(57)【要約】【課題】  ＤＬＢＣＬのサブグループを適切に評価するための遺伝子検出方法、及びそのためのＤＮＡマイクロアレイを提供すること。【解決手段】  ＤＬＢＣＬ患者について、特定の２４個の遺伝子群（ＣＤ５特定遺伝子群）の発現量を調べることにより、ＤＬＢＣＬのサブグループ（すなわち、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬ及びＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬ）を特定することができる。また、従来の胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬ及び活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬの分類と組み合わせることにより、ＤＬＢＣＬを４つのサブグループに分類すると、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬかつ活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬは、その他の３つのグループに比較すると、有意に予後不良であることがわかった。【選択図】          図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＬＢＣＬ患者において、ＤＰＰＡ４、ＴＣＬ１Ａ、Ｃ１２ＯＲＦ１２、ＴＲＰＭ４、ＳＭＰＤ３、ＴＮＮＣ２、ＴＣＬ１Ｂ、ＭＬＡＴ４、ＭＡＧＥＡ９、ＢＳＰＲＹ、ＦＬＪ１２５０５、ＧＺＭＢ、ＭＭＰ９、ＣＴＳＫ、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＳＦ−２、ＬＡＭＢ３、ＳＬＣ１Ａ１、ＬＭＯ２、ＣＬＵ、ＣＲ２、ＵＣＨＬ１の２４個のうち、少なくとも１個の遺伝子の発現量を比較することにより、ＤＬＢＣＬのサブグループを特定することを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法を実施するためのものであって、前記２４個の遺伝子のうち、少なくとも１個の遺伝子の塩基配列、またはこの塩基配列に相補的な塩基配列のうちの全部または一部と実質的に同一な塩基配列を備えた核酸がスポットされたことを特徴とするＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の方法に基づいて特定されたサブグループであるＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬ及びＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬについて、別のサブグループである胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬ及び活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬとを組み合わせることを特徴とするＤＬＢＣＬの分類方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（Diffuse large B-cell lymphoma：以下、「ＤＬＢＣＬ」という）を特定の遺伝子の発現プロファイルに基づいて分類することにより、治療計画・予後評価等に資するための遺伝子検出方法、及びその方法に用いるＤＮＡマイクロアレイに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＤＬＢＣＬは、非ホジキンリンパ腫のなかでは最も一般的なタイプであり、病態生理学的に多様なグループを含むことが知られている（Harris NL, Jaffe ES, Stein H, et al. A revised European-American classification of lymphoid neoplasms: a proposal from the International Lymphoma Study Group. Blood 1994; 84: 1361-92.,  Offit K, Le Coco F, Louie DC, Parza NZ, et al. Rearrangement of BCL6 gene as a prognostic marker in diffuse large cell lymphoma. N Engl J Med 1994; 331: 74-80.,  Kramer MHH, Hermans J, Wijburg E, et al. Clinical relevance of BCL2, BCL6, and MYC rearrangements in diffuse large B-cell lymphoma. Blood 1998; 92: 3152-62., Monti S, Savage KJ, Kutok JL, Feuerhake F, Kurtin P, Mihm M, Wu B, Pasqualucci L, Neuberg D, Aguiar RC, Dal Cin P, Ladd C, Pinkus GS, Salles G, Harris NL, Dalla-Favera R, Habermann TM, Aster JC, Golub TR, Shipp MA. Molecular profiling of diffuse large B-cell lymphoma identifies robust subtypes including one characterized by host inflammatory response. Blood. 2005 Mar 1;105(5):1851-61. Epub 2004 Nov 18.）。
【０００３】
また、ＤＬＢＣＬ患者は、極めて異なる臨床経過と治療への反応性を示すことから、ＤＬＢＣＬは臨床的にも多様である（Fisher RI, Gaynor ER, Dahlberg S, et al. Comparison of a standard regimen (CHOP) with three intensive chemotherapy regimens for advanced non-Hodgkin's lymphoma. N Engl J Med. 1993; 328: 1002-6.,  Coiffier B, Lepage E, Briere J, et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 2002; 346: 235-42., Shipp MA, Ross KN, Tamayo P, et al. Diffuse large B-cell lymphoma outcome prediction by gene-expression profiling and supervised machine learning. Nat Med 2002; 8: 68-74.）。このため、ＤＬＢＣＬのサブグループを同定することの重要性が注目されてきた。
【０００４】
このようなサブグループの一つとして、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（mediastinal large B-cell lymphoma：ＰＭＢＬ）と称するサブグループが知られている。このグループは、特定の起源を持つ腫瘍細胞と特徴的な臨床像によって区別される（Cazals-Hatem D, Lepage E, Brice P, et al. Primary mediastinal large B-cell lymphoma. A clinicopathologic study of 141 cases compared with 916 nonmediastinal large B-cell lymphomas, a GELA (”Groupe d'Etude des Lymphomes de l'Adulte”) study. Am J Surg Pathol. 1996; 20: 877-88.,  Rosenwald A, Wright G, Leroy K, et al. Molecular diagnosis of primary mediastinal B cell lymphoma identifies a clinically favorable subgroup of diffuse large B cell lymphoma type to Hodgkin lymphoma. J Exp Med. 2003; 198: 851-62.）。
【０００５】
上記サブグループを除外しても、ＤＬＢＣＬは更に広い範囲の異なる実在を含むと考えられている（Gatter KC and Warnke RA. Diffuse large B-cell lymphoma, In: Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW, eds. World health classification of tumors. Pathology & Genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. Washington: IARC press, Lyon; 2001. 171-4.）。例えば、非特許文献１では、ＤＬＢＣＬには、予後が良好な胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬ（germinal-center B-cell-like DLBCL）と、予後不良な活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬ（activated B-cell-like DLBCL）が存在することが示されている。また、非特許文献２には、その他に中間型として、タイプ３  ＤＬＢＣＬが存在することが示されている。
【０００６】
【非特許文献１】Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature 2000; 403: 503-11.
【非特許文献２】Rosenwald A, Wright G, Chan WC, et al. The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse la  rge-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 2002; 346: 1937-47.
【非特許文献３】Monti S, Savage KJ, Kutok JL, Feuerhake F, Kurtin P, Mihm M, Wu B, Pasqualucci L, Neuberg D, Aguiar RC, Dal Cin P, Ladd C, Pinkus GS, Salles G, Harris NL, Dalla-Favera R, Habermann TM, Aster JC, Golub TR, Shipp MA. Molecular profiling of diffuse large B-cell lymphoma identifies robust subtypes including one characterized by host inflammatory response. Blood. 2005 Mar 1;105(5):1851-61. Epub 2004 Nov 18
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記サブグループについては、必ずしも的確に予後の評価を行えるとは限らないことから、更なるグループ分けの方法が望まれていた。本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＤＬＢＣＬのサブグループを適切に評価するための遺伝子検出方法、及びそのためのＤＮＡマイクロアレイを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、従来はＤＬＢＣＬの中に含まれると考えられていたＣＤ５＋ＤＬＢＣＬが、臨床的に異なるＤＬＢＣＬのサブグループに分けられることを見出した（Harada S, Suzuki R, Uehira K, et al. Molecular and immunological dissection of diffuse large B cell lymphoma: CD5+, and CD5 with CD10+ groups may constitute clinically relevant subtypes. Leukemia 1999; 13: 1441-7.,  Yamaguchi M, Seto M, Okamoto M, et al. De novo CD5+ diffuse large B-cell lymphoma: a clinicopathologic study of 109 patients. Blood 2002; 99: 815-21.）。このサブグループは、全てのＤＬＢＣＬ中の約１０％が含まれ、ＣＤ５−ＤＬＢＣＬに比べて、より攻撃的な臨床的特徴と、より悪い予後によって特徴付けられる。また、ＣＤ５＋ＤＬＢＣＬの遺伝的異常についても、同定を行った（Karnan S, Tagawa H, Suzuki R, et al. Analysis of chromosomal imbalances in de novo CD5-positive diffuse large-B-cell lymphoma detected by comparative genomic hybridization. Genes Chromosomes Cancer 2004; 39: 77-81.,  Tagawa H, Tsuzuki S, Suzuki R, et al. Genome-Wide Array-based Comparative Genomic Hybridization of Diffuse Large B-Cell Lymphoma: Comparison between CD5-Positive and CD5-Negative Cases. Cancer Res. in press.）。
【０００９】
これまでは、ＣＤ５＋ＤＬＢＣＬのｍＲＮＡ発現プロファイル分析は、臨床症状との関連については触れられておらず、限られた分析しか行われていない（Kobayashi T, Yamaguchi M, Kim S, et al. Microarray reveals differences in both tumors and vascular specific gene expression in de novo CD5+ and CD5- diffuse large B-cell lymphomas. Cancer Res 2003; 63: 60-6.,  Gascoyne RD, Dave S, Zettl A, et al. Gene expression microarray analysis of de novo CD5+ diffuse large B-cell lymphoma (LLMPP Study). Blood 2003; 102: 178a. Abstract 621.）。そこで我々は、ＣＤ５＋ＤＬＢＣＬ及びＣＤ５−ＤＬＢＣＬのｍＲＮＡ発現プロファイルの違いを検討し、発現量の異なる遺伝子を選択し、クラスター分析を行った。その結果、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬとＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬの二つのサブグループを同定することができた。これら二つのサブグループについて、３つの特徴が確認された。
【００１０】
すなわち、（１）ＣＤ５＋ＤＬＢＣＬのほとんどは、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬに含まれた。（２）ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬは、ＭＭＰ９、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＳＦ−２、ＬＡＭＢ３のような細胞外マトリックスと関係する遺伝子の発現が減少するという特徴的なｍＲＮＡ発現プロファイルを有していた。（３）ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬは、ＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬに比べると、有意に悪い予後を示した。
【００１１】
これらのＤＬＢＣＬのサブグループは、われわれのものではない、一般公開されている別のＤＬＢＣＬマイクロアレイデータによっても、確認された。加えて、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬ及びＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬによる分類、並びに胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬ及び活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬによる分類を組み合わせることによって、ＤＬＢＣＬを４つのグループに分類し、非常に予後の悪いＤＬＢＣＬのサブグループを同定することに成功した。こうして、基本的には本発明を完成するに至った。
【００１２】
上記課題を解決するために、第１の発明は、ＤＬＢＣＬ患者において、ＤＰＰＡ４、ＴＣＬ１Ａ、Ｃ１２ＯＲＦ１２、ＴＲＰＭ４、ＳＭＰＤ３、ＴＮＮＣ２、ＴＣＬ１Ｂ、ＭＬＡＴ４、ＭＡＧＥＡ９、ＢＳＰＲＹ、ＦＬＪ１２５０５、ＧＺＭＢ、ＭＭＰ９、ＣＴＳＫ、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＳＦ−２、ＬＡＭＢ３、ＳＬＣ１Ａ１、ＬＭＯ２、ＣＬＵ、ＣＲ２、ＵＣＨＬ１の２４個のうち、少なくとも１個または２個〜２４個の任意の整数個の遺伝子の発現量を比較することにより、ＤＬＢＣＬのサブグループを特定することを特徴とする遺伝子検出方法である。
上記２４個の遺伝子は、我々の研究によって、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬとＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬとの間で発現プロファイルが、２.５倍以上も異なっていることが明らかとなった。各遺伝子の発現量の変化は、図１〜図７を参照することにより、より一層明らかとなる。また、２４個の遺伝子のうち、少なくとも１個の遺伝子の発現量を比較することにより、ＤＬＢＣＬのサブグループの特定が可能であることは、図１、図３、または図５の各患者のデータを参照すれば容易に理解できる。
【００１３】
第２の発明は、上記第１の発明を実施するためのものであって、前記２４個の遺伝子のうち、少なくとも１個または２個〜２４個の任意の整数個の遺伝子の塩基配列、またはこの塩基配列に相補的な塩基配列のうちの全部または一部と実質的に同一な塩基配列を備えた核酸がスポットされたことを特徴とするＤＮＡマイクロアレイである。
「遺伝子の塩基配列、またはこの塩基配列に相補的な塩基配列」とは、ｍＲＮＡ、またはこれに相補的なｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ等の核酸を含むことを意味している。
【００１４】
「全部または一部」とは、ターゲットとなる遺伝子の全長またはその一部（例えば、数十個程度の長さ）を備えていることを意味しており、具体的には、その遺伝子の発現を確認できる程度の長さを備えていれば足りる。
「実質的に同一」とは、目的とする塩基配列を備えたＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを意味しており、両ＤＮＡの塩基配列間のホモロジーが好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上のものを意味している。なお、ストリンジェントな条件とは、例えば、（１）温度約４０℃以上、塩濃度約５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成は、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝液［ｐＨ７．０］、１５０ｍＭ  塩化ナトリウムである）、好ましくは、（２）約５０℃以上、約２×ＳＳＣ、更に好ましくは、（３）約６５℃以上、約０.１×ＳＳＣでのハイブリダイズ条件をいうが、これらの条件に制限されるものではない。また、上記条件以外にも、モレキュラー・クローニング（第２版）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ１：  Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されているハイブリダイゼーションの条件に準じることができる。
【００１５】
「ＤＮＡマイクロアレイ」とは、ガラスや半導体材料などの基板上に多種類のＤＮＡ断片や合成オリゴヌクレオチド（以下、「ＤＮＡ断片等」という）を高密度に貼り付けたバイオ素子の総称を意味している。マイクロアレイ上のＤＮＡ断片等とターゲットとなる遺伝子の発現量を反映する核酸（ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ）が、二本鎖を形成する現象を原理として、複数の遺伝子の発現状態を網羅的に解析することができる。
【００１６】
第３の発明は、第１の発明に基づいて特定されたサブグループであるＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬ及びＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬについて、別のサブグループである胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬ及び活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬとを組み合わせることを特徴とするＤＬＢＣＬの分類方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ＤＬＢＣＬ患者のサブグループを同定することができるので、治療計画、予後評価等に有効に役立てることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
本実施形態の遺伝子検出方法は、リンパ腫患者から調製された核酸サンプルにおいて、特定の遺伝子の発現量を調べることにより、その患者のＤＬＢＣＬサブグループを特定するためのものである。
【００１９】
リンパ腫患者の核酸サンプルを調製するための試料としては、血液・髄液・組織液等の体液、生検により採取された生体組織が例示されるが、好ましくは生体組織、更に好ましくはリンパ節組織である。これらの試料中には、リンパ腫の種類に応じて発現されたｍＲＮＡが存在している。試料中から、ＲＮＡ（トータルＲＮＡ、またはｍＲＮＡ）を調製する。トータルＲＮＡを調製する場合には、当業者にとって公知のいずれの方法を用いても良い（例えば Oncogene, 1992(7), 1401-1406 に記載の方法に従って、調製することができる）。
【００２０】
調製されたｍＲＮＡ（或いは、トータルＲＮＡ中のｍＲＮＡ）をそのまま用いることもできるが、一般的には、これをテンプレート核酸として、プローブ核酸（ｃＤＮＡ、或いはｃＲＮＡ）を調製する。ＤＬＢＣＬ患者試料から調製した被験用プローブ核酸は、ＤＮＡマイクロチップに使用可能な物質で標識しておく。具体的には、プローブ核酸を調製する際に、標識化ヌクレオチドを取り込むことにより、プローブ核酸が検出可能な構成としておく。標識化ヌクレオチドとしては、検出感度が高く、かつ取り扱いの点から、蛍光物質（Ｃｙ３やＣｙ５等）、またはビオチンにより標識化されたヌクレオチドが使用される。この標識化ヌクレオチドは、テンプレート核酸からプローブ核酸を調製する際に、プローブ核酸に取り込まれることで、そのプローブ核酸自体を標識化する。なお、ビオチンにより標識化されたヌクレオチドの場合には、標識化されたポリヌクレオチドをＥＬＩＳＡにより可視化することができる。
【００２１】
なお、コントロール（比較対象）となるコントロール用プローブ核酸は、リンパ腫に罹患していない者（非ＤＬＢＣＬ患者）の試料から調製したものを使用する。この場合に、両プローブ核酸では、それぞれ異なる標識化ヌクレオチドを用いることが好ましい。
次に、ＤＮＡマイクロアレイ法により、特定の遺伝子の発現量を調べる。ＤＮＡマイクロアレイ法は、１枚のスライドガラス（又はプラスチック板）上に数十〜数百種類以上のターゲットＤＮＡをそれぞれ異なる所定の位置に固定したＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）を用いて、各遺伝子の発現量を比較するものである。ターゲットＤＮＡとしては、ＤＬＢＣＬのサブグループを特定するための塩基配列を備えたＤＮＡ又はそのＤＮＡと実質的に同一のＤＮＡが用いられる。また、この遺伝子検出には、レーザー蛍光検出機器又はイライザが用いられる。
【００２２】
ＤＮＡマイクロアレイ上には、前述した２４個の遺伝子、またはこれらの遺伝子から任意に取り出した１個〜２４個の遺伝子の塩基配列、またはこの塩基配列に相補的な塩基配列のうちの全部または一部と実質的に同一な塩基配列を備えたＤＮＡがスポットされていることが好ましい。なお、以下の記載において、このＤＮＡマイクロアレイを「ＤＬＢＣＬタイプ特定用ＤＮＡマイクロアレイ」と記載する。
【００２３】
次に、被験用プローブ核酸とコントロール用プローブ核酸とをＤＬＢＣＬタイプ特定用ＤＮＡマイクロアレイに静置し、そのマイクロアレイ上に固定されているターゲットＤＮＡとプローブ核酸（ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、またはｃＤＮＡ）とをハイブリダイズさせる。最後に、ＤＮＡマイクロアレイ用の検出手段を用いて、ＤＬＢＣＬタイプ特定用ＤＮＡマイクロアレイ上にハイブリダイズされた標識化ポリヌクレオチドを検出する。
【００２４】
検出されたデータから各遺伝子の発現プロファイルを評価することにより、患者のＤＬＢＣＬタイプを後述のＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬ又はＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬのいずれかのサブグループに特定することができる。なお、このタイプとは別のサブグループである胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬ及び活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬと、上記サブグループとを組み合わせることにより、ＤＬＢＣＬを４つのサブグループに分類できる。この分類のうち、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬでありかつ活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬのサブグループは、他の３グループに比べて、特に予後が悪い。このようにして、本発明を実施することができる。
【実施例】
【００２５】
次に、上記実施形態を具体化した実施例について説明する。
＜実施例１＞  患者及び検体
リンパ節のサンプルと臨床データは施設内の治験委員会によって承認されたプロトコールに従い、２２名のＣＤ５＋ＤＬＢＣＬ、及び２６名のＣＤ５−ＤＬＢＣＬから得た。いずれの患者もリンパ腫の既往歴はなかった。ＣＤ５抗原の発現は、フローサイトメトリー（fluorescence-activated cell sorter）、又は免疫組織染色で調べた。４８名のＤＬＢＣＬ患者は、適切なシクロフォスファミド、アドリアマイシン、ビンクリスチン、プレドニンの投与を受けていた（ＣＨＯＰ療法）。平均追跡期間は２.４年であり、５年生存率は４０％だった
【００２６】
＜実施例２＞  ＤＮＡマイクロアレイの手順
トータルＲＮＡは、各サンプルから文献に開示された方法に従い、塩化セシウム遠心法により分離した（Seto M, Yamamoto K, Iida S, et al. Gene rearrangement and overexpression of PRAD1 in lymphoid malignancy with t(11;14)(q13;q32) translocation. Oncogene. 1992; 7: 1401-6.）。このトータルＲＮＡからロー・ＲＮＡ・インプット・リニア・アンプリフィケーションキット（Low RNA Input Linear Amplification Kit : アジレントテクノロジー社製, Palo Alto, CA）を用いて、Ｃｙ５若しくはＣｙ３によって標識化された相補的ＲＮＡ（complementary RNA ： ｃＲＮＡ）を調製した。ＤＬＢＣＬ患者の検体から調製された被験用プローブ核酸は、Ｃｙ５によって標識化した。コントロール用プローブ核酸は、１０名の非ＤＬＢＣＬ患者からの過形成リンパ節から得たトータルＲＮＡから、上記キットを用いて、Ｃｙ３によって標識化した。こうして、被験用プローブ核酸とコントロール用プローブ核酸との混合物としてプローブ核酸を構成した。
【００２７】
ＤＮＡマイクロアレイは、財団法人癌研究会のためにアジレントテクノロジー社によって特別に製造されたものであり、全部で２１，６１９個の遺伝子がスポットされていた。これら２１，６１９個の遺伝子は、アジレント・ヒト１Ａオリゴマイクロアレイグラス（Agilent Human 1A Oligo Microarray glass、アジレントテクノロジー社製）上に見られる１７，０８６個の遺伝子と、４，５３３個の追加の遺伝子から構成された。プローブ核酸は、このスライドグラス上で、イン・ザイチュー・ハイブリダイゼーションキット・プラス（In Situ Hybridization Kit Plus、アジレントテクノロジー社製）、及びその使用説明書に従ってハイブリダイズした。
【００２８】
ハイブリダイズしたマイクロアレイの蛍光像は、スキャナー（Agilent scanner G2565AA、アジレントテクノロジー社製）で読み取り、フューチャー・エクストラクション・ソフトウエア（Future Extraction software、アジレントテクノロジー社製）を用いて、Ｃｙ３標識化コントロールに対するＣｙ５標識化被験体の蛍光比率を計算した。
【００２９】
＜実施例３＞  マイクロアレイ分析
すべての非標識蛍光比率は、底を２とする対数に変換し、各遺伝子の中央値を差し引いて中心化した。マーカー遺伝子は、ＣＤ５＋ＤＬＢＣＬとＣＤ５−ＤＬＢＣＬの平均値の差の大きいものから同定した。また、マーカー遺伝子を用いた階層的クラスター分析は、クラスター・アンド・ツリービュー（Cluster and TreeView ( http://rana.lbl.gov/EisenSoftware )）（Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, et al. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95: 14863-8.）を用いて行った。
カプラン・メイヤー生存分析は、スタービュー（StatView for Windows version 5.01(SAS Institute inc., Cary, NC)）を用いて計算した。生存率の違いはログランクテスト（log-rank test(Mantel-Cox Method)）によって分析した。
【００３０】
＜実施例４＞  公開されたマイクロアレイデータの分析
公開されたマイクロアレイデータは、キャンサー・ゲノミック・グループによって発表されているものを用いた。このデータには、３３，０００個の遺伝子の発現プロファイルが含まれている。キャンサー・ゲノミック・グループが公開したデータは、Monti S, Savage KJ, Kutok JL, Feuerhake F, Kurtin P, Mihm M, Wu B, Pasqualucci L, Neuberg D, Aguiar RC, Dal Cin P, Ladd C, Pinkus GS, Salles G, Harris NL, Dalla-Favera R, Habermann TM, Aster JC, Golub TR, Shipp MA. Molecular profiling of diffuse large B-cell lymphoma identifies robust subtypes including one characterized by host inflammatory response. Blood. 2005 Mar 1;105(5):1851-61. Epub 2004 Nov 18. に掲載されている。また、ＨＰアドレスは、http//www.broad.mit.edu/cancer/pub/dlbclである。
【００３１】
＜実施例５＞  ＤＬＢＣＬサンプルの胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬと活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬへの分類
胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬと活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬは、その遺伝子発現プロファイルに基づいて、最近同定されたＤＬＢＣＬのサブグループである。本発明者は、これら二つのグループと、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬ及びＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬとの関係を検討した。胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬと活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬを同定するための１００個の遺伝子のうち、６７個の遺伝子は、我々のマイクロアレイデータの中にも含まれていた。このため、これら６７個の遺伝子の発現プロファイルを用いて、我々の４８名のＤＬＢＣＬ症例を胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬと活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬに分類するために、クラスター解析を行った。
【００３２】
＜結果＞
１．ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬ及びＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬ
ＣＤ５＋ＤＬＢＣＬ及びＣＤ５−ＤＬＢＣＬのｍＲＮＡ発現プロファイルの差を同定するために、２群間の平均発現比が２.５倍以上である２４個の遺伝子、及び２倍以上である７０個の遺伝子を用いた解析を行った。これら遺伝子の発現レベルに従って、４８例のＤＬＢＣＬに階層型クラスタリングアルゴリズムを適用したところ、両者において同様の結果を得た。このため、２４個の遺伝子（個々の遺伝子名については既述であるため、記載を削除する。）により解析の結果を図１に示した。
【００３３】
４８例のＤＬＢＣＬは、２つのサブグループに分けられた。これらのサブグループのうち一方には、ＣＤ５＋ＤＬＢＣＬが偏っていた。ＣＤ５＋ＤＬＢＣＬが多いグループは、２０例のＣＤ５＋ＤＬＢＣＬと１１例のＣＤ５−ＤＬＢＣＬから構成され、他方のグループは、２例のＣＤ５＋ＤＬＢＣＬと１５例のＣＤ５−ＤＬＢＣＬから構成されていた。つまり、ＣＤ５＋ＤＬＢＣＬであっても、ＣＤ５−ＤＬＢＣＬと良く似たプロファイルを持つ症例が２症例あり、ＣＤ５−ＤＬＢＣＬであっても、ＣＤ５＋ＤＬＢＣＬと良く似たプロファイルを持つ症例が１１例存在した。本発明者は、ＣＤ５＋ＤＬＢＣＬが多いグループを「ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬ」と、他方のグループを「ＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬ」と命名した。
【００３４】
特に、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬに発現比の高い遺伝子群の中に、Ｔ細胞と関連する遺伝子であるＧＺＭＢとＴＲＰＭ４が含まれ、Ｔ細胞白血病における転座遺伝子であるＴＣＬ１ＡとＴＣＬ１Ｂが含まれていた。一方、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬに発現比の低い遺伝子群には、細胞外マトリックス関連の遺伝子（例えば、ＭＭＰ９、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＯＳＦ−２、ＬＡＭＢ３）が多く含まれていた。これらＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬにおいて特徴的な発現をする遺伝子群を、ＣＤ５特定遺伝子群と命名した。
【００３５】
ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬとＣＤ５−タイプＤＬＢＣＤについて、臨床的な検討を行った。表１には、両タイプの患者の特徴を示した。
【表１】
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【００３６】
表に示すように、これら二つのサブグループは、従来から使用されている国際予後指標（International Prognostic Index：ＩＰＩ）によって決定されたリスクグループと相関していた（The International Non-Hodgkin's Lymphoma Prognostic Factors Project. A Predictive Model for Aggressive Non-Hodgkin's Lymphoma. N Engl J Med. 1993; 329: 987-94.）。ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬは、ＣＤ５−ＤＬＢＣＬに比べ、ＩＰＩ因子のＳｔａｇｅ２以上の症例が多く（９０％対４７％、ｐ＝０.００２８）、ハイリスクグループに属する症例も多かった（６６％対２５％、ｐ＝０.０３６７）。また、図２に示すように、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬの全体的な  生存率は、ＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬの生存率に比して有意に低く（ｐ＜０.０００３）、予後が不良であった。
【００３７】
２．活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬと胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬへの適用
これまでに報告されている活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬと胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬについて、今回の４８症例を用いて検討を行った。活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬと胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬを決定する１００遺伝子のうち、本発明者が使用するＤＮＡアレイには６７遺伝子が存在していた。このため、これら６７遺伝子を使用してクラスター解析を行った。
その結果、４８症例は、図３に示すように、活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬと胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬとの二つのサブグループに分類された。また、図４に示すように、活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬは、胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬに比べ、有意に予後が不良であった（ｐ＝０.００２８）。
【００３８】
３．公開されたマイクロアレイデータに対するＣＤ５特定遺伝子群の適用
これまで報告されたＤＬＢＣＬに関するマイクロアレイデータとしては、キャンサー・ゲノミックス・グループのものが最大である。この報告には、３３，０００遺伝子についてのデータが掲載されている。このデータに対して、ＣＤ５特定遺伝子群を適用した。ＣＤ５特定遺伝子群の２４個の遺伝子のうち、キャンサー・ゲノミックス・グループの報告に存在していた２２個の遺伝子を用い、初発ＤＬＢＣＬである１７６例について、クラスター解析を行った。その結果、図５に示すように、細胞外マトリックス遺伝子群の発現が、相対的に低下しているＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬと、亢進しているＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬの２群に分類できた。臨床的な検討では、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬは、ＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬに比べて予後が不良であったが、有意差は認められなかった（ｐ＝０.０７６２）。
【００３９】
また、２つのタイプのＤＬＢＣＬサブグループ、すなわち（１）活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬと胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬ、及び（２）ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬとＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬの間の関係について検討した。その結果、活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬに限ると、図６に示すように、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬは、ＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬに比べ、有意に予後が不良であった（ｐ＝０.０３９７）。一方、胚中心ＤＬＢＣＬに限ると、図７に示すように、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬとＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬとの間に予後の差は認められなかった（ｐ＝０.５０７３）。こうして、活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬかつＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬのサブグループは、残りの３つのグループに比べ、予後が悪いことが判明した。
【００４０】
＜考察＞
従来より、ＣＤ５＋ＤＬＢＣＬは、比較的予後の悪いサブグループとして知られている。本発明者は、ＣＤ５＋ＤＬＢＣＬの特徴的なｍＲＮＡプロファイルを明らかにするために、２２例のＣＤ５＋ＤＬＢＣＬと２６例のＣＤ５−ＤＬＢＣＬとの間で発現の異なる遺伝子を選択し、クラスター分析を行った。この結果、ＣＤ５特定遺伝子群となる遺伝子を見出し、これら遺伝子の発現プロファイルを比較することにより、２つの臨床的に異なるＤＬＢＣＬのサブグループ、即ちＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬ及びＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬを同定した。また、ＣＤ５特定遺伝子群を公開されたマイクロアレイデータに適用することにより、これらのサブグループの存在が確認された。
【００４１】
ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬ及びＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬについて、３つの特徴が明らかになった。
第１に、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬは、ＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬに比して、予後不良であった。このことは、本発明者のデータでは有意に認められた。公開されたマイクロアレイデータについては、有意差は認められないものの、その傾向が認められた。また、本発明者の症例検討では、５個のＩＰＩ因子のうち、ステージ（ｓｔａｇｅ）のみが有意であったことから、病変がより広がりやすい傾向がＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬの特徴であり、この特徴が予後不良に関与していると考えられた。
【００４２】
ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬ及びＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬと、活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬ及び胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬとの関係を調べたところ、活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬに限った場合には、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬは、ＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬに比べ、有意に予後不良であった。一方、胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬにおいては、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬとＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬとの間には予後の差違は認められなかった。ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬであり、かつ活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬの場合には、他の３群に比べて予後が不良であることが判明した。こうして、本発明者が見出したサブグループと、これまでに報告されたサブグループとを組み合わせることにより、臨床的に最も重要である予後不良の一群を見出すことができた。
【００４３】
第２に、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬを特徴づけるＣＤ５特定遺伝子群のうち、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬで発現比の低い遺伝子群には、細胞外マトリックス関連遺伝子が多く、これらの遺伝子では症例間における相関が非常に高かった。公開されたマイクロアレイデータにおいても、これらの遺伝子群の症例間の相関は、他の遺伝子群に比べると高く、明らかに特定遺伝子群を形成していた。また、この遺伝子群のうち、いくつかの遺伝子は、ＣＤ５＋ＤＬＢＣＬで発現比が低いと報告されている遺伝子と一致していた（Gascoyne RD らの報告（既述）。ＭＭＰ９、ＣＯＬ３Ａ１、ＳＰＡＲＣ）。このようなＣＤ５特定遺伝子群は、ＤＬＢＣＬにおいて何らかの重要な性質と関連していることが予想される。
【００４４】
第３に、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬは、我々の臨床データによれば、主としてＣＤ５＋ＤＬＢＣＬから構成されていたが、何例かのＣＤ５−ＤＬＢＣＬが含まれていた。このため、サブタイプを決定するためには、表面マーカーであるＣＤ５の有無のみではなく、ｍＲＮＡプロファイルであるＣＤ５特定遺伝子群を用いた方が良いと考える。但し、公開されたマイクロアレイデータでは、ＣＤ５＋ＤＬＢＣＬと検体との対応が不明であったため、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬが主としてＣＤ５＋ＤＬＢＣＬから構成されているか否かは不明であった。公開されたマイクロアレイデータでは、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬが全体のほぼ半数を占めていた。ＤＬＢＣＬ全体では、ＣＤ５＋ＤＬＢＣＬの割合が約１０％であること、及び我々の解析の結果では、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬに１０例のＣＤ５−ＤＬＢＣＬが含まれていたことを考慮すると、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬには、一定割合のＣＤ５−ＤＬＢＣＬが含まれている可能性が考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】クラスター分析により決定されたＤＬＢＣＬのサブグループであるＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬ及びＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬのｍＲＮＡプロファイルを比較する図である。ＣＤ５特定遺伝子群を構成する２４遺伝子の発現レベルに従った４８症例のＤＬＢＣＬ患者の階層的クラスター分析結果を示している。これらの遺伝子は、ＣＤ５＋ＤＬＢＣＬ及びＣＤ５−ＤＬＢＣＬの間で最も発現量に違いを示した２４個の遺伝子として選択された。最上段の樹状図は、遺伝子発現の性状から、各ＤＬＢＣＬがそれぞれどのように関係しているかの程度を示している。４８例のＤＬＢＣＬは、大きく２つのサブグループ、即ちＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬ(左側)と、ＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬ(右側)に分けられた。ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬは、細胞外マトリックス関連遺伝子(ＣＯＬ１Ａ、ＣＯＬ３Ａ、ＬＡＭＢ３、ＭＭＰ９、ＳＰＡＲＣ、ＯＳＦ−２など)の発現量が低下するという特異的なｍＲＮＡプロファイルを有していた。一方、ＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬでは、これら遺伝子は高い発現量を示した。
【００４６】
【図２】カプラン・メイヤー分析によって、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬとＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬとの間の生存率の差を解析したグラフである。これらのサブグループのｐ値はログランクテストで分析した。
【図３】我々の４８症例について、これまでに報告されている活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬと胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬを決定する１００遺伝子のうち、６７遺伝子を用いてクラスター解析を行った結果を示す図である。
【００４７】
【図４】我々の４８症例に関し、胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬと活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬとについて、カプラン・メイヤー分析による生存分析の結果を示すグラフである。活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬの生存率は、胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬに比べて、有意に生存率が悪かった（ｐ＝０.００３７）。
【図５】キャンサー・ゲノミックス・グループが報告したマイクロアレイデータについて、ＣＤ５特定遺伝子群の２４個の遺伝子のうち２２個の遺伝子を用い、クラスター解析を行った結果を示す図である。
【００４８】
【図６】活性化Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬについて、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬとＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬとに分類したときの生存分析を行った結果を示すグラフである。ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬは、ＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬに比べ、有意に予後が不良であった（ｐ＝０.０３９７）。
【図７】胚中心Ｂ細胞様ＤＬＢＣＬについて、ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬとＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬとに分類したときの生存分析を行った結果を示すグラフである。ＣＤ５＋タイプＤＬＢＣＬとＣＤ５−タイプＤＬＢＣＬとの間には、有意な差は認められなかった（ｐ＝０.５０７３）。
【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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