(57)【要約】【課題】肌のはり、たるみに対する改善効果や皮膚の抗老化作用を示すことができ、かつ安全性の高いヒアルロン酸産生促進剤を見出すこと、及び該ヒアルロン酸産生促進剤を用いた皮膚外用剤を提供すること。【解決手段】本発明は、一般式（１）【化１】2007246421.tif 000012（ただし、式中、Ｒは水素原子、β−ガラクトシル基、β−（Ｎ−アセチルグルコサミニル）基、β−プリメベロシル基、またはβ−ゲンチオビオシル基を表し、ｎは１〜２の整数を表わす）で表わされるクロマノール誘導体を必須成分とするヒアルロン酸産生促進剤【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2007246421.tif 000010
（ただし、式中、Ｒは水素原子、β−ガラクトシル基、β−（Ｎ−アセチルグルコサミニル）基、β−プリメベロシル基、またはβ−ゲンチオビオシル基を表し、ｎは１〜２の整数を表わす）で表わされるクロマノール誘導体を必須成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項２】
請求項１に記載のヒアルロン酸産生促進剤を用いる皮膚外用剤。
【請求項３】
一般式（１−１）
【化２】
2007246421.tif 000011
（ただし、式中、Ｒ1はβ−（Ｎ−アセチルグルコサミニル）基、β−プリメベロシル基、またはβ−ゲンチオビオシル基を表し、ｎは１〜２の整数を表わす）で表わされるクロマノール誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全性の高いヒアルロン酸産生促進剤に関する。具体的には、クロマノール構造を有する化合物を必須成分とするヒアルロン酸産生促進剤、及びそれを用いた皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会が進みつつある中、老化防止に対する関心が高まっており、化粧料においても、各種の老化防止剤が開発され、利用されるに至っている。これら老化防止剤のうち、レチノイン酸またはレチノイン酸と同様のイソプレノイド鎖を有する化合物；ラベンダー抽出液，メソイの植物抽出液；N-メチル-L-セリン，エタノールアミン，N-メチルエタノールアミンまたはそれらの塩等を有効成分として含有するヒアルロン酸産生促進剤は、加齢とともに減少するヒアルロン酸量を補い、組織の柔軟性と湿潤性を向上させるため、優れた老化防止効果を持つことが報告（特開平０６−１８９７８０（特許文献１）、特開平０９−０８７１６３（特許文献２）、特開平１０−１８２４０２（特許文献３）、特開２００４−３５９５７３（特許文献４）等）されている。
【０００３】
また、ある種の２−（β−グリコシルオキシアルキル）クロマノールについては、その酸化防止作用に基づき、酸化防止剤、放射線防護剤、皮膚障害予防・治療剤、紫外線障害予防・治療剤、皮膚色素沈着予防・治療剤、皮膚美白化剤、皮膚老化防止剤、細胞賦活剤である皮膚外用剤などの用途が開示（特開平７−１１８２８７（特許文献５）、特開平１０−７２３５６（特許文献６）、ＷＯ００／５７８８９（特許文献７）等）されている。
【０００４】
しかしながら、レチノイン酸等のヒアルロン酸産生促進剤は、その有効性は確認されているものの、安全性の問題が指摘されている。また、植物抽出物などでは、ヒアルロン酸産生促進効果は十分ではなく、ヒアルロン酸産生促進剤として満足すべき機能を有する物質は見出せていないのが現状である。
【０００５】
また、上記２−（β−グリコシルオキシアルキル）クロマノールは、その酸化防止作用に基づく皮膚外用剤としての用途を提案しているが、皮膚老化防止に重要なヒアルロン酸産生促進作用については全く記載がなく、本発明の比較試験においても、その代表的化合物である２−（β−グルコシルオキシメチル）クロマノールはヒアルロン酸産生促進作用を示さなかった、後述の比較例  表４を参照）。
【特許文献１】特開平０６−１８９７８０号公報
【特許文献２】特開平０９−０８７１６３号公報
【特許文献３】特開平１０−１８２４０２号公報
【特許文献４】特開２００４−３５９５７３号公報
【特許文献５】特開平７−１１８２８７号公報
【特許文献６】特開平１０−７２３５６号公報
【特許文献７】ＷＯ００／５７８８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明者らは、安全性が高く、かつ有効なヒアルロン酸産生促進効果を持つヒアルロン酸産生促進剤を見出すことを課題とし、鋭意検討することにより、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ある特定のクロマノール骨格を有する化合物が、レチノイン酸等とは異なり、有効なヒアルロン酸産生促進効果を持ちながら、安全性が高く、さらに酸化・紫外線障害の抑制に有効な抗酸化作用も強いことを確認し、外用剤、化粧品として有用なことを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は
（１）一般式（１）
【化１】
2007246421.tif 000002
（ただし、式中、Ｒは水素原子、β−ガラクトシル基、β−（Ｎ−アセチルグルコサミニル）基、β−プリメベロシル基、またはβ−ゲンチオビオシル基を表し、ｎは１〜２の整数を表わす）で表わされるクロマノール誘導体を必須成分とするヒアルロン酸産生促進剤；
（２）上記（１）に記載のヒアルロン酸産生促進剤を用いる皮膚外用剤；
（３）一般式（１−１）
【化２】
2007246421.tif 000003
（ただし、式中、Ｒ1はβ−（Ｎ−アセチルグルコサミニル）基、β−プリメベロシル基、またはβ−ゲンチオビオシル基を表し、ｎは１〜２の整数を表わす）で表わされるクロマノール誘導体；である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、安全性が高く、かつ有効なヒアルロン酸産生促進効果を持つヒアルロン酸産生促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
一般式（１）で示されるクロマノール誘導体の内、Ｒが水素原子を表す２−ヒドロキシアルキルクロマノールは公知化合物であり（例えば、特開昭５８−２０１７７５号公報、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、１０１巻、２２号、６７１０頁参照）、また、Ｒがβ−ガラクトシル基を表す２−（β−ガラクトシルオキシアルキル）クロマノールも公知化合物であり（例えば、特開平９−２４９６８８号公報参照）、公知の方法により容易に入手することができる。
【００１１】
一方、ＲおよびＲ1がβ−（Ｎ−アセチルグルコサミニル）基を表す２−（β−（Ｎ−アセチルグルコサミニル）オキシアルキル）クロマノールは新規化合物であり、下記一般式（２）で示される通り、２−ヒドロキシアルキルクロマノールとＮ−アセチルグルコサミンオリゴマーやアリール  Ｎ−アセチルグルコサミニドなどの糖供与体とをＮ−アセチルヘキソサミニダーゼなどの糖転移酵素の存在下、反応させることにより容易に得ることができる。
一般式（２）：
【化３】
2007246421.tif 000004
（式中、ｎは１または２を表す。）
【００１２】
さらに、ＲおよびＲ1が、β−プリメベロシル基、またはβ−ゲンチオビオシル基を表す２−（β−プリメベロシルオキシアルキル）クロマノールおよび２−（β−ゲンチオビオシルオキシアルキル）クロマノールも新規化合物であり、一般式（３）で示される通り、２−ヒドロキシアルキルクロマノールと、相当する二糖の１−Ｏ−ｐ−ニトロフェニルエーテルなどの脱離基を有する二糖誘導体とをプリメベロシダーゼなどの二糖転移酵素の存在下に反応させることにより容易に得ることができる。
一般式（３）
【化４】
2007246421.tif 000005
（式中、ｎは１または２を表し、Ｒ2はβ−プリメベロシル基またはβ−ゲンチオビオシル基を表し、Ｙは脱離基を表す。）
【００１３】
これらの配糖化反応は、溶媒の存在下に実施され、使用される溶媒としては、水、リン酸緩衝液、酢酸塩緩衝液、などの水性溶媒およびこれらとともに用いることができるジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリルなどの共溶媒が挙げられる。添加する共溶媒の濃度は１〜５０（ｖ／ｖ）％、反応効率の観点から好ましくは５〜３５（ｖ／ｖ）％である。上記式（３）におけるＲ2−Ｙに相当するｐ−ニトロフェニ配糖体の濃度は１〜７０（ｗ／ｖ）％、好ましくは５〜５０（ｗ／ｖ）％である。ｐＨは４．５〜８．５、好ましくは５．０〜７．５である。反応温度は１０〜７０℃、好ましくは２０〜６０℃である。反応時間は１〜６０時間、好ましくは２〜５０時間である。但し、これらの条件は使用する前記酵素の種類および量により影響をうける。
【００１４】
このようにして得られたクロマノール誘導体（１）の水に対する溶解度は、例えば２５℃で（２，３−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−ベンゾピラン−２−イル）メタノール（ＨＭＣ）は０．０２ｇ／１００ ｍｌ、１β−Ｏ−（２，３−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−ベンゾピラン−２−イル）メチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ−ＨＭＣ）は６．０ｇ／１００ ｍｌと高いものとなり、水溶性剤としての利用が可能である。また、該クロマノール誘導体の熱安定性およびｐＨ安定性も向上する。
また、これらのクロマノール誘導体（１）は、高い抗酸化作用を有しており、生体内の酸化ストレスによる老化防止にも有効である。類似骨格を有する２−（β−グルコシルオキシメチル）クロマノールが全くヒアルロン酸合成促進作用を示さなかったこと（後述の比較例  表４を参照）からも明らかなように、本発明化合物のみがヒアルロン酸合成促進作用を有することは予想外の現象であった。これらのクロマノール誘導体の中でも、特に２−（β−（Ｎ−アセチルグルコサミニル）オキシアルキル）クロマノール、２−（β−ガラクトシルオキシアルキル）クロマノール、ヒドロキシアルキルクロマノールに高いヒアルロン酸産生促進作用が見出された。
【００１５】
本発明の皮膚外用剤の形態は特に制限されることは無く、クリーム、乳液、ローション、メイクアップ化粧料（ファンデーション等）等が挙げられる。また、用途としては皮膚老化防止化粧料、あるいは紫外線防止化粧料に有効に用いることができる。
【００１６】
本発明の皮膚外用剤には、上記必須成分のほか、本発明の効果を損なわない範囲で化粧品、医薬部外品などの皮膚外用剤に配合される成分として通常用いられている成分、すなわち動植物油由来の硬化油、天然由来のロウ、炭化水素系の油相成分、動植物由来の油相成分、シリコーン系の油相成分、フッ素系の油相成分、炭素数１１〜２０の高級アルコール、増粘剤、紫外線吸収剤、粉体、顔料、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、多価アルコール、糖、高分子化合物、生理活性成分、経皮吸収促進剤、溶媒、酸化防止剤、香料、防腐剤等を配合することができる。
【００１７】
本発明の皮膚外用剤に有効成分として含まれるヒアルロン酸産生促進剤としてのクロマノール誘導体は、その含有量が０．０００１質量％以上であれば有効に機能を発揮する。
【実施例】
【００１８】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００１９】
［合成実施例１］
１β−Ｏ−（２，３−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−ベンゾピラン−２−イル）メチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＨＭＣ−β−ＧｌｃＮＡｃ）の合成
１β−Ｏ−（４−ニトロフェニル）−Ｎ−アセチルグルコサミン（ｐＮＰ−β−ＧｌｃＮＡｃ）（０．４０ｍｍｏｌ）および（２，３−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−ベンゾピラン−２−イル）メタノール（ＨＭＣ）（２．５
ｍｍｏｌ）を酢酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ５．５）１０ｍｌに溶解した後、アミコラトプシス・オリエンタリス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（β−ＮＡＨａｓｅ）（１．２Ｕ）を添加し、４０℃にて振とうしながら反応を行った。ＴＬＣにて反応の経時変化を追い（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水＝７／３／０．５（容量比））、反応開始から２４時間後に１００℃で１０分間煮沸して反応を停止させた。０．１Ｎ塩酸にてｐＨ３．５とした反応液と適量のクロロホルムを分液漏斗に加えて振とうし、反応液からｐ−ニトロフェノール（ｐＮＰ）およびＨＭＣを抽出した。得られた水層を濃縮してカラムクロマトグラフィ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０Ｓ）（φ２．４×６０ｃｍ）に供し、メタノール／水（１／３（容量比））溶液にて溶出させた。
生成物の検出は二重結合に由来する２１０ｎｍ、ベンゼン環に由来する３００ｎｍの吸光度およびフェノール硫酸法による４８５ｎｍの吸光度の測定により行い、目的画分を濃縮し凍結乾燥した。得られたＨＭＣ−β−ＧｌｃＮＡｃの収量は２ｍｇで収率はｐＮＰ−β−ＧｌｃＮＡｃあたり１％であった。
得られたＨＭＣ−β−ＧｌｃＮＡｃのＮＭＲスペクトルを以下に示す。
【００２０】
1 Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ：
１．２０，１．２１（ｓ，３Ｈ），１．７−２．１（ｍ），１．７６（ｓ，３Ｈ），
２．０９６（ｓ，３Ｈ），２．１０６（ｓ，３Ｈ），２．０８７，２，０９８，
２．１０９，２．１３９（ｓ，９Ｈ），２．６３−２．６５（ｍ，２Ｈ），
３．４２−３．９３（ｍ，６Ｈ），４．４９，４．５７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）
【００２１】
［合成実施例２］
ＨＭＣ−β−ＧｌｃＮＡｃの合成
Ｎ−アセチルグルコサミンテトラマー（（ＧｌｃＮＡｃ）4）（１．２ｍｍｏｌ）およびＨＭＣ（７．６ｍｍｏｌ）を酢酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ５．５）／アセトニトリル（７／３（容量比））混合液３１ｍｌに溶解し、Ａ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ由来β−ＮＡＨａｓｅ（１４Ｕ）を添加して４０℃にて振とうしながら反応を行った。ＴＬＣ（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水＝７／３／０．５（容量比））及びＨＰＬＣにて反応の経時変化を追い、反応開始から３０時間後、１００℃で１０分間煮沸して反応を停止させた。０．１Ｎ塩酸にてｐＨ３．５とした反応液と適量のクロロホルムを分液漏斗に加えて振とうし、反応液からＨＭＣを抽出した。得られた水層を濃縮してカラムクロマトグラフィ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０Ｓ）（φ６×９０ｃｍ）に供し、メタノール／水（１／３（容量比））溶液にて溶出させた。生成物の検出は二重結合に由来する２１０ｎｍ、ベンゼン環に由来する３００ｎｍの吸光度の測定により行った。目的物が存在すると思われる画分を濃縮し凍結乾燥した。得られたＨＭＣ−β−ＧｌｃＮＡｃの収量は１２４ｍｇで収率は（ＧｌｃＮＡｃ）4あたり１８％であった。
【００２２】
1 Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ：
１．２１（ｓ，３Ｈ），１．７０−１，７６（ｍ，２Ｈ），１．７６（ｓ，３Ｈ），
１．８８−２．０（ｍ，２Ｈ），２．０９６（ｓ，３Ｈ），２．１０６（ｓ，３Ｈ），
２．１４７（ｓ，３Ｈ），２．６−２．７（ｍ，２Ｈ），３．４４（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），３．５−３．３．５５（ｍ，１Ｈ），３．６７−３．７６（ｍ，３Ｈ），
３．８４（ｄ，Ｊ＝１１Ｈｚ，１Ｈ），３．９２（ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ，１Ｈ），
４．５８（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ）
【００２３】
［合成実施例３］
１β−Ｏ−（２，３−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−ベンゾピラン−２−イル）メチル−ガラクトピラノシド（ＨＭＣ−β−Ｇａｌ）の合成
ラクトース（１０ｍｍｏｌ）およびＨＭＣ（１０ｍｍｏｌ）を酢酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ５．５）／アセトニトリル（７／３（容量比））混合液４０ｍｌに溶解した後、ペニシリウム・マルチカラー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）由来ベータ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）（４．０Ｕ）を添加し、４０℃にて振とうしながら反応を行った。
ＴＬＣ（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水＝７／３／０．５（容量比））及びＨＰＬＣにて反応の経時変化を追い、反応時間３０時間にて、１００℃にて５分間煮沸して反応を停止させた。０．１Ｎ塩酸にてｐＨ３．５とした反応液と適量のクロロホルムを分液漏斗に加えて振とうし、反応液からＨＭＣを抽出した。
得られた水層を濃縮してカラムクロマトグラフィ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０Ｓ）（φ２．５×６０ｃｍ）に供し、メタノール／水（１／３（容量比））溶液にて溶出させた。生成物の検出は二重結合に由来する２１０ｎｍ、ベンゼン環に由来する３００ｎｍでの吸光度の測定により行った。目的物が存在すると思われる画分を濃縮し凍結乾燥した。得られたＨＭＣ−β−Ｇａｌの収量は１１ｍｇで収率はラクトースあたり０．３％であった。
【００２４】
1 Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ：
１．２４，１．２８（ｓ，３Ｈ），１．７４−１．８２（ｍ，２Ｈ），
１．９１−２．０２（ｍ，２Ｈ），２．０７４，２．０７８，２．０８３，
２．１２４（ｓ，９Ｈ），２．６２−２．６５（ｍ，２Ｈ），
３．５２−３．６３（ｍ，３Ｈ），３．６９−３．７６（ｍ，３Ｈ），
３．８７−３．９３（ｍ，２Ｈ），４．３７−４．４０（ｍ，１Ｈ）
【００２５】
［合成実施例４］
ＨＭＣ−β−Ｇａｌの合成
１β−Ｏ−（４−ニトロフェニル）ガラクトース（ｐＮＰ−β−Ｇａｌ）（４ｍｍｏｌ）およびＨＭＣ（１０ｍｍｏｌ）を酢酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ５．５）／アセトニトリル（７／３（容量比））混合液１０ｍｌに溶解し、Ｐ．ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ由来β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（９０ｍＵ）を添加して４０℃にて振とうしながら反応を行った。ＴＬＣ（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水＝７／３／０．５（容量比））及びＨＰＬＣにて反応の経時変化を追い、反応時間２２時間にて、１００℃で５分間煮沸して反応を停止させた。０．１Ｎ塩酸にてｐＨ３．５とした反応液と適量のクロロホルムを分液漏斗に加えて振とうし、反応液からＨＭＣを抽出した。
得られた水層を濃縮してカラムクロマトグラフィ（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０Ｓ）（φ６×９０ｃｍ）に供し、メタノール／水（１／３（容量比））溶液にて溶出させた。生成物の検出は二重結合に由来する２１０ｎｍ、ベンゼン環に由来する３００ｎｍの吸光度の測定により行った。目的物が存在すると思われる画分を濃縮し凍結乾燥した。得られたＨＭＣ−β−Ｇａｌの収量は２８ｍｇで収率はｐＮＰ−β−Ｇａｌあたり７％であった。
【００２６】
1 Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ：
１．２４，１．２８（ｓ，３Ｈ），１．７４−１．８３（ｍ，２Ｈ），
１．９１−２．０８（ｍ，２Ｈ），２．０７３，２．０７８，２．０８３
（ｓ，６Ｈ），２．１２４（ｓ，３Ｈ），２．６２−２．６５（ｍ，２Ｈ），
３．３５−３．９３（ｍ，８Ｈ），４．３７−４．７５（ｍ，１Ｈ）
【００２７】
［合成実施例５］
１β−Ｏ−（２，３−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−ベンゾピラン−２−イル）メチル−プリメベロース（ＨＭＣ−β−Ｐｒｉｍ）の合成
１β−Ｏ−（４−ニトロフェニル）プリメベロース（ｐＮＰ−β−Ｐｒｉｍ）（３５ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）およびＨＭＣ（５９ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を水８００μｌに加えて調製した基質溶液に、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解したＰ．ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ由来β−プリメベロシダーゼ（β−Ｐｒｉｍｅｖｅｒｏｓｉｄａｓｅ）を０．６Ｕ／ｍｌとなるように添加した。４０℃で４８時間振とうしながら反応させた後、１００℃で５分間煮沸することにより反応を停止させた。反応液を遠心分離し、その上清をメタノール／水（１／３（容量比））溶液で平衡化しておいたＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０Ｓ（φ２．４×７３ｃｍ）に供し、メタノール／水（１／３（容量比））溶液にて溶出させた。生成物の検出は二重結合に由来する２１０ｎｍ、ベンゼン環に由来する３００ｎｍ、中性糖のフェノール−硫酸法による４８５ｎｍの吸光度の測定により行った。目的物が存在すると思われる画分を濃縮し凍結乾燥した。得られたＨＭＣ−β−Ｐｒｉｍの収量は７．５２ｍｇで収率はｐＮＰ−β−Ｐｒｉｍあたり１７．５％であった。
【００２８】
［試験例］：ヒアルロン酸産生促進効果の確認
（２，３−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−ベンゾピラン−２−イル）メタノール（ＨＭＣ）および合成実施例２、４にて合成した１β−Ｏ−（２，３−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−ベンゾピラン−２−イル）メチル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＨＭＣ−β−ＧｌｃＮＡｃ）、１β−Ｏ−（２，３−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−ベンゾピラン−２−イル）メチル−ガラクトピラノシド（ＨＭＣ−β−Ｇａｌ）の各試料による正常ヒト真皮線維芽細胞のヒアルロン酸産生促進効果を表１から表３に示す。また、比較例として、１α−Ｏ−（２，３−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−ベンゾピラン−２−イル）メチル−グルコピラノシド（ＨＭＣ−α−Ｇｌｃ）による正常ヒト真皮線維芽細胞のヒアルロン酸産生促進効果を表４に示す。
【００２９】
各試料は、９９．５質量％エタノールに溶解後、培地で各濃度に希釈し、下記の方法により試験を行った。
【００３０】
〔細胞培養方法〕
正常ヒト真皮線維芽細胞は、２．０×１０4 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で９６穴マイクロプレートに播種した。０．５％牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ）にて２４時間培養後、所定の濃度の試料を含有した０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に交換した。陽性コントロールには５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いた。４８時間培養後、培養上清を採取しヒアルロン酸の産生量を下記の方法で定量した。
【００３１】
〔ヒアルロン酸の定量法〕
０．２ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸溶液をＥＬＩＳＡプレートに添加し、３７℃で１時間静置することによりコーティング処理し、更に１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を用いて３７℃にて１時間ブロッキング処理を行った。次にプロテオグリカンモノマー含有１％ＢＳＡ溶液、およびリン酸緩衝液（ＰＢＳ）にて１０倍希釈した培養上清を一晩静置した。その後、 一次抗体（抗ケラタン硫酸（マウス））を３７℃にて１時間反応させた。さらに、二次抗体（ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ１）を３７℃にて１時間反応後、０．３ｍｇ／ｍｌＡＢＴＳ含有リン酸−クエン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ４．０）を加えた。１０分後、マイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。ヒアルロン酸量は、同じプレートで測定した検量線から算出した。
同時に細胞のタンパク定量試験をＢＣＡタンパク定量試薬を用いて定量した。培養上清中のヒアルロン酸量をタンパク量で除することにより、単位蛋白量あたりのヒアルロン酸量を算出し、これを細胞のヒアルロン酸産生量とした。
【００３２】
〔ヒアルロン酸産生効果の評価〕
測定は、各試料の一点の濃度につき、５回の測定を行い、得られたデータの有意差検定は、スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ−検定によった。ｐ（ｔ−ｔｅｓｔ）はスチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）ｔ−検定を表し、ｐ＜０．０５の時有意であると判定した。
なお対照の１α−Ｏ−（２，３−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−ベンゾピラン−２−イル）メチル−グルコピラノシド（ＨＭＣ−β−Ｇｌｃ）を用いて同様の試験を行なった結果を表４に示す。なお陽性コントロールとしては、ＦＢＳ濃度５％のものを用いた。
【００３３】
［試験例１］
【表１】
2007246421.tif 000006
【００３４】
［試験例２］
【表２】
2007246421.tif 000007
【００３５】
［試験例３］
【表３】
2007246421.tif 000008
【００３６】
[比較例]
【表４】
2007246421.tif 000009
【００３７】
［実施例１］：［クリーム］
〔配合成分〕                                                        （質量％）
（１）ステアリン酸                                                    ２．０
（２）ステアリルアルコール                                            ７．０
（３）水添ラノリン                                                    ２．０
（４）スクワラン                                                      ５．０
（５）２−オクチルドデシルアルコール                                  ６．０
（６）ポリオキシエチレン（２５モル）セチルアルコールエーテル          ３．０
（７）グリセリンモノステアリン酸エステル                              ２．０
（８）プロピレングリコール                                            ５．０
（９）ＨＭＣ−β−ＧｌｃＮＡｃ                                        ０．５
（１０）Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩                ０．５
（１１）亜硫酸水素ナトリウム                                          ０．０３
（１２）エチルパラベン                                                ０．３
（１３）香料                                                          適量
（１４）イオン交換水                                                  残余
〔製  法〕
（１４）に（８）〜（１０）を加え、加熱して７０℃に保った（水相）。一方、（１）〜（７）、（１１）〜（１３）を混合し、加熱融解して７０℃に保った（油相）。水相に油相を加え、予備乳化を行い、次いでホモミキサーで均一に乳化した後、よくかき混ぜながら３０℃まで冷却し、クリームを得た。
【００３８】
［実施例２］：［クリーム］
〔配合成分〕                                                        （質量％）
（１）固形パラフィン                                                  ５．０
（２）ミツロウ                                                      １０．０
（３）ワセリン                                                      １５．０
（４）流動パラフィン                                                ４１．０
（５）グリセリンモノステアリン酸エステル                              ２．０
（６）ポリオキシエチレン（２０モル）ソルビタンモノラウリン酸エステル  ２．０
（７）石けん粉末                                                      ０．１
（８）硼砂                                                            ０．２
（９）ＨＭＣ                                                          ２．０
（１０）Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド                              ２．０
（１１）亜硫酸水素ナトリウム                                          ０．０３
（１２）エチルパラベン                                                ０．３
（１３）香料                                                          適量
（１４）イオン交換水                                                  残余
〔製  法〕
（１４）に（７）、（８）を加え、加熱溶解して７０℃に保った（水相）。一方、（１）〜（６）、（９）〜（１３）を混合し、加熱融解して７０℃に保った（油相）。水相に油相をかき混ぜながら徐々に加え、添加終了後、ホモミキサーで均一に乳化した後、よくかき混ぜながら３０℃まで冷却し、クリームを得た。
【００３９】
［実施例３］：［乳  液］
〔配合成分〕                                                        （質量％）
（１）ステアリン酸                                                    ２．５
（２）セチルアルコール                                                １．５
（３）ワセリン                                                        ５．０
（４）流動パラフィン                                                １０．０
（５）ポリオキシエチレン（１０モル）モノオレイン酸エステル            ２．０
（６）ポリエチレングリコール１５００                                  ３．０
（７）トリエタノールアミン                                            １．０
（８）カルボキシビニルポリマー                                        ０．０５
（９）ＨＭＣ−β−Ｇａｌ                                              １．０
（１０）４−メトキシサリチル酸カリウム                                ０．５
（１１）亜硫酸水素ナトリウム                                          ０．０１
（１２）エチルパラベン                                                ０．３
（１３）香料                                                          適量
（１４）イオン交換水                                                  残余
〔製  法〕
少量の（１４）に（８）を溶解した（Ａ相）。一方、残りの（１４）に（６）、（７）、（９）および（１０）を加え、加熱溶解して７０℃に保った（水相）。また、（１）〜（５）、（１１）〜（１３）を混合し、加熱融解して７０℃に保った（油相）。水相に油相を加え、予備乳化を行い、ここにＡ相を加え、ホモミキサーで均一乳化し、乳化後よくかき混ぜながら３０℃まで冷却し、乳液を得た。
【００４０】
［実施例４］：［乳  液］
〔配合成分〕                                                        （質量％）
（１）マイクロクリスタリンワックス                                    １．０
（２）ミツロウ                                                        ２．０
（３）ラノリン                                                      ２０．０
（４）流動パラフィン                                                １０．０
（５）スクワラン                                                      ５．０
（６）ソルビタンセスキオレイン酸エステル                              ４．０
（７）ポリオキシエチレン（２０モル）ソルビタンモノオレイン酸エステル  １．０
（８）プロピレングリコール                                            ７．０
（９）ＨＭＣ                                                          ２．０
（１０）亜硫酸水素ナトリウム                                          ０．０１
（１１）エチルパラベン                                                ０．３
（１２）香料                                                          適量
（１３）イオン交換水                                                  残余
〔製  法〕
（１３）に（８）、（１０）を加え、加熱して７０℃に保った（水相）。一方、（１）〜（７）、（９）、（１１）〜（１３）を混合し、加熱融解して７０℃に保った（油相）。油相をかき混ぜながらこれに水相を徐々に加え、ホモミキサーで均一に乳化した。乳化後、よくかき混ぜながら３０℃まで冷却し、乳液を得た。