(57)【要約】      （修正有）【課題】生体膜から膜タンパク質を効率よく可溶化できる膜タンパク質可溶化剤を提供する。【解決手段】下記一般式（１）2007314526.tif 000012（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ７はそれぞれ炭素数１〜１０、１〜４及び１〜６の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ３，Ｒ４及びＲ５は同一又は異なってもよく、水素原子又は炭素数１〜６の直鎖若しくは分岐鎖の炭化水素基を示し、Ｒ６及びＲ８は水素又はメチル基を示し、ｍとｎは各構成単位の割合を示し、ｍ／ｎは５／９５〜９５／５であり、平均分子量１，０００〜５，０００，０００である。）で示される共重合体を含む膜タンパク質可溶化剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体膜中に含まれる膜タンパク質を可溶化するための膜タンパク質可溶化剤であって、下記一般式（１）
【化１】
2007314526.tif 000010
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１０の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ２は炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ３，Ｒ４及びＲ５は同一又は異なってもよく、水素原子又は炭素数１〜６の直鎖若しくは分岐鎖の炭化水素基を示し、Ｒ６は水素又はメチル基を示し、Ｒ７は炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ８は水素又はメチル基を示し、ｍとｎは各構成単位の割合を示し、ｍ／ｎは５／９５から９５／５であり、ゲルパーミエーションクロマトグラフにより標準ポリエチレングリコールを用いて換算した重量平均分子量が１，０００〜５，０００，０００の範囲である。）で示される共重合体を含むことを特徴とする膜タンパク質可溶化剤。
【請求項２】
前記膜タンパク質は、エリスロポエチン受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、マクロファージコロニー刺激因子受容体、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体、ヒト成長ホルモン受容体、アディポネクチン受容体、ＴＮＦ−α受容体、インターロイキン−１受容体、インターロイキン−２受容体、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６受容体）からなる群から選択される１又は２種類以上であることを特徴とする請求項１に記載の膜タンパク質可溶化剤。
【請求項３】
生体膜中に含まれる膜タンパク質を可溶化するための膜タンパク質可溶化方法であって、前記生体膜を含有する試料と、下記一般式（１）
【化２】
2007314526.tif 000011
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１０の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ２は炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ３，Ｒ４及びＲ５は同一又は異なってもよく、水素原子又は炭素数１〜６の直鎖若しくは分岐鎖の炭化水素基を示し、Ｒ６は水素又はメチル基を示し、Ｒ７は炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ８は水素又はメチル基を示し、ｍとｎは各構成単位の割合を示し、ｍ／ｎは５／９５から９５／５であり、ゲルパーミエーションクロマトグラフにより標準ポリエチレングリコールを用いて換算した重量平均分子量が１，０００〜５，０００，０００の範囲である。）で示される共重合体を含む膜タンパク質可溶化剤と、を混合して前記生体膜から前記膜タンパク質を可溶化する可溶化工程を行うことを特徴とする膜タンパク質可溶化方法。
【請求項４】
前記可溶化された前記膜タンパク質を、前記膜タンパク質可溶化剤が残存した溶液中で保存することを特徴とする請求項３に記載の膜タンパク質可溶化方法。
【請求項５】
前記膜タンパク質は、エリスロポエチン受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、マクロファージコロニー刺激因子受容体、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体、ヒト成長ホルモン受容体、アディポネクチン受容体、ＴＮＦ−α受容体、インターロイキン−１受容体、インターロイキン−２受容体、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６受容体）からなる群から選択される１又は２種類以上であることを特徴とする請求項３又は４に記載の膜タンパク質可溶化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜タンパク質可溶化剤および膜タンパク質可溶化方法に係り、特に、生体膜中に含まれる膜タンパク質を可溶化するための膜タンパク質可溶化剤および膜タンパク質可溶化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体膜は細胞を構成する膜状の構造物であり、細胞と外部、あるいはミトコンドリア等の細胞内小器官と原形質を区別する役割を果たしている。
生体膜は、一対のリン脂質が疎水性相互作用により結合した脂質二重膜構造をしており、疎水性領域を内側に、親水性領域を外側に向けた構造をしている。そして、この脂質二重膜の内部には膜タンパク質が埋め込まれている。細胞や細胞内小器官の活動に必要な物質の輸送や情報伝達は、主としてこの膜タンパク質を介して行われる。
【０００３】
膜タンパク質は、脂質二重膜を介して細胞内と細胞外、あるいは原形質と細胞内小器官との間の物質の選別や輸送を行うなどの様々な機能を有する。細胞内外の物質に関与する膜タンパク質としては、細胞増殖因子受容体、ホルモン受容体、サイトカイン受容体などがあり、これらの受容体は物質の受容、伝達、変換などを行う。また、細胞内小器官の膜タンパク質としては、小胞体におけるタンパク質合成や、ミトコンドリアや葉緑体でのエネルギー変換に関与する膜タンパク質などがある。
【０００４】
このように、膜タンパク質は生命活動にとって重要な機能を果たしているため、医薬、農業、食品、工業などのあらゆる分野で研究対象とされている。特に、医薬の分野では、膜タンパク質の構造・機能を解析することにより、様々な疾病に対する有効な治療薬の開発が行われている。更に、このような治療薬として、近年では精製した膜タンパク質を医薬品の有効成分として直接利用する膜タンパク質製剤の開発が行われている。
【０００５】
一般に、膜タンパク質は疎水性領域が表面に局在した構造をしており、脂質二重膜の内部に埋め込まれた状態で生体膜に保持されている。膜タンパク質は、その表面の疎水性領域と脂質二重膜内部の疎水性領域が疎水性相互作用により結合しているため、生体膜から膜タンパク質を可溶化する際には、可溶化剤を用いて脂質二重膜を溶解し、膜タンパク質を脂質二重膜構造から抽出して水溶液中に溶解させる必要がある。
【０００６】
従来、膜タンパク質の可溶化に使用される可溶化剤としては、分子内に疎水性部分と親水性部分の両方を有する両親媒性の界面活性剤が使用されてきた。界面活性剤の具体例としては、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート等の非イオン性界面活性剤や、３−［（３−コール酸アミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コール酸アミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）等の両イオン性界面活性剤や、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、コール酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性剤が広く用いられてきた。
そして、生体膜を含む試料をこれらの界面活性剤を含む可溶化剤と混合して、超音波やホモジネート処理等を行うことで生体膜から膜タンパク質を水層（水溶媒）に移行させて可溶化させる。
【０００７】
膜タンパク質の可溶化において重要なことは、膜タンパク質の可溶化時や可溶化後に変性や失活をさせないことである。しかしながら、従来の界面活性剤は、脂質二重層を溶解させるのみならず、膜タンパク質の立体構造をも崩壊させて、膜タンパク質を変性させた状態で水溶媒中に溶解させる。このため、可溶化後の膜タンパク質のうち活性を保持したままの状態にあるものの収量が減少するという不都合があった。
【０００８】
このように、可溶化後の膜タンパク質は、一部が界面活性剤により変性した状態で水溶媒中に溶解しているため、使用時には溶媒を適当な条件にして、変性した膜タンパク質を再折りたたみ（リフォールディング）させる必要がある。しかしながら、このリフォールディング工程では、膜タンパク質の疎水性相互作用などによる不可逆的な凝集（アグリゲーション）や、誤った折りたたみ（ミスフォールディング）などが起こりやすく、所定の活性や機能を有さなくなる場合がある。
【０００９】
また、膜タンパク質の可溶化時に使用した界面活性剤が溶液中に残存した状態で保存すると、活性を保持している膜タンパク質も残存界面活性剤により変性や失活が生じるという不都合があった。
このような変性や失活を防止するため、一般に膜タンパク質の可溶化後は、可溶化時に使用した残存界面活性剤を透析等によって除去してポリエチレングリコール等の安定化剤に置換する操作が必要になる。しかしながら、このような透析操作を行うことで、膜タンパク質の可溶化工数の増加に伴う精製コストの上昇、透析操作による膜タンパク質の変性や凝集による活性の低下、透析チューブなどの器具への試料の付着による収率の減少といった不都合が生じる。
従って、かねてから、膜タンパク質を安定的に可溶化できる膜タンパク質可溶化剤が求められていた。
【００１０】
ところで、従来、ホスホリルコリン基を有する重合体とタンパク質を共存させるタンパク質の安定化方法およびこの方法を利用した組成物が知られている（例えば、特許文献１）。この安定化方法や組成物を用いることで、アルブミン製剤等の血漿製剤タンパク質を安定化することが可能となる。
【００１１】
【特許文献１】特開平１０−４５７９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、ホスホリルコリン基を有する重合体であって、膜タンパク質の可溶化に使用されるものについては、未だに開発されていなかった。
【００１３】
本発明の目的は、生体膜から膜タンパク質を安定的に可溶化できる膜タンパク質可溶化剤およびこれを使用した膜タンパク質可溶化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、ホスホリルコリン類似基とアルキル基含有側鎖を分子内に含む共重合体を用いることで、膜タンパク質を安定的に可溶化できるという新たな知見を得るに至った。
すなわち、上記課題を解決するために、本発明の膜タンパク質可溶化剤は、生体膜中に含まれる膜タンパク質を可溶化するための膜タンパク質可溶化剤であって、下記一般式（１）
【化３】
2007314526.tif 000002
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１０の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ２は炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ３，Ｒ４及びＲ５は同一又は異なってもよく、水素原子又は炭素数１〜６の直鎖若しくは分岐鎖の炭化水素基を示し、Ｒ６は水素又はメチル基を示し、Ｒ７は炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ８は水素又はメチル基を示し、ｍとｎは各構成単位の割合を示し、ｍ／ｎは５／９５から９５／５であり、ゲルパーミエーションクロマトグラフにより標準ポリエチレングリコールを用いて換算した重量平均分子量が１，０００〜５，０００，０００の範囲である。）で示される共重合体を含むことを特徴とする。
【００１５】
また、前記膜タンパク質は、エリスロポエチン受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、マクロファージコロニー刺激因子受容体、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体、ヒト成長ホルモン受容体、アディポネクチン受容体、ＴＮＦ−α受容体、インターロイキン−１受容体、インターロイキン−２受容体、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６受容体）からなる群から選択される１又は２種類以上であることが好ましい。
【００１６】
また、上記課題を解決するために、本発明の膜タンパク質可溶化方法は、生体膜中に含まれる膜タンパク質を可溶化するための膜タンパク質可溶化方法であって、前記生体膜を含有する試料と、下記一般式（１）
【化４】
2007314526.tif 000003
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１０の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ２は炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ３，Ｒ４及びＲ５は同一又は異なってもよく、水素原子又は炭素数１〜６の直鎖若しくは分岐鎖の炭化水素基を示し、Ｒ６は水素又はメチル基を示し、Ｒ７は炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ８は水素又はメチル基を示し、ｍとｎは各構成単位の割合を示し、ｍ／ｎは５／９５から９５／５であり、ゲルパーミエーションクロマトグラフにより標準ポリエチレングリコールを用いて換算した重量平均分子量が１，０００〜５，０００，０００の範囲である。）で示される共重合体を含む膜タンパク質可溶化剤と、を混合して前記生体膜から前記膜タンパク質を可溶化する可溶化工程を行うことを特徴とする。
【００１７】
この場合、前記可溶化された前記膜タンパク質を、前記膜タンパク質可溶化剤が残存した溶液中で保存することが好ましい。
【００１８】
また、前記膜タンパク質は、エリスロポエチン受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、マクロファージコロニー刺激因子受容体、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体、ヒト成長ホルモン受容体、アディポネクチン受容体、ＴＮＦ−α受容体、インターロイキン−１受容体、インターロイキン−２受容体、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６受容体）からなる群から選択される１又は２種類以上であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の膜タンパク質可溶化剤によれば、ホスホリルコリン類似基含有側鎖とアルキル基含有側鎖の両側鎖を分子内に含む共重合体を含んでおり、この共重合体は生体膜を溶解して膜タンパク質を可溶化する可溶化能に優れている。従って、生体膜中から膜タンパク質を高い効率で安定的に可溶化できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に、本発明の膜タンパク質可溶化剤について説明する。なお、以下に説明する材料、器具、条件などは本発明を限定するものではなく、本発明の趣旨に沿って各種改変することができることは勿論である。
【００２１】
本発明の膜タンパク質可溶化剤は、ホスホリルコリン類似基含有側鎖とアルキル基含有側鎖を分子内に含む共重合体（以下、ＰＣポリマーという）を膜タンパク質可溶化の有効成分として含んでいる。
このＰＣポリマーは、具体的には、下記一般式（１）
【化５】
2007314526.tif 000004
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１０の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ２は炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ３，Ｒ４及びＲ５は同一又は異なってもよく、水素原子又は炭素数１〜６の直鎖若しくは分岐鎖の炭化水素基を示し、Ｒ６は水素又はメチル基を示し、Ｒ７は炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ８は水素又はメチル基を示し、ｍとｎは各構成単位の割合を示し、ｍ／ｎは５／９５から９５／５であり、ゲルパーミエーションクロマトグラフにより標準ポリエチレングリコールを用いて換算した重量平均分子量が１，０００〜５，０００，０００の範囲である。）で示される共重合体である。
【００２２】
このＰＣポリマーは、下記一般式（２）で示されるホスホリルコリン類似基を分子内に有している。
【化６】
2007314526.tif 000005
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１０の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ２は炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ３，Ｒ４及びＲ５は同一又は異なってもよく、水素原子又は炭素数１〜６の直鎖若しくは分岐鎖の炭化水素基である）。
【００２３】
このホスホリルコリン類似基は、生体膜の構成成分の１つであるリン脂質極性基（ホスホリルコリン基）と同一又は類似した構造をしている。このため、ホスホリルコリン類似基を分子内に含むＰＣポリマーは、水溶媒内で自己組織化して生体膜とよく似た性質の擬似生体膜を構築する。この擬似生体膜中に膜タンパク質が保持されることで、生体膜内に存在する場合と同様に安定した状態となり、可溶化後の膜タンパク質を安定的に保存できると推定される。
【００２４】
更に、ホスホリルコリン類似基は、リン酸基とコリン類似基の二つの荷電性基を有している。このリン酸基のマイナス電荷とコリン類似基のプラス電荷は分子内で打ち消しあうため、ホスホリルコリン類似基は電気的に中性な官能基として挙動する。従って、膜タンパク質の電荷型アミノ酸側鎖と静電的相互作用を起こしにくく、これらの側鎖と相互作用することによる膜タンパク質の構造変化を防止することができると考えられる。
【００２５】
更にまた、このＰＣポリマーは生体に対する毒性が低い。これは、ＰＣポリマーの有するホスホリルコリン類似基が生体膜の成分であるリン脂質極性基と類似した構造をしており、生体が異物として認識しにくいためであると推定される。このため、ＰＣポリマーを製剤に含有して生体に投与しても、拒絶反応、生体組織の破壊、溶血、死亡といった悪影響を及ぼすことが無い。
【００２６】
また、このＰＣポリマーは、一般式：−Ｒ７（式中、Ｒ７は炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ８は水素又はメチル基である。）で示されるアルキル基を分子内に有している。
【００２７】
このアルキル基は疎水性であるため、脂質二重膜を構成するリン脂質の疎水基と疎水性相互作用を起こし、二重層構造を崩壊させる性質を有すると考えられる。従って、膜タンパク質を保持する脂質二重膜を溶解させて膜タンパク質を可溶化する機能に中心的な役割をはたしていると推定される。
更に、このアルキル基は、膜タンパク質表面に局在する疎水性領域と疎水性相互作用をすると考えられる。この疎水性相互作用により、膜タンパク質は水溶媒中でも凝集を起こしにくく、活性を保持した状態で安定的に水溶媒中に分散していると推定される。このように、アルキル基は、可溶化後の膜タンパク質の安定性にも寄与すると考えられる。
【００２８】
このように、本発明のＰＣポリマーは、上述したような脂質二重膜を溶解しやすい性質を備えているため、特に生体膜に埋もれた膜タンパク質を可溶化する際に好適に使用される。
【００２９】
次に、ＰＣポリマーの製造方法について説明する。
上記ＰＣポリマーは、分子内にホスホリルコリン類似基を有するホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）と、分子内にアルキル基を有するアルキル基含有単量体（ａ２）の２種類の単量体を共重合することで合成することが可能である。
【００３０】
ホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）としては、細胞膜の構成成分であるリン脂質が有するホスホリルコリン基と類似した性質を有するホスホリルコリン類似基を側鎖として備え、且つ、重合性の（メタ）アクリロイル基を分子内に有する単量体が挙げられる。
【００３１】
具体的には、下記一般式（３）で示される化合物が好適に使用される。
【化７】
2007314526.tif 000006
（式中、Ｒ１は炭素数１〜１０の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ２は炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ３，Ｒ４及びＲ５は同一又は異なってもよく、水素原子又は炭素数１〜６の直鎖若しくは分岐鎖の炭化水素基を示し、Ｒ６は水素又はメチル基である。）
【００３２】
このような化合物としては、例えば、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、５−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、７−（メタ）アクリロイルオキシヘプチル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、８−（メタ）アクリロイルオキシオクチル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、９−（メタ）アクリロイルオキシノニル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、１０−（メタ）アクリロイルオキシデシル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２−（トリプロピルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２−（トリブチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシブチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシヘキシル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート等が挙げられる。
ここで、「（メタ）アクリロイル」とは、メタクリルおよび／またはアクリルを意味しており、本明細書中の他の記載においても同じ意味で使用する。
なお、上記化合物は、使用に際して単独または混合物として用いることができる。
このうち、入手が特に容易などの理由から、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート｛別名、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンともいう（以下、ＭＰＣ）｝が好適である。
【００３３】
また、ＰＣポリマーは、アルキル基含有単量体（ａ２）を構成単位として備えている。アルキル基含有単量体（ａ２）としては、側鎖にアルキル基を有し、且つ、分子内に重合性の（メタ）アクリロイル基を有する単量体が挙げられる。
【００３４】
具体的には、下記一般式（４）で示される化合物が好適に使用される。
【化８】
2007314526.tif 000007
（式中、Ｒ７は炭素数１〜６の直鎖又は分岐鎖の２価の炭化水素基を示し、Ｒ８は水素又はメチル基である。）
【００３５】
このような化合物としては、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸イソプロピル、（メタ）アクリル酸ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸ｓｅｃ−ブチル、（メタ）アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル、（メタ）アクリル酸ペンチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル等が挙げられる。
なお、上記化合物は、使用に際して単独または混合物として用いることができる。
上記複数の化合物のうち、入手が容易である点や、ホスホリルコリン類似基単量体（ａ１）との重合性に優れている点から、（メタ）アクリル酸ｎ−ブチル（以下、ＢＭＡ）が好ましい。
【００３６】
ホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）とアルキル基含有単量体（ａ２）との共重合体であるＰＣポリマーにおいて、両単量体の組成比は可溶化する膜タンパク質や生体膜の性質、可溶化後の保存安定性などを考慮して任意の組成比とすることができる。
具体的には、ＰＣポリマー中でのホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）の含有割合は、モル分率（すなわち、ｍ／ｍ＋ｎ）で０．０５〜０．９５の範囲であればよい。
特に、膜タンパク質の可溶化の点から、ホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）の含有割合は、０．３０〜０．５０の範囲が好ましい。モル分率が０．３０よりも小さいと、ホスホリルコリン類似基の割合が少なくなるため膜タンパク質の安定性が低下して好ましくない。一方、モル分率が０．５０よりも大きいと、アルキル基の割合が多くなり過ぎるためＰＣポリマーの溶媒への溶解度が低下して好ましくない。
【００３７】
ＰＣポリマー中の各単量体の構成割合は、重合反応開始前の各単量体の混合比にほぼ等しくなるため、混合比を調整することで所望の組成比とすることが可能である。例えば、ホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）のＰＣポリマー中でのモル分率（すなわち、ｍ／ｍ＋ｎ）が０．４のＰＣポリマーを製造する場合、重合開始前の溶液中のホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）とアルキル基含有単量体（ａ２）の混合比をモル比で０．４：０．６にすればよい。
【００３８】
また、ＰＣポリマーの重量平均分子量は、特には限定されないが、１，０００〜５，０００，０００の範囲内であればよい。
特に、膜タンパク質の可溶化の観点からは、１０，０００〜１，０００，０００の範囲が好適である。重量平均分子量が１０，０００より小さいと、膜タンパク質の安定性への重合体の寄与度が低下するため好ましくない。逆に、重量平均分子量が１，０００，０００よりも大きいと、溶液の粘度が高くなりすぎて取り扱いが不便となるため好ましくない。
特に、可溶化した膜タンパク質を用いて膜タンパク質製剤を製造する場合、ＰＣポリマーが膜タンパク質製剤に残存する場合があるが、ＰＣポリマーの重量平均分子量が大きすぎると腎臓などで代謝されにくい。このため、ＰＣポリマーの重量平均分子量としては、５０，０００〜１５０，０００程度が好ましい。
【００３９】
なお、この場合の重量平均分子量とは、ゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）により標準ポリエチレングリコールを用いて換算した重量平均分子量を意味する。本明細書中の他の記載においても同様の意味である。
具体的には、以下の条件でＧＰＣを行って算出した重量平均分子量を意味する。
カラム：Ｇ３０００ＰＷＸＬを２本（東ソー社製）
溶出溶媒：２０ｍＭリン酸バッファ
標準物質：ポリエチレングリコール（ポリマー・ラボラトリー社製）
流速：０．５ｍｌ／分
試料溶液使用量：１００μｌ
カラム温度：４０℃
視差屈折計・計算プログラム：東ソー社製インテグレータ内臓分子量計算プログラム（ＳＣ−８０２０用ＧＰＣプログラム）
【００４０】
ＰＣポリマーの重量平均分子量は、重合反応の時間、重合開始剤の濃度、重合温度などの重合条件によって調整することができる。例えば、重合反応の時間を２４時間と長くすれば、得られるＰＣポリマーの重量平均分子量は５００，０００程度と大きくなる。一方、重合反応時間を１．５時間と短時間にすれば、得られるＰＣポリマーの重量平均分子量は３０，０００程度と小さくなる。
【００４１】
また、ＰＣポリマーの種類としては、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体などの、公知の重合様式による重合体のいずれであってもよい。各単量体の重合は、溶液重合、塊状重合、乳化重合、懸濁重合などの公知の方法を用いて行われる。この際必要に応じて、重合系を窒素、二酸化炭素、ヘリウム等の不活性ガスで置換して、または置換せずにこの不活性ガスを重合系に連続的に導入した状態で、重合温度０〜１００℃、重合時間１０分〜４８時間の重合条件下でラジカル重合させる方法等により調製する事ができる。
【００４２】
重合に際しては、アクリル系高分子化合物の重合反応において通常使用されるラジカル重合開始剤を用いることができる。ラジカル重合開始剤としては、例えば、２，２−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩、４，４−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２−アゾビス（２−（５−メチル−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）二塩酸塩、２，２−アゾビスイソブチルアミド二水和物、２，２−アゾビスイソブチロニトリル、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート、ｔ−ブチルペルオキシジイソブチレート、過酸化ラウロイル、アゾビスイソブチロニトリル、２，２  −アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート等が挙げられる。
特に、４，４−アゾビス（４−シアノ吉草酸）または２，２−アゾビスイソブチロニトリルが好適である。
【００４３】
これらのラジカル重合開始剤は単独で用いても混合物で用いてもよい。また、ラジカル重合開始剤の他に各種レドックス系の促進剤を用いても良い。ラジカル重合開始剤の使用量は、単量体組成物１００重量部に対して０．０１〜５．０重量部が好ましい。反応温度は４０〜８０℃、好ましくは５０〜７０℃である。
ラジカル重合開始剤の種類、濃度、反応時間、反応温度などを適宜選択することにより、所望の重量平均分子量や分子量分布を有するＰＣポリマーを得ることが可能となる。
重合反応後のＰＣポリマーの精製は、再沈殿法、透析法、精密濾過法、限外濾過法など一般的な精製方法により行うことができる。
【００４４】
精製したＰＣポリマーは、乾燥して粉末状で保存するか、または水、各種緩衝液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ニトロメタンなどの溶媒中で保存することができる。溶媒としては、水溶液や有機溶媒、または有機溶媒と水溶媒を混合した混合溶媒などの各種溶媒を使用することが可能である。有機溶媒としては、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルオキシド、アセトニトリル、ジオキサン、アセトン、塩化メチレン、クロロホルム、メチルエチルケトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、トルエン、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、ｎ−ヘキサン、イソプロピルエーテル、四塩化炭素、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドンなどが挙げられる。
【００４５】
精製したＰＣポリマーを膜タンパク質可溶化剤として使用する場合は、試料中に直接粉末を混合するか、または生理的食塩水や各種緩衝液などの溶媒に上記保存状態のＰＣポリマーを混合して溶液状の可溶化剤を調整した後で、この可溶化剤を試料中に混合する。
ＰＣポリマーの濃度は、可溶化する膜タンパク質の種類や特性にもよるが、０．１〜１．０ｍＭ程度が好ましい。
緩衝液として、例えばリン酸バッファ、酢酸バッファ、クエン酸バッファ、Ｔｒｉｓ−塩酸バッファ、Ｔｒｉｓ−酢酸バッファ、Ｔｒｉｓ−塩酸バッファ、Ｈｅｐｅｓバッファ、ＭＯＰＳバッファなどが挙げられる。
【００４６】
この溶媒には、ＰＣポリマーの可溶化作用や膜タンパク質に対する保存安定作用を阻害しない範囲で各種成分を配合することができる。
このような成分としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム、硫酸アンモニウムなどの塩や、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどのキレート剤、ＳＤＳなどの界面活性剤、ＤＴＴ、２−メルカプトエタノール、グルタチオン、アスコルビン酸などの還元剤、エチレングリコール、グリセロールなどの凍結保護剤、アジ化ナトリウム、チメロサールなどの防腐剤、アプロチニン、ペプスタチン、ロイペプチンなどのプロテアーゼ阻害剤などを挙げることができる。
【００４７】
本発明の膜タンパク質可溶化剤は、特に生体膜に結合した膜タンパク質の可溶化に最適である。生体膜の種類としては、細胞と外界との境界を形成する細胞膜、ミトコンドリアや葉緑体、リソソームなどの細胞内オルガネラを囲む膜など、ホスホリルコリン基を含む生体膜のすべてを含んでいる。
このような膜タンパク質には様々な種類があるが、例えば、細胞増殖因子受容体、ホルモン受容体、サイトカイン受容体などが挙げられる。
細胞増殖因子受容体の例としては、赤血球産生調節因子であるエリスロポエチン受容体（ＥＰＯ受容体）、好中球前駆細胞の分化促進作用を有する顆粒球コロニー刺激因子受容体（Ｇ−ＣＳＦ受容体）、単球の分化促進作用を有するマクロファージコロニー刺激因子受容体（Ｍ−ＣＳＦ受容体）などが挙げられる。
ホルモン受容体の例としては、血中糖分濃度の調節機能を有するインスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１受容体）、ヒト成長ホルモン受容体などが挙げられる。
サイトカイン受容体の例としては、脂肪細胞から分泌されインスリンの作用に関与するアディポネクチン受容体、慢性炎症などに関与するＴＮＦ−α受容体（ＴＮＦ−α受容体）、免疫応答に関与するインターロイキン−１受容体（ＩＬ−１受容体）、Ｔ細胞の増殖促進機能を有するインターロイキン−２受容体（ＩＬ−２受容体）、抗体産生促進機能を有するインターロイキン−６受容体（ＩＬ−６受容体）などが挙げられる。
なお、膜タンパク質としては、野生型のみならず、これらの膜タンパク質の変異型も含む。このような変異型の膜タンパク質は、膜タンパク質をコードする遺伝子に先天的な変異を有するものであっても、遺伝子組換え等により人工的に変異を導入したものであってもよい。
【００４８】
膜タンパク質を可溶化するには、まず膜タンパク質を含む生体組織や生体細胞などの試料を調整する。例えば、ＥＰＯ受容体は骨髄組織中に多く含まれるため、試料として骨髄組織を使用する。
なお、目的とする膜タンパク質をコードする遺伝子をトランスジェニック生物や大腸菌などの微生物に組み込ませて膜タンパク質を発現させ、この生物から膜タンパク質を含む組織や細胞を調整することも可能である。この場合、ＧＳＴ融合タンパク質やＨｉｓ−タグ結合タンパク質といった、生化学・生理学の分野で広く用いられている発現系を利用することも可能である。
【００４９】
生体組織から膜タンパク質を可溶化する方法としては、目的とする膜タンパク質を含む生体組織や細胞の調製液に、ＰＣポリマーを含む膜タンパク質可溶化剤を混合することで行われる。単に混合するだけでも、生体膜から膜タンパク質を可溶化することが可能であるが、混合後の試料溶液に対して超音波処理やホモジナイズなどの処理を施すことで、脂質二重層に埋もれた膜タンパク質をより効率的に水層に溶解させることができる。
膜タンパク質可溶化後の溶液中に含まれる不溶成分は、遠心分離などにより沈殿させて除去する。
【００５０】
可溶化後の膜タンパク質を含む溶液は、目的とする膜タンパク質以外の成分を多く含んだ状態にあるので、実験などに使用する際には、公知の方法で目的とする膜タンパク質を精製してもよい。
可溶化した膜タンパク質の精製方法としては、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーといった公知のタンパク質精製技術を用いて行うことができる。更に、各クロマトグラフィーの溶出溶液としてＰＣポリマーを含む溶液を使用すると、精製過程での膜タンパク質の変性や失活を防止することが可能となるため好ましい。精製後の膜タンパク質は、必要に応じてペプチド限定分解や糖鎖付加を行ってもよい。
【００５１】
精製後の膜タンパク質は、試験、研究などに用いられるほか、医薬品として生体に直接投与することも可能である。精製後の膜タンパク質から膜タンパク質製剤を製造するには、膜タンパク質溶液に製剤用基材を混合して、所定の剤形に成形する。この際、上述したようにＰＣポリマーは生体毒性が低いため、可溶化時に用いられたＰＣポリマーが多少残存していても、生体に対して悪影響を及ぼすことがほとんどない。
【００５２】
逆に、ＰＣポリマーは生体膜の構成成分と類似した構造のホスホリルコリン類似基を有しているため、膜タンパク質の保存安定性を向上させる。このため、膜タンパク質の可溶化に用いたＰＣポリマーが溶液中に残存した状態でそのまま保存することが好ましい。
このように、抽出後の膜タンパク質を可溶化剤が含まれた状態でそのまま保存することができるため、抽出後の溶液から透析などにより可溶化剤を除去したり、溶液を安定化剤などに置換したりする必要が無く、可溶化・保存工程の簡略化や膜タンパク質の収率向上などを図ることができる。
【００５３】
膜タンパク質製剤の剤形としては、その使用形態に応じて適宜設定することができる。剤形の種類としては、例えば散剤、細粒剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、トローチ剤、貼付剤、軟膏剤、坐剤、噴霧剤、吸引剤などが挙げられる。そして、これらの剤形に応じて上記製剤用基剤から所望の製剤用基剤を選択したり、他の製剤用基剤を適宜配合したりすることができる。
【００５４】
膜タンパク質製剤の投与方法としては、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、髄腔内投与、皮下投与、舌下投与、経直腸投与、点眼投与、経鼻投与、経皮投与など、公知の投与方法を用いることができる。なお、経口投与の場合は、散剤、細粒剤、カプセル剤などの薬剤の表面を、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートやヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの腸溶性コーティング剤や胃溶性コーティング剤で被覆することで、有効成分が所望の組織や器官に到達しやすいようにすることも可能である。
【００５５】
このような膜タンパク質を有効成分とする膜タンパク質製剤は、細胞増殖因子やホルモンなどと特異的に結合するため、これらの成分が過剰に産生されることが原因の疾患、例えば糖尿病、高血圧、心不全、腎不全、膠原病、リウマチ、関節炎などの治療薬として有効である。
【実施例】
【００５６】
（実施例１、２）
以下に、本発明の膜タンパク質可溶化剤について実施例を挙げて説明をする。本実施例では、膜タンパク質として、Ｇタンパク質共役型受容体（以下、ＧＰＣＲ）の一種であるマウス肝臓由来のアディポネクチンＲ２受容体（以下、ＡｄｉｐｏＲ２受容体）を使用した。また、本発明の共重合体であるＰＣポリマーは、ホスホリルコリン類似基含有単量体（ａ１）としてＭＰＣ、アルキル基含有単量体（ａ２）としてＢＭＡを用い、ＭＰＣとＢＭＡのモル比が５：５の共重合体（以下、ＰＭＢ５０）、モル比が３：７の共重合体（ＰＭＢ３０）の２種類の共重合体を使用した。
【００５７】
＜ＰＭＢ５０およびＰＭＢ３０の調整＞
ＭＰＣ（日本油脂製）とＢＭＡ（ナカライ製）を用いてＰＭＢ５０およびＰＭＢ３０を合成した。本発明で用いるＰＭＢ５０およびＰＭＢ３０は、
石原ら、「りん脂質ポリマの調製及びそれらのポリマのヒドロゲル膜としての性質」、ポリマージャーナル（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、１９９０年５月、Ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．５、ｐ．３５５−３６０、
に記載された方法に従って製造した。
ＰＭＢ５０の合成方法について簡単に説明すると、ＭＰＣとＢＭＡを５０ｍｏｌ：５０ｍｏｌのモル比となるようにテトラヒドロフランとエタノールの混合溶媒中に溶解し、重合開始剤としてα、α´−アゾビスイソブチロニトリルを添加して６０℃、２．５時間反応させることにより合成した。
ＰＭＢ３０についても同様に、ＭＰＣとＢＭＡを３０ｍｏｌ：７０ｍｏｌのモル比となるようにテトラヒドロフランとエタノールの混合溶媒中に溶解し、重合開始剤としてα、α´−アゾビスイソブチロニトリルを添加して６０℃、２．５時間反応させることにより合成した。
【００５８】
＜ＡｄｉｐｏＲ２受容体の可溶化＞
２０週齢マウスの肝臓を摘出し、肝臓組織１ｇにつき、０．１Ｍ、ｐＨ７．５のＴＢＳ（Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ：トリス緩衝生理食塩水）、１％のプロテアーゼインヒビターの混合溶液を添加し、ホモジナイザ（池本理化社製テフロン（登録商標）ホモジナイザ）にて４℃、１分間ホモジナイズして肝臓組織を破砕した。
ホモジナイズ処理で得られた懸濁液を１．５ｍｌの遠心分離用マイクロチューブに１００μｌずつ分注し、４℃、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、ＡｄｉｐｏＲ２受容体を含む難溶性タンパク質と水溶性タンパク質を分離した。遠心分離後の上清を除去して沈殿のみを回収した。再度、０．１Ｍ、ｐＨ７．５のＴＢＳ（Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ：トリス緩衝生理食塩水）、１％のプロテアーゼインヒビター混合溶液を添加して洗浄し、上記条件にて遠心分離を行った。この工程を計３回繰り返した。
最終的に得られた沈殿に３種類の膜タンパク質可溶化剤を１ｍｌ添加して混合し、肝細胞懸濁液を得た。膜タンパク質可溶化剤の条件は以下の通りである。
実施例１：５重量％濃度ＰＭＢ５０
実施例２：５重量％濃度ＰＭＢ３０
比較例：  ５重量％濃度  Ｍｅｍ−ＰＥＲ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）
【００５９】
続いて、実施例１，２および比較例の肝細胞懸濁液に対して、アウトプットコントロールレベル１で１０分間超音波処理して、ＡｄｉｐｏＲ２受容体の細胞膜からの可溶化を行った。超音波処理後の溶液を３７℃、１時間インキュベートし、その後、４℃、１０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後に、上清のみを取得した。
【００６０】
＜ＡｄｉｐｏＲ２受容体の確認＞
上記実施例１，２および比較例の上清中にＡｄｉｐｏＲ２受容体が含まれているか否かを、ウェスタンブロッティングにより確認した。
まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）用の４ウェルの電気泳動用ゲルを作成した。作成したゲルを泳動槽にセットして、２５ｍＭＴｒｉｓ緩衝液を泳動槽に注入してゲルを浸漬させた。次に、遠心分離で分離した実施例１，２、比較例の各上清に、９％ＳＤＳ、１５％２−メルカプトエタノール、４０ｍｌＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ、３０％グリセリンとなるよう調整した試料処理液を、上清：試料処理液＝１：２となるように混合して、全量を６０μｌとした。ＳＤＳ処理した試料をそれぞれゲル上のウェルに注入して、電気泳動装置（アドバンテック社製ＦＰ−０８０）で２０ｍＡ、１８０分間通電して電気泳動を行った。
【００６１】
続いて、電気泳動後のゲルを用いてウェスタンブロッティングを行った。ブロッティング装置としてバイオラッド社製ＴｒａｎｓＢｌｏｔ（登録商標）  Ｃｅｌｌ、転写膜としてＭＳＩ社製ＰＶＤＦメンブレムを使用した。ブロッティングバッファとして１９２ｍＭグリシン、２５ｍＭＴｒｉｓバッファ、２０％メタノールを使用し、ブロッキング剤として５％スキムミルクを添加したＴＴＢＳ溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）を使用した。また、一次抗体として、マウス抗ＡｄｉｐｏＲ２受容体抗体（ＡＬＰＨＡ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ社製）を希釈率１０００倍にして使用した。二次抗体として、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＣＥＬＬ  ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ  ＰＲＯＤＵＣＴ社製）を希釈率１０００倍にして使用した。
電気泳動後のゲルを２５℃、３時間、８０Ｖにて転写膜に転写し、転写後の転写膜にブロッキング剤を添加して２５℃、１時間振とうして転写膜をブロッキングして、ブロッキング反応後にブロッティングバッファで３回洗浄した。ブロッキング後の転写膜に一次抗体を添加して、４℃、１６時間振とうして転写膜と反応させ、反応後の転写膜を上記ブロッティングバッファで３回洗浄した。
一次抗体反応後の転写膜に二次抗体を添加して、２５℃、１時間振とうして一次抗体と反応させ、反応後の転写膜をＴＴＢＳ溶液で３回洗浄した。
反応後の転写膜をラップ上に載置した後、転写膜を発色剤（ＥＣＬ  ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）と反応させて、転写膜に転写されたＡｄｉｐｏＲ２受容体を検出した。
【００６２】
図１はウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。左から順に、（１）比較例、（２）実施例２（ＰＭＢ３０）、（３）実施例１（ＰＭＢ５０）の結果を示している。
この図からわかるように、（１）の比較例の場合と実施例１、２のいずれの場合においても、ＡｄｉｐｏＲ２受容体の存在を示す約５０ｋＤａのバンドが検出されていることから、ＡｄｉｐｏＲ２受容体が上清中に溶解（すなわち、可溶化）していることがわかる。しかも、両者のバンドの検出強度がほぼ等しいことから、ＰＭＢ５０、ＰＭＢ３０ともに、従来の界面活性剤と同様に高い膜タンパク質可溶化能力を備えていることがわかる。
【００６３】
（実施例３〜８）
次に、膜タンパク質可溶化剤による抽出後の膜タンパク質の活性残存試験を行った。
本実施例では、膜タンパク質としてインスリン受容体（Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＩＲ）を用いた。
図２に、インスリン受容体の模式図を示す。この図に示すように、インスリン受容体は、αサブユニットとβサブユニットがＳ−Ｓ結合により２個ずつ会合した４量体タンパク質である。αサブユニットにはインスリン結合ドメインがあり、完全に膜外に存在する。βサブユニットには、膜外に存在する領域、膜貫通領域、細胞内に存在する領域があり、このうち細胞内領域にインスリンによって活性化されるチロシンキナーゼドメインが存在する。
【００６４】
インスリンがαサブユニットのインスリン結合ドメインに結合すると、βサブユニットのチロシンキナーゼドメインが刺激され、まず受容体の自己リン酸化により細胞質タンパク質であるインスリン受容体基質（Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；ＩＲＳ）に対するチロシンキナーゼ活性が増加する。
チロシンキナーゼドメインにあるチロシン残基１１６２、１１６３がリン酸化されることはチロシンキナーゼ活性に必須であると考えられている。
【００６５】
そこで、本実施例では、本発明の膜タンパク質可溶化剤（ＰＭＢ３０、ＰＭＢ５０）を実施例（実施例３〜８）とし、実施例１、２と同様にＰＩＥＲＣＥ社製の膜タンパク質可溶化剤を比較例（比較例３〜８）として活性残存試験を行った。具体的には、これら膜タンパク質可溶化剤を用いて生体組織からインスリン受容体を可溶化して抽出し、抽出後のサンプルをＥＬＩＳＡで分析してインスリン受容体の中に活性があるインスリン受容体の割合と、得られたインスリン受容体とそのリガンド（インスリン）との結合力を調べることで、活性残存の評価を行った。
【００６６】
（ステップ１）
４匹の１０週齢オス  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ａ〜Ｄ）（日本チャールス・リバー社製）を用意し、１６時間絶食させた。ＰＢＳ（−）でグルコースを溶かし、２匹（Ａ、Ｂ）にグルコース２ｇ／ｋｇを腹腔内注射し、マウスＡを注射後１５分後、マウスＢを２５分後に解剖して肝臓、骨格筋、内臓脂肪組織を取り出した。
残りの２匹（Ｃ、Ｄ）にＰＢＳ（−）を腹腔内注射し、いずれも１５分後に解剖して肝臓、骨格筋、内臓脂肪組織を取り出した。
マウスＡ〜Ｄから取り出したこれらの組織を速やかに液体窒素に入れ、冷蔵庫にて−８０℃で保存した。
これらのマウスのうちマウスＡ〜Ｃから取り出した組織を用い、以下の膜タンパク質抽出実験を行った。マウスＤの組織についてはそのまま保存しておいた。
【００６７】
（ステップ２）
実施例３〜８と比較例の膜タンパク質可溶化剤によりマウスから取り出した組織からインスリン受容体を抽出する実験を行い、得られたインスリン受容体の濃度を定量した。
膜タンパク質可溶化剤（ＰＭＢ３０、ＰＭＢ５０、ＰＩＥＲＣＥの３種類）と１×ＴＢＳに、１×Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＰＩＥＲＣＥ社製）、１ｍＭ  ＮａＦ（Ｓｉｇｍａ社製）、２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４（Ｓｉｇｍａ社製）を混合した。
【００６８】
次に、１２０ｍｇの肝臓（又は骨格筋）と１ｍｌのＴＢＳを遠心管の中に入れ、ポリトロンホモジナイザでホモジナイズして均質液を得た。脂肪組織１２０ｍｇとＴＢＳ１ｍｌをダウンス型ホモジナイザ（ｓｏｆｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｉｎｄｅｒ）に入れ、手作業でホモジナイズして均質液を得た。これは、脂肪組織の膜タンパク質は、通常の方法でホモジナイズすると壊れやすいと言われているためである。
【００６９】
上の工程で得られた均質液を３本の１．５ｍｌチューブに同量となるように分け、１０００ｇ、５分間、４℃で遠心分離した。脂肪組織の均質液については、この条件で遠心分離しても沈殿物が見られなかったため、さらに１００００ｇ、１５分間、４℃で遠心分離した。その結果、少量の沈殿物を確認することができた。
遠心分離後に上清を捨て、沈殿物をＰＩＥＲＣＥ社製のＲｅａｇｅｎｔ  Ａ  ３００μｌ（比較例３〜８）、ＰＭＢ３０  １ｍｌ（実施例３−１〜８−１）、ＰＭＢ５０  １ｍｌ（実施例３−２〜８−２）のいずれかを用いて溶かし、更に１ｍｌ注射器（２５Ｇ針）で沈殿物を含む溶液の吸引・吐出を１０回程度繰り返し、沈殿物を細かくした。
【００７０】
得られたサンプルに対して氷上で超音波処理（ｏｕｔｐｕｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  １、ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ  １０％）を１０分間行い、３７℃、１時間インキュベーションした。その後、１００００ｇ、６分間、４℃で遠心分離を行い、上清を−８０℃で保存した。
なお、この際バッファ交換などは行っていない。すなわち、保存液中には、実施例や比較例の膜タンパク質可溶化剤が含まれた状態となっている。
【００７１】
抽出後２ヶ月目に、得られたサンプルに含まれるインスリン受容体の濃度を測定した。その結果を表１に示す。なお、肝臓、骨格筋からはインスリン受容体が抽出できるが（表１の「タンパク量（ｍｇ／ｍｌ）」の欄参照）、内臓脂肪組織についてはタンパク質濃度が０ｍｇ／ｍｌとなり、抽出できなかった。
【００７２】
表１の「タンパク量」の欄に示す結果からわかるように、肝臓、骨格筋については、すべての実験において実施例の方が比較例よりも得られたインスリン受容体の濃度が明らかに高いことがわかる。加えて、実施例の方が比較例よりも得られるインスリン受容体のボリュームも多かった（比較例では２００μｌ弱に対し、実施例では１ｍｌ弱）。
このことから、実施例の膜タンパク質可溶化剤のほうが比較例の膜タンパク質可溶化剤よりも膜タンパク質の抽出能力に優れていることがわかる。
【００７３】
（ステップ３）
次に、得られたサンプル中に含まれるインスリン受容体のうちリン酸化されたインスリン受容体の割合を検討した。
冷凍保存したサンプルを抽出後２ヶ月目に解凍し、リン酸化インスリン受容体とインスリン受容体の定量を行った。リン酸化インスリン受容体の定量は、ＥＬＩＳＡキット１（ＰｈｏｓｐｈｏＤｅｔｅｃｔＴＭ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｐＴｙｒ１１６２／１１６３））を用いて行った。また、インスリン受容体の定量は、ＥＬＩＳＡキット２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＢＡ０３８）を用いて行った。なお、ＥＬＩＳＡキット１は、チロシン残基１１６２、１１６３がリン酸化されたインスリン受容体のみと反応し、ＥＬＩＳＡキット２は、これらのチロシン残基がリン酸化されたかどうかにかかわらず反応する。
【００７４】
まず、得られたサンプルのそれぞれについて上記２種類のＥＬＩＳＡキットを用いてＥＬＩＳＡを行い、実施例、比較例の膜タンパク質可溶化剤によって得られた全インスリン受容体に対するリン酸化されたインスリン受容体の割合を算出した。
【００７５】
その結果、得られたインスリン受容体の中で活性があるインスリン受容体の割合を、表１の「Ｐ−ＩＲ／ＩＲ（Ｕｎｉｔ／ｎｇ）」の値で示す。
比較例よりも実施例の方が得られたサンプルのＰ−ＩＲ／ＩＲ値が全体的に高かったことから、比較例の膜タンパク質可溶化剤よりも実施例の膜タンパク質可溶化剤を用いてインスリン受容体の抽出を行ったほうが、活性を高く保持できることがわかる。
【００７６】
なお、実験前には、マウスＡ、ＢのサンプルのＰ−ＩＲ／ＩＲ値は、マウスＣより倍以上高いと予想したが、実際は大きな差が見られなかった。すなわち、肝臓サンプルでは差がほとんど無く、骨格筋サンプルではマウスＢ／マウスＣ＝１．６８（ＰＭＢ３０）、マウスＢ／マウスＣ＝１．５３（ＰＭＢ５０）と、１．５倍程度と低いものになった。これは、グルコース注射後１０分、２５分後では、各組織内のインスリン受容体の活性がまだピークに達していないと考えられる。このため、マウスＡ〜Ｃの結果は、いずれもインスリン受容体のベースレベル（すなわち、空腹状態でどの程度インスリン受容体が活性化しているか）を示す可能性が高いと考えられる。
【００７７】
（ステップ４）
次に、別の評価方法でインスリン受容体の活性残存性を調べた。
まず、ステップ２で得られたインスリン受容体を含んだ膜タンパク質溶液に９６ウェルプレートを一晩浸してコーティングした。Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  （Ｓ−Ｔｙｐｅ）を用意し、キットのインスリン抗体固相化９６ウェルプレートに替えて、上で一晩コーティングしたプレートを使用した。
インスリン受容体と試薬との反応、吸光度の測定は、シバヤギ社のプロトコールに従った。概要としては、まずプレートにインスリンを加え、次に酵素標識インスリン二次抗体、酵素基質（発色試薬）を順次反応させた。そして、反応後の溶液の４５０ｎｍの吸光度を測定することで、インスリン受容体とインスリンとの結合力を評価した。
【００７８】
この測定結果を表１に示す（「吸光度（インスリン結合力）」の欄参照）。
この表からわかるように、実施例と比較例のいずれも骨格筋よりも肝臓の方が吸光度が高く、骨格筋ではほぼブランクウェルの吸光度と同じであった。
この結果から、実施例、比較例ともに、インスリンとの結合力が温存されていることがわかった。
【００７９】
以上の結果から、本発明の膜タンパク質可溶化剤（実施例）の方が従来の膜タンパク質可溶化剤（比較例）よりも膜タンパク質の可溶化能が優れるとともに、可溶化後の膜タンパク質の活性を高い状態で維持していることがわかった。
これは、本発明の膜タンパク質可溶化剤が、生体膜と類似した構造を備えたホスホリルコリン類似基を含んでいるため、膜タンパク質の可溶化の際に膜タンパク質可溶化剤が膜タンパク質の安定化に貢献し、膜タンパク質の構造変化をほとんど引き起こすことなく可溶化できたためと考えられる。
【表１】
2007314526.tif 000008
【００８０】
また、得られたサンプルのうちマウスＡの肝臓（実施例３、比較例３）とマウスＢの骨格筋（実施例７、比較例７）については、抽出直後の活性（Ｐ−ＩＲ／ＩＲ）を測定し、抽出直後の活性と２ヶ月保存後の活性を比較することで、実施例と比較例とで保存安定性の違いを調べた。
【００８１】
この結果を表２に示す。この表に示すように、比較例３と比較例７のいずれも抽出直後から２ヶ月後では活性が低下していたが（比較例３では抽出直後の値１．２３９→２ヵ月後０．４４１、比較例７では抽出直後１．５０４→２ヵ月後０．４８２）、実施例３、７では一部（実施例３−１）に活性の低下が見られたものの、他のサンプルについては活性がほとんど低下していない。
【００８２】
特に、実施例７−１では抽出直後４．５６２→２ヶ月後４．６６７、実施例７−２では抽出直後２．５６０→２ヶ月後２．４２９と、いずれの実施例でも活性はほとんど変化していない。このことから、特に実施例７の膜タンパク質可溶化剤は、保存において膜タンパク質を安定化させていることがわかる。
以上の結果から、本発明の膜タンパク質可溶化剤は、膜タンパク質の抽出のみならず、その後の保存安定性にも貢献することがわかった。
【表２】
2007314526.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】ウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図２】インスリン受容体の構造の模式図である。
【図１】
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【図２】
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