当業者であれば容易に想到し得る。また，甲６に記載されているように，核酸合成反応の生成物を検出するための検出剤は，周知技術であるから，甲１ないし甲５及び周知技術を組み合わせることにより，本件発明１０に，当業者であれば容易に想到し得る（審判請求書の６２〜６４頁）。 
 　 
 （３）特許法第３６条第６項第１号及び同条第４項違反（無効理由３，４） 
 ア　本件発明１ないし１０の課題は，「単一の酵素で特異性が高い等温増幅の提供」であるところ，甲９には，前記課題を解決するためには，二つのＴＰと二つのＯＰが必須である旨が記載されている。また，甲９の図４Ｂでは，実証データを示して，二つのＴＰ及び二つのＯＰを使用しなければ，同一の酵素により，高い特異性での等温増幅反応が起きないことが示されている（審判請求書の７２〜７３頁）。 
 　 
 イ　本件発明１，２，３，６，８，１０について，本件発明１の工程ａ）の核酸は，3'末端側のみ規定しており，5'末端側が規定されていない。このような核酸は，フォワードプライマーとしてＴＰを用い，リバースプライマーとしてＰＣＲプライマーを用いて合成されるが，本件特許公報の段落【００３７】と図５及び６から明らかなように，ＴＰとＰＣＲプライマーから合成された構成要件Ａ２の核酸は，図５（Ｂ）の核酸であり，本件発明１の合成の目的となる核酸は，図６（Ｄ）の核酸である。そして，図６（Ｄ）の核酸は，その構造（相補配列の関係）から明らかなように，加熱変性をしなければ，それ以上の増幅反応が進行しないものである。したがって，本件発明１では，加熱変性が必要となるため，本件発明１の「単一の酵素により，高い特異性の等温増幅反応」を実現するという効果を得ることができない（審判請求書の７３〜７４頁）。 
 　 
 ウ　図５及び図６から明らかなように，本件発明１の工程ａ）の核酸（図５Ｂ）を得るために，二つのＯＰを使用している。本件特許公報には，ＯＰ以外の代替手段として，「この工程は加温による変性や，DNAヘリカーゼによって達成することもできる。」（１３頁３７〜３８行）とあるが，熱変性を使用すれば，本件発明１の効果に反することになるし，熱変性を使用すると，鎖置換ＤＮＡポリメラーゼが失活し，ステムループ構造を含む全ての二重鎖構造が破壊されるから，本件発明１の特徴的構成要件の「ループにプライマーをアニールさせて伸長反応を生起させる」ことができなくなる。また，ＤＮＡヘリカーゼを反応チューブに添加しただけでは，二重鎖の解離が生じないことは，当業者の常識である。したがって，本件発明１は，二つのＴＰ及び二つのＯＰを必須としない部分において，３６条６項１号及び同条４項１号の規定に反する（審判請求書の７４〜７５頁）。 
 　 
 ＜証拠方法＞ 
 甲第１号証：THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.266, No.21, pp.14031-14038, 1991 
 甲第１号証の２：甲第１号証の抄訳（平成２３年５月２７日付手続補正書） 
 甲第１号証の３：Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.79, pp.724-728, 1982 
 甲第２号証：“DNA REPLICATION SECOND EDITION”, ARTHUR KORNBERG,TANIA A BAKR, W.H.FREEMAN AND COMPANY,1992　 pp.700-704 pp.713-716. 
 甲第２号証の２：甲第２号証の抄訳 
 甲第２号証の３：“DNA REPLICATION SECOND EDITION”, ARTHUR KORNBERG,TANIA A BAKER, W.H.FREEMAN AND COMPANY, 1992 pp.492-493 pp.504. 
 甲第２号証の４：甲第２号証の３の抄訳 
 甲第３号証：ＷＯ　９６／０１３２７ 
 甲第３号証の２：甲第３号証の訳文 
 甲第４号証：ＷＯ　９７／０４１３１ 
 甲第４号証の２：甲第４号証の抄訳 
 甲第５号証：特表平７−２８９２９８号公報 
 甲第６号証：「バイオ実験イラストレイテッド　３＋　本当にふえるＰＣＲ」秀潤社，１９９８年６月１日発行 
 甲第７号証：特開平２−５８６４号公報 
 甲第８号証：特開２０００−３７１９４号公報 
 甲第８号証の２：甲第８号証の優先権証明書 
 甲第９号証：Nucleic Acids Research,2000,Vol.28,No.12,e63 
 甲第９号証の２：甲第１０号証の抄訳 
 甲第１０号証：平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の，原告栄研化学株式会社による平成２２年２月１日付け第４準備書面 
 甲第１１号証：平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の，原告栄研化学株式会社による平成２２年２月１８日付け第５準備書面） 
 甲第１２号証：平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の，原告栄研化学株式会社による平成２２年７月７日付け第７準備書面 
 甲第１３号証：平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の，原告栄研化学株式会社による平成２２年９月２９日付け技術説明資料 
 甲第１４号証：無効２００８−８００２９３（特許第３８９７８０５号特許無効審判事件）の，請求人栄研化学による平成２１年８月７日付け技術説明資料 
 甲第１５号証：無効２００８−８００２９３（特許第３８９７８０５号特許無効審判事件）の，請求人栄研化学による平成２１年９月１８日付け上申書 
 甲第１６号証：平成２１年（行ケ）第１０４２０号事件の，原告栄研化学株式会社による平成２２年３月１日付け第１準備書面 
 甲第１７号証：平成２１年（行ケ）第１０４２０号事件の，原告栄研化学株式会社による平成２２年８月２３日付け第３準備書面 
 甲第１８号証：平成２１年（行ケ）第１０４２０号事件の，原告栄研化学株式会社による平成２２年９月８日付け技術説明資料 
 甲第１９号証：平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の，原告栄研化学株式会社による平成２１年１０月５日付け第２準備書面 
 甲第２０号証：特願２００１−５７５１７１の，出願人栄研化学株式会社による平成２３年３月７日付け意見書 
 甲第２１号証：特願２００１−５７５１７１の審査経過における，平成２３年１月４日付け発送拒絶理由通知 
 甲第２２号証：特願２００１−５７５１７１の出願経過書類 
 甲第２３号証：平成17年（行ケ）10207号審決取消請求事件の判決文 
 甲第２４号証：請求人による平成２３年５月１１日付け口頭審理説明資料 
 甲第２５号証：無効２０１０−８００１９５（特許第３３１３３５８号無効審判事件），無効２０１０−８００１９７（特許第３９７４４４１号無効審判事件）及び無効２０１０−８００１９８（特許第４１３９４２４号無効審判事件）の，被請求人栄研化学による平成２３年５月１１日付け口頭審理技術説明資料 
 甲第２６号証：東京化学同人「分子細胞生物学辞典」第２版　８０７頁（「ヘアピンループ」の解説の頁），平成９年（１９９７年）３月１０日　第1版第１刷発行 
 甲第２７号証：被請求人栄研化学作成のＷｅｂサイト「ＬＡＭＰ法の原理」（http://loopamp.eiken.co.jp/lamp/principle.htmlからダウンロード［ダウンロード日：平成２３年（２０１１年）５月１９日］） 
 　 
 ２．被請求人の主張の要点 
 （１）特許法第２９の２違反（無効理由２）に対し 
 ア　甲８には，本件発明１の合成方法における合成物である「１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸」も，工程ｂ）の「Ｆ１ｃにアニールしたＦ１の3'末端を合成起点として相補鎖合成を行うこと」も，工程ｃ）の「工程ｂ）で合成された相補鎖を置換すること」も，工程ｄ）の「工程ｃ）で置換され塩基対結合が可能となった相補鎖における任意の領域に相補的な配列を3'末端に含むポリヌクレオチドをアニールさせ，その3'末端を合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って，工程ｃ）で合成された相補鎖を置換すること」も開示されておらず，甲８に開示された増幅方法が，本件発明１とは異なることは明らかである（答弁書の２８頁）。 
 　そして，本件発明１は，工程ａ）ないしｄ）によって，「１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸」を合成する方法であり，工程ｂ）における自己伸長反応によって合成された１本鎖内に相補的な塩基配列が交互に連結された合成物の自己伸長反応で合成された相補鎖が，工程ｃ）において，ループ内のＦ２ｃ領域にアニールされたオリゴヌクレオチドからの鎖置換相補鎖合成反応によって鎖置換されて塩基対結合が可能な状態となり，工程ｄ）に規定されているように，ポリヌクレオチドがアニールして，そこからの鎖置換相補鎖合成反応によって工程ｃ）で合成された相補鎖を置換するため，効率的に合成反応を進めることができるものである。甲８の記載からは，かかる本件発明１の目的，構成および効果は記載されておらず，また甲８の記載から自明なものでもないので，本件発明１は，先願発明と同一ではない（答弁書の３４頁）。 
 　請求人は，自己伸長反応（工程ｂ）は公知技術との差別化に寄与するものではないため，重要な工程に当たらず，「微差」であると主張している（甲２４）。しかし，２９条の２の規定における微差とは，正確には「課題解決のための具体化手段における微差（周知技術，慣用技術の付加，削除，転換等であって，新たな効果を素するものではないもの）」である（審査基準）。「公知技術との差別化に寄与する」か否かの判断基準自体，請求人の独自の見解にすぎない。そもそも，本件発明と甲８では，課題，増幅目的物が相違するため，自己伸長反応の有無が「微差」ではあり得ない。また，本件発明１においては，自己伸長反応（工程ｂ）に次いでループにアニールしたプライマーからの伸長反応（工程ｃ）が生じることにより，「一本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸」が増幅されるという新たな効果が奏されるから，この点からも自己伸長反応が微差であるとは認められない（上申書の１１〜１２頁）。 
 　 
 イ　請求人は，周知技術として甲２を引用し，自己伸長反応は甲８に「記載されているに等しい事項」であると主張しているが，「記載されているに等しい」事項とは，甲８に記載されている事項から甲８の優先日における技術常識を参酌することにより導き出せるものをいう。請求人は，本件特許公報の記載に基づいて，本件優先日以前に「周知技術」であると主張している。かかる主張は，基準日を誤っており失当である。さらに，請求人は，平成17年（行ケ）第10207号事件を引用し，「先願明細書において文献名のみを特定して引用している文献中の記載を，先願明細書に記載されている発明の技術内容を理解するために参酌し得る」と主張しているが，甲８自体に自己伸長反応について何らの記載がないにも関わらず，甲２の特定の一部を，文献名のみの引用を根拠に，技術的関連性を無視して一部を取り出し，周知技術と称して追加しようとしていることは，上記判決の判示事項はもちろん，請求人自身の上記判決の理解を超える主張である。また，東京高等裁判所昭和６０年９月３０日判決は，明細書の記載を参酌できる範囲について，「それはあくまで当該明細書自体から知ることができる具体的内容に関連する場合に限られるものと解すべきであって，・・・抽象的記載についてまでかかる解釈方法を持ち込むことは，いたずらに明細書の記載内容を技術的に広く認めることとなり，後願者に対する関係で不当に有利に扱うこととなり相当とは認めがたい。」と判示しており，甲８に自己伸長反応の記載が一切存在しないにも拘わらず，明細書中に甲２の文献名が引用されていることをもって同文献を周知技術として参酌することは許されないのである（上申書の１２〜１３頁）。 
 　 
 ウ　請求人は，図１７ＡとＢとを対比し，これらに現れているバンドの移動度の違いから，インキュベーション時間が長いほど，サイズ（分子量）の大きなバンドが出現していると解釈し，サイズの大きなバンドが「自己伸長反応」が起こったことを示すものであると主張しているが，図１７Ａ及びＢからは，インキュベーション時間が長いほどサイズ（分子量）の大きなバンドが出現しているとの事実を読み取ることはできない。３０分のインキュベーションの増幅産物の電気泳動と，１８０分のインキュベーションの増幅産物の電気泳動とで，異なる組成のアガロースゲルを使用していることが認められる（甲８の段落【０１８２】）が，１８０分の増幅産物に用いられている４％Metaphorアガロースゲルは，３０分の増幅産物に用いられている２％アガロースゲルよりアガロースの濃度が高く，移動度が小さくなるよう調製されている。２．０％のゲル濃度は１５０〜７００ＤＮＡ長の分離に適しており，これに対し４．０％のゲル濃度は，よりサイズの小さい７０〜３００のＤＮＡ長の分離に適している。したがって，仮に図１７Ａと図１７Ｂに同じ分子量の増幅産物を流したとしても，当然に図１７Ｂの移動度の方が小さくなる。ゆえに，図１７Ｂに現れたバンドの移動度が図１７Ａに比して小さいことをもって，分子量の大きな増幅産物が生じたことが確認される訳ではない（上申書の５〜７頁）。 
 　また，甲８の出願人が１８０分の増幅産物の電気泳動において，３０分の増幅産物の電気泳動よりも移動度の小さいアガロースを使用したという事実自体，実施例１の記載が図３マル４の増幅産物の確認のみに留まり，それより分子量の大きな増幅産物の可能性，分析については完全に度外視していることを表している。つまり，移動度の小さいアガロースゲルを用いるということは，より分子量の低い増幅産物のバンドを分析する目的で行なわれるものであるから，甲８の実施例１の記載は分子量の大きな増幅産物を全く対象としていないのである（上申書の７頁）。 
 　さらに，甲８には，「５３℃で３時間インキュベーションした後，標的が少しもないようなコントロールでさえ，実質的な合成の証拠を示している。」（段落【０１８３】）との記載があり，標的が存在しないコントロールにおいても，増幅産物が生じているのである。したがって，自己伸長反応による産物が生じているとの結論を導くことなどできない。これに加えて，二次構造が形成されることによって，効果的な移動度が変化し，複数のバンドが観察されることは請求人自身も認めていることである（上申書の７〜８頁）。 
 　以上のとおり，実施例１における電気泳動の複数のバンドについて，それが自己伸長反応を示すものとは到底言えない（上申書の８頁）。 
 　 
 エ　請求人は，甲８の「アンプリコンをプライマーおよびテンプレートとして機能させる二次構造の存在に起因し得る」（段落【０１８３】）との部分が，自己伸長反応を記載するものであると主張しているが，上記引用部分はその文言上も，自己伸長反応とは記載していないし，また，意識的に「おそらく」，「起因し得るか，または」，「兆候であり得る。」との表現が用いられており，単に，甲８の出願人が複数のバンドができた原因を抽象的に複数推測しているに過ぎないことは明らかである。かかる抽象的な推測から，甲８に記載されていない自己伸長反応を含む発明が読み取れるはずがないのである（上申書の９頁）。 
 　さらに，請求人は「アンプリコンをプライマーおよびテンプレートとして機能させる二次構造」はループ部を意味することを前提に，ループ部からの自己伸長反応が記載されていると主張するが，例えば，図３マル４の二本鎖分子は末端部分において，ループ構造と二本鎖構造との動的平衡状態にあるため，他の二本鎖分子の末端部分の相補鎖に相当する部分と分子間でアニールすることも考えられる。このような二次構造が形成された場合，アニールした末端部分をプライマーとし，相手の二本鎖分子をテンプレートした反応が起こるため，かかる二次構造も「アンプリコンをプライマーおよびテンプレートとして機能させる二次構造」に該当するのである。このような分子間のアニールによる二次構造の形成によっても分子量は増大し，複数のバンドを生じる可能性があるから，「アンプリコンをプライマーおよびテンプレートとして機能させる二次構造の存在に起因し得る」との記載からループ部の自己伸長を導き出すことはできない（上申書の９〜１０頁）。 
 　 
 オ　請求人は，別件（平成21年（行ケ）第10107号）において被請求人が提出した準備書面等を部分的に引用し，甲８に，本件特許発明１ないし１０と同一の発明が記載されていることを，被請求人自身が認めていると主張するが，このような主張は，事実無根であるばかりか，主張態度として著しく妥当性を欠いている。そもそも別件における争点と本件における争点とは，内容も前提となる事実も異なるものであるから，別件における被請求人の主張を本件で考慮することを求める請求人の主張は，明らかに失当である。本件無効審判において争点となるのは，甲８の当初明細書等に記載された発明の内容であり，それは，甲８の優先日（平成１０年６月２４日）の時点において，その当時の技術常識を備えた当業者が，その技術的知識に基づき，甲８の当初明細書等から客観的に把握できるものに限られるのであり，当然，平成１２年５月１８日に公開された本件特許において開示された技術内容を甲８の優先日（平成１０年６月２４日）当時の当業者は知得できないし，そのような技術内容を知得し得たとする根拠もない。よって，甲８の当初明細書等に記載された発明は，本件特許において開示された技術に基づいて認定することは許されないのである。したがって，請求人の各主張は，本件無効審判において検討すべき事項とは全く論点を別にし，無関係なものであるため，本件無効審判において参酌されるものではなく，請求人の主張は前提を明らかに誤り，失当である（答弁書の２９〜３０頁）。 
 　 
 カ　本件発明１は，甲８に記載されておらず，先願発明と同一ではないので，本件発明１を直接又は間接的に引用する本件発明２〜１０も，甲８に記載されておらず，先願発明と同一でない。また，甲８の図１３のプライマーは，領域c'd'から領域a'b'が合成され，領域g'h'からは領域e'f'が合成されているだけであり，かかる合成反応は，領域c'd'の部分を鎖置換相補鎖合成を行うことにより分離するものでないことは明らかである。さらに，甲８の分離方法では，先の伸長プライマーが動的平衡を利用して二次構造を形成しない限り，新たな初期プライマーがアニールできないため，反応が動的平衡に依存した不確実なものであり，再現性が悪いものである。これに対し，アウタープライマーを使用して分離すると，鋳型からの分離は動的平衡に依存しない。そのため，分離は効率よく進むし，分離した後は二本鎖が形成されるので，通常は，プライマー結合部位を再生することがない。このように，甲８の分離方法は，アウタープライマーを使用した分離方法とは全く異なる特徴を持つものであり，動的平衡による分離方法しか記載されていない甲８において，当業者はアウタープライマーを使用した分離方法を把握することはできない（答弁書の３８〜４１頁）。 
 　 
 （２）特許法第２９条第２項違反（無効理由１）に対し 
 　請求人は，本件発明１に対する無効理由１において，進歩性欠如の引用例の組み合わせを手当たり次第に主張する。しかし，何れの組み合わせについても，極めて曖昧に対比を行って相違点を抽象化し，具体的な動機付けや契機に基づく裏付けも明らかにせずに，漫然と想到容易であるとの主張を繰り返すだけである。しかも，請求人は，核酸合成方法における一連の機構の一体性を無視して，個別のステップや要素だけを強引に取り出して周知技術であると決めつけて組み合わせており，論理の欠如も甚だしく，暴論である。かかる請求人の無効理由１に関する主張態様からすれば，そもそも主張自体に無理があることは明らかであるが，以下，念のため，各証拠に基づく想到非容易性を簡潔に説明する（答弁書の１５頁）。 
 　 
 ア　本件発明１と甲１の図８とを比較すると，甲１は，本件発明１の工程ａ）における核酸を開示していない。また，甲１の鋳型が，「末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え」ていないことから，甲１の増幅機構は，本件発明１の工程ｂ）における「Ｆ１ｃにアニールしたＦ１の3'末端を合成起点として相補鎖合成を行う」ものでもないし，本件発明１の工程ｃ）における「領域Ｆ２ｃに相補的な配列からなるＦ２を3'末端に含むオリゴヌクレオチドをアニールさせ，これを合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って，工程ｂ）で合成された相補鎖を置換する」ものでもなく，工程ｄ）における「工程ｃ）で合成された相補鎖を置換する」ものでもない。（答弁書の１８頁）。 
 　請求人は，甲１の「直鎖ｓｓＤＮＡ」が本件発明１の工程ｃ）における「オリゴヌクレオチド」に該当し，Ｓｔｅｐ２及び３における直鎖ｓｓＤＮＡの3'末端が，二本鎖ヘアピン生成物のループにアニールし，プライマーの伸長反応により二本鎖部分を置換することが本件発明１の工程ｃ）に該当すると主張するが，本件発明１の工程ｃ）における「オリゴヌクレオチド」は，工程ａ）における鋳型が有するループを前提としているオリゴヌクレオチドである。甲１に開示された合成方法では，uvsXリコンビナーゼによって，二本鎖ヘアピン生成物や二本鎖の二量体中間体の一部に鋳型である直鎖ｓｓＤＮＡ分子をＤＮＡ組換えにより導入しているのであり，二本鎖ヘアピン生成物のループに直鎖ｓｓＤＮＡの3'末端をアニールさせるものではない。以上のとおり，甲１には，本件発明１の構成は全く開示されておらず，請求人が主張するような一致点は存在しない（答弁書の１８〜１９頁）。 
 　また，請求人は，甲１に，甲２又は甲３等の周知技術を適用することにより，本件発明１に，当業者であれば容易に想到し得ると主張するが，上述したとおり，請求人は，本件発明１と甲１との間の一致点及び相違点の認定を誤るものであるから，かかる請求人の主張は前提において誤りである。さらに，甲１は，生体内（in vivo）におけるＤＮＡ複製の機構を考察しただけであるから，そもそも甲２ないし甲４に適用できるものではない。さらに，甲１の図８の増幅機構では少なくとも「Ｔ４ホロ酵素」及び「uvsXリコンビナーゼ」を必須の要件とするものであり，これらを有していない甲２ないし甲４に適用できないことは明らかである（答弁書の１９頁）。 
 　なお，請求人は，甲１の３に依拠して，「uvsXタンパク質が無くても，フリーループを形成すれば，一本鎖になったループにプライマーがアニールすることは周知技術である」と主張するが，甲１の３と甲１との関連性を明らかにしておらず，請求人の主張は趣旨不明である。しかも，甲１には，フリーループを形成することは開示されていないから，何れにしても，甲１の３に依拠した請求人の主張は理由がない（答弁書の２０頁）。 
 　 
 イ　請求人の主張を「甲２及び甲３に記載の発明は，ループにアニールしたプライマーの伸長反応が記載されていない点で，本件発明１と相違する」という誤記と善解したとしても，上述したとおり，甲１には，ＤＮＡ組換え技術が開示されているだけであり，「ループにアニールしたプライマーの伸長反応」は開示されていないので，請求人の主張は成り立たない（答弁書の２０頁）。 
 　 
 ウ　甲４に記載の発明は，従来のＰＣＲにおいて二つのプライマーが必要であったことを課題として，単一のプライマーによって増幅を行うために，ポリヌクレオチドヘアピンと単一のプライマーとを使用したものである。したがって，甲４の図１７Ｃでは，ポリヌクレオチドヘアピンのＤ'領域に単一のプライマーＤがアニールした場合だけが，発明の目的とする増幅反応となるのである。よって，甲４には，本件発明１の工程ｃ）は開示されていない。また，甲４では，熱変性によって二本鎖を分離して反応を段階的に進めるものであるから，等温条件下で鎖置換合成を行って，塩基対結合が可能な状態を形成する本件発明１とは本質的に異なるのである。さらに，上述したとおり，甲４には，本件発明１の工程ｃ）が開示されていないのであるから，工程ｄ）も開示されていない（答弁書の２２〜２３頁）。 
 　以上のとおり，増幅が鎖置換反応によって進む本件発明１と，熱変性によって進む甲４とは，そもそも本質的に異なるものであり，さらに甲４には，少なくとも本件発明１の工程ｃ）及びｄ）が開示されていない（答弁書の２３頁）。 
 　また，請求人は，等温条件下での鎖置換反応は，甲１ないし甲３に記載のように周知技術であり，甲５のように，等温増幅において鎖置換活性をもったＤＮＡポリメラーゼの使用は周知技術であるから，甲４に甲１ないし甲３を適用することにより，当業者であれば，本件発明１に容易に想到し得ると主張するが，甲４は，単一のプライマーによって増幅を行うものであるから，本件発明１の工程ｃ）を組合わせることは，甲４の目的に反するものであり，当業者にとって明白な阻害事由に該当する。しかも，甲４においては，等温条件下で増幅を進めるための手段を記載も示唆もしていないので，等温条件を採用できるものではない。よって，本件発明１は，甲４に，周知技術である甲１ないし甲３を適用することにより，当業者が容易に想到できたものではない（答弁書の２３〜２４頁）。 
 　 
 エ　甲４にも，「ループにアニールしたプライマーの伸長反応」は開示されていないので，当業者は，甲２又は甲３に甲４を適用しても，本件発明１を容易に想到できるものではない（答弁書の２０〜２１頁）。 
 　 
 オ　本件発明１は甲１ないし甲５に基づいて当業者が容易に想到できたものではない以上，本件発明１を直接又は間接的に引用する本件発明２〜４も，甲１ないし甲５に基づいて当業者が容易に想到できたものではない。甲１において一対のプライマーを採用することはできないし，甲４において一対のプライマーを採用することは阻害事由が存在する。また，甲６を加えても本件発明１を容易に想到できない以上，本件発明１を直接又は間接的に引用する本件発明５は，甲１ないし甲６に基づいて当業者が容易に想到できたものではない。甲１ないし甲６には，本件発明５のような条件について記載も示唆も存在しない。また，甲７を加えても本件発明１を容易に想到できない以上，本件発明１を直接又は間接的に引用する本件発明６〜７は，甲１ないし甲７に基づいて当業者が容易に想到できたものではない。本件発明１ないし７は，甲１ないし甲５及び周知技術を組合わせることにより，当業者が容易に想到し得るものではないので，本件発明８〜１０に係る核酸の合成用キットを想到する動機付けが存在しない。よって，本件発明８〜１０は，甲１ないし甲５及び周知技術を組合わせることにより，当業者が容易に想到し得るものではない（答弁書２４〜２７頁）。 
 　 
 （３）特許法第３６条第６項第１号及び同条第４項違反（無効理由３，４）に対し 
 　請求人は，無効理由３として，「二つのＯＰを必須の構成要件とはしていない本件発明１，２，３，６，８及び１０は，発明の詳細な説明において発明の課題を解決できることを当業者が認識できるように記載された範囲を超えているため，３６条６項１号の規定の要件を具備していない。」と主張し，無効理由４として，「二つのＯＰを必須の構成要件とはしていない本件発明１，２，３，６，８及び１０は，本件特許の明細書及び図面に記載された発明の実施についての教示と出願時の技術常識とに基づいて，当業者が実施しようとした場合に，どのように実施するかが理解できないため，３６条４項１号の規定の要件を具備していない。」と主張している（答弁書の４１頁）。 
 　しかし，本件発明１は，工程ａ）において提供される核酸を出発物質として，工程ａ）〜ｄ）を含む，「１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸」を合成する方法である。本件発明１の合成方法において，二つのＯＰは必須の構成要件ではないので請求項に記載する必要はない。本件特許の図２（７）から図３に例示された増幅機構又は図５（Ｂ）から図（６）において例示された増幅機構においてもアウタープライマー（ＯＰ）を使用していない（答弁書の４１〜４２頁）。 
 　請求人は，工程ａ）の鋳型について，「二つのＴＰを用いて合成されることが条件となるが，二つのＯＰの使用は必須となっていない。」と主張するが，上記のとおり，本件発明１は，工程ａ）の鋳型の合成方法に関するものではなく，かかる鋳型からの合成方法を特許請求の範囲とするものである。本件特許公報には，「本発明の特徴となっている，3'末端に同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールすることができる領域Ｆ１を備え，この領域Ｆ１が同一鎖上のＦ１ｃにアニールすることによって，塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成することができる核酸は，様々な方法によって得ることができる。」（段落【００２４】）とあり，核酸の合成方法を限定していない。したがって，請求人の主張は，本件発明１を誤解してなされたものであり，前提において誤りであるから，無効理由３及び４は理由がない（答弁書の４２頁）。 
 　 
 ＜証拠方法＞ 
 乙第１号証：「生化学辞典　第３版」第１刷１９９８年１０月８日，株式会社東京化学同人発行 
 乙第２号証：特願平１１−１７９０５６の審査経過における平成１５年１２月２４日付手続補正書 
 乙第３号証：特願平１１−１７９０５６の審査経過における平成１６年２月２７日起案の拒絶理由通知書 
 乙第４号証：特願平１１−１７９０５６の審査経過における平成１６年９月２日付意見書 
 乙第５号証：特願平１１−１７９０５６の審査経過における平成１７年１月１１日起案の拒絶査定 
 乙第６号証：特願平１１−１７９０５６の審査経過における平成１７年４月１８日付出願取下書 
 乙第７号証：平成２３年５月１１日付被請求人技術説明資料 
 乙第８号証：タカラバイオ株式会社のウェブサイト（http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100003529）のプリントアウト 
 　 
 第４　当審の判断 
 １　無効理由２（特許法第２９条の２違反）について 
 （１）本件発明と甲８の記載 
 ア　本件発明について 
 　本件発明１〜１０の構成要件は，上記第２のとおりである。また，本件明細書（本件特許公報）には，以下の記載がある。 
 　 
 　「【００１３】【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は，新規な原理に基づく核酸の合成方法を提供することである。より具体的には，低コストで効率的に配列に依存した核酸の合成を実現することができる方法を提供することである。すなわち，単一の酵素を用い，しかも等温反応条件の下でも核酸の合成と増幅を達成することができる方法の提供が，本発明の課題である。更に本発明は，公知の核酸合成反応原理では達成することが困難な高い特異性を実現することができる核酸の合成方法，並びにこの合成方法を応用した核酸の増幅方法の提供を課題とする。」 
 　 
 　「【００１６】【発明の実施の形態】本発明において合成の目的としている１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸とは，１本鎖上に互いに相補的な塩基配列を隣り合せに連結した核酸を意味する。更に本発明においては，相補的な塩基配列の間にループを形成するための塩基配列を含まなければならない。本発明においては，この配列をループ形成配列と呼ぶ。そして本発明によって合成される核酸は，実質的に前記ループ形成配列によって連結された互いに相補的な塩基配列で構成される。・・・」 
 　 
 　「【００２１】・・・へアピンループを形成させて自身を鋳型(template)とする相補鎖合成反応の報告は多いが，本発明においてはヘアピンループ部分に塩基対結合を可能とする領域を備えており，この領域を相補鎖合成に利用している点において新規である。・・・」 
 　 
 　「【００２３】本発明の特徴となっている，3'末端に同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールすることができる領域Ｆ１を備え，この領域Ｆ１が同一鎖上のＦ１ｃにアニールすることによって，塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成することができる核酸は，様々な方法によって得ることができる。もっとも望ましい態様においては，次の構造を持ったオリゴヌクレオチドを利用した相補鎖合成反応に基づいてその構造を与えることができる。 
 【００２４】すなわち本発明において有用なオリゴヌクレオチドとは，少なくとも以下の２つの領域Ｘ２およびＸ１ｃとで構成され，Ｘ２の5'側にＸ１ｃが連結されたオリゴヌクレオチドからなる。 
 Ｘ２：特定の塩基配列を持つ核酸の領域Ｘ２ｃに相補的な塩基配列を持つ領域 
 Ｘ１ｃ：特定の塩基配列を持つ核酸における領域Ｘ２ｃの5'側に位置する領域Ｘ１ｃと実質的に同じ塩基配列を持つ領域」 
 　 
 　「【００３６】本発明による核酸の合成方法において有用な上記オリゴヌクレオチドを利用し，鎖置換活性を持ったDNAポリメラーゼと組み合わせて合成を行う反応について，基本的な原理を図５−６を参考にしながら以下に説明する。上記オリゴヌクレオチド（図５におけるＦＡ）は，まずＸ２（Ｆ２に相当）が鋳型となる核酸にアニールし相補鎖合成の起点となる。図５においてはＦＡを起点として合成された相補鎖がアウタープライマー（Ｆ３）からの相補鎖合成（後述）によって置換され，１本鎖（図５−Ａ）となっている。得られた相補鎖に対して更に相補鎖合成を行うと，このとき図５−Ａの相補鎖として合成される核酸の3'末端部分は，本発明によるオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を持つ。つまり，本発明のオリゴヌクレオチドは，その5'末端部分に領域Ｘ１ｃ（Ｆ１ｃに相当）と同じ配列を持つことから，このとき合成される核酸の3'末端部分はその相補配列Ｘ１（Ｆ１）を持つことになる。図５は，Ｒ１を起点として合成された相補鎖がアウタープライマーＲ３を起点とする相補鎖合成によって置換される様子を示している。置換によって3'末端部分が塩基対結合が可能な状態となると，3'末端のＸ１（Ｆ１）は，同一鎖上のＸ１ｃ（Ｆ１ｃ）にアニールし，自己を鋳型とした伸長反応が進む（図５−Ｂ）。そしてその3'側に位置するＸ２ｃ（Ｆ２ｃ）を塩基対結合を伴わないループとして残す。このループには本発明によるオリゴヌクレオチドのＸ２（Ｆ２）がアニールし，これを合成起点とする相補鎖合成が行われる（図５−Ｂ）。このとき，先に合成された自身を鋳型とする相補鎖合成反応の生成物が，鎖置換反応によって置換され塩基対結合が可能な状態となる。 
 【００３７】本発明によるオリゴヌクレオチドを１種類，そしてこのオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖を鋳型として核酸合成を行うことが可能な任意のリバースプライマーを用いた基本的な構成によって，図６に示すような複数の核酸合成生成物を得ることができる。図６からわかるとおり，(D)が本発明において合成の目的となっている１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸である。他方の生成物(E)は，加熱変性などの処理によって１本鎖とすれば再び(D)を生成するための鋳型となる。また２本鎖状態にある核酸である生成物(D)は，もしも加熱変性などによって１本鎖にされた場合，もとの２本鎖とはならずに高い確率で同一鎖内部でのアニールが起きる。なぜならば，同じ融解温度(Tm)を持つ相補配列ならば，分子間(intermolecular)反応よりも分子内(intramolecular)反応のほうがはるかに優先的に進むためである。同一鎖上でアニールした生成物(D)に由来する１本鎖は，それぞれが同一鎖内でアニールして(B)の状態に戻るので，更にそれぞれが１分子づつの(D)と(E)を与える。これらの工程を繰り返すことによって，１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸を次々に合成していくことが可能である。１サイクルで生成される鋳型と生成物が指数的に増えていくので，たいへん効率的な反応となる。 
 【００３８】ところで図５−(A)の状態を実現するためには，はじめに合成された相補鎖を少なくともリバースプライマーがアニールする部分において塩基対結合が可能な状態にしなければならない。このステップは任意の方法によって達成することができる。すなわち，最初の鋳型に対して本発明のオリゴヌクレオチドがアニールする領域Ｆ２ｃよりも更に鋳型上で3'側の領域Ｆ３ｃにアニールするアウタープライマー（Ｆ３）を別に用意する。このアウタープライマーを合成起点として鎖置換型の相補鎖合成を触媒するポリメラーゼによって相補鎖合成を行えば，本発明の前記Ｆ２ｃを合成開始点として合成された相補鎖は置換され，やがてＲ１がアニールすべき領域Ｒ１ｃを塩基対結合が可能な状態とする（図５）。鎖置換反応を利用することによって，ここまでの反応を等温条件下で進行させることができる。」 
 　 
 　「【０１１０】・・・すなわち，本発明に基づくオリゴヌクレオチドを鋳型鎖とその相補鎖に対して適用することによって，１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸が連続して合成されるようになる。この反応は，原理的には合成に必要な出発材料が枯渇するまで続き，その間にループ部分から合成を開始した新たな核酸を生成し続ける。こうして，ループにアニールしたオリゴヌクレオチドからの伸長が，長い１本鎖核酸（すなわち，複数組の相補的な塩基配列が連結したもの）の伸長のための3'-OHを供給する鎖置換を行う。一方，長い１本鎖の3'-OHは自身を鋳型とする相補鎖合成反応を行うことによって自身の伸長を達成すると同時に，ループから合成開始した新たな相補鎖の置換を行う。このような増幅反応工程が，高い特異性を維持しながら等温条件下で進行する。」 
 　 
 　「【００５０】・・・すなわち本発明においては，１つの核酸の伸長に伴って，これとは別に伸長を開始する新たな核酸を供給しつづける反応が進行する。更に鎖が伸長するのに従い，末端のみならず，同一鎖上に複数のループ形成配列がもたらされる。これらのループ形成配列は，鎖置換合成反応により塩基対形成可能な状態となると，オリゴヌクレオチドがアニールし，新たな核酸の生成反応の基点となる。末端のみならず鎖の途中からの合成反応も組み合わされることにより，さらに効率のよい増幅反応が達成されるのである。・・・」 
 　 
 　「【００７４】本発明の望ましい態様によれば，1本の核酸鎖上に塩基対結合が可能な多数のループがもたらされる。このことは，核酸１分子に多数のプローブがハイブリダイズ可能なことを意味しており，感度の高い検出を可能とする。また感度のみならず，たとえば凝集反応のような特殊な反応原理に基づく核酸の検出方法を可能とするものでもある。」 
 　 
 　「【００７８】【実施例】〔実施例１〕 M13mp18内の領域の増幅 
 M13mp18を鋳型として，本発明による１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法を試みた。実験に使用したプライマーは，M13FA，M13RA，M13F3，そしてM13R3の４種類である。M13F3とM13R3は，それぞれM13FAとM13RAを合成起点として得られた第１の核酸を置換するためのアウタープライマーである。・・・ 
 【００７９】・・・ 
 【００８０】このようなプライマーによって，M13mp18の領域F1cからR1cにいたる領域とその相補的な塩基配列とが，F2cを含むループ形成配列を挟んで１本鎖上に交互に連結した核酸が合成される。これらのプライマーによる本発明による核酸の合成方法のための反応液組成を以下に示す。 
 【００８１】 
 反応液組成（２５μL中） 
 20mM Tris-HCl pH8.8 
 10mM KCl 
 10mM (NH4)2SO4 
 6mM MgSO4 
 0.1% Triton X-100 
 5% ジメチルスルホキシド(DMSO) 
 0.4mM dNTP 
 プライマー： 
 800nM M13FA／配列番号：１ 
 800nM M13RA／配列番号：２ 
 200nM M13F3／配列番号：３ 
 200nM M13R3／配列番号：４ 
 ターゲット：M13mp18 dsDNA ／配列番号：５ 
 反応：上記反応液を９５℃で５分間加熱し，ターゲットを変性させて１本鎖とした。反応液を氷水上に移し，Bst DNA ポリメラーゼ(NEW ENGLAND BioLabs)を４U 添加し，６５℃で１時間反応させた。反応後，８０℃１０分間で反応を停止し再び氷水上に移した。 
 反応の確認：上記反応液の５μL に１μLのloading bufferを添加し，２％アガロースゲル（0.5% TBE）を使って，１時間，80mVで電気泳動した。分子サイズマーカーとして，XIV(100bp ladder, Boehringer Mannheim製)を使用した。泳動後のゲルをSYBR Green I (Molecular Probes,Inc.)で染色して核酸を確認した。結果は図８に示すとおりである。各レーンは次のサンプルに対応している。 
 1. XIV size marker 
 2. 1fmol M13mp18 dsDNA 
 3. targetなし 
 【００８２】レーン３では未反応のプライマーが染色されている以外にバンドは確認されなかった。レーン２はターゲットが存在する場合，低サイズのバンドのラダーと高サイズでのスメアな染色，およびゲル内でほとんど泳動されていないバンドとして生成物が確認された。低サイズのバンドのうち，290bp，450bp付近のバンドは，それぞれ本発明の合成反応により予想される産物である，配列番号：１１および配列番号：１２が２本鎖となったもの（図２−(7)および図２−(10)が２本鎖となったものに相当）および配列番号：１３（図３−(9)にある長い１本鎖に相当）とサイズが一致することから，反応が予想されるとおりに進行していることが確認された。高サイズのスメアなパターン，および泳動されていないバンドは，本反応が基本的に連続的な反応であることから，反応産物が一定のサイズにはならないこと，そして部分的な１本鎖，あるいは２本鎖の複合体を形成した複雑な構造をともなっているため，結果としてこのような泳動結果を与えるものと考えられた。」 
 　 
 　「【００８３】〔実施例２〕 反応産物の制限酵素消化確認 
 実施例１で得られた本発明による１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の構造を明らかにすることを目的として，制限酵素による消化を行った。制限酵素を使った消化によって理論どおりの断片を生じる一方，実施例１で観察された高サイズのスメアなパターンや泳動されないバンドが消滅すれば，これらがいずれも本発明によって合成された１本鎖上に相補的な塩基配列を交互に連結した核酸であることが推定できる。 
 【００８４】実施例１の反応液を８本分（200μL）プールし，フェノール処理後，エタノール沈でんを行って精製した。この沈でんを回収して200μLのTE緩衝液で再溶解し，その10μLを制限酵素BamHI，PvuII，およびHindIIIでそれぞれ３７℃２時間消化した。消化物を2%アガロースゲル（0.5% TBE）を使って，１時間，80mVで電気泳動した。分子サイズマーカーとして，SUPER LADDER-LOW (100bp ladder)（Gensura Laboratories,Inc.製）を使用した。泳動後のゲルをSYBR Green I (Molecular Probes,Inc.)で染色して核酸を確認した。結果は図９に示すとおりである。各レーンは次のサンプルに対応している。 
 1. XIV size marker 
 2. 精製物のBamHI消化物 
 3. 精製物のPvuII消化物 
 4. 精製物のHindIII消化物 
 【００８５】ここで比較的鎖長の短い増幅生成物を構成している塩基配列は，配列番号：１３，配列番号：１４，配列番号：１５，および配列番号：１６等と推定される。これらの塩基配列から，推測される各制限酵素消化断片のサイズは表１のとおりである。表中のLは，ループ（１本鎖）を含む断片なので泳動位置が未確定であることを示す。 
 【００８６】【表１】本発明による増幅生成物の制限酵素消化断片 
 【００８７】未消化でのバンドのほとんどが消化後には推定されるサイズのバンドへ変化したことから，目的の反応産物が増幅されていることが確認された。また非特異的産物はほとんどないことも示された。」 
 　　 
 「（図面省略）」 
 　 
 イ　甲８の記載について 
 　甲８（特開２０００−３７１９４号公報）には，以下の記載がある。 
 　 
 　「【請求項１２】特定の核酸配列を非直線的に増幅するためのプロセスであって，以下の工程：該特定の核酸配列，該特定の核酸配列ついての第１の初期プライマーまたは核酸構築物であって，該第１の初期プライマーまたは核酸構築物が，以下の２つのセグメント：（Ａ）第１のセグメントであって，（ｉ）該特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり，そして（ｉｉ）テンプレート依存性の第１の伸長をし得る，セグメント，および，（Ｂ）第２のセグメントであって，（ｉ）該第１のセグメントに実質的に非同一であり，そして（ｉｉ）該特定の核酸配列の第２の部分に実質的に同一であり，（ｉｉｉ）該第２のセグメントの相補的配列に結合し得，そして（ｉｖ）第２のプライマー伸長が生成されて第１のプライマー伸長を置換するように，均衡または限定サイクリング条件下で，続く第２のプライマーまたは核酸構築物の第１のセグメントの，該特定の核酸配列の該第１の部分への結合を提供し得る，セグメント，を含む；ならびに，該特定の核酸配列の相補体に対する続く初期プライマーまたは核酸構築物であって，該続く初期プライマーまたは該核酸構築物が，以下の２つのセグメント，（Ａ）第１のセグメントであって，（ｉ）該特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり，そして（ｉｉ）テンプレート依存性の第１の伸長をし得る，セグメント，および，（Ｂ）第２のセグメントであって，（ｉ）該第１のセグメントに実質的に非同一であり，（ｉｉ）該特定の核酸配列の第２の部分に実質的に同一であり，（ｉｉｉ）該第２のセグメントの相補的配列に結合し得，そして（ｉｖ）第２のプライマー伸長が生成され，そして第１のプライマー伸長を置換するように，均衡または限定サイクリング条件下で，続くプライマーの第１のセグメントの，該特定の核酸配列の該第１の部分への結合を提供し得る，セグメント，を含む：ならびに基質，緩衝液，およびテンプレート依存性重合化酵素；を提供する工程：ならびに，均衡または限定サイクリング条件下で，該基質，緩衝液，またはテンプレート依存性重合化酵素の存在下で，該特定の核酸配列および該新規プライマーまたは核酸構築物をインキュベートし；それにより，該特定の核酸配列を非線形に増幅する，工程，を包含する，プロセス。」 
 　 
 　「【００１３】【発明が解決しようとする課題】本発明は，核酸増幅，核酸配列決定，および重要な特徴（例えば，低減した熱力学的安定性）を有する独特の核酸の生成に有用かつ応用可能である新規のプロセスを提供することを目的とする。」 
 　 
 　「【００９２】本発明の特定の局面において，新規のプライマーおよび核酸構築物が開示され，これらは，新規のプライマーまたは核酸構築物の少なくとも１つのセグメントが，適切な条件下で二次構造形成し得るという固有の特徴を有する。本発明において，二次構造の形成は，結合部位の再生を提供し得，その結果それらは，上記の外側調節因子のいずれも必要とせずに，新規のプライマーまたは核酸構築物の複数の結合および伸長のために使用され得る。」 
 　 
 　「【０１０３】（１つのステムループ形成プライマーとの直線的増幅）本発明の１つの局面において，特定の核酸配列の直線的増幅は，均衡または限定サイクリング条件下で，少なくとも２つのセグメントを有する新規の単一のプライマーまたは新規の単一の核酸構築物の使用によって行われる。・・・新規のプライマーおよび核酸構築物の第１セグメントは，標的核酸配列に存在する配列に実質的に相補的である配列を含む。新規のプライマーまたは核酸構築物の第２セグメントは，標的核酸に存在する配列に実質的に同一である配列を含む。新規の核酸構築物は，第１セグメントおよび第２セグメントの１つ以上のコピーを有し得る。新規のプライマーまたは核酸構築物のテンプレート依存性伸長は，自己ハイブリダイゼーションによって形成されるステムループ構造，ならびに新規のプライマーまたは核酸構築物を含む配列に同一または相補的でない伸長配列を有する産物を作製し得る。 
 【０１０４】この産物は，図１に例示される，連続する一連の以下の工程によって，形成され得る。新規のプライマーまたは核酸構築物のテンプレート依存性伸長は，この新規のプライマーまたは核酸構築物の第２セグメントを含む配列に相補的である伸長部分配列において生成する。これらの自己相補性領域は，テンプレートに結合しままであり得るか，または自己相補性構造を形成し得る。二次構造の形成は，テンプレートからの，伸長した新規のプライマーの第１セグメントの全てまたは一部の除去を提供し得る。このことは，別の初期プライマーが，テンプレートからの新規の第１伸長プライマーの除去の前に，テンプレート配列に結合することを可能にする。テンプレート上の第２プライマーの伸長は，テンプレートからの第１伸長プライマーの置換を導き得る。このことは，伸長プライマーの分離が，別の結合および伸長反応のためのテンプレートの使用の前に常に起こる先行技術とは対照的である。これらの手段によって，単一のテンプレートは，均衡条件下で，２つ以上の初期事象を提供し得る。さらに，この方法は，全ての温度が伸長産物およびそのテンプレートのＴｍのものを下回る，限定サイクル条件下で使用され得る。連続するプロセスにおいて，新規の第２伸長プライマーにおける二次構造の形成は，新規の第３プライマーの結合および続く伸長を提供し得る。このようにして，変性条件の非存在下において，本発明の新規のプロセスは，核酸テンプレートの単鎖からの多重プライミング，伸長，および遊離事象を提供し得る。さらに，これらの工程の全ては，均衡条件下で，同時および連続的に起こり得る。」 
 　 
 　「【０１０６】新規の伸長プライマーおよび核酸構築物の，自己相補性構造を形成する能力は，適切な条件下で実現化され得る。先行技術は，その特徴が短い相補性オリゴヌクレオチドの会合および解離が，温度，塩条件，塩基含有量，および相補配列の長さによって決定される平衡反応として生じることを示している。・・・相補性ＤＮＡの大きな方の鎖は，広範な条件にわたって容易に解離しない安定な立体配置における２本鎖分子として存在するが，それらは，鎖間結合の一時的および局在した弛緩を形成することが周知である。用語「呼吸」は，水素結合のこの局在化破壊を説明するために使用されている。パリンドローム配列を含む２本鎖ＤＮＡ分子における二次元構造を作製する「呼吸」のための経路は，Ａ．ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＴ．Ａ．Ｂａｋｅｒによって，「ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版」（１９９２）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ． ＮＹ，ＮＹ（その内容を本明細書中で参考として援用する）に記載されている。 
 【０１０７】本発明において，上記のように，線状２本鎖分子のセグメントの，鎖内ステムループ構造への転移は，プライマー開始事象を，伸長プライマーのそのテンプレートからの分離の前に起こることを可能にし得る。これらの２つの構造の間の平衡は，多数の要因に依存する。第１に，首尾良いプライマー結合のために，標的に結合する初期プライマーのセグメントは，反応に使用される温度で，安定なプライミングが可能であるように適切な長さおよび塩基組成でなければならない。第２に，初期プライマーの伸長後に自己ハイブリダイゼーションに関与するプライマーのセグメントは，適切な長さおよび塩基組成でなければならず，その結果伸長されたプライマーのテンプレートからの部分解離は，十分に安定な二次構造の形成（すなわち，ステムループ構造のステム）を可能にし得る。」 
 　 
 　「【０１３１】非直線的増幅産物は，均衡または限定条件下で，連続した一連の以下の工程によって，新規のプライマーおよび標準的なプライマーによって合成され得る。新規のプライマーは標的鎖に結合し，そして新規の単一プライマーとの直線的増幅について以前に記載されるのと，同じ一連の伸長，二次構造形成，プライマー結合部位の再生，第２結合，第２伸長，およびテンプレートからの第１伸長プライマーの分離が存在する。新規の伸長プライマーは，他方の新規のプライマーの連続する結合および伸長によって置換されるので，これらの１本鎖産物は標準的なプライマーに結合し得，そしてそれらを伸長させて，完全な２本鎖アンプリコンを作製し得る。この潜在的な一連の事象を，図２に示す。得られる２本鎖構造は一方の鎖において新規のプライマーについてのプライマー結合部位に相補的な配列と，および他方の鎖において新規のプライマーについてのプライマー結合部位に同一の配列と隣接する各鎖自己相補配列を含む。この結果として，各鎖は，アンプリコンの一方の末端で，ステムループ構造を形成し得る。次いで，１本鎖ループ構造におけるプライマー結合部位の露出は，図１において以前に示した同じプロセスによって，さらなる一連のプライマー結合および置換反応をもたらし，それにより均衡または限定サイクル条件下で，目的の配列の非直線的増幅の生成を可能にする。・・・」 
 　 
 　「【０１３３】非直線的増幅産物はまた，均衡または限定サイクル条件下で，２つの第１セグメントおよび１つの第２セグメントを含む新規の核酸構築物によって合成され得る。第１セグメントの各々は，核酸の鎖またはその相補体に相補的であり，そして第２セグメントは，第１セグメントの１つの伸長後に，二次構造を形成し得る。この構築物は，一対の相補的な潜在的ステムループ構造を有する産物を作製し得る。この産物は，連続する一連の以下の工程によって形成され得る。新規の構築物の１つの第１セグメントおよび１つの第２セグメントは，新規の単一プライマーによる直線的増幅について以前に記載されているのと同様の連続する一連の結合，伸長，二次構造形成，プライマー結合部位の再生，第２結合，第２伸長，および鎖分離工程を行い得る。さらに，この合成の産物は，一連の結合および伸長工程のためのテンプレートとして，新規のプライマーおよび標準的なプライマーでの非直線的増幅について上に記載されているような他方の第１セグメントによって使用され得る。これらの工程が作製し得る潜在的な一連の異なる形態は，図３および４に与えられる。この新規の構築物が潜在的に行い得る一連の事象は，以前に記載されたのと同じであり，そして図４に示される最終産物は，ともに結合したプライマーの２つの５'末端を有する図２の最終産物の位相的等価体である。」 
 　 
 　「【０１４４】これらの特徴によって，適切な標的分子の一方の鎖の存在は，新規の単一プライマーを非直線的増幅し得る自己複製核酸に変換し得る。本発明の新規の単一プライマーは，標的に結合し得，そして伸長のためのテンプレートとしてそれを利用する。・・・ 
 【０１４５】標的核酸の適切な鎖の存在によって直線状の新規のプライマーからこのような形態を合成するのに使用され得る一連の工程は，図９，１０，および１１に示される。新規のプライマーはテンプレートに結合し得，そして伸長して，図９の工程２の構造を形成し得る。」 
 　 
 　「【０１５６】・・・上記の鎖配置で２つの第１，第２，および第３セグメントを有する構築物の例は，図１３および図１５に与えられる。本発明のこの局面において使用される構築物は，図９，１０，および１１に例示された以前の局面に関連する。・・・それにより，図１３および１５の工程３は，単一テンプレート分子が，１つのみではなく２つの３'末端の伸長に使用されることを除いて，図９の工程２に等しい。・・・」 
 　 
 　「【０１５９】（反応の単純化および反応産物）本発明を含む全ての増幅において，反応の間にも起こり得る副反応が存在する。これらは，高分子量産物の複雑な多様性を形成し得る。それらは，所望の配列の合成の効率またはこれらの配列の検出の効率のいずれかを減少する点において有害であり得る。合成の効率の減少は，副反応が，所望の配列の合成の量を，ポリメラーゼおよび基質資源についての競合によって減少する場合に起こり得る。副反応はまた，適切な配列が合成されるが，反応のいくつかの工程に阻害的な二次構造にある場合，効率を減少し得る。このことは，プライマーの結合または伸長のいずれかを妨害する構造によって起こり得る。後者の場合において，プライムされたテンプレートを使用できないことに起因して，そして酵素が結合するが進行し得ない場合のポリメラーゼ活性の欠失にも起因して，効率が失われ得る。不適切な二次構造もまた，適切な配列の検出における問題を生じ得る。」 
 　 
 　「【０１７６】本発明はさらに，上記の種々のプロセスにおける使用のために組成物およびキットを意図しそして包含する。」 
 　 
 　「【０１７８】【実施例】（実施例１ ５３℃および６３℃でのＢｓｔポリメラーゼによるＰＣＲ産物の等温増幅） 
 （ｉ）ＨＢＶプラスミドＤＮＡのＰＣＲ増幅 
 ＨＢＶマイクロタイタープレートアッセイ・・・からのＨＢＶポジティブコントロールを，ＰＣＲによる増幅のための標的として使用した。・・・１ｕｌのＨＢＶ標的，１×ＰＥ緩衝液・・・，４ｍＭのＭｇＣｌ2，２５０ｕｍのｄＮＴＰ，６単位のアンプリサーム（Ａｍｐｌｉｔｈｅｒｍ）・・・ならびに１０ピコモルのＨＢＶオリゴプライマーＦＣおよびＲＣからなる５０ｕｌのＰＣＲ反応を実施した。 
 ＦＣ配列＝５’−ＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡ ＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧ ＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡ ＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ ＧＣＧＧＣＧＴＴＴ−３’ 
 ＲＣ配列＝５’−ＴＣＣＴＣＴＡＡＴＴ ＣＣＡＧＧＡＴＣＡＡ ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧ ＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡ ＴＧＧＴＣＣＣＧＴＡ−３’。 
 【０１７９】この実施例において，ＦＣプライマーの３’末端における２９塩基，およびＲＣプライマーの３’末端における３０塩基は，テンプレートとしてＨＢＶ標的ＤＮＡを使用して伸長し得る第１のセグメントである。ＦＣおよびＲＣプライマーの５’末端における３０塩基は，テンプレートとしてＨＢＶ ＤＮＡを使用して，プライマーの伸長によって合成された最初の３０塩基に相補的な第２のセグメントである。熱循環条件は，９４℃を１’，５６℃を１５”，および６８℃を３０”を３０サイクル行った。ＨＢＶ配列に基づいて，予想されたＰＣＲ産物は長さが２１１ｂｐであるべきである。ステムループ構造は，それぞれ，第２のセグメントおよびその相補体により与えられる３０塩基対のステム，ならびにＦＣおよびＲＣの第１のセグメントにより与えられる２９および３０塩基のループを伴って，この生成物のそれぞれの末端において起こり得る。 
 【０１８０】（ｉｉ）ＰＣＲ産物の分析 
 増幅は，０．５ｕｇ／ｍｌの臭化エチジウムの存在下で，０．５×ＴＢＥ緩衝液を用いて流した４％Ｍｅｔａｐｈｏｒアガロースゲル・・・中の１０ｕｌのサンプルのゲル電気泳動によってアッセイした。ＵＶ照射下で，３つのバンドが出現し，それらはＤＮＡサイズマーカーによる判定で，長さがおよそ２１０，１８０，および１７０ｂｐであった。２１０ｂｐに対応するバンドは，予想された線状ＰＣＲ産物であり，そしておそらく他の２つのバンドは，同じサイズのアンプリコンに対応しており，ここで，二次構造が一方または両方のいずれかの末端上で形成され，それによってそれらの効果的な移動度が変化している。 
 【０１８１】（ｉｉｉ）ＰＣＲ産物の等温増幅 
 上記のＰＣＲ産物の種々の希釈物５ｕｌは，１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液・・・，２００ｕＭのｄＮＴＰ，２０ピコモルの正方向および逆方向プライマー，８単位のＢｓｔポリメラーゼ・・・からなる１００ｕｌの反応混合物中で使用された。正方向プライマーはＦＣまたはＬＦＣのどちらかであり，逆方向プライマーはＲＣまたはＬＲＣのどちらかであった。ＦＣおよびＲＣプライマーの配列は上記に示した。ＬＦＣおよびＬＲＣプライマーは，ＦＣおよびＲＣプライマーだけの第１のセグメントに対応する配列を有している。そのような配列は以下のとおりである： 
 ＬＦＣ＝５’−ＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ ＧＣＧＧＣＧＴＴＴ−３’ 
 ＬＲＣ＝５’−ＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡ ＴＧＧＴＣＣＣＧＴＡ−３’。 
 【０１８２】インキュベーションは，３０分，１８０分，もしくは終夜のインキュベーションであった。反応温度は５３℃もしくは６３℃のどちらかであった。３０分反応したものは２％アガロースゲルを用いてゲル電気泳動で分析した；１８０分反応したものは４％Ｍｅｔａｐｈｏｒアガロースを用いて分析した。 
 【０１８３】この分析結果を図１７に示す。３０分インキュベーションの後に取り出したサンプルの最初の組の中で，ＰＣＲ産物の１０-2希釈物だけが５３℃でいくらかの合成を示すが，６３℃からの反応物は，１０-2，１０-3および１０-4希釈物で合成を示している。これらのデータは，合成量は加えた標的ＤＮＡの量に依存するということを示している。１８０分の合成の後に取り出されたサンプルの組では，実質的により多くの合成が行われている。これらの反応の生成物は，分離したパターンを形成する一連のバンドである。これは，通常ＰＣＲで見られる単一の分離したバンド，またはＰＣＲ増幅の後でＬＣおよびＲＣプライマーを用いて以前に見られた２つもしくは３つのバンドと対照をなしている。この複数のバンドは，おそらく，アンプリコンをプライマーおよびテンプレートとして機能させる二次構造の存在に起因し得るか，またはストランドスイッチングの徴候であり得る。５３℃で３時間インキュベーションした後，標的が少しもないようなコントロールでさえ，実質的な合成の証拠を示している。しかし，標的テンプレートを有するすべての５３℃の反応物に見られる，単一の標的依存性パターンが存在し，そして標的なしのコントロールに存在するパターンは実質的に異なることが留意され得る。これはおそらく標的が合成を開始した経路が異なっていることに起因する。６３℃でインキュベーションしたものは，全てのテンプレート希釈物で実質的な合成を示し，そして同じパターンが５３℃の反応によって生成されることを証明する。しかし，本実施例においては，６３℃では，標的非依存性増幅の証拠はない。１０-5の希釈でさえ実質的な量の合成があるということは，この系が実質的な増幅をし得ることを示している。終夜のインキュベーションもまたゲルによって分析され，そして３時間インキュベーションと同じパターンおよび同じ量を示した（データ表示なし）。」 
 　 
 　「【０１８４】（実施例２ ＨＢＶ配列の等温増幅の時間経過／感度） 
 （ｉ）増幅 
 Ｅｃｏ Ｒ１であらかじめ消化されたＨＢＶプラスミドＤＮＡを，等温増幅のテンプレートとして使用した。ＤＮＡ混合物は， ＦＣおよびＲＣプライマーがそれぞれ４０ｐＭ，１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液・・・および４×１０6，４×１０4，または０ ＨＢＶ分子を含む１００ｕｌからなった。これらはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ・・・製のサーモサイクラーモデル４８０を使用して５分間で９４℃まで熱した。次いで装置を６３℃で４８０分セットした。ブロックを６３℃に調節した後，酵素混合物２５ｕｌを含有する個々のチューブをサーモサイクラーブロックの中に置いた。それぞれの酵素混合物チューブは，４単位のＢｓｔポリメラーゼ・・・，１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液・・・，および４００ｕＭのｄＮＴＰを含有した。ＤＮＡ混合物，および酵素混合物を６３℃に調節した後，２５ｕｌのサンプルをそれぞれのＤＮＡ混合物から採取し，合計容量がそれぞれ５０ｕｌになるようにそれぞれの酵素混合物チューブに加えた。ＤＮＡ混合物のそれぞれのチューブ用として，３件のサンプルを採取した。それぞれのＤＮＡ濃度用についてひとつのサンプルを，２，４，および８時間後に６３℃のブロックの外に取り出した。 
 【０１８５】（ｉｉ）増幅のアッセイ 
 標的依存性増幅と標的非依存性増幅とを区別するために，マイクロタイタープレートアッセイを標的特異的配列の存在を検出するために使用した。このアッセイ用に使用される試薬および説明書は，ＬＣおよびＲＣプライマーによって作られたアンプリコンに特異的なプレートおよびシグナルプローブを置換して，ＥＮＺＯ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ・・・製のＨＢＶマイクロタイタープレートアッセイから得られた。 
 【０１８６】（ｉｉｉ）マイクロタイタープレートの調製 
 ・・・これらのプレートに使用した捕獲オリゴヌクレオチドの配列は，ＦＣおよびＲＣプライマーの間にあるＨＢＶの領域に由来し，そして以下のとおり記載される： 
 ５’−ＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴ ＴＡＴＴＧＧＴＴＣＴ ＴＣＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＧＴＡＴ−３’。 
 【０１８７】・・・ 
 【０１８８】（ｉｖ）プローブの調製 
 増幅のためのプライマーとして使用されるＲＣオリゴヌクレオチドは，プレートアッセイのためのシグナルプローブとしても使用される。ＲＣオリゴヌクレオチド１００ｕＭのＴ−テーリングは，ＥＮＺＯ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ・・・からの末端テーリングキットの使用によって達成された。テーリングしたＲＣオリゴヌクレオチド２６ｕｌを，シグナルプローブ緩衝液・・・１２．８ｍｌと混合した。 
 【０１８９】ｅ）反応物からのサンプルを用いたマイクロタイタープレートアッセイの結果を以下に示す： 
 ２時間 ４時間 ８時間 
 １×１０6標的 ０．４１３ １．４９１ １．４１９ 
 １×１０4標的 ０．２０３ ０．０９８ １．０１７ 
 標的なし ０．０８６ ０．０８５ ０．０６３ 
 上記に見られるように，生成物の量は，初期の標的の量および反応が進行する時間量の両方と関係があった。標的がないときに形成された任意の生成物から発生したシグナルもなかった。またこのアッセイでは１．４以上の値は飽和値であり，そして生成物の量は，はるかに大きくなり得る。・・・」 
 　 
 「（図面省略）」 
 　 
 （２）本件発明１〜７について 
 ア　対比 
 　甲８には，二つのＴＰを用いた核酸の増幅方法が記載されており，二つのＴＰを用いれば，図３のマル４に示す，3'端と5'端の双方にループが形成された核酸が生じ，図２のマル４からマル５への反応と同様の反応が，図３のマル４に示される核酸にも起こり，この核酸の3'末端側に位置するループに，図１のマル１のＴＰ及び図３のマル１のＴＰがアニールして非直線的な増幅反応が生じることは明らかである（段落【０１３１】【０１３３】，実施例１及び２）。 
 　そこで，本件発明１と甲８に記載された発明とを対比すると，甲８の図３のマル４に記載された「3'端と5'端の双方にループが形成された核酸」は，その形状及び性質から明らかであるように，本件発明１の「同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールすることができる領域Ｆ１を3'末端に備え，この領域Ｆ１がＦ１ｃにアニールすることによって，塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成することができる核酸」に相当する。また，この核酸は，１本鎖上に互いに相補的な塩基配列を隣り合わせに連結した核酸であり，相補的な塩基配列の間にループを形成しているから，本件発明１の「１本鎖上に互いに相補的な塩基配列が交互に連結された核酸」にも相当する。 
 　してみると，両者は，「ａ）同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールすることができる領域Ｆ１を3'末端に備え，この領域Ｆ１がＦ１ｃにアニールすることによって，塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成することができる核酸を与える工程を含む，１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成方法。」である点で一致し，以下の点で相違している。 
 　 
 ［相違点］本件発明１では，さらに，「ｂ）Ｆ１ｃにアニールしたＦ１の3'末端を合成起点として相補鎖合成を行う工程，ｃ）領域Ｆ２ｃに相補的な配列からなるＦ２を3'末端に含むオリゴヌクレオチドをアニールさせ，これを合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って，工程ｂ）で合成された相補鎖を置換する工程，ｄ）工程ｃ）で置換され塩基対結合が可能となった相補鎖における任意の領域に相補的な配列を3'末端に含むポリヌクレオチドをアニールさせ，その3'末端を合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って，工程ｃ）で合成された相補鎖を置換する工程」を含んでいるのに対し，甲８に記載された発明では，工程ｂ）〜ｄ）（特に，工程ｂ））を含むことが明記されていない点。 
 　 
 イ　当審の判断 
 ア）甲８の実施例１及び２について 
 　甲８の実施例１には，２つのＴＰを用いたＰＣＲ産物を鋳型として，２つのＴＰを用いた等温増幅が記載されている。そしてその結果として，図１７とともに「これらの反応の生成物は，分離したパターンを形成する一連のバンドである。これは，通常ＰＣＲで見られる単一の分離したバンド，またはＰＣＲ増幅の後でＬＣおよびＲＣプライマーを用いて以前に見られた２つもしくは３つのバンドと対照をなしている。」（段落【０１８３】）と記載され，いわゆるラダー状のバンドが得られたことが示されている。甲８の図３のマル４に示される核酸において，図２のマル４のように，ループ部にＴＰがハイブリダイズし，相補鎖が合成されただけでは，同じ分子量のものが得られるだけであるので，この結果は別の反応も起こり，分子量が大きな核酸も生成されている可能性が高いことが示されているといえる。 
 　この実施例１で用いられているＤＮＡポリメラーゼは，本件において用いられているものと同じ鎖置換相補鎖合成反応を触媒するＢｓｔポリメラーゼであり，プライマーの3'末端から相補鎖を合成するものである。そして，甲８の図３のマル４に示される核酸には，3'末端のステムループ構造の部分に，相補鎖の合成を開始しうる3'末端があることから，ここから相補鎖が合成され，E'FEDCBC'D'E'F'EやCB'C'D'E'F'EDCBC'なる構造の一本鎖となることが考えられる。そして，これらには，BやF'の配列からなるループ部があることから，ここにＴＰがハイブリダイズし，本件発明１の工程ｃ）の反応が続いて起きることになり，その結果，鎖置換されて生じた１本鎖の3'末端は，ステムループ構造となり，同様の反応が続くこととなり，分子量が段階的に増加したラダー状のバンドが得られた可能性がある。 
 　このように考えると，甲８の実施例１において，本件発明１で定められたと同じ工程の反応が起きている可能性はあるが，図１７は不鮮明であり，一連のバンドの分子量も確認できないものであり，また，図１７Ａと図１７Ｂでは，ゲル濃度も異なり，インキュベーションの時間による生成物の分子量の違いも確認できないものであり，確かに，本件発明１で定められたと同じ工程の反応が起きているとまでいえない。 
 　 
 　また，甲８の実施例２には，ＥｃｏＲ１であらかじめ消化されたＨＢＶプラスミドＤＮＡを鋳型として，２つのＴＰを用いた等温増幅が記載されている。本件の実施例１に記載される方法においては，２つのＴＰと２つのＯＰを用いているのに対し，甲８の実施例２においては２つのＴＰのみを用いている点が基本的に相違している。 
 　ところが，甲８のＴＰは，その図１に示されるように，本件のＯＰと同じ機能をするものであり，反応条件も本件の実施例１と同様であるから，本件の図２（７）以降の工程に違いが生じる特段の理由もなく，本件発明１で定められたと同じ工程の反応が起きている可能性はあるが，反応条件が全く同じではないために，確かに，本件発明１で定められたと同じ工程の反応が起きているとまでいえない。 
 　 
 イ）甲８の段落【０１８３】の記載について 
 　甲８の段落【０１８３】には，「この複数のバンドは，おそらく，アンプリコンをプライマーおよびテンプレートとして機能させる二次構造の存在に起因し得るか，またはストランドスイッチングの徴候であり得る。」（段落【０１８３】）と記載され，「おそらく」「起因し得るか，または」「兆候であり得る」のように，複数の原因を抽象的に記載し，推測のみが記載されているものであり，該記載から，複数のバンドが生じた原因が，3'末端のステムループ構造からの自己伸長反応であることを読み取ることはできないし，ましてや，この記載に自己伸長反応が記載されているとも認められない。 
 　そして，当業者が，甲８の記載から自己伸長反応が起こっているが理解できるのであれば，当業者である甲８の出願人がこのような曖昧な記載をすることは不自然であり，このことは甲８の記載から自己伸長反応が起きているとはいえないことを裏付けるものである。 
 　 
 　また，甲８の段落【０１５９】には，副反応により，高分子量産物の複雑な多様性を形成し得，有害であることが記載され，複数のバンドの形成自体，有害であると認識されていたものである。 
 　 
 ウ）甲８の段落【０１０６】【０１０７】などの記載について 
 　甲８の段落【０１０６】【０１０７】には，甲２を引用して，「呼吸」という現象を説明し，プライマーの結合について説明されているが，これは，甲８の図２のマル２からマル３へ変化する現象と，マル４のようにプライマーが結合することに関する説明であって，そこから，3'末端のステムループ構造からの自己伸長反応を読み取ることはできない。 
 　 
 　また，甲８のその他の記載をみても，そこから，3'末端のステムループ構造からの自己伸長反応が起こり，次いで，ループにＴＰがハイブリダイズし，鎖置換相補鎖合成反応が起こることを読み取ることはできない。 
 　 
 　さらに，本件発明１を理解した上で甲８をみれば，そのような反応が生じていると理解し得るかもしれないが，それは後付けの解釈であって，甲８の優先日時点で甲８の記載をみた当業者が該反応が生じていると理解するとはいえない。 
 　 
 エ）判断 
 　以上検討したところによれば，甲８の記載自体には，本件発明１が記載されていることにはならないし，また，その実施例１及び２においては，本件発明１と同様の増幅反応が起きている可能性はあるが，これは有害な反応と認識されているものであって，これを積極的に利用して，一本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の増幅をするという技術思想が，甲８に記載されているということはできない。 
 　よって，本件発明１は甲８に記載された発明と同一の発明ではない。そして，そうであれば，本件発明１を引用してさらに限定する本件発明２〜７も，甲８に記載された発明と同一の発明でないことは明らかである。 
 　 
 オ）付記 
 　請求人は，別の訴訟事件（平成21年（行ケ）第10107号）で，被請求人自身が，本件発明と甲８に記載された発明が同一発明であることを認めていると主張する。ところが，特許法第１５１条において準用する民事訴訟法第１７９条は，「裁判所において当事者が自白した事実及び顕著な事実」とあるのは「顕著な事実」と読み替えるものとされている。したがって，仮に本件において，被請求人自身が本件発明と甲８に記載された発明が同一発明であることを認めたとしても，認めたこと自体が，審決の基礎となり，本件特許が無効であるか否かの判断を左右するものではない。 
 　また，請求人は，本件特許公報にある記載を根拠に，被請求人はループ3'末端からの自己伸長反応が周知技術であることを認めていると主張するが，該記載は，従来技術の説明をしているだけであり，周知技術であることを認めているとは言い難く，そもそも本件特許公報に記載された技術内容が，甲８の優先日当時に当業者が知り得るものであったかどうかも確かではない。 
 　 
 （３）本件発明８〜１０について 
 ア　対比 
 　甲８には，標的核酸配列に存在する配列に実質的に相補的である配列である第１セグメントと，標的核酸に存在する配列に実質的に同一である配列である第２セグメントとを有する新規のプライマー(ＴＰ）を，均衡条件下で，基質，及びテンプレート依存性重合化酵素の存在下で，特定の核酸配列とともにインキュベーションし，該特定の核酸配列を非線形に増幅するプロセス及びそのためのキットが記載されている（【請求項１２】，段落【０１７６】）。そして，このプライマーの第２セグメントは，平衡反応によって，プライマーの伸長鎖における相補性領域と結合し，二次構造（ステムループ構造）を形成する（以下，「動的平衡」ともいう。）ので，プライマー結合部位が再生し，別のプライマーがテンプレートに結合できるようになることも記載されている（段落【０１０４】【０１０６】）。さらに，テンプレートに結合した別のプライマーの伸長は，テンプレートからの伸長プライマーの置換を導き，これによって直線的な増幅が可能になることも記載されている（段落【０１０３】【０１０４】）。また，図２に示されるように，前記置換によって得られた１本鎖産物は標準的なプライマー（ＰＣＲプライマー）と結合し，該プライマーを伸長させて，完全な２本鎖アンプリコンを作製すること，そして，アンプリコンの一方の末端で，ステムループ構造を形成し，それによってプライマー結合部位が露出するので，さらなる一連のプライマー結合及び置換反応がもたらされ，目的の配列の非直線的な増幅が可能になることも記載されている（段落【０１３１】）。 
 　ここで，本件発明８と甲８に記載された事項とを対比すると，甲８に記載の「第１セグメント」及び「第２セグメント」は，本件発明８の「Ｆ２ｃに相補的な塩基配列Ｆ２」及び「Ｆ１ｃと同一の塩基配列」にそれぞれ相当する。そして，甲８の図１又は２においてステムループ構造が形成されていることからみて，甲８の「第２セグメント」は「第１セグメント」の5'側に位置するものであると認められるから，甲８には，本件発明８の「i) 前記Ｆ２ｃに相補的な塩基配列Ｆ２を持つ領域の5'側に前記Ｆ１ｃと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチド」が記載されている。 
 　また，甲８に記載の「標準的プライマー」は，伸長プライマー（１本鎖産物）に結合するものであるから，本件発明８の「ii) i)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド」に相当する。 
 　さらに，甲８に記載の「テンプレート依存性重合化酵素」及び「基質」は，本件発明８の「v) 鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するDNAポリメラーゼ」及び「vi) 要素v)の基質となるヌクレオチド」にそれぞれ相当する。 
 　加えて，甲８（図１のマル１）に記載の核酸（鋳型）は，第１セグメントに相補的な塩基配列を有し，その核酸の5'側に第２セグメントと同一の塩基配列を有するものであるから，本件発明８の「領域Ｆ２ｃ，および領域Ｆ１ｃを3'側からこの順で含む鋳型核酸」に相当する。そして，甲８（図２のマル５）に記載された「アンプリコンの一方の末端にステムループが形成された核酸」は，１本鎖上に互いに相補的な塩基配列を隣り合わせに連結した核酸であり，相補的な塩基配列の間にループを形成しているから，本件発明８の「１本鎖上に互いに相補的な塩基配列が交互に連結された核酸」に相当し，また，甲８に記載の「増幅するプロセス」は，本件発明８の「核酸の合成」に相当する。 
 　してみると，両者は，「以下の要素を含む，１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成用キット。 
 　領域Ｆ２ｃ，および領域Ｆ１ｃを3'側からこの順で含む鋳型核酸に対し， 
 i) 前記Ｆ２ｃに相補的な塩基配列Ｆ２を持つ領域の5'側に前記Ｆ１ｃと同一の塩基配列を持つ領域を連結して含むオリゴヌクレオチド 
 ii) i)のオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド 
 v) 鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するDNAポリメラーゼ，および 
 vi) 要素v)の基質となるヌクレオチド」である点で一致し，以下の点で相違している。 
 　 
 ［相違点］本件発明８では，さらに，該鋳型核酸において，領域Ｆ２ｃの3'側に領域Ｆ３ｃが含まれており，ＯＰとして「iii) 前記Ｆ３ｃに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド，iv) i)のオリゴヌクレオチドを合成起点として合成された相補鎖における任意の領域Ｒ２ｃの3'側に位置する領域Ｒ３ｃに相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチド」を含んでいるのに対し，甲８に記載された発明では，このような領域Ｆ３ｃや前記iii)及びiv)のオリゴヌクレオチド（ＯＰ）を含むことが記載されていない点。 
 　 
 イ　判断 
 　上記の点が相違しており，この点は，課題解決のための具体化手段における微差とはいえないから，本件発明８が甲８に記載された発明と同一のものであるとはいえない。そして，請求人が，本件発明８が甲８に記載された発明と同一のものであるとする主張について，採用できない理由は以下の通りである。 
 　 
 ア）甲８においてＯＰを用いることは微差との主張（主張カ） 
 　甲８では，図１に示されるように，動的平衡を利用して二次構造を形成し，これにより新たなプライマー結合部位を再生して，テンプレートからの伸長生成物の置換及び分離を行って直線的増幅をしており，ＯＰは使用されていない。ＴＰに加えてさらにＯＰを用いれば，ＯＰから伸びた鎖は，動的平衡によりループを形成することができなくなるから，直線的増幅ができなくなることは明らかである。 
 　ＯＰの使用が周知技術であるとしても，ＯＰの使用は，甲８の課題に反するものであって，甲８の増幅反応にＯＰを使用することは，課題解決のための微差にすぎないとは到底いえない。 
 　 
 イ）甲６の図１３のマル２にＯＰの変形例があるとの主張（主張カ） 
 　本件特許の請求項８の記載を素直に読む限り，i）〜iv）のオリゴヌクレオチドはそれぞれ別のオリゴヌクレオチドであると解されるものである。また，甲８の図１３に記載されたオリゴヌクレオチドは，5'末端で２つのオリゴヌクレオチドが連結され，２つの3'末端を有するという特殊な分子であり，特許請求の範囲に記載された用語の通常の理解によって当業者が想定できるものに当たらない。さらに，甲８の図１３のものを本件発明８のＴＰ及びＯＰとして用いたとしても，マル４の鋳型において合成される相補鎖は(5')ａｂｃｄｂ’ａ’ｃ(3')となり，3'末端のｃによって自己伸長反応を開始できるステムループ構造を形成しないものとなるため，本件発明８のＴＰ及びＯＰとは相違するものであることは明らかである。 
 　また，本件明細書の全体を参酌すれば，ＯＰの目的が，鎖置換相補鎖合成によって伸長生成物を分離することにあることは明らかであり，図１３のマル４〜マル７の記載からわかるように，図１３は鎖置換合成反応を意図していないものであるから，このような目的を達成しないＯＰが特許請求の範囲に含まれていると解釈する余地はない。 
 　さらに，甲８の段落【０１４４】【０１４５】【０１５６】の記載から明らかなように，図１３のプライマーは単一のプライマーとして用いることを意図しているものであるから，この点でも，複数のプライマーを用いる本件発明８のものとは相違している。 
 　したがって，図１３のマル２のオリゴヌクレオチドは，ＯＰを示すものではなく，甲８にＯＰの変形例があるとは認められない。 
 　 
 ウ）別件での被請求人の主張が，本件特許の無効と関係するとの主張（主張オ） 
 　上記（２）のオ）付記のとおり。 
 　 
 　よって，本件発明８は甲８に記載された発明と同一の発明ではない。そして，そうであれば，本件発明８を引用してさらに限定する本件発明９〜１０も，甲８に記載された発明と同一の発明でないことは明らかである。 
 　 
 （４）小括 
 　以上のとおり，請求人の主張に理由があるとはいえず，本件発明１〜１０に係る発明についての特許は，特許法第２９条の２の規定に違反してされたものとはいえない。 
 　 
 ２　無効理由１（特許法第２９条２項違反）について 
 （１）本件発明と引用例の記載 
 ア　本件発明について 
 　本件発明１〜１０の構成要件は，上記第２のとおりである。また，本件明細書（本件特許公報）に記載された事項については，上記１（１）アのとおりである。 
 　 
 イ　甲１の記載について 
 　甲１（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.266, No.21, pp.14031-14038, 1991）には，以下の事項が記載されている。 
 　 
 「観察に基づき，スナップバック（snap-back）ＤＮＡ合成における増幅に対し，図８のモデルを提案する。 
 　工程１　Ｔ４ホロ酵素が，スナップバック機構により，直鎖ssＤＮＡ鋳型を複製する。この反応の生成物は，長い二本鎖のヘアピンであり，それは，出発物質である直鎖ssＤＮＡに対して相同である。 
 　工程２　uvsXタンパク質が，工程１における直鎖ssＤＮＡ分子と二本鎖ヘアピン生成物との間の結合を触媒する。uvsＸタンパク質（６）によって触媒されるＤＮＡ分岐点移動の，５'から３'への方向性（ssＤＮＡへの侵入に関する）により，前記ssＤＮＡの３'末端は，Ｄ-ループ構造に組み込まれ，そこで，ＤＮＡ複製を開始できる状態を保つ６。 
 　工程３および４　このように開始されるＤＮＡ合成により，Ｄ-ループ中間体を，ダイマー長の直鎖二本鎖に分解し，前記直鎖二本鎖は複製開始ＤＮＡ合成における鋳型としてもよい（工程５）。 
 　工程５及び６　uvsＸタンパク質が直鎖ssＤＮＡ分子（出発物質）と二本鎖の二量体中間体の相同性タンパク質との間のシナプシスを触媒し，ＤＮＡ合成を開始する。ＤＮＡバブル移動機構（１３）によるこの鋳型の複製によって，内部相補的であり，急速に復元するダイマー長の直鎖ssＤＮＡ分子が生じる。 
 　工程７　この生成物の復元によって，工程１と同一のヘアピン構造が形成される。そして，これらの生成物は新たなＤＮＡ合成に用いてもよく，それによって，これらの生成物は増幅される。」（１４０３７頁右欄２８〜５４行） 
 　 
 「図８　Ｔ４ｕｖｓＸタンパク質の複製開始活性に基づく，前記タンパク質によるスナップバック（snap-back）ＤＮＡ合成の増幅モデル。ｕｖｓＸが触媒する，直線ｓｓＤＮＡプライマー／テンプレートと，スナップバック複製のｄｓＤＮＡ産物との再結合が，スナップバック産物と同じ配列を持つ２倍の長さの二重鎖を産生するＤＮＡ合成を開始する。このテンプレートにおける再結合で開始されたＤＮＡ合成は，スナップバック産物の産生を増幅させる。詳細は，ディスカッションを参照。」（１４０３７頁左欄１〜８行） 
 　　 
 「（図面省略）」 
 　 
 「最後に，snap-backのＤＮＡ合成反応は，比較的シンプルな，試験管内システムにおいて，高い精度のＤＮＡポリメラーゼを用いて実施されるＤＮＡの等温増幅プロセスの一例である。」（１４０３８頁右欄１３〜１６行） 
 　 
 ウ　甲２の記載について 
 　甲２（“DNA REPLICATION SECOND EDITION”, ARTHUR KORNBERG,TANIA A BAKR, W.H.FREEMAN AND COMPANY,1992 pp.700-704, pp.713-716, pp.492-493 pp.504)には，以下の事項が記載されている。 
 　 
 　「一般に，自律的ウイルスは，mRNAの相補鎖をカプシドに包んでいる。一方，AAVは，(+)鎖と(−)鎖のどちらかを同じ頻度で別々の粒子としてパッケージしている。このウイルス粒子からの放出時に，相補鎖は直鎖状二重鎖を形成するようにアニールできる。パルボウイルスのDNAの鎖端は，自己アニーリングによるさまざまなヘアピン構造を形成できるように反転して末端繰り返し配列を持っている（図19-6）。」（７０１頁１〜６行） 
 　 
 　「図19-6　AAVの提案モデル。A，A’，B，B’などの文字は，末端繰り返し配列を示している。(1) ウイルス鎖。鎖の形成しうる四つの末端構造のうち，三つは大括弧内に示されている。(2)　ヘアピンループは，相補鎖合成を開始し，二本鎖複製型をつくる。（右の直線分画におけるBとCの間の距離は，左の折り返し型の距離と同じであるはずである。）ニック（矢印）は，親鎖の3’端の反対側に起こる。(3)　ニックとニックからの鎖伸長反応の結果，ヘアピンの転移がおこる。(4) 末端ヘアピンの再構成により，どちらかの末端にひとしく3’プライマー末端が作られる。(5) その3’プライマー末端からの(DNAが)合成されることで，1ユニット分の長さのゲノムが置換される。(6)　1ラウンドの置換合成反応が完了することにより，置換された一本鎖が（（この鎖は）ステップ1記載にあるように，相補鎖合成のスタート準備ができている），そして，ヘアピン転移反応と鎖置換反応の他のラウンドが起こりうる二本鎖分子（（この鎖は）ステップ2の初めに記載）が，結果として生じる。（Berns KI, Hauswirth WW (1982) ウイルスDNAの構成と複製（カプランA編）。CRC出版，クリーブランド，25ページ）」（７０１頁図19-6の説明） 
 　 
 　「末端配列は，ヘアピンのプライミングとヘアピンループの転移のための基礎となる（図19-6）42。AAVの各々の鎖における四つの可能な末端配列の組み合わせは同じ割合で見つかっており，このことは，末端配列の特定の方向性には，バイアスがないということを示している。反転は，ウイルス粒子のAAV鎖の3’末端に起こらないので，複雑な複製も出るが推測できる。 
 　親と子孫の双方の細胞内複製中間体43における末期のクロス結合分子は，5’端配列を複製するための末端ヘアピン鎖からの（複製）開始とヘアピンループの転移メカニズムに一致している。双方の鎖の合成が，5’から3’方向の鎖置換機構による継続的伸長反応によって起こる。感染したウイルスの一本鎖からの親の複製型（DNA分子）の初期合成におけるように，置換された一本鎖は，カプシドに包まれるか，または，相補鎖の合成によって，複製型にもどされ，リサイクルされる（図19-6）。」（７０２頁２１〜３４行） 　 
 「（図面省略）」 
 　 
 　「図19-12　牛痘ウイルスDNAの複製モデル。一方の端のループ領域で開始する複製は，ヘアピンループ機構により，そこから直線状のゲノムが遊離してサイクルが回るところのコンカテマーをつくるために一方向的に進行する（左の経路）。両端から始まる複製は，直線状ゲノムを直接産生する（右の経路）[After Moss B (1990) in Virology (Fields BN, Knipe DM, eds.). Raven Press, New York, p2079]」（７１６頁図19-12の説明） 
 　 
 　「適切な時間に，いくつかの場所で鋳型環が開くことが完全な二本鎖を作るのに必要とされる。おそらく，パリンドローム配列が折り返して，最終的に環状ウイルスの子孫DNA分子を作るヘアピンを作る。ニッキングと結合酵素は，ゲノムを完成させるための分子内結合の原因となるものかもしれない。」（７１６頁１〜５行） 
 　 
 　「１本鎖鋳型（図15-3a）が，ストランド内塩基対形成によりループをして折り返すと（図15-3b），前記一本鎖鋳型の3'-OH末端から新たな鎖が開始し得る。前記3'末端におけるすべての塩基対非形成領域は，塩基対形成されたプライマー末端に至るまで3'−5'エキソヌクレアーゼにより加水分解され（図15-3c），その後，鎖伸長が進行する（図15-3d）。エキソヌクレアーゼIIIは，二本鎖生成物の3'末端に攻撃することで，新たに合成された鎖を除去する（図15-3e及び15-4a）。一方，ファージλエキソヌクレアーゼ（セクション13-3）は，5'末端において働くことで，鋳型ヌクレオチドのみを除去する（図15-3f及び15-4），エキソIII及びλエキソが，二本鎖ＤＮＡに対してのみ働く限り，鋳型又は生産物の一部は，消化されずに残される。一本鎖への変換により，前記ＤＮＡは，再度，一本鎖特異性エキソヌクレアーゼ（例えば，エキソＩ）に対し感受性となる。 
 　この段階におけるヘアピン形成（図15-3g）に加え，その後，非塩基対形成の3'末端を3'−5'エキソヌクレアーゼで除去し，塩基対形成末端をλエキソで除去する（図15-3h）ことで，ポリメラーゼによる合成の開始が，再度可能とある（図15-3i）。さらに別の，λエキソ消化，アニーリング，3'−5'エキソ消化及びポリメラーゼ作用の過程（図15-3j）により，最初の鋳型を完全に消化して置き換えることができる。」（４９２頁２８行〜４３行） 
 　 
 　「図15-3　一本鎖DNAがT4ポリメラーゼに対し「ヘアピン」鋳型プライマーとして働く場合のスキームであり，ポリメラーゼ生成物に対する種々のエキソヌクレアーゼの作用により示している。［After Goulian M, Lucas ZJ, Kornberg A (1968) JBC 243:627］」（４９３頁図15-3の説明） 
 　 
 　「末端パリンドロームの使用に基づく，真核における染色体の複製のモデルである。［Tattersall P, Ward DC(1976) Nature 263:106］」（５０４頁図15-7の説明） 
 　 
 エ　甲３の記載について 
 甲３（ＷＯ　９６／０１３２７）には，以下の事項が記載されている。 
 　 
 　「本発明は，ＤＮＡポリメラーゼによる核酸標的配列の増幅方法であって，標的配列と特異的にハイブリダイズできる部分（3'），及び少なくとも１つの逆方向反復配列を含む部分（5'）からなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を利用することを特徴とする方法に関する。」（４頁２８〜３５行） 
 　 
 　「逆方向反復配列（またはパリンドローム配列ともいう）により，ヘアピン形状の二本鎖構造を形成するための自己プライミングが可能になる。」（５頁２９〜３２行） 
 　 
 　「実際，熱撹拌の効果により，ＤＮＡの二本鎖の末端のパリンドローム配列は，２つの形成の間の動的平衡にある：すなわち，通常の二本鎖⇔二本ヘアピンである（図5h及び5i）。 
 　ＤＮＡポリメラーゼは，二本ピンに折り曲げられた鎖の一方の末端3'に結合され，かつ折り曲げられた末端をプライマーとして用いて，鎖の一方の複製を開始することができる（図5j）。ＤＮＡポリメラーゼは，そうすることで，相補的鎖を移動させ，かつ２つの鎖は温度上昇を行うことを必要とせず，このようにして分離される（図5j）。このステップから，鎖の一方は，新規なプライマーP2とハイブリダイズして，新規な複製サイクルを開始することができる（図5f）。他方は，各サイクルで，その長さは理論上二倍になるサイズの増大を受ける（図5k，5l，5m）。 
 　反応の間中一定に維持される反応温度は，プライマーのハイブリダイゼーション，広げた形状及びヘアピン状に折り曲げられた形状の間の逆方向反復配列の平衡，及び他方で選択したポリメラーゼによる鎖の伸長を可能にするように選択される。一般的に，この温度は，45-75℃であり，好ましくは50-65℃である。」（７頁３１行〜８頁２０行） 
 　 
 「（図面省略）」 
 　 
 オ　甲４の記載について 
 甲４（ＷＯ　９７／０４１３１）には，以下の事項が記載されている。 
 　 
 　「他の好ましい態様において，図17に示す通り，ヘアピンDNAは，標的ポリヌクレオチド上でのプライマー（プローブ）の伸長によって得られる。AからＤの領域の一本鎖の標的ポリヌクレオチドを，パネルＡに示す。前記プローブの３’末端は，前記標的ポリヌクレオチドの領域Ａに相補的な配列である。前記プローブの５’末端は，前記標的ポリヌクレオチドの領域Ｂと同一の配列である。前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖の場合，それを，一本鎖の標的を産生するために変性させる。その後，前記プローブを前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる（図17，パネルＡ）。そして，少なくとも前記標的ポリヌクレオチドの領域Ｄの５’末端に伸長させた状態で，前記プローブを鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼに接触させる（図17，パネルＢ）。変性は，図Ｃ（注：「パネルＣ」の誤記と思われる。）の伸長生成物を産生する鎖分離を引き起こす。この伸長生成物は，5' 末端が牧杖形状をしており，プライマーＤを用いて増幅できる。前述のとおり，前記プライマーＤは，図17，パネルＤに示す生成物を産生するために，伸長生成領域Ｄ’に相補的である。」（２３頁第５行〜２３行） 
 　 
 　「（図面省略）」 
 　 
 カ　甲５の記載について 
 　甲５（特開平７−２８９２９８号公報）には，以下の事項が記載されている。 
 　 
 　「【目的】 好熱性ポリメラーゼおよび好熱性制限エンドヌクレアーゼの両方が同一の反応混合物中で効率的に機能する等温鎖置換増幅法（好熱ＳＤＡ）の温度条件および反応条件を提供する。 
 【構成】 本発明は，通常のＳＤＡより広い温度範囲（３７−７０℃）で実施しうる好熱ＳＤＡを提供する。好熱ＳＤＡに好ましい温度範囲は５０−７０℃である。特定の好熱性制限エンドヌクレアーゼがＳＤＡに要求される半修飾された制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位をニックし，次いでその部位から解離しうることが見出された。さらに特定の好熱性ポリメラーゼはそのニックから伸長させ，一方では下流の鎖を置換しうることが見出された。これらの知見から，好熱ＳＤＡは通常のＳＤＡ酵素系につき従来可能であったものより高い温度で実施しうるため，向上した特異性および効率，減少した非特異的バックグラウンド増幅，ならびに潜在的に向上した増幅生成物収率を有する。さらに，変性温度で安定な酵素を用いる場合，二本鎖標的の初期の熱変性後に別個の工程で酵素を添加する必要性が除かれる。」 
 　 
 　「【請求項５】 標的配列を含む二本鎖フラグメントが下記を含む方法により生成する，請求項４に記載の方法： 
 ａ）標的配列を含む核酸フラグメントに第１および第２増幅プライマーを結合させ，第１および第２増幅プライマーは核酸フラグメントの対向鎖上の標的配列の３′側に結合し； 
 ｂ）フラグメント上の第１および第２増幅プライマーを伸長させ，これにより，第１増幅プライマーの第１伸長生成物および第２増幅プライマーの第２伸長生成物を産生させ； 
 ｃ）第１および第２バンパープライマーを伸長させることにより第１および第２伸長生成物を置換し，そして； 
 ｄ）置換された第１および第２伸長生成物に対する相補鎖を誘導デオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下に合成し，これによりＳＤＡによって増幅しうる標的配列を含む二本鎖フラグメントが生成する。」 
 　 
 　「【０００９】バンパー（ｂｕｍｐｅｒ）プライマーまたはエクスターナル（ｅｘｔｅｒｎａｌ）プライマーは，増幅プライマーより上流で標的配列にアニールし，従ってバンパープライマーの伸長によって下流の増幅プライマーおよびその伸長生成物が置換される。バンパープライマーの伸長は，増幅プライマーの伸長生成物を置換するための１方法であるが，加熱も適している。」 
 　 
 　「【００１４】ＳＤＡによって増幅するための標的は，標的配列を切断しないエンドヌクレアーゼで，より大型核酸をフラグメント化することによって調製しうる。しかし一般に，ＳＤＡ反応におけるニッキングのために選ばれる制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を有する標的核酸を，ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら（１９９２．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，前掲，および米国特許第５，２７０，１８４号明細書（本明細書に参考として引用する）の記載に従って製造することが好ましい。簡単に述べると，標的配列が二本鎖である場合，４つのプライマーがそれにハイブリダイズする。２つのプライマー（Ｓ1およびＳ2）はＳＤＡ増幅プライマーであり，２つのプライマー（Ｂ1およびＢ2）はエクスターナルまたはバンパープライマーである。Ｓ1およびＳ2は，標的配列をフランキングする二本鎖核酸の対向鎖に結合する。Ｂ1およびＢ2は，それぞれＳ1およびＳ2の５′側（すなわち上流）の標的配列に結合する。次いでエキソヌクレアーゼ欠如ポリメラーゼを用いて，３種類のデオキシヌクレオシドトリホスフェートおよび少なくとも１種類の修飾デオキシヌクレオシドトリホスフェート（たとえば２′−デオキシアデノシン−５′−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）“ｄＡＴＰαＳ”）の存在下に，４つのプライマーすべてを同時に伸長させる。これによりＳ1およびＳ2の伸長生成物は，Ｂ1およびＢ2の伸長によって元の標的配列鋳型から置換される。置換された増幅プライマーの一本鎖伸長生成物は対向する増幅およびバンパープライマーの結合の標的となり（たとえばＳ1の伸長生成物はＳ2およびＢ2に結合する），次の伸長および置換のサイクルの結果，それぞれの末端に半修飾された制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を備えた２つの二本鎖核酸フラグメントが得られる。これらはＳＤＡによる増幅に適した基質である。ＳＤＡの場合と同様に，標的生成反応の各段階は同時かつ連続的に起こり，ＳＤＡにおける制限酵素によるニッキングに必要な認識／開裂部位を末端に備えた標的配列が生成する。ＳＤＡ反応のすべての成分が既に標的生成反応に存在するので，標的配列は自動的に生成し，かつ連続的にＳＤＡサイクルに入り，そして増幅される。」 
 　 
 「（図面省略）」 
 　 
 （２）本件発明１〜７について 
 ア　対比・判断 
 　上記１（１）アの記載によれば，本件発明１は，単一の酵素を用い，等温反応条件下で核酸を合成及び増幅する方法の提供を課題とし，このような課題を解決する方法として，3'末端においてヘアピンループが形成される核酸を与え，3'末端のヘアピンループは自身を鋳型とする相補鎖合成を行うと共に，該ヘアピンループ部分にもオリゴヌクレオチド（プライマー）をアニールさせて，この領域も相補鎖合成の起点として利用し，互いに伸長された鎖を置換し合って１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸を合成及び増幅させるという発明であると認められる。 
 　一方，甲１に記載された発明は，uvsXリコンビナーゼの組換え反応に依存する，Ｔ４ホロ酵素を用いたスナップバックＤＮＡ増幅機構を開発することを課題とするものであり，その増幅機構は図８に記述されるように，Ｔ４ホロ酵素がスナップバック機構により中央にヘアピンを有する長い二本鎖ＤＮＡを合成し，これに二重鎖ＤＮＡに相同な直鎖ｓｓＤＮＡがuvsXリコンビナーゼの作用によって侵入し，該直鎖ｓｓＤＮＡがプライマーとして機能し相補鎖合成を行って鎖置換反応を行うというものである。 
 　そこで，本件発明１と甲１に記載された発明とを対比すると，甲１には，3'末端や5'末端においてループが形成されることは記載されておらず，ループの3'末端を合成起点として自己を鋳型とする相補鎖合成は記載されていない。また，甲１には，中央部のヘアピン構造に直鎖ｓｓＤＮＡが侵入し，結果としてＤループ構造が形成されることは記載されているが，本件発明１のように，3'末端側にループ構造を形成した上で，これにオリゴヌクレオチドをアニールさせて，相補鎖合成を行うことは記載されていない。また，「アニーリング」とは，加熱やアルカリ条件下で１本鎖ＤＮＡに変性したものを，徐冷や中和により再び水素結合を形成させ，元の二本鎖ＤＮＡに戻すことを意味するから，酵素の作用により結合させることは通常含まれない。してみると，甲１における直鎖ｓｓＤＮＡの侵入は，uvsXリコンビナーゼの触媒作用による組換え反応であって，アニーリングと呼べるものではない。そして，ステップ４を経て得られる核酸は二本鎖であって，本件発明１のように，3'末端が塩基対結合が可能な状態とはなっていないものである。 
 　以上のとおり，甲１は，解決課題及び課題解決手段において，特に工程ｃ）において，本件発明１とは全く異なる発明であり，請求人が主張するようなループ部分にプライマーをアニールさせることも記載されていない。 
 　請求人はこの点について，甲１はuvsXリコンビナーゼにより，プライマーをループにアニールさせているが，甲１の３から明らかなように，uvsXタンパク質がなくても，フリーループを形成すれば，１本鎖となったループにプライマーがアニールすることは周知技術であることを主張しているが，甲１においては，ステップ２のみならず，ステップ５においてもuvsXタンパク質の作用を利用しているのであるから，甲１の３のようにフリーループを形成して，uvsXタンパク質を用いないようにすれば，ステップ５の反応は起こらなくなり，増幅することはなくなるから，当業者であれば，甲１に記載された鋳型に，フリーループを形成するようなことはするはずがないものである。 
 　 
 　次に，甲２〜甲４について検討する。　 
 　甲２に記載された発明は，種々のウイルスの生体内におけるＤＮＡ複製機構を明らかにすることを課題とするものであり，例えば，アデノ随伴ウイルスの増幅機構は，図19-6に詳述されているが，3'末端と5'末端の双方にループが形成された１本鎖核酸（鋳型）において，その3'末端から自己を鋳型とする相補鎖合成が開始され，二本鎖の複製型が一旦形成され，その親鎖の3'端の反対側でニックが生じ，ニックからの伸長反応の結果，ヘアピン構造への転移が生じ，末端ヘアピンの再構成によって，どちらかの末端に3'末端が形成され，当該末端からの自己を鋳型とする相補鎖合成によって，次の新しい鋳型が提供されるというものである。 
 　ところが，3'末端側に位置するループ部分にプライマーをアニールさせることは甲２のどこにも記載されていない。 
 　甲３に記載された発明は，ヘアピン構造を形成し得るプライマーを使用し，核酸を等温増幅する方法の提供を課題とするものであり，二本鎖ＤＮＡの末端にあるパリンドローム配列は動的平衡によってヘアピン構造を形成し，折り曲げられた末端はプライマーとして機能し，自己を鋳型とする相補鎖合成を行って，核酸の伸長反応が継続的に生じるこというものである。 
 　この甲３にも，3'末端側に位置するループ部分にプライマーをアニールさせることはどこにも記載されていない。 
 　甲４に記載された発明は，単一のプライマーを用いて，ヘアピン構造を有する核酸を増幅することを課題とするものであり，その詳細は，図１７に示されるとおり，標的ポリヌクレオチドの領域Ａに相補的な配列と，標的ポリヌクレオチドの領域Ｂと同一の配列を有するプライマー（ＴＰ）を標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ，3'末端からの伸長反応によって伸長生成物を生じさせ，これを熱変性によって鎖分離し，該伸長生成物が5'末端にヘアピン構造を形成した後に，ＰＣＲプライマー（Ｄ）をハイブリダイズさせ，該生成物を増幅するというものである。 
 　この甲４に記載される，標的ポリヌクレオチドの領域Ａに相補的な配列と，標的ポリヌクレオチドの領域Ｂと同一の配列を有するプライマーは，ＴＰと構造は同じではあるが，これを3'末端側に位置するループ部分にプライマーをアニールさせることはどこにも記載されていない。 
 　請求人はこの点について，図１７Ｄの核酸分子のループに，図１７ＡのＴＰがアニールして伸長可能であることは自明であり，これは，本件発明１の「１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の増幅方法」及び工程ｃ）（鎖置換を除く）に該当することを主張しているが，単一のプライマーを用いての増幅を意図している，プライマーＤを用いた増幅工程において，図１７ＡのＴＰを存在させることが何ら記載されていないのであるから，図１７ＡのＴＰがアニールして伸長可能であることは自明であるとしても，本件発明１の工程ｃ）に相当するものが記載されていることにならない。 
 　 
 　このように，これら甲２〜４にも，甲１と同様に，3'末端側に位置するループ部分にプライマーをアニールさせること（本件発明１の工程ｃ）に相当するもの。）は記載されていない。　 
 　したがって，甲１〜甲４に記載された発明を，どのように組合わせたとしても，本件発明１には到達できず，本件発明１は，これらの発明から当業者が容易に発明できないというべきものである。 
 　そして，そのことは，本件発明１を引用してさらに限定する本件発明２〜７についても同様である。 
 　 
 （３）本件発明８〜１０について 
 ア　対比・判断 
 　上記１（１）アの記載によれば，本件発明８は，単一の酵素を用い，等温条件下での核酸の合成方法の提供を課題とし，このような課題を解決する方法として，領域Ｆ３ｃ，領域Ｆ２ｃおよび領域Ｆ１ｃを3'側からこの順で含む鋳型核酸と，i)〜iv)までの４つのプライマーを使用するものであると認められる。その反応は，図５に示されるように，第一に鋳型核酸の領域Ｆ２ｃに，i)のオリゴヌクレオチド（ＴＰ）がアニールして伸長生成物を形成し，第二に該鋳型核酸の領域Ｆ３ｃに，iii)のオリゴヌクレオチド（ＯＰ）がアニールして該伸長生成物を鋳型から分離し，第三に分離された伸長生成物の任意の領域Ｒ１ｃ（Ｒ２ｃ）に，ii)のオリゴヌクレオチド（ＰＣＲプライマー）がアニールして伸長生成物を形成し，第四に該領域Ｒ１ｃ（Ｒ２ｃ）よりも3'側に位置する任意の領域Ｒ３ｃに，iv)のオリゴヌクレオチド（ＯＰ）がアニールして該伸長生成物を分離し，この分離された伸長生成物の3'末端側には，領域Ｆ１及び領域Ｆ１ｃをステムとし，領域Ｆ２ｃをループとするステムループ構造が形成され，自身を鋳型とする相補鎖合成を行われると共に，該領域Ｆ２ｃのループ部分に，領域Ｆ２を有するi)のオリゴヌクレオチドがアニールし，この領域をも起点として鎖置換相補鎖合成が行われ，互いの伸長生成物を置換し合って，１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸が合成されるというものである。つまり，本件発明８には，3'末端側に位置するループ部分に，i）のオリゴヌクレオチド（プライマー）がアニールすることが含まれていると解される。 
 　しかし，上記（２）で検討したように，甲１ないし甲４にはいずれも，3'末端側に位置するループ部分にプライマーがアニールすることは記載されていない。 
 　また，甲５に記載された発明は，好熱性のポリメラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼの両方が効率的に機能する等温鎖置換増幅法（好熱ＳＤＡ）の反応条件を提供することであり，その解決手段は，特定の好熱性のポリメラーゼや制限エンドヌクレアーゼを用いることであり，好熱ＳＤＡを行う前段階として，制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を含む標的核酸を増幅するために，２つのＳＤＡ増幅プライマーと，２つのバンパープライマー（ＯＰに相当）を用いるというものであるが，この甲５にも，3末端側に位置するループ部分にプライマーをアニールさせることは記載されていない。 
 　したがって，甲１ないし甲５をどのように組合わせたとしても，3'末端側に位置するループ部分に，プライマーがアニールすることを含む，本件発明８には到達できず，本件発明８は，これらの発明から，当業者が容易に発明できないというべきものである。 
 　そして，そのことは，本件発明８を引用してさらに限定する本件発明９〜１０についても同様である。 
 　 
 　また，請求人は，甲４にはＴＰが記載され，甲５に記載のようにＯＰは周知技術であるから，甲４と甲５を組合わせて，本件発明８を想到することは当業者が容易になし得ることであると主張している。 
 　しかし，甲５の図１の記載から明らかなように，ＯＰを用いても，増幅が連続して続くといったものではなく，数倍に増幅される程度にすぎないものであり，甲４は，熱変性を利用して，単一のプライマーにより非直線的に増幅しようとするものであるから，当業者であれば，その図１７Ｃに記載されるプライマーＤに，ＯＰを組み合わせようとするはずがないものである。 
 　また，甲５のＯＰは，ニックする制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を導入して，次の図２に示される増幅に用いるものであるから，これを甲４に記載されるＴＰにすると，次の増幅に用いられなくなることは明らかであるから，当業者であれば，制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を導入するプライマーに代えて，甲４に記載されるＴＰにするはずがないものである。 
 　したがって，甲４と甲５を組合わせることは困難であり，当業者が本件発明８に到達できるとは認められない。 
 　そして，このことは，本件発明８を引用してさらに限定する本件発明９〜１０についても同様である。 
 　 
 （４）小括 
 　以上のとおり，請求人の主張に理由があるとはいえず，本件発明１〜１０に係る発明についての特許は，特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものとはいえない。 
 　　　 
 ３　無効理由３，４（特許法第３６条第６項第１号，同条４項違反）について 
 　 
 （１）本件明細書の記載 
 　本件明細書（本件特許公報）の記載は，上記１（１）アに記載されたとおりである。 
 　 
 （２）当審の判断 
 　請求人は，本件発明１ないし１０の課題は，「単一の酵素で特異性が高い等温増幅の提供」であり，前記課題を解決するためには，二つのＴＰと二つのＯＰが必須であり，二つのＴＰ及び二つのＯＰを必須の構成要素としていない本件発明１，２，３，６，８及び１０は，特許法第３６条第６項第１号及び同条４項の規定に違反する旨を主張している。 
 　 
 ア　二つのＯＰが必須なものであるとの主張 
 　本件特許公報の図１〜３に示されているとおり，二つのＯＰは，鋳型の合成のために使用されているものである。例えば，図２（７）に示される3'末端と5'末端の双方にループを形成した核酸（工程ａ）における核酸）が一旦合成されれば，図２（７）〜図３に示されているように，その後の増幅反応は，二つのＯＰを用いなくても進行するものである。 
 　したがって，本件発明１，２，３，６，８及び１０において，２つのＯＰは必須なものではない。そのため，特許請求の範囲に，二つのＯＰを記載する必要はない。 
 　 
 イ　二つのＴＰが必須なものであるとの主張 
 　本件発明１，２，３，６，８及び１０では，リバースプライマーとしてはＰＣＲプライマーが用いられており，２つのＴＰが使用されていないから，図６（Ｄ）（Ｅ）のような核酸ができ上がり，加熱変性を利用しなければ，それ以上の合成反応を進めることはできないと認められる。 
 　しかし，本件特許公報の段落【００６８】にもあるように，本件発明は，「等温反応が可能とは言え，最初の鋳型となる核酸の提供のためにも加熱変性は行われる可能性があ」るというものであり，加熱変性などの処理を行って鋳型核酸を得ることが完全に排除されているものではない。また，本件特許公報の段落【００４６】等の記載を参酌すれば，わずかな程度の加熱変性などの処理は許容されているものと認められる。そして，図６（Ｄ）に示される核酸が加熱変性されて一本鎖核酸となれば，その内側にある一本鎖核酸の中央部には領域Ｆ２ｃを持つループ部分が形成されることとなり，この部分にオリゴヌクレオチドがアニールして核酸の合成が行われるとともに，その3'末端に位置する領域Ｒ１ｃにオリゴヌクレオチドがアニールして，核酸の合成が行われることになる。一方，図６（Ｅ）に示される核酸が加熱変性されて一本鎖核酸となれば，下側の鎖の3'末端側には，領域Ｆ２ｃを持つループ部分が形成されることになるから，該3'末端側からの自己伸長反応が行われるとともに，該ループ部分にもオリゴヌクレオチドがアニールして，核酸の合成が行われることになる。これらの合成反応は，ＰＣＲほどではないとしても，鋳型と生成物が指数的に増えていくものであるから，相当程度効率の良い核酸の合成が行われると認められるものである。 
 　したがって，本件発明１，２，３，６，８及び１０において，２つのＴＰが必須なものであるということはできない。そのため，特許請求の範囲に，二つのＴＰを記載する必要はない。 
 　 
 ウ　鋳型核酸の合成に関し，二つのＯＰを用いる方法しか具体的に開示されていないとの主張 
 　上記のとおり，わずかな程度の熱変性を行うことが本件発明の目的に反するとまではいえないし，また，本件特許公報に記載された事項及び当業者の技術常識を前提とすれば，3'末端にループを形成した核酸（図５の（Ａ））が持つ技術的意味を当業者は理解できるし，その技術的意味に照らし合わせて，様々な方法の中から適宜のものを選択して，前記のような核酸を合成することができるものと認められる。例えば，自動核酸合成装置などを用いても前記核酸を合成することができる。 
 　したがって，本件発明１，２，３，６，８及び１０において，二つのＯＰを用いなくても，所定の鋳型核酸を合成することは可能であり，請求人の主張は成り立たない。 
 　 
 （３）小括 
 　以上のとおり，請求人の主張に理由があるとはいえず，本件発明１，２，３，６，８及び１０は，発明の詳細な説明に記載されたものであり，当業者がその実施をすることができる程度に明確かつ十分に記載されたものである。したがって，本件発明１，２，３，６，８及び１０に係る発明についての特許は，特許法第３６条第６項第１号及び同条第４項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものとはいえない。 
 　 
 第５　むすび 
 　以上まとめると，本件発明１〜１０について，請求人が申し立てた無効理由は，いずれも理由がないものであるから，本件請求項１〜１０に係る発明についての特許を無効にすることはできない。なお，請求人は，他にもいろいろと主張しているが，いずれも採用の限りではない。 
 　審判に関する費用については，特許法第１６９条第２項の規定で準用する民事訴訟法第６１条の規定により，請求人が負担すべきものとする。 
 　よって，結論のとおり審決する。 
　
 平成２３年　７月２５日 
　
 審判長　　特許庁審判官 平田 和男 
 特許庁審判官 引地 進 
 特許庁審判官 鵜飼 健