(57)【要約】【課題】インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の診断および治療に使用すること。【解決手段】ヒト６０ｋＤａ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６０）のエピトープである新規なペプチドを、ＩＤＤＭの診断および治療に使用することができる。また、このペプチドを含有する医薬組成物およびＩＤＤＭの診断に使用するためのキットも開示されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１に示すペプチドから選択されるペプチド、ならびにその塩および機能的誘導体。
【請求項２】
ｐ１２と命名した請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ｐ３２と命名した請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の診断のための請求項１に記載のペプチドの使用。
【請求項５】
患者のＩＤＤＭの初期または存在を診断するための方法であって、抗原として請求項１に記載のペプチドを用いて、ヒトｈｓｐ６０と免疫学的に反応するＴ細胞または抗体の存在について、該患者の血液または尿を試験することからなる方法。
【請求項６】
ｈｓｐ６０と免疫反応するＴ細胞または抗ｈｓｐ６０抗体の存在について患者を試験することからなり、ｈｓｐ６０と免疫反応するＴ細胞または抗ｈｓｐ６０抗体の陽性の存在を示す結果がＩＤＤＭの初期または存在の高い蓋然性を示すものである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抗ｈｓｐ６０抗体の存在について患者を試験する請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
試験方法がラジオイムノアッセイからなる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
試験方法がＥＬＩＳＡ試験からなる請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれかに記載の方法に従って抗ｈｓｐ６０抗体の存在を試験することによってＩＤＤＭの存在を診断するためのキットであって、
（ｉ）請求項１に記載のペプチドである抗原；および
（ｉｉ）検出しようとする抗ｈｓｐ６０抗体の非可変領域を認識することができるタグを付けた抗体；
を含むキット。
【請求項１１】
抗原が請求項２に記載のペプチドである請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
抗原が請求項３に記載のペプチドである請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
抗原が固相に固定されている請求項１０〜１２のいずれかに記載のキット。
【請求項１４】
ＩＤＤＭの診断においてキットを使用するための指示をさらに含む請求項１０〜１３のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
タグが、放射性同位体、酵素、発色団および蛍光団からなる群から選択される請求項１０〜１４のいずれかに記載のキット。
【請求項１６】
ｈｓｐ６０と免疫反応するＴ細胞の存在について患者を試験する請求項５または６に記載の方法。
【請求項１７】
試験方法が、以下の工程：
（ｉ）患者から得た血液試料から、Ｔ細胞を含む単核細胞分画を調製し；
（ｉｉ）該単核細胞分画に、請求項１に記載のペプチドから選択される抗原を添加し；
（ｉｉｉ）該細胞分画を、該抗原の存在下に、適当な時間、適当な培養条件下でインキュベートし；
（ｉｖ）該インキュベート期間の終了前の適当な時間に、工程（ｉｉｉ）のインキュベート細胞培養物にラベル化ヌクレオチドを添加して、該ラベル化ヌクレオチドを増殖Ｔ細胞のＤＮＡ中に導入し；そして
（ｖ）該Ｔ細胞中に導入されたラベル化ヌクレオチドの量を分析することによって、増殖Ｔ細胞の量を測定する；
を含むＴ細胞増殖試験からなる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項５、６および１７のいずれかに記載の方法に従ってｈｓｐ６０と免疫反応するＴ細胞の存在を試験することによってＩＤＤＭの存在を診断するためのキットであって、
（ｉ）請求項１に記載のペプチドから選択される抗原；
（ｉｉ）ラベル化ヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）リンパ球の培養のための適当な培地；
を含むキット。
【請求項１９】
ＩＤＤＭの診断においてキットを使用するための指示をさらに含む請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
試験方法が、以下の工程：
（ｉ）患者から得た血液試料から、Ｔ細胞を含む単核細胞分画を調製し；
（ｉｉ）該単核細胞分画に、請求項１に記載のペプチドから選択される抗原を添加し；
（ｉｉｉ）該細胞分画を、該抗原の存在下に、適当な時間、適当な培養条件下でインキュベートし；そして
（ｉｖ）応答リンパ球により培地中に分泌されるサイトカインの存在を測定する；
を含むＴ細胞サイトカイン応答試験からなる請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
サイトカインが、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦαまたはＴＧＦβである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項５、６、２０および２１のいずれかに記載の方法に従ってｈｓｐ６０と免疫反応するＴ細胞の存在を試験することによってＩＤＤＭの存在を診断するためのキットであって、
（ｉ）請求項１に記載のペプチドから選択される抗原；
（ｉｉ）リンパ球の培養のための適当な培地；および
（ｉｉｉ）応答リンパ球により培地中に分泌されるサイトカインの存在を測定するためのアッセイキット；
を含むキット。
【請求項２３】
ＩＤＤＭの診断においてキットを使用するための指示をさらに含む請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
請求項１に記載のペプチドから選択される抗原を患者に皮下注射し、検出可能な皮膚反応の出現を観察する請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
ＩＤＤＭを予防または治療するための調製物であって、以下の成分を含む調製物：
（ａ）請求項１に記載のペプチドと免疫学的に交差反応性であるペプチドまたはタンパク質に対して特異性を示すＴ細胞であって、該ペプチドの存在下にインキュベートすることによって活性化したＴ細胞；
（ｂ）照射したか、または他の方法で弱毒化した該Ｔ細胞；
（ｃ）静水圧による圧力処理、化学的架橋剤による処理、および／または細胞骨格架橋剤による処理にかけた該Ｔ細胞；
（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の断片、またはこれらから放散された表面タンパク質；または
（ｅ）該タンパク質に特異的な（ａ）の受容体の可変領域からなるペプチド、またはその塩、機能的誘導体、前駆体もしくは活性分画。
【請求項２６】
（ａ）のＴ細胞がヒトＴ細胞であり、該Ｔ細胞の特異性が該ペプチドとのインビトロ接触によって生じたものである請求項２５に記載の調製物。
【請求項２７】
Ｔ細胞が、請求項１に記載のペプチドに対してインビトロ特異性を示す請求項２５または２６に記載の調製物。
【請求項２８】
請求項１に記載のペプチドおよび薬学的に許容しうる担体を含有する医薬組成物。
【請求項２９】
ＩＤＤＭの予防または治療のための請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
ペプチドが請求項２に記載のペプチドである請求項２８または２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
ペプチドが請求項３に記載のペプチドである請求項２８または２９に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
ＩＤＤＭ治療用の医薬組成物を製造するための、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト６０ｋＤａ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６０）のエピトープである新規なペプチド、ならびに、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の診断および治療のための該ペプチドを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型糖尿病またはＩＤＤＭは、膵臓の島に位置するインスリン産生β細胞を攻撃および破壊するＴ細胞によって引き起こされる自己免疫疾患である［カスタノ（Ｃａｓｔａｎｏ）およびアイゼンバース（Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ）、１９９０］。ＩＤＤＭで終わる自己免疫過程は無症状で始まり、進行する。この疾患は、β細胞の累積損失が、残存β細胞のインスリン供給能力を越えたときにのみ臨床的に表面化する。実際のところ、臨床的ＩＤＤＭおよびグルコース定常性の崩壊は、８０〜９０％のβ細胞が免疫系によって不活性化された後にのみ起こると考えられている。即ち、ＩＤＤＭに罹患していると識別しうる患者は、β細胞の自己免疫破壊の進行段階にある。さらに、β細胞自己免疫の免疫学的マーカーの検出による初期の臨床前の糖尿病の診断は、自己免疫過程の開始後に行うことができるにすぎない。従って、治療学的な探索は、既に十分に進行している自己免疫過程の流れを変える安全な特異的かつ効果的な方法を見い出すことである。
【０００３】
本発明者らは、以前に、ヒトＩＤＤＭの信頼性の高いモデルであると考えられるＮＯＤ株マウス［カスタノおよびアイゼンバース、１９９０］において現れる自発糖尿病を研究することによって、この問題を調べた。ＮＯＤマウスは約４週齢でインスリン炎を現すが、これは穏やかな島周囲の浸潤として始まり、重篤な島内部の炎症に進行する。インスリン不全の証拠となる高血糖症は、我々のコロニーの雌では約１４〜１７週齢で始まる。３５〜４０週齢までに、ほとんど全ての雌ＮＯＤマウスは重篤な糖尿病を現し、インスリン治療がないと大部分が死亡する。雄ＮＯＤマウスは比較的低い疾患発生率を有するが、この理由は明らかではない。このＮＯＤマウスの糖尿病は、自己免疫Ｔ細胞によって引き起こされることが示されている［ベンデラック（Ｂｅｎｄｅｌａｃ）ら、１９８７］。
【０００４】
種々の抗原に対する自己抗体およびＴ細胞反応性が、ヒトＩＤＤＭ患者ならびにＮＯＤマウスにおいて検出されているが［エリアス（Ｅｌｉａｓ）、１９９４］、いずれかの単一の可能な標的抗原に対する免疫がこの疾患の一次的な原因であるか否かは明らかではない。原因の問題以上に治療の問題がある。
【０００５】
糖尿病の開始前に、ＮＯＤマウスを種々の操作、例えば食餌制限、ウイルス感染または免疫系の非特異的刺激にかけることによって、ＮＯＤマウスにおける自己免疫過程の開始を妨げうることが示された［ボウマン（Ｂｏｗｍａｎ）ら、１９９４］。また、糖尿病前のマウスにおいて抗原グルタミン酸デカルボキシラーゼに対する免疫寛容を誘導することによってＮＯＤ糖尿病を妨げることができる［カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら、１９９３；ティッシュ（Ｔｉｓｃｈ）ら、１９９３］。
【０００６】
ＮＯＤ雌マウスにおいて自然発生するインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、種々の自己抗原に対する免疫反応性に関連している［バッハ（Ｂａｃｈ）、１９９４］。これら抗原の中で注目されるのは、哺乳動物６０ｋＤａ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６０）分子の配列に由来するｐ２７７ペプチドである。これは、ヒトｈｓｐ６０分子中の残基４３７〜４６０に対応する［エリアスら、１９９１、イスラエル特許出願Ｎｏ．９４２４１、ＰＣＴ公開  ＷＯ９０／１０４４９］。このヒトｐ２７７ペプチドは、以下の配列を有する：
Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-
Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp
（配列番号１のアミノ酸４３７〜４６０）。
【０００７】
糖尿病前のＮＯＤマウスは、ｈｓｐ６０およびｐ２７７ペプチドのヒト（２）またはマウス（３）変異体に対して、自発的な糖尿病誘発性Ｔ細胞応答を示す。マウスおよびヒトのペプチドは１個のアミノ酸が異なり、免疫学的に交差反応性である（３）。マウスのある種の非糖尿病傾向の株（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６）は、外来の免疫原性キャリアー分子に共有結合によりコンジュゲート化したｐ２７７に対して免疫したときに、一時的な過血糖症およびインスリン炎を現す。また、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ株のマウスは、極めて低用量のβ細胞毒素ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（自己免疫糖尿病を誘導する）で処理した後に、ｈｓｐ６０およびｐ２７７に対して自発的なＴ細胞応答を現す（５）。
【０００８】
この疾患の発現に関与していることに加えて、ペプチドｐ２７７は自己免疫過程の治癒においても機能的であるようである：不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ；鉱油）中のｐ２７７の皮下投与は、若いＮＯＤマウス（２）または１２〜１７週齢の進行インスリン炎を有するＮＯＤマウス（６、７）において疾患進行の停止を導いた。ｐ２７７のヒト（６、７）およびマウス（３）変異体の両方が有効であった。ＭＨＣ  ＩＩ型プロモーター上のマウスｈｓｐ６０遺伝子についてトランスジェニックしたＮＯＤマウスは、ｐ２７７に対する自発的なＴ細胞増殖応答の下方調節を示し、有意の割合のマウスが糖尿病を発症しなかった（８）。さらに、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪマウスへのｐ２７７の投与は、予め極めて低用量のＳＴＺを投与しておいたマウスにおいて自己免疫糖尿病の発生を止めた（ＧＡＤ６５分子のペプチドによるこれらマウスの処置は有効ではなかった）（９）。
【０００９】
６位および１１位のシステイン残基の一方または両方をバリン残基により置換したｐ２７７ペプチドの変異体［それぞれ、ｐ２７７（Ｖａｌ６）、ｐ２７７（Ｖａｌ１１）およびｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）と命名］が、対応するイスラエル特許出願Ｎｏ．１１２０９４に記載されており、糖尿病の治療においてｐ２７７と同程度に活性であることが示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ＩＤＤＭの診断および治療に有用な別のヒトｈｓｐ６０ペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ヒトｈｓｐ６０分子のフラグメントおよびペプチドの研究において、予想外に、ＩＤＤＭ患者およびＮＯＤマウスが他のｈｓｐ６０  Ｔ細胞エピトープに応答性であり、これをＩＤＤＭの診断および治療に使用しうることを見い出した。これらのエピトープは、それ自体が、あるいはｐ２７７またはｐ２７７変異体［ｐ２７７（Ｖａｌ６）、ｐ２７７（Ｖａｌ１１）およびｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）から選択される］と組合せて、治療効果を改善することができる。
【００１２】
これら新規なペプチドを以下の表１に示す。
【００１３】
【表１】
2007119482.tif 000002
【００１４】
ｐ２７８（ヒトｈｓｐ６０配列中の４５８〜４７４位に対応）、ｐ１９（ヒトｈｓｐ６０配列中の２７１〜２９０位に対応）、ならびに、ｐ２１（ヒトｈｓｐ６０配列中の３０１〜３２０位に対応）と命名したペプチドを含むｈｓｐ６０の他のペプチドは、有効ではないことが示された。ｐ２７８のアミノ末端は３残基（ＮＥＤ）が有効なｐ２７７ペプチドと重なっており、ｐ２７８のカルボキシ末端は９残基（ＥＩＩＫＲＴＬＫＩ）が有効なｐ３２ペプチドと重なっていることに注意すべきである。即ち、ｐ３２の残りの１１残基（ＰＡＭＴＩＡＫＮＡＧＶ）が重要である。
【００１５】
即ち、本発明は、表１に示すペプチド、ならびにその塩および機能的誘導体に関する。
【００１６】
本発明の別の目的は、本発明のペプチドを用いてＩＤＤＭを早期診断するための方法およびキットを提供することである。ＩＤＤＭを発症する過程において、動物はｈｓｐ６０分子またはそれと交差反応する分子を発現し、これらは動物の血液および尿中に到達する。また、これら動物は、このような分子に特異的に指向するＴ細胞および抗体を発現する。従って、血液または尿中のｈｓｐ６０（または、それと交差反応性である分子）またはそれに特異的なＴ細胞もしくは抗体の存在は、β細胞の破壊が完了し、個体が生涯にわたる糖尿病を持つようになる前に、ＩＤＤＭ過程を検出するためのアッセイに利用することができる。
【００１７】
患者におけるＩＤＤＭの初期または存在は、本発明のペプチドｐ１２またはｐ３２を抗原として用いて、ヒトｈｓｐ６０と免疫学的に反応するＴ細胞または抗体の存在を、患者の血液または尿において試験することによって診断することができる。
【００１８】
即ち、本発明は患者のＩＤＤＭの初期または存在を診断するための方法であって、本発明のペプチドを抗原として用いて、ｈｓｐ６０と免疫反応するＴ細胞または抗ｈｓｐ６０抗体の存在について患者を試験することからなり、ｈｓｐ６０と免疫反応するＴ細胞または抗ｈｓｐ６０抗体の陽性の存在を示す結果がＩＤＤＭの初期または存在の高い蓋然性を示すものである方法を提供する。
【００１９】
ＩＤＤＭを診断するための方法においては、抗ｈｓｐ６０抗体の存在について患者を試験するが、ここでは、その試験方法はラジオイムノアッセイまたはＥＬＩＳＡ試験からなっていてよい。
【００２０】
また、ｈｓｐ６０と免疫反応するＴ細胞の存在について患者を試験することもできる。この態様の１つにおいては、この試験方法は、以下の工程：
（ｉ）患者から得た血液試料から、Ｔ細胞を含む単核細胞分画を調製し；
（ｉｉ）該単核細胞分画に、本発明のペプチドから選択される抗原を添加し；
（ｉｉｉ）該細胞分画を、該抗原の存在下に、適当な時間、適当な培養条件下でインキュベートし；
（ｉｖ）該インキュベート期間の終了前の適当な時間に、工程（ｉｉｉ）のインキュベート細胞培養物にラベル化ヌクレオチドを添加して、該ラベル化ヌクレオチドを増殖Ｔ細胞のＤＮＡ中に導入し；そして
（ｖ）該Ｔ細胞中に導入されたラベル化ヌクレオチドの量を分析することによって、増殖Ｔ細胞の量を測定する；
を含むＴ細胞増殖試験からなる。
【００２１】
上記の工程（ｉｖ）において、ラベル化ヌクレオチドは３Ｈ−チミジンであるのが好ましい。増殖Ｔ細胞の量の測定は、常法により、Ｔ細胞の刺激指数を算出することによって行う。
【００２２】
本発明のこの態様の別の例においては、この試験方法は、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）が上記のＴ細胞増殖試験の場合と同じであり、第４工程（ｉｖ）において応答リンパ球によって培地中に分泌されるＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦαまたはＴＧＦβなどのサイトカインの存在を、市販のキットを用いて常法により検出するＴ細胞サイトカイン応答試験からなる。
【００２３】
別の態様においては、本発明は、本発明のペプチドから選択される抗原を患者に皮下注射し、検出可能な皮膚反応（遅延型過敏症；ＤＴＨ）の出現を観察するインビボ法を提供する。
【００２４】
また本発明は、このようなアッセイ（検定）を行うための方法ならびにこのようなアッセイを行うためのキットに関する。これらキットを、本発明の実施に使用する種々のアッセイのいずれかを行うために調製することができる。このようなキットのそれぞれは、単一のアッセイまたは一定の多数のアッセイを行うのに必要な材料の全てを含む。例えば、抗ｈｓｐ６０抗体の存在を測定するためのキットは、固相に固定化した本発明のペプチド、ならびに、検出しようとする抗ｈｓｐ６０抗体の非可変領域を認識しうるタグを付けた抗体、例えばタグを付けた抗ヒトＦａｂを含んでいてよい。またこのキットは、キットを使用するための指示およびキット材料を保持するための容器を含んでいてよい。あらゆる通常のタグまたはラベル、例えば放射性同位体、酵素、発色団または蛍光団を用いることができる。代表的な放射性同位体は、ヨウ素−１２５またはイオウ−３５である。この目的のための代表的な酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、西洋ワサビガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれる。
【００２５】
抗ｈｓｐ６０抗体の存在を試験することによってＩＤＤＭの存在を診断するためのキットは、
（ｉ）本発明のペプチドから選択される抗原；および
（ｉｉ）検出しようとする抗ｈｓｐ６０抗体の非可変領域を認識することができるタグを付けた抗体；
を含有する。
【００２６】
ｈｓｐ６０と免疫反応するＴ細胞の存在を試験することによってＩＤＤＭの存在を診断するためのキットは、
（ｉ）本発明のペプチドから選択される抗原；
（ｉｉ）リンパ球（Ｔ細胞）の培養のための適当な培地；および
（ｉｉｉ）Ｔ細胞増殖試験のためのラベル化ヌクレオチド、または、サイトカイン試験のためのサイトカイン（例えば、インターフェロン−γアッセイキット）；
を含有する。
【００２７】
インビボ試験のためには、このキットは注射用の適当な形態にある本発明のペプチドのみを含有する。
【００２８】
さらに本発明は、ＩＤＤＭを予防または治療するための方法に関する。本発明の抗原ペプチドのワクチン接種は、抗原に対する自己免疫の特異的な下方調節を与えることができ、ＩＤＤＭの自己免疫過程に対する耐性を効果的に創製する。同じことが、このような抗原に特異的なＴ細胞（弱毒化または無毒形態にあるか、またはその抗原性を改善するように処理した後のもの）またはそのフラグメントもしくは活性分画のワクチン接種についても言える。患者が既にＩＤＤＭの臨床前の初期段階にあることが示されているときには、このような抗原またはＴ細胞（または分画）の注射はこの抗原に対する自己免疫の下方調節を創製することができ、こうして重大な永続的な損傷を受ける前に自己免疫過程を止めることができる。また、ペプチドｐ２７７によるＮＯＤマウスの処理に関連して本発明者らの実験室により最近示されているように［エリアス（Ｅｌｉａｓ）およびコーエン（Ｃｏｈｅｎ）、１９９４］、このペプチドを治療剤として用いて、相当に進行した後であっても自己免疫過程を止めることができる。
【００２９】
従って、本発明はインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を予防または治療するための調製物であって、以下の成分を含む調製物を提供する：
（ａ）本発明のペプチドと免疫学的に交差反応性であるペプチドまたはタンパク質に対して特異性を示すＴ細胞であって、該ペプチドの存在下にインキュベートすることによって活性化したＴ細胞；
（ｂ）照射したか、または他の方法で弱毒化した該Ｔ細胞；
（ｃ）静水圧による圧力処理、化学的架橋剤による処理、および／または細胞骨格架橋剤による処理にかけた該Ｔ細胞；
（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の断片、またはこれらから放散された表面タンパク質；または
（ｅ）該タンパク質に特異的な（ａ）の受容体の可変領域からなるペプチド、またはその塩、機能的誘導体、前駆体もしくは活性分画。
【００３０】
本発明の好ましい態様においては、この調製物は、本発明のペプチドとのインビトロ接触によって特異性を示すヒトＴ細胞を含有する。
【００３１】
また本発明は、薬学的に許容しうる担体、および活性成分として有効量の本発明のペプチド、その塩または機能的誘導体を含有する、ＩＤＤＭの予防または治療のための医薬組成物を提供する。
【００３２】
さらに本発明は、ＩＤＤＭを予防または治療する方法であって、それを必要としている患者に、本発明のペプチドに対して特異性を示すＴ細胞を含む調製物、または本発明のペプチド、その塩もしくは機能的誘導体を含む医薬組成物を投与することからなる方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本明細書および請求の範囲において「本発明のペプチド」またはいずれかの個々の名称、例えば「ペプチドｐ１２」または「ペプチドｐ３２」と言及するときには、糖尿病に関するペプチドの生物学的活性が保持されている限り、その塩および機能的誘導体も意図されている。
【００３４】
本発明により意図されている本発明のペプチドの「塩」とは、生理学的に許容しうる有機および無機の塩である。
【００３５】
本発明において使用する本発明のペプチドの「機能的誘導体」とは、当分野で既知の方法により、ＮもしくはＣ末端基または残基の側鎖として存在する官能基から調製しうる誘導体を包含し、これらが薬学的に許容しうるままである限り、即ち、これらがペプチドの活性を破壊せず、それを含む組成物に毒性を付与せず、かつその抗原性に悪影響を及ぼさない限り、本発明に含まれる。
【００３６】
これらの誘導体には、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第一もしくは第二アミンとの反応によって製造されるカルボキシル基のアミド、アシル部分（例えば、アルカノイルまたは炭素環式アロイル基）との反応によって生成するアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、またはアシル部分との反応によって生成する遊離ヒドロキシル基（例えば、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基）のＯ−アシル誘導体が含まれるであろう。
【００３７】
本発明のペプチドを、医薬組成物における免疫原、特にＩＤＤＭの軽減および治療のためのワクチンとして、ならびに、ＩＤＤＭの診断のための診断組成物における抗原として用いることができる。当分野で既知の方法によって製造することができるこれらの医薬および診断組成物も、本発明の一部を構成する。
【００３８】
本発明に従う治療組成物は、経口または非経口により、例えば皮下、筋肉内、静脈内、鼻内または直腸内によって投与することができる。
【００３９】
以下の実施例および添付の図面により、本発明をさらに説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４０】
（原材料および方法）
（ｉ）マウス
ＮＯＤ／Ｌｔ株のＩｎｂｒｅｄ雌マウスは、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＳｃｉｅｎｃｅのＡｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ［レホボ（Ｒｅｈｏｖｏｔ）、イスラエル］により、またはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ［バー・ハーバー（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）、メーン州］により供給されている。これらのマウスは、１４〜１７週齢のときに、ヒトのＩＤＤＭに似た自己免疫糖尿病を自然発症する。
【００４１】
（ｉｉ）抗原
ペプチドは、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＳｃｉｅｎｃｅのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにおいて、自動多ペプチド合成機［ＡｂｉｍｅｄモデルＡＭＳ４２２；ランゲンフェルト（Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ）、ドイツ］を用い、この会社のＮ−α−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）合成のためのプロトコールに従って合成した。粗生成物を、半プレパレティブＣ８−カラム［リクロソーブ（Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ）ＲＰ−８、７ｍｍ、２５０×１０ｍｍ、メルク（Ｍｅｒｃｋ）、ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、ドイツ］の逆相ＨＰＬＣによって精製した。ペプチドの溶離は、水中の０．１％トリフルオロ酢酸と水中７５％アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）の間の直線勾配によって行った。単一のペプチド生成物の純度は、分析用逆相ＨＰＬＣおよびアミノ酸分析によって確認した。ペプチドＭＴ−ｐ２７８は、ミコバクテリアｈｓｐ６０の配列に由来する（４３１〜４４７）。ペプチドｐ２７７は、６位および１１位のところに、天然配列中のシステイン（Ｃ）の代わりにバリン（Ｖ）を置換する。２個のＣ残基をＶによって置換すると、免疫学的活性に影響することなくペプチドの安定性が大きく増加するが、Ｖ置換されたペプチドは、Ｔ細胞および抗体アッセイによって天然ペプチドと完全に交差反応性である。指定がないときには、ヒト配列が意図されている。マウスｐ１２およびマウスｐ３８ペプチドは、マウスｈｓｐ６０分子から導いたが、これらはそれぞれ１６８〜１８８、４３７〜４６０および５５６〜５７３配列に対応している。ペプチドＧＡＤ−ｐ３５は、ＧＡＤ６５分子に由来する（５２４〜５４３）。本発明において使用した全てのペプチドのアミノ酸配列を以下の表２に示す。
【００４２】
【表２】
2007119482.tif 000003
【００４３】
（ｉｉｉ）ペプチドに対するＴ細胞増殖
９週齢のＮＯＤマウスまたは他の株のマウスを、完全フロイントアジュバント［ＣＦＡ；ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、デトロイト、ミシガン州］と等容量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の混合物中にペプチド（２５μｇ）を含有するエマルジョン（０．１ｍｌ）を用いて後足肉趾に免疫した。排出膝窩リンパ節を１０日後に取り、３つの重複培養物中のリンパ球の懸濁液について、文献［エリアスら、１９９１］の記載のように［３Ｈ］−チミジンの導入を用いて、種々のペプチド（５μｇ／ｍｌ）の存在下に増殖を試験した。これらの結果を刺激指数（ＳＩ）（試験ペプチドの存在下での平均ｃｐｍと、ペプチドの非存在下の対照培養物の平均ｃｐｍの比）として示す。標準誤差は、常に平均の１０％未満であった。
【００４４】
（ｉｖ）処理および後処理
ＰＢＳ中のペプチド（１００ｍｇ）を等容量のＩＦＡで乳化させ、文献［エリアスおよびコーエン、１９９５］の記載のように１０週齢のＮＯＤ雌マウスに皮下注射した。対照マウスには、等容量のＩＦＡで乳化させたＰＢＳを投与した。このマウスについて、血液グルコースセンサー［メディセンス社（ＭｅｄｉＳｅｎｓｅ．Ｉｎｃ．）、ワルザム（Ｗａｌｔｈａｍ）、マサチューセッツ州］を用いて、１０ａｍに非絶食時の血液グルコースを毎月モニターした。１１．１ｍモル／Ｌを越える血液グルコースを有するマウスを糖尿病であるとみなした。このグルコース濃度は、非糖尿病マウスにおいて測定した平均血液グルコース濃度より上の３標準偏差よりも大きかった［エリアスおよびコーエン、１９９５］。膵臓の島の組織学的検査を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した切片で行った。群の内容を知らない２人の観察者により独立して、これら切片を採点した。χ２検定を用いて種々の処理間の統計学的な差異を確かめた。
【００４５】
（ｖ）血清の抗体
マウスから毎月採血して抗体の応答を検査した。文献［エリアスら、１９９１］に記載のようにＥＬＡＳＡアッセイを行った。簡単に説明すると、平底マキシソーブ（Ｍａｘｉｓｏｒｂ）プレート［ヌンク（Ｎｕｎｃ）、ロスキルデ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ）、デンマーク］を、抗ペプチド抗体の検出のために、１００ｍｌ／ウエルのＰＢＳ中のペプチド（１０ｍｇ／ｍｌの濃度）を用いて、室温で２時間、次いで４℃で一晩インキュベートして被覆した。ペプチドとのインキュベートの後に、プレートを洗浄し、ＰＢＳ中の７％ＢＳＡ［シグマ（Ｓｉｇｍａ）］を用いて３７℃で２時間ブロックした。血清を１：５０希釈して添加し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで１００ｍｌ／ウエルのアルカリホスファターゼにコンジュゲート化したヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖Ｆｃ特異的）［ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）、フィラデルフィア、ペンシルバニア州］とともに２時間インキュベートした。洗浄した後、基質ジエタノールアミン（シグマ）とともにプレートをインキュベートし、ＥＬＡＳＡリーダーを用いて４０５ｎｍで読み取った。
【００４６】
（実施例１）ＮＯＤマウスにおけるｈｓｐ６０エピトープのマッピング
ＮＯＤマウスにおいてｈｓｐ６０ペプチドｐ１２、ｐ３２、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）およびｐ２７８の免疫原性を、上記ｉｉｉ（ａ）の記載のように、ＣＦＡ中に乳化させたペプチドを用いて後足肉趾においてマウスを免疫し、１０日後に採取リンパ節細胞の増殖応答をアッセイすることにより試験した。図２に示すように、ペプチドｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）、ｐ１２およびｐ３２は免疫原性が強く、一方、ｐ２７８は免疫原性ではなかった。
【００４７】
（実施例２）ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）、ｐ１２またはｐ３２によるＮＯＤマウスの処理
ｐ１２およびｐ３２ペプチドがｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）のように糖尿病の進行をブロックすることができるか否かを試験するために、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）、ｐ１２またはｐ３２ペプチド（ＩＦＡの乳化液０．１ｃｃ中に１００μｇ）をジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）［バー・ハーバー、メーン州］の９週齢のＮＯＤ／Ｌｔ雌マウス１０〜１２匹の群に皮下投与した。１１．１ｍモル／Ｌを越える持続的な血中グルコース濃度として決めた糖尿病を、２５週齢のときに試験した。対照マウスは、未処理またはｐ２７８により処理した。
【００４８】
表１に示すように、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）、ｐ１２およびｐ３２ペプチドは糖尿病の処置において有効であった。即ち、未処理マウスまたはｐ２７８処理マウスにおける糖尿病の発生率は９０％であり、一方、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）、ｐ１２およびｐ３２で処理したマウスは、それぞれ１０％、２０％および３０％の発生率を示す。他方、対照ｐ２７８ペプチドは治療効果を持たなかった。
【００４９】
【表３】
2007119482.tif 000004
【００５０】
２つまたは３つのｈｓｐ６０エピトープペプチドを組み合わせると、より多くのＴ細胞集団がこの治療によって影響を受けるので、１つのペプチドのみよりもさらに効果的になりうる。
【００５１】
（実施例３）ｈｓｐ６０、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１＋）、ｐ１２およびｐ３２に対してＴ細胞増殖応答を示す新たに診断されたＩＤＤＭ患者
種々のｈｓｐ６０ペプチドに対するＴ細胞応答を測定するために、新たに診断された（２週間〜４カ月）ＩＤＤＭ患者の末梢血液からのリンパ球を、増殖アッセイで試験した。血液１０〜２０ｍｌを、抗凝血薬としてヘパリンを含む滅菌試験管中に取り、ＰＢＳで１：２に希釈した。末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）を、リンパ調製層上の血液の遠心によって単離した。ＰＢＭＣの増殖を、増殖の尺度として［３Ｈ］−チミジンの取り込みを用いて、６日間、種々の抗原（１０μｇ／ｍｌ）の存在下、３重に試験した。試験した抗原は、ヒトｈｓｐ６０またはｈｓｐ６０ペプチドｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）、ｐ１２、ｐ３２および対照ペプチドｐ２７８であった。Ｔ細胞増殖応答は、刺激指数（ＳＩ）として示した。即ち、Ｔ細胞による、ペプチド刺激されたチミジン取り込みと、バックグラウンド（抗原無添加）のチミジン取り込みの間の比として示した。
結果を、以下の表４にまとめる。
【００５２】
【表４】
2007119482.tif 000005
【００５３】
患者の大部分がｈｓｐ６０に応答したこと（６／８）、およびｈｓｐ６０に応答した６人の全てが３種のｈｓｐ６０ペプチド［ｐ１２、ｐ３２またはｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）］の少なくとも１つに応答したことを見ることができる。従って、これらペプチド群への応答は、全ｈｓｐ６０分子に応答する個体を特徴づけるのに役立ちうる。
【００５４】
（実施例４）Ｔ細胞増殖応答
前糖尿病ＮＯＤマウスにおける自発的なＴ細胞応答を、マウスｐ２７７ペプチド［エリアス（Ｅｌｉａｓ）ら、１９９１；ビルク（Ｂｉｒｋ）ら、１９９６］、およびマウスｐ２７７配列を含むマウスｈｓｐ６０分子の比較的大きな断片［ビルク（Ｂｉｒｋ）ら、１９９６］に対して検出した。マウスｈｓｐ６０分子上の他のＴ細胞エピトープを検出するために、ＮＯＤマウスをｈｓｐ６０配列と重なるペプチドのプールに浸し、全マウスがマウスｐ２７７およびマウスｐ１２の両方に強い応答を示すことがわかった（図３）。ＮＯＤマウスに免疫原性の他のペプチドは、ＭＴ−ｐ２７８ペプチド［マイコバクテリアの（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）ｈｓｐ６０分子中の残基４５８〜４７４］およびＧＡＤ−ｐ３５（ＧＡＤ６５分子中の残基５２４〜５４３）である。図３は、ＭＴ−ｐ２７８がマウスｐ２７７およびマウスｐ１２と同程度に強い免疫原性であることを示す。また、ＧＡＤ−ｐ３５も免疫原性であるが比較的弱い。
【００５５】
３〜１６週齢における雌ＮＯＤマウスの長期的研究は、それらの脾臓においてマウスｐ１２に対する自発応答がないことを示した（示していない）が、マウスｐ２７７および全マウスｈｓｐ６０に対する応答が観察された。即ち、４種の免疫原性ペプチド［マウスｈｓｐ６０分子由来のｐ１２およびｐ２７７、糖尿病関連のＧＡＤ６５分子由来のＧＡＤ−ｐ３５、ならびに外来免疫原であるＭＴ−ｐ２７８］のうち、マウスｐ２７７およびＭＴ−ｐ２７８に対してのみ、自発応答が検出された。
【００５６】
（ペプチド処理）
マウスｐ２７７を用いて有効であることが示されたプロトコール（エリアスら、１９９１；エリアスおよびコーエン、１９９４；エリアスおよびコーエン、１９９５）に従って、１０週齢の雌ＮＯＤマウスの群を、ＩＦＡ中で乳化した各ペプチド（１００ｍｇ）の１回の皮下注射により処理した。８ヵ月齢まで糖尿病の発生について、マウスを観察した。図４は、マウスｐ２７７およびマウスｐ１２の両ペプチドが、糖尿病の発生抑制に効果的であったことを示す（Ｐ＜０．０５）。対照的に、ペプチドＭＴ−ｐ２７８またはＧＡＤ−ｐ３５による処理は、ＩＦＡのみによる処理と比較して差がなかった。合計３回の実験は、実質的に同じ結果を示した。
【００５７】
（抗体）
マウスペプチドｐ２７７を用いるＳＴＺ誘導された糖尿病の成功裏の処理は、多くがＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂアイソタイプである抗ペプチド抗体の出現に関連していた（エリアスおよびコーエン、１９９６）。従って、ペプチド処理したＮＯＤマウスの血清抗体を調べた。図５は、糖尿病を止めるのに効果的な２種類のペプチド、マウスｐ１２およびマウスｐ２７７が、強い抗体力価のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂアイソタイプを誘導するのにも効果的であったことを示す（Ｐ＜０．００１）。また、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ抗体の力価は、これらの群においてＩｇＧ２ａ抗体の力価よりも有意に大きかった（Ｐ＜０．００１）。ペプチドＭＴ−ｐ２７８またはＧＡＤ−ｐ３５で処理したマウスは、強く応答しなかった。即ち、ＧＡＤ−ｐ３５処理したマウスはいずれも特異的なＩｇＧ１抗体を生成せず、ＭＴ−ｐ２７８処理したマウスの２匹のみがＩｇＧ１アイソタイプの抗体を生成した。ＭＴ−ｐ２７８またはＧＡＤ−ｐ３５で処理したマウスは、有意に低い力価のＩｇＧ２ｂ抗体を生成した（Ｐ＜０．００１）。このように、糖尿病を抑制する効果は、主にＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂアイソタイプの抗体応答の誘導に関連していた。
【００５８】
効果的な治療学的応答と抗体力価との関係を、７ヵ月齢のときに個々のマウスにおいて、血中グルコース濃度を抗体濃度と比較することによって確認した。図６は、比較的高い力価の抗マウスｐ１２抗体を有するマウスが比較的低い血中グルコース濃度を有する傾向にあること、逆に言うと、マウスｐ１２処理したマウス（マウスｐ１２に対する抗体をわずかしか生成しなかった）が高い血中グルコース濃度を有する傾向にあることを示す（Ｐ＜０．００２）。
【００５９】
（考察）
この実施例で得られた結果は、マウスｈｓｐ６０分子のペプチドｐ１２が、ペプチドｐ２７７と同様、明瞭な過血糖症の発生に近いマウスの処置に有効でありうることを示す。ｐ２７７とは対照的に、糖尿病前のＮＯＤマウスの脾臓におけるｐ１２に対する自発的なＴ細胞増殖応答は観察されなかった。即ち、末梢において検出しうる自発的な抗ペプチド増殖応答は、ペプチドが糖尿病性の自己免疫過程のブロックに有効であるための要件ではない。
【００６０】
ペプチドｐ２７７が、ＮＯＤ糖尿病を調節しうる唯一のｈｓｐ６０ペプチドではないという知見は重要である。ＮＯＤ糖尿病におけるｈｓｐ６０の関与は、ｈｓｐ６０のｐ２７７ペプチドと、β細胞にさらに特異的なある種の未知分子［コーエン、１９９１］の間の類似によって生じたものであろうと考えられた。しかし、ｈｓｐ６０の２つの異なるセグメントであるｐ２７７およびｐ１２の両方が、提案されてはいるが未知であるβ細胞分子のセグメントに類似しているというのは非常に可能性が低い。ペプチド処置におけるｐ１２の有効性は、糖尿病において機能的なｈｓｐ６０様の分子がｈｓｐ６０それ自体であるという結論［ビルク（Ｂｉｒｋ）ら、１９９６］を支持する。
【００６１】
ペプチドＭＴ−ｐ２７８およびＧＡＤ−ｐ３５が糖尿病の発生を止めることができないということは、あらゆる自己抗原またはあらゆる自発的Ｔ細胞増殖抗原を用いて自己免疫過程を止めることができる訳ではないことを示す。ペプチドがＴ細胞に対する強力な免疫原性を持つという事実（未公表の観察）にもかかわらず、ＭＴ−ｐ２７８が高力価の抗体または保護を誘導することができないということは興味あることである。しかし、いずれかの特異性を有する抗体の誘導は、必ずしもＮＯＤ糖尿病に影響を与えない。即ち、高力価の抗体ならびに強力なＴ細胞応答を誘導するＢＳＡによるＮＯＤマウスの処理（示していない）は、糖尿病の発生に影響を与えない［エリアスおよびコーエン、１９９４］。我々は、ＧＡＤ−ｐ３５が他のペプチドと同程度にＴ細胞に対して強力な免疫原性であるということを観察しなかったが（図３）、ＮＯＤマウスは、これらのペプチドに対して自発的なＴ細胞応答を示すことが報告されている［カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら、１９８９］。
【００６２】
最後に、ペプチドに特異的な抗体の誘導による有効な処置の関連では、ｐ１２およびｐ２７７の治療効果が、ＩＬ−４の産生によって調節される抗体である特異的なＩｇＧ１抗体［モスマン（Ｍｏｓｓｍａｎ）およびコフマン（Ｃｏｆｆｍａｎ）、１９９３］の誘導を助けるのに寄与するＴｈ２型Ｔ細胞の活性化に関係していることが示唆される。このようなＴ細胞は、β細胞に損傷を与える原因となると考えられているＴｈ１型Ｔ細胞を抑制することができる［カッツ（Ｋａｔｚ）ら、１９９５；リブラウ（Ｌｉｂｌａｕ）ら、１９９５］。実際に、ＮＯＤ糖尿病のｐ２７７ペプチド治療は、脾臓におけるＩＬ−４およびＩＬ−１０産生Ｔ細胞の破裂ならびに脾臓および島の両方におけるＴ細胞産生ＩＮＦ−γの低下に関係していることが見い出された（未公表の観察）。ペプチド治療に応答したＴｈ２アイソタイプを有するペプチド特異的抗体の出現は、有益な応答の指標となるようである。
【００６３】
（実施例５）ＩＤＤＭ患者がＴ細胞応答を示しうる別のペプチド
２６人の新たに診断されたＩＤＤＭ患者（ＩＤＤＭ診断の１〜１６週後）を登録した。患者の年齢は５〜６０才の範囲であった。これら患者を、ヒトｈｓｐ６０、ならびにヒトｈｓｐ６０タンパク質配列の一部である表１および表５に示すヒトｈｓｐ６０合成ペプチドに対する末梢血液Ｔ細胞増殖応答についてスクリーニングした。
【００６４】
また、患者のＴ細胞について、破傷風トキソイド、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｅｃａｎｓ）およびインフルエンザなどの通常のリコール抗原に対するその増殖応答を分析し、刺激指数（ＳＩ）が２またはそれを越えるときにその応答が陽性であると採点した（後記を参照）。
【００６５】
以下のプロトコールを用いて増殖を分析した。
【００６６】
（細胞調製および細胞増殖プロトコール）
ＩＤＤＭ患者または健康な対照から、末梢血液（１０ＩＵ／ｍｌのヘパリンを追加した）（５０ｍｌ）を採取した。２倍容量のＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）を加えた。この血液−ＰＢＳ調製物を、１０ｍｌピペットを用いて混合した。フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（１０ｍｌ）を血液混合物の下に敷き、次いで、室温（２０〜２４℃）で３０分間、２，０００ｒｐｍで遠心した（ブレーキをかけて止めた）。淡黄褐色の被覆中の末梢血液Ｔ細胞を１０ｍｌピペットを用いて集め、新たな５０ｍｌ試験管に移した。３０〜４０ｍｌのＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）を、集めたＴ細胞に加えた。次いで、これを混合し、室温で２０分間、１，０００ｒｐｍで遠心した（ブレーキをかけて止めた）。
【００６７】
上清を吸引し、細胞ペレットを、ＡＩＭ−Ｖ血清不含培養培地［ギブコ（ＧＩＢＣＯ）、米国］中に再懸濁した。この培養培地は、１％ピルビン酸ナトリウム、１％Ｌ−グルタミン（各２００ｍＭ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍｌ／１０，０００ｍｇ／ｍｌ）および２％ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）（１Ｍ、ｐＨ７．３）を追加したＡＩＭ−Ｖを含有する。また、血液銀行からの１０％ＡＢ血清を追加したＲＰＭＩを使用した。次いで、細胞混合物を、室温で１０分間、２，０００ｒｐｍで遠心した（ブレーキをかけて止めた）。上清を再び吸引し、細胞ペレットを比較的少量の新鮮なＡＩＭ−Ｖ（１０〜２０ｍｌ）に再懸濁した。細胞を再懸濁し、計数した。トリパンブルーを用いて、細胞計数および生存性アッセイを行った。この工程のために、血球計および光学顕微鏡を用いた。
【００６８】
次いで、細胞濃度をＡＩＭ−Ｖ培地中の２×１０６細胞／ｍｌに調節した。ウエルあたり１００μｌの細胞を、９６ウエル微量滴定プレートの各ウエルに移した。次いで、２倍の推奨抗原濃度（以下の抗原と濃度のリストを参照）を含む培地（１００μｌ）を加えた。アッセイは４重に行った。４つのウエルについては、対照として抗原を含まない培地および細胞を用いてアッセイを行った。５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中、３７℃で７日間、プレートを培養した。培養期間の６日目に、１μＣｉ／ウエルの３Ｈ−チミジンを加えた。培養を１８時間続け、収穫した。ＤＮＡへの３Ｈ−チミジンの導入を、シンチレーション液とβ計数管リーダーを用いて測定することによって細胞増殖のアッセイを行った。
【００６９】
【表５】
2007119482.tif 000006
【００７０】
増殖応答は、Ｔ細胞ＤＮＡによって取り込まれた３Ｈ−チミジンにより測定した［エリアスら、１９９１］。１分間あたりの放射活性計測数（ＣＰＭ）を、試験抗原を含んで、または対照として抗原を含まず（培地のみ）に培養した細胞間で比較した。増殖値は刺激指数値（ＳＩ）として表示した（抗原を含むときの平均ＣＰＭを、抗原を含まないときの平均ＣＰＭで割る）。２に等しいか、またはそれより大きいＳＩ値を陽性とみなした。
【００７１】
これらの結果は、ヒトｈｓｐ６０またはｈｓｐ６０ペプチド反応性の個体の発生率が、健康人（３０％）の間よりもＩＤＤＭ患者（８４％）の間で高いことを示した。この差異のフィッシャー・イグザクト（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｅｘａｃｔ）検定のｐ値は０．００４４であり、有意性が高かった。
【００７２】
ヒトｈｓｐ６０タンパク質、ｈｓｐ６０合成ペプチドおよび種々のリコール抗原に対する、２人の代表的なＩＤＤＭ患者および１人の健康な個体の増殖応答を、図７、図８および図９に示す。表５は、ＩＤＤＭ患者が応答しなかったｈｓｐ６０合成ペプチドの２つの個々の例（ｐ１９、ｐ２１）を示すものである（図１０Ａおよび図１０Ｂをも参照）。
【００７３】
患者のそれぞれが、リコール抗原（カンジダ、破傷風またはインフルエンザ）およびヒトｈｓｐ６０タンパク質および種々のヒトｈｓｐ６０ペプチドに応答したことを見ることができる。対照の人は、対照のリコール抗原にのみ応答した。
【００７４】
ＩＤＤＭ患者の少なくとも１人が応答したｈｓｐ６０合成ペプチドの配列を表１に示す。これらペプチドのそれぞれは、ＩＤＤＭ治療のための治療学的可能性を有する。
【００７５】
【表６】
2007119482.tif 000007
【００７６】
上記の特定の態様についての説明は、本発明の全体の性質を完全に明らかにしているので、当業者の知識（本明細書中に挙げた参考文献の内容を含む）を適用することによって、本発明の全体のコンセプトから逸脱することなく、また、多くの実験を行うことなく、これら特定の態様を容易に修飾し、そして／または種々の応用に適合させることができる。即ち、このような適合化および修飾は、本明細書中に示した教示および指針に基づき、開示した態様の等価物の意味および範囲内であることが意図されている。本明細書中の表現または用語は説明のためのものであって限定のためのものではなく、本明細書の表現または用語は、当業者の知識と組合せて、本明細書中に示した教示および指針に照らして、当業者により解釈されるべきものであることを理解すべきである。
【００７７】
（参考文献）
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【００７８】
（配列表）
（１）    一般的情報
（ｉ）  特許出願人：  イェダ・リサーチ・アンド・ディベロップメント・
カンパニー・リミテッド
（ｉｉ）  発明の名称：  糖尿病の治療のためのヒト熱ショックタンパク質６０
由来の新規ペプチド、組成物、方法およびキット
（ｉｉｉ）  配列の数：  ６
（２）    配列番号１の情報
（ｉ）    配列の特徴：
（Ａ）    長さ：５７３アミノ酸
（Ｂ）    型：アミノ酸
（Ｃ）    鎖の数：一本鎖
（Ｄ）    トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）    配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）    配列：配列番号１：
【化１−１】
2007119482.tif 000008
【化１−２】
2007119482.tif 000009
（２）    配列番号２の情報
（ｉ）    配列の特徴：
（Ａ）    長さ：２４アミノ酸
（Ｂ）    型：アミノ酸
（Ｃ）    鎖の数：一本鎖
（Ｄ）    トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）    配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）    配列：配列番号２：
【化２】
2007119482.tif 000010
（２）    配列番号３の情報
（ｉ）    配列の特徴：
（Ａ）    長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）    型：アミノ酸
（Ｃ）    鎖の数：一本鎖
（Ｄ）    トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）    配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）    配列：配列番号３：
【化３】
2007119482.tif 000011
（２）    配列番号４の情報
（ｉ）    配列の特徴：
（Ａ）    長さ：１７アミノ酸
（Ｂ）    型：アミノ酸
（Ｃ）    鎖の数：一本鎖
（Ｄ）    トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）    配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）    配列：配列番号４：
【化４】
2007119482.tif 000012
（２）    配列番号５の情報
（ｉ）    配列の特徴：
（Ａ）    長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）    型：アミノ酸
（Ｃ）    鎖の数：一本鎖
（Ｄ）    トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）    配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）    配列：配列番号５：
【化５】
2007119482.tif 000013
（２）    配列番号６の情報
（ｉ）    配列の特徴：
（Ａ）    長さ：１８アミノ酸
（Ｂ）    型：アミノ酸
（Ｃ）    鎖の数：一本鎖
（Ｄ）    トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）    配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）    配列：配列番号６：
【化６】
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【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、ヒトｈｓｐ６０分子の全配列上の、本明細書中で言及したペプチドの位置を示すものである。
【図２】図２は、ヒトｈｓｐ６０ペプチドｐ１２、ｐ３２、ｐ２７７（Ｖａｌ６−Ｖａｌ１１）およびｐ２７８に対するＮＯＤマウスＴ細胞増殖を示すものである。
【図３】図３は、ペプチドに対するＮＯＤマウスのＴ細胞増殖応答を示すグラフである。３匹のＮＯＤマウスの群に、ＩＦＡ中のマウスｐ１２、マウスｐ２７７、ＧＡＤ−ｐ３５およびＭＴ−ｐ２７８ペプチドを、それぞれＩＦＡ中２５μｇの用量で与えた。１０日後に排出リンパ節を取り、５、１０、２０および５０μｇ／ｍｌの濃度の対応ペプチドに対する増殖応答を調べた。２０μｇ／ｍｌの最適濃度での刺激が示される。以下のｃｐｍ範囲が培地対照において得られた；マウスｐ１２、８８１；マウスｐ２７７、１２４３；ＭＴ−ｐ２７８、６９８；およびＧＡＤ−ｐ３５、１４３０。マウスｐ３８ペプチドはマウスｈｓｐ６０から得たペプチド（５５６〜５７３）であり、これは、試験したペプチドとの配列相同性を持たず、特異性の陰性対照として働く。これらの結果は、実施した３回の実験の代表例である。それぞれのアッセイは３回行い、棒でＳＤ値を示す。ペプチド間には交差反応性は存在しなかった（示していない）。
【図４】図４は、糖尿病に対するペプチド投与の効果を示すグラフである。１０〜２０匹のＮＯＤマウスの群を、１０週齢のときに、１００μｇのＩＦＡ中のマウスｐ１２、ｐ２７７、ｐ３５−ＧＡＤもしくはＭＴ−ｐ２７８、またはＩＦＡ単独で処理した。これらのマウスから毎月採血し、過血糖症の開始を追跡した。ＩＦＡ処理した対照群と比較したときに、ｐ１２およびｐ２７７で処理したマウスは有意に保護された（Ｐ＜０．０５）。
【図５】図５は、ペプチド処理に応答するＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体アイソタイプを示すものである。図４の説明に記載したようにマウスを処理した。個々の試料について、マウスｐ１２（Ａ）、ｐ２７７（Ｂ）、ＧＡＤ−ｐ３５（Ｃ）およびＭＴ−ｐ２７８（Ｄ）に対する抗体のＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂアイソタイプを分析した。同様の効果が２つの実験において得られた。結果は、各群の１０匹の個々のマウスの４０５ｎｍでの吸光度（ＯＤ）で示す。群ＣおよびＤと比較したときの群ＡおよびＢにおけるＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ抗体の優勢度の有意レベルは、Ｐ＜０．００１である。群ＡおよびＢにおけるＩｇＧ２ａ抗体と比較したときのＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂ抗体のレベルの間の差異は有意であった（Ｐ＜０．００１）。抗体の間には交差反応性は存在しなかった（示していない）。
【図６】図６は、抗体と血液グルコースの間の陰性の関係を示すものである。図４の説明に記載したように、ＮＯＤ雌マウスの群をｐ１２（１０匹のマウス）またはＩＦＡ単独（９匹のマウス）で処理した。抗ｐ１２特異的抗体の量（１：５０希釈した血清中のＥＬＩＳＡ  ＯＤ単位；７カ月齢のときに測定）を、血液グルコース濃度（７カ月齢のときに測定）と共にプロットする。高抗体と血液グルコースの間の関係の程度は、Ｐ＜０．００２である。
【図７】図７は、リコール抗原、ｈｓｐ６０タンパク質およびｈｓｐ６０合成ペプチドに対する、１人のＩＤＤＭ患者ドナーのＴ細胞増殖応答（ＳＩ）を示すグラフである。
【図８】図８は、リコール抗原、ｈｓｐ６０およびｈｓｐ６０合成ペプチドに対する、健康なドナーのＴ細胞増殖応答（ＳＩ）を示すグラフである。
【図９】図９は、リコール抗原、ｈｓｐ６０およびｈｓｐ６０合成ペプチドに対する、別のＩＤＤＭ患者ドナーのＴ細胞増殖応答（ＳＩ）を示すグラフである。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、ｈｓｐ６０合成ペプチドに対する、２人のＩＤＤＭ患者ドナーのＴ細胞増殖応答（ＳＩ）を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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