(57)【要約】【課題】蛍光性スルホインドシアニン染料の合成に有用なインドレニン核を有する新規中間体を提供すること。【解決手段】蛍光性スルホインドシアニン染料の合成に有用なインドレニン核を有する新規中間体が開示される。このような中間体を用いて合成された染料は、アミン又はヒドロキシ含有部分で標的分子と共有結合的に結合する反応基を含有しない。むしろ、上記中間体は酵素基質又は特異的結合対のメンバーと結合する。また、チラミド含有スルホインドシアニン染料を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルホインドシアニン染料を合成するための、インドレニン核を有するが、標的分子に共有結合的に結合する反応基を含まない化合物であって、下記構造を有する化合物：
【化１】
2007016038.tif 000009
（式中、ＸはＣＨ3−Ｃ−ＣＨ3、Ｏ及びＳからなる群から選択され；
Ｚはインドレニン核がＡに結合するための結合基であり；及び
Ａは酵素基質及び特異的結合対のメンバーからなる群から選択される）
【請求項２】
ＸがＣＨ3−Ｃ−ＣＨ3であり、Ｚが−（ＣＨ2）5−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2）2−であり、Ａがフェノール基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
以下の第一の化合物、第二の化合物及び試薬を弱塩基溶媒中で還流下に少なくとも１時間反応させる、標的分子に共有結合的に結合する反応基を含まないスルホインドシアニン染料の製造方法。
ａ）インドレニン核を有する第一の化合物であり、下記構造を有する化合物 ；
【化２】
2007016038.tif 000010
（式中、ＸはＣＨ3−Ｃ−ＣＨ3、Ｏ及びＳからなる群から選択され；
Ｚはインドレニン核がＡに結合するための結合基であり：及び
Ａは酵素基質及び特異的結合対のメンバーからなる群から選択される）
ｂ）第一の化合物と、同一又は異なる、インドレニン核を有する第二の化合物；
ｃ）第一の化合物を第二の化合物に結合するための試薬。
【請求項４】
ＸがＣＨ3−Ｃ−ＣＨ3であり、Ｚが−（ＣＨ2）5−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2）2−であり、Ａがフェノール基である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
Ａがフェノール基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ａがフェノール基である、請求項３に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光性のスルホインドシアニン(sulfoindocyanine)染料に関し、更に詳細にはインドレニン核を有する化合物、及びスルホインドシアニン染料を製造するための、このような化合物の利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体、ＤＮＡプローブ、生化学的類似体、脂質、薬剤、サイトカイン、細胞及びポリマーとの蛍光標識の利用は、一部は新規な蛍光標識試薬の有効性のために近年急速に拡大した。
Mujurndar ら，Bioconjugate Chemistry，Vol.4，pages 105-111（1993）は、スルホインドシアニン染料をベースとする一連の蛍光標識試薬を開示している。それらはスクシニミジル(succinimidyl)エステル反応基を含み、抗体、アビジン、ＤＮＡ、脂質、ポリマー、及び他のアミノ基含有物質と容易に結合し得る。上記スルホインドシアニン染料は、一般に、発蛍光団の後に活性化されるカルボキシルアルキル基を有する４級化インドレニン核が同一の（又は異なる）第２のインドレニン核と３、５又は７個の結合したメチン原子を通じて結合することにより形成される。
Chaoら，Cytometry，Vol.23，pages 48-53（1996）は、蛍光性セイヨウワサビパーオキシダーゼ基質、Cy3.29及びシグナル増幅系に基づく酵素におけるその利用を開示している（触媒されたレポータ一蒸着(catalysed reporter deposition,CARD)）。Cy3.29チラミドは、スクシンイミドエステル中間体を用いて合成される。
Southwick らによって１９９１年１月１日に発行された米国特許第4,981,977号明細書は、カルボン酸基を含む蛍光性シアニン染料とその中間体とを開示している。
Waggonerらによって１９９３年１２月７日に発行された米国特許第5,268,486号明細書は、アリールスルホネートシアニン染料を用いた、物質の標識及び検出法を開示している。
同様に、Waggonerらによって１９９６年１月２３日に発行された米国特許第5,486,616 号明細書は、アリールスルホネートシアニン染料を用いた、物質の標識及び検出法を開示している。
Ohnoらによって１９９２年４月２１日に発行された米国特許第5,106,990 号明細書は、染料としてのインドレニン誘導体を開示している。
Ruthによって１９９０年８月１４日に発行された米国特許第4,948,882 号明細書は、一本鎖標識オリゴヌクレオチド、反応性モノマー、及び合成方法を開示している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、スルホインドシアニン染料を合成するためのインドレニン核を有する化合物であって、下記構造を有する化合物に関する。
【化１】
2007016038.tif 000002
（式中、ＸはＣＨ3−Ｃ−ＣＨ3、Ｏ及びＳからなる群から選択され；
Ｚはインドレニン核がＡに結合するための結合基であり；及び
Ａは酵素基質及び特異的結合対のメンバーからなる群から選択される）
【０００４】
第２の態様において、本発明は下記構造を有するスルホインドシアニン染料に関する。
【化２】
2007016038.tif 000003
（式中、ｍは１、２又は３である。）
【０００５】
第３の態様において、本発明は以下の第一の化合物、第二の化合物及び試薬を弱塩基溶媒中で還流下に少なくとも１時間反応させる、スルホインドシアニン染料の製造方法に関する。
ａ）インドレニン核を有する第一の化合物であり、下記構造を有する化合物；
【化３】
2007016038.tif 000004
（式中、ＸはＣＨ3−Ｃ−ＣＨ3、Ｏ及びＳからなる群から選択され；
Ｚはインドレニン核がＡに結合するための結合基であり：及び
Ａは酵素基質及び特異的結合対のメンバーからなる群から選択される）
ｂ）第一の化合物と、同一又は異なる、インドレニン核を有する第二の化合物；
ｃ）第一の化合物を第二の化合物に結合するための試薬。
【０００６】
第４の態様において、本発明はインドレニン核を有する化合物を用いて製造されたスルホインドシアニン染料に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、アミン−又はヒドロキシ−含有部位等の部位で標的分子に共有結合的に結合する反応基を含まないスルホインドシアニン染料の合成に有用なインドレニン核を有する新規中間体に関する。むしろ、上記中間体は酵素基質又は特異的結合対のメンバーと結合する。
特に、上記中間体はインドレニン核を有する化合物であり、スルホインドシアニン染料を合成するために用いられ、上記化合物は下記構造を有する；
【化４】
2007016038.tif 000005
（式中、ＸはＣＨ3−Ｃ−ＣＨ3、Ｏ及びＳからなる群から選択され；
Ｚはインドレニン核がＡに結合するための結合基であり；及び
Ａは酵素基質及び特異的結合対のメンバーからなる群から選択される）。
【０００８】
ＺをＡに結合するための結合基の例としては、エーテル基、エステル、アミド、チオエーテル（スルフィド）、スルホンアミド、尿素、チオ尿素、ウレタン又はリン酸エステル等の置換基（これらの置換基に限定されない）で置換されているか又は置換されていない、−（ＣＨ2）5−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2）2−、アルキル、アルケニル又はアルキニル基等が挙げられるがこれらに限定されない。
好ましい結合基は、−（ＣＨ2）5−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2）2−である。
【０００９】
適当な酵素基質は、チラミン等のフェノール基(phenolic groups)、チオリン酸塩、又は３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等の他の基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１０】
特異的な結合対のメンバーとしては、免疫性及び非免疫性のタイプが挙げられる。免疫性特異的結合対としては、抗原／抗体系又はハプテン／抗ハプテン系が挙げられる。ポリクローナルであるか、モノクローナルであるか、又はそれらの免疫反応性断片であろうと、抗体メンバーは当業者に知られた通常の方法で製造することができる。このような断片は、Ｆｃ部分を欠いている断片として定義される、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）2等のＦａｂタイプ断片であってもよく、そのままの抗体のＨ鎖に結合したジスルフィド結合の還元的切断によって得られる、いわゆる「半分子」（half-molecule）断片であってもよい。特異的結合対の抗原メンバーがハプテン等の免疫原性でない場合、それを免疫原性にするためにキャリアー蛋白質に共有結合的に結合することができる。
非免疫結合対としては、２成分が相互に自然の親和性を有するが抗体でない系が挙げられる。模範的な非免疫結合対は、ビオチン−アビジン又はビオチン−ストレプタビジン、葉酸−葉酸結合蛋白質、相補的な核酸プローブ等である。
【００１１】
本発明の方法は、以下の第一の化合物、第二の化合物及び試薬を弱塩基溶媒中で還流下に少なくとも１時間反応させることを含む。
ａ）インドレニン核を有する第一の化合物であり、下記構造を有する化合物；
【化５】
2007016038.tif 000006
（式中、ＸはＣＨ3−Ｃ−ＣＨ3、Ｏ及びＳからなる群から選択され；
Ｚはインドレニン核がＡに結合するための結合基であり：及び
Ａは酵素基質及び特異的結合対のメンバーからなる群から選択される）
ｂ）第一の化合物と、同一又は異なる、インドレニン核を有する第二の化合物；
ｃ）第一の化合物を第二の化合物に結合するための試薬。
【００１２】
以下の実施例に示すように、対称的な染料は、インドレニン核を有する同一の化合物と、化合物を結合するための試薬とを、弱塩基溶媒中で還流下に少なくとも１時間反応させることにより合成される。上記化合物の構造は上記に示される。
非対称的な染料は、第２化合物が第１化合物と異なることを除き、対称的な染料と同様の方法で合成される。例えば、第２化合物は以下の構造を有する。
【化６】
2007016038.tif 000007
（式中、Ｒはスルホネート又は水素であり、Ｚ及びＡは上述した通りであり、少なくとも１つのＺ又はＡは第１化合物と異なるものである）
モノマーを結合するのに適した試薬は、少なくとも３個の炭素原子のポリメチン鎖の生成に有用なものである。好ましいポリメチン鎖は、３、５又は７個の結合したメチン炭素原子を有する。適当な試薬の例は、トリエチルオルトホルメート、及び１，３，３−トリメトキシプロペンである。
「弱塩基」なる用語は、約８〜約１０の範囲のｐＨを意味するものとする。弱塩基溶媒の例としては、ピリジン又はアルコール、又は酢酸カリウムを溶解することのできる他の適当な溶媒が挙げられる。
本発明の方法を用いて製造されたチラミド含有スルホインドシアニン染料は、catalysed reporter deposition(CARD)と呼ばれる、酵素をベースとするシグナル増幅系においてレポーター基質(reporter substrate)として用いられる。上記ＣＡＲＤ系は１９９３年３月２３日にBobrowらによって発行された米国特許第5,196,306 号明細書の主題を構成し、上記明細書の開示は参考文献として本明細書に組み込まれる。このような染料のＣＡＲＤ系と関連した使用はChaoら，Cytometry，23:48-53(1996)に開示されている。
上述した方法を用いて合成することができるチラミド含有スルホインドシアニン染料の構造は以下の構造を含む。
【化７】
2007016038.tif 000008
（式中、ｍは１、２又は３である）
本発明の方法を用いて製造されるスルホインドシアニン染料も含まれる。
以下の実施例は本発明を説明することを意図する。これらの例は、図１にも示される。
【００１３】
実施例１
a)２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸，カリウム塩（Ｉ）
酢酸（３００ｍｌ）中のｐ−ヒドラジノベンゼンスルホン酸（１００ｇ、0.53モル）及び３−メチル−２−ブタノン（１６８ｍｌ、1.6モル）の混合物を機械的に攪拌しながら３時間還流して加熱し、反応混合物を室温まで冷却し攪拌を一晩続け、ろ過してピンク色の固体を得、ついでメタノール（７５０ｍｌ）で再結晶し、イソプロパノール（４００ｍｌ）中の飽和水酸化カリウム溶液を加えて沈殿させた。混合物をろ過し、真空オーブンで乾燥し、（Ｉ）を黄／茶色のケーキとして得、乳鉢及び乳棒で微粉に砕いた。
1H NMR(D2O)δ7.84(s，1H,芳香族4-H)，7.80(s，1H,芳香族6-H)，7.55(d,1H,芳香族7-H)，2.33(s，3H，2- メチル)，1.32(s，6H，3,3-gem−ジメチル)
【００１４】
b)６−ブロモ−Ｎ−［２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル］−ヘキサンアミド(II)
６−ブロモヘキサン酸（4.51ｇ、23.1ミリモル）のアセトニトリル溶液（５０ｍ１）溶液にＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネート（6.5ｇ、２５ミリモル）及びトリエチルアミン（3.2ｍｌ、２３ミリモル）を加えた。上記溶液を室温で４時間攪拌し、チラミン（3.2ｇ、２３ミリモル）を加え、室温で一晩攪拌を続け、真空下濃縮し酢酸エチル（１００ｍｌ）に再溶解し、水（６×５０ｍｌ）及び飽和塩化ナトリウム溶液（２×２５ｍｌ）で洗浄した。上記酢酸エチル溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下に濃縮し、明るい茶色のガムを得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、６−ブロモ−Ｎ−［２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル］−ヘキサンアミド(II)を明るい褐色のシロップとして得た。
1H NMR(CDCl3)δ7.5(br，1H，OH)，7.0(d，2H，芳香族3.5)，6.8(d，2H，芳香族2,6)，5.8(br t，1H，NH)，3.5(m，2H，CH2N)，3.3(t，2H，CH2Br)，2.7(t,2H，CH2Ph)，2.1(t，2H，αCH2)，1.9(m，2H,δCH2)，1.6(m，2H γCH2)，1.4(m,2H，βCH2)
【００１５】
c)１−［Ｎ−［２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル］−ヘキサンアミド］
−２，３，３−トリメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム，分子内塩(III)
１，２−ジクロロベンゼン（２０ｍｌ）中の６−ブロモ−Ｎ−［２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル］−ヘキサンアミド(II)（1.7ｇ、5.3ミリモル）及び２，３，３−トリメチルインドレニニウム−５−スルホネート（Ｉ）（1.2ｇ、4.2ミリモル）の懸濁液を還流下に撹拌しながら１６時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、ジクロロベンゼンをデカントし、残留物を２−プロパノール（４×２０ｍｌ）で洗浄し、乾燥して紫色のガラス状固体を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、１−［Ｎ−［２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル］−ヘキサンアミド］−２，３，３−トリメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム，分子内塩(III)を得た。
1H NMR(CD3OD)δ7.8(m，1H，4-H)，7.6(m，1H，6-H)，7.5(m，1H，7-H)，3.5(t，2H，εCH2)，3.3(m，CHD2OD + CH2NH)，2.7(m，2H，CH2Ph)，2.2(t，2H，αCH2），1.6(m，6H,β，γ，δCH2)，1.4(s，3H，3-CH3)，1.3(s，3H，3-CH3)
【００１６】
d)１−［［（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル］−ヘキサンアミド］−２−［３−［１−［Ｎ−［２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル］−ヘキサンアミド］−１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−５−スルホ−２Ｈ−インド−ル−２−イリデン］−１−プロペニル］−３，３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム，分子内塩(IV)
１−［Ｎ−［２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル］−ヘキサンアミド］−２，３，３−トリメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム，分子内塩(III)（５８ｍｇ、0.12ミリモル）の溶液をピリジン（３ｍｌ）中で還流下に加熱し、トリエチルオルトホルメート（８０μｌ、0.48ミリモル）を４等分してシリンジを通して１時間かけて加えた。次いで、紫色の懸濁液を還流下に更に１時間加熱し、室温まで冷却しジエチルエーテル（１５ｍｌ）を加え、粗生成物を紫色の固体として沈殿させた。次いで、上記固体を付加的なジエチルエーテル（５×１５ｍｌ）で洗浄し、ＨＰＬＣで精製し分離された生成物をAG50W-X4,200-400 メッシュ，K+型の0.4×６ｃｍのカラムに通し、蒸発させ、(IV)を紫色の固体として得た。
1H NMR(CD3OD)δ8.3，(br t，1H，スペーサーの２位)，7.9(m，4H，4,7-H),7.3(m，2H，6-H)，7.0(d，4H，3,5-H，チラミド)，6.5(d，4H，2,6-H，チラミド),6.3(t，2H,スペーサーの1,3位)，4.0(m，4H，CH2N)，3.3(m，4H，CH2NH)，2.5(m，4H，CH2Ph)，2.0(m，4H，CH2CO)，1.0-1.8(m，24H，gem-ジメチル+β，γ，δCH2)．λmax (H2O)=550，517，278 nm.
【００１７】
実施例２
１−［［２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル］−ヘキサンアミド］−２−［３−［１−［Ｎ−［２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル］−ヘキサンアミド］−１，３−ジヒドロ−３，３−ジメチル−５−スルホ−２Ｈ−インドール−２−イリデン］−１，３−ペンタジエニル］−３，３−ジメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム，分子内塩（Ｖ）
１，３，３−トリメトキシプロペン（0.6ｍｌ）を４等分（各0.15ｍｌ）して３０分間隔で加えながら、１−［Ｎ−［２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル］−ヘキサンアミド］−２，３，３−トリメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム，分子内塩(III)（１ｇ、2.1ミリモル）、酢酸カリウム（１１０ｍｇ、1.05ミリモル）及びメタノール（５ｍｌ）を還流した。最後の１，３，３−トリメトキシプロペンを添加した後、混合物を更に３０分間還流し（合計反応時間は2.5時間）、酢酸カリウムを溶液からろ過し、ろ液を一晩４℃に冷却し、得られた染料（Ｖ）をろ過し、２−プロパノールで洗浄し、真空下で乾燥した。
【００１８】
実施例３
a)Ｎ−１−ビオチニル−Ｎ−５−（６−ブロモヘキサノイル）−ペンタンジアミン(VI) ビオチンカダバリン（２１ｍｇ、0.064ミリモル）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（１０μＬ、0.071ミリモル）及び６−ブロモヘキサノイルクロライド（１１μＬ、0.071ミリモル）をシリンジを通して加えた。室温で一晩攪拌した後、ＤＭＦを真空下に蒸発させ、Ｃ８逆相クロマトグラフィーで精製し、(VI)を白色固体として得た。
1H NMR(CD3OD)δ7.9(br t，NH)，4.4(m，1H，ビオチンメチン)，4.2(m，1H,ビオチンメチン)，3.4(t，2H，CH2-Br)，3.2(t，1H，CH-S，3.1(m,4H，CH2-NH),2.6，2.8(m，2H，CH2-S)，2.1(m，CH2-CO)，1.1-1.8(m，18H,分子内CH2)
【００１９】
b)１−［Ｎ−［ビオチニルアミノフェニルヘキサンアミド］−２，３，３−トリメチル−５−スルホ−３Ｈ−インドリウム、分子内塩（VII）
１，２−ジクロロベンゼン（１ｍｌ）中のＮ−１−ビオチニル−Ｎ−５−（６−ブロモヘキサノイル）−ペンタンジアミン(VI)（２４ｍｇ、0.047ミリモル）及び２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−５−スルホン酸、カリウム塩（Ｉ）の懸濁液を、１１５℃まで加熱し、窒素雰囲気下で１６時間攪拌した。懸濁液を室温まで冷却し、１，２−ジクロロベンゼンをデカントし、残留物を２５％メタノール／水に溶解し、Ｃ８逆相クロマトグラフィーで精製し、（VII）をピンクの固体として得た。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、インドレニン核を有する化合物の合成及びスルホインドシアニン染料の合成におけるその利用を示す。
【図１】
2007016038.tif 000011