(57)【要約】【課題】重力に応答して生長する生物試料を継続的に観察し得る観察方法を提供する。【解決手段】重力に応答する生物試料４０を、その光軸が重力方向に垂直になるように配置された顕微鏡対物レンズ１２を介して観察する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
重力に応答する生物試料を、その光軸が重力方向に垂直になるように配置された顕微鏡対物レンズを介して観察する観察方法。
【請求項２】
前記生物試料に対して明視野照明をおこなって明視野像を取得する請求項１に記載の観察方法。
【請求項３】
重力の影響を受けて発現する遺伝子に対するレポーターである発光遺伝子の発光像を取得する請求項２に記載の観察方法。
【請求項４】
さらに前記明視野像と前記発光像の合成処理をおこなう請求項３に記載の観察方法。
【請求項５】
重力の影響を受けて発現する遺伝子に対するレポーターである発光遺伝子の発光像を取得する請求項１に記載の観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重力に応答する生物試料の観察に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は、周囲の環境に応じて形態を変化させ、エネルギーの獲得方法や生殖スタイルを調整することが知られている。光や重力、周囲に存在する物質の濃度などが環境からの情報として認識され、様々な器官の細胞が異なる応答を示すことにより多細胞体の形態が形成される。環境に応答した形態形成のメカニズムを解明することは、生物学の基礎研究のみならず、医療や地球環境などの応用を考える上でも大きな課題である。そのためには、多細胞体の様々な細胞が外界からの情報をどのように認識し、多様な応答を示すのかを明らかにする必要がある。
【０００３】
以前より、顕微鏡を用いた形態観察は多細胞体に存在する様々な細胞の特徴を明らかにしてきた。近年、顕微鏡や分子プローブの技術進化によって、細胞内部の刺激受容や多様な応答の過程が経時的に観察されつつある。植物の観察においては、光刺激による光受容体の核内移行過程や薬剤処理による遺伝子発現の変化過程などが可視化されている。一般的な顕微鏡観察は、水平方向に配置された試料を鉛直方向に配置された対物レンズを通して観察するという方式でおこなわれている。そのため、生きたサンプルの経時観察をおこなう時には、観察対象のピント位置がずれない方法で観察するかずれたピントの位置を観察するたびに移動させる必要がある。この方法では、植物などのように形態形成の過程が重力の影響を大きく受けるような試料の経時観察は困難である。以上のような背景から重力の影響を受けて生長する生物試料の形態形成の過程を顕微鏡で経時観察する方法の開発が期待されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これまでの顕微鏡観察では、試料が水平方向、対物レンズが鉛直方向に配置されている。そのため、正立型顕微鏡の場合は試料の上方向から、倒立型顕微鏡の場合は試料の下方向から観察することになる。また、試料の側面を観察したい場合は、試料を９０度回転させて観察することになる。この場合、生物試料が生きたものではなく固定されたものであれば、試料を設置する際に重力の作用する方向を考慮する必要はない。しかし、重力の影響を受けて生長する植物を観察するような場合は、試料の配置が制限されてしまう。例えば、植物の芽と根はそれぞれ負および正の重力方向に伸長し、試料台上で水平方向には伸長しないので、重力方向に伸長した芽や根に対して、対物レンズを垂直方向からアプローチすることが困難である。そのため、重力に応答して生長する生物試料をその状態を変えることなく継続的に観察することはできない。
【０００５】
本発明は、このような実状を考慮して成されたものであり、その目的は、重力に応答して生長する生物試料を継続的に観察し得る観察方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明による観察方法は、重力に応答する生物試料を、その光軸が重力方向に垂直になるように配置された顕微鏡対物レンズを介して観察する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、重力に応答して生長する生物試料を継続的に観察し得る観察方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の実施形態の観察方法を実施するための観察装置を模式的に示している。
【図２】生物試料の一例である芽生えたばかりのシロイヌナズナを示している。
【図３】本発明の実施形態の観察方法によって取得されたシロイヌナズナの明視野画像と発光画像と重ね合わせ画像を示している。
【図４】図３に示した発光画像中の胚軸の中心部の発光シグナルの変化を示している。
【図５】生物試料に作用する重力方向を変化させた様子を示している。
【図６】重力の方向に向かってシロイヌナズナの根の伸長方向が徐々に変化していく様子を示している。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【００１０】
図１は、本実施形態の観察方法を実施するための観察装置を模式的に示している。観察装置は、生物試料４０の光学像を取得するための撮像光学系１０と、生物試料４０を明視野照明するための照明光学系２０と、撮像光学系１０で取得された画像を処理するための画像処理装置３０を有している。
【００１１】
撮像光学系１０は、その光軸が実質的に重力方向６２に垂直になるように配置された顕微鏡対物レンズ１２と、顕微鏡対物レンズ１２を介して入射する光を結像させる結像レンズ１４と、撮像装置たとえばＣＣＤカメラ１６を有している。撮像光学系１０は、（顕微鏡対物レンズ１２のＮＡの２乗）／（総合倍率の２乗）の値が０．０１以上である。
【００１２】
照明光学系２０は、照明光を発する光源２２と、照明光を導光する光ファイバー２４を有している。
【００１３】
生物試料４０は、重力に応答する試料である。たとえば、生物試料４０は、シロイヌナズナなどの植物やムラサキホコリカビなどの細胞性粘菌など、重力の影響を受けて応答・生長する生物である。または、重力の影響を受ける発生進行中の動物の胚などであってもよい。これらの生物において、重力に応答して発現する遺伝子を発光遺伝子たとえばルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして発光でモニターできる系統を作製する。
【００１４】
一例では、生物試料４０は、芽生えたばかりのシロイヌナズナであり、図２に示されるように、子葉４２と胚軸４４と根４６などの器官から構成されている。生物試料４０は、たとえば、図１に示されるように、シャーレ５２内に設けられた培地５４の上に配置される。シャーレ５２は、たとえば、重力方向６２への生長を保持した状態で生物試料４０を観察するために、生物試料４０の生長方向が鉛直方向になるように保持される。シャーレ５２はまた、重力の作用する方向を経時的に変えられるように、顕微鏡対物レンズ１２の光軸に平行な軸の周りに回転可能に保持されてもよい。
【００１５】
本実施形態の観察方法では、生物試料４０の観察は、水平方向から顕微鏡対物レンズ１２を介しておこなう。たとえば、生物試料４０の明視野像の取得と、重力に応答して発現する遺伝子に対するレポーターである発光遺伝子の発光像の取得をおこなう。発光遺伝子の発光は微弱であるため、撮影は、暗黒下の状態でおこなわなければならない。このため、撮像光学系１０と生物試料４０は暗箱７０で覆われる。
【００１６】
明視野像を取得する際は、照明光学系２０によって生物試料４０に対して明視野照明をおこなう。光源２２で生成された照明光は、光ファイバー２４を伝搬し、生物試料４０を側方から照明する。生物試料４０で反射された光は、顕微鏡対物レンズ１２によって集められ、結像レンズ１４によってＣＣＤカメラ１６の受光面に結像される。ＣＣＤカメラ１６は、受光面に結像された像（明視野像）に対応した画像データを生成して画像処理装置３０に送る。
【００１７】
発光像を取得する際は、照明光学系２０による照明をおこなうことなく、暗黒下の状態で撮影をおこなう。生物試料４０内の発光遺伝子で発せられた光は、顕微鏡対物レンズ１２によって集められ、結像レンズ１４によってＣＣＤカメラ１６の受光面に結像される。ＣＣＤカメラ１６は、受光面に結像された像（発光像）に対応した画像データを生成して画像処理装置３０に送る。
【００１８】
画像処理装置３０は、ＣＣＤカメラ１６から受け取った画像データを記憶しておき、必要に応じて明視野像と発光像を表示する、または明視野像と発光像の画像データを出力する。また画像処理装置３０は明視野像と発光像の合成処理をおこなう。たとえば画像処理装置３０は明視野像と発光像を重ね合わせた画像を形成する。画像処理装置３０は、合成処理した画像を記憶または表示または出力する。
【００１９】
このような観察方法によって、重力に応答して生長する生物試料を経時的に観察し得る。また、生物試料に対する重力の影響を画像情報として取得し得る。これにより、また、さらに明視野像と発光像の合成処理をおこなうことにより、これまでと比較して、生物試料に対する重力の影響の評価を容易に精度良くおこなうことが可能になる。
【００２０】
以下に本実施形態の観察方法を用いて発光遺伝子を持つ遺伝子組換えシロイヌナズナを観察した実施例を示す。
【実施例１】
【００２１】
（重力刺激の方向に依存した生長の経時観察）
本実施例では、シロイヌナズナの芽生えにおいて胚軸が重力とは逆向きに生長している様子を側方から発光観察と明視野観察を組み合わせて経時観察した例を示す。
【００２２】
（材料と方法）
観察に用いた発光遺伝子を持つ遺伝子組換えシロイヌナズナＮ９８０８系統はノッティンガムシードストックセンターから購入した。Ｎ９８０８系統は、ＣＣＲ２遺伝子の上流領域にルシフェラーゼ遺伝子を連結させたカセットを導入した系統である（Ｄｏｙｌｅら、（２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ４１９、７４−７７頁）。
【００２３】
シロイヌナズナの種子を滅菌した後に寒天培地上で４日間栽培し、発光観察と明視野観察を組み合わせて経時観察をおこなった。種子の滅菌は０．１％  次亜塩素酸ナトリウム、０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む蒸留水内で攪拌した後、５分室温で放置し、次いで種子を滅菌蒸留水で５回洗うことによりおこなった。観察用の寒天培地は、次のように作成した。蒸留水９８５ｍｌに１Ｍ  ＫＮＯ３  ５ｍｌ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４  ２ｍｌ、１Ｍ  Ｃａ（ＮＯ３）２  ２ｍｌ、２０ｍＭ  Ｆｅ−ＥＤＴＡ  ２．５ｍｌ、微量要素液  １ｍｌ、Ｋ−ＰＯ４緩衝液液（ｐＨ５．５）  ２．５ｍｌと寒天末（ＳＩＧＭＡ社）を１．５％の濃度になるように加え、オートクレーブ後にシャーレに注いで固化させた（白石英秋ら、（１９９１）  現代化学  増刊  ２０  植物バイオテクノロジーＩＩ、３８頁）。滅菌した種子を寒天培地上に播種し、約３日間冷暗所に置いた後に、シャーレを垂直に立てた状態で約２０℃に設定したインキュベータに移して４日間栽培した。栽培時の光環境は、約５０−６５μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１の強度の光を１２時間照射した後、光を１２時間照射しないというサイクルに設定した。経時観察をおこなう１日前に基質溶液を植物個体全体に噴霧した。基質溶液は２．５ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン（プロメガ社）を含む０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０水溶液である。経時観察中は、約２７℃の環境で光を照射していない条件で約３日間生育させた。
【００２４】
画像の取得はＥＭ−ＣＣＤカメラ（ＩｍａｇＥＭ、浜松ホトニクス社Ｃ９１００−１３）を用いた。発光観察は、ＥＭ−ＣＣＤ読み出しモードで、露出時間１分、ｂｉｎｎｉｎｇ  １ｘ１でおこなった。明視野観察は、ＮＯＲＭＡＬ−ＣＣＤ読み出しモードで露出時間１２２ｍｓ、ｂｉｎｎｉｎｇ  １ｘ１でおこなった。経時観察により各々撮像され保存された画像は、市販のソフトウェア（ＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳ、浜松ホトニクス社）もしくはアメリカ国立衛生研究所で開発されたＩｍａｇｅＪを用いて解析した。
【００２５】
（結果）
シロイヌナズナの芽生えは、図２に示すように、重力方向６２に向かって根４６が伸長し、重力方向とは逆向きには胚軸４４が伸長する。観察する視野を胚軸４４に合わせて、ＯＬＹＭＰＵＳ社製対物レンズＵＰＬＦＬＮ  ４ｘを通して、明視野画像と発光画像を取得した。また明視野画像と発光画像の重ね合わせ画像を形成した。
【００２６】
明視野画像と発光画像と重ね合わせ画像を図３に示す。図３（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）は、それぞれ、経時観察の開始から２時間後の胚軸の明視野画像、発光画像、重ね合わせ画像である。図３（Ｄ），（Ｅ），（Ｆ）は、それぞれ、経時観察の開始から３２時間後の胚軸の明視野画像、発光画像、重ね合わせ画像である。図３（Ｇ），（Ｈ），（Ｉ）は、それぞれ、経時観察の開始から６２時間後の胚軸の明視野画像、発光画像、重ね合わせ画像である。図３（Ｂ），（Ｅ），（Ｈ）の四角枠内を関心領域に設定した。図３（Ｃ），（Ｆ），（Ｉ）の重ね合わせ画像では、発光シグナルを黄色に着色した。
【００２７】
経時観察の開始から２時間後の観察では、胚軸と子葉では、全体的に発光シグナルが検出でき、特に胚軸と片側の子葉の先端と基部から強いシグナルが検出された。その後、３２時間後、６２時間後の観察から、時間が経過するにつれて胚軸が重力方向６２とは逆向きに屈曲して生長することが確認できる（図３（Ｄ），（Ｇ））。３２時間後、６２時間後には胚軸の頂端部に強い発光シグナルが観察されるが、それ以外の領域では発光シグナルが減衰しほとんど消失した（図３（Ｂ），（Ｃ），（Ｅ），（Ｆ），（Ｈ），（Ｉ））。経時観察の結果を元に発光シグナルの経時変化を解析した。発光画像から胚軸の中心部をＲＯＩに設定し、約３日間の発光シグナルの変化をプロットした（図４）。発光シグナルは小さく振幅していることが確認できた。
【００２８】
このように本実施形態の観察方法を用いることによって、胚軸が重力とは逆向きに生長する過程において明視野観察と発光観察を同時におこなうことができ、器官ごとや器官内の特定の領域の発光シグナルの強弱を識別できることが分かった。また、発光画像を元に発光シグナルの変化を解析し、特徴付けることができることが分かった。
【実施例２】
【００２９】
（根端の重力刺激の方向変化に応答した伸長方向の変化の経時観察）
本実施例では、シロイヌナズナの根端が重力刺激の方向変化に応答して伸長方向を変化させる様子を発光観察と明視野観察を組み合わせて経時観察した例を示す。
【００３０】
（材料と方法）
観察に用いたシロイヌナズナは実施例１と同じ系統である。
【００３１】
滅菌したシロイヌナズナの種子を寒天培地上で６日間栽培した後、図５に示すように、シャーレ５２を９０度回転させることで生物試料４０の伸長方向に垂直な向きから重力刺激を加わるようにして、回転直後から経時観察をおこなった。
【００３２】
種子の滅菌方法、寒天培地の作成方法は実施例１と同じ方法である。滅菌した種子を寒天培地上に播種し、約３日間冷暗所に置いた後に、シャーレを垂直に立てた状態で約２７℃の実験室内で６日間栽培した。栽培時の光強度は約５０−６５μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−１である。経時観察をおこなう１日前に基質溶液を植物個体全体に噴霧した。基質溶液の組成は実施例１と同じである。経時観察中は、約２７℃の環境で光を照射していない条件で約１日半生育させた。
【００３３】
画像の取得に用いたカメラ及び解析に用いたソフトウェアは実施例１と同じである。発光観察時の露出時間のみを実施例１の１分から１０秒に変更した。
【００３４】
（結果）
観察する視野を根端に合わせて、重力刺激の方向変化後の根端の伸長方向の変化を経時観察した。画像取得はＯＬＹＭＰＵＳ社製対物レンズＬＭＰｌａｎＦＬ  １０ｘを通しておこなった。図６に示すように、重力の方向に向かって徐々に伸長方向が変化していった。３０．５時間後には根端は変化後の重力の方向を向いており、伸長方向の変化が完了していた。観察した系統では、根端に分裂領域から伸長領域に存在する細胞で強い発光シグナルが確認できた。屈曲して伸長する根の内側の細胞層と外側の細胞層では、どちらも同程度の発光シグナルであった。
【００３５】
このように本実施形態の観察方法を用いることによって、根の重力刺激に応答した伸長方向の変化の過程を発光観察と明視野観察を組み合わせて経時観察することができ、根端の分裂領域、伸長領域、屈曲の内側と外側の細胞を区別して特徴付けることができることが分かった。
【００３６】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。ここにいう様々な変形や変更は、上述した実施形態を適当に組み合わせた実施も含む。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００３７】
【非特許文献１】Ｄｏｙｌｅら著、（２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ４１９、７４−７７頁
【非特許文献２】白石英秋ら著、（１９９１）  現代化学  増刊  ２０  植物バイオテクノロジーＩＩ、１８１−１８７頁
【符号の説明】
【００３８】
１０…撮像光学系、１２…顕微鏡対物レンズ、１４…結像レンズ、１６…ＣＣＤカメラ、２０…照明光学系、２２…光源、２４…光ファイバー、３０…画像処理装置、３８…植物バイオテクノロジー、４０…生物試料、４２…子葉、４４…胚軸、４６…根、５２…シャーレ、５４…培地、６２…重力方向。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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