【事件の表示】
　特願２０１１−２２１２２９「パラフィン包埋標本の解析法」拒絶査定不服審判事件〔平成２４年　２月１６日出願公開、特開２０１２−　３２４０２〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯 
　本願は、平成１９年９月２１日を国際出願日とする特許出願の一部を新たに平成２３年１０月５日（優先権主張日　平成１８年９月２８日）に特許出願したものであって、平成２５年２月２１日付けで拒絶の理由が通知され、同年４月１５日に意見書が提出され、さらに、同年５月２２日付けで拒絶の理由が通知され、同年７月２５日に意見書と手続補正書が提出されたが、同年８月８日付けで拒絶査定がなされ、その謄本は同年８月２０日に請求人に送達された。これに対し、同年１０月２３日に拒絶査定不服審判の請求がなされ、それと同時に手続補正書が提出されたものである。
 　 
第２　本願発明 
　平成２５年１０月２３日に提出された手続補正書による補正は、実質的に、同補正前の平成２５年７月２５日に提出された手続補正書に記載の特許請求の範囲の請求項１ないし１２を削除し、同請求項１ないし１２を引用する請求項１３を引用する請求項毎に独立請求項として書き下したものへと補正するものであるから、請求項の削除を目的とするものであって適法なものである。
　したがって、本願の請求項１ないし１２に係る発明は、平成２５年１０月２３日に提出された手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項１ないし１２に記載された事項により特定されるものであって、そのうち請求項１に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、以下のとおりのものである。
  　
「【請求項１】
　生体試料がパラフィンに包埋された標本を、加熱条件下で、前記パラフィンと互いに相溶性がある有機溶剤に晒し、前記パラフィンを融解及び前記有機溶剤へ溶解させることによって、前記生体試料を露出させる工程と、
　前記パラフィンが溶解した有機溶剤と、前記露出した生体試料とを分離することによって、前記標本から前記パラフィンを除去する工程と、
　前記生体試料を質量分析装置によって測定する工程と、
を含み、
　前記生体試料を露出させる工程における前記加熱条件は、５５〜６５℃の温度条件である、パラフィン包埋標本の解析法。」
　
第３　引用例の記載事項 
　１　本願の優先権主張日前に頒布され、原査定の拒絶の理由に引用された刊行物である「R. Lemaire et al.，Direct analysis and MALDI Imaging on Formalin Fixed paraffin-Embedded Tissues (FFPE): Application to parkinson disease，54th ASMS Conference on Mass Spectrometry Proceedings (May 28 - June 1, 2006, Seattle , Washington，２００６年　６月，p. 147，講演番号 Thp 333」（以下、「引用例」という。）
　（１）引用例に記載の事項
　引用例には、つぎの事項が記載されている（下線は当審により付加したもの。）。　
　ア　「Introduction
　Mapping the dynamic state of proteome directly inside cells or tissues using direct analysis by mass spectrometry is a promising technique for many biological applications.  Moreover, extending direct analysis to Imaging Mass Spectrometry(IMS) gives spatial localization of compounds in tissues leading to the reconstruction of two-dimensional molecular maps. Direct MALDI methods have demonstrated great potential and interest in the medical field for the research of new biomarkers, pathology diagnosis and better understanding of molecular mechanisms implicated in specific pathologies. These methods are especially well suited for cancer research. However, actually, all studies have been performed on fresh frozen tissues which have its limitations, since all pathology tissue archives (eg. up 30 years) kept in the hospitals are fixed in paraformaldehyde and embedded in paraffin. Thus, the feasibility to perform analyses with archived samples would open the door to a great potential and opportunity to go ahead for pathologies such as for example ageing diseases.
　In the present work, we focus on new developments for MALDI tissue direct analysis and imaging. We report, here, for the first time, direct MALDI analysis and MALDI imaging of tissue sections embedded in paraffin. Methods were developed for tissue fixed for less than 6 months, and for tissues fixed for longer times (more than two years). The method was applied on rat simulating Parkinson disease. This demonstrates the possibility of analyzing FFPE tissues for clinical proteomic applications.」（左側第２段落）
（当審仮訳：はじめに
　質量分析による直接分析を利用して、細胞または組織内部のプロテオームの動的な状態をマッピングすることは、多くの生物学的用途のための有望な技術である。それ以上に、イメージング質量分析法（IMS）への直接分析の拡張は、2次元分子マップの再構築につながる組織における化合物の空間的局在を与える。直接MALDI法は、新しいバイオマーカー、病理診断と特定の病態に関与する分子メカニズムのより良い理解の研究のために医療分野で大きな可能性と興味を示した。これらの方法は、特によく癌研究に適している。しかしながら、現実には、すべての病理組織の病院内の保管された試料（例えば、最大30年）は、パラホルムアルデヒドで固定しパラフィンに包埋されているので、実際には、新鮮な凍結組織で実行されたすべての研究は、制限があった。このため、保管されたサンプルに対する分析の実行の実現は、例えば加齢性疾患のような病理のための進歩の大きな可能性と機会への扉を開くだろう。
　本研究では、我々はMALDIの組織の直接分析とイメージングの新たな発展に焦点を当てる。我々は、初めて、パラフィン包埋組織切片の直接MALDI分析及びMALDIイメージングをここに報告する。方法は、6ヶ月未満のために固定された組織と、より長い時間（二年以上）固定した組織について開発された。この方法は、パーキンソン病をシミュレートするラットに適用され、これは、臨床プロテオームへの適用のためにFFPE組織を分析する可能性を示している。）
　イ「 Methods
 Tissues were dewaxed using organic solvent (xylene) then rinsed using ethanol 100°,96°then 80°before matrix application (SA at 20 mg/mL or HCCA at 10 mg/mL).
For biochemical digestion, enzyme in 25mM TRIS buffer (pH 7.4) was applied directly on tissue during 2 min to several hours then rinsed using 80% ethanol to remove salts.  」（左側第３段落　１〜４行目）
（当審仮訳：方法
　マトリクスアプリケーション（20mg/ mLのSAあるいは、10mg/ mLのHCCA）の前に、組織は、有機溶剤（キシレン）を用いて脱蝋され、その後、エタノール100°、96°、それから80°を使用してすすがれた。
　生物学的消化のために25mMのTRIS緩衝液（pH7.4）中の酵素液が直接組織に2分〜数時間の間適用され、それから脱塩のために80％エタノールを用いてすすがれた。）
　ウ　「Automatic spotter was used to perform both enzyme and matrix microspotting. Automatic spotter (Micro Fraction Collector MALDI spotter SunCollect) was from SunChrom (GmbH) and distributed in France by Disruptive Technology (Dir. W. Amoyal).」（左側第３段落５〜７行）
（当審仮訳：自動スポッターは、酵素と基質の両方のマイクロスポッティングを実行するために使用された。自動スポッター（マイクロフラクションコレクターMALDIスポッター　SunCollect）はSunChrom（社）製で、 フランスでDisruptive Technology（Dir.　W. Amoyal）によって流通されている。）
　エ　「MALDI direct analysis were performed on a voyager DE-STR mass spectrometer (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA) with delayed extraction and operating with a pulsed nitrogen laser at 337nm (3Hz).
  MALDI imaging experiments were performed on ultraflex II MALDI-LIFT TOF/TOF (Bruker daltocics, Bremen, DE) operating with a pulsed nitrogen laser at 337nm (50Hz) and using fleximaging software for imaging reconstruction.  」（左側第３段落８〜１２行）
（当審仮訳：MALDI直接分析は、遅延引き出し付きのVoyager DE-STR質量分析計（Applied Biosystems社、フラミンガム、マサチューセッツ州、米国）で実施し、337nm（3Hz）のパルス窒素レーザーで動作させた。
　MALDIイメージング実験は、ウルトラフレックスII MALDI-LIFTのTOF/ TOF（ブルカーのdaltocics、ブレーメン、DE）337nm（50Hz）のパルス化窒素レーザーで動作し、イメージング・再構築のためのfleximagingソフトウェアを使用して実施した。）
　
　オ　「NanoESI-LC-MS/MS analysis were performed on an ion trap mass spectrometer (LCQ deca XP plus, Thermo electron). For each run, 0.5μL of digest was injected with a Switchos Autosampler (Dionex corporation) and separation was realized on a C18 silica bonded stationary phase (75μm i.d. 150mm long, 3μm 100A pore size Dionex). The LCQ was operated in a data dependent MS/MS mode in which one MS full scan was followed by one MS/MS scan on the most abundant peptide molecular ion. Samples were washed during 2 minutes at 10μL/min with 100% mobile phase A (95% H2O, 5% ACN, 0.1% formic acid). Peptides were eluted using a linear gradient of 1% mobile phase B (CAN 80%, H2O 20%, formic acid 0.08%) during 70 minutes at a flow rate of 0.200μL/min.
Identification of peptides/proteins was done using MASCOT sequence Query and interrogation of the SwissProt database.
」（左側第３段落１３〜２２行）
（当審仮訳：NanoESI-LC-MS/ MS分析は、イオントラップ質量分析計（LCQ deca XP plus, Thermo electron）で行った。各実行では、消化試薬0.5μLをSwitchosオートサンプラー（Dionex corporation）で注入され、分離は、C18シリカ結合した固定相（75μm、つまり150ｍｍ長、3μmの100Aの孔径ダイオネクス）上で実現した。 LCQは、MSフルスキャンは、最も豊富なペプチド分子イオンスキャンをMS / MSによって追跡したデータ依存MS / MSモードで操作した。サンプルは、100％の移動相A（95％H 2 O、5％ACN、0.1％ギ酸）と10μL/分で2分の間洗浄した。ペプチドは、0.200μL/分の流速で70分の間、1％の移動相B（CAN80％、H 2 O、20％、ギ酸0.08％）の直線勾配を用いて溶出した。ペプチド/タンパク質の同定は、MASCOTシーケンスクエリおよびSwissProtデータベースの照会を用いて行った。）
 
　カ　引用例の真ん中のカラムの図面が示されている部分の左上隅には、「FFPE rat brain section」との記載とともに、「脳組織」の写真が記載されており、その図から、右矢印にMatrixとの添え字がされた先に、「Figure1:Direct FFPE vs fresh tissue MALDI mass spectra using SA as matrix」（当審仮訳：図１：パラフィン包埋と新鮮な組織のＳＡをマトリクスとして用いたＭＡＬＤＩ質量スペクトルの対比）が記載されている。
　キ　「Conclusion 
 Direct MALDI FFPE tissue analysis can be performed directly on tissues for recentry fixed tissue(6 months) using SA or HCCA, and after enzymatic cleavage for older fixed tissues(2years).
 Imaging MS experiments can be performed on FFPE tissues and especially on older tissues using micro-spotting of both the enzyme and matrix.
 Identification of peptides from FFPE tissue sections can be achieved by LC-MS/MS experiments after biochemical cleavage(more than 100 proteins identified). 」（右下第１段落　１〜１１行）
（当審仮訳：　結論　直接MALDI FFPE組織分析は、SAまたはHCCAを使用して、最近固定された組織（6月以内）と、酵素切断した後のより古い固定された組織（２年以上）に直接行うことができます。
　イメージングMS実験は、FFPE組織、及び特に古い組織において、酵素および基質の両方のマイクロスポッティングを使用して実行可能である。
　FFPE組織切片からのペプチドの同定は、生化学的切断後のLC-MS/ MS実験により達成することができる（100以上のタンパク質が同定された）。）
　（２）引用例に記載された発明
　ア　上記（１）ア及びカに摘示した事項から、引用例に記載のものが、パラフィン包埋されたラットの脳組織であって、パーキンソン病をシミュレートするものを対象としているといえることから、引用例に記載のものの分析対象は、生体試料がパラフィンに包埋された標本であるといえる。
　
　イ　そして、同エの記載から、引用例に記載のものが、パラフィン包埋されたラットの脳組織をMALDIにより質量分析を行うものであり、同キに摘示した「結論」の記載において、パラフィン包埋組織の直接MALDI分析及びイメージング質量分析の実行が可能であることが示されていること、及び同エにおいて、引用例には、MALDI分析を質量分析のVoyager DE-STR質量分析計を用いて、MALDIイメージング実験をウルトラフレックスII MALDI-LIFTのTOF/ TOFで実施したことが記載されていることから、引用例には、生体試料がパラフィン包埋された標本を質量分析装置を用いて分析するパラフィン包埋標本の解析法が記載されているといえる。
　ウ　以上のことから、引用例には、つぎの発明が記載されていると認められる。
  「生体試料がパラフィンに包埋された標本を、キシレンを用いて脱蝋し、その後、エタノールを使用してすすいだ後に、その生体試料を質量分析装置によって測定することにより分析するパラフィン包埋標本の解析法」（以下、「引用発明」という。）
第４　本願発明と引用発明との対比
　１　本願の特許請求の範囲の請求項３において、本願発明の「有機溶剤」として「キシレン」がその選択肢として特定されていること、また、「キシレン」が、パラフィン包埋生体試料からの脱パラフィン用のパラフィン相容性の溶媒として周知のものであることが、例えば、特表２００１−５１４４８３号公報（以下、「周知例１」という。）の６４頁の２５行〜６５頁３行、特表２００５−５１１０３０号公報（以下、「周知例２」という。）の４７頁５行〜１０行、国際公開第２００４／０８９４１９号（以下、「周知例３」という。）の３６頁１６〜２５行にそれぞれ記載されているように周知の技術であることから、引用発明の「生体試料がパラフィンに包埋された標本」を、「脱蝋」する際に用いる「キシレン」は、本願発明の「前記パラフィンと互いに相溶性がある有機溶剤」に相当するものである。
　２　引用発明の「生体試料がパラフィンに包埋された標本」を「脱蝋」することは、生体試料を直接ＭＡＬＤＩ分析可能とするための前処理であることからすれば、本願発明の「生体試料を露出させる」ことに相当することは明らかである。
　また、引用発明の「エタノールを使用してすすぐ」こと（工程）は、生体試料からパラフィンが溶け出したキシレンを洗い流すこと（工程）であって、生体試料からパラフィンを除去する工程であるから、本願発明の「前記パラフィンが溶解した有機溶剤と、前記露出した生体試料とを分離することによって、前記標本から前記パラフィンを除去する工程」に相当する。
 
　３　してみると、本願発明と引用発明とは、つぎの一致点で一致し、相違点において相違する。
＜一致点＞
　「生体試料がパラフィンに包埋された標本を、前記パラフィンと互いに相溶性がある有機溶剤に晒し、前記パラフィンを前記有機溶剤へ溶解させることによって、前記生体試料を露出させる工程と、前記パラフィンが溶解した有機溶剤と、前記露出した生体試料とを分離することによって、前記標本から前記パラフィンを除去する工程と、前記生体試料を質量分析装置によって測定する工程とを含むパラフィン包埋標本の解析法。」である点
＜相違点＞
  本願発明が「標本」を「加熱条件下」で「有機溶剤に晒し」、「パラフィン」を「融解」及び有機溶剤へ溶解させることによって、生体試料を露出させる工程を備え、その加熱条件が「５５〜６５℃の温度条件」であるのに対して、引用発明は「標本」を「キシレン」で脱蝋することにより「パラフィン」を有機溶剤へ溶解させることにより生体試料を露出させる工程を備えるものであるとはいえるものの、同工程において、「標本」を「加熱条件下」で有機溶剤に晒してパラフィンを「融解」することや、その加熱条件が特定されていない点
  　
第４　当審の判断
　（１）上記第４の１において例示した周知例１及び２には、パラフィン包埋された生体試料を脱パラフィンする際に、キシレンを６０℃で１０分間インキュベートすることにより脱パラフィン化する工程が記載されており、周知例３には、パラフィン包埋された標本を６５℃で５分×３系列キシレンに浸漬して脱パラフィンする工程が記載されている。
　
　（２）また、特表２００４−５１４８８６号公報（以下、「周知例４」という。）の段落【００３６】には、生体試料をパラフィン包埋する際に用いるパラフィンの融点が５０〜５７℃であることが例示され、さらに、段落【００３７】ないし【００３９】には、その温度よりも高い温度に生体試料を加熱した場合にパラフィンが融解することについても記載されており、特開２００５−２２１５１１号公報（以下、「周知例５」という。）の段落【００２５】ないし【００２８】にも同様の記載があること、また、特開２００２−３１８１７７号公報（以下、「周知例６」という。）の段落【０００９】においても、包埋装置に用いる通常のパラフィンの融点が５５℃〜６０℃であること、パラフィンの溶融状態とするためには加熱することが必要であることが記載されていることから、本願優先日当時において、包埋用パラフィンの融点が５０℃〜６０°程度の範囲であること、それ以上の温度で加熱してパラフィンを融解させて脱パラフィンを行うことは、周知の技術事項であったといえる。
  　
　（３）そして、脱パラフィンを加熱条件下で行うことは、原審の拒絶理由において説示したように常套手段であるところ、上記（１）及び（２）に説示した事項から、本願優先日当時において、「（包埋用パラフィンをキシレンを用いて生体試料から脱蝋する工程において、）パラフィンの融点よりも少し高い温度の加熱条件である「６０℃」や「６５℃」の条件で「脱蝋」することも周知の脱蝋方法であるといえるから、引用発明の「生体試料がパラフィンに包埋された標本を、キシレンを用いて脱蝋」する工程において、脱パラフィンを効率良く行うことを目的として、当該（１）のように周知の加熱条件下で脱蝋を行うこと、及び、パラフィンが融解するようなパラフィンの融点よりも少し高い上記周知の加熱条件である「６０℃〜６５℃」（すなわち、本願発明の「５５℃〜６５℃」を満たす条件）を採用して実施することは、当業者が適宜選択し得る程度のことである。
　また、そのような条件で脱蝋を行えば、その過程においてパラフィンが融解することも周知例４ないし６に記載された技術事項に鑑みれば明らかなことといえる。
　してみると、引用発明に、周知技術を適用することにより、本願発明の相違点に係る構成を得るようにすることに格別の困難性はない。
　そして、本願発明の作用効果は、引用発明及び周知技術に基づいて当業者が予測し得る程度のものであって格別のものとはいえない。
　
　（４）小活
　以上のとおりであるから、本願発明は、引用発明及び周知技術に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
　
第５　請求人の主張についての検討
　（１）請求人は、本願発明は、原査定で引用した引用例１及び８には記載のされていない「５５〜６５℃の加熱条件下で有機溶剤に晒す」との構成を採用することにより、「生体試料の損傷を招くことなく、生体試料内に浸透したパラフィンを効率的に除去し、情報量の多いマススペクトルを得る」という作用効果を生じることから、進歩性が肯定されるべきものであり、その根拠として、本願明細書の段落【００５５】の記載及び図１の実証結果を挙げている。
　（２）本願発明の明細書の発明の詳細な説明の段落【００５５】には、「具体的な加熱温度については、パラフィンによって融点が異なるため、特に限定されるものではなく、当業者が適宜決定することができる。例えば、上述のように、パラフィンの融点が例えば４５〜７０℃程度であることから、加熱条件としても４５〜７０℃とすることができる。さらに、５５〜６５℃とすることが好ましい場合もある。実施例には、加熱条件を５５〜６５℃として本発明の脱パラフィン処理を行い、その後、脱パラフィン処理した標本について、質量分析を行った場合に、情報量の多いマススペクトルを得られていることが実証されている。上記範囲を下回ると、パラフィンの融解が効果的に起こらないため脱パラフィンが十分に起こらず、情報量の少ないマススペクトルが得られる傾向にあり、上記範囲を上回ると、生体試料自身の損傷を引き起こしやすくなる傾向にある。」との記載があるところ、当該記載によれば、本願発明における加熱条件の温度条件は、パラフィンの融点程度とすることが好適であると記載されており、実施例において、加熱条件を５５〜６５℃て本発明の脱パラフィン処理を行なった場合に情報量の多いマススペクトルが得られたことが実証された旨記載されているが、発明の詳細な説明には、当該結果が得られた実施例において用いた「パラフィン」の特性については何ら記載されておらず、そして、本願発明においても、用いられる「パラフィン」の融点などについても特定されるものではないことからすれば、当該実証結果の存在により、本願発明の作用効果が格別なものということはできない。
　また、上記記載によれば、実施例において実証されている効果は、パラフィンの融点より少し高い温度範囲において脱パラフィン処理を行うことによるものであると解されるところ、上記第４において説示したように、本願優先日当時において、「包埋用パラフィンをキシレンを用いて生体試料から脱蝋する工程において、パラフィンの融点よりも少し高い温度の加熱条件である６０℃〜６５℃の条件で脱蝋する」ことが周知の脱蝋方法であると認められるのであるから、そのような条件を採用することが困難であるということもできない。
　以上のとおりであるから、請求人の主張は理由がない。
第６　むすび 
 　以上のとおり、本願発明は、本願優先権主張日前に頒布された引用例に記載された発明及び周知技術に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであって特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるから、その他の請求項に係る発明について論及するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。
　 
 　よって、結論のとおり審決する。