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　特願２００７−５０６７３２「ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）由来のＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子」拒絶査定不服審判事件〔平成１７年１０月２０日国際公開、ＷＯ２００５／０９７９８２、平成１９年１１月１５日国内公表、特表２００７−５３２１０４〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
第１　手続の経緯・本願発明
　
　本願は、２００５年（平成１７年）４月　８日（パリ条約による優先権主張外国庁受理２００４年　４月　８日，ドイツ）を国際出願日とする特許出願であって、本願の請求項１乃至１２に係る発明は、平成２４年　７月２７日付け手続補正書により補正された特許請求の範囲の請求項１乃至１２に記載された事項により特定されるとおりのものと認められるところ、そのうち請求項１に係る発明（以下、「本願発明」という。）は、次の事項により特定される発明である。
　
「【請求項１】
　ａ．配列番号６（ＯＲＦ１）において表されるアミノ酸配列、又はこの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、ＰＵＦＡ−ＰＫＳの生物活性を有するアミノ酸配列、あるいは、
　ｂ．
（i）配列番号３２において表されるアミノ酸配列、又はこの配列と少なくとも９９％の配列同一性を有し、かつ、βケトアシルシンターゼの生物活性を有するアミノ酸配列、
（ii）マロニルＣｏＡ−ＡＣＰトランスフェラーゼ、
（iii）ＡＣＰドメインの１０個の繰り返しを有するアラニンに富む配列、および
（iv）ケトレダクターゼに部分的に一致する配列、
あるいは、
　ｃ．
（i）βケトアシルシンターゼ、
（ii）配列番号３３において表されるアミノ酸配列、又はこの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、マロニルＣｏＡ−ＡＣＰトランスフェラーゼによる生物活性を有するアミノ酸配列、
（iii）配列番号３４において表されるアミノ酸配列、又はこの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、ＡＣＰドメインの１０個の繰り返しを有するアラニンに富む配列による生物活性を有するアミノ酸配列、および
（iv）配列番号３５において表されるアミノ酸配列、又はこの配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、ケトレダクターゼに部分的に一致する配列による生物活性を有するアミノ酸配列、
を有することを特徴とするＰＵＦＡ−ＰＫＳ。」
　
　
第２　引用例
　
１．引用例１
　原査定の拒絶の理由に引用された、本願の優先日前に頒布された刊行物である、国際公開第０２／０８３８７０号（２００２年１０月２４日公開、以下「引用例１」という。）には、次の事項が記載されている。（翻訳は対応する国内公表公報である、特表２００５−５１０２０３号公報によるものである。）
　なお、下線は当審にて付記したものである。
　
（１−ａ）「本発明は一般に、
非細菌生物から単離または誘導された高度不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系
　
（１−ｂ）「好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、組換えDNA技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、クローニング）または化学的合成を用いて作製される。・・・核酸分子相同体は、当業者に公知の多数の方法を用いて作製されうる（例えば、Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989を参照）。」（３４頁２９行目〜３５頁７行目）
　
（１−ｃ）「本発明のさらにもう一つの態様は、スラウストキトリド微生物由来の高度不飽和脂肪酸(PUFA)ポリケチドシンターゼ(PKS)系の少なくとも1つの生物活性を有するドメインまたはその生物活性を有する断片をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子に関する。上記で考察されているように、本発明者らは、PUFA PKS系を有する非細菌の微生物を同定するための方法を用いて、PUFA PKS系を含んでいるスラウストキトリアレスの追加のメンバーを同定することに成功した。3つのそのような微生物の同定は、実施例2に記載されている。具体的に言うと、本発明者らは、本発明のスクリーニング方法を用いて、PUFA PKS系を含むことが高度に予想されるスラウストキトリウム種(Thraustochytrium sp.)23B(ATCC20892)を同定し、続いて、本明細書に開示されるシゾキトリウムPUFA PKS遺伝子にハイブリダイズするスラウストキトリウム種23Bゲノムにおける配列を検出した。シゾキトリウム・リマシウム(Schizochytrium limacium)(IFO32693)およびウルケニア(Ulkenia)(BP-5601)もまた、PUFA PKS系を含んでいる有力な候補として同定された。これらのデータおよびヤブレツボカビ目のメンバー間の類似性に基づき、多くの他のスラウストキトリアレスPUFA PKS系が、本発明により提供される方法および道具を用いて現在容易に同定されうると考えられる。それゆえ、スラウストキトリアレスPUFA PKS系および部分および/またはそれらの相同体(例えば、タンパク質、ドメインおよびそれらの断片)、そのような系および部分および/またはそれらの相同体を含む遺伝的に改変された生物、ならびにそのような微生物およびPUFA PKS系を用いる方法が本発明に含まれる。」（５６頁１７行目〜５７頁４行目）
　
（１−ｄ）「実施例1
  下記実施例は、
シゾキトリウム由来のPKS関連配列
  本発明者らは、国際公開公報第0042195号および米国特許出願第09/231,899号からの、実施例8および9において概説された一般的方法を使用し、シゾキトリウムPUFA PKS系において、3個のオープンリーディングフレーム(Orf)の全長を全て含む、ゲノムDNAを配列決定した。シゾキトリウムPKSタンパク質の生物活性ドメインは、図1に図示した。シゾキトリウムのPUFA PKS系のドメイン構造は、以下により詳細に説明する。
オープンリーディングフレームA(OrfA):
  OrfAの完全なヌクレオチド配列は、本明細書において配列番号：1として示される。
OrfAは、
本明細書においては配列番号：2として示されている2910個のアミノ酸配列をコードしている。
  (a)1個のβ-ケトアシル-ACPシンターゼ(KS)ドメイン；
  (b)1個のマロニル-CoA:ACPアシルトランスフェラーゼ(MAT)ドメイン；
  (c)9個のアシルキャリヤータンパク質(ACP)ドメイン；
  (d)1個のケトレダクターゼ(KR)ドメイン」（８５頁１３〜３０行目）
　
（１−ｅ）「実施例2
  
下記実施例は、本発明のPUFA PKS系を含む3種の他の非細菌の生物を同定するための、本発明のスクリーニング法の使用を説明している。
  
スラウストキトリウム種23B(ATCC 20892)は、
本明細書において詳細に説明するスクリーニング法により、培養された。
　PUFA生成PKS系を含む微生物を検出するために開発された生物学的に合理性のあるスクリーニング(振盪フラスコ培養を用いる)を、下記に説明する：
  試験される菌株／微生物の2mLの培養物を、培養培地50mLと共に、250mLのバッフル付き振盪フラスコに入れ(好気的処理)、別の同じ菌株の培養物2mLを、培養培地200mLと共に、250mLのバッフル無し振盪フラスコに入れた(嫌気的条件)。両方のフラスコを、200rpmの振盪台上に配置する。培養時間48〜72時間後、これらの培養物を、遠心により収集し、かつ細胞を、ガスクロマトグラフィーにより、脂肪酸メチルエステルについて分析し、各培養物について下記のデータを測定した：(1)脂肪酸プロファイル；(2)PUFA含量；(3)脂肪含量(総脂肪酸量として算出(TEA))。
  
次にこれらのデータを、下記の5つの質問について分析する：
選択基準：低O2／嫌気性フラスコ、対、好気性フラスコ(はい／いいえ)
(1)DHA(または他のPUFA含量)(％FAMEとして)は、低酸素培養において、好気性培養と比べ、ほぼ同じであるか、または好ましくは増加したか？
(2)嫌気性培養において、C14:0＋C16:0＋C16:1は、約40％TFAより大きいかどうか？
(3)嫌気性培養において、通常の酸素依存型エロンガーゼ／デサチュラーゼ経路への前駆体(C18:3n-3＋C18:2n-6＋C18:3n-6)は、非常にわずかに(FAMEとして＞1％)存在するか、または存在しないか？
(4)脂肪含量(総脂肪酸量／細胞乾燥質量として)は、低酸素培養において、好気性培養と比べ、増加したか？
(5)DHA(または他のPUFA含量)は細胞乾燥質量％として、低酸素培養において、好気性培養と比べ、増加したか？
  
最初の3つの質問の答えが「はい」であるならば、その菌株が、長鎖PUFAの生成のためのPKS遺伝子系を含むことの良好な指標が存在する。
　
（１−ｆ）「スラウストキトリウム23Bに関するスクリーニング結果は下記のようであった：
  ％FAMEとしてのDHAは増大したか？  はい(38-44％)
  C14:0＋C16:0＋C16:1は、約40％TFAよりも大きいか？  はい(44％)
  C18:3(n-3)またはC18:3(n-6)は存在しないか？  はい(0％)
  脂肪含量は増加したか？  はい(2倍増加)
  DHA(または他のHUFA含量)は増加したか？  はい(2.3倍増加)
  これらの結果、特に低酸素条件下でのDHA含量(％FAMEとしての)の有意な増加は、このスラウストキトリウム株におけるPUFA生成PKS系の存在を強力に示している。
  PUFA PKS系の存在を確認する追加のデータを提供するために、スラウストキトリウム23Bのサザンブロットを、PUFA生成PKS系(すなわち、前記配列番号：1〜32)を有することが既に決定されているシゾキトリウム株20888由来のPKSプローブを用いて行った。PKS PUFA合成遺伝子からのハイブリダイゼーションプローブと相同であるスラウストキトリウム23BゲノムDNAの断片は、サザンブロット技術を用いて検出した。スラウストキトリウム23BゲノムDNAは、ClaIまたはKpnI制限エンドヌクレアーゼのいずれかにより消化し、アガロースゲル電気泳動(0.7％アガロース、標準のTris-酢酸-EDTA緩衝液中)により分離し、Schicicher  Schuell Nytran Supercharge膜に、キャピラリートランスファーによりブロティングした。2種のジゴキシゲンインで標識したハイブリダイゼーションプローブを用いた。即ち、ひとつはシゾキトリウムPKS OrfBのエノイルレダクターゼ(ER)領域(OrfBのヌクレオチド5012〜5511；配列番号：3)に特異的であり、他方はシゾキトリウムPKS OrfCの始まりの保存領域(OrfCのヌクレオチド76〜549；配列番号：5)に特異的である。
  OrfB-ERプローブは、スラウストキトリウム23BゲノムDNAにおける約13kb ClaI断片および約3.6kb KpnI断片を検出した。OrfCプローブは、スラウストキトリウム23BゲノムDNAにおける約7.5kb ClaI断片および約4.6kb KpnI断片を検出した。
  最後に、ベクターλFIX II(Stratagene社)に挿入されたスラウストキトリウム23BゲノムDNAのDNA断片からなる組換えゲノムライブラリーを、下記のシゾキトリウム20888 PUFA-PKS遺伝子のセグメントに相当する
ジゴキシゲニン標識プローブを用いて、スクリーニングした：OrfAのヌクレオチド7385〜7879(配列番号：1)、
プローブは、スラウストキトリウム23Bライブラリーから陽性プラークを検出し、これはシゾキトリウム PUFA-PKS遺伝子と、スラウストキトリウム23Bの遺伝子の間の強度の相同性を示している。
　
（１−ｇ）「
前述のスクリーニング法は、PUFA PKS系を含む他の可能性のある候補菌株の同定に使用される。本発明者らによりPUFA PKS系を有することが同定された2種の追加の菌株は、シゾキトリウム・リマシウム(SR21) Honda  Yokochi (IFO32693)およびウルケニア(BP-5601)である。
シゾキトリウム株およびウルケニア株の両方について、スラウストキトリウム23Bに関し先に考察した最初の3個のスクリーニング質問の回答は、「はい」(シゾキトリウム-DHA(％FAME) 32-41％ 好気性対嫌気性、58％ 14:0/16:0/16:1、0％ 前駆体)および(ウルケニア-DHA(％FAME) 28-44％ 好気性対嫌気性、63％ 14:0/16:0/16:1、0％ 前駆体)であり、これは、これらの株はPUFA PKS系を含むことの良好な候補であることを示している。
これらのスラウストキトリド微生物も、前記態様における使用のための遺伝子の追加供給源として、本明細書において主張されている。
　
　摘記事項（１−ａ）及び（１−ｄ）の下線部分を整理すると、引用例１には、次の発明が記載されていると認められる（以下、「引用発明」という。）。
　
「配列番号２（ＯｒｆＡ）において表されるアミノ酸配列を有することを特徴とするシゾキトリウム由来のＰＵＦＡ−ＰＫＳ。」
　
　
第３　対比
　
　本願発明はａ、ｂおよびｃの選択肢からなり、ａはさらに「配列番号６（ＯＲＦ１）において表されるアミノ酸配列」と「この配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、ＰＵＦＡ−ＰＫＳの生物活性を有するアミノ酸配列」の選択肢を有するから、ａの後者に相当する発明である、「配列番号６（ＯＲＦ１）において表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、ＰＵＦＡ−ＰＫＳの生物活性を有するアミノ酸配列を有することを特徴とするＰＵＦＡ−ＰＫＳ。」と引用発明を対比する。
　そうすると両者は、「１つのＯＲＦのアミノ酸配列を有することを特徴とするＰＵＦＡ−ＰＫＳ。」である点で一致し、以下の点で相違する。
　
相違点：ＰＵＦＡ−ＰＫＳが、本願発明は、配列番号６（ＯＲＦ１）において表されるアミノ酸配列を有するウルケニア由来のものであるのに対して、引用発明は、配列番号２（ＯｒｆＡ）において表されるアミノ酸配列を有するシゾキトリウム由来のものである点。
　
　
第４　判断
　
　上記相違点について検討する。
　引用例１の摘記事項（１−ｃ）には、PUFA PKS系を含んでいるスラウストキトリアレスの追加のメンバーとして、PUFA PKS系を含むことが高度に予想されるスラウストキトリウム種23B(ATCC20892)を同定し、さらにシゾキトリウム・リマシウム(IFO32693)およびウルケニア(BP-5601)を、PUFA PKS系を含んでいる有力な候補として同定したことが記載されている。
　具体的には、まずスラウストキトリウム種23B(ATCC20892)に関して、既に取得しているシゾキトリウム20888 PUFA-PKS遺伝子のセグメントに相当する、OrfAのヌクレオチド（配列番号：1）における7385〜7879の配列を含むジゴキシゲニン標識プローブを用いてスクリーニングを行った結果、当該プローブはスラウストキトリウム23Bライブラリーから陽性プラークを検出したことが記載されており、このことはシゾキトリウム PUFA-PKS遺伝子と、スラウストキトリウム23Bの遺伝子の間の強度の相同性を示していると記載されている（摘記事項（１−ｅ）〜（１−ｆ））。さらに、上記スクリーニング法が、PUFA PKS系を含む他の候補菌株の同定に使用され、その結果としてシゾキトリウム・リマシウム(SR21)(IFO32693)およびウルケニア(BP-5601)が同定されたことが記載されており、これらのスラウストキトリド微生物もPUFA PKS系における使用のための遺伝子の追加供給源であることも記載されている（引用例１の摘記事項（１−ｇ））。
　
　引用例１の上記記載より、スラウストキトリウム23Bのみならずウルケニア(BP-5601)についても、シゾキトリウム PUFA-PKS遺伝子との間の強度の相同性を示していることは当然に予測できることであるといえ、ウルケニア(BP-5601)、さらには他の既知のウルケニアについても、それらに由来するPUFA-PKS遺伝子を追加的に得ようとする動機付けは十分に存在したといえる。
　そして、引用例１の摘記事項（１−ｂ）にも記載されているように、組換えDNA技術により目的の遺伝子をＰＣＲ増幅及びクローニングしてその配列を決定することは本願優先日前当業者の周知技術であるから、引用例１に記載のウルケニア(BP-5601)又は他の既知のウルケニアについてゲノムＤＮＡを調製し、引用例１に記載のシゾキトリウム由来のＰＵＦＡ−ＰＫＳをコードする配列番号１のＤＮＡ配列を元にプライマーを作製して、調製したゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った後、その増幅産物を切り出してベクターに組み込むことで、引用発明のシゾキトリウム由来の配列番号２（ＯｒｆＡ）に対応するウルケニア由来のＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子をクローニングすること、さらにクローニングされた遺伝子のＤＮＡ配列、並びに当該ＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を決定することは当業者であれば容易になし得るものである。そして、引用発明に配列番号２（ＯｒｆＡ）として記載されている、異種であるシゾキトリウム由来のＰＵＦＡ−ＰＫＳのアミノ酸配列でさえ、本願発明のウルケニア由来の配列番号６（ＯＲＦ１）のアミノ酸配列と８１％という高い配列同一性を有するのであるから、同じウルケニアに由来するＰＵＦＡ−ＰＫＳであれば、そのアミノ酸配列が本願発明の配列番号６（ＯＲＦ１）のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する蓋然性は高いものと認められる。
　
　なお、特表２０００−５１３５７５号公報に「ドコサヘキサエン酸およびドコサペンタエン酸含有油脂を生産する能力を有する
ウルケニア属SAM2179
BP-5601
　
　また、本願発明の効果について、本願の発明の詳細な説明にはウルケニアに由来するＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子のゲノム上の位置や当該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列が記載されているのみであって、当該アミノ酸配列を有するタンパク質を用いることでＰＵＦＡが高い収率で得られるといった効果を確認することもできない。
　
　審判請求人は平成２６年　９月１１日付け回答書において、実際には、ウルケニアに特異的なプライマー（ＰＳＦ２：配列番号８３及びＰＳＲ２：配列番号８４）を用いたＰＣＲスクリーニングで得られた配列番号１を得てもＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子の全容を解析することはできなかったこと、種々のプライマーの選択を行うという試行錯誤を経て到達したＣＦＯＲ１（配列番号：８５）及びＣＲＥＶ（配列番号：８６）をＰＣＲ用として転用するという工夫を行うことでＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子の全容が明らかとされたことを主張している。
　しかしながら、上記主張はＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子を構成するＯＲＦ１〜３の全容を明らかにすることの困難性を述べているに過ぎず、本願の特許請求の範囲はそのうちの１つであるＯＲＦ１に関する部分のみであるから、特許請求の範囲に基づいた主張とは認められないので採用することができない。
　
　したがって、本願発明は、引用例１に記載された発明及び本願優先日当時における周知技術に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものである。
　
　
第５　結び　
　
　以上のとおりであるから、本願請求項１に係る発明は、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであるから、他の請求項に係る発明について検討するまでもなく、本願は拒絶すべきものである。　
　
　よって、結論のとおり審決する。