(57)【要約】      （修正有）【課題】子宮頸癌のリンパ節転移の有無をより高い精度で判定することができる子宮頸癌のリンパ節転移の検査方法、子宮頸癌のリンパ節転移判定装置およびコンピュータプログラムを提供する。【解決手段】子宮頸癌患者から採取された、子宮頸癌の転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された測定試料に含まれるSERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のmRNAの発現量に関する情報を取得し、取得したmRNAの発現量に関する情報に基づいて、上記のリンパ節組織に子宮頸癌が転移しているか否かを判定する方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮頸癌患者から採取された、子宮頸癌の転移が疑われるリンパ節組織から調製された測定試料に含まれる、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のmRNAの発現量に関する情報を取得し、
取得したmRNAの発現量に関する情報に基づいて、前記リンパ節組織に子宮頸癌が転移しているか否かを判定する、
子宮頸癌のリンパ節転移の判定方法。
【請求項２】
前記mRNAの発現量に関する情報からmRNAの発現量が過剰であると判断された場合に、前記リンパ節組織に子宮頸癌が転移していると判定する、請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
前記mRNAの発現量に関する情報が核酸増幅法によって取得される、請求項１または２に記載の判定方法。
【請求項４】
前記核酸増幅法が、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応法または転写増幅法である、請求項３に記載の判定方法。
【請求項５】
前記mRNAの発現量に関する情報が、核酸増幅法における核酸増幅反応のサイクル数に基づく値である、請求項３または４に記載の判定方法。
【請求項６】
前記核酸増幅反応のサイクル数と所定の閾値とを比較し、サイクル数が所定の閾値以下の場合に、前記リンパ節組織に子宮頸癌が転移していると判定する、請求項５に記載の判定方法。
【請求項７】
前記核酸増幅反応のサイクル数が所定の閾値より大きい場合に、前記リンパ節組織に子宮頸癌が転移していないとさらに判定する、請求項６に記載の判定方法。
【請求項８】
前記mRNAの発現量に関する情報が、核酸増幅法によって取得されるmRNAの定量値である、請求項３に記載の判定方法。
【請求項９】
前記mRNAの定量値と所定の閾値とを比較し、定量値が所定の閾値以上の場合に、前記リンパ節組織に子宮頸癌が転移していると判定する、請求項８に記載の判定方法。
【請求項１０】
前記mRNAの定量値が所定の閾値より小さい場合に、前記リンパ節組織に子宮頸癌が転移していないとさらに判定する、請求項９に記載の判定方法。
【請求項１１】
前記リンパ節組織が、骨盤内リンパ節を含む組織である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項１２】
前記骨盤内リンパ節が、総腸骨リンパ節、外腸骨リンパ節、内腸骨リンパ節、中直腸動脈根リンパ節および閉鎖リンパ節からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１１に記載の判定方法。
【請求項１３】
前記リンパ節組織から調製された測定試料が、子宮頸癌の転移が疑われるリンパ節組織を前処理液中でホモジナイズすることにより得ることができる試料である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項１４】
前記前処理液のpHが2.5〜5.0である、請求項１３に記載の判定方法。
【請求項１５】
前記前処理液が緩衝液を含む、請求項１３または１４に記載の判定方法。
【請求項１６】
前記前処理液が界面活性剤を含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項１７】
子宮頸癌の転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された測定試料に含まれる、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のmRNAの発現量に関する情報を取得する測定部と、
前記測定部で取得したmRNAの発現量に関する情報に基づいて、前記リンパ節組織に子宮頸癌が転移しているか否かを判定する判定部と、
前記判定部で得られた判定結果を出力する出力部と
を備える、子宮頸癌のリンパ節転移判定装置。
【請求項１８】
コンピュータに、
子宮頸癌の転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された測定試料に含まれる、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のmRNAの発現量に関する情報を受け取る受領ステップと、
前記受領ステップで受け取ったmRNAの発現量に関する情報に基づいて、前記リンパ節組織に子宮頸癌が転移しているか否かを判定する判定ステップと、
前記判定ステップで得られた判定結果を出力する出力ステップと
を実行させるためのコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮頸癌のリンパ節転移の判定方法、子宮頸癌のリンパ節転移判定装置およびコンピュータプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌患者の体内では、癌細胞が、血液またはリンパ液の流れに乗って原発巣から移動して他の部位で増殖すること(転移)が知られている。特に、癌細胞がリンパ液の流れによりリンパ節にたどり着き、そこで癌細胞が増殖した状態をリンパ節転移という。
子宮頸癌において、リンパ節は高い確率で癌が転移しやすい組織である。それゆえ、子宮頸癌の手術では、癌だけではなくリンパ節も取り除くことが一般的である。
しかしながら、リンパ節の切除により、手術後にリンパ浮腫などの後遺症が発生することが多い。また、リンパ節を切除する際に自律神経を切断してしまうことがあるので、手術後に排尿・排便障害のような深刻な後遺症が生じる可能性があることも問題となっている。
【０００３】
近年、リンパ節中の癌細胞を検出するリンパ節転移診断の研究がなされている。例えば、癌細胞が原発巣から最初に到達するリンパ節であるセンチネルリンパ節(SLN)に癌細胞が存在するか否かを調べることにより、子宮頸癌のリンパ節転移を診断することが検討されている。そのような診断によって子宮頸癌のリンパ節への転移が認められなければ、リンパ節の切除は不要であるので、手術後の患者のQOL向上につながる。
このように、子宮頸癌の診断において、リンパ節転移の有無は、手術における切除範囲などの治療方針の決定に有益な情報となる。また、子宮頸癌のリンパ節転移診断は癌の進行度(ステージ)の正確な決定にも利用できるので、その重要性が高まりつつある。
【０００４】
現在、多くの医療機関などでは、リンパ節転移の有無の検査として、リンパ節組織から作製された切片を顕微鏡で観察する組織診が行なわれている。
しかしながら、組織診では、リンパ節組織中に癌細胞が実際に存在していても、癌細胞を含まない切断面で作製された切片が用いられた場合やリンパ節転移が微小転移であった場合、正確な診断結果を得ることができないことがある。また、組織診は、診断する病理医の熟練度によって、その診断結果にばらつきが生じることがある。
【０００５】
そこで、分子マーカーの発現に基づいて子宮頸癌のリンパ節転移を判定する方法が提案されている。例えば、Wang H.Y.らの論文(非特許文献１)およびSamouelian V.らの論文(非特許文献２)には、子宮頸癌のリンパ節転移の分子マーカーが報告されている。具体的には、非特許文献１には、SLNのRT-PCRや免疫組織化学(IHC)解析により、CK19が微小転移の同定に有用な分子マーカーであることが記載されている。また、非特許文献２には、子宮頸癌組織と転移陰性リンパ節のRT-PCRの結果から、CK19およびMUC1などが有用な分子マーカーとして記載されている。
【０００６】
上述のように、子宮頸癌のリンパ節転移を診断は、患者のQOLに大きな影響を与える、手術における切除範囲の決定に利用されるので、その診断結果には高い正確性が要求される。分子マーカーを用いたリンパ節転移の診断においては、当然ながら、対象となる分子マーカーの数が増えるほど、その診断結果の正確性は向上する。例えば、既知の分子マーカーであるCK19およびMUC1を用いた診断結果が擬陽性や擬陰性の場合、他の分子マーカーの結果を参照することで、より適正な治療方針の決定が可能となる。そのため、子宮頸癌のリンパ節転移の診断に有用な新たな分子マーカーの開発が望まれていた。
【０００７】
セルピンペプチダーゼインヒビター・クレードB・メンバー５（serpin peptidase inhibitor, clade B, member 5：SERPINB5）、サイトケラチン15（cytokeratin 15：CK15）、サイトケラチン４（cytokeratin 4：CK4）、ペプチダーゼインヒビター３（peptidase inhibitor 3：PI3）およびアネキシン８（annexin A8：ANXA8）の５つの遺伝子について、種々の癌との関連が報告されている。
【０００８】
Domann F.E.らの論文(非特許文献３)には、マスピン(maspin：SERPINB5の別名)が、乳癌においてダウンレギュレーションされている癌抑制遺伝子であることが報告されている。さらに、特表２００８−５２８０２４号公報(特許文献１)およびＵＳ２００６／００７８９４１公報(特許文献２)には、マスピンが、正常組織よりも肺癌や卵巣癌の一種である漿液性乳頭状腺癌において高発現することが示されている。また、Karanjawala, Z.E.らの論文(非特許文献４)には、ANXA8が浸潤性の膵管腺癌に発現することが報告されている。また、特開２００７−１７５０２１号公報(特許文献３)には、大腸癌のリンパ節転移陽性および陰性の組織におけるANXA8の発現を調べた結果、陽性と陰性との間で発現量の差が小さいことが開示されている。しかしながら、これらの論文には、そもそも子宮頸癌について全く記載が無い。当然ながら、子宮頸癌の転移陽性リンパ節と、SERPINB5及びANXA8の発現量との関係について、全く記載も示唆も無い。
【０００９】
Pyeon D.らの論文(非特許文献５)には、KRT4（CK4の別名）、KRT15（CK15の別名）などの遺伝子発現が、正常組織に比べて子宮頸癌の原発巣においてダウンレギュレーションしていることが報告されている。また、Clauss A.らの論文(非特許文献６)には、具体的なデータは示されていないが、エラフィン(elafin：PI3の別名)が子宮頸癌細胞株Helaに発現することが記載されている。ここで、当該技術においては、株化細胞と実際に患者から採取した癌細胞とでは、遺伝子の発現パターンなど細胞の性質が異なる場合が多いことが知られている。しかし、いずれの論文にも、子宮頸癌の転移陽性リンパ節とCK4、CK15およびPI3の発現量との関係については、記載も示唆も全くされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００８−５２８０２４号公報
【特許文献２】ＵＳ２００６／００７８９４１公報
【特許文献３】特開２００７−１７５０２１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Wang H.Y.ら, Int J Gynecol Cancer, vol.16, p.643-648 (2006)
【非特許文献２】Samouelian V.ら, Int J Bio Markers, vol.23, p.74-82 (2008)
【非特許文献３】Domann F.E.ら, Int. J. Cancer, vol.85, p.805-810 (2000)
【非特許文献４】Karanjawala, Z.E.ら, Am J Surg Pathol., vol.32, p.188-196 (2008)
【非特許文献５】Pyeon D., Cancer Res, vol.67, p.4605-4619 (2007)
【非特許文献６】Clauss A.ら, Neoplasia, vol.12, p.161-172 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記のとおり、子宮頸癌のリンパ節転移に関する分子マーカーの報告はまだ少ない。そのため、子宮頸癌のリンパ節転移の判定に有用な新規分子マーカーや、そのようなマーカーを用いたリンパ節転移の判定方法のさらなる開発が望まれている。
そこで、本発明は、子宮頸癌のリンパ節転移を判定可能な新規分子マーカーを用いて、子宮頸癌のリンパ節転移を判定する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、子宮頸癌のリンパ節転移判定装置およびコンピュータプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、子宮頸癌の転移が組織学的に認められたリンパ節（以下、「転移陽性リンパ節」ともいう）および子宮頸癌の転移が組織学的に認められないリンパ節（以下、「転移陰性リンパ節」ともいう）におけるmRNAの発現プロファイルをそれぞれ調べた。
その結果、本発明者らは、セルピンペプチダーゼインヒビター・クレードB・メンバー５（SERPINB5）、サイトケラチン15（CK15）、サイトケラチン４（CK4）、ペプチダーゼインヒビター３（PI3）およびアネキシン８（ANXA8）のmRNA発現量の解析結果に基づいて、転移陽性リンパ節と転移陰性リンパ節とを高精度に区別できることを見出して、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明によれば、子宮頸癌患者から採取された、子宮頸癌の転移が疑われるリンパ節組織から調製された測定試料に含まれる、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のmRNAの発現量に関する情報を取得し、
取得したmRNAの発現量に関する情報に基づいて、上記のリンパ節組織に子宮頸癌が転移しているか否かを判定する、子宮頸癌のリンパ節転移の判定方法が提供される。
【００１５】
また、本発明によれば、子宮頸癌の転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された測定試料に含まれる、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のmRNAの発現量に関する情報を取得する測定部と、
該測定部で取得したmRNAの発現量に関する情報に基づいて、上記のリンパ節組織に子宮頸癌が転移しているか否かを判定する判定部と、
該判定部で得られた判定結果を出力する出力部と
を備える、子宮頸癌のリンパ節転移判定装置が提供される。
【００１６】
さらに、本発明によれば、子宮頸癌の転移が疑われるリンパ節組織を用いて調製された測定試料に含まれる、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のmRNAの発現量に関する情報を受け取る受領ステップと、
該受領ステップで受け取ったmRNAの発現量に関する情報に基づいて、上記のリンパ節組織に子宮頸癌が転移しているか否かを判定する判定ステップと、
該判定ステップで得られた判定結果を出力する出力ステップとを、
コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが提供される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の子宮頸癌のリンパ節転移の判定方法、子宮頸癌のリンパ節転移判定装置およびコンピュータプログラムによれば、子宮頸癌のリンパ節転移の有無をより高い精度に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】子宮頸癌のリンパ節転移の判定を実行する判定装置の一実施形態である。
【図２】子宮頸癌のリンパ節転移判定の一例を示すフローチャートである。
【図３】各遺伝子についての、リンパ節転移の有無とPCRサイクル数との関係を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［１．子宮頸癌のリンパ節転移の判定方法］
本発明の子宮頸癌のリンパ節転移の判定方法（以下、単に「判定方法」ともいう）は、子宮頸癌患者から採取された、子宮頸癌の転移が疑われるリンパ節組織から調製された測定試料に含まれる、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のmRNAの発現量に関する情報を取得し、取得したmRNAの発現量に関する情報に基づいて、上記の患者のリンパ節組織に子宮頸癌が転移しているか否かを判定することを特徴としている。
【００２０】
上記の各遺伝子のmRNAの塩基配列は、米国生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）により提供されているデータベースGenBankから知ることができる。各遺伝子のGenBankアクセッション番号は、以下の表１に示すとおりである。なお、これらのGenBankアクセッション番号は、２０１０年１０月１２日時点での最新の番号である。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
［１−１．mRNAの発現量に関する情報の取得］
本発明の判定方法では、まず、子宮頸癌患者から採取された、子宮頸癌の転移が疑われるリンパ節組織から調製された測定試料に含まれる、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のmRNAの発現量に関する情報を取得する。
なお、mRNAの発現量に関する情報が取得される遺伝子は、上記の５つの遺伝子のうち１つであってもよいが、続く判定工程での判定精度を向上させるために、複数の遺伝子のmRNAの発現量に関する情報を取得することが好ましい。
【００２３】
上記のリンパ節組織は、骨盤内に存在するリンパ節を含む組織であれば特に限定されない。そのようなリンパ節としては、例えば総腸骨リンパ節、外腸骨リンパ節、内腸骨リンパ節、中直腸動脈根リンパ節および閉鎖リンパ節などが挙げられる。これらのリンパ節は、本実施形態に係る判定方法の適用対象となる患者の状態などに応じて、適宜選択することができる。
【００２４】
本発明の方法に用いられる測定試料は、上記の５つの遺伝子のmRNAが含まれている試料であれば特に限定されない。そのような測定試料の調製は、当該技術において公知の方法により行うことができる。例えば、リンパ節組織を適切な前処理液中で物理的処理(撹拌、ホモジナイズ、超音波破砕など)を施して、該組織中の細胞に含まれるRNAを溶液中に遊離させることによって、RNAを含む測定試料を得ることができる。なお、測定試料の調製は、簡便かつ短時間で測定試料を調製できることから、前処理液を用いる方法により行なうことが好ましい。
上記のようにして得られた測定試料は、必要に応じて、当該技術において公知の方法、例えば遠心分離、フィルター濾過、カラムクロマトグラフィーなどにより、組織や細胞の残渣を除去してもよい。また、測定試料に含まれるRNAを精製してもよい。例えば、細胞から遊離させたRNAを含む溶液(測定試料)を遠心分離して上清を回収し、この上清をフェノール／クロロホルム抽出することにより、測定試料中のRNAを精製できる。
リンパ節組織からの測定試料の調製およびRNAの精製は、市販のRNA抽出・精製キットなどを用いて行うこともできる。
【００２５】
測定試料の調製に用いられる前処理液は、リンパ節組織に含まれる細胞からのmRNAの抽出に用いることができる溶液であれば特に限定されない。該前処理液は、RNAの分解を避けるために、酸性pHであることが好ましい。そのようなpHは、pH2.5〜pH5.0が好ましく、pH3.0〜pH4.0がより好ましい。また、該前処理液としては、例えばグリシン−塩酸緩衝液などの緩衝液を含む溶液が挙げられる。なお、該前処理液中の緩衝液の濃度は、前処理液のpHを酸性に保つことができる範囲内で適宜設定できる。
【００２６】
また、上記の前処理液は、リンパ節組織に含まれる細胞からmRNAを効率よく抽出させるために、界面活性剤をさらに含むことが好ましい。界面活性剤は、リンパ節組織に含まれる細胞の細胞膜および核膜を損傷させ、該細胞中の核酸を溶液中に遊離させることができる界面活性剤であれば特に限定されない。そのような界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤などが挙げられる。非イオン性界面活性剤は、好ましくはポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤、より好ましくは次式（Ｉ）：
【００２７】
Ｒ1−Ｒ2−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｈ                          （Ｉ）
【００２８】
（式中、Ｒ1は炭素数10〜22のアルキル基、炭素数10〜22のアルケニル基、炭素数10〜22のアルキニル基または炭素数10〜22のイソオクチル基を示し、Ｒ2は、酸素原子またはフェニレンオキシ基を示し、ｎは8〜120の整数を示す)
で表されるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤である。
そのようなポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤は特に限定されないが、例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンノ二ルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクテルフェニルエーテルなどが挙げられる。それらの中でも、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル(オキシエチレン基の付加モル数23)（シグマ−アルドリッチ社製、商品名：Brij(登録商標)35）などを好適に用いることができる。
なお、前処理液中の界面活性剤の濃度は、リンパ節組織に含まれる細胞からmRNAを十分に抽出させる観点から、好ましくは0.1〜６体積％、より好ましくは１〜５体積％である。
【００２９】
なお、前記遺伝子のmRNAの発現量に関する情報を後述する核酸増幅法によって取得する場合、前処理液はジメチルスルホキシド(DMSO)を含むことが好ましい。これにより、核酸増幅法に用いられる核酸合成酵素の活性の低下を抑制することができる。さらに、該核酸合成酵素の反応を阻害する物質（阻害物質）がリンパ節組織中に含まれている場合であっても、この阻害物質の影響を効果的に低減させることができる。なお、前処理液中のDMSOの濃度は、そのような効果を十分に発揮させる観点から、１〜50体積％が好ましく、５〜30体積％がより好ましく、10〜25体積％がさらに好ましい。
【００３０】
測定試料の調製に用いる前処理液の量は、前処理液の種類などに応じて適宜設定することできるが、通常、リンパ節組織１mgあたり６〜80μLである。リンパ節組織に含まれる細胞と前処理液との混合は、例えば、室温でリンパ節組織に含まれる細胞と前処理液とを撹拌させることにより行なうことができる。
【００３１】
本発明の判定方法において、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8の各遺伝子のmRNAの発現量に関する情報は、当該技術において公知の方法、例えば核酸増幅法などによって取得することができる。また、該mRNAの発現量に関する情報は、上記の各遺伝子の塩基配列に相補的な核酸プローブが配置されたマイクロアレイを用いたマイクロアレイハイブリダイゼーション法によっても取得できる。それらの中でも、mRNAの発現量に関する情報は、後述する核酸増幅法によって取得されることが好ましい。
【００３２】
本明細書において「遺伝子のmRNAの発現量に関する情報」は、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8の各遺伝子のmRNAの発現量を示すデータであれば特に制限されない。
そのようなデータを核酸増幅法によって取得する場合、該データとしては、例えば、増幅後の反応液の光学的測定値(蛍光強度、濁度、吸光度など)が挙げられる。さらに、mRNAの発現量を示すデータには、核酸増幅法において該光学的測定値が所定の基準値に達したときのサイクル数(または時間)、該光学的測定値の変化量が所定の基準値に達したときのサイクル数(または時間)、該光学的測定値(またはサイクル数)と検量線とから取得されるmRNAの定量値なども含まれる。
なお、所定の基準値は、上記のデータの種類に応じて適宜設定することができる。例えば、該データがサイクル数である場合、所定の基準値として、核酸増幅反応が対数増殖を示すときの蛍光強度の変化量を設定できる。
【００３３】
上記の各遺伝子のmRNAの発現量を示すデータを、マイクロアレイを用いる方法によって取得する場合、上記のデータの一例として、マイクロアレイ上の核酸プローブと、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8の各遺伝子のmRNAまたは該mRNAに由来する核酸(cDNA、cRNAなど)とのハイブリダイゼーションに由来するシグナル強度(蛍光強度、発色強度、電流量の変化など)が挙げられる。さらに、上記のデータには、該シグナル強度と検量線とから取得されるmRNAの定量値も含まれる。
【００３４】
核酸増幅法は、調製した測定試料と、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8から選択される少なくとも１つの遺伝子のmRNAまたは該mRNAに由来する核酸(cDNA、cRNAなど)を増幅するためのプライマーと、核酸合成酵素とを含む反応液を、適切な反応条件下に維持することにより行なうことができる。
【００３５】
本発明の判定方法に適する核酸増幅法としては、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応法、転写増幅法などが挙げられる。これらの核酸増幅法自体は、いずれも当該技術において公知の方法である。
PCR法としては、例えばリアルタイムRT-PCR（Reverse Transcription PCR）法などが挙げられる。鎖置換反応法としては、例えばリアルタイムRT-LAMP（Reverse Transcription LAMP）法（例えば、米国特許６４１０２７８号明細書を参照されたい）などが挙げられる。転写増幅法としては、例えばTAS法などが挙げられる。これらの方法の中でも、上記のデータの取得が容易であることから、リアルタイムRT-PCR法およびリアルタイムRT-LAMP法が好ましい。
【００３６】
リアルタイムRT-PCR法としては、例えばTaqMan法(「TaqMan」はロシュモレキュラーシステムス社の登録商標)、SYBR Green（モレキュラー・プローブ・インク社）などのインターカレーターを用いるインターカレーター法などが挙げられる。リアルタイムRT-PCR法では、核酸の増幅に伴って反応液の光学的状態(蛍光強度、発色強度など)が変化するので、該反応液の光学的測定値またはこの値が所定の基準値に達するまでのサイクル数に基づいて、上記遺伝子のmRNAの発現量に関する情報を取得することができる。
【００３７】
リアルタイムRT-LAMP法では、mRNAに由来するcDNAの増幅に伴って、副産物として不溶性のピロリン酸マグネシウムが生成される。このピロリン酸マグネシウムが増加するにつれ、反応液は白濁する。したがって、リアルタイムRT-LAMP法では、反応液の濁度もしくは吸光度の測定値、またはこれらの値が所定の基準値に達するまでの時間に基づいて、上記の遺伝子のmRNAの発現量に関する情報を取得することができる。
【００３８】
上記の核酸増幅法に用いられるプライマーは、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8の各遺伝子のmRNAまたは該ｍRNAに由来するcDNAを増幅できるものであれば、特に限定されない。そのようなプライマーは、上記の各遺伝子のmRNAまたは該ｍRNAに由来するcDNAの塩基配列に基づいて設計できる。また、プライマーは、核酸増幅法の種類に応じて設計されることが好ましい。プライマーの長さは、通常５〜50ヌクレオチド、好ましくは10〜40ヌクレオチドである。プライマー自体は、当該技術において公知の核酸合成方法により製造することができる。
上記のプライマーは、上記の各遺伝子のmRNAもしくは該ｍRNAに由来するcDNAを増幅できるプライマー対またはプライマーセットとして用いることができる。
【００３９】
上記のプライマーは、当該技術において通常用いられる技術により修飾されていてもよい。プライマーの標識は、放射活性元素または非放射活性分子を用いて行うことができる。放射活性同位体としては、32P、33P、35S、3Hおよび125Iが挙げられる。非放射活性物質としては、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはジゴキシゲニンのようなリガンド、ハプテン、色素、および化学発光性、生物発光性、蛍光またはリン光性の試薬のような発光性試薬が挙げられる。
【００４０】
核酸合成酵素は、核酸増幅法の種類に応じた酵素を用いればよい。そのような核酸合成酵素としては、例えば逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、鎖置換型DNAポリメラーゼ、リガーゼなどが挙げられる。核酸増幅法がリアルタイムRT-PCR法である場合、核酸合成酵素としては逆転写酵素およびDNAポリメラーゼが用いられる。
逆転写酵素としては、例えばAMV（Avian Myeloblastosis Virus）逆転写酵素、M-MLV （Molony Murine Leukemia Virus）逆転写酵素などが挙げられる。また、DNAポリメラーゼとしては、Taq DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、Bst DNAポリメラーゼなどが挙げられる。なお、リアルタイムRT-PCR法では、逆転写活性およびDNA合成活性の両方を有する酵素を用いてもよい。
【００４１】
核酸増幅法の反応条件は、核酸増幅法の種類、プライマーの配列などによって異なるが、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual（第２版）(Sambrook, J.ら、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989))などに記載の方法を参照して、適宜設定することができる。
【００４２】
［１−２．子宮頸癌のリンパ節転移の判定］
本発明の判定方法では、取得した上記の各遺伝子のmRNAの発現量に関する情報に基づいて、子宮頸癌患者から採取された、転移が疑われるリンパ節組織に子宮頸癌が転移しているか否かを判定する。
【００４３】
上記のとおり、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8の各遺伝子のmRNAの発現量は転移陰性リンパ節よりも転移陽性リンパ節に多いことが、本発明者らにより見出されている。したがって、該mRNAの発現量が過剰である場合に、上記のリンパ節組織に子宮頸癌が転移していると判定することができる。例えば、mRNAの発現量に関する情報が、核酸増幅法において核酸の増幅に十分な反応時間を経た反応液の光学的測定値(蛍光強度、濁度、吸光度など)である場合、その値が大きいときに、子宮頸癌患者から採取されたリンパ節組織に子宮頸癌が転移していると判定することができる。反対に、上記の測定値が小さいときに、該リンパ節組織に子宮頸癌が転移していないと判定することができる。
【００４４】
このような測定値自体によるリンパ節転移の判定はデータの蓄積により経験的に行うことができる。しかし、微小転移の場合などでは、より高い精度の判定が求められることもある。その場合、上記の各遺伝子のmRNAの発現量が過剰であるか否かは、該発現量に関するデータと、そのデータの種類に応じた閾値とを比較し、その比較結果から決定することが好ましい。例えば、前記データが、核酸増幅後の反応液の光学的測定値(蛍光強度、濁度、吸光度など)の変化量が所定の基準値に達したときのサイクル数(または時間)である場合、該サイクル数(または時間)が所定の閾値以下のときに、取得したmRNAの発現量は過剰であると決定できる。したがって、この場合は、上記のリンパ節組織に子宮頸癌が転移していると判定することができる。
さらに、該サイクル数(または時間)が所定の閾値よりも大きいとき、取得したmRNAの発現量は過剰ではないと決定できる。したがって、この場合は、上記のリンパ節組織に子宮頸癌が転移していないと判定することができる。
【００４５】
上記の各遺伝子のmRNAの発現量に関する情報が該mRNAの定量値である場合、該定量値が所定の閾値以上のときに、取得したmRNAの発現量は過剰であると決定できる。したがって、この場合は、上記のリンパ節組織に子宮頸癌が転移していると判定することができる。
さらに、mRNAの定量値が所定の閾値よりも小さいとき、取得したmRNAの発現量は過剰ではないと決定できる。したがって、この場合は、上記のリンパ節組織に子宮頸癌が転移していないと判定することができる。
【００４６】
本発明の判定方法に用いられる「所定の閾値」は、上記の発現量に関するデータの種類に応じて適宜設定することができる。すなわち、該閾値は、子宮頸癌の転移が認められるリンパ節の群と転移が認められないリンパ節の群とを明確に区別できる、特定の発現量を示す値として経験的に設定することができる。より具体的には、発現量に関するデータがサイクル数である場合、子宮頸癌の転移が組織学的に認められた複数のリンパ節、および子宮頸癌の転移が組織学的に認められない複数のリンパ節のそれぞれについてサイクル数を取得し、リンパ節転移が認められたリンパ節の群とリンパ節転移が認められないリンパ節の群とを明確に区別できるサイクル数を所定の閾値として設定することができる。
【００４７】
［２．子宮頸癌のリンパ節転移判定装置］
つぎに、本発明の実施形態に係る子宮頸癌のリンパ節転移判定装置(以下、単に「判定装置」ともいう)について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る判定装置は、本発明の実施形態に係る判定方法を実施するのに好適な装置の一例である。なお、本実施の形態に係る判定装置は、上記のmRNAの発現量に関する情報として、蛍光強度の変化量が所定の基準値に達したときのサイクル数を採用し、該サイクル数とサイクル数についての閾値とを比較して判定を行なう装置である。
【００４８】
［２−１．判定装置の構成］
図１は、本発明の一実施の形態に係る判定装置１の全体構成を示すブロック図である。
本実施の形態に係る判定装置１は、核酸増幅測定装置１００(以下、「測定部１００」ともいう)と、これと接続された情報処理装置２００(以下、「コンピュータ２００」ともいう)とから構成されている。
測定部１００は、リアルタイムRT-PCR法などの核酸増幅法を実行可能なPCR装置からなる。測定部１００は、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8の各mRNAを鋳型として核酸増幅するとともに、増幅産物に基づく蛍光強度およびサイクル数を測定する装置である。
測定部１００には、コンピュータ２００が接続されている。コンピュータ２００は、測定部１００の動作を制御するとともに、測定部１００で測定された上記の蛍光強度のデータおよびサイクル数のデータに基づいて、リンパ節転移が陽性であるか否かを判定する。
【００４９】
コンピュータ２００は、情報処理装置本体２１０(以下、「判定部２１０」ともいう)と、必要なデータを判定部２１０に入力する入力デバイス２３０と、入出力データなどを表示する表示部(出力部)２２０とを備えている。コンピュータ２００には、必要に応じて、外部記録媒体２４０が含まれる。
【００５０】
コンピュータ２００は、判定部２１０と、表示部２２０と、入力デバイス２３０とから主として構成されている。判定部２１０は、ＣＰＵ２１０ａと、ＲＯＭ２１０ｂと、ＲＡＭ２１０ｃと、ハードディスク２１０ｄと、読出装置２１０ｅと、入出力インタフェース２１０ｆおよび画像出力インタフェース２１０ｈは、バス２１０ｉによって互いにデータ通信可能に接続されている。
判定部２１０は、ＣＰＵ２１０ａと、ＲＯＭ２１０ｂと、ＲＡＭ２１０ｃと、ハードディスク２１０ｄと、読出装置２１０ｅと、入出力インタフェース２１０ｆと、画像出力インタフェース２１０ｈと、バス２１０ｉとを備えている。
判定部２１０内において、ＣＰＵ２１０ａ、ＲＯＭ２１０ｂ、ＲＡＭ２１０ｃ、ハードディスク２１０ｄ、読出装置２１０ｅ、入出力インタフェース２１０ｆおよび画像出力インタフェース２１０ｈは、それぞれバス２１０ｉによって、データの送受信が可能に接続されている。
【００５１】
ＣＰＵ２１０ａは、ＲＯＭ２１０ｂに記憶されているコンピュータプログラムおよびＲＡＭ２１０ｃにロードされたコンピュータプログラムを実行することができる。ＲＯＭ２１０ｂには、ＣＰＵ２１０ａによって実行されるコンピュータプログラムおよびＣＰＵ２１０ａがコンピュータプログラムを実行するためのデータなどが記録されている。ＲＡＭ２１０ｃは、ＲＯＭ２１０ｂおよびハードディスク２１０ｄに記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、ＲＡＭ２１０ｃは、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ２１０ａの作業領域として利用される。
ハードディスク２１０ｄには、オペレーティングシステム(OS)、アプリケーションプログラムなど、ＣＰＵ２１０ａに実行させるための種々のコンピュータプログラムおよびそのコンピュータプログラムの実行に用いられるデータがインストールされている。
ハードディスク２１０ｄにインストールされているプログラムには、子宮頸癌のリンパ節転移の判定方法を実現するためのアプリケーションプログラム２４０ａおよび測定部１００を制御するプログラムが含まれている。また、ハードディスク２１０ｄには、子宮頸癌のリンパ節転移の判定方法を実現するためのプログラムの実行に用いられるデータとして、閾値などが記憶されている。
【００５２】
読出装置２１０ｅは、フレキシブルディスクドライブ、CD-ROMドライブ、DVD-ROMドライブなどによって構成されており、外部記録媒体２４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。なお、アプリケーションプログラム２４０ａは、外部記録媒体２４０に記録されていてもよく、情報処理装置本体２１０内に設けられたＲＯＭ２１０ｂまたはＲＡＭ２１０ｃに保存されていてもよい。
また、ＣＰＵ２１０ａが外部記録媒体２４０から当該アプリケーションプログラム２４０ａを読み出し、アプリケーションプログラム２４０ａをハードディスク２１０ｄにインストールすることも可能である。
【００５３】
また、ハードディスク２１０ｄには、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するWindows（登録商標）などのグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。以下の説明においては、上述した判定に係るアプリケーションプログラム２４０ａは、該オペレーティングシステム上で動作するものとしている。
【００５４】
入出力インタフェース２１０ｆは、例えばＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインタフェースおよびＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインタフェースなどから構成されている。入出力インタフェース２１０ｆには、キーボードやマウスなどの入力デバイス２３０が接続されている。また、入出力インタフェース２１０ｆには測定部１００が接続されている。これにより、判定部２１０は、入出力インタフェース２１０ｆを介して測定部１００とデータの送受信が可能である。
【００５５】
画像出力インタフェース２１０ｈは、ＬＣＤまたはＣＲＴなどで構成された表示部２２０に接続されており、ＣＰＵ２１０ａから与えられた画像データに応じた映像信号を表示部２２０に出力する。表示部２２０は、入力された映像信号にしたがって、画像(画面)を表示する。また、表示部２２０は、後述するＣＰＵ２１０ａから与えられた判定結果を出力する。
【００５６】
ここで、上記の測定装置１において実行されるアプリケーションプログラム２４０ａの動作フローの一例について、図２を参照して説明する。
【００５７】
まず、判定部１００から入出力インタフェース２１０ｆを介して、核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量のデータおよびサイクル数のデータが受領される（ステップＳ１）。
【００５８】
次いで、ステップＳ２において、ＣＰＵ２１０ａは、核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量のデータおよびサイクル数のデータに基づき、核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量が各遺伝子についての基準値に達したときのサイクル数(サイクル数Ａ)を算出する。なお、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8の各遺伝子のmRNAを増幅する場合における蛍光強度の変化量の基準値は、それぞれ0.04、0.02、0.05、0.02および0.03である。
【００５９】
ステップＳ３において、ＣＰＵ２１０ａは、アプリケーションプログラム２４０ａのデータとしてハードディスク２１０ｄに予め記憶させたサイクル数の閾値のデータと、上記のサイクル数Ａのデータとを比較する。このステップＳ３では、該サイクル数Ａがサイクル数の閾値以下であるか否かについて比較判断される。
サイクル数Ａが閾値以下の場合(Ｙｅｓ)、ステップＳ４−１に処理を進める。反対に、サイクル数Ａが閾値よりも小さくない場合(Ｎｏ)、ステップＳ４−２に処理を進める。なお、各遺伝子についての閾値は、表２に示すとおりである。なお、表２に示す閾値は、８例の陰性検体における各遺伝子のＣｔ値（後述の基準値に達したときのサイクル数）の平均値を求め、その平均値から３ＳＤ(標準偏差の３倍)を引くことで取得した。
【００６０】
【表２】
2012080847.tif 000004
【００６１】
ステップＳ４−１において、ＣＰＵ２１０ａは、リンパ節組織に子宮頸癌が転移している(リンパ節転移陽性)と判定する。あるいは、ステップＳ４−２において、ＣＰＵ２１０ａは、リンパ節組織に子宮頸癌が転移していない(リンパ節転移陰性)と判定する。
【００６２】
ステップＳ５において、ＣＰＵ２１０ａは、上記の判定結果を、ＲＡＭ２１０ｃに格納するとともに、画像出力インタフェース２１０ｈを介して表示部２２０に出力する。
【００６３】
なお、本実施形態において、核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量のデータおよびサイクル数のデータは、コンピュータ２００から入出力インタフェース２１０ｆを介して取得されるが、これに限定されるものではない。ユーザーが核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量のデータおよびサイクル数のデータを入力デバイス２３０により入力し、ＣＰＵ２１０ａが、これら入力された値から、核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量が基準値に達したときのサイクル数(サイクル数Ａ)を算出して取得してもよい。
また、本実施形態において、ＣＰＵ２１０ａは、該サイクル数Ａを、核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量のデータおよびサイクル数のデータから算出して取得しているが、これに限定されるものではない。ユーザーが該サイクル数Ａを入力デバイス２３０により入力し、ＣＰＵ２１０ａがこれを取得してもよい。
【００６４】
なお、本実施形態において、ＣＰＵ２１０ａは、核酸増幅反応時の蛍光強度の変化量のデータおよびサイクル数のデータに基づき、上記のサイクル数Ａを算出しているが、これに限定されるものではない。蛍光強度やサイクル数などと検量線とから各遺伝子のmRNAの定量値を算出してもよい。この場合、ステップＳ３において、該定量値が所定の閾値よりも大きい場合にステップＳ４−１に処理を進め、該定量値が所定の閾値よりも小さい場合にステップＳ４−２に処理を進めることができる。
【実施例】
【００６５】
以下に、実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６６】
（調製例１）
子宮頸癌の転移が組織学的に認められた６個のリンパ節〔陽性検体（うち、腺癌転移陽性リンパ節：２個、扁平上皮癌転移陽性リンパ節：４個）〕および子宮頸癌の転移が組織学的に認められない８個のリンパ節〔陰性検体（うち、腺癌転移陽性リンパ節：４個、扁平上皮癌転移陽性リンパ節：４個）〕を用いて、下記のようにして測定試料を調製した。
【００６７】
まず、前記リンパ節（約30〜370 mg/個）に前処理液［組成：200 mMグリシン−塩酸（pH3.4）、５体積％ポリオキシエチレンラウリルエーテル（オキシエチレン基の付加モル数23）（シグマ−アルドリッチ社製、商品名：Brij(登録商標)35）、20体積％ジメチルスルホキシドおよび0.05体積％消泡剤〔信越化学工業（株）製、商品名：KS-538〕］４mLを添加した。つぎに、ブレンダーで前記リンパ節をホモジナイズした。得られたホモジネートを、室温で10000×g、１分間遠心分離し、上清を得た。その後、RNA抽出・精製用キット（キアゲン社製、商品名：RNeasy Miniキット、カタログ番号74014）を用いて、前記上清400μＬからRNAを抽出・精製してRNA溶液60μＬを得た。得られた各ＲＮＡ溶液について、波長260 nmにおける吸光度を測定した。得られたRNA溶液を測定試料として用いた。
【００６８】
（試験例１）
調製例１で得られた各測定試料と、SERPIN5B (Maspin) 用プライマー対と、定量RT-PCRキット（キアゲン社製、商品名：Quanti Tect SYBR Green RT-PCRキット、カタログ番号204245）とを用い、リアルタイムPCR装置（アプライドバイオシステムズ社製、商品名：ABI Prism 7500）でリアルタイムRT-PCR法を行ない、各測定試料について、増幅産物に基づく蛍光強度の変化量が基準値に達したときのPCRサイクル数を決定した。得られたPCRサイクル数を、測定試料におけるmRNAの発現量に関する情報として用いた（実施例１）。
【００６９】
また、SERPINB5用プライマー対の代わりに、CK15用プライマー対（実施例２）、ANXA8用プライマー対（実施例３）、PI3（実施例４）またはCK4（実施例５）を用いたことを除き、前記と同様に操作を行ない、各測定試料について、増幅産物に基づく蛍光強度の変化量が基準値に達したときのＰＣＲサイクル数を決定した。
【００７０】
なお、CK19用プライマー対（比較例）またはβ−アクチン用プライマー対（対照）を用いたことを除き、前記と同様に操作を行ない、各測定試料について、増幅産物に基づく蛍光強度の変化量が基準値に達したときのPCRサイクル数を決定した。ここで、CK19は、子宮頸癌のリンパ節転移に対する既知の分子マーカーである。また、β−アクチンは、ハウスキーピング遺伝子として知られる分子マーカーである。
【００７１】
SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8の各遺伝子mRNAを増幅する場合における蛍光強度の変化量の基準値は、以下の表３に示すとおりである。なお、これらの基準値は、SERPINB5、CK15、CK4、PI3、ANXA8およびCK19の各遺伝子のmRNAについての核酸増幅反応が対数増殖期にあるときの蛍光強度の変化量である。また、これら基準値は、単位鎖長あたりの蛍光強度の変化量に換算したとき、ほぼ同じ値になるように設定している。
【００７２】
【表３】
2012080847.tif 000005
【００７３】
リアルタイムRT-PCR法で用いた各プライマーの配列および反応液の組成を、それぞれ表４および表５に示す。
【００７４】
【表４】
2012080847.tif 000006
【００７５】
【表５】
2012080847.tif 000007
【００７６】
また、リアルタイムRT-PCR法におけるサーマルプロファイルは、50℃で30分間の保温および95℃で10分間の保温と、それに続く、94℃で15秒間の変性と53℃で30秒間のアニーリングと72℃で30秒間の伸長とを１サイクルとする40サイクルの反応である。
【００７７】
試験例１の結果より得られた、各遺伝子についてのリンパ節転移の有無とPCRサイクル数との関係を図３に示す。図中、「PCRサイクル数」は、陽性検体の測定試料または陰性検体の測定試料を用いたリアルタイムRT-PCR法において、増幅産物に由来する蛍光強度の変化量が上記の各基準値に達したときのサイクル数である。また、「＋」は陽性検体の測定試料を用いたときのPCRサイクル数、「−」は陰性検体の測定試料を用いたときのPCRサイクル数を示す。
【００７８】
図３から、CK19（比較例）、SERPINB5（実施例１）、CK15（実施例２）、ANXA8（実施例３）、PI3（実施例４）およびCK4（実施例５）は、陽性検体と陰性検体と間のPCRサイクル数に、明らかに差があることが分かる。より具体的には、陽性検体のPCRサイクル数は、陽性検体のPCRサイクル数よりも少ないことが分かる。すなわち、子宮頸癌が転移しているリンパ節組織では、子宮頸癌が転移していないリンパ節組織よりも、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8のmRNAの発現量が高いことが分かる。これに対して、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンについては、陽性検体と陰性検体と間のPCRサイクル数にほとんど差がない。すなわち、β−アクチンのmRNAの発現量は、陽性検体と陰性検体でほとんど差がないことが分かる。このことから、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8から選択される少なくとも１つの遺伝子のmRNAの発現量に基づいて、リンパ節組織に子宮頸癌が転移しているか否かを判定できることが明らかとなった。
【００７９】
また、図３から、腺癌および扁平上皮癌のいずれの子宮頸癌の場合でも、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8は、陽性検体と陰性検体と間のPCRサイクル数に明らかに差があることが分かる。より具体的には、PCRサイクル数の閾値として、それぞれ、SERPINB5は32.9、CK15は32.0、CK4は37.7、PI3は31.9およびANXA8は31.4に設定することで、陽性検体と陰性検体とを区別可能であることが分かる。このことから、子宮頸癌の組織型に関わらず、SERPINB5、CK15、CK4、PI3およびANXA8のmRNAの発現量に基づいて、リンパ節組織への転移が判定できることが分かる。
【００８０】
さらに、図３から、SERPINB5（実施例１）およびCK15（実施例２）の陽性検体と陰性検体と間のPCRサイクル数の差は、CK19（比較例）と同等であることが分かる。このことから、特に、SERPINB5またはCK15の遺伝子のmRNAの発現量を用いることで、リンパ節組織に子宮頸癌が転移しているか否かを高い精度で判定できることが分かる。
【符号の説明】
【００８１】
１００    核酸増幅測定装置（測定部）
２００    情報処理装置（コンピュータ）
２１０    情報処理装置本体（判定部）
２２０    表示部（出力部）
２３０    入力デバイス
２４０    外部記録媒体
２１０ａ  ＣＰＵ
２１０ｂ  ＲＯＭ
２１０ｃ  ＲＡＭ
２１０ｄ  ハードディスク
２１０ｅ  読出装置
２１０ｆ  入出力インタフェース
２１０ｈ  画像出力インタフェース
２１０ｉ  バス
２４０ａ  アプリケーションプログラム
【図１】
2012080847.tif 000008
【図２】
2012080847.tif 000009
【図３】
2012080847.tif 000010
【配列表】
2012080847000001.app