(57)【要約】【課題】本発明は、小型、高信頼性、低価格の汎用蛍光検出装置を提供することを目的とする。【解決手段】本発明では、ラインビーム光源多重アッセンブリー１からの励起光は、ラインビーム光ＬＢとなり、平板の回転ミラー２で反射される。回転ミラー２の反射光は、被検体基板９の縦軸のラインビームとなる。この縦軸を１ラインとして蛍光検出データが取得され、回転ミラー２を図１の回転機構３で回転させることで、XラインからYラインまでの間ビームを走査させる。【選択図】          図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上の特定区画に多数・多種の化合物がアレイ化されたチップとその上に塗布ないし添加された検体との相互作用を、励起光ユニットから蛍光化合物に励起光を照射して蛍光強度とその変化によるパターンを検出する蛍光検出装置において、前記励起光ユニットが、単色光を発する半導体発光ダイオードと、前記発光ダイオードから発せられる小円筒状ビーム光をラインビーム光にするためのラインジェネレータレンズとを組み合わせてユニット化し、更にこのユニットを複数個組み合わせてなる蛍光検出装置。
【請求項２】
請求項１記載の蛍光検出装置において、励起光ユニットからの励起光を基板上の蛍光化合物に反射照射するための回転ミラーと、その回転ミラーを駆動するための回転ミラー駆動機構をさらに備えてなる請求項１記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
請求項１又は２記載の蛍光検出装置を用い、被検体基板上に励起光を均一照射することにより被検体基板上のあるマイクロ／ナノウエルあるいは液滴様サンプルの蛍光測定をも可能としたことを特徴とする蛍光検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ライン状ビーム光を回転するミラーで反射させて平面検体に照射することにより平面検体上にアレイ化された蛍光物質を含む多種の捕捉／認識分子に励起光を区画限定の面積に移動照射すると共に、励起光を照射された多数の蛍光標識された化合物の微小スポットから発する蛍光を検出し、それらの各輝点を統合し、パターン認識化することを可能ならしめる蛍光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の蛍光検出装置は、蛍光物質励起用光源としてレーザ光源あるいは水銀やキセノンに代表されるランプ系光源が用いられてきた。レーザ光源使用の場合はビーム照射であるため被励起面画像取得にはＸ、Ｙ二軸の高速・高精度の可動機構を備えた装置を必要とし、被励起面のスポットをビームスキャンしつつ画面の蛍光データを取得している。蛍光はその波長の光を通すバンドパスフィルタを通して蛍光検出カメラでデータ取得している。この装置は高精度ながら全体の機構が大型化、複雑化するため、それに伴って製造コストが高額となり、また保守に費用がかかる欠点を有している。
また、もう少し安価な装置として水銀ランプやキセノンランプを励起用光源としている装置では、その光源から照射される光を必要とする励起波長域のみ通すバンドパスフィルタを通して被励起面を一括面照射し、蛍光検出には蛍光波長域透過用バンドパスフィルタを通し蛍光検出カメラでデータを取得している。この装置は比較的簡単に装置構成ができるが、ランプの寿命が短いこと、ランプ光の照射面での照度むらの是正を必要とし、装置が大型化し重量も大きく、維持費用も増大する欠点を有する。
【０００３】
DNAチップ等のバイオチップの蛍光検出用に蛍光レーザースキャナー（蛍光アレイスキャナー）が市販されているが、当該装置は平板チップすなわちスライドグラスサイズのチップ板の蛍光検出であり、例えば細胞をアレイしたチップ（細胞チップ）のようにナノウエルあるいは液滴様の基板の測定には適していない。
【０００４】
また、励起光源としてレーザの代わりに高輝度発光ダイオード（LED）を用いる装置も提案されている（特許文献１）。この装置は、蛍光標識されたDNA断片用の多数の泳動路を有する平板型ゲル電気泳動手段、泳動路に励起光を照射するLED、蛍光標識DNA断片から発生される蛍光を検出する屈折率分布型レンズアレー、フィルタおよびCCDラインセンサから構成される蛍光検出装置とからなるが、断続的なライン光源としてのみ使用されてきた。
さらに本願出願人らは、レーザビーム光源からのビーム光をビームエキスパンダーレンズを通すことにより励起光照射面積を増大させて面照射することによる蛍光検出法（特許文献２）やLED出力光に特有な光の輝度分布（ガウシアン分布）を均一輝度に是正するバンドル型光ファイバーからなる励起光システム（特許文献３）を提供している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−２８２０７８号
【特許文献２】実用新案登録第３１５０１１７号
【特許文献３】実用新案登録第３１５５２９６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来提案されているLEDを励起光源として用いる特許文献１の装置は、電気泳動するDNAを時間で捕らえるDNA塩基配列決定装置であるため、励起光源は、細いライン状のものであり、限定された面積に面（矩形）照射する思想は全く開示されていない。また、励起光源はラインビーム装置の小型化には寄与するとしても、LEDは各泳動路毎に設置するため、部品点数の増大による高価格、各部品の公差等による励起条件の相違等の課題がある。また、このLEDを用いた従来装置は、励起光側にプリズムを使用するために照射強度の低減等の課題もある。また、特定面積を計測するための蛍光検出装置は上記背景技術の項でも述べた通り励起光用光源が水銀ランプあるいはキセノンランプであるため装置の大型化及び重量増大が避けられない状況にあった。
さらに、本願出願人の特許文献２は、機構が極めて簡単である利点を有するが、照射面積を拡げた分だけ照射強度が低くなり、蛍光物質の表面状態によってはＳ／Ｎ比が極めて悪くなる欠点を有している。また、レーザビーム光が有するガウシアン照度分布の影響も有しており精確な蛍光検出データの取得は難しい欠点を併せ持っている。
本発明は、上述の諸課題を解決するために鋭意創意と工夫を重ねされたもので、小型、高信頼性、低価格の汎用蛍光検出装置を提供することができた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明が提供する蛍光検出装置は、限定された長さを有するライン状に整形された励起強度の強い光を回転するミラーに反射させその反射光の一部を特定面積内の蛍光物体に照射する励起光発生源として用いることが最大の特徴である。強い励起力を有するライン状ビーム光がミラーの回転に従って断続的に特定の照射面積を一定強度の照射度で被検体物質内の蛍光物質を励起照射することで被検体物質から発する蛍光を逐次面センサーカメラでデータ取得し、それらを積算することで鮮明な蛍光検出を可能とした。
すなわち、本発明は、基板上の特定区画に蛍光化合物を多数アレイすることにより、アレイ化蛍光化合物と基板上に塗布ないし添加された被検体との相互作用を、励起光ユニットから蛍光化合物に励起光を照射して蛍光強度とそのパターンを検出する蛍光検出装置において、前記励起光ユニットが、単色光を発する半導体発光ダイオードと、前記発光ダイオードから発せられる小円筒状ビーム光をラインビーム光にするためのラインジェネレータレンズとを組み合わせてユニット化し、更にこのユニットを複数個組み合わせて励起光モジュールとすることで規定長均一照度のラインビーム取得を可能とした蛍光検出装置である。
そして、本発明の蛍光検出装置は、さらに励起光ユニットからのラインビーム状の励起光を基板上の蛍光化合物に反射照射するための回転ミラーと回転ミラーを駆動するための機構とを備えている。
【発明の効果】
【０００８】
本発明が提供する蛍光検出装置は、多数の被検体を載せた基板の特定面積にラインビームレーザ光を簡単な回転機構で励起用照射光として走査させ、蛍光受光側は蛍光検出用バンドパスフィルタと蛍光検出カメラを用い、特定面積を有する被検体から発する蛍光を高精度で検出するためのシステム構成によって小型化、高信頼性、低価格の蛍光検出装置の製作を可能とした。これによって、バイオチップの需要が飛躍的に拡大する。特に感染性検体を扱う閉鎖隔離空間のバイオセーフティレベル２（Ｐ２施設）からレベル４（Ｐ４施設）で威力を発揮する。本発明の最大の特徴は励起強度の強い特定の長さを有するライン状の光を安定、高信頼度且つ安価にすることを可能とし、これを蛍光検出装置に用いた点にある。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明による蛍光検出装置の構成図である。
【図２】本発明のライン状ビーム光が検体基板を励起照射する状況図である。
【図３】本発明によるラインビーム光源多連アッセンブリーの特定ラインにおける励起強度を示す図であり、ビーム光源単体に比較し多連アッセンブリーは照度特性が良くなることを示す。
【図４】細い円筒状のレーザビーム光をラインジェネレータレンズを介してライン状の光に変換する状態図、即ちラインビーム発生機構図である。
【図５】ラインジェネレータレンズの外形を示す。
【図６】ラインビーム光源の構成を示す。
【図７】本発明の特徴とするラインビーム光源多連アッセンブリー用ハウジングの構成と外形を示す。
【図８】本発明のラインビームを利用しての計測データの取込タイミングの図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の最大の特徴は、特定波長のレーザ光（スポット状の光）を図４および図５に示すラインジェネレータレンズを用いて特定の長さ（例えばスライドガラス横幅と同じ約２５ｍｍ長さ、そのライン光の厚み幅は０．３ｍｍ以下）のラインビームに形状変換させて、面照射に比較し遥かに強い励起光を被検体に当てることにより、被検体が発する蛍光をＳ／Ｎ比が高い数値で効果的に検出することにある。しかしながら、１個のレーザ光源でのラインビームは、スポットビームに比較して励起強度が低下するだけではなく、ラインの照度分布は中央部の照度が強いガウシアン強度分布特性を有するため図３（ａ）に示すように複数のライン状ビーム光源を組み合わせることで図３（ｂ）に示すように特定の長さ間のラインビームの照度分布の均一化と共に励起強度の向上を実現した。
【実施例】
【００１１】
まず、本発明の蛍光検出装置の全体機能を図１に示す。
図中、１はラインビーム光源多重アッセンブリー（励起光モジュール）であり、蛍光物質に照射することにより蛍光を発せさせるための励起光源である。その詳細構成は後述する。２は回転ミラーであり、ラインビーム光源多重アッセンブリー１から出た光を全面反射する。回転ミラー２はミラー回転機構３の回転駆動軸と連結した回転軸２ａを中心に回転し、ラインビーム光源多重アッセンブリー１から出た光を試料台８全面（あるいは特定面積）にラインビームを走らせることができる。ミラー回転機構３としては、例えばDCブラシレスモータなどを使用することができ、その制御は、回転制御機構７により行われる。
試料台８上の９は被検体基板で、１０は多種の捕捉／認識分子（化合物）であり、この多種の捕捉／認識分子１０には合成時に蛍光物質を導入してあり、被検体基板９上にアレイ化されている。１１は被検体である。多種の捕捉／認識分子１０と被検体１１に含まれる物質が相互作用した場合、ラインビーム光源多重アッセンブリー１からの励起光を受光した時、その反応箇所に限定して多種の捕捉／認識分子１０に含まれた蛍光物質の蛍光強度が変化する。（日本国特許第４５６２０１８号、特許成立日：2010.08.06；発明の名称：「ペプチド固定化用基板及びそれを用いた標的タンパク質の測定方法」；発明者：軒原清史、三原久和参照）
これら多種の捕捉／認識分子１０に組み込まれた蛍光物質から発する蛍光はバンドパスフィルタ４により必要最小限波長幅の光のみを通過させる。５はカメラレンズであり、６は蛍光検出カメラである。バンドパスフィルタ４を透過した特定波長の蛍光はカメラレンズ５を通して蛍光検出カメラ６で検出され、データ処理用コンピュータ１３で画像化されて、表示器１２に画像表示される。
前述した回転制御機構７の駆動信号と蛍光検出カメラ６の検出信号は同期制御されており、試料台８上を一定速度で走査するビームラインに合わせ、１ライン／単位時間  毎に蛍光検出データを取得しデータを蓄積する。
【００１２】
本発明の大きな特徴は、下記詳述する図３に示すような強力で均一なラインビーム光源多連アッセンブリーの採用とそのラインビームを図２斜視図で示すように回転ミラーでラインビームを移動させることで時間と共に移動する励起光ライン毎の蛍光検出データを順次取得して、これらのデータを積算することでＳ／Ｎ比の良い、面データを取得することができる点にある。
図２は、図１の主要部分を斜視図として示したものである。図１と同一物には同一番号が付してある。ラインビーム光源多重アッセンブリー１からの励起光は、ラインビーム光ＬＢとなり、平板の回転ミラー２で反射される。回転ミラー２の反射光は、図２に示す通り、被検体基板９の縦軸のラインビームとなる。この縦軸を１ラインとして蛍光検出データが取得され、回転ミラー２を図１の回転機構３で回転させることで、図２中のXラインからYラインまでの間ビーム走査に連動して蛍光検出データを取得する。
X、Yラインの検出は、前述した蛍光検出カメラ６にて被検体基板９と披検体１１との信号の変化点より行う。
【００１３】
図３ないし図７で本発明の特徴とするラインビーム光源多連アッセンブリー１を説明する。
まず、図３は、本発明によるラインビーム光源多連アッセンブリー１の特定ラインにおける励起強度を示す図である。本発明のラインビーム光源多連アッセンブリー１は、例えば３本の細い円筒状のラインビーム光源３ａ〜ｃが後述するハウジングの中で束ねられており（図３（ａ））、これらは、例えば、Ｐラインで各々の光源の照射強度が合成される（図３（ｂ））。Ｐラインは、ラインビーム光源の光源波長、光源間の距離などから一義的に決定される。
図４は、ラインビーム発生機構図で、レーザビーム光源41ａ（〜41ｃ）を図５に示すラインジェネレータレンズＬＧＬを介してライン状の光に変換する状態図である。図４（ａ）は、上からの平面図、図４（ｂ）は横からの平面図である。レーザビーム光源41ａ（〜41ｃ）の光束断面は細い円筒状であるが、ラインジェネレータレンズＬＧＬを通過させることにより、出力光を細いライン光に変換する。
図５はラインジェネレータレンズの外形（形状）を示したものである。図５（ａ）はラインジェネレータレンズを横に倒した図、図５（ｂ）はラインジェネレータレンズを立てた図である。一方の端面は、断面半円のレンズを45度の傾斜でもって断面側で合わせた形をしており、他の端面は真円になっている。光を図の矢印方向からいわゆる頂部に入射させることにより、出力光を細いライン光に変換する。
図６はレーザビーム光源とラインジェネレータレンズを組み合わせたラインビーム光源（３ａ〜ｃ）の内部構成図である。中空の外筒61内にレーザビーム光源41ａ（〜41ｃ）、ラインジェネレータレンズＬＧＬが収容されており、レーザビーム光源41ａ（〜41ｃ）のレーザ光軸とラインジェネレータレンズＬＧＬの頂部が一致している。外筒61は遮光性の材質からなり、外部光の侵入を防いでいる。62は、レーザビーム光源41ａ（〜41ｃ）につながる電源コードである。
図７は、図６で示したラインビーム光源を使用して、図１で示すラインビーム光源多連アッセンブリー１を組み立てた図である。図６で示すラインビーム光源３つを１つにまとめてラインビーム光源多連アッセンブリー１を構成している。図７（ａ）は、Ｐライン上（即ち、図３に示すＰラインと同じ）に限定された長さのラインビームを発生させるようにアッセンブリー化した平面図（ａ）と斜視図（ｂ）を示す。図中、71は３個のラインビーム光源３ａ〜ｃを１つに構成する容器、すなわちラインビーム光源多連アッセンブリー用ハウジングで、これは、直方体の箱になっており、この中にラインビーム光源３ａ〜ｃが図示しない支持機構で支持されている。中央のラインビーム光源３ａはハウジング71の長軸に対して垂直に支持されており、ラインビーム光源３ｂ、３ｃは、垂直軸に対し45度の角度で傾斜して支持されている。
【００１４】
次に本発明のラインビームを利用しての計測データの取込タイミング図を図８に示す。図８はデータの取込状態を時系列で示した図である。図２でラインビームがｘラインからｙラインに向かって走査されるとき、予め設定されたタイミングでライン上の蛍光を蛍光検出カメラ６で取り込んでゆくタイミング過程を図８に示したものである。図８の横軸は時間で、パルス信号は、ライン毎のデータ取得時間に対応する。ｘラインからｙラインまでのｎ回の取得データをデータ処理用コンピュータ１３で加算し、ｘラインからｙラインまでの蛍光画像をコンピュータ表示器１２に表示することで蛍光検出装置として機能する。
【００１５】
（実験例）
バイオチップの検出に従来から用いられている共焦点レーザー蛍光スキャナーでは基板上に加工されたマイクロ／ナノウェル中の検体の蛍光強度を測定することが難しい。そこで本発明が提供する蛍光検出器を用い、微少ウェル（60 ウェル堀削口径 1 mm）のチップ基板に添加された微量検体の蛍光強度が精確に測定できた。ウエル内の溶液量は0.5 マイクロリットル、蛍光標識ペプチドの濃度は10 μM であった。このシステムによって蛍光物質を導入した細胞の観察も可能であった。露光時間は0.1 〜 0.5 msに設定し、カメラのフォーカスを合わせて測定した。データの取り込みを行った後、フリーソフト（ImageJ）により測定値を算出しパターンが作成できた。
【００１６】
本発明は、上記の構成を採用することにより、従来照射面積が拡大された分だけ照射強度が低くなり、蛍光検出の状態によってはＳ／Ｎ比が極めて悪くなるという従来の課題を解決するとともに、励起光の照射強度ムラを解消し、また極微小ウエル（窪み）の捕捉／認識分子・検体の相互作用においても蛍光検出が可能である。特定面積を有する被検体から発する蛍光を高精度で検出できるシステム構成によって小型、高信頼性、低価格の蛍光検出装置の製作が可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００１７】
バイオ検出。本発明によれば、特に高信頼性を有し且つ安価な蛍光検出装置を必需とするバイオチップ分野の需要が飛躍的に拡大することが期待できる。
【符号の説明】
【００１８】
１：ラインビーム光源多重アッセンブリー
２：回転ミラー  
３ａ〜ｃ：ラインビーム光源
４：バンドパスフィルタ  
５：カメラレンズ
６：蛍光検出カメラ
７：回転制御機構
８：試料台
９：被検体基板
１０：多種の捕捉／認識分子
１１：被検体
１２：表示器
１３：データ処理用コンピュータ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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