(57)【要約】【課題】大きな複雑な因子（例えば、ポリヌクレオチド）の細胞への有効な送達に効果的なビヒクルとして使用できる化合物等の提供。【解決手段】脂質結合体化ポリアミド化合物およびそれらの組成物であって、これらは、生物学的に活性な因子の細胞への送達に、特に有用である、組成物、または本願明細書中に記載の一般式を有する脂質結合体化ポリアミド化合物、あるいは、細胞による生物学的に活性な因子の取り込みを誘発する方法であって、以下を包含する：  有効量の生物学的に活性な因子および本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物を含有する組成物を提供すること；次いで、有効用量のこの組成物に、生物学的サンプルを接触させること；  ここで、この生物学的サンプルは、細胞を含有する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載されるような、核酸送達用の脂質−ポリアミド結合体および組成物など。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、脂質結合体化ポリアミド化合物、それらを製造する方法だけでなく
、例えば、生物学的に活性な因子の細胞への送達にて、それらを使用するための
組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
益々複雑な分子構造を有する新規治療剤の発見により、いかにして、それらを
効率的に標的部位へと送達できるかに関する新しい難題が提示されている。例え
ば、組み換えＤＮＡ技術およびヒトゲノム特徴付けにおける最近の発展により、
多くの遺伝的疾患および後天的疾患の分子起源の同定、および所望の遺伝子を含
有する適切なプラスミドの構築が可能となっている。しかしながら、これらの強
力に荷電した大きな構築物（これらは、数千万ダルトンまでの分子量を有し、数
万もの負電荷を含む）の細胞への効率よい送達は、かなりの難題のまま残ってい
る。ポリヌクレオチドの細胞への送達のためのビヒクルとして中性およびカチオ
ン性リポソーム構造物を使用することを評価する研究は、それらのカプセル化し
た構造物がかなり大きくかつ不安定であるので、限定された成功を収めているに
すぎない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、大きな複雑な因子（例えば、ポリヌクレオチド）の細胞への有効な送
達に効果的なビヒクルとして使用できる化合物が、非常に望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明によって、以下が提供される：
（項目１）次式を有する化合物：
【化１】
2007161722.tif 000002
ここで、ｎは、１〜約４８から選択される整数であり、そしてｍは、約２〜約
４８から選択される整数である；
ここで、各単量体単位
【化２】
2007161722.tif 000003
に対するＲ1、およびＲaは、独立して、以下からなる群から選択される：水素原
子；水酸基；アミノ基；カルボキシル基；スルホニル基；−ＳＨ；  必要に応じ
て置換された分枝鎖または直鎖の脂肪族基であり、該脂肪族基は、骨格構造中に
て、１個〜約８個の炭素原子を有し、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素
、イオウおよびリンを含有し、ここで、該脂肪族基は、必要に応じて、１個また
はそれ以上の二重結合または三重結合を有する；必要に応じて置換されたアリー
ル基であって、該アリール基は、骨格構造中にて、約３個〜約１２個の炭素原子
を有し、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有す
る；必要に応じて置換されたアリールアルキル基であり、該アリールアルキル基
は、骨格構造中にて、約３個〜約１２個の炭素原子を有し、該骨格構造は、必要
に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有し、ここで、該アリールアルキ
ル基のアルキル成分は、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三
重結合を有する；ならびに必要に応じてリンカー部分に結合した脂質部分；
ここで、Ｒ1は、少なくとも１個の単量体単位に対して、水素原子ではない；
ここで、Ｒcは、以下から選択される：水素原子；水酸基；アミノ基；ヒドラ
ジン基；スルホニル基；−ＳＨ；必要に応じて置換された分枝鎖または直鎖の脂
肪族基であり、該脂肪族基は、骨格構造中にて、１個〜約８個の炭素原子を有し
、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有し、ここ
で、該脂肪族基は、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三重結
合を有する；必要に応じて置換されたアリール基であって、該アリール基は、骨
格構造中にて、約３個〜約１２個の炭素原子を有し、該骨格構造は、必要に応じ
て、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有する；必要に応じて置換されたアリー
ルアルキル基であり、該アリールアルキル基は、骨格構造中にて、約３個〜約１
２個の炭素原子を有し、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよ
びリンを含有し、ここで、該アリールアルキル基のアルキル成分は、必要に応じ
て、１個またはそれ以上の二重結合または三重結合を有する；ならびに必要に応
じてリンカー部分に結合した脂質部分；
ここで、Ｒ1、ＲaまたはＲcが、骨格構造中にて、約５個より少ない炭素原子
を有するアリール基またはアルキルアリール基のとき、該骨格構造は、さらに、
１個またはそれ以上のヘテロ原子を含有する；
ここで、各単量体単位に対するＷは、独立して、必要に応じて置換された分枝
鎖または直鎖二価部分から選択され、該二価部分は、骨格中にて、１個〜約５０
個の原子を有し、そして必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三
重結合を含有し、該骨格は、炭素を含有し、必要に応じて、窒素、酸素、イオウ
およびリンを含有する；
ここで、該脂質部分は、以下からなる群から選択される疎水性部分または両親
媒性部分である：
（ｉ）  必要に応じて置換されたアリール部分またはアリールアルキル部分で
あって、該アリール部分またはアリールアルキル部分は、骨格構造中にて、約１
４個〜約５０個の炭素原子を有し、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、
イオウおよびリンを含有し、ここで、該アリールアルキルのアルキル成分は、必
要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三重結合を有する；ならびに
（ｉｉ）  必要に応じて置換された分枝鎖または直鎖の脂肪族部分であって、
該脂肪族部分は、骨格構造中にて、約１０個〜約５０個の炭素原子を有し、該骨
格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有し、ここで、該
脂肪族部分は、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三重結合を
有する；および
ここで、Ｒa、Ｒc、単一の単量体単位に対するＷおよび単一の単量体単位に対
するＲ1の少なくとも１個は、脂質部分を含有する。
（項目２）Ｒ1が、少なくとも２個の単量体単位に対して、水素原子で
はない、項目１に記載の化合物。
（項目３）Ｒ1が、前記単量体単位のいずれかに対して、水素原子では
ない、項目１に記載の化合物。
（項目４）各Ｒ1が、独立して、カチオン性側鎖、アニオン性側鎖およ
び中性側鎖からなる群から選択される、項目１に記載の化合物。
（項目５）Ｒ1が、天然に生じるアミノ酸および天然に生じないアミノ
酸で見出される部分から選択される、項目１に記載の化合物。
（項目６）前記カチオン性側鎖が、アミノアルキルおよびその誘導体；
（Ｓ）−α−メチルエチレンジアミノおよびその誘導体；トリメチルアミノエチ
ルおよびその誘導体；グアニジノアルキルおよびその誘導体；アミノベンジルお
よびその誘導体；ピリジニウムおよびその誘導体；およびイソアミルおよびその
誘導体からなる群から選択される、項目４に記載の化合物。
（項目７）前記中性側鎖が、（Ｓ）−α−メチルベンジル、（Ｒ）−α
−メチルベンジル、およびそれらの誘導体；ベンジルおよびその誘導体；フェネ
チルおよびその誘導体；ナフチルメチルおよびその誘導体；（Ｓ）−α−メチル
ナフチル、（Ｒ）−α−メチルナフチル、およびそれらの誘導体；Ｎ−プロピル
ピロリジノンおよびその誘導体；シクロヘキシルメチルおよびその誘導体；フル
フリルおよびその誘導体；３，４，５−トリメトキシベンジルおよびその誘導体
；アルコキシアルキルおよびその誘導体；ならびにｐ−メトキシフェネチルおよ
びその誘導体からなる群から選択される、項目４に記載の化合物。
（項目８）前記アニオン性側鎖が、カルボキシ、カルボキシメチル、カ
ルボキシエチル、およびそれらの誘導体；安息香酸およびその誘導体；ホスフェ
ートおよびその誘導体；ならびにスルフェートおよびその誘導体からなる群から
選択される、項目４に記載の化合物。
（項目９）−Ｗ−が、−ＣＨ2ＣＨ2−、
【化３】
2007161722.tif 000004
−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−、および−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−からなる群から選択される
、項目１に記載の化合物。
（項目１０）−Ｗ−が、次式、−ＣＲ2Ｒ3−を有する、項目１に記載
の化合物：
ここで、各単量体単位に対するＲ2およびＲ3は、独立して、以下から選択され
る一価部分である：水素原子；水酸基；アミノ基；カルボキシル基；スルホニル
基；−ＳＨ；必要に応じて置換された分枝鎖または直鎖の脂肪族基であり、該脂
肪族基は、骨格構造中にて、１個〜約８個の炭素原子を有し、該骨格構造は、必
要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有し、ここで、該脂肪族基は、
必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三重結合を有する；必要に
応じて置換されたアリール基であって、該アリール基は、骨格構造中にて、約３
個〜約１２個の炭素原子を有し、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イ
オウおよびリンを含有する；必要に応じて置換されたアリールアルキル基であり
、該アリールアルキル基は、骨格構造にて、約３個〜約１２個の炭素原子を有し
、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有し、ここ
で、該アリールアルキルのアルキル成分は、必要に応じて、１個またはそれ以上
の二重結合または三重結合を有する；ならびに必要に応じてリンカー部分に結合
した脂質部分；
ここで、Ｒ2またはＲ3のいずれかが、骨格構造中にて、約５個より少ない炭素
原子を有するアリール基またはアリールアルキル基であるとき、該骨格構造は、
さらに、１個またはそれ以上のヘテロ原子を含有する。
（項目１１）Ｒ2およびＲ3が、共に、水素原子である、項目１０に記
載の化合物。
（項目１２）Ｒaが、脂質部分を含有する、項目１に記載の化合物。
（項目１３）少なくとも１個のＲ1が、脂質部分を含有する、項目１
に記載の化合物。
（項目１４）Ｒcが、脂質部分を含有する、項目１に記載の化合物。
（項目１５）Ｒaが、脂質部分を含有する、項目１１に記載の化合物
。
（項目１６）少なくとも１個のＲ1が、脂質部分を含有する、項目１
１に記載の化合物。
（項目１７）Ｒcが、脂質部分を含有する、項目１１に記載の化合物
。
（項目１８）前記脂質部分が、天然または合成で誘導体化される、請求
項１に記載の化合物。
（項目１９）前記脂質部分が、ホスホグリセリド、グリコシルグリセリ
ド、スフィンゴ脂質、および飽和および不飽和ステロールから誘導体化される、
項目１に記載の化合物。
（項目２０）前記ホスホグリセリドが、ホスファチジルエタノールアミ
ンである、項目１９に記載の化合物。
（項目２１）ｎが３であり、その結果として前記化合物が次式を有する
、項目１に記載の化合物：
【化４】
2007161722.tif 000005
ここで、Ｒ11は、カチオン性側鎖であり、そしてＲ12およびＲ13は、共に、中
性側鎖である。
（項目２２）Ｒaが、脂質部分を含有する、項目２１に記載の化合物
。
（項目２３）前記脂質部分が、ホスホグリセリド、グリコシルグリセリ
ド、スフィンゴ脂質、飽和ステロールおよび不飽和ステロールからなる群から選
択される化合物から誘導される、項目２２に記載の化合物。
（項目２４）前記ホスホグリセリドが、ホスファチジルエタノールアミ
ンおよびホスファチジルプロパノールアミンからなる群から選択される、項目
２３に記載の化合物。
（項目２５）前記Ｒaが、次式を有する、項目２４に記載の化合物：
【化５】
2007161722.tif 000006
ここで、ｐは、２または３から選択される整数であり、そして各Ｒ4は、独立
して、骨格中にて約６個〜約２５個の炭素原子を有するアルキル部分またはアル
ケニル部分から選択される。
（項目２６）脂質結合体化ポリアミド化合物を合成する方法であって、
該方法は、以下を包含する：
ａ）  以下の（１）と（２）とを接触させる工程：
（１）  脂質反応物；
（２）  オリゴマー反応物であって、ここで、該オリゴマー反応物は、以下
の一般式を有する：
【化６】
2007161722.tif 000007
ここで、ｎは、１〜約４８から選択される整数であり、そしてｍは、約２〜約
４８の整数である；
ここで、各ＴaおよびＴcは、独立して、末端基、および該脂質反応物とさらに
反応し得る反応性部分から選択される；
ここで、該オリゴマー反応物中にて、各単量体単位
【化７】
2007161722.tif 000008
に対するＲ1は、以下からなる群から選択される：水素原子；水酸基；アミノ基
；カルボキシル基；スルホニル基；−ＳＨ；必要に応じて置換された分枝鎖また
は直鎖の脂肪族基であり、該脂肪族基は、骨格構造中にて、１個〜約８個の炭素
原子を有し、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含
有し、ここで、該脂肪族基は、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合ま
たは三重結合を有する；必要に応じて置換されたアリール基であって、該アリー
ル基は、骨格構造中にて、約３個〜約１２個の炭素原子を有し、該骨格構造は、
必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有する；必要に応じて置換さ
れたアリールアルキル基であり、該アリールアルキル基は、骨格構造にて、約３
個〜約１２個の炭素原子を有し、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イ
オウおよびリンを含有し、ここで、該アリールアルキルのアルキル成分は、必要
に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三重結合を有する；ならびに前
記脂質反応物とさらに反応し得る反応性部分；
ここで、Ｒ1、ＲaまたはＲcが、骨格構造中にて、約５個より少ない炭素原子
を有するアリール基またはアルキルアリール基のとき、該骨格構造は、さらに、
１個またはそれ以上のヘテロ原子を含有する；
ここで、Ｒ1は、少なくとも１個の単量体単位に対して、水素原子ではない、
ここで、各単量体単位に対するＷは、必要に応じて置換された分枝鎖または直
鎖二価部分から選択され、該二価部分は、骨格中にて、１個〜約５０個の原子を
有し、そして該骨格は、炭素を含有し、そして必要に応じて、窒素、酸素、イオ
ウおよびリンを含有し、また、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合ま
たは三重結合を含有する；
ここで、Ｔa、Ｔc、単一の単量体単位に対するＷ、および単一の単量体単位に
対するＲ1の少なくとも１個は、該脂質反応物とさらに反応し得る反応性部分を
含有する；次いで、
ｂ）  該脂質反応物を該オリゴマー反応物と反応させて、該脂質反応物を該オ
リゴマー反応物と結合体化する工程。
（項目２７）項目１に記載の前記脂質結合体化ポリアミド化合物およ
び生物学的に活性な因子を含有する組成物。
（項目２８）細胞による生物学的に活性な因子の取り込みを誘発する方
法であって、該方法は、以下を包含する：
有効量の生物学的に活性な因子および脂質結合体化ポリアミド化合物を含有す
る組成物を提供すること；次いで、
有効用量の該組成物に、生物学的サンプルを接触させること；
ここで、該生物学的サンプルは、細胞を含有する。
（項目２９）前記生物学的に活性な因子が、ポリ核酸である、項目２
８に記載の方法。
（項目３０）インビボにて細胞による生物学的に活性な因子の取り込み
を誘発する方法であって、該方法は、以下を包含する：
有効量の生物学的に活性な因子および項目１に記載の脂質結合体化ポリアミ
ド化合物を含有する組成物を提供する工程；次いで、
有効用量の該組成物を被験体に投与する工程。
（項目３１）前記生物学的に活性な因子が、ポリ核酸である、項目３
０に記載の方法。
（項目３２）哺乳動物にて遺伝子を発現する方法であって、該方法は、
以下を包含する：
項目１に記載の脂質結合体化ポリアミド化合物で複合体化したポリ核酸を、
哺乳動物に投与する工程；
ここで、該ポリ核酸は、該哺乳動物にて、該遺伝子を機能的に発現し得る；な
らびに
ここで、該複合体は、該遺伝子を該哺乳動物中の細胞へとトランスフェクトす
るのに有効である。
（項目３３）ヌクレアーゼで誘発したポリヌクレオチドの分解を実質的
に防止する方法であって、該方法は、以下を包含する：
分解を防止する量の項目１に記載の前記脂質結合体化ポリアミド化合物に、
ポリヌクレオチドを接触させる工程；ならびに
該ポリヌクレオチドおよび該脂質結合体化ポリアミド化合物を、ヌクレアーゼ
含有環境へと導入する工程。
（項目３４）送達ビヒクルで複合体化したポリ核酸の安定な調製物を製
造する方法であって、該方法は、以下を包含する：
ａ）  実質的に沈殿物のない希釈ポリ核酸溶液として、第一の液状キャリア中
にて、ポリ核酸を提供する工程；
ｂ）  実質的に沈殿物のない送達ビヒクル溶液として、第二の液状キャリア中
にて、送達ビヒクル形成化合物を提供する工程；
ｃ）  該希釈ポリ核酸溶液を、該送達ビヒクル溶液と配合して、送達ビヒクル
／ポリ核酸複合体の希釈調製物を形成する工程；次いで、
ｄ）  該希釈調製物の容量を減少して、送達ビヒクル／ポリ核酸複合体の安定
な調製物を形成する工程；
ここで、該安定な調製物中のポリ核酸の濃度は、該希釈ポリ核酸溶液中のポリ
核酸の濃度よりも高い；そして
ここで、該安定な調製物は、実質的に沈殿物を含有しない。
（項目３５）前記送達ビヒクルが、リポソームである、項目３４に記
載の方法。
（項目３６）前記送達ビヒクル形成化合物が、脂質、ポリカチオン性非
脂質化合物、および脂質結合体化ポリアミド化合物から選択される、項目３４
に記載の方法。
（発明の要旨）
本発明は、脂質結合体化ポリアミド化合物およびそれらの組成物に関し、これ
らは、生物学的に活性な因子の細胞への送達に、特に有用である。具体的には、
本発明は、以下の一般式を有する脂質結合体化ポリアミド化合物を提供する：
【０００５】
【化８】
2007161722.tif 000009
【０００６】
ここで、ｎは、１〜約４８から選択される整数であり、そしてｍは、約２〜約
４８から選択される整数である；
ここで、各単量体単位
【０００７】
【化９】
2007161722.tif 000010
【０００８】
についてのＲ1、およびＲaは、独立して、以下からなる群から選択される：水素
原子；水酸基；アミノ基；カルボキシル基；スルホニル基；−ＳＨ；必要に応じ
て置換された分枝鎖または直鎖の脂肪族基であり、この脂肪族基は、骨格構造中
にて、１個〜約８個の炭素原子を有し、この骨格構造は、必要に応じて、窒素、
酸素、イオウおよびリンを含有し、ここで、この脂肪族基は、必要に応じて、１
個またはそれ以上の二重結合または三重結合を有する；必要に応じて置換された
アリール基であって、このアリール基は、骨格構造中にて、約３個〜約１２個の
炭素原子を有し、この骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリ
ンを含有する；必要に応じて置換されたアリールアルキル基であり、このアリー
ルアルキル基は、骨格構造にて、約３個〜約１２個の炭素原子を有し、この骨格
構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有し、ここで、この
アリールアルキル基のアルキル成分は、必要に応じて、１個またはそれ以上の二
重結合または三重結合を有する；および必要に応じてリンカー部分に結合した脂
質部分；
ここで、Ｒ1は、少なくとも１個の単量体単位に対して、水素原子ではない；
ここで、Ｒcは、独立して、以下から選択される：水素原子；水酸基；アミノ
基；ヒドラジン基；スルホニル基；−ＳＨ；必要に応じて置換された分枝鎖また
は直鎖の脂肪族基であり、この脂肪族基は、骨格構造中にて、１個〜約８個の炭
素原子を有し、この骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリン
を含有し、ここで、この脂肪族基は、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重
結合または三重結合を有する；必要に応じて置換されたアリール基であって、こ
のアリール基は、骨格構造中にて、約３個〜約１２個の炭素原子を有し、この骨
格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有する；必要に応
じて置換されたアリールアルキル基であり、このアリールアルキル基は、骨格構
造中にて、約３個〜約１２個の炭素原子を有し、この骨格構造は、必要に応じて
、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有し、ここで、このアリールアルキル基の
アルキル基は、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三重結合を
有する；および必要に応じてリンカー部分に結合した脂質部分；
ここで、Ｒ1、ＲaまたはＲcが、骨格構造中にて、約５個より少ない炭素原子
を有するアリール基またはアルキルアリール基のとき、この骨格構造は、さらに
、１個またはそれ以上のヘテロ原子を含有する；
ここで、各単量体単位についてのＷは、独立して、必要に応じて置換された分
枝鎖または直鎖二価部分から選択され、この二価部分は、骨格中にて、１個〜約
５０個の原子を有し、そして必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合また
は三重結合を含有し、この骨格は、炭素を含有し、必要に応じて、窒素、酸素、
イオウおよびリンを含有する；ここで、このＷの任意の置換は、必要に応じてリ
ンカー部分に結合した脂質部分であり得る；
ここで、この脂質部分は、以下からなる群から選択される疎水性部分または両
親媒性部分である：
（ｉ）  必要に応じて置換されたアリール部分またはアリールアルキル部分で
あって、このアリール部分またはアリールアルキル部分は、骨格構造中にて、約
１４個〜約５０個の炭素原子を有し、この骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸
素、イオウおよびリンを含有し、ここで、このアリールアルキル部分のアルキル
成分は、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三重結合を有する
；および
（ｉｉ）  必要に応じて置換された分枝鎖または直鎖の脂肪族部分であって、
この脂肪族部分は、骨格構造中にて、約１０個〜約５０個の炭素原子を有し、こ
の骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有し、ここで
、この脂肪族部分は、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三重
結合を有する；および
ここで、Ｒa、Ｒc、単一の単量体単位についてのＷ、および単一の単量体単位
についてのＲ1の少なくとも１個は、必要に応じてリンカー部分に結合した脂質
部分を含有する。
【０００９】
本発明はまた、脂質結合体化ポリアミド化合物を合成する方法を提供し、この
方法は、以下を包含する：
ａ）  以下の（１）と（２）とを接触させること：
（１）  脂質反応物；
（２）  オリゴマー反応物であって、ここで、このオリゴマー反応物は、以
下の一般式を有する：
【００１０】
【化１０】
2007161722.tif 000011
【００１１】
ここで、ｎは、１〜約４８から選択される整数であり、そしてｍは、約２〜約
４８の整数である；
ここで、各ＴaおよびＴcは、独立して、末端基、およびこの脂質反応物とさら
に反応できる反応性部分から選択される；
ここで、このオリゴマー反応物中にて、各単量体単位
【００１２】
【化１１】
2007161722.tif 000012
【００１３】
についてのＲ1は、以下からなる群から選択される：水素原子；水酸基；アミノ
基；カルボキシル基；スルホニル基；−ＳＨ；必要に応じて置換された分枝鎖ま
たは直鎖の脂肪族基であり、この脂肪族基は、骨格構造中にて、１個〜約８個の
炭素原子を有し、この骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリ
ンを含有し、ここで、この脂肪族基は、必要に応じて、１個またはそれ以上の二
重結合または三重結合を有する；必要に応じて置換されたアリール基であって、
このアリール基は、骨格構造中にて、約３個〜約１２個の炭素原子を有し、この
骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有する；必要に
応じて置換されたアリールアルキル基であり、このアリールアルキル基は、骨格
構造にて、約３個〜約１２個の炭素原子を有し、この骨格構造は、必要に応じて
、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有し、ここで、このアリールアルキル基の
アルキル基は、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三重結合を
有する；およびこの脂質反応物とさらに反応できる反応部分；
ここで、Ｒ1、ＲaまたはＲcが、骨格構造中にて、約５個より少ない炭素原子
を有するアリール基またはアルキルアリール基のとき、この骨格構造は、さらに
、１個またはそれ以上のヘテロ原子を含有する；
ここで、Ｒ1は、少なくとも１個の単量体単位について、水素原子ではない；
ここで、各単量体単位についてのＷは、必要に応じて置換された分枝鎖または
直鎖二価部分から選択され、この二価部分は、骨格中にて、１個〜約５０個の原
子を有し、そしてこの骨格は、炭素を含有し、必要に応じて、窒素、酸素、イオ
ウおよびリンを含有し、また、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合ま
たは三重結合を含有する；ここで、このＷの任意の置換は、この脂質反応物とさ
らに反応できる反応部分であり得る；
ここで、Ｔa、Ｔc、単一の単量体単位についてのＷ、または単一の単量体単位
に対するＲ1の少なくとも１個は、この脂質反応物とさらに反応できる反応性部
分を含有する；次いで、
ｂ）  この脂質反応物をこのオリゴマー反応物と反応させて、この脂質反応物
をこのオリゴマー反応物と結合体化すること。
【００１４】
他の実施態様では、本発明は、本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物および
生物学的に活性な因子を含有する組成物を提供する。
【００１５】
さらに他の実施態様では、本発明は、細胞による生物学的に活性な因子の取り
込みを誘発する方法を提供し、この方法は、以下を包含する：
有効量の生物学的に活性な因子および本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物
を含有する組成物を提供すること；次いで、
有効用量のこの組成物に、生物学的サンプルを接触させること；
ここで、この生物学的サンプルは、細胞を含有する。
【００１６】
さらに他の実施態様では、本発明は、インビボにて細胞による生物学的に活性
な因子の取り込みを誘発する方法を提供し、この方法は、以下を包含する：
有効量の生物学的に活性な因子および本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物
を含有する組成物を提供すること；次いで、
有効用量のこの組成物を被験体に投与すること。
【００１７】
さらに別の実施態様では、本発明は、哺乳動物にて遺伝子を発現する方法を提
供し、この方法は、以下を包含する：
本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物と複合体化したポリ核酸を、哺乳動物
に投与すること；
ここで、このポリ核酸は、この哺乳動物にて、この遺伝子を機能的に発現でき
る；そして
ここで、この複合体は、この遺伝子をこの哺乳動物の細胞へとトランスフェク
トするのに効果的である。
【００１８】
さらに他の実施態様では、本発明は、ヌクレアーゼで誘発したポリヌクレオチ
ドの分解を実質的に阻害する方法を提供し、この方法は、以下を包含する：
分解を阻害する量の脂質結合体化ポリアミド化合物に、ポリヌクレオチドを接
触させること；そして
このポリヌクレオチドおよびこの脂質結合体化ポリアミド化合物を、ヌクレア
ーゼ含有環境に導入すること。
【００１９】
さらに別の実施態様では、本発明は、送達ビヒクルで複合体化したポリ核酸の
安定な製剤を製造する方法を提供し、この方法は、以下を包含する：
ａ）  実質的に沈殿物のない希釈ポリ核酸溶液として、第一液状キャリア中に
て、ポリ核酸を提供すること；
ｂ）  実質的に沈殿物のない送達ビヒクル溶液として、第二液状キャリア中に
て、送達ビヒクル形成化合物を提供すること；
ｃ）  この希釈ポリ核酸溶液を、この送達ビヒクル溶液と配合して、送達ビヒ
クル／ポリ核酸複合体の希釈製剤を形成すること；次いで、
ｄ）  この希釈製剤の容量を小さくして、この送達ビヒクル／ポリ核酸複合体
の安定な製剤を形成すること；
ここで、この安定な製剤中のポリ核酸の濃度は、この希釈ポリ核酸溶液中のポ
リ核酸の濃度よりも高い；そして
ここで、この安定な製剤は、実質的に沈殿物を含有しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（一般方法および詳細な説明）
「脂質結合体化ポリアミド化合物」および「脂質結合体化化合物」との用語は
、オリゴマー性アミド部分および１個またはそれ以上の脂質部分の両方を有する
本発明の化合物を意味するように、本明細書中では、交換可能に使用される。
【００２１】
「オリゴマー」および「オリゴマー性アミド」との用語は、アミド結合、すな
わち、
【００２２】
【化１２】
2007161722.tif 000013
【００２３】
により共に連結した２個またはそれ以上の単量体単位を意味するように、本明細
書中では、交換可能に使用される。
【００２４】
「単量体」または「単量体」単位との用語は、次式
【００２５】
【化１３】
2007161722.tif 000014
【００２６】
により定義される単位を意味する。
【００２７】
本明細書中で使用する「脂質」との用語は、疎水性部分または両親媒性部分を
意味する。脂質部分は、このオリゴマー性アミド部分に直接的に、または必要に
応じてリンカー部分を介してこのオリゴマー性アミド部分に間接的に結合体化で
きる。
【００２８】
「オリゴマー性反応物」、「オリゴマー反応物」および「オリゴマー性アミド
反応物」および「脂質反応物」との用語は、本明細書中にて、そこから本発明の
脂質結合体化ポリアミド化合物が合成される反応性種を意味する。
【００２９】
「骨格」との用語は、本明細書中では、典型的には、共有結合した炭素または
ヘテロ原子の直鎖、分枝または環状配列のいずれかである部分の足場構造を意味
する（すなわち、この足場構造は、いずれの水素原子も含まないか、あるいは、
そこに結合した置換基を含まない）。
【００３０】
本明細書中で使用する「必要に応じて置換された」との用語は、一価基（例え
ば、ヒドロキシル、カルボキシル、ホスホ、アミノ、ハロ、アルキル、アリール
、アリールアルキル、チオアミド、アミド、ニトロ、シアノ、ハロアルキルなど
）での水素の置き換えを意味する。
【００３１】
「脂肪族」との用語は、本明細書中では、芳香族特性を有さない直鎖、分枝お
よび環状化合物を意味し、これらは、炭素原子、および必要に応じて、１個また
はそれ以上のヘテロ原子（すなわち、１個またはそれ以上の官能基、例えば、置
換アミノ、アルコキシ、カルボニル、エステルなど）、および必要に応じて、１
個またはそれ以上の二重結合または三重結合（すなわち、それぞれ、アルケニル
またはアルキニル）を包含する。
【００３２】
本明細書中で使用する「アリール」との用語は、芳香族基、例えば、一環式お
よび多環式の芳香族基を意味し、その中には、１個またはそれ以上のヘテロ原子
（例えば、窒素、酸素、イオウおよびリン）が取り込まれている。「多環式」と
の用語は、本明細書中では、少なくとも１個の環式構造が芳香族である縮合およ
び非縮合の両方の環式構造を意味する。代表的なアリール部分は、フェニル、ナ
フチルなどを含む。
【００３３】
「アリールアルキル」との用語は、本明細書中では、アリール基で置換された
アルキル基を意味し、その中には、任意の官能基が取り込まれている。代表的な
アリールアルキル部分には、ベンジル、ピコリル（ｐｉｃｏｌｙｌ）などが挙げ
られる。
【００３４】
本明細書中で使用する「送達ビヒクル」との用語は、複合体化して、そして標
的部位への生物学的に活性な化合物の送達を容易にする化合物および／または構
造体を意味する。本発明を実施する際に使用する適切な送達ビヒクルには、例え
ば、本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物、脂質、ポリカチオン性非脂質化合
物、リポソームなどが挙げられる。
【００３５】
本明細書中で使用する「複合体」との用語は、２個またはそれ以上の化合物ま
たは構造体の間の相互作用により形成される構造体を意味する。このような相互
作用は、化学的な相互作用（例えば、共有結合、イオン結合または二次結合（例
えば、水素結合））などを介してであり得、または物理的相互作用（例えば、カ
プセル化、包括など）を介してであり得る。
【００３６】
例えば、本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物は、内生タンパク質分解酵素
による分解を受けやすい中間に位置したアミノ酸配列によって、共有結合を介し
て、低分子量の生物学的に活性な化合物（例えば、オリゴヌクレオチドを含めて
）に複合体化できる。それゆえ、例えば、この複合体を分解性酵素に晒すことに
より、開裂が起こり、引き続いて、この複合体から、この生物学的に活性な化合
物が解離される。本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物はまた、イオン結合ま
たは二次結合によって、あるいは、カプセル化または包括によって、生物学的に
活性な化合物（例えば、ポリヌクレオチド）に複合体化できる。
【００３７】
「ポリヌクレオチド」および「ポリ核酸」との用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およ
びそれらのアナログ、ペプチド−核酸だけでなく、非リン酸塩含有ヌクレオチド
を有するＤＮＡまたはＲＮＡを意味するように、本明細書中では、交換可能に使
用される。本発明を実施する際に使用されるポリヌクレオチドは、一本鎖、二本
鎖、またはキメラ一本鎖または二本鎖の分子であり得る。
【００３８】
本明細書中で言及した全ての文献の内容は、これらの文献が関連して引用する
本発明の特徴を開示し記述する目的上、本明細書中で参考として援用されている
。
【００３９】
（脂質結合体化ポリアミド化合物）
本発明は、以下の一般式を有する脂質結合体化ポリアミド化合物を提供する：
【００４０】
【化１４】
2007161722.tif 000015
【００４１】
ここで、ｎは、１〜約４８から選択される整数であり、そしてｍは、約２〜約
４８から選択される整数である；
ここで、各単量体単位
【００４２】
【化１５】
2007161722.tif 000016
【００４３】
に対するＲ1、およびＲaは、独立して、以下からなる群から選択される：水素原
子；水酸基；アミノ基；カルボキシル基；スルホニル基；−ＳＨ；  必要に応じ
て置換された分枝鎖または直鎖の脂肪族基であり、該脂肪族基は、骨格構造中に
て、１個〜約８個の炭素原子を有し、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素
、イオウおよびリンを含有し、ここで、該脂肪族基は、必要に応じて、１個また
はそれ以上の二重結合または三重結合を有する；必要に応じて置換されたアリー
ル基であって、該アリール基は、骨格構造中にて、約３個〜約１２個の炭素原子
を有し、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有す
る；必要に応じて置換されたアリールアルキル基であり、該アリールアルキル基
は、骨格構造にて、約３個〜約１２個の炭素原子を有し、該骨格構造は、必要に
応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有し、ここで、該アリールアルキル
基のアルキル成分は、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三重
結合を有する；および必要に応じてリンカー部分に結合した脂質部分；
ここで、Ｒ1は、少なくとも１個の単量体単位に対して、水素原子ではない；
ここで、Ｒcは、以下から選択される：水素原子；水酸基；アミノ基；ヒドラ
ジン基；スルホニル基；−ＳＨ；必要に応じて置換された分枝鎖または直鎖の脂
肪族基であり、該脂肪族基は、骨格構造中にて、１個〜約８個の炭素原子を有し
、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有し、ここ
で、該脂肪族基は、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三重結
合を有する；必要に応じて置換されたアリール基であって、該アリール基は、骨
格構造中にて、約３個〜約１２個の炭素原子を有し、該骨格構造は、必要に応じ
て、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有する；必要に応じて置換されたアリー
ルアルキル基であり、該アリールアルキル基は、骨格構造中にて、約３個〜約１
２個の炭素原子を有し、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよ
びリンを含有し、ここで、該アリールアルキル基のアルキル基は、必要に応じて
、１個またはそれ以上の二重結合または三重結合を有する；および必要に応じて
リンカー部分に結合した脂質部分；
ここで、Ｒ1、ＲaまたはＲcが、骨格構造中にて、約５個より少ない炭素原子
を有するアリール基またはアルキルアリール基のとき、該骨格構造は、さらに、
１個またはそれ以上のヘテロ原子（例えば、酸素および／または窒素）を含有す
る；
ここで、各単量体単位に対するＷは、独立して、必要に応じて置換された分枝
鎖または直鎖二価部分から選択され、該二価部分は、骨格中にて、１個〜約５０
個の原子を有し、そして必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三
重結合を有し、該骨格は、炭素を含有し、必要に応じて、窒素、酸素、イオウお
よびリンを含有し、ここで、Ｗの該任意の置換は、必要に応じてリンカー部分に
結合した脂質部分であり得る；
ここで、該脂質部分は、以下からなる群から選択される疎水性部分または両親
媒性部分である：
（ｉ）  必要に応じて置換されたアリール部分またはアリールアルキル部分で
あって、該アリール部分またはアリールアルキル部分は、骨格構造中にて、約１
４個〜約５０個の炭素原子を有し、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、
イオウおよびリンを含有し、ここで、該アリールアルキル部分のアルキル基は、
必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三重結合を有する；および
（ｉｉ）  必要に応じて置換された分枝鎖または直鎖の脂肪族部分であって、
該脂肪族部分は、骨格構造中にて、約１０個〜約５０個の炭素原子を有し、該骨
格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有し、ここで、該
脂肪族部分は、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三重結合を
有する；および
ここで、Ｒa、Ｒc、単一の単量体単位に対するＷおよび単一の単量体単位に対
するＲ1の少なくとも１個は、脂質部分を含有する。
【００４４】
本発明の脂質結合体化ポリアミドは、ランダム重合体であり得、ここで、各Ｒ
1およびＷは、単量体ごとに変わる（例えば、ここで、ｎは１であり、そしてｍ
は、約２〜約４８の整数である）。あるいは、この脂質結合体化ポリアミドは、
ｍ個のｎ量体を有する重合体であり得（すなわち、ｎは、１より大きく、そして
ｍは、約２〜約４８の整数である）、これは、繰り返し（すなわち、各ｎ量体は
、同じである）またはランダム変数（すなわち、各ｎ量体の単量体組成は、ｎ量
体ごとに異なっている）のいずれかである。
【００４５】
典型的には、整数ｎは、約４０以下であり、さらに典型的には、約２０以下で
あり、さらにより典型的には、約６以下である。好ましくは、ｎは、約３である
。整数ｍは、典型的には、約４０以下であり、さらに典型的には、約２５以下で
ある。通常、整数ｍは、約１５以下であり、典型的には、約１２以下であり、さ
らにより典型的には、約８以下である。
【００４６】
脂肪族部分の骨格構造およびアリールアルキル部分のアルキル成分に取り込ま
れるヘテロ原子（すなわち、窒素、酸素、イオンおよびリン）は、典型的には、
官能基（例えば、置換アミン、カルボニル、アルコキシ、エステルなど）を形成
する。それゆえ、本発明の化合物で使用される脂肪族部分およびアリールアルキ
ル部分は、必要に応じて、その中に取り込まれた、１個またはそれ以上の官能基
を有する。アリール部分の骨格構造に取り込まれたヘテロ原子は、環状アリール
部分では、環原子として取り込まれている。
【００４７】
Ｒ1、ＲaおよびＲcが脂肪族のとき、それらは、典型的には、骨格構造中にて
、少なくとも２個の炭素原子を含有し、さらに典型的には、骨格構造中にて、少
なくとも約３個の炭素原子を含有する。アリールおよびアリールアルキルＲ1、
ＲaおよびＲc基は、線状または環状であり得る。骨格構造中に約５個未満の炭素
原子を有するアリールおよびアリールアルキルＲ1、ＲaおよびＲcはまた、典型
的には、骨格構造中にて、１個またはそれ以上のヘテロ原子（例えば、窒素およ
び／または酸素）を有する。典型的には、アリールおよびアリールアルキルＲ1
、ＲaおよびＲcは、骨格構造中にて、少なくとも約５個の炭素原子を有する。
【００４８】
Ｒaは、典型的には、−ＯＨ、−Ｈ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、スルホニル、また
は必要に応じてリンカー部分に結合体化した脂質部分である。Ｒcは、典型的に
は、−ＯＨ、−Ｈ、−ＳＨ、−ＮＨ2、スルホニル、ヒドラジン、または必要に
応じてリンカー部分に結合体化した脂質部分である。好ましくは、ＲaまたはＲc
のいずれかは、必要に応じてリンカー部分に結合体化した脂質部分である。
【００４９】
Ｒ1は、生理学的に適切なｐＨでカチオン性、アニオン性または中性である側
鎖であり得る。典型的には、生理学的なｐＨは、少なくとも約５．５であり、典
型的には、少なくとも約６．０である。さらに典型的には、生理学的なｐＨは、
少なくとも約６．５である。通常、生理学的なｐＨは、約８．５未満であり、典
型的には、約８．０未満である。さらに典型的には、生理学的なｐＨは、約７．
５未満である。
【００５０】
適当なカチオン性側鎖には、例えば、アミノアルキル（例えば、アミノエチル
、アミノプロピル、アミノブチル、アミノペンチルなど）ならびにそれらの誘導
体；（Ｓ）−α−メチルエチレンジアミノおよびその誘導体；トリメチルアミノ
エチルおよびその誘導体；グアニジノアルキル（例えば、グアニジノエチル、グ
アニジノプロピル、グアニジノブチル、グアニジノペンチルなど）およびそれら
の誘導体；アミノベンジルおよびその誘導体；ピリジニウムおよびその誘導体；
および他の同様の当業者に公知のカチオン性部分が挙げられる。
【００５１】
適当な中性側鎖には、例えば、（Ｓ）または（Ｒ）−α−メチルベンジルおよ
びそれらの誘導体；ベンジルおよびその誘導体；フェネチルおよびその誘導体；
ナフチルメチルおよびその誘導体；（Ｓ）または（Ｒ）−α−メチルナフチルお
よびそれらの誘導体；Ｎ−プロピルピロリジノンおよびその誘導体；シクロヘキ
シルメチルおよびその誘導体；フルフリルおよびその誘導体；３，４，５−トリ
メトキシベンジルおよびその誘導体；メトキシエチルおよびその誘導体；ｐ−メ
トキシフェネチルおよびその誘導体；イソアミル（「ＩｓｏＡ」）およびその誘
導体；および他の同様の当業者に公知の中性部分が挙げられる。
【００５２】
適当なアニオン性側鎖には、例えば、カルボキシメチル、カルボキシエチルな
ど、およびそれらの誘導体；安息香酸およびその誘導体；ホスフェートおよびそ
の誘導体；サルフェートおよびその誘導体；および他の同様の当業者に公知のア
ニオン性部分が挙げられる。
【００５３】
必要に応じて、Ｒ1は、天然に生じるアミノ酸または天然に生じないアミノ酸
で見出される部分であり得、またはＲ1は、必要に応じてリンカー部分に結合し
た脂質部分であり得る。本明細書中で使用する「天然に生じるアミノ酸」とは、
Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、
Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙ
ｒを意味する。「天然に生じないアミノ酸」との用語は、典型的には、自然界に
見出されないアミノ酸（例えば、天然に生じるアミノ酸のＤ−異性体、２−アミ
ノアジピン酸、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチンなどを
含めて）を意味する。
【００５４】
典型的には、Ｒ1は、少なくとも２個の単量体単位に対して、水素ではなく、
さらに典型的には、もし、ｎ×ｍが３またはそれ以上であるなら、Ｒ1は、少な
くとも３個の単量体単位に対して、水素ではない。典型的には、これらの単量体
単位の約７５％未満は、水素であるＲ1を有する。さらに典型的には、これらの
単量体単位の約５０％未満は、水素であるＲ1を有する。さらにより典型的には
、これらの単量体単位の約２５％未満は、水素であるＲ1を有する。さらにより
典型的には、Ｒ1は、これらの単量体単位のいずれに対しても、水素ではない。
【００５５】
Ｗは、典型的には、−ＣＨ2ＣＨ2−、
【００５６】
【化１６】
2007161722.tif 000017
【００５７】
（すなわち、トルイル酸）、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−、−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−、ま
たは
（ＩＩ）  −ＣＲ2Ｒ3−であり、
ここで、各単量体単位に対するＲ2およびＲ3は、独立して、以下から選択され
る一価部分である：水素原子；水酸基；アミノ基；カルボキシル基；スルホニル
基；−ＳＨ；必要に応じて置換された分枝鎖または直鎖の脂肪族基であり、該脂
肪族基は、骨格構造中にて、１個〜約８個の炭素原子を有し、該骨格構造は、必
要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンなどを含有し、ここで、該脂肪族基
は、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三重結合を有する；必
要に応じて置換されたアリール基であって、該アリール基は、骨格構造中にて、
約３個〜約１２個の炭素原子を有し、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素
、イオウおよびリンなどを含有する；必要に応じて置換されたアリールアルキル
基であり、該アリールアルキル基は、骨格構造にて、約３個〜約１２個の炭素原
子を有し、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンなどを
含有し、ここで、該アリールアルキル基のアルキル成分は、必要に応じて、１個
またはそれ以上の二重結合または三重結合を有する；および必要に応じてリンカ
ー部分に結合した脂質部分；
ここで、Ｒ2またはＲ3のいずれかが、骨格構造中にて、約５個より少ない炭素
原子を有するアリール基またはアリールアルキル基であるとき、該骨格構造は、
典型的には、１個またはそれ以上のヘテロ原子（例えば、酸素および／または窒
素）を含有する。
【００５８】
Ｒ2およびＲ3が脂肪族のとき、それらは、典型的には、骨格構造中にて、少な
くとも２個の炭素原子を含有し、さらに典型的には、骨格構造中にて、少なくと
も約３個の炭素原子を含有する。アリールおよびアリールアルキルＲ2およびＲ3
基は、線状または環状であり得る。骨格構造中に約５個未満の炭素原子を有する
アリールおよびアリールアルキルＲ2およびＲ3はまた、典型的には、骨格構造中
にて、１個またはそれ以上のヘテロ原子（例えば、窒素および／または酸素）を
有する。典型的には、アリールおよびアリールアルキルＲ2およびＲ3は、骨格構
造中にて、少なくとも約５個の炭素原子を有する。
【００５９】
Ｒ2およびＲ3は、典型的には、天然に生じるアミノ酸および天然に生じないア
ミノ酸で見出される部分である。通常、Ｒ2およびＲ3の少なくとも１つは、水素
原子である。最も典型的には、Ｒ2およびＲ3は、共に、全ての単量体単位に対し
て、水素であり、その結果、化合物（Ｉ）は、脂質結合体化Ｎ−置換ポリグリシ
ン化合物である。
【００６０】
この脂質部分は、１個またはそれ以上の単量体に対して、Ｒa、Ｒc、Ｒ1に、
または１個またはそれ以上の単量体に対して、Ｗにある置換基位置に位置づける
ことができる。脂質部分は、単量体単位に直接的に結合できるか、またはリンカ
ー部分を介して単量体単位に間接的に結合できる。
【００６１】
本明細書中で使用する「リンカー」との用語は、このオリゴマー性アミド部分
および脂質部分の間の分子間距離が、もし、この脂質部分およびオリゴマー性ア
ミド部分が互いに直接的に結合したなら得られるであろう距離よりも大きくなる
ような様式で、これらの２個の部分を共に結合するように機能する部分を意味す
る。リンカー部分は、比較的に小さくでき、骨格中にて１個〜約２０個の原子を
有するか、またはその代わりに、重合体であり得る。小さなリンカー部分は、必
要に応じて、置換され、典型的には、骨格中にて、１個〜約２０個の原子（例え
ば、炭素、窒素、酸素、イオウ、リンなど）を有する。典型的には、小さなリン
カー部分は、骨格中にて、約１８個未満の原子を有し、さらに典型的には、骨格
中にて、約１５個未満の原子を有する。通常、小さなリンカー部分は、骨格中に
て、約１０個未満の原子を有し、必要に応じて、骨格中にて、約５個未満の原子
を有する。
【００６２】
リンカー部分は、オリゴマー性反応物および脂質反応物の両方と反応できる二
官能性分子（例えば、６−アミノヘキサン酸、２−（２−（２−アミノエトキシ
）エトキシ）エトキシ酢酸など）から誘導できる。リンカー部分はまた、このオ
リゴマー性部分へのこの脂質部分の結合体化を促進するために化学合成中に使用
される基（例えば、アシル基および置換アシル基、スルホニル基および置換スル
ホニル基、および他の類似の反応性部分）から誘導できる。
【００６３】
重合体リンカー部分は、必要に応じて置換され（例えば、ヒドロキシ−、カル
ボキシ−、ホスホ−、アミノ−など）、実質的に線状の重合体であり、これは、
骨格を有し、この骨格は、炭素を含有し、必要に応じて、窒素、酸素、イオウ、
リンなどを含有する。重合体リンカー部分は、約３００ダルトンと約１５，００
０ダルトンとの間、典型的には、約１０，０００ダルトン未満、さらに典型的に
は、約５，０００ダルトン未満、さらにより典型的には、約３０００ダルトン未
満、必要に応じて、約１０００ダルトン未満の平均分子量を有する。適当な重合
体リンカー部分には、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコ
ール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００６４】
脂質部分は、疎水性部分または両親媒性部分であり、これらは、中性（すなわ
ち、電荷を有さないか、または実効電荷がゼロである）であるか、または荷電さ
れているかのいずれかであり、天然または合成のいずれかで誘導される。典型的
には、本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物中の脂質部分は、両親媒性である
。
【００６５】
適当な脂質部分には、以下が挙げられる：（１）必要に応じて置換されたアリ
ール部分またはアリールアルキル部分であって、このアリール部分またはアリー
ルアルキル部分は、骨格構造中にて、約１４個〜約５０個の炭素原子を有し、こ
の骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウ、リンなどを含有し、ここで
、このアリールアルキル部分のアルキル成分は、必要に応じて、１個またはそれ
以上の二重結合または三重結合を有する；（２）必要に応じて置換された分枝鎖
または直鎖の脂肪族部分であって、この脂肪族部分は、骨格構造中にて、約１０
個〜約５０個の炭素原子を有し、この骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、
イオウ、リンなどを含有し、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合また
は三重結合を有する。
【００６６】
典型的には、アリールおよびアリールアルキル脂質部分は、少なくとも約１６
個の炭素原子、さらに典型的には、少なくとも約２０個の炭素原子、さらにより
典型的には、少なくとも約３０個の炭素原子を有する。
【００６７】
本発明の化合物中で使用される脂肪族脂質部分は、典型的には、少なくとも約
１２個の炭素原子、さらに典型的には、少なくとも約１４個の炭素原子を有する
。通常、この脂肪族脂質部分は、少なくとも約１８個の炭素原子、さらに普通に
は、少なくとも約２４個の炭素原子、さらにより普通には、少なくとも約３０個
の炭素原子を有する。
【００６８】
本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物中における脂質部分の数は、所望の疎
水性の程度に依存して変わり得、また、オリゴマー長（すなわち、ｎ×ｍ）およ
び脂質部分のサイズと共に、変わる。例えば、この脂質部分が約３０個以下の炭
素原子を有するとき、本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物は、典型的には、
それに単量体基の全数（すなわち、ｎ×ｍ）の９０％として計算される数より少
ない数の脂質部分を結合体化している（すなわち、もし、ｎが３であり、そして
ｍが３であるなら、この脂質結合体化ポリアミド化合物に結合体化される脂質部
分の数は、典型的には、約８未満である）。さらに典型的には、この脂質部分が
、約３０個以下の炭素原子を有するとき、本発明の脂質結合体化ポリアミド化合
物はそれに、単量体基の全数の約８０％より少なく、より典型的には、単量体基
の全数の約７５％より少なく、さらにより典型的には、単量体基の全数の約６０
％より少ない数の脂質部分を結合体化している。
【００６９】
この脂質部分が、約３０個より多い炭素原子を有するとき、典型的には、本発
明の脂質結合体化ポリアミド化合物はそれに、単量体基の全数の５０％として計
算される数より少ない数の脂質部分を結合体化している。
【００７０】
適当な脂質部分には、１個またはそれ以上の疎水性尾部を有するものが挙げら
れ、これらの尾部は、必要に応じて置換された脂肪族直鎖部分であり、各疎水性
尾部は、独立して、骨格中にて、約８個〜約３０個の炭素原子を有し、この骨格
は、さらに、必要に応じて、窒素、酸素、イオウ、リンなどを含有する。典型的
には、疎水性尾部は、骨格中にて、少なくとも約１０個の炭素原子を有し、さら
に典型的には、骨格中にて、少なくとも約１２個の炭素原子を有する。本発明の
脂質結合体化ポリアミド化合物中で使用される疎水性尾部は、典型的には、骨格
中にて、約２６個より多い炭素原子を有さず、さらに典型的には、骨格中にて、
約２４個より多い炭素原子を有しない。
【００７１】
本発明を実施する際に使用される天然脂質部分は、例えば、リン脂質（これに
は、例えば、ホスホグリセリド（アシルホスホグリセリド（例えば、ホスファチ
ジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチ
ジルイノシトール、ホスファチジルイノシトールリン酸、ホスファチジルイノシ
トール二リン酸、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール
など）およびエーテルホスホグリセリドの両方を含めて）が挙げられる）；グリ
コシルグリセリド（例えば、モノガラクトシルジアシルグリセロール、ジガラク
トシルジアシルグリセロール、スルホキノボシルジアシルグリセロール、ジマン
ノシルジアシルグリセロール、ガラクトフラノシルジアシルグリセロール、ガラ
クトシルグルコシルジアシルグリセロール、グルコシルガラクトシルグルコシル
ジアシルグリセロールなど）；スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴシン、グリ
コシルセラミド、ガングリオシドなど）；ならびに飽和および不飽和ステロール
（例えば、コレステロール、エルゴステロール、スチグマステロール、シトステ
ロールなど）；および他の類似の天然脂質から誘導できる。
【００７２】
適当な合成脂質部分は、例えば、ジパルミトイルホスホチジルエタノールアミ
ン（ＤＭＰＥ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、ＤＭ
ＲＩＥ−Ｃ（登録商標）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ
）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチ
ル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯ
ＳＰＡ）（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエ
チル）カルバモイル］コレステロール、Ｔｆｘ−５０（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒ
ｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、Ｎ，Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３−テトラメチル−Ｎ
，Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３−テトラパルミチルスペリミン（ＴＭ−ＴＰＳ）（Ｃｅｌｌ
ｆｅｃｔｉｎ，  ＧｉｂｃｏＢＲＬ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、ジ
パルミトイルホスファチジルエタノールアミノスペルミンなどから誘導できる。
【００７３】
適当な脂質部分には、また、骨格中にて、約８個〜約２４個の炭素原子を有す
る脂肪酸および脂肪アルコールから誘導されるものが挙げられる。典型的には、
これらの脂肪酸および脂肪アルコールは、骨格中にて、少なくとも約１０個の炭
素原子を有し、さらに典型的には、骨格中にて、少なくとも約１２個の炭素原子
を有する。通常、脂質部分が誘導される脂肪酸およびアルコールは、骨格中にて
、約２０個未満の炭素原子を有する。
【００７４】
典型的には、Ｒaは、脂質部分、またはリンカー部分に結合体化した脂質部分
である。特に有用な脂質部分含有Ｒa基には、次式を有するホスファチジルアル
キルアミノ置換アシル基がある：
【００７５】
【化１７】
2007161722.tif 000018
【００７６】
ここで、ｐは、２または３から選択される整数であり、そして各Ｒ4は、独立
して、骨格中にて約６個〜約２５個の炭素原子を有するアルキル部分またはアル
ケニル部分から選択される。典型的には、Ｒ4は、骨格中にて、約２２個までの
炭素原子を有し、さらに典型的には、約２０個までの炭素原子を有し、さらによ
り典型的には、約１８個までの原子を有する。典型的には、Ｒ4は、骨格中にて
、少なくとも約８個の炭素原子を有し、さらに典型的には、少なくとも約１０個
の炭素原子を有し、さらにより典型的には、骨格中にて、少なくとも約１２個の
炭素原子を有する。代表的なＲ4部分には、ドデシル、トリデシル、テトラデシ
ル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシルなどが挙げられ
る。好ましくは、ｐは、２である。
【００７７】
本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物は、必要に応じて、例えば、標的化性
能、構造特性、生物学的活性を与える試薬、または分解部位を導入する試薬など
で、さらに結合体化または複合体化できる。適当な試薬には、例えば、単糖類、
二糖類および多糖類、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、ポリペプ
チド、タンパク質（例えば、リポタンパク質、グリコタンパク質、抗体などを含
めて）、架橋剤、マーカー剤（例えば、フルオレセイン、ビオチン、32Ｐなど）
などが挙げられる。
【００７８】
当業者は、Ｒ1、Ｒc、Ｒa、Ｗ、および使用される特定の脂質部分が、特定の
種類の生物学的活性化合物を送達するために、この脂質結合体化ポリアミド化合
物の物理化学的な特性を最適化するように、容易に変えることができることを知
っている。例えば、ポリ核酸を細胞へと送達する際に使用するのに適当な本発明
のオリゴマー性部分は、実効正電荷を有し、そしてサイズがさらに小型となるよ
うにポリ核酸を縮合でき、それにより、それらの細胞への送達が容易になる。
【００７９】
ポリ核酸を細胞へと送達する際に使用するのに適当な式（Ｉ）の化合物には、
繰り返しｎ量体単位を有する脂質結合体化ポリアミド化合物（すなわち、ここで
、ｎは、１より大きい）が挙げられる。例えば、ｎが３のとき、式（Ｉ）の脂質
結合体化ポリアミド化合物は、繰り返し三量体単位、すなわち、
【００８０】
【化１８】
2007161722.tif 000019
【００８１】
を有し、ここで、Ｒa、Ｒc、ｍ、各Ｗおよび各Ｒ1は、式（Ｉ）のように定義さ
れる。ポリ核酸を細胞へと送達する際に使用するのに適当な式（ＩＶ）を有する
化合物には、例えば、Ｒ11がカチオン性側鎖であり、Ｒ12およびＲ13が、共に、
中性側鎖であり、各ＷがＣＨ2であり、ＲcがＮＨ2であり、そしてＲaが式（ＩＩ
Ｉ）により定義されるもの（例えば、本明細書中にて、実施例１で、表２で示し
た化合物）が挙げられる。
【００８２】
本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物は、典型的には、溶液中にて、濃度依
存性の規則的な二次元または三次元構造を形成する。このような構造には、二次
元アレー（例えば、単一荷電した層または脂質二重層表面）および三次元構造（
例えば、ミセル、小胞およびリポソーム）が挙げられる。典型的には、本発明の
脂質結合体化ポリアミド化合物自体から形成される規則的な構造は、典型的には
、光を散乱しない程に充分に小さい。ミセル、小胞、およびポリヌクレオチドと
複合体化した脂質結合体化化合物から調製されるリポソームは、典型的には、約
１μｍ未満、さらに典型的には、約５００ｎｍ未満、さらにより典型的には、約
２００ｎｍ未満の平均粒径を有する。
【００８３】
生物学的に活性な因子の細胞への送達に加えて、本発明の脂質結合体化ポリア
ミド化合物はまた、例えば、以下のような用途で使用できる：ペプチド様化合物
を生物学的活性についてスクリーニングすること；そのオリゴマー性部分が、標
的リガンドに結合する性能を有するように、バイオセンサに組み込むことなど。
薬剤スクリーニング用途については、例えば、種々のＲ1基を有する脂質結合体
化ポリアミド化合物のライブラリが合成でき、引き続いて、ＰＣＴ公報ＷＯ  ９
１／１９７３５（１９９１年１２月２６日に公開された）（その内容は、本明細
書中で参考として援用されている）で記述されている改変ペプチドライブラリを
合成しスクリーニングする方法に従って、生物学的活性についてスクリーニング
され得る。
【００８４】
（脂質結合体化ポリアミド化合物の合成）
本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物は、固相方法および溶液相方法の両方
により、合成できる。本発明はまた、脂質結合体化ポリアミド化合物を合成する
方法を提供し、該方法は、以下を包含する：
ａ）  以下の（１）と（２）とを接触させること：
（１）  脂質反応物；
（２）  オリゴマー反応物であって、ここで、該オリゴマー反応物は、以下
の一般式を有する：
【００８５】
【化１９】
2007161722.tif 000020
【００８６】
ここで、ｎは、１〜約４８から選択される整数であり、そしてｍは、約２〜約
４８の整数である；
ここで、各ＴaおよびＴcは、独立して、末端基、および該脂質反応物とさらに
反応できる反応性部分から選択される；
ここで、該オリゴマー反応物中にて、各単量体単位
【００８７】
【化２０】
2007161722.tif 000021
【００８８】
に対するＲ1は、以下からなる群から選択される：水素原子；水酸基；アミノ基
；カルボキシル基；スルホニル基；−ＳＨ；必要に応じて置換された分枝鎖また
は直鎖の脂肪族基であり、該脂肪族基は、骨格構造中にて、１個〜約８個の炭素
原子を有し、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含
有し、ここで、該脂肪族基は、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合ま
たは三重結合を有する；必要に応じて置換されたアリール基であって、該アリー
ル基は、骨格構造中にて、約３個〜約１２個の炭素原子を有し、該骨格構造は、
必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよびリンを含有する；必要に応じて置換さ
れたアリールアルキル基であり、該アリールアルキル基は、骨格構造にて、約３
個〜約１２個の炭素原子を有し、該骨格構造は、必要に応じて、窒素、酸素、イ
オウおよびリンを含有し、ここで、該アリールアルキル基のアルキル成分は、必
要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三重結合を有する；ならびに
該脂質反応物とさらに反応し得る反応性部分；
ここで、Ｒ1、ＲaまたはＲcが、骨格構造中にて、約５個より少ない炭素原子
を有するアリール基またはアリールアルキル基のとき、該骨格構造は、典型的に
、１個またはそれ以上のヘテロ原子（たとえば、酸素および／または窒素のよう
な）を含有する；
ここで、Ｒ1は、少なくとも１個の単量体単位に対して、水素原子ではない、
ここで、各単量体単位に対するＷは、必要に応じて置換された分枝鎖または直
鎖二価部分から選択され、該二価部分は、骨格中にて、１個〜約５０個の原子を
有し、そして該骨格は、炭素を含有し、必要に応じて、窒素、酸素、イオウおよ
びリンを含有し、また、必要に応じて、１個またはそれ以上の二重結合または三
重結合を含有する；ここで、該Ｗの任意の置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）
は、該脂質反応物とさらに反応し得る反応性部分であり得る。
【００８９】
ここで、Ｔa、Ｔc、単一の単量体単位に対するＷ、または単一の単量体単位に
対するＲ1の少なくとも１個は、該脂質反応物とさらに反応できる反応性部分を
含有する；次いで、
ｂ）  該脂質反応物を該オリゴマー反応物と反応させて、該脂質反応物を該オ
リゴマー反応物と結合体化すること。
【００９０】
本明細書中で使用する「脂質反応物」との用語は、化学反応（例えば、求核置
換、縮合など）に関与できる脂質部分を有する反応性種を意味する。官能基（例
えば、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＯ2Ｃｌおよび−ＣＨＯ）を
有する脂質反応物は、本発明の脂質結合体化化合物を合成するのに、特に有用で
ある。本発明を実施する際に使用するのに適当な脂質反応物には、本明細書中で
記述されている脂質部分のいずれか１個を有する脂質反応物であって、このオリ
ゴマー反応物またはリンカーと反応できるかまたはそれと反応するように修飾さ
れ得るものが挙げられる。典型的には、脂質反応物は、第一級、第二級または第
三級アミンである。好ましい脂質反応物には、ホスファチジルエタノールアミン
がある。
【００９１】
本明細書中で使用される「オリゴマー反応物」との用語は、化学反応（例えば
、求核置換、縮合など）に関与できるオリゴマー性アミドを意味する。オリゴマ
ー反応物は、典型的には、求核試薬による求核置換を受けやすい脱離基（例えば
、アミン）でアシル化される。本発明を実施する際に使用するのに適当なオリゴ
マー反応物には、本明細書中の式（Ｉ）（すなわち、
【００９２】
【化２１】
2007161722.tif 000022
【００９３】
）について記述したオリゴマー性アミド置換基の全てが挙げられる。
【００９４】
本明細書中で使用する「反応性部分」との用語は、この脂質反応物との反応に
関与できる部分を意味する。典型的な反応性部分には、例えば、−ＮＨ2、−Ｏ
Ｈ、−Ｈ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、アシル（例えば、アセチル）、ベンゾイル、ス
ルホニル（例えば、ダンシル）、アミド、ヒドラジン（典型的には、Ｔc基）、
およびそれらの誘導体（アルキル置換誘導体を含めて）などが挙げられる。典型
的には、この反応性部分は、求核試薬による求核置換を受けやすい脱離基（例え
ば、アミン）で置換されたアシル部分である。
【００９５】
代表的な末端基には、反応性部分ではないＲaおよびＲc部分、生物学的に活性
な因子、標的化因子（例えば、細胞レセプターリガンド、抗体など）、マーカー
剤、アミノ酸残基（これは、例えば、内因性タンパク質分解酵素のための分解部
位として、機能する）などである部位が挙げられる。これらの末端基は、典型的
には、この脂質反応物とは、さらに反応しない。
【００９６】
これらのオリゴマー反応物および脂質反応物は、必要に応じて、リンカー部分
（これは、必要に応じて、反応性部分から誘導できる）を介して、互いに結合で
きる。あるいは、このリンカー部分は、オリゴマー性反応物および脂質反応物の
両方と反応できる分子から誘導されるが、必要に応じて、脂質反応物とオリゴマ
ー反応物との間の反応前に、この脂質またはオリゴマー反応物のいずれかと結合
体化できる。それゆえ、この脂質反応物は、直接的に、またはこのリンカー部分
を介して間接的に、のいずれかで、このオリゴマー反応物と結合体化できる。
【００９７】
本明細書中で使用する「反応させる」との用語は、この脂質反応物およびオリ
ゴマー反応物の間で、直接的に、またはこのリンカー部分を介して間接的に、の
いずれかで、化学結合を形成する１つまたはそれ以上の化学反応を意味する。適
当な反応には、例えば、縮合（例えば、アシル化など）および求核置換が挙げら
れる。
【００９８】
一般式（ＩＶ）を有するオリゴマー反応物は、例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ
ら、ＰＣＴ  ＷＯ  ９４／０６４５１（１９９４年３月３１日に公開された）（
その内容は、本明細書中で参考として援用されている）により記述された固相方
法に従って、一連の求核置換反応を介して、調製できる。この方法は、自動化ペ
プチド合成器具を利用して実施され得、目的のオリゴマー反応物を迅速に合成さ
せる。これらの器具は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市
販されている。
【００９９】
具体的には、オリゴマー反応物への単量体アセンブリは、その成長鎖への「サ
ブモノマー」単位の逐次付加により、達成される。単量体アセンブリの１方法で
は、各サイクルの単量体付加は、以下の２つの工程からなる：
（１）  脱離基（すなわち、求核試薬による求核置換を受けやすい基、例えば
、アミン）およびカルボニル基（例えば、カルボキシル基）を有するアシル化剤
を用いる、固体支持体に結合した第二級アミンのアシル化（すなわち、「アシル
化工程」）；それに続いて、
（２）  側鎖を導入するのに充分な量のサブモノマー（これは、第一級、第二
級または第三級アミノ基を有する）を用いる、この脱離基の求核置換（すなわち
、「求核置換工程」）。
【０１００】
この反応スキームの概略図は、図１で示す。代表的なアシル化剤には、ハロ酢
酸、ハロメチル安息香酸などが挙げられる。この脱離基の置換効率は、使用する
アシル化剤の種類により、調節される。例えば、ハロ酢酸を使用するとき、この
脱離基を置換する際には、塩素と比較すると、ヨウ素のほうが効率的であること
が認められている。適当なサブモノマーには、アルキルアミン、アルケニルアミ
ン、芳香族アミン、アルコキシアミン、セミカルバジド、アシルヒドラジド、お
よびそれらの誘導体などが挙げられる。
【０１０１】
このサブモノマーアプローチを用いるオリゴマー合成は、そのカルボキシから
アミノへの方向で、起こる。このオリゴマーは、所望の長さになるまで仕上げら
れ、次いで、例えば、ブロモアセトアミド基で停止される。本発明のオリゴマー
反応物を構築するために固相サブモノマーアセンブリを使用することの１つの利
点には、反応性側鎖の官能基を保護する必要があるにすぎないので、Ｎ−α−保
護単量体の必要性がなくなることがある。
【０１０２】
典型的には、このオリゴマー性反応物は、一連の繰り返し二量体、三量体また
は四量体単位として、合成される。代表的な三量体ベースのカチオン性オリゴマ
ーは、そのアミノ末端（Ｔa）からカルボキシ末端（Ｔc）の方向で、以下の単量
体配列を有する：
（１）  正電荷単量体；
（２）  中性単量体；および
（３）  中性単量体。
本明細書中で使用する「中性単量体」および「正電荷単量体」との用語は、その
単量体単位の有効電荷を意味する。
【０１０３】
このオリゴマー反応物とこの脂質反応物とのさらなる反応は、別のアシル化お
よび／または求核置換により、起こり得る。例えば、ハロアシル化されたオリゴ
マー反応物（例えば、ここで、Ｔaは、ブロモアセチル基である）は、第一級、
第二級または第三級アミンである脂質反応物と反応できる。それにより、この臭
素の求核置換によって、結合体化が起こり、脂質結合体化ポリアミド化合物が形
成される。
【０１０４】
（脂質結合体化ポリアミド組成物およびそれらの用途）
さらに他の実施態様では、本発明は、本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物
（単数または複数）および有効量の生物学的に活性な因子を含有する組成物を提
供する。本明細書中で使用する用語「有効量」および「有効用量」とは、例えば
、細胞、哺乳動物または鳥類において、生物学的応答（例えば、シグナル変換、
転写、翻訳、リンパ球活性化（例えば、抗体産生を含めて）など）を検出可能に
誘発するかまたはそれに関与するのに充分な量の本発明の生物学的に活性な因子
または生物学的に活性な因子を含有する脂質結合体化ポリアミド組成物を意味す
る。本明細書中で使用する「生物学的に活性な因子」との用語は、例えば、細胞
、哺乳動物または鳥類に有効量で投与すると、生物学的応答を誘発するかまたは
それに関与する試薬を意味する。
【０１０５】
この生物学的に活性な因子がポリヌクレオチドであるとき、脂質結合体化ポリ
アミド化合物のポリ核酸に対する相対的な量は、典型的には、この組成物中の脂
質結合体化ポリアミド化合物とポリヌクレオチドとの＋／−電荷比が、少なくと
も約２であり約１０未満であるように、選択される。さらに典型的には、この＋
／−電荷比は、約８未満であり、さらにより典型的には、約４未満である。この
電荷比は、以下に従って、計算される：
電荷比＝（ｎL×ＭL）／（３．０３×ＭDNA）
ここで、ｎLは、脂質結合体化ポリアミド化合物のモル数であり、ＭLは、有効電
荷数／脂質結合体化ポリアミド１モルであり、ここで、ＭDNAは、ＤＮＡのマイ
クログラムである。
【０１０６】
本発明の組成物は、液体形状または固体形状であり得、必要に応じて、薬学的
に受容可能な賦形剤を含有し得る。このような賦形剤は、充填剤、加工助剤、送
達向上剤および改良剤などとして、使用できる。適当な賦形剤には、例えば、リ
ン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、単糖類、二糖類、多糖類
、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナト
リウム、デキストロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、低融
点ワックス、イオン交換樹脂などだけでなく、それらの任意の２種またはそれ以
上の組み合わせが挙げられる。薬学的に受容可能な賦形剤の徹底的な論述は、「
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」
（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，  ＮＪ  １９９１）（その内容は、本明細書中
で参考として援用されている）で入手できる。
【０１０７】
この組成物には、追加の試薬（例えば、マーカー剤、栄養物など）を含有させ
ることができる。例えば、この生物学的に活性な因子がポリヌクレオチドである
とき、本発明の組成物には、所望の核酸のエンドサイトーシスを促進する試薬、
またはこの核酸と細胞表面との結合を補助する試薬、またはそれらの両方を組み
合わせ得る。
【０１０８】
本発明の脂質組成物は、液状キャリアと共に、溶液、懸濁液または乳濁液の形
状であり得る。適当な液状キャリアには、例えば、水、生理食塩水、薬学的に受
容可能な有機溶媒（単数または複数）、薬学的に受容可能なオイルまたは脂肪、
それらの混合物などが挙げられる。この液状キャリアは、他の適当な薬学的に受
容可能な添加剤（例えば、可溶化剤、乳化剤、栄養剤、緩衝剤、防腐剤、懸濁剤
、増粘剤、粘度調節剤、安定化剤など）を含有し得る。適当な有機溶媒には、例
えば、一価アルコール（例えば、エタノール）、および多価アルコール（例えば
、グリコール）が挙げられる。適当なオイルには、例えば、大豆油、やし油、オ
リーブ油、サフラワー油、綿実油などが挙げられる。非経口投与のためには、こ
のキャリアはまた、油性エステル（例えば、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イ
ソプロピルなど）であり得る。
【０１０９】
さらに他の実施態様では、本発明は、細胞による生物学的に活性な因子の取り
込みを誘発する方法を提供し、該方法は、以下を包含する：
有効量の生物学的に活性な因子および脂質結合体化ポリアミド化合物を含有す
る組成物を提供すること；次いで、
有効用量の該組成物に、生物学的サンプルを接触させること；
ここで、該生物学的サンプルは、細胞を含有する。
【０１１０】
本明細書中で使用する「生物学的サンプル」との用語は、１種またはそれ以上
の細胞または組織を含有するサンプルを意味する。本発明を実施する際に使用す
るのに適当な細胞には、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手できる哺乳動物細胞株、チャイニ
ーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスターの腎臓
（ＢＨＫ）細胞、サルの腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒトの肝臓癌細胞（例えば、Ｈｅ
ｐ  Ｇ２）、ヒトの胎児腎臓細胞、ベビーハムスターの腎臓細胞、マウスのセル
トリ細胞、イヌの腎臓細胞、バッファローラットの肝臓細胞、ヒトの肺細胞、ヒ
トの肝臓細胞、マウスの乳癌細胞、他の哺乳動物（ヒトを含めて）の細胞（例え
ば、幹細胞、特に、血液細胞（ｈｅｍａｐｏｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）、リンパ球、
マクロファージ、樹状細胞、腫瘍細胞など）などが挙げられる。
【０１１１】
本発明でサンプルとして使用するのに適当な組織には、例えば、哺乳動物から
誘導される組織、例えば、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、血液、骨髄、胸腺
、心臓、リンパ、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直
腸、神経系、目、腺、結合組織などが挙げられる。
【０１１２】
サンプルへの投与様式には、例えば、被験体から誘導したサンプルのエキソビ
ボ投与、およびサンプルへのインビトロ投与が挙げられる。これらの投与様式を
行う方法は、当業者に周知である。例えば、この生物学的に活性な因子がポリヌ
クレオチドであるとき、形質転換した細胞の被験体へのエキソビボ送達および再
移植は、例えば、国際公報第ＷＯ  ９３／１４７７８号（１９９３年８月５日に
公開された）（その内容は、本明細書中で参考として援用されている）で記述さ
れているように、達成できる。
【０１１３】
さらに他の実施態様では、本発明は、インビボにて細胞による生物学的に活性
な因子の取り込みを誘発する方法を提供し、該方法は、以下を包含する：
有効量の生物学的に活性な因子および脂質結合体化ポリアミド化合物を含有す
る組成物を提供すること；次いで、
有効用量の該組成物を被験体に投与すること。
【０１１４】
本発明は、さらに、哺乳動物にて遺伝子を発現する方法を提供し、該方法は、
以下を包含する：
本発明の脂質結合体化ポリアミドで複合体化したポリ核酸を、哺乳動物に投与
すること；
ここで、該ポリ核酸は、該哺乳動物にて、該遺伝子を機能的に発現できる；そ
して
ここで、該複合体は、該遺伝子を該哺乳動物中の細胞へとトランスフェクトす
るのに効果的である。
【０１１５】
本明細書中で使用する「被験体」との用語は、鳥類および哺乳動物（例えば、
げっ歯類およびヒト）を意味する。被験体への直接投与は、典型的には、皮下、
腹腔内、静脈内または筋肉内のいずれかでの注射により達成できるか、または組
織の間質領域に送達できる。これらの組成物はまた、腫瘍または外傷へと投与で
きる。他の投与様式には、経口投与および肺投与、座剤、および経皮適用などだ
けでなく、注射針、遺伝子ガン（ｇｅｎｅ  ｇｕｎｓ）またはハイポスプレーに
よるものが挙げられる。
【０１１６】
本発明の脂質結合体化化合物は、生物学的に活性な因子と配合するとき、細胞
によるこの生物学的に活性な因子の取り込みを誘発するのに効果的である。本明
細書中で使用する「誘発する」との用語およびその種々の文法的に等価なものは
、細胞により生物学的に活性な因子の取り込みを起こすことを意味する。細胞に
よる生物学的に活性な因子の取り込みを検出するのに使用される方法は、使用す
る生物学的に活性な因子の種類に依存して変わるが、しかしながら、当業者は、
細胞の取り込みが、種々の公知のアッセイおよび組織学的技術だけでなく、種々
の診断方法（例えば、臨床的な診断方法（例えば、症状の軽減など）を含めて）
により検出できることを理解する。
【０１１７】
典型的には、本発明の化合物は、細胞によるこの生物学的に活性な因子の取り
込みを向上させるのに効果的である。細胞によるこの生物学的に活性な因子の取
り込みが向上するとき、典型的には、細胞による生物学的に活性な因子の取り込
みは、純粋な形状（例えば、脂質結合体化ポリアミド化合物を実質的に含有しな
い）でのこの生物学的に活性な因子の取り込みよりも、少なくとも約５％大きい
。さらに典型的には、この取り込みを向上するとき、細胞による生物学的な活性
な因子の取り込みは、純粋な形状でのこの生物学的に活性な因子の取り込みより
も、少なくとも約１０％大きく、さらにより典型的には、少なくとも約１５％大
きく、さらにより典型的には、少なくとも約２０％大きい。
【０１１８】
有効量の生物学的に活性な因子および同様に、有効用量の脂質結合体化ポリア
ミド／生物学的に活性な因子を含有する組成物は、もちろん、公知の因子（例え
ば、特定の生物学的に活性な因子の薬力学的な特性、その投与様式および投与経
路；受容者の年齢、健康および体重；症状の性質および程度；同時に行う治療の
種類（単数または複数）、治療の頻度、望ましい効果など）に依存して、変わる
。しかしながら、特定の患者および生物学的に活性な因子に対する正確な量は、
当業者の医師により、慣用的実験によって、容易に決定できる。当業者はまた、
本発明の組成物中で使用される脂質結合体化化合物の正確な量が、所望の応答を
誘発するための脂質結合体化ポリアミド化合物の生物学的に活性な因子に対する
最適な比を決定するために、慣用的なスクリーニング研究により、容易に決定で
きることを理解する。生物学的に活性な因子と複合体化した脂質結合体化ポリア
ミド化合物の組成物は、単一用量としてまたは複数用量で、投与できる。複数用
量は、連続的に、間隔をおいて、または両方を組み合わせて、投与できる。本発
明の目的上、有効なインビボ量は、約０．０１  ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０  ｍｇ
／ｋｇ／日または約０．０５  ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０  ｍｇ／ｋｇ／日の生物
学的に活性な因子である。
【０１１９】
本発明の組成物は、ポリヌクレオチドの細胞への取り込みを誘発するのに、特
に効果的である。細胞によるポリヌクレオチドの取り込みは、タンパク質発現ア
ッセイまたはポリヌクレオチドハイブリダイゼーション技術を用いて検出できる
。組成物は、レポーター遺伝子をＤＮＡに組み込み、そして標準的なイムノアッ
セイ法または生物学的または酵素活性アッセイ（例えば、ルシフェラーゼアッセ
イ）を用いて、このレポーター遺伝子の産生についてアッセイすることにより、
トランスフェクション効率に関して、スクリーンされ最適化できる。
【０１２０】
ポリヌクレオチドと配合するとき、脂質結合体化ポリアミド化合物は、ヌクレ
アーゼで誘発したポリヌクレオチドの分解（これは、血清または他の生物学的流
体中で存在するヌクレアーゼにより、引き起こされる）を阻害するのに、特に効
果的である。結果として、本発明の組成物を使用して、より少ない量のポリヌク
レオチドが、さらに効果的に投与できる。
【０１２１】
それゆえ、本発明はまた、ヌクレアーゼで誘発したポリヌクレオチドの分解を
実質的に防止する方法を提供し、該方法は、以下を包含する：分解を防止する量
の脂質結合体化ポリアミド化合物に、ポリヌクレオチドを接触させること；そし
て該ポリヌクレオチドおよび該脂質結合体化ポリアミド化合物を、ヌクレアーゼ
含有環境へと導入すること。ヌクレアーゼで誘発したポリヌクレオチドの分解の
阻害は、例えば、血清中にて、種々の時間にわたって、脂質結合体化ポリアミド
で保護したポリヌクレオチドのサンプルおよび未保護ポリヌクレオチドのコント
ロールサンプルをインキュベートし、次いで、この混合物をゲル電気泳動により
分析して、未保護ポリヌクレオチドと比較して、この保護したポリヌクレオチド
に対して、分解が起こるかとき（例えば、このポリヌクレオチドの約５０％が分
解したとき）を決定することとにより、検出できる。分解の程度は、公知の定量
法（例えば、放射線標識など）を用いて、モニターできる。
【０１２２】
典型的には、分解を防止する量の脂質結合体化ポリアミド化合物とは、未保護
の（すなわち、純粋な）ポリヌクレオチドと比較して、少なくとも約５分間にわ
たって、ポリヌクレオチドのヌクレアーゼで誘発したポリヌクレオチド分解を実
質的に防止するのに充分な脂質結合体化ポリアミド化合物の量である。さらに典
型的には、脂質結合体化ポリアミド化合物の量は、未保護のポリヌクレオチドと
比較して、少なくとも１０分間、さらに典型的には、少なくとも約３０分間、さ
らに典型的には、少なくとも６０分間、さらに典型的には、少なくとも９０分間
、さらにより典型的には、少なくとも１２０分間にわたって、ヌクレアーゼで誘
発したポリヌクレオチドの分解を防止するのに充分である。本発明の脂質結合体
化ポリアミド化合物は、脂質結合体化ポリアミド保護ポリ核酸が、典型的には、
同じ時間にわたって、未保護の（すなわち、純粋な）ポリヌクレオチドにより生
じる分解の約８０％未満の分解、さらに典型的には、約５０％未満の分解、さら
により典型的には、約３０％未満の分解、さらに典型的には、約２０％未満の分
解を生じる範囲まで、ヌクレアーゼで誘発したポリヌクレオチドの分解を防止す
るのに効果的である。
【０１２３】
細胞によるポリヌクレオチドの取り込みを向上させるのに特に効果的な脂質結
合体化ポリアミド化合物およびポリ核酸の組成物には、この脂質結合体化ポリア
ミド化合物が式（Ｉ）を有するものであって、ここで、ＷがＣＨ2であり、Ｒaが
、脂質部分（好ましくは、ホスファチジルエタノールアミン）を含有し、ｎが、
１より大きく、そして各ｎ量体が、カチオン性および中性の両方のＲ1側鎖基を
含有するものがある。この脂質結合体化ポリアミド化合物はまた、ポリヌクレオ
チドを、ヌクレアーゼで誘発した分解から保護するのに効果的である。
【０１２４】
（安定なポリ核酸／送達ビヒクル複合体製剤を製造するための希釈−濃縮方
法）
さらに他の実施態様では、本発明は、送達ビヒクルで複合体化したポリ核酸の
安定な製剤を製造する方法を提供し、該方法は、以下を包含する：
ａ）  ポリ核酸を第一液状キャリアと混合し、実質的に沈殿物のない希釈ポリ
核酸溶液を形成すること；
ｂ）  送達ビヒクル形成化合物を第二液状キャリアと混合し、実質的に沈殿物
のない送達ビヒクル溶液を形成すること；
ｃ）  該希釈ポリ核酸溶液を、該送達ビヒクル溶液と配合して、送達ビヒクル
／ポリ核酸複合体の希釈製剤を形成すること；次いで、
ｄ）  該希釈製剤の容量を小さくして、送達ビヒクル／ポリ核酸複合体の安定
な製剤を形成すること；
ここで、該安定な製剤中のポリ核酸の濃度は、該希釈ポリ核酸溶液中のポリ核
酸の濃度よりも高い；そして
ここで、該安定な製剤は、実質的に沈殿物を含有しない。
【０１２５】
送達ビヒクル／ポリ核酸複合体を、製剤の「希釈−濃縮」方法に従って、液体
キャリア中で製剤するとき、得られる複合体は、粒径およびトランスフェクショ
ン効率に関して、比較的に長時間にわたって安定であることが発見された。さら
に、これらの安定な製剤は、特徴的には、沈殿物を含まない。それゆえ、通常の
送達ビヒクル／ポリ核酸製剤（ここで、ポリ核酸および送達ビヒクルの希釈溶液
の等量が、トランスフェクションの直前に、混合されている）とは異なり、本発
明の製剤の希釈−濃縮方法に従って製造した安定な製剤は、トランスフェクショ
ン効率が実質的に変わることなく調製でき、そしてトランスフェクションの前に
、何日間も保存できる。本明細書中で使用する「トランスフェクション効率」と
の用語は、細胞へと送達ビヒクル／ポリヌクレオチド複合体を投与した結果とし
て、発現するタンパク質または合成されるポリ核酸の量または活性を意味する。
【０１２６】
典型的には、この安定な製剤中の送達ビヒクル／ポリヌクレオチド複合体の粒
径分布は、本発明の方法による製剤後１日で、製剤直後のこの複合体の粒径分布
と比較して、約４０％未満で変わる。さらに典型的には、この安定な製剤中の送
達ビヒクル／ポリヌクレオチド複合体の粒径分布は、本発明の濃縮方法に従った
製剤後１日で、製剤直後のこの複合体の粒径分布と比較して、約３０％未満、さ
らに典型的には、約２０％未満、さらにより典型的には、約１５％未満で変わる
。
【０１２７】
さらに典型的には、この安定な製剤中の送達ビヒクル／ポリヌクレオチド複合
体の粒径分布は、本発明の方法による製剤後５〜８日で、製剤直後のこの複合体
の粒径分布と比較して、約４０％未満、さらに典型的には、約３０％未満、通常
、２０％未満、さらに普通には、約１５％未満で変わる。
【０１２８】
本明細書中で使用する「ポリ核酸希釈溶液」との用語は、約３００μｇ／ｍｌ
未満のポリ核酸の濃度を有する溶液を意味する。典型的には、ポリ核酸希釈溶液
は、約２５０μｇ／ｍｌ未満、さらに典型的には、約１５０μｇ／ｍｌ未満、さ
らにより典型的には、約１００μｇ／ｍｌ未満のポリ核酸濃度を有する。好まし
くは、ポリ核酸希釈溶液は、約５０μｇ／ｍｌ未満のポリ核酸濃度を有する。
【０１２９】
送達ビヒクル／ポリ核酸複合体の安定な製剤中のポリ核酸の濃度は、このポリ
核酸希釈溶液のポリ核酸濃度よりも大きく、典型的には、少なくとも約１５０μ
ｇ（ポリヌクレオチド）／ｍｌ（製剤）である。さらに典型的には、安定な製剤
中のポリヌクレオチドの濃度は、少なくとも約２５０μｇ／ｍｌ、さらに典型的
には、少なくとも約５００μｇ／ｍｌ、さらにより典型的には、少なくとも約１
ｍｇ／ｍｌ、さらにより典型的には、少なくとも約２ｍｇ／ｍｌである。
【０１３０】
この送達ビヒクル溶液中で使用される送達ビヒクル形成化合物の濃度は、ＤＮ
Ａと所望送達ビヒクルとの比および使用する送達ビヒクル形成化合物の溶解特性
に依存して、変わる。当業者は、第二液状キャリア中の送達ビヒクル形成化合物
の濃度および容量が、送達ビヒクルとＤＮＡとの所望の標的比を達成するように
調節できることを知っている。
【０１３１】
この送達ビヒクル形成化合物が、本発明の脂質結合体化ポリアミドのとき、こ
の送達ビヒクル溶液の濃度は、典型的には、約５ｍｇ／ｍｌ以下、さらに典型的
には、約２．５ｍｇ／ｍｌ以下、典型的には、少なくとも約１．２５ｍｇ／ｍｌ
である。送達ビヒクル溶液およびポリ核酸希釈溶液を組み合わせた容量は、好ま
しくは、脂質結合体化ポリアミドとポリ核酸との比が、約５ｍｇの脂質結合体化
ポリアミド：約１ｍｇのポリ核酸となるように、選択される。それゆえ、例えば
、もし、この送達ビヒクル溶液として５ｍｇ／ｍｌの脂質結合体化ポリアミド溶
液を使用するなら、等量の１ｍｇ／ｍｌポリ核酸溶液と組み合わせることにより
、５ｍｇの脂質結合体化ポリアミド：５ｍｇのポリ核酸の脂質結合体化ポリアミ
ド：ポリ核酸の比が得られる。
【０１３２】
第一液状キャリアは、第二液状キャリアと同じまたは異なり得る。適当な第一
および第二液状キャリアには、本明細書中で記述した液状キャリアが挙げられる
。本明細書中で使用する「送達ビヒクル」との用語は、ポリヌクレオチドと複合
体化するかまたはそれを包み得る規則的な構造を意味する。適切な送達ビヒクル
には、リポソーム、ミセル、ベシクルなどが挙げられる。本明細書中で使用する
「送達ビヒクル形成化合物」との用語は、送達ビヒクルを形成できる化合物を意
味する。代表的な送達ビヒクル形成化合物には、両親媒性脂質、ポリカチオン性
非脂質化合物、脂質結合体化ポリアミド化合物などが挙げられる。
【０１３３】
この希釈ポリヌクレオチド溶液および送達ビヒクル製剤を配合した後、得られ
た混合物の容量は、低下される。得られた混合物の容量を低下させる適当な方法
には、例えば、遠心濾過、真空濾過だけでなく、当業者に周知である他の容量低
減方法が挙げられる。典型的には、得られた混合物の容量は、この製剤中のポリ
ヌクレオチドの濃度が、約１５０μｇ／ｍｌより高くなるように、低下される。
この濃縮した製剤の最終濃度は、この容量低減工程後に、所望の濃度を得るのに
充分な液状キャリアをこの製剤に添加することにより、低くできる。
【０１３４】
本明細書中で使用する「沈殿物のない」との用語は、肉眼で視覚的に検出した
とき、固形物質（すなわち、沈殿物質）を含まない製剤または溶液を意味する。
【０１３５】
安定な送達ビヒクル／ポリヌクレオチド複合体製剤を用いる細胞のトランスフ
ェクションは、典型的には、図１４で図示しているように、トランスフェクショ
ンの直前にて、ポリヌクレオチドおよび送達ビヒクルの等量の希釈溶液を共に混
合する通常の方法により形成される複合体を用いるよりも、さらに効率的である
ことが発見された。
【０１３６】
本発明は、今ここで、以下の非限定的な実施例を参照して、さらに詳細に記述
する。
【実施例】
【０１３７】
（実施例１）
脂質結合体化ポリアミド化合物の調製
Ａ．脂質結合体化ポリアミド化合物の合成
（１）  オリゴマー反応物の合成
フリット付き反応容器に、約０．５０ｍｍｏｌ／１ｇ樹脂の置換レベルを有す
るＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂１００ｍｇを充填した。この樹脂に、ジメチル
ホルムアミド（ＤＭＦ）２ｍｌを添加した。この混合物を１〜２分間攪拌して、
この樹脂を膨張させ、次いで、このＤＭＦを排出した。この樹脂に、ＤＭＦ中の
２０％ピペリジン２．０ｍｌを添加し、次いで、１分間攪拌することにより、こ
のＦｍｏｃ基を除去した。次いで、この溶液を樹脂から排出した。この樹脂に、
ＤＭＦ中の他の２０％ピペリジン２ｍｌを添加し、続いて、１５分間攪拌し、そ
の後、次いで、この樹脂から、このＤＭＦを排出した。
【０１３８】
この樹脂に、ＤＭＦ（２ｍｌ）を添加し、続いて、攪拌して均一なスラリーを
形成することにより、この樹脂を洗浄した。このフリット付き容器の底部からア
ルゴンを泡立たせることにより、この樹脂スラリーを攪拌した。この樹脂が乾燥
して見えるまで（典型的には、約５秒間）、この反応容器のフリット付き底部を
通した真空濾過により、この樹脂から、このＤＭＦを除去した。この洗浄工程を
、ＤＭＦを用いて、６回繰り返した。
【０１３９】
次いで、この樹脂に、ＤＭＦ中の１．２Ｍブロモ酢酸８５０μｌを添加し、続
いて、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）２００μｌを添加す
ることにより、脱ブロックしたアミンをアシル化した。この混合物を、３５℃で
、４５分間攪拌し、次いで、この溶液を、この樹脂から排出した。この樹脂を、
ＤＭＦの６×２ｍｌアリコートで洗浄した。この樹脂を、アミンのジメチルスル
ホキシド（ＤＭＳＯ）１Ｍ溶液８５０μｌで処理することにより、アミン置換を
行った。この混合物を、３５℃で、２０分間攪拌し、次いで、このアミン溶液を
、この樹脂から排出した。このアミン置換工程の後、この樹脂を、ＤＭＦの６×
２ｍｌアリコートで洗浄した。これにより、アシル化および置換の１サイクルを
完結した。
【０１４０】
第二サイクルは、ブロモ酢酸およびＤＩＣを用いたアシル化に続いて、上記の
ような第二アミンでの置換により、開始した。このアシル化／置換サイクルは、
所望のオリゴマーに達するまで、繰り返した。
【０１４１】
得られたオリゴマーのＮ−末端を、ＤＭＦ中のブロモ酢酸８５０μｌ（１．２
Ｍ）およびＤＩＣ（２００μｌ）を用いて、３５℃で、４５分間アシル化した。
【０１４２】
（２）  ブロモアセチル化オリゴマー反応物に由来の臭化物のジミリストイル
ホスファチジルエタノールアミンでの置換
一定量のジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）（Ｇｅ
ｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）２５４ｍｇを、クロロベンゼン中の１
５％メタノール２ｍｌで懸濁し、次いで、１２．８Ｎ  ＫＯＨ水溶液３０μｌで
処理した。ＤＭＰＥの得られた溶液を、上記（１）から得た樹脂上のブロモアセ
チル化オリゴマーに添加し、この反応系を、３５℃で、１４時間にわたって、３
０秒ごとに１秒間アルゴンを泡立たせることにより、攪拌した。次に、この樹脂
を、クロロベンゼン中の１５％メタノールで完全に洗浄して、未反応ＤＭＰＥを
除去した。
【０１４３】
得られた脂質結合体化ポリアミド化合物を、この樹脂から切断し、そして水中
の９５％  ＴＦＡを用いて脱保護し、次いで、凍結乾燥して、粗生成物を得た。
【０１４４】
ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）およびジオレオ
イルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を用いて、この方法を繰り返
した。この方法に従って調製した脂質結合体化ポリアミド化合物は、以下の表１
および表２に示す。
【０１４５】
【表１】
2007161722.tif 000023
【０１４６】
†  式（Ｉ）の化合物であって、ここで、Ｗは、ＣＨ2であり、Ｒcは、ＮＨ2で
あり、そしてＲaは、式（ＩＩＩ）により定義され、ここで、ｐは、２である。
【０１４７】
【表２】
2007161722.tif 000024
【０１４８】
†  式（ＩＶ）の化合物であって、ここで、Ｗは、ＣＨ2であり、Ｒcは、ＮＨ2
であり、そしてＲaは、式（ＩＩＩ）により定義され、ここで、ｐは、２である
。
【０１４９】
Ｂ．脂質結合体化ポリアミド化合物の特性付け
Ａ部から得た凍結乾燥した粗生成物を、水中の５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリ
ル５ｍｌに溶解し、得られた溶液を、Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（登録商標）Ｃ４カラ
ム（１５μｍ、３００Å）（これは、ＵＶ検出器を備えたＷａｔｅｒ  Ｐｒｅｐ
ＬＣ３０００システム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）
上にて、溶媒Ａ（水中の０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）中で８０％（ｖ／ｖ）溶媒
Ｂ（アセトニトリル中の０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）で平衡化した）に加えた。
５０ｍｌ／分の流速で、２０分間にわたる溶媒Ａ中の８０％（ｖ／ｖ）溶媒Ｂか
ら１００％溶媒Ｂに続いて、１５分間にわたる１００％溶媒Ｂの線形勾配を用い
て、ピークを溶出した。２２０ｎｍで、ピークをモニターした。所望の脂質結合
体化ポリアミド化合物を含有する画分を合わせて、真空中で濃縮した。
【０１５０】
生成物を、ＭＡＧＩＣ  ２００２液体クロマトグラフィーシステム（Ｍｉｃｈ
ｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）上のＶｙｄａｃ  Ｃ４
カラム（５μｍ  ３００Å、１．０×１５０ｍｍ）を用いる分析用逆相ＨＰＬＣ
およびエレクトロスプレーイオン化質量分析（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，ＦＩＳＯＮ
Ｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｅｖｅｌｙ，ＭＡ）により、特徴付けた。
【０１５１】
本実施例Ａ（２）部からの反応生成物のクロマトグラフィーは、大きな鋭いピ
ーク（これは、この脂質結合体化ポリアミド化合物に相当している）およびそれ
より小さいピーク（これは、未反応オリゴマーに相当している）を生じた。質量
分析により、本実施例でのＡ（２）部から得た合成脂質結合体化ポリアミド化合
物の理論分子量を確認した。それゆえ、これらの結果から、この脂質結合体化ポ
リアミド化合物の予想分子量が確認される。
【０１５２】
（実施例２）
（プラスミドＤＮＡで複合体化した脂質結合体化ポリアミド化合物の調製）
プラスミドＤＮＡで複合体化した脂質結合体化ポリアミド（実施例１に由来）
を調製した。これらの実験で使用したプラスミドは、ｐＣＭＶｋｍＬＵＣであっ
た。プラスミドｐＣＭＶｋｍＬＵＣは、ｐＳＰ−ｌｕｃ＋（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃ
ｏｒｐ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）由来のｌｕｃ＋遺伝子を発現ベクターｐＣＭＶ
ｋｍ２に挿入することにより、構築した。ベクターＣＭＶｋｍ２の配列を、配列
番号１に示す。ベクターＣＭＶｋｍ２のプラスミドマップは、図２で示す。
【０１５３】
要約すると、ｐＳＰ−ｌｕｃ＋を制限酵素Ｎｈｅ１−ＥｃｏＲＶ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で消化し、
そして１６９１ｂｐの断片を標準方法により単離した。この断片をｐＣＭＶｋｍ
２に挿入し、これを、Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて、Ｘｂ
ａＩ、ＥｃｏＲＶで消化した。このｌｕｃ＋遺伝子をｐＣＭＶｋｍ２中にクロー
ン化して、このＣＭＶ前初期エンハンサープロモーターにより発現を駆動し、そ
してウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより、停止する。
【０１５４】
実施例１で合成した脂質結合体化ポリアミド化合物を、５ｍＭの濃度で滅菌水
に溶解し、そして１分間超音波処理して、透明溶液を得た。ｐＣＭＶｋｍＬＵＣ
の５ｍＭ滅菌水溶液を調製した。この脂質結合体化ポリアミド化合物溶液および
プラスミド溶液の等容量を共に混合し、そしてトランスフェクション前に、室温
で１５分間放置した。トランスフェクション研究のためには、滅菌水の代わりに
、ＯｐｔｉＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使
用した。
【０１５５】
脂質結合体化ポリアミド化合物とＤＯＰＥまたはコレステロールとを等モル比
で混合することにより、複合体もまた調製し、次いで、超音波処理して、リポソ
ームを形成した。次いで、これらの前形成したリポソームに、プラスミドＤＮＡ
を添加して、複合体を形成した。
【０１５６】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ
ｕｒｇ，ＭＤ）およびＤＭＲＩＥ−ＣTM（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ，ＭＤ）およびプラスミドＤＮＡの複合体もまた、製造業者の指示に従
って、以下の実施例において、対照として調製した。
【０１５７】
（実施例３）
（プラスミドＤＮＡで複合体化した脂質結合体化ポリアミド化合物の特徴付
け）
滅菌水中での凍結乾燥した化合物１６（表２を参照）の再水和により、光を散
乱しない透明溶液を生じた。逆染色した電子顕微鏡測定下では、この溶液中の脂
質結合体化ポリアミド化合物は、ほぼ円筒形ミセルの凝集物として現れ、一部の
円筒形ミセルは、約１０  ｎｍ〜約１５  ｎｍの間の直径を有していた。化合物
１６を実施例３から得たｐＣＭＶｋｍＬＵＣと混合しつつ、動的光散乱測定（Ｎ
４  Ｐｌｕｓ，  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｍｉａｍｉ，  
ＦＬ）により、その＋／−電荷比が約２と約４との間のとき、粒径は、最低で約
１２０  ｎｍに達することが明らかとなった。これらの複合体の粒径は、この電
荷比が変わるにつれて、僅かに増加した。２：１＋／−電荷比の複合体の逆染色
した電子顕微鏡測定により、約１５０  ｎｍの直径を有する均一な球形粒子の形
成が明らかとなった。
【０１５８】
動的光散乱測定は、同様に、化合物２３をｐＣＭＶｋｍＬＵＣと混合しつつ、
行った。得られた脂質結合体化ポリアミド／ＤＮＡ複合体の粒径は、その＋／−
電荷比が約２と約４との間のとき、１２０  ｎｍの最低値に達した。この電荷比
が増加または減少したとき、これらの複合体の粒径は、僅かに増加した。
【０１５９】
ゼータ電位測定（Ｄｅｌｓａ  ４００，  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ）により、化合物１６／ＤＮＡ複合体のゼータ電位は、脂質結合体化ポリ
アミドとＤＮＡとの比が上がるにつれて、着実に増加し、そして電荷中和は、約
０．５と１との間の電荷比にて、実現した。
【０１６０】
複合体形成はまた、アガロースゲル移動度シフトアッセイにより、特徴付けた
。１以上の＋／−電荷比で、１μｇ  ｐＣＭＶｋｍＬＵＣと化合物１６との複合
体を１％アガロースゲル（７０Ｖ、１時間）にロードして、裸のプラスミドＤＮ
Ａと比較して、複合体化プラスミドＤＮＡの遅延を検査した。ゲル移動度シフト
により、このプラスミドＤＮＡは、この複合体中にて保持されていることが確認
された。
【０１６１】
（実施例４）
（脂質結合体化ポリアミド化合物との複合体中におけるＤＮＡ安定性の特徴
付け）
本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物が、複合体化したＤＮＡのＤＮａｓｅ
Ｉ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，
ＩＮ）による分解を阻害するかどうかを決定するために、脂質結合体化ポリア
ミド／ＤＮＡ複合体をＤＮａｓｅＩで処理し、そしてその結果を、アガロースゲ
ル電気泳動により、分析した。１０μｇのｐＣＭＶｋｍＬＵＣを含む、ｐＣＭＶ
ｋｍＬＵＣ（１０μｇ）および脂質結合体化１０／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣ複合体を
、３７℃で、５０μｌの１０  ｍＭ  ＭｇＣｌ2中にて、１５分間にわたって、
１０単位のＤＮａｓｅＩでインキュベートした。１アリコート（１μｇ  ＤＮＡ
）の複合体／ＤＮａｓｅ混合物を１％アガロースゲル（７０Ｖ、１時間）にロー
ドして（そのロード緩衝液は、１％  ＳＤＳを含有していた）、このプラスミド
ＤＮＡの完全性を検査した。
【０１６２】
これらの結果により、芳香族または脂肪族のいずれかのＲ1基を有する脂質結
合体化ポリアミド化合物が、ＤＮａｓｅ分解に対する耐性を与える際に有効であ
るが、しかしながら、芳香族Ｒ1基は、分解に対して、ある程度より大きな耐性
を与えるようであることが明らかとなった。これらの結果は、芳香族Ｒ1基を有
する脂質結合体化ポリアミド化合物の方が、ＤＮＡとより強力に結合体化するこ
とを示唆している。
【０１６３】
さらに、アミノエチル：２−（４’−メトキシフェニル）エチル：２−（４’
−メトキシフェニル）エチルのＲ11：Ｒ12：Ｒ13モチーフを有する式（ＩＶ）の
脂質結合体化ポリアミド化合物は、保持されている多くの量のスーパーコイル化
したプラスミドＤＮＡから明らかなように、他のモチーフよりも大きな程度まで
、このプラスミドＤＮＡを保護するようであった。この結果は、この脂質結合体
化ポリアミド化合物の長さとは非依存性であるようであった。プラスミドＤＮＡ
の安定性もまた、複合体＋／−電荷比の関数として、評価した。異なる量の化合
物１６と一定量のプラスミドＤＮＡとを混合することにより、異なる電荷比を有
するリピトイド（ｌｉｐｉｔｏｉｄ）／ポリヌクレオチド複合体を調製した。評
価した電荷比（すなわち、＋／−  １０：１、８：１、４：１および２：１）の
いずれを用いても、有意な分解は認められなかった。しかしながら、スーパーコ
イル立体配置は、低い電荷と比較すると、高い電荷比では、より大きな程度で維
持された。
【０１６４】
（実施例６）
（トランスフェクション方法およびアッセイ）
このトランスフェクション研究では、以下の３種の細胞系を使用した：ＨＴ１
０８０（アメリカンタイプカルチャーコレクション，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  
ＭＤ，  受託番号  ＣＣＬ  １２１）、ＮＩＨ３Ｔ３（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ
．，  Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，  ＣＡの培養物の収集ストックから得た）、およ
びＣｏｓ６Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，  ＣＡの
Ｅ．  Ｇｌａｚｅｒ研究室から得た）。トランスフェクション前に、これらの細
胞（１×１０5細胞／ＤＭＥ−ＦＣＳ  １  ｍｌの懸濁液２  ｍｌ）を、６ウェ
ルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）の各ウェルにプ
レートし、そして徐々に移動させて、これらの細胞を均等に分散させた。これら
の細胞を、２４時間後にトランスフェクトした。
【０１６５】
トランスフェクションのためには、プラスミド（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，  Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）を含有する一過性複合体および安定複合体の両方
を使用した。各ウェルに、および１μｇのｐＣＭＶｋｍＬＵＣ／ウェルで、１μ
ｇ／１００μｌの濃度にて、複合体化ＤＮＡのトランスフェクション培地を添加
した。全ての試験条件は、二連のウェル中で実施した。細胞は、３７℃で、３時
間にわたって、トランスフェクション培地で培養した。このトランスフェクショ
ン培地を、その細胞層を乱すことなく、ピペットにより除去し、そして２  ｍｌ
のＤＭＥ−ＦＣＳ（血清陽性条件用）またはＯｐｔｉＭＥＭ（無血清条件用）の
いずれかで置き換えた。次いで、これらの細胞を４８時間再インキュベートし、
その培地を捨てた。これらの細胞を、次いで、ＤＰＢＳ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ，  Ｌｅｎｅｘａ，  ＫＳ）で２回リンスした。
【０１６６】
これらのウェルに、レポーター溶解緩衝液（３００μｌ／ウェル）（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を添加し、そしてこれらの細
胞を、ロッカー上にて、１５〜２０分間にわたって、溶解させた。各ウェルから
の細胞溶解物を、細胞スクレーパ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｐ
ｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，  ＰＡ）を用いて、エッペンドルフ管に移し、続いて、凍
結（エタノール−ドライアイス）融解サイクルおよび微量遠心分離（最大速度で
２分間）にかけた。
【０１６７】
製造業者の指示に従って、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）およびＭＬ２２５０自動
化ルミノメータ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，  Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，  ＶＡ）を用いて
、これらの溶解物についてホタルルシフェラーゼ活性を分析した。
【０１６８】
（実施例７）
（脂質結合体化ポリアミド／ＤＮＡ複合体電荷密度の関数としてのトランス
フェクション効率の評価）
脂質結合体化ポリアミド／ＤＮＡ複合体は、実施例２で記述されているように
、化合物１６およびＯｐｔｉＭＥＭ中のｐＣＭＶｋｍＬＵＣから調製した。これ
は０．５：１、１：１、２：１、４：１、および８：１の＋／−電荷密度を有し
た。ＨＴ１０８０細胞を実施例６の方法に従って、トランスフェクトし、そして
アッセイした。トランスフェクション効率（すなわち、ルシフェラーゼ活性）と
複合体電荷密度との間の関係を、図２で示す。これらの結果により、化合物１６
を用いるＨＴ１０８０のトランスフェクションが、この複合体の＋／−電荷密度
が約２：１のとき、最も効率的であったことが明らかである。これらの結果はま
た、血清が、トランスフェクション効率に対して有意な影響を有するようではな
かったことを示している。
【０１６９】
（実施例８）
（脂質結合体化ポリアミド化合物のトランスフェクション効率に対するオリ
ゴマー長の効果の評価）
脂質結合体化ポリアミド／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣ複合体は、実施例２に従って、
ＯｐｔｉＭＥＭ中にて、２：１の＋／−電荷比を有する化合物１５〜１９から調
製した。化合物１５〜１９は、全て、同じ一般的な構造（すなわち、式（ＩＶ）
）、同じ側鎖および脂質基を有しているが、しかしながら、それらは、オリゴマ
ー長に関して、異なる（すなわち、整数ｍは、これらの化合物の各々について、
異なる）。整数ｍは、化合物１５、１６、１７、１８および１９について、それ
ぞれ、２、３、４、８および１２である。ＨＴ１０８０細胞を、これらの化合物
の各々から調製した複合体でトランスフェクトし、次いで、実施例６で記述のよ
うにして、アッセイした。
【０１７０】
これらの結果は、図３で示すが、この特定の一連の化合物について、トランス
フェクション効率は、化合物１６（ｍ＝３）に対して、最も高いことを示してい
る。
【０１７１】
（実施例９）
（トランスフェクション効率に対する脂質部分の効果）
結合体化脂質ポリアミド／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣ複合体は、実施例２で記述のよ
うにして、２：１の＋／−電荷密度を有して、化合物１６および２３（両方とも
、ＤＭＰＥ結合体化化合物）、および化合物２０および２４（両方とも、ＤＯＰ
Ｅ結合体化化合物）から調製した。これらの複合体を用いて、ＨＴ１０８０細胞
をトランスフェクトし、そして共に、実施例６で記述の方法に従って、トランス
フェクション効率をアッセイした。
【０１７２】
これらの結果は、図４で示すが、これらのＤＯＰＥ結合体化化合物と比較して
、これらのＤＭＰＥ結合体化化合物について、より高いトランスフェクション効
率を示した。
【０１７３】
（実施例１０）
（脂質結合体化ポリアミド化合物を用いた異なる細胞株のトランスフェクシ
ョン）
脂質結合体化ポリアミド／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣプラスミド複合体は、実施例２
に従って、２：１の＋／−電荷密度を有して、ＯｐｔｉＭＥＭ中の化合物１６お
よび２３から調製した。さらに、製造業者の指示に従って、ＯｐｔｉＭＥＭ中に
て、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣおよびＤＭＲＩＥ
−ＣTM／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣ複合体を調製した。これらの複合体を用いて、ＨＴ
１０８０細胞、Ｃｏｓ６Ｍ細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞をトランスフェクトし、
引き続いて、実施例６に従って、ルシフェラーゼ活性について、アッセイした。
【０１７４】
これらの結果を、表３で示す。これらの結果は、市販のトランスフェクション
調製物と比較して、脂質結合体化ポリアミド化合物の高いトランスフェクション
効率を立証している。
【０１７５】
（表３．脂質結合体化ポリアミド化合物のトランスフェクション効率†）
【０１７６】
【表３】
2007161722.tif 000025
【０１７７】
†  標準化ルシフェラーゼ活性（ｏｐｔｉＭＥＭ、無血清）／標準化ルシフェラ
ーゼ活性（血清）
a血清活性および無血清活性の両方は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）媒介
トランスフェクションに由来の対応するルシフェラーゼ活性に対して標準化する
。
b血清活性および無血清活性の両方は、ＤＭＲＩＥ−ＣTM媒介トランスフェクシ
ョンに由来の対応するルシフェラーゼ活性に対して標準化する。
【０１７８】
（実施例１１）
（種々の脂質結合体ポリアミド化合物を用いたＨＴ１０８０細胞のトランス
フェクション）
脂質結合体化ポリアミド／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣプラスミド複合体は、実施例２
で記述のようにして、実施例１から得た脂質結合体化ポリアミド化合物の一部か
ら、調製した。これらの複合体は、２：１の＋／−電荷密度を有していた。さら
に、製造業者の指示に従って、ＯｐｔｉＭＥＭ中にて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（
登録商標）／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣおよびＤＭＲＩＥ−ＣTM／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣ
複合体を調製した。これらの複合体を用いて、ＨＴ１０８０細胞をトランスフェ
クトし、引き続いて、実施例６に従って、ルシフェラーゼ活性について、実施例
６に従って、アッセイした。
【０１７９】
これらの結果を、表４で示す。
【０１８０】
（表４．脂質結合体化ポリアミド化合物のトランスフェクション効率†a）
【０１８１】
【表４】
2007161722.tif 000026
【０１８２】
†  標準化ルシフェラーゼ活性（ｏｐｔｉＭＥＭ、無血清）／標準化ルシフェラ
ーゼ活性（血清）
a全ての活性は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）媒介トランスフェクション
に由来の対応する血清および無血清ルシフェラーゼ活性に対して標準化する。
【０１８３】
カチオン性側鎖および中性側鎖（Ｒ1）の両方と共に繰り返しｎマー単位を有
する脂質結合体化ポリアミド化合物は、一般に、カチオン性側鎖だけを有する脂
質結合体化ポリアミド化合物と比較して、トランスフェクションを媒介する際に
、より効率的であった。
【０１８４】
（実施例１２）
（脂質結合体化ポリアミド化合物／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣ複合体を用いたイン
ビボトランスフェクション）
その複合体の＋／−電荷比が８：１になるように、ｐＣＭＶｋｍＬＵＣ（６０
μｇ）のＤ５Ｗ（２００μｌ）溶液２００μｌ（５％デキストロース）および化
合物１６（２．９  ｍｇ）のＤ５Ｗ（２００μｌ）溶液２００μｌ（５％デキス
トロース）を混合することにより、脂質結合体化ポリアミド／ｐＣＭＶｋｍＬＵ
Ｃ複合体を調製した。この脂質結合体化ポリアミド／ＤＮＡ複合体調製物の最終
容量は、４００μｌであった。この調製物の４００μｌ投薬量を、Ｂａｌｂ／Ｃ
マウスの尾静脈に注射した。
【０１８５】
このマウスを、注射の２４時間後に殺し、そして肺、肝臓、心臓、腎臓および
脾臓を採取した。これらの採取した臓器を２．０  ｍｌスクリューキャップ管（
ここで、これらの管の容量の３分の１は、ガラスビーズ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，  ＯＫ）で満たした
）に入れた。これらの管を液体窒素中で凍結し、次いで、−７０℃で保存した。
【０１８６】
これらの採取した臓器からルシフェラーゼを抽出するために、各管に、１×  
Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｃｏｒｐ．
，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）の３００μｌアリコートを添加した。これらの管
の内容物を、次いで、４℃で１分間にわたって、ホモジナイズした。各管に１×
ＲＬＢの２００μｌアリコートを添加した後、これらの管の内容物を、冷室にて
、３０分間にわたって、ボルテックスした。次いで、これらの管およびそれらの
内容物を、３サイクル中にて、エタノール／ドライアイス浴にて凍結し、次いで
、２０℃で、水浴中にて、融解した。これらの管を、次いで、冷室にて、５分間
にわたって、１２，５００  ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離後、その上清をピ
ペットにより集めた。
【０１８７】
この上清を、製造業者の指示に従って、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓ
ｅアッセイシステムおよびＤｙｎａｔｅｃｈ  ＭＬ２２５０自動化ルミノメータ
ー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，  Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，  ＶＡ）を用いて、ルシフェラ
ーゼ活性についてアッセイした。
【０１８８】
これらの結果は、図５で示すが、ルシフェラーゼは、マウスの肺、肝臓におい
て、発現し、また、脾臓組織では、それより低い範囲で発現することが明らかで
ある。これらの結果は、インビボトランスフェクションを媒介する際での脂質結
合体化ポリアミド化合物の効力を立証している。
【０１８９】
（実施例１３）
（送達ビヒクル／ポリヌクレオチド複合体の安定調製物を処方する希釈濃縮
方法）
Ｉ．電荷計算
ＤＮＡ上の負電荷の濃度は、各ヌクレオチドについて、３３０ダルトンの平均
分子量に基づいて、１μｇのＤＮＡあたり、３．０３  ｎｍｏｌのホスフェート
として計算した。各脂質結合体化ポリアミド化合物の式量は、セミ−トリフルオ
ロアセテート塩（アミノ基の５０％は、ＴＦＡとの塩を形成する）として計算し
、そして、この脂質結合体化ポリアミド化合物の濃度は、実施例１から得た凍結
乾燥した生成物に基づいて、決定した。
【０１９０】
ＩＩ．複合体形成
全ての工程は、室温で行った。全てのストック溶液を調製するために、診断等
級の精製水（ＤＧＰＷ）を使用した。０．５：１、１：１、２：１、４：１およ
び８：１の＋／−電荷比を有する脂質結合体化ポリアミド／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣ
複合体を調製した。５０μｇ／ｍｌのポリヌクレオチドの希釈溶液を調製し、こ
れは、１５１μＭの負電荷に相当していた。脂質結合体化ポリアミド化合物１６
の５  ｍＭ溶液を調製した。
【０１９１】
穏やかに攪拌しつつ、各脂質結合体化ポリアミド溶液の等容量に、一定容量の
このＤＮＡ溶液を素早く添加した。これらの２種の溶液をゆっくりと添加すると
、大きな複合体および偶然の沈殿物が形成される傾向にあることが認められた。
このＤＮＡ溶液をこの脂質結合体化ポリアミド溶液に添加したとき、その逆の場
合よりも良好な結果が得られた。
【０１９２】
これらの処方物を、適切な分子量カットオフ（例えば、１００  ｋｄ）を有す
る市販の限外濾過膜濃縮デバイスを用いて、濃縮した。各希釈脂質結合体化ポリ
アミド／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣ複合体調製物（３０％（ｖ／ｖ）エタノール中）２
ｍｌをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）−１００（Ａｍｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．，
Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）中に入れ、そして１０００  ×ｇで３０分間、また
は複合体含有保持物の容量が約５０μｌになるまで、遠心分離した。その濾液を
、その底部受容器から除去した。この保持物を５％グルコース２  ｍｌで希釈し
、そして上記手順を繰り返すことにより、再度、５０μｌまで濃縮した。この操
作を再度繰り返して、５％グルコース中に１  ｍｇ／ｍｌのｐＣＭＶｋｍＬＵＣ
を含有する濃縮した安定調製物を製造した。この方法は、冷たい温度（例えば、
４℃で）または室温で行うことができる。一般に、この保持物中のＤＮＡの最終
濃度は、いずれの目に見える沈殿もなしに、１  ｍｇ／ｍｌ程度であり得る。
【０１９３】
ゼータ電位測定は、各濃縮製剤について、処方後第１日、第２日および第８日
で、行った。これらの結果は、図６および７で示すが、この濃縮調製物中の複合
体のゼータ電位が、８日間にわたって、事実上安定なままであることを示してい
る。
【０１９４】
脂質結合体化ポリアミド／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣ複合体の各濃縮調製物について
、動的光散乱測定（Ｎ４  Ｐｌｕｓ，  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ，  Ｍｉａｍｉ，  ＦＬ）を行った。これらの結果は、図８および９で示すが
、これらの複合体の粒径もまた、８日間にわたって、事実上安定なままであるこ
とを示している。
【０１９５】
実施例６で記述した方法に従って、処方後第２日および第１８日（化合物１６
）および処方後第４日および第１２日で、脂質結合体化ポリアミド／ｐＣＭＶｋ
ｍＬＵＣ複合体の各濃縮調製物を用いて、ＨＴ１０８０細胞をトランスフェクト
した。ＤＭＲＩＥ−ＣTM／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣ複合体の調製物は、実施例２で記
述した通常方法を用いて調製し、そしてＨＴ１０８０細胞をトランスフェクトし
た。細胞コンフルエンスもまた、顕微鏡を用い、そして生存細胞の割合を概算し
て、測定した。
【０１９６】
これらの結果は、図１０〜１２で示すが、この「濃縮」処方方法に従って調製
した脂質結合体化ポリアミド／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣ複合体でトランスフェクトし
た細胞中のルシフェラーゼ活性が、通常方法に従って調製したＤＭＲＩＥ−ＣTM
／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣ複合体よりも高いことが明らかとなった。これらの結果は
、細胞コンフルエンスが、０．５：１、１：１および２：１の＋／−電荷比の複
合体およびＤＭＲＩＥ−ＣTMについて高く、また、４：１および８：１の＋／−
電荷比の複合体について低いことを示している。トランスフェクション調製物の
量を２倍にすることにより、図１４で示すように、２：１の＋／−電荷比を有す
る複合体では、ルシフェラーゼ発現が高くなったが、４：１の＋／−電荷比を有
する複合体では、発現が低くなった。図１４はまた、４：１の＋／−電荷比の複
合体の量が２倍になったとき、細胞コンフルエンスもまた低下したことを示して
いる。
【０１９７】
実施例２で示したように、送達ビヒクル／ＤＮＡ複合体を調製する通常方法を
使用することの効果を、送達ビヒクル／ＤＮＡ複合体を調製する濃縮方法の使用
と比較した。脂質結合体化ポリアミド化合物（１６および２３）／ｐＣＭＶｋｍ
ＬＵＣ複合体は、実施例２で記述した通常方法に従って、調製した。ＨＴ１０８
０細胞を、処方の３０分間以内に、トランスフェクトした。これらら結果は、図
１５では、「混合」と呼んでいる。同様に、この濃縮方法に従って、脂質結合体
化ポリアミド化合物（１６および２３）／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣ複合体を調製し、
続いて、処方の１〜７日後に、ＨＴ１０８０細胞をトランスフェクトした。これ
らの結果は、図１４および１５では、「予備形成した」と呼んでいる。ｐＣＭＶ
ｋｍＬＵＣでのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎおよびＤＭＲＩＥ−Ｃの複合体もまた、実
施例２で記述した通常の処方方法を用いて、調製した。これらの結果は、図１５
で示すが、この濃縮方法で形成した複合体でトランスフェクトした細胞では、こ
の通常方法で形成した複合体でトランスフェクトした細胞におけるよりも、ルシ
フェラーゼ活性が高かったことが明らかである。細胞生存は、トリパン（ｔｒｙ
ｐｈａｎ）ブルーで染色することにより、測定した。
【０１９８】
本発明は、その一定の好ましい実施態様を参照して、詳細に記述しているもの
の、改良および変更は、記述し請求した精神および範囲内であることが理解され
る。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】図１は、脂質結合体化ポリアミド化合物を調製するための反応スキームを示す。
【図２】図２は、ベクターＣＭＶｋｍ２のプラスミドマップである。
【図３】図３は、ＨＴ１０８０細胞のトランスフェクトに対する、本発明のプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶｋｍＬＵＣ）および脂質結合体化ポリアミド（すなわち、表２の化合物１６）の複合体の＋／−電荷比の効果を示す。トランスフェクトした細胞中のルシフェラーゼ活性は、ｙ軸上にて、（ｐｇ／２０μｌ）で示し、その＋／−電荷比は、ｘ軸上で示す。その白棒は、ＦＣＳ補充培地で増殖した細胞を意味し、そして黒棒は、ＯｐｔｉＭＥＭ（すなわち、無血清培地）で増殖した細胞を意味する。
【図４】図４は、トランスフェクト効率と、本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物のオリゴマー性部分中の単量体単位の全数との間の関係を示す。トランスフェクトしたＨＴ１０８０細胞におけるルシフェラーゼ活性（全て、３６量体（すなわち、式（Ｉ）を参照すると、ｎ＝３、ｍ＝１２）に対応するルシフェラーゼ活性に規格化した）は、ｙ軸上で示し、そしてオリゴマーの長さは、ｘ軸上で示す。これらの脂質結合体化ポリアミド／ＤＮＡ複合体は、２：１の＋／−電荷比を有していた。
【図５】図５は、ＤＭＰＥ−結合体化ポリアミド化合物（すなわち、化合物１６および２３）とＤＯＰＥ−結合体化ポリアミド化合物（すなわち、化合物２０および２４）との間のトランスフェクト効率の比較を示す。その白棒は、ＦＣＳ補充培地で増殖した細胞を意味し、そして黒棒は、ｏｐｔｉＭＥＭ（すなわち、無血清培地）で培養した細胞を意味する。
【図６】図６は、脂質結合体化ポリアミド化合物（化合物１６）／ｐＣＭＶｋｍＬＵＣ複合体（８：１の＋／−電荷比）でインビボトランスフェクトした後の、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの肺、肝臓および脾臓の組織におけるルシフェラーゼ発現を示す。ルシフェラーゼ発現は、この脂質結合体化ポリアミドの静脈内注射２４時間後で測定した。
【図７】図７は、脂質結合体化ポリアミド（化合物１６）／ＤＮＡ（ｐＣＭＶｋｍＬｕｃ）複合体の処方物（これは、本発明の「希釈−濃縮」処方方法により、調製した）の８日間にわたるゼータ電位安定性を示す。
【図８】図８は、脂質結合体化ポリアミド（化合物２３）／ＤＮＡ（ｐＣＭＶｋｍＬｕｃ）複合体の処方物（これは、この「希釈−濃縮」処方方法により、調製した）の８日間にわたるゼータ電位安定性を示す。
【図９】図９は、脂質結合体化ポリアミド（化合物１６）／ＤＮＡ（ｐＣＭＶｋｍＬｕｃ）複合体の処方物（これは、この「希釈−濃縮」処方方法により、調製した）の８日間にわたる粒子サイズ安定性を示す。
【図１０】図１０は、脂質結合体化ポリアミド（化合物２３）／ＤＮＡ（ｐＣＭＶｋｍＬｕｃ）複合体の処方物（これは、この「希釈−濃縮」処方方法により、調製した）の８日間にわたる粒子サイズ安定性を示す。
【図１１】図１１は、この「希釈−濃縮」処方方法により調製された脂質結合体化ポリアミド（化合物１６）／ＤＮＡ（ｐＣＭＶｋｍＬｕｃ）複合体の処方物および通常の処方方法により調製したＤＭＲＩＥ−Ｃ（登録商標）／ＤＮＡ複合体の処方物の安定性を図示している。ＨＴ１０８０細胞は、処方後２日目で、脂質結合体化ポリアミド／ＤＮＡ複合体でトランスフェクトし、そして処方直後にて、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（登録商標）／ＤＮＡ複合体でトランスフェクトした。結果は、ＦＣＳ−補充培地およびＯｐｔｉＭＥＭ培地の両方で培養したトランスフェクト細胞について、示している。
【図１２】図１２は、この「希釈−濃縮」処方方法により調製された脂質結合体化ポリアミド（化合物１６）／ＤＮＡ（ｐＣＭＶｋｍＬｕｃ）複合体（２：１の＋／−電荷比）の処方物および通常の処方方法により調製したＤＭＲＩＥ−Ｃ（登録商標）／ＤＮＡ複合体の処方物の安定性を図示している。ＨＴ１０８０細胞は、処方後１８日目で、脂質結合体化ポリアミド／ＤＮＡ複合体でトランスフェクトし、そして処方直後にて、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（登録商標）／ＤＮＡ複合体でトランスフェクトした。結果は、ＦＣＳ−補充培地およびＯｐｔｉＭＥＭ培地の両方で培養したトランスフェクト細胞について、示している。
【図１３】図１３は、この「希釈−濃縮」処方方法により調製された脂質結合体化ポリアミド（化合物２３）／ＤＮＡ（ｐＣＭＶｋｍＬｕｃ）複合体の処方物および通常の処方方法により調製したＤＭＲＩＥ−Ｃ（登録商標）／ＤＮＡ複合体の処方物の安定性を図示している。ＨＴ１０８０細胞は、処方後４日目で、脂質結合体化ポリアミド／ＤＮＡ複合体でトランスフェクトし、そして処方直後にて、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（登録商標）／ＤＮＡ複合体でトランスフェクトした。結果は、ＦＣＳ−補充培地およびＯｐｔｉＭＥＭ培地の両方で培養したトランスフェクト細胞について、示している。
【図１４】図１４は、この「希釈−濃縮」処方方法により調製された脂質結合体化ポリアミド（化合物２３）／ＤＮＡ（ｐＣＭＶｋｍＬｕｃ）複合体の処方物および通常の処方方法により調製されたＤＭＲＩＥ−Ｃ（登録商標）／ＤＮＡ複合体の処方物の安定性を図示している。ＨＴ１０８０細胞は、処方後１２日目で、脂質結合体化ポリアミド／ＤＮＡ複合体でトランスフェクトし、そして処方直後にて、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（登録商標）／ＤＮＡ複合体でトランスフェクトした。また、トランスフェクト効率における、トランスフェクト培地の量の２倍の効果を示している。結果は、ＦＣＳ−補充培地およびＯｐｔｉＭＥＭ培地の両方で培養したトランスフェクト細胞について、示している。
【図１５】図１５は、通常方法および「希釈−濃縮」処方方法を用いたトランスフェクト効率を図示している。「混合」とは、通常の処方方法（ここで、この送達ビヒクルおよびＤＮＡは、トランスフェクトの直前に混合した）を意味する。「予備成形した」とは、この「希釈−濃縮」処方方法に続いて１〜５日後にトランスフェクトによる、送達ビヒクル／ＤＮＡ複合体の処方を意味する。細胞毒性もまた、示されている。結果は、ＦＣＳ補充培地中で培養したトランスフェクト細胞に対して、示されている。（配列表）
【数１】
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【数２】
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【数３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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