(57)【要約】      （修正有）【課題】オーダーメイド放射線治療を具現化するために、癌患者の放射線に対する感受性の程度を予め予測することのできるＤＮＡ配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドである、放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドを提供する。【解決手段】本発明の放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドは、特定な配列で示される、二種類のＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドであって、一方の塩基配列の１２１番目の塩基がＴであり、他方の塩基配列の１２１番目の塩基がＧであることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１および配列番号２に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドであって、
前記配列番号１の１２１番目の塩基がＴであり、
前記配列番号２の１２１番目の塩基がＧであることを特徴とする放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列表の配列番号３から配列番号７に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドであって、
前記配列番号３の１２１番目の塩基がＴであり、
前記配列番号４の１２１番目の塩基がＴであり、
前記配列番号５の１２１番目の塩基がＴであり、
前記配列番号６の１２１番目の塩基がＧであり、
前記配列番号７の１２１番目の塩基がＴであることを特徴とする放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列表の配列番号８から配列番号１０に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドであって、
前記配列番号８の１２１番目の塩基がＡであり、
前記配列番号９の１２１番目の塩基がＣであり、
前記配列番号１０の１２１番目の塩基がＧであることを特徴とする放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列表の配列番号１１および配列番号１２に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドであって、
前記配列番号１１の１２１番目の塩基がＣであり、
前記配列番号１２の１２１番目の塩基がＴであることを特徴とする放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１から請求項４のうちいずれか一項に記載の放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドにおいて、１２１番目の塩基以外の塩基が１個若しくは数個欠失、置換若しくは付加しているひとつながりのポリヌクレオチド、または、これらの相補的なＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドであることを特徴とする放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１から請求項５のうちいずれか一項に記載の放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド、または、この放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするひとつながりのポリヌクレオチドであることを特徴とする放射線治療における副作用発症用ポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列表の配列番号１３から配列番号３６に示されるＤＮＡ塩基配列を有するポリヌクレオチドのうち、配列番号１３から順次２つのポリヌクレオチドを１セットとして用いることを特徴とする増幅用プライマーセット。
【請求項８】
配列表の配列番号１３から配列番号３６に示されるＤＮＡ塩基配列を有するポリヌクレオチドのうち、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加したことを特徴とする請求項７に記載の増幅用プライマーセット。
【請求項９】
配列表の配列番号３７から配列番号４８のいずれかに示されるＤＮＡ塩基配列からなることを特徴とする検出用プライマー。
【請求項１０】
配列表の配列番号３７から配列番号４８に示されるＤＮＡ塩基配列を有するポリヌクレオチドのうち、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加したことを特徴とする請求項９に記載の検出用プライマー。
【請求項１１】
配列表の配列番号１および配列番号２に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドを利用する放射線治療における副作用発症予測方法であって、
前記ポリヌクレオチドのうち、前記配列番号１の１２１番目の位置に相当する塩基と、前記配列番号２の１２１番目の位置に相当する塩基と、を解析するステップと、
前記ポリヌクレオチドのうち、前記配列番号１の１２１番目の位置に相当する塩基がＴ、前記配列番号２の１２１番目の位置に相当する塩基がＧである場合に、副作用発症の危険性が高いと予測するステップと、
を含むことを特徴とする放射線治療における副作用発症予測方法。
【請求項１２】
配列表の配列番号３から配列番号７に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドを利用する放射線治療における副作用発症予測方法であって、
前記ポリヌクレオチドのうち、前記配列番号３の１２１番目の位置に相当する塩基と、前記配列番号４の１２１番目の位置に相当する塩基と、前記配列番号５の１２１番目の位置に相当する塩基と、前記配列番号６の１２１番目の位置に相当する塩基と、前記配列番号７の１２１番目の位置に相当する塩基と、を解析するステップと、
前記ポリヌクレオチドのうち、前記配列番号３の１２１番目の位置に相当する塩基がＴ、前記配列番号４の１２１番目の位置に相当する塩基がＴ、前記配列番号５の１２１番目の位置に相当する塩基がＴ、前記配列番号６の１２１番目の位置に相当する塩基がＧ、前記配列番号７の１２１番目の位置に相当する塩基がＴである場合に、副作用発症の危険性が高いと予測するステップと、
を含むことを特徴とする放射線治療における副作用発症予測方法。
【請求項１３】
配列表の配列番号８から配列番号１０に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドを利用する放射線治療における副作用発症予測方法であって、
前記ポリヌクレオチドのうち、前記配列番号８の１２１番目の位置に相当する塩基と、前記配列番号９の１２１番目の位置に相当する塩基と、前記配列番号１０の１２１番目の位置に相当する塩基と、を解析するステップと、
前記ポリヌクレオチドのうち、前記配列番号８の１２１番目の位置に相当する塩基がＡ、前記配列番号９の１２１番目の位置に相当する塩基がＣ、前記配列番号１０の１２１番目の位置に相当する塩基がＧである場合に、副作用発症の危険性が高いと予測するステップと、
を含むことを特徴とする放射線治療における副作用発症予測方法。
【請求項１４】
配列表の配列番号１１および配列番号１２に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドを利用する放射線治療における副作用発症予測方法であって、
前記ポリヌクレオチドのうち、前記配列番号１１の１２１番目の位置に相当する塩基と、前記配列番号１２の１２１番目の位置に相当する塩基とを解析するステップと、
前記ポリヌクレオチドのうち、前記配列番号１１の１２１番目の位置に相当する塩基がＣ、前記配列番号１２の１２１番目の位置に相当する塩基がＴである場合に、副作用発症の危険性が高いと予測するステップと、
を含むことを特徴とする放射線治療における副作用発症予測方法。
【請求項１５】
（ａ）生体から採取した試料をもとに、配列表の配列番号１および配列番号２に示されるＤＮＡ塩基配列、配列表の配列番号３から配列番号７に示されるＤＮＡ塩基配列、配列表の配列番号８から配列番号１０に示されるＤＮＡ塩基配列、または、配列表の配列番号１１および配列番号１２に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドを調製する工程と、
（ｂ）前記（ａ）の工程で調製したひとつながりのポリヌクレオチドをもとにＤＮＡ増幅産物を増幅して得る工程と、
（ｃ）前記（ｂ）の工程で増幅したＤＮＡ増幅産物と、配列表の配列番号３７から配列番号４８に示されるいずれかの検出用プライマーと、を用いて伸長反応を行ない、ＤＮＡ伸長反応生成物を得る工程と、
（ｄ）前記（ｃ）の工程で得られたＤＮＡ伸長反応生成物のＤＮＡ塩基配列を解析する工程と、
（ｅ）前記（ｄ）の工程で解析されたＤＮＡ伸長反応生成物のＤＮＡ塩基配列のうち、配列表の配列番号１から配列番号１２のいずれかに示される１２１番目の位置に相当する塩基と、配列表の配列番号１から配列番号１２のいずれかに示されるＤＮＡ塩基配列の１２１番目の塩基と、が一致する場合に、前記（ｃ）の工程で得られたＤＮＡ伸長反応生成物のＤＮＡ塩基配列を有するアレルが指標となるアレルであるか否かを判定した結果であって、前記（ａ）の工程で得られたポリヌクレオチドに存在する複数のＳＮＰサイトの塩基種を組み合わせて判定・解析した結果に基づいて、前記生体が放射線によって副作用を発症する危険性が高いかまたは低いかを予測する工程と、
を含むことを特徴とする放射線治療における副作用発症予測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドであって、特に遺伝子の一塩基多型を判定の指標として、特定のＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドに存在する複数の一塩基多型を組み合わせることにより、放射線治療における副作用の発症を予測するポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
年間約５０万人が罹患すると言われている癌は、日本人の死亡原因の１位であり、その克服は国民の悲願である。
放射線治療は、癌に対する有効な局所療法の一つであるが、外科手術と異なり、病巣部を切除せずに治療することが可能であるため、身体機能や形態の温存の観点から優れた治療方法であるということができる。すなわち、外科手術のように身体にメスを入れないことから、患者の精神的な負担も軽く、手術後の社会復帰も容易であるので、患者のＱＯＬ（Quality of Life）を高めることができるという利点もあって、今後、大いに発展が望まれる治療方法である。
【０００３】
また、放射線治療は患者への負担も軽く、合併症を有する患者や高齢者にも適応することができる利点もある。さらに、近年では、ＣＴやＭＲＩなどの画像情報をもとに病巣の位置・形状・大きさを３次元座標上で正確に決定し、病巣へ線量を集中できる定位（的）放射線治療の技術も確立されている。
【０００４】
このように、放射線治療は癌の治療において非常に有用な治療方法であるが、照射した放射線により皮膚に潰瘍が生じたり、腸穿孔や肺炎を合併するなどの重篤な副作用を伴ったり、場合によっては放射線治療を中断しなければならない放射線感受性の高い癌患者がいる。
【０００５】
このような放射線に対する感受性の違いの一因には遺伝的な個人差もあり、それぞれの癌患者が有するＤＮＡ塩基配列の相違に関連していると考えられる。このようなＤＮＡ塩基配列の相違は一般には多型（ポリモルフィズム）と呼ばれ、以下のように分類することができる。すなわち、（１）１から数十塩基が欠失や挿入をしている多型（挿入／欠失多型）、（２）２塩基から数十塩基を１単位とする配列が繰り返されている多型（ＶＮＴＲやマイクロサテライト多型）、そして、（３）１個の塩基が他の塩基に置き換わっている多型（一塩基多型）、である。
【０００６】
これらの中でも（３）の一塩基多型（ＳＮＰ；Single Nucleotide Polymorphism）は、数百塩基対から１０００塩基対に１箇所の割合で存在していると推測され、ヒトの全ゲノム中には３００万〜１０００万のＳＮＰがあると考えられている。そして、このＳＮＰが各人の顔立ちや性格、医薬品に対する応答性などの、いわゆる“個性”に強い影響を及ぼしていると考えられている（非特許文献１参照）。
【非特許文献１】監修・松原謙一、榊佳之、編集・中村祐輔「ポストシークエンスのゲノム科学（１）  ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」、中山書店、２頁および３頁、２０００年６月出版
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
放射線に対する感受性の個人差にも、ＳＮＰをはじめとする遺伝子のＤＮＡ塩基配列の相違が大きく影響していると考えられる。これはすなわち、放射線治療前にＤＮＡ塩基配列を調べることによって、癌患者の放射線に対する感受性の程度を予め知ることができれば、オーダーメイド放射線治療を実現することが可能になると考えられる。
しかしながら、どのような遺伝子が放射線の感受性に関与し、また、どのＳＮＰが放射線の感受性に影響を与えているのかということに関しては、ほとんど研究が進んでいない状況であった。
【０００８】
ここで、放射線治療前に遺伝子のＤＮＡ塩基配列を調べるためには、ＳＮＰを含むＤＮＡ塩基配列を増幅しなければならない。増幅方法としては、ポリアクリルアミドゲルに抽出した染色体を埋め込み、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲでＤＮＡ塩基配列を増幅し、ＤＮＡ塩基配列を決定する方法が従来から知られている（Mitra RD., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 100, 581-584(2003)）。
しかしながら、ポリアクリルアミドゲルはゲル化の際にラジカル産生が不可欠であり、埋め込まれる染色体へのダメージが避けられない。また、未重合アクリルアミドによってＴａｑＤＮＡポリメラーゼが化学修飾を受け、安定した増幅反応効率が得られないことが多く、ゲル中での蛍光標識したジデオキシ塩基（ｄｄＮＴＰｓ）を用いての一塩基伸長反応と、蛍光スキャナーによる蛍光イメージの解析を何度も繰り返さなければならないなどの問題があった。
【０００９】
本発明の課題は前記問題に鑑みてなされたものであり、オーダーメイド放射線治療を具現化するために、癌患者の放射線に対する感受性の程度を予め予測することのできるＤＮＡ配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドおよび副作用発症予測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、ｃＳＮＰ（coding SNP）やｒＳＮＰ（regulatory SNP）、ｉＳＮＰ（intron SNP）を中心にＳＮＰタイピングを行えば、前記課題が解決でき、オーダーメイド放射線治療の実現を図ることができると考え、鋭意研究に励んだ。その結果、放射線治療後、副作用を発症した患者（以下、発症群という）と副作用を発症しなかった、あるいは軽微な発症であった患者（以下、非発症群という）の遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定を行った結果、発症群のアレル（allele;対立遺伝子）の出現頻度と、非発症群のアレルの出現頻度との間に統計学的に有意な差を見出すことができ、本発明を完成するに至った。
また、その発明を完成するに当たって、人為的な剪断を極力抑制しつつ、染色体ＤＮＡを鋳型として好適に遺伝子解析を行なうことのできる染色体ＤＮＡの調製方法を見出した。
【００１１】
請求項１記載の発明は、配列表の配列番号１および配列番号２に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドであって、前記配列番号１の１２１番目の塩基がＴであり、前記配列番号２の１２１番目の塩基がＧであることを特徴とする放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド、を提供するものである。
【００１２】
請求項２記載の発明は、配列表の配列番号３から配列番号７に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドであって、前記配列番号３の１２１番目の塩基がＴであり、前記配列番号４の１２１番目の塩基がＴであり、前記配列番号５の１２１番目の塩基がＴであり、前記配列番号６の１２１番目の塩基がＧであり、前記配列番号７の１２１番目の塩基がＴであることを特徴とする放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド、を提供するものである。
【００１３】
請求項３記載の発明は、配列表の配列番号８から配列番号１０に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドであって、前記配列番号８の１２１番目の塩基がＡであり、前記配列番号９の１２１番目の塩基がＣであり、前記配列番号１０の１２１番目の塩基がＧであることを特徴とする放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド。
【００１４】
請求項４記載の発明は、配列表の配列番号１１および配列番号１２に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドであって、前記配列番号１１の１２１番目の塩基がＣであり、前記配列番号１２の１２１番目の塩基がＴであることを特徴とする放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド、を提供するものである。
【００１５】
請求項５記載の発明は、請求項１から請求項４のうちいずれか一項に記載の放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドにおいて、１２１番目の塩基以外の塩基が１個若しくは数個欠失、置換若しくは付加しているひとつながりのポリヌクレオチド、または、これらの相補的なＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドであることを特徴とする放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド、を提供するものである。
【００１６】
請求項６記載の発明は、請求項１から請求項５のうちいずれか一項に記載の放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド、または、この放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするひとつながりのポリヌクレオチドであることを特徴とする放射線治療における副作用発症用ポリヌクレオチド。
【００１７】
請求項７記載の発明は、配列表の配列番号１３から配列番号３６に示されるＤＮＡ塩基配列を有するポリヌクレオチドのうち、配列番号１３から順次２つのポリヌクレオチドを１セットとして用いることを特徴とする増幅用プライマーセット、を提供するものである。
【００１８】
請求項８記載の発明は、配列表の配列番号１３から配列番号３６に示されるＤＮＡ塩基配列を有するポリヌクレオチドのうち、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加したことを特徴とする請求項７に記載の増幅用プライマーセット、を提供するものである。
【００１９】
請求項９記載の発明は、配列表の配列番号３７から配列番号４８のいずれかに示されるＤＮＡ塩基配列からなることを特徴とする検出用プライマー、を提供するものである。
【００２０】
請求項１０記載の発明は、配列表の配列番号３７から配列番号４８に示されるＤＮＡ塩基配列を有するポリヌクレオチドのうち、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加したことを特徴とする請求項９に記載の検出用プライマー、を提供するものである。
【００２１】
請求項１１記載の発明は、配列表の配列番号１および配列番号２に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドを利用する放射線治療における副作用発症予測方法であって、
前記ポリヌクレオチドのうち、前記配列番号１の１２１番目の位置に相当する塩基と、前記配列番号２の１２１番目の位置に相当する塩基と、を解析するステップと、前記ポリヌクレオチドのうち、前記配列番号１の１２１番目の位置に相当する塩基がＴ、前記配列番号２の１２１番目の位置に相当する塩基がＧである場合に、副作用発症の危険性が高いと予測するステップと、を含むことを特徴とする放射線治療における副作用発症予測方法、を提供するものである。
【００２２】
請求項１２記載の発明は、配列表の配列番号３から配列番号７に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドを利用する放射線治療における副作用発症予測方法であって、前記ポリヌクレオチドのうち、前記配列番号３の１２１番目の位置に相当する塩基と、前記配列番号４の１２１番目の位置に相当する塩基と、前記配列番号５の１２１番目の位置に相当する塩基と、前記配列番号６の１２１番目の位置に相当する塩基と、前記配列番号７の１２１番目の位置に相当する塩基と、を解析するステップと、前記ポリヌクレオチドのうち、前記配列番号３の１２１番目の位置に相当する塩基がＴ、前記配列番号４の１２１番目の位置に相当する塩基がＴ、前記配列番号５の１２１番目の位置に相当する塩基がＴ、前記配列番号６の１２１番目の位置に相当する塩基がＧ、前記配列番号７の１２１番目の位置に相当する塩基がＴである場合に、副作用発症の危険性が高いと予測するステップと、を含むことを特徴とする放射線治療における副作用発症予測方法、を提供するものである。
【００２３】
請求項１３記載の発明は、配列表の配列番号８から配列番号１０に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドを利用する放射線治療における副作用発症予測方法であって、前記ポリヌクレオチドのうち、前記配列番号８の１２１番目の位置に相当する塩基と、前記配列番号９の１２１番目の位置に相当する塩基と、前記配列番号１０の１２１番目の位置に相当する塩基と、を解析するステップと、前記ポリヌクレオチドのうち、前記配列番号８の１２１番目の位置に相当する塩基がＡ、前記配列番号９の１２１番目の位置に相当する塩基がＣ、前記配列番号１０の１２１番目の位置に相当する塩基がＧである場合に、副作用発症の危険性が高いと予測するステップと、を含むことを特徴とする放射線治療における副作用発症予測方法、を提供するものである。
【００２４】
請求項１４記載の発明は、配列表の配列番号１１および配列番号１２に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドを利用する放射線治療における副作用発症予測方法であって、前記ポリヌクレオチドのうち、前記配列番号１１の１２１番目の位置に相当する塩基と、前記配列番号１２の１２１番目の位置に相当する塩基とを解析するステップと、前記ポリヌクレオチドのうち、前記配列番号１１の１２１番目の位置に相当する塩基がＣ、前記配列番号１２の１２１番目の位置に相当する塩基がＴである場合に、副作用発症の危険性が高いと予測するステップと、を含むことを特徴とする放射線治療における副作用発症予測方法、を提供するものである。
【００２５】
さらに、請求項１５記載の発明は、（ａ）生体から採取した試料をもとに、配列表の配列番号１および配列番号２に示されるＤＮＡ塩基配列、配列表の配列番号３から配列番号７に示されるＤＮＡ塩基配列、配列表の配列番号８から配列番号１０に示されるＤＮＡ塩基配列、または、配列表の配列番号１１および配列番号１２に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドを調製する工程と、（ｂ）前記（ａ）の工程で調製したひとつながりのポリヌクレオチドをもとにＤＮＡ増幅産物を増幅して得る工程と、（ｃ）前記（ｂ）の工程で増幅したＤＮＡ増幅産物と、配列表の配列番号３７から配列番号４８に示されるいずれかの検出用プライマーと、を用いて伸長反応を行ない、ＤＮＡ伸長反応生成物を得る工程と、（ｄ）前記（ｃ）の工程で得られたＤＮＡ伸長反応生成物のＤＮＡ塩基配列を解析する工程と、（ｅ）前記（ｄ）の工程で解析されたＤＮＡ伸長反応生成物のＤＮＡ塩基配列のうち、配列表の配列番号１から配列番号１２のいずれかに示される１２１番目の位置に相当する塩基と、配列表の配列番号１から配列番号１２のいずれかに示されるＤＮＡ塩基配列の１２１番目の塩基と、が一致する場合に、前記（ｃ）の工程で得られたＤＮＡ伸長反応生成物のＤＮＡ塩基配列を有するアレルが指標となるアレルであるか否かを判定した結果であって、前記（ａ）の工程で得られたポリヌクレオチドに存在する複数のＳＮＰサイトの塩基種を組み合わせて判定・解析した結果に基づいて、前記生体が放射線によって副作用を発症する危険性が高いかまたは低いかを予測する工程と、を含むことを特徴とする放射線治療における副作用発症予測方法、を提供するものである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドによれば、ＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドに存在する複数のＳＮＰサイトの塩基種を組み合わせて判定・解析することにより、放射線治療による副作用を発症する危険性が高いか低いかを予測することができる。したがって、本発明によれば、オーダーメイド放射線治療の実現に資することとなる。
【００２７】
本発明の放射線治療における副作用発症予測方法によれば、生体から採取したＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドに含まれるＳＮＰサイトの塩基種の情報から、放射線による副作用を発症する危険性が高いか低いかを予測することができる。すなわち、オーダーメイド放射線治療を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を実施するための最良の形態について説明するが、本発明の内容は以下に説明する内容に限定されるものではない。
〔１．放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド〕
本発明における「放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド」とは、配列表の（１）配列番号１および配列番号２、（２）配列番号３から配列番号７、（３）配列番号８から配列番号１０、（４）配列番号１１および配列番号１２の４種類の組合せのうち、いずれかを組合せたＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドである。
ただし、本発明においては、配列表の配列番号１から配列番号１２に示されるＤＮＡ塩基配列を有するポリヌクレオチドは、１２１番目の塩基を有していればよく、ＤＮＡ塩基配列の長短について特に限定されるものではない。すなわち、これらのポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１から配列番号１２に示されるＤＮＡ塩基配列のうち、１２１番目の塩基を含む１０塩基以上２４１塩基以下のＤＮＡ塩基配列であってもよく、また、２４１塩基を超えるものであっても構わない。
また、ＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドにおいても、前記組合せにおける配列表の各配列番号が、１２１番目の塩基を含むＤＮＡ塩基配列を有していればよく、ＤＮＡ塩基配列の長短について特に限定されるものではない。
【００２９】
本発明においては、配列表の配列番号１から配列番号１２に示されるＤＮＡ塩基配列のうち、１２１番目に示す塩基（ＳＮＰサイト）を含むひとつながりのポリヌクレオチドを指標となるアレル（以下、「指標アレル」）という。「指標アレル」とは、当該ＳＮＰサイトにおいて、放射線治療を行った後に副作用（障害）を発症する危険性が高い者の有するアレル（allele；対立遺伝子）中の塩基と、副作用を発症する危険性が低い者の有するアレル中の塩基と、が異なるアレルのことである。言い換えれば、当該副作用を発症する危険性が高いか低いかを予測（判断）できるアレルをいう。したがって、ＳＮＰタイピングを行ってこの指標アレルを認識することができれば、放射線治療による副作用の発症の危険性を予測することが可能となる。
なお、本発明で規定する配列表の配列番号１から配列番号１２に示される１２１番目の塩基種を認識することができれば、ＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドにおける位置は限定されない。すなわち、当該指標アレルとなるＳＮＰサイトがＤＮＡ塩基配列およびポリヌクレオチド中の中ほどに位置するようにすることができるほか、５′末端や３′末端に位置するようにすることも可能である。
これに対し、本発明の配列表の配列番号１から配列番号１２のいずれかと同一または実質的に同一であるＤＮＡ塩基配列において、前記の指標アレルに相当するＳＮＰサイトに存在する指標アレルとは異なる塩基であって、指標とはならないアレルを、本発明では「非指標アレル」と呼ぶこととする。
【００３０】
配列表の配列番号１から配列番号１２に示すＤＮＡ塩基配列は、そのＤＮＡ塩基配列中における特定のＳＮＰサイトの塩基を確認することによって、指標アレルであるか非指標アレルであるかを判定し、さらにＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドに存在する複数のＳＮＰサイトの塩基種を組み合わせて判定・解析することで、癌の放射線治療において副作用が発症する危険性が高いか低いかを予測するために用いることができる。特に、乳癌の放射線治療開始から早期のステージにおける副作用の発症予測については、配列表の配列番号１から配列番号１２に示すＤＮＡ塩基配列（１２１番目の塩基（ＳＮＰサイト））を用いて好適に予測することができる。
【００３１】
本発明で用いるＳＮＰサイトを含んだ配列表の配列番号１から配列番号１２に示すＤＮＡ塩基配列を有するポリヌクレオチドは、１２１番目の塩基（指標アレル）を含んで任意の長さの連続したポリヌクレオチド（例えば、前記したように１０塩基以上２４１塩基以下、または２４１塩基を超える（数千から数万塩基）長さのポリヌクレオチド）として用いることができる。つまり、配列表の配列番号１から配列番号１２に示すＤＮＡ塩基配列のうち１２１番目の塩基を含むポリヌクレオチドを標識プローブなどの遺伝子マーカーとして用いることができる。
適切な長さを選択すれば、特異的なハイブリダイズを行うことができるほか、例えば染色体ＤＮＡ（制限酵素処理あるいは物理的切断を行なったものも含む）と、かかる遺伝子マーカーと、をハイブリダイズさせた状態で電気泳動し、その泳動度の差異を利用することで、適切にＳＮＰタイピングを行うことが可能である。つまり、配列表の配列番号１から配列番号１２のいずれかに示すＤＮＡ塩基配列のうち１２１番目の塩基を塩基種ごとに違えて作成した遺伝子マーカー（１つの遺伝子マーカーであってもよく、複数の遺伝子マーカーを用いたひとつながりの遺伝子マーカーであってもよい）を用いて染色体ＤＮＡとハイブリダイズさせることによってＳＮＰタイピングを行うことが可能である。
【００３２】
本発明は、前記で説明したように、配列表の配列番号１から配列番号１２のいずれかに示すＤＮＡ塩基配列のうち１２１番目の塩基を照合・判定し、組み合わせることで、放射線治療における副作用の発症のしやすさに影響する遺伝的素因を有するか否かを解析し、その結果から放射線による副作用を発症する危険性が高いか低いかを予測するためになされたものである。
したがって、解析したひとつながりのポリヌクレオチドのＤＮＡ塩基配列と、配列表の配列番号１から配列番号１２のうちのいずれかのＤＮＡ塩基配列と、を対比することで、本発明で特定されている指標アレルに該当するか、あるいは、非指標アレルに該当するかを判定する。そして、解析したひとつながりのポリヌクレオチドに存在する複数のＳＮＰサイトの塩基種を組み合わせることで、放射線に対して副作用を発症する危険性が高い型の塩基種を有する者（危険群）であるか、副作用を発症する危険性が低い型の塩基種を有する者（非危険群）であるかを判定することができる。すなわち、指標アレルを有する者は、非指標アレルを有する者よりも放射線治療における副作用を発症する危険性が高い遺伝的素因を有している、と判断することができる。
【００３３】
ここで、本発明に係る放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドは、当該１２１番目の塩基以外の塩基が、１個または複数個欠失、置換若しくは付加していてもよく、また、その相補鎖であっても構わない。すなわち、本発明の特許請求の範囲と配列表で特定するＳＮＰサイトを含むものであれば、それ以外の箇所に塩基の置換、欠失、挿入等が起こっていても、実質的に同一またはこれと相補的なＤＮＡ塩基配列を有しているひとつながりのポリヌクレオチドであれば本発明の放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドと同等のものである。
【００３４】
さらに、このような放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼ、特に耐熱性ポリメラーゼ（例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）などの種々のポリメラーゼによって複製あるいは増幅されたＤＮＡ産物を好適に用いることができる。
そして、本発明の放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドは、それが有するＤＮＡ塩基配列を直接解析するために好適に用いることができる。この放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドのＤＮＡ塩基配列の直接的な解析には、従来公知のＤＮＡシーケンサーや質量分析機などを好適に用いることができる。
【００３５】
本発明の放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドを遺伝子マーカーとして用いる場合は、ＤＮＡ塩基配列の末端、または、ＤＮＡ塩基配列中のいずれかの塩基を蛍光色素や放射性同位元素などで標識化した遺伝子マーカー（標識プローブ）とするのがより好ましい。標識遺伝子マーカーとすれば、蛍光強度や放射線量を測定することによって容易に検出可能となるほか、例えば、Ｘ線フィルムを蛍光で感光させる、あるいは、放射線で感光させるなどして、容易に検出することも可能となる。なお、放射線量や蛍光強度の測定は、従来公知の放射線検出装置や蛍光測定装置などを好適に用いることができる。また、このように蛍光色素を標識化しておけば、ＤＮＡシーケンサーによって適切に解析することもできる。
【００３６】
標識化するために用いる放射性同位元素としては、例えば、３２Ｐや３５Ｓなどの通常用
いられる放射性同位元素を挙げることができる。また、標識化するために用いる蛍光色素としては、例えば、ＦＡＭＴＭ、Ｙａｋｉｍａ ＹｅｌｌｏｗＴＭ、ＶＩＣＴＭ、ＴＡＭＲＡＴＭ、ＲＯＸＴＭ、Ｃｙ３ＴＭ、Ｃｙ５ＴＭ、ＨＥＸＴＭ、ＴＥＴＴＭ、ＦＩＴＣなどの通常用いられる蛍光色素を挙げることができる。
【００３７】
以上説明したように、本発明の放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドは、そのＤＮＡ塩基配列を直接解析することや、当該放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドを遺伝子マーカーとして用いることにより、好適に一塩基多型の検出、すなわちＳＮＰタイピングを好適に行うことができる。なお、「多型」とは、人口中１％以上の頻度で存在している塩基の変化と一般的に定義されているが、本発明における「多型」は、この定義に限定されず、１％未満の塩基の変化も「多型」に含めることとする。
【００３８】
〔２．プライマー〕
配列表の配列番号１３から配列番号３６に示すＤＮＡ塩基配列は、配列番号１３から順次２つのＤＮＡ塩基配列を１セットとするプライマーセット、として用いるのが好ましい。
かかるプライマーセットの中から適宜適切な１セットのプライマーを選択してＤＮＡの増幅に用いれば、配列表の配列番号１から配列番号１２に示す任意のＤＮＡ塩基配列を特異的に増幅することができる。なお、このプライマーセットのうち、配列番号の小さいＤＮＡ塩基配列がフォワードプライマーであり、配列番号の大きいＤＮＡ塩基配列がリバースプライマーに該当する。これら２種類のプライマーに対応する配列に挟まれた部分がＰＣＲ増幅反応によって増幅される対象となる。
【００３９】
このように、配列表の配列番号１３から配列番号３６に示すプライマーセットは、特にＰＣＲを行う際に好適に用いることができることから、本発明の配列表の配列番号１３から配列番号３６に示すＤＮＡ塩基配列を有するポリヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅用のプライマーセットとして用いることが好ましい。したがって、このＰＣＲ増幅用のプライマーセットを用いれば、特定のＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチド、すなわち、配列表の配列番号１から配列番号１２の特定のＳＮＰサイト（本発明においては１２１番目の塩基が特定のＳＮＰサイトである。）を含む前記４種類の組合せのうち、いずれかの組合せを含むＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドのＤＮＡ塩基配列を確実、簡便かつ特異的に増幅することが可能である。
なお、このプライマーセットを構成するそれぞれのＤＮＡ塩基配列は、それが有するＤＮＡ塩基配列のうち、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加したものであってもよい。また、配列番号１３から配列番号３６に示すプライマーには、必要に応じて適宜の制限酵素認識配列（例えば「5’-ACGTTGGATG-3’」（配列番号４９）のような１０塩基程度のＤＮＡ配列）を、各プライマーの５′上流側に付加して用いてもよい。このように付加した配列は、ＰＣＲによる増幅反応を安定化させる効果を有する。なお、付加する塩基配列はこれに限られることはなく、同様の効果を奏するものであればどのような配列でも用いることができる。
【００４０】
〔３．ＳＮＰタイピング〕
ＳＮＰタイピングを行う手法としては、プライマー伸長に基づく手法、ハイブリダイゼーションに基づく手法、ＤＮＡの切断に基づく手法、ライゲーションに基づく手法などがある。
【００４１】
（３−１．ＳＮＰタイピングの手法）
プライマーエクステンションに基づく手法としては、例えば、１塩基プライマー伸長法（Syvanen, A.C. et al., Genomics, 8, 684-692(1990)）や、これを用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Ross, P., et al. Nat Biotechnol, 16, 1347-1351(1998)；Buetow, K.H. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 98, 581-584(2001)；ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、１０６〜１１７頁）のほか、アレル特異的プライマーエクステンション法（Uggozzoli, L. et al., Genet Anal Tech Appl, 9, 107-112(1992)）、ＡＰＥＸ法（in the arrayed primer extension, Shumaker, J.M. et al., Hum Mutat, 7, 346-354(1996)）などを挙げることができる。これらの中でも、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法を用いれば、簡易かつ大量のサンプルのＳＮＰタイピングを同時に行うことが可能であるので特に好適である。
【００４２】
このＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight/mass spectrometry）は、ＤＮＡ試料から得られたＤＮＡ産物のＤＮＡ塩基配列を直接決定して比較することができる、非常に効率的な手法である。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法は、前記したように大量のサンプルを高速度で処理するジェノタイピング法の一つである。この方法は、以前から生物学・化学の分野で使用されてきた質量分析機をＳＮＰタイピングに適用したものである。質量分析機による方法であるので、多型による差異を何らかの形で分子の違いに対応させ、その分子の質量の差を検出することで塩基の配列を決定することを基本原理としている。すなわち、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法は、質量分析機とプライマー伸長法とを組み合わせ、ＳＮＰサイトにおける塩基の違いを判定する。
【００４３】
具体的には、まず、生体からＤＮＡ試料を抽出する。この際、本発明の配列表の配列番号１から配列番号１２に示されるＳＮＰサイトに相当する部位の塩基を含むＤＮＡを、ＰＣＲなどを使用して増幅することで調製する。次いで、ＰＣＲ産物を鋳型として、ジェノタイピングプライマー（配列表の配列番号１から配列番号１２で示されるＳＮＰサイトに相当する部位における塩基の１塩基３′側の塩基から３′側の塩基配列に相補的な配列を有するプライマー、または、配列表の配列番号１から配列番号１２の相補鎖の場合は、その相補鎖と相補的な配列を有するプライマー（本発明においては配列表の配列番号３７から配列番号４８に示す検出用プライマーがこれに相当する））のｄｄＮＴＰプライマー伸長反応を行い、１個から数個の塩基を伸長する。なお、この反応に用いるＰＣＲ産物は、ＰＣＲ増幅用のプライマーを除去するための精製が行われていることが好ましく、ジェノタイピングプライマー（検出用プライマー）は、通常、１５ｂｐ以上の長さを有するのが好ましい。また、プライマー伸長反応においては、通常、ＰＣＲ産物に対して１０倍以上の過剰のジェノタイピングプライマーを加えるが、本発明はこれに制限されるものではない。ＰＣＲを行うためのサーマルサイクルの条件は適宜選択し得るが、ジェノタイピングプライマーのうち３０〜６０％程度が伸長する条件が好適である。例えば、９４℃と３７℃の２温度間で２５回程度行うことで適当な伸長効率を得ることができる。次いで、プライマー伸長反応産物のＭＡＬＤＩプレートへのスポットを行い、次いで、質量測定を行って、マススペクトログラムを作成する。そして、作成されたマススペクトログラムを解析することでＤＮＡ塩基配列を判定し、本発明の配列表の配列番号１から配列番号１２に示されるＳＮＰサイトに相当する部位の塩基が放射線に対して副作用を発症しやすい型の塩基種である場合と、副作用を発症しにくい型の塩基種である場合を１回の反応で判別することが可能である。
【００４４】
このように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法では質量分析機を用いてＤＮＡ塩基配列を直接判定し、大量かつ高速でＳＮＰタイピングを実現することができるが、本発明におけるＤＮＡ塩基配列を決定する手段としてはこれに限定されない。ＤＮＡ試料を用いてＤＮＡの塩基配列の決定を行う手段として、例えば、スラブゲルあるいはマルチキャピラリーを用いたＤＮＡシーケンサー等によってもＳＮＰタイピングを行うことができる。
【００４５】
（３−２．その他のＳＮＰタイピングの手法）
その他の手法として、例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法（Livak, K.J. et al., PCR Methods Appl., 4, 357-362(1995)；ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、94-105頁）、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ：Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法（Baner, J. et al., Nucleic Acids Res, 26, 5073-5078(1998)）、Ｉｎｖａｄｅｒ法（Lyamichev, V. et al., Nat Biotechnol, 17,292-296(1999)；ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、９４〜１０５頁、ＲＣＡ法（rolling circle amplification, Lizardi, P.M et al., Nat Genet, 19, 225-232(1998)；Magnus J., TECHNOLOGY DEVELOPMENT FOR GENOME AND POLYMORPHISM ANALYSIS, 23-24(2003), Karolinska University Press, Stockholm, Sweden；ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、１１８〜１２７頁）、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（single-strand conformation polymorphism；一本鎖高次構造多型, Genomics, 12, 139-146(1992)；Oncogene, 6, 1313-1318(1991)；PCR Methods Appl, 4, 275-282(1995)）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ：Restriction Fragment Length Polymorphism）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＤＮＡチップを用いる方法などを挙げることができる。
【００４６】
〔４．放射線治療に用いる放射線〕
本発明において、放射線治療に用いることのできる放射線としては、Ｘ線、γ線、重粒子線を好適に用いることができるが、これに限定されることはなく、陽子線、中性子線といった放射線のほか、電子線も用いることができる。
【００４７】
〔５．ＳＮＰ情報〕
ＳＮＰタイピングを行うための情報は、例えば、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）や種々の文献情報等に記載されている各遺伝子の情報、およびＪＳＮＰ ＤＢ（http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/）に登録された情報からＳＮＰに関する情報を得ることができる。
【００４８】
〔６．放射線治療における副作用発症予測方法〕
次に、図１を参照して、生体から試料を採取・調製した、配列表の配列番号１から配列番号１２に示されるいずれかのＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドのＤＮＡ塩基配列を直接解析して、ポリヌクレオチド中に存在する複数のＳＮＰサイトの塩基種を照合し、さらにそのポリヌクレオチドに存在する複数のＳＮＰサイトの塩基種を組み合わせて、放射線によって副作用を発症する危険性が高いか低いかを予測する、放射線治療における副作用発症予測方法について説明する。図１は、本発明の放射線治療における副作用発症予測方法を説明するためのフローチャートである。
【００４９】
本発明に係る放射線治療における副作用発症予測方法は、配列表の配列番号１から配列番号１２に示すポリヌクレオチドを用いて判定を行う、下記（ａ）〜（ｅ）の工程を含むものである。すなわち、（ａ）生体から採取した試料をもとに、配列表の配列番号１および配列番号２に示されるＤＮＡ塩基配列、配列表の配列番号３から配列番号７に示されるＤＮＡ塩基配列、配列表の配列番号８から配列番号１０に示されるＤＮＡ塩基配列、または、配列表の配列番号１１および配列番号１２に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドを調製する工程（ステップＳ１１）と、（ｂ）前記（ａ）の工程で調製したひとつながりのポリヌクレオチドをもとにＤＮＡ増幅産物を増幅して得る工程（ステップＳ１２）と、（ｃ）前記（ｂ）の工程で増幅したＤＮＡ増幅産物と、配列表の配列番号３７から配列番号４８に示されるいずれかの検出用プライマーと、を用いて伸長反応を行ない、ＤＮＡ伸長反応生成物を得る工程（ステップＳ１３）と、（ｄ）前記（ｃ）の工程で得られたＤＮＡ伸長反応生成物のＤＮＡ塩基配列を解析する工程（ステップＳ１４）と、（ｅ）前記（ｄ）の工程で解析されたＤＮＡ伸長反応生成物のＤＮＡ塩基配列のうち、配列表の配列番号１から配列番号１２のいずれかに示される１２１番目の位置に相当する塩基と、配列表の配列番号１から配列番号１２のいずれかに示されるＤＮＡ塩基配列の１２１番目の塩基と、が一致する場合に、前記（ｃ）の工程で得られたＤＮＡ伸長反応生成物のＤＮＡ塩基配列を有するアレルが指標となるアレルであるか否かを判定した結果であって、前記（ａ）の工程で得られたポリヌクレオチドに存在する複数のＳＮＰサイトの塩基種を組み合わせて判定・解析した結果に基づいて、前記生体が放射線によって副作用を発症する危険性が高いかまたは低いかを予測する工程（ステップＳ１５）と、を含んでなる。
【００５０】
以下、本発明の放射線治療における副作用発症予測方法の各工程について詳細に説明する。
まず、（ａ）の工程では、生体から採取した試料をもとに、配列表の配列番号１および配列番号２に示されるＤＮＡ塩基配列、配列表の配列番号３から配列番号７に示されるＤＮＡ塩基配列、配列表の配列番号８から配列番号１０に示されるＤＮＡ塩基配列、または、配列表の配列番号１１および配列番号１２に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドを調製する（ステップＳ１１）。
このとき、採取した試料としては、血液を用いるのが好ましいが、これに限定されず、例えば、皮膚、口腔粘膜、毛髪、手術等によって切除された組織など、ＤＮＡを含む試料であればどのようなものでも用いることができる。かかる試料を用いれば、染色体ＤＮＡなどのＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドを好適に抽出することができる。
この工程において、例えば、放射線治療が施行される予定の癌患者から採取した血液（試料）からＤＮＡ試料を抽出するには、前記した染色体ＤＮＡの調製方法が好適である。しかし、この方法以外に、血液から自動的にＤＮＡを抽出する、自動ＤＮＡ抽出装置を用いてもよい。大量のサンプルのＤＮＡを抽出する時間を節約することができるうえに操作が簡便だからである。
また、簡便にＤＮＡ試料を抽出する他の方法として、各社から販売されている簡易なシステムまたはキットを用いてＤＮＡ試料の抽出を行ってもよい。
【００５１】
次に、（ｂ）の工程では、前記（ａ）の工程で調製したひとつながりのポリヌクレオチドをもとにＤＮＡ増幅産物を増幅して得る（ステップＳ１２）。
この工程でポリヌクレオチドのＤＮＡ塩基配列を増幅する方法としては、ＰＣＲ法を好適に用いることができる。ＰＣＲに用いるプライマーとしては、例えば、配列表の配列番号１３から配列番号３６に示すプライマーセットを、配列番号１３から順次２つのポリヌクレオチドを１セットとしたＰＣＲ増幅用のプライマーセットを用いるのが好ましい。そして、ＰＣＲの反応条件としては、例えば、９４℃で２分間の熱変性の後、９４℃で４０秒間の熱変性と、５０℃で１分間のアニーリングと、７２℃で２分間の伸長反応と、を行なうサイクルを３０回繰り返した後、７２℃で５分間の最終伸長反応を行うことを好適に示すことができるがこれに限定されることはなく、適宜に条件を変更することも可能である。また、ＰＣＲ法によらないでもＤＮＡ産物を増幅できる場合には、ＤＮＡポリメラーゼ等を用いてＤＮＡの増幅を行ってもよい。
【００５２】
次に、（ｃ）の工程では、前記（ｂ）の工程で増幅したＤＮＡ増幅産物と、配列表の配列番号３７から配列番号４８に示されるいずれかの検出用プライマーと、を用いて伸長反応を行ない、ＤＮＡ伸長反応生成物を得る（ステップＳ１３）。
このとき用いるＤＮＡ塩基配列を解析するための伸長用（検出用）のプライマーとしては、本発明の配列表の配列番号３７から配列番号４８に示すプライマーを用いるのが好ましい。また、伸長反応の条件は、適宜に設定・変更することが可能であるが、各伸長用のキットで指定されている条件とするのが好ましい。
【００５３】
次に、（ｄ）の工程では、前記（ｃ）の工程で得られたＤＮＡ伸長反応生成物のＤＮＡ塩基配列を解析する（ステップＳ１４）。
ここで、ＤＮＡ伸長反応生成物のＤＮＡ塩基配列を解析する方法としては、前記で詳述したＤＮＡ塩基配列を直接解析する方法である、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法を好適に用いることができるが、これに限定されることはなく、前述した適宜の手法を用いてＤＮＡ塩基配列の解析、すなわち、ＳＮＰタイピングを行うことができる。
【００５４】
次に、（ｅ）の工程では、前記（ｄ）の工程で解析されたＤＮＡ伸長反応生成物のＤＮＡ塩基配列のうち、配列表の配列番号１から配列番号１２のいずれかに示される１２１番目の位置に相当する塩基と、配列表の配列番号１から配列番号１２のいずれかに示されるＤＮＡ塩基配列の１２１番目の塩基と、が一致する場合に、前記（ｃ）の工程で得られたＤＮＡ伸長反応生成物のＤＮＡ塩基配列を有するアレルが指標となるアレルであるか否かを判定した結果であって、前記（ａ）の工程で得られたポリヌクレオチドに存在する複数のＳＮＰサイトの塩基種を組み合わせて判定・解析した結果に基づいて、前記生体が放射線によって副作用を発症する危険性が高いかまたは低いかを予測する（ステップＳ１５）。
【００５５】
〔７．染色体ＤＮＡの調製方法〕
ところで、従来用いられている生体から試料を採取・調製方法には、以下の問題があった。
すなわち、ＤＮＡ塩基配列に存在する複数のＳＮＰサイトの塩基種を組み合わせて判断することで確実な予測が可能と考えられる。しかしながら、１回のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）反応で増幅できるＤＮＡ塩基配列の長さには限りがあり、ひとつながりの染色体ＤＮＡを得ることができなかった。そのため、例えば、ひとつながりの染色体ＤＮＡに存在する複数のＳＮＰサイトの塩基種を組合せた統計的解析による推定は可能であるが、実際に個人のＳＮＰサイトの塩基種の組合せを知ることは困難であり、ＳＮＰサイトの塩基種の組合せによる正確な放射線治療における副作用発症予測ができなかった。
したがって、オーダーメイド放射線治療を具現するためのより正確な指標を設定することができないという問題があった。
さらに、細胞内の染色体は、両親からそれぞれ由来した染色体ＤＮＡから構成されているために、画像解析などによって得られるデータは、それぞれの染色体ＤＮＡに由来したものとなる。そのため、従来の増幅方法に従って得られたＳＮＰサイトの塩基種は、それぞれの染色体ＤＮＡ由来のＳＮＰサイトの塩基種が混ざり合うことが多く、染色体ＤＮＡごとのＳＮＰを決定することができないという問題があった。
【００５６】
そこで、ＳＮＰサイトの塩基種を確実に決定するための染色体ＤＮＡの調製方法の実現が望まれている。
【００５７】
そこで、発明者らは、鋭意研究した結果、ＳＮＰサイトの塩基種を確実に決定するための染色体ＤＮＡの調製方法を完成するに至った。
次に、図２を参照して、生体（例えば、癌患者など）から採取した細胞から人為的な剪断を極力抑制しつつ、できるだけ長鎖の染色体ＤＮＡ（ひとつながりのポリヌクレオチド）を得るための方法について説明する。図２は、染色体ＤＮＡの調製方法を説明するためのフローチャートである。
【００５８】
染色体ＤＮＡの調製方法は、生体から採取した試料をもとに、下記（イ）〜（ト）の工程を含むものである。すなわち、（イ）生体から採取した細胞と、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を含むアガロースゲル溶液とを混合し、ゲル混合溶液とする工程（ステップＳ２１）と、（ロ）前記（イ）の工程で得られたゲル混合溶液を、細胞一個あたりに含まれる染色体数に相当する容量に分注し、固化してゲルを得る工程（ステップＳ２２）と、（ハ）前記（ロ）の工程で得られたゲルを、タンパク質分解酵素阻害剤溶液内に浸す工程（ステップＳ２３）と、（ニ）前記（ハ）の工程でタンパク質分解酵素阻害剤溶液内に浸したゲルを、アルカリ溶液に浸し、染色体を変性させてから中和する工程（ステップＳ２４）と、（ホ）前記（ニ）の工程で中和がされたゲルを、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーおよび基質を含む溶液に浸し、増幅反応または複製反応を行ない、増幅反応産物または複製反応産物を含んだゲルを得る工程（ステップＳ２５）と、（ヘ）前記（ホ）の工程で得られた増幅反応産物または複製反応産物を含んだゲルを、断片化し、加熱しながらゲル断片を溶解して、ゲル断片溶解液とする工程（ステップＳ２６）と、（ト）前記（ヘ）の工程で得られたゲル断片溶解液から抽出された増幅反応産物または複製反応産物から、目的とするアレルを含む染色体ＤＮＡを選別する工程（ステップＳ２７）と、を含んでなる。
【００５９】
以下、細胞から染色体ＤＮＡを調製する方法の各工程について詳細に説明する。
【００６０】
まず、（イ）の工程では、生体から採取した細胞数十個を、界面活性剤とタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン等）が入ったアガロースゲルに加える（ステップＳ２１）。このとき、採取した試料としては、血液を用いるのが好ましいが、これに限定されず、例えば、皮膚、口腔粘膜、手術等によって切除された組織など、ＤＮＡを含む試料であればどのようなものでも用いることができる。かかる試料を用いれば、染色体ＤＮＡを好適に抽出することができる。
なお、界面活性剤としては、例えば、Triton X-100, Digitonin, n-Octyl-b-D-gulcoside, Sodium chorate, Sodium deoxychorate等のタンパク質分解酵素活性に影響を与えずに効率よく細胞膜および核膜を溶解する性質を有するものを使用するのがよい。
また、タンパク質分解酵素としては、プロティナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドぺプチダ−ゼ、ペプシン、Ｖ８エンドプロティナーゼ、Arg-C、Glu-C等の界面活性剤により影響を受けないタンパク質分解酵素を使用するのが好ましい。
この工程において、界面活性剤で細胞膜および核膜を破壊し、染色体をゲル溶液中に剥きだしの状態にする。なお、染色体を剥きだしの状態にしておくと、細胞内に含まれる各種酵素などにより、染色体が剪断される可能性がある。そこで、タンパク質分解酵素を加えることで、細胞内に含まれる各種酵素を分解し、酵素による染色体の剪断を防ぐことができる。
また、アガロースは低融解温度アガロースが好ましく、濃度は１％以上、好ましくは３．５％であるほうが処理しやすい。アガロース濃度を３．５％とすることで、最適増幅効率と非鋳型依存増幅の最適抑制効率を得ることができる。ただし、濃度は設計事項であり、適宜設定することができる。
【００６１】
次に、（ロ）の工程では、前記（イ）の工程で得られたゲル混合溶液を、細胞一個あたりに含まれる染色体数に相当する容量に分注し、固化してゲルを得る（ステップ２２）。
この工程において、おおよそ細胞一個に含まれる染色体をシリコンチューブなどの容器内にゲルごと閉じ込めることができる。また固化させることで、以降の取り扱いが行ないやすくなる。シリコンチューブの径は設計事項であり、適宜設定できる。なお、細胞一個あたりに含まれる染色体数に相当する量を取り分ける際には、染色体が陰圧などで剪断されないように、ピペットマン等で勢いよく吸い上げるのではなく、非常にゆっくりと吸い上げるか、または先端口径が、直径約１．８ｍｍ以上のチップ（例えば、#118-N-MC-Q,Quality Scientific Plastics Inc.製）等を用いるのがよい。
また、ゲルの固定は室温で最低でも１０分以上放置し、固化させるのがよい。
【００６２】
次に、（ハ）の工程では、前記（ロ）の工程で得られたゲルを、タンパク質分解酵素阻害剤溶液内に浸す（ステップＳ２３）。
この工程において、染色体を含むゲル混合溶液中のタンパク質分解酵素の反応を止めることができる。浸漬時間はタンパク質分解酵素阻害剤溶液の濃度にもよるが、おおよそ１０〜３０分間である。ただし、浸漬時間はこれに限られるものではなく、タンパク質分解酵素の反応を止めるだけの時間浸漬していれば十分である。
ここで、タンパク質分解酵素阻害剤としては、Antipain dihydrochloride, (4-Amidinophenyl)-methanesulfonyl fluoride, Aprotinin, Bestatin, Calpain inhibitor I, Calpain inhibitor II, Chymostatin, E-64, Leupeptin, α2-macroglobulin, Pefabloc SC AEBSF, Pepstatin, Phosphoramidon, PMSF, TLCK, TPCK, Trypsin inhibitor等を用いることができる。
【００６３】
次に、（ニ）の工程では、前記（ハ）の工程でタンパク質分解酵素阻害剤溶液内に浸したゲルを、アルカリ溶液に浸し、染色体を変性させてから中和する（ステップＳ２４）。
この工程において、ゲルをアルカリ溶液（例えば、1.5M NaCl，0.5N NaOH）に浸すことで、不要なＲＮＡや細胞内のタンパク質をゲルから取り除き、染色体のクロマチン構造を変性させることができる。アルカリ溶液で染色体を変性させた後に中和溶液で（例えば、1M Tris−HCl（pH7.4），1.5M NaCl）中和することで、変性した染色体のクロマチン構造を元に戻すことができる。
さらに、前記工程で、後記する増幅反応用または複製反応用のプライマーが、鋳型となる染色体ＤＮＡと結合しやすい状態にすることができる。
【００６４】
次に、（ホ）の工程では、前記（ニ）の工程で中和がされたゲルを、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーおよび基質を含む溶液に浸し、増幅反応または複製反応を行ない、増幅反応産物または複製反応産物を含んだゲルを得る（ステップＳ２５）。
この工程において、３０℃で１２時間以上、より好ましくは４８時間反応をさせることで、ゲル内において、染色体ＤＮＡを鋳型として、ほぼ７０ｋｂｐごとに分けて染色体ＤＮＡを増幅または複製することで、全長鎖を増幅または複製することができる。なお、従来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼでは増幅または複製できる長さが限られていたが、Phi29バクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼを用いることで、より長くより精確に染色体ＤＮＡを増幅または複製することができる。
【００６５】
次に（ヘ）の工程では、前記（ホ）の工程で得られた増幅または複製反応産物を含んだゲルを、断片化し、加熱しながらゲル断片を溶解して、ゲル断片溶解液とする（ステップＳ２６）。
この工程において、反応終了後にゲルをTris−EDTA溶液または純水で洗浄し、ゲルに残っていた余分な基質やプライマーを取り除く。そして、後記する工程のために、ゲルを断片化し、各ゲル断片を反応チューブに移し、以降の工程のためにTris−EDTA溶液または純水を加えて、６５℃以上で加熱してゲル断片溶解液とする。
なお、ゲル断片の溶融を確実に行ない、かつ、均一な溶液を得るために、好ましくは９４℃で行ったほうがよい。
【００６６】
次に、（ト）の工程では、前記（ヘ）の工程で得られたゲル断片溶解液から抽出された増幅反応産物または複製反応産物から、目的とするアレルを含む染色体ＤＮＡを選別する（ステップＳ２７）
この工程においては、前記したプライマーセットを用いて、ゲル断片溶解液に、配列表の（１）配列番号１および配列番号２、（２）配列番号３から配列番号７、（３）配列番号８から配列番号１０、（４）配列番号１１および配列番号１２の４種類の組合せのうち、いずれかの組合せを有する指標アレルを含む染色体ＤＮＡが含まれているかを、ＰＣＲ法および電気泳動法を用いて選別する。選別する手段としては、リアルタイムＰＣＲ法によって好適に行なうことができるが、これに制限されることはなく、単にＰＣＲ法で増幅したものを、電気泳動法などによって選別しても良い。
【００６７】
この染色体ＤＮＡの調製方法によれば、生体から採取した細胞から人為的な剪断を極力抑制しつつ、ひとつながりの染色体ＤＮＡ（ポリヌクレオチド）を得ることができる。そして、当該染色体ＤＮＡを鋳型として好適に遺伝子解析を行なうことができる。また、相同染色体ではなく、染色体ＤＮＡごとで増幅反応および遺伝子解析が行なえるので、ＳＮＰサイトの塩基種の決定を確実かつ迅速に行なうことができる。
【００６８】
なお、本出願においては、本実施形態で説明した染色体ＤＮＡの調製方法は、配列表の配列番号１から配列番号１２に示されるいずれかのＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドの抽出およびＳＮＰサイトの塩基種を決めるために用いられたが、これに限られるものではない。すなわち、染色体ＤＮＡを用いる実験、例えば遺伝子解析などにも応用可能である。
【００６９】
以上、本発明に係る放射線治療における副作用発症予測方法、および染色体ＤＮＡの調製方法について詳細に説明してきたが本発明はこれらの内容に限定して解してはならず、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で広く変更・改変して行うことができることはいうまでもない。
【００７０】
（１）本発明の放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドに、例えば、蛍光色素、放射性同位元素、蛍光色素発光用酵素、または、特定の物質との結合能を有するタンパク質のうちの少なくとも一つを付加した構成とすることができる。
【００７１】
（２）本発明の放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドは、例えば、指標アレルと相補的なＤＮＡ塩基配列を有するポリヌクレオチドと、非指標アレルと相補的なＤＮＡ塩基配列を有するポリヌクレオチドとを、異なる種類の蛍光色素、放射性同位元素、蛍光色素発光用酵素、または、特定の物質との結合能を有するタンパク質、を用いてそれぞれ付加した構成とすることができる。
【００７２】
本発明の放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドは、請求項１から請求項６のうちいずれか一項に記載の放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド、または、請求項７または請求項８に記載の増幅用プライマーに、蛍光色素、放射性同位元素、蛍光色素発光用酵素、または、特定の物質との結合能を有するタンパク質、を付加した構成とすることができる。
【００７３】
例えば、（３）本発明の放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドは、指標アレルと相補的なＤＮＡ塩基配列を有する放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドと、非指標アレルと相補的なＤＮＡ塩基配列を有する放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチドを、異なる種類の蛍光色素、放射性同位元素、蛍光色素発光用酵素、または、特定の物質との結合能を有するタンパク質、を用いてそれぞれ付加した構成とすることができる。
【００７４】
例えば、（４）本発明の放射線治療における副作用発症予測方法は、配列表の配列番号１から配列番号１２に示す塩基配列を用いて判定を行う下記（ａ）〜（ｅ）の工程を含むものであってもよい。
すなわち、（ａ）生体から採取した試料をもとに配列表の配列番号１および配列番号２に示されるＤＮＡ塩基配列、配列表の配列番号３から配列番号７に示されるＤＮＡ塩基配列、配列表の配列番号８から配列番号１０に示されるＤＮＡ塩基配列、または、配列表の配列番号１１および配列番号１２に示されるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドを調製する工程、（ｂ）前記（ａ）の工程で調製したひとつながりのポリヌクレオチドをもとにＤＮＡ増幅産物を増幅して得る工程、（ｃ）前記（ｂ）の工程で増幅したＤＮＡ増幅産物と、配列表の配列番号３７から配列番号４８のうちいずれかに示される検出用プライマーと、をハイブリダイズさせる工程、（ｄ）前記（ｃ）の工程でハイブリダイズした前記検出用プライマーを、ｄｄＮＴＰを用いてアレル特異的に１塩基伸長反応を行ない、伸長産物であるＤＮＡ伸長反応生成物を得る工程、（ｅ）前記（ｄ）の工程で得られたＤＮＡ伸長反応生成物のＤＮＡ塩基配列を解析する工程、（ｆ）前記（ｅ）の工程で解析されたＤＮＡ塩基配列のうち配列表の配列番号１から配列番号１２のいずれかに示される１２１番目の位置に相当する塩基と、配列表の配列番号１から配列番号１２のいずれかに示されるＤＮＡ塩基配列の１２１番目の塩基と、が一致する場合に、前記（ｄ）の工程で得られたＤＮＡ伸長反応生成物のＤＮＡ塩基配列を有するアレルが指標アレルであるか否かを判定した結果であって、前記（ａ）の工程で得られたＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドに存在する複数のＳＮＰサイトの塩基種を組み合わせて判定・解析した結果に基づいて、前記生体が放射線によって副作用を発症する危険性が高いかまたは低いかを予測する工程、としてもよい。
【００７５】
そして（５）前記のｄｄＮＴＰが、蛍光色素、放射性同位元素、蛍光色素発光用酵素、または、特定の物質との結合能を有するタンパク質、を付加したものとすることができる。
【実施例】
【００７６】
次に、本発明に係る放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド、および放射線治療における副作用発症予測方法を、実施例を参考にしてさらに具体的に説明する。
【００７７】
副作用を発症する危険性を予測するためのＳＮＰの検討は、（１）ヒト培養細胞株における放射線感受性の遺伝子の解析と、（２）マウス系統差における放射線感受性の遺伝子の解析と、（３）文献調査を行い、（４）放射線による副作用の発症に関連した遺伝統計学的解析を行った。
【００７８】
まず、〔１〕ヒト培養細胞株における放射線感受性の遺伝子については、放射線感受性に関わる遺伝子についてこれまでにも多くの報告がある。それらは一部のＤＮＡ修復遺伝子など、特定の機能を持った遺伝子に焦点が当てられたものであった。本発明においては、これらの遺伝子についても検討を加えているが、ヒトゲノムの全ＤＮＡ塩基配列が決定されたことを受けてそのＤＮＡ塩基配列情報の解析から遺伝子または遺伝子候補と考えた２１，０００種類を選択し、Ａｇｉｌｅｎｔ社（ＣＡ，ＵＳＡ）に委託してこれらの遺伝子特異的な６０塩基のＤＮＡ塩基配列を持ったオリゴアレイを作製して、独自に放射線感受性の分類に有効な遺伝子の検索を行った。
まず６０種類のヒト培養細胞株の線量−生存率曲線を求め、感受性の異なる３２細胞株を選択してＸ線照射前後の遺伝子発現プロファイルを細胞間で比較し、Ｄ１０、Ｄｑ、α／βなどの複数のモデルのパラメータ別に細胞株の分類に有効な遺伝子を同定し、放射線感受性遺伝子候補とした。この中には細胞増殖、細胞周期調節、レドックス、ＤＮＡ損傷修復などに関わると考えられる遺伝子が含まれていた。
【００７９】
次に、〔２〕マウス系統差の解析については、放射線感受性の異なるＡ／Ｊ，Ｃ３Ｈ／ＨｅＭｓ，Ｃ５７ＢＬ６Ｊの３系統のマウスに関して、皮膚・肺・腸管等各種臓器における放射線照射後の損傷／修復過程を判定した（M. Iwakawa et al., Radiation Res., 44, 7-13 (2003)）。また同時に、マイクロアレイを用いて対象臓器での放射線照射後の遺伝子発現プロファイルを比較し、系統差に関連すると考えられる遺伝子群を抽出した。そして、これら遺伝子のヒトホモログを感受性遺伝子候補とした。この中には、シグナルトランスダクション、アポトーシス、免疫関連の遺伝子が含まれていた。
【００８０】
〔３〕放射線による副作用の発症に関連した遺伝統計学的解析では、候補遺伝子上の多型マーカー（ＳＮＰサイト）に関するＤＮＡ塩基配列情報は、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（バージョン：UCSC Human April 2003（http://genome.ucsc.edu/））、ＪＳＮＰ ＤＢ（http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/）、ｄｂＳＮＰ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）から得た。収集した健常人集団（ＳＮＰサイトの塩基種が非発症群の塩基種である集団）を用いてこれらのアレルの多型頻度を解析し、解析するアレルの選択を行った。
次に、放射線による副作用の発症の判定などによって分類した集団に対してＳＮＰタイピングを行った。研究の対象は、２００１年４月から２００４年８月までに当該研究を行うことについてのインフォームド・コンセントを取得するとともに血液および診療情報の提供を受けた乳癌患者２８４人についてまず診療データ解析を行い、多型頻度解析のために層別化を行った。放射線による副作用（障害）の発症は、乳癌患者は皮膚障害を対象とした。そして、各障害別に放射線治療開始から３ヶ月未満（早期のステージ）での判定結果により２群に分類した。
【００８１】
表１は、ＤＮＡを採取し、ＳＮＰタイピングを行うことについてインフォームド・コンセントを得た乳癌患者について、それぞれ放射線治療開始から早期のステージにおける、ＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドに存在する複数のＳＮＰサイトの塩基種の組合せにおけるアレル頻度を統計学的に求めて示した表である。
【００８２】
すなわち、表１は、乳癌の放射線治療開始から早期のステージにおける乳癌患者群における、ＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドに存在する複数のＳＮＰサイトの塩基種を組合せた場合におけるアレル頻度（例えば、オッズ比や９５％信頼区間など）をそれぞれ表す。
なお、表１に記載の二つの集団、すなわち、有害反応なしとありのグループの患者数は、それぞれ１４０人と４４人である。人は両親から染色体ＤＮＡを１本づつ受け取り、２本有しているので、表１でハプロタイプについて述べるときには、染色体の数は人数の２倍となる。また、ハプロタイプをもつ人数は統計学的な推定値であり、必ずしも全部足すと総数に等しくなるわけではない。計算上、別の頻度が非常に少ないハプロタイプの人数が１以下の数で存在する、と計算されることもありうる。
【００８３】
そして、表１および表２のＡ欄からＪ欄は、以下の内容を示す。
Ａ欄：各ＳＮＰに割り当てられている公共データバンク（ＮＣＢＩやＪＳＮＰ（ＩＭＳ−ＪＳＴ ＳＮＰ））に登録されているＳＮＰ ＩＤとＳＮＰサイトの塩基種の組合せ、つまり、確認できたアレル頻度を示すものである。なお、乳癌については皮膚障害を調査対象とした。
ここで、Ｃ−ＧやＴ−Ｇ−Ｇは、ＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドに存在する複数のＳＮＰサイトの塩基種の組合せが、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）、または、Ｔ（チミン）とＧ（グアニン）とＧ（グアニン）であることを示している。
【００８４】
Ｂ欄：障害が認められない（Ｇｒａｄｅ０）か、障害が軽微であった（Ｇｒａｄｅ１（表１中、これらを「Ｇｒａｄｅ≦１」で表す））症例数（ｎ）とその割合を示す。
Ｃ欄：放射線治療を行った後に障害が認められた症例数（ｎ）とその割合、そのグレード（Ｇｒａｄｅ２〜４（表１中、これらを「Ｇｒａｄｅ≧２」で表す））を示す。
副作用の度合いは、Ｇｒａｄｅ０，１，２，３，４と、数字が大きくなる程重症であることを示す。早期のステージにおける副作用に対する判定は、国際的な判定基準であるＮＣＩ／ＣＴＣ（National Cancer Institute, Common Toxicity Criteria）に従った。また、放射線治療開始から３ヶ月のステージにおける副作用（障害）に対する判定は、国際的な判定基準であるＲＴＯＧ（Radiation Therapy Oncology Group）に従った。なお、取得した臨床情報から、癌種に応じて項目を選択し、例えば乳癌では年齢、喫煙、飲酒、合併症、家族病歴、ＴＮＭ分類、病理検査、化学療法、照射方法、再燃・転移等に関する３８項目について解析し、標準化を行い、条件に合致しない症例は多型頻度解析から除外した。
【００８５】
Ｄ欄：スコア検定によるＰ値を示す。生物学における統計学的にはＰ値が０．０５以下である場合、それらには有意な差があるとして評価することができる。なお、本発明では、自由度は全て１としている。また、表１のＰ値は、ハプロタイプの統計学的推定を行った計算（10000回繰り返して確からしいか計算を行なう）に対するＰ値である。
Ｅ欄：オッズ比を表す。オッズ比は、リスク比または危険率ともいわれ、要因を有する場合（指標アレルの組み合わせによる判定から、放射線感受性である（すなわち、副作用を発症する危険性が高い）と判定されること）に副作用（障害）を発症する危険性を、要因を有さない場合（ほとんど副作用を発症せず、放射線非感受性である（すなわち、副作用を発症する危険性が低い）と判定されること）に副作用を発症する危険性で除算した値である。このオッズ比は、その値が高いほど副作用を発症する危険が高いアレルであることを示す。なお、本実施例においては、各表の最上段のＳＮＰサイトの塩基種の組合せを基準として、他の組合せのオッズ比を算出している。
Ｆ欄：９５％信頼区間を示す。なお、サンプルの一部のアレル頻度が「０」、または、比較の基準としているために、９５％信頼区間が求めることができないデータもある（表１中において「−」で示す）。
【００８６】
具体的に一例をもってその説明を行うと、例えば、表１の一番上に示すＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ１９２６２６１とｒｓ２２９６６２０は、どちらもＴＧＦＢＲ３の遺伝子上に存在するＳＮＰサイトであり、本発明であるＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドに存在する複数のＳＮＰサイトに該当する。そして、そのＳＮＰサイトの塩基種の組合せは、Ｃ−Ｇ，Ｔ−Ａ，Ｔ−Ｇのいずれかである。
【００８７】
より詳細に見ていくと、放射線治療開始から早期に皮膚に障害が認められなかった（Ｇｒａｄｅ０，１（Ｇｒａｄｅ≦１））乳癌患者の染色体数の総計は２８０本（Ｂ欄）、皮膚に障害が認められた（Ｇｒａｄｅ２,３,４（Ｇｒａｄｅ≧２））乳癌患者の染色体数の総計は８８本であった（Ｃ欄）。
ここで、放射線治療開始から早期に皮膚に障害が認められた乳癌患者において、ＳＮＰサイトの塩基種の組合せがＣ−Ｇであった染色体の本数は４０本であるのに対し、放射線治療開始から早期に皮膚に障害が認められなかった乳癌患者の染色体の本数は１７２本であった。
一方、ＳＮＰサイトの塩基種の組合せがＴ−Ｇであった染色体の本数は４０本であるのに対して、放射線治療開始から早期に皮膚に障害が認められなかった乳癌患者の染色体の本数は８３本であった（Ｂ，Ｃ欄）。
【００８８】
これらの結果をスコア検定により統計学的に解析した結果、乳癌患者において、ＳＮＰサイトの塩基種の組合せがＣ−Ｇである者のＰ値は０．０２０９であり、ＳＮＰサイトの塩基種の組合せがＴ−Ｇである者のＰ値は０．００３３であった（Ｄ欄）。また、ＳＮＰサイトの塩基種の組合せがＣ−Ｇである者を基準とした場合のＳＮＰサイトの塩基種の組合せがＴ−Ｇである者のオッズ比は２．７２であり（Ｅ欄）、その９５％信頼区間は１．２５〜５．９３であった（Ｆ欄）。
【００８９】
また、注目すべきは、表３に示すオッズ比（Ｅ欄）である。ＳＮＰサイトの組み合わせる塩基種の数を増やせば（Ａ欄）、その分、信憑性が増し、実に基準となる組合せの６．９０倍放射線による副作用を発症する危険性が高いと判断できる。
【００９０】
次に表２について説明する。表２は、試験Ｎｏ．１〜４においてスコア検定のＰ値が０．０５より低く、かつオッズ比が高いＳＮＰサイトの組合せであるものと、配列表の配列番号との対応表である。
すなわち、各ＳＮＰサイトのＳＮＰ ＩＤ、ＳＮＰ ａｌｌｅｌｅ、ＳＮＰサイトを含むＤＮＡ塩基配列や各プライマーのＤＮＡ塩基配列に対応する配列表の配列番号に対応している。
【００９１】
Ｉ欄：本発明のＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドにおいて、含まれるＳＮＰサイト名を示している。
Ｊ欄：Ｉ欄に示すＳＮＰサイトのアレルを示す。スラッシュ「／」の左が指標アレルであり、右が非指標アレルである。
Ｋ欄：本発明のＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドにおいて、Ｉ欄に示すＳＮＰサイトを含む各ＤＮＡ塩基配列の配列番号を示す。
Ｌ欄：Ｋ欄に示す配列番号のＤＮＡ塩基配列をＰＣＲで増幅する際に用いたプライマー（フォワードプライマー）の配列番号を示す。
Ｍ欄：Ｋ欄に示す配列番号のＤＮＡ塩基配列をＰＣＲで増幅する際に用いたプライマー（リバースプライマー）の配列番号を示す。
【００９２】
Ｎ欄：Ｋ欄に示す配列番号のＤＮＡ塩基配列のＳＮＰタイピングを行った際に使用したプライマー（検出用プライマー）の配列番号をそれぞれ示す。なお、本発明の検出用プライマーの中には、配列番号１から配列番号１２に示すＤＮＡ塩基配列と同じ向きのストランドのＤＮＡ塩基配列を有するものと、これと逆向きのストランドのＤＮＡ塩基配列を有するものがある。逆向きのストランドである検出用プライマーの場合は、これの３′下流側に付加される塩基と相補的な塩基が、配列番号１から配列番号１２のいずれかに示す１２１番目の塩基（指標アレル）に該当する。
【００９３】
表１と表２の左に記載してある試験Ｎｏ．はそれぞれ対応している。つまり、表１におけるアレル頻度を統計学的に求めるために使用したＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチド（例えば試験Ｎｏ．１）において、ＳＮＰサイトを含むＤＮＡ塩基配列は、表２の試験Ｎｏ．１のＫ欄に記載されている配列表の配列番号（この場合は、配列番号１と配列番号２）ということになる。そしてＫ欄に記載されている配列表の配列番号をＰＣＲで増幅する際には、Ｌ欄とＭ欄に記載されている配列表の配列番号のポリヌクレオチドまたはプライマー（配列番号１に示すＤＮＡ塩基配列を有するポリヌクレオチドを増幅するためには、配列番号１３のプライマーと配列番号１４のプライマー）を用いることを示している。同様にＳＮＰタイピングを行なった際に使用した検出用プライマーはＮ欄に記載されている配列表の配列番号のプライマー（配列番号１に示すＤＮＡ塩基配列を有するポリヌクレオチドのＳＮＰタイピングを行なう場合には、配列表の配列番号３７のプライマー）を用いることを示している。
【００９４】
以上、本発明で示した表についていくつか説明を行ったが、これは、表１と表２で示すＳＮＰ全てに共通するものである。
【００９５】
【表１】
2007116905.tif 000002
【００９６】
【表２】
2007116905.tif 000003
【００９７】
次に、本発明において行ったＳＮＰタイピングの方法について説明する。ＳＮＰタイピングは、染色体ＤＮＡの調製と、ＤＮＡの増幅と、質量分析によるＤＮＡの塩基配列の決定とで行われる。以下に、ＳＮＰタイピングについて詳細に説明する。
【００９８】
（染色体ＤＮＡの調製）
まず、放射線治療を施行する癌患者および健常人からインフォームド・コンセントを取得した上で血液を採取した。採取した血液１μｌを９９９μｌ  ＰＢＳ（−）に加えピペッティングにより懸濁後、血球計算盤により細胞数を計測した。そして、細胞１３個に相当する容量を取り、界面活性剤（１０％ＳＤＳ：５０μｌ）とタンパク質分解酵素（１ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫ：１μｌ）を添加した３．５％アガロース（Ｎｕｓｉｅｖｅ（登録商標）  ＧＴＧ  Ａｇａｒｏｓｅ、ＴａＫａＲａ社製）ゲル溶液１ｍｌの入った１．５ｍｌのエッペンチューブに加え、４２℃で１時間穏やかに撹拌した。
次に、細胞一個あたりに含まれる染色体数に相当する容量の前記ゲル混合溶液を、φ２ｍｍのシリコンチューブに充填し、室温で１５分放置し固化させた。シリコンチューブから固化したゲルを取り出し、タンパク質分解酵素阻害剤溶液（コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃａｔ  Ｎｏ．＃１６９７４９８、Ｒｏｃｈｅ社製）１錠／５０ｍｌ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ溶液）に１０分間浸し、酵素活性を失活させた。
次に、固化したゲルをアルカリ溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５Ｎ  ＮａＯＨ）に浸し、複製反応用のプライマーが鋳型となる染色体ＤＮＡと結合しやすい状態にするために、染色体を変性させた後、中和溶液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ７．４），１．５Ｍ  ＮａＣｌ）で中和した。
次に、固化したゲルを反応溶液（ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー及び基質を含む溶液）１００μｌに浸し、３０℃で４８時間増幅反応を行なわせた。反応溶液の組成は、６μｌのＰｈｉ２９バクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼ（０．１ｕｎｉｔ／μｌ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社製）、２４μｌの３′末端２塩基をフォスフォチオエステル化したランダムオリゴヌクレオチドヘキサマープライマー（２５０ｍＭ）、５μｌの基質２５ｍＭｄＮＴＰｓ（ＴａＫａＲａ社製）、１０μｌの１０×緩衝液（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、４０ｍＭ  ＤＴＴ）、５５μｌの純水を加えて全量で１００μｌとした。
次に、増幅反応を済ませたゲルをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ溶液で洗浄し、１０等分した。各ゲル断片を個別の１．５ｍｌのエッペンチューブに移し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝溶液をゲル片の２０倍容量加え、９４℃で加熱してゲルを溶解させた。
次に、前記ゲルを溶解させたＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝溶液を５μｌとり、１０μｌの２×ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘと、配列表の配列番号１３と配列番号１４の０．４μｌの各１０μＭ  増幅用プライマー（配列表の配列番号１に示すＤＮＡ塩基配列を有するポリヌクレオチドの場合）と、４．２μｌの純水を加え、全量で２０μｌのＰＣＲ反応溶液を調製した。
このＰＣＲ反応溶液を９６ウェルプレートに分注し、サーマルサイクラーにより以下のプログラムでＰＣＲ反応を行った。９５℃で１５分間のＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑポリメラーゼの活性化を行った後、（ａ）二本鎖ＤＮＡの熱変性条件：９５℃で２０秒間、（ｂ）アニール条件：６０℃で１分間、（ｃ）伸長条件：７２℃で３分間という、（ａ）〜（ｃ）の順に行う反応を５０サイクル行い、最後に７２℃で３分間の伸長反応を行い、増幅反応産物を得た。
反応溶液中のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉが２本鎖ＤＮＡと結合して生じる蛍光シグナルを測定し、シグナル強度の対数的増加（標的遺伝子の対数的増幅）を示すゲル片のスクリーニングを行った。
【００９９】
（プライマーの選択と作製）
ＳＮＰタイピングに用いた各フォワードプライマーおよびリバースプライマー、並びに検出用プライマーは、前記〔３〕で述べたＳＮＰに関する情報をもとに、プライマー３．０（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）を用いて適宜適切な範囲を選択して作製した。各プライマーは、ＳＩＧＭＡ  ＧＥＮＯＳＹＳ社（シグマアルドリッチジャパン株式会社）またはＰＲＯＬＩＧＯ社（プロリゴ・ジャパン株式会社）に委託して合成した。
【０１００】
（ＳＮＰタイピング）
抽出したＤＮＡ試料を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法によりＳＮＰタイピングを行った。なお、質量分析機はＳＥＱＵＥＮＯＭ社製のＭａｓｓＡＲＲＡＹ  ｓｙｓｔｅｍを用いた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法によるＳＮＰタイピングは、下記の（１）〜（３）の手順で行われる。
（１）ＤＮＡの増幅：
ＤＮＡ試料を用いて目的とする塩基配列を増幅するため、配列表の配列番号１３から配列番号３６の奇数番号に示すフォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）、および、偶数番号に示すリバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）の中から適宜選択したプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲの反応条件としては以下の通りである。０．５μｌの１０×ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ緩衝液と、０．２μｌのＭｇＣｌ２と、０．０４μｌの２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓと、１μｌの各１μＭ  ＰＣＲ  プライマーと、０．０２μｌのＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ溶液と、１μｌのＤＮＡ溶液（２．５ｎｇ／μｌ）と、２．２４μｌの純水を加え、全量で５μｌのＰＣＲ反応溶液を調製した。
このＰＣＲ反応溶液を３８４ウェルプレートに分注し、サーマルサイクラーにより以下のプログラムでＰＣＲ反応を行った。９５℃で１５分間のＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑポリメラーゼの活性化を行った後、（ａ）二本鎖ＤＮＡの熱変性条件：９５℃で２０秒間、（ｂ）アニール条件：５６℃で３０秒間、（ｃ）伸長条件：７２℃で１分間という、（ａ）〜（ｃ）の順に行う反応を５５サイクル行い、最後に７２℃で３分間の伸長反応を行った。
【０１０１】
（２）ＳＡＰ反応：
ＤＮＡの脱リン酸化反応のために、ＳＡＰ（Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）反応を行った。ＳＡＰ反応溶液として、０．１７μｌのｈＭＥ緩衝液と、０．３μｌのＳＡＰ溶液と、１．５３μｌの純水を加えて全量２μｌとしたＳＡＰ反応溶液を、先のＰＣＲ反応を行った後のＰＣＲ反応溶液に加え、３７℃で２０分間の反応を行った後、８５℃で５分間の反応を行った。
【０１０２】
（３）伸長反応：
次いで、配列表の配列番号３７から配列番号４８に示す検出用プライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＳＮＰとなるＤＮＡの塩基種を決定するためである。反応溶液の組成としては、０．２μｌのｄＮＴＰｓ／ｄｄＮＴＰｓミックスと、０．０５４μｌの１００μＭ検出用プライマーと、０．０１８μｌのＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅと、１．７２８μｌの純水を加えて全量２μｌとした伸長反応溶液を、先のＰＣＲ反応溶液とＳＡＰ反応溶液とを混合した反応溶液（７μｌ）に加え、以下のＰＣＲ反応条件でＰＣＲ反応を行うことでＳＮＰを解析するためのＰＣＲ産物を得た。まず、サーマルサイクラーにより９４℃で２分間の二本鎖ＤＮＡの熱変性を行った後、（ａ）二本鎖ＤＮＡの熱変性条件：９４℃で５秒間、（ｂ）アニール条件：５２℃で５秒間、（ｃ）伸長条件：７２℃で５秒間という、（ａ）〜（ｃ）の順に行う反応を５５サイクル行った。
【０１０３】
（４）脱塩処理：
その後、反応溶液９ｍｌあたり脱塩樹脂であるＳｐｅｃｔｒｏＣＬＥＡＮ  ３ｍｇと、純水１６μｌを加え、室温で１０分間インキュベートして反応溶液を脱塩した。
【０１０４】
（５）質量分析：
こうして得られた全量２５μｌのＳＮＰタイピング用の反応溶液の内、約０．０１μｌを質量分析用Ｓｐｅｃｔｒｏ  Ｃｈｉｐにスポットし、質量分析を行い、配列表の配列番号１から配列番号１２のいずれかに示すＤＮＡ塩基配列を有する指標アレル（１２１番目の塩基）のＳＮＰタイピングを行った。
【０１０５】
（臨床への応用）
本発明に係るＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチド（放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド）、増幅用プライマーセット、検出用プライマーおよび放射線治療における副作用発症予測方法の臨床における応用は以下の如くである。
例えば、放射線治療をこれから受けようとする癌患者からＳＮＰタイピングによるＤＮＡ診断についてのインフォームド・コンセントを取得した後、患者から採取した血液等の試料から配列表の配列番号１から配列番号１２のいずれかに示すＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドを抽出し、プライマーセットを用いて増幅、解析、ＳＮＰサイトにおける塩基種を判定・解析するか、または、蛍光標識等を行ったポリヌクレオチドを用いてＳＮＰのタイピングを行う。前述した該当するＳＮＰの塩基種の組み合わせをもとに、この癌患者の放射線治療後による副作用の発症の危険性を算出する。そして、当該癌患者の放射線治療担当医は、算出された危険性を指標として、その癌患者に対する治療後の管理（ｃａｒｅ）計画に活かしてＱＯＬを高めるなどの治療計画を適切に行うことができる。
【０１０６】
このように、本発明に係るＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチド（放射線治療における副作用発症予測用ポリヌクレオチド）、増幅用プライマーセット、検出用プライマーおよび放射線治療における副作用発症予測方法を用いることによって、現在、何ら予測手段をもたない放射線による副作用の発症のリスクに対し、科学的根拠をもった予測を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】本発明の放射線治療における副作用発症予測方法を説明するためのフローチャートである。
【図２】本発明の細胞からのＤＮＡ塩基配列を有するひとつながりのポリヌクレオチドを調製する方法を説明するためのフローチャートである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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