(57)【要約】【課題】  ヒートショックファクター1または活性型ヒートショックファクター1をコードするポリヌクレオチドを遺伝子導入することによって、副作用の少ない糖尿病治療手段を提供する。【解決手段】  ヒートショックファクター1または活性型ヒートショックファクター1をコードするポリヌクレオチド、あるいはヒートショックファクター1または活性型ヒートショックファクター1に相当するポリペプチドが細胞内に導入可能な形態を有することを特徴とする糖尿病治療薬。【選択図】 なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒートショックファクター1をコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入可能な形態を有することを特徴とする糖尿病治療薬。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、ヒートショックファクター1の一部を欠失させた活性型ヒートショックファクター1をコードする活性型ポリヌクレオチドである請求項１の糖尿病治療薬。
【請求項３】
ヒートショックファクター1に相当するポリペプチドが細胞内に導入可能な形態を有することを特徴とする糖尿病治療薬。
【請求項４】
ポリペプチドが、ヒートショックファクター1の一部を欠失させた活性型ヒートショックファクター1に相当する活性型ポリペプチドである請求項の糖尿病治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、糖尿病の治療薬に関するものである。さらに詳しくは、本願発明は、ヒートショックファクター1のインスリン分泌および合成作用を機序とする新しい糖尿病治療薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、糖尿病の治療法としては、スルホニルウレア剤の投与が一般的である。しかし、スルホニルウレア剤には二次無効という現象がある。つまり、スルホニルウレア剤は膵ベータ細胞のスルホニルウレア受容体に作用してインスリンを分泌させるため、長年に渡ってスルホニルウレア剤を投与され、膵機能が低下した場合には、スルホニルウレア剤が無効になることがある。このような症例の場合、経口糖尿病治療薬による治療は困難であり、インスリン治療を行わなければならない。インスリン治療の場合には、自らの注射によってインスリンを投与するため、糖尿病患者にとっては抵抗があり、治療の同意がなかなか得られない。また、インスリン治療には低血糖の副作用が常に伴う。さらに、インスリン分泌能を有する膵細胞等の移植治療は、適合性の問題や費用の問題がある。そのため、患者負担の少ない、副作用の少ない糖尿病の治療法や治療薬の開発および実用化が期待されている。
【０００３】
ヒートショックタンパク質（Heat Shock Protein：HSP）は熱刺激によって発現が上昇するタンパク質として発見され、分子量によってHSP90、HSP70、HSP32、HSP27等の種類が知られている。これらのHSPは不安定な状態のタンパク質と結合し、安定化（シャペロン作用）させることによって、細胞の保護作用を担っている。
【０００４】
HSPとインスリンに関しては、HSP32がインスリン分泌に関与していることが報告されている（非特許文献１）。この報告では、HSP32の合成産物である一酸化炭素を膵培養細胞に添加することによってインスリン分泌にとって重要なシグナルである細胞内カルシウムが上昇するという結果が得られている。しかしながら、この報告では、一酸化炭素を用いており、実際にHSP32を過剰発現させていない。また、膵培養細胞内の細胞内カルシウムを測定しただけで実際にインスリン分泌を測定していない。そもそも、一酸化炭素は高濃度では生体にとって有害であるので、一酸化炭素を臨床的な糖尿病治療に応用するのは困難である。
【０００５】
また、熱刺激とインスリンに関しては、膵培養細胞を42℃に加熱すると細胞からのインスリン分泌が増加するという報告が存在する（非特許文献２）。しかしながら、この報告では、42℃の加熱によるインスリン増加は一過性であり、しかも、膵臓の加熱は臨床的な糖尿病治療としては非現実的である。
【０００６】
一方、ヒートショックタンパク質（Heat Shock Protein：HSP）の発現を誘導する転写因子の一つとして、ヒートショックファクター1（Heat Shock Transcription Factor 1：HSF1）が知られている（例えば非特許文献３）。近年、HSF1に変異を施した変異型のHSF1（mutHSF1）が、HSPの発現量を活性化するという報告がなされている（非特許文献４）。また、このmutHSF1を利用した治療方法（特許文献１）が提案されている。この提案された方法では、mutHSF1を細胞内に導入し、HSPの発現を調節・変化（増幅または抑制）させて、ストレスや炎症、毒物、また腫瘍等から細胞を保護することを目的としている。さらに、この方法におけるmutHSF1は、約180〜約315の間のアミノ酸の欠失によって正作用を有するmutHSF1（ストレスの非存在下でもHSPの発現を活性）および約277〜約529の間のアミノ酸の欠失によって負作用を有するmutHSF1（ストレスの存在下でもHSPの発現を抑制）の2種類のmutHSF1を使い分けることによって、前記のような悪影響から細胞を保護することを可能としている。ただし、この特許文献１は、各種の変異型HSF1が糖尿病の治療効果を有することは開示も示唆もしていない。
【０００７】
また、本願発明者らは、HSF1（特に活性型HSF1）が血管収縮および／または血管凝固を原因とする血管疾患の治療効果を有することを見出し、HSF1または活性型HSF1を患者体内の細胞に導入する治療用物質の発明を特許出願している（特許文献２）。ただし、この特許文献２においても、HSF1または活性型HSF1が糖尿病に対して治療効果を有することは何ら開示されていない。なお、特許文献２等における治療薬成分としてのHSF1または活性型HSF1は、それらが増殖因子としての機能を有していない（ガン細胞の増殖促進の心配が少ない）ことを利点の一つとしてもいる。
【特許文献１】特表2001-511006号公報
【特許文献２】特開2004-269446号公報
【非特許文献１】Lindquist, I. Etal. Am J Physilol Endocrinol Metab. 285(5), E1055-63, Nov., 2003.
【非特許文献２】Takeda, T. et al. Biochem Biophys Res Commun 284(1), p20-25, Jun., 1, 2001.
【非特許文献３】Rabindran, S. K. ET AL. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88(16), p6906-6910, 1991.
【非特許文献４】Zuo, J. et al. Mol. Cell. Biol., vol.15, No.8, p4319-4330, 1995
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、従来の問題点を解消し、副作用が少なく、また移植に比して安価で容易な糖尿病治療薬を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、HSF1が膵ベータ細胞においてインスリンの合成と発現を促進させ、また、インスリンの分泌を促進させることを見出した。また、活性型HSF1が、ヒト正常型HSF1に比べて、強いインスリン分泌増加作用を有することを見出した。そして実際に、HSF1または活性型HSF1を糖尿病ラットの膵臓に発現させた場合に、ラットの血中インスリン量が増加し、血糖が低下することを確認した。
【００１０】
本願発明は、発明者らによる以上の新規知見に基づいてなされたものである。
【００１１】
すなわち、第１の発明は、ヒートショックファクター1をコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入可能な形態を有することを特徴とする糖尿病治療薬である。
【００１２】
この第１発明においては、ポリヌクレオチドが、ヒートショックファクター1の一部を欠失させた活性型ヒートショックファクター1をコードする活性型ポリヌクレオチドであることを好ましい態様としている。
【００１３】
本願第２の発明は、ヒートショックファクター1に相当するポリペプチドが細胞内に導入可能な形態を有することを特徴とする糖尿病治療薬である。
【００１４】
この第２発明においては、ポリペプチドが、ヒートショックファクター1の一部を欠失させた活性型ヒートショックファクター1に相当する活性型ポリペプチドであることを好ましい態様としている。
【発明の効果】
【００１５】
第１発明により、長期間にわたって安定にインスリン分泌を増加させることのできる糖尿病治療薬が提供される。
【００１６】
第２発明により、内服や注射等の通常の投与によって、安価、簡便かつ効果的にインスリン分泌を増加させることのできる糖尿病治療薬が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
＜発明の定義＞
本願発明の治療薬の対象となる「糖尿病」は、主として、インスリンの供給以上による糖尿病（１型糖尿病）およびインスリンの消費以上による糖尿病（２型糖尿病）である。
【００１８】
本願発明の「糖尿病治療薬」とは、糖尿病治療に有効な医薬組成物を意味する。特に第１発明の治療薬は、遺伝子治療用の薬剤組成物（治療用のポリヌクレオチドを含む組成物）を意味し、第２発明の治療薬は、治療用の有効分子を含有し、通常の投与経路（注射、内服等）を介して投与される医薬組成物を意味する。
【００１９】
「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ-N-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ATP、GTP、CTP、UTP；またはdATP、dGTP、dCTP、dTTP）が複数個結合した分子を言う。以下の説明では、「HSF1をコードするポリヌクレオチドを「HSF1ポリヌクレオチド」と記載することがある。
【００２０】
「ポリペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）または非天然の残基連結によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。「HSF1に相当するポリペプチド」とは、天然のHSF1と同一のアミノ酸配列からなり、天然HSF1と同様の活性を有するポリペプチド（例えば、組換え体ポリペプチド、または合成ポリペプチド）を意味する。また天然HSF1の活性を維持した状態で、天然HSF1のアミノ酸配列における１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されたアミノ酸からなるポリペプチドを意味する。以下の説明では、「HSF1に相当するポリペプチド」を「HSF1ポリペプチド」と記載することがある。
【００２１】
「ポリヌクレオチドが細胞内に導入可能な形態」とは、ポリヌクレオチドが細胞内に導入され、細胞内において、細胞内の天然HSF1遺伝子が天然のHSF1を発現するように、コードされているHSF1を発現すること可能とする形態を意味する。また、「ポリペプチドが細胞内に導入可能な状態」とは、ポリペプチドが細胞内に導入され、細胞内の天然のHSF1と同様な機能を発揮することを可能とする形態を意味する。
【００２２】
本願発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。また本願発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、本願発明の薬剤（医薬組成物）の調製はRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990等に、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。さらに、この発明における用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
【００２３】
本願発明に使用するHSF1ポリペプチドおよびHSF1ポリヌクレオチドは、原則として各種哺乳動物に由来するものを使用することができるが、ヒト治療薬成分としての適応性、有効性の観点から、ヒト由来であることが特に好ましい。ヒトHSF1ポリペプチド（正常型）のアミノ酸配列（全519アミノ酸残基）はデータベースにより公知であり（GenPept/NP005517）、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（cDNA）のヌクレオチド配列も公知である（GenBank/NM 005526）。
【００２４】
第１発明の糖尿病治療薬における有効成分であるHSF1ポリヌクレオチドは、前記の公知ヌクレオチド配列に基づき作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いて既存のcDNAライブラリーをスクリーニングする方法や、オリゴヌクレオチドプライマーを用いたRT-PCR等の公知の方法によって取得することができる。
【００２５】
第１発明の糖尿病治療薬における好ましい態様は、正常型HSF1の一部を欠失させた活性型HSF1をコードする活性型HSF1ポリヌクレオチドを有効成分とすることである。活性型HSF1とは、具体的には、そのアミノ酸配列（GenPept/NP005517）の第186-202位アミノ酸領域を欠失させたポリペプチドである。従って、この活性型HSF1をコードする活性型HSF1ポリヌクレオチドは、正常型HSF1ポリヌクレオチド（GenBank/NM005526）のうち、上記の第186-202位アミノ酸をコードする領域を欠失させたポリヌクレオチドである。このような活性型HSF1ポリヌクレオチドは、例えば、正常型HSF1ポリヌクレオチドを制限酵素で複数個に断片化し、不要な断片を除いた後に、必要断片をライゲーションすることによって取得することができる。あるいは、必要領域をそれぞれPCR増幅し、各PCR産物をライゲーションすることによっても作製することができる。
【００２６】
このような正常型または活性型のHSF1ポリヌクレオチドを細胞内に導入可能な状態とするためには、例えば、ポリヌクレオチドが「むき出し（naked）DNA」として（例えば、米国特許第5,580,859号参照）、あるいは組換えウイルスベクターの形態で製剤化される。
【００２７】
特にウイルスベクターとしては、バキョロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、またはピコルナウイルス科から選ばれるウイルスのゲノムに由来するものとすることができる。各々の親ベクターの都合のよい長所を利用したキメラベクターもまた用いることができる（例えば、Feng（1997）Nature Biotechnology 15:866-870参照）。このようなウイルスゲノムは、複製欠損性か、条件により複製するか、または複製コンピテントとなるべくさらに加工されてもよい。別の態様においては、ベクターはアデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルスゲノムに由来する複製非コンピテントベクター、例えば米国特許第6,096,718号；6,110,458号；6,113,913号；5,631,236号参照）；アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスゲノムに由来するベクターである。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（MuLV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、およびそれらの組合せを主成分とするものが含まれる（例えば、米国特許第6,117,681号；6,107,478号; 5,658,775号; 5,449,614号；Buchscher（1992）J. Virol. 66:2731-2739; Johann（1992）J. Virol. 66:1635-1640参照）。
【００２８】
また、生体より取り出した組織あるいは細胞にポリヌクレオチド発現ベクターを導入した後に生体に戻すようにしてもよい（ex vivo法）。そのような場合は、ポリヌクレオチドを組込んだ発現ベクターを、例えばマイクロインジェクション法やエレクトロポーレーション法等の公知のトランスフェクション法により細胞内に導入する方法を採用することができる。
【００２９】
なお、前記のウイルスベクターや発現ベクターにおいて、ポリヌクレオチドは、それが全身性または組織特異的（特に膵臓特異的）に発現するような任意のプロモーター支配下に連結されるようにする。特に、膵臓特異的に発現させるためには、例えば、膵ベータ細胞特異的なインスリンプロモーターの採用が好ましい。また、ウイルスベクターを膵臓特異的に感染させる場合には、経皮的に動脈にカテーテルを挿入して、X線でカテーテルの位置を確認しながら腹部大動脈、腹腔動脈を経由して膵臓を栄養している膵臓動脈にカテーテルを挿入して組換えベクターを膵臓特異的に導入することが可能である。
【００３０】
第２発明の糖尿病治療薬に使用するHSF1ポリペプチドや活性型HSF1ポリペプチドは、前記のHSF1ポリヌクレオチドや活性型HSF1ポリヌクレオチドを用いた遺伝子工学的方法により作成することができる。すなわち、ポリヌクレオチドを有するベクターからインビトロ転写によってRNAを調整し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行うことによりインビトロでHSF1ポリペプチドや活性型HSF1ポリペプチドを得ることができる。またポリヌクレオチドを公知の方法により適当な発現ベクターに組換えれば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞の発現産物としてHSF1ポリペプチドや活性型HSF1ポリペプチドを得ることができる。
【００３１】
HSF1ポリペプチドや活性型HSF1ポリペプチドは、周知の化学合成法（例えば、Merrifield, R.B. J. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963； Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, W.C. and White, P.D., Oxford University Press, 2000）等に準じて合成することもできる。
【００３２】
HSF1ポリペプチドや活性型HSF1ポリペプチドの別の形態は、「ペプチド誘導体」である。この誘導体は、合成や精製を促進するための修飾、物理・化学的安定化を促進するための修飾、生体内の代謝に対する安定性と不安定性、条件付けの等の活性化修飾等を含む。
【００３３】
ペプチド誘導体におけるその他の修飾には、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、脂質結合、硫酸化、セレノイル化等が含まれる。より具体的には、ペプチド誘導体は、HSF1ポリペプチドや活性型HSF1ポリペプチドの活性を破壊せず、またこれを含有する組成物に毒性を与えない範囲において、残基の側鎖またはN末端基もしくはC末端基として生じる機能性基として調製することができる。例えば、体液中でポリペプチドの残存を延長するポリエチレングリコール側鎖を含む誘導体、あるいはカルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアとまたは第１級もしくは第２級アミンと反応することによるカルボキシル基のアミド、アシル部分（moiety）（たとえば、アルカノイル基またはカルボサイクリックアロイル基）と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体またはアシル部分と形成される遊離の水酸基（たとえば、セリルまたはスレオニル残基の水酸基）のＯ−アシル誘導体等である。もちろん、このようなペプチド誘導体は、HSF1ポリペプチドまたは活性型のHSF1ポリヌクレオチドと実質的に同様の活性（インスリン分泌の増加）を有することを前提とする。
【００３４】
HSF1ポリペプチドまたは活性型のHSF1ポリヌクレオチドのさらに別の形態は、薬理学的に許容し得る「塩」であってもよい。この塩は、ポリペプチドのカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両者を意味する。カルボキシル基の塩は、当該技術分野における公知の方法によって形成することができ、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛などの無機塩、およびトリエタノールアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどのようなアミンを用いて形成されたような有機塩基との塩が含まれる。酸付加塩としては、たとえば塩酸または硫酸などの鉱酸との塩およびたとえば酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩を含む。もちろん、このようなあらゆる塩もまた、HSF1ポリペプチドまたは活性型のHSF1ポリヌクレオチドと実質的に同様の活性（インスリン分泌の増加）を有することを前提とする。
【００３５】
このようなHSF1ポリペプチドまたは活性型のHSF1ポリヌクレオチドを細胞内に導入可能な形態に製剤化するためには、公知の様々な手段を採用することができる。例えば、ポリペプチドのＮ末端側に細胞膜通過ペプチドを連結させた融合ポリペプチドの使用である。この細胞膜通過ペプチドを備えることによって、ポリペプチドは細胞膜を通過して細胞内に取り込まれ、細胞内においてインスリン分泌を増加させる。細胞膜通過ペプチドとしては、HIV-1・TAT（Science, 285:1569-1572, 1999; GenBank Accession NO. U39362 M96155）のPTD（protein transduction domain：HIV・TATの第47-57位アミノ酸配列）や、ショウジョウバエのホメオボックスタンパク質アンテナペディアのPTD（GenBank Accession No. AE001573）を使用することができる。融合ポリペプチドは、例えば、HSF1ポリヌクレオチドとPTDポリヌクレオチドとを連結して作製した融合ポリヌクレオチドを用いて、遺伝子工学的に作製することができる。また、2価の架橋剤（例えば、EDCやβ−アラニン等）を介して、ポリペプチドとPTDペプチドを結合させる方法によって細胞膜通過ペプチドを連結した融合ポリペプチドを作成することもできる。このような融合ポリペプチドは、例えば経皮的に動脈にカテーテルを挿入して、X線でカテーテルの位置を確認しながら腹部大動脈、腹腔動脈を経由して膵臓を栄養している膵臓動脈にカテーテルを挿入することによって、膵臓特異的に導入することが可能である。
【００３６】
また、ex vivo法によるHSF1ポリペプチドや活性型HSF1ポリペプチドの細胞内導入の場合には、脂質（BioPORTER：Gene Therapy Systems社、米国、Chariot：Active Motif社、米国等）によるポリペプチドの細胞内導入法を採用することもできる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例を示して本願発明の作用効果についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、本願発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例１：培養細胞を用いた試験
1：材料
1-1：ベクター
アデノウイルスベクターに野生型HSF1ポリヌクレオチド、または活性型HSF1ポリヌクレオチドを挿入し、組換えアデノウイルスベクターを作製した。コントロールベクターとして、LacZ遺伝子による組換えアデノウイルスベクターを作製した。
1-2：細胞等
膵ベータ細胞は、American type cell collection(ATCC)から入手した。培養用培地およびウシ胎児血清はインビトロジェンより購入した。
2：方法
膵ベータ細胞を培地に播種して培養し、翌日に、HSF1組換えアデノウイルスベクター、活性型HSF1組換えアデノウイルスベクター、LacZ組換えアデノウイルスベクター（コントロール）を細胞数に対して感染させた。２日後に、以下の測定を行った。
2-1：RNA抽出とノーザンブロット法
RNA抽出には、日本ジーン社製RNA抽出キット（ISOGEN）を使用した。等量のRNAを25mmol/L MOPSバファー(pH 7.0)、1 mmol/L EDTA、および2.2 mmol/Lホルマリンを含む1.2%アガロースで電気泳動し、アマシャムファルマシア製のナイロンメンブランに転写した。42℃で[α-32P]dCTPでラベリングした特異的なcDNAでハイブリダイゼーションを行った。
【００３８】
結果は図１Aに示したとおりである。活性型HSF1ポリヌクレオチドを導入した培養膵ベータ細胞は、コントロール（LacZ導入）に比してインスリンmRNAを3.1倍発現させた。
【００３９】
なお、図１において、MOIとは膵ベータ培養細胞数に対するウイルスの数を表現している。つまり、5 MOIとは膵ベータ培養細胞数の5倍量のウイルスを感染させたことを示している。
2-2：タンパク質抽出とウエスタンブロット法
タンパク質抽出はラミニバッファーを用いた（3%SDS、20%グリセリン、200mM Tris/HCl：pH 6.8、100mMDTT）。抽出したタンパク質は16.5%SDSアクリルアミドゲルで泳動し、ニトロセルロースメンブランに転写し、アマシャムファルマシアの検出キットに従ってタンパク質の発現量を調べた。
【００４０】
結果は図1Bに示したとおりである。活性型HSF1ポリヌクレオチドを導入した培養膵ベータ細胞は、コントロール（LacZ導入）に比してインスリンを2.3倍発現させた。
2-3：インスリン分泌測定
各組換えアデノウイルスベクターを感染させた培養膵ベータ細胞の培養上清におけるインスリン分泌量を測定した。その後、細胞数を計算し、単位時間、細胞数当りのインスリン分泌量を求めた。
【００４１】
結果は図２に示したとおりである。野生型HSF1ポリヌクレオチドおよび活性型HSF1ポリヌクレオチドを導入した細胞は、コントロールに比較して有意（P<0.05）に高いインスリン分泌を示した。また、活性型HSF1ポリヌクレオチドを導入した細胞では、野生型HSF1ポリヌクレオチドを導入した細胞と比較して、約1．2倍のインスリン分泌が観察された。
実施例２：糖尿病モデル動物を用いた試験
1：材料
1-1：ベクター
アデノウイルスベクターに、ヒトインスリンプロモーターを連結した活性型HSF1ポリヌクレオチドを挿入し、活性型HSF1組換えアデノウイルスベクターを作製した。コントロールベクターとして、同様のプロモーターを連結したLacZ遺伝子による組換えアデノウイルスベクターを作製した。
1-2：モデルラット
実験動物は、チャールズ リバー社より購入した。１型糖尿病モデルラット、生後5週のラットに、麻酔下で大腿静脈にストレプトゾトシンを投与して作成した。２型糖尿病モデルラットは、出産直後の新生児ラット腹腔にストレプトゾトシンを投与して作成した。
2：方法
2-1：１型糖尿病モデルラットによる試験
大腿静脈にストレプトゾトシン投与と同時に、活性型HSF1組換えアデノウイルスベクターまたはコントロールベクターを1.0×108個、麻酔下で膵臓に直接投与した。感染後、一日おきに体重、血糖、各種タンパク質を測定した。
【００４２】
結果は、図３Aに示したとおりである。活性型HSF1組換えベクターを膵臓細胞に感染させた１型糖尿病モデルラットは、コントロールに比して、随時血糖、空腹時血糖の低下と、血中インスリンの上昇が確認された。
【００４３】
また、感染１週間後に経口ブドウ糖負荷試験を行った。経口ブドウ糖負荷試験は、８時間の絶食後にラットの体重および血糖を測定し、体重100gあたり0.1gのブドウ糖をゾンデにて経口摂取させ、15分、30分、60分、120分後に血糖を測定した。
【００４４】
結果は図３Bに示したとおりである。活性型HSF1組換えベクターを膵臓細胞に感染させた１型糖尿病モデルラットは、コントロールに比して、30分後、60分後において有意な血糖値の低下が確認された。
2-2：２型糖尿病モデルラットによる試験
出産直後のラットにストレプトゾトシンを投与し、生後３週から随時血糖を測定し、血糖が120から150mg/dlのラットを用いた。４週目に経口ブドウ糖負荷試験を実施し、その翌日に、活性型HSF1組換えベクターまたはコントロールベクターを1.0×108個、麻酔下で膵臓に直接投与した。感染後、一日おきに随時血糖と体重を測定した。感染後５日に再び経口ブドウ糖負荷試験を実施し、活性型HSF1ポリヌクレオチドの発現による影響を評価した。
【００４５】
図４Aは活性型HSF1組換えベクターを膵臓細胞に感染させた２型糖尿病モデルラットにおける感染前と後の血糖値および随時血糖である。活性型HSF1ポリヌクレオチドの過剰発現により経口ブドウ糖負荷試験において血糖値は有意に低下した。また、随時血糖も有意に低下した。
【００４６】
図４Bはコントロールベクターを感染させた２型糖尿病モデルラットにおける感染前後の血糖値および随時血糖である。コントロール（LacZ発現）では、経口ブドウ糖負荷試験において若干の血糖値上昇が観察された。また、随時血糖は、活性型HSF1ポリヌクレオチドの過剰発現とは反対に、LacZ発現により有意に上昇した。
2-3：正常ラットによる試験
生後5週のラットに活性型HSF1組換えアデノウイルスベクターを1.0×108個、麻酔下で膵臓に直接投与した。感染後、一日おきに血糖値を測定した。感染後５日に経口ブドウ糖負荷試験を実施し、活性型HSF1ポリヌクレオチドの発現による影響を評価した。
【００４７】
図５Aに示したように、経口ブドウ糖負荷試験において、活性型HSF1ポリヌクレオチドの過剰発現により、15分後以降の血糖値が正常コントロールラットと比して有意に低下した。
【００４８】
また図５Bに示したように、随時血糖、空腹時血糖は活性型HSF1ポリヌクレオチドを過剰発現するラットと正常ラットにおいてほぼ同一であった。
【００４９】
なお、この動物試験に用いたラットは小型であるため膵臓動脈から膵臓への組換えベクター導入は困難であり、そのためラットを麻酔下で開腹し、組換えベクターを膵臓に直接注射した。ヒトを対象とする臨床場面では、前記のとおり、経皮的に動脈にカテーテルを挿入して、X線でカテーテルの位置を確認しながら腹部大動脈、腹腔動脈を経由して膵臓を栄養している膵臓動脈にカテーテルを挿入して組換えベクターを膵臓特異的に導入することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】Aは、ノーザンブロット法によりインスリンmRNAを測定した結果である。Bは、ウエスタンブロット法によりインスリン量を測定した結果である。
【図２】細胞のインスリン分泌量を測定した結果である。
【図３】Aは、組換えアデノウイルスベクター感染後の１型糖尿病モデルラットにおける各種測定結果である。Bは、経時的な血糖変化である。
【図４】Aは、組換えアデノウイルスベクター感染前後の２型糖尿病モデルラットにおける経時的な血糖変化である。Bは、コントロールベクター感染前後の２型糖尿病モデルラットにおける経時的な血糖変化である。
【図５】Aは、組換えアデノウイルスベクターを感染させたラットと非感染ラット（正常ラット）における経時的な血糖変化である。Bは、組換えアデノウイルスベクターを感染させたラットと正常ラットにおける空腹時血糖と随時血糖の測定結果である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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