(57)【要約】【課題】  ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞において、その作用メカニズムに基づいた免疫抑制剤を提供するための方法、そのような免疫抑制剤を提供すること、及びＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞と共に用いることにより自己免疫疾患を治療するための方法等を提供すること。【解決手段】  ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞サブセットの免疫活性抑制は、主としてＩＬ−１０によって伝達される。このため、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞からのＩＬ−１０発現を増加させる物質をスクリーニングすることにより、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞と共に使用可能な免疫抑制剤を提供できる。そのような免疫抑制剤として、ペオニフロリン、グリチルリチンが例示される。ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞と免疫抑制剤を用いることにより、自己免疫疾患を有効に治療することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫抑制活性を備えたＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞からのＩＬ−１０発現量を増加させることを特徴とする免疫抑制剤。
【請求項２】
前記免疫抑制剤が抗炎症剤から選択されることを特徴とする請求項１に記載の免疫抑制剤。
【請求項３】
前記抗炎症剤が、グリチルリチンとその誘導体、またはペオニフロリンとその誘導体から選択されるものであることを特徴とする請求項２に記載の免疫抑制剤。
【請求項４】
ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の免疫抑制活性を増強させるために自己免疫疾患の治療または予防を目的として用いられることを特徴とするペオニフロリンまたはその誘導体。
【請求項５】
ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の免疫抑制活性を増強させるために自己免疫疾患の治療または予防を目的として用いられることを特徴とするグリチルリチンまたはその誘導体。
【請求項６】
免疫抑制活性を備えたＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞からのＩＬ−１０発現量を指標とすることを特徴とする免疫抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
免疫抑制活性を備えたＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞と該Ｔ細胞の免疫抑制活性を増強する免疫抑制剤とを投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療または予防方法。
【請求項８】
前記免疫抑制剤が、抗炎症剤から選択されることを特徴とする請求項７に記載の自己免疫疾患の治療または予防方法。
【請求項９】
抗炎症剤が、グリチルリチンとその誘導体、またはペオニフロリンとその誘導体から選択されることを特徴とする請求項８に記載の自己免疫疾患の治療または予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内において免疫応答の抑制に関わるＴ細胞サブセット及びその疾患治療への応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者は、長年に渡ってヒトの免疫機能に関する研究を行っている。近年になって、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞サブセットが、既に活性化されたＣＤ８＋ＣＴＬ（cytotoxic T cell）を制御する能力を有することを見出し、その成果の一部を発表してきた（特許文献１）。
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０７８０７２公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の作用メカニズムなどについては、十分に解明されていない点も多く残されていた。
こうして、本発明の課題は、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞において、その作用メカニズムに基づいた免疫抑制剤を提供するための方法、そのような免疫抑制剤を提供すること、及びＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞と共に用いることにより自己免疫疾患を治療するための方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意検討の結果、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の作用がＩＬ−１０を介してもたらされること、及びその作用を増強させる免疫抑制剤の一例として、グリチルリチン・ペオニフロリンが該当することを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
こうして、第１の発明に係る免疫抑制剤は、免疫抑制活性を備えたＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞からのＩＬ−１０発現量を増加させることを特徴とする。
【０００６】
ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞とは、細胞膜の表面にＣＤ８＋とＣＤ１２２＋という２種類のタンパク質を発現したＴ細胞サブセットである。但し、全てのＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞が、本発明に必須の免疫抑制活性を示すとは限らない。このため、本発明においては、そのようなＴ細胞サブセットのうち、免疫抑制活性を備えたものに係る。
また、本発明の免疫抑制剤は、抗炎症剤から選択されることが好ましい。また、そのような抗炎症剤は、グリチルリチンとその誘導体、またはペオニフロリンとその誘導体から選択されることが好ましい。
第２の発明は、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の免疫抑制活性を増強させるために自己免疫疾患の治療または予防を目的として用いられることを特徴とするペオニフロリンまたはその誘導体である。
【０００７】
第３の発明は、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の免疫抑制活性を増強させるために自己免疫疾患の治療または予防を目的として用いられることを特徴とするグリチルリチンまたはその誘導体である。
第４の発明に係る免疫抑制剤のスクリーニング方法は、免疫抑制活性を備えたＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞からのＩＬ−１０発現量を指標とすることを特徴とする。
第５の発明に係る自己免疫疾患の治療または予防方法は、免疫抑制活性を備えたＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞と該Ｔ細胞の免疫抑制活性を増強する免疫抑制剤とを投与することを特徴とする。
【０００８】
上記発明においては、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞が、自己末梢血から分離されたもの、または分離された後に増殖されたものであることが好ましい。
また、上記発明においては、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の免疫抑制活性を増強する免疫抑制剤が、抗炎症剤から選択されることが好ましい。そのような抗炎症剤としては、グリチルリチンとその誘導体、またはペオニフロリンとその誘導体から選択されることが好ましい。
上記免疫抑制剤およびＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を個体に投与することによって、ＣＤ８＋キラーＴ細胞の活性を抑制し、その結果個体に障害を引き起こしていた免疫応答反応を特異的に抑制することができる。
【０００９】
本発明は、上記免疫抑制剤をヒトを含む哺乳動物に投与すること、及び哺乳動物において免疫応答を抑制する方法を提供する。更に、薬理上有効な量の上記免疫抑制剤を哺乳動物に投与することを含む自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主反応、造血障害などの免疫異常を治療または予防する方法を提供する。また、上記免疫抑制剤を自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主反応、造血障害などの免疫異常の治療剤または予防剤を製造することに用いる用途を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
活性化されたＣＤ８＋ＣＤ１２２−キラーＴ細胞サブセットが、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞に比して圧倒的に多くなり、ＣＤ８＋細胞内のアンバランスが生じると免疫応答の異常が生じる。ここにＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞及びこの細胞を活性化させる免疫抑制剤を投与することにより、この異常が解消されることが明らかとなった。
こうして、本発明は、ＣＤ８＋ＣＤ１２２−キラーＴ細胞が何らかの原因によって過度に活性化された結果としての免疫異常、すなわち種々の自己免疫疾患、移植拒絶反応、移植片対宿主反応、造血障害などに対して、その異常の要因であるＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の量的あるいは活性の不足を解消し、もって該免疫異常を治療または予防することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明者は、分離したＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の免疫抑制活性がＩＬ−１０を介して発揮されることを明らかにした。このため、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞から発現されるＩＬ−１０を指標として、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を活性化する薬剤を探索することが出来る。そのような薬剤としては、例えばペオニフロリンが例示される。この薬剤とＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞とを同時に用いることにより、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の免疫抑制活性を増強させることができる。また、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の活性は、主としてＩＬ−１０を介して行われることが分かった。このため、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を分離した後、このサブセットから発現されるＩＬ−１０の増加を確認することにより、そのような薬剤を見出すことができる。
【００１２】
こうして、本発明は、（１）ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞からのＩＬ−１０の発現量を指標として、その活性を向上させる薬剤を探索する方法、（２）ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の免疫抑制活性を増強させる免疫抑制剤、および（３）ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞と上記免疫抑制剤とを併用する自己免疫疾患等の治療方法などを提供するものである。
上記免疫抑制剤を個体に投与することによって、ＣＤ８＋キラーＴ細胞の活性を抑制し、その結果個体に障害を引き起こしていた免疫応答反応を特異的に抑制することができる。
【００１３】
ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を増殖させる方法としては、ＮＯＧマウスなどの免疫不全マウスに分離した該細胞を養子移入する方法も取り得る。ＮＯＧマウスを用いた実験においては、このマウスに移入したヒトのＣＤ８＋Ｔ細胞が７〜８週後に１０倍以上に増えることが確認されている。このマウスの脾臓からは、ヒトのＣＤ８＋細胞を抗ヒトＣＤ８抗体を用いたセルソーティングによって分離できる。
【００１４】
発症の予測がなされずに自己免疫疾患を発症した場合であっても、発症個体の自己血を採取し、上記と同様にＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を分離して増殖させ、このＴ細胞サブセット及びＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の免疫抑制活性を増強させる免疫抑制剤を元の個体に投与することによって、自己の組織に対する障害反応を鎮静化させることができる。
【００１５】
ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の免疫抑制活性は、主としてＩＬ−１０を介して行われる。このため、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞からのＩＬ−１０の発現量を増加させる物質をスクリーニングすることにより、免疫抑制剤を選択することができる。具体的には、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞を個体から分離し、培養を行う際に、候補物質を添加することにより、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞からのＩＬ−１０の発現量が増加するか否かを指標として、免疫抑制剤をスクリーニングし、選択することができる。この方法によって見出される免疫抑制剤としては、例えばグリチルリチン、ペオニフロリンが例示されるが、本発明はこれらによって限定されない。従来より、抗炎症剤として知られている物質は、上記候補物質の大きなカテゴリーであるが、必ずしも全ての抗炎症剤が、本発明の免疫抑制剤となるわけではない。もちろん、候補物質としては、抗炎症剤に限られず、新規な化学物質も含まれる。
＜実施例１＞
【００１６】
マウス脾細胞からＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞とＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞をセルソーターによって分離した。２種類の細胞について、共培養（ＣＤ１２２−細胞＋ＣＤ１２２＋細胞）、またはＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞の単独培養（ＣＤ１２２−細胞のみ）を行った。ＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞は培養前にＣＦＳＥ（5− or 6 − (N−Succinimidyloxycarbonyl) − 3',6' − O,O' − diacetylfluorescein)で標識し、抗ＣＤ３抗体で４８時間の刺激を行った後の細胞分裂状況をＣＦＳＥの蛍光減弱によって測定した。培養中に何も添加しない細胞(−)、コントロールとしてＩｇＧ抗体(ＩｇＧ)を添加した細胞、抗ＩＬ−１０抗体(αＩＬ−１０)を添加した細胞、および抗ＴＧＦ−β抗体(αＴＧＦ−β）を添加した細胞をそれぞれ培養した。
【００１７】
結果を図１に示した。図中の各パネル内には、分裂増殖してＣＦＳＥの蛍光が減弱した細胞の割合を示した。ＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞とＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞とを共培養したときには、ＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞の増殖が抑制された。この増殖抑制効果は、抗ＩＬ−１０抗体を入れた時には、阻害されることがわかった。このことから、ＩＬ−１０がＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞の主たる効果伝達物質であることが示された。
＜実施例２＞
【００１８】
マウス脾細胞からＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞とＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞をセルソーターによって分離した。２種類の細胞について、共培養（ＣＤ１２２−細胞＋ＣＤ１２２＋細胞）またはＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞の単独培養（ＣＤ１２２−細胞のみ）を行った。培養中に何も添加しない細胞(−)、コントロールとしてＩｇＧ抗体(ＩｇＧ)を添加した細胞、抗ＩＬ−１０抗体(αＩＬ−１０)を添加した細胞、および抗ＴＧＦ−β抗体(αＴＧＦ−β）を添加した細胞をそれぞれ培養した。培養後にＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞からのＩＦＮ−γ産生を細胞内サイトカイン染色法によって染色して解析した。
【００１９】
結果を図２に示した。図中の各パネル内には、ＩＦＮ−γを産生する細胞の割合を示した。ＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞とＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞とを共培養したときには、ＩＦＮ−γ産生の抑制が確認された。この抑制効果は、抗ＩＬ−１０抗体を入れた時には、阻害されることがわかった。このことから、サイトカイン産生抑制効果においても、ＩＬ−１０がＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞の主たる効果伝達物質であることが示された。
＜実施例３＞
【００２０】
次に、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞からＩＬ−１０が産生されていることを確認する試験を行った。
まず、ＲＴ−ＰＣＲ法によるＩＬ−１０転写産物の検出を行った。マウスの脾細胞からＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞(＋)とＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞(−)をセルソーターによって分離し、それぞれを抗ＣＤ３抗体刺激下に４８時間培養した。培養後にそれぞれの細胞からＲＮＡを抽出し、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、およびＬＴ−αのサイトカイン遺伝子産物を増幅するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。なお、コントロールとして、β−ａｃｔｉｎの発現をＲＴ−ＰＣＲによって確認した。また、ＩＬ−１０に関しては、ＩＬ−１０遺伝子の転写産物であることを確認するために、ＩＬ−１０のプローブを用いてＲＴ−ＰＣＲ解析サンプルに対してサザン解析を行った。
【００２１】
結果を図３に示した。ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＬＴ−αについては、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞(＋)とＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞(−)とで同程度に発現していることが分かった。但し、ＩＬ−１０は、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞のみに発現していることが分かった。
＜実施例４＞
【００２２】
次いで、ＩＬ−１０の発現を細胞内サイトカイン染色によって調べた。マウスの脾細胞からＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞(＋)とＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞(−)をセルソーターによって分離し、それぞれを抗ＣＤ３抗体刺激下に４８時間培養した後に、細胞内サイトカイン染色を行った。
結果を図４に示した。それぞれの細胞から各パネル内には、ＩＬ−１０を産生する細胞の割合を示した。ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞(ＣＤ１２２＋)では、ＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞(ＣＤ１２２−)よりも多くの細胞が、ＩＬ−１０産生細胞となっていることがわかった。
＜実施例５＞
【００２３】
マウス脾細胞からＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞とＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞をセルソーターによって分離した。２種類の細胞について、共培養（ＣＤ１２２−細胞＋ＣＤ１２２＋細胞）、またはＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞の単独培養（ＣＤ１２２−細胞のみ）を行った。ＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞のみを培養前にＣＦＳＥで標識し、４８時間抗ＣＤ３抗体で刺激した後の細胞分裂状況をＣＦＳＥの蛍光減弱によって測定した。培養液中には、ペオニフロリン（ＰＦ）を、無添加（−）、或いは１００μｇ／ｍＬの濃度で添加して培養を行った。
【００２４】
結果を図５に示した。図中の各パネル内には、分裂増殖してＣＦＳＥの蛍光が減弱した細胞の割合を示した。１００μｇ／ｍＬのＰＦを添加した場合には、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞と共培養したＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞の増殖がより強く抑制されることがわかった。こうして、ＰＦは、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞が有するＣＤ８＋ＣＤ１２２−の細胞増殖抑制作用を増強することがわかった。
また、同様の試験をグリチルリチンについて行ったところ、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞が有するＣＤ８＋ＣＤ１２２−の細胞増殖抑制作用を増強することがわかった。
＜実施例６＞
【００２５】
実施例１２において、ＰＦの添加濃度を７０μｇ／ｍＬとした以外は、同様の操作を行った。
結果を図６に示した。その結果、７０μｇ／ｍＬのＰＦを添加した場合には、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞と共培養したＣＤ８＋ＣＤ１２２−細胞の増殖がより強く抑制されることがわかった。
＜実施例７＞
【００２６】
マウスの脾細胞からＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞をセルソーターによって分離し、抗ＣＤ３抗体刺激下に４８時間培養した。培養液中には、ＰＦをそれぞれ０、１００、２００、および３００μｇ／ｍＬ添加した。培養後にＩＬ−１０の発現を細胞内サイトカイン染色によって調べた。
結果を図７に示した。図中の各パネル内には、ＩＬ−１０を産生する細胞の割合を示した。ＰＦの濃度依存的にＣＤ８＋ＣＤ１２２＋細胞からのＩＬ−１０産生が促進されていることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の効果を担う物質を特定するための試験結果を示すグラフである。グラフ中の記号は、（−）：抗体の添加なし、ＩｇＧ：ＩｇＧ抗体を添加、αＩＬ−１０：抗ＩＬ−１０抗体を添加、αＴＧＦ−β：抗ＴＧＦ−β抗体を添加したものを示している。
【図２】ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の効果を担う物質を特定するための試験結果を示すグラフである。グラフ中の記号は、図１０と同じである。
【図３】ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の効果を担う物質を特定するための試験結果を示した写真図である。ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞（＋）と、ＣＤ８＋ＣＤ１２２−Ｔ細胞（−）とにおいて、各種サイトカインの発現の有無を比較した。
【図４】ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞とＣＤ８＋ＣＤ１２２−Ｔ細胞とにおいて、ＩＬ−１０を産生する細胞の割合を比較したグラフである。
【図５】１００μｇ／ｍＬのペオニフロリン（ＰＦ）が、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の効果を増強することを確認するための試験結果を示した図である。
【図６】７０μｇ／ｍＬのＰＦが、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞の効果を増強することを確認するための試験結果を示した図である。
【図７】ＰＦの添加により、ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞からのＩＬ−１０産生作用が増強することを確認するための試験結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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