(57)【要約】      （修正有）【課題】非侵襲、非観血的に採取可能なサンプルにより、糖尿病や肥満治療効果の指標であるケトン体を測定し、判定を可能とすること。【解決手段】汗を採取しサンプルとし、その中の３−ヒドロキシ酪酸を測定することを特徴とする３−ヒドロキシ酪酸の測定方法。好ましくは皮膚表面に蓄積された汗をエタノール水溶液などの液体を用いて採取し、それに含まれる３−ヒドロキシ酪酸を測定する。３−ヒドロキシ酪酸の測定には高速液体クロマトグラフィーが好ましく用いられる。汗中３−ヒドロキシ酪酸値は血中３−ヒドロキシ酪酸値と相関することから、汗中３−ヒドロキシ酪酸値を測定することで、採血を伴わずに糖尿病の病態およびその発症リスク、または肥満治療の効果の指標の判定に用いることができる。本発明は個人が簡便に実施することができる糖尿病の病態およびその発症リスクまたは肥満治療、ダイエットの効果判定キットをも提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
汗を採取しサンプルとし、その中の３−ヒドロキシ酪酸を測定することを特徴とする糖尿病の病態およびその発症リスク、脂肪燃焼度の判定方法。
【請求項２】
汗が皮膚表面から汗採取液を用いて採取されたものであることを特徴とする請求項１記載の糖尿病の病態およびその発症リスク、脂肪燃焼度の判定方法。
【請求項３】
汗採取液がアルコールを成分に含むことを特徴とする請求項２記載の糖尿病の病態およびその発症リスク、脂肪燃焼度の判定方法。
【請求項４】
アルコールがエタノールであることを特徴とする請求項３記載の糖尿病の病態およびその発症リスク、脂肪燃焼度の判定方法。
【請求項５】
汗が、洗浄後、よく乾燥した皮膚上に、所定の時間蓄積された汗であることを特徴とする請求項１から４のいずれか記載の糖尿病の病態およびその発症リスク、脂肪燃焼度の判定方法。
【請求項６】
皮膚が手指の皮膚であることを特徴とする請求項２から５のいずれか記載の糖尿病の病態およびその発症リスク、脂肪燃焼度の判定方法。
【請求項７】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて汗中のケトン体の測定を行うことを特徴とする請求項１から６のいずれか記載の糖尿病の病態およびその発症リスク、脂肪燃焼度の判定方法。
【請求項８】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に先立ち汗中のケトン体をフェナシル化誘導体とすることを特徴とする請求項７記載の糖尿病の病態およびその発症リスク、脂肪燃焼度の判定方法。
【請求項９】
皮膚表面から採取された汗中３−ヒドロキシ酪酸を測定対象とするケトン体測定キット。
【請求項１０】
皮膚表面より汗を採取するための汗採取液を含有することを特徴とする請求項９記載のケトン体測定キット。
【請求項１１】
汗採取液がアルコールを含む水溶液であることを特徴とする請求項１０記載のケトン体測定キット。
【請求項１２】
アルコールがエタノールであることを特徴とする請求項１１記載のケトン体測定キット。
【請求項１３】
汗含有液体を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析する方法を用いて測定することを特徴とする請求項９から１２のいずれか記載のケトン体測定キット。
【請求項１４】
汗含有液体中のケトン体をフェナシル化することを特徴とする請求項１３記載のケトン体測定キット。
【請求項１５】
請求項１から８のいずれか記載の３−ヒドロキシ酪酸の測定方法により得られた結果を用いた糖尿病またはその発症リスクの判定方法。
【請求項１６】
請求項１から８のいずれか記載の３−ヒドロキシ酪酸の測定方法により得られた結果を用いた脂肪燃焼度の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−ヒドロキシ酪酸の測定方法および測定キットに関する。本発明はまた、上記測定方法により得られた結果を用いた糖尿病またはその発症リスクの判定方法、脂肪燃焼度の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
主として脂肪酸の肝臓酸化代謝物として生じるケトン体とは、３−ヒドロキシ酪酸、アセト酢酸、アセトンの総称であり、エネルギー源として糖質が利用されない状況においてその存在量が増加するものである。そのため、ケトン体は糖尿病患者の体内インスリン作用の不足程度やケトン体濃度上昇により血液が酸性となるケトアシドーシスを反映する指標として、また肥満治療、ダイエットにおける脂肪の燃焼をモニターする指標として用いられる。
【０００３】
３−ヒドロキシ酪酸、アセト酢酸、アセトンの血中存在比率はそれぞれ７８、２０，２％とされており、アセトンはその低い濃度および高い揮発性のためめったに測定されない（特許文献１）。３−ヒドロキシ酪酸はその高い存在比率からケトン体の診断において信頼性の高い指標であり、病態ではケトン体全体の増加に加えて、アセト酢酸に対する比率がさらに６〜１２倍に増大することが知られているため、ケトン体の検出には最も適した指標である（特許文献２）。
【０００４】
一方、上記の糖尿病の病態管理、ダイエットの効果モニターの目的に利用する場合には、個人が家庭で測定できることがより望ましい。そのためには、非侵襲的なサンプル採取が必要となり、尿が測定対象としてよく用いられている。しかしながら尿からの個人で実施可能な測定法は、アセト酢酸を対象とするものであり、その測定原理であるニトロプルシド反応は十分な病態管理には感度が不十分である。さらにはケトアシドーシスから快復する際にはアセト酢酸はかえって増加することが知られており、診断を難しくするおそれがあった。
【特許文献１】特開２０００−９３１９８号公報
【特許文献２】特開平１１−３１８４３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上の従来技術の問題点に鑑み、ケトン体測定のための試料サンプリングは、非侵襲かつ非観血に行えるなど被験者の生理的負荷が少ないことが望ましい。また、日常的にサンプリングが行え、手軽に在宅で可能なサンプリング法が望ましい。
そこで、本発明は上記状況に鑑みて、被験者への負荷を軽減し、かつ簡便で手軽に採取することができる汗を用いた体液中ケトン体の測定方法およびケトン体測定キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、鋭意検討の結果、本発明者らは汗中に３−ヒドロキシ酪酸が含まれることを見出した。そこで、汗を採取し、その中のケトン体濃度を測定したところ、得られた測定値は血中ケトン体値と相関しており、汗中のケトン体値が健康疾病マーカーとして簡易的に採取、測定可能であることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は
（１）汗を採取しサンプルとし、その中の３−ヒドロキシ酪酸を測定することを特徴とする糖尿病の病態およびその発症リスク、脂肪燃焼度の判定方法。
（２）汗が皮膚表面から汗採取液を用いて採取されたものであることを特徴とする上記（１）記載の糖尿病の病態およびその発症リスク、脂肪燃焼度の判定方法。
（３）汗採取液がアルコールを成分に含むことを特徴とする上記（２）記載の糖尿病の病態およびその発症リスク、脂肪燃焼度の判定方法。
（４）アルコールがエタノールであることを特徴とする上記（３）記載の糖尿病の病態およびその発症リスク、脂肪燃焼度の判定方法。
（５）汗が、洗浄後、よく乾燥した皮膚上に、所定の時間蓄積された汗であることを特徴とする上記（１）から（４）のいずれか記載の糖尿病の病態およびその発症リスク、脂肪燃焼度の判定方法。
（６）皮膚が手指の皮膚であることを特徴とする上記（２）から（５）のいずれか記載の糖尿病の病態およびその発症リスク、脂肪燃焼度の判定方法。
（７）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて汗中のケトン体の測定を行うことを特徴とする上記（１）から（６）のいずれか記載の糖尿病の病態およびその発症リスク、脂肪燃焼度の判定方法。
（８）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に先立ち汗中のケトン体をフェナシル化誘導体とすることを特徴とする上記（７）記載の糖尿病の病態およびその発症リスク、脂肪燃焼度の判定方法。
（９）皮膚表面から採取された汗中３−ヒドロキシ酪酸を測定対象とするケトン体測定キット。
（１０）膚表面より汗を採取するための汗採取液を含有することを特徴とする上記（９）記載のケトン体測定キット。
（１１）汗採取液がアルコールを含む水溶液であることを特徴とする上記（１０）記載のケトン体測定キット。
（１２）アルコールがエタノールであることを特徴とする上記（１１）記載のケトン体測定キット。
（１３）汗含有液体を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析する方法を用いて測定することを特徴とする上記（９）から（１２）のいずれか記載のケトン体測定キット。
（１４）汗含有液体中のケトン体をフェナシル化することを特徴とする上記（１３）記載のケトン体測定キット。
（１５）上記（１）から（８）のいずれか記載の３−ヒドロキシ酪酸の測定方法により得られた結果を用いた糖尿病またはその発症リスクの判定方法。
（１６）上記（１）から（８）のいずれか記載の３−ヒドロキシ酪酸の測定方法により得られた結果を用いた脂肪燃焼度の判定方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、非侵襲かつ非観血に被験者の生理的負荷の少ない体液中からの３−ヒドロキシ酪酸の測定が可能となる。これにより、日常的にサンプリングが行え、手軽に在宅で可能なケトン体測定用のサンプル採取が可能となる。
【０００９】
このように簡便で手軽に汗中に存在する３−ヒドロキシ酪酸を測定することにより、糖尿病やその発症リスク、肥満治療やダイエット効果に関する健康疾病マーカーを日常的に測定管理し、重篤な疾患の予防を図ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明では生体由来の体液などから得られるケトン体（３−ヒドロキシ酪酸、アセト酢酸、アセトン）中、存在比率が最も大きく、病態をより反映する３−ヒドロキシ酪酸を測定することにより体液中に存在するケトン体レベルを判定する。
【００１１】
血液や尿中のケトン体値は糖質にかわり脂肪酸がエネルギーとして利用される際に体内に生じることから、糖質を効率的に利用できない糖尿病、肥満治療やダイエット時の脂肪燃焼度の指標として知られている。また高い状態が続くと血液中のｐＨが酸性となるケトアシドーシスを引き起こすことから、糖尿病の病態や肥満治療、ダイエットにおいては適切な範囲での管理が必要となる。
【００１２】
従来、３−ヒドロキシ酪酸の測定は病院などにおいて採血針により侵襲的に血液を採取し測定するほか手段がなく、気軽に実施可能な尿からの試験紙による検出はアセト酢酸しか検出できないため、測定の機会は限られていた。本発明では皮膚表面より採取した汗中に３−ヒドロキシ酪酸が存在し、それらを測定した結果が血中３−ヒドロキシ酪酸値と相関することから、新たな体液中ケトン体値の判定方法となりうることを開示する。
【００１３】
汗の採取は、汗中に存在する３−ヒドロキシ酪酸が採取でき、測定できるのであれば、どのような方法を使っても差し支えない。皮膚に布、紙、ガーゼを押し当てることや、運動時、入浴時などには汗の液滴を採取することによっても回収可能である。好適には、液体、好ましくは水溶液、特にアルコール類や界面活性剤を含む水溶液を皮膚に接触させた後、その液体を回収することにより採取可能である。アルコールとしてはメタノール、エタノール、イソプロパノ−ルなどが使用可能である。好ましくは０．１〜７０％エタノール水溶液、さらに好ましくは１％エタノール水溶液である。
【００１４】
またこれら水溶液の皮膚への接触方法としてはいかなる方法でも実施可能であるが、好ましくは霧状に水溶液を塗布することのできる小型噴霧器（松下電工製ＩＮＨＡＬＥＲなど）により皮膚に水溶液を噴霧し、その液を治具を用いて回収することで皮膚からの汗の採取が可能となる。または適当な容器に入った水溶液を皮膚に押し当てることでも汗の採取は可能であるため、上記治具としては容器であってもよいし、スポイト、管など、吸引もしくは毛細管現象を利用して回収できる治具であってもよい。
【００１５】
採取する皮膚の部位については、体のどこの部位から採取してもよい。汗の採取は、顔、首、背中、腹、腕、手の甲、てのひら、手指、もも、足の裏などさまざまな部位から可能であることが確認されているが、採取の容易さを考慮すると手指、腕からの採取が好ましいと考えられる。
【００１６】
また採取時間については、どのような時間であっても検出に十分な３−ヒドロキシ酪酸量が得られれば問題はないが、５分以上であることが好ましく、１５分以上であることがより好ましい。
【００１７】
具体的な採取方法としては、皮膚表面を十分に洗浄したのち、清浄に拭き取るなどして乾燥させ、その後所定時間染み出しにより供給される汗を皮膚表面に蓄積させる方法が好ましい。それを前述の回収法により回収したときに得られる汗３−ヒドロキシ酪酸量を適当な分析法により測定する。
【００１８】
なお、皮膚表面には汗からの成分の他、皮膚細胞からの成分、皮膚組織からの成分、浸出液からの成分の混入がありうるが、混入しても特に問題はない。
【００１９】
また、３−ヒドロキシ酪酸の分析方法としては、いかなる方法でも利用可能である。３−ヒドロキシ酪酸の測定法としてはガスクロマトグラフィーによるもの、高速液体クロマトグラフィーによるもの、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用いる酵素法、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用いる酵素サイクリング法（特開平０４−１５８７７９号公報）などが報告されている。好ましくは、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法であり、その場合、必要に応じて汗サンプルを臭化フェナシル、トリエチルアミンと反応させるなどして、フェナシル基で誘導体化（フェナシル誘導体化）することが望ましい。
【００２０】
また汗をサンプルとした３−ヒドロキシ酪酸の測定用キットには、汗中の３−ヒドロキシ酪酸の測定に必要などのようなものでも含むことができる。好ましくは、上記で述べた汗の採取に必要となる液体および治具を含むことが望ましい。上記液体、治具、その他測定方法については前述と同様である。
【００２１】
測定にあたっては、簡易な方法で可能であればキットに測定のための試薬、測定装置を含むことができるが、高速液体クロマトグラフィーでの測定を採用する場合には、その場で測定することは不可能であり、その場合、キットに含まれる採取用の液体、治具で採取されたサンプルを郵送などで専門機関に送付し、そこで測定された結果を被験者に返還する仕組みなどが考えられる。
【００２２】
本発明によれば、３−ヒドロキシ酪酸はエネルギー源として糖質が利用されない状況においてその存在量が増加するので、これを被検物質とすることにより、脂肪燃焼の度合いを判定することでき、体重管理をしようとする際の運動量の指針とすることができる。また３−ヒドロキシ酪酸を含むケトン体は糖尿病患者の体内インスリン作用の不足程度やケトン体濃度上昇により血液が酸性となるケトアシドーシスを反映する指標として用いられてもいるのでこれを測定とすることにより糖尿病もしくはその発症リスクも判定（糖尿病の病態の判定も含む）することができる。
【００２３】
本発明の方法は、非侵襲的、かつ容易に被験者の皮膚表面に存在する成分中に含まれる３−ヒドロキシ酪酸を測定することにより、痛みを伴うことなく上記用途に供することができる。すなわち、定期的、もしくは随時、被験者の皮膚表面に存在する３−ヒドロキシ酪酸を測定することにより、手軽に３−ヒドロキシ酪酸の多寡が把握でき、糖尿病の疑い、発症リスクあるいは糖尿病の病態を認識することができ、早期受診、生活の改善等に利用することができる。特に皮膚表面の測定個所、採集時間等、採集条件を一定として、定期的もしくは随時に測定し、もしくはある行動（運動、食事等）の前後に測定して、その値を比較することにより、皮膚表面に３−ヒドロキシ酪酸の増え方、減り方の傾向が容易に把握することができる。
【００２４】
以下に、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
実施例１
被験者（２０代女性）より指先皮膚より汗を採取し、その３−ヒドロキシ酪酸濃度を測定した。
【００２６】
右人差し指の第２関節より先の部分（表面積５０平方センチメートル）を水道水、蒸留水でよく洗浄後、乾燥し、１５分間安静にした後、小型噴霧器（松下電工製ＩＮＨＡＬＥＲ）を用いて１％エタノール水溶液を10秒間噴霧し、第２関節より先の部分に付着したその液を可能な限り全量となるようチューブに回収した。回収量は約４００μLであった。そこに１２mg/mL臭化フェナシルアセトン溶液を１０μL、１０mg/mLトリエチルアミンアセトン溶液を１０μL、アセトン１０μLを加え、５０℃で２時間反応させた。室温に冷却後、減圧乾固させた後、３０％エタノール水溶液４０μLに溶解した。
【００２７】
上記で調製したサンプルを以下の条件でＨＰＬＣ分析を行った。
カラム：  ODS(QUICK SORB)  SIZE 4.6×150(W)
溶離液：  アセトニトリル／水＝３０／７０
流速  ：  ０．３ｍＬ／分
検出  ：  ２４４ｎｍＵＶ吸収
【００２８】
標準サンプルとして、０．４mmol/Lの３−ヒドロキシ酪酸アセトン溶液４０μLを同様に測定した。これに基づき、上記汗中に含まれる３−ヒドロキシ酪酸の含有量を求め、後述する方法により求めた汗量から汗中の３−ヒドロキシ酪酸の濃度を求めた。その結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
2007127423.tif 000002
【００３０】
その結果、クロマトグラム上、約１８分に標準３−ヒドロキシ酪酸と保持時間の一致するピークが確認された。別途左人差し指に装着した発汗計により求めた15分間の発汗量は23.9μLであったので、右人差し指において15分間安静にしたときの指先での汗量も同じであると仮定して計算した結果、汗中３−ヒドロキシ酪酸濃度は４３．６μmol/Lであることがわかった。
【００３１】
実施例２
被験者（６０代男性）より経時的に汗、血液を採取して含まれる３−ヒドロキシ酪酸濃度を測定した。汗中濃度は実施例１と同様の方法で、血中濃度はケトメーター（KM-4520、（株）三和化学研究所）で測定した。
【００３２】
実験は朝食をとらず絶食しておこなった。実験開始時にエルゴメーターを用いて２０分運動を行い、その２時間後に発汗量を計測しながら汗サンプルを採取し、次に血液を採取した。この操作をさらに２回繰り返し、血中と汗中の３−ヒドロキシ酪酸を測定した。その結果を表２に、相関性の検討結果を図１に示した。すなわち、図１は血中と汗中３−ヒドロキシ酪酸濃度の相関を示すグラフである。
【００３３】
【表２】
2007127423.tif 000003
【００３４】
３−ヒドロキシ酪酸について血中と汗中の濃度の相関性を検討したところ、血中、汗中ともに３−ヒドロキシ酪酸濃度は空腹時の運動負荷により上昇がみられた。また血中、汗中濃度の間にはゆるやかな相関関係がみられた。従って、汗中の３−ヒドロキシ酪酸を測定することで、糖尿病や肥満治療の指標となる体内ケトン体濃度の測定が可能であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明によれば、汗中の３−ヒドロキシ酪酸を測定することにより、糖尿病や肥満治療の効果指標である体内ケトン体濃度の測定が可能となるものであり、医療現場における診断用途などに有益に使用可能である。また非侵襲、非観血的に採取可能なサンプルにより測定可能であることから、生活習慣病の予防、ダイエット効果のモニターを目的とした家庭での個人で測定可能な健康管理測定キットとしても有用である。また、人間のみならず動物においても利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】実施例２における血中と汗中３−ヒドロキシ酪酸濃度の相関を示すグラフである。
【図１】
2007127423.tif 000004