(57)【要約】      （修正有）【課題】被検物質の食欲抑制効果をスクリーニングするための手段を提供する。【解決手段】視床下部細胞に被検物質を接触させる工程、および視床下部細胞における、血清／グルココルチコイド誘導性キナーゼ１（ＳＧＫ−１）遺伝子の発現量を測定する工程、を含む被検物質の食欲抑制効果をスクリーニングする方法。また、ＳＧＫ−１遺伝子を特異的に増幅するためのプライマー、ＳＧＫ−１遺伝子を検出するためのプローブからなる、食欲抑制効果をスクリーニングするためのキット、プローブ固定化担体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
視床下部細胞に被検物質を接触させる工程、および
視床下部細胞における、SGK-1遺伝子の発現量を測定する工程、
を含む、被検物質の食欲抑制効果をスクリーニングする方法。
【請求項２】
以下の(a)および(b)：
(a)SGK-1遺伝子を特異的に増幅するための15〜30塩基長のプライマー、
(b)SGK-1遺伝子を検出するための20〜1500塩基長のプローブ
からなる群より選ばれる少なくとも１以上を含む、被検物質の食欲抑制効果をスクリーニングするためのキット。
【請求項３】
SGK-1遺伝子を検出するための20〜1500塩基長のプローブが担体上に固定化されてなる、被検物質の食欲抑制効果をスクリーニングするためのプローブ固定化担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食欲抑制剤をスクリーニングする方法、ならびに食欲抑制剤をスクリーニングするためのキットおよびプローブ固定化担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
過食行動の抑制は、神経性過食症、無茶食い障害、肥満、および２型糖尿病の治療に重要である。食欲抑制作用を発揮する物質または薬物の標的分子として、視床下部で発現する多くの神経伝達物質、神経ペプチドおよびそれらの受容体がこれまで報告されている（非特許文献１および２)。
【０００３】
血清／グルココルチコイド誘導性キナーゼ１（SGK-1）は、Aktのそれと相同な触媒ドメインを有するセリンキナーゼであるが、Aktに存在するプレクストリン相同ドメインを欠如している。SGK-1は、末梢では、塩分取込み、腎臓の発達、タンパク尿、およびミネラルコルチコイド過剰の際の腎臓からのK(+)排出の促進、グルココルチコイドによって誘導されるインスリン分泌の阻害、ならびに末梢組織における血圧およびグルコース代謝の調節に寄与することが報告されている（非特許文献３〜６）。中枢神経系におけるSGK-1遺伝子の発現は、拘束ストレス、高浸透圧または低浸透圧ストレス、ＵＶ照射、熱ショックストレス、および脳における広範囲の虚血などの、様々なストレス因子によって誘導されることが知られている(非特許文献７〜１０)。しかし、環境刺激に対する視床下部でのSGK-1の遺伝子発現については報告がなく、また、視床下部におけるSGK-1遺伝子発現と食欲やエネルギー代謝との関連は知られていない。
【非特許文献１】Korner J et al., 2003, N Engl J Med 349:926-928
【非特許文献２】Friedman JM, 2004, Nat Med 10:563-569
【非特許文献３】Busjahn A et al., 2000, Hypertension 40:256-260
【非特許文献４】Sakoda H et al., 2003, J Biol Chem 278:25802-25807
【非特許文献５】Ullrich S et al., 2005, Diabetes 54:1090-1099
【非特許文献６】Vallon V et al., 2005, Am J Physiol 289:R395-R401
【非特許文献７】Leong ML et al., 2003, J Biol Chem 278:5871-5882
【非特許文献８】Nishida Y et al., 2004, Mol Brain Res 123:121-125
【非特許文献９】Koya E et al., 2005, Mol Brain Res 137:184-192
【非特許文献１０】Murata S et al., 2005, FEBS Lett. 579:2137-2142
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、被検物質の食欲抑制効果をスクリーニングするための手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、食欲抑制剤を投与すると視床下部細胞において有意にSGK-1遺伝子の発現量が変動することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
一実施形態において本発明は、
視床下部細胞に被検物質を接触させる工程、および
視床下部細胞における、SGK-1遺伝子の発現量を測定する工程、
を含む、食欲抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【０００７】
一実施形態において本発明は、上記遺伝子の発現量を測定する工程が、以下の(a)および(b)の工程：
(a)視床下部細胞試料から全RNAを抽出する工程、
(b)該全RNAにおけるSGK-1遺伝子のmRNAを測定する工程、
を含む、食欲抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【０００８】
一実施形態において本発明は、上記遺伝子の発現量を測定する工程が、以下の(a)および(b)の工程：
(a)視床下部細胞試料からポリペプチド試料を調製する工程、
(b)該ポリペプチド試料におけるSGK-1を測定する工程、
を含む、食欲抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【０００９】
一実施形態において本発明は、以下の(a)および(b)：
(a)SGK-1遺伝子を特異的に増幅するための15〜30塩基長のプライマー、
(b)SGK-1遺伝子を検出するための20〜1500塩基長のプローブ
からなる群より選ばれる少なくとも１以上を含む、食欲抑制剤をスクリーニングするためのキットに関する。
【００１０】
一実施形態において本発明は、SGK-1遺伝子を検出するための20〜1500塩基長のプローブが担体上に固定化されてなる、食欲抑制剤をスクリーニングするためのプローブ固定化担体に関する。
【００１１】
本発明により、食欲抑制剤または抗過食薬を探索するための有用な遺伝子が提供され、食欲抑制剤または抗過食薬の広範なスクリーニングが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明者らは、血清／グルココルチコイド誘導性キナーゼ１遺伝子（SGK-1遺伝子）が、食欲抑制剤、特にセロトニン系および／またはノルアドレナリン系の食欲抑制剤の存在下で発現量が有意に変動すること、これらの薬剤に応答した摂食の調節に関与していることを見出した。
【００１３】
従って、一実施形態において本発明は、
視床下部細胞に被検物質を接触させる工程、および
視床下部細胞における、SGK-1遺伝子の発現量を測定する工程、
を含む、食欲抑制剤のスクリーニング方法に関する。
【００１４】
スクリーニングの対象となる被検物質としては、特に制限されず、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、ならびに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。好ましくは、セロトニン系薬剤およびノルアドレナリン系薬剤を対象とする。セロトニン系薬剤は、生体においてセロトニン活性を高める薬剤をさし、セロトニン再取り込み阻害薬、セロトニン放出因子、セロトニン受容体刺激薬等が挙げられ、具体的には、フルボキサミン、フルオキセチン、ミルナシプラン、シブトラミン、フェンフルラミン、パロキセチン、mCPP等が挙げられる。ノルアドレナリン系薬剤は、生体においてノルアドレナリン活性を高める薬剤をさし、ノルアドレナリン再取り込み阻害薬、ノルアドレナリン放出因子、ノルアドレナリン受容体刺激薬、セロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害薬等が挙げられ、具体的には、ミルナシプラン、シブトラミン等が挙げられる。
【００１５】
食欲抑制剤とは、摂食中枢に働いて食欲を抑制する活性を有する物質をさす。
被検物質を接触させる視床下部細胞としては、特に制限されないが、好ましくは哺乳動物の視床下部細胞を用いる。また、視床下部は、摂食を介したストレスへの応答、自律神経系、および神経内分泌系にとって重要であることが知られている。視床下部は、脊椎動物の間脳の一部域で、自律神経系の中枢をさし、ヒトでは第三脳室の床と壁をなし、下面は漏斗を介して下垂体に連なる。哺乳動物としては、ヒトおよびサルなどの霊長類、マウス、モルモット、ラットおよびウサギなどの齧歯類、ならびにネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
視床下部細胞に被検物質を接触させるとは、in vitroで培養細胞に被検物質を接触させる場合だけでなく、in vivoで、動物に被検物質を投与し間接的に接触させる場合も包含する。
【００１７】
in vitroで培養細胞に被検物質を接触させる場合の細胞培養は、当技術分野で通常用いられる方法によって実施できる。例えば、1〜20体積％CO2、5〜45℃で1時間〜100日間、必要に応じて1〜7日毎に培地交換しながら培養する。好ましくは、5％CO2、37℃の条件で、2〜3日毎に培地交換しながら1〜36日間培養する。用いる培地としては、RPMI培地、MEM培地、BME培地、DME培地、αMEM培地、IMEM培地、ES培地、DM-160培地、Fisher培地、F12培地およびWE培地等、これらの培地に血清成分（仔ウシ血清、ウシ胎児血清等）等を添加したもの、ならびに市販の無血清培地等が用いられる。これらのうち、基礎培地に血清成分を加えたものが好ましい。さらに培地中には必要に応じて、他の成分として、アミノ酸類、ビタミン類（コリン、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、葉酸、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、イノシトール、ニコチンアミド、グルタミン、ビタミン等）、サイトカイン類（インターロイキン等）、成長促進剤（アルブミン、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾンおよびエタノールアミン等）、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシンおよびアクチノマイシン等）、安定化剤（例えば、酸化防止剤等）およびｐＨ調整剤（例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウム等）等を含有させることができる。上記のように培養した視床下部細胞の培養物に被検物質を添加しインキュベートすることにより、視床下部細胞と被検物質とを接触させることができる。
【００１８】
哺乳動物に被検物質を投与する場合、好ましくはヒトを除く哺乳動物に投与する。投与方法としては、特に制限されず、例えば、経口投与、ならびに口腔内、気道内、腹腔内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与を挙げることができるが、好ましくは腹腔内に投与する。投与後、断頭し、視床下部を摘出する。
【００１９】
本明細書においてSGK-1遺伝子とは、血清／グルココルチコイド誘導性キナーゼ１（SGK-1）をコードする遺伝子をさす。SGK-1遺伝子をコードする塩基配列は、例えばヒトおよびマウスについては、GenBankにおいてアクセッション番号NM_005627およびNM_011361としてそれぞれ公開されており、具体的には、配列番号１または２の塩基配列が挙げられる。従って、SGK-1遺伝子には、配列番号１または２の塩基配列からなる遺伝子、ならびにこれと機能的に同等の遺伝子が包含される。本明細書において遺伝子には、DNAおよびRNAが包含され、cDNA、ゲノムDNA、mRNA等が包含される。DNAには、一本鎖DNAおよび二本鎖DNAが包含される。ここで「機能的に同等」とは、対象となる遺伝子によってコードされるポリペプチドが、配列番号１または２の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるポリペプチドと同等の生物学的機能または生化学的機能を有することをさす。本発明において、ポリペプチドには、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が包含される。
【００２０】
配列番号１の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子としては、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、該遺伝子によってコードされるポリペプチドが、配列番号１の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるポリペプチドと同等の生物学的機能または生化学的機能、すなわち血清／グルココルチコイド誘導性キナーゼ1の活性を有するような遺伝子が挙げられる。
【００２１】
配列番号２の塩基配列からなる遺伝子と機能的に同等の遺伝子としては、配列番号２の塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、該遺伝子によってコードされるポリペプチドが、配列番号２の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるポリペプチドと同等の生物学的機能または生化学的機能、すなわち血清／グルココルチコイド誘導性キナーゼ1の活性を有するような遺伝子が挙げられる。
【００２２】
血清／グルココルチコイド誘導性キナーゼ1（SGK-1）は、Aktのそれと相同な触媒ドメインを有するセリンキナーゼであるが、Aktに存在するプレクストリン相同ドメインを欠如している。SGK-1は、塩分取込み、腎臓の発達、タンパク尿、およびミネラルコルチコイド過剰の際の腎臓からのK(+)排出の促進、グルココルチコイドによって誘導されるインスリン分泌の阻害、ならびに末梢組織における血圧およびグルコース代謝の調節に寄与することが報告されている。
【００２３】
ストリンジェントな条件とは、当技術分野で周知であり、特に限定されない。ストリンジェントな条件としては、例えばナトリウム濃度が、10〜300mM、好ましくは20〜100mMであり、温度が25〜70℃、好ましくは42〜65℃における条件が挙げられる。
【００２４】
すなわち、配列番号１の塩基配列の全長において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるDNA断片の変異、欠失、連結等により、部分的にその配列が変化したものであっても、これらの変異型遺伝子が配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、SGK-1と機能的に同等のポリペプチドをコードする遺伝子であれば、配列番号１に示した塩基配列との相違に関わらず、SGK-1遺伝子に含まれる。配列番号２の塩基配列についても同様である。またSGK-1遺伝子には、配列番号１または２の塩基配列と少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは少なくとも95%の同一性、さらに好ましくは少なくとも99%の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であって、SGK-1と機能的に同等のポリペプチドをコードする遺伝子も包含される。
【００２５】
また、機能的に同等の遺伝子は、通常、アミノ酸配列レベルにおいて高い相同性または同一性を有する。SGK-1のアミノ酸配列は、例えばヒトおよびマウスについては、GenBankにおいてアクセッション番号NM_005627およびNM_011361としてそれぞれ公開されており、具体的には、配列番号３または４のアミノ酸配列が挙げられる。高い相同性または同一性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも50％以上、好ましくは75％以上、さらに好ましくは85％以上、さらに好ましくは95％以上の相同性または同一性をさす。アミノ酸配列や塩基配列の相同性または同一性は、アルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993)）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。
【００２６】
視床下部細胞におけるSGK-1遺伝子の発現量を測定する方法としては、視床下部細胞におけるSGK-1遺伝子のmRNAを測定する方法、および視床下部細胞におけるSGK-1（すなわちSGK-1ポリペプチド）を測定する方法が挙げられる。
【００２７】
以下、視床下部細胞における、SGK-1遺伝子のmRNAを測定する方法について説明する。ここで、SGK-1遺伝子のmRNAの測定には、該mRNAから調製されたcRNA、cDNAまたはaRNAを測定することも包含される。
【００２８】
当該方法は、(a)視床下部細胞試料から全RNAを抽出する工程、および(b)該全RNAにおけるSGK-1遺伝子に対応するmRNAを測定する工程を含む。
【００２９】
視床下部細胞試料から全RNAを抽出する方法は、特に限定されず、例えば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159）等を採用することができる。なかでも、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。
【００３０】
抽出された全RNAは、必要に応じてさらにmRNAのみに精製して用いることが好ましい。精製方法は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在するmRNAの多くは、その3'末端にポリ(A)配列を持つため、この特徴を利用して、例えば、以下のように実施することができる。まず抽出した全RNAにビオチン化オリゴ（dT）プローブを加えてポリ(A)＋RNAを吸着させる。次に、ストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子担体を加え、ビオチン/ストレプトアビジン間の結合を利用して、ポリ(A)＋RNAを捕捉させる。洗浄操作の後、最後にオリゴ（dT）プローブからポリ(A)＋RNAを溶出する。また、オリゴ（dT）セルロースカラムを用いてポリ(A)＋RNAを吸着させ、これを溶出して精製する方法を採用してもよい。溶出されたポリ(A)＋RNAは、さらに、ショ糖密度勾配遠心法等により分画してもよい。
【００３１】
対照として用いられる視床下部細胞試料からの全RNAも、上記と同様に調製することができるが、市販のものを用いてもよい。
【００３２】
続いて、上記で得られた全RNAよりcRNA、cDNAまたはaRNAなどの被検ポリヌクレオチドを調製し、これを放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの適当な標識でラベルしてそのシグナル強度を検出することにより、mRNAを測定することができる。放射性同位体としては、32P、125I、35Sなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、CyDye、フルオレセン（FITC）、スルホローダミン（SR）、テトラメチルローダミン（TRITC）などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。本明細書において、ポリヌクレオチドにはオリゴヌクレオチドも包含される。
【００３３】
シグナル強度の検出は、標識を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法の使用できる。例えば、標識として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ-カウンターなどにより計測することができる。また標識として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダー、蛍光スキャナーなどを用いて検出することができる。
【００３４】
具体的には、上記被検ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブが固定された担体に前記被検ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより測定できる（Brown, P. O. et al., Nature Genet. 21, suppliment, 33-37 (1999)）。例えば、抽出した全RNAから逆転写酵素反応でcDNAを作製し、該cDNAからT7酵素反応でaRNAを作製する際にアミノアリル-UTP等を加え、蛍光標識（例えば、Cy3、Cy5等）で間接標識し、固定化されたプローブとハイブリダイゼーションを行い、標識に由来する蛍光シグナルを検出、解析する。被検ポリヌクレオチドを調製するための出発材料としては、精製していないmRNAを用いてもよいが、前述の方法で精製したポリ(A)＋RNAを用いることがより好ましい。
【００３５】
プローブが固定化されてなる担体としては、例えば、DNAチップを用いることができる。DNAチップは、データベース上のEST配列、または全RNA配列を基に合成したDNAを固定化したものが好ましい。該DNAチップは、市販のもの（AceGene（Hitachi Software Engineering Co.,Ltd）、Mouse Oligo Microarray（Agilent Technologies, Tokyo, Japan）など）を用いてもよいし、公知の方法（Lipshutz, R. J. etal., Nature Genet. 21, suppliment, 20-24 (1999)）に基づき作製してもよい。固定化するプローブとしては、ヒトのESTデータベース等の配列情報をもとに作製されたプライマーで逆転写酵素反応やPCRを実施することによりクローン化されたものを用いることができる。
【００３６】
また、プライマーを用いて被検ポリヌクレオチドを鋳型とした増幅反応を行い、その特異的増幅反応を検出することにより、細胞試料におけるSGK-1遺伝子のmRNAを測定することもできる。
【００３７】
増幅手法としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法の原理を利用した公知の方法、例えば、PCR法、RT-PCR法、リアルタイムPCR、リアルタイム定量RT-PCR法等が挙げられる。その他の増幅手法としては、LAMP法、ICAN法、RCA法、LCR法、SDA法などを挙げることができる。増幅は、増幅産物が検出可能なレベルになるまで行う。
【００３８】
上記増幅反応後に特異的な増幅反応が起こったか否かを検出するには、増幅反応により得られる増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、アガロースゲル電気泳動法等を利用して、特定のサイズの増幅断片が増幅されているか否かを確認することにより、特異的な増幅反応を検出することができる。
【００３９】
あるいは、増幅反応の過程で取り込まれるdNTPやdUTPに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識を作用させ、この標識を検出する。これら標識の種類や標識の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。標識された増幅産物を観察する方法としては、上記と同様に標識を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法も使用できる。以上のようにして特異的な増幅反応の増減により、細胞試料においてSGK-1遺伝子のmRNAを測定できる。
【００４０】
その他の対象遺伝子のmRNAの測定方法としては、例えば、サブトラクション法（Sive, H. L. and John, T. St., Nucleic Acids Research 16, 10937 (1988)、Wang, Z., and Brown, D. D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 11505-11509 (1991)）、ディファレンシャル・ディスプレイ法（Liang, P., and Pardee, A. B., Science 257, 967-971 (1992)、Liang, P., Averboukh, L.,Keyomarsi, K., Sager, R., and Pardee, A. B., Cancer Research 52, 6966-6968 (1992)）、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法（John, T. St., and Davis, R. W. Cell, 16, 443-452 (1979)）、また、適当なプローブを用いたクロスハイブリダイゼーション法（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982)）等を挙げることができる。
【００４１】
上記方法において、視床下部細胞試料は、細胞を含む試料であれば特に制限されないが、例えば、培養された視床下部細胞から調製した試料、ならびに動物から単離された視床下部細胞を含む血液、体液、組織または排泄物等から調製した試料等を使用できる。好ましくは培養された視床下部細胞、または動物から単離された視床下部組織から調製した試料を用いる。培養された視床下部細胞から調製した試料としては、例えば、培養上清および細胞の破砕物が挙げられる。視床下部組織から調製した試料としては、例えば、組織破砕物が挙げられる。
【００４２】
上記のような方法により、SGK-1遺伝子の発現量を測定することにより、食欲抑制剤をスクリーニングすることができる。被検物質を接触させた視床下部細胞に由来する試料において測定されたSGK-1遺伝子の発現量を対照と比較し、その発現量が有意に上昇している場合、当該被検物質は、食欲抑制剤であると判定される。対照とは、被検物質を接触させていない同種の視床下部細胞に由来する試料をさす。好ましくは、対照と比較してその発現量が、対数値の比で1.6倍以上、好ましくは1.8倍以上、より好ましくは2.0倍以上上昇している場合に、当該被検物質を食欲抑制剤と判定する。
【００４３】
本発明はまた、食欲抑制剤をスクリーニングするためのキットに関する。本発明のキットは、以下の(a)および(b)：
(a)SGK-1遺伝子を特異的に増幅するための15〜30塩基長のプライマー、
(b)SGK-1遺伝子を検出するための20〜1500塩基長のプローブ
からなる群より選ばれる少なくとも１以上を含む。
【００４４】
前記(a)記載のプライマーは、SGK-1遺伝子の塩基配列、例えば、配列番号１または２の塩基配列に基づき、市販のプライマー設計ソフトを用いる等、常法により容易に設計し、増幅することができる。利用可能なソフトとしては、例えばOligoTM(National Bioscience Inc.)、GENETYX(ソフトウェア開発（株））などが挙げられる。プライマーとして実質的な機能を有する長さは、通常15〜30塩基であり、さらに好ましくは18〜20塩基である。例えば、マウスSGK-1を特異的に増幅するためのプライマーとしては、フォワードプライマーとして5'- ACC CTT ACC TAC TCC AGA ATG -3'（配列番号５）およびリバースプライマーとして5'- GCT GGC AAT CTT CTG AAT A -3'（配列番号６）が挙げられる。上記プライマーの塩基配列における、15塩基以上、好ましくは18塩基以上の連続した塩基配列からなるプライマーもまた、マウスSGK-1を特異的に増幅するためのプライマーとして好適である。
【００４５】
前記(b)記載のプローブは、SGK-1遺伝子のmRNAから調製されるcDNA、cRNAまたはaRNA等の被検ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、好ましくは20〜1500塩基長、より好ましくは30〜1000塩基長程度である。具体的には、ノーザンハイブリダイゼーション法であれば、20〜50塩基長程度の１本鎖オリゴヌクレオチドか2本鎖DNAが好適に用いられる。また、DNAチップであれば、100〜1500塩基長程度の2本鎖DNA、または20〜100塩基長程度の1本鎖オリゴヌクレオチドが好適に用いられる。本明細書においてポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドには、DNAおよびRNAが包含される。SGK-1遺伝子を検出するためのプローブの具体例としては、AceGene（Hitachi Software Engineering Co., Ltd）やMouse Oligo Microarray（Agilent Technologies, Tokyo, Japan）においてSGK-1遺伝子に対して用いられるプローブが挙げられる。
【００４６】
これらのプライマーやプローブは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、またビオチン、リン酸、アミン等により修飾されていてもよい。また、プライマーやプローブの設計の際には、融解温度（Tm）やGC含量などを考慮することが好ましい。
【００４７】
本発明のキットは上記した構成要素に加えて、その他の要素を付加的に組み合わせることができる。例えば、対照に用いる被験物質、ならびにハイブリダイゼーション、プローブやプライマーの標識およびラベル体の検出等、SGK-1遺伝子の発現量の測定工程において必要な試薬を組み合せることができる。対照に用いる被験物質としては、食欲抑制効果を有しないことが知られている物質（陽性対照）、または食欲抑制効果を有することが確認されている物質（陰性対照）を用いることができる。
【００４８】
本発明のキットには更に細胞の培養のための培地、および培養容器をパッケージすることもできる。培養容器は、ハイスループットスクリーニングに適用できる形状とするのが有利である。更に本発明のキットには、アッセイ方法を説明するためのインストラクションマニュアルを組み合せることもできる。
【００４９】
本発明はまた、SGK-1遺伝子を検出するための20〜1500塩基長のプローブが担体上に固定化されてなる、食欲抑制剤をスクリーニングするためのプローブ固定化担体に関する。プローブ固定化担体は、前記(b)記載のプローブを、ガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、プラスチック基板等の担体に固定することにより作製される。このような固定化担体とその作製方法については、既に説明したが、例えば、DNAチップやマイクロアレイを挙げることができ、その具体例としては、AceGene（Hitachi Software Engineering Co.,Ltd）やMouse Oligo Microarray（Agilent Technologies, Tokyo, Japan）が挙げられる。
【００５０】
以下に実施例を示すことにより本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
薬物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの食欲抑制効果の有無および程度を本発明により検査した。動物および薬剤処理は次のとおりとした：
4週齢のオスC57BL/6Jマウスを自由に水および餌を取れる状態で、光（12時間オン/12時間オフ）および温度（20〜22℃）制御環境において、個別にケージで飼育した。動物を実験前に1週間、研究室環境に馴化した。
【００５２】
（実施例１）
5週齢のC57BL/6Jマウスに生理食塩水、薬物Ａ（30 mg/kg）、薬物Ｂ（3 mg/kg）、薬物Ｃ（3 mg/kg）、または薬物Ｄ（30 mg/kg）（各群６匹ずつ）を腹腔内注射し、注射後は、絶食として１時間後に断頭して視床下部を摘出し、視床下部の遺伝子発現を同定した。
【００５３】
（方法）リアルタイム定量RT-PCR
マウス視床下部組織からRNeasy Midi kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて製造メーカーの使用法に従って全RNAを単離し、Super Script III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit（Invitrogen, Rockville, MD）を用いて1μgの全RNAを用いて cDNA合成を行った。全RNAから合成されたcDNAを、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）定量システム（Light Cycler Quick System 350S; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）で評価した。不変対照としてβ-アクチンmRNAを用いて、mRNAの相対量を計算した。データは、生理食塩水を受けた対照群の平均値の倍数変化として示される。
【００５４】
本発明のキットから、マウスSGK-1のフォワードプライマー：5'- ACC CTT ACC TAC TCC AGA ATG -3'（配列番号５）、リバースプライマー：5'- GCT GGC AAT CTT CTG AAT A -3'（配列番号６）を使用し、マウスβ-アクチンのフォワードプライマー：5'- TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG -3'（配列番号７）、リバースプライマー：5'- GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG -3'（配列番号８）を使用した。
【００５５】
（結果）視床下部SGK-1 mRNAレベルの変動
リアルタイム定量RT-PCRを用いて視床下部の遺伝子発現の変動を調べた。生理食塩水対照と比較して視床下部の血清／グルココルチコイド誘導性キナーゼ（SGK-1）mRNAレベルは、薬物Ａ、薬物Ｂ、薬物Ｃ、薬物Ｄについて、生理食塩水対照と比較してそれぞれ対数値の比で、約2.4倍、約2.3倍、約2.5倍、約1.4倍の増加を呈した（図１）。
【００５６】
以上の方法により、薬物Ａ、Ｂ，Ｃが食欲抑制効果を発揮し、薬物Ｄはそれ自体では食欲抑制効果を発揮しないことが確認された。更に薬物Ａは、視床下部から摂食抑制効果のシグナルを選択的に出すことが判明した。
【００５７】
（実施例２）
上記の確認のために23時間絶食後に同上の薬物を同上の量で（各群６匹ずつ）同様に腹腔内注射し、30分後に餌を与えて、1時間摂食量を測定した。
【００５８】
1時間の摂食量は生理食塩水対照と比較して、薬物Ａ、薬物Ｂ、薬物Ｃ投与群では、それぞれ、有意な摂食量の抑制を示したが、薬物Ｄ投与群では、有意な摂食抑制効果は認められなかった（図２）。以上の結果より、SGK-1mRNAレベルが2倍以上上昇した場合に摂食抑制効果が発揮されることが示された。
【００５９】
実施例１および２で用いた薬物Ａ〜Ｄは、次のとおりである：
薬物Ａ：mCPP、薬物Ｂ：フェンフルラミン（FEN）、薬物Ｃ：ミルナシプラン（MIL）、薬物Ｄ：フルボキサミン（FLUV）。
【００６０】
実施例２において、薬物Ａ（mCPP）、薬物Ｂ（フェンフルラミン）、薬物Ｃ（ミルナシプラン）が食欲抑制効果を有すること、薬物Ｄ（フルボキサミン）が食欲抑制効果を有しないことが確認されたことから、本発明により、食欲抑制剤をスクリーニングできることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】薬物Ａ〜Ｄの投与による視床下部SGK-1 mRNAレベルの変動を示す。
【図２】薬物Ａ〜Ｄのマウスにおける摂食量に対する影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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