(57)【要約】【課題】  患者ごとのメトトレキサートの有効投与量を把握するための検査方法及び関節リウマチの治療方法の提供。【解決手段】  関節リウマチ患者ごとのメトトレキサートの有効投与量を判断するための、患者ごとのMTHFR遺伝子のA1298C多型の検査方法を得た。これによって、患者ごとにおける関節リウマチの治療方法を得た。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節リウマチ患者におけるメトトレキサートの有効投与量を判断するための検査方法であって、患者のメチレンテトラヒドロフォレート還元酵素（methylenetetrahydrofolate reductase：MTHFR）遺伝子のA1298C多型がA/A、A/C、C/Cの３つの型のいずれに該当するかを検査する方法。
【請求項２】
患者のメチレンテトラヒドロフォレート還元酵素（methylenetetrahydrofolate reductase：MTHFR）遺伝子のA1298C多型がA/A、A/C、C/Cの３つの型のいずれに該当するかを検査することにより、個人ごとのメトトレキサートの有効投与量を判断する方法。
【請求項３】
有効投与量が高い可能性が、CアレルのみからなるC/C遺伝子型は低く、A/C遺伝子型は中間で、AアレルのみからなるA/A遺伝子型を有する患者は高いと判断する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項３又は４に記載の方法を用い、個人ごとのメトトレキサートの投与量を決定する関節リウマチの治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチ患者における抗リウマチ薬メトトレキサートの有効投与量を判断する方法に関する。さらに、この方法を用い、個人ごとのメトトレキサートの投与量を決定する関節リウマチの治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メトトレキサートは関節リウマチの治療薬として最も多く処方される、効果的な薬物の一つである（例えば、非特許文献1参照）。メトトレキサートは痛みを一時的に抑えるだけでなく、関節リウマチによる関節破壊を抑制し、関節リウマチの生命予後も改善することが知られている（例えば、非特許文献2参照）。
【０００３】
しかし、メトトレキサートは個人ごとに関節リウマチを抑える必要用量が著しく異なる。例えば、ある患者は2mg/週の投与で十分効果があるが、別の患者は15mg/週の投与でも十分な効果が得られない。このような十分な効果が得られない患者には、副作用などを考慮しつつ、15mg/週を上限に、なるべく早く投与量を増やすことが必要であると考えられている（例えば、非特許文献1参照）。
従って、治療開始から十分な時間が経過した後の患者のメトトレキサートの使用量は個人のメトトレキサートの有効投与量を反映しており、メトトレキサートの効果を受けやすい患者は、最終的に投与量が低く、効果を受けにくい患者は、投与量が高いという傾向がある。しかし、患者ごとの有効投与量を事前に知ることは困難であった。
【０００４】
このような患者ごとのメトトレキサートの有効投与量について、近年、メチレンテトラヒドロフォレート還元酵素（methylenetetrahydrofolate reductase又は5,10-methylenetetrahydrofolate reductase、略語MTHFR、EC1.5.1.20）遺伝子との関係が示唆されている。
即ち、MTHFR遺伝子の第7エキソンに存在するA1298C多型（例えば、非特許文献4参照）が関節リウマチにおけるメトトレキサートの使用量と関係することが報告されている（例えば、非特許文献3参照）。ここでは関節リウマチの患者にメトトレキサートを投与し、少なくとも投与開始後3か月が経過した99人の患者について、メトトレキサートの最終投与量を調べたコホート研究が行われている。そして、これらの患者のMTHFR遺伝子のA1298C遺伝子型と、メトトレキサートの最終投与量の関係を調べた結果、68人のA/Aの遺伝子型の個体（第一群）の方が31人のそれ以外の遺伝子型（A/C及びC/C、第二群）の個体より5 mgを超えて投与される割合が高く、その割合の比は1.78であった。即ち、A/Aの遺伝子型を持つ関節リウマチの患者は5mg/週を超えるメトトレキサートを最終的に投与される確率が、それ以外の遺伝子型の個体の1.78倍という結果が報告されている。
【０００５】
しかし、この文献ではA/Aの遺伝子型を持つ患者は、メトトレキサートの投与量が高くなる傾向があるとの報告はされているものの、A/C又はC/Cのそれぞれの遺伝子型とメトトレキサートの投与量との関係については検討がなされていない。従って、関節リウマチの治療において、患者ごとのメトトレキサートの有効投与量を事前に把握し、投与量を決定できるような、精度の高い判断方法は存在しなかった。
【非特許文献１】American College of Rheumatology Subcommittee on Rheumatoid Arthritis  Guidelines. Guidelines for the management of rheumatoid arthritis: 2002 Update. Arthritis Rheum. 2002;46(2):328-46.
【非特許文献２】Choi HK, Hernan MA, Seeger JD, Robins JM, Wolfe F.  Methotrexate and mortality in patients with rheumatoid arthritis: a prospective study. Lancet. 2002; 359(9313):1173-7
【非特許文献３】Urano W, Taniguchi A, Yamanaka H, Tanaka E, Nakajima H, Matsuda Y, Akama H, Kitamura Y, Kamatani N. Polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene were associated with both the efficacy and the toxicity of methotrexate used for the treatment of rheumatoid arthritis, as evidenced by single locus and haplotype analyses.Pharmacogenetics. 2002;12(3):183-90.
【非特許文献４】van der Put NM, Gabreels F, Stevens EM, Smeitink JA, Trijbels FJ, Eskes TK, van den Heuvel LP, Blom HJ. A second common mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene: an additional risk factor for neural-tube defects Am J Hum Genet. 1998;62(5):1044-51.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、関節リウマチの治療において、患者ごとのメトトレキサートの有効投与量を把握するための検査方法の提供を課題とする。さらに、個人ごとのメトトレキサートの投与量を決定する関節リウマチの治療方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、関節リウマチ患者の各個人におけるMTHFR遺伝子のA1298C多型を検査することで、患者ごとのメトトレキサートの有効投与量が判断できることを見出した。特に、3つの遺伝子型のいずれに該当するかを検査することにより、CアレルのみからなるC/C遺伝子型の患者は有効投与量が高い可能性が低く、A/Cの患者はその中間で、AアレルのみからなるA/Aの遺伝子型の患者は高いと判断できることを見出した。これによって、関節リウマチの治療において、患者ごとのメトトレキサートの投与量を決定する方法を得ることができ、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は次の（１）〜（４）に関する。
（１）関節リウマチ患者におけるメトトレキサートの有効投与量を判断するための検査方法であって、患者のMTHFR遺伝子のA1298C多型がA/A、A/C、C/Cの３つの型のいずれに該当するかを検査する方法。
（２）患者のMTHFR遺伝子のA1298C多型がA/A、A/C、C/Cの３つの型のいずれに該当するかを検査することにより、個人ごとのメトトレキサートの有効投与量を判断する方法。
（３）有効投与量が高い可能性が、CアレルのみからなるC/C遺伝子型は低く、A/C遺伝子型は中間で、AアレルのみからなるA/A遺伝子型を有する患者は高いと判断する上記（２）に記載の方法。
（４）上記（３）又は（４）に記載の方法を用い、個人ごとのメトトレキサートの投与量を決定する関節リウマチの治療方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の判断方法を臨床検査等に利用することにより、治療における投与開始の投与量や、効果が十分でない場合の投与量の増やし方を患者ごとに決めることができる。この方法により、メトトレキサートの過剰な投与を防止し、患者の身体への負担や治療費の削減が可能となる。またこの方法により、関節リウマチ患者を、患者ごとにより早く有効投与量による治療へ導くことが出来、関節リウマチの進展を防止できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の「関節リウマチ患者」とは、医師によって関節リウマチと診断された患者であって、メトトレキサートを治療薬として利用する患者のことをいう。関節リウマチ患者等のいずれの関節リウマチ患者も含む。
【００１１】
本発明の「メトトレキサートの有効投与量」とは、関節リウマチ患者個人において、メトトレキサートが効果を示す用量のことをいう。メトトレキサートの効果とは、メトトレキサートの投与によって、患者個人における関節の疼痛、腫脹等の症状が緩和されたことで判断される。
一般的な治療において、メトトレキサートは2 mg/週の投与が行われる。しかし、十分な効果が得られない患者については、6mg/週以上の投与が行われる。このことから、本発明におけるメトトレキサートの有効投与量として、6mg/週未満の投与を低投与量、6mg/週以上の投与を高投与量とした。
【００１２】
なお、メトトレキサートの錠剤として、一般的に2mg、2.5mgの錠剤が用いられており、本発明の実施例においては２mgの錠剤を用いたことから、低投与量と高投与量の判断の基準を6mgとした。一方、非特許文献３に見られるように、2.5mgの錠剤を用いた場合は5mgを基準としており、使用する錠剤によって異なる。
【００１３】
本発明の「メトトレキサートの有効投与量を判断するための検査方法」とは、患者個人におけるメトトレキサートの有効投与量が低投与量又は高投与量のいずれに該当するかを検査する方法のことをいう。
本発明においては、患者個人のMTHFR遺伝子のA1298C多型がA/A、A/C、C/Cの３つの型のいずれに該当するかを検査することで、患者個人が有する遺伝子型に応じて、低投与量又は高投与量のいずれかに該当する可能性を判断することができる。本発明の有効投与量が高投与量である可能性は、MTHFR遺伝子のA1298C多型がCアレルのみからなるC/C遺伝子型の患者は高く、A/C遺伝子型の患者はその中間で、Aアレルのみを有するA/A遺伝子型の患者は高いと判断する。
個人の遺伝子型は一生変わらないので、一度検査すればその人には一生涯有効である。従って、本発明の方法によって、遺伝子型が調べられた患者については一生涯、その情報をもって、メトトレキサートの有効投与量を判断することができる。
【００１４】
なお、メトトレキサートの作用機序は葉酸低下によると考えられているが、非特許文献４より抜粋した下記表１によれば、A/A>A/C>C/Cの順でMTHFRの酵素活性が低いが血清中の葉酸濃度には違いが無いことが報告されている。
【００１５】
【表１】
2007074927.tif 000002
【００１６】
このように遺伝子型による酵素活性の低下は示されているものの、葉酸濃度の低下は示されておらず、A1298Cの遺伝子多型とメトトレキサートの有効投与量とに関係があるとは到底想定できない。例えば、MTHFRのC677Tの多型の遺伝子型によって、MTHFR酵素活性はA1298Cの場合よりさらに大きな違いがあり、かつ、この多型は葉酸濃度の違いにも関係していることが示されているが（非特許文献４）、C677Tの遺伝子型とメトトレキサートの有効投与量には関係が見られないのである（非特許文献３のTable5）。このように、酵素活性、物質の濃度及び薬物の有効性の関連性には大きな隔たりがあり、実際に患者にその薬物を投与した結果から判断しないと意味が無いことは医学上の常識である。例えば、最近の医学の判断の正当性はエビデンスに基づいた医学（Evidence-based medicine, EBM）に基づくことは世界の医学の常識である。EBMにおいては実際に人間に薬物を投与して得られた結果しか採用されず、単に患者の酵素や物質濃度のみを医療行為の判断材料とすることは大きな問題があると考えられている。従って、A1298C多型によりMTHFRの酵素活性に違いがあるとしても、そのことが直ちにメトトレキサートの有効用量に関係していると推測することは正当な科学的推測とはいえないのである。
【００１７】
本発明の「MTHFR遺伝子のA1298C多型がA/A、A/C、C/Cの３つの型のいずれに該当するかを検査する方法」とは、患者個人のMTHFR遺伝子の第7エキソンに存在するA1298C遺伝子型を正確に調べることができる方法であれば、いずれも用いることができる。例えば、DNAシークエンサーや、polymerase-chain reaction - restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）法により調べることもできる。
PCR-RFLP法で調べる場合には、次のような方法で行うことができる。まず、患者個人から得られたDNAと配列表配列番号１及び配列願剛２に記載の配列を持った二つの合成DNAとを混合し、必要な化合物を保有する溶液を加えpolymerase-chain reaction（PCR）によりMTHFR遺伝子のA1298C多型を含む遺伝子領域を増幅する。そして、その増幅したDNAを制限酵素Fnu4Iで切断し、電気泳動で切断されたかの有無を調べる事によりA/A、A/C、C/Cのどの遺伝子型を持つかを知ることができる。
【００１８】
本発明の「個人ごとのメトトレキサートの投与量を決定する関節リウマチの治療方法」とは、本発明の検査方法を臨床検査等として利用することによって、患者ごとのメトトレキサートの投与量を判断し、治療における投与開始の投与量や、効果が十分でない場合の投与量の増やし方を決定することをいう。
【００１９】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２０】
＜対象＞
東京女子医科大学 (膠原病リウマチ痛風センター)に通院中である関節リウマチ患者157名(M/F=24/133)を対象とした。これらの患者は、非特許文献３で検討された患者とは全員異なる患者である。
これら157人の関節リウマチ患者についてMTHFR遺伝子のA1289Cの遺伝子型と12か月後のメトトレキサートの使用量を調べた。
【００２１】
＜ゲノムＤＮＡ増幅反応＞
各関節リウマチ患者の末梢血白血球よりゲノムDNAを抽出した。該ゲノムDNAより、MTHFR遺伝子のA1289Cを含むDNA領域をPCRにより増幅した。この増幅には、配列表配列番号１及び配列番号２に記載のプライマーを用いた。
DNA増幅反応は総量50μlの系で行い、5μlの10xPCR Buffer（Applied Biosystem, Japan）、0.5μl(=2.5U)のAmpliTaq Gold(Applied Biosystem, Japan)、5.0μlの8mM dNTP(200μM of each dNTP)、10pmoleのプライマー各々1μlずつ用いた(0.2μM of each primer)。PCRの条件は、95℃10分のdenatureに続いて95℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 60秒を合計34サイクル行い、最後に72℃、7分間final extensionを行った。
【００２２】
＜遺伝子型の決定＞
該PCRにより増幅した産物は、制限酵素Fnu4Iで切断し、切断の有無を電気泳動で調べることにより各患者における遺伝子型（A/A、A/C、C/C）を決定した。
【００２３】
＜統計学的処理＞
集団におけるアレル、遺伝子型の比較には統計解析のためフィッシャーの正確確率計算法、χ二乗検定を用い、統計ソフトはExcelを使用した。
【００２４】
＜MTHFR遺伝子のA1289Cの遺伝子型とメトトレキサートの有効投与量の関連の検討＞
関節リウマチ患者の全対象について、遺伝子型とメトトレキサートの有効投与量の関連を表２に示した。表における各セル中の人数を整数値で示した。
【００２５】
関節リウマチ患者の全対象について、MTHFRのA1298C多型の遺伝子型と投与量の関係を表２に示した。本実施例では、メトトレキサート投与開始から12か月後に投与量が6 mg/週を超えた場合を高投与量、それ以外を低投与量とし、MTHFRのA1298C多型の遺伝子型により個人をA/A、A/C、C/Cに分類して高投与量との関係をまとめた。図１及び表２に示すように、A/A>A/C>C/Cの遺伝子型の順番でメトトレキサートの高用量である割合が高かった。即ち、C/Cの遺伝子型Cアレルのみを有する場合に比較して、Aアレルを含む遺伝子型では急激に高投与量が必要であるリスク値が上がることが示された。A/Aの患者が高用量である可能性は49%であるのに比較して、A/Cの患者は28%、C/Cの患者は13%であった（表2と図1）。A/AとA/Cの間には1.7の違い（リスク比、P<0.05）、A/AとC/Cの間には3.8の違い（リスク比、P<0.05）があった。
【００２６】
【表２】
2007074927.tif 000003
【００２７】
［比較例］
＜MTHFR遺伝子のA1289Cの遺伝子型A/Aとそれ以外の区別とメトトレキサートの有効投与量の関連の検討＞
関節リウマチ患者の全対象について、A1289Cの遺伝子型A/Aとそれ以外（A/C及びC/C）とメトトレキサートの有効投与量の関連を表３に示した。表における各セル中の人数を整数値で示した。
【００２８】
関節リウマチ患者の全対象について、MTHFRのA1298C多型の遺伝子型A/Aとそれ以外（A/C及びC/C）と投与量の関係を表３及び図２に示した。本参考例では、メトトレキサート投与開始から12か月後に投与量が6 mg/週を超えた場合を高投与量、それ以外を低投与量とし、MTHFRのA1298C多型の遺伝子型がA/A、それ以外に分類して高投与量との関係をまとめた。
図２に示したように、A1298Cの遺伝子型がA/Aの個体の49％が高投与量であったのに比較して、A/C及びC/Cの個体のうち、高投与量であったのは26%であった。即ち、A/Aの遺伝子型の個体はそれ以外の個体より、6mgを超えてメトトレキサートを投与されている割合が1.87倍であった。6mg/週を超える投与量をリスクと考えれば、リスク比は1.87(95%信頼区間、1.14-3.06)であり、独立性を検定するピアソンのχ二乗検定によるとP<0.01であった。この結果は文献３のTable5の結果とほぼ同様であった。
【００２９】
【表３】
2007074927.tif 000004
【００３０】
図１と図２の比較において、A/Aの個体が高投与量になる確率は変わらないものの（49％）、A/Cの個体が高投与量になる確率は26%から28%に増え、C/Cの個体が高投与量になる確率は26%から13％に減ることが示された。即ち、C/Cの個体の人にとっては高投与量を必要とする確率が約半分となることが示された。従って、本発明によって初めて、CアレルのみからなるC/C遺伝子型の人のメトトレキサートの有効投与量は、低投与量となる確率がA/Cの場合より高いことが確認された。これによって、本発明の検査方法により、個体ごとの確率がより正確に判断できる遺伝子検査法を提供できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の検査方法や、治療方法を用いることにより、治療における投与開始の投与量や、効果が十分でない場合の投与量の増やし方を患者ごとに決めることができる。この方法により、メトトレキサートの過剰な投与を防止し、患者の身体への負担や治療費の削減が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】MTHFR遺伝子のA1298C多型の遺伝子型とメトトレキサートの12ヵ月後の採取投与量が6mg/週を超える個体の割合の関係を示した図である（実施例）。
【図２】MTHFR遺伝子のA1298C多型の遺伝子型とメトトレキサートの12ヵ月後の採取投与量が6mg/週を超える個体の割合の関係を示した図である（比較例）。
【図１】
2007074927.tif 000005
【図２】
2007074927.tif 000006
【配列表】
2007074927000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年1月11日(2006.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節リウマチ患者におけるメトトレキサートの有効投与量を判断するための検査方法    であって、患者のメチレンテトラヒドロフォレート還元酵素(methylenetetrahydrofo    late reductase：MTHFR）遺伝子のA1298C多型がA/A、A/C、C/Cの３つの型のいずれに    該当するかを検査する方法。
【請求項２】
患者のメチレンテトラヒドロフォレート還元酵素（methylenetetrahydrofolate red    uctase：MTHFR）遺伝子のA1298C多型がA/A、A/C、C/Cの３つの型のいずれに該当する    かを検査することにより、個人ごとのメトトレキサートの有効投与量を判断する方      法。
【請求項３】
有効投与量が高い可能性が、CアレルのみからなるC/C遺伝子型は低く、A/C遺伝子型    は中間で、AアレルのみからなるA/A遺伝子型を有する患者は高いと判断する請求項２    に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月6日(2006.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節リウマチ患者のメチレンテトラヒドロフォレート還元酵素（methylenetetrahydrofolate  reductase：ＭＴＨＦＲ）遺伝子のＡ１２９８Ｃ多型がＡ／Ａ、Ａ／Ｃ、Ｃ／Ｃの３つの型のいずれに該当するかを検査することにより、個人ごとのメトトレキサートの有効投与量を判断する方法であって、ＣアレルのみからなるＣ／Ｃ遺伝子型を有する患者の有効投与量が低く、Ａ／Ｃ遺伝子型は中間で、ＡアレルのみからなるＡ／Ａ遺伝子型を有する患者の有効投与量は高いと判断する方法。