(57)【要約】【課題】中枢神経損傷患者に嗅神経鞘細胞または該細胞を含む粘膜組織を嗅神経部位に移植することにより中枢神経を再生治療するに際して、その再生治療効果を増強させる薬剤を提供する。【解決手段】中枢神経損傷患者に嗅神経鞘細胞または該細胞を含む粘膜組織を移植して中枢神経を再建する再生治療における効果増強剤であって、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を有効成分とすることを特徴とする効果増強剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経損傷患者に嗅神経鞘細胞または該細胞を含む粘膜組織を移植して中枢神経を再建する再生治療における効果増強剤であって、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を有効成分とすることを特徴とする効果増強剤。
【請求項２】
中枢神経損傷が、脊髄損傷、外傷性脳損傷、脳血管障害に基づく脳損傷、または脳手術後の脳損傷である請求項１に記載の効果増強剤。
【請求項３】
中枢神経損傷が脊髄損傷であることを特徴とする請求項２に記載の効果増強剤。
【請求項４】
注射剤の剤形である請求項１〜３のいずれかに記載の効果増強剤。
【請求項５】
点滴静注するための請求項４に記載の効果増強剤。
【請求項６】
嗅神経鞘細胞を含む粘膜組織が嗅粘膜である請求項１〜５のいずれかに記載の効果増強剤。
【請求項７】
嗅粘膜が自家嗅粘膜である請求項１〜６のいずれかに記載の効果増強剤。
【請求項８】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が塩酸ファスジル水和物であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の効果増強剤。
【請求項９】
中枢神経損傷患者に嗅神経鞘細胞または該細胞を含む粘膜組織を移植して中枢神経を再建する再生治療に際し、前記患者にＲｈｏキナーゼ阻害剤を投与することを特徴とする中枢神経再生治療の効果増強法。
【請求項１０】
中枢神経損傷患者に嗅神経鞘細胞または該細胞を含む粘膜組織を移植して中枢神経を再建する再生治療における効果増強剤を製造するためのＲｈｏキナーゼ阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中枢神経損傷の再生治療のための効果増強剤およびそれに用いる再生治療法に関し、さらに詳しくは中枢神経損傷患者に嗅神経鞘細胞もしくは該細胞を含む粘膜組織を移植して中枢神経を再建する再生治療における効果増強剤、および該効果増強剤を用いる中枢神経再生治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経は脳および脊髄からなる。中枢神経損傷は、中枢神経が損傷することにより起きる疾患であり、具体的には、例えば脊髄損傷、脳挫傷などの外傷性脳損傷、脳出血あるいは脳梗塞などの脳血管障害に基づく脳損傷、脳手術後の脳損傷などが挙げられる。
【０００３】
脊髄損傷は、交通事故や高所転落に伴う脊椎脱臼骨折などの外傷により、脊髄実質が損傷されることによって、損傷部以下の末梢の運動・感覚・自律神経系の麻痺を呈する病態のことである。現在、脊髄損傷の患者は、日本では約１０万人、米国では約２５万人に及ぶとされており、年間日本では５千人、米国では１万人以上の患者が増加している。近年医療の進歩に伴い受傷後も生存することは十分可能になっているが、それだけに日常生活の不便さや精神的な負担が患者を苦しめる結果ともなり、社会的な問題となっているのが現状である。
【０００４】
長年にわたって、成体哺乳動物の中枢神経系（脳と脊髄）は一度損傷を受けると再生しないと考えられてきた。中枢神経系が再生し難いのに対し、末梢神経系が容易に再生することは古くから知られており、その違いは、中枢神経系ではオリゴデンドロサイト、ミエリンまたは細胞外基質に軸索伸長抑制因子が存在するのに対して、末梢神経系ではそのような因子が存在しないからであると説明されている。つまり、末梢神経系の軸索環境が新しく伸びてくる軸索に対して全体として許容的（permissive）であるのに対して、中枢神経系では拒絶的（non-permissive）すなわち、軸索の新生が阻害される環境にある。もし、この説明が正しければ、哺乳動物の中枢神経系の再生を促すには拒絶的な環境を許容的に変えることが必要になる。その試みの一つとして、嗅神経鞘細胞の移植が挙げられる（非特許文献１参照）。
【０００５】
嗅神経細胞は、哺乳動物の成体細胞の中で生涯を通じて継続的に再生を続ける特異的な細胞である。Luらは、ラット鼻の嗅粘膜由来の嗅神経鞘細胞を、完全切断したラットの脊髄に移植したところ、運動機能が著しく回復し、脊髄反射の下行性抑制が著しく修復され、それに伴って切断部位を越えて軸索が成長したとの知見を得、ヒトの中枢神経である脊髄損傷の再生治療にも応用できる可能性が示された（非特許文献２参照）。
【０００６】
嗅粘膜は成人においても採取可能であるため、自家移植できるという点でその期待は急速に高まり、臨床治験が行われている。例えば、ポルトガルでは、カルロス・リマらが脊髄損傷患者に嗅粘膜を自家移植して治療効果があったと報告している（非特許文献３参照）。また自家移植ではないが、中国では、黄らが中心となって、２００２年より脊髄損傷患者に対するヒト胎児由来嗅神経鞘細胞移植の臨床治験が行われ、一部患者では改善が得られたと報告している（非特許文献４参照）。
【０００７】
このように、嗅神経鞘細胞や嗅粘膜を損傷部位に移植することにより、中枢神経損傷の一つである脊髄損傷を治療する方法は、一定の成果を上げてはいるが、依然としてその効果は限定的であり、さらなる機能回復を獲得するためには、該治療方法を改良することが必要である。
【０００８】
損傷を受けた脊髄内の軸索が再生しない別な原因の一つは、損傷部位のグリア瘢痕に蓄積するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン類（ＣＳＰＧ）や、ミエリン膜上のＮｏｇｏタンパクなどが軸索伸長の阻害活性を有することであると考えられている。したがって、これら阻害物質の作用を抑制すれば脊髄の軸索再生を促進できる可能性がある。
【０００９】
ＣＳＰＧや、ミエリン膜上のＮｏｇｏタンパクなどの阻害物質の作用を抑制する因子となり得る有望なターゲットの一つとして、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒｈｏからのシグナルの大部分を媒介する情報伝達分子であるＲｈｏキナーゼを阻害する物質が考えられている（非特許文献５参照）。
【００１０】
そうした背景があり、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を脊髄の軸索再生に適用する試みが、様々検討されてきた。例えば、Ｄｅｒｇｈａｍらは、マウス胸髄背側部の損傷時にＲｈｏキナーゼ阻害剤であるＹ２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）シクロヘキサンカルボキサミド）を損傷部位に適用すると、皮質脊髄路の軸索の再生を促進すること、および該阻害剤がＢＢＢスコアを指標とした運動機能の回復も促進することを示した（非特許文献６参照）。
【００１１】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤としては、これまでに様々な物質が知られており、このような化合物としては、例えば、ＲＯＫα（ＲＯＣＫ−ＩＩ）、ｐ１６０ＲＯＣＫ（ＲＯＫβ、ＲＯＣＫ−Ｉ）およびその他のセリン／スレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質を阻害する化合物が挙げられる。その具体例としては、ヘキサヒドロ−１−（５−イソキノリンスルホニル）−１Ｈ−１，４−ジアゼピン（特許文献１および２参照）、（Ｒ）−トランス−Ｎ−（ピリジン−４−イル）−４−（１−アミノエチル）シクロヘキサンカルボキサミド、（Ｒ）−（＋）−Ｎ−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−（１−アミノエチル）ベンズアミド等のＲｈｏキナーゼ阻害剤（特許文献２または３参照）、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン、１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン等のＲｈｏキナーゼ阻害剤（特許文献４または非特許文献７参照）、（１−ベンジルピロリジン−３−イル）−（１Ｈ−インダゾール−５−イル）アミン等のＲｈｏキナーゼ阻害剤（特許文献５参照）、（１−ベンジルピペリジン−４−イル）−（１Ｈ−インダゾール−５−イル）アミン等のＲｈｏキナーゼ阻害剤（特許文献６参照）、Ｎ−［２−（４−フルオロフェニル）−６，７−ジメトキシ−４−キナゾリニル］−Ｎ−（１Ｈ−インダゾール−５−イル）アミン等のＲｈｏキナーゼ阻害剤（特許文献７参照）、Ｎ−４−（１Ｈ−インダゾール−５−イル）−６，７−ジメトキシ−Ｎ−２−ピリジン−４−イル−キナゾリン−２，４−ジアミン等のＲｈｏキナーゼ阻害剤（特許文献８参照）、および４−メチル−５−（２−メチル−［１，４］ジアゼパン−１−スルホニル）イソキノリン等のＲｈｏキナーゼ阻害剤（特許文献９参照）などが知られている。
【００１２】
しかしながら、脊髄損傷などの中枢神経損傷に対する中枢神経再生治療に際して、嗅神経鞘細胞または該細胞を含む粘膜組織の移植とＲｈｏキナーゼ阻害剤の投与を組み合わせて行うことを特徴とする中枢神経の再建に関しての報告は、未だかつてない。
【特許文献１】特開昭６１−２２７５８１号公報
【特許文献２】特開平１１−３４９４８２号公報
【特許文献３】国際公開第９８／０６４３３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第００／０９１６２号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９７／２３２２２号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０１／５６９８８号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０２／１００８３３号パンフレット
【特許文献８】国際公開第０２／０７６９７６号パンフレット
【特許文献９】国際公開第０２／０７６９７７号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第９９／６４０１１号パンフレット
【非特許文献１】川口、実験医学、第２０巻、第５号（増刊）、７９６−８０３頁、２００２年
【非特許文献２】Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，１２５，１４−２１（２００２）
【非特許文献３】Ｌａｕｒａｎｃｅ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，”ＯＬＦＡＣＴＯＲＹ−ＴＩＳＳＵＥ  ＴＲＡＮＳＰＬＡＮＴＡＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＳＣＩ：  ＰＯＲＴＵＧＡＬ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＴＲＩＡＬＳ”，［ｏｎｌｉｎｅ］，２００３年，［平成１８年２月１５日検索］，インターネット＜ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｅａｌｉｎｇｔｈｅｒａｐｉｅｓ．ｉｎｆｏ／ＯｌｆａｃｔｏｒｙＴｉｓｓｕｅ２．ｈｔｍ＞
【非特許文献４】岩波ら、ＰＴジャーナル、第３９巻、第６号、５３９−５４６頁、２００５年
【非特許文献５】香月、日本薬理学雑誌、第１２０巻、第４号、２６０頁、２００２年
【非特許文献６】Ｄｅｒｇｈａｍ  Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２，６５７０−６５７７（２００２）
【非特許文献７】Ｕｅｈａｔａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８９，９９０−９９４（１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、中枢神経損傷（例えば、脊髄損傷）の損傷部位に嗅神経鞘細胞または該細胞を含む粘膜組織を移植することにより中枢神経を再建する再生治療を行うに際して、その再生治療の効果を増強させる薬剤を提供するものである。また本発明の他の目的は、前記薬剤を用いて前記再生治療の効果を増強する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記課題を解決すべく種々検討を重ねた結果、中枢神経損傷（例えば、脊髄損傷）に対して嗅神経鞘細胞または該細胞を含む粘膜組織を損傷部位に移植して中枢神経を再建する再生治療を行うに際し、当該患者にＲｈｏキナーゼ阻害剤を投与することにより、その再生治療効果を顕著に増強させ得ることを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、
［１］中枢神経損傷患者に嗅神経鞘細胞または該細胞を含む粘膜組織を移植して中枢神経を再建する再生治療における効果増強剤であって、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を有効成分とすることを特徴とする効果増強剤、
［２］中枢神経損傷が、脊髄損傷、外傷性脳損傷、脳血管障害に基づく脳損傷、または脳手術後の脳損傷である上記［１］に記載の効果増強剤、
［３］中枢神経損傷が脊髄損傷であることを特徴とする上記［２］に記載の効果増強剤、
［４］注射剤の剤形である上記［１］〜［３］のいずれかに記載の効果増強剤、
［５］点滴静注するための上記［４］に記載の効果増強剤、
［６］嗅神経鞘細胞を含む粘膜組織が嗅粘膜である上記［１］〜［５］のいずれかに記載の効果増強剤、
［７］嗅粘膜が自家嗅粘膜である上記［１］〜［６］のいずれかに記載の効果増強剤、
［８］Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が塩酸ファスジル水和物であることを特徴とする上記［１］〜［７］のいずれかに記載の効果増強剤、
［９］中枢神経損傷患者に嗅神経鞘細胞または該細胞を含む粘膜組織を移植して中枢神経を再建する再生治療に際し、前記患者にＲｈｏキナーゼ阻害剤を投与することを特徴とする中枢神経再生治療の効果増強法、および
［１０］中枢神経損傷患者に嗅神経鞘細胞または該細胞を含む粘膜組織を移植して中枢神経を再建する再生治療における効果増強剤を製造するためのＲｈｏキナーゼ阻害剤の使用
に関する。
【発明の効果】
【００１６】
中枢神経損傷（例えば、脊髄損傷）患者に嗅神経鞘細胞または該細胞を含む粘膜組織を移植して中枢神経を再建する再生治療に際し、当該患者にＲｈｏキナーゼ阻害剤を投与することによって、再生治療の効果を顕著に増強することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の効果増強剤は、中枢神経損傷患者に嗅神経鞘細胞または該細胞を含む粘膜組織を移植して脊髄を再建する再生治療における効果増強剤であって、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を有効成分とすることを特徴とする。
【００１８】
本発明でいう「中枢神経損傷」とは、脳および脊髄からなる中枢神経に損傷を受けることによる疾患をいい、例えば、脊髄損傷、外傷性脳損傷、脳血管障害（例えば、脳出血、脳梗塞など）に基づく脳損傷、脳手術後の脳損傷などが挙げられる。
【００１９】
本発明でいう「嗅神経鞘細胞」とは、嗅神経細胞の軸索の周りを取り囲む細胞である。ヒトにおける嗅神経鞘細胞の位置を図１に示す。
【００２０】
本発明でいう「該細胞を含む粘膜組織」とは、具体的には「嗅粘膜」が好適に挙げられる。
【００２１】
本発明でいう「嗅粘膜」は、主嗅覚器として鼻腔内の鼻中隔上部と左右の上部鼻甲介上部に囲まれた部位にあり、例えばヒトにおいては左右各々約２ｃｍ２程度の面積を持つものである。嗅粘膜は、嗅上皮および嗅粘膜固有層から構成され、嗅神経鞘細胞は、主に嗅粘膜固有層に存在する。
【００２２】
本発明に係る再生治療を実施するに際して、まず、「嗅神経鞘細胞または該細胞を含む粘膜組織」を調製する。
嗅神経鞘細胞を含む粘膜組織の調製は、哺乳動物の鼻に存在する「嗅粘膜」を含む粘膜組織を摘出することで行われ、好ましくは嗅粘膜、さらに好ましくは嗅粘膜固有層を摘出することで行われる。ヒトにおける該摘出箇所は、図２に示す部位が好ましいが、嗅粘膜が主体となっておれば、呼吸粘膜（嗅神経鞘細胞を含まない）が混在していてもよい。摘出された嗅粘膜は、必要に応じて細断するなどして脊髄損傷部位に移植しやすい形態にすることができる。
【００２３】
また、嗅粘膜由来の嗅神経鞘細胞を培養し、単離して用いることもでき、そのための培養・単離方法は、自体公知の方法で行うことができる。例えば、摘出した嗅神経鞘細胞を含む粘膜組織を、１０％ウシ胎仔血清を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で３〜４日間培養し、その後ＤＭＥＭ無血清培地で２〜３週間培養し、後者の培地を週２回投入して培養してからトリプシン−ＥＤＴＡを用いることによって、嗅神経鞘細胞を単離してもよい。さらに、この単離した嗅神経鞘細胞を適当な培地（例えば、ＤＭＥＭ、血清添加ＤＭＥＭなど）に懸濁して使用することもできる。
【００２４】
嗅神経鞘細胞および該細胞を含む粘膜組織のソースとしては、ヒト成体（自家移植または他家移植）、ヒト胎児（同種移植）、ヒト死体（同種移植）およびブタなど他の哺乳動物（異種移植）などが挙げられるが、ドナーの問題、移植後に起こり得る免疫拒絶反応の問題、倫理の問題などを考慮すると、移植を受けるヒト成体（自家移植）が好ましい。
【００２５】
嗅神経鞘細胞および該細胞を含む粘膜組織の移植は中枢神経損傷部位で行われる。移植は、様々な方法で行うことができるが、中枢神経損傷が脊髄損傷である場合、例えば次のようにして行うことができる。
患者を全身麻酔下で、正中切開を行い、適切なレベルで筋肉を骨膜下に剥離する。硬膜開口中、筋肉、骨、硬膜外腔を慎重に扱う。病変部全体にわたる範囲で椎弓切除を行う。外科的処置による脊髄変形を避けるため、かつ嗅神経鞘細胞移植後に構造的な再生が可能になるように、椎弓の全体を切除する。培養した嗅神経鞘細胞の懸濁液を、脊髄の病変部における頭側部と尾側部に隣接した部位に注入するか、嗅神経鞘細胞を含む粘膜組織を切除部位の空隙に充填することによって移植する。
【００２６】
また、中枢神経損傷が脳損傷である場合、例えば次のようにして行われる。
患者に対して全身麻酔下、開頭術を施行し、患部を開いて嗅粘膜鞘細胞または該細胞を含む粘膜組織（例えば、嗅粘膜）を移植する。脳梗塞などでは患部周辺に定位的に嗅粘膜鞘細胞を注入してもよい。また、脳梗塞急性期などでは経血管的に嗅粘膜鞘細胞を患部に投与してもよい。さらに、脳損傷慢性期においては、すでに形成されたグリア瘢痕組織を除去した後に移植を行ってもよく、または患部周辺に嗅粘膜鞘細胞を注入してもよい。
【００２７】
また移植時期としては、患者の状態などに応じて、中枢神経損傷後直ちに行ってもよいし、または１〜数週間後に行ってもよい。さらに慢性期移植では、損傷後数ヶ月から数年経過している場合も対象になり、場合によってはリハビリテーション等で回復が望めなくなった患者に対して行ってもよい。
【００２８】
本発明では、上記移植治療の効果を増強するために、下記するＲｈｏキナーゼ阻害剤を用いる。
【００２９】
本発明でいう「Ｒｈｏキナーゼ阻害剤」は、Ｒｈｏキナーゼの活性を阻害する物質である。Ｒｈｏキナーゼは、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）の分解酵素であるＧＴＰアーゼの範疇に含まれる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（低分子量Ｇタンパク質）の１種である。Ｒｈｏキナーゼは、アミノ酸末端にセリン／スレオニンキナーゼ領域、中央部にコイルドコイル領域およびカルボキシ末端にＲｈｏ相互作用領域を有する（Ａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，２６１，４４−５１（２０００））。
【００３０】
本発明の有効成分であるＲｈｏキナーゼ阻害剤としては、前記特許文献１〜９に記載の化合物が挙げられ、具体的には、例えばヘキサヒドロ−１−（５−イソキノリンスルホニル）−１Ｈ−１，４−ジアゼピン、（Ｒ）−トランス−Ｎ−（ピリジン−４−イル）−４−（１−アミノエチル）シクロヘキサンカルボキサミド、（Ｒ）−（＋）−Ｎ−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４−（１−アミノエチル）ベンズアミド、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン、１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン、（１−ベンジルピロリジン−３−イル）−（１Ｈ−インダゾール−５−イル）アミン、（１−ベンジルピペリジン−４−イル）−（１Ｈ−インダゾール−５−イル）アミン、Ｎ−[２−（４−フルオロフェニル）−６，７−ジメトキシ−４−キナゾリニル]−Ｎ−（１Ｈ−インダゾール−５−イル）アミン、Ｎ−4−（１Ｈ−インダゾール−５−イル）−６，７−ジメトキシ−Ｎ−2−ピリジン−４−イル−キナゾリン−２，４−ジアミン、および４−メチル−５−（２−メチル−[１，４]ジアゼパン−１−スルホニル）イソキノリンなど、または上記各化合物の薬学的に許容される塩が挙げられる。本発明においては、上記各化合物またはその薬学的に許容される塩は、含水物、水和物及び溶媒和物も包含される。
【００３１】
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の薬学的に許容される塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
【００３２】
本発明においては、上記各化合物のうち、ヘキサヒドロ−１−（５−イソキノリンスルホニル）−１Ｈ−１，４−ジアゼピンまたはその薬学的に許容できる塩が好ましく、ヘキサヒドロ−１−（５−イソキノリンスルホニル）−１Ｈ−１，４−ジアゼピン塩酸塩（塩酸ファスジル）がさらに好ましく、塩酸ファスジル１／２水和物が特に好ましい。
【００３３】
本発明の効果増強剤は、種々の製剤形態、例えば液剤、固形剤、半固形剤などをとり得るが、一般的にはＲｈｏキナーゼ阻害剤のみ、またはそれと薬学的に許容される担体と共に注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（例えば、多孔性スポンジ、デポ剤など）、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などの製剤として、経口または非経口に適した剤形とされる。
【００３４】
上記担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、ｐＨ調整剤等として配合される。また必要に応じて、保存剤、抗酸化剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることもできる。上記賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。上記滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。上記結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の高分子化合物等が挙げられる。上記崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等が挙げられる。上記溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール（エタノールなど）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、マクロゴール、ゴマ油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール脂肪酸エステル等が挙げられる。上記溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。上記懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース等が挙げられる。上記等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。上記緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、グルタミン酸塩、イプシロンアミノカプロン酸塩、トリス緩衝液等の緩衝液等が挙げられる。無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコール等が挙げられる。上記ｐＨ調整剤の好適な例としては、例えば塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等が挙げられる。上記保存剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。上記抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸等が挙げられる。上記甘味料の好適な例としては、例えばアスパルテーム、サッカリンナトリウム、ステビア等が挙げられる。
【００３５】
上記注射剤は、水性注射剤または油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水など）に、薬学上許容される添加剤、例えば上記した等張化剤、緩衝剤、保存剤、増粘剤、安定化剤、ｐＨ調整剤などを適宜添加した溶液に、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を溶解することにより調製することができる。溶解後、その溶液をフィルターなどで濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填してもよく、また適当な上記溶解補助剤などを使用してもよい。また、油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油、トウモロコシ油または大豆油などが用いられる。適当な上記溶解補助剤などを使用してもよい。調製された注射剤は、通常、適当なアンプルまたはバイアルなどに充填される。
【００３６】
噴霧剤も製剤上の常套手段によって調製することができる。噴霧剤として製造する場合、その添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添加剤であればいずれのものであってもよく、例えば、噴霧剤の他、上記した溶剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤などが用いられる。噴霧剤としては、液化ガス噴霧剤または圧縮ガスなどが用いられる。液化ガス噴霧剤としては、例えば、フッ化炭化水素（ＨＣＦＣ２２、ＨＣＦＣ−１２３、ＨＣＦＣ−１３４ａ、ＨＣＦＣ１４２などの代替フロン類など）、液化石油、ジメチルエーテルなどが挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば、可溶性ガス（炭酸ガス、亜酸化窒素ガスなど）または不溶性ガス（窒素ガスなど）などが挙げられる。
【００３７】
また、本発明の効果増強剤は、生体分解性高分子を用いて、徐放性製剤（例えば、多孔性スポンジ、デポ剤など）とすることもできる。該徐放性製剤は公知の方法に従って製造することができる。前記徐放性製剤に使用される生体内分解性高分子は、公知の生体内分解性高分子のなかから適宜選択できるが、例えばデンプン、デキストランまたはキトサンなどの多糖類、コラーゲンまたはゼラチンなどのタンパク質、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリロイシン、ポリアラニンまたはポリメチオニンなどのポリアミノ酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸重合体または共重合体、ポリカプロラクトン、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物またはフマル酸・ポリエチレングリコール・ビニルピロリドン共重合体などのポリエステル、ポリオルソエステルまたはポリメチル−α−シアノアクリル酸などのポリアルキルシアノアクリル酸、ポリエチレンカーボネートまたはポリプロピレンカーボネートなどのポリカーボネートなどが挙げられる。
【００３８】
投与方法としては、全身的または局所的に、経口または非経口で投与できる。例えば、注射剤を用いる場合は、静脈内投与、腹腔内投与、または嗅神経鞘細胞もしくは該細胞を含む粘膜組織（例えば、嗅粘膜）を移植した部位もしくはその近傍に直接注射（徐放性ポンプによる持続投与など）して投与することができ、好ましくは静脈内投与、さらに好ましくは点滴静注である。また、徐放性製剤として多孔性スポンジまたは埋め込み式ポンプを用いる場合には、移植した嗅神経鞘細胞もしくは該細胞を含む粘膜組織（例えば、嗅粘膜）に接するか、あるいはそれに近い部位に埋め込む方法が挙げられる。
【００３９】
有効成分の投与量は、剤形、疾患（中枢神経損傷）の程度または年齢などに応じて適宜選択されるが、通常、1日当たり約１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは約１０ｍｇ〜５００ｍｇである。１日の投与回数は１〜数回とすることができる。
【００４０】
本発明の効果増強剤は、さらに肝実質細胞増殖因子（以下、ＨＧＦと略記する）タンパク質と併用してもよい。
【００４１】
上記ＨＧＦタンパク質としては、例えば特開平３−７２８３３号公報の第１図に記載されているアミノ酸配列、または該アミノ酸配列の１６１〜１６５番目の５個のアミノ酸残基が欠失している５アミノ酸欠損型ＨＧＦタンパク質などが挙げられる。これらアミノ酸配列を有するタンパク質は、ＨＧＦとしてのマイトーゲン活性、モートゲン活性などを有する。
【００４２】
ＨＧＦタンパク質を併用する場合、該ＨＧＦタンパク質は、注射剤や噴霧剤、あるいは生体分解性高分子と共に、徐放性製剤（例えば、多孔性スポンジ、デポ剤など）などとすることができる。
【００４３】
徐放性製剤を用いる場合には、例えば、移植した嗅神経鞘細胞もしくは該細胞を含む粘膜組織（例えば、嗅粘膜）に接するか、あるいはそれに近い部位に埋め込む方法が挙げられる。注射剤または噴霧剤を用いる場合は、移植した嗅神経鞘細胞または該細胞を含む粘膜組織（例えば、嗅粘膜）に直接注射（徐放性ポンプによる持続投与など）するか、噴霧する方法が挙げられる。また注射剤を用いる場合は、髄腔内（intrathecal）投与してもよい。
【００４４】
以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４５】
［試験方法］
（嗅粘膜および呼吸粘膜の摘出および調製）
８週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）雌ラットをネンブタール５００μｇ／１００ｇの腹腔内投与により麻酔し、ラット鼻腔を頭部方向に縦割し鼻中隔を露出した。嗅神経鞘細胞を含む嗅粘膜は鼻中隔上の尾側上部に存在し黄色調である。これの吻側に存在する嗅神経鞘細胞を含まない呼吸粘膜は灰白色調で、嗅粘膜よりやや薄い色調である。嗅粘膜および呼吸粘膜をそれぞれ摘出し、１ｍｍ四方に細切した。
【００４６】
（脊髄損傷動物の調製）
他の同種ラットをネンブタール１００μｇ／１００ｇの腹腔内投与により麻酔し、保温器を用いて直腸温度を３７±０．５℃に維持した。該ラットに対して第８−９胸椎レベルにて椎弓切除を行い、脊髄を露出した。露出した脊髄を幅２ｍｍ摘出し、腹側の硬膜まで確認し、幅２ｍｍの完全離断とした。図３にラットの脊髄を幅２ｍｍで完全離断した部位の写真を示す。このようにして、２ｍｍ幅の脊髄摘出腔をもつラット脊髄離断モデルを調製した。
【００４７】
（嗅粘膜または呼吸粘膜の移植）
ラット脊髄離断モデル（１群５匹）の２ｍｍ幅の脊髄摘出腔に、上記細切した嗅粘膜または呼吸粘膜をその脊髄に作った２ｍｍ幅の空隙が埋まるまで充填した後、閉創した。図３に嗅粘膜を移植した部位の写真を示す。
【００４８】
（Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の投与）
Ｒｈｏキナーゼ阻害剤として、塩酸ファスジル水和物注射剤（商品名：エリル注Ｓ、旭化成ファーマ株式会社製）を用い、この注射剤を嗅粘膜を移植したラット脊髄離断モデルに１日１回、１０ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内投与した。１４日間継続して投与を行った。
【００４９】
（運動機能評価方法）
本発明に無関係な独立した２人が、ＢＢＢスコア（Ｂａｓｓｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ（１９９５）１２、１−２１頁）を用いて、後肢運動機能評価を術後８週まで毎週行った。
【００５０】
［試験結果］
結果を図４および図５に示す。図４は嗅粘膜移植の対照群（ＯＭ）と呼吸粘膜移植の対照群（ＲＭ）とを比較したものであり、図５は嗅粘膜移植の対照群（ＯＭ）と嗅粘膜移植Ｒｈｏキナーゼ阻害剤投与群（ＯＭ＋ｆａｓｕｄｉｌ）とを比較したものである。
図４の結果より、ラット脊髄離断モデルにおいて、嗅粘膜移植の対照群は呼吸粘膜移植の対照群に比べて有意に後肢運動機能の改善されたことが判る。また図５から嗅粘膜移植に際してＲｈｏキナーゼ阻害剤を投与することで、運動機能がさらに改善されたことが判る。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
中枢神経損傷に対して、嗅神経鞘細胞または該組織を含む粘膜組織（例えば、嗅粘膜）を損傷部位に移植して中枢神経を再建する再生治療を行うに際して、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を投与することによって、再生治療の効果を増強することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、ヒトの嗅神経鞘細胞の位置を示す模式図を示す。
【図２】図２は、ヒトの鼻部分の断面と嗅粘膜の摘出箇所を示す模式図である。
【図３】図３は、ラットの脊髄を露出した写真（Ａ）、そのラット脊髄を２ｍｍ幅で完全離断した写真（Ｂ）、および前記完全離断した脊髄損傷部位にラットの嗅粘膜を移植した部位の写真（Ｃ）を示す。
【図４】図４は、実施例におけるラット脊髄離断モデルの運動機能評価について、嗅粘膜移植群（ＯＭ）と呼吸粘膜移植群（ＲＭ）とを比較した結果を示す。
【図５】図５は、実施例において嗅粘膜移植を行ったラット脊髄離断モデルの運動機能評価について、Ｒｈｏキナーゼ投与群とＲｈｏキナーゼ非投与群とを比較した結果を示す。
【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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