(57)【要約】【課題】作業手順が少なく、消耗品及び汚染廃物が少ない遺伝子増幅法、検体数が少ない検査にも有用な遺伝子増幅法、コンタミネーションの危険性が極めて少ない遺伝子増幅法、及び、既存の器具及び機器を用いることによる、安価且つ簡便な遺伝子増幅法を提供する。【解決手段】  ピペットチップを反応容器として用意する工程と、前記ピペットチップ中に、標的核酸を含む試料及び増幅反応液の混合液の層と、前記混合液の層の上面を覆うオイルの層とを調製する工程と、前記ピペットチップ中で前記標的核酸の増幅を行う工程とを含む、核酸増幅法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピペットチップを反応容器として用意する工程と、
前記ピペットチップ中に、標的核酸を含む試料及び増幅反応液の混合液の層と、前記混合液の層の上面を覆うオイルの層とを調製する工程と、
前記ピペットチップ中で前記標的核酸の増幅を行う工程とを含む、核酸増幅法。
【請求項２】
前記ピペットチップ中に前記混合液の層と前記オイルの層とを調製する工程は、
前記ピペットチップとは別の容器内に、前記増幅反応液の層と、前記増幅反応液の層の上面を覆う前記オイルの層とを用意する工程と、
前記オイルの層から、前記ピペットチップ内に前記オイルを吸い上げる工程と、
前記増幅反応液の層から、前記ピペットチップ内に前記増幅反応液を吸い上げる工程と、
前記ピペットチップ内に前記試料を吸い上げる工程とを含む、請求項１に記載の核酸増幅法。
【請求項３】
前記ピペットチップ中に前記混合液の層と前記オイルの層とを調製する工程は、
前記ピペットチップとは別の容器内に、前記増幅反応液を前記オイルと混合分散した分散液を用意する工程と、
前記ピペットチップ内に前記分散液を吸い上げる工程と、
前記ピペットチップ内に試料を吸い上げる工程と、
前記ピペットチップ内に吸い上げられた前記分散液から分離する前記オイルの層を得る工程とを含む、請求項１に記載の核酸増幅法。
【請求項４】
前記混合液の層の下面を覆うオイルの層を調製する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸増幅法。
【請求項５】
オイルの層で上面を覆われた核酸増幅反応液が収容されたピペットチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ/ＲＮＡからの遺伝子増幅、感染症検査、遺伝子組み換え植物の検出、特定微生物の存在有無確認、及び遺伝子多型解析などに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子増幅法として、ＰＣＲ、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ法）、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などが知られている。もっとも一般的に知られているＰＣＲ法は、温度の上げ下げを頻繁に繰り返すことで、ＤＮＡを増幅する方法である。ＰＣＲ法には専用装置が必要であり、通常増幅には１．５〜２．５時間程度かかる。この増幅の時間を短くするための方法として、キャピラリーを用いたＰＣＲ法などが知られている。
【０００３】
増幅されたＤＮＡは、通常、アガロースゲル電気泳動で確認する。増幅されたＤＮＡをリアルタイムで確認するために、増幅操作をしながら蛍光物質を検出するリアルタイムＰＣＲ装置が開発されている。
【０００４】
ＰＣＲ技術は、研究分野以外でも広く行われるようになってきた。例えば、感染症検査の分野では、ＰＣＲにより、感染症の原因菌が存在するかどうかを判別することができる。JP Forum, Vol. 12, No. 1, p.21-22 (2003)には、ＰＣＲを用い、医薬品の製造工程管理試験や出荷判定試験において検出される微生物を、遺伝学的に種又は属レベルで同定又は推定する手法が示されている。また、遺伝子組み換え食品に関する分野や、食品のトレーサビリティの分野でも、ＰＣＲを使った判定が広く行われるようになってきた。さらに、近年では、微生物を使った環境浄化も行われるようになり、ここでも有用菌の存在の有無をＰＣＲによって判定することが有用である。
【０００５】
ＰＣＲには、１．５〜２．５時間程度かかることが多く、この反応時間を短くするために、キャピラリーや特殊なプレートを利用したＰＣＲ装置が開発されている。しかしながら、このような装置は高価である。一般的に実験室で使用されるＰＣＲ装置の反応容器は、０．５ｍｌ用チューブから０．２ｍｌ用チューブへと、容量及び外形が小さくなってきている。現在では、さらに細かい３８４ウェルプレートが使用されることもあり、ＰＣＲ反応容器の容量及び外形がさらに小さくなってきている。
【０００６】
例えば、特開２００４−１５４００８号公報においては、マイクロチップ上において等温条件下で核酸増幅反応を行い、得られた増幅産物を引き続きマイクロチップ上で解析を行う方法が記載されている。この方法においては、電気泳動解析、又は核酸増幅産物に過剰のインターカレーターを添加し、生じる色の変化によって標的核酸の有無を目視検出する可視的解析が行われる。
【０００７】
一方、特開平８−１９６９２３号公報においては、ピストンと、このピストンがボア内を往復動するシリンダと、このシリンダの先端に設けられてチップの嵌め合わされるノズルとを有するピペットと、このピペットでチップ内に吸引された反応試料を加熱冷却する温度サイクル装置とで構成された液体分注反応装置が開示されており、この液体分注反応装置によって核酸増幅を行う方法が記載されている。
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−１５４００８号公報
【特許文献２】特開平８−１９６９２３号公報
【非特許文献１】日本公定書協会編、ジャパニーズ・ファーマコピーアル・フォーラム（Japanese Pharmacopoeial Forum）、２００３年、第１２巻、第１号、ｐ．２１−２２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来、ＰＣＲ法などの遺伝子増幅を行う際には、ＤＮＡの抽出・精製という前処理が必要であり、この前処理に時間と手間とがかかっていた。血液などから直接ＰＣＲ反応を行う手法も知られているが、ＰＣＲ反応までの手順を考えると、依然として試薬の混合や分注操作などの手数がかかっている。
【００１０】
特開２００４−１５４００８号公報などに開示されている反応容器の小型化は、研究を効率的に進めるためや、大量のサンプルを処理するために、時間と試薬量とを節約することが目的である。一方、検査対象の検体数が少ない場合、反応容器をチューブで行うことが好ましい。しかしながら、この場合は、反応用チューブが小さすぎて、サンプル名の判別が困難となる場合がある。判別がしやすいように、より大きなチューブを用いるとすれば、液量が多く必要となり、反応時間もかかってしまう。
【００１１】
また、JP Forum, Vol. 12, No. 1, p.21-22 (2003)などに開示されているように、遺伝子検査などでＰＣＲが行われるようになっているが、そのためにはできるだけ簡便な操作が求められている。しかしながら、以下に示す理由で、ＰＣＲは、その操作を行う環境や、その操作を行う人の経験などによっては、まだ難しい技術であるといえる。
【００１２】
例えば、サンプルごとに、チップと反応チューブが必要である。さらに、ＰＣＲ後の確認にも、別のチップを使用し、反応液とローディングダイとを混ぜて、アガロースゲルへアプライする操作が必要である。このため、消耗品のコストがかかり、操作が複雑であり、環境の整った実験室以外で作業を行うには、手間が多すぎるといえる。  
【００１３】
また例えば、チューブで反応をかける場合には、DNaseのコンタミネーションなどを防ぐため、例えばふたの裏面をさわらない、などの細心の注意が必要である。  
【００１４】
一方、特開平８−１９６９２３号公報に開示された液体分注反応装置によって核酸増幅を行う方法では、シリンジをつけた状態で増幅反応が行われる。すなわち、既存の機器を用いることができず、特定の液体分注反応装置を用意しなければならない。
【００１５】
そこで、本発明の目的は、作業手順が少なく、消耗品及び汚染廃物が少ない遺伝子増幅法を提供することにある。特に本発明の目的は、検体数が少ない検査にも有用な遺伝子増幅法、コンタミネーションの危険性が極めて少ない遺伝子増幅法、及び、既存の器具及び機器を用いることによる、安価且つ簡便な遺伝子増幅法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）ピペットチップを反応容器として用意する工程と、
前記ピペットチップ中に、標的核酸を含む試料及び増幅反応液の混合液の層と、前記混合液の層の上面を覆うオイルの層とを調製する工程と、
前記ピペットチップ中で前記標的核酸の増幅を行う工程とを含む、核酸増幅法。
【００１７】
前記（２）〜（４）は、ピペットチップ中に混合液の層とオイルの層とを調製するための操作について記載する。
（２）前記ピペットチップ中に前記混合液の層と前記オイルの層とを調製する工程は、
前記ピペットチップとは別の容器内に、前記増幅反応液の層と、前記増幅反応液の層の上面を覆う前記オイルの層とを用意する工程と、
前記オイルの層から、前記ピペットチップ内に前記オイルを吸い上げる工程と、
前記増幅反応液の層から、前記ピペットチップ内に前記増幅反応液を吸い上げる工程と、
前記ピペットチップ内に前記試料を吸い上げる工程とを含む、（１）に記載の核酸増幅法。
【００１８】
（３）前記ピペットチップ中に前記混合液の層と前記オイルの層とを調製する工程は、
前記ピペットチップとは別の容器内に、前記増幅反応液を前記オイルと混合分散した分散液を用意する工程と、
前記ピペットチップ内に前記分散液を吸い上げる工程と、
前記ピペットチップ内に試料を吸い上げる工程と、
前記ピペットチップ内に吸い上げられた前記分散液から分離する前記オイルの層を得る工程とを含む、（１）に記載の核酸増幅法。
【００１９】
（４）前記混合液の層の下面を覆うオイルの層を調製する工程をさらに含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の核酸増幅法。
【００２０】
なお、（２）〜（４）において、ピペットチップ内に吸い上げるとは、ピペットのボタン操作によってピペットチップ内に吸い上げることと、ボタン操作によらず毛細管現象によってピペットチップ内に引き込むことの両方を含む。
【００２１】
前記ピペットチップは使い捨てのものである、（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸増幅法。
【００２２】
下記は、試料について記載する。
前記標的核酸がＤＮＡ又はＲＮＡである、（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸増幅法。
前記試料は、前記標的核酸の抽出操作を受けていない、（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸増幅法。
前記標的核酸は、薬物応答性に対する遺伝子、遺伝病に関連する遺伝子、病気の易罹患性に関連する遺伝子、細菌又はウイルスの遺伝子、遺伝子組み換え植物のマーカー遺伝子、品種を判別するマーカー遺伝子、プラスミド又はファージベクターにクローン化された遺伝子から選ばれる遺伝子を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸増幅法。
【００２３】
下記は、増幅反応液について記載する。
前記増幅反応液は、プライマーを１組以上含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸増幅法。
前記増幅反応液は、前記標的核酸の増幅を確認するための試薬を含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸増幅法。
前記増幅を確認するための試薬が電気泳動用の試薬である、上記の核酸増幅法。
前記増幅を確認するための試薬が蛍光物質である、上記の核酸増幅法。  
【００２４】
前記増幅をＰＣＲ法、ＬＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、又はＩＣＡＮ法によって行う、上記の核酸増幅法。
【００２５】
下記（５）は、核酸増幅のための反応容器として有用なピペットチップについて記載する。
（５）オイルの層で上面を覆われた核酸増幅反応液が収容されたピペットチップ。
【発明の効果】
【００２６】
本発明では、ピペットチップを反応容器に用いることによって、作業手順が非常に少なく、消耗品及び汚染廃棄物が少ない遺伝子増幅が可能になる。また、本発明では、ピペットチップを反応容器に用いることによって、検体数が少ない場合であっても、１つの反応容器内に極小スケールの反応系を構築することができるため、増幅反応の反応時間を短くすることができる。しかも、本発明においては、個々の反応容器の識別及び取り扱いが簡単である。従って、本発明によって、検体数が少ない検査にも有用な遺伝子増幅が可能になる。また、本発明によって、コンタミネーションの危険性が極めて少ない遺伝子増幅が可能になる。さらに、本発明によって、既存の器具及び機器を用いることによる、安価且つ簡便な遺伝子増幅が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、ピペットチップを反応容器とし、ピペットチップ中において、核酸増幅のための反応混合液の表面をオイルで覆った状態で核酸増幅反応を行う方法である。すなわち、本発明は、ピペットチップを用意する工程；ピペットチップ中に、核酸増幅のための反応混合液の層とその上面にオイルの層とを調製する工程；及び、ピペットチップ中で核酸増幅反応を行う工程を含む。
【００２８】
本明細書においては、核酸増幅のための反応混合液とは、増幅すべき標的核酸を含む試料と増幅反応液との混合液をいい、増幅反応混合液と記載することがある。また、増幅反応液とは、増幅反応試薬又は増幅反応試薬を含む溶液をいう。
【００２９】
本発明を行うために必要なものは、標的核酸を含む試料、増幅反応試薬、ピペットチップ（本明細書では、単にチップと記載することがある）、オイル、及びＰＣＲ装置を準備する。目的を絞った検査の場合、増幅に用いる試薬セットは１種類であることが多い。特にこの場合、増幅を行うためのプライマーが決まっており、プライマーが含まれる増幅反応液は、各検体について共通のものを準備することができる。
【００３０】
ピペットチップは、好ましくは使い捨てのものを、１検体につき１個用意する。ピペットチップは、その材質などを問わず、市販のものを特に限定することなく用いることができる。ピペットチップの容量は、例えば１０〜２５０μｌとすることができる。ピペットチップの長さとしては、例えば１２〜３５ｍｍ程度とすることができる。ピペットとしても、その性能や精度などを問わず、市販のものを特に限定することなく用いることができる。
【００３１】
標的核酸としては、ＤＮＡ及びＲＮＡを問わない。本発明では、最終的に検出したい遺伝子の種類などに応じて、あらゆる種類の核酸を増幅すべき標的核酸とすることができる。例えば、薬物応答性に対する遺伝子、遺伝病に関連する遺伝子、病気の易罹患性に関連する遺伝子、細菌又はウイルスの遺伝子、遺伝子組み換え植物のマーカー遺伝子、品種を判別するマーカー遺伝子、プラスミド又はファージベクターにクローン化された遺伝子などから選ばれる遺伝子を含む核酸が挙げられる。
【００３２】
核酸を含む試料は、当業者によって適宜調製される。従って、試料はどのような形態で用意してもかまわない。例えば、採取検体をバッファなどの適当な液体に含ませる場合や、採取検体そのものが液状である場合などは、液体状のものとして用意することができる。一方、採取検体からコロニーを形成した場合や、採取検体そのものが固体である場合などは、固形状のものとして用意することができる。また、試料は、標的核酸の抽出操作を行っていない状態のものであっても良い。
【００３３】
これら試料は、その形態に応じて、チューブなどの適当な容器内や、コロニープレートなどの適当なプレート上などに用意しておくことができる。また、液体状の試料（以下、単に試料液と記載する場合がある）を用意し、その試料液を核酸増幅以外に用いる可能性がある場合などは、増幅に使用する適量分の試料液を別の場所に移しておくと良い。例えば、増幅に使用する適量分の試料液を、ピペットチップとは別の適当な容器の中、パラフィルムの上、又は、増幅反応液などが用意されたチューブの蓋の中などに滴下しておくことができる。
【００３４】
一方、増幅反応液の組成としては、増幅反応の種類に応じて、当業者が適宜決定することができる。本発明では、増幅反応液に１組以上のプライマーを含ませることができる。２組以上のプライマーを含ませる場合は、マルチプレックス増幅用に設計されたプライマーが用意される。また、増幅反応液には、標的核酸の増幅を確認するための試薬を含ませても良い。このような試薬に関しては、後述する。さらに、増幅反応液には、核酸増幅を促進する作用などがある添加物を含ませても良い。このような添加物としては例えば、島津製作所製Ａｍｐｄｉｒｅｃｔなどが挙げられる。
【００３５】
なお、本発明において増幅反応液と記載する場合、調製の途中段階で必ずしも必要な増幅反応試薬の全てを含んでいる必要はなく、増幅反応を行う直前の段階において、必要な増幅反応試薬の全てを含んでいれば良い。例えば、プライマーや核酸ポリメラーゼと、バッファ、塩、ｄＮＴＰなどの、全ての増幅反応系に共通する試薬とは、増幅反応の直前で混合されれば良く、それらを別々の容器内に用意し、別々の段階でチップ内に収容しても構わない。もちろん、必要な全ての増幅試薬を含む増幅反応液を一つの容器中に用意しても良い。
【００３６】
増幅反応を行う直前の、増幅に必要な全ての試薬がピペットチップ内に収容されたとき、増幅反応液の最終ｐＨとしては、例えば、２５℃において８．５〜９．５とすることができる。
【００３７】
オイルとしては、増幅反応混合液より比重の低い不揮発性液体を特に制限無く用いることができる。本明細書において不揮発性とは、核酸増幅反応の条件下において揮発しない性質をいう。このような液体としては、ミネラルオイル(鉱物油）、植物油、動物油、シリコーンオイル、ジフェニルエーテルなどが挙げられる。ミネラルオイルは、ペトロラタムから蒸留により得られる液体の炭化水素化合物であり、流動パラフィン、流動ペトロラタム、ホワイト油などとも呼ばれ、低比重の軽油も含む。動物油としては、タラの肝油、オヒョウ油、ニシン油、オレンジラフィー油またはサメの肝油などが挙げられる。また、植物油としてはカノーラ油、扁桃油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ピーナツ油、ベニバナ油、ゴマ油、ダイズ油などが挙げられる。
【００３８】
本発明では、ピペットチップを反応容器として用いるため、試料、増幅反応液、及びオイルが収容された反応容器を用意する際には、チップをピペットに装着し、試料、増幅反応液、及びオイルをチップ内に吸い上げるという操作を行うことが簡便で好ましい。ピペットの容量設定値は、５〜５０μｌ、例えば１５μｌ程度とすることができる。なお、本発明における吸い上げ操作は、吸い上げたい液量によって、ピペットのボタンを上に上げる操作によって行ってもよいし、ボタン操作によらず毛細管現象を利用してチップ内に液体を引き込むことによって行っても良い。
【００３９】
ピペットチップ中に、核酸増幅のための反応混合液の層とその上面にオイルの層とを調製する工程においては、ピペットチップ中に増幅反応混合液の層とその上面にオイルの層とが収容された状態のものが用意されれば、どのような手順を行っても良い。本発明においては、場合により、増幅反応混合液の層の下面にもオイルの層を設けてもよい。オイルの層を設けることにより、作業中や増幅反応中において生じうる、混合液のコンタミネーションや、混合液からの水分蒸発を防止することができる。
【００４０】
ピペットチップ内で増幅反応混合液層の上面がオイル層で覆われるようにするためには、例えば、最初にオイルを吸い上げ、次に、上述のように増幅反応液と試料とを吸い上げる操作を行うことができる。増幅反応混合液層の下面もオイル層で覆う場合は、内径の小さいピペットチップの先端部の内壁にオイルが付着した状態でとどまる現象を利用することができる。このため、上層のオイルと同じ成分のオイルで下層を形成させることができる。
【００４１】
オイルと増幅反応液とは、ピペットチップとは別の一つの容器中に共存させて用意しても良い。この場合、両者が層をなした状態で用意してもよいし、両者が混合分散された状態で用意しても良い。このような方法は、増幅反応液が核酸増幅を行う検体に共通して使用される場合や、検体数が少数である場合などにおいて有効である。
【００４２】
試料を液体状の試料として用意した場合は、例えば、適当な場所に用意された試料液と、適当な容器内に用意された増幅反応液とを、一本のピペットチップの中に吸い上げると、増幅反応混合液を調製することができる。試料液と増幅反応液とが、最終的にチップ内で互いに混ざり合って増幅反応混合液となればよいため、それぞれの液を吸い上げる順序は問わない。例えば、同一増幅反応液にて多検体について増幅を行う場合など、容器内の増幅反応液への他の試料の混入を防ぐため、増幅反応液を先に吸い上げることが好ましい。
【００４３】
オイルと増幅反応液とを、ピペットチップとは別の容器中に層をなした状態で用意する場合、そのような容器としては、チューブなどを用いると良い。そして、具体的には、以下のような操作を行うことができる。最初にチューブＡ(1)内のオイル(3)の層にチップ(2)を差し込んでオイルを吸い上げ（図１−<1>）、続いてチップを増幅反応液(4)の層に差し込んで（図１−<2>）、増幅反応液を吸い上げ（図１−<3>）、さらに別のチューブＢ(5)に試料液(6)を用意し（図１−<4>）、試料液中にチップを差し込んで試料を吸い上げる（図１−<5>）と、増幅反応混合液(7)の上面をオイル(3)の層で覆うことができる（図１−<6>）。なお、図１−<5>においては、便宜上、増幅反応液と試料液とが重層しているように描いているが、これらの液は、自然にチップ内で均一に混ざり合い、増幅反応混合液となる。なお、図１においては、ピペット本体を省略して描画している。
さらに、増幅反応液と試料とをチップ内に収容した後、最後にもう一度オイルを吸い上げて下層のオイル層を形成しても良い。
【００４４】
また、オイルと増幅反応液とを、ピペットチップとは別の容器中に混合分散された状態で用意する場合、具体的には、以下の操作を行うことができる。チューブなどの容器内に増幅反応液とオイルとを入れ、振り混ぜるなどすることにより、両者を混合分散する。このようにして用意した分散液を一時に吸い上げるというシンプルな操作によって、増幅反応液とオイルとの両方をピペット内に収容することができる。その後、試料をピペットチップ内に吸い上げる。ピペットチップ内に収容された分散液からは、自然に、又は、分散液吸い上げ後又は試料吸い上げ後に静置などの操作を行うことにより、図１のＩや、図１の<6>のようにオイルの層が分離する。
【００４５】
試料を固体状のものとして用意した場合も、上記に準じた操作を行うことができる。この場合、固体状試料の表面にチップの先端を接触させて吸い上げることによって試料を採取することができる。そして、採取した固体状試料の一部がチップ内に入りきらずチップの先端に付着している場合があるため、付着した試料が効率よくチップ内に収容されるように、さらに液体を吸い上げる操作を行うことができる。具体的には、例えば、オイル(3)と増幅反応液(4)とを収容したチューブＡ(2)を用意し、チップ(1)の中へオイルを吸い上げ（図２−<1>）、続いて増幅反応液を吸い上げ（図１−<2>及び<3>）、その後、コロニープレート(8)上のコロニー(9)の表面にチップの先端を接触させて吸い上げる（図２−<4>）、さらにチューブＡ(2)内のオイルを吸い上げる（図２−<5>）操作を行うことができる。なお、図２においては、ピペット本体を省略して描画している。
【００４６】
吸い上げる液量としては、ピペットチップの容量を考慮し、当業者が適宜決定することができる、増幅反応液の吸い上げ量としては、例えば、３〜１０μｌ程度とすることができる。試料液の吸い上げ量としては、例えば、０．５〜１μｌ程度とすることができる。さらに、オイルの吸い上げ量としては、例えば、０．５〜２μｌ程度とすることができる。吸い上げる操作は、チップの先を液面にわずかにつけることによって行うとよい。
【００４７】
試料、増幅反応液及びオイルから選ばれる必要な全てをピペットチップ内に収容した後は、ピペットのボタンを上に上げ、チップの先に空気層を作っても良い。試料、増幅反応液及びオイルから選ばれる必要な全てをピペットチップ内に収容した段階で、試料の一部がチップ内に入りきらずチップの先端に付着している場合を考慮し、付着した試料を効率よくチップ内に収容する目的で、この操作が任意に行われる。
【００４８】
さらに、チップの先を物理的に閉じる操作を行ってもよい。例えば、熱したピンセット(10)などでチップの先をはさみ（図３−<1>）、はさんだ部分を溶かして栓(11)を形成することにより密閉する（図３−<2>）方法や、ゴムなどの固形物を栓として用いて密閉する方法などにより行うことができる。反対に、このように閉じる操作を行わず、チップの先が開いた状態であっても、増幅反応終了まで内容物がこぼれ落ちることはない。このため、チップの先を物理的に閉じる操作は任意に行うことができる。
【００４９】
また、ピペットチップには、ＩＤタグを付けることが好ましい。たとえば、サンプル名やサンプル番号を記載したシールやテープをピペットチップ上部に貼り付けることができる（図３−<3>）。本発明では、反応容器として用いられるピペットチップは、小さい容量でありながら、ある程度の大きさの外形を有する。このため、本発明は、反応系のスケールが微小でありながら、サンプル名の識別がしやすい十分な大きさを有するＩＤタグを付けることが可能で、しかも反応容器の取り扱いが簡単であるという利点を有する。
【００５０】
以上のようにして、増幅反応混合液をピペットチップ内に調製することができる。なお、増幅反応混合液をピペットチップ内に調製するまでの工程の中で、オイルで上面を覆われた増幅反応液が収容されたピペットチップ（例えば図２や図３で示される例ではＩに相当する）は、さまざまな試料に対して有用である。例えば、バッファ、塩、ｄＮＴＰなどの、全ての増幅反応系に共通する試薬を含んだ増幅反応液と、オイルとが収容されたピペットチップを調製して保存しておくことができる。そして、試料中の核酸を増幅したい時に、保存しておいたピペットチップ内に、さらに適宜選択されたプライマーや核酸ポリメラーゼを収容した後、試料を収容し、増幅反応に供することができる。
【００５１】
本発明では、１検体ごとに１つの反応容器を用いるという形式をとりながら、１つの反応容器内に極小スケールの反応系を構築することが可能になる。そして、ピペットチップをそのまま直接増幅反応装置に装着することによって、増幅反応混合液を増幅反応に供することができる。増幅反応装置に装着する際は、ピペットチップはピペット本体からはずされた状態で装着する。なお、ピペットを用いて吸い上げる操作が全て終了した後、チップ先端を閉じる操作やＩＤタグを付ける操作においては、チップはピペット本体からはずしておくことができる。
【００５２】
本発明では、ピペットチップ内で増幅反応を行うため、反応用チューブを準備する必要がない。従って、従来、ピペットを用いて反応用チューブに試料などを移す工程において求められた、コンタミネーションに対する細心の注意を緩和することができる。また、作業手順が非常に少なく、消耗品や汚染廃棄物が非常に少ないという利点もある。
【００５３】
核酸増幅法としては、特に限定されず、あらゆる方法を採用することができる。例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法、ＬＣＲ（リガーゼ鎖反応）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop-mediated Isothermal Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法などが挙げられる。最も一般的方法として、ＰＣＲ法を行うことが好ましい。
【００５４】
本発明では、１検体ごとに１つの反応容器を用い、且つ１つの反応容器内に極小スケールの反応系を構築するため、反応時間を短くすることが可能である。例えば、本発明の方法を用いると、増幅反応時間は０．５〜３時間程度とすることができる。
【００５５】
反応が終わったチップは、先を物理的に閉じたものであれば、閉じた部分を切り落とし、増幅物の検出の作業に供することができる。増幅反応前に増幅反応液に検出用試薬を含ませていた場合であれば直接、検出を行うことができる。増幅反応前に増幅反応液に検出用試薬を含ませていなかった場合であれば、増幅反応後に、チップ内容物と前述の検出用試薬とを混ぜ合わせ、検出を行うことができる。
【００５６】
増幅物の検出法としては、通常、核酸の検出のために用いられる方法であればどのような方法を用いることができる。従って、検出用試薬としては、通常、核酸の検出に用いられるものを特に限定することなく用いることができる。
【００５７】
例えば、電気泳動法によって確認する場合、電気泳動用ダイなどが挙げられる。予め電気泳動用のダイを増幅反応液に含ませていた場合は、増幅反応終了後、チップをピペットに装着すれば、反応容器として用いたチップをそのまま引き続いて用いることによって、増幅物を電気泳動ゲルのウェルにアプライすることができる。このように、本発明の方法を用いると、増幅反応後の検出においても、消耗品を最小限にとどめるとともに非常に操作が簡単になる。
【００５８】
また例えば、蛍光を検出することによって確認する場合、適当な蛍光物質が挙げられる。具体的には、例えばインベーダー法で用いられる試薬などが挙げられる。この場合、増幅反応に引き続いてインベーダー反応に供することができる。本発明によって、このように遺伝子多型のタイピングも非常に簡単に行うことができる。
【００５９】
このように、本発明の方法を用いると、遺伝子増幅を用いるさまざまな検査を非常に簡単に行うことが可能になる。増幅反応用の試薬や検出用の試薬などを検査液として収容したチューブとピペットチップとがあれば、何所ででも、反応用混合液の調製を行うことができる。例えば、検査液入りチューブとピペットチップとを現場に持って行き、環境中の微生物を採取することによって、環境検査の作業を非常に簡単にすることができる。しかも、本発明は、反応容器ごとに微小スケールの反応系構築が可能であることや、個々の反応容器の取り扱いの簡便さなどから、検査すべき検体数が少ない場合にも有用に用いることができる。また、作業手順が非常に少なく、消耗品及び汚染廃棄物が少ないことから、検査すべき検体数が多い場合も、本発明が有用であることはいうまでもない。
【実施例】
【００６０】
＜実施例１＞
［１．２０組のプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲ反応］
精製ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、３５ｎｇ/μｌ鋳型ＤＮＡを含むＰＣＲ反応混合液２４μｌを調製した。ＰＣＲ反応混合液には以下の成分が混入されている。
鋳型ＤＮＡ  ３５ｎｇ/μｌ
２０対（４０種類）のプライマー  各１２．５ｍｍｏｌ
Ｅｘ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）１０ユニット
ＴａｑＳｔａｒｔ（クローンテック・ラボラトリーズ社製）  ０．５５μｇ
なお、TaqStartは、EX-TaqDNAポリメラーゼに対する抗体であり、反応液に加えることによってホットスタートを行うことができる。    
【００６１】
プライマーとしては、具体的には、表１に示すＳＮＰを含む領域を増幅することができる、配列番号１〜４０のプライマーを使用した。これらのプライマーは、プロリゴ・ジャパン社に合成を委託した。
【００６２】
【表１】
2007074960.tif 000003
【００６３】
上記混合液を、３μｌずつピペットチップへ分注後、ミネラルオイルを２μｌずつ重層した。ピペットチップを、１．５ｍｌのアシストチューブにいれて軽く遠心した後、ＰＣＲ反応を行った。
【００６４】
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ反応装置Quick Thermo Personal QTP-1（日本ジェネティックス社製）を用いた。ＰＣＲ反応は、まず９８℃で２分加熱し、９８℃１秒−５５℃３０秒−６５℃１分のサイクルを３５回繰り返すという条件で行った。このとき、ＰＣＲ反応時間は約２時間であった。
【００６５】
［２．インベーダー反応による確認］
ＰＣＲ反応終了後、反応済混合液０．２μｌをインベーダー反応に用いた。インベーダー試薬としては、インベーダーアッセイキット（サードウェーブテクノロジー社製）を使用した。
インベーダー反応の条件は、まず９６℃で５分加熱した後、６３℃で４０分インキュベーションを行い、リアルタイムで１分おきに蛍光シグナルＶＩＣ及びＦＡＭを検出した。蛍光シグナルの検出は、Mx3000P（ストラタジーン社製）を用いた。Ｘ軸にＶＩＣシグナル、Ｙ軸にＦＡＭシグナルをプロットし、タイピングを試みたところ、予想される適切な位置に１４ＳＮＰｓがタイピングされた。
【００６６】
［３．評価］
ピペットチップが、反応容器として有用であることを確認することができた。また、ピペットチップが、インベーダー反応で、遺伝子多型のタイピングを行う前処理容器としても有用であることを確認することができた。
【００６７】
＜実施例２＞
［１．ＰＣＲ反応］
精製ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、５ｎｇ/μｌ鋳型ＤＮＡを含むＰＣＲ反応混合液２４μｌを調製した。ＰＣＲ反応混合液は、以下のものを含む。
鋳型ＤＮＡ  ３ｎｇ
１対のプライマー  各４μｍｏｌ
Ｅｘ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）  ５ユニット
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（各２．５ｍＭ）  １．２μｌ
Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（島津製作所製）  ４．８μｌ
なお、プライマーとしては、具体的には、表１に記載の配列番号３３及び３４のプライマーを使用した。
【００６８】
上記混合液を、先端を熱によって密閉したピペットチップへ３μｌずつ分注後、ミネラルオイルを２μｌずつ重層した。ピペットチップを、１．５ｍｌのアシストチューブにいれてスピンダウンし、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、QTP-1にて、まず９８℃で２分加熱し、９８℃１秒−５５℃１０秒−６５℃４０秒のサイクルを３０回繰り返すという条件で行った。このとき、ＰＣＲ反応時間は約１時間であった。
【００６９】
［２．アガロース電気泳動法による確認］
ＰＣＲ反応後、ピペットチップをピペットへ装着し、密閉されたピペットチップの先をはさみで切断し、ミネラルオイルと反応済混合液とをパラフィルム上に吐き出した。反応済混合液を電気泳動用ダイと混合後、反応済混合液２μｌについてアガロース電気泳動を行った。その結果、約５５０ｂｐのバンドを確認することができた。  
【００７０】
［３．インベーダー反応による確認］
別途、ＰＣＲ反応後、反応済混合液０．２μｌについてインベーダー反応を行った。インベーダー試薬としては、インベーダーアッセイキット（サードウェーブテクノロジー社製）を使用した。
インベーダー反応の条件は、まず９６℃で５分加熱した後、６３℃で３０分インキュベーションを行い、リアルタイムで１分おきに蛍光シグナルＶＩＣ及びＦＡＭを検出した。蛍光シグナルの検出は、Mx3000P（ストラタジーン社製）を用いた。その結果、両者の蛍光シグナルが検出されたため、鋳型ＤＮＡには野生型と変異型との両方の塩基を有することが明らかになった。
【００７１】
［４．評価］
ピペットチップが、反応容器として有用であることを確認することができた。また、ピペットチップが、インベーダー反応で、遺伝子多型のタイピングを行う前処理容器としても有用であることを確認することができた。
【００７２】
＜実施例３＞      
［１．ＰＣＲ反応］
プラスミドにクローニングした大腸菌のインサート確認と、大腸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の増幅とを行うため、次のような工程でＰＣＲを行った。
1)チューブに、ＰＣＲ反応液（下層）とミネラルオイル（上層）とを予め入れておいた。
2)ピペットに装着したピペットチップに、まず上層からミネラルオイルを２μｌ吸い上げた。  
3)次に、チップを深く差し込んで、下層からＰＣＲ反応液を３μｌ吸い上げた。
4)チップをチューブから取り出し、チップの先をプレート上の大腸菌コロニーに接触させた。
5)もう一度、チューブ内の上層からミネラルオイルを２μｌ吸い上げ、ＰＣＲ反応液をミネラルオイルではさんだ状態にした。
6)ピペットチップの先端を熱したピンセットではさむことによって熱をかけて密閉し、その後、ＰＣＲ反応を行った。
【００７３】
ＰＣＲ反応液は、以下のものを含む。
Ｅｘ−Ｔａｑ（５ユニット/μｌ）１．０μｌ
ＥｘＴａｑバッファ  １．２μｌ
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（各２．５ｍＭ）１．２μｌ
プライマー  各４μｌ  
蒸留水  （反応溶液の全量を１２μｌとした。）
【００７４】
なお、プライマーとしては、具体的には以下のものを用いた。
Ｍ１３プラスミドＤＮＡ由来の遺伝子の増幅用プライマーとして；
M13-F（フォワードプライマー；CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT：配列番号４１）及び
M13-R（リバースプライマー；GGAAACAGCTATGACCATGATTAC：配列番号４２）、各々２０ｐｍｏｌ/μｌで０．５μｌ（いずれも宝酒造社製）と、
大腸菌１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の増幅用プライマーとして；
10F（フォワードプライマー；GTTTGATCCTGGCTCA：配列番号４３）及び
800R（リバースプライマー；TACCAGGGTATCTAATCC：配列番号４４）、各々１０μＭで０．５μｌ（いずれもプロリゴ・ジャパン社に合成を委託した。）とを用いた。
【００７５】
ＰＣＲ反応は、QTP-1（日本ジェネティクス社製）にて、まず９８℃で２分加熱し、９８℃１秒−５５℃１０秒−６５℃４０秒のサイクルを３０回繰り返すという条件で行った。このとき、ＰＣＲ反応時間は約１時間であった。
【００７６】
［２．アガロースゲル電気泳動法による確認］
ＰＣＲ反応後、ピペットチップをピペットへ装着し、密閉されたピペットチップの先をはさみで切断し、ミネラルオイルと反応済混合液とをパラフィルム上に吐き出した。反応済混合液を電気泳動用ダイと混合後、反応済混合液２μｌについてアガロース電気泳動を行った。その結果を図４に示す（Ｍはマーカーのレーンであることを示す）。図４が示すように、プラスミドにクローニングされたＤＮＡのＰＣＲ増幅産物（図中M13で示されるバンド）及び大腸菌１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅産物（図中16Sで示されるバンド）を確認した。
【００７７】
なお、本実施例は、JP Forum（日本公定書協会）Vol.12 No.1(2003) p.21-22第十四改正日本薬局方第二追補に収載予定の改正案を参考にした。当該文献には、１６ＳｒＲＮＡの高度可変領域の一部の遺伝子配列を自動解析し、データーベースと照合することによって、微生物である細菌を迅速に同定又は推定する手法を記載している。
【００７８】
［３．評価］
コロニーに直接接触したピペットチップで電気泳動の操作までを行うことができるため、消耗品が少なくてすむことが示された。また、プラスミドＤＮＡだけでなく１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の増幅を行うことも可能であったことから、微生物検査に有効であることが示された。
【００７９】
＜実施例４＞
［１．ＰＣＲ反応］
実施例１で調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、３ｎｇ/μｌの鋳型ＤＮＡ水溶液をチューブ内に調製した。また、ＰＣＲ反応液１０μｌを別のチューブ（０．２ｍｌ）内に調製した。ＰＣＲ反応液は、以下のものを含む。
１対のプライマー  各４μｍｏｌ
Ｚ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）  １ユニット
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（各２．５ｍＭ）  １．０μｌ
Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（島津製作所製）２．５μｌ
なお、プライマーとしては、表１に記載の配列番号３３及び３４のプライマーを使用した。
【００８０】
ＰＣＲ反応液１０μｌの入ったチューブに、ミネラルオイル１０μｌを重層した。  
１０μｌ用のピペットのメモリを１０μｌにセットし、ピペットチップを装着した。
鋳型ＤＮＡが入っているチューブから鋳型ＤＮＡ溶液を２μｌほど吸い上げ、ＰＣＲ反応液とミネラルオイルとが入ったチューブのふたに吐出して移した。
【００８１】
ピペットチップを、チューブ内上層のミネラルオイル層に入れ、約２μｌのミネラルオイルを吸引した後、ピペットチップを下層の反応液層に差し込んで、３μｌの反応液を吸引した。さらに、チューブのふたの中に移しておいた鋳型ＤＮＡ溶液を０．５μｌ吸入した。もう一度、チューブ内の上層からミネラルオイルを２μｌ吸い上げ、最後にチップを外に出して、空気を吸い上げた。
【００８２】
ピペットからピペットチップをはずし、コンタミネーション防止のためのアルミホイルでチップをはさみ、in situＰＣＲ用ブロックを用いたサイクラー（DNA Engine Tetrad 2 PTC-240、Flat Block Alpha Unit、ＭＪリサーチ社製）でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、まず９８℃で２分加熱し、９８℃１秒−５５℃１０秒−６５℃４０秒のサイクルを３０回繰り返すという条件で行った。このとき、ＰＣＲ反応時間は約１時間であった。
【００８３】
［２．アガロース電気泳動法による確認］
ＰＣＲ反応後、ピペットチップをピペットへ装着し、ミネラルオイルと反応済混合液とをパラフィルム上に吐き出した。反応済混合液を電気泳動用ダイと混合後、アガロース電気泳動を行った。その結果を図５に示す（Ｍはマーカーのレーンであることを示す）。図５が示すように、約５５０ｂｐのバンドを確認することができた。  
【００８４】
［３．評価］
ピペットチップの先端をつぶさない方法で増幅を行うことが可能であることが示された。電気泳動時に先端を切断する必要がないため、例えばＰＣＲ反応液に電気泳動用のダイを予め加えておけば、ＰＣＲ反応後にピペットチップをピペットに装着すれば、そのまま電気泳動を行うことができる可能性が示された。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】増幅すべき核酸が含まれる試料が液体状試料である場合に、増幅反応混合液を調製する過程を模式的に示したものである。
【図２】増幅すべき核酸が含まれる試料が固形状試料である場合に、増幅反応混合液を調製する過程を模式的に示したものである。
【図３】ピペットチップの先端を密閉し、ＩＤタグを付す過程を模式的に示したものである。
【図４】実施例３で得られた電気泳動の結果である。
【図５】実施例４で得られた電気泳動の結果である。
【符号の説明】
【００８６】
1：ピペットチップ
2：チューブＡ
3：オイル
4：増幅反応液
5：チューブＢ
6：試料液
7：増幅反応混合液
8：コロニープレート
9：コロニー
10：ピンセット先端部
11：栓
12：ＩＤタグ
Ｉ：オイルで上面を覆われた増幅反応液が収容されたピペットチップ
【配列表フリーテキスト】
【００８７】
配列番号１〜４４は、プライマーである。
【図１】
2007074960.tif 000004
【図２】
2007074960.tif 000005
【図３】
2007074960.tif 000006
【図４】
2007074960.tif 000007
【図５】
2007074960.tif 000008
【配列表】
2007074960000001.app