(57)【要約】【課題】種々の糖鎖の合成を可能とする方法の提供。【解決手段】  下記式（Ｉ）：【化１】2007297429.tif 000058〔式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ、同一又は異なって、直線状又は分岐状の糖鎖であり、  Ｓ１は任意の糖残基であり、  ＳＡ、ＳＢは、同一又は異なる糖残基であり、  Ｌは、結合、又は直線状の糖鎖であり、  Ｘは、存在しないか、又は存在する場合には所定の基を示し、  ＳＡ、ＳＢの糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断される〕で表される、保護された糖鎖化合物及びそのライブラリ、並びにそれらの製造方法；該保護された糖鎖化合物及びライブラリをグリコシダーゼで処理することを含む、糖鎖化合物の製造方法、並びにそのグリコシダーゼ分解物；該保護された糖鎖化合物の合成中間体；試薬及びキットなど。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
保護された糖鎖化合物又はその塩であって、
下記式（Ｉ）：
【化１】
2007297429.tif 000047
〔式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ、同一又は異なって、糖残基数１〜１０の直線状の糖鎖であるか、又は糖残基数が１〜１０である、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、
Ｓ１は任意の糖残基であり、
ＳＡ、ＳＢは、同一又は異なる糖残基であり、
Ｌは、結合、又は糖残基数１〜５の直線状の糖鎖であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示し、
ＳＡ、ＳＢの糖残基、及びＲ１、Ｒ２における該保護用糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断される〕で表される、糖鎖化合物又はその塩。
【請求項２】
以下（ａ）〜（ｄ）から選ばれる１以上の特徴を有する、請求項１記載の糖鎖化合物又はその塩：
（ａ）Ｒ１、Ｒ２が直線状の糖鎖であり、かつＳＡ、ＳＢが互いに異なる糖残基である；
（ｂ）Ｒ１、Ｒ２の一方又は双方が、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、かつ保護用糖残基、及びＳＡ、ＳＢの糖残基がそれぞれ異なる；
（ｃ）Ｒ１、Ｒ２が直線状の糖鎖であり、かつＲ１におけるＳＡと隣接する糖残基及びＳＡの糖残基が互いに異なり、Ｒ２におけるＳＢと隣接する糖残基及びＳＢの糖残基が互いに異なる；
（ｄ）Ｒ１、Ｒ２の一方又は双方が、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、かつ保護用糖残基及びそれと隣接する糖残基が互いに異なり、Ｒ１におけるＳＡと隣接する糖残基及びＳＡの糖残基が互いに異なり、Ｒ２におけるＳＢと隣接する糖残基及びＳＢの糖残基が互いに異なる。
【請求項３】
以下（ａ）〜（ｃ）から選ばれる１以上の特徴を有する、請求項１記載の糖鎖化合物又はその塩：
（ａ）Ｒ１、Ｒ２が直線状の糖鎖であり、かつＲ１、Ｒ２が１種の糖残基から構成される；
（ｂ）Ｒ１、Ｒ２の一方又は双方が、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、かつＲ１、Ｒ２が、保護用糖残基を除いて、１種の糖残基から構成される；
（ｃ）Ｒ１におけるＳＡと隣接する糖残基、Ｒ２におけるＳＢと隣接する糖残基が、同一のエキソ型グリコシダーゼにより切断される。
【請求項４】
Ｒ１、Ｒ２における糖残基数がそれぞれ３〜８である、請求項１記載の糖鎖化合物又はその塩。
【請求項５】
Ｒ１、Ｒ２がそれぞれ、同一又は異なって、下記式（ｖ３）、（ｖ１４）
【化２】
2007297429.tif 000048
〔式（ｖ３）におけるＳ２〜Ｓ４、式（ｖ１４）におけるＳ２〜Ｓ６は任意の糖残基であり、式（ｖ１４）におけるＳＴ１は保護用糖残基である〕のいずれかである、請求項１記載の糖鎖化合物又はその塩。
【請求項６】
式（Ｉ）におけるＳＡ、ＳＢの糖残基、式（ｖ３）におけるＳ２〜Ｓ４の糖残基、式（ｖ１４）におけるＳ２〜Ｓ６、ＳＴ１の糖残基が、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｌ−フコース及びシアル酸からなる群より選ばれる、請求項５記載の糖鎖化合物又はその塩。
【請求項７】
保護された糖鎖化合物が、下記式（Ｉａ）：
【化３】
2007297429.tif 000049
〔式中、Ｓ１〜Ｓ９は、任意の糖残基であり、
ＳＡ、ＳＢ、ＳＣは、同一又は異なる糖残基であり、
Ｌは、結合、又は糖残基数１〜５の直線状の糖鎖であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示し、
ＳＡ、ＳＢ、ＳＣの糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断される〕で表される化合物である、請求項１記載の糖鎖化合物又はその塩。
【請求項８】
保護された糖鎖化合物が、下記式（ＩＩ）で表される化合物である、請求項１記載の糖鎖化合物又はその塩：
【化４】
2007297429.tif 000050
〔式中、ＭａｎはＤ−マンノースを示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを示し、
ＳＡ、ＳＢ、ＳＣは、同一又は異なる糖残基であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）ＧｌｃＮＡｃ中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）ＧｌｃＮＡｃ中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示し、
ＳＡ、ＳＢ、ＳＣの糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断される〕。
【請求項９】
Ｍａｎ間、ＧｌｃＮＡｃ間及びＭａｎとＧｌｃＮＡｃとの間の全ての結合様式が、天然の高マンノース型糖鎖化合物と同一の結合様式である、請求項８記載の糖鎖化合物又はその塩。
【請求項１０】
ＳＡ、ＳＢ、ＳＣの糖残基がそれぞれ異なる糖残基である、請求項８記載の糖鎖化合物又はその塩。
【請求項１１】
ＳＡがＤ−グルコースである、請求項８記載の糖鎖化合物又はその塩。
【請求項１２】
２種以上の保護された糖鎖化合物又はその塩を含むライブラリであって、
該糖鎖化合物が、下記式（Ｉ）及び（Ｉ’）：
【化５】
2007297429.tif 000051
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、Ｒ２’はそれぞれ、同一又は異なって、糖残基数１〜１０の直線状の糖鎖であるか、又は糖残基数が１〜１０である、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、
Ｓ１、Ｓ１’は、同一の糖残基であり、
ＳＡ、ＳＢ、ＳＡ’、ＳＢ’はそれぞれ、同一又は異なる糖残基であり、
Ｌは、結合、又は糖残基数１〜５の直線状の糖鎖であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１又はＳ１’の糖残基中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１又はＳ１’の糖残基中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示し、
ＳＡ、ＳＢの糖残基、及びＲ１、Ｒ２における該保護用糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断され、
ＳＡ’、ＳＢ’の糖残基、及びＲ１’、Ｒ２’における該保護用糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断される〕で表される、ライブラリ。
【請求項１３】
Ｒ１、Ｒ１’が同一の糖鎖であり、Ｒ２、Ｒ２’が同一の糖鎖であり、かつＳＡ、ＳＡ’が互いに異なる糖残基であり、ＳＢ、ＳＢ’が互いに異なる糖残基である、請求項１２記載のライブラリ。
【請求項１４】
以下（ａ）又は（ｂ）の特徴を有する、請求項１２記載のライブラリ：
（ａ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、Ｒ２’が直線状の糖鎖であり、かつＳＡ、ＳＡ’、ＳＢ、ＳＢ’の糖残基がそれぞれ異なる；
（ｂ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、Ｒ２’のうち少なくとも１つが、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、かつ保護用糖残基、及びＳＡ、ＳＡ’、ＳＢ、ＳＢ’の糖残基がそれぞれ異なる。
【請求項１５】
下記式（Ｉ’’）：
【化６】
2007297429.tif 000052
〔式中、Ｒ１’’、Ｒ２’’はそれぞれ、同一又は異なって、糖残基数１〜１０の直線状の糖鎖であるか、又は糖残基数が１〜１０である、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、
Ｓ１’’は、Ｓ１、Ｓ１’と同一の糖残基であり、
ＳＡ’’は、ＳＡ、ＳＡ’と異なる糖残基であり、ＳＢ’’は、ＳＢ、ＳＢ’と異なる糖残基であり、
Ｌは、結合、又は糖残基数１〜５の直線状の糖鎖であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１’’の糖残基中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１’’の糖残基中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示し、
ＳＡ’’、ＳＢ’’の糖残基、及びＲ１’’、Ｒ２’’における該保護用糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断される〕で表される、保護された糖鎖化合物をさらに含む、請求項１３記載のライブラリ。
【請求項１６】
糖鎖化合物の製造方法であって、
下記式（Ｉ）：
【化７】
2007297429.tif 000053
〔式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ、同一又は異なって、糖残基数１〜１０の直線状の糖鎖であるか、又は糖残基数が１〜１０である、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、
Ｓ１は任意の糖残基であり、
ＳＡ、ＳＢは、同一又は異なる糖残基であり、
Ｌは、結合、又は糖残基数１〜５の直線状の糖鎖であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示し、
ＳＡ、ＳＢの糖残基、及びＲ１、Ｒ２における該保護用糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断される〕で表される、保護された糖鎖化合物又はその塩を、グリコシダーゼで処理して糖鎖化合物を得ることを含む、方法。
【請求項１７】
糖鎖化合物の製造方法であって、
２種以上の保護された糖鎖化合物又はその塩を含むライブラリを、グリコシダーゼで処理することを含み、
該糖鎖化合物が、下記式（Ｉ）及び（Ｉ’）：
【化８】
2007297429.tif 000054
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、Ｒ２’はそれぞれ、同一又は異なって、糖残基数１〜１０の直線状の糖鎖であるか、又は糖残基数が１〜１０である、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、
Ｓ１、Ｓ１’は、同一の糖残基であり、
ＳＡ、ＳＢ、ＳＡ’、ＳＢ’はそれぞれ、同一又は異なる糖残基であり、
Ｌは、結合、又は糖残基数１〜５の直線状の糖鎖であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１又はＳ１’の糖残基中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１又はＳ１’の糖残基中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示し、
ＳＡ、ＳＢの糖残基、及びＲ１、Ｒ２における該保護用糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断され、
ＳＡ’、ＳＢ’の糖残基、及びＲ１’、Ｒ２’における該保護用糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断される〕で表される、方法。
【請求項１８】
天然に存在する糖鎖と同一構造を有する糖鎖の非還元末端に少なくとも１つの糖残基が導入されている、保護された糖鎖化合物を合成し、合成された糖鎖化合物をグリコシダーゼで処理して糖鎖化合物を得ることを含む、糖鎖化合物の製造方法。
【請求項１９】
糖鎖化合物又はその塩であって、
下記式（ＩＩ）：
【化９】
2007297429.tif 000055
〔式中、ＭａｎはＤ−マンノースを示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを示し、
ＳＡ、ＳＢ、ＳＣはそれぞれ、同一又は異なる糖残基であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）ＧｌｃＮＡｃ中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）ＧｌｃＮＡｃ中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示し、
ＳＡ、ＳＢ、ＳＣの糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断される〕で表される、保護された高マンノース型糖鎖化合物を、グリコシダーゼにより分解することにより得られ、かつ
（ａ）ＳＢ、ＳＣの糖残基の一方又は双方を保持する化合物；又は
（ｂ）ＳＡとして、α−Ｄ−グルコース以外の糖残基を保持する化合物。
【請求項２０】
下記式（ＩＩａ１）〜（ＩＩａ４）、（ＩＩａ８）、（ＩＩｂ４）〜（ＩＩｂ５）、（ＩＩｂ１４）のいずれかの糖鎖化合物又はその塩：
【化１０】
2007297429.tif 000056
〔式中、ＭａｎはＤ−マンノースを示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを示し、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）ＧｌｃＮＡｃ中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）ＧｌｃＮＡｃ中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示し、
ＳＡ、ＳＢ、ＳＣの糖残基はそれぞれ異なって、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｌ-フコース、シアル酸からなる群より選ばれる糖残基である〕。
【請求項２１】
糖鎖化合物又はその塩であって、
下記式（ＩＰ）：
【化１１】
2007297429.tif 000057
〔式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ、同一又は異なって、糖残基数１〜１０の直線状の糖鎖であるか、又は糖残基数が１〜１０である、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、
Ｓ１は任意の糖残基であり、
ＰＡ、ＰＢは、互いに異なるヒドロキシ保護基であり、
Ｌは、結合、又は糖残基数１〜５の直線状の糖鎖であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示す〕で表される、糖鎖化合物又はその塩。
【請求項２２】
請求項１記載の糖鎖化合物又はその塩、請求項１２記載のライブラリあるいはそれらのグリコシダーゼ分解物又はその塩、あるいは請求項２０記載の糖鎖化合物又はその塩を含む、試薬又はキット。
【請求項２３】
以下（ａ）及び（ｂ）を含む、キット：
（ａ）請求項１記載の糖鎖化合物又はその塩、又は請求項１２記載のライブラリ；
（ｂ）１以上のグリコシダーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、保護された糖鎖化合物及びそのライブラリ、並びにそれらの製造方法；保護された糖鎖化合物及びそのライブラリをグリコシダーゼにより処理することを含む、糖鎖化合物の製造方法、並びにそのグリコシダーゼ分解物；保護された糖鎖化合物の合成中間体；保護された糖鎖化合物及びそのライブラリを含む試薬及びキットなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖生物学において最近特に注目を集め世界各国で活発な研究が行われているものとして、糖鎖と細胞内レクチン/分子シャペロンとの相互作用による新生タンパク質の品質管理機構（quality control）が挙げられる。粗面小胞体においてタンパク質の多くはグルコース３個、マンノース９個、Ｎ−アセチルグルコサミン２個からなる１４糖（Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）により修飾される。タンパク質に結合したこのような糖鎖は、グリコシダーゼにより分解されて１２糖（ＧｌｃＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２。下記参照）を生じ、次いで糖鎖部分は糖加水分解酵素によりトリミングに供されるが、このトリミング過程で生じる種々の糖鎖構造とポリペプチド部分を厳密に認識するレクチン様タンパク質が存在し、正しい高次構造をとっているタンパク質をゴルジ体へと送り出したり、未成熟タンパク質が正しい高次構造を取るまで小胞体へ留め置いたり、また高次構造を取れなかった不良タンパク質を小胞体関連分解へと導くと考えられている。この様に小胞体内ではグルコシダーゼ、グルコース転移酵素、レクチン様タンパク質等と糖鎖との相互作用が絡み合ってタンパク質の品質管理が行なわれていると考えられている。
【０００３】
【化１】
2007297429.tif 000002
【０００４】
【化２】
2007297429.tif 000003
【０００５】
現在、糖鎖の分離、分析技術の向上に伴い、天然物から多種類の糖鎖サンプルが得られるようになってきている。しかし、糖鎖の機能解析、あるいは種々の製品及び方法への応用を可能とするのに十分な量の目的糖鎖（例、以下に示される、グリコシダーゼ分解により高マンノース型糖鎖から生成する糖鎖）を、天然物から精製することは困難である。従って、天然に存在する種々の糖鎖（糖鎖ライブラリ）のより容易な入手を可能とする方法の開発が求められている。
【０００６】
【化３】
2007297429.tif 000004
【０００７】
これまでに、糖鎖ライブラリを作製する方法としては、酵素を用いる方法が知られている。例えば、非特許文献１には、酵素により糖鎖ライブラリを作製する方法として、グリコシダーゼとグリコシルトランスフェラーゼとを組み合わせて、アスパラギン結合型糖鎖の限定分解および糖鎖伸長反応を繰り返すことにより種々の糖鎖へと変換することが記載されている。しかしながら、このような方法では、糖鎖化合物が、例えば、上述した高マンノース型糖鎖のように、その隣接する糖残基に同一の結合様式（α１−２結合）で結合している同種の糖残基（Ｄ−マンノース）を有する複数の非還元末端を有する場合、グリコシダーゼとグリコシルトランスフェラーゼを作用させても、当該複数の非還元末端において同様の反応が生じるため、先に示したような、高マンノース型糖鎖から生成する種々の天然糖鎖を特異的かつ系統的に製造できないという問題点がある。
【非特許文献１】Kajihara et al., Chemistry-A European Journal Vol.10: 971-985 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、種々の糖鎖（糖鎖ライブラリ）のより容易な入手を可能とする新規方法論を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、異なるグリコシダーゼにより選択的に除去可能な糖残基が糖鎖の各末端に導入されている、末端が糖残基により保護された糖鎖化合物を合成し、次いでこのように合成された糖鎖化合物を、グリコシダーゼによる加水分解反応に供することで、種々の糖鎖化合物を特異的かつ系統的に製造できることを見出した。天然糖鎖化合物を特異的かつ系統的に作製するため、天然糖鎖化合物と同一構造を有する糖鎖化合物の非還元末端に糖残基が導入された、天然糖鎖と非同一構造を有する糖鎖化合物をあえて有機合成することにより、グリコシダーゼによる切断特異性を確保するという思想は、これまでに全く知られていない。酵素法は容易に行うことができ、また、並行して同時に反応をかけることも可能である。従って、本発明者らの方法によれば、基盤となる糖鎖化合物（末端が糖残基により保護された糖鎖化合物）を一旦合成しさえすれば、種々の糖鎖化合物への変換（ライブラリの構築）を容易に行うことが可能となる。さらに、還元末端部分に蛍光物質等のタグを導入した非天然型糖鎖の製造にも応用でき、糖鎖プローブライブラリの構築も可能となる。本発明者らはこのような種々の利点を有する方法の開発に成功し、以って本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の発明などを提供する：
[１]保護された糖鎖化合物又はその塩であって、
下記式（Ｉ）：
【００１１】
【化４】
2007297429.tif 000005
【００１２】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ、同一又は異なって、糖残基数１〜１０の直線状の糖鎖であるか、又は糖残基数が１〜１０である、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、
Ｓ１は任意の糖残基であり、
ＳＡ、ＳＢは、同一又は異なる糖残基であり、
Ｌは、結合、又は糖残基数１〜５の直線状の糖鎖であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示し、
ＳＡ、ＳＢの糖残基、及びＲ１、Ｒ２における該保護用糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断される〕で表される、糖鎖化合物又はその塩。
[２]以下（ａ）〜（ｄ）から選ばれる１以上の特徴を有する、上記[１]の糖鎖化合物又はその塩：
（ａ）Ｒ１、Ｒ２が直線状の糖鎖であり、かつＳＡ、ＳＢが互いに異なる糖残基である；
（ｂ）Ｒ１、Ｒ２の一方又は双方が、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、かつ保護用糖残基、及びＳＡ、ＳＢの糖残基がそれぞれ異なる；
（ｃ）Ｒ１、Ｒ２が直線状の糖鎖であり、かつＲ１におけるＳＡと隣接する糖残基及びＳＡの糖残基が互いに異なり、Ｒ２におけるＳＢと隣接する糖残基及びＳＢの糖残基が互いに異なる；
（ｄ）Ｒ１、Ｒ２の一方又は双方が、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、かつ保護用糖残基及びそれと隣接する糖残基が互いに異なり、Ｒ１におけるＳＡと隣接する糖残基及びＳＡの糖残基が互いに異なり、Ｒ２におけるＳＢと隣接する糖残基及びＳＢの糖残基が互いに異なる。
[３]以下（ａ）〜（ｃ）から選ばれる１以上の特徴を有する、上記[１]の糖鎖化合物又はその塩：
（ａ）Ｒ１、Ｒ２が直線状の糖鎖であり、かつＲ１、Ｒ２が１種の糖残基から構成される；
（ｂ）Ｒ１、Ｒ２の一方又は双方が、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、かつＲ１、Ｒ２が、保護用糖残基を除いて、１種の糖残基から構成される；
（ｃ）Ｒ１におけるＳＡと隣接する糖残基、Ｒ２におけるＳＢと隣接する糖残基が、同一のエキソ型グリコシダーゼにより切断される。
[４]Ｒ１、Ｒ２における糖残基数がそれぞれ３〜８である、上記[１]の糖鎖化合物又はその塩。
[５]Ｒ１、Ｒ２がそれぞれ、同一又は異なって、下記式（ｖ３）、（ｖ１４）
【００１３】
【化５】
2007297429.tif 000006
【００１４】
〔式（ｖ３）におけるＳ２〜Ｓ４、式（ｖ１４）におけるＳ２〜Ｓ６は任意の糖残基であり、式（ｖ１４）におけるＳＴ１は保護用糖残基である〕のいずれかである、上記[１]の糖鎖化合物又はその塩。
[６]式（Ｉ）におけるＳＡ、ＳＢの糖残基、式（ｖ３）におけるＳ２〜Ｓ４の糖残基、式（ｖ１４）におけるＳ２〜Ｓ６、ＳＴ１の糖残基が、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｌ−フコース及びシアル酸からなる群より選ばれる、上記[５]の糖鎖化合物又はその塩。
[７]保護された糖鎖化合物が、下記式（Ｉａ）：
【００１５】
【化６】
2007297429.tif 000007
【００１６】
〔式中、Ｓ１〜Ｓ９は、任意の糖残基であり、
ＳＡ、ＳＢ、ＳＣは、同一又は異なる糖残基であり、
Ｌは、結合、又は糖残基数１〜５の直線状の糖鎖であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示し、
ＳＡ、ＳＢ、ＳＣの糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断される〕で表される化合物である、上記[１]の糖鎖化合物又はその塩。
[８]保護された糖鎖化合物が、下記式（ＩＩ）で表される化合物である、上記[１]の糖鎖化合物又はその塩：
【００１７】
【化７】
2007297429.tif 000008
【００１８】
〔式中、ＭａｎはＤ−マンノースを示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを示し、
ＳＡ、ＳＢ、ＳＣは、同一又は異なる糖残基であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）ＧｌｃＮＡｃ中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）ＧｌｃＮＡｃ中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示し、
ＳＡ、ＳＢ、ＳＣの糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断される〕。
[９]Ｍａｎ間、ＧｌｃＮＡｃ間及びＭａｎとＧｌｃＮＡｃとの間の全ての結合様式が、天然の高マンノース型糖鎖化合物と同一の結合様式である、上記[８]の糖鎖化合物又はその塩。
[１０]ＳＡ、ＳＢ、ＳＣの糖残基がそれぞれ異なる糖残基である、上記[８]の糖鎖化合物又はその塩。
[１１]ＳＡがＤ−グルコースである、上記[８]の糖鎖化合物又はその塩。
[１２]２種以上の保護された糖鎖化合物又はその塩を含むライブラリであって、
該糖鎖化合物が、下記式（Ｉ）及び（Ｉ’）：
【００１９】
【化８】
2007297429.tif 000009
【００２０】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、Ｒ２’はそれぞれ、同一又は異なって、糖残基数１〜１０の直線状の糖鎖であるか、又は糖残基数が１〜１０である、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、
Ｓ１、Ｓ１’は、同一の糖残基であり、
ＳＡ、ＳＢ、ＳＡ’、ＳＢ’はそれぞれ、同一又は異なる糖残基であり、
Ｌは、結合、又は糖残基数１〜５の直線状の糖鎖であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１又はＳ１’の糖残基中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１又はＳ１’の糖残基中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示し、
ＳＡ、ＳＢの糖残基、及びＲ１、Ｒ２における該保護用糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断され、
ＳＡ’、ＳＢ’の糖残基、及びＲ１’、Ｒ２’における該保護用糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断される〕で表される、ライブラリ。
[１３]Ｒ１、Ｒ１’が同一の糖鎖であり、Ｒ２、Ｒ２’が同一の糖鎖であり、かつＳＡ、ＳＡ’が互いに異なる糖残基であり、ＳＢ、ＳＢ’が互いに異なる糖残基である、上記[１２]のライブラリ。
[１４]以下（ａ）又は（ｂ）の特徴を有する、上記[１２]のライブラリ：
（ａ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、Ｒ２’が直線状の糖鎖であり、かつＳＡ、ＳＡ’、ＳＢ、ＳＢ’の糖残基がそれぞれ異なる；
（ｂ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’、Ｒ２’のうち少なくとも１つが、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、かつ保護用糖残基、及びＳＡ、ＳＡ’、ＳＢ、ＳＢ’の糖残基がそれぞれ異なる。
[１５]下記式（Ｉ’’）：
【００２１】
【化９】
2007297429.tif 000010
【００２２】
〔式中、Ｒ１’’、Ｒ２’’はそれぞれ、同一又は異なって、糖残基数１〜１０の直線状の糖鎖であるか、又は糖残基数が１〜１０である、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、
Ｓ１’’は、Ｓ１、Ｓ１’と同一の糖残基であり、
ＳＡ’’は、ＳＡ、ＳＡ’と異なる糖残基であり、ＳＢ’’は、ＳＢ、ＳＢ’と異なる糖残基であり、
Ｌは、結合、又は糖残基数１〜５の直線状の糖鎖であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１’’の糖残基中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１’’の糖残基中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示し、
ＳＡ’’、ＳＢ’’の糖残基、及びＲ１’’、Ｒ２’’における該保護用糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断される〕で表される、保護された糖鎖化合物をさらに含む、上記[１３]のライブラリ。
[１６]上記式（Ｉ）で表される保護された糖鎖化合物又はその塩を、グリコシダーゼで処理して糖鎖化合物を得ることを含む、糖鎖化合物の製造方法。
[１７]上記式（Ｉ）及び（Ｉ’）で表される、２種以上の保護された糖鎖化合物又はその塩を含むライブラリを、グリコシダーゼで処理することを含む、糖鎖化合物の製造方法。
[１８]天然に存在する糖鎖と同一構造を有する糖鎖の非還元末端に少なくとも１つの糖残基が導入されている、保護された糖鎖化合物を合成し、合成された糖鎖化合物をグリコシダーゼで処理して糖鎖化合物を得ることを含む、糖鎖化合物の製造方法。
[１９]糖鎖化合物又はその塩であって、
上記式（ＩＩ）で表される保護された高マンノース型糖鎖化合物を、グリコシダーゼにより分解することにより得られ、かつ
（ａ）ＳＢ、ＳＣの糖残基の一方又は双方を保持する化合物；又は
（ｂ）ＳＡとして、α−Ｄ−グルコース以外の糖残基を保持する化合物。
[２０]下記式（ＩＩａ１）〜（ＩＩａ４）、（ＩＩａ８）、（ＩＩｂ４）〜（ＩＩｂ５）、（ＩＩｂ１４）のいずれかの糖鎖化合物又はその塩：
【００２３】
【化１０】
2007297429.tif 000011
【００２４】
〔式中、ＭａｎはＤ−マンノースを示し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを示し、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）ＧｌｃＮＡｃ中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）ＧｌｃＮＡｃ中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示し、
ＳＡ、ＳＢ、ＳＣの糖残基はそれぞれ異なって、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｌ-フコース、シアル酸からなる群より選ばれる糖残基である〕。
[２１]糖鎖化合物又はその塩であって、
下記式（ＩＰ）：
【００２５】
【化１１】
2007297429.tif 000012
【００２６】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ、同一又は異なって、糖残基数１〜１０の直線状の糖鎖であるか、又は糖残基数が１〜１０である、保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、
Ｓ１は任意の糖残基であり、
ＰＡ、ＰＢは、互いに異なるヒドロキシ保護基であり、
Ｌは、結合、又は糖残基数１〜５の直線状の糖鎖であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示す〕で表される、糖鎖化合物又はその塩。
[２２]上記[１]の糖鎖化合物又はその塩、上記[１２]のライブラリあるいはそれらのグリコシダーゼ分解物又はその塩、あるいは上記[２０]の糖類化合物又はその塩を含む、試薬又はキット。
[２３]以下（ａ）及び（ｂ）を含む、キット：
（ａ）上記[１]の糖鎖化合物又はその塩、又は上記[１２]のライブラリ；
（ｂ）１以上のグリコシダーゼ。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の保護された糖鎖化合物及びその塩、並びにそれらを含むライブラリは、種々の糖鎖化合物の特異的かつ系統的な製造などを可能にするため有用である。
本発明の保護された糖鎖化合物及びその塩、並びにそれらを含むライブラリをグリコシダーゼで処理することにより得られる糖鎖化合物及びその塩、並びにそれらを含むライブラリは、生理活性を有する天然糖鎖の生成反応における中間体又はその集合体などとして有用である。
本発明の合成中間体は、本発明の保護された糖鎖化合物及びその塩、並びにそれらを含むライブラリの容易な作製などを可能にするため有用である。
本発明はまた、上述したような糖鎖化合物及びその塩、並びにそれらを含むライブラリの製造方法、並びにこのような糖鎖化合物及びその塩、並びにそれらを含むライブラリを含む試薬及びキットなどを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
（１．保護された糖鎖化合物及びその製造方法）
本発明は、保護された糖鎖化合物又はその塩を提供する。
【００２９】
本明細書中で用いる場合、「保護された糖鎖化合物」における「保護」とは、異なるエキソ型グリコシダーゼにより選択的に除去可能な糖残基を糖鎖の各非還元末端に有することをいう。従って、本発明における保護された糖鎖化合物は、異なるエキソ型グリコシダーゼにより選択的に除去可能な糖残基を、２以上の糖鎖の非還元末端に有する糖鎖化合物であり得る。このような保護された糖鎖化合物としては、例えば、（ａ）異種の糖残基を２以上の糖鎖末端に有する糖鎖化合物、（ｂ）同種の糖残基を２以上の糖鎖末端に有するが、該糖残基とその隣接する糖残基との間の結合様式がそれぞれ異なる糖鎖化合物、（ｃ）上記（ａ）及び（ｂ）の組合せを有する糖鎖化合物が挙げられる。
【００３０】
「保護された糖鎖化合物」における「糖鎖化合物」は、天然に存在する糖鎖と同一構造を共有する化合物（糖組成、糖配置パターン及び糖間結合様式が一致する構造からなる化合物、又はそのような構造を部分構造として含む化合物）、又は天然に存在しない、新たに設計された糖鎖化合物（それ故、任意の糖組成、糖配置パターン及び糖間結合様式を有し得る糖鎖化合物）であり得る。天然に存在する糖鎖としては、例えば、タンパク質（ペプチド）中に見出されるアスパラギン残基に結合するＮ結合型糖鎖（例、高マンノース型糖鎖、複合型糖鎖、混成型糖鎖）、タンパク質中に見出されるセリン又はスレオニン残基に結合するＯ結合型糖鎖（例、ムチン型糖鎖ＣＯＲＥ１〜８、動物ジストログリカン糖鎖）、Ｎｏｔｃｈ糖鎖が挙げられる。
【００３１】
以下、本発明における保護された糖鎖化合物を、必要に応じて「本発明の保護化合物」と省略することがある。また、本発明の保護化合物における糖鎖末端（非還元末端）に存在する糖残基を、必要に応じて「末端糖残基」と省略することがある。例えば、末端糖残基は、後述するＳＡ、ＳＢ（及び存在する場合、ＳＣ、ＳＤ）、並びに保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖（例、Ｒ１、Ｒ２）における保護用糖残基（例、ＳＴ１、ＳＴ２）であり得る。
【００３２】
詳細には、本発明の保護化合物は、例えば、上記式（Ｉ）で表される化合物であり得る。
【００３３】
上記式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ、同一又は異なって、直線状の糖鎖、又は保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり得る。「保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖」における「保護用糖残基」とは、エキソ型グリコシダーゼにより選択的に除去可能である、分岐鎖末端に存在する糖残基をいう（例、後述の（ｖ５）、（ｖ１３）、（ｖ１４）、（ｖ２７）におけるＳＴ１、ＳＴ２参照）。従って、「保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖」は、ＳＡ、ＳＢ、及び他の保護用糖残基（複数の分岐構造を有する場合）を選択的に除去可能なエキソ型グリコシダーゼと異なるエキソ型グリコシダーゼにより選択的に除去可能な糖残基が分岐鎖の末端に導入されている糖鎖であり得る。
【００３４】
Ｒ１、Ｒ２の糖鎖における糖残基数は特に限定されないものの、例えば、１〜２０であり得る。該糖残基数の上限値は、好ましくは１５以下、より好ましくは１０以下、さらにより好ましくは８以下、最も好ましくは７、６又は５以下であり得る。該糖残基数の下限値は、１以上、好ましくは２以上、より好ましくは３、４又は５以上であり得る。
【００３５】
「保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖」は、１以上の分岐構造を有する糖鎖である限り特に限定されないが、有機合成の容易さの観点から分岐数はより少ないことが好ましく、例えば４以下、好ましくは３以下、より好ましくは２以下、最も好ましくは１であり得る。
【００３６】
より詳細には、Ｒ１、Ｒ２は、以下（ｖ１）〜（ｖ４３）からなる群より選ばれる糖鎖構造を有するものであり得る。ここで、Ｓ２〜Ｓ８は任意の糖残基であり、ＳＴ１又はＳＴ２は保護用糖残基であり得る。なお、下記の実施例では、Ｒ１、Ｒ２における糖鎖構造として、（ｖ３）、（ｖ１４）を実際に作製している。従って、Ｒ１とＲ２との組合せとしては、以下の糖鎖構造のうち、（ｖ３）と（ｖ１４）との組合せ、（ｖ３）と（ｖ３）との組合せ、（ｖ１４）と（ｖ１４）との組合せであることもまた好ましいが、天然糖鎖（例、高マンノース型糖鎖、複合型糖鎖、混成型糖鎖）と同一構造もまた好ましいという観点からは、（ｖ３）と（ｖ１４）との組合せ、（ｖ１４）と（ｖ１４）との組合せがより好ましい。また、天然糖鎖と同一構造が好ましいという観点からは、Ｒ１、Ｒ２として、（ｖ１）もまた好ましい。
【００３７】
【化１２】
2007297429.tif 000013
【００３８】
【化１３】
2007297429.tif 000014
【００３９】
例えば、上記式（Ｉ）で表される化合物は、天然に存在する糖鎖化合物と共通する糖鎖骨格を有する化合物であることもまた好ましい。このような化合物としては、上記式（Ｉａ）で表される糖鎖化合物、下記式（Ｉｂ）：
【００４０】
【化１４】
2007297429.tif 000015
【００４１】
〔式中、Ｓ１〜Ｓ１１は、任意の糖残基であり、
ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤはそれぞれ、同一又は異なる糖残基であり、
Ｌは、結合、又は糖残基数１〜５の直線状の糖鎖であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示し、
ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤの糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断される〕で表される化合物、あるいは
下記式（Ｉｃ）：
【００４２】
【化１５】
2007297429.tif 000016
【００４３】
〔式中、Ｓ１〜Ｓ３は、任意の糖残基であり、
ＳＡ、ＳＢは、同一又は異なる糖残基であり、
Ｌは、結合、又は糖残基数１〜５の直線状の糖鎖であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示し、
ＳＡ、ＳＢの糖残基はそれぞれ、異なるエキソ型グリコシダーゼにより切断される〕で表される化合物であってもよい。
【００４４】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（ｖ１）〜（ｖ４３）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｌの糖鎖を構成する糖残基、並びにＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤ、ＳＴ１、ＳＴ２、Ｓ１〜Ｓ１１の糖残基としては、例えば、ペントース、ヘキソース、ヘプトースが挙げられる。糖残基はまた、アルドース又はケトースであり得る。糖残基はさらに、Ｄ体又はＬ体であり得る。上記糖残基のなかでも、Ｒ１、Ｒ２の糖鎖を構成する糖残基、並びにＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤ、ＳＴ１、ＳＴ２、Ｓ２〜Ｓ１１の糖残基、特に、ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤ、ＳＴ１、ＳＴ２の糖残基としては、これまでに種々の特異的エキソ型グリコシダーゼが単離されていることから、このようなエキソ型グリコシダーゼにより選択的に切断され得る、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｌ−フコース、Ｄ−キシロース、シアル酸が好ましい。
【００４５】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（ｖ１）〜（ｖ４３）中、Ｒ１、Ｒ２の糖鎖を構成する糖残基、並びにＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤ、ＳＴ１、ＳＴ２、Ｓ２〜Ｓ１１の糖残基、特に、ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤ、ＳＴ１、ＳＴ２の糖残基はまた、これらを切断するエキソ型グリコシダーゼの観点から特徴付けることができる。これらの糖残基を切断するエキソ型グリコシダーゼとしては特に限定されないが、例えば、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、キシラナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＧｌｃＮＡｃａｓｅ）、Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼが挙げられる。また、Ｒ１、Ｒ２の糖鎖を構成する糖残基、Ｓ２〜Ｓ１１の糖残基は、これを切断するエンド型グリコシダーゼの観点から特徴付けることもできる。これらの糖残基を切断するエンド型グリコシダーゼとしては特に限定されないが、例えば、エンドマンノシダーゼ、エンドＮ-アセチルグルコサミニダーゼが挙げられる。エキソ型及びエンド型グリコシダーゼについては、例えば、Ernst et al., 「Carbohydrates in Chemistry and Biology」Part II Biology of Saccharides, Vol.3, Biosynthesis and Degradation of Glycoconjugates, WILEY-VCHを参照のこと。
【００４６】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（ｖ１）〜（ｖ４３）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｌの糖鎖を構成する糖残基、並びにＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤ、ＳＴ１、ＳＴ２、Ｓ１〜Ｓ１１の糖残基における糖間結合様式は、任意の結合様式でありα又はβ結合のいずれでもよい。上記のなかでも、Ｒ１、Ｒ２の糖鎖を構成する糖残基、並びにＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤ、ＳＴ１、ＳＴ２、Ｓ２〜Ｓ１１の糖残基、特にＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤ、ＳＴ１、ＳＴ２の糖残基における糖間結合様式は、糖残基の種類に応じて所定のグリコシダーゼにより選択的に切断され得る結合様式である限り限定されない。より詳細には、このような結合様式としては、α１−２結合、α１−３結合、α１−４結合、α１−５結合、α１−６結合、β１−２結合、β１−３結合、β１−４結合、β１−５結合、β１−６結合が挙げられる。また、シアル酸等のケトースは２位のヒドロキシ基を結合に利用することから、結合様式としては、α２−２結合、α２−３結合、α２−４結合、α２−５結合、α２−６結合もまた挙げることができる。本発明の保護化合物は、例えば、天然糖鎖と同一の結合様式を有し得る。
【００４７】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）中、Ｌの糖鎖を構成する糖残基は特に限定されないが、天然糖鎖との同一性の観点からは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが好ましい。また、Ｌの糖鎖を構成する糖残基数は特に限定されず、例えば、０（即ち、結合）〜１０個、好ましくは０〜５個、より好ましくは０〜３個であり得るが、天然糖鎖との同一性の観点からは０又は２個が好ましい。同様の観点から、Ｌの糖鎖を構成する糖残基間の結合様式としてはβ１−４結合が好ましい。
【００４８】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）中、Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示す。上記（ｉｉ）におけるヒドロキシル保護基が結合するヒドロキシル基、上記（ｉｉｉ）におけるアミノ基に置換されるヒドロキシル基の数は特に限定されず、例えば１〜３個であり得るが、１又は２個が好ましく、１個がより好ましい。（ｉｉ）におけるヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質が結合するヒドロキシル基、及び上記（ｉｉｉ）におけるアミノ基（アミノ保護基又は機能性物質が結合していてもよい）に置換されるヒドロキシル基の位置は特に限定されず、例えば６員環の糖残基については１位、２位、３位、４位及び６位のヒドロキシル基、５員環の糖残基については１位、２位、３位及び５位のヒドロキシル基が挙げられるが、例えば、天然糖鎖と同じ位置のヒドロキシル基を利用するという観点からは、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）ではそれぞれ１位のヒドロキシル基が利用され得る。
【００４９】
Ｘにおけるヒドロキシ保護基、アミノ保護基は、後述するものと同様であり得る。アミノ酸残基としては特に限定されるものではないが、天然物中に見出される糖鎖結合アミノ酸残基が好ましく、このようなアミノ酸残基としては、例えば、Ｎ結合型糖鎖が結合するアスパラギン、Ｏ結合型糖鎖が結合するセリン／スレオニンが挙げられる。機能性物質としては、例えば、標識用物質、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン、ベンゾフェノン、メトトレキセート）、ペプチド（例、分泌ペプチド、塩基性ペプチド、酸性ペプチド）、並びにこれらの物質にリンカー（例えば、−ＮＨ−、−Ｏ−、Ｃ１−１０（例、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル等のＣ１−６アルキル）及びこれらの組合せ）などを結合させた化合物が挙げられる。標識用物質としては、例えば、蛍光物質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ）、発色物質（例、パラニトロフェニル基）、放射性同位体（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ）含有物、反応性置換基（例、ハロアミド基、チオール基）、光親和性置換基（例、ベンゾフェノン誘導体、ジアジリン誘導体、アジド基）が挙げられる。
【００５０】
一実施形態では、本発明の保護化合物は、エキソ型グリコシダーゼによる切断の選択性の観点より、末端糖残基の種類が異なるか、又は末端糖残基が同種であってもその結合様式が異なり得る。ここで、基本的には、結合様式が異なれば選択的な糖残基の除去は可能であるが、利用可能な酵素の選び易さの観点より、末端糖残基の種類が異なることが好ましい。従って、上記式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２が直線状の糖鎖であるとき、ＳＡ、ＳＢは互いに異なる種類の糖残基であってもよい。Ｒ１、Ｒ２の一方又は双方が１以上の保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であるとき、該保護用糖残基及びＳＡ、ＳＢのうち少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは全ての糖残基が、それぞれ異なる種類の糖残基であってもよい。また、上記式（Ｉａ）中、ＳＡ、ＳＢ、ＳＣはそれぞれ、異なる種類の糖残基であってもよい。上記式（Ｉｂ）中、ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤはそれぞれ、異なる種類の糖残基であってもよい。上記式（Ｉｃ）中、ＳＡ、ＳＢはそれぞれ、異なる種類の糖残基であってもよい。
【００５１】
別の実施形態では、本発明の保護化合物は、糖鎖の各末端に対して異なるグリコシダーゼ切断性を付与することにより末端を保護するという観点から、末端糖残基とそれと隣接する糖残基の種類が異なり得る。従って、上記式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２が直線状の糖鎖であるとき、Ｒ１におけるＳＡと隣接する糖残基及びＳＡの糖残基、及び／又はＲ２におけるＳＢと隣接する糖残基及びＳＢの糖残基は互いに異なり得る。Ｒ１、Ｒ２の一方又は双方が保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であるとき、該保護用糖残基及びそれと隣接する糖残基の間、Ｒ１におけるＳＡと隣接する糖残基及びＳＡの糖残基の間、及びＲ２におけるＳＢと隣接する糖残基及びＳＢの糖残基の間のうち、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは全ての糖残基の間で、糖残基の種類が異なり得る。また、上記式（Ｉａ）中、Ｓ４とＳＡとの間、Ｓ７とＳＢとの間、Ｓ９とＳＣとの間のうち、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは全ての糖残基の間で、糖残基の種類が異なり得る。上記式（Ｉｂ）中、Ｓ４とＳＡとの間、Ｓ９とＳＢとの間、Ｓ６とＳＣとの間、Ｓ１１とＳＤとの間のうち、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは全ての糖残基の間で、糖残基の種類が異なり得る。上記式（Ｉｃ）中、Ｓ２とＳＡとの間、及び／又はＳ３とＳＢとの間で、糖残基の種類が異なり得る。
【００５２】
別の実施形態では、本発明の保護化合物は、それに含まれる２以上の糖鎖（但し、末端糖残基を除く）において、糖組成及び／又は糖間結合様式が類似するものであり得る。従って、上記式（Ｉ）中、Ｒ１とＲ２との間において、それらを構成する糖残基の種類及び／又は結合様式が全て一致する構造（完全同一構造）を有していてもよく、あるいは部分的に一致する構造（部分同一構造）を有していてもよい。また、上記式（Ｉａ）中、ａ）Ｓ２〜Ｓ４から構成される糖鎖、ｂ）Ｓ５〜Ｓ７から構成される糖鎖、ｃ）Ｓ５、Ｓ８、Ｓ９から構成される糖鎖のうち少なくとも２つ、例えば全ての糖鎖において、完全又は部分同一構造を有していてもよい。上記式（Ｉｂ）中、ａ）Ｓ２〜Ｓ４から構成される糖鎖、ｂ）Ｓ２、Ｓ５、Ｓ６から構成される糖鎖、ｃ）Ｓ７〜Ｓ９から構成される糖鎖、ｄ）Ｓ７、Ｓ１０、Ｓ１１から構成される糖鎖のうち少なくとも２つ、例えば３つ又は全ての部分糖鎖において、完全又は部分同一構造を有していてもよい。上記式（Ｉｃ）中、Ｓ２、Ｓ３もまた、同一の糖残基及び／又は結合様式を有していてもよい。エキソ型グリコシダーゼで処理すべき糖鎖化合物（未保護糖鎖化合物）が、糖残基の組成及び／又は結合様式において高い類似性を有する糖鎖を有する場合、グリコシダーゼ分解により種々の糖鎖化合物を特異的かつ系統的に製造することは困難である。一方、異なるエキソ型グリコシダーゼにより選択的に除去可能な糖残基により、このような糖鎖化合物を保護した場合、エキソ型グリコシダーゼを適宜活用することで、種々の糖鎖化合物を特異的かつ系統的に容易に製造することが可能となる。従って、本発明者らが開発した方法論は、糖残基の組成及び／又は結合様式において高い類似性を有する糖鎖を有する糖鎖化合物を対象とする場合、特にその利点を発揮し得る。
【００５３】
別の実施形態では、本発明の保護化合物は、それに含まれる２以上の糖鎖（但し、末端糖残基を除く）において、同一のエキソ型グリコシダーゼにより切断される糖残基を有するものであり得る。例えば、このような糖残基は、末端糖残基に隣接するものであり得る。従って、上記式（Ｉ）中、Ｒ１におけるＳＡと隣接する糖残基、Ｒ２におけるＳＢと隣接する糖残基（及び必要に応じて、Ｒ１、Ｒ２の一方又は双方が保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であるときはその保護用糖残基に隣接する糖残基）が、同一のエキソ型グリコシダーゼにより切断され得る。また、上記式（Ｉａ）中、Ｓ４、Ｓ７、Ｓ９の糖残基のうち、少なくとも２つ、例えば全ての糖残基が、同一のエキソ型グリコシダーゼにより切断され得る。上記式（Ｉｂ）中、Ｓ４、Ｓ６、Ｓ９、Ｓ１１の糖残基のうち、少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ又は全ての糖残基が、同一のエキソ型グリコシダーゼにより切断され得る。上記式（Ｉｃ）中、Ｓ２、Ｓ３の糖残基が、同一のエキソ型グリコシダーゼにより切断され得る。本発明者らが開発した方法論は、このような糖鎖化合物を対象とする場合も、上記と同様の理由により、特にその利点を発揮し得る。
【００５４】
別の実施形態では、本発明の保護化合物は、共通する少数の糖残基から構成される２以上の糖鎖を有し得る。従って、上記式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２が直線状の糖鎖であるとき、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ、例えば３種以下、好ましくは２種以下、より好ましくは１種の共通する糖残基から構成される糖鎖であり得る。Ｒ１、Ｒ２の一方又は双方が１以上の保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であるとき、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ、該保護用糖残基を除いて、例えば３種以下、好ましくは２種以下、より好ましくは１種の共通する糖残基から構成される糖鎖であり得る。また、上記式（Ｉａ）中、ａ）Ｓ２〜Ｓ４から構成される糖鎖、ｂ）Ｓ５〜Ｓ７から構成される糖鎖、ｃ）Ｓ５、Ｓ８、Ｓ９から構成される糖鎖のうち少なくとも２つ、例えば全ての糖鎖が、２種以下、例えば１種の共通する糖残基から構成される糖鎖であり得る。上記式（Ｉｂ）中、ａ）Ｓ２〜Ｓ４から構成される糖鎖、ｂ）Ｓ２、Ｓ５、Ｓ６から構成される糖鎖、ｃ）Ｓ７〜Ｓ９から構成される糖鎖、ｄ）Ｓ７、Ｓ１０、Ｓ１１から構成される糖鎖のうち少なくとも２つ、例えば３つ又は全ての糖鎖が、２種以下、例えば１種の共通する糖残基から構成される糖鎖であり得る。上記式（Ｉｃ）中、Ｓ２、Ｓ３もまた、共通する糖残基から構成される糖鎖であり得る。本発明者らが開発した方法論は、このような糖鎖化合物を対象とする場合も、上記と同様の理由により、特にその利点を発揮し得る。
【００５５】
より詳細には、上記式（Ｉａ）で表される化合物は、上記式（ＩＩ）で表される高マンノース型糖鎖、あるいは高マンノース型糖鎖及び複合型糖鎖の部分構造を有する混成型糖鎖が糖残基により保護された化合物であり得る。上記式（Ｉａ）で表される化合物が、上記式（ＩＩ）で表される高マンノース型糖鎖化合物である場合、Ｍａｎ間、ＧｌｃＮＡｃ間及びＭａｎとＧｌｃＮＡｃとの間の全ての結合様式は、天然の高マンノース型糖鎖化合物と同一の結合様式であり得る（例えば、背景技術を参照）。ＳＡ、ＳＢ、ＳＣの糖残基は、それぞれ異なる糖残基であり得る。好ましくは、ＳＡはＤ−グルコースであり得る。ＳＢ、ＳＣとしては、Ｄ−マンノース以外の任意の糖残基が好ましい。より好ましくは、ＳＢがＤ−ガラクトースであり、ＳＣがＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンであり得る。
【００５６】
上記式（Ｉｂ）で表される化合物は、複合型糖鎖が糖残基により保護された化合物であり得る。従って、複合型糖鎖における糖組成、糖配置パターン及び結合様式は、図９Ａに示されるものと一致し得る。ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤの糖残基は、それぞれ異なる糖残基であり得る。好ましくは、ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤは、α−Ｄ−ガラクトース（又はＤ−ガラクトース）以外の糖残基であり得る。
【００５７】
上記式（Ｉｃ）で表される化合物は、Ｏ結合型糖鎖が糖残基により保護された化合物であり得る。従って、Ｏ結合型糖鎖における糖組成、糖配置パターン及び結合様式は、図１０Ａに示されるＣＯＲＥ１〜８のいずれかと一致し得る。ＳＡ、ＳＢの糖残基は、互いに異なる糖残基であり得る。
【００５８】
本発明の糖鎖化合物の塩としては特に限定されないが、例えば無機塩基（例、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属；カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属；アルミニウム、アンモニウム）、有機塩基（例、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン）、無機酸（例、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸）、有機酸（例、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸）、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、リジン、オルニチン）または酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）との塩などが挙げられる。
【００５９】
本発明の保護化合物は、自体公知の糖鎖合成方法を適宜組み合わせることにより容易に作製できる。例えば、式（Ｉ）で表される本発明の保護化合物は、（ａ）ＳＡ及び／又はＳＢ含有糖ブロック化合物と、その相補糖ブロック化合物又はその相補単糖とを反応させるか、又は（ｂ）ＳＡ及び／又はＳＢと、その相補糖ブロック化合物とを反応させることにより製造できる。本発明はまた、このような製造方法を提供する。「糖ブロック化合物」とは、２以上の糖残基を有する化合物をいう。また、「相補糖ブロック化合物」又は「相補単糖」における「相補」とは、最終生成物（例、上記式（Ｉ）で表される糖鎖化合物）の製造において、足りない部分構造を補うものであることを意味する。例えば、ＳＡ含有糖ブロック化合物に対する相補糖ブロック化合物は、目的とする最終生成物が有する糖鎖構造のうち、ＳＡ含有糖ブロック化合物が有しない部分糖鎖構造を有する糖鎖化合物であり得る。
【００６０】
本発明の製造方法はまた、上記式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（Ｉｃ）で表される化合物の製造方法であり得る。このような化合物の製造は、（ａ）少なくとも１つのＳｎ（ｎは、Ａ、Ｂ、及び存在する場合、Ｃ、Ｄのうちのいずれかを示す）を含有する糖鎖ブロック化合物と、その相補糖ブロック化合物又はその相補単糖とを反応させるか、又は（ｂ）Ｓｎと、その相補糖ブロック化合物とを反応させることにより製造できる。
【００６１】
本発明の保護化合物の製造は、糖鎖末端がヒドロキシ保護基で保護された糖鎖化合物（合成中間体）を一旦生成した後、各ヒドロキシ保護基を除去し、糖残基を付加することにより行われてもよい。このような合成中間体は、後述する複数種の本発明の保護化合物を含むライブラリを調製する際、特に有用である。本発明はまた、このような合成中間体を提供する。以下、製造方法における説明の便宜上、本発明の保護化合物及び合成中間体を包括的に下記式（ＩＰ）で表わす。
【００６２】
【化１６】
2007297429.tif 000017
【００６３】
〔式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ、同一又は異なって、直線状の糖鎖であるか、又は保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖であり、
Ｓ１は任意の糖残基であり、
ＰＡ、ＰＢは、所定の保護基（例、エキソ型グリコシダーゼにより選択的に除去可能である糖残基（例、ＳＡ、ＳＢ）、ヒドロキシ保護基）であり、
Ｌは、結合、又は直線状の糖鎖であり、
Ｘは、（ｉ）存在しないか、（ｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基に結合しているヒドロキシル保護基、アミノ酸残基又は機能性物質を示すか、あるいは（ｉｉｉ）Ｌが存在する場合にはＬを構成する還元末端側の糖残基中の任意のヒドロキシル基、又はＬが存在しない場合にはＳ１の糖残基中の任意のヒドロキシル基がアミノ基に置換されている構造を示すか、あるいは置換された該アミノ基に結合しているアミノ保護基又は機能性物質を示す〕
（Ｒ１、Ｒ２、Ｓ１、ＳＡ、ＳＢ、Ｌ、Ｘは上述したものと同様であり得る）
【００６４】
例えば、上記式（ＩＰ）で表される化合物は、天然に存在する糖鎖化合物と共通する糖鎖骨格を有する化合物であることもまた好ましい。このような化合物としては、下記式（ＩａＰ）、（ＩｂＰ）及び（ＩｃＰ）で表される糖鎖化合物が挙げられる。
【００６５】
【化１７】
2007297429.tif 000018
【００６６】
上記式（ＩａＰ）、（ＩｂＰ）、（ＩｃＰ）中、ＰｎはＳｎ又はヒドロキシ保護基であり得る（ｎは、Ａ、Ｂ、及び存在する場合、Ｃ、Ｄのうちのいずれかを示す）。各記号はまた、上記式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）のものと同様である。
【００６７】
特定の実施形態では、上記式（ＩａＰ）で表される化合物は、上記式（ＩＩＰ）で表される化合物であり得る。
【００６８】
【化１８】
2007297429.tif 000019
【００６９】
上記式（ＩＩＰ）中、各記号は、上記式（Ｉａ）のものと同様である。また、式（ＩＩＰ）中、ＰＡがＤ−グルコースであり、ＰＢ、ＰＣがヒドロキシ保護基であることもまた好ましい。
【００７０】
本発明において使用される糖ブロック化合物は、最終生成物の糖鎖構造を構築するために、所定の位置に反応性置換基を有し、反応を避ける必要があるヒドロキシ基についてヒドロキシ保護基により、及び存在する場合にはアミノ基についてもアミノ保護基により保護されている化合物であり得る。
【００７１】
ヒドロキシ保護基とは、反応中にヒドロキシ基を保護する置換基をいい、例えば、それぞれ置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、フェニル、Ｃ７−１１アリールアルキル基（例、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル基）、ホルミル、Ｃ１−６アシル基（例、アセチル、プロピオニル、ピバロイル基）、フェニルオキシカルボニル基、Ｃ７−１１アラルキルオキシ−カルボニル基（例、ベンジルオキシカルボニル）、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、トリチル基、シリル、ｔ−ブチルジメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、メタンスルホニル基などが用いられる。これらの置換基としては、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、Ｃ１−６アルキル基（例、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル）、Ｃ７−１１アラルキル基（例、ベンジル）、Ｃ６−１０アリール基（例、フェニル、ナフチル）、ニトロ基などが用いられる。
【００７２】
アミノ保護基とは、反応中にアミノ基を保護する置換基をいい、例えば、アセトアミド、トリクロロアセトアミド等のアミド含有保護基、フタロイル等のイミド含有保護基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル（例、アセチル、プロピオニル）、アリルカルバメート、Ｃ７−２０アラルキルカルバメート（例、ベンジルカーバメート）等のカルバメート含有保護基、トリチルなどが用いられる。これらの置換基としては、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、Ｃ１−６アルキル−カルボニル（例、アセチル、プロピオニル、バレリル）、ニトロ基などが用いられる。本発明で特に好ましく用いられるアミノ基の保護基はフタロイル基である。
【００７３】
以下、式（Ｉａ）で表される化合物を例に挙げて、本発明の保護化合物及び中間体の合成の概略を示す。式（Ｉａ）で表される化合物は、下記のスキーム及びその説明、実施例の記載及び当該分野における自体公知の方法に従って容易に製造できる。勿論、当業者は、他の糖鎖化合物も同様に容易に製造できる。本発明は、下記スキームに記載される化合物、実施例中に記載される化合物及びそれらの塩もまた提供する。
【００７４】
【化１９】
2007297429.tif 000020
【００７５】
【化２０】
2007297429.tif 000021
【００７６】
【化２１】
2007297429.tif 000022
【００７７】
【化２２】
2007297429.tif 000023
【００７８】
【化２３】
2007297429.tif 000024
【００７９】
保護化反応、脱保護反応、脱アセチル化反応、糖付加反応等の有機合成反応は、自体公知の方法により行われ得る。さらに所望により、公知の脱保護反応、アシル化反応、アルキル化反応、水素添加反応、酸化反応、還元反応、炭素鎖延長反応、置換基交換反応を各々、単独あるいはその二つ以上を組み合わせて行うことにより、本発明の保護化合物を製造できる。これらの反応は、例えば、特開2004-244583号公報、実施例中に開示される文献、及びProtective groups in organic synthesis Jhon wiely & Sons Inc. 新実験化学講座 14[V] (丸善)などに記載されている。
【００８０】
また、天然糖鎖の全合成方法が知られているので、本発明の保護化合物の製造に際しては、そのような合成方法もまた参考にすることができる。例えば、高マンノース型糖鎖の全合成方法については特開2004-244583号公報及び実施例中に開示される文献、複合型糖鎖の全合成方法についてはSeifert et al., Angewandte Chemie International Edition 39: 531-534 (2000)、並びにＯ結合型糖鎖の全合成方法についてはNakahara et al., Tetrahedron Letter 35: 3321-3324 (1994) を参考にすることができる。混成型糖鎖の全合成は、高マンノース型糖鎖及び複合型糖鎖についての上記文献記載の方法を併用することで行われ得る。
【００８１】
なお、本発明の合成中間体の作製に際しては、式（ＩＰ）、（ＩａＰ）、（ＩｂＰ）、（ＩｃＰ）、（ＩＩＰ）で表される化合物における複数のＰｎ（ｎは、Ａ、Ｂ、及び存在する場合、Ｃ、Ｄのうちのいずれかを示す）において、脱保護反応における反応性が異なるヒドロキシ保護基を用いることが好ましい。例えば、反応性が異なるヒドロキシ保護基としては、１）保護反応後にエーテル部分を形成するヒドロキシ保護基（以下、必要に応じて、エーテル系保護基と省略する：例、メトキシ置換ベンジル基、ニトロ基置換ベンジル基、トリチル基、ベンジル基、メトキシメチル基、メトキシエトキシメチル基）、２）アシル系保護基（例、アセチル基、クロロアセチル基、レブリノイル基）、３）シリル系保護基（例、ＴＢＤＭＳ、ＴＢＤＰＳ、ＴＭＳ、ＴＩＰＳ基）が挙げられる。また、上述の同カテゴリーに属するヒドロキシ保護基であっても、脱保護条件が異なるものが存在するので、そのようなヒドロキシ保護基を利用することもできる。例えば、２種のヒドロキシ保護基を用いる場合、反応性が異なるヒドロキシ保護基の組合せとしては、ａ１）エーテル系保護基とアシル系保護基との組合せ、ａ２）エーテル系保護基とシリル系保護基との組合せ、ａ３）アシル系保護基とシリル系保護基との組合せ、ａ４）脱保護条件が異なる２種のエーテル系保護基の組合せ、ａ５）脱保護条件が異なる２種のアシル系保護基の組合せ、ａ６）脱保護条件が異なる２種のシリル系保護基の組合せが挙げられる。また、３種のヒドロキシ保護基を用いる場合、反応性が異なるヒドロキシ保護基の組合せとしては、ｂ１）エーテル系保護基、アシル系保護基及びシリル系保護基の組合せ、ｂ２）脱保護条件が異なる２種のエーテル系保護基、及びアシル系保護基又はシリル系保護基の組合せ、ｂ３）脱保護条件が異なる２種のアシル系保護基、及びエーテル系保護基又はシリル系保護基の組合せ、ｂ４）脱保護条件が異なる２種のシリル系保護基、及びエーテル系保護基又はアシル系保護基の組合せ、ｂ５）脱保護条件が異なる３種のエーテル系保護基の組合せ、ｂ６）脱保護条件が異なる３種のアシル系保護基の組合せ、ｂ７）脱保護条件が異なる３種のシリル系保護基の組合せが挙げられる。
【００８２】
（２．ライブラリ及びその製造方法）
本発明はまた、２種以上の本発明の保護化合物を含むライブラリを提供する。本発明のライブラリは、上記式（Ｉ）及び（Ｉ’）で表される糖鎖化合物、必要に応じて、さらに式（Ｉ’’）及び／又は式（Ｉｎ）で表される糖鎖化合物を含み得る：
【００８３】
【化２４】
2007297429.tif 000025
【００８４】
式（Ｉ’）、（Ｉ’’）、（Ｉｎ）中、Ｒ１’、Ｒ１’’、Ｒ１ｎはそれぞれ独立してＲ１と同義であり得、Ｒ２’、Ｒ２’’、Ｒ２ｎはそれぞれ独立してＲ２と同義であり得、ＳＡ’、ＳＡ’’、ＳＡｎはそれぞれ独立してＳＡと同義であり得、ＳＢ’、ＳＢ’’、ＳＢｎはそれぞれ独立してＳＢと同義であり得る。ｎ（整数）は’数を示し（即ち、ｎ＋１が本発明のライブラリが含む異種の保護化合物数を意味する）、例えば１以上、２以上、３以上、４以上又は５以上であってもよい。ｎはまた、例えば、９以下、７以下又は５以下であり得る。
【００８５】
本発明のライブラリに含まれる、上記式（Ｉ）及び（Ｉｎ）（上記の通りｎは２以上）で表される化合物は、Ｒ１、Ｒ１ｎが同一の糖鎖、及び／又はＲ２、Ｒ２ｎが同一の糖鎖であり得る。このような化合物はまた、ＳＡ、Ｓｎが異なる糖残基、及び／又はＳＢ、Ｓｎが異なる糖残基であり得、ＳＡ、ＳＢ、ＳＡｎ、ＳＢｎがそれぞれ異なる糖残基であることもまた好ましい。このような化合物はさらに、Ｒ１、Ｒ１ｎ、Ｒ２、Ｒ２ｎの少なくとも１つが保護用糖残基を末端に有する分岐状の糖鎖である場合、保護用糖残基の少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ、最も好ましくは全て、及びＳＡ、ＳＢ、ＳＡｎ、ＳＢｎがそれぞれ異なる糖残基であり得る。（Ｉｎ）としては、例えば、（Ｉａｎ）、（Ｉｂｎ）、（Ｉｃｎ）が挙げられる。
【００８６】
本発明のライブラリは、複数種の本発明の保護化合物を含むものである限り特に限定されず、例えば、複数種の本発明の保護化合物を同一溶液（例、グリコシダーゼ反応溶液）中に含むもの、複数種の本発明の保護化合物を同一容器（プレート、チューブ）の同一又は異なる区画に含むもの（例、マルチウェルプレートの異なるウェルにそれぞれ含むもの）、複数種の本発明の保護化合物を同一基板（例、平面状のプレート、粒子等の支持体）上に固定したもの、複数種の本発明の保護化合物が異なる基板上に固定されている基板の集合体、あるいは複数種の本発明の保護化合物が同一分子（例、ペプチド）に結合したもの（例、異なるアミノ酸残基に対して複数種の糖鎖化合物が結合しているペプチド、タンパク質）が挙げられる。
【００８７】
本発明のライブラリは、上記式（Ｉ）の糖鎖化合物と、上記式（Ｉｎ）（例、式（Ｉ’）、（Ｉ’’））の糖鎖化合物とを組合せることにより製造できる。本発明はまた、このような製造方法を提供する。
【００８８】
上記式（Ｉ）の糖鎖化合物と、上記式（Ｉｎ）の糖鎖化合物とを組合せる工程は、例えば、ａ）同一溶液又は容器の同一又は異なる区画に対する、複数種の保護化合物の添加、ｂ）同一基板に対する、複数種の保護化合物の固定化、ｃ）異なる基板に対する、複数種の保護化合物の固定化、及びこのような保護化合物が固定化された基板の集合化、ｄ）同一分子に対する、複数種の保護化合物の結合化、あるいはｅ）複数種の保護化合物の重合（例、複数種の保護化合物と結合しているアミノ酸残基の重合による、糖ペプチド又は糖タンパク質の形成）などにより行われ得る。
【００８９】
（３．保護された糖鎖化合物からの所定の糖鎖化合物の製造方法、及び当該方法により得られる糖鎖化合物）
本発明はまた、本発明の保護化合物、又は２種以上の保護化合物を含むライブラリをグリコシダーゼにより処理することを含む、糖鎖化合物の製造方法を提供する。グリコシダーゼとしては、上述したエキソ型グリコシダーゼ、エンド型グリコシダーゼが挙げられる。また、本発明の保護化合物をグリコシダーゼで処理する場合、最初に反応させるグリコシダーゼとしては、エキソ型グリコシダーゼのみならず、２以上の糖単位を除去可能なエンド型グリコシダーゼもまた使用できる。例えば、本発明の保護化合物が式（ＩＩ）で表される化合物である場合、２糖単位（例、ＳＡ及びＭａｎから構成される２糖単位）を除去可能なエンドグリコシダーゼを反応させることもまた好ましい。本処理に供される保護化合物及びそれを含むライブラリは、単離及び／又は精製されたものであり得る。
【００９０】
グリコシダーゼによる、本発明の保護化合物、又は２種以上の保護化合物を含むライブラリの処理は、自体公知の方法により行われる。例えば、処理は、用いるグリコシダーゼが活性を示す、所望の産物が得られる適切な条件（例、ｐＨ、塩濃度、温度、反応時間）下で行われ得る。このような処理はまた、グリコシダーゼ固定化カラムを用いて行われてもよい。本発明の保護化合物、又は２種以上の保護化合物を含むライブラリをグリコシダーゼ固定化カラムに通し、次いで溶出液を回収することにより、所望の糖鎖化合物を容易に得ることができる。このような処理はさらに、同時に並行して行われてもよい。例えば、本発明の保護化合物を同一容器の異なる区画（例、マルチウェルプレートの異なるウェル）に分注し、次いで各区画に対して異なるグリコシダーゼ又はグリコシダーゼカクテルを添加することにより、所望の糖鎖化合物を得ることができる。
【００９１】
本発明はまた、このような製造方法により得られる糖鎖化合物（グリコシダーゼ分解物）及びこのような糖鎖化合物を２種以上含むライブラリを提供する。
【００９２】
例えば、本発明の糖鎖化合物は、本発明の保護化合物又はそのライブラリをグリコシダーゼにより処理することにより得られる、天然に存在しない糖鎖化合物であり得る。より詳細には、本発明の糖鎖化合物は、（ａ）（ａ１）式（ＩＩ）で表されるＳＢ、ＳＣの糖残基の一方又は双方を保持する、保護された高マンノース型糖鎖化合物のグリコシダーゼ分解物、（ａ２）式（ＩＩ）で表される、ＳＡとしてＤ−グルコース以外の糖残基を保持する、保護された高マンノース型糖鎖化合物のグリコシダーゼ分解物、（ｂ）式（Ｉｂ）〔式中、Ｓ１〜Ｓ１１、Ｌは、天然複合型糖鎖と同一であり、ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤは任意の糖残基である〕で表される、ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＤのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つの糖残基を保持する、保護された複合型糖鎖化合物のグリコシダーゼ分解物、（ｃ）式（Ｉｃ）〔式中、Ｓ１〜Ｓ３、Ｌは天然Ｏ結合型糖鎖と同一であり、ＳＡ、ＳＢは任意の糖残基である〕で表される、ＳＡ、ＳＢの糖残基の一方を保持する、保護されたＯ結合型糖鎖化合物のグリコシダーゼ分解物であり得る。本発明の保護化合物を一旦合成し、それをグリコシダーゼにより特異的に切断することで、糖鎖化合物を特異的かつ系統的に作製するという本発明者らのアイデアなしには、このような糖鎖化合物を作製する動機付けはない。一方、本発明者らの上記アイデアによれば、グリコシダーゼによる天然糖鎖生成反応における中間体として、このような糖鎖化合物を製造する動機付けが生まれる。
【００９３】
例えば、天然糖鎖生成反応における中間体としては、以下に示される糖鎖化合物が好ましい（ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、Ｘは上述の通りである。但し、上記（ａ１）、（ａ２）のいずれかの条件を満たす）。
【００９４】
【化２５】
2007297429.tif 000026
【００９５】
【化２６】
2007297429.tif 000027
【００９６】
【化２７】
2007297429.tif 000028
【００９７】
本発明はまた、本発明の保護化合物を合成し、次いで当該保護化合物をグリコシダーゼで処理することを含む、糖鎖化合物の製造方法を提供する。保護化合物の合成、及びグリコシダーゼによる本発明の保護化合物の処理は、上述の通り行われ得る。本発明の保護化合物は、例えば、天然に存在する糖鎖と同一構造を有する糖鎖の非還元末端に少なくとも１つの糖残基が導入されている、保護された糖鎖化合物であってもよい。導入される糖残基数は特に限定されるものではないが、天然に存在する糖鎖と同一構造を有する糖鎖の非還元末端数を上限とし、例えば、４以下、３以下、好ましくは１又は２であり得る。
【００９８】
天然に存在する糖鎖は、種々の生理活性を示し得る。例えば、天然に存在する糖鎖は、タンパク質の高次構造形成、タンパク質分解のシグナルなどの役割を担い、また、小胞体内でのタンパク質品質管理機構の異常は、タンパク質のフォールディング異常に起因する疾患（例、アルツハイマー病）に関与すると考えられており、さらには、疾患への糖鎖合成酵素欠損の関与もまた報告されている（例えば、Helenius et al., Science 291: 2364-2369 (2001); Ellgaard et al., Nature Reviews, Molecular Cell Biology 4: 181-191 (2003); McCracken et al., BioEssays 25: 868-877 (2003) 参照）。従って、このようなグリコシダーゼ分解物（天然に存在しない糖鎖化合物）は、例えば、天然に存在する上述の生理活性糖鎖の合成における中間体として有用である。
【００９９】
（４．試薬及びキット）
本発明は、本発明の保護化合物若しくはその塩又はそれらのライブラリ、あるいはそれらの任意のグリコシダーゼ分解物、あるいは本発明の保護化合物の合成中間体を含む、試薬及びキットを提供する。
【０１００】
例えば、本発明の試薬及びキットは、本発明の保護化合物及びライブラリ、又はそれらの任意のグリコシダーゼ分解物を含む場合、グリコシダーゼをさらに含んでいてもよい。本発明のキットに含まれるグリコシダーゼは、１種以上（例、２、３又は４種）である限り特に限定されないが、保護用糖残基を切断し得る異なるエキソ型グリコシダーゼを２種以上、好ましくは３種以上又は４種以上含んでいてもよい。
【０１０１】
本発明の試薬及びキットは、例えば、糖鎖化合物の選択的かつ系統的な作製に有用である。
【０１０２】
なお、本明細書中で使用される置換基、保護基および試薬の略語は次の通りである。
Ｂｎ：ベンジル
Ａｃ： アセチル
Ａｌｌ：アリル（ａｌｌｙｌ）
Ｐｈｔｈ： フタロイル
Ｂｚ： ベンゾイル
ＣＡ： モノクロロアセチル酢酸
ＡｇＯＴｆ： 銀トリフラート
Ｍｅ： メチル
【０１０３】
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【０１０４】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０１０５】
（材料）
以下の実験に用いたA. oryzae由来ガラクトシダーゼ、 Jack beans由来α-マンノシダーゼ、 Jack beans 由来GlcNAc’aseは、Sigmaから購入した。A. oryzae由来グルコシダーゼIIは、以下のようにして得た。Aspergillus oryzae RIB40（ATCC number: 42149)菌を 100 ml DPY (2% dextrin, 1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% KH2PO4, 0.05% MgSO4・7H2O, pH 5.5) 培地にて30℃ 、18時間培養後、菌体を回収した。菌体を液体窒素で凍結後粉砕、6 ml の抽出バッファー (50 mM Tris (pH 7.5), 2 mM PMSF, 1:100 PIC (protein inhibitor cocktail))に溶かした。遠心分離 (3,000×g, 10分間, 4℃) にて不溶物を除去後、超遠心分離 (20,000×g, 20分間, 4℃) することにより膜画分を回収した。得られた膜画分を1% Triton X-100 を含む抽出バッファー600μLに溶かし、粗酵素液として使用した。
【０１０６】
製造例１：[GlcNAc-マンノビオシル1-6(ガラクトシルマンノビオース)1-3マンノシル] 1-6グルコシル・トリマンノシル・コア・トリサッカリドの合成
標記化合物を、下記の方法に従い合成した。なお、参考文献は、以下の通りである。
1) Matsuo, I., Wada, M., Manabe, S., Yamaguchi, Y., Otake, K., Kato, K., Ito, Y. (2003) J. Am. Chem. Soc., 125, 3402.
2) Matsuo, I., Ito, Y. (2003) Carbohydr. Res., 338, 2163.
3) Matsuo, I., Kashiwagi, T., Totani, K., Ito, Y. (2005) Tetrahedron Lett., 46, 4197.
4) Ito, Y., Ohnishi, Y., Ogawa, T. (1998) Synlett, 1102.
5) Matsuo, I., Wada, M., Ito, Y. (2002) Tetrahedron Lett., 43, 3273.
6) Matsuo, I., Isomura, M., Miyazaki, T., Sakakibara, T., Ajisaka, K. (1998) Carbohydr Res., 305, 401.
7) Matsuo, I., Miyazaki, T., Isomura, M., Sakakibara, T., Ajisaka, K. (1998) J. Carbohydr. Chem., 17, 1249.
【０１０７】
１．１．マンノビオース (mannobiose) の合成
乾燥トルエン (5 mL) 中のSMe-マンノースアクセプター (276.1 mg, 0.573 mmol)、AgOTf (288.2 mg, 1.12 mmol) 及びモレキュラーシーブ4A (5 g) の混合液を、-40℃で30分間攪拌した。乾燥トルエン (5 mL) 中のCl-ドナー (298.0 mg, 0.577 mmol) の溶液を加え、混合液を-10℃で1時間、周囲温度で12時間攪拌した。反応をTEA (1 mL) で停止した。反応混合液をEtOAcで希釈し、シリカゲルを通してろ過した。ろ液をNaHCO3水溶液及びブライン (brine) で連続して洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (トルエン:EtOAc, 20:1〜9:1) により精製し、マンノビオース (310.7 mg, 57 %) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.326-7.174 (m, 30H), 5.205 (bs, 1H), 5.136 (bs, 1H), 4.905 (d, 1H, J = 11.0 Hz), 4.832 (d, 1H, J = 10.7 Hz), 4.670-4.487 (m, 11H), 4.368 (bd, 1H, J = 11.7 Hz), 4.257 (dd, 1H, J = 5.3 and 11.7 Hz), 4.291-4.047 (m, 2H), 3.965-3.765 (m, 6H), 3.678 (bd, 1H, J = 11.2 Hz), 2.086 (s, 3H), 2.101 (s, 3H); MALDI-TOF mass calcd for C57H62O11SNa (M + Na)+977.4, found 977.9.
【０１０８】
【化２８】
2007297429.tif 000029
【０１０９】
１．２．マンノビオースアクセプターの合成
THF:MeOH (4:1, 5 mL) 中のマンノビオース (310.7 mg, 0.325 mmol) の攪拌溶液に、1M NaOMe/MeOH (15μL) を0℃で加えた。混合液を１時間攪拌し、1N HCl (20μL) で中和した。反応混合液をEtOAcで希釈し、NaHCO3水溶液及びブラインで連続して洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、真空中で濃縮し、マンノビオースアクセプター (279.7 mg, 94 %) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.348-7.172 (m, 30H), 5.214 (bs, 1H), 5.130 (bs, 1H), 4.907 (d, 1H, J = 11.2 Hz), 4.822 (d, 1H, J = 10.4 Hz), 4.669-4.490 (m, 10H), 4.052 (bs, 1H), 3.930-3.686 (m, 11H), 2.093 (s, 3H); MALDI-TOF mass calcd for C55H62O11SNa (M + Na)+ 935.4, found 935.9.
【０１１０】
【化２９】
2007297429.tif 000030
【０１１１】
１．３．マンノビオースアクセプター及びガラクトースドナーのカップリング
乾燥トルエン (5 mL) 中のマンノビオースアクセプター (279.7 mg, 0.306 mmol)、AgOTf (500.0 mg, 1.946 mmol) 及びモレキュラーシーブ4A (2 g) の混合液を、-40℃で30分間攪拌した。乾燥CH2Cl2(5 mL) 中のCl-ガラクトースドナー (317.2 mg, 0.516 mmol) の溶液を加え、混合液を-10℃で1時間及び40℃で24時間攪拌した。反応をTEA (1 mL) で停止した。反応混合液をEtOAcで希釈し、セライト (Celite) を通してろ過した。ろ液をNaHCO3 水溶液及びブラインで連続して洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をPTLC (トルエン:EtOAc, 5:1) により精製し、ガラクトシルマンノビオースドナー (295.3 mg, 65 %) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.104-7.151 (m, 50H), 5.598 (bd, 1H, J = 3.6 Hz), 5.891 (dd, 1H, J = 8.0 and 10.0 Hz), 5.580 (dd, 1H, J = 3.6 and 10.4 Hz), 5.199 (bs, 1H), 5.055 (bs, 1H), 4.802-4.772 (m, 2H), 4.663-4.261 (m, 14H), 4.102-3.674 (m, 11H), 2.118 (s, 3H); MALDI-TOF mass calcd for C89H86O19SNa (M + Na)+1513.54, found 1514.19.
【０１１２】
【化３０】
2007297429.tif 000031
【０１１３】
１．４．マンノビオースアクセプター及びGlcNAcドナーのカップリング
乾燥CH2Cl2(5 mL) 中のCp2HfCl2 (269.5 mg, 0.710 mmol)、AgOTf (365.5 mg, 1.423 mmol)、及びモレキュラーシーブ4A (3 g) の攪拌混合液に、乾燥CH2Cl2 (10 mL) 中のマンノビオースアクセプター (541.1 mg, 0.593 mmol) 及びGlcNAc-ドナー (354.0 mg, 0.609 mmol) の溶液を-78℃で加えた。混合液を2時間及び-40℃で1時間攪拌した。シリカゲルを通すことにより不溶性物質を除去し、次いでろ液をEtOAcで希釈し、ブライン、NaHCO3水溶液及びブラインで連続して洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、真空中でエバポレートした。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (トルエン:EtOAc, 15:1〜10:1) により精製し、化合物GlcNAc-マンノビオースドナー (393.4 mg, 45 %) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.347-6.830 (m, 49H), 5.246 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 5.128 (bs, 1H), 4.934 (bs, 1H), 4.750-4.273 (m, 18H), 4.200 (bd, 1H, J =10.4Hz), 3.994 (m, 2H), 3.786-3.611 (m, 15H), 2.111 (s, 3H); MALDI-TOF mass calcd for C90H91O16NSNa (M + Na)+ 1496.6, found 1497.5.
【０１１４】
【化３１】
2007297429.tif 000032
【０１１５】
１．５．3-アセチル化マンノースアクセプターの合成
6-CA-マンノース (533.6 mg, 1.008 mmol) をピリジン (0.8 mL) に溶解した。混合液に無水酢酸 (0.4 mL) を0℃で加え、2時間攪拌した。反応混合液を真空中で濃縮した。残渣をCH2Cl2(5 mL) 中のNBS (535.0 mg, 3.009 mmol) 及びDAST (135μL, 1.022 mmol) で-40℃にて処理した。反応混合液を-30℃で1時間、次いで周囲温度で攪拌した。12時間後、MeOH (0.5 mL) を加え、混合液をEtOAcで希釈し、NaHCO3 水溶液及びブラインで連続して洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をDABCO (432 mg) で50℃にて2時間処理した。混合液をAmberlist 15 E [H+] で中和した。不溶性物質をろ過により除去し、ろ液を真空中で乾燥させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (トルエン:EtOAc, 10:1〜4:1) により精製し、3-アセチル化マンノースアクセプター (117.3 mg, 28%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.377-7.282 (m, 10H), 5.525 (dd, 1H, J = 2.0 and 50.4 Hz), 5.216 (m, 1H), 4.745-4.617 (m, 4H), 4.092 (t, 1H, J = 9.6 Hz), 4.006 (bs, 1H), 3.863-3.758 (m, 3H), 1.976 (s, 3H); MALDI-TOF mass calcd for C22H25O6FNa (M + Na)+ 427.2, found 427.7.
【０１１６】
【化３２】
2007297429.tif 000033
【０１１７】
１．６．GlcNAcマンノビオースドナー及び3-アセチル化マンノースアクセプターのカップリング
乾燥トルエン (20 mL) 中の3-アセチル化マンノースアクセプター (45.0 mg, 0.111 mmol)、GlcNAc-マンノビオースドナー (181.0 mg, 0.123 mmol)、及びモレキュラーシーブ4A (2 g) の溶液を0℃で１時間攪拌し、次いでClCH2CH2Cl中の1M MeOTf (0.2 mL, 0.2 mmol) を加えた。反応混合液を40℃で24時間攪拌した。反応をTEA (0.2 mL) で0℃にて停止させた。混合液をEtOAcで希釈し、セライトを通してろ過した。ろ液をNaHCO3水溶液及びブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をPTLC (トルエン:EtOAc, 5/1) により精製し、GlcNAc-マンノビオシル3-アセチル化マンノース (172.8 mg, 84%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.361-6.840 (m, 59H), 5.750 (bd, 1H, J = 50.4 Hz), 5.240 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 4.884-3.500 (m, 48H), 1.974 (s, 3H); MALDI-TOF mass calcd for C111H112O22NFNa (M + Na)+ 1854.06, found 1854.5.
【０１１８】
【化３３】
2007297429.tif 000034
【０１１９】
１．７．GlcNAc-マンノビオシル3-OHマンノースアクセプターの合成
THF:MeOH (5:1, 6 mL) 中のGlcNAc-マンノシル3-アセチル化マンノース (172.8 mg, 0.932 mmol) の攪拌溶液に、1M NaOMe/MeOH (100μL) を0℃で加えた。混合液を1時間攪拌し、1N HCl (200μL) で中和した。反応混合液をEtOAcで希釈し、NaHCO3水溶液及びブラインで連続して洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、真空中で濃縮し、GlcNAc-マンノビオシル3-OHマンノースアクセプター (98.0 mg, 58 %) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.361-6.840 (m, 59H), 5.809 (bd, 1H, J = 49.2 Hz), 5.238 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 4.904 (bs, 2H), 4.849-4.752 (m, 6H), 4.645-4.253 (m, 17H), 4.183 (bd, 1H, J = 10.8 Hz), 4.109 (bd, 1H, J = 9.2 Hz), 3.974-3.506 (m, 22H), 2.395 (bd, 1H, J = 9.6 Hz); MALDI-TOF mass calcd for C109H110O21NFNa (M + Na)+ 1810.8, found 1812.5.
【０１２０】
【化３４】
2007297429.tif 000035
【０１２１】
１．８．GlcNAc-マンノビオシル3-OHマンノースアクセプター及びガラクトシルマンノビオースドナーのカップリング
乾燥トルエン (20 mL) 中のGlcNAc-マンノビオシル3-OHマンノースアクセプター (98.0 mg, 0.055 mmol)、ガラクトシル-マンノビオースドナー (182.0 mg, 0.122 mmol)、及びモレキュラーシーブ4A (2 g) の混合液を、0℃で1時間攪拌し、次いでClCH2CH2Cl中の1M MeOTf (0.6 mL, 0.6 mmol) を加えた。反応混合液を40℃で24時間攪拌した。反応をTEA (1 mL) で 0℃にて停止させた。混合液をEtOAcで希釈し、セライトを通してろ過した。ろ液をNaHCO3水溶液及びブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をPTLC (トルエン: EtOAc, 7:1) により精製し、GlcNAc-マンノビオシル1-6(ガラクトシルマンノビオース)1-3マンノースドナー (93.3 mg, 44%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.104-6.804 (m, 109H), 5.959-5.916 (m, 2H), 5.683- 5.541 (m, 2H), 5.261-5.104 (m, 3H), 4.862-3.419 (m, 76H); MALDI-TOF mass calcd for C197H192O40NFNa (M + Na)+ 3253.29, found 3255.8.
【０１２２】
【化３５】
2007297429.tif 000036
【０１２３】
１．９．3-OHトリマンノシル・コア・トリサッカリドアクセプターの合成
トリマンノシル・コア・トリサッカリド (trimannosyl core trisaccharide) (1.09 g, 0.422 mmol) (Matsuo et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 3402 (2003) 参照) を、10% HF/ピリジンを含有するDMF (3 mL) 中に溶解し、3 mLテフロン反応容器に移した。これを、1.0 GPaまで加圧し、30℃で12時間放置した。混合液をEtOAcで希釈し、NaHCO3水溶液及びブラインで連続して洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、真空中で濃縮した。合わせた混合液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン:EtOAc, 5:1〜1:1) により精製し、化合物3-OHトリマンノシル・コア・トリサッカリドアクセプター (0.939 g, 収率94 %) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.855-6.707 (m, 73H), 5.640-5.543 (m, 1H), 5.336-5.173 (m, 5H), 5.008-4.794 (m, 8H), 4.687-3.361 (m, 66H), 3.278 (bd, 1H, J = 9.6 Hz), 3.177 (bd, 1H, J= 9.6 Hz), 2.893-2.831 (m, 1H), 2.011 (s, 3H); MALDI-TOF mass calcd for C154H160O34N2Na (M + Na)+ 2604.1, found 2603.7.
【０１２４】
【化３６】
2007297429.tif 000037
【０１２５】
１．１０．3-OHトリマンノシル・コア・トリサッカリドアクセプター及びグルコースドナーのカップリング
乾燥トルエン/エーテル (2:1, 15 mL) 中のCp2HfCl2(225.0 mg, 0.528 mmol)、AgOTf (319.0 mg, 1.056 mmol)、及びモレキュラーシーブ4A (2.6 g) の攪拌混合液に、乾燥トルエン (5 mL) 中の3-OHトリマンノシル・コア・トリサッカリドアクセプター (363.9 mg, 0.141 mmol) 及びグルコースドナー (257.3 mg, 0.440 mmol) の溶液を-40℃で加えた。混合液を2時間及び-10℃で12時間攪拌した。シリカゲルを通すことにより不溶性物質を除去し、次いでろ液をEtOAcで希釈し、ブライン、NaHCO3水溶液及びブラインで連続して洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、真空中でエバポレートした。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (トルエン:EtOAc, 15:1〜10:1) により精製し、化合物グルコシル・トリマンノシル・コア・トリサッカリド(glucosyl trimannosyl core trisaccharide) (295.5 mg, 67 %) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.985-6.727 (m, 93H), 6.070 (t, 1H, J= 10.0 Hz), 5.641-5.522 (m, 2H), 3.367-5.332 (m, 2H), 5.220-5.514 (m, 3H), 5.006-4.703 (m, 5H), 4.674-3.359 (m, 66H), 3.278 (bd, 1H, J = 8.8 Hz), 3.175 (bd, 1H, J= 10.4 Hz), 2.903-2.843 (m, 1H), 1.999 (s, 3H); MALDI-TOF mass calcd for C188H188O42N2Na (M + Na)+ 3168.2, found 3169.5.
【０１２６】
【化３７】
2007297429.tif 000038
【０１２７】
１．１１．グルコシル・トリマンノシル・コア・トリサッカリドアクセプターの合成
乾燥CH3CN中のグルコシル・トリマンノシル・コア・トリサッカリド (237.1 mg, 0.075 mmol) の攪拌溶液に、p-トルエンスルホン酸・一水和物 (72.3 mg, 0.381 mmol) を加え、室温で1時間攪拌した。反応をTEA (0.1 mL) で停止させ、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (トルエン:EtOAc, 5:1) により精製し、グルコシル・トリマンノシル・コア・トリサッカリドアクセプター (221.8 mg, 96%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.221-6.715 (m, 91H), 6.020 (t, 1H, J=7.2 Hz), 5.651-5.541 (m, 2H), 5.367-3.171 (m, 85H), 2.939 (m, 1H), 1.965 (s, 3H); MALDI-TOF mass calcd for C182H180O42N2Na (M + Na)+ 3088.2, found 3089.9.
【０１２８】
【化３８】
2007297429.tif 000039
【０１２９】
１．１２．グルコシル・トリマンノシル・コア・トリサッカリドアクセプター及びGlcNAc-マンノビオシル1-6(ガラクトシルマンノビオース)1-3マンノースドナーのカップリング
乾燥トルエン (5 mL) 中のCp2HfCl2(22.7 mg, 0.060 mmol)、AgOTf (36.8 mg, 0.143 mmol)、及びモレキュラーシーブ4A (1.8 g) の攪拌混合液に、乾燥トルエン (10 mL) 中のグルコシル・トリマンノシル・コア・トリサッカリドアクセプター (104.6 mg, 0.0323 mmol) 及びGlcNAc-マンノビオシル1-6(ガラクトシルマンノビオース)1-3マンノースドナー (93.3 mg, 0.030 mmol) の溶液を-30℃で加えた。混合液を0℃まで徐々に温め、4時間攪拌した。反応をTEA (1 mL) で停止させた。セライトを通すことにより不溶性物質を除去し、ろ液をEtOAcで希釈し、ブライン、NaHCO3水溶液及びブラインで連続して洗浄した。溶液をNa2SO4で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をPTLC (トルエン:EtOAc, 5:1) により精製し、[GlcNAc-マンノビオシル1-6(ガラクトシルマンノビオース)1-3マンノシル]1-6グルコシル・トリマンノシル・コア・トリサッカリド (42.7 mg, 23%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.064-6.596 (m, 197H), 6.089 (t, 1H, J = 9.6 Hz), 5.092 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 3.834 (dd, 1H, J = 10.0 and 8.4 Hz), 5.611-5.466 (m, 3H), 5.339-5.142 (m, 9H), 4.985-3.164 (m, 155H), 3.051 (bd, 1H, J = 10 Hz), 2.109 (s, 3H); MALDI-TOF mass calcd for C379H371O82N3Na (M + Na)+6298.5, found 6300.2.
【０１３０】
【化３９】
2007297429.tif 000040
【０１３１】
１．１３．[GlcNAc-マンノビオシル1-6(ガラクトシルマンノビオース)1-3マンノシル] 1-6グルコシル・トリマンノシル・コア・トリサッカリドの脱保護
1 mLのエチレンジアミンを含有するn-ブタノール (2 mL) 中の[GlcNAc-マンノビオシル1-6(ガラクトシルマンノビオース)1-3マンノシル]1-6グルコシル・トリマンノシル・コア・トリサッカリド (42.7 mg, 0.0068 mmol) の溶液を、90℃で15時間攪拌した。揮発物を真空中でのエバポレーションにより除去し、残渣をピリジン (3 mL) に溶解した。溶液をAc2O (1.5 mL) で0℃にて5時間処理し、真空中でエバポレートした。残渣をEtOAcで希釈し、ブライン、1 N HCl、ブライン、NaHCO3水溶液及びブラインで連続して洗浄した。溶液をNa2SO4で乾燥させ、真空中で濃縮し、アセチル化化合物を得た。アセチル化化合物を、MeOH (10 mL) 中のPd(OH)2-C (20 wt. %, 50 mg) で室温にて24時間処理した。セライトを通して混合液をろ過した。ろ液を真空中で濃縮した。Sep-Pak C18カートリッジ (500 mg, Waters, H2O:MeOH, 100:0〜20:1) を用いて残渣を精製し、14糖であるTM (14 mg, 85%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.185 (bs, 3H), 5.127 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 4.966 (bs, 1H), 4.934 (bs, 1H), 4.910 (bs, 1H), 4.898 (bs, 1H), 4.774 (bs, 1H), 4.266 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 4.464 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 4.374 (d, 1H , J = 7.6 Hz), 4.309 (d, 1H, J = 8.0Hz), 4.109 (bs, 2H), 3.990-3.247 (m, H), 1.946 (s, 3H), 1.940 (s, 3H), 1.902 (s, 3H), 1.410 (m, 1H), 0.735 (t, 3H, J = 7.6 Hz); MALDI-TOF mass calcd for C93H157O71N3Na (M + Na)+ 2474.9, found 2474.6.
【０１３２】
【化４０】
2007297429.tif 000041
【０１３３】
製造例２：グリコシダーゼを用いる末端糖残基の選択的切断
糖鎖の非還元末端側に各々独立に除去できる保護基が導入された、糖鎖ライブラリに必要な全ての構造を含む出発糖鎖化合物を調製することにより、グリコシダーゼの選択性に依存することなく、該出発糖鎖化合物を目的糖鎖化合物へと変換することが可能になる。例えば、上記1.13.で製造された、糖鎖の非還元末端側に各々独立に除去できる保護基が導入された高マンノース型糖鎖 (14糖)、又はその誘導体 (例、上記1.12.で製造された化合物) を、グリコシダーゼにより戦略的に切断することで、糖鎖ライブラリを構築できる（図１）。上記1.13. (及び1.12.) で製造された高マンノース型糖鎖化合物は、図２に示されるグリコシダーゼ切断部位を有するので、各種のグリコシダーゼを適宜反応させることで、以下の表１〜４ (但し、一部の化合物は重複) に示されるような種々の糖鎖が生成可能である。
【０１３４】
【表１】
2007297429.tif 000042
【０１３５】
【表２】
2007297429.tif 000043
【０１３６】
【表３】
2007297429.tif 000044
【０１３７】
【表４】
2007297429.tif 000045
【０１３８】
そこで、先ず、上記1.13.で製造された高マンノース型糖鎖の非還元末端に導入された保護基 (糖残基) が実際に、各々独立に除去できるかを検討した。
100μLの反応混合液 (14糖; 1 mg, Jack beans 由来GlcNAc’ase (5 U), A. oryzae 由来ガラクトシダーゼ (50 U) 又はA. oryzae由来グルコシダーゼII (A. oryzae膜画分200μL) のいずれかの酵素, DMNM (デオキシマンノノジリマイシン), 40mM 酢酸バッファー (pH 4.5)) を37℃にて、所定の日数インキュベートした。反応を、100℃で1分間加熱することにより停止させた。不溶性物質をultra-free (Millipore) によりろ過し、ろ液をSep-Pakカートリッジ (Waters, H2O:MeOH, 100:0〜70:30) により精製した（図３Ａ〜Ｂ）。
その結果、高マンノース型糖鎖 (14糖) の非還元末端から、D-グルコースが除去された糖鎖化合物 (上記式 (IIb4’) で表される化合物)、D-ガラクトースが除去された糖鎖化合物 (上記式 (IIa4’) で表される化合物) 及びN-アセチル-D-グルコサミンが除去された糖鎖化合物 (上記式 (IIa1’) で表される化合物)の生成がそれぞれ確認された（図３Ｂ）。
・D-グルコースが除去された糖鎖化合物
C87H147N3O66K1  Calcd for 2328.8, Found 2328.4
・D-ガラクトースが除去された糖鎖化合物
C87H147N3O66Na1  Calcd for 2312.8, Found 2313.5
・N-アセチル-D-グルコサミンが除去された糖鎖化合物
C85H144N2O66Na1  Calcd for 2271.8, Found 2271.7
【０１３９】
製造例３：GM9 (上記式 (IIa5’) で表される化合物) の作製
100μLの反応混合液 (14糖; 1 mg, Jack beans 由来GlcNAc’ase (0.3 U), A. oryzae 由来ガラクトシダーゼ (30 U), 10mM DMNM 1μL, 40mM 酢酸バッファー (pH 4.5)) を37℃で10日間インキュベートした。反応を、100℃で1分間加熱することにより停止させた。不溶性物質をultra-free (Millipore) によりろ過し、ろ液をSep-Pakカートリッジ (Waters, H2O:MeOH, 100:0〜70:30) により精製して、GM9 (1 mg, 収量)を得た。
・GM9 (上記式 (IIa5’) で表される化合物)
Matsuo et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 3402 (2003) に記載の化合物とNMRおよびMSの値の一致を確認した。
【０１４０】
製造例４：GM8B (上記式 (IIa9’) で表される化合物) の作製
100μLの反応混合液 (14糖; 1 mg, A. oryzae由来ガラクトシダーゼ (50U), 40mM酢酸バッファー (pH 4.5)) を37℃で7日間インキュベートした。混合液にα1-2 マンノシダーゼ (A. saitoi, 0.003 U) を加え、12時間インキュベートし、次いでGlcNAc’ase (Jack beans, 0.3 U) 及び10 mM DMN (デオキシノジリマイシン) 1μLを加えた。反応混合液を12時間インキュベートした。100℃で1分間加熱することにより反応を停止させた。不溶性物質をultra-free (Millipore) によりろ過し、ろ液をSep-Pakカートリッジ (Waters, H2O:MeOH, 100:0〜70:30) でろ過して、GM8B (1 mg, 収量)を得た（図４Ａ〜Ｃ）。
・GM8B (上記式 (IIa9’) で表される化合物)
Matsuo et al., Carbohydr. Res. 338: 2163 (2003)に記載の化合物とNMRおよびMSの値の一致を確認した。
また、GM8Bの作製における中間体として、上記式 (IIa4’) 及び (IIa8’) で表される化合物の生成も確認された（図４Ｂ、Ｃ）。
・上記式 (IIa8’) で表される化合物
C81H137N3O61Na1  Calcd for 2150.8, Found 2151.5
【０１４１】
製造例５：GM8C (上記式 (IIa6’) で表される化合物) の作製
100μLの反応混合液 (14糖; 1 mg, Jack beans由来GlcNAc’ase (0.3 U), A. saitoi由来α1-2 Mannosidase (0.001 U), 40mM 酢酸バッファー (pH 4.5)) を37℃で24時間インキュベートした。混合液に、A. oryzae由来ガラクトシダーゼ (30U) 及びDMNMを加えた。反応混合液を10日間インキュベートし、次いで100℃で1分間加熱することにより反応を停止させた。不溶性物質をultra-free (Millipore) によりろ過し、ろ液をSep-Pakカートリッジ (Waters, H2O:MeOH, 100:0〜70:30) により精製して、GM8C (1 mg, 収量) を得た。
・GM8C (上記式 (IIa6’) で表される化合物)
C73H124N2O56Na1  Calcd for 1947.7, Found 1948.9
また、GM8Cの作製における中間体として、上記式 (IIa1’) 及び (IIa2’) で表される化合物の生成も確認された。
・上記式 (IIa2’) で表される化合物
C79H134N2O61Na1  Calcd for 2109.7, Found 2109.9
【０１４２】
製造例６：GM7 (上記式 (IIa10’) で表される化合物) の作製
100μLの反応混合液 (14糖; 1 mg, A. oryzae由来ガラクトシダーゼ (3 mg), Jack beans由来α-マンノシダーゼ (5μL), 40mM 酢酸バッファー (pH 4.5)) を37℃で7分間インキュベートした。混合液にJack beans 由来GlcNAc’ase (0.3 U) 及びA. saitoi由来α1-2マンノシダーゼ (0.001 U) を加え、24時間インキュベートした。100℃で1分間加熱することにより反応を停止させた。不溶性物質をultra-free (Millipore) によりろ過し、ろ液をSep-Pakカートリッジ (Waters, H2O:MeOH, 100:0〜70:30) により精製してGM7を得た（図５Ａ〜Ｃ）。
・GM7 (上記式 (IIa10’) で表される化合物)
C67H114N2O51Na1  Calcd for 1785.6, Found 1787.2
また、GM7の作製における中間体として、上記式 (IIa4’)、(IIa8’)及び (IIa9’) で表される化合物の生成も確認された（図５Ｂ）。
【０１４３】
製造例７：GM7C (上記式 (IIa7’) で表される化合物) の作製
100μLの反応混合液 (14糖; 1 mg, Jack beans由来GlcNAc’ase (0.3 U), Jack beans由来α-マンノシダーゼ (0.5 U), 40mM酢酸バッファー (pH 4.5)) を37℃で12時間インキュベートした。混合液にA. oryzae由来ガラクトシダーゼ (30 U) を加え、26日間インキュベートし、次いで100℃で1分間加熱することにより反応を停止させた。不溶性物質をultra-free (Millipore) によりろ過し、ろ液をSep-Pakカートリッジ (Waters, H2O:MeOH, 100:0〜70:30) により精製して、GM7Cを得た（図６Ａ〜Ｂ）。
・GM7C (上記式 (IIa7’) で表される化合物)
C67H114N2O51Na1  Calcd for 1785.6, Found 1787.2
また、GM7Cの作製における中間体として、上記式 (IIa1’)、(IIa2’) 及び (IIa3’) で表される化合物の生成も確認された（図６Ｂ）。
・上記式 (IIa3’) で表される化合物
C73H124N2O56Na1  Calcd for 1947.7, Found 1945.3
【０１４４】
製造例８：M6Cの作製
600μLの反応混合液 (14糖; 1 mg, Jack beans由来GlcNAc’ase (0.6 U), A. oryzae由来グルコシダーゼII（膜画分）500μL, 40mM酢酸バッファー (pH 4.5)) を37℃で４日間インキュベートした。混合液にA. saitoi由来α1-2マンノシダーゼ (0.001 U) を加え、24時間インキュベートした。混合液にA. oryzae由来ガラクトシダーゼ (30 U) を加え、4日間インキュベートし、次いで100℃で1分間加熱することにより反応を停止させた。不溶性物質をultra-free (Millipore) によりろ過し、ろ液をSep-Pakカートリッジ (Waters, H2O:MeOH, 100:0〜70:30) により精製して、GM6Cを得た（図７Ａ〜Ｂ）。
・GM6C
C55H94N2O41Na1  Calcd for 1461.5, Found 1463.4
また、M6Cの作製における中間体として、上記式 (IIb4’)、(IIb5’) 及び (IIb14’)で表される化合物の生成も確認された（図７Ｂ）。
・上記式 (IIb5’) で表される化合物
C79H134N2O61Na1  Calcd for 2109.7, Found 2111.3
・上記式(IIb14’) で表される化合物
C61H104N2O46Na1  Calcd for 1623.6, Found 1625.8
【０１４５】
製造例９：高マンノース型糖鎖から生成する天然糖鎖と同一構造を有するその他の糖鎖化合物の作製
グルコシダーゼII、ガラクトシダーゼ、GlcNAc’ase、α-マンノシダーゼ及びα1-2マンノシダーゼを、各酵素に応じた適切な反応条件（例、上記の糖鎖化合物の作製で用いた反応条件）において、下記表５に記載される組合せで用いることにより、高マンノース型糖鎖から生成する天然糖鎖と同一構造を有する糖鎖化合物（例、表１参照）を作製する。
【０１４６】
【表５】
2007297429.tif 000046
酵素名は以下の通りである。
Ｇａｌ：β−ガラクトシダーゼ；ＭＩＩ：α１−２マンノシダーゼ；Ｍ：マンノシダーゼ；ＧＮ：グルコシダーゼＩＩ；ＥＭ：エンドマンノシダーゼ
【０１４７】
製造例１０：複合型糖鎖から生成する天然糖鎖と同一構造を有する糖鎖化合物の作製
先ず、糖鎖の非還元末端側に各々独立に除去できる保護基が導入された複合型糖鎖を合成する。このような複合型糖鎖は、Seifert et al., Angewandte Chemie International Edition 39: 531-534 (2000) に記載される方法、及び当該分野において周知の方法を用いることにより、容易に合成できる。次いで、糖鎖の非還元末端側に各々独立に除去できる保護基が導入された複合型糖鎖化合物を、グリコシダーゼにより戦略的に切断することで、糖鎖ライブラリを構築する（図８）。複合型糖鎖化合物は、図９Ａに示される糖残基間の結合様式を有し、図９Ｂに示されるグリコシダーゼ切断部位を有するので、これらのグリコシダーゼを適宜反応させることで、種々の糖鎖が生成される。
【０１４８】
製造例１１：天然Ｏ結合型糖鎖と同一構造を有する糖鎖化合物の作製
糖鎖の非還元末端側に各々独立に除去できる保護基が導入された、糖鎖ライブラリに必要な全ての構造を含む出発糖鎖化合物を調製することにより、グリコシダーゼの選択性に依存することなく、該出発糖鎖化合物を目的糖鎖化合物へと変換することが可能である。天然Ｏ結合型糖鎖は、図１０Ａに示されるＣＯＲＥ１〜８の構造を有し、図１０Ｂに示されるグリコシダーゼ切断部位を有する。従って、図１０Ｃに示されるような、糖鎖の非還元末端側に各々独立に除去できる保護基が導入されたＯ結合型糖鎖化合物を作製し、図１０Ｄに示されるようにグリコシダーゼで選択的に切断することで、天然Ｏ結合型糖鎖と同一構造を有する糖鎖化合物を得ることができる。
また、糖鎖の非還元末端側に各々独立に除去できる保護基（糖残基）が導入された複数の種類のＯ結合型糖鎖化合物（Ｏ結合型糖鎖化合物の末端を保護する糖残基の組合せはそれぞれ異なる）を合成し、これらをアミノ酸（セリン又はスレオニン）の側鎖に結合させる。このように作製された、糖鎖化合物が結合したアミノ酸を、アミノ酸重合反応に供し、複数の種類のＯ結合型糖鎖化合物が結合した糖ペプチドを得る。糖鎖化合物が結合したアミノ酸の重合は、例えば、Nakahara et al., Tetrahedron Letter 35: 3321-3324 (1994) 記載の方法により行う。次いで、複数の種類のＯ結合型糖鎖化合物が結合した糖ペプチドを、グリコシダーゼにより選択的に切断することで、糖ペプチドライブラリを得る（図１１）。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】保護された高マンノース型糖鎖化合物からの種々の糖鎖化合物の構築の概要を示す図である。糖鎖末端の糖残基は、一時的な保護基を示す。
【図２】保護された高マンノース型糖鎖化合物におけるグリコシダーゼ切断部位を示す図である。糖鎖末端の糖残基は、一時的な保護基を示す。  ＧＩＩ：グルコシダーゼＩＩ；Ｇａｌ：β−ガラクトシダーゼ；ＧＮ：ＧｌｃＮＡｃａｓｅ；ＭＩＩ：α１−２マンノシダーゼ；Ｍ：マンノシダーゼ
【図３Ａ】グルコシダーゼＩＩ、ガラクトシダーゼ又はＧｌｃＮＡｃａｓｅによる、保護された高マンノース型糖鎖における糖鎖末端の糖残基の選択的切断の概略を示す図である。
【図３Ｂ】保護された高マンノース型糖鎖化合物における糖鎖末端の糖残基の選択的切断について、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによる確認を示す図である。
【図４Ａ】ガラクトシダーゼ、α１−２マンノシダーゼ及びＧｌｃＮＡｃａｓｅによるＧＭ８Ｂの製造の概略を示す図である。
【図４Ｂ】保護された高マンノース型糖鎖化合物の選択的切断により製造されたＧＭ８Ｂ、及びその中間体について、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによる確認を示す図である。
【図４Ｃ】保護された高マンノース型糖鎖化合物の選択的切断により製造されたＧＭ８Ｂ、及びその中間体について、ＮＭＲによる確認を示す図である。標品として用いた化学合成されたＧＭ８Ｂについては、例えば、 Matsuo et al., Carbohydr. Res. 338: 2163 (2003) を参照のこと。
【図５Ａ】ガラクトシダーゼ、α１−２マンノシダーゼ及びＧｌｃＮＡｃａｓｅによるＧＭ７の製造の概略を示す図である。
【図５Ｂ】保護された高マンノース型糖鎖化合物の選択的切断により製造されたＧＭ７、及びその中間体について、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによる確認を示す図である。
【図５Ｃ】保護された高マンノース型糖鎖化合物の選択的切断によるＧＭ７の製造について、ＮＭＲによる確認を示す図である。標品として用いた化学合成されたＧＭ７は、自ら合成したものを用いた。
【図６Ａ】ガラクトシダーゼ、α１−２マンノシダーゼ、マンノシダーゼ及びＧｌｃＮＡｃａｓｅによるＧＭ７Ｃの製造の概略を示す図である。
【図６Ｂ】保護された高マンノース型糖鎖化合物の選択的切断により製造されたＧＭ７Ｃ、及びその中間体について、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによる確認を示す図である。
【図７Ａ】グルコシダーゼＩＩ、ＧｌｃＮＡｃａｓｅ、ガラクトシダーゼ、α１−２マンノシダーゼ、及びガラクトシダーゼによるＭ６Ｃの製造の概略を示す図である。
【図７Ｂ】保護された高マンノース型糖鎖化合物の選択的切断により製造されたＭ６Ｃ、及びその中間体について、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによる確認を示す図である。
【図８】保護された複合型糖鎖化合物からの種々の糖鎖化合物の構築の概要を示す図である。糖鎖末端の糖残基は、一時的な保護基を示す。
【図９Ａ】保護された複合型糖鎖化合物における糖残基間の結合様式を示す図である。
【図９Ｂ】保護された複合型糖鎖化合物におけるグリコシダーゼ切断部位を示す図である。
【図１０Ａ】天然Ｏ結合型糖鎖ＣＯＲＥ１〜８における糖残基間の結合様式を示す図である。
【図１０Ｂ】天然Ｏ結合型糖鎖ＣＯＲＥ１〜８を切断するグリコシダーゼを示す図である。
【図１０Ｃ】保護されたＯ結合型糖鎖の構造を示す図である。
【図１０Ｄ】保護されたＯ結合型糖鎖化合物からの種々の糖鎖化合物の構築の概要を示す図である。糖残基の記号は、図１０Ａ及び１０Ｂと同じである。
【図１１】糖ペプチドライブラリ構築の概要を示す図である。
【図１】
2007297429.tif 000059
【図２】
2007297429.tif 000060
【図３Ａ】
2007297429.tif 000061
【図４Ａ】
2007297429.tif 000062
【図５Ａ】
2007297429.tif 000063
【図６Ａ】
2007297429.tif 000064
【図７Ａ】
2007297429.tif 000065
【図８】
2007297429.tif 000066
【図９Ａ】
2007297429.tif 000067
【図９Ｂ】
2007297429.tif 000068
【図１０Ａ】
2007297429.tif 000069
【図１０Ｂ】
2007297429.tif 000070
【図１０Ｃ】
2007297429.tif 000071
【図１０Ｄ】
2007297429.tif 000072
【図１１】
2007297429.tif 000073
【図３Ｂ】
2007297429.tif 000074
【図４Ｂ】
2007297429.tif 000075
【図４Ｃ】
2007297429.tif 000076
【図５Ｂ】
2007297429.tif 000077
【図５Ｃ】
2007297429.tif 000078
【図６Ｂ】
2007297429.tif 000079
【図７Ｂ】
2007297429.tif 000080