(57)【要約】      （修正有）【課題】動脈硬化及びその関連疾患の感受性遺伝子の同定、該遺伝子を用いた該疾患の発症リスク判定方法、並びに該方法によってハイリスク群と判定された患者に対する、該疾患の予防・治療剤の新規投与プロトコルの提供。【解決手段】被験者について、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNPのジェノタイプを検定し、該被験者が、該アミノ酸がProであるアレルのホモ接合体である場合に、該被験者は動脈硬化又はその関連疾患に対する遺伝的感受性が高いと判定することを特徴とする方法、該アミノ酸がProであるアレルのホモ接合体であると判定された患者に、血中総コレステロールおよび／またはLDL-コレステロール値が、所定のガイドラインによる該患者の属するカテゴリーよりも少なくとも１段階ハイリスクなカテゴリーにおける目標値となるように投与される、動脈硬化又はその関連疾患の予防・治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の動脈硬化又はその関連疾患に対する遺伝的感受性を判定する方法であって、該被験者について、ＨＲＧ蛋白質の１８６番目のアミノ酸を決定するＳＮＰのジェノタイプを検定することを特徴とする方法。
【請求項２】
被験者が１８６番目のアミノ酸がＰｒｏであるアレルのホモ接合体である場合に、該被験者は動脈硬化又はその関連疾患に対する遺伝的感受性が高いと判定することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
動脈硬化又はその関連疾患の予防・治療薬の薬効評価もしくは投与計画の決定におけるハイリスク群の被験者もしくは患者を選択する方法であって、各被験者もしくは患者について、ＨＲＧ蛋白質の１８６番目のアミノ酸を決定するＳＮＰのジェノタイプを検定し、１８６番目のアミノ酸がＰｒｏであるアレルのホモ接合体である被験者もしくは患者を、ハイリスク群として選択することを特徴とする方法。
【請求項４】
ジェノタイプの検定を核酸レベルで行うことを特徴とする、請求項１または３記載の方法。
【請求項５】
ジェノタイプの検定を蛋白質レベルで行うことを特徴とする、請求項１または３記載の方法。
【請求項６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるみかけの分子量が約７５ｋＤａであるＨＲＧ蛋白質および約７７ｋＤａであるＨＲＧ蛋白質の存在を検定することを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるみかけの分子量が約７５ｋＤａであるＨＲＧ蛋白質のみが検出された場合に、被験者がＨＲＧ蛋白質の１８６番目のアミノ酸がＰｒｏであるアレルのホモ接合体であると判定することを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＨＲＧ蛋白質の１８６番目のアミノ酸を決定するＳＮＰを検出し得る核酸プローブおよび／またはプライマー対を含んでなる、動脈硬化又はその関連疾患に対する遺伝的感受性の判定用キット。
【請求項９】
核酸プローブが、ＨＲＧ蛋白質の１８６番目のアミノ酸を決定するＳＮＰ部位の塩基を含む、約15〜約500塩基の連続した塩基配列を含有してなる核酸であり、核酸プライマー対が、ＨＲＧ遺伝子もしくはＨＲＧ ｍＲＮＡの部分塩基配列であって、ＨＲＧ蛋白質の１８６番目のアミノ酸を決定するＳＮＰ部位の塩基を含む約50〜約1,000塩基の連続した塩基配列を増幅し得る一対の核酸である、請求項８記載のキット。
【請求項１０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるみかけの分子量が約７５ｋＤａであるＨＲＧ蛋白質を検出し得る第１試薬と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるみかけの分子量が約７７ｋＤａであるＨＲＧ蛋白質を検出し得る第２試薬とを含んでなる、動脈硬化又はその関連疾患に対する遺伝的感受性の判定用および／または動脈硬化又はその関連疾患のハイリスク群の選択用キット。
【請求項１１】
第１試薬および／または第２試薬がＨＲＧ蛋白質に対する抗体である、請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
第１および第２試薬が同一の抗体である請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
第１試薬がＳＤＳ−ＰＡＧＥによるみかけの分子量が約７５ｋＤａであるＨＲＧ蛋白質のみを認識し得る抗体である、および／または第２試薬がＳＤＳ−ＰＡＧＥによるみかけの分子量が約７７ｋＤａであるＨＲＧ蛋白質のみを認識し得る抗体である、請求項１１記載のキット。
【請求項１４】
血中総コレステロールおよび／またはＬＤＬ−コレステロール低下作用を示す物質を含有してなる、動脈硬化又はその関連疾患の予防・治療剤であって、ＨＲＧ蛋白質の１８６番目のアミノ酸がＰｒｏであるアレルのホモ接合体である患者に、血中総コレステロールおよび／またはＬＤＬ−コレステロール値が、所定のガイドラインによる該患者の属するカテゴリーよりも少なくとも１段階ハイリスクなカテゴリーにおける目標値となるように投与することを特徴とする剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化およびその関連疾患の感受性遺伝子、該遺伝子の多型を検出することによる動脈硬化およびその関連疾患に対する遺伝的感受性の判定方法、あるいは該疾患の予防・治療薬の薬効評価マーカーとして有用な蛋白質、並びに該蛋白質の発現変動を指標とした動脈硬化又はその関連疾患の診断方法、あるいは化合物の該疾患予防・治療効果の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化とは、動脈壁が肥厚し、弾性を失った状態の総称であり、不安定狭心症（UA）や急性心筋梗塞（AMI）等の急性冠動脈症候群（ACS）、脳梗塞や脳出血等の脳血管障害（CVA）、腎不全などの、人命を脅かす重大疾病の根底病態である。動脈硬化は10代の頃から無症候のうちに進行し、血液の流れが悪くなって臓器障害が起こり始めてから、臨床症状が現れてくる場合が多い。したがって、動脈硬化性疾患によるイベント発症をいかに早期に予測し、効率よく予防していくかはきわめて重要な課題である。
【０００３】
動脈硬化は、遺伝的背景に糖尿病、高血圧、高脂血症、喫煙、感染などのリスクファクターが蓄積することにより発症する。糖尿病のような生活習慣病をはじめとする頻度の高いありふれた疾患（いわゆるcommon disease；CD）は、浸透率（penetrance；ある遺伝子に変異を有する個体がある疾患を発症する割合）の低い複数の疾患関連遺伝子の変異と、運動・栄養などの複数の環境因子との相互作用により発症に至る多因子性疾患であると考えられている。CDの疾患関連遺伝子の変異は頻度の高い遺伝子多型（common variant；CV）であり、健常者にも存在するが、患者における保有率が有意に高いものであるとの仮説（Common Disease-Common Variant (CD-CV) hypothesis）が提唱されている。有名な一例としては、アポリポ蛋白E遺伝子ε4における一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism；SNP）がアルツハイマー病の発症と相関することが知られている。
わが国では、2000年度から、ミレニアム・ゲノム・プロジェクトの一環として、ヒトゲノムの遺伝子領域にある約20万個のSNPを同定し（それらはJSNPデータベースとしてhttp://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/上で公開されている）、これらのSNPについて代表的なCDとの相関を解析することにより、CDに対する感受性（易罹患性）を規定する遺伝子群を同定しようとする研究が進められており、動脈硬化性疾患である心筋梗塞についても感受性遺伝子が発見されている（非特許文献１）。
【０００４】
血中に多く存在する糖蛋白質であるHistidine-Rich Glycoprotein（以下、「HRG」と略記する）は、プラスミンと相互作用することから、血液凝固系への関与が示唆されており（例えば、特許文献２参照）、血栓症の家系では血中HRGレベルが上昇していることが報告されている（特許文献３〜５）。HRG蛋白質には糖鎖修飾の違いにより約75kDaと約77kDaの2つのバリアントが存在し、この相違はHRG遺伝子の多型（即ち、186番目のアミノ酸におけるPro/Serのアミノ酸置換を与えるSNP）に起因することが知られている（非特許文献６）。また、Ser186アレルを保有するヒトでは血漿HRGレベルが高いとの報告もある（非特許文献７）。しかし、大規模臨床試験の結果は、この多型が心筋梗塞（非特許文献８）及び深部静脈血栓症（非特許文献９）のいずれとも相関を示さなかった。
【非特許文献１】尾崎 (Ozaki) ら, 「ネイチャー・ジェネティックス (Nat. Genet.)」, (米国), 第32巻, pp. 650-654, 2002年
【非特許文献２】ジョーンズ (Jones A.L.) ら, 「イムノロジー・アンド・セル・バイオロジー (Immunol. Cell Biol.)」, (豪国), 第83巻, pp. 106-118, 2005年
【非特許文献３】エンゲッサー (Engesser L.) ら, 「ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー (Br. J. Haematol.)」, (英国), 第67巻, pp. 355-358, 1987年
【非特許文献４】ファルコン (Falkon L.) ら, 「スロンボーシス・リサーチ (Thromb. Res.)」, (米国), 第66巻, pp. 265-270, 1992年
【非特許文献５】カスタマン (Castaman G.) ら, 「スロンボーシス・リサーチ (Thromb. Res.)」, (米国), 第69巻, pp. 297-305, 1993年
【非特許文献６】ヘニス (Hennis B.C.) ら, 「スロンボーシス・アンド・ヘモスターシス (Thromb. Heamost.)」, (独国), 第74巻, pp. 1491-1496, 1995年
【非特許文献７】ヘニス (Hennis B.C.) ら, 「スロンボーシス・アンド・ヘモスターシス (Thromb. Heamost.)」, (独国), 第74巻, pp. 1497-1500, 1995年
【非特許文献８】ヘルマン (Herrmann S.M.) ら, 「スロンボーシス・アンド・ヘモスターシス (Thromb. Heamost.)」, (独国), 第79巻, pp. 359-361, 1998年
【非特許文献９】ラティンク (Rattink A.P.) ら, 「フィブリノリシス・アンド・プロテオリシス (Fibrinolysis and Proteolysis)」, 第13巻, pp. 35-38, 1999年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、動脈硬化及びその関連疾患に対する遺伝的感受性に影響する遺伝子を同定し、それを用いて、該疾患の発症リスクを簡便に判定する方法、並びに該疾患の予防・治療薬の薬効評価や投与計画決定におけるハイリスク群の選択方法を提供することである。また、本発明の別の目的は、該遺伝子のジェノタイプに基づいて決定される投与量にて投与される、動脈硬化及びその関連疾患の予防・治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、高コレステロール血症と動脈硬化を自然発症することで知られるWHHL (Watanabe Heritable Hyperlipidemic) ウサギの血漿サンプルを用いて、二次元ゲル電気泳動法により動脈硬化の血中マーカーを探索していたところ、病変の進行に伴って発現が上昇する蛋白質としてHRGを同定した。次いで、本発明者らは、ヒト血漿を用いて、ウェスタンブロットにより動脈硬化の進展に伴う血中HRGレベルの変動を確認した結果、意外にも発現量には大きな変動はなかったが、疾患と正常対照との間でバンドパターンが異なることを見出した。さらに検討を重ねた結果、健常人の多くは約75kDaと約77kDaの位置に2本のバンドを与えるのに対し、心筋梗塞や不安定狭心症などの動脈硬化性疾患患者の多くは約75kDaの位置に1本のバンドを与えることが明らかとなった。グリコシダーゼ処理により2本のバンドは1本となり、上記1本のバンドを同様に処理したものと同じ位置にバンドを与えることから、2本のバンドは糖鎖修飾の違いによることが示唆された。分子量などから、これら2本のバンドは、既報のHRG遺伝子多型（即ち、186番目のアミノ酸におけるPro/Serの相違）によることが示唆されたので、該遺伝子多型についてジェノタイピングを行ったところ、2本バンドはPro186/Serのジェノタイプ、1本バンドはPro186/Pro（またはSer186/Ser）のジェノタイプと一致した。これらの知見に基づいて、本発明者らはHRG遺伝子を動脈硬化及びその関連疾患の感受性遺伝子であると結論し、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］被験者の動脈硬化又はその関連疾患に対する遺伝的感受性を判定する方法であって、該被験者について、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNPのジェノタイプを検定することを特徴とする方法、
［２］被験者が186番目のアミノ酸がProであるアレルのホモ接合体である場合に、該被験者は動脈硬化又はその関連疾患に対する遺伝的感受性が高いと判定することを特徴とする、上記［１］記載の方法、
［３］動脈硬化又はその関連疾患の予防・治療薬の薬効評価もしくは投与計画の決定におけるハイリスク群の被験者もしくは患者を選択する方法であって、各被験者もしくは患者について、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNPのジェノタイプを検定し、186番目のアミノ酸がProであるアレルのホモ接合体である被験者もしくは患者を、ハイリスク群として選択することを特徴とする方法、
［４］ジェノタイプの検定を核酸レベルで行うことを特徴とする、上記［１］または［３］記載の方法、
［５］ジェノタイプの検定を蛋白質レベルで行うことを特徴とする、上記［１］または［３］記載の方法、
［６］SDS-PAGEによるみかけの分子量が約75kDaであるHRG蛋白質および約77kDaであるHRG蛋白質の存在を検定することを特徴とする、上記［５］記載の方法、
［７］SDS-PAGEによるみかけの分子量が約75kDaであるHRG蛋白質のみが検出された場合に、被験者がHRG蛋白質の186番目のアミノ酸がProであるアレルのホモ接合体であると判定することを特徴とする、上記［６］記載の方法、
［８］HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNPを検出し得る核酸プローブおよび／またはプライマー対を含んでなる、動脈硬化又はその関連疾患に対する遺伝的感受性の判定用キット、
［９］核酸プローブが、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNP部位の塩基を含む、約15〜約500塩基の連続した塩基配列を含有してなる核酸であり、核酸プライマー対が、HRG遺伝子もしくはHRG mRNAの部分塩基配列であって、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNP部位の塩基を含む約50〜約1,000塩基の連続した塩基配列を増幅し得る一対の核酸である、上記［８］記載のキット、
［１０］SDS-PAGEによるみかけの分子量が約75kDaであるHRG蛋白質を検出し得る第１試薬と、SDS-PAGEによるみかけの分子量が約77kDaであるHRG蛋白質を検出し得る第２試薬とを含んでなる、動脈硬化又はその関連疾患に対する遺伝的感受性の判定用および／または動脈硬化又はその関連疾患のハイリスク群の選択用キット、
［１１］第１試薬および／または第２試薬がHRG蛋白質に対する抗体である、上記［１０］記載のキット、
［１２］第１および第２試薬が同一の抗体である上記［１１］記載のキット、
［１３］第１試薬がSDS-PAGEによるみかけの分子量が約75kDであるHRG蛋白質のみを認識し得る抗体である、および／または第２試薬がSDS-PAGEによるみかけの分子量が約77kDaであるHRG蛋白質のみを認識し得る抗体である、上記［１１］記載のキット、および
［１４］血中総コレステロールおよび／またはLDL-コレステロール低下作用を示す物質を含有してなる、動脈硬化又はその関連疾患の予防・治療剤であって、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸がProであるアレルのホモ接合体である患者に、血中総コレステロールおよび／またはLDL-コレステロール値が、所定のガイドラインによる該患者の属するカテゴリーよりも少なくとも１段階ハイリスクなカテゴリーにおける目標値となるように投与することを特徴とする剤、などを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
HRG遺伝子のジェノタイプがPro186/Proであるヒトは、Pro186/Serのジェノタイプを有するヒトに比べて動脈硬化及びその関連疾患の発症リスクが高いので、該ジェノタイプを検定することにより該疾患の予防を有効に行うことができる。また、該疾患の予防・治療薬の薬効評価や投与計画の決定において、投与対象からハイリスク群を選別することができる。さらに、該ジェノタイプを動脈硬化リスクファクターとして加えた、新規な動脈硬化性疾患の予防・治療指針が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、被験者の動脈硬化又はその関連疾患に対する遺伝的感受性を判定する方法を提供する。該方法は、被験者のHRG遺伝子のジェノタイプ、具体的には、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNPのジェノタイプを検定することを特徴とする。
本発明の判定方法の対象となる「被験者」は、ヒトであれば年齢、性別、人種、既往歴などに特に制限はない。例えば、(i)３０歳以上、好ましくは４０歳以上、(ii)一定期間内（例えば、３０日以内、６０日以内、好ましくは９０日以内）に、空腹時採血による血清脂質値が高脂血症の診断基準以上（例えば、血清総コレステロール値が220 mg/dl以上、血清LDL-コレステロール値が140 mg/dl以上、血清トリグリセライド（TG）値が、150 mg/dl以上、好ましくは130 mg/dl以上、血清HDL-コレステロール値が40 mg/dl以上等）を記録、(iii)高脂血症の原因となりうる疾患および／または状態（例えば、肥満症、甲状腺機能低下症、ネフローゼ症候群、糖尿病等）の診断を有する、(iv)心筋梗塞症の既往歴および／または家族歴を有する、等から選ばれる１以上の条件を満たしているヒトに好ましく適用され得るが、それらに限定されない。
ここで動脈硬化の「関連疾患」とは、動脈硬化病変の進展に付随して引き起こされる種々の疾患や、結果として動脈硬化病変の進展を引き起こす疾患を包含する意味で用いられる。例えば、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、脳出血、脳血栓、脳塞栓、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症、腎不全、閉塞性動脈硬化症、PCI後再狭窄、急性冠症候群、冠動脈疾患、末梢動脈閉塞症等の疾患が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書においては、動脈硬化及びその関連疾患を包括して「動脈硬化性疾患」という場合がある。また、ここで「遺伝的感受性」とは、ある疾患（本発明においては動脈硬化性疾患）に罹患しやすい性質を遺伝的背景として有していることを意味する。
【００１０】
本発明の判定方法で検定されるHRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNPは、詳細には、186番目のアミノ酸がProであるか、あるいはSerであるかを決定するSNPであり、これまでに報告されているSNPは、186番目のアミノ酸をコードするコドン（YCC）の第１塩基がC（Proをコードする）又はT（Serをコードする）である１塩基置換である（従って、以下、186番目のアミノ酸がProであるHRG蛋白質をコードするアレルをCアレル、186番目のアミノ酸がSerであるHRG蛋白質をコードするアレルをTアレルという）。
【００１１】
本発明の判定方法では、被験者の、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNPについてのジェノタイプが検定される。可能性のあるジェノタイプはCアレルのホモ接合体（CC）、ヘテロ接合体（CT）及びTアレルのホモ接合体（TT）である。かかるジェノタイピングは自体公知の手法を用いて、(a)遺伝子レベルで、もしくは(b)蛋白質レベルで行うことができる。以下、それぞれの場合について詳述する。
【００１２】
(a)遺伝子レベルでのHRGジェノタイピング
任意の自体公知のSNP検出方法を使用することができる。古典的な検出方法としては、例えば、被験者由来の生体試料（ゲノムDNAを含有する限り特に限定されないが、低侵襲的に採取し得るものが好ましく、例えば、血液、精液、粘膜、皮膚、毛髪などや、生検から採取されるものが挙げられる）から抽出したゲノムDNAを試料とし、GenBankアクセッション番号NC_000003.10（配列番号：１）で表される塩基配列の部分塩基配列であって、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNP部位の塩基（即ち、塩基番号6830で示される塩基Y (NC_000003.10では、該塩基はCである)）を含む約15〜約500塩基の連続した塩基配列を含有してなる2種類の核酸（即ち、Cアレルに完全相補的な核酸とTアレルに完全相補的な核酸）をそれぞれプローブとして用い、例えばWallaceら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 278-282 (1983)）の方法に従って、ストリンジェンシーを正確にコントロールしてプローブと完全相補的な配列を有する核酸のみがハイブリダイズし得る条件下でハイブリダイゼーション反応を行う方法や、上記核酸のうちのいずれか一方を標識し、他方を未標識としたミックスプローブを用い、変性温度から徐々に反応温度を低下させながらハイブリダイゼーションを行い、一方のプローブと完全相補的な配列を先にハイブリダイズさせ、ミスマッチを有するプローブとの交差反応を防ぐ方法などが挙げられる。ここで標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。
【００１３】
好ましくは、多型の検出は、例えば、WO 03/023063に記載された種々の方法、例えば、RFLP法、PCR-SSCP法、ASOハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ARMS法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、RNaseA切断法、化学切断法、DOL法、TaqMan PCR法、インベーダー法、MALDI-TOF/MS法、TDI法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法、UCAN法、DNAチップまたはDNAマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法およびECA法などにより実施することができる（WO 03/023063，第17頁第5行〜第28頁第20行を参照）。以下、代表的な方法として、TaqMan PCR法、インベーダー法、RFLP法について、より詳細に説明する。
【００１４】
（１）TaqMan PCR法
TaqMan PCR法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド（TaqManプローブ）とTaq DNAポリメラーゼによるPCRとを利用した方法である。TaqManプローブとしては、配列番号：１で表される塩基配列の部分塩基配列であって、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNP部位の塩基を含む約15〜約30塩基の連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが用いられる。該プローブは、その5’末端がFAMやVICなどの蛍光色素で、3’末端がTAMRAなどのクエンチャー（消光物質）でそれぞれ標識されており、そのままの状態ではクエンチャーが蛍光エネルギーを吸収するため蛍光は検出されない。プローブは双方のアレルについて調製し、一括検出のために互いに蛍光波長の異なる蛍光色素（例えば、一方のアレルをFAM、他方をVIC）で標識することが好ましい。また、TaqManプローブからのPCR伸長反応が起こらないように3’末端はリン酸化されている。TaqManプローブとハイブリダイズする領域を含むゲノムDNAの部分配列を増幅するように設計されたプライマーおよびTaq DNAポリメラーゼとともにPCRを行うと、TaqManプローブが鋳型DNAとハイブリダイズし、同時にPCRプライマーからの伸長反応が起こるが、伸長反応が進むとTaq DNAポリメラーゼの5’ヌクレア−ゼ活性によりハイブリダイズしたTaqManプローブが切断され、蛍光色素が遊離してクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光が検出される。鋳型の増幅により蛍光強度は指数関数的に増大する。
例えば、配列番号：１で表される塩基配列中、塩基番号6830で示される塩基における多型の検出において、当該塩基を含むアレル特異的オリゴヌクレオチド（約15〜約30塩基長；CアレルはFAMで、TアレルはVICでそれぞれ5’末端標識し、3’末端はいずれもTAMRAで標識）をTaqManプローブとして用いた場合、被験者のジェノタイプがCC、あるいはTTであれば、それぞれFAMあるいはVICの強い蛍光強度を認め、他方の蛍光はほとんど認められない。一方、被験者のジェノタイプがCTであれば、FAMおよびVIC両方の蛍光が検出される。
【００１５】
（２）インベーダー法
インベーダー法では、TaqMan PCR法と異なり、アレル特異的オリゴヌクレオチド（アレルプローブ）自体は標識されず、多型部位の塩基の5’側に鋳型DNAと相補性のない配列（フラップ）を有し、3’側には鋳型に特異的な相補配列を有する。インベーダー法では、さらに鋳型の多型部位の3’側に特異的な相補配列を有するオリゴヌクレオチド（インベーダープローブ；該プローブの5’末端である多型部位に相当する塩基は任意である）と、5’側がヘアピン構造をとり得る配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に5’末端の塩基と対をなす塩基から3’側に連続する配列がアレルプローブのフラップと相補的な配列であることを特徴とするFRET（fluorescence resonance energy transfer）プローブとが用いられる。FRETプローブの5’末端は蛍光標識（例えば、FAMやVICなど）され、その近傍にはクエンチャー（例えば、TAMRAなど）が結合しており、そのままの状態（ヘアピン構造）では蛍光は検出されない。
鋳型であるゲノムDNAにアレルプローブおよびインベーダープローブを反応させると、三者が相補結合した際に多型部位にインベーダープローブの3’末端が侵入する。この多型部位の構造を認識する酵素（cleavase）を用いてアレルプローブの一本鎖部分（即ち、多型部位の塩基から5’側のフラップ部分）を切り出すと、フラップはFRETプローブと相補的に結合し、フラップの多型部位がFRETプローブのヘアピン構造に侵入する。この構造をcleavaseが認識して切断することにより、FRETプローブの末端標識された蛍光色素が遊離してクエンチャーの影響を受けなくなって蛍光が検出される。多型部位の塩基が鋳型とマッチしないアレルプローブはcleavaseによって切断されないが、切断されないアレルプローブもFRETプローブとハイブリダイズすることができるので、同様に蛍光が検出される。但し、反応効率が異なるため、多型部位の塩基がマッチするアレルプローブでは、マッチしないアレルプローブに比べて蛍光強度が顕著に強い。
通常、３種のプローブおよびcleavaseと反応させる前に、鋳型DNAはアレルプローブおよびインベーダープローブがハイブリダイズする部分を含む領域を増幅し得るプライマーを用いてPCRにより増幅しておくことが好ましい。
【００１６】
（３）RFLP法
HRG遺伝子は、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNPにより制限酵素断片長に差異を生じるので、これを利用して上記多型を簡便に検出することができる。即ち、TアレルはHpy188III（TCNNGAを認識してCとNの間で切断する）で切断されるが、Cアレルは切断されない。そこで、例えば、配列番号：１で表される塩基配列中、塩基番号6781〜6940で示される160bpからなるフラグメントをPCR法により増幅してHpy188III消化すれば、Cアレルは160bpの1本のフラグメントを生じるのに対し、Tアレルは51bpと109bpの2本のフラグメントを生じる。従って、消化産物を電気泳動すると、ジェノタイプがCCの場合、160bpの位置に1本のバンドが検出され、ジェノタイプがCTの場合、51bp、109bpおよび160bpの位置に3本のバンドが検出され、ジェノタイプがTTの場合、51bpおよび109bpの位置に2本のバンドが検出される。このようにして被験者におけるHRG遺伝子のジェノタイプを決定することができる。
【００１７】
(b)蛋白質レベルでのHRGジェノタイピング
186番目のアミノ酸におけるPro/Ser多型は、結果としてその遺伝子産物に約2kDaの分子量の差を生じさせる。即ち、186番目のアミノ酸がProであるHRG蛋白質は、SDS-PAGEにおけるみかけの分子量が約75kDaであるのに対し、186番目のアミノ酸がSerであるHRG蛋白質は、SDS-PAGEにおけるみかけの分子量が約77kDaである。これらの2つのバリアントをグリコシダーゼ処理して電気泳動した場合、同じ位置にバンドを生じることから、かかる分子量の差は糖鎖修飾の相違に基づくものと考えられる（配列番号：２で表されるHRGアミノ酸配列の186番目のアミノ酸付近のアミノ酸配列をみると、Ser186のバリアントはAsn-Xaa-Ser/ThrのN-グリコシレーションコンセンサス配列を有することから、例えば、Asn184への糖鎖付加が示唆される）。
上述のように、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNPは、その遺伝子産物に糖鎖修飾の相違に基づく分子量の差を生じるので、これを利用して蛋白質レベルで該SNPを検出することができる。例えば、被験者から採取した生体試料（特に限定されないが、低侵襲的に採取し得るものが好ましく、例えば、血液、血清、血漿、唾液、精液、粘膜、涙、尿などの人から分泌されるものや、生検から採取されるものが挙げられる。より好ましくは、血液、血清、血漿であり、さらに好ましくは血清又は血漿である）あるいはその分画物［2つのHRGバリアントの分子量の差は約2kDaと小さいので、分子量の差を利用して両者を分離・検出する場合には、出発試料中に大量に存在する夾雑蛋白質（例えば血漿、血清であれば、アルブミンなど）を予め除去しておくことが望ましい］から、常法により蛋白質を抽出し、HRG蛋白質に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、約75kDa及び約77kDaの位置のバンドの有無を検出することで、当該多型を検出することができる。即ち、約75kDaの位置に1本のバンドが検出された場合は、該被験者におけるHRG遺伝子のジェノタイプはCCであり、約75kDa及び約77kDaの位置に2本のバンドが検出された場合は、該被験者におけるHRG遺伝子のジェノタイプはCTであり、約77kDaの位置に1本のバンドが検出された場合は、該被験者におけるHRG遺伝子のジェノタイプはTTである。
【００１８】
上記した生体試料からの夾雑蛋白質の除去方法として、被験者から採取した生体試料をHRGに対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーに付すことによってHRG蛋白質を精製し、これをウェスタンブロッティングに付してもよい。あるいは、上記のようにして精製したHRG蛋白質をSDS-PAGEなどのゲル電気泳動にかけ、クマシーブリリアントブルー染色や銀染色により約75kDa及び約77kDaの位置のバンドの有無を検出することもできる。
【００１９】
上記の方法において使用されるHRGに対する抗体は、分子量約75kDaのPro186バリアントと分子量約77kDaのSer186バリアントの両方を認識し得るものであれば特に制限はない。そのような抗体は、例えば、HRG蛋白質を、これを発現するヒト細胞から単離・精製し、該蛋白質もしくはその部分ペプチドを抗原として動物を免疫することにより調製することができる。あるいは、公知のHRGのアミノ酸配列（配列番号：２に表されるアミノ酸配列）に基づいて、その部分ペプチドを公知のペプチド合成の手法により合成し、これを抗原（ハプテン）として利用することもできる。さらには、常法に従ってHRGをコードするcDNA（配列番号：１に表される塩基配列中、塩基番号24〜206、2927〜3043、3930〜4020、5615〜5781、6779〜6859、9081〜9182および11039〜11875で示される塩基配列を連結した配列がHRGのコード領域（CDS）に相当する）を得て、該cDNAを適当な発現ベクターに組み込んで適当な宿主細胞に導入し、得られる形質転換体を培養して組換え蛋白質を採取し、公知の蛋白質分離精製法を用いてHRGを精製するか、上記のようにして得られるcDNAを鋳型として、無細胞転写・翻訳系を用いて該蛋白質を取得して、抗原として用いることもできる。
【００２０】
HRGに対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。また、該抗体は完全抗体分子だけでなくそのフラグメントをも包含し、例えば、Fab、F(ab')2、ScFv、minibody等が挙げられる。
【００２１】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製
HRGは、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常2〜6週毎に１回ずつ、計2〜10回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウス及びラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された哺乳動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の2〜5日後に脾臓又はリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化HRGと抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法［Nature, 256, 495 (1975年)］に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、NS-1、P3U1、SP2/0などが挙げられるが、P3U1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は1:1〜20:1程度であり、PEG（好ましくは、PEG1000〜PEG6000）が10〜80%程度の濃度で添加され、約20〜40℃、好ましくは約30〜37℃で約1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００２２】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、蛋白質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）又はプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体又はプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した蛋白質等を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別及び育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、1〜20%、好ましくは10〜20%のウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地、1〜10%のウシ胎児血清を含むGIT培地（和光純薬工業（株））又はハイブリドーマ培養用無血清培地（SFM-101、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常20〜40℃、好ましくは約37℃である。培養時間は、通常5日〜3週間、好ましくは1週間〜2週間である。培養は、通常5%炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００２３】
（ｂ）モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、DEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相又はプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００２４】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
HRGに対するポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（蛋白質等の抗原）とキャリアー蛋白質との複合体を作り、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行なうか鶏に免疫をおこない、該免疫動物からHRGに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物及び鶏を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類及びキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜20、好ましくは約1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
又ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、哺乳動物又は鶏に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水、母乳など、好ましくは血液から採取することができ、鶏の場合は血液及び卵黄から採取できる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００２５】
分子量の差を利用して、Pro186バリアントとSer186バリアントとを分離し、それぞれの蛋白質を検出する他の方法としては、質量分析を利用する方法が挙げられる。例えば、上記HRGに対する抗体を、質量分析計に適合し得るプローブの表面上に固定化し、該プローブ上の該抗体に被験試料を接触させ、該抗体に捕捉された生体試料成分を質量分析にかけ、各分子量のHRGのピークを検出する方法が挙げられる。
【００２６】
あるいは、クロマトグラフィー技術と飛行時間型質量分析（TOF-MS）を組み合わせて、クロマト担体（例：カチオン交換体、アニオン交換体、疎水性クロマト担体、金属イオンなど）に一定条件下で捕捉されるすべての生体試料成分の質量を一括して測定する方法、とりわけ飛行時間型質量分析に使用するプローブの表面に該クロマト担体を固定し、このプローブ表面と被検試料を接触させ、適当な条件で洗浄した後、該プローブ表面に捕捉された成分の質量を飛行時間型質量分析計で測定する方法などが挙げられる。飛行時間型質量分析計に適合可能なプローブとしては、サイファージェン・バイオシステムズ社製の各種プロテインチップ等が挙げられるが、それらに限定されない。洗浄は水又は緩衝液を用いて行うことができるが、例えば、pHは、各々の試料のターゲットマーカの等電点に合わせて適宜選択される。例えば、pH 4〜8のトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液等が用いられる。質量分析は適当なマトリックスを用いてMALDI法で行うことが好ましく（MALDI-TOFMS）、使用するマトリックス分子としては、例えばシナピン酸（SPA）、飽和2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）、インドールアクリル酸（IAA）、桂皮酸などが挙げられる。
【００２７】
分子量の差を利用しない、即ち、Pro186バリアントとSer186バリアントとを分離しないでこれらの各々の存在を検出する方法としては、これらのバリアントのいずれか一方のみを検出し得る試薬を用いる方法が挙げられる。このような試薬としては、例えば、各バリアントに特異的に反応する抗体、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられるが、これに限定されない。
【００２８】
各バリアントに特異的に反応するモノクローナル抗体は、各バリアントに特異的な部分［例えば、186番目のアミノ酸およびその近傍のアミノ酸配列からなる部分ペプチド、あるいは一方のバリアントに特異的で他方のバリアントにはない糖鎖または該糖鎖を含む部分ペプチド（上述のように、Pro186バリアントとSer186バリアントとの分子量の差は糖鎖修飾の相違に基づくので、各バリアントを分離精製して、エンドペプチダーゼで限定分解することなどにより得られる186番目のアミノ酸およびその近傍、例えば184番目のAsnを含む部分ペプチド等が用いられ得る）］を免疫原として、上記HRGに対するモノクローナル抗体の作製方法と同様の方法を実施することにより取得することができる。各バリアントの調製は、CCアレル及びTTアレルを有するヒトの血液などから自体公知の蛋白質精製法を用いて行うこともできるが、各バリアントをコードするDNAを宿主哺乳動物細胞（好ましくはヒト細胞）に導入して、各バリアントを過剰発現させたものから精製することが望ましい。また、各バリアントに特異的に反応する抗体は、各バリアント自体を免疫原としてモノクローナル抗体を作製し、得られた各モノクローナル抗体の両バリアントに対する交差反応性を検証し、一方のバリアントにしか反応性を有しないことを検証することによっても取得することができる。
【００２９】
各バリアントに特異的な抗体を用いる本発明の判定方法は、特に制限されるべきものではなく、被検試料中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的又は物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法及びサンドイッチ法等が好適に用いられる。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン-アビジン系を用いることもできる。
【００３０】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては、不溶化したHRGバリアント特異的抗体に被検試料を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別のHRGに対する抗体（バリアント特異的である必要はない）を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、被検試料中のHRGバリアント量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。
【００３１】
HRGバリアントに対するモノクローナル抗体を、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることもできる。
競合法では、被検試料中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原(Ｆ)と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検試料中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する２次抗体などを用いる液相法、及び、１次抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、１次抗体は可溶性のものを用い２次抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検試料の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検試料中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検試料中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検試料中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００３２】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
【００３３】
上記HRGバリアント特異的抗体を用いた検出法では、両方のバリアントについて、それぞれ特異的抗体を用いて検出を行ってもよいし、あるいは一方のバリアントに対する特異的抗体を用いて該バリアントの検出・定量を行い、さらに両方のバリアントに対して反応性を有する抗体を用いてHRGの検出・定量を行い、前者と後者の測定値を比較（差引き）することで、他方のバリアントの存在の有無を検証してもよい。
【００３４】
上記の測定を実施した結果、Pro186バリアントのみが検出された場合は、該被験者におけるHRGのジェノタイプはCCであり、Pro186バリアントとSer186バリアントの両方が検出された場合は、該被験者におけるHRGのジェノタイプはCTであり、Ser186バリアントのみが検出された場合は、該被験者におけるHRGのジェノタイプはTTである。
【００３５】
上述の(a)遺伝子レベルもしくは(b)蛋白質レベルでのジェノタイピングの結果、HRGのジェノタイプがCCであると認められた被験者は、ジェノタイプがCTであると認められた被験者に比べて、将来動脈硬化性疾患（例えば、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞、脳出血、脳血栓、脳塞栓、大動脈瘤、大動脈解離、腎硬化症、腎不全、閉塞性動脈硬化症、PCI後再狭窄、急性冠症候群、冠動脈疾患、末梢動脈閉塞症等）を発症するリスクがより高いと判定することができる。また、HRGのジェノタイプがCCであると認められた被験者が、既に動脈硬化の病態を示しているか、もしくはその関連疾患に罹患している場合には、ジェノタイプがCTであると認められた動脈硬化性疾患患者に比べて、より厳格な疾患管理（例えば、LDL-コレステロール及び／又は総コレステロールの目標値をより低値に設定するなど）が必要であると診断することができる。尚、ジェノタイプがTTであると認められた被験者については、判定対象外とする。
【００３６】
上述のように、HRG遺伝子についてCCジェノタイプを有するヒトは、CTジェノタイプを有するヒトに比べて、動脈硬化性疾患を発症するリスクが顕著に高い。また、既に動脈硬化性疾患に罹患している患者においても、重篤な心・脳血管イベントを引き起こすリスクが高いといえる。そのため、動脈硬化性疾患の予防・治療薬の臨床試験や既存薬の予防・治療効果を評価するにあたっては、試験・評価データをより有効に解析するために、被験者もしくは患者群を、HRG遺伝子のジェノタイプによって予め分類しておくことが望ましい。従って、本発明はまた、各被験者もしくは患者について、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNPのジェノタイプを検定し、該ジェノタイプがCCである被験者もしくは患者を、ハイリスク群として選択することを特徴とする、動脈硬化性疾患の予防・治療薬の薬効評価もしくは投与計画の決定におけるハイリスク群の被験者もしくは患者の選択方法を提供する。ジェノタイプの検定は、遺伝的感受性の判定方法について上記した(a)または(b)のジェノタイピング方法により行うことができる。
【００３７】
本発明はまた、上記本発明の判定方法及びハイリスク群の選択方法に用いるためのキットを提供する。本発明のキットは、(a)遺伝子レベルでのジェノタイピングのためのキットと(b)蛋白質レベルでのジェノタイピングのためのキットに分類される。
遺伝子レベルでのジェノタイピング用のキットは、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNPを検出し得る核酸プローブおよび／またはプライマー対を含むことを特徴とする。
【００３８】
具体的には、核酸プローブは、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNP部位の塩基を含む領域でゲノムDNAとハイブリダイズする核酸であり、標的部位に対して特異的であり且つ多型性を容易に検出し得る限りその長さ（ゲノムDNAとハイブリダイズする部分の塩基長）に特に制限はなく、例えば約15塩基以上、好ましくは約15〜約500塩基、より好ましくは約15〜約200塩基、いっそう好ましくは約15〜約50塩基である。
該プローブは、多型性の検出に適した付加的配列（ゲノムDNAと相補的でない配列）を含んでいてもよい。例えば、上記インベーダー法に用いられるアレルプローブは、多型部位の塩基の5’末端にフラップと呼ばれる付加的配列を有する。
また、該プローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ等）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されていてもよい。あるいは、蛍光物質（例：FAM、VIC等）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
【００３９】
好ましくは、本発明の診断用キットに用いられる核酸プローブは、GenBankアクセッション番号NC_000003.10（配列番号：１）で表される塩基配列中、塩基番号6830で示されるSNP部位の塩基Y（即ち、C又はT）を含む、約15〜約500塩基、好ましくは約15〜約200塩基、より好ましくは約15〜約50塩基の連続した塩基配列を含有してなる核酸である。使用する多型検出法に応じて、SNP部位についていずれか一方の塩基を有する核酸を用いることもできるし、Cアレル及びTアレルに対応する２種類の核酸を用いることもできる。尚、上記インベーダー法に使用されるインベーダープローブについては、多型部位の塩基（即ち、3’末端の塩基）は任意の塩基でよい。
【００４０】
本発明のキットに用いられる核酸プライマーは、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNP部位の塩基を含むゲノムDNAの領域を特異的に増幅し得るように設計されたものであればいかなるものであってもよい。例えば、GenBankアクセッション番号NC_000003.10（配列番号：１）で表される塩基配列の部分塩基配列であって、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNP部位の塩基より5’側の相補鎖配列の一部にハイブリダイズする、約15〜約50塩基、好ましくは約15〜約30塩基の塩基配列を含む核酸と、該多型部位の塩基より3’側の配列の一部にハイブリダイズする、約15〜約50塩基、好ましくは約15〜約30塩基の塩基配列を含む核酸との組み合わせであり、それらによって増幅される核酸の断片長が約50〜約1,000塩基、好ましくは約50〜約500塩基、より好ましくは約50〜約200塩基である、一対の核酸が挙げられる。尚、後記実施例で用いられるように、プライマー対の一方がハイブリダイズするゲノムDNA配列中に検出すべきSNP部位が含まれていてもよい。
該プライマーは、多型性の検出に適した付加的配列（ゲノムDNAと相補的でない配列）、例えばリンカー配列を含んでいてもよい。
また、該プライマーは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ等）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されていてもよい。
【００４１】
好ましくは、本発明のキットに用いられる核酸プライマーは、GenBankアクセッション番号NC_000003.10（配列番号：１）で表される塩基配列中、塩基番号6830で示されるSNP部位の塩基Y（即ち、C又はT）を含む、約50〜約1,000塩基、好ましくは約50〜約500塩基、より好ましくは約50〜約200塩基の連続した塩基配列を増幅し得る一対の核酸である。
【００４２】
本発明のキットに用いられる核酸プローブまたはプライマーは、DNAであってもRNAであってもよく、また、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖の場合は二本鎖DNA、二本鎖RNA、DNA／RNAハイブリッドのいずれであってもよい。従って、本明細書においてある塩基配列を有する核酸について記載する場合、特に断らない限り、該塩基配列を有する一本鎖核酸、該塩基配列と相補的な配列を有する一本鎖核酸、それらのハイブリッドである二本鎖核酸をすべて包含する意味で用いられていると理解されるべきである。
上記核酸プローブまたはプライマーは、例えば、NC_000003.10で表される塩基配列の情報に基づいて、DNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
【００４３】
上記核酸プローブおよび／またはプライマーは、各々別個に（あるいは可能であれば混合した状態で）水もしくは適当な緩衝液（例：TEバッファーなど）中に適当な濃度（例：2×〜20×濃度で1〜50μMなど）となるように溶解し、約-20℃で保存することができる。
本発明のキットは、多型検出法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。例えば、該キットがTaqMan PCR法による多型検出用である場合には、該キットは、10×PCR反応緩衝液、10×MgCl2水溶液、10×dNTPs水溶液、Taq DNAポリメラーゼ（5U/μL）等をさらに含むことができる。また、該キットがPCR-RFLP法による多型検出用である場合には、該キットは、上記試薬に加えて、制限酵素Hpy188III、制限酵素反応用緩衝液等をさらに含むことができる。
【００４４】
一方、蛋白質レベルでのジェノタイピング用のキットは、SDS-PAGEによるみかけの分子量が約75kDaであるHRG蛋白質（即ち、Pro186バリアント）を検出し得る第１試薬と、SDS-PAGEによるみかけの分子量が約77kDaであるHRG蛋白質（即ち、Ser186バリアント）を検出し得る第２試薬とを含む。ジェノタイピングの手法がウェスタンブロッティング等の分子量の差を利用して２つのバリアントを分離してそれぞれを検出する様式の場合には、第１試薬と第２試薬は同一のものであってよい。そのような共通試薬としては、例えば、上記した両バリアントを認識し得る抗体や、HRGと相互作用することが知られているプラスミン等の蛋白質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
一方、ジェノタイピングの手法が２つのバリアントを分離せずにそれぞれを検出する様式の場合には、第１試薬と第２試薬の少なくとも一方は、一方のバリアントのみを検出し得る物質でなければならない。定量測定を要しない点で、第１試薬と第２試薬の両方が他方のバリアントと交差反応性を示さないことがより好ましい。そのような第１及び第２試薬としては、上記した各バリアントに特異的な抗体が挙げられる。
【００４６】
本発明のキットは、多型検出法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。例えば、該キットがウェスタンブロッティング法による多型検出用である場合には、該キットは、分子量マーカー、転写用メンブレン、転写緩衝液、ブロッキング液、洗浄用緩衝液、標識剤、標識検出用試薬等をさらに含むことができる。
【００４７】
本発明はまた、上記HRGのジェノタイピングによりCCジェノタイプを有すると判定された被験者もしくは動脈硬化性疾患患者を対象として、新規な投与プロトコル（例えば、投与量・投与スケジュールなど）にて投与される動脈硬化性疾患の予防・治療剤を提供する。
本発明の予防・治療剤に含まれる有効成分としては、動脈硬化性疾患の予防・治療効果が知られている任意の化合物を選択することができるが、例えば、イベント発症に深く関与するマクロファージの泡沫化を抑制するのに効果的な、LDL-コレステロール低下作用を示す化合物などが好ましく例示される。そのような化合物としては、例えば、WO 2005/012272、WO 02/059077に記載されるもの等が挙げられる。また、既に上市されている薬剤として、クロフィブラート及びその誘導体（例：シンフィブラート、クリノフィブラート、ベザフィブラート等）、ニコチン酸およびその誘導体（例：ニコモール、ニセリトロール、トコフェロールニコチネート等）、デキストラン硫酸、陰イオン交換樹脂（例：コレスチラミン等）、植物ステロール（例：ソイステロール、γ-オリザノール等）、プロブコール、HMG-CoA還元酵素阻害薬（例：プラバスタチン、シンバスタチン等）なども好ましく用いることができる。
【００４８】
上記LDL-コレステロール低下作用を示す化合物は、必要に応じて薬理学的に許容し得る担体とともに混合して医薬組成物とした後に、動脈硬化性疾患の予防・治療剤として用いることができる。
ここで、薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、乳糖、白糖、D-マンニトール、D-ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどが挙げられる。
滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
結合剤の好適な例としては、α化デンプン、ショ糖、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、D-マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
崩壊剤の好適な例としては、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、軽質無水ケイ酸、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、注射用水、生理的食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、D-マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子；ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトール、D-ソルビトール、ブドウ糖などが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられる。
着色剤の好適な例としては、水溶性食用タール色素（例、食用赤色2号および3号、食用黄色4号および5号、食用青色1号および2号などの食用色素、水不溶性レーキ色素（例、前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩など）、天然色素（例、β-カロチン、クロロフィル、ベンガラなど）などが挙げられる。
甘味剤の好適な例としては、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム、ステビアなどが挙げられる。
【００４９】
前記医薬組成物の剤形としては、例えば錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、顆粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などの経口剤；および注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤など）、外用剤（例、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤など）、坐剤（例、直腸坐剤、膣坐剤など）、ペレット、点滴剤、徐放性製剤（例、徐放性マイクロカプセルなど）等の非経口剤が挙げられる。
医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。以下に、製剤の具体的な製造法について詳述する。医薬組成物中の有効成分の含量は、剤形、有効成分の投与量などにより異なるが、例えば約0.1ないし100重量％である。
例えば、経口剤は、有効成分に、賦形剤（例、乳糖，白糖，デンプン，D-マンニトールなど）、崩壊剤（例、カルボキシメチルセルロースカルシウムなど）、結合剤（例、α化デンプン，アラビアゴム，カルボキシメチルセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース，ポリビニルピロリドンなど）または滑沢剤（例、タルク，ステアリン酸マグネシウム，ポリエチレングリコール6000など）などを添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性を目的として、コーティング基剤を用いて自体公知の方法でコーティングすることにより製造される。
【００５０】
該コーティング基剤としては、例えば糖衣基剤、水溶性フィルムコーティング基剤、腸溶性フィルムコーティング基剤、徐放性フィルムコーティング基剤などが挙げられる。
糖衣基剤としては、白糖が用いられ、さらに、タルク、沈降炭酸カルシウム、ゼラチン、アラビアゴム、プルラン、カルナバロウなどから選ばれる１種または２種以上を併用してもよい。
水溶性フィルムコーティング基剤としては、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース系高分子；ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、アミノアルキルメタアクリレートコポリマーE〔オイドラギットE（商品名）、ロームファルマ社〕、ポリビニルピロリドンなどの合成高分子；プルランなどの多糖類などが挙げられる。
腸溶性フィルムコーティング基剤としては、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース  フタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース  アセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロースなどのセルロース系高分子；メタアクリル酸コポリマーL〔オイドラギットL（商品名）、ロームファルマ社〕、メタアクリル酸コポリマーLD〔オイドラギットL-30D55（商品名）、ロームファルマ社〕、メタアクリル酸コポリマーS〔オイドラギットS（商品名）、ロームファルマ社〕などのアクリル酸系高分子；セラックなどの天然物などが挙げられる。
徐放性フィルムコーティング基剤としては、例えばエチルセルロースなどのセルロース系高分子；アミノアルキルメタアクリレートコポリマーRS〔オイドラギットRS（商品名）、ロームファルマ社〕、アクリル酸エチル・メタアクリル酸メチル共重合体懸濁液〔オイドラギットNE（商品名）、ロームファルマ社〕などのアクリル酸系高分子などが挙げられる。
上記したコーティング基剤は、その２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。また、コーティングの際に、例えば酸化チタン、三二酸化鉄等のような遮光剤を用いてもよい。
【００５１】
注射剤は、有効成分を分散剤（例、ポリソルベート80，ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60，ポリエチレングリコール，カルボキシメチルセルロース，アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例、メチルパラベン，プロピルパラベン，ベンジルアルコール，クロロブタノール，フェノールなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム，グリセリン，D-マンニトール，D-ソルビトール，ブドウ糖など）などと共に水性溶剤（例、蒸留水，生理的食塩水，リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例、オリーブ油，ゴマ油，綿実油，トウモロコシ油などの植物油、プロピレングリコール等）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造される。この際、所望により溶解補助剤（例、サリチル酸ナトリウム，酢酸ナトリウム等）、安定剤（例、ヒト血清アルブミン等）、無痛化剤（例、ベンジルアルコール等）等の添加物を用いてもよい。注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
【００５２】
通常、上記薬剤の投与量は、患者の血中総コレステロールおよび／またはLDL-コレステロール値が、所定のガイドラインによる該患者の属するカテゴリーにおける目標値の範囲内でコントロールされるように設定される。例えば、日本動脈硬化学会「動脈硬化性疾患診療ガイドライン2002年版」によると、冠動脈疾患（確定診断された心筋梗塞、狭心症）なしで、LDL-C以外の主要冠危険因子［加齢、高血圧、糖尿病、喫煙、冠動脈疾患の家族歴、低HDL-C血症］が0，1，2，3，≧4の患者をそれぞれ患者カテゴリーA，B1〜B4、冠動脈疾患ありを患者カテゴリーCに分類し、患者カテゴリーA、B1-B2、B3-B4、Cに対して、TCがそれぞれ＜240、＜220、＜200、＜180（mg/dl）、LDL-Cがそれぞれ＜160、＜140、＜120、＜100（mg/dl）の目標値（以下、便宜的に管理カテゴリーI、II、III、IVと称する）が定められている。
しかしながら、従来のいずれのガイドラインにおいても、HRG遺伝子のジェノタイプはリスクファクターとして考慮されていない。しかしながら、本発明によれば、HRGのジェノタイプがCCであるヒトの動脈硬化性疾患の発症リスクは、後記実施例の結果に従う限り、高血圧症や高脂血症の診断を有するヒトのそれに匹敵する。従って、本発明の予防・治療剤は、所定のガイドラインによる患者の属するカテゴリーよりも少なくとも１段階（例えば、１段階、２段階、３段階）ハイリスクなカテゴリーにおける目標値の範囲内に血中総コレステロールおよび／またはLDL-コレステロール値をコントロールするように投与される。例えば、上記日本動脈硬化学会のガイドラインにおいて、管理カテゴリーIに属する患者がCCジェノタイプを有する場合には、管理カテゴリーII（又はIII又はIV）扱いとし、TCの目標値を＜220mg/dl（又は＜200mg/dl又は＜180mg/dl）、LDL-Cの目標値を＜140mg/dl（又は＜120mg/dl又は＜100mg/dl）に設定して投与される。
【００５３】
本明細書及び図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
【００５４】
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｍｅ            ：メチル基
Ｅｔ            ：エチル基
Ｂｕ            ：ブチル基
Ｐｈ            ：フェニル基
ＴＣ            ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
【００５５】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５６】
（サンプル）
ウサギ：  世界中で高コレステロールや動脈硬化症などの研究に用いられているWHHLウサギの血漿を使用した。ウサギは血管内超音波（IVUS）により、aorta病変（動脈硬化）面積を算出。病変の軽い方から重いほうへ0〜5のスコアをつけ、IVUSスコア0のグループをコントロールとして発現比較に使用した。
ヒト：  HRGの発現パターンの確認にはヒト血清を使用した。全てのヒト血清は米国BioClinical Partners社より入手し、採血は４０歳以上の男女を対象に行なわれた。採血の際、次のいずれかの基準に当てはまるものは疾患群として登録した：
１．採血日よりさかのぼって21日以内にEKG検査により急性心筋梗塞と診断された者。
２．採血日に冠動脈造影法により冠状動脈閉塞と診断された者。
上記の基準に当てはまらないドナーで、かつ次の条件を満たしたものを正常人として登録した：
１．９０日以内に測定した空腹時の血清トリグリセライドが130 mg/dl以下及びHDLコレステロールが40 mg/dl以上。
２．高脂血症の原因となりうる肥満症、甲状腺機能低下症、ネフローゼ症候群、及び糖尿病の診断をもたない。
３．心筋梗塞症の既往歴及び家族歴をもたない。
採血はBioClinical Partners社と提携している病院で行なわれ、採血後30分から60分の間に遠心分離処理により血清を確保し速やかに冷凍保存した。
（血漿及び血清の前処理）
蛋白質発現解析時に血液中の高発現蛋白質の影響を少なくするため、下記のいずれかの方法にて血漿及び血清を前処理した。
１．アルブミン・IgG除去：Blue sepharoseとProtein Aのカラムでウサギ血漿を処理して血漿中のアルブミン及びIgGを除去。
２．血中高発現蛋白質除去：抗体アフィニティカラムによりウサギ血漿を処理して血漿中のトランスフェリン、ヘモペキシン、アルファ１アンチトリプシン及びフィブリノゲンを除去し、ヒト血清においてはアルブミン、IgG、アンチトリプシン、IgA、トランスフェリン及びハプトグロビンを除去。
３．レクチン分画：レクチンのカラムにてウサギ血漿を処理。高発現蛋白質の影響が最も少ない画分を選択。
（二次元電気泳動による蛋白質発現解析）
各前処理・分画法で得たウサギ血漿蛋白質を二次元電気泳動ゲルにて展開（一次元：等電点、二次元：分子量）した。発現解析用のゲルは、Cy dye（Amersham Bioscience社）により染色、蛋白質同定用のゲルはSyproRuby(Molecular Probe社)にて染色した。蛋白質発現解析はAmersham社のDecyderソフトにより解析した。
（蛋白質同定）
二次元ゲル解析で有意に発現差異の認められた蛋白質スポットの同定は質量分析法により行った。発現変動スポットをSyproRuby染色したゲルより切り出し、蛋白質をゲル内でトリプシンにより消化した。その後、質量分析装置(Q-TOF型)によりMS及びMS/MSで測定した。この方法で得た質量分析データを、下記のプロダクトイオン検索法で解析した。すなわち、親ペプチドの質量を基に蛋白質データベースを検索し、ヒットした候補のアミノ酸配列にMS/MSスペクトルを照合してスコアを決定した。この方法は、データベースに蛋白質が登録してある場合に有効であるが、登録されていない蛋白質の同定は困難である。
（ウエスタンブロット）
ヒト血清中のHRGの発現パターンはウエスタンブロット法により確認した。上記高発現蛋白質除去処理を施した血漿蛋白質をSDS-PAGEにて展開した後、PVDFメンブレンにトランスファーをした。メンブレン上のHRGは、抗HRG抗体（R&Dシステムズ社）により認識させ、HRP標識した2次抗体とインキュベートした後に反応させ検出をした。
（グリコシダーゼ処理）
糖鎖付加修飾の確認にはグリコシダーゼ処理を用いた。上記高発現蛋白質除去処理を施した血漿蛋白質をグリコペプチダーゼF（タカラバイオ社）及び付随試薬により脱糖鎖処理を行なった後、SDS-PAGEにて展開してウエスタンブロットを実施した。
（PCRによる多型解析）
血液ドナーのHRG遺伝子のジェノタイプはPCR法により確認した。血液ドナーのゲノム遺伝子に対し、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸を決定するSNP部位にシトシン又はチミンのいずれかの塩基を含む2種類の20塩基配列のどちらか一つと約400残基下流にある20塩基配列の組み合わせをプローブとして用い、PCRを行った。その後、アガロースゲルにより増幅されたバンドの有無を確認した。この時、バンドが検出していれば、このドナーは特定のSNPを保有している事とした。
【００５７】
実施例１  二次元ゲル電気泳動による発現変動解析
J-0およびJ-4,5のウサギからそれぞれ採取した血漿（n=4）をBlue sepharose/Protein Aカラム、次いで抗体アフィニティカラムで処理し、さらにレクチン分画を行った後、異なるCy dyeで標識して同一ゲル上で二次元電気泳動に付した結果、動脈硬化の進行に伴って発現が増加する蛋白質のスポットが見出された。これらのうちの１つのスポットについての発現変動を図１に示す。
【００５８】
実施例２  蛋白質の同定
実施例１で得られた蛋白質の部分アミノ酸配列を、プロダクトイオン検索法により決定した。その結果、実施例１で得られたスポットから得られた蛋白質は、HRG（図２にウサギHRGのアミノ酸配列を示す）であることが明らかとなった。分離された蛋白質のアミノ酸配列解析により同定された部分のアミノ酸配列を図２に下線で示す。
【００５９】
実施例３  ヒトHRGのウエスタンブロットによる解析
実施例１及び２で得られた、HRGが動脈硬化に伴って増加する現象を、正常及び患者由来のヒト血清を用いてウエスタンブロットにより確認した。その結果、ヒトでは分子量が約77kDa及び75kDaの2種類のHRGが検出されることが明らかとなった（図３(a)）。更に、正常人の多くでは77kDa及び75kDaの両方のHRGが検出されるのに対し、ほとんどの疾患群由来の血清では75kDaのHRGしか存在しないことが明らかになった（図３(b)）。
【００６０】
実施例４  グリコシダーゼ処理後のヒトHRG
実施例３で得たヒトHRGの分子量の差が糖鎖の違いによるかどうかを検証するため、高発現蛋白質除去を施したヒト血清を、グリコシダーゼ処理した後にウエスタンブロットをしたところ、グリコシダーゼ処理前に77kDaと75kDaのHRGがどちらか一方もしくは両方存在していたかにかかわらず、全てほぼ同じ分子量の一本のバンドが検出された（図４）。このことから、分子量の異なる２つのHRGの差は、糖鎖の違いによるものであることが明らかとなった。
【００６１】
実施例５  ヒトHRG遺伝子多型解析
実施例４で示したHRGへの糖鎖修飾が、HRGの186番目のアミノ酸置換をもたらす遺伝子多型に起因することをゲノム遺伝子のPCRにより確認した。その結果、図５(a)で示したように、HRG蛋白質の186番目のアミノ酸がProとなるアレルを持つ場合にはSNP部位がcとなるプライマーによりバンドが検出され、Serとなるアレルを持つ場合にはtとなるプライマーによりバンドが検出された。これらを正常人と疾患群のHRG遺伝子で比較したのが図５(b)であり、正常人ではヘテロ接合体、そして疾患群ではProのみとなるホモ接合体が多いことが明らかとなった。この結果はウエスタンブロットによる77kDaと75kDaのバンドの検出パターンと一致していることから、この蛋白質の表現型は遺伝子多型を反映していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明によれば、患者の血液サンプル等を用いて、非侵襲的に動脈硬化性疾患に対する遺伝的感受性を容易に判定することができ、動脈硬化性疾患の予防・治療薬の薬効評価や該疾患患者の投与計画を決定する上で有用である。また、本発明により、HRG遺伝子のジェノタイプに基づく動脈硬化性疾患の新規かつ有用な管理ガイドラインを提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】各スコア（aorta病変面積率：J-0、J-4,5）のWHHLウサギから採取した血漿におけるHRGの発現を示す二次元ゲル電気泳動スポットの大きさの変動を示す図である。縦軸はStandardized Log Abundanceを示す。図中、丸印は各測定値（n=4）を示し、＋印はその平均値を示す。
【図２】質量分析法により検出された、HRGに相当するスポットから分離した蛋白質のアミノ酸配列とウサギHRGアミノ酸配列を示す図である。下線部が検出されたペプチドのアミノ酸配列と同一の配列を示す。
【図３】高発現蛋白質除去処理後のヒト血清でのHRGに対するウエスタンブロット解析の結果を示す図である。(a)はメンブレンの染色像である。図中、Nは正常人、MIは心筋梗塞患者、UAは不安定狭心症患者をそれぞれ示し、数字は各群における被験者番号を示す。(b)は検出したHRGバンドが1本か2本の判定結果を示すパネルである。図中、MIは心筋梗塞患者、UAは不安定狭心症患者をそれぞれ示し、No.は各群の被験者番号を示す。A欄が網掛けされているものは約75kDaの１本バンドを示し、B欄が網掛けされているものは２本バンドを示す。A、B欄とも空白のものは判定不可能であることを示す。
【図４】グリコシダーゼ処理後のヒト血清タンパク質のHRGに対するウエスタンブロット解析の結果を示す図である。処理前のパターンに関係なく、同じ分子量の１本のバンドが検出され、処理前の試料に見られる分子量の違いが糖鎖の違いによることを示している。図中、Nは正常人、MIは心筋梗塞患者、UAは不安定狭心症患者をそれぞれ示し、数字は各群における被験者番号を示す。(-)はグリコシダーゼ処理なし、（+）はグリコシダーゼ処理した蛋白質試料をそれぞれ表している。
【図５】ヒトHRG遺伝子のPCRによる多型解析を示した図である。（a）はPCRにより増幅したHRG遺伝子の一部分をアガロースゲルで検出したものである。図中、Nは正常人、MIは心筋梗塞患者、UAは不安定狭心症患者をそれぞれ示し、数字は各群における被験者番号を示す。c及びtはプライマー中に組み込まれたSNP部位の塩基を示している。（b）は186番目のアミノ酸を決定するSNP部位についての遺伝子型をパネルに示したものである。図中、MIは心筋梗塞患者、UAは不安定狭心症患者をそれぞれ示し、No.は各群の被験者番号を示す。
【図１】
2007282553.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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