(57)【要約】      （修正有）【課題】障壁機能が正常なヒトの表皮に近似していると共に、セラミドプロフィールが改善された、再構築皮膚モデルを容易に得られるようにするための方法を提供する。【解決手段】再構築表皮又は皮膚等価物の培養培地に、セラミド７及び／又は５．５の少なくとも一の誘導体を導入し、及び／又はセラミド７及び／又は５．５の少なくとも一の誘導体が導入されたラメラ状脂質小胞体をベースとする組成物を、再構築皮膚又は該皮膚等価物の表面に局所的に適用することを含む。セラミド７及び／又は５．５の誘導体は、次の式(Ｉ)：2007246538.tif 000021[上式中、Ｘは水素原子又はヒドロキシル基を表し、ｎは１９〜２９を表し、ｍは９〜１９を表す]のものを使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外側水性相中に、親水層により互いに分離させられたラメラ状脂質相により形成された小胞体が分散した分散液を含有し、前記ラメラ相が少なくとも一の両親媒性脂質を含有し、Ｘが水素原子を表す、式（Ｉ）：
【化１】
2007246538.tif 000015
[上式中：
−  Ｘは水素原子又はヒドロキシル(ＯＨ)基を表し；
−  ｎは１９〜２９の範囲の整数を表し；
−  ｍは９〜１９の範囲の整数を表す]
のセラミド５．５ファミリーの少なくとも一の誘導体が前記ラメラ状脂質相に含有されている化粧品組成物。
【請求項２】
小胞体がニオソーム又はリポソームであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
式(Ｉ)の誘導体の量が、小胞体を構成している脂質組成物の全重量に対して０．００１％〜５％であることを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
分散液中の水性相の量に対する脂質相の量の重量比が、１／１０００〜３００／１０００であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ラメラ状相が：
−  ポリオキシエチレン化されていてもいなくてもよい、脂肪酸とポリオールのエステル及び／又はエーテル；
−  α-ブチルグリコシドの脂肪酸のエステル及び／又はエーテル；
−  水素化されていてもいなくてもよい、合成又は天然のリン脂質；
から選択される少なくとも一の非イオン性の両親媒性脂質を含有していることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
脂肪酸とポリオールのエステル又はエーテルが、ポリオール基当たりのアルキル鎖の数が１〜１０である、直鎖状又は分枝状で飽和又は不飽和のＣ５-Ｃ２２アルキル鎖を有する少なくとも一の脂肪酸と、２〜３０のエチレンオキシド単位を担持するグルコース類、スクロール類、２〜１５のグリセロール単位を有するポリグリセロール類、２〜３０のエチレンオキシド単位を担持するグリセロール、２〜６０のエチレンオキシド単位を担持するソルビタン、ソルビタン、１〜６０のエチレンオキシド単位を有するポリエチレングリコールからなる群から選択される少なくとも一のポリオールとのエステル混合物又はエーテル混合物から選択されることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
α-ブチルグリコシドの脂肪酸のエステル及び／又はエーテルが、
−  種々の脂肪鎖が、１又は２の違いの炭素原子を有する、α-ブチルグルコシドの種々の脂肪酸のエステル混合物及び／又はエーテル混合物、又は
−  α-ブチルグルコシドの同じ脂肪酸のモノ-、ジ-、トリ-又はポリエーテルの混合物及び／又はモノ-、ジ-、トリ-又はポリエステルの混合物であり；
α-ブチルグルコシドの脂肪酸の前記エステル及び前記エーテルが、８〜２４の炭素原子を有する脂肪鎖を含有することを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
ラメラ状相が少なくとも一のイオン性の両親媒性脂質をさらに含有していることを特徴とする、請求項５ないし７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
イオン性の両親媒性脂質が：
−  リン酸ジミリスチル及びジセチルのアルカリ塩；
−  硫酸コレステロールのアルカリ塩；
−  リン酸コレステロールのアルカリ塩；
−  味の素からアシルグルタマートＨＳ２１の名称で販売されているＮ-ステアロイル-Ｌ-グルタミン酸の二ナトリウム塩のような、アシルグルタミン酸一ナトリウム及び二ナトリウム塩等の、リポアミノ酸及びそれらの塩；
−  ホスファチジン酸のナトリウム塩；
−  リン脂質；
−  次の式(Ｘ)：
【化２】
2007246538.tif 000016
[上式中、ＲはＣ１６-Ｃ２２アルキル基を表し、Ｍはアルカリ又はアルカリ土類金属、例えばナトリウム；及びそれらの混合物である]
のアルキルスルホン誘導体；
−  第４級アンモニウム塩、及び脂肪アミン及びその塩；
からなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
第４級アンモニウム塩が：
−  次の式(ＸＩ)：
【化３】
2007246538.tif 000017
[上式中、Ｒ１ないしＲ４基は同一でも異なっていてもよく、直鎖状又は分枝状で１〜３０の炭素原子を有する脂肪族基、又はアリール又はアルキルアリール等の芳香族基を示し；Ｘはハロゲン化物、ホスファート類、アセタート類、ラクタート類、(Ｃ２-Ｃ６)アルキルスルファート類、アルキルスルホナート類及びアルキルアリールスルホナート類から選択されるアニオンである]
で表される第４級アンモニウム塩；
−  次の式(ＸＩＩ)：
【化４】
2007246538.tif 000018
[上式中、Ｒ５は、獣脂脂肪酸誘導体等の８〜３０の炭素原子を有するアルケニル又はアルキル基を表し、Ｒ６は水素原子、Ｃ１-Ｃ４アルキル基又は８〜３０の炭素原子を有するアルケニル又はアルキル基を表し、Ｒ７はＣ１-Ｃ４アルキル基を表し、Ｒ８は水素原子又はＣ１-Ｃ４アルキル基を表し、Ｘはハロゲン化物、ホスファート類、アセタート類、ラクタート類、アルキルスルファート類、アルキルスルホナート類及びアルキルアリールスルホナート類の群から選択されるアニオンである]
で表されるイミダゾリウムの第４級アンモニウム塩；
−  次の式(ＸＩＩＩ)：
【化５】
2007246538.tif 000019
[上式中、Ｒ９は約１６〜３０の炭素原子を有する脂肪族基を示し、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は同一でも異なっていてもよく、水素及び１〜４の炭素原子を有するアルキル基から選ばれ、Ｘはハロゲン化物、アセタート類、ホスファート類、ニトラート類及び硫酸メチルの群から選択されるアニオンである]
で表される二第４級アンモニウム塩、
−  少なくとも一のエステル官能基を有する第４級アンモニウム塩；
から選択されることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
少なくとも一のエステル官能基を有する第４級アンモニウム塩が、次の式（ＸＩＶ）：
【化６】
2007246538.tif 000020
[上式中、
−  Ｒ１５は、Ｃ１-Ｃ６アルキル基及びＣ１-Ｃ６ヒドロキシアルキル又はジヒドロキシアルキル基から選択され；
−  Ｒ１６は、
・Ｒ１９-ＣＯ-基；
・直鎖状又は分枝状で飽和又は不飽和のＣ１-Ｃ２２炭化水素ベース基であるＲ２０；
・水素原子；
から選択され；
−  Ｒ１８は、
・水素原子、
・Ｒ２１-ＣＯ-基；
・直鎖状又は分枝状で飽和又は不飽和のＣ１-Ｃ６炭化水素ベース基であるＲ２２、
から選択され；
−  Ｒ１７、Ｒ１９及びＲ２１は同一でも異なっていてもよく、直鎖状又は分枝状で飽和又は不飽和のＣ７-Ｃ２１炭化水素ベース基から選択され；
−  ｎ、ｐ及びｒは同一でも異なっていてもよく、２〜６の範囲の整数であり；
−  ｙは１から１０の範囲の整数であり；
−  ｘとｚは同一でも異なっていてもよく、０から１０の範囲の整数であり；
−  Ｘ−は、単純又は複合の有機又は無機アニオンである]
に相当し、但しｘ＋ｙ＋ｚの合計が１〜１５であり、ｘが０の場合、Ｒ１６はＲ２０であり、ｚが０の場合、Ｒ１８はＲ２２であることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
少なくとも一のエステル官能基を有する第４級アンモニウム塩が、式(ＸＩＶ)において：
−  Ｒ１５がメチル又はエチル基を示し；
−  ｘ及びｙが１に等しく；
−  ｚが０又は１に等しく；
−  ｎ、ｐ及びｒが２に等しく；
−  Ｒ１６が、
・Ｒ１９-ＣＯ-基；
・メチル、エチル、又はＣ１４-Ｃ２２炭化水素ベース基、
・水素原子、
から選択され；
−  Ｒ１８が、
・Ｒ２１-ＣＯ-基；
・水素原子、
から選択され；
−  Ｒ１７、Ｒ１９及びＲ２１は同一でも異なっていてもよく、直鎖状又は分枝状で飽和又は不飽和のＣ１３-Ｃ１７炭化水素ベース基、好ましくは直鎖状又は分枝状で飽和又は不飽和のＣ１３-Ｃ１７アルキル及びアルケニル基から選択される；
ものに相当することを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
両親媒性脂質の量に対する非イオン性の両親媒性脂質の量の重量比が、５０／１〜５０／２５であることを特徴とする請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ラメラ状相が、ステロール類、脂肪鎖アルコール類及びジオール類、及び脂肪鎖アミン類及びその第４級アンモニウム誘導体から選択される、少なくとも一の添加剤を含有していることを特徴とする、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記添加剤がコレステロールであることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
組成物が、前記ラメラ状脂質相に含まれる少なくとも一の他のセラミドを含有しており、該セラミドがセラミドＳＴＡＲ、１、２、２．５、３、４、５及び／又は６から選択されることを特徴とする、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
セラミドがセラミドＳＴＡＲ及び／又は４から選択されることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
組成物が、アスコルビン酸又はその類似体、レシチン類、スフィンゴ糖脂質、リン脂質、コレステロール、フィトステロール（スチグマステロール、β-シトステロール、キャンペステロール）、必須脂肪酸、１,２-ジアシルグリセロール、４-クロマノン、ウルソル酸等の五環系トリテルペン類、ワセリン及びラノリンから選択される、障壁機能を改善するための他の化合物を含有していることを特徴とする、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
落屑剤；保湿剤；色素脱失剤又は色素形成誘発剤；抗グリケーション剤；ＮＯ-シンターゼインヒビター；筋肉弛緩剤；収斂剤；汚染防止剤及び／又はフリーラジカル捕捉剤；及びそれらの混合物から選択される少なくとも一の付加的な活性剤を含有していることを特徴とする、請求項１ないし１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
防腐剤、酸化防止剤、溶媒、香料、臭気吸収剤、中和剤、サンスクリーン剤、ポリマー類、乳化剤及び共乳化剤、及び染料から選択されるアジュバントを含有していることを特徴とする請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セラミド７及び／又は５．５の少なくとも一の誘導体が補填された再構築表皮(reconstructed epidermis)又は皮膚等価物(skin equivalent)の調製方法であって、該再構築表皮又は皮膚等価物の培養培地に、セラミド７及び／又は５．５の少なくとも一の誘導体を導入し、及び／又はセラミド７及び／又は５．５の少なくとも一の誘導体が導入されたラメラ状脂質小胞体ベースの組成物を、前記再構築表皮又は前記皮膚等価物に局所的に適用することを含む方法に関する。
また本発明は、セラミド５．５ファミリーの少なくとも一の誘導体を含有する再構築表皮又は皮膚等価物に関する。
さらに本発明は、外側水性相中に、親水層により互いに分離させられたラメラ状脂質相により形成された小胞体が分散した分散液を含有する組成物で、前記ラメラ相が少なくとも一の両親媒性脂質、及びセラミド７及び／又はセラミド５．５ファミリーの少なくとも一の誘導体がラメラ状脂質相に含まれている組成物、及び正常なヒトの表皮の障壁機能を強化し、６-ヒドロキシ-４スフィンゲニン-塩基のセラミド類のわずかであっても欠乏を示す表皮、特に乾燥肌、及び再構築皮膚又は皮膚等価物の障壁機能を改善するための、前記組成物の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚は、２つの区画、すなわち深層区画である真皮と表層区画である表皮とからなる。表皮は外部の環境と接している。表皮の役割は、脱水と、化学的、機械的、物理的又は感染性のものであれ、外部攻撃から器官を保護することにある。
天然のヒトの表皮は、主に三種の細胞、すなわち、大部分を占めるケラチノサイトと、メラノサイトとランゲルハンス細胞から構成されている。これらの細胞型の各々は、それ自身の機能により、生物体において皮膚が果たす本質的な役割に寄与している。
表皮を構成する細胞は脂質ドメインにより画成されている。分化の間、その役割が表皮の生きている層の細胞膜の流動構造を形成させることであるリン脂質が、主として脂肪酸、コレステロール及びスフィンゴ脂質からなる混合物と徐々に置き換えられる。
これらの脂質は、その完全性が、存在しているフラクションの質に依存するばかりでなくその各々の割合にも依存する特定のラメラ状液晶相に組織化されている。表皮の脂質ドメインにおける脂質のこのラメラ構造により、表皮の障壁機能が得られている。
表皮の脂質は主に生きた表皮において合成されている。それらは、主としてリン脂質、セラミド類（又はスフィンゴ脂質)、コレステロール、遊離脂肪酸、トリグリセリド類、コレステロールのエステル類及びアルカン類からなる。
【０００３】
セラミド類は、表皮脂質の必須構成成分の一つであり、部分的には、そのラメラ状液晶構造をもたらすばかりでなく、表皮の障壁機能をももたらすものである。
セラミド類は、飽和していてもよく、α-ヒドロキシル化していてもよく、又はωエステル化していてもよい脂肪酸と、スフィンガニン、スフィンゲニン、フィトスフィンゴシン及び６-ヒドロキシ-４-スフィンゲニン等、４種類でありうるフィンゴイド塩基からなる。塩基と脂肪酸との可能な種々の組合せにより、Robson, K.J.；Stewart, M.E.；Michelsen, S.；Lazo, N.D.；Downing, D.T., 6-hydroxy-4-sphingenine in human epidermal ceramides, J. Lipid Res. 1994 35：2060-2068；及びChopart M., Castiel-Higounenc I., Arbey E., Guey C., Gaetani Q., Schmidt R., The Normal Human stratum corneum：a new ceramide profile, Perspectives in Percutaneous Penetration, 8th International Conference, Antibes Juan-Les-Pins-France, April 2-6, 2002に列挙されているように、約１０種のセラミド類が得られる。
【０００４】
程度の差はあれヒトの皮膚に近いモデルの開発はできている。例えば、特許出願ＥＰ-Ａ-２８５４７１、ＥＰ-Ａ-２８５４７４、ＥＰ-Ａ-７８９０７４、ＥＰ-Ａ-５０２１７２、ＥＰ-Ａ-４１８０３５、ＷＯ-Ａ-９１１６０１０、ＥＰ-Ａ-１９７０９０、ＥＰ-Ａ-２０７５３、ＦＲ-Ａ-２６６５１７５、ＦＲ-Ａ-２６８９９０４、及びＦＲ-Ａ-２７９２６５０に記載されているモデルを挙げることができる。
極めて一般的には、これらの文献に記載されている再構築皮膚のモデルは、多くの場合は真皮等価物である支持体上に付着され、表皮等価物の形成に至る分化プログラムになるような条件下で培養されてなる、例えばメラノサイト及び／又はランゲルハンス細胞のような他の皮膚細胞と場合によっては組合せられるヒトケラチノサイトを含んでなる。今日までに記載されている真皮等価物は、人工膜、例えばミリポア(Millipore)(商標)フィルター、コラーゲンベースの皮下代替品、プラスチック又は細胞生存性と適合性のある任意の他の支持体、又は自然の真皮により近くなるようにさらに改良された支持体、例えば前もって脱表皮化された(pre-de-epidermalized)真皮又はコラーゲン／線維芽細胞の混合格子(lattices)である。コラーゲン／線維芽細胞の混合格子において、天然のコラーゲンと単離されたヒト線維芽細胞とが組合されて、時間の作用を被っていない真皮を模倣する真皮等価物が得られる。
【０００５】
再構築皮膚モデルは、一般的に不完全な障壁機能しか示さない(M. Ponec, P.J.J. Wauben-Penris, A. Burger, J. Kempenaarr, H.E. Bodde, Skin Pharmacol 1990；3：pp.126-135)。この不完全さは、正常なヒトの表皮と比較して観察されるこのモデルのセラミドプロフィールの重大な改変に因るところが大きい。
さらに、アトピー性、乾燥性及び加齢した皮膚には、セラミド類１及び／又は３の合成の減少が伴っていることが従来から知られている。例えば次の文献が挙げられる：
−  Imokawaら, J Invest Dermatol, 96(4)：523-6, 1991は、セラミド類が障壁機能に関与しており、それらの合成、特にセラミド１の合成がアトピー性及び乾燥性の皮膚の場合では低減していることを記載している。
−  Di Nardoら, Acta Derm Venereol, 78(1)：27-30, 1998は、直ぐに刺激されるアトピー性皮膚炎及び障壁機能が損なわれている乾燥肌について記載している。著者は、セラミド類１及び３の合成の減少が、アトピー性皮膚炎における障壁機能障害と乾燥肌の原因であるかもしれないことを示した。
−  Rogersら, Arch. Dermaol. Res. 288：765-770, 1996は、加齢した皮膚における、特に冬季の乾燥症及び障壁機能障害の原因となっているセラミド類、特にセラミド１の合成の減少について記載している。
−  Rogersら, J. Invest. Dermatol. 100：510, 1993は、乾燥肌の脂質多層構造が障害を受け、この障害が遊離の脂肪鎖の増加とセラミド類の減少を伴っていることについて記載している。
【０００６】
加齢した皮膚、乾燥肌及び皮膚の過敏性を改善するために、セラミド合成刺激剤として、スフィンガニン及びスフィンゴシン塩基、脂肪酸アミド類、及びビタミンＢ３から選択されるセラミド合成のための前駆体を含有する組成物（ＷＯ９９／４７１１４）が、セラミド合成刺激剤として、脂肪酸、スフィンガニン及びスフィンゴシン塩基、及びビタミンＡから選択されるセラミド類の合成経路の中間体又は前駆体を含有する組成物（ＷＯ９４／２３６９４）と同様に既に知られている。
【０００７】
さらに、M. Ponecら, Skin  Pharmacol 1990；3：pp.126-135は、再構築皮膚モデルが、一般的に不完全な障壁機能しか示さないと記載している。この不完全さは、正常なヒトの表皮と比較して観察されるこのモデルのセラミドプロフィールの重大な改変に因るところが大きい。
【０００８】
また、文献ＦＲ２８１１５５６から、再構築皮膚の障壁機能を高め、表皮、特に乾燥した及び／又は荒れた及び／又はダメージを受けた皮膚の脂質障壁を強化し、及び／又は角質層の整合性を再確立又は保持し、及び／又は皮膚の表面の外観及び／又は保湿性を改善し、及び／又は皮膚、特に乾燥して荒れた皮膚を保護し、及び／又はケラチン物質(皮膚、毛髪、睫、爪)に必須の栄養剤として、及び／又は再構築皮膚又は皮膚等価物の脂質障壁を強化し、及び／又はインビボ及びインビトロにおけるヒトの表皮の脂質含有量を高め及び／又は保持し、及び／又は脂質含有量及び／又は障壁特性値といった、再構築表皮及び／又は表皮細胞培養体の質及び特性を改善するために、６-ヒドロキシ-４-スフィンゲニンを使用することは、従来から行われている。
【０００９】
しかしながら、６-ヒドロキシ-４-スフィンゲニンを使用しても、表皮において脂肪酸と組合せられた後、インシトゥーで得られるであろうセラミドの種類を制御することができない。実際、６-ヒドロキシ-４-スフィンゲニンは、いくつかのセラミド類：セラミドＳＴＡＲ、４、５．５及び７を構成するスフィンゴイド塩基である("The Normal Human stratum corneum：a new ceramide profile" M.Chopartら, Prospectives in Percutaneous Penetration, 8th International Conference, Antibes Juan-Les Pins, France, 2-6, April 2002及びKaneboのJP2000/143598公報)。さらに、再構築皮膚は、その生存性を限られた期間(約１ヶ月)のみ維持できる脆弱な構造体である。よって、再構築皮膚が障壁機能を獲得するための時間の獲得がその寿命に関連した重要なパラメータとなる。
【００１０】
再構築皮膚の脂質プロフィールを改善するため、培養培地にアスコルビン酸すなわちビタミンＣ(J. Invest. Dermatol. 109：348-355, 1997)又はアスコルビン酸誘導体(ＦＲ２８０７３２０)を添加することが、また従来から行われている。
しかしながら、アスコルビン酸は、その化学構造(アルファ-ケトラクトン)のために、ある種の環境パラメータ、例えば光、熱及び水性媒体、特にアルカリ性及び／又は好気性媒体に対して非常に敏感である。これらの安定性に関する問題があるために、アスコルビン酸を含有する組成物の皮膚に対する効果を観察するには、高濃度のアスコルビン酸を使用する必要がある。さらに、アスコルビン酸又はその誘導体の一つを培養培地に導入しても、インシトゥーで合成されるセラミドの正確な種類を制御することができない。
よって、正常なヒトの表皮に近似したものとなる障壁機能を持つ、セラミドプロフィールが改善された、より迅速に再構築される皮膚モデルを得るための他の方法が必要とされている。
【特許文献１】WO99/47114
【特許文献２】WO94/23694
【特許文献３】FR2811556
【特許文献４】JP2000/143598
【特許文献５】FR2807320
【非特許文献６】M. Ponec, P.J.J. Wauben-Penris, A. Burger, J. Kempenaarr, H.E. Bodde, Skin Pharmacol 1990；3：pp.126-135
【非特許文献７】Imokawaら, J Invest Dermatol, 96(4)：523-6, 1991
【非特許文献８】Di Nardoら, Acta Derm Venereol, 78(1)：27-30, 1998
【非特許文献９】Rogersら, Arch. Dermaol. Res. 288：765-770, 1996
【非特許文献１０】Rogersら, J. Invest. Dermatol. 100：510, 1993
【非特許文献１１】M. Ponecら, Skin  Pharmacol 1990；3：pp.126-135
【非特許文献１２】M.Chopartら,  Prospectives in Percutaneous Penetration,  8th International Conference, Antibes Juan-Les Pins, France, 2-6, April 2002
【非特許文献１３】J. Invest. Dermatol. 109：348-355, 1997
【発明の開示】
【００１１】
本出願人は、培養培地中に、セラミド７及び／又は５．５の少なくとも一の誘導体を導入し、及び／又はセラミド７及び／又は５．５の少なくとも一の誘導体が導入されたラメラ状脂質小胞体をベースとする組成物を、再構築表皮又は皮膚等価物に局所的に適用することを含む、セラミド７及び／又は５．５の少なくとも一の誘導体が補填された再構築表皮又は皮膚等価物を調製するための新規の方法を見出した。
その新規な調製方法により、皮膚等価物又は再構築皮膚における割合を増加させて、セラミドの種類を正確に制御することで、式(Ｉ)のセラミド５．５及び／又は７の少なくとも一の誘導体、好ましくは式(Ｉ)のセラミド７の誘導体が補填された再構築皮膚又は皮膚等価物を得ることが可能になる。
【００１２】
また本出願人は、セラミド７及び／又はセラミド５．５ファミリーの少なくとも一の誘導体が導入されたラメラ状脂質小胞体をベースとする組成物により、６-ヒドロキシ-４-スフィンゲニン-塩基のセラミド類が不足した表皮の障壁機能を改善することができることを見出した。特に本発明においては、乾燥肌及び再構築皮膚(エピスキン(EPISKINTM)モデルについてなされた研究)では殆どの極性のあるセラミド類が不足しており、その結果、６-ヒドロキシ-４-スフィンゲニン(また６-ヒドロキシ-４-スフィンゴシンとも称される)スフィンゴイド塩基が不足することが実証されているから、このことは特に有利である。
よって、本発明の第１の主題は、再構築表皮又は皮膚等価物の培養培地中に、セラミド７及び／又は５．５の少なくとも一の誘導体を導入し、及び／又はセラミド７及び／又は５．５の少なくとも一の誘導体が導入されたラメラ状脂質小胞体をベースとする組成物を、前記再構築表皮又は前記皮膚等価物の表面に局所的に適用することを含む、セラミド７及び／又は５．５の少なくとも一の誘導体が補填された再構築表皮又は皮膚等価物の調製方法であって、前記セラミド７及び／又は５．５の誘導体が、次の式(Ｉ)：
【化１】
2007246538.tif 000002
[上式中：
−  Ｘは水素原子又はヒドロキシル(ＯＨ)基；有利にはヒドロキシル基を表し；
−  ｎは１９〜２９、好ましくは２１〜２７の範囲、有利には２１、２２又は２３に等しい整数を表し；
−  ｍは９〜１９、好ましくは９〜１５の範囲；有利には１１、１２又は１３に等しい整数を表す]
のものである方法に関する。
式(Ｉ)のセラミド５．５の誘導体は、Ｘが水素原子を表すものである。式(Ｉ)のセラミド７の誘導体は、Ｘがヒドロキシル基を表すものである。
【００１３】
本発明の好ましい実施態様では、式(Ｉ)の化合物は、ｎが２１〜２７、ｍが９〜１５であるものである。
本発明の他の好ましい実施態様では、式(Ｉ)の化合物は、ｎが２１、２２又は２３に等しく、ｍが１１、１２又は１３に等しいものである。Robsonら, J. Lipid Res. 1994 35：2060-2068により記載されているように、ｎが２１に等しく、ｍが１１に等しい式(Ｉ)の化合物に相当するセラミド７が、本発明において特に好ましい。
【００１４】
本発明の方法において、培養培地に導入される式(Ｉ)の少なくとも一の誘導体の濃度は、培養培地の１０ｇ／ｌ〜１０−６ｇ／ｌ、好ましくは１ｇ／ｌ〜１０−５ｇ／ｌ、有利には１０−１ｇ／ｌ〜１０−５ｇ／ｌである。
【００１５】
式(Ｉ)のセラミド５．５及び／又は７の少なくとも一の誘導体の培養培地への導入は、最終的に式(Ｉ)のセラミド５．５及び／又は７を培養培地に可溶化させるような方法から選択される、種々の方法により実施され得る。実際、式(Ｉ)のセラミド５．５及び／又は７の誘導体は親油性構造であるため、培養培地へのこの溶解は先験的には明白ではないことが理解される。第１の変形例では、前記誘導体を溶媒に予め溶解させておく。他の変形例では、前記誘導体を、それを輸送可能な他の分子と予め組合せておく。さらに他の変形例は、少なくとも前記セラミド７及び／又は５．５ファミリーの誘導体が導入されたラメラ状脂質小胞体をベースとする組成物を、予め調製しておくことからなる。ついで、このようにして予め得られたこれらの組成物、組合せ及び／又は溶媒を培養培地に導入する。
【００１６】
選択される溶媒は、式(Ｉ)のセラミド７及び／又は５．５を可溶化できなければならない。ついで、得られた溶液を培養培地に導入する。培養培地に導入される溶媒量は、表皮の正常な発育及びそのホメオスタシスを阻害しないような量である。有利には、式(Ｉ)のセラミド７及び／又は５．５は、所望する濃度でエタノール又はＤＭＳＯに溶解されうる；培養培地に導入された溶媒の最終的な比率は、１／１０００を超えてはいけない。
【００１７】
また本発明の方法は、少なくとも一の前記誘導体と、該誘導体を培養培地から輸送し、再構築表皮又は皮膚等価物内でそれを生物学的に利用可能なものとすることができる少なくとも一の分子とを含む、予め調製された組合せ物を培養培地中に導入することからなる。
前記誘導体を輸送し、それを生物学的に利用可能にすることができる分子は、ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)及び／又は同様にして培養培地内での輸送と可溶化を可能にするシクロデキストリンファミリーの化合物又はシクロデキストリンファミリー誘導体から、有利に選択される。
【００１８】
式(Ｉ)のセラミド７及び／又は５．５がＢＳＡと組合せられる場合、ＢＳＡに対するモル比は、例えば１／１０００〜１／３、好ましくは１／１００〜１／５である。培養培地に導入され得るＢＳＡの濃度は、１００μｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは０．５μｍｏｌ／ｌ〜１００μｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１０μｍｏｌ／ｌ〜５０μｍｏｌ／ｌとすべきである。
式(Ｉ)のセラミド７及び／又は５．５が、同様にして培養培地内での輸送及び可溶化を可能にする、シクロデキストリンファミリーの少なくとも一の化合物、有利にはＨＰＢＣＤ又は１２-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、又はシクロデキストリンファミリーの誘導体と組合せられる場合、式(Ｉ)のセラミド７及び／又は５．５のおよその濃度は、例えばシクロデキストリン類の５０％溶液(水で希釈)の０．０１ｎｍｏｌ／μｌ〜１００ｎｍｏｌ／μｌ、好ましくは０．１ｎｍｏｌ／μｌ〜１０ｎｍｏｌ／μｌ、特に１ｎｍｏｌ／μｌ〜５ｎｍｏｌ／μｌになるようにされる。もちろんこの濃度は、選択される誘導体及び培養培地自体の二次組成の関数として調節されるであろう。ついで、この調製物を培養培地中に導入し、このようにして導入された容量は、式(Ｉ)のセラミド７及び／又は５．５の所望最終濃度に調節される。
【００１９】
式(Ｉ)のセラミド７及び／又は５．５及びビヒクルからなる上述した組合せは：
−  培養培地の５０μｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは０．５μｍｏｌ／ｌ〜５０μｍｏｌ／ｌ、有利には２１μｍｏｌ／ｌの濃度の酸化防止剤、有利には酢酸ＤＬ-α-トコフェロール、及び／又は
−  培養培地の１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．５〜１００μｍｏｌ／ｌ、有利には１０μｍｏｌ／ｌの濃度の細胞輸送剤、有利にはＬ-カルニチン；
をさらに含有していてもよい。
【００２０】
本発明の方法が、セラミド７及び／又は５．５ファミリーの少なくとも一の誘導体が導入されたラメラ状脂質小胞体をベースとする組成物を、培養培地中に導入することからなる場合、前記組成物は、外側水性相中に、親水層により互いに分離させられたラメラ状脂質相により形成された小胞体が分散した分散液を含有し、前記ラメラ相は少なくとも一の両親媒性脂質を含有し、前記式(Ｉ)の少なくとも一の誘導体は該ラメラ状脂質相に含有される。
上述された濃度は、表皮の正常な発育及びそのホメオスタシスを阻害しないような濃度範囲が保持されるように調節(増加又は減少)してもよい。
【００２１】
本発明の培養培地は、当業者によく知られている培地である。それは特に、次の公報：ＥＰ-Ａ-２８５４７１、ＥＰ-Ａ-２８５４７４、ＥＰ-Ａ-７８９０７４、ＥＰ-Ａ-５０２１７２、ＥＰ-Ａ-４１８０３５、ＷＯ-Ａ-９１１６０１０、ＥＰ-Ａ-１９７０９０、ＥＰ-Ａ-２０７５３、ＥＰ-Ａ-２６６５１７５、ＦＲ-Ａ-２６８９９０４、ＦＲ-Ａ-２７９２６５０及びＦＲ２８１１５５６の一つに記載されている培地である。
【００２２】
本発明の方法の他の実施態様では、少なくとも一の式(Ｉ)のセラミド７及び／又は５．５が補填された再構築皮膚は、セラミド７及び／又は５．５ファミリーの少なくとも一の誘導体が導入されたラメラ状脂質小胞体をベースとする組成物を、培地中の表皮の表面に局所的に適用することにより得られる。有利には、前記組成物は、外側水性相中に、親水層により互いに分離させられたラメラ状脂質相により形成された小胞体が分散した分散液を含有し、前記ラメラ相は少なくとも一の両親媒性脂質を含有し、式(Ｉ)の少なくとも一の誘導体は前記ラメラ状脂質相に含有される。
【００２３】
本発明の他の主題は、外側水性相中に、親水層により互いに分離させられたラメラ状脂質相により形成された小胞体が分散した分散液を含有する組成物であって、前記ラメラ相が少なくとも一の両親媒性脂質を含有し、上述した式(Ｉ)の少なくとも一の誘導体が、該ラメラ状脂質相に含有される組成物に関する。
本発明の組成物は、特にスキンケアに使用され得る。特に、本発明の組成物により、乾燥肌、荒れた及び／又はダメージを受けた及び／又は加齢した及び／又は敏感な及び／又はアトピー性の皮膚、再構築皮膚又は皮膚等価物、並びに６-ヒドロキシ-４-スフィンゲニン-塩基のセラミド類の欠乏をわずかでも示す任意の表皮の障壁機能を改善し、あるいはさらに正常なヒトの皮膚の障壁機能を強化することが可能になる。
【００２４】
よって、本発明の他の主題は：
−  正常なヒトの表皮の障壁機能を強化し、及び／又は
−  再構築皮膚又は皮膚等価物の障壁機能を強化し、ここで有利には再構築皮膚がエピスキン(EPISKINTM)モデルであり、及び／又は
−  ６-ヒドロキシ-４-スフィンゲニン-塩基のセラミド類の欠乏をわずかでも示す表皮、好ましくは乾燥肌、あるいは荒れた及び／又はダメージを受けた及び／又は加齢した及び／又は敏感な皮膚の障壁機能を改善し、及び／又は
−  角質層の整合性(integrity)を再確立又は保持し、及び／又は
−  皮膚の表面の外観及び／又は保湿性を改善し、及び／又は
−  インビボ及びインビトロで、ヒトの表皮の脂質含有量を改善又は保持し、及び／又は
−  脂質含有量及び／又は障壁特性といった、再構築表皮及び／又は表皮細胞培養体の質及び特性を改善するための、
前記組成物の使用に関する。
【００２５】
また本発明の他の主題は、アトピー性の皮膚の処置を意図した組成物を製造するための、本発明の組成物の使用に関する。
再構築皮膚がヒトの皮膚に近いモデルを表すことは、よく証明されている。その結果、再構築皮膚の障壁機能を増大させることが可能な本発明の組成物は、その障壁機能を増大又は保持可能にするセラミドのプロフィールを維持し又は再樹立することにより、正常なヒトの表皮にとって、さらには６-ヒドロキシ-４-スフィンゲニン-塩基のセラミド類の欠乏をわずかでも示す任意の表皮、特に乾燥及び／又は荒れた及び／又はダメージを受けた及び／又は加齢した及び／又は敏感な皮膚の表皮、及び／又はアトピー性の皮膚にとって、価値のあるものとなる。
さらに本発明の主題は、上述した組成物を皮膚に局所的に適用することからなることを特徴とする、ヒトの皮膚をより魅力的に又は保湿するための美容処理方法に関する。
【００２６】
「小胞体(vesicle)」又は「小胞体分散液」なる用語は、水又は親水性媒体と接触して、コアが親水性(水又は親水性混合物)で、壁部がラメラ状液晶型の二重層からなる粒子を形成する両親媒性脂質の分散液を意味するものと理解される。これらの小胞体は、一般的にリポソームと称されている。それらは、主として、水素化されていてもされていなくてもよい、天然又は合成のリン脂質からなる。ニオソームに関しては、それらはイオン性界面活性剤及び／又はコレステロールと組合わされていてもよい非イオン性界面活性剤からなる。
本発明の小胞体は、二分子型で、実質的に同心である、１〜２５のラメラ相の小葉(leaflets)からなるか又はこれを含有する。
本発明の小胞体は、特許出願ＥＰ０９５８８５６、ＥＰ０５８２５０３、ＥＰ０４５５５２８及びＥＰ００４３３２７に記載されているようなタイプのニオソーム類か、又は一般的なタイプのリポソーム類のいずれであってもよい。本発明の式(Ｉ)の誘導体は、この種の構造において、ラメラ相の構成物質の一つとなる。
【００２７】
式(Ｉ)の誘導体の量は、小胞体を構成している脂質組成物の全重量に対して、０．００１％〜３０％、好ましくは０．００１％〜１０％、有利には０．００１％〜５％の範囲である。
分散液における水性相の量に対する脂質相の量の重量比は、１／１０００〜３００／１０００である。
【００２８】
本発明の小胞体分散液は、当業者によく知られている多くの方法によって調製できる。例えば、第１の方法では、本発明の式(Ｉ)の誘導体を含む全ての両親媒性脂質を、揮発性溶媒に溶解させ、溶媒を蒸発させることにより、フラスコの壁面に薄い脂質皮膜を形成させ、ついで脂質皮膜をオクチルグルコシド水溶液に取り込み、オクチルグルコシド／小胞体脂質混合ミセルを形成させる。ついでこの溶液を蒸留水により透析する。オクチルグルコシドを透析すると、リポソームが形成される。この方法は、式(Ｉ)の誘導体が非常に少量しか入手できない場合に、特に適している。
しかしながら、この方法に制限されるものではなく、小胞体分散液(リポソーム)の形成に使用される他の方法を考えることができる(Bangham, エタノール注入、融解、「逆相」等)。さらにＥＰ０５８２５０３Ｂ１に記載の方法を挙げることができる。
【００２９】
再構築皮膚で証明されるように、前記式(Ｉ)の誘導体を単に局所適用するだけでは、表皮を改善できない場合でも、少なくとも一の式(Ｉ)の誘導体が導入されたラメラ状脂質小胞体をベースとする本発明の組成物により、表皮の質を改善することができる。
式(Ｉ)の誘導体に固有の特徴：大きな分子、処方及び安定化に対する困難性を考慮に入れる同時に、ラメラ状脂質相中に、前記式(Ｉ)の少なくとも一の誘導体を導入することにより、再構築表皮の障壁機能の改善性に対して所望の効果を得ることができる。
【００３０】
また本発明の小胞体分散液により、表皮層内での式(Ｉ)の誘導体の生物学的利用能を改善することができる。本発明の小胞体分散液の処方が、前記式(Ｉ)の誘導体の標的を表す、表皮の多層脂質構造に類似した処方を表すために、前記生物学的利用能が改善される。
さらに、式(Ｉ)の誘導体は、顕著に両親媒性の性質であるが、これは表皮中へのそれらの導入を容易にするという利点を有する。
よって、式(Ｉ)の少なくとも一の誘導体を含有する本発明の小胞体分散液により、表皮の多相脂質構造体内に特に提供されるセラミドの種類を制御することができる。
【００３１】
本発明の目的において、「生物学的利用能」なる用語は、活性剤が皮膚、特に表皮の生きているエレメントに生物学的に利用可能となるように、皮膚に活性剤が浸透することを意味するものである。よって、活性剤の生物学的利用能が増加させると、生きている表皮に到達するであろう活性剤の量を増加させるという効果がある。
さらに、本発明の組成物により、適切な処方をしないと、セラミド類が角化層に浸透しない状況において、セラミド７及び／又は５．５を角化層内で直接利用可能とすることができる。よって、本発明の組成物により、角化層において直接セラミド５．５及び／又は７の欠乏を補償することができる。
【００３２】
前記組成物は、再構築表皮の表面１ｃｍ２当たり、０．５μｌ〜１０μｌ、好ましくは１μｌ〜５μｌ、特に２μｌの量で、培養される表皮の表面に、局所的に適用され得る。ついで一般的には、スパチュラを使用して広げることにより、組成物は表皮の表面に均一にされる。
【００３３】
本発明の式(Ｉ)の誘導体は、当業者によく知られている方法に従い、正常なボランティアから非侵襲的な方法により採られた脂質サンプルから、ＴＬＣにより単離することができる。ついで、この脂質サンプルを、他の脂質から式(Ｉ)の誘導体を単離し、それらを精製するための分取・分析処理にかける。これらの方法は、例えば文献ＪＰ２０００／１４３５９８又はM. Chopart ら, Prospectives in Percutaneous Penetration, 8th International Conference, Antibes, Juan-Les Pins, France, 2-6 April 2002、及びKaneboの文献ＪＰ２０００／１４３５９８に記載されている。
【００３４】
また式(Ｉ)の誘導体は、式(ＩＩ)の脂肪酸と、式(ＩＩＩ)の塩基、好ましくは６-ヒドロキシ-４-スフィンゲニン-塩基との間の縮合反応による一般的な有機合成法に従い調製することができる。
【化２】
2007246538.tif 000003
[上式中、Ｘ、ｎ及びｍは上述した定義を有している]。
６-ヒドロキシ-４-スフィンゲニン-塩基は、開示され当業者によく知られており、例えば「Mendeleev, Commun., 108-110, 1992」又は「Tetrahedron Letters, 34, No.7, 1191-1194, 1993」に記載され又は示唆されている合成法に従い調製することができる。
脂肪酸は広く商業的に入手可能である。
文献ＪＰ２０００／１４３５９８に記載されている一般的な有機合成の他の方法は、非酸化前駆体を使用する塩基の６位での酸化を含む反応からなる。
【００３５】
式(Ｉ)の誘導体は、培養培地に導入及び／又は局所適用することにより、本発明の方法の少なくとも一に従い、没入状態であろうと出現状態であろうと、皮膚等価物の耐用年限(最大２ヶ月)の間の任意の瞬間に導入することができる。好ましくは、式(Ｉ)のセラミド７及び／又は５．５は、培養の１日目から培養の３０日目、特に４日目から２１日目までの間に、皮膚等価物に導入され得る。
培養培地を変える度に、培養培地への直接の補填を行ってもよく、培地の取り替えは一般に２日毎に行う。この補填は、ある種の生成法、又は研究上の必要性及び所望される効果に応じて生じる培養培地の交換の結果として増加され又は減少され得る。
局所投与による補填は、好ましくは２日毎に行われ得る。ここで再び、この頻度は、所望する効果、及び研究の必要性、又はある種の生成法に応じて、毎時間から毎週の範囲で調節されるであろう。
【００３６】
本発明の好ましい実施態様では、本方法はエピスキン(EPISKINTM)再構築表皮モデルにおいて行われる。
よって、上述した式(Ｉ)の化合物は、式(Ｉ)の少なくとも一の誘導体が補填された、新規の皮膚等価物を研究者に提供するという、大きな利点を有する。本発明の方法において、再構築皮膚の角質層に導入され得るセラミド７及び／又は５．５の量は、角質層１ｍｇ当たり０．１μｇ〜５０μｇ、有利には０．５μｇ〜１５μｇである。
好ましくは、本発明の一方法により得られた式(Ｉ)のセラミド５．５又は７ファミリーの少なくとも一の誘導体が補填された皮膚等価物又は再構築皮膚は、全セラミドの１％を超える量の式(Ｉ)のセラミド５．５又は７を含有する。
【００３７】
また本発明は、本質的に４−スフィンゲニン-塩基(スフィンゴシンとも呼ばれる)に有利になるように、再構築された皮膚では大抵の極性のセラミド類が明らかに不足しており、その結果、これらのセラミド類を構成する６-ヒドロキシ-４-スフィンゲニンスフィンゴイド塩基が欠乏しているという本出願人の得た知見に基づいている。得られた結果を図１に示す。図１は正常なヒトの角質層及びエピスキン(EPISKINTM)から得られたセラミド誘導スフィンゴイド塩基の相対プロフィールの比較を示している。
【００３８】
本出願人は、上述したＸ＝Ｈである式(Ｉ)のセラミド５．５ファミリーの誘導体により、皮膚等価物とも称される再構築皮膚の障壁機能を補強することができることを見出した。
実際、上述したＸ＝Ｈである式(Ｉ)の少なくとも一の誘導体を、前記再構築皮膚に補填することにより、該皮膚の障壁特性及び外観を改善することができ、正常な皮膚に構造的により類似したものにできることが分かった。
よって、上述したＸ＝Ｈである式(Ｉ)のセラミド５．５の少なくとも一の誘導体を含有する新規な皮膚等価物、又は新規な再構築皮膚を得ることができる。
【００３９】
したがって、本発明の他の主題は、上記においてＸ＝Ｈであり、ｎ及びｍが上述したものと同じ定義をさらに保持している、式(Ｉ)の少なくとも一の誘導体を含有する皮膚等価物又は再構築皮膚に関する。好ましくは、皮膚等価物又は再構築皮膚は全セラミドに対して１％を超える量の式(Ｉ)のセラミド５．５を含有している。
Ｘ＝Ｈである式(Ｉ)の少なくとも一の誘導体を含有する、前記皮膚等価物又は再構築皮膚は、上述した方法の一つを使用して得ることができる。
【００４０】
本発明の小胞体分散液を構成する両親媒性脂質は、当業者によく知られている。例えば、これらの両親媒性脂質は、コレステロールと組合せられていてもいなくてもよい非イオン性の界面活性剤、及び／又は水素化されていてもいなくてもよい天然又は合成リン脂質をベースとするものであってよい。
本発明において好ましいイオン性、カチオン性、アニオン性又は非イオン性の両親媒性脂質は、文献ＥＰ０５８２５０３Ａ１、ＦＲ２４８５９２１及びＦＲ２３１５９９１に記載されているものから選択される。
【００４１】
好ましいアニオン性の両親媒性脂質(Ｂ)は：
−  リン酸ジミリスチル及びジセチルのアルカリ塩；
−  硫酸コレステロールのアルカリ塩；
−  リン酸コレステロールのアルカリ塩；
−  リポアミノ酸及びそれらの塩、例えばアシルグルタミン酸一ナトリウム及び二ナトリウム、例えば味の素(AJINOMOTO)社からアシルグルタマートＨＳ２１の名称で販売されているＮ-ステアロイル-Ｌ-グルタミン酸の二ナトリウム塩；
−  ホスファチジン酸のナトリウム塩；
−  リン脂質；
−  特に次の式(Ｘ)：
【化３】
2007246538.tif 000004
[上式中、ＲはＣ１６-Ｃ２２アルキル基、特に混合物として又は別々の形でのＣ１６Ｈ３３及びＣ１８Ｈ３７基を表し、Ｍはアルカリ又はアルカリ土類金属、例えばナトリウム；及びそれらの混合物である]
のアルキルスルホン誘導体；
からなる群から選択される。
【００４２】
本発明のカチオン性の両親媒性脂質は、第４級アンモニウム塩、脂肪アミン類及びそれらの塩からなる群から好ましく選択される。
第４級アンモニウム塩は、例えば次のものである：
−  次の一般式(ＸＩ)：
【化４】
2007246538.tif 000005
のもの。
上式中、Ｒ１ないしＲ４基は同一でも異なっていてもよく、直鎖状又は分枝状で１〜３０の炭素原子を有する脂肪族基、又は芳香族基、例えばアリール又はアルキルアリールを示す。前記脂肪族基は、例えば特に酸素、窒素、硫黄又はハロゲン等のヘテロ原子を含んでもよい。脂肪族基は、例えば、アルキル、アルコキシ、ポリオキシ(Ｃ２-Ｃ６)アルキレン、アルキルアミド、(Ｃ１２-Ｃ２２)アルキルアミド(Ｃ２-Ｃ６)アルキル、(Ｃ１２-Ｃ２２)アルキルアセタート及びヒドロキシアルキル基で約１〜３０の炭素原子を有するものから選択される；Ｘはハロゲン化物、ホスファート類、アセタート類、ラクタート類、(Ｃ２-Ｃ６)アルキルスルファート類、アルキルスルホナート類及びアルキルアリールスルホナート類から選択されるアニオンである；
−  イミダゾリニウムの第４級アンモニウム塩、例えば次の式(ＸＩＩ)：
【化５】
2007246538.tif 000006
のもの。
上式中、Ｒ５は８〜３０の炭素原子を有するアルケニル又はアルキル基、例えば獣脂脂肪酸誘導体を表し、Ｒ６は水素原子、Ｃ１-Ｃ４アルキル基又は８〜３０の炭素原子を有するアルケニル又はアルキル基を表し、Ｒ７はＣ１-Ｃ４アルキル基を表し、Ｒ８は水素原子又はＣ１-Ｃ４アルキル基を表し、Ｘはハロゲン化物、ホスファート類、アセタート類、ラクタート類、アルキルスルファート類、アルキルスルホナート類又はアルキルアリールスルホナート類の群から選択されるアニオンである。好ましくは、Ｒ５とＲ６は、獣脂脂肪酸誘導体等の、１２〜２１の炭素原子を有するアルケニル又はアルキル基の混合物を示し、Ｒ７はメチルを示し、Ｒ８は水素を示す。このような製品は、例えば、リウォ社(REWO)から、「リウォカット（REWOQUAT）Ｗ７５」名称で市販されている；
−  次の式(ＸＩＩＩ)：
【化６】
2007246538.tif 000007
の二第４級アンモニウム塩。
上式中、Ｒ９は約１６〜３０の炭素原子を有する脂肪族基を示し、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は同一でも異なっていてもよく、水素及び１〜４の炭素原子を有するアルキル基から選ばれ、Ｘはハロゲン化物、アセタート類、ホスファート類、ニトラート類及び硫酸メチルの群から選択されるアニオンである。このような二第４級ジアンモニウム塩には、特にプロパン獣脂ジアンモニウムジクロリドが含まれる。
−  少なくとも一のエステル官能基を有する第４級アンモニウム塩。
本発明で使用可能な少なくとも一のエステル官能基を有する第４級アンモニウム塩は、例えば次の式（ＸＩＶ）：
【化７】
2007246538.tif 000008
のものである。
上式中、
−  Ｒ１５は、Ｃ１-Ｃ６アルキル基及びＣ１-Ｃ６ヒドロキシアルキル又はジヒドロキシアルキル基から選択され；
−  Ｒ１６は、
・Ｒ１９-ＣＯ-基；
・直鎖状又は分枝状で飽和又は不飽和のＣ１-Ｃ２２炭化水素ベース基であるＲ２０；
・水素原子；
から選択され；
−  Ｒ１８は、
・Ｒ２１-ＣＯ-基；
・直鎖状又は分枝状で飽和又は不飽和のＣ１-Ｃ６炭化水素ベース基であるＲ２２、
・水素原子、
から選択され；
−  Ｒ１７、Ｒ１９及びＲ２１は同一でも異なっていてもよく、直鎖状又は分枝状で飽和又は不飽和のＣ７-Ｃ２１炭化水素ベース基から選択され；
−  ｎ、ｐ及びｒは同一でも異なっていてもよく、２〜６の範囲の整数であり；
−  ｙは１から１０の範囲の整数であり；
−  ｘとｚは同一でも異なっていてもよく、０から１０の範囲の整数であり；
−  Ｘ−は、単純又は複合の有機及び無機アニオンであり；
但し、ｘ＋ｙ＋ｚの合計が１から１５であり、ｘが０であればＲ１６はＲ２０を示し、ｚが０であればＲ１８はＲ２２を示す。
アルキル基Ｒ１５は直鎖状又は分枝状であり、特に直鎖状である。
Ｒ１５は、好ましくはメチル、エチル、ヒドロキシエチル又はジヒドロキシプロピル基、さらにはメチル又はエチル基を示す。
有利には、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は１〜１０である。
Ｒ１６が炭化水素ベース基Ｒ２０である場合、それは長くてもよく、１２〜２２の炭素原子を有するか、もしくは短く、１〜３の炭素原子を有し得る。
Ｒ１８が炭化水素ベース基Ｒ２２である場合、それは好ましくは１〜３の炭素原子を有する。
有利には、Ｒ１７、Ｒ１９及びＲ２１は同一でも異なっていてもよく、直鎖状又は分枝状で飽和又は不飽和のＣ１１-Ｃ２１炭化水素ベース基、特に直鎖状又は分枝状で飽和又は不飽和のＣ１１-Ｃ２１アルキル及びアルケニル基から選択される。
好ましくは、ｘ及びｚは同一でも異なっていてもよく、０又は１である。
有利には、ｙは１に等しい。
好ましくは、ｎ、ｐ及びｒは同一でも異なっていてもよく、２又は３、特に２に等しい。
アニオンは、好ましくはハロゲン化物(塩化物、臭化物又はヨウ化物)又はアルキルスルファート、特にメチルスルファートである。しかしながら、メタンスルホナート、ホスファート、ニトラート、トシラート、有機酸から誘導されるアニオン、例えばアセタート又はラクタート、又はエステル官能基を有するアンモニウムと融和性のある任意の他のアニオンを使用することもできる。
アニオンＸ−は、特に塩化物又はメチルスルファートである。
【００４３】
式(ＸＩＶ)において：
−  Ｒ１５がメチル又はエチル基を示し；
−  ｘ及びｙが１に等しく；
−  ｚが０又は１に等しく；
−  ｎ、ｐ及びｒが２に等しく；
−  Ｒ１６が、
・Ｒ１９-ＣＯ-基；
・メチル、エチル、又はＣ１４-Ｃ２２炭化水素ベース基、
・水素原子、
から選択され；
−  Ｒ１８が、
・Ｒ２１-ＣＯ-基；
・水素原子、
から選択され；
−  Ｒ１７、Ｒ１９及びＲ２１は同一でも異なっていてもよく、直鎖状又は分枝状で飽和又は不飽和のＣ１３-Ｃ１７炭化水素ベース基、好ましくは直鎖状又は分枝状で飽和又は不飽和のＣ１３-Ｃ１７アルキル及びアルケニル基から選択される；
であるアンモニウム塩が特に使用される。
有利には、炭化水素ベース基は直鎖状である。
【００４４】
式(ＸＩＶ)の化合物として、例えばジアシルオキシエチル-ジメチルアンモニウム、ジアシルオキシエチルヒドロキシエチルメチルアンモニウム、モノアシルオキシエチルジヒドロキシエチルメチルアンモニウム、トリアシルオキシエチルメチルアンモニウム、及びモノアシルオキシエチルヒドロキシエチルジメチルアンモニウムの塩(特に塩化物又はメチルスルファート)及びそれらの混合物を挙げることができる。アシル基は、好ましくは１４〜１８の炭素原子を有し、特に植物性油、例えばパーム油又はヒマワリ油に由来する。化合物がいくつかのアシル基を有している場合は、これらの基は同一でも異なっていてもよい。
これらの生成物は、例えば脂肪酸もしくは植物又は動物由来の脂肪酸の混合物と、オキシアルキレン化されていてもよいアルキルジイソプロパノールアミン、アルキルジエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン、トリエタノールアミンの直接エステル化、又はそれらのメチルエステルのエステル交換により得られる。このエステル化に続いて、アルキル化剤、例えばアルキルハロゲン化物(好ましくはメチル又はエチルハロゲン化物)、ジアルキルスルファート(好ましくはジメチル又はジエチルスルファート)、メタンスルホン酸メチル、パラ-トルエンスルホン酸メチル、グリコールクロロヒドリン又はグリセロールクロロヒドリンを使用して第４級化する。
【００４５】
このような化合物は、例えばヘンケル社(HENKEL)からデハイカート(DEHYQUART)、ステパン社(STEPAN)からステパンカート(SEPANQUAT)、セカ社(CECA)からノキサミウム(NOXAMIUM)、リウォ-ウィトコ社(REWO-WITCO)からリウォカット(REWOQUAT)ＷＥ１８の名称で販売されている。
【００４６】
本発明の小胞体の膜を構成する非イオン性の両親媒性脂質(Ａ)は、好ましくは：
−  ポリオキシエチレン化されていてもいなくてもよい、脂肪酸とポリオールのエステル及び／又はエーテル；
−  α-ブチルグリコシドの脂肪酸のエステル及び／又はエーテル；
−  水素化されていてもいなくてもよい、合成又は天然のリン脂質；
からなる群から選択される。
脂肪酸とポリオールのエステル又はエーテルは、ポリオール基当たりのアルキル鎖の数が１〜１０である、直鎖状又は分枝状で飽和又は不飽和のＣ５-Ｃ２２アルキル鎖を有する少なくとも一の脂肪酸と、２〜３０のエチレンオキシド単位を担持するグルコース類、スクロール類、２〜１５のグリセロール単位を有するポリグリセロール類、２〜３０のエチレンオキシド単位を担持するグリセロール、２〜６０のエチレンオキシド単位を担持するソルビタン、ソルビタン、１〜６０のエチレンオキシド単位を有するポリエチレングリコールからなる群から選択される少なくとも一のポリオールのエステル混合物又はエーテル混合物から好ましく選択される。
【００４７】
特に好ましいＣ５-Ｃ２２脂肪酸とポリオールのエーテルは、次の式(ＸＶ)に相当するものである：
【化８】
2007246538.tif 000009
上式中、ｎは、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４等の、種々の割合でエステルを含有し得る統計値であり；これは、アルキル鎖がＣ１７鎖であるイソステアラート類が異性体の複合混合物であり、又はＣ５-Ｃ２２アルキル鎖を含むココアート類のような、それらの親油性成分にいくつかのアルキル鎖を含有しているエステルの場合であり；さらに、同じポリオールのモノ-、ジ-、トリ-又はポリエステルの混合物からなる生成物の場合である。
【００４８】
本発明で使用可能であり、上述したＣ５-Ｃ２２脂肪酸とポリオールとのエステル混合物の構造を有する市販品としては：
−  「ＩＣＩ」社から「スパン(SPAN)２０、４０、６０及び８０」の市販名で販売されている、脂肪酸とソルビタン(又は無水ソルビトール)の部分的エステル；
−  「ニッコー(NIKKO)」社から「ＳＩ１０Ｒニッコール(NIKKOL)」の商品名で販売されているイソステアリン酸ソルビタン；
−  「ＩＣＩ」社から「トゥイーン(TWEEN)６１」の名称で販売されている、４単位のエチレンオキシドを担持しているステアリン酸ソルビタン；
−  「ＩＣＩ」社から「ＭＹＲ Ｊ ４５」の名称で販売されている、８単位のエチレンオキシド単位を有するポリエチレングリコールステアラート；
−  「ニッコー」社から「ＭＹＳ４」の名称で販売されている、次の式(ＸＶＩ)
【化９】
2007246538.tif 000010
[上式中、ｎは４に等しい]
のポリエチレングリコールモノステアラート；
−  「ユニケマ(UNICHEMA)」社から販売されている、バイテクノロジーにより生産された品質又は化学的な品質のポリエチレングリコール(分子量４００)ステアラート；
−  「ヘキスト(HOECHST)」社から「ホスタセリン(HOSTACERINE)ＤＧＳ」の名称で販売されている、４のエチレンオキシド単位を担持しているステアリン酸ジグリセリル；
−  「ニッコー」社から「テトラグリン(TETRAGLYN)１Ｓ」の名称で販売されている、ステアリン酸テトラグリセリル、
−  「ソルベイ(SOLVAY)」社から販売されているイソステアリン酸ジグリセリル；
−  「ニホン(NIHON)」社から「エマレックス(EMALEX)ＤＳＧ２」の名称で販売されているジステアリン酸ジグリセリル；
−  「クロダ(CRODA)」社から「Ｆ５０、Ｆ７０、Ｆ１１０及びＦ１６０クロデスタ(CRODESTA)」の名称で販売されているモノ-、ジ-及びトリパルミトステアリン酸スクロース；
−  「グリロ(GRILLO)」社から「グリロテン(GRILLOTEN)ＰＳＥ１４１Ｇ」の名称で販売されている、モノ-及びジパルミトステアリン酸スクロースの混合物；
−  「ＩＣＩ」社から「アルラトーン(ARLATONE)２１２１」の名称で販売されている、ステアリン酸スクロースとスクロースココアートの混合物；
−  「アメルコール(AMERCHOL)」社から「グルカム(GLUCAM)Ｅ２０ジステアラート(DISTEARATE)」の名称で販売されている、２０のエチレンオキシド単位を担持するジステアリン酸メチルグルコース；
を挙げることができる。
【００４９】
本発明で使用されるα-ブチルグルコシドの脂肪酸のエステル及びエーテルは、好ましくは、種々の脂肪酸が互いに似た数の炭素原子(例えば１又は２の違い)を有する、α-ブチルグルコシドの種々の脂肪酸エステル混合物及び／又はエーテル混合物、又はα-ブチルグルコシドの同じ脂肪酸のモノ-、ジ-、トリ-又はポリエーテルの混合物及び／又はモノ-、ジ-、トリ-又はポリエステルの混合物である。
本発明で使用されるα-ブチルグルコシドの脂肪酸のエステル及びエーテルは、好ましくは８〜２４の炭素原子、より好ましくは１２〜２２の炭素原子、特に１４〜１８の炭素原子を有する脂肪鎖を含有する。
例えば、α-ブチルグルコシドと、ラウリン酸(Ｃ１２)、ミリスチン酸(Ｃ１４)、パルミチン酸(Ｃ１６)、ステアリン酸(Ｃ１８)又はベヘン酸(Ｃ２２)のエステル及びエーテルを挙げることができる。
特に、本発明の脂質小胞体において、記載されたような酵素的方法に従い得られたα-ブチルグルコシドとパルミチン酸のモノ-及びジエステルの混合物が使用される。
【００５０】
本発明のα-ブチルグルコシドと脂肪酸のエステル及びエーテルは、α-トランスグルコシル化活性を有する精製された酵素調製物の存在下、デンプン、マルトデキストリン又はマルトースとブタノールを接触させることからなる、仏国特許出願ＦＲ-Ａ-２６８０３７３に記載されている酵素的調製方法に従い得られたα-ブチルグルコシドから調製され得る。α-ブチルグルコシドと脂肪酸のエステル及びエーテルは、一般的な方法により、α-ブチルグルコシドと脂肪酸又は対応する脂肪酸混合物を反応させることにより合成することができる。
【００５１】
本発明で好ましい、水素化されていてもいなくてもよい合成又は天然のリン脂質は、コレステロールと、場合によってはイオン性界面活性剤と組合せられたレシチン、好ましくは水素化レシチン、及び２〜５０のエチレンオキシド単位を有するオキシエチレン化されたフィトステロールから選択される。
文献ＦＲ２３１５９９１及びＦＲ２４８５９２１に記載されている両親媒性脂質を、このリストに付け加えるべきである。
本発明の小胞体分散液を調製するためには、公知の方法で、イオン性の両親媒性脂質の混合物、非イオン性の両親媒性脂質の混合物、及びこれら２つの種類の脂質の混合物が使用される。
【００５２】
本発明の好ましい実施態様では、イオン性の両親媒性脂質(Ｂ)の量に対する非イオン性の両親媒性脂質(Ａ)の量の重量比は、５０／１〜５０／２５である。
公知の方法で、本発明の水性-コア小胞体の脂質膜を構成する脂質相中に、その主たる機能が小胞体の浸透性を低減させ、その凝集と融合を防止し、カプセル化度合いを増大させる少なくとも一の添加剤を導入することが可能である。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様では：
−  ステロール類、特にフィトステロール及びコレステロール、
−  長鎖のアルコール類及びジオール類、
−  長鎖のアミン類及びその第４級アンモニウム誘導体、
からなる群から好ましくは選択される少なくとも一の添加剤を脂質相に添加することができる。
これらの添加剤は、化粧品的及び／又は皮膚用製薬的活性を有するものであってもよい。これは、例えばコレステロールの場合である。
これらの添加剤の量は、水性-コア小胞体を構成する脂質組成物の全重量に対して０〜５０％の範囲である。
本発明の組成物において、水性-コア小胞体は、好ましくは１０〜５０００ｎｍの範囲の平均径を有している。
【００５４】
有利には、本発明の小胞体分散液は、セラミドＳＴＡＲ、１、２、２．５、３、４、５及び／又は６("The Normal Human stratum corneum: a new ceramide profile", M. Chopartら, Prospectives in Percutaneous Penetration, 8th International Conference, Antibes, Juan-Les Pins, France, 2-6, April 2002)に記載されたようなものから選択される少なくとも一の他のセラミド、有利にはセラミドＳＴＡＲ及び／又は４をさらに含有してもよい。
付加的なセラミドの量は、小胞体を構成する脂質組成物の全重量に対して０．００１％〜３０％、好ましくは０．００１〜１０％、特に０．００１％〜５％の範囲である。
【００５５】
「セラミド２．５」なる用語は、その構造が次の式(ＩＶ)：
【化１０】
2007246538.tif 000011
[上式中、ｎ１は２２〜３５、好ましくは２５〜３３、より好ましくは２６〜２９であり、ｎ２は１１〜２１、好ましくは１３〜１７、より好ましくは１３〜１５であり、ＲＣＯはリノレオイル残基を示す]
で表すことのできる化合物を意味するものである。ｎ１の値は、好ましくは２９に等しい。
式(ＩＶ)の化合物は正常なボランティアから非侵襲的な方法により採られた脂質サンプルから単離することができる。ついで、セラミドファミリーを分離し同定するために、これらの脂質サンプルに、分取・分析処理を施す。
【００５６】
式(ＩＶ)の化合物の他の可能性のある供給源は、酵素のモジュレータ又は前駆体に作用するトランスアシラーゼ等の酵素の使用にある。
前駆体は、特に次の式(Ｖ)：
【化１１】
2007246538.tif 000012
[上式中、ｎ１は２２〜３５、好ましくは２５〜３３、より好ましくは２６〜２９であり、ｎ２は１１〜２１、好ましくは１３〜１７、より好ましくは１３〜１５である]
の化合物である。
ｎ１の値は、好ましくは２９に等しい。
これらの前駆体は、ヒドロキシル化脂肪酸の末端ＯＨがエステル化されていない、式(ＩＶ)の化合物に相当する。
【００５７】
「セラミドＳＴＡＲ」なる用語は、構造が次の式(ＶＩ)：
【化１２】
2007246538.tif 000013
[上式中、ｎ３は１７〜３５、好ましくは２１〜３０、より好ましくは２３〜２８の範囲の整数、特に２５、２６又は２７に等しく、ｎ４は９〜１８、好ましくは１１〜１５、より好ましくは１１〜１３の範囲の整数、さらに好ましくは１１に等しく、ｎ５は１２〜１８、好ましくは１４〜１６の範囲の整数、特に１４に等しい]
で表すことのできる化合物を意味するものである。
式(ＶＩ)の化合物は正常なボランティアから非侵襲的な方法により採られた脂質サンプルから単離することができる。ついで、セラミドファミリーを分離し同定するために、これの脂質サンプルに分取・分析処理を施す。
【００５８】
式(ＶＩ)の化合物の他の可能性のある供給源は、酵素のモジュレータ又は前駆体に作用するトランスアシラーゼ等の酵素の使用にある。
前駆体は、特に次の式(ＶＩＩ)：
【化１３】
2007246538.tif 000014
[上式中、ｎ３は１７〜３５、好ましくは２１〜３０、より好ましくは２３〜２８、さらに好ましくは２５〜２７の範囲の整数であり、ｎ４は９〜１８、好ましくは１１〜１５、より好ましくは１１〜１３の範囲の整数、さらに好ましくは１１に等しい]
の化合物である。
これらの前駆体は、１位がエステル化されていない式(ＶＩ)の化合物に相当する。
【００５９】
有利には、本発明の小胞体分散液は、少なくとも一の付加的な活性剤をさらに含有していてもよい。
活性剤が水溶性である場合、それらは小胞体のカプセル化された親水相に導入される。
活性剤が脂溶性である場合、それらは膜を構成している脂質相に導入される。
活性剤が両親媒性である場合、それらは、両親媒性活性剤の性質、脂質相及びカプセル化された親水相のそれぞれの組成に応じて変化する分配係数で、脂質相とカプセル化された親水相とに分配される。
【００６０】
活性剤として、落屑剤；保湿剤；色素脱失剤又は色素形成誘発剤(propigmenting agents)；抗グリケーション剤(anti-glycation agents)；ＮＯ-シンターゼインヒビター；真皮又は表皮の高分子の合成を刺激し、及び／又はその分解を防止するための薬剤；線維芽細胞及び／又はケラチノサイトの増殖を刺激し、又はケラチノサイトの分化を刺激するための薬剤；筋肉弛緩剤；収斂剤(tightening agents)；汚染防止剤及び／又はフリーラジカル捕捉剤；毛細血管循環に作用する薬剤；細胞のエネルギー代謝に作用する薬剤、及びそれらの混合物から選択される少なくとも一の化合物を使用することができる。
【００６１】
有利には、本発明の小胞体分散液は、障壁機能を改善するための少なくとも一の他の化合物をさらに含有してもよい。この誘導体は、アスコルビン酸(ビタミンＣ)又はその類似体、レシチン類、スフィンゴ糖脂質、リン脂質、コレステロール及びその誘導体、フィトステロール(スチグマステロール、β-シトステロール、キャンペステロール）、必須脂肪酸、１,２-ジアシルグリセロール、４-クロマノン、五環系トリテルペン類、例えばウルソル酸、ワセリン及びラノリンから選択される。
好ましくは、障壁機能を改善するための化合物は、Ｄ又はＬ形、有利にはＬ形のアスコルビン酸、又はその塩、好ましくはアスコルビン酸ナトリウム、アスコルビルリン酸マグネシウム、又はアスコルビルリン酸ナトリウム、そのエステル、好ましくはその酢酸、プロピオン酸又はパルミチン酸のエステル、又はその糖類、好ましくはグリコシル化されたアスコルビン酸から選択される類似体である。
【００６２】
公知の方法で、本発明の組成物は、化粧品の分野で通常のアジュバント、例えば、防腐剤、酸化防止剤、溶媒、香料、臭気吸収剤、中和剤、サンスクリーン剤、ポリマー類、乳化剤及び共乳化剤、及び染料をさらに含有してもよい。
【００６３】
本発明の組成物は、化粧品の分野において一般的に使用されている全ての製薬的形態で提供される任意の化粧品用担体に導入されていてもよく；それは、特にゲル化していてもよい水溶液、２相を有していてもよいローション型の分散液、水相に脂肪相を分散させて得られる(Ｏ／Ｗ)又は逆の(Ｗ／Ｏ)エマルション、又は３相エマルション(Ｗ／Ｏ／Ｗ又はＯ／Ｗ／Ｏエマルション)であってよい。これらの形態は通常の方法に従って調製される。本発明において好ましくは、水中油型エマルションの形態の化粧品用担体が使用される。
【実施例】
【００６４】
本発明を、次の実施例においてより詳細に例証する。これらの実施例は本発明の範囲を決して制限することができない。
実施例１：ヒトの角質層からのＴＬＣによる式(Ｉ)のセラミド７の調製
工程１：タービン抽出
出発サンプル：正常なボランティアからの表皮
操作：有機溶媒(最も一般的にはヘキサン／エタノールの２／３混合物)を、角質層を通過させ、タービンにより脂質を取り込ませる。
最終サンプル：溶媒和した形態の表皮脂質
【００６５】
工程１ａ：テープ剥離を使用する抽出
出発サンプル：正常なボランティアからの表皮
操作：接着ストリップ-ラッカー＋ナイロン-をボランティアの皮膚に適用し、全体をむしり取り、角質層の一部を、同操作で取り込む。ついでストリップを溶媒(クロロホルム／メタノール(２／１)タイプ、撹拌）中に入れる。
最終サンプル：溶媒和形態の表皮脂質
【００６６】
工程２：セラミド７の単離
出発サンプル：溶媒和形態の表皮脂質
(全脂質)
操作：セラミドファミリーの分離
・必要ならば、このようにして得られた脂質プールを濃縮(溶媒の一部を蒸発させることにより濃縮)した後、脂質プールを２０ｘ２０ｃｍのＷｈａｔｍａｎ ＬＫ５又はＭｅｒｃｋ５７２１シリカプレートに付着させ、２回の連続した溶離を、１回目の溶離には１９０／５／１の比率、２回目の溶離には１９０／９／１の比率のクロロホルム／メタノール／酢酸の混合物を用いて行う。
・５ｍｇ／１００ｍｌのプリムリン(primuline)溶液をプレートにスプレーした(ラッカーを暴露)後、紫外線(２５４ｎｍ)下でセラミドのクラスを検出する。この観察により、最も溶離した領域から最も溶離していない領域の範囲を、例えば１〜１０の番号を付けた、シリカプレート上にある約１０の隣接した領域に定めることができる。これらの領域のそれぞれのシリカを廃棄し、回収して、クロロホルム／メタノール(２／１)の混合物を用い、数回抽出する(そこからセラミド類を抽出するため)。有機相をプールし、水で洗浄し、ついで純粋なセラミド化合物を得るために、蒸発乾固させる。ついでこれらのセラミド類(移動バンドによりグループ化されたもの)を、クロロホルム／メタノール(２／１)の混合物に再溶解させる。主たるセラミドクラス及び不純物(一般的に他のセラミド類)を決定するために、セラミド含有量の分析的同定(セラミド化合物の構造分析、以下のパラグラフ)用の各サンプルを少量、取り除く。このようにして、一般的にセラミド６(不純物)と混合されてセラミド７を含有するサンプルを同定することができる。
最終サンプル：溶媒和セラミド７(＋不純物の形態のセラミド６)
【００６７】
工程３：必要である場合のセラミド７のサンプルの精製
出発サンプル：溶媒和セラミド７(＋不純物の形態のセラミド６)
操作：セラミド７を含有するサンプルを、ついで工程２：サンプルの付着、顕色、シリカの剥離及びセラミドの抽出、主としてセラミド７を含有するバンドの同定(最終的な構造分析)を繰り返すことにより精製する。
最終サンプル：精製された式(Ｉ)のセラミド７。
【００６８】
セラミド化合物の構造分析：
分析用のサンプルを２つのフラクションに分割する。
第１のセラミドフラクションの誘導体化を塩化ベンゾイルを使用して実施する。このようにして得られたベンゾイル誘導体を高速液体クロマトグラフィーにより分離し、ＨＰＬＣ-ＭＳカップリングによりカラム流出口にて、質量分析器に注入する。
セラミド内に含有されるスフィンゴイド塩基が放出されるように、第２のフラクションをアルカリ加水分解にかける。放出された塩基を、蛍光検出を用いたＨＰＬＣによる分離の前に、オルト-フタルアルデヒド(phthaldehyde)で誘導体化する。
このようにして得られた分析結果により、サンプル中に存在する各セラミドに厳密な分子構造を与えることができる。
【００６９】
実施例２：ヒトの角質層からのＴＬＣによるセラミド５．５の調製
セラミド５．５の調製法は、種々の移動バンドのセラミド含有量の構造分析後に単離されたバンドが主としてセラミド５．５を含むバンドで、後者が一般に多量の不純物(セラミド５)を伴っており、それを正しく精製された形で得るには精製工程３を必要ならば一又は複数回繰り返すことが必要であるという点以外は、実施例１のセラミド７の場合と同一である。
【００７０】
実施例３：再構築皮膚の障壁機能に対する本発明の小胞体分散液の効果の評価
以下の２種の懸濁液を調製する：
［セラミド７を含有しないニオソームの処方］
パルミチン酸ソルビタン                                    ０．２２５％
(ユニケマ社(Uniquema)から販売されて
いるスパン４０)
コレステロール                                            ０．２２５％
Ｎ-ステアロイル-Ｌ-グルタミン酸、二
ナトリウム塩                                              ０．０５０％
プロピレングリコール                                      ３．０００％
水                                        全体を１００．０００％にする量
［セラミド７を含有するニオソームの処方］
パルミチン酸ソルビタン                                    ０．２２５０％
コレステロール                                            ０．１２５０％
Ｎ-ステアロイル-Ｌ-グルタミン酸、二
ナトリウム塩                                              ０．０５００％
セラミド７                                                ０．０３１５％
脱塩水                                  全体を１００．００００％にする量
【００７１】
手順
２つの場合において、脂質を予めメタノール／クロロホルム(重量で５０／５０)の溶媒相と組合せる。ついで、ロータリーエバポレータを使用し、減圧下で溶媒を蒸発させる。ついで、丸底フラスコの壁面に形成された脂質皮膜を、オクチルグルコシド水溶液(６％)で可溶化し、オクチルグルコシド／小胞体脂質混合ミセルを形成させる。ついでこの溶液を蒸留水に対して２４時間透析する。オクチルグルコシドを透析すると、リポソームが形成される。
ついで、それぞれ１ｃｍ２のエピスキン(EPISKINTM)表皮を含む、１２ウェルの３つのキットで実験を行う。
種々の処理は以下の通りである：
−  対照キット、すなわち処理なし、
−  プラシーボキット、すなわちセラミド７を含有しないニオソームの処方物で処理、
−  ニオソームを含む処方に処方されたセラミド７(処方ＣＥＲ７)で処理されたキット。
【００７２】
３つのキットを局所適用により処理し：各処理タイプ(対照キットを除く)に対して、２マイクロリットルの処方物を、各再構築表皮の表面に適用する。４８時間の間隔をあけて、処理を２回繰り返す。ついで表皮を取り除き、表面を洗浄し、各表皮に含有される脂質を抽出する。最終的に、スフィンゴ脂質(本質的にセラミド類)を、それらのスフィンゴイド塩基を分析することによって定量する。
上述の処理条件下における結果は、図２のヒストグラムに示されるように、未処理の表皮、又はプラシーボで処理された表皮と比較して、セラミド７を含有するリポソームの処方物で処理されたエピスキン(EPISKINTM)再構築皮膚モデルの表皮に見出される６-ヒドロキシスフィンゲニン塩基が、大きく増加していることを示している。
【００７３】
セラミド７を安定させ、それを生物学的に利用可能にする小胞体分散液にセラミド７を処方することで、エピスキン(EPISKINTM)モデルの再構築表皮のセラミドプロフィールを改善することができる。しかして、エピスキン(EPISKINTM)等の再構築皮膚モデルのプロフィールにおいて、セラミド７の割合を増加させることにより、６-ヒドロキシスフィンゲニン-塩基のセラミドの割合を増加させると、モデルの障壁機能を増強させることができる。
よって、再構築皮膚モデルの障壁機能を、正常なヒトの皮膚の障壁機能により似たものになるようにすることにより、この方法は前記障壁機能を改善することを可能にする。
【００７４】
実施例４：エピスキン(EPISKINTM)再構築表皮の障壁機能に対する本発明のニオソームに処方されたセラミド７の効果
浸透研究法の原理：静的モードの拡散セルにおいて、放射標識カフェインの浸透性を研究することによる、局所適用されたニオソーム処方物中のセラミド７で処理されたエピスキン(EPISKINTM)モデルの再構築表皮の障壁機能の状態を評価：両親媒性分子である放射標識カフェインは、前記表皮の質に応じて多少の程度の差はあるが表皮に浸透する；分子がより多く通過すればするほど、障壁機能は損なわれている。
実施例３で提案されたようにして、セラミド７を含有しない処方物(プラシーボ処方物と称する)、又はセラミド７を含有するニオソーム処方物のいずれか２μｌを、表皮の表面に適用することにより、エピスキン(EPISKINTM)モデルの再構築表皮の処理を、培養８日目から１４日目に実施した。
培養１４日目に、拡散セルにおいてモデルを可溶化させた後、過剰のＣ１４カフェイン(グリセロールに１０ｍＭ、１３５μＣｉ／ｍＭｏｌ)の溶液を９０μｌ(３２２μｌ／ｃｍ２)、表皮の表面に適用する。１６時間浸透させた後、過剰分を除去し回収する。ついで、皮膚を回収し、組織を消化させる。培地、次に皮膚、次に過剰分からの放射能を、シンチレーションカウンターで計測する。
【００７５】
ついで、このようにして回収された放射能の全量を、同じ付着実験値にして後者を標準化し、これにより、種々の処理の効果をより良好に比較することができる。さらに、可能な限り、実験の代表値となる結果を得るために、次の値を組にした：第１に表面過剰分＋洗浄液(洗浄液は、表皮上の全てのものを構成するため)、受容培地＋組織(組織に見出されうる全てのものがそれを通して浸透するため)。
この研究の結果を図３のヒストグラムにまとめる。
図３のヒストグラムは、ほとんどのカフェインが組織内に浸透しておらず、より多くが表面に保持されていることから、ニオソームに処方されたセラミド７で処理した後、エピスキン(EPISKINTM)モデルの再構築皮膚の障壁機能が改善されていることを示している。
【００７６】
実施例５：乾燥肌中の６-ヒドロキシ-４-スフィンゲニン-塩基のセラミドの不足の証明
この研究では、正常な皮膚(乾燥スコア０)及び乾燥肌(乾燥スコア２)のサンプルの脂質プロフィールを比較した。サンプル(角質層を横断した溶媒を用い、タービンにより直接抽出された脂質)を、スコア０を有する２２人の個人と、スコア２を有する１９人の個人から採る。ついで、分析感度の理由から、スコア毎にサンプルをプールした。
よって、薄層クロマトグラフィーにより種々のクラスに分離した後、セラミド類をＨＰＬＣ／質量分析検出により同定した。ついで、各移動バンドに含まれているセラミド類の定量を、セラミド類を塩基及び脂肪酸及び特定の塩基誘導体に加水分解した後、ＨＰＬＣ／蛍光検出により実施した(非常に厳密な定量アプローチ)。
結果を図４にまとめる。
よって、この研究により、スコア０の正常な皮膚と比較して、スコア２の乾燥肌では、６-ヒドロキシ-４-スフィンゲニン-塩基のセラミド類(ＣＥＲ５．５、７及び４)の平均量が少ないことが示されている。
【００７７】
実施例６：セラミドＳＴＡＲの調製
脂質サンプル：
平均年齢３３．８±８．８で、その皮膚が臨床医に正常であると記述されている女性(正常なボランティア)２２人の群からサンプルを採る。微量な皮脂を除去するためにエーテルに浸した脱脂綿で皮膚を清浄にした後、タービンを使用して前腕からサンプルを採る。１０ｍｌのヘキサン／エタノール混合物(２／３)で満たされたタービンの抽出チャンバーを、１２．５６ｃｍ２の表面領域に適用する。混合物を１分間攪拌した後、ガラスシリンジを使用して収集し、ついで−２０℃でガラス容器内に保存する。
このようにして、各個人の前腕から３つのサンプルを採る。ついでサンプルをプールし、ロータリーエバポレータを使用して、蒸発乾固させ、１ｍｌのクロロホルム／メタノール(２／１)に取り込み、−２０℃で保存する。これら全てのサンプルに相当する固形含有量は３６．４ｍｇであり、８２９ｃｍ２の抽出表面領域を表す。
【００７８】
セラミド類の分離及び単離：
第１工程において、正常相シリカカートリッジ(シリカゲル６０)上に、上で得られた脂質サンプルを付着させることにより、セラミド類を他のカテゴリーの脂質から分離する。１％の酢酸を含有する１０ｍｌのクロロホルムで中性脂質を除去した後、セラミド類を、１０ｍｌのクロロホルム／メタノール(９５／５)の混合物で溶離させる。ついで、セラミド類を−２０℃で、１ｍｌのクロロホルムに保存する。
第２工程において、種々のセラミド類を、次の条件下にて、薄層クロマトグラフィーにより分離する：
第１工程の終わりに得られたセラミド類の混合物１．７ｍｇを、２０ｘ２０ｃｍのＷｈａｔｍａｎ ＬＫ５シリカプレートに付着させ、２回の連続した溶離を、１回目の溶離には１９０／５／１の比率、２回目の溶離には１９０／９／１の比率のクロロホルム／メタノール／酢酸の混合物を用いて行う。
５ｍｇ／１００ｍｌのプリムリン溶液をプレートにスプレーした後、紫外線(２５４ｎｍ)下でセラミドのクラスを検出する。この観察により、最も溶離した領域から最も溶離していない領域の範囲を、１〜１０の番号を付けた、シリカプレート上にある１０の隣接領域を定めることができる。これらの領域のそれぞれのシリカを廃棄し、回収し、クロロホルム／メタノール(２／１)の混合物を用い、数回抽出する。有機相をプールしておき、水で洗浄し、ついで純粋なセラミド化合物を得るために、蒸発乾固させる。ついでこれらのセラミド類の一部を、分析的同定のために、クロロホルム／メタノール(２／１)の混合物に再溶解させる。
ｎ３が１７〜３５、ｎ４が９〜１８、ｎ５が１２〜１８である上述したセラミド類が、シリカプレート上の第１スポットに回収される。
【００７９】
セラミド化合物の構造分析：
分析用のサンプルを２つのフラクションに分割する。
第１のセラミドフラクションの誘導体化を塩化ベンゾイルを使用して実施する。このようにして得られたベンゾイル誘導体を高速液体クロマトグラフィーにより分離し、ＨＰＬＣ-ＭＳカップリングによりカラム流出口にて、質量分析器に注入する。
セラミド内に含有されるスフィンゴイド塩基が放出されるように、第２のフラクションをアルカリ加水分解にかける。放出された塩基を、蛍光検出を用いたＨＰＬＣによる分離の前に、オルト-フタルアルデヒドで誘導体化する。
このようにして得られた分析結果により、サンプル中に存在する各セラミドに厳密な分子構造を与えることができる。
ｎ３が２５〜２７であり、ｎ４が１１に等しく、ｎ５が１４に等しいセラミド類を含有するフラクションＡを、混合物から単離する。
【００８０】
実施例７：セラミド２．５の調製
セラミド２．５の調製は、セラミド類を分離し単離する工程の終わりに、ｎ１が２２〜３５、ｎ２が１１〜２１であり、ＲＣＯがリノレオイル残基を示す上述したセラミド類が、シリカプレートの第４スポットに回収されることを除いて、実施例６のセラミドＳＴＡＲの場合と同一である。さらに、セラミド化合物の構造分析中、ｎ１が２９に等しく、ｎ２が１３〜１５であるセラミド類を含有するフラクションＡが、混合物から単離される。
【００８１】
実施例８：ＢＳＡと組合せられてセラミド７ファミリーの誘導体が添加されていてもよい培養培地
−  ダルベッコ(DULBECCO)及びギブコ(GIBCO)より
販売されているＤＭＥＭ(３容量)及びＨＡＭ Ｆ
１２(１容量)培養培地                              ４５０ｍｌ
−  鉄が補填された子ウシ血清                            ５０ｍｌ
−  ＥＧＦ(表皮成長因子)(１０ｎｇ／ｍｌ)              ５００μｌ
−  イソプロテレノール(１０−６Ｍ)                    ５００μｌ
−  ヒドロコルチゾン(０．４μｇ／ｍｌ)                ４００μｌ
−  Ｌ-グルタミン(２ｍＭ)                                 ５ｍｌ
−  ＤＬ-α-トコフェロールアセタート                    １０．６μｍｏｌ
−  Ｌ-カルニチン                                         ５．１μｍｏｌ
−  ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)                          １２．１μｍｏｌ
−  セラミド７                                        １７５μｇ
(０．２５μｍｏｌ)
【００８２】
実施例９：組成物
セラミド７を含有するリポソームの処方
−  リポイド(Lipoid)Ｓ７５の名称でセピッ
ク社(SEPPIC)から販売されている大豆
レシチン(７５％のホスファチジルコリ
ンに富む)                                             ０．５０００％
−  プロピレングリコール                                  ３．００００％
−  セラミド７                                            ０．０３１５％
−  水                                  全体を１００．００００％にする量
【００８３】
セラミド５．５を含有するリポソームの処方
−  大豆レシチン(７５％のＰＣに富む)リポ
イドＳ７５                                            ０．５０００％
−  プロピレングリコール                                  ３．００００％
−  セラミド５．５                                        ０．０３１５％
−  水                                            全体を１００％にする量
【００８４】
セラミド７の懸濁液をベースとする保湿クリーム
小胞体相
−  パルミチン酸ソルビタン                                ２．２５０％
−  コレステロール                                        １．１２５％
−  Ｎ-ステアロイル-Ｌ-グルタミン酸、二
ナトリウム塩                                          ０．５００％
−  セラミド７                                            ０．３１５％
−  グリセロール                                          ５．０００％
−  メチルパラベン                                        ０．３００％
−  脱塩水                                        全体を１００％にする量
【００８５】
Ａ１相：
−  ヘプタン酸ステアリル                                  ４．０％
−  コーデックスワセリン                                  １．５％
−  アボカド油                                            ３．２％
−  ホホバ油                                              ３．０％
−  揮発性シリコーン油                                    ２．７％
−  ビタミンＥアセタート                                  １．０％
−  「コフェロール(COPHEROL)１３００」
の名称でヘンケル社(Henkel)から販売さ
れている天然のＤ-α-トコフェロール                    １％
−  ビタミンＦグリセリド                                  ３％
Ａ２相：
−  「Ｑ２-１４０３フルイド」の名称でダウ
・コーニング社(Dow Corning)から販売さ
れているシリコーンガム                                ３．０％
−  プロピルパラベン                                      ０．２％
−  香料                                                  ０．３％
Ｂ相：
−  グッドリッチ社(Goodrich)から「カルボポ
ール(CARBOPOL)９４０」の名称で販売
されているカルボキシビニルポリマーの
混合物                                                ０．４０％
−  脱塩水                                                ９．５０％
−  トリエタノールアミン                                  ０．２５％
【００８６】
小胞体相を既に記載されている方法の一つに従い調製し、ついで、Ｓｏａｖｉ ＯＢＬ２０型又はMicrofluidics型の高圧ホモジナイザー、５００ｂに２回通してホモジナイズする。
ついでローターステーターで十分に攪拌しつつ、Ａ１及びＡ２相を添加し、十分に安定した油のプレディスパージョンを作製する。次に、全混合物を５００ｂで２回ホモジナイズする。
予め調製しておいたＢ相を、上述したようにして調製されたエマルションに添加し、解膠タービンを使用して分散させる。
乾燥肌の処置に適した滑らかな白色クリームが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】正常なヒトの角質層及びエピスキンから得られたセラミド誘導スフィンゴイド塩基の相対プロフィールの比較を示す。
【図２】１８-炭素-６-ヒドロキシ-４-スフィンゲニン-塩基に対する種々の処理の効果を示す。
【図３】エピスキン(登録商標)モデルの再構築表皮の障壁機能に対するニオソーム処方物のセラミド７の効果を示す。
【図４】スコア２を有する乾燥肌におけるクラス毎の塩基プロフィールを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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