(57)【要約】      （修正有）【課題】標的付けられた細胞の、エフェクター細胞が媒介する致死を誘導する多重特異的分子を提供する。【解決手段】抗原提示細胞の表面上の成分に対する二つ以上の結合特異的部分と、前記結合特異的部分に結合した少なくとも一つの抗原とを包含した多重特異的分子複合体。結合する標的の一つは、免疫細胞表面上のＦｃ受容体である。これら分子を用いて、自己抗原などの通常は非免疫原性のタンパク質に対して、インビボ又はインビトロで免疫反応を誘導又は向上させうる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）抗原提示細胞の表面上の成分に対する二つ以上の結合特異的部分と、
（ｂ）前記結合特異的部分に結合した少なくとも一つの抗原と
を包含した分子複合体であって、前記成分が、前記結合特異的部分を結合させたときに前記分子複合体の内部移行を媒介する、分子複合体。
【請求項２】
前記複合体が三つ以上の結合特異的部分を包含する、請求項１に記載の分子複合体。
【請求項３】
前記結合特異的部分が抗体又はその抗原結合フラグメントを包含する、請求項１又は２に記載の分子複合体。
【請求項４】
前記結合特異的部分の少なくとも一つが、抗原提示細胞上のFc受容体（FcR）（例えばFcγ受容体又はFcα受容体）に結合する、請求項１乃至３のいずれかに記載の分子複合体。
【請求項５】
前記結合特異的部分の一つ以上が、H22（ATCC預託番号CRL11177）、M22（ATCC預託番号HB12147）、M32.2（ATCC預託番号HB9469）及びこれらの抗原結合フラグメントから選択される抗体を包含する、請求項１乃至４のいずれかに記載の分子複合体。
【請求項６】
前記結合特異的部分が、前記細胞表面成分の同じエピトープ又は異なるエピトープに結合するか、又は、前記結合特異的部分が異なる細胞表面成分に結合する、請求項１乃至５のいずれかに記載の分子複合体。
【請求項７】
前記抗原が、腫瘍抗原、自己抗原（autoantigen）及び自己抗原（self antigen） からなる群より選択され、及び／又は、前記抗原が、FcγRIに結合する（例えば前記抗原がH22（ATCC預託番号CRL11177）、M22（ATCC預託番号HB12147）、M32.2（ATCC預託番号HB9469）及びこれらの抗原結合フラグメントから選択される抗体を包含するなど）、請求項１乃至６のいずれかに記載の分子複合体。
【請求項８】
抗原に対する免疫応答を誘導又は向上させる医薬品の製造における、請求項１乃至７のいずれかに記載の分子複合体の利用。
【請求項９】
被験体を免疫処置するための医薬品の製造における、請求項１乃至７のいずれかに記載の分子複合体の利用。
【請求項１０】
抗原を抗原提示細胞に接触させる段階を包含する、抗原提示細胞による試料中の抗原提示を誘導又は向上させる方法であって、前記抗原が、抗原提示細胞の表面上の成分に対する二つ以上の結合特異的部分に結合させてあり、前記成分が、前記結合特異的部分を結合させたときに前記抗原の内部移行を媒介する、方法。
【請求項１１】
前記抗原が三つ以上の結合特異的部分に結合させてある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記結合特異的部分が、抗体又はその抗原結合フラグメントを包含する、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体がFc受容体（FcR）に結合する、請求項１０乃至１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原が、腫瘍抗原、自己抗原（autoantigen）及び自己抗原（self antigen） からなる群より選択される、請求項１０乃至１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願 
本願は、１９９９年７月３０日に出願された米国出願第０９／３６４，０８８号の一部継続出願であり、それは１９９８年１１月６日に出願された米国出願第０９／１８８，０８２号の一部継続出願であり、それは発行された米国特許第５，８３７，２４３号となっている、１９９６年６月７日に出願された米国出願第０８／６６１，０５２号の一部継続であって、それは１９９５年６月７に出願され、「抗Ｆｃ受容体抗体からなる治療用化合物」と題された米国出願第０８／４８４，１７２号の一部継続出願である。上記の各出願の全ての内容及びそこに引用された全ての参照文献、発行された特許及び公開特許出願は、本明細書に言及により編入される。 
【０００２】
発明の背景 
免疫グロブリン（Ｉｇ）は、二つのＨ鎖と二つのＬ鎖からなり、それぞれの鎖は、Ｎ（ＮＨ２）末端抗原結合可変ドメインと、抗体のエフェクター機能を担うＣ（ＣＯＯＨ）末端恒常ドメインと、を含む。免疫グロブリンのＨ鎖のＣ末端ドメインは、Ｆｃ（結晶断片）領域を形成し且つＦｃ受容体（ＦｃＲ）として知られる特異的な受容体との相互作用を介して細胞活性を惹起させることに関与する。全ての免疫グロブリンのクラス、もしくはアイソタイプ、に関するＦｃ受容体（例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ特異的Ｆｃ受容体、ＦｃγＲ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ特異的Ｆｃ受容体、ＦｃεＲ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ特異的Ｆｃ受容体、ＦｃαＲ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ特異的Ｆｃ受容体、ＦｃμＲ）および免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ特異的Ｆｃ受容体、ＦｃδＲ）が特定されている。種々のアイソタイプの抗体の様々な生物学的活性の一部は、種々の免疫（エフェクター）細胞表面上で発現した種々のＦｃ受容体に結合するこれらアイソタイプの能力による（Fridman, W.H.(Sept. 1991) The FASEB Jounal Vol. 5. 2684-2690）。ＦｃＲを標的にするマウス抗体が作製されている（例えば、「ヒト一核性貪食細胞上の、免疫グロブリンＧに関するＦｃ受容体に対するモノクローナル抗体」と題された米国特許第４，９５４，６１７号および「免疫グロブリンＡ受容体に関して特異的なモノクローナル抗体」と題された国際特許出願公報第ＷＯ９１／５８７１号を参照されたい）。 
【０００３】
マウスのモノクローナル抗体は、ヒトの治療に有用であり、かつ肝炎又はヒト免疫不全ウイルスのような病原体によって汚染されることなく作製できる。しかし、マウスのモノクローナル抗体をヒトの治療に用いると、これら「異物の」マウスのタンパク質に対する免疫反応が生じる場合がある。こうした反応は、ヒト抗マウス抗体、即ちＨＡＭＡ反応（Schroff, R. et al. Cancer Res., 45, 879-885）と呼ばれており、ヒトの血清病を発症させかつ個体の血中からマウス抗体の急速なクリアランスが生じる一つの状態である。ヒトの免疫反応は、マウスの免疫グロブリンの可変および恒常領域の双方に対するものであることが分かっている。 
【０００４】
組換えＤＮＡ技術を用いることで、例えば、一つの種から得た特異的な免疫グロブリン領域を、別の種から得た免疫グロブリン領域で置換することによって、抗体を変更させることができる。Neuberger等（特許協力条約に基づく特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８５／００３９２号）が、ある種から得た免疫グロブリン分子の相補的なＨ鎖およびＬ鎖可変ドメインを、別の種から得た免疫グロブリンの相補的なＨ鎖およびＬ鎖恒常ドメインと結合可能にする方法を記載している。こうした方法を用いることで、マウスの恒常領域ドメインで置換して、ヒトの治療に使用可能な「キメラ」抗体を作製してもよい。Neuberger等の記載のように作製されたキメラ抗体は、補体結合のような抗体媒介エフェクター機能を効率的に刺激するヒトＦｃ領域を有しているが、マウスの（「異物の」）可変領域に対するヒトの免疫反応を誘発するポテンシャルを依然として保有する。 
【０００５】
Winter（英国特許出願第ＧＢ２１８８５３８Ａ号）が、相補性決定領域（ＣＤＲ）を、別の種から得た相補性決定領域で置換することによって、抗体を変更する方法を記載している。この方法を用いることで、ヒトのＨ鎖およびＬ鎖免疫グロブリン可変領域ドメインを、所望の特性（例えば、ヒトの病原体に対するような）を有するモノクローナル抗体のマウス可変領域ドメインから得たＣＤＲに置換してもよい。このような変更された免疫グロブリン可変領域は、次にヒト免疫グロブリン恒常領域と結合して、置換されたマウスＣＤＲを除いて、組成が完全にヒトである抗体を作製することができる。Winterの記載による「再構築された」つまり「ヒト化された」抗体は、マウスの成分が著しく少ないので、キメラ抗体に比べて、ヒトにおける免疫反応が著しく抑制されるようになる。さらに、血中における変更された抗体の半減期は、本来のヒト抗体の半減期にほぼ等しいはずである。しかし、Winterが述べているように、ウイルス性もしくは病原性のタンパク質のような抗原に関して特異的な、別の抗体から得た相補的なＣＤＲで、ヒトのＣＤＲを置き換えるだけでは、所望の結合能を保持する変更された抗体が必ずしも得られるとは限らない。実際に、抗体可変領域のフレームワークにおけるアミノ酸には、これらのＣＤＲを構成するアミノ酸残基と相互作用するものがあり、抗原結合を再生するにはヒトの免疫グロブリン領域にアミノ酸置換が必要となる場合が多い。 
【０００６】
抗Ｆｃ受容体部分と抗標的部分とを包含する二重特異的分子（例えば、異種抗体）が調製され、例えば、癌（乳癌又は卵巣癌など）又は病原性感染症（ヒト免疫不全ウイルスなど）処置などの治療に用いられている（例えば、「二重エフェクター機能を有する二重特異的異種抗体」と題した国際特許出願公開第ＷＯ９１／０５８７１号および「ＡＩＤＳ治療のための二重特異的試薬」と題した国際特許出願公開第ＷＯ９１／００３６０号を参照されたい）。さらに、抗原および抗原提示細胞を認識する二重特異的分子を被験体に投与して免疫反応を刺激することができる（例えば、「二重特異的試薬で標的を決められた免疫刺激」と題した国際特許出願公開第ＷＯ９２／０５７９３号を参照されたい）。 
【０００７】
発明の概要 
本発明は、組換え及び化学合成された、免疫細胞を標的にする多重特異的分子を提供する。これらの分子が「多重特異的」であるのは、これらが多くの（二つ又はそれ以上の）別個の標的に結合するからであり、それらの標的の一つに、エフェクター細胞及び／又は抗原提示細胞（ＡＰＣ）のような免疫細胞の表面上の分子がある。好適な免疫細胞標的には、Ｆｃ受容体、具体的には、ＩｇＤ特異的Ｆｃ受容体Ｉ型（ＦｃδＲＩ）およびＩｇＡ特異的Ｆｃ受容体（ＦｃαＲ）が含まれる。 
【０００８】
一実施例においては、本発明の多重特異的分子は、エフェクター細胞表面上のＦｃ受容体のような分子に結合する少なくとも一つの部分と、腫瘍細胞又は病原体の表面上の抗原のような異なる標的に結合する少なくとも一つの部分（例えば、二つ、三つ又はそれ以上の部分）とからなる分子を含む。よって、これらの分子を用いることで、エフェクター細胞を媒介にして標的の脱離を誘導することができる。好適な実施例においては、これらの多重特異的分子は、結合特異的部分として、ヒト抗体又はヒト化抗体（もしくは抗体フラグメント）を包含する。 
【０００９】
別の実施例においては、本発明の多重特異的分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面上の、一つ又はそれ以上の抗原と結合したＦｃ受容体のような分子に結合する多くの（即ち、二つ又はそれ以上の）部分からなる抗原「マルチマー複合体」を含む。自己抗原のような、ＡＰＣに対するこれらのマルチマー複合体標的抗原は、ＡＰＣによる抗原のエンドサイトーシス、プロセシング及び／又は提示を誘導及び／又は増強する。よって、これらの分子を用いて、自己抗原のような通常は非免疫性のタンパク質に対して、インビビオ又はインビトロの何れでも免疫反応を誘導又は増強させることができる。 
【００１０】
別の態様においては、抗Ｆｃ受容体部分及び抗標的部分を少なくとも包含し、随意に、第三の標的に対して向けられた第三の部分を包含する多重特異的分子を特徴とする。この第三の部分は、本明細書において「抗増強因子」（抗ＥＦ）とも呼ばれるが、例えば、これらの抗体もしくは抗体フラグメント、又は細胞受容体リガンドでもよい。好適な一実施例においては、多重特異的分子は、結合特異的部分として、ヒト又はヒト化抗体（もしくは抗体フラグメント）を包含する。 
【００１１】
別の態様においては、多重特異的分子を作製する方法を特徴とする。一実施例においては、両方の特異的部分が同じベクターにおいてコード化され、また、例えば、二重特異的分子又は融合タンパク質として、一つの宿主細胞において発現かつ結合される。別の一実施例では、それぞれの結合特異的部分は、別々に生成された（例えば、組換え型で）後、例えば、抗体の場合では、Ｈ鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して相互に化学的に共役される。 
【００１２】
さらに別の態様においては、本発明は、少なくとも一つの抗原に結合した二つ又はそれ以上の結合特異的部分を包含する多重特異的分子（本明細書において「抗原マルチマー複合体」とも呼ぶ）を特徴とする。これらの結合特異的部分は、抗原提示細胞の表面上の成分（Ｆｃ受容体のような）に結合され、このＦｃ受容体は、これらの結合特異的部分と結合されると分子複合体の内部移行に介在する能力を有する。好適な一実施例においては、この分子複合体は、三つ又はそれ以上の結合特異的部分を包含し、かつこれらの結合特異的部分の内の少なくとも一つが、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃδＲＩ又はＦｃαＲ）に対して特異的である。特に好適な一実施例においては、抗原は、非複合体の形態で投与される場合は、非免疫原性である。 
【００１３】
本発明はまた、被験体に本発明の抗原マルチマー複合体を投与することによって、被験体における抗原に対する免疫反応を誘導又は増強させる方法を特徴とする。さらに本発明は、被験体に本発明の抗原マルチマー複合体を投与することによって、被験体を免疫化する方法も含む。 
【００１４】
本発明の多重特異的分子はまた、それらの能力に基づいて多くの免疫治療で用いられ、エフェクター細胞が介在して標的細胞を殺す。一つの具体的な実施例においては、多重特異的分子を用いて腫瘍細胞の変種を殺したり、又はその成長を阻害したりする。 
【００１５】
詳細な説明 
多重特異的分子 
本発明は、免疫細胞を標的にする組換え及び化学合成された多重特異的分子に関する。これらの分子が「特異的」であるのは、それらが多数の（二つ又はそれ以上の）、別個の標的に結合するからであり、その標的の一つは免疫細胞表面上の分子である。一実施例においては、本発明の多重特異的分子は、エフェクター細胞表面上の分子、好ましくはＦｃ受容体に結合する少なくとも一つの部分からなる分子と、腫瘍細胞又は病原体上の抗原のような種々の標的に結合する少なくとも一つの部分（例えば、二つ、三つ、四つ又はそれ以上の部分）と、からなる分子を含む。別の実施例においては、本発明の多重特異的分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面上の、一つ又はそれ以上の抗原と結合したＦｃ受容体のような分子に結合する多くの（即ち、二つ又はそれ以上の）部分からなる抗原「マルチマー複合体」を含む。ＡＰＣに対するこれらのマルチマー複合体標的抗原（自己抗原のような）は、ＡＰＣによる抗原のエンドサイトーシス、プロセシング及び／又は提示を誘導及び／又は増強する。よって、これらの分子を用いて、自己抗原のような通常は非免疫性のタンパク質に対して、インビボ又はインビトロの何れでも免疫反応を誘導又は増強させることができる。 
【００１６】
特に好適な実施例においては、本発明の多重特異的分子は、Ｆｃ受容体、典型的にはＦｃδＲ（例えば、ＦｃδＲＩ）又はＦｃαＲに結合する、ヒト又はヒト化（キメラ）抗体もしくは抗体フラグメントを含む。これらの多重特異的分子はさらに、別の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）表面上の抗原に結合する、リガンド及び／又は別のヒト抗体もしくは抗体フラグメントのような一つ又はそれ以上の結合特異的部分を含む。このような多重特異的分子は、化学的に結合させるか或いは融合タンパク質として遺伝子的に発現させることができる。さらには、これらの分子は、例えば、ＦｃδＲＩ又はＦｃαＲを介してエフェクター細胞を標的にするので、それらを用いてエフェクター細胞（例えば、多形核好中球（ＰＭＮ）、マクロファージ及び単球）を媒介にして標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を殺すのを誘導できるし、或いは抗原に結合されている場合は、それらの分子を用いて抗原提示（ＡＰ）エフェクター細胞（例えば、樹状細胞）による抗原提示を増強させることもできる。 
【００１７】
本明細書において本発明の多重特異的分子を記載するのに用いる場合は、「に結合する部分」という用語は、「に関する結合特異的部分」という用語と同義に用いられる。両者は、標的エピトープに結合する多重特異的分子の領域を指す。以下にさらに記載する如く、これらの部分もしくは結合特異的部分には、抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又は単鎖Ｆｖ）及びそれらのミメティック（例えば、ペプチド、抗体もしくは抗体フラグメントの結合を「模倣する」化学的及び有機的ミメティック）を含むが、これらに限定されない、標的エピトープに結合する能力がある任意の化合物が含まれる。適切な抗体および抗体フラグメントには、マウス、ヒト化（キメラ）、単鎖およびヒトのモノクローナル抗体及びそのフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。一実施例においては、これら結合特異的部分には、Ｈ２２（ＡＴＣＣ預託番号ＣＲＬ１１１７７）、Ｍ２２（ＡＴＣＣ預託番号ＨＢ１２１４７）、Ｍ３２．２（ＡＴＣＣ預託番号ＨＢ９４６９）から選択した一つ又はそれ以上の抗体及びその抗原結合フラグメントが含まれており、それらの各々が、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）に結合する。ヒト化抗体Ｈ２２及びそのマウス同等物Ｍ２２は、自然のリガンド（ＩｇＧ）結合部位の外でＦｃγＲＩに結合する利点を提供し、よってインビボ投与時に内生的リガンドによって妨害又は排除されることがない。他の実施例においては、これらの結合特異的部分には、ＦｃαＲ（ＣＤ８９）に結合するヒトモノクローナル抗体１４．１及びＨＥＲ２に結合するヒトモノクローナル抗体３．Ｆ２から選択された一つ又はそれ以上の抗体が含まれる。 
【００１８】
ここで使用する、抗体の「抗原結合性部分」（もしくは単に「抗体部分」）という用語は、  ある抗原（例えば、Ｆｃ受容体）に特異的に結合した能力を保持する抗体の一つ又はそれ以上のフラグメントを指す。ある抗体の抗原結合作用が、完全長抗体のフラグメントによって実現され得ることが分かっている。抗体の「抗原結合性部分」という用語で網羅される結合フラグメントの例には、（ｉ）抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）、即ち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＨＩドメインからなる１価フラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、即ち、ヒンジドメインにおいてジスルフィド架橋によって結合された二つのＦａｂフラグメントを包含する２価フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨＩドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989）Nature 341: 544-546）及び（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖフラグメントの二つのドメイン、即ち、ＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によって遺伝コードを指定されるが、これらのドメインは、組換え法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域が対になって１価分子を形成する単一タンパク質鎖としてこれらのドメインを形成させることができる合成リンカーによって結合し得る（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として既知であり、例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい）。このような単鎖の抗体が、抗体の「抗原結合性部分」という用語に網羅されることも思料する。これらの抗体フラグメントは、当業者に既知の通常の技法を用いて得られ、また無傷の抗体と同じ態様で、スクリーニングされて利用される。 
【００１９】
Ｉ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的にする抗原マルチマー複合体を包含する多重特異的分子 
【００２０】
本発明の抗原マルチマー複合体は、抗原提示細胞の表面上の、一つ又はそれ以上の抗原に結合した成分（ＡＰＣ細胞表面成分）を標的とする複数の部分又は結合特異的部分を含む。多重結合特異的部分は、ＡＰＣ細胞表面成分上の同じか又は異なるエピトープ、又は種々のＡＰＣ細胞表面成分と結合することができる。好適な一実施例においては、マルチマー複合体は、一つ又はそれ以上のＡＰＣ細胞表面成分に関して少なくとも三つのこれら結合特異的部分を含む。ＡＰＣ表面の標的にするのに適切な成分には、結合特異的部分によって結合されると、結合特異的部分に結合した抗原が効率よく内部移行され且つＡＰＣによって提示されるように、その内部移行を媒介するものが含まれている。 
【００２１】
ここで用いられているように、「抗原提示細胞」もしくは「ＡＰＣ」という用語は、免疫系（例えば、クラスＩＩＭＨＣ制限ヘルパーＴリンパ球）によって認識され得るような態様で、抗原決定因子が、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ)としてこの細胞表面に提示されるように、抗原を内部移行且つプロセシングする能力を有する免疫細胞を指す。細胞をＡＰＣとして機能させることができる必須の二つの特性は、内部移行された抗原を、プロセシングする能力及びクラスＩＩＭＨＣ遺伝子産生物の発現である。最もよく定義された、ヘルパーＴ細胞に関するＡＰＣには、単核貪食細胞（例えば、マクロファージ）、Ｂリンパ球、樹状細胞、皮膚のランゲルハンス細胞及び、ヒトにおいては、内皮細胞が含まれる。 
【００２２】
好適な一実施例においては、結合特異的部分の標的となるＡＰＣ細胞表面成分は、Ｆｃ受容体、典型的にはＦｃγＲである。したがって、本発明の一実施例では、マルチマー複合体は、ＦｃγＲＩ上の種々のエピトープを標的にする多重結合特異的部分（例えば、二つ又はそれ以上の、好ましくは三つ又はそれ以上の）を含む。あるいは、このマルチマーは、ＦｃγＲＩ上の同一のエピトープを標的にする多重結合特異的部分を含んでもよい。しかし、他の適切なＡＰＣ細胞表面成分を標的にすることもできる。このような成分の識別は、例えば、ある動物（例えば、ヒトＦｃγＲＩに関して遺伝子導入したマウス）をＡＰＣで免疫化し、例えば、標準的（ウェスタン法など）アッセイなどを用いて、その動物から採取した血清が結合した細胞表面成分を測定することによって可能となる。次に、これらのＡＰＣ細胞表面成分は、この成分と結合する化合物を内部移行する能力の有無を実験できる。 
【００２３】
したがって、一実施例においては、マルチマー複合体は、少なくとも一つの抗体もしくはそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又は単鎖Ｆｖ）を含み、この抗体もしくはそのフラグメントは、ヒトの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）受容体（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））等のＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）のような、一つのＦｃ受容体に結合する。好適なＦｃガンマ受容体は、高親和性Ｆｃガンマ受容体、即ち、ＦｃγＲＩである。しかし、他のＦｃ受容体、例えば、ヒトの免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）受容体（ＦｃαＲＩ等）等も標的にしてもよい。Ｆｃ受容体は、ＡＰＣ（例えば、単球もしくはマクロファージ）の表面上に存在している。一実施例においては、マルチマー複合体は、受容体の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ又はＩｇＡ）結合部位とは別個の部位においてＦｃ受容体に結合する。したがって、マルチマー複合体の結合が、生理学的レベルの免疫グロブリンによっては妨害されることはない。好適なヒト化された抗ＦｃγＲモノクローナル抗体は、国際特許協力条約に基づく特許出願第ＷＯ９４／１０３３２号及び米国特許第４，９５４，６１７号において記載されており、それらの教示は、言及により本明細書に全て編入されている。 
【００２４】
本明細書の例において記載の如く、本発明の抗原マルチマー複合体に用いるのに適切な、特定のヒト化された及びマウスのモノクローナル抗ＦｃγＲＩ抗体及び抗体フラグメントは、ヒト化抗体Ｈ２２（ＡＴＣＣ預託番号ＣＲＬ１１１７７）、そのマウス対応物Ｍ２２（ＡＴＣＣ預託番号ＨＢ１２１４７）及びマウスＭ３２．２（ＡＴＣＣ預託番号ＨＢ９４６９）と、これらの抗体の抗原結合フラグメントとを含むが、これらに限定されない。 
【００２５】
ＡＰＣを標的にする本発明のマルチマー複合体はさらに、一つ又はそれ以上の抗原を含む。ここで用いる「抗原」という用語は、免疫細胞によって認識され得る（例えば、Ｔ細胞を介した免疫反応のように免疫反応を惹起するような）任意の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物など）を指す。抗原の中には、通常は宿主内に存在するが、その宿主からの免疫反応を惹起することがない（つまり、その免疫系が抗原を「異物」ではなく「自己」と認識するからである）「自己抗原」（self antigens or autoantigens）が含まれる。疾患の中には、通常は宿主内に存在せず、よって宿主の免疫系による免疫反応を惹起するはずの抗原が免疫反応を起こさないものがある。換言すれば、これらの抗原は、宿主の免疫系による認識を「逃れる」のである。このような抗原には、例えば、ある種の腫瘍抗原及び病原性の（ウイルス及び細菌性）抗原が含まれる。このような状態においては、抗原又は抗原を産生する細胞／生体が宿主から排除するべく、免疫細胞がその抗原を認識するのを誘導又は増強させるようにその抗原を改変することが望ましいであろう。換言すれば、免疫細胞がその抗原をもはや「自己抗原」として認識しないように、その抗原を変更する。 
【００２６】
本発明の抗原マルチマー複合体は、ここで記載されるように、当該分野で周知の標準的な架橋試薬及び共役プロトコルを用いて、ＡＰＣ表面の成分に関する多数の（二つ又はそれ以上の）結合特異的部分に、一つ又はそれ以上の抗原を化学的に結合することによって調製できる。あるいは、抗原マルチマー複合体は、同様にここで記載されるように、単一の融合タンパク質として組換えによって作製することができる。 
【００２７】
したがって、さらに別の実施例においては、本発明は抗原マルチマー複合体をコード化する核酸を提供する。一般的には、核酸は、発現ベクター内で、マルチマー複合体の発現を制御する促進因子（プロモーター）及び他の遺伝子調節配列に作用的に結合する。核酸は、それが別の核酸配列と作用的な関係に配置されると、「作用的に結合」すると言う。例えばプロモーター又はエンハンサーは、それが配列転写に作用する場合、コードする配列に作用的にする。転写調節配列に関しては、作用的に結合する、とは、結合されるＤＮＡ配列が連続しており、且つ二つのタンパク質をコードする領域を結合する必要のある箇所では、連続かつ解読枠内にあることを意味する。スイッチ配列に関しては、作用的に結合する、とは、それらの配列がスイッチ組換えを引き起こすことを意味する。 
【００２８】
ここで用いる「ベクター」という用語は、一つの核酸分子であり、それに結合された別の核酸を輸送する能力を有する核酸分子を指すものとする。一つのベクターのタイプは、「プラスミド」であり、付加的ＤＮＡ染色体部分が結合することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルス性ベクターであり、付加的ＤＮＡ染色体部分がウイルスのゲノムに結合できる。あるベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的複製ができる（例えば、細菌性複製起点を有する細菌性ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞へ導入されると、その宿主細胞のゲノムと一体化することができ、それによってその宿主ゲノムと共に複製される。更に、あるベクターは、それらが作用的に結合する遺伝子の発現を支配することができる。本明細書では、このようなベクターを、「組換え発現ベクター」（もしくは単に「発現ベクター」）と呼ぶ。一般的には、組換えＤＮＡ技術において利用される発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であり、本明細書においては、「プラスミド」及び「ベクター」を同義で用いることができる。しかし、本発明は、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連性ウイルス）のような、同等の作用を果たすこのような他の発現ベクターの形態も含めることを思料する。 
【００２９】
ここで用いられる「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）という用語は、組み換え発現ベクターが導入された細胞を指すものとする。このような用語は、特定の被験体細胞ばかりでなく、このような細胞の子孫をも指すものであることを理解すべきである。世代が続く内に変異又は環境の影響の何れかによって何らかの変更が生じることがあるので、このような子孫は、実際には親細胞とは同一でないことがあり得るが、本明細書において用いられる「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として包含される。 
【００３０】
本発明の抗原マルチマー複合体は、免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）による、抗原の内部移行、プロセシング及び発現を誘導又は増強させるのに用いることができる。したがって、本発明はさらに、被験体に有効量の抗原マルチマー複合体を投与することによって、抗原に対する免疫反応を誘導又は増強する方法を提供する。例えば、抗原マルチマー複合体を投与して、自己抗原（免疫系によって認識されない腫瘍抗原を含む）に対する免疫反応を誘導したり、或いは腫瘍抗原もしくは病原体の成分のような抗原に対する免疫反応を増強する。よって、抗原マルチマー複合体は、宿主を免疫化するワクチンとして用いることもできる。 
【００３１】
ＩＩ．エフェクター細胞を標的にする多重特異的分子 
【００３２】
本発明の多重特異的分子はまた、エフェクター細胞を標的として、例えば、標的細胞、病原体、アレルゲン又は他の実体をエフェクター細胞を介して排除するように設計された分子を含む。したがって、本発明は、別の態様においては、エフェクター表面の成分、典型的にはＦｃ受容体に結合する少なくとも一部分と、腫瘍細胞又は病原体表面の抗原のような別の標的に結合する少なくとも一部分（例えば、二つ、三つ、四つ又はそれ以上の部分）と、からなる多重特異的分子を提供する。 
【００３３】
ここで用いられる「エフェクター細胞」は免疫細胞を言う。特異的なエフェクター細胞は、特異的なＦｃ受容体を発現し、かつ特異的な免疫作用を果たす。例えば、単球、マクロファージ、好中球及び樹状細胞は、ＦｃγＲＩ及びＦｃαＲを発現するが、それらは標的細胞を特異的に殺すこと及び免疫系の他の成分に対して抗原を提示することの双方に関与している。よって、ＦｃγＲＩ及びＦｃαＲは、これらのエフェクター細胞タイプのそれぞれの表面上おいて発現するので、それらの受容体は、本発明において使用するのに好ましいトリガー標的である。さらに、エフェクター細胞上の特定のＦｃＲの発現は、サイトカインのような体液性因子によって制御され得る。例えば、ＦｃγＲＩは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）によって上方制御されることが分かっている。このような増強された発現によって、ＦｃγＲＩ細胞の標的に対する細胞障害活性が増大する。 
【００３４】
エフェクター細胞を標的にする多重特異的分子は、Ｆｃ受容体のような、エフェクター細胞表面の成分に結合する一つ又はそれ以上の結合特異性もしくは部分を有している。一実施例においては、この結合特異的部分は、本明細書で既に記載した如く、抗体又は抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’又は単鎖Ｆｖ）によって提供される。一実施例では、この抗体又は抗体フラグメントは、ヒトのものであるか又はヒト化されている（即ちヒト抗体由来であるが、非ヒト抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部分を有しており、この部分は、例えば、ヒトＦｃ受容体に関する、ヒト化抗体の特異的部分を提供するように選択されている）。ヒト化抗体は、非ヒト抗体由来のＣＤＲを有するが、この抗体分子の残余の部分はヒトである。 
【００３５】
この抗体は、完全なもの、即ちＨ及びＬ鎖又は、例えば、Ｆａｂもしくは（Ｆａｂ’）２フラグメント等、その任意のフラグメントを有していてもよい。この抗体はさらに、Ｌ鎖二量体もしくはＨ鎖二量体、又はＦｖ又は単鎖構成体のような、その最小限の任意のフラグメントであってもよく、これらのフラグメントは、Ladner等（１９９０年８月７日付けで発行された米国特許第４，９４６，７７８号）において記載されており、その内容は言及により明示的に本明細書に編入されている。このヒト化抗体又はフラグメントは、非ヒトＣＤＲを保持できる任意のヒト抗体でよい。好適なヒト抗体は、Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）に関する既知のタンパク質ＮＥＷＭ及びＫＯＬ、及び免疫グロブリンκ鎖可変領域（ＶＫ）に関するタンパク質ＲＥＩから由来するものである。 
【００３６】
ヒト抗体へ挿入された非ヒトＣＤＲの部分は、ヒト化抗体がＦｃ受容体に結合できるように十分な部分が選択される。十分な数の部分を選択するには、このＣＤＲの一部をヒト抗体へ挿入し、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）を用いて作製されたヒト化抗体の結合能を実験することで可能である。 
【００３７】
あるヒト抗体のＣＤＲの全てを、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部分と置換しても、或いはこれらのＣＤＲの幾つかだけを非ヒトＣＤＲと置換してもよい。ただ必要なことは、Ｆｃ受容体にヒト化ＣＤＲを結合させるのに必要な数のＣＤＲを置換することである。マウスモノクローナル抗体（ｍａｂ）、即ち、ｍａｂ２２由来の非ヒトＣＤＲは、その内容を言及により本明細書に全て編入する国際特許出願公開第ＷＯ９４／１０３３２号において記載されている。このｍａｂ２２抗体は、Ｆｃ受容体に対して特異的であり、１９８８年９月４日付けで発行された米国特許第４，９５４，６１７号にさらに詳細に記載されており、その内容も言及により明示的に編入されている。セルラインを作製するヒト化ｍａｂ２２抗体は、指定ＨＡ００２ＣＬ１の下に１９９２年９月４日付けでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に保管され、預託番号ＣＲＬ１１１７７を有する。 
【００３８】
抗体のヒト化は、ヒト抗体の一つのＣＤＲの少なくとも一部分を、非ヒト抗体由来の一つのＣＤＲと置換することができる任意の方法によって実行してよい。Winterが、本発明によるヒト化抗体の調製に使用できる方法を記載しており（１９８７年３月２６日付け出願の英国特許出願第ＧＢ２１８８６３８Ａ号）、その内容は言及により明示的に本明細書に編入する。「免疫グロブリンＧに関する、ヒト単核貪食細胞上のＦｃ受容体に対するヒト化抗体」と題された国際特許出願公開第ＷＯ９４／１０３３２号において記載のオリゴヌクレオチド特定部位の変異誘発を用いて、ヒトＣＤＲを非ヒトＣＤＲと置換してもよい。 
【００３９】
抗Ｆｃ受容体部分の他に、多重特異的分子は、「抗標的部分」（例えば、抗体）、機能的抗体フラグメント、又は、病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌類）、病原体感染細胞、癌もしくは腫瘍細胞（例えば、乳房、卵巣、前立腺など）もしくは被験体（例えば、ヒト又は動物）内の他の有害細胞もしくはそれらの抗原もしくは改変された形態、を認識かつ結合するリガンドを包含し得る。更に、標的部分は、抗原を包含したり又はそれを標的にすることができる。好適な実施例には、免疫系を刺激し、例えば慢性感染症の場合は、リンパ系の抗原を減少させ、また腫瘍を治療するのに使用できる抗原が含有されている。とりわけ好適な一実施例には、抗ＦｃＲ抗体を含有する多価分子に付着する抗原が含まれている。 
【００４０】
本発明の一実施例においては、多重特異的分子はリガンドを含有する。このリガンドは、分子と相互作用するものなら何れのリガンドでもよい。好適な一実施例においては、このリガンドは、タンパク質に、例えば、癌細胞のような標的細胞上の表面タンパク質に、結合する。好適なリガンドは、成長もしくは分化因子のような、受容体に対するリガンドを含む。例えば、多価分子は、上皮成長因子又は受容体（例えば、上皮成長因子受容体）と相互作用することができる少なくとも一部分もしくは改変された形態を包含する。別の好適な実施例においては、リガンドは、ボンベシンのような小ペプチド、胃酸分泌ホルモン（ＧＲＰ）、リトリン（原語：litorin）、ニューロメジンＢ（原語：neuromedin B）又はニューロメジンＣ（原語：neuromedin C）である。これらのペプチドの配列は、例えば、ここにその内容が言及によって編入される米国特許第５，２１７，９５５号において見いだすことができる。リガンドは、これら内の任意のペプチドの改変された形態でもよい。改変することによって、受容体への結合を増大させたり、結合を減少させたり、或いは受容体への結合に影響を与えないようにすることができる。リガンドを改変することで、リガンドが細胞増殖を刺激するのではなく阻害するように、アゴニストをアンタゴニストへ形質転換させることもできる。リガンドの改変には、少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、置換又は変更があり得る。 
【００４１】
本発明の一実施例においては、多価もしくは二重特異的分子は抗原を包含する。ここで用いられている場合は、「抗原」という用語は、任意の自然の或いは合成の免疫原性物質、免疫原性物質のフラグメントもしくは部分、ペプチド・エピトープ又は付着体（ハプテン）を意味する。「抗原」という用語はまた、複合体にされていない形態では非免疫原性であるが、複合体にされると免疫原性となる物質も含む。「複合体にされていない」という用語には、本発明の分子複合体を形成するように結合されない物質が含まれる。「複合体にされたもの」という用語には、本発明の分子複合体を形成するように結合される物質が含まれる。 
【００４２】
本発明の一実施例においては、二重又は多重特異的分子を用いて、細胞に対して抗原を向かわせ、これらの細胞の内部移行及び提示プロセスを増強し、最終的にはその細胞内の免疫反応を刺激する。特定の一実施例においては、二重特異的結合薬が、抗原と特異的に結合し（直接又は間接の何れかで、即ち、抗原のエピトープ又は抗原に付着したエピトープの何れかに）、かつ同時に、プロセシング及び提示を行うために抗原を内部移行することができる抗原提示細胞の表面受容体と結合する。別の実施例においては、抗原が、多重特異的又は二重特異的分子に結合され、かつ同時に抗原提示細胞の表面受容体と結合する。これらの二重又は多重特異的分子の受容体結合成分（よって二重又は多重特異的分子それ自身）が、抗原提示細胞の受容体と結合する。場合によっては、分子の結合は、分子がこの受容体に関する本来のリガンドによって実質的に妨害されることなく起こることがある。したがって、受容体に対して抗原を向かわせても、リガンドの生理学的レベルによって阻止されることなく、また標的された受容体は、リガンドと結合し且つ作用する能力を温存することになる。 
【００４３】
ある種の抗原にはアレルゲンがある。「アレルゲン」は、感受性のある被験体においてアレルギー性又は喘息性反応を惹起させ得る物質を指す。アレルゲンのリストは膨大であり、花粉、昆虫毒、動物のふけ埃、真菌胞子及び薬物（例えば、ペニシリン）を含み得る。自然、動物及び植物アレルゲンの例には、以下に掲げる属に特有なタンパク質を含み、それらには、イヌ科（Canis familiaris）ヤケヒョウヒダニ属（Dermatophagoides）（例えば、Dermatophagoides farinae）、ネコ属（Felis domesticus）、ブタクサ（Ambrosia artemiisfolia）、ライグラス（例えば、Lolium perenne又は Lolium multiflorumホソムギまたはイタリアンライグラス）、スギ（スギCryptomeria japonica）、アルタナリア（Alternaria alternata）、ハンノキ類、ハンノキ（Alnus gultinosa）、シラカンバ（Betula verrucosa）、コナラ（Quercus alba）、オリーブ（Olea europa）、ヨモギ（Artemisia vulgaris）、オオバコ（例えば、Plantago lanceolata）、パリエタリアParietaria（例えばParietaria officinalis又は Parietaria judaica）、チャバネゴキブリ属（例えばチャバネゴキブリ）、ミツバチ（例えば、Apis multiflorum）、Cupressus（例えば、Cupressus sempervirens、Cupressus arizonica及びCupressus macrocarpaモントレーイトスギ）、ビャクシン属（例えば、Juniperus sabinoides、Juniperus virginiana、Juniperus communis及びJuniperus ashei）クロベ属（例えば、Thuya orientalis）、ヒノキ（例えば、Chamaecyparis obtusa）、Periplaneta（例えば、Periplaneta americanaワモンゴキブリ）、カモジグサ属（例えば、Agropyron repens）、ライムギ（例えば、 Secale cerealeライムギ）、コムギ属（例えば、Triticum aestivum）、Dactylis（例えば、Dactylis glomerata）、フェスキュ（例えば、Festuca elatior）、イチゴツナギ属（例えば、Poa pratensis 又はPoa compressa）、Avena（例えば、Avena sativaマカラスムギ）、Holcus（例えば、Holcus lanatus）、Anthoxanthum（例えば、Anthoxanthum odoratum）、Arrhenatherum（例えば、Arrhenatherum elatius）、ヌカボ（例えば、Agrostis alba）、イネ科（例えば、チモシー）、Phalaris（例えば、Phalaris arundinacea）、スズメノヒエ（例えば、Paspalum notatumバヒアグラス）、モロコシ属（例えば、Sorghum halepensis）及びブロムグラス（例えば、Bromus inermis）がある。 
【００４４】
数多くのアレルゲンが、ブタクサ、草又は樹木の空中浮遊の花粉や、真菌類、動物、家の塵埃又は食物に見い出される。一般的に、 それらはタンパクの消化に対して比較的耐性がある。好適なアレルゲンは、マスト細胞および好塩基性細胞上のＩｇＥに結合し、それによってタイプＩアナフィラキシー過敏性反応を引き起こすものである。多価作用物質の少なくとも一つの特異的部分が、ＩｇＧに関するリガンド結合ドメインの外側にある高親和性Ｆｃ受容体のエピトープに関する場合は、この二重特異的結合物質は、被験体内の過敏性を抑制することができる。このようなことが達成されるのは、ＩｇＥ結合アレルゲンがマスト細胞および好塩基性細胞上のＩｇＥに結合する前に、二重特異的結合物質がこのアレルゲンと結合をめぐって競合するので、タイプＩ過敏性反応の可能性を減ずることになるからである。さらに、アレルゲンがＦｃγＲに向けられた結果、このアレルゲンに対する、ＩｇＥ媒介型のタイプＩ反応を阻害するＴ細胞耐性状態が誘導され得る。耐性は、現在用いられているアレルゲン用量よりも実質的に少ない用量を用いて、アレルゲンに結合しようするＩｇＥと競合するＩｇＧを減誘導することによって達成できる。 
【００４５】
場合によっては、投与用の大きな免疫原性タンパク質（例えば、細菌毒素）のような担体分子に、抗原性が弱いか或いは本質的に非抗原性（ハプテンのような）の物質を結合させるのが望ましかろう。これらの場合においては、二重特異的結合試薬は、それ自身のエピトープではなく、その結合試薬が結合する担体のエピトープと結合するように作ってもよい。 
【００４６】
直接又は間接の何れかで、本発明の多重特異的もしくは二重特異的分子と結合することができる抗原は、可溶性または微粒子であってもよく、この抗原は、Ｂ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープ又は両者を保持できる。この抗原は、細菌、ウイルス又は寄生体由来であってもよい。この抗原は、病原性生体の表面構成体の成分を包含する。例えば、この抗原は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）のウイルス体膜グリコタンパク質のようなウイルス表面構成又は肝炎ウイルスの表面抗原を包含してもよい。さらに、この抗原は、腫瘍細胞のような、病原細胞と結合されてもよく、その病原細胞に対する免疫反応を高めて病疾を治療する。この抗原は、ヒトの乳癌及び卵巣癌細胞上で発現するＨｅｒ−２／ｎｅｗプロト腫瘍形成遺伝子(Slamon et al. (1989) Science 244:707)のような、腫瘍特異的又は腫瘍結合抗原を包含できる。 
【００４７】
被験体の細胞を、本発明の多価分子に、インビトロ又はインビボで暴露することができる。多価分子を用いて、培養中の抗原提示細胞に対する抗原を標的にすることができる。免疫適格細胞は、患者の血液から分離且つ精製される。次に、これらの細胞を、抗原を含む多価分子に暴露するか、又は抗原に関する結合特異的部分を有する多価分子と共に抗原に暴露できる。標的を決められた抗原提示細胞は、抗原をプロセシングし、且つそれらの表面上のフラグメントを提示する。刺激の後、これらの細胞を患者に戻すことができる。 
【００４８】
本発明の方法は、抗原に対する免疫反応を増強もしくは強化するのに用いることができきる。例えば、この方法は、肝炎又は後天性免疫不全ウイルス症候群（ＡＩＤＳ）のような、本来の免疫系では感染症に打ち勝つことができない場合に、慢性的な感染症を治療するのに価値を発揮する。その方法は又、侵入生体に対する免疫反応を強化する必要がある感染症の急性段階の処置にも用いることができる。 
【００４９】
この方法を用いて、予防的もしくは治療的な免疫反応を得る場合や、宿主が抗原に対して反応しないか或いは最低限にしか反応しない場合は、必要な抗原の用量を減ずることができる。一般的には望ましいことであるが、有効用量を減ずるのは、アレルギーに関する症例の如く、宿主にとって当該抗原が毒性である場合には特に望ましい。抗原を含有するか、又はリガンド（例えば、抗原と相互作用する抗体）を含有する二重もしくは多重特異的分子を用いる方法及び利用法は、公開されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１／０７２８３号において更に詳細に記載されている。 
【００５０】
本発明の別の実施例においては、多重特異的分子は、改変された抗原を包含しており、したがってＴ細胞活性に及ぼすその分子の効果は、抗原提示細胞によりこの改変抗原がＴ細胞に提示されると、改変される。Allan等は、Ｔ細胞を刺激する（例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激する）ペプチドの一つ又はそれ以上のアミノ酸を置換することによって、Ｔ細胞を刺激することが不能な抗原を、もしくはＴ細胞におけるアネルギーを誘導する抗原を得ることができるのを実際に証明した。このような改変されたペプチドは、改変ペプチドリガンド（ＡＰＬ）と呼ばれる。したがって、このようなＡＰＬは、ＦｃγＲＩに関する少なくとも一つの結合特異的部分を有する二重特異的もしくは多重特異的分子に結合し得る。抗原提示細胞が、これらの分子を食作用により取り込んでＴ細胞へ提示すると、Ｔ細胞の増殖は阻害されるか、もしくはアネルギー状態にすることができる。よって、（ａ）通常はＴ細胞を刺激するが、改変されるとＴ細胞のアネルギーを誘導する抗原の少なくとも一つの改変ペプチドと、（ｂ）少なくとも一つの抗ＦｃγＲＩ抗体と、を包含する多重特異的分子を被験体に投与することによって、抗原に対する被験体の耐性が誘導されることになる。よって、このような多重特異的もしくは二重特異的分子を用いて種々の抗原（例えば、自己抗原）に対して被験体を耐性化することができる。したがって、使用したこれらの抗原によっては、本発明の方法は、例えば、Ｔ細胞を刺激する抗原を用いることで免疫反応を高める方法を提供し、かつ本発明はまた、Ｔ細胞への刺激を阻害するか或いはＴ細胞のアネルギーを誘導するか、その何れかによって免疫反応を抑制する方法も提供する。 
【００５１】
本発明の多重特異的の、多価分子はまた、「抗増強因子（抗ＥＦ）部分」を含んでもよい。この「抗増強因子部分」は、抗原と結合することによって、抗Ｆｃ受容体部分又は抗標的部分の機能を増強させる、抗体、作用的な抗体フラグメント又はリガンドでもよい。この「抗増強因子部分」は、Ｆｃ受容体又は標的と結合できる。一つの標的細胞抗原に結合する抗標的部分と、異なる標的抗原に結合する抗増強因子部分と、を包含する多価分子は、標的細胞が、抗原変調もしくは抗原性変異（例えば、トリパノソーマ類のようなある種の寄生体に関して記載された如く）を受ける場合において特に有用である。あるいは、この抗増強因子部分は、抗標的もしくは抗Ｆｃ受容体部分が結合する実体とは異なる別の実体と結合することもできる。例えば、抗増強因子部分は、細胞障害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１又は標的に対して免疫反応の増強をもたらすその他の免疫細胞を介して）と結合することができる。 
【００５２】
多重特異的分子の作成方法 
【００５３】
上述の多重特異的分子は、数多くの方法によって作成することができる。例えば、両方の特異的部分を同一のベクターにおいてコードし、且つ同一の宿主細胞において発現および組み立ててよい。このような方法は、多重特異的分子が、以下の例２において記載する（リガンド）ｘ（ｆａｂ）融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の二重特異的分子はまた、単鎖二重特異的抗体のような単鎖二重特異的分子、一つの単鎖抗体及び一つのリガンドを含む単鎖二重特異的分子、或いは二つのリガンドを含む単鎖二重特異的分子でもよい。多価分子はまた、単鎖分子でもよいし、或いは少なくとも二つの単鎖分子を含んでもよい。二価又は多価抗体を調製する方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，４５５，０３０号、米国特許第４，８８１，１７５号、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４７６，７８６号、米国特許第５，０１３，６５３号、米国特許第５，２５８，４９８号及び米国特許第５，４８２，８５８号において記載されている。 
【００５４】
こうした単鎖分子がそれに特異的な標的と結合するのは、本明細書の例において記載される二重特異的ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）によって確認することができる。 
【００５５】
あるいは、多重特異的分子の各特異的部分を別々に作製することができ、得られたタンパク質もしくはペプチドを相互に共役させることができる。例えば、二つのヒト化抗体は、二つのＨ鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル（ＳＨ）結合を介して共役させることができる。一実施例においては、共役する前に、このヒンジ領域が、奇数（好ましくは一つ）のスルフヒドリル（ＳＨ）残基、を含有するように改変する。 
【００５６】
本発明の二重特異的分子は、以下の例において記載の方法或いは当分野で周知の方法を用いて、抗ＦｃＲ及び抗標的部分を共役させることによって調製できる。例えば、種々の結合もしくは架橋薬を共有結合型共役に用いてよい。架橋薬の例には、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシニミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate）(SATA)、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate）(SPDP)及びスルフォスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロハクサン−１−カルボキシレート（sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohaxane-1-carboxylate）(sulfo-SMCC)が含まれる(例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648、を参照されたい)。その他には、Paulusによって記載されたものが含まれる(Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229:81-83), and Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375)。好適な共役剤は、 SATA及びsulfo-SMCCであり、共にピアスケミカル社(イリノイ州ロックフォード)から入手可能である。 
【００５７】
多重特異的分子内の結合特異的部分として抗体を用いる場合は、好適な抗体には、ヒトモノクローナル抗体及びそのヒト化抗体（例えば、Ｆａｂ’及び単鎖Ｆｖ等のフラグメント）が含まれる。ヒト化抗体を作製する方法は、当該分野では既知であり、以下の例において詳細に記載される。完全にヒトのモノクローナル抗体を作製する方法も当該分野では既知である。これらの抗体は、例えば、Kohler 及びMilstein（Nature 256: 495 (1975）の標準的な体細胞雑種形成技術などの従来のモノクローナル抗体方法論を含めて種々の技術よって作製することができる。原則的には体細胞雑種形成法が好ましいが、モノクローナル抗体を作製する他の方法も用いてもよい（例えば、Bリンパ球のウイルス又は腫瘍形成形質変換）。 
【００５８】
ハイブリドーマを調製する好適な動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマの作製は、非常によく確立された方法である。免疫化した、融合のための脾細胞を分離する免疫化プロトコルおよび技術は、当該分野では既知である。融合相手（例えば、マウス骨髄腫細胞）及び融合方法も当該分野では既知である。 
【００５９】
好適な一実施例においては、ヒト・モノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒトの免疫系の部分を担持する遺伝子導入マウスを用いて作製する。これらの遺伝子導入マウス（ここでは「ＨｕＭａｂ」マウスと呼ぶ）は、内生的なμ及びκ鎖遺伝子座を非活性化させる、標的を決められた変異体と共に、再配列されていないヒトＨ鎖（μ及びγ）及びκＬ鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（miniloci）を含有する(Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859)。したがって、当該マウスは、マウスＩｇＭもしくはκの発現が抑制され、かつ導入されたヒトＨ及びＬ鎖遺伝子は、クラススイッチ及び体性変異を経て高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを、免疫化に対応して作製する(Lonberg, N. et al. (1994), 上述; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101に説明あり; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546)。ＨｕＭａｂマウスの調製は、以下の詳細なセクションＩＩ及び以下の参考文献に記載があり、これら全ての内容はその全体が言及により本明細書に編入されている（Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851）。更に参照されたいのは、Lonberg並びにKay及びGenPharm International社に発行された米国特許第５，５４５，８０６号及び第５，６２５，８２５号、Surani等に発行の米国特許第５，５４５，８０７号 、及び１９９８年６月１１日付け国際公開第ＷＯ９８／２４８８４号 、１９９４年１１月１０日付け第ＷＯ９４／２５５８５号、１９９３年６月２４日付け第ＷＯ９３／１２２７号、１９９２年１２月２３日付け第ＷＯ９２／２２６４５号、１９９２年３月１９日付け第ＷＯ９２／０３９１８号であり、これらの全ての内容の開示は、その全体が言及により本明細書に編入されている。或いは、例２において記載のＨＣＯ１２遺伝子導入マウスを用いて完全にヒトのモノクローナル抗体を作製することができる。 
【００６０】
完全にヒトのモノクローナル抗体を作製するために、マウスは、所望の免疫原を発現する所望の免疫原及び／又は細胞を精製し且つ強化したプレパラートによって免疫化できる（Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856 859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 and WO 98/24884）。好適には、マウスは最初の注入時に６乃至１６週齢である。例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕの精製又は強化プレパラート（５乃至２０μｇ）を用いてＨｕＭａｂマウスを腹腔内免疫化できる。ＨＥＲ２／ｎｅｕの精製又は強化プレパラートを用いる免疫化によって抗体が作製されない場合は、例えば腫瘍細胞株などの、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する細胞によって免疫化して免疫反応を促進することもできる。 
【００６１】
種々の抗原に関して経験的に分かったことは、ＨｕＭＡｂ遺伝子導入マウスが最もよく反応するのは、フロインド完全アジュバントにおいて、抗原でまず腹腔内（ＩＰ）免疫化をした後、フロインド完全アジュバントにおいて、抗原で一週おきにＩＰ免疫化（合計六回まで）を実施する場合である。免疫反応は、免疫化プロトコルの全過程に亘ってモニターすることができ、且つ血漿試料を眼窩後方からの採血によって得ることができる。この血漿はＥＬＩＳＡ（以下に記載の如く）によってスクリーニングされ、所望の免疫原に対する十分な力価のヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合に用いることができる。マウスは、脾臓を犠牲にし且つ除去する前三日間、抗原で静脈内に追加刺激してよい。それぞれの抗原に関して二回から三回の融合を実行する必要が見込まれる。それぞれの抗原に関して六匹のマウスを免疫化することになろう。例えば、合計１２匹のＨＣ０７及びＨＣ１２系のマウスを免疫化してもよい。 
【００６２】
マウス脾細胞は、次に、標準的なプロトコルに基づいて単離され且つポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でマウス骨髄腫セルラインに融合させることができる。次に、その結果得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体を作製するためにスクリーニングすることができる。例えば、免疫化したマウスから得た脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、５０％のＰＥＧで、六分の一の数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）まで融合する。細胞は、平底の微量定量プレート内でおよそ２ｘ１０５個を平板培養した後、２０％の胎児クローン血清、１８％の「６５３」調整培地、５％のオリゲン（ＩＧＥＮ社）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのＬ~グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０ユニット／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び１ＸＨＡＴ（シグマケミカル社、ＨＡＴ（混合培養液）は融合のあと２４時間後に加えられる）を含有する選択的な媒体中で、二週間定温放置される。二週間後、細胞は、ＨＡＴがＨＴと置換されている媒体中で培養される。次に、所望の免疫原に対するヒトモノクローナルＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の有無に関して、個々のウェルは、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。一旦、全体的にハイブリドーマが成長すると、媒体は通常１０乃至１４日間観察する。ハイブリドーマを分泌する抗体を再度平板培養して、再度スクリーニングを行い、ヒトＩｇＧモノクローナル抗体に関して依然として陽性なら、限界希釈して少なくとも二回サブクローニングすることができる。次に、特性の説明のために、安定したサブクローンは、インビトロ培養して組織培地に少量の抗体を作製する。 
【００６３】
ヒトモノクローナル抗体の結合を特性を説明するために、免疫化されたマウスから得た血清が、例えば、ＥＬＩＳＡ法によって実験される。簡単に説明すると、微量定量プレートに、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中での、およそ０．２５μｇ／ｍｌの所望の免疫原（精製された）を塗布し、次にＰＢＳ中の５％のウシの血清アルブミンで遮断する。所望の免疫原で免疫化したマウスから得た血漿の希釈液を各ウェルに加え、３７℃で一、二時間定温放置する。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、 アルカリホスファターゼに共役したヤギ抗ヒトＩｇＧのＦｃ特異的多クローン薬と共に、３７℃で一時間定温放置する。洗浄後、プレートはｐＮＰＰ( ４−リン酸ニトロフェニル、ジナトリウム塩六水和物、リン酸パラニトロフェニル（4-nitrophenyl phosphate, disodium salt hexahydrate; para-nitrophenyl phosphate）)基質（１ｍｇ／ｍｌ）で展開され、４０５乃至６５０のＯＤ（光学濃度）で分析される。好適には、最高の力価濃度を生じるマウスを融合に用いる。 
【００６４】
上述のＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）アッセイも、所望の免疫原に関する陽性活性を示すハイブリドーマの有無をスクリーニングするために用いることができる。高結合活性を示して所望の免疫原と結合するハイブリドーマは、サブクローニングされ、さらに特性の説明をする。各ハイブリドーマから一つのクローン（親細胞の反応性を保持する（ＥＬＩＳＡによる））を選択して、−１４０℃で保管した５乃至１０個のバイアル細胞バンク（a 5-10 vial cell bank）の作製及び抗体精製することができる。 
【００６５】
所望の免疫原に対するヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマを２リットルのスピンナーフラスコ内で成長させてモノクローナル抗体を精製する。プロテインＡセファロース(ファーマシア社、ニュージャージー州ピスカタウェー)で親和性クロマトグラフィーを実施する前に、上澄み液を濾過し濃縮することができる。溶離したＩｇＧは、ゲル電気泳動及び高性能液体クロマトグラフィーにより検査して純度を確認することができる。緩衝液はＰＢＳと交換し、濃度は、１．４３吸光係数を用いてＯＤ２８０によって測定できる。モノクローナル抗体は、等分割して−８０℃で保管できる。 
【００６６】
選択されたヒトモノクローナル抗体が所望の免疫原上の特異的なエピトープと結合するかどうか測定するために、各抗体を市販の試薬（イリノイ州ロックフォード、ピアスケミカル社）を使用してビオチン標識することができる。標識されていないモノクローナル抗体及びビオチニレート化されていない抗体を使用する競合研究を、上述の如く所望の免疫原を塗布したＥＬＩＳＡプレートを用いて実行してもよい。ビオチニレート化されたｍＡｂ（モノクローナル抗体）結合をストレプアビジンアルカリホスファターゼ（strep-avidin-alkaline phosphatase）・プローブで検出することができる。 
【００６７】
精製された抗体のアイソタイプを測定するには、アイソタイプＥＬＩＳＡを実行することができる。４℃で一晩、微量定量プレートのウェルに１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇを塗布することができる。５％のウシ血清アルブミンで遮断した後、周囲温度で二時間、これらのプレートを１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体又は精製したアイソタイプ対照と反応させる。次に、これらのウェルをヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＭの何れかに特異的なアルカリ性ホスファターゼ共役プローブと反応させることができる。上述したように、プレートは展開され且つ分析される。 
【００６８】
例えば、腫瘍細胞受容体などの、所望の免疫原を発現する生きた細胞に、モノクローナル抗体が結合するのを証明するために、流動細胞光度測定法（フローサイトメトリー）を用いることができる。簡単に説明すると、所望の免疫原（標準的な成長条件下で成長させた）を発現するセルラインは、０．１％のＴｗｅｅｎ８０及び２０％のマウス血清を含有するＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）内で種々の濃度のモノクローナル抗体と混合し、３７℃で一時間定温放置する。洗浄後、これらの細胞を、第一次抗体染色と同一条件下でフルオレセイン標識された抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させる。これらの試料は、光源及び単離細胞上で作動する側方散乱特性を用いるＦＡＣＳｃａｎ装置によって分析することができる。螢光顕微鏡検査法を用いる別のアッセイをフローサイトメトリー・アッセイ（それに加えて又はその代わりに）を用いてもよい。細胞は上述と同様に染色し且つ螢光顕微鏡検査法によって検査される。このような方法によって、個々の細胞を視覚化できるが、抗原の濃度によって感受性が減少する可能性がある。 
【００６９】
所望の免疫原に結合するヒトＩｇＧは、ウェスタン法によって所望の免疫原との反応性の有無をさらに実験することができる。簡単に説明すると、所望の免疫原を発現する細胞から細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸塩ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動にかけることができる。電気泳動の後、分離された抗原は、ニトロセルロース膜に移し、２０％のマウス血清で遮断し、モノクローナル抗体をプローブにして実験される。ヒトＩｇＧ結合は、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを用いて検出可能であり、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤（シグマケミカル社、ミズーリ州セントルイス）で展開(develop)することができる。 
【００７０】
多重特異的分子の治療的使用 
ＦｃＲを担持する免疫細胞と特異的な標的細胞を結合する能力を基に、特定の特異的分子を被験体に投与して、以下のような種々の疾患又は状態を処置又は予防することできる。それらの疾患又は状態には、癌（例えば、乳癌、卵巣癌、肺臓の小細胞癌）、病原性感染症（例えば、ＨＩＶなどのウイルス性）、原虫によるもの（トキソプラズマ原虫のような）、真菌類によるもの（カンジダ症のような）、自己免疫状態（例えば、免疫性血小板減少紫斑病及び全身性紅斑性狼瘡）が含まれる。また、多重特異的多価抗体は予防的に投与して、標的細胞による感染症に対して被験体を予防接種することもできる。 
【００７１】
治療上の使用目的では、有効量の適正な多重特異的分子は、これらの分子がその意図された治療効果を発揮できれば任意の態様で被験体に投与してもよい。好適な投与経路には、経口及び経皮（例えば、貼付薬を介して）が含まれる。その他の投与経路には、注射（皮下、静脈、腸管外、腹腔内、クモ膜下など）がある。注射には、大量注射又は継続的な点滴があり得る。 
【００７２】
多重特異的分子は、薬学的に許容可能な担体と共に投与できる。本明細書に使用されているように、「薬学的に許容可能な担体」という文言は、多重特異的分子と同時投与でき且つその分子を見込み通りに働くようにさせる物質を含むことを意図している。このような担体の例には、溶液、溶剤、分散媒体、遅延剤、乳剤などが含まれる。薬学的活性物質に関するこのような媒体の使用は、当該分野において周知である。これらの分子を用いるのに適切であれば、その他の通常の担体は何れも本発明の範囲内にある。 
【００７３】
「有効量」の多重特異的分子の「有効量」という言葉は、所望の生物学的効果を実現するのに必要な又は十分な用量を指す。例えば、有効量の多重特異的分子（抗標的部分が病原性細胞を認識する）は、腫瘍、癌又は細菌性、ウイルス性もしくは真菌性感染を排除するのに必要な用量である。具体的な適用に関する有効量は、治療中の疾患又は状態、投与される具体的な多重特異的分子、被献体の体格又はこれら疾患もしくは状態の重症度などの要因により様々であり得えよう。通常の技能を備えた当業者であれば、余計な実験の必要もなく個々の多重特異的分子の有効量を経験的に決定することができる。 
【００７４】
これより本発明は、以下の例によって更に示されるが、それをもって更なる限定であると解釈するべきではない。本願を通じて引用される、全ての参照文献、出願中の特許出願及び公開特許の内容は、言及により本明細書に明示的に編入される。 
【００７５】
例 
例１．Ｆｃ受容体及び抗ｈｅｒ２ｎｅｕ抗体に関して特異的なマウス又はヒト化抗体を包含する二重特異的抗体の作製 
【００７６】
モノクローナル抗体 
抗ＦｃγＲＩモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、Ｍ２２、Ｍ３２．２及び１９７は、イオン交換クロマトグラフィーによってハイブリドーマ上澄から精製し、またＤＺ３３、即ち、ヒト抗ＨＩＶ−１ＩｇＧ１ｍＡｂは、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（ファーマシア社、ニュージャージー州ピスカタウエー）及びゲル濾過によってハイブリドーマ上澄から精製された。Ｍ３２．２は、２０８５２メリーランド州，ロックビル、パークローンドライブ１２３０１に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に、１９８７年７月１日付けで預託され、ＡＴＣＣ預託番号ＨＢ９４６９と指定されている。 
【００７７】
セルライン 
マウス骨髄腫ＮＳＯ（ＥＣＡＣＣ８５１１０５０３）は、非Ｉｇ合成系であり、組換えｍＡｂの発現に用いられた。ＮＳＯ細胞は、ＤＭＥＭプラス１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ、ギブコ社、英国ペイリー）中で培養された。ＳＫＢＲ−３は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ癌原遺伝子（ＡＴＣＣ，メリーランド州ロックビル）を過剰発現するヒトの乳癌腫セルラインであり、イスコーブの改変されたダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、ギブコ社、ニューヨーク州グランドアイランド)において培養された。Ｕ９３７は、ＦｃγＲＩを発現する単球様セルラインであり、ＡＴＣＣから入手して、ＲＰＭ−１６４０プラス１０％のＦＢＳ（ギブコ社、ニューヨーク州グランドアイランド）中で育成した。 
【００７８】
マウス免疫グロブリンＶ領域遺伝子のクローニング 
マウスハイブリドーマ２２から得られた細胞質ＲＮＡは、Favaloro等（ Favaloro, J., R. Treisman and R. Kamen，(1982) ポリオーム特異的ＲＮＡの転写マップ：二次元Ｓ１ゲルマップによる分析、Meth. Enzymol. 65:718)において記載のように調製された。ＩｇＶ領域ｃＤＮＡは、「ヒト単核貪食細胞上の、免疫グロブリンに関するＦｃ受容体に対するヒト化抗体」と題された国際特許出願公開第ＷＯ９４／１０３３２号に記載の如くプライマＣＧ１ＦＯＲ及びＣＫ２ＦＯＲから開始された逆転写を介してＲＮＡから作製された。ｃＤＮＡ合成を、１００ＵＭＭＬＶ逆転写酵素（英国ペイスリー、ライフテクノロジー社）を用いて標準的な条件下で行った。ＶＨ及びＶκｃＤＮＡは、国際特許出願公開第ＷＯ９４／１０３３２号に記載したようにＨ２ＢＡＣＫ及びＶＫ７ＢＡＣＫと共にｃＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって増幅された(Orlandi, R., D.H. Gussow, P.T. Jones and G. Winter (1989) (ポリメラーゼ連鎖反応による、免疫グロブリン発現可変ドメインのクローニング), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833)。増幅されたＶＨ及びＶκＤＮＡは精製し、Ｍ１３にクローニングし、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ファーマシア社、ニュージャージー州ピスタウェー）を用いてジデオキシ法によって配列された。 
【００７９】
キメラ抗体遺伝子の作成 
マウスＶ領域ＤＮＡを発現ベクターにクローニングするのを促進するために、制限部位を、両Ｍ２２Ｖ領域遺伝子の末端の極めて近接位に配置した。ＶＨに関しては、５’ＰｓｔＩ部位及び３’ＢｓｔＥＩＩ部位が、ＶＨ１ＢＡＣＫ及びＶＨ１ＦＯＲ（Ｉｄ．）を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によりクローニングされたマウスＶＨ遺伝子へ導入した。Ｖκに関しては、５’ＰｖｕＩＩ部位及び３’ＢｇｌＩＩ部位を、ＶＫ１ＢＡＣＫ及びＶＫ１ＦＯＲ（Ｉｄ．）を用いてＰＣＲによりクローニングされたマウスＶκへ導入した。幾つかの場合では、これらのプライマーは、このような自然発生的なアミノ酸から一つ又はそれ以上のアミノ酸を変化させた。これらのＶ領域遺伝子（ＣｈＶＨ及びＣｈＶＫ）は、適正な制限酵素で切断され、Ｉｇプロモーター、シグナル配列及びスプライス部位を含有するＭ１３ＶＨＰＣＲ１１ＢＡＣＫ及びＶＫＰＣＲ１（Ｉｄ．）にクローニングされた。ＤＮＡは、Ｍ１３からＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして切除されて、ヒトＩｇＧ１（Takahashi, N. et al. (1982)、 ヒト免疫グロブリンガンマ遺伝子の構成：遺伝子系統群の進化に関する示唆、Cell, 29:671）及びヒトカッパ恒常領域ゲノムＤＮＡ（Hieter, R.A. et al. (1980)、クローニングされたヒト及びマウスカッパ免疫グロブリン恒常及びＪ領域遺伝子は、作用的セグメントにおいて相同性を保存する。 Cell 22:197）を含有するｐＳＶｇｐｔ及びｐＳＶｈｙｇ発現ベクターへ、クローニングされた。 
【００８０】
ヒト化抗体遺伝子の作成 
二つのＨ鎖が作成され、ＮＥＷＭのヒトＶＨｓ（Poljak, R.J. et al.、ヒトマイクローマ免疫グロブリン(IgG New), Biochemistry, 16:3412）のＶＨ領域のアミノ酸配列、及びＫＯＬ（Marquat, M. et al., (1980)無傷な免疫グロブリン分子Ｋｏｌの 結晶学的な精製及び原子模型及び３．０Ａ及び１．９Ａ分解能その抗原結合フラグメント， J. Mol. Biol. 141:369）、に基づくものであった。ヒト化Ｌ鎖は、幾つかの基質領域（ＦＲ）の変更部を有するヒトベンス−ジョーンズ・タンパク質ＲＥＩ（Epp, O. et al, (1974)ベンス−ジョーンズ・タンパク質ＲＥＩのバンディブル部分からなるダイマーの結晶及び分子構造, Eur. J. Biochem. 45:513）に由来するものであった。改変されてＶκドメインが更に典型的なヒトサブグループＩになり、Ｔｈｒ３９、Ｌｅｕ１０４、Ｇｌｎ１０５及びＴｈｒ１０７が、Ｌｙｓ３９、Ｖａｌ１０４、Ｇｌｕ１０５及びＬｙｓ１０７に置換されている。更に、Ｍｅｔ４をＬｅｕ４に変更して、ＰｖｕＩＩ制限部位を収容可能とする。 
【００８１】
無関係なＣＤＲ（相補性決定領域）を備えたＮＥＷＭＶＨ及びＲＥＩＶκＦＲを含有するＤＮＡを、ベクターＭ１３ＶＨＰＣＲ１及びＭ１３ＶＫＰＣＲ１（Favaloro et al. 上述）にクローニングした。ＫＯＬＶＨをコードするＤＮＡ、ＫＯＬＦＲアミノ酸及び無関係のＣＤＲをコードするオリゴデオキシリボヌクレオチドを用いて、一連の連続ＰＣＲ（ ポリメラーゼ連鎖反応）によって作成した。これらの作成物を、次にＭ１３ＶＨＰＣＲ１にクローニングした。 
【００８２】
オリゴデオキシリボヌクレオチドが合成されて、ヒトＦＲに対応するヌクレオチドによってフランクされたｍＡＢＭ２２ＣＤＲをコードした。ＮＥＷＭに基づくヒト化ＶＨに関しては、プライマーが、マウスＦＲアミノ酸Ｐｈｅ２７、ＩＩｅ２８及びＡｒｇ７１（これらは抗原結合に影響するので）を含んでいた（Chothia, C. and A.M. Lesk (1987), 免疫グロブリンの高度可変領域に関するカノニカル構造, J. Mol. Biol., 196:901; Tramontano, A. et al., (1990),フレームワーク残基７１は、免疫グロブリンのＶＨドメインにおける第二の高度可変領域の配置及び配座の主要な決定因子である, J. Mol. Biol., 215:175）。ヒト化Ｖκに関しては、マウスアミノ酸Ｐｈｅ７１が、親和性に作用する能力を有する残基として同様に含まれている(Foote, J. and G. Winter, (1992), 高度可変ループの配座に作用する抗体フレームワーク残基, J. Mol. Biol. 224:487）。マウスＦＲ残基は、ＫＯＬＶＨには一切含まれていなかった。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、５’−リン酸化され、Ｍ１３ユニバーサル前方プライマーで、Ｍ１３ｓｓＤＮＡ鋳型を含むＭ１３に反応でクローニングしたヒトＶ領域遺伝子に、アニーリングされた。このＤＮＡは、拡大されて２．５ＵのＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳバイオケミカル社、オハイオ州クリーブランド）及び０．５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ、ギブコ社、ニューヨーク州グランドアイランド）に結合された。変異ストランドは、１ＵのＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブ、マサッチューセッツ州ベバリー ）を有するＭ１３逆方配列プライマーを使って拡大／結合混合物から選択的に増幅した後、Ｍ１３の前方及び逆方プライマーの両者を用いるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅した。産生物ＤＮＡは、ＢａｍＨ１及びＨｉｎｄＩＩＩで切断され、ＤＮＡ配列により識別された、Ｍ１３及び三重ＣＤＲ移植変異体にクローニングされた。 
【００８３】
ヒト化Ｖ領域を含有するＭ１３クローンは、その全体が配列されて偽性変異が存在しないことが確認された。確認されたクローンからのＲＦＤＮＡは、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化され、ｐＳＶｇｐｔもしくはｐＳＶｈｙｇ及びヒトＩｇＧ１もしくはキメラ抗体遺伝子の作成に関して記載したのと全く同様に付加されたヒトカッパ恒常領域にクローニングされた。 
【００８４】
組換えｍＡｂの発現及び精製 
Ｈ鎖（５μｇ）及びＬ鎖（１０μｇ）発現ベクターは、ＰｖｕＩで消化され、エタノール沈降させて、５０μｌの水に溶解された。ＮＳＯ細胞（１−２ｘ１０７個）が遠心沈澱法により回収され、０．５ｍｌＤＭＥＭで再懸濁されて、０．４ｃｍの電気穿孔キュベット内でＤＮＡと混合された。５分後、氷の上で、これらの細胞は、１７０Ｖ、９６０μＦで一回パルスされ（ギーンパルサー社、バイオラッド社、ニューヨーク州メルビルGenePulser, Bio-Rad, Melville, NY ）、氷の上で１５分間さらに定温放置された。これらの細胞は、２４乃至４８時間ＤＭＥＭ中で回復させることができた。媒体は、次にマイコフェノール酸（mycophenolic  acid）（０．８μｇ／ｍｌ）及びキサンチン（２５０μｇ／ｍｌ）を加えることによって選択的になった。２００μｌのアリコートが、９６−ウェル・プレート内へ分配された。さらに１０乃至１２日後、これらのウェルから得た、ＥＬＩＳＡによって測定された最高レベルの抗体を含有する細胞が選択されかつ希釈度を制限することによってクローニングされた。   
【００８５】
抗体は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって過成長した培養組織から精製された（ボーリンジャーマンハイム社、英国リューズ）。濃度は、Ａ２８０ｎｍを測定することにより測定し、かつＥＬＩＳＡ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。 
【００８６】
抗体結合の測定に関するＥＬＩＳＡ 
微量定量プレートのウェルに、ｐＨ９．６の５０ｍＭ重炭酸塩緩衝液中のヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体（セララブ社英国クローリーダウン）を塗布した。このプレートには、１％のＢＳＡで遮断された後、一時的に形質移入したＣＯＳ細胞から得られたヒトＦｃγＲＩ及びヒトＩｇＭのＨ鎖（ｓＦｃγＲＩ−μ）の細胞外ドメインからなる可溶性融合タンパク質を加えた（発現ベクターは、マサチューセッツ州ボストンのマサチューセッツ総合病院のBrian Seed博士のご好意により提供された）。次に、組換え体２２もしくは対照ｍＡｂが、被験体ｍＡｂがそのＦｃ部分を介して非特異的に結合するのを遮断するλＬ鎖を含有するヒトＩｇＧ１抗体(シグマ社、ミズーリー州セントルイス)の過剰（２．２μｇ／ｗｅｌｌ）な存在下で加えられた。結合された２２ｍＡｂは、ペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗ヒトカッパ鎖抗体（セララボ、英国クローリーダウン）及びｏ−フェニレンジアミンで検出された。 
【００８７】
抗体のフルオレセイン染色 
ｍＡｂのｐＨは、０．１ＭのＮａ２Ｃｏ３を加えることにより９．３に調節された。フルイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）(シグマ社、ミズーリー州セントルイス）を、２ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解させた。１ミリグラムのｍＡｂ当り４０μｇのＦＩＴＣを加えて、室温で二時間定温放置した。フルオレセイン染色されたｍＡｂは、Ｇ−２５クロマトグラフィーにより遊離ＦＩＴＣから分離された。 
【００８８】
血液細胞の調製 
軟膜は、ヘパリン化全静脈血から調製された。全血は、５％のデキストランを含有するＲＰＭＩで２．５対１（ｖ／ｖ）の比率で希釈された。赤血球は、氷の上で４５分間沈降させた後、上澄中の細胞を新たな試験管に移し替えて遠心分離法によりペレット化した。残留赤血球を低張溶解により除去した。後に残ったリンパ球、単球、好中球は、結合アッセイで使用するまで氷の上で保管した。幾つかの実験に関して、好中球は、フィコール・ハイパーク(ファーマシア社、ニュージャージー州ピスカタウェー)勾配分離法により単核細胞から分離した。ＦｃγＲＩを上方制御するために、好中球及び単核細胞はサイトカインで処理した。単核細胞の培養組織は、２．５％の通常のＡＢ型ヒト血清（シグマ社、ミズーリー州セントルイス）及び５００ＩＲＵ／ｍｌのＩＦＮ−γ(Ｒ＆Ｄシュステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス)を含有する１ｍｌ当たり４ｘ１０６個の細胞のＲＰＭＩ希釈液において、３７℃、５％のＣＯ２で４８時間テフロン（登録商標）（R）皿内に定温放置した。好中球は、５０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ（ドイツのエアランガー大学のR. Repp氏の好意により提供される）及び５００ＩＲＵ／ｍｌのＩＦＮ−γを含有するＡＩＭＶ培地(ギブコ社、ニューヨーク州グランドアイランド)中で４８時間（３７℃、５％のＣＯ２）培養した。 
【００８９】
フローサイトメトリー 
細胞結合アッセイは、既述のごとく９６−ウェル微量定量プレートを用いて実施した(Guyre, P.M. et al.,  受容体機能を惹起することができるＦｃγＲ上の別々のエピトープに結合するモノクローナル抗体、 J. Immunol., 143:1650)。簡単に説明すると、２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ及び０．０５％のＮａＮ３（ＰＢＡ）を含有する、ｐＨ７．４のＰＢＳで、細胞を洗浄し且つそれら細胞をＰＢＡで１ｍｌ当たり２．０ｘ１０７個の細胞まで調節した。ＦＩＴＣ標識され且つ共役されていない抗体が、ＰＢＡ中に調製された。細胞（２５μｌ）、抗体（２５μｌ）及びヒト血清（２５μｌ）、又はヒトＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍｌ、ミズリー州セントルイスのシグマ社）（２５μｌ）、又はＰＢＡ（２５μｌ）を微量定量プレートに加えて、４５乃至６０分間氷上に放置した。結合されていない抗体は、ＰＢＡで三回洗浄してウェルから除去した。これらの細胞を１％のパラホルムアルデヒドで固定した。フルオレセンス染色された細胞が、ベクトン−ディキンソンＦＡＣＳｃａｎにおいて分析された。 
【００９０】
ＢｓＡｂ共役方法 
ＢｓＡｂは、Glennie等の方法を用いて作成した(Glennie, M.J. et al., (1987),チオエーテル結合の二重特異的Ｆ（ａｂ’γ）２抗体の調製及び性能, J. Immunol., 139:2367)。ｍＡｂ２２（マウスおよびヒト化の両方）及び５２０Ｃ９（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ）抗体を、それぞれのハイブリドーマ細胞のインビトロ培養によって作製した。これらの抗体は、別々にペプシンでＦ（ａｂ’）２へ消化分解され、さらに１０ｍＭのメルカプトエタノールアミン（ＭＥＡ）を加えて、３０℃、３０分間でＦａｂ’に分解された。Ｆａｂ’フラグメントは、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ５．３、４℃）中で平衡させたセファッデクスＧ−２５カラムにかけた。ジメチルホルムアミドに溶解させ且つメタノール／氷の溶液中で冷却したオルトフェニレンジマルイミド（ｏ−ＰＤＭ、１２ｍＭ）を、Ｍ２２ｘ５２０Ｃ９の場合はマウス２２Ｆａｂ’に、及びＨ２２ｘ５２０Ｃ９の場合は５２０Ｃ９Ｆａｂ’に加えて（半量）、さらに氷上で３０分間定温放置した。次に、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ５．３、４℃）中で平衡させたセファッデクスＧ−２５カラムにおいて、遊離ｏ−ＰＤＭからこのＦａｂ’−マレイミダを分離した。ＢｓＡｂの調製に関しては、１対１のモル比で、Ｍ２２Ｆａｂ’−マレイミドを５２０Ｃ９Ｆａｂ’に加えるか、或いは５２０Ｃ９Ｆａｂ’−マレイミドをＨ２２Ｆａｂ’に加えた。アミコン（商品名）チャンバ内で、デアフロ膜を用いて、窒素存在下において、これらの反応体を出発量まで濃縮した（全て４℃）。１８時間後に、ｐＨ８．０の１ＭトリスＨＣＬでそのｐＨを８．０に調節した。次いで、この混合物を１０ｍＭのＭＥＡで還元し（３０℃で３０分間）且つ２５ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化した。ＰＢＳにおいて平衡させたスーパーデックス２００(ファーマシア社、ニュージャージー州イスカタウェー)カラムによって生じた、非反応Ｆａｂ’及び他の作製物から、二重特異的Ｆ（ａｂ’）２を分離した。 
【００９１】
抗体依存性細胞傷害性 
ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現するヒト乳癌腫細胞（ＳＫＢＲ−３）は、サイトカインで活性化された好中球による溶解の標的として用いられた（血液細胞の調製を参照されたい）。標的は、好中球及び抗体と結合する前に、Ｕ字底の微量定量プレート内で一時間にわたり１００μＣｉの５１Ｃｒで標識された。３７℃で五時間放置した後、上澄を回収して放射能の有無を分析した。細胞障害性は、次式によって計算された。即ち、溶解（％）＝（実験用ＣＰＭ−標的漏出ＣＰＭ／洗浄剤溶解ＣＰＭ−標的漏出ＣＰＭ）ｘ１００％である。特異的溶解＝抗体含有溶解（％）−抗体非含有溶解（％）である。アッセイは、三重反復実験で実施した。 
【００９２】
スーパーオキシドの誘導 
Ｕ９３７細胞を用いて、ＦｃγＲＩを介するスーパーオキシドのバーストを惹起するＨ２２の能力を測定した(Pfefferkorn, L.C. and G.R. Yeaman (1994), Ｕ９３７細胞におけるＩｇＡＦｃ受容体（ＦｃｘＲ）のＦｃεＲＩγ２サブユニットとの会合, J. Immunol. 153:3228; Hallet, H.B. and A.K. Campbell (1983).多形核球白血球における酸素遊離基の産生を刺激する別個の二つの機序, Biochem J. 216:459)。１０％のＦＢＳ（ハイクローン社、ユタ州ローガン）を含有するＲＰＭＩ−１６４０（ギブコ社、ニューヨーク州グランドアイランド）中で、１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ（ゲネンテック社Genentech, カリフォルニア州サンフランシスコ）の存在下で、五日間、Ｕ９３７細胞を培養して、ＦｃγＲＩの分化及び増強された発現を誘導した。実験日に、これらの分化させた細胞は、１０％のＦＢＳを含有する新鮮なＲＰＭＩ−１６４０中において、３７℃で２０分間定温放置した。次に、これらの細胞をペレット化し、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭグルコース及び１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ（シグマ社、ミズーリー州セントルイス）を補足したＰＢＳ中に、１ｍｌ当たり３ｘ１０６個の細胞の濃度で懸濁させた。スーパーオキシドの放出を惹起するために、０．１ｍＭのルミノール（シグマ社、ミズーリー州セントルイス）、０．５ｍＭ１００μｌのバナジウム酸ナトリウム（シグマ社、ミズーリー州セントルイス）およびｍＡｂＭ２２，Ｈ２２又は１９７のうち何れかを含有する１００μｌの反応溶液に、１００μｌの細胞を加えて、２２℃で、照度計中に配置した。照度計中で反応溶液に細胞を加えた直後から開始して、スーパーオキシドの自発的な産生を、３０乃至４０秒ごとに照度計で測定した。ＦｃγＲＩをＭ２２、Ｈ２２又は１９７と架橋させることで惹起されたスーパーオキシドを比較するために、各ｍＡｂは同一濃度１０μｇ／ｍｌで使用した。ｍＶ／ｓｅｃでのスーパーオキシドの産生を２０分間モニターした。ｍＡｂＭ２２、Ｍ３２．２及び１９７を種々の濃度で加えてスーパーオキシド産生の用量反応性を確立した。 
【００９３】
結果 
マウスＩｇのＶ領域遺伝子 
マウスのＨ鎖及びκの恒常領域に関して特異的なプライマーを用いて、Ｍ２２ハイブリドーマＲＮＡからＩｇＶ領域ｃＤＮＡを調製し、成熟したＶ領域の既知のシグナル及び／又は５’配列の配列に基づいて一連のプライマーを付加的に用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅した。ＶＨ及びＶκに関して、見込んだ大きさのＰＣＲ作製物が、ＳＨ２ＢＡＣＫ／ＣＧ１ＦＯＲ及びＶＫ７ＢＡＣＫ／ＣＫ２ＦＯＲプライマーの組み合わせを使用して得られた。増幅されたＤＮＡは適正な制限酵素で消化され、Ｍ１３にクローニングされて、両方向の配列は、少なくとも２４個の別個のクローンから決定された。導き出したアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号２９及び３０に示されている。Ｖκの４つのＮ末端残基は、ＶＫＢＡＣＫプライマーによってコードされている。 
【００９４】
Ｍ２２ＶＨ及びＶκは、それぞれマウスＨ鎖サブグループＩＩＩＤ及びカッパサブグループＩの仲間である（Kabat, E.A. et al., (1991), 免疫グロブリンに関するタンパク質配列第５版、米国健康福祉省 （Department of Health and Human Services）。Ｌ９７の残基を除けば、Ｍ２２Ｖκのアミノ酸配列は、マウス抗ＩｇＧｍＡｂＡ１７からの配列と同一である（Shlomchik, M. et al., マウスＩｇＭ抗ＩｇＧモノクローナル自己抗体の可変領域配列（リウマチ因子）。II ＩＩ．バイリポ多糖類刺激及び二次プロテイ免疫化から由来のハイブリドーマの比較、 bylipopolysaccharide,  J. Exp. Med. 165:970）。 
【００９５】
ヒト化ｍＡｂ及びその結合の最初の特性説明 
Ｍ２２ＶＨＦＲは、ＮＥＷＭ（相同率５７％）（ヒトサブグループＩＩ）よりＫＯＬ（ヒトサブグループＩＩＩ）に対してより大きな相同性（７９％）を示した。この違いがどのように結合に影響するのかを見るために、マウス残基Ｐｈｅ２７、Ｉｌｅ２８及びＡｒｇ７１を含むＮＥＷＭＶＨ又はマウスＦＲアミノ酸を含まないＫＯＬＶＨの何れかに基づいて、Ｈ鎖を作成した。両方のヒト化ＶＨが、同じＲＥＩ由来のヒト化Ｌ鎖と組み合わせられた。 
【００９６】
ＦｃγＲＩ／ＩｇＭＨ鎖融合タンパク質への結合を測定して、ヒト化ｍＡｂの親和性をＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）によって最初に評価した。このデータによれば、ＫＯＬＶＨ／ＲＥＩＶκｍＡｂは、キメラｍＡｂと同じ結合性を有するが、ＮＥＷＭＶＨ／ＲＥＩＶκｍＡｂは、低親和性がおよそ５倍低いことが分かった。非特異的ヒトＩｇＧ１ｍＡｂの結合性が低いことにより、ヒト化ｍＡｂの結合が９５％より高い場合ＦｃドメインではなくＦｖ部分を介するものであることがわかった。 
【００９７】
結合親和性を再生させるためにはＮＥＷＭＦＲに追加的変更が必要となると考えられたが、これらは有害な免疫反応を引き起こす可能性がある新規のエピトープを創製する恐れがあった。よって、Ｈ２２と指定されたＫＯＬＶＨ／ＲＥＩＶκｍＡｂを、その結合特性を更に実験するために選択した。 
【００９８】
ｍＡｂＨ２２の機能に関する特性説明 
一連の結合実験を実施してＨ２２抗体の特異的部分及びアイソタイプを確立した。フルオレセインと結合したＭ２２又はＨ２２で染色された末梢血白血球によって、細胞一個当たりおよそ１０４箇所の結合部位を有する単球に対する特異的結合が証明された。対照的に、リンパ球又は刺激されなかった好中球には殆どもしくは全く特異的結合が見られなかった（表１）。 
【００９９】
【表１】
2007119485.tif 000003
【０１００】
Ｈ２２は、Ｍ２２と同一の部位においてＦｃγＲＩに結合すること、及びＨ２２はＦｃ結合領域においてリガンドとしても結合することを証明するために、二つの抗ＦｃγＲＩマウスｍＡｂ（Ｈ２２及びＭ３２．２）及びヒトＩｇＧ１ｍＡｂに関して競合実験を実施した。非共役Ｈ２２及びＭ２２は、ＦｃγＲＩのＦｃ結合部位を飽和させる過剰なヒトＩｇＧの存在下で、フルオレセイン染色されたＭ２２又はフルオレセインされた染色されたＨ２２の何れかに関して、同等に競合した。見込み通り、Ｍ２２とは異なるＦｃγＲＩ上の部位に結合する抗ＦｃγＲＩ抗体Ｍ３２．２（Guyre, P.M. et al., J. Immunol. 143:1650）も、Ｍ２２−ＦＩＴＣと競合することができなかった。さらに、Ｈ２２によって、したがって無関連なヒトＩｇＧ１ｍＡｂによってではなく、Ｈ２２−ＦＩＴＣが阻害されることから、Ｈ２２のＶ領域を介したＦｃγＲＩの特異性が確認された。 
【０１０１】
Ｈ２２は、、フルオレセイン染色されたヒトＩｇＧ１によって、ＦｃγＲＩとのＦｃ媒介結合をめぐって競合することができたが、Ｍ２２はそれができなかった。この実験の結果、Ｍ２２ではなく、Ｈ２２のＦｃ部分が、ＦｃγＲＩのＦｃ結合ドメインに結合することが証明された。これは、マウスＩｇＧ１ではなく、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分が高親和性をもってＦｃγＲＩと結合することができる事実と一致している。 
【０１０２】
Ｍ２２をヒト化すると主にその免疫治療能を増大させるので、単球及びサイトカイン活性化された好中球に対するＨ２２の結合活性を、ヒト血清の存在下で測定した。Ｈ２２−ＦＩＴＣは、ヒト血清の存在下でも非存在下においても、同様の親和性をもって単球上のＦｃγＲＩと結合した。対照的に、無関連のヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣのＦｃ媒介結合は、完全にヒト血清によって阻害された。同様に、Ｈ２２−ＦＩＴＣは、ヒト血清の存在下でも非存在下においても、同様の親和性をもってＩＦＮ−γ処理した好中球と結合した。総括すれば、Ｈ２２は、そのＶ領域を介してＦｃ結合ドメインとは別の部位に結合し、且つそのＦｃ領域を介してＦｃγＲＩのリガンド結合ドメインに結合する、ということがデータによって証明された。前者の結合活性によって、ヒトＩｇＧ１の抗体妨害を効果的に克服することができる。 
【０１０３】
Ｈ２２ＢｓＡｂの機能的活性 
免疫治療に関して抗ＦｃγＲＩ抗体主に適用されるのは、腫瘍細胞、ウイルス又はウイルス感染細胞にＦｃγＲＩ担持エフェクター細胞を結合させるＢｓＡｂの開発である。こうしたＢｓＡｂはＭ２２を用いて開発されたので、Ｍ２２抗腫瘍ＢｓＡｂ（５２０Ｃ９ｘＭ２２）及び対応するＨ２２ＢｓＡｂ（５２０Ｃ９ｘＨ２２）を細胞障害性介在能力に関して比較した。これらのＢｓＡｂは、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体（５２０Ｃ９）のＦａｂ’と化学的に共役したＨ２２又はＭ２２のＦａｂ’からなり、よってエフェクター細胞トリガ分子ＦｃγＲＩ及び腫瘍抗原に関して特異的であった。 
【０１０４】
Ｍ２２由来及びＨ２２由来のＢｓＡｂの比較をＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害）アッセイにより実施した。Ｍ２２及びＨ２２由来のＢｓＡｂは、ＨＥＲ２／ｎｅｕＳを過剰発現するＫＢＲ−３細胞の致死に介在した。マウス及びヒトＢｓＡｂの両方とも、同様なレベルの抗原担持標的細胞の溶解を示した。さらに、両方のＢｓＡｂが、ヒト血清の存在下で、ＡＤＣＣ活性を保持したが、過剰なＭ２２Ｆ（ａｂ’）２は、致死を完全に阻害することになった。これらの結果を合わせると、Ｈ２２ＢｓＡｂ誘導溶解は、Ｍ２２エピトープを介して媒介されることと、及びＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩ特異的であることが分かった。 
【０１０５】
最後に、単球様セルラインＵ９３７によるスーパーオキシド産出を刺激するＨ２２及びＭ２２の能力を評価した。Ｍ２２（そのＶ領域によってのみＦｃγＲＩに結合する）が非常に低レベルの酸素バーストしか誘導しないのは、おそらくそれが受容体と効率的に架橋できないからであると考えられる。しかし、Ｈ２２は、そのＦｃドメインを介してリガンドとして、また更にそのＦｖを介して抗体としても結合することによって、ＦｃγＲＩを架橋することができるが、Ｈ２２はスーパーオキシドのより多くの放出を誘導した。 
【０１０６】
例２：機能的Ｈ２２上皮成長因子融合タンパク質の作製 
【０１０７】
材料及び方法 
発現ベクター及びクローニング 
Ｈ鎖（ｐＳＶｇｐｔ）及びＬ鎖（ｐＳＶｈｙｇ）のゲノミッククローンに関する発現ベクターは、国際特許出願公開第ＷＯ９４／１０３３２（名称「ヒト単核貪食細胞上の免疫グロブリンＧに関するＦｃ受容体に対するヒト化抗体」）に記載の如くである。Ｆａｂリガンド融合構成体に関して、そのＬ鎖を変更する必要があった。しかし、そのＨ鎖に関しては、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを除去し且つリガンドをコードする配列で置換しなければならなかった。Ｈ鎖ベクターは、二つのＢａｍＨＩ部位を含み、一方はＶＨ及びＣＨ１の間のイントロン中に、他方はＣＨ３のすぐ下流側に存在する。ＢａｍＨＩ制限部位を用いて、恒常ドメインをコードするＤＮＡをＣＨ１及びヒンジの大部分だけをコードする切断型と置換した。このようにするために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して、図１に示した変更部を有するＨ鎖フラグメントの新たなＣ末端を設計した。 
【０１０８】
図１Ｃに示した構成体は、クローニング制限部位（ＸｈｏＩ及びＮｏｔＬ）の下流側であり、ＶＨの下流側の新たなＰＣＲ産生ＣＨＩフラグメントをクローニングするのに用いた、ＢａｍＨＩ部位の上流側にある翻訳末端コドンと、からなるが、この構成体を融合タンパク質構成体を作製するのに用いた。 クローニング部位は、Ｆｄとリガンドドメインとの間で柔軟性を保持するために殆どヒンジの下流側に位置するが、この部位を用いてＥＧＦ又は他のリガンドをコードするＤＮＡを挿入した。同様に、一つのＣｙｓ残基が、二量体分子を形成するための共役が可能なように前構成体から保持された。 
【０１０９】
リガンドをコードするＤＮＡは、Ｎ末端上にＸｈｏＩ部位を又コード化領域のＣ末端上にＮｏｔＩ部位を有するようにＰＣＲにより増幅され、次に適正な解読枠内で上記の新たに作成されたＨ２２Ｈ鎖切形フラグメントの同一部位に挿入された。上皮成長因子（ＥＧＦ）をコードするｃＤＮＡは、ＡＴＣＣ（預託番号５９９５７）から入手した。およそ１２００の残基先駆物質から成熟したＥＧＦの５３個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡだけを、開始はＡｓｎ９７１で、そして終止はＡｒｇ１０２３でクローニングした。(Bell, G.I., Fong, N.M., Stempien, M.M., Wormsted, MA., Caput, D., Ku. L., Urdea, M.S., Rall, L.B. & Sanchez-Pescador, R. ヒト上皮成長因子前駆物質：ｃＤＮＡ配列、インビトロ発現及び遺伝子組織、 Nucl. Acids Res. 14: 8427 8446,1986.) 
【０１１０】
発現 
マウス骨髄腫ＮＳＯ（ＥＣＡＣＣ８５１１０５０３）は非免疫グロブリン合成ラインであり、融合タンパク質の発現に用いられた。最終表現ベクター、即ちフレーム内でＥＧＦ（図２に示す）に融合されたＨ２２ＦｄをコードするＤＮＡを有するｐＳＶｇｐｔ構成体が、バイオラッド・ジーン・パルサーを用いる電気穿孔法によって、Ｈ２２Ｌ鎖をコードするＤＮＡを含有するｐＳＶｈｙｇで、既に形質移入されたＮＳＯに形質移入された。これらのポリペプチドは、ベクター内に存在するＩｇプロモーター及びＩｇエンハンサーによって発現され、これらの構成体のＮ末端上に存在するｍＡｂ２２Ｈ鎖ペプチドによって分泌された。形質移入後一日又は二日間、マイコフェノール酸及びキサンチンを培地に加えて、ＤＮＡを取り込んだ細胞を選択した。結合活性をＥＬＩＳＡによって証明した後、個々の成長コロニーは分離されサブクローニングされた。 
【０１１１】
精製 
Ｈ２２−ＥＧＦ融合タンパク質を発現する細胞は、サブクローニングされ、拡大された。融合タンパク質発現クローンは、撹拌培養で拡大かつ成長させ、その上澄を清澄且つ濃縮させた。抗ヒトカッパ鎖親和性カラム（ステロジーン社、カリフォルニア州カールスバッド）上で親和性クロマトグラフィーによって、小規模な精製を実施した。精製されたタンパク質は、５乃至１５％アクリルアミド勾配ゲル上で非還元性条件下において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって分析した。図３は、抗Ｆｃ受容体−リガンド融合タンパク質の作製を概略図で示したものである。 
【０１１２】
二重特異性フローサイトメトリー 
融合タンパク質がＦｃγＲＩ及びＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）の両方と結合する能力を有することを証明するために、フローサイトメトリー・アッセイが開発された（図４）。このアッセイにおいては、種々の濃度のＨ２２−ＥＧＦ融合タンパク質又は二重特異的抗体、即ちＢｓＡｂＨ４４７（Ｈ２２ＸＨ４２５、リガンド結合部位においてＥＧＦＲを結合する（E. Merck）マウスモノクローナル抗体Ｍ４２５のヒト化型）を、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）を発現するセルラインＡ４３１細胞（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル）と共に定温放置した。洗浄後、ＦｃγＲＩの細胞外ドメイン及びヒトＩｇＭのＦｃ部分からなる融合タンパク質を含有する上澄を加えた。最後に、ｍＡｂ２２によって結合された部位とは別の部位でＦｃγＲＩを結合する、フィコエリトリン（ＰＥ）標識ｍＡｂ（３２．２）を加えた。次に、これらの細胞をファックスキャンによって分析した。或いは、ＥＧＦＲとの結合は、過剰の（１００μｇ／ｍｌ）全マウスｍＡｂ４２５（E. Merck）によって遮断し、ｂｓＡｂの結合、つまり融合タンパク質が、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧによって検出された。 
【０１１３】
ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害） 
融合タンパク質が介在するＡＤＣＣは、５１Ｃｒ致死アッセイを用いて測定された。ＥＧＦＲ（Ａ４３１）を過剰に発現するセルラインは、γインターフェロン（ＩＦＮ−γ）において２４時間培養されたヒト単球による溶解に関する標的として用いられた。Ｕ字底微量定量プレート内でエフェクター細胞及び抗体を結合させる前に、標的を１００μＣｉの５１Ｃｒで一時間標識した。３７℃で五時間放置後、上澄を回収して放射能の有無を分析した。細胞障害性は、次式によって計算された。即ち、溶解（％）＝（実験用ＣＰＭ−標的漏出ＣＰＭ／洗浄剤溶解ＣＰＭ−標的漏出ＣＰＭ）ｘ１００％。特異的溶解＝抗体を含む溶解（％）−抗体を含まない溶解（％）。ＡＤＣＣを媒介する融合タンパク質の能力が、それぞれのＢｓＡｂの能力と比較された。２５％のヒト血清の存在下においてもこのアッセイを実施して、ＩｇＧ又は他のヒト血清中の要素は融合タンパク質介在ＡＤＣＣを阻害しないことを証明した。。 
【０１１４】
結果 
精製 
Ｈ２２カッパ鎖を発現するＮＳＯ細胞を、Ｈ２２−ＥＧＦＨ鎖構成体で形質移入し、マイコフェノール酸及びキサンチンに対する耐性に関して選択されたクローンを拡大し、融合タンパク質を抗ヒトカッパカラム（ステロジーン社、カリフォルニア州カールズバッド）の上の上澄から親和精製した。精製されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。精製されたタンパク質は、５０乃至５５ｋＤａの見かけ分子量で泳動したが、これは融合タンパク質が、ジスルフィド結合二量体ではなく、単量体として発現されていることを示すものである。さらに、２５ｋＤａの見かけ分子量で、バンドが認められたが、おそらく遊離Ｌ鎖であろう。 
【０１１５】
結合特異性 
融合タンパク質がＦｃγＲＩ及びＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）と同時に結合できることを証明するために二重特異的ＦＡＣＳ（細胞自動解析分離装置）アッセイが考案された。図５に示すのは、化学的に結合され、完全にヒト化されたＢｓＡｂＨ４４７（Ｈ２２（抗ＦｃγＲＩ）ｘＨ４２５）と、以下の例３に記載されるように作成されたＨ２２−ＥＧＦ融合タンパク質とが、Ａ４３１細胞上のＥＧＦＲ及び可溶性のＦｃγＲＩと、同時に用量依存の態様で結合した。 
【０１１６】
この融合タンパク質のＥＧＦＲ特異性は、リガンド結合部位においてＥＧＦＲと結合するマウスｍＡｂ（Ｍ４２５）が、融合タンパク質又はＨ２２ｘＨ４２５結合を阻害する能力によって証明された。種々の濃度のＢｓＡｂＨ４４７又はＨ２２−ＥＧＦ融合タンパク質の何れかを、過剰なＭ４２５の存在か又は非存在下の何れかで、Ａ４３１細胞と一緒に定温放置した。図６が示すのは、ＢｓＡｂ及び融合タンパク質の両者の結合がＭ４２５によって阻害されたことであり、ＥＧＦＲに関する融合タンパク質の特異性を証明する。          
【０１１７】
ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害） 
融合タンパク質がＡＤＣＣを媒介する能力を、Ａ４３１細胞を標的として用いて分析した。ＩＦＮ−γの存在下で２４時間培養したヒト単球がエフェクター細胞として用いられた。図７は、完全な抗体（Ｈ４２５）、ＢｓＡｂＨ４４７（Ｈ２２ｘＨ４２５）及びＡ４３１細胞の融合タンパク質媒介用量依存溶解を実証するものである。図８は、完全な抗体によって媒介されたＡＤＣＣが、２５％のヒト血清（２５％ＨＳ）によって阻害され且つ一方で、この実験の場合においては、融合タンパク質媒介ＡＤＣＣはヒト血清によって増強されたことを証明する。この融合タンパク質は、生体内に存在するＦｃγＲＩ発現エフェクター細胞の存在下であってさえも、ＥＧＦＲ過剰発現細胞を殺す能力があることを証明することによって、これらの分子の治療上の有用性がこのような結果によって裏打ちされた。 
【０１１８】
Ｈ２２−ＥＧＦ融合タンパク質の成長阻害特性 
ＥＧＦは、それに関する受容体を発現する正常な細胞の成長を刺激するように作用するが、それは同時にＥＧＦ−Ｒを過剰発現する腫瘍細胞の成長を阻害するようにも作用する（Barnes, D.W. (1982) J. Cell Biol. 93:1, MacLeod, C.L. et al. (1986) J. Cell. Physiol. 127:175）。ＥＧＦ及びＨ２２−ＥＧＦ融合タンパク質がＡ４３１細胞の成長を阻害できることが以下のごとく検査された。 
【０１１９】
完全培地だけの場合と、或いは種々の濃度のＥＧＦ、Ｈ２２−ＥＧＦ、Ｈ２２のＦａｂフラグメント又はＨ４２５のＦ（ａｂ’）２フラグメントの何れかを含有する培地の場合で、２ｘ１０４Ａ４３１細胞を六つのウェルプレートに加えた。七日後に、生存能力のある細胞を血球計数器を使って勘定した。分析は、二重反復実験で実施し、平均値＋／−標準偏差で報告した。 
【０１２０】
結果が図９に示してある。これらの結果が示すのは、ＥＧＦ及びＨ２２−ＥＧＦは、用量依存の態様で細胞の成長を顕著に阻害したことである。逆に高濃度においてのみ幾らか阻害活性を有したＨ４５のＦ（ａｂ’）２フラグメント及びＨ２２のＦａｂフラグメントには阻害活性が見られなかった。 
【０１２１】
よって、Ｈ２２−ＥＧＦは、ＦｃγＲＩ及びＥＧＦの両者と同時に結合でき、この分子は、適切にフォールドし、且つ両方の受容体と同時結合するのに必要な融通性を適正に保持し且つ維持したこと分かる。更に、Ｈ２２−ＥＧＦは、ＥＧＦ−Ｒ腫瘍を発現するセルライン（Ａ４３１）の増殖を阻害したことで、ＥＧＦと同様に、Ｈ２２−ＥＧＦ融合タンパク質は、ＥＧＦ−Ｒを介して信号を送ることができることを示す。Ｈ２２−ＥＧＦはまた、ＦｃγＲＩを発現するエフェクター細胞の存在下で、Ａ４３１細胞を殺す潜在能を媒介する。よって、Ｈ２２−ＥＧＦは、ＥＧＦ−Ｒを発現する細胞に対する、細胞障害性及び細胞増殖抑制性の両方の効果を媒介する。腫瘍細胞を有する被験体にＨ２２−ＥＧＦを投与すると、潜在的には三つの異なる態様、即ち、細胞障害、成長阻害及び食菌作用によって、体に本来ある細胞障害性エフェクター細胞を動員して腫瘍細胞を殺す媒介を行うことになろう。さらに、腫瘍細胞の細胞媒介性細胞障害に加えて、Ｈ２２−ＥＧＦによって動員されたエフェクター細胞は、炎症性のサイトカインの分泌及び／又は腫瘍特異的Ｔ細胞に腫瘍抗原をプロセシングしかつ提示することによって、抗腫瘍免疫性をさらに増大させることもできる。 
【０１２２】
例３：Ｈ２２−ヘレグリン（Ｈ２２−ｇｐ３０）融合タンパク質による腫瘍細胞致死の媒介 
【０１２３】
ヘレグリン（ＨＲＧ）は、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４分子に関するリガンドである。これら受容体は両方とも幾つかの乳癌細胞に過剰発現されることがある分子ＨＥＲ２と共に異質二量体を形成できる。ＨＥＲ３及びＨＥＲ４に関するＨＲＧの親和性は、これらの分子が分子ＨＥＲ２と異質二量体を形成する場合に著しく増大する。この例によって分かることは、ヘレグリン及びＦｃγＲＩに関する結合特異性を包含する二重特異的分子は、腫瘍セルラインの成長を阻害し、かつＦｃγＲＩ担持細胞障害性エフェクター細胞の存在下においてこれらの細胞の融合タンパク質依存型細胞侵害性を媒介するということである。 
【０１２４】
Ｈ２２−ヘレグリン融合タンパク質は、例２に記載のＨ２２−ＥＧＦ融合タンパク質と同じ方法で構成することができる。簡単に説明すると、ヒト化抗ＦｃγＲＩｍＡｂ（Ｈ２２）のＦｄフラグメントをコードするゲノムＤＮＡを、ＨＲＧのβ２型のＥＧＦドメインをコードするｃＤＮＡに融合させた。Ｈ２２−ＨＲＧ融合タンパク質（配列ＩＤ番号４）のアミノ酸配列が図１０に示されている。この融合タンパク質は、米国特許第５，３６７，０６０号に示されているヘレグリンβ２のアミノ酸１７１乃至２３９からなる。ヘレグリンβ２の他の部分も、米国特許第５，３６７，０６０号に開示されたような、他のヘレグリン分子の部分同様、用いてもよい。得られたＨ２２Ｆｄ−ＨＲＧ発現ベクターを、Ｈ２２カッパＬ鎖をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質移入済みの骨髄腫セルラインに形質移入した。結果として得られた融合タンパク質は、それがＨ２２Ｆａｂ成分のヒンジ領域における遊離Ｃｙｓ残基を含んではいるが、モノマーとして概ね発現された。フローサイトメトリーの結果、この融合タンパク質は、ＦｃγＲ発現細胞とばかりでなく、ＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍セルライン（ＳＫＢＲ−３）とも結合できることが分かった。 
【０１２５】
Ｈ２２Ｆｄ−ＨＲＧ融合タンパク質の生物活性度をテストするために、この融合タンパク質を発現する骨髄腫細胞の上澄を３倍乃至３０倍に希釈して、ＩＦＮ処理単球の存在下において、１００対１の単球と標的腫瘍細胞との比率で、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４を発現するＰＣ−３細胞もしくはＳＫＢＲ−３腫瘍細胞に加えた。これらの単球は、ＩＦＮ−γで処理し、これらの標的細胞は、例２の記載の如く５１Ｃｒで標識した。特異的な溶解のパーセントは、例２と同じく計算された。その結果は、図１１に示す。この結果が示唆するのは、約４５％のＳＫＢＲ−３細胞及び約４９％までのＰＣ−３細胞は、三倍に希釈した上澄と一緒にこれらの細胞を定温放置すると溶解されることである。 
【０１２６】
このような融合タンパク質は、ＦｃγＲＩ担持細胞障害性エフェクター細胞の存在下において、ＳＫＢＲ−３腫瘍細胞の成長を阻害し且つこれらの細胞の融合タンパク質依存性細胞障害性を媒介する。よって、この例の結果が示すのは、抗ＦｃγＲＩ−ＨＲＧ融合タンパク質は、生理学的な条件下において抗腫瘍細胞障害的活性を媒介できることをであり、且つこのような融合タンパク質は、種々の癌の処置における治療上の有用性を有することが示されている。 
【０１２７】
例４：Ｈ２２−ボンベシン融合タンパク質による腫瘍細胞致死の媒介 
【０１２８】
Ｈ２２−ボンベシン融合タンパク質は、上記のＨ２２−ＥＧＦ融合タンパク質と同様に作製された。しかし、ボンベシンは短いペプチド（１４個のアミノ酸残基）なので、ボンベシンをコードするｃＤＮＡをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術を用いて増幅するのではなく、ボンベシンのセンス及びアンチセンス鎖をコードするＤＮＡオリゴノマーを交雑させてコード領域を創製した。Ｈ２２抗体のＨ鎖のＣ末端に融合したボンベシンペプチドのアミノ酸配列は次のものである。 
【０１２９】
−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−（配列ＩＤ番号５） 
【０１３０】
上記配列は、ボンベシンのアミノ酸２ないし１４に対応し(Anastasi et al. (1971) Experientia 27:166)、ペプチドのＣ末端における付加的なグリシン残基を含む。これらのオリゴマーは、その重複端部は交雑はしなかったが、その代わりにＮ末端上のＸｈｏｌ部位及びＣ末端上のＮｏｔＩ部位に関する付着端を創製するので、その部位は、上記のＨ２２Ｈ鎖発現ベクターにクローン化され得た。 
【０１３１】
腫瘍細胞致死に関するＨ２２−ボンベシン融合タンパク質の生物学的活性は、Ｈ２２−ＥＧＦおよびＨ２２−ヘレグリン融合タンパク質に関して記載したような方法で検査した。簡単に説明すると、ＰＣ−３腫瘍細胞担持ボンベシン受容体を５１Ｃｒで標識し、単球及び種々の濃度のＨ２２融合タンパク質と一緒に定温放置して、上記記載の如く、融合タンパク質依存性溶解を測定した。図１２に示した結果は、標的細胞が溶解したことと、アッセイに加えた融合タンパク質の量に比例して、標的細胞溶解のレベルが増加することを示している。 
【０１３２】
ひとつの結合実体としてＨ２２を、及びひとつの二次的な結合実体としてＣＤ４（エイズレポジトリー）又はｇｐｌ２０（エイズ・レポジトリー）を有する融合タンパク質も同様に作製された。 
【０１３３】
例５：改変されたヒト化抗体フラグメントからの二重特異的抗体の作製 
【０１３４】
材料及び方法 
発現ベクター及びクローニング 
Ｈ２２のＨ（ｐＳＶｇｐｔ）及びＬ（ｐＳＶｙｇ）鎖のゲノムクローンに関する発現ベクターは、「ヒト単核貪食細胞上の免疫グロブリンに関するＦｃ受容体に対するヒト化抗体」と題する国際特許出願公開第ＷＯ９４／１０３３２号おいて記載されている。Ｆａｂ’の構成体に関してはＬ鎖を変更する必要があった。しかし、Ｈ鎖に関しては、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、除去し且つ末端コドンに置き換えねばならなかった。Ｈ鎖ベクターには二つのＢａｍＨＩ部位が含まれており、一つはＶＨ及びＣＨｌ間のイントロンの中に、そして他方はＣＨ３のすぐ下流側に存在する。ＢａｍＨＩ制限部位を使用して、恒常ドメインをコードするＤＮＡは、ＣＨ１とヒンジの大部分だけをコードする切断型と置換した。こうするために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して、図１に示した変更部を有するＨ鎖フラグメントの新たなＣ末端を作製した。図１Ｂに、切断された単一スルフヒドリル形の作製に関する変更を示す。 
【０１３５】
発現 
マウス骨髄腫ＮＳＯ（ＥＣＡＣＣ８５１１０５０３）は非免疫グロブリン合成ラインであり、改変Ｈ２２抗体の発現に用いた。最終表現ベクター、即ち、Ｈ２２ＦｄをコードするＤＮＡを持つｐＳＶｇｐｔ構成体は、バイオラッド・ジーン・パルサーを用いる電気穿孔法によって、Ｈ２２Ｌ鎖をコードするＤＮＡを含むｐＳＶｈｙｇ構成体で同時形質移入された。これらのポリペプチドは、ベクター内に存在するＩｇプロモーター及びＩｇエンハンサーによって発現され、これらの構成体のＮ末端上に存在するｍＡｂ２２Ｈ鎖シグナルペプチドによって分泌された。形質移入後一日又は二日間、マイコフェノール酸及びキサンチンを培地に加えて、ＤＮＡを取り込んだ細胞を選択した。ＦｃγＲＩの結合活性が実証された後、個々の成長コロニーは分離されサブクローニングされた。 
【０１３６】
精製 
単一スルフヒドリル形のＨ２２抗体及び完全Ｈ４２５（抗ＥＧＦＲ）抗体は、それぞれの形質移入されたＮＳＯ細胞のインビトロ培養によって作製した。Ｈ４２５は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。単一スルフヒドリル形のＨ２２抗体は、Ｑ−セファロースに続いてＳＰ−セファロース（ファーマシア社、ニュージャージー州ピスカタウェー）を使用してイオン交換クロマトグラフィーによって精製された。単一スルフヒドリル形のＨ２２抗体の精製は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。 
【０１３７】
二重特異的抗体（ＢｓＡｂ）の作製 
ＢｓＡｂは、Glennie等の方法を用いて作成した(Glennie, M.J. et al., (1987),チオエーテル結合の二重特異的Ｆ（ａｂ’γ）２抗体の調製及び性能, J. Immunol., 139:2367)。Ｈ４２５のＦ（ａｂ’）２は、０．１Ｍのクエン酸塩緩衝液で、ｐＨ３．５において、制限ペプシンタンパク質加水分解によって作製され、Ｆ（ａｂ’）２は、イオン交換クロマトグラフィーによって精製された。  ｍＡｂは、２０ｍＭのメルカプトエタノールアミン（ＭＥＡ）を加えることによって、３０℃で３０分間還元された。Ｆａｂ’フラグメントは、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ５．３、４℃）中で平衡させたセファッデクスＧ−２５カラムにかけた。ジメチルホルムアミドに溶解させ且つメタノール／氷の溶液中で冷却したオルトフェニレンジマルイミド（ｏ−ＰＤＭ、１２ｍＭ）をＨ２２Ｆａｂ’に加えて（半量）、さらに氷上で３０分間定温放置した。次に、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ５．３、４℃）中で平衡させたセファッデクスＧ−２５カラムにおいて、遊離ｏ−ＰＤＭからこのＦａｂ’−マレイミダを分離した。ＢｓＡｂの調製に関しては、１．２対１のモル比で、Ｈ２２Ｆａｂ’−マレイミドをＨ４５Ｆａｂ’に加えた。アミコンチャンバ内で、デアフロ膜を用いて、窒素存在下において、これらの反応体を出発量まで濃縮した（全て４℃）。１８時間後に、ｐＨ８．０の１ＭのトリスＨＣＬでそのｐＨを８．０に調節した。次いで、この混合物を１０ｍＭのＭＥＡで還元し（３０℃で３０分間）且つ２５ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化した。ＰＢＳにおいて平衡させたスーパーデックス２００(ファーマシア社、ニュージャージー州イスカタウェー)カラムによって生じた、非反応Ｆａｂ’及び他の作製物から、二重特異的Ｆ（ａｂ’）２を分離した。 
【０１３８】
二重特異性フローサイトメトリー 
ＤＴＮＢ（ベータジストロブレビンdystrobrevinβ）法によって作製されたものばかりでなくｏ−ＰＤＭ（オルトフェニレンジマルイミド）法によって作製されたＢｓＡｂが、ＦｃγＲＩ及びＥＧＥＲと同時に結合できることを証明するために、フローサイトメトリーアッセイが開発された（図１３）。このアッセイにおいては、種々の濃度の二つのＢｓＡｂが、Ａ４３１細胞（ＥＧＦ受容体、つまりＥＧＦＲ受容体を発現するセルライン）と一緒に定温放置された。洗浄後、ＦｃγＲＩの細胞外ドメイン及びＩｇＭのＦｃ部分からなる融合タンパク質を含有する上澄がこれらの細胞と一緒に定温放置された。最後に、これらの細胞を、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＭ特異的抗体と一緒に定温放置した。その後、これらの細胞を、ＦＡＣＳＣＡＮによって分析した。 
【０１３９】
ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害） 
ＢｓＡｂ媒介ＡＤＣＣは、５１Ｃｒ致死アッセイを用いて測定された。ＥＧＦＲ（Ａ４３１）を過剰に発現するセルラインは、γインターフェロン（ＩＦＮ−γ）において２４時間培養されたヒト単球による溶解に関する標的として用いられた。平底微量定量プレート内で、エフェクター細胞及び抗体を結合する前に、標的を１００μＣｉの５１Ｃｒで一時間標識した。３７℃で１６時間放置後、上澄を回収して放射能の有無を分析した。細胞障害性は、次式によって計算した。即ち、溶解（％）＝（実験用ＣＰＭ−標的漏出ＣＰＭ／洗浄剤溶解ＣＰＭ−標的漏出ＣＰＭ）ｘ１００％。Ａｂ依存性溶解＝抗体を含む溶解（％）−抗体を含まない溶解（％）。 
【０１４０】
結果 
精製 
ＮＳＯ細胞は、切断型Ｈ２２Ｈ鎖構成体及び無傷のκ鎖構成体で同時形質移入された。マイコフェノール酸及びキサンチンに対する耐性に冠して選択されたクローンが展開され、このタンパク質は、Ｑ−セファロースに続きＳＰ−セファロースによって上澄から精製された。精製されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。精製されたタンパク質は、５０ｋＤａの見かけ分子量で泳動したが、これは融合タンパク質が、ジスルフィド結合二量体ではなく、単量体として発現されていることを示すものである。 
【０１４１】
Ｈ４２５のＦａｂ’（抗ＥＧＦＲ）に結合した単一スルフヒドリル形Ｈ２２からなるＢｓＡｂの作製及び特性説明 
ＢｓＡｂは、単一スルフヒドリル形のＨ２２がＨ４２５のＦａｂ’フラグメント、即ち、ヒト化抗ＥＧＦＲｍＡｂに結合した所に構成された。ＢｓＡｂは、ｏ−ＰＤＭをリンカーとして用いてGlennie等の方法によって作製されている（Glennie, M.J. et al., (1987),  チオエーテル結合Ｆａｂ’γフラグメントを含有する抗体である二重特異的Ｆ（ａｂ’γ）２の調製及び性能、 J. Immunol., 139:2367）。ＢｓＡｂの活性が、完全Ｈ２２のペプシン消化及び還元から作製されたＦａｂ’フラグメントを用いるＤＴＮＢ法によって作製されたものと比較された。これらのＢｓＡｂがＦｃγＲＩ及びＥＧＦＲと同時結合できることを証明するために、三重特異的ＦＡＣＳアッセイが考案された。図１４は、ｏ−ＰＤＭ結合ＢｓＡｂ及びＤＴＮＢ法によって作成されたＢｓＡｂの両者が、用量依存の態様で、Ａ４３１細胞上のＥＧＦＲ及び可溶性のＦｃγＲＩと同時に結合したことを示す。 
【０１４２】
ＡＤＣＣを媒介するこれらＢｓＡｂの能力は、Ａ４３１細胞を標的として用いることで分析した。ＩＦＮ−γの存在下において２４時間培養されたヒト単球は、エフェクター細胞として用いた。図１５は、Ａ４３１細胞の二つのＢｓＡｂ媒介用量依存性溶解を比較可能な態様で示す。これらの結果によって、切断型、単一スルフィドリル形のＨ２２は、ＦｃγＲＩ発現エフェクター細胞の存在下においてＥＧＦＲ過剰発現細胞を殺すことができることが証明された。 
【０１４３】
例６：三価抗体の作製 
【０１４４】
材料及び方法 
セルライン及び抗体（Ｍ２２、５２０Ｃ９、Ｈ４２５。ＳＫＢＲ３及びＡ４３１） 
Ｍ２２及び５２０Ｃ９は、イオン交換クロマトグラフィー（ファーマシア社、ニュージャージ州ピスカタウェー）によってハイブリドーマ上澄から精製され、５２０Ｃ９は更にプロテインＡ親和性クロマトグラフィー（ファーマシア社、ニュージャージ州ピスカタウェー）によって精製された。Ｈ４２５は、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー（ファーマシア社、ニュージャージ州ピスカタウェー）によってハイブリドーマ上澄から精製された。Ｍ２２及び５２０Ｃ９から作製したマウスハイブリドーマは、既に記載がなされている（Guyre et al., (1989)  ＦｃｇＲＩ上の別個のエピトープに結合するモノクローナル抗体は、受容体機能を惹起することができる。 J. Immunol. 143:5, 1650-1655; Frankel et al., (1985) モノクローナル抗体によって定義された乳癌関連抗体の生体内分布、 J. Biol. Response Modifiers, 4:273-286）。マウス骨腫瘍ＮＳＯ（ＥＣＡＣＣ８５１１０５０３）は、非Ｉｇ合成ラインであり、ヒト化ｍＡｂ、即ちＨ４２５の発現に用いられた（Kettleborough et al., (1991)ＣＤＲ移植によるマウスモノクローナル抗体のヒト化：ループ立体配座上のフレームワーク残基の重要性, Protein Eng., 4:773）。ＳＫＢＲ３（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル）、即ち、ＨＥＲ２／ｎｅｕプロト腫瘍遺伝子を過剰発現するヒト乳癌腫セルライン、及びＡ４３１（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル）、即ち、ＥＧＦＲを過剰発現するヒト有棘細胞癌腫セルラインが、イスコーブの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、ギブコ社、ニューヨーク州グランドアイランド）において培養された。 
【０１４５】
好中球の調製 
好中球は、フィコール・ハイパーク(ファーマシア社、ニュージャージー州ピスカタウェー)勾配分離法により単核細胞から分離した。ＦｃγＲＩを上方制御するために、好中球はサイトカインで処理した。好中球は、２．５％の正常なヒトＡＢ型血清（シグマ社、ミズーリー州セントルイス）、５０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ（ドイツのエアランガーErlanger大学のR. Repp氏の好意により提供される）及び１００ＩＲＵ／ｍｌのＩＦＮ−γを含有するＡＩＭＶ培地（ギブコ社、ニューヨーク州グランドアイランド）において２４乃至４８時間（３７℃、５％ＣＯ２）培養した。 
【０１４６】
共役方法 
ＢｓＡｂは、Glennie等の方法によって作製された（Glennie, M.J. et al., (1987),  チオエーテル結合Ｆａｂ’γフラグメントを含有する抗体である二重特異的Ｆ（ａｂ’γ）２の調製及び性能、 J. Immunol., 139:2367）。ｍＡｂＭ２２、５２０Ｃ９（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、３３）及びＨ４２５（抗ＥＧＦＲ）抗体は、それぞれのハイブリドーマ細胞のインビトロ培養で作製された。各抗体のＦ（ａｂ’）２は、０．１Ｍのクエン酸塩緩衝液で、ｐＨ３．５において、制限ペプシンタンパク質加水分解によって作製され、Ｆ（ａｂ’γ）２ は、イオン交換クロマトグラフィーによって精製された。ｍＡｂＭ２２及びＨ４２５は、２０ｍＭのメルカプトエタノールアミン（ＭＥＡ）を加えることによって、３０℃で３０分間還元された。Ｆａｂ’フラグメントは、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ５．３、４℃）中で平衡させたセファッデクスＧ−２５カラムにかけた。ジメチルホルムアミドに溶解させ且つメタノール／氷の溶液中で冷却したオルトフェニレンジマルイミド（ｏ−ＰＤＭ、１２ｍＭ）をマウス２２Ｆａｂ’に加えて（半量）、氷上で３０分間定温放置した。次に、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ５．３、４℃）中で平衡させたセファッデクスＧ−２５において、遊離ｏ−ＰＤＭからこのＦａｂ’−マレイミダを分離した。ＢｓＡｂの調製に関しては、１対１のモル比で、Ｍ２２Ｆａｂ’−マレイミドをＨ４２５Ｆａｂ’に加えた。アミコンチャンバ内で、デアフロ膜（商品名）を用いて、窒素存在下において、これらの反応体を出発量まで濃縮した（全て４℃）。１８時間後に、ｐＨ８．０の１ＭのトリスＨＣlでそのｐＨを８．０に調節した。次いで、この混合物を１０ｍＭのＭＥＡで還元し（３０℃で３０分間）且つ２５ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化した。ＰＢＳ（食塩加リン酸緩衝液）において平衡させたスーパーデックス２００(ファーマシア社、ニュージャージー州イスカタウェー)カラムによって生じた、非反応Ｆａｂ’及び他の生成物から、二重特異的Ｆ（ａｂ’）２を分離した。ＢｓＡｂＭ２２ｘ５２０Ｃ９は、Ｈ４２５の代わりに５２０Ｃ９を用いた以外は同様の態様で作製された。 
【０１４７】
Ｍ２２ｘＨ４２５ｘ５２０Ｃ９からなる三重特異的抗体は、二つの段階で作製された（図１６）。  最初の段階においては、最終的な還元及びアルキル化ではなく、反応体がＤＴＮＢで処理されて残余の遊離スルフィドリル基を遮断した以外は、上述のように、Ｍ２２をＨ４２５と結合させてＭ２２ｘＨ４２５ＢｓＡｂを創製した。二価ＢｓＡｂは、スーパーデックス２００カラム上でゲル濾過することによって精製し、Ｆ（ａｂ）’２（ＳＨ）に還元して、１対１のモル比でｏ−ＰＤＭ処理した５２０Ｃ９と混合された。こうして得られた三重特異的Ｆ（ａｂ）３は、スーパーデックス２００カラムにおいて精製された。このＴｓＡｂは、ＴＳＫ３０００カラム（トージョーハース社、日本）を用いてＨＰＬＣサイズ・エクスクルージョン・クロマトグラフィーによって分析した。上記と同じ方法で、ｍ２２Ｆａｂ’ｘ３２．２Ｆａｂ’ｘｍ２２Ｆａｂ’を含む別のＴｓＡｂが作製された。 
【０１４８】
二重特異性フローサイトメトリー 
ＴｓＡｂは、ＥＧＦＲ及びＦｃγＲＩと同時結合でき、又はＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＦｃγＲＩとも同時結合できる。Ａ４３１細胞（高度ＥＧＦＲ発現細胞）又はＳＫＢＲ−３（高度ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現細胞）の何れかを、種々の濃度のＢｓＡＢ（Ｍ２２ｘ５２０Ｃ９又はＭ２２ｘＨ４２５）又はＴｓＡｂ（Ｍ２２ｘＨ４２５ｘ５２０Ｃ９）の何れかと一緒に定温放置した。これらの細胞は洗浄後、可溶性のＦｃγＲＩと一緒に定温放置した。可溶性ＦｃγＲＩ結合が、２２結合部位とは別個の部位においてＦｃγＲＩと結合するｍＡｂ３２．２−ＦＩＴＣで検出された。これらの細胞は、次にＦＡＣＳＣＡＮによって分析された。 
【０１４９】
ＡＤＣＣ 
サイトカイン活性化好中球による溶解に関する標的として、ＳＫＢＲ−３細胞又はＡ４３１細胞の何れかを用いた。Ｕ字底微量定量プレート内で、好中球及び抗体と結合する前に、標的を１００μＣｉの５１Ｃｒで一時間標識した。３７℃で１６時間放置後、上澄を回収して放射能の有無を分析した。細胞障害性は、次式によって計算した。即ち、溶解（％）＝（実験用ＣＰＭ−標的漏出ＣＰＭ／洗浄剤溶解ＣＰＭ−標的漏出ＣＰＭ）ｘ１００％。特異的溶解＝抗体を含む溶解（％）−抗体を含まない溶解（％）。アッセイは、三重反復実験で実施した。 
【０１５０】
ＦｃγＲＩ変調アッセイ 
全血中の単球上のＦｃγＲＩの変調にＭ２２ｘ３２．２ｘＭ２２ＢｓＡｂを用いた。アッセイの方法は、拡大フローチャート（図２３Ａ参照）に示す。図２３Ｂは、１０μｇ／ｍＬのこのＢｓＡｂで処理することによって、単球上のＦｃγＲＩ発現が、処理前のレベルのおよそ５０％に減少したことを示している。 
【０１５１】
結果 
ＴｓＡｂの構成及び生物学的な特性説明 
ＴｓＡｂは、図１６に示したフローチャートにしたがって作成された。この方法の第一段階においては、Ｍ２２が、Ｈ４２５に結合され、ＤＴＮＢで処理されて、得られた二重特異的Ｆ（ａｂ’）２がゲル濾過によって精製された。第二段階においては、この二重特異的Ｆ（ａｂ’）２ を、還元され且つｏ−ＰＤＭ処理５２０Ｃ９Ｆａｂ’と混合して、ＴｓＡｂ（Ｍ２２ｘＨ４２５ｘ５２０Ｃ９）が得られた。このＴｓＡｂが図１７に示されている。この図においては、Ｆａｂ’−ＡはＭ２２、Ｆａｂ’−ＢはＨ４２５、そしてＦａｂ’−Ｃは５２０Ｃ９を表す。 
【０１５２】
結合（ＢｓＦＡＣＳ） 
ＴｓＡｂ（Ｍ２２ｘＨ４２５ｘ５２０Ｃ９）がＦｃγＲＩ及びＨＥＲ２／ｎｅｕと同時に結合できることを証明するために、二重特性ＦＡＣＳアッセイが考案された。このアッセイは、図１８Ａにシグナルしか発生しなかった示してある。図１９は、用量依存の態様で、ＴｓＡｂが、ＳＫＢＲ−３上のＨＥＲ２／ｎｅｕと可溶性ＦｃγＲＩとの両者に同時に結合したことが示す。ＢｓＡｂ（Ｍ２２ｘＨ４２５）は、広範囲の濃度に亘ってこのアッセイにおいてごくわずかなシグナルしか発生しなかった。ＴｓＡｂ（Ｍ２２ｘＨ４２５ｘ５２０Ｃ９）が、ＦｃγＲＩ及びＥＧＦＲと結合できることを証明するために、ＥＧＦＲ過剰発現セルライン（この場合はＡ４３１）を用いる同様なアッセイが考案された。このアッセイは図１８Ｂに概略的に示す。図２０が示すのは、ＴｓＡｂ及びＢｓＡｂ（Ｍ２２ｘＨ４２５）の両者とも、Ａ４３１細胞上のＥＧＦＲ及び可溶性のＦｃγＲＩと用量依存の態様で同時に結合したことである。ＢｓＡｂ（Ｍ２２ｘ５２０Ｃ９）は、広範囲の濃度に亘ってこのアッセイにおいてごくわずかなシグナルしか発生しなかった。 
【０１５３】
ＡＤＣＣ 
ＴｓＡｂがＡＤＣＣを媒介する能力が、ＳＫＢＲ−３又はＡ４３１細胞の何れかを標的として用いて分析された。ＩＦＮ−γ及びＧ−ＳＦ存在下において２４乃至４８時間培養したヒト好中球が、エフェクター細胞として用いられた。図２１によって、ＢｓＡｂ（Ｍ２２ｘ５２０Ｃ９）及びＴｓＡｂ（Ｍ２２ｘＨ４２５ｘ５２０Ｃ９）は、ＳＫＢＲ−３細胞の溶解を媒介するが、ＢｓＡｂ（Ｍ２２ｘＨ４２５）はしなかったことを証明している。他方、図２２においては、ＢｓＡｂ（Ｍ２２ｘＨ４２５）及びＴｓＡｂは、ＳＫＢＲ−３細胞の溶解を媒介したが、ＢｓＡｂ（Ｍ２２ｘ５２０Ｃ９）はしなかったことを証明する。この結果証明されたことは、ＴｓＡｂは、ＦｃγＲＩを過剰発現するエフェクター細胞の存在下においてＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＥＧＦＲを過剰発現する細胞の両者を殺すことができたことである。 
【０１５４】
上記の三重特異的抗体には、Ｍ２２、即ち、抗ＦｃγＲＩｍＡｂのマウス型、が含まれていた。このような三重特異的抗体は、単一スルフィドリル形のヒト化抗ＦｃγＲＩｍＡｂ（Ｈ２２）を用いて作製することができた。唯一の相違は、単一スルフィドリル形は、この抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントとして分泌されることであった。この単一スルフィドリル形は、Ｑ−セファロースに続いてＳＰ−セファローズ（ファーマシア社ニュージャージー州ピスカタウェー）を用いるイオン交換クロマトグラフィーを利用して、培養上澄から精製することができる。単一スルフィドリル形のＨ２２が精製されれば、この試薬を使う三重特異的抗体は、Ｍ２２のＦ（ａｂ’）２フラグメントを用いる上記と同一の方法で創製されよう。 
【０１５５】
例７：Ｈ２２−抗原融合タンパク質で増強された抗原提示 
【０１５６】
この例によって証明されることは、（ａ）抗ＦｃγＲＩ抗体の恒常領域上に遺伝子的に移植された抗原ペプチドは、抗原単独の場合に比べて、抗原による抗原提示及びＴ細胞刺激の効率が顕著に増大すること、及び（ｂ）抗ＦｃγＲＩ抗体の恒常領域上に遺伝子的に移植されたアンタゴニストペプチドは、アンタゴニストペプチド単独の場合に比べて、Ｔ細胞刺激阻害の効率が顕著に増大することである。よって、このような融合タンパク質は、インビボでの抗原提示細胞へのペプチド輸送を効果的に増大させることになり、したがって種々の治療法に有用となろう。 
【０１５７】
材料及び方法 
試薬 
ＡＩＭＶ（ギブコ社、ニューヨーク州グランドアイランド）を培養培地として用いた。テタヌス・トキソイド（ＴＴ）は、アクラクト・ケミカル社（ニューヨーク州ウエストベリー）から購入した。マウス抗ＦｃγＲＩｍＡｂ２２の無菌で低い内毒素性Ｆ（ａｂ’）２フラグメント及び二重特異的Ａｂ、即ちＭＤＸＨ２１０（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍ＡｇｍＡｂ５２０Ｃ９のＦａｂ’と化学的に結合した、ヒト化Ａｂ２２のＦａｂ’からなる）は、メダレックス社（ニュージャージー州アナンデール）から提供された。ＴＴのユニバーサルＴｈエピトープ、即ち、ＴＴ８３０−８４４（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列ＩＤ番号６）、以後ＴＴ８３０と呼ぶ）（Valmori D. et al. (1994) J. Immunol. 152:2921-29）及びこのエピトープの変異形、即ち、ＴＴ８３３Ｓ（ＱＹＩＳＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ）（配列ＩＤ番号９）、８３３位においてセリンに変更されたリジン）は、ペプチドジェニック社（カリフォルニア州リバーモア）によって合成され、純度は９５％より高く精製された。別のＴＴユニバーサルＴｈエピトープ、即ち、ＴＴ９４７−９６７（ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列ＩＤ番号１２）、以後ＴＴ９４７と呼ぶ。純度は８０％より高い）（Valmori D. 同上）は、この研究では制御ペプチドとして用いられた。市販されている静脈注射（ＩＶＩ）用ヒトＩｇＧは、遮断実験に用いた。 
【０１５８】
細胞 
ＦｃγＲＩを発現する単球セルライン（Ｕ９３７）は、ＡＴＣＣから入手した。ＣＤ４＋、即ち、ペプチドＴＴ８３０−特異的Ｔ細胞は、ＴＴ特異的Ｔセルラインに関する既述のプロトコルから改変された（Gosselin E.J. (1992) J. Immunol. 149:3477-81）。簡単に説明すると、単核細胞は、フィコール・ハイパックを用いて末梢血から分離された。１５０ｘ１０６個の単核細胞が、５０ｍｌのＡＩＭＶ培地において１０μＭのＴＴ８３０で刺激された。５％のＣＯ２下のインキュベータにおいて、三日間３７℃で定温放置後、１０ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝ＲＰＭＩ１６４０でフラスコ１Ｘを洗浄することによって、非付着物（殆どが非特異的細胞）を取り除くと、そのフラスコには、付着した単球と共に特異的Ｔ細胞のコロニーが残った。５０ｍｌのＡＩＭＶプラス２０Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２（イムネックス社、ワシントン州シアトル）、及び１ｍｌ（最終濃度２％）のヒトのプール血清をこのフラスコに加えた。１０乃至１４日間放置後、Ｔ細胞を採取し、死んだ細胞をフィコール・ハイパックによってペレット化すると、高度に培養強化された個体群（９５乃至９８％）の生きたＣＤ４＋、即ち、Ａｇ特異的Ｔ細胞が作製された。Ｔ細胞が、図３に示すように、ＴＴ８３０ペプチドに関して特異的であることが確認された。大量の単球を、低温凝集法（Mentzer S.J. et al. (1986) Cell. Immunol. 101:132）を用いてロイコフォレシス・パックから精製して、８０乃至９０％の純度が得られた。単球及びＴ細胞の両方を将来使用するために等分割して冷凍したが、解凍すると正常に機能することが分かった。 
【０１５９】
Ａｇ（抗原）提示アッセイ 
増殖アッセイにおいては、Ｔ細胞（５ｘ１０４）、放射能照射した単球（３０００ｒａｄ、１０５／ウェル）及び種々の濃度のペプチドＴＴ８３０融合タンパク質Ｆａｂ２２−ＴＴ８３０を一緒に、最終量２００μｌ／ウェルで、平底の９６ウエル組織培養プレートにおいて二日間定温放置した。  次に、１０μｌ（１μＣｉ／ウェル）３Ｈ− チミジンを各ウエルに加えた。一晩放置した後、プレートを回収して液浸計数装置で数を測定した。Ｔ細胞の増殖は、三重反復試験の平均計数／分（１分間のカウント）±標準偏差で表示した。バックグラウンドＣＰＭ（抗原を含有しないＴ細胞及び単球）を全データポイントから差し引いた。ＡＰＬ（改変されたペプチドリガンド）を用いる実験は、Sette等によって報告されたものと同様のプロトコルに従って実行した(De Magistris (1992) Cell 68:625)。阻害アッセイに関して簡単に説明すると、放射能照射した単球は、種々の濃度のＴＴ８３３Ｓ又はＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓで一晩処理した後、２０ｎＭのＴＴ８３０及びＴ細胞を加えた。さらに二日間放置した後、Ｔ細胞を上記のように測定した。「プリパルシング」実験においては、１０μＭのＴＴ８３３Ｓ又は０．１μＭのＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓを加える前に、放射能照射した単球を２０ｎＭのＴＴ８３０で４時間に亘りパルスした。一晩定温放置した後、Ｔ細胞を加えた。更に二日間放置後、放射能照射した単球及びＴＴ８３３ＳもしくはＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓで、Ｔ細胞を一日刺激し、フィコール・ハイパックで遠心分離した後、回収して、二日間、単球及び種々の濃度のＴＴ８３０で再度刺激した。次に、Ｔ細胞増殖を３Ｈ−チミジンの取り込みによって測定し、三重反復試験の平均ＣＰＭ（１分間のカウント）をグラフにした。幾つかのケースにおいては、阻害パーセンテージを次式によって計算した。即ち、阻害（％）＝（ＣＰＭ無阻害物質−ＣＰＭ阻害物質）／ＣＰＭ無阻害物質Ｘ１００。全実験は少なくとも三回反復した。 
【０１６０】
染色及びフローサイトメトリー 
染色方法は、既に記載したものを適宜改良した(Gosselin E.J. et al. (１９９０年)。簡単に説明すると、３０μｌのＲＰＭＩ（培地もしくは培養液）とＦａｂ−ＴＴ８３０、Ｆａｂ−ＴＴ８３３Ｓの何れかを含むタンパク質とを含有する１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、或いは、種々の濃度のＢｓＡｂＭＤＸＨ２１０を、４℃の９６−ウエルプレートの個々のウエルに加えた。４℃で一時間定温放置した後、プレートを遠心分離し、上澄を除去して、細胞をＰＢＳ（食塩加リン酸緩衝液）／ＢＳＡで４℃において三回洗浄した。次に、４０μｌ／ウェルのＦＩＴＣ標識したＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ジャクソン・イミュノリサーチ・ラボラトリーズ社、ペンシルバニア州ウエストグローブ）と一緒に定温放置した後、ＰＢＳ／ＢＳＡで三回洗浄し、さらに１％のパラフォルムアルデヒド（コダック社、ニューヨーク州ロチェスター）を含有するＰＢＳ／ＢＳＡ中に再懸濁させた。次に、細胞をＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディキンソン社、カリフォルニア州マウントビュー）によって検査して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。 
【０１６１】
サイトカイン測定 
二日間刺激した後、抗原提示アッセイの９６ウエルプレートから上澄を回収し、使用するまで冷凍した。これらの試料からのＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）及びＩＬ−４（インターロイキン４）のレベルを、特異的ＥＬＩＳＡによって測定した。ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４特異的ＥＬＩＳＡに関するＡｂ（抗体）対は、ファーミンゲン社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。ＥＬＩＳＡ（酸素結合免疫吸着検査法）アッセイは、製造業者のプロトコルにしたがって実施した。 
【０１６２】
Ｈ２２−ＴＴペプチド融合タンパク質の作製 
融合タンパク質Ｆａｂ−ＴＴ８３０及びＦａｂ−ＴＴ８３３Ｓを作製するために、以下に記載の方法にしたがって、各ペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドをヒト化抗ＦｃγＲＩｍＡｂ２２（Ｈ２２）のＨ鎖ヒンジ領域に別個に作製した。 
【０１６３】
発現及びクローニングベクター 
ｍＡｂ２２は、そのＣＤＲ領域をヒトＩｇＧ１フレームワークに移植することによってヒト化された(上記及びGraziano R. F. et al. (1995) J. Immunol. 155:4996-5002を参照)。Ｈ２２のＨ鎖（ｐＳＶｇｐｔ）のゲノムクローンに関する発現ベクターを改変して、他の分子、この場合においてはＴＴペプチドに関するコード化配列を取り込むことができた。ＣＨ１，ヒンジ、及び、新たに設計したＸｈｏＩ及びＮｏｔＩクローニング部位、を含有するこのベクターのＢａｍＨＩフラグメントをｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位へ挿入してベクターｐＵＣ１９／Ｈ２２ＣＨ１（Ｘ＋Ｎ）を作製した。このベクターを用いて、以下に記載の如く、ＴＴペプチドコードするオリゴヌクレオチド配列をクローン化した。 
【０１６４】
破傷風毒素（ＴＴ）ペプチドをコード化するオリゴヌクレオチド配列は、コード化領域のＮ末端上にＸｈｏＩ部位及びＣ末端上にＮｏｔＩ部位を有するように設計された（図２４Ａ参照）。これらのオリゴヌクレオチドは、ジェノシス（バイオテクノロジー社、テキサス州ウッドランド）によて合成かつ精製された。次に、合成オリゴヌクレオチドを、クローニングベクターｐＵＣ１９／Ｈ２２ＣＨｌ（Ｘ＋Ｎ）にアニールし、且つ結合した。 
ＴＴペプチドに関するコード化配列を取り込んだクローンは、制限地図によってスクリーニングされた。次に、ＣＨ１、ヒンジ及びＴＴ８３０もしくはＴＴ８３３Ｓを含有するＢａｍＨＩが、ｐＵＣ１９から切断されて、既にＶＨを含有した発現ベクターへ挿入された。ＴＴペプチドと融合されたＨ２２Ｈ鎖の最終的な発現構成体が図２４Ｂに示されている。 
【０１６５】
Ｈ２２−ＴＴ融合タンパク質の発現 
マウス骨髄腫ＮＳＯ（ＥＣＡＣＣ８５１１０５０３）は、非Ｉｇ合成ラインであり、Ｈ２２−ＴＴ融合タンパク質の発現に用いられた。まず、Ｈ２２Ｌ鎖コード化配列を含有するｐＳＶｈｙｇベクターで、ＮＳＯ細胞を形質移入した。次に、ＴＴコード化配列にフレーム内融合されたＨ２２Ｈ鎖Ｆｄ配列を含有する発現ベクター構成体で、ＮＳＯ細胞を発現するＨ２２Ｌ鎖を形質移入した（図２４Ｂ）。バイオラッド・ジーン・パルサー電気穿孔法装置を使って、２００Ｖ及び９６０μＦ（ファラド）を用いる形質移入を実施した。形質移入から一日又は二日後、マイコフェノール酸（０．８μｂ／ｍｌ、シグマ社）及びキサンチン（２．５μｇ／ｍｌ、シグマ社）を媒体に加えて、首尾よく発現ベクターを内部移行済みのトランスフェクタントを選択した。個々のコロニーは、フローサイトメトリーによって示したように、培養上澄がＵ９３７細胞上のＦｃγＲＩと結合する活性度に基づいて分離された。陽性コロニーは、限界希釈することでサブクローン化した。 
【０１６６】
Ｆａｂ２２−ＴＴ融合タンパク質の精製 
Ｆａｂ２２−ＴＴ８３０融合タンパク質を発現するクローンｐＷ５と、Ｆａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓ融合タンパク質を発現するクローンｐＭ４とをローラーボトル培養で拡大した。上澄は、清澄しかつ濃縮した。親和性クロマトグラフィーによって小規模な精製を抗Ｈ２２親和カラム上で実施した。非還元条件下における５乃至１０％のアクリルアミド勾配ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、これらの融合タンパク質の純度は９０％より高く、また見込み通り５０ｋＤａの分子量を得た。タンパク質濃度は、ＩｇＧＦａｂ’の吸光係数＝１．５３を使用して２８０ｎｍでの吸光度で測定した。 
【０１６７】
結果 
Ｕ９３７細胞とのＨ２２Ｆｄ−ＴＴ融合タンパク質の結合 
まず最初に実験したのは、ＦｃγＲＩに結合するＨ２２融合タンパク質、即ち、Ｆａｂ２２−ＴＴ８３０及びＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓの能力であった。同一のＦｃγＲＩ結合成分（ヒト化ｍＡｂ２２のＦａｂ’）を含有する、既述の二重特異的抗体（Ａｂ）、即ち、ＭＤＸＨ２１０を陽性対照として使用した。融合タンパク質及びＭＤＸＨ２１０と、構成的にＦｃγＲＩを発現するＵ９３７細胞との結合は、ＦＩＴＣ標識された、ヒトＩｇＧに関して特異的なヤギ抗体による染色、及びフローサイトメトリーによって測定された。図２４Ａ及び２４Ｂに示したように、融合タンパク質（Ｆａｂ２２−ＴＴ８３０及びＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓ）は、ＭＤＸＨ２１０と同様に用量依存の態様で、Ｕ９３７細胞と結合した。融合タンパク質の結合は、マウス抗ヒトＦｃγＲＩｍＡｂ２２Ｆ（ａｂ’）２によって完全に遮断され、ＦｃγＲＩに関する融合タンパク質の特異性を証明した。 
【０１６８】
Ｈ２２Ｆｄ−ＴＴ融合タンパク質によって、ＴＴペプチドの提示が１００乃至１０００倍増強される、という事実 
融合タンパク質、即ち、Ｆａｂ２２−ＴＴ８３０を抗原（Ａｇ）提示アッセイにおいて使用して、Ｔｈエピトープ、即ち、ＴＴ８３０が、Ｈ２２の恒常領域において発現された場合、単球によって効果的に自己由来のＴ細胞に対して提示され得るかを測定した。図２６に示すように、同一レベルのＴ細胞の増殖を達成するのに必要なＦａｂ２２−ＴＴ８３０は、ＴＴ８３０単独の場合に比べると、およそ１０００倍少ない量であった。さらに、図２６によると、Ｆａｂ２２−ＴＴ８３０の提示は、無傷のＴＴを提示する場合に比べると、およそ１０，０００倍効率的であったことが分かり、Ｆａｂ２２−ＴＴ８３０の提示が増強されたのは、単に分子量が大きくなったせいでなく、ＴＴ８３０ペプチドではなく、Ｆａｂ２２−ＴＴ８３０の安定性が増強されたからもないことを示している。別の抗原性ＴＴエピトープ、即ち、ＴＴ９４７は、これらのＴ細胞を刺激することができなかったので、これらのＴ細胞はＴＴ８３０に関して特異的であることが確認された。よって、これらの結果は、Ｈ２２の恒常領域において発現されたＴｈエピトープは、効果的かつ特異的に提示され得ることを明確に証明している。 
【０１６９】
単球上のＦｃγＲＩの遮断は、Ｈ２２Ｆｄ−ＴＴ融合タンパク質による、抗原（Ａｇ）提示の増強を排除する、という事実 
ペプチド提示が融合タンパク質の使用によって増強されることに、ＦｃγＲＩが媒介するのかどうかを直接的に測定するために、Ｆａｂ２２−ＴＴ８３０又はＴＴ８３０ペプチドを加える前に、ｍＡｂ２２Ｆ（ａｂ’）２で一時間単球を処理することによって、抗原提示する単球上のＦｃγＲＩにＦａｂ２２−ＴＴ８３０が結合するのを遮断した。融合タンパク質による、ペプチド提示の増強は、ｍＡｂ２２Ｆ（ａｂ’）２によって排除されたが、ＴＴ８３０の提示は影響を受けなかった（図２７）。ＦｃγＲＩにｍＡｂ２２Ｆ（ａｂ’）２が結合しても、遊離ペプチドの提示の増強に至らなかったことから、ＦｃγＲＩにｍＡｂ２２が結合するだけでは、抗原提示を増強するようには、単球の機能状態を変更することはなかったことが示唆される。よって、抗原提示に対する観察された増強効果を得るには、抗ＦｃγＲＩＡｂ２２にペプチドが結合する必要があることが分かる。このことは、このような提示の増強は、おそらくＦｃγＲＩによって抗原が効率的に捕捉された結果であることを示唆する。 
【０１７０】
Ｈ２２によるペプチド提示の増強は、ヒトＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）の存在によって影響を受けない、という事実 
生理学的な条件下では、ＦｃγＲＩのリガンド結合ドメインは、この受容体に対してＡｇＡｂ（抗原抗体）が効率的に標的にするのを妨害するＩｇＧによって飽和されている。ｍＡｂ２２の誘導体を使ってＦｃγＲＩ機能を惹起するという他にない利点は、Ａｂ２２がリガンド結合ドメインの外でエピトープに結合することである。したがって、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）のような、ｍＡｂ２２によって惹起される機能は、生理学的なレベルのＩｇＧによって阻害されない(Gosselin E. J.,同上, Guyre P. M. (1989) J. Immunol. 143-1650-55)。同様に、融合タンパク質Ｆａｂ２２−ＴＴ８３０を使うＴＴ８３０提示の増強がＩｇＧによって阻害されなかった（図２８）ことは、Ｈ２２を基体にした融合タンパク質も、ＦｃγＲＩに対してペプチドＡｇをインビボで向かわせる効果的な方法であることを示唆している。 
【０１７１】
Ｈ２２Ｆｄ−ＴＴ融合タンパク質による抗原（Ａｇ）提示増強に続いて、ＩＦＮ−γ（インターフェロンγ）及びＩＬ−４（インターロイキン４）の産生が増加される。 
活性されると、Ｔ細胞は、増殖によるクローン拡大を経るばかりでなく、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４のようなサイトカインを産生して、Ｂ細胞分化及び単球活性化というそのエフェクター機能を働かせる(Paul W. E. and Seder, R. A. (1994) Cell 76:241-251)。したがって、Ｈ２２融合タンパク質によるＡｇ提示の増強後の、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の産生を調べた。図２８Ａ及び２８Ｂに示すように、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の両方の産生レベルが、特に最適以下のＡｇ濃度において、Ｆａｂ２２−ＴＴ８３０によって増強された。しかし、これらの実験においては、サイトカイン産生に関する増強（約２０倍）は、Ｔ細胞増殖に関する増強（約６００倍）よりも少なかった。 
【０１７２】
よって、抗ＦｃγＲＩｍＡｂＨ２２の恒常領域において発現されたＴｈエピトープを、ヒト単球によって効果的にプロセシング且つ提示することができ、Ｔ細胞の活性化及びサイトカインの産生が増強されるようになる。 
【０１７３】
ＡＰＬ、ＴＴ８３３Ｓ及びＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓの提示によって、Ｔ細胞増殖は刺激されない。 
自生のＴ細胞エピトープから一つ又は二つのアミノ酸が変更されたものを含有するペプチド（Allenと共同研究者により改変ペプチド・リガンド（ＡＰＬ）と命名された）は、Ｔ細胞の活性化に関して、アゴニストもしくは部分的なアゴニストであり、或いはアンタゴニストでもあることが分かっている(Sette et al. (1994) Ann. Rev. Immunol. 12:413 and Evavold et al. (1993) Immunol. Today 14:602)。ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）を介する、特異的なＴ細胞によるＡＰＬの認識は、場合によっては、部分的なシグナル伝達を惹起して、（ｉ）超抗原による、Ｔ細胞刺激の阻害（Evavlold et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:2300）、Ｔ細胞アネルギー（Sloan-Lancaster et al. (1993) Nature 363:156 and Sloan-Lancaster et al. (1994) J. Exp. Med. 185:1195）又は（ｉｉｉ）Ｔｈ１／Ｔｈ２の変調（Nicholson et al. (1995) Immunity 3:397;  Pfeiffer et al. (1995) J. Exp. Med. 181:1569; and Windhagen et al. (1995) Immunity 2:373）をもたらすことがある。部分的アゴニストはアネルギーを誘導することもできる。ＡＰＬ（改変ペプチド・リガンド）のなかには、ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）との相互作用時には何ら検出され得るようなシグナリング事象を惹起しないが、野生型ペプチド抗原に反応して、ＴＣＲアンタゴニストとして機能し、Ｔ細胞の増殖を阻害できるものある。したがって、このようにＴＣＲアンタゴニストと呼ばれている（De Magistris et al. (1992) Cell 68:625 and Ruppert et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2671）。 
【０１７４】
このような例が示すのは、ペプチドＴＴ８３３Ｓ、即ち、破傷風毒素（ＴＴ）のＴ細胞エピトープＴＴ８３０に関するアンタゴニスト・ペプチド、及びＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓが、Ｔ細胞の増殖を刺激し得ないことである。図３０に示す如く、ＴＴ８３３Ｓに関して１００μＭ、及びＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓに関して１μＭもの高レベルの用量においてさえも、ＴＴ８３０に特異的なＴ細胞の有意な増殖は一切観察されなかった。このことが示すのは、ＴＴ８３０ペプチドの８３３位におけるリシンからセリンへの変更によって、このＴ細胞エピトープのＴ細胞反応性が除去されたことである。さらに、ペプチドＴＴ８３０及びＴＴ８３３Ｓが、同時にＴＴ８３０に特異的なＴ細胞に提示されると、ＴＴ８３０に反応するＴ細胞増殖が用量依存の態様で、ＴＴ８３３Ｓによって阻害された。このことは、ＴＴ８３３Ｓが、ＴＴ８３０に特異的なＴ細胞に関するアンタゴニストとして機能できることを示す（図３１）。 
【０１７５】
Ｔ細胞の活性化阻害において、Ｆａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓは、ＴＴ８３３Ｓより少なくとも１００倍効果的である、という事実 
この例によって、ＴＴ８３０に反応したＴ細胞増殖の阻害における、ＴＴ８３３Ｓ及びＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓの相対的効率を比較する。図３２において示すように、Ｆａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓは、ＴＴ８３３Ｓよりも約１００倍以上効果的に、ＴＴ８３０に刺激されたＴ細胞の増殖を阻害した。このことは、ＡＰＬ（ＴＴ８３３Ｓ）は、ｍＡｂＨ２２の恒常領域において発現されると、正確かつ効果的にＡＰＣ（抗原提示細胞）によって提示され得ることを示す。融合タンパク質Ｆａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓが、アンタゴニストとして、Ｔ細胞増殖に対してより効力を増大するのは、遊離ペプチドに比べて、ＦｃγＲＩの媒介による抗原の捕捉がより効率的であったことを反映している。 
【０１７６】
Ｔ細胞活性化の阻害を媒介するのは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ結合めぐる競合ではなく、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）結合をめぐる競合である、という事実 
ＡＰＬ、即ち、ＴＴ８３３Ｓ及び融合タンパク質Ｆａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓのアンタゴニストとしての効果は、おそらくＭＨＣ結合もしくはＴＣＲ結合、又は両方のレベルにおける競合によるものであろう。これに関係する機序を考察するために、「プリパルシング」実験を実施したが、これはSette等によって最初に記載されている（DeMagistris, M.T. et al. (1992) Cell 68:625-634）。この実験設定によって、アゴニスト（ＴＴ８３０）は、阻害因子（ＴＴ８３３Ｓ）からの競合の不存在下において、ＭＨＣクラスＩＩに結合することができ、よって、純粋なＭＨＣ遮断薬ではなく、ＴＣＲアンタゴニストのみが、アゴニストによって刺激されたＴ細胞増殖を効果的に阻害するものと思われる。抗原（Ａｇ）提示単球を最適以下の（２０ｎＭ）ＴＴ８３０で四時間パルスして、ＴＴ８３３Ｓからの競合の不存在下においてＴＴ８３０をＭＨＣクラスＩＩと結合させることができた。次に、このＡＰＬ、即ち、ＴＴ８３３ＳもしくはＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓを、プリパルシングした単球と一緒に更に１６時間定温放置した。応答するＴ細胞を加えて、上記の如くそれらの増殖を測定した。ＭＨＣの遮断が最小限の役割しか果たさない条件下においてさえ、Ｔ細胞増殖が依然として阻害された（図３３）。よって、この阻害は、ＭＨＣクラスＩＩ結合をめぐる競合ではなく、Ｔ細胞受容体をめぐる競合の結果であることが分かる。 
【０１７７】
ＴＴ８３３Ｓ及びＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓの提示は、Ｔ細胞によるＩＬ−４（インターロイキン４）及びＩＦＮ−γ（ガンマ・インターフェロン）の産生を刺激しない、という事実 
状況によっては、ＡＰＬは、Ｔ細胞サイトカインの産生を刺激できるが、増殖を刺激することができないことがある。ＴＴ８３３Ｓの提示によってサイトカインの産生が刺激されるかどうかを測定するために、Ａｇ提示アッセイから得た上澄におけるＩＬ−４及びＩＦＮ−γのレベルを測定した。図３４に示すように、ＴＴ８３３Ｓ及びＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓの両者ともＴ細胞によるＩＬ−４及びＩＦＮ−γの産生を刺激する効果はなかった。 
【０１７８】
ＴＴ８３３Ｓ及びＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓの提示は、Ｔ細胞のアネルギーに至らない、という事実 
Allen及びその同僚研究者等の報告によると、ＴＣＲが幾つかのＡＰＬ−ＭＨＣクラスＩＩ複合体と相互作用するとＴ細胞のアネルギーをもたらした(Sloan-Lancaster J. et al. (1993) Nature 363:156-159, Sloan-Lancaster J. et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1195-1205)。彼らのスキームと同様な実験的スキームを用いて、同様に、ＴＴ８３３Ｓの提示がＴ細胞のアネルギーをもたらし得るかどうかを測定した。図３５に示すように、ＡＰＣ及びＴＴ８３３ＳもしくはＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓと共に、一日間、二日間又は三日間定温放置した後、Ｔ細胞を回収すると、ＡＰＣだけで定温放置していたＴ細胞ばかりでなく、これらのＴ細胞もその後の抗原性攻撃に反応した。よって、ペプチドのみ又はＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓの何れかを用いることによって提示されたアンタゴニストは、Ｔ細胞アネルギーを惹起しなかった。更には、同一パーセントの生きたＴ細胞（約５０％）がペプチド、即ち、ＴＴ８３３ＳもしくはＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓを含有しない培養体から回収されたことによって、同様に、ＴＴ８３３Ｓの提示もＴ細胞致死を増大させなかったことを示唆している。 
【０１７９】
免疫原性が、抗ＦｃγＲＩｍＡｂ２２を基体にした融合タンパク質を用いて、ＦｃγＲＩに対して抗原性ペプチドを向かわせることによって約１０００倍も増大する、という観察によって、このような融合タンパク質は、感染性疾患及び癌などに関するペプチドを基体にしたワクチンに有用となることが示されている。特定のＡＰＣ表面分子に特異的なペプチドを、ヒトｍＡｂの恒常ドメインに設計することは、ペプチドを基体にしたワクチンに関する抗原性潜在能を増大させる一般的な方法である。 
【０１８０】
さらには、ＡＰＣが自生ペプチドで最初にパルスされた場合でさえ、つまり、自己抗原反応を改善しようと試みる際に、インビボで遭遇する可能性のある状況に匹敵する状況でさえ、ＦｃγＲＩ標的のアンタゴニスト・ペプチドは、ＴＴ８３０に特異的なＴ細胞の増殖を阻害するということが観察されたが、この観察によって、標的を決められた、アンタゴニスト的なペプチドの提示が、Ｔ細胞媒介の自己免疫病などの疾患に関するＡｇ特異的治療として利用できることが証明された。ＡＰＬを基体にした処理によって、慢性関節リウマチ及び多発性硬化症のような、Ｔ細胞が介在する自己免疫疾患に免疫療法が提供されよう。さらに、ＦｃγＲＩに対して一つの結合特異的部分を有する融合タンパク質、及び過剰免疫反応を特徴とする免疫疾患に関与する抗原の部分的アゴニストであるペプチドを用いることは、抗原特異的アネルギーを誘導することによって、このような免疫疾患を処置するのに有用となろう。よって、本発明は、Ｔ細胞の刺激、Ｔ細胞増殖の遮断及び／又はサイトカイン分泌、或いはＴ細胞におけるアネルギーの誘導の何れかを行う、抗原の抗原提示を増大させ得る方法を提供することによって、種々の免疫学的疾患を処置する方法を提供する。 
【０１８１】
例８：機能的単鎖抗ＦｃγＲＩ−抗ＣＥＡ二重特異的分子 
この例は、抗胎児性癌抗原抗（抗ＣＥＡ）抗体と融合したヒト化抗ＦｃγＲＩ抗体を包含する組換え特異的単鎖分子は、ＦｃγＲＩ及びＣＥＡ（胎児性癌抗原）と結合することができることを示すものである。 
【０１８２】
図３７は、このＦｃγＲＩに関する一つの結合特異的部分と、調製された胎児性癌抗原（ＣＥＡ）関する一つの結合特異的部分を有する二重特異的単鎖分子（構成体３２１及び３２３）をコード化する哺乳類の発現構成体の概略図である。構成体３２１によってコード化された二重特異的単鎖分子Ｈ２２−抗ＣＥＡのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号１６）及びこの融合タンパク質をコード化する核酸（配列ＩＤ番号１５）が図４０に示してある。構成体３２３によってコード化された二重特異的単鎖分子Ｈ２２−抗ＣＥＡ、と構成体３２１によってコード化された融合タンパク質との唯一の違いは、Ｈ２２のＶＨ及びＶＬ鎖がスイッチされているところである。 
【０１８３】
ＦｃγＲＩに関する一つの結合特異的部分を有する単鎖抗体をコード化する哺乳類の発現構成体（構成体２２５）も調製した。構成体２２５によってコード化された単鎖抗体Ｈ２２のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号１４）及びこの単鎖抗体をコード化する核酸の配列（配列ＩＤ番号１３）が図３９に示してある。 
【０１８４】
このような構成体がそれぞれ、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ部位にクローン化され、これらの部位から、発現がＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターから駆動される。これらの構成体はまた、それぞれが、ｃ−ｍｙｃからのペプチド及びヘキサヒスチジンペプチドをコード化する核酸配列を含んでおり、これらは、組換えタンパク質を細胞培養から精製するのに用いられた。ｃ−ｍｙｃタグは、ヒトｃ−ｍｙｃのアミノ酸４１０乃至４２０に対応する(Evan et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3610)。ＭＦＥ−３２と呼ばれる抗ＣＥＡ単鎖抗体は、Casey et al. (1994) J. Immunol. Methods 179:105 及びChester et al. (1994) Lancet 343:455に更に詳しく記載されている。 
【０１８５】
単鎖二重特異的分子Ｈ２２−抗ＣＥＡ及び単鎖Ｈ２２抗体を、結合アッセイにおいて使用して、次のようにアッセイを実施した。ＥＬＩＳＡプレートにＣＥＡを塗布し、５％のＰＢＡ（多クローン性Ｂ細胞活性化物質）で遮断した。これらの単鎖分子をコード化する構成体（トランスフェクトーマ）で形質移入した細胞の上澄をプレートに加え、可溶性のＦｃγＲＩ／ＩｇＭ−μ（上記のＣＯＳ形質移入細胞からの上澄）を加えて、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）共役したヤギ抗ヒトＩｇＭと共にプレートを定温放置し、ＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニール燐酸）で展開し、そして４０５乃至６５０ｎｍでこのプレートを読み取ることによって、結合を検出した。 
【０１８６】
結果が図３８に示してある。この結果が示すことは、構成体３２１及び３２３によってコード化された単鎖二重特異的Ｈ２２−抗ＣＥＡ分子は、ＦｃγＲＩとＣＥＡの両者と結合することである。他方では、単鎖Ｈ２２抗体（構成体２２５によるコードされる）は、見込み通りにＦｃγＲＩとＣＥＡの両者と結合しない。 
【０１８７】
例９：ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）を標的にして、抗原プロセシング及び提示を誘導及び／又は増強する、という事実 
通常は非免疫原性抗原（例えば、自己抗原）をヒトＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）に向けると、インビボで免疫非反応性を克服できるかどうかを測定するために、抗原提示細胞上のＦｃ受容体に向けられたＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントに結合するこうした抗原を含む幾つかのマルチマー複合体を調製して次のように実験を行った。具体的には、ヒトＣＤ６４に関して遺伝子導入マウスを、それらの同腹子ともども、マウス抗ヒトＣＤ６４ｍＡｂ、即ち、Ｍ２２（ＡＴＣＣ預託番号ＨＢ−１２１４７のハブリドーマによって作製した）のＦ（ａｂ’）２フラグメントで免疫化した。マウスを隔週ごとの免疫化を四回実施後七日目に、これらのマウスから採血した。ＥＬＩＳＡによって分析すると、六匹のうち三匹の遺伝子導入マウスは、顕著な抗Ｍ２２Ｉｄ特異的抗体力価を呈したが、六匹の非遺伝子導入の同腹子の何れも全く呈しなかった。このような抗血清は、Ｍ２２特異的であり、他のマウス抗体とは反応しなかった。 
【０１８８】
Ｍ２２Ｆａｂ’のマルチマー複合体が抗体内部移行をより効率的に誘導し、よって抗原提示及びより強力な抗Ｍ２２Ｉｄ免疫反応を増強させるかどうかを測定するために、Ｍ２２Ｆａｂ’分子のマルチマーを化学的及び遺伝子的の両方で合成し、実験を行った。これらのマルチマーは、２２Ｆ（ａｂ’）２ （もしくは外のＦｃ受容体結合剤）及び付加的な２２Ｆａｂ’分子に化学的に結合され得る抗体を包含する。最終的なマルチマーは、例えば、多重２２Ｆａｂ’アーム（例えば、二つ又はそれ以上）と、一つ又はそれ以上の抗原分子とを含む幾つかの分子種からなる。これらの化学種は、所望であれば、サイズ排除又は親和クロマトグラフィーによって精製してよい。図４１に示すのは、このように化学的に結合された多重結合標的抗原の形成に関する概略図である。 
【０１８９】
化学的合成マルチマーは、２０モル過剰のカルボン酸スクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−（succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate）（ＳＭＣＣ）と共に、室温にて二時間定温放置して作製した。Ｇ−２５クロマトグラフィーによって、遊離ＳＭＣＣを、得られた複合体、即ち、Ｆ（ａｂ’）２−ＳＭＣＣから除去した。遊離チオール（ＳＨ）基を有する抗原を１対１のモル比でＭ２２Ｆ（ａｂ’）２−ＳＭＣＣに加えた。得られた混合物を一晩室温で放置した。この反応は過剰のヨードアセトアミドを加えることによって停止させ、得られた共役体をサイズ・エクスクルージョン・クロマトグラフィーによって精製した。 
【０１９０】
Ｍ２２Ｆ（ａｂ’）２＋抗原マルチマーは、抗原反応を増強／誘導する、という事実 
図４２ａが示すのは、精製Ｍ２２Ｆ（ａｂ’）２（右側）を含有する非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及び化学的結合Ｍ２２Ｆａｂ’マルチマー（左側）である。このマルチマーは、Ｆ（ａｂ’）３，Ｆ（ａｂ’）４，Ｆ（ａｂ’）５，Ｆ（ａｂ’）６及びより大きな分子量の分子を表す幾つかの分子種からなる。 
【０１９１】
マルチマーＭ２２Ｆ（ａｂ’）３＋と比較して、ヒトＣＤ６４の内部移行を媒介するＭ２２Ｆ（ａｂ’）２の能力を測定するために、種々の濃度のＭ２２Ｆ（ａｂ’）２又はＭ２２Ｆ（ａｂ’）３＋の何れかを、ヒトＣＤ６４遺伝子導入マウスから分離したマクロファージと共に二時間定温放置した。Ｍ２２エピトープとは別個のヒトＣＤ６４上の部位に結合するＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ６４ｍＡｂＭ３２．２（ＡＴＣＣ預託番号９４６９を有するハブリドーマによって作製）によって、ヒトＣＤ６４表面発現を検出した。図４２Ｂに示すように、Ｍ２２Ｆ（ａｂ’）２との定温放置は、このマクロファージの表面からヒトＣＤ６４の顕著な抑制をもたらさなかった。しかし、３７℃におけるＦ（ａｂ’）３＋との定温放置では、用量依存の態様でヒトＣＤ６４発現が５０％まで抑制されるに至った。Ｆ（ａｂ’）３＋と共に４℃で定温放置してもヒトのＤＣ６４の発現の現象には至らなかったことで、このような現象の温度依存性が証明された。 
【０１９２】
変調がインビボで生じるかどうか測定するために更に実験を行った。ヒトＣＤ６４遺伝子導入マウスにＭ２２Ｆ（ａｂ’）２又はＭ２２Ｆ（ａｂ’）３＋の何れかを注射して、一時間後に採血した。Ｍ２２Ｆ（ａｂ’）３＋で免疫化した動物からの血中単球上では、ヒト６４の表面発現が抑制されたが、Ｍ２２Ｆ（ａｂ’）２で免疫化した動物からの血中単球上では抑止されなかった。ヒト６４の表面発現は、Ｆ（ａｂ’）３＋マルチマーを伴った受容体の内部移行を表す、という仮説を立てた。 
【０１９３】
次に考察されたのは、ヒトＣＤ６４遺伝子導入及び非遺伝子導入の同腹子が、Ｍ２２Ｆ（ａｂ’）３＋マルチマーで三回免疫化した後、抗Ｍ２２イディオタイプ（「Ｉｄ」）反応を起こすことができるかどうかである。図４３Ａで示されているデータによって、このマルチマーで三回免疫化（一回の免疫化当たり２５μｇ）した、ヒトＣＤ６４遺伝子導入マウス（ｎ＝１２）の全てにおいて高い力価のＭ２２特異的抗体の産生をみたが、同様に免疫化した非遺伝子導入の同腹子（ｎ＝１０）の何れにもＭ２２特異的抗体は産生されなかったことが示された。Ｍ２２Ｆ（ａｂ’）３＋マルチマーによって惹起されたヒトＣＤ６４遺伝子導入体における免疫反応は、Ｍ２２Ｆ（ａｂ’）２によって惹起された反応よりも著しく優れていた。マルチマー免疫マウスは全てが反応し、且つこのマルチマーで免疫化して免疫反応を起こすのに必要な免疫化回数は、Ｆ（ａｂ’）２に比べて、より少ない回数であった（三回対四回）。このような結果が証明するのは、Ｆａｂ’マルチマー複合体によって、ヒトＣＤ６４を介する抗原のより優れた内部移行が導かれ、結果的に抗原特異的な免疫反応を増強させるということである。実際に、図４３Ｂにおいて示されたデータでは、わずか０．２５μｇのマルチマーでヒトＣＤ６４遺伝子導入マウスを免疫化しても、殆どのマウスにおいて免疫反応を依然として検出できることが証明されている。 
【０１９４】
免疫系は、多くの腫瘍関連抗原に対して耐性があることが多いので、これらの抗原に効果的な免疫反応を認めるのは難しい。このような通常は非免疫原性である抗原をヒトＣＤ６４に向けることによって、この抗原に対する免疫反応を惹起するかを確かめるために、モデル抗原として、マウスモノクローナル抗体のＦａｂ’フラグメント、即ち、５２０Ｃ９をＭ２２マルチマーに結合した。 
【０１９５】
ヒトＣＤ６４遺伝子導入又はそれらの非遺伝子導入同腹子の何れかを免疫化した後、抗５２０Ｃ９Ｉｄ力価及び抗Ｍ２２Ｉｄ力価の両者を査定した。図４４ａに示すように、八匹の免疫化ヒトＣＤ６４遺伝子導入マウスの内の七匹が、強力な抗５２０Ｃ９及び抗Ｍ２２力価を顕現した。七匹の免疫化非遺伝子導入マウスは何れも、５２０Ｃ９又はＭ２２の何れに対しても測定できるような力価を顕現することはなかった。これらのデータによって証明されるのは、ヒトＣＤ６４＋抗原提示細胞が、通常は非免疫原性的なタンパク質を内部移行するように、そのタンパク質をヒトＣＤ６４に結合させると、この抗原に対する効果的な免疫反応が誘導されると言うことである。幾つかのグループでは、Ｂ細胞リンパ種細胞の表面Ｉｇによって発現されたイジオタイプに関する免疫特異性の発生によって、潜在的な腫瘍細胞特異的な免疫性をもたらし得ることが分かった。この例は、特異的な抗５２０Ｃ９Ｉｄ反応は、５２０Ｃ９イディオタイプをヒトＣＤ６４に向けることによって容易に惹起することができることを証明する。 
【０１９６】
任意の抗原、とりわけ腫瘍関連又はウイルス性抗原に対する免疫反応の質も、反応の量と同様に重要な場合がある。Ｔヘルパー細胞は、それらが分泌するサイトカインの型及び刺激時にそれらがＢ細胞に対して提供する補助の型によって、Ｔｈ１及びＴｈ２に分けられている。Ｔｈ１細胞は、刺激を受けると、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γを分泌し、且つ通常はＢ細胞を刺激してＩｇＧ２ａアイソタイプを分泌させる。Ｔｈ２細胞は、刺激を受けると、ＩＬ−４及びＩＬ−５を分泌し、且つ通常はＢ細胞を刺激してＩｇＧ１又はＩｇＥアイソタイプを分泌させる。一般的に言えば、Ｔｈ１細胞は、免疫反応の細胞アームを刺激し、一方、Ｔｈ２細胞は、体液性アームを刺激する。５２０Ｃ９特異的抗体の、即ち、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａアイソタイプの何れかの力価を、Ｍ２２マルチマーに結合した５２０Ｃ９でヒトＣＤ６４遺伝子導入マウスを免疫化しておいてから、アイソタイプ特異的な展開試薬を用いて検査した。図４４ｂに示すデータによって証明されているのは、ＩｇＧ２ａＩｄ特異的な強い力価ばかりでなく、ＩｇＧ１特異的な強い力価が惹起されるということであり、この方法による免疫化は、Ｔｈ１及びＴｈ２反応の両者を活性化させ得ることを証明する。 
【０１９７】
Ｈ２２ｓＦｖ−Ｈ２２ｓＦｖ−３２．２ｓＦｖ抗原マルチマーは、免疫反応を誘導する、という事実 
図４５ａが示すのは、遺伝子的に結合した多重結合の、標的を決められた抗原をコード化するベクターのマップである。このベクターは、ヒト化抗ＦｃγＲＩ抗体、即ち、Ｈ２２（ＡＴＣＣ預託番号ＣＲＬ１１１７７を有するハブリドーマによって作製）からの二つのｓＦｖ領域、及び抗体Ｍ３２．２からの一つのｓＦｖ領域（これらの抗体は全て一つの抗原に一体に結合している）で、タンパク質をコード化する。この結果作製される融合タンパク質、Ｈ２２ｓＦｖ−Ｈ２２ｓＦｖ−３２．２ｓＦｖ抗原（図４５Ｂに示す）は、多数の部位においてＦｃγＲＩと結合でき、それによって受容体の凝集を介して内部移行を誘導する。 
【０１９８】
Ｈ２２ｓＦｖ−Ｈ２２ｓＦｖ−３２．２ｓＦｖ抗原マルチマーは、遺伝子導入マウスのモデル研究に関する抗原としてマウスｇｐ７５（Ｔｒｐ−１メラノーマ抗原）を使用することで作成された。分かったことは、この融合タンパク質は、ＦｃγＲＩと効率的に結合し、且つ受容体の内部移行を誘導するということであった。図４６に示すように、化学的に結合したＭ２２ＦａｂｘＭ２２ＦａｂｘＭ３２Ｆａｂ及び遺伝子的に結合したＨ２２ｓＦｖ−Ｈ２２ｓＦｖ−３２．２ｓＦｖ抗原は、それぞれＦｃγＲＩの内部移行を誘導した。この研究は、ＩＦＮ−γ処理したＵ−９３７細胞に３７℃で二時間試料を加えて実施した。次に、ヒトＩｇＧ１−ＦＩＴＣで４℃で一時間細胞を染色することで、ＦｃγＲＩの発現を測定し、試料をＦＡＣｓｃａｎによって分析した。変調のパーセント（％）を次式によって計算した。［１−（試料のＭＦＩ／対照のＭＦＩ）］ｘ１００％：ここでＭＦＩは、平均蛍光強度である。 
【０１９９】
Ｈ２２ｓＦｖ−抗原は、Ｈ２２Ｆａｂ２−抗原とほぼ同等の親和性をもってＦｃγＲＩに結合する、という事実 
図４７ａに、遺伝子的に一つの抗原に一体に遺伝子的に結合した二つのＨ２２ｓＦｖ領域からなる融合タンパク質をコード化するベクターのマップを示す。得られた融合タンパク質、即ち、Ｈ２２ｓＦｖ−Ｈ２２ｓＦｖ抗原（図４７Ｂに示す）は、二つのＦｃγＲＩ分子に結合することができる。このような融合タンパク質は、一つのＨ２２ｓＦｖのみからなるなる融合タンパク質よりもＦｃγＲＩに関する親和性がより大きいはずである。同様に、二つのＦｃγＲＩ分子と結合するこのマルチマーの能力は、受容体の内部移行もより強力に誘導する可能性がある。 
【０２００】
こうした仮説を実験するために（即ち、Ｈ２２ｓＦｖ−Ｈ２２ｓＦｖ抗原融合は、単一のＨ２２ｓＦｖ抗原融合に比べてより大きな親和性をもってＦｃγＲＩに結合するかどうかを）、競合実験を実施した。ＦｃγＲＩの発現を増強するために事前にＩＦＮ−γで処理したＵ９３７細胞を、抗体２２及びフィコエリトリン共役体で染色した。図４８に示すように、種々の濃度のＨ２２Ｆａｂ、Ｈ２２ｓＦｖ２−ＥＧＦ融合タンパク質又はＨ２２Ｆａｂ２によって、この共役体を阻害した。同様に図４８に示すように、Ｈ２２ｓＦｖ２−ＥＧＦは、Ｈ２２Ｆａｂ２とほぼ同等の親和性をもってＦｃγＲＩと結合する。Ｈ２２Ｆａｂ’及びＨ２２ｓＦｖは、ＦｃγＲＩに関して同様な親和性を有することが分かっていた（Goldstein et al. (1997) J. Immunol.）。 
【０２０１】
Ｈ２２ｓＦｖ−Ｈ２２ｓＦｖ−Ｈ２２ｓＦｖ−ＣＥＡは、ＦｃγＲＩの内部移行を誘導する、という事実 
図４９Ａは、一つの抗原に結合した三つのＨ２２ｓＦｖフラグメントを含有するマルチマー融合タンパク質をコード化するベクターのマップである。この融合タンパク質、即ち、Ｈ２２ｓＦｖ−Ｈ２２ｓＦｖ−Ｈ２２ｓＦｖ−ＣＥＡ（図４９ｂに示す）は、三つのＨ２２ｓＦｖと結合する腫瘍抗原ＣＥＡ（胎児性癌抗原）を含有する。この融合タンパク質は、高親和性をもってＦｃγＲＩと結合し（三つのｓＦｖ分子の三価結合により）、かつ三つのＦｃγＲＩ分子の凝集によってＦｃγＲＩの内部移行を誘導するはずである。 
【０２０２】
遺伝子的に結合したＨ２２ｓＦｖ−Ｈ２２ｓＦｖ−Ｈ２２ｓＦｖ−ＣＥＡ融合が、ＦｃγＲＩの内部移行を誘導する能力を、既に説明の如く実験し、その結果が図５０に示してある。重要なことは、Ｈ２２Ｆａｂ−ＣＥＡは、おそらくそれがＦｃγＲＩと一価性的に結合したために、同様な濃度では内部移行を媒介しなかった。ＩＦＮ−γ処理したＵ−９３７細胞に試料を加え、且つ３７℃で一時間又は一晩の何れかで定温放置してこの例を実験した。次に、４℃で一時間Ｍ３２．２−ＦＩＴＣで細胞を染色することによってＦｃγＲＩ発現を測定した。 
【０２０３】
例１０：ＣＤ８９（ＦｃαＲ）及び腫瘍抗原（例えば、ＥＧＦ受容体）に向けられたヒト抗体融合タンパク質は、腫瘍細胞の細胞媒介による細胞障害を促進する、という事実 
次の研究は、ＥＧＦ（上皮成長因子）受容体（ＥＧＦ−Ｒ）を発現する腫瘍細胞のエフェクター細胞媒介による致死を誘導する二重特異的融合構成体の作製及び特徴に関連する。この構成体は、抗ＣＤ８９（抗ＦｃαＲ）抗体（ＳｃＦｖもしくはＦａｂ’）に結合したＥＧＦを含む。よって、これらの構成体は、腫瘍細胞に向けられたＣＤ８９発現細胞のエフェクター機能を活性化させる。 
【０２０４】
ＣＤ８９（ＦｃαＲＩ）は、ＩｇＡ（ヒトの体において最もふんだんにある免疫グロブリン）のＦｃ部分に結合する受容体である。ＣＤ８９は、主に、多核白血球（ＰＭＮ）、単球、マクロファージ、好中球及び好酸球を含む細胞障害性免疫エフェクター上において構成的に発現される。Ａｇ複合体及び単量体のＩｇＡ１及びＩｇＡ２の両者が、ＣＤ８９と結合するが、これは、この受容体が単量体ＩｇＡとインビボでは飽和され得ることを示唆する。リガンド結合部位の内側又は外側で、エピトープに対して特異的なｍＡｂによって、骨髄腫エフェクター細胞上で架橋するＣＤ８９は、脱顆粒、スーパーオキシドの放出、炎症性サイトカインの分泌、エンドサイトーシス及び食細胞活動を刺激する。よって、ＣＤ８９は、細胞障害性免疫エフェクター細胞上の治療的に関連性のあるトリガー受容体となる得る。 
【０２０５】
タイプＩ成長因子受容体系統群のメンバーは、種々の癌の進行時に過剰発現されたと報告されている、チロシン−キナーゼ結合受容体である。この系統群の一つのメンバーに、上皮細胞成長因子に関する受容体がある（ＥＧＦ−Ｒ、ｃ−ｅｒｂＢ−１遺伝子産物）。ＥＧＦ−Ｒは、殆ど全ての頭部及び首部、およそ三分の一の乳癌及び卵巣癌において過剰発現され、前立腺、腎臓、膀胱、肺臓、脳、膵臓及び胃腸系の癌において過剰発現し得る。ケラチン生成細胞及び肝細胞のような幾つかの正常な細胞上にこの受容体が存在するが、腫瘍細胞上におけるＥＧＦ−Ｒの過剰発現は、特定の腫瘍にたいして特異的な治療法を差し向けるのに有用となり得る。対象となる治療法には、ＥＧＦ−Ｒに関して特異的なｍＡｂ、即ち、ＥＧＦのような、この受容体に関するリガンドの一つを含むことができる。ＥＧＦは、ＥＧＦ−Ｒを発現する種々の細胞のタイプの細胞分割及び分化の変調成分である。ＥＧＦは５３アミノ酸、即ち、三つのジスルフィド結合を含有する非グリコシル化タンパク質であり、１２０７アミノ酸先駆物質からタンパク質分解処理される。 
【０２０６】
融合構成体の作製 
二重特異的融合タンパク質を作製するには、本明細書において既に記載の如く、ＨｕＭＡｂ−マウス（商標）技術を利用して、完全にヒトＣＤ８９ｍＡｂを作製した。このｍＡｂ、即ち、１４Ａ８（１４．１とも呼ぶ）は、エフェクター機能を惹起する能力を保持しつつＦｃ結合部位とは別個のエピトープに結合する。よって、この抗体は、単量体ＩｇＡを飽和することによって引き起こされる、リガンド結合部位の遮断可能性を克服する。ここでは、ｍＡｂ１４Ａ８のｆａｂ’及びｓＦｖフラグメントをＥＧＦに融合させる。簡単に説明すると、この１４Ａ８ハブリドーマ・セルラインを、可溶性のＣＤ８９で免疫化したＨｕＭＡｂマウスから得た。そのｖ領域は、このセルラインから分離したＲＮＡのＲＴ＝ＰＣＲを用いてクローン化した。ＤＮＡ配列分析で分かったことは、この抗体は、ＤＮ１Ｄセグメント及びＪＨ４Ｊセグメントを有する３０．３ＶＨと、ＪＫ３Ｊセグメントを有するＬ１８Ｖｋとからなることである。 
【０２０７】
ＨｕＭＡｂ−マウス（商標）から作製した完全にヒトの抗ＣＤ８９ｍＡｂから、可変領域をコード化するＤＮＡを使用すると、二重特異的分子（ＢＭＳ）として機能する抗体融合タンパク質が作製され且つ発現された。図５１に示すように、これらの分子は、Ｆｃ結合部位とは別個の一つのエピトープにおける、ヒトＩｇＡ（ＦｃαＲＩ、即ち、ＣＤ８９）のＦｃ部分に特異的な受容体に結合し且つエフェクター機能を依然として惹起する、抗体フラグメントと、種々の腫瘍セルライン上で過剰発現する上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）に結合する一つのアームとから構成されていた。このＢＳＭを作成するために、ｍＡｂ１４Ａ８（抗ＣＤ８９）のＦａｂ又はｓｃ−Ｆｖフラグメントを、ＥＧＦに対するフレキシブルなペプチド・リンカー、即ち、ＥＧＦ−Ｒに関するリガンドを介して融合した。ｍＡｂ１４Ａ８の可変領域を、ＲＴ−ＰＣＲ及びＤＮＡ配列を用いてクローン化且つ特性説明した。 
【０２０８】
このＦａｂ融合構成体は、ヒトＩｇＧ１ＣＨ１のｃＤＮＡ及びＥＧＦに融合したヒンジ領域を含有する一つの発現ベクターに１４Ａ８ＶＨＤＮＡを挿入することによって作成した。１４Ａ８ＶＬＤＮＡも同様に、ヒトＣＬ領域のｃＤＮＡを含有する発現ベクターに挿入した。ｓｃ−Ｆｖ融合タンパク質も、単鎖で、一つのベクターから発現された。図５１に概略的に示すように、ＰＪＺ９０６（１４Ａｆｄ−ＥＧＦ）及びｐＪＺ９０７（１４Ａ８Ｌ鎖）を、電気穿孔法によって、ＮＳＯ細胞内に同時形質移入し、Ｇ４１８及びハイグロマイシンを含有する媒体で選択した。ＰＪＺ９０９（１４Ａ８ｓＦｖ−ＥＧＦ）も同様に形質移入して、Ｇ４１８を含有する媒体で選択した。融合タンパク質を発現するセルラインは、限界希釈クローニングによってサブクローン化した。これらの融合構成体を精製するために、融合タンパク質を発現するセルラインの上澄を、プロテインＬカラム上に流し、還元及び非還元条件下で、約２μｇの精製したタンパク質を４乃至１５％のトリスグリシン・ゲルに加えた。 
【０２０９】
腫瘍細胞に結合する融合タンパク質の特性説明 
図５２Ａ及びＢ、及び図５３に示すように、フローサイトメトリー実験によって、抗体フラグメント及びこれらのＢＳＭにおけるＥＧＦ部分は、これらの各々の細胞表面受容体に特異的に結合することが確証された。図５２Ａは、Ａ４３１細胞上のＥＧＦ−Ｒに結合する１４Ａ８ｆａｂ’−ＥＧＦ融合タンパク質を示す。図５２Ｂは、Ａ４３１細胞（フィコエリトリンに共役したヤギ抗ヒトＩｇＧＦａｂ−２で染色された）に結合する１４Ａ８ｓＦｖ−ＥＧＦを示す。１４Ａ８のｆａｂ−２フラグメントは、ＥＧＦを含有しないが、対照として用いられた。図５２Ｃに示すのは、１４Ａ８融合タンパク質及び市販のＥＧＦは、ＥＧＦ−ＦＩＴＣ共役体（７ｎＭ）を含有するＡ４３１との結合をめぐって競合することである。図５３Ａは、１４Ａ８ｆａｂ’−ＥＧＦ融合タンパク質が、ＣＤ８９を発現するＵ９３７細胞（フィコエリトリンに共役したヤギ抗ヒトＩｇＧＦａｂ−２で染色された）ＣＤ８９に結合することを示す。ヒト化ｍＡｂＨ４１５のｆａｂ−２フラグメント（ＥＧＦ−Ｒに関して特異的である）は、対照として用いられた。図５３Ｂは、１４Ａ８ｓＦｖ−ＥＧＦ融合タンパク質も同様にＣＤ８９を発現するＵ９３７細胞に結合することを示す。種々の濃度の１４Ａ８ｓＦｖ−ＥＧＦが、１４Ａ８ｆａｂ’−ＥＧＦ融合（２３ｎＭ）の結合を阻害するかどうかに関する査定を除いて、この実験を図５３Ａにおけるものと同様な態様で実施した。ここでもＨ２２ｓＦｖ−ＥＧＦ融合タンパク質を対照として用いた。ｍＡｂＨ２２は、ＣＤ６４（ＲｃγＲＩ）、即ち、Ｕ９３７細胞上の異なるＦｃ受容体、に結合する。 
【０２１０】
ＥＧＦ−Ｒを発現する腫瘍細胞の、エフェクター細胞媒介による溶解 
クロム遊離（細胞溶解）アッセイによって確認されたのは、１４Ａ８ｆａｂ’−ＥＧＦ及び１４Ａ８ｓＦｖ−ＥＧＦ構成体の両者とも、精製された、ＣＤ８９を発現する多形核球（ＰＭＮ）白血球、単球又は全血エフェクター細胞で、用量依存の態様において、ＥＧＦ−Ｒを発現する腫瘍細胞の特異的な溶解を媒介することである。 
【０２１１】
図５４Ａ、５４Ｂ、５４Ｃ及び図５５は、１４Ａ８融合タンパク質が、単球（５４Ａ）、ＰＭＮ（５４Ｂ）及び全血（５４Ｃ）を用いてＡ４３１細胞の細胞障害を媒介したことを示す。クロム遊離アッセイは、定温放置期間１６乃至１８時間及び１００対１の標的に対するエフェクターの割合（単球、ＰＭＮに関して）を用いて、定温放置で実施した。１４Ａ８のｆａｂ−２フラグメントは、対照として用いた。図５６に示すように、Ａ４３１細胞の１４Ａ８ｆａｂ’−ＥＧＦ融合（１μｇ／ｍｌ）及び１４ａ８Ｓｆｖ−Ｅｇｆ融合（１μｇ／ｍｌ）媒介細胞障害は、１４Ａ８のｆａｂ−２フラグメント（４０μｇ／ｍｌ）によって阻害されている。このことは、これら融合タンパク質による細胞溶解は、ＣＤ８９に結合することによって特異的に媒介されるということを証明する。 
【０２１２】
全般的に言えば、上記の研究は、１４Ａ８のＦａｂ’又はｓＦｖフラグメントにＥＧＦを結合し、哺乳類の細胞培養において構成体を発現させ、且つプロテインＬ・クロマトグラフィーを用いて近似均質までこれらの構成体を精製する、遺伝子的手段による融合タンパク質の作製を説明したものである。このような融合タンパク質は、１４Ａ８は完全にヒトあり、ＥＧＦはヒト由来であって、融合タンパク質の治療上の効力を増強することができるので、ヒトにおいて最上限には免疫原性である。上記研究はまた、これらの融合タンパク質、即ち、１４Ａｆａｂ’−ＥＧＦ及び１４Ａ８ｓＦｖは、ＣＤ８９及びＥＧＦ−Ｒを発現する細胞と結合できる。重要なことは、これらの研究は、ＣＤ８９を発現する免疫エフェクター細胞の存在下において、これらの融合タンパク質が、用量依存の態様で、ＥＧＦを過剰に発現する細胞の致死を媒介することを更に証明していることである。腫瘍細胞の溶解も、全血の存在下において証明された。 
【０２１３】
例１１：ＣＤ８９（ＦｃαＲ）及び腫瘍細胞（例えば、ＥＧＦ受容体及び／又はＨＥＲ２）に向けられたヒト抗体結合部分を含有する二重特異的及び三重特異的分子は、腫瘍の細胞媒介細胞障害を促進する、という事実 
次の研究は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦ−Ｒ）及び／又はＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＨＥＲ２とも呼ぶ）を発現する腫瘍細胞を、フェクター細胞の媒介によって致死させるのを誘導する二重特異的及び三重特異的分子の作製及び特性説明に関する。これらの二重特異的構成体は、３．Ｆ２と呼ばれる、ヒト・モノクローナル抗ＨＥＲ２抗体（ＳｃＦｖもしくはＦａｂ’）に結合した、１４．１と呼ばれる、ヒト・モノクローナル抗ＣＤ８９（抗ＦｃαＲ）抗体（ＳｃＦｖもしくはＦａｂ’）を含む。三重特異的構成体には、ＥＧＦに融合した、二重特異的抗ＣＤ８９（ＳｃＦｖ）ｘ抗ＨＥＲ２（ＳｃＦｖ）構成体が含まれていた。これらの構成体は、腫瘍細胞に向けられている、ＣＤ８９を発現する細胞のエフェクター機能を活性化させる。これらは完全にヒトであるという利点も提供する。 
【０２１４】
二重特異的及び三重特異的融合タンパク質の作製 
図５７及び５８は、選択された本発明の二重及び三重特異的分子及びそれらの親ヒト抗体（ＨｕＭａｂ）を示す。図５７に示すのは、単鎖（ＳｃＦｖ）二重特異的融合分子（９３１及び９３４）であり、これらは、９３４はＥＧＦを含むが、９３１はＥＧＦを含まないということ以外同一のものである。１４．１（抗ＣＤ８９）及び３Ｆ２（抗ＨＥＲ２）の可変Ｌ及びＨ鎖領域は、これらの構成体を作製するのに用いられる。図５８は、化学的に共役したＦａｂ’抗ＣＤ８９ｘ抗ＨＥＲ２二重特異的分子を示す。１４．１及び３Ｆ２のｆａｂ’フラグメントは、標準的な化学架橋法を用い、ジスルフィド結合によって結合して、この二重特異的分子を作製した。 
【０２１５】
単鎖二重及び三重特異的分子（９３１及び９３４）は、プラスミド（例えば、ｐＪＺ９３４）でＮＳＯ細胞を形質移入することで作製し（抗ＣＤ８９ｘＥＧＦ融合に関して、図５１で示したように）、Ｇ４１８を含有する媒体中で選択した。セルラインを融合タンパク質の発現に関してスクリーニングし、限界希釈クローニングによてサブクローン化した。最後に、融合タンパク質を発現するセルラインの上澄をプロテインＬ・カラム上に流し、その後非還元及び還元条件下において、およそ２μｇの精製したタンパク質を４乃至１５％のトリスグリシンのゲルに加えることによって、を融合タンパク質を精製した。９３４構成体が、還元条件下において、主としてモノマーに解離する三量体として精製された。 
【０２１６】
腫瘍細胞に結合する二重及び三重分子の特性説明 
フロー・クロマトグラフィーを用いて、二重及び三重分子の特性説明を行った。図５９Ａは、トランスフェクトーマ上澄における、融合タンパク質の腫瘍細胞との結合を示す。形質移入された（９３１及び９３４）及び形質移入されなかった（ＮＳＯ）上澄を、ＳＫＢＲ−３又はＡ４３１腫瘍セルラインの何れかと共に定温放置した。次に、融合タンパク質の結合を、フィコエリトリンに共役されたヤギ抗ヒトＩｇＧｆａｂ−２で染色することで検出した。図５９Ｂに示したように、形質移入された細胞（９３１及び９３４）からの上澄も細胞溶解（ＡＤＣＣ）を媒介した。これれらの研究においては、１６乃至１時間の放置期間及び１００対１の標的（ＳＫＢＲ−３、Ａ４３１）に対するエフェクター（単球、ＰＭＮ）の割合で、クロム遊離アッセイを実施した。腫瘍細胞致死は、特異的な溶解を媒介するべき、形質移入された（９３１及び９３４）及び形質移入されなかった（ＮＳＯ）上澄を用いて検出した。 
【０２１７】
図６０Ａは、精製された二重及び三重特異的分子（９３１及び９３４）がＵ９３７細胞（ＣＤ８９受容体を介して）に結合する活性を示す。Ｕ９３７細胞に結合しない、抗体４２５（抗ＥＧＦ−ＲｍＡｂ）のｆａｂ−２フラグメントは、陰性対照として用いた。抗ＣＤ８９（Ｆａｂ’）ｘ抗ＨＥＲ２（Ｆａｂ’）、即ち、化学的結合した二重特異性分子（図５８に示す）は、陽性対照として用いた。図６０Ｂは、ＳＫＢＲ−３細胞との結合（ＨＥＲ２受容体を介する）実験以外は、図６０Ａと同一である。抗ＣＤ８９抗体（１４．１）のｆａｂ−２フラグメントは、陰性対照として用いた。図６１は、Ａ４３１細胞との９３４三重特異的構成体の結合を示す。この実験は、ＥＧＦ−Ｒを過剰発現するＡ４３１腫瘍細胞を用いた点以外は、図６０に示したものと同一の態様で実施した。ＥＧＦに融合した１４．１のｓＦｖフラグメントからなる融合タンパク質を陽性対照として、また抗ＣＤ８９抗体のｆａｂ−２フラグメント（１４．１）を陰性対照として用いた。 
【０２１８】
エフェクター細胞媒介による、ＥＧＦ−Ｒ及びＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍細胞の溶解 
単鎖二重及び三重特異的分子（９３１及び９３４）に関しても、エフェクター細胞の存在下において、ＥＧＦ−Ｒ及びＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍細胞の細胞溶解（ＡＤＣＣ）を媒介できるかを実験した。１６乃至１８時間の定温放置期間及び１００対１の標的（ＳＫＢＲ−３、Ａ４３１）に対するエフェクター（単球、ＰＭ）の割合で、クロム遊離アッセイを実施した。腫瘍細胞致死は、特異的な溶解を媒介するべき、形質移入された（９３１及び９３４）及び形質移入されなかった（ＮＳＯ）上澄を用いて検出した。図５９Ｂに示すように、形質移入された（９３１及び９３４）からの上澄は、単球、ＰＭＮ及び全血の細胞溶解（ＡＤＣＣ）を媒介した。これらの研究においては、１６乃至１８時間の定温放置期間及び１００対１の標的（ＳＫＢＲ−３、Ａ４３１）に対するエフェクター（単球、ＰＭ）の割合で、クロム遊離アッセイを実施した。腫瘍細胞致死は、特異的な溶解を媒介するべき、形質移入された（９３１及び９３４）及び形質移入されなかった（ＮＳＯ）上澄を用いて検出した。 
【０２１９】
図６２及び図６３は、精製された単鎖二重特異的構成体（９３１）による、ＰＭＮ及び単球の存在下におけるＳＫＢＲ−３細胞（図６２Ａ及び図６３Ａ）及びＢＴ４７４細胞（図６２Ｂ及び図６３Ｂ）のエフェクター細胞媒介溶解をそれぞれ示す。１６乃至１８時間の定温放置期間及び１００対１の標的に対するエフェクターの割合で、クロム遊離アッセイを実施した。抗ＣＤ８９抗体（１４．１）のｆａｂ−２フラグメントを、各実験において陰性対照として用いた。 
【０２２０】
さらに、二つの架橋されたＦａｂ’抗体フラグメント（９３１及び９３４構成体の場合の単鎖抗体とは異なり）を含有する、精製され化学的に共役された二重特異的分子１４．１ｘ３．Ｆ２（図５８）をテストして、５１Ｃｒ標識されたＳＫＢＲ−３又はＢＴ−４７４ヒト腫瘍細胞の多形核球（ＰＭＮ）細胞、単球及び全血によるＡＤＣＣ致死をテストした。３７℃で一晩放置した後、培養上澄中に遊離された５１Ｃｒの分析によって、腫瘍細胞致死の量を測定した。特異的溶解は、二重特異的分子の存在下における腫瘍細胞致死から、多形核球細胞のみでの腫瘍細胞致死を減じた量として算出した。図６４に示すように、二重特異的分子１４．１ｘ３．Ｆ２は、用量依存の態様で、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するＳＫＢＲ−３及びＢＴ−４７４の両方の腫瘍細胞の、ＰＭＮによる細胞致死を媒介した。更に、図６５に示すように、二重特異的分子１４．１ｘ３．Ｆ２は、用量依存の態様で、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するＳＫＢＲ−３及びＢＴ−４７４の両方の腫瘍細胞の、単球による細胞致死を媒介した。両方の場合において、１０μｇ／ｍｌの１４．１Ｆａｂ’２を加えることによって、１μｇ／ｍｌの二重特異的分子１４．１ｘ３．Ｆ２による腫瘍細胞のＡＤＣＣが完全に遮断された。これは、標的にされた細胞の致死が、エフェクター細胞に結合するＣＤ８９によって排他的に媒介されたことを証明する。図６６は、二重特異的分子１４．１ｘ３．Ｆ２も、用量依存の態様で、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するＢＴ−４７４腫瘍細胞の、全血による細胞致死を媒介したことを示す。 
【０２２１】
全般的に言うと、上記研究は、ヒトのモノクローナル抗体（単鎖及びＦａｂ’フラグメントを含めて）を含有する二重及び三重特異的分子の作製を説明したものである。さらに、これらの例によって、これらの二重及び三重特異的分子は、エフェクター細胞の存在下において、ＨＥＲ２／ｎｅｕ及びＥＧＦ−Ｒを発現する腫瘍細胞の致死を効果的に媒介することを証明する。 
【０２２２】
同等物 
当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の実施例に対する数多くの同等物を認識もしくは通常程度の実験法を用いて確認するであろう。このような同等物は、添付の特許請求の範囲によって網羅されるものと思料する。 
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】ヒト化したＦｃγＲＩ抗体Ｈ２２のヒンジ領域の一部のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示し［Ａ］、変更して、切断された単一スルフヒドリル形とし［Ｂ］、更に変更して、二つの固有のクローニング部位を作製したもの［Ｃ］、を示す。下線のヌクレオチドは、以前の配列からの変更を示す。上線のヌクレオチドは、示した制限部位の認識配列である。
【図２】Ｈ鎖ＥＧＦ融合発現構成体ｐＪＧ０５５の略図である。
【図３】抗Ｆｃ受容体−リガンド二重特異的分子の産生を概略図で示したものである。
【図４】ヒト化Ｆｃγ受容体−上皮成長因子融合タンパク質の活性を調べるために用いたフローサイトメトリー・アッセイの略図である。
【図５】様々な濃度の上皮成長因子（ＥＧＦ）融合タンパク質（Ｈ２２−ＥＧＦ融合）及び完全にヒト化した二重特異性（ＢｓＡｂ）Ｈ４４７のＥＧＦ受容体（ＥＦＧＲ）発現１４８３細胞への結合を表す平均蛍光強度（ＭＦＩ）をグラフで示す。
【図６】マウスの抗体Ｍ４２５（ＥＧＦＲに結合する）の存在下又は不存在下における、様々な濃度のＥＧＦ融合タンパク質又はＢｓＡｂＨ４４７細胞のＡ４３１細胞への結合を示すグラフである。
【図７】ＥＧＦ融合タンパク質、ＢｓＡｂＨ４４７、又はＨ４２５抗体のＡ４３１細胞への結合に起因する抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を示すグラフである。
【図８】培地のみ、２５％のヒト血清（ＨＳ）を含む培地、又は、Ｆｃγ受容体抗体ｍ２２のｆａｂフラグメントを含む培地の存在下における、ＥＧＦ融合タンパク質、ＢｓＡｂＨ４４７、又はＨ４２５抗体結合に起因する抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を示す棒グラフである。
【図９】様々な量のＥＧＦ、Ｈ２２−ＥＧＦ、Ｈ２２のｆａｂフラグメント（Ｈ２２Ｆａｂ）、又はＨ４２５のＦ（ａｂ’）２フラグメント（Ｈ４２５Ｆ（ａｂ’）２）の存在下で培養された生存Ａ４３１細胞の数を表すグラフである。
【図１０】Ｈ２２Ｆｄ−ＨＲＧ融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図１１】ＰＣ−３又はＳＫＢｒ−３腫瘍細胞を、インターフェロン−γ処理した単球と、Ｈ２２−ヘレグリン融合タンパク質を発現する骨髄腫細胞からの上澄みを１：３又は１：３０の希釈と、で培養したことに起因するこれら細胞の致死のパーセントを示す柱状グラフである。
【図１２】単球の存在下及び様々な濃度のＨ２２−ボンベシン融合タンパク質の存在下における、ＰＣ−３腫瘍細胞溶解のパーセントを示すグラフである。
【図１３】オルトフェニレンジマルイミド（ｏ−ＰＤＭ）法又はＤＴＮＢ法によって産生されたＢｓＡｂ４７７の活性を評価するためのフローサイトメトリーアッセイを表す略図である。
【図１４】ｏ−ＰＤＭ法及びＤＴＮＢ法で得た様々な濃度のＢｓＡｂ４７７の、Ａ４３１細胞を発現するＥＧＦＲ及びＦｃγＲＩに関する平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表すグラフである。
【図１５】ｏ−ＰＤＭ法及びＤＴＮＢ法で得たＢｓＡｂ４７７の、Ａ４３１細胞を発現するＥＧＦＲ及びＦｃγＲＩへの結合に起因する抗体依存性細胞障害を示すグラフである。
【図１６】三重特異性抗体の作製を表すフローチャートである。
【図１７】二価二重特異性抗体の三価二重特異性抗体への転換を示す図である。二価二重特異性抗体は、還元し且つｏ−ＰＤＭ処理した５２０Ｃ９Ｆａｂ’と混合して、ＴｓＡｂを得た。
【図１８】ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ａ）及びＥＧＦＲ（Ｂ）に関する二重機能蛍光活性化細胞選別アッセイを示す図である。
【図１９】様々の濃度のＴｓＡｂ又はＴｓＡｂ抗体の標的細胞への結合を示すグラフである。平均蛍光強度（ＭＦＩ）はＡｂ結合の増加と共に増加する。これは、ＴｓＡｂがＳＫＢｒ−３上の可溶性のＨＥＲ２／ｎｅｕとＦｃγＲＩの両者に、用量依存の態様で、同時に結合したことを示す。
【図２０】ＴｓＡｂが、Ａ４３１細胞上のＥＧＦＲ及び可溶性のＦｃγＲＩと用量依存の態様で同時に結合したことを示すグラフである。このアッセイは図１９で用いたアッセイと類似のものである。
【図２１】ＴｓＡｂ（Ｍ２２ｘＨ４２５ｘ５２０Ｃ９）及びＢｓＡｂ（Ｍ２２ｘ５２０Ｃ９）が、ＳＫＢｒ−３のＡＤＣＣを誘導する能力があるが、ＢｓＡｂ（Ｍ２２ｘＨ４２５）にはその能力が無かったことを示すグラフである。様々な濃度の抗体をＳＫＢｒ−３細胞及び予め活性化したＰＭＮと一緒に定温放置した。
【図２２】ＴｓＡｂ（Ｍ２２ｘＨ４２５ｘ５２０Ｃ９）及びＢｓＡｂ（Ｍ２２ｘＨ４２５）が、Ａ４３１のＡＤＣＣを誘導する能力があるが、ＢｓＡｂ（Ｍ２２ｘ５２０Ｃ９）にはその能力が無かったことを示すグラフである。このアッセイは図２１で用いたアッセイと類似の様態で実行した。
【図２３】（ａ）は、全血変調アッセイのフローチャートである。   （ｂ）は、そのアッセイからの結果を示すグラフである。この三価抗体は、単球表面からのＦｃγＲＩを急速に変調する。
【図２４】Ａは、野生型（ＴＴ８３０）及び突然変異体（ＴＴ８３３Ｓ）破傷風毒素ペプチドを符号化する合成オリゴヌクレオチドのアミノ酸配列を示す。   Ｂは、Ｈ２２Ｆｄ−ＴＴ融合タンパク質を示す。
【図２５】（ａ）は、ＭＤＸＨ２１０のＦｃγＲＩ陽性Ｕ９３７細胞への結合を示すフローサイトメトリー・アッセイの結果を示す。   （ｂ）は、Ｆａｂ２２−ＴＴ８３０のＦｃγＲＩ陽性Ｕ９３７細胞への結合を示すフローサイトメトリー・アッセイの結果を示す。   （ｃ）は、Ｈ２２−ＴＴ８３３ＳのＦｃγＲＩ陽性Ｕ９３７細胞への結合を示すフローサイトメトリー・アッセイの結果を示す。破線はそれぞれ陰性対照を示し、実線は融合タンパク質による染色を示し、点線はマウスｍＡｂ２２Ｆ（ａｂ’）２により阻害された融合タンパク質結合を表す。
【図２６】ＦｃγＲＩ陽性Ｕ９３７細胞へ結合した様々な量の融合タンパク質ＭＤＸＨ２１０、ＦＡｂ２２−ＴＴ８３０、及びＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓの定温放置に起因する平均蛍光強度を示すグラフである。
【図２７】照射した単球及び様々な濃度のＴＴ８３０、Ｆａｂ２２−ＴＴ８３０、ＴＴ、又はＴＴ９４７と一緒に定温放置したＴ細胞の増殖を表すグラフであり、ＴＴ８３０と比較すると融合タンパク質Ｆａｂ２２−ＴＴ８３０は、Ｔｈエピトープの提示を１０００倍向上させることを示す。
【図２８】Ｔ細胞及び抗体を付加する前に、飽和量のｍＡｂ２２Ｆ（ａｂ’）２と一緒に予備的に定温放置した場合または定温放置しなかった場合の、１０００ｎＭにおけるＴＴ８３０又は１０ｎＭのＦＡｂ２２−ＴＴ８３０及び単球と一緒に定温放置したＴ細胞の増殖を表す柱状グラフである。
【図２９】ＩｇＧの不存在下（対照）又は存在下で、単球及び５ｎＭのＦａｂ２２−ＴＴ８３０又は１０００ｎＭのＴＴ８３０と一緒に定温放置されたＴ細胞の増殖を表す柱状グラフである。
【図３０】（ａ）は、単球と様々の濃度のＴＴ８３０又はＦａｂ２２−ＴＴ８３０で二日間培養したＴ細胞の上澄みにおけるＩＦＮ−γの濃度を示すグラフである。   （ｂ）は、単球と様々の濃度のＴＴ８３０又はＦａｂ２２−ＴＴ８３０と一緒に二日間培養したＴ細胞の上澄みにおけるＩＬ−４の濃度を示すグラフである。
【図３１】単球と様々の濃度のＴＴ８３３Ｓ、Ｆａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓ、又はＴＴ８３０と共に定温放置したＴ細胞の増殖を示すグラフである。
【図３２】様々な濃度のＴＴ８３３Ｓと一緒に予備的に定温放置した後、単球とＴＴ８３０と一緒に一晩定温放置したＴ細胞の増殖を示すグラフである。
【図３３】様々な濃度のＴＴ８３３Ｓ又はＦＡｂ２２−ＴＴ８３３Ｓと一緒に予備的に一晩定温放置した後、単球とＴＴ８３０と一緒に二日間定温放置したＴ細胞増殖の抑制をパーセントで示すグラフである。
【図３４】Ｔ細胞を付加する前に、先ずＴＴ８３０と一緒に４時間定温放置し（プリパルス）、更に１０μＭのＴＴ８３３Ｓ又は０．１μＭのＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓと一緒に一晩定温放置（チェース）した後に、単球と一緒に二日間定温放置したＴ細胞増殖を示す柱状グラフである。
【図３５】単球とＴＴ８３０、ＦＡｂ２２−ＴＴ８３０、ＴＴ８３３Ｓ、又はＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓで培養したＴ細胞の上澄みにおけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）及びＩＬ−４の濃度を示す柱状グラフである。
【図３６】培地において単球のみで、ＴＴ８３３Ｓで、又はＦａｂ２２−ＴＴ８３３Ｓで１日間刺激して、その後、単球と様々の濃度のＴＴ８３０で２日間にわたり再刺激したＴ細胞の増殖を示すグラフであり、ＴＴ８３３Ｓ及びＦａｂ２２−ＴＴ８３３ＳはＴ細胞のアネルギーを引き起こさなかったことを示している。
【図３７】ＦｃγＲＩ（Ｈ２２）に関する一つの結合特異的部分と、胎児性癌抗原（ＣＥＡ）（構成体３２１及び３２３）に関する一つの結合特異的部分とを備えた単鎖二重特異的分子を符号化する二つの発現構成体及び、ＦｃγＲＩに関する一つの結合特異的部分を備えた単鎖抗体を符号化する一つの発現構成体を示すグラフである。これら符号化領域はＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ  Ｐｒ）の制御下にある。抗体のＨ鎖（ＶＨ）及びＬ鎖（ＶＬ）からの可変領域に加え、これら構成体により符号化されるタンパク質は、ｃ−ｍｙｃ（ｃ−ｍｙｃ）からのペプチド及びヘキサヒスチジンペプチド（Ｈ−６）に融合する。
【図３８】発現構成体３２１（３２１−Ａ５及び３２１−Ｂ４）及び３２２（３２２−Ｂ及び３２３−Ｃ４）により符号化される単鎖二重特異的分子Ｈ２２−抗ＣＥＡと、構成体２２５（２２５−Ｃ２）により符号化される単鎖Ｈ２２抗体との、二重特異的ＥＬＩＳＡにより測定した結合レベルを示す柱状グラフである。
【図３９】（ａ）乃至（ｃ）は、単鎖ヒト化抗ＦｃγＲＩ抗体の核酸配列と、その核酸により符号化されるアミノ酸配列を示す。
【図４０】（ａ）乃至（ｄ）は、ＦｃγＲＩに関する一つの結合特異的部分と、胎児性癌抗原に関する一つの結合特異的部分とを備えた単鎖二重特異的分子の核酸配列及び、その核酸により符号化されるアミノ酸配列を示す。
【図４１】抗原に結合した複数のＦａｂ’フラグメントから構成されるマルチマー複合体の構造を示す略図である。
【図４２】（ａ）は、精製したＭ２２Ｆ（ａｂ’）２マルチマー（左側ライン）及び化学的に結合したＭ２２Ｆａｂ’３マルチマー複合体（右側ライン）を示す非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。   （ｂ）は、Ｍ２２Ｆ（ａｂ’）３＋との定温放置が、マクロファージの表面におけるＣＤ６４の発現を、投与量に依存して５０％まで減らすことを示すグラフである。
【図４３】（ａ）は、遺伝子導入されていない同腹子マウスに比べ、高い力価のＭ２２特異的抗体が、三回免疫化されたＣＤ６４遺伝子導入マウス全てにおいて見られたことを示す。   （ｂ）は、僅か０．２５ｍｇのマルチマー複合体でＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）遺伝子導入マウスを免疫化しても、検出可能な免疫反応が得られることを示す。
【図４４】（ａ）および（ｂ）は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）の遺伝子導入マウス及び遺伝子導入されていないマウスの、抗５２０Ｃ９及び抗Ｍ２２力価で判断した免疫反応を示すグラフである。これらマウスは、Ｍ２２マルチマー複合体に結合したマウス抗体５２０Ｃ９のＦａｂ’フラグメントで免疫化した。
【図４５】（ａ）は、抗原（Ｈ２２（２ｘ）−３２．２−抗原複合体）に結合した一つのＭ３２．２ｓＦｖ領域に結合した二つのＨ２２ｓＦｖ領域を含んだ遺伝子的に関連したマルチマー複合体を符号化する発現ベクターのマップを示す。   （ｂ）は、作製されたマルチマー複合体を示す図である。
【図４６】Ｍ２２ＦａｂｘＭ２２ＦａｂｘＭ３２及びＨ２２ｓＦｖ−Ｈ２２ｓＦｖ−３２．２ｓＦｖ−ｇｐ７５マルチマー複合体の、ＦｃγＲＩに効率的に結合して内部移行を誘導する能力を示す棒グラフである。
【図４７】（ａ）は、互いに抗原（Ｈ２２（２ｘ）抗原マルチマー複合体）に結合した二つのＨ２２ｓＦｖ領域を含んだ遺伝子的に関連したマルチマー複合体を符号化する発現ベクターのマップを示す。   （ｂ）は、作製されたマルチマー複合体を示す図である。
【図４８】Ｈ２２Ｆａｂ’、Ｈ２２ｓＦｖ２−ＥＧＦマルチマー、及びＨ２２Ｆａｂ２マルチマーを用いた結合競合アッセイの結果を示すグラフである。結果は、これらマルチマーによるＭ２２−フィコエリトリン共役の結合阻害に関して示したものである。
【図４９】（ａ）は、抗原（Ｈ２２（３ｘ）抗原マルチマー複合体）に結合した三つのＨ２２ｓＦｖフラグメントを含んだ遺伝子的に関連したマルチマー複合体を符号化する発現ベクターのマップを示す。   （ｂ）は、作製されたタンパク質を示す図である。
【図５０】他のマルチマー複合体と比較したＨ２２（３ｘ）−ＣＥＡマルチマー複合体の、ＦｃγＲＩ内部移行を誘導する能力を示す棒グラフである。
【図５１】抗ＣＤ８９（１４Ａ８）ＨｕＭＡｂ融合分子の作製を表す略図である。ＰＪＺ９０６（１４Ａｄｆ−ＥＧＦ）及びｐＪＺ９０７（１４Ａ８Ｌ鎖）は電気穿孔法によってＮＳＯ細胞に同時形質移入され、Ｇ４１８及びハイグロマイシンを含んだ培地で選択された。ＰＪＺ９０９（１４Ａ８ｓＦｖ−ＥＧＦ）は、同様に、形質移入され、Ｇ４１８を含んだ培地で選択された。融合タンパク質を発現する細胞株は、限界希釈クローニングによりサブクローニングした。
【図５２】Ａは、１４Ａ８Ｆａｂ’−ＥＧＦ融合構成体のＡ４３１細胞上のＥＧＦ−Ｒへの（フローサイトメトリーで測定した）結合を示すグラフである。   Ｂは、１４Ａ８ｓＦｖ−ＥＧＦ融合構成体のＡ４３１細胞上のＥＧＦ−Ｒへの結合を示すグラフである。Ａ４３１細胞は、フィコエリトリンに共役したヤギの抗ヒトＩｇＧＦａｂ−２で染色した。ＥＧＦを含まない１４Ａ８のＦａｂフラグメント（ヒトモノクローナル抗ＦｃαＲ抗体、１４．１とも称する）を、対照として用いた。   Ｃは、融合タンパク質と市販のＥＧＦが、ＥＧＦ−ＦＩＴＣ共役を備えた４３１細胞への結合で競争することを示す（７ｎＭ）。
【図５３】Ａは、１４Ａ８ｆａｂ’−ＥＧＦ融合構成体のＵ９３７細胞への（フローサイトメトリーで測定した）結合を示すグラフである。Ｕ９３７細胞へ結合した融合タンパク質は、フィコエリトリンに共役したヤギの抗ヒトＩｇＧＦａｂ−２で染色した。ヒト化したｍＡｂＨ４１５ののＦａｂ−２フラグメント（ＥＧＦ−Ｒに対して特異的である）を、対照として用いた。   Ｂは、１４Ａ８ｓＦｖ−ＥＧＦ融合構成体の、Ｕ９３７細胞への結合を示す。この実験はＡと類似の様態で実施されたが、相違点は、１４Ａ８Ｆａｂ’−ＥＧＦの結合を阻害する能力を、１４Ａ８ｓＦｖ−ＥＧＦの様々な濃度において評価したことである。ｍＡｂＨ２２は、Ｕ９３７細胞上の異なるＦｃ受容体であるＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）に結合する。
【図５４】用量に依存したＡ４３１細胞の融合タンパク質媒介細胞障害を示すグラフである。クロミウム放出アッセイを、１６乃至１８時間定温放置して、１００：１のエフェクター対標的（単球及びＰＭＮに関して）の比を用いて行った。１４Ａ８のＦａｂ２フラグメントを対照として用いた。   Ａ  エフェクター細胞には新鮮な単球を含めた。   Ｂ  エフェクター細胞にはＰＭＮを含めた。   Ｃ  エフェクター細胞には全血を含めた。
【図５５】図５４Ａ乃至Ｃの結果を比較した棒グラフである。
【図５６】Ａは、Ａ４３１細胞の１４Ａ８ｆａｂ’−ＥＧＦ（１μｇ／ｍｌ）融合タンパク質媒介細胞障害は、１４Ａ８のｆａｂ−２フラグメントにより抑制されることを示す棒グラフである。   Ｂは、Ａ４３１細胞の１４ａ８ｓｆｖ−ｅｆｇ（１μｇ／ｍｌ）融合タンパク質媒介細胞障害も、１４Ａ８のｆａｂ−２フラグメント（４０μ／ｍｌ）により抑制されることを示す棒グラフである。
【図５７】二重特異的単鎖融合分子９３１及び９３４及びこれらの親ＨｕＭａｂの略図である。１４．１及び３Ｆ２の可変Ｌ鎖及びＨ鎖領域を用いて９３１及び９３４（ｗ／ＥＧＦ）構成体を作製した。
【図５８】陽性対照として用いた、１４．１及び３Ｆ２（抗ＨＥＲ２）のｆａｂ’フラグメントからなる、化学的に共役した二重特異的分子の略図である。
【図５９】Ａは、フロー・クロマトグラフィー分析法で測定した、トランスフェクトーマ上澄において発現した融合タンパク質９３１及び９３４のスクリーニング（結合）アッセイを示す棒グラフである。形質移入された（９３１及び９３４）及び形質移入されなかった（ＮＳＯ）上澄を、ＳＫＢＲ−３又はＡ４３１腫瘍セルラインの何れかと一緒に定温放置した。融合タンパク質の結合を、フィコエリトリンに共役されたヤギ抗ヒトＩｇＧｆａｂ−２で染色することで検出した。   Ｂは、融合タンパク質９３１及び９３４のＡＤＣＣ分析を示す棒グラフである。１６乃至１時間の定温放置期間及び１００対１の標的（ＳＫＢＲ−３、Ａ４３１）に対するエフェクター（単球、ＰＭＮ）の割合で、クロム遊離アッセイを実施した。腫瘍細胞致死は、特異的な溶解を媒介すべき、形質移入された（９３１及び９３４）及び形質移入されなかった（ＮＳＯ）上澄を用いて検出した。
【図６０】Ａは、単鎖融合タンパク質９３１及び９３４のＵ９３７細胞への結合（フロー・クロマトグラフィーで測定した）を示すグラフである。Ｕ９３７細胞に結合しない、４２５（抗ＥＧＦ−ＲｍＡｂ）のｆａｂ’フラグメントは、陰性対照として用いた。図５８に示した化学的結合した二重特異性分子（１４．１ｘ３Ｆ２）は、陽性対照として用いた。   Ｂは、単鎖融合タンパク質９３１及び９３４のＳＫＢＲ−３細胞への（フロー・クロマトグラフィー分析法で測定した）結合を示すグラフである。１４．１ｆａｂ−２を陰性対照として用いた。図５８に示した化学的に結合した二重特異的分子（１４．１ｘ３Ｆ２）を、再び陽性対照として用いた。
【図６１】単鎖融合タンパク質９３４のＡ４３１との（フロー・クロマトグラフィーで測定した）結合を示すグラフである。この実験は、ＥＧＦ−Ｒを過剰発現するＡ４３１腫瘍細胞を用いた点以外は、図６０に示したものと同一の態様で実施した。ＥＧＦに融合した１４．１のｓＦｖフラグメントからなる融合タンパク質を陽性対照として、また１４．１ｆａｂ−２フラグメントを陰性対照として用いた。
【図６２】単鎖融合タンパク質９３１による、ＳＫＢＲ３（図６２Ａ）及びＢＴ４７４（図６２Ｂ）腫瘍細胞のＰＭＮ（エフェクター細胞）媒介細胞障害を示すグラフである。クロミウム放出アッセイを、１６乃至１８時間の定温放置及び１００：１のエフェクターに対する標的の比を用いて行った。各実験において、１４．１ｆａｂ−２を対照として用いた。
【図６３】単鎖融合タンパク質９３１による、ＳＫＢＲ３（図６２Ａ）及びＢＴ４７４（図６２Ｂ）腫瘍細胞の単球（エフェクター細胞）媒介細胞障害を示すグラフである。クロミウム放出アッセイを、１６乃至１８時間の定温放置及び１００：１のエフェクターに対する標的の比を用いて行った。各実験において、１４．１ｆａｂ−２を対照として用いた。
【図６４】５１Ｃｒ放出により測定した、ヒト抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ×抗ＣＤ８９多特異的分子（１４．１×３．Ｆ２）により媒介された多核細胞によるＳＫＢＲ−３及びＢＴ−４７４腫瘍細胞の抗体依存細胞障害を示すグラフである。
【図６５】５１Ｃｒ放出により測定した、ヒト抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ×抗ＣＤ８９多特異的分子（１４．１×３．Ｆ２）により媒介された単球によるＳＫＢＲ−３及びＢＴ−４７４腫瘍細胞の抗体依存細胞障害を示すグラフである。
【図６６】５１Ｃｒ放出により測定した、ヒト抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ×抗ＣＤ８９多特異的分子（１４．１×３．Ｆ２）により媒介された全血によるＢＴ−４７４腫瘍細胞の抗体依存細胞障害を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５２Ｃ】
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【図５３】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５４Ｃ】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【配列表】
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