(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、バイオセンサを用いて生体分子及び生化学反応の検出及びバイオセンサの品質検査を非標識・非接触で行う方法を提供することにある。【解決手段】  本発明によれば、白色干渉法を用いることで、バイオセンサを用いた生体分子や生化学反応の検出を非接触かつ非破壊で行うことができる。更に、本発明によれば、前記方法を用いて、非接触かつ非破壊でバイオセンサの品質検査を行うことで品質管理することができる。【選択図】  図２
2007010557.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上にプローブ用生体分子を固定したバイオセンサを用いて生体分子を検出する工程において、
(1)プローブ用生体分子が固定されたバイオセンサをステージの上に載置する工程、
(2)前記バイオセンサに白色光を照射する工程、
(3)前記バイオセンサからの反射光と、参照面からの反射光を干渉させて発生した干渉縞を検出する工程、
(4)干渉縞の変調量が最大となる前記バイオセンサと白色光源間の距離あるいは光路長を求める工程、
(5)前記距離あるいは前記光路長から前記バイオセンサ表面の3次元形状を算出する工程、
(6)得られた3次元形状から、プローブ用生体分子の固定された部分の高さT1を求める工程、
(7)前記バイオセンサを生体分子が含まれた溶液と反応させる工程、
(8)反応させた前記バイオセンサに対し、上記（1）から（5）に記載した全ての工程を行う工程、
(9)得られた3次元形状から、プローブ用生体分子が固定された部分の高さT2を求める工程、
(10)（9）で得られたT2と（6）で得られたT1の差（T2−T1）を算出する工程、
を有することを特徴とする生体分子薄膜計測方法。
【請求項２】
基板上にプローブ用生体分子を固定したバイオセンサを製造する方法において、
(1)プローブ用生体分子が固定されたバイオセンサをステージの上に載置する工程、
(2)前記バイオセンサに白色光を照射する工程、
(3)前記バイオセンサからの反射光と、参照面からの反射光を干渉させて発生した干渉縞を検出する工程、
(4)干渉縞の変調量が最大となる前記バイオセンサと白色光源間の距離あるいは光路長を求める工程、
(5)前記距離あるいは前記光路長から前記バイオセンサ表面の3次元形状を算出する工程、
(6)得られた3次元形状から、プローブ用生体分子の固定された部分の平均高さT1と、高さバラツキCv1を求める工程、
(7)得られたT1、バラツキCv1から前記プローブ用生体分子の品質管理を行う工程、
を有することを特徴とするバイオセンサの製造方法。
【請求項３】
基板上にプローブ用生体分子を固定したバイオセンサを製造する方法において、
(1)プローブ用生体分子が固定される前の状態のバイオセンサ基板をステージの上に載置する工程、
(2)前記基板に白色光を照射する工程、
(3)前記基板からの反射光と、参照面からの反射光を干渉させて発生した干渉縞を検出する工程、
(4)干渉縞の変調量が最大となる前記基板と白色光源間の距離あるいは光路長を求める工程、
(5)前記距離あるいは前記光路長から前記基板表面の3次元形状を算出する工程、
(6)得られた3次元形状から、表面バラツキCv1を求める工程、
(7)得られたバラツキCv1から前記プローブ用生体分子の品質管理を行う工程、
を有することを特徴とするバイオセンサの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子及び化学反応をセンシングするために核酸やたんぱく質等の生体分子が表面に固定されたバイオセンサの非破壊・非接触検査方法と製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム計画により、ヒトゲノムシーケンスの全てが解読され、現在では研究の主題が従来の「シーケンス解析」からその機能を調べる「機能解析」へと移行している。ここから得られるデータは、生命現象を解明するための重要な情報を提供すると考えられ、医療、環境、食品など、生物が関わるあらゆる分野の問題を解く鍵になると予測されている。そこでは、膨大な情報量を持つ遺伝子や、遺伝子から作られるたんぱく質を網羅的にかつ迅速に解析することが求められている。そこで開発されたのがDNAマイクロアレイやプロテインチップに代表されるバイオセンサの一種であるバイオチップである。
【０００３】
バイオチップで用いる主な検出方法は、検出される生体分子に蛍光標識を付け、励起レーザーにより蛍光標識を励起し、発生した蛍光を検出するものである。この方法では、検出されるべき生体分子に蛍光分子を付ける必要が生じる。例えば、生体分子がたんぱく質の場合、蛍光分子を付けたことで、たんぱく質の構造が大きく変わる可能性がある。また、蛍光標識によりチップと生体分子との反応を妨害される可能性もある。更に、蛍光標識を導入する時の歩留り、蛍光標識の量子効率や経時変化、蛍光検出系の感度の違いにより、生体分子の存在量を蛍光強度から正確に見積もることが困難な場合がある。その他の検出方法として、表面プラズモン共鳴（SPR）を用いた例がある（US6,207,381）。しかし、バイオチップ上に捕捉された微小領域内の生体分子を検出するためには、SPRの空間分解能が低いため、SPRをバイオチップの検出に用いることは現状では困難である。よって、標識を用いることなく検出でき、また微小領域も検出できる検出システムが必要であった。
【０００４】
ここで、バイオチップの一般的な製造方法を説明する。バイオチップの製造方法として大きく２つの方法がある。一つは、フォトリソグラフィーやインクジェットを用いて、基板上でアミノ酸や核酸塩基を逐次的に固定化し、たんぱく質やDNAといったプローブ用生体分子をin-situ合成する方法である（US5,424,186）。もう一つは、プローブ用生体分子をex-situで合成した後に、これらを基板上に固定化する方法である（US5,700,637）。バイオチップは、将来例えばガンの診断などの医療診断に使われると予想されている。医療診断にバイオチップを用いる場合には、バイオチップから得られるデータが高い定量性や再現性を持つことが必要である。この場合、バイオチップ表面に固定されたプローブ用生体分子の量、構造を把握し品質管理を行うことが重要になる。しかし、バイオチップ表面のプローブ用生体分子は、モノレイヤーでコーティングされている場合が多く、プローブ用生体分子がコーティングされた膜の膜厚はオングストロームオーダーである。また、一種類のプローブDNAが固定化される領域の大きさは、サブmmオーダーとなっている。この微小領域に極薄にコーティングされたプローブ用生体分子の量や構造を知るためには、極めて感度が高く、かつ充分な空間分解能を持つ分析技術が必要である。
【０００５】
【特許文献１】US6,207,381
【特許文献２】US5,424,186
【特許文献３】US5,700,637
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上の問題は、バイオセンサで生体分子を検出する時に、検出すべき生体分子に予め標識することなく非破壊で検出できる非標識・非破壊検出方法を提供することで解決できる。また、バイオセンサの品質管理を行うために、センサ表面の微小領域に固定されたプローブ用生体分子の量、構造を高感度にかつ簡易に評価できる分析方法を提供することで解決できる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に関わるバイオセンサ検出方法の形態は、基板上にプローブ用生体分子を固定したバイオセンサを用いて生体分子を検出する工程において、
（1）プローブ用生体分子が固定されたバイオセンサをステージの上に載置する工程、
（2）前記バイオセンサに白色光を照射する工程、
（3）前記バイオセンサからの反射光と、参照面からの反射光を干渉させて発生した干渉縞を検出する工程、
（4）干渉縞の変調量が最大となる前記バイオセンサと白色光源間の距離あるいは光路長を求める工程、
(5)前記距離あるいは前記光路長から前記バイオセンサ表面の3次元形状を算出する工程、
(6)得られた3次元形状から、プローブ用生体分子の固定された部分の高さT1を求める工程、
(7)前記バイオセンサをターゲット生体分子が含まれた溶液と反応させる工程、
(8)ターゲット分子と反応させた後の前記バイオセンサに対し、上記（1）から（5）に記載した全ての工程を行う工程、
(9)得られた3次元形状から、プローブ用生体分子が固定された部分の高さT2を求める工程、
（10）（9）で得られたT2と（6）で得られたT1の差（T2−T1）を算出する工程、
を有することを特徴とする生体分子検出方法である。
【０００８】
本発明に関わるバイオセンサ製造方法の形態は、基板上にプローブ用生体分子を固定したバイオセンサを製造する方法において、
(1)プローブ用生体分子が固定されたバイオセンサを、あるいはプローブ用生体分子が固定される前の状態のバイオセンサ基板をステージの上に載置する工程、
(2)前記バイオセンサあるいは基板に白色光を照射する工程、
(3)前記バイオセンサあるいは基板からの反射光と、参照面からの反射光を干渉させて発生した干渉縞を検出する工程、
(4)干渉縞の変調量が最大となる前記バイオセンサあるいは基板と白色光源間の距離あるいは光路長を求める工程、
(5)前記距離あるいは前記光路長から前記バイオセンサあるいは基板表面の3次元形状を算出する工程、
(6)得られた3次元形状から、プローブ用生体分子の固定された部分の平均高さT1と、高さバラツキCv1、あるいは表面バラツキCv2を求める工程、
(7)得られたT1、バラツキCv1、バラツキCv2から前記プローブ用生体分子の品質管理を行う工程、
を有することを特徴とするバイオセンサの製造方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、白色干渉法を用いることで、バイオセンサを用いた生体分子や生化学反応の検出を非接触かつ非破壊で行うことができる。更に、本発明によれば、前記方法を用いて、非接触かつ非破壊でバイオセンサの品質検査を行うことで品質管理することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
実施例では、本検出方法及び製造方法を白色干渉法を用いて行った例を示す。
【００１１】
平板型DNAマイクロアレイを特開2004−28953号公報に開示された作製方法に従って作製した。基板として、スライドガラスサイズのホウ珪酸ガラスを用い、この基板上に10,000種類の配列の50merプローブDNAをスポットした。１つのスポットサイズの径は約300umであり、それぞれのプローブDNAがモノレイヤー程度で基板に固定されている。
【００１２】
このDNAマイクロアレイをxyzθステージ上、かつ対物レンズ×10倍の直下に載置する。この時、対物レンズの倍率は、×2.5倍から×100倍のうちいずれを用いても良い。次に、このマイクロアレイ表面にほぼ垂直にハロゲンランプからの白色光を照射する。このマイクロアレイ最表面からの反射光と、光路中に置かれた参照面からの反射光を干渉させる。この干渉光をCCDカメラを用いて検出する。ここで、対物レンズをＺ軸方向、すなわち、マイクロアレイ表面に対して垂直方向に走査する。この時、マイクロアレイ最表面からの反射光と参照面からの反射光の光路差がゼロになると干渉光から形成される干渉縞のコントラスト（干渉縞変調量）が最大となる。CCDカメラで検出した各画素におけるコントラストが最大となる対物レンズとマイクロアレイ表面の距離をそれぞれ求めることで、マイクロアレイ表面の3次元形状を算出することができる。すなわち、プローブDNAが固定化された各スポットの3次元形状を求めることができる。ここで、各スポット内の平均膜厚Tn1と各スポット内高さのバラツキCv(Tn1)(Coefficient of Variation)値を求める。nはスポット位置を表す。図１に、この方法により求めたスポットの3次元形状と膜厚及びCv値の例を示す。図１に示したようにプローブDNAのコーティングされた各スポットに対して、その膜厚やスポット内の膜厚バラツキを求めることができる。
【００１３】
ここで、求めたTn1、Cv(Tn1)値と、予めマイクロアレイの種類によって定められた品質管理基準範囲を照らし合わせる。Tn1の平均値であるT1と、Tn1のバラツキ、つまりスポット間の膜厚バラツキCv(T1)と、それらの品質管理基準範囲を比べる。それらが品質管理基準範囲内であれば、このマイクロアレイは合格品となり良品として扱うが、品質管理基準範囲外である場合不合格とし、不良品として扱う。また各スポットに対して別々に良品・不良品判定を行っても良い。この場合、スポットnについてTn1かつスポット内の膜厚バラツキであるCv(Tn1)が品質管理基準範囲内である時、このスポットnを良スポットとし検査に使用する。一方、スポットmについてTm1あるいはCv(Tm1)が品質管理基準範囲外である場合、このスポットmを不良スポットとして目的の検出に使用しないこととする。
【００１４】
一方、プローブDNAを固定化する前に、上記と同様にマイクロアレイ表面の3次元形状を求めることもできる。ここでは、プローブDNAを固定化するために予めコーティングされていたコーティング層のラフネスR1を得る。このラフネスは測定した表面凹凸から得られるRms値（二乗平均粗さ）であり、高さの平均線から測定値までの偏差の二乗を平均した値の平方根として表す。この値と予めマイクロアレイの種類によって定められたラフネスの品質管理基準範囲と照らし合わせ、求めたR1が品質管理基準範囲内である場合良品として扱い、品質管理基準範囲外である場合不良品として扱う。あるいは、図１の102に示したプローブDNAのスポットされていない部分のラフネスを上記と同様に求めることで、コーティング層の品質管理を同様に行うこともできる。
【００１５】
次に、上記の評価により良品と判定されたDNAマイクロアレイを、特開2004−28953号公報に示された方法で、細胞から抽出したトータルRNAから調製したターゲットDNAとハイブリダイゼーション反応させた。その後、洗浄・乾燥させた。以上の処理を行ったDNAマイクロアレイを再び、前述したxyzθステージ上、かつ対物レンズ×10倍の直下に載置する。白色光を照射し、マイクロアレイ表面からの反射光と参照面からの反射光を干渉させ、対物レンズをマイクロアレイと垂直に走査させることでアレイ表面の3次元形状を求める。ここで、ハイブリダイゼーションされた各スポット膜厚Tn2を求める。算出したTn2から同一スポットにおいてハイブリダイゼーション前に求めたTn1を引き算することで、ターゲットDNAがハイブリダイゼーションした量をスポット毎に求めることができる。これらの品質管理も含めた一連の流れを図２に示す。この方法を用いることによって、ターゲットDNAに蛍光標識等を付ける必要がなく非標識で検出でき、蛍光分子の退色といった定量評価するにあたっての問題点を解決できる。また、非接触で検出及び検査することができるため、マイクロアレイに対するダメージを回避することができる。この方法で算出したハイブリダイゼーション量と比較するために、一般的な方法である蛍光分子を修飾されたターゲットDNAを用いてハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーション量を蛍光スキャナを用いて算出した。蛍光分子としてアマシャムバイオサイエンス社の試薬Ｃy5を用いたため、励起光として635nmのレーザーを用い、スライドガラス上をレーザースキャンした。得られた蛍光を空間分解能10umで検出した。蛍光強度から得られたハイブリダイゼーション量と、白色光を用いた膜厚差から得られたハイブリダイゼーション量には相関が見られた。その結果を図３に示す。
【００１６】
従来方法である蛍光量検出の場合、測定できるダイナミックレンジが小さい。したがって、例えばスライドガラス上に多くのスポットがある場合、蛍光スキャナの測定条件を一定にしたまま、蛍光量を測定することが困難である。そこで、検出器の感度を調整することによってダイナミックレンジを広げる。例えば、検出系の光電子倍増管への印加電圧や励起光のレーザー強度を変化させれば全てのスポットに対して検出することが可能になる。しかし、スポットによってこれらの測定条件を変えた場合には、全てのスポットを定量的に比較することが困難である。一方、白色光を用いて膜厚を測定する場合には、全てのスポットに対して絶対膜厚を求めることができるので、全てのスポット、あるいはバイオチップ間に対して定量的に比較することができるというメリットもある。
【００１７】
ここで白色光光源としてハロゲンランプを用いたが、水銀ランプ、メタルハライドランプ等の放電ランプ、白色LEDを用いても良い。ここでは、生体分子としてDNAを用いたが、RNA、たんぱく質、PNA、糖鎖、これらの複合物となった生体分子を用いても同様の結果を得ることができる。また、本方法を用いて生体分子の検出を行ったが、生化学反応の検出も行ってもよい。
【００１８】
基板として、スライドガラス以外の石英、プラスチック、金属コーティング基板等であり、いかなる大きさや形状の基板を用いても同様の検査及び検出を行うことができる。本実施例では、プローブDNAがスポットされた径は約300umであるが、これ以外の大きさのスポットに対しても同様の検査及び検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】白色光を用いてプローブDNAのスポット形状、膜厚及び膜厚バラツキを求めた結果を示す図である。
【図２】ハイブリダイゼーション前後で白色光を用いてスポット膜厚を求めることで、ハイブリダイゼーション量を求める手順を示す図である。
【図３】白色光を用いて測定したハイブリダイゼーション量と蛍光により測定したハイブリダイゼーション量の相関を示す図である。
【符号の説明】
【００２０】
101…プローブDNAスポット領域、102…プローブDNAスポット領域外、103…プローブDNA断面の高さを表す曲線。
【図１】
2007010557.tif 000003
【図２】
2007010557.tif 000004
【図３】
2007010557.tif 000005