(57)【要約】【課題】  ターゲット物質相互間の斥力による影響を回避して、カンチレバーの表面上にターゲット物質認識物質との結合を介して、付着するターゲット物質の面密度をより高めることが可能であり、その荷重によって、カンチレバーの共振周波数の変化量をより大きくでき、高い検出感度でターゲット物質の検出を可能とする検出方法の提供。【解決手段】  外力を加えて、予め撓んだ状態とした上で、カンチレバーとターゲット物質と接触させると、ターゲット物質同士の斥力が小さい状態で、ターゲット物質認識物質との結合を介して、ターゲット物質の付着がなされ、その後、カンチレバーを撓ませていた外力を取り除き、カンチレバーの共振周波数の変化量を測定すると、より高い検出感度、また、より簡易な手順でターゲット物質の検出が可能となる。【選択図】    図１
2007010518.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンチレバーセンサを利用して、ターゲット物質を検出する方法であって、
（Ａ）カンチレバーセンサを構成するカンチレバー表面に、前記ターゲット物質と結合可能なターゲット物質認識物質を固定する工程；
（Ｃ）前記カンチレバーに外力を加えて、少なくとも一方の面を凸として、撓んだ状態で保持する工程；
（Ｄ）撓んだ状態で保持する前記カンチレバーを、試料と接触させ、ターゲット物質認識物質に対するターゲット物質の結合を可能とする工程；
（Ｅ）前記カンチレバーに加えた外力を取り除く工程；
（Ｆ）ターゲット物質との結合を目的とする、試料との接触を行った後、前記カンチレバーの共振周波数を測定する工程、
（Ｇ）前記工程（Ｆ）で測定される、試料との接触後のカンチレバーの共振周波数と、試料との接触前の該カンチレバーの初期共振周波数との差を算出する工程、
を含む
ことを特徴とするターゲット物質の検出方法。
【請求項２】
試料との接触前の該カンチレバーの初期共振周波数を測定するため、
前記工程（Ａ）と前記工程（Ｃ）の間に、
（Ｂ）前記カンチレバーの前記初期共振周波数を測定する工程、
を設けている
ことを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記工程（Ｄ）と前記工程（Ｅ）の間に、
（Ｃ’）前記カンチレバーに、前記工程（Ｃ）において加えられる外力とは逆の方向の外力を加えて、前記工程（Ｃ）における撓みの方向に対して、反対方向に撓んだ状態で保持する工程、
（Ｄ’）該反対方向に撓んだ状態で保持する前記カンチレバーを、試料と接触させ、ターゲット物質認識物質に対するターゲット物質の結合を可能とする工程、
をさらに含む
ことを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
カンチレバーセンサを利用して、ターゲット物質を検出する検出装置であって、
（ａ）ターゲット物質認識物質を表面に固定したカンチレバーを具えたカンチレバーセンサ；
（ｃ）前記カンチレバーに外力を加えて、少なくとも一方の面を凸として、撓んだ状態で保持する手段；
（ｄ）前記撓んだ状態で保持する前記カンチレバーを、ターゲット物質認識物質に対するターゲット物質の結合を可能とする状態で、試料と接触させる手段；
（ｅ）前記カンチレバーに加えた外力を取り除く手段；
（ｆ）ターゲット物質との結合を目的とする、試料との接触を行った後の前記カンチレバーの共振周波数を測定する手段；
（ｈ）試料との接触後のカンチレバーの共振周波数測定値と、試料との接触前の該カンチレバーの初期共振周波数とから算出される共振周波数差に基づき、該カンチレバー表面に固定されているターゲット物質認識物質に対して結合したターゲット物質の有無、あるいは、結合したターゲット物質の量を算出する手段
を具えている
ことを特徴とするターゲット物質検出装置。
【請求項５】
前記（ｆ）試料との接触を行った後の前記カンチレバーの共振周波数を測定する手段において、該共振周波数の測定に利用する、カンチレバーを強制的に振動させるための振動子は、
前記（ａ）カンチレバーセンサ中に組み込む、あるいは、測定に際して、前記（ａ）カンチレバーセンサに接触させる形態に作製されている
ことを特徴とする請求項４に記載の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カンチレバーセンサを利用して、ターゲット物質を検出する方法、ならびに該検出方法に基づく、ターゲット物質の検出装置に関する。特には、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）等のようなプローブ式顕微鏡において、微小な力の検出用プローブとして利用されている片持ち梁式針（以下、カンチレバー）を応用して、高い検出感度でターゲット物質を検出する方法、ならびに該方法に基づく、高い検出感度を有するターゲット物質の検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
カンチレバーセンサでは、片持ち梁式針（以下、カンチレバー）の撓み量は、カンチレバー表面の曲げ応力に比例するという特質を利用して、曲げ応力の変化を撓み量変化として検出する手法が、多く利用されている。例えば、プローブ式顕微鏡の検出用プローブでは、カンチレバー先端に加わる微小な力、例えば、原子間力の変化を高い感度で検出する手段として利用されている。
【０００３】
カンチレバーセンサを応用して、ターゲット物質を検出する方法として、カンチレバー表面にターゲット物質を選択的に結合させることにより、カンチレバー表面の曲げ応力の変化を誘起させる方法が検討されている。例えば、ターゲット物質に対して、特異的な結合性を示す物質（ターゲット物質認識物質）、例えば、ターゲット物質である抗原に対して、特異的な抗原抗体反応性を有する抗体分子をカンチレバーの表面上に固定する。このカンチレバーを、ターゲット物質（例えば、抗原）を含有している試料と接触させると、ターゲット物質（例えば、抗原）は、特異的な結合性を示す物質（ターゲット物質認識物質、例えば、特異的抗体）との結合を介して、カンチレバーの表面上に付着した状態となる。その際、カンチレバー先端部の表面上に付着するターゲット物質自体の荷重に起因して、カンチレバー全体に加わる曲げ応力が増加し、結果的に、カンチレバー先端部の撓み量が増加する。
【０００４】
加えて、カンチレバー先端部の表面上に付着するターゲット物質自体の荷重に起因して、カンチレバー全体の質量ｍも増加するため、カンチレバーの共振周波数ωが変化する。このような原理を応用して、カンチレバーを用いてターゲット物質の検出する方法としては、非特許文献１，２に示すような方法が検討されている。
【０００５】
カンチレバーは、片持ちバネの一形態であり、外部から強制振動させた際、特定の周波数において、共振を起こす。このカンチレバーに固有の共振周波数ωは、カンチレバーの質量ｍと、そのバネ定数ｋによって決定されている。すなわち、下記式１のように、カンチレバーに固有の共振周波数ωを表記することができる。
【０００６】
ω＝（ｋ／ｍ）1/2  ・・・  式１
カンチレバー表面にターゲット物質を選択的に結合させると、カンチレバー先端部の表面上に付着するターゲット物質自体の荷重に起因して、カンチレバー全体の質量ｍは、ｍ→ｍ＋Δｍへと増加する。その際、カンチレバーのバネ定数ｋは変化しないと、前記の質量増加に伴い、カンチレバーの共振周波数がΔω減少する。質量ｍの増加量Δｍは、ターゲット物質の付着量に比例しており、カンチレバー全体の質量ｍに対して、その増加量Δｍが十分に小さな範囲では、近似的に、共振周波数の減少量Δωは、増加量Δｍに比例する。従って、共振周波数の減少Δωを検出することによって、カンチレバー上に付着するターゲット物質の有無や量（濃度）を検出することが可能となる。一般に、ＡＦＭ等で用いられるカンチレバーを用いた場合、質量の変化Δｍに対する共振周波数の変化Δωの比率：Δｍ／Δωは、数ｐｇ／Ｈｚといわれている。
【非特許文献１】Ａｐｐ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．６９（１９），１９９６  ｐ２８３４〜２８３６
【非特許文献２】Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ，２００１  ｐ１２２〜１３１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このカンチレバー共振周波数変化Δωに基づき、カンチレバー上に付着するターゲット物質の有無や量（濃度）を検出手法は、上記のように高い検出感度を有するが、下記する問題を有している。
【０００８】
ターゲット物質によっては、ターゲット物質同士が近接すると、ターゲット物質相互間に強い斥力が生じる場合がある。その場合、ターゲット物質相互間の斥力が強すぎて、カンチレバー表面上に高密度にターゲット物質を付着することができない。検体試料中に含まれるターゲット物質の濃度が高くなると、この斥力の影響を受け、カンチレバー表面上に付着するターゲット物質の面密度は、ある水準に達すると、それ以上上昇しなくなる。すなわち、検体試料中に含まれるターゲット物質の濃度と、カンチレバー表面上に付着するターゲット物質の面密度とは比例せず、結果として、カンチレバーの共振周波数変化量Δωの増加も抑えられる。このターゲット物質の濃度範囲に達すると、ターゲット物質の濃度を正確に検出できなくなるという課題を有している。
【０００９】
換言すると、ターゲット物質相互間の斥力が強すぎると、試料中に含まれているターゲット物質の濃度がある水準を超えると、平坦に保持されているカンチレバーにおいて、ターゲット物質認識物質との結合を介して、その表面上に付着するターゲット物質の面密度は、それ以上増加しない状態となり、ターゲット物質の濃度を適正に評価できない可能性がある。
【００１０】
本発明は前記の課題を解決するものであり、本発明の目的は、カンチレバーの表面にターゲット物質認識物質を高い面密度で固定化している場合にも、前記のターゲット物質相互間の斥力による影響を回避して、固定化されているターゲット物質認識物質との結合を介して、付着するターゲット物質の面密度自体もより高めることが可能であり、その荷重によって、カンチレバーの共振周波数の変化量をより大きくでき、高い検出感度でターゲット物質の検出を可能とする検出方法、ならびに、かかる検出方法に基づく、高感度のターゲット物質の検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記の課題を解決すべく、研究を進めたところ、下記の知見を得た。
【００１２】
まず、カンチレバーの両面に同じ面密度でターゲット物質認識物質を固定した場合であっても、外力を加えて、カンチレバーを予め撓ませた状態とすると、凸面側と凹面側との間で、実効的なターゲット物質認識物質の面密度に差違が生じることを見出した。すなわち、撓みの無い状態と比較すると、凸面側では、実効的なターゲット物質認識物質の面密度は、相対的に疎な状態となり、一方、凹面側では、実効的なターゲット物質認識物質の面密度は、相対的に密な状態となっている。
【００１３】
ターゲット物質認識物質と結合するターゲット物質は、相互間隔が一定値を下回ると、ターゲット物質相互の間に斥力が生じる場合、カンチレバーに撓みの無い際に、ターゲット物質認識物質と結合したターゲット物質相互の間に斥力が生じる臨界的状態は、ターゲット物質認識物質Ｎflat分子当たり、一つのターゲット物質が付着している状態に相当する。一方、かかる臨界的状態は、凸面側では、ターゲット物質認識物質Ｎconvex分子当たり、一つのターゲット物質が付着している状態に相当し、凹面側では、ターゲット物質認識物質Ｎconcave分子当たり、一つのターゲット物質が付着している状態に相当する。その際、実効的なターゲット物質認識物質の面密度を考慮すると、Ｎconvex＜Ｎflat＜Ｎconcaveとなり、換言すると、撓みの無い状態と比較すると、凸面側では、より多くの量のターゲット物質を付着させることができ、一方、凹面側では、より少ない量のターゲット物質しか付着させることができないことを見出した。
【００１４】
さらに、ターゲット物質認識物質とターゲット物質との結合が一定以上の強さを有する場合、凸面状とすることで高い面密度で表面に付着させたターゲット物質は、カンチレバーを逆方向に撓ませ、凹面状とすると、ターゲット物質相互間により大きな斥力が作用するが、通常、離脱を引き起こすまでには至らないことを見出した。この状態では、前は凹面側であった面は、凸面状となっており、ターゲット物質は、ターゲット物質認識物質Ｎconcave分子当たり、一つのターゲット物質が付着している状態から、ターゲット物質認識物質Ｎconvex分子当たり、一つのターゲット物質が付着している状態まで、さらに付着面密度を増加することができる。最終的には、カンチレバーの両面ともに、ターゲット物質認識物質Ｎconvex分子当たり、一つのターゲット物質が付着している状態とすることも可能である。勿論、カンチレバーを平坦に状態に戻すと、ターゲット物質相互間には斥力が作用するが、一旦、ターゲット物質認識物質との結合により付着しているターゲット物質は、通常、その斥力の起因する離脱を引き起こすまでには至らないことを見出した。
【００１５】
少なくとも、カンチレバーの両面にターゲット物質認識物質を固定した上で、カンチレバーを予め撓ませ、一方の面を凸面状として、ターゲット物質をターゲット物質認識物質に結合させ、引き続き、他方の面を凸面状として、ターゲット物質をターゲット物質認識物質に結合させることで、カンチレバーを平坦な状態として、ターゲット物質を付着する場合よりも、より多くのターゲット物質を付着することが可能となることを見出した。すなわち、カンチレバー全体として、より多くのターゲット物質を付着することが可能となると、質量の増加量Δｍもより大きくなり、それに伴い、共振周波数の変化量Δωもより大きくすることが可能となる。
【００１６】
加えて、この凸面側において、ターゲット物質認識物質と結合したターゲット物質相互の間に斥力が生じる臨界的状態に達するためには、ターゲット物質認識物質Ｎconvex分子当たり、一つのターゲット物質が付着している状態と平衡する、試料中のターゲット物質濃度Ｃconvexは、ターゲット物質認識物質Ｎflat分子当たり、一つのターゲット物質が付着している状態と平衡する、試料中のターゲット物質濃度Ｃflatと比較すると、より高い濃度となることも判明した。すなわち、カンチレバーセンサによって、定量的な濃度測定が可能な上限濃度（検出可能上限濃度）は、外力を加えて、カンチレバーを予め撓ませた状態における、凸面側の検出可能上限濃度Ｃconvexは、撓みの無い状態のカンチレバー表面の検出可能上限濃度Ｃflatよりも高くなり、定量的な測定が有効な範囲も拡大することが判った。
【００１７】
本発明者らは、以上の一連の知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明の第一の形態にかかるターゲット物質の検出方法は、
カンチレバーセンサを利用して、ターゲット物質を検出する方法であって、
（Ａ）カンチレバーセンサを構成するカンチレバー表面に、前記ターゲット物質と結合可能なターゲット物質認識物質を固定する工程；
（Ｃ）前記カンチレバーに外力を加えて、少なくとも一方の面を凸として、撓んだ状態で保持する工程；
（Ｄ）撓んだ状態で保持する前記カンチレバーを、試料と接触させ、ターゲット物質認識物質に対するターゲット物質の結合を可能とする工程；
（Ｅ）前記カンチレバーに加えた外力を取り除く工程；
（Ｆ）ターゲット物質との結合を目的とする、試料との接触を行った後、前記カンチレバーの共振周波数を測定する工程、
（Ｇ）前記工程（Ｆ）で測定される、試料との接触後のカンチレバーの共振周波数と、試料との接触前の該カンチレバーの初期共振周波数との差を算出する工程、
を含む
ことを特徴とするターゲット物質の検出方法である。
【００１９】
また、本発明の第二の形態にかかるターゲット物質検出装置は、
カンチレバーセンサを利用して、ターゲット物質を検出する検出装置であって、
（ａ）ターゲット物質認識物質を表面に固定したカンチレバーを具えたカンチレバーセンサ；
（ｃ）前記カンチレバーに外力を加えて、少なくとも一方の面を凸として、撓んだ状態で保持する手段；
（ｄ）前記撓んだ状態で保持する前記カンチレバーを、ターゲット物質認識物質に対するターゲット物質の結合を可能とする状態で、試料と接触させる手段；
（ｅ）前記カンチレバーに加えた外力を取り除く手段；
（ｆ）ターゲット物質との結合を目的とする、試料との接触を行った後の前記カンチレバーの共振周波数を測定する手段；
（ｈ）試料との接触後のカンチレバーの共振周波数測定値と、試料との接触前の該カンチレバーの初期共振周波数とから算出される共振周波数差に基づき、該カンチレバー表面に固定されているターゲット物質認識物質に対して結合したターゲット物質の有無、あるいは、結合したターゲット物質の量を算出する手段
を具えている
ことを特徴とするターゲット物質検出装置である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明にかかるターゲット物質の検出方法の原理では、予めカンチレバーを撓ませた状態とした上で、カンチレバーとターゲット物質とを接触させることによって、ターゲット物質同士の斥力が小さい状態で、カンチレバー表面にターゲット物質を付着させることが可能となる。その際、カンチレバーの両面に対して、ターゲット物質認識物質を固定する形態を選択し、それぞれの面について、予めカンチレバーを撓ませた状態とした上で、カンチレバーとターゲット物質とを接触させることによって、ターゲット物質同士の斥力が小さい状態で、カンチレバー表面にターゲット物質を付着させることが可能となる。結果として、カンチレバー表面上には、両面合わせて、ターゲット物質をより多く付着した状態とでき、この状態で、ターゲット物質の付着に起因する、カンチレバーの共振振動数の変化を測定することによって、ターゲット物質のより高感度な検出が可能となり、または、より簡易な検出手段による測定が可能となる効果が得られる。
【００２１】
さらに、カンチレバーに付着するターゲット物質の最大量が増加することで、測定装置の測定上限（飽和検出量）が高くなり検出範囲が広がる、という効果も得られる。
【００２２】
加えて、カンチレバーの片面のみにターゲット物質認識物質を固定する必要はなく、換言すれば、カンチレバーの一方の面のみにターゲット物質認識物質を固定するために要する工程を省くことが可能となるという利点もある。特に、カンチレバーの両面にターゲット物質認識物質を固定すると、温度等の外的要因によって、カンチレバーに反りが導入される現象も回避でき、この種の外的要因に起因する、カンチレバーの反りなどのノイズ要因を較正するため、比較用カンチレバーの利用、較正用のソフトウエアの付加を行わなくとも、高い信頼性を有する測定が可能となる。すなわち、カンチレバーの片面のみにターゲット物質認識物質を固定化するための付加的な工程を省ける利点以上に、カンチレバーの両面の状態が相違することに由来する、温度等の外的要因に起因するトラブルや、誤検出の問題も大幅に低減する上で、大きな貢献を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
上述の本発明にかかるターゲット物質の検出方法は、
カンチレバーセンサを利用して、ターゲット物質を検出する方法であって、
（Ａ）カンチレバーセンサを構成するカンチレバー表面に、前記ターゲット物質と結合可能なターゲット物質認識物質を固定する工程；
（Ｃ）前記カンチレバーに外力を加えて、少なくとも一方の面を凸として、撓んだ状態で保持する工程；
（Ｄ）撓んだ状態で保持する前記カンチレバーを、試料と接触させ、ターゲット物質認識物質に対するターゲット物質の結合を可能とする工程；
（Ｅ）前記カンチレバーに加えた外力を取り除く工程；
（Ｆ）ターゲット物質との結合を目的とする、試料との接触を行った後、前記カンチレバーの共振周波数を測定する工程、
（Ｇ）前記工程（Ｆ）で測定される、試料との接触後のカンチレバーの共振周波数と、試料との接触前の該カンチレバーの初期共振周波数との差を算出する工程、
を含む
ことを特徴とするターゲット物質の検出方法であるが、
その際、試料との接触前の該カンチレバーの初期共振周波数を測定するため、
前記工程（Ａ）と前記工程（Ｃ）の間に、
（Ｂ）前記カンチレバーの前記初期共振周波数を測定する工程、
を設けている構成とすることが好ましい。
【００２４】
更には、前記工程（Ｄ）と前記工程（Ｅ）の間に、
（Ｃ’）前記カンチレバーに、前記工程（Ｃ）において加えられる外力とは逆の方向の外力を加えて、前記工程（Ｃ）における撓みの方向に対して、反対方向に撓んだ状態で保持する工程、
（Ｄ’）該反対方向に撓んだ状態で保持する前記カンチレバーを、試料と接触させ、ターゲット物質認識物質に対するターゲット物質の結合を可能とする工程、
をさらに含む構成とすることが望ましい。
【００２５】
また、かかる本発明の検出方法に基づく、本発明のターゲット物質検出装置は、
カンチレバーセンサを利用して、ターゲット物質を検出する検出装置であって、
（ａ）ターゲット物質認識物質を表面に固定したカンチレバーを具えたカンチレバーセンサ；
（ｃ）前記カンチレバーに外力を加えて、少なくとも一方の面を凸として、撓んだ状態で保持する手段；
（ｄ）前記撓んだ状態で保持する前記カンチレバーを、ターゲット物質認識物質に対するターゲット物質の結合を可能とする状態で、試料と接触させる手段；
（ｅ）前記カンチレバーに加えた外力を取り除く手段；
（ｆ）ターゲット物質との結合を目的とする、試料との接触を行った後の前記カンチレバーの共振周波数を測定する手段；
（ｈ）試料との接触後のカンチレバーの共振周波数測定値と、試料との接触前の該カンチレバーの初期共振周波数とから算出される共振周波数差に基づき、該カンチレバー表面に固定されているターゲット物質認識物質に対して結合したターゲット物質の有無、あるいは、結合したターゲット物質の量を算出する手段
を具えている
ことを特徴とするターゲット物質検出装置であり、
特に、前記（ｆ）試料との接触を行った後の前記カンチレバーの共振周波数を測定する手段において、該共振周波数の測定に利用する、カンチレバーを強制的に振動させるための振動子は、
前記（ａ）カンチレバーセンサ中に組み込む、あるいは、測定に際して、前記（ａ）カンチレバーセンサに接触させる形態に作製することが可能であり、一般に、望ましい形態である。
【００２６】
以下に、本発明を詳しくに説明する。
【００２７】
図を参照して、本発明にかかるカンチレバーセンサを利用した、ターゲット物質の検出方法の検出原理を模式的に説明する。
【００２８】
図１（ａ）のように、チップ１１から突き出すように設置されたカンチレバー１３の表面にターゲット物質認識物質１２を予め固定する。このカンチレバーの一端が自由端の状態で、自然振動させると、カンチレバーの先端は、かかる状態におけるカンチレバーの質量ｍと、バネ定数ｋに依存する共振周波数ω0で振動する。この図１（ａ）に示す状態のカンチレバーが示す共振周波数を、該カンチレバーの「初期共振周波数」ω0iと呼ぶ。
【００２９】
また、チップ１１に対して、発振子１０を取り付け、周波数ωの強制振動を付加すると、カンチレバーも、この周波数ωで撓み振動を開始する。その際、強制振動の周波数ωと、カンチレバーに固有の共振周波数ω0との差違が大きい場合、カンチレバー先端部の周期的な変位の振幅は、小さなものとなる。一方、強制振動の周波数ωと、カンチレバーに固有の共振周波数ω0とが一致すると、共振状態となるため、カンチレバー先端部の周期的な変位の振幅は、極大を示す。すなわち、図４に示すように、強制振動の周波数ωに対して、そのときのカンチレバー先端部の周期的な変位の振幅をプロットすると、カンチレバーに固有の共振周波数ω0において、極大となるようなピークを示す。
【００３０】
カンチレバー１３を自然振動させ、共振周波数を測定することも可能であるが、チップ１１に発振子１０を取り付け、この発振子１０に交流電圧（不図示）を印加して、周波数ωの強制振動を付加して、図４に示すような、強制振動の周波数ωに対して、そのときのカンチレバー先端部の周期的な変位の振幅をプロットとした結果から、振幅が極大を示す周波数を、カンチレバーに固有の共振周波数ω0の実測値とすることもできる。
【００３１】
次に、図１（ｂ）のように、カンチレバーに外力１４を加えて、ターゲット物質認識物質１２が固定されているカンチレバーを、凸状に撓んだ状態とする。この凸状に撓んだ状態を保持したまま、カンチレバー１３とターゲット物質１５と接触させる。予めカンチレバー１３を撓んだ状態とすることによって、カンチレバーの凸面側では、撓みの無い状態に較べて、表面に固定されているターゲット物質認識物質は、実効的に疎な状態となっている。
【００３２】
図１（ｃ）のように、カンチレバーの凸面側では、撓みの無い状態に較べて、ターゲット物質認識物質と結合したターゲット物質同士の間隔も開いており、ターゲット物質相互間の斥力１６が小さい状態で、カンチレバーの凸面側表面にターゲット物質が付着する。逆に、カンチレバーの凸面側では、撓みの無い状態に較べて、表面に固定されているターゲット物質認識物質は、実効的に密な状態となっている。そのため、ターゲット物質認識物質と結合したターゲット物質は、ターゲット物質相互間の斥力１６の影響が及ばない間隔を達成するため、より低い面密度でしか、カンチレバー表面に付着しない。
【００３３】
その後、図１（ｄ）のように、前の外力１４の除き、それとは逆方向の変位を引き起こす外力１４’を加え、前が凹面側となっていた面が、凸面側となるように、カンチレバーを逆方向に撓んだ状態とする。その時、凹面側（図では上側）となる表面では、ターゲット物質認識物質１２と結合したターゲット物質１５の面密度は高いため、ターゲット物質同士の間隔は狭まり、場合によっては、ターゲット物質相互間に斥力が働く状態となる。しかし、一度付着したターゲット物質１５は、ターゲット物質認識物質１２と安定に結合した状態となっており、このターゲット物質相互間の斥力によって、脱離が引き起こされることはない。
【００３４】
一方、図１（ｄ）のように、新たに凸面側となった面（図では下側）では、表面に固定されているターゲット物質認識物質は、実効的に疎な状態となっており、既にターゲット物質認識物質と結合したターゲット物質同士の間隔も大きく開いている。そのため、図１（ｅ）のように、新たに凸面側となった表面には、ターゲット物質相互間の斥力１６が小さい状態で、さらにターゲット物質１５が付着する。すなわち、新たに凸面側となった表面でも、高密度にターゲット物質１５が付着した状態となる。
【００３５】
最後に、図１（ｆ）のように、カンチレバーを撓ませていた外力１４’を取り除き、カンチレバー１３が平坦な状態とする。勿論、ターゲット物質認識物質１２と結合したターゲット物質１５の面密度は高いため、ターゲット物質同士の間隔は狭まり、場合によっては、ターゲット物質相互間に斥力が働く状態となる。しかし、一度付着したターゲット物質１５は、ターゲット物質認識物質１２と安定に結合した状態となっており、このターゲット物質相互間の斥力によって、脱離が引き起こされることはない。
【００３６】
このカンチレバー１３の両面に、高密度にターゲット物質１５が付着した状態で、カンチレバーの共振周波数を測定する。試料との接触を行った後に測定される、カンチレバーの共振周波数を、「ターゲット物質付着処理後の共振周波数」ω0fと呼ぶ。実際に、カンチレバー１３の表面に、ターゲット物質認識物質１２との結合を介して、ターゲット物質１５が付着すると、カンチレバーの質量は、当初の値ｍから、付着したターゲット物質１５による荷重増加に相当する質量増加分Δｍを含む、ｍ＋Δｍに変化する。従って、「初期共振周波数」ω0iと「ターゲット物質付着処理後の共振周波数」ω0fとは相違しており、その差Δω0＝（ω0i−ω0f）を算出し、差Δω0＝（ω0i−ω0f）に基づき、カンチレバー表面へのターゲット物質付着の有無やその付着量を検出する。
【００３７】
なお、予め、ターゲット物質を付着させる前に、「初期共振周波数」ω0iを測定している場合、前記の差Δω0＝（ω0i−ω0f）の算出には、その実測値を用いる。一方、同一条件で、ターゲット物質認識物質１２の固定化を行った同種のカンチレバーでは、本質的に「初期共振周波数」ω0iは同じ値となるため、別途、同種のカンチレバーで測定された「初期共振周波数」ω0iの値を、代表値として利用するもできる。
【００３８】
カンチレバーを撓ませることの効果を、ターゲット物質認識物質の１つである抗体を例に挙げて説明する。平均的な抗体分子（Ｆａｂ）2の長手サイズは、約１５ｎｍであり、Ｆａｂの可変領域ＶHとＶL相互の間隔に起因する、その上部の開き幅は、約１０〜２０ｎｍといわれている。図１（ａ）の様に、抗体分子（Ｆａｂ）2が密集して固定化されている場合、撓みの無い状態では、当然、抗体分子同士の間隔は、各抗体分子の上部の開き幅によって制限され、１０〜２０ｎｍとなっている。外力を加えて、厚さＴ１μｍ、長さＬ＝５００μｍのカンチレバーを、曲率半径ｒの円弧形状に撓ませ、その先端での撓み量Δｄ（変位量）が５０μｍになったと仮定する。すなわち、この円弧の角度をθとすると、θが十分に小さな範囲では、
Ｌ＝ｒ×θ、
Δｄ＝ｒ−ｒｃｏｓθ≒ｒ×θ×ｓｉｎθ≒ｒ×θ2
と、近似的に表すことが可能である。従って、曲率半径ｒは、ｒ≒Ｌ2／Δｄとなる。
【００３９】
この外力に因る撓みの曲率半径ｒが、およそ５０００μｍとなる場合、カンチレバー表面上に固定されている長手サイズ約１５ｎｍの抗体分子先端部の間隔は、この撓みに伴い、率にして０．３％程度拡がることになる。すなわち、抗体分子先端部の間隔は、０．３〜０．６Å程度拡がることになる。その抗体分子先端部の可変領域ＶHとＶLに結合する抗原分子相互の間隔は、この抗体分子先端部の間隔の拡がりよりも、さらに大きな拡がりを示すことになる。その間隔拡がりの程度は、抗原分子の長手サイズが大きくなるとともに大きくなる。その結果、抗体と結合した抗原同士間の斥力は、撓みの無い場合と比較すると、予めカンチレバーを撓ませておくことで弱まり、抗原分子の長手サイズが大きくなると、一層その効果は増すことになる。
【００４０】
本発明にかかるターゲット物質の検出方法について、その工程をより詳しく説明する。
【００４１】
（工程Ａ）カンチレバーの表面にターゲット物質認識物質を固定する工程
カンチレバー：
カンチレバーの形状・材質は、ターゲット物質分子同士の斥力程度の応力によって、所望の撓みが発生可能である限り、特に、限定はされない。なお、固定化されるターゲット物質認識物質の面密度、付着されるターゲット物質の付着量範囲を事前に検討した上で、最適の素材、形状を選択することが好ましい。カンチレバー全体のバネ定数は、一般的なプローブ顕微鏡のカンチレバー型プローブにおいて採用される、０．０１〜１００Ｎ／ｍ程度の範囲内であれば、通常、問題無く利用できる。但し、検出対象のターゲット物質の種類や、カンチレバーの素材・形状によっては、カンチレバー全体のバネ定数は、前記の範囲以外に設定することも可能である。
【００４２】
また、カンチレバーが静電気を帯びると、静電的な相互作用に起因する力によって、カンチレバー全体が撓んだ状態となる可能性がある。このターゲット物質同士の斥力とは、無関係な撓みの発生要因を排除するため、カンチレバー自体の素材に、導電性を示す材料を利用することが望ましい。例えば、カンチレバー本体を、半導体や絶縁性素材で作製する場合は、その表面を金属被膜でコーティングする形態とする、あるいは、半導体材料に、その導電性を向上させるようなドーパントを添加し、導電性半導体材料とすることが好ましい。
【００４３】
さらには、後述の工程Ｂに関する説明中に例示するように、光学的手法でカンチレバー先端部の撓み量（変位量）振幅を検出する場合は、検出に利用するレーザ光をカンチレバー表面で反射させる必要がある。その際、必要に応じて、カンチレバー先端部の少なくとも一部に、光反射率を向上させる処理、例えば、アルミニウム金属コート膜等の、表面コーティングを施すこともできる。
【００４４】
上記のバネ定数、導電性、表面の光反射率等の要件を満足するカンチレバーの一例として、例えば、ボロン等をドープしたｎ型シリコンウエハに対して、半導体加工プロセスを適用することで作製される、厚さ（Ｔ）数μｍ程度、長さ（Ｌ）数百μｍ程度、幅（Ｗ）数十μｍ程度の、長方形形状のカンチレバーや、厚さ（Ｔ）数μｍ程度、根本から先端までの長さ（Ｌ）数百μｍ程度、一片の幅（Ｗ）数十μｍ程度の、Ｖ字型またはＵ字型のカンチレバーを挙げることができる。但し、カンチレバーだけでは取り扱いが困難であるため、一辺が数ｍｍ以上の大きさのチップに、前記のカンチレバーが取り付けられたような形状に、一体加工することが好ましい。また、プローブ顕微鏡用のプローブとして市販されている、長さ５ｍｍ程度、幅２ｍｍ程度、厚さ１ｍｍ程度のチップの先端に、厚さ（Ｔ）５μｍ程度、長さ（Ｌ）２００μｍ程度、幅（Ｗ）３５μｍ程度のカンチレバーが形成されているカンチレバー付きチップを転用することもできる。また、チップの中央に穴が空いていて、その穴中にカンチレバーが突きだしているような構造のものは、チップの先端からカンチレバーが突き出した構造のものより、チップを取り扱う際、カンチレバー部を破損させるトラブルの発生頻度を大幅に減らすことができる。さらに、後述する変位量測定装置にチップを装着する際に、カンチレバーが傾いて装着され、カンチレバー先端部の撓み量（変位量）を誤検出するトラブルの発生頻度も大幅に減らすことができる。
【００４５】
なお、カンチレバーの共振周波数を測定する際、チップ部分を振動子で振動させ、周波数ωの強制振動を起こさせるが、この振動子はカンチレバー付きチップに組み込んだ形態とすることもでき、あるいは、測定装置側に組み込み、チップに接触させる形態とすることもできる。また、外力を印加して、予めカンチレバーを撓んだ状態に保持する手段や、共振周波数の検出に利用する手段をカンチレバーに組み込んでしまう形態に関しては、工程Ｂ、工程Ｃの説明中にて詳説する。
【００４６】
ターゲット物質およびターゲット物質認識物質：
ターゲット物質は、それを特異的に結合することが可能なターゲット物質認識物質が存在するものならば、イオン種や、高分子であってもよく、特に、その形態は限定されない。また、ターゲット物質とターゲット物質認識物質との結合を行う際には、両者の結合の促進または橋渡しする第三の物質を添加してもよい。本発明が適用可能なターゲット物質とターゲット物質認識物質の組み合わせの例として、以下のようなものを挙げることができる。
（１）ターゲット物質は、１〜数個の原子で構成される分子あるいはイオン種で、ターゲット物質認識物質は。かかるターゲット物質の分子やイオン形状に対して、ちょうど合うような、相補的な形状を示す高分子、またはそのような高分子を官能基として含んでいる巨大高分子。
【００４７】
具体的には、カリックス［ｎ］アレーンは、側鎖やｎの数値によって、様々なイオン種やフラーレンなどと特異的に結合することが、化学  Ｖｏｌ．５３  Ｎｏ．３  ｐ２６〜（１９９８）に紹介されている。また、キチンやキトサンのアミノ基は、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）と水素結合した状態で、ＰＡＡのカルボキシル基部分（−ＣＯＯ-）に、カルシウム・カチオン種（Ｃａ2+）が特異的に付着することが、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９９  ｐ１９９〜に報告されている。
（２）ターゲット物質は、アミノ酸、ペプチド・タンパク質、あるいは、これらの配糖体、糖鎖との結合体など、抗原分子であり、ターゲット物質認識物質は、前記抗原分子と特異的な抗原・抗体反応する抗体。あるいは、例えば、ビオチンとアビジンなど、リガンド分子とその受容体の組み合わせ。
【００４８】
特異的な結合を行う、リガンド分子とその受容体に関しては、様々な組み合わせが報告されている。一方、抗原分子に対する特異的抗体に関しては、抗原分子に応じた、目的とする抗体の創製方法、特に、モノクローナル抗体の単離・精製方法も確立されている。さらに、種々のモノクローナル抗体に関しては、市販もされている。
（３）ターゲット物質は、ＤＮＡやＲＮＡ分子であり、ターゲット物質認識物質は、該ターゲット物質の一本鎖核酸分子の塩基配列に対して、それ相補的な塩基配列を有し、該ターゲット物質の一本鎖核酸分子とハイブリド体を形成する一本鎖ＤＮＡ、ＰＮＡ。
【００４９】
ターゲット物質となる、一本鎖核酸分子に対して、その塩基配列中から、該ターゲット物質に特有な数十塩基長の部分塩基配列を選択し、それと相補的な関係の数十塩基の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーション反応用のプローブとして利用することができる。なお、数十塩基の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡは、市販のＤＮＡ合成装置を利用することで、簡単に合成することが可能である。
【００５０】
ターゲット物質認識物質をカンチレバー表面上に固定する方法：
ターゲット物質認識物質の固定方法は、特には、限定はなく、用いるターゲット物質認識物質の特性に合わせて、適切な方法を選択すればよい。例えば、ターゲット物質認識物質、あるいは、ターゲット物質認識物質を側鎖に持つ巨大高分子が有機溶媒等に溶解する場合、ターゲット物質認識物質や巨大高分子を溶解した溶液をカンチレバー表面に滴下し、スピンコートする方法、あるいは、溶液中にカンチレバーを浸漬した後、引き上げるディップコート法が適用可能である。また、インクジェット技術などを用いて、溶液の微細液滴を吹き付ける方法は、例えば、複数のカンチレバーが並んだアレイに対して、個々のカンチレバーに別のターゲット物質認識物質を塗布する場合に有効である。また、ターゲット物質認識物質が、抗体分子や一本鎖ＤＮＡの場合、分子の一端にチオール基（−ＳＨ）を結合させ、一方、カンチレバーの表面上に金や白金被膜層をコートした上で、該金や白金被膜層へ結合する方法も、一般的に利用される手法である。例えば、ターゲット物質認識物質がビオチンの場合、ビオチンにチオール基（−ＳＨ）を導入したビオチンチオールの作製法と、導入されたチオール基（−ＳＨ）を利用して、金基板上へ結合させる方法が、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，ｐ１７０６〜（１９９３）に報告されている。また、カンチレバーの表面が、金属や金属酸化物で構成されている場合、ビオチンシランを利用して、シラン部分の反応を介して、結合させる手法が、特開平７−２６０７９０号公報に開示されており、本発明でも利用できる。
【００５１】
（工程Ｂ）カンチレバーの初期共振周波数を測定する工程
カンチレバーを振動させる方法：
自由振動を行わせて、カンチレバーの共振周波数を測定する際には、カンチレバーの先端部が撓むように、外部から単一パルス状の外力（衝撃）を加えて、振動を誘起する。この自由振動の誘起に利用する単一パルス状の外力（衝撃）は、特に限定されない。例えば、工程Ｃでも触れるカンチレバーをたわませる手段を用いて、カンチレバーが破損・変形されない程度の衝撃を加える手法を利用することもできる。
【００５２】
一方、カンチレバー付きチップに強制振動を印加して、カンチレバーを所定の周波数で強制振動させる方法は、例えば、タッピングＡＦＭや周波数変調方式ＡＦＭ等で一般的に使われている、カンチレバー付きチップにピエゾ発振子を接触させて、このピエゾ発振子に、所定の周波数の交流電圧を加えて、強制的に振動させる方法を利用することができる。
【００５３】
共振周波数の測定方法：
カンチレバーの共振周波数を測定する方法は、特に限定されない。例えば、カンチレバーを自由振動させ、その自由振動の振動周波数として、共振周波数を測定する方法を用いることができる。自由振動を誘起する手段としては、カンチレバーに初期撓みを生じるため、衝撃を加える方法を利用することができる。また、強制振動を行わせた際、その振動振幅の周波数依存性に基づき、共振周波数を求める方法を用いることもできる。この強制振動を行わせる場合、カンチレバーの根元部を所定の周波数で微小振動させることで、カンチレバーを撓み振動させる手法が利用可能である。例えば、カンチレバー付きチップに対して、発振素子を用いて、そのチップ部を強制的に振動させ、カンチレバーを撓み振動させる方法が考えられる。
【００５４】
いずれの測定方法を用いる場合も、カンチレバーの撓み振動は、カンチレバー先端部の周期的な撓み変位量を測定することにより検出する。このカンチレバー先端部の撓み変位量を測定する方法としては、カンチレバーの先端にレーザ光線を照射し、撓み変位に起因する反射光のズレを検出する「光てこ法」や、光ファイバを用いて、カンチレバーの先端にレーザ光線を照射し、反射光も同じ光ファイバに導き、入射光と反射光の干渉波の変化に基づき、光ファイバ先端からカンチレバーの先端までの光路長の変化、すなわち、カンチレバー先端の撓み変位量を検出する干渉法といった光学的な検出方法が利用できる。また、カンチレバーに、ピエゾ素子などの歪み検出素子を張り合わせて、撓み変位量を圧電効果による抵抗値の変化として検出する方法、あるいは、導電性のカンチレバーと平行に電気的に絶縁された電極を設置し、平行平板型コンデンサーを構成し、その静電容量の変化に基づき、電極間の平均距離の変化、すなわちカンチレバー先端の撓み変位量を検出する方法を利用することもできる。
【００５５】
カンチレバーの自由振動の振動周波数を測定する際には、カンチレバー先端部の周期的な撓み変位量を検出し、その周期的変化の周波数を測定すればよい。また、カンチレバーを発振子で強制的に振動させる場合は、カンチレバー先端部の周期的な撓み変位量を検出し、その振幅を測定し、振幅の周波数依存性を求める。カンチレバーの共振周波数は、求められた振幅の周波数依存性において、振幅が極大を示す周波数として求められる。
【００５６】
なお、カンチレバー自体に、ピエゾ・センサや発振子などの何らかの素子を貼り付ける場合、工程Ａでカンチレバーを作製する際に、同時に、これらの素子を作り込むことになる。その際、貼り付けられる素子が、逆にカンチレバーの剛直性を必要以上に上昇させる、あるいは、カンチレバー自身の素材と貼り付けた素子の素材との間の熱膨張率差のため、貼り付けた素子とカンチレバーとの界面領域が、バイメタル素子のように温度に応じて撓み変形を起こす、といった問題に対する配慮が必要である。
【００５７】
カンチレバー先端部の周期的な撓み変位量を検出し、その検出結果に基づき、共振周波数を求める操作には、上記共振周波数を測定する専用の電子回路を用いてもよい。また、強制振動を誘起させる発振子に、所定の周波数の交流電圧を供給する電源装置等、測定装置全体の制御も考慮すると、ＡＤコンバータなどアナログ信号を取り込む機能を備えたパーソナルコンピュータ（以下、パソコン）を利用して、測定条件の制御と、検出結果に基づき、共振周波数を求める演算処理とを、一括して行う構成を用いてもよい。
【００５８】
（工程Ｃ）カンチレバーに外力を加えて、撓んだ状態で保持する工程
カンチレバーを予め撓ませ、その撓んだ状態に保持する方法は、特に限定されない。例えば、カンチレバーの先端をカンチレバーと同程度の大きさ形状・素材のもので押す、またはフック付きニードルで引くといった機械的な手法により、所望の外力が印加されている状態とする、機械的な撓みの形成方法が利用できる。また、工程Ｂの説明中に記述した、カンチレバーにピエゾ素子を張り合わせた形態では、このピエゾ素子に電圧を印加して、歪みを引き起こし、カンチレバーを変形させる方法が利用できる。その他、導電性を有する、Ｖ字型またはＵ字型のカンチレバー二つを上下に対向させて配置した状態とし、カンチレバー両者にそれぞれ電流を流し、発生する磁界による静電的力によって、撓ませる方法、予め、カンチレバーの先端に鉄等の磁性材料を組み込み、電磁石で吸引することで、撓ませる方法を採用することもできる。さらには、後述する工程Ｄにおいて説明するように、一定の流量・流速・方向で試料溶液または気体をカンチレバー表面に吹き付け、撓んだ状態とする方法なども利用可能である。
【００５９】
いずれの手法を選択する場合も、カンチレバーに印加される外力によって、カンチレバーが破損したり、塑性変形を引き起こしたりしないように、カンチレバーの材質、形状に応じて、印加される外力の大きさ、保持される撓みの曲率の範囲を事前に検討することが必要である。
【００６０】
（工程Ｄ）カンチレバーをターゲット物質を含む試料に接触させる工程
予め撓んだ状態に保持されているカンチレバーを、ターゲット物質を含む試料と接触させる方法は、特に限定されない。試料が液体である場合は、カンチレバーを試料中に浸漬すればよい。また、試料が気体である場合は、カンチレバーを試料雰囲気中に曝せばよい。また、試料溶液または気体を一定の流量・流速・方向でカンチレバーの表面に吹き付ける形態を採用することもできる。その際、試料溶液または気体を一定の流量・流速・方向でカンチレバーの表面に吹き付けることにより、カンチレバーを撓んだ状態に保持するとともに、ターゲット物質との接触もなされ、工程Ｃと工程Ｄを同時に行う形態とすることも可能である。
【００６１】
工程Ｄは、カンチレバーを変位量測定装置に組み込んだ状態で行ってもよい。また、工程Ｂの終えた後、変位量測定装置からカンチレバーを取り外し、カンチレバーを撓んだ状態に保持する機構を備えた、脱着が容易なカセットに取り付け、工程Ｃを行い、このカセットに取り付けた状態で、工程Ｄを実施することができる。すなわち、フィールドや医療現場など、試料をサンプリングする場所において、このカセットに取り付けた状態のカンチレバーを利用して、工程Ｄを実施することができる。
【００６２】
その後、ターゲット物質付着処理工程を終えたカセットを回収して、再び、カセットから取り外しや、ターゲット物質の付着がなされたカンチレバーを変位量測定装置にセットしなおし、ターゲット物質の付着後の、カンチレバーの共振周波数の測定を行う。すなわち、回収されたカセットは、一か所にまとめた上で、ターゲット物質の付着後の、カンチレバーの共振周波数の測定をまとめて行うも可能となる。
【００６３】
（工程Ｃ’）カンチレバーに外力を加えて、逆方向に撓んだ状態で保持する工程
工程Ｃ’では、カンチレバーに、工程Ｃとは逆方向の力を加えることで、工程Ｃでは、凹面だった側が、凸面になるようにカンチレバーを逆に撓ませる。なお、逆方向の外力を加え、逆方向に撓んだ状態にする方法は、工程Ｃと同様に、特に限定されない。
【００６４】
（工程Ｄ’）カンチレバーをターゲット物質を含む試料に接触させる工程
前記工程Ｃ’により、凹面だった側が、凸面になるようにカンチレバーを逆に撓ませる状態とした上で、工程Ｄ’では、カンチレバーを、ターゲット物質を含む試料にさらに接触させる。工程Ｄ’において、ターゲット物質を含む試料に接触させる方法は、工程Ｄと同様に特に限定されない。
【００６５】
（工程Ｅ）カンチレバーに印加された外力を取り除く工程
工程Ｃ、あるいは、工程Ｃ’おいて、外力を印加して、強制的に撓んだ状態に保持されているカンチレバーは、印加されている外力を取り除くと、この強制的な撓みは解消され、カンチレバーの先端が自由端となる「解放」状態となる。この印加されている外力を取り除く際、いきなり、カンチレバーに印加されている外力をゼロにすると、蓄えられている弾性応力によって、カンチレバーは振動を始める。この振動は次第に減衰して、最終的には、カンチレバーは制止する。
【００６６】
ただし、撓んだ状態で保持されている際、カンチレバー全体が凸面状とするため、カンチレバーの先端部に外力を印加しているが、その撓み量が大きいと、いきなり、カンチレバーに印加されている外力を取り除き、自由振動を行わせると、大きな振幅で振動を開始する。すなわち、カンチレバーを大きな撓み量で反復的に撓ませる状態が継続すると、カンチレバーが反復的な曲げ応力印加に起因する機械的な疲労を起こし、破損を生じる可能性がある。この点を考慮し、カンチレバーに印加されている外力を徐々に減らして、振動の発生を回避しつつ、最終的に印加される外力をゼロにすることが望ましい。この外力を徐々に取り除く段階に要する時間は、カンチレバーのバネ定数に依存しており、すなわち、カンチレバーの素材や形状に依存する。実際に測定に利用するカンチレバーと、全く同じ素材、形状のカンチレバーを利用して、事前に、外力を徐々に取り除く段階に適する外力の低下速度を検討した上で、適宜決定することが可能である。
【００６７】
また、いきなり、カンチレバーに印加されている外力を取り除いた際に、発生する振動の振幅を抑制し、速やかに減衰するとうに、例えば、カンチレバーの根本部分にダンパーを取り付け、振幅を制限し、同時に、弾性応力の減衰を行う形態を利用することもできる。また、いきなり、カンチレバーに印加されている外力を取り除いた際に、発生する振動によって、カンチレバーの先端が反対方向に方向に撓む状態を回避するように、ストッパーを作用させ、強制的に振動を止める手法の利用も考えられる。
【００６８】
このダンパーや、ストッパーを取り付けている場合、カンチレバーの共振周波数の測定に際して、その自由振動を阻害する要因とならないように、予め取り外した上で、共振周波数の測定を実施することが必要となる。
【００６９】
（工程Ｆ）ターゲット物質の付着処理後の、カンチレバーの共振周波数を測定する工程
ターゲット物質の付着処理を終えた後、カンチレバーの共振周波数を測定する。その際、ターゲット物質付着処理後のカンチレバーの共振周波数は、上記工程Ｂで利用する測定方法と同様の測定手順に従って、測定する。
【００７０】
なお、カンチレバー表面にターゲット物質が付着し、ターゲット物質の荷重によりカンチレバー全体の質量増加が生じていると、測定される「ターゲット物質付着処理後の共振周波数」ω0fは、上記工程Ｂで測定される「初期共振周波数」ω0iとは異なったものとなっている。
【００７１】
（工程Ｇ）前記工程（Ｂ）で測定される「初期共振周波数」ω0iと前記工程（Ｆ）で測定される「ターゲット物質付着処理後の共振周波数」ω0fの差を算出する工程
工程Ｂで測定した「初期共振周波数」ω0iと、工程Ｆで測定した「ターゲット物質付着処理後の共振周波数」ω0fとの差Δω0＝（ω0i−ω0f）をパソコン等で計算し、さらに、この差Δω0に基づき、カンチレバー表面にターゲット物質が付着することに由来する質量変化の有無や質量変化量を算出する。
【００７２】
なお、「初期共振周波数」ω0iの実測値に代えて、カンチレバーの推定初期共振周波数を用いて、差Δω0＝（ω0i−ω0f）を算出することもできる。
【００７３】
なお、上記の説明では、本発明の検出原理を説明する上で、説明を簡単にする目的で、一本のカンチレバーを有するセンサを用いる形態について記述したが、複数のカンチレバーを有するセンサ構成を利用することもできる。
【００７４】
例えば、複数のカンチレバーを並べたアレイ構成を利用し、複数のカンチレバー表面に同一のターゲット物質認識物質を固定し、それら複数のカンチレバーの共振周波数変化量Δω0の測定結果を平均して、この平均値に基づき、付着しているターゲット物質の量を算定する形態を採用すると、試料中に含まれるターゲット物質の検出を、より精度で行うことが可能となる。
【００７５】
また、複数のカンチレバーを並べたアレイ構成を利用し、個々のカンチレバーに別のターゲット物質認識物質を固定すると、各カンチレバーの共振周波数変化量Δω0の測定結果に基づき、一度に複数のターゲット物質を検出する形態とすることも可能である。
【００７６】
また、別の例として、並列した二本のカンチレバーを一組とし、一方はターゲット物質認識物質を固定した検出用カンチレバーとし、もう一方はターゲット物質認識物質と似てはいるがターゲット物質とは結合しない物質を固定して、対比用カンチレバーとすると、カンチレバーの共振周波数変化量Δω0測定時に、両者の変化量Δω0を同時に測定し、対比することで、カンチレバーのバネ定数ｋの変化に起因する共振周波数変化を考慮した上で、カンチレバー表面にターゲット物質が付着することに由来する質量変化の有無や質量変化量を算定することが可能となる。
【００７７】
その際、対比用カンチレバー表面には、ターゲット物質が付着していない点を利用し、測定用カンチレバーの共振周波数と、対比用カンチレバーの共振周波数との差は、測定用カンチレバー上に付着しているターゲット物質の有無、ならびにその付着量を反映する。一方、対比用カンチレバーにおける、「初期共振周波数」と、「ターゲット物質付着処理後の共振周波数」との差は、試料との接触に伴い、カンチレバーのバネ定数ｋの変化の有無、あるいは、その程度を算出する基礎とすることができる。
【００７８】
なお、本発明にかかるターゲット物質の検出方法の原理に基づく、ターゲット物質検出装置の装置構成は、上記の工程（Ａ）〜工程（Ｇ）に対応する装置構成を備えることが好ましい。具体的には、
（ａ）ターゲット物質認識物質を表面に固定したカンチレバーを具えたカンチレバーセンサ；
（ｂ）ターゲット物質認識物質を表面に固定したカンチレバーの初期共振周波数を測定する手段；
（ｃ）前記カンチレバーに外力を加えて、ターゲット物質認識物質が固定されている一方の面を凸として、撓んだ状態で保持する手段；
（ｄ）前記撓んだ状態で保持する前記カンチレバーを、ターゲット物質認識物質に対するターゲット物質の結合を可能とする状態で、試料と接触させる手段；
（ｅ）前記カンチレバーに加えた外力を取り除く手段；
（ｆ）ターゲット物質との結合を目的とする、試料との接触を行った後の前記カンチレバーの共振周波数を測定する手段；
（ｇ）試料との接触を行った後の前記カンチレバーの共振周波数と、カンチレバーの初期共振周波数との差を算出する手段；
（ｈ）試料との接触後のカンチレバーの共振周波数測定値と、試料との接触前の該カンチレバーの初期共振周波数とから算出される共振周波数差に基づき、該カンチレバー表面に固定されているターゲット物質認識物質に対して結合したターゲット物質の有無、あるいは、結合したターゲット物質の量を算出する手段
を具えていることを特徴とするターゲット物質検出装置とすると、より好ましい。
【００７９】
以上に説明したように、本発明にかかるターゲット物質の検出方法の原理では、予めカンチレバーを撓ませた状態とした上で、カンチレバーとターゲット物質とを接触させることによって、ターゲット物質同士の斥力が小さい状態で、カンチレバー表面にターゲット物質を付着させることが可能となり、付着後、カンチレバーを撓ませている外力を取り除くと、カンチレバーの表面には、高い面密度で付着したターゲット物質は、そのターゲット物質間の斥力によって、脱落することなく、付着状態を維持する。この状態で、高い面密度で付着したターゲット物質による荷重増加を反映する、カンチレバーの共振周波数変化量を測定することによって、ターゲット物質のより高感度な検出が可能となっており、または、より簡易な検出手段による測定が可能になる。
【実施例】
【００８０】
以下、具体例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。なお、下記の具体例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例であるが、本発明は、これら具体例の態様に限定されるものではない。
【００８１】
（実施態様１）
本実施態様では、ターゲット物質のアビジンを、ターゲット物質認識物質として、ビオチンを利用して、ビオチンを固定化したカンチレバーセンサによって検出する事例を示す。すなわち、ビオチンは、アビジンと特異的に結合する補酵素であり、ターゲット物質のタンパク質を、それと特異的な結合能を有する基質物質との複合体形成を介して、カンチレバー表面に付着させる事例に相当する。
【００８２】
この態様で利用するカンチレバーセンサは、一本のカンチレバーで構成される形態である。カンチレバーの共振周波数の測定は、付設する発振子によって、カンチレバーを所定の振動周波数で強制振動させ、その際、カンチレバー先端部の振幅（撓み量の変化幅）を光てこ法を利用して測定する。強制振動条件において、その振動周波数ωに対して、観測されるカンチレバー先端部の振幅（撓み量の変化幅）をプロットし、極大を与える振動周波数ωをカンチレバーの共振周波数ω0の実測値とする。
【００８３】
なお、同一工程で作製されるカンチレバーは、カンチレバー自体の質量ｍ、バネ定数ｋは、本質的に同じとなるように、作製精度、特性の再現性を高めており、同一工程で作製したカンチレバーの共振周波数は、ほぼ同様の値となっている。従って、アビシンの検出に利用するカンチレバーの初期共振周波数の測定を行った後、比較用に用いるカンチレバーに関しては、その初期共振周波数の測定は省くこともできる。
【００８４】
（１）カンチレバー表面へのビオチンの固定化
検出に利用するカンチレバーセンサは、カンチレバーの表面に予め金コートを施した後、金に対するスルファニル基（−ＳＨ）の反応性を利用して、スルファニル基（−ＳＨ）を導入したビオチン（ビオチンチオール）を金コート膜上に固定化したものである。
【００８５】
図２（ａ）に、シリコン基板から通常の半導体製造プロセスを利用して作製する、カンチレバー付きチップ自体の構造を模式的に示す。縦横１０ｍｍ、厚さ１ｍｍ程度の正方形チップ３１の中心に、カンチレバー３３が形成されている。図２（ｂ）に示すように、カンチレバー３３は、厚さ１μｍ、長さ５００μｍ、幅１００μｍの片持ち梁状の構造であり、シリコン基板をエッチング加工することで作製する。このエッチング加工によって除去される部分は、正方形チップ３１の中心に、直径６００μｍの穴３２となる。この穴３２の中央に、カンチレバー３３が突き出した形状とする。この加工工程後、カンチレバー付きチップＡ、Ｂは、そのカンチレバーａ、ｂの上面、下面ともに、金蒸着膜をコートする。
【００８６】
ビオチンに対して、スルファニル基（−ＳＨ）を導入したビオチンチオールのエタノール溶液（０．５ｍＭ）中に、金蒸着膜コートを施したカンチレバー付きチップを３０分間浸漬する。金被膜表面へのビオチンの固定化処理後、ビオチンチオールのエタノール溶液から取り出し、未反応ビオチンチオールの除去のため、エタノールで３回洗浄する。洗浄後、乾燥を行った後、シリコン基板から上記のサイズで、ダイシング処理を行って、カンチレバー付きチップを切り離す。
【００８７】
その結果、カンチレバー付きチップＡ、Ｂは、本質的に全く等しい、両面ビオチン固定型のカンチレバーセンサとなる。
【００８８】
（２）ビオチン固定カンチレバーセンサを利用するアビジンの検出
次に、両面ビオチン固定型のカンチレバーセンサを利用して、アビジンを検出する手順を説明する。
【００８９】
図３に、カンチレバーの共振周波数の測定に利用する装置の構成を模式的に示す。この測定装置は、カンチレバー先端の撓み量を検出するために利用する、光てこ法を応用した変位量測定装置と、カンチレバーを所定の周波数ωで強制振動させるピエゾ素子型発振子とで構成されている。その際、カンチレバーを所定の周波数ωで強制振動させた状態で、カンチレバー先端の撓み量の変化幅（振幅）を測定し、各振動周波数ωに対する、カンチレバー振動の振幅をプロットし、その極大を与える振動周波数を、カンチレバーの共振周波数ω0の実測値とする。
【００９０】
カンチレバー付きチップ３１を固定するステージ４１は、チップと接する面はチップ形状に合わせて窪んでおり、かつチップと接触する面は、鏡面加工し、平坦な面とされている。クランプ４２で、チップ３１をステージ４１に固定する際、チップ３１自体の装着位置は、高い精度と再現性で同じ位置となる。一方、半導体レーザ発信器４３から放出されるレーザ光線４４は、レンズ４５を通して、カンチレバー先端部に照射される。カンチレバー先端部で反射された反射光４６は、ディテクタ４７に達する。ディテクタ４７は、上下２個のフォトダイオード（不図示）より構成される、所謂、二分割センサである。上下２個のフォトダイオードの信号は、それぞれ２チャンネルＡＤ変換ボードを介して、デジタル情報として、パソコン４８に入力される。
【００９１】
ステージ４１には、チップ３１と接触するように、ピエゾ発振子４０が埋め込まれている。該ピエゾ発振子４０を、所定の周波数ωで発振させることにより、チップ３１を介して振動が伝播される結果、カンチレバー３３は、該振動周波数ωで強制振動される状態となる。
【００９２】
この強制振動によって、カンチレバー先端部の撓み量が周期的に変化すると、先端部に対する、レーザ光線４４の入射角θが変化し、対応して、反射光の反射角θも変化し、反射光の軌跡は、４６’の様なズレ状態と、４６’’の様なズレ状態との間を周期的に往復する。カンチレバー３３が静止している状態において、ディテクタ４７の二分割センサ上に入射される反射光の中心軸は、レーザ光線４４の入射角θが当初の角度θ0である状態で、上下２個のフォトダイオードの境界線上に位置するように、半導体レーザ発信器４３とディテクタ４７の位置合わせがなされる。一般に、そのゼロ点調整がなされた状態では、上下２個のフォトダイオードへの入射光強度に比例する、出力信号強度は等しくなるように、位置合わせがなされる。
【００９３】
カンチレバー先端の撓み量が変化すると、レーザ光線４４の入射角θが、当初の角度θ0から変位すると、最終的に、二分割センサ上に入射される反射光の中心軸は、上下２個のフォトダイオードの境界線上から、上下２個のフォトダイオードの何れかに偏る位置に変位する。その結果、上下２個のフォトダイオードへの入射光強度に比例する、出力信号強度に差違が生じる。両者の出力信号強度の差違に基づき、二分割センサ上に入射される反射光の中心軸の、上下２個のフォトダイオードの境界線上からの変位量を算出し、さらに、カンチレバー先端部に対するレーザ光線４４の入射角θが、当初の角度θ0から変位した量Δθを算出する。これら一連の演算処理は、パソコン４８内において、データ解析プログラムに従って実施される。
【００９４】
強制振動状態では、カンチレバー先端の撓み量は周期的に変動し、対応して、当初の角度θ0から変位した量Δθも周期的に変動する。すなわち、反射光の軌跡が、４６’の様なズレ状態と、４６’’の様なズレ状態となる二つの時点の変位量Δθ（極大値と極小値）に基づき、カンチレバー先端の撓み量δにおける極大値δｍａｘと極小値δｍｉｎをそれぞれ算出し、その差（δｍａｘ−δｍｉｎ）を、カンチレバー先端の撓み量の変動幅（振幅）実測値とする。
【００９５】
ピエゾ発振子４０の発振周波数は、その駆動電源である、オシレータ４９から供給される高周波電圧の周波数に一致している。この高周波電圧の周波数を、ω1からω2まで、連続的に変化させて、各振動周波数ωにおける、カンチレバー先端の撓み量の変動幅（振幅）実測値を測定する。撓み量の変動幅（振幅）実測値を、振動周波数ωに対してプロットすると、図４に示すように、カンチレバーの共振周波数ω0に相当する振動周波数領域で、振幅は極大を示す。換言すると、撓み量の変動幅（振幅）実測値（δｍａｘ−δｍｉｎ）を、振動周波数ωの関数として、数値微分を行って、微分係数：ｄ（δｍａｘ−δｍｉｎ）／ｄω＝０となる振動周波数ωを算定し、カンチレバーの共振周波数ω0の実測値：ω0-obsとする。
【００９６】
なお、当初の角度θ0から変位した量Δθから、カンチレバー先端の撓み量δを算出する操作では、カンチレバー付きチップ３１のカンチレバー形状、例えば、カンチレバー３３の長さ、カンチレバー３３上におけるレーザ光線４４の当初の照射位置、当初の撓み量（または、曲率半径）ならびに、検出結果から算出される、当初の角度θ0から変位した量Δθに基づき、カンチレバー先端の撓み量δを算出する。この当初の角度θ0から変位した量Δθから、カンチレバー先端の撓み量δを算出する操作、さらには、撓み量の変動幅（振幅）実測値（δｍａｘ−δｍｉｎ）を振動周波数ωの関数として、数値微分し、カンチレバーの共振周波数ω0の実測値：ω0-obsを算定する操作などの数値演算処理も、パソコン４８内において、対応するデータ解析プログラムに従って実施される。加えて、オシレータ４９から供給される高周波電圧の周波数を、ω1からω2まで、連続的に変化させて、各振動周波数ωにおける、当初の角度θ0から変位した量Δθの極大値Δθｍａｘと極小値Δθｍｉｎを測定する操作も、パソコン４８による制御プログラムに従って、自動化された測定ルーチン化がなされている。
【００９７】
両面ビオチン固定型のカンチレバーＡを利用して、アビジンの検出を行う前に、予め、ビオチン固定カンチレバー付きチップＡを変位量測定装置にセットし、そのカンチレバーの先端部におけるレーザ光線４４の照射スポット位置が、所定の位置となるように、レーザ発信器４３と集光レンズ４５とからなる、入射光源系の光軸を微調整する。併せて、反射光の受光系を構成する二分割センサ型ディテクタ４７の位置を微調整し、二分割センサ上に入射される反射光の中心軸が上下２個のフォトダイオードの境界線上に位置するようにする。具体的には、二分割センサを構成する、上下２個のフォトダイオードへの入射光強度に比例する、出力信号強度が、等しくなるように、二分割センサ型ディテクタ４７の位置を微調整する。
【００９８】
引き続き、オシレータ４９から供給される高周波電圧の周波数を、ω1からω2まで、連続的に変化させて、各振動周波数ωにおける、カンチレバー先端の撓み量の変動幅（振幅）を実測し、その実測値（δｍａｘ−δｍｉｎ）を基に、該ビオチン固定カンチレバーａの初期の共振周波数実測値：ω0-obs-Aiを算定する。
【００９９】
以上の「初期の共振周波数」の実測を終えた後、カンチレバー付きチップＡを取り外し、図５に示すように、プローブ顕微鏡用の探針５３付きカンチレバー５２を具えたチップ５１を、スペーサ５４を介して、該チップ３１の上面に取り付け、カンチレバー３３の先端に、探針５３が接触する状態とする。その結果、探針５３の接触点に印加される外力のため、カンチレバー３３は、上面を凸にして撓んだ状態となる。ここでは、厚さ１μｍ、長さ５００μｍ、幅１００μｍの片持ち梁状構造のカンチレバー３３に対して、その先端における撓み量が、約１００μｍとなる当接条件（特には、スペーサ５４の厚さ）を選択している。
【０１００】
この探針５３付きカンチレバー５２を具えたチップ５１を取り付けた状態で、カンチレバー付きチップＡをアビジン水溶液に浸漬する。所定時間を経過した後、アビジン水溶液からカンチレバー付きチップＡを取り出し、蒸留水で洗浄を行う。カンチレバー表面に固定されているビオチンとの結合を介して、安定に付着するアビジンを除き、カンチレバー表面に物理的吸着しているアビジンなどは、蒸留水洗浄によって、除去される。蒸留水洗浄後、表面にアビジンが付着しているカンチレバー付きチップＡを自然乾燥する。
【０１０１】
「初期の共振周波数」実測値の測定に用いた共振周波数測定装置に、ビオチンとの結合を介して、安定にアビジンの付着がなされているカンチレバー付きチップＡを再セットし、その表面にアビジンが付着しているカンチレバーａの共振周波数を実測する。表面にアビジンが付着しているカンチレバーａの共振周波数実測値：ω0-obs-Afと、該ビオチン固定カンチレバーａの「初期共振周波数」実測値：ω0-obs-Aiとの差、Δω0-obs-A＝（ω0-obs-Ai−ω0-obs-Af）を算出する。
【０１０２】
一方、カンチレバー付きチップＢに関しては、そのビオチン固定カンチレバーｂは、上記ビオチン固定カンチレバーａと本質的に同一に作製されており、すなわち、該ビオチン固定カンチレバーｂの「初期の共振周波数」実測値は、ビオチン固定カンチレバーａの初期の共振周波数実測値：ω0-obs-Aiと同じ値となる。実際に、該ビオチン固定カンチレバーｂの「初期共振周波数」を実測したところ、該ビオチン固定カンチレバーｂの「初期共振周波数」実測値：ω0-obs-Biは、該ビオチン固定カンチレバーａの「初期共振周波数」実測値：ω0-obs-Aiと、測定誤差内で一致している。
【０１０３】
カンチレバー付きチップＢに対しても、図５に示すように、プローブ顕微鏡用の探針５３付きカンチレバー５２を具えたチップ５１を、スペーサ５４を介して、該チップ３１の上面に取り付け、カンチレバー３３の先端に、探針５３が接触する状態とする。その結果、探針５３の接触点に印加される外力のため、カンチレバー３３は、上面を凸にして撓んだ状態となる。ここでは、厚さ１μｍ、長さ５００μｍ、幅１００μｍの片持ち梁状構造のカンチレバー３３に対して、その先端における撓み量が、約１００μｍとなる当接条件（特には、スペーサ５４の厚さ）を選択している。
【０１０４】
この探針５３付きカンチレバー５２を具えたチップ５１を取り付けた状態で、カンチレバー付きチップＢを純水に浸漬する。所定時間を経過した後、純水からカンチレバー付きチップＢを取り出し、自然乾燥する。
【０１０５】
共振周波数測定装置に、純水浸漬処理を施したカンチレバー付きチップＢをセットし、その表面にアビジンの付着がなされていないカンチレバーｂの共振周波数を実測する。表面にアビジンの付着がなされていないカンチレバーｂの共振周波数実測値：ω0-obs-Bfと、該ビオチン固定カンチレバーｂの「初期共振周波数」実測値：ω0-obs-Bi≒ω0-obs-Aiとの差、Δω0-obs-B＝（ω0-obs-Ai−ω0-obs-Bf）を算出する。
【０１０６】
Δω0-obs-Bから、アビジンを検出できない場合の共振周波数の変動量を求めることができる。
【０１０７】
具体的には、このΔω0-obs-B＝（ω0-obs-Ai−ω0-obs-Bf）は、ビオチン固定カンチレバーを、アビジンを含有していない試料溶液と接触させた状態、すなわち、ビオチン固定カンチレバーの表面に付着されるアビジンは存在してなく、カンチレバー全体の質量ｍの増減はないが、水性溶媒に浸漬することに起因して、カンチレバーのバネ定数が、ｋから（ｋ−Δｋ）に変化することによって、初期の共振周波数：ω0-i＝（ｋ／ｍ）1/2から、浸漬処理後の共振周波数：ω0-Bf＝（［ｋ−Δｋ］／ｍ）1/2へと変化することを、反映している。
【０１０８】
Δω0-obs-Aから、アビジンを検出したことに由来する共振周波数の変動量を求めることができる。
【０１０９】
具体的には、このΔω0-obs-A＝（ω0-obs-Ai−ω0-obs-Af）は、ビオチン固定カンチレバーを、アビジンを含有している試料溶液と接触させた状態、すなわち、ビオチン固定カンチレバーの表面にアビジンが付着される結果、カンチレバー全体の質量は、ｍから（ｍ＋Δｍ）に増加し、同時に、水性溶媒に浸漬することに起因して、カンチレバーのバネ定数が、ｋから（ｋ−Δｋ）に変化することによって、初期の共振周波数：ω0-i＝（ｋ／ｍ）1/2から、アビジン付着後の共振周波数：ω0-Af＝（［ｋ−Δｋ］／［ｍ＋Δｍ］）1/2へと変化することを、反映している。
【０１１０】
前記の対応に基づき、
Δω0-obs-B＝（ω0-obs-Ai−ω0-obs-Bf）
≒[（ｋ/ｍ）1/2−（［ｋ−Δｋ］/ｍ）1/2]
Δω0-obs-A＝（ω0-obs-Ai−ω0-obs-Af）
≒[（ｋ/ｍ）1/2−（［ｋ−Δｋ］/［ｍ＋Δｍ］）1/2]
Δω0-obs-A−Δω0-obs-B≒｛（［ｋ−Δｋ］/ｍ）1/2−（［ｋ−Δｋ］/［ｍ＋Δｍ］）1/2｝
ω0-obs-Ai≒（ｋ/ｍ）1/2
以上の関係式から、最終的に、［ｍ＋Δｍ］／ｍを算出することも可能であり、すなわち、ビオチン固定カンチレバーの表面に付着しているアビジンに起因する質量増加Δｍの推定が可能とある。
【０１１１】
（実施態様２）
本実施態様では、ターゲット物質のカルシウムイオン（Ｃａ2+）を、ターゲット物質認識物質としてキトサンを利用して、キトサンを固定化したカンチレバーセンサによって検出する事例を示す。すなわち、キトサンは、一旦、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）と水素結合し、このキトサンと水素結合した状態のＰＡＡは、カルシウムイオンと特異的な結合性を有する特徴を利用し、ＰＡＡを補助剤とし、キトサンをターゲット物質認識物質とする事例に相当する。
【０１１２】
なお、キトサン（β−１，４−ポリ−Ｄ−グルコサミン）に代えて、β−Ｄ−マンヌロン酸（β−Ｄ−マンノピラヌロン酸）とα−Ｌ−グルロン酸（α−Ｌ−グロピラヌロン酸）からなるポリウロン酸である、アルギン酸を、陰性対照として利用する。糖鎖状の繊維状高分子であるキトサン（β−１，４−ポリ−Ｄ−グルコサミン）と同様に、粘質多糖の一種であるアルギン酸も、常温では水に溶けにくい繊維状高分子であるが、ＰＡＡと水素結合による複合体形成を行わない。従って、アルギン酸は、カルシウムイオン（Ｃａ2+）を固定化する機能を発揮しないものである。
【０１１３】
（１）カンチレバー表面へのキトサン、または、アルギン酸の固定化
検出に利用するカンチレバーセンサは、センサを構成するカンチレバーは２本一組であり、２本のカンチレバー先端における撓み量差の検出には、分波されたレーザ光線を、光ファイバを用いて、それぞれのカンチレバー先端部に照射し、その反射光による干渉波を測定し、撓み量差（光路長差）を算出する手法を採用している。
【０１１４】
一方のカンチレバーの表面には、キトサンが固定化され、他方のカンチレバーの表面には、アルギン酸が固定化されている２本一組のカンチレバーを具えるセンサチップＣ、Ｄを、下記の手順に従って作製する。
【０１１５】
図６（ａ）に、シリコン基板から通常の半導体製造プロセスを利用して作製する、カンチレバー付きチップ自体の構造を模式的に示す。縦横１０ｍｍ、厚さ１ｍｍ程度の正方形チップ３１の中心に、２本一組のカンチレバー６３、６３’が形成されている。カンチレバー６３、６３’は、ともに厚さ１μｍ、長さ５００μｍ、幅１００μｍの片持ち梁状の構造であり、５０μｍの間隔で平行に配置されている。図６（ｂ）に示すように、カンチレバー６３、６３’は、その上面は、チップ上面と一致するように、シリコン基板をエッチング加工することで作製する。このエッチング加工によって除去される部分は、正方形チップ３１の中心に、直径６００μｍの穴３２となる。この穴３２の中央に、２本一組のカンチレバー６３、６３’が突き出した形状とする。
【０１１６】
この加工工程により作製される、カンチレバー付きチップＣにおいては、２本一組のカンチレバー６３、６３’に相当するものを、それぞれ、カンチレバーｃ、ｃ’と表記する。また、カンチレバー付きチップＨにおいては、２本一組のカンチレバー６３、６３’に相当するものを、それぞれ、カンチレバーｄ、ｄ’と表記する。
【０１１７】
次に、このカンチレバー付きチップＣ、Ｄが作製されている基板をスピンコータにセットし、カンチレバーｃおよびカンチレバーｄに対して、１．０％の酢酸水溶液にキトサンを１．０％溶解したキトサン酢酸水溶液を滴下し、２０００ｒｐｍ２０ｓｅｃの条件でスピンコートする。スピンコート後、乾燥させることで、カンチレバーｃおよびカンチレバーｄを、その表面にキトサンがコートされているカンチレバーとする。一方、基板をスピンコータにセットし、カンチレバーｃ’およびカンチレバーｄ’に対して、６０℃に加熱して溶解した１．０％アルギン酸水溶液を滴下し、２０００ｒｐｍ２０ｓｅｃの条件でスピンコートする。スピンコート後、乾燥させることで、カンチレバーｃ’およびカンチレバーｄ’を、その表面にアルギン酸がコートされカンチレバーとする。
【０１１８】
２本一組のカンチレバーの表面に、それぞれ異なるコートを施した後、シリコン基板から上記のサイズで、ダイシング処理を行って、２本一組のカンチレバー付きチップを切り離す。
【０１１９】
（２）キトサン固定カンチレバーとアルギン酸固定カンチレバーを具えたカンチレバーセンサを利用するカルシウムイオンの検出
次に、カンチレバーセンサを利用して、カルシウムイオンを検出する手順を説明する。
【０１２０】
まず、実施例１と同様に、カンチレバー付きチップＣのカンチレバーｃ，ｃ’の初期共振周波数測定を行う。その際、共振周波数の測定方法は、実施例１とほぼ同様であり、各カンチレバーを所定の周波数ωで強制振動させた状態で、各カンチレバー先端の撓み量の変化幅（振幅）を測定し、各振動周波数ωに対する、各カンチレバー振動の振幅をプロットし、その極大を与える振動周波数を、各カンチレバーの共振周波数ω0の実測値とする。
【０１２１】
一方、カンチレバー振動の振幅測定は、カンチレバーの先端に光ファイバでレーザ光線を照射し、反射したレーザ光線を同じ光ファイバで受光して、カンチレバー先端の撓み量の変化（光路長変化）は、撓み量の変化（光路長変化）に起因する反射光の位相変化を、干渉光として測定する。干渉光の強度は、前記強制振動の周波数ωに従って、反復的に変動する。測定された干渉光の強度と、その周期的な変化に基づき、各カンチレバー先端の撓み量の変化幅（振幅）を算出する。算出される振幅が最大になる周波数を初期共振周波数とする。なお、周波数ωで強制振動がなされていない状態、すなわち、光ファイバの先端が停止している状態において、予め、光ファイバの端面とカンチレバー先端との相対的位置を微調整し、カンチレバーｃおよびｃ’それぞれの先端にレーザ光線をあてる。
【０１２２】
引き続き、ピエゾ発振子の駆動電源である、オシレータから供給される高周波電圧の周波数を、ω1からω2まで、連続的に変化させて、各振動周波数ωにおける、カンチレバー先端の撓み量の変動幅（振幅）を実測し、その実測値（δｍａｘ−δｍｉｎ）を基に、カンチレバーｃおよびｃ’の初期の共振周波数実測値：ω0-obs-ciとω0-obs-c'iをそれぞれ算定する。
【０１２３】
図７に、カンチレバーセンサ３１が具えている２本一組のカンチレバーを、キトサンあるいはアルギン酸のコートが施されている表面が凸にして撓んだ状態とした上で、ＰＡＡを添加した炭酸カルシウム水溶液７１中に浸漬するための装置の構成を模式的に示す。図７（ａ）に示すように、２本一組のカンチレバー付きチップＣは、ＰＡＡを添加した炭酸カルシウム水溶液７１がパドル７２の回転で一定の流速で循環する流路７３に挿入される。その際、ＰＡＡを添加した炭酸カルシウム水溶液７１が、カンチレバーセンサ３１の穴３２を通過するため、２本一組のカンチレバー７４は、この流れによる外力を受け、図７（ｂ）に示すように、所定の曲率半径で撓った状態に保持される。この状態で、一定時間、流路７３中に静置する。
【０１２４】
次いで、パドル７２を一度停止し、流路７３内の水溶液の流れが止まった後、パドル７２を逆回転させる。パドル７２の回転方向が逆転したため、流路７３中を、ＰＡＡを添加した炭酸カルシウム水溶液７１が、一定の流速で逆方向に循環する。その際、ＰＡＡを添加した炭酸カルシウム水溶液７１が、カンチレバーセンサ３１の穴３２を通過するため、２本一組のカンチレバー７４は、この流れによる外力を受け、図７（ｂ）に示す向きと逆の向き、所定の曲率半径で撓った状態に保持される。この状態で、また、一定時間、流路７３中にカンチレバー付きチップＣを静置する。
【０１２５】
その後、パドル７２を停止し、流路７３内の水溶液の流れが止まった後、２本一組のカンチレバー付きチップＣを水溶液から取り出す。取り出したカンチレバーセンサ３１は、数回蒸留水で洗浄した後、自然乾燥する。
【０１２６】
最後に、再びカンチレバーｃ，ｃ’の共振周波数測定を行い、ＰＡＡを添加した炭酸カルシウム水溶液浸漬処理後の共振周波数実測値：ω0-obs-cfとω0-obs-c'fをそれぞれ算定する。「初期共振周波数」実測値と、「浸漬処理後の共振周波数」実測値との差を、それぞれ、Δω0-obs-c＝（ω0-obs-ci−ω0-obs-cf）、Δω0-obs-c'＝（ω0-obs-c'i−ω0-obs-c'f）とする。
【０１２７】
同様に、カンチレバー付きチップＤのカンチレバーｄ，ｄ’についても、予め、各振動周波数ωにおける、カンチレバー先端の撓み量の変動幅（振幅）を実測し、その実測値（δｍａｘ−δｍｉｎ）を基に、カンチレバーｄおよびｄ’の初期の共振周波数実測値：ω0-obs-diとω0-obs-d'iをそれぞれ算定する。その後、上記チップＣに施した浸漬処理の手順に準じて、チップＤを純水が一定の流速で流れる水路に挿入し、純水浸漬処理を行い、次いで、自然乾燥する。
【０１２８】
最後に、再びカンチレバーｄ，ｄ’の共振周波数測定を行い、純水浸漬処理後の共振周波数実測値：ω0-obs-dfとω0-obs-d'fをそれぞれ算定する。「初期共振周波数」実測値と、「浸漬処理後の共振周波数」実測値との差を、それぞれ、Δω0-obs-d＝（ω0-obs-di−ω0-obs-df）、Δω0-obs-d'＝（ω0-obs-d'i−ω0-obs-d'f）とする。
【０１２９】
カンチレバーの表面にコートされているキトサン層、ならびに、アルギン酸層は、水溶液または純水中に浸漬した場合、水を吸水する結果、膨潤を起こす。この膨潤に伴って、カンチレバーのバネ定数ｋは、当初の乾燥状態と、膨潤した状態では、ｋ→（ｋ−Δｋ）に変化する。そのため、純水浸漬処理を施したカンチレバーｄ，ｄ’では、キトサン層、ならびに、アルギン酸層に対して、なんらの付着も生じていないが、「初期共振周波数」実測値と、「浸漬処理後の共振周波数」実測値との差、Δω0-obs-dとΔω0-obs-d'は、共にゼロではない。しかしながら、なんらの付着も生じていないため、Δω0-obs-dとΔω0-obs-d'の間の差違は小さな値となる。
【０１３０】
また、アルギン酸層を具えているカンチレバーｃ’でも、カルシウムイオンを捕捉した状態のＰＡＡの付着は生じていないが、カンチレバーのバネ定数ｋは、当初の乾燥状態と、膨潤した状態では、ｋ→（ｋ−Δｋ）に変化する。そのため、カンチレバーｃ’においても、「初期共振周波数」実測値と、「浸漬処理後の共振周波数」実測値との差、Δω0-obs-c'は、ゼロではない。
【０１３１】
一方、キトサン層を具えているカンチレバーｃでは、そのカンチレバーの両面ともに、カルシウムイオンを捕捉した状態のＰＡＡの付着が生じており、カンチレバー全体の質量ｍは、当初の乾燥状態から、膨潤した状態となる間に、ｍ→（ｍ＋Δｍ）と増加する。勿論、カンチレバーｃでも、カンチレバーのバネ定数ｋは、当初の乾燥状態と、膨潤した状態とで、はｋ→（ｋ−Δｋ）に変化しており、カンチレバー全体の質量ｍの増加に起因する影響もある。この二つの要因によって、カンチレバーｃにおいて観測される、「初期共振周波数」実測値と、「浸漬処理後の共振周波数」実測値との差、Δω0-obs-cを、カンチレバーｃ’のΔω0-obs-cと比較すると、カルシウムイオンを捕捉した状態のＰＡＡの付着量に比例する、明確な相違を示す。
【０１３２】
例えば、前記の対応に基づき、
ω0-obs-ci＝ω0-obs-di≒（ｋ/ｍ）1/2
Δω0-obs-d＝（ω0-obs-di−ω0-obs-df）
≒[（ｋ/ｍ）1/2−（［ｋ−Δｋ］/ｍ）1/2]
Δω0-obs-c＝（ω0-obs-ci−ω0-obs-cf）
≒[（ｋ/ｍ）1/2−（［ｋ−Δｋ］/［ｍ＋Δｍ］）1/2]
Δω0-obs-d−Δω0-obs-c≒｛（［ｋ−Δｋ］/ｍ）1/2−（［ｋ−Δｋ］/［ｍ＋Δｍ］）1/2｝
以上の関係式から、最終的に、［ｍ＋Δｍ］／ｍを算出することも可能であり、すなわち、キトサン層を設けているカンチレバーｃの表面の付着している、カルシウムイオンを捕捉した状態のＰＡＡの付着に起因する質量増加Δｍの推定も可能とある。
【０１３３】
少なくとも、カンチレバーの両面にキトサン層を形成しているカンチレバーｃにおいては、カンチレバーの両面に対して、それぞれ予め撓んだ状態とした上で、カルシウムイオンを捕捉した状態のＰＡＡの付着を行うことで、その付着量の増すことができ、質量増加Δｍを大きくすることが可能である。カルシウムイオンを捕捉した状態のＰＡＡの付着量を反映する、カンチレバーｃとカンチレバーｃ’の間、あるいは、カンチレバーｃとカンチレバーｄ’の間における共振振動数変化の相違、Δω0-obs-c'−Δω0-obs-cまたはΔω0-obs-d−Δω0-obs-cを容易に測定することが可能である。
【０１３４】
（実施態様３）
本実施態様では、ターゲット物質のＤＮＡを、ターゲット物質認識物質として、特定の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを利用して、該一本鎖ＤＮＡを固定化したカンチレバーセンサによって検出する事例を示す。すなわち、プローブ・ハイブリダイゼーション反応を利用して、プローブ用の一本鎖ＤＮＡと、相補的な塩基配列を含んでいる検出対象ＤＮＡとのハイブリッド体形成を介して、検出対象ＤＮＡのみを選択的にカンチレバー表面に付着させる事例に相当する。
【０１３５】
また、カンチレバーセンサは、複数種のＤＮＡプローブを、それぞれ個別のカンチレバー表面に固定化し、このプローブ固定カンチレバー複数をアレイ状に配置することで、所謂、マルチプローブアレイ型のセンサとする。例えば、試料中に含有される検出対象ＤＮＡの塩基配列の中に、これら複数種のＤＮＡプローブの塩基配列に対して、相補的な塩基配列部分が存在しているか否かの検出に利用することもできる。
【０１３６】
（１）カンチレバー表面への一本鎖ＤＮＡの固定化
検出に利用するマルチプローブアレイ型センサでは、各プローブに対して、それぞれ、上下一組の電気的に絶縁された電極付きＶ字型カンチレバーが向き合った構造に配置されている。図８に示すように、互いに向かい合って配置され、導電性材料で作製される、上下一組のＶ字型カンチレバーに電流を流すと、電磁気力が発生し、すなわち、その電流の方向に従って、引力または斥力が発生する。また、上下一組のＶ字型カンチレバーに含まれる導電性層は、コンデンサーを構成しており、その間隔の変化は、かかるコンデンサーの静電容量の変化を引き起こす構成となっている。
【０１３７】
従って、この特徴を利用することで、上下一組のＶ字型カンチレバーに、互いに逆方向の電流を流すと、引力が発生し、Ｖ字型カンチレバーを撓ませることが可能である。また、Ｖ字型カンチレバー先端の撓み量の変化に起因して、その間隔の変化が引き起こされると、かかるコンデンサーの静電容量の変化として検出が可能である。
【０１３８】
（上下一組のＶ字型カンチレバーを具えたチップの作製）
図８に、絶縁体製基板の上面と下面に形成される、上下一組の電極付きＶ字型カンチレバーが、互いに向き合った配置に設けられているセンサチップの構造を模式的に示す。チップ８１は、絶縁体製基板を利用して作製されており、チップ８１の中央部分に、Ｖ字型カンチレバーをアレイ状に配置するための、縦幅５ｍｍのスリット８２が設けられている。
【０１３９】
チップ８１の上面には、上面側のＶ字型カンチレバー８３と一体化して形成される導線８４−１、８４−２に対して、電流を供給する際に利用される電極８５−１、８５−２が設けられる。対応して、チップ８１の下面には、下面側のＶ字型カンチレバー８３’と一体化されている導電性層で形成される導線８４−３、８４−４に対して、電流を供給する際に利用される電極８５−３、８５−４が設けられる。なお、図８（ａ）には、チップ８１の上面側の導線８４−１、８４−２と電極８５−１、８５−２のみを表示しているが、下面側の導線８４−３、８４−４と電極８５−３、８５−４は、対応する位置に配置されている。
【０１４０】
上面側のＶ字型カンチレバー８３と、下面側のＶ字型カンチレバー８３’とは、両者の間に１００μｍの間隔を設けて、スリット８２中に突き出した形状で設けられる。すなわち、チップ８１において、スリット８２の一つの長辺に沿って、１００μｍの間隔を与えるスペーサ部分に相当する、厚さ１μｍの絶縁体層を残し、絶縁体製基板に対して、エッチング処理が施されている領域が設けられている。なお、上下一組のＶ字型カンチレバーで構成されるコンデンサー構造において、その静電容量へ主要な寄与を有する部分は、スリット８２中に突き出した形状の上下一組のＶ字型カンチレバー部分と、厚さ１μｍの絶縁体層を挟んで、導線８４−１、８４−２と導線８４−３、８４−４とが配置される部分となる。上下一組のＶ字型カンチレバーにおける先端の撓み量の変化に起因する静電容量変化を検出する際、上下一組の導線が厚さ１００μｍの絶縁体層を挟んでいる部分の寄与を抑えておくことが望ましい。従って、上下一組のＶ字型カンチレバーの間隙を調整するスペーサ部分に相当する、所定の厚さを有する絶縁体層は、高い絶縁特性を有し、同時に、誘電率は低い絶縁材料を選択することが好ましい。また、チップ８１自体も、高い絶縁特性を有し、同時に、誘電率は低い絶縁材料で構成することが望ましく、例えば、石英基板を用いることが好ましい。
【０１４１】
Ｖ字型カンチレバー８３と８３’は、導電性材料のｎ型シリコンをエッチング加工して、厚さ５μｍ、根本から先端までの距離５００μｍ、幅１００μｍのＶ字型形状に作製する。また、導線８４−１、８４−２と導線８４−３、８４−４も、それぞれ、Ｖ字型カンチレバー８３と８３’と一体化し、ｎ型シリコンをエッチング加工して作製する。加えて、一体化されるＶ字型カンチレバーと導線は、ｎ型シリコン層の上面、下面には、膜厚約１００ｎｍの金蒸着膜を付加し、金／ｎ型シリコン／金の積層構造とされている。
【０１４２】
金とｎ型シリコンの熱膨張係数は異なっており、周辺温度が変動した際、金／ｎ型シリコンの二層構造では、表面応力が誘起され、撓みを生じるが、金／ｎ型シリコン／金の三層積層構造では、上面と下面とで誘起される応力が互いに相殺する結果、全体として、温度変動に起因する撓みの発生は抑制される。加えて、Ｖ字型カンチレバー部の上面、下面は、金蒸着膜で被覆する形態となっており、スルファニル基（−ＳＨ）の金に対する反応性を利用して、一本鎖ＤＮＡの結合を行うことが可能である。勿論、金／ｎ型シリコン／金の三層積層構造を用いると、上面と下面の金蒸着膜は、全体の導電率を向上する機能も有している。
【０１４３】
さらに、Ｖ字型カンチレバー８３の先端には、ＧｄＦｅを蒸着する（不図示）。この磁性材料ＧｄＦｅを利用して、カンチレバー８３は、磁界の影響を受けるようになっている。
【０１４４】
４種のＤＮＡプローブを用いて、マルチプローブアレイ型センサを構成する際には、上下一組の電極付きＶ字型カンチレバー４組；（ｅ１，ｅ’１）〜（ｅ４，ｅ’４）を、横長のスリット８２にアレイ状に配置する。
【０１４５】
（ＤＮＡプローブ用の一本鎖ＤＮＡの作製）
ＤＮＡプローブ用の一本鎖ＤＮＡは、所定の塩基配列を有する、化学合成オリゴＤＮＡを利用する。一本鎖ＤＮＡの合成は、ＤＮＡ自動合成機（ＡＢＩ社製、３８１Ａ）を利用して行うことができる。合成される一本鎖ＤＮＡの５’末端に、金蒸着膜上への結合に利用するスルファニル基（−ＳＨ）を導入する。チオールモディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ：Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を利用し、ＤＮＡ自動合成機による合成時に、５’末端にチオール基導入を行う。合成後、通常の脱保護処理を行って、化学合成オリゴＤＮＡを回収する。次いで、高速液体クロマトグラフィーを利用し、精製を行い、目的とする塩基配列を有し、５’末端にチオール基導入処理がなされた一本鎖ＤＮＡ標品を得る。
【０１４６】
表１に示す、４種のＤＮＡプローブ：Ｐｒｏｂｅ  Ｅ１〜Ｅ４を調製する。
【０１４７】
ＤＮＡプローブ：Ｐｒｏｂｅ  Ｅ１は、市販のクローニングベクターである、プラスミドｐＵＣ１８中のマルチクローニングサイト部分のうち、ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩ認識部位の部分に相当する塩基配列（配列番号：１）を有する一本鎖ＤＮＡである。
【０１４８】
ＤＮＡプローブ：Ｐｒｏｂｅ  Ｅ２は、プラスミドｐＵＣ１８中のマルチクローニングサイト部分のうち、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ認識部位の部分に相当する塩基配列（配列番号：２）を有する一本鎖ＤＮＡである。
【０１４９】
ＤＮＡプローブ：Ｐｒｏｂｅ  Ｅ３は、プラスミドｐＵＣ１８中のマルチクローニングサイト部分のうち、ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩ認識部位の部分に相当する塩基配列（配列番号：３）を有する一本鎖ＤＮＡである。
【０１５０】
ＤＮＡプローブ：Ｐｒｏｂｅ  Ｅ４は、プラスミドｐＵＣ１８中のマルチクローニングサイト部分のうち、ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄIII認識部位の部分に相当する塩基配列（配列番号：４）を有する一本鎖ＤＮＡである。
【０１５１】
【表１】
2007010518.tif 000003
【０１５２】
（一本鎖ＤＮＡのカンチレバー表面への固定化）
４種の一本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡプローブ）：Ｐｒｏｂｅ  Ｅ１〜Ｅ４を、それぞれ、最終濃度が１μＭになるように、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に溶解して、４種のＤＮＡプローブ水溶液を調製する。マイクロピペットを用いて、Ｐｒｏｂｅ  Ｅ１水溶液を、上下一組のカンチレバー（ｅ１，ｅ’１）に、Ｐｒｏｂｅ  Ｅ２水溶液を、上下一組のカンチレバー（ｅ２，ｅ’２）に、Ｐｒｏｂｅ  Ｅ３水溶液を、上下一組のカンチレバー（ｅ３，ｅ’３）に、Ｐｒｏｂｅ  Ｅ４水溶液を、上下一組のカンチレバー（ｅ４，ｅ’４）に、それぞれ滴下する。滴下されたＤＮＡプローブ溶液の液滴は、上下一組のカンチレバーを包み込み、隣接する液滴とは混じり合わないようにする。その状態で、しばらく静置した後、１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を数回滴下して、未固定の一本鎖ＤＮＡを洗浄除去する。この工程で、上下一組のカンチレバーのそれぞれ外側の面上に一本鎖ＤＮＡが固定される。
【０１５３】
（３）  ターゲットＤＮＡの調製
下記の６種の鎖状ＤＮＡ；ターゲットＤＮＡ１〜ターゲットＤＮＡ６を調製する。
【０１５４】
ターゲットＤＮＡ１は、プラスミドｐＵＣ１８を、消化酵素ＥｃｏＲＩで消化した鎖状ＤＮＡである。すなわち、プラスミドｐＵＣ１８中には、ＥｃｏＲＩ認識部位は、マルチクローニングサイト部分に唯一存在するのみであり、このＥｃｏＲＩ認識部位で消化される結果、得られる鎖状ＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ認識部位をもはや有していない。
【０１５５】
ターゲットＤＮＡ２は、プラスミドｐＵＣ１８を、消化酵素ＢａｍＨＩで消化した鎖状ＤＮＡである。すなわち、プラスミドｐＵＣ１８中には、ＢａｍＨＩ認識部位は、マルチクローニングサイト部分に唯一存在するのみであり、このＢａｍＨＩ認識部位で消化される結果、得られる鎖状ＤＮＡは、ＢａｍＨＩ認識部位をもはや有していない。
【０１５６】
ターゲットＤＮＡ３は、プラスミドｐＵＣ１８を、消化酵素ＰｓｔＩで消化した鎖状ＤＮＡである。すなわち、プラスミドｐＵＣ１８中には、ＰｓｔＩ認識部位は、マルチクローニングサイト部分に唯一存在するのみであり、このＰｓｔＩ認識部位で消化される結果、得られる鎖状ＤＮＡは、ＰｓｔＩ認識部位をもはや有していない。
【０１５７】
ターゲットＤＮＡ４は、プラスミドｐＵＣ１８を、消化酵素ＨｉｎｄIIIで消化した鎖状ＤＮＡである。すなわち、プラスミドｐＵＣ１８中には、ＨｉｎｄIII認識部位は、マルチクローニングサイト部分に唯一存在するのみであり、このＨｉｎｄIII認識部位で消化される結果、得られる鎖状ＤＮＡは、ＨｉｎｄIII認識部位をもはや有していない。
【０１５８】
ターゲットＤＮＡ５は、プラスミドｐＵＣ１８を、消化酵素ＫｐｎＩで消化した鎖状ＤＮＡである。すなわち、プラスミドｐＵＣ１８中には、ＫｐｎＩ認識部位は、マルチクローニングサイト部分に唯一存在するのみであり、このＫｐｎＩ認識部位で消化される結果、得られる鎖状ＤＮＡは、ＫｐｎＩ認識部位をもはや有していない。但し、マルチクローニングサイト部分に含まれる、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIII認識部位は残存している。
【０１５９】
ターゲットＤＮＡ６は、プラスミドｐＵＣ１８を、消化酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIIIで消化し、二つの断片とした後、電気泳動によって、分子量の大きい鎖状ＤＮＡ断片のみを回収・精製したものである。消化酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIIIで消化すると、プラスミドｐＵＣ１８中のマルチクローニングサイト部分は、分子量の小さな鎖状ＤＮＡ断片となる。従って、分子量の大きい鎖状ＤＮＡ断片は、マルチクローニングサイト部分に存在する、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIII認識部位を含んでいない。
【０１６０】
（４）マルチプローブアレイ型のセンサを利用するターゲットＤＮＡの検出
上記の４種のＤＮＡプローブ：Ｐｒｏｂｅ  Ｅ１〜Ｅ４を用いて、作製されているマルチプローブアレイ型のセンサを利用して、前記６種の鎖状ＤＮＡ；ターゲットＤＮＡ１〜ターゲットＤＮＡ６の検出を行う手順を説明する。
【０１６１】
予め、作製されているマルチプローブアレイ型のセンサについて、上下一組のカンチレバー（ｅ１，ｅ’１）〜（ｅ４，ｅ’４）のそれぞれの「初期共振周波数」ω0-obs-e1i〜ω0-obs-e4iを測定する。
【０１６２】
まず、図９（ａ）に示すように、電極８５−１、８５−２に直流電源９１を接続し、導線８４−１、８４−２にパルス状の直流電流を流し、上下一組のカンチレバー８３、８３’のうち、上側のＶ字型カンチレバー８３の先端に設けているＧｄＦｅを磁化する。この磁化操作を、上側のカンチレバーｅ１〜ｅ４に対して、それぞれ行う。次いで、直流電源９１を取り外し、電極８５−３、８５−４に、高周波オシレータ４９を接続し、下側のＶ字型カンチレバー８３’に形成されている導線８４−３、８４−４に高周波電流を流す。高周波オシレータ４９は、パソコン４８で制御されており、その制御により、供給される高周波電流の周波数ωの設定、周波数ωの掃引がなされる。下側のＶ字型カンチレバー８３’の導線８４−３、８４−４に流れる高周波電流により、周波数ωで振動する磁界が誘起される。上側のＶ字型カンチレバー８３の先端に設ける磁化されたＧｄＦｅと、下側のＶ字型カンチレバー８３’において誘起されている振動磁界の間に磁気力が発生する。その結果、振動磁界の周波数ωに従って、引力・斥力が発生し、上側のＶ字型カンチレバー８３と下側のＶ字型カンチレバー８３’は、対象的に振動する。電極８５−１、８５−３に静電容量計９２を接続し、上下一組のカンチレバー８３、８３’間の静電容量を測定すると、周波数ωでの振動に伴い、上下一組のカンチレバー８３、８３’間の間隙が変動することに起因する、周期的な容量変化が測定される。この周期的な容量変化の振幅は、強制振動による上下一組のカンチレバー８３、８３’の撓み振動の振幅の和に対応している。
【０１６３】
上下一組のカンチレバー８３、８３’は、本質的に同じ構成とされており、その共振周波数は等しくなっており、前記の電磁気力により強制振動させ、その周波数ωにおける周期的な容量変化の振幅ΔＣ（ω）を測定する。この容量変化の振幅ΔＣ（ω）が極大となる周波数ω、すなわち、上下一組のカンチレバー８３、８３’の撓み振動の振幅の和が極大を示す周波数ωを、上下一組のカンチレバー８３、８３’の「共振周波数」実測値とする。
【０１６４】
初期状態で測定される、上下一組のカンチレバー（ｅ１，ｅ’１）〜（ｅ４，ｅ’４）の「共振周波数」実測値を、それぞれの「初期共振周波数」実測値ω0-obs-e1i〜ω0-obs-e4iとする。
【０１６５】
次いで、図９（ｂ）のように、上下一組のＶ字型カンチレバーに対して、高周波オシレータ４９から、電極８５−３、８５−４に供給される電流を直流電流とし、上側のＶ字型カンチレバー８３の先端に設ける磁化されたＧｄＦｅと、下側のＶ字型カンチレバー８３’において誘起されている磁界との間に生じる電磁気力が、引力となるように、その電流方向を選択する。この引力によって、互いに内側に撓み、カンチレバーの外面を凸形状として撓んだ状態のＶ字型カンチレバー９３および９３’となる。
【０１６６】
ターゲットＤＮＡを含む水溶液を、予め９０℃に加熱して、含まれる二本鎖ＤＮＡをディネーチャーし、二本の一本鎖ＤＮＡに分離させる。このディネーチャー処理済みの一本鎖ＤＮＡを含む水溶液を、マイクロピペットで、マルチプローブアレイ型のセンサの、内側に撓んだ状態とされている上下一組のＶ字型カンチレバー（ｅ１，ｅ’１）〜（ｅ４，ｅ’４）に滴下する。各液滴は、上下一組のカンチレバー（ｅ１，ｅ’１）〜（ｅ４，ｅ’４）を、それぞれ包むようにする。この状態で一定時間静置した後、電極８５−３、８５−４に供給される直流電流の電流方向を反転させる。その結果、上側のＶ字型カンチレバー８３の先端に設ける磁化されたＧｄＦｅと、下側のＶ字型カンチレバー８３’において誘起されている磁界との間に生じる電磁気力は、斥力となる。その際、図９（ｃ）のように、この斥力によって、互いに外側に撓み、カンチレバーの内面を凸形状として撓んだ状態のＶ字型カンチレバー９４および９４’となる。この状態で、さらに一定時間静置した後、電流の供給を停止する。最終的に、上下一組のカンチレバー（ｅ１，ｅ’１）〜（ｅ４，ｅ’４）そえぞれに、１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を数回滴下して、未結合の一本鎖ＤＮＡを洗浄除去し、静置乾燥する。
【０１６７】
マルチプローブアレイ型のセンサの各Ｖ字型カンチレバー（ｅ１，ｅ’１）〜（ｅ４，ｅ’４）上に固定化されている４種のＤＮＡプローブ：Ｐｒｏｂｅ  Ｅ１〜Ｅ４との、ハイブリダイゼーション反応を、前記の手順で行った後、再び、それぞれの共振振動数を測定する。共振振動数の測定は、上記と同様の手順で実施する。ハイブリダイゼーション反応後に測定される共振振動数を、それぞれの「浸漬処理後の共振周波数」実測値ω0-obs-e1f〜ω0-obs-e4fとする。各上下一組のカンチレバー（ｅ１，ｅ’１）〜（ｅ４，ｅ’４）について、「浸漬処理後の共振周波数」実測値ω0-obs-e1f〜ω0-obs-e4fと、「初期共振周波数」実測値ω0-obs-e1i〜ω0-obs-e4iとの差：Δω0-obs-g1＝（ω0-obs-e1i−ω0-obs-e1f）からΔω0-obs-e4＝（ω0-obs-e4i−ω0-obs-e4f）を算出する。
【０１６８】
ハイブリダイゼーション反応によって、ＤＮＡプローブに対象となる一本鎖核酸がハイブリダイズすると、カンチレバー全体の質量ｍは、ハイブリダイゼーション反応の前後において、ハイブリダイズする一本鎖核酸の量に比例して、ｍ→（ｍ＋Δｍ）と増加する。一方、カンチレバーのバネ定数ｋも、ハイブリッド体相互の斥力が存在すると、ハイブリダイゼーション反応の前後において、ｋ→（ｋ＋Δｋ）と増加する。例えば、Ｖ字型カンチレバー（ｅ１，ｅ’１）上のＤＮＡプローブＥ１にハイブリッド体形成が生じると、前記の対応に基づき、
ω0-obs-e1i≒（ｋ/ｍ）1/2
ω0-obs-e1f≒（［ｋ＋Δｋ］/［ｍ＋Δｍ］）1/2
Δω0-obs-e1＝（ω0-obs-e1i−ω0-obs-e1f）
≒[（ｋ/ｍ）1/2−（［ｋ＋Δｋ］/［ｍ＋Δｍ］）1/2]
のような共振周波数の変化が引き起こされる。
【０１６９】
ターゲットＤＮＡ１〜６に関して、上記の手順に従って、ハイブリダイゼーション反応後に測定される静電容量「浸漬処理後の共振周波数」実測値と、初期状態における「初期共振周波数」実測値の測定結果に基づき、その差違を算出し、ハイブリダイゼーション反応の前後における各Ｖ字型カンチレバー全体の質量ｍ、バネ定数ｋの変化の有無を算出する。
【０１７０】
表２に、ハイブリダイゼーション反応の前後における各Ｖ字型カンチレバー全体の質量ｍ、バネ定数ｋの変化に起因する共振周波数変化の有無を、ターゲットＤＮＡ１〜６に関して纏めて示す。
【０１７１】
【表２】
2007010518.tif 000004
【０１７２】
ハイブリダイゼーション反応の前後において、各Ｖ字型カンチレバーの共振周波数変化を有する場合、かかるＶ字型カンチレバー上に固定化されるＤＮＡプローブと、ターゲットＤＮＡとがハイブリッド体を形成し、Ｖ字型カンチレバー上に付着が生じていることを示している。従って、各Ｖ字型カンチレバー共振周波数変化の有無の測定結果に基づき、各ターゲットＤＮＡが、ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩ、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ、ＰｓｔＩおよびＳｐｈＩ、ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄIIIの４組の認識部位を有しているか否かの判定を行うことが可能である。
【０１７３】
一般に、マルチプローブアレイ型のセンサとして、上下一組のＶ字型カンチレバーｎ組をアレイ状に配置し、各上下一組のＶ字型カンチレバーに対して、異なる塩基配列を有するＤＮＡプローブを固定化することで、ターゲットＤＮＡ中に、ｎ種類のプローブの塩基配列が含まれるか否かの判定を行うことが可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１７４】
本発明によれば、１〜数個の原子で構成される分子あるいはイオン種、アミノ酸・ペプチド・タンパク質ならびに、これらの配糖体、糖鎖との結合体などを含む抗原分子、ＤＮＡやＲＮＡの核酸分子をターゲットとする、高感度の検出方法・装置を提供することができる。それに伴い、水中や大気中に微少に存在する物質、例えば、大気中の希ガスや有毒ガスなどを検知するガスセンサ、あるいは、大気中の臭い物質などを検知する臭いセンサ（人工嗅覚）、水中のウランや希少金属といった有用資源、環境ホルモン（内分泌攪乱化学物質）や環境汚染物質、バクテリアなどの検出装置、血液や呼気中の何らかの指標物質やウイルス等を検出する医療機器、遺伝子診断用の特定ＤＮＡ配列検出装置などに、本発明の原理を応用することで、その検出感度を向上させることも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】本発明にかかるカンチレバーセンサを利用する、ターゲット物質の検出方法において利用する作用原理を模式的に示す図である。
【図１−１】本発明にかかるカンチレバーセンサを利用する、ターゲット物質の検出方法において利用する作用原理を模式的に示す図である。
【図２】本発明において利用されるカンチレバーセンサの一形態を示し、一本のカンチレバー付きチップの構成の一例を模式的に示す図である。
【図３】本発明において利用される、カンチレバーの共振周波数の測定装置の一例であり、カンチレバー先端の撓み量を測定するための、光てこ方式の変位量検出装置を応用する装置構成例を模式的に示す図である。
【図４】カンチレバーを強制振動させた際、カンチレバーの共振周波数近傍における、振動周波数と振幅との関係を模式的に示す図である。
【図５】本発明において利用される、カンチレバーに撓みを導入する手段の一形態を示し、プローブ顕微鏡用カンチレバー探針を利用して、外力を印加する手法の一例を模式的に示す図である。
【図６】本発明において利用されるカンチレバーセンサの一形態を示し、二本一組のカンチレバー付きチップの構成の一例を模式的に示す図である。
【図７】本発明において利用される、カンチレバーに撓みを導入した状態で、ターゲット物質に接触させるための装置の一例を模式的に示す図である。
【図８】本発明において利用されるカンチレバーセンサの一形態を示し、二本一組のＶ字型カンチレバー付きチップの構成の一例を模式的に示す図である。
【図９】本発明において利用される、二本一組のＶ字型カンチレバーに撓みを導入する手段、ならびに、該Ｖ字型カンチレバー先端の撓み量変化を静電容量変化を介して検出する手段を利用し、カンチレバーの共振周波数を測定する手段の一例を模式的に示す図である。
【符号の説明】
【０１７６】
１０  カンチレバーを振動させる発振子
１１  カンチレバーを固定しているチップ
１２  ターゲット物質認識物質
１３  カンチレバー
１４  カンチレバーを撓ませる外力
１５  ターゲット物質
１６  ターゲット物質同士の斥力
３１  カンチレバー付きチップ
３２  カンチレバーを納めた穴
３３  カンチレバー本体
４１  変位量測定装置のカンチレバー付きチップ固定ステージ
４２  変位量測定装置のカンチレバー付きチップ固定用クランプ
４３  レーザ光源
４４  レーザ光線
４５  レンズ
４６、４６’、４６’’  カンチレバー先端で反射したレーザ光線
４７  レーザ光線ディテクタ
４８  ＡＤコンバータ付き、装置制御用パソコン
４９  高周波オシレータ
５１  プローブ顕微鏡用カンチレバーのチップ部分
５２  プローブ顕微鏡用カンチレバー本体
５３  プローブ顕微鏡用カンチレバー探針
５４  カンチレバーのたわみ量調整用のスペーサ
６３、６３’  カンチレバー本体
７１  ＰＰＡを含む炭酸カルシウム水溶液
７２  水流を起こすためのパドル
７３  水溶液の流路
７４  水流によって撓んだカンチレバー本体
８１  カンチレバーアレイ付きチップ
８２  カンチレバーを納めたスリット
８３、８３’  Ｖ字型カンチレバー本体
８４−１〜４  導線
８５−１〜４  電極
９１  電源装置
９２  静電容量計
９３、９３’  電磁気力で内側に撓んだＶ字型カンチレバー本体
９４、９４’  電磁気力で外側に撓んだＶ字型カンチレバー本体
【図１】
2007010518.tif 000005
【図１−１】
2007010518.tif 000006
【図２】
2007010518.tif 000007
【図３】
2007010518.tif 000008
【図４】
2007010518.tif 000009
【図５】
2007010518.tif 000010
【図６】
2007010518.tif 000011
【図７】
2007010518.tif 000012
【図８】
2007010518.tif 000013
【図９】
2007010518.tif 000014
【配列表】
2007010518000001.app