(57)【要約】【課題】アルデヒド還元酵素遺伝子の発現方法の提供。【解決手段】  細胞内におけるアルドース還元酵素活性を阻害することを特徴とする、アルデヒド還元酵素遺伝子の発現方法、並びに、高グルコース濃度条件及び/又は高浸透圧条件下におけるマウス由来不死化成熟シュワン細胞の培養物に被験物質を添加し、アルデヒド還元酵素遺伝子の発現を指標として糖尿病治療薬をスクリーニングする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内におけるアルドース還元酵素活性を阻害することを特徴とする、アルデヒド還元酵素遺伝子の発現方法。
【請求項２】
高グルコース濃度条件及び/又は高浸透圧条件下におけるマウス由来不死化成熟シュワン細胞の培養物に被験物質を添加し、アルデヒド還元酵素遺伝子の発現を指標として糖尿病治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項３】
グルコース濃度が少なくとも30mMである請求項２記載の方法。
【請求項４】
高浸透圧条件が、培地に塩化ナトリウムを少なくとも50mM含むものである請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルデヒド還元酵素遺伝子の発現方法、及び糖尿病治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
末梢神経障害は、網膜症及び神経障害と共に、糖尿病の最も一般的な合併症の一つである。主としてニューロン及びシュワン細胞における細胞成分中の代謝変性及び微小血管異常は、いずれも糖尿病性神経障害の進行において主要な役割を担っていると考えられているが、詳細な発症機序は未だ明らかになっていない (Mizisin & Powell, 2003)。
【０００３】
シュワン細胞は、末梢神経システムにおいて、軸索の隔離、軸索内径の修復、軸索損傷後の効果的な神経再生及び他の神経機能を介した活動電位速度に関与している (Eckersley, 2002)。それゆえ、高血糖のためのシュワン細胞異常は、神経伝達速度の減少、軸索萎縮及び損傷した軸索の再生のような神経機能不全の原因となりうる (Song et al., 2003; Dyck & Giannini, 1996; Yasuda et al., 2003)。
【０００４】
糖尿病性神経障害におけるシュワン細胞の役割は、ポリオール代謝経路の亢進に関連してたびたび議論されてきた (Mizisin & Powell, 2003; Eckersley, 2002)。ポリオール代謝経路は、グルコース代謝の副経路として知られている代謝経路である。通常、細胞内に取り込まれたグルコースの多くは、解糖系からクエン酸回路に入り、ATPの産生に利用される。しかし、高血糖に伴い細胞内に流入するグルコース量が増加すると、解糖系経路だけでは処理しきれなくなり、迂回経路の一つであるポリオール代謝経路を通るようになる。
【０００５】
糖尿病性神経障害では、シュワン細胞での糖代謝異常が神経障害の発症及び進行に深く関与している。シュワン細胞中に、糖代謝異常の原因であるポリオール代謝経路の主要酵素であるアルドース還元酵素が局在するためである。アルドース還元酵素 (AR: EC 1.1.1.21)は、ポリオール代謝経路における最初の酵素であり、NADPHを補因子としてグルコースをソルビトールに変換する。ARは末梢神経中のシュワン細胞に局在する (Kern et al., 1982)ため、高血糖条件下のシュワン細胞におけるARの活性化は、以下のような様々なメカニズムを介して神経機能に影響を与えると考えられる。 
(1) ソルビトールが蓄積すると、浸透圧ストレス及びミオイノシトール及びタウリンの枯渇がおこる(Tomlinson, 1999; Pop-Busui et al., 2001)。
(2) ARの活性が上昇することにより、補酵素であるNADPHが消費される。その結果、同じくNADPHを補酵素にとる一酸化窒素 (NO) 合成酵素やグルタチオン還元酵素の活性が阻害される。グルタチオン還元酵素が阻害されることにより、還元型グルタチオン (GSH)が枯渇する結果、フリーラジカルが過剰産生される (Low et al., 1999) 。また神経組織におけるNO 合成酵素の阻害はNO産生の減少をもたらし、神経組織への血流が低下する。
(3) ポリオール代謝経路の第２酵素であるソルビトール脱水素酵素 (SDH: EC 1.1.1.14)によりソルビトールがフルクトースに変換される。フルクトース及びその代謝産物であるフルクトース-6-リン酸及びトリオース-リン酸は、細胞内タンパク質及び脂質の非酵素的糖化の引き金となりうる(Takagi et al., 1995)。
【０００６】
シュワン細胞の培養システムは、糖尿病性神経障害の発症機序におけるポリオール代謝経路亢進の役割を研究するのに有用である。しかし、樹立されたシュワン細胞株 JS1 (非特許文献４) 及び初代培養成熟ラットシュワン細胞非特許文献３、非特許文献６) をポリオール代謝の研究に用いても、高浸透圧性ストレス (? 100 mM)を適用した場合を除いては、当該細胞における高グルコース (25-30 mM) 条件下での細胞内ソルビトールの蓄積又は AR 発現 / 酵素活性の促進は見られない。なぜこれらの細胞において生体内での高血糖を再現する高グルコース濃度に反応してポリオール代謝経路が活性化されないのかは、明らかではない。
【０００７】
本発明者らは、成熟マウス 脊髄後根神経節（dorsalroot ganglia (DRG)） 及び末梢神経の長期培養物から不死化シュワン細胞株 IMS32を樹立した (Watabe et al., 1995)。本細胞株は成熟シュワン細胞の多くの性質を保持しているとともに、高増殖活性という生物学的性質を有するため (Watabe et al., 1995, 2003; Sango et al., 2004)、高血糖環境に曝露されたIMS32は、糖尿病性神経障害の研究に適するモデルとなりうる。高グルコース濃度条件下で、シュワン細胞におけるポリオール代謝経路が活性化されると、細胞生存能、増殖活性及び他の細胞機能も影響を受ける。実際、Kamiyaら (2003) は、高グルコース濃度 (20 mM) 条件下でラット神経鞘腫細胞（Schwannoma 細胞）の増殖性及びプロテインキナーゼC-α (PKC-α)活性が減少したが、AR 阻害剤である Epalrestat (ONO-2235) 処理により、上記細胞が元の状態に修復されたことを報告している。またIMS32の増殖性は20-40 mM程度の高グルコースに伴い低下することが、Katoら及びNakamuraらによって報告されている (Kato et al, 2003; Nakamura et al, 2003)。これらの結果より、高グルコース濃度により誘導されるポリオール代謝経路の亢進が、IMS32の増殖性が減少する原因の一つであることが推測される (Kato et al, 2003; Nakamura et al, 2003)。また、高グルコース(20-40 mM) 条件下で増殖活性が低下したIMS32は、C-ペプチド及び塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF) (Nakamura et al., 2003)で処理することにより改善されたことが報告されている (Kato et al., 2003)。しかしながら、上記細胞におけるポリオール代謝経路の解析に関する報告はない。
【０００８】
一方、最近の研究において、DNAマイクロアレイ法によりDRG (Burnand et al, 2004)、上腸間膜及び腹腔神経節(SMG-CG) 及び上頸神経節 (superior cervical ganglia; SCG) (非特許文献１) の遺伝子発現パターンをSTZ-糖尿病ラットと正常対照ラットとの間で比較した報告がある。上記アプローチは、糖尿病性神経障害の進行の分子メカニズムの解析に有用であるように思われる。しかしながら、末梢神経節はニューロン、シュワン細胞及びその他の細胞を含有するため、糖尿病性神経障害に関して研究する場合に、神経節でのマイクロアレイ解析は、遺伝子発現に変化が生じる細胞を特定するのに十分ではない。
【特許文献１】特開２００４−８１１５６号公報
【非特許文献１】Carroll S.L., Byer S.J., Dorsey D.A., Watson M.A. and Schmidt R.E. (2004) Ganglion-specific patterns of diabetes-modulated gene expression are established in prevertebral and paravertebral sympathetic ganglia prior to the development of neuroaxonal dystrophy. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63, 1144-1154.
【非特許文献２】Danesh F.R., Wada J., Wallner E.I., Sahai A, Srivastava S.K. and Kanwar Y.S. (2003) Gene regulation of aldose-, aldehyde- and a renal specific oxido reductase (RSOR) in the pathobiology of diabetes mellitus. Curr. Med. Chem. 10, 1399-1406.
【非特許文献３】Maekawa K., Tanimoto T., Okada S., Suzuki T., Suzuki T. and Yabe-Nishimura C. (2001) Expression of aldose reductase and sorbitol dehydrogenase genes in Schwann cells isolated from rat: effects of high glucose and osmotic stress. Brain Res. Mol. Brain Res. 87, 251-256.
【非特許文献４】Mizisin A.P., Li L., Perello M., Freshwater J.D., Kalichman M.W., Roux L. and Calcutt N.A. (1996) Polyol pathway and osmoregulation in JS1 Schwann cells grown in hyperglycemic and hyperosmotic conditions. Am. J. Physiol. 270, F90-97.
【非特許文献５】Rittner H.L., Hafner V., Klimiuk P.A., Szweda L.I., Goronzy J.J. and Weyand C.M. (1999) Aldose reductase functions as a detoxification system for lipid peroxidation products in vasculitis. J. Clin. Invest. 103, 1007-10013.
【非特許文献６】Suzuki T., Mizuno K., Yashima S., Watanabe K., Taniko K., Suzuki T. and Yabe-Nishimura C. (1999) Characterization of polyol pathway in Schwann cells isolated from adult rat sciatic nerves. J. Neurosci. Res. 57, 495-503.
【非特許文献７】Takahashi M., Lu Y.B., Myint T., Fujii J., Wada Y. and Taniguchi N. (1995) In vivo glycation of aldehyde reductase, a major 3-deoxyglucosone reducing enzyme: identification of glycation sites. Biochemistry 34, 1433-1438.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、アルデヒド還元酵素遺伝子の発現を指標として糖尿病治療薬をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行い、高グルコース (30 mM 及び 56 mM) 及び 高浸透圧 (50 mM of 塩化ナトリウム)条件下でのIMS32におけるAR 及び SDHのmRNA 発現、ARタンパク質発現、並びにソルビトール及びフルクトースの細胞内含量を検討し、さらに、高グルコース条件下(30 mM)で誘導されたIMS32における遺伝子発現プロファイルの変化を、ノザンブロッティングやDNAマイクロアレイ解析を用いて観察した。その結果、高グルコース濃度条件下で培養されたIMS32細胞内では、アルドース還元酵素遺伝子の発現は上昇し、アルデヒド還元酵素遺伝子の発現は低下するという知見を得て、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）細胞内におけるアルドース還元酵素活性を阻害することを特徴とする、アルデヒド還元酵素遺伝子の発現方法である。
（２）高グルコース濃度条件及び/又は高浸透圧条件下におけるマウス由来不死化成熟シュワン細胞の培養物に被験物質を添加し、アルデヒド還元酵素遺伝子の発現を指標として糖尿病治療薬をスクリーニングする方法である。この場合、グルコース濃度は少なくとも30mMが好ましい。また、高浸透圧条件は、培地に塩化ナトリウムを少なくとも50mM含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によりアルデヒド還元酵素遺伝子の発現方法、及び糖尿病治療薬をスクリーニングする方法が提供される。
【００１３】
高血糖条件下の末梢神経系におけるアルデヒド還元酵素の発現及び活性、特にARとの関係に焦点をあてた研究を重ねることにより、糖尿病性神経障害の発症機序における本酵素の役割との関係が解明される。
【００１４】
また、ポリオール代謝異常の原因物質を探索することは、ポリオール異常のメカニズムの解明が進むほか、ポリオール代謝異常に起因して起こる糖尿病又はその合併症の治療等に役立つ情報をもたらす上で重要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、細胞内におけるアルドース還元酵素活性の阻害によって生じることを特徴とする、アルデヒド還元酵素遺伝子の発現方法である。アルデヒド還元酵素は、アルドース還元酵素とともに生体内で生じた反応性アルデヒド、糖化物の解毒にあたるという点で糖尿病と密接に関係する。従って、本発明は、アルデヒド還元酵素遺伝子の発現が低下した細胞に候補物質を添加し、アルデヒド還元酵素の発現を指標として糖尿病治療薬をスクリーニングする方法も提供する。
１．概要
糖尿病が合併症を引き起こすに至るまでには、複数の経路が介在するといわれているが、その主要経路のひとつにアルドース還元酵素(AR)を介するポリオール経路の代謝亢進が挙げられる。
本発明者は、不死化成熟マウスシュワン細胞 (IMS32)と呼ばれる細胞を、高グルコース条件下及び/又は高浸透圧条件下で培養するとアルドース還元酵素遺伝子の発現が上昇し、アルデヒド還元酵素遺伝子の発現が低下することを見出した。そして、高グルコース濃度条件及び/又は高浸透圧条件で培養された上記細胞は、糖尿病性神経障害及びその発症機序におけるポリオール代謝経路の機能解明のためのインビトロモデルに適することを見出した。
【００１６】
また、本発明においては、アルドース還元酵素阻害薬であるSNK-860を高グルコース濃度培地に適用すると、細胞内のソルビトール量及びフルクトース量並びにアルデヒド還元酵素(AKR1A4)のmRNA発現が正常条件のレベルに回復することを見出した。
【００１７】
さらに、高グルコース濃度条件下で培養されたIMS32細胞においては、血清アミロイドA3 (SAA3)、アンジオポイエチン様4 (ANGPTL4) 及びエコトロピックウイルス挿入部位3 (Evi3)のmRNA発現が顕著にアップレギュレートされるが、細胞中のアルデヒド還元酵素 のmRNA 発現はダウンレギュレートされることが示された。
【００１８】
アルデヒド還元酵素はアルドース還元酵素とは異なり、グルコース及び他のアルド糖には実質的に不活性であるため (Kawasaki et al, 1989; Ansari et al, 1991)、糖尿病及びその合併症の研究分野において注目されていなかった物質である(Takahashi et al, 1995; Danesh et al, 2003)。これに対し、本発明においては、アルデヒド還元酵素に注目して、高グルコース環境で低下したアルデヒド還元酵素遺伝子発現を回復させることとしたものである。
【００１９】
従って、本発明は、細胞内におけるアルドース還元酵素活性を阻害することにより、アルデヒド還元酵素遺伝子を発現させる方法を提供する。また、本発明は、高グルコース濃度条件及び/又は高浸透圧条件下におけるマウス由来不死化成熟シュワン細胞の培養物に被験物質を添加し、アルデヒド還元酵素遺伝子の発現を指標として糖尿病治療薬をスクリーニングする方法を提供する。
２．アルデヒド還元酵素遺伝子の発現
アルデヒド還元酵素はアルド-ケト還元酵素 (AKR) スーパーファミリー (AKR1A サブファミリーは、アルデヒド還元酵素を表し、AKR1B サブファミリーは、アルドース還元酵素を表す) の一員であり(Hyndman et al, 2003)、その mRNA はユビキタスに発現され、腎臓及び肝臓で豊富に存在している (Barski et al, 1999; Allan & Lohnes, 2000)。約 50%のアミノ酸配列がアルデヒド還元酵素及びAR 間で保存されており(Bohren et al, 1989; Barski et al, 1999)、両酵素はNADPHを補因子として用いることにより、グリセルアルデヒド、メチルグリオキサル (MG)、ヒドロキシノネナル (HNE) 及び グルコソンのような反応性生体アルデヒドの還元を触媒する(Flynn, 1986; Bohren et al, 1989; Vander Jagt et al, 1992)。これはまた、アルデヒド解毒作用に加えてカテコールアミン及びステロイド代謝に関与する(Turner et al, 1982; Wermuth & Monder, 1983; Yabe-Nishimura, 1998; Kawamura et al, 1999)。
【００２０】
ARとは異なり、アルデヒド還元酵素はグルコース及び他のアルド糖には実質的に不活性である (Kawasaki et al, 1989; Ansari et al, 1991)。従って、アルデヒド還元酵素は糖尿病及びその合併症の研究分野において、ARほどは注目されていなかった(Takahashi et al, 1995; Danesh et al, 2003)。
【００２１】
本発明である糖尿病治療薬をスクリーニングする方法においては、アルデヒド還元酵素遺伝子の発現が指標となる。マウスのアルデヒド還元酵素遺伝子の塩基配列情報は、データベースから入手可能であり(AKR1A4; GenBank Accession No. NM_021473)、これを配列番号１に示す。なお、マウスのアルデヒド還元酵素のアミノ酸配列情報を配列番号２に示す。
【００２２】
本発明において、アルデヒド還元酵素遺伝子の発現方法、又は糖尿病治療薬をスクリーニングする方法で用いられる指標は、アルデヒド還元酵素遺伝子に限られず、上記アルデヒド還元酵素遺伝子と同等の機能を有する物質も含まれる。上記アルデヒド還元酵素遺伝子と同等の機能を有する物質は、具体的には、配列番号１又はその一部からなるヌクレオチドに対し、相補的な塩基配列よりなるヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ上記アルデヒド還元酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチドである。ここで、アルデヒド還元酵素活性とは、アルデヒドをアルコールに変換する活性を意味する。上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、1×SSC〜２×SSC、0.1％〜0.5％SDS及び42℃〜68℃の条件が挙げられ、より詳細には、60〜68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブによるハイブリダイゼーションを行い、2×SSC、0.1％SDS中、室温で5〜15分の洗浄を4〜6回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press (1989);特にSection9.47-9.58)等を参照することができる。
【００２３】
アルデヒド還元酵素遺伝子を発現させるために使用される細胞は、特に限定されるものではなく、シュワン細胞 (Schwann cell)、神経細胞、血管内皮細胞等が挙げられるが、シュワン細胞におけるポリオール代謝亢進が糖尿病性神経障害の発症に深く関与している点でシュワン細胞が好ましく、成熟マウス由来のシュワン細胞であることがより好ましい。
【００２４】
シュワン細胞(Schwann cell)は、末梢神経系に存在するグリア細胞であり、末梢神経の軸索を取り囲み、神経線維の興奮を伝播する上で重要な働きをする。例えば、末梢神経システムにおいて、軸索の隔離、軸索内径の修復、軸索損傷後の効果的な神経再生及び他の神経機能を介した活動電位速度に関与している。従って、シュワン細胞の異常は、神経伝達速度の減少、軸索萎縮及び損傷した軸索の再生のような神経機能不全の原因となりうる。また、シュワン細胞は、神経成長因子(NGF)や毛様体神経栄養因子(CNTF)を産生し、軸索損傷後の神経再生に重要な役割を担っている。
【００２５】
不死化成熟マウスシュワン細胞株 (IMS32)は本発明者らが樹立した細胞株であり、成熟マウス DRG 及び末梢神経の長期培養において自発的に不死化したもので、成熟したシュワン細胞として機能及び高増殖活性という生物学的性質を有する。JS1のような他のシュワン細胞株や、初代培養成熟ラットシュワン細胞では、ポリオール代謝経路の亢進の指標となる高グルコース濃度 (25-30 mM) 条件下での細胞内ソルビトールの蓄積又は AR 発現 / 酵素活性の促進は見られない。これに対してIMS32におけるポリオール代謝経路は、上記したように、高グルコース濃度条件(30 mM)負荷により活性化される。従って、高グルコース濃度条件下でのIMS32の培養システムを確立することにより、糖尿病性神経障害の発症機序においてポリオール代謝経路がどのような役割を担っているのかを解明するのに役立つインビトロモデルを提供することができる。
【００２６】
高グルコース濃度条件で培養された細胞は、高血糖環境にさらされる。高血糖下では、インシュリン非依存性グルコースの取り込みを行う細胞のグルコース濃度が上昇し、糖尿病合併症病変に至る過程で介在する経路の１つであるアルドース還元酵素を介するポリオール経路の代謝が亢進し糖尿病合併症の標的となる臓器の代謝異常が誘発される。
【００２７】
細胞内におけるアルドース還元酵素遺伝子の発現阻害には、特に限定されるものではないが、例えばRNA干渉（RNAi）を利用することができる。アルドース還元酵素遺伝子に対するsiRNA(small interfering RNA)を設計及び合成し、これを細胞内に導入させることによって、RNAiを引き起こし、アルドース還元酵素遺伝子の発現を阻害することができる。RNAiとは、dsRNA(double-strand RNA)が標的遺伝子に特異的かつ選択的に結合し、当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害する現象である。
【００２８】
siRNAの設計は、まず、アルドース還元酵素遺伝子の任意の領域を候補として選択する。次に、選択した領域から、AAで始まる19〜25塩基、好ましくは19〜21塩基の塩基配列を選択する。
【００２９】
siRNAを細胞に導入するには、in vitroで合成したsiRNAをプラスミドDNAに連結してこれを細胞に導入する方法、２本のRNAをアニールする方法などを採用することができる。
【００３０】
また、RNAi効果をもたらすためにshRNAを使用することもできる。shRNA とは、ショートヘアピンRNA(short hairpin RNA)と呼ばれるRNA分子であり、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するというものである。
【００３１】
shRNAは、ステムとループが形成されるようにする。
また、アルドース還元酵素遺伝子の発現抑制は、アンチセンス核酸法を採用することができる。アンチセンス核酸法は、当分野において周知である。
３．糖尿病治療薬をスクリーニングする方法
本発明は、高グルコース濃度条件及び/又は高浸透圧条件下で培養された不死化成熟マウスシュワン細胞に候補物質を添加して、低下したアルデヒド還元酵素遺伝子の発現を指標として、糖尿病又はその合併症の治療又は予防に有効な物質をスクリーニングすることができる。
【００３２】
例えば、本発明の高グルコース濃度条件や高浸透圧条件の培地で培養した細胞に候補物質を投与した場合に、上記低下したアルデヒド還元酵素遺伝子のmRNA発現量又はタンパク質発現量の強度が正常濃度条件の培地で培養した細胞由来のmRNA発現量又はタンパク質発現量の強度と同等レベルに回復した場合は、当該候補物質を糖尿病又はその合併症の治療又は予防に有効な物質であるとして選択することができる。
【００３３】
なお、ポリオールの細胞内含有量を測定することによって、糖尿病治療薬をスクリーニングすることも可能である。例えば、IMS32細胞を高グルコース濃度条件下及び/又は高浸透圧条件下で培養すると、細胞内の特定のポリオール含有量は増加する。そのIMS32細胞に候補物質を添加した後、ポリオールの細胞内含有量を測定する。測定結果が、高グルコース濃度条件でない通常の条件で培養した細胞における当該ポリオールの細胞内含有量と同等レベルに減少した場合は、当該候補物質を糖尿病又はその合併症の治療又は予防に有効な物質として選択することができる。
【００３４】
不死化成熟マウスシュワン細胞の培養は、適当なpH及び浸透圧を有し、細胞増殖に必要な栄養素、微量成分、血清や抗生物質等の生物材料を含んでいる培養液（培地）であれば、いかなる培養液も用いうる。例えば、ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)、Eagle必須培地（MEM）、RPMI培地、Hanks培地、F12培地を用いることができるが、これらに限定されない。
【００３５】
培地には、細胞の増殖に用いる増殖培地と、増殖した細胞をそのまま長期間保つための維持培地とがある。増殖培地としては、血清を5〜10％添加したものが用いられる。例えば本発明のIMS32細胞の増殖培地としては、10％FCS添加DMEMを用いることができる。維持培地は血清濃度を下げたものが用いられる。本発明のIMS32細胞の維持培地としては、DMEM培地に1％ ウシ胎仔血清 (FCS, Invitrogen)を添加したものが好ましい。低濃度血清 (1%) によりIMS32の増殖が抑制され (Watabe et al., 1995)、細胞を剥離及び再播種をせずに14日目まで同一の培養フラスコで培養を続けることができる。
【００３６】
不死化成熟マウスシュワン細胞は、まず増殖培地で培養し、適当な集密度となった時点で継代し、維持培地で培養をする。維持培地は、高グルコース濃度及び/又は高NaCl濃度（高浸透圧条件）のものを作製し、適当な濃度の細胞を播種して培養を維持する。上記のように、低濃度血清 (1％) により細胞の増殖が抑制され、細胞を剥離及び再播種をせずに14日目程度まで同一の培養フラスコで培養を続けることが可能である。そこで、培養開始後から、細胞継代前の時点の適当な時期に細胞を剥離する。
【００３７】
ここで、高グルコース濃度条件とは、不死化成熟マウスシュワン細胞の維持培地のグルコース濃度が、通常用いられる維持培地のグルコース濃度（例えば5〜10mM)に比べて高い条件を意味する。本発明における高グルコース濃度条件は、例えば培地中のグルコース濃度が30mM以上であり、好ましくは56mM以上である。
【００３８】
高浸透圧条件とは、細胞の培養培地の塩化ナトリウム(NaCl)濃度が通常用いられる培地の濃度に比べて高い条件を意味する。本発明では、上記した培地にNaClが50mM以上含まれている場合をいうがこれらに限定されるものではない。
【００３９】
高グルコース濃度条件及び/又は高浸透圧条件におけるポリオール経路の代謝亢進を確認するには、上記条件下で培養した細胞における、ポリオール代謝異常の指標となる酵素又は遺伝子の発現をノザンブロット法、ウェスタンブロット法、免疫細胞化学法等により測定すればよい。また、上記条件下で培養した細胞におけるソルビトール及びフルクトース等の細胞内含有量を定量することもできる。
【００４０】
遺伝子又は酵素（タンパク質）の発現量は、例えば、正常濃度条件の培地で培養した細胞由来のmRNA発現量の強度と比較した、高グルコース濃度や高浸透圧条件の培地で培養した細胞由来のmRNA発現量の強度として表すことができる。このような発現量を「相対発現量」という。この相対的発現量により、上記遺伝子の発現がアップレギュレートされたのかダウンレギュレートされたのかを判断することができる。また、細胞中のポリオールレベルは、公知の方法、例えば、タンデム質量分析を用いた液体クロマトグラフィーにより測定することができる（Guerrant ら (1984)）。
【００４１】
ウェスタンブロットを用いる場合の「相対的発現量」 は、正常濃度条件の培地で培養した細胞由来タンパク質発現量の強度と比較した、高グルコース濃度や高浸透圧条件の培地で培養した細胞由来のタンパク質発現量の強度で表すことができる。
【００４２】
免疫細胞化学としては、酵素抗体法、凝集反応、沈降反応、ラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素抗体測定法（ELISA）、リポソームを利用した免疫測定法（LILA）、フローサイトメトリーなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
IMS32を高グルコース環境に曝露するとARの発現及び活性が促進され、その結果、ポリオール代謝経路を介して顕著な細胞機能障害が誘導されることが示される。
【００４４】
従来、糖尿病性神経障害に関して研究する場合に、マイクロアレイは、細胞の遺伝子発現が変化してしまうような細胞を特定するには適当ではなかった。末梢神経節はニューロン、シュワン細胞及びその他の細胞を含有するためである。
【００４５】
これに対し、本発明者は、正常グルコース濃度条件及び高グルコース濃度条件下で適当期間培養したIMS32を用いるとマイクロアレイによる遺伝子発現プロファイルを解析し得ることを見出した。この遺伝子発現プロファイルの解析は、細胞から全RNAを単離し、DNA マイクロアレイ解析を行った後、RT-PCR又はノザンブロット解析を行い、両濃度条件でのmRNA又はタンパク質の発現を比較するものである。
【００４６】
この遺伝子プロファイル解析により、血清アミロイドA3 (SAA3)、アンジオポイエチン様4 (ANGPTL4)、エコトロピックウイルス挿入部位3 (Evi3)、アルデヒド還元酵素 (AKR1A4) が見出された。
以下、アルデヒド還元酵素 (AKR1A4)以外の物質について説明する。
(i) SAA3: 
血清アミロイド A (SAA)は、アポリポタンパク質ファミリーの一つであり、高密度リポタンパク質 (HDL)と関連する急性期反応物質として知られる(Stearman et al, 1986)。Lin ら (2001) は、糖尿病及びその心血管系の合併症の進行にSAAタンパク質が関与することを示唆しており、高グルコース (20 mM) 条件下で、糖尿病のマウスの脂肪組織及び 3T3-L1 脂肪細胞系において、SAA3 がアップレギュレートされることを見出している。さらに、糖化最終産物 (AGE) 同様に、SAAはAGEの受容体(RAGE)のリガンドの1つであり、RAGE-リガンドの相互作用は細胞機能障害を誘導することが示唆されている (Schmidt et al, 2000; Yan et al, 2000)。SAA3遺伝子の塩基配列情報は、データベースから入手可能である(GenBank Accession No. NM 011315) 。
【００４７】
(ii) ANGPTL4: 
ANGPTL4はaka 空腹時誘導脂肪因子(FIAF) であり、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体 (PPARα及びPPARγ)の下流標的遺伝子として認識されており(Kersten et al, 2000)、リポタンパク質リパーゼ活性を阻害することにより高脂血症を誘導する (Yoshida et al, 2002; Xu et al, 2005)。ANGPTL4 遺伝子は主として脂肪組織および肝臓において発現するが、それが虚血組織で誘導されることから (Le Jan et al, 2003)、虚血及び低酸素症での代替的な血管新生において本分子が関与することが示唆されている(Deindl et al, 2001)。従って、高血糖条件下でシュワン細胞においてアップレギュレートされたANGPTL4は、脂肪酸代謝異常及び/又は神経組織における神経血管機能障害に関与するといえる (Cameron et al, 1998; Martin et al, 2003)。ANGPTL4の塩基配列情報は、データベースから入手可能である(GenBank Accession No. NM 020581)。
【００４８】
(iii) Evi3:
Evi3 は、マウスリンパ腫のマウスB-細胞における共通のレトロウイルス組込み部位であり、新規なジンクフィンガータンパク質である (Warming et al, 2003)。本研究のマイクロアレイ解析では、高グルコース濃度によるEvi3 mRNAの発現量が３倍というアップレギュレーションが示されたが、本分子が糖尿病やその合併症の病理にどのように関与しているかは今後の検討課題である。Evi3の塩基配列情報は、データベースから入手可能である(GenBank Accession No.NM 145492)。
なお、896 bpのマウス AR (aldo-keto 還元酵素 1B3 以下、AKR1B3という)の塩基配列、及び1074 bpのマウス SDH 遺伝子も、データベースから入手可能である(それぞれ、GenBank Accession No. XM 126843、 BCO24124)。ソルビトール脱水素酵素であるSDHは、ポリオール代謝経路において、ARによりグルコースが還元されて生成するソルビトールをさらにフルクトースに変換する酵素である。
【００４９】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５０】
（１）細胞培養
不死化成熟マウスシュワン細胞 (IMS32)を75 cm2 フラスコ (Nalge Nunc International, Naperville, IL, USA) に5x104/cm2 の密度で播種し、10% ウシ胎仔血清 (FCS, Invitrogen) 添加ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) (Sigma, St Louis, MO, USA) で培養した。当該培地に5.6 mM グルコースを加えた。細胞がおおよそ80-85% 密集度になったときに、5.6 mM グルコース [Glc-5.6], 30 mM グルコース [Glc-30], 56 mM グルコース [Glc-56] 又は 5.6 mM グルコース及び 50 mM 塩化ナトリウム [NaCl-50]を含む、1% FCS 添加DMEMで維持培養を行った。
【００５１】
低濃度血清 (1%) によりIMS32の増殖が抑制され (Watabe et al., 1995)、細胞を剥離及び再播種をせずに14日目まで同一の培養フラスコで培養を続けることが可能となった。7日目の各実験条件における細胞をリン酸-緩衝生理食塩水 (PBS, Sigma) でリンスし、細胞スクレイパーでフラスコから剥離した (Sumitomo Bakelite Co. Ltd, Tokyo, Japan)。当該細胞を、ノーザンブロット又はウェスタンブロットで使用するために滅菌チューブに回収し2 mlの滅菌水中で懸濁した。
（２）マウスのAR cDNA及び SDH cDNAを含有するプラスミドの作製
マウス AR 及び SDHのcDNA フラグメントを含有するプラスミドをSango らの方法によるPCR クローニングによって以下のように作製した (Sango et al., 2004)。すなわち、Sepazol 試薬 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)を用いてIMS32から単離した全RNAを、M-MLV 逆転写酵素 (Invitrogen, Groningen, Netherlands) 及び pd(N)6ランダムプライマー (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ, USA)を用いて逆転写させた。合成 cDNAをPCR 反応の鋳型に用いた。896 bpのマウス AR (aldo-keto 還元酵素 1B3 以下、AKR1B3という) 遺伝子(GenBank Accession No. XM_126843)を増幅するために以下のプライマーを設計した。
センスプライマー： 5’-ATGGCCAGCCATCTGGAACTC-3’ （配列番号３）
アンチセンスプライマー：5’-CACACCCTCCAGTTCCTGTT-3’（配列番号４）
及び
1074 bpのマウス SDH 遺伝子 (GenBank Accession No. BCO24124) を増幅するために以下のプライマーを設計した。
センスプライマー： 5’-ATGGCAGCTCCAGCTAAGGGC-3’ （配列番号５）
アンチセンスプライマー： 5’-CTAGGGGTTTTGGTCATTGGG-3’ （配列番号６）
製造業者の指示書に従い、PCR生産物をpGEM-T Easy Vector (Promega Corp., Madison, WI, USA)にサブクローニングし、得られたプラスミド DNAをシークエンスした (Promega / Bex Co. Ltd., Tokyo, Japan)。
（３）ノーザンブロット
AR 及び SDH (10 ng/ml) の cDNA フラグメントをプラスミドから調製して、製造業者の指示に従い、アルカリフォスファターゼで標識した(AlkPhos Direct (Amersham Biosciences))。
【００５２】
Sepazol 試薬を用いてIMS32細胞から全RNA を単離して、RNA 濃度を分光光度計 (Gene Quant Pro; Amersham Biosciences)で測定した。25 mg のRNAを1%アガロースアルデヒドゲルで電気泳動し、Hybond N+ 膜 (Amersham Biosciences)で転写した。同一の RNA 試料につき2つの膜を調製し、1つはメチレンブルーで染色し(Waldeck-Gmbh & Co KG, Munster, Germany)、他方は、標識プローブで50°C一晩ハイブリダイズさせた。CDP-StarTM 化学発光検出試薬及びHyperfilm ECL (Amersham Biosciences) をポジティブシグナルの可視化に用いた (Sango et al., 2004)。バンドの強度をEdas 290 1D Image Analysis software (Eastman Kodak, New York, NY, USA) で定量し (Sango et al., 2002)、mRNA の存在量を「相対的発現量」 ([Glc-5.6]中の強度と比較した試験グループ中の強度)で表した。二重膜においてメチレンブルーで染色した28S リボゾーム RNA を標準化に用いた。 
【００５３】
その結果、AR mRNA及び SDH mRNA は、各々の分子サイズが、2キロベース対 (kb) 及び 3 kb付近の分子量に対応する単一バンドとして検出された (図1A, 上部)。
【００５４】
ブロットから、AR mRNA は[Glc-5.6]よりも [Glc-30]、[Glc-56] 及び [NaCl-50]中でシグナル強度がより強く、SDH mRNA は、[Glc-5.6]よりも [Glc-56] 及び [NaCl-50] でシグナル強度がより強かった。
【００５５】
二重膜をメチレンブルー (MB)染色すると (図1A, 下部)、相対的に同量のRNA が取り込まれたことが示された。AR mRNA の相対的発現の平均値は、各々、[Glc-5.6]で1、[Glc-30]で1.88、[Glc-56]で2.41 及び[NaCl-50]で2.78であった (図1B)。[Glc-30] 及び [Glc-5.6] での値に統計的な有意差がないにもかかわらず、AR mRNA 発現は、高グルコース ([Glc-30] 及び [Glc-56]) 及び高浸透圧 ([NaCl-50]) 条件下でアップレギュレートされた。SDH mRNA の相対的発現の平均値は、[Glc-5.6]で1、[Glc-30]で1.19、[Glc-56] で2.03及び [NaCl-50] で2.99であった。SDH mRNA 発現は、高グルコース ([Glc-56]) 及び高浸透圧([NaCl-50])条件下で有意にアップレギュレートされた。
（４）ウェスタンブロット
細胞破砕機 (Tomy Seiko Co. Ltd., Tokyo, Japan) で細胞をホモジネートして、タンパク質濃度を、製造業者の指示に従ってDC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) を用いて測定した。20 mg のタンパク質を非還元条件で14-16% 勾配ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) / ポリアクリルアミドゲル (Daiichi Pure Chem. Co. Ltd, Tokyo, Japan) で電気泳動して、ニトロセルロース紙 (Bio-Rad) に転写した。ブロットした紙を5%スキムミルクでブロッキングして、ヤギ抗AR 抗体 (ALR2 (P-20), 1:2,000; Santa Cruz Biotech. Inc., Santa Cruz, CA, USA) を用いて、室温で1 時間インキュベートし、その後、ビオチン化抗ヤギ IgG (1:1,000; Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) 及びストレプトアビジン-アルカリフォスファターゼ (1:1,000; Promega) でインキュベーションした。反応物は、アルカリフォスファターゼ (Promega)の基質で安定化したWestern blue（登録商標） で着色して可視化した。
【００５６】
その結果、AR が発現したことを示すバンドは分子サイズレベルで36 kDa 付近に同定された (図2A, 上部)。ブロットから、[Glc-5.6]よりも[Glc-56] 及び [NaCl-50]において、AR タンパク質のシグナル強度が高かった。クマシーブリリアントブルー (CBB) 染色した SDS-PAGEにより (図2A, 下部) 、相対的に同量のタンパク質が取り込まれたことが示された (図1A, 下部)。相対発現の平均値は、各々[Glc-5.6]で1、[Glc-30]で1.79、[Glc-56]で2.15 及び [NaCl-50]で1.95であった。AR タンパク質発現は、高グルコース ([Glc-30] 及び [Glc-56]) 及び高浸透圧 ([NaCl-50]) 条件下でアップレギュレートされた。
（５）免疫細胞化学
IMS32 を1-2 x 104/cm2の密度で、8-ウェルチャンバースライド(Nalge Nunc) のウェル又はアクリルフルオロカーボンカバースリップ(Nissin EM Co. Ltd, Tokyo, Japan; 直径9 mm) に播種し、[Glc-5.6]、[Glc-30]、[Glc-56] 又は [NaCl-50] 下で7 日間維持した。その後、細胞を4%パラフォルムアルデヒドで 4°C 15分間固定した。固定した細胞をヤギ抗AR ポリクローナル抗体 (1:3,000)を用いて 4°Cで一晩インキュベートした。PBSでリンス後、細胞をペルオキシダーゼ抱合抗ヤギ IgG抗体 (1:100, Vector Laboratories)を用いて、37°C で1時間インキュベートした。免疫反応は、0.01%ジアミノベンジジンテトラヒドロ-クロライド(DAB)(Wako Co., Tokyo, Japan) 及び50mM トリス緩衝液 (pH7.4) 中の0.01% 過酸化水素を用いて常温で15分間、光学顕微鏡で可視化した (Sango et al., 2003)。
【００５７】
その結果、AR の免疫活性は、[Glc-5.6] (図3A)に比較して[Glc-30] (図3B)中で顕著に亢進され、AR タンパク質が細胞質中に局在していることが明らかとなった。
【００５８】
[Glc-5.6] と比較すると、[Glc-56]では、AR及びSDHのmRNA発現及びARタンパク質発現が著しくアップレギュレートされ(図1及び2)、[Glc-30]でのmRNAレベル及びタンパク質レベルでのAR発現は[Glc-5.6]の場合に比しておおよそ1.8倍も高かった。これは、免疫細胞化学実験結果から、[Glc-30]でARの免疫活性が促進されることと一致する (図3)。[Glc-30]下では、ソルビトール及びフルクトースが過剰産生されることから、AR 及び SDHが高グルコース濃度により活性化されたことが示される。
【実施例２】
【００５９】
（１）細胞内ソルビトール及びフルクトース含量の測定
IMS32を5x104/cm2の密度で6-ウェルプレート(Corning Inc., Corning, NY, USA) のウェルに播種し、[Glc-5.6] 又は[Glc-30]下で14日間維持培養を行った。[Glc-30]のサブセットとして AR 阻害剤である SNK-860 (Sanwa Kagaku Kenkyusho)を1μMの濃度で培養開始から7日目から14日目までの7日間処理した。上記培養条件を[Glc-30/SNK]とする。各条件下の細胞を氷冷したPBS でリンスし、細胞破砕機で2ml冷水中で破砕した。タンパク質濃度を製造業者の指示に従い、DC Protein Assay (Bio-Rad) で測定した。各凍結乾燥標試料中のポリオールレベルを、Guerrantら(1984)の方法に従って、タンデム質量分析を用いた液体クロマトグラフィーで測定した。ポリオール値は、ナノモル (nmol) /タンパク質 mgとして表した。
【００６０】
その結果、ソルビトール及びフルクトースの細胞内含有量は、[Glc-5.6] (1±0.2 nmol/mg 及び 13.6±3.4 nmol/mg)よりも [Glc-30] (17.9±1.7nmol/mg 及び77.7±6.7nmol/mg)中で極めて高かった(図4)。[Glc-56]での細胞におけるポリオールレベルは極めて高く、測定限界を超えていた。AR 阻害剤であるSNK-860を適用すると、7日間で、高グルコース ([Glc-30]) 条件では、ポリオールが正常グルコース ([Glc-5.6]) 条件に近いレベルまで急激に還元された。すなわち、ソルビトールは、[Glc-30]では17.9±1.7nmol/mg に対し、[Glc-30/SNK]では3.4±0.4 nmol/mgであった。フルクトースは、[Glc-30] では77.7±6.7 nmol/mgに対し、[Glc-30/SNK]では29.2±4.8 nmol/mgであった。
（２）DNA マイクロアレイ解析
IMS32 細胞を175 cm2フラスコ (Nalge Nunc) で14日間、[Glc-5.6] 又は [Glc-30] 中で維持し、全RNA (> 10μg) を、RNeasy mini kit (QIAGEN K.K., Tokyo, Japan) を用いて細胞から単離した。これらの試料を用いて以下のようにDNA マイクロアレイ解析を行った (Custom Technology Service by Kurabo Industries Ltd, Osaka, Japan)。すなわち、全RNAをT7 oligo d(T)プライマー (Amersham Biosciences) でcDNAに逆転写した。cDNA 合成産物をT7 RNA ポリメラーゼ及びビオチン化UTPを含有するインビトロ転写反応で用いた。その後、標識cRNA 産物をフラグメント化し、CodeLinkTM Uniset mouse 20K microarrays (Amersham Biosciences) にロードして、製造業者のプロトコールに従ってハイブリダイズした。ハイブリダイズした標的配列を検出するための蛍光結合体としてストレプトアビジン-シアニン5を用いた。Codelink bioarraysから得られた強度の生データをMicrosoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) で解析し、遺伝子発現レベルを相対的強度として表した[Glc-30]中の強度データを[Glc-5.6]のものと比較した。相対的強度の倍数変化が > 2.0 及び < 0.5 のもののみが、各々、際立ったアップレギュレーション及びダウンレギュレーションを起こしたものとみなした。
【００６１】
その結果、20,000 近くのマウス遺伝子のうち、高グルコース ([Glc-30]) 条件下で発現が変化した28 個の遺伝子が同定された。そのうち10個の遺伝子は2.0倍又はそれ以上のレベルで発現し、18個の遺伝子は、2.0倍又はそれ以上のレベルでダウンレギュレートされた (表1)。
【００６２】
【表１】
2007116925.tif 000002
（３）RT-PCR 及びノザンブロット 解析による高グルコース-反応性遺伝子発現の確認
マイクロアレイの結果を確認するために、RT-PCR 又はノザンブロット解析を行い、[Glc-5.6]、[Glc-30] 及び [Glc-30/SNK] 下の細胞中のこれらの遺伝子の相対的発現を測定した。Sepazol 試薬を用いて、75 cm2 フラスコで14日間、[Glc-5.6]、[Glc-30] 又は [Glc-30/SNK] 中で維持された細胞から全RNAを単離した。以前述べたように半定量的 RT-PCR 解析を行った (Sango et al., 2002; Tsukiji et al., 2004)。簡潔には、4μgの全RNAから第一鎖cDNAを合成し、2 μl の希釈 cDNA、0.625UのAmpliTaqGoldO DNA polymerase (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)、0.2 mMの各dNTP、50 mM KCl、10 mM Tris-HCl (pH8.3)、1.5 mM MgCl2及び各0.5 μMのセンス及びアンチセンスプライマーを含有する25μlの反応ボリュームでPCR 増幅を行った。PCRに用いた  オリゴヌクレオチドセンス及びアンチセンスプライマーは以下の通りである：
血清アミロイド A3 (SAA3) (365-bp) (GenBank Accession No. NM_011315) 5’-ATGAAGCCTTCCATTGCCA-3’           （配列番号７）及び
5’-TATCTTTTAGGCAGGCAGGCCAGCA-3’   （配列番号８）; 
アンジオポイエチン様 4 (978-bp) (ANGPTL4) (GenBank Accession No. NM_020581) 5’-AGGGGCCCAAGGGAAAAGAT-3’ （配列番号９）及び 
5’-TAGCCTCCATGGGCTGGAT-3’   （配列番号１０）;
エコトロピックウイルス挿入部位3 (Evi3) (640bp) (GenBank Accession No.NM_145492) 
5’-TGGGGAGGCAGTAGACTG-3’   （配列番号１１）及び 
5’-CTCCATCCTGGAGCCAGA-3’   （配列番号１２）
β-アクチン(内部標準) (382-bp) (GenBank Accession No. NM_007393)
5’-AGAAGCTGTGCTATGTTGCC-3’    （配列番号１３）及び
5’-ATCCACACAGAGTACTTGCG-3’    （配列番号１４）
PCR 反応は全て適当なサイクル数を用いてリニアとなるような条件下で行った (Sango et al., 2002)。PCR 産物を、100 V で 30分間、2 %アガロースゲル中で電気泳動により分離した。エチジウムブロマイド染色で可視化したPCR フラグメントの強度をEdas 290 で定量し、各 mRNA の存在量を各cDNA フラグメントの強度/ 各β-アクチン cDNA フラグメントの強度で表した。
【００６３】
ノーザンブロット解析のため、マウスアルデヒド還元酵素 (AKR1A4; 配列番号１(GenBank Accession No. NM_021473)) cDNA フラグメントを含有するプラスミド(969-bp 産物)を以下のプライマーを用いてPCR クローニングにより作製した。
5’-TCCAGTGTCCTCCTGCACA-3’     （配列番号１５） 及び 
5’-TCAGTATGGGTCATTAAAGGG-3’   （配列番号１６）
その結果、RT-PCR 解析では、[Glc-5.6]と比較して、[Glc-30]中で血清アミロイド A3 (SAA3)、アンジオポイエチン様 4 (ANGPTL4) 及びエコトロピックウイルス挿入部位 3 (Evi3)の3つの遺伝子でアップレギュレーションが生じた (図5)。ノーザンブロット解析では、アルデヒド還元酵素 (EC 1.1.1.2, aka アルド-ケト還元酵素 1A4 (AKR1A4)) のmRNA 発現がダウンレギュレートされたことが示された (図6)。SNK-860で処理しても、SAA3, ANGPTL4 又は Evi3の mRNA 発現は何ら影響を受けないが、AKR1A4のmRNA 発現は[Glc-5.6]と同等のレベルにまで減少した(図5及び6)。
【００６４】
文献
Allan D. and Lohnes D. (2000) Cloning and developmental expression of mouse aldehyde reductase (AKR1A4). Mech. Dev. 94, 271-275
Bhatnagar A., Liu S.Q., Das B., Ansari N.H. and Srivastava S.K. (1990) Inhibition kinetics of human kidney aldose and aldehyde reductases by aldose reductase inhibitors. Biochem. Pharmacol. 39, 1115-1124.
Bohren K.M., Bullock B., Wermuth B. and Gabbay K.H. (1989) The aldo-keto reductase superfamily. cDNAs and deduced amino acid sequences of human aldehyde and aldose reductases. J. Biol. Chem. 264, 9547-9551.
Burnand R.C., Price S.A., McElhaney M., Barker D. and Tomlinson D.R. (2004) Expression of axotomy-inducible and apoptosis-related genes in sensory nerves of rats with experimental diabetes. Brain Res. Mol. Brain Res. 132, 235-240.
Cameron N.E., Cotter M.A., Horrobin D.H. and Tritschler H.J. (1998) Effects of alpha-lipoic acid on neurovascular function in diabetic rats: interaction with essential fatty acids. Diabetologia. 41, 390-399.
Carroll S.L., Byer S.J., Dorsey D.A., Watson M.A. and Schmidt R.E. (2004) Ganglion-specific patterns of diabetes-modulated gene expression are established in prevertebral and paravertebral sympathetic ganglia prior to the development of neuroaxonal dystrophy. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63, 1144-1154.
Danesh F.R., Wada J., Wallner E.I., Sahai A, Srivastava S.K. and Kanwar Y.S. (2003) Gene regulation of aldose-, aldehyde- and a renal specific oxido reductase (RSOR) in the pathobiology of diabetes mellitus. Curr. Med. Chem. 10, 1399-1406.
Deindl E., Buschmann I., Hoefer I.E., Podzuweit T., Boengler K., Vogel S., van Royen N., Fernandez B. and Schaper W. (2001) Role of ischemia and of hypoxia-inducible genes in arteriogenesis after femoral artery occlusion in the rabbit. Circ. Res. 89, 779-786.
Dyck P.J. and Giannini C. (1996) Pathologic alterations in the diabetic neuropathies of humans: a review. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 55, 1181-1193.
Eckersley L. (2002) Role of the Schwann cell in diabetic neuropathy. Int. Rev. Neurobiol. 50, 293-321.
Flynn T.G. (1986) Aldose and aldehyde reductase in animal tissues. Metabolism 35 (4 Suppl.1), 105-108.
Grunewald R.W., Wagner M., Schubert I, Franz H.E., Muller G.A. and Steffgen J. (1998) Rat renal expression of mRNA coding for aldose reductase and sorbitol dehydrogenase and its osmotic regulation in inner medullary collecting duct cells. Cell. Physiol. 
Biochem. 8, 293-303. Guerrant G. and Moss C.W. (1984) Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyoxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas chromatography. Anal. Chem. 56, 633-638.
Hamano M., Saito M., Eto M., Nishimatsu S, Suda H, Matsuda M, Matsuki M, Yamamoto S. and Kaku K. (2004) Serum amyloid A, C-reactive protein and remnant-like lipoprotein particle cholesterol in type 2 diabetic patients with coronary heart disease. Ann. Clin. Biochem. 41, 125-129.
Ho H.T., Chung S.K., Law J.W., Ko B.C., Tam S.C., Brooks H.L., Knepper M.A. and Chung S.S. (2000) Aldose reductase-deficient mice develop nephrogenic diabetes insipidus. Mol. Cell Biol. 20, 5840-5846.
Hyndman D., Bauman D.R., Heredia V.V. and Penning T.M. (2003) The aldo-keto reductase superfamily homepage. Chem. Biol. Interact. 143-144, 621-631.
Kato K., Nakamura J., Kamiya H., et al. (2003) Effect of high glucose and C-peptide on proliferation and MAP kinase activity in cultured immortalized mouse Schwann (IMS32) cells. J. Peripher. Nerv. Syst. (Abstract) 8, 183.
Kawamura M., Eisenhofer G., Kopin I.J., et al. (1999) Aldose reductase, a key enzyme in the oxidative deamination of norepinephrine in rats. Biochem. Pharmacol. 58, 517-24.
Kawamura M., Eisenhofer G., Kopin I.J., Kador P.F., Lee Y.S., Fujisawa S. and Sato S. (2002) Aldose reductase: an aldehyde scavenging enzyme in the intraneuronal metabolism of norepinephrine in human sympathetic ganglia. Auton. Neurosci. 96, 131-139.
Kawasaki N., Tanimoto T. and Tanaka A. (1989) Characterization of aldose reductase and aldehyde reductase from rat testis. Biochim. Biophys. Acta 996, 30-36.
Kern T.S. and Engerman R.L. (1982) Immunohistochemical distribution of aldose reductase. Histochem. J. 14, 507-515.
Kersten S., Mandard S., Tan N.S., Escher P., Metzger D., Chambon P., Gonzalez F.J., Desvergne B. and Wahli W. (2000) Characterization of the fasting-induced adipose factor FIAF, a novel peroxisome proliferator-activated receptor target gene. J. Biol. Chem. 275, 28488-28493.
Kikuchi S., Shinpo K., Moriwaka F., Makita Z., Miyata T. and Tashiro K. (1999) Neurotoxicity of methylglyoxal and 3-deoxyglucosone on cultured cortical neurons: synergism between glycation and oxidative stress, possibly involved in neurodegenerative diseases. J. Neurosci. Res. 57, 280-289.
Le Jan S., Amy C., Cazes A., et al. (2003) Angiopoietin-like 4 is a proangiogenic factor produced during ischemia and in conventional renal cell carcinoma. Am. J. Pathol. 162, 1521-1528.
Lin Y., Rajala M.W., Berger J.P., Moller D.E., Barzilai N. and Scherer P.E. (2001)
Hyperglycemia-induced production of acute phase reactants in adipose tissue. J. Biol. Chem. 276, 42077-42083.
Low P.A., Nickander K.K. and Scionti L. (1999) Role of hypoxia, oxidative stress, and excitatory neurotoxins in diabetic polyneuropathy, in Diabetic Neuropathy, (Dyck P.J. and Thomas P.K., eds), pp. 317-329. W.B. Saunders, Philadelphia.
Maekawa K., Tanimoto T., Okada S., Suzuki T., Suzuki T. and Yabe-Nishimura C. (2001) Expression of aldose reductase and sorbitol dehydrogenase genes in Schwann cells isolated from rat: effects of high glucose and osmotic stress. Brain Res. Mol. Brain Res. 87, 251-256.
Martin A., Komada M.R, and Sane D.C. (2003) Abnormal angiogenesis in diabetes mellitus. Med. Res. Rev. 23, 117-145.
Meek R.L., Eriksen N. and Benditt E.P. (1992) Murine serum amyloid A3 is a high density apolipoprotein and is secreted by macrophages. Proc. Natl Acad. Sci. USA 89, 7949-7952.
Mizisin A.P., Li L., Perello M., Freshwater J.D., Kalichman M.W., Roux L. and Calcutt N.A. (1996) Polyol pathway and osmoregulation in JS1 Schwann cells grown in hyperglycemic and hyperosmotic conditions. Am. J. Physiol. 270, F90-97.
Mizisin A.P., Li L. and Calcutt N.A. (1997) Sorbitol accumulation and transmembrane efflux in osmotically stressed JS1 schwannoma cells. Neurosci. Lett. 229, 53-56.
Mizisin A.P. and Powell HC. (2003) Pathogenesis and pathology of diabetic neuropathy,  in Textbook of diabetic neuropathy, (Gries F.A., Cameron N.E., Low P.A. and Ziegler D., eds), pp. 83-169, Georg Thieme Verlag, New York.
Mizuno K., Suzuki T., Tanaka T., Taniko K. and Suzuki T. (2000) Inhibitory effects of fidarestat on aldose reductase and aldehyde reductase activity evaluated by a new method using HPLC with post-column spectrophotometric detection. Biol. Pharm. Bull. 23, 244-248.
Murata-Ohsawa M., Kotani M., Tajima Y., et al. Establishment of immortalized Schwann cells from a Sandhoff mouse and corrective effect of recombinant human β-hexosaminidase A on the accumulated GM2 ganglioside. J. Human Genet., in press (accepted July 15, 2005).
Nakamura J., Kamiya H., Nakae M., Naruse K., Hamada Y., Kato K. and Hotta N. (2003) Effect of bFGF on Schwann cell growth and diabetic neuropathy in rats. J. Peripher. Nerv. Syst. (Abstract) 8, 188-189.
Obrosova I.G. (2002) How does glucose generate oxidative stress in peripheral nerve？ Int. Rev. Neurobiol. 50, 3-35.
Pop-Busui R., Sullivan K.A., Van Huysen C., Bayer L., Cao X., Towns R. and Stevens M.J. (2001) Depletion of taurine in experimental diabetic neuropathy: implications for nerve metabolic, vascular, and functional deficits. Exp. Neurol. 168, 259-272.
Rittner H.L., Hafner V., Klimiuk P.A., Szweda L.I., Goronzy J.J. and Weyand C.M. (1999) Aldose reductase functions as a detoxification system for lipid peroxidation products in vasculitis. J. Clin. Invest. 103, 1007-10013.
Sango K., Horie H., Saito H., Ajiki K., Tokashiki A., Takeshita K., Ishigatsubo Y., Kawano H. and Ishikawa Y. (2002) Diabetes is not a potent inducer of neuronal cell death in mouse sensory ganglia, but it enhances neurite regeneration in vitro. Life Sci. 71, 2351-2368.
Sango K., Oohira A., Ajiki K., Tokashiki A., Horie M. and Kawano H. (2003) Phosphacan and neurocan are repulsive substrata for adhesion and neurite extension of adult rat dorsal root ganglion neurons in vitro. Exp. Neurol. 182, 1-11.
Sango K., Tokashiki A., Ajiki K., Horie M., Kawano H., Watabe K., Horie H. and Kadoya T. (2004) Synthesis, localization and externalization of galectin-1 in mature dorsal root ganglion neurons and Schwann cells. Eur. J. Neurosci. 19, 55-64.
Schmidt A.M., Yan S.D., Yan S.F. and Stern D.M. (2000) The biology of the receptor for advanced glycation end products and its ligands. Biochim. Biophys. Acta 1498, 99-111.
Shen J.S., Watabe K., Meng X.L., Ida H., Ohashi T. and Eto Y. (2002) Establishment and characterization of spontaneously immortalized Schwann cells from murine model of globoid cell leukodystrophy (twitcher). J. Neurosci. Res. 68, 588-594.
Song Z., Fu D.T., Chan Y.S., Leung S., Chung S.S. and Chung S.K. (2003) Transgenic mice overexpressing aldose reductase in Schwann cells show more severe nerve conduction velocity deficit and oxidative stress under hyperglycemic stress. Mol. Cell. Neurosci. 23:, 638-647.
Suzuki K., Koh Y.H., Mizuno H., Hamaoka R. and Taniguchi N. (1998) Overexpression of aldehyde reductase protects PC12 cells from cytotoxicity of methylglyoxal or 3-deoxyglucosone. J. Biochem. 123, 353-357.
Suzuki T., Mizuno K., Yashima S., Watanabe K., Taniko K., Suzuki T. and Yabe-Nishimura C. (1999) Characterization of polyol pathway in Schwann cells isolated from adult rat sciatic nerves. J. Neurosci. Res. 57, 495-503.
Takagi Y., Kashiwagi A., Tanaka Y., Maegawa H. and Shigeta Y. (1995) Significance of fructose-induced protein oxidation and formation of advanced glycation end product. J. Diabetes Complications 9, 87-91.
Takahashi M., Lu Y.B., Myint T., Fujii J., Wada Y. and Taniguchi N. (1995) In vivo glycation of aldehyde reductase, a major 3-deoxyglucosone reducing enzyme: identification of glycation sites. Biochemistry 34, 1433-1438.
Tomlinson D.R. Role of aldose reductase inhibitors in the treatment of diabetic polyneuropathy, in Diabetic Neuropathy, (Dyck P.J. and Thomas P.K., eds), pp. 330-340. W.B. Saunders, Philadelphia.
Tsukiji J., Sango K., Udaka N., et al. (2004) Long-term induction of β-CGRP mRNA in rat lungs by allergic inflammation. Life Sci. 76, 163-177.
Vander Jagt D.L., Robinson B., Taylor K.K. and Hunsaker L.A. (1992) Reduction of trioses by NADPH-dependent aldo-keto reductases. Aldose reductase, methylglyoxal, and diabetic complications. J. Biol. Chem. 267, 4364-4369.
Warming S., Liu P., Suzuki T., Akagi K., Lindtner S., Pavlakis G.N., Jenkins N.A. and  Copeland N.G. (2003) Evi3, a common retroviral integration site in murine B-cell lymphoma, encodes an EBFAZ-related Kruppel-like zinc finger protein. Blood 101, 1934-1940.
Watabe K., Fukuda T., Tanaka J., Honda H., Toyohara K. and Sakai O. (1995) Spontaneously immortalized adult mouse Schwann cells secrete autocrine and paracrine growth-promoting activities. J. Neurosci. Res. 41, 279-290.
Watabe K., Ida H., Uehara K., et al. (2001) Establishment and characterization of immortalized Schwann cells from murine model of Niemann-Pick disease type C (spm/spm). J. Peripher. Nerv. Syst. 6, 85-94.
Watabe K., Sakamoto T., Kawazoe Y., Michikawa M., Miyamoto K., Yamamura T., Saya H. and Araki N. (2003) Tissue culture methods to study neurological disorders: establishment of immortalized Schwann cells from murine disease models. Neuropathology 23, 68-78.
Yabe-Nishimura C. (1998) Aldose reductase in glucose toxicity: a potential target for the prevention of diabetic complications. Pharmacol. Rev. 50, 21-33.
Yasuda H., Terada M., Maeda K., Kogawa S., Sanada M., Haneda M., Kashiwagi A. and Kikkawa R. (2003) Diabetic neuropathy and nerve regeneration. Prog. Neurobiol. 69, 229-285.
Yoshida K., Shimizugawa T., Ono M. and Furukawa H. (2002) Angiopoietin-like protein 4 is a potent hyperlipidemia-inducing factor in mice and inhibitor of lipoprotein lipase. J. Lipid Res. 43, 1770-1772.
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】ＡはIMS32におけるAR 及び SDHの相対的mRNA 発現をノザンブロット解析により測定したことを示す図である。    ＢはIMS32におけるAR 及び SDHの相対的mRNA 発現量を示すグラフである。
【図２】ＡはIMS32におけるARの相対タンパク質発現をウェスタンブロット解析により測定した結果を示す図である。    Ｂは、IMS32におけるARの相対タンパク質発現量を示すグラフである。
【図３】IMS32の細胞質中のAR タンパク質の免疫細胞化学的局在を示す写真である。
【図４】細胞内ソルビトール及びフルクトースの細胞内含有量をガスクロマトグラフィーで測定したグラフである。
【図５】ＡはIMS32中の Saa3、Agptl4 及び Evi3 の相対的mRNA 発現を半定量的RT-PCRで測定した写真である。    Ｂは、IMS32中の Saa3、Agptl4 及び Evi3 の相対的mRNA 発現量を示すグラフである。
【図６】ＡはIMS32において、AKR1A4 の相対的mRNA 発現をノザンブロット解析により測定したグラフである。    Ｂは、IMS32において、AKR1A4 の相対的mRNA 発現量を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
配列番号１５：プライマー
配列番号１６：プライマー
【図１】
2007116925.tif 000003
【図２】
2007116925.tif 000004
【図３】
2007116925.tif 000005
【図４】
2007116925.tif 000006
【図５】
2007116925.tif 000007
【図６】
2007116925.tif 000008
【配列表】
2007116925000001.app