(57)【要約】【課題】薬物透過性スクリーニングの前に予め調製し保存しておくことができる、ＰＡＭＰＡ用の安定なプレコートフィルタ膜を提供すること。【解決手段】本発明では、一般に疎水性の液体を多孔膜の細孔内に分散させるステップと、その液体を含有する多孔膜の少なくとも第１の表面上に、脂質を含む溶液を塗布するステップとを含む、フィルタ膜の調製方法が提供される。有利なことに、本発明によって、性能が劣化せずに長期間保存できるフィルタ膜を調製することが可能になる。本発明は、様々なコンテキストで利用可能であり得るが、透過性スクリーニング、特にＰａｒａｌｌｅｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（ＰＡＭＰＡ）用のフィルタ膜を調製するのによく適している。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般に疎水性の液体を、多孔膜の細孔内に分散させるステップと、
脂質を含む溶液を、前記液体を含む多孔膜の第１の表面上に塗布するステップと
を含むことを特徴とする、フィルタ膜の調製方法。
【請求項２】
前記塗布された溶液を揮発させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脂質を含む前記多孔膜の、前記第１の表面から離隔された第２の表面上に、脂質を含む溶液を塗布するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１および第２の表面は実質上平行であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記多孔膜はフィルタプレートの穴の開端全体に広がることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記脂質は生体膜の両親媒性構成成分であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記脂質はリン脂質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記脂質は血液脳関門の成分であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記溶液は生体膜の非脂質成分を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記液体は実質的に不揮発性のアルカンを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記液体はヘキサデカンを含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アルカンは１２個より多い炭素原子の鎖を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記溶液は、前記脂質がそれに少なくとも部分的に溶解する溶媒を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶媒は揮発性であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶媒はヘキサンを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶媒はペンタンを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶媒は、６個以下の炭素原子の鎖を有するアルカンを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶媒はアルコールを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記多孔膜はＰＶＤＦを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記多孔膜はポリカーボネートを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記多孔膜内に分散される前記液体の体積は、前記多孔膜の細孔の総容積未満であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記液体を、以下のステップ、すなわち、
ベース液体を実質的に揮発性の溶媒で希釈することによって液体を形成するステップと、
前記液体を前記多孔膜に塗布するステップと、
前記溶媒を揮発可能にするステップと
を用いて多孔膜内に分散させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ベース液体の体積は、前記多孔膜の細孔の総容積未満であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１の方法に従って調製されることを特徴とする多孔膜。
【請求項２５】
開いた上端部および開いた底端部を有する複数の穴と、請求項１の方法に従って調製され、前記穴の前記開いた底端部全体に広がる多孔膜とを備えることを特徴とするフィルタプレート。
【請求項２６】
ポリプロピレンまたはポリスチレンから製造されることを特徴とする請求項２５に記載のフィルタプレート。
【請求項２７】
ポリプロピレンから製造されることを特徴とする請求項２５に記載のフィルタプレート。
【請求項２８】
前記多孔膜は、ＰＶＤＦまたはポリカーボネートを含むことを特徴とする請求項２５に記載のフィルタプレート。
【請求項２９】
少なくとも１種の化合物を含む第２の溶液を提供するステップと、
前記第２の溶液を、請求項１の方法に従って調製した多孔膜と接触させるステップと
を含むことを特徴とする、化合物のスクリーニング法。
【請求項３０】
前記第２の溶液は、ＰＢＳおよびメタノールの緩衝液を含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記緩衝液は、メタノールまたはアセトニトリル約１０％〜２０％を含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィルタ膜の調製方法に係るものであり、より詳細には、薬物透過性スクリーニング用のフィルタ膜の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物透過性スクリーニングは、薬物開発プロセスにおいて非常に重要な手段となっている。ＰＡＭＰＡ（Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）は、広く受け入れられている、高スループットの薬物透過性スクリーニング法となっている。
【０００３】
典型的なＰＡＭＰＡフォーマットでは、１対の多穴プレート（ｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓ）が使用される。すなわち、フィルタプレートおよびレシーバプレートである。フィルタプレートは開いた穴を含み、多孔性フィルタ膜がその各穴の底端部全体に広がっている。フィルタ膜は、一般に、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）またはポリカーボネート材料からなる。レシーバプレートは、閉じた底端部を有する典型的な多穴プレートである。
【０００４】
図１Ａを参照すると、ＰＡＭＰＡ用フィルタ膜を調製するために使用される従来の方法が示されている。この従来方法では、膜に脂質のアルカン溶液を含浸させる。例えば、２００３年１１月２７日公開の特許文献１に論じられているように、アルカン溶液は一般に、リン脂質（例えば、２％ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ））のドデカン溶液である。フィルタ膜を調製した後、分析される化合物を含む緩衝液を、レシーバプレートの各穴に配置する。分析される化合物を含まない緩衝液を、フィルタプレートの各穴に配置する。フィルタプレートをレシーバプレートの上に、フィルタ膜がレシーバプレートの各穴に配置された化合物の緩衝液と接触するように配置する。レシーバプレートおよびフィルタプレート両方の溶液の化合物濃度を分析して、フィルタ膜を通る化合物の拡散を観察する。
【０００５】
従来技術を使用する場合、脂質のアルカン溶液を含浸させたフィルタ膜が不安定であるため、ＰＡＭＰＡ用フィルタ膜の調製の後比較的すぐにスクリーニング実験を実施しなければならないことが判明している。例えば、図１Ｂを参照すると、新品の従来技術のフィルタ膜（調製の直後に使用する）および１日経過した従来技術のフィルタ膜（室温で保存する）を使用して、７種の異なる薬物化合物に関してＰＡＭＰＡによって測定した透過率が示されている。フィルタ膜に、リン脂質の２％ドデカン溶液を含浸させた。測定された透過率の顕著な変化が認められ、比較的短い時間（例えば、１日）の経過で信頼度がひどく低下した。一般に、透過率の測定結果は時間と共に上昇するが、このことは膜が劣化し、全ての化合物に対してより高い透過性をもつようになったことを示している。このため、従来技術を使用して調製したＰＡＭＰＡ用フィルタ膜は、試験の前に予め調製し保存しておくにはあまり適していない。測定は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用緩衝液として用いて実施した。
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開２００３／０２１９７１６号明細書
【特許文献２】米国特許第７，０６０，４２８号
【非特許文献１】Ruell, .I.A.; Avdeef, A.; Du, C.; Tsinman, K. "A Simple PAMPA Filter for Passively Absorbed Compounds", Poster, ACS National Meeting, Boston, August 2002
【非特許文献２】Avdeef, A.; Strafford, M.; Block, E.; Balogh, M.; Chambliss, W.; Khan, I. "Drug Absorption in vitro Model: Filter-Immobilized Artificial Membranes 2. Studies of the Permeability Properties of Lactones in piper Methysticum Forst", Eur..1 Pharm. Sci. Vol. 14, Page 271 (2001)
【非特許文献３】Liu H.; Sabus, C.; Carter, G. T.; Du, C.; Avdeef, A.; Tischler, M. "In Vitro Permeability of Poorly Aqueous Soluble Compounds Using Different Solubilizers in the PAMPA Assay with Liquid Chromatography / Mass Spectrometry Detection", Pharmaceutical Research, Vol. 20, Page 1820 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、当該技術分野では、薬物透過性スクリーニングの前に予め調製し保存しておくことができる、ＰＡＭＰＡ用の安定なプレコートフィルタ膜が必要とされている。
【０００８】
さらに、従来技術を使用した薬物候補の透過性スクリーニングには、一群の市販の化合物が、生物薬剤学的な分類体系（ＢＣＳ）で透過性の高い化合物として分類されるかどうかの予測が不正確であるという難問がある。これらの化合物の例には、カフェイン、アンチピリン、ケトプロフェン、メトプロロール、ナプロキセン、フェニトイン、チモロール、およびテオフィリンが含まれる。ＢＣＳでは、透過性の高い化合物を、ヒト経口吸収率が９０％を上回るものとして定義している。これらの化合物は全て、ヒト経口吸収率が９０％を上回っている。しかし、従来技術によって見出されるこれらの化合物のＰＡＭＰＡ透過率の値は低い。
【０００９】
したがって、当該技術分野においては、現在予測が不十分な化合物の透過性測定値の予測可能性を高める必要がある。
【００１０】
従来技術を使用した薬物候補の透過性スクリーニングにおける別の難問は、「粘着性」化合物、すなわちプレートのプラスチック表面に結合し、かつ／または人工膜内に捕捉される可能性が高い化合物から生じる。「粘着性」化合物は、質量保持率（プラスチック表面に結合する、かつ／またはフィルタ膜内に保持される結果、透過性の測定中に失われる化合物の総質量の割合）が高い。質量保持率が高い場合、信頼性のある定量的な透過性測定結果を得ることは難しい。
【００１１】
従来技術を使用した薬剤候補の透過性スクリーニングにおけるさらなる難問は、溶解度が小さい化合物から生じる。溶解度が小さい化合物は、その化合物のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）原液を、使用緩衝液（通常、ＰＢＳまたは他の水性懸濁液）で希釈する。これにより、懸濁液中のかかる化合物の濃度を測定することが困難となり、したがって、信頼性のある、定量的な透過性測定結果を得ることが困難となる。
【００１２】
したがって、当該技術分野では、「粘着性」化合物および溶解度が小さい化合物の透過性測定値を改善する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明では、一般に疎水性の液体を多孔膜の細孔内に分散させるステップと、その液体を含む多孔膜の少なくとも第１の表面上に、脂質を含む溶液を塗布するステップとを含む、フィルタ膜の調製方法が提供される。有利なことに、本発明によって、性能が劣化せずに長期間保存できるフィルタ膜を調製することが可能になる。本発明はまた、以下の利点を有する。すなわち、（１）試験データとヒト吸収率データの相関関係を改善し、したがって試験化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ透過性のより良好な予測を提供すること、（２）「粘着性」化合物の膜内での保持率を低減させ、したがって「粘着性」化合物の測定を改善すること、ならびに（３）ある種の有機溶媒を使用緩衝液に添加して、ある種の化合物の溶解度を高めるときに、膜がその完全性を保持し、したがって溶解度が小さい化合物の透過性を測定できる能力を改善することである。本発明は、様々なコンテキストで利用可能であり得るが、透過性スクリーニング、特にＰＡＭＰＡ用のフィルタ膜を調製するのによく適している。
【００１４】
本発明によって、生体膜の構造を模倣するフィルタ膜を調製することが可能になる。特に、疎水性の内部および親水性の表面を有する、本発明のフィルタ膜を調製することができる。
【００１５】
本発明のこれらの態様および他の態様は、以下の詳細な説明および添付の図を検討することによって、よりよく理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
図２および３を参照すると、フィルタ膜を調製する方法１０が示されている。当該技術分野の技術者には理解されるように、得られるフィルタ膜は、様々な関連先で利用可能であり得るが、透過性スクリーニング、特にＰＡＭＰＡ用によく適している。
【００１７】
第１のステップ１２では、離隔した第１および第２の表面１６および１８を有する多孔膜１４が提供される。多孔膜１４は、その所望の用途に適合する（例えば、以下に記載の液体および溶液、ならびにスクリーニングすべき化合物と相溶性がある）いかなる材料からも形成することができる。非限定的な例として、多孔膜１４は、ＰＶＤＦまたはポリカーボネート材料から形成することができる。さらに、多孔膜１４は、０．４５〜３．０μｍの範囲の細孔を有し、厚さ１０〜１５０μｍの範囲であることが好ましい。多孔膜１４は、一般に一定の厚さで形成することができ、表面１６および１８は、実質上平行である。多孔膜１４内の細孔は、様々な幾何形状および配置をとることができる。以下にさらに記載するように、多孔膜１４は、フィルタプレートなどのサンプリング装置に固定することができる。
【００１８】
方法１０の第２のステップ２０では、一般に疎水性のサポート用液体２２を、多孔膜１４の細孔内に分散させる。周知の任意の技術を使用して、サポート用液体２２を細孔内に分散させることができる。好ましくは、サポート用液体２２は一般に親油性である。サポート用液体２２は、好ましくはヘキサデカン（Ｃ１６Ｈ３４）など、炭素原子が１２個より多い炭素鎖を有するアルカンである。他の一般に疎水性の液体（例えば様々な油）を使用することもできる。サポート用液体２２は、好ましくは実質的に不揮発性である。
【００１９】
好ましくは、ある溶媒を希釈剤として使用して、サポート用液体２２を多孔膜１４の細孔内に分散させる。この技術を用いる場合、サポート用液体２２を溶媒で希釈し、次いで多孔膜１４に塗布することが好ましい。あるいは、サポート用液体２２を希釈せずに（すなわち、溶液状態ではない）直接塗布することもできる。この溶媒は、サポート用液体２２を少なくとも部分的に溶解するのに適する任意の種類のものでよい。この溶媒は揮発性であって、塗布後に急速に揮発できることが好ましい。さらに、この溶媒は、炭素原子、より好ましくは６個以下の炭素原子の短鎖を有する、ペンタン（Ｃ５Ｈ１２）やヘキサン（Ｃ６Ｈ１４）などのアルカンであることが好ましい。アルコールも適切な溶媒である。例えば、サポート用液体２２をヘキサデカンとし、ヘキサンを希釈剤として使用し、ヘキサン中１０％〜５０％ヘキサデカンとして塗布することができる。
【００２０】
図３に示されるように、さらに、サポート用液体２２の塗布量は、多孔膜１４の細孔の総容積未満とする（すなわち、塗布されるサポート用液体２２が、多孔膜１４の全ての細孔を満たし切らない）ことが好ましい。サポート用液体２２を溶液状態で塗布する場合、その溶液は多孔膜１４の細孔の総容積を上回る量でよく、その場合、溶媒が揮発すると、多孔膜１４の細孔の総容積未満の量のサポート用液体２２が残る。サポート用液体２２は、望むならば、多孔膜１４の細孔の総容積と等しいか、それを上回る量などその他の量を塗布することもできる。生体膜は、一般に厚さ約１０ｎｍであり、主として脂質からなる。多孔膜１４の非脂質成分の量を低減する（すなわち、サポート用液体２２の量を低減する）と、生体膜のより良好なモデルになると考えられる。
【００２１】
図２および３でさらに示されるように、方法１０の第３のステップ２４では、溶液２６を多孔膜１４の第１の表面１６に塗布する。溶液２６は、溶媒および脂質を含む。この脂質は、リン脂質など、生体膜の両親媒性構成成分であることが好ましい。この脂質はまた、その内容が参照により本明細書に組み込まれる特許文献２に開示されているように、血液脳関門から抽出される脂質（例えば、脳の極性脂質抽出物）でもよい。この溶媒は、脂質を少なくとも部分的に溶解するのに適する任意の種類のものでよい。この溶媒は揮発性であって、塗布後に急速に揮発できることが好ましい。さらに、この溶媒は、炭素原子、より好ましくは６個以下の炭素原子の短鎖を有する、ペンタン（Ｃ５Ｈ１２）やヘキサン（Ｃ６Ｈ１４）などのアルカンであることが好ましい。アルコールも適切な溶媒である。溶液２６は、０．１％〜１０％範囲の濃度の脂質を含むことが好ましい。溶液２６はまた、生体膜の非脂質成分を含んでもよい。
【００２２】
溶液２６を塗布すると、溶媒が揮発して、多孔膜１４上に脂質層が残る。サポート用液体２２の塗布量に応じて、脂質層を、第１の表面１６の上方に、その上に、それと重ね合わせて、またはその下に形成することができる。図２を参照すると、脂質層は第１の表面１６の上方に示されている。図３を参照すると、脂質層は第１の表面１６の下（すなわち、多孔膜１４内）に示されている。脂質層の位置は、サポート用液体２２の塗布量に少なくともある程度依存する。
【００２３】
ステップ２４の後、図２および３のステップ２８によって示されるように、第２の溶液３０を、任意選択で多孔膜１４の第２の表面１８に塗布することができる。第２の溶液３０は、第２の表面１８に塗布することが好ましい。第２の溶液３０は、溶液２６に関して前述したのと同じように調製する。好ましくは、溶液２６および３０は同一の溶液であるが、異なる溶媒、非脂質成分、および／または脂質を溶液２６および３０に使用することもできる。第２の溶液３０が揮発すると、溶液２６に関して前述したのと同じように、脂質層が多孔膜１４上に形成される。
【００２４】
方法１０によって、完成したフィルタ膜３２が形成される（図４）。溶液２６および３０の両方を塗布すると、フィルタ膜３２は生体膜の構造を模倣したものになる。特に、フィルタ膜３２上の生成した脂質層によって親水性の表面が提供されるが、サポート用液体２２が存在するため、フィルタ膜３２の内部は疎水性となる。これは、細胞壁に類似する特徴的な構成である。
【００２５】
図４を参照すると、フィルタ膜３２は、サンプリング装置、好ましくはフィルタプレート３４と一緒に使用することができる。フィルタプレート３４は、周知の構成に従って形成され、開いた上端部３８および開いた底端部４０を有する１個または複数の穴３６を含む。１個または複数のフィルタ膜３２を、融着、ボンディング、機械的相互作用、およびそれらの組合せを含めた従来技術を用いて、開いた底端部４０全体に固定することができる。フィルタ膜３２の１つを、開いた底端部４０の１つに固定することが好ましい。好ましくは、上記の方法１０の最初の段階で、フィルタ膜３２をフィルタプレート３４に取り付ける（すなわち、ステップ１２中に、フィルタ膜３２を多孔膜１４として未処理の状態で取り付ける）。調製方法の後またはその最中にフィルタ膜３２をサンプリング装置に取り付けることもできるが、層形成の前に取付けを行うことにより、フィルタ膜３２の層の崩壊を最小限に抑えることが好ましい。フィルタ膜３２は、カラム、試験管、ピペットなどの様々なサンプリング装置と共に使用することができる。
【実施例】
【００２６】
例を挙げると、多孔膜１４を０．４５μｍの細孔寸法を有するＰＶＤＦ膜とし、最初（層形成の前）に多孔膜１４をフィルタプレート（例えば、９６穴フィルタプレート）の穴の開端に固定し、ヘキサデカンをサポート用液体２２とし（ヘキサンを希釈剤として使用し、ヘキサン中１０％〜５０％ヘキサデカンとしてヘキサデカンを塗布することができる）、ヘキサンを、リン脂質を含む溶液２６の溶媒とし（リン脂質１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬ溶液）、第２の溶液３０を使用し、溶液２６と同一のものとして、フィルタ膜３２を形成することができる。
【００２７】
図４を参照すると、透過性スクリーニングにおいてフィルタ膜３２を使用する例示的方法が図示されている。特に、ＰＡＭＰＡスクリーニングが示されている。フィルタプレート３４に加えて、レシーバプレート４２が提供され、レシーバプレート４２は、その中に形成された、底部が閉じた複数の穴４４を有する。好ましくは、穴４４の数および位置は、フィルタプレート３４の穴３６と一致する。スクリーニングされる化合物を含む緩衝液４６を、穴４４に配置する。緩衝液４８を、フィルタ膜３２の上方の穴３６に配置する。緩衝液４８は、スクリーニングされる化合物を含まない。図４に示すように、調製後、フィルタプレート３４をレシーバプレート４２上に、フィルタ膜３２がレシーバプレート４２の穴４４に配置された緩衝液４６と接触するように配置する。時間が経過すると、緩衝液４６からの化合物が、フィルタ膜３２を通り、緩衝液４８に移動する。緩衝液４６および４８の濃度を分析して、当該の化合物の透過性を評価する。
【００２８】
緩衝液４６、４８は、ＰＢＳ溶液およびメタノール溶液でよい。さらに、緩衝液４６、４８は、メタノールまたはアセトニトリル約１０％〜２０％と共にＰＢＳを含むこともできる。
【００２９】
従来のＰＡＭＰＡフォーマットでは、フィルタプレート３４およびレシーバプレート４２が結合されたとき、緩衝液４６がフィルタ膜３２と完全に接触するように、レシーバプレート４２の各穴ごとに２００〜３００μｌの緩衝液４６が必要となる。化合物の消費を低減するために、穴４４の底部を上げたレシーバプレートを使用し、それによって穴４４の容積を低減させることが可能となる。これによって、フィルタ膜３２と完全に接触させるのに必要な緩衝液４６の必要量が減少し、それによって化合物消費が低減するはずである。
【００３０】
図５〜９は、本発明に関する様々なデータを示している。図５〜９における「本発明の膜」との言及は、以下の詳細に従って形成される膜に関するものである。すなわち、底部が開いた穴３６を、それに取り付けられたＰＶＤＦ多孔膜１４と共に有する、９６穴フィルタプレート３４を使用し；ヘキサン中１０％ヘキサデカンの溶液１０μＬをＰＶＤＦ多孔膜１４上に配置することによって、ヘキサデカン１μＬのサポート用液体２２をＰＶＤＦ多孔膜１４の細孔内に分散させ；次いで、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）４ｍｇ／ｍＬを、エタノール０．４％、ヘキサン９９．６％に溶かした溶液の５μＬの脂質溶液２６を、ＰＶＤＦ多孔膜１４の一方の面上に配置し；次いで、フィルタプレート３４をひっくり返し、ＤＯＰＣ４ｍｇ／ｍＬを、エタノール０．４％、ヘキサン９９．６％に溶かした溶液の５μＬの溶液３０を、ＰＶＤＦ多孔膜１４の反対側の底部面上に配置し；コーティング後、フィルタプレート３４を−２０℃で保存した。
【００３１】
さらに、図５〜９のＰＡＭＰＡ測定は、ＰＢＳを緩衝液４８として使用して実施した（メタノール１０％、ＰＢＳ９０％を使用緩衝液４８として使用した図８に示すデータを除く）。化合物を含む緩衝液４６は、ＤＭＳＯ原液１０ｍＭを緩衝液４８で希釈することによって調製した（緩衝液４６の最終濃度は２００μＭであった）。化合物を含む緩衝液４６を、レシーバプレート４２の穴４４（３００μＬ／穴）に添加し、化合物を含まない緩衝液４８を、フィルタプレート３４の穴３６（２００μＬ／穴）に添加した。次いで、フィルタプレート３４をレシーバプレート４２と結合させ、そのアセンブリを、湿度チャンバ内で、室温で撹拌なしに５時間インキュベートした（アセンブリを、湿度チャンバ内で、撹拌なしに３７℃でインキュベートした図９に示すデータを除く）。インキュベーションの終了時に、プレート３４、４２を分離し、フィルタプレート３４およびレシーバプレート４２両方の各穴３６、４４からの溶液１５０μＬを、ＵＶ透過プレートに移した。ドナー穴およびアクセプタ穴両方の化合物の最終濃度を、ＵＶプレートリーダによって分析した。化合物の透過率を、以下にまとめた式を用いて算出した。
透過率（単位ｃｍ／ｓ）：
【００３２】
【数１】
2007118003.tif 000003
【００３３】
質量保持率：
Ｒ＝１−［ＣＤ（ｔ）＊ＶＤ＋ＣＡ（ｔ）＊ＶＡ］／（Ｃ０＊ＶＤ）
式中、
Ｃ０＝ドナー穴の最初の化合物濃度（ｍＭ）
ＣＤ（ｔ）＝ドナー穴の時間ｔの化合物濃度（ｍＭ）
ＣＡ（ｔ）＝アクセプタ穴の時間ｔの化合物濃度（ｍＭ）
ＶＤ＝ドナー穴容積＝０．３ｍＬ
ＶＡ＝アクセプタ穴容積＝０．２ｍＬ
Ｃｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｉｍ＝［ＣＤ（ｔ）＊ＶＤ＋ＣＡ（ｔ）＊ＶＡ］／（ＶＤ＋ＶＡ）
Ａ＝フィルタ面積＝０．３ｃｍ２
ｔ＝インキュベーション時間＝１８０００ｓ（＝５時間）
本発明の膜の安定性／再現性
【００３４】
図５を参照すると、１６種の異なる薬物化合物に関して本発明の膜を使用したＰＡＭＰＡスクリーニングの結果を示すグラフが図示されている。図５からわかるように、上記の方法を使用して、新規調製、５カ月経過、および６カ月経過のフィルタ膜の間で、再現可能な一貫した結果を得た。５カ月経過および６カ月経過のフィルタ膜は、使用前−２０℃で保存しておいた。本発明では、性能の実質的な劣化なしに、フィルタ膜を使用の前に予め製造し保存しておくことができる。
【００３５】
ＰＡＭＰＡの結果とヒト吸収率データの相関関係
図６は、３８種の化合物から得られた透過率データと、それらのヒト吸収率データとの相関関係を分析することによって、従来技術のＰＡＭＰＡ膜および本発明の膜の性能を比較したものである。従来技術のＰＡＭＰＡ用の膜の透過率データは、非特許文献１から得た。本発明の膜の透過率データは、上記の方法を使用して得た。両方の組の実験において、使用緩衝液をＰＢＳ、ｐＨ７．４とし、フィルタプレート／レシーバプレートのアセンブリを室温で撹拌なしにインキュベートした。類似の緩衝液およびインキュベーション条件を使用したので、従来技術の膜と本発明の膜の透過率データにおける著しい差は、従来技術の膜と本発明の膜の違いに起因するものである。従来技術のＰＡＭＰＡ用の膜を使用する場合には、ヒト吸収特性は高いが予測が不十分である一群の化合物（図６の丸い囲み）が存在する。驚くべきことに、これらの化合物は、本発明の膜を使用して正確に予測される。
【００３６】
生物薬剤学的分類体系（ＢＣＳ）では、透過性の高い化合物を、ヒト経口吸収率が９０％を上回るものとして定義している。表１および２は、図６のヒト吸収率の相関関係を分析するのに使用した化合物を列挙している。表１には、ＢＣＳ透過率の低い１２種の化合物と共に、従来技術のＰＡＭＰＡ用の膜について報告された、化合物のヒト吸収率データおよび透過率データ、および本発明の膜を用いて得られた、化合物のヒト吸収率データおよび透過率データを列挙している。両方のＰＡＭＰＡ用の膜（従来技術および本発明の膜）によって、１×１０−６ｃｍ／ｓ未満の透過率の値が得られ、したがってＢＣＳ透過性の低いものを正確に予測できるようになった。表２では、ＢＣＳ透過率の高い１６種の化合物と共に、従来技術のＰＡＭＰＡ用の膜について報告された、化合物のヒト吸収率データおよび透過率データ、および本発明の膜を用いて得られた、化合物のヒト吸収率データおよび透過率データを列挙している。従来技術のＰＡＭＰＡ用の膜は、この群の多くの化合物について１×１０−６ｃｍ／ｓ未満の透過率の値をもたらしたが、このことは、実際のヒト吸収率の予測可能性が不十分であることを示している。本発明の膜は、この群の全ての化合物について、実際のヒト吸収率により近い透過率の値をもたらしたが、このことは、予測可能性が顕著に改善されたことを示している。
【００３７】
【表１】
2007118003.tif 000004
【００３８】
【表２】
2007118003.tif 000005
【００３９】
質量保持率の改善
図７を参照すると、３種の「粘着性」化合物の質量保持率を示すグラフが図示されている。質量保持率は、プラスチック表面に結合する、かつ／またはフィルタ膜中に保持される結果、透過性の測定中に失われる化合物の総質量の割合として定義されている。列挙した、従来技術のＰＡＭＰＡ用の膜を使用した３種の化合物の質量保持率の値は、非特許文献２に報告されている。図７からわかるように、前述の詳細に従って形成され試験された本発明の膜を使用する場合、従来技術のＰＡＭＰＡ用の膜と比較して、化合物の質量保持率が低下する。このことは、従来技術の膜に比べて本発明の膜の溶媒の量が減少していることに起因する可能性が最も高い。従来技術の膜の過剰な溶媒は、「粘着性」化合物を捕捉するように作用している可能性があると考えられる。
【００４０】
従来のポリスチレンプレートの代わりにポリプロピレンプレートを使用すると、いくつかの「粘着性」化合物の質量保持率がさらに低下する。このことは、質量保持率の幾分かがポリスチレンの表面に粘着する化合物に起因していることを示唆している。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、ポリスチレンの表面に粘着する化合物がその一因となっている質量保持率を低下させるために、フィルタプレート３４および／またはレシーバプレート４２をポリプロピレンで製造する。ただし、代わりに従来のポリスチレンプレートを使用することもできる。
【００４１】
溶解度が小さい化合物のための使用緩衝液での有機溶媒の使用
図８を参照すると、ＰＢＳを使用緩衝液として使用したＰＡＭＰＡスクリーニングと、メタノール１０％、ＰＢＳ９０％を使用緩衝液として使用したＰＡＭＰＡスクリーニングの結果を比較したグラフが図示されている。使用したフィルタ膜は、前述の詳細に従って形成し試験した。図８からわかるように、全ての化合物の測定透過率は、メタノール１０％を用いると増加し、高透過性化合物の測定透過率の増加分は、低透過性化合物の測定透過率の増加分よりも大きい。このため、高透過性であるか低透過性であるかの予測は、当該の緩衝液に関しては変わらないままである（化合物を高透過性または低透過性にランク付けするには、主としてＰＡＭＰＡが使用される）。したがって、使用緩衝液にメタノール１０％を添加したとき、フィルタ膜はそれらの完全性を保持し、一貫した結果をもたらした。使用緩衝液にメタノール１０％を使用すると、溶解度が小さい多くの化合物の溶解度が顕著に増大することが判明した。例えば、共に溶解度が小さいミコナゾールおよびテルフェナジンの透過率は、従来技術のＰＡＭＰＡ法を使用して測定することが難しいと非特許文献３に報告されている。本発明のフィルタ膜を使用し、かつ使用緩衝液にメタノール１０％を使用する場合、ミコナゾールおよびテルフェナジンの透過性と共に、他の試験化合物も測定することができる。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、使用緩衝液にメタノール１０％を使用して透過性測定を実施する。
【００４２】
３７℃での透過性アッセイの実施
図９を参照すると、室温および３７℃で実施した、本発明の膜のＰＡＭＰＡスクリーニングの結果を比較したグラフが図示されている。使用したフィルタ膜は、前述の詳細に従って形成し試験した。図９からわかるように、３７℃でアッセイを実施するとき、リストした全ての化合物の透過率が増加し、高透過性化合物の測定透過率の増加分は、低透過性化合物の測定透過率の増加分よりも大きい。このため、高透過性であるか低透過性であるかの予測は、温度に関しては依然として変わることはない。３７℃でアッセイを実施するとき、フィルタ膜はそれらの完全性を保持し、一貫した結果をもたらした。３７℃を用いると、生理的温度での薬物輸送に関する情報がより多く得られることがある。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１Ａ】使用の直前に多孔膜にアルカン／脂質溶液を含浸させる従来技術の方法を示す流れ図である。
【図１Ｂ】図１Ａに示される従来方法により調製された未使用および１日経過の従来技術のフィルタ膜を使用して、７種の薬物化合物の透過性を測定した値を示すグラフである。測定は、ＰＢＳを使用緩衝液として用いて実施した。
【図２】本発明によるフィルタ膜の調製を示す流れ図である。図中の細孔の幾何形状は、単に例示的なものであり、多孔膜の細孔の実際の幾何形状を必ずしも反映するものではない。
【図３】本発明によるフィルタ膜の調製を示す流れ図である。図中の細孔の幾何形状は、単に例示的なものであり、多孔膜の細孔の実際の幾何形状を必ずしも反映するものではない。
【図４】本発明のフィルタ膜を使用するＰＡＭＰＡ実験を示す略図である。
【図５】未使用、５カ月経過、および６カ月経過の本発明のフィルタ膜を使用して、１６種の薬物化合物の透過性を測定した値を示すグラフである。５カ月経過および６カ月経過の本発明のフィルタ膜は、使用前−２０℃で保存した。
【図６】ヒト吸収率と試験データを比較するプロット、具体的には、本発明に従って調製したフィルタ膜および従来技術の方法に従って調製したフィルタ膜を使用して測定した、３８種の薬物化合物のＰＡＭＰＡ透過率の値をヒト吸収率と比較するプロットを含むグラフである。
【図７】本発明に従って調製したフィルタ膜を使用するＰＡＭＰＡの、３種の「粘着性」化合物の質量保持率を、従来技術に従って調製したフィルタ膜と比べて示すグラフである。
【図８】本発明のフィルタ膜を使用して、１６種の薬物化合物の透過性を測定した値を示すグラフである。ある群の測定は、ＰＢＳを使用緩衝液として用いて実施し、別の群の測定は、１０％メタノール、９０％ＰＢＳを使用緩衝液として用いて実施した。
【図９】本発明のフィルタ膜を使用して、１６種の薬物化合物の透過性を測定した値を示すグラフである。ある群の測定は、室温の湿度チャンバ内で実施し、別の群の測定は、３７℃の湿度チャンバ内で実施した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【外国語明細書】
2007118003000001.pdf