(57)【要約】【課題】排水等の液体中に含まれるトリアジン系化合物、特にメラミンやメラミン樹脂などのメラミン誘導体の資化分解能を有する新規な微生物を提供すること。【解決手段】アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属またはファイロバクテリウム（Phyllobacterium）属に属するトリアジン系化合物の分解資化能を有する微生物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属またはファイロバクテリウム（Phyllobacterium）属に属するトリアジン系化合物の分解資化能を有する微生物。
【請求項２】
アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＭＤ５−ＹＭＴＫ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０９である請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
ミクロバクテリウム sp.（Microbacterium sp.）ＭＤ７−ＭＮＴＹ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１１である請求項１に記載の微生物。
【請求項４】
オクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）ＭＤ１−ＭＴＪＹ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０８である請求項１に記載の微生物。
【請求項５】
ファイロバクテリウム・ミルシナセアラム（Phyllobacterium myrsinacearum）ＭＤ６−ＪＫＲＨ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１０である請求項１に記載の微生物。
【請求項６】
トリアジン系化合物がメラミンまたはメラミン樹脂である請求項１〜５のいずれか１項に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、廃水処理等で難分解物質とされるトリアジン系化合物を分解資化する能力を有する新規な微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、塗料工場から排出される塗料廃水などの工場廃水、農業廃水などの有機物を多く含む廃水は、凝集分離処理や限外濾過などの物理的処理を行った後、活性汚泥法により好気性条件下で生物処理されるのが一般的である（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、通常の活性汚泥法では、微生物が有機物を分解する能力に限界があり、この手法では難分解性の有機物、例えばトリアジン系化合物などはそのまま処理水中に残存し、汚染物質として環境に残留する。
【０００３】
一般に、トリアジン系の化合物は、塗料、光重合開始剤、紫外線吸収剤、金属処理剤、コンクリート製品用減水剤などの工業製品に含まれており、また、農薬、除草剤、防藻剤、防黴剤などの農業用または一般家庭用品にも多く含まれている。しかし、トリアジン系の化合物は難分解性であるために、工場から排出される工場廃水、農業廃水、家庭廃水などの処理水中に残存し、さらに、使用された農薬や除草剤が土中に染み込むことにより地下水中にも残存し、汚染物質となって環境に残留したり拡散することが問題となっている。
【０００４】
また、トリアジン系化合物は、水中での安定性がかなり高く、２０℃でｐＨ５〜９の水溶液中では分解せず、内分泌攪乱作用があると言われており、人体への影響が心配されている。
【０００５】
トリアジン系化合物、特にメラミンやメラミン樹脂などのメラミン誘導体を分解処理する方法として、特許文献２には、メラミンの水溶液または懸濁液を嫌気性条件下でメラミナーゼ活性をもつ微生物又は酵素剤に接触させることによってメラミンを生物学的に減成する方法が開示されている。また、特許文献３及び特許文献４には、トリアジン系化合物を好気性条件下でシュウドモナス（Pseudomonas）属またはロドコッカス（Rhodococcus）属のある種の菌株に接触させることにより分解する方法が開示されている。さらに、特許文献５には、世界中で多用されているトリアジン系農薬をベータプロテオバクテリアに属する細菌及び／またはこれを含む複合微生物系を用いて分解する方法が開示されている。
【０００６】
【特許文献１】特開平６−５５１７２号公報
【特許文献２】特開昭５４−１６３８９２号公報
【特許文献３】特開昭５７−８６２９３号公報
【特許文献４】特開昭６０−１１４１９１号公報
【特許文献５】特開２００５−２７５３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、排水等の液体中に含まれるトリアジン系化合物、特にメラミンやメラミン樹脂などのメラミン誘導体の資化分解能を有する新規な微生物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、トリアジン系化合物を窒素源として増殖可能な微生物、すなわちトリア
ジン系化合物の資化分解能を有する微生物に着目し、種々スクリーニングを行い、今回、塗装排水処理リアクターから得られるトリアジン系化合物の１種であるメラミンを分解する菌群の中からメラミン分解能を持つ菌体を分離し、得られた菌体を同定したところ、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属及びファイロバクテリウム（Phyllobacterium）属の４つの属に属する微生物がメラミンを分解する優れた能力を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
かくして、本発明は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、オクロバクトラム（Ochrobactrum）属またはファイロバクテリウム（Phyllobacterium）属に属するトリアジン系化合物の分解資化能を有する微生物を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の微生物は、工場廃水、農業廃水、家庭廃水などの液体中に含まれるトリアジン系化合物を分解資化し得るものであり、環境保全の面から非常に有用である。
【００１１】
本明細書において、「トリアジン系化合物」は、トリアジン環を１分子中に少なくとも１個有する化合物であり、例えば、メラミン、メラミン樹脂、シアヌール酸、イソシアヌール酸、硫酸メラミン、ポリリン酸メラミン、アンメリン、メラム、硫酸メラム、ベンズグアナミン、アセトグアナミン、フタロジグアナミン、サクシノグアナミン、メラミンシアヌレート、メラミンフォスフェート、ピロリン酸メラミン、ブチレンジグアナミン、ノルボルネンジグアナミン、トリグアナミン、ベンゾグアナミン、アセトグアナミン、メチレンジメラミン、エチレンジメラミン、トリメチレンジメラミン、テトラメチレンジメラミン、ヘキサメチレンジメラミン、１，３−ヘキシレンジメラミン、トリス（β−シアノエチル）イソシアヌレート等が挙げられ、特にメラミン及びメラミン樹脂が好適である。ここで、メラミン樹脂とは、メラミンにアルデヒド、殊にホルムアルデヒド及び/又はアルコールを反応させることにより得られる樹脂を包含し、例えば、メチルエーテル化メラミン、エチルエーテル化メラミン、ブチルエーテル化メラミン等のアルキルエーテル化メラミンやメチロール化メラミンなどを挙げることができる。
【００１２】
以下、本発明のトリアジン系化合物の資化分解能を有する微生物の単離培養及び同定についてさらに詳細に説明する。
【００１３】
トリアジン系化合物の資化分解能を有する微生物の単離及び同定
本発明のトリアジン系化合物の資化分解能を有する微生物は、以下のようにしてスクリーニグすることにより得られたものである。
【００１４】
基本培地（組成：塩化ナトリウム  ５ｇ，リン酸水素二カリウム  １ｇ，リン酸二水素カリウム  １．１８ｇ，硫酸マグネシウム７水和物  ２００ｍｇ，塩化カリウム  ２．２３ｇ，メラミン  １００ｍｇ，蒸留水  １Ｌ）を作製し、それに、コハク酸５９０ｍｇ／Ｌ（培地１−１）、またはコハク酸５９０ｍｇ／Ｌ及びｎ−ブタノール５５５ｍｇ／Ｌ（培地１−２）、またはコハク酸５９０ｍｇ／Ｌ及びエチレングリコールモノブチルエーテル５９０ｍｇ／Ｌ（培地１−３）、またはコハク酸５９０ｍｇ／Ｌ及びグルコース９００ｍｇ／Ｌ（培地１−４）を炭素源として添加した４種の培地を調製し、孔径０.２０μｍのフィルターを用いて濾過滅菌した。
【００１５】
一方、塗料製造工場の廃水処理施設から採取したスラッジを上記４種の各培地１００ｍｌに対して接種し、次いで、２５℃、１５０ｒｐｍで振とう培養を行った。７日間培養後の各培地におけるメラミン濃度は図1に示すとおりであった。これらの培養においてメラ
ミンの減少が確認され、同時にアンモニア態窒素濃度の増加が確認された。この培養により、メラミンを分解する４種の菌群が得られた。各菌群をＭＤ−１、ＭＤ−２、ＭＤ−３、ＭＤ−４と称する。
【００１６】
上記方法によって得られたＭＤ−１、ＭＤ−２、ＭＤ−３、ＭＤ−４のメラミン分解性菌群を以下の方法で培養し、分解菌群からメラミン分解性菌株を単離した。
【００１７】
培地２（組成：肉エキス  ５ｇ，ペプトン  １０ｇ，塩化ナトリウム  ５ｇ，寒天  １５ｇ，蒸留水  １Ｌ）を作製し、この培地２に各分解菌群の培養液を塗布し、３０℃で２日間静置培養した。この培養で生育したコロニーを釣菌し、メラミンの分解性を有すると考えられる菌のコロニーを確認するための培地３（組成：塩化ナトリウム  ５ｇ，リン酸水素二カリウム  １ｇ，リン酸二水素カリウム  １．１８ｇ，硫酸マグネシウム７水和物
２００ｍｇ，塩化カリウム  ２．２３ｇ，メラミン  １００ｍｇ，寒天  １５ｇ，蒸留水  １Ｌ）に移植し、３０℃、７日間静置培養を行った。培養の結果、各分解菌群の中から両培地で生育可能な菌株の存在が確認され、それらの菌株を常法で単離した。
【００１８】
かくして単離されたメラミン分解性菌株を以下の方法により同定した。
【００１９】
上記の如くして単離されたメラミン分解性菌株の形態的性質、培地における生育の様相及び生理学的性質を通常の方法で評価した。培養は特記しない限り３０℃で実施した。生育した菌株の形態的性質、培地における生育の様相及び生理学的性質から４種の菌株の存在が確認された。これら４種の菌株の菌学的性質を下記表１〜表４に示す。また、これら４種の菌株の１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の分析をエヌシーアイエムビー・ジャパン社に依頼し、１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定した。これら４種の菌株の１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の両端のＰＣＲ用プライマ―配列を除いた約１５００塩基の部分の塩基配列を配列表の配列番号１〜４に示す。さらに、近隣結合法（ＮＪ法）により系統樹を作成し、比較したところ、４種の菌株は、Agrobacterium属、Microbacterium属、Ochrobacterium属及びPhyllobacterium属に分類される菌であると推定された。
【００２０】
上記の４種の菌株の形態的性質、培地における生育の様相、生理学的性質及び１６Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列の結果を総合的に解析すると、Agrobacterium属の微生物はアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の菌株であり、Microbacterium属の微生物はミクロバクテリウム sp.（Microbacterium sp.）の菌株であり、Ochrobacterium属の微生物はオクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）の菌株であり、そしてPhyllobacterium属の微生物はファイロバクテリウム・ミルシナセアラム（Phyllobacterium myrsinacearum）の菌株であると同定された。これらの菌株は、それぞれ、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＭＤ５−ＹＭＴＫ、ミクロバクテリウム sp.（Microbacterium sp.）ＭＤ７−ＭＮＴＹ、オクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）ＭＤ１−ＭＴＪＹ及びファイロバクテリウム・ミルシラセアラム（Phyllobacterium myrsinacearum）ＭＤ６−ＪＫＲＨとして、International  Patent  Organism  Depository，National  Institute  of
Advanced  Industrial  Science  and  Technologyに、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７１９、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７２１、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７１８及びＦＥＲＭ  Ｐ−２０７２０として平成１７年１１月２４日に受託（原寄託）され、そして平成１８年１０月２３日に、BUDAPEST  TREATY  ON  THE  INTERNATIONAL  RECOGNITION  OF  THE  DEPOSIT  OF  MICROORGANISMS  FOR  THE  PURPOSES  OF  PATENT  PROCEDUREに基き、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０９、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１１、ＦＥＲＭ
ＢＰ−１０７０８及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１０として国際寄託に移管された。
【００２１】
【表１】
2007282631.tif 000002
【００２２】
【表２】
2007282631.tif 000003
【００２３】
【表３】
2007282631.tif 000004
【００２４】
【表４】
2007282631.tif 000005
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００２６】
なお、実施例で使用する培地３の組成は、塩化ナトリウム  ５ｇ，リン酸水素二カリウム  １ｇ，リン酸二水素カリウム  １．１８ｇ，硫酸マグネシウム７水和物  ２００ｍｇ，塩化カリウム  ２．２３ｇ，メラミン  １００ｍｇ，寒天  １５ｇ，蒸留水  １Ｌであり、基本培地の組成は、塩化ナトリウム  ５ｇ，リン酸水素二カリウム  １ｇ，リン酸二
水素カリウム  １．１８ｇ，硫酸マグネシウム７水和物  ２００ｍｇ，塩化カリウム  ２．２３ｇ，メラミン  １００ｍｇ，蒸留水  １Ｌである。
【００２７】
実施例１：シアヌ−ル酸の分解性
シアヌール酸１００ｍｇを配合した培地３（以下、培地３−１という）を調製し、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＭＤ５−ＹＭＴＫ
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０９、ミクロバクテリウム sp.（Microbacterium sp.）ＭＤ７−ＭＮＴＹ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１１、オクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）ＭＤ１−ＭＴＪＹ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０８及びファイロバクテリウム・ミルシラセアラム（Phyllobacterium myrsinacearum）ＭＤ６−ＪＫＲＨ  ＦＥＲＭ
ＢＰ−１０７１０の４種の各菌株を植菌し、３０℃、７日間静置培養を行った。各菌株の培養の結果、培地３−１にコロニーが確認された。
【００２８】
この結果、上記４種の菌株はいずれもトリアジン環分解活性を有することが確認された。
【００２９】
実施例２：メラミン樹脂の分解性
メラミン樹脂（サイメル３２５、サイテックインダストリー（株）製、メチルエーテル化メラミン樹脂、固形分８０％）１００ｍｇを配合した培地３（以下、培地３−２という）を調製し、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＭＤ５−ＹＭＴＫ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０９、ミクロバクテリウム sp.（Microbacterium sp.）ＭＤ７−ＭＮＴＹ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１１、オクロバクトラム・アンスロピ（Ochrobactrum anthropi）ＭＤ１−ＭＴＪＹ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０８及びファイロバクテリウム・ミルシラセアラム（Phyllobacterium myrsinacearum）ＭＤ６−ＪＫＲＨ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１０の４種の各菌株を植菌し、３０℃、７日間静置培養を行った。各菌株の培養の結果、培地３−２にコロニーが確認された。
【００３０】
この結果、上記４種の菌株はいずれもトリアジン環分解活性を有することが確認された。
【００３１】
実施例３
前述の分解菌群ＭＤ−１、ＭＤ−２、ＭＤ−３及びＭＤ−４をそれぞれ遠心分離した（４℃で１０分間、１００００ｒｐｍ）。このようにして得られた菌ペーストを基本培地で洗浄し、再度遠心分離した（４℃で１０分間、１００００ｒｐｍ）。遠心分離後の上清液をとりだし、孔径０.２０μｍのフィルターで濾過して、上清液から完全に細胞を取り除いた濾液を得た。このようにして得られた菌ペースト及び濾液を基本培地に懸濁し、２５℃、１５０ｒｐｍで振とう培養し、メラミン濃度の経日変化を追跡した。その結果を下記表５に示す。
【００３２】
【表５】
2007282631.tif 000006
【００３３】
この結果、菌のメラミン分解活性は細胞外の酵素によるものではなく、細胞内の酵素により発現されることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ＭＤ−１、ＭＤ−２、ＭＤ−３、ＭＤ−４培養系におけるメラミン分解性を示すグラフである。
【図１】
2007282631.tif 000007
【配列表】
2007282631000001.app