(57)【要約】      （修正有）【課題】ＤＮＡを固定してＤＮＡライブラリーとして用いるための基体の提供、さらに、ＤＮＡ増幅反応によりＤＮＡを複製するために使用するのに最適な基体の提供。【解決手段】非晶質炭素、無定形炭素、グラファイトからなる構成要素のうち、１つ又は複数からなる基体表面にＤＮＡを固定化する。また、基体体表面に水酸基を結合させるか、または末端にカルボキシル基を有する、炭化水素基とカルボキシル基が結合してなる基を、エステル結合またはペプチド結合をを介して、基体表面に結合させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非晶質炭素、無定形炭素、グラファイトからなる構成要素のうち、１つ又は複数からなるＤＮＡを固定化するための基体。
【請求項２】
末端に極性基、水酸基又はカルボキシル基を有する化学修飾された請求項１記載の基体。
【請求項３】
前記カルボキシル基が、エステル結合を介して基体表面に結合している請求項２記載の基体。
【請求項４】
前記カルボキシル基が、ペプチド結合を介して基体表面に結合している請求項２記載の基体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡを固定化するための基体に関し、より詳しくは、化学修飾された基体に関し、さらに詳しくは、末端に水酸基、カルボキシル基等を有する化学修飾された基体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＤＮＡの増幅反応等においては、目的とするＤＮＡを特定量得るために、
１）二本鎖ＤＮＡの水素結合をほどくために試料の温度を９５℃に上昇させる、
２）次いでＤＮＡを複製するためのプライマーと再結合させるために試料の温度を４５℃に下降させる、
３）さらに耐熱性ポリメラーゼによりプライマーを伸長させてＤＮＡを複製させるために試料の温度を７４℃に上昇させる、
といった１）〜３）のヒートサイクルを幾度も繰り返す必要があった。
このようなＤＮＡの増幅反応では、試料を合成樹脂の容器などに入れ、この容器をアルミニウムブロックに収容し前記ヒートサイクルを行っていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、前記ヒートサイクルは多大な時間がかかり、目的とする量のＤＮＡを得るには数時間を要していた。また、温度制御の精度が低いために、目的とする以外のＤＮＡも複製されるという問題点もあった。
本発明は、このような問題点に鑑み、ＤＮＡを容易に固定化できて、ＤＮＡ増幅反応によりＤＮＡを複製するために最適な基体を提供することを技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の基体は、ＤＮＡを固定化するための基体であり、非晶質炭素、無定形炭素、グラファイトからなる構成要素のうち、１つ又は複数からなることを特徴とする。
上記基体は、末端に極性基、水酸基又はカルボキシル基を有する化学修飾されていることが望ましい。また、前記カルボキシル基が、エステル結合を介して基体表面に結合していることも望ましく、前記カルボキシル基が、ペプチド結合を介して基体表面に結合していることも望ましい。
【発明の効果】
【０００５】
本発明のＤＮＡを固定化するための基体は、非晶質炭素、無定形炭素、グラファイト等の炭素物質からなり、炭素が表層に存在するので、表面を水酸基やカルボキシル基等で化学修飾しやすく、ＤＮＡの固定化を容易に行え、ＤＮＡ増幅反応によりＤＮＡを複製するためのチップなどに最適である。また、本発明の基体は、表面が汚染された場合に、加水分解させて化学修飾を再生させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明に用いる基体は、非晶質炭素、無定形炭素、グラファイト等の炭素物質を構成要素とし、これらの形成方法は適宜選択できるが、好適には、マイクロ波プラズマＣＶＤ法、ＥＣＲＣＶＤ法、高周波プラズマＣＶＤ法、ＩＰＣ法、直流スパッタリング法、ＥＣＲスパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ蒸着法、抵抗加熱蒸着法などである。また、たとえば、ポリイミド系材料からなるレジスト膜を蒸し焼きにして得られる水素を含有した非晶質炭素であってもよい。さらに、グラファイト粉末を樹脂を混合してスラリー状にして焼き固めたもの等でもよい。本発明では、上記の構成要素を１つ又は複数を組み合わせたものでもよい。
【０００７】
また、本発明の基体表面は、意図的に粗面にされていることも望ましい。このような粗面表面は表面積が増えて多量のＤＮＡを固定化させることができるからである。また、基体の形状は、平板状、球状、多角形状など特に問わない。さらにこれらの基体と他の物質との合成体であってもよい。本発明の基体が表層に存在すればよい。
【０００８】
次に、上記の基体の表面に特定の基を付加（化学修飾）させる。この化学修飾によって、ＤＮＡが基体の表面に固定化されやすくなる。基体表面に付加（化学修飾）され、末端に極性基を有する特定の基としては、水酸基、カルボキシル基、硫酸基、シアノ基、ニトロ基、チオル基、アミノ基などの基が該当する。また、この他、有機カルボン酸も含まれる。
また、カルボキシル基は、基体との間に他の炭化水素基を介し、末端にカルボキシル基を有する基としてもよい。ここで、炭化水素基は炭素数０〜１０のものが、ＤＮＡの固定化にあたって好ましい。炭化水素基となりうるような酸は、蟻酸、酢酸、プロピオン酸などのモノカルボン酸や、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸などのジカルボン酸や、トリメリット酸などの多価カルボン酸などがあげられる。
【０００９】
ＤＮＡ増幅反応に本発明の基体を適用する場合、耐加水分解性が必要とされる場合と、加水分解させて化学修飾を再生させる必要がある場合との２通りの適用ケースがある。
耐加水分解性が必要とされる場合は、耐アルカリ性を付与するために、上記の炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基を、ペプチド結合を介して基体表面に結合させることが好ましい。
【００１０】
一方、生成した化学修飾を加水分解させて除去し再生させる必要がある場合は、アルカリ溶液で加水分解可能とするために、上記の炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基を、エステル結合を介して基体表面に結合させることが好ましい。
【００１１】
炭化水素基の末端に水酸基を基体表面に結合させる方法としては、基体表面を酸素プラズマで酸化し、次いで水蒸気処理する方法、または塩素ガス中で紫外線照射して基体表面を塩素化した後アルカリ溶液中で加水分解してヒドロキシル化する方法、さらに基体表面を酸素プラズマで酸化し、次いで塩素化した後アルカリ溶液中で加水分解してヒドロキシル化する方法を挙げることができる。
【００１２】
また、炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基をペプチド結合を介して基体表面に結合させる方法としては、塩素ガス中で紫外線照射して基体表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化した後、非水溶媒中でカルボン酸クロライドと反応させ、次いで弱アルカリ溶液中で中和させる方法を挙げることができる。
【００１３】
また、炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基をエステル結合を介して基体表面に結合させる方法としては、塩素ガス中で紫外線照射して基体表面を塩素化し、次いで非水溶媒中でカルボン酸ソーダと反応させ、次いで弱酸溶液中で中和させる方法、または、基体表面を酸素プラズマで酸化し、次いで塩素化した後アルカリ溶液中で加水分解してヒドロキシル化した後、非水溶媒中でカルボン酸クロライドと反応させ、次いで弱アルカリ溶液中で中和させる方法を挙げることができる。
【実施例】
【００１４】
以下、実施例にて本発明を詳細に説明する。
（実施例１）
マイクロ波プラズマＣＶＤ法を用いて、直径が６４ｍｍ、厚さが０．１ｍｍの表面粗さがＲａで０．５ｍｍの非ダイヤモンド炭素を含有したダイヤモンド円板を気相合成した。この円板を、１０ｍｍ×１０ｍｍの面積において、ラマン分光分析法により分析した結果、ダイヤモンド炭素（完全ダイヤモンド）と非ダイヤモンド炭素（不完全ダイヤモンド）とのピーク比を調査したところ、非ダイヤモンド炭素の存在が確認できた。この非ダイヤモンド炭素を含む円板からレーザーにより１０ｍｍ角の試料を切り出した。
実施例１においては、マイクロ波により励起した酸素プラズマで試料表面を酸化した後、セパラブルフラスコ中に配置し、フラスコ中の雰囲気を水蒸気で置換した後、水蒸気を流入させながら４００℃に加熱し３０分間保持した後放冷した。次いで試料を取り出し乾燥し、末端に水酸基を有する基体を得た。
また、ＳＩＭＳにより、試料切り出し後、酸素プラズマ処理後、および水蒸気処理後の水素及び水酸基のピーク強度を測定したところ、水素のピーク強度を１とした場合の、水酸基のピーク強度比は下記の表１に示す値となった。
【００１５】
表１
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
水酸基のピーク強度比
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
試料切り出し後        ０．１１
酸素プラズマ処理後    ０．６１
水蒸気処理後          １．０９
上記に示すように、水酸基のピーク強度比は、酸素プラズマ処理、それに続く水蒸気処理により増加しており、基体表面が水酸基により化学修飾されていることが確認された。
【００１６】
（実施例２）
マイクロ波プラズマＣＶＤ法を用いて、直径が６４ｍｍ、厚さが０．１ｍｍの表面粗さがＲａで０．３ｍｍの非ダイヤモンド炭素を含むダイヤモンド円板を気相合成した。この円板を、１０ｍｍ×１０ｍｍの面積において、ラマン分光分析法により分析した結果、全部が非ダイヤモンド炭素（不完全ダイヤモンド）であった。この円板をレーザーにより１０ｍｍ角の試料を切り出した。
この試料をセパラブルフラスコ中に配置し、フラスコ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した後、塩素ガスを１ＳＣＣＭの流量で流入させながらＨｇ−Ｘｅランプを用い、主波長が３６００オングストロームの紫外線を６０分間照射して試料表面を塩素化した。雰囲気をアルゴンガスで置換した後試料を取り出し、１０重量％の水酸化ナトリウム水溶液中で１５分間煮沸し、さらに水洗した後乾燥し、末端に水酸基を有する基体を得た。
また、ＳＩＭＳにより、塩素化の前後および水酸化ナトリウム処理後の、水素、水酸基および塩素基のピーク強度を測定したところ、水素のピーク強度を１とした場合の、水酸基、塩素基のピーク強度比は下記表２に示す値となった。
【００１７】
表２
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ピーク強度比
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
水酸基        塩素基
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
塩素化前                  ０．１１        −
塩素化後                  ０．１７      ０．４７
水酸化ナトリウム処理後    ０．４５      ０．３１
上記に示すように、水酸基のピーク強度比は、塩素化処理、それに続く水酸化ナトリウム処理により増加しており、基体表面が水酸基により化学修飾されていることが確認された。また、塩素基が減少していることから水酸基により置換されたことが確認された。
【００１８】
（実施例３）
マイクロ波プラズマＣＶＤ法を用いて、直径が６４ｍｍ、厚さが０．１ｍｍの表面粗さがＲａで０．５ｍｍの完全及び不完全ダイヤモンドが混在したダイヤモンド円板を気相合成した。この円板を、１０ｍｍ×１０ｍｍの面積において、ラマン分光分析法により分析した結果、ダイヤモンド炭素と非ダイヤモンド炭素（不完全ダイヤモンド）とのピーク比を調査したところ、非ダイヤモンド炭素の存在が確認できた。この非ダイヤモンド炭素を含むダイヤモンド円板からレーザーにより１０ｍｍ角の試料を切り出し、マイクロ波により励起した酸素プラズマで表面を酸化した後、試料表面を塩素化した。雰囲気をアルゴンガスで置換した後試料を取り出し、１０重量％の水酸化ナトリウム水溶液中で１５分間煮沸し、さらに水洗した後乾燥し、末端に水酸基を有する基体を得た。
また、ＳＩＭＳにより、表面研磨後、酸素プラズマ処理後、塩素化後、および水酸化ナトリウム処理後の水素、水酸基、塩素基のピーク強度を測定したところ、水素のピーク強度を１とした場合の、水酸基、塩素基のピーク強度比は、下記表３に示す値となった。
【００１９】
表３
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ピーク強度比
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
水酸基        塩素基
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
酸素プラズマ処理前        ０．１１        −
酸素プラズマ処理後        ０．６７        −
塩素化後                  ０．１９      ０．４４
水酸化ナトリウム処理後    ０．５０      ０．３０
上記に示すように、水酸基のピーク強度比は、酸素プラズマ処理、それに続く塩素化、さらにそれに続く水酸化ナトリウム処理により増加しており、基体表面が水酸基により化学修飾されていることが確認された。また、塩素基が減少していることから水酸基により置換されたことが確認された。
【００２０】
（実施例４）
スパッタ法によりグラファイト円板を形成し、この円板をレーザーにより１０ｍｍ角の試料を切り出し、セパラブルフラスコ中に配置し、フラスコ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した後、塩素ガスを１ＳＣＣＭの流量で流入させながらＨｇ−Ｘｅランプを用い、主波長が３６００オングストロームの紫外線を６０分間照射して試料表面を塩素化した。再びフラスコ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した後、１重量％のセバシン酸ソーダのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液１００ｍｌを添加し、セパラブルフラスコにコンデンサを設置し、２時間還流した。次いで試料を取り出し、１重量％の酢酸水溶液で洗浄し、さらにアセトンで洗浄した後乾燥し、セバシン酸がエステル結合を介して結合した、末端にカルボキシル基を有する基体を得た。
また、ＳＩＭＳにより、塩素化の前後、およびセバシン酸ソーダ処理後の水素、水酸基、塩素基のピーク強度を測定したところ、水素のピーク強度を１とした場合の、水酸基、塩素基のピーク強度比は、下記表４に示す値となった。
【００２１】
表４
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ピーク強度比
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
水酸基        塩素基
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
塩素化前                  ０．１１        −
塩素化後                  ０．１７      ０．４７
セバシン酸ソーダ処理後    ０．３５      ０．３１
上記に示すように、水酸基のピーク強度比は、塩素化、さらにそれに続くセバシン酸ソーダ処理により増加していること、またＦＴＩＲ法を用いてで試料表面の炭素−水素の伸縮振動に由来する吸収強度、および炭素−酸素の伸縮振動に由来する吸収強度を測定したところ、いずれの吸収強度も増大していた（試料の表面ブランクに対する吸収強度の増大率は約３０％であった）。このことから、基体表面がセバシン酸の炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基により化学修飾されていることが確認された。また、塩素基が減少していることから水酸基により置換されたことが確認された。
【００２２】
（実施例５）
ポリイミド系材料からなるレジスト膜を蒸し焼きにして水素を含有する非晶質炭素からなる薄板を形成した。この薄板をレーザーにより１０ｍｍ角の試料を切り出し、マイクロ波により励起した酸素プラズマで表面を酸化した後、試料表面を塩素化した。雰囲気をアルゴンガスで置換した後試料を取り出し、１０重量％の水酸化カリウム水溶液中で１５分間煮沸して試料表面をヒドロキシル基で置換した。乾燥した後、上部に塩化カルシウム乾燥管を備えたコンデンサを設置したセパラブルフラスコ中に試料を配置し、クロロホルム５０ｍｌとトリエチルアミン１ｇを添加し、フラスコ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した。次いで、セパラブルフラスコを氷冷しながら、クロロホルム５０ｍｌに塩化スクシニル１０ｇを溶解させた溶液を徐々に添加した。その後４時間還流した後試料を取り出し、１０重量％の炭酸カリウム水溶液で洗浄し、さらにアセトンで洗浄した後乾燥し、マロン酸がエステル結合を介して結合した、末端にカルボキシル基を有する基体を得た。
また、ＳＩＭＳにより、酸素プラズマ処理の前後、塩素化後、ヒドロキシル化後、および塩化スクシニル処理後の水素、水酸基のピーク強度を測定したところ、水素のピーク強度を１とした場合の水酸基のピーク強度比は、下記表５に示す値となった。
【００２３】
表５
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
水酸基のピーク強度比
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
酸素プラズマ処理前        ０．１１
酸素プラズマ処理後        ０．６６
塩素化後                  ０．１９
ヒドロキシル化後          ０．６５
塩化スクシニル処理後      ０．４６
上記に示すように、水酸基のピーク強度比は、酸素プラズマ処理、それに続く塩素化、さらにそれに続くヒドロキル化、さらにそれに続く塩化スクシニル処理により増加していること、またＦＴＩＲ法を用いて試料表面の炭素−水素の伸縮振動に由来する吸収強度、および炭素−酸素の伸縮振動に由来する吸収強度を測定したところ、いずれの吸収強度も増大していた（試料の表面ブランクに対する吸収強度の増大率は約２５％であった）。このことから、基体表面がマロン酸の炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基により化学修飾されていることが確認された。
【００２４】
（実施例６）
グラファイト粉末に樹脂粉末を混合し溶剤を加えてスラリー状にし、溶剤を気化させて、直径が６４ｍｍ、厚さが０．１ｍｍの表面粗さがＲａで０．３ｍｍのグラファイト円板を気相合成した。この円板を、１０ｍｍ×１０ｍｍの面積において、ラマン分光分析法により分析した結果、全部が非ダイヤモンド炭素（非晶質ダイヤモンド）であった。この円板をレーザーにより１０ｍｍ角の試料を切り出した。この試料をマイクロ波により励起した水素プラズマで表面を水素化した後試料表面を塩素化した。試料が配置されたセパラブルフラスコ中の雰囲気をアルゴンガスで置換した後、アンモニアガスを１ＳＣＣＭの流量で流入させながらＨｇ−Ｘｅランプを用い、主波長が３６００オングストロームの紫外線を６０分間照射して試料表面をアミノ化した。雰囲気をアルゴンガスで置換した後、セパラブルフラスコ上部に塩化カルシウム乾燥管をそなえたコンデンサを設置し、クロロホルム５０ｍｌを添加し、再び雰囲気をアルゴンガスで置換した。
【００２５】
次いで、セパラブルフラスコを氷冷しながら、クロロホルム５０ｍｌに塩化スクシニル１０ｇを溶解させた溶液を徐々に添加した。その後４時間還流した後試料を取り出し、１０重量％の炭酸カリウム水溶液で洗浄し、さらにアセトンで洗浄した後乾燥し、マロン酸がペプチド結合を介して結合した、末端にカルボキシル基を有する基体を得た。
また、ＳＩＭＳにより、塩素化の前後、アミノ化後、および塩化スクシニル処理後の水素、水酸基、塩素基のピーク強度を測定したところ、水素のピーク強度を１とした場合の水酸基、塩素基のピーク強度比は、下記表６に示す値となった。
【００２６】
表６
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
ピーク強度比
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
水酸基        塩素基
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
塩素化前                  ０．１１        −
塩素化後                  ０．１９      ０．４５
アミノ化後                ０．１６      ０．１０
塩化スクシニル処理後      ０．５５      ０．１０
上記に示すように、水酸基のピーク強度比は、水素プラズマ処理、それに続く塩素化、さらにそれに続くヒドロキル化、さらにそれに続く塩化スクシニル処理により増加していること、またＦＴＩＲ法を用いて試料表面の炭素−水素の伸縮振動に由来する吸収強度、および炭素−酸素の伸縮振動に由来する吸収強度を測定したところ、いずれの吸収強度も増大していた（試料の表面ブランクに対する吸収強度の増大率は約２５％であった）。
このことから、基体表面がマロン酸の炭化水素基の末端にカルボキシル基が結合した基により化学修飾されていることが確認された。
実施例１〜６のようにして得られた末端にカルボキシル基を有する化学修飾された基体を用いてＤＮＡの増幅反応を実施したところ、約１時間で目的とする量のＤＮＡを得ることができた。
【００２７】
さらに本発明の化学修飾された基体を用い、末端水酸基または末端カルボキシル基に、水素結合でオリゴ核酸の末端塩基を固定化し、さらに、このオリゴ核酸と相補的塩基配列を有するＤＮＡを固定して、ＤＮＡライブラリチップとして用いることもできる。また、ＤＮＡのかわりに、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡフラグメント等を、ダイヤモンド表面に固定化して、ライブラリーとすることもできる。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明の基体は、炭素素材を用いたことにより、基体上にＤＮＡを固定化しやすく、たとえばＤＮＡ増幅反応操作の作業をきわめて容易にできる。
また、本発明の基体は、表面を水酸基やカルボキシル基等で化学修飾してあるので、ＤＮＡの固定化の安定化を図れ、ＤＮＡ増幅反応によりＤＮＡを複製するためのチップなどに最適である。
また、本発明の基体は、表面が汚染された場合に、加水分解させて化学修飾を再生させることができ、高価なＤＮＡチップを節約できる。