(57)【要約】【課題】異常プリオンタンパク質の発生原因を解明するために、タンパク質分解酵素に抵抗性を示す異常プリオンタンパク質を生成させる方法を提供すること。【解決手段】タンパク質を溶解ないし懸濁させた水溶液に外部から電気パルス刺激を与え、電気パルス刺激により生成される電気的又は物理的エネルギーにより当該タンパク質の構造変換を誘導することを特徴とするアミロイド様凝集体を水溶液中で生成させる方法であり、具体的には、電気パルスの刺激により生成される電気的又は物理的エネルギーが、電場形成によるイオン形成とイオン流動、水分子の電気分解によるマイクロバブルの発生とマイクロバブルの消滅時に発生する張力、局所的な高温、又は溶液中に生成されたフリーラジカルによるものである上記のアミロイド様凝集体を水溶液中で生成させる方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を溶解ないし懸濁させた水溶液に外部から電気パルス刺激を与え、電気パルス刺激により生成される電気的又は物理的エネルギーにより当該タンパク質の構造変換を誘導することを特徴とするアミロイド様凝集体を水溶液中で生成させる方法。
【請求項２】
電気パルスの刺激により生成される電気的又は物理的エネルギーが、電場形成によるイオン形成とイオン流動、水分子の電気分解によるマイクロバブルの発生とマイクロバブルの消滅時に発生する張力、局所的な高温、又は溶液中に生成されたフリーラジカルによるものである請求項１に記載のアミロイド様凝集体を水溶液中で生成させる方法。
【請求項３】
タンパク質の構造変換が、ジスルフィド結合の開裂により生ずるタンパク質の立体構造変換である請求項１又は２に記載のアミロイド様凝集体を溶液中で生成させる方法。
【請求項４】
タンパク質を溶解ないし懸濁させる水溶液がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）である請求項１〜３のいずれかに記載のアミロイド様凝集体を水溶液中で生成させる方法。
【請求項５】
電気パルスの条件が、タンパク質を溶解ないし懸濁させたＰＢＳ溶液中において、電圧１０Ｖ〜２５００Ｖの下、静電容量（１０〜３０００マイクロＦ）と抵抗値（１０〜５０００Ω）により規定されるパルス発生時間により定められることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のアミロイド様凝集体を水溶液中で生成させる方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法で生成されたアミロイド様凝集体をインキュベーションし、当該アミロイド様凝集体の成長を促し、更にこの電気パルス刺激−インキュベーションを繰り返すことによりアミロイド繊維を得る方法。
【請求項７】
タンパク質としてアミロイド性タンパク質であるプリオンタンパク質を用い、請求項１ないし５のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、タンパク質分解酵素に抵抗性を示すアミロイド性タンパク質である異常プリオンタンパク質の生成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正常タンパク質に電気パルス刺激を与え、タンパク質の構造変換を誘導することによるアミロイド様凝集体を生成させる方法に関し、より詳細には、アミロイド性タンパク質であるプリオンタンパク質からタンパク質分解酵素に抵抗性を示す異常プリオンタンパク質を生成させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
異常プリオンタンパク質の増殖による疾患として最初に発見されたのが、スクレイピー（Scrapie）というヒツジにみられる運動機能失調にかかわる疾患であり、脳にはスポンジ状の穴があくという特徴的な疾患である。その後、この異常プリオンタンパク質の増殖による疾患として、牛の狂牛病（牛海綿状脳症：ＢＳＥ：Bovine Spongiform Encephalopathy）、ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ：Creutzfeldt Jakob Disease）や、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ：Gerstmann-Staussler-Scheinker Syndrome）などが知られている。また、脳に対するそれに類する症候として、アルツハイマー症候群（Alzheimer's Syndrome）も知られている。
【０００３】
これらの疾患はウイルス感染によるものではなく、また既知の病原体は発見されておらず、特異的なタンパク質が共通に存在するところから、これが伝達〜感染を起こす病原物質と思われ、「タンパク質性感染粒子“プリオン”：small proteinaceous infectious particle：prion」が提唱され、上記した各種の特異的疾患は、プリオン病と称されるようになった。
【０００４】
これらプリオン病のなかでも、家族性プリオン病であるゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）では、プリオンタンパク質の変異（点突然変異：point mutation）で１００％発症することが判明している。すなわち、プリオンタンパク質のなかにあるアミノ酸が一つ変化（ロイシンへ変化）するだけで、ＧＳＳになることが確認されている。
【０００５】
ところで、プリオンタンパク質遺伝子は、第２０番染色体上に存在し、プリオンタンパク質は、２３５個のアミノ酸により構成されていることが判明している。感染因子プリオンの主な構成成分はこのプリオンタンパク質と考えられており、感染因子を構成するプリオンタンパク質をスクレイピー型または異常型プリオン（ＰｒＰＳＣ）と称し、正常型のプリオンタンパク質を正常プリオン（ＰｒＰＣ）と称している。
【０００６】
上記したゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）でみられたプリオンタンパク質の変異（点突然変異）による発症は、他の症状の発症においても観察されている。例えば、プリオンタンパク質のコドン１０２番におけるプロリン（Pro）からロイシン（Leu）への置換は小脳失調症を発症させ、コドン１０２／２１９（Lys）におけるプロリン（Pro）からロイシン（Leu）への置換は痴呆または小脳失調症を発症させ、コドン１０５／１２９（Val）におけるプロリン（Pro）からロイシン（Leu）への置換は痙性四肢麻痺を発症させている。また、頑固な不眠症を主徴徴とし、１年以内に死亡する致死性家族性不眠症（ＦＦＩ：Fatal Familial Insomnia）では、プリオンタンパク質コドン１７８番におけるアスパラギン酸（Asp）がアスパラギン（Asn）に置換されている。
【０００７】
このようなプリオンタンパク質の突然変異による疾患は、各種動物においても観察されており、動物種の違いによる異常プリオンによる感染が、異種の動物間でも観察されている。例えば、スクレイピーに感染したヒツジ材料の動物飼料への混入により牛の狂牛病（ＢＳＥ）が牛に感染し、そのＢＳＥに感染した牛材料を含む飼料を食した猫に、猫海綿状脳症（ＦＳＥ）が発症している。したがって、最近の研究では、特にＢＳＥがヒトへ感染する可能性が濃厚となっていると報告されている（非特許文献１）。
【０００８】
【非特許文献１】Collinge J. et al., Nature 第383号、685-690頁、1996年
【０００９】
異常プリオンタンパク質による感染の様式は、現在のところ詳細には判明していないが、プリオンはタンパク質でありながら高圧滅菌、乾燥滅菌によってもその感染性が死滅することはなく、またホルマリン、またはアルコール或いはフェノールによってもタンパク質の変性を受けない。したがって、異常プリオンタンパク質による感染を受けた場合には、かかる異常プリオンの増殖を極力抑制させることが、プリオン病の発症を抑えることとなる。
【００１０】
一般的に、感染性異常プリオンは、臓器移植等の外科的手術、輸血や血液製剤の投与、または汚染食物の経口摂取などにより感染するといわれている。プリオン病に感染した宿主では、脳組織を中心に異常プリオンがアミロイドとして沈着し、最終的には死に至る。プリオン病の有効な予防方法及び治療方法は、現状では存在せず、唯一の対策としては、医薬品や食品等へ感染性異常プリオンの混入を防止することである。
【００１１】
ところで、異常プリオンの発生の原因を解明するためには、異常プリオンタンパク質の立体構造を詳細に検討し、正常プリオンタンパク質との比較において、その発生原因を解明していくことも一つの手段である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明は、異常プリオンタンパク質の発生原因を解明するために、タンパク質分解酵素に抵抗性を示す異常プリオンタンパク質を生成させる方法を提供することを課題とする。
かかる課題を解決するために、本発明者等は鋭意検討し、プリオンタンパク質であるアミロイドタンパク質の立体構造に着目した。すなわち、プリオンなどのアミロイドタンパク質は、アミロイド化（アミロイド線維化）して難溶化することで狂牛病やアルツハイマー病の原因となることが知られている。このアミロイド化は、タンパク質の立体構造が変化することで生じており、アミロイド繊維は、タンパク質の二次構造の一つであるβシート構造が多数集まったものである。
【００１３】
本発明者等は種々検討した結果、このアミロイドタンパク質の構造変化を、水溶液中のタンパク質に外部から電気パルス刺激を与えることで誘導させることができることを新規に見出した。
すなわち、タンパク質は溶液中で安定な立体構造をとっているが、その安定構造が一旦乱されると（アンフォールド）、元の構造にもどるよりも（リフォールド）構造エネルギー的により安定な凝集塊を形成する（ミスフォールド）傾向があるが、この安定構造の乱れを、外部から電気パルス刺激を与えることで誘導し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって本発明は、その基本的態様として、以下の構成からなるものである。
（１）タンパク質を溶解ないし懸濁させた水溶液に外部から電気パルス刺激を与え、電気パルス刺激により生成される電気的又は物理的エネルギーにより当該タンパク質の構造変換を誘導することを特徴とするアミロイド様凝集体を水溶液中で生成させる方法。
【００１５】
より具体的には、本発明は、
（２）電気パルスの刺激により生成される電気的又は物理的エネルギーが、電場形成によるイオン形成とイオン流動、水分子の電気分解によるマイクロバブルの発生とマイクロバブルの消滅時に発生する張力、局所的な高温、又は溶液中に生成されたフリーラジカルによるものである上記のアミロイド様凝集体を水溶液中で生成させる方法である。
【００１６】
さらに本発明は、
（３）タンパク質の構造変換が、ジスルフィド結合の開裂により生ずるタンパク質の立体構造変換である上記（１）または（２）に記載のアミロイド様凝集体を溶液中で生成させる方法である。
【００１７】
また本発明は、より具体的には、
（４）タンパク質を溶解ないし懸濁させる水溶液がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）である上記（１）〜（３）のいずれかに記載のアミロイド様凝集体を水溶液中で生成させる方法である。
【００１８】
さらにまた本発明は、さらに具体的には、
（５）電気パルスの条件が、タンパク質を溶解ないし懸濁させたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中において、電圧１０Ｖ〜２５００Ｖの下、静電容量（１０〜３０００マイクロＦ）と抵抗値（１０〜５０００Ω）により規定されるパルス発生時間により定められることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載のアミロイド様凝集体を水溶液中で生成させる方法である。
【００１９】
また、本発明は別の態様として、
（６）上記した（１）〜（５）のいずれかに記載の方法で生成されたアミロイド様凝集体をインキュベーションし、当該アミロイド様凝集体の成長を促し、更にこの電気パルス刺激−インキュベーションを繰り返すことによりアミロイド繊維を得る方法である。
【００２０】
さらに別の態様としての本発明は、
（７）タンパク質としてアミロイド性タンパク質であるプリオンタンパク質を用い、上記した（１）ないし（５）のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、タンパク質分解酵素に抵抗性を示すアミロイド性タンパク質である異常プリオンタンパク質の生成方法である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、タンパク質分解酵素に抵抗性を示すアミロイド性タンパク質である異常プリオンタンパク質が簡便な方法により生成される。生成された異常プリオンタンパク質の立体構造を解明することが可能となり、狂牛病（ＢＳＥ）や、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）の新たな診断法の確立や、有効な治療方法の開発にもつながることが期待される。
【００２２】
また、異常プリオンタンパク質を用いて、それに極めて強く結びつく特殊なタンパク質、すなわち特異的な抗体（モノクローナル抗体）を開発することで、同様に、狂牛病（ＢＳＥ）や、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）の有効な治療方法を開発することができる。
【００２３】
さらに、本発明の原理によりＢＳＥの根本的な発生原因を説明することが可能となる。すなわち、牛の屠畜処理の際に、牛に対してスタンニング、或いは電殺を行っているが、この外部からの電気刺激により、脳内のプリオンタンパク質の構造変換が誘導され、異常プリオンタンパク質が生成されることになる。したがって、今後の屠畜処理に際しては、スタンニング、或いは電殺等の処理を回避し、別の手段による屠畜を行う指針が示されたものといえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、上記したように、タンパク質を溶解ないし懸濁させた水溶液に外部から電気パルス刺激を与え、電気パルス刺激により生成される電気的又は物理的エネルギーにより当該タンパク質の構造変換を誘導することを特徴とするアミロイド様凝集体を水溶液中で生成させる方法であり、具体的にはタンパク質としてアミロイド性タンパク質であるプリオンタンパク質を用いる、タンパク質分解酵素に抵抗性を示すアミロイド性タンパク質である異常プリオンタンパク質の生成方法である。
【００２５】
本発明の方法に実施に際して使用されるタンパク質を溶解ないし懸濁させる溶液としては、種々の溶液を挙げることができるが、好ましくは生理的な緩衝液、なかでもリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）を用いるのがよい。
【００２６】
その場合のタンパク質の溶液に対する使用量は特に限定されるものではなく、外部からの電気パルスの刺激が均等にいきわたる程度のものであればよく、好ましくは１０％程度の溶液または懸濁液（乳化溶液）とするのがよい。
【００２７】
本発明でタンパク質に与える電気パルス刺激は、例えば、電気パルスの条件が、タンパク質を溶解ないし懸濁させた、例えばＰＢＳ溶液中において、電圧１０Ｖ〜２５００Ｖの下、静電容量（１０〜３０００マイクロＦ）と抵抗値（１０〜５０００Ω）により規定されるパルス発生時間により定められるのがよい。
このような電気パルスは、種々の電気パルス発生装置を用いて行うことが可能であり、例えば、ＥＣＭ６００装置を用いて行うのも一つの例である。
【００２８】
本発明においては、かかる電気パルスの刺激により、電気的または物理的エネルギー生成され、かかるエネルギーが、（１）電場形成によるイオン形成とイオン流動、（２）水分子の電気分解によるマイクロバブルの発生とマイクロバブルの消滅時に発生する張力、（３）局所的な高温、又は（４）溶液中に生成されたフリーラジカルとなり、水溶液中のタンパク質の立体構造変換、すなわち、アミロイド様凝集体を水溶液中で生成させるものと考えられる。
【００２９】
本発明者等の検討によれば、かかるタンパク質の構造変換は、タンパク質の立体構造の変換であって、具体的には、タンパク質のジスルフィド結合の開裂、すなわちβへリックス構造の変換により、タンパク質の二次構造の一つであるβシート構造が多数集合したもの（アミロイド様凝集体）への変換であった。
【００３０】
本発明が提供する異常プリオンの生成方法は、かかる電気パルス刺激により生成したアミロイド様凝集体を、さらにインキュベーションし、アミロイド様凝集体の成長を促し、更にこの電気パルス刺激−インキュベーション操作を繰り返すことによりアミロイド繊維（βシート構造の多数の集まり）を得ることが効果的である。このインキュベーションは、通常の３７℃の条件下で行うのが好ましい。
【００３１】
かかる電気パルス刺激−インキュベーションを繰り返し行う回数は、特に限定されるものではないが、３ないし１５回程度、好ましくは５ないし１０回程度繰り返すのがよく、所望によっては、途中にインキュベーションの操作のみを加え、その後さらに電気パルス刺激−インキュベーションを繰り返し行うこともできる。
【００３２】
かくして生成された異常プリオンタンパク質は、タンパク質分解酵素に抵抗性を示すアミロイド性タンパク質である異常プリオンタンパク質であり、その立体構造を解明することが可能となり、狂牛病（ＢＳＥ）や、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）の新たな診断法の確立や、有効な抗体（モノクローナル抗体）の検索による抗体療法の開発につながるものである。
【実施例】
【００３３】
以下に本発明を、実施例に代わる試験例を説明することにより、詳細に説明する。
【００３４】
試験例１：異常プリオンタンパク質の生成（その１）
［方法］
ハムスター１０％正常脳乳剤（１％Triton X  ４ｍＭ、ＥＤＴＡ−ＰＢＳで抽出）２００μＬを２ｍｍギャップのキュベットに入れ、ＥＣＭ６００装置を用いて、それぞれ下記表１に示した条件での電撃パルスを与えた。
なお、対照としての試験４においては電撃パルスを与えなかった。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
所定の条件による電撃パルス後、３７℃で１時間攪拌しながらインキュベートした。
この操作を５回繰り返した後、１４時間インキュベーションのみを行い、さらにパルス−インキュベーションを５回繰り返した。
脳乳剤を回収後、proteinase K（ＰＫ）を終濃度５０μｇ／ｍＬになるよう加え、３７℃で１時間インキュベートした。１５％ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ウェスタンブロット法を行いて、アルカリフォスファターゼ標識３Ｆ４抗体を用いて、プリオン蛋白質を検出した。
【００３７】
［結果］
図１にその結果を示した。なお、図中、Ｍはマーカーを示し、１ないし４の数字は試験番号を示す。
図に示した結果からも判明するように、電撃パルスおよび３７℃でのインキュベーションを繰り返した後、ＰＫ抵抗性のプリオンタンパク質のシグナルが明瞭になった。これに対して、電撃パルスを与えなかったタンパク質では、異常プリオンタンパク質の生成は認められず、本発明方法が特異的な異常プリオンタンパク質の生成方法であることが理解される。
なお、アミロイド様プリオンタンパク質の生成は、レーン２（試験２）に示した電圧１５０Ｖ、静電容量３００マイクロ、と抵抗値７２Ωのパルスを与えた時、最も多く見られた。その増加量は５倍であった。
【００３８】
試験例２：異常プリオンタンパク質の生成（その２）
［方法］
ハムスター１０％正常脳乳剤（ＰＢＳで抽出）２００μＬを２ｍｍギャップのキュベットに入れ、ＥＣＭ６００装置を用いて、それぞれ下記表２に示した条件での電撃パルスを与えた。
なお、対照としての試験０（図におけるレーン０に対応）においては、電撃パルスを与えなかった。
【００３９】
【表２】
2007119400.tif 000004
【００４０】
所定の条件による電撃パルス後、３７℃で１時間攪拌しながらインキュベートした。この操作を５回繰り返した後、１４時間インキュベーションのみを行った。
脳乳剤を回収後、proteinase K（ＰＫ）を終濃度５０μｇ／ｍＬになるよう加え、３７℃で１時間インキュベートした。１５％ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ウェスタンブロット法を行いて、アルカリフォスファターゼ標識３Ｆ４抗体を用いて、プリオン蛋白質を検出した。
【００４１】
［結果］
図２にその結果を示した。なお、図中、Ｍはマーカーを示し、０ないし４のレーンの数字は、試験番号に対応する数字である。
図に示した結果からも判明するように、電撃パルスおよび３７℃でのインキュベーションを繰り返した後、ＰＫ抵抗性のプリオンタンパク質のシグナルが明瞭になった。アミロイド様プリオンタンパク質の生成は、レーン３（試験３）に示した電圧１５０Ｖ、静電容量３００μＦ、抵抗値７５Ωのパルスを与えた時、最も多く見られ、その増加量は２２．５倍であり、試験例１の１％Triton X、ＥＤＴＡ存在下での電撃パルスの５倍の増加量よりも明らかに高いものであった。
このことは、よりネイティブ（native）に近い条件下での電撃パルスの刺激が、異常プリオンタンパク質の生成量を多くしているものであるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
以上記載のように、本発明が提供する正常タンパク質に電気パルス刺激を与えることにより、タンパク質の構造変換を誘導することにより、アミロイド性タンパク質であるプリオンタンパク質からタンパク質分解酵素に抵抗性を示す異常プリオンタンパク質を生成させることができる。
生成された異常プリオンタンパク質を用いて、その立体構造を解明することが可能となり、狂牛病（ＢＳＥ）や、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）の新たな診断法の確立や、有効な治療方法の開発にもつながることが期待される。
【００４３】
また、本発明が提供する異常プリオンタンパク質の生成の原理により、ＢＳＥの根本的な発生原因を説明することが可能となった。すなわち、牛の屠畜処理の際に、牛に対してスタンニング、或いは電殺による外部からの電気刺激により、脳内のプリオンタンパク質の構造変換が誘導され、異常プリオンタンパク質が生成されることになる。したがって、今後の屠畜処理に際しては、スタンニング、或いは電殺等の処理を回避し、別の手段による屠畜を行うことが必要となる指針が示されたものであり、その産業上の利用可能性は多大なものといえる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の試験例１の結果を示す図である。
【図２】本発明の試験例２の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
2007119400.tif 000006