(57)【要約】【課題】血管内皮細胞、マクロファージなどで発現されている酸化ＬＤＬ受容体であるＬＯＸ−1への酸化ＬＤＬの結合を阻害するアンタゴニスト作用に優れ、かつ安全性が高い組成物および該組成物を含有する動脈硬化抑制剤を提供すること。【解決手段】コバノイシカグマ科に属するワラビの植物抽出物を有効成分として含有する、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用を有する組成物、前記組成物を含有する動脈硬化抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コバノイシカグマ科に属するワラビの植物抽出物を有効成分として含有する、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用を有する組成物。
【請求項２】
前記抽出物が水および／または有機溶媒を用いて得られたものである請求項１記載の組成物。
【請求項３】
請求項１または２記載の組成物を含有する動脈硬化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質（ＬＯＸ-1）に対してアンタゴニスト作用を有する組成物および該組成物を含有する動脈硬化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化症は近年、過脂肪食や運動不足を主な要因とする肥満症が最上流であるメタボリックシンドロームの下流に位置する症状であるとの認識がコンセンサスになりつつあり、この動脈硬化症がさらに進行することにより血栓を形成し、心疾患・脳血管疾患の原因となる。
【０００３】
ところで、日本国厚生労働省の最近の人口動態統計によると、日本における疾患別死亡者の１位が悪性新生物（腫瘍および癌）、２位が心疾患、３位が脳血管疾患となっているが、心疾患と脳血管疾患による死亡者の合計は全体の約２８％であり、これは悪性新生物の死亡者割合である約３０％にほぼ匹敵する（平成１７年(２００５年)）。悪性新生物の対処方法に関しては、その発症プロセスから考慮すると早期発見・早期治療が重要であり、臨床学的なアプローチが望ましいとされる。ところが上述のように、生活習慣病に起因する肥満症・動脈硬化症の下流に位置する心疾患・脳血管疾患については、食品からの予防学的なアプローチが可能なプロセスであり、日常的に摂取可能な形態を用いることでの対処方法が望ましい。
【０００４】
動脈硬化症において、食生活を含めた食品学的なアプローチが重要であることは上述の通りであるが、複雑・多岐なプロセスにおいてどの作用機序をターゲットにするかは重要である。動脈硬化症は酸化ストレスなどによる低密度リポ蛋白質（Low-density Lipoprotein: ＬＤＬ）の変性、血管内皮細胞への取り込みによる血管内皮機能障害を発症の端緒としており、その後のシーケンシャルなプロセスとしてマクロファージや血管平滑筋の分化・脱分化による泡沫化現象を呈する。そして最終的には狭窄性病変を経て血栓形成となる。つまり、予防学的観点から考えれば、初期病変である酸化ストレスなどによる脂質の変性、あるいは変性ＬＤＬが血管内皮細胞に取り込まれることによる機能障害を抑制することが重要である。
【０００５】
アポリポプロテインE欠損マウスにおいて、マクロファージのスカベンジャー受容体であるSR-A（Class A scavenger receptor）をノックアウトすると動脈硬化は抑えられるが、むしろ血中のコレステロール値は上昇することが報告されている（例えば、非特許文献１）。また、逆にSR-Aを過剰発現させるとマクロファージ内へのコレステロールの取り込みは促進されても、動脈硬化は促進しないことが報告されている（例えば、非特許文献２）。つまり、血中コレステロールの上昇とマクロファージなどへの脂質蓄積は、動脈硬化症の進展に対して２次的なものであるとも考えられる。さらに心血管疾患者の２人に１人は血清脂質が正常であり、また、脂質の変性を防ぐ目的での予防効果はビタミンE以外に十分なものはないとも言われている（例えば、非特許文献３）。つまり、血中脂質を改善することで全ての動脈硬化症が予防・改善できるわけではない。
【０００６】
一方で、脂質の変性とともに動脈硬化症の初期原因とされる血管内皮細胞の機能障害は、変性ＬＤＬ、特に酸化ＬＤＬが酸化ＬＤＬ受容体であるＬＯＸ-1（レクチン様酸化低密度リポプロテインレセプター-1 : Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1）を介して血管内皮細胞に取り込まれることに依存するという報告がある（例えば、非特許文献４）。ヒトのスカベンジャー受容体には、タイプAからタイプHまでの少なくとも８種類のクラスが存在するが（例えば、非特許文献５）、血管内皮細胞ではＬＯＸ-1を含め、少なくとも６種類のスカベンジャー受容体が機能していると考えられている（例えば、非特許文献６）。これらの受容体を介した変性ＬＤＬの取り込みに起因する血管内皮細胞の機能障害は、様々な接着因子の発現亢進や一酸化窒素産生の抑制などを引き起こし、単球・マクロファージの集積・泡沫化あるいは平滑筋細胞の遊走・増殖・形質転換に繋がる。そして結果として動脈硬化症を発症するものと考えられている。
【０００７】
LOX-1は血管内皮細胞のみならず、上述のように動脈硬化症に関与するマクロファージ、平滑筋細胞、あるいは血小板にも発現していることから（非特許文献７）、動脈硬化症の標的因子として非常に注目されている。例えばＬＯＸ-1を過剰発現させたアポリポプロテインＥ欠損マウスでは、マクロファージの集積数の増加、接着因子系の発現上昇、アテローム様部位の増大など、ＬＯＸ-1の過剰発現によって惹起された血管内皮細胞の機能障害を介した動脈硬化症の亢進が確認されている（例えば、非特許文献８）。このようにＬＯＸ-1が動脈硬化症の発症に対して非常に大きな影響を与えていることは予想されるものの、ＬＯＸ-1と変性ＬＤＬの結合を阻害する市販の薬剤については現在のところ知られていない。
【０００８】
ところで、ワラビ（Pteridium aquilinum）は、シダ植物の一種であるコバノイシカグマ科に属する植物であり、日本では古くから山菜として食されている。しかしながら、これらの植物抽出物が、ＬＯＸ-1に対してアンタゴニスト作用を有することは知られていない。
【非特許文献１】Suzuki H. et al. Nature (1997); 386: 292-6
【非特許文献２】Van Eck M. et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol (2000); 20: 2600-6
【非特許文献３】Ross R. N Engl J Med (1999); 340: 115-26
【非特許文献４】Sawamura T. et al. Nature (1997); 386: 73-7
【非特許文献５】Murphy J. E. et al. Atherosclerosis (2005); 182: 1-15
【非特許文献６】Adachi H. and Tsujimoto M. Prog Lipid Res (2006); 45: 379-404
【非特許文献７】Chen M. et al. Pharmacol Ther (2002); 95: 89-100
【非特許文献８】Inoue K. et al. Circ Res (2005); 97: 176-84
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記観点からなされたものであり、血管内皮細胞、マクロファージなどで発現されている酸化ＬＤＬ受容体であるＬＯＸ−1への酸化ＬＤＬの結合を阻害するアンタゴニスト作用に優れ、かつ安全性が高い組成物および該組成物を含有する動脈硬化抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するために、酸化ＬＤＬ受容体であるＬＯＸ−1に対するアンタゴニスト作用を有する成分を種々の材料からスクリーニングにより鋭意探索した結果、コバノイシカグマ科に属するワラビの抽出物に、顕著なアンタゴニスト作用を有する成分が存在することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明の要旨は、
（１）  コバノイシカグマ科に属するワラビの植物抽出物を有効成分として含有する、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用を有する組成物（以下、本発明の組成物と略する）、
（２）  前記抽出物が水および／または有機溶媒を用いて得られたものである前記（１）記載の組成物、
（３）  前記（１）または（２）記載の組成物を含有する動脈硬化抑制剤
に関する。
なお、本発明において、アンタゴニスト作用とは、後述の実施例に記載のような方法で評価した場合に、ＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合を阻害し、かつ酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みを阻害する作用を意味する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の組成物を用いることで、ＬＯＸ-1を介した酸化ＬＤＬの血管内皮細胞、マクロファージ、平滑筋細胞などの細胞内への取り込みを阻害することができ、結果として動脈硬化症の発症を抑制するという効果が奏される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において用いるワラビ（学名：ペテリジウム  アクイリナム（Pteridium aquilinum））は、コバノイシカグマ科に属する植物で、同じ科に属する植物としてコバノイシカグマ（学名：デンスタエデティア  スカブラ（Dennstaedtia scabra））、フモトシダ（学名：ミクロレピア  マルギナタ（Microlepia marginata））などがあるが、本発明においてはワラビが用いられる。
【００１４】
ワラビの植物体は、酸化ＬＤＬ受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用を有する成分を含有しており、前記植物体から得られる抽出物は上記成分を含むため、本発明の組成物の有効成分として用いることができる。本発明において植物抽出物としては、前記ワラビの植物体由来の抽出物、該抽出物の分画物、またはこれらの濃縮物のいずれでもよく、またこれらの混合物でもよい。また、抽出に用いた溶媒を乾燥させて乾固した固体状物でも、該固体状物を水などの溶媒に溶解させたものでもよい。なお、植物体の粉砕物を取り除かず、混合した状態のものも植物抽出物として使用できる。抽出には、植物体の全体を使用することができ、葉、茎、根などの植物体の特定の部位に限定されない。
【００１５】
ワラビの抽出処理は、連続式、還流式、バッチ式、浸漬式、超音波処理などの方法で常法により任意の温度・時間で行う。例えば、ワラビの葉、茎、根などをミキサーなどで破砕処理し、抽出溶媒中での短時間の超音波処理、抽出溶媒に室温で１〜３日間の浸漬、あるいは抽出溶媒の煮沸温度で１〜５時間還流しながら抽出を行う。その後、抽出液から破砕残渣を取り除き、減圧または限外濾過により抽出液を濃縮する。さらに必要に応じて溶媒を完全に除去して乾固するか凍結乾燥を行ってもよい。また、粉砕残渣は取り除かずに濃縮等の処理を行ってもよい。
【００１６】
抽出に用いる溶媒としては、水および／または有機溶媒が好ましい。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ブタノール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、これら単独または２種類以上を混合して用いてもよく、またこれらと水の混合溶媒としてもよい。中でも、アンタゴニスト作用を有する抽出物を効率よく得ることができるという観点から、エタノールで抽出処理することが好ましい。
【００１７】
このようにして得られた抽出物を製剤化に用いてもよいが、さらにこの抽出物からＬＯＸ−１アンタゴニスト作用を有する画分を精製したものを用いてもよい。精製物を得るためには、上記抽出物を吸着分配型充填担体、ゲル濾過担体などを充填したカラムクロマトグラフィーなどで分画する方法を用いることができる。
【００１８】
例えば、上記抽出物を酢酸エチルに溶解させ、ブタノール、水の３液に分配すると酢酸エチル層およびブタノール層、中でも酢酸エチル層にＬＯＸ−１アンタゴニスト活性は検出される。さらに酢酸エチル画分、ブタノール画分をセップパックＣ18カラム（ウォーターズ社製）に負荷すると、活性画分は吸着し、メタノール、アセトン等で溶出させると、前記活性画分の濃縮・精製物を得ることができる。さらに必要に応じてこの活性画分の溶液から溶媒を除去して乾固物を得てもよい。また、これらの方法はバッチ法などでも行うことができる。
【００１９】
以上のようにして得られる前記コバノイシカグマ科に属するワラビの植物抽出物を、本発明の組成物では主成分として含有する。本発明の組成物における前記植物抽出物の含有量としては、アンタゴニスト作用を示す量であれば特に限定はない。
【００２０】
前記組成物中におけるワラビの植物抽出物の量、該抽出物以外の成分およびその量などについては、前記組成物を摂取した個体が酸化ＬＤＬ受容体（ＬＯＸ−１）に対してアンタゴニスト作用が発現されるのであれば、特に限定はない。
【００２１】
また、本発明の組成物は、前記のようにＬＯＸ-１への酸化ＬＤＬの結合を阻害し、かつ酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みを阻害することから、好適な用途として、動脈硬化抑制剤が挙げられる。したがって、本発明は、コバノイシカグマ科に属するワラビの植物抽出物を有効成分として含有する、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）アンタゴニスト作用を有する組成物を含有する動脈硬化抑制剤に関する。
【００２２】
本発明の組成物をそのまま動脈硬化抑制剤として用いることが好ましいが、他の成分を混合してもよい。他の成分としては前記ＬＯＸ-1アンタゴニニスト作用を阻害しないものであれば、特に限定はない。
【００２３】
また、本発明の組成物または動脈硬化抑制剤は、食品・医薬品などの組成物に、公知の技術を用いて、配合することができる。この場合、本発明の組成物または動脈硬化抑制剤をそのまま用いてもよいが、各種基材に配合してもよい。基材の種類は特に限定されるものではなく、適時設定すればよいが、例えば、錠剤、カプセル、飴、グミあるいはドリンクなどの経口投与基材が、食品などに簡易に配合できる観点から好ましい。
【００２４】
また、食品としては、一般食品として、種々の食品原料に前記植物抽出物の所望量を加え、通常の製造方法により加工することにより、また、健康食品、機能性食品として、前記植物抽出物、分画物をそのまま、あるいは食べ易い状態にして使用することができる。
【００２５】
また、医薬品としては、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤、液剤などが挙げられ、これらは増量剤、賦形剤、潤沢剤、崩壊剤、結合剤、矯味矯臭剤などと共に通常の方法に従って製剤すればよい。
【００２６】
本発明の組成物または動脈硬化抑制剤の１日あたりの投与量は、症状、身長、体重、年齢などにより異なるが、成人１人あたりの摂取量が、１〜２０００ｍｇ／ｋｇ・日、好ましくは３〜１００ｍｇ／ｋｇ・日となるように、１回ないし数回に分けて被検体に投与するのがよい。
【００２７】
本発明の組成物または動脈硬化抑制剤は、ヒトや非ヒト動物（例えば、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラクダ、ウサギ、イヌ、ネコ、ネズミ、マウス、モルモット、ニワトリ、アヒル、ガチョウなどの哺乳動物）における動脈硬化症を予防／治療することが期待できる。
【００２８】
なお、コバノイシカグマ科に属するワラビは、日本において古くから若芽を食する山菜として知られており、安全性に関して問題はない。
【００２９】
本発明において標的としているＬＯＸ−1は、ヒトや非ヒトの哺乳動物（マウス、ラットなど）の血管内皮細胞のみならず、マクロファージ、平滑筋細胞、血小板にも存在しており、それぞれの細胞に酸化ＬＤＬが取り込まれることが動脈硬化症の発症に重要な役割を果たしていると考えられる。したがって、本発明の組成物は、血管内皮細胞などの動脈硬化症に関与する複数の細胞群において酸化ＬＤＬの取り込みを顕著に阻害する作用を有することから、多面的でかつ顕著に動脈硬化症を抑制することが期待でき、さらに安全性に優れることから、動脈硬化の予防効果も期待することができる。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の主旨はこれらによって制限されるものではない。
【００３１】
（実施例１）
ワラビをミキサーにより細かく破砕した。この破砕物１０ｇに対して１０倍量のエタノールを加え、超音波処理を３回に分けて１５分間ずつ行った。この処理液を減圧下のロータリーエバポレーターで濃縮した。これらの操作により１５０ｍｇのワラビ抽出物を得た。さらに得られたワラビ抽出物を水と酢酸エチルによる分配を次のようにして行った。得られた抽出物を酢酸エチル:水=１：１の溶媒中（１６０ｍL）で混合し、適当な時間静置した後に、上層を酢酸エチル画分として回収した。この操作を３回繰り返し、２４０ｍＬの酢酸エチル層を取り出し、ロータリーエバポレーターにより乾固し（４０℃）、酢酸エチル抽出画分を得た。水層については、さらにブタノール（８０ｍL）を加え、同様に分配を行った。これらの得られた各画分をそのままアンタゴニスト組成物として用いた。
【００３２】
（実施例２）
前記実施例1で得られた酢酸エチル層の乾燥画分を、少量のオクタデシルシリル基（ODS）-シリカゲル担体（富士シリシア化学工業社製）と混合した後、減圧下で溶媒を完全に除去した。この抽出物−担体の混合物を35mLのセップパックカラムに重層し、0-100%までのメタノールを用いたステップワイズ法による溶出を行った。メタノール濃度は10%ずつ変化させ、各フラクションを100mLとして回収した。最後に100mLのアセトンにより担体に結合した抽出物を完全に溶出した。各フラクションについて、溶媒をロータリーエバポレーターで乾燥させたものをアンタゴニスト組成物として用いた。
【００３３】
（実施例３）
上記実施例1で得られたアンタゴニスト組成物の酸化ＬＤＬに対するＬＯＸ−１結合阻害率について、大腸菌より得られた組換えＬＯＸ−１蛋白質を用いて評価を行った。
【００３４】
組換えＬＯＸ−１は、ウシ由来ＬＯＸ−１（ｂＬＯＸ−１）の膜貫通領域を除いたＣ末端までの配列を、Ｎ末端側に６個のヒスチジンタグ配列〔６× Ｈｉｓ〕を持つｐＱＥ ３０ベクター（キアゲン社製）に、翻訳フレームを揃える配列で挿入した。このベクターをＴ５プロモータで制御可能な大腸菌にトランスフォーメーションし、１ｍＭのイソプロピル 1-チオ-β-D-ガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）誘導下でｂＬＯＸ−１の発現誘導を行った。３７℃、３時間の発現誘導後、不溶性画分から組換えＬＯＸ−１は得られたので、６ Ｍグアニジン塩酸塩を含むバッファー中で大腸菌を溶解し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム（キアゲン社製）による６×Ｈｉｓを指標としたアフィニティーカラム精製を行った。さらにｂＬＯＸ−１を含む溶出画分について、２０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ９．０）、８Ｍ尿素を含むバッファー中で透析し、陰イオン交換体であるHiTrap Qカラム（アマシャム社製）にアプライし、ＮａＣｌの直線濃度勾配による溶出・精製を行った。このようにして得られたｂＬＯＸ−１を含む画分は、過剰量のＤＴＴ（ジチオスレイトール）を含むバッファー中で還元処理を行い、その後、低分子チオール化合物の酸化型（ＧＳＨ）および還元型（ＧＳＳＧ）の混合物を利用した酸化還元システムによる分子内Ｓ−Ｓ結合の巻き戻しを行った。このようにして得られたｂＬＯＸ−１は、酸化ＬＤＬに対する結合能力を有し、以下のプレートアッセイによる試験用ｂＬＯＸ−１標品として用いることにした。
【００３５】
プレートアッセイは、マキシソープ・イムノプレート（９６ウェルタイプ、NUNC社製）を用いて行った。上記精製ｂＬＯＸ−１を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳバッファーで調製し、１００μＬずつ各ウェルにアプライした。4℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μＬ×２回で洗浄し、２５％ブロックエース（大日本住友製薬社製）を含むＰＢＳバッファー３００μＬを各ウェルにアプライした。４℃で1晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μＬ×２回で洗浄し、ＰＢＳバッファーで適当な希釈倍率となるように調製した各精製サンプルを１００μＬずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、５ｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳバッファーで調製した酸化ＬＤＬを、１００μＬずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置した後に、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗アポリポプロテインＢ抗体（The Binding Site社製）をＰＢＳバッファーで１０００倍希釈し、１００μＬずつ各ウェルにアプライした。室温で２時間の静置後、ＰＢＳバッファーで各ウェルを４００μＬ×５回で洗浄し、3,3',5,5'-テトラメチルベンヂジン（ＴＭＢ）-ペルオキシダーゼ-酵素免疫測定（ＥＩＡ）-基質-キット試薬（バイオラッド社製）を１００μＬずつ各ウェルにアプライした。適当な反応時間後に、２Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を５０μＬずつ各ウェルにアプライして反応を停止させた。最終的に４５０ｎｍで検出を行い、ＬＯＸ−１結合活性を定量した。得られた結果を図１に示す。
【００３６】
図１は、実施例１の方法により得られた各組成物について、実施例３の試験方法により得られたデータを示す。グラフの縦軸は、プレート上に固定化されたＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合量を相対値で示しており、コントロールは抽出液を含まない処理区の値を１００として示している。また、添加したサンプル調製は、得られた乾固物を１０ｍＬのメタノールに溶解し、ＰＢＳバッファーで１００倍に希釈したものを用いた。図１で示されるように、酢酸エチル層、ブタノ−ル層由来の組成物にＬＯＸ−１に対する酸化ＬＤＬの高い結合阻害活性が見られた。
【００３７】
（実施例４）
実施例１、２で得られた各精製物について、ｂＬＯＸ−１を安定的に発現しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用い、ｂＬＯＸ−１を介したＣＨＯ細胞内への酸化ＬＤＬ取り込み抑制能を評価した。
【００３８】
ｂＬＯＸ−１を安定的に発現しているＣＨＯ細胞は、既報の方法に従って経代・維持を行った（Nature, Vol.385, p73-77, 1997）。細胞を用いたアッセイについては、次のように行った。２４ウェルプレート（ファルコン社製）に１．０Ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように各ウェルに５００μＬずつ細胞の蒔き込みを行い、３７℃、５％のＣＯ2濃度の環境下で２日間培養した。２日間の培養後、培養上清２５０μＬを除去し、各抽出液を適当な希釈倍率で含む２５０μＬの新しい培養液を添加した。抽出液を含む新しい培養液を添加した後に、１時間の前処理を上記環境下で行うことにより、ＬＯＸ−１への抽出物の結合反応を行った。その後、カルボシアニン蛍光色素である1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン  パーコレート（DiI:インビトロジェン社製）で標識した酸化ＬＤＬを５μｇ／ｍＬとなるように各ウェルにアプライし、上記環境下で６時間のＣＨＯ細胞内への蛍光標識酸化ＬＤＬの取り込み処理を行った。これらの処理を行った後に、１ｍＬ  ＰＢＳバッファーで３回各ウェルを洗浄し、０．１％ ＳＤＳによる細胞溶解を行った。溶解後に一定量の溶解液を回収し、９６ウェルのブラックプレート（NUNC社製）に分注し、DiIを指標に取り込まれた酸化ＬＤＬの測定を行った。蛍光測定機器は、Molecular Devices社の「ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ ＧＥＭＩＮＩ ＥＭ」を用いており、励起波長５４０ｎｍ、検出波長５８５ｎｍ、遮断波長５７０ｎｍで行った。
【００３９】
図２〜３は、実施例１〜２の方法により得られた各組成物について、実施例４の試験方法により得られたデータを示す。各グラフの縦軸は、DiIを指標に取り込まれた酸化ＬＤＬ量を各処理細胞由来の蛋白質量で除した相対値で示しており、コントロールは抽出液を含まない処理区の値を１００として示している。また、各組成物は終濃度０．５％となるように添加した。実施例３の結果と同様に、酢酸エチル層でＬＯＸ−１に対する高いアンタゴニスト活性を有する画分が細胞レベルでも得られており、蛋白質量もほぼ１００％回収されることから細胞への毒性も全く問題とはならなかった（図２）。また、ブタノール層もＬＯＸ−１に対してアンタゴニスト活性を有する画分であった。さらに、図３で示されるように、実施例２の精製方法により得られた各画分については、９０％メタノールからアセトン溶出画分の範囲で活性画分が検出された。つまり、これら組成物は、ＬＯＸ−１を介した細胞内への酸化ＬＤＬの取り込みを特異的に抑制することが可能であることがわかる。したがって、前記組成物はＬＯＸ−１に対する酸化ＬＤＬアンタゴニスト組成物であることがわかる。
【００４０】
また、実施例３、４に示されるように、本発明の組成物は、高いＬＯＸ-１アンタゴニスト作用を有することから、動脈硬化抑制剤としても好適に使用できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の組成物は、酸化ＬＤＬ受容体であるＬＯＸ−1への酸化ＬＤＬの結合を阻害するアンタゴニスト作用に優れ、かつ安全性が高いため、本発明の組成物をヒトや非ヒトの哺乳動物などの被検体が継続的に摂取しても副作用などの心配がなく、また、血管内皮細胞などの動脈硬化症に関連する細胞への酸化ＬＤＬの取り込みが継続的に阻害されることで、結果としてヒト、非ヒト哺乳動物における動脈硬化症の発症を抑えたり、また症状を緩和することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】実施例1の分配操作による各画分をサンプルとして用いたときの、実施例３の実験から得られた解析結果である。縦軸は抽出液を含まないサンプルの値を１００％として換算した相対値で示しており、全ての４５０ｎｍの値については抽出液および酸化ＬＤＬを含まないネガティブコントロールの値を差し引いた。
【図２】実施例１の分配操作による各画分をサンプルとして用いたときの、実施例４の実験から得られた解析結果である。細胞内へ取り込まれた酸化ＬＤＬ量を示す蛍光量については、全ての処理区において抽出液および蛍光標識した酸化ＬＤＬを含まないネガティブコントロールの値を差し引いた。また縦軸は、上記蛍光量を細胞溶解液の蛋白質量で除したコントロールの値を１００％として換算した値を示す。
【図３】実施例２の精製操作による各画分をサンプルとして用いたときの、実施例４の実験から得られた解析結果である。細胞内へ取り込まれた酸化ＬＤＬ量を示す蛍光量については、全ての処理区において抽出液および蛍光標識した酸化ＬＤＬを含まないネガティブコントロールの値を差し引いた。また縦軸は、上記蛍光量を細胞溶解液の蛋白質量で除したコントロールの値を１００％として換算した値を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2007297381.tif 000004