(57)【要約】【課題】   低コストで食材としての安全性が高く且つアレルゲンの腸管透過抑制効果に優れた抑制剤複合体を提供する。【解決手段】  キトサンと脱脂ゴマ抽出物（ＴＳＥ）とを接触せしめると、ＴＳＥとキトサンが有するアミノ基とが結合して微細粒子が形成され、この微粒子にＴＳＥ中の有効成分である活性ポリフェノール類縁化合物及び／又は活性ペプチドが保持された複合体が得られる。複合体とすることでプロテアーゼなどの消化酵素が入り込めなくなり、分解が抑制される。【選択図】        図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
油糧種子由来の活性ペプチドを有効成分とするアレルゲンの腸管透過抑制剤であって、前記活性ペプチドは以下の構造式（化１）で特定されることを特徴とする請求項１に記載のアレルゲンの腸管透過抑制剤。
（化１）
ＳＮＡＬＶＳＰＤＷＳＭＴＧＨ
但し、Ｓはセリン、Ｎはアスパラギン、Ａはアラニン、Ｌはロイシン、Ｖはバリン、Ｐはプロリン、Ｄはアスパラギン酸、Ｗはトリプトファン、Ｍはメチオニン、Ｔはスレオニン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジンを表す。
【請求項２】
前記油糧種子は黒ゴマ、大豆またはトウモロコシである請求項１に記載のアレルゲンの腸管透過抑制剤。
【請求項３】
油糧種子抽出物とキトサンとが結合して形成される微細粒子に、請求項１または請求項２に記載のアレルゲンの腸管透過抑制剤が保持されていることを特徴とするアレルゲンの腸管透過抑制剤複合体。
【請求項４】
前記微細粒子は油糧種子抽出物中の酸性高分子量化合物とキトサンのアミノ基とが結合することで形成されることを特徴とする請求項３に記載のアレルゲンの腸管透過抑制剤複合体。
【請求項５】
前記微細粒子は懸濁液または粉体の状態で存在することを特徴とする請求項４に記載のアレルゲンの腸管透過抑制剤複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルゲンの腸管透過抑制剤とその複合体、更にはこれらを含有した食品素材およびこれらを用いたアレルギーの予防・治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
過敏な免疫反応により下痢、皮膚炎、喘息などの症状が現れる食物アレルギーは、アレルゲン（アレルギー原因物質）の腸管からの体内への吸収（透過）によって惹起される。アレルゲンの原因食品としては、卵、牛乳、小麦、蕎麦、海老、ピーナッツなどが挙げられ、これら食材を通常の食生活から完全に排除することは困難である。
【０００３】
また、食物アレルギーは３段階の過程を経て発症する。第１段階はアレルゲンの腸管吸収、第２段階は免疫細胞による情報伝達、第３段階は肥満細胞の脱顆粒である。
第１段階のアレルゲンの腸管吸収は、腸管の粘膜表層細胞同士を洩れなくシールし表層細胞の周囲を鉢巻状に取り囲んでいるタイト・ジャンクション間を透過して吸収されると言われており、このタイト・ジャンクション間の透過を阻止するアレルゲンの腸管透過抑制剤として、ホエー蛋白質（牛乳から脂肪とカゼインを除いた成分）が有効であるとの提案がなされている。（特許文献１）
【０００４】
【特許文献１】特開平８−７３３７５号公報
【０００５】
上記（特許文献１）に挙げられる物質以外に、本発明者らは芳香族アミノ酸を一部に含むペプチドやポリフェノール類縁化合物がアレルゲンの腸管透過抑制剤として有効であるとの知見を得た（特願２００２−１６１６９５）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
芳香族アミノ酸を一部に含むペプチドやポリフェノール類縁化合物はアレルゲンの腸管透過抑制効果に優れることが分ったが、安全で安価に且つ効率よく製造する課題が残っている。
【０００７】
また上記のペプチドは、アレルゲンの腸管透過抑制効果が高くても、腸で作用する前にプロテアーゼなどによってアミノ酸に分解されると腸管透過抑制効果は低下する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、アレルゲンの腸管透過抑制効果が高いペプチドやポリフェノール類縁化合物を同定すること、また、このペプチドやポリフェノール類縁化合物を腸管の有効な部位まで、分解されることなく効率的に送り込むことが可能なアレルゲンの腸管透過抑制剤複合体を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明に係るアレルゲンの腸管透過抑制剤は、油糧種子由来の活性ペプチドを有効成分とする。油糧種子としては、腸管透過抑制活性を基準とした場合には、黒ゴマ、大豆、トウモロコシが好ましく、この中では黒ゴマが最も好ましい。即ち、油糧種子は元来ポリフェノールを大量に含んでおり、特に黒ゴマは発芽の際に胚芽内に蛋白質を蓄えるため、材料として最適である。
【００１０】
また、上記アレルゲンの腸管透過抑制剤を途中で分解されることなく腸管で作用させるため、本発明はアレルゲンの腸管透過抑制剤をキトサンとの複合体とした。この複合体は油糧種子抽出物中の酸性高分子量化合物とキトサンのアミノ基とが結合することで微細粒子を形成し、この微細粒子に活性ポリフェノール類縁化合物及び活性ペプチドが保持されている。この微細粒子は懸濁液または粉末状で存在し、プロテアーゼは複合体の中に入り込めず、活性ペプチドは分解されない。
【００１１】
また、活性ペプチドやポリフェノール類縁化合物は、例えば、黒ゴマ、大豆、トウモロコシ等の油糧種子を粉砕して脱脂し、脱脂した油糧種子をトリプシン等の加水分解酵素によって加水分解し、熱水抽出することで得る。上記に挙げた油糧種子の中では、黒ゴマがアレルゲン腸管透過抑制効果が最も高く好ましい。また加水分解酵素としては、精製度の低いトリプシンが苦味低減の観点（食品素材）から好ましい。
【００１２】
また、本発明には上記のアレルゲンの腸管透過抑制剤複合体を含有する食品素材およびこのアレルゲンの腸管透過抑制剤複合体を経口投与するアレルギーの予防・治療方法も含まれる。投与量は１回に体重１ｋｇ当たり１３０μｇ〜１３ｇの範囲で、１〜数回／日とする。
【発明の効果】
【００１３】
以上に説明したように本発明によれば、安全で低コストのアレルゲンの腸管透過抑制剤が得られる。
また本発明に係るアレルゲンの腸管透過抑制剤複合体は、腸管で作用する前にプロテアーゼなどによる分解が抑制され、且つ腸管の有効な部位に到達することが可能となる。
更に、本発明に係るアレルゲンの腸管透過抑制剤およびその複合体は食材としてまた予防・治療剤としも有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明する。図１はアレルゲンの腸管透過抑制剤の抽出までの工程を示した図であり、出発原料としては黒ゴマを用いた。
【００１５】
先ず、黒ゴマを脱脂し、脱脂ゴマ（１ｋｇ）をトリプシン水溶液（トリプシン１０ｇ水１０Ｌ）に浸漬して加水分解を行いペプチドを生成する。加水分解は４０℃、３時間、ｐＨを８〜８．５に調整して行う。
【００１６】
ペプチドの生成が完了したならば、加熱（９０℃加熱）してトリプシンを失活させると同時にポリフェノール類縁化合物およびペプチドを抽出した。トリプシン失活は品質を一定にするためと添加する細胞に悪影響を及ぼさないようにするためである。
加熱後、遠心分離（５，０００ｘｇ  １５分）及びろ過して残存油分と残渣を除去し、水溶性画分を凍結乾燥してゴマトリプシン分解抽出物（以下、ＴＳＥとも記載する）を得た。
【００１７】
ＴＳＥから以下の逆相ＨＰＬＣ（クロマト）により活性成分を単離した。
ファーストラン
カラム  ：Shodex  RS  pak  RP１８−４１５
溶媒    ：0〜90％（30分）メタノール/0.1％TFA水溶液リニアグラジエント
流速    ：１ｍｌ／分
検出波長：２２０ｎｍ
クロマトグラムを図２に示す。
【００１８】
セカンドラン
カラム  ：Shodex  RS  pak  ＤＥ６１３
溶媒    ：活性化合物１、３、４では、メタノール／0.1％TFA水溶液
活性化合物２では、アセトニトリル／0.1％TFA水溶液
活性化合物１では、40〜60％（15分）のメタノールのリニアグラジエント
（保持時間は10.3分）
活性化合物２では、20〜30％（15分）のアセトニトリルのリニアグラジエント
活性化合物３では、40〜90％（15分）のメタノールのリニアグラジエント
活性化合物４では、60〜100％（15分）のメタノールのリニアグラジエント
流速    ：１ｍl／分
検出波長：２２０ｎｍ
活性化合物２、３および４のクロマトグラムを図３に示す。
【００１９】
得られた脱脂ゴマ抽出物（ＴＳＥ）中の活性成分であるポリフェノール類縁化合物とペプチドの構造をＮＭＲ（核磁気共鳴）、ＭＳ（質量分析）およびエドマン分解にて特定した。
【００２０】
単離した活性物質３および４はポリフェノール類縁化合物であり、以下の構造式（化４）、（化５）で特定される化合物であった。
【化４】
2007161731.tif 000003
セサミノール 2'-O-ベータ-グルコピラノシル-O-[ベータ-グルコピラノシル(1→6)]-O-ベータ-グルコピラノシド
【化５】
2007161731.tif 000004
セサミノール 2'-O-ベータ-グルコピラノシル(1→2)-O-ベータ-グルコピラノシド
【００２１】
単離した活性物質２は以下の構造式（化６）で表されるペプチドであった。また活性化合物１はトリプトファンであった。
（化６）
ＳＮＡＬＶＳＰＤＷＳＭＴＧＨ
但し、Ｓはセリン、Ｎはアスパラギン、Ａはアラニン、Ｌはロイシン、Ｖはバリン、Ｐはプロリン、Ｄはアスパラギン酸、Ｗはトリプトファン、Ｍはメチオニン、Ｔはスレオニン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン
【００２２】
以上によって得たトリプシン分解抽出物（ＴＳＥ）について、Caco−２を用いたモデル系とマウスを用いた動物実験でのＯＶＡ（卵白アルブミン）の吸収抑制試験を行った。モデル系では蛍光標識ＯＶＡを用いた。蛍光標識卵白アルブミンは、市販卵白アルブミンを常法（微アルカリ性・氷冷下）でフルオレッセンイソチオシアネートと反応させて結合後、流水透析、SephadexG−１５カラムクロマトグラフィーで精製して調製した。
【００２３】
Caco−２細胞の培養は以下の方法で行った。
Caco−２細胞をAmerican Type Culture Collection(U.S.A)から入手し、継代数３０〜４０のものを透過試験に用いた。培養液の組成はDulbecco’s modified Eagle’s medium(Gibco, Life Technologies,Inc., U.S.A.)にウシ胎子血清（２０％、大日本製薬）、非必須アミノ酸溶液（１％、Gibco, Life Technologies,Inc., U.S.A.）、ペニシリン（１００  IU／ml、和光純薬）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ml、和光純薬）、及びゲンタマイシン（５０μｇ／ml、和光純薬）を加えたものとした。
細胞を３７℃、５％ＣＯ２、加湿条件下で培養し、３，４日おきに継代を行った。透過試験に際しては、細胞を１２穴トランズウェル内のメンブレンフィルター（No.３４６０、Corning,  U.S.A.）で培養した。培養液を基底膜側には１．５ｍｌ、管腔側には０．５ｍｌを加え約２週間培養した。Millicell−ESR（Millipore  Co., U.S.A.）を用いて経上皮電気抵抗（TEER）を測定し、TEERが３００Ω・ｃｍ−２となり単層が完成したものを透過試験に用いた。
図４に吸収抑制試験に供したモデル系の断面図、図５に要部拡大図を示す。
【００２４】
ＴＳＥを０．１％含む試料を管腔側および基底膜側に添加して、３０分後基底膜側の透過液を回収し、透過したＯＶＡ量を蛍光強度により測定した。
蛍光強度測定は、島津製作所社製の分光蛍光光度計を用いて励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで行った。
【００２５】
図６は抽出した活性ポリフェノール類縁化合物と活性ペプチドの透過抑制活性（％）の実験結果を示すグラフであり、グラフ中、
（１）は、ＳＮＡＬＶＳＰＤＷＳＭＴＧＨ
但し、Ｓはセリン、Ｎはアスパラギン、Ａはアラニン、Ｌはロイシン、Ｖはバリン、Ｐはプロリン、Ｄはアスパラギン酸、Ｗはトリプトファン、Ｍはメチオニン、Ｔはスレオニン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン
（２）は、セサミノール 2'-O-ベータ-グルコピラノシル-O-[ベータ-グルコピラノシル(1→6)]-O-ベータ-グルコピラノシド
（３）は、セサミノール 2'-O-ベータ-グルコピラノシル(1→2)-O-ベータ-グルコピラノシドを表す。
このグラフから、本発明に係る活性ポリフェノール類縁化合物および活性ペプチドは極めて低い濃度で高い透過抑制活性を発揮することが分る。
【００２６】
マウスを用いた動物実験
キトサンの１％酢酸溶液（１mg/ｍl）にＴＳＥ（２mg/ｍl  ｐH9.5）を１：１の割合で滴下し、ｐH9.0に調整して攪拌した。その結果、微細粒子が形成され、懸濁液が得られた。微粒子はゴマ中の酸性多糖が有するカルボキシル基とキトサンが有するアミノ基とが結合することによって形成されたと考えられる。そして、この微粒子に活性ポリフェノール類縁化合物および活性ペプチドが保持されていると推定される。このようにして得られた微細粒子の粒径と形状を６０°、９０°、１２０°の散乱光強度から求めたところ、粒径は約２１０ｎｍで形状は球形であることが分った。
【００２７】
ＢＡＬＢ／ｃマウス（♂、６週齢）にＴＳＥ（0，0.1，1mg/マウス）とキトサンからなる微細粒子懸濁液を５日間投与した後に、ＯＶＡ（2mg/マウス）を投与し、０分、１５分、３０分、６０分後に尾静脈から採血し、血清中のＯＶＡ濃度を測定した。結果を図７のグラフに示す。
尚、図７においてＴＳＥが0mg／マウスとなっているものは、キトサンのみを投与したことを意味する。
【００２８】
図７から血清中のＯＶＡ濃度はＴＳＥを添加したものが少なくなっており、有意な差異が認められる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】脱脂ゴマから脱脂ゴマ抽出物（ＴＳＥ）を得るまでの工程を説明した図
【図２】脱脂ゴマ抽出物（ＴＳＥ）のＨＰＬＣファーストランのクロマトグラム
【図３】脱脂ゴマ抽出物（ＴＳＥ）のＨＰＬＣセカンドランのクロマトグラム
【図４】吸収抑制試験に供したモデル系の断面図
【図５】図２の要部拡大図
【図６】脱脂ゴマ抽出物（ＴＳＥ）の透過抑制活性の実験結果を示すグラフ
【図７】ＯＶＡ投与後の経過時間と血清中のＯＶＡ濃度との関係を示すグラフ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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