(57)【要約】      （修正有）【課題】ブタＴＳＨ(Thyroid-stimulating hormone)レセプターをコードするＤＮＡ断片およびその用途を提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列をコードする塩基配列、他の特定の塩基配列、またはこれらの配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された配列、あるいはこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつブタ由来ＴＳＨレセプターをコードするＤＮＡ断片。  さらに、上記いずれかのＤＮＡ断片をプラスミドもしくはファージに挿入して調製した発現ベクター、及び当該発現ベクターを用い、宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養して得られる組換えブタＴＳＨレセプターおよびその製造法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示される塩基配列を有するブタＴＳＨ（Thyroid-stimulating hormone）レセプターをコードするＤＮＡ断片を用いて調製した配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する組換えブタＴＳＨレセプター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブタＴＳＨ(Thyroid-stimulating hormone)レセプターをコードするＤＮＡ断片およびその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺刺激ホルモンレセプター（Thyroid-Stimulating Hormone Receptor;以下ＴＳＨレセプターとする）は甲状腺細胞膜上に存在する甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の受容体である。甲状腺の代表的な疾患であるグレーブス(Graves)病〔バセドウ(Basedow)病〕は、甲状腺機能が亢進する疾患であり、ＴＳＨレセプターに対する自己抗体が原因となって発症するとされている。
【０００３】
ＴＳＨレセプターに対する自己抗体には、ＴＳＨレセプターに結合して甲状腺刺激活性を示す抗体（甲状腺刺激抗体）とＴＳＨレセプターに結合してＴＳＨのＴＳＨレセプターに対する刺激活性を妨げる抗体（甲状腺刺激阻害抗体）の少なくとも２種類の異なった活性を持つ抗体が存在していることが知られている。
ＴＳＨレセプターに対する自己抗体の測定は、グレーブス病の診断、病勢把握、病因解析などに利用されており、測定原理により大きく２つに分類することができる。
【０００４】
すなわち、１つの方法は、可溶化ブタ甲状腺細胞膜画分に患者血清とアイソトープ標識したＴＳＨを加えて反応させ、被検血清中のＴＳＨレセプター自己抗体による標識化ＴＳＨのＴＳＨレセプターへの結合阻害率をＴＳＨレセプター自己抗体値として測定する方法（非特許文献１）である。
【０００５】
また、他の方法は、ポリエチレングリコール処理により分画した被検血清を測定サンプルとし、これをブタ甲状腺細胞に反応させると、サンプル中の甲状腺刺激抗体（ＴＳＡｂ）がブタ甲状腺細胞膜上のＴＳＨレセプターに結合して細胞中のアデニレートシクラーゼが活性化されてｃＡＭＰが産生されるので、被検血清とコントロール血清におけるｃＡＭＰ産生量の比率からＴＳＡｂ活性を算出する方法（非特許文献２）である。
【非特許文献１】Methods in Enzymology，74，405〜420(1981)、Endocr.Rev.,9,106-120,(1988)
【非特許文献２】Endoclin.Vol.125,No.1,pp410-(1985)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記の方法で使用するブタ由来の甲状腺細胞あるいはその膜画分の調製は必ずしも簡便とはいえなかった。たとえば、屠殺したブタより甲状腺組織を取得し、さらに組織をコラゲナーゼおよびトリプシン処理により細胞を個々に分離させた後に凍結させて保存し、これを解凍させてアッセイに用いていた。また、細胞調製に用いるブタの個体差、処理操作時の状況、保存状態等により細胞のロット間に差が生じる可能性も否定できなかった。
【０００７】
このため、組換えＴＳＨレセプターを用いることができれば、ＴＳＨレセプターに対する自己抗体測定のための試薬あるいはキットの調製が簡便になり、ロット差を生じる危険性も小さくできることが期待される。特に、ヒトやイヌ等由来の組換えＴＳＨレセプターを使用するよりも、ブタ由来の組換えＴＳＨレセプターを使用した方が、従来法による測定値との解離が少ないと考えられるため、組換えＴＳＨレセプターとしてはブタ由来のものを使用するのが好ましいと考えられていた。
【０００８】
しかしながら、ヒトやイヌなどのＴＳＨレセプター遺伝子に関する報告および当該遺伝子を含むウイルスを用いてＣＨＯ細胞やミエローマ細胞を形質転換し、これら細胞を培養することでヒトＴＳＨレセプターなどを生産する試みは報告されているものの（特表平４−５０６７５２、特表平５−５０４６８３など）、ブタ由来のＴＳＨレセプターに関しては、当該レセプターをコードする遺伝子の解析はもとより、そのアミノ酸配列さえ報告されていないのが現状である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで本発明者は、ブタ甲状腺細胞由来のＴＳＨレセプターをコードする遺伝子をクローニングすべく、ウシ、ヒツジ、ヒト、マウス、ラット由来の甲状腺ＴＳＨレセプター遺伝子配列をもとにプライマーを作製し、ブタ甲状腺細胞のＲＮＡを鋳型にして合成したｃＤＮＡをスクリーニングした結果、アミノ酸７６４個、分子量８６，６４１のタンパク質をコードする遺伝子を見出し、当該遺伝子の塩基配列は、公知の動物由来のＴＳＨレセプター遺伝子と類似していることを確認した。
さらに、この遺伝子を発現させ、その機能を確認した結果、当該遺伝子はブタＴＳＨレセプターをコードする遺伝子であることを確認し、得られた組換えブタＴＳＨレセプターがＴＳＨレセプターに対する自己抗体の測定に使用できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
したがって、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列、または配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなるブタＴＳＨレセプターをコードするＤＮＡ断片に関するものである。
【００１１】
また、本発明は、配列番号２で示される塩基配列、または配列番号２で示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列を有し、あるいはこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつブタ由来ＴＳＨレセプターをコードするＤＮＡ断片に関するものである。
【００１２】
さらに、本発明は、上記いずれかのＤＮＡ断片をプラスミドもしくはファージに挿入して調製した発現ベクター、及び当該発現ベクターを用い、宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養して得られる組換えブタＴＳＨレセプターおよびその製造法に関するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明者によって、初めてブタ由来ＴＳＨレセプターをコードするＤＮＡ断片を特定することができ、このようなＤＮＡ断片を用いて調製した組換えビタＴＳＨレセプターは、抗ＴＳＨレセプター抗体測定に有用である。
特に、通常のブタ甲状腺細胞を用いた従来法と比較すると、組換えビタＴＳＨレセプターを用いた方がｃＡＭＰの産生量が高く、より高感度に測定可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるブタＴＳＨレセプターをコードするＤＮＡ断片に関するものである。
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるレセプターは、ＴＳＨレセプター活性を維持する限りにおいて、配列番号１で示されるアミノ酸配列に限定されるものではなく、配列番号１に示されるアミノ酸配列における１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾または付加されたアミノ酸配列であってもかまわない。
【００１５】
本発明のＤＮＡ断片を塩基配列をもって例示すれば、配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を挙げることができる。
配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片は、後述の実施例に詳述するように、ブタ甲状腺細胞のＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡから調製されたものであって、図１−１〜図１−２の塩基番号５４〜２３４５番目で示される配列と同一のものであり、ＴＳＨレセプターの構造遺伝子に相当する。
【００１６】
本発明においては、ブタＴＳＨレセプターを産生することができる限りにおいて、配列番号２で示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたＤＮＡ断片、またはそれらのＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片も利用することができる。なお、ここでいうストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶解させたもの）、０．１％ｗ／ｖ Ｎ−ラウロイルザルコシン・ナトリウム塩、０．０２％ ｗ／ｖ ＳＤＳ、０．５％ ｗ／ｖブロッキング試薬を含む溶液を用い、６０℃で２０時間程度ハイブリダイゼーション反応を行ったときにハイブリダイズすることを意味する。
【００１７】
本発明のＤＮＡ断片の調製、すなわち、動物組織より抽出・精製したＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡからの目的遺伝子のクローニング、クローン化したＤＮＡ断片を用いた発現ベクターの調製、および発現ベクターを用いた組換えＴＳＨレセプターの生産などは、分子生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、具体的には、例えば、「Molecular Cloning」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor、New York(1982））に記載の方法に従って行うことができる。
【００１８】
例えば、まず、既にクローニングされている類似の遺伝子の配列を参考にプライマーを合成する。具体的には、ウシ、ヒツジ、ヒト等のＴＳＨレセプター遺伝子は既にクローニングされているので（Biochemical and Biophysical Research Communications,165,1184(1984)等を参照）、それらの配列をそのまま用いてプライマーを合成しても良いし、公知動物のＴＳＨレセプター遺伝子どうしを比較し、共通部分の塩基配列を用いてプライマーを合成してもよい。
【００１９】
次に、合成したプライマーをプローブとして、ブタ甲状腺細胞から抽出したＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡ（もしくはｃＤＮＡから公知の方法で作製されたｃＤＮＡライブラリー）よりＴＳＨレセプターをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片をクローニングする。クローニングの方法としては、公知の方法、例えば、アミノ酸配列にもとづいて化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いたプラークまたはコロニーハイブリダイゼーション法〔Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory,(1982)〕等が挙げられる。
【００２０】
このようにして得られたＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えばMaxam-Gilbert法（Pro. Natl. Acad.Sci., U.S.A. 74,560(1977)）、ジデオキシ法（Nucl. Acids. Res.,9,309(1981)）、あるいはデアザ法（Nucl. Acids. Res.,14,1319(1986)）などによって決定する。
【００２１】
決定した塩基配列もしくはそこから推定されるアミノ酸配列を、公知の動物由来ＴＳＨレセプターのそれと比較することにより、ブタ由来のＴＳＨレセプターをコードするＤＮＡ断片の存在を確認する。上述の方法を繰り返し行うことにより、ブタＴＳＨレセプター遺伝子の塩基配列を決定する。
【００２２】
遺伝子の両端、つまり５’周辺、Ｎ末端、Ｃ末端あるいは３’周辺の領域はＰＣＲのプライマーの設定が困難なため、上述の方法では塩基配列が決定できない場合が多い。そのような場合には、これらの領域の配列は、５’ＲＡＣＥ法及び３’ＲＡＣＥ法（宝酒造（株）製の3'-Full RACE Core Set及び5'-Full RACE Core Set等）を用いることにより決定することができる。
【００２３】
ＴＳＨレセプターの調製は、プロモーター等を保有する公知のプラスミドもしくはファージに、上記クローン化したＴＳＨレセプター遺伝子を挿入して発現ベクターを調製し、該発現ベクターを用いて形質転換した細胞（CHO、COSなどの哺乳類由来細胞もしくはSf9、Sf21等の昆虫細胞等）を自体公知の方法に従って培養し、ＴＳＨレセプターを産生させる方法をあげることができる（例えば、Biochemical and Biophysical Research Communications Vol.165,No.3,1250-1255(1989)、特表平４−５０６７５２、J.Immunol.158,2798-2804(1997)などを参考）。
【００２４】
調製した培養物から、膜分離あるいは遠心分離処理などによりＴＳＨレセプターが産生した細胞を回収する。回収した細胞はそのまま抗ＴＳＨレセプター抗体の測定に使用することもでき、また、超音波処理等により細胞を破砕し、遠心分離、ゲルろ過等を行い種々の夾雑物を分離後、熱処理、硫安塩析処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理等を数種組み合わせて単離精製し、該測定に使用することもできる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本願発明が実施例に限定されないことは明らかである。
【００２６】
実施例１：ブタＴＳＨレセプター遺伝子の塩基配列の決定
（１）プライマー
図２−１〜図２−３に示すように、既にクローン化されているヒト、ウシ、ヒツジ、イヌ、マウス及びラットのＴＳＨレセプター遺伝子の塩基配列を比較して、２０〜３０塩基の範囲において５種類の動物でほぼ１００％保存されている領域を選び、５’プライマーを３種類、３’プライマーを３種類、合計６種類のプライマーを合成した。５’プライマーにはプライマー番号として奇数を、３’プライマーには偶数を用いた。また、対応箇所として、各プライマーがヒトＴＳＨレセプター遺伝子のどの箇所に対応しているかを、開始コドンＡＴＧのＡを＋１として表した。
【００２７】
プライマー１：5'-GACTTCAGAGTCACCTGCAAGG -3'
（22塩基、対応箇所+106〜+127、GC含量54.5%）
プライマー２：5'-CAGATGCCAAACTTGCTGAG -3'
（20塩基、対応箇所+2074〜+2093、GC含量50.0%）
プライマー3：5' -ATGGGCTACAAGTTCCTGAG -3'
（20塩基、対応箇所+1234〜+1253、GC含量50.0%）
プライマー4：5'-GCCAGTCGATGGCATGGTTGT -3'
（21塩基、対応箇所+1445〜+1465、GC含量57.1%）
プライマー5：5'-CTGGATGCTGTTTACCTGAAC -3'
（21塩基、対応箇所+604〜+624、GC含量47.6%）
プライマー6：5'-GGATTCCTCTGATTTTCTTCTG -3'
（22塩基、対応箇所+865〜+886、GC含量40.9%）
【００２８】
（２）ブタ甲状腺細胞からのＲＮＡの調製
ブタ甲状腺組織をコラゲナーゼおよびトリプシン等のプロテアーゼで処理して個々の細胞に分散させた。約６ｇのブタ甲状腺細胞を初発材料として、ＡＧＰＣ法（実験医学（羊土社）Vol.9 No.15 p99(1991)、バイオ実験イラストレイテッド（秀潤社）第2巻 p161）によってＲＮＡを調製した。この結果、１．７５ｍｇの全ＲＮＡが得られた。さらにOligotex-dT30（宝酒造（株）製）を用いてこの全ＲＮＡよりｍＲＮＡを精製した。この結果、約４０ｍｇのｍＲＮＡが得られ、ＯＤ260／ＯＤ280値は１．７５８であった。
【００２９】
（３）ＰＣＲ
ＲＮＡ  ＬＡ  ＰＣＲTMＫｉｔ  （ＡＭＶ）  ｖｅｒ．１．１（宝酒造（株）製）を用いて、ブタ甲状腺細胞より調製した全ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成した。逆転写反応のプライマーはOligo dT-Adaptor primer（キットに添付）を、酵素はAvian Myeloblastosis Virus由来のRiverse transcriptaseを使用し、反応は５５℃、３０分間行った。
【００３０】
次に、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、前述のプライマーを、No.1とNo.6、No.3とNo.2、No.5とNo.4をペアにしてＰＣＲを行った。ＰＣＲによる遺伝子の増幅は、熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、１分）、伸長反応（７２℃、１分）のステップを５０回繰り返すことにより行った。
【００３１】
ヒトＴＳＨレセプター遺伝子の塩基配列から計算すると、プライマー１とプライマー６の場合は７８１塩基、プライマー３とプライマー２の場合は８６４塩基、プライマー５とプライマー４の場合は８６２塩基の大きさの断片が増幅されることが予想される。ＰＣＲで増幅された３つのＤＮＡ断片を各々アガロース電気泳動を行ったところ、予想と一致する大きさのＤＮＡ断片が検出された。それぞれのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動により分離し、その断片を含む箇所をＤＮＡＣＥＬＬ（第一化学薬品製）を用いて回収・精製した。精製したＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、対応するアミノ酸配列を推定し、他の動物由来の塩基配列およびアミノ酸配列と比較したところ、良く似ていることが示された。そこで、得られた塩基配列をもとに、さらに下記のプライマーを合成して上記と同様にＰＣＲを行い、ＴＳＨレセプター構造遺伝子のほぼ全領域の塩基配列を決定した。
【００３２】
プライマー9  5'-CACTGACTTCATGTGCATGGC-3'
(21塩基、対応箇所+1893〜+1913、52.4%)
プライマー10 5'-GGACTGTGATTCCAGCTGCTG-3'
(21塩基、対応箇所+268〜+288、57.1%)
プライマー11 5'-GACATCAATCCCTGCGAATGC-3'
(21塩基、対応箇所+492〜+512、52.4%)
プライマー13 5'-GTGAATGCTGTAAATGGTCCC-3'
(21塩基、対応箇所+943〜+963、47.6%)
プライマー15 5'-ACGCCTACGCCATCATGGCTG-3'
(21塩基、対応箇所+1610〜+1630、61.9%)
プライマー16 5'-AACAGCATCCAGCTTTGTCCC-3'
(21塩基、対応箇所+595〜+615、52.4%)
プライマー18 5'-GTCGTAATGGCTGTCAAAGGC-3'
(21塩基、対応箇所+1138〜+1158、52.4%)
プライマー20 5'-AGAGGAGTCTCAGTGTCCATG-3'
(21塩基、対応箇所+1713〜+1733、52.4%)
【００３３】
（４）Ｃ末端及び３’周辺領域の塩基配列の決定
構造遺伝子の両側にあたる５’および３’周辺領域に関しては、比較した動物間でアミノ酸をコードしている領域とは異なっていた。得られた構造遺伝子の塩基配列が比較的ヒト、マウス、ラットに比べてウシやヒツジに近い傾向が観察されたため、ウシもしくはヒツジの塩基配列をもとに、３’周辺領域に対応するプライマーの設定を行った。
【００３４】
プライマー12  5'-CAGCCTAAGTCCTTGTACCACTTA-3'
（24塩基、GC含量45.8%）
プライマー14  5'-GTGTCGATGGTTGGAATGATGCTC-3'
(24塩基、GC含量50.0%)
上記の２つの３’プライマーを上記のプライマー９およびプライマー１５と組み合わせてＰＣＲを行ったところ、プライマー１４を用いた時に予想される大きさのＤＮＡ断片の増幅が観察された。プライマー９とプライマー１４を用いて得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、得られたブタＴＳＨレセプター遺伝子のＣ末端領域の塩基配列と一致する箇所が存在し、該遺伝子由来であることが示された。これにより、Ｃ末端領域およびその下流の塩基配列が明らかになった。
【００３５】
（５）Ｎ末端領域および５’周辺領域の塩基配列の決定
３’周辺領域の塩基配列を決定した時と同様に、ウシもしくはヒツジ由来の塩基配列を参考にして５’周辺領域に３種類の５’プライマーを設定した。
【００３６】
プライマー7  5'-ATCGCCGAGCACGCAGAGGTAG-3'
(22塩基、GC含量63.6%)
プライマー17 5'-ATGAGAGGGAGGCGATC-3'
(17塩基、GC含量58.8%)
プライマー19 5'-GGGCCCGGAGGACGATG-3'
(17塩基、GC含量76.5%)
【００３７】
ｃＤＮＡを鋳型として上記プライマーを５’プライマーとして、これに対する３’プライマーとしてプライマー１０および１６を用いてＰＣＲを行ったが、明確に増幅されるＤＮＡ断片は検出されなかったため、cDNA PCR Library KitおよびcDNA Synthesis kit（いずれも宝酒造（株）製）を用いてcDNA PCR Libraryの作製を行った。
作製したブタ甲状腺細胞由来cDNA PCR Libraryを鋳型として、５’プライマーとしてＣＡプライマー（cDNA PCR Library Kitに添付）を、３’プライマーとしてプライマー２０を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液をアガロース電気泳動に供し、ゲルより約１５００塩基以上のＤＮＡ断片を回収・精製した。
【００３８】
この調製したＤＮＡを鋳型として、さらにＣＡプライマーおよびプライマー１６を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を鋳型として、ＣＡプライマーとプライマー１０を用いてＰＣＲを行ったところ、ほぼ予想される大きさのＤＮＡ断片の増幅が観察された。ＤＮＡ断片を回収・精製し、塩基配列を決定したところ、既に明らかになっているプライマー１０より上流の塩基配列が検出され、この断片がＴＳＨレセプター遺伝子由来であることが示された。これにより、ＴＳＨレセプター遺伝子のＮ末端領域とＡＴＧ開始コドンより５３塩基上流までの塩基配列が明らかになった。
【００３９】
実施例２：ブタＴＳＨレセプター遺伝子のクローニング
上記で明らかになった塩基配列をもとに、５’周辺領域に対応する５’プライマーであるプライマー２１と、３’周辺領域に対応する３’プライマーであるプライマー２２を設計・合成した。
【００４０】
プライマー21 5'-GCTGAAGATGAAGAGATAGCC-3'
(21塩基、対応箇所-18〜-38、GC含量47.6%)
プライマー22 5'-CTAAGACACCAGCCTAAGTCC-3'
(21塩基、対応箇所+2312〜+2332、GC含量52.4%)
【００４１】
ブタ甲状腺細胞より調製したｍＲＮＡを鋳型として、Oligo dT-アダプター プライマー（cDNA PCR Library Kitに添付）、Avian Myeloblastosis Virus由来のRiverse transcriptaseを用いてｃＤＮＡを合成した。さらにこのｃＤＮＡを鋳型として、プライマー２１及びプライマー２２を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、熱変性（９８℃、１０秒）、アニーリング（５５℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、２分）のステップを２５回繰り返すことにより行った。増幅したＴＳＨレセプター遺伝子（ｃＤＮＡ）はアガロース電気泳動により分離し、回収・精製した。
【００４２】
精製したＴＳＨレセプター遺伝子断片を、パーフェクトリー ブラント クローニング キット（Novagen社製、宝酒造（株）販売）を用いてプラスミドへクローン化した。得られたＴＳＨレセプター遺伝子の塩基配列は、上記で決定された塩基配列と同一であり、変異は起こっていなかった。
【００４３】
実施例３：組換えブタＴＳＨレセプターの調製
（１）クローン化したブタＴＳＨレセプター遺伝子（ｃＤＮＡ）のｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔへの組み込み
クローン化したブタ甲状腺組織由来のＴＳＨレセプターｃＤＮＡを鋳型とし、下に示したプライマー２３（ＴＳＲ３７）とプライマー２４（ＴＳＲ２２）を用いて常法に従いＰＣＲを行った。
プライマー２３  5'-GCC CGG CCA CCA TGG GTC TGA CGC CC-3'
プライマー２４  5'-CTA AGA CAC CAG CCT AAG TCC-3'
【００４４】
増幅されたＰＣＲ断片をＴＳＨＲ３７／２２と名付けた。ＴＳＨＲ３７／２２は、アガロース電気泳動を行って同ＤＮＡ断片を分離・切り出した後にＤＮＡＣＥＬＬにより回収・精製した。得られたＴＳＨＲ３７／２２をｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ  （ストラタジーン社）を用いて、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔへクローン化し、得られたプラスミドをｐＣＭＶ：ｐＴＳＨＲと名付けた。なお、クローニングの方法はキットに付随している説明書にしたがって行った。
【００４５】
（２）ｐＣＭＶ：ｐＴＳＨＲのＣＨＯ−Ｋ１細胞へのトランスフェクション及びＧ−４１８耐性株の単離
リポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）を用いてｐＣＭＶ：ｐＴＳＨＲ  ＤＮＡをＣＨＯ−Ｋ１細胞（第日本製薬）へ導入した。トランスフェクション方法はリポフェクトアミンに付随している説明書にしたがって行った。
トランスフェクション操作後、処理した細胞を４８時間Ｈａｍ'ｓＦ−１２培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）で培養した。トリプシン処理によってＣＨＯ細胞をプレートから剥がした後、１０分の１量の細胞を新たにＧ−４１８（ゲンタマイシン誘導体、１６０ｍｇ／Ｌ）を添加した培地に植え継ぎ培養を行った。
【００４６】
２〜３日ごとに培地を交換し、死滅した細胞を除き、Ｇ−４１８存在下で生育する細胞の培養を続けた。ある程度Ｇ−４１８を含む培地で細胞が生育したら、トリプシン処理によってトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を剥がし、細胞数を計測した。細胞濃度に応じてＧ−４１８添加培地で段階的に希釈を行い、それぞれの希釈液を９６ｗｅｌｌプレートで培養した。さらに２〜３日後に顕微鏡で観察し、１つのｗｅｌｌに１個のコロニーしかないものを探し、１１株ほど単離した。この単離した１１株を培養し、ある程度ｗｅｌｌの底面に覆うように生育した段階で、トリプシン処理によって剥がして直径１００ｍｍのプレートに植え継ぎ培養を続けた。
【００４７】
（３）ｐＣＭＶ：ｐＴＳＨＲを導入されたＣＨＯ細胞（トランスフェクタント）の探索
単離した１１個のＧ−４１８耐性ＣＨＯ細胞株を直径２２ｍｍのｗｅｌｌに２５，０００個／ｗｅｌｌになるようにそれぞれを植え継いで培養した。３日間培養後、培地を除去し、各ｗｅｌｌに０．５ｍｌの下記組成のＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（以下、単にＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒという）を添加した。さらに５μｌのＩ125ラベルしたウシ由来ＴＳＨ（以後Ｉ125−ｂＴＳＨと表記）を添加して３７℃で２時間インキュベーションした。
【００４８】
インキュベーション後、培地を除去し、さらに０．５ｍｌの氷冷したＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した。洗浄後に各ｗｅｌｌに０．５ｍｌのＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｎ  ＮａＯＨ，１％ＳＤＳ、以下、単にＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒという）を加えて底面に付着している細胞を可溶化した。可溶化した細胞を試験管に回収後、さらにｗｅｌｌに０．５ｍｌの氷冷したＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを加えて洗浄した。可溶化細胞液とこの洗浄液を合わせてγ−カウンターでＴＳＨレセプターに結合したＩ125−ｂＴＳＨ量を計測した。なお、コントロールとしてｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔをトランスフェクトした細胞４株も同様に培養・検討を行った。この結果を下記表１に示す。
【００４９】
表１から明らかなように、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡをトランスフェクションした４株の結合量（ｃｐｍ）が基準値（ｂａｓａｌ  ｌｅｖｅｌ）と考えられるため、これよりも明らかに高い結合量を示すｐＣＭＶ：ｐＴＳＨＲトランスフェクタント  Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．７、Ｎｏ．８、Ｎｏ．９及びＮｏ．１１の計９株が、ＴＳＨレセプターを発現していることが示唆された。この中からより高い結合を示したＮｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６及びＮｏ．８株を選び、さらに検討した。
【００５０】
【表１】
2007314548.tif 000002
【００５１】
なお、表中、ＰｏｒｃｉｎｅはｐＣＭＶ：ｐＴＳＨＲを、ＳｃｒｉｐｔはｐＣＭＶ−ＳｃｒｉｐｔをそれぞれトランスフェクトしたＣＨＯ細胞株を示す。
【００５２】
Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒの組成（ｇ／Ｌ）
ＫＣｌ                            ０．４０
ＫＨ2ＰＯ4                      ０．０６
ＮａＨＣＯ3                      ０．３５
Ｎａ2ＨＰＯ4                    ０．０４８
Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ                １．００
Ｓｕｃｒｏｓｅ                  ９５．８４
Bovine Serum Albumin  （ＢＳＡ）  ２．５
【００５３】
（４）ＣＨＯ／ｐＣＭＶ：ｐＴＳＨＲトランスフェクタントの確認
ｐＣＭＶ：ｐＴＳＨＲトランスフェクタント  Ｎｏ．３、Ｎｏ．５、Ｎｏ．６、Ｎｏ．８の計４株（以後、それぞれＰ３、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ８と表記）とコントロールとしてｐＣＭＶ−ＳｃｒｉｐｔトランスフェクタントＮｏ．１と２株（以後、Ｃ１、Ｃ２と表記）を用いて、Ｉ125−ｂＴＳＨとの結合およびアイソトープで修飾されていないｂＴＳＨ（ｃｏｌｄ  ｂＴＳＨ）添加によるＩ125−ｂＴＳＨ結合阻害効果の検討を行った。
【００５４】
すなわち、直径１００ｍｍのプレートへ５×１０5ｃｅｌｌｓ／プレートになるように各トランスフェクタントを植え継いだ。３７℃で３日間ＣＯ2インキュベーターで培養した。培養後培地を除去し、４ｍｌの３７℃で保温していたＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに置換した。これに４０μｌのＩ125−ｂＴＳＨを添加して３７℃で２時間インキュベーションして結合を検討した。さらにこの他に２０μｌのｃｏｌｄＴＳＨ（５０ｍＩＵ／ｍｌ）添加によるＩ125−ｂＴＳＨの結合阻害も検討した。なお、何れの試験も２連で行った。また。コントロールのＣ１，Ｃ２株は結合のみ検討した。
【００５５】
インキュベーション後、培地を除去し、さらに２ｍｌの氷冷Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した。これに２ｍｌのＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを添加してプレート底面に付着している細胞を可溶化し回収した。さらに１ｍｌの氷冷Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。これら細胞可溶化液と洗浄液を合わせてγ−カウンターでＩ125量を計測し、その結果を下記表２に示す。なお、表２における（−）はｃｏｌｄ  ｂＴＳＨ無添加を、（＋）は添加を示している。したがって、（−）ではＩ125−ｂＴＳＨとの結合能を、（＋）ではｃｏｌｄ  ＴＳＨ添加による阻害効果を表している。
表２の結果から、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ６及びＰ８の各トランスフェクタントは、コントロールに比べて有意にＩ125−ｂＴＳＨとの結合能が高く、またその結合がｂＴＳＨの添加によって阻害されるため、トランスフェクションしたｐｏｒｃｉｎｅＴＳＨＲ遺伝子が発現していることが明らかとなった。
【００５６】
【表２】
2007314548.tif 000003
【００５７】
（５）リガンド（Ｉ125−ｂＴＳＨ）との結合能の検討
Ｐ６及びＣ１株を直径２２ｍｍのｗｅｌｌに２５，０００個／ｗｅｌｌになるようにそれぞれを植え継いで培養した。３日間培養後、培地を除去し、各ｗｅｌｌに０．５ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを添加した。さらに５段階（２、４、６、１０及び２０μｌ）にＩ125−ｂＴＳＨ量を分けて添加して３７℃で２時間インキュベーションした。
【００５８】
インキュベーション後培地を除去し、さらに０．５ｍｌの氷冷したＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した。洗浄後に各ｗｅｌｌに０．５ｍｌのＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを加えて底面に付着している細胞を可溶化した。可溶化した細胞を試験管に回収後、さらにｗｅｌｌに０．５ｍｌの氷冷したＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを加えて洗浄した。可溶化細胞液とこの洗浄液を合わせてγ−カウンターでＴＳＨレセプターに結合したＩ125−ｂＴＳＨ量を計測し、その結果を表３に示した。なお、何れの試験も２連で行った。
【００５９】
表３から明らかなように、Ｐ６の結合量は、添加Ｉ125−ｂＴＳＨ量が１０μｌ（＝約３０００ｃｐｍ）まで添加量に相関して上昇しており、添加リガンド量が約３０００と６０００でそれ程差が見られないことから、結合が飽和に達していることがわかる。これに対してＣ１の結合量は、添加リガンド量に関係せずほぼ一定であり、非特異的結合であることを示唆している。
【００６０】
【表３】
2007314548.tif 000004
【００６１】
（６）ｃｏｌｄ  ｂＴＳＨ添加によるリガンド（Ｉ125−ｂＴＳＨ）結合阻害効果の検討
Ｐ６及びＣ１株を直径２２ｍｍのｗｅｌｌに２５，０００個／ｗｅｌｌになるようにそれぞれを植え継いで培養した。３日間培養後、培地を除去し、各ｗｅｌｌに０．５ｍｌのＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを添加した。これらに１０μｌのＩ125−ｂＴＳＨ量を添加し、さらに添加ｃｏｌｄ  ｂＴＳＨ量を７段階に分けて添加し３７℃で２時間インキュベーションした。なお、添加ｃｏｌｄ  ｂＴＳＨ量は、各ｗｅｌｌあたり０、５、１５、５０、１５０、５００および１５００μＩＵであり、最終濃度としては０、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１．０及び３．０ｍＩＵ／ｍｌとなる。
【００６２】
インキュベーション後培地を除去し、さらに０．５ｍｌの氷冷したＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した。洗浄後に各ｗｅｌｌに０．５ｍｌのＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを加えて底面に付着している細胞を可溶化した。可溶化した細胞を試験管に回収後、さらにｗｅｌｌに０．５ｍｌの氷冷したＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを加えて洗浄した。可溶化細胞液とこの洗浄液を合わせてγ−カウンターでＴＳＨレセプターに結合したＩ125−ｂＴＳＨ量を計測し、その結果を表４に示した。なお、何れの試験も２連で検討した。
【００６３】
表４から明らかなように、コントロールＣ１のリガンド結合量がｃｏｌｄ  ｂＴＳＨ添加量に影響されず一定なのに対して、Ｐ６の方はｃｏｌｄ  ｂＴＳＨ添加濃度が高まるにつれて相対的にリガンド結合量が低下し、ほぼ１ｍＩＵ／ｍｌの濃度で１００％結合が阻害されている。したがって、Ｐ６のＩ125−ｂＴＳＨとの結合がｐＴＳＨレセプターを介した特異的な結合であることが示された。
【００６４】
【表４】
2007314548.tif 000005
【００６５】
（７）ｂＴＳＨ及びＴＳＡｂ刺激によるｃＡＭＰ産生能の検討
体外診断用医薬品ＴＳＡｂキット「ヤマサ」（ヤマサ醤油製）（以後、単にキットと表記する）を用いて測定した。測定方法はキットに付いている添付文書に従って行った。すなわち、Ｐ６及びＣ１株を直径１１ｍｍのｗｅｌｌに６，０００個／ｗｅｌｌになるようにそれぞれを植え継いで培養した。６日間培養して細胞がほぼｗｅｌｌ一杯になったら、培地を除去しさらにキットに付いている０．５ｍｌの細胞洗浄液で洗浄した。ｗｅｌｌに５０μｌの細胞洗浄液を添加した後にキットに付いている２００μｌの細胞活性判定液（ｂＴＳＨ  １００ｍＩＵ／ｍｌ）もしくはＴＳＡｂを含むヒト血清より調製したＩｇＧ分画サンプルを添加して撹拌した。
【００６６】
３７℃で４時間インキュベーション後，１０μｌの反応停止液を添加した。この反応液２５μｌをガラスチューブに移し、１００μｌのＩ125−ｃＡＭＰ液と１００μｌのｃＡＭＰ抗体液を添加して良く撹拌した。４℃で一晩インキュベーションした後に５００μｌのｃＡＭＰ第２抗体液を添加、撹拌した。４℃で３０分間インキュベーション後、１８６０〜１９７０ｇ、４℃、１５分間の条件で遠心した。アスピレーターで上清を吸引除去した後に沈殿のＩ125をγ−カウンターで測定した。なお、ＴＯＴＡＬ、ＮＳＢサンプルの調製及びｃＡＭＰ標準曲線の作成はキットの添付文書にしたがって行った。測定結果は、表５に示す。
【００６７】
表５から明らかなように、コントロールのＣ１ではｂＴＳＨやＩｇＧ画分で値が変わらないことから、刺激物質に反応していない事が示された。一方、Ｐ６は、ｂＴＳＨやＴＳＡｂに反応して、かなり高いｃＡＭＰを産生することから、本発明のＣＨＯ／ｐＴＳＨＲ（Ｐ６）細胞は、ＴＳＨと特異的に結合し、ＴＳＨとの結合およびＴＳＡｂによる刺激により、ｃＡＭＰ産生が起きることから、ｐＴＳＨＲ  ｃＤＮＡをトランスフェクションしたＣＨＯ細胞で該レセプター蛋白が機能を有した形で発現しているが明らかとなった。
さらに、通常のブタ甲状腺細胞を用いた時よりも組換えブタＴＳＨレセプターを用いた方がｃＡＭＰの産生量が高く、より高感度に測定可能である。
【００６８】
【表５】
2007314548.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１−１】ブタ由来ＴＳＨレセプター構造遺伝子（２２９２ｂｐ、７６４個のアミノ酸からなる分子量８６，６４１のポリペプチドをコードする）を含有するＤＮＡ断片の塩基配列を示したものである。図中、Ｍｅｔはブタ由来ＴＳＨレセプター構造遺伝子の翻訳開始コドンを、ｓｔｏｐはその停止コドンを示す。
【図１−２】ブタ由来ＴＳＨレセプター構造遺伝子（２２９２ｂｐ、７６４個のアミノ酸からなる分子量８６，６４１のポリペプチドをコードする）を含有するＤＮＡ断片の塩基配列を示したものである。図中、Ｍｅｔはブタ由来ＴＳＨレセプター構造遺伝子の翻訳開始コドンを、ｓｔｏｐはその停止コドンを示す。
【図２−１】本発明のブタ由来ＴＳＨレセプターのアミノ酸配列を、ヒト、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット、イヌ由来ＴＳＨレセプターのアミノ酸配列と比較して示したものである。図中、porcine はブタ、Humanはヒト、Bos taurusはウシ、Ovis ariesはヒツジ、Mus musculusはマウス、Rattusはラット、Canineはイヌ由来のそれぞれのＴＳＨレセプターのアミノ酸配列を示す。また、図中のアルファベットはアミノ酸の１文字記号で、以下のアミノ酸を示す。
【図２−２】本発明のブタ由来ＴＳＨレセプターのアミノ酸配列を、ヒト、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット、イヌ由来ＴＳＨレセプターのアミノ酸配列と比較して示したものである。図中、porcine はブタ、Humanはヒト、Bos taurusはウシ、Ovis ariesはヒツジ、Mus musculusはマウス、Rattusはラット、Canineはイヌ由来のそれぞれのＴＳＨレセプターのアミノ酸配列を示す。また、図中のアルファベットはアミノ酸の１文字記号で、以下のアミノ酸を示す。
【図２−３】本発明のブタ由来ＴＳＨレセプターのアミノ酸配列を、ヒト、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット、イヌ由来ＴＳＨレセプターのアミノ酸配列と比較して示したものである。図中、porcine はブタ、Humanはヒト、Bos taurusはウシ、Ovis ariesはヒツジ、Mus musculusはマウス、Rattusはラット、Canineはイヌ由来のそれぞれのＴＳＨレセプターのアミノ酸配列を示す。また、図中のアルファベットはアミノ酸の１文字記号で、以下のアミノ酸を示す。Ａ：アラニン、Ｒ：アルギニン、Ｎ：アスパラギン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｃ：システイン、Ｑ：グルタミン、Ｅ：グルタミン酸、Ｇ：グリシン、Ｈ：ヒスチジン、Ｉ：イソロイシン、Ｌ：ロイシン、Ｋ：リジン、Ｍ：メチオニン、Ｆ：フェニルアラニン、Ｐ：プロリン、Ｓ：セリン、Ｔ：スレオニン、Ｗ：トリプトファン、Ｙ：チロシン、Ｖ：バリン
【図１−１】
2007314548.tif 000007
【図１−２】
2007314548.tif 000008
【図２−１】
2007314548.tif 000009
【図２−２】
2007314548.tif 000010
【図２−３】
2007314548.tif 000011
【配列表】
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