(57)【要約】【課題】  ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌を検出するマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット及びそれを用いた大腸菌の検出方法である。【解決手段】  ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌のLT、STp、ST II、VTe、F4及びF18をコードする遺伝子を検出するためのマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットであって、上記遺伝子を同時に検出でき且つＰＣＲ産物の全てが肉眼的に識別可能なバンドを形成することを可能とするマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット及びそれを用いた大腸菌の検出方法である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌のLT、STp、ST II、VTe、F4及びF18をコードする遺伝子を検出するためのマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットであって、上記遺伝子を同時に検出でき且つＰＣＲ産物の全てが肉眼的に識別可能なバンドを形成することを可能とするマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット。
【請求項２】
各ＰＣＲ増幅産物の塩基長が１０塩基以上の差が生じるように各プライマーセットが選択されている請求項１記載のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット。
【請求項３】
プライマーセットが、下記(1)〜(4)のプライマーセットの組合せの何れか、又は当該プライマーセットの組合せの各オリゴヌクレオチドに相補的配列の組合せで構成されるプライマーセットからなる請求項１又は２記載のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット。
(1)配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(2)配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(3)配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号７に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(4)配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号７に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２０に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３１に示される塩基配列からなるプライマー。
【請求項４】
配列番号１、３〜７、９〜１１、１３，１４、１６、１７、１９，２０、２２〜２９及び３１に示される塩基配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
(a)ブタ由来検体からＤＮＡを抽出する工程、(b)当該ＤＮＡを鋳型として、請求項１〜３の何れかに記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、(c)ＤＮＡの増幅の有無を検出する工程を含み、大腸菌のLT、STp、ST II、VTe、F4及びF18をコードする遺伝子を同時且つ肉眼的に識別可能なバンドで検出することからなるブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はブタ消化器系疾患を惹起する大腸菌の検出用プライマー及び当該プライマーを用いる大腸菌の検出方法に関する。より詳細には、ブタ消化器系疾患を惹起する複数の型の大腸菌を同時に検出するためのマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット及び当該プライマーセットを用いる大腸菌の型別の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタに下痢、嘔吐、浮腫病などの消化器系疾患を惹起する原因の一つとして大腸菌がある。ブタの大腸菌消化器系疾患は、例えば2002年の死亡淘汰発生率が約5%であったように、大きな経済的損失を生じる。
授乳期及び離乳後（1ヶ月齢程度以降）のブタの大腸菌消化器系疾患はエンテロトキシン産生性大腸菌（ETEC）及び／又はベロ毒素産生性大腸菌（VTEC）により起こる。ETECは易熱性エンテロトキシン(以下、LT)、メタノール可溶性の耐熱性エンテロトキシン（以下、STp）及び／又はメタノール不溶性の耐熱性エンテロトキシン（以下、ST II）を産生し、ブタに消化器系疾患を惹起する。VTECはブタ型ベロ毒素（以下、VTe）を産生し、ブタに消化器系疾患を惹起する。なお、ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌は、上記毒素の単独又は複数を産生する。
上記の大腸菌はブタ小腸上皮細胞付着因子として機能する線毛（Ｆ4、Ｆ5、Ｆ6、Ｆ18、Ｆ41など）を有している。なお、ブタがＦ18のレセプターを発現するのは3週齢以降なので、3週齢以前のブタはＦ18型線毛を有する大腸菌による消化器系疾患は発症しない。
LT、STp、ST IIはETEC菌体内ではシグナルペプチドの付いた前駆体として産生され、菌体外に分泌される際にシグナルペプチドが外されブタ細胞毒性を発現するので、ETECに細胞壁合成阻害型の抗生物質を作用させ、LT、STp及び／又はST IIの前駆体を菌体外に放出させた場合でも、LT、STp及び／又はST II自体のブタ細胞毒性を発現せず、消化器系疾患の症状を悪化させる事はない。一方、VTeはVTEC菌体内でベロ毒素活性を有する物質として産生されるので、細胞壁合成阻害型等の抗生物質を作用させるとVTeの菌体外放出を促進しブタの病状を悪化させる。従って、VTECによる消化器系疾患の治療に当該抗生物質を使用してはならない。このように、原因大腸菌型により治療用薬剤を適切に選択する必要がある。
【０００３】
ところで、ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌の血清型やその出現頻度は、ブタが飼養されている地域や、同一の地域であっても時期によって異なる（非特許文献１）。例えば、VTe非産生菌とVTe産生菌の出現頻度は、オーストラリアではそれぞれ100% (126/126)と0％ (0/126)（非特許文献２）、中国ではそれぞれ97％ (200/206)と3%
(6/206)（非特許文献３）であったが、日本国内の一例では後記表６が示すように、それぞれ35%
(20/56)と65%(36/56)であった。このように農地面積が狭く畜産立地としての適性に恵まれない日本では、ブタの大腸菌消化器系疾患はVTe非産生菌とVTe産生菌の両方が高率に発生している。このようなことから、特に日本では、ブタの消化器系疾患を惹起する大腸菌を正確・迅速・簡便に検査し、薬剤を適切に選択し、生産コストの上昇防止と薬剤耐性菌の発生防止を図ることが必要である。
【非特許文献１】Vet Microbiol. 2004: 103; 13-20
【非特許文献２】Aus Vet J. 2005: 83(5); 293-299
【非特許文献３】Vet Microbiol. 2004: 103; 13-20
【０００４】
大腸菌の検査結果は、一般的には、選択培地等による分離培養、生化学性状試験、血清学的試験、毒素産生試験、薬剤耐性試験等を経て得られるが、検査結果を得るまでに数日間を要する。そこで、近年ではＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を主とする遺伝子検査が行われている。ＰＣＲ法では、培養試験に比べて短時間で検査結果を得ることができる。また、複数のプライマーセットを使用するマルチプレックスＰＣＲを適用することにより、複数の標的遺伝子を同時に検査することができる。
マルチプレックスＰＣＲを用いた大腸菌の検出に関し、Botteldoornらは、VTECについてvt1、vt2、eaeAとhlyA遺伝子を検出するマルチプレックスＰＣＲと、ETECについてLT I、ST IaとST II遺伝子を検出するマルチプレックスＰＣＲを行ったが、VTECとETECの両方を単一のＰＣＲチューブ内で同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲは行っていない。また、供試菌株によっては、当該菌株が保有する遺伝子のマルチプレックス検出に成功しなかった（非特許文献４）。
一方、ChenらはVTECとETECを検出するマルチプレックスＰＣＲを行ったが、線毛型別は血清学的試験で行った（非特許文献５）。
更に、ＰＣＲ増幅反応の温度サイクル条件を一定とする複数の微生物を検出する方法及びプライマーセットが提案されている（特許文献１）が、遺伝子の増幅反応を単一のＰＣＲチューブ内で行うのではなく、検出対象微生物毎に複数のＰＣＲチューブを用いた。
このように、ブタの消化器系疾患を惹起するVTECとETECの両方を同時に検出すると共に、それらの線毛型別を行うことを目的に、複数の標的遺伝子群を単一のＰＣＲチューブ内で増幅させるマルチプレックスＰＣＲは行われていなかった。
【非特許文献４】Res Microbiol. 2003: 154; 97-104
【非特許文献５】Vet Microbiol. 2004: 103; 13‐20
【特許文献１】特開２００２−２２３７６６公報
【０００５】
マルチプレックスＰＣＲを行う場合、複数のプライマーセットを単純に混合しただけでは、満足のいく特異的な遺伝子増幅産物が得られるとは限らない。一般に、ＰＣＲにより2つ以上の遺伝子を単一のＰＣＲチューブ内で増幅させようとする場合、目的以外の遺伝子が非特異的に増幅されたり、目的の遺伝子が増幅されなかったりするので、標的遺伝子のみを特異的に増幅させると共に、プライマー間の干渉の生じないプライマーを設計する必要がある（非特許文献６）。しかし、これらを十分考慮してプライマーを設計した場合でも反応効率が低下することもあるので、特異的なマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットの設計は容易でなかった。
【非特許文献６】Clin Microbiol  Rev. 2000:13; 559-570
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、マルチプレックスＰＣＲ法では、複数のプライマーセットを単純に混合しただけでは、それぞれの特異的な遺伝子増幅産物が得られるとは限らなかった。また、ブタの消化器系疾患を惹起するVTECとETECの両方を同時に検出すると共に、それらの線毛型別を行うことを目的に、複数の標的遺伝子群を単一のＰＣＲチューブ内で増幅させるマルチプレックスＰＣＲは行われていなかった。
本発明者らは係る問題点を解消するために鋭意検討したところ、大腸菌のLT、STp、ST II及びVTe並びに線毛抗原F4及びF18の遺伝子を単一のＰＣＲチューブ内で特異的に増幅させると共に干渉反応を生じさせないで増幅させ、ＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動する際に、同一レーン上で標的遺伝子群に対応する増幅産物を肉眼的に識別可能なバンドとして検出できるマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットを見出した。
本発明は係る知見に基づくもので、ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌のLT、STp、ST II及びVTe並びに線毛抗原F4及びF18をコードする６種類の遺伝子を同時に正確、迅速、簡便に検出するマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット及び当該プライマーセットを用いる大腸菌のLT、STp、ST II及びVTe並びに線毛抗原F4及びF18の遺伝子を正確、迅速、簡便に検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するためになされた本発明は、ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌のLT、STp、ST II、VTe、F4及びF18をコードする遺伝子を検出するためのマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットであって、上記遺伝子を同時に検出でき且つＰＣＲ産物の全てが肉眼的に識別可能なバンドを形成することを可能とするマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットである。特に、上記のプライマーセットは、各ＰＣＲ増幅産物の塩基長が１０塩基以上の差が生じるように各プライマーセットを選択するのが好ましい。
更に、好ましいプライマーセットは、下記(1)〜(4)のプライマーセットの組合せの何れか、又は当該プライマーセットの組合せの各オリゴヌクレオチドに相補的配列の組合せで構成されるプライマーセットからなるマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットである。
(1)配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(2)配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(3)配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号７に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(4)配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号７に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２０に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３１に示される塩基配列からなるプライマー。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３〜７、９〜１１、１３，１４、１６、１７、１９，２０、２２〜２９及び３１に示される塩基配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドである。
更に、本発明の大腸菌の検出方法は、(a)ブタ由来検体からＤＮＡを抽出する工程、(b)当該ＤＮＡを鋳型として、上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、(c)ＤＮＡの増幅の有無を検出する工程を含み、大腸菌のLT、STp、ST II、VTe、F4及びF18をコードする遺伝子を同時且つ肉眼的に識別可能なバンドで検出することからなるブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌を検出する方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットを用いてブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌を検査することにより、VTe非産生菌とVTe産生菌の型別などを正確・迅速・簡便に行うことができ、ブタの治療用の薬剤を適切に選択し、生産コストの上昇防止と薬剤耐性菌の発生防止を図ることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットは、ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌が保有するLT、STp、ST II及びVTe並びに線毛抗原F4及びF18をコードする遺伝子のそれぞれと特異的に結合する複数のプライマーセットからなり、上記遺伝子を同時に検出でき且つＰＣＲ産物の全てが肉眼的に識別可能なバンドを形成することを可能とするマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットである。
ここで、上記の「同時に検出でき且つＰＣＲ産物の全てが肉眼的に識別可能なバンドを形成することを可能とする」とは、(1)１本のＰＣＲチューブ内で、熱変性、アニーリング、伸長反応を単一のＰＣＲ条件で行い、ＰＣＲ増幅産物を調製し、(2)当該ＰＣＲ増幅産物を単一のレーン上で電気泳動して、LT、STp、ST II及びVTe並びに線毛抗原F4及びF18をコードする遺伝子を正確に検出でき、(3)供試プライマー特異的な６種のＰＣＲ増幅産物の全てが、肉眼的に識別可能なバンドを形成することをいう。
肉眼的に識別可能なバンドを形成させるためには、近接する増幅産物のサイズの差が10〜400bp、好ましくは20〜300bpであるのが望ましい。
また、正確に検出できるとは、擬陰性又は擬陽性の出現頻度がそれぞれ10％未満であることをいう。
また、上記の消化器系疾患としては、例えば、下痢、嘔吐、浮腫病などが例示される。
また、本発明のプライマーセットは、後記の実施例が示すように、ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌とのみ反応し、ブタに消化器系疾患を惹起しない大腸菌、ブタに消化器系疾患を惹起するClostridium perfringens、Salmonella属細菌、Brachyspira hyodysenteriae及びBrachyspira pilosicoli、並びにブタ糞便中に常在し消化器系疾患には関与しない腸内細菌（Bacteroide など）とは、交差反応しないという特徴を有する。
【００１０】
本発明でプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、選択性や検出感度及び再現性から考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さを持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然のどちらでもよく、プライマーが標識されているか否かは問わない。また、プライマーとしての機能を果たす限り、プライマー（オリゴヌクレオチド）の５’末端側に１又は２以上の塩基が付加していてもよく、また１又は２以上の塩基が置換、欠失していてもよい。
【００１１】
ＰＣＲ増幅産物の塩基長は選択したプライマーセットにより規定されるが、検出対象遺伝子の増幅領域は、５０塩基から２,０００塩基、望ましくは、１００塩基から１,０００塩基となるように選択する。
【００１２】
本発明では複数の標的遺伝子群を単一のＰＣＲチューブ内で特異的に増幅させると共に、干渉反応を生じさせないで増幅させる必要があるので、アニーリング温度が一定になるようにプライマーを設計する必要があり、各プライマーの融解温度（Tm）を一定にする必要がある。Tm値は正確には実験により求められるが、プライマーの塩基配列から換算することができる。例えば、Ａ又はＴを２℃、Ｇ又はＣを４℃として合計する方法が一般に用いられている。
【００１３】
本発明の好ましいプライマーセットの例としては、下記(1)〜(4)のプライマーセットの組合せの何れか、又は当該プライマーセットの組合せの各オリゴヌクレオチドに相補的配列の組合せで構成されるプライマーセットからなるマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットが挙げられる。なお、プライマーセットの各オリゴヌクレオチドに相補的配列の組合せの構成もプライマーセットとして機能することは当業者にとって自明である。
(1)配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(2)配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(3)配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号７に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー。
(4)配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号７に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２０に示される塩基配列からなるプライマー；
配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー；及び
配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３１に示される塩基配列からなるプライマー。
【００１４】
本発明の大腸菌の検出方法は、(a)ブタ由来検体からＤＮＡを抽出する工程、(b)当該ＤＮＡを鋳型として、請求項１〜３の何れかに記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、(c)ＤＮＡの増幅の有無を検出する工程を含み、大腸菌のLT、STp、ST II、VTe、F4及びF18をコードする遺伝子を同時且つ肉眼的に識別可能なバンドで検出することからなるブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌を検出（型別）する方法である。
【００１５】
上記のブタ由来検体としては、糞便、嘔吐物、スワブ、腸内容物、臓器などが例示されるが、糞便が代表的な例である。係る材料をＰＣＲの試料として用いるには、材料中に存在する菌体からＤＮＡ成分を遊離させる操作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハイブリダイズできるＤＮＡが数分子から数十分子以上存在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行させるに十分なＤＮＡ量を持った試料液が調製できる。なお、必要に応じて、検査材料を適当な培地中で培養して大腸菌を増殖させてからＤＮＡ試料を調製してもよい。しかし、大腸菌感染により下痢症を発症したブタから採取した糞便（下痢便）中には、原因大腸菌が優勢的かつ純培養的に存在するので、前培養または増菌培養を要さないことは当業者には自明である。
【００１６】
次いで、上記で調製した試料中のＤＮＡを鋳型として、本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットを用いてＰＣＲを行う。
係るＰＣＲ工程は常法に準じて行うことができ、既に市販されているＰＣＲ装置などを用いて行うことができる。
より詳細には、例えば、ＰＣＲ反応に使用される反応液は、市販のＰＣＲ測定キットなどに添付されている反応液を使用すればよい。
また、ＰＣＲ反応に用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは９０〜９５℃の温度で活性を保持していれば、何れの生物種由来でもよい。使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばGene Taq、TaKaRa Taq、ExTaq HSなどが例示できる。
ＰＣＲ条件としては、熱変性の温度は９０〜９５℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング操作の温度は３７〜６５℃、伸長反応は５０〜７５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４５サイクル行って増幅させる。特に本発明は一回のＰＣＲ反応で複数の大腸菌の遺伝子の同時検出を可能にするために、熱変性の温度は９４℃、全てのプライマーのTm値を５０から６０℃の範囲内となるように設計した。
プライマーセットの使用量は、特に制限されないが、一般的に各プライマーが最終濃度0.5μＭ程度になるように使用することが好ましい。
【００１７】
ＰＣＲを終えた反応液をアガロースゲル電気泳動に供することによって、ＰＣＲ増幅産物の存在及びその増幅産物がプライマー特異的なものであるか否かを確認することができる。便宜的には増幅産物の移動度と既知のマーカーの移動度を比較することによって目的の増幅産物であるか否かを判定できる。更には、アガロースゲルから抽出したＤＮＡについてシーケンスする方法、ネスティッドＰＣＲに供する方法、サザンブロッティングに供する方法などによって標的遺伝子の増幅産物であることを確認することができる。
増幅されたヌクレオチド断片の検出には、アガロースゲル以外の支持体を使用する電気泳動法やクロマトグラフィーを適用することもできる。
係る方法によれば、ブタ由来検体中に存在する可能性のある、大腸菌のLT、STp、ST II、VTe、F4及び／又はF18をコードする遺伝子を同時且つ肉眼的に識別可能なバンドで検出することができる。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は係る例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１〜４及び比較例１〜８
(1)プライマーの調製
表１に示す配列からなるオリゴヌクレオチドを、バルブブロック集合体装置を用いるホスホアミダイト法により合成し、オリゴプリフィキ逆相カートリッジで精製した。
(2)プライマーセット
実施例１〜４として、表２に示される６種類のプライマーセットを混合してブタ消化器系疾患を惹起する大腸菌を検出するためのマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットとして使用した。
また、比較例１〜８として、表３に示される６種類のプライマーセットを混合してマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットとして使用した。
【００２０】
【表１】
2007282608.tif 000002
【００２１】
【表２】
2007282608.tif 000003
【００２２】
【表３】
2007282608.tif 000004
【００２３】
(3)試験例１(ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌のマルチプレックスＰＣＲによる検出)
検体の調製
毒素遺伝子LT,
STp, ST II及び／又はVTe並びにF4及び／又はF18を保有する大腸菌株を増菌培地に混合接種し、３７℃で一晩培養した。これをブタ糞便（Bacteroides などのブタ糞便中に常在する腸内細菌が大量に存在する）と混合し、該糞便０．１ｇに滅菌蒸留水１．２ｍｌを加え、十分に攪拌し、１５分間放置した。その後、２００×ｇで遠心分離し、その上清を更に１５，０００×ｇで５分間遠心し、上清を除去した。沈渣ペレットを細胞溶解液（50mM Tris-HCl pH 8.4, 1mM EDTA, 0.5% Tween 20）４００μｌに浮遊させ、沸騰水中で１０分間加熱した。その後、再度１５，０００×ｇで２分間遠心分離した後、上清を別のチューブに移し、その上清にフェノール-クロロホルム４００μｌを添加し、よく攪拌した。その後、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清をエタノール沈殿し、得られた沈殿物をＴＥ緩衝液４０μｌで溶解しＰＣＲに供した。
【００２４】
ＰＣＲ
検体液２μｌ、１０×反応緩衝液（500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH8.3, 30
mM MgCl2）５μｌ、ｄＮＴＰ溶液（dATP, dCTP, dGTP, dTTPの混合溶液で各2.5 mM）５μｌ、実施例１から４、又は比較例１から８に示すマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットの何れかの１２μｌ及び耐熱性ポリメラーゼ（Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ, 5 unit/μl, Roche社製）０．５μｌを加え、更に滅菌蒸留水を加えて全量５０μｌの反応液を調製した。この反応液を０．２ｍｌ容ＰＣＲ用チューブに入れ、ＤＮＡサーマルサイクラー(Bio-Rad社製iCycler）を用いてＰＣＲを行った（熱変性；９４℃、１分間：アニーリング；５５℃、１分間：伸長反応；６８℃、１分間：熱変性からアニーリングを経て伸長反応に至る過程を１サイクルとし、このサイクルを３５回繰り返した）
【００２５】
検出
反応液からＰＣＲによる増幅産物を検出するため、アガロースゲル電気泳動を行った。アガロースゲルはゲル濃度２％（W/V）とし、臭化エチジウム（100ng/ml）を含むものを用いた。ＴＡＥ溶液の入った泳動槽にゲルを浸し、１３５Ｖの定電圧で電気泳動を行なった。電気泳動後のゲルはＵＶランプを照射して増幅産物の鎖長を相対的に計測した。
【００２６】
結果
ブタに消化器系疾患を惹起する大腸菌のマルチプレックスＰＣＲによる検出結果を表４及び図１に示す。表４及び図１が示すように、本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットは、ブタの糞便（Bacteroides などのブタ糞便中に常在する腸内細菌が大量に存在する）が共存する条件下でもLT、STp、ST II、VTe、F4及びF18をコードする遺伝子のそれぞれを増幅し、アガロース電気泳動ゲルの単一のレーン上に、それぞれ肉眼的に識別可能なバンドが観察された。
一方、比較例のプライマーセットを用いた場合には、LT、STp、ST II、VTe、F4又はF18の何れかの増幅バンドが観察されない、又は非特異的な増幅バンドが観察された。
【００２７】
【表４】
2007282608.tif 000005
【００２８】
(4)試験例２（本発明のマルチプレックスＰＣＲプライマーとブタ消化器系疾患を惹起する大腸菌以外の細菌との交差反応）
実施例１、２、３及び４、並びに比較例１及び５のマルチプレックスＰＣＲプライマーがブタ消化器系疾患を惹起する大腸菌以外の病原性細菌と交差反応するか否かを調べた。
【００２９】
検体の調製
試験例１の大腸菌に代えて、ブタに消化器系疾患を惹起しない大腸菌(Esherichia coli ATCC11775, O157:H2)、ブタに消化器系疾患を惹起するClostridium perfringens、Salmonella属細菌、Brachyspira hyodysenteriae及びBrachyspira pilosicoliをそれぞれ至適な条件下で培養した。ＰＣＲ及び検出は試験例１と同様に操作した。
【００３０】
結果
ブタに消化器系疾患を惹起しない大腸菌、ブタに消化器系疾患を惹起するClostridium perfringens、Salmonella属細菌、Brachyspira hyodysenteriae及びBrachyspira pilosicoliの本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセット（及び比較例のプライマーセット）を用いた検査結果を表５に示す。表５が示すように、本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットは、ブタの糞便（Bacteroides などのブタ糞便中に常在する腸内細菌が大量に存在する）が共存する条件下でも、ブタに消化器系疾患を惹起しない大腸菌、ブタに消化器系疾患を惹起するClostridium perfringens、Salmonella属細菌、Brachyspira hyodysenteriae及びBrachyspira pilosicoliと交差反応しないことが示された。
【００３１】
【表５】
2007282608.tif 000006
【００３２】
(5)試験例３（ブタに消化器系疾患を惹起した大腸菌のマルチプレックスＰＣＲ法による同定）
下痢を発症したブタの便から分離された大腸菌株を実施例１のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーを用いて型別した。ＰＣＲ及び検出は試験例１と同様に操作した。
【００３３】
結果
結果を表６に示す。標的遺伝子の増幅産物を検出できた場合は「○」、検出できなかった場合は「×」と示した。表６が示すように、農場分離で分離され従来法（生化学性状試験、血清学的診断など）で型別された大腸菌株を本発明のマルチプレックスＰＣＲ法で検査したところ、供試５６株中５１株が毒素遺伝子(LT、STp、ST II、VTe)並びに線毛抗原遺伝子(F4及びF18)を単独あるいは複数保有していることが確認された。即ち、本発明で使用したプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行えば、ブタに消化器系疾患を惹起した大腸菌の９０％以上を型別でき、従来法とほぼ同様の型別ができ、養豚飼養現場で実質的に必要とされている迅速、正確な型別を可能にすることが分かった。また、大腸菌感染により下痢症を発症したブタから採取した糞便（下痢便）中には、原因大腸菌が優勢的かつ純培養的に存在するので、糞便から直接抽出したＤＮＡを対象として本発明で使用したプライマーセットを用いてマルチプレックスＰＣＲを行えば、養豚飼養現場で実質的に必要とされている迅速、正確な型別を可能にすることが分かった。
また上述のように、VTe非産生菌とVTe産生菌の出現頻度は、それぞれ35% (20/56)と65%(36/56)であり、農地面積が狭く畜産立地としての適性に恵まれない日本では、ブタの大腸菌消化器系疾患はVTe非産生菌とVTe産生菌の両方が高率に発生しており、至適薬剤の迅速な選別に寄与することが確認された。
【００３４】
【表６】
2007282608.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明のマルチプレックスＰＣＲ用プライマーセットによるブタ糞便中のブタ消化器系疾患を惹起する大腸菌のLT、STp、ST II、VTe、F4及びF18をコードする遺伝子の検出を示す電気泳動像である。  なお、図中、M：分子量マーカー、レーン１；実施例１、レーン２；実施例２、レーン３；比較例１、レーン４；比較例２、レーン５；比較例３、レーン６；比較例４、レーン７；比較例５、レーン８；比較例６、レーン９；実施例３、レーン１０；比較例７、レーン１１；比較例８、レーン１２；実施例４である。
【図１】
2007282608.tif 000008
【配列表】
2007282608000001.xml