(57)【要約】【課題】生体内で増殖可能な細胞と糖鎖プライマーを用いて、効率よくオリゴ糖鎖を合成する方法、並びにその方法に用いられる糖鎖合成細胞及び糖鎖合成キットを提供すること。【解決手段】まず、HL-60細胞等の培養細胞や固形癌由来の癌細胞等の生体から採取された細胞等の生体内（in vivo）で増殖可能な細胞を、宿主動物の皮下等の生体内で培養する。そして、生体内で培養した細胞を生体から取り出して培地に懸濁し、糖鎖合成細胞とする。この糖鎖合成細胞を懸濁した液に糖鎖プライマーを添加して、この細胞と糖鎖プライマーとを反応させ、オリゴ糖鎖を合成する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴ糖鎖を合成する方法であって、
生体内（in vivo）で増殖可能な細胞を前記生体内で培養し、
前記細胞を前記生体内から取り出し、
前記生体内から取り出した前記細胞に糖鎖プライマーを投与して、前記細胞と前記糖鎖プライマーとを反応させること、
を特徴とするオリゴ糖鎖合成方法。
【請求項２】
生体内から取り出した前記細胞を溶液に懸濁し、前記懸濁した細胞に前記糖鎖プライマーを投与することを特徴とする請求項１に記載の合成方法。
【請求項３】
生体内から取り出した前記細胞を培養器に付着させ、前記付着させた細胞に前記糖鎖プライマーを投与することを特徴とする請求項１に記載の合成方法。
【請求項４】
前記細胞が、培養細胞又は生体から採取された細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の合成方法。
【請求項５】
前記培養細胞が、株化ヒトリンパ球細胞であることを特徴とする請求４に記載の合成方法。
【請求項６】
前記培養細胞が、RPMI4788細胞またはCHO-K1細胞であることを特徴とする請求項４に記載の合成方法。
【請求項７】
前記生体内が皮下であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の合成方法。
【請求項８】
前記糖鎖プライマーが、ラクトシド型プライマー又はNアセチルグルコサミン型糖鎖プライマーであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の合成方法。
【請求項９】
前記オリゴ糖鎖が、ネオラクト系列の糖鎖又はグロボ系列の糖鎖であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の合成方法。
【請求項１０】
糖鎖プライマーを用いてオリゴ糖鎖を合成するための糖鎖合成細胞であって、
生体内（in vivo）で培養された、前記生体内で増殖可能な細胞であることを特徴とする糖鎖合成細胞。
【請求項１１】
前記細胞が浮遊細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の糖鎖合成細胞。
【請求項１２】
前記細胞が付着細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の糖鎖合成細胞。
【請求項１３】
前記細胞が、培養細胞又は生体から採取された細胞であることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれかに記載の糖鎖合成細胞。
【請求項１４】
前記培養細胞が、株化ヒトリンパ球細胞であることを特徴とする請求項１３に記載の糖鎖合成細胞。
【請求項１５】
前記培養細胞が、RPMI4788細胞またはCHO-K1細胞であることを特徴とする請求項１３に記載の糖鎖合成細胞。
【請求項１６】
前記生体内が皮下であることを特徴とする請求項１０〜１５のいずれかに記載の糖鎖合成細胞。
【請求項１７】
前記糖鎖プライマーが、ラクトシド型プライマー又はNアセチルグルコサミン型糖鎖プライマーであることを特徴とする請求項１０〜１６のいずれかに記載の糖鎖合成細胞。
【請求項１８】
前記オリゴ糖鎖が、ネオラクト系列の糖鎖又はグロボ系列の糖鎖であることを特徴とする請求項１０〜１７のいずれかに記載の糖鎖合成細胞。
【請求項１９】
糖鎖プライマーを用いてオリゴ糖鎖を合成するための糖鎖合成キットであって、
生体内（in vivo）で培養された、前記生体内で増殖可能な細胞を含むことを特徴とする糖鎖合成キット。
【請求項２０】
前記細胞が浮遊細胞であることを特徴とする請求項１９に記載の合成キット。
【請求項２１】
前記細胞が付着細胞であることを特徴とする請求項１９に記載の合成キット。
【請求項２２】
前記細胞が、培養細胞又は生体から採取された細胞であることを特徴とする請求項１９〜２１のいずれかに記載の糖鎖合成キット。
【請求項２３】
前記培養細胞が、株化ヒトリンパ球細胞であることを特徴とする請求項２２に記載の糖鎖合成キット。
【請求項２４】
前記培養細胞が、RPMI4788細胞またはCHO-K1細胞であることを特徴とする請求項２２に記載の糖鎖合成キット。
【請求項２５】
前記生体内が皮下であることを特徴とする請求項１９〜２４のいずれかに記載の糖鎖合成キット。
【請求項２６】
前記糖鎖プライマーをさらに含むことを特徴とする請求項１９〜２５のいずれかに記載の糖鎖合成キット。
【請求項２７】
前記糖鎖プライマーが、ラクトシド型プライマー又はNアセチルグルコサミン型糖鎖プライマーであることを特徴とする請求項１９〜２６のいずれかに記載の糖鎖合成キット。
【請求項２８】
前記オリゴ糖鎖が、ネオラクト系列の糖鎖又はグロボ系列の糖鎖であることを特徴とする請求項１９〜２７のいずれかに記載の糖鎖合成キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内で増殖可能な細胞と糖鎖プライマーを用いたオリゴ糖鎖の合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は、個体の発生、細胞分化、細胞増殖、アポトーシス、組織形成、免疫、血液型抗原、毒素やウイルスの受容体、癌化、疾病、細胞機能の発現、又は細胞間相互作用等の様々な場面において、シグナルやマーカー分子として重要な役目を果たしている。これより、バイオテクノロジーや医薬品開発の分野において、糖鎖の需要が高まっている。特に、オリゴ糖鎖は、医薬品、診断薬、糖鎖チップ等への応用が見込まれている。
【０００３】
近年、細胞の機能を利用してオリゴ糖鎖を作ることができる糖鎖プライマー（Saccharide Primer）が開発された。この糖鎖プライマーの開発によって、糖鎖プライマーと培養細胞さえ準備できれば、オリゴ糖鎖が得られるようになった（例えば、特許文献１〜５参照。）。
【特許文献１】特開２０００−２４７９９２
【特許文献２】特開２００３−２７４９９０
【特許文献３】特開２００３−２７４９９３
【特許文献４】特開２００３−２７４９８９
【特許文献５】特開２００５−１１７９１８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の事情を鑑みると、より効率よくオリゴ糖鎖を合成させる方法を開発することが期待される。
【０００５】
そこで、本発明は、生体内で増殖可能な細胞と糖鎖プライマーを用いて、効率よくオリゴ糖鎖を合成する方法、並びにその方法に用いられる糖鎖合成細胞及び糖鎖合成キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明にかかるオリゴ糖鎖合成方法は、オリゴ糖鎖を合成する方法であって、生体内（in vivo）で増殖可能な細胞を前記生体内で培養し、前記細胞を前記生体内から取り出し、前記生体内から取り出した前記細胞に糖鎖プライマーを投与して、前記細胞と前記糖鎖プライマーとを反応させることを特徴とする。ここで、生体内から取り出した前記細胞を溶液に懸濁し、前記懸濁した細胞に前記糖鎖プライマーを投与してもよく、生体内から取り出した前記細胞を培養器に付着させ、前記付着させた細胞に前記糖鎖プライマーを投与してもよい。前記細胞は、培養細胞又は生体から採取された細胞等が挙げられる。前記培養細胞は、株化ヒトリンパ球細胞、あるいはRPMI4788細胞またはCHO-K1細胞であることが好ましい。なお、前記株化ヒトリンパ球細胞としては、例えば、HL-60細胞、CCRF-CEM細胞、又はBALL-1細胞等が挙げられる。また、前記合成方法において、前記生体内は、皮下であることが好ましい。また、前記糖鎖プライマーは、ラクトシド型プライマー又はNアセチルグルコサミン型糖鎖プライマーであることが好ましい。なお、前記オリゴ糖鎖は、ネオラクト系列の糖鎖又はグロボ系列の糖鎖であってもよい。
【０００７】
また、本発明にかかる糖鎖合成細胞は、糖鎖プライマーを用いてオリゴ糖鎖を合成するための糖鎖合成細胞であって、生体内（in vivo）で培養された、前記生体内で増殖可能な細胞であることを特徴とする。ここで、前記細胞は、浮遊細胞であっても、付着細胞であってもよい。前記細胞は、培養細胞又は生体から採取された細胞等が挙げられる。前記培養細胞は、株化ヒトリンパ球細胞、あるいはRPMI4788細胞またはCHO-K1細胞であることが好ましい。なお、前記株化ヒトリンパ球細胞としては、例えば、HL-60細胞、CCRF-CEM細胞、又はBALL-1細胞等が挙げられる。また、前記糖鎖合成細胞において、前記生体内は、皮下であることが好ましい。また、前記糖鎖プライマーは、ラクトシド型プライマー又はNアセチルグルコサミン型糖鎖プライマーであることが好ましい。なお、前記オリゴ糖鎖は、ネオラクト系列の糖鎖又はグロボ系列の糖鎖であってもよい。
【０００８】
本発明にかかる糖鎖合成キットは、糖鎖プライマーを用いてオリゴ糖鎖を合成するための糖鎖合成キットであって、生体内（in vivo）で培養された、前記生体内で増殖可能な細胞を含むことを特徴とする。ここで、前記細胞は、浮遊細胞であっても、付着細胞であってもよい。前記細胞は、培養細胞又は生体から採取された細胞等が挙げられる。前記培養細胞は、株化ヒトリンパ球細胞、あるいはRPMI4788細胞またはCHO-K1細胞であることが好ましい。なお、前記株化ヒトリンパ球細胞としては、例えば、HL-60細胞、CCRF-CEM細胞、又はBALL-1細胞等が挙げられる。また、前記糖鎖合成キットにおいて、前記生体内は皮下であることが好ましい。なお、前記糖鎖合成キットは、前記糖鎖プライマーをさらに含んでいてもよい。また、前記糖鎖プライマーは、ラクトシド型プライマー又はNアセチルグルコサミン型糖鎖プライマーであることが好ましい。なお、前記オリゴ糖鎖は、ネオラクト系列の糖鎖又はグロボ系列の糖鎖であってもよい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、生体内で増殖可能な細胞と糖鎖プライマーを用いて、効率よくオリゴ糖鎖を合成する方法、並びにその方法に用いられる糖鎖合成細胞及び糖鎖合成キットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１１】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１２】
＝＝オリゴ糖鎖の合成＝＝
一般に、糖鎖生合成経路を有している糖鎖合成細胞に糖鎖プライマーを投与すると、この糖鎖プライマーが細胞中に入って細胞中の糖転移酵素と反応し、その結果、糖鎖の伸長が起きることが知られている。
【００１３】
以下の実施例に示す通り、ヒト培養リンパ球細胞を予め生体内（in vivo）で培養し、糖鎖合成細胞として糖鎖プライマーと反応させれば、効率よくオリゴ糖鎖を合成できる。
【００１４】
（１）糖鎖合成細胞
まず、細胞を生体内（in vivo）で培養する。ここで、生体内培養に用いる細胞は、生体内で増殖可能な細胞であればよく、例えば、培養細胞、又は生体から採取された細胞等が挙げられる。培養細胞は、初代培養細胞であっても、株化された培養細胞であってもよく、培養条件下で培養された細胞であればあらゆる細胞が含まれ、培養回数・培養時間・トランスファー回数などによって限定されることはない。株化された培養細胞としては、ヒトリンパ球細胞（例えば、HL60細胞、CCRF-CEM細胞、BALL-1細胞、A4/Fuk細胞、B104細胞、B104-R3細胞、HLCL-1細胞、PEER細胞、TK細胞、WIL2-NS細胞等）、マウスリンパ球細胞（例えば、SP2/O細胞等）等の、通常培養器に付着し難く、浮遊状態で培養される浮遊細胞や、ヒト大腸癌細胞（例えば、RPMI 4788細胞等）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（例えば、CHO-K1細胞等）等の、通常培養器に付着しやすく、付着状態で培養される付着細胞が挙げられる。細胞によっては、培養条件（培養器内面の表面加工や培地の種類等）によって、浮遊状態でも付着状態でも培養できる細胞があり、そのような細胞は、本明細書では付着細胞として取り扱う。また、生体から採取された細胞としては、増殖細胞であることが好ましく、癌細胞（固形腫瘍を含む）であることがより好ましい。
【００１５】
なお、HL60細胞及びCCRF-CEM細胞の各細胞株が有する糖鎖の生合成経路を考慮すると、HL60細胞を用いればネオラクト系列の糖鎖（H. Nojiri, F. Takaku, T. Tetsuka, K. Motoyoshi, Y. Miura, M. Saito, Blood, 64, 534-541(1984)）を、CCRF-CEM細胞を用いればグロボ系列の糖鎖（C.L.M. Stults, R.D. Larsen, B.A. Macher, Glycoconjugate J., 12, 680-689(1995)）を合成することができる。
【００１６】
ここで、生体内（in vivo）とは、ヒト以外の宿主動物（例えば、マウス、ハムスター、モルモット等）でこれらの細胞を生着させることができる部位であればどこでもよいが、細胞が分散しないような腹腔中や皮下であることが好ましい。なお、宿主動物にヒト由来細胞を移植する場合は、細胞が生体内で生着できるように、その動物に対して、移植前または移植後に、抗血清や免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、シクロスポリン、タクロリムス等）等を投与しておくことが望ましいが、宿主動物として、ヌードマウスやＳＣＩＤマウスのような、免疫不全動物を用いることもできる。
【００１７】
次に、移植した細胞を生体内から取り出して溶液に懸濁する。この際用いる溶液は、取り出した細胞を生きたまま懸濁できるものであれば何でもよく、例えば、RPMI 1640培地等の細胞培養用培地が挙げられる。この方法は、浮遊細胞にも付着細胞にも適用できる。また、付着細胞を用いる場合、移植した細胞を生体内から取り出して培養器に付着させてもよい。培養器は特に限定されず、例えばガラス製であってもプラスティック製であってもよく、内面が表面加工されていてもされていなくてもよい。培養条件によって培養器に付着する細胞に対しては、培養器に付着する培養条件を用いる必要がある。また、細胞を付着させるのは、培養器内部の底面であることが好ましい。  
こうして調整した細胞を糖鎖合成細胞として利用する。
【００１８】
（２）糖鎖プライマー
本発明のオリゴ糖鎖合成方法において用いられる糖鎖プライマーは、例えば、ラクトシド型プライマー（例えば、Lac-C12: 1-(n-dodecyl)-β-Lactoside）、N-アセチルグルコサミン型糖鎖プライマー（例えば、GlcNac-C12; 1-(n-dodecyl）-2-N-acetyl-β-Glucopyranoside)、N-アセチルガラクトサミン型糖鎖プライマー、マンノース型糖鎖プライマー、キシロース型糖鎖プライマー、又はグルコース型糖鎖プライマー等が挙げられる。これらの糖鎖プライマーは、市販のものであっても、当業者に公知の方法で化学合成されたものでもよい。
【００１９】
（３）オリゴ糖鎖合成反応
前述の通り、in vivoで培養した細胞にこれらの糖鎖プライマーを投与すれば、この細胞と糖鎖プライマーとが反応し、その結果、オリゴ糖鎖を得ることができる。具体的には、まず、in vivoで培養した上述の細胞の懸濁液または細胞を培養器に付着させた培地に、糖鎖プライマーを添加し、37℃で1〜5日間培養する。このような培養を行うと、糖鎖プライマーが細胞に取り込まれ、その糖鎖プライマーに糖が付加され、多様なオリゴ糖鎖が培養液中に産生される。そして、この培養液から、濃縮、分離、抽出等を行うことによって、オリゴ糖鎖を精製することができる。なお、懸濁液に添加すべき糖鎖プライマーは、懸濁液に対して10μM〜100μMの濃度であることが好ましく、約50μMの濃度であることが最も好ましい。
【００２０】
＝＝糖鎖合成キット＝＝
上記糖鎖合成方法を用いる際、糖鎖合成細胞や、好ましくは糖鎖プライマーを、オリゴ糖鎖を合成するための糖鎖合成キットとすることにより、容易に効率よく糖鎖を合成できるようになる。そこで、糖鎖合成細胞として生体内（in vivo）で培養された、生体内で増殖可能な細胞を含むキットを本発明の糖鎖合成キットとするが、このキットは、さらに糖鎖プライマーを含んでいることがより好ましい。なお、このキットに含まれる生体内で増殖可能な細胞及び糖鎖プライマーは、「オリゴ糖鎖の合成」で記載した細胞やプライマーと同様に選択できる。また、上記オリゴ糖鎖合成方法に用いられる緩衝液や培養液などをキットに含ませてもよい。
【００２１】
＝＝合成されたオリゴ糖鎖の有用性＝＝
本発明の方法によって合成されたオリゴ糖鎖は、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、実験・研究器具（例えば、糖鎖チップ）、バイオテクノロジー研究試薬等に用いることができる。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例を用いて、以上に説明した実施態様を具体的に説明するが、これは例示であって、本発明をこの実施例に限定するものではない。
【００２３】
本実施例では、オリゴ糖鎖の合成能を比較するために、2種の糖鎖プライマー（Lac-C12及びGlcNAc-C12）と、3種の株化されたヒト由来のリンパ球細胞（「株化ヒトリンパ球細胞」ともいう）（BALL-1細胞、HL-60細胞及びCCRF-CEM細胞）、株化されたヒト由来の大腸癌細胞（RPMI4788細胞）及び株化されたチャイニーズハムスター由来の卵巣細胞(CHO-K1細胞)と、2種の培養方法（in vitro及びin vivo）を組み合わせて、以下の実験を行った。なお、BALL-1細胞、HL-60細胞、CCRF-CEM細胞、RPMI4788細胞、及びCHO-K1細胞はジャパニーズ・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリソーシス（JCRB）から入手した。
【００２４】
＝＝培養細胞の調製＝＝
１.生体外（in vitro）で培養した細胞の調製
まず、生体外（in vitro）で、BALL-1細胞、HL-60細胞、CCRF-CEM細胞、RPMI4788細胞、及びCHO-K1細胞を培養した。具体的には、牛胎児血清を10v/v％を添加したRPMI 1640培地（pH7.2）に、株化されたヒト由来の各リンパ球細胞、RPMI4788細胞、及びCHO-K1細胞をそれぞれ播種（1×105個/ml〜2×105個/ml）し、常法に従って37℃で培養した。次いで、株化されたヒト由来の各リンパ球細胞については、血清無添加のRPMI 1640培地（pH7.2、フェノールレッド不含、カナマイシン60μg/ml、ゲンタマイシン2.5μg/ml、セフチゾキシム20μg/mlを含む）でこれら各細胞を洗浄した。一方、RPMI4788細胞及びCHO-K1細胞については、コラゲナーゼ含有生理食塩水でこれら各細胞を分散させ、分取した。次いで、上記血清無添加のRPMI 1640培地でこれら各細胞を洗浄した。最後に、細胞濃度が3×106個/mlになるように、これら各細胞を上記血清無添加のRPMI 1640培地に懸濁した。
【００２５】
２.生体内（in vivo）で増殖させた細胞の調製
株化されたヒト由来のリンパ球細胞を生体内（in vivo）で増殖させるために、以下の実験を行った。
【００２６】
まず、0日齢の（性別区別無し）新生仔ハムスター（ゴールデン、株式会社ドーケン）に、12週齢の（性別区別無し）ウサギ（ニュージーランドホワイト、日本チャールズリバー株式会社）から公知の方法で調製した抗血清を予め注射（0.1ml/匹）し、ハムスターの免疫応答を低下させた。その後、これらのハムスターの皮下に株化された各種細胞（BALL-1細胞、HL-60細胞、CCRF-CEM細胞、RPMI4788細胞、及びCHO-K1細胞）を1×105個/匹〜1×107個/匹ずつ移植して、その後、明暗サイクルを12時間とし、ポリカーボネート製ケージ（温度22±1℃、湿度50〜60％）にて3〜4週間飼育した。一週間に1回、前記抗血清を同量注射し、3〜4週後、皮下に生じた腫瘍を摘出して、この腫瘍を外科用メスを装着した機械分散機を用いて細切分散した。RPMI4788細胞、及びCHO-K1細胞については、コラゲナーゼ含有生理食塩水により、さらに細胞を分散させた。これらの分散した細胞を血清無添加のRPMI 1640培地（pH7.2、フェノールレッド不含、カナマイシン60μg/ml、ゲンタマイシン2.5μg/ml、セフチゾキシム20μg/mlを含む）で洗浄した。最後に、細胞濃度が5×106個/mlになるように、各細胞を上記血清無添加のRPMI 1640培地に懸濁した。
【００２７】
＝＝オリゴ糖鎖の合成＝＝
１-１.糖鎖プライマーと浮遊細胞との反応
各細胞内で糖鎖プライマーを用いてオリゴ糖鎖を合成させるために、糖鎖プライマー  Lac-C12（Lac-C12：1-(n-dodecyl)-β-Lactoside）及びGlcNAc-12（GlcNAc-C12：1-(n-dodecyl)-2-N-acetyl-β-Glucopyranoside）と上記「培養細胞の調製」に記載の方法によって調製した細胞を用いて、以下の実験を行った。
【００２８】
まず、Lac-C12は文献（Y. Miura, T. Yamagata, Biochem. Biophys. Res. Commun., 241, 698-703(1997)）に従って合成した。また、GlcNAc-C12は次のように合成した。まず、無水酢酸15 ml(Wako)とピリジン(Wako)40 mlの混合溶液を氷浴中で撹拌し、N-アセチルグルコサミンGlcNAc 2.5 g (Sigma)を加えた。26時間反応して1,3,4,6-tetra-O-acethyl-2-N-acetyl-D-glucopyranoside(Ac-GlcNAc) を得た。次に、Ac-GlcNAc 3 gにモレキュラーシーブA-4 (Wako) 3 gを入れ、ジクロロメタン(Wako) 70 mlと、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル(TMSOTf)3.5 ml(Merk)を加え、窒素注入してから50 ℃で撹拌下還流させた後、室温で12時間撹拌した。得られた生成物を1,2-ジクロロエタン(Wako)40 mlに溶解し、1-ドデカノール3.6 ml(Wako),三フッ化ほう素ジエチルエーテール錯体BF3Oet(Wako)21 mlを加えて、室温で撹拌した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(Merck, 溶媒酢酸エチル(Wako):n-ヘキサン(Wako)=1:1)により精製し、白色結晶1-(n-dodecyl)-3,4,6-tri-O-acetyl-2-N-acetyl-β-D-glucopyranoside（Ac-GlcNAc-C12）を得た。Ac-GlcNAc-C12 2.5 gに窒素下メタノール(Wako)100 mlを加えた。氷浴下でナトリウムメトキシド(Wako)270 mgを加えて撹拌し、白色結晶のGlcNAc-C12を得た。
【００２９】
次に、上記「培養細胞の調製」に記載の方法によって得られた各種細胞懸濁液それぞれに、ラクトシド型プライマー又はＮ−アセチルグルコサミン型糖鎖プライマーを、細胞懸濁液に対して終濃度50μMとなるように添加し、37℃で2日間保ち、オリゴ糖鎖を合成させ、上清に分泌させた（表１に組み合わせを示す）。その後、遠心分離（×3000rpm、15分、4℃）し、オリゴ糖鎖を含む培養上清を回収した。これらの培養上清は、以下「２.オリゴ糖鎖の精製及び高性能薄層クロマトグラフィー」に示すように精製して、高性能薄層クロマトグラフィーに用いた。
【００３０】
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【００３１】
１-２.糖鎖プライマーと付着細胞との反応
本来付着状態で培養されるRPMI4788細胞、及びCHO-K1細胞については、懸濁状態で、その培養液に糖鎖を加え、オリゴ糖鎖を合成させることも可能であるが、本実施例では、細胞を培養フラスコに付着させた状態でオリゴ糖鎖を合成させた。上記「培養細胞の調製」に記載の方法によって調整したRPMI4788細胞、及びCHO-K1細胞をポリスチレン製培養フラスコ（150cm2）に牛胎児血清10v/v％を添加したRPMI 1640培地（pH7.2、カナマイシン60μg/ml、ゲンタマイシン2.5μg/ml、セフチゾキシム20μg/mlを含む）で1×105個/mlになるよう希釈し、その50mlを播種した。付着細胞密度が1.3×105個/cm2）になるまで培養後、培養フラスコを血清無添加のRPMI 1640培地（pH7.2、フェノールレッド不含、カナマイシン60μg/ml、ゲンタマイシン2.5μg/ml、セフチゾキシム20μg/mlを含む）で洗浄した。50μMのラクトシド型プライマー又はＮ−アセチルグルコサミン型糖鎖プライマーを含む、上記血清無添加のRPMI 1640培地30mlを培養フラスコに添加し、37℃で2日間保ち、オリゴ糖鎖を合成させ、上清に分泌させた（表2に組み合わせを示す）。その後、これらの培養上清は、以下「２.オリゴ糖鎖の精製及び高性能薄層クロマトグラフィー」に示すように精製して、高性能薄層クロマトグラフィーに用いた。
【００３２】
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【００３３】
２.オリゴ糖鎖の精製及び高性能薄層クロマトグラフィー
Preparative C18 125オングストローム 55−105μm Bulk Packing Material(Waters)を充填したカラム(20×200mm)を用いて、上記「１-１. 糖鎖プライマーと浮遊状態との反応」及び「１-２. 糖鎖プライマーと付着状態との反応」の方法によって得られた培養上清から、オリゴ糖鎖（糖脂質）を含む脂質成分を精製した。
【００３４】
具体的には、まず、メタノール400mlを通してカラムを活性化し、超純水800mlでカラムを平衡化させた。次に、培養上清300ml〜600mlを二度カラムに通して脂質成分を吸着させ、超純水800mlを通してカラムを洗浄した。続いてメタノール300ml、クロロホルム／メタノール（2/1(v/v)）を150ml通して脂質成分をカラムから溶出し、溶出液を蒸発乾燥させた。
【００３５】
次に、各培養上清に産生されたオリゴ糖鎖の合成量及び種類を比較するために、精製した脂質成分をクロロホルム／メタノール（2/1(v/v)）に溶解した。  
この溶解液の1/20量をHPTLCプレート（high performance thin layer chromatoglaphy; Silicagel 60、Merck社）にスポットし、クロロホルム／メタノール／超純水＝50/40/10(v/v/v)を展開溶媒に使用して、展開させた。
【００３６】
HPTLCプレート（Merck、Silicagel 60）に付着した溶媒を乾燥させた後、HPTLCプレートをオルシノール硫酸試薬で染色して発色させ、合成したオリゴ糖鎖を検出した。その結果を図1及び図2に示す。
【００３７】
さらに、デンシトメーターを用いて、各レーンのバンドの強度を測定した。また、Rf値が等しいバンドにおいて、測定したバンドの強度から、in vivo法とin vitro法におけるオリゴ糖鎖合成量の比を算出した。その結果を、図3〜8に示す。
【００３８】
３.得られた糖鎖の質量及び構造
前述の「２.オリゴ糖鎖の精製及び高性能薄層クロマトグラフィー」を実施後、これらのバンドに含まれる糖鎖の質量をMALDI-TOF-MSで計測した。なお、前述の通り、HL60細胞はネオラクト系列の糖鎖を、CCRF-CEM細胞はグロボ系列の糖鎖を、BALL-1細胞はグロボ系列の糖鎖を合成すると考えられるので、計測した質量の値から分子量を予測し、以下に示すように糖鎖の構造を推定した。なお、以下A、B等は、図１及び図2のバンドに相当している。
【００３９】
＜糖鎖の構造＞
No.1 −A：Mw=533：Lac-C12
−B：Mw=695：Gal−Lac−C12
−C：Mw=824：NeuAc−Lac−C12
No.2 −A：Mw=533：Lac−C12
−B：Mw=695：Gal−Lac−C12
−C：構造未決定
No.3 −A：Mw=533：Lac−C12
−B：Mw=695：Gal−Lac−C12
−C：構造未決定
No.4 −A：Mw=533：Lac−C12
−B：Mw=695：Gal−Lac−C12
−C：構造未決定
No.5 −A：Mw=533：Lac−C12
−B：Mw=695：Gal−Lac−C12
−C：Mw=846：Fuc−Gal−Lac−C12
No.6 −A：Mw=533：Lac−C12
−B：Mw=695：Gal−Lac−C12
−C：Mw=846：Fuc−Gal−Lac−C12
No.7 −A：Mw=574：Gal−GlcNAc−C12
−B：Mw=720：Gal−( Fuc )−GlcNAc−C12
−C：Mw=842：NeuAc−Gal−GlcNAc−C12
Mw=988：NeuAc−Gal−( Fuc ) −GlcNAc−C12
−D：Mw=1208：NeuAc−Gal−GlcNAc−Gal−GlcNAc−C12
−E：Mw=1354：NeuAc−Gal−GlcNAc−Gal−( Fuc )−GlcNAc−C12
No.8 −A：Mw=574：Gal−GlcNAc−C12
−B’：Mw=736：Gal−Gal−GlcNAc−C12
−C：構造未決定
−D：構造未決定
No.9 −A：Mw=574：Gal−GlcNAc−C12
−B：Mw=720：Fuc−Gal−GlcNAc−C12
−C：構造未決定
−D：構造未決定
−E：構造未決定
No.10 −A：Mw=574：Gal−GlcNAc−C12
−B：Mw=720：Fuc−Gal−GlcNAc−C12
−C：構造未決定
−E：構造未決定
No.11 −A：Mw=574：Gal−GlcNAc−C12
−B：Mw=736：Gal−Gal−GlcNAc−C12
−C：Mw=591：HexNAc−GlcNAc−C12
−D：構造未決定
No.12 −A：Mw=574：Gal−GlcNAc−C12
−B：構造未決定
−C： Mw=591：HexNAc−GlcNAc−C12
No.13−A：Mw=534：Lac−C12
−B：Mw=695：Gal −Lac−C12
−C：Mw=898：GalNAc−Gal − Lac −C12
−D：Mw=1101：GalNAc−GalNAc−Gal − Lac −C12
−E：構造未決定
−F：構造未決定
−H：構造未決定
−I：構造未決定
No.14−A：Mw=534：Lac−C12
−B：Mw=695：Gal − Lac−C12
−F：構造未決定
−G：HexNAc − Lac−C12
−H：構造未決定
No.15−A：Mw=534：Lac−C12
−B：Mw=695：Gal − Lac−C12
−C：Mw=898：GalNAc−Gal − Lac −C12
−D：Mw=1101：GalNAc−GalNAc−Gal − Lac −C12
−E：構造未決定
−F：Mw=1101：GalNAc−GalNAc−Gal − Lac −C12
−H：構造未決定
−I：構造未決定
No.16−A：Mw=534：Lac−C12
−B：Mw=695：Gal − Lac−C12
−C：構造未決定
−D：構造未決定
−H：構造未決定
No.17−A：構造未決定
−B：構造未決定
−C：Mw=574：Gal−GlcNAc −C12
−D：Mw=720：Gal−(Fuc)―GlcNAc −C12
−E：Mw=736：Gal−Gal−GlcNAc −C12
−F：Mw=939：Gal−GlcNAc −Gal−GlcNAc −C12
−G：構造未決定
−H：構造未決定
−I：Mw=1142：GlcNAc −Gal−GlcNAc −Gal−GlcNAc −C12
−J：構造未決定
−K：構造未決定
No.18−C：Mw=574：Gal−GlcNAc −C12
No.19−A：構造未決定
−B：構造未決定
−C：構造未決定
−D：構造未決定
−E：構造未決定
−G：構造未決定
−H：Mw=1142：GlcNAc −Gal−GlcNAc −Gal−GlcNAc −C12
−I：構造未決定
−J：構造未決定
No.20−C：Mw=574：Gal−GlcNAc −C12
−D：構造未決定
−F：構造未決定
No.21−A：Mw=534：Lac−C12
−B：Mw=695：Gal − Lac−C12
−C：Mw=898：GalNAc−Gal − Lac −C12
−D：Mw=1101：HexNAc − Lac −C12
−E：構造未決定
−F：構造未決定
−G：構造未決定
No.22−A：Mw=534：Lac−C12
−B：Mw=695：Gal − Lac−C12
−C：Mw=846：Fuc−Gal − Lac −C12
−D：Mw=736：HexNAc − Lac −C12
−E：Mw=1049：GalNAc −(Fuc)−Gal −Lac −C12
−F：構造未決定
−G：構造未決定
No.23−A：Mw=534：Lac−C12
−B：構造未決定
−C：構造未決定
−D：構造未決定
No.24−A：Mw=534：Lac−C12
−B：構造未決定
−C：Mw=846：Fuc−Gal − Lac −C12
−D：構造未決定
No.25−A：Mw=574：Gal−GlcNAc −C12
−B：Mw=720：Fuc−Gal−GlcNAc −C12
−C：Mw=736：Gal−Gal−GlcNAc −C12
−D：構造未決定
−E：構造未決定
No.26−A：Mw=574：Gal−GlcNAc −C12
−B：Mw=720：Fuc−Gal−GlcNAc −C12
−C：Mw=736：Gal−Gal−GlcNAc −C12
−D：構造未決定
−E：構造未決定
No.27−B：Mw=574：Gal−GlcNAc −C12
−C：Mw=736：Gal−Gal−GlcNAc −C12
−D：構造未決定
No.28−A：Mw=574：Gal−GlcNAc −C12
−B：Mw=574：Gal−GlcNAc −C12
−C：構造未決定
−D：構造未決定
【００４０】
図3〜8に示すように、用いるリンパ球を予めin vivoで培養することにより、ほとんどの場合において、目的のオリゴ糖鎖は多く合成されるだけでなく、オリゴ糖の種類も多くなることが明らかになった。
【００４１】
以上より、合成されるオリゴ糖鎖の量を増加させたり、合成されるオリゴ糖鎖の種類を増加させたりするためには、糖鎖プライマーを反応させる前に、in vivoでリンパ球を培養することが有効であることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の一実施例において、高性能薄層クロマトグラフィー（HPTLC）の結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、高性能薄層クロマトグラフィー（HPTLC）の結果を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、デンシトメーターを用いて各バンド強度を測定した結果を示す図である。
【図４】本発明の一実施例において、デンシトメーターを用いて各バンド強度を測定した結果を示す図である。
【図５】本発明の一実施例において、デンシトメーターを用いて各バンド強度を測定した結果を示す図である。
【図６】本発明の一実施例において、デンシトメーターを用いて各バンド強度を測定した結果を示す図である。
【図７】本発明の一実施例において、デンシトメーターを用いて各バンド強度を測定した結果を示す図である。
【図８】本発明の一実施例において、デンシトメーターを用いて各バンド強度を測定した結果を示す図である。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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