(57)【要約】【課題】ヒト及び非ヒト動物細胞を形質転換し、その中で蛋白質を発現するために役立つ更なるウイルスベクター及び方法を提供する。【解決手段】遺伝的に不能にされた変異ウイルスは、感染性の新しいウイルス粒子の生産のために本質的である選択された遺伝子に関して欠損しており、GM−CSF 又はIL−２等のような免疫調節蛋白質をコードする異種遺伝材料を有するゲノムを有し、ここで該変異ウイルスが、通常の宿主細胞に感染することができ、そして免疫調節蛋白質の発現を引きおこすことができるが、前記変異ウイルスは、該ウイルスが前記本質的なウイルス遺伝子の機能を供する遺伝子を発現することができる組換え補足性宿主細胞に感染する場合を除き、感染性の新しいウイルス粒子の生産を引きおこすことができず；前記免疫調節蛋白質をコードする前記異種遺伝材料の挿入の部位が、好ましくは前記選択された本質的なウイルスゲノムにおける欠損の部位である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染性の新しいウイルス粒子の生産のために本質的である選択された遺伝子に関して欠損しており、GM−CSF、IL−２、IL−12、OX40、OX40L（gp34)及びCD40Lから選択される免疫調節蛋白質をコードする異種遺伝材料を有するゲノムを有する変異ヘルペスウイルスであって、
該変異ヘルペスウイルスが、通常の宿主細胞に感染することができ、そしてその中での免疫調節蛋白質をコードする前記異種遺伝材料の発現を引きおこすことができるが、前記変異ヘルペスウイルスは、該ウイルスが前記本質的なウイルス遺伝子の機能を供する遺伝子を有するように作製されそれを発現することができる組換え補足性宿主細胞に感染する場合を除き、感染性の新しいウイルス粒子の生産を引きおこすことができないことを特徴とする、前記変異ヘルペスウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス調製物、免疫原、ワクチン及び免疫治療剤、特に、変異ウイルス、それらの培養物、ワクチン、並びにそれらの調製及び使用、例えば免疫応答を喚起するため又は矯正的な遺伝子療法のためのベクターとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景及び先行技術
遺伝子工学組換え体を含む弱毒化された生きたウイルスは、有用なワクチンベクターとして知られている。生きたウイルスのゲノムは、生きたウイルスの複製能力が保存され、そしてその異種遺伝子が組換えウイルスにより感染した細胞内で発現されるように、免疫学的応答が要求される異種抗原をコードする遺伝子を有するように操作することができる。これにより発現された抗原は、有用な免疫応答を誘導するのに利用できる。異種抗原は保護的又は治療的免疫応答が感染源に対して構築され得るように、感染性の病原性から得られうるが、あるいは、それらは腫瘍細胞特異的又は腫瘍関連抗原を供し得る；ここでの目的は、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導すること、腫瘍除去又は退縮を誘導することである。
【０００３】
更に一般的には、組換えウイルスベクターは、蛋白質として発現され得るように細胞内に外来遺伝子を導入するために利用できるいくつかの周知の作因体の１つである。中心の要素は、導入されるべき細胞内で機能し得る適切なプロモーター配列の制御下でそれ自体標的遺伝子である。周知の技術には、遊離DNA としての標的遺伝子構成物の単一付加のような非ウイルス法：標的DNA と、その標的細胞内へのDNA の取込みのためにデザインされた特定の蛋白質と、の複合体とのインキュベーション；並びに例えばリポソーム又は他の脂質ベースの移入剤に複包された標的DNA とのインキュベーションを含む。
【０００４】
更に選択可能なものは、要求される標的遺伝子を含むよう操作され、標的細胞に感染することができ、それにより発現され得る形態で細胞内に標的遺伝子を運ぶことができる組換えウイルスベクターの使用である。
【０００５】
明細書EP 0 176 170 (Institut Merieux : B Roizman) は、ゲノムのプロモーター調節領域の制御下で単純ヘルペスウイルスゲノム内に挿入され、それにより外来遺伝子の発現のためのベクターを供する外来遺伝子を記載する。DNA 構成物、外来遺伝子の発現のために有用な構成物を含むプラスミドベクター、ベクターで作製された組換えウイルス及び関連する方法が開示される。
【０００６】
明細書EP 0 448 650 (General Hospital Corporation : AI Geller, XO Breakfield)は、感染することができ、非有糸分裂細胞内で増殖し、神経の病気の治療に用いるため、並びにこのような病気の動物及び試験管内モデルを作るための１型単純ヘルペスウイルスを記載する。
【０００７】
組換えウイルスは、特に遺伝子欠損条件に適用される遺伝子療法に用いるために知られている。
【０００８】
遺伝子療法に用いられ、又は用いることか提案されている遺伝子の例は、例えば、WO 92/10564 (KW CulverらUS Secretary, for Commerce & Cellco Inc), WO 89/12109 及びEP 0 420 911 (IH Pastan ら）に言及されるようなヒトアデノシンデアミナーゼ(ADA) のための遺伝子；WO 91/02796 (L-C Tsui ら：HSC Research & University of Michigan), WO 92/05273 (FS Collins 及びJM Wilson : University of Michigan) 及びin WO 94/12649 (RJ Gregoryら：Genzyme Corp) ．に記載される嚢胞性繊維症遺伝子及び変異体を含む。
【０００９】
悪性腫瘍治療の先行技術は、患者自身の腫瘍由来の自己由来材料を用いて腫瘍に対する治療ワクチンの可能性を重点とした研究を含む。この試みの背景にある一般的理論は、腫瘍細胞が、通常の健康な細胞から区別され、それゆえ腫瘍細胞を認識して破壊するための免疫応答を標的とするのに用いられ得る１以上の蛋白質又は他の生物高分子を発現し得ることである。
【００１０】
これらの腫瘍標的は、特定のタイプの腫瘍内に遍在して存在し得る。この優れた例は、大量の腫瘍がヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７蛋白質を発現する頸癌である。この場合、腫瘍標的は、自己蛋白質でなく、従って、癌療法のための特有の腫瘍特異的マーカーとしての可能性が明らかである。
【００１１】
特定の自己蛋白質が腫瘍標的抗原としても用いることができるという証拠が増えてきている。これは、それらが腫瘍細胞内で一貫して発現されるが、通常の健康細胞内で発現されないという観察に基づく。これらの例は、MAGEファミリーの蛋白質である。腫瘍標的として役立つより多くの自己蛋白質が同定され続けることが予想される。
【００１２】
腫瘍関連抗原及び特定の癌の免疫生物学におけるそれらの役割は、例えばP. van der Bruggenら（Current Opinion in Immunology, 4 (5) (1992)  608〜612)に議論される。一連のMAGEの他のこのような抗原は、T. Boon (Adv Cancer Res 58 (1992) pp 177〜210)に同定され、他の関連する癌抗原は、P. van der Bruggenら（Science 254 (1991)  1643〜1647) により同定され；腫瘍関連ムシンは、PO. Livingston (current opinion in Immunology 4 (5) (1992) pp  624〜629)に言及され；例えば MUC１は、Burchellら（Int J Cancer 44 (1989) pp  691〜696)に言及される。
【００１３】
これらによりいくつかの可能性ある有用な腫瘍特異的マーカーが同定されてキャラクタライズされているが、新しく、そしておそらくより特異的なマーカーについての調査は、労力を要し、時間を浪費し、そして成功の保証がない。
【００１４】
サイトカインの哺乳動物への投与が試みられているが、しばしばホストによりほとんど許容されず、頻繁に悪心、骨の痛み及び熱を含むいくつかの副作用を伴う（A Mire−Sluis, TIB Tech vol. 11(1993) ; MS Moore, in Ann Rev Immunol 9 (1991) 159〜91) 。これらの問題は、有効な血漿濃度を維持することがしばしば要求される投与レベルにより悪化させられる。
【００１５】
ウイルスベクターは、腫瘍免疫応答性を増強させるための手段を供するための癌免疫療法に用いるために提案されている。
【００１６】
サイトカイン又は腫瘍抗原をコードする遺伝子を含むように生きたウイルスベクターを改変することが知られている；明細書WO 94/16716 (E Paoletti ら：Virogenetics Corp.) 及び本明細書に引用される文献を参照のこと：WO 94/16716 は、癌療法に用いるための、サイトカイン又は腫瘍抗原をコードするDNA を含む弱毒化された組換えワクチンウイルスを記載する。サイトカインは、免疫調節蛋白質の例である。サイトカイン、インターロイキン１、インターロイキン２及び顆粒球−マイクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF)（例えばA W Heath らVaccine 10 (7) (1992) 及びTao Mi−Huaら、Nature 362 (1993) のような免疫応答を増強する免疫調節蛋白質は、有効なワクチンアジュバントであり得る。腎臓癌に対する治療ワクチンとしてGMCSF が導入された腫瘍細胞を用いることが提案されている。それに対応する試みのためのプロトコルは、患者からの腫瘍材料の除去、及び次の適切な免疫調節遺伝子の導入に関する。次に操作された細胞は、有益な免疫応答を刺激するために患者に再導入される。
【００１７】
特定の種類の腫瘍細胞内に免疫調節遺伝子を導入することが提案されているが、現在の方法は、導入量の低さ、複雑さ、又は用いられる系の不必要な副作用のため困難であるという制限を有すると考えられる。
【００１８】
現在、実験用の頭蓋内ネズミ黒色腫は、その複製が腫瘍細胞に制限されず、周囲の脳組織上で発生しないことが観察される神経弱毒化 HSV１変異体1716（BP Randazzo ら、Virology 211 (1995) pp94〜101)で処理されたものとして記載されている。
【００１９】
更に、非ヒト霊長類のウイルスであるリスザルヘルペスウイルス（herpesvirus saimiri)に基づくベクターは、ヒトリンパ系細胞において遺伝子発現を導くものとして記載されている（B Fleckenstein及びGrassmann, Gene 102 (2) (1991), pp 265〜9)。しかしながら、臨床上のセッティングにおいてこのようなベクターを用いることは不要であると考えられている。
【００２０】
先行技術は、例えば、ウイルスが通常の宿主細胞に感染し得、このような細胞中でウイルス抗原の複製及び発現を行うが感染性ウイルスを生産し得ないように、感染性ウイルスの生産のために本質的な遺伝子に関してそのゲノムが不完全である変異ウイルスのワクチンとしての使用を記載する明細書WO 92/05263 (Inglis ら：Immunology Limmited) (その内容は引用により本明細書に組み込まれる）を含む。WO 92/05263 は特に、ウイルス感染性に必要とされる本質的なグリコプロテインＨ（gH) をコードする遺伝子の欠失により無力化されたHSV ウイルスを記載する（A Forrester ら、J Virol 66 (1992)  341〜348)。gH蛋白質発現の欠如下において、ほとんど完全な範囲のウイルス蛋白質を供する非感染性ウイルス粒子が作られる。しかしながら、これらの子孫のウイルスは、変異ウイルスが欠失している遺伝子産物を発現する細胞系内で培養することができる。このタイプの特定のウイルスの培養に適した細胞系は、文献：例えば言及される明細書WO 92/05263 に供される引用に記載されている。
【００２１】
完全な又は実質的な配列データは、エプスタイン−バールウイルスEBV (Baer ら、Nature 310 (1984) 207)、ヒトサイトメガロウイルスCMV (Weston 及びBarrell, J Mol Biol 192 (1986) 177〜208)、水痘帯状疱疹ヘルペスウイルスVZV (Davison及びScott, J Gen Virol 67 (1986) 759〜816)及び単純ヘルペスウイルスHSV (McGeochら、J. Gen. Virol. 69 (1988)  1531〜1574) のようないくつかのウイルスについて記載されている。gHグリコプロテインは、EBV, CMV及びVZV において相同性を有することが知られている（Desai ら、J Gen Virol 69 (1988) 1147) 。
【００２２】
ウイルスベクターは、免疫化及び遺伝子療法、例えば矯正遺伝子療法のため、並びに例えば癌免疫療法に用いるために、DNA 及び蛋白質の両方の細胞内輸送のための機会を供するが、先行技術は、ヒト及び非ヒト動物細胞を形質転換し、その中で蛋白質を発現するために役立つ更なるウイルスベクター及び方法を提供することをなお要求する。
【発明の開示】
【００２３】
本発明の概要及び記載
本発明によれば、以下に更に詳細に記載されるように、遺伝的に不活性化された（遺伝的に無能化された）変異ウイルスワクチンは、免疫調節蛋白質をコードする遺伝子のための有用な担体を提供し、そしてこれによりウイルスベクターとして用いることができる。ウイルスワクチンは、例えばウイルス抗原及び免疫調節蛋白質の細胞内合成を導くワクチン化対象物の細胞に感染することができる。これにより、ウイルスに対する免疫応答は、本発明の特定の実施例において、ウイルスにコードされた抗原に対して、又はウイルスによりコードされた免疫調節蛋白質に応答してのいずれかを行うことで強化される。遺伝的に不活性化されたワクチンは、外来抗原の輸送のためのベクターとしても作用し、次に外来抗原に対する免疫応答も増強され得る。
【００２４】
ワクチンウイルスは、ワクチン化された宿主の細胞内で一回のサイクルの複製のみを行うことができるが、免疫調節蛋白質の産生は、感染が体全体を通して広がり得る複製能のあるウイルスでの状況と対照的に、ワクチン接種部位に限定されよう。更に、強力な免疫応答を刺激するのに局所的に十分に産生される全体の量は、複製能のあるウイルスにより産生されるそれよりかなり少なく、これによりほとんど逆の全身的応答を形成しないであろう。
【００２５】
免疫調節蛋白質の局所的産生の利点と共に生きたウイルス又はウイルスベクターの免疫学的利点を有し、そして不測の病理をワクチン接種された患者に与える危険の可能性を最小にし、更に新しい潜在的に有害な病原体の広がりを許容する潜在的な環境的危険も避けるワクチン又はワクチンシステムを提供することが有利であると考えられる。
【００２６】
サイトカイン投与それだけでは、しばしばホストによりほとんど許容されず、そして頻繁に悪心、骨の痛み及び発熱を含むいくつかの副作用を引きおこす（A Mire−Sluis, TIB Tech vol. 11 (1993) ; MS Moore, Ann Rev Immunol 9 (1991)  159〜91) 。これらの問題は、有効な血漿濃度を維持するのにしばしば要求される投与レベルにより悪化させられる。全身の毒性を削減するために、活性なサイトカインのより標的化された輸送が本明細書に記載されるように提案される。
【００２７】
この問題を克服するための以前の試みは、抗原及びサイトカイン遺伝子を融合して単一の二重機能のポリペプチドを形成することである（M Hazamaら、Vaccine 11 (1993) p6)。
【００２８】
他の試みは、免疫調節蛋白質をコードするヌクレオチド配列を生きたウイルスワクチン内に組み込むことである。明細書WO 94/16716 (E Paoletti ら：Virogenetics Corp.) は、癌療法に用いるためにサイトカイン又は腫瘍抗原をコードするDNA を含む弱毒化組換えワクチンウイルスを記載する。
【００２９】
ウイルスベクターは、腫瘍免疫応答性を増強するための手段を供することにより、癌免疫療法における適用が見出されている。
【００３０】
しかしながら、本発明者らは、免疫調節遺伝子を有するウイルスの使用が群集及びワクチン接種された個体に危険を与え得ると本発明者らは考える。本明細書に記載される本発明により供されるような細胞から細胞へ広がることができないワクチンウイルスは、普通の環境においてワクチンから他の個体へ伝染することができないので、かなりの安全性の利点を供する。
【００３１】
しかしながら伝染の危険がおこり得る１つの異常な環境は、ワクチン内で遺伝的に不活性化されたウイルスと天然の野生型ウイルスとの間に組換えがおきた場合、免疫調節遺伝子の天然のウイルスゲノムへの転移がおこり得ること、又は誤った遺伝子の獲得によりワクチンウイルスによる複製能力の再構築がおこることである。密接に関連するウイルス間の相同組換えが、細胞が両ウイルスに同時に感染した場合に比較的高頻度でおこり得ることが公知である。しかしながらこの潜在的な能力は、好ましくは本発明により開示されるように、免疫調節遺伝子が、その本質的な遺伝子が削除されているワクチンウイルスゲノム内の部分に挿入されることを確実にすることにより避けることができる。この作製の方法の結果は、ワクチン接種されたホスト内で実際におこるはずである野生ウイルスとの相同組換えが、複製能力と免疫調節遺伝子との両方を有する新しいウイルスの生産を生じ得ないことである（添付の図面の図７）。これは、ワクチンウイルスに逆に戻る削除された遺伝子の転移がこの部位に挿入された異種配列の損失を導くであろうためである。同様に野生ウイルスへの異種配列の転移は、本質的な遺伝子の損失を引きおこすだろう。
【００３２】
それゆえ本発明によれば、感染性ウイルスの生産に本質的な第１の第１について欠失があり、免疫調節蛋白質をコードする異種ヌクレオチド配列を含むゲノムを有する変異ウイルスを提供する。更に、特定の実施形態において、ウイルスは、異種抗原、例えばウイルス又は非ウイルスの例えば腫瘍抗原もコードすることができる。
【００３３】
変異ウイルスは、変異DNA 又はRNA ウイルス、例えば変異非レトロウイルス、例えばレトロウイルス以外のRNA ウイルス、例えば、変異ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パポーバウイルス、又は変異ポックスウイルスであり得る。変異ヘルペスウイルスは、例えば、 HSV１， HSV２，VZV, CMV, EBV, HHV６， HHV７に、又はPRV, IBRV/BHV, MDV、及びEHV 等のような非ヒト動物ヘルペスウイルスに基づくことができる。
【００３４】
変異ウイルスのゲノムは、ウイルスが通常の宿主細胞（即ち、ウイルスが欠失している本質的な遺伝子の産物を発現するように変異されている細胞以外の細胞）に感染することができ、これらの細胞中でウイルス抗原遺伝子の複製及び発現を引きおこすが通常の感染性ウイルスの生産は引きおこすことができないように、感染した宿主細胞による感染性ウイルスの生産に本質的な選択された遺伝子に関して欠損がある。このような変異ウイルスにおいて、変異ウイルスが宿主細胞を補足するこのような組換え体以外の宿主細胞に感染する場合に非感染性ウイルス粒子の生産及び遊離を許容するように、遺伝的欠損（例えばヘルペルウイルスgH又はgDの欠失）がおこり得る。
【００３５】
これにより、本発明は、そのゲノムが、ウイルスが通常の細胞に感染することができ、そこで複製して生産及び非感染性ウイルスの細胞からの遊離を引きおこすような感染性ウイルスの生産に本質的な遺伝子に関して欠損があり、そして少なくとも１つの免疫調節蛋白質をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含む変異ウイルスを提供する。必要に応じて複数の免疫調節蛋白質をコードする複数の異種配列を、１つのウイルスベクターが有することができる。あるいは、免疫調節配列をコードする各々の異種核酸配列をその各々が含むベクターの混合物を用いることができる。
【００３６】
本発明は、そのゲノムが感染性ウイルスの生産に本質的な遺伝子に関して欠損があり、ウイルスが通常の細胞に感染しそして免疫原をコードする遺伝材料のいくらかの複製及び発現を行うことができるが感染性ウイルス粒子を生産することができないように、ウイルスに対して外因性の病原体からの１つ又は複数の免疫原をコードする遺伝材料を有し、そして免疫調節蛋白質をコードする異種ヌクレオチド配列を含む変異ウイルスも提供する。
【００３７】
本明細書に用いる場合、“免疫調節蛋白質”という表現及びそれに関連する用語は、変異ウイルスもしくはそれによりコードされる蛋白質に、又はウイルスに対して外因性の病原体もしくはソースからの免疫原もしくは腫瘍関連抗原のような抗原に対するホストの免疫応答の増強又は抑制のいずれかを行う蛋白質を含む。免疫調節蛋白質は、通常それ自体が免疫原（抗原）として現在用いられるこれらの蛋白質ではない。免疫調節蛋白質は、例えばこのような免疫系の他の天然の構成物のための機能的結合能力を伴う哺乳動物免疫系のヒト又は非ヒト動物免疫系の天然のメンバーであり得る。あるいは、免疫調節蛋白質は、このような免疫系の天然の構成物のための機能的結合能力を有する病原体によりコードされる蛋白質であり得る。あるいは、免疫調節蛋白質は、人工の蛋白質、例えば天然の免疫調節蛋白質のフラグメント、もしくはこのような蛋白質又はフラグメントのムテイン、又はこれらのいずれかを組込む融合蛋白質であり得る。多くの免疫調節蛋白質、及びそれをコードする遺伝材料、並びにそれらのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、本対象物の文献に知られており、EMBLデータベースのような遺伝配列データベースで利用でき、そしてクローニング及び他の操作のための操作される遺伝材料の形態で市販される。
【００３８】
それをコードするヌクレオチド配列を本明細書に記載されるような変異ウイルスベクターが発現的に有する免疫調節蛋白質は、通常例えば組換えウイルスによるワクチン接種を受容するべき種に対してネイティブである配列のもの、例えばヒト患者の治療のためのヒト種の免疫調節蛋白質である。
【００３９】
蛋白質は、免疫原として、例えばワクチンとしての変異ウイルスの効果を増強するために、本発明の特定の実施例において選択することができる。十分に複製するウイルス中のこのような蛋白質の発現に関連した潜在的な危険は、本明細書に記載されるように用いられるベクターの欠損特徴により避けることができる。
【００４０】
有用な免疫調節蛋白質の例は、サイトカイン、ケモカイン、補体構成物、免疫系付帯物及び付着分子並びにそれらのヒト又は非ヒト動物特異性のレセプターを含む。役立つ例は、GM−CSF ，IL−２，IL−12, OX40, OX40L (gp34)、リンホタクチン、CD40及びCD40L を含む。更に役立つ例は、インターロイキン、例えばインターロイキン１〜15、インターロイキンα，β又はγ、腫瘍壊死因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF)、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−CSF)、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−CSF)、好中球活性化蛋白質(NAP) のようなケモカイン、マクロファージ化学誘引物質及び活性化因子（MCAF) 、RANTES、マクロファージ炎症性ペプチド MIP−１ａ及び MIP−１ｂ、補体構成物及びそれらのレセプター、又はB7.1, B7.2, ICAM−１，２もしくは３のような付帯分子並びにサイトカインレセプターを含む。OX40及びOX40−リガンド（gp34）は、免疫調節蛋白質の更に役立つ例である。免疫調節蛋白質は、種々の目的のため、ヒト又は非ヒト動物特異性のものであり得、場合により、便利には、天然の蛋白質及びその変異体並びにそれらの融合蛋白質の、他のポリペプチド配列、例えばイムノグロブリン重鎖定常ドメインとの結合特性を有する細胞外ドメイン及び他のフラグメントにより、本目的のために供され得る。１超の免疫調節蛋白質をコードするヌクレオチド配列が挿入される場合、それらは、例えば１超のサイトカイン、又はサイトカイン及び付帯／付着分子の組合せを含み得る。
【００４１】
このような産物をコードするこのようなベクターの使用により喚起される免疫応答は、ウイルスにより刺激され得る種々のタイプの免疫応答、例えばウイルスにコードされる蛋白質に対する応答、及び／又はウイルスベクターによりもしくはそれによりコードされる異種遺伝子の発現により刺激された応答である宿主抗原に対する応答を含むことができる。本明細書に記載されるような変異ウイルスベクターの使用の１つは、例えば、被検体がそれで治療され、例えばそれ、例えば直接的免疫化により感染された場合に、対応する野生型ウイルスによる感染に対して、感受性ある種の被検体を保護することである。
【００４２】
免疫調節蛋白質をコードする遺伝材料は、他の相同性及び必要に応じて他の官能性を有するポリペプチド領域に連結された免疫調節蛋白質との相同性及びその官能性を有するポリペプチド領域を含むハイブリッド又は融合蛋白質をコードする発現可能なオープンリーディングフレームとして変異ウイルスゲノム内に有することができる。例えば、免疫調節蛋白質は、ヒトOx−40との結合パートナーとして同定されたgp34に対する官能性を含む、又はそれに対応する（W Godfrey ら、J Exp Med 180 (2) 1994 pp  757〜762 、及びS Miura ら、Mol Cell Biol 11 (3) 1991, pp 1313〜1325を含むそれに引用される文献）。変異ウイルスゲノム中にコードされ得るこの蛋白質官能性のバージョンは、それ自体天然のgp34配列に、又はそのフラグメントに、又は例えば他の蛋白質、例えばヒト IgG１のようなイムノグロブリン重鎖の定常領域に融合されたgp34の（Ｃ−末端）細胞外（結合）ドメイン、例えばイムノグロブリン定常ドメインのＮ末端〜Ｃ末端において融合されたgp34の細胞外ドメイン（タイプ２膜蛋白質）に基づくハイブリッド発現産物に対応する。
【００４３】
免疫調節蛋白質以外のものも有することができ、このような誘導体及びハイブリッド形態において発現され得る。このような免疫調節蛋白質のアミノ酸配列の変異体を組み込むことができることも理解される。ここに含まれるものは、対応する親配列を有する蛋白質との配列、機能、及び抗原の特徴における相同性を保持するような変異配列を有する蛋白質である。このような変異体は、好ましくは、例えば保存性アミノ酸変換、例えば広範囲に類似した分子特性のアミノ酸間の変換を含む変異であり得る。例えば、脂肪族基アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン間の相互交換は、保存的なものとして考えることができる。時折、これらの１つについてのグリシンの置換も保存的なものとして考えることができる。脂肪族基アスパラテート及びグルタメート内の相互交換も保存的なものとして考えることができる。アミド基アスパラギン及びグルタミン内の相互交換も保存的なものとして考えることができる。水酸基セリン及びトレオニン内の相互交換も保存的なものとして考えることができる。芳香基フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン内の相互交換も保存性のものとして考えることができる。塩基性基リシン、アルギニン及びヒスチジン間の相互交換も保存性のものとして考えることができる。硫黄含有基メチオニン及びシステイン内の相互交換も保存性のものとして考えることができる。時折、基メチオニン及びロイシン内の置換も保存性のものとして考えることができる。好ましい保存性置換基は、アスパラテート−グルタメート；アスパラギン−グルタミン；バリン−ロイシン−イソロイシン；アラニン−バリン；フェニルアラニン−チロシン；及びリシン−アルギニンである。他の観点において、変異された配列は、挿入及び／又は欠失を含むことができる。
【００４４】
特定の例において、免疫調節蛋白質は、サイトカイン、好ましくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF)、例えばネズミ又は好ましくはヒトGM−CSF を含むことができる。
【００４５】
ネズミ及びヒトGM−CSF は両方周知であるネズミGM−CSF 遺伝子は、141 アミノ酸のポリペプチドであるグリコシル化の程度に依存して14ｋ〜30ｋグルトンの間の分子量を有する成熟分泌グリコプロテインをコードする。GM−CSF は、遺伝的に、造血成長因子ファミリーのメンバーであり、造血性始原体中の試験管内コロニー形成を刺激する能力により最初に規定され、同定される。GM−CSF は、好中球、好酸球及びマクロファージ−単球機能、マイグレーションの増強、貧食作用、主要組織適合性遺伝子複合体(MHC) 発現、及び免疫システムを更に刺激する生物活性分子のカスケードを開始する潜在的なアクティベーターである。GM−CSF は、化学療法後の好中球減少の治療のため、及び癌療法におけるアジュバントとして現在臨床的に評価されている。
【００４６】
用いられる異種ヌクレオチド配列は、それが先に定義されるような免疫調節蛋白質をコードするなら、異種遺伝子、遺伝子フラグメント又は遺伝子の組合せを含むことができる。
【００４７】
本発明の例によれば、その各々が異なる免疫調節産物をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む１つのベクター又は２以上のベクターの混合物内で本明細書に記載される目的のためにコードされ得る２以上の免疫調節蛋白質の組合せを、用いることができる。特定の例において、これらは詳説するためであり限定するためではないが、IL２，GMCSF 、リンホタクチン及び／又はCD40L を含む組合せを、互いと共に、又は先に言及される免疫調節蛋白質以外のものと共に用いることができる。上述の免疫調節蛋白質の各々の他の２つの組合せは、本開示により、及びその範囲内でも供される。
【００４８】
本明細書により供される変異ウイルスの例は、対応する野生型ウイルスによる感染に対してそれで免疫化された感受性ある種を保護することができる。変異ウイルスは、例えば他の病原体、例えばバクテリア又はウイルス病原体に対応する抗原の宿主細胞内で発現を引きおこさせることができる変異も有することができ、それにより、このような変異ウイルスで免疫化された感受性のある種のホストへのこのような他の病原体に対する免疫性を供する。
【００４９】
このような抗原の例は、パピローマウイルス蛋白質Ｌ１及びＬ２，HIV 蛋白質、gag, pol, env 及びnef 、（クラミジア主要外部膜蛋白質（Major Outer Membrane Protein) MOMPのような）クラミジア抗原及びクラミジアヒートショック蛋白質である。
【００５０】
あるいは、抗原は、それにより腫瘍細胞枯渇に関連するCTL の抗腫瘍活性が増強される腫瘍関連抗原であり得る。腫瘍壊死因子−α、インターロイキンγ、インターロイキン−２、インターロイキン−４及びインターロイキン−７のような特定のサイトカインがこの点に関して特に役立つことが見出されている。腫瘍関連抗原及び特定の癌の免疫生物学におけるそれらの役割は、例えば、P. van der Bruggenら（Current Opinion in Immunology, 4 (5) (1992)  608〜612)により議論される。本適用の文脈に用いるために認められるこのような抗原の特定の例は、ヒトパピローマウイルス（特に例えばタイプ６，11，16，18等）のＥ６及びＥ７抗原；エプスタイン−バールウイルス由来蛋白質、例えば上述のP. van der Bruggenらにおける引用文献24及び25に同定されるもの；T. Boon (Adv Cancer. Res 58 (1992) pp  177〜210)に同定されるMAGEシリーズの抗原及び／又はP. van der Bruggenら（Science 254 (1991)  1643〜1647）に同定されるMZ２−Ｅ及び他の抗原；黒色種蛋白質、例えばヒトチロシナーゼ；並びにP. O. Livingston (Current Opinion in Immunology 4 (5) (1992) pp  624〜629)に同定されるもののようなムチン；例えばJ Burchellら（Int J Cancer 44 (1989) pp  691〜696)に同定されるような MUC１である。
【００５１】
一般に、変異ウイルスは、二本鎖DNA ウイルス、例えば単純ヘルペスウイルスのようなヘルペスウイルスに基づき得る。先に言及されるような第１の第１はグリコプロテインpH遺伝子であり得る。
【００５２】
第１の遺伝子における欠損は、完全な欠失又は完全もしくは部分的な不活性化を含むことができる。その遺伝子は、例えば発現をブロックするいずれかの変異、例えば点もしくはプロモーター変異又は不活性化挿入変異により不活性化することができる。好ましくは、第１の遺伝子は、その全体において削除される。
【００５３】
変異ウイルスの特定の例のゲノム内に挿入された異種ヌクレオチド配列は、感染した細胞において、例えば接種の部位において発現され得、感染したニューロンにおいて潜在期に発現され得る。異種ヌクレオチド配列の発現は、適切なプロモーターの選択により、及び変異ウイルス自体の固有の制限により、２つレベルで制御することができる。異種配列は、広範囲の周知のウイルスプロモーターのいずれか、例えばCMV IEプロモーターの制御下で、又は周知の哺乳動物、例えば組織特異的プロモーターの制御下で存在し得る。ホスト内での変異ウイルスの広がりは、自己限定的であり、それゆえこのような場合における異種ヌクレオチド配列の発現は、接種の部位における細胞内発現の持続時間に制限される。より正確な遺伝子発現及び蛋白質濃度の制御を可能にするために、ウイルス又は細胞源の誘導可能又は構造的な適切なプロモーターを選択することができる。
【００５４】
好ましい実施形態において、免疫調節蛋白質をコードする異種ヌクレオチド配列は、変異ウイルスのゲノム内の第１の遺伝子の座に挿入される：最も好ましくは、その全体が削除される。この方法において、いずれの不要な組換えがおこり、野生ソースからの変異ウイルス内への第１の遺伝子の再挿入を生じても、それはほとんどが挿入された異種ヌクレオチド配列を除去することとなろう。これは、異種ヌクレオチド配列のための複製能を有するウイルス担体が作られ得る可能性を避けるであろう。このような組換えは極めて希であるが、この実施形態において、このようなことがおこることの有害な効果は最少化されよう。本発明の免疫原の利点は、抗体と細胞媒介免疫性との両方を刺激し得る細胞内抗原輸送、並びに全身毒性を誘導せずに抗原の存在下で有効に局在化されたサイトカイン濃度の形成を提供することである。例えば、感染性ウイルスベクター内のGM−CSF をコードする遺伝子の存在の結果として発生するベクターにより感染されている処理された動物の細胞における上述のウイルスベクターでワクチン接種された動物におけるGM−CSF の発現は、ウイルス又は腫瘍抗原に対するワクチン接種された動物による特異的及び／又は中和抗体反応のレベルを有意に増加させることができる。
【００５５】
サイトカインと抗原との組合せは、関連する抗原に対するホストの応答を増加させることができる。次にこれは、乏しい免疫原性の蛋白質の免疫原性を増加させることができ、そしてより有効な抗原で投与量削減を許容し得る。
【００５６】
本明細書により供される変異ウイルスの例は免疫原として、例えばそれで処理された被検体において免疫応答を形成することにおける予防又は治療に用いるため用いることができる。本発明の実施形態は、治療又は予防に用いるためのワクチンのような免疫原の調製において供される本明細書による変異ウイルスの使用も提供する。特定の適用は、上述のように、例えば免疫原の役割が内因性腫瘍抗原に対する免疫応答を刺激することができる場合の、先に議論されるような腫瘍療法の分野である。
【００５７】
本発明は、本明細書により供されるような変異ウイルスを含むワクチンのような免疫原、例えば生きたワクチンの調製に用いられるような医薬として許容されるビヒクルと共に上述の変異ウイルスを含むワクチンのような免疫原性調製物も提供し、それは必要に応じてアジュバントを含み得る。
【００５８】
変異ウイルスは、例えば５×10７  pfu までの変異ウイルス、例えば約５×10６  pfu まで又は約５×10５ pfu までの変異ウイルスを含む投与量において、免疫原又はワクチン調製物内に製剤化することができる。
【００５９】
本明細書により供される変異ウイルスは、変異ウイルスに感染している細胞の培養及びその培養物からの変異ウイルスの回収を含む方法であって、該細胞が、欠損したゲノムを含む感染性ウイルス粒子の生産を許容するように、第一の欠損したウイルス遺伝子を補足する遺伝子を発現することを特徴とする方法によって、製造することができる。
【００６０】
本明細書に開示されるウイルスの免疫原の例において、上述の第２の遺伝子を有するウイルスに対するホストの免疫応答を下降制御するよう通常機能する第２のウイルス遺伝子が不活性化、例えば削除、結果として生ずる、ウイルスに対して通常外来性の免疫刺激蛋白質又は抗原のような蛋白質を感染したホストの免疫系に送り出すための安全なベクターとして用いられる変異ウイルスとなる：これは、ウイルスによる宿主細胞の感染の間にそれらの発現を引きおこすように、上述の蛋白質をコードする核酸配列をウイルスのゲノム内に挿入することにより達成することができる。例えば、要求される外来抗原をコードする遺伝子は、遺伝子及びプロモーターを含むDNA カセットを得るために、ウイルスプロモーターに続く要求される遺伝子をクローニングし；前記カセットを適切なプロモーター内にクローニングし；そしてその産物が細胞系により供される遺伝子において欠損を有する変異ウイルスから精製されたDNA と共に、補足する細胞系内にプラスミドを同時移入することにより、有効な様式で挿入することができる。例えばWO 92/05263 (Immunology Ltd: Inglisら）においてSIVgp120抗原をコードする遺伝子に関するいくらか類似した技術の適用の例が記載される。
【００６１】
このような遺伝的に無能にされたウイルスベクターの例は、例えば癌免疫療法の目的のために、処理されたヒト又は非ヒト動物被検体に免疫刺激を供する方法に用いることができる。ベクターの使用は、直接的、例えば被検体への投与、例えば固状腫瘍の部位への投与により、又は関接的のいずれかであり得る。例えばベクターの使用は、
（ｉ）治療されるべき被検体に免疫刺激を供するベクターを感染させた後に能力のある細胞の調製物に生体外で欠損ウイルスベクターを接触させ；そして
（ii）例えば
（ａ）例えば投与前の不活性化の後、例えば照射の後に、ワクチンとして感染した細胞を直接投与することにより、又は
（ｂ）治療されるべき被検体の免疫系の細胞のような免疫コンピテント細胞を生体外で刺激し、次に例えばウイルス又はウイルス感染細胞の同時投与なしで、免疫−コンピテント細胞を再投与する細胞の間接的な使用により、感染した細胞を用いて、治療されるべき被検体に免疫刺激を供することを含む。本文節において不要ないずれの細胞も、例えば陰性枯渇を含む精製方法により、例えば対応する抗体又は他の結合剤での不要なタイプの細胞の選択的除去により、除去することができる。
【００６２】
ウイルスベクターに生体外で感染した細胞は、自己細胞又は異種細胞のいずれか、例えば治療されるべきそれと同様の条件で１又は複数の被検体から得られた異種細胞であり得る。その細胞は、単一細胞タイプのもの又は細胞タイプの混合物のものであり得、例えばそれらは、臨床用の腫瘍サンプルから確立された１又は複数の細胞系の細胞を含むことができる。これにより、例えば黒色腫細胞に対して免疫刺激が与えられた場合、異種細胞は、治療されるべき被検体以外、又は治療されるべき被検体を含む黒色腫を有する１以上の被検体からの黒色腫であり得る。
【００６３】
免疫刺激を供するための投与のための感染した細胞は、好ましくは、投与前に、例えば照射により不活性化することができる。それらは、ウイルスベクターが有する異種遺伝子を発現するのを許容するために不活性化前に十分な時間、インキュベートされ得る。
【００６４】
本発明の例によれば、例えばそれに含まれる感染した細胞の数又は濃度を指示することにより、又は発現される異種遺伝子産物の量を指示することにより、投与量校正されている、免疫刺激に治療されるべき被検体への投与のための、ベクターに感染し、必要に応じて不活性化された細胞の単位投与量の又は校正された調製物も提供する。
【００６５】
あるいは、遺伝的に不能にされたウイルスベクターは、接触し、それにより生体内の腫瘍細胞、例えば黒色腫のような固状腫瘍の細胞に感染するための、所定量又は所定濃度のウイルスベクターの生体内投与に用いることができる。
【００６６】
この方法で有用に処理され得る細胞の１つは、例えばヒト及び非ヒト動物の悪性細胞、特に例えば、血液細胞に関連する悪性細胞、例えば白血病細胞、例えばCD34＋細胞（造血細胞）である（例えばR. Jurecicら（ch2, pp7〜30‘Somatic Gene Therapy' CRC Press1995, ed. P. L. Chang)に言及される細胞タイプを参照のこと）。
【００６７】
サイトカインを用いる腫瘍の免疫治療は、H. Tahara ら（ch. 15, pp 263〜285 in‘Samatic Gene Therapy' CRC Press 1995, ed.P. L. Chang)に報告される。本明細書に記載されるベクターは、サイトカインの免疫学的適用及び当業者に直ちに明らかになるであろう適切な調節及び改良を用いてH. Tahara らによる報告に報告される治療の方法に適用することができる。
【００６８】
本発明は、ウイルス特異的細胞毒性Ｔ細胞のようなＴ細胞の拡大のような例えば試験管内治療のような更なる試験管内適用も見い出される。免疫抑制又は細胞毒性治療の２つの合併症は、潜伏性のウイルス再活性化の結果としてのウイルス感染及びウイルス感染細胞の拡大の後の全身性のウイルス血症である。これは、このような感染を制御するための通常のメカニズムが治療の結果として損なわれるという事実のためである。この問題に対する１つの可能な解決法は、ウイルスに感染した細胞を制御することができる適切な細胞毒性Ｔ細胞を試験管内で生産することである。これは、被検体の治療前に末梢血液単核細胞又はリンパ球もしくはＴ細胞を単離し、そして生きたウイルスの調製物で試験管内でこのような細胞を刺激することによって行うことができる。抗原提示細胞内で合成される外来蛋白質から得られたペプチドに対して細胞毒性Ｔ細胞が一般に発生されるように、生きたウイルスを用いることが必要である：不活性化されたウイルス又は個々の蛋白質は細胞毒性Ｔ細胞応答を生じさせることに極めて乏しい。次に活性化された細胞は、抗原及びインターロイキン−２のような成長因子での更なる再刺激を行いながら数週間にわたって培養で増殖される。しかしながら、CTL が被検体内に再注入された場合に細胞培養物中に残った生きたウイルスが存在しないであろうという考慮がある。それゆえCTL 活性を誘導することができるか、被検体内で広がることができない無能なウイルスの使用は、不注意で試験管内で広げられた細胞と共に供された場合、複製能力のあるウイルスを用いる系より優れた利点を供するだろう。
【００６９】
従って本発明は、ウイルス特異的細胞毒性Ｔ細胞を生産するための方法であって、該方法が、
（ａ）血液単核細胞、リンパ球又はＴ細胞のサンプルを被検体から単離し；
（ｂ）感染性ウイルスの生産のために本質的な第１の遺伝子に関して欠損を有し、免疫調節蛋白質をコードする異種ヌクレオチド配列を必要に応じて含み得る変異ウイルスの存在下で前記サンプルを試験管内で培養し、
（ｃ）培養した細胞を前記被検体に再注入することを含むことを特徴とする方法を更に提供する。
【００７０】
本発明により供される特定のベクターは、遺伝子療法、例えば矯正遺伝子療法にも適用することができる。このような適用において、ベクターは、矯正遺伝子療法の方法により送り出されるべき遺伝子、例えばADA をコードする遺伝子又は例えば上述のような目的のために投与されるべき他の遺伝子を更にコードすることができる。免疫調節蛋白質 TGFβをコードする本明細に記載されるようなベクターは、ベクターでの感染の後に、本明細書により供されるベクターで直接又は自己由来もしくは異種の生きた細胞のいずれかで通常治療されるであろう治療された被検体の応答を下降制御するための矯正遺伝子療法のためのベクターとして特に適切であり得る。負の免疫調節効果は、これ又は免疫調節蛋白質の他の適切な選択により供され得る。この適用のための免疫調節蛋白質の更なる選択は、例えば次の通りであり得る：Th１効果の阻害は、Th２サイトカインをコードするベクターで達成され、又はその逆も可である：例えば、Th１効果に対するIL10をコードするベクター及びTh２効果に対する IFN−γをコードするベクターである。免疫応答は、例えばウイルス又は他の病原の免疫下降制御遺伝子をコードするベクター、例えば(HSV１又は HSV２からの）ヘルペスICP47 遺伝子をコードし、又は他の周知の免疫下降制御遺伝子、例えばアデノウイルスのE3−gp19ｋを更にコードするベクターを用いることにより更に下降制御することができる（G Fejer ら（J Virol 68 (1994) 5871〜813 を参照のこと）。遺伝子療法の文献の手順、例えばUSP 5,399,346 (WFAndersonら）は、本明細書により供されるベクターの使用に適合され得る。
【００７１】
あるいは、本明細書に開示されるシステムは、免疫調節蛋白質特に真の哺乳動物蛋白質を発現するのに用いることができる。多くの発現系が、臨床的に関連のある蛋白質の製造のために利用できる。
【００７２】
選択された発現系及び特に用いられる生物は、分子量並びにグリコシル化、免疫原性、毒性及び潜伏性の程度への影響の可能性と共に蛋白質の最終的な特徴への十分な影響を有するだろう。GM−CSFは、大腸菌（Libby, R. T.ら（DNA 1987 Jun 6) 、イースト（Price. Vら（Gene 1985 55 (２〜３）））及び哺乳動物細胞培養システムで上手く生産されるが、収率、産物能力並びにそれゆえコスト、毒性及び生体内クリアランス比率においてかなりの差が見られる（Dorr, R. T. Clin. Ther. 1993 Jan−Feb 15, D Hovgaard Eur J.Hematology 1993 Jan 50) 。次にこれらのパラメータは、蛋白質産物で特定の病気を治療することの経済的及び技術的可能性に影響を与え得る。
【００７３】
更なる態様において、本発明は、免疫調節蛋白質を生産する方法であって、該方法が、感染性ウイルスの生産に本質的である第１の遺伝子に関して欠損しており、そして免疫調節蛋白質をコードする異種ヌクレオチド配列を含む変異ウイルスに感染した細胞系を試験管内培養し、ここで前記細胞系が、前記変異ウイルスの複製を支持することができる補足的細胞系であり、そしてその後必要に応じて、前記培養物から免疫調節蛋白質を単離することを含むことを特徴とする方法を提供する。
【００７４】
特に、組換えHSV ベクターは、真の哺乳動物細胞由来の産物が必要とされる場合及び慣用的な安定な細胞発現系が成功せず、又は不適切である場合に他の発現系として用いられるべき能力を有する。その系は、補足性細胞、即ちCR１細胞(HSV１のgHを発現する組換え補足性Vero由来細胞の名称）が標準的組織培養系を用いて集密的になるまで増殖される慣用的バッチ培養システムとして作動し得、その細胞は異種遺伝子発現のためのコーディング配列を含む組換えウイルスで高タイターで感染される。感染後の適当な時間において、培養上清が収集され、関連する蛋白質を回収するよう処理され得る。
【００７５】
本発明をより十分に説明するために、実施例が限定する手段でなく例としてのみ記載されよう。gH欠損ウイルスの構造及び特性は、WO 92/05263 及びWO 94/21807 においてForrester ら（1992, J. Virol. 66, p 341)に記載される。更に、全ての遺伝操作手順は、“Molecular Cloning ”（A Laboratory Manual, eds. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) に記載されるような標準的な方法に従って行うことができる。
【００７６】
本実施例は、添付の図面を引用することより非限定的に記載される。ここで、図１〜６は、各々プラスミド pIMMB45, pIMMB56, pIMMB46, pIMC14, pIMR１及びpIMR３の作製を示す。図７は、本発明を説明する記載を示す組換えの図である。
以下の記載が特に含まれる：
gH遺伝子の削除部位において（ネズミ）GM−CSF をコードし、感染した細胞においてGM−CSF の発現を引きおこすことができるgHが削除された HSV１及び HSV２の作製：
免疫原（ワクチン）としての上述のベクターの効果のテスト：
gH遺伝子の削除部位においてヒトGM−CSF をコードし、感染した細胞においてGM−CSF の発現を引きおこすことができるgHが削除された HSV２の作製：並びに
gH遺伝子の削除部位においてヒトIL−２をコードし、感染した細胞においてIL−２の発現を引きおこすことができるgHが削除されたHSV２の作製。
【００７７】
GM−CSF を発現するgHが削除された HSV１及びgHが削除された HSV２の作製
gHが削除された HSV１ウイルス及びgHが削除された HSV２ウイルスを補足性細胞系内で増殖させた。これらの細胞系を各々 HSV−１gH遺伝子又は HSV−２gH遺伝子を形現するように操作した。これらの細胞系をWO 94/05207 及びWO 94/21807 並びに本明細書に言及される引用文献に記載されるように作製することができる。以下の節は、適切な細胞系の作製の更なる記載を提供し、そして特定のプラスミドの作製から始まる。
【００７８】
ウイルスDNA のソース：
HSV ウイルスDNA が要求される場合、それは、例えば(HSV２の場合）Walboomers及びTer Scheggt (1976) (Virology 74, 256〜258)の方法により、又はその方法の適切な調節により、株HG52から作ることができる。HG52株の選択された保存物は、Institute of Virology, MRC Virology Unit, Chwrch Street, Glasgow, Scotland, UKに維持されている。他の HSV−２株のDNA は、この領域において極めて類似しているようであり、例えば株Ｇ及びMSは、ATCC, Rockville, Maryland, USAから得ることができる。
【００７９】
プラスミド pIMCO５の作製
HSV−１（HFEM) gH遺伝子及び上流の HSV−１gDプロモーター（−392 〜＋11）をコードする 4.3kb Sst−１フラグメントをプラスミドpg DBrgH（Forrester ら、前掲）から切り出し、pUC119 (Vieira及びMessing, 1987)内にクローニングしてプラスミドpUC119gHを作製した。 Not１部位を部位特異的変異誘発により、プラスミドpUC119gH内に、gH停止コドンの87bp下流に導入した。結果として生ずるプラスミド pIMCO３を用いて修復され、真核生物発現ベクターpRc/CMV (Invitrogen Corporation)内に連結された Not１− Sst１フラグメントを形し、CMV IEプロモーターを除去するために Not１及び Nru１で予備消化した。結果として生ずるプラスミド、 pIMCO５は、ウイルス誘導可能gDプロモーター及びBGH(ウシ成長ホルモン）ポリＡの転写制御下で HSV−１gH遺伝子を含む。それは、G418耐性の安定な細胞系の選択のためのネオマイシン耐性遺伝子も含む。
【００８０】
gH削除 HSV−１補足性細胞系の作製
プラスミド pIMCO５をCaPO４  技術を用いてVero (ATCC番号88020401) 細胞内に移入した（Sambrook, Fritsch 及びManiatis, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 。細胞をG418の存在下で希釈クローニングすることにより単離し、クローン細胞系を単離した。増殖させて凍結した後、細胞を24ウェルプレート内に種つけし、gH陰性ウイルスの増殖を支持する能力についてテストした。0.1pfu／細胞におけるSC16ΔgH（'Forresterら、前掲）での感染によるgH陰性ウイルスの増殖を支持するそれらの能力についてテストした。gH遺伝子の発現を確認するため、ウイルスのプラークを感染後３日間、観察した。
【００８１】
BHK TK−細胞系の作製
これらの細胞を、gH削除 HSV−１及びgH削除 HSV−２補足細胞について記載される方法と同様にチミジンキナーゼ陰性（TK−）BHK細胞(ECACC番号85011423) 内へのプラスミド pIMCO５の移入により作製した。
【００８２】
プラスミド pIMCO８の作製
HSV−２gH遺伝子を含むプラスミドpIMMB24 を HSV−２株25766の２つの隣接したBamHＩフラグメントから作製する。そのプラスミドをそれら両方がpBR322のBamHＩ部位内にクローンされた、約3484塩基対のBamHＩＲフラグメントを含むpTW49 と、そして約3311を塩基対BamHＩＳフラグメントを含むpTW54 と命名する。均等なプラスミドは、多くの利用できる株又は HSV−２の臨床的単離物から容易にクローンすることができる。 HSV−２遺伝子の５’末端を、BamHＩ及び KpnＩを用いてpTW54 から切り出し、ゲル精製した2620塩基対フラグメントを作製する。 HSV−２gH遺伝子の３’末端をBamHＩ及び SalＩを用いてpTW49 から切り出し、ゲル精製もされる870 塩基対フラグメントを形成する。２つのフラグメントをSalHＩ及び KpnＩで消化されているpUC119内にクローンする。このプラスミドは、なお完全な HSV−２gH遺伝子を含む。
【００８３】
HSV−２（株25766)gH遺伝子を含むプラスミド pIMCO８を次の通り作製した。プラスミドpIMMB24 を NcoＩ及びBstXＩで消化し、gH遺伝子の中心部分を含むフラグメントをアガロースゲルから精製した。その遺伝子の５’末端を、HindIII 及び NcoＩ部位により結合された連結配列を形成する２つのオリゴヌクレオチドCE39及びCE40から再構築した。
【００８４】
その遺伝子の３’末端を、BstXＩ及び NcoＩ部位により結合した連結配列を形成する２つのオリゴヌクレオチドCE37及びCE38から再構成した。
【００８５】
【化１】
2007130022.tif 000002
【００８６】
２つのオリゴヌクレオチドリンカー及び精製された NcoＩ−BstXＩgHフラグメントをHindIII − NotＩ消化した pIMCO５内に三重連結でクローンし、これにより HSV−２gH遺伝子により HSV−１gH遺伝子を置換した。結果として生ずるプラスミドを pIMCO８と命名した。
【００８７】
gH削除 HSV−２補足細胞系の作製
プラスミド pIMCO５は、ウイルス誘導可能gDプロモーター及びBGH(ウシ成長ホルモン）ポリＡの転写制御下に HSV−２gH遺伝子を含む。それは、G418耐性の安定な細胞系の選択のためのネオマイシン耐性遺伝子も含む。プラスミド pIMCO８を、CaPO４  技術を用いてVero (ATCC番号88020401) 細胞内に移入した（Sambrook, Fritsch 及びManiatis, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 。細胞を、G418の存在下で希釈クローニングすることにより選択し、クローン細胞系を単離した。増殖させ、凍結させた後、CR２細胞と命名されるこれらの細胞を24ウェルプレートに種つけし、0.1pfu／細胞においてgH削除 HSV−１（SC16gH) に感染させた。ウイルスプラークを、gH遺伝子の発現を確認するため注入後３日間、観察した。
【００８８】
組換えプラスミドの作製
ａ）pIMMB56 ＋
pIMMB56 ＋は、gH遺伝子の両側から HSV−２配列に隣接するlacZカセットを有するベクターである。それは次のように作られる：オリゴMB97−MB96により、及びオリゴMB57−MB58により作られた２つのPCR フラグメントを、PCR オリゴヌクレオチド内に含まれている部位に適した制限酵素で消化する。MB97−MB96フラグメントをHindIII 及び HpaＩで消化する。MB57−MB58フラグメントを HpaＩ及びEcoRＩで消化する。次にこれらのフラグメントを、HindIII 及びEcoRＩで消化されたベクターpUC119内に連結する。結果として生ずるプラスミドをpIMMB45 と呼ぶ（図１）。
【００８９】
PCR に用いられるオリゴヌクレオチドを以下に示す：
【００９０】
【化２】
2007130022.tif 000003
【００９１】
第１段階の組換えの容易な検出を許容するために、大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を、SV40プロモーターの制御下でpIMMB45 内に挿入する。SV40プロモーター＋β−ガラクトシダーゼ遺伝子をBamHＩ及び TthIII １を用いてプラスミドpCH110 (Pharmacia)から切り出す。その両端をDNA ポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて満たす。そのフラグメントをゲル精製する。プラスミドpIMMB45を HpaＩで消化し、自己連結を避けるために、ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIAP）でリン酸化し、ゲル精製する。次にゲル精製したフラグメントを一緒に連結してプラスミドpIMMB56 ＋を作る（図２を参照）。
【００９２】
ｂ）pIMMB46
pIMM46は、中心の特有の HpaＩ部位と共に、 HSV−２gH遺伝子に隣接する配列を含む。この部位内にクローンされたいずれの遺伝子もgH座において HSV−２ゲノム内に組換えにより挿入することができる。ウイルスか、TK陰性gH陰性ウイルスであるなら、（例えば上述のpIMMB56 ＋プラスミドを用いて作られた）プラスミドは、TK遺伝子の３’末端を置き換え、これによりTK活性を復元し、TK陰性ウイルスについての選択を許容する。
【００９３】
オリゴMB94−MB109 により、及びオリゴMB57−MB108 により作られた２つのPCR フラグメントを、PCR オリゴヌクレオチド内に含まれている部位に適した制限酵素で消化する。MB94−MB109 フラグメントをHindIII 及び HpaＩで消化する。MB57−MB108 フラグメントを HpaＩ及びEcoRＩで消化する。次にこれらのフラグメントを、HindIII 及びEcoRＩで消化されているベクターpUC119に連結する。結果として生ずるプラスミドをpIMMB46 と呼ぶ（図３を参照のこと）。用いたオリゴヌクレオチドは次の通りである。
【００９４】
【化３】
2007130022.tif 000004
【００９５】
ｃ）pIMC14
プラスミドpRc/CMV (Invitrogen Corporation)を制限酵素 MruＩ， PvuII及び BsmＩで消化し、1066塩基対 MruＩ− PvuIIフラグメントをアガロースゲルから単離した。そのフラグメントを HpaＩで消化されたpIMMB46 内にクローンした（図４を参照のこと）。結果として生ずるものをpIMC14と呼ぶ。
【００９６】
pRc/CMV フラグメントはサイトメガロウイルス主要即時早期プロモーター（immediate early promoter) (CMV−IEプロモーター）及びウシ成長ホルモン(BGH) ポリＡ付加部位を含む。このプラスミドpIMC14は、後に HSV−２gH削除DISCベクター内に組換えられ得る外来遺伝子の挿入のための特有の部位を有する一般的な組換えプラスミドである。
【００９７】
ｄ）pIMR１
プラスミドpIMR１は、 CMV−IEプロモーターの制御下でDISC HSV−２ベクター内へのネズミGM−CSF 遺伝子の挿入のための組換えベクターである。pIMC14を XbaＩで消化し、CIAPでホスファターゼ処理し、ゲル精製し、そして出来たオーバーハング端をクレノウポリメラーゼで平滑化する。ネズミGM−CSF 遺伝子を２段階の手順により、（Gough ら（EMBO Journal 4,  645〜653)にpGM3.2として言及される）プラスミドpGM3.2FFから、（又は以下に記載されるように作製された均等なプラスミドから）切り出す。最初に、pGM3.2FFをEcoRＩで消化し、1048塩基対フラグメントをゲル精製する。次にこのフラグメントをHinfＩ及び StuＩで消化する。495 塩基対フラグメントをゲル精製し、その端をクレノウポリメラーゼで修復する。次にこのフラグメントを上述のように調製されるpIMC14のマルチクローニング部位内にクローンする。結果として生ずるプラスミドはpIMR１と命名する（図５を参照のこと）。
【００９８】
pGM3.2と均等な他のプラスミドは次のように作製することができる。
【００９９】
cDNAクローンのライブラリーを、GM−CSF の合成がコンカナバリンＡにより誘導され得るLB３（Kelso ら（J. Immunol. 132, 2932, 1984)) のような（マウスのBALB／ｃ株からの）クローンされたＴリンパ球系から作製する。そのライブラリーを、ネズミGM−CSF 遺伝子に特異的な配列とのコロニーハイブリダイゼーションにより調査する（配列についてGough ら、EMBO J, 4, 645, 1985を参照のこと）。この場合に利用できるオリゴヌクレオチドの例は、5' TGGATGACAT GCCTGTCACA TTGAATGAAG AGGTAGAAGT 3' である。１kb超のクローンを取り、それらがGM−CSF であることを検査するために配列決定する。これらの作業は、“Molecular Cloning : A Laboratory Manual”, ed. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring  Harbor Laboratory Press に記載されるように行うことができる。このような作業により、pGM3.2について記載されるようにHinfＩ及び StuＩで切り出され得る完全なGM−CSF 配列を含むクローンを生ずる。
【０１００】
ｅ）pIMR３
プラスミドpIMR１において、GM−CSF 遺伝子についてのオープンリーディングフレームは、15塩基対の短いオープンリーディングフレーム(ORF) より先にある。これはGM−CSF の発現を妨害することができることが可能であると考えられたので、この小さな読み枠を除去するようにプラスミドpIMR１を変える。pIMR１を NotＩ及びPpuMＩで消化した。消化したベクターをウシ腸アルカリホスファターゼ（CIAP）でホスファターゼ処理してゲル精製した。２つの制限酵素部位の間の配列を、２つのオリゴヌクレオチドCE55及びCE56：
【０１０１】
【化４】
2007130022.tif 000005
【０１０２】
のアニーリングにより作られた二本鎖DNA の短い断片により置き換えた。
【０１０３】
pIMR１の消化により作られた Not１及びPpuMＩ末端に適合するオーバーハング端を有するように、オリゴヌクレオチドを作製する。２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、リン酸化し、そして NotＩ−PpuMＩで消化されたpIMR１に連結する。結果として生ずるベクターをpIMR３と命名する。関連する領域における配列を以下に示す：
【０１０４】
【化５】
2007130022.tif 000006
【０１０５】
【化６】
2007130022.tif 000007
【０１０６】
GM−CSF 蛋白質を発現する HSV−１ DISC ウイルスを作るために、異なるセットのプラスミドを作る：
ｆ）pIMMB34
これは、 HSV−１gH遺伝子に隣接する配列を含む組換えベクターである。左側に隣接する配列は、gH遺伝子に隣接して存在するTK遺伝子を不活性化する。オリゴMB97−MB100 により、及びオリゴMB61−MB58により作られた２つのPCR フラグメントをPCR オリゴヌクレオチド内に含まれている部位に適した制限酵素、で消化する。MB97−MB100 フラグメントをHindIII 及び HpaＩで消化する。MB61−MB58フラグメントを HpaＩ及びEcoRＩで消化する。次にこれらのフラグメントを、HindIII 及びEcoRＩで消化されているベクターpUC119内に連結する。結果として生ずるプラスミドをpIMMB34 と呼ぶ。用いたオリゴヌクレオチドは次の通りである：
【０１０７】
【化７】
2007130022.tif 000008
【０１０８】
ｇ）pIMMB55 ＋
第１段階の組換えの容易な検出を許容するために、大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子をSV40プロモーターの制御下でpIMMB34 内に挿入する。SV40プロモーター＋β−ガラクトシダーゼ遺伝子をBamHＩ及び TthIII １を用いてプラスミドpCH110 (Pharmacia)から切り出す。端をDNA ポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて満たす。そのフラグメントをゲル精製する。プラスミドpIMMB34 を HpaＩで消化し、自己連結を避けるためにウシ腸アルカリホスファターゼ（CIAP）でホスファターゼ処理し、ゲル精製する。次にそのゲル精製したフラグメントを一緒に連結してプラスミドpIMMB55 ＋を作る。
【０１０９】
ｈ）pIMMB63 ：
pIMMB63 を HSV−１株 KOS (ｍ）DNA から作る。pIMMB63 は、中心の特有の HpaＩ部位と共に、 HSV−１gH遺伝子に隣接する配列を含む。この部位にクローンされたいずれの遺伝子も、gH座における HSV−１ゲノムへの組換えにより挿入することができる。ウイルスが（例えば上述のpIMMB55 ＋プラスミドを用いて作られた）TK陰性ウイルスであるなら、次にプラスミドをTK遺伝子の３’末端を置換し、これによりTK活性を復元してTK陽性ウイルスについての選択を許容する。
【０１１０】
オリゴMB98−MB63により、及びオリゴMB61−MB58により作られた２つのPCR フラグメントを、PCR オリゴヌクレオチドに含まれている部位に適した制限酵素で消化する。MB98−MB63フラグメントをHindIII 及び HpaＩで消化する。MB61−MB58フラグメントを HpaＩ及びEcoRＩで消化する。次にこれらのフラグメントを、HindIII 及びEcoRＩで消化されているベクターpUC119内に連結する。結果として生ずるプラスミドをpIMMB63 と呼ぶ。用いたオリゴヌクレオチドは次の通りである：
【０１１１】
【化８】
2007130022.tif 000009
【０１１２】
ｉ）pIMX1.0
このプラスミドは、後に HSV−１gH削除DISCベクター内に組換えられ得る外来遺伝子の挿入のための特有の部位を有する一般的な組換えプラスミドである。プラスミドpRc/CMV を NruＩ及び PvuIIで消化し、CMV IEプロモーター及びポリＡシグナルを含む1066bpフラグメントをクレノウポリメラーゼで平滑断端化し、プラスミドpIMM  B63 の特有の HpaＩ部位内に挿入する。このプラスミドをpIMX1.0と命名する。CMV IEプロモーターとポリＡシグナルとの間に含まれる多種クローニング部位は、プラスミド内に他の遺伝子をクローニングし、次にDISC HSV−１内に導入するのに理想的である。
【０１１３】
ｊ）pIMX3.0
プラスミドpIMX3.0 は、タイプＩ DISC HSV の削除されたgH領域内へのCMV IEプロモーターの制御下でのネズミGM−CSF の挿入のための組換えベクターである。このプラスミドを、 SmaＩ及び DraＩでプラスミドpGM3.2FF（前掲）から切り出したネズミGM−CSF をpIMX1.0 の特有のBsaBＩ部位に挿入することにより作製した。このプラスミドpIMX3.0 はpIMR３の HSV−１均等物である。
【０１１４】
組換えウイルスの作製
GM−CSF を発現する組換えウイルスは、２段階で作ることができる。第１段階において、gH遺伝子及びTK遺伝子の部分は大腸菌lacZ遺伝子を駆動するSV40プロモーターからなる“lacZカセット”により置換される。このウイルスは、TK−表現型を有し、色原基質Ｘ−gal を含むオーバーレイ下で増殖する場合に青色のプラークも供する。この組換えウイルスは、gH座における外来遺伝子の挿入に便利には用いられ得る。遺伝子は、TK遺伝子の不適正部分に関連して挿入される。同時に、lacZカセットが除去される。これらのウイルスは、TK陽性表現型及びＸ−gal 下の白色に基づいて選択することができる。
【０１１５】
ａ）gHを置換するSV40−lacZカセットでの第１段階組換え体の作製。
組換えウイルスを、(HSV−２のための）プラスミドpIMMB56 ＋又は(HSV−１のための）pIMMB55 ＋のウイルスDNA への移入により作製した。ウイルスDNA をWalboomers及びTer Schegget（1976）Virology 74, 256〜258 に記載されるようなヨウ化ナトリウム勾配で精製する。
【０１１６】
組換えは次の通り行う：
ａ）第１段階
移入混合物を５μｇのウイルスDNA, 0.5μｇの直鎖状プラスミドDNA(制限酵素 ScaＩでの消化により直鎖状にされたもの）を１mlのHEBS緩衝液（137mM NaCl, ５mM KCl, 0.7mM Na２HPO４, 5.5mMグルコース、20mM Hepes, pH 7.05)中で混合することにより調製する。70μｌの２Ｍ CaCl２を適下して加え、静かに混合する。その培地をCR１及びCR２のサブ密集皿から除き、 500μｌの移入混合物を２つの皿の各々に加える。その細胞を、５％胎児ウシ血清(FCS）を含む増殖培地４mlを加えた場合、40分間、37℃でインキュベートする。移入混合物を加えた後４時間に、培地を除去し、その細胞を血清を含まない培地で洗浄する。その細胞を次に２分間、15％グリセロールの皿当り 500μｌで‘ショックを与える(shocked）’。グリセロールを除去した後、その細胞を血清を含まない培地で２回、洗浄し、５％FCS を含む増殖培地を加える。
【０１１７】
４〜７日後、十分なウイルスの細胞障害効果(CPE）を観察した時に、その細胞を培地にこすり取り、４℃で５分間、 2500rpmで遠心して沈殿させ、 120μｌのイーグルの最小必須培地（EMEM）中に再懸濁する。これは、野生型及び組換えウイルスを含む半日ウイルス保存液である。その保存液を凍結し、解凍して音波処理し、特定範囲の希釈度でCR１細胞上で組換え体についてスクリーニングする。その培地は、TK−ウイルスについて選択するために10μｇ／mlのアシクロビールを含む。ウイルス希釈液を加えた後、その細胞に１％低ゲル化温度アガロースを含む培地を重ねる。約３日目にウイルスのプラークが現れた後、 330μｇ／mlのXgal及び10μｇ／mlのアシクロビールを含むアガロースの第２のオーバーレイを加える。48時間以内に青いプラークを取り、CR１細胞を含む24ウェル皿（１cm２/ウェル）に移す。そのプラークを十分なCPE まで増殖させて、培地内にこすりとる。複数回のプラーク精製を、純粋なウイルスの保存液が得られるまで行う。
【０１１８】
第１段階の組換え体の構造を次の通り確認する。ヨウ化ナトリウム精製されたDNA を先のように調製し、そしてBamHＩで消化する。この消化物をアガロースゲルで分離し、ナイロン膜に移す。これをgh遺伝子の両側にその配列に相同な放射能標識DNA フラグメントでプロービングする。
【０１１９】
ｂ）第２段階
第１段階の組換え体からのウイルスDNA 並びに(HSV−２のために）プラスミドpIMR３又は(HSV−１のために）pIMX3.0 を用いて、先の通り組換えを行う。ウイルスの最初の収集の後、 0.6μＭメトトレキセート、15μＭチミジン、 9.5μＭグリシン、4.75μＭアデノシン及び4.75μＭグアノシンの存在下でBHK gH陽性TK陰性細胞を増殖させることにより、TK陰性組換えウイルスを選択する。６ウェル皿（ウェル当り10cm２)でこの選択を３回、行う。各々の段階において、感染した細胞を培地中にこすり取ることにより収集し、遠心して沈殿させ、 200μｌのEMEM中に再懸濁する。音波処理した後、この50μｌを新鮮なBHK gH陽性TK陰性細胞に加え、その選択を続ける。
【０１２０】
最後の選択の後、ウイルス感染した細胞を先の通り収集し、gH欠損 HSV１補足細胞でスクリーニングする。オーバーレイを先のように加え、白色のプラークを、Xgalの存在下で選択する。プラークを先のように取り、前記gH欠損 HSV１補足細胞で３回、プラーク精製する。
そのウイルスDNA の構造を先のように分析する。
【０１２１】
gH欠損GM−CSF 発現性変異ウイルスのワクチン能力のテスト
gH欠損GM−CSF 発現性変異ウイルスは、Farrell ら (J. Virol. 68, 927〜32, 1994）に記載されるようにマウスモデル系を用いることにより、ワクチンとしての効能についてテストすることができる。gH欠損変異ウイルス、GM−CSF 発現性ウイルス、gH欠損GM−CSF −発現性変異ウイルス、及びgH復帰変異体の 10２〜10６  プラーク形成単位(pfu）の範囲の種々の投与量を、耳翼を犠牲にすることにより、マウスのグループにワクチン接種する。対照のグループをPBS でワクチン接種する。３週間後、10６  pfu の野生型 HSV−１（株SC16）で反対側の耳翼にマウスを攻撃する。攻撃後５日目にマウスを殺し、攻撃した耳を除去し、−70℃に凍結する。その耳をホモジナイズし、各々の耳中の感染性攻撃ウイルスの量をプラークタイトレーションにより決定する。PBS 処理した対照と比較したマウスのワクチン接種されたグループ中のウイルスタイターの減少は、ウイルスワクチンにより供される保護の規準である。gH欠損ウイルスは、５×10５  pfu のワクチン投与量で感染性ウイルスの存在を完全に捨てることができ、５×10４  pfu でさえ1000倍の減少が観察される。gH欠損GM−CSF 発現性変異体が保護のレベルを増加させることができることは、gH欠損変異ウイルスワクチン接種マウスにおいてのより低い攻撃投与量でのいずれの感染性ウイルスからの完全な保護、並びにPBS ワクチン接種対照と比較した感染性ウイルスタイターのより大きな削減を観察することによりテストすることができる。gH欠損したGM−CSF 含有ウイルスは、GM−CSF 遺伝子を有さないgH欠損ウイルスと比較して抗体応答のレベルを増加させることができる。
【０１２２】
GM−CSF アッセイ
Cosl細胞(ECACC番号88031701）に、Gene Transfer and Expression (A laboratory Manual, Michael Kriegler)に記載されるようにDEAEデキストランを用いてプラスミドDNA を移入する。移入されたCosl細胞又は感染したCR２細胞からの上清をバイオアッセイによりGM−CSF 活性についてスクリーニングする。C2GMと呼ばれるIL−３／GM−CSF 反応性ネズミ造血細胞系をDr. E. Spooner (Paterson Institure for Cancer Research, Christie Hospital, UK)から得た。細胞系C2GMを、20％ウマ血清、１％グルタミン及び10％ならし細胞培地を有するフィッシャー培地中に維持する。そのならし細胞培地を、ネズミIL−３を培地に分泌するWehi36細胞(ECACC番号86013003）の培養物を指数増殖させることから得る。Wehi36細胞をRPMI1640培地、10％ FCS及び１％グルタミン中に維持する。
【０１２３】
上述の例は、gH陰性で、GM−CSF を発現する HSV−１及び HSV−２変異体の形成に関する。
【０１２４】
上記の記載は、例えば以下のように、種々の免疫調節蛋白質を発現するベクターの作製に直ちに適合させることができる。
【０１２５】
ヒトGM−CSF を発現するgH欠損 HSV２ベクターの作製
ヒトGMCSF 及びその遺伝子は、M. Cantrell ら (PNAS 82 (1985)  6250〜6254) ; F Lee ら (PNAS 82 (1985)  4360〜4364) ; G. Wong ら (Sience (1985) 228 ： 810〜815)に記載される。
【０１２６】
クローニングのためのDNA は、普通の方法でPCR 及びオリゴヌクレオチドを用いることにより得ることができ、そしてその遺伝子の操作された型は、R & D System Europe Ltd (Abingdon, OX14 3YSUK）からも市販される。
【０１２７】
その遺伝子は、哺乳動物系における発現のための天然のリーダー配列及び開始配列が５’末端に存在するのを確実にするためにDNA末端を操作することにより、そして本目的のために、相補端を（５’末端において）HindIII 部位及び（３’末端において）EcoRＩ部位に適合するように加えることにより、クローニングのために調製することができる。
【０１２８】
その調製された遺伝子は、次にHindIII とEcoRＩ部位との間にクローニングベクター pcDNA３(Invitrogen Corporation)を連結し、クローニングすることができる。その結果生ずるベクターを pcDNA３−hGMSCFと命名する。これをEcoRＩで消化し、次にHindIII で消化し、平滑断端化し、そして（上述の例に用いられるようなネズミ遺伝子の場所において）上述のようにベクターpIMC14内にクローンすることができる。
【０１２９】
次に、結果として生ずるhGMCSFを有するクローニングベクターを、例えばgH遺伝子の欠損部位においてヒトGMCSF をコードするgH削除欠損 HSV２ウイルスベクターを作製するために、本明細書に既に記載される手順を適合させるのに用いることができる。
【０１３０】
ヒトIL−２を発現するgH削除 HSV２ベクターの作製
ヒトIL−２及びその遺伝子は、T. Taniguchiら（Nature 302 (1983) (5906) 305〜310)及びEMBL配列HSILO2（IL２をコードするmRNA）に記載される；（バクテリアの発現に言及する）R. Devosら (Nucl Acids Res 11 (13) (1983) 4307〜4323）も参照のこと。
【０１３１】
クローニングのためのDNA は、普通の方法でPCR 及びオリゴヌクレオチドを用いることにより、例えばＴ細胞から得ることができ、そしてその遺伝子の操作された型は、R & D Systems Europe, Ltd(Abingdon, OX14 3YS UK）からも市販される。
【０１３２】
その遺伝子は、哺乳動物系における発現のための天然のリーダー配列及び開始配列が５’末端に存在するのを確実にするためにDNA末端を操作することにより、そして本目的のために、相補端を（５’末端において）HindIII 部位及び（３’末端において）EcoRＩ部位に適合するように加えることにより、クローニングのために調製することができる。
【０１３３】
その調製された遺伝子は、次にHindIII とEcoRＩ部位との間にクローニングベクター pcDNA３(Invitrogen Corporation)を連結し、クローニングすることができる。その結果生ずるベクターを pcDNA３−hGMSCFと命名する。これをEcoRＩで消化し、次にHindIII で消化し、平滑断端化し、そして（上述の例に用いられるようなネズミ遺伝子の場所において）上述のようにベクターpIMC14内にクローンすることができる。
【０１３４】
次に、結果として生ずるヒトIL−２を有するクローニングベクターを、例えばgH遺伝子の欠損部位においてヒトIL−２をコードするgH削除欠損 HSV２ウイルスベクターを作製するために、本明細書に既に記載される手順を適合させるのに用いることができる。
【０１３５】
その技術は、多くの他のものの中で、他のインターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、例えばIL−12、リンホタクチン、及びCD40L に直ちに適合させることができる。
【０１３６】
これにより、例えば特に本明細書に記載されるウイルスベクターを用いて、ウイルスが通常の細胞に感染し、それらの細胞中で複製及びウイルス抗原遺伝子の発現を行うことができるが通常の感染性ウイルスを生産することができないように、感染性ウイルスの生産のために本質的である選択された遺伝子に関して欠損したゲノムを有する変異体を含む免疫原又はワクチンの投与により、本明細書に言及されるもののような診断又は治療目的のために被検体を免疫化することができる。ここで前記ゲノムは、免疫調節蛋白質、好ましくは欠損した本質的な遺伝子の座においてコードされたものを発現するよう機能する異種ヌクレオチド配列も有する。
【０１３７】
ウイルスが通常の細胞に感染し、そしてこれらの細胞中で複製及びウイルス抗原の発現を行うことができるがいわゆる感染性ウイルスを生産することができないように、感染性ウイルスの生産のために本質的な第１の遺伝子に関して欠損し、そして免疫調節蛋白質をコードする異種ヌクレオチド配列を発現することもできる他の変異ウイルスの調製に、当業者はこの教授を直ちに適合させることができる。
【０１３８】
多くの他の変異ウイルスは、（例えば）以下のウイルス及びウイルスタイプにおいて、以下の本質的な遺伝子の削除又は他の不活性化に基づいて作ることができる。
【０１３９】
単純ヘルペスウイルスにおいて、gB、gD、gL、ICP４、ICP８及び／又はICP27 のような本質的な遺伝子が削除され、もしくは不活性化され、先の例に用いられるgH遺伝子のかわりに用いることができる。他のヘルペスウイルスにおいて、HSV のgB、gD、gL、gH、ICP４、ICP８及び／又はICP27 遺伝子に対するいずれかの周知の本質的な相同体のような周知の本質的な遺伝子が、削除又は他の不活性化のために選択することができる。サイトメガロウイルスは、例えばDionら (Virology 158 (1987)228〜230)から同定され得るような温度感受性変異に応答する遺伝子を削除又は活性化することにより、遺伝的に不活性化することができる。
【０１４０】
ワクチニア（vaccinia）ウイルスのようなポックスウイルスにおいて、遺伝的に不能にされたウイルスは、例えばGoebelら (Virology 179 (1990) pp 249以下）における条件致死性(conditional−lethal）温度感受性変異体に本質的なものとして、又はそれを生ずるものとして同定されたものの１つのような遺伝子を削除し又は不活性化することにより、作ることができる。
【０１４１】
遺伝的に不能にされたSV40ウイルスは、例えばＴ抗原コーディング領域を削除又は不活性化することにより作ることができる。
【０１４２】
アデノウイルスタイプ５は、例えば導入において先に言及された引用で同定されたもののような本質的な遺伝子を削除又は不活性化することにより、遺伝的に不能にすることができる。
【０１４３】
これらの例は本明細書に言及されるように用いるのにも適用することができる。
【０１４４】
先の記載において言及された実施例及び実施形態並びに添付の請求の範囲、並びに特に先の記載は詳説のためであり、限定のためではない：その範囲の種々の改良が当業者に明らかであろうし、それらは本発明の範囲に含まれる。本開示及び本発明は、言及されるような特徴の組合せ及びサブコンビネーションにまで広げられ、そして本開示はその全体が引用により本明細書に組み込まれる本明細書に言及される出版物を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、プラスミド pIMMB45の作製を示す図である。
【図２】図２は、プラスミド pIMMB56の作製を示す図である。
【図３】図３は、プラスミド pIMMB46の作製を示す図である。
【図４】図４は、プラスミド pIMC14の作製を示す図である。
【図５】図５は、プラスミド pIMR１の作製を示す図である。
【図６】図６は、プラスミド pIMR３の作製を示す図である。
【図７】図７は、本発明を説明する記載を示す組換えの図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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