(57)【要約】【課題】  作業者による熟練を必要とせず、結果の個人差が少ない、迅速簡便な糸状菌の胞子発芽率の決定法の提供。【解決手段】（１）糸状菌含有物に含まれる胞子画分を分画する第１工程、（２）胞子が発芽する条件にて胞子画分を培養する第２工程、（３）培養終了後の胞子内のＡＴＰ量を測定する第３工程、（４）測定されたＡＴＰ量に基づいて、培養終了後の胞子の発芽率を決定する第４工程、を含む糸状菌の胞子発芽率の決定法。  糸状含有物とは、例えば糸状菌培養物、麹菌培養物、醸造用種麹又は醸造用麹である。また、第１工程では、醸造用種麹と水溶液を混合して種麹懸濁液を調製し、次いで該種麹懸濁液を濾過することにより、胞子画分を分画することが好ましい。第３工程では、ルシフェリン−ルシフェラーゼ−生物発光反応法を用いて、培養後の胞子内のＡＴＰ量を測定することが好ましい。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む糸状菌の胞子発芽率の決定法。
（１）糸状菌含有物に含まれる胞子画分を分画する第１工程。
（２）胞子が発芽する条件にて胞子画分を培養する第２工程。
（３）培養終了後の胞子内のＡＴＰ量を測定する第３工程。
（４）測定されたＡＴＰ量に基づいて、培養終了後の胞子の発芽率を決定する第４工程。
【請求項２】
糸状菌含有物が、糸状菌培養物、麹菌培養物、醸造用種麹又は醸造用麹である、請求項１又は２記載の胞子発芽率の決定法。
【請求項３】
第１工程が、醸造用種麹と水溶液を混合して種麹懸濁液を調製し、次いで該種麹懸濁液を濾過することにより、胞子画分を分画する工程である、請求項１記載の胞子発芽率の決定法。
【請求項４】
第３工程が、ルシフェリン−ルシフェラーゼ−生物発光反応法を用いて、培養終了後の胞子内のＡＴＰ量を測定する工程である、請求項１、２又は３記載の胞子発芽率の決定法。
【請求項５】
以下の工程を含む、醸造用種麹の胞子発芽率の決定法。
（１）醸造用種麹と水溶液を混合して種麹懸濁液を調製し、次いで該種麹懸濁液を濾過することにより、胞子画分を分画する第１工程。
（２）胞子が発芽する条件にて胞子画分を培養する第２工程。
（３）ルシフェリン−ルシフェラーゼ−生物発光反応法を用いて、培養終了後の胞子内のＡＴＰ量を測定する第３工程。
（４）測定されたＡＴＰ量に基づいて、培養終了後の胞子の発芽率を決定する第４工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌の胞子発芽率の決定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌の有無や生育条件を測定することは、食品醸造、食品衛生、臨床検査等の分野において極めて重要であり、既に糸状菌の細胞内ＡＴＰを生物発光反応法により測定する方法が開発されている。生物発光反応法とは、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ及び金属イオンが関与する発光反応を利用して、細胞内のＡＴＰ量を測定する方法である。例えば、糸状菌の細胞内のＡＴＰを生物発光反応法により測定する方法（特許文献１参照）、カビの胞子を培養した後、細胞内のＡＴＰ量を測定することによりカビ生育条件を評価する方法（特許文献２参照）が公知である。
糸状菌は、古来より食品醸造に利用されている。醤油、味噌、日本酒等の食品醸造においては、糸状菌として麹菌、例えばAspergillus（アスペルギルス）属に属するAspergillus sojae、Aspergillus oryzae等が使用されている。醤油醸造においては、蒸煮した大豆と炒った小麦を混合したものに種麹を加えて製麹を行う。また、清酒醸造においては、蒸煮した米に種麹を加えて、製麹を行う。
種麹又は麹の品質管理のため、麹菌の生育状況を的確に把握することは重要な問題である。食品醸造の現場では、種麹又は麹に含まれる麹菌の胞子数、或いは胞子の発芽率を測定することにより、麹菌の生育状況を把握し、更には種麹又は麹の醸造適性を判断することが行われている。胞子数又は胞子の発芽率の測定法としては、作業者による顕微鏡観察が一般的である。しかし、目視による測定は、熟練を要するのみならず、観察者による測定誤差が大きいという問題があった。
【０００３】
【特許文献１】特開平７−９５８９８号公報
【特許文献２】特開平７−２８９２８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、迅速簡便な糸状菌の胞子発芽率の決定法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、糸状菌培養物の一種である醤油醸造用の種麹から分離した胞子を、当該胞子が発芽する条件で培養し、培養終了後の胞子内のＡＴＰ量を測定した。また、本発明者らは、培養終了後の胞子を顕微鏡観察し、その発芽率を測定した。その結果、培養終了後の胞子内のＡＴＰ量と当該胞子の発芽率とが密接に関係することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、以下に関する。
１．以下の工程を含む糸状菌の胞子発芽率の決定法。
（１）糸状菌含有物に含まれる胞子画分を分画する第１工程。
（２）胞子が発芽する条件にて胞子画分を培養する第２工程。
（３）培養終了後の胞子内のＡＴＰ量を測定する第３工程。
（４）測定されたＡＴＰ量に基づいて、培養終了後の胞子の発芽率を決定する第４工程。
２．糸状菌含有物が、糸状菌培養物、麹菌培養物、醸造用種麹又は醸造用麹である、上記１記載の胞子発芽率の決定法。
３．第１工程が、醸造用種麹と水溶液を混合して種麹懸濁液を調製し、次いで該種麹懸濁液を濾過することにより、胞子画分を分画する工程である、上記１．または２．記載の胞子発芽率の決定法。
４．第３工程が、ルシフェリン−ルシフェラーゼ−生物発光反応法を用いて、培養終了後の胞子内のＡＴＰ量を測定する工程である、上記１、２又は３記載の胞子発芽率の決定法。
５．以下の工程を含む、醸造用種麹の胞子発芽率の決定法。
（１）醸造用種麹と水溶液を混合して種麹懸濁液を調製し、次いで該種麹懸濁液を濾過することにより、胞子画分を分画する第１工程。
（２）胞子が発芽する条件にて胞子画分を培養する第２工程。
（３）ルシフェリン−ルシフェラーゼ−生物発光反応法を用いて、培養終了後の胞子内のＡＴＰ量を測定する第３工程。
（４）測定されたＡＴＰ量に基づいて培養終了後の胞子の発芽率を決定する第４工程。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、作業者による熟練を必要とせず、結果の個人差が少ない、迅速簡便な糸状菌の胞子発芽率の決定法が提供された。本発明は、食品醸造、食品衛生、臨床検査等の分野において利用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、以下の４工程を含む糸状菌の胞子発芽率の決定法である。
（１）糸状菌含有物に含まれる胞子画分を分画する第１工程。
（２）胞子が発芽する条件にて胞子画分を培養する第２工程。
（３）培養終了後の胞子内のＡＴＰ量を測定する第３工程。
（４）測定されたＡＴＰ量に基づいて、培養終了後の胞子の発芽率を決定する第４工程。
【０００９】
本発明でいう糸状菌とは、糸状菌に属し、胞子を形成する微生物であれば特に限定されない。糸状菌とは例えば、Aspergillus属に属する微生物であり、具体的には、Aspergillus sojae、Aspergillus oryzae等である。
糸状菌含有物とは、糸状菌を含む物であれば特に限定されず、例えば、適当な培地で培養した糸状菌培養物、麹菌培養物、醸造用種麹、醸造用麹が挙げられる。
第１工程では、糸状菌含有物に含まれる胞子画分を分画する。分画する方法としては、特に限定されないが、例えば濾過法、遠心分離法等が使用できる。
濾過法を使用する場合、糸状菌含有物を適当な溶液に懸濁し、実質的に胞子のみを透過する濾過装置を用いて濾過し、胞子画分として透過液を得る方法が好ましい。例えば、Aspergillus属に属する糸状菌を使用した醸造用種麹から胞子画分を得る場合、醸造用種麹を、０．１％Ｔｗｅｅｎ−６０液中で攪拌して得た懸濁液をガーゼで濾過した後に、ろ液をメッシュサイズ７０μｍのセルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス社製  ＢＤファルコン  セルストレーナー使用）で再度濾過すればよい。培養残渣や麹菌の菌糸はセルストレーナー上に残留し、胞子はろ液中に含まれる。得られたろ液が胞子画分として使用できる。
本発明において、胞子画分とは、実質的に胞子のみを含む画分をいう。ただし、胞子画分は、第２工程以降に支障を来たさない範囲で、胞子以外の成分を含んでいても良い。
【００１０】
第２工程では、胞子が発芽する条件にて胞子画分を培養する。培養方法は特に限定されず、糸状菌の種類によって適宜設定すればよい。例えばAspergillus属に属する糸状菌の胞子画分の場合、あらかじめ加熱殺菌した９％マルツエキス液体培地１００ｍｌに胞子画分を添加し、３０℃で３〜５時間程度振とう培養すればよい。
【００１１】
第３工程では、培養終了後の胞子内のＡＴＰ量を測定する。ＡＴＰ量の測定方法は、特に限定されないが、例えばルシフェリン−ルシフェラーゼ−生物発光反応法が使用できる。生物発光反応法により胞子内のＡＴＰ量を測定する場合、胞子画分に界面活性剤等を含む抽出試薬を添加して胞子からＡＴＰを抽出した後、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び２価の金属イオン等を含む発光試薬を添加して発光反応を生じさせ、その発光量を発光測定装置により測定すればよい。この場合、市販の試薬キット（キッコーマン社製ＡＴＰ測定キット「ルシフェール２５０プラス」等）及び、発光測定装置（キッコーマン社製「ルミテスターＫ−２００」等）が使用できる。
【００１２】
第４工程では、測定された胞子内ＡＴＰ量に基づいて、培養終了後の胞子の発芽率を決定する。実施例に示す通り、目視で測定した胞子の発芽率と、胞子内のＡＴＰ量とは強い相関関係を有する。従って、予め胞子内ＡＴＰ量と胞子の発芽率との関係を示す検量線を作成しておくことにより、胞子内ＡＴＰ量に基づいて、胞子の発芽率を決定することができる。
【実施例】
【００１３】
以下実施例により、本発明を更に説明する。
１．糸状菌含有物の調製
本発明の糸状菌含有物として、麹菌（Aspergillus sojae）を使用した醸造用種麹を調製した。
（１）三角フラスコに入れた小麦ふすま１００ｇに、水分約４０％程度になるよう撒水した後に加熱殺菌した。次いで保存していた麹菌を白金耳で接菌し、３０℃で５日間培養した。
（２）小麦ふすまと割砕小麦を１：４の割合で混合した原料に、水分約５０％程度になるよう撒水した。この原料１００ｇを三角フラスコに入れた後に加熱殺菌した。この原料に、上記（１）で得た培養物１００ｍｇを添加し、３０℃で７日間培養した。
（３）小麦ふすまと割砕小麦を６：４の割合で混合した原料に水分約４０％程度になるよう撒水した。この原料１ｋｇをアルミトレイに入れた後に加熱殺菌した。この原料に、上記（２）で得た培養物を１ｇ添加し、攪拌混合した後、３０℃で７日間培養した。培養終了後の培養物を、本発明の糸状菌含有物（醸造用種麹）とした。
２．胞子画分の分画（第１工程）
醸造用種麹４ｇを採取し、０．１％Ｔｗｅｅｎ−６０液中で攪拌し懸濁液を得た。この懸濁液をガーゼで濾過した後に、ろ液をメッシュサイズ７０μｍのセルストレーナー（ＢＤバイオサイエンス社製  ＢＤファルコン  セルストレーナー使用）で再度濾過しながら２５倍程度に希釈した。原料残渣や麹菌の菌糸はセルストレーナー上に残留し、胞子はろ液中に含まれる。得られたろ液を胞子画分とした。
３．胞子が発芽する条件での胞子画分の培養（第２工程）
胞子画分１０ｍｌを、あらかじめ加熱殺菌した９％マルツエキス液体培地１００ｍｌに添加し、３０℃で約３時間程度振とう培養した。
４．培養終了後の胞子内のＡＴＰ量測定（第３工程）
胞子内のＡＴＰ量は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬キット（キッコーマン社製ＡＴＰ測定キット「ルシフェール２５０プラス」）を使用して測定した。まず、３．で得た胞子画分培養液を１００倍希釈し、サンプル液とした。このサンプル液１ｍｌに「ルシフェールＡＴＰ消去試薬」（キッコーマン社製）０．１ｍｌ添加して混合し、胞子内ＡＴＰ以外の遊離ＡＴＰを消去した。サンプル液にキット付属の「ＡＴＰ抽出試薬」を添加して、胞子からＡＴＰを抽出した。次いでサンプル液にキット付属の発光試薬キットを加え、発光反応を生じさせ、ルミノメーター（キッコーマン社製  ルミテスターＫ−２００）を使用して発光量を測定した。
５．ＡＴＰ量に基づく胞子の発芽率の決定（第４工程）
以下により、目視で測定した胞子の発芽率と、胞子内のＡＴＰ量とが強い相関関係を有することが明らかとなった。ＡＴＰ量に基づく胞子の発芽率の決定が可能であることが示された。
【００１４】
（１）目視による胞子の発芽率の測定：
上記１．の方法で醸造用種麹を複数回調製し、それぞれの醸造用種麹における胞子の発芽率を目視により測定した。まず、醸造用種麹を水で２０倍に希釈し、希釈液を９％マルツエキス寒天培地に塗布した後、湿度１００％、３０℃で５時間培養した。その後、熟練した作業者が培養終了後の寒天培地を顕微鏡観察し、胞子の発芽率を目視で測定した。
（２）胞子の発芽率と、胞子内のＡＴＰ量との相関関係：
図１に示す通り、目視で測定した胞子の発芽率と、胞子内のＡＴＰ量とが強い相関関係を有することが判明した。図１のグラフが胞子の発芽率決定のための検量線として使用可能であることが明らかである。なお、濃度既知のＡＴＰ溶液の発光量を１とした相対比較値を使用することでサンプル間の比較が容易になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例５．（２）に記載した、胞子発芽率と胞子内ＡＴＰ量との相関関係を示す図。
【図１】
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