(57)【要約】      （修正有）【課題】転写因子ＮＦκＢと相互作用する事から、ＨＩＶの感染とエイズの発症に関わることが可能なヒトのＮＡＦ１タンパク質の高精度な研究用ツールを提供する。【解決手段】ヒトＮＡＦ１タンパク質の、コイルドコイルドメイン等の特定配列部位に対するモノクローナル抗体を、細胞融合により製造し、ＮＡＦ１タンパク質に対する抗体結合部位を含む抗体フラグメント。更にこれらを用いて、ＮＡＦ１タンパク質の検出方法と検出キットを得る。【選択図】図４
2007246487.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＦ１タンパク質の配列番号２の部位に対するモノクローナル抗体、又はＮＡＦ１タンパク質に対する抗体結合部位を含む抗体フラグメント。
【請求項２】
請求項１に記載のＮＡＦ１タンパク質の配列番号２の部位に対する前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、又はそれらに由来する細胞株。
【請求項３】
請求項１に記載の前記モノクローナル抗体、又はＮＡＦ１タンパク質に対する抗体結合部位を含む前記抗体フラグメントを用いることを特徴とするＮＡＦ１タンパク質の検出方法。
【請求項４】
請求項１に記載の前記モノクローナル抗体、又はＮＡＦ１タンパク質に対する抗体結合部位を含む前記抗体フラグメントを含むことを特徴とするＮＡＦ１タンパク質検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗体に関するものであり、特に、ヒトＮＡＦ１特異的モノクローナル抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＨＩＶのエンベロープであるｇｐ１２０などに対するモノクローナル抗体がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の基礎研究のために、利用されてきた（特許文献１参照）。
【０００３】
しかし、ＨＩＶの病原性についての解析結果から、ＨＩＶのもつＮｅｆタンパク質の重要性が広く認識されるようになり、どのようにしてＮｅｆがエイズ発症を引き起こすのかについて現在大きな関心が寄せられている。
【０００４】
研究の結果、Ｎｅｆタンパク質が、細胞内でどのようなタンパク質に作用するか知られてきており、現在までに、例えば、ＮＡＦ１、Ｈｃｋ、Ｌｃｋ、クラスリンなどのタンパク質に作用することが知られている。この中でも、ＮＡＦ１タンパク質は、細胞の持つ転写因子ＮＦｋＢとの関連から、ＨＩＶの感染成立とエイズ発症にどのように関わるか非常に注目されている。
【特許文献１】特許第２７９２７３３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＮＡＦ１タンパク質を研究する際に、有効なツールが無いため、ＮＡＦ１の機能を研究する上で大きな障害となっている。
【０００６】
本発明は、上述したような課題に鑑みてなされたものである。その目的は、新規の有用なＮＡＦ１タンパク質の高精度な研究用ツールを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以上のような目的を達成するために、本発明は、以下のようなものを提供する。
【０００８】
（１）  ＮＡＦ１タンパク質の配列番号２の部位に対するモノクローナル抗体、又はＮＡＦ１タンパク質に対する抗体結合部位を含む抗体フラグメント。
【０００９】
（１）の発明において、ヒトＮＡＦ１タンパク質の配列番号２の部位に特異的に結合することができるモノクローナル抗体、又はＮＡＦ１タンパク質に対する抗体結合部位を含む抗体フラグメントを提供することができる。このモノクローナル抗体、または抗体フラグメントが、ＮＡＦ１タンパク質の特定部位と結合するため、ＮＡＦ１を研究する際の精度を上昇させることができる。このため、新規の有用なＮＡＦ１タンパク質の高精度研究用ツールを提供することができる。
【００１０】
（２）  （１）に記載のＮＡＦ１タンパク質の配列番号２の部位に対する前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、又はそれらに由来する細胞株。
【００１１】
（２）の発明において、ヒトＮＡＦ１タンパク質に特異的に結合することができるモノクローナル抗体、又はＮＡＦ１タンパク質に対する抗体結合部位を含む抗体フラグメントを産生するハイブリドーマ細胞株又はそれらに由来する細胞株を提供することができる。このため、これらのモノクローナル抗体、又は抗体フラグメントを安定的に提供することが可能となる。
【００１２】
（３）  （１）に記載の前記モノクローナル抗体、又はＮＡＦ１タンパク質に対する抗体結合部位を含む前記抗体フラグメントを用いることを特徴とするＮＡＦ１タンパク質の検出方法。
【００１３】
（３）の発明において、ヒトＮＡＦ１タンパク質に特異的に結合することができるモノクローナル抗体、又はＮＡＦ１タンパク質に対する抗体結合部位を含む抗体フラグメントを用いたＮＡＦ１タンパク質の検出方法を提供する。このため、ＮＡＦ１タンパク質が高精度で検出可能となり、新規の有用なＮＡＦ１タンパク質の高精度研究用ツールを提供することができる。
【００１４】
（４）  （１）に記載の前記モノクローナル抗体、又はＮＡＦ１タンパク質に対する抗体結合部位を含む前記抗体フラグメントを含むことを特徴とするＮＡＦ１タンパク質検出用キット。
【００１５】
（４）の発明において、ヒトＮＡＦ１タンパク質に特異的に結合することができるモノクローナル抗体、又はＮＡＦ１タンパク質に対する抗体結合部位を含む抗体フラグメントを用いたＮＡＦ１タンパク質検出用キットを提供する。このため、ＮＡＦ１タンパク質検出用キットによって、ＮＡＦ１タンパク質が高精度で検出可能となり、新規の有用なＮＡＦ１タンパク質の高精度研究用ツールを提供することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体は、ＮＡＦ１の特定部位と結合するため、ＮＡＦ１の研究時の精度を上昇させることができる。このため、新規の有用なＮＡＦ１の高精度研究用ツールを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
現在、ＮＡＦ１タンパク質は、細胞の持つ転写因子ＮＦｋＢとの関連から、ＨＩＶの感染成立とエイズ発症にどのように関わるか非常に注目されている。細胞性タンパク質のＮＡＦ１（Ｎｅｆ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１）は重要な細胞性タンパク質であり、様々なヒトの組織やＴ細胞において発現している。ＮＡＦ１タンパク質は、異なったスプライシングによって生産される、Ｃ末端が異なる２つのイソ型（ＮＡＦ１αとＮＡＦ１β）がある。ＮＡＦ１αやＮＡＦ１βは、約７２ｋＤａである。ヒトＮＡＦ１タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【００１８】
しかしながら、ＮＡＦ１タンパク質を研究する際に、有効なツールが無いことが、ＮＡＦ１の機能を研究する上で大きな障害となっている。例えば、ＮＡＦ１タンパク質に対するポリクローナル抗体を用いて、研究することも考えられるが、実験精度が低いため、ＮＡＦ１タンパク質の機能を研究することが困難である。
【００１９】
本出願人は、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、抗原として、組換バキュロウイルスによってＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞で発現させたＮＡＦ１Ｎ末タンパク質のニッケルアガロースビーズによる精製物を大量に用いて、Ｂａｌｂ／ｃ  Ｍｉｃｅを免疫することによって、ヒトＮＡＦ１に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を得た。得られたモノクローナル抗体のうちの１つが免疫沈降法や、ＥＬＩＳＡや、ウエスタンブロット法、免疫染色法のいずれにも用いることが出来ることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００２０】
本発明のモノクローナル抗体又はその可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントとしては、ＮＡＦ１タンパク質と反応する抗ＮＡＦ１モノクローナル抗体や該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントであればどのようなものでもよいが、免疫沈降法やウエスタンブロット法のみならず組織免疫染色法にも用いることができるモノクローナル抗体や、これらモノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントが好ましい。また、これら抗体フラグメントとしては、モノクローナル抗体をペプシンで消化して得られるＦ（ａｂ′）２、Ｆ（ａｂ′）２を還元して得られるＦａｂ′、モノクローナル抗体をパパインで消化して得られるＦａｂなどを例示することができる。これらのＮＡＦ１タンパク質に特異的に結合することができるモノクローナル抗体、およびＮＡＦ１タンパク質に対する抗体結合部位を含む抗体フラグメントは、例えば、コイルドコイルドメインなどの、ＮＡＦ１タンパク質の特定部位と結合するため、ＮＡＦ１タンパク質を研究する際の精度を上昇させることができる。このため、新規の有用なＮＡＦ１タンパク質の高精度研究用ツールを提供することができる。
【００２１】
モノクローナル抗体とは、単クローン抗体ともいう。動物を抗原で免疫して得られる抗血清は、一つの抗原分子上に存在する複数の抗原決定基に対する抗体（ポリクローナル抗体）を含んでいる。このため、抗体のイソタイプも多様である。しかし、１個のＢ細胞は、一つの特異性を示す１種の抗体しか産生しない。このため、１個の抗体産生細胞を無限に増やすことができれば、構造が同一の抗体分子を大量に調製することができる。この単一性のことを単クローン性といい、この抗体をモノクローナル抗体という。
【００２２】
ＮＡＦ１タンパク質に対するモノクローナル抗体は、医学、生物学の広い分野で適用が可能であり、例えば、細胞に微量に存在し、ＨＩＶ感染に重要な機能を果たしているＮＡＦ１タンパク質の同定と精製、また、例えば、ＮＡＦ１タンパク質を定量する固層酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）などに、使用され得る。
【００２３】
上記モノクローナル抗体の製造方法としては、ハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法など任意の方法における慣用のプロトコールを用いて、動物（例えば、マウスやラットやヤギなど）に組換えＮＡＦ１タンパク質の精製物を大量に投与することにより産生させる方法を挙げることができる。これらの方法によって、例えば、ＮＡＦ１タンパク質を用いてマウスを免疫し、抗ＮＡＦ１モノクローナル抗体を得ることができる。例えば、ハイブリドーマ法による場合、ニッケルアガロースビーズを用いた精製物を抗原とせず、夾雑物を含むＮＡＦ１タンパク質をそのまま抗原として用いた場合には、抗ＮＡＦ１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることが困難である。
【００２４】
抗体フラグメントとは、例えば、非共有結合で結合したＨ鎖可変部（ＶＨ）とＬ鎖可変部（ＶＬ）からなるＦｖフラグメントなどの抗原結合フラグメントである。本発明のＮＡＦ１タンパク質に対する抗体フラグメントは、例えば、コイルドコイルドメインなどの、ＮＡＦ１タンパク質の特定部位と結合するため、ＮＡＦ１タンパク質を研究する際の精度を上昇させることができる。このため、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫染色法など、新規の有用なＮＡＦ１タンパク質の高精度研究用ツールを提供することができる。なお、本発明に係るＮＡＦ１タンパク質に対するモノクローナル抗体及び抗原フラグメントを利用する研究手法は、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫染色法に限定されず、ＮＡＦ１タンパク質と本発明にかかるモノクローナル抗体及び抗体フラグメントとの抗原抗体反応を利用するあらゆる研究手法に応用が可能である。
【００２５】
本発明のＮＡＦ１タンパク質の検出方法としては、上記本発明のモノクローナル抗体や、該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントを用いる方法であれば特に制限されるものではなく、これらモノクローナル抗体等を用いて、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法等の免疫学的測定方法を行うことにより、ＮＡＦ１タンパク質を特異的、かつ正確に検出・測定することができる。例えば、固相化された上記本発明のモノクローナル抗体及び／又はその可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントと、これらモノクローナル抗体又はその可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントとは認識部位を異にする、標識化された第２のモノクローナル抗体及びその可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントまたはいずれか一方を用いる方法（サンドイッチＥＬＩＳＡ）や、細胞において発現したＮＡＦ１タンパク質に特異的に結合可能な本発明のモノクローナル抗体と該モノクローナル抗体に対する標識化二次抗体（抗Ｉｇ抗体）とを用いる方法等を挙げることができる。上記固相化用の担体としては、シリコン、ナイロン、プラスチック、ガラスからなるビーズ、マイクロプレート、試験管、フィルター、メンブレン等を用いることができる。
【００２６】
本発明において組織免疫染色法とは、標識化抗体を用いる免疫反応により組織・細胞等を顕微鏡等で観察することができるように染色する方法をいい、以下、組織免疫染色法の一つである蛍光抗体法（免疫蛍光法）を例にとって説明する。蛍光抗体法は、蛍光標識した抗体を用いて、細胞におけるタンパク質の局在を蛍光顕微鏡下に検出する方法である。このような蛍光抗体法としては、パラホルムアルデヒド等で処理した細胞において発現したＮＡＦ１タンパク質に蛍光標識した抗ＮＡＦ１モノクローナル抗体を用いる直接蛍光抗体法や、パラホルムアルデヒド等で処理した細胞において発現したＮＡＦ１タンパク質に未標識の抗ＮＡＦ１モノクローナル抗体（一次抗体）を結合させた後に蛍光標識した二次抗体（抗Ｉｇ抗体）を結合させる間接蛍光抗体法を例示することができる。抗体の蛍光標識には、緑色系のＦＩＴＣ（フルオレセイン  イソチオシアネート）、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）、Ｃｙ３（シアニン−３）等の蛍光物質や、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることもできる。また、上記組織免疫染色法において、モノクローナル抗体に代えて、前記Ｆ（ａｂ′）２、Ｆａｂなどの該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含むＮＡＦ１タンパク質に結合する抗体フラグメントを使用することもできる。
【００２７】
また、本発明のＮＡＦ１タンパク質の検出方法において、抗ＮＡＦ１モノクローナル抗体や抗体フラグメントの標識物質としては、上記蛍光物質の他、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素を例示することができる。またこれら酵素に代えて、例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ等のラジオアイソトープを用いることもできる。
【００２８】
このように、本発明にかかるモノクローナル抗体、又はＮＡＦ１タンパク質に対する抗体結合部位を含む抗体フラグメントは、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法及び免疫染色法のいずれにも用いることができる。このため、新規の有用なＮＡＦ１タンパク質の高精度研究用ツールを提供することができる。
【００２９】
ハイブリドーマとは、融合雑種腫瘍細胞ともいい、種あるいは遺伝的性質の異なった２つ以上の細胞を人工的に融合されてできる雑種細胞である。ハイブリドーマは、特定の抗原（ＮＡＦ１タンパク質）と反応するマウスＢ細胞と、培養できるように樹立してあるマウス形質細胞種細胞とを融合することによって、特定の抗体を産生しつつかつ増殖し続ける細胞である。本発明のハイブリドーマは、抗原（ＮＡＦ１タンパク質）により免疫されたマウスなどのリンパ球と、ＨＧＰＲＴ（ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）欠損骨髄種細胞とをポリエチレングリコールなどの融合剤を用いることによって融合するなどして、得ることができる。
【００３０】
本発明のＮＡＦ１タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株又はそれらに由来する細胞株としては、抗ＮＡＦ１モノクローナル抗体を産生することができる細胞株であれば特に制限されるものではない。本発明にかかる抗ＮＡＦ１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞株は、精製した組換えＮＡＦ１タンパク質を大量に投与した動物（例えば、マウスやラットやヤギなど）の脾臓細胞と当該動物の由来の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを、常法により細胞融合させ、ＨＡＴ培地で選択し、その中からＮＡＦ１タンパク質に対して特異的に免疫反応することができるものを標識化抗ＩｇＧ抗体等によってスクリーニングすることにより作出することができる。かかる抗ＮＡＦ１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞株又はそれらに由来する細胞株を、インビボ又はインビトロで常法により培養することにより抗ＮＡＦ１モノクローナル抗体を生産することができ、例えば、インビボ系においては、マウス又はラット等の齧歯目動物、好ましくはハイブリドーマと由来を同じくする齧歯目動物の腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより、抗ＮＡＦ１モノクローナル抗体を得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。
【００３１】
本発明のＮＡＦ１タンパク質に対する抗体を産生するハイブリドーマは、継代培養や、液体窒素で凍結保存して維持することが可能である。また、必要に応じて、培養液を集めることによって、ＮＡＦ１タンパク質に対するモノクローナル抗体を生成できる。また、一度、ＮＡＦ１タンパク質に対して特異性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが樹立されると、同一の抗体を用いて研究することが可能となる。このため、ＮＡＦ１タンパク質に対するモノクローナル抗体、又は抗体フラグメントを安定的に提供することが可能となる。また、本発明のＮＡＦ１タンパク質に対する抗体を産生するハイブリドーマは、特許生物寄託センターに寄託されたハイブリドーマ（受領番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６２７）であっても良い。
【００３２】
本発明のＮＡＦ１タンパク質検出用キットとしては、本発明のモノクローナル抗体や抗体フラグメントが含まれている検出用キットであれば特に制限されるものでなく、例えば、本発明のモノクローナル抗体及び／又は抗体フラグメントと、該モノクローナル抗体又は抗体フラグメントとは異なる部位でＮＡＦ１タンパク質と反応する少なくとも１種の第２の標識化モノクローナル抗体及び／又は抗体フラグメントとが含まれている検出・測定用キットや、本発明のモノクローナル抗体と該モノクローナル抗体に対する標識化二次抗体（抗Ｉｇ抗体）とが含まれている検出・測定用キットなどを挙げることができる。
【００３３】
［実施例１］  免疫原の入手
図１は、Ｓｆ９細胞に組換ＮＡＦ１バキュロウイルスを感染させた細胞の免疫蛍光染色法による写真である。
【００３４】
組換ＮＡＦ１バキュロウイルスは、Ｎ末端側のＮＡＦ１タンパク質の遺伝子配列の他、マーカーとしてｃ−Ｍｙｃタンパク質及びヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）をコードする遺伝子配列を有している。組換ＮＡＦ１バキュロウイルスを感染させたＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞を、メタノールによって固定した。さらに、このＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞は、一次免疫染色を、抗−ｃ−Ｍｙｃ−ＭＡｂ（モノクローナル抗体）（左側の写真）、又はＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ（リン酸緩衝液））（右側の写真）を用いて行い、続いて、二次免疫染色を、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（フルオレセイン  イソチオシアネート））標識抗体を二次抗体として用いて行った。
【００３５】
図１の左側の写真（ａｎｔｉ−ｍｙｃ）では、蛍光が確認され、ｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現が確認された。しかし、右側の写真（ｃｏｎｔｒｏｌ）では、蛍光が確認されなかった。ｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現によって、ＮＡＦ１遺伝子の導入が確認された。
【００３６】
図２は、発現したタンパク質を精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、銀染色を行った写真である。
【００３７】
ニッケルアガロースゲル樹脂（ＱＩＡＧＥＮ社製  商品名Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ）を使用して精製した、６個のヒスチジンタグ付の組換ＮＡＦ１（Ｎ末端）Ｍｙｃ融合タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後、銀染色法を行った。図２のレーン１〜５に示すように、タンパク質の発現が確認された。
【００３８】
［実施例２］  免疫方法
６週齢の３匹のＢａｌｂ／ｃ  Ｍｉｃｅに、精製したＮＡＦ１タンパク質１００μｇを、１００μＬのアジュバント（Ｗａｋｏ社製  商品名Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）とともに接種した（一次免疫）。さらに、精製ＮＡＦ１タンパク質１００μｇを１００μＬのアジュバント（Ｗａｋｏ社製  商品名Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）とともに２回接種した。１週間後、ウエスタンブロット法によって、これらのＢａｌｂ／ｃ  Ｍｉｃｅが、ＮＡＦ１に対する抗体を発現しているかを確認した。さらに１週間後、抗ＮＡＦ１抗体を発現しているＢａｌｂ／ｃ  Ｍｉｃｅに対し、精製したＮＡＦ１タンパク質１００μｇを用いて追加免疫を行った。
【００３９】
［実施例３］  製造方法
ＮＡＦ１に対する抗体値が高かったＢａｌｂ／ｃ  Ｍｉｃｅから脾臓を採取し、さらに脾臓細胞を調製し、細胞濃度を２×１０５細胞／ウェルにした。さらに、ミエローマ細胞の細胞濃度を調製し、５×１０４細胞／ウェルにした。５０μＭのポリエチレングリコール（Ｒｏｃｈｅ社製  商品名ＰＥＧ１５００）を用いて、細胞融合を行った。この融合によって得られたハイブリドーマ細胞を、２０％ＦＣＳを含むＨＡＴ培地で２週間培養した。
【００４０】
［実施例４］  抗体産生細胞の選択採取方法
ＮＡＦ１バキュウロウイルスを感染させたＳｆ９細胞をメタノールで固定し、採取した抗体（１次抗体）を１時間反応させた。次に、ＮＡＦ１タンパク質に結合した抗体に対するＦＩＴＣ標識抗マウス抗体（２次抗体）を１時間反応させた。抗ＮＡＦ１抗体に結合していない２次抗体を洗浄後、ＦＩＴＣの蛍光強度を計測した蛍光が検出されたウェルは抗ＮＡＦ１抗体を含むことを意味するため、カットオフ値以上のウェルから抗ＮＡＦ１抗体産生細胞を選択採取した。
【００４１】
［実施例５］  モノクローナル抗体の確認手段
図３は、抗ＮＡＦ１抗体を用いて、Ｓｆ９細胞に組換ＮＡＦ１バキュロウイルスを感染させた細胞の免疫蛍光染色法による写真である。組換ＮＡＦ１バキュロウイルスを感染させたＳｆ９細胞は、ＮＡＦ１タンパク質を発現している。ＮＡＦ１タンパク質を発現したＳｆ９細胞を、メタノールによって固定した。このＳｆ９細胞に、一次免疫染色を、抗ＮＡＦ１  ＭＡｂ（モノクローナル抗体）（左側の写真）、又はＰＢＳ（右側の写真）を用いて行い、続いて、二次免疫染色を、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（フルオレセイン  イソチオシアネート））標識抗体を二次抗体として用いて免疫染色を行った。
【００４２】
図３の右側の写真（ｃｏｎｔｒｏｌ）では、蛍光が確認されなかった。しかし、左側の写真（ａｎｔｉ  Ｎａｆ１）では、蛍光が確認され、本実施例に係る抗ＮＡＦ１  ＭＡｂがＮＡＦ１タンパク質に結合することが示された。
【００４３】
図４は、精製した組換ＮＡＦ１タンパク質のウエスタンブロットにおける抗ＮＡＦ１  ＭＡｂの反応性を示す写真である。レーン１が、精製ＮＡＦ１タンパク質、レーン２がコントロールタンパク質（ＢＳＡ）である。図４に示すように、抗ＮＡＦ１  ＭＡｂが、ＮＡＦ１タンパク質に特異的に結合していることが示された。
【００４４】
図５は、精製した組換ＮＡＦ１タンパク質のウエスタンブロットにおける抗ＮＡＦ１  ＭＡｂの反応性を示す写真である。レーン１は、ＮＡＦ１発現プラスミドが導入されていない２９３細胞である。レーン２は、ヒトの２９３細胞にＮＡＦ１発現ベクターを導入したものである。レーン３は、ヒトの２９３細胞にＮＡＦ１のＮ末端側を発現する発現ベクターを導入したものである。ＮＡＦ１のＮ末端側を使用して、マウスを免疫したため、本実験によってＮＡＦ１のＮ末端側に抗ＮＡＦ１  ＭＡｂが結合することが示された。
【００４５】
［実施例６］  モノクローナル抗体のエピトープの確認
図６は、ＮＡＦ１タンパク質の概略図である。ＮＡＦ１（Ｎ）は、免疫に使用されたＮＡＦ１タンパク質のＮ末配列（３８番目から１３５番目）を表している。ＮＡＦ１（Ｎ）−１は、ＮＡＦ１タンパク質の第３８アミノ酸残基から第８８アミノ酸残基である。ＮＡＦ１（Ｎ）−２は、ＮＡＦ１タンパク質の第６４アミノ酸残基から第１１３アミノ酸残基である。ＮＡＦ１（Ｎ）−３は、ＮＡＦ１タンパク質の第８８アミノ酸残基から第１３５アミノ酸残基である。
【００４６】
図７は、Ｍｙｃ配列付のＮＡＦ１（Ｎ）−１、ＮＡＦ１（Ｎ）−２、ＮＡＦ１（Ｎ）−３の遺伝子を大腸菌に導入し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後にＣＢＢ染色を行った写真である。
【００４７】
図８は、各タンパク質のウエスタンブロットにおける抗ＮＡＦ１  ＭＡｂの反応性を示す写真である。抗Ｍｙｃ抗体を使用したウエスタンブロットは、コントロールである。各タンパク質はＭｙｃ配列を持っており、タンパク質がうまく発現していることを示している。抗ＮＡＦ１  ＭＡｂを使用したウエスタンブロットは、ＮＡＦ１（Ｎ）−１とＮＡＦ１（Ｎ）−２で反応している。これにより、本実施例にかかる抗ＮＡＦ１  ＭＡｂは、ＮＡＦ１の第６４アミノ酸残基から第８８アミノ酸残基の間にエピトープが存在することが示された。
【００４８】
さらに、詳しくエピトープを定めるために実験を行った。図９は、ＮＡＦ１の第６４アミノ酸残基から第８８アミノ酸残基を表している。ＮＡＦ１（Ｎ）−Ａは、ＮＡＦ１タンパク質の第６４アミノ酸残基から第７７アミノ酸残基である。ＮＡＦ１（Ｎ）−Ｂは、ＮＡＦ１タンパク質の第６９アミノ酸残基から第８１アミノ酸残基である。ＮＡＦ１（Ｎ）−Ｃは、ＮＡＦ１タンパク質の第７７アミノ酸残基から第８８アミノ酸残基である。
【００４９】
図１０は、Ｍｙｃ配列付のＮＡＦ１（Ｎ）−Ａ、ＮＡＦ１（Ｎ）−Ｂ、ＮＡＦ１（Ｎ）−Ｃの遺伝子を大腸菌に導入し、タンパク質の発現を誘導し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後にＣＢＢ染色を行った写真である。
【００５０】
図１１は、各タンパク質のウエスタンブロットにおける抗ＮＡＦ１  ＭＡｂの反応性を示す写真である。抗Ｍｙｃ抗体を使用したウエスタンブロットは、コントロールである。各タンパク質はＭｙｃ配列を持っており、タンパク質がうまく発現していることを示している。抗ＮＡＦ１  ＭＡｂを使用したウエスタンブロットは、ＮＡＦ１（Ｎ）−Ｃで反応している。これにより、本実施例にかかる抗ＮＡＦ１  ＭＡｂは、ＮＡＦ１の第７７アミノ酸残基から第８８アミノ酸残基の間にエピトープが存在することが示された。このように、本発明に係るＮＡＦ１タンパク質に対するモノクローナル抗体、又はＮＡＦ１タンパク質に対する抗体結合部位を含む抗体フラグメントは、ＮＡＦ１タンパク質の配列番号２の部位に対する抗体結合部位を含む抗体フラグメントであっても良い。特に配列番号２の部位は、Ｍｏｕｓｅ  Ｎａｆ１には類似配列が無いため、Ｈｕｍａｎ  Ｎａｆ１特有の配列だと考えられる。このため、配列番号２の部位に対する抗体結合部位を含む抗体及び抗体フラグメントは、Ｍｏｕｓｅ  Ｎａｆ１に交差反応を示さない。このため、配列番号２の部位に対する抗体結合部位を含む抗体及び抗体フラグメントは、Ｈｕｍａｎ  ＮＡＦ１の特定部位と結合するため、ＮＡＦ１の研究時の精度を上昇させることができる。このため、新規の有用なＮＡＦ１の高精度研究用ツールを提供することができる。
【００５１】
［実施例７］
図１２は、抗ＮＡＦ１  ＭＡｂを用いて、ＮＡＦ１の細胞内の局在を調べる実験をした写真である。ＰＢＬ（末梢血リンパ細胞）とＭＴ−４細胞（ＨＴＬＶ−ＩトランスフォームＴ細胞株）を抗ＮＡＦ１  ＭＡｂとコントロールとしてＩｇＧを用いて免疫染色を行った。図１２に示すように、どちらの細胞においても、抗ＮＡＦ１  ＭＡｂを用いることによって、ＮＡＦ１の細胞局在を、研究することが可能である。このため、本実施例にかかる抗ＮＡＦ１  ＭＡｂは、ＮＡＦ１を研究する際の精度を上昇させることができる。新規の有用なＮＡＦ１の高精度研究用ツールを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】Ｓｆ９細胞に組換ＮＡＦ１バキュロウイルスを感染させた細胞の免疫蛍光染色法による写真である。
【図２】発現したタンパク質を精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、銀染色を行った写真である。
【図３】抗ＮＡＦ１抗体を用いて、Ｓｆ９細胞に組換ＮＡＦ１バキュロウイルスを感染させた細胞の免疫蛍光染色法による写真である。
【図４】精製した組換ＮＡＦ１タンパク質のウエスタンブロットにおける抗ＮＡＦ１  ＭＡｂの反応性を示す写真である。
【図５】ＮＡＦ１タンパク質発現ベクターをトランスフェクションした細胞のライセートを用いてウエスタンブロットを行い、抗ＮＡＦ１  ＭＡｂの反応性を確認した写真である。
【図６】ＮＡＦ１タンパク質Ｎ末端に存在する第１コイルドコイルドメイン（ＮＡＦ１（Ｎ））と、エピトープを決定するために作成したＮＡＦ１タンパク質断片（ＮＡＦ１（Ｎ）−１、ＮＡＦ１（Ｎ）−２、ＮＡＦ１（Ｎ）−３）の概略図である。
【図７】６個のヒスチジンタグ付のＮＡＦ１（Ｎ）−１、ＮＡＦ１（Ｎ）−２、ＮＡＦ１（Ｎ）−３発現プラスミドを大腸菌に導入し、ＩＰＴＧで発現を誘導したものとそうでないもののライセートに対してＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後にＣＢＢ染色を行った写真である。
【図８】ウエスタンブロットにおける抗ＮＡＦ１  ＭＡｂのＮＡＦ１（Ｎ）−１、ＮＡＦ１（Ｎ）−２、ＮＡＦ１（Ｎ）−３に対する反応性を示す写真である。
【図９】ＮＡＦ１の第６４アミノ酸残基から第８８アミノ酸残基と、エピトープを決定するために作成したＮＡＦ１タンパク質断片（ＮＡＦ１（Ｎ）−Ａ、ＮＡＦ１（Ｎ）−Ｂ、ＮＡＦ１（Ｎ）−Ｃ）の概略図である。
【図１０】６個のヒスチジンタグ付のＮＡＦ１（Ｎ）−Ａ、ＮＡＦ１（Ｎ）−Ｂ、ＮＡＦ１（Ｎ）−Ｃ発現プラスミドを大腸菌に導入し、ＩＰＴＧで発現を誘導したものとそうでないもののライセートに対してＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後にＣＢＢ染色を行った写真である。
【図１１】各エピトープのウエスタンブロットにおける抗ＮＡＦ１  ＭＡｂのＮＡＦ１（Ｎ）−Ａ、ＮＡＦ１（Ｎ）−Ｂ、ＮＡＦ１（Ｎ）−Ｃに対する反応性を示す写真である。
【図１２】抗ＮＡＦ１  ＭＡｂを用いて、ＮＡＦ１の細胞内の局在を調べる実験をした写真である。
【図６】
2007246487.tif 000003
【図９】
2007246487.tif 000004
【図１】
2007246487.tif 000005
【図２】
2007246487.tif 000006
【図３】
2007246487.tif 000007
【図４】
2007246487.tif 000008
【図５】
2007246487.tif 000009
【図７】
2007246487.tif 000010
【図８】
2007246487.tif 000011
【図１０】
2007246487.tif 000012
【図１１】
2007246487.tif 000013
【図１２】
2007246487.tif 000014
【配列表】
2007246487000001.app