(57)【要約】【課題】  核酸が基板に結合した状態での二本鎖核酸の融点、また、複数のプローブを固定した核酸チップの各プローブに対応した二本鎖核酸ごとの融点の測定を可能とする融点測定方法及びそのための装置を提供すること【解決手段】  プローブなどの第一の核酸を基板表面に固定し、基板表面での第一の核酸とこれとハイブリダイズし得る第二の核酸とから得られるハイブリッドの温度に依存する形成または解離を、基板表面に合焦した光学系で第二の核酸に標識した蛍光を利用して測定することでこれらの核酸からなるハイブリッドの融点を測定する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖核酸の融点を測定するための方法において、
（１）第一の核酸を表面に固定した基板を用意する工程と、
（２）前記第一の核酸とハイブリダイズし得る塩基配列を有し、且つ、蛍光標識された第二の核酸を用意する工程と、
（３）前記基板上に固定された第一の核酸と前記第二の核酸のハイブリッドを形成し得る反応系を該基板上に形成する工程と、
（４）前記反応系の温度を変化させ、該反応系内でのハイブリッドの形成または解離を生じさせる工程と、
（５）前記ハイブリッドの形成または解離にともなって前記基板の表面に生成または消失する蛍光標識された第二の核酸由来の蛍光を、検出装置の検出光学系の焦点を前記基板表面に合焦させて測定する工程と、
（６）前記検出装置により測定された蛍光の強度のプロファイルから前記基板上におけるハイブリッドの融点を決定する工程と、
を有することを特徴とする二本鎖核酸の融点測定方法。
【請求項２】
前記検出光学系の前記基板表面への合焦が、外部から光ビームを前記基板表面に照射して、該光ビームの前記基板面での反射位置を検出し得る位置に、前記検出光学系の対物レンズと基板表面間の距離を自動的に調整することによる請求項１に記載の融点測定方法。
【請求項３】
前記検出光学系の前記基板表面への合焦が、前記検出光学系の対物レンズと前記基板表面間の距離を自動的に変化させて、第二の核酸由来の蛍光、または、あらかじめ基板表面に結合した蛍光マーカーの蛍光の最大蛍光強度が得られた点を合焦点とすることにより行なう請求項１に記載の融点測定方法。
【請求項４】
前記検出光学系の前記基板表面への合焦が、前記検出光学系の対物レンズと前記基板表面間の距離を連続的に変化させて、第二の核酸由来の蛍光、または、あらかじめ基板表面に結合した蛍光マーカーの蛍光輝度値を連続的に取得した後、最大蛍光強度が得られた点を合焦点とすることにより行なう請求項１に記載の融点測定方法。
【請求項５】
上記検出装置が共焦点蛍光顕微鏡である請求項１から４のいずれかに記載の融点測定方法。
【請求項６】
前記第二の核酸の標識物質と同じ蛍光物質をマーカーとして前記基板表面に予め結合させておき、前記第二の核酸由来の蛍光強度と前記マーカー由来の蛍光強度を同時に取得し、前記第二の核酸由来の蛍光強度のプロファイルを、前記マーカー由来の蛍光強度のプロファイルによって補正する請求項１から５のいずれかに記載の融点測定方法。
【請求項７】
二本鎖核酸の融点を測定するための方法において、
（１）複数種の第一の核酸の各々を互いに区分した固定領域毎に基板表面に結合した核酸チップを用意する工程と、
（２）前記第一の核酸とハイブリダイズし得る塩基配列を有し、且つ、蛍光標識された複数種の第二の核酸を用意する工程と、
（３）前記基板の各固定領域に第一の核酸と第二の核酸のハイブリッドを形成し得る反応系を形成する工程と、
（４）各反応系の温度を変化させ、各反応系内でのハイブリッドの形成または解離を生じさせる工程と、
（５）各ハイブリッドの形成または解離にともなって前記基板の表面に生成または消失する蛍光標識された第二の核酸由来の蛍光を、検出装置の検出光学系の焦点を前記基板表面に合焦させて測定する工程と、
（６）前記検出装置により測定された蛍光の強度のプロファイルから前記基板上における各ハイブリッドの融点を決定する工程と、
を有することを特徴とする二本鎖核酸の融点測定方法。
【請求項８】
前記検出光学系の前記基板表面への合焦が、外部から光ビームを前記基板表面に照射して、該光ビームの前記基板面での反射位置を検出し得る位置に、前記検出光学系の対物レンズと基板表面間の距離を自動的に調整することによる請求項７に記載の融点測定方法。
【請求項９】
前記検出光学系の前記基板表面への合焦が、前記検出光学系の対物レンズと前記基板表面間の距離を自動的に変化させて、第二の核酸由来の蛍光、または、あらかじめ基板表面に結合した蛍光マーカーの蛍光の最大蛍光強度が得られた点を合焦点とすることにより行なう請求項７に記載の融点測定方法。
【請求項１０】
前記検出光学系の前記基板表面への合焦が、前記検出光学系の対物レンズと前記基板表面間の距離を連続的に変化させて、第二の核酸由来の蛍光、または、あらかじめ基板表面に結合した蛍光マーカーの蛍光輝度値を連続的に取得した後、最大蛍光強度が得られた点を合焦点とすることにより行なう請求項７に記載の融点測定方法。
【請求項１１】
上記検出装置が共焦点蛍光顕微鏡である請求項７から１０のいずれかに記載の融点測定方法。
【請求項１２】
前記第二の核酸の標識物質と同じ蛍光物質をマーカーとして前記基板表面に予め結合させておき、前記第二の核酸由来の蛍光強度と前記マーカー由来の蛍光強度を同時に取得し、前記第二の核酸由来の蛍光強度のプロファイルを、前記マーカー由来の蛍光強度のプロファイルによって補正する請求項７から１１のいずれかに記載の融点測定方法。
【請求項１３】
二本鎖核酸の融点を測定するための装置において、
基板上に第一の核酸の固定領域を有する核酸チップと、該固定領域に接触して配置され、該第一の核酸とハイブリダイズし得る塩基配列を有し、かつ蛍光標識された第二の核酸を含む液体と、から構成される反応系を有する試料を保持するための試料保持手段と、
前記反応系の温度を制御するための温度制御手段と、
前記反応系の温度を検出するための温度検出手段と、
前記温度検出手段で検出された反応系の温度の変化を記録する手段と、
前記試料保持手段に保持された核酸チップの基板表面での前記第二の核酸の蛍光標識に由来する蛍光強度を検出するための検出装置と、
前記検出装置の検出光学系の焦点を前記基板表面に合焦させるための焦点調整手段と、
前記検出装置で検出した前記基板表面での蛍光強度の変化を記録するための蛍光強度検出手段と、
を有し、
前記反応系の温度変化に基づく前記第二の核酸の蛍光標識に由来する前記基板表面での蛍光強度の変化を示すプロファイルから前記第一及び第二の核酸からなるハイブリッドの融点を決定するための二本鎖核酸の融点測定装置。
【請求項１４】
前記焦点調整手段が、外部から光ビームを前記基板表面に照射する手段と、該光ビームの前記基板面での反射位置を検出し得る位置に前記検出光学系の対物レンズの位置を前記基板表面に対して自動的に調整する手段と、を有する請求項１３に記載の融点測定装置。
【請求項１５】
前記焦点調整手段が、前記基板表面での第二の核酸由来の蛍光、または、あらかじめ前記基板表面に結合させた蛍光マーカーの蛍光の最大蛍光強度が得られる前記検出光学系の対物レンズと基板表面間の距離にこれらの位置を自動的に調整する手段を有する請求項１４に記載の融点測定装置。
【請求項１６】
前記焦点調整手段が、前記検出光学系の対物レンズと前記基板表面間の距離を連続的に変化させて、前記基板表面での第二の核酸由来の蛍光、または、あらかじめ基板表面に結合した蛍光マーカーの蛍光輝度値を連続的に取得する手段、および、前記第二の核酸由来の蛍光、または前記蛍光マーカーの最大の蛍光輝度値を選択する手段を有する請求項１４に記載の融点測定装置。
【請求項１７】
前記検出装置が、前記焦点調整手段を具備する共焦点蛍光顕微鏡である請求項１３から１６のいずれかに記載の核酸融点の融点測定装置。
【請求項１８】
前記基板として前記第二の核酸の標識物質と同じ蛍光物質からなるマーカーを有する基板を用い、該マーカー由来の蛍光強度の変化を検出するためのマーカー蛍光検出手段を更に有し、該マーカー由来の蛍光強度のプロファイルは、前記第二の核酸の蛍光標識に由来する蛍光強度のプロファイルを補正するためのものである請求項１３〜１７のいずれかに記載の融点測定装置。
【請求項１９】
前記固定領域が前記基板面に複数設けられている請求項１３〜１８のいずれかに記載の融点測定装置。
【請求項２０】
二本鎖核酸の融点を測定するためのシステムにおいて、
基板上に第一の核酸の固定領域を有する核酸チップと、該固定領域に接触して配置され、該第一の核酸とハイブリダイズし得る塩基配列を有し、かつ蛍光標識された第二の核酸を含む液体と、から構成される反応系を有する試料を調製するための試薬及び器具の少なくいとも一方と、請求項１〜１６に記載の測定装置と、を有することを特徴とする二本鎖核酸の融点測定システム。
【請求項２１】
前記固定領域が前記基板面に複数設けられている請求項１７に記載の融点測定システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は固相基板上の核酸ハイブリッドの融点の測定方法及びそのための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子検出の分野では、サザンブロッティングの時代からDNAプローブ法が広く用いられている。この手法の基本は、ハイブリダイゼーション、すなわち互いに相補的な塩基配列を有するDNA、RNA等の核酸が二本鎖（ハイブリッド）を形成することにより、２本鎖が互いを認識することにある。
【０００３】
近年に於いても、同時に多項目の遺伝子検出を行うことを可能とする、いわゆるDNA核酸チップの検出原理もハイブリダイゼーションである。また、厳密に言えば、遺伝子検出とは言えないかもしれないが、塩基配列決定法、あるいは、PCR（ポリメレースチェインリアクション）に用いられるプライミングの基本もハイブリダイゼーションである。
【０００４】
ハイブリダイゼーションには、それが可能となる要件、また、可能となった場合に、その強度（二本鎖の安定性）を左右する要件がある。それらを以下にまとめた。
（１）ハイブリダイゼーションが可能となるためには基本的に、二本の核酸鎖の（ここでは三重鎖、四重鎖は議論しない）ハイブリダイゼーションが起こる部分の塩基配列全体が相補的（フルマッチ、もしくは、パーフェクトマッチ）でなくてはならない。
（２）ハイブリダイゼーションが起こる部分の塩基配列に相補的でない塩基部分（ミスマッチ）があると、場合によって二本鎖形成が行われないか、二本鎖形成が可能であっても、相補的でない塩基部分に対応して、その塩基数が増加するにしたがって二本鎖の安定性は基本的に減じる。
（３）相補的でない塩基数、位置により、形成した二本鎖部分中に、バルジ、ループなどの高次構造を生じることがある。
（４）基本的に二本鎖を形成する部分の塩基数（鎖長）が多く（鎖長が長く）なれば二本鎖の安定性は増す。
（５）基本的にグアニン（G）：シトシン（C）塩基対の割合が多くなれば二本鎖の安定性は増し、逆にアデニン（A）：チミン（T）、RNAの場合はアデニン（A）：ウラシル（U）塩基対の割合が多くなれば二本鎖の安定性は減じる。これはそれぞれに塩基対を形成する水素結合の数の多寡に由来する。
（６）鎖長が同一であり、また、塩基対の割合が同じであっても、塩基対の鎖内の位置によって二本鎖の安定性が異なる場合がある。
（７）ハイブリダイゼーションは水素結合によって形成されるので、二本鎖が溶解している溶液の温度が上昇するにしたがって、二本鎖の安定性は減じる。
（８）溶液のｐHが変化すると二本鎖の安定性が変化することがある。これはそれぞれの塩基が固有の（複数の）酸解離定数（ｐKa）をもつことによる。
（９）溶液中の塩濃度により二本鎖の安定性は変化する。これは各々の核酸鎖のリン酸のマイナス電荷が反発するのを塩のプラスイオンが抑えるためである。
（１０）各々の核酸鎖のいずれか、または、それぞれが単独で何らかの高次構造をとって、単独での安定性が変化すると、二本鎖の安定性、もしくは、二本鎖形成の速度が変化することがある。
【０００５】
このように核酸の二本鎖の安定性は、さまざまな条件によって変化する。この安定性を評価する一つの指標として二本鎖核酸の融点（Tm：melting temperature）がある。
【０００６】
以下、液相中にハイブリダイズし得る１つの一本鎖核酸から形成される二本鎖核酸の融点とその測定方法についての概略を説明する（ここでは例としてDNAについてのみ議論する）。
【０００７】
互いに相補的な塩基配列を有する二本のDNAは、条件が整えば互いに塩基配列を認識して二本鎖を形成し、ワトソン−クリック型としてよく知られている二重らせん構造をとる。その際、二重らせんの内側で、水素結合により形成される塩基対が、平面状（実際にはすこし傾いている）に、角度を少しずつ変えながら連なっていく構造となる。そのとき、それぞれの塩基対は、それぞれの塩基対の上下の塩基対とスタッキング構造をとることとなる。その結果として、それぞれの塩基のπ電子は、上下の塩基のπ電子と電子雲の重なりをもち電子状態は安定化する。核酸塩基は、260nm付近に光の吸収があるが、DNAが一本鎖から二本鎖に変化すると、上記スタッキングの安定化効果により、この吸収の強度が低下する。したがって、この吸収の変化を指標として、DNAの一本鎖から二本鎖に遷移する過程、逆に、二本鎖から一本鎖に遷移する過程をモニターすることが可能となる。
【０００８】
すでに述べたように、核酸の二本鎖の安定性は温度に依存するので、上記遷移の実際の測定は核酸溶液の温度を徐々に昇温、または、降温させて、その際の溶液の吸光度を測定することによって行うのが一般的である。この際、一本鎖核酸の二本鎖への遷移、また、二本鎖核酸の一本鎖への解離は、ある温度を境に急激に起こり、この温度を核酸の融点と呼ぶ。
【０００９】
融点の高い核酸の組み合わせは二本鎖の安定性が高く、一方、融点の低い核酸の組み合わせは二本鎖の安定性が低い。
【００１０】
DNAプローブ法をはじめとして、核酸塩基配列決定法、PCR法のように二本鎖核酸形成を利用する手法においては、二本鎖核酸の安定性はきわめて重要な因子である。すなわち、所望するハイブリッド形成が生起しない場合は、望むべき結果が得られないからである。
【００１１】
そのような理由で、上記手法を行う場合、用いる核酸群のハイブリッドの安定性を予め予想するのが一般的である。その手法としてはA：Tペア、G：Cペア、それぞれの塩基対の安定性を規定値として、鎖長、G：C含有率、さらには各々のDNA鎖の一本鎖状態での高次構造のとり易さ等を勘案して融点を計算する方法がある。また、塩基配列を考慮して、実験的に得られた最近接塩基対の安定性パラメーターから融点を見積もる方法もある（Biotechniques Vol. 27, 1218-1228, 1999）。
【００１２】
このように諸パラメーターによって核酸の融点は計算である程度予測できるが、これらの計算も完全ではないので、予測できない因子により予測した融点と実際の融点が異なる場合がある。
【００１３】
したがって、正確な融点を求めようとすると、実際の核酸の溶液に対して、上述のように温度を変化させて、その際の吸光度を測定して、そのプロファイルから融点を求めることになる。この実際の操作は、数mlの核酸溶液の温度を0.2〜0.5℃／分程度の刻みで変化させ、60〜80℃の温度範囲で吸光度の変化を測定することにより行われる。この操作に基づく融点測定では、場合によっては一回の測定に6〜8時間を要することになる。最近では、例えば600μl程度の核酸溶液を6種同時に測定する装置（ベックマン・コールターベックマン・コールター社 DU640）も市販されているので、測定効率の向上を図ることも可能であるが、いずれにしても多数種の核酸の融点を測定しようとすると膨大な時間が必要となる。
【００１４】
また、従来技術による融点の測定は、吸光度の微妙な変化を捉える方法によっているので、例えば、十数量体のプローブと実際の遺伝子検査で用いられるような数百量体、数千量体の標的核酸とのハイブリッドの融点を検出することは原理的に困難である。また、測定が可能であったとしても、極めて大きな誤差を含むことが予測される。
【００１５】
一方、上述したサザンブロッティングをはじめとして、1990年代初頭から登場した、多数の核酸プローブが基板上にマトリクス状に配置された、いわゆる核酸チップなどは、核プローブを固相に固定化した状態で核酸試料と反応させてターゲット核酸（標的核酸）の検出を行なうために使用される。この場合におけるハイブリダイゼーションは固液界面で行われる（固相ハイブリダイゼーション）。固相ハイブリダイゼーションにおいては、基板表面の状態；プローブあるいはターゲット核酸と基板表面との相互作用；プローブあるいはターゲット核酸の基板表面に対する吸着性；プローブあるいはターゲット核酸の鎖長；プローブとターゲット核酸の有する相補的な塩基配列の全長における位置；プローブまたはターゲット核酸における標識物質の位置；標識物質と基板表面との相互作用；プローブとターゲット核酸の衝突回数の減少；等に基づく種々の要因により、ハイブリッドの安定性、言い換えれば融点は変化することが予想される。上述した液相ハイブリダイゼーションに基づいた融点計算方法、あるいは、液相ハイブリダイゼーションを用いた測定した融点の値をもって、そのまま固相ハイブリダイゼーションの融点を論じることは困難である。したがって、固相ハイブリダイゼーションにおける複数種のハイブリッドの融点を測定する効率的な方法が必要とされてきた。
【００１６】
まず、上述した液相でのハイブリダイゼーションにおいて適用した温度変化による吸光度の変化によって融点を求めることが考えられる。しかしながら、固相表面における核酸はたかだか二分子膜程度でしか存在しないので、吸光度が極めて小さく、このような融点測定方法が現実的ではない。
【００１７】
そこで、複数種の核酸の融点を測定する方法としてDASH（Dynamic Allele Specific Hybridization）が開発されている（ThermoHybaid Limited, UK）。この手法では、まず、二本鎖核酸について解析を所望する側のみビオチン標識したプライマーを用いてPCRを行ない、このPSR産物を予めストレプトアビジンコートしたマイクロプレートに固定して、ついでアルカリ変性により、解析を所望する側の核酸鎖のみをプレート上に残す。次に、プレート上にオリゴ核酸プローブを加えてハイブリッドを形成する。更に、このハイブリッドに、SYBR Green I（Molecular Probe Inc. USA）などの二本鎖核酸にインターカレートして蛍光を発する蛍光色素を作用さる。この状態で、マイクロプレートの温度を変化させて、蛍光色素の蛍光量の変化から各ウェル中に形成された二本鎖核酸の融点を求める。
【非特許文献１】Biotechniques Vol. 27, 1218-1228, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
上記DASH法によれば、場合によって数百種の二本鎖核酸の融点を同時に測定することが可能であるが、以下に示す問題点がある。
【００１９】
通常、ハイブリダイゼーションの蛍光による分析は、標的核酸を蛍光色素によって標識（通常は共有結合によって標識化する）して、この蛍光色素の蛍光強度を測定することによって行う。しかし、この方法をDASH法に適用しようとすると、マイクロプレート上のウェル内にはハイブリッドを形成しなかった蛍光標識された標的核酸が残存しているので、その蛍光が圧倒的に強く、本来のハイブリッドを形成した核酸からの蛍光を正しく測定することが困難である。融点を測定しようとするとき、昇温させていく場合にはハイブリッドが解離して標的核酸が溶液中に拡散していくし、降温させる場合には溶液中にハイブリッドを形成するべき標的核酸が溶解している必要があるので、ハイブリッドを形成していない標的核酸を洗い流すとうことを原理的に行うことができない。従って、ウェル中に残存するハイブリッドを形成していない蛍光標識された標的核酸からの蛍光の融点測定への影響をなくすことは基本的に不可能である。
【００２０】
このような問題点があるために、DASH法ではインターカレーター色素を用いている。ところが、インターカレーターはインターカレーションする核酸の鎖長、塩基配列によってインターカレートする分子数が異なることがあり、融点測定に際し安定な蛍光強度が得られない場合がある。また、インターカレーター色素はプラスチック、ガラスなどの基板表面、また、有機化合物等によって表面処理されたこれらの基板表面に非特異的に吸着して蛍光を発する場合があることが知られている。そうした場合には得られた蛍光量は、不安定であったり、正しくハイブリッドの量を反映しないことになる。実際、SYBR Green Ｉはプラスチック表面には比較的吸着しづらいが、ガラス表面、もしくは、表面処理したガラス表面には非特異的吸着を起こす場合があることが知られている。また、インターカレーションしていない状態でも程度の差こそあれ、蛍光を発する場合があるというインターカレーター固有の問題点もある。さらに、インターカレーターは、その特性上、一般的な蛍光色素に較べると、蛍光の強度が温度変化に強く影響される場合がある。そのような色素を温度を比較的広い範囲で変化させる融点測定に使用すると、温度変化にみに起因する蛍光強度の変化が起き、正確な融点測定が困難となる場合が生じる、といった基本的な問題点もある。さらに、インターカレーターが核酸ハイブリッドにインターカレートすることで核酸ハイブリッドの安定性そのものを左右する場合があり、そのような場合には測定された融点そのものが基本的に意味のないものとなってしまう。
【００２１】
また、蛍光顕微鏡を用いて各ウェル内で得られる蛍光色素からの蛍光を観察し、更に、その蛍光強度を測定する場合には、各ウェルの底面が蛍光顕微鏡の焦点調整が不要な程度の平面性を有していれば、煩雑な焦点調整を省略できるという利点がある。更に、各ウェル間での底部が、その平面性にばらつきがないように形成されていることで各ウェル毎の焦点調整も不要となる。また、ウェル底部の平面性が適当でない場合や、各ウェル間でその底部の平面性にばらつきがある場合には、蛍光検出装置の種類、蛍光を観察する位置、ウェルの形状、大きさ等の種々の要因によって、正しい蛍光量を把握できないことがある。
【００２２】
また、マイクロプレートの構造を考慮すると、マイクロプレートを用いた融点測定では、数百種程度のハイブリッド、もしくは数千〜数万種のハイブリッドの融点測定が可能であるが、それ以上となると現実的ではないという問題点もある。
【００２３】
さらに上述のように二本鎖核酸の融点は基板表面の状態に左右されるため、例えば、ウェルを有していない基板平面上にプローブを固定した核酸チップ上での融点は、DASH法で測定された融点とは異なる可能性があるという問題点もある。
【００２４】
本発明の目的は、核酸が基板に結合した状態での二本鎖核酸の融点、また、複数のプローブを固定した核酸チップの各プローブに対応した二本鎖核酸ごとの融点の測定を可能とする融点測定方法及びそのための装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は上記従来技術のもつ問題点を解決するために為された。
【００２６】
本発明にかかる二本鎖核酸の融点の測定方法の第１の態様は、
二本鎖核酸の融点を測定するための方法において、
（１）第一の核酸を表面に固定した基板を用意する工程と、
（２）前記第一の核酸とハイブリダイズし得る塩基配列を有し、且つ、蛍光標識された第二の核酸を用意する工程と、
（３）前記基板上に固定された第一の核酸と前記第二の核酸のハイブリッドを形成し得る反応系を該基板上に形成する工程と、
（４）前記反応系の温度を変化させ、該反応系内でのハイブリッドの形成または解離を生じさせる工程と、
（５）前記ハイブリッドの形成または解離にともなって前記基板の表面に生成または消失する蛍光標識された第二の核酸由来の蛍光を、検出装置の検出光学系の焦点を前記基板表面に合焦させて測定する工程と、
（６）前記検出装置により測定された蛍光の強度のプロファイルから前記基板上におけるハイブリッドの融点を決定する工程と、
を有することを特徴とする二本鎖核酸の融点測定方法である。
【００２７】
本発明にかかる二本鎖核酸の融点の測定方法の第２の態様は、
二本鎖核酸の融点を測定するための方法において、
（１）複数種の第一の核酸の各々を互いに区分した固定領域毎に基板表面に結合した核酸チップ（核酸アレイともいう）を用意する工程と、
（２）前記第一の核酸とハイブリダイズし得る塩基配列を有し、且つ、蛍光標識された複数種の第二の核酸を用意する工程と、
（３）前記基板の各固定領域に第一の核酸と第二の核酸のハイブリッドを形成し得る反応系を形成する工程と、
（４）各反応系の温度を変化させ、各反応系内でのハイブリッドの形成または解離を生じさせる工程と、
（５）各ハイブリッドの形成または解離にともなって前記基板の表面に生成または消失する蛍光標識された第二の核酸由来の蛍光を、検出装置の検出光学系の焦点を前記基板表面に合焦させて測定する工程と、
（６）前記検出装置により測定された蛍光の強度のプロファイルから前記基板上における各ハイブリッドの融点を決定する工程と、
を有することを特徴とする二本鎖核酸の融点測定方法である。
【００２８】
本発明にかかる二本鎖核酸の融点測定装置は、
基板上に第一の核酸の固定領域を有する核酸チップと、該固定領域に接触して配置され、該第一の核酸とハイブリダイズし得る塩基配列を有し、かつ蛍光標識された第二の核酸を含む液体と、から構成される反応系を有する試料を保持するための試料保持手段と、
前記反応系の温度を制御するための温度制御手段と、
前記反応系の温度を検出するための温度検出手段と、
前記温度検出手段で検出された反応系の温度の変化を記録する手段と、
前記試料保持手段に保持された試料の基板表面での前記第二の核酸の蛍光標識に由来する蛍光強度を検出するための検出装置と、
前記検出装置の検出光学系の焦点を前記基板表面に合焦させるための焦点調整手段と、
前記検出装置で検出した前記基板表面での蛍光強度の変化を記録するための蛍光強度検出手段と、
を有し、
前記反応系の温度変化に基づく前記第二の核酸の蛍光標識に由来する前記基板表面での蛍光強度の変化を示すプロファイルから前記第一及び第二の核酸からなるハイブリッドの融点を決定するための二本鎖核酸の融点測定装置である。
【００２９】
本発明にかかる二本鎖核酸の融点測定用システムは、二本鎖核酸の融点を測定するためのシステムにおいて、
基板上に第一の核酸の固定領域を有する核酸チップと、該固定領域に接触して配置され、該第一の核酸とハイブリダイズし得る塩基配列を有し、かつ蛍光標識された第二の核酸を含む液体と、から構成される反応系を有する試料を調製するための試薬及び器具の少なくいとも一方と、上記構成の測定装置と、を有することを特徴とする二本鎖核酸の融点測定システムである。
【発明の効果】
【００３０】
本発明により核酸が基板に結合した状態での二本鎖核酸の融点、また、核酸チップの各プローブに対応した二本鎖核酸ごとの融点の測定が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明にかかる二本鎖核酸融点の測定方法においては、二本鎖核酸（ハイブリッド）を構成する２つの一本鎖核酸（以下、第一の核酸及び第二の核酸という）の一方が基板に固定された核酸チップが用いられる。基板への第一の核酸の固定は、ハイブリダイゼーション用の反応液との接触状態において、更には融点測定のための温度変化において安定した固定状態が得られるように定法から選択された方法によって行なうことができる。
【００３２】
基板に複数の異なる第一の核酸それぞれを区分した複数の固定領域を設けることで、複数の異なる第一の核酸毎に形成されるハイブリッドの融点をそれぞれ測定できる。
【００３３】
図１に本発明にかかる二本鎖核酸の融点測定装置の一例を示す。この装置は、第一の核酸と第二の核酸からなるハイブリッドの形成または解離を生じさせる反応系（不図示）が形成されるチャンバー４と、チャンバー４内の温度を検出するための温度検出手段と、チャンバー４内の温度を調整する温度調整手段と、チャンバー４内に形成された反応系内にある核酸チップ（不図示）の基板面からの蛍光を検出するための検出装置１３、チャンバー４内に配置された試料ステージ５の位置制御手段とを少なくとも有して構成されている。
【００３４】
温度検出手段は、測温度抵抗体などを有する温度センサー３、温度取り込み用データローダ２及びコンピューター１等から構成されている。一対の温度センサー３の一方（図２のセンサー１６）は試料ステージ５の温度を検知できる位置に配置され、他方の温度センサー（図２のセンサー１７）は試料の温度（例えば、図３に示す試料の天板３３の温度）を検知可能な位置に設置されている。コンピューター１及びデータローガー２を利用して温度を測定し、測定されたデータを保存する。コンピューター１は、温度センサーで検出された温度に関するデータを保持するとともに、核酸チップ内の反応領域に融点測定用の温度変化を付与するための温度調節プログラムを有する。チャンバー４内の温度調整は、例えば、サーキュレーター１２により行うことができる。また、必要に応じて、サーキュレーター１１を用いてチャンバー４を冷却してもよい。
【００３５】
上記の装置は、チャンバー内の各反応系において同一の温度変化が一括して行なわれる構成を有する。必要に応じて、局所的な加熱手段を用いて各反応系が個別に温度調整が可能となる構成としてもよい。
【００３６】
コンピューター１４は、試料ステージ５上に保持した核酸チップ１５の表面から得られる蛍光シグナルをフォトセンサーなどの蛍光検知手段（不図示）で検知して得られたデータを取り込んで、保存する。取り込まれたデータは、コンピューター１で記録された試料温度と対比されることで融点が決定される。この対比操作は、コンピューター１及び１４を接続して、所定のプログラムに従って行なうこともできる。更に、コンピューター１及び１４は一つのコンピューター内に統合してもよい。
【００３７】
ステージ５は、蛍光装置１３に対する位置を制御可能に設けられている。この位置制御は、ステージ５及び検出装置１３の少なくとも一方を移動可能とし、コンピューター１４に格納したプログラムに従って行なうことができる。
【００３８】
一方、チャンバー４の上部は、検出装置１３からの励起光の導入及び蛍光の取り出しのための透光性の窓が設けられており、この窓が結露することを防止するために、窒素ガスボンベ１０からの窒素ガスを利用してチャンバー４内に対して窒素ガス置換が行われる。
【００３９】
図３に異なる第一の核酸３４ａ及び３４ｂを基板３１の表面にそれぞれ区分した固定領域に固定した核酸チップの１例を模式的断面図として示す。
【００４０】
第一の核酸とハイブリダイズしてハイブリッドを形成し得る第二の核酸は、ハイブリダイゼーション用の反応液中に含有させて、基板上の第一の核酸の固定領域に接触するように配置する。図３に示す例では、枠体３５と天板３３とにより反応液２を基板上の所定位置に保持し得る構造体を形成している。反応液２は第一の核酸と第二の核酸とのハイブリダイゼーションに必要な反応系を形成している。反応液は融点測定の温度条件下でのハイブリッドの形成が可能な組成を有していればよく、ハイブリダイゼーション用として用いられているものから適宜選択することができる。
【００４１】
次に、核酸チップの表面に反応系を形成した試料を、試料保持手段としてのステージに固定する。検出装置としては共焦点蛍光顕微鏡の構成を有する装置が好適に利用できる。図４に、共焦点蛍光顕微鏡の構成を有する装置を組み込んだ融点測定装置の一例の構成を模式的に示す。この融点測定装置は、蛍光標識の励起用の光源４３と、からの光を試料４１の有する基板（図３における３１）表面の第一の核酸の固定領域（不図示）にスポット状に結像するための光学系（ダイクロイックミラー４８及び対物レンズ４７を含む）と、基板の表面で得られる蛍光を蛍光検知手段に導く光学系（ダイクロイックミラー４８、対物レンズ４７、フィルター４９、プリズム５０、レンズ５１、５２を含む）と、蛍光検知手段４４と、蛍光検知手段で検知した蛍光強度のデータを記録するレコーダーを有するコンピューター４５と、焦点調節手段４６と、を少なくとも有して構成されている。なお、図４では、図１〜３に示したチャンバー及び試料の詳細な構造の図示を省略している。なお、蛍光検知手段、レコーダー及び焦点制御手段は、図１に示した装置構成におけるコンピューター１４（例えばPC）を利用して構成することができる。
【００４２】
図１及び２で示した温度制御手段によって試料４２の温度を調整して試料４２の有する基板表面でハイブリッドの形成または解離を行う。試料４２の有する反応系としては、基板に固定した第一の核酸と第二の核酸との温度変化に伴う可逆的なハイブリダイゼーションを可能とする各種反応液が用いられる。
【００４３】
基板表面に共焦させた光源４３からの励起光スポットを蛍光検出手段４４で検知して得られる試料４２の有する基板表面での蛍光強度のプロファイルと、試料４２における温度変化とから、基板表面に形成されたハイブリッドの融点を判定する。
【００４４】
蛍光強度のプロファイルは、温度測定手段において測定された温度に対して、あるいは、反応系における温度変化が測定時間に対して十分に線形な場合には、測定にかかる経過時間に対して、測定された蛍光強度の変化を記録することで作成可能である。
【００４５】
ステージ４１に対する対物レンズ４７の位置は、コンピューター４４に格納したプログラムに従って、焦点調節手段４６により自動制御される。あるいは、ステージ４１がＸＹ軸方向及び／またはＺ軸方向に移動してもよい。励起された蛍光物質から得られる蛍光を核酸チップの基板表面に検出光学系を合焦させる方法としては、以下の方法が好ましい。
（１）光源４３からの光ビームを試料４２の有する基板表面に照射して、光ビームの基板表面での反射位置を検出し得る位置に、対物レンズ４７と基板表面間の距離を自動的に調整する方法。
（２）対物レンズ４７と基板表面間の距離を、自動的に変化させて、第二の核酸由来の蛍光、または、あらかじめ基板表面に結合させておいた蛍光マーカーの蛍光の最大蛍光強度が得られた点を合焦点とする方法。
（３）対物レンズ４７と基板表面間の距離を、連続的に変化させて、第二の核酸由来の蛍光、または、あらかじめ基板表面に結合させておいた蛍光マーカーの蛍光を連続的に取得した後、最大の蛍光輝度値を示す点における第二の核酸由来の蛍光輝度値を合焦点における蛍光輝度値とする方法。
【００４６】
上記（３）の方法には、例えば、連続的に取得した蛍光をメモリーに記憶させておき、記憶させておいた複数のデータの中から最大蛍光輝度を示すデータを選択して合焦点における蛍光輝度値とする手法を用いることができる。
【００４７】
融点測定の精度を更に向上させる上で、第二の核酸の標識物質と同じ蛍光物質をマーカーとして試料４２の有する基板表面に予め結合させておき、第二の核酸由来の蛍光強度とマーカー由来の蛍光強度を同時に取得し、第二の核酸由来の蛍光強度のプロファイルを、マーカー由来の蛍光強度のプロファイルによって補正してもよい。
【００４８】
本発明によれば、吸光度によらず蛍光法を用いて融点を測定するので、従来技術の課題であった長鎖核酸の融点測定を可能とし、また、固相ハイブリダイゼーションの融点測定も可能とする。また、基板表面の蛍光を観察するの上記DASH法のおける課題、すなわち、蛍光標識第二の核酸を用いることができない問題、あるいは、インターカレーター色素を用いることによって発生する問題を解決することができる。
【００４９】
試料４２の有する核酸チップには、１種類の第一の核酸を固定したものや、図３に示すように複数種の第一の核酸の各々を互いに分離された領域に固定したものが利用できる。多種類のプローブのそれぞれの固定領域を基板面に形成し、反応系内に各プローブとハイブリッドし得る核酸を含有させることで、同時に多種類のプローブが形成するハイブリッドの融点を測定することが可能となる。この場合、核酸チップ表面での各固定領域（核酸スポットや核酸ドット）の蛍光強度を画像として一括して取り込み、核酸チップの温度変化に応じた蛍光強度の変化を記録して、融点を判定する方法が好ましく利用できる。
【００５０】
この多種類の第一の核酸を基板に固定した形態によれば、核酸チップを構成する固相表面としての基板表面における蛍光測定により融点が測定できるという利点に加えて、核酸チップを用いて、同時に多数種の第一核酸（プローブ）と、それらに対応した多数種の第二の核酸とのハイブリッドのそれぞれの融点を測定することができる。その結果、液相において多数の核酸の融点を測定することに関わる課題を解決することができる。
【００５１】
試料を形成するための試薬及び器具の少なくとも一方と、上記構成の装置とを少なくとも用いて融点測定用のシステムを構成することができる。これらの試薬及び器具として、第１の核酸、第２の核酸、基板、蛍光マーカー、ハイブリダイゼーション反応液（各種緩衝液）、試料形成用の覆いやフレームなどから必要に応じて選択した１種以上を装置と組み合わせて提供する。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
（実施例１：外部からの光ビームの反射を利用した合焦による融点測定例）
（１）核酸チップの作製
特開平11-187900号公報に準じて核酸プローブ核酸チップを以下に示す方法により作製した。
（１−１）基板洗浄
25．4mm×25,4mm×1mmの合成石英基板をラックに入れ、純水で10％に稀釈した超音波洗浄用洗剤（ブランソン：GPIII）に一晩浸した。その後、洗剤中で２０分間超音波洗浄を行い、その後、水洗により洗剤を除去した。純水ですすいだ後、純水の入った容器中でさらに超音波処理を２０分間行った。次に、予め８０℃に加温した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に基板を１０分間浸した。引き続き水洗、純水洗浄を行って、そのまま次工程に供した。
（１−２）表面処理
アミノ基を結合したシランカップリング剤、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン  ＫＢＭ６０３（信越化学工業）の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。次いでこの溶液に上記（１−１）で得た基板を室温で1時間浸漬した後、純水で洗浄し、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークして最終的に基板表面にアミノ基を導入した。
【００５３】
次いでＮ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（同仁化学研究所：以下ＥＭＣＳ）２．７ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１溶液に濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解した。シランカップリング処理を行った石英基板をこのＥＭＣＳ溶液に室温で２時間浸漬して、シランカップリング処理によって基板表面に担持されているアミノ基とＥＭＣＳ溶液のスクシイミド基を反応させた。この段階で基板表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が存在することになる。またこの処理により、核酸が基板表面に吸着することを防止する。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた基板はＤＭＳＯ及びエタノールの混合溶媒及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。
（１−３）プローブＤＮＡ（第一の核酸）の合成
DNA合成業者（ベックス）に依頼して配列番号１から6の一本鎖核酸（それぞれｄTの20、25、30、35、40、45量体）を合成した。なお配列番号１の一本鎖ＤＮＡの5'末端には合成時にチオールモディファイア（グレンリサーチ）を用いる事によってチオール（ＳＨ）基を導入した。なお、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製にはHPLCを用いた。合成から精製までの一連の工程はすべて合成業者に依頼して行った。
配列番号：１
5'  HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 3'
配列番号：2
5'  HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3'
配列番号：3
5'  HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3'
配列番号：4
5'  HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3'
配列番号：5
5'  HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3'
配列番号：6
5' HS-(CH2)6-O-PO2-O-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3'
（１−４）蛍光マーカーの合成
DNA合成業者（ベックス）に依頼して配列番号7の蛍光マーカーを合成した。なおフォスフォロアミダイトを使って5'末端にはCy3標識、3'末端にはチオールモディファイア（グレンリサーチ）を用いる事によってチオール（ＳＨ）基を導入した。なお、脱保護、ＤＮＡの回収は定法により行い、また、精製にはHPLCを用いた。合成から精製までの一連の工程はすべて合成業者に依頼して行った。
配列番号：7
5'  Cy3 -(CH2)6-O-PO2-O-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-O- PO2-O-(CH2)6-SH 3'
（１−５）サーマルジェットプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
上記配列番号１から6の一本鎖ＤＮＡは８μＭの濃度で、上記配列番号7の蛍光マーカーは吸光度にて0.1になるようにグリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、アセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥＨ；川研ファインケミカル（株）社製）１ｗｔ％を含む溶液に溶解した。サーマルジェット法の一種であるバブルジェット法を用いたバブルジェットプリンターBJF-850（キヤノン）用のプリンターヘッドBC-50（キヤノン）を数100μlの溶液を吐出可能とするべく改造し、このヘッドを上記石英基板上へ吐出可能となるよう改造した吐出描画機に搭載した。このヘッド6個搭載されている改造タンク部に上記6種のDNA溶液をそれぞれ数100μl注入し、吐出描画機にEMCS処理基板を装着して、ここにスポッティングした。なお、スポッティング時の吐出量は4pl／dropletで、スポッティングの範囲は基板の中央部に10mm×10mmの範囲に200dpi（dot per inch）すなわち127μmのピッチで吐出した。この条件ではスポッティングされたドットの直径は約50μmであった。スポットの基本パターンは上記6種のDNAと上記マーカーをDNAの周囲に配置させ、5×4の行列となっているもので、本実施例では上記パターンを10パターンスポッティングした。
【００５４】
スポッティング終了後、基板を３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス板表面のマレイミド基と核酸プローブおよびマーカーの末端のチオール基とを反応させた。次いで、基板を純水で洗浄し、純水中で保存した。この基板を融点測定に供した。
【００５５】
（２）ハイブリダイゼーション反応場の作製
上記（１）で作製した核酸プローブ核酸チップ上面（プローブが結合した側）に内寸15×16mm、幅8mm、厚さ0.25mmの両面に接着物質が付いたフレーム（日本ジェネティクス株式会社製、製品名；ハイブリダイゼーション用フレーム）を貼り、両端に穴を開けた22×22mm、厚さ0.17mmのカバーガラスを、上記フレームに貼り付け、反応場を封入した試料を作製した。カバーガラスの一端より、下記組成のハイブリダイゼーション溶液65μlを滴入し、カバーガラスの両端の穴をポリイミドテープにて封止した。なお、下記配列番号8は蛍光色素Cy3で標識された、上記6種のプローブに対する共通した相補的核酸（第二の核酸）である。
ハイブリダイゼーション溶液：
6×SSPE、10%ホルムアミド
50 nM Cy3標識dA45（配列番号：8；下記）
配列番号：8
5' Cy3-(CH2)6-O-PO2-O-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 3'
（３）融点測定
上記（２）で作製した試料を、図１の５（図２）の融点測定装置の温度コントロール（温調）ステージにセットし、温度コントローラーを25℃から80℃まで0.5℃／minのレートで昇温、あるいは、降温するようにセットし、上記カバーガラス(ハイブリダイゼーション溶液)の温度を制御し、１分毎にカバーガラス表面にセットされた測温抵抗体からの温度を取り込んだ。蛍光輝度の取り込みは、LSM510に20倍（×20）蛍光観察用対物レンズ（フルオール）と、Cy3蛍光観察用フィルターブロック（N0.20）をセットして行った。顕微鏡の外部に設けた赤色半導体レーザーを上記核酸チップに照射した際の反射光を、同じく顕微鏡の外部に設けたフォトセンサーによって検知し、フォトセンサー内の検知位置から、顕微鏡のステージ高さを調整し、合焦させ、上記昇温、降温を順次行い、1分毎にカバーガラス表面にセットされた測温抵抗体からの温度と、各スポットからの蛍光輝度のピクセルあたりの平均輝度をデータとして取り込んだ。
【００５６】
取り込んだ各データからそれぞれのプローブとそれに対して相補的な核酸との融点を求
めた。得られた結果を表１に示す。
【００５７】
【表１】
2007010413.tif 000003
【００５８】
表１から本発明の核酸融点測定装置、あるいは、本発明の核酸融点測定方法により核酸チップ上において各核酸プローブと相補的な核酸との融点が測定可能であることがわかる。
（実施例２：検出光学系の対物レンズと基板表面間の距離を自動的に変化させて合焦を行うことによる融点測定例）
実施例１で得た試料を、図１の５（図２）の融点測定装置の温度コントロール（温調）ステージにセットし、温度コントローラーを25℃から80℃まで0.5℃／minのレートで昇温、あるいは、降温するようにセットした。上記カバーガラス(ハイブリダイゼーション溶液)の温度を制御し、1分毎にカバーガラス表面にセットされた測温抵抗体からの温度を取り込んだ。蛍光輝度の取り込みは、LSM510に20倍（×20）蛍光観察用対物レンズ（フルオール）と、Cy3蛍光観察用フィルターブロック（N0.20）をセットして行った。共焦点顕微鏡のステージを高さ方向（Ｚ軸方向）に移動させながら、核酸チップ上の第二の核酸あるいは蛍光マーカー由来の蛍光輝度が一番高くなる位置にて画像を取得することとして、上記昇温、降温を順次行い、1分毎にカバーガラス表面にセットされた測温抵抗体からの温度と、各スポットからの蛍光輝度のピクセルあたりの平均輝度をデータとして取り込んだ。
【００５９】
取り込んだ各データからそれぞれのプローブとそれに対して相補的な核酸との融点を求めたところ表１と同じ結果が得られた。
（実施例３：検出光学系の対物レンズと基板表面間の距離を逐次変化させ、一通り画像を取得後、第二の核酸または蛍光マーカー由来の蛍光輝度が最大となる画像を選択し、合焦点における蛍光輝度値とする融点測定例）
実施例１で得た試料を、図１の５（図２）の融点測定装置の温度コントロール（温調）ステージにセットし、温度コントローラーを25℃から80℃まで0.5℃／minのレートで昇温、あるいは、降温するようにセットした。上記カバーガラス(ハイブリダイゼーション溶液)の温度を制御し、1分毎にカバーガラス表面にセットされた測温抵抗体からの温度を取り込んだ。蛍光輝度の取り込みは、LSM510に20倍（×20）蛍光観察用対物レンズ（フルオール）と、Cy3蛍光観察用フィルターブロック（N0.20）をセットして行った。共焦点顕微鏡内蔵の"Time Series"ソフトを用いて、1分毎にZ軸を1μm移動させながら、自動で画像を取得した。取得した画像データから、蛍光マーカーの輝度が一番高く得られる高さの画像を選択し、各スポットからの蛍光輝度のピクセルあたりの平均輝度を出し、蛍光マーカーによる蛍光輝度の温度依存性の補正を前記平均輝度に対して行い、温度との関係をプロットした。
【００６０】
取り込んだ各データからそれぞれのプローブとそれに対して相補的な核酸との融点を求めたところ、表１と同じ結果が得られた。
（実施例４：基板上の蛍光マーカーによる第二の核酸の蛍光輝度補正を行う場合の融点測定例）
実施例１で作製した試料を、図１の５（図２）の融点測定装置の温度コントロール（温調）ステージにセットし、温度コントローラーを25℃から80℃まで0.5℃／minのレートで昇温、あるいは、降温するようにセットした。上記カバーガラス(ハイブリダイゼーション溶液)の温度を制御し、１分毎にカバーガラス表面にセットされた測温抵抗体からの温度を取り込んだ。蛍光輝度の取り込みは、LSM510に20倍（×20）蛍光観察用対物レンズ（フルオール）と、Cy3蛍光観察用フィルターブロック（N0.20）をセットして行った。顕微鏡の外部に設けた赤色半導体レーザーを上記核酸チップに照射した際の反射光を、同じく顕微鏡の外部に設けたフォトセンサーによって検知し、フォトセンサー内の検知位置から、顕微鏡のステージ高さを調整し、合焦させ、上記昇温、降温を順次行い、1分毎にカバーガラス表面にセットされた測温抵抗体からの温度と、各スポットからの第二の核酸と蛍光マーカーの蛍光輝度をデータとして取り込んだ。
【００６１】
取り込んだ第二の核酸の蛍光輝度データを、同一時刻の蛍光マーカの蛍光輝度で割り算を行い、横軸に温度、縦軸に前記割り算の一次微分をプロットし融点を求めたところ、表１と同じ結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】融点測定装置の一例の概要を示す図である。
【図２】融点測定装置の温度制御機構を説明するための図である。
【図３】核酸ハイブリッドの形成または解離を生じさせるための反応系を基板上に形成した核酸チップの一例の断面図である。
【図４】融点測定装置の有する光学系の構成の一例を説明するための図である。
【符号の説明】
【００６３】
１    温度制御用のコンピュータ
２    温度取り込み用データローガ
３    温度センサー
４    チャンバー
５    試料ステージ
６    チャンバー冷却用の純水出入り口
７    試料ステージ恒温水出入り口
８    置換用窒素ガス出入り口
９    減圧弁
１０  窒素ガスボンベ
１１  チャンバー冷却用サーキュレーター
１２  試料ステージ調温用のサーキュレーター
１３  検出装置部
１４  検出画像取り込み用およびステージ移動制御用
１５  核酸チップ
１６  ステージ温度検知用温度センサー
１７  試料温度検知用温度センサー
３１  基板
３２  反応領域
３３  覆い
３４ａ  核酸固定領域
３４ｂ  核酸固定領域
３５  フレーム
４１  ステージ
４２  核酸チップ
４３  光源
４４  蛍光検知手段
４５  レコーダー
４６  焦点調節手段
４７  対物レンズ
４８  ダイクロイックミラー
４９  フィルター
５０  プリズム
５１、５２  レンズ
【図１】
2007010413.tif 000004
【図２】
2007010413.tif 000005
【図３】
2007010413.tif 000006
【図４】
2007010413.tif 000007
【配列表】
2007010413000001.app