(57)【要約】      （修正有）【課題】伝染病の因果作因の特定、個人が遺伝病を患い易い確立の予測、飲料水やミルクの純度の測定、組織サンプルの特定など法医学、医学、疫学および公衆衛生ならびに疾病の予測および診断に極めて重要な分析法を等温条件下で、単一のプライマを用いて核酸分子を増幅する方法の提供。【解決手段】ポリメラーゼ、ヌクレオチド、クレ組換え酵素、プライマー及び制限エンドヌクレアーゼの存在下で、線状二本鎖核酸をインキュベートし、サンプル中に存在する二本鎖核酸分子の対象ポリヌクレオチド領域を増幅する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載されるサンプル中に存在する二本鎖核酸分子の対象ポリヌクレオチド領域を増幅する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【表１】
2007190028.tif 000002
【背景技術】
【０００２】
【表２】
2007190028.tif 000003
【０００３】
【表３】
2007190028.tif 000004
【０００４】
【表４】
2007190028.tif 000005
【０００５】
【表５】
2007190028.tif 000006
【０００６】
【表６】
2007190028.tif 000007
【０００７】
【表７】
2007190028.tif 000008
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
【表７−１】
2007190028.tif 000009
【０００９】
【表８】
2007190028.tif 000010
【００１０】
【表９】
2007190028.tif 000011
【００１１】
【表１０】
2007190028.tif 000012
【００１２】
【表１１】
2007190028.tif 000013
【００１３】
【表１２】
2007190028.tif 000014
【００１４】
【表１３】
2007190028.tif 000015
【００１５】
【表１４】
2007190028.tif 000016
【００１６】
【表１５】
2007190028.tif 000017
【００１７】
したがって、本発明は以下を提供する：
【表１６】
2007190028.tif 000018
2007190028.tif 000019
2007190028.tif 000020
2007190028.tif 000021
2007190028.tif 000022
2007190028.tif 000023
2007190028.tif 000024
2007190028.tif 000025
2007190028.tif 000026
2007190028.tif 000027
2007190028.tif 000028
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
【表２０】
2007190028.tif 000029
【００１９】
【表２１】
2007190028.tif 000030
【００２０】
【表２２】
2007190028.tif 000031
【００２１】
【表２３】
2007190028.tif 000032
【００２２】
【表２４】
2007190028.tif 000033
【００２３】
【表２５】
2007190028.tif 000034
【００２４】
【表２６】
2007190028.tif 000035
【００２５】
【表２７】
2007190028.tif 000036
【００２６】
【表２８】
2007190028.tif 000037
【００２７】
【表２９】
2007190028.tif 000038
【００２８】
【表３０】
2007190028.tif 000039
【００２９】
【表３１】
2007190028.tif 000040
【００３０】
【表３２】
2007190028.tif 000041
【００３１】
【表３３】
2007190028.tif 000042
【００３２】
【表３４】
2007190028.tif 000043
【００３３】
【表３５】
2007190028.tif 000044
【００３４】
【表３６】
2007190028.tif 000045
【００３５】
【表３７】
2007190028.tif 000046
【００３６】
【表３８】
2007190028.tif 000047
【００３７】
【表３９】
2007190028.tif 000048
【００３８】
【表４０】
2007190028.tif 000049
【００３９】
【表４１】
2007190028.tif 000050
【００４０】
【表４２】
2007190028.tif 000051
【００４１】
【表４３】
2007190028.tif 000052
【００４２】
【表４４】
2007190028.tif 000053
【００４３】
【表４５】
2007190028.tif 000054
【００４４】
【表４６】
2007190028.tif 000055
【００４５】
【表４７】
2007190028.tif 000056
【００４６】
【表４８】
2007190028.tif 000057
【００４７】
【表４９】
2007190028.tif 000058
【００４８】
【表５０】
2007190028.tif 000059
【００４９】
【表５１】
2007190028.tif 000060
【００５０】
【表５２】
2007190028.tif 000061
【００５１】
【表５３】
2007190028.tif 000062
【００５２】
【表５４】
2007190028.tif 000063
【００５３】
【表５５】
2007190028.tif 000064
【００５４】
【表５６】
2007190028.tif 000065
【００５５】
【表５７】
2007190028.tif 000066
【００５６】
【表５８】
2007190028.tif 000067
【００５７】
【表５９】
2007190028.tif 000068
【００５８】
【表６０】
2007190028.tif 000069
【００５９】
【表６１】
2007190028.tif 000070
【００６０】
【表６２】
2007190028.tif 000071
【００６１】
【表６３】
2007190028.tif 000072
【００６２】
【表６４】
2007190028.tif 000073
【００６３】
【表６５】
2007190028.tif 000074
【００６４】
【表６６】
2007190028.tif 000075
【００６５】
【表６７】
2007190028.tif 000076
【００６６】
【表６８】
2007190028.tif 000077
【００６７】
【表６９】
2007190028.tif 000078
【００６８】
【表７０】
2007190028.tif 000079
【００６９】
【表７１】
2007190028.tif 000080
【００７０】
【表７２】
2007190028.tif 000081
【００７１】
【表７３】
2007190028.tif 000082
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、適当な５′アダプタ分子の例を示す。
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂ（図面Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを含む）は、適当な３′アダプタ分子の例を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂ（図面Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを含む）は、適当な３′アダプタ分子の例を示す。
【図３Ａ】図３Ａ及び３Ｂは、プライマ伸長生成物の３′末端の適合を示す。図３Ａの線Ａ、Ｂ、Ｃは別のプライマ伸長を介したプライマ伸長生成物の３′末端を修飾するための異なるアダプタ分子の使用を示す。図３Ｂの線Ｄは、３′末端を修飾するための連結の使用を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ及び３Ｂは、プライマ伸長生成物の３′末端の適合を示す。図３Ａの線Ａ、Ｂ、Ｃは別のプライマ伸長を介したプライマ伸長生成物の３′末端を修飾するための異なるアダプタ分子の使用を示す。図３Ｂの線Ｄは、３′末端を修飾するための連結の使用を示す。
【図４Ａ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ及び４Ｄは、組換え部位を含むアダプタ分子を用いて適合させた直鎖状分子からの二本鎖環状分子の形成を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ及び４Ｄは、組換え部位を含むアダプタ分子を用いて適合させた直鎖状分子からの二本鎖環状分子の形成を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ及び４Ｄは、組換え部位を含むアダプタ分子を用いて適合させた直鎖状分子からの二本鎖環状分子の形成を示す。
【図４Ｄ】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ及び４Ｄは、組換え部位を含むアダプタ分子を用いて適合させた直鎖状分子からの二本鎖環状分子の形成を示す。
【図５】図５は、逆方向反復塩基配列を有する３′アダプタ分子とのプライマ伸長生成物の適合から形成したヘヤピンループ分子を示す。
【図６】図６は、一対の並置逆方向反復塩基配列を有する３′アダプタ分子とのプライマ伸長生成物の適合から形成した「ボータイ」分子を示す。
【図７】図７は、直接反復組換え部位を有するヘヤピンループ及び「ボータイ」分子の一本鎖環状分子への変換を示す。
【図８Ａ】図８Ａ及び８Ｂは、本発明の増幅レプリコンを示す。図８Ａは、一本鎖環状分子の増幅時に二つのプライマの伸長から生じる双起点「ローリングサークル」を示す。図８Ｂは、二本鎖環状分子の増幅から生じる「シータ」及び「ローリングサークル」レプリコンを示す。
【図８Ｂ】図８Ａ及び８Ｂは、本発明の増幅レプリコンを示す。図８Ａは、一本鎖環状分子の増幅時に二つのプライマの伸長から生じる双起点「ローリングサークル」を示す。図８Ｂは、二本鎖環状分子の増幅から生じる「シータ」及び「ローリングサークル」レプリコンを示す。
【図９】図９は、例１に記載した例示的等温増幅反応の概略図である。
【図１０】図１０、例１に記載した別の例示的等温増幅反応の概略図である。図は、プロト−ロックス部位の部分に相補的なプライマＩの５′第四領域の使用を示す。
【図１１】図１１は、例２に示したような二本鎖環状分子を形成するための連結の使用の概略図である。図１１において、プロト−ロックス部位の部分に相補的なプライマＩの５′第四領域は、必要に応じて省略される。
【図１２】図１２は、例２に示したように、二本鎖環状分子を形成するための連結の別の使用の概略図である。図１２において、プロト−ロックス部位の部分に相補的なプライマ１の５′第四領域は、必要に応じて省略される。
【図１３】図１３は、非修飾プライマを使用してＤＮＡリガーゼを採用した、例４に記載の別の例示的等温増幅反応の概略図である。
【００７３】
（配列表）
【００７４】
【表７４】
2007190028.tif 000083
【００７５】
【表７５】
2007190028.tif 000084
【００７６】
【表７６】
2007190028.tif 000085
【００７７】
【表７７】
2007190028.tif 000086
【００７８】
【表７８】
2007190028.tif 000087
【００７９】
【表７９】
2007190028.tif 000088
【００８０】
【表８０】
2007190028.tif 000089
【００８１】
【表８１】
2007190028.tif 000090
【００８２】
【表８２】
2007190028.tif 000091
【図１】
2007190028.tif 000092
【図２Ａ】
2007190028.tif 000093
【図２Ｂ】
2007190028.tif 000094
【図３Ａ】
2007190028.tif 000095
【図３Ｂ】
2007190028.tif 000096
【図４Ａ】
2007190028.tif 000097
【図４Ｂ】
2007190028.tif 000098
【図４Ｃ】
2007190028.tif 000099
【図４Ｄ】
2007190028.tif 000100
【図５】
2007190028.tif 000101
【図６】
2007190028.tif 000102
【図７】
2007190028.tif 000103
【図８Ａ】
2007190028.tif 000104
【図８Ｂ】
2007190028.tif 000105
【図９】
2007190028.tif 000106
【図１０】
2007190028.tif 000107
【図１１】
2007190028.tif 000108
【図１２】
2007190028.tif 000109
【図１３】
2007190028.tif 000110