(57)【要約】【課題】汎用のマイクロプレートを用いて良好な蛋白質結晶化を簡便な方法で実現することができる蛋白質結晶化方法を提供することを目的とする。【解決手段】蛋白質溶液１２と結晶化溶液１３とを混合した混合液１４を、オイル１１内に浸漬状態で保持することにより混合液１４内で蛋白質結晶を生成させる蛋白質結晶化方法において、ウェル１０ａにオイル１１を蛋白質溶液１２および結晶化溶液１３の液滴を覆うのに必要な第１の量だけ予め供給しておき、蛋白質溶液１２および結晶化溶液１３を順次分注して混合液１４の液滴を形成するとともにこの液滴をオイル１１で覆った後に、オイル１１を追加供給して十分な厚さＤのオイル層を形成し、混合液１４の液滴を外気から遮断した状態で保持して液滴内に蛋白質結晶を生成させる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質溶液と結晶化溶液とを混合した混合液をオイル内に浸漬状態で保持することにより前記混合液内で蛋白質結晶を生成させる蛋白質結晶化方法であって、
前記オイルを収納する容器に前記オイルを前記蛋白質溶液および結晶化溶液の量に応じて定められる第１の量だけ供給する第１のオイル供給工程と、
前記第１のオイル供給工程後の前記容器内に分注された前記オイルに対して前記蛋白質溶液および結晶化溶液を順次分注して前記混合液の液滴を形成する分注工程と、
前記分注工程後の前記容器内に前記第１の量よりも多い第２の量のオイルを追加供給することにより前記液滴の上方にオイル層を形成する第２のオイル供給工程と、
前記容器内において前記液滴を前記オイル層によって外気から遮断した状態で保持することにより前記液滴内に蛋白質結晶を生成させる結晶化工程とを含むことを特徴とする蛋白質結晶化方法。
【請求項２】
前記第１のオイル供給工程において前記液滴サイズよりも大きい厚みのオイル膜を前記容器の底面に形成することを特徴とする請求項１記載の蛋白質結晶化方法。
【請求項３】
前記第１のオイル供給工程において前記液滴サイズよりも小さい厚みのオイル膜を前記容器の底面に形成することを特徴とする請求項１記載の蛋白質結晶化方法。
【請求項４】
前記第２のオイル供給工程において、オイルを複数回に分けて追加供給することを特徴とする請求項１記載の蛋白質結晶化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質溶液中において蛋白質結晶を生成させる蛋白質結晶化方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年遺伝子情報を医療などの分野に有効に利用するための取り組みが活発化しており、その基礎技術として遺伝子の産物である蛋白質の構造を解析する努力が行われている。この蛋白質の構造解析は、蛋白質の３次元立体構造を特定するものであり、Ｘ線結晶構造解析などの方法によって行われる。このような蛋白質の構造解析を行うためには、まず解析対象の蛋白質を結晶化することが求められ、従来より知られている蒸気拡散法やマイクロバッチ法などの結晶化方法とともに、各種の結晶化のための装置や方法が提案されている（例えば特許文献１，２参照）。
【０００３】
上述の蛋白質結晶化方法のうちのマイクロバッチ法では、結晶化対象の蛋白質を含む蛋白質溶液と結晶化溶液とを混合した混合液をオイル中に浸漬して外気と遮断した状態に保ち蛋白質結晶を徐々に生成させる。このマイクロバッチ法において良好な結晶化を実現するためには、容器に溜めたオイル中に蛋白質溶液と結晶化溶液を分注し、それぞれの溶液の液滴をオイル中で合体して混合することが必要とされる。各溶液は分注後直ちにオイルで覆われるので、蒸発による濃度等の変化を生じにくい状態で混合される。
【０００４】
このため従来方法においては、予め蛋白質溶液と結晶化溶液との混合液を作っておくか、または底が浅くてオイル深さが小さい特殊な形状の容器を使用するか、あるいは一般に用いられているＵ字底のウェルを有する汎用型のマイクロプレートを用いる場合には、２液混合のために分注後の蛋白質溶液と結晶化溶液とをウェル底部に強制的に位置させるためのプレート遠心器を用いるかのいずれかを選択する必要があった。
【特許文献１】特開平１０−２９８９８号公報
【特許文献２】特開２００５−２３０３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、予め混合液を作る方法では２液混合のための工程が増えることとなり、多種類の結晶化溶液との組み合わせが必要とされる試験に対しては好ましくない。また浅底形状の容器を使用する場合には、使用可能な容器の種類が限定されるという難点がある。さらにプレート遠心器を用いる方法では、このための付帯設備を別途必要とするとともに、作業工程を増やして手間を大きく増大させる結果となる。このように、従来のマイクロバッチ方による蛋白質結晶化方法においては、汎用のマイクロプレートを用いて良好な蛋白質結晶を簡便な方法で実現することが困難であるという問題点があった。
【０００６】
そこで本発明は、汎用のマイクロプレートを用いて良好な蛋白質結晶化を簡便な方法で実現することができる蛋白質結晶化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の蛋白質結晶化方法は、蛋白質溶液と結晶化溶液とを混合した混合液をオイル内に浸漬状態で保持することにより前記混合液内で蛋白質結晶を生成させる蛋白質結晶化方法であって、前記オイルを収納する容器に前記オイルを前記蛋白質溶液および結晶化溶液の量に応じて定められる第１の量だけ供給する第１のオイル供給工程と、前記第１のオイル供給工程後の前記容器内に分注された前記オイルに対して前記蛋白質溶液および結晶化
溶液を順次分注して前記混合液の液滴を形成する分注工程と、前記分注工程後の前記容器内に前記第１の量よりも多い第２の量のオイルを追加供給することにより前記液滴の上方にオイル層を形成する第２のオイル供給工程と、前記容器内において前記液滴を前記オイル層によって外気から遮断した状態で保持することにより前記液滴内に蛋白質結晶を生成させる結晶化工程とを含む。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、容器にオイルを蛋白質溶液と結晶化溶液の量に応じて定められる第１の量だけ供給し、次いで容器内に蛋白質溶液および結晶化溶液を順次分注して混合液の液滴を形成するとともに液滴をオイルで覆い、さらに容器内に第１の量よりも多い第２の量のオイルを追加供給して液滴の上方にオイル層を形成する方法を採用することにより、汎用のマイクロプレートを用いて良好な蛋白質結晶化を簡便な方法で実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
次に本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。図１は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶化方法に用いられる分注装置の斜視図、図２は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶化方法における分注操作の説明図、図３，図４，図５，図６は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶化方法の工程説明図である。
【００１０】
まず図１を参照して、蛋白質結晶化において用いられる分注装置１の構成を説明する。この分注装置１は、蛋白質溶液と結晶化溶液とを混合した混合液をオイル内に浸漬状態で保持してこの混合液内で蛋白質結晶を生成させる蛋白質結晶化において、これらの液体を結晶化用の容器に分注する処理を行う機能を有している。
【００１１】
図１において、基台２の上面は分注ステージ２ａとなっており、分注ステージ２ａに立設された支持ポスト３にはＸ軸テーブル４が架設されており、Ｘ軸テーブル４にはＹ軸テーブル５が移動自在に結合されている。Ｙ軸テーブル５には下部に３本の分注ティップ７を着脱自在に備えた分注ヘッド６が装着されている。分注ヘッド６は分注ティップ７を個別に昇降させる昇降機構および分注ティップ７から液体を吸引しまた吐出する吸引・吐出機構を内蔵している。
【００１２】
Ｘ軸テーブル４、Ｙ軸テーブル５を駆動することにより、分注ヘッド６は分注ステージ２ａの所定範囲内でＸ方向、Ｙ方向に移動し、分注ティップ７を個別に昇降させることができる。そして内蔵された吸引・吐出機構によって分注ティップ７から液体を吸引し、また吐出することにより、所定の分注操作が行われる。分注ステージ２ａの一方側の端部には、複数の分注ティップ７を垂直姿勢で収納したティップラック８が載置されている。分注ヘッド６をティップラック８の上方に移動させて昇降させることにより、分注ヘッド６の下方に設けられたティップ装着部には分注ティップ７が装着される。
【００１３】
分注ステージ２ａ内のティップラック８に隣接したエリアは、分注される液体を供給する液供給部９となっている。液供給部９には、それぞれ異なる種類の液体を収納する第１の貯液部９Ａ、第２の貯液部９Ｂ、第３の貯液部９Ｃが載置される。下部に分注ティップ７が装着された分注ヘッド６を液供給部９の上方に移動させて、分注ティップ７を液供給部９に対して下降させることにより、それぞれの分注ティップ７は、第１の貯液部９Ａ、第２の貯液部９Ｂ、第３の貯液部９Ｃから液体を吸引する。
【００１４】
分注ステージ２ａ内の液供給部９に隣接したエリアには、複数のマイクロプレート１０が載置される。マイクロプレート１０は、液体を収納する容器であるＵ字底のウェル１０ａが格子状に複数設けられた汎用品を、蛋白質結晶化の用途に用いるようにしている。液
供給部９から液体を吸引した分注ヘッド６がマイクロプレート１０上に移動し、分注ティップ７をウェル１０ａ内に挿入して液体を吐出することにより、液供給部９に準備された複数種類の液体を所定量だけマイクロプレート１０の各ウェル１０ａ内に吐出する分注操作が行われる。
【００１５】
次に図２を参照して、マイクロバッチ法による蛋白質検品化を目的として行われる分注操作について説明する。図２に示すように、分注ステージ２ａに設けられた液供給部９には、第１の貯液部９Ａ、第２の貯液部９Ｂ、第３の貯液部９Ｃが載置されており、第１の貯液部９Ａ、第２の貯液部９Ｂ、第３の貯液部９Ｃには、それぞれオイル１１、蛋白質溶液１２、結晶化溶液１３が貯溜されている。オイル１１は、マイクロバッチ法において試料溶液を浸漬して外気と遮断するために用いられる。蛋白質溶液１２は、結晶化対象の蛋白質を含む溶液であり、結晶化溶液１３は蛋白質溶液１２と混合して蛋白質溶液１２中の蛋白質の結晶化を促進するための溶液である。
【００１６】
オイル１１、蛋白質溶液１２、結晶化溶液１３は、それぞれ第１のティップ７Ａ、第２のティップ７Ｂ、第３のティップ７Ｃによって分注され、蛋白質結晶化のための分注操作に際しては、第１のティップ７Ａ、第２のティップ７Ｂ、第３のティップ７Ｃによって液供給部９から取り出されたオイル１１、蛋白質溶液１２、結晶化溶液１３を、マイクロプレート１０のウェル１０ａ内に所定量だけ順次分注する操作が行われる。
【００１７】
次に図３、図４を参照して、蛋白質結晶化のための分注操作の詳細を説明する。まず第１の貯液部９Ａからオイル１１を吸引して取り出した第１のティップ７Ａをマイクロプレート１０上に移動させ、分注対象となるウェル１０ａに分注ティップ７を位置合わせし、次いで図３（ａ）に示すように、第１のティップ７Ａをウェル１０ａ内に挿入してオイル１１を第１のティップ７Ａから所定量だけ吐出して供給し、ウェル１０ａの底面に厚さｔ１のオイル１１の膜を形成する。
【００１８】
ここで厚さｔ１は、以下に説明するように、結晶化プレート作製過程においてウェル１０ａ内に供給されたオイル１１中に蛋白質溶液１２、結晶化溶液１３を分注する際に、オイル１１が蛋白質溶液１２、結晶化溶液１３の液滴（図３（ｃ）参照）を完全に覆うような厚さに設定される。そして、第１のティップ７Ａによるオイル１１の吐出に際しては、ウェル１０ａの底面に厚さｔ１のオイル膜を形成するのに必要な量（第１の量）のオイル１１が吐出される。すなわち、オイル１１を収納する容器であるウェル１０ａに、オイル１１を蛋白質溶液１２および結晶化溶液１３の量に応じて定められる第１の量だけ供給する（第１のオイル供給工程）。
【００１９】
次いで図３（ｂ）に示すように、オイル１１が分注されたウェル１０ａに第２のティップ７Ｂを挿入し、第２のティップ７Ｂの下端部をオイル１１の液面に近接させた状態で、規定量（０．０５μｌ〜５μｌの範囲内）の蛋白質溶液１２を吐出する。ここで規定量とは前述の厚さｔ１との関連で定められた液径ｄの液滴を形成することができる量であり、これにより、図３（ｃ）に示すように、分注後の蛋白質溶液１２は、吐出後直ちにオイル１１中に浸漬された状態となる。また、オイル１１の厚さｔ１、すなわちオイル１１の液面からウェル１０ａの底までの距離は極めて短いので、オイル１１に分注された蛋白質溶液１２の液滴は、オイル１１に接触した位置からほとんど水平方向への位置ずれを生じることなくウェル１０ａの底まで沈む。
【００２０】
次に、結晶化溶液１３の分注が行われる。すなわち図４（ａ）に示すように、既にオイル１１、蛋白質溶液１２が分注されたウェル１０ａに第３のティップ７Ｃを挿入し、下端部をオイル１１中の蛋白質溶液１２の直上に位置させた状態で、第３のティップ７Ｃから前述と同様の規定量の結晶化溶液１３を滴下させる。このとき、オイル１１の量が少なく
第３のティップ７Ｃを蛋白質溶液１２に極めて近接させた状態で結晶化溶液１３を吐出させることができることから、蛋白質溶液１２の液滴と結晶化溶液１３の液滴とは容易に合体して混合する。
【００２１】
これにより、図４（ｂ）に示すように、オイル１１中において蛋白質溶液１２と結晶化溶液１３とが混合した混合液１４の液滴が形成される。この状態においても、混合液１４はオイル１１中に浸漬されて大気と遮断された状態にある。仮に、オイル１１の量が多いとオイル１１と空気の界面（オイル１１の液面）から先に分注されてウェル１０ａの底に位置する蛋白質溶液１２までの距離が長くなり、その結果、オイル１１の液面に投下された結晶化溶液１３の液滴が沈降する進路を乱され、蛋白質溶液１２と接触して合体する確率が低くなる。
【００２２】
すなわち図３（ａ）〜図４（ｂ）に示す動作工程は、第１のオイル供給工程後のウェル１０ａ内に、蛋白質溶液１２および結晶化溶液１３を順次分注して混合液１４の液滴を形成する分注工程となっている。そしてここに示す例では、第１のオイル供給工程において、後に供給される蛋白質溶液１２や結晶化溶液１３さらにはこれらが混合した混合液１４の液滴サイズよりも大きい厚みのオイル膜をウェル１０ａの底面に形成し、分注工程においてオイル膜の内部に蛋白質溶液１２や結晶化溶液１３、混合液１４の液滴を浸漬するようにしている。このためオイル１１に分注された蛋白質溶液１２や結晶化溶液１３は、分注後直ちにオイル１１で覆われて外気から遮断され、この状態で両者が混じり合って混合液１４となる。
【００２３】
この後、ウェル１０ａにはオイル１１が追加して分注される。図４（ｃ）に示すように、オイル１１中に混合液１４が浸漬されたウェル１０ａに第１のティップ７Ａを挿入し、混合液１４中で結晶を育成するのに十分な深さＤのオイル層を形成するのに必要な量（第２の量）のオイル１１を吐出して追加供給する。すなわち分注工程後のウェル１０ａ内に前述の第１の量よりも多い第２の量のオイル１１を追加供給することにより、混合液１４の液滴の上方に深さＤのオイル層を形成する（第２のオイル供給工程）。なお、ここでは第２のオイル供給工程においてオイル１１を複数回に分けて追加供給するようにしている。この後、上述の分注操作が行われたマイクロプレート１０（結晶化プレート）を所定環境下で保持し、ウェル１０ａ内において混合液１４の液滴内に蛋白質結晶を生成させる（結晶化工程）。
【００２４】
上記説明したように、本発明の蛋白質結晶化方法は、マイクロプレート１０のウェル１０ａにオイル１１、蛋白質溶液１２、結晶化溶液１３を順次分注して結晶化プレートを作製するための分注操作において、ウェル１０ａにオイル１１を蛋白質溶液１２と結晶化溶液１３の量に応じて定められる第１の量だけ供給し、次いでウェル１０ａ内に蛋白質溶液１２および結晶化溶液１３を順次分注して混合液１４の液滴を形成し、さらにウェル１０ａ内に第１の量よりも多い第２の量のオイルを追加供給することにより、液滴の上方にオイル層を形成するようにしたものである。
【００２５】
これにより、マイクロバッチ法による蛋白質結晶化において従来より採用されていた方法と比較して、以下に述べるような優れた効果を得る。すなわち蛋白質溶液１２と結晶化溶液１３との混合液を予め作製する方法のように、２液混合工程を別途設ける必要がない。したがって多種類の結晶化溶液との組み合わせが必要とされる試験に対しても、効率的に試験を実行することができる。
【００２６】
また分注によって２液を良好に混合させることを目的として底浅形状のプレートを用いる場合には、使用可能なプレートがこのような特殊形状の専用容器に限定されていたが、本実施の形態においては汎用型のマイクロプレートを用いることができ、低コストで試験
を実行することができる。さらに、従来はこのような汎用型のマイクロプレートを用いて２液を良好に混合させようとすれば、プレート遠心器を用いる必要があったが、本実施の形態においては、分注操作のみで良好な２液混合を実現している。これにより、汎用のマイクロプレートを用いて良好な蛋白質結晶を簡便な方法で実現することが可能となっている。
【００２７】
なお、図３、図４に示す例では、分注工程において、蛋白質溶液１２、結晶化溶液１３の液滴を完全に浸漬状態で覆うのに十分な量のオイル１１を予めウェル１０ａ内に供給しておくようにしているが、図５〜図６に示すように、第１のオイル供給工程において液滴サイズよりも小さい厚みのオイル膜をウェル１０ａの底面に形成し、分注工程においてこのオイル膜によって液滴を覆うようにしてもよい。
【００２８】
すなわちこの場合には、図５（ａ）に示すように、図３に示す液滴径ｄよりも小さい厚みｔ２のオイル膜を、ウェル１０ａの底面に形成しておく。この後、第２のティップ７Ｂによって蛋白質溶液１２をウェル１０ａ内に滴下すると、図５（ｃ）に示すように、オイル１１が蛋白質溶液１２の液滴を覆ってオイル膜１１ａを形成する。これにより、蛋白質溶液１２の大気との直接の接触が防止される。
【００２９】
次いで図６（ａ）に示すように、第３のティップ７Ｃをウェル１０ａ内に挿入して蛋白質溶液１２に近接させ、結晶化溶液１３を直上から滴下する。これにより、ウェル１０ａの底面には蛋白質溶液１２と結晶化溶液１３が混合した混合液１４の液滴が形成されるが、この状態においてもオイル１１は混合液１４の表面を覆うオイル膜１１ａを形成し、これにより混合液１４の大気との直接の接触が防止される。この後、第１のティップ７Ａによってオイル１１を追加供給し、混合液１４を浸漬状態にして前述と同様の蛋白質結晶化が行われる。
【００３０】
なお本実施の形態では、オイル１１に蛋白質溶液１２を分注した後、結晶化溶液１３を分注する例で説明したが、本発明において分注する順序は逆でも良く、どちらを先に行ってもよい。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の蛋白質結晶化方法は、汎用のマイクロプレートを用いて良好な蛋白質結晶化を簡便な方法で実現することができるという効果を有し、生化学分野などにおいて蛋白質の３次元立体構造解析に先立って行われる蛋白質結晶化処理において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶化方法に用いられる分注装置の斜視図
【図２】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶化方法における分注操作の説明図
【図３】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶化方法の工程説明図
【図４】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶化方法の工程説明図
【図５】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶化方法の工程説明図
【図６】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶化方法の工程説明図
【符号の説明】
【００３３】
１  分注装置
６  分注ヘッド
７  分注ティップ
７Ａ  第１のティップ
７Ｂ  第２のティップ
７Ｃ  第３のティップ
９  液供給部
１０  マイクロプレート
１０ａ  ウェル（容器）
１１  オイル
１２  蛋白質溶液
１３  結晶化溶液
１４  混合液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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