(57)【要約】【課題】ポリアミドにおいて、DNAの塩基認識力を有すると共に、その配向構造をDNAの曲率に合わせる柔軟性を持つ置換基を提供する。【解決手段】そのような置換基として、α置換γアミノアルキルカルボン酸基が適切であり、特にα置換γアミノ酪酸が好適である。α置換基としては、水酸基又はアミノ基を好適に用いることができる。これらの置換基はDNAのT・A及びA・T塩基対を認識することができる。また、これらの好適な置換基の新しい製造法を開発した。このような置換基を組み込んだポリアミドは、公知のポリアミドより特定の遺伝子をより強く認識し、その発現をより巧妙に制御できる。【選択図】図１
2007314477.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式(1)で表わされる、S配置又はR配置の光学活性2-t-ブチルオキシ-(3+n)-(9-フルオレニルメトキシ)カルボニルアミノアルキルカルボン酸。
【化１】
2007314477.tif 000007
（式中、C*は光学活性炭素原子であって、S配置又はR配置をとり、nは自然数を表し、Fmocはフルオレニルメトキシカルボニル基を表す。主鎖の炭素原子に結合する水素原子は記載を省略している。分子中の水素原子は重水素原子に置き換えてもよい。）
【請求項２】
一般式(1)においてn＝1である、S配置又はR配置の光学活性2-t-ブチルオキシ-4-(9-フルオレニルメトキシ)カルボニルアミノアルキルカルボン酸。
【請求項３】
S配置又はR配置の光学活性(3+n)-アミノ-2-ヒドロキシアルキルカルボン酸を出発物質として、
(a)該出発物質を、少量の重炭酸ソーダ存在下において水と1,2-ジメトキシエタンの混合液中で(9-フルオレニルメトキシ)カーボニルサクシイミドと反応させ、光学活性(3+n)-[(9-フルオレニルメトキシ)カーボニルアミノ]-2-ヒドロキシアルキルカルボン酸を得て、
(b)該アルキルカルボン酸をジクロロメタン中で懸濁させ、常温で過剰のイソブテンを加え、透明な溶液が得られるまで反応を続け、2-t-ブトキシ-(3+n)-(9-フルオレニルメトキシ)カルボニルアミノアルキルカルボン酸t-ブチルエステルを得て、
(c)該ブチルエステルに高活性シリル置換試薬トリメチルシリルトリフルオロメタンスルフォン酸（TMSOTf）を加えて反応させる、
一般式(1)に示したS配置又はR配置の光学活性2-t-ブチルオキシ-(3+n)-(9-フルオレニルメトキシ)カルボニルアミノアルキルカルボン酸の製造方法。
【請求項４】
n＝1である、請求項３に記載のS配置又はR配置の光学活性2-t-ブチルオキシ-4-(9-フルオレニルメトキシ)カルボニルアミノアルキルカルボン酸の製造方法。
【請求項５】
一般式(2)で表されるヘアピン型ポリアミド。
【化２】
2007314477.tif 000008
（式中、X及びYは、βアラニン、ジアミノアルキルカルボン酸、光学活性α,ωアミノアルキルカルボン酸、光学活性αヒドロキシル-ωアミノアルキルカルボン酸の内から選ばれた互いに等しいかまたは互いに異なる置換基であり（ωはα位置と対向する末端を表す）、Wは(CH2)r、βアラニン、ジアミノアルキルカルボン酸、光学活性α,ωアミノアルキルカルボン酸、光学活性αヒドロキシル-ωアミノアルキルカルボン酸の内から選ばれた置換基である。p, q, r, s, tはそれぞれ独立の自然数を表し、Zは末端ジアミノ基又はアルキル化反応部位を表す。式中のピロール環の全部或いは一部をイミダゾール環に置き換えてもよい。）
【請求項６】
一般式(2)においてr=3, p=2, q=1, s=2, t=1であり、ピロール環を３環とイミダゾール環を３環含み、Wが（CH2)3であり、Zがプロピルジアミンカチオン基である、下記構造式(3)で表される請求項５に記載のヘアピン型ポリアミド。
【化３】
2007314477.tif 000009
（式中、X及びYは、βアラニン、ジアミノ酪酸、光学活性α,γジアミノ酪酸、光学活性αヒドロキシル-γアミノ酪酸の内から選ばれた互いに等しいかまたは互いに異なる置換基である。）
【請求項７】
一般式(2)においてr=3, p=2, q=1, s=2, t=1であり、ピロール環を３環とイミダゾール環を３環含み、Wが光学活性α,γジアミノ酪酸、光学活性αヒドロキシル-γアミノ酪酸の内から選ばれた置換基であり、Zがプロピルジアミンカチオン基である、下記構造式(4)で表される請求項５に記載のヘアピン型ポリアミド。
【化４】
2007314477.tif 000010
（式中、X、Y及びWは、βアラニン、ジアミノ酪酸、光学活性α,γジアミノ酪酸、光学活性αヒドロキシル-γアミノ酪酸の内から選ばれた互いに等しいかまたは互いに異なる置換基である。）
【請求項８】
請求項５、請求項６又は請求項７に記載のポリアミドを用いてDNAを認識する方法。
【請求項９】
請求項５、請求項６又は請求項７に記載のポリアミドを用いてDNAのA-T塩基対又はT-A塩基対を認識する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の遺伝子を認識することができ、遺伝子治療や遺伝子診断に有用な、新規なヘアピン型ピロール-イミダゾールポリアミドに関する。
【背景技術】
【０００２】
２種又は３種の異なる複素芳香環からなるピロール-イミダゾール-ポリアミドは、抗生物質と同様、化学療法やバイオセンシングに有望な合成試薬の一つである。この化合物は、一定のDNAシーケンスを認識することができ、遺伝子の発現を制御するために生きている細胞に導入することができる（非特許文献１）。この化合物は、ヘアピン型構造をとることにより、各ポリアミドリングがDNAの各塩基とつながり、DNA列に逆平行に隣接してペアを作る（特許文献１−３）。N-メチルピロール(Py)はG塩基を除くT,A,C塩基と結合し、N-メチルイミダゾール(Im)はG塩基に、3-ヒドロキシル-N-メチルピロール(Hp)はチミン塩基に選択的である。このように３種の芳香族アミノ酸の異なる組み合わせを用いれば、ワトソンクリック塩基対を全て認識できる（非特許文献２）。すなわち、Im/Pyペアは対称性によりG・C塩基対を読み、Py/ImペアはC・G塩基対を読み、Hp/PyペアはA・T, G・C, C・G塩基対からT・A塩基対を識別することができ、Py/PyペアはG・C,C・G塩基対からA・T,T・A塩基対を識別することができるからである。
【０００３】
しかしHpは分解しやすく、時間と共に変質してゆき、またそのT塩基認識力はPyに比較して弱いため、HpをT塩基認識要素とするには不利な点がある。
【０００４】
芳香族アミノ酸残基からなるポリアミドは、DNAへリックスの曲がり具合より大きく曲がっている。この曲率の差のため、ポリアミドは、残基数が５つ以下であれば、B-DNAへリックスのピッチとほぼ合致し、B-DNAのマイナーグルーブと結合することができる。しかし、ポリアミドがこれより大きくなると結合が困難となる。このとき、ポリアミド鎖の中により柔軟性があるβアラニン(β)を入れることにより、ポリアミドの配向構造をよりB-DNAの曲率に合わせることができる。しかも、β/βペアは、Py/Pyペアと同様に、T・A, A・T塩基対を非選択的に認識できるという特徴を有する（非特許文献３）。
【０００５】
このような有用なポリアミドは、モノマーユニットから固相合成法により製造できることが開示されている（特許文献４）。
【０００６】
【特許文献１】特開2003-261541号公報
【特許文献２】WO00/15642号公報
【特許文献３】特表2001-513759号公報
【特許文献４】WO2003/000683号公報
【非特許文献１】T. P. Best 他３名, "Nuclear localization of pyrrole-imidazole polyamide-fluorescein conjugates in cell culture", Proceedings of the National Academy of Science, 米国, 2003年, 100巻, 12063-12068頁。
【非特許文献２】S. White 他４名, "Recognition of the four Watson-Crick base pairs in the DNA minor groove by synthetic ligands", Nature, 1998年、391巻、468-471頁。
【非特許文献３】J. W. Trauger 他３名, "Extension of sequence-specific recognition in the minor groove of DNA by pyrrole-imidazole polyamides to 9-13 base pairs", Journal of the American Chemical Society, 1996年, 118巻, 6160-6166頁。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
高いDNA認識能を有する有用な試薬の開発のためには、塩基認識力を有すると共にポリアミドの配向構造をB-DNAの曲率に合わせる柔軟性を持つ置換基を探索する必要がある。いろいろな５員環複素芳香環が検討されてきたが、未だこれまで適切なものは見いだされていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この課題の解決のためには、ポリアミド構造体中にＴ塩基を特異的に認識するα置換ωアミノアルキルカルボン酸基を導入すればよいことを発見した。ここに、ω位置とは、α位置に対向する末端位置を表す。
α置換ωアミノアルキルカルボン酸の中でも、(R)-α,γ-ジアミノ酪酸（以下γRNと略記する）、(S)-α,γ-ジアミノ酪酸（以下γSNと略記する）、(R)-α-ヒドロキシル-γ-アミノ酪酸(以下γROと略記する）、(S)-α-ヒドロキシル-γ-アミノ酪酸(以下γSOと略記する）を特に好適に用いることができる。これらはポリアミド鎖に容易に組込むことができ、かつT塩基を認識することができる。
【０００９】
これらの内、S配置又はR配置のα-ヒドロキシル-ω-アミノアルキルカルボン酸は、具体的には、一般式(1)で表される。
【化１】
2007314477.tif 000003
（式中、C*は光学活性炭素原子であって、S配置又はR配置をとり、nは自然数を表し、Fmocはフルオレニルメトキシカルボニル基を表す。主鎖の炭素原子に結合する水素原子は記載を省略している。分子中の水素原子は重水素原子に置き換えてもよい。）
一般式(1)で表されるアルキルカルボン酸の内、n＝1のものは酪酸と呼ばれる。本明細書において、n＝1のものを指定するときは酪酸という名称を用いる。
【００１０】
このS配置又はR配置の光学活性2-t-ブチルオキシ-(3+n)-(9-フルオレニルメトキシ)カルボニルアミノカルボン酸を下記の方法により新規に合成した。
光学活性(3+n)-アミノ-2-ヒドロキシアルキルカルボン酸を出発物質として、
(a)該出発物質を、少量の重炭酸ソーダ存在下において水と1,2-ジメトキシエタンの混合液中で(9-フルオレニルメトキシ)カーボニルサクシイミドと反応させ、光学活性(3+n)-[(9-フルオレニルメトキシ)カーボニルアミノ]-2-ヒドロキシアルキルカルボン酸を得て、
(b)該アルキルカルボン酸をジクロロメタン中で懸濁させ、常温で過剰のイソブテンを加え、透明な溶液が得られるまで反応を続け、2-t-ブトキシ-(3+n)-(9-フルオレニルメトキシ)カルボニルアミノアルキルカルボン酸t-ブチルエステルを得て、
(c)該ブチルエステルにに高活性シリル置換試薬トリメチルシリルトリフルオロメタンスルフォン酸（TMSOTf）を加えて反応させる、
ことにより目的の光学活性2-t-ブチルオキシ-(3+n)-(9-フルオレニルメトキシ)カルボニルアミノアルキルカルボン酸を得た。
【００１１】
光学活性2-t-ブチルオキシ-4-(9-フルオレニルメトキシ)カルボニルアミノ酪酸は、光学活性2-ヒドロキシ-4-アミノ酪酸を出発物質として同様に合成することができる。
【００１２】
これらのアミノアルキルカルボン酸を用いて、ポリアミド構造中にＴ塩基を認識する置換基を含む一般式(2)で表されるヘアピン型ポリアミドを得ることができる。
【化２】
2007314477.tif 000004
（式中、X及びYは、βアラニン、ジアミノアルキルカルボン酸、光学活性α,ωジアミノアルキルカルボン酸、光学活性αヒドロキシル-ωアミノアルキルカルボン酸の内から選ばれた互いに等しいかまたは互いに異なる置換基であり、Wは(CH2)r、βアラニン、ジアミノアルキルカルボン酸、光学活性α,ωアミノアルキルカルボン酸、光学活性αヒドロキシル-ωアミノアルキルカルボン酸の内から選ばれた置換基であり、p, q, r, s, tは自然数を表してそれぞれ独立であり、Zは末端ジアミノ基又はアルキル化反応部位を表す。）
なお、一般式(2)において、ピロール環の全部或いは一部はイミダゾール環に置き換えても良い。
【００１３】
Zとしてアルキル化反応部位を用いれば、DNAの特定位置をアルキル化してそのDNAの発現を制御することができる。そのようなアルキル化反応部位の例としては、特許文献１に［化１１］として記載されているDU-86残基や、同じ特許文献１に［化１２］として記載されている1,2,9,9a-テトラヒドロシクロプロパ[e]ベンズ[e]インドール-4-オン残基が挙げられる。
【００１４】
上記の化合物(2)において、r=3, p=2, q=1, s=2, t=1であり、ピロール環を３環とイミダゾール環を３環含み、Wが（CH2)3であり、Zがプロピルジアミンカチオン基である下記構造式(3)で示されるヘアピン型ポリアミドを特に好適に用いることができる。
【化３】
2007314477.tif 000005
（式中、X及びYは、βアラニン、ジアミノ酪酸、光学活性α,γジアミノ酪酸、光学活性αヒドロキシル-γアミノ酪酸の内から選ばれた互いに等しいかまたは互いに異なる置換基である。）
【００１５】
上記の化合物(2)において、r=3, p=2, q=1, s=2, t=1であり、ピロール環を３環とイミダゾール環を３環含み、Wが光学活性α,γジアミノ酪酸、光学活性αヒドロキシル-γアミノ酪酸の内から選ばれた置換基であり、Zがプロピルジアミンカチオン基である下記構造式(4)で示されるヘアピン型ポリアミドをも特に好適に用いることができる。
【化４】
2007314477.tif 000006
（式中、X及びYは、βアラニン、ジアミノ酪酸、光学活性α,γジアミノ酪酸、光学活性αヒドロキシル-γアミノ酪酸の内から選ばれた互いに等しいかまたは互いに異なる置換基である。）
【００１６】
これらのポリアミドはDNAを有効かつ安定に認識できる。特に、そのA-T塩基対又はT-A塩基対を認識することができる。
【発明の効果】
【００１７】
上記の光学活性2-t-ブチルオキシ-4-(9-フルオレニルメトキシ)カルボニルアミノ酪酸の合成方法は、出発物質光学活性2-ヒドロキシ-4-アミノ酪酸の光学的性質を97%以上の精度で変化させないという特徴を有している。また、その収率も70%に近く、極めて優れている。
【００１８】
このα,γ置換アミノ酪酸残基は、ピロール-イミダゾール芳香環間に容易に組み込むことができ、Ｔ塩基を特異的に認識することができ、かつ柔軟性を有しているため、ポリアミドをヘアピン型DNAとより柔軟に結合させることができる。従ってこの残基を含むポリアミドは、公知のポリアミドと比較して特定の遺伝子をより強く認識し、その発現をより巧妙に制御することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（略号）
以下の記載において、記載の簡明のために化合物名を略号で示す。略号1-12は図５に示されている12種のポリアミドを、略号25-28は図６に示されている4種のポリアミドを示す。略号13-17は図１に示されている各化合物を、略号19-24は図２に示されている各化合物を示す。
【００２０】
（モノマー合成）
保護基を付けた光学活性なモノマーγSO17a(S)及びγRO17b(R)は、次の方式により合成した。図１にその化学反応式を示す。
原料である(2S)-2-ヒドロキシ-4-(9-フルオレニルメトキシ)カーボニルアミノ酪酸14aは、少量の重炭酸ソーダ存在下において水と1,2-ジメトキシエタンの混合液中で(9-フルオレニルメトキシ)カーボニルサクシイミドと反応させ、対応する光学活性出発物質13aから合成した。生成したFmocで保護された2-ヒドロキシ酪酸14aはDCM（ジクロロメタン）中で懸濁させ、常温で過剰のイソブテンを加えた。反応は透明な溶液が得られるまで続け、(2s)-2-ブトキシ-4-(9-フルオレニルメトキシ)カルボニルアミノ酪酸15aを得た。15aからt-ブチルエステルを開裂させるには、高活性シリル置換試薬TMSOTf（トリメチルシリルトリフルオロメタンスルフォン酸）を用いて、非常に不安定な中間体16aをへて(2S)-2-tブトキシ-4-(9-フルオレニルメトキシ)カルボニルアミノ酪酸17aを得た。17bもこれと同様に合成できた。NMRで測定したこれらの化合物の光学異性純度は17aと17b共に97%以上であった。
【００２１】
化合物17a及び17bには、塩基に不安定なアミノ保護基Fmocと酸に不安定な水酸基保護基t-butylが共存するため、光学活性な17a及び17bの最適合成条件を得ることは困難であった。副反応やラセミ化を避け、光学活性な生成物を得るためには２つの重要なステップがある。その一は、t-ブチルエステルとエーテルの同時生成であり、その二は、t-ブチルエステルを対応するトリメチルシリルエステルに変えることである。t-ブチルによる水酸基の選択的保護と、光学活性ヒドロキシアミノ酸によるt-ブチルエステルの選択的脱プロトン化を成功させることによりこの合成法は可能となった。
この新しい合成法は全く知られていなかったものであり、これによりラセミ化を3%以下に抑え、最終生成物17a又は17bを69.5%又は67.2%の収量で得ることができた。
【００２２】
このモノマー製造方法は、アミノ酪酸に限定されることはなく、アミノカルボン酸一般に適用できる。
【００２３】
（ポリアミドの合成）
α置換γブチル酸のＴ塩基認識力を調べるため、Fmoc-β-アラニンクリア酸樹脂と図２に示した８種のモノマー（17a, 17b, 19-24）を用いて、合成機械を用い、Fmoc固相合成法により１６種のポリアミドを合成した。溶媒としてはDMF（N,N-ジメチルホルムアミド）、活性化剤としてはHATU（N-(ジメチルアミノ-1H-1,2,3トリアゾ[4,5-b]-ピリジノ-1-ylメチレン)-N-メチルメタンアミニウム-6-フルオロリン酸）を用いた。
【００２４】
Fmoc-Py酸19はDIEA（N,N-ジイソプロピルエチルアミン）存在下でHATUにより活性化し、６０分程度反応させれば容易に合成カラム中の膨潤した樹脂18と結合する。芳香族モノマー20もこの方法で結合させることができる。修飾した、或いは修飾していない脂肪族モノマー17a,17b,21,22,23,24もHATUを用いて同様に結合することができる。脂肪族モノマー17a,17b,23,24について、t-ブチトキシ基かt-ブチトキシカルボニルアミノ基（NHBoc）かによる差は認められなかった。ポリアミドを高い収率で得るためには、モノマーとイミダゾールの結合及びイミダゾール自身の結合に際し、二重の結合サイクルが必須であった。
【００２５】
合成機械による固相合成の完了後、ポリアミドを樹脂1a-12aからDp（3-ジメチルアミノプロピルアミン）によるアミノ分解により分離し、目的のポリアミド1,2,3,4、t-ブチル保護ポリアミド5,6,7,8、Boc保護ポリアミド9,10,11,12（Boc：t-ブトキシカルボニル）を得た。酸素とt-ブチルの結合の開裂によるt-ブチトキシの脱離に際し、ラセミ化は起こらなかった。全ての合成ポリアミドの最終純度は98%以上であることが、HPLC、H-NMR及び質量分析の結果を組み合わせて確認された。
【００２６】
一般式（２）においてWが(CH2)r、βアラニン、ジアミノアルキルカルボン酸、光学活性α,ωアミノアルキルカルボン酸、光学活性αヒドロキシル-ωアミノアルキルカルボン酸のいずれかであるポリアミドも、上記と同様に合成でき、同様に純度を確認できる。
【００２７】
（表面プラズモン共鳴法による試験）
ストレプトアビジンで機能化されたバイアコアセンサチップ上に非共有結合的に結合され、ビオチン化された34塩基からなるオリゴ核酸(5'-biotin-GGCCGATGN'GCATGCTATAGCATGCNCATCGGCC-3'：N・N'は、T・A, A・T, C・G, G・Cのいずれかを表す。)を用いて、DNAへのポリアミドの結合の動的及び熱力学的性質を結合力、選択性及び立体特性の観点から表面プラズモン共鳴法で調べた。結果を図４に示す。このオリゴ核酸は、図３(a)又は(b)で示すように、Ｔ塩基選択的な認識部位を持つポリアミドとの結合部位を持ち、２点で固着されたヘアピン型DNAを形成する。
【００２８】
図３において、X/Yは脂肪族モノマーペアであって、β/β, β/γ, γ/β, γ/γ, β/γSO, β/γRO, γSO/β, γRO/β, β/γSN, β/γRN, γSN/β, γRN/βのいずれかを表す。N・N'は、T・A, A・T, C・G, G・Cのいずれかを表す。●はImを、○はPyを、βはβアラニン残基を、Dpは3-ジメチルアミノプロピルアミドを、⊂は２つのサブユニットを繋ぐγアミノ酪酸残基を、Acはアセチルを、表す。
【００２９】
図４において、各実験は３回繰り返され、1:1相互作用モデルに適合させた。全ての実験は、HBS-EP緩衝溶液を用い、センサチップ上同一量のDNAを用いて行った。
Ａ:β/βペアを持つポリアミド1とA・T塩基対とのペア。濃度は、3.75×10-8M（最低カーブ）から2.00×10-7M（最高カーブ）。Ｂ：β/SγαOHペアを持つポリアミド5とA・T塩基対とのペア。濃度は、2.00×10-8M（最低カーブ）から5.00×10-7M（最高カーブ）。Ｃ：β/SγαOHペアを持つポリアミド5とT・A塩基対とのペア。濃度は、1.00×10-8M（最低カーブ）から1.00×10-7M（最高カーブ）。Ｄ：β/SγαNH2ペアを持つポリアミド9とA・T塩基対とのペア。濃度は、1.00×10-8M（最低カーブ）から5.00×10-7M（最高カーブ）。Ｅ：β/SγαNH2ペアを持つポリアミド9とT・A塩基対とのペア。濃度は、1.50×10-7M（最低カーブ）から1.25×10-6M（最高カーブ）。
【００３０】
ポリアミド1-12の表面プラズモン共鳴の測定は、バイアコアX装置とSAセンサチップを用いHBS-EP緩衝液（0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 界面活性剤P20）に0.1%の中でDMSO(ジメチルスルホキサイド)を加えた溶液中で、25℃で行った。解離平衡定数(KD, M)は、図４に示すように、得られたセンサ図形を、機能化されたγモノマー/βとT・A, A・T, G・C, C・Gの４つの塩基対との結合の親和性と特異性を明らかにする理論モデルに適合させて求めた。KDから標準自由エネルギー変化(△G0 kcal/mol)をも求めた。
【００３１】
合理的で正確な結合定数を求めるために、各ポリアミノについていろいろな濃度で表面プラズモン共鳴測定を行った。ヘアピンDNAに結合するポリアミドの量的関係は、一つの結合座に１分子のポリアミドが結合したときの最大応答RUmaxを飽和時の応答RUと比較して決定した。１座モデルでは
RUmax = (RUDNA/MWDNA)×MWpolyamide×RII
となる。ここに、RUDNAはセンサチップ上に固定されたヘアピンDNAの量、MWはポリアミドとヘアピンDNAの分子量、そしてRIIは化合物の屈折率増加分とDNAの屈折率の比である。RIIは、1.25から1.40の値をとる。
【００３２】
（水酸基の立体化学の認識と結合の立体化学への効果）
DNAマイナーグルーブにあるT・A, A・T, G・C, C・G塩基対とペアを作る脂肪族モノマーを含有するポリアミド1-12,25-28の認識力を評価するため、その結合特性を表面プラズモン共鳴法で調べた。ペア作成モデルを図３に、結果を図４、図５及び図６に示す。
図５及び図６において実験誤差は10%より小さい。選択性はKD(T・A)/KD(A・T)として定義した。
以下のDNAの塩基配列式において、下線部はポリアミドの結合位置を示す。
【００３３】
調べた全てのポリアミドにおいて、5'-TGCNCA-3'(N=C,G)とは低濃度では結合しないが、高濃度では大きな非選択的な結合があることに注意すべきであろう。その結果正確な解離平衡定数を求めることができなかった。非置換脂肪族アミノ酸ペアをもつポリアミド1-4はついては、本実験条件において5'-TGCNCA-3'/3'-ACGN'GT-5'(N・N'=T・A及びA・T)との選択性は見られなかった。
しかし、ポリアミド2及び3のようにγアミノ酪酸（以下γと略記する。図３(a)において同じ。）を導入してβアラニン（以下βと略記する）とペアを作らせると、1のβ/βのペアと比較して、A-T塩基対への結合性が35倍及び4.7倍減少し、T-A塩基対への結合性が30倍及び4.5倍減少することが見つかったのは注意すべきである。
さらに２つのβを２つのγで置換したポリアミド4においては、5'-TGCACA-3'/3'-ACGTGT-5'との結合性が846倍、5'-TGCTCA-3'/3'-ACGAGT-5'との結合性が724倍減少する。これらの測定結果から、βの代わりに一つのγを入れてA-T塩基対及びT-A塩基対を認識させると、結合親和性は減少するが、大きい減少ではないことが分かる。
【００３４】
β/γSOを有するポリアミド5は、図５に示されるように5'-TGCTCA-3'/3'-ACGAGT-5'(N・N'=T・A)より5'-TGCACA-3'/3'-ACGTGT-5'(N・N'=A・T)との結合性が19倍大きい。脂肪族モノマーを持つポリアミド、例えばポリアミド5及び7におけるβ/γSOとγSO/β、の結合親和性をポリアミド5-12について比較すると次のことが分かる。α-ヒドロキシ-/アミノ置換γモノマーは、OH/NH2とTのO2の間の水素結合によりT塩基やA塩基を認識することができないが、しかし多分同時に２つの塩基すなわち5'-TG-3'を、OH/NH2とT塩基に隣接した3'-G塩基のN3との間の強い水素結合を通して認識している（図５）。
【００３５】
さらに、γモノマーのヒドロキシ置換基がα位置にあることは、T塩基に隣接する3'ターミナルグアニンのN3とこのOH基との間に今一つの水素結合があることを予想させる。このことは、ポリアミド5と5'-TGCNCA-3'/3'-ACGN'GT-5'(N・N'=T・A及びA・T)との結合選択性の理由であろう（図７）。また、γ残基のα位置のプロトンとグアニンのデオキシリポーズのH1'及び／又はH4'との間にはファンデルワールス力が働いている。これらを合わせて考えると、結合親和性及び選択性は隣の塩基と直接関係づけられることを暗示している。この場合、一つのβ/γSOペアを有するポリアミド5と5'-TGCTCA-3'/3'-ACGAGT-5'とが結合するとき、A塩基による大きな立体障害が、3'ターミナルグアニンのN3と水酸基との間の付加的な水素結合を弱め、より弱い親和性に導く。それゆえに、認識に際し、現実にはモノマーγSOが一つの5'-TG-3'を判別する。
【００３６】
図７はβ/γSOペアを持つポリアミド5とDNA(5'-GCATGCA/TCATCG-3'/5'-CGATGA/TGCATGC-3')との相互作用の分子モデルを示している。
(a)ポリアミド5と5'-GCATGCACATCG-3'/5'-CGATGTGCATGC-3'シーケンスとの1:1錯体の分子モデル。エネルギー最小法の計算で求めた。ポリアミドが太線で示されている。
(b)ポリアミド5とA・T塩基対の分子モデルの部分拡大図。(c)(b)において、水素結合を示した図。(d)ポリアミド5とT・A塩基対の分子モデルの部分拡大図。(e)(d)において、水素結合を示した図。
【００３７】
ポリアミド間の結合の違いを定量的に明確にするために、表面プラズモン共鳴の結果（図５）から錯体生成の熱力学パラメータである標準自由エネルギー変化(△G0)を求めた。5とA・T塩基対を有するシークエンスとの結合は、T・A塩基対を有するシークエンスとの結合より約2kcal/molだけ安定である。5'-TGCACA-3'/3'-ACGTGT-5'シークエンスとの結合がより安定なのは、5'-TGCTCA-3'/3'-ACGAGT-5'シークエンスとの結合と比較して解離速度がより遅いことと関係づけられる（図4B、4C）。ポリアミド5と5'-TGCACA-3'/3'-ACGTGT-5'の錯体の解離速度がより遅いのは、OH基とGのN3との間の水素結合が強くて開裂し難いことに基づいており、DNAマイナーグルーブでの水分子の放出や取り込みに関係していよう。
【００３８】
一方、γROモノマーを有するポリアミド6の5'-TGCACA-3'/3'-ACGTGT-5'と5'-TGCTCA-3'/3'-ACGAGT-5'とに対する認識を比較すると、わずか4.8倍しか選択性が増加しなかった（図５並びに図４A及びB）。5のγSOを同じ位置でγROに置き換えた6において、5'-TGCACA-3'/3'-ACGTGT-5'(N・N=T・A)及び5'-TGCTCA-3'/3'-ACGAGT-5'に対する結合が不安定となった。特に、γROがTと対向するときは、親和性が4.3倍低下した。これは、(R)α水酸基はB-DNAのマイナーグルーブの壁方向を向いていて壁と立体的にぶつかり系を不安定化するのに対し、(S)α水酸基はより好ましい立体的配向をとるので結合親和性が増加するものとして説明できる。
【００３９】
逆に、ポリアミド7と8はそれぞれγSO/βとγRO/βペアを有し、5'-TGCACA-3'/3'-ACGTGT-5'及び5'-TGCTCA-3'/3'-ACGAGT-5'に殆ど選択性なく結合する。しかし、その結合の親和性は、対応するβ/γSOペアを持つポリアミド5やβ/γROペアを持つポリアミド6と比較するとより大きい。このことは水酸基を持つγモノマーと側面にある塩基との間のファンデルワールス力が、選択性に重要な寄与をしていることを暗示している。
【００４０】
さらに、置換γ基を持つポリアミド5-12は不安定であるため、β/βペアを持つポリアミド1に比較して、5'-TGCACA-3'/3'-ACGTGT-5'及び5'-TGCTCA-3'/3'-ACGAGT-5'シークエンスをより明確に認識する。しかし、ポリアミド1と比較して、あるポリアミドは不安定化するが、他のものはそうではない（図５）。このことは、ポリアミドのDNAのシークエンス選択的認識での選択性は、結合の親和性を犠牲にして増加するとして説明できそうである。
【００４１】
以上の結果は、G・C塩基対とC・G塩基対の認識を除き、全てポリアミドとDNAの１：1の相互作用モデルに適合している。高濃度のポリアミドを使用したにもかかわらず、ポリアミドとヘアピンDNAとの２：１結合の例は確認できなかった。
【００４２】
ヘアピン部にγRO、γSO、γRN、γSNを有するポリアミド25-28も、ポリアミド1-12と同様にDNAのマイナーグルーブに結合してDNAを認識できることが図６に示されている。
【００４３】
（アミノ置換基の結合への効果）
β/γSNペアを持つポリアミド9は、5'-TGCTCA-3'/3'-ACGAGT-5'より5'-TGCACA-3'/3'-ACGTGT-5'シークエンスに9.6倍より強く結合する。これに対し、β/γRNペアを持つ10は、5'-TGCACA-3'/3'-ACGTGT-5'シークエンスに2.3倍より強く結合する（図５）。この選択性の差は、Sアミノ基とRアミノ基の結合の配向の差が認識能の差をもたらしているとして説明できる。さらに、図4Dと図4Eに示されている表面プラズモン共鳴の結果より、9とT・Aシークエンスの錯体の解離が速いことは、A・T及びT・A塩基対を持つシークエンス間の結合親和性の差に帰すことができる。同様に、図５に示されているように、△G値は、ポリアミド9がT・A塩基対よりA・T塩基対に結合しやすいことと対応している。
【００４４】
同様に、γSN/βを持つ11とγRN/βを持つ12とA・T及びT・A塩基対との間の結合親和力が殆ど等しいことも見いだされた。しかし、その結合安定性はγSN/βを持つ9やγRN/βを持つ10よりも大きかった。さらに、β/γSOを持つポリアミド5は、β/γSNを持つ9より5'-TGCACA-3'/3'-ACGTGT-5'や5'-TGCTCA-3'/3'-ACGAGT-5'により高い結合親和性を有しており、特に、T塩基側にγSOモノマーがあるときは約4.6倍の増加を示す。この差は、(S)αヒドロキシはプロトン化された(S)αアミノよりグアニンのN3とより強い水素結合を作ること、及び大きなプロトン化されたアミノはマイナーグルーブと立体的にぶつかり、若しくはDNAのマイナーグルーブに大きな歪を引き起こすためとして説明できる。要するに、水素結合能力は重要なファクターではあるが、DNAのマイナーグルーブやヘアピンポリアミドの表面の複雑さやファンデルワールス相互作用も、ポリアミドのDNAマイナーグルーブ認識に役割を果たしている。
【００４５】
（分子モデル）
ポリアミド5がT・A塩基対よりA・T塩基対に選択的にかつより強く結合しやすい機構は、5-DNA錯体の分子モデルをエネルギー最小法により求めてみるとはっきりする。結果を図7に示す。図7aに示されているように、ヘアピンポリイミド5は、DNAマイナーグルーブ内にA・T塩基対を持つ5'-GCATGCACATGC-3'/5'-CGATGTGCATGC-3'シーケンスと逆平行になってうまくはまりこみ、認識されるべき塩基と密接なコンタクトをとることが示されている。また、図7bと図7dとには、γモノマーのαヒドロキシが3'-GのN3に近く、γ残基とG塩基が互いに近くよくマッチしているのでOH基とGのN3との間に水素結合が生じていることを示している。5がA・T及びT・A塩基対を認識しているとき、この水素結合の長さはそれぞれ2.53Åと4.11Åであった（図7(C),(D)参照）。
【００４６】
しかし図7dに示されているように、5-T・A錯体の場合、A塩基の大きな立体構造は、γモノマーをマイナーグルーブの底から押しやり、5-A・T錯体に見られる(図7b)ような強い水素結合の生成を妨げ、ポリアミドモノマーとDNA塩基との間の好ましい芳香環の重なりに影響を及ぼしている。これらの効果の結果、5とT・A錯体の結合親和性はより弱くなっている。結論として、分子モデルは表面プラズモン共鳴の結果とよく一致しており、熱力学的に得られた結果を分子レベルで根拠づけている。
【００４７】
結論として、異なる脂肪族モノマーペア（β/β, β/γ, γ/β, γ/γ, β/γSO, β/γRO, γSO/β, γRO/β, β/γSN, β/γRN, γSN/β, γRN/β）を有する１２の新しいポリアミドを設計し合成し、それらのヘアピンDNAに対する結合の動力学的性質を表面プラズモン共鳴法で調べた。重要なことは、ポリアミドのγアミノ酪酸基のα置換基の立体構造は、非修飾βアラニン又はγアミノ酪酸と比較してDNAシーケンスとの結合性に影響を与えることが分かったことである。さらに重要なことは、β/γSOペアを持つポリアミドは、5'-TGCTCA-3'/3'-ACGAGT-5'より5'-TGCACA-3'/3'-ACGTGT-5'に対し19倍大きな選択性をもってより強く結合する一方、β/γSNを持つポリアミドはこれらの序列に対し9.6倍の選択性をもって結合することである。
【００４８】
DNAマイナーグルーブにおいてα置換γアミノ酪酸をもつヘアピンポリアミドによる認識は、γアミノ酪酸のα位置の置換基の側面にある塩基、立体構造、立体的大きさ、電子的及び水素結合能といった分子環境に大きな影響を受ける。表面プラズモン共鳴と分子モデルの結果を合わせると、αヒドロキシ修飾されたγアミノ酪酸はポリアミド構造の柔軟性に富んだサブユニットであるのみならず、ヘアピンポリアミドにおいて5'-TG-3'を認識するユニットであることを示している。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００５０】
（実験条件一般）
１H NMRスペクトルは、JEOL JNM-FX400超伝導NMR分光器により400MHzで測定した。この時、化学シフトは溶媒を基準にppm単位で、結合定数はヘルツ単位で示す。以下に示すNMRの結果において、sは１本線(singlet)を、dは２本線(doublet)を、tは３本線(triplet)を、qは４本線(qluartet)を、mは多重線(multiplet)を、brは幅広い線(broad)を示す。また、Hに引かれた下線は、複数の水素原子の内その水素原子の信号に帰属できることを示す。
【００５１】
紫外可視吸収スペクトルは、ベックマンのCoulter DU650型ダイオードアレイ分光光度計でバッファ溶液を用いて測定した。
MALDI-TOFスペクトルはブルカーダルトニクスのBioTOF II質量分析計で、ESI-質量スペクトルはアプライドバイオシステムズのAPI 165質量分析計で測定した。
【００５２】
薄層クロマトグラフ（TLC)は60F254(メルク)シリカゲルで覆ったガラス板上で、カラムクロマトグラフはシリカゲル60(63-200μm)を用いて行った。紫外光照射又はニンヒドリンスプレーにより可視化した。
高速液体クロマトグラフ(HPLC)は、東ソー株式会社のCCP & 8020シリーズシステムを用いた。分析には、150×10mmのChemco Pak Chemocoband 5-ODS-H逆相カラムを用い、溶媒には0.1%の酢酸を含む水とアセトニトリルの混合液を用い、流速は毎分3.0mLとし、254nmで検出した。合成用には、150×20mmのYMC-Pack R&D ODS DOD-5-ST S-5逆相カラムを用い、溶媒には0.1%の酢酸を含む水とアセトニトリルの混合液を用い、流速は毎分6.0mLとし、254nm若しくは350nmで検出した。分取した成分は、ESI又はTOF質量分析器により分析した。
【００５３】
バイアコア試験は、Biacore X systemを用いて行い、BIA評価4.1版でデータ解析を行った。純水は、ミリポアのMilliQ純水製造装置より18MΩの純水を得て用いた。バイアコア試験の水はさらに0.3μmで濾過し、脱ガスして用いた。
【００５４】
ヘアピンDNAはProligoより得て、精製することなく用いた。HBS-EP緩衝液とセンサチップはバイアコアAB(スウェーデン)から購入した。クリア樹脂、光学活性(S)及び(R)-α-t-ブトキシカルボニルアミノ-γ-(9-フルオレニルメトキシ)-カルボニルアミノ酪酸はペプチド国際(Peptides International)から購入した。Fmoc-ImCOOH、Fmoc-PyCOOH、DMF、DMSO、ピペリジン、ピリジンはWakoから、Fmoc-β-Ala-OH及びFmoc-γ-Abu-COOHはNovabiochemから購入した。なお、Fmocは、フルオレニルメトキシカルボニル基の略号である。(S)-α-ヒドロキシル-γ-アミノ酪酸(γSO)はAldrichから、(R)-α-ヒドロキシル-アミノ酪酸(γRO)はXiamen Forever Green Source Bio-Chem Technologyから購入した。その他の薬品類も標準的な試薬業者から購入した。
【００５５】
（モノマー合成：(2S)-4-(9-フルオレニルメトキシ)カーボニルアミノ-2-ヒドロキシ酪酸14a及びその(2R)体14b）
(9-フルオレニルメトキシ)カーボニルサクシイミド(Fmoc-ONSu)(6.72g, 24mmol)を90mLの1,2ジメトキシエタンに溶解させ、（S)-4-アミノ-2-ヒドロキシ酪酸13a(2.38g, 24mmol)と炭酸水素ナトリウム(2.0g)を30mLの水に溶かした水溶液中に常温で45分かけて撹拌しつつ滴下した。その後溶液を15時間攪拌し続けた。この反応の進行は、DCM/メタノール/酢酸(4/1/0.2 v/v)溶媒を用いて薄層クロマトグラフでモニターした。この溶液を濃塩酸で酸性とした後、ロータリーエバポレータで濃縮した。
残渣に20mLの氷水を加えて濾過し、少量の冷水で洗って白い固体を得た。濾液を同様に濃縮し、冷水を加えて濾過し、同様にして白い固体を得た。これらを合わせ、脱水し、白い固体を98.2%の収率で得た。HPLCにより純度は98%と確認した。この白い固体が14aであることをESI質量分析法により確認した。
【００５６】
14aの性質は次の通りである。
Rf: 0.70 (ジクロロメタン/メタノール/酢酸, 4/1/0.2 v/v)。
HPLC：tR＝19.73min。
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)：δ 7.87(d, J=7.6Hz, 2H, Fluoren H)、7.67(d, J=7.2Hz, 2H, Fluoren H)、7.40(m, 2H, Fluoren H)、7.32(m, 2H, Fluoren H)、4.25(m, 2H, OCH2)、4.22(m, 1H, Fluoren H)、3.97(dd, J=8.8Hz, J=4.0Hz, 1H, CH2CH)、3.10(m, 2H, NHCH2)、1.78及び1.59(m, 2H, CH2CH)。
ESI-MASS：calculated for C19H19NO5 341.13、  found 342.12[M+H]+ 。
【００５７】
化合物14bも化合物14aと同様に合成した。収量は95.8%、HPLCで判断した純度は98%であった。14bの性質は次の通りである。
Rf: 0.71 (ジクロロメタン/メタノール/酢酸, 4/1/0.2 v/v)。
HPLC：tR＝19.75min。
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)：δ 7.87(d, J=7.6Hz, 2H, Fluoren H)、7.67(d, J=7.2Hz, 2H, Fluoren H)、7.40(m, 2H, Fluoren H)、7.32(m, 2H, Fluoren H)、4.26(m, 2H, OCH2)、4.20(m, 1H, Fluoren H)、3.96(dd, J=8.7Hz, J=4.0Hz, 1H, CH2CH)、3.08(m, 2H, NHCH2)、1.79及び1.59(m, 2H, CH2CH)。
ESI-MASS：calculated for C19H19NO5 341.13、  found 342.12[M+H]+ 、 364.12[M+Na]+。
【００５８】
（(2S)-2-t-ブトキシ-4-(9-フルオレニルメトキシ)カルボニルアミノ酪酸t-ブチルエステル(15a)及びその(2R)体(15b)）
圧力フラスコを用いて14a(1g, 2.93mmol)を40μLの濃硫酸(98%)を入れた20mLの乾燥ジクロロメタン(DCM)に溶かし、低温で攪拌しながらその溶液にイソブチレンを20mL加えた。この溶液を室温まで徐々に温めつつ40時間攪拌し続けた。反応の進行はエチルアセトン-ヘキサン混合溶媒(1/2, v/v)を用いてTLCでモニターした。反応完結後溶液を室温で空気にさらし、過剰のイソブチレンを除いた。その後溶液を分液ロートに移し、3mLの水で洗い、2Mの水酸化ナトリウムを用いてpHを7.0にした。ジクロロメタン層を分離し、有機溶媒を回転蒸発法により注意深く除去した。残渣に酢酸エチル(5mL)と水(3mL)を加え、有機層をブリネ(3mL)を用いて洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて5時間乾燥し、濾過し、溶媒がなくなるまで乾燥し、1.41gの淡黄色油状の粗生成物を得た。この生成物をカラムクロマトグラフ(63-200μmシリカゲル)を用いてエチルアセテートとヘキサンの混合溶媒によるグラディエント溶離により精製し、1.01gの淡黄色油を76.5%の収率で得た。HPLCで見た純度は98%であった。ESI質量分析により、求める化合物15aであることを確認した。
【００５９】
15aの性質は次の通りである。
Rf: 0.52 (酢酸エチル/ヘキサン, 1/2 v/v)。
HPLC：tR＝29.70min。
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)：δ 7.88(d, J=7.2Hz, 2H, Fluoren H)、7.67(d, J=7.6Hz, 2H, Fluoren H)、7.40(m, 2H, Fluoren H)、7.31(m, 2H, Fluoren H)、7.24(t, J=4.8Hz, 1H, NH)、4.28(m, 2H, OCH2)、4.20(m, 1H, Fluoren H)、3.88(dd, J=8.8Hz, J=3.6Hz, 1H, CH2CH)、3.04(m, 2H, NHCH2)、1.67及び1.58(m, 2H, CH2CH)、1.39(s, 9H, COOCMe3)、1.09(s, 9H, OCMe3)。
ESI-MASS：calculated for C27H35NO5 453.25、  found 454.26[M+H]+。
【００６０】
15bも上記と同様に合成し、収率は79.6%、HPLCで見た純度は98%であった。15bの性質は次の通りである。
Rf: 0.53 (酢酸エチル/ヘキサン, 1/2 v/v)。
HPLC：tR＝29.70min。
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)：δ 7.88(d, J=7.6Hz, 2H, Fluoren H)、7.66(d, J=7.6Hz, 2H, Fluoren H)、7.40(t, 2H, Fluoren H)、7.31(m, 2H, Fluoren H)、7.23(t, J=4.8Hz, 1H, NH)、4.28(m, 2H, OCH2)、4.19(t, J=6.8Hz, 1H, Fluoren H)、3.89(dd, J=8.8Hz, J=4.0Hz, 1H, CH2CH)、3.03(m, 2H, NHCH2)、1.66及び1.57(m, 2H, CH2CH)、1.39(s, 9H, COOCMe3)、1.08(s, 9H, OCMe3)。
ESI-MASS：calculated for C27H35NO5 453.25、  found 454.27[M+H]+。
【００６１】
（(2S)-2-t-ブチルオキシ-4-(9-フルオレニルメトキシ)カルボニルアミノ酪酸(17a)及びその(2R)体(17b)）
15a(295.5mg, 0.65mmol)を150μLのN,N'ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を加えた6.5mLのジオキサンに溶かし、この溶液を攪拌しながらトリメチルシリルトリフルオロメタンスルフォン酸(TMSOTf, 215.6mg, 0.97mmol)を室温で25分間かけて滴下した。反応後の溶液をさらに50分間攪拌した。反応の進行は酢酸エチル/ヘキサン/酢酸混合溶媒(2/1/0.01, v/v)を用いてTLCでモニターした。反応完結後反応液を室温まで冷却した。氷水浴上で反応液に水(5mL)と酢酸エチル(8mL)を手早く加え、溶液を分液ロートに移した。有機層を分離し、5%の炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。
反応中間体である16aは極めて不安定であり、操作中に加水分解して標的化合物17aとなる。そのため得られた混合溶液を分離・精製することなく、10%の塩酸を加えてpH=5としてさらに2時間攪拌を続けた。反応溶液は、5%の炭酸水素ナトリウム、10%の硫酸カリウム、そして5mLのブリネで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、さらに乾燥して溶媒を除去した。こうして239.3mgの白色固体を92.6%の収率で得、純度はHPLCで見て98%であった。最終生成物はESI質量分析法により17aであることを確認した。
【００６２】
16aの性質は次の通りである。
Rf: 0.46 (酢酸塩/ヘキサン/酢酸, 2/1/0.01 v/v)。
HPLC：tR＝25.83min。
ESI-MASS：calculated for C26H35NO5Si 469.23、  found 470.21[M+H]+ 、492.23[M+Na]+。
【００６３】
17aの性質は次の通りである。
Rf: 0.28 (酢酸塩/ヘキサン/酢酸, 2/1/0.01 v/v)。
HPLC：tR＝24.01min。
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)：δ 12.3(br, 1H, COOH)、7.87(d, J=7.6Hz, 2H, Fluoren H)、7.67(d, J=7.2Hz, 2H, Fluoren H)、7.40(t, J=7.6Hz, 2H, Fluoren H)、7.30(t, J=7.6Hz, 2H, Fluoren H)、7.25(t, J=4.8Hz, 1H, NH)、4.27(m, J=6.4Hz, 2H, OCH2)、4.19(t, J=6.8Hz, 1H, Fluoren H)、3.94(dd, J=8.4Hz, J=3.6Hz, 1H, CH2CH)、3.04(m, 2H, NHCH2)、1.71及び1.60(m, 2H, CH2CH)、1.13(s, 9H, OCMe3)。
ESI-MASS：calculated for C23H27NO5 397.19、  found 398.26[M+H]+ 、420.17[M+Na]+。
【００６４】
17bも上記と同様に合成し、収率は88%、HPLCで見た純度は98%であった。
16bの性質は次の通りである。
Rf: 0.48 (酢酸塩/ヘキサン/酢酸, 2/1/0.01 v/v)。
HPLC：tR＝25.9min。
ESI-MASS：calculated for C26H35NO5Si 469.23、  found 470.22[M+H]+ 、492.25[M+Na]+。
17bの性質は次の通りである。
Rf: 0.28 (酢酸塩/ヘキサン/酢酸, 2/1/0.01 v/v)。
HPLC：tR＝24.0min。
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)：δ 12.3(br, 1H, COOH)、7.88(d, J=7.6Hz, 2H, Fluoren H)、7.67(d, J=7.2Hz, 2H, Fluoren H)、7.40(t, J=7.4Hz, 2H, Fluoren H)、7.31(t, J=7.6Hz, 2H, Fluoren H)、7.26(t, J=4.6Hz, 1H, NH)、4.28(m, 2H, OCH2)、4.19(t, J=6.0Hz, 1H, Fluoren H)、3.95(dd, J=8.2Hz, J=3.6Hz, 1H, CH2CH)、3.05(m, 2H, NHCH2)、1.71及び1.60(m, 2H, CH2CH)、1.11(s, 9H, OCMe3)。
ESI-MASS：calculated for C23H27NO5 397.19、  found 398.23[M+H]+ 、420.16[M+Na]+。
【００６５】
上記の合成スキームを図１に示した。各合成段階での試薬は次の通りである。(i)（S)-(-)-4-アミノ-2-水酸化ブチル酸(13a)又は(R)-(+)-4-アミノ-2-水酸化ブチル酸(13b)、炭酸水素ナトリウム、水、(ii)FmocONSu、1,2ジメトキシエタン、(iii)濃塩酸、(iv)98%硫酸、DCM、イソブチレン、(v)2M水酸化ナトリウム水溶液、(vi)TMSOTf、DIEA、ジオキサン、(vii)酢酸エチル水溶液、(viii)10%塩酸、(ix)5%炭酸水素ナトリウム及び10%硫酸カリウム水溶液。
【００６６】
（17aと17bの鏡像異性体純度の決定）
17a又は17b(7.95mg, 0.02mmol)をN,Nジメチルフォルムアミド(0.45mL)に溶かし、N-(ジメチルアミノ-1H-1,2,3トリアゾ[4,5-b]-ピリジノ-1-ylメチレン)-N-メチルメタンアミニウムヘキサフルオロリン酸(HATU)(22.8mg, 0.06mmol)とN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)(4.6μL)を加えた。この混合物を室温で約１５分間攪拌し、その後(S)-(-)-1-(1-ナフチル)エチルアミン(7.78mg, 0.0454mmol)を加えた。この混合物を室温で引き続き２時間攪拌した。反応の進行は酢酸エチル-ヘキサン混合溶媒(1/1, v/v)を用いてTLCでモニターした。
【００６７】
反応完結後、溶液に1mLの酢酸エチルを加え、10%のクエン酸(2×1mL)、引き続きブリン(1×1mL)で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮し、酢酸エチル/ヘキサン混合溶媒(2/1, v/v)を用いてクロマトグラフ(63-200μmシリカゲルカラム)で精製した。このようにして、17a(S)のアミド10.9mgを収率99%で、17b(R)のアミド10.8mgを収率99%で得た。生成物は、1H NMR及びESI質量分析により確認した。17a(S)のアミドはδ7.17ppmに３重線(J=5.4)、δ6.83ppmに２重線(J=8.0)を、17b(R)のアミドはδ7.23ppmに３重線(J=5.6)、δ6.96ppmに２重線(J=7.6)を示した。いずれのスペクトルにもジアステレオマー不純物(<3%)の混在を示す証拠は得られなかった。
【００６８】
（Fmoc化学によるポリアミド合成：固相での機械的手順）
機械を用いたポリアミド合成には、コンピュータ操作のPioneerペプチド合成機（アプライドバイオシステムズ）を用い、Fmoc化学を利用し、0.10mmol(200mgクリア樹脂, 0.52meq/g)スケールで操作した。反応位置は次の通りである。洗浄位置：N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、非ブロック化位置：ピペリジンのDMF20%溶液、活性化位置1：0.5M HATUのDMF溶液、活性化位置2：1.0MDIEAのDMF溶液、補助試薬位置1：メタノール、補助試薬位置3：5%無水酢酸と5%ピリジンのDMF溶液。全てのポリアミドの固相合成には次の条件を用いた。20%ピペリジンのDMF溶液による５分間の非ブロック化、0.5M HATU/DMFと1.0M DIEA/DMFによる２分間の活性化、60分間の結合、5%無水酢酸と5%ピリジンのDMF溶液による５分間のキャッピング、そして最後にメタノールによる洗浄、とした。モノマーをイミダゾールに結合する場合とイミダゾール自身を結合させる場合には、結合サイクルを2回用い、それ以外の結合には1回とした。
【００６９】
典型的な場合には、Fmocβアラニンクリアアシッド樹脂(200mg, 0.10mmol)を15mLのプラスチック遠心管内で3mLのDMFにより30分間膨潤させ、反応カラム中に装着した。DMF溶媒中のモノマーを入れたガラスシンチレーション管を前方から後方に順にラックに置いた。このようにしてよく知られたプログラムを用いコンピュータにより管理されながら合成が開始された。溶液を入れる前後には、全てのラインをアルゴンを用いて空にした。
【００７０】
ペプチド合成機による合成が完了後、樹脂はメタノール/ジクロロメタン混合溶媒(1/1, v/v)で洗浄し、真空中室温で乾燥した。その後、樹脂は20mLのガラスシンチレーション容器に入れ、5mLのジメチルアミノプロピルアミンを加え、溶液を55℃で一夜攪拌した。樹脂はセリット板を通して濾過して分離し、メタノール/ジクロロメタン混合溶媒(1/1, v/v)により洗浄した。濾液は10%塩酸を用いてpH4-5の酸性とし、溶媒を真空除去した。残渣を0.5mLのN,N-ジメチルホルムアミドに溶かし、不溶物を濾過して除いた。得られたポリアミド溶液は、HPLCにより精製した。1H NMR及びESI又はTOF質量分析法により確認後、凍結乾燥した目的のポリアミド1,2,3,4を白又は淡黄色粉として得た。
【００７１】
（Fmoc化学によるポリアミド合成：人工的合成手順）
ポリアミド5-12をアミノ又はヒドロキシル修飾されたモノマーから得るには、さらに次のステップが必要であった。ジメチルアミノプロピルアミン存在下、樹脂5a-12aからポリアミドを取り、HPLCで精製し、乾燥してから、t-ブトキシカルボニル(Boc)又はt-ブチルで保護されたポリアミドが得られ、1H NMR及びESI又はTOF質量分析法により確認した。
【００７２】
この後、生成物はトリフルオロ酢酸/トリイソプロピルシラン/トリメチルシラン/水混合溶媒(91/3/3/3, v/v)0.5μLを用いて室温窒素雰囲気下で30分間攪拌し、真空中でジクロロメタンを用いて溶媒を蒸発除去した。残渣に塩酸(0.5mL, 5M)を加え、冷水酸化カリウムとラップを用いて溶媒を真空除去した。残渣をHPLCで分離し分析し、1H NMR及びESI又はTOF質量分析法により確認した。最後に凍結乾燥して目的のポリアミド5-12を白色又は淡黄色粉として得た。
【００７３】
ポリアミドの製造手順を図２に示した。用いた８種類のX及びYは右に示している。各合成段階での試薬は次の通りである。(i)20%ピペリジン/DMF、(ii)FmocPyCOOH, HATU, DIEA、(iii)5%無水酢酸＋5%ピリジン/DMF、(iv)20%ピペリジン/DMF、(v)1a, 2a, 5a, 6a, 9a, 10aについてはFmoc-β-Ala-OH, HATU, DIEA、3a, 4aについてはFmoc-γ-Abu-COOH, HATU, DIEA、7aについては化合物17a, HATU, DIEA、8aについては化合物17b, HATU, DIEA、11aについては化合物23, HATU, DIEA、12aについては化合物24, HATU, DIEA、(vi)5%無水酢酸＋5%ピリジン/DMF、(vii)20%ピペリジン/DMF、(viii)FmocPyCOOH, HATU, DIEA、(ix)5%無水酢酸＋5%ピリジン/DMF、(x)20%ピペリジン/DMF、(xi)FmocImCOOH, HATU, DIEA、(xii)5%無水酢酸＋5%ピリジン/DMF、(xiii)20%ピペリジン/DMF、(xiv)Fmoc-γ-Abu-COOH、(xv)5%無水酢酸＋5%ピリジン/DMF、(xvi)20%ピペリジン/DMF、(xvii)FmocPyCOOH, HATU, DIEA、(xviii)5%無水酢酸＋5%ピリジン/DMF、(xix)20%ピペリジン/DMF、(xx)FmocImCOOH, HATU, DIEA、(xxi)5%無水酢酸＋5%ピリジン/DMF、(xxii)20%ピペリジン/DMF、(xxiii)1a, 3a, 7a, 8a, 11a, 12aについてはFmoc-β-Ala-OH, HATU, DIEA、2a, 4aについてはFmoc-γ-Abu-COOH, HATU, DIEA、5aについては化合物17a, HATU, DIEA、6aについては化合物17b, HATU, DIEA、9aについては化合物23, HATU, DIEA、10aについては化合物24, HATU, DIEA、(xxiv)5%無水酢酸＋5%ピリジン/DMF、(xxv)20%ピペリジン/DMF、(xxvi)FmocImCOOH, HATU, DIEA、(xxvii)5%無水酢酸＋5%ピリジン/DMF、(xxviii)1-4についてはN,N-ジメチルアミノプロピルアミン、5-12についてはBoc-及びt-ブチル保護のもの、55℃、一昼夜、(xxiv)5-12についてTFA/TMS/TIS/H2O(91/3/3/3, v/v)。
【００７４】
なお、この合成法によれば、PyやImの繰り返し数は任意であり、請求項３に記載したようにp, q, r, s, tは任意に選ぶことができる。また、PyとImの配列や置換基Zも任意に選ぶことができる。
【００７５】
製造したポリアミド25-28について分析結果を以下に示す。
ポリアミド25の性質は次の通りである。
白色粉末としての収量： 8.53%。
HPLC: tR = 11.60 min at a 98% min. purity。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):  d 10.35 (s, 1H, aromatic NH), d 10.29 (s, 1H, aromatic NH),  10.18 (s, 1H, aromatic NH), 9.87 (s, 1H, aromatic NH), 9.83 (s, 1H, aromatic NH), 9.44 (s, 1H, aromatic NH), 8.04 (m, 2H, aliphatic NH), 7.80 (t, 1H, aliphatic NH), 7.87-7.84 (m, 2H, aliphatic NH), 7.45 (s, 1H, aromatic CH), 7.43 (s, 1H, aromatic CH), 7.36 (s, 1H, aromatic CH), 7.20 (m, 2H, aromatic CH), 7.11 (d, 4JH,H = 1.6 Hz, 1H, aromatic CH), 6.92 (m, 2H, aromatic CH), 6.62 (d, 4JH,H = 1.6 Hz, 1H, aromatic CH), 4.14 (dd, 3JH,H = 8.0 Hz, 3JH,H = 3.6 Hz, 1H, CH2CH2CHOH), 3.95 (s, 3H, NCH3), 3.94 (s, 3H, NCH3), 3.90 (s, 3H, NCH3), 3.80 (s, 3H, NCH3), 3.79 (s, 3H, NCH3), 3.76 (s, 3H, NCH3), 3.51 (m, 2H, NHCH2), 3.42 (m, 2H, NHCH2), 3.32 (m, 4H, 2NHCH2), 3.03 (q, 2H, NHCH2), 2.60 (t, 3JH,H = 6.8 Hz, 2H, COCH2), 2.46 (m, 2H, NMe2CH2), 2.29 (t, 3JH,H = 6.8 Hz, 2H, COCH2), 2.15 (t, 3JH,H = 7.2 Hz, 2H, COCH2), 2.06 (s, 6H, N(CH3)2), 1.97 (s, 1H, COCH3), 1.72 (m, 2H, CH2CH2CHOH), 1.48 (m, 2H, CH2CH2CH2)。 
ESI-Mass: m/z calcd for C53H71N21O12: 1193.5591; found: 1194.5700 [M+H]+, 597.7964 [M+2H]2+。
【００７６】
ポリアミド26の性質は次の通りである。
白色粉末としての収量：18.7%。 
HPLC: tR = 11.55 min at a 98% min. purity。 
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):  d 10.35 (s, 1H, aromatic NH), 10.29 (s, 1H, aromatic NH), 10.19 (s, 1H, aromatic NH), 9.88 (s, 1H, aromatic NH), 9.83 (s, 1H, aromatic NH), 9.42 (s, 1H, aromatic NH), 8.06-7.99 (m, 3H, aliphatic NH), 7.88 (m, 2H, aliphatic NH), 7.45 (s, 4JH,H = 2.0 Hz, 1H, aromatic CH), 7.43 (s, 4JH,H = 2.0 Hz, 1H, aromatic CH), 7.36 (s, 4JH,H = 2.0 Hz, 1H, aromatic CH), 7.20 (m, 2H, aromatic CH), 7.10 (s, 1H, aromatic CH), 6.93 (m, 2H, aromatic CH), 6.64 (s, 1H, aromatic CH), 4.13 (m, 1H, CH2CH2CHOH), 3.95 (d, 4JH,H = 2.0 Hz, 3H, NCH3), 3.94 (d, 4JH,H = 2.0 Hz, 3H, NCH3), 3.89 (d, 4JH,H = 2.0 Hz, 3H, NCH3), 3.79 (s, 3H, NCH3), 3.78 (s, 4JH,H = 2.0 Hz, 3H, NCH3), 3.76 (s, 4JH,H = 1.6 Hz, 3H, NCH3), 3.50-3.32 (m, 8H, 4NHCH2), 3.05 (q, 2H, NHCH2), 2.59 (t, 3JH,H = 5.6 Hz, 2H, COCH2), 2.43 (m, 2H, NMe2CH2), 2.28 (m, 4H, 2COCH2), 2.07 (s, 6H, N(CH3)2), 1.97 (s, 1H, COCH3), 1.74 (m, 2H, CH2CH2CHOH), 1.57 (m, 2H, CH2CH2CH2)。 
ESI-Mass: m/z calcd for C53H71N21O12: 1193.5591; found: 1194.5987 [M+H]+, 597.7986 [M+2H]2+。
【００７７】
ポリアミド27の性質は次の通りである。
白色粉末としての収量：20.5%。
HPLC： tR = 9.95 min at a 98% min. purity。 
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):  d 10.35 (s, 1H, aromatic NH), 10.29 (s, 1H, aromatic NH), 10.07 (s, 1H, aromatic NH), 9.91 (s, 2H, aromatic NH), 9.85 (s, 1H, aromatic NH), 8.17 (t, 1H, aliphatic NH), 8.07 (t, 1H, aliphatic NH), 8.00 (t, 1H, aliphatic NH), 7.96 (t, 1H, aliphatic NH), 7.87 (t, 1H, aliphatic NH), 7.47 (s, 1H, aromatic CH), 7.44 (s, 1H, aromatic CH), 7.36 (s, 1H, aromatic CH), 7.21 (m, 2H, aromatic CH), 7.16 (d, 4JH,H = 1.6 Hz, 1H, aromatic CH), 6.98 (d, 4JH,H = 1.6 Hz, 1H, aromatic CH), 6.93 (d, 4JH,H = 1.6 Hz, 1H, aromatic CH), 6.64 (d, 4JH,H = 1.6 Hz, 1H, aromatic CH), 4.18 (m, 1H, CH2CH2CHNH2), 3.95 (s, 3H, NCH3), 3.94 (s, 3H, NCH3), 3.90 (s, 3H, NCH3), 3.80 (s, 6H, 2NCH3), 3.76 (s, 3H, NCH3), 3.51-3.31 (m, 10H, 5NHCH2), 3.07 (m, 2H, NHCH2), 2.59 (m, 4H, NMe2CH2＋NHCH2), 2.43 (s, 6H, NMe2), 2.31 (t, 3JH,H = 6.8 Hz, 2H, COCH2), 1.97 (s, 3H, COCH3), 1.80 & 1.97 (m, 2H, CH2CH2CHNH2), 1.63 (m, 2H, CH2CH2CH2)。 
ESI-Mass: m/z calcd for C53H72N22O11: 1192.5751; found: 1193.7769 [M+H]+, 597.7783 [M+2H]2+。
【００７８】
ポリアミド28の性質は次の通りである。
白色粉末としての収量： 9.80%。
HPLC: tR = 9.93 min at a 98% min. purity。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):  d 10.34 (s, 1H, aromatic NH), 10.29 (s, 1H, aromatic NH), 10.15 (s, 1H, aromatic NH), 9.90 (s, 2H, aromatic NH), 9.83 (s, 1H, aromatic NH), 8.06 (m, 2H, aliphatic NH), 7.99 (t, 1H, aliphatic NH), 7.87 (m, 2H, aliphatic NH), 7.45 (s, 1H, aromatic CH), 7.43 (s, 1H, aromatic CH), 7.36 (s, 1H, aromatic CH), 7.20 (br, 2H, aromatic CH), 7.11 (s, 1H, aromatic CH), 6.94 (s, 1H, aromatic CH), 6.92 (s, 1H, aromatic CH), 6.62 (s, 1H, aromatic CH), 4.19 (m, 1H, CH2CH2CHNH2), 3.94 (s, 6H, 2NCH3), 3.90 (s, 3H, NCH3), 3.79 (s, 6H, 2NCH3), 3.76 (s, 3H, NCH3), 3.51-3.30 (m, 10H, 5NHCH2), 3.03 (m, 2H, NHCH2), 2.59 (m, 2H, NMe2CH2), 2.28 (t, 3JH,H = 6.8 Hz, 2H, COCH2), 2.19 (t, 3JH,H = 6.8 Hz, 2H, COCH2), 2.10 (s, 6H, NMe2), 1.97 (s, 3H, COCH3), 1.60 & 0.98 (m, 2H, CH2CH2CHNH2), 1.50 (m, 2H, CH2CH2CH2)。
ESI-Mass: m/z calcd for C53H72N22O11: 1192.5751; found: 1193.8657 [M+H]+, 597.6786[M+2H]2+。
【００７９】
（表面プラズモン共鳴試験）
全ての表面プラズモン共鳴測定はバイアコアX装置を用い25℃で行った。biotin化されたヘアピンDNA：5'-biotin-GGCCGATGN'GCATGCTATAGCATGCNCATCGGCC-3'(N・N'：T・A, A・T, G・C, C・G)はプロリゴ(proligo)から得た。ストレプトアビジン機能化されたSAセンサチップはバイアコア(Biacore)から購入した。これらヘアピンDNAのセンサチップへの固定や、ポリアミドのヘアピンDNAへの結合曲線の測定や、データ解析は、以下の手順で行った。
【００８０】
（ビオチン化されたDNAの固定）  
ストレプトアビジン被覆化されたSAセンサチップを装置に装着後、HBS-EP緩衝液で３回洗い、バイアコア基準化液(40%グリセロール水溶液)で基準化し、ベースラインが安定するまで約10分間その緩衝液を10μL/minの速度で流した。その後、センサチップは、結合していないストレプトアビジンをセンサ表面から除去するため、1M塩化ナトリウム/50mM水酸化ナトリウムの溶液で10μL/minの流速で3-5回流し調子を整えた。その後その緩衝液を水酸化ナトリウムを除去するためベースラインが安定するまで10分間流した。同様に、配管を洗浄するため20μLの緩衝液を同じ流速で3回流した。
DNAをセンサチップに固定する前に、5'にビオチン化したDNA緩衝溶液100μLをジメチルスルホキシドを加えることなく85℃で2分間加熱し、ゆっくりと常温に戻して復元した。その後DNAは、2μL/minの流速で適当量のDNA溶液を予定した固定化レベルになるまで注入して、選択したフローセルに固定化した。DNA注入終了後、センサの感度が一定になるまで緩衝液はセルに流し続けた。DNAを固定していないフローセルを、マトリックス効果の基準として用いた。
【００８１】
（表面プラズモン共鳴測定の一般的手順）
いろいろな濃度のポリアミド溶液を、DMSOを溶媒とした保存溶液(10mM)に0.1%のジメチルスルホキシドを加えたHBS-EP緩衝液を加えて薄めることにより調製した。濃度は294nmでの紫外吸収により確認した。特記しない限り以下の測定には上記の緩衝液を用い、この緩衝液又は10mMのグリシン-HCl液(pH=1.5)を再生溶液として用いた。
典型的には、ベースラインが安定してから、緩衝液を5μL/minの流速でブランクとして注入した。それから5nMから5μMの範囲の濃度で試料を同じ条件で流した。前回測定の影響を避けるため、試料は薄いものから濃いものの順に注入した。BIA評価4.1プログラムを用い、時間に対する信号を質量移行効果モデルにフィティングし、動的な解析を行った。
【００８２】
（分子モデルの計算法）
CVFF力場パラメータを使用しDiscoverプログラム(MSI, San Diego, USA)を用いて最小化を行った。初期構造は、NMRにより定めたIMPyPy-γ-PyPyPy-5'-d(CGCTAACAGGC)-3'/5'-d(GCCTGTTAGCG)-3'錯体の構造を基とした。脂肪族モノマーは標準的な結合長と結合角を用いてポリアミドに挿入した。22個のナトリウムカチオンは、リン原子から2.21Åの距離でO-P-O角の２等分位置に置いた。得られた錯体は10Åの水層にひたされた。全系はRMSが0.001kcal/molÅ以下となるように無条件に最小化した。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】２つの新しいモノマーの合成スキーム。
【図２】ポリアミドの合成スキーム。
【図３】ポリアミドのヘアピンDNAとの相互作用の分子モデル。(a)Wが(CH2)3の場合、(b)WがγSO若しくはγROの場合。
【図４】ポリアミドとセンサチップ上に固定されたヘアピンDNAとの相互作用による表面プラズモン共鳴信号の時間変化。
【図５】ポリアミド1-12のヘアピンDNAとの解離平衡定数(M)及び選択性の表。
【図６】ポリアミド1,25-28のヘアピンDNAとの解離平衡定数(M)及び選択性の表。
【図７】β/γSOペアを持つポリアミド5とDNA(5'-GCATGCA/TCATCG-3'/5'-CGATGA/TGCATGC-3')との相互作用の分子モデル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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