(57)【要約】【課題】褐変原因菌の増殖開始前に培地自体の褐変が生じない改良された褐変原因菌検出培地およびその調製方法を提供する。【解決手段】ＰＧＧ培地を構成する成分中ビーフエクストラクトをイーストエクストラクトで置換するとともに、該培地を構成する成分中糖成分と他の成分をそれぞれ別個に加熱滅菌した後混合する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＧＧ培地を構成する成分中ビーフエクストラクトをイーストエクストラクトで置換するとともに、該培地を構成する成分中糖成分と他の成分をそれぞれ別個に加熱滅菌した後混合することを特徴とする褐変原因菌検出培地の調製方法。
【請求項２】
ＰＧＧ培地を構成する成分中ビーフエクストラクトをイーストエクストラクトで置換するとともに、該培地を構成する成分中糖成分と他の成分をそれぞれ別個に加熱滅菌した後混合してなる褐変原因菌検出培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、缶詰等容器詰食品の加熱殺菌後に生じる褐変の原因となる細菌を検出するための改良された培地およびその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来容器詰食品の加熱殺菌後に生じる褐変の原因となる細菌を検出するためＳＭＡ培地（標準寒天培地）やＰＧＧ培地が使用されている。ＰＧＧ培地の組成は、通常ペプトン１％、ビーフエクストラクト０．５％、グルコース５％、グルタミン酸ナトリウム５％、塩化ナトリウム０．５％、寒天１．５％からなり、ｐＨは７．０〜７．５である。ＰＧＧ培地は、これらの成分の粉末を蒸留水に溶かし、オートクレーブで１２１℃、１５分の加熱滅菌を行うことによって調製する。
【０００３】
しかし、以前より、このようにしてＰＧＧ培地を調製する場合、オートクレーブによる加熱により培地自体がある程度褐変することが知られている。
【０００４】
オートクレーブによって培地に生成される褐変物質（メラノイジン）には抗菌作用があることが知られており、このためこの褐変物質が生成したＰＧＧ培地で褐変原因菌の増殖を行うと、ＳＭＡ培地で増殖を行った場合に比べて検出される生菌数が少ないという結果を生じ、褐変原因菌の正確な検出ができない、という問題を生じていた。また、褐変原因菌の培養を開始する以前に培地自体がある程度褐変しているために、バックグラウンドが高くなり、褐変原因菌の視認性が劣るという問題を生じていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、褐変原因菌検出用培地としての従来のＰＧＧ培地の問題点にかんがみなされたものであって、褐変原因菌の増殖開始前に培地自体の褐変が生じない改良された褐変原因菌検出培地を提供し、またその調製方法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ＰＧＧ培地の調製に際し、オートクレーブによる加熱により培地自体に褐変が生じるのは、ＰＧＧ培地の組成に糖成分とアミノ酸成分が含まれているため、これら両成分による非酵素的褐変反応が生じるためと考えられる。本発明者らは、上記本発明の課題を解決するため研究と実験を重ねる過程においてこの点に着目し、従来のようにＰＧＧ培地中の糖成分とアミノ酸成分を混合した後にオートクレーブで加熱滅菌するかわりに両成分を分けてそれぞれ加熱滅菌した後に混合して培地とすれば、両成分間の非酵素的褐変反応を抑制できることを見出し、本発明に到達した。また、本発明者らは、従来のＰＧＧ培地組成の１成分であるビーフエクストラクトが糖成分と非酵素的に反応するアミノ酸を多量に含んでいる上に加熱によりそれ自体褐変し、培地自体の褐変を増大する原因の一つとなっていることを見出し、ビーフエクストラクトをこのような褐変を起こし難い成分であるイーストエクストラクトに変えることにより培地自体の褐変を減少させることに成功した。
【０００７】
すなわち、上記本発明の課題を解決する褐変原因菌検出培地の調製方法は、ＰＧＧ培地を構成する成分中ビーフエクストラクトをイーストエクストラクトで置換するとともに、該培地を構成する成分中糖成分と他の成分をそれぞれ別個に加熱滅菌した後混合することを特徴とするものである。
【０００８】
また、上記本発明の課題を解決する褐変原因菌検出培地は、ＰＧＧ培地を構成する成分中ビーフエクストラクトをイーストエクストラクトで置換するとともに、該培地を構成する成分中糖成分と他の成分をそれぞれ別個に加熱滅菌した後混合してなるものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ＰＧＧ培地を構成する成分中ビーフエクストラクトをイーストエクストラクトで置換するとともに、該培地を構成する成分中糖成分と他の成分をそれぞれ別個に加熱滅菌した後混合することにより、ビーフエクストラクトによる培地の褐変が防止され、また糖成分とアミノ酸成分相互間の非酵素的褐変反応が生じることがなく、褐変原因菌の増殖開始前に培地自体の褐変が生じない改良された褐変原因菌検出培地を提供することができる。
【００１０】
したがって、褐変原因菌の検出精度を上げることができ、またバックグラウンドが改善されることにより褐変原因菌の視認性を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下本発明の実施の形態について説明する。  
本発明に係る培地は、ペプトン、イーストエクストラクト、グルコース、グルタミン酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよび寒天を主成分として含有し、ビーフエクストラクトを含有しない。培地組成の好適な一例は、ペプトン１％、イーストエクストラクト０．５％、グルコース５％、グルタミン酸ソーダ５％、塩化ナトリウム０．５％、寒天１．５％を含有し、ｐＨ７．０〜７．５の培地である。
【００１２】
培地を調製するには、これらの諸成分の中グルコースの粉末を蒸留水に溶かしてグルコース水溶液とする一方これら諸成分中グルコースを除く成分の粉末をまとめて蒸留水に溶かしてこれら他の成分の水溶液を作る。グルコース水溶液および他の成分の水溶液をそれぞれ別個にオートクレーブで適当な滅菌条件たとえば１２１℃、１５分の滅菌条件で加熱滅菌した後冷却する。
【００１３】
こうして別々に加熱滅菌したグルコース水溶液および他の成分の水溶液はそのまま保存しておき、褐変原因菌接種のために培地をシャーレ等に分注する前に両成分を混合して褐変原因菌検出培地とする。
【００１４】
検出対象菌の増殖を阻害する酵母、カビ等の真菌の増殖を防止し検出対象菌のみを充分に増殖させるためにアンホテリシン（Amphotericin）Ｂやミコナゾール（Miconazole）のように耐熱性のない抗真菌剤を培地に添加する場合は、別途メンブレンフイルター等によって予め除菌を行った後加熱滅菌後の他の培地成分または混合培地に添加する。
【００１５】
本発明に係る培地の検出対象となる褐変原因菌としては、たとえば、Gluconobactor oxydans、Enterobactor intermidius、Ewingella Americana、Tatumera Ptyseous、Rahnella aquatilisを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００１６】
培地成分の混合および必要により抗真菌剤の添加後、培地をシャーレ等に分注し、検出対象の褐変原因菌を培地に接種し、培養することにより、検出対象菌を増殖し、分離し、菌数を測定する。
【実施例１】
【００１７】
ＰＧＧ改良培地１の調製
培地組成が、ペプトン１％、イーストエクストラクト０．５％、グルコース５％、グルタミン酸ソーダ５％、塩化ナトリウム０．５％、寒天１．５％を含有し、ｐＨ７．０〜７．５となるように各成分の粉末を用意した。  
これらの諸成分の中グルコースの粉末を蒸留水に溶かしてグルコース水溶液とする一方これら諸成分中グルコースを除く成分の粉末をまとめて蒸留水に溶かしてこれら他の成分の水溶液を作った。グルコース水溶液および他の成分の水溶液をそれぞれ別個にオートクレーブで１２１℃、１５分の滅菌条件で加熱滅菌した後冷却した。  
こうして別々に調製したグルコース水溶液および他の成分の水溶液はそのまま保存しておき、褐変原因菌接種のために培地をシャーレの平板に塗抹する直前に両成分を混合してＰＧＧ改良培地とした。
【００１８】
次いで検出対象菌としてEnterobactor intermidius菌を培地に接種し、培養を行った後増殖した生菌数を分離し、生菌数を測定した。
【００１９】
ＰＧＧ改良培地２の調製
ＰＧＧ改良培地１と同一組成、同一工程によりグルコース水溶液および他の成分の水溶液を別個に調製した後培地をシャーレの平板に塗抹する直前に両成分を混合し、この混合溶液にさらに抗真菌剤としてAmphotericin Ｂ１０ｐｐｍを添加混合してＰＧＧ改良培地２とした。以下ＰＧＧ改良培地１と同様にして検出対象菌の接種、培養、分離、菌数測定を行った。
【００２０】
ＰＧＧ培地１の調製
比較のため、培地組成が、ペプトン１％、ビーフエクストラクト０．５％、グルコース５％、グルタミン酸ソーダ５％、塩化ナトリウム０．５％、寒天１．５％を含有し、ｐＨ７．０〜７．５となるように各成分の粉末を用意した。  
これらの諸成分の粉末をまとめて蒸留水に溶かして培地成分水溶液を作った。この水溶液をオートクレーブで１２１℃、１５分の滅菌条件で加熱滅菌した後冷却してＰＧＧ培地１を調製した。
【００２１】
次いでこのＰＧＧ培地１をシャーレの平板に塗抹し、検出対象菌としてEnterobactor intermidius菌を培地に接種し、培養を行った後増殖した生菌数を分離し、菌数を測定した。
【００２２】
ＰＧＧ培地２の調製
ＰＧＧ培地１と同一組成、同一工程により培地を調製し、さらに抗真菌剤としてAmphotericin Ｂ１０ｐｐｍを添加混合してＰＧＧ培地２とした。以下ＰＧＧ培地１と同様にして検出対象菌の接種、培養、分離、菌数測定を行った。
【００２３】
各種培地による生菌数の比較
上記各培地による検出対象菌の菌数測定の結果を図１のグラフに示す。図１中ＳＭＡは比較のために使用したバールコア標準寒天培地を示す。このＳＭＡ培地においては、上記各培地で使用したEnterobactor intermidius菌を上記各培地の場合と同一条件で接種し、培養を行った後増殖した生菌数を分離し、菌数を測定した。また、図１において、ＰＧＧ１は上記ＰＧＧ培地１を、ＰＧＧ２は上記ＰＧＧ培地２を、ＰＧＧ（改１）は上記ＰＧＧ改良培地１を、ＰＧＧ(改２)は上記ＰＧＧ改良培地２をそれぞれ示す。
【００２４】
図１から、上記ＰＧＧ改良培地１の測定生菌数はＳＭＡ培地の測定生菌数に比べて実質的に遜色がなく、これを従来のＰＧＧ培地１と比べて有意に多く、またＰＧＧ改良培地２の測定生菌数はＰＧＧ培地２と比べて有意に多いことが判る。
【実施例２】
【００２５】
従来のＰＧＧ培地と本発明に係る改良ＰＧＧ培地における褐変原因菌の増殖による培地の褐変の度合いを視覚的に客観的に数値化するために、コニカミノルタ株式会社製ＭＩＮＯＬＴＡ色差計ＣＲ−２００を用いて菌の生えている培地部分すなわち検出対象菌を接種して増殖させた培地部分と菌が生えていない培地部分のＬ値、ａ値およびｂ値をそれぞれ測定した。その結果を下表１に示す。表１において、「ＰＧＧ改」は実施例１のＰＧＧ改良培地１を示す。また「菌あり」は検出対象菌を接種、培養した培地部分を示し、「菌なし」は検出対象菌を接種していない培地部分を示す。Ｌ、ａ、ｂは検出対象菌を接種した時点での測定値であり、ΔＬ、Δａ、Δｂは菌が増殖を終了した時点でのＬ値、ａ値、ｂ値の変化量を示す値である。したがって、ΔＬが大きいほど褐変の度合いは大きいこと、すなわち生菌数が増えたことを示すものである。
【００２６】
表１
コントロール
L       a      b     ΔL     Δa     Δb  
ＰＧＧ    菌無し  31.86    3.25  10.15    0       0       0   
ＰＧＧ改  菌なし  38.14  −0.36   5.56    0       0       0   
検出対象菌 Gluconobactor oxydans
L       a       b     ΔL     Δa     Δb 
ＰＧＧ    菌あり  24.93    4.84   2.06    6.93  −1.59    8.09 
菌なし  31.82    3.51   10.11   0.04  −0.26    0.04 
ＰＧＧ改  菌あり  23.13    1.61    0.3   15.01    1.97    5.26 
菌なし  37.89  −0.45   5.95    0.25    0.09  −0.39 
検出対象菌 Enterobactor intermidius
L       a      b     ΔL     Δa     Δb  
ＰＧＧ    菌あり  24.1    3.68    1.31   7.76   −0.43    8.84 
菌なし  32.01   3.26   10.77   0.15   −0.01  −0.62 
ＰＧＧ改  菌あり  23.65   1.9     0.21   8.21     1.25    9.94 
菌なし  38.07  −0.47   5.42   0.07     0.11    0.14 
検出対象菌 Tatumera ptyseous
L       a       b     ΔL     Δa     Δb 
ＰＧＧ    菌あり  28.19    6.6    5.74   3.67   −3.35    4.41 
菌なし  32.46   2.94   10.84  −0.6     0.31  −0.69 
ＰＧＧ改  菌あり  27.34   6.98    5.78    10.8  −7.34  −0.22 
菌なし  38.32 −0.54    4.77  −0.18    0.18    0.79 
検出対象菌 Rhanella aquatilis
L       a       b     ΔL     Δa     Δb 
ＰＧＧ    菌あり  27.92   6.47    5.98   3.94   −3.22    4.17 
菌なし  32.94   2.64   11.2  −1.08     0.61  −1.05 
ＰＧＧ改  菌あり  27.4    6.91    5.87  10.74 .  −7.27  −0.31 
菌なし  38.   −0.42    4.53   0.14     0.06    1.03 
検出対象菌 Ewingella americana
L        a      b     ΔL     Δa     Δb 
ＰＧＧ    菌あり  26.38    5.52    3.34   5.48  −2.27    6.81 
菌なし  32.71    2.79    11.1  −0.85   0.46  −0.95 
ＰＧＧ改  菌あり  25.32    5.54    3.36   12.82  −5.9    2.2  
菌なし  38.12  −0.45    5.3    0.02    0.09   0.26  
表１から明らかなように、従来のＰＧＧ培地ではΔＬは３．７〜７．８であるのに対して本発明に係るＰＧＧ改良培地ではΔＬは８．２〜１５．１であり、色の差が数値的にもはっきりと判る。したがって、本発明の培地によれば、培地自体の褐変を抑えることによって、視覚的にもバックグラウンドが低くなり、従来のＰＧＧ培地よりも褐変原因菌の検出が容易にできることが判る。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】各培地による検出対象菌の菌数測定結果を示すグラフである。
【図１】
2007116917.tif 000002