(57)【要約】【課題】インスリン非依存性糖尿病者の血中のレチノール結合蛋白質を正常域にまで低下させる。レチノール結合蛋白質を腎臓から容易に排泄させるために、レチノールよりも側鎖の大きい物質をレチノール結合蛋白質に結合させてトランスサイレチンとの複合体形成を阻害する。【解決手段】褐藻類由来の、レチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体形成を結合を阻害することができるカロチノイド画分を用いる。カロチノイド画分は、好ましくは、フコキサンチン及び／又はその類縁体からなる。原料褐藻類としては、天然又は養殖されたモズク、特にオキナワモズク（Cladoshiphon okamuranus Tokida）、Cladoshiphon novae-caledoniae Kylin）、又はCladoshiphon caledoniae Kylinを好適に用いることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
褐藻類由来の、レチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体形成を結合を阻害することができるカロチノイド画分を含む、インスリンの抵抗性の改善を必要とする疾患又は状態の処置のための、医薬組成物。
【請求項２】
カロチノイド画分が、フコキサンチン及び／又はその類縁体からなる、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
フコキサンチンを含む、インスリンの抵抗性の改善を必要とする疾患又は状態の処置のための、医薬組成物。
【請求項４】
インスリンの抵抗性の改善を必要とする疾患又は状態が、インスリン非依存性糖尿病である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
一日当たり0.02〜200mg/kg（好ましくは0.05〜100mg/ml、より好ましくは0.1〜50mg/ml）のカロチノイドを投与するための、請求項4記載の医薬組成物。
【請求項６】
経口投与製剤である、請求項5に記載の医薬組成物。
【請求項７】
フコイダンをさらに含む、請求項5に記載の医薬組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の医薬組成物を製造する方法であって、褐藻類からレチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体形成を阻害することができるカロチノイドを抽出する工程を含む、前記方法。
【請求項９】
さらにフコイダンを添加する工程を含む、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
フコキサンチンを含む、レチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体形成阻害剤。
【請求項１１】
臨床上有効量のフコキサンチン及びフコキサンチン安定化上有効量のフコイダンを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満やインスリン非依存性糖尿病時に生じているインスリン抵抗性を改善する物質に関する。また本発明はインスリン抵抗性の改善方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の血中グルコース量の恒常性の調節においてPPARγ（peroxisome proliferator-activated receptor γ；ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体γ）が関与しているとの明瞭な直接的証明はないが、ヒトにおいてPPARγはインスリン感受性、ならびに血糖値及び血圧のコントロールに重要であることが知られている（非特許文献1）。このことから、PPARγの特異的高親和性リガンドであるthiazolidinedione類が合成され、糖尿病等の治療に用いられている（非特許文献2、非特許文献3）。
【０００３】
一方、レチノール結合蛋白質は、生体内ではビタミンA等のレチノイドの輸送蛋白質として機能するものであり、トランスサイレチンは、レチノール結合蛋白質と結合してレチノールを輸送する以外にチロキシンとも結合するものであるが、インスリン非依存性糖尿病患者の血漿中では、レチノール結合蛋白質、レチノール及びトランスサイレチンの各含有量が、正常者のそれらに比べて有意に上昇していることが明らかにされている（非特許文献4）。
【０００４】
さらに、 Yang  Q. らは、肥満やII型糖尿病ではアディポサイトの影響により、Glut 4 グルコース（Glc）運搬体が選択的に減少するが、Glut 4 遺伝子を欠損させたノックアウトマウスでは、筋・肝臓でインスリン抵抗性が上昇し、脂肪組織のレチノール結合タンパク質（RBP）の発現が亢進したこと；ならびに血清RBPレベルは、肥満やII型糖尿病を示すインスリン抵抗性マウスとヒトで上昇しているが、インスリン感受性改善薬であるRosiglitazoneにより正常化すること、正常マウスにおいて、ヒト型RBPの強制過剰発現かもしくはリコンビナントRBPの注入で、インスリン抵抗性を誘起でき、逆に、rbp遺伝子を消去するとインスリン感受性が増すこと、高脂肪食で誘導した肥満マウスにおいて、RBPの尿排泄を増加させる合成レチノイドであるFenretinideは、血清RBPレベルを正常化し、インスリン抵抗性とGlc不耐性を改善すること、及び血清RBPの増加は肝のGlc新生酵素PEPCK（phosphoenolpyrucate carboxykinase）の発現を誘導し、筋のインスリンシグナルを阻止することを報告している。そして、これらのことから、RBPはII型糖尿病の病理像の一因である脂肪細胞由来シグナル因子であって、RBPの低下は、II型糖尿病治療の新戦略に成り得るであろうとの知見を提示している（非特許文献5）。
【０００５】
通常、分子量が21kDaであるレチノール結合蛋白質は、腎糸球体膜を容易に通過できるが、循環器系でRBPはトランスサイレチンに結合して80kDaの複合体を形成し、腎臓からの排泄を防いでいる（非特許文献6）。また、レチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体は。レチノール結合蛋白質とレチノール間の反応を安定化させている（非特許文献7）。
【先行技術文献】
【０００６】
【非特許文献１】Barroso I. et al., Dominant negative mutations in human PPARγ associated with severe insulin resistance, diabetes mellitus and hypertension. Nature vol402, 880-883, 1999
【非特許文献２】Lehmann, J.M. et al. An antidiabetic Thiazolidinedione is a high affinity ligand for peroxisome proliferator-activated receptor γ（PPARγ）. J. Biol. Chem. 270, 12953-12956, 1995
【非特許文献３】Willson, T.M. et al. The structure-activity relationship between peroxisome proliferator-activated receptorγ agonism and the anti-hyperglycemic activity of Thiazolidinediones. J. Med. Chem. 39, 665-668, 1996
【非特許文献４】Basualdo C. G. et. al., Vitamin A（retinol） status of first nation adults with non-insulin-diabetes mellitus, J. Ammerican College of Nutrition, Vol. 16, 39-45, 1997
【非特許文献５】Qin Yang et al., Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes, Nature, vol 436, 356-362, 2005
【非特許文献６】Naylor H. M. and Newcomer M. E. The structure of human retinol-binding protein（RBP） with its carrier protein transthyretin reveals an interaction with the carboxy terminus of RBP. Biochemistry 38, 2647-2653, 1999
【非特許文献７】Goodman D. S. and Raz A. J. Lipid Res., 13, 338-347, 1972
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したthiazolidinedione類を用いる方法は、PPARγをその特異的高親和性リガンドで積極的に活性化することで糖の代謝を活発にさせ、インスリン抵抗性を改善し、血糖値を正常域にまで低下させるものであり、インスリン抵抗性を示す生理的な状態を惹起させるトリガーを除く方法ではない。インスリン抵抗性獲得におけるトリガーは、血中のレチノール結合蛋白質量の異常であることから、肥満やインスリン非依存性糖尿病のインスリン抵抗性を改善するには、この蛋白質を正常域にまで低下させることのほうが合目的であり、かつ重要である。
【０００８】
そして、レチノール結合蛋白質を腎臓から容易に排泄させるには、レチノールよりも側鎖の大きい物質をレチノール結合蛋白質に結合させてトランスサイレチンとの複合体形成を阻害するか、又はトランスサイレチンは甲状腺ホルモン結合蛋白質であることから、同様に甲状腺ホルモンよりも大きい物質をトランスサイレチンに結合させ、レチノール結合蛋白質との複合体形成を阻害することにより、達成できると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、長年、海藻類のカロチノイドや多糖体の研究に従事してきた。そしてモズクから分画した特定の画分を含む、種々のカロチノイドについて、レチノール結合蛋白質に対する親和性を評価し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明は、褐藻類由来の、レチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体形成を結合を阻害することができるカロチノイド画分を含む、インスリンの抵抗性の改善を必要とする疾患又は状態の処置のための、医薬組成物を提供する。
【００１１】
本明細書で「カロチノイド（carotenoid(s)）」というときは、特別な場合を除き、通常の意味で用いており、多数の共役二重結合を含む脂肪族又は脂環式のポリエン類をいう。天然物であるか、合成物であるかに限定されない。カロチノイドには、α−カロチン、β−カロチン、リコピン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ルチン、及びフコキサンチン、並びにそれらの立体異性体（幾何異性体、光学異性体）が含まれる。
【００１２】
フコキサンチン（fucoxanthin）とは、 (3S,5R,6S,3'S,5'R,6'R)-3'-acetoxy-5,6-epoxy-3,5'-dihydroxy-6',7'-didehydro-5,6,7,8,5',6'-hexahydro-β,β-caroten-8-one（IUPAC）、又は (3S,3'S,5R,5'R,6S,6'R)-3'-(acetyloxy)-6',7'-didehydro-5,6-epoxy-5,5',6,6',7,8-hexahydro-3,5'-dihydroxy-8-oxo-β,β-carotene（CAS）であり、下式で表される化合物である（分子量658.88）。
【００１３】
【化１】
2007314451.tif 000002
【００１４】
本明細書で「カロチノイド画分」というときは、特別な場合を除き、原料からカロチノイドを分離・精製するための手段を用いることにより得られた画分であって、実質的に、カロチノイド単体又は複数のカロチノイドの混合物からなるものをいう。カロチノイド画分は、分離・精製のために使用した溶媒に溶解した状態であることもあり、そのような溶媒を除去した状態であることもある。
【００１５】
種々の動植物を原料としたカロチノイドの分離・精製は広く行われており、本発明には、そのいずれを用いてもよい。例えば、カロチノイド画分は次のようにして得ることができる。
【００１６】
(1) 一般的には、原料からの有機溶媒による抽出液を、クロマトグラフィーにより、分離・精製する。
【００１７】
(2) 褐藻類を原料とする場合は、例えば、原料をメタノールに浸漬し、浸漬物から固／液分離により抽出液を得て；抽出液からメタノールを減圧下で除去することにより固体抽出物を得て；そして固体抽出物を脱イオン水と酢酸エチルとの混合液に溶解して酢酸エチル層を分取し、必要に応じて酢酸エチル層を再度加水して、再び酢酸エチル層を分取する。
【００１８】
あるカロチノイド画分又はカロチノイドが、「レチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体形成を結合を阻害することができる」かどうかは、種々の結合試験により、対象物とレチノール結合蛋白質との親和性を定量的に評価することにより、判断することができる。例えば、表面プラズモン共鳴法、より詳細には、レチノール結合蛋白質を金膜上に固定し、対象物を供し、金属膜表面の誘電率の変化を追うことにより、結合の有無、結合量、結合速度等に関する情報を得ることができる。評価の際には、コントロールとして対象物の代わりにレチノールを用い、レチノールの親和性を100として対象物の親和性を相対値で表すとよい。そして、対象物の親和性が70％を超えるとき、75％以上であるとき、80％以上であるとき、又は85％以上であるときに、当該対象物が高い親和性を有する、すなわち当該対象物がレチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体形成を結合を阻害することができる、と評価することができる。
【００１９】
また、あるカロチノイド画分又はカロチノイドが、「レチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体形成を結合を阻害することができる」かどうかは、種々の複合体形成阻害試験により、複合体形成率を定量的に評価することにより、判断することができる。
例えば、レチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体形成が対象物の存在の有無により影響されるか否かを、ゲル濾過クロマトグラフィーにより、レチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体の分子量位置（約80kDa）に溶出されるピーク高さ又は面積により評価することができる。評価の際は、コントロールとして対象物が存在しない系を用い、その系におけるレチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体形成率を100とし、対象物を加えた系での複合体形成率を相対値で表すとよい。そして、対象物存在下での複合体形成率が50％以下であるとき、40％以下であるとき、30％以下であるとき、又は20％以下であるときに、当該対象物がレチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体形成を結合を阻害することができる、と評価することができる。
【００２０】
本明細書で「褐藻類」というときは、特別な場合を除き、褐藻綱（Phaeophyceae）に分類される藻類をいう。褐藻類には、ナガマツモ目（Chordariales）、コンブ目（Laminariales）、ウイキョウモ目（Dictyosiphonales）、アミジグサ目（Dictyotales）、ヒバマタ目（Fucales）、イソガワラ目（Ralfsiales）、カヤモノリ目（Scytosiphonales）、シオミドロ目（Ectocarpales）、クロガシラ目（Sphacelariales）、ウルシグサ目（Desmarestiales）、ムチモ目（Cutleriales）、ケヤリ目（Sporochnales）、ウスバオウギ目（Syringodermatales）に属する藻類が含まれる。褐藻類には、具体的には、ニセモズク、ナガマツモ、オキナワモズク、ナミマクラ、ニセフトモズク、ソメワケグサ、イシゲ、ネバリモ、モズク、クロモ、シワノカワ、イシモズク、ヒモマクラ、フトモズク；アナメ、チガイソ、アイヌワカメ、ネコアシコンブ、ツルモ、スジメ、ミスジコンブ、カジメ、アントクメ、アラメ、クロシオメ、トロロコンブ、コンブ、ニセツルモ、ワカメ；コンブモドキ、コモンブクロ、エゾフクロ、ニセカヤモ、ウイキョウモ、サメズグサ、キタイワヒゲ、イワヒゲ、ハバモドキ、ヨコジマノリ；ヤハズグサ、アミジグサ、ニセアミジ、フタエオウギ、ヤレオウギ、ハイオウギ、サナダグサ、ウミウチワ、コモングサ、ヂガミグサ、シマオウギ；スギモク、ウガノモク、ヒバマタ、ヒジキ、ヤバネモク、ジョロモク、エゾイシゲ、ホンダワラ、ラッパモク；マツモ、クロハンモン、キンイロハンモン、イシツキゴビア、ニセイシノカワ、イソガワラ；ムラチドリ、フクロノリ、ハバノリ、カゴメノリ、セイヨウハバノリ、カヤモノリ；イソブドウ、シオミドロ、ピラエラ、ヤドリミドロ；クロガシラ、カシラザキ；ウルシグサ；ムチモ；イチメガサ、ウミボッス、ケヤリ；ウスバオウギが含まれる。
【００２１】
本明細書で「モズク」というときは、特別な場合を除き、ナガマツモ目のナガマツモ科（Chordariaceae）、ニセモズク科（Acrohtricaeae）又はモズク科（Spermatochnaceae）に属する褐藻類をいい、これには、イシモズク、フトモズク、クロモ、マツモ、モズク（Nemacystus decipiens  Okam）（通称：イトモズク）、オキナワモズク（Cladoshiphon okamuranus Tokida）（通称：フトモズク）、ニューカレドニア近海に生育するCladoshiphon novae-caledoniae Kylin）及びトンガ王国近海に生育するCladoshiphon caledoniae  Kylinが含まれる。
【００２２】
本発明の医薬組成物は、インスリンの抵抗性の改善を必要とする疾患又は状態の処置のために用いることができる。インスリンの抵抗性の改善を必要とする疾患又は状態の例は、インスリン非依存性糖尿病（II型糖尿病ということもある。）である。糖尿病は、インスリン作用の不足による慢性高血糖を主徴とし、種々の特徴的な代謝異常を伴う疾患群である。糖尿病であるか否かの判断は、糖代謝異常の判定区分（糖尿病型（空腹時血糖値≧126mg/dl又は75g糖負荷試験（75gOGTT）2時間値≧200mg/dl，あるいは随時血糖値≧200mg/dl），正常型（空腹時＜110mg/dl，かつ2時間値＜140mg/dl），境界型（糖尿病型でも正常型でもないもの））により判断することができる。これらの基準値は通常、静脈血漿値である。持続的に糖尿病型を示すものを糖尿病と判断することができる。糖尿病はまた、成因により、I（膵β細胞破壊を特徴とする）、II（インスリン分泌低下とインスリン感受性の低下（インスリン抵抗性）の両者が発症に関わる）、III（その他の特定の機序、疾患によるもの）、IV（妊娠糖尿病）に大別される。
本明細書において疾患又は状態について「処置」というときは、特別な場合を除き、その疾患又は状態について、治療すること、予防すること、進行を遅延又は停止すること、良好な状態を維持することが含まれ、治療には、症状を抑える対処的治療と、根本的な治療とが含まれる。
【発明を実施するための好ましい態様】
【００２３】
本発明の「褐藻類由来の、レチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体形成を結合を阻害することができるカロチノイド画分を含む、インスリンの抵抗性の改善を必要とする疾患又は状態の処置のための、医薬組成物」におけるカロチノイド画分は、好ましくは、カロチノイドのうち、比較的かさ高く（例えば、フコキサンチンと同程度の分子量を有し）、そのためレチノール結合蛋白質と結合したときに、立体的に障害となってレチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体の形成を阻害することができるようなカロチノイドを含む。カロチノイドのうち、-OH型であるものが好ましい場合がある。カロチノイドは、天然のものでも、合成されたものでもよい。カロチノイド画分は、より好ましくは、フコキサンチン及びその類縁体、フコキサンチン、又はフコキサンチン類縁体からなる。フコキサンチンは、本発明に用いられるカロチノイドの最も好ましい例の一つである。なお、本発明を、前掲の化学式で示される特定立体配置を有するフコキサンチンを例に説明することがあるが、その説明は、特別な場合を除き、フコキサンチンの種々の立体異性体（シス−トランス異性体、光学異性体）にも当てはまる。
【００２４】
フコキサンチン以外の他の成分を含むカロチノイド画分もまた、本発明の医薬組成物に好適に用いることができる。褐藻類は、フコキサンチンを比較的多く含むことが知られているが、褐藻類からカロチノイドを分画しようとすると、得られたカロチノイド画分にはフコキサンチン以外に、他の成分が含まれることがある。
【００２５】
本発明の医薬組成物のためのカロチノイド画分、フコキサンチン及び／又は類縁体は、天然物由来であっても、合成されたものであってもよい。原料としては、天然又は養殖されたモズク、特にオキナワモズク（Cladoshiphon okamuranus Tokida）、Cladoshiphon novae-caledoniae Kylin）、又はCladoshiphon caledoniae Kylinを好適に用いることができる。ミネラルを豊富に含み、重金属類の有害物質が検出されないという観点からは、トンガ産の天然のCladoshiphon caledoniae Kylinを用いることが好ましい。
【００２６】
本発明の医薬組成物の用量、投与経路、剤形は、当業者であれば適宜設計することができる。
【００２７】
用量は、例えば、インスリン非依存性糖尿病の治療の目的では、成人一日当たり0.02〜200mg/kg、好ましくは0.05〜100mg/ml、より好ましくは0.1〜50mg/mlとすることができる。予防、維持の目的では、より少ない量で効果的な場合もありうる。投与は一日分の量を、単回で投与してもよく、複数回（例えば、一日2回又は3回）に分割して投与してもよい。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、経口的に投与することができ、また腹腔内、皮下、静脈内に投与することができる。本発明の医薬組成物は、当業者であれば、投与経路に応じた種々の製剤形態とすることができ、例えば、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、注射剤とすることができる。経口投与製剤は、好ましい例の一つである。フコキサンチンを有効成分とする場合は、フコキサンチンが水不溶性であることから、油脂又はDMSO等の溶媒に溶解して製剤化することもできる。
【００２９】
本発明の医薬組成物は、医薬として許容される添加剤、例えば、賦形剤、結合剤、安定剤、保存剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、溶解剤、緩衝剤を用いることができる。
【００３０】
本発明の医薬組成物において、フコキサンチン及び／又は類縁体を有効成分とする場合は、フコキサンチンが比較的不安定な物質であることから、製剤化の際には、フコキサンチンの安定化のための成分を含有させることが好ましい。例えば、α-トコフェロール等の抗酸化物質の添加は、本発明の好ましい態様の一つである。また、本発明者らの検討では、フコイダンを添加した場合に、フコキサンチンを安定的に保持することができた（データ示さず。）。したがって、本発明は、臨床上有効量のフコキサンチン及びフコキサンチン安定化上有効量のフコイダンを含む、医薬組成物も提供する。フコイダンは、フコース、キシロース、ガラクトース、ウロン酸等（原料褐藻類によってはマンノースを含むことがある。）で構成される褐藻類由来の硫酸化多糖体である。構成糖にフコースのみを持つものを「フコイダン」 フコース以外の糖を含むものを「フコイダン様多糖体」と称することもあるが、ここでいうフコイダンには、双方が含まれる。フコイダンの原料としては、天然又は養殖されたモズク、特にオキナワモズク（Cladoshiphon okamuranus Tokida）、Cladoshiphon novae-caledoniae Kylin）、又はCladoshiphon caledoniae Kylinを好適に用いることができる。ミネラルを豊富に含み、重金属類の有害物質が検出されないという観点からは、トンガ産の天然のCladoshiphon caledoniae Kylinを用いることが好ましい。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、単独で使用してもよく、医薬品や食品に一般的に使用されている他の成分と併用してもよい。また、糖尿病治療のための他の医薬、療法と併用することができる。
【００３２】
本発明はまた、フコキサンチンを含む、レチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体形成阻害剤を提供する。本発明はまた、褐藻類からレチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体形成を阻害することができるカロチノイドを抽出する工程を含む、褐藻類由来の、レチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体形成を結合を阻害することができるカロチノイド画分を含む、インスリンの抵抗性の改善を必要とする疾患又は状態の処置のための、医薬組成物の医薬組成物を提供する。この製造方法は、さらにフコイダンを添加する工程を含んでもよい。
【００３３】
以下、実験例に基づいて本発明をより詳細に説明する。
【実験例１】
【００３４】
〔モズクからのフコキサンチン及びその類縁体の調製〕
クラドシフォン カレドニア キリン（Cladoshiphon caledoniae Kylin、トンガ王国産。冷凍、生。）から、フコキサンチン及びその類縁体を調製した。方法は、Hosokawaら（Hosokawa M., et. al. Apoptosis-Inducing effect of fucoxanthin on human leukemia cell line HL-60, Food Sci. Technol. Res., 5（3）, 243-246, 1999）の方法に準じた。詳細には、1kgの原料に2kgのメタノールを加え、時々撹拌しながら遮光下で2日間室温に放置した。固／液分離により抽出液を得、減圧下にてメタノールを除去した。減圧乾固した抽出物を、脱イオン水と酢酸エチル混合液（1:1）を加えて溶解し、分液ロートに移した。酢酸エチル層を分取し、再度加水し、液／液分配した。酢酸エチル層を分取した後、減圧下にて酢酸エチルを除去し、赤褐色、ペースト状の物質約1g（収率0.1％）を得た。
【００３５】
これを本発明のフコキサンチン及びその類縁体として、以下の実験に供した。
【実験例２】
【００３６】
センサーチップ（CM5 Research Grade、ビアコア社製）に、ヒト由来レチノール結合蛋白質（和光純薬社製）をビアコア社のマニュアルに基づいて固定化した。実施例1のフコキサンチン及びその類縁体、並びに市販のレチノール、レチナール、αカロチン、β-カロチン、リコピン、ゼアキサンチン、β-クリプトキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ルチン等の各カロチノイドを、10%（v/v）エチルアルコールに溶解し、ビアコアS3000（ビアコア社製）にアプライし、表面プズモン共鳴法にて、レチノール結合蛋白質との親和性を調べた。結果を表1にまとめて示す。
【００３７】
【表１】
2007314451.tif 000003
【００３８】
レチノール結合蛋白質と高い親和性を有するカロチノイドはフコキサンチン及びその類縁体のみであった。
【実験例３】
【００３９】
〔カロチノイドを結合させたレチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体形成阻害能に関する検討〕
10mgのレチノール結合蛋白質を10mlのPBSに溶解し、これにフコキサンチン及びその類縁体0〜10mg/ml・10%エチルアルコール溶液を1ml添加して室温下で30分間反応させた。脱塩カラムにて未反応のフコキサンチン及びその類縁体を除去した。この溶液に、PBSに溶解したトランスサイレチン（10mg/ml PBS、1ml）（人血由来・和光純薬）を加え、室温下で30分間反応させた後、ゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル濾過トーソーHW50S、トーソー社製）にて複合体形成能について調べた。
【００４０】
キャリアーソルベントは各蛋白質を溶解した緩衝液と同じPBSとした。レチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体の分子量は約80kDaであることから、この分子量位置に溶出される物質のピークハイトの割合を測定した。結果を表2に示す。
【００４１】
【表２】
2007314451.tif 000004
【００４２】
表2から明らかなように、フコキサンチン及びその類縁体がレチノール結合蛋白質とトランスサイレチンとの複合体形成を明瞭に阻害した。
【実験例４】
【００４３】
生体内でも実施例３と同様な現象が生ずると考えられるので、高脂肪食によりインスリン抵抗性やグルコース不耐性を生じさせたラットにフコキサンチン及びその類縁体を経口投与し、尿と血液中のレチノール結合蛋白質の変動を調べた。さらに、血糖値についてもその影響を測定した。
【００４４】
詳細には、4週令のウイスター系ラット（♂）を高脂肪食（クレア社製）で8週間飼育し、血糖値が充分に上昇していることを確認した後、体重1kg当たり1mgのフコキサンチン及びその類縁体を脱イオン水に混合して、胃ゾンデで強制的に経口投与した。投与は12時間間隔で1日に2回とし、2週間連続した。フコキサンチン及びその類縁体の投与前を0日とし、7日目と14日目にエーテル麻酔下にて眼底静脈から採血し、レチノール結合蛋白質と血糖値を測定した。また尿中のレチノール結合蛋白質は全尿で検討した。レチノール結合蛋白質は抗レチノール結合蛋白質抗体（ダコー社製）を用いたELISA法で、血糖値は血糖値測定キット（和光純薬社製）を用いて測定した。結果を表3に示す。
【００４５】
【表３】
2007314451.tif 000005
【００４６】
実験的に高脂肪食で作成した糖尿病ラットの血糖値はフコキサンチン及びその類縁体の経口投与で表3に示したように、投与1週間目で既に48%も低下していた。この時の血清中レチノール結合蛋白質の量は14%低下しており、尿中に排泄されていたそれは600%程度上昇していた。この現象はレチノール結合蛋白質量の異常がインスリン抵抗性やグルコース不耐症を伴うインスリン非依存性糖尿病のトリガーであるとの仮説を証明するものである。
【実験例５】
【００４７】
次に、インスリン非依存性糖尿病ヒトボランティア（♂、♀）に、実験例1で記載した方法で調製したフコキサンチン及びその類縁体を、体重1kg当たり1mg、朝と夕の1日2回経口摂取させた。15日目と30日目に上腕静脈から採血し、血糖値を測定した。その結果を表4に示す。
【００４８】
【表４】
2007314451.tif 000006
【実験例６】
【００４９】
実施例1で得られたフコキサンチン及びその類縁体について分析した。
【００５０】
フコキサンチン及びその類縁体の吸収極大（99.5% ethanol）は、450.5nmであった。
【００５１】
市販のフコキサンチンと、フコキサンチン及びその類縁体とを、薄層シリカゲルクロマトグラフィー（TLC）で展開した。方法は、前掲Hosokawaら（1999）の方法に準じた。フコキサンチン及びその類縁体には、市販のフコキサンチンと同じ位置とそれ以外の位置とに、計2つのスポットが認められた。市販のフコキサンチン（和光純薬工業株式会社製）と同じ位置に表れたスポットについて求めたRf値は0.307であった。
【００５２】
下記の条件のLCMSでは、図1のようなチャートが得られた。
【００５３】
【表５】
2007314451.tif 000007
[発明の効果]
【００５４】
本発明により、肥満やインスリン非依存性糖尿病時にインスリン抵抗性によって生ずる高血糖をより安全な天然
型カロチノイドであるフコキサンチンで容易に改善することが可能になった。従来、インスリン抵抗性や肝臓での糖の新生による空腹時高血糖の改善は非常に困難であるとされており、これを改善するには既述した合成カロチノイドであるPPAR-γ作動薬程度とされていた。本発明のレチノール結合蛋白質量の改善により、インスリン抵抗性を改善させる天然物質の発見は初めての知見である。本発明によって、世界的にますます増加してきている肥満やインスリン非依存性糖尿病患者を治療できるばかりではなく、後に生ずる各種合併症の発症も未然に防ぐことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図1は、実施例1のフコキサンチン及びその類縁体について、LCMSによる分析結果を示したチャートである。
【図１】
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