(57)【要約】【課題】性分化異常症を診断できるマーカー、及びそのマーカーを検出するための性分化異常症診断用キットを提供すること。【解決手段】性分化異常症の診断マーカーをCXorf6遺伝子関連物質とする。例えば、野生型CXorf6ペプチド、CXorf6遺伝子の下流遺伝子（Hes1遺伝子、Hes5遺伝子、Hes7遺伝子）の転写を活性化する機能を欠損しているポリペプチド、ヒトCXorf6において少なくとも第653番目のアミノ酸残基よりC末端側のペプチド領域を欠損しているペプチド、又はこれらのポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくはそれらの相補鎖は、尿道下裂を主とする性分化異常症を診断するマーカーとして有用である。性分化異常症診断用キットは、上記のマーカーを検出するためのプローブ、プライマー、抗体等を含むキットとする。【選択図】図１
2007282598.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CXorf6遺伝子の下流遺伝子の転写を活性化する機能を欠損したCXorf6ポリペプチド。
【請求項２】
前記CXorf6遺伝子が、ヒト由来の遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載のCXorf6ポリペプチド。
【請求項３】
前記下流遺伝子が、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子、又はHes7遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２に記載のCXorf6ポリペプチド。
【請求項４】
少なくとも第６５３番目以降のアミノ酸残基を欠失している請求項２に記載のCXorf6ポリペプチド。
【請求項５】
ヒトCXorf6において、少なくとも第６５３番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の機能を欠損しているポリペプチド。
【請求項６】
前記機能が、ヒトCXorf6遺伝子の下流に存在する下流遺伝子の転写活性化であることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記下流遺伝子が、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子、又はHes7遺伝子であることを特徴とする請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡである核酸。
【請求項９】
性分化異常症の指標となる遺伝子マーカーであって、
前記遺伝子マーカーが、CXorf6遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする遺伝子マーカー。
【請求項１０】
前記性分化異常症が、尿道下裂であることを特徴とする請求項９に記載の遺伝子マーカー。
【請求項１１】
性分化異常症を診断するための診断用キットであって、
請求項９に記載の遺伝子マーカーを検出することができるハイブリダイゼーション用プローブ、塩基配列決定用プライマー、ＰＣＲ用プライマーペア、又は特異的抗体を含むことを特徴とする診断用キット。
【請求項１２】
前記塩基配列決定用プライマーが、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列を決定することができるプライマーであることを特徴とする請求項１１に記載の診断用キット。
【請求項１３】
前記ＰＣＲ用プライマーが、CXorf6のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの一部又は全部を増幅することができるプライマーであることを特徴とする請求項１１又は１２に記載の診断用キット。
【請求項１４】
前記性分化異常症が、尿道下裂であることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれかに記載の診断用キット。
【請求項１５】
CXorf6ポリペプチドの機能を評価するための遺伝子マーカーであって、
前記遺伝子マーカーが、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子、又はHes7遺伝子のいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする遺伝子マーカー。
【請求項１６】
性分化異常症の指標となる遺伝子マーカーであって、
前記遺伝子マーカーが、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子、又はHes7遺伝子のいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする遺伝子マーカー。
【請求項１７】
前記性分化異常症が、尿道下裂であることを特徴とする請求項１６に記載の遺伝子マーカー。
【請求項１８】
性分化異常症を診断するための診断用キットであって、
請求項１６に記載の遺伝子マーカーを検出することができるハイブリダイゼーション用プローブ、塩基配列決定用プライマー、ＰＣＲ用プライマーペア、又は特異的抗体を含むことを特徴とする診断用キット。
【請求項１９】
前記性分化異常症が、尿道下裂であることを特徴とする請求項１８に記載の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、性分化異常症における診断マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
性分化は、個人の性的表現型の発現を規定する遺伝的プログラムによる、時間的・空間的に厳密な制御の下で進行する。その結果、性腺形成、性管・外性器形成、二次性徴出現、配偶子形成等の性的表現型が生じる。この性分化の過程は、
（１）性腺形成と外性器分化において、発生初期に両性に共通する原器が形成され、その後、遺伝的性に従って、異なる性腺や外性器に分化すること。  
（２）性管形成において、発生初期に両性の器官が形成され、その後、遺伝的性に一致する性管のみが発達すること。  
（３）生殖細胞という、次世代に引き継がれる唯一の細胞が発生すること。  
によって、特徴づけられる。この遺伝的プログラムの進行過程のどこかに問題が生じると、性分化異常症が発症する。
【０００３】
性分化異常症の中でも、臨床的には、男児における外陰部異常症に遭遇することが多い。これまで、患者における遺伝子解析や実験動物を用いた研究から、男児における外陰部異常症に関与する遺伝子が多数同定されてきた。これらの遺伝子の異常は、胎児精巣形成不全（未分化性腺形成障害及び胎児精巣分化障害に大別される）、男性ホルモン産生障害（コレステロール合成障害及びステロイドホルモン合成酵素障害に大別される）、男性ホルモン効果障害、外陰部原器形成不全のいずれかを介して、外陰部異常症を招くことが知られている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、それらの疾病を引き起こす遺伝子型は知られていなかった。
【非特許文献１】Grumbach, M.M., Hughes, I. A. & Conte, F. A. Disorders of sex differentiation. Williams textbook of endocrinology, 10th edn (eds. Larsen, P. R., Kronenberg, H. M., Melmed, S., Polonsky, K. S.)(Saunders, Philadelphia, pp842-1002, 2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特定の遺伝子型と疾病の発症を関連付けることができれば、正確な診断名を付けたり、病気の発症を予見したりすることができるようになり、その結果、患者に対して、例えば遺伝相談や治療方法等のフォローアップを行うことが可能になる。
【０００５】
そこで、本発明は、性分化異常症を診断できるマーカー、及びそのマーカーを検出するための性分化異常症診断用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者らは、種々の性分化異常症患者（男性化障害や染色体46,XY核型を有する患者等）166例（特発性症例152例、家族性症例（発端者）14例）を対象として、Ｘ染色体長腕末端に存在するヒトCXorf6遺伝子の変異を解析した。なお、この166人の患者のうち、尿道下裂を有する日本人患者は56例（重症例22例）であった。すると、尿道下裂の表現型を示す日本人患者3家系4例において、ヒトCXorf6遺伝子にナンセンス変異が認められ、欠失ポリペプチドが生じていた。このことから、上記患者における尿道下裂の原因遺伝子がCXorf6遺伝子であることが示唆された。
【０００７】
これらの患者においては、アンドロゲンレセプター遺伝子（ＡＲ：androgen receptor）及び5α−還元酵素遺伝子（SRD5A2）には変異が検出されなかった。また、マウスCXorf6遺伝子の発現を調べたところ、胎児の精巣で発現しており、これらの事実は、尿道下裂の原因遺伝子がCXorf6遺伝子であることを強く支持する。こうして、発明者らは、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明にかかるCXorf6ポリペプチドは、CXorf6遺伝子の下流遺伝子の転写を活性化する機能を欠損していることを特徴とする。ここで、前記CXorf6遺伝子は、例えば、ヒト由来の遺伝子であってもよい。また、前記下流遺伝子は、例えば、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子、又はHes7遺伝子であることが好ましい。また、前記CXorf6ポリペプチドは、少なくとも第６５３番目以降のアミノ酸残基を欠失していることが好ましい。
【０００９】
また、本発明にかかるポリペプチドは、ヒトCXorf6において、少なくとも第６５３番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の機能を欠損していることを特徴とする。ここで、前記機能は、ヒトCXorf6遺伝子の下流に存在する下流遺伝子の転写活性化であることが好ましい。また、前記下流遺伝子は、例えば、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子、又はHes7遺伝子であることが好ましい。
【００１０】
さらに、本発明にかかる核酸は、前記いずれかに記載のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡであることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明にかかる遺伝子マーカーは、性分化異常症の指標となる遺伝子マーカーであって、前記遺伝子マーカーが、CXorf6遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする。なお、前記性分化異常症は、尿道下裂であってもよい。
【００１２】
さらに、本発明にかかる診断用キットは、性分化異常症を診断するための診断用キットであって、前記遺伝子マーカーを検出することができるハイブリダイゼーション用プローブ、塩基配列決定用プライマー、ＰＣＲ用プライマーペア、又は特異的抗体を含むことを特徴とする。ここで、前記塩基配列決定用プライマーは、前記いずれかに記載のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列を決定することができるプライマーであってもよい。また、前記ＰＣＲ用プライマーは、CXorf6のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの一部又は全部を増幅することができるプライマーであってもよい。なお、前記性分化異常症は、尿道下裂であってもよい。
【００１３】
また、本発明にかかる遺伝子マーカーは、CXorf6ポリペプチドの機能を評価するための遺伝子マーカーであって、前記遺伝子マーカーが、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子、又はHes7遺伝子のいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする。
【００１４】
さらに、本発明にかかる遺伝子マーカーは、性分化異常症の指標となる遺伝子マーカーであって、前記遺伝子マーカーが、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子、又はHes7遺伝子のいずれかの遺伝子に関連する遺伝子関連物質であることを特徴とする。なお、前記性分化異常症は、尿道下裂であってもよい。
【００１５】
また、本発明にかかる診断用キットは、性分化異常症を診断するための診断用キットであって、前記遺伝子マーカーを検出することができるハイブリダイゼーション用プローブ、塩基配列決定用プライマー、ＰＣＲ用プライマーペア、又は特異的抗体を含んでいてもよい。なお、前記性分化異常症は、尿道下裂であってもよい。
【００１６】
なお、本発明において「CXorf6遺伝子」とは、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするヒト由来の遺伝子及びそのホモログ（homolog）やオーソログ（ortholog）をいう。「CXorf6」とは、上記「CXorf6遺伝子」がコードするポリペプチドを意味し、例えば、「ヒトCXorf6」とは、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒト由来のポリペプチドを言うが、野生型と同じ機能を持っているのであれば、遺伝的多型による変異を含んでいてもかまわない。
【００１７】
また、本発明において「遺伝子マーカー」は、ある対象物の状態又は作用の評価の指標となる検出対象物質であって、ここではある遺伝子の発現過程に関連する遺伝子関連物質をいう。「遺伝子関連物質」とは、遺伝子それ自体、又はその遺伝子に関わる物質であり、例えば、CXorf6遺伝子を含むゲノムＤＮＡ、転写物であるｈｎＲＮＡやｍＲＮＡ、その逆転写物であるｃＤＮＡ、翻訳物であるペプチド、遺伝子発現の最終産物であるタンパク質及びそれらの一部等が含まれる。
【００１８】
また、本発明において「性分化異常症」とは、男性又は女性における性腺、性管又は外性器形成過程のどこかに障害が生じた疾患をいい、例えば、尿道下裂等の外陰部異常症、性腺形成障害、真性半陰陽、仮性半陰陽等をいう。
【００１９】
また、「CXorf6（遺伝子）の下流遺伝子」とは、CXorf6が直接転写を活性化する遺伝子だけでなく、CXorf6が機能することによって、発現が変化する全ての遺伝子を意味する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、性分化異常症を診断できるマーカー、及びそのマーカーを検出するための性分化異常症診断用キットを提供することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコルを用いる。
【００２２】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２３】
＝＝性分化異常症診断マーカー＝＝
ヒトCXorf6(chromosome X open reading frame 6、別名:F18又はCG1)（配列番号１）は、Ｘ染色体長腕遠位に存在する遺伝子としてLaporteらにより同定されたが（Hu, L. J. et al. Deletions in Xq28 in two boys with myotubular myopathy and abnormal genital development define a new contiguous gene syndrome in a 430kb region. Hum. Mol. Genet. 5, 139-143 (1996), Laporte, J. et al. Cloning and characterization of an alternatively spliced gene in proximal Xq28 deleted in two patients with intersexual genitalia and myotubular myopathy. Genomics 41, 458-462 (1997)）、現在まで、その機能は知られていない。
【００２４】
本発明者らは、性分化異常症のうち尿道下裂の表現型を有する患者のヒトCXorf6遺伝子の塩基配列を調べたところ、370番目、589番目、1957番目の塩基にナンセンス変異が生じている患者が存在することを見出した（図１〜図３を参照のこと）。その結果、ヒトCXorf6ポリペプチドは、第124番目、第197番目、又は第653番目のコドンが終止コドンとなり、それぞれ、第124番目、第197番目、又は第653番目のアミノ酸残基以降のＣ末端領域が欠失したポリペプチドが生産される。このことは、ヒトCXorf6ポリペプチドの第653番目以降のＣ末端領域の機能の欠損が尿道下裂の表現型を引き起こすことを示す。
【００２５】
また、これらの変異遺伝子を用いて、その産物の下流遺伝子に対する転写活性化能を調べたところ、実施例に記載のレポーターアッセイから示されるように、これらの変異遺伝子のコードするポリペプチドには、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子等の転写を活性化する機能が欠損していることを見出した（図６を参照のこと）。このことは、ヒトCXorf6ポリペプチドの第653番目以降のＣ末端領域には、下流遺伝子の転写を活性化する機能があり、その転写活性化能が欠損すると、尿道下裂の表現型が生じることを示す。
【００２６】
従って、CXorf6の下流遺伝子に対する転写活性化能を評価することにより、CXorf6遺伝子関連物質及び下流遺伝子の遺伝子関連物質を「性分化異常症を診断するための遺伝子マーカー」（以下、「性分化異常症の診断マーカー」と記載する）として利用できる。これは、ヒトに限定されず、どんな生物種にも適用可能である。
【００２７】
このような性分化異常症を診断する際の一つのマーカーとしては、CXorf6遺伝子の下流に存在する下流遺伝子の転写活性化能が欠損しているポリペプチドが考えられ、それは、例えば、CXorf6遺伝子において、塩基の欠失、挿入、置換などの変異により、CXorf6遺伝子の転写活性化能を欠損しているポリペプチドであって、例えば、ヒトCXorf6（配列番号１）のアミノ酸配列においては、少なくとも第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の機能を欠損しているものが考えられる。他の例として、実施例に示すような、第197番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の機能を欠損しているポリペプチドや、第124番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の機能を欠損しているポリペプチドであってもよい。
【００２８】
典型的な例としては、ヒトCXorf6（配列番号１）のアミノ酸配列において、少なくとも第653番目のアミノ酸残基以降のＣ端側領域を欠失しているポリペプチドが挙げられ、実施例に記載されるような、第197番目以降のアミノ酸残基を欠失しているポリペプチドや、又は第124番目以降のアミノ酸残基を欠失しているポリペプチドであってもよい。
【００２９】
なお、下流遺伝子としては、例えば、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子等が挙げられる。
【００３０】
また、本発明の診断マーカーは、前述のポリペプチドだけに限らず、それらのポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はそれらの相補鎖（二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、またＲＮＡとＤＮＡのヘテロ二重鎖を含む）であってもよい。
【００３１】
さらに、CXorf6の発現自体が無くなれば、下流遺伝子に対する活性能は無くなることから、野生型のCXorf6遺伝子関連物質も、本発明のマーカーに含まれる。
【００３２】
＝＝CXorf6転写活性化機能評価用遺伝子マーカー＝＝
実施例に記載するレポーターアッセイから示されるように、ヒトCXorf6は、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子等下流遺伝子の転写を活性化することができ、ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域に、その転写活性化領域が存在する。従って、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子等下流遺伝子の発現を調べることにより、ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域が機能しているどうか判断できる。そこで、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子等CXorf6の下流遺伝子に関連する遺伝子関連物質は、CXorf6遺伝子の下流遺伝子に対する転写活性化機能を評価するマーカーとして利用できる。
【００３３】
また、前述のように、ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の欠失と、尿道下裂の表現型とは相関がある。従って、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子等CXorf6の下流遺伝子に関連する遺伝子関連物質は、性分化異常症の診断マーカーとしても有用である。
【００３４】
＝＝性分化異常症の診断方法＝＝
上述の遺伝子マーカーを用いて性分化異常症を診断するには、ヒトCXorf6の場合、第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の機能の有無を調べればよく、具体的には、（１）ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の発現、又は（２）ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の転写活性化機能、を調べる。以下に、それぞれの検出方法の例を述べるが、検出方法としては、これらの方法に限定されない。
【００３５】
なお、図３に示す通り、尿道下裂は、陰茎の形態異常等の臨床所見が認められるので、本発明のマーカーの検出とこのような臨床所見とを併せれば、性分化異常症をより正確に診断することができる。
【００３６】
（1）発現を調べる場合
まず、CXorf6遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等をマーカーとし、診断対象の個体から得た、本来CXorf6が発現している細胞内において、これらの診断マーカーの存在をノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲで検出することにより、ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の発現を調べることができる。ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲにおいては、特に、ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域をコードする領域に対応するプローブやプライマーを用いることが好ましい。また、CXorf6遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等のＲＮＡの塩基配列を決定することにより、ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の発現を無くさせるようなナンセンス変異などの突然変異の有無を知ることもできる。
【００３７】
なお、診断対象の個体から得た細胞からＲＮＡを抽出し、逆転写して作成したｃＤＮＡを用い、CXorf6をコードするｃＤＮＡに対し、ｃＤＮＡの量や、発現を無くさせるような変異の有無を調べてもよい。その具体的な方法は、ハイブリダイゼーション、塩基配列の決定、ＰＣＲ、ＲＦＬＰ検出など、特に限定されないが、ハイブリダイゼーションやＰＣＲにおいては、特に、ヒトCXorf6の第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域をコードする領域に対応するプローブやプライマーを用いることが好ましい。
【００３８】
また、診断対象の個体から得た細胞からゲノムＤＮＡを単離し、CXorf6の塩基配列を決定することにより、発現を無くさせるような変異の有無を調べることができる。
【００３９】
なお、塩基配列を決定することにより、CXorf6遺伝子の変異を直接検出する場合、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ又はその相補鎖等の核酸にはCXorf6遺伝子全体が含まれている必要はなく、CXorf6遺伝子の変異を有する箇所の塩基が含まれ、その塩基を決定することができる塩基配列があれば十分である。
【００４０】
さらに、上記マーカーが、CXorf6の一部又は全部をコードするペプチドの場合、CXorf6の量を検出するためには、このようなペプチドに対して特異的に反応する抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング法、免疫組織学的方法等を行えばよい。ヒトCXorf6の場合、第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域に特異的な抗体を用いることが好ましい。
【００４１】
このようにして調べた結果、診断対象の個体において、CXorf6の発現が全く無くなっていたり、発現していても、例えばヒトCXorf6において少なくとも第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側の領域を欠失したペプチドが発現していて、野生型ペプチドが発現していないような場合、その個体は性分化異常症であると診断する。
【００４２】
（2）機能を検出する場合
CXorf6の転写活性化機能を検出するには、診断対象の個体から得た細胞において、CXorf6遺伝子の下流遺伝子の発現を調べればよい。下流遺伝子としては、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子などがあり、これらの遺伝子の発現を、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＴ、ＥＬＩＳＡ、組織染色など、遺伝子発現を検出できる公知の方法によって調べる。
【００４３】
また、CXorf6のHes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子のプロモーターへの結合を、ゲルシフトアッセイ等によって直接測定してもよい。この場合、例えば、診断対象の個体から得た細胞から抽出した抽出物を用いて、ラベルしたHes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子のプロモーターをプローブとして用いて実験を行う。
【００４４】
さらに、診断対象の個体から得た細胞から単離したCXorf6遺伝子やｃＤＮＡを用い、培養細胞を用いてレポーターアッセイを行なってもよい。例えば、実施例のように、Hes1遺伝子、Hes5遺伝子又はHes7遺伝子のプロモーターの下流にルシフェラーゼを組み込んだレポーターとともに、単離したCXorf6遺伝子やｃＤＮＡの発現ベクターを細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、CXorf6の機能を調べることができる。
【００４５】
このようにして調べた結果、診断対象の個体において、CXorf6の下流遺伝子に対する転写活性化機能が欠損している場合、その個体は性分化異常症であると診断する。
【００４６】
＝＝診断マーカーの有用性＝＝
本発明の診断マーカーは、細胞（血液を含む）や組織等のサンプルから検出することができる。特に、CXorf6遺伝子の一部又は全部を含むゲノムＤＮＡの塩基配列を調べる方法を用いれば、サンプルの細胞におけるCXorf6遺伝子の発現にかかわらず、診断が可能である。一般に、血液の採取は、生検に比べて患者へのリスクが少ないため、血液中から採取したゲノムＤＮＡをマーカーとし、その塩基配列を調べることが好ましく、例えば、先天異常をチェックする新生児検診や乳幼児健診等の集団検診において有用である。
【００４７】
また、母胎の血液、羊水又は絨毛組織等をサンプルに用いることができれば、出生前の胎児における性分化異常症の診断も可能である。
【００４８】
なお、CXorf6遺伝子又はその下流遺伝子の発現を調べる場合は、実施例及び図４に示されるような、各遺伝子が発現している細胞を用いればよい。
【００４９】
＝＝性分化異常症診断用キット＝＝
本発明にかかる性分化異常症診断用キットは、CXorf6の下流遺伝子の活性化能の有無を検出するための試薬又は器具が含まれていればどのようなものでもよいが、ヒトCXorf6の場合、特に第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の発現の有無を検出するための試薬又は器具であるのが好ましい。そのような試薬又は器具の例として、サザンブロット法、ノーザンブロット法もしくはin situ ハイブリダイゼーション法に用いられるプローブや試薬、ゲルシフトアッセイに用いられるプローブや試薬、塩基配列決定に用いられるプライマーや試薬、ＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法に用いられるプライマーペアや試薬、又はウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、免疫組織学的方法もしくはゲルシフトアッセイにおいて使用する特異的抗体等が挙げられる。ヒトCXorf6の発現を調べる場合は、特に、第653番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域を特異的に認識するプライマー、プローブ、又は抗体が好ましい。その他、細胞（血液を含む）又は組織からＲＮＡを単離するための試薬、酵素・蛍光物質・放射性物質等により標識された抗体、この酵素と反応する基質等を含んでいてもよい。なお、検出するための標識物質として、例えば、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ等の酵素、Cy2、FluorX、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC（イソチオシアン酸フルオレセイン）、ローダミン等の蛍光物質、3H、32P、35S、121I、125I等の放射性物質を含んでいてもよい。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例を用いて、以上に説明した実施態様を具体的に説明するが、これは例示であって、本発明をこの実施例に限定するものではない。
【００５１】
＝＝対象患者＝＝
Ｘ染色体長腕末端に存在するヒトCXorf6遺伝子の変異を解析するために、種々の性分化異常症患者（男性化障害や染色体46,XY核型を有する患者等）166例（特発性症例152例、家族性症例（発端者）14例）を対象として、以下の実験を行った。なお、この166人の患者のうち、尿道下裂を有する日本人患者は56例（重症例22例）であった。以下の実験の結果、患者の染色体に変異（アミノ酸置換）が認められた場合には、その患者の家族に対して同様の実験を行った。
【００５２】
＝＝遺伝子解析＝＝
上記患者における、Ｘ染色体長腕末端に存在するヒトCXorf6のエキソン３〜エキソン６をコードする領域及びそれらに隣接するスプライス部位に対して、以下のように塩基配列を決定した。
【００５３】
まず、上記患者の末梢血を採取し、採取した血液（白血球細胞）からゲノムＤＮＡを単離した。次に、単離したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ヒトCXorf6のエキソン3〜エキソン6をコードする領域及びそれらに隣接するスプライス部位をＰＣＲ法（95℃で2分間処理後、表１に示すアニーリング温度（AT）で45秒、次いで72℃で45秒伸長反応、95℃で45秒脱ハイブリダイゼーションを30回繰り返し、最終的に72℃で10分間処理した）で増幅した。なお、ＰＣＲに用いたプライマーは、表１に示す通りである。
【００５４】
2007282598.tif 000003
【００５５】
次に、ＣＥＱ8000自動シークエンサー（Beckman Coulter社）を用いて、こうして得られたＰＣＲ産物の塩基配列を解析した。
【００５６】
図１に示す通り、尿道下裂の表現型を示す日本人患者3家系4例において、男児では1個のみ存在するCXorf6遺伝子にナンセンス変異が認められ、終止コドンが生じていた（図１において、黒の四角で示す）。具体的にいうと、家族Ａ由来の異母兄弟において370番目の塩基ＧがＴに変異した結果、124番目のGlu以降のポリペプチドが欠失し（症例1及び症例2）、家族Ｂ由来の患者において589番目の塩基ＣがＴに変異した結果、197番目のGln以降のポリペプチドが欠失し（症例３）、家族Ｃ由来の患者において1957番目の塩基ＣがＴに置換した結果、653番目のArg以降のポリペプチドが欠失することとなった（症例４）。なお、家族Ａ及び家族Ｃの母親は、上記変異についてヘテロ接合体である、変異のキャリアであった。（家族Ｂの母親は未解析）。また、コントロールである150人の日本人男性患者には、これらの変異が認められなかった。
【００５７】
一方、尿道下裂の表現型を有するスウェーデン人男性患者には、856番目の塩基ＣがＴに置換し、その結果ヒトCXorf6ペプチドで286番目のProがSerに置換するミスセンス変異が認められた。なお、同じ表現型を有する患者の兄弟及び患者のいとこには、この変異が認められなかった（家族Ｄ）。同様に、女性化された性器を有するイタリア人患者の兄弟において、1520番目のＡがＧに置換し、その結果ヒトCXorf6ペプチドで507番目のGlnがArgに置換するミスセンス変異が認められた。しかし、同じ表現型を有するいとこ（男性）では、この変異が認められなかった（家族Ｅ）。従って、これらのミスセンス変異は、尿道下裂の原因であるとは考えられない。
【００５８】
なお、上記のナンセンス変異、ミスセンス変異、及び既に報告されている遺伝子多型（N589S）の位置関係を示したヒトCXorf6遺伝子の構造は、図２に示す通りである。
【００５９】
以上より、尿道下裂の発現は、ヒトCXorf6において653番目のArg以降のポリペプチドの欠失、すなわち653番目のArg以降のＣ末端領域が担う機能の欠損によることが示唆された。
【００６０】
＝＝尿道下裂の臨床所見＝＝
ヒトCXorf6遺伝子に変異を有する、家族Ａ（症例１及び２）及び家族Ｃ（症例４）由来の3人の患者における臨床所見を図３に示す。なお、家族Ａ〜家族Ｃのヘテロ接合体の母親が臨床所見上正常であったことから、この変異がＸ染色体連鎖劣性変異であることがわかる。
【００６１】
＝＝アンドロゲンレセプター遺伝子（ＡＲ：androgen receptor）及び5α−還元酵素遺伝子（SRD5A2）の解析＝＝
前述のように、症例１〜４においてヒトCXorf6遺伝子に変異が認められたので、これらの患者（症例１及び２：2歳5ヶ月、症例３：1ヶ月、症例４：3ヶ月）をさらに詳しく調べた。
【００６２】
まず、これらの患者において、血中の下垂体由来のゴナドトロピンの値を測定した。その結果、この値は全ての患者において正常範囲内であった。これより、患者の性腺刺激ホルモンは正常であることが分かった。  
次に、これらの患者において、血中のテストステロンの値を測定した。その結果、症例１では、ヒト絨毛性ゴナドトロピンの負荷によってテストステロンの産生が認められた。また、症例２及び症例４において、血中テストステロンの値は基準値の範囲であった。
【００６３】
以上の所見から、これらの患者において、アンドロゲンレセプター遺伝子（ＡＲ：androgen receptor）及び5α−還元酵素遺伝子（SRD5A2）に変異があるか否かを確認するために、これらの遺伝子の塩基配列を決定した。具体的な方法は、以下の通りである。
【００６４】
まず、上記患者の末梢血を採取し、採取した血液（白血球細胞）からゲノムＤＮＡを単離した。次に、単離したゲノムＤＮＡを鋳型とし、アンドロゲンレセプター遺伝子（ＡＲ）及び5α−還元酵素遺伝子（SRD5A2）をＰＣＲ法（95℃で2分間処理後、表２及び表３に示すアニーリング温度（AT）で45秒、次いで72℃で45秒伸長反応、95℃で45秒脱ハイブリダイゼーションを30回繰り返し、最終的に72℃で10分間処理した）で増幅した。なお、ＰＣＲに用いたプライマーは、以下に示す通りである。
【００６５】
2007282598.tif 000004
【００６６】
2007282598.tif 000005
【００６７】
こうして得られたＰＣＲ産物の塩基配列を解析したが、症例１〜症例４の患者全てにおいて、ＡＲ遺伝子及びSRD5A2遺伝子に変異は認められなかった。このことは、症例１〜症例４の患者においては、尿道下裂の原因遺伝子がヒトCXorf6遺伝子であるという結論を支持する。
【００６８】
＝＝各組織におけるヒトCXorf6遺伝子等の発現解析＝＝
ヒトCXorf6がどの組織に発現しているかを調べるために、以下の実験を行った。  
まず、包茎を合併している思春期前の男児の陰茎皮膚から線維芽細胞（図４の陰茎の皮膚に対応）を調製し、また、ＡＲ変異のために外性器異常を合併している思春期前の患者の性器皮膚から線維芽細胞（図４の性器の皮膚に対応）を調製した。次に、Superscript III逆転写酵素（Invitrogen社）を用いて、これらの線維芽細胞からｃＤＮＡを調製した。  
また、これらの細胞以外のヒトｃＤＮＡは、Invitrogen社又はClontech社から購入し、そのうち0.5ngのｃＤＮＡをＰＣＲに用いた。
【００６９】
次に、上記のｃＤＮＡを鋳型とし、表４に記載の各種プライマーを用いて、ＰＣＲ法（95℃で2分間処理後、表４に示すアニーリング温度（AT）で45秒、次いで72℃で45秒伸長反応、95℃で45秒脱ハイブリダイゼーションを30回繰り返し、最終的に72℃で10分間処理した）行った。なお、表中のRBP-Jは、「recombination signal binding protein-J」の略である。
【００７０】
2007282598.tif 000006
【００７１】
図４に示す通り、ヒトCXorf6遺伝子は、主に胎児の精巣、成人の下垂体、成人の視床下部、小児の陰茎の皮膚で特に強く発現していた。また、Hes5遺伝子及びHes7遺伝子は、胎児の精巣において強く発現していた。これより、ヒトCXorf6遺伝子及びHes5遺伝子及びHes7遺伝子は、胎児の精巣の発生過程において重要な役割を有することが示唆された。
【００７２】
＝＝マウスCXorf6遺伝子のin situハイブリダイゼーション＝＝
さらに詳細に、胎児期におけるCXorf6遺伝子の発現を調べるため、in situハイブリダイゼーションを行った。ここで、プローブには、胎生14.5日のマウス精巣のｃＤＮＡにおいて、マウスCXorf6遺伝子のエキソン3の667bpの領域を含む851bpのフラグメント（配列番号７０及び配列番号７１）を用いた（表５を参照のこと）。
【００７３】
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【００７４】
まず、胎生11.5日目、胎生12.5日目及び胎生14.5日目のＩＣＲマウスの胎仔から性腺を摘出し、これらの性腺を4％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで固定し、20％スクロースに浸し、OTC compound（ティッシュテック社）で包埋した。包埋したサンプルを凍結切片にし、ＤＩＧ  ＲＮＡ標識キット（Roche社）によってジゴキシゲニンで標識したプローブを用いてin situハイブリダイゼーションを行った（図５ａを参照のこと）。
【００７５】
図５ａに示す通り、胎生11.5日目のマウスの精巣の内部には、マウスCXorf6遺伝子の発現が認められた。また、精巣が形成される胎生12.5日目には、精巣の内部にマウスCXorf6遺伝子の発現が認められ、特に、この発現はセルトリ細胞に局在していた。さらに、小数のライディッヒ細胞において、弱いながらもマウスCXorf6遺伝子の発現が認められた。胎生14.5日目には、マウスCXorf6遺伝子の発現はやや弱くなっていたが、セルトリ細胞及びライディッヒ細胞の大部分においてマウスCXorf6遺伝子の発現が認められた。このようにして明らかになったマウスCXorf6遺伝子の発現パターンは、ヒトにおいて尿道下裂の原因遺伝子がCXorf6遺伝子であることを支持する。
【００７６】
また、卵巣では、胎生11.5日目及び胎生12.5日目において、主に、中腎へ分化する少数の体細胞において、マウスCXorf6遺伝子の発現が認められた。胎生14.5日目には、少数の体細胞の内部領域において、弱いマウスCXorf6遺伝子の発現が認められた。胎生12.5日目の性腺外組織では、発達中の副腎においてマウスCXorf6遺伝子の発現が認められなかった。一方、性器結節を含む性器領域の外側において、マウスCXorf6遺伝子の発現が認められ、この発現は、性器外組織の周りと同レベルであった。また、ミュラー管、前脳、体節、神経管及び膵臓にもマウスCXorf6遺伝子の発現が認められた。従って、これらの組織から得られた細胞において、CXorf6遺伝子やその転写産物、翻訳産物の構造や量を調べることができる。
【００７７】
＝＝トランスアクチベーション（transactivation）機能の解析＝＝
Hes1遺伝子、Hes5遺伝子及びHes7遺伝子に対するCXorf6変異体の転写活性化能を調べるため、各遺伝子のプロモーターにルシフェラーゼ遺伝子を挿入したレポーターを用い、培養細胞においてレポーターアッセイを行った。
【００７８】
まず、ヒト胎児精巣ｃＤＮＡ（Invitrogen社、D8921-01）を用いて、ヒトCXorf6(アミノ酸配列番号1〜701)の全長ｃＤＮＡをＰＣＲ法（98℃で2分間処理後、98℃10秒−60℃20秒−72℃2分のサイクルを35回繰り返し、72℃で7分間処理した）で増幅した。また、変異導入法（site-directed mutagenesis）を用いて、in vitro突然変異導入法により、ヒトCXorf6遺伝子に対してナンセンス変異(E124X、Q197X、Q653X)、ミスセンス変異（P286S、Q507R、N589S）を導入した。なお、ヒトCXorf6のｃＤＮＡの作製に用いたプライマーは、表４に記載の通りである。
【００７９】
次に、これらの変異を有するｃＤＮＡと、△エキソン4のｃＤＮＡをＰＣＲ法（98℃で2分間処理後、98℃10秒−60  20秒−72℃2分のサイクルを35回繰り返し、72℃で7分間処理する）で増幅し、発現ベクターpEF-Bos（大阪大学, 長田重一教授から供与）に挿入した（Mizushima, S. & Nagata, S. pEF-BOS, a powerful mammalian expression vector. Nucleic Acids Res. 18, 5322 (1990).を参照）。なお、ＰＣＲに用いたプライマーは、表６に示す通りである。
【００８０】
2007282598.tif 000008
【００８１】
次に、10％胎児ウシ血清含有RPMI1640を用いて、5％CO2、37℃の条件下で、MLT細胞（American Type Culture Collection, カタログナンバー  CRL-2065）を培養した。この細胞を6ウェルの培養皿に1.0〜1.5×105細胞/ウェルの濃度で播種し、リポフェクタミン（Invitrogen社）を用いて、これらの細胞に0.6μgのHes1遺伝子プロモーター、Hes5遺伝子プロモーターもしくはHes7遺伝子プロモーターの下流にルシフェラーゼを組み込んだレポーター（pHES1-luc、pHES5-lucもしくはpHES7-luc:  Nishimura, M. et al. Structure, chromosomal locus, and promoter of mouse Hes2 gene, a homologue of Drosophila hairy and Enhancer of Split. Genomics 49, 69-75 (1998), Bessho, Y., Miyoshi, G., Sakata, R. & Kageyama, R. Hes7: a bHLH-type repressor gene regulated by Notch and expressed in the presomitic mesoderm. Genes Cells 6, 175−185 (2001).
を参照）に、0.6μgのCXorf6遺伝子の各発現ベクター及び／又は0.8μgのN1-ICD（Notch 1 intracellular domain）もしくはN2-ICD（Notch 2 intracellular domain）の発現ベクター（pEF-BOSneo-mNOtch1もしくはpEF-BOSneoaNotch2、Mizutani, T., Taniguchi, Y., Aoki, T., Hashimoto, No. & Honjo, T. Conservation of the biochemical mechanisms of signal transduction among mammalian Notch family members. Proc Natl. Acad. Sci.U. S. A. 98, 9026-9031 (2001), Shimizu, K., Chiba, S., Saito, T., Kumano, K., Hamada, Y. & Hirai, H. Functional diversity among Notch1, Notch2, and Notch3 receptors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 291, 775-779 (2002)を参照）をトランジエントに導入した。なお、導入効率の内部コントロールとして、上記細胞に20ngのpRL-CMVベクター（Promega社）を導入した実験を行った。また、発現ベクターに対するコントロールとしては、上記のｃＤＮＡを含まないオリジナルのベクターを導入した。
【００８２】
トランスフェクトしてから48時間経過後に、Lumat ＬＢ9507（Berthold社）を用いて蛍光強度を測定した（これを4〜5回繰り返した）。これらの結果は、図６に示す通りである。なお、統計解析にはt検定を用いた。
【００８３】
野生型のヒトCXorf6は、Hes1遺伝子プロモーター、Hes5遺伝子プロモーター及びHes7遺伝子プロモーターを活性化できるのに対し、性分化異常症の原因であるナンセンス変異（E124X、Q197X、R653X）を有するヒトCXorf6は、これら下流遺伝子のプロモーターを活性化しなかったが、性分化異常症の原因にならないミスセンス変異（P286S、Q507R、N589S）を有するヒトCXorf6遺伝子はこれらの下流遺伝子プロモーターを活性化することができた。
【００８４】
従って、ヒトCXorf6の第６５３番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域が、下流遺伝子の転写活性化能を有することが示された。このように、ヒトCXorf6遺伝子の下流遺伝子の発現はヒトCXorf6の転写活性化機能を反映するため、ヒトCXorf6の第６５３番目のアミノ酸残基よりＣ末端側のペプチド領域の機能の有無を、下流遺伝子の発現の有無によって調べることが可能である。さらに、下流遺伝子の活性化と性分化異常症の相関が観察され、性分化異常症が下流遺伝子の転写活性化の機能欠損によることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明の一実施例において、ヒトCXorf6のアミノ酸配列に変異を有する患者において、遺伝子解析結果を示した図である。
【図２】本発明の一実施例において、ヒトCXorf6のアミノ酸配列をコードする遺伝子の構造を示した図である。
【図３】本発明の一実施例において、ヒトCXorf6のアミノ酸配列に変異を有する患者において、臨床所見を示した図である。
【図４】本発明の一実施例において、各種組織のヒトCXorf6の発現を示した図である。Exon4(+)はExon4を有する転写産物、Exon4(-)はExon4を有しない転写産物を検出したシグナルである。
【図５】（a）本発明の一実施例において、マウス胎生11.5日目、12.5日目及び14.5日目の精巣及び卵巣における、マウスCXorf6のin situハイブリダイゼーションの結果を示す図である。（ｂ）本発明の一実施例において、マウス出生時、1週齢、2週齢、3週齢及び8週齢の精巣及び卵巣における、性腺の発現パターンを免疫組織化学法で調べた結果を示す図である。
【図６】本発明の一実施例において、ヒトCXorf6遺伝子変異によるpHes1-luc、pHes5-luc及びpHes7-lucの制御下における、Notchシグナルの活性を示す図である。なお、N-ICDは、Notch細胞内ドメインのことを、N1-ICDは、Notch1細胞内ドメインのことを、N2-ICDは、Notch2細胞内ドメインのことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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