(57)【要約】【課題】測定対象溶液の紫外吸収スペクトルから測定対象溶液中のデオキシヌクレオチド等の濃度を直接算出する。【解決手段】各デオキシヌクレオチドの水溶液について、デオキシヌクレオチドの濃度と、２２０ｎｍ〜３００ｎｍにおけるサンプリング幅１ｎｍ単位での紫外吸光度との関係をＰＬＳ回帰分析することで、測定対象溶液の紫外吸収スペクトルから測定対象溶液中の各々のデオキシヌクレオチドの濃度を直接算出できることを見出した。これはオリゴマーやＤＮＡ１本鎖、ＤＮＡ２本鎖であっても適用でき、それらの各濃度が算出できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド又はそのオリゴマー、デオキシヌクレオシド、ＲＮＡ、ＲＮＡ断片、ヌクレオチド又はそのオリゴマー、ヌクレオシド、及び核酸塩基のうちの何れかを有する溶液の、各溶質の濃度を測定する方法であって、
濃度を算定すべき溶質の全てについて、各々濃度既知の複数個の標準溶液の紫外吸収スペクトルを所定の波長帯域において測定し、
各波長における吸光度を説明変数、各溶質の濃度を目的変数として、ＰＬＳ回帰分析により回帰係数を算出し、
測定対象溶液の紫外吸収スペクトルを前記波長帯域において測定し、前記算出した回帰係数に基づき、各溶質の濃度を算出することを特徴とする核酸及びその構成要素の濃度測定方法。
【請求項２】
前記各標準溶液の紫外吸収スペクトルを複数個のｐＨ下において測定し、それら全体をＰＬＳ回帰分析により算出した回帰係数に基づいて、前記測定対象溶液の前記ｐＨ毎の紫外吸収スペクトルから、前記測定対象溶液の各溶質の濃度を算出することを特徴とする請求項１に記載の核酸及びその構成要素の濃度測定方法。
【請求項３】
前記各標準溶液の紫外吸収スペクトルを所定の電界を印加した場合及びしない場合において測定し、それら全体をＰＬＳ回帰分析により算出した回帰係数に基づいて、前記測定対象溶液の前記所定の電界を印加した場合及びしない場合の紫外吸収スペクトルから、前記測定対象溶液の各溶質の濃度を算出することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の核酸及びその構成要素の濃度測定方法。
【請求項４】
前記各標準溶液の紫外吸収スペクトルを所定の複数の温度において測定し、それら全体をＰＬＳ回帰分析により算出した回帰係数に基づいて、前記測定対象溶液の前記複数の温度での紫外吸収スペクトルから、前記測定対象溶液の各溶質の濃度を算出することを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の核酸及びその構成要素の濃度測定方法。
【請求項５】
二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド又はそのオリゴマー、デオキシヌクレオシド、ＲＮＡ、ＲＮＡ断片、ヌクレオチド又はそのオリゴマー、ヌクレオシド、及び核酸塩基のうちの何れかを有する溶液の、各溶質の濃度を測定する装置であって、
所定範囲の紫外吸収スペクトルを測定する手段と、
濃度既知の複数個の標準溶液の、当該紫外吸収スペクトルの各波長における吸光度を説明変数、各溶質の濃度を目的変数としてＰＬＳ回帰分析を実行する手段と、
測定対象溶液の紫外吸収スペクトルと、前記ＰＬＳ回帰分析により得られた回帰係数とから測定対象溶液中の各溶質の濃度を算出する手段とを有すること
を特徴とする核酸及びその構成要素の濃度測定装置。
【請求項６】
所定範囲の紫外吸収スペクトルを測定する手段と組み合わせて、対象試料に所定の電界を印加する手段を有し、
前記ＰＬＳ回帰分析を実行する手段においては、印加した電界ごとに、濃度既知の複数個の標準溶液の、当該紫外吸収スペクトルの各波長における吸光度を説明変数、各溶質の濃度を目的変数としてＰＬＳ回帰分析を実行することを特徴とする請求項５に記載の核酸及びその構成要素の濃度測定装置。
【請求項７】
所定範囲の紫外吸収スペクトルを測定する手段と組み合わせて、対象試料を所定の複数の温度に保つ手段を有し、
前記ＰＬＳ回帰分析を実行する手段においては、各温度ごとに、濃度既知の複数個の標準溶液の、当該紫外吸収スペクトルの各波長における吸光度を説明変数、各溶質の濃度を目的変数としてＰＬＳ回帰分析を実行することを特徴とする請求項５又は請求項６に記載の核酸及びその構成要素の濃度測定装置。
【請求項８】
請求項５乃至請求項７のいずれか１項に記載の核酸及びその構成要素の濃度測定装置をその内部構成に含んだ、核酸及びその誘導体の合成装置。
【請求項９】
核酸及びその誘導体の合成方法として、ＰＣＲを用いる請求項８に記載の核酸及びその誘導体の合成装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸及びその誘導体の合成装置であって、
所望の増幅段において、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の核酸及びその構成要素の濃度測定方法を実施可能として、各増幅段ごとの反応系中の複数の化学種の各濃度を測定可能としたことを特徴とするリアルタイムＰＣＲ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡその他のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド等の溶液或いは混合溶液について、各溶質の濃度を直接測定する方法に関する。本発明は、測定すべき全ての溶質について標準濃度サンプルの紫外吸収スペクトルをＰＬＳ回帰分析することにより決定した回帰係数に基づき、測定対象溶液の紫外吸収スペクトルから、各溶質の濃度を決定するものである。
【背景技術】
【０００２】
紫外吸収スペクトルから核酸溶液の濃度を測定する方法は、例えば非特許文献１を始め、種々提案されている。これは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基配列又は塩基数が既知である場合に、波長２６０ｎｍにおける吸光度と、各塩基のモル吸光係数からランバート・ベールの式を用いて濃度を求めるものである。
【０００３】
一方、近赤外吸収スペクトルから、ＰＬＳ回帰分析を用いて成分分析する方法が非特許文献２及び３のように広く用いられている。ＰＬＳ（部分最小二乗法）回帰分析は、主成分回帰を拡張したものであり、統計数学における正準相関分析と同様の概念である。説明変数Ｘと目的変数Ｙとから、各々ローディングによってＸ側スコア（主成分）とＹ側スコア（主成分）とを直交分解により求め、それらＸ側スコア（主成分）とＹ側スコア（主成分）の回帰係数を導くものである。
【非特許文献１】G. H. Beaven, E. R. Holiday, and E. A. Johnson, "Optical Properties of Nucleic Acids and Their Components," Nucleic Acids, 1955, vol. 1, pp.492-553
【非特許文献２】Hongyan Zhang and Liqiang Song, "Study on the Noninvasive Blood Glucose Measurement by Diffusion Reflectance NIR Spectroscopy," Optics in Health Care and Biomedical Optics, January 2005, pp. 460-467
【非特許文献３】Jie Yu Chen, Ryuji Matsunaga, and Kyoko Ishikawa, "Main Inorrganic Component Measurement of Seawater Using Near-Infrared Spectroscopy," Applied Spectroscopy, November 2003, vol. 57, Issue 11, pp. 1399-1406
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
非特許文献１にある通り、紫外吸収スペクトルから核酸溶液の濃度を測定する従来の方法においては、測定対象の塩基配列又は塩基数が既知であることが前提である。また、各塩基に基づくモノマーの濃度からポリ又はオリゴヌクレオチドの濃度を算出する手法であるので、複数種類のポリ又はオリゴヌクレオチドの混合溶液において、各溶質の濃度を算出できるものではない。
【０００５】
本発明者らは各デオキシヌクレオチドの水溶液について、デオキシヌクレオチドの濃度と、２２０ｎｍ〜３００ｎｍにおけるサンプリング幅１ｎｍ単位での紫外吸光度との関係をＰＬＳ回帰分析することで、測定対象溶液の紫外吸収スペクトルから測定対象溶液中の各々のデオキシヌクレオチドの濃度を直接算出できることを見出した。これはオリゴマーやＤＮＡ１本鎖、ＤＮＡ２本鎖であっても適用でき、それらの各濃度が算出できる。このようにして、本願発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
請求項１に係る発明は、測定対象である核酸塩基を１種類有する測定対象溶液についてのものである。即ち、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、デオキシヌクレオチド又はそのオリゴマー、デオキシヌクレオシド、ＲＮＡ、ＲＮＡ断片、ヌクレオチド又はそのオリゴマー、ヌクレオシド、及び核酸塩基のうちの何れかを有する溶液の、各溶質の濃度を測定する方法であって、濃度を算定すべき溶質の全てについて、各々濃度既知の複数個の標準溶液の紫外吸収スペクトルを所定の波長帯域において測定し、各波長における吸光度を説明変数、各溶質の濃度を目的変数として、ＰＬＳ回帰分析により回帰係数を算出し、測定対象溶液の紫外吸収スペクトルを前記波長帯域において測定し、前記算出した回帰係数に基づき、各溶質の濃度を算出することを特徴とする核酸及びその構成要素の濃度測定方法である。
【０００７】
請求項２に係る発明は、複数のｐＨにおける標準サンプルデータから総合的にＰＬＳ回帰分析を行い、当該複数のｐＨにおける測定対象の紫外吸収から、総合的に各溶質の濃度を測定するものである。即ち、各標準溶液の紫外吸収スペクトルを複数個のｐＨ下において測定し、それら全体をＰＬＳ回帰分析により算出した回帰係数に基づいて、測定対象溶液のｐＨ毎の紫外吸収スペクトルから、測定対象溶液の各溶質の濃度を算出する。
請求項３に係る発明は、複数の電界下における標準サンプルデータから総合的にＰＬＳ回帰分析を行い、当該複数の電界下における測定対象の紫外吸収スペクトルから、総合的に各溶質の濃度を測定するものである。即ち、各標準溶液の紫外吸収スペクトルを所定の電界を印加した場合及びしない場合において測定し、それら全体をＰＬＳ回帰分析により算出した回帰係数に基づいて、測定対象溶液の所定の電界を印加した場合及びしない場合の紫外吸収スペクトルから、測定対象溶液の各溶質の濃度を算出する。
請求項４に係る発明は、複数の温度における標準サンプルデータから総合的にＰＬＳ回帰分析を行い、当該複数の温度における測定対象の紫外吸収スペクトルから、総合的に各溶質の濃度を測定するものである。即ち、各標準溶液の紫外吸収スペクトルを所定の複数の温度において測定し、それら全体をＰＬＳ回帰分析により算出した回帰係数に基づいて、測定対象溶液の当該複数の温度での紫外吸収スペクトルから、測定対象溶液の各溶質の濃度を算出する。
上記測定方法は、核酸及びその構成要素の濃度測定装置として容易に実現でき（請求項５乃至７）、当該濃度測定装置を内部構成に含んだ合成装置、特にＰＣＲ（Polyimerase Chain Reaction）装置或いはリアルタイムＰＣＲ装置として容易に実現できる（請求項８乃至１０）。
【発明の効果】
【０００８】
以下に示す通り、各デオキシヌクレオチドの水溶液について、デオキシヌクレオチドの濃度と、例えば２２０ｎｍ〜３００ｎｍにおけるサンプリング幅１ｎｍ単位での紫外吸光度との関係をＰＬＳ回帰分析することで、測定対象溶液中の各々のデオキシヌクレオチドの濃度を直接算出できることを見出したものである。一般に用いられる１点又は複数点の吸収波長のみに基づくものでなく、例えば８１点の波長に対する紫外吸光度を総合的に判断するものである。これにより、混合溶液について、各構成単位の吸収スペクトルにオーバーラップがあったとしても、その影響を排除して各構成単位の濃度を算出することが可能となる。これを４種のモノマーのみでなく、測定対象溶液中に検出可能な濃度であると予想される全てのオリゴマー、ＤＮＡ１本鎖、ＤＮＡ２本鎖について、各々濃度既知の標準溶液を用意し、ＰＬＳ回帰分析により予め回帰係数を求めておけば、混合溶液中の各化学種の濃度が検出可能である。これはＰＣＲ等の反応の追跡にも適用できる。標準溶液について、複数のｐＨや電界下でＰＬＳ回帰分析を行い、測定対象溶液を対応した複数のｐＨ、電界下、温度下で紫外吸収スペクトルを測定すれば、各構成要素間の分子間干渉を抑制できるので、より精度良く各溶質の濃度を測定できる。
【０００９】
また、本発明によれば、合成装置において、目的化合物であるＤＮＡ鎖等を所定濃度以上に合成した段階で当該合成を終了させたり、リアルタイムＰＣＲ装置において、各サイクル毎に全溶質の濃度を測定、追跡して、例えば目的化合物であるＤＮＡ鎖等の初期段階（ＰＣＲ開始前）の濃度を決定することが可能である。また、蛍光化合物や放射性同位体を含んだ化合物による修飾無しに対象核酸試料の各溶質の濃度を測定できるので、合成、増幅した対象核酸試料を更に利用することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、デオキシヌクレオチドとそのオリゴマー、ＤＮＡ及びＤＮＡ断片について説明する。ヌクレオチドとそのオリゴマー、ＲＮＡ及びＲＮＡ断片についても、各核酸構成単位をリボース誘導体に置き換え、チミン若しくはその誘導体に替えてウラシル若しくはその誘導体の標準濃度サンプルに基づきＰＬＳ回帰分析を行って、所定の波長領域における回帰係数を決定することで、全く同様に実施できる。
【００１１】
ＰＬＳ回帰分析において、説明変数は各波長における吸光度、目的変数は各デオキシヌクレオチドの濃度である。各デオキシヌクレオチドは、慣例に従い、ｄＡＭＰ（デオキシアデノシン一リン酸）、ｄＴＭＰ（チミジン一リン酸）、ｄＧＭＰ（デオキシグアノシン一リン酸）、ｄＣＭＰ（デオキシシチジン一リン酸）の表記を用いる。また、特に断らない限り、各測定においてはｐＨは６．８とした。この場合の緩衝液の組成は以下の通りである。ＮａＣｌ：１３７ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｎａ2ＨＰＯ4：８．１ｍｍｏｌ／Ｌ，ＫＣｌ：２．７ｍｍｏｌ／Ｌ，ＫＨ2ＰＯ4：１．５ｍｍｏｌ／Ｌ。また、紫外吸収スペクトルは、島津自記分光光度計ＵＶ−３１００ＰＣを用い、ＰＬＳ回帰分析には、ＣＡＭＯ社の「The Unscrambler Ver.9.2」を用いた。
【実施例１】
【００１２】
まず、本発明が有効であることを実証するため、ｄＡＭＰのみについて、ＰＬＳ回帰分析を行った。ｄＡＭＰの標準濃度サンプルとして濃度は１．４４×１０-7〜１．３１×１０-4ｍｏｌ／Ｌの範囲の１４の異なる濃度のものを用意した。
【００１３】
図１はｄＡＭＰの紫外吸収スペクトルである。波長範囲は２２０ｎｍ〜３００ｎｍである。一方図２は上記１４の異なる濃度のｄＡＭＰの標準濃度サンプルについて、各波長（１ｎｍ単位の８１点）における吸光度を説明変数、ｄＡＭＰの濃度を目的変数として、各波長に対する回帰係数を算出してプロットしたものである。即ち、濃度未知の試料に対し、各波長（１ｎｍ単位の８１点）における吸光度を測定し、図２の縦軸に相当する回帰係数（単位は１０-6ｍｏｌ／Ｌ）を乗じて総和を取れば濃度が算出できる。
【００１４】
図２の回帰係数の算定に用いた１５の異なる濃度のｄＡＭＰの標準濃度サンプルの紫外吸収スペクトルから濃度を逆に算出すると、図３のようになる。尚、この際フルクロス検定を行い、１４の異なる濃度のｄＡＭＰの標準濃度サンプルの１について紫外吸収スペクトルから濃度を予測する場合には、他の１３の濃度のｄＡＭＰの標準濃度サンプルから回帰係数を求めることとした。このように、１４の異なる濃度のｄＡＭＰの標準濃度サンプルの濃度は、紫外吸収スペクトルからＰＬＳ回帰分析により算定された回帰係数に基づき非常に精度良く予測できることがわかる。
【００１５】
全く同様に、ｄＴＭＰのみ、ｄＧＭＰのみ、ｄＣＭＰのみについて、各々異なる濃度の標準濃度サンプルを用意して紫外吸収スペクトルを測定し、ＰＬＳ回帰分析により回帰係数を算出して、逆に標準濃度サンプルの紫外吸収スペクトルから濃度を算出した。ここで、フルクロス検定を行い、１について紫外吸収スペクトルから濃度を算出する場合には、そのデオキシヌクレオチドの異なる他の濃度の標準濃度サンプルから回帰係数を求めることとした。フルクロス検定による標準偏差と実測値（各サンプルの実濃度）と予測値の相関係数を表１に示す。また、各デオキシヌクレオチドの１の濃度サンプルについて、予測値、実濃度との誤差、標準偏差を表２に示す。フルクロス検定の結果から、本実施例によるモデルが極めて精度が高いことがわかる。尚、表２における標準偏差は、ＲＭＳＥＰ（Root Mean Square Error of Prediction）であり、回帰係数算定段階での予測応答値と測定応答値の平均的な差を示すものである。また、表２以下の表においては、単に「Ｍ」で単位「ｍｏｌ／Ｌ」を示すことが有る。
【表１】
2007116995.tif 000002
【表２】
2007116995.tif 000003
【００１６】
各標準サンプルは次の通りの濃度のものを用意した。
ｄＴＭＰについて、６．４５×１０-8〜８．７７×１０-5ｍｏｌ／Ｌの範囲の１１個。
ｄＧＭＰについて、６．２４×１０-6〜７．３５×１０-5ｍｏｌ／Ｌの範囲の６個。
ｄＣＭＰについて、１．４９×１０-6〜１．５８×１０-5ｍｏｌ／Ｌの範囲の５個。
【実施例２】
【００１７】
本実施例においては、次のようにしてＰＬＳ回帰分析を行った。即ち、実施例１では、例えばｄＡＭＰのＰＬＳ回帰分析においては濃度をｄＡＭＰの１種類とし、他のデオキシヌクレオチドの濃度についてはそもそも考慮せずに、且つ独立に分析を行った。本実施例においては、上記の標準サンプル３６種類を全て一括して処理し、その際、含まれていないデオキシヌクレオチドの濃度を０として入力した。即ち、実施例１においては、各デオキシヌクレオチドごとに、目的変数は当該デオキシヌクレオチドの濃度のみであったが、本実施例においては、目的変数は４つのデオキシヌクレオチドの濃度である。ＰＬＳ回帰分析においては説明変数、目的変数とも直交分解されるが、本実施例において４つのデオキシヌクレオチドの濃度はそもそも「独立変数」であるので、分解されない。一方、８１点の各波長ごとの吸光度は、直交分解され、４つの目的変数である４つのデオキシヌクレオチドの濃度と、線形関係にある主成分（スコア）にローディングされる。ＰＬＳ回帰分析は、当該主成分（スコア）がいくつ有るかをも分析した上、その個数の主成分（スコア）に説明変数をローディング、即ち直交分解する分析手法である。直交分解された説明変数側の主成分（スコア）は、説明変数の線形結合で表される。また、目的変数も、説明変数側の主成分（スコア）の線形結合で表される。結局、本実施例においては、目的変数は説明変数の線形結合で表される。この係数が回帰係数である。
【００１８】
このような条件により、図４のような回帰係数を得た。いずれのデオキシヌクレオチドにおいても、回帰係数が負となる部分が有り、例えばｄＡＭＰにおいては図１又は図２の曲線とは全く異なる形状となる。即ち、本実施例においては、各デオキシヌクレオチドの波長２２０ｎｍ〜３００ｎｍにおける吸収スペクトルが、他のデオキシヌクレオチドの吸収スペクトルと独立となるように、各波長における回帰係数を算定することとなる。尚、フルクロス検定の結果を表３に、また、１０-4ｍｏｌ／ＬのｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰの標準サンプルについて紫外吸収スペクトルから図４の回帰係数に基づき「４つのデオキシヌクレオチド濃度」を予測した結果を表４に示す。
【表３】
2007116995.tif 000004
【表４】
2007116995.tif 000005
【００１９】
表３から、各標準サンプルに対して、精度良く濃度が予測できることが理解できる。実際、表４のように、１０-4ｍｏｌ／ＬのｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰの標準サンプルについて、含まれていないはずのデオキシヌクレオチドの濃度は、負又は誤差範囲として無視でき得る極めて小さい値として予測されている。
【００２０】
次に、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰをいずれも１０-5ｍｏｌ／Ｌ程度有する混合溶液を作成し、紫外吸収スペクトルを測定して図４の回帰係数により濃度を予測した。この結果を表５に示す。若干の誤差が生じるが、良好な結果が得られた。
【表５】
2007116995.tif 000006
【実施例３】
【００２１】
実施例２の結果は若干の誤差を生じているので、この誤差を抑制すべく、次のような重みの付加操作を行った。即ち、図４において各デオキシヌクレオチドの回帰係数の曲線の山（極大値付近）及び谷（極小値付近）となる波長を８箇所選択して、その８箇所について、各回帰係数を２倍とした。この際、負の回帰係数となるものはその絶対値が２倍となった。これを図５に示す。図４と図５の回帰係数によるフルクロス検定の標準偏差を各々「付加前」「付加後」として表６に、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰをいずれも１０-5ｍｏｌ／Ｌ程度有する混合溶液の紫外吸収スペクトルから図４と図５の回帰係数による予測の結果を表７に示す。
【表６】
2007116995.tif 000007
【表７】
2007116995.tif 000008
【００２２】
表６のように、重み付加により、フルクロス検定における予測誤差の標準偏差は若干小さくなった。また、表７のように、４種混合溶液の各デオキシヌクレオチドの濃度予測値は、重み付加によりさほど影響されなかったが、誤差の標準偏差は小さくなった。
【実施例４】
【００２３】
ＤＮＡ１本鎖を４種類用意し、濃度既知の標準溶液を用いて本発明を適用した例を表８乃至１０に示す。表８は、ＣＧ５０−Ａ、ＣＧ５０−Ｇ、ＣＧ７０−Ａ、ＣＧ７０−Ｇの紫外吸収スペクトルと濃度をＰＬＳ回帰分析した場合のフルクロス検定による標準偏差と実測値（各サンプルの実濃度）と予測値の相関係数を示したものである。いずれもデオキシヌクレオチドが２０単位（２０ｍｅｒ）であり、ＣＧ５０はｄＣＭＰ及びｄＧＭＰがその５０％を占めることを意味し、末尾の−Ａは５’末端がｄＡＭＰであることを示している。表９及び表１０は、表８を算出した回帰係数に基づき、ＣＧ５０−ＡとＣＧ５０−Ｇの混合溶液、ＣＧ７０−ＡとＣＧ７０−Ｇの混合溶液について濃度を算定した結果である。いずれの表においても各オリゴマーを１０-5ｍｏｌ／Ｌにて混合した溶液については十分良好な結果が得られた。
【表８】
2007116995.tif 000009
【表９】
2007116995.tif 000010
【表１０】
2007116995.tif 000011
【実施例５】
【００２４】
良く知られているように、デオキシヌクレオチド等は温度やｐＨによって紫外吸収スペクトルが大きく変化する。例えばｄＣＭＰの吸光度のｐＨ依存性は図６のようである。そこで、ＰＬＳ回帰分析においても、異なるｐＨ条件でデータを用意し、それらを総合的にＰＬＳ回帰分析すると良い。ｐＨ６、７及び８の３条件で各々２２０ｎｍ〜３００ｎｍの８１点、合計２４３点の吸光度を説明変数とし、標準サンプルのｐＨ及び波長に対する吸光度から、回帰係数を求めた場合を表１１に「ｐＨ三条件」として示す。尚、図４の回帰係数を用いた場合である表５のデータを「ｐＨ一条件」として合わせて掲載する。「ｐＨ三条件」によるＰＬＳ回帰分析により、予測値は良好なものとなった。全く同様に、各溶質の濃度既知の標準溶液に電界を印加した場合と印加しない場合の吸収スペクトルをＰＬＳ回帰分析し、測定対象溶液に電界を印加した場合と印加しない場合の吸収スペクトルから、各溶質の濃度をより精度良く測定することも可能である。
【表１１】
2007116995.tif 000012
【実施例６】
【００２５】
図７は、本発明に係る、拡散及びその構成要素の濃度測定装置付きリアルタイムＰＣＲ装置１０００の構成を示すブロック図である。リアルタイムＰＣＲ装置１０００は、ＰＣＲ部１００と、各セルの溶質の濃度測定部２００とから成る。濃度測定部２００は、デジタル信号処理部２０とそれにより制御される紫外線発光部２１及び光強度検出部２２、並びにＰＬＳ回帰分析部３０とから成る。ＰＣＲ部１００は、４種のデオキシヌクレオチドモノマーを大過剰に含む試料Ｓを封入したセル１０と、セル１０の移動装置１１０と、湯煎１２０と、移動装置１１０及び湯煎１２０を制御する制御装置１５０とから成る。制御装置１５０により、湯煎１２０の湯浴１２の温度が調整され、例えば熱変成の９６℃１５秒、プライマーアニーリングの５５℃３０秒、ＤＮＡの鎖延長の７２℃９０秒のサイクルを所望回、繰り返し行うことができる。また、移動装置１１０により、試料Ｓを封入したセル１０は順次、濃度測定部２００の紫外線発光部２１と光強度検出部２２の間に移動されて、紫外吸収スペクトルが測定される。濃度測定部２００は紫外線発光部２１と光強度検出部２２とにより、セル１０内の試料Ｓについて、所定波長範囲の紫外吸収スペクトルを測定し、デジタル信号処理部２０によりデジタルデータとして記憶される。また、制御装置１５０はデジタル信号処理部２０とＰＬＳ回帰分析部３０とを制御し、且つそれらから情報を得ることができる。
【００２６】
このようなリアルタイムＰＣＲ装置１０００に、まずセル１０の試料Ｓとして、所望のデオキシヌクレオチド、ＤＮＡ鎖その他の核酸又はその構成要素の、濃度既知の標準溶液を充填する。そして、順に濃度測定部２００において紫外吸収スペクトルを測定し、且つその各波長における吸光度を説明変数、当該溶質の濃度を目的変数としてＰＬＳ回帰分析部３０において分析し、回帰係数を求める。この際、のちに測定すべき系である、ＰＣＲを適用する試料の、ＰＣＲにおいて合成されうる全ての化学種について、各々の標準溶液を用意することが必要である。例えば、４つのデオキシヌクレオチド、通常は２種類用意されるプライマー（５’末端オリゴマー）、目的化合物であるＤＮＡ２本鎖の７種類である。
【００２７】
このようにして、ＰＣＲにおいて合成されうる核酸の全ての化学種について、回帰係数が用意されたので、ＰＣＲ部１００において、ＰＣＲを実行し、各サイクル毎に、各セル１０の紫外吸収スペクトルを測定することで、当該セル１０内の試料Ｓ中の目的化合物であるＤＮＡ鎖等の濃度を逐次算定することができる。これにより、ＰＣＲ部１００において、各々のセル１０内の目的化合物が所定濃度に達するまでＰＣＲサイクルを実行することが可能となる。或いは、各々のセル１０内の目的化合物の濃度が検出可能となるまでＰＣＲサイクルを実行して、ＰＣＲサイクル数と増幅率との周知の関係から、ＰＣＲ実行前のセル１０内の試料Ｓの目的化合物（又はそれを誘導するための元の長鎖ＤＮＡ）の初期濃度を算定することが可能となる。
【００２８】
上記実施例において、更に紫外線発光部２１と光強度検出部２２の間に配置されたセル１０に対して、所望の方向に所望電界をかけて紫外吸収スペクトル測定及びＰＬＳ回帰分析を行っても良く、また、各試料Ｓについて、所定の複数のｐＨに設定しても良い。移動装置１１０により測定されたセル１０は再び湯煎１２０に戻されても良く、また戻さないこととしても良く、それらを取り混ぜて実行しても良い。紫外線発光部２１と光強度検出部２２の間に配置されたセル１０は湯煎１２０内にて実行されても良く、また湯煎１２０に替えて、温風浴を用いても良い。ＰＬＳ回帰分析３０における手法は、実施例１乃至５のいずれの手法を用いても良く、制御装置１５０及びデジタル信号処理部２０はそれに応じてセル１０の移動装置１１０の制御、紫外吸収スペクトル測定、及び回帰分析を行う。。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明は核酸を用いる任意の作業工程において適用可能である。特に、リアルタイムＰＣＲ装置において、各増幅段毎に生成するＤＮＡの濃度を追跡するのに適しており、且つ最終生成物に蛍光化合物等が含まれていないので、増幅したＤＮＡを有効活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】デオキシヌクレオチドの紫外吸収スペクトルを示したグラフ図。
【図２】ｄＡＭＰに実施例１を適用した場合の回帰係数を示したグラフ図。
【図３】ｄＡＭＰに実施例１を適用した場合の予測値と実濃度の相関関係を示したグラフ図。
【図４】４つのデオキシヌクレオチドに実施例２を適用した場合の回帰係数を示したグラフ図。
【図５】４つのデオキシヌクレオチドに実施例３を適用した場合の回帰係数を示したグラフ図。
【図６】ｄＣＭＰの３つのｐＨにおける紫外吸収スペクトルを示したグラフ図。
【図７】本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置１０００の構成を示すブロック図。
【符号の説明】
【００３１】
ｄＡＭＰ：デオキシアデノシン一リン酸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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