【事件の表示】
　上記当事者間の特許第３３１３３５８号「核酸の合成方法」の特許無効審判事件についてされた平成２３年　７月２５日付け審決に対し、東京高等裁判所において審決取消の判決（平成２３年（行ケ）第１０２７４号平成２４年１０月３１日判決言渡）があったので、さらに審理のうえ、次のとおり審決する。
【結　論】
　訂正を認める。
　本件審判の請求は、成り立たない。
　審判費用は、請求人の負担とする。
【理　由】
第１　手続の経緯
　本件特許第３３１３３５８号（以下、「本件特許」という。）は、平成１１年１１月８日（優先権主張平成１０年１１月９日）を国際出願日として出願され、平成１４年５月３１日に特許権の設定の登録がされたものである。 
　これに対して、請求人は、平成２２年１０月２５日に、請求項１〜１１に係る発明についての特許を無効とする審決を求めて特許無効審判を請求した。
　平成２３年７月２５日に、「本件審判請求は、成り立たない。」との審決（以下、「１次審決」という。）がされたが、知的財産高等裁判所において同審決を取消す判決がされ（平成２３年（行ケ）１０２７４号、平成２４年１０月３１日判決言渡）、最高裁判所において上記判決に対する上告を棄却する旨及び上告審として受理しない旨の決定（平成２５年（行ツ）第４５号、平成２５年（行ヒ）第５４号）がされ、上記判決は確定した。
　その後、被請求人は、平成２６年４月２８日に訂正の請求の申立てをし、平成２６年５月２３日に訂正請求書を提出し、同日付けで上申書を提出した。
　平成２６年６月３日に請求人に訂正請求書を送付し弁駁を求めたところ、請求人から応答はなかった。
　
第２　訂正の可否に対する判断 
 １．平成２６年５月２３日付け訂正請求の内容  
　被請求人が平成２６年５月２３日に提出した訂正請求書による訂正請求によって求める訂正（以下、「本件訂正」という。）は、本件特許の願書に添付した明細書（以下、「本件特許明細書」という。）の記載を、同訂正請求書に添付した明細書のとおりに訂正することを求めるものであって、以下の訂正事項１〜７からなるものと認められる（下線部は訂正箇所である）。 
 　 
 （１）訂正事項１ 
　本件特許公報の特許請求の範囲の請求項１において
「【請求項１】
　次の工程を繰り返すことによる１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の増幅方法。
 Ａ）３′末端と５′末端において、それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互いに相補的な塩基配列がアニールしたときに両者の間に塩基対結合が可能となるループが形成される鋳型を提供する工程
 Ｂ）同一鎖にアニールさせた前記鋳型の３′末端を合成起点として相補鎖合成を行う工程、 Ｃ）前記ループのうち３′末端側に位置するループ内に相補的な塩基配列を３′末端に含むオリゴヌクレオチドを、ループ部分にアニールさせ、これを合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って、工程Ｂ）で合成された相補鎖を置換してその３′末端を塩基対結合が可能な状態とする工程、および
 Ｄ）工程Ｃ）において３′末端を塩基対結合が可能な状態とした鎖を工程Ａ）における新たな鋳型とする工程」 
とあるのを、
「【請求項１】
　次の工程を繰り返すことによる１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の増幅方法。
 Ａ）３′末端と５′末端において、それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互いに相補的な塩基配列がアニールしたときに両者の間に塩基対結合が可能となるループが形成される鋳型を提供する工程
であって、
　
前記鋳型は、３′末端に存在し同一鎖上の相補的な塩基配列にアニールする領域を領域Ｆ１とし、前記領域Ｆ１と相補的な塩基配列からなる領域を領域Ｆ１ｃとし、前記領域Ｆ１と前記領域Ｆ１ｃとの間に存在し前記領域Ｆ１と前記領域Ｆ１ｃがアニールしたときに塩基対結合可能となる領域を領域Ｆ２ｃとし、かつ、５′末端に存在し同一鎖上の相補的な塩基配列にアニールする領域を領域Ｒ１ｃとし、前記領域Ｒ１ｃと相補的な塩基配列からなる領域をＲ１とし、前記領域Ｒ１ｃと前記領域Ｒ１との間に存在し前記領域Ｒ１と前記領域Ｒ１ｃがアニールしたときに塩基対結合可能となる領域を領域Ｒ２とした場合に、前記領域Ｆ２ｃと前記領域Ｆ１ｃとの距離が１０〜７０塩基であり、および／または、前記領域Ｒ２と前記領域Ｒ１との距離が１０〜７０塩基である工程、
 Ｂ）同一鎖にアニールさせた前記鋳型の３′末端を合成起点として相補鎖合成を行う工程、
 Ｃ）前記ループのうち３′末端側に位置するループ内
の前記領域Ｆ２ｃ
の領域Ｆ２
前記
の前記領域Ｆ２ｃ
 Ｄ）工程Ｃ）において３′末端を塩基対結合が可能な状態とした鎖を工程Ａ）における新たな鋳型とする工程。」
と訂正する。 
 　 
（２）訂正事項２
　本件特許公報の特許請求の範囲の請求項２において
「【請求項２】
　工程Ｃ）におけるオリゴヌクレオチドが、その５′側末端に工程Ｂ）において合成起点となった３′末端に相補的な塩基配列を備えたものである請求項１に記載の増幅方法。」
とあるのを、
「【請求項２】
　工程Ｃ）におけるオリゴヌクレオチドが、その５′側末端に工程Ｂ）において合成起点となった３′末端
の領域Ｆ１
の領域Ｆ１ｃ
と訂正する。
　
（３）訂正事項３
　詳細な説明について、特許公報２頁４欄３０行の「DispIacement」を「Disp
l
　
（４）訂正事項４
　詳細な説明について、特許公報３頁５欄１８行の「NucIeic」を「Nuc
l
　
（５）訂正事項５
　詳細な説明について、特許公報９頁１７欄１２行の「増てえいく」を「増
えて
　
（６）訂正事項６
　詳細な説明について、特許公報９頁１７欄３１行〜３２行の「インナープライマーの温度」を「インナープライマーの
濃度
　
（７）訂正事項７
　詳細な説明について、特許公報１２頁２４欄１８行の「プライマータイマー」を「プライマー
ダ
　
２．訂正の適否について
（１）訂正事項１
ア．訂正の目的の適否及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否について
　訂正事項１は、請求項１の鋳型を提供する工程Ａ）において、
「前記鋳型は、３′末端に存在し同一鎖上の相補的な塩基配列にアニールする領域を領域Ｆ１とし、前記領域Ｆ１と相補的な塩基配列からなる領域を領域Ｆ１ｃとし、前記領域Ｆ１と前記領域Ｆ１ｃとの間に存在し前記領域Ｆ１と前記領域Ｆ１ｃがアニールしたときに塩基対結合可能となる領域を領域Ｆ２ｃとし、かつ、５′末端に存在し同一鎖上の相補的な塩基配列にアニールする領域を領域Ｒ１ｃとし、前記領域Ｒ１ｃと相補的な塩基配列からなる領域をＲ１とし、前記領域Ｒ１ｃと前記領域Ｒ１との間に存在し前記領域Ｒ１と前記領域Ｒ１ｃがアニールしたときに塩基対結合可能となる領域を領域Ｒ２とした場合に、前記領域Ｆ２ｃと前記領域Ｆ１ｃとの距離が１０〜７０塩基であり、および／または、前記領域Ｒ２と前記領域Ｒ１との距離が１０〜７０塩基である工程」
という記載を追加するものである。
　訂正前の請求項１は、工程Ａ）で提供される鋳型について、「３′末端と５′末端において、それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互いに相補的な塩基配列がアニールしたときに両者の間に塩基対結合が可能となるループが形成される鋳型」であることは特定していたものの、各領域の関係について具体的に特定していなかった。
　訂正後の請求項１は、鋳型の各領域を
「３′末端に存在し同一鎖上の相補的な塩基配列にアニールする領域を領域Ｆ１」
「前記領域Ｆ１と相補的な塩基配列からなる領域を領域Ｆ１ｃ」
「前記領域Ｆ１と前記領域Ｆ１ｃとの間に存在し前記領域Ｆ１と前記領域Ｆ１ｃがアニールしたときに塩基対結合可能となる領域を領域Ｆ２ｃ」
「５′末端に存在し同一鎖上の相補的な塩基配列にアニールする領域を領域Ｒ１ｃ」
「前記領域Ｒ１ｃと相補的な塩基配列からなる領域をＲ１」
「前記領域Ｒ１ｃと前記領域Ｒ１との間に存在し前記領域Ｒ１と前記領域Ｒ１ｃがアニールしたときに塩基対結合可能となる領域を領域Ｒ２」
と特定し、さらに、その場合に、
「前記領域Ｆ２ｃと前記領域Ｆ１ｃとの距離が１０〜７０塩基であり、および／または、前記領域Ｒ２と前記領域Ｒ１との距離が１０〜７０塩基である」ことを限定するものであるから、訂正事項１は、特許請求の範囲の減縮を目的とするものであり、実質上特許請求の範囲を拡張し又は変更するものではない。
　また、上記訂正事項により領域を特定したことから、Ｃ）におけるループ内の領域が「前記領域Ｆ２ｃ」であり、プライマーであるオリゴヌクレオチドの「領域Ｆ２」がループ内の「前記領域Ｆ２ｃ」にアニールすることを明確にした。この訂正事項は上記訂正事項と整合させるためのものであり、明りょうでない記載の釈明を目的とするものであり、実質上特許請求の範囲を拡張し又は変更するものではない。
　
イ．新規事項の有無について
　訂正事項１について、発明の詳細な説明には以下の事項が記載されている。
「本発明の特徴となっている、3'末端に同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールすることができる領域Ｆ１を備え、この領域Ｆ１が同一鎖上のＦ１ｃにアニールすることによって、塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成することができる核酸は、様々な方法によって得ることができる。もっとも望ましい態様においては、次の構造を持ったオリゴヌクレオチドを利用した相補鎖合成反応に基づいてその構造を与えることができる。
  すなわち本発明において有用なオリゴヌクレオチドとは、少なくとも以下の２つの領域Ｘ２およびＸ１ｃとで構成され、Ｘ２の5'側にＸ１ｃが連結されたオリゴヌクレオチドからなる。
Ｘ２：特定の塩基配列を持つ核酸の領域Ｘ２ｃに相補的な塩基配列を持つ領域
Ｘ１ｃ:特定の塩基配列を持つ核酸における領域Ｘ２ｃの5'側に位置する領域Ｘ１ｃと実質的に同じ塩基配列を持つ領域
  ここで、本発明のオリゴヌクレオチドの構造を決定する特定の塩基配列を持つ核酸とは、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用するときに、その鋳型となる核酸を意味する。本発明の合成方法に基づいて核酸の検出を行う場合には、特定の塩基配列を持つ核酸とは、検出対象、あるいは検出対象から誘導された核酸である。特定の塩基配列を持つ核酸は、少なくともその一部の塩基配列が明らかとなっている、あるいは推測が可能な状態にある核酸を意味する。塩基配列を明らかにすべき部分とは、前記領域Ｘ２ｃおよびその5'側に位置する領域Ｘ１ｃである。この２つの領域は、連続する場合、そして離れて存在する場合とを想定することができる。
両者の相対的な位置関係により、生成物である核酸が自己アニールしたときに形成されるループ部分の状態が決定される
生成物である核酸が分子間のアニールではなく自己アニールを優先的に行うためには、両者の距離が不必要に離れないほうが望ましい
両者があまりにも接近している場合には望ましい状態のループの形成を行うには不利となるケースも予想される
ループにおいては、新たなオリゴヌクレオチドのアニールと、それを合成起点とする鎖置換を伴う相補鎖合成反応がスムーズに開始できる構造が求められる
１０〜７０塩基となるように設計する
　
　このように、本件特許の発明の詳細な説明には、鋳型の領域Ｘ２ｃおよびその５′側に位置する領域Ｘ１ｃの相対的な位置関係により、生成物である核酸が自己アニールしたときに形成されるループ部分の状態が決定され、生成物である核酸が分子間のアニールではなく自己アニールを優先的に行うためには、両者の距離が不必要に離れない方が望ましいが、一方で、両者があまりにも接近している場合には望ましい状態のループの形成を行うには不利となるケースも予想されることから、新たなオリゴヌクレオチドのアニールと、それを合成起点とする鎖置換を伴う相補鎖合成反応がスムーズに開始できる構造として、領域Ｘ２ｃおよび領域Ｘ１ｃとの距離が、１０〜７０塩基となるように設計することが望ましいことが開示されている。
　よって、訂正事項１は、願書に添付した明細書又は図面に記載した事項の範囲内においてなされたものである。
　
（２）訂正事項２
　訂正事項２は、訂正事項１により領域を特定したことから、請求項２に記載された「工程Ｂ）において合成起点となった３′末端」を「領域Ｆ１」と、その「相補的な塩基配列」を「領域Ｆ１ｃ」と明確にしたものであり、当該訂正事項は、明りょうでない記載の釈明を目的とするものである。
　そして、訂正事項２は、特許明細書又は図面に記載した事項の範囲内でなされたものであり、さらに、実質上特許請求の範囲を拡張し又は変更するものでもない。
　
（３）訂正事項３〜７
　訂正事項３〜５、７は、いずれも誤記の訂正を目的とするものであり、特許明細書又は図面に記載した事項の範囲内でなされたものであり、さらに、実質上特許請求の範囲を拡張し又は変更するものでもない。
　
　訂正事項６について、訂正前は「アウタープライマーを利用する場合には、Ｆ２ｃからの合成よりも後にアウタープライマー（Ｆ３）からの合成が開始される必要がある。最も単純な方法はインナープライマーの
温度
　
 ３．むすび  
 　以上のとおり、本件訂正は、特許法第１３４条の２第１項ただし書各号に掲げる事項を目的とするものであり、同条第５項において読み替えて準用する第１２６条第３項〜第５項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
 なお、平成２６年８月２５日に提出した承諾書により、訂正請求書に添付した訂正明細書、特許請求の範囲のとおり訂正を請求することについて、通常実施権者の承諾を得られたと認められ、本件訂正は、特許法第１３４条の２第５項において準用する特許法第１２７条の要件を満たしている。
　
第３　本件発明 
　上記第２のとおり、本件訂正は認められたので、本件発明は、本件訂正により訂正された明細書の特許請求の範囲の請求項１〜１１に記載された以下のとおりのものである。（以下、「本件発明１」、「本件発明２」等という。） 
「【請求項１】
　次の工程を繰り返すことによる１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の増幅方法。 
 Ａ）３′末端と５′末端において、それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互いに相補的な塩基配列がアニールしたときに両者の間に塩基対結合が可能となるループが形成される鋳型を提供する工程であって、
　前記鋳型は、３′末端に存在し同一鎖上の相補的な塩基配列にアニールする領域を領域Ｆ１とし、前記領域Ｆ１と相補的な塩基配列からなる領域を領域Ｆ１ｃとし、前記領域Ｆ１と前記領域Ｆ１ｃとの間に存在し前記領域Ｆ１と前記領域Ｆ１ｃがアニールしたときに塩基対結合可能となる領域を領域Ｆ２ｃとし、かつ、５′末端に存在し同一鎖上の相補的な塩基配列にアニールする領域を領域Ｒ１ｃとし、前記領域Ｒ１ｃと相補的な塩基配列からなる領域をＲ１とし、前記領域Ｒ１ｃと前記領域Ｒ１との間に存在し前記領域Ｒ１と前記領域Ｒ１ｃがアニールしたときに塩基対結合可能となる領域を領域Ｒ２とした場合に、前記領域Ｆ２ｃと前記領域Ｆ１ｃとの距離が１０〜７０塩基であり、および／または、前記領域Ｒ２と前記領域Ｒ１との距離が１０〜７０塩基である工程、 
 Ｂ）同一鎖にアニールさせた前記鋳型の３′末端を合成起点として相補鎖合成を行う工程、
 Ｃ）前記ループのうち３′末端側に位置するループ内の前記領域Ｆ２ｃに相補的な塩基配列の領域Ｆ２を３′末端に含むオリゴヌクレオチドを、前記ループ部分の前記領域Ｆ２ｃにアニールさせ、これを合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って、工程Ｂ）で合成された相補鎖を置換してその３′末端を塩基対結合が可能な状態とする工程、および 
 Ｄ）工程Ｃ）において３′末端を塩基対結合が可能な状態とした鎖を工程Ａ）における新たな鋳型とする工程。
【請求項２】
　工程Ｃ）におけるオリゴヌクレオチドが、その５′側末端に工程Ｂ）において合成起点となった３′末端の領域Ｆ１に相補的な塩基配列の領域Ｆ１ｃを備えたものである請求項１に記載の増幅方法。
【請求項３】 更に工程Ｃ）におけるオリゴヌクレオチドを合成起点として合成された相補鎖を工程Ａ）における鋳型とする工程を含む請求項２に記載の増幅方法。
【請求項４】 融解温度調整剤の存在下で鎖置換相補鎖合成反応を行う請求項１に記載の方法。
【請求項５】 融解温度調整剤がベタインである請求項４に記載の方法。
【請求項６】 反応液中に0.2〜3.0Mのベタインを存在させる請求項５に記載の方法。
【請求項７】 請求項１〜６に記載のいずれかの増幅方法を行い、増幅反応生成物が生じたかどうかを観察することにより試料中の標的塩基配列を検出する方法。
【請求項８】 増幅反応生成物に、ループに相補的な塩基配列を含むプローブを加え、両者のハイブリダイズを観察する請求項７に記載の方法。
【請求項９】 プローブが粒子標識されており、ハイブリダイズによって生じる凝集反応を観察する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】 核酸の検出剤存在下で請求項１〜６に記載のいずれかの増幅方法を行い、検出剤のシグナル変化に基づいて増幅反応生成物が生じたかどうかを観察する請求項７に記載の方法。
【請求項１１】 請求項７に記載の検出方法によって標的塩基配列の変異を検出する方法であって、増幅対象である塩基配列における変異が、増幅方法を構成するいずれかの相補鎖合成を妨げるものである方法。」 
 
第４　当事者の主張の概要
１．請求人の主張の概要
　請求人が主張する無効理由の概要は、次のとおりであり、甲第１号証〜甲第３３号証（以下、「甲１」〜「甲３３」ということがある。）を提出している。
　
（１）無効理由１
　本件発明１〜１１は、甲１〜甲８に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。　
（２）無効理由２
　本件発明１〜１１は、本件出願前（優先日前）に出願され、かつ本件出願後に出願公開された甲９に記載の発明と同一であるから、特許法第２９条の２の規定により特許を受けることができない。
（３）無効理由３、４
　本件発明１〜１１は、特許法第３６条第６項第１号及び同条第４項に規定する要件を満たしていない。
　
＜証拠方法＞ 
 甲第１号証：THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.266、 No.21、 pp.14031-14038、 1991 
 甲第１号証の２：甲第１号証の抄訳（平成２３年５月２７日付手続補正書） 
 甲第１号証の３：Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.79、 pp.724-728、 1982 
 甲第２号証：“DNA REPLICATION SECOND EDITION”、 ARTHUR KORNBERG、TANIA A BAKR、 W.H.FREEMAN AND COMPANY、1992　 pp.700-704  pp.713-716. 
 甲第２号証の２：甲第２号証の抄訳 
 甲第２号証の３：“DNA REPLICATION SECOND EDITION”、 ARTHUR KORNBERG、TANIA A BAKER、 W.H.FREEMAN AND COMPANY、 1992 pp.492-493  pp.504. 
 甲第２号証の４：甲第２号証の３の抄訳 
 甲第３号証：ＷＯ　９６／０１３２７ 
 甲第３号証の２：甲第３号証の訳文 
 甲第４号証：ＷＯ　９７／０４１３１ 
 甲第４号証の２：甲第４号証の抄訳 
 甲第５号証：特表平１０−５１０１５８号公報 
 甲第６号証：特開平９−１６８４００号公報 
 甲第７号証：「バイオ実験イラストレイテッド　３＋　本当にふえるＰＣＲ」秀潤社、１９９８年６月１日発行 
 甲第８号証：ＷＯ９６／３１６２２ 
 甲第８号証の２：特表平１１−５０３０１９（甲第８号証の訳文） 
 甲第９号証：特開２０００−３７１９４号公報 
 甲第９号証の２：甲第８号証の優先権証明書 
 甲第１０号証：Nucleic Acids Research、2000、Vol.28、No.12、e63 
 甲第１０号証の２：甲第１０号証の抄訳 
 甲第１１号証：平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の、原告栄研化学株式会社による平成２２年２月１日付け第４準備書面 
 甲第１２号証：平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の、原告栄研化学株式会社による平成２２年２月１８日付け第５準備書面） 
 甲第１３号証：平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の、原告栄研化学株式会社による平成２２年７月７日付け第７準備書面 
 甲第１４号証：平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の、原告栄研化学株式会社による平成２２年９月２９日付け技術説明資料 
 甲第１５号証：無効２００８−８００２９３（特許第３８９７８０５号特許無効審判事件）の、請求人栄研化学による平成２１年８月７日付け技術説明資料 
 甲第１６号証：無効２００８−８００２９３（特許第３８９７８０５号特許無効審判事件）の、請求人栄研化学による平成２１年９月１８日付け上申書 
 甲第１７号証：平成２１年（行ケ）第１０４２０号事件の、原告栄研化学株式会社による平成２２年３月１日付け第１準備書面 
 甲第１８号証：平成２１年（行ケ）第１０４２０号事件の、原告栄研化学株式会社による平成２２年８月２３日付け第３準備書面 
 甲第１９号証：平成２１年（行ケ）第１０４２０号事件の、原告栄研化学株式会社による平成２２年９月８日付け技術説明資料 
 甲第２０号証：平成２１年（行ケ）第１０１０７号事件の、原告栄研化学株式会社による平成２１年１０月５日付け第２準備書面 
 甲第２１号証：特願２００１−５７５１７１の、出願人栄研化学株式会社による平成２３年３月７日付け意見書 
 甲第２２号証：特願２００１−５７５１７１の審査経過における、平成２３年１月４日付け発送拒絶理由通知 
 甲第２３号証：特願２００１−５７５１７１の出願経過書類 
 甲第２４号証：平成17年（行ケ）10207号審決取消請求事件の判決文 
 甲第２５号証：請求人による平成２３年５月１１日付け口頭審理説明資料 
 甲第２６号証：無効２０１０−８００１９５（特許第３３１３３５８号無効審判事件）、無効２０１０−８００１９７（特許第３９７４４４１号無効審判事件）及び無効２０１０−８００１９８（特許第４１３９４２４号無効審判事件）の、被請求人栄研化学による平成２３年５月１１日付け口頭審理技術説明資料 
 甲第２７号証：東京化学同人「分子細胞生物学辞典」第２版　８０７頁（「ヘアピンループ」の解説の頁）、平成９年（１９９７年）３月１０日　第1版第１刷発行 
甲第２８号証：被請求人栄研化学作成のＷｅｂサイト「ＬＡＭＰ法の原理」（http://loopamp.eiken.co.jp/lamp/principle.htmlからダウンロード［ダウンロード日：平成２３年（２０１１年）５月１９日］） 
甲第２９号証：平成２４年（行サ）第１００４４号事件上告理由書の第１、３及び８〜１１頁
甲第３０号証：平成２４年（行ノ）第１００６４号事件上告受理申立理由書の第１、３及び８〜１１頁
甲第３１号証：平成２４年（行サ）第１００４４号事件上告理由書及び平成２４年（行ノ）第１００６４号事件上告受理申立理由書における乙第２号証の２
甲第３２号証：平成２４年（行サ）第１００４４号事件上告理由書及び平成２４年（行ノ）第１００６４号事件上告受理申立理由書における乙第２号証の３
甲第３３号証：平成２４年（行サ）第１００４４号事件上告理由書及び平成２４年（行ノ）第１００６４号事件上告受理申立理由書における乙第２号証の１６
　
 ２．被請求人の主張の概要
　被請求人は、請求人の主張する無効理由１〜４はいずれも理由がないと主張し、乙第１号証〜乙第８号証（以下、「乙１」〜「乙８」ということがある）を提出している。
　
＜証拠方法＞ 
 乙第１号証：「生化学辞典　第３版」第１刷１９９８年１０月８日、株式会社東京化学同人発行 
 乙第２号証：特願平１１−１７９０５６の審査経過における平成１５年１２月２４日付手続補正書 
 乙第３号証：特願平１１−１７９０５６の審査経過における平成１６年２月２７日起案の拒絶理由通知書 
 乙第４号証：特願平１１−１７９０５６の審査経過における平成１６年９月２日付意見書 
 乙第５号証：特願平１１−１７９０５６の審査経過における平成１７年１月１１日起案の拒絶査定 
 乙第６号証：特願平１１−１７９０５６の審査経過における平成１７年４月１８日付出願取下書 
 乙第７号証：平成２３年５月１１日付被請求人技術説明資料 
 乙第８号証：タカラバイオ株式会社のウェブサイト（http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100003529）のプリントアウト 
　
第５　当審の判断
１．本件発明について
（１）本件明細書の記載について
　本件明細書には、以下の事項が記載されている。
ア．「本発明の課題は、新規な原理に基づく核酸の合成方法を提供することである。より具体的には、低コストで効率的に配列に依存した核酸の合成を実現することができる方法を提供することである。すなわち、単一の酵素を用い、しかも等温反応条件の下でも核酸の合成と増幅を達成することができる方法の提供が、本発明の課題である。更に本発明は、公知の核酸合成反応原理では達成することが困難な高い特異性を実現することができる核酸の合成方法、並びにこの合成方法を応用した核酸の増幅方法の提供を課題とする。」（本件特許公報７欄６〜１５行） 
 　 
イ．「本発明において合成の目的としている１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸とは、１本鎖上に互いに相補的な塩基配列を隣り合せに連結した核酸を意味する。更に本発明においては、相補的な塩基配列の間にループを形成するための塩基配列を含まなければならない。本発明においては、この配列をループ形成配列と呼ぶ。そして本発明によって合成される核酸は、実質的に前記ループ形成配列によって連結された互いに相補的な塩基配列で構成される。」（本件特許公報１０欄２７〜３５行）。 
 　 
ウ．「ヘアピンループを形成させて自身を鋳型(template)とする相補鎖合成反応の報告は多いが、本発明においてはヘアピンループ部分に塩基対結合を可能とする領域を備えており、この領域を相補鎖合成に利用している点において新規である。」（本件特許公報１２欄５〜１０行） 
 　 
エ．「本発明の特徴となっている、３′末端に同一鎖上の一部Ｆ１ｃにアニールすることができる領域Ｆ１を備え、この領域Ｆ１が同一鎖上のＦ１ｃにアニールすることによって、塩基対結合が可能な領域Ｆ２ｃを含むループを形成することができる核酸は、様々な方法によって得ることができる。もっとも望ましい態様においては、次の構造を持ったオリゴヌクレオチドを利用した相補鎖合成反応に基づいてその構造を与えることができる。 
 すなわち本発明において有用なオリゴヌクレオチドとは、少なくとも以下の２つの領域Ｘ２およびＸ１ｃとで構成され、Ｘ２の５′側にＸ１ｃが連結されたオリゴヌクレオチドからなる。 
 　Ｘ２：特定の塩基配列を持つ核酸の領域Ｘ２ｃに相補的な塩基配列を持つ領域 
 　Ｘ１ｃ:特定の塩基配列を持つ核酸における領域Ｘ２ｃの５′側に位置する領域Ｘ１ｃと実質的に同じ塩基配列を持つ領域
  ここで、本発明のオリゴヌクレオチドの構造を決定する特定の塩基配列を持つ核酸とは、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用するときに、その鋳型となる核酸を意味する。本発明の合成方法に基づいて核酸の検出を行う場合には、特定の塩基配列を持つ核酸とは、検出対象、あるいは検出対象から誘導された核酸である。特定の塩基配列を持つ核酸は、少なくともその一部の塩基配列が明らかとなっている、あるいは推測が可能な状態にある核酸を意味する。塩基配列を明らかにすべき部分とは、前記領域Ｘ２ｃおよびその５′側に位置する領域Ｘ１ｃである。この２つの領域は、連続する場合、そして離れて存在する場合とを想定することができる。両者の相対的な位置関係により、生成物である核酸が自己アニールしたときに形成されるループ部分の状態が決定される。また、生成物である核酸が分子間のアニールではなく自己アニールを優先的に行うためには、両者の距離が不必要に離れないほうが望ましい。したがって、両者の位置関係は、通常0-500 塩基分の距離を介して連続するようにするのが望ましい。ただし、後に述べる自己アニールによるループの形成において、両者があまりにも接近している場合には望ましい状態のループの形成を行うには不利となるケースも予想される。ループにおいては、新たなオリゴヌクレオチドのアニールと、それを合成起点とする鎖置換を伴う相補鎖合成反応がスムーズに開始できる構造が求められる。したがってより望ましくは、領域Ｘ２ｃおよびその５′側に位置する領域Ｘ１ｃとの距離が、０〜１００塩基、さらに望ましくは１０〜７０塩基となるように設計する。なおこの数値はＸ１ｃとＸ２を含まない長さを示している。ループ部分を構成する塩基数は、更にＸ２に相当する領域を加えた長さとなる。」（本件特許公報１２欄３９行〜１３欄３６行） 
 　 
オ．「本発明による核酸の合成方法において有用な上記オリゴヌクレオチドを利用し、鎖置換活性を持ったDNA ポリメラーゼと組み合わせて合成を行う反応について、基本的な原理を図５−６を参考にしながら以下に説明する。上記オリゴヌクレオチド（図５におけるＦＡ）は、まずＸ２（Ｆ２に相当）が鋳型となる核酸にアニールし相補鎖合成の起点となる。図５においてはＦＡを起点として合成された相補鎖がアウタープライマー（Ｆ３）からの相補鎖合成（後述）によって置換され、１本鎖（図５−Ａ）となっている。得られた相補鎖に対して更に相補鎖合成を行うと、このとき図５−Ａの相補鎖として合成される核酸の3'末端部分は、本発明によるオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を持つ。つまり、本発明のオリゴヌクレオチドは、その5'末端部分に領域Ｘ１ｃ（Ｆ１ｃに相当）と同じ配列を持つことから、このとき合成される核酸の3' 末端部分はその相補配列Ｘ１ (Ｆ１)を持つことになる。図５は、Ｒ１を起点として合成された相補鎖がアウタープライマーＲ３を起点とする相補鎖合成によって置換される様子を示している。置換によって3' 末端部分が塩基対結合が可能な状態となると、3'末端のＸ１ (Ｆ１)は、同一鎖上のＸ１ｃ（Ｆ１ｃ）にアニールし、自己を鋳型とした伸長反応が進む (図５−Ｂ)。そしてその3' 側に位置するＸ２ｃ（Ｆ２ｃ）を塩基対結合を伴わないループとして残す。このループには本発明によるオリゴヌクレオチドのＸ２（Ｆ２）がアニールし、これを合成起点とする相補鎖合成が行われる (図５−Ｂ)。このとき、先に合成された自身を鋳型とする相補鎖合成反応の生成物が、鎖置換反応によって置換され塩基対結合が可能な状態となる。
  本発明によるオリゴヌクレオチドを１種類、そしてこのオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成された相補鎖を鋳型として核酸合成を行うことが可能な任意のリバースプライマーを用いた基本的な構成によって、図６に示すような複数の核酸合成生成物を得ることができる。図６からわかるとおり、(D)が本発明において合成の目的となっている１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸である。他方の生成物(E)は、加熱変性などの処理によって１本鎖とすれば再び(D)を生成するための鋳型となる。また２本鎖状態にある核酸である生成物(D)は、もしも加熱変性などによって１本鎖にされた場合、もとの２本鎖とはならずに高い確率で同一鎖内部でのアニールが起きる。なぜならば、同じ融解温度(Tm)を持つ相補配列ならば、分子間(intermolecular)反応よりも分子内(intramolecular)反応のほうがはるかに優先的に進むためである。同一鎖上でアニールした生成物(D)に由来する１本鎖は、それぞれが同一鎖内でアニールして(B)の状態に戻るので、更にそれぞれが１分子づつの(D)と(E)を与える。これらの工程を繰り返すことによって、１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸を次々に合成していくことが可能である。１サイクルで生成される鋳型と生成物が指数的に増えていくので、たいへん効率的な反応となる。
  ところで図５−(A)の状態を実現するためには、はじめに合成された相補鎖を少なくともリバースプライマーがアニールする部分において塩基対結合が可能な状態にしなければならない。このステップは任意の方法によって達成することができる。すなわち、最初の鋳型に対して本発明のオリゴヌクレオチドがアニールする領域Ｆ２ｃよりも更に鋳型上で3' 側の領域Ｆ３ｃにアニールするアウタープライマー（Ｆ３）を別に用意する。このアウタープライマーを合成起点として鎖置換型の相補鎖合成を触媒するポリメラーゼによって相補鎖合成を行えば、本発明の前記Ｆ２ｃを合成開始点として合成された相補鎖は置換され、やがてＲ１がアニールすべき領域Ｒ１ｃを塩基対結合が可能な状態とする(図５)。鎖置換反応を利用することによって、ここまでの反応を等温条件下で進行させることができる。」（本件特許公報１６欄１２行〜１７欄２８行）
　
カ．「以下の態様においては、本発明に基づくオリゴヌクレオチドとして２種類を用意する。これを説明のためにＦＡとＲＡと名づける。ＦＡとＲＡを構成する領域は、以下のとおりである。
        Ｘ２    Ｘ１ｃ
ＦＡ    Ｆ２    Ｆ１ｃ
ＲＡ    Ｒ２    Ｒ１ｃ
  ここで、Ｆ２は鋳型となる核酸の領域Ｆ２ｃに相補的な塩基配列である。またＲ２はＦ２をプライマーとして合成される相補鎖に含まれる任意の領域Ｒ２ｃに相補的な塩基配列である。Ｆ１ｃとＲ１ｃはそれぞれ、Ｆ２ｃおよびＲ２ｃのそれぞれ下流に位置する任意の塩基配列である。ここでＦ２−Ｒ２間の距離は任意であって良い。相補鎖合成を行うDNA ポリメラーゼの合成能力にも依存するが、好適な条件では1kbp 程度の長さであっても十分に合成が可能である。より具体的には、Bst DNA ポリメラーゼを用いた場合、F2/R2c 間で 800bp、望ましくは 500bp以下の長さであれば確実に合成される。温度サイクルを伴うPCR では、温度変化ストレスによる酵素活性の低下が長い塩基配列の合成効率を下げるとされている。本発明における望ましい態様では、核酸増幅工程における温度サイクルが不要となるので、長い塩基配列であっても合成、ならびに増幅を確実に達成することができる。
  まず鋳型となる核酸に対してＦＡのＦ２をアニールさせ、これを合成起点として相補鎖合成を行う。以下、図１の(4)にいたるまでは先に説明した本発明の基本的な態様(図５) と同様の反応工程となっている。図１の(2)でＦ３としてアニールしている配列は、先に説明したアウタープライマーである。このプライマーを合成起点として鎖置換型の相補鎖合成を行うDNA ポリメラーゼで行うことにより、ＦＡから合成した相補鎖は置換され、塩基対結合が可能な状態となる。
  (4)でＲ２ｃが塩基対結合が可能な状態となったところで、リバースプライマーとしてのＲＡがＲ２ｃ／Ｒ２の組み合わせでアニールする。これを合成起点とする相補鎖合成は、ＦＡの5'側末端であるＦ１ｃに至る部分まで行われる。この相補鎖合成反応に続いて、やはり置換用のアウタープライマーＲ３がアニールし、鎖置換を伴って相補鎖合成を行うことにより、ＲＡを合成起点として合成された相補鎖が置換される。このとき置換される相補鎖は、ＲＡを5'側に持ちＦＡに相補的な配列が3'末端に位置する。」（本件特許公報１９欄３１行〜２０欄２３行）
　
キ．「さて、こうして置換された１本鎖核酸の3'側には、同一鎖上のＦ１ｃに相補的な配列Ｆ１が存在する。Ｆ１は、同一分子内に並ぶＦ１ｃに速やかにアニールし、相補鎖合成が始まる。3'末端（Ｆ１）が同一鎖上のＦ１ｃにアニールするときに、Ｆ２ｃを含むループが形成されている。このループ部分は塩基対結合が可能な状態で維持されていることは、図２-(7)からも明らかである。Ｆ２ｃに相補的な塩基配列を持つ本発明のオリゴヌクレオチドＦＡは、このループ部分にアニールして相補鎖合成の起点となる(7)。ループ部分からの相補鎖合成は、先に開始したＦ１からの相補鎖合成の反応生成物を置換しながら進む。その結果、自身を鋳型として合成された相補鎖は、再び3'末端において塩基対結合が可能な状態となる。この3'末端は、同一鎖上のＲ１ｃにアニールしうる領域Ｒ１を3'末端に備えており、やはり同一分子内の速やかな反応により両者は優先的にアニールする。こうして、先に説明したＦＡを鋳型として合成された3'末端からの反応と同様の反応が、この領域でも進行する。結果として、本発明による１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸は次々と相補鎖合成と置換とを継続し、その3' 末端Ｒ１を起点とする伸長を続けることになる。3'末端Ｒ１の同一鎖へのアニールによって形成されるループには常にＲ２ｃが含まれることから、以降の反応で3'末端のループ部分にアニールするのは常にＲ２を備えたオリゴヌクレオチド（すなわちＲＡ）となる。
  一方、自分自身を鋳型として伸長を継続する１本鎖の核酸に対して、そのループ部分にアニールするオリゴヌクレオチドを合成起点として相補鎖合成される核酸に注目すると、ここでも本発明による１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の合成が進行している。すなわち、ループ部分からの相補鎖合成は、たとえば図２−(7)においては、ＲＡに達した時点で完了する。そして、この核酸の合成によって置換された核酸が相補鎖合成を開始（図３−(8)）すると、やがてその反応はかつて合成起点であったループ部分に達して再び置換が始まる。こうしてループ部分から合成を開始した核酸も置換され、その結果同一鎖上にアニールすることができる3' 末端Ｒ１を得る（図３−(10)）。この3' 末端Ｒ１は同一鎖のＲ１ｃにアニールして相補鎖合成を開始する。さて、この反応のＦとＲを読みかえれば、図２−(7)で起きている反応と同じである。したがって図３−(10)に示す構造は、自身の伸長と新たな核酸の生成を継続する新しい核酸として機能することができる。
  なお図３−(10)に示す核酸から開始する核酸の合成反応は、ここまで述べてきたものとは逆に常に3' 末端Ｆ１を合成起点とする伸長となる。すなわち本発明においては、１つの核酸の伸長に伴って、これとは別に伸長を開始する新たな核酸を供給しつづける反応が進行する。更に鎖が伸長するのに従い、末端のみならず、同一鎖上に複数のループ形成配列がもたらされる。これらのループ形成配列は、鎖置換合成反応により塩基対形成可能な状態となると、オリゴヌクレオチドがアニールし、新たな核酸の生成反応の基点となる。末端のみならず鎖の途中からの合成反応も組み合わされることにより、さらに効率のよい増幅反応が達成されるのである。以上のようにリバースプライマーとして本発明に基づくオリゴヌクレオチドＲＡを組み合わせることによって、伸長とそれに伴う新たな核酸の生成が起きる。更に本発明においては、この新たに生成した核酸自身が伸長し、それに付随する更に新たな核酸の生成をもたらす。一連の反応は、理論的には永久に継続し、きわめて効率的な核酸の増幅を達成することができる。しかも本発明の反応は、等温条件のもとで行うことができる。
  このとき蓄積する反応生成物は、Ｆ１−Ｒ１間の塩基配列とその相補配列が交互に連結された構造を持つ。ただし繰り返し単位となっている配列の両端には、Ｆ２−Ｆ１ (Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ)、またはＲ２−Ｒ１（Ｒ２ｃ−Ｒ１ｃ）の塩基配列で構成される領域が連続している。たとえば図３−(9)では、5'側から（Ｒ２−Ｆ２ｃ）−（Ｆ１−Ｒ２ｃ）−（Ｒ１−Ｆ１ｃ）−（Ｆ２−Ｒ２ｃ）という順序で連結された状態となる。これは、本発明に基づく増幅反応が、オリゴヌクレオチドを合成起点としてＦ２（またはＲ２）から開始し、続いて自身の3' 末端を合成起点とするＦ１（またはＲ１）からの相補鎖合成反応によって伸長するという原理のもとに進行しているためである。
  さて、ここでは最も望ましい態様としてループ部分にアニールするオリゴヌクレオチドに本発明によるオリゴヌクレオチドＦＡ、およびＲＡを用いた。しかし本発明による核酸の増幅反応は、これらの限られた構造を持ったオリゴヌクレオチドのみならず、ループからの相補鎖合成を開始できるオリゴヌクレオチドを利用しさえすれば実施することができる。つまり、伸長を続ける3'末端はループからの相補鎖合成によって置換されさえすれば、再びループ部分を与える。ループ部分から開始する相補鎖合成は、常に１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸を鋳型としていることから、本発明で目的としている核酸の合成が可能なことは自明である。ただし、ここで合成される核酸は、置換後にループを形成して相補鎖合成は行うものの、以降のループを形成するための3'末端を持たないため、新たな鋳型としては機能できなくなる。したがって、ＦＡ、あるいはＲＡによって合成を開始した核酸と違って指数的な増幅は期待できない。このような理由から、ＦＡやＲＡのような構造を持ったオリゴヌクレオチドは、本発明に基づく高度に効率的な核酸の合成に有用なのである。
  一連の反応は、鋳型となる１本鎖の核酸に対して、以下の成分を加え、ＦＡおよびＲＡを構成する塩基配列が相補的な塩基配列に対して安定な塩基対結合を形成することができ、かつ酵素活性を維持しうる温度でインキュベートするだけで進行する。
・４種類のオリゴヌクレオチド：
  ＦＡ、
  ＲＡ、
  アウタープライマーＦ３、
  およびアウタープライマーＲ３、
・鎖置換型の相補鎖合成を行うDNA ポリメラーゼ、
・DNA ポリメラーゼの基質となるヌクレオチド
  したがって、PCR のような温度サイクルは必要無い。なおここでいう安定な塩基対結合とは、反応系に存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が相補鎖合成の起点を与えうる状態を意味する。安定な塩基対結合をもたらす望ましい条件は、たとえば融解温度(Tm)以下に設定することである。一般に融解温度(Tm)は、互いに相補的な塩基配列を持つ核酸の 50%が塩基対結合した状態となる温度とされている。融解温度(Tm)以下に設定することは本発明の必須の条件ではないが、高度な合成効率を達成するためには考慮すべき反応条件の一つである。鋳型とすべき核酸が２本鎖である場合には、少なくともオリゴヌクレオチドがアニールする領域を塩基対結合が可能な状態とする必要がある。そのためには一般に加熱変性が行われるが、これは反応開始前の前処理として１度だけ行えば良い。」（本件特許公報２０欄２４行〜２２欄４７行）
　
ク．「この反応は、酵素反応に好適なpH を与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持やアニールのために必要な塩類、酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度(Tm)の調整剤等の共存下で行う。緩衝剤としては、Tris-HCl 等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。pH は使用するDNA ポリメラーゼに応じて調整する。塩類としては KCl、NaCl、あるいは(NH4)2SO4等が、酵素の活性維持と核酸の融解温度(Tm)調整のために適宜添加される。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が利用される。更に融解温度(Tm)の調整剤には、ジメチルスルホキシド(DMSO)やホルムアミドが一般に利用される。融解温度(Tm)の調整剤を利用することによって、前記オリゴヌクレオチドのアニールを限られた温度条件の下で調整することができる。更にベタイン(N、N、N、-trimethylglycine)やテトラアルキルアンモニウム塩は、そのisostabilize 作用によって鎖置換効率の向上にも有効である。ベタインは、反応液中 0.2〜3.0Ｍ、好ましくは 0.5〜1.5 M 程度の添加により、本発明の核酸増幅反応の促進作用を期待できる。」（本件特許公報２２欄４８行〜２３欄５１行） 
 　 
ケ．「この特徴を遺伝子変異の検出に利用することができる。本発明におけるアウタープライマーを用いる態様においては、このアウタープライマー２種、本発明のオリゴヌクレオチドからなるプライマー２種の合計４種のプライマーが用いられている。すなわち４種のオリゴヌクレオチドに含まれる６領域が設計通りに働かなければ本発明の合成反応は進行しない。特に、相補鎖合成の起点となる各オリゴヌクレオチドの3'末端、および相補配列が合成起点となるＸ１ｃ領域の5'末端の配列は重要である。そこで、この重要な配列を検出すべき変異に対応するように設計すれば、本発明による合成反応生成物を観察することによって、塩基の欠失や挿入といった変異の有無、あるいはSNPs のような遺伝子多型を総合的に分析することができる。より具体的には、変異や多型が予想される塩基が、相補鎖合成の起点となるオリゴヌクレオチドの3'末端付近（相補鎖が起点となる場合には5'末端付近）に相当するように設計するのである。相補鎖の合成起点となる3'末端や、その付近にミスマッチが存在すると核酸の相補鎖合成反応は著しく阻害される。本発明においては、反応初期の生成物における末端構造が繰り返し反応を行わなければ高度な増幅反応に結びつかない。したがって、たとえ誤った合成が行われたとしても、増幅反応を構成する相補鎖合成がいずれかの段階で常に妨げられるのでミスマッチを含んだままでは高度な増幅は起きない。結果的にミスマッチが増幅反応を効果的に抑制し、最終的には正確な結果をもたらすことになる。つまり本発明に基づく核酸の増幅反応は、より完成度の高い塩基配列のチェック機構を備えていると言うことができる。これらの特徴は、たとえば単純に２つの領域で増幅反応を行っているPCR 法などでは期待しにくい利点である。」（本件特許公報２３欄３２行〜２４欄１２行）
　
コ．「本発明によって合成された核酸は、１本鎖とは言え相補的な塩基配列から構成されるため、その大部分が塩基対結合を形成している。この特徴を利用して、合成生成物の検出が可能である。エチジウムブロマイド、SYBR Green 1、あるいはPico Green のような２本鎖特異インターカレーターである蛍光色素の存在下で本発明による核酸の合成方法を実施すれば、生成物の増加に伴って蛍光強度の増大が観察される。これをモニターすれば、閉鎖系でリアルタイムな合成反応の追跡が可能である。この種の検出系はPCR 法への応用も考えられているが、プライマーダイマー等によるシグナルの発生と区別がつかないことから問題が多いとされている。しかし本発明に応用した場合には、非特異的な塩基対結合が増加する可能性が非常に低いことから、高い感度と少ないノイズが同時に期待できる。２本鎖特異インターカレーターと同様に、均一系の検出系を実現する方法として、蛍光エネルギー転移の利用が可能である。」（本件特許公報２６欄９行〜２６欄２５行）
　
サ．「本発明による核酸の合成方法を支えているのは、鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するDNA ポリメラーゼである。上記反応中には、必ずしも鎖置換型のポリメラーゼを要しない反応ステップも含まれてはいる。しかし、構成試薬の単純化、そして経済性の点で、１種類のDNA ポリメラーゼを利用するのが有利である。この種のDNA ポリメラーゼには、以下のようなものが知られている。また、これらの酵素の各種変異体についても、それが配列依存型の相補鎖合成活性と鎖置換活性を有する限り、本発明に利用することができる。ここで言う変異体とは、酵素の必要とする触媒活性をもたらす構造のみを取り出したもの、あるいはアミノ酸の変異等によって触媒活性、安定性、あるいは耐熱性を改変したもの等を示すことができる。
Bst DNA ポリメラーゼ
Bca(exo-)DNA ポリメラーゼ
DNA ポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント
Vent DNA ポリメラーゼ
Vent(Exo-)DNA ポリメラーゼ（Vent DNA ポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）
DeepVent DNA ポリメラーゼ
DeepVent(Exo-)DNA ポリメラーゼ（DeepVent DNA ポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）
Φ29ファージDNA ポリメラーゼ
MS-2ファージDNA ポリメラーゼ
Z-Taq DNA ポリメラーゼ（宝酒造）
KOD DNA ポリメラーゼ（東洋紡績）
  これらの酵素の中でもBst DNA ポリメラーゼやBca(exo-)DNA ポリメラーゼは、ある程度の耐熱性を持ち、触媒活性も高いことから特に望ましい酵素である。本発明の反応は、望ましい態様においては等温で実施することができるが、融解温度(Tm)の調整などのために必ずしも酵素の安定性にふさわしい温度条件を利用できるとは限らない。したがって、酵素が耐熱性であることは望ましい条件の一つである。また、等温反応が可能とは言え、最初の鋳型となる核酸の提供のためにも加熱変性は行われる可能性があり、その点においても耐熱性酵素の利用はアッセイプロトコールの選択の幅を広げる。」（本件特許公報２６欄２６行〜２７欄１３行）
　
シ．「第二の特徴は、塩基対結合が可能な状態にあるループを常に形成することである。塩基対結合が可能な状態にあるループの構造を、図４に示した。図４からわかるように、ループはプライマーのアニールが可能な塩基配列Ｆ２ｃ（Ｘ２ｃ）と、Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ（Ｘ１ｃ）の間に介在する塩基配列とで構成される。Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ間（普遍的に示せばＸ２ｃ−Ｘ１ｃ間）の配列は、鋳型に由来する塩基配列である。したがってこの領域に対して相補的な塩基配列を持つプローブをハイブリダイズさせれば、鋳型特異的な検出を行うことができる。しかも、この領域は常に塩基対結合が可能な状態にあることから、ハイブリダイズに先だって加熱変性する必要がない。なお本発明の増幅反応生成物におけるループを構成する塩基配列は、任意の長さとすることができる。したがって、プローブのハイブリダイズを目的とする場合には、プライマーがアニールすべき領域とプローブがハイブリダイズすべき領域を別々にして両者の競合を避けることにより理想的な反応条件を構成することができる。
　本発明の望ましい態様によれば、１本の核酸鎖上に塩基対結合が可能な多数のループがもたらされる。このことは、核酸１分子に多数のプローブがハイブリダイズ可能なことを意味しており、感度の高い検出を可能とする。また、感度のみならず、たとえば凝集反応のような特殊な反応原理に基づく核酸の検出方法を可能とするものでもある。」（本件特許公報２８欄３１行〜２９欄５行）。 
　
ス．「すなわち、本発明に基づくオリゴヌクレオチドを鋳型鎖とその相補鎖に対して適用することによって、１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸が連続して合成されるようになる。この反応は、原理的には合成に必要な出発材料が枯渇するまで続き、その間にループ部分から合成を開始した新たな核酸を生成し続ける。こうして、ループにアニールしたオリゴヌクレオチドからの伸長が、長い１本鎖核酸（すなわち、複数組の相補的な塩基配列が連結したもの）の伸長のための３′-OH を供給する鎖置換を行う。一方、長い１本鎖の３′-OH は自身を鋳型とする相補鎖合成反応を行うことによって自身の伸長を達成すると同時に、ループから合成開始した新たな相補鎖の置換を行う。このような増幅反応工程が、高い特異性を維持しながら等温条件下で進行する。」（本件特許公報４３欄４９行〜４４欄３０行）。 
 　 
　
セ．「図１
図２
図３
図５
図６
」
　 
２．無効理由２（特許法第２９条の２違反）について
（１）先願明細書の記載について
　平成１０年６月２４日が優先権主張日であり、平成１２年２月８日に出願公開された特願平１１−１７９０５６号の願書に最初に添付された明細書及び図面である先願明細書（甲９）には、以下の事項が記載されている。
　「【請求項１２】特定の核酸配列を非直線的に増幅するためのプロセスであって、以下の工程：該特定の核酸配列、該特定の核酸配列ついての第１の初期プライマーまたは核酸構築物であって、該第１の初期プライマーまたは核酸構築物が、以下の２つのセグメント：（Ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性の第１の伸長をし得る、セグメント、および、（Ｂ）第２のセグメントであって、（ｉ）該第１のセグメントに実質的に非同一であり、そして（ｉｉ）該特定の核酸配列の第２の部分に実質的に同一であり、（ｉｉｉ）該第２のセグメントの相補的配列に結合し得、そして（ｉｖ）第２のプライマー伸長が生成されて第１のプライマー伸長を置換するように、均衡または限定サイクリング条件下で、続く第２のプライマーまたは核酸構築物の第１のセグメントの、該特定の核酸配列の該第１の部分への結合を提供し得る、セグメント、を含む；ならびに、該特定の核酸配列の相補体に対する続く初期プライマーまたは核酸構築物であって、該続く初期プライマーまたは該核酸構築物が、以下の２つのセグメント、（Ａ）第１のセグメントであって、（ｉ）該特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性の第１の伸長をし得る、セグメント、および、（Ｂ）第２のセグメントであって、（ｉ）該第１のセグメントに実質的に非同一であり、（ｉｉ）該特定の核酸配列の第２の部分に実質的に同一であり、（ｉｉｉ）該第２のセグメントの相補的配列に結合し得、そして（ｉｖ）第２のプライマー伸長が生成され、そして第１のプライマー伸長を置換するように、均衡または限定サイクリング条件下で、続くプライマーの第１のセグメントの、該特定の核酸配列の該第１の部分への結合を提供し得る、セグメント、を含む：ならびに基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素；を提供する工程：ならびに、均衡または限定サイクリング条件下で、該基質、緩衝液、またはテンプレート依存性重合化酵素の存在下で、該特定の核酸配列および該新規プライマーまたは核酸構築物をインキュベートし；それにより、該特定の核酸配列を非線形に増幅する、工程、を包含する、プロセス。」 
 　 
 　「【００１３】【発明が解決しようとする課題】本発明は、核酸増幅、核酸配列決定、および重要な特徴（例えば、低減した熱力学的安定性）を有する独特の核酸の生成に有用かつ応用可能である新規のプロセスを提供することを目的とする。」 
　
　「【００７４】本発明はまた、特定の核酸配列を非直線的に増幅するプロセスを提供する。このプロセスにおいて、増幅されることが求められている目的の特定の核酸配列、第１初期プライマーまたは目的の特定の核酸配列のための核酸構築物、後続の初期プライマーまたは目的の特定の核酸配列の相補体に対する核酸構築物、ならびに基質、緩衝液、およびテンプレート依存性ポリマー化酵素が提供される。第１初期プライマーまたは核酸構築物は、２つのセグメントを含む。第１セグメント（Ａ）は独特であり、（ｉ）特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能であると特徴づけられる。第２セグメントもまた独特であり、以下の４つの特徴で特徴づけられる。第１に、それは、（ｉ）第１セグメントと実質的に同一でない。第２に、それは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分と実質的に同一である。第３に、第２セグメントは、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得る。第４に、第２セグメントは、（ｉｖ）均衡または限定サイクル条件下で、第２プライマーの第１セグメントまたは核酸構築物の、特定の核酸配列の第１部分への続く結合を提供し得る。この方法において、第１プライマー伸長を置換するために、第２プライマー伸長を生成する。後続の初期プライマーまたはこの特定の核酸配列の相補体に対する核酸構築物はまた、２つのセグメントを含む。第１セグメント（Ａ）は、（ｉ）特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能であると特徴づけられる。第２セグメント（Ｂ）は、以下の４つの特徴で独特に特徴づけられる。第１に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉ）第１セグメントと実質的に同一でない。第２に、それは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分と実質的に同一である。第３に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得る。第４に、それは、（ｉｖ）均衡または限定サイクル条件下で、後続のプライマーの第１セグメントの、特定の核酸配列の第１部分への後続の結合を提供し得る。このような条件下およびこの方法において、第１プライマー伸長を置換する第２プライマー伸長が生成される。このプロセスを行うために、特定の核酸配列および新規のプライマーまたは核酸構築物が、基質、緩衝液、およびテンプレート依存性ポリマー化酵素の存在下で、均衡または限定サイクル条件下で、インキュベートされる；それにより、目的の特定の核酸配列が非直線的に増幅される。」
 　 
 　「【００９２】本発明の特定の局面において、新規のプライマーおよび核酸構築物が開示され、これらは、新規のプライマーまたは核酸構築物の少なくとも１つのセグメントが、適切な条件下で二次構造形成し得るという固有の特徴を有する。本発明において、二次構造の形成は、結合部位の再生を提供し得、その結果それらは、上記の外側調節因子のいずれも必要とせずに、新規のプライマーまたは核酸構築物の複数の結合および伸長のために使用され得る。」 
 　 
 　「【０１０３】（１つのステムループ形成プライマーとの直線的増幅）本発明の１つの局面において、特定の核酸配列の直線的増幅は、均衡または限定サイクリング条件下で、少なくとも２つのセグメントを有する新規の単一のプライマーまたは新規の単一の核酸構築物の使用によって行われる。・・・新規のプライマーおよび核酸構築物の第１セグメントは、標的核酸配列に存在する配列に実質的に相補的である配列を含む。新規のプライマーまたは核酸構築物の第２セグメントは、標的核酸に存在する配列に実質的に同一である配列を含む。新規の核酸構築物は、第１セグメントおよび第２セグメントの１つ以上のコピーを有し得る。新規のプライマーまたは核酸構築物のテンプレート依存性伸長は、自己ハイブリダイゼーションによって形成されるステムループ構造、ならびに新規のプライマーまたは核酸構築物を含む配列に同一または相補的でない伸長配列を有する産物を作製し得る。 
 【０１０４】この産物は、図１に例示される、連続する一連の以下の工程によって、形成され得る。新規のプライマーまたは核酸構築物のテンプレート依存性伸長は、この新規のプライマーまたは核酸構築物の第２セグメントを含む配列に相補的である伸長部分配列において生成する。これらの自己相補性領域は、テンプレートに結合しままであり得るか、または自己相補性構造を形成し得る。二次構造の形成は、テンプレートからの、伸長した新規のプライマーの第１セグメントの全てまたは一部の除去を提供し得る。このことは、別の初期プライマーが、テンプレートからの新規の第１伸長プライマーの除去の前に、テンプレート配列に結合することを可能にする。テンプレート上の第２プライマーの伸長は、テンプレートからの第１伸長プライマーの置換を導き得る。このことは、伸長プライマーの分離が、別の結合および伸長反応のためのテンプレートの使用の前に常に起こる先行技術とは対照的である。これらの手段によって、単一のテンプレートは、均衡条件下で、２つ以上の初期事象を提供し得る。さらに、この方法は、全ての温度が伸長産物およびそのテンプレートのＴｍのものを下回る、限定サイクル条件下で使用され得る。連続するプロセスにおいて、新規の第２伸長プライマーにおける二次構造の形成は、新規の第３プライマーの結合および続く伸長を提供し得る。このようにして、変性条件の非存在下において、本発明の新規のプロセスは、核酸テンプレートの単鎖からの多重プライミング、伸長、および遊離事象を提供し得る。さらに、これらの工程の全ては、均衡条件下で、同時および連続的に起こり得る。」 
 　 
 　「【０１０６】新規の伸長プライマーおよび核酸構築物の、自己相補性構造を形成する能力は、適切な条件下で実現化され得る。先行技術は、その特徴が短い相補性オリゴヌクレオチドの会合および解離が、温度、塩条件、塩基含有量、および相補配列の長さによって決定される平衡反応として生じることを示している。・・・相補性ＤＮＡの大きな方の鎖は、広範な条件にわたって容易に解離しない安定な立体配置における２本鎖分子として存在するが、それらは、鎖間結合の一時的および局在した弛緩を形成することが周知である。用語「呼吸」は、水素結合のこの局在化破壊を説明するために使用されている。パリンドローム配列を含む２本鎖ＤＮＡ分子における二次元構造を作製する「呼吸」のための経路は、Ａ．ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＴ．Ａ．Ｂａｋｅｒによって、「ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版」（１９９２）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ． ＮＹ、ＮＹ（その内容を本明細書中で参考として援用する）に記載されている。 
 【０１０７】本発明において、上記のように、線状２本鎖分子のセグメントの、鎖内ステムループ構造への転移は、プライマー開始事象を、伸長プライマーのそのテンプレートからの分離の前に起こることを可能にし得る。これらの２つの構造の間の平衡は、多数の要因に依存する。第１に、首尾良いプライマー結合のために、標的に結合する初期プライマーのセグメントは、反応に使用される温度で、安定なプライミングが可能であるように適切な長さおよび塩基組成でなければならない。第２に、初期プライマーの伸長後に自己ハイブリダイゼーションに関与するプライマーのセグメントは、適切な長さおよび塩基組成でなければならず、その結果伸長されたプライマーのテンプレートからの部分解離は、十分に安定な二次構造の形成（すなわち、ステムループ構造のステム）を可能にし得る。」 　 
　　「【０１１２】本発明はまた、特定の核酸配列を非直線的に増幅するためのプロセスを提供する。非直線的増幅は、以下の成分または試薬を提供する最初の工程を含む：増幅されることが求められる目的の特定の核酸配列、特定の核酸配列のための第１初期プライマーまたは核酸構築物、この特定の核酸配列の相補体に対する続く初期プライマーまたは核酸構築物、ならびに適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素。記載したばかりの第１初期プライマーまたは核酸構築物は、２つのセグメントを含む。第１に、２つの規定された特徴を有する第１セグメント（Ａ）が存在する。それは、（ｉ）この特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そして（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能である。第１初期プライマーの第２セグメントは、４つの規定された特徴を有する。第１に、それは、（ｉ）第１セグメント（Ａ）と実質的に同一でない。第２に、それは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分と実質的に同一である。第２セグメントの第３の特徴は、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得るその能力である。第２セグメントの第４の特徴は、（ｉｖ）均衡または限定サイクル条件下で、第２プライマーまたは核酸構築物の第１セグメントの、特定の核酸配列の第１部分への続く結合を提供するためのその能力である。このような条件下で、第２プライマー伸長が生成されて、第１プライマー伸長を置換する。
　【０１１３】続く初期プライマーまたは核酸構築物に関して、このエレメントは２つのセグメント、第１セグメント（Ａ）および第２セグメント（Ｂ）を含む。第１セグメント（Ａ）は、（ｉ）特定の核酸配列の第１の部分に実質的に相補的であり、そしてそれは、（ｉｉ）テンプレート依存性第１伸長が可能である。４つの特徴は、第２セグメント（Ｂ）を規定する。第１に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉ）第１セグメントと実質的に同一でない。第２に、それは、（ｉｉ）特定の核酸配列の第２部分と実質的に同一である。第３に、第２セグメント（Ｂ）は、（ｉｉｉ）第２セグメントの相補配列に結合し得る。第２セグメント（Ｂ）の第４の特徴は、（ｉｖ）均衡または限定サイクル条件下で、続くプライマーの第１セグメントの、特定の核酸配列の第１部分への続く結合を提供するその能力である。このような条件下で、第２プライマー伸長が生成され、そしてそれは第１プライマー伸長を置換する。このプロセスの第２工程は、特定の核酸配列および新規のプライマーまたは核酸構築物を、適切な基質、緩衝液、およびテンプレート依存性重合化酵素の存在下で、均衡または限定サイクル条件下で、インキュベートすることを含む。それにより、目的の特定の核酸配列は、非直線的に増幅される。」
　
 　「【０１３１】非直線的増幅産物は、均衡または限定条件下で、連続した一連の以下の工程によって、新規のプライマーおよび標準的なプライマーによって合成され得る。新規のプライマーは標的鎖に結合し、そして新規の単一プライマーとの直線的増幅について以前に記載されるのと、同じ一連の伸長、二次構造形成、プライマー結合部位の再生、第２結合、第２伸長、およびテンプレートからの第１伸長プライマーの分離が存在する。新規の伸長プライマーは、他方の新規のプライマーの連続する結合および伸長によって置換されるので、これらの１本鎖産物は標準的なプライマーに結合し得、そしてそれらを伸長させて、完全な２本鎖アンプリコンを作製し得る。この潜在的な一連の事象を、図２に示す。得られる２本鎖構造は一方の鎖において新規のプライマーについてのプライマー結合部位に相補的な配列と、および他方の鎖において新規のプライマーについてのプライマー結合部位に同一の配列と隣接する各鎖自己相補配列を含む。この結果として、各鎖は、アンプリコンの一方の末端で、ステムループ構造を形成し得る。次いで、１本鎖ループ構造におけるプライマー結合部位の露出は、図１において以前に示した同じプロセスによって、さらなる一連のプライマー結合および置換反応をもたらし、それにより均衡または限定サイクル条件下で、目的の配列の非直線的増幅の生成を可能にする。・・・」 
 　 
 　「【０１３３】非直線的増幅産物はまた、均衡または限定サイクル条件下で、２つの第１セグメントおよび１つの第２セグメントを含む新規の核酸構築物によって合成され得る。第１セグメントの各々は、核酸の鎖またはその相補体に相補的であり、そして第２セグメントは、第１セグメントの１つの伸長後に、二次構造を形成し得る。この構築物は、一対の相補的な潜在的ステムループ構造を有する産物を作製し得る。この産物は、連続する一連の以下の工程によって形成され得る。新規の構築物の１つの第１セグメントおよび１つの第２セグメントは、新規の単一プライマーによる直線的増幅について以前に記載されているのと同様の連続する一連の結合、伸長、二次構造形成、プライマー結合部位の再生、第２結合、第２伸長、および鎖分離工程を行い得る。さらに、この合成の産物は、一連の結合および伸長工程のためのテンプレートとして、新規のプライマーおよび標準的なプライマーでの非直線的増幅について上に記載されているような他方の第１セグメントによって使用され得る。これらの工程が作製し得る潜在的な一連の異なる形態は、図３および４に与えられる。この新規の構築物が潜在的に行い得る一連の事象は、以前に記載されたのと同じであり、そして図４に示される最終産物は、ともに結合したプライマーの２つの５′末端を有する図２の最終産物の位相的等価体である。」 
 　 
 　「【０１４４】これらの特徴によって、適切な標的分子の一方の鎖の存在は、新規の単一プライマーを非直線的増幅し得る自己複製核酸に変換し得る。本発明の新規の単一プライマーは、標的に結合し得、そして伸長のためのテンプレートとしてそれを利用する。・・・ 
 【０１４５】標的核酸の適切な鎖の存在によって直線状の新規のプライマーからこのような形態を合成するのに使用され得る一連の工程は、図９、１０、および１１に示される。新規のプライマーはテンプレートに結合し得、そして伸長して、図９の工程２の構造を形成し得る。」 
 　 
 　「【０１５６】・・・上記の鎖配置で２つの第１、第２、および第３セグメントを有する構築物の例は、図１３および図１５に与えられる。本発明のこの局面において使用される構築物は、図９、１０、および１１に例示された以前の局面に関連する。・・・それにより、図１３および１５の工程３は、単一テンプレート分子が、１つのみではなく２つの３′末端の伸長に使用されることを除いて、図９の工程２に等しい。・・・」 
 　 
 　「【０１５９】（反応の単純化および反応産物）本発明を含む全ての増幅において、反応の間にも起こり得る副反応が存在する。これらは、高分子量産物の複雑な多様性を形成し得る。それらは、所望の配列の合成の効率またはこれらの配列の検出の効率のいずれかを減少する点において有害であり得る。合成の効率の減少は、副反応が、所望の配列の合成の量を、ポリメラーゼおよび基質資源についての競合によって減少する場合に起こり得る。副反応はまた、適切な配列が合成されるが、反応のいくつかの工程に阻害的な二次構造にある場合、効率を減少し得る。このことは、プライマーの結合または伸長のいずれかを妨害する構造によって起こり得る。後者の場合において、プライムされたテンプレートを使用できないことに起因して、そして酵素が結合するが進行し得ない場合のポリメラーゼ活性の欠失にも起因して、効率が失われ得る。不適切な二次構造もまた、適切な配列の検出における問題を生じ得る。」 
 　 
 　「【０１７８】【実施例】（実施例１ ５３℃および６３℃でのＢｓｔポリメラーゼによるＰＣＲ産物の等温増幅） 
 （ｉ）ＨＢＶプラスミドＤＮＡのＰＣＲ増幅 
 ＨＢＶマイクロタイタープレートアッセイ・・・からのＨＢＶポジティブコントロールを、ＰＣＲによる増幅のための標的として使用した。・・・１ｕｌのＨＢＶ標的、１×ＰＥ緩衝液・・・、４ｍＭのＭｇＣｌ2、２５０ｕｍのｄＮＴＰ、６単位のアンプリサーム（Ａｍｐｌｉｔｈｅｒｍ）・・・ならびに１０ピコモルのＨＢＶオリゴプライマーＦＣおよびＲＣからなる５０ｕｌのＰＣＲ反応を実施した。 
 ＦＣ配列＝５′−ＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡ ＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧ ＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡ ＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ ＧＣＧＧＣＧＴＴＴ−３′ 
 ＲＣ配列＝５′−ＴＣＣＴＣＴＡＡＴＴ ＣＣＡＧＧＡＴＣＡＡ ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧ ＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡ ＴＧＧＴＣＣＣＧＴＡ−３′。 
 【０１７９】この実施例において、ＦＣプライマーの３′末端における
２９塩基
３０塩基
 【０１８０】（ｉｉ）ＰＣＲ産物の分析 
 増幅は、０．５ｕｇ／ｍｌの臭化エチジウムの存在下で、０．５×ＴＢＥ緩衝液を用いて流した４％Ｍｅｔａｐｈｏｒアガロースゲル・・・中の１０ｕｌのサンプルのゲル電気泳動によってアッセイした。ＵＶ照射下で、３つのバンドが出現し、それらはＤＮＡサイズマーカーによる判定で、長さがおよそ２１０、１８０、および１７０ｂｐであった。２１０ｂｐに対応するバンドは、予想された線状ＰＣＲ産物であり、そしておそらく他の２つのバンドは、同じサイズのアンプリコンに対応しており、ここで、二次構造が一方または両方のいずれかの末端上で形成され、それによってそれらの効果的な移動度が変化している。 
 【０１８１】（ｉｉｉ）ＰＣＲ産物の等温増幅 
 上記のＰＣＲ産物の種々の希釈物５ｕｌは、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液・・・、２００ｕＭのｄＮＴＰ、２０ピコモルの正方向および逆方向プライマー、８単位のＢｓｔポリメラーゼ・・・からなる１００ｕｌの反応混合物中で使用された。正方向プライマーはＦＣまたはＬＦＣのどちらかであり、逆方向プライマーはＲＣまたはＬＲＣのどちらかであった。ＦＣおよびＲＣプライマーの配列は上記に示した。ＬＦＣおよびＬＲＣプライマーは、ＦＣおよびＲＣプライマーだけの第１のセグメントに対応する配列を有している。そのような配列は以下のとおりである： 
 ＬＦＣ＝５′−ＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ ＧＣＧＧＣＧＴＴＴ−３′ 
 ＬＲＣ＝５′−ＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡ ＴＧＧＴＣＣＣＧＴＡ−３′。 
 【０１８２】インキュベーションは、３０分、１８０分、もしくは終夜のインキュベーションであった。反応温度は５３℃もしくは６３℃のどちらかであった。３０分反応したものは２％アガロースゲルを用いてゲル電気泳動で分析した；１８０分反応したものは４％Ｍｅｔａｐｈｏｒアガロースを用いて分析した。 
 【０１８３】この分析結果を図１７に示す。３０分インキュベーションの後に取り出したサンプルの最初の組の中で、ＰＣＲ産物の１０-2希釈物だけが５３℃でいくらかの合成を示すが、６３℃からの反応物は、１０-2、１０-3および１０-4希釈物で合成を示している。これらのデータは、合成量は加えた標的ＤＮＡの量に依存するということを示している。１８０分の合成の後に取り出されたサンプルの組では、実質的により多くの合成が行われている。これらの反応の生成物は、分離したパターンを形成する一連のバンドである。これは、通常ＰＣＲで見られる単一の分離したバンド、またはＰＣＲ増幅の後でＬＣおよびＲＣプライマーを用いて以前に見られた２つもしくは３つのバンドと対照をなしている。この複数のバンドは、おそらく、アンプリコンをプライマーおよびテンプレートとして機能させる二次構造の存在に起因し得るか、またはストランドスイッチングの徴候であり得る。５３℃で３時間インキュベーションした後、標的が少しもないようなコントロールでさえ、実質的な合成の証拠を示している。しかし、標的テンプレートを有するすべての５３℃の反応物に見られる、単一の標的依存性パターンが存在し、そして標的なしのコントロールに存在するパターンは実質的に異なることが留意され得る。これはおそらく標的が合成を開始した経路が異なっていることに起因する。６３℃でインキュベーションしたものは、全てのテンプレート希釈物で実質的な合成を示し、そして同じパターンが５３℃の反応によって生成されることを証明する。しかし、本実施例においては、６３℃では、標的非依存性増幅の証拠はない。１０-5の希釈でさえ実質的な量の合成があるということは、この系が実質的な増幅をし得ることを示している。終夜のインキュベーションもまたゲルによって分析され、そして３時間インキュベーションと同じパターンおよび同じ量を示した（データ表示なし）。」 
 　 
「
図１
図２
図３
図１３
図１４
 」 
 　 
（２）「二次構造」の意義について
　先願明細書にいう「二次構造」とは、【０１０４】及び図１の記載によれば、ステムループ構造と同義であり、図１マル３〜マル５、図２マル１及びマル３〜マル５並びに図３マル１、マル３及びマル４において、領域Ｃ−Ｂ′−Ｃ′、領域Ｃ−Ｂ−Ｃ′、領域Ｅ−Ｆ′−Ｅ′及び領域Ｅ−Ｆ−Ｅ′により形成されるループ部分を意味するものと認められる。
　
（３）等温増幅に使用されたＦＣプライマー及びＲＣプライマーの構成について
　先願明細書の【０１７９】に記載のＦＣプライマー及びＲＣプライマーの塩基配列は、いずれも【０１７８】に記載されており、それによれば、これらの塩基数は、ＦＣプライマーが４９塩基であり、ＲＣプライマーが５０塩基であると認められる一方、【０１７９】には、ＦＣプライマーの第１セグメントが２９塩基で、第２セグメントが３０塩基である旨及びＲＣプライマーの第１セグメントが３０塩基で、第２セグメントが３０塩基である旨が記載されており、両者の塩基数の記載は、一致していない。むしろ、先願明細書の【０１８１】には、ＦＣプライマー及びＲＣプライマーの第１セグメントに対応する配列として、塩基数が１９のＬＦＣプライマー及び塩基数が２０のＬＲＣプライマーの塩基配列が記載されていることに照らすと、ＦＣプライマーの第１セグメントの塩基数は１９であり、ＲＣプライマーの第１セグメントの塩基数は２０であると認められる。したがって、【０１８１】の下線部分のうち、「２９」は「１９」の、「３０」は「２０」の誤記であり、ＰＣＲ産物の等温増幅に使用されたＦＣプライマーは、３′末端側の１９塩基対（第１セグメント）及びこれに連続する３０塩基対（第２セグメント）からなる一方、ＲＣプライマーは、３′末端側の２０塩基対（第１セグメント）及びこれに連続する３０塩基対（第２セグメント）からなるものと認められる。
　
　また、ここで、第１セグメントは、【０１７９】に記載のとおり、テンプレート（鋳型）としてＨＢＶ標的ＤＮＡ（ＨＢＶプラスミドＤＮＡ）を使用して伸長し得るものとして設計されているから、これと相補的な塩基配列と塩基対結合（アニール）を生じた場合、ＤＮＡポリメラーゼが触媒となって、ＦＣプライマー及びＲＣプライマーは、いずれも第１セグメントに隣接する３′末端を合成起点として相補鎖合成反応を開始することになる。他方、第２セグメントは、【０１７９】に記載のとおり、ＦＣプライマー又はＲＣプライマーの上記相補鎖合成反応によって合成された最初の３０塩基に相補的に設計されているから、第１セグメント及び第２セグメントは、第２セグメント及びその相補体により与えられる３０塩基対のステム並びに第１セグメント（ＦＣプライマーの場合１９塩基、ＲＣプライマーの場合２０塩基）からなるループを発生させ、これにより生成物に１個のステムループ構造（二次構造）を生じさせることになる旨が記載されているといえる。
　さらに、上記ＦＣプライマーは、【０１８１】に記載のとおり、正方向プライマーであるから、その「第１セグメント」は、図１マル１の太い矢印に記載された領域Ｂ′に対応する一方、上記ＲＣプライマーは、【０１８１】に記載のとおり、逆方向プライマーであるから、その「第１セグメント」は、図３マル１の下側の矢印に記載された領域Ｆに対応するものと認められる。また、これらのプライマーの各「第２セグメント」は、同じく領域Ｃ（ＦＣプライマー）及びＥ′（ＲＣプライマー）にそれぞれ対応するものであり、これらのプライマーの３′末端の相補鎖合成反応により生成するステムループ構造は、例えば、図１マル３の領域Ｃ−Ｂ′−Ｃ′（ＦＣプライマー）及び図３マル４の領域Ｅ−Ｆ−Ｅ′（ＲＣプライマー）により形成されるループ部分に対応するものと認められる。
　
（４） 先願明細書に記載の増幅反応について
ア． 先願明細書の記載について
　先願明細書には、【０１８１】【０１８２】に記載のとおり、ＨＢＶプラスミドＤＮＡの２１１ｂｐのＰＣＲ産物を、直前のＰＣＲで使用したＦＣプライマー及びＲＣプライマーと同じプライマー及びＢｓｔポリメラーゼを使用して、５３℃及び６３℃で３０分、１８０分又は終夜のインキュベーションを実施した旨の記載があるが、このインキュベーションについて「ＰＣＲ産物の等温増幅」という標題が付されているから、当業者は、先願明細書から、当該インキュベーションにより当該ＰＣＲ産物を鋳型とする等温増幅が行われた旨を記載していることを読み取ることができる。
　次に、上記インキュベーションによる等温増幅の結果について、先願明細書には、「これらの反応の生成物は、分離したパターンを形成する一連のバンドである。これは、通常ＰＣＲでみられる単一の分離したバンド、またはＰＣＲ増幅の後でＬＣ及びＲＣプライマーを用いて以前にみられた２つもしくは３つのバンドと対照をなしている。」との記載がある（【０１８３】）ところ、「ＰＣＲ産物の等温増幅」という標題の実験の結果が、それまでにみられた「バンドと対照をなしている。」と記載されていることに照らすと、当業者は、上記記載部分から、ＰＣＲ産物の等温増幅により、これに先立つＰＣＲ増幅（【０１７８】【０１７９】）及びこれによる産物の分析結果（【０１８０】）とは異なる独自の等温増幅反応が生じていることを読み取ることができるものといえる。
　そして、上記独自の等温増幅反応が発生した理由について、先願明細書には、「この複数のバンドは、おそらく、アンプリコンをプライマーおよびテンプレートとして機能させる二次構造の存在に起因し得る」との記載がある（【０１８３】）ところ、ここにいう「アンプリコン」とは、ＰＣＲ産物にほかならず、「二次構造」とは、前記（２）に説示のとおり、ステムループ構造を意味するものであるから、ここにいう「二次構造」（ステムループ構造）を有する「アンプリコン」（ＰＣＲ産物）とは、前記【０１８０】の記載に図１ないし３を参照すると、ＰＣＲ産物である(1)２１０ｂｐに対応するバンドで示される線状産物、(2)１８０ｂｐに対応するバンドで示される、一方の末端上で二次構造（ステムループ構造）が形成された産物、(3)１７０ｂｐに対応するバンドで示される両方の末端上で二次構造（ステムループ構造）が形成された産物（図３マル４。ダンベル型中間体）のうち、(2)及び(3)（ダンベル型中間体）を意味するものといえる。したがって、これらのＰＣＲ産物のうちダンベル型中間体に着目すると、上記記載部分は、「ダンベル型中間体をプライマー及びテンプレート（鋳型）として機能させるステムループ構造の存在」、すなわちステムループ構造が存在することによって、ＰＣＲ産物であるダンベル型中間体それ自体が、相補鎖合成により核酸を合成するプライマーであると同時にその鋳型になるという増幅反応を発生させており、これが、上記独自の等温増幅反応の理由であると説明しているものと理解することができる。
　
イ． 先願明細書の記載から理解される増幅反応の作用機序について
　先願明細書に記載の等温増幅反応の鋳型とされたＰＣＲ産物には、前記アに説示のとおり、両方の末端上で二次構造（ステムループ構造）が形成された産物（図３マル４。ダンベル型中間体）が含まれている。
　他方、上記等温増幅の際に使用されたＦＣプライマー及びＲＣプライマーは、前記（３）に説示のとおり、第１セグメント（領域Ｂ′又はＦ）が鋳型の相補的な塩基配列（領域Ｂ又はＦ′）と塩基対結合（アニール）を発生させ、第２セグメント（領域Ｃ又はＥ′）が３′末端の相補鎖合成反応によって合成された最初の３０塩基（領域Ｃ′又はＥ）に相補的になるように設計されているものである。
　さらに、Ｂｓｔポリメラーゼが鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するＤＮＡポリメラーゼであることや、ＤＮＡポリメラーゼの機能によって、部分的に２本鎖となった鋳型核酸の３′末端が鋳型核酸の１本鎖となっている部分に対して相補鎖合成を行うということは、本件優先権主張日当時、当業者の技術常識であったものと認められる。
　したがって、鋳型となる核酸としてダンベル型中間体に着目した場合、先願明細書の「アンプリコンをプライマーおよびテンプレートとして機能させる二次構造の存在に起因し得る」との前記記載、すなわちステムループ構造が存在することによって、ＰＣＲ産物であるダンベル型中間体それ自体が、相補鎖合成により核酸を合成するプライマーであると同時にその鋳型になるという増幅反応を発生させており、これが、上記独自の等温増幅反応の理由であるとの記載部分について、当業者は、上記技術常識及び先願明細書の記載から、次の増幅反応が発生していることを読み取ることが可能であるというべきである。
(ア) Ｂｓｔポリメラーゼは、鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するＤＮＡポリメラーゼであるから、鋳型であるダンベル型中間体を構成する鎖の各３′末端（例えば、図３マル４の下側の鎖の領域Ｃ′）を合成起点として、ダンベル型中間体を構成する２本の鎖の塩基対結合部分を置換しながら相補鎖合成を行うことになる。
(イ) 次に、ＦＣプライマー及びＲＣプライマーは、いずれも鋳型と塩基対結合（アニール）を発生させる第１セグメントを備えているところ、ダンベル型中間体の下側の鎖を鋳型とする場合を例にとると、ＦＣプライマーの第１セグメント（領域Ｂ′）は、鋳型となる鎖のうち、塩基対結合を生じていないループ部分（図３マル４の下側の鎖の領域Ｂ）と塩基対結合（アニール）を発生させる。そして、前記のとおり、Ｂｓｔポリメラーゼは、鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するから、ＦＣプライマーの３′末端は、ダンベル型中間体のステム部分及びそれに引き続く塩基対結合を置換しながら相補鎖合成を開始する。
(ウ) ダンベル型中間体の下側の鎖の３′末端は、塩基対結合の置換により相補鎖を合成して当該鎖の５′側末端まで到達するが、次いで、ＦＣプライマーの３′末端は、当該相補鎖を５′末端に至るまで置換して相補鎖合成を行うから、ダンベル型中間体の下側の鎖の３′末端が合成してきた塩基配列は、１本鎖となり、その結果、当該鎖は、３′末端に引き続く部分に新たなステムループ構造（３′末端側から、領域Ｅ−Ｆ′−Ｅ′となる。）を形成した上で、再び自らを鋳型として３′末端から塩基対結合の置換による相補鎖合成を開始する。他方、ＲＣプライマーは、上記新たなステムループ構造のループ部分（領域Ｆ′）に対してアニールできる領域（領域Ｆ）を第１セグメントに備えているから、当該ループ部分に塩基対結合（アニール）を発生させ、先にＦＣプライマーが行ったのと同じ塩基対結合の置換による相補鎖合成を行うことになる。こうして、ダンベル型中間体は、そのうち１本の鎖の３′末端が、Ｂｓｔポリメラーゼの触媒により塩基対結合の置換による相補鎖合成を行うことに加えて、ＦＣプライマー及びＲＣプライマーが相次いでアニールを繰り返すことで、それ自身がプライマーであると同時にテンプレート（鋳型）である増幅反応を繰り返す結果、１本鎖上に鋳型核酸の塩基配列が交互に連結された核酸が得られることになる。
　
（５） 先願明細書に記載の発明について
　以上のとおり、先願明細書には、ＰＣＲ増幅に引き続くインキュベーションにより「等温増幅」が発生した旨が記載されており、それが先行するＰＣＲ増幅とは異なる独自の増幅反応であって、その理由について「おそらく、アンプリコンをプライマーおよびテンプレートとして機能させる二次構造の存在に起因し得る」との記載があるが、当該記載は、ステムループ構造が存在することによって、ＰＣＲ産物（ダンベル型中間体を含む。）それ自体が、ＦＣプライマー及びＲＣプライマーと相俟って、塩基対結合の置換による相補鎖合成を繰り返し、核酸を合成するプライマーであると同時にその鋳型になるという増幅反応を発生させているとの趣旨に理解することができる。そして、ここでみられる塩基対結合の置換による相補鎖合成反応は、３′末端からの自己伸長反応と呼んで差し支えない。
　このように、当業者は、先願明細書の記載及び本件優先権主張日当時の技術常識に基づき、上記増幅反応の作用機序を、前記（４）イに説示したものとして理解することが可能であったものと認められるから、先願明細書には、次の発明が記載されているものと認められる。
　
先願発明：３′末端側から領域Ｂ′−Ｃという構造を有するＦＣプライマー、３′末端側から領域Ｆ−Ｅ′という構造を有するＲＣプライマー及びＢｓｔポリメラーゼを使用する等温増幅反応であって、
工程１：両方の末端にステムループ構造を有する核酸であって、３′末端側から順に領域Ｃ′−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｅ′を有する核酸（ダンベル型中間体の下側の鎖）を鋳型として、
工程２：その３′末端からの自己伸長反応により、塩基対結合を可能とする領域Ｂを備えるループを有し、その余の部分が互いに相補的な配列で塩基対結合した核酸を得、
工程３：このループにＦＣプライマーをアニールさせ、自己伸長反応を行うと同時に、上記工程２の自己伸長反応によって合成された相補的な塩基配列を置換し、その結果、上記工程２の自己伸長反応によって合成された鎖の３′末端に、塩基対結合を可能とする領域Ｆ′を備える新たなステムループ構造が形成され、
工程４：上記工程３で新たに形成された３′末端のステムループ構造からの自己伸長反応により、塩基対結合を可能とする領域Ｆ′を備えるループを有し、その余の部分が互いに相補的な配列で塩基対結合した核酸を得ると同時に、上記工程３のＦＣプライマーの自己伸長反応により合成された相補的な塩基配列を置換し、３′末端から順に、領域Ｅ−Ｆ′−Ｅ′−Ｄ′−Ｃ′−Ｂ′−Ｃである核酸を得、
工程５：上記工程４の塩基対結合を可能とする領域Ｆ′を備えるループを有する核酸に、ＲＣプライマーをアニールさせ、伸長反応を行うと同時に、上記工程４の自己伸長反応によって合成された相補的な塩基配列を置換し、その結果、上記工程４の自己伸長反応によって合成された鎖の３′末端に、塩基対結合を可能とする領域Ｆを備える新たなステムループ構造が形成され、
工程６：これら一連の、ステムループ構造の３′末端からの自己伸長反応と、その際に形成されるループへのプライマー結合に伴う自己伸長反応を繰り返すことによって、鋳型の領域Ｄとその相補的配列を有する領域Ｄ′が交互に１本鎖の核酸上に延伸する方法
　
（６）本件発明１と先願発明との対比について
ア．本件発明１及び先願発明の方法発明における目的物は、いずれも鋳型の有する領域と当該領域に相補的な配列を有する領域が交互に１本鎖の核酸上に延伸した核酸である点で一致する。
　
イ．次に、本件発明１の酵素は、「鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼ」であるが、前記１．（１）サに記載のとおり、当該ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔポリメラーゼを含む一方、先願発明の酵素は、Ｂｓｔポリメラーゼであるから、両者の酵素は、一致する。
　
ウ．また、本件発明１の鋳型核酸は、「３′末端と５′末端において、それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互いに相補的な塩基配列がアニールしたときに両者の塩基対結合が可能となるループが形成される鋳型」であって、「３′末端に存在し同一鎖上の相補的な塩基配列にアニールする領域を領域Ｆ１とし、前記領域Ｆ１と相補的な塩基配列からなる領域を領域Ｆ１ｃとし、前記領域Ｆ１と前記領域Ｆ１ｃとの間に存在し前記領域Ｆ１と前記領域Ｆ１ｃがアニールしたときに塩基対結合可能となる領域を領域Ｆ２ｃとし、かつ、５′末端に存在し同一鎖上の相補的な塩基配列にアニールする領域を領域Ｒ１ｃとし、前記領域Ｒ１ｃと相補的な塩基配列からなる領域をＲ１とし、前記領域Ｒ１ｃと前記領域Ｒ１との間に存在し前記領域Ｒ１と前記領域Ｒ１ｃがアニールしたときに塩基対結合可能となる領域を領域Ｒ２とした場合」に、本件発明１の鋳型核酸は、図２（７）に記載されるように、３′末端側から順に領域Ｆ１−Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ１ｃを有するものとなる。そうすると、先願発明の「３′末端側から順に領域Ｃ′−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｅ′を有する両末端にステムループ構造を有する核酸」は、本件発明１の「３′末端と５′末端において、それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互いに相補的な塩基配列がアニールしたときに両者の塩基対結合が可能となるループが形成される鋳型」に相当する。
　しかしながら、本件発明１の鋳型は、「前記領域Ｆ２ｃと前記領域Ｆ１ｃとの距離が１０〜７０塩基であり、および／または、前記領域Ｒ２と前記領域Ｒ１との距離が１０〜７０塩基である」ことが特定されているのに対し、先願発明には、そのような特定はなされていない。
　
エ．そして、本件発明１のプライマーは、「前記ループのうち３′末端側に位置するループ内の前記領域Ｆ２ｃに相補的な塩基配列の領域Ｆ２を３′末端に含むオリゴヌクレオチド」である。先願発明のＦＣプライマーにおける「Ｂ′」は、本件発明１における「Ｆ２」に相当するから、先願発明のＦＣプライマーは、本件発明１のプライマーと一致する。
　
オ．本件発明１の工程Ｂ）は、工程Ａ）で与えられた鋳型核酸の３′末端からの自己伸長反応であり、この工程は、先願発明の工程２と一致する。
　
カ．本件発明１の工程Ｃ）は、鋳型核酸の３′末端側のループにオリゴヌクレオチド（プライマー）がアニールし、その３′末端を合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼにより相補鎖合成を行うものであり、その際、工程Ｂ）で合成された相補鎖を置換しながら相補鎖合成が進行し、その結果、工程Ｂ）で合成された相補鎖の３′末端が塩基対結合可能な状態となるという工程であるところ、本件発明１と先願発明とでは、前記イ及びエに説示のとおり、使用するポリメラーゼ及びプライマーが一致するほか、本件発明１の工程Ｃ）のうち、プライマーのアニールと鎖置換型の相補鎖合成及び工程Ｂ）で合成された相補鎖の３′末端を塩基対結合可能な状態とする点は、いずれも先願発明の工程３と一致する。
　
キ．本件発明１の工程Ｄ）は、工程Ｂ）で合成された相補鎖を新たな鋳型とすることを規定するものである。他方、先願発明の工程４では、同じく工程２の自己伸長反応により合成された核酸にＲＣプライマーがアニールし、一連の反応が進行するものであって、先願発明においても、工程２の自己伸長反応により合成された核酸を新たな鋳型として一連の反応が進行しているということができる。したがって、本件発明１の工程Ｄ）は、先願発明の工程４と一致する。
　
ク．以上のとおりであるから、本件発明１と先願発明の一致点及び相違点は以下のとおりである。
一致点：次の工程を繰り返すことによる１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の増幅方法。 
 Ａ）３′末端と５′末端において、それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互いに相補的な塩基配列がアニールしたときに両者の間に塩基対結合が可能となるループが形成される鋳型を提供する工程、 
 Ｂ）同一鎖にアニールさせた前記鋳型の３′末端を合成起点として相補鎖合成を行う工程、
 Ｃ）前記ループのうち３′末端側に位置するループ内の前記領域Ｆ２ｃに相補的な塩基配列の領域Ｆ２を３′末端に含むオリゴヌクレオチドを、前記ループ部分の前記領域Ｆ２ｃにアニールさせ、これを合成起点として鎖置換相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼによる相補鎖合成を行って、工程Ｂ）で合成された相補鎖を置換してその３′末端を塩基対結合が可能な状態とする工程、および 
 Ｄ）工程Ｃ）において３′末端を塩基対結合が可能な状態とした鎖を工程Ａ）における新たな鋳型とする工程。
　
相違点：本件発明１では、「前記鋳型は、３′末端に存在し同一鎖上の相補的な塩基配列にアニールする領域を領域Ｆ１とし、前記領域Ｆ１と相補的な塩基配列からなる領域を領域Ｆ１ｃとし、前記領域Ｆ１と前記領域Ｆ１ｃとの間に存在し前記領域Ｆ１と前記領域Ｆ１ｃがアニールしたときに塩基対結合可能となる領域を領域Ｆ２ｃとし、かつ、５′末端に存在し同一鎖上の相補的な塩基配列にアニールする領域を領域Ｒ１ｃとし、前記領域Ｒ１ｃと相補的な塩基配列からなる領域をＲ１とし、前記領域Ｒ１ｃと前記領域Ｒ１との間に存在し前記領域Ｒ１と前記領域Ｒ１ｃがアニールしたときに塩基対結合可能となる領域を領域Ｒ２とした場合に、前記領域Ｆ２ｃと前記領域Ｆ１ｃとの距離が１０〜７０塩基であり、および／または、前記領域Ｒ２と前記領域Ｒ１との距離が１０〜７０塩基である」のに対し、先願発明では、そのような特定はなされていない点。
　
ケ．上記相違点に関して先願明細書をみると、先願明細書には、本件発明１の「前記領域Ｆ２ｃと前記領域Ｆ１ｃ」に相当する「セグメントＢとセグメントＣ」間、及び本件発明１の「前記領域Ｒ２と前記領域Ｒ１」に相当する「セグメントＥとセグメントＦ」間の塩基数については、特に記載はなされていない。
　また、先願明細書における実施例についてみると、実施例１には、ＨＢＶプラスミドＤＮＡをＦＣプライマー及びＲＣプライマーを使用してＰＣＲ増幅することが記載されており（【０１７８】）、ＦＣプライマーの配列は、「５′−ＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡ ＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧ ＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡ ＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ ＧＣＧＧＣＧＴＴＴ−３′」であり、ＲＣプライマーの塩基配列は、「５′−ＴＣＣＴＣＴＡＡＴＴ ＣＣＡＧＧＡＴＣＡＡ ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧ ＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡ ＴＧＧＴＣＣＣＧＴＡ−３′」であることが記載されている。先願明細書には、鋳型となるＨＢＶのＤＮＡ配列は記載されていないが、平成２６年５月２３日付け上申書に添付された参考資料１に示されるとおり、ＨＢＶのＤＮＡ配列は、本願優先日前の平成８年５月１５日にEMBL/GenBank/DDBJデータベースにアクセッション番号Z72478として登録されており、当該配列は本願優先日前における技術常識であったといえる。
　そして、参考資料１のＨＢＶのＤＮＡ配列によれば、参考資料１の塩基配列の３７５位〜３９３位は、ＦＣプライマーの３′末端に位置するＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴ ＧＣＧＧＣＧＴＴＴと同一であり、これの相補配列は先願発明におけるセグメントＢ（本件発明１の「領域Ｆ２ｃ」に相当）に対応する。また、参考資料１の塩基配列の３９４位〜４２３位は、ＦＣプライマーの５′末端に位置するＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡ ＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧ ＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡの相補配列であり、これの相補配列は先願発明におけるセグメントＣ（本件発明１の「領域Ｆ１ｃ」に相当）に対応する。そして、このセグメントＢとセグメントＣは連続しており、両セグメント間の塩基数は０であることが理解できる。
　さらに、参考資料１の塩基配列の４７５位〜５０４位は、ＲＣプライマーの５′末端に位置するＴＣＣＴＣＴＡＡＴＴ ＣＣＡＧＧＡＴＣＡＡ ＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧと同一であり、これは先願発明におけるセグメントＥ（本件発明１の「領域Ｒ１」に相当）に対応する。また、参考資料１の塩基配列の５０５位〜５２３位は、ＲＣプライマーの３′末端に位置するＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡ ＴＧＧＴＣＣＣＧＴＡの相補配列であり、これは先願発明におけるセグメントＦ（本件発明１の「領域Ｒ２」に相当）に対応する。そして、このセグメントＥとセグメントＦは連続しており、両セグメント間の塩基数は０であることが理解できる。
　そうすると、先願明細書には、鋳型において、「前記領域Ｆ２ｃと前記領域Ｆ１ｃとの距離が１０〜７０塩基」とすること、および「前記領域Ｒ２と前記領域Ｒ１との距離が１０〜７０塩基」とすることは開示されていない。
　そして、この点が本願優先日前における周知技術であるとは認められないから、上記相違点が、課題解決のための具体的手段における微差であるともいえない。
　したがって、本件発明１は、先願明細書に記載された発明ではない。
　
コ．本件発明２〜１１について
　本件発明２〜１１は、本件発明１に更に他の構成要件を付加したものであるところ、本件発明１は、先願明細書に記載された発明ではないから、本件発明２〜１１も、先願明細書に記載された発明とはいえない。
　
（７）小括
　以上のとおり、本件発明１〜１１に係る発明についての特許は、特許法第２９条の２の規定に違反してされたものとはいえない。
　
３．無効理由１（特許法第２９条第２項違反）について
（１）甲１の記載について
　甲１（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.266、 No.21、 pp.14031-14038、 1991）には、以下の事項が記載されている。 
 「観察に基づき、スナップバック（snap-back）ＤＮＡ合成における増幅に対し、図８のモデルを提案する。 
 　工程１　Ｔ４ホロ酵素が、スナップバック機構により、直鎖ｓｓＤＮＡ鋳型を複製する。この反応の生成物は、長い２本鎖のヘアピンであり、それは、出発物質である直鎖ｓｓＤＮＡに対して相同である。 
 　工程２　ｕｖｓＸタンパク質が、工程１における直鎖ｓｓＤＮＡ分子と２本鎖ヘアピン生成物との間の結合を触媒する。ｕｖｓＸタンパク質（６）によって触媒されるＤＮＡ分岐点移動の、５′から３′への方向性（ｓｓＤＮＡへの侵入に関する）により、前記ｓｓＤＮＡの３′末端は、Ｄ-ループ構造に組み込まれ、そこで、ＤＮＡ複製を開始できる状態を保つ（脚注６：ヘアピン構造領域におけるループ部分の２重鎖は、直鎖ｓｓDNAと非相同的であり、このため、３′末端の対合が困難になっている）。 
 　工程３および４　このように開始されるＤＮＡ合成により、Ｄ-ループ中間体を、ダイマー長の直鎖２本鎖に分解し、前記直鎖２本鎖は複製開始ＤＮＡ合成における鋳型としてもよい（工程５）。 
 　工程５及び６　ｕｖｓＸタンパク質が直鎖ｓｓＤＮＡ分子（出発物質）と２本鎖の二量体中間体の相同性タンパク質との間のシナプシスを触媒し、ＤＮＡ合成を開始する。ＤＮＡバブル移動機構（１３）によるこの鋳型の複製によって、内部相補的であり、急速に復元するダイマー長の直鎖ｓｓＤＮＡ分子が生じる。 
 　工程７　この生成物の復元によって、工程１と同一のヘアピン構造が形成される。そして、これらの生成物は新たなＤＮＡ合成に用いてもよく、それによって、これらの生成物は増幅される。」（１４０３７頁右欄２８行〜５４行） 
 　 
 「図８　Ｔ４ｕｖｓＸタンパク質の複製開始活性に基づく、前記タンパク質によるスナップバック（snap-back）ＤＮＡ合成の増幅モデル。ｕｖｓＸが触媒する、直線ｓｓＤＮＡプライマー／テンプレートと、スナップバック複製のｄｓＤＮＡ産物との再結合が、スナップバック産物と同じ配列を持つ２倍の長さの二重鎖を産生するＤＮＡ合成を開始する。このテンプレートにおける再結合で開始されたＤＮＡ合成は、スナップバック産物の産生を増幅させる。詳細は、ディスカッションを参照。」（１４０３７頁左欄１行〜８行）　
 「図８
 」 
 　 
 「最後に、snap-backのＤＮＡ合成反応は、比較的シンプルな、試験管内システムにおいて、高い精度のＤＮＡポリメラーゼを用いて実施されるＤＮＡの等温増幅プロセスの一例である。」（１４０３８頁右欄１３行〜１６行）
　
（２）甲２の記載について 
　甲２（“DNA REPLICATION SECOND EDITION”, ARTHUR KORNBERG,TANIA A BAKR, W.H.FREEMAN AND COMPANY,1992 pp.700-704, pp.713-716, pp.492-493 pp.504)には、以下の事項が記載されている。 
 　「一般に、自律的ウイルスは、mRNAの相補鎖をカプシドに包んでいる。一方、AAVは、(+)鎖と(−)鎖のどちらかを同じ頻度で別々の粒子としてパッケージしている。このウイルス粒子からの放出時に、相補鎖は直鎖状二重鎖を形成するようにアニールできる。パルボウイルスのDNAの鎖端は、自己アニーリングによるさまざまなヘアピン構造を形成できるように反転して末端繰り返し配列を持っている（図19-6）。」（７０１頁１行〜６行）
 　 
 　「図19-6　AAVの提案モデル。A、A’、B、B’などの文字は、末端繰り返し配列を示している。(1) ウイルス鎖。鎖の形成しうる四つの末端構造のうち、三つは大括弧内に示されている。(2)　ヘアピンループは、相補鎖合成を開始し、二本鎖複製型をつくる。（右の直線分画におけるBとCの間の距離は、左の折り返し型の距離と同じであるはずである。）ニック（矢印）は、親鎖の３′端の反対側に起こる。(3)　ニックとニックからの鎖伸長反応の結果、ヘアピンの転移がおこる。(4) 末端ヘアピンの再構成により、どちらかの末端にひとしく３′プライマー末端が作られる。(5) その３′プライマー末端からの(DNAが)合成されることで、1ユニット分の長さのゲノムが置換される。(6)　1ラウンドの置換合成反応が完了することにより、置換された一本鎖が（（この鎖は）ステップ1記載にあるように、相補鎖合成のスタート準備ができている）、そして、ヘアピン転移反応と鎖置換反応の他のラウンドが起こりうる二本鎖分子（（この鎖は）ステップ2の初めに記載）が、結果として生じる。（Berns KI、 Hauswirth WW (1982) ウイルスDNAの構成と複製（カプランA編）。CRC出版、クリーブランド、25ページ）」（７０１頁図19-6の説明）
 　 
 　「末端配列は、ヘアピンのプライミングとヘアピンループの転移のための基礎となる（図19-6）42。AAVの各々の鎖における四つの可能な末端配列の組み合わせは同じ割合で見つかっており、このことは、末端配列の特定の方向性には、バイアスがないということを示している。反転は、ウイルス粒子のAAV鎖の３′末端に起こらないので、複雑な複製も出るが推測できる。 
 　親と子孫の双方の細胞内複製中間体43における末期のクロス結合分子は、５′端配列を複製するための末端ヘアピン鎖からの（複製）開始とヘアピンループの転移メカニズムに一致している。双方の鎖の合成が、５′から３′方向の鎖置換機構による継続的伸長反応によって起こる。感染したウイルスの一本鎖からの親の複製型（DNA分子）の初期合成におけるように、置換された一本鎖は、カプシドに包まれるか、または、相補鎖の合成によって、複製型にもどされ、リサイクルされる（図19-6）。」（７０２頁２１行〜３４行）
　 
 　「図19-6 
 」 
 　 
 　「図19-12　牛痘ウイルスDNAの複製モデル。一方の端のループ領域で開始する複製は、ヘアピンループ機構により、そこから直線状のゲノムが遊離してサイクルが回るところのコンカテマーをつくるために一方向的に進行する（左の経路）。両端から始まる複製は、直線状ゲノムを直接産生する（右の経路）[After Moss B (1990) in Virology (Fields BN、 Knipe DM、 eds.). Raven Press、 New York、 p2079]」（７１６頁図19-12の説明）
 　 
 　「適切な時間に、いくつかの場所で鋳型環が開くことが完全な二本鎖を作るのに必要とされる。おそらく、パリンドローム配列が折り返して、最終的に環状ウイルスの子孫DNA分子を作るヘアピンを作る。ニッキングと結合酵素は、ゲノムを完成させるための分子内結合の原因となるものかもしれない。」（７１６頁１行〜５行）
 　 
（３）甲３の記載について
　甲３（ＷＯ　９６／０１３２７）には、以下の事項が記載されている。 
 　「本発明は、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸標的配列の増幅方法であって、標的配列と特異的にハイブリダイズできる部分（３′）、及び少なくとも１つの逆方向反復配列を含む部分（５′）からなる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を利用することを特徴とする方法に関する。」（４頁２８行〜３５行）
 　 
 　「逆方向反復配列（またはパリンドローム配列ともいう）により、ヘアピン形状の二本鎖構造を形成するための自己プライミングが可能になる。」（５頁２９行〜３２行）
 　 
 　「実際、熱撹拌の効果により、ＤＮＡの二本鎖の末端のパリンドローム配列は、２つの形成の間の動的平衡にある：すなわち、通常の二本鎖⇔二本ヘアピンである（図5h及び5i）。
 　ＤＮＡポリメラーゼは、二本ピンに折り曲げられた鎖の一方の末端３′に結合され、かつ折り曲げられた末端をプライマーとして用いて、鎖の一方の複製を開始することができる（図5j）。ＤＮＡポリメラーゼは、そうすることで、相補的鎖を移動させ、かつ２つの鎖は温度上昇を行うことを必要とせず、このようにして分離される（図5j）。このステップから、鎖の一方は、新規なプライマーP2とハイブリダイズして、新規な複製サイクルを開始することができる（図5f）。他方は、各サイクルで、その長さは理論上二倍になるサイズの増大を受ける（図5k、5l、5m）。
 　反応の間中一定に維持される反応温度は、プライマーのハイブリダイゼーション、広げた形状及びヘアピン状に折り曲げられた形状の間の逆方向反復配列の平衡、及び他方で選択したポリメラーゼによる鎖の伸長を可能にするように選択される。一般的に、この温度は、45-75℃であり、好ましくは50-65℃である。」（７頁３１行〜８頁２０行）
 　 
 「図５　 
」
　
（４）甲４の記載について
　甲４（ＷＯ　９７／０４１３１）には、以下の事項が記載されている。 
 　「他の好ましい態様において、図17に示す通り、ヘアピンDNAは、標的ポリヌクレオチド上でのプライマー（プローブ）の伸長によって得られる。AからＤの領域の一本鎖の標的ポリヌクレオチドを、パネルＡに示す。前記プローブの３′末端は、前記標的ポリヌクレオチドの領域Ａに相補的な配列である。前記プローブの５′末端は、前記標的ポリヌクレオチドの領域Ｂと同一の配列である。前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖の場合、それを、一本鎖の標的を産生するために変性させる。その後、前記プローブを前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる（図17、パネルＡ）。そして、少なくとも前記標的ポリヌクレオチドの領域Ｄの５′末端に伸長させた状態で、前記プローブを鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼに接触させる（図17、パネルＢ）。変性は、図Ｃ（注：「パネルＣ」の誤記と思われる。）の伸長生成物を産生する鎖分離を引き起こす。この伸長生成物は、５′ 末端が牧杖形状をしており、プライマーＤを用いて増幅できる。前述のとおり、前記プライマーＤは、図17、パネルＤに示す生成物を産生するために、伸長生成領域Ｄ’に相補的である。」（２３頁第５行〜２３行）
 　 
 　「図１７　 
 」
　
（５）本件発明１と甲１に記載された発明の対比
　前記（１）の甲１の記載によれば、甲１には、「Ｔ４ホロ酵素がスナップバック機構により中央にヘアピン構造を有する長い２本鎖ＤＮＡを合成し、これに当該２本鎖ＤＮＡに相同な直鎖ｓｓＤＮＡがｕｖｓＸリコンビナーゼの作用によって侵入し、当該直鎖ｓｓＤＮＡがプライマーとして機能して鎖置換型の相補鎖合成を行うことによる、ｕｖｓＸリコンビナーゼの組換え反応に依存する、Ｔ４ホロ酵素を用いたスナップバックＤＮＡ増幅機構」が記載されている（以下、「引用発明１」という。）。
　
　本件発明１と引用発明１を対比すると、両者は、ＤＮＡの増幅方法である点で一致する。
　請求人は、引用発明１におけるヘアピン構造が本件発明１のループ部分に相当し、同じく直鎖ｓｓＤＮＡがプライマー（オリゴヌクレオチド）に相当する旨主張する。
　しかしながら、本件発明１の工程Ａ）で提供される鋳型となる核酸のループ部分（ループ形成配列）は、３′末端及び５′末端にそれぞれ領域Ｆ１−Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ及びＲ１ｃ−Ｒ２−Ｒ１の塩基配列で構成される領域（ループ形成配列）を有するものであり、かつ、当該領域は、本件発明１における工程Ｃ）以下を実現させる上で不可欠の構成である。さらに、本件発明１では、「前記領域Ｆ２ｃと前記領域Ｆ１ｃとの距離が１０〜７０塩基であり、および／または、前記領域Ｒ２と前記領域Ｒ１との距離が１０〜７０塩基である」ことが特定されている。
　一方、引用発明１のヘアピン構造は、Ｔ４ホロ酵素のスナップバック機構により生ずるものであるばかりか、本件発明１のループ形成配列における領域Ｆ２ｃ又はＲ２に相当する部分を欠くものであり、また、領域間の塩基数に関する記載もない。
　したがって、引用発明１におけるヘアピン構造は、本件発明１のループ部分に相当するということはできない。
　そうすると、本件発明１が「Ａ）３′末端と５′末端において、それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互いに相補的な塩基配列がアニールしたときに両者の間に塩基対結合が可能となるループが形成される鋳型を提供する工程であって、
　前記鋳型は、３′末端に存在し同一鎖上の相補的な塩基配列にアニールする領域を領域Ｆ１とし、前記領域Ｆ１と相補的な塩基配列からなる領域を領域Ｆ１ｃとし、前記領域Ｆ１と前記領域Ｆ１ｃとの間に存在し前記領域Ｆ１と前記領域Ｆ１ｃがアニールしたときに塩基対結合可能となる領域を領域Ｆ２ｃとし、かつ、５′末端に存在し同一鎖上の相補的な塩基配列にアニールする領域を領域Ｒ１ｃとし、前記領域Ｒ１ｃと相補的な塩基配列からなる領域をＲ１とし、前記領域Ｒ１ｃと前記領域Ｒ１との間に存在し前記領域Ｒ１と前記領域Ｒ１ｃがアニールしたときに塩基対結合可能となる領域を領域Ｒ２とした場合に、前記領域Ｆ２ｃと前記領域Ｆ１ｃとの距離が１０〜７０塩基であり、および／または、前記領域Ｒ２と前記領域Ｒ１との距離が１０〜７０塩基である工程」を有する一方、引用発明１にはこれが存在しないことは、両者の実質的な相違点である（以下、「相違点Ａ」という。）。
　
　また、本件発明１においてアニールされるオリゴヌクレオチドは、３′末端側のループ内の領域Ｆ２ｃ部分に相補的な塩基配列部分（領域Ｆ２）を含むもので、当該領域Ｆ２部分が当該領域Ｆ２ｃ部分にアニールするというものであり、かつ、当該オリゴヌクレオチドの構成及びそれに基づくアニールの方法は、いずれも工程Ｃ）以下を実現させる上で不可欠の構成である一方、引用発明１は、既存の２本鎖ＤＮＡに相同な直鎖ｓｓＤＮＡがｕｖｓＸリコンビナーゼの組換え反応に依存して侵入するというものであって、アニールされる直鎖ｓｓＤＮＡの構成及びアニール（侵入）の方法が、いずれも本件発明１とは相違するというほかない。
　したがって、引用発明１における直鎖ｓｓＤＮＡは、本件発明１のオリゴヌクレオチドに相当するということはできず、むしろ、本件発明１が上記のようなオリゴヌクレオチド、すなわち、「３′末端側に位置するループ内の前記領域Ｆ２ｃに相補的な塩基配列の領域Ｆ２を３′末端に含むオリゴヌクレオチドを、ループ部分にアニールさせ（工程Ｃ））」るとの構成を有する一方、引用例１に記載の発明が「当該２本鎖ＤＮＡに相同な直鎖ｓｓＤＮＡがｕｖｓＸリコンビナーゼの作用によって侵入」するとの構成を有することは、両者の実質的な相違点である（以下、「相違点Ｂ」という。）。
　
（８）判断
ア．相違点Ａについて
　引用発明１におけるヘアピン構造は、Ｔ４ホロ酵素のスナップバック機構により生ずるものであって、本件発明のループ形成配列における領域Ｆ２ｃ又はＲ２に相当する部分を欠くものであるから、構成として自己完結しているものであって、甲１には、ＤＮＡの増幅に当たって、あえて本件発明１の相違点Ａに係る構成を採用させるに足りる示唆ないし動機付けが見当たらない。また、技術分野を同じくする他の文献にも、この点に関する示唆ないし動機付けは見当たらない。
　
イ．相違点Ｂについて
　引用発明１は、既存の２本鎖ＤＮＡに相同な直鎖ｓｓＤＮＡがｕｖｓＸリコンビナーゼの組換え反応に依存して侵入するというものであって、相補鎖の置換を開始するための方法としては、本件発明１における塩基対結合の相補性を利用したアニールと全く異なる原理に基づくものであるから、甲１には、ＤＮＡの増幅に当たって、引用発明１の相違点Ｂに係る構成に代えて、本件発明１の相違点Ａに係る構成を前提とした本件発明１の相違点Ｂに係る構成を採用させるに足りる示唆ないし動機付けが見当たらない。また、技術分野を同じくする他の文献にも、この点に関する示唆ないし動機付けは見当たらない。
　
（９）甲２〜８について
 　甲２に記載された発明は、種々のウイルスの生体内におけるＤＮＡ複製機構を明らかにすることを課題とするものであり、例えば、アデノ随伴ウイルスの増幅機構は、図19-6に詳述されているが、３′末端と５′末端の双方にループが形成された１本鎖核酸（鋳型）において、その３′末端から自己を鋳型とする相補鎖合成が開始され、二本鎖の複製型が一旦形成され、その親鎖の３′端の反対側でニックが生じ、ニックからの伸長反応の結果、ヘアピン構造への転移が生じ、末端ヘアピンの再構成によって、どちらかの末端に３′末端が形成され、当該末端からの自己を鋳型とする相補鎖合成によって、次の新しい鋳型が提供されるというものである。 
 　ところが、３′末端側に位置するループ部分にプライマーをアニールさせることは甲２のどこにも記載されていない。 
 　甲３に記載された発明は、ヘアピン構造を形成し得るプライマーを使用し、核酸を等温増幅する方法の提供を課題とするものであり、二本鎖ＤＮＡの末端にあるパリンドローム配列は動的平衡によってヘアピン構造を形成し、折り曲げられた末端はプライマーとして機能し、自己を鋳型とする相補鎖合成を行って、核酸の伸長反応が継続的に生じるこというものである。 
 　この甲３にも、３′末端側に位置するループ部分にプライマーをアニールさせることはどこにも記載されていない。 
 　甲４に記載された発明は、単一のプライマーを用いて、ヘアピン構造を有する核酸を増幅することを課題とするものであり、その詳細は、図１７に示されるとおり、標的ポリヌクレオチドの領域Ａに相補的な配列と、標的ポリヌクレオチドの領域Ｂと同一の配列を有するプライマー（ＴＰ）を標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、３′末端からの伸長反応によって伸長生成物を生じさせ、これを熱変性によって鎖分離し、該伸長生成物が５′末端にヘアピン構造を形成した後に、ＰＣＲプライマー（Ｄ）をハイブリダイズさせ、該生成物を増幅するというものである。 
 　この甲４に記載される、標的ポリヌクレオチドの領域Ａに相補的な配列と、標的ポリヌクレオチドの領域Ｂと同一の配列を有するプライマーは、ＴＰと構造は同じではあるが、これを３′末端側に位置するループ部分にプライマーをアニールさせることはどこにも記載されていない。 
 　請求人はこの点について、図１７Ｄの核酸分子のループに、図１７ＡのＴＰがアニールして伸長可能であることは自明であり、これは、本件発明１の「１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結された核酸の増幅方法」及び工程ｃ）（鎖置換を除く）に該当することを主張しているが、単一のプライマーを用いての増幅を意図している、プライマーＤを用いた増幅工程において、図１７ＡのＴＰを存在させることが何ら記載されていないのであるから、図１７ＡのＴＰがアニールして伸長可能であることは自明であるとしても、本件発明１の工程ｃ）に相当するものが記載されていることにならない。 
　
 　このように、これら甲２〜４にも、甲１と同様に、３′末端側に位置するループ部分にプライマーをアニールさせること（本件発明１の工程Ｃ））は記載されていない。
　また、甲５〜８にも、この点は記載されていない。
 　したがって、甲１〜甲８に記載された発明を、どのように組合わせたとしても、本件発明１には到達できず、本件発明１は、これらの発明から当業者が容易に発明することができないというべきものである。 
　
（９）小括
　よって、本件発明１は、甲１〜８に記載された発明に基づき、当業者が容易に発明をすることができたものとは認められない。
　また、本件発明２〜１１は、いずれも本件発明１を引用する発明であるところ、本件発明１は、甲１〜甲８に基づいて当業者が容易に想到することができなかったものであるから、本件発明２〜１１も、同じく容易に想到することができなかったものというべきである。
　以上のとおり、本件発明１〜１１に係る発明についての特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものとはいえない。
　
４．無効理由３、４（特許法第３６条第６項第１号及び同条第４項違反）について
（１）実施可能要件について
　本件明細書には、前記１．（１）エ、オ及びカに記載のとおり、本件発明１の工程Ａ）の鋳型を提供する方法について、具体例を挙げつつ、様々な方法が可能である旨の記載があり、かつ、そこに記載の具体例は、いずれも一般的な技術に基づくものであるから、本件出願日当時の技術常識に照らして、当業者が実施可能であると認められる。
　次に、本件発明１の工程Ｂ）それ自体は、ＤＮＡポリメラーゼの機能によって、部分的に２本鎖となった鋳型核酸の３′末端が鋳型核酸の１本鎖となっている部分に対して相補鎖合成を行うということであって、本件出願日当時の当該分野における技術常識にほかならない（甲２参照）。
　本件発明１の工程Ｃ）のうち、既存の核酸のループ形成配列（領域Ｆ２ｃ）と相補的な塩基配列（領域Ｆ２）を有するオリゴヌクレオチドをループ部分にアニールさせることそれ自体は、ループ部分に塩基対結合を生じていない塩基配列が存在すれば発生し得ることであって、これもまた、本件出願日当時の当業者の技術常識であったものと認められる。また、上記工程Ｃ）のうち、特定のＤＮＡポリメラーゼが触媒となって、他の核酸にアニールしたオリゴヌクレオチドの３′末端（プライマー）が塩基対結合の置換による相補鎖合成反応を示すことは、本件明細書でも多数の既存のＤＮＡポリメラーゼが鎖置換型ポリメラーゼとして紹介されていること（前記１．（１）サ）から、やはり本件出願日当時の当業者の技術常識であったものと認められる。したがって、上記工程Ｃ）自体は、当業者が本件出願日当時の技術常識に照らして実施可能であったといえる。
　さらに、本件発明１の工程Ｄ）は、工程Ａ）において、５′末端に領域Ｒ１ｃ−Ｒ２−Ｒ１の塩基配列で構成されるループ形成配列をあらかじめ提供していたことによる論理的帰結であって、それ自体に何ら技術的な困難性が見当たらない。
　以上に加えて、本件発明２以下は、いずれも、本件発明１に他の構成が追加されたものであるが、これらの追加された各構成は、前記１．（１）に記載の本件明細書の記載によれば、いずれも既存ないし既知の技術に立脚するものと認められ、当該各構成を使用することが本件発明２〜１１の場合において不可能であると認めるに足りる証拠もないから、いずれも、本件明細書の記載及び本件出願日当時の技術常識に照らして当業者が実施可能であるものといえる。
　したがって、本件発明１〜１１は、いずれも本件明細書の記載及び本件出願日当時の技術常識に照らして当業者が使用可能なものであるといえる。
　
（２）サポート要件について
　本件明細書は、前記１．（１）エ、オ及びカに記載のとおり、本件発明の工程Ａ）の鋳型核酸の製造方法について記載した上で、本件発明１〜３については、前記１．（１）キにその作用機序及び技術的思想に関する詳細な説明を記載しており、本件発明４〜６については、前記１．（１）クに、本件発明７〜１１については、前記１．（１）ケ、コ及びシに、それぞれその構成及びその技術的意義に関する詳細な説明を記載しており、これらの記載は、いずれも当業者が本件発明の課題を解決できると認識できるものであると認められる。
　
（３）請求人の主張について
ア．請求人は、本件明細書には本件発明１の工程Ａ）の鋳型核酸の製造方法として２つのＯＰを用いた方法以外には記載がないから、当業者がこれを実施できず、また、本件発明のＬＡＭＰ法では２つのＯＰ及びＴＰが必須である旨を主張する。
　しかしながら、本件明細書には、上記工程Ａ）の鋳型核酸は、様々な方法によって得ることができるとされており（前記１．（１）エ）、それ自体実施可能であるとされているから、この点を問題として実施可能要件又はサポート要件違反を指摘する主張は、失当である。
　
イ．請求人は、本件発明における工程Ａ）の鋳型核酸を作るに当たり、加熱変性が必要であることから、本件発明が実施可能要件又はサポート要件に違反する旨を主張する。
　しかしながら、前記１．（１）サにもあるように、本件発明は、「等温反応が可能とは言え、最初の鋳型となる核酸の提供のためにも加熱変性は行われる可能性があ」るというものであり、本件発明において、加熱変性などの処理を行って鋳型核酸を得ることが完全に排除されているわけではないから、請求人の上記主張は採用できない。
　
（４）小括 
 　以上のとおり、本件発明１〜１１に係る発明についての特許は、特許法第３６条第６項第１号及び同条第４項に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものとはいえない。 
 　 
 第５　むすび 
 　以上まとめると、本件発明１〜１１について、請求人が申し立てた無効理由は、いずれも理由がないものであるから、本件請求項１〜１１に係る発明についての特許を無効にすることはできない。
　審判に関する費用については、特許法第１６９条第２項の規定で準用する民事訴訟法第６１条の規定により、請求人が負担すべきものとする。
　
　よって、結論のとおり審決する。