(57)【要約】【課題】  今までにはない分子標的を利用し、がんの浸潤・転移を抑制することによって、より効果的ながんの治療薬を提供する【解決手段】  浸潤性乳がんに特化されたAMAP1/パキシリン(paxillin)/コルタクチン(cortactin)の三者からなる蛋白質複合体の形成を阻害するために、AMAP1のプロリンリッチ配列とコルタクチンのSrcホモロジードメイン３（ＳＨ３）との結合を阻害するポリペプチドを合成する。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＭＡＰ１のプロリンリッチ領域第４配列に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
配列番号：１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号：３のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号：４のヌクレオチド配列を含む請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１ないし３のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分として含む、ヒトがん細胞の浸潤および転移を阻害する薬剤。
【請求項８】
請求項４ないし６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを有効成分として含む、ヒトがん細胞の浸潤および転移を阻害する薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド性化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、細胞浸潤に特化された蛋白質間相互作用で見出された非定型なSH3/プロリンリッチ配列結合阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
がんの最も大きな脅威はその浸潤・転移性にある。上皮がんの場合、転移の多くはまずがん細胞の基底膜への浸潤を介して起こる。このことは、ヒト乳がんにおいて顕著であることが病理学的所見により示されている（非特許文献１参照）。
近年では、浸潤・転移活性の阻害に関与することが知られている蛋白質分解酵素等を分子標的とした抗がん剤の臨床試験が世界レベルで多数実施されているものの、有効性が確認されたものは皆無に等しい。したがって、新しい方法や分子標的を世界中の研究者らが模索しているのが現状である。
【０００３】
本発明者らは、ヒト正常乳腺上皮や非浸潤性乳がんには検出されず、浸潤性乳がんに特化された蛋白質複合体があることを発見した(非特許文献2)。この複合体は、AMAP1/パキシリン(paxillin)/コルタクチン(cortactin)の３つの蛋白質からなり、その形成はSrcホモロジードメイン3（SH3ドメイン）によって媒介される。すなわち、AMAP1のSH3ドメインでパキシリンのプロリンリッチ配列と結合し、コルタクチンのSH3ドメインでAMAP1のプロリンリッチ配列と結合している。
特にコルタクチンのSH3ドメインとAMAP1のプロリンリッチ配列との結合様式が、他の一般的なSH3／プロリン結合とは大きく異なることも見出している(非特許文献2)。
例えば、コルタクチンのＳＨ３とダイナミン２のプロリンリッチ配列は、通常の結合様式で１：１結合しているが、コルタクチンのSH3ドメインとAMAP1のプロリンリッチ配列とは、２分子のコルタクチンがSH3ドメインを介して１分子のAMAP1のプロリンリッチ配列と結合している。
【０００４】
SH3ドメインは、細胞の増殖制御や細胞骨格制御をはじめとして様々な重要局面に関与することから、製薬企業を中心として、SH3ドメインの結合阻害剤のスクリーニングが行われてきた。しかしながら、SH3ドメインは種々の蛋白質に存在し、また構造的にも互いによく保存され、結合相手であるプロリンペプチドも互いに類似している。そのため、ある一つのSH3結合を阻害することを目安に阻害剤をスクリーニングしても、得られたものは他の多くのSH3結合をも同様に阻害してしまった例がほとんどである。したがって、このような阻害剤を、例えば抗がん剤や抗炎症剤、血管新生阻害剤等として開発しようとしても、副作用が強く役に立たなかったものがほとんどであると考えられる。
【０００５】
【非特許文献１】Allred DC, Mohsin SK, & Fuqua SA. Endocr. Relat. Cancer, 2001, Mar;8(1):47-61
【非特許文献２】Onodera Y, Hashimoto S, Hashimoto A, Morishige M, Mazaki Y, Yamada A, Ogawa E, Adachi M, Sakurai T, Manabe T, Wada H, Matsuura N, Sabe H. EMBO J., 2005, Mar 9;24(5):963-973
【非特許文献３】Vives E., Brodin P., & Leblus B. J. Biol. Chem., 1997, Jun 20;272(25):16010-16017
【非特許文献４】Nagahara H., Vocero-Akbani A. M., Snyder E. L., Ho A., Latham D. G., Lissy N. A., Becker-Hapak M., Ezhevsky S. A., & Dowdy S. F. Nat. Med., Dec;4(12): 1449-1452
【非特許文献５】Vocero-Akbani A., Heyden N. V., Lissy N. A., Ratner L., & Dowdy S. F. Nat. Med., 1999, Jan;5(1):29-33
【非特許文献６】Schwarze S., Ho A., Vocero-Akbani A., & Dowdy S. F. Science, 1999, Sep 3;285(5433): 1569-1572
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、がんの治療に関して、がんの浸潤・転移を抑制する手立てを提供することである。本発明の目的は、今までにはない分子標的を利用し、より効果的ながんの治療薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ヒト乳がん細胞を用いて、浸潤性乳がんに特化されたAMAP1/パキシリン(paxillin)/コルタクチン(cortactin)の三者からなる蛋白質複合体の形成を阻害することで、がん細胞の浸潤と転移を効果的に阻害できることを明らかにした。
したがって、このAMAP1のプロリンリッチ領域第４配列に相当するアミノ酸配列（配列番号：１の第５ないし第１９アミノ酸残基までの１５アミノ酸残基配列）を含むポリペプチドを用いれば、AMAP1のプロリンリッチ配列とコルタクチン蛋白質のＳＨ３との間の結合を特異的に阻害することが可能となる。
【０００８】
本発明において、AMAP1のプロリンリッチ領域第４配列に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチドとして、例えば、配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを合成し、このペプチドが、AMAP1のプロリンリッチ配列と競合して、AMAP1のプロリンリッチ配列とコルタクチン蛋白質のＳＨ３との間の結合を低濃度で特異的に阻害することが確認された。
【０００９】
本発明においては、配列番号：１のアミノ酸配列に配列番号：２のHIVのTAT蛋白質に由来するポリペプチド配列（非特許文献３ないし６）を結合させたアミノ酸配列からなるポリペプチド（配列番号：３）を用いることによって、添加するだけで配列番号：１のポリペプチドが直接細胞内に導入されるように工夫している。
このTAT配列の付加により、（１）ポリペプチドを添加するだけで細胞内に導入できる、（２）導入時間が短い、（３）個体への投与の際、腹腔内注射や静脈注射などにより各組織に導入できる等の利点がある。また、このTAT配列は、目的のペプチド配列等のN末端／C末端のいずれにも付加することができ、今後薬剤として配列番号：１に基づいた低分子性化合物等をデザインする際にも自由に利用できる。
【００１０】
また、細胞内局在を可視化するため、配列番号：３のポリペプチドのＣ末端側に蛍光物質であるイソチオシアン酸フルオレッセイン（fluorescein isothiocyanate: FITC)を付加することもできる。
【００１１】
本発明は、配列番号：１または配列番号：３のポリペプチドを有効成分として含む、ヒトがん細胞の浸潤・転移活性を阻害する薬剤に関する。このようなポリペプチドを含有する組成物は、ヒトがんに特化された蛋白質複合体の形成を阻害することによって、ヒトがん細胞の浸潤・転移活性を阻害する薬剤となりうる。
対象となるがんは、乳がんをはじめとする基底膜を介する浸潤過程を経るあらゆる臓器の上皮組織由来のがんである。
【００１２】
これらのポリペプチドは、ポリペプチドの形態で投与してもよいが、これらのポリペプチドをコードするDNAを遺伝子導入の方法で細胞にトランスフェクトし、細胞内で発現させてもよい。
したがって、本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列番号：４のポリヌクレオチドに関する。
また、本発明は、配列番号：４のポリヌクレオチドを有効成分として含む薬剤にも関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明において、今まで試されたことがない蛋白質相互作用に関わるインターフェースを分子標的とし、当該蛋白質複合体形成を阻害することによって非常に効果的にがんの浸潤活性と転移活性を抑制できることが示された。同定されたインターフェースにはいずれもSH3領域と呼ばれる蛋白質相互作用モジュールが関与している。
本発明においては、ペプチドを用いることによって当該蛋白質相互作用を阻害したが、この知見に基づき、低分子化合物をデザインして合成すること、あるいはこれらのモジュールに結合して当該蛋白質相互作用を阻害する化合物をスクリーニングすることが可能となり、今後、乳がんをはじめとする様々な上皮組織由来がんに対して有効な薬剤の開発を促進することができると期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（１）化学的合成法によるポリペプチドの製造
本発明のペプチドを製造するには化学的合成法によるのが便利である。
化学的合成法としてはメリフィールド固体ペプチド合成法が便利である。この方法では、まず、合成しようとするアミノ酸配列のカルボキシ末端の第一のアミノ酸のｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）誘導体を、クロロメチル化した架橋ポリスチレンに導入する。次に、Ｂｏｃ基を除去して得られる樹脂上のアミノ基に第二のＢｏｃ−アミノ酸を導入する。この操作を繰り返し、目的とするペプチド鎖が構築できたら、全保護基を除くとともにペプチドを樹脂から切り離す。
【００１５】
（２）遺伝子組換え法によるポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドを製造するには遺伝子組換え法によるのが便利である。
配列番号：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号：４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、適当な宿主系内で組換え配列番号：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する発現ベクターを構築することができる。得られた発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、この形質転換体を配列番号：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡの発現に適した条件下で培養することにより、配列番号：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドを製造することができる。
【００１６】
配列番号：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは当業者既知の方法で構築することができる。配列番号：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現に適したベクターは、該ポリヌクレオチドの挿入部位の直ぐ上流に転写開始のためのプロモーターを有するものであろう。
適当なプロモーターも当該技術分野で既知であり、宿主細胞内での機能特性に応じて選択することができる。例えば、ＳＶ４０ウイルス初期遺伝子のプロモーター、ペプチド鎖延長因子ＥＦ−１αのプロモーター、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター、β−アクチンのプロモーター、ＣＭＶウイルスのプロモーター等を動物細胞系での発現で、Ｔ７ポリメラーゼのプロモーターやベーターガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター等を細菌、大腸菌での発現に用いることができる。
配列番号：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入部位下流には転写終結シグナルがあることが望ましい。
【００１７】
ベクター中には、例えば、薬物耐性マーカーのような選択可能マーカーが存在することが望ましい。あるいは、ヒト造血器型ＰＧＤ合成酵素を含有する発現ベクターと別個の抗生物質等の薬物耐性をコードするプラスミドを用いて同時に形質転換してもよい。
【００１８】
発現ベクターを構築するには配列番号：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当なベクターに挿入する。適当なベクターは、プロモーター、転写終結シグナル、選択マーカーその他の条件を考慮し、当該技術分野で既知のものから選択する。配列番号：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入し、培養細胞に導入してこのポリヌクレオチドを発現する目的に用いることができるベクターとして、例えば動物細胞での発現においてはｐＫＣＲ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４ウシパピローマウィルスＤＮＡなど、大腸菌においてはｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ、pTAT等を挙げることができる。
【００１９】
配列番号：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現に用い得る細胞は複製可能であって、配列番号：４のヌクレオチド配列に配列番号：５のHIVのTAT蛋白質に由来するヌクレオチド配列を付加したポリヌクレオチドを発現し得るものであればよい。例えば、大腸菌のような原核性微生物、Ｓ．セレビジエのような真核性微生物、さらには哺乳類細胞が用いられる。組織培養細胞には鳥類の細胞、または、例えばネズミ、ラットおよびサルなどの哺乳類の細胞が含まれる。適当な宿主細胞−ベクターシステムの選択および使用方法等は、当業者に既知であり、それらの内から配列番号：２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に適した系を任意に選択することができる。
【００２０】
形質転換した細胞を常法に従い培養することにより所望の蛋白質が得られる。培養に用いる培地は宿主の性質に応じて適宜選択することができるが、例えば宿主が大腸菌である場合にはＬＢ培地やＴＢ培地が、宿主が哺乳動物細胞である場合にはＲＰＭＩ１６４０培地等を適宜用いることができる。
この培養により得られる培養物からの本発明に用いる蛋白質の単離および精製は常法により行うことが可能であり、例えば培養物を蛋白質の物理的および化学的性質を利用した各種の処理操作を用いて行うことが可能である。具体的には蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、高速液体クロマトグラフィー、遠心分離、電気泳動、アフィニティクロマトグラフィーなどを単独で、または組み合わせて用いることができる。
【００２１】
（３）配列番号：３のポリペプチドの培養細胞への導入方法
本発明で用いたペプチドの導入方法においては、特に細胞の種類は問わない。しかしながら、細胞種によって導入効率は異なる。細胞への導入効率は、配列番号：３のポリペプチドのC末側に付加したFITCの蛍光強度により評価することが可能である。導入物質濃度は、最終濃度が１μＭから１００μＭの範囲で行っている。また、導入時間は、30分から２時間程度で十分である。
【００２２】
（４）配列番号：３のポリペプチドの生体への導入方法
上記と同様に本発明で用いたペプチドの導入方法において、マウスやラットに導入する際には、１−１０ｍｇ／ｋｇのペプチドを必要とする。投与方法は腹腔注射、皮下注射および静脈注射等が可能である。口腔投与も検討対象である。各組織への導入効率は、配列番号：３のポリペプチドのC末端側に付加したFITCの蛍光強度により評価することが可能である。
【００２３】
（５）配列番号：３のポリペプチドを有効成分とする製剤の調製
配列番号：３のポリペプチドを自体公知の担体と混合希釈して、たとえば液剤などとして製剤化することができる。液剤を調製するには、例えば精製水、生理食塩水、エタノール・プロピレングリコール・グリセリン・ポリエチレングリコール等のアルコール類、トリアセチン等の溶媒を用いて行うことができる。このように調整した液剤は、たとえば乳酸リンゲル液、輸液用電解質液よりなる維持液、術後回復液、脱水補給液、点滴用生理食塩液等に希釈して用いることができる。通常液剤に適宜選択して用いられる添加剤、例えば、ｐＨ調整用の緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、酢酸緩衝液等）、等張化剤（例えば、ソルビトール、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール，グルコース、塩化ナトリウム等）を加えてもよい。
このような製剤にはさらに薬学上許容しうる塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸エステル類、ベンジルアルコール、パラクロルメタキシノール、クロルクレゾール、フェネチルアルコール、ソルビン酸またはその塩、チメロサール、クロロブタノール等の適当な防腐殺菌剤、タルク等の湿潤剤、モノオレイン酸ポリエチレングリコール等の乳化剤、分散剤、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、メタ重亜硫酸塩等の安定剤のような補助剤を加えても良い。またアラビアゴム、カオリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等を懸濁化剤として用いた懸濁剤として投与することも好ましい剤型の１つといえる。
【００２４】
投与経路としては非経口投与が好ましく、例えば経静脈的投与、経脳脊髄液投与、カテーテルによる経動脈的な局所投与、もしくは外科的な局所投与を含む。本発明の有効成分の投与量は、０．１−１０００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１−５００ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００２５】
（６）配列番号：４のポリヌクレオチドの遺伝子導入法
本発明は、本発明はヒトがん細胞の浸潤活性と転移活性を阻害する薬剤であって、配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドコードするポリヌクレオチドを含む薬剤に関する。
配列番号：１のアミノ酸配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号：４に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドがある。
これらのポリヌクレオチドを、遺伝子導入（gene transfer）の方法で細胞に導入し、細胞内でポリペプチドを発現させる。遺伝子導入の方法としては、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、ウイルスベクターを用いるウイルス法、パーティクルガン法等がある。好ましい方法はリポフェクション法である。この方法ではDNAが結合したリポソームを用い細胞融合を利用して細胞にポリヌクレオチドを導入する。人工的に作成した脂質二重層でできた陽イオンリポソームとポリヌクレオチドを混合するとリポソーム−ポリヌクレオチド複合体ができる。この複合体を含む溶液で細胞を培養すると複合体中のポリヌクレオチドが細胞に取り込まれる。陽イオンリポソームを作る人工脂質としてはリポフェクチン（商品名）、リポフェクタミン（商品名）等を好ましく利用できる。
【００２６】
実施例１：AMAP1／コルタクチンの複合体形成阻害試験
COS7細胞において強制発現させたAMAP1、パキシリンと大腸菌において発現／精製したコルタクチン、AMAP1-SH3ドメインを用いて、AMAP1／コルタクチン、およびAMAP1／パキシリンの複合体の形成の確認と、配列番号：３のアミノ酸配列のＣ末端側にＦＩＴＣを付加して得られたポリペプチド（以下、「P4-TAT-FITCペプチド」という。図中、単に「Ｐ４」と略記する。）による複合体形成の阻害効果の検討をプルダウン法により行った。
【００２７】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）タグを付加したコルタクチンまたはAMAP1-SH3ドメインのcDNAを大腸菌に導入し、常法により発現誘導し、グルタチオンセファロース（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）によりGST-コルタクチンまたはGST-AMAP1-SH3ドメインを精製した。
【００２８】
COS7細胞にグリーンフルオレセンス（GFP）タグを付加したAMAP1またはダイナミン２(dynamin 2)、あるいはパキシリンのcDNAをリポフェクション法を用いて導入することにより強制発現させた。導入にはPolyfect (キアゲン社製)を使用した。遺伝子導入後３６時間、細胞抽出液を1％ NP-40バッファー(１％ ノニデット（Nonidet）-40, 150mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH7.4, 5mM EDTA, 1mM Na3VO4, 1mM フェニルメチルスルホニルクロライド, 5μg/mL アプロチニン, 2μg/mL ロイペプチン（leupeptin）および3μg/mL ペプスタチンA)により作成した。
【００２９】
３００μｇの細胞抽出液に対して、P4-TAT-FITCペプチドを添加し、5μgの精製したGST-コルタクチン、あるいはGST-AMAP1-SH3ドメインおよび１０μＬのグルタチオンセファロースを加え、4℃で2時間インキュベートした。グルタチオンセファロースに吸着したAMAP1／コルタクチン複合体を1% NP-40バッファーにより精製した。精製後のSH3ドメイン結合蛋白質ビーズ複合体それぞれに30μＬのレムリのサンプルバッファー［蛋白質の化学Ｉ−分離精製、東京化学同人、211頁（1976年）参照］を添加し、よく混合させた後、95℃で3分間加熱した。回転遠心機により25℃、1,000rpmで３分間ビーズを沈澱させた後、上清をそれぞれ8%ポリアクリドアミドゲル電気泳動に供した。
【００３０】
引き続き、以下のようにしてウエスタンブロットにより、上記上清中の各SH3ドメイン結合蛋白質複合体におけるプロリンリッチ配列を含む蛋白質を検出した。まず、電気泳動後のゲル中の蛋白質を0.45μmのニトロセルロース膜（イモビロン（Immobilon）；ミリポア社製）にブロット後、膜に5％ウシアルブミンを含むTBST（0.1% Tween-20, 150mM NaCl, １0mM Tris-HCl）をのせて非特異的結合をブロックした。
プロリンリッチ配列を含む蛋白質の検出にはマウス抗GFP抗体、1:1000に希釈して2時間反応させた。TBSTで洗浄した後、1:10,000に希釈したHRP結合抗マウス抗体（ジャクソン社製）を１時間反応させた。TBSTで洗浄した後、検出はECL試薬（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いた化学発光により行った。
図１に、AMAP1／コルタクチンおよびダイナミン２／コルタクチン複合体の形成と、P4-TAT-FITCペプチドによる複合体の形成の阻害を示すウエスタンブロット電気泳動図を示す。また、図２に、AMAP1／パキシリン複合体の形成と、P4-TAT-FITCペプチドによる複合体の形成の阻害を示すウエスタンブロット電気泳動図を示す。
【００３１】
その結果、図１および２から分かるように、P4-TAT-FITCペプチドは、低濃度で特異的にAMAP1／コルタクチンの複合体形成を阻害することが確認された。
図１によれば、１０μＭのP4-TAT-FITCペプチド添加により、ＡＭＡＰ１とコルタクチンとの結合が阻害され、３０μＭ以上のP4-TAT-FITCペプチド添加により、この結合が完全に阻害されることが確認された。
一方、１００μＭを超えるP4-TAT-FITCペプチド添加により、ダイナミン２とコルタクチンとの結合も阻害されることが確認された。
さらに、図２によれば、１００μＭを超えるP4-TAT-FITCペプチド添加により、ＡＭＡＰ１とパキシリンとの結合も阻害されることが確認された。
【００３２】
以上の結果から、本発明のペプチドの添加量が１０〜１００μＭの範囲、および、より好ましくは、３０〜１００μＭの範囲にあれば、ＡＭＡＰ１とコルタクチンとの結合を特異的に阻害することが確認された。
【００３３】
実施例２：乳がん細胞の浸潤活性阻害試験
マウス乳がん細胞4T1/lucのマトリゲル上での浸潤活性に与える影響をボイデンチャンバー法(Boyden Chamber Assay)により調べた。細胞にP4-TAT-FITCペプチド添加し、マトリゲルを塗布したボイデンチャンバーの上に播き、その後１２時間における浸潤活性を測定した。また、コントロールとして、配列番号：１のアミノ酸配列を無作為に並べ替えて得られたアミノ酸配列のＣ末端側に配列番号：２のアミノ酸配列を付加し、さらにそのＣ末端側にFITCを付加したペプチド（以下、「スクランブル-TAT-FITCペプチド」という。図中、単に「スクランブル」と略記する。）を添加し、マトリゲルを塗布したボイデンチャンバーの上に播き、その後１２時間における浸潤活性を測定した。
その結果を図３に示す。縦軸は未処理の細胞の示すマトリゲル浸潤活性を１００とした時の、各々の処理細胞の相対的浸潤活性を示す。
【００３４】
同時に、化合物の細胞毒性をMTSアッセイキット（3-(4,5-ジメチルチアゾル-2-イル)-5-(3-カルボキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム・アッセイ・キット；プロメガ社製）により評価した。
その結果を図４に示す。縦軸は未処理の細胞の示すMTS活性を１００とした時の、各々の処理細胞の相対的生存率を示す。
【００３５】
図３および４から分かるように、P4-TAT-FITCペプチドの場合、細胞毒性に影響を与えず、浸潤活性が大幅に低下している。
【００３６】
実施例３：マウス個体における乳がん細胞転移への阻害試験（インビボ試験）
Balb/cマウスにおけるマウス4T1/luc細胞の肺への転移活性に与える影響を調べた。4T1/luc細胞はルシフェラーゼを恒常的に発現させたマウス乳がん細胞である。転移活性は1×10６個の細胞をBalb/cマウス（メス、6−8週齢）の右側の鼡頚部乳房脂肪組織に注入し、１９日目における左肺への転移を、肺組織抽出液中のルシフェラーゼ活性を測定することにより評価した（図５）。
P4-TAT-FITCペプチドを最終濃度が１、３および１０ｍｇ／ｋｇになるように、または、スクランブル-TAT-FITCペプチドを最終濃度が１０ｍｇ／ｋｇになるように、4T1/luc細胞注入後１１日目から連日、マウス腹腔内に投与した。
１９日目における元の注入部位に形成された腫瘍の重さを測定した（図６）。
また、細胞注入後、１１日目からのマウスの体重を測定した（図７）。
各々のアッセイには、マウスを１０匹ずつ用いた。
【００３７】
その結果、図５から分かるように、P4-TAT-FITCペプチドにより、濃度依存的に4T1/luc細胞の肺への転移が抑制された。
一方、その条件下では、元の注入部位に形成された腫瘍の重さ、およびマウスの体重に有意な変化は見られなかった（図６および７）。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】P4-TAT-FITCペプチドによるAMAP1／コルタクチン複合体およびダイナミン２／コルタクチン複合体の形成と、複合体の形成の阻害を示すウエスタンブロット電気泳動図。
【図２】AMAP1／パキシリン複合体の形成と、P4-TAT-FITCペプチドによる複合体の形成の阻害を示すウエスタンブロット電気泳動図。
【図３】P4-TAT-FITCペプチドによる乳がん細胞浸潤活性の阻害を示すグラフ図：マトリゲルを塗布したボイデンチャンバーにおける浸潤活性。
【図４】P4-TAT-FITCペプチドによる乳がん細胞生存活性の阻害を示すグラフ図：細胞のMTS活性。
【図５】P4-TAT-FITCペプチドによる乳がんの肺への転移の抑制を示すグラフ図。
【図６】乳がん細胞注入部位での腫瘍重量変化。
【図７】乳がん細胞注入後１１日目からのマウスの体重変化。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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