(57)【要約】      （修正有）【課題】定方向進化のために核酸分子濃度を増大させる方法の提供。【解決手段】以下のステップ：  （a）熱安定性で、１０９を超える微小区画／ｍＬの密度で封入された水性微小区画を含む、Ｗ／Ｏ型乳液を形成すること；  （b）複数の該微小区画内に、核酸と熱安定性のポリメラーゼ等のポリメラーゼ連鎖反応による核酸の増幅に必要な成分を含んでなる水溶液を封入すること；及び  （c）核酸増幅の熱サイクルにより該核酸の増幅された複製物を産生させ、核酸濃度を増大させること；を含む方法。また、増幅した核酸を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子濃度を増大させる方法であって、以下のステップ：
（a）熱安定性で、１０９を超える微小区画／ｍＬの密度で封入された水性微小区画を含む、Ｗ／Ｏ型乳液を形成すること；
（b）複数の該微小区画内に、核酸と熱安定性のポリメラーゼ等のポリメラーゼ連鎖反応による核酸の増幅に必要な成分を含んでなる水溶液を封入すること；及び
（c）核酸増幅の熱サイクルにより該核酸の増幅された複製物を産生させ、核酸濃度を増大させること；
を含む上記方法。
【請求項２】
複数の微小区画内に、ビーズとポリメラーゼ連鎖反応により産生された核酸断片を該ビーズ上に結合させる手段を準備し、該PCR断片が該ビーズ上に移されることをさらに含む上記方法。
【請求項３】
ビーズがポリスチレンビーズを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ビーズがストレプトアビジン又はオリゴヌクレオチドの被覆を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
核酸がビオチンタグを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ポリメラーゼ連鎖反応による核酸の増幅に必要な成分が、ビオチン化プライマーを含む、請求項１〜５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
乳液が少なくとも２０サイクルのＰＣＲの間安定である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
Ｗ／Ｏ型乳液の比（水相：油相）が１：２〜１：４である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｗ／Ｏ型乳液が乳化剤を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
乳化剤が非イオン性界面活性剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
乳化剤がモノオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、及びオクチルフェノキシポリエトキシエタノールから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
乳化剤がＳｐａｎ８０、Ｔｗｅｅｎ８０及びＴｒｉｔｏｎＸ-１００から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
乳化剤がアニオン性界面活性剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
乳化剤がコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム及びデオキシコール酸ナトリウムから選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
核酸がゲノムＤＮＡ又はcＤＮＡである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
各区画が１区画当たり平均で1個以下の核酸分子を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
各区画が１区画当たり平均で５〜１０００個の核酸分子を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
核酸ライブラリーを微小区画に分割することをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
微小区画からビーズをプールし、増幅した核酸について特定の変異若しくは対立遺伝子の存在を調べることをさらに含む、請求項２、３、又は４に記載の方法。
【請求項２０】
配列決定のために、個々のビーズを選別することをさらに含む、請求項２、３、又は４に記載の方法。
【請求項２１】
該核酸を含む細胞を区画に送達することによって、該核酸が区画に送達される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分子ライブラリーの進化に用いる方法に関する。特に、本発明は遺伝子産物をコードする核酸を選択する方法に関し、該方法では該核酸及びコードされる遺伝子産物の活性が区画化によって関連付けられる。
【背景技術】
【０００２】
進化には、遺伝的多様性（核酸における多様性）の発生と、その後の有益な特性をコードする核酸の選択を必要とする。核酸と該核酸がコードする遺伝子産物の活性は生物体内では全体として関連付けられており（核酸はそれが収容される細胞の分子的計画（blue print）をコードしている）、表現型の適応性の変化をもたらすような遺伝子型での変化は、生存率と子孫の増大のような生物体にとっての有益性を生み出す。突然変異と選択が多数回行われると、ある所定の選択条件に対する適応性が増大しつつ生物体（及びそれをコードする遺伝子型）が進行的に濃縮されうる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸若しくはタンパク質の迅速な進化を起こさせようとする系は、このプロセスを分子レベルで模倣する必要があり、そのような系では、核酸とそれによってコードされる遺伝子産物の活性が相関されており、かつ遺伝子産物の活性は選択可能なものでなければならない。
【０００３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択の技法は急速に拡大している分野であり、所望の特性を有する生体高分子を得るためには、合理的に設計することよりも効果的なものであることが示されることが多い。過去１０年間で、例えばファージディスプレイ若しくはＳＥＬＥＸ法などを用いた選択についての実験から多数の新規なポリヌクレオチド及びポリペプチドリガンドが生み出されている。触媒反応についての選択はより困難なものであることが示されている。その手法としては、遷移状態の類似体の結合、自殺阻害剤との共有結合による連結、近接性連関、及び共有結合による産物の連結が含まれる。これらの手法は酵素反応のサイクルのある特定の部分にのみ焦点を当てたものではあるが、ある程度の成功は収めてきた。しかし、究極的には、触媒反応の回転を直接的に選択することが望ましい。確かに、かなり小規模の変異体ライブラリーの触媒反応回転を単純にスクリーニングすることは、種々の選択手法に比べてより成功を収めてきており、著しく触媒反応速度が向上した触媒をいくつか生み出してきた。
【０００４】
ポリメラーゼは、分子生物学に特徴的な技法、すなわち、部位特異的突然変異誘発法、ｃＤＮＡクローニング、特にサンガー配列決定法及びＰＣＲにおいて必要なものであるが、ポリメラーゼは、自然には最適化されなかった機能を実行させられているという事実のために、大きな欠陥を示してしまうことがしばしばある。自然界から得られるポリメラーゼの性質をタンパク質工学によって改良し、特別な用途のためにそれを適合させようとの試みが少数ながら行われてきた。技術的進歩は大多数は周辺的なものであり、そのようなものとしては、より広範な生物体に由来するポリメラーゼの使用、バッファー及び添加物系、並びに酵素の混合が含まれる。
【０００５】
ポリメラーゼの性質を改良しようとの試みは、伝統的にはタンパク質工学に依存してきた。例えば、Ｔａｑポリメラーゼの変異体（例えば、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片及びＫｌｅｎｔａｑ）はその５’−３’エキソヌクレアーゼドメインの完全な若しくは部分的な欠失によって作製され、プロセッシビティ（連続移動性）の低減という犠牲はあったが熱安定性と忠実性は改善を示している（Barnes 1992, Gene 112, 29-35; Lawyerら, 1993, PCR Methods and Applications 2, 275）。さらに、タンパク質の高分解能での構造が明らかとなったことで、性質が改良された変異体を合理的に設計できるようになった（例えば、サイクルシークエンシングのためのジデオキシヌクレオチド取込みの特性が改良されたＴａｑ変異体、Liら, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9491）。ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝的手法もまたタンパク質の設計に用いられており、例えばｐｏｌＡ−株の相補性により変異型ポリメラーゼの集団から活性を有するポリメラーゼを選択する手法が挙げられる（Suzukiら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9670）。しかし、遺伝的相補性を用いた手法は選択しうる性質に制限がある。
【０００６】
分子生物学の最近の進歩によって、いくつかの分子についてはそれらをコードする核酸とともにその性質に従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏで同時選択が行えるようになった。選択された核酸は、次いで、さらに分析若しくは使用するためにクローニングすることができ、又は変異と選択のラウンドをさらに行うことができる。これらの方法に共通することは、大きな核酸ライブラリーを確立することである。所望の性質（活性）を有する分子を、コードされる遺伝子産物の所望の活性、例えば所望の生化学的若しくは生物学的活性、例えば結合活性などについて選択する選択過程により単離することができる。
【０００７】
ＷＯ９９／０２６７１号は、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする１つ以上の遺伝的エレメントを単離する方法について述べている。遺伝的エレメントは、まずマイクロカプセルに区画化し、次いで転写及び／又は翻訳されてそれらのそれぞれの遺伝子産物（ＲＮＡ又はタンパク質）をそのマイクロカプセル内で産生させる。あるいはまた、それらの遺伝的エレメントを、転写及び／又は遺伝子産物への翻訳（発現）が起こる宿主細胞中に入れ、この宿主細胞を最初にマイクロカプセル中に区画化する。次いで、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝的エレメントが選別される。ＷＯ９９／０２６７１号に記載の方法は、マイクロカプセル若しくは遺伝子エレメント（又はその双方）を触媒作用で改変する遺伝子産物に依存するものであり、それによって改変されたものを濃縮して所望の活性の選択が可能となる。
【特許文献１】ＷＯ９９／０２６７１号
【特許文献２】米国特許第4,683,195号
【特許文献３】米国特許第4,683,202号
【特許文献４】米国特許第4,800,159号
【特許文献５】PCT公開第WO91/01384号
【特許文献６】EPO公開No.0547359A1(1993)
【特許文献７】米国特許第5,079,352号
【特許文献８】PCT公開No.WO92/06188(1992)
【特許文献９】EPO公開No. 0482714A1(1992)
【特許文献１０】PCT公開No.WO92/06202(1992)
【特許文献１１】日本特許出願平4[1992]-131400号（公開日1993年11月19日）
【特許文献１２】EPO公開No.0455430A3(1991)
【特許文献１３】EPO公開No.0547920A2(1993)
【特許文献１４】PCT公開No.WO93/25691(1993)
【特許文献１５】米国特許第5,079,352号
【特許文献１６】EPO公開No.0517418A2
【特許文献１７】米国特許第4,683,195号
【特許文献１８】米国特許第4,683,202号
【特許文献１９】ＷＯ９３／０３１５１号
【非特許文献１】Barnes 1992, Gene 112, 29-35
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【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様では、本発明は、核酸加工触媒（ＮＡＰ）酵素を選択する方法を提供し、その方法は以下のステップを含む：（ａ）ＮＡＰ酵素又は該ＮＡＰ酵素の変異体をコードする核酸メンバーを含む核酸プールを調製するステップ；（ｂ）該核酸プールを区画に分割するステップであって、各区画が、該プールの核酸メンバーと該核酸メンバーによってコードされるＮＡＰ酵素又は変異体とを共に含むように分割するステップ；（ｃ）核酸加工触媒を起こさせるステップ；及び（ｄ）該ＮＡＰ酵素による該核酸メンバーの加工触媒を検出するステップ。
【０００９】
本発明の第２の態様において、本発明は、ＮＡＰ酵素の活性を改変可能な物質を選択する方法であって、その方法は以下のステップを含む：（ａ）ＮＡＰ酵素を調製するステップ；（ｂ）１以上の候補物質をコードする核酸メンバーを含む核酸プールを調製するステップ；（ｃ）該核酸プールを区画に分割するステップであって、各区画が、該プールの核酸メンバー、該核酸メンバーによりコードされる物質、及びＮＡＰ酵素を含むように分割するステップ；並びに（ｄ）該ＮＡＰ酵素による該核酸メンバーの加工触媒を検出するステップ。
【００１０】
好ましくは、上記物質は、ＮＡＰ酵素活性のプロモーターである。上記物質は酵素であってもよく、好ましくはキナーゼ若しくはホスホリラーゼであるが、それはＮＡＰ酵素の活性を改変するよう該酵素に作用することが可能なものである。上記物質は、ＮＡＰ酵素の折りたたみ若しくはアセンブリーに関与する、又はレプリカーゼ機能（例えば、テロメラーゼ、ＨＳＰ９０）の維持に必要とされるシャペロンであってもよい。あるいはまた、上記物質は、代謝経路に関与するポリペプチド又はポリヌクレオチドであってもよく、その経路は複製反応に関与する基質を最終生成物として含むものである。さらに上記物質は、ＮＡＰ酵素の阻害物質（天然若しくは非天然のもの）を、その阻害活性を低減又は失活させるように改変する反応を触媒することのできる何らかの酵素であってもよい。最後に、上記物質は、ＮＡＰ活性を非触媒経路で促進する、例えばＮＡＰ酵素若しくはその基質などと結合することによって促進することができる（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ（例：Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、及びチオレドキシン）の場合にはプロセッシビティ因子（鎖伸長能に関与する因子）。
【００１１】
本発明の第３の態様では、本発明は,安定に相互作用することが可能なポリペプチド対の選択方法を提供し、その方法は、以下のステップを含む：（ａ）第１の核酸及び第２の核酸を調製するステップであって、第１の核酸はＮＡＰ酵素の第１サブドメインとそれと融合した第１ポリペプチドを含む第１融合タンパク質をコードし、第２の核酸はＮＡＰ酵素の第２サブドメインとそれと融合した第２ポリペプチドを含む第２融合タンパク質をコードし、ここでＮＡＰの第１及び第２サブドメインの安定な相互作用によってＮＡＰ酵素活性がもたらされ、また第１及び第２の核酸の少なくとも１つが第１及び／又は第２ポリペプチドの各々の変異体をコードする核酸プールの形態で調製されるものであるステップ；（ｂ）上記単数又は複数の核酸プールを区画に分割するステップであって、各区画が第１の核酸及び第２の核酸と、第１及び第２の核酸によりコードされる各融合タンパク質とを共に含むように分割するステップ；（ｃ）第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとを結合させるステップであって、第１及び第２ポリペプチドの結合によって、ＮＡＰ酵素サブドメインが安定に相互作用し、ＮＡＰ酵素活性がもたらされるステップ；並びに（ｄ）ＮＡＰ酵素による第１及び第２の核酸の少なくとも１つの加工触媒を検出するステップ。
【００１２】
さらに、上記の（ａ）のＮＡＰ酵素ドメインを、本発明の第２の態様で述べたように、ＮＡＰ酵素の活性を改変することが可能なポリペプチドのドメイン、及びそのような所望の性質を有するように改変するポリペプチドを選択するために用いられるＮＡＰ酵素活性を改変することが可能なポリペプチドのドメインと置換することができる。
【００１３】
好ましくは、第１及び第２の核酸は核酸のプールから提供される。
【００１４】
好ましくは、第１及び第２の核酸は共有結合で（例えば、同じ鋳型分子の一部として）又は非共有結合（例えば、ビーズなどの上に連結することによって）結合する。
【００１５】
ＮＡＰ酵素は、例えばポリペプチド又はリボ核酸酵素分子とすることができる。非常に好ましい実施形態においては、本発明のＮＡＰ酵素はレプリカーゼ酵素、すなわち鋳型から核酸を増幅することの可能な酵素、例えばポリメラーゼ酵素（又はリガーゼ）である。本発明は、特にレプリカーゼに関して以下に説明する。しかし、当業者であれば、本発明が他のＮＡＰ酵素、例えばテロメラーゼやヘリカーゼにも同等に適用可能であることが理解され、また以下にさらに記載するとおり、それらの酵素は核酸を加工触媒するものであるが、それは増幅には限定されず、それらの酵素は核酸増幅を検出することによって選択可能なものであり、すなわちそれらは複製を間接的に促進するものである。
【００１６】
本発明の好ましい１実施形態においては、核酸の増幅は、１ラウンド以上の核酸複製により起こる。好ましくは、核酸の増幅は指数関数的な増幅である。
【００１７】
増幅反応は、好ましくは下記のものから選択される：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ネステッドＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）、自己持続性配列複製（３ＳＲ）、ＮＡＳＢＡ、転写媒介性増幅反応（ＴＭＡ）、及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）。
【００１８】
非常に好ましい１実施形態においては、核酸メンバーの増幅後のコピー数はレプリカーゼの活性、必要な物質の活性、第１及び第２のポリペプチドの結合親和性と実質的に比例している。
【００１９】
核酸の複製は、核酸メンバーのコピー数をアッセイすることによって検出することができる。あるいはまた、若しくはさらに、核酸の複製は、核酸メンバーによりコードされるポリペプチドの活性を測定することによって検出することができる。
【００２０】
非常に好ましい１実施形態においては、区画内の条件は、そのような条件下で活性を有するレプリカーゼ若しくは物質、又はそのような条件下で安定に相互作用することが可能なポリペプチド対を選択するために調節される。
【００２１】
レプリカーゼは、好ましくは、ポリメラーゼ、逆転写酵素、又はリガーゼの活性を有する。
【００２２】
上記ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写及び翻訳によって核酸から調製することができる。あるいはまた、ポリペプチドはｉｎ  ｖｉｖｏで発現宿主中で核酸から調製することができる。
【００２３】
好ましい１実施形態においては、上記区画は、Ｗ／Ｏ型乳液が封入された水性成分から構成される。Ｗ／Ｏ型乳液は、好ましくは、４．５％  ｖ／ｖ  Ｓｐａｎ  ８０、０．４％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ８０及び０．１％  ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含むサーファクタント、又はＳｐａｎ  ８０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を実質的に同じ比率で含むサーファクタントの存在下で水相と油相とを乳化することによって調製される。好ましくは、水相：油相の比が１：２であり、この比によって適切な油滴のサイズがもたらされる。このような乳液は、油相がより多い乳液と比較して熱安定性が高い。
【００２４】
本発明の第４の態様として、本発明は、前述の方法によって同定されたレプリカーゼ酵素を提供する。好ましくは、該レプリカーゼ酵素は対応する未選択の酵素よりも熱安定性が高い。より好ましくは該レプリカーゼ酵素は、野生型のＴａｑポリメラーゼと比較して９７．５℃での半減期が１０倍以上増大したＴａｑポリメラーゼである。
【００２５】
上記レプリカーゼ酵素は、対応する未選択の酵素と比較してヘパリンに対する抵抗性がより大きいものである。好ましくは、レプリカーゼ酵素は、０．０８３ユニット／μＬ以上のヘパリン濃度において活性を有するＴａｑポリメラーゼである。
【００２６】
上記レプリカーゼ酵素は、３’ミスマッチを有するプライマーを伸長可能なものでありうる。好ましくは、該３’ミスマッチは３’プリン−プリンミスマッチ又は３’ピリミジン−ピリミジンミスマッチである。より好ましくは、該３’ミスマッチはＡ−Ｇミスマッチであるか、又は該３’ミスマッチはＣ−Ｃミスマッチである。
【００２７】
本発明の第５の態様では、本発明は、以下の変異（アミノ酸置換）を含むＴａｑポリメラーゼ変異体を提供する：Ｆ７３Ｓ、Ｒ２０５Ｋ、Ｋ２１９Ｅ、Ｍ２３６Ｔ、Ｅ４３４Ｄ、及びＡ６０８Ｖ。
【００２８】
第６の態様において、本発明は、以下の変異（アミノ酸置換）を含むＴａｑポリメラーゼ変異体を提供する：Ｋ２２５Ｅ、Ｅ３８８Ｖ、Ｋ５４０Ｒ、Ｄ５７８Ｇ、Ｎ５８３Ｓ、及びＭ７４７Ｒ。
【００２９】
第７の態様において、本発明は、以下の変異（アミノ酸置換）を含むＴａｑポリメラーゼ変異体を提供する：Ｇ８４Ａ、Ｄ１４４Ｇ、Ｋ３１４Ｒ、Ｅ５２０Ｇ、Ａ６０８Ｖ、及びＥ７４２Ｇ。
【００３０】
第８の態様において、本発明は、以下の変異（アミノ酸置換）を含むＴａｑポリメラーゼ変異体を提供する：Ｄ５８Ｇ、Ｒ７４Ｐ、Ａ１０９Ｔ、Ｌ２４５Ｒ、Ｒ３４３Ｇ、Ｇ３７０Ｄ、Ｅ５２０Ｇ、Ｎ５８３Ｓ、Ｅ６９４Ｋ、及びＡ７４３Ｐ。
【００３１】
本発明の第９の態様においては、本発明は、４．５％  ｖ／ｖ  Ｓｐａｎ  ８０、０．４％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ８０及び０．１％  ｖ／ｖ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含むサーファクタント、若しくはＳｐａｎ  ８０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を実質的に同じ比率で含むサーファクタントの存在下で水相と油相とを乳化することによって得られるＷ／Ｏ型乳液を提供する。好ましくは、水相：油相の比は１：２である。この比率は、より高い温度での区画間のｄＮＴＰ（及びおそらくはその他の小分子）の拡散が可能となるものと考えられ、それが有益な適用もあれば有益ではない適用もある。拡散は水相：油相の比を１：４に増加させることにより制御することができる。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明の実施は、特に断らない限りは、従来の化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の技法を用いて行われ、それらは当業者であれば可能な範囲のものである。そのような技法については文献中に説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, 及びT. Maniatis, 1989 「分子クローニング：実験室マニュアル」"Molecular Cloning:A Laboratory Manual", 第２版、第１〜３巻, Cold Spring Harbor Laboratory Press; B. Roe, J. Crabtree,及びA. Kahn, 1996, 「ＤＮＡの単離と配列決定：基本技法」"DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques", John Wiley & Sons; J. M. Polak及びJames O'D. McGee, 1990, 「ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：原理と実際」"In Situ Hybridization: Principles and Practice", Oxford University Press; M. J. Gait(編), 1984, 「オリゴヌクレオチドの合成：実際的な手法」"Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach", Irl Press; 並びに、D. M. J. Lilley及びJ. E. Dahlberg, 1992, 「酵素学の方法：ＤＮＡの構造ＰａｒｔＡ：ＤＮＡの合成と物理的分析」"Methods of Enzymology: DNA Structure PartA: Synthesis and Physical Analysis of DNA", Methods in Enzymology, Academic Pressを参照させたい。これらの総説の各々は本明細書中に参照により組み入れる。
【００３３】
区画化された自己複製
本発明は、新規の選択技法について開示するものであり、それを本発明者はＣＳＲ（区画化自己複製）と称する。この方法は触媒作用並びに巨大分子相互作用についての一般的な選択系へと拡張できる可能性がある。
【００３４】
ＣＳＲはその最も単純な形態では、新規の熱安定性Ｗ／Ｏ型乳液の、個別の空間的に分離された水性区画内での、ＤＮＡポリメラーゼをコードし、その産生を指令する遺伝子の分別（分離）を行う。ヌクレオチド三リン酸と適切なフランキングプライマーがあれば、ポリメラーゼはそれ自体の遺伝子のみを複製する。その結果、活性のあるポリメラーゼをコードする遺伝子のみが複製され、一方、不活性な変異体はその遺伝子をコピーできず遺伝子プールから消滅する。生物系と同様に、分化により適応した変異体のうちで最も活性の高い（最もよく適応した）ものが最も多数の「子孫」をもたらし、そのことは選択後のコピー数と酵素回転とを直接相関させるものである。
【００３５】
ＣＳＲはポリメラーゼに限定されず、「レプリカーゼエンジン」の周囲に構築された広範囲の酵素的転換に適用できる。例えば、ポリメラーゼに「材料を供給する（ｆｅｅｄｉｎｇ）」する酵素であって、そのポリメラーゼが次にその酵素の遺伝子を複製することとなるものを選択することができる。レプリカーゼの基質を産生する又はレプリカーゼの阻害物質を消費するかいくつかの酵素が含まれる、より複雑で関連性のある協同反応スキームを考えることができる。
【００３６】
ポリメラーゼは、ゲノムの維持、伝達、及び遺伝情報の発現に中心的な役割を果たしている。ポリメラーゼはまた、現代の生物学の核心部分に位置し、突然変異誘発、ｃＤＮＡライブラリー、配列決定、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの主要技術を可能なものとしている。しかし、一般的に用いられているポリメラーゼでは、自然界で最適化されなかった機能を果たすよう使用しているために、大きな欠陥を示してしまうことがしばしばある。技術的進歩は大多数は周辺的なものであり、そのようなものとしてはより広範な生物に由来するポリメラーゼの使用、バッファー及び添加物系の改良、並びに酵素の混合が含まれる。ＣＳＲは、特別な用途のための「デザイナー」ポリメラーゼの単離に理想的に適した新規の選択系である。ポリメラーゼ機能の多数の特徴を「改良」（例えば、プロセッシビティ、基質の選択など）することができる。さらに、ＣＳＲは、ポリメラーゼの機能、例えば、不変の領域を探索すること、レプリソームの構成成分を研究すること、などの機能を調べるためのツールともなる。さらに、ＣＳＲは、多様で未知の微生物集団から直接ポリメラーゼのショットガン機能クローニングに用いることができる。
【００３７】
ＣＳＲはポリペプチド集団の選択の新規の原理を示している。これまでの手法は種々の「ディスプレイ」法を特徴としており、それらでは表現型と遺伝子型（ポリペプチドとコードする遺伝子）は「遺伝的パッケージ」の一部として連結されており、そのパッケージはコードする遺伝子を含み、「外側」にポリペプチドをディスプレイしている。選択は親和性による精製ステップを介して行い、そのステップの後に、さらに選択のラウンドを行うために生存しているクローンを細胞中で増殖（増幅）させる（増殖をゆがめるような選択において結果として偏りが生じる）。種々のポリペプチド間のデイスプレイの効率の相違性からさらにゆがみがもたらされる。
【００３８】
別の種類の手法では、ポリペプチドとコードする遺伝子の双方が１つの細胞内に「パッケージ」される。選択はｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を改変するポリペプチドを介して行い、そのポリペプチドはその細胞が新たな表現型（例えば抗生物質の存在下でも増殖することなど）を獲得するように改変する。選択圧は全細胞にかかるので、このような手法は偽陽性を生ずる傾向が強くなる。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの相補性を利用した方法は、選択条件によって制限され、それゆえに選択可能な表現型を自由に選ぶことはできず、それらはさらに、宿主の生存可能性という限定によって拘束される。
【００３９】
ＣＳＲでは、ポリペプチドとコードする遺伝子との間に直接的な物理的結合（共有結合若しくは非共有結合）はない。好都合な遺伝子のより多数のコピーが直接的に「増殖」し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択プロセスの一部分となる。
【００４０】
ＣＳＲは広範なＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡポリメラーゼに対して適用可能であり、実際に複製若しくは遺伝子発現に関与する全てのポリペプチド（若しくはポリヌクレオチド）に適用可能である。ＣＳＲはまた、オリゴヌクレオチド断片からそれらの遺伝子をアセンブルするＤＮＡリガーゼ及びＲＮＡリガーゼにも適用することができる。
【００４１】
ＣＳＲは、酵素の回転速度が選択後のそのコードする遺伝子のコピー数と直接相関している唯一の選択系である。
【００４２】
塩基に変化のあるもの、糖に変化のあるもの、若しくはさらに骨格に化学的な変化のあるようなポリヌクレオチドポリマーは大いに関心を持たれている。しかし、固相合成では通常は比較的短いポリマーのみが作られ、また天然のポリメラーゼは大多数の類似体をほとんど取り込まないことは驚くにあたらない。ＣＳＲは、化学的、生物学的、及びナノテクノロジー（例えばＤＮＡワイヤー）の点で新規の性質を有するポリヌクレオチドポリマーを調製するための、非天然基質に対してより許容性のあるポリメラーゼの選択に理想的に適したものである。
【００４３】
最後に、ＣＳＲ用に開発された熱安定性の乳液はそれ自体に用途がある。１０９を超える微小区画／ｍＬで、乳液のＰＣＲ（ｅＰＣＲ）は、並行ＰＣＲができる可能性を示しており、遺伝子連鎖解析から、単一細胞からの直接的なゲノムレパートリー構築に至るまでの、用途の可能性がかつてないスケールで多様に存在する。ｅＰＣＲはまた、「デジタルＰＣＲ」（Vogelstein及びKinzler(1999), PNAS, 96, 9236-9241）のような大規模診断用ＰＣＲの用途にも適用できる可能性がある。個々の反応を区画化することは、マルチプレックスＰＣＲ若しくはランダムプライマーを用いるＰＣＲのいずれかで増幅される種々の遺伝子部分断片間の競合を避けることができ、より偏りの少ない増幅産物の分布をもたらす。従ってｅＰＣＲは、全ゲノムＤＯＰ−ＰＣＲ（及び関連する方法論）に代替しうる方法を提供し、又は実際にＤＯＰ−ＰＣＲ（及び関連する方法論）をより効率的にするために用いることができる。
【００４４】
本発明の選択系は、区画化系内での自己複製に基づいている。本発明は、活性のあるレプリカーゼは核酸を複製できるが（とりわけそのコード配列を複製する）、不活性なレプリカーゼは複製できないとの事実に依拠している。従って、本発明の方法では、ある区画内のレプリカーゼが実質的にその区画内にある鋳型以外のいかなる鋳型にも作用しえないような区画化された系を提供する。とりわけ、そのレプリカーゼは他のいかなる区画内の鋳型をも複製できないものである。非常に好ましい実施形態においては、区画内の鋳型核酸はレプリカーゼをコードするものである。従って、レプリカーゼはそのコード配列以外のいかなるものも複製できない。従ってレプリカーゼはそのコード配列と「関連付け」られている。その結果、本発明の非常に好ましい実施形態においては、該コード配列の最終濃度（すなわちコピー数）はそれによってコードされる酵素の活性に依存する。
【００４５】
本発明の選択系は、レプリカーゼの選択に適用する場合には、その系が触媒反応の回転（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を、その触媒をコードする遺伝子の選択後のコピー数と相関させるという利点を有している。従って区画化によって、レプリカーゼ酵素の遺伝子型と表現型を関連付ける可能性が提示され、以下にさらに詳細に説明するとおり、その関連づけは、その系のステップの１つとして該酵素の単数若しくは複数の遺伝子の複製を行う関連する酵素反応によって行われるものである。
【００４６】
本発明の方法は、好ましくは核酸ライブラリーを利用するものであり、その性質と構築は以下に詳細に説明する。核酸ラブラリーは、種々の核酸のプールを含み、そのライブラリーのメンバーは特定の物質（選択しようとする物質）の変異体をコードする。従って、例えば、レプリカーゼの選択に用いる場合には、本発明の方法は、該レプリカーゼ若しくは該レプリカーゼの変異体をコードする核酸メンバーを有する核酸ライブラリー若しくはプールを用いる。該ライブラリーの種々のメンバーによってコードされる物質の各々は、異なる性質、例えば熱に対して若しくは阻害性の小分子の存在に対しての耐容性の相違、又は塩基対ミスマッチ（以下にさらに詳細に説明する）に対しての耐容性の相違などを有している。従って核酸変異体の集団は選択の出発材料を提供し、その集団は突然変異によって生じる生物体の天然の集団における変動と多くの点で類似のものである。
【００４７】
本発明では、核酸ライブラリー若しくはプールの種々のメンバーが多数の区画又はマイクロカプセル中にソート又は区画化される。好ましい実施形態においては、各区画は核酸プールの核酸メンバーを実質的に１つ含んでいる（１若しくは複数のコピーで含む）。さらに、区画はまた、その核酸メンバーによりコードされるポリペプチド若しくはポリヌクレオチド（１若しくは好ましくは複数のコピー）を含む（以下に述べるとおり、それはレプリカーゼ、ある種の物質、ポリペプチドなどである）。これらの区画の性質は、異なる区画間で巨大分子（核酸及びポリペプチドなど）の交換が最小限であるか又は実質的に交換が起こらないようなものである。以下にさらに詳細に説明するとおり、本発明の非常に好ましい実施形態では、Ｗ／Ｏ型乳液中の水性区画を利用する。上述したとおり、区画内に存在するいかなるレプリカーゼ活性（レプリカーゼによって示されるもの、ある種の物質によって改変されるもの、又はポリペプチドが別のポリペプチドと関連して作用することによって示されるもののいずれであっても）もその区画内の鋳型にのみ作用することができる。
【００４８】
区画内の条件は、それらの条件下で活性を示すポリペプチドを選択するために、変えることができる。例えば、レプリカーゼを選択する場合には、より高い熱安定性を有するレプリカーゼを選択するために該区画は温度を高くすることができる。さらに、本明細書に記載の選択方法を、熱安定性レプリカーゼ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質について用いると、熱安定性のタンパク質の選択ができることとなる。
【００４９】
不安定な商業的に重要なタンパク質中に熱安定性を取り込むための方法は、大規模生産及び販売の点から望ましいものである。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合体としてタンパク質を発現させることによりタンパク質の折りたたみを改良するためのレポーター系が報告されている（Waldoら, (1999), Nat. Biotechnol. 17:691-695）。ＧＦＰの機能は、ＧＦＰの折りたたみ及び／又は機能性に影響を与える融合したタンパク質の効果的な折りたたみに関与し、折りたたみと発現が改良された変異体の定方向への進化を可能とする。本発明のこの態様では、タンパク質は熱安定性レプリカーゼ（若しくはレプリカーゼ活性を促進する物質）と融合させ、熱安定性及び／若しくは溶解性の増大しているタンパク質へ進化させるための方法として乳液中で活性のある融合体の選択を行う。融合パートナーの不安定な変異体は、熱サイクルの前又はその間に凝集し沈殿するものと考えられ、この結果、それぞれの区画内でレプリカーゼ活性が低下する。生存可能な融合体は乳液中で自己増幅することができ、その増幅では回転率が融合パートナーの安定性と関連している。
【００５０】
関連する手法においては、シャペロンのライブラリーをポリメラーゼ−ポリペプチド融合タンパク質と共に共発現させることによって進化させてシャペロニン活性を新たに得る又は増大させることができるが、その融合タンパク質中ではタンパク質部分は誤っておりたたまれている（その選択条件下において）。シャペロニンをコードする遺伝子の複製は、シャペロニン活性が、該ポリメラーゼ−ポリペプチド融合タンパク質中のポリメラーゼ活性を救出した後にはじめて進行することができる。
【００５１】
ある酵素の熱安定性は、当業界では既知の従来法で測定することができる。例えば、天然酵素の触媒活性はある一定の温度でアッセイして基準値とすることができる。酵素アッセイ法は当業界ではよく知られており、標準的なアッセイ法は多年にわたって確立されてきた。例えば、ポリメラーゼによるヌクレオチドの取込みは、例えば、放射性標識したｄＮＴＰ（ｄＡＴＰなど）の使用、及び当業界では既知のフィルター結合アッセイなどで測定される。熱安定性をアッセイしようとする酵素は高温でプレインキュベートし、次いで保持されている活性（例えば、ポリメラーゼの場合にはポリメラーゼ活性）をより低いその酵素に最適の温度で測定し、基準値と比較する。Ｔａｑポリメラーゼの場合には、その高温とは９７．５℃であり、最適温度とは７２℃である。熱安定性はその高温における半減期の形で表される（すなわち、その高温条件で、ポリメラーゼがその活性を５０％失うまでに要したインキュベーション時間）。例えば、本発明で選択された熱安定性レプリカーゼ、融合タンパク質、又は物質は、天然酵素と比較して、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又はそれ以上の半減期を有しうる。最も好ましくは、熱安定性レプリカーゼなどは、このように比較した場合に１１倍以上の半減期を有しているものである。好ましくは、選択したポリメラーゼを、９５℃以上、９７．５℃以上、１００℃以上、１０５℃以上、又は１１０℃以上でプレインキュベートする。本発明の非常に好ましい１実施形態においては、９７．５℃での半減期が、対応する野生型（天然）の酵素と比較して１１倍以上である熱安定性が増大されたポリメラーゼを提供する。
【００５２】
阻害物質、例えばポリメラーゼの場合にはヘパリンなどに対する抵抗性も上記のようにアッセイし測定することができる。阻害に対する抵抗性は阻害因子の濃度を用いて表すことができる。例えば、本発明の好ましい実施形態においては、ヘパリンの濃度が０．０８３ユニット／μＬから０．３３ユニット/μＬの間に至るまで活性を有するヘパリン抵抗性のポリメラーゼを提供する。比較のために、本発明のアッセイでは、天然（野生型）のＴａｑポリメラーゼを阻害するヘパリンの濃度は０．０００５から０．００２６ユニット／μＬの範囲である。
【００５３】
抵抗性は、阻害物質の濃度を用いて表すことが好都合であり、その濃度とは、天然の酵素を阻害するとみとめられた濃度と比較して、選択されたレプリカーゼ、融合タンパク質又は物質の活性を阻害するとみとめられる濃度である。本発明で選択される抵抗性のレプリカーゼ、融合タンパク質又は物質は、天然の酵素と比較して、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、又はそれ以上の抵抗性を有しうる。最も好ましくは、抵抗性レプリカーゼなどは、この方法で比較した場合に１３０倍以上の抵抗性の増大を示すものである。選択されるレプリカーゼなどは、好ましくはその阻害因子の濃度で、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又はさらに１００％の活性を有しているものである。さらに、上記区画はヘパリンなどの阻害物質をある量で含有させることができ、そのような条件下で活性を有するレプリカーゼが選択される。
【００５４】
以下に説明するとおり、本発明の方法は、相互作用するポリペプチド対を選択するために用いることができ、区画内の条件はそのような条件下で作用することが可能なポリペプチドを選択するために変更することができる（例えば、高塩濃度、若しくは高温その他）。本発明の方法はまた、これらの条件下（例えば、高塩濃度、若しくは高温、カオトロピック剤その他）で作用する融合ポリペプチドの折りたたみ、安定性、及び／又は溶解性について選択するために用いることができる。
【００５５】
本発明の選択方法は、種々の複製に関係する活性、例えばポリメラーゼ活性についての選択に用いることができる。ここではレプリカーゼはポリメラーゼであり、触媒作用はポリメラーゼによるそれ自体の遺伝子の複製である。従って不完全なポリメラーゼ若しくはその反応を行う条件下（選択条件）では不活性なポリメラーゼは、それら自体の遺伝子を増幅することができない。同様にして、活性がより低いポリメラーゼは、それらの入っている区画内にてそれらをコードする配列の複製をより緩慢に行うこととなる。従って、これらの遺伝子は遺伝子プールで検出未満となるか、そのプールから消失するまでになる。
【００５６】
他方、活性のあるポリメラーゼは、それら自体の遺伝子を複製することができ、その結果得られるそれらの遺伝子のコピー数は増加することとなる。本発明の好ましい１実施形態においては、該プール内の遺伝子のコピー数は、反応が行われる条件下でコードされるポリペプチドの活性と直接相関を示す。この好ましい実施形態においては、最も活性の高いポリメラーゼがそのプールの最終状態で最も多く現れていることとなる（すなわち、そのプール内のその遺伝子のコピー数が最多である）。このことから理解しうるとおり、これによって活性のあるポリメラーゼを不活性のポリメラーゼから分けてクローニングすることが容易に行えるようになる。従って、本発明の方法は、酵素の回転速度を、この方法で得られるその酵素をコードしている遺伝子のコピー数と直接相関させることができるものである。
【００５７】
例として、本発明の方法は、好熱性生物からの活性のあるポリメラーゼ（ＤＮＡ−、ＲＮＡ−ポリメラーゼ及び逆転写酵素）の単離に適用することができる。簡潔に述べれば、熱安定性のポリメラーゼは細菌細胞の細胞内で発現されるが、それらの細胞を適切なバッファー中で適切な量のｄＮＴＰ及びオリゴヌクレオチドと共に区画化するが（例えばＷ／Ｏ型乳液中で）、そのオリゴヌクレオチドは該ポリメラーゼ遺伝子のどちらかの末端又は該ポリメラーゼ遺伝子に隣接するプラスミド配列上にプライミング（結合）するものである。ポリメラーゼとその遺伝子は、細胞を溶解しその宿主細胞に伴う酵素活性を破壊するような温度ステップによって、細胞から放出される。常温を好む生物から得たポリメラーゼ（すなわち熱安定性がより低いポリメラーゼ）は類似の方法で発現させることができるが、ただし細胞の溶解を常温で進めるか（例えば、溶解性タンパク質（例えば溶解性バクテリオファージ由来のもの）を発現させることによって、若しくは界面活性剤（例えば、BugbusterＴＭ、市販品）を用いた溶解によって行う）、又は溶解をポリメラーゼ安定化剤（例えば、クレノウの場合には高濃度のプロリン（実施例２７参照）、若しくはＲＴの場合にはトレハロース）の存在下で高温で進めるかの、いずれかを行わなければなければならない。そのような場合には、宿主株のバックグラウンドのポリメラーゼ活性が選択を妨害する可能性があり、変異株（例えばｐｏｌＡ−）を利用することが好ましいこともある。
【００５８】
あるいはまた、ポリメラーゼ遺伝子（プラスミドとして、又は線状断片として）を上記のように区画化し、該ポリメラーゼをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳（ｉｖｔ）を用いて区画内でｉｎ  ｓｉｔｕで発現させた後、温度ステップでｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳抽出物に伴う酵素活性を破壊することができる。常温を好む生物から得たポリメラーゼ（すなわち熱安定性がより低いポリメラーゼ）はｉｎ  ｓｉｔｕで類似の方法で発現させることができるが、ただしｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳抽出物に伴う酵素活性を避けるために、ＰＵＲＥシステム（Simizuら, (2001) Nat. Biotech., 19:751）のようなよく確立された精製成分から再構成された翻訳抽出物を用いることが好ましいこともある。
【００５９】
ＰＣＲの熱サイクルにより、次いで、ポリメラーゼ遺伝子がコードするポリペプチドによる該遺伝子の増幅、すなわち活性のあるポリメラーゼ若しくは選択された条件下で活性のあるポリメラーゼをコードする遺伝子のみの増幅が行われる。さらに、自己増幅後のあるポリメラーゼ遺伝子Ｘのコピー数はその遺伝子がコードするポリメラーゼＸの触媒活性に直接比例することとなる（図１Ａ及び１Ｂを参照）。
【００６０】
区画内の選択条件を変えることによって、所望の性質を有するポリメラーゼ若しくはその他のレプリカーゼを本発明の方法を用いて選択することができる。このように、ポリメラーゼ遺伝子の集団（標的特異的な若しくはランダムな突然変異によって多様化したもの）に自己複製を起こさせることにより、また自己複製が起こりうる条件を変えることにより、本発明の系は、変更を加えた、増強させた、若しくは新規の性質を有するポリメラーゼを単離し操作するために用いることができる。そのような増強される性質としては、熱安定性の増大、プロセッシビティの増大、正確性の向上（より良好なプルーフリーディング）、本来は好ましくない基質の取込み（例えば、リボヌクレオチド、５’−ニトロインドールなどの色素で修飾した一般的な塩基、若しくはピレンヌクレオチド（Matray及びKool, (1999), Nature 399, 704-708）（図３）などの通常にはないその他の基質）、又は阻害物質（例えば、臨床検査用サンプル中に含まれるヘパリンなど）に対する抵抗性が含まれる。新規の性質としては、非天然基質（例えばリボヌクレオチド）の取込み、損傷を受けた部位（例えば塩基のない部位（Paz-Elizur T.ら, (1997) Biochemistry, 36, 1766）、チミジンダイマー（Wood, R.D., (1999) Nature, 399, 639）、ヒダントイン塩基（Duarte, V.ら, (1999) Nucleic Acids Res. 27, 496）を回避した読みとり、及び新規の化学的性質（例えば、ＰＮＡ（Nielsen, P.E., Curr. Opin. Biotechnol. 1999; 10(1):71-5）若しくはスルホン（Benner, S.A.ら, Pure Appl. Chem. 1998, Feb; 70(2):263-6）などの新規の骨格、又は糖の化学的性質を変更（A.Eschenmoser, Science 284, 2118-24(1999)）も含まれる。本発明の系はまた、プロセッシビティ因子などのポリメラーゼ機能を増強若しくは改変する因子（Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼの場合のチオレドキシン（Doublie, S.ら, (1998) Nature 391, 251））の単離若しくは進化のためにも用いることができる。
【００６１】
しかし、レプリカーゼ以外の酵素、例えばテロメラーゼ、ヘリカーゼその他なども、本発明に従って選択することができる。テロメラーゼはｉｎ  ｓｉｔｕで（区画内で）、例えばテロメラーゼ−ＲＮＡと共に（外から添加するか若しくはｉｎ  ｓｉｔｕで転写させる。例えば、Bachandら, (2000) RNA 6:778-784）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳により発現される。
【００６２】
区画はまた、Ｔａｑ  Ｐｏｌ及びｄＮＴＰ並びにテロメア特異的プライマーも含有している。低温ではＴａｑは不活性であるが、活性のあるテロメラーゼはテロメアをそれ自体をコードする遺伝子（適切な末端を有する線状ＤＮＡ断片）に付加する。テロメラーゼ反応の後には、熱サイクルでは活性を有するテロメラーゼをコードする遺伝子のみが増幅される。テロメラーゼ遺伝子若しくはＲＮＡ（又はその双方）に多様性を導入することができ、その多様性は標的特異的若しくはランダムなものとしうる。ヘリカーゼの選択に適用する場合には、その選択方法は本質的にはテロメラーゼについて述べたものと同じであるが、ヘリカーゼは熱変性ではなく鎖の巻き戻しに用いられる。
【００６３】
本発明の方法はまた、ＤＮＡ修復酵素若しくは大腸菌のＰｏｌ  ＩＶ及びＰｏｌ  Ｖなどの損傷を越えて合成する（translesion）ポリメラーゼの選択のためにも用いることができる。この方法では、損傷をプライマー中に導入するか（標的特異的な化学的方法）若しくは変異原（例えば、ＵＶ、変異原性化学物質その他）での処理によってランダムに導入する。このことによって複製に必要なプライマー、若しくは自身の遺伝子配列を修復することのできる（情報の修繕）酵素の選択ができ、又は遺伝子治療用の改良された「修復酵素（repairase）」その他が得られる。
【００６４】
本発明の方法はその種々の実施形態において、レプリカーゼ活性を直接的若しくは間接的に改変可能な物質を選択するために用いることができる。さらに、本発明は、相互作用することが可能なポリペプチド対の選択、若しくは触媒作用のあるＲＮＡ（リボザイム）などの触媒作用のある核酸の選択に用いることができる。これら及びその他の実施形態は以下にさらに詳細に説明する。
【００６５】
核酸加工触媒酵素
本明細書で用いる核酸加工触媒酵素とは、タンパク質酵素若しくは核酸酵素であって、核酸を改変、伸長（少なくとも１個のヌクレオチド分）、増幅、若しくはそれ以外の何らかの影響を及ぼして、本発明に従って増幅させることによってその核酸を選択可能なものとするいかなる酵素をも意味する。従って、そのような酵素は、例えば、核酸の増幅、安定化、不安定化、ハイブリダイゼーション若しくは変性、複製、保護若しくは脱保護をもたらすような活性、又は、ある核酸が増幅によって選択しうることを基礎とする何らかの他の活性を有している。例としてはヘリカーゼ、テロメラーゼ、リガーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、及びレプリカーゼが含まれる。レプリカーゼが好ましい。
【００６６】
レプリカーゼ／複製
本明細書で用いる「複製」という用語は、鋳型依存性の核酸配列のコピーを意味している。核酸については下記に論じ、例示している。一般的には、複製の産物は別の核酸であり、同一種のものであるか又は異なる種のものである。従って、ＤＮＡを複製してＤＮＡを産生させる複製、ＤＮＡを複製してＲＮＡを産生させる複製、ＲＮＡを複製してＤＮＡを産生させる複製、ＲＮＡを複製してＲＮＡを産生させる複製が含まれる。従って「複製」という用語は、ＤＮＡ複製、重合、オリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドの連結（例えば、トリヌクレオチド（トリプレット）５’トリホスファターゼ）により長い配列を形成すること、転写、逆転写などをも包含する。
【００６７】
「レプリカーゼ」という用語は、ヌクレオチドビルディングブロックを結合させて核酸配列を形成させることが可能な触媒活性を有している酵素を意味することを意図している。そのようなヌクレオチドビルディングブロックとしては、限定はされないが、ヌクレオシド、ヌクレオシド三リン酸、デオキシヌクレオシド、デオキシヌクレオシド三リン酸、ヌクレオチド（アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、その他などの窒素含有塩基、５炭糖、及び１つ以上のリン酸基を含む）、ヌクレオチド三リン酸、デオキシヌクレオチド（デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシシチジン、デオキシウリジン、デオキシグアニジンなど）、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、並びにこれらの合成の若しくは人工の類似体が含まれる。ビルディングブロックとしてはまた、上記のいずれかのオリゴマー若しくはポリマー、例えば、トリヌクレオチド（トリプレット）、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドが含まれる。
【００６８】
このように、レプリカーゼはヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドを取り込むことにより既にある核酸配列（プライマー）を伸長することができる。このような活性は当業界では「重合」として知られ、これを行う酵素は、「ポリメラーゼ」として知られている。そのようなポリメラーゼの例として、レプリカーゼはＤＮＡポリメラーゼであり、ＤＮＡを複製することができる。プライマーはおそらく伸長される配列と化学的に同じであるか若しくは異なるものである（例えば、哺乳動物のＤＮＡポリメラーゼはＲＮＡプライマーからＤＮＡ配列を伸長させることが知られている）。レプリカーゼという用語はまた、核酸配列（ポリマー若しくはオリゴマーのいずれか）を結合させてより長い核酸配列を形成させる酵素をも含んでいる。そのような活性はＤＮＡ若しくはＲＮＡの小片を連結するリガーゼによって示される。
【００６９】
レプリカーゼは、レプリカーゼ配列の全てから構成されるものとすることができ、又はレプリカーゼは異種のポリペプチド若しくはある物質などの他の分子と、化学的な方法で、若しくは融合タンパク質の形で、若しくは２種以上の構成部分からアセンブルして連結されたレプリカーゼ配列を含むものとすることができる。
【００７０】
好ましくは、本発明のレプリカーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼ、若しくはＲＮＡリガーゼである。
【００７１】
好ましくは、レプリカーゼは熱安定性のレプリカーゼである。本明細書中で用いる「熱安定性」レプリカーゼとは、高温、典型的には体温（３７℃）より高い温度での熱変性に対して著しい抵抗性を示すレプリカーゼである。好ましくは、そのような温度は４２℃から１６０℃の範囲であり、より好ましくは６０から１００℃であり、最も好ましくは９０℃を超える温度である。熱安定性でないレプリカーゼと比較すると、熱安定性レプリカーゼは著しく長い半減期（高温条件でその活性を５０％失うまでに要したインキュベーション時間）を示す。好ましくは、熱安定性レプリカーゼは高温でのインキュベーション後に３０％以上の活性を保持し、より好ましくは活性の保持が４０％、５０％、６０％、７０％、若しくは８０％以上である。さらにより好ましくは、該レプリカーゼは８０％の活性の保持を示す。最も好ましくは、活性の保持は９０％、９５％以上、１００％にまでなる。熱安定性でないレプリカーゼは高温での同様のインキュベーションを行った後には活性はほとんど若しくは全く保持されない。
【００７２】
ポリメラーゼ
レプリカーゼの例はＤＮＡポリメラーゼである。ＤＮＡポリメラーゼ酵素は天然に存在する細胞内酵素であり、細胞に利用されて鋳型分子を用いた核酸鎖の複製を行い、相補的な核酸鎖を生成する。ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、核酸プライマーの伸長しつつある末端の３’ヒドロキシル基とヌクレオチド三リン酸の５’リン酸基との間の結合の形成を触媒する。これらのヌクレオチド三リン酸は、通常は、デオキシアデノシン三リン酸（Ａ）、デオキシチミジン三リン酸（Ｔ）、デオキシシチジン三リン酸（Ｃ）、及びデオキシグアノシン三リン酸（Ｇ）から選択される。しかし、ＤＮＡポリメラーゼはこれらのヌクレオチドの改変形態をも取り込みうる。ヌクレオチドが付加される順番は、ＤＮＡ鋳型鎖に対しての塩基対合によって決定される。そのような塩基対合は「規則的な（canonical）」水素結合を介して形成されている（向かい合っているＤＮＡ鎖のＡ及びＴヌクレオチド間並びにＣ及びＧヌクレオチド間の水素結合）が、規則的ではない塩基対号、例えばＧ−Ｕ塩基対合なども当業界では知られている。例えば、Adamsら, 「核酸の生化学」"The Biochemistry of the Nucleic Acids" 14-32(第11版, 1992)を参照のこと。ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用は、種々の生化学的用途において最近では以前より一般的に行われており、そのような用途としては、ｃＤＮＡ合成及びＤＮＡの配列決定反応（Sambrookら, (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)を参照すればよくこれは本明細書中に参照により組み入れる）、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの方法による核酸の増幅（Mullisら, 米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、及び第4,800,159号、これらは本明細書中に参照により組み入れる）、並びにＲＮＡ転写を利用する増幅方法（例えば、Kacianら, PCT公開第WO91/01384号）が含まれる。
【００７３】
ＰＣＲなどの方法は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を利用したプライマーの伸長を行い、その後、プライマーのアニーリングと伸長をもう１ラウンド行うための新しい鋳型を生成するために、得られた二本鎖核酸を熱変性するサイクルを利用している。鎖の変性に必要な高温において多数のＤＮＡポリメラーゼの不可逆的な不活化がもたらされてしまうので、約３７℃から４２℃を超える温度で活性を維持可能なＤＮＡポリメラーゼ（熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素）を発見しそれを使用すればコスト及び労力の点で有利である。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはこれまでに多数の好熱性生物中で発見されており、そのようなものとしては、限定はされないが、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、及びバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）、スルホロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属するいくつかの種が含まれる。ＤＮＡポリメラーゼはこれらの好熱性生物から直接的に精製することができる。しかし、まず最初にその酵素をコードする遺伝子を多重コピー発現ベクター中に組換えＤＮＡ技法によってクローニングし、そのベクターを、該酵素を発現しうる宿主細胞株中に挿入し、ベクターを含有している宿主細胞を培養し、次いで該ＤＮＡポリメラーゼを、それを発現した宿主細胞株から抽出することによって、ＤＮＡポリメラーゼの収率を大きく向上させることができる。
【００７４】
現在までに特性決定されている細菌由来のＤＮＡポリメラーゼは、ある一定のパターンの類似点と相異点があり、そのことによってこれらの酵素を２つの群に分ける考え方がある。その群とは、その遺伝子がイントロン／インテインを含んでいるもの（クラスＢ  ＤＮＡポリメラーゼ）、及びそのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩの遺伝子とほぼ類似していてイントロンを含まないもの（クラスＡ  ＤＮＡポリメラーゼ）である。
【００７５】
好熱性生物由来のクラスＡ及びクラスＢの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのいくつかはクローニングされ発現されている。クラスＡの酵素のうちでは、Lawyerら, J. Biol. Chem. 264:6427-6437(1989)及びGelfundら, 米国特許第5,079,352号は、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの完全長のもののクローニングと発現を報告している。Lawyerら, PCR Methods and Applications, 2:275-287(1993)、及びBarnes, PCT公開No.WO92/06188(1992)は、同じＴａｑＤＮＡポリメラーゼの末端切断型のクローニングと発現を開示しており、一方、Sullivan, EPO公開No. 0482714A1(1992)は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの変異型のクローニングを報告している。Asakuraら, J. Ferment. Bioeng.(Japan), 74:265-269(1993)は、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼのクローニングと発現を報告している。Gelfundら, PCT公開No.WO92/06202(1992)は、サーモシホ・アフリカナス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ）由来の精製熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを開示している。サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼについてはAkhmetzjanov及びVakhitov, Nucleic Acids Res., 20:5839(1992)が報告している。Uemoriら, J. Biochem. 113: 401-410(1993)及びEPO公開No.0517418A2(1992)は好熱性細菌であるバシラス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）由来のＤＮＡポリメラーゼのクローニング及び発現を報告している。Ishinoら, 日本特許出願平4 [1992] -131400号（公開日1993年11月19日）は、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼのクローニングを報告している。クラスＢの酵素では、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、Combら, EPO公開No.0455430A3(1991)、Combら, EPO公開No.0547920A2(1993)、及びPerlerら, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 89:5577-5581(1992)によって報告されている。スルホロバス・ソロファタリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｏｆａｔａｒｉｕｓ）由来のクローニングされた熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはPisaniら, Nucleic Acids Res., 20:2711-2716(1992)及びPCT公開No.WO93/25691(1993)中に開示されている。ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）の熱安定性酵素はUemoriら, Nucleic Acids Res., 21:259-265(1993)に開示されており、一方、ピロコッカス・エスピー（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）由来の組換えＤＮＡポリメラーゼはCombら, EPO公開No.0547359A1(1993)に開示されている。
【００７６】
多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼ活性以外の活性を有している。そのような活性としては、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性及び／若しくは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が含まれる。５’−３’及び３’−５’エキソヌクレアーゼの活性は当業者には周知である。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は新たに合成された鎖の正確性を、取り込まれた可能性のある正しくない塩基を除去することによって改善する。そのような活性が低いか若しくは活性を持たないＤＮＡポリメラーゼとしては、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼが含まれることが報告されているが（Lawyerら, J. Biol. Chem. 264:6427-6437）、そのようなＤＮＡポリメラーゼでは、伸長するプライマー鎖中へのヌクレオチド残基の取込みの誤り率が高い。プライマー伸長サイクルのサイクル数に関してＤＮＡの複製が等比級数的であることが多い核酸増幅方法などに適用する場合には、そのような誤りは、核酸増幅産物（アンプリコン）の配列の不均質性などの深刻な人為的な問題を引き起こす可能性がある。従って、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性はそのような目的に用いる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの特性として望ましいものである。
【００７７】
これに対して、ＤＮＡポリメラーゼ酵素中にしばしば存在する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性は、保護されていない５’末端を有する核酸（プライマーを含む）を消化することができるので、特定の用途には望ましくないことが多い。従って、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が減弱した、若しくはそのような活性がない熱安定性ＤＮＡポリメラーゼも生化学的用途にとって望ましい特性の酵素である。ＤＮＡポリメラーゼに改変を導入した種々のＤＮＡポリメラーゼ酵素が報告されており、それはこの目的を達成している。例えば、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を制御しているタンパク質のドメインが除去されたホロ酵素のタンパク質分解断片として産生される。そのクレノウ断片は依然としてポリメラーゼ活性と３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とを保持している。Barnes（上述の文献）、及びGelfundら, 米国特許第5,079,352号は、５’−３’エキソヌクレアーゼの欠損した、組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼを作製した。Ishinoら, EPO公開No.0517418A2は、バシラス・カルドテナクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｒｄｏｔｅｎａｘ）由来の、５’−３’エキソヌクレアーゼ欠損のＤＮＡポリメラーゼを作製した。他方、５’−３’エキソヌクレアーゼドメインを欠損するポリメラーゼはプロセッシビティの低下がよく見られる。
【００７８】
リガーゼ
複製、修復、及び組換えの際にＤＮＡ鎖の切断やギャップが生ずる。哺乳動物細胞の核では、そのような鎖の切断の再結合はいくつかの種のＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼ酵素に依存している。ＤＮＡリガーゼ酵素によるＤＮＡ鎖の中断の結合機作は様々に報告されている。その反応は、共有結合による酵素−アデニル酸複合体の形成によって開始される。哺乳動物とウイルスのＤＮＡリガーゼ酵素は補因子としてＡＴＰを用いるが、細菌のＤＮＡリガーゼ酵素はアデニリル基をもたらすためにＮＡＤを用いる。ＡＴＰを利用するリガーゼの場合には、そのＡＴＰは切断されてＡＭＰとピロリン酸となり、アデニリル残基はタンパク質の活性部位にある特定のリジン残基のε−アミノ基とホスホロアミダイト結合によって結合する（Gumport, R.I.ら, PNAS, 68:2559-63(1971)）。ＤＮＡリガーゼ−アデニル酸中間体の再活性化されたＡＭＰ残基は二本鎖ＤＮＡ中の一本鎖切断部分の５’リン酸末端に転移され５’−５’無水リン酸結合を持つ共有結合ＤＮＡ−ＡＭＰ複合体が生ずる。この反応中間体は微生物及び哺乳動物ＤＮＡリガーゼ酵素についても単離されてはいるが、アデニリル化酵素よりも寿命が短い。ＤＮＡの連結の最終ステップでは、ホスホジエステル結合の生成に必要なアデニリル化されていないＤＮＡリガーゼ酵素がアデニリル化部位上の近接する３’−ヒドロキシル基による攻撃を通じてＡＭＰ残基の排除を触媒する。
【００７９】
３種類の異なるＤＮＡリガーゼ酵素、すなわちＤＮＡリガーゼＩ、ＩＩ、及びＩＩＩについては精製された酵素の特徴を生化学的及び免疫学的に調べることによってこれまでに確立されている（Tomkinson, A.E.ら, J. Biol. Chem., 266:21728-21735(1991)、及びRoberts, E.ら, J. Biol. Chem., 269:3789-3792(1994)）。
【００８０】
増幅
本発明の方法は、所望の核酸の鋳型を用いた増幅を行う。「増幅」とは、ある特定の核酸断片（若しくはその一部分）のコピー数の増加を意味し、それは酵素的連鎖反応（ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、若しくは自己持続性配列複製など）、又はその断片がクローニングされたベクターの全体若しくは一部の複製のいずれかによってもたらされるものである。好ましくは、本発明において行う増幅は、例えばポリメラーゼ連鎖反応によって示されるような、指数関数的な増幅である。
【００８１】
文献中には多数の標的増幅法及びシグナル増幅法が報告されており、例えば、それらの方法の総説は、Landegren, U.ら, Science 242:229-237(1988)及びLewis, R., Genetic Engineering News 10:1, 54-55(1990)中に述べられている。これらの増幅法を本発明の方法に用いることができ、そのようなものとしては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、リガーゼ増幅反応（ＬＡＳ）、リガーゼハイブリダイゼーション、Ｑバクテリオファージレプリカーゼ、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）、転写物の配列決定を伴うゲノム増幅（ＧＡＷＴＳ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。
【００８２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＰＣＲは、特に米国特許第4,683,195号及び第4,683,202号に記載されている増幅方法である。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼによって行われるプライマー伸長反応の反復サイクルからなっている。標的ＤＮＡを熱変性させ、２つのオリゴヌクレオチド（増幅されることとなるＤＮＡの向かい合った鎖上の標的配列を挟む配列）とハイブリダイズさせる。これらのオリゴヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼを用いるためのプライマーとなる。このＤＮＡはプライマーの伸長によってコピーされて双方の鎖の第２のコピーができる。熱変性、プライマーハイブリダイゼーション、及び伸長のサイクルを繰り返すことによって、標的ＤＮＡを約２から４時間のうちに１００万倍以上に増幅することができる。ＰＣＲは分子生物学のツールであり、増幅の結果を調べるための検出技法と共に用いなければならない。ＰＣＲの利点は、標的ＤＮＡの量を増幅することによって約４時間のうちに１００万倍から１０００万倍感度を増大させることである。
【００８３】
このポリメラーゼ連鎖反応は、本発明の選択方法で次のとおり用いることができる。例えば、ＰＣＲはポリメラーゼ活性を有するＴａｑポリメラーゼの変異体を選択するために用いることができる。より詳細に上述したとおり、核酸のライブラリーであって、それぞれがレプリカーゼ若しくはそのレプリカーゼの変異体（例えばＴａｑポリメラーゼ）をコードしているようなライブラリーを作製し、さらに区画に分割する。各区画は、実質的には、ライブラリーのメンバーの１つとそのメンバーによってコードされるレプリカーゼ若しくはその変異体を含むものである。
【００８４】
該ポリメラーゼ若しくはその変異体は、形質転換された細菌若しくはその他の適当な発現宿主、例えば酵母又は昆虫若しくは哺乳動物細胞内でｉｎ  ｖｉｖｏで発現され、その発現宿主はある区画内に封入されたものである。熱若しくはその他の適切な方法を適用してその宿主を破壊してその区画内にあるポリメラーゼ変異体及びそれをコードする核酸を放出させる。細菌宿主の場合には、溶解タンパク質の時間を定めた発現、例えばΦＸ１７４からのプロテインＥ、若しくは誘導可能なλ溶菌ファージを、細菌の破壊のために用いることができる。
【００８５】
ポリメラーゼ若しくはその他の酵素がその宿主内で発現される異種タンパク質である必要はない（例えば、プラスミド）ことは明らかであろうが、宿主ゲノムの遺伝子形成部分から発現させることができる。従って、ポリメラーゼは、例えば内因性若しくは細菌がもともと持っているポリメラーゼとすることができる。本発明者は、ヌクレオチド二リン酸キナーゼ（ｎｄｋ）の場合には、ｎｄｋの内因性の（誘導されたものでない）発現は、それ自体の複製のためのｄＮＴＰを生成するには十分であることを示した。従って本発明の選択方法は、多様な（及び未知の）微生物集団からのポリメラーゼ及びその他の酵素の直接的機能性クローニングに用いることができる。
【００８６】
あるいはまた、核酸ライブラリーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系（本明細書でさらに詳細に説明する）の構成要素、及びその区画内でｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現されるポリメラーゼ変異体と共に区画化することができる。
【００８７】
各区画はまた、ＰＣＲ反応の構成要素、例えばヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、バッファー、マグネシウム、及びオリゴヌクレオチドプライマーなどを含んでもよい。オリゴヌクレオチドプライマーはポリメラーゼ遺伝子に隣接する（すなわち、ゲノムＤＮＡ若しくはベクターＤＮＡ内の）配列、又はポリメラーゼ遺伝子内の配列に対応する配列を有しているものとすることができる。次いで、ＰＣＲの熱サイクルを開始し、ポリメラーゼ活性を有しているポリメラーゼ変異体がその核酸配列を増幅することができるようにする。
【００８８】
活性のあるポリメラーゼは対応する核酸配列を増幅するが、一方で、活性の弱い若しくは不活性のポリメラーゼをコードする核酸配列は複製が少ないか若しくは全く複製されない。一般的には、核酸ライブラリーの各メンバーの最終的なコピー数は、それによってコードされるポリメラーゼ変異体の活性レベルに比例することとなると考えられる。活性のあるポリメラーゼをコードする核酸は多量に検出され、不活性若しくは活性の弱いポリメラーゼをコードする核酸は検出できない程度に少ない。この結果得られる増幅された配列は、次いでクローニングされ、配列決定などが行われ、各メンバーの複製能がアッセイされる。
【００８９】
他の箇所で詳細に説明したとおり、各区画内の条件を変えて、その条件下で活性を有するポリメラーゼの選択を行うことができる。例えば、反応混液中にヘパリンを添加してヘパリンに抵抗性のポリメラーゼを選択することができる。ＰＣＲを行う温度を上げてポリメラーゼの熱抵抗性変異体を選択することができる。さらに、３’末端が改変されているプライマーなどのＤＮＡ配列、又はプライマー配列の改変部分を伸長することのできるポリメラーゼを選択することができる。改変された３’末端、若しくはその他の改変としては、非天然塩基（改変された糖若しくは塩基部分）、改変された塩基（例えば、ブロックされた３’末端）、又は骨格の化学的性質に変更を加えられたプライマー（例えば、ＰＮＡプライマー）などが挙げられる。
【００９０】
逆転写酵素−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲはＲＮＡ標的を増幅するために用いられる。このプロセスでは、逆転写酵素はＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換するために用いられ、次いでＰＣＲを用いてこの相補的ＤＮＡが増幅される。この方法はＲＮＡウイルスの検出に有用であることが証明されている。
【００９１】
本発明の方法ではＲＴ−ＰＣＲを用いることができる。レプリカーゼ若しくはその変異体をコードしている核酸のプールはＲＮＡライブラリーの形で提供することができる。このライブラリーは、ｉｎ  ｖｉｖｏで区画化された細菌、哺乳動物細胞、酵母などで作製することができ、又は区画化されたＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写によって作製することもできる。ＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現された（及び乳液中に下記に開示する方法によってＲＮＡと共に放出された）、若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現された、同じ区画に入れられたレプリカーゼ（例えば、逆転写酵素若しくはポリメラーゼ）をコードしうる。増幅に必要なその他の構成成分（ポリメラーゼ及び／若しくは逆転写酵素、ｄＮＴＰ、プライマー）も区画化される。ある与えられた選択圧下では逆転写反応のｃＤＮＡ産物はＰＣＲ増幅の鋳型となる。他の複製反応（特に実施例中のｎｄｋ）と同様に、ＲＮＡは、この反応に材料を供給する一連の酵素をコードするものであってもよい。
【００９２】
自己持続性配列複製（３ＳＲ）
自己持続性配列複製（３ＳＲ）はＴＡＳの変法であり、その方法では、酵素カクテル及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーによって媒介される、逆転写酵素（ＲＴ）、ポリメラーゼ、及びヌクレアーゼの活性の連続的なラウンドによる核酸鋳型の等温増幅を行う（Guatelliら, (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874）。ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖のＲＮＡの酵素的分解を、熱変性の替わりに用いる。ＲＮＡａｓｅＨ及びその他の酵素の全ては反応液中に添加され、全てのステップは同一温度で、さらに試薬を添加することなく行われる。このプロセスの後、４２℃で１時間で１０６から１０９の増幅が達成されている。
【００９３】
従って本発明の方法は、ＰＣＲの熱サイクルに替えて３ＳＲ等温増幅（Guatelliら, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:7797; Compton(1991) Nature 7; 350:91-92）を用いる常温を好む生物に由来するポリメラーゼ若しくはレプリカーゼの選択へ拡張することができる。上述のとおり、３ＳＲには２種類の酵素の協調作用が関与している。すなわち、ＲＮＡポリメラーゼと逆転写酵素は転写と逆転写の連動した反応において協同して作用し、ＲＮＡとＤＮＡの同時増幅をもたらす。この系においては、自己増幅を、関与している２種類の酵素のいずれかに適用でき、又はそれらの双方に同時に適用できることは明らかである。この系はまた、ＲＮａｓｅＨ活性を逆転写酵素（例えば、ＨＩＶ−１  ＲＴ）の一部として若しくはそれ自体が持つようなものの進化をも含んでいる。
【００９４】
３ＳＲ及び関連する方法を定義づけている種々の酵素の活性は、その全てが本発明の方法を用いた選択の標的となるものである。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（ＲＴ）、若しくはＲＮＡｓｅＨの変異体は乳液の水性区画内に提供することができ、その他の点では制限を付するような条件下で選択される。これらの変異体は大腸菌の「遺伝子ペレット」により導入することができ（すなわち、ポリペプチドを発現する細菌）、又は本明細書の他の箇所に述べた他の方法により導入することができる。乳液中の最初の放出は酵素的に（例えばλ溶菌ファージ）、若しくは熱による溶解、又はその他の本明細書に記載の方法によって行われる。熱による溶解の場合には、一時的に高く設定した温度で酵素活性を安定化させる物質を用いることが必要であろう。例えば、逆転写酵素などの熱感受性の酵素の安定化を行うためには当業界では既知のプロリン、グリセロール、トレハロース、若しくはその他の安定化剤を適量で含むことがおそらく必要であろう。さらに、そのような物質の段階的除去を行うことによって、熱感受性酵素の安定性の増大について選択することができる。
【００９５】
あるいはまた、及び他の箇所で開示されているとおり、変異体は連動した転写と翻訳を介して産生させることができ、発現された産物が３ＳＲサイクル中へ送り込まれる。
【００９６】
また、逆転写酵素を熱安定性のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼと置換することが可能であることも理解されよう。Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼは逆転写酵素活性を有することが知られており、ＲＮＡ鋳型はこの酵素を用いて効率的に逆転写されてＤＮＡ鋳型となる。従ってこの酵素の有用な変異体を、例えば細菌で発現されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ変異体を乳液中に入れ、この実験以外では許されない温度でプレインキュベーションを行って、選択することができる。
【００９７】
下記の実施例１８は、本発明の方法が、自己持続性配列複製（３ＳＲ）を用いたレプリカーゼの選択に適用できる１方法を示している。
【００９８】
ライゲーション増幅（ＬＡＲ／ＬＡＳ）
ライゲーション増幅反応若しくはライゲーション増幅系は、ＤＮＡリガーゼと標的鎖あたり２個で合計４個のオリゴヌクレオチドを用いる。この技法については、Wu, D.Y.及びWallace, R.B., (1989) Genomics 4:560に述べられている。これらのオリゴヌクレオチドは標的ＤＮＡ上の隣接する配列にハイブリダイズし、リガーゼによって結合される。この反応は熱変性とサイクルを反復するものである。
【００９９】
ポリメラーゼへの適用の場合と同様に、本発明の方法は、リガーゼ、特に好熱性生物由来のリガーゼに適用することができる。リガーゼ遺伝子配列の一方の鎖に対して相補的なオリゴヌクレオチドを合成する（完全に一致したものとするか、又は、標的特異的な若しくはランダムな多様性を含んだものとする）。２個の末端オリゴはベクター若しくはリガーゼ遺伝子の非翻訳領域と重複する部分を有している。リガーゼ遺伝子は、適切な宿主中での発現のためにクローニングされ、該オリゴヌクレオチド及び適切なエネルギー源（通常はＡＴＰ（若しくはＮＡＤＰＨ））と共に区画化される。必要があれば、上述のように細菌中で発現させたリガーゼを熱溶解によって細胞から放出させる。区画には、適切なバッファーと共に適切な量の適切なエネルギー源（ＡＴＰ若しくはＮＡＤＰＨ）及び該リガーゼの遺伝子全体をコードしているオリゴヌクレオチド、並びにクローニングに必要なフランキング配列が含まれる。オリゴヌクレオチドによって、活性のリガーゼにより完全長のリガーゼ遺伝子がアセンブリ（構築）される（発現プラスミド上のリガーゼ遺伝子を鋳型として起こる）。不活性なリガーゼを含んでいる区画では、アセンブリは起こらない。ポリメラーゼの場合と同様に、リガーゼ遺伝子Ｘのセルフライゲーション後のコピー数は、好ましくはその遺伝子がコードするリガーゼＸの選択条件下での触媒活性と比例することとなる。
【０１００】
細胞の溶解後、熱サイクルによって該オリゴヌクレオチドのリガーゼ遺伝子へのアニーリングが起こる。しかし、該オリゴのライゲーション及び完全長リガーゼ遺伝子のアセンブリーは同一区画内に活性のあるリガーゼが存在するか否かに依存している。従って、活性のあるリガーゼをコードする遺伝子のみがそこに存在するオリゴヌクレオチドからそれら自体のコード遺伝子をアセンブリすることとなる。次いでそのアセンブリされた遺伝子を必要に応じてもう一度選択のラウンドにかけるために、増幅、多様化、及び再クローニングしてもよい。従って、本発明の方法は、ライゲーションをより迅速に又は効率的に行うリガーゼの選択に適したものである。
【０１０１】
他の箇所で述べたとおり、リガーゼは、ｉｎ  ｓｉｔｕで適切な細菌若しくはその他の宿主から発現させるか、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳により産生させることができる。リガーゼは、利用可能な断片からそれ自体の配列をアセンブリするオリゴヌクレオチドの（例えば、リボザイム若しくはデオキシリボザイム）リガーゼとすることができ、又はリガーゼは従来の（ポリペプチド）リガーゼとすることができる。オリゴヌクレオチドの長さは個々の反応によって異なるが、必要に応じて、非常に短いもの（例えばトリプレット）とすることができる。他の箇所で述べたとおり、本発明の方法はリガーゼ活性を直接的若しくは間接的に改変可能な物質を選択するために用いることができる。例えば、進化させようとする遺伝子を、リガーゼの基質を作る別の若しくは複数の酵素（例えばＮＡＤＨ）又は阻害物質を消費する酵素のものとすることができる。
【０１０２】
オリゴヌクレオチド間のライゲーション反応には別の化学的反応、例えばアミド結合を組み入れることができる。この化学結合がレプリカーゼ（例えば逆転写酵素）の対向する鎖の鋳型をもとにしたコピー作成を妨害しない限りは、多様な化学的結合反応及びそれを触媒するリガーゼを進化させることができる。
【０１０３】
Ｑβレプリカーゼ
この技法では、バクテリオファージＱβのＲＮＡレプリカーゼを標的ＤＮＡの増幅に用いるもので、この酵素は一本鎖ＲＮＡを複製する。この技法についてはLizardら, (1988) Bio. Technology 6:1197に述べられているとおりである。まず最初に標的ＤＮＡを、Ｔ７プロモーター及びＱβ５’配列領域を含むプライマーとハイブリダイズさせる。逆転写酵素はこのプライマーを用いて、そのプロセスにおいて該プライマーをその５’末端に連結したｃＤＮＡを生成する。これらの２つのステップはＴＡＳのプロトコールと類似のものである。この結果得られるヘテロ二本鎖を熱変性させる。次いで、Ｑβ３’配列領域を含む第２のプライマーを第２ラウンドのｃＤＮＡ合成を開始するために用いる。この結果Ｑβバクテリオファージの５’と３’末端の双方と活性のあるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ結合部位とを含む二本鎖ＤＮＡがもたらされる。次いでＴ７  ＲＮＡポリメラーゼはその二本鎖ＤＮＡを新たなＲＮＡに転写するが、それはＱβを模倣したものである。十分に洗ってハイブリダイズしていないプローブを除去した後、その新たなＲＮＡを標的から溶出し、Ｑβレプリカーゼで複製する。後者の反応では約２０分間で１０７倍の増幅が行われる。上記反応の間に非特異的に保持されるプローブＲＮＡのごく少量によって有意な量のバックグラウンドが形成されることもある。
【０１０４】
上述のＱβレプリカーゼを用いる反応は、本発明の別の１実施形態において、連続的選択反応を構築するために用いることができる。
【０１０５】
例えば、Ｑβレプリカーゼの遺伝子（適切な５’及び３’領域を有する）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳反応液中に添加し区画化する。区画内ではレプリカーゼが発現され、それ自身の遺伝子の複製が直ちに開始される。活性のあるレプリカーゼをコードしている遺伝子のみがそれ自体を複製する。複製はＮＴＰが尽きるまで進行する。しかし、ＮＴＰは乳液全体に拡散するようになっているので（実施例中のｎｄｋの説明を参照せよ）、複製反応は外部から材料を与えられずっと長く進行させて、その区画内にさらに複製する余地が本質的に残っていない状態となるまで進めることができる。この反応をさらに、該混合乳液を新鮮な油相に連続希釈し、ＮＴＰを含有する新鮮な水相を添加後再度乳化することによって拡大することができる。Ｑβレプリカーゼは非常に変異を起こしやすいものとして知られているので、複製のみでは多数のランダムな多様性が導入されてしまう（これは望ましいこともある）。上述の方法では、より特異的な（例えばプライマー依存性の）Ｑβレプリカーゼの形態への進化が可能である。他の複製反応と同様に（特に実施例中のｎｄｋ）、この反応に材料を与える広範な酵素を進化させることができる。
【０１０６】
その他の増幅技法
本発明では別の増幅技法も用いることができる。例えば、ローリングサークル増幅法（Lizardiら, (1998) Nat. Genet. 19:225）は市販されている増幅技法であり（ＲＣＡＴＴＭ）、その方法はＤＮＡポリメラーゼで駆動され環状オリゴヌクレオチドプローブを等温条件下で直線的若しくは幾何級数的に増加するような反応速度で複製することができる。
【０１０７】
２個の適切に設計されたプライマーの存在下で幾何級数的増幅がＤＮＡ鎖の置換及び高度の分枝を介して起こり、１時間で各環の１０１２個以上のコピーが生成される。
【０１０８】
単一のプライマーを用いた場合には、ＲＣＡＴは２、３分後には標的と共有結合で連結された標的のＤＮＡコピーが数千個縦につながって結合された直鎖を生成する。
【０１０９】
さらに別の技法として、鎖置換増幅（ＳＤＡ；Walkerら, (1992) PNAS(USA) 80:392）は特定の標的に対して特有の、特異的に規定された配列を用いて開始する。しかし熱サイクルに依存している他の技法とは異なり、ＳＤＡは一連のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及び制限酵素を用いてその特有の核酸配列を指数関数的に増幅する等温プロセスである。
【０１１０】
ＳＤＡは標的生成段階と指数関数的増幅段階の双方を含む。
【０１１１】
標的生成では、二本鎖ＤＮＡを熱変性させて２本の一本鎖コピーを作る。特別に製造された一組のプライマーをＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて（基礎となっている配列をコピーするための増幅プライマー、及び新たに作られた鎖の置換のためのバンパープライマー）、指数関数的増幅が可能な改変された標的を形成させる。
【０１１２】
指数関数的増幅プロセスは標的生成段階からの改変標的（制限酵素認識部位を有する一本鎖の部分ＤＮＡ鎖）を用いて開始される。
【０１１３】
増幅プライマーを各鎖のそのプライマーと相補的なＤＮＡ配列の位置で結合させる。次いでＤＮＡポリメラーゼはそのプライマーを用いて、そのプライマーをその３’末端から、改変標的を個々のヌクレオチドを付加するための鋳型として用いて伸長させる位置を決定する。その伸長されたプライマーは各鎖の末端に完全な形の制限酵素認識部位を含む二本鎖ＤＮＡの部分断片を形成する。
【０１１４】
次いで制限酵素をその二本鎖ＤＮＡ部分断片にその認識部位で結合させる。制限酵素は、その認識部位で両側の部分断片の一方の鎖のみを切断してニックを形成した後にその部位から解離する。ＤＮＡポリメラーゼはそのニックを認識し、その部位から鎖を伸長させて、その前に作られていた鎖と置換される。このように認識部位は繰り返しニックが挿入され、制限酵素及びＤＮＡポリメラーゼによる、標的部分断片を含むＤＮＡ鎖の連続的な置換を用いて修復される。
【０１１５】
次いで置換された鎖の各々を上述のとおり増幅プライマーとアニーリングすることができる。このプロセスは、ニック挿入、伸長、及び新しいＤＮＡ鎖の置換を繰り返すことによって継続され、もとのＤＮＡ標的の指数関数的増幅をもたらす。
【０１１６】
触媒ＲＮＡの選択
既知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化方法は、触媒作用としての多様な範囲の活性を有するＲＮＡ分子（リボザイム）の生成のために用いられてきた。しかし、それらの方法は自己改変による選択を含むものであり、それは近傍の触媒作用に依存し、トランスの活性の低減を示す変異体を本質的に単離する。
【０１１７】
区画化を行えば、基質を共有結合で若しくは水素結合（すなわち塩基対合）の相互作用でリボザイムに繋いでおく必要のない、多重回転が可能な真にトランス作用性のリボザイムを選択するための方法が可能となる。
【０１１８】
最も単純な場合には、リボザイムをコードする遺伝子を乳液中に導入し容易に転写することができるが、それはＴａｑポリメラーゼをコードするＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕでの転写と３ＳＲ増幅によって示すことができ、それは次のとおりである：Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子をまず乳液中で転写する。８０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、２４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭスペルミジン、４０ｍＭ  ＤＴＴ、ｒＮＴＰ（３０ｍＭ）、５０ｎｇ  Ｔ７−Ｔａｑ鋳型（実施例１８  自己持続性配列複製（３ＳＲ）を用いた選択、を参照せよ）、６０ユニットのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ）、４０ユニットのＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む１００μＬの反応混液を標準プロトコールを用いて乳化する。乳液を３７℃で６時間までインキュベートし、反応産物をゲル電気泳動により分析したところ、ＲＮＡ産生のレベルは乳化しなかった対照のレベルと同等であることが示された。
【０１１９】
乳化した遺伝子の５’末端に突出末端を作ることによって（例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡアダプターのいずれかのライゲーションによって行う）、鋳型によって指令される逐次的ｄＮＴＰの付加をトランスの形で行うことのできる能力（すなわちポリメラーゼ活性、図６を参照せよ）についてＲＮＡ変異体が選択される。「充填」された遺伝子は、その遺伝子の一本鎖領域（すなわち、リボザイムが充填する前には一本鎖となっている領域）と相補的なプライマーを用いるか、又は取り込んだビオチン（若しくはその他のもの）修飾ヌクレオチドを捕捉しその後ＰＣＲを行うことによって回収することができる。触媒としてのＲＮＡ活性のない区画では、この領域は一本鎖のままであり、ＰＣＲでは鋳型を増幅できないこととなる（あるいはまた、ヌクレオチドは取り込まれず、鋳型は捕捉されずに洗い流される）。
【０１２０】
選択されることとなる酵素活性の範囲をさらに拡張するために連動する手法を用いることができる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼと上述の遺伝子（５’突出末端）との同時乳化を、他の点では不適切なＮＴＰ基質をポリメラーゼによって利用しうるものに変換するようなリボザイムを選択するために、用いることができる。前述のとおり、「充填」された遺伝子はＰＣＲによって回収することができる。上述の手法は類似の鋳型（すなわち３’突出末端を有するもの）からｉｎ  ｓｉｔｕで産生されたタンパク質ポリメラーゼ酵素の選択にも用いることができる。触媒活性を有するＲＮＡの選択を示す図は、図６に示している。
【０１２１】
レプリカーゼ活性を改変可能な物質の選択
別の実施形態においては、本発明はレプリカーゼの活性を改変可能な物質の選択に用いられる。この実施形態においては、核酸プールを、１種以上の候補物質をコードするメンバーを含むように調製する。核酸ライブラリーのメンバーはレプリカーゼと共に区画化される（上で説明したとおり、このレプリカーゼはその物質をコードする核酸に対してのみ作用する）。
【０１２２】
候補物質はお互いが機能的に若しくは化学的に独立したものであるか、又は、それらはレプリカーゼ活性の改変能があることが既に知られているか若しくはそのように考えられている物質の変異体とすることができる。次いでプールのメンバーを、それらによってコードされるポリペプチド若しくはポリヌクレオチドと共に区画に分割し、好ましくは各区画が該プールの単一のメンバーとその同一の起源によってコードされたポリペプチドを含むようにする。各区画は、１種以上のレプリカーゼ分子をも含む。従って、コードされたポリペプチド物質はレプリカーゼの活性を調節することができ、区画化された核酸（すなわち、その物質をコードする核酸）の複製を妨げるか若しくは増強する。この方法でポリペプチド物質はレプリカーゼを介してその物質をコードしている核酸の分子数を増大若しくは低減させることができる。本発明の非常に好ましい１実施形態においては、該物質はレプリカーゼ活性の増強能を有し、その物質をコードする核酸を検出することによってその物質の検出若しくは選択が可能となる。
【０１２３】
調節物質（modulating agent, modulator）は、レプリカーゼに直接的若しくは間接的に作用することができる。例えば、調節物質は、レプリカーゼ分子に、例えばレプリカーゼの翻訳後修飾によって作用して該レプリカーゼを活性化若しくは不活化するような活性を含む酵素とすることができる。この物質は、レプリカーゼ分子からリガンドを取り去るか若しくはリガンドを置くことによって作用することができる。ポリメラーゼ及びリガーゼなどの多数のレプリカーゼがリン酸化によって調節されていることが知られているので、好ましい実施形態では、本発明の該物質はキナーゼ若しくはホスホリラーゼである。調節物質はまた、直接的にレプリカーゼと相互作用してその性質を改変するものであってもよい（例えば、チオレドキシンとＴ７−ＤＮＡポリメラーゼ、レプリソームのメンバー、例えばクランプ（clamp）、ヘリカーゼその他、とＤＮＡポリメラーゼＩＩＩとの相互作用）。
【０１２４】
あるいはまた、調節物質は、間接的にレプリカーゼに対し作用を示すものであってもよい。例えば、レプリカーゼ活性の調節は第３のものを介して行うことができ、その第３のものは調節物質（例えば上述したもの）によって改変される。
【０１２５】
さらに、調節物質は、最終産物としてレプリカーゼの基質を産生するような経路の一部を形成する酵素とすることができる。この実施形態においては、調節物質はその経路の中間体（若しくは最終産物）の合成に関与する。従って、複製速度（及びその物質をコードする核酸の量）は調節物質の活性に依存する。
【０１２６】
例えば、調節物質は、塩基、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド（ｄＡＭＰ、ｄＣＭＰ、ｄＧＭＰ、及びｄＴＭＰなど）、デオキシリボヌクレオシド二リン酸（ｄＡＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＧＤＰ、及びｄＴＤＰなど）、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、若しくはｄＴＴＰ）、ヌクレオシド、ヌクレオチド（ＡＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、及びＵＭＰなど）、ヌクレオシド二リン酸（ＡＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、及びＵＤＰ）、ヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、もしくはＵＴＰなど）などの生合成に関与するキナーゼとすることができる。調節物質は、ヌクレオチドの生合成の他の中間体（報告がなされており、また生化学の教科書、例えばStryer若しくはLehningerなどでよく知られている）、例えば、ＩＭＰ、５−ホスホ−α−Ｄ−リボース−１−ピロリン酸、５−ホスホ−β−Ｄ−リボシルアミン、５−ホスホリボシル−グリシンアミド、５−ホスホリボシル−Ｎ−ホルミルグリシンアミド、その他などの合成に関与するものとすることができる。従って該物質は、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ、ホスホリボシルグリシンアミドシンテターゼその他の酵素を含むものとすることができる。そのような物質の他の例については当業者であれば理解できる。本発明の方法はそ・BR>フような物質で触媒活性の改良されたものの選択を可能とする。
【０１２７】
また別の実施形態においては、調節物質は、複製カクテル（プライマー、ｄＮＴＰ、レプリカーゼその他）の構成成分の「障害を取り除く（unblock）」ように機能する。障害のある構成成分の例としては、ＣＳＲサイクル中に用いられるレプリカーゼを阻害する化学的部分を付加したプライマー若しくはｄＮＴＰである。あるいはまた、用いられるプライマー対は連結剤によって共有結合で繋ぐことができ、この薬剤が調節物質により開裂されて、補充されたレプリカーゼの存在下で双方のプライマーがその遺伝子を増幅することを可能にする。連結剤の例としてはペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。さらに、標的のヌクレオチド配列が間に入るプライマー配列対をコードする大きなオリゴヌクレオチドを設計することによって、新規の部位特異的制限酵素を進化させうる。前述のとおり、複製速度（及びその物質をコードしている核酸の量）は該調節物質の活性に依存する。あるいはまた、調節物質はプライマーの５’末端を改変するものであってもよく、その結果、プライマーを取り込んでいる増幅産物が適切な物質（例えば抗体）によって捕捉されうるようになり、その量が増加し再増幅されることとなる。
【０１２８】
さらに別の実施形態においては、ＣＳＲの範囲をさらに拡大して、必ずしも熱安定性ではない物質の選択も行えるようにすることができる。分泌可能な形態の調節物質／対象のレプリカーゼをコードする発現構築物を含んでいる送達ビヒクル（例えば大腸菌）が区画化される。水相に誘導剤を含ませて許容しうる温度（例えば３７℃）でインキュベートするとその調節物質／レプリカーゼが該区画において発現・分泌される。次いでその調節物質には、その後それをコードする遺伝子の増幅を促進するための前述した方法により作用する（例えば、複製の阻害物質を消費する）ために十分な時間がある。この増幅プロセスの間に起こる温度変化は宿主細胞の酵素活性（これはこの時点までは水相から隔てられていたものである）を有する区画を排除し、増幅のためにコードしている遺伝子を放出する。
【０１２９】
従って、本発明の１実施形態では、本発明者は、最終生成物として複製反応に関与する基質を含む経路において機能するポリペプチド（「経路ポリペプチド」）を選択する方法を提供し、その方法は次のステップを含む：（ａ）レプリカーゼを調製するステップ；（ｂ）経路ポリペプチド若しくは経路ポリペプチドの変異体を各々コードするメンバーを含む核酸プールを調製するステップ；（ｃ）核酸プールを区画に分割するステップであって、各区画が、該プールの核酸メンバー、その核酸メンバーによりコードされる経路ポリペプチド若しくは変異体、該レプリカーゼ、及び経路のその他の成分を含むように分割するステップ；（ｄ）該核酸メンバーの該レプリカーゼによる増幅を検出するステップ。
【０１３０】
実施例（特に実施例１９及びそれ以降の実施例）はヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＰキナーゼ）の選択における本発明の使用を示しており、そのＮＤＰキナーゼはリン酸基をＡＴＰからデオキシヌクレオシド二リン酸へと転移させてデオキシヌクレオシド三リン酸を生成する触媒反応を有する。
【０１３１】
また別の実施形態においては、調節物質はレプリカーゼ活性の阻害物質を消費するものである。例えば、ヘパリンはレプリカーゼ（ポリメラーゼ）活性の阻害物質であることが知られている。本発明の方法を用いれば、ヘパリナーゼ若しくはこの酵素の変異体をコードする核酸ライブラリーの区画化をヘパリン及びポリメラーゼの存在下で行うことによって、活性の増強されたヘパリナーゼの選択が可能となる。活性の増強されたヘパリナーゼ変異体はヘパリンをより強度に若しくはより迅速に分解することができ、従って該区画内のレプリカーゼ活性の阻害を除去し、該区画内の核酸（すなわち、そのヘパリナーゼ変異体をコードする核酸）の複製が可能となる。
【０１３２】
相互作用するポリペプチドの選択
タンパク質−タンパク質相互作用の選択のための最も重要な系はｉｎ  ｖｉｖｏ法であり、最も重要かつ最もよく開発されているものは酵母の２ハイブリッド系である（Field及びSong, Nature (1989) 340, 245-246）。この系及び関連の手法では２種のハイブリッドタンパク質が生成される。すなわち、ＤＮＡ結合ドメインと融合させたタンパク質Ｘを含む餌の（bait）ハイブリッド及び転写活性化ドメインに融合させたタンパク質Ｙを含む補足する（prey）ハイブリッドの２種であり、ＸとＹの同種の相互作用で転写活性化因子が再構成される。酵素のポリペプチド鎖が２つのタンパク質ＸとＹと２つの部分で融合されて発現され、同種のＸ−Ｙ相互作用は酵素の機能を再構成するという、２つの他のｉｎ  ｖｉｖｏ系が提唱されており（Karimova (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5752-6; Pelletier (1999) Nat. Biotechnol. 17 683-690）、その系では細胞に選択可能な表現型を付与する。
【０１３３】
最近、Ｔａｑポリメラーゼが類似の方法で分割しうることが示された（Vainshteinら, (1996) Protein Science 5,1785）。従って、本発明は、Ｔａｑポリメラーゼまたはポリメラーゼ反応を補助する何らかの酵素若しくは因子を分割することによって安定な相互作用を行うことが可能なポリペプチド対の選択方法を提供する。
【０１３４】
この方法はいくつかのステップを含む。第１ステップは、第１の核酸と第２の核酸を提供する。第１の核酸は第１の融合タンパク質をコードし、そのタンパク質は第１のポリペプチドと融合させたレプリカーゼ（若しくはその他のもの、上記参照）酵素の第１のサブドメインを含み、一方、第２の核酸は第２の融合タンパク質をコードし、そのタンパク質は第２のポリペプチドと融合させたレプリカーゼ（若しくはその他のもの、上記参照）酵素の第２のサブドメインを含む。これらの２つの融合タンパク質は、第１及び第２のレプリカーゼ（若しくはその他のもの、上記参照）サブドメインの安定な相互作用によってレプリカーゼ活性（直接的に若しくは間接的に）がもたらされる。第１及び第２の核酸のうちの少なくとも１つ（好ましくは双方）は、第１及び／又は第２ポリペプチドの各々の変異体をコードする核酸プールの形態で提供される。
【０１３５】
次いでその単数若しくは複数の核酸プールを区画に分割し、その区画の各々が第１核酸及び第２の核酸を、第１及び第２の核酸によってコードされるそれぞれの融合タンパク質と共に含むようにする。次いで第１ポリペプチドを第２ポリペプチドと結合させて、第１及び第２ポリペプチドの結合によってレプリカーゼサブドメインが安定に相互作用し、レプリカーゼ活性がもたらされるようにする。最後に、第１及び第２の核酸のうちの少なくとも１つのレプリカーゼによる増幅を検出する。
【０１３６】
従って本発明は、２つのポリペプチドリガンドの同種の会合でその２つのリガンドの遺伝子の増幅と連結が駆動されることを介してレプリカーゼ機能の再構成が起こる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの選択系を包含するものである。このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏの２ハイブリッド系は、高温でのタンパク質−タンパク質相互作用の研究に特に適しており、そのような研究としては例えば、好熱性生物のプロテオームの研究若しくは高度に安定な相互作用を作り出す研究が挙げられる。
【０１３７】
この系はまた、同種の相互作用を促進する分子化合物のスクリーニング及び単離にも適用できる。例えば、化合物をプライマー若しくはｄＮＴＰと化学的に結合させることができ、それにより化合物は、会合を促進させた場合にアンプリコン中に取り込まれるであろう。交叉反応を防止するためには、このような化合物は区画化が行われた後、例えばマイクロビーズへの固定若しくは溶解可能なミクロスフェア中へ含有させた後にはじめて放出されるようになっていなければならない。
【０１３８】
単一ステップ及び多重ステップ選択
適切な封入条件を選択することが望ましい。スクリーニングしようとするライブラリーの複雑度とサイズの如何によって、１つのマイクロカプセル若しくは区画あたり１つ以下の核酸が封入されることとなるように封入工程を定めることが有益であろう。このことによってより高い分解能がもたらされることとなる。しかし該ライブラリーがより大きい及び／若しくはより複雑である場合には、この方法は実用できではない。従って、いくつかの核酸を一緒に封入若しくは区画化し、本発明の方法を繰り返し適用して所望の活性を選別することに頼ることが好ましい。封入技法の組み合わせは所望の濃縮化を達成するために用いることができる。
【０１３９】
理論的研究では、作り出される核酸変異体の数が多くなればなるほど、所望の性質を有する分子が作り出される可能性がより高くなることが示されている（この方法を抗体レパートリーに適用する方法についての説明はPerelson及びOster, 1979 J. Theor. Biol., 81, 64570を参照）。最近、より大きなファージ−抗体レパートリーはより小さなレパートリーよりも、良好な結合アフィニティーを有する抗体をより多く生じさせることが実際に確認された（Griffithsら, (1994) Embo J., 13,3245-60）。まれな変異体が作製されてもそれを選択できるようにするために、大きなライブラリーサイズが望ましい。従って最適な小マイクロカプセルの使用が有益である。
【０１４０】
上述の核酸に加えて、本発明のマイクロカプセル若しくは区画は、複製反応が起こるために必要な成分をさらに含むことができる。該系の他の成分としては、例えば、核酸の転写及び／若しくは翻訳に必要な成分を含む。それらの成分はある特定の系に必要なものを以下から選択する。適切なバッファー、必要な成分を全て含んでいるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／複製系及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系、酵素及び補因子、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、核酸（天然のもの若しくは合成）、トランスファーＲＮＡ、リボソーム及びアミノ酸、並びに改変された遺伝子産物の選択が可能となるようにするための目的の反応の基質。
【０１４１】
バッファー
適切なバッファーとは生物学的系の所望の構成成分の全てが活性を有し、それ故に特異的反応系の各々の要件に応じて変更する。生物学的及び／若しくは化学的反応に適したバッファーは当業界では既知であり、その調製法は種々の実験教科書中に述べられている（Sambrookら, (1989) 「分子クローニング：実験室マニュアル」"Molecular cloning:a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)。
【０１４２】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳
レプリカーゼは、他の箇所に記載したとおり、適切な宿主からの発現によって提供することができるし、又は当業界で既知のとおり適切な系におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳によって産生させることもできる。
【０１４３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系は、通常は、細胞抽出物、典型的には細菌抽出物（Zubay, 1973, Annu. Rev. Genet., 7, 267-87; Zubay, 1980, Methods Enzymol., 65, 856-77; Lesleyら, 1991, J. Biol. Chem. 266(4), 2632-8; Lesley, 1995, Methods Mol. Biol., 37, 265-78）、ウサギ網赤血球（Pelham及びJackson, 1976, Eur. J. Biochem., 67, 247-56）、若しくはコムギ胚芽（Andersonら, 1983, Methods Enzymol., 101, 635-44）を含む。多数の適切な系が市販されており（例えばＰｒｏｍｅｇａ社から）、そのようなものとしては連動された転写／翻訳のできるもの（細菌系の全て及びＰｒｏｍｅｇａ社の網赤血球とコムギ胚芽ＴＮＴＴＭ抽出系）が含まれる。用いるアミノ酸の混合物には、該ライブラリー中で産生されるタンパク質の数及び多様性を増大するように所望により合成のアミノ酸を含めることができる。このことはｔＲＮＡに人工のアミノ酸を組み込み、そのようなｔＲＮＡを、選択しようとするタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳に用いることによって達成することができる（Ellmanら, 1991, Methods Enzymol., 202, 301-36; Benner, 1994, Trends Biotechnol., 12, 158-63; Mendelら, 1995, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 24, 435-62)。特に望ましいのは、ＰＵＲＥシステム（Shimizuら, (2001) Nat. Biotech., 19, 751) のような、精製された成分から再構成されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系の使用であろう。
【０１４４】
各選択ラウンド後に、核酸プールにおける対象の分子をコードする核酸の濃縮度を、区画化しないｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／複製反応、又は連動された転写−翻訳反応によってアッセイすることができる。その選択されたプールは適切なプラスミドベクター中にクローニングし、ＲＮＡ若しくは組換えタンパク質がその個々のクローンから産生されてさらに精製及びアッセイされる。
【０１４５】
本発明はさらに、ある遺伝子産物をコードする核酸が本発明の方法で選択された後の、その遺伝子産物を産生させるための方法に関する。核酸自体を従来法によって直接的に発現させてこの遺伝子産物を産生させることができることは明らかである。しかし、当業者には明白なとおり、それに替わる技法を用いることもできる。例えば、該遺伝子産物に組み込まれている遺伝情報を適切な発現ベクター中に組み込んでそこから発現させることができる。
【０１４６】
区画
本明細書で用いる「区画」という用語は、「マイクロカプセル」と同義であり、これらの用語は相互に交換可能な形で用いられる。区画の機能は核酸とその核酸によってコードされる対応するポリペプチドとを同じ場所に局在化できることである。この局在化は、好ましくは鋳型と産物である鎖の他の区画への拡散を実質的に制限する区画の能力によって達成される。従ってポリペプチドのどのようなレプリカーゼ活性もある区画の範囲内の核酸に対してのみ作用するように制限され、他の区画内の他の核酸には働かない。区画の別の機能は、化学若しくは酵素反応中で生成される、複製反応に材料を与える又はその反応における障害を除く分子の拡散を制限することである。
【０１４７】
従って本発明の区画には、本発明を実施可能とする適切な物理的性質が必要とされる。
【０１４８】
第１に、核酸とポリペプチドが区画間で拡散しないことを確保するために、各区画の内容物は周囲の区画の内容物から隔離されていて、該核酸とポリペプチドの区画間の交換がかなりの時間にわたり全く若しくはほとんど起きないようにしなければならない。
【０１４９】
第２に、本発明の方法では１区画あたりには限定された数の核酸しか存在せず、ある単一の区画内のメンバーは全て単一クローン性（すなわち同一のもの）であることが必要である。このことによって個々の核酸によってコードされ、それに対応するポリペプチドが他の異なる核酸とは隔離されることとなる。従って、核酸とそれの対応するポリペプチドとの間の関連性は非常に特異的なものとなる。濃縮の因子は１区画あたり平均で１個以下の核酸のクローン種の時に最大となり、個々の核酸によってコードされるポリペプチドはその他の全ての核酸の産物から隔離されることとなるので、核酸とそれによってコードされるポリペプチドの活性との間の関連性は可能な限り密接なものとなる。しかし、理論的に最適な状況である１区画あたり核酸が平均して１個以下の状態を用いなくとも、大きなライブラリーからの選択において１区画あたりの核酸の比率が５、１０、５０、１００、若しくは１０００個以上のものでもおそらく有益であろう。その後の選択ラウンド、それには核酸の分布が異なる新たな区画化を含むが、それによって核酸のより厳密な選択が可能となろう。平均して１区画あたり１個以下の核酸クローン種が存在することが好ましい。
【０１５０】
さらに、各区画は１個の核酸を含有している。このことはいくつかの区画は空のままである一方、各区画が核酸を少なくとも１個、好ましくは１個のみを、統計学的に含有していることとなるように条件を調整することを意味している。
【０１５１】
第３に、該区画の形成と組成は核酸の発現のための装置の機能とポリペプチドの活性とを失わせるようなものであってはならない。
【０１５２】
この結果、採用する区画化系は全て、これらの３つの要件を満足するものでなければならない。適切な系とは、当業者であれば明らかであろうが、本発明の各適用における要件の性質が正確にはどのようなものであるかによって変わりうるものである。
【０１５３】
区画化には種々の技法が利用でき、そのような技法としては例えば、気体区別化（gas aphrons；Juaregi及びVarley, 1998, Biotechnol Bioeng 59, 471）及び作成済みの（prefabricated） ナノウエル（Huang及びSchreiber, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 25）が挙げられる。以下にさらに詳細に論じるように、異なる適用に対しては異なる区画サイズと区画表面の化学的性質が望ましい。例えば、ゲル若しくはアルギン酸塩（Dragetら, 1997, Int. J. Macromol. 21, 47）又はゼオライトタイプの物質のような拡散を制限する有孔物質を用いることで十分であろう。さらに、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ若しくは細胞内ＰＣＲを行う場合には、細胞を架橋固定剤で処理して有孔性の区画を形成させ、ｄＮＴＰ、酵素、及びプライマーの拡散が可能なようにすることができる。
【０１５４】
様々な区画化若しくはマイクロカプセル封入のための方法が利用でき（Benita, S.編, (1996), 「マイクロカプセル封入：方法と工業での応用」"Microencapsulation:methods and industrial applications", Drug and pharmaceutical sciences, Swarbrick, J.編, New York: Marcel Dekker）、本発明で用いられる区画を作るために用いることができる。文献中では２００種類以上のマイクロカプセル封入法若しくは区画化法が確認されている（Finch, C.A., (1993) 「封入化と制御された放出」"Encapsulation and controlled release", Spec. Publ.-R. Soc. Chem., 138,35）。
【０１５５】
それらの方法には、脂質小胞（リポソーム）などの膜に封入された水性小胞（New, R. R. C.編, (1990), 「リポソーム：実際的な手法」"Liposomes: a practical approach", The practical approach series, Rickwood, D.及びHames, B.D.編, Oxford: Oxford University Press）、及び非イオン性サーファクタント小胞（van Hal, D. A., Bouwstra, J. A.及びJunginger, H. E.(1996), 「局所適用のためのエストラジオール含有の非イオン性サーファクタント小胞」"Nonionic surfactant containing estradiol for topical application", Microencapsulation: methods and industrial applications(Benita, S.編), pp329-347, Marcel Dekker, New York）が含まれる。これらは非共有結合で構築された分子の単一若しくは複数の二重層の閉鎖膜カプセルで、各二重層はその近傍から水性の区画によって分離されている。リポソームの場合には、その膜は脂質分子からできており、それらの脂質分子は通常はリン脂質であるがコレステロールなどのステロール類も膜内に組み込むことができる（New, R. R. C.編, (1990), 「リポソーム：実際的な手法」"Liposomes: a practical approach", The practical approach series, Rickwood, D.とHames, B.D.編, Oxford: Oxford University Press）。リポソーム内ではＲＮＡ及びＤＮＡの重合を含む、酵素が触媒する様々な反応を行うことができる（Chakrabarti, J. Mol. Evol. (1994), 39, 555-9; Oberholzer, Biochem. Biophys. Res. Commun, (1995), 207, 250-7; Oberholzer, Chem. Biol. (1995), 2, 677-82; Walde, Biotechnol. Bioeng.(1998), 57, 216-219; Wick及びLuisi, Chem. Biol. (1996), 3, 277-85）。
【０１５６】
膜に封入された水性小胞系では、水相の多くは小胞の外側にあり、従って区画化されない。この連続的な水相は除去すべきであり、除去しないのならば、該反応を区画化されたマイクロカプセルに限定するために、その連続的な水相中の生物学的系を阻害若しくは破壊する（例えば、ＤＮａｓｅ若しくはＲＮａｓｅを用いた核酸の消化により行う）（Luisiら, Methods Enzymol. 1987, 136, 188-216）。
【０１５７】
酵素で触媒される生化学的反応もまた、他の種々の方法によって作製されるマイクロカプセル区画内で行われてきた。ＡＯＴ−イソオクタン−水系（Menger, F. M.及びYamada, K. (1979), J. Am. Chem. Soc. 101, 6731-6734）などの逆転ミセル溶液中で多数の酵素が活性を示す（Bru及びWalde, Euro. J. Biochem. 1991, 199, 95-103; Bru及びWalde, Biochem. Mol. Bio. Int. 1993, 31,685-92; Creaghら, Enzyme Microb. Technol. 1993, 15, 383-92; Haberら, 1993 発見できず;  Kumarら, Biophys. J. 1989, 55, 789-792; Luisi, P. L. 及びB., S.-H. (1987), 「逆転ミセル溶液中の酵素の活性とコンフォメーション」"Activity and conformation of enzymes in reverse micellar solutions", Methods Enzymol. 136(188), 188-216; MaoとWalde, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 178, 1105-1112; Mao, Q.とWalde, P., (1991), 「逆転ミセル中のα−キモトリプシンの酵素活性に及ぼす基質の影響」, "Substrate effects on the enzymatic activity of alpha-chymotrypsin in reverse micelles", Biochem. Biophys. Res. Commun. 178(3), 1105-1112; Mao, Eur. J. Biochem. 1992, 208, 165-70; Perez, G. M., Sanchez, F. A.及びGarcia, C.F., (1992), 「逆転ミセル中のリポキシゲナーゼの反応速度分析への活性相プロットの応用」, "Application of active-phase plot to the kinetic analysis of lipoxygenase in reverse micelles", Biochem. J. ; Walde, P., Goto, A., Monnard, P.-A., Wessicken, M.及びLuisi, P. L., (1994), 「オパーリン反応の再来：ミセル中及び自己再生小胞中でのポリアデニル酸の酵素的合成」, "Oparin's reactions revisited: enzymatic synthesis of poly(adenilic acid) in micelles and self-reproducing vesicles", J. Am. Soc. 116, 7541-7547; Walde, P., Han, D.及びLuisi, P. L., (1993), 「逆転ミセル中に溶解したリパーゼの分光学的及び反応速度論的研究」, "Spectroscopic and kinetic studies of lipase solubilized in reverse micelles", Biochemistry, 32, 4029-34; Walde, Eur. J. Biochem. 1988, 173, 401-9）。
【０１５８】
区画は、界面重合及び界面錯化によって作製することもできる（Whateley, T. L. (1996) 「マイクロカプセル：界面重合と界面錯化による調製とその応用」, "Microcapsules: preparation by interfacial polymerisation and interfacial complexation and their applications", 「マイクロカプセル封入：方法と工業での応用」"Microencapsulation:methods and industrial applications"中の記載, (Benita, S.編), pp.349-375, Marcel Dekker,  New York）。この種のもののマイクロカプセル区画は、堅く非透過性の膜、若しくは半透過性の膜を有している。ニトロセルロース膜、ポリアミド膜、及び脂質−ポリアミド膜によって協会形成される半透過性のマイクロカプセルは全て、多酵素系を含む生化学的反応をサポートすることができる（Chang, Methods Enzymol. 1987, 136, 67-82; Chang, Artif. Organs, 1992, 16, 71-4; Lim, Appl. Biochem. Biotechnol. 1984, 10:81-5）。アルギン酸塩／ポリリジン区画（LimとSun, Science (1980), 210, 908-10）は非常に穏和な条件下で形成され、また、例えば、生きている細胞及び組織を封入する効果的な方法を用いれば、非常に良好な生体適合性を示す（Chang, Artif. Organs, 1992, 16, 71-4; Sun ASAIO J. (1992), 38, 125-7)。
【０１５９】
乳液などのコロイド系中の水性環境の相分配に基づく、膜を使わない区画化系も用いることができる。
【０１６０】
好ましくは、本発明の区画は、乳液から形成される。２つの混和しない液相を有する不均質系で、２つの相のうちの１つはもう一方の相に顕微鏡的若しくはコロイド状のサイズの液滴として分散させている（Becher, P. (1957) 「乳液：理論と実際」"Emulsions: theory and practice", Reinhold, New York; Sherman, P. (1968) Emulsion science, Academic Press, London; Lissant, K. J.編, 「乳液と乳液技術」, "Emulsions and emulsion science", Surfactant Science, New York, Marcel Dekker, 1974;  Lissant, K. J.編, 「乳液と乳液技術」, "Emulsions and emulsion science", Surfactant Science, New York, Marcel Dekker, 1984）。
【０１６１】
乳液は混和しない液体の何らかの適切な組み合わせから作製することができる。好ましくは、本発明の乳液は、水（その中に生化学的成分を含有している）を微細に分割された液滴の形態で存在する相とし（散乱した、内部の、若しくは不連続な相）、疎水性の混和しない液体（「油」）をその中に上記液滴が懸濁されているマトリックス（非散乱、連続的、若しくは外部の相）としている。このような乳液を「油中水滴型」（Ｗ／Ｏ）と呼ぶ。これは、生化学的成分を含有している水相の全体が個別の液滴中に区画化されている（内部相）という利点がある。外部相、すなわち疎水性の油であるが、その相は通常は生化学的成分を含まず、従って不活性である。
【０１６２】
乳液は、１種以上のサーファクタント（サーファクタント）の添加によって安定化することができる。それらのサーファクタントは、乳化剤と呼ばれ、水／油の界面に作用して２つの相の分離を防止（若しくは少なくとも遅延）する。Ｗ／Ｏ型乳液の作製には多種の油と多種の乳化剤を用いることができる。最近の資料では、１６０００種以上のサーファクタントが挙げられており、その多くは乳化剤として用いることができる（Ash, M.及びAsh, I. (1993), Handbook of industrial surfactants, Gower, Aldershot）。適切な油としては軽質白色鉱油、及びモノオレイン酸ソルビタン（ＳｐａｎＴＭ  ８０；ＩＣＩ）及びモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ＴｗｅｅｎＴＭ  ８０；ＩＣＩ）若しくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）などの非イオン性サーファクタント（Schick, 1966, 発見できず）が含まれる。
【０１６３】
アニオン性サーファクタントの使用も有益である。適切なサーファクタントとしては、コール酸ナトリウム及びタウロコール酸ナトリウムが含まれる。特に好ましいのはデオキシコール酸ナトリウムであり、好ましくは０．５％  ｗ／ｖ以下の濃度のものである。そのようなサーファクタントを含めると、場合によっては、核酸の発現及び／若しくはポリペプチドの活性を増加させることができる。乳化していない反応混液にアニオン性サーファクタントを添加すると翻訳が完全に行われなくなる。しかし、乳化の際には、サーファクタントは水相から界面に移動し活性が復活する。乳化しようとする混合液にアニオン性サーファクタントを添加すると、反応は区画化した後にのみ進行することが確保される。
【０１６４】
乳剤の調製には通常は２つの相を一緒にする力を与えるために機械的なエネルギーをかけることが必要である。それを行うには様々なやり方があり、それらは様々な機械装置を用いるが、そのようなものとしてはスターラー（マグネティックスターラー、噴射機、及びタービンスターラー、撹拌用棒（paddle device）、泡立て器など）、ホモジナイザー（ローター−ステーターホモジナイザー、高圧バルブホモジナイザー、及びジェットホモジナイザーを含む）、コロイドミル、超音波、及び「膜乳化」装置が含まれる（Becher, P. (1957) 「乳液：理論と実際」"Emulsions: theory and practice", Reinhold, New York; Dickinson, E. (1994), Wedlock, D.J.編, 「乳液と液滴のサイズの制御」"Emulsions and droplet size control", Butterworth-Heine-mann, Oxford, Vol. pp.191-257）。
【０１６５】
Ｗ／Ｏ型乳液中に形成される水性の区画は、通常は安定で、区画間ではポリペプチド若しくは核酸の交換はあるとしてもごくわずかである。さらに、乳液の区画内でいくつかの生化学反応が進行することが知られている。その上、複雑な生化学的プロセス、とりわけ遺伝子の転写と翻訳も乳液のマイクロカプセル中で起こる。何千リットルもの工業的規模にまで容積を増やした乳液を作製する技術も存在する（Becher, P. (1957) 「乳液：理論と実際」"Emulsions: theory and practice", Reinhold, New York; Sherman, P. (1968) Emulsion science, Academic Press, London; Lissant, K. J.編, 「乳液と乳液技術」, "Emulsions and emulsion science", Surfactant Science, New York, Marcel Dekker, 1974;  Lissant, K. J.編, 「乳液と乳液技術」, "Emulsions and emulsion science", Surfactant Science, New York, Marcel Dekker, 1984）。
【０１６６】
好ましい区画のサイズは、本発明に従って行おうとする個々の選択プロセスの厳密な要件の如何によって変わることとなる。いずれにしても、遺伝子ライブラリーのサイズ、必要とされる濃縮度と、ポリペプチドの効率的な発現と反応性を達成するための個々の区画内での必要とされる構成成分の濃度との最適なバランスがあるであろう。
【０１６７】
発現のプロセスは個々のマイクロカプセルの各々の中でｉｎ  ｓｉｔｕで起こるか、又は細胞（例えば細菌）内で外因性に起こるか、又は他の適切な小区画化の形態で起こる。ＤＮＡの濃度がナノモル／Ｌ未満ではｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写と連動された転写−翻訳は双方とも効率が低くなる。各区画内に存在するＤＮＡ分子は限定された数しか必要とされないので、そのことによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写が用いられる場合には、区画の取りうるサイズの実際的な上限が定められる。好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写及び／若しくは翻訳を用いたｉｎ  ｓｉｔｕ発現では区画の平均容積は５．２×１０−１６ｍ３であり、これは１μｍ未満の直径の球状の区画に相当する。
【０１６８】
別法としては、発現と区画化の分離を、例えば、細胞性宿主を用いて行うことである。細胞を含めると（とりわけ真核細胞）、平均の区画直径としては１０μｍを超えるものがおそらく好ましい。
【０１６９】
実施例に示すとおり、同一乳液区画内のポリメラーゼ遺伝子及びコードされるタンパク質を同時に局在させるために、本発明者はＴａｑポリメラーゼを過剰発現している細菌（大腸菌）を「送達ビヒクル」として用いた。大腸菌細胞（直径１−５μｍ）は、本発明の乳液区画内にヌクレオチド三リン酸及びプライマーなどのＰＣＲ試薬の十分量を入れる余地を残しつつ、容易に収まる（図２に示すとおり）。ＰＣＲの第１サイクルの変性ステップは、細菌細胞を破裂させ、発現したポリメラーゼとそれをコードする遺伝子とを区画内に放出して、バックグラウンドの細菌の酵素活性を破壊しつつ同時に自己複製を進めることができる。さらに、ホットスタートを用いる方法と同様に、この細胞性の「小区画化」は常温でのポリメラーゼ活性及び結果として生じてくる非特異的増幅産物の放出を防止する。
【０１７０】
区画内での効果的なＤＮＡ濃度若しくはＲＮＡ濃度は、当業者にはよく知られている種々の方法を用いて人工的に増加させることができる。そのような方法としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの容積排除化学物質の添加、及び種々の遺伝子増幅技法が含まれ、その遺伝子増幅技法には、大腸菌などの細菌由来のＲＮＡポリメラーゼを用いた転写（Roberts, 1969, Nature 224, 1168-74; BlattnerとDahlberg, 1972 Nat. New Biol. 237, 227-32; Robertsら, 1975, J. Biol. Chem. 250, 5530-41; Rosenbergら, 1975, J. Biol. Chem. 250, 4755-4764）、真核生物由来の由来のＲＮＡポリメラーゼを用いた転写（Weilら, 1979 J. Biol. Chem. 254, 6163-6173; Manleyら, 1983 Methods Enzymol. 101, 568-82）、及びＴ７、Ｔ３、及びＳＰ６などのバクテリオファージ由来の由来のＲＮＡポリメラーゼを用いた転写（Meltonら, 1984 Nucleic Acids Res. 12, 7035-56）；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Saikiら, 1988 Science 239, 487-91）；ＱＢレプリカーゼ増幅（Mieleら, 1983 J. Mol. Biol. 171, 281-95; Cahillら, 1991 Clin. Chem. 37, 1482-5; ChetverinとSpirin, 1995 Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 51, 225-70; katanaevら, 1995 FEBS Lett., 359, 89-92）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Landegrenら, 1988, Science, 241, 1077-80; Brany, 1991, PCR Methods Appl. 1, 5-16）；並びに自己持続性配列複製系（Fahyら, 1991 PCR Methods Appl. 1, 25-33）及び鎖置換増幅（Walkerら, 1992 Nucleic Acids Res. 20, 1691-6）が含まれる。ＰＣＲ及びＬＣＲなどの熱サイクルを必要とする遺伝子増幅技法は、乳液及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写若しくは連動された転写−翻訳系が熱安定性の場合でも（例えば、連動された転写−翻訳系がサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）などの熱安定性の生物から調製される）、用いることができる。
【０１７１】
局在している核酸の有効濃度を増加させるとより大きな区画を効率的に用いることができるようになる。
【０１７２】
区画の大きさはその区画内で生じさせる必要のある生化学的反応に必要な構成成分の全てを収めるために十分なサイズのものでなければならない。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、転写反応及び連動された転写−翻訳反応の双方とも約２ｍＭの総ヌクレオシド三リン酸濃度を必要とする。
【０１７３】
例えば、ある遺伝子を５００塩基長の短い一本鎖ＲＮＡ分子に転写するためには、１区画あたり最低５００個のヌクレオシド三リン酸分子を必要とする（８．３３×１０−２２モル）。２ｍＭの溶液を構成させるためには、この数の分子が４．１７×１０−１９リットル（４．１７×１０−２２ｍ、これは球状のものとすれば直径が９３ｎｍのものである）の容積の区画内に入れられていなければならない。従って、マイクロカプセルの大きさの下限として好ましいのは直径が約０．１μｍ（１００ｎｍ）である。
【０１７４】
送達ビヒクルとして発現宿主を用いる場合には、区画のサイズに関しての要件の厳密性ははるかに少ないものとなる。基本的には、区画は発現宿主並びに必要とされる反応を行うのに十分な量の試薬を収めるために十分なサイズを有するものでなければならない。従って、この場合には１０μｍを超える大きな区画サイズが好ましい。宿主中での発現に用いるベクターを適切に選択し、区画内の鋳型の濃度をベクターの起源及び結果として得られるコピー数（例えば大腸菌ｃｏｌＥ（ｐＵＣ）：＞１００、ｐ１５：３０〜５０、ｐＳＣ１０１：１〜４）によって制御することができる。同様にして、遺伝子産物の濃度を、発現プロモーター及び発現プロトコール（例えば発現の完全な誘発とプロモーターの損失）の選択によって遺伝子産物の量で制御することができる。遺伝子産物の濃度は可能な限り高いことが好ましい。
【０１７５】
さらに、材料を供給する区画の使用によって外部からの基質の供給が可能となる（Ghadessyら, (2001), PNAS, 98, 4522:01を参照せよ）。乳液反応に対して外部から材料を供給することによって、リボザイムの選択には０．１μｍ未満の直径の区画を用いることが可能となるが、それは該区画内に試薬類の全てを収めておく必要がないからである。
【０１７６】
乳液マイクロカプセルもしくは区画のサイズは、選択系の要件に従って乳液を形成するために用いられる乳化条件を変更することによって簡単に変えることができる。区画サイズが大きくなればなるほど、ある与えられた核酸ライブラリーを封入するために必要な容積は大きくなるが、その究極的な限定因子は、区画のサイズ、従ってユニット容積あたりに収めることが可能なマイクロカプセル区画の数であるからである。
【０１７７】
区画のサイズは、複製系の要件を考慮するのみならず、該核酸について用いられる選択系の要件をも考慮して選択される。従って、選択系、例えば化学修飾系などの構成成分は、複製のためには最適ではないような反応のための容積及び／若しくは試薬濃度を必要とする。本明細書で述べるとおり、このような要件は二次的再封入ステップによって解決することができ、さらに、複製と選択を全体として最大限とするための区画サイズを選択することによっても解決することができる。例えば本明細書に述べているように、経験的に最適な区画容積及び試薬濃度を決定することが好ましい。
【０１７８】
本発明の非常に好ましい実施形態においては、乳液はＷ／Ｏ型乳液である。Ｗ／Ｏ型乳液は、鉱油中に、４．５％（ｖ／ｖ）Ｓｐａｎ  ８０、約０．４％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ８０、及び約０．０５〜０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含むサーファクタントの存在下で、好ましくは油相：水相の比が２：１若しくは３：１となるように油相に水相を滴下して添加することによって作製される。３種類のサーファクタントの比率は乳液が有利な性質を持つようにするために重要であると考えられ、従って本発明はサーファクタントの量を増加さ・BR>ケたＷ／Ｏ型乳液をも包含するが、それはＳｐａｎ  ８０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００の比が実質的に同じである乳液である。好ましい実施形態においては、該サーファクタントは４．５％（ｖ／ｖ）Ｓｐａｎ  ８０、０．４％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ８０、及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含む。
【０１７９】
Ｗ／Ｏ型乳液は、好ましくは２ｍＬの丸底の生体試料凍結用バイアル瓶中で水相を完全に添加した後、さらに４若しくは５分間にわたり１０００ｒｐｍで一定に撹拌して形成される。添加速度は１２滴／分（１滴が約１０μＬ）までとすることができる。水相は水のみを含むものとすることができるし、又は核酸、ヌクレオチド三リン酸などの他の成分を含有したバッファー溶液を含むものとすることができる。好ましい実施形態においては、水相は本明細書中に開示したようなＰＣＲ反応混合物、並びに核酸及びポリメラーゼを含むものとすることができる。Ｗ／Ｏ型乳液は２００μＬの水相（例えばＰＣＲ反応混合物）及び４００μＬの油相から上述のとおり形成することができる。
【０１８０】
本発明のＷ／Ｏ型乳液は熱安定性が増大しているという有利な性質を有している。従って、２０サイクルのＰＣＲを行った後に、レーザー光回折及び光学顕微鏡で調べても区画サイズ若しくは区画の合体を示す証拠は観察されない。このことは図２に示している。さらに、ポリメラーゼ連鎖反応はこのＷ／Ｏ型組成の区画内で効率的に進行し、その速度は溶液中でのＰＣＲで観察される速度に近いものである。本発明でのＷ／Ｏ型乳液中の平均的な水性区画は、平均サイズが１５μｍである。本発明の乳液の区画はいったん形成されるとＤＮＡ及びタンパク質のような巨大分子の交換は、有意な程度には起こらない（図３Ａに示すとおり）。このことはおそらく、巨大分子は分子量が大きく荷電性質を有し、たとえ高温条件となっても疎水性のサーファクタントの殻を横切って拡散することが妨げられるためと考えられる。
【０１８１】
核酸
本発明での核酸とは上述のとおりである。好ましくは、核酸は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、全てが合成の塩基若しくは天然の塩基と合成の塩基の混合物からなる部分的に若しくは完全に人工的な核酸分子、ポリペプチドに連結された前記のもののうちのいずれか１つ、並びに他の分子群若しくは構築物に連結された前記のもののうちのいずれか１つからなる群から選択された分子若しくは構築物である。他の分子群若しくは構築物は、核酸、ポリマー物質、特にビーズ（例えばポリスチレンビーズ、磁性ビーズなどの磁性物質）、フルオロフォア（蛍光体）若しくはアイソトープ標識などの標識、化学試薬、大環状高分子などの結合剤などからなる群から選択することが有利である。
【０１８２】
核酸は、遺伝子産物の効率的な発現に必要とされる、例えば、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始配列、ポリアデニル化配列、スプライス部位などの適切な調節配列を含むものとすることができる。
【０１８３】
「単離」「ソート（選別）」及び「選択」という用語、並びにそれらの変化したものが本明細書中で用いられている。本発明での単離とは、異種が含まれている集団、例えば混合物からある物質を分離するプロセスであってその単離プロセスを行う前にはその物質が共存していたもののうち少なくとも１つの物質は含まれないようにすることを意味する。好ましい１実施形態においては、単離とは、ある物質を精製して実質的に均質となるようにすることを意味する。ある物質をソート（選別）する、とは、所望の物質を所望ではない物質から優先的に単離するプロセスを意味する。このことが所望の物質を単離に関連する限りは、「単離」及び「ソート」という用語は同等である。本発明の方法は、所望の核酸を含有している核酸のプール（ライブラリー若しくは集団）から所望の核酸をソートすることができる。「選択」とは、ある物質をそれの持つ特定の性質に従って単離するプロセス（ソートプロセスを含む）を意味するものとして用いる。
【０１８４】
「オリゴヌクレオチド」とは、２個以上の、好ましくは３個以上のデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドを含む分子を意味する。オリゴヌクレオチドの正確なサイズはそのオリゴヌクレオチドの究極的な機能若しくはその用途に依存する。オリゴヌクレオチドは合成のもの若しくはクローニングによるものとすることができる。
【０１８５】
本発明に従って選択された核酸は、さらに操作を加えることができる。例えば、選択されたレプリカーゼ若しくは相互作用性ポリペプチドをコードする核酸をベクター中に組み入れ、適切な宿主細胞中に導入して、該遺伝子産物を発現する形質転換された細胞系統を作成する。次いで、この結果得られた細胞系統を、遺伝子産物の機能に影響を及ぼしうる薬剤の効果の再現可能な定性的及び／若しくは定量的分析を行うために増殖させる。従って遺伝子産物を発現している細胞は、遺伝子産物の機能を調節する化合物、特に小分子量の化合物の同定に用いることができる。従って、遺伝子産物を発現している宿主細胞は、薬剤のスクリーニングに有用であり、遺伝子産物の活性を調節する化合物を同定するための方法を提供することは本発明の別の１目的であって、該方法は、遺伝子産物をコードしている異種ＤＮＡを含有している細胞（機能を有する遺伝子産物を産生する）を、測定しようとする遺伝子産物の活性を調節する能力のある少なくとも１つの化合物、若しくは化合物の混合物、又はシグナルに暴露させ、その後、その調節によって生ずる変化についてその細胞をモニターすることを含む。そのようなアッセイによって、アゴニスト、アンタゴニスト、及びアロステリックな調節物質などの遺伝子産物の調節物質の同定が可能となる。本明細書で用いる遺伝子産物の活性を調節させる化合物若しくはシグナルとは、その遺伝子産物の活性が該化合物若しくはシグナルの存在下では異なるものとなるように（該化合物若しくはシグナルが存在しないときと比較した場合）、その遺伝子産物の活性を改変する化合物を意味する。
【０１８６】
細胞をベースとしたスクリーニングアッセイ法は、リポータータンパク質、すなわちβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの容易にアッセイしうるタンパク質の発現が遺伝子産物に依存しているような細胞系統を構築することによって設計することができる。そのようなアッセイによって、遺伝子産物と拮抗する化合物、又は遺伝子産物の活性に必要なその他の細胞性機能を阻害する若しくは増強する化合物などの、遺伝子産物の機能を直接的に調節させる化合物の検出が可能となる。
本発明はまた、細胞内で起こる、遺伝子産物依存性のプロセスに外因的に影響を及ぼす方法をも提供する。組換え遺伝子産物を産生する宿主細胞、例えば哺乳動物細胞を、供試化合物と接触させ、次いでその化合物の調節効果を、その供試化合物の存在する条件と不在の条件での該遺伝子産物が媒介する応答を比較すること、又は供試細胞若しくは対照の細胞（すなわち、遺伝子産物を発現していない細胞）の遺伝子産物が媒介する応答を該化合物の存在と関連づけることによって評価することができる。
【０１８７】
核酸ライブラリー
本発明の方法は、核酸のライブラリーのソートに有用である。本明細書では、「ライブラリー」「集団（レパートリー）」及び「プール」という用語は、当業界で通常用いられている意味で用いており、核酸のライブラリーは遺伝子産物の集団をコードするというように用いる。一般的には、ライブラリーは核酸のプールから構築され、ソートを促進するような性質を有している。本発明を用いた核酸のライブラリーからの核酸の最初の選択では、大多数の場合、多数の核酸変異体のスクリーニングを必要とする。核酸のライブラリーは様々な方法で作ることができるが、そのようなものとしては下記のものが含まれる。
【０１８８】
天然の核酸のプールはゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡからクローニングすることができる（Sambrookら, (1989) 「分子クローニング：実験室マニュアル」"Molecular cloning:a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）；例えば、免疫した若しくは免疫していないドナーから得た抗体遺伝子のＰＣＲ増幅レパートリーによって作られたファージ抗体ライブラリーは、機能性抗体フラグメントの供与源として非常に有効なものであることが証明されている（Winterら, 1994, Annu. Rev. Immunol. 12, 433-55；Hoogenboom, H. R. (1997) 「高アフィニティー抗体を作成するためのライブラリー選択の方法の設計と最適化」"Designing and optimizing library selection strategies for generating high-affinity antibodies", Trends Biotechnol., 15, 62-70）。遺伝子のライブラリーはまた、遺伝子の全て（例えば、Smith, G. P. (1985) Science, 228, 1315-7; Parmley, S. F.及びSmith, G. P., (1988) Gene, 73, 305-18を参照せよ）若しくは一部（例えば、Lowmanら, (1991) Biochemistry, 30, 10832-8を参照せよ）、又は遺伝子のプール（例えば、Nissim, A., Hoogenboomら, (1994) Embo J., 13, 692-8を参照せよ）を、ランダム化した若しくはドープ（doped）合成オリゴヌクレオチドによってコードすることにより構築することもできる。ライブラリーはまた、ある核酸若しくは核酸のプール中に種々のｉｎ  ｖｉｖｏの技法を用いてランダムに突然変異を導入することによって作ることもでき、そのような技法としては、大腸菌ｍｕｔＤ５などの細菌の「突然変異導入株」を用いること（Liaoら, (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 576-80; Yamagishiら, (1990) Protein Eng., 3, 713-9; Lowら, (1996) J. Mol. Biol., 260, 359-68）；Ｂリンパ球の抗体高度突然変異系を用いること（Yelamosら, (1995) Nature, 376, 225-9）が含まれる。ランダムな突然変異もｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの双方で化学的突然変異誘発物質、イオン化、若しくはＵＶ照射によって（Friedbergら, 1995, 「ＤＮＡ修復と突然変異導入」"DNA repair and mutagenesis", ASM Press, Washington D.C.を参照せよ）、又は突然変異導入性の塩基類似体の組み入れによって（Freese, 1959, J. Mol. Biol., 1, 87; Zaccoloら, (1996), J. Mol. Biol., 255, 589-603）、導入することができる。「ランダムな」突然変異はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの重合の際、例えば変異性ポリメラーゼを用いることによって遺伝子内に導入することができる（Leungら, (1989) Technique, 1, 11-15）。
【０１８９】
さらに相同組換えをｉｎ  ｖｉｖｏで（Kowalczykowskiら, (1994) Microbial Rev., 58,401-65）若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで（Stemmer, (1994) Nature, 370, 389-9; Stemmer, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10747-51）用いることによって多様性を導入することができる。
【０１９０】
物質
本明細書で用いる「物質」という用語は、限定はされないが、原子若しくは分子を含むものであり、その分子は無機若しくは有機のもの、生物学的エフェクター分子及び／又は生物学的エフェクター分子などの物質をコードしている核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ウイルス、ウイルス様粒子、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドの合成類似体、リボヌクレオチドの合成類似体、修飾ヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、アミノ酸、アミノ酸類似体、修飾アミノ酸、修飾アミノ酸類似体、ステロイド、プロテオグリカン、脂質、脂肪酸、及び炭水化物とすることができる。ある物質は、溶液中若しくは懸濁液中（例えば、結晶、コロイド状、若しくはその他の粒子状）に存在させることができる。物質は、モノマー、ダイマー、オリゴマーなど、若しくは複合体の形態を取ることができる。
【０１９１】
ポリペプチド
本明細書で用いる「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、ポリマーであって、そのモノマーはアミノ酸であり、モノマー同士がペプチド若しくはジスルフィド結合を介して結合しているものを意味する。「ポリペプチド」とは、天然のアミノ酸鎖の完全長のもの、若しくは「その断片」、若しくは「ペプチド」を意味し、例えば、別のタンパク質、ペプチド、若しくはポリペプチドと、あるリガンドによって調節可能な様式で結合しているポリペプチドの選択された領域などを意味するか、又は、部分的に若しくはその全てが非天然であるようなアミノ酸ポリマー、又はその断片若しくはペプチドを意味する。従って「その断片」とは、完全長のポリペプチドの一部分、約８個から５００個の長さのアミノ酸、好ましくは約８個から３００個、より好ましくは約８個から２００個、さらにいっそう好ましくは約１０個から約５０若しくは１００個のアミノ酸の長さのものを意味する。「ペプチド」とは、１０〜４０個のアミノ酸の長さ、好ましくは１０〜３５個のアミノ酸の長さの短いアミノ酸配列を意味する。さらに、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシン、及びホモアルギニンを含むことができる。一般的に見かけるアミノ酸、それらは遺伝子によってコードされるものではないが、そのようなアミノ酸も本発明で用いることができる。本発明で用いられているアミノ酸はその全てがＤ−若しくはＬ−光学異性体のいずれかとすることができる。Ｌ−異性体が好ましい。さらに、その他のペプチド疑似体も、例えば本発明のポリペプチドのリンカー配列中などに有用である（Spatola, (1983), 「アミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の化学と生化学」"Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins"中の記載, Weinstein編, Marcel Dekker, New York, p.267）。「ポリペプチド結合分子」とは、１つの分子、好ましくはポリペプチド、タンパク質、若しくはペプチドで、それは別のポリペプチドであって、タンパク質、若しくはペプチドと結合する能力があるものである。好ましくは、この結合能はリガンドによって調節可能なものである。
【０１９２】
本明細書で用いる「合成」という用語は、記載されたプロセス若しくは物質が自然界では通常は起こらないものを意味する。好ましくは、合成物質はｉｎ  ｖｉｔｒｏの合成若しくは操作によって産生される物質と定義される。
【０１９３】
本明細書で用いる「分子」という用語は、原子、イオン、分子、巨大分子（例えばポリペプチド）、若しくはそのような物質の組み合わせのいずれかを意味する。「リガンド」という用語は「分子」という用語と相互に交換可能な形で用いることができる。本発明における分子は、溶液中で遊離の形とすることができ、又は部分的に若しくは完全に固定化することができる。分子は個別の物質として存在しているものとしてもよいし、又は他の分子と複合体化したものとすることができる。好ましくは、本発明の分子は、バクテリオファージ粒子の表面上にディスプレイされるポリペプチドを含んでいる。より好ましくは、本発明の分子には、バクテリオファージ粒子の外表面上のエンベロープタンパク質の必須部分として提示されているポリペプチドのライブラリーを含んでいる。ランダム化されたポリペプチドをコードするライブラリーの作製方法は当業界では既知であり、本発明に適用することができる。ランダム化は全体的若しくは部分的なものとすることができる。部分的ランダム化の場合には、選択されたコドンは好ましくはアミノ酸をコードするものであって停止コドンをコードするものではない。
【０１９４】
実施例
実施例１  Ｔａｑポリメラーゼ発現プラスミドの構築
ＴａｑポリメラーゼのオープンリーディングフレームをＰＣＲでサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ゲノムＤＮＡからプライマー１及び２を用いて増幅し、ＸｂａＩとＳａｌＩで切断し、ＸｂａＩとＳａｌＩで切断したｐＡＳＫ７５中に連結する（Skerra, A. 1994, Gene, 151, 131）。ｐＡＳＫ７５は、ｔｅｔＡプロモーター／オペレーターの転写制御のもとで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での外来タンパク質の合成を指令する発現ベクターである。
【０１９５】
プライマー３、４を用いてインサートのあるクローンをスクリーニングし、活性のあるＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｑ  ｐｏｌ）（下記参照）の発現をアッセイする。不活性なＴａｑ  ｐｏｌ変異体であるＤ７８５Ｈ／Ｅ７８６ＶはＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて構築する。変異が導入された残基は活性に決定的に重要なものである（Doublie, S.ら, 1998, Nature 391, 251; Kiefer, J. R.ら, 1998, Nature 391, 304）。この結果得られるクローンをプライマー３、５を用いたＰＣＲスクリーニングで変異のあるものをスクリーニングし、その産物をＰｍｌＩで消化して調べる。変異のあるクローンを活性Ｔａｑ  ｐｏｌの発現についてアッセイする（下記参照）。
【０１９６】
実施例２  タンパク質の発現及び活性のアッセイ
形質転換したＴＧ１細胞を２×ＴＹ  ０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリン中で増殖させる。発現のために一晩培養した培養物を新鮮な２×ＴＹ培地中に１／１００に希釈し、３７℃でＯＤ６００＝０．５となるまで増殖させる。タンパク質の発現は無水テトラサイクリンを終濃度が０．２μｇ／ｍＬとなるように添加することによって誘導する。３７℃でさらに４時間インキュベートした後、細胞を遠心して集め、一度洗い、同量の１×ＳｕｐｅｒＴａｑポリメラーゼバッファー（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）に再懸濁する。
【０１９７】
洗浄した細胞をＰＣＲ反応混液に直接添加（３０μＬの反応混液あたり２μＬ）するが、その反応混液は、鋳型のプラスミド（２０μｇ）、プライマー４及び５（各１μＭ）、ｄＮＴＰ（０．２５ｍＭ）、１×ＳｕｐｅｒＴａｑポリメラーゼバッファーを含み、それに鉱物油を重層したものである。反応液を９４℃で１０分間インキュベートしてＴａｑ  ｐｏｌを細胞から放出させ、次いで熱サイクルを９４℃（１分間）、５５℃（１分間）、７２℃（２分間）を１サイクルとして３０サイクル行った。
【０１９８】
実施例３  増幅産物の乳化
反応液の乳化は下記のとおり行う。２００μＬのＰＣＲ反応混液（Ｔａｑ発現プラスミド（２００ｎｇ）、プライマー３及び４（各１μＭ）、ｄＮＴＰ（０．２５ｍＭ）、Ｔａｑポリメラーゼ（１０ユニット））を、２ｍＬ容の丸底生体試料凍結用バイアル瓶（biofreeze vial：Ｃｏｓｔａｒ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）中に入れた油相（鉱物油（Ｓｉｇｍａ））に、４．５％（ｖ／ｖ）Ｓｐａｎ  ８０（Ｆｌｕｋａ）、０．４％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ８０（Ｓｉｇｍａ）、及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下で定速で撹拌（１０００ｒｐｍ）しつつ滴下した（１２滴／分）。水相を完全に添加した後、撹拌をさらに４分間続ける。次いで乳化した混合物を０．５ｍＬ容の薄壁ＰＣＲ用試験管に移し（１００μＬ／管）、ＰＣＲを開始時に９４℃で５分間インキュベートした後、９４℃（１分間）、６０℃（１分間）、７２℃（３分間）を１サイクルとして２５サイクル行う。反応混液は、２倍量のエーテルを添加し、ボルテックスにかけ、２分間遠心した後、エーテル相を除去することにより回収する。増幅産物はアガロースゲルでのゲル電気泳動を標準的な方法を用いて行うことによって可視化する（例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, 及びT. Maniatis, 1989 「分子クローニング：実験室マニュアル」"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 第２版、第１−３巻, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照せよ）。
【０１９９】
Ｔａｑポリメラーゼを発現している細胞の全体を乳化するために、プロトコールを次のように改変する：反応混液中にＴａｑ発現プラスミド及びＴａｑポリメラーゼを入れず、その替わりに５×１０８の誘導された大腸菌ＴＧ１細胞（発現されたＴａｑポリメラーゼ並びに発現プラスミドを含んでいる）を、添加剤のテトラメチル塩化アンモニウム（５０μＭ）、及びＲＮＡａｓｅ（０．０５％  ｗ／ｖ，Ｒｏｃｈｅ，  ＵＫ）と共に添加する。ＰＣＲのサイクル数も２０に減らす。
【０２００】
実施例４  完全長の野生型Ｔａｑ遺伝子の自己複製
自己複製の間の遺伝子型−表現型の関連性を調べるために、野生型Ｔａｑポリメラーゼ（ｗｔＴａｑ）又は活性がほとんどない（このバッファーの条件下においての活性）Ｓｔｏｆｆｅｌ断片（ｓｆＴａｑ）（F. C. Lawyerら, PCR Methods Appl. 2, 275-87 (1993)）を発現する細胞を１：１の比で混合し、次いでそれらを溶液中若しくは乳液中でのＣＳＲにかけた。溶液中では、より小さなｓｆＴａｑが優先的に増幅される。しかし、乳液中では、ほぼ全てにおいて完全長ｗｔＴａｑ遺伝子の自己複製が起こる（図３Ｂ）。細菌の細胞数は乳液区画の大多数が細胞を１個のみ含有しているように調整する。しかし、細胞は各区画にランダムに分布しているので、区画のうちの少数のものが２個以上の細胞を含有してしまうことは避けられない。区画が鋳型ＤＮＡ（図３Ａ）を交換するとは考えられないので、乳液中の少量のｓｆＴａｑ増幅はおそらくこれらの区画からのものであろう。これらの存在量は低いことは明らかなので、選択に影響を及ぼすとは考えない。事実、試験的に行った選択では、ｗｔＴａｑクローンを１０６倍過剰の不活性Ｔａｑ変異体から単離するには１ラウンドのＣＳＲで十分である。
【０２０１】
変異性（エラーを起こしやすい）ＰＣＲを用いてランダムなＴａｑ変異体の２つのレパートリーを調製した（Ｌ１（J. P. Vartanian, M. Henry, S. Wain-Hobson, Nucleic Acid Res. 24, 2627-2631, 1996））及びＬ２（M. Zaccolo, E. Gherardi, J. Mol. Biol. 285, 775-83, 1999）。ＰＣＲで調べるとＬ１若しくはＬ２クローンのうちわずかに１〜５％に活性があるにすぎないが、標準的ＰＣＲ条件下でポリメラーゼ活性についてＣＳＲでの選択を１ラウンド行うと、活性のあるクローンの比率は８１％（Ｌ１＊）及び７７％（Ｌ２＊）に増加する。
【０２０２】
実施例５  突然変異誘発ＰＣＲ
Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子の変異体を、変異性ＰＣＲを用いた２種類の異なる方法で構築する。
【０２０３】
第１の方法はヌクレオシド類似体であるｄＰＴＰ及びｄＬＴＰを利用する（Zaccoloら, (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603）。簡潔に記せば、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ（５００μＭ）、ｄＰＴＰ（５００μＭ）、ｄＬＴＰ（５００μＭ）、１ｐＭ  鋳型ＤＮＡ、プライマー８及び９（各１μＭ）、Ｔａｑポリメラーゼ（２．５ユニット）を含む総液量５０μＬの反応液で３サイクルのＰＣＲ反応を行い、その熱サイクルは、９４℃（１分間）、５５℃（１分間）、７２℃（５分間）とする。次いで２μＬのアリコートを、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  １．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ（２５０μＭ）、プライマー６及び７（各１μＭ）、Ｔａｑポリメラーゼ（２．５ユニット）を含む１００μＬの標準ＰＣＲ反応液中に移す。この反応液を９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）、７２℃（４分間）を１サイクルとして３０サイクル行う。増幅産物をゲルで精製し、上述のとおりｐＡＳＫ７５中にクローニングしライブラリーＬ２を作る。
【０２０４】
第２の方法は、ＰＣＲ中に変異（エラー）を導入するために偏りのあるｄＮＴＰとＭｎＣｌ２の組み合わせを利用する。反応混液は５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｐＭ  鋳型ＤＮＡ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ（全て１ｍＭ）、ｄＡＴＰ（１００μＭ）、プライマー８及び９（各１μＭ）、及びＴａｑポリメラーゼ（２．５ユニット）を含む。この反応は９４℃（３０秒間）、５５℃（３０秒間）、７２℃（４分間）を１サイクルとして３０サイクル行い、増幅産物は上述のとおりクローニングしてライブラリーＬ１を作る。
【０２０５】
実施例６  選択プロトコール
活性を有するポリメラーゼを選択するために、上述のとおり乳液中でＰＣＲ反応を行うが、プライマーは８、９を用いる。熱安定性の増大した変異体の選択には、乳液を上述のとおりサイクルにかける前に９９℃で７分間までプレインキュベートする。阻害物質のヘパリンの存在下で活性の増大を示す変異体の選択には、ヘパリンを０．０８及び０．１６ユニット／μＬの濃度となるように添加し、上述のとおりサイクルを行う。詳細なプロトコールは下記の実施例で示す。
【０２０６】
活性のあるポリメラーゼを含有している区画から得た増幅産物を、前述のとおり乳液からエーテルで抽出し、次いで標準的なフェノール−クロロホルム抽出で精製する。次いで０．５倍量のＰＥＧ／ＭｇＣｌ２溶液（３０％  ｖ／ｖ  ＰＥＧ８００、３０μＭ  ＭｇＣｌ２）を添加し、混合後、１３，０００ＲＰＭで１０分間、室温で遠心する。その上清（取り込まれていないプライマーとｄＮＴＰを含有している）を廃棄し、ペレットをＴＥ中に再懸濁する。次いで、増幅産物をさらにスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製してプライマーを完全に除去する。次いでこれらの産物をプライマー６、７（これらはプライマー８及び９の外側に配置させたもの）を用いて標準的なＰＣＲ反応で再増幅するが、サイクル数は例外で、２０サイクルのみとする。再増幅産物をゲルで精製しｐＡＳＫ７５中に上述のとおり再度クローニングする。形質転換体をプレートに蒔き、コロニーを下記のとおりスクリーニングする。その残りを掻き取り２×ＴＹ／０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリン中に入れ、ＯＤ６００＝０．１となるまで希釈し、選択プロトコールを反復して行うために上述のとおり増殖／誘導を行う。
【０２０７】
実施例７  コロニースクリーニングプロトコール
コロニーを取り９６ウエルの培養ディッシュ（Ｃｏｓｔａｒ）中に入れ、上述のとおり発現させるために増殖と誘導を行う。スクリーニングには、細胞２μＬを３０μＬのＰＣＲ反応液中に入れ、プライマー４及び５を用いて９６ウエルのＰＣＲプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で上述のとおり活性を試験する。熱安定性の増大した選択体のスクリーニングのために温度勾配によるブロックを用いる。反応液を９４．５〜９９℃の範囲の温度で５分間プレインキュベートした後、プライマー４及び５、又はプライマー３及び４を用いて上述のとおり標準的なサイクルを行う。ヘパリンと共存しうるポリメラーゼのスクリーニングには、９６ウエルのフォーマットのコロニーＰＣＲスクリーニングの際にヘパリンを０．１ユニット／３０μＬ添加する。次いで、活性のあるポリメラーゼをヘパリン濃度０．００７〜３．７５ユニット／３０μＬの範囲でアッセイし、野生型と比較する。
【０２０８】
実施例８  ポリメラーゼの触媒活性のアッセイ
Ｋｃａｔ及びＫｍ（ｄＴＴＰ）をホモポリマーの基質を用いて測定する（Poleskyら, (1990) J. Biol. Chem. 265:14579-91）。反応混液（２５μＬ）の最終組成は、１×ＳｕｐｅｒＴａｑバッファー（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ｐｏｌｙ（ｄＡ）．オリゴｄＴ（５００ｎＭ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、及び様々な濃度の［α−３２Ｐ］ｄＴＴＰ（約０．０１Ｃｉ／ミリモル）を含む。反応は１×ＳｕｐｅｒＴａｑバッファー中の５μＬの酵素を添加することによって開始し、酵素の最終濃度は１−５ｎＭの間とする。反応液を７２℃で４分間インキュベートし、実施例１４のとおりＥＤＴＡで反応停止し、２４ｍｍのＤＥ−８１フィルターにアプライする。フィルターを洗い、活性を実施例１４のとおり測定する。速度論的パラメーターは標準的なＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅプロットを用いて決定する。ホモポリマー基質を５０％減らした実験ではポリメラーゼによるｄＴＴＰの取込みに大きな差は見られず、このことは、基質が十分過剰に存在しておりここで用いる速度論的分析プロトコールが有効であることを示している。
【０２０９】
実施例９  乳液中の水性区画内での標準的なＰＣＲ
乳液中に存在する水性区画内での条件が触媒作用を許容する条件であるか確認するために、標準的な反応混液を乳化しＰＣＲを行う。このことによって鋳型となるプラスミド中に存在する正しいサイズのＴａｑポリメラーゼ遺伝子が増幅され、その収率は標準的なアガロースゲル電気泳動を行って可視化するには十分である。
【０２１０】
実施例１０  Ｔａｑポリメラーゼを発現する大腸菌の乳化と、その後のポリメラーゼ遺伝子増幅のためのＰＣＲ
Ｔａｑポリメラーゼを発現する大腸菌細胞を乳化し、発現ベクター中のポリメラーゼカセットに隣接するプライマーを用いてＰＣＲを行う。５×１０８個までの細胞（６００μＬの総容量あたり）の乳化は、アガロースゲル電気泳動で調べたときに認識しうる産物の形成をもたらす。従って、細胞は、発現されたＴａｑポリメラーゼによるポリメラーゼ遺伝子の自己増幅に適した条件を有する水性区画内に隔離（分割）される。類似の乳液は１ｍＬあたり約１×１０１０個の区画を含むものと推定される（Tawfik, D.及びGriffiths, A.D. (1998) Nature Biotech., 16, 652）。乳化しうる細胞数がこのように多数であることによって、ランダム化したタンパク質の多様なレパートリーからの選択が可能となる。
【０２１１】
実施例１１  乳液中での遺伝子型−表現型関連性の維持
選択法が有効となるためには、乳液中の水性区画の大多数は１個の細胞のみを有するものとすべきであり、熱サイクルの間に区画の状態が完全に保たれるようにすべきである。このことは、その乳液中に、競合する鋳型（サイズの小ささによって識別しうるものとする）を有する細胞を含めることによって調べる。
【０２１２】
Ｔａｑポリメラーゼを発現する大腸菌をＳｔｏｆｆｅｌ断片を発現する大腸菌と１対１の比率で一緒に乳化する。このＳｔｏｆｆｅｌ断片は乳液中で用いられている条件下ではほとんど活性を持たず、従ってＴａｑの自己増幅に用いたものと同じプライマー対によるその断片の発現カセットの増幅は、活性のあるＴａｑポリメラーゼを発現する１つの細胞での同時区画化がなされた結果であるか、又は区画間のＴａｑポリメラーゼの漏出の結果である。ＰＣＲの後大多数の産物が活性Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子に対応したものとわかれば、１つの耐久性の区画あたり１個の細胞があるという前提が確認されること意味する（図２参照、Ghadessyら, (2001), PNAS, 98, 4552）。
【０２１３】
実施例１２  不活性なＴａｑポリメラーゼに対して活性なものの試験的選択
上記の方法がほとんど存在しないと考えられる変異体を選択しうることを示すために、活性型を発現している細胞に対して不活性なポリメラーゼを発現している細胞を１０６倍過剰で用いて一緒に乳化する。ＰＣＲ及び増幅産物のクローニングの後、９６ウエルのフォーマットを用いて単一発現スクリーニングを行うと、活性ポリメラーゼを発現している細胞は１０４倍の濃縮が認められる。
【０２１４】
実施例１３  熱安定性の増大したＴａｑポリメラーゼ変異体の定方向進化
熱安定性の増大したポリメラーゼは利用上重要である可能性があり、すなわち熱サイクルの間の活性の喪失が低減され、ＧＣに富む鋳型の増幅を行う際に変性温度をより高く設定できる。従って、本発明者はまず、本発明の選択方法を熱安定性の増大したＴａｑ変異体を得るための定方向進化に用い、あらかじめ選択したライブラリー（Ｌ１＊、Ｌ２＊）から開始し、次第に温度と最初の熱変性の時間を増加させた。３ラウンドの選択の後、本発明者はＴ８（表１）を単離したが、これは野生型Ｔａｑ酵素で既に熱安定性であるもの（表２）と比較して９７．５℃で１１倍長い半減期を有するＴａｑクローンであり、Ｔ８はＰｏｌ  Ｉファミリーのうち記録されている限り最も熱安定性の高いメンバーとなった（クローンはＰＣＲアッセイでスクリーニングし著しいものを選択した。簡潔に記せば、誘導した細胞の２μＬを３０μＬのＰＣＲ反応混液中に添加し、０．４ｋｂの断片の増幅を選択条件下（例えばヘパリン量の増加）でアッセイする。精製したＨｉｓを、標識した野生型及び変異型Ｔａｑクローンの熱安定性及びヘパリンに対する抵抗性について、活性化したサケ精子ＤＮＡ及び規準化した酵素濃度を用いて文献（Lawyerら, PCR Methods Appl. 2, 275-287(1993); Lawyerら, J. Biol. Chem. 264, 6427-37(1989)）に示されているとおり測定する）。Ｔ８（及びより熱安定性の低い変異体の大多数）に熱安定性を付与する変異は、５’−３’エキソヌクレアーゼドメイン中にまとまって存在する（表１）。事実、該エキソヌクレアーゼドメインを欠損するＴａｑポリメラーゼの末端切断型変異体（F. C. Lawyerら, (1993)  PCR Methods Appl. 2, 275-287; W. M. Barnes, (1992) Gene, 112, 29-35）は熱安定性の改善を示し、このことはこの変異体が主なポリメラーゼドメインよりも熱安定性が低いことを示唆している。Ｔ８における安定化変異によってエキソヌクレアーゼ活性が低減する（約５分の１に低減）ので、エキソヌクレアーゼドメインの熱安定性がより低いことにはおそらく機能的な重要性があると考えられる例えば、より大きな自由度（フレキシビリティ）の必要性を反映している、など）（５’−３’エキソヌクレアーゼ活性は、１ｘＴａｑバッファー中で０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ及び５’末端をＣｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識した２２量体オリゴヌクレオチドを用いること以外は、基本的には（Y. Xuら, J. Mol. Biol. 268, 284-302 (1997)）に記載の方法で測定する。定常状態の速度論の解析はホモポリマー基質であるポリ（ｄＡ）２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及びオリゴ（ｄＴ）４０プライマーを５０℃で（少なくとも低温で）用いて、（A. H. Polesky, T. A. Steitz, N. D. Grindley, C. M. Joyce, J. Biol. Chem. 265, 14579-91(1990)）に記載のとおり行った）。
【０２１５】
【表１】
2007190027.tif 000002
【０２１６】
変異性ＰＣＲを用いてＴａｑポリメラーゼ変異体の２つのライブラリーを作製し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させ（ライブラリーＬ１、８ｘ１０７クローン、ライブラリーＬ２、２ｘ１０７クローン；実施例５を参照せよ）、前述のとおり乳化する。第１ラウンドのＰＣＲは上述の標準的なＴａｑポリメラーゼ熱サイクルプロフィールを用いて活性のある変異体が濃縮されるように行う。濃縮化された増幅産物を精製し、再クローニングして活性を有する変異体を含むライブラリーを作製する（Ｌ１＊、Ｌ２＊；各ライブラリーは約１０６個のクローンを含む）。Ｌ１＊とＬ２＊ライブラリーのスクリーニングでは、ランダムに選択したクローンのうち、それぞれ８１％と７７％が活性を有するものとしてスクリーニングされた。
【０２１７】
Ｌ１＊とＬ２＊ライブラリーを次のラウンドのＰＣＲの際に通常のＰＣＲサイクルの前に９９℃で６若しくは７分間プレインキュベートして選択圧をかける。これらの条件下では、野生型Ｔａｑポリメラーゼはその活性を全て失う。増幅産物を上述のとおり濃縮及びクローニングし、９６ウエルの発現スクリーニングを用いて正常なＰＣＲ条件下で活性を有する変異体を選択する。これによってＬ２＊ライブラリーから７クローン、Ｌ１＊ライブラリーから１０クローンが得られた。次いでこれらを、標準的なサイクルにかける前に９４．５〜９９℃で５分間プレインキュベートし、温度勾配ＰＣＲブロックを用いて熱安定性の増大したものをスクリーニングする。ゲル電気泳動で判定すると、各ライブラリーの５個のクローンが野生型と比較して熱安定性の増大を示す。これらの変異体は９９℃で５分間のプレインキュベーションを行った後でも３２０ｂｐの標的を効率的に増幅することができる。野生型の酵素は９７℃を超える温度で５分間以上プレインキュベートすると活性が認められなくなる。
【０２１８】
実施例１４  ポリメラーゼの熱安定性のアッセイ
野生型及び精製Ｈｉｓ標識ポリメラーゼの熱不活化アッセイを標準的な５０μＬのＰＣＲ混合液中で行い、その混合液は１×ＳｕｐｅｒＴａｑバッファー（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、０．５ｎｇプラスミドＤＮＡ鋳型、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、プライマー３及び４（１０μＭ）、並びにポリメラーゼ（約５ｎＭ）を含む。反応混液に油を重層し９７．５℃でインキュベートし、５μＬのアリコートを取り、一定時間後氷上で保管する。これらのアリコートを５０μＬの活性反応バッファー中でアッセイするが、そのバッファーは２５ｍＭ  Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］−３−アミノ−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）（ｐＨ９．５）、１ｍＭ  β−メルカプトエ・BR>^ノール、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ、１００μＭ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（０．０５Ｃｉ／ミリモル）、並びに２５０μｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡ鋳型を含む。反応液を７２℃で１０分間インキュベートし、ＥＤＴＡ（最終濃度２５ｍＭ）を添加して反応を停止させる。反応液量を溶液Ｓ（２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍＬの切断されたサケ精子ＤＮＡ）を用いて５００μＬとし、５００μＬの２０％ＴＣＡ（ｖ／ｖ）／２％ピロリン酸ナトリウム（ｖ／ｖ）を添加する。氷上で２０分間インキュベートした後、反応液を２４ｍｍのＧＦ／Ｃフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）にアプライする。取り込まれなかったヌクレオチドを、５％ＴＣＡ（ｖ／ｖ）、２％  ピロリン酸ナトリウム（ｖ／ｖ）で３回洗った後、９６％エタノール（ｖ／ｖ）で２回洗う。フィルターを乾燥させて、Ｅｃｏｓｃｉｎｔ  Ａ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有するシンチレーションバイアル瓶に入れてカウントする。このアッセイは既知量の標識ｄＣＴＰ溶液を用いて（洗浄過程は省いて）較正する。
【０２１９】
実施例１５  阻害物質であるヘパリンの存在下で活性の増大を示すＴａｑポリメラーゼ変異体の定方向進化
上述のとおり、本発明の方法はまた、酵素活性の阻害物質に対する抵抗性を進化させるために用いることもできる。ヘパリンは広く用いられている抗凝固剤であるが、ポリメラーゼ活性の強力な阻害物質でもあり、臨床の場で採取された血液サンプルからＰＣＲ増幅を行うことが困難になる（J. Satsangi, D. P. Jewell, K. Welsh, M. Bunce, J. I. Bell, Lancet 343, 1509-10 (1994)）。 ヘパリンは血液サンプルから種々の方法で除去することはできるが、それらの方法は高価でかつ時間がかかるものである。従って、ヘパリンと共存しうるポリメラーゼが利用できれば、治療上有意義なアンプリコンの特徴の検討が大いに改善され、コストがかかりすぎると考えられる、サンプルのヘパリナーゼ処理（Taylor, A. C. (1997) Mol. Ecol. 6, 383）が不要なものとなるであろう。
【０２２０】
Ｌ１＊及びＬ２＊ライブラリーを合わせ、１μＬあたり０．１６ユニットまでのヘパリンが存在しても活性のあるポリメラーゼを乳液中で選択する。１回のラウンドの後、０．１ユニット／３０μＬ版応益を取り込んだ９６ウエルのＰＣＲスクリーニングで５個のクローンが活性を示すのに対し、野生型では活性を示さない。力価測定を行うとこれらのクローンのうち４個は野生型を阻害するヘパリンの量の４倍までのヘパリンの量が存在しても活性を示す（０．０６ユニット／３０μＬ  対  ０．０１５ユニット／３０μＬ）。残りの１個のクローンでは野生型を阻害するヘパリンの量の８倍までの量が存在しても活性を示す（０．１２ユニット／３０μＬ  対  ０．０１５ユニット／３０μＬ）。
【０２２１】
ヘパリンの存在量を増加させつつ選択を行って、本発明者はＨ１５というクローンを単離したが、これはヘパリンの阻害濃度の１３０倍までの濃度においてもＰＣＲにおいて機能を有するＴａｑ変異体であった（表２）。興味深いことに、ヘパリン抵抗性の付与されるような変異もまとまって存在し、この場合にはポリメラーゼのフィンガー（finger）サブドメイン及びサム（thumb）サブドメインの基部で、２本鎖ＤＮＡ結合に関与する領域である。事実、最近の高分解能Ｔａｑ−ＤＮＡ複合体構造解析（Y. Li, S. Korolev, G. Waksman, EMBO J. 17, 7514-25 (1998)）から判断すると、Ｈ１５中で変異している６個の残基のうちの４個（Ｋ５４０、Ｄ５７８、Ｎ５８３、Ｍ７４７）は、鋳型若しくは産物の鎖のいずれかと直接接触している（図７に示すとおりである）。Ｈ１５の変異は２本鎖ＤＮＡに対する親和性に関する限りは、中性（すなわち相互に補い合う）ものと考えられる（一方おそらくヘパリンに対する親和性は低下しているであろう）（表２）（ＤＮＡのＫＤはＢＩＡｃｏｒｅを用いて測定する。簡潔に記せば、（M. Astatke, N. D. Grindley, C. M. Joyce, J. Biol. Chem. 270, 1945-54 (1995)）で用いられている６８量体を５’末端の位置でビオチニル化し、ＳＡセンサーチップに固定し、ポリメラーゼの結合を１×Ｔａｑバッファー（上記参照）中で２０℃で測定する。相対的ＫＤ値は鋳型の量を低減させつつＰＣＲランキングアッセイで推定する）。ヘパリンによる阻害の分子的原理の詳細は未知であるが、本発明者の結果はポリメラーゼの活性部位中でのＤＮＡとヘパリンの結合部位の重複（及びおそらくは相互排除）を強く示唆するものであり、このことは、ヘパリンが、活性部位への結合に対して２本鎖ＤＮＡを模倣し競合することによってその阻害作用を現すという考え方を支持するものである。鋳型ＤＮＡが過剰である条件下ではヘパリンによる阻害が顕著に低減されるとの本発明者の観察結果は、この仮説と一致していると考えられる（次の事項を参照せよ（クローンはＰＣＲアッセイでスクリーニングし分類・評価する（ランク付けする）。簡潔に記せば、誘導した細胞の２μＬを３０μＬのＰＣＲ混液中に添加し、０．４ｋｂの断片の増幅を選択条件下（例えばヘパリン量の増加）でアッセイする。精製したＨｉｓ標識した野生型及び変異型Ｔａｑクローンの熱安定性及びヘパリンに対する抵抗性について、活性化したサケ精子ＤＮＡ及び規準化した酵素濃度を用いて文献（F.C. Lawyerら, PCR Methods Appl. 2, 275-287(1993); F.C. Lawyerら, J. Biol. Chem. 264, 6427-37(1989)）に示されているとおり測定する。表２）。
【０２２２】
【表２】
2007190027.tif 000003
【０２２３】
実施例１６  乳液中での選択による鋳型の進化
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ複製実験における古典的な結論は、鋳型配列のより迅速な複製への適応である（S. Spiegelman, Q. Rev. Biophys. 4, 213-253 (1971)）。事実、本発明者もサイレント変異による鋳型の進化を観察している。コード配列の変異（ＡＴからＧＣ対ＧＣからＡＴ／２９対１６）とは異なり、非コード配列の変異はＧＣ含量の減少に対する驚くべき偏り（ＡＴからＧＣ対ＧＣからＡＴ／０対４２）を示し、一般的にはこれは鎖の分離を起こりやすくし、２次構造を不安定化させることによってより効率的な複製を促進するものと考えられている。適応しているものを選択することの他に、本発明の方法は適応能についての選択も行うことができる。すなわち、ポリメラーゼは、最適でおそらくはより高率の、自己突然変異の方向へと進化する可能性がある（M. Eigen, Naturwissenschaften 58, 465-523 (1971)）。事実、突然変異誘発遺伝子は無性の細菌集団中で適応ストレス下で自発的に生じうる（F. Taddeiら, Nature 387, 700-2 (1997); P. D. Sniegowski, P. J. Gerrish, R. E. Lenski, Nature 387, 703-5 (1997)）。これと類似しているため、本発明の方法は、より変異を起こしやすく従ってより早い適応進化を起こしうるポリメラーゼ変異体に都合のよいものと主張可能である。しかし、選択されたポリメラーゼのいずれもが変異率の増大は示さなかった（表２）。本発明の方法のサイクルの際に組換えの排除と突然変異の負荷（load）の低減を行うと、より変異を起こしやすい酵素に対する選択圧を増大させることができる。
【０２２４】
実施例１７  ポリメラーゼのヘパリン抵抗性についてのアッセイ
ポリメラーゼのヘパリン抵抗性は熱安定性についてのアッセイと類似の方法を用いてアッセイする。ヘパリンを活性バッファー中に連続希釈し（０−３２０ユニット／４５μＬ）、上述の標準的なＰＣＲ混液中に５μＬの酵素を添加する。反応液をインキュベートし、取込みは上述のとおりアッセイする。
【０２２５】
実施例１８  ３’のミスマッチの塩基からの伸長能が増大しているＴａｑ変異体の選択
用いるプライマーはプライマー９（ＬＭＢ３８８ｂａ５ＷＡ）及びプライマー１０（８ｆｏ２ＷＣ）である。このプライマーの組み合わせは３’プリン−プリンミスマッチ（Ａ−Ｇ）、及び３’ピリミジン−ピリミジンミスマッチ（Ｃ−Ｃ）を有するポリメラーゼ変異体を提供する。これらはＴａｑポリメラーゼで最も抵抗性の低いミスマッチであり（Huangら, 1992, Nucleic Acids Res. 20(17):4567-73）、伸長も乏しいものである。
【０２２６】
選択プロトコールは、乳液中でこれら２つのプライマーが用いられること以外は本質的には前述のものと同じである。伸長時間も８分間に延長される。選択のラウンドを２回行った後、ＰＣＲランキングアッセイによって判定するときミスマッチのところからの伸長が最大１６倍で増大を示す７個のクローンを単離し（実施例２を参照せよ：プライマー５及び１１使用）、通常のプライマー対を用いて活性を標準化する。次いでこれらのクローンをシャフリングして元のＬ１＊とＬ２＊ライブラリーに野生型Ｔａｑと共に戻し、ＣＳＲ反応の際のサイクル数をより少数（１０）とし、選択プロセスを反復する。この選択のラウンドによって多数のクローンが得られ、そのうちで最良のものはミスマッチからの伸長においてプライマー５及び１１を用いてのＰＣＲ（実施例２参照）で判定するとき３２倍までの増大が示された。
【０２２７】
Ｔａｑポリメラーゼによる正しくない塩基対の取込みは、ある種のミスマッチ（上記参照）がＴａｑによる伸長がうまく行われないので、ＤＮＡ合成のプロセスを失速させる。従って、Ｔａｑポリメラーゼはそれ自体単独では大きな（＞６Ｋｂ）鋳型の増幅には用いることができない（Ｂａｒｎｅｓ）。この問題点はＴａｑに３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ（例えばＰｆｕポリメラーゼ）を補うことによって克服することができる。このポリメラーゼは不正確に取り込まれた塩基を除去しＴａｑによるＤＮＡ合成を続行させるものである。従って、上述のクローンをλＤＮＡ鋳型からの大きなＤＮＡ断片（長距離ＰＣＲ）の増幅能について調べ、不正確な塩基の取込みが起こってもＤＮＡ合成の失速は起こらないことが予測される。プライマー１２（ＬＢＡ２３）及び１３（ＬＦＯ４６）（各１μＭ）を、３ｎｇのλＤＮＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭ）、１×ＰＣＲバッファー（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含有するＰＣＲ反応液５０μＬ中で用い、クローンＭ１は２ステップの増幅サイクル（９４℃１５秒間；６８℃２５秒間）を２０回反復して用いて２３Ｋｂ断片を増幅することができる。野生型ポリメラーゼは同じ反応バッファーを用いた場合には１３Ｋｂから先へ産物を伸長させることができない。市販のＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）はその製造者が供給しているバッファーを用いると６Ｋｂより先に伸長できなかった。
【０２２８】
実施例１９  自己持続性配列複製を用いる選択（３ＳＲ）
３ＳＲの乳液中内での実施可能性を証明するために、Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子をまず親のプラスミドから、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをＰＣＲ産物中に取り込むように設計されたフォワードプライマーを用いて、ＰＣＲで増幅させる（実施例１参照）。３ＳＲ反応混液（改変されたＴａｑ遺伝子（５０ｍｇ）、１８０ユニットのＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ）、６３ユニットの逆転写酵素（ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ｒＮＴＰ（１２．５ｍＭ）、ｄＮＴＰ（１ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、プライマーＴａｑｂａ２Ｔ７（プライマー１２：１２５ピコモル）、プライマー８８ｆｏ２（プライマー４；１２５ピコモル）、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、及び２．０ｍＭ  ＤＴＴを含む）２５０μＬを調製する。これの２００μＬを標準的なプロトコールを用いて乳化する。室温で長時間インキュベーションを行った後、標準的なゲル電気泳動で判定した場合に、乳液中でのＴａｑ遺伝子（モデルとなる遺伝子サイズを示している）の増幅が起こっていることが認められる。
【０２２９】
本発明の方法の範囲をさらに拡大するために、この３ＳＲ反応をｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物（ＥｃｏＰｒｏ、Ｎｏｖａｇｅｎ）中で行う。不活性なＴａｑ遺伝子（実施例１参照）をプライマー２（ＴａｑｆｏＳａｌ）及び１２（Ｔａｑｂａ２Ｔ７）を用いて親のプラスミドから増幅する。１００ｎｇ（約１×１０１０コピー）を添加して水相を１００μＬとするが、この水相は、ＥｃｏＰｒｏ抽出物（７０μＬ）、メチオニン（４μＬ）、逆転写酵素（８４ユニット、ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、プライマー１２（Ｔａｑｂａ２Ｔ７、２μＭ）、プライマー１３（ＴａｑｆｏＬＭＢ２、２μＭ）、ｄＮＴＰ（２５０μＭ）を含む。その水相を４００μＬの油相中に標準的なプロトコールを用いて乳化する。３７℃で一晩インキュベートした後その乳液を標準的なプロトコールを用いて抽出し、水相をさらにＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製する。カラムの溶出液５μＬを２μＬのＥｘｏＺａｐ試薬（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で処理してプライマーを完全に除去する。３ＳＲによって乳液中に産生されたＤＮＡは、２μＬの処理済みのカラム溶出液を用いて回収（rescue）するが、そのこと以外は標準的な５０μＬＰＣＲ反応を２０サイクルの増幅及びプライマー６（ＬＭＢ、ｒｅｆ２）及び１２（Ｔａｑｂａ２Ｔ７）を用いて行う。産物をアガロースゲル電気泳動を用いて可視化すると、バックグラウンド（逆転写酵素を乳液中での３ＳＲ反応から省いた対照の反応）と比較して、正しいサイズのバンドがより濃く認められる。従って、この３ＳＲ反応を転写／翻訳抽出物で進めることができ、それによって水性区画内で発現される物質の定方向進化が可能となる。
【０２３０】
ＷＴ  Ｔａｑポリメラーゼは逆転写酵素の活性を制限する（Perlerら, (1996) Adv. Protein Chem. 48, 377-435）。また、逆転写酵素（例えばＨＩＶ逆転写酵素、これは逆転写酵素とポリメラーゼの双方の活性を有する）は、その他のポリメラーゼよりもかなり変異を起こしやすい。このことは、より変化を起こしやすいポリメラーゼ（同種のものでない基質に対する許容性が増大していることが明らかな場合）は、逆転写酵素活性の増大を示すのではないかという可能性を提示する。Ｔａｑ変異体Ｍ１、Ｍ４、並びに不活性の変異体を親のプラスミドからプライマー１２（Ｔａｑｂａ２Ｔ７）及び２（ＴａｑｆｏＳａｌ）を用いて増幅し、３ＳＲ反応を転写／翻訳抽出物（Ｎｏｖａｇｅｎ）中で、逆転写酵素を外部から添加しなかったことを除いては上述のとおり行う。対照の反応では、反応混液からメチオニンを省く。３７℃で３時間インキュベートした後、その反応液を上述のとおり処理し、ＰＣＲをプライマー６と１２のプライマー対を用いて行って３ＳＲ反応の間に合成された産物を回収する。産物をアガロースゲル電気泳動で可視化すると、対照の反応と比較して、試験したクローンのうち、クローンＭ４は、正しいサイズのバンドをより濃く示した。従って、クローンＭ４はある程度の逆転写酵素活性を持つものと考えられる。この結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで機能的な活性を示すレプリカーゼを発現することができることを示している。区画化による選択と組み合わせた場合には、新規のレプリカーゼを進化させて得ることができると考えられる。
【０２３１】
レプリカーゼ活性を改変する物質の選択
実施例１９及び下記の実施例は、最終産物がレプリカーゼの基質であるような代謝経路に関与する酵素の選択に、本発明の方法をどのように用いることができるかを説明したものである。これらの実施例は、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＰキナーゼ）の選択方法を示しており、この酵素はＡＴＰからデオキシヌクレオシド二リン酸へリン酸基を転移させてデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を生成する反応を触媒する。ここではこの選択可能な酵素（ＮＤＫ）は、Ｔａｑポリメラーゼの基質を提供してそれをコードしている遺伝子を増幅する。この選択方法は、区画化されたレプリカーゼの自己複製（ＣＳＲ、Ghadessy及びHolliger）とは異なり、その複製は関連したプロセスであり、レプリカーゼ自体ではない酵素（核酸及びタンパク質）の選択を可能にする。ＮＤＫを発現する（及び発現ベクター上にその遺伝子を含んでいる）細菌をその基質（この場合、ｄＮＤＰ及びＡＴＰ）並びにその増幅を促進するために必要なその他の試薬（Ｔａｑポリメラーゼ、ｎｄｋ遺伝子に特異的なプライマー、及びバッファー）と共に一緒に乳化する。Ｗ／Ｏ型乳液中での区画化によって個々のライブラリーの変異体の弁別が行われる。活性のあるクローンは、Ｔａｑポリメラーゼがｎｄｋ遺伝子の増幅に必要とするｄＮＴＰを供給する。活性の増大した変異体は、それ自体の増幅のためにより多量の基質を供給するので、選択後のコピー数は、ポリメラーゼ活性の制約の範囲内で酵素活性と相関する。ポリメラーゼ活性に必要なｄＮＴＰの最小必要量からさらに選択圧が生じるので、触媒活性の増大したクローンは活性がほとんどない変異体を犠牲にして優先的に増幅される（選択はｋｃａｔ並びにＫｍに関して行われる）。
【０２３２】
ポリメラーゼ反応に材料を与えるような産物をもたらす酵素を進化させうることを本発明者が示すことによって、やがては、１つの酵素の産物が次の酵素の基質であるような経路を通じて関連性のある多数の酵素を同時に進化させうることが期待される。多様性は２個以上の遺伝子に導入しうるであろうし、両方の遺伝子を同じ発現宿主中でプラスミド又はファージ上で共形質転換させうるであろう。非天然の基質の合成及びその後のそれらのＤＮＡ中への取込みについての選択を可能とする、協調的酵素系を開発することが望まれる。
【０２３３】
実施例２０  細菌細胞中でのＮＤＰキナーゼの発現の誘導
ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断断片とミクソコッカス・キサンタス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  Ｘａｎｔｈｕｓ）から得たヌクレオシド二リン酸キナーゼのオープンリーディングフレームとを含むｐＵＣ１９発現プラスミドをクローニングする。プラスミドは一晩培養することによって調製し、大腸菌ＱＬ１３８７のｎｄｋ−、ｐｙｋＡ−、ｐｙｋＦ−株中に形質転換する。ＱＬ１３８７／ｐＵＣ１９ｎｄｋの一晩培養物を、クロラムフェニコール（終濃度１０μｇ／ｍＬ）、アンピシリン（終濃度１００μｇ／ｍＬ）、及びブドウ糖（２％）の存在下で１４−１８時間増殖させる。この一晩培養した培養物を、（２×ＴＹ，１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、及び０．１％ブドウ糖）中に１：１００に希釈する。細胞をＯ．Ｄ．（６００ｎｍ）が０．４となるまで増殖させ、ＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を用いて３７℃で４時間誘導させる。タンパク質を誘導させた後、細胞をＳｕｐｅｒＴａｑバッファー（１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９，５０ｍＭ  ＫＣｌ，０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で１回洗い、同じバッファーの１／１０容量に再懸濁する。細胞数は、分光学的分析でＯ．Ｄ．６００が０．１である場合に１×１０８細胞／ｍＬとする近似値で定量する。
【０２３４】
実施例２１  乳液中の水性区画内でのリン酸基転移反応
Ｔａｑバッファー中でデオキシヌクレオシド二リン酸がＮＤＰキナーゼによってリン酸化されうるか確認するために、標準的なＰＣＲ反応をｄＮＴＰの替わりにｄＮＤＰ及びリン酸分子ドナーのＡＴＰを用いて行う。前の実施例で述べたようにヌクレオシド二リン酸キナーゼは大腸菌ＱＬ１３８７（大腸菌のｎｄｋ及びピルビン酸キナーゼ欠損株）から発現される。細胞をＰＣＲ反応混液と混合する。
【０２３５】
洗浄した細胞を、ＳｕｐｅｒＴａｑバッファー、０．５μＭプライマー、各１００μＭのｄＮＤＰ、４００μＭのＡＴＰ、ＳｕｐｅｒＴａｑポリメラーゼ（終濃度０．１ユニット／μＬ、ＨＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含有するＰＣＲ反応混液に添加する（終濃度  約８ｅ５細胞／μＬ）。
【０２３６】
６５℃で１０分間処理して細胞を破裂させた後、反応混液を３７℃で１０分間インキュベートし、熱サイクルをかけ（９４℃１５秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分３０秒間を１サイクルとして１５サイクル）、増幅産物を標準的な１．５％アガロース／ＴＢＥゲルを臭化エチジウム（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）で染色して可視化する。この実験の結果は、発現されたＮＤＰキナーゼがｄＮＴＰをリン酸化してＴａｑポリメラーゼにｎｄｋ遺伝子のＰＣＲ増幅のための基質を提供できることを示している。
【０２３７】
この実験を、上述のように鉱油及び界面活性剤と共にこの反応混液を乳化するステップをさらに行って繰り返す。ＮＤＰキナーゼが乳液の水性区画内で活性を有することを確認する。
【０２３８】
実施例２２  乳化によるＮＤＫ変異体の区画化
オリジナルの乳液混合物は、小分子を熱サイクルの間に区画間に拡散させることができた。しかし、水と油の比率を調整し、熱サイクル変化の程度を最小限のものとすることによって、区画間の産物と基質の交換は最小限となり、遺伝子型と表現型のより緊密な連関がもたらされる。拡散速度は乳液混合物を改変することによって制御できるので、バッファー条件を乳化後に調整することがおそらく可能であり、それによって選択条件のより大きな制御が可能となろう（すなわち、酸若しくは塩基を添加してｐＨを調整する、又は基質若しくは阻害剤を添加して反応を開始／停止させる）。
【０２３９】
１５０μＬのＰＣＲ反応混液（ＳｕｐｅｒＴａｑバッファー、各０．５μＭのプライマー、各１００μＭのｄＮＤＰ、４００μＭのＡＴＰ、０．１ユニット／μＬのＴａｑポリメラーゼ、８ｘ１０５細胞／μＬのＱＬ１３８７／ｎｄｋ）を、２ｍＬの丸底生体試料凍結用バイアル瓶（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で一定に撹拌しつつ、４．５％  ｖ／ｖ  Ｓｐａｎ  ８０、０．４％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ８０及び０．０５％  ｖ／ｖ  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の存在下で、４５０μＬの油相（鉱油）に滴下（１滴／５秒）して添加する。水相を添加した後、撹拌をさらに５分間続ける。乳液の反応液のアリコート（１００μＬ）を薄壁ＰＣＲ試験管中に入れ、熱サイクルを上述のとおり行った。
【０２４０】
乳化後、増幅産物の回収を次のとおり行う。熱サイクルをかけた後、産物を２倍量のジエチルエーテルで抽出することによって回収し、ボルテックスにかけ、卓上微量遠心機で１０分間遠心する。増幅産物は前述のとおり分析する。
【０２４１】
実施例２３  バックグラウンドのキナーゼ活性の最小化
バックグラウンドのキナーゼ活性レベルは、上述のとおりＴａｑバッファー中で基質と共に大腸菌ＴＧ１細胞を乳化することによって測定する。大腸菌由来の天然のヌクレオシド二リン酸キナーゼは最初の変性の後でも十分な活性を保持しており、本発明者のアッセイでは著しいキナーゼ活性を示すことが見出されている。ｎｄｋ遺伝子を含むｐＵＣ１９発現プラスミドを大腸菌ＱＬ１３８７のｎｄｋ欠損株中に形質転換する。ｍｘ  ｎｄｋ（Ｈ１１７Ａ）の触媒作用をノックアウトした変異体と比較すると、ｎｄｋをそのノックアウト株から発現させた場合に、本発明者のアッセイではバックグラウンドのキナーゼ活性は無視できる程度のものである（増幅産物はアガロースゲル電気泳動では可視化できなかった）。
【０２４２】
実施例２４  乳液中での遺伝子型−表現型連関性の維持
ＮＤＰキナーゼの触媒作用をノックアウトした変異体（ＮＤＫ  Ｈ１１７Ａ）を野生型のＮＤＰキナーゼと等量で一緒に乳化する。ｎｄｋの不活性な変異体は増幅産物がより少ないことから区別されるが、それは、プライミング部位から下流のＯＲＦに隣接している５’領域及び３’領域がノックアウト変異体の構築の際に除去されているためである。本発明の乳化方法は、アガロースゲル電気泳動で測定した場合に、活性キナーゼの増幅の方に完全に偏った結果をもたらす。
【０２４３】
実施例２５  異種の細胞集団での並行遺伝子型分析方法
この手法では、対象の細胞、ＰＣＲ試薬その他、及びポリメラーゼの乳液中での区画化（ＷＯ９３／０３１５１号を参照）を行う。しかし、１つの細胞由来の遺伝子をＰＣＲアセンブリーにより連結する替わりに、１つの（若しくは複数の）ビオチニル化プライマーをストレプトアビジンで被覆したポリスチレンビーズ（若しくはプライマーをビーズ上に固定するその他の何らかの適切な方法）と共に用いる。このようにして、１つの細胞からのＰＣＲ断片が１個のビーズ上に移される。ビーズをプールし、特定の変異若しくは対立遺伝子の存在を、蛍光標識したプローブで調べ（「デジタルＰＣＲ」と呼ばれている）、ＦＡＣＳで計数する。マルチプレックスＰＣＲによって１０種若しくはおそらくそれ以上のマーカーを同時に調べることが可能である。単一のビーズはまた配列決定のために選別することができる。
【０２４４】
用途としては、例えば、無症候性腫瘍の診断が含まれ、この診断は正常細胞が大過剰の状態で非常に少数の変異細胞の検出が可能か否かにかかっている。細胞染色に対してのこの方法の利点は処理能力である。おそらく１０８−１０９個の細胞を同時に調べることができるであろう。
【０２４５】
実施例２６  ショートパッチＣＳＲ
本実施例は触媒活性若しくはプロセッシビティが低いポリメラーゼの選択に関する。区画化自己複製（ＣＳＲ）は、上述したとおり、明確に定められた選択条件への適応性の増大したポリメラーゼ変異体を選択する方法である。触媒活性の増大した変異体は、その選択条件下でより活性の低いものに対して選択上の利点を有する。しかし、多数の選択目的について（例えば、変化した基質特異性など）、新しい表現型への進化の経路の途中にある中間体は触媒活性が低下していることも起こりうる。例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの速度論の研究から、Ｅ７１０Ａなどの突然変異は、野生型基質（デオキシリボヌクレオチド）に対しての触媒速度の低下と親和性の低下を犠牲にして、リボヌクレオチドの親和性と取込みが増大したものであった（F. B. Perler, S. Kumar, H. Kong, Adv. in Prot. Chem. 48, 377-430 (1996)）。これに対応するＴａｑＤＮＡポリメラーゼＩの変異体であるＥ６１５Ａは、野生型ポリメラーゼよりも効率的にリボヌクレオチドをＰＣＲ産物中に取り込むことができる。しかし、野生型基質を用いると、アガロースゲル電気泳動で分析した場合にこの変異体は短い断片を合成できるにすぎず、完全長のＴａｑ遺伝子は合成できない。従って、このような突然変異をＣＳＲで選択することは困難であろう。別の選択実験は、β−グルクロニダーゼを進化させてβ−ガラクトシダーゼとするものであり、この実験では、所望の表現型は数ラウンドの選択後に得られるが、触媒活性は犠牲になっている。また、最初の何ラウンドかの選択で選択された変異体は、親の酵素のいずれでも利用できないようないくつかの異なる基質の変換を触媒することができるが、その触媒速度ははるかに低いことが見出されている（T. A. Steitz, J. Biol. Chem. 274, 17395-8 (1999)）。
【０２４６】
所望の表現型に至る進化の道筋で生ずる可能性のあるものなどの、低い触媒活性とプロセッシビティを有するポリメラーゼ変異体を選択することが可能であるか、という問題に対処するために、ＣＳＲの変法（調べようとしている遺伝子の小さな領域（「パッチ」）のみをランダム化して複製する）を用いる。この技法は「ショートパッチＣＳＲ」（ｓｐＣＳＲ）と呼ばれる。ｓｐＣＳＲを用いれば、活性若しくはプロセッシビティのより低いポリメラーゼでも、選択のラウンドの間に、活性若しくはプロセッシビティの高い変異体に対して与えられる選択上の有利性を低減させることによって、濃縮することができる。この方法は前述の区画化自己複製法に拡張しうるが、遺伝子全体が複製されないので、このショートパッチ法は、例えばあるタンパク質の特定のドメインをそのタンパク質の残りの部分とは独立に調べるためにも有用である。
【０２４７】
ある遺伝子中に局部的に多様性を導入するためには多数の方法があり、そのようなものとしては、変異性ＰＣＲ（上述のＴａｑポリメラーゼライブラリーについて述べたのと同様に、マンガン若しくは合成塩基を用いる）、ＰＣＲシャフリング（C. A. Brautigam, T. A. Steitz, Curr. Opin. Struct. Biol. 8, 54-63 (1998); Y. Li, S. Korolev, G. Waksman, EMBO J. 17, 7514-25 (1998)）、カセット突然変異誘発（E. Bedford, S. Tabor, C. C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,479-84 (1997)）、及び縮重オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発（Y. Li, V. Mitaxov, G. Waksman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9491-6 (1999); M. Suzuki, D. Baskin, L. Hood, L. A. Loeb, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9670-5 (1996)）とその変法、例えば突出末端（sticky feet）突然変異誘発（J. L. Jestin, P. Kristensen, G. Winter, Angew. Chem. Int. Ed. 38, 1124-1127 (1999)）、並びにプラスミド全体の増幅によるランダムな突然変異誘発（T. Oberholzer, M. Albrizio, P. L. Luisi, Chem. Biol. 2, 677-82 (1995)）がある。コンビナトリアルアラニンスキャンニング（A. T. Haase, E. F. Retzel, K. A. Staskus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4971-5 (1990)）は、どのアミノ酸残基が機能的に重要であるかを決定するための変異体のライブラリーを作製するために用いることができる。
【０２４８】
ＤＮＡポリメラーゼＩに関する研究から得られた構造データ（M. J. Embleton, G. Gorochov, P. T. Jones, G. Winter, Nucleic Acids Res. 20, 3831-7 (1992)）、配列アラインメント（D. S. Tawfik, A. D. Griffiths, Nat. Biotechnol. 16, 652-656 (1998)）、及び生化学的データからは、ヌクレオチド結合と触媒作用に関与する遺伝子の領域が明らかになっている。標的とされうるいくつかの領域としては、領域１から６があり、それは（D. S. Tawfik, A. D. Griffiths, Nat. Biotechnol. 16, 652-656 (1998)）中に述べられているとおりである（領域３、４及び５はまたそれぞれＴａｑＤＮＡポリメラーゼＩのモチーフＡ、Ｂ及びＣと呼ばれている）。その他の標的となりうる領域はいくつかの異なった種を通じて保存されている領域であり、それらは構造データによって、ヌクレオチド基質との接触に関連している、又は触媒作用に関与している、又は活性部位に近接している、あるいはポリメラーゼ機能若しくは基質結合に重要なその他の領域であると関係づけられた領域である。
【０２４９】
１ラウンドの選択の間に、各ライブラリーの変異体は多様性のある領域のみの複製が必要とされる。このことは、ＰＣＲ反応において多様化される領域に隣接するプライマー（フランキングプライマー）を用いることによって容易に達成しうる。ＣＳＲでの選択は本質的には既に述べたとおり行われる。ＣＳＲ選択の後、多様化され複製された短い領域が、今度は、適切に場所を定めた制限酵素切断部位、又はＰＣＲシャフリング若しくはＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発などのＰＣＲ組換え法のいずれかを用いて、最初の遺伝子中（又は別の遺伝的フレームワーク、例えば親の遺伝子の変異体のライブラリー、関連遺伝子、その他）に再導入される。ｓｐＣＳＲのサイクルは多数回反復することができ、多重領域をフランキングプライマーを用いて同時に若しくは反復的に標的として、個々の領域を別々に若しくはまとめて増幅しうる。
【０２５０】
後半のステージでの選択においてストリンジェンシーを増加させるために、ｓｐＣＳＲを、フランキングプライマーによって定められる複製配列の長さを完全長ＣＳＲまで増大させることによって簡単に調整することができる。事実、プロセッシビティのないものを選択するためには、複製される部分配列を、コード遺伝子を超えてベクター全体まで、ｉＰＣＲ（逆ＰＣＲ）と類似の方法を用いて伸長させることが有益であろう。
【０２５１】
ｓｐＣＳＲは活性若しくはプロセッシビティが低いポリメラーゼ変異体を求める場合のみならず、タンパク質の別々の領域を、その変異能についてどのアミノ酸残基が機能的に重要であるかを決定するために、例えばコンビナトリアルアラニンスキャンニング（A. T. Haase, E. F. Retzel, K. A. Staskus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4971-5 (1990)）と併せてマッピングする際にも、完全長ＣＳＲに比べて有利である。このような情報は、おそらく後の段階で行う半合理的な（ｓｅｍｉｒａｔｉｏｎａｌ）手法、すなわち、核となるポリメラーゼ活性に関与しない残基／領域に多様性をもたらす標的とするために有用であろう。さらにｓｐＣＳＲは、ポリメラーゼ間にポリペプチド部分配列を移植するために用いることができる（免疫グロブリンにＣＤＲを移植するのと同様である）。部分配列同士を単純に交換した場合、立体構造の衝突によって活性があるポリメラーゼから乏しいものへ変化するが、この場合に部分配列を機能を有するように組み込むには「再構成（reshaping）」が必要であろう。再構成は完全長のＣＳＲ（例えば、既にあるランダムな変異体のライブラリーに由来するもの）又は二次領域（抗体中の「補助的領域（vernier zone」）を標的としたｓｐＣＳＲのいずれかを用いて行うことができる。
【０２５２】
ショートパッチはまた、既にあるポリメラーゼ遺伝子への伸長としてＮ末端若しくはＣ末端のいずれかに、又はその遺伝子の内部挿入として配置させることができる。このような表現型を改変する伸長及び挿入の先例は自然界に存在する。例えば、Ｔ５  ＤＮＡ  ｐｏｌのＣ末端の伸長及びＴ７  ＤＮＡ  ｐｏｌ中へのチオレドキシン結合性の挿入はこれらの酵素のプロセッシビティに決定的に重要であり、それらの酵素が大きな（＞３０ｋｂ）Ｔファージゲノムを効率的に複製することを可能としている。Ｎ末端若しくはＣ末端の伸長は他の酵素でも活性の増強が見られている。
【０２５３】
実施例２７  クレノウ断片を用いる低温ＣＳＲ
クレノウ断片を大腸菌ゲノムＤＮＡから発現ベクターｐＡＳＫ７５中にクローニングし（Ｔａｑと同様に行う）、大腸菌ＤＨ５αＺ１株中で発現させた（Lutz, R.及びBujard, H. (1997), Nucleic Acids Res. 25, 1203）。細胞を洗い、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５中に再懸濁した。再懸濁した細胞２×１０８個（２０μＬ）を２００μＬの低温ＰＣＲバッファー（ＬＴＰ）（Iakobashvili, R.及びLapidot, A. (1999), Nucleic Acids Res., 27, 1566）中に添加し、既に報告されているとおり乳化した（Ghadessyら, (2001), PNAS, 98, 4552）。ＬＴＰは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５．５Ｍ  Ｌ−プロリン、１５％  ｗ／ｖ  グリセロール、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋適切なプライマー（プロリンは融解温度を低下させるのでプライマーは４０量体以上の長さである必要がある）、及びｄＮＴＰであり、報告されているとおり乳化した。低温ＰＣＲサイクルは７０℃１０分間の後、７０℃３０秒間、３７℃１２分間を１サイクルとして５０サイクル行った。水相を報告されているとおり抽出し、精製した選択産物を報告されているとおり再増幅した（Ghadessyら, (2001), PNAS, 98, 4552）。
【０２５４】
上述の明細書中で言及した刊行物は全て本明細書中に参照により組み入れる。当業者であれば、本発明の範囲と精神から逸脱することなく、本明細書中で説明した方法及び系に種々の改変と変化を加えうることは理解できると考えられる。本発明は特定の好ましい実施形態との関連で説明されてはいるが、特許請求の範囲に記載されている本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきものではないことは理解されるべきである。事実、分子生物学の分野若しくは関連分野の当業者であれば明白な、本発明を実施するための説明した方法の種々の改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０２５５】
【表３】
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2007190027.tif 000005
【０２５６】
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【図面の簡単な説明】
【０２５７】
【図１】図１Ａは、本発明の方法の１実施形態を示したもので、自己進化型のポリメラーゼの選択に適用した場合、その方法では遺伝子のコピー数は酵素回転と関連している。  図１Ｂは、区画化された自己複製（ＣＳＲ）の一般的スキームを示したものであり、１）様々なポリメラーゼ遺伝子の集団をクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させる。球は活性のあるポリメラーゼ分子を示す。２）ポリメラーゼ及びコードしている遺伝子を含む細菌細胞をフランキングプライマー及びヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含有する反応バッファー中に懸濁し、水性の区画内に分離（分割）させる。３）該ポリメラーゼ酵素及びコードしている遺伝子は細胞から放出され自己増幅を進めることが可能となる。活性がほとんどないポリメラーゼ（白の６角形）ではコードしている遺伝子の複製を行うことができない。４）「子孫」のポリメラーゼ遺伝子が放出され、再度多様化されて別のＣＳＲのサイクルのために再クローニングされる。
【図２】図２は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現している大腸菌を含有する熱安定性乳液の水性区画を、熱サイクルの前（Ａ、Ｂ）及び後（Ｃ）の光学顕微鏡像で示したものである。（Ａ，Ｂ）は同一フレームである。（Ａ）はＧＦＰ蛍光を５３５ｎｍで画像化したものであり（Ｂ）は区画内の細菌細胞を可視光で可視化したものである。（Ａ）での蛍光を発する細菌のぼけは露光中のブラウン運動によるものである。レーザー光の回折によって測定した区画の平均の大きさは下部に示している。
【図３】図３Ａは、乳液区画間の交叉を示している。２種類の標準的なＰＣＲ反応、それらは鋳型のサイズ（ＰＣＲ１（０．９ｋｂ）、ＰＣＲ２（０．３ｋｂ））及びＴａｑの存在（ＰＣＲ１：＋Ｔａｑ、ＰＣＲ２：酵素なし）の相違があるものであるが、それらを単独で又は組み合わせて増幅を行う。溶液中で組み合わせる場合には、双方の鋳型が増幅される。混合する前に別々に乳化した場合には、ＰＣＲ１のみが増幅される。Ｍ：ΦＸ１７４ＨａｅＩＩＩマーカー  図３Ｂは、乳液区画間の交叉を示している。野生型Ｔａｑポリメラーゼ（２．７ｋｂ）若しくはＴａｑポリメラーゼＳｔｏｆｆｅｌ断片（該バッファー条件下では活性がほとんどない）（１．８ｋｂ）を発現する細菌細胞を乳化前に１：１で混合する。溶液中では、短いＳｔｏｆｆｅｌ断片は優先的に増幅される。乳液中では、野生型Ｔａｑ遺伝子が主として増幅され、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片（矢印）の増幅は弱いものにすぎない。Ｍ：λＨｉｎｄＩＩＩマーカー
【図４】図４は、自己進化型ポリメラーゼの選択に適用した場合の本発明の方法の１実施形態の詳細を示したものである。
【図５】図５は、新規の又は正常ではない基質の取込みについて選択するための本発明の方法の１実施形態の詳細を示したものである。
【図６】図６は、本発明の方法を用いた、（分子間）触媒活性を有するＲＮＡの選択を示している。
【図７】図７はＴａｑ−ＤＮＡ複合体のモデルを示している。
【図８】Ａ：共同的ＣＳＲ反応の全体図。    ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ｎｄｋ）はプラスミドから発現され、デオキシヌクレオシド二リン酸（Ｔａｑポリメラーゼの基質ではない）をデオキシヌクレオシド三リン酸に変換する。ｎｄｋが十分な量の基質を産生させると直ちにＴａｑはｎｄｋ遺伝子を複製することができる。  Ｂ：野生型ｎｄｋ（０．８ｋｂ）若しくは不活性な末端切断断片（０．５ｋｂ）を発現している細菌細胞を乳化前に１：１で混合する。溶液中では、より短い末端切断断片が優先的に増幅される。乳液中では、野生型ｎｄｋ遺伝子が主として増幅され、末端切断断片（矢印）の増幅は弱いものにすぎず、このことは、乳液中では、基質を産生している、活性のあるｎｄｋ遺伝子のみが増幅されることを示している。Ｍ：ＨａｅＩＩＩΦＸ１７４マーカー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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