(57)【要約】【課題】より感受性の高いＨＣＶ診断方法を提供すること。【解決手段】一般構造式(I)を有する複数コピーエピトープ配列を用いてＨＣＶを診断する方法：（Ａ）ｘ−（Ｂ）ｙ−（Ｃ）ｚ  （Ｉ）  ここで、（Ｉ）は直鎖状アミノ酸配列であり；  Ｂは、少なくとも５で１，０００より多くないアミノ酸を含有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸は、生物の天然に存在する抗原決定基に対応し；  ＡおよびＣは、各々Ｂおよび互いと異なるアミノ酸配列であり、各々独立して少なくとも５で１，０００より多くないアミノ酸を含有するアミノ酸配列であり、該アミノ酸は天然ではＢに隣接しない抗原決定基を示し；  ｙは２以上の整数であり；そして  ｘおよびｚは各々独立して整数であり、ここでｘ＋ｚは１以上である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１．一般構造式(I)を有する複数コピーエピトープ配列を用いてＨＣＶを診断する方法：
（Ａ）ｘ−（Ｂ）ｙ−（Ｃ）ｚ            （Ｉ）
ここで、（Ｉ）は直鎖状アミノ酸配列であり；
Ｂは、少なくとも５で１，０００より多くないアミノ酸を含有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸は、生物の天然に存在する抗原決定基に対応し；
ＡおよびＣは、各々Ｂおよび互いと異なるアミノ酸配列であり、各々独立して少なくとも５で１，０００より多くないアミノ酸を含有するアミノ酸配列であり、該アミノ酸は天然ではＢに隣接しない抗原決定基を示し；
ｙは２以上の整数であり；そして
ｘおよびｚは各々独立して整数であり、ここでｘ＋ｚは１以上である。
【請求項２】
実施例に記載されるＨＣＶの診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的にはタンパク質合成およびイムノアッセイの分野に関し、そして詳細には、ＨＣＶのようなウイルスのエピトープの複数のコピーを含有するアミノ酸の長鎖を合成する方法、および複数のエピトープを利用して抗体の存在を検出するアッセイデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
一般的には、イムノアッセイはウイルスと特異的に関連するエピトープを最初に決定し、次いでどのエピトープが開発されるアッセイに好ましいかを決定することにより産生される。免疫優性なエピトープが単離される場合、その配列が決定され、そして免疫優性なエピトープを産生するための遺伝物質が産生される。化学的または生物学的手段のいずれかによってタンパク質を産生する方法は、特定のエピトープに対する抗体の存在を検出するために用いるアッセイと同様に既知である。
【０００３】
イムノアッセイの産生において、全体の目的は高感度および高選択性の両方であるイムノアッセイを得ることである。さらに詳細には、イムノアッセイは、このイムノアッセイが検出するように設計された物質を非常に低レベルでさえ検出し得る（すなわち高感度である）ように設計されなければならない。高い程度の感度を有するアッセイは、試験されたサンプルが、アッセイが検出するように設計される物質で汚染されていないことを保証する。例えば、所定のウイルスについての抗体のごく微量の存在さえも検出する高感度アッセイは、サンプルがウイルスを含有することを示す任意の量の抗体を含むサンプルを、検出し、従って棄却することをこのアッセイが可能にする点で望ましい。
【０００４】
高い程度の感度はアッセイには望ましいが、アッセイが物質の存在を誤って示す（すなわち、アッセイが偽陽性の結果を生じる）場合望ましくない。このような偽陽性結果は、分析物がサンプル中に存在する別の物質との高い程度の類似性を有する場合起こり得る。２つの類似するが異なる物質の間を区別するアッセイの能力は、その選択性に関連する。
【０００５】
高い程度の選択性を有するイムノアッセイは、物質が類似の構造を有する他の物質と組み合わせでサンプル中に存在する場合でさえ、アッセイされる物質の存在を検出する。従って、高度選択性イムノアッセイは、ほとんどの最も偽陽性結果を除去する。一般的には、選択性が増加するに従って感度が低減する。これは、一部は、ウイルスの高い程度の変異性に起因して起こる。従って、高感度であるように設計されるアッセイは、異なるウイルス間の変異性を考慮に入れなければならない。ウイルスの変異性が感度を改善するために調節されると、選択性が低減する。あるいは、特定のウイルスに関してますます選択的であるイムノアッセイを産生すると、感度が低減するほど選択的になるアッセイの可能性が増加する。
【０００６】
大部分において、改善された選択性（より少ない偽陽性）を提供する問題は最も免疫優性なエピトープを探し、そして見い出すことにより処理される。感度（低濃度検出）の問題は、ウイルスの種々の異なる領域から免疫優性なエピトープを提供することにより処理される。
【０００７】
現在のアッセイは「主要なエピトープ」または非常に免疫優性なエピトープとして選択された比較的少ないペプチドを利用して設計されている。アッセイ感度は固体支持体上で利用可能な主要なエピトープの数に依存する。エピトープの利用可能性が、固相上にコートされ得るペプチドの数により制限される場合、アッセイは感度を低減する。これらの結果は、不十分なアッセイ希釈感度、不十分なセロコンバージョン感度、および／または偽陰性検出として示され得る（非特許文献１）。
【０００８】
従って、現在、生物学的液体中の病原体に対する抗体についてのアッセイの感度および選択性を改善し、そしてそれによって改善された血液供給物のスクリーニングを生じる病原体感染の診断を改善する必要性が存在する。
【非特許文献１】Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．ら、（１９９３）  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．  ８：Ｓ３３−３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の要旨
単一のアッセイにおいて多数の病原体株由来の抗体を検出し得る複数コピー融合抗原（ＭＥＦＡ）イムノアッセイは、（１）免疫優性な成分を含む複数の異なるエピトープをコードするヌクレオチド配列を同定する工程；（２）発現カセットへヌクレオチド配列を配置する工程、ここで、ウイルスのような生物の同じエピトープ領域または異なるウイルス株の対応する領域をコードする配列の少なくとも２つのコピーが、単一のカセットに配置される；（３）エピトープをコードする配列を発現するためにカセットの１つ以上のコピーで適切な宿主を形質転換する工程（この配列は一本鎖抗原における少なくとも１つのエピトープの２つ以上のコピーを含む）；（４）発現した複数エピトープ抗原を精製する工程；および（５）精製された複数エピトープ抗原をイムノアッセイに適合させる工程、ここで適合させる工程は以下を含むが、それらに限定されない：基質の表面上に複数エピトープ抗原をコートする工程；複数エピトープ抗原に検出可能なマーカーを共有結合させる工程；などの工程により産生される。
【００１０】
精製されたエピトープは、直鎖状アミノ酸配列を示す一般構造式（Ａ）ｘ−（Ｂ）ｙ−（Ｃ）ｚにより包含される。Ｂは、少なくとも５アミノ酸で１，０００より多くないアミノ酸の抗原決定基または抗原決定基のクラスターのアミノ酸配列であり、そしてｙは２以上の整数である。Ｂの各コピーは等価抗原決定基である（例えば、各コピーは異なるウイルス株由来のエピトープである）。ＡおよびＣは、各々独立して天然にはＢにすぐ隣接していないエピトープまたはエピトープのクラスターのアミノ酸配列である；そしてｘおよびｚは各々独立して０以上の整数であり、ここでｘおよびｚの少なくとも１つは１以上である。好ましくは、Ｂのｙ個のエピトープは、異なるウイルス株由来の等価抗原決定基であり、それにより単一の複数エピトープ抗原により検出可能な病原体の多様性を増加する。
【００１１】
選択性は、同じウイルスの２つ以上の異なる株の同じ領域由来の免疫優性なエピトープを含むことによりさらに改善される。より好ましくは、Ｂの等価抗原決定基が異なる血清型特異性を有する。Ｂエピトープ間の相同性は少なくとも３０％であり、好ましくは少なくとも４０％である。本発明のエピトープはより可溶性であり、従って従来のエピトープより容易に精製される。さらに、繰り返しエピトープ配列の存在は、マスキング問題を低減し、そして非常に多くのエピトープが基質の単位面積上に可能であることにより抗体を検出する感度を改善する。感度は、本発明の複数コピーエピトープを小さな球形または不規則な形のビーズまたは微粒子上に配置し、それによりアッセイデバイスの所定の面積あたりの露出した表面積を増加することにより、さらに改善される。
【００１２】
本発明の目的は、複数のエピトープを含有するアミノ酸配列を提供することであり、ここで少なくとも１つのエピトープの少なくとも抗原決定基部分は２回以上の回数を繰り返す。
【００１３】
本発明の別の目的は、複数エピトープ融合抗原を用いるイムノアッセイを産生する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の特徴は、所定のエピトープ配列の多数のコピーを含むアミノ酸配列が、任意の所定のエピトープの単一のコピーのみを含むアミノ酸配列と比較してより高い溶解度を有することである。
【００１５】
本発明の別の特徴は、エピトープをコードするヌクレオチド配列が、病原体のゲノムにおける直線的順序とは異なり得る直線的順序であることである。従って、Ａ、ＢおよびＣの抗原決定基は、Ａ、ＢおよびＣの天然に存在する抗原決定基とは異なる直線的順序であり得る。本発明の配列の直線的順序は、好ましくは複数エピトープ融合抗原を含む発現されたアミノ酸配列の至適な抗原性について整えられる。
【００１６】
本発明の利点は、式（Ｉ）の複数エピトープ抗原が従来のエピトープと比較してより容易に精製され得ることである。
【００１７】
本発明の別の利点は、抗原決定基のマスキングが低減され得ることである。
【００１８】
本発明の別の利点は、複数エピトープ融合抗原を利用するイムノアッセイが、改善された感度および選択性を有することである。
【００１９】
本発明のさらに別の利点は、複数のエピトープ（特にＢの繰り返しエピトープ）が、エピトープのタイプ特異性に基づく１つより多いの病原体または単一の病原体の１つより多いの株を検出し得るアッセイを提供することである。
【００２０】
本発明の別の特徴は、式（Ｉ）の複数エピトープ配列が、任意の所定のエピトープの単一のコピーのみを含むエピトープ配列に一般的に存在するより多数のおよび／またはより長い配列を含むように設計され得ることである。
【００２１】
本発明の別の利点は、式（Ｉ）による複数エピトープ抗原の設計が、任意の所定のエピトープの単一のコピーのみを含む抗原に比較して、イムノアッセイの表面の単位面積上により多くの数の抗原決定基を含むことを可能にすることである。
【００２２】
本発明はまた、複数のエピトープが必要であり、そして固相表面積が限定される場合、血清学的試験の一般的な特異性および感度を改善する利点を提供する。さらに、単一のキメラ抗原に基づくイムノアッセイ試験は、特に検出可能なマーカーで標識した抗原を必要とする試験について、製造工程を非常に簡素化する。
【００２３】
本発明の実施態様は、１工程同時アッセイであるために、実施するのに簡単かつ便利な、複数エピトープ融合抗原を用いる迅速な捕捉リガンドイムノアッセイをさらに提供する。検出は、抗原／抗体複合体のメンバー（好ましくは抗原）への検出可能なマーカーの接着による。接着は、共有結合手段によるか、または標準サンドイッチアッセイのような検出可能な標識抗体の結合によるか、または酵素反応（その反応産物が検出可能である）により得る。検出可能なマーカーは、発色団、抗体、抗原、酵素、酵素反応化合物（それらの分解産物が検出可能である）、ローダミンまたはローダミン誘導体、ビオチン、ストレプトアビジン、蛍光化合物、化学発光化合物（例えば、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ、Ｃｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．））、これらのマーカーの誘導体および／または組み合わせ、を包含し得るがそれらに限定されない。
【００２４】
本発明の別の実施態様において、捕捉リガンド形式アッセイは、抗原としてのＭＥＦＡ、およびアッセイ混合物に添加されるさらなる検出可能なエピトープを含有する。さらなる検出可能なエピトープは、単一のエピトープまたは複数のエピトープであり得、そしてＭＥＦＡに含まれるエピトープ、好ましくはＥ１、Ｅ２、およびｃ３３ｃのような領域由来のエピトープを含有し得るがこれらに限定されない。本発明のこの実施態様によると、さらなるエピトープは上記のように検出可能なマーカーに接着されているかまたは接着可能である。さらなるエピトープが、コンフォメーション、グリコシル化などのような好ましい特徴を有する場合、さらなるエピトープは、細胞から組換えポリペプチドとして発現され、その発現は所望の形態でエピトープを提供する。好ましくは、エピトープは、エピトープの所望の特徴を保存する緩和な単離条件を用いて細胞から得られ得る。細胞は、さらなるエピトープが所望の形態で単離され得る、哺乳動物細胞（好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ））あるいは細菌、酵母または昆虫細胞のような任意の適切な細胞であり得る。
【００２５】
本発明のこれらおよび別の目的、利点および特徴は、本明細書の一部を形成する付随的な一般構造式（ここでは同様のシンボルは一貫して同様の分子部分を言う）に対してなされる言及とともに、下記により十分に記載される、複数コピーエピトープ、イムノアッセイおよびこれらの産生方法の詳細を読むことで当業者に明らかになる。
【００２６】
また、本発明は、以下を提供する：
項目１．一般構造式（Ｉ）を有する複数コピーエピトープ配列：
（Ａ）ｘ−（Ｂ）ｙ−（Ｃ）ｚ            （Ｉ）
ここで、（Ｉ）は直鎖状アミノ酸配列であり；
Ｂは、少なくとも５で１，０００より多くないアミノ酸を含有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸は、生物の天然に存在する抗原決定基に対応し；
ＡおよびＣは、各々Ｂおよび互いと異なるアミノ酸配列であり、各々独立して少なくとも５で１，０００より多くないアミノ酸を含有するアミノ酸配列であり、該アミノ酸は天然ではＢに隣接しない抗原決定基を示し；
ｙは２以上の整数であり；そして
ｘおよびｚは各々独立して整数であり、ここでｘ＋ｚは１以上である。
項目２．Ａ、Ｂ、およびＣが複数の生物由来のエピトープである、項目１に記載の複数コピーエピトープ。
項目３．Ａ、Ｂ、およびＣがＣ型肝炎ウイルスの免疫優性なエピトープである、項目１に記載の複数コピーエピトープ。
項目４．Ａ、Ｂ、およびＣが１種のウイルスのエピトープであり、少なくとも１つのＢは該ウイルスの異なるウイルス株由来の等価抗原決定基である、項目１に記載の複数コピーエピトープ。
項目５．Ａ、Ｂ、およびＣがＨＣＶポリタンパク質の領域由来のエピトープであり、ここで該領域が、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５、ｃ１００、Ｃ２５、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｃ３３ｃ、ｃ１００−３、およびｃ２２からなる群より選択される、項目３に記載の複数コピーエピトープ。
項目６．イムノアッセイを産生する方法であって：
複数の異なるエピトープをコードするヌクレオチド配列を同定する工程；
発現カセットへ該ヌクレオチド配列を配置する工程、ここで、エピトープの所定の抗原決定基をコードする配列の少なくとも２コピーが、該カセットに配置される；
複数エピトープポリペプチドとしてエピトープをコードする配列を発現するために、該カセットで適切な宿主を形質転換する工程；
該発現した複数エピトープポリペプチドを精製する工程；および
イムノアッセイのために該複数エピトープポリペプチドを修飾する工程、
を包含する、方法。
項目７．前記エピトープがＨＩＶおよびＨＣＶからなる群より選択されるウイルスのエピトープである、項目６に記載の方法。
項目８．アッセイデバイスであって：
支持体表面；および
該支持体表面に結合するエピトープ、ここで該エピトープは一般構造式（Ｉ）を有する：
（Ａ）ｘ−（Ｂ）ｙ−（Ｃ）ｚ              （Ｉ）
ここで（Ｉ）は直鎖状アミノ酸配列であり；
Ｂは、少なくとも５で１，０００より多くないアミノ酸を含有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸は生物の天然に存在する抗原決定基に対応し；
ＡおよびＣは、各々Ｂおよび互いと異なるアミノ酸配列であり、各々独立して少なくとも５で１，０００より多くないアミノ酸を含有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸は天然にはＢに隣接しない抗原決定基を示し；
ｙは２以上の整数であり；そして
ｘおよびｚは各々独立して整数であり、ここでｘ＋ｚは１以上である。
項目９．Ａ、Ｂ、およびＣがＣ型肝炎ウイルスのエピトープである、項目８に記載のアッセイデバイス。
項目１０．Ａ、Ｂ、およびＣが１つのウイルスのエピトープであり、各Ｂが該ウイルスの異なるウイルス株由来の等価抗原決定基である、項目８に記載のアッセイデバイス。
項目１１．Ａ、Ｂ、およびＣがＨＣＶポリタンパク質の領域由来のエピトープであり、ここで該領域が、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５、ｃ１００、Ｃ２５、コア、Ｅ１、Ｅ２、ｃ３３ｃ、ｃ１００−３、およびｃ２２からなる群より選択される、項目８に記載のアッセイデバイス。
項目１２．項目１に記載の複数コピーエピトープを含有するアッセイ組成物であって、該複数コピーエピトープが検出可能なマーカーに接着されている、アッセイ組成物。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
実施態様の詳細な説明
本発明の実施は、他に記載のない限り、当該技術の範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる。このような技術は、文献に十分記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第二版，１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  およびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第二版、ＩおよびＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）を参照のこと。
【００２８】
本発明の複数エピトープ融合タンパク質、イムノアッセイならびにこれを産生および使用する方法が記載される前に、本発明は、特定のアミノ酸配列、イムノアッセイまたは産生方法に限定されないこと（これらはもちろん変化し得るので）が理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語は、特定の実施態様のみを記載する目的のためであり限定する意図はないことも理解されるべきである。なぜなら本発明の範囲は、添付の請求の範囲によってのみ限定されるためである。
【００２９】
他に定義されない限り、本明細書中に用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中の記載と類似または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験に用いられ得るが、好ましい方法および材料はこれから記載する。
【００３０】
定義
本明細書中に用いられる用語「複数コピー」は、直鎖状分子内で２回以上の回数を繰り返される、少なくとも約５で約１，０００より多くないアミノ酸を直鎖形式に含有するアミノ酸配列を特定する。繰り返し配列は、それ自身に直接連結する必要はなく、自然界では同じ様式で繰り返さず、さらに、繰り返されないかまたは「コピーされない」他のアミノ酸を含有するより大きな配列内に存在し得る。少なくとも５で１，０００より多くないアミノ酸の配列は、下記に定義されるエピトープを含有する。本発明の目的では、アミノ酸配列の「コピー」は、正確な配列コピーまたは異なるウイルス株の同じエピトープに対応する配列のいずれかであり得る（すなわちコピーは、正確なコピーまたは下記に定義される「等価抗原決定基」である配列のいずれかである）。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「エピトープ」は、少なくとも約５で約１，０００より多くないアミノ酸の直鎖形式に連結した配列をいい、このアミノ酸はそれ自身またはより大きな配列の一部として、このような配列に対して生成される抗体に結合する。本発明に用いられるエピトープは、由来する親タンパク質の一部分の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際、ウイルスゲノムは一定の流動的状態にあり、そして単離物間の比較的高い程度の変異性を示すいくつかの可変ドメインを含有する。従って、用語「エピトープ」は、本来の配列と同じ配列、ならびに欠失、付加、および置換（一般的に性質が保存）のような本来の配列への修飾を包含する。
【００３２】
本明細書で使用する用語「構造エピトープ」は、全長の天然のタンパク質内のエピトープをコードするアミノ酸配列に本来由来する構造的特徴を有する組換えエピトープをいう。本来の構造的特徴は、グリコシル化および３次元構造を含むが、それらに限定されない。一般的に、構造エピトープは、ＭＥＦＡ含有イムノアッセイ混合物に添加され、アッセイ感度および選択性を増強する。好ましくは、組換え構造エピトープは、細胞中で発現され、この細胞から所望の構造的特徴を保存する（例えば、エピトープの変性なし）条件下で抽出可能である）。このような細胞は、細菌、酵母、昆虫、および哺乳動物細胞を含む。好ましくは、構造エピトープが発現される細胞は、哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ））である。ＨＣＶのＥ１およびＥ２領域由来の組換え構造エピトープの発現および単離は、ＷＯ９６／０４３０１、ＷＯ９４／０１７７８、ＷＯ９５／３３０５３、ＷＯ９２／０８７３４に記載されている。
【００３３】
本明細書中に用いられる用語「発現カセット」は、適合性宿主中のコード領域の発現をもたらし得る１つ以上の適切な制御配列に作動可能に連結したコード領域を含有するＤＮＡ配列をいう。発現系はプロモーターを常に含むが、意図される宿主に依存し、リボソーム結合部位またはＣＡＰ部位、終結配列、およびプロモーターから上流のまたは他の作動可能な位置にある随意のエンハンサー配列のような重要なヌクレオチド配列をさらに含み得る。本明細書中に記載の本発明の組換え発現カセットは、その発現を果たし得るさらなるＤＮＡ配列に作動可能に連結したＭＥＦＡをコードする本発明のＤＮＡを含む。発現カセットは、宿主細胞の染色体から独立して自己複製しているプラスミドまたは他のベクターのような転移ベクターに存在し得るか、または宿主細胞へ挿入する場合に染色体へ統合し得るように構築され得る。
【００３４】
「等価抗原決定基」とは、所定の生物の異なる亜種または株（例えばＣ型肝炎ウイルスの株１、２、または３由来のような異なるウイルス株）由来の抗原決定基を意味する。Ｃ型肝炎のようなウイルスについてより詳細には、エピトープは５−１−１のように既知であり、そしてこのようなエピトープは既知の株１、２、および３の間で変化する。従って、３つの異なる株由来のエピトープ５−１−１は等価抗原決定基であり、従ってその配列が同一ではないとしても「コピー」である。一般には、等価抗原決定基のアミノ酸配列は、２つの配列が並列された場合、高い程度の配列相同性（例えば３０％より多い、好ましくは４０％より多いアミノ酸配列相同性）を有する。
【００３５】
用語「トレーサー」は、エピトープまたはＭＥＦＡに接着可能な任意の検出可能なマーカー分子を意味する。接着は、好ましくは共有結合による。本発明においてトレーサーとして有用な検出可能なマーカー分子は、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、発色団、ビオチン、ストレプトアビジン、抗体、抗原、酵素蛍原性光化合物、ローダミン化合物、フルオレセイン、ＦＩＴＣなどを含むが、それらに限定されない。
【００３６】
イムノアッセイー一般
高感度および高選択性イムノアッセイは、本発明の複数エピトープ融合抗原を用いて産生され得る。このようなイムノアッセイを産生するために、最初にサンプルがアッセイするべき標的（例えば、体液サンプル中の特定のウイルス）を同定する必要がある。目的のウイルスを同定した後、ウイルスの好ましい免疫優性なエピトープが単離され、配列決定され、そしてエピトープのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が決定および産生される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、標準的な組換え法を用いて互いに融合され得る。配列はまた、その発現および精製を容易にするために、さらなるポリペプチドに融合され得る。
【００３７】
融合配列は、所定のエピトープをコードするヌクレオチド配列の少なくとも２つのコピーを含まなければならない。次いで、ヌクレオチド配列は発現カセット内に配置され、そして適切な宿主がそのカセットで形質転換される。宿主は、複数コピーエピトープ（複数エピトープ融合抗原、ＭＥＦＡ）を提供するために配列を発現させられる。次いで、産生した複数コピーエピトープは、例えば、アフィニティクロマトグラフィにより精製され、この工程は、所定のエピトープの複数のコピーの存在に起因して、ある程度まで促進される。次いで、精製ＭＥＦＡは、ＥＬＩＳＡ型アッセイの基質の表面上にコートされる。あるいは、精製ＭＥＦＡは、化学発光アッセイ（ＣＬＩＡ）のような、抗体結合の検出のための検出可能なマーカートレーサー分子に接着される。
【００３８】
本発明の本質は、精製された複数コピーエピトープ（すなわち天然には通常はこのような形式で互いに連結されていない他のエピトープに融合された、所定のエピトープの複数のコピーを直鎖状形式で含む精製融合タンパク質）（ＭＥＦＡ）である。精製エピトープは、以下のような一般構造式（Ｉ）に包含される：（Ａ）ｘ−（Ｂ）ｙ−（Ｃ）ｚ、これは直鎖状アミノ酸配列を示す。Ｂはエピトープまたはエピトープのクラスターのアミノ酸配列であり、そして各Ｂは少なくとも５で１，０００より多くないアミノ酸を含み、ｙは２以上の整数であり、ＡおよびＣはそれぞれ独立して天然にはＢにすぐ隣接していないエピトープまたはエピトープのクラスターのアミノ酸配列であり、そしてｘおよびｚはそれぞれ独立して０以上の整数であり、ここでｘおよびｚの少なくとも１つは１以上である。ｘ、ｙ、またはｚの各々が１より大きい場合、またはｘ、ｙ、およびｚの各々が１より大きい場合、Ａ、Ｂ、およびＣの複数のコピーは同一であり得る。すなわちＡの各コピー（ＢおよびＣと異なる）が正確に同じアミノ酸配列であり、  Ｂの各コピー（ＡおよびＣと異なる）が正確に同じアミノ酸配列であり、そしてＣの各コピー（ＡおよびＢと異なる）が正確に同じアミノ酸配列である。あるいは、各Ａ、Ｂ、またはＣコピーは、同じウイルスの異なる株由来の等価抗原決定基であり得る。従って，例えばｙが３である場合、各Ｂは、同一のアミノ酸配列またはＨＣＶ株１、２、および３由来の等価抗原決定基由来の３つの異なる配列であり得る。本発明は、式（Ｉ）の複数コピーエピトープを産生する核酸構築物中に遺伝物質を連結することにより、既知のエピトープまたはエピトープグループをコードする遺伝物質を利用し得る。
【００３９】
個々の単一エピトープが固相支持体上にコートされているＨＣＶ抗体捕捉アッセイは、キメラ複数エピトープポリタンパク質（例えば免疫優性なコア由来のエピトープ、ｃ３３ｃ（ＮＳ３）、およびｃ１００（ＮＳ４）領域配列を含むポリタンパク質（Ｃ２５）（Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．ら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１００１１−１００１５））が固相支持体上にコートされている捕捉アッセイより感度が低い。同様に、Ｃ２５キメラポリタンパク質を用いる捕捉アッセイは、本発明のＭＥＦＡを用いるＨＣＶ抗体捕捉アッセイより感度が低い。このＭＥＦＡは少なくとも１つのエピトープの複数コピーを含み、そして少なくとも１つのコピーは異なるＨＣＶ株由来である。従って、一般式Ａｘ−Ｂｙ−Ｃｚを有する本発明の好ましいＭＥＦＡは、エピトープの１つより多いコピーを含み（すなわち、ｙは２以上の整数である）、そしてＢの少なくとも１つのエピトープは、異なる等価抗原決定基（例えば、異なる病原体株由来のエピトープ）である。
【００４０】
本明細書中に開示された発明は、組換えＤＮＡ技術およびタンパク質工学を利用して、種々の病原体または病原体株由来の種々の異なる免疫優性なエピトープを、イムノアッセイ開発のためのキメラ抗原として融合する組換えポリタンパク質を設計する。さらに、本発明は、組換えポリタンパク質として結合および発現される遺伝子の構造および非構造コード領域由来の選択されたエピトープの複数コピーを利用して、イムノアッセイの感度および選択性を有意に改善する。
【００４１】
本発明の複数コピーエピトープを作製するのに用いられるエピトープは、種々の異なる生物由来であり得る。例えば、エピトープは、細菌、原生類、ウイルス、リケッチア、寄生虫または菌類由来のアミノ酸配列であり得る。本発明の好ましい実施態様は、細菌またはウイルス由来のエピトープを用い、特に好ましいエピトープはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のようなウイルス由来のエピトープであり、最も好ましくはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来である。例えば、ＨＩＶエピトープは、免疫反応性を示す任意の種々のウイルス領域（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０およびｇｐ４１、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇのようなｇａｇ抗原、ならびにｐｏｌ領域由来のタンパク質のような任意の種々のエンベロープタンパク質のような（しかしそれらに限定されない））由来であり得る。同様に、ＨＣＶエピトープは、Ｃ、Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、およびＮＳ５領域のような（しかしそれらに限定されない）任意の種々のウイルス領域由来であり得る。
【００４２】
図１は、ＨＣＶ由来の本発明で用いられる代表的なＭＥＦＡ抗原を示す。しかし、ＨＣＶゲノム由来の他のエピトープもまた、本アッセイでの使用を見い出すことが理解されるべきである。例えば、アミノ酸３８４−４１０または３９０−４１０に広がる領域のような、さらなるエピトープ（例えばＥ２の超可変領域由来）がＭＥＦＡ抗原に含まれ得る。特に有効なＥ２エピトープは、この領域由来のコンセンサス配列（例えば、コンセンサス配列
【００４３】
【化１】
2007127671.tif 000002
（これは、ＨＣＶタイプ１ゲノムのアミノ酸３９０−４１０のコンセンサス配列を示す）を含むエピトープである。本発明のＭＥＦＡ抗原に存在する代表的なＥ２エピトープは、アミノ酸３９０−４４４に広がるハイブリッドエピトープを含み得る。このようなハイブリッドＥ２エピトープは、ＨＣＶ  Ｅ２のアミノ酸４１１−４４４の本来のアミノ酸配列に融合されたコンセンサス配列を示すアミノ酸３９０−４１０を含み得る。
【００４４】
任意の所定の生物が、ある個々の生物から別の生物に変化し、そしてさらにウイルスのような所定の生物が多くの異なる株を有し得ることは周知である。例えば、多数のＨＩＶ単離物が存在し、そしてＣ型肝炎ウイルスは少なくとも１、２、および３株を含む。これらの株の各々は、等価抗原決定基を含有する。より詳細には、各株はウイルスの全ての株に存在する多数の抗原決定基を含むが、ウイルス株ごとわずかに異なる。例えば、Ｃ型肝炎は、５−１−１（ウイルスゲノムのＮＳ３領域中）として公知の抗原決定基を含む。この特定の抗原決定基は、Ｃ型肝炎の３つの異なるウイルス株上に３つの異なる形態で現れる。従って、本発明の好ましい実施態様において、５−１−１の３つのすべての形態は、本発明の複数エピトープ融合抗原上に現れる。本発明のＭＥＦＡは上記の構造式  Ｉ  を有し、ここでｙは３であり、従って３つの”Ｂ”の各々は、Ｃ型肝炎の３つの異なるウイルス株から得られた５−１−１  の等価抗原決定基である。
【００４５】
本発明の複数コピーエピトープはまた、同じエピトープの正確なコピーである複数のコピーを含む。例えば、Ｃ型肝炎のコア領域由来のエピトープの２つのコピーを含むことが望ましい。本発明の特に好ましい実施態様は、図３に示される複数コピーエピトープである。この複数コピーエピトープは、コア領域由来のエピトープの２つの正確なコピーおよび５−１−１領域由来のエピトープの３つのコピーを含み、この３つのコピーは、それらがＣ型肝炎の３つの異なるウイルス株から得られる抗原決定基であることを意味する等価抗原決定基である。一般的には、等価抗原決定基は、並列した場合相同性の程度が一般的に３０％以上、あるいはより好ましくは４０％以上、のアミノ酸配列に関する高い程度の相同性を有する。
【００４６】
ＨＣＶイムノアッセイ
高選択性および高感度イムノアッセイは一般的に、患者に感染する疑いのある病原体の主要な免疫優性なエピトープを含む。以前、イムノアッセイは、生物学的サンプル中の抗ＨＣＶ抗体に結合するために個々のエピトープを使用してきた。
【００４７】
ウイルスＨＣＶについて、主要な免疫優性な直鎖状エピトープは、ウイルスポリタンパク質のコア、ＮＳ３（非構造（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ））、ＮＳ４、およびＮＳ５領域から同定された。Ｓａｌｌｂｅｒｇらは、ＨＣＶに対する抗体を含有するヒト血清サンプルに対してＨＣＶコアタンパク質および推定マトリックスタンパク質をアッセイし、そしてＨＣＶタンパク質内のいくつかの免疫優性な領域を定義した（Ｓａｌｌｂｅｒｇ，Ｍ．ら、（１９９２）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３０：１９８９−１９９４）。ドメインＣ、Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５を含むＨＣＶ−１ポリタンパク質のタンパク質ドメインが同定され、そしてそれらのおよその境界線はＣｈｉｅｎおよびＲｕｔｔｅｒにより提供された（Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．およびＲｕｔｔｅｒ，Ｗ．、ＷＯ９３／００３６５、国際公開日１９９３年１月７日）。Ｋｏｔｗａｌらが、ＨＣＶ患者の血清の試験に有用な免疫優性なエピトープを得るため、ウイルスＨＣＶの構造領域由来の配列を有する個々のポリペプチドを設計した（Ｋｏｔｗａｌ，Ｇ．Ｊ．ら、（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：４４８６−４４８９）。
【００４８】
ＨＣＶの血清学的に定義可能なサブタイプが、変異した抗原性を示すウイルスサブタイプとしてＣｈｉｅｎらにより同定された（第三回国際肝炎学会、東京、１９９３年５月に提示されたおよびＣｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．ら（１９９４）Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ、３２０−３２４頁）。ＨＣＶ−１コア、ＮＳ４およびＮＳ５領域は、血清型特異的エピトープを含有することが見い出された。ＨＣＶ−１およびＨＣＶ−２由来の個々の推定コアタンパク質は、個々の抗原として用られ、血清学的に区別可能なコア抗原サブタイプを用いてＨＣＶ感染を検出する酵素結合免疫吸着アッセイのための抗体が産生された（Ｍａｃｈｉｄａ，Ａ．ら、（１９９２）  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １６：８８６−８９１）。Ｓｉｍｍｏｎｄｓらは、エピトープマッピングおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、ＮＳ４タンパク質の抗原性に対するＨＣＶの異なるタイプ間の配列変異性の効果を調査した。これらの著者は、ＨＣＶによる自然感染で誘起された抗体により認識されたＨＣＶ  ＮＳ４ポリタンパク質中の２つの主要な抗原領域をマッピングした。特定のＨＣＶタイプに対するタイプ特異的抗体も検出された（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｐ．ら（１９９３）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３１：１４９３−１５０３）。Ｃｈｉｎｇらは、ＨＣＶ推定ヌクレオキャプシド（コア）タンパク質の高度に保存された領域の配列に基づく一連の合成ぺプチドを調製し、そしてヒトおよびチンパンジー血清により認識された免疫優性な領域を発見した（Ｃｈｉｎｇ，Ｗ．−Ｍ．ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８９：３１９０−３１９４）。
【００４９】
試験抗原として単一のエピトープを含むアッセイは、短いペプチドを含む大量の個々のエピトープによる支持体表面の固相コートを制御することが困難であるという欠点を有する。このような場合において、アッセイが固相支持体上の免疫原性抗原の沈殿を含む場合、アッセイの感度は、固相支持体の表面上にコートされ得る抗原量により制限される。
【００５０】
単一のウイルスサブタイプの異なる領域由来の免疫優性なエピトープを含むイムノアッセイの例は、Ｃｈｉｅｎらに開示されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１００１１−１００１５（１９９２））。Ｃｈｉｅｎにより記載されたアッセイは、キメラ組換えポリタンパク質（Ｃ２５）の領域（構造および非構造領域の両方で明らかな免疫優性な成分を含む）を含むＨＣＶタイプ１ポリタンパク質の多くの異なる領域由来の組換えＨＣＶポリペプチドを用いる。産生されたポリタンパク質は、組換え的に誘導されたウイルスポリペプチドであり、そして抗体を捕捉する（すなわち、ＨＣＶの感染に応答して生じた抗体の存在を検出する）ためにイムノアッセイの表面上に含まれる。しかし、これらのポリタンパク質は、単一のウイルス株由来のエピトープ含み、それによりそのウイルスの異なる株由来の抗ＨＣＶ抗体を検出する能力を限定する。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例は、複数コピーエピトープおよび本発明のイムノアッセイに使用するための試薬を作製する方法、ならびにこれらの使用の完全な開示および記載を当業者に提供するために記載され、そして発明者が本発明として考える範囲を限定する意図はない。用いられる数値（例えば量、温度など）に関して正確さを確実にするために努力がなされたが、いくらかの実験的誤差および偏差は本明細書中に内在し得る。他に記載がない限り、部分は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は℃、および圧力は大気圧またはその付近である。
【００５２】
実施例１：ＨＣＶエピトープポリタンパク質発現カセットの構築および発現
以下の実施例は、主要なエピトープのポリタンパク質カセット、特に複数エピトープのカセットを調製する構想を例示する。実施例は、病原体の異なる株由来のエピトープを首尾よく用いることをさらに例示する。親水性複数エピトープ抗原は、ポリタンパク質の溶解度を増加することもまた示される。エピトープは、ポリタンパク質の抗原性により例証されるように、抗体に結合するための本来の局所コンフォメーションを維持することが示される。
【００５３】
複数エピトープカセットから発現されたポリタンパク質は、本明細書中において複数エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）といわれる。
【００５４】
好ましくは、エピトープが繰り返される場合、余分のコピーが同じ方向に縦に整列される。エピトープとして用いられたウイルスコード配列の領域がわずかに変更し得、そしてなお抗原活性を維持し、そしてアミノ酸番号表示は株毎に変更し得ることが理解される。従って、繰り返しエピトープは、株配列変異および／または番号表示に起因して、アミノ酸配列が株毎に変化し得る。好ましくは、ＭＥＦＡ内の繰り返しエピトープのアミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも３０％相同、より好ましくはアミノ酸レベルで少なくとも４０％相同である。
【００５５】
前記順序にエピトープを連結し、そしてキメラ抗原の設計における修飾を容易にすることにより本発明の有用性を強化するために独特の制限酵素部位を導入した。制限酵素部位の選択およびクローニング手順が、組換えＤＮＡ技術の分野の当業者により容易に決定される。好ましくは、エピトープ接合部（クローニングに起因してエピトープ間に生成されるアミノ酸配列）は、非特異的エピトープを生成しない。非特異的エピトープは、例えば、天然ではＨＣＶエピトープに隣接して存在しない非ＨＣＶ配列である。非特異的エピトープは、偽陽性アッセイ結果を引き起こす試験サンプル中の抗体を結合し得る。好ましくは、複数エピトープ融合タンパク質は、エピトープ接合部で生成したこのような配列に起因する偽陽性結果について試験される。接合部配列に起因するＭＥＦＡとの非特異的相互作用を避けるために、接合部をコードするＤＮＡ配列を、例えば変異アミノ酸配列との非特異的相互作用を低減するように変異し得、エピトープフラグメントのクローニングを可能にする。
【００５６】
ＨＣＶエピトープのＭＥＦＡ発現カセットの構築
ＨＣＶ  ＭＥＦＡ−３発現カセットを、図１に示される縦列で主要なエピトープを含むコードヌクレオチド配列をクローニングすることにより構築した。主要なエピトープを、エピトープへの抗体反応頻度および反応強度（力価）に基づいて選択した（Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．ら、（１９９４）  Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ、３２０−３２４頁）。ＨＣＶエピトープをコードする種々のＤＮＡ  セグメントを、ＰＣＲ増幅によりまたは合成オリゴヌクレオチドにより構築した。各セグメント中にコードされるアミノ酸コドンを、各セグメントの下に示す。完全なＨＣＶ−１アミノ酸配列（３０１１アミノ酸）が、Ｃｈｏｏら（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５により決定された。ＨＣＶに結合し得るオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，３５０，６７１号に記載される。本発明のエピトープ中のアミノ酸の番号は、Ｃｈｏｏら（前出）に提供される番号表示に従う。ここで、アミノ酸＃１はコア領域のコード配列によりコードされる最初のメチオニンである。例えば、コア領域由来のエピトープセグメントは、ＨＣＶコアタンパク質のアミノ酸コドン１０〜５３にコードされる。ｃ３３ｃ領域由来のエピトープは、アミノ酸コドン１１９２〜１４５７にコードされる。
【００５７】
ＭＥＦＡ−３構築物は、発現カセット中にコアセグメントエピトープアミノ酸１０−３５の２つのコピー；アミノ酸１１９２−１４５７由来のｃ３３ｃエピトープセグメントの１つのコピー；ＨＣＶ  ＮＳ４領域（特に５−１−１領域）由来の等価抗原決定基の３つのコピー、ここで２つのエピトープは、ＨＣＶタイプ１のＮＳ４  ５−１−１領域由来のセグメント（アミノ酸１６９４〜１７３５）であり、一方、１つのコピーは、アミノ酸１６９４〜１７３５由来のＨＣＶ  タイプ２（Ｎｏｍｏｔｏ）のＮＳ４  ５−１−１領域由来のセグメントである；アミノ酸１９０１−１９４０由来のＮＳ４（Ｃ１００）Ｃ末端領域主要エピトープの２つのコピー；ならびにＮＳ５領域のアミノ酸２２７８−２３１０由来の主要エピトープの２つのコピーを含む。ＭＥＦＡ−３発現カセットは、  Ａｘ−Ｂｙ−Ｃｚについて一般構造式２−１−２−１−２−２を有し、ここでＡ＝コア−コア−ｃ３３ｃ、ｘ＝１；Ｂ＝（５−１−１）、ｙ＝３；およびＣ＝（ｃ１００）−（ｃ１００）−（ＮＳ５）−（ＮＳ５）、ｚ＝１である。
【００５８】
他のＨＣＶ  ＭＥＦＡは、  ＭＥＦＡ−５およびＭＥＦＡ−６を含み、この発現カセットを、図２および表１、ならびに図３および表２にそれぞれ記載されるように、縦列に主要なエピトープを含むコードヌクレオチド配列をクローニングすることにより構築した。ＭＥＦＡ−５およびＭＥＦＡ−６中のエピトープのすべてが、５−１−１エピトープの３つの等価抗原決定基の２つを除いてＨＣＶタイプ１由来であることに注意する。５−１−１領域由来のエピトープがＨＣＶ血清型間で変異する事が見いだされた。本明細書中に記載のＭＥＦＡ中に存在するＨＣＶタイプ特異的５−１−１エピトープの各々のコピーは、試験生物学的サンプル中に存在し得る任意のＨＣＶタイプを結合させる。ＨＣＶのようなウイルス血清型を区別するのに有用なエピトープを、繰り返しの等価抗原決定基として提供し、単一のアッセイにおいて多数のタイプのウイルスまたは病原体を検出することが本発明の特徴である。ＨＣＶ血清型を検出する方法はＷＯ９６／２７１５３に見いだされる。
【００５９】
（表１  ＭＥＦＡ−５抗原エピトープおよびＨＣＶゲノム内のその配置）
【００６０】
【表１】
2007127671.tif 000003
（表２  ＭＥＦＡ−６抗原エピトープおよびＨＣＶゲノム内のその配置）
【００６１】
【表２】
2007127671.tif 000004
ＭＥＦＡ−５およびＭＥＦＡ−６の調製のためのクローニング手順は、上記のＭＥＦＡ−３を調製するために用いられる手順に類似していた。ＭＥＦＡ−５およびＭＥＦＡ−６は、ＨＣＶ株１、２、および３由来の等価抗原決定基を含む、Ｃ型肝炎ポリタンパク質のコア、エンベロープ、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５領域由来のエピトープを含んだ。ＨＣＶエピトープをコードする種々のＤＮＡセグメントを、ＰＣＲ増幅によりまたは合成オリゴヌクレオチドにより構築した。図２および３は、ＭＥＦＡ−５および−６に用いられたＨＣＶゲノム内のエピトープの配置、ならびにＭＥＦＡベクター構築物を示す概略表示である。表１および２は、それぞれ、ＭＥＦＡ−５およびＭＥＦＡ−６カセットにおける各エピトープのアミノ酸セグメント、種々のエピトープの直鎖状配置、ならびにコピーの数を記載する。各エピトープ間のアミノ酸（接合部アミノ酸）は、クローニングに用いられる制限部位由来である。好ましくは、ＭＥＦＡは、非病原体（例えば、ＨＣＶ）接合部アミノ酸に起因する偽陽性結果についてイムノアッセイで試験される。ＭＥＦＡ−５は、そこではコアセグメントがＭＥＦＡ−５ではＮ末端の付近にあるが、ＭＥＦＡ−６ではＣ末端にある点で直鎖状配置がＭＥＦＡ−６とは異なる。アミノ酸１０−５３コアエピトープは高抗原性であるので、そのＣ末端での配置は、おそらくコアタンパク質およびＥ１およびＥ２領域由来の抗原由来のエピトープとサンプルの抗ＨＣＶ抗体との改善された相互作用により、ＭＥＦＡの抗原性を改良する。
【００６２】
エピトープを、酵母発現ベクターにサブクローニングし、そして配列を２０６０塩基対のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメント（ＭＥＦＡ−５およびＭＥＦＡ−６について）および約１９２７塩基対のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメント（ＭＥＦＡ−３について）として全体の融合抗原を組立てる前に確認した。ＭＥＦＡ−５およびＭＥＦＡ−６を、ハイブリッドＡＤＨ２−ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下でヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）融合タンパク質（ｈＳＯＤの１５７アミノ酸）としてクローニングした。ＭＥＦＡ−５およびＭＥＦＡ−６発現カセットを、酵母シャトルベクターｐＡＢ２４（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に連結し、それぞれ図２および図３に示されるようにｐＭＥＦＡ−５およびｐＭＥＦＡ−６を産生した。
【００６３】
図３に示すように、ＭＥＦＡ−６抗原は、コアおよびＮＳ５領域由来のＨＣＶエピトープの複数のコピー；ＮＳ４  ５−１−１領域由来の異なる血清型エピトープ；ｃ１００  Ｃ末端領域、Ｅ１およびＥ２領域、ならびにＨＣＶ  ＮＳ３（ｃ３３ｃ）領域由来の主要な直鎖状エピトープの単一のコピーを含む。ＭＥＦＡ−６の一般構造式は、ｈＳＯＤ−−Ｅ１−Ｅ２−ｃ３３ｃ−５−１−１（タイプ１）−５−１−１（タイプ３）−５−１−１（タイプ２）−ｃ１００−ＮＳ５（２コピー）−コア（２コピー）である。この抗原は、酵母中で非常に高発現レベルを有し、高度の同質性に精製し、そして下記のイムノアッセイ中で高感度および高選択性を示す。
【００６４】
ＭＥＦＡの酵母中での発現
酵母中におけるＭＥＦＡの発現の以下の実施例は、本発明の任意のＭＥＦＡの発現に適用し得る。必要に応じて条件を変更し、特定のＭＥＦＡ構築物を発現することは本発明の範囲内である。本発明のＭＥＦＡの発現に好ましい細胞としては、細菌、酵母、および昆虫細胞が挙げられる。酵母におけるＭＥＦＡ−６の発現は、本発明の限定されない実施例として提供される。
【００６５】
酵母株ＡＢ１２２、ＪＳＣ３１０、およびＡＤ２（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、酢酸リチウムプロトコルを用いて、適切なＭＥＦＡ発現プラスミド（例えばｐＭＥＦＡ−６）で形質転換した。Ｕｒａ−形質転換体を単一のコロニーについてストリークし、プラスミドコピー数を増加するためにＬｅｕ−／８％グルコースプレートにパッチした。Ｌｅｕ−開始培養物を、２４時間３０℃で増殖させ、次いでＹＥＰＤ（酵母抽出物バクトペプトングルコース）培地で１：２０に希釈した。細胞を４８時間３０℃で増殖させ、そして回収した。ＭＥＦＡ−６組換え抗原の発現を試験するために、細胞のアリコート（０．５  ＯＤ単位等価）を、５０ｍＭ  ＤＴＴを含むＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）ゲル電気泳動サンプル緩衝液（例えば、Ｌａｍｍｌｉ緩衝液）中で煮沸し、細胞混合物のタンパク質成分を、Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル上でゲル電気泳動により分離した。ＭＥＦＡ−６は、不溶性ペレット画分中に非常に富んでいた。
【００６６】
酵母中のＭＥＦＡタンパク質の精製
以下の手順は、特定のＭＥＦＡ、ＭＥＦＡ−６の精製を記載する。技術および条件は、本発明を限定する意図はない。なぜなら、当業者は、本発明の別のＭＥＦＡの精製のための条件を調整する必要があることを見いだし得るからである。他に示さない限り、ＭＥＦＡの精製は約０℃で処理される。
【００６７】
ＭＥＦＡ−６を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現させ、細胞を上記のように回収した。細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ８．０）中に懸濁し、そしてＤｙｎｏ−Ｍｉｌｌ（Ｗａｂ  Ｗｉｌｌｙ  Ａ．  Ｂａｃｈｏｆｏｎ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）またはガラスビーズを用いる同等の装置で溶解した。溶解物を、低速度条件（３，０００〜５，０００ｒｐｍ、１５分間）で遠心分離し、そして不溶性タンパク質画分を含むペレットを、溶解緩衝液中の尿素濃度（１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ）を増加させて洗浄した。タンパク質を、溶解緩衝液中０．１Ｎ  ＮａＯＨ、４Ｍ尿素で遠心分離ペレットから可溶化した。細胞片を、低速度遠心分離（３，０００から５，０００ｒｐｍ、１５分間）により除去した。上清を、６Ｎ  ＨＣｌでｐＨ８．０に調整し、これらの条件下で不溶性のタンパク質を沈殿させた。
【００６８】
沈殿物を遠心分離によって除去し、上清を２．３％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ８．０）に調整し、そして３分間煮沸した。混合物中のタンパク質を、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含み、そしてｐＨ７．４に調整したリン酸緩衝化生理食塩水において、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００上でゲル濾過により分画した。ＭＥＦＡ−６を含むカラム溶出画分を回収し、プールし、そしてＡｍｉｃｏｎ  ＹＭ−３０膜で濃縮した。ゲル濾過を、プールした画分について同じカラムおよび条件を用いて繰り返した。
【００６９】
ＭＥＦＡの抗原性の評価
本発明のキメラ抗原の抗原性を評価するために、ＭＥＦＡ−３のエピトープを、特定の個々のエピトープに対して惹起したポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体に暴露した。精製した組換え複数エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）を、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）において至適なコーティング濃度に希釈し、Ｉｍｍｕｌｏｎ  Ｉプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）上にコートした。コア、ＮＳ３（ｃ３３ｃ）、ＮＳ４（ｃ１００および５−１−１）、ＮＳ５に対するモノクローナル抗体ならびにウサギ由来のポリクローナル抗血清抗Ｅ１およびＥ２を、標準的な技術（ＢＩＯＳ−Ｃｈｉｌｅ、Ｍａｒａｔｏｎ  １９４３，Ｓａｎｔｉａｇｏ，Ｃｈｉｌｅ）により調製し、そしてプレート上でサンプル希釈液で２００倍に希釈し、３７℃で１時間インキュベートし、そしてプレート洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０７５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．２）で洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合したヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２またはアフィニティ精製ヤギ抗ウサギＩｇＧのいずれかの重鎖および軽鎖特異的抗体（抗マウス結合物に対して１：５０００希釈；抗ウサギ結合物に対して１：１０，０００希釈）を、各アッセイウェル  に添加した。このプレートを、３７℃で１時間インキュベートし、そして洗浄した。ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）および過酸化水素を、西洋ワサビペルオキシダーゼ反応呈色物（ＨＲＰＯ）として添加した。光学密度の読みを、４９２ｎｍ／６２０ｎｍでプレートリーダーを用いて測定した。
【００７０】
結果は、設計されたＭＥＦＡ内のすべての抗原エピトープが、本発明のすべてのＭＥＦＡに対する特異的ＨＣＶ抗体により容易に検出されたことを示した。例えば、表３は、個々のエピトープ、ならびにＨＣＶ特異的エピトープのモノクローナル抗体に対するキメラ抗原（ＭＥＦＡ−３）の免疫反応性についてのデータを提供する。表３に示すように、ＭＥＦＡ−３のコア、ｃ３３ｃ、ｃ１００、５−１−１およびＮＳ５エピトープは、ＨＣＶ特異的抗体と免疫反応性であった。表４は、ＭＥＦＡ−５およびＭＥＦＡ−６のエピトープｃ３３ｃ、ｃ２２、５−１−１、ｃ１００、ＮＳ５、Ｅ１およびＥ２がＨＣＶ特異的抗体と免疫反応性であることを示す。
【００７１】
（表３  ＭＥＦＡ−３抗原のＨＣＶ特異的エピトープ：抗ＨＣＶモノクローナル抗体による評価）
【００７２】
【表３】
2007127671.tif 000005
（表４  ＭＥＦＡ−５およびＭＥＦＡ−６内のＨＣＶエピトープ曝露）
【００７３】
【表４】
2007127671.tif 000006
Ｒ＝反応
ＮＲ＝反応せず。
【００７４】
阻害アッセイ：ペプチド阻害アッセイを、ＭＥＦＡ抗原上の抗原型特異的エピトープが、血清中のＨＣＶタイプ特異的抗体を検出するかどうかを試験するために行った。アッセイは、溶液中のＭＥＦＡが血清ＨＣＶタイプ特異的抗体に結合し、それにより抗原型特異的ペプチドが固相支持体上の抗原性種である連続するＥＬＩＳＡ反応を阻害する程度を評価した。図４は、固相支持体結合抗原への結合が酵素触媒加水分解により検出される、標準ＥＬＩＳＡ手順の模式図である。
【００７５】
阻害アッセイを、複数の抗原ＥＬＩＳＡにより行った。組換えＨＣＶ抗原を、Ｃｈｉｅｎら（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：１００１１−１００１５に記載されたように調製した。ｃ２２（１１９アミノ酸）、Ｅ１（１３０アミノ酸）、ＮＳ５（９４２アミノ酸）、およびキメラＣ２５（８５８アミノ酸）抗原を、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）とのＣ末端融合物として、ｃ１００−３（３６３アミノ酸）抗原の生成について以前に記載された方法（Ｋｕｏ，Ｇら（１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：３６２−３６４、参考として本明細書中に引用されている；およびＣｏｕｓｅｎｓ，Ｌ．Ｓ．ら（１９８７）、Ｇｅｎｅ  ６１：２６５−２７５、参考として本明細書中に引用されている）を用いて、酵母Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内の内部抗原として発現した。ｃ３３ｃ抗原（３６３アミノ酸）を、５−１−１抗原の合成について記載された方法（Ｃｈｏｏ，Ｏ．−Ｌ．ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：３５９−３６２、（本明細書中に参考として引用される））によりＥ．ｃｏｌｉ中に内部ＳＯＤ融合ポリペプチドとして発現した。組換えＨＣＶ抗原を、Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．ら（（１９８９）ＰＮＡＳ  ８９：１００１１−１００１５、前出、本明細書中に参考として引用されている）に記載されたように精製した。
【００７６】
阻害アッセイを行う前に、患者サンプル希釈ブレーキングポイントを決定した（表５）。患者サンプルを、系列希釈し、そして固相支持体上に別々に固相化された組換えｃ２２、ｃ３３ｃ、ｃ１００およびＮＳ−５抗原に対する反応性について試験した（例えば、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｅｌ，Ｃ．Ｌら、（１９９１）  Ｌａｎｃｅｔ  ３３７：３１７−３１９を参照のこと（本明細書中に参考として引用される））。希釈ブレーキングポイントは、結合がなお検出可能である最大希釈であった。連続する阻害アッセイにおける至適な検出のために、患者サンプルは、表５に示されるように、希釈ブレーキングポイント希釈より低い希釈であった。
【００７７】
（表５  患者サンプルＭＥＦＡ−３抗原エピトープについての検出限界決定）
【００７８】
【表５】
2007127671.tif 000007
ＮＲ＝反応せず
ＮＤ＝試験せず。
【００７９】
一般に、阻害アッセイを以下の手順により行った。組換えＨＣＶ抗原および変性ＳＯＤ（コントロール）をリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）で至適な濃度に希釈し、そしてＩｍｍｕｌｏｎ  Ｉプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）上にコートした。３０％牛胎児血清（ＦＣＳ）または３０％ＦＣＳ中に溶解されたＭＥＦＡ−３ペプチド（示されたようにアッセイあたり５または１０μｇ）のいずれかの２００μｌアリコートを、５μｌの希釈血清または血漿試料とプレート上で混合した。サンプルを３７℃で１時間インキュベートし、そしてプレート洗浄緩衝液で洗浄した。１２５Ｉまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のいずれかに結合したポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ（重鎖および軽鎖特異的）抗体を各ウェルに加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次いで洗浄した。ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩および過酸化水素を、ＨＲＰ呈色剤として加えた。結果を、４９２ｎｍ／６２０ｎｍ（ＥＬＩＳＡ）でプレートリーダーを用いて読んだ。ＳＯＤ、Ｃ２５、ｃ２２、Ｅ１、Ｅ２、ｃ３３ｃおよびＮＳ５領域由来の抗原についてのＥＬＩＳＡカットオフＯＤ値は、各アッセイに含まれる３つの陰性コントロール血清の０．４０＋平均ＯＤであった。コントロールＳＯＤ抗原が反応性であった場合、それによりサンプルは非反応性または不確定であると考えられた。結合阻害の割合を以下の式により計算した：１００×（加えたＭＥＦＡ抗原を含まない患者サンプルについてのＡ４９２ｎｍ）−（加えたＭＥＦＡ抗原を含む患者サンプルについてのＡ４９２ｎｍ）／（加えたＭＥＦＡ抗原を含まない患者サンプルについてのＡ４９２ｎｍ）。加えたＭＥＦＡ−３により引き起こされたタイプ特異的ペプチドに対する結合阻害％は、患者サンプルの抗ＨＣＶ抗体を結合するＭＥＦＡ−３内のエピトープの能力を示す（表６を参照のこと）。
【００８０】
（表６  MEFA-3の特定のエピトープによる結合阻害）
【００８１】
【表６】
2007127671.tif 000008
抗ＨＣＶタイプ１および抗ＨＣＶタイプ２抗体と相互作用するＭＥＦＡ−３の能力を、ＭＥＦＡ  ＥＬＩＳＡプロトコルを用いる阻害研究により証明した。ＨＣＶタイプ１ａ、１ｂ、２ａおよび２ｂ  ５−１−１領域由来の個々の合成ペプチドを、別々の固相支持体上に固相化した。タイプ特異的患者抗体に結合する５−１−１領域由来の合成ペプチドの能力を、加えたＭＥＦＡ−３との競合により測定した。表７の結果は、ＭＥＦＡ−３が、個々のタイプ特異的エピトープ（５−１−１領域由来のアミノ酸１６８９−１７１８）へのＨＣＶ  １ａ、１ｂ、２ａおよび２ｂの結合を阻害することを示す。ＭＥＦＡのＨＣＶの２つの異なる株に対する抗体を結合する能力は、ＭＥＦＡ−３、ＭＥＦＡ−５およびＭＥＦＡ−６と同じであった。
【００８２】
（表７  ＨＣＶタイプ特異性：ＨＣＶタイプ１および２に対する抗体と相互作用するＭＥＦＡ−３  ５−１−１エピトープ）
【００８３】
【表７】
2007127671.tif 000009
実施例２：抗原としてＭＥＦＡを使用するＥＬＩＳＡの感度
希釈感度の比較を、ＭＥＦＡ  ＥＬＩＳＡ（ＭＥＦＡ−３）とＣ２５  ＥＬＩＳＡとの間で行った。ＨＣＶポリタンパク質Ｃ−２５（ｃ３３ｃ−ｃ１００−３−ｃ２２）およびアッセイ手順は、１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．０〜７．２）のコーティング緩衝液を使用する、Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１００１１−１００１５（前出）に記載された通りであった。抗原をＩｍｍｕｌｏｎ  Ｉプレートマイクロリットルウェルの表面に、１ウェルあたり１００  ｎｇの抗原および５μｇ／ｍｌのＢＳＡでコーティングした。サンプルサイズは、１アッセイあたり５μｌであった。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（重鎖および軽鎖特異的）抗体は、ＭＥＦＡ−３アッセイについては１：６０，０００に、そしてＣ２５アッセイについては１：４０，０００に希釈した。表８の結果は、Ｃ２５  ＥＬＩＳＡが反応を示さなかった希釈率で、ＭＥＦＡ−３  ＥＬＩＳＡを用いて血清抗体が検出可能であることを示す。ＭＥＦＡ−３、−５、および−６  ＣＬＩＡの感度を、互いにそしてＣ２５  ＥＬＩＳＡと比較した。表９の結果は、ＭＥＦＡ−５およびＭＥＦＡ−６  ＣＬＩＡは、ＭＥＦＡ−３  ＣＬＩＡより優れた感度を提供し、一方、ＭＥＦＡ−３  ＣＬＩＡは、Ｃ２５  ＥＬＩＳＡより感度が高かったことを示す。
【００８４】
（表８  希釈感度：ＭＥＦＡ  ＥＬＩＳＡとＣ−２５  ＥＬＩＳＡとの間の比較研究）
【００８５】
【表８】
2007127671.tif 000010
（＋／−）＝カットオフ値に近いＯＤ
ＮＲ＝非反応性
Ｃ−２５  ＥＬＩＳＡは２Ｇ（第２世代）ＨＣＶ  ＥＬＩＳＡに等しい。
【００８６】
（表９  ＭＥＦＡ−３対ＭＥＦＡ−５対ＭＥＦＡ−６対ｃ２５の希釈感度）
【００８７】
【表９】
2007127671.tif 000011
Ｓ／ＣＯ＝感度（ＯＤ）／カットオフ（ＯＤ）。
【００８８】
セロコンバージョン感度アッセイは、感染に応答した力価の増加として病原体特異的抗体を検出する方法の感度を測定する。一人のＨＣＶ感染患者からの血液サンプルについて、Ｃ２５  ＥＬＩＳＡと比較したＭＥＦＡ−３  ＥＬＩＳＡの経時的感度を、表８に示す。ＭＥＦＡ−３は、感染後の早い時期にＣ２５  ＥＬＩＳＡよりも高い感度で抗体を検出した。
【００８９】
現存する市販のアッセイに対するＭＥＦＡを使用する化学発光イムノアッセイの感度および簡便性
トレーサーとしてのＭＥＦＡ
ＭＥＦＡ−６組換え抗原を使用して、Ｃｈｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＡＣＳ−ＮＧシステム（Ｆモデル）上で、手動化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）ならびに自動ＣＬＩＡを設計した。
【００９０】
ＨＣＶ  ｒ−Ａｇ−ＤＭＡＥ  ＣＬＩＡ（ＨＣＶ組換え抗原−ジメチルアクリジニウムエステル化学発光イムノアッセイ）と称されるＣＬＩＡを開発した（図５）。ポリペプチドまたは合成ペプチド抗原を、ＤＭＡＥに共有結合した反応性部分とのアミノ酸側鎖（例えば、リジン側鎖またはシステインチオール）の反応によって、ＤＭＡＥで標識した（ＷＯ  ９５／２７７０２、１９９５年１０月１９日公開、Ｃｈｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．を参照のこと）。本明細書中に記載のＨＣＶ  ＭＥＦＡを、リジン側鎖のアミノ基とＣｈｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇから入手したＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳ（２’，６’−ジメチル−４’−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）フェニル１０−（３’−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキシレート）との反応によって標識した。アミノ酸側鎖のチオールは、ＤＭＡＥ−ＥＤ−ＭＣＣまたはＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＰＥＧ−ＢｒＡｃ（Ｃｈｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して標識し得る。標識手順は、一般的に、ＷＯ  ９５／２７７０２（前出）に、最適な検出および抗原性を提供するために各抗原に必要な種々の条件とともに記載されている。他の検出可能なマーカー（例えば、蛍光化合物、ローダミン化合物、抗体、抗原、酵素など）が、本発明において有用であるということが理解される。任意のマーカーでの標識を、ＭＥＦＡまたは他のエピトープの最適な検出および抗原性が得られる条件下で行う。
【００９１】
ＤＭＡＥがアッセイにおいて検出可能なマーカーである場合、得られるＨＣＶ  ｒ−Ａｇ−ＤＭＡＥ結合体はトレーサーであり、ＤＭＡＥは、ＮａＯＨ／Ｈ２Ｏ２と反応した場合に発光によって検出可能である。特定のＭＥＦＡ（例えば、ＭＥＦＡ−６）をアッセイに使用した場合、そのアッセイをＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ  ＣＬＩＡと称した。
【００９２】
手動アッセイ。本明細書中に開示された研究に使用された手動ＨＣＶ  ｒ−Ａｇ−ＤＭＡＥ  ＣＬＩＡプロトコルを、最初に説明する。Ｍａｇｉｃ  Ｌｉｔｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ（ＭＬＡ  ＩＩ）を、手動アッセイに使用した。容量、濃度、時間、および温度のようなパラメーターは、ガイダンスのために提供される。抗体検出を得るためのこれらのパラメーターの変化は、本発明の範囲内である。試験サンプルの２〜１０μｌのアリコートを、対応するチューブに添加した。試験サンプルは、抗ＨＣＶ抗体を含む生物学的液体（例えば、血漿または血清）が好ましい。各チューブに、５０μｌの水を添加し、続いて１００μｌのビオチン化組換え抗原、合成ペプチド、またはＤＭＡＥとポリペプチドとの直接結合体（例えば、ＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ、ｃ３３ｃ−ＤＭＡＥ、ｃ−２００−ＤＭＡＥ、およびｃ２２−ＤＭＡＥ）を添加する。抗原を、リガンド試薬（ＬＲ）希釈剤で、約０．１μｇ／アッセイ〜１μｇ／アッセイの濃度に希釈した。好ましくは、所定量のリガンド試薬を各サンプルに添加し、約２５×１０６光単位当量（相対光単位、ＲＬＵ）が、アッセイ毎に存在するようにした。光単位当量のこの概量は、１つのリガンドまたは複数のリガンドの添加について好ましかった。ＬＲ希釈剤は、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０％  ＢＳＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０９％  ＮａＮ３、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含んでいた。抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃに付着するＰＭＰ（常磁性粒子）の１００〜１５０μｌアリコートを、約６０μｇ／アッセイの最終濃度で、各チューブに添加した。好ましくは、常磁性粒子は、直径約１０μｍ未満であった。抗ＩｇＧＦｃ−ＰＭＰ粒子を、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７５％ＢＳＡ、０．１％カゼイン、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％イーストエキストラクト、０．２５％  Ｅ．ｃｏｌｉエキストラクト、０．００５％  ＳＯＤ、０．０９％  ＮａＮ３、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む希釈剤で希釈した。完全な混合を確実にするために、チューブを、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで、各回につき５〜１０秒で６回振盪した。サンプルチューブを、３７℃で１８分間インキュベートした。サンプルチューブを、３分間（ＰＭＰ粒子の沈殿に十分な時間）磁石上に置いた。サンプルを、磁石を用いてデカンテーションし、ＰＭＰ粒子を維持した。ＰＭＰ粒子を、１ｍｌのＰＢＳ中でボルテックスして２回洗浄した。洗浄液は、ＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０９％  ＮａＮ３、１ｍＭ  ＥＤＴＡであった。混合、インキュベート、沈殿、デカンテーションの工程を、少なくとも一回反復し得る。各チューブに１００μｌの水を添加し、ＰＭＰ粒子を再懸濁した。次いで、チューブをＭＬＡ−ＩＩ機器に置き、そして発光を２秒間測定した。
【００９３】
手動ＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ  ＣＬＩＡ法は、ＭＥＦＡ−６  ＥＬＩＳＡと比較して増強された検出感度を提供した。８希釈感度パネルの研究に続いて、ＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ  ＣＬＩＡが、８パネルのうちの６つにおいて、ＥＬＩＳＡより良好な希釈感度を示すことが見出された。
【００９４】
重要なことに、ＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ  ＣＬＩＡ法は、試験した慢性感染ＨＣＶ患者からの全てのサンプルにおいてＨＣＶ抗体の存在を検出した。例えば、２９の慢性Ｃ型肝炎感染個体のうち、２６がＣ２５  ＥＬＩＳＡを用いて陽性であったが、２９全てが本発明のＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ  ＣＬＩＡを用いて陽性であった。さらに、偽陽性結果は、ＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ  ＣＬＩＡによる２００のランダムなサンプルの試験では認められなかった。ＣＬＩＡ法の他の利点は、共分散が１０％未満のアッセイ間およびアッセイ内精度である。さらに、ＣＬＩＡは、ＥＬＩＳＡに比べて、より広範な応答範囲および改善された直線性を有する。
【００９５】
自動化アッセイ。以下のプロトコルを有する自動化ＭＥＦＡ−ＤＭＡＥアッセイもまた、使用した。Ｆモデル自動化分析装置を、アッセイのために使用した。１０μｌのサンプル（例えば、ヒト抗ＨＣＶ抗体を含む生物学的液体）を、各サンプルチューブに添加した。次いで、自動化サンプラーが、各サンプルチューブに、以下のものを同時に分配した：１００μｌのＨＣＶ  ｒ−Ａｇ−ＤＭＡＥ結合体（１試験あたり合計約２５×１０６光単位当量を有する）および常磁性粒子に付着させた１５０μｌの抗ヒトＩｇＧＦｃ（１アッセイあたり６０μｇのＩｇＧＦｃ）および４０μｌの水バッキング（ｗａｔｅｒ  ｂａｃｋｉｎｇ）。リガンド希釈剤およびＩｇＧ−ＰＭＰ希釈剤は、上記の手動アッセイのものであった。ボルテックスによる混合を必要としなかった。サンプルを、加熱ブロック上で、３７℃まで１８分間加熱した。血清サンプル中に存在するＨＣＶ抗体に結合した抗ヒトＩｇＧ  ＦＣ  ＰＭＰ粒子を、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０９％  ＮａＮ３、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳの洗浄緩衝液中に再懸濁して、３回洗浄した。磁石を使用してＰＭＰ粒子を維持する一方、サンプル上清を吸引した。粒子を、５００μｌの洗浄緩衝液に再懸濁した。自動化法を使用すると、混合、インキュベート、沈殿、およびデカンテーション工程を繰り返す必要がなく、このことが、ＨＣＶ  ｒ−Ａｇ−ＤＭＡＥ  ＣＬＩＡアッセイを現存する市販のアッセイと比較して、効率的（２０分対４０分）で、感度よく、正確にした。
【００９６】
ＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ  ＣＬＩＡおよびＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ＋ｃ３３ｃ−ＤＭＡＥ  ＣＬＩＡは、複数抗原ＨＣＶ  ２．０Ｇ  ＥＬＩＳＡテスト（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）（別々の組換えペプチドｃ１００−３、ｃ２２−３、およびｃ２００（ｃ１００−３に連結したｃ３３ｃ）を含む）と比較した場合、より良好であるかまたは等しい感度および特異性を有した（図７を参照のこと）。さらに、本発明のアッセイ法は、実施するのが容易である。なぜなら、１つの簡単な組換え捕獲抗原を用いる、単一の機器での１工程同時アッセイであるからである。本発明のさらなる実施態様によれば、さらなるエピトープは、構造エピトープＣＨＯ  Ｅ１またはＣＨＯ  Ｅ２（チャイニーズハムスター卵巣細胞から発現されるＨＣＶエピトープＥ１またはＥ２）のようなＭＥＦＡの異なるエピトープで有り得、そして上記の実施例のさらなるエピトープｃ３３ｃのために記載されるような検出可能なマーカーで標識され得る。ＨＣＶからのこのような構造エピトープおよびそれらを含むイムノアッセイは、ＷＯ  ９６／０４３０１、ＷＯ  ９４／０１７７８、ＷＯ  ９５／３３０５３、ＷＯ  ９２／０８７３４（前出）に記載される。
【００９７】
セロコンバージョン感度
ＭＥＦＡ−６キメラ抗原のセロコンバージョン感度もまた、ＣＬＩＡ（検出可能なマーカーとしてＤＭＡＥ）によって決定し、そして市販のＥＬＩＳＡ法と比較した。抗原としてＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ単独を用いることに加えて、ＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ＋ｃ３３ｃ−ＤＭＡＥの混合物を、本発明の別の実施態様として、セロコンバージョン感度について試験した。血液サンプルを、慢性感染ＨＣＶ患者から経時的に得て、上記の手順を用いてＣＬＩＡによって試験し、そしてＯｒｔｈｏ  ３．０  ＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ）（表１０のみ）およびＡｂｂｏｔｔ  ２．０  ＥＬＩＳＡ（図８および表１０を参照のこと）の性能と比較した。感度を、（アッセイサンプルの光学密度）／（光学密度単位アッセイ検出カットオフ）（Ｓ／ＣＯ）として報告した。
【００９８】
これらのサンプルにおけるＨＣＶ抗体の検出もまた、市販のストリップイムノブロットアッセイ（ＲＩＢＡ（登録商標）３．０  Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって実施した。このアッセイは、ＨＣＶ抗体検出のための確認試験として臨床的に使用される。ＲＩＢＡ（登録商標）法によれば、組換えＨＣＶ抗原は、ゲル電気泳動によって分離され、そして患者血清と接触させられる。分離した抗原との反応性は、二次標識抗体を用いるイムノブロットアッセイによって実施される（Ｅｈｅｌｉｎｇ，Ｆら  （１９９１）  Ｌａｎｃｅｔ  ３３７：９１２−９１３）。
【００９９】
図８および表１０中の比較の結果は、ＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ＋ｃ３３ｃ−ＤＭＡＥアッセイが、ＨＣＶ抗体を、より早期の採血日により高い感度で検出可能であったことを示す。ＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥおよびＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ＋ｃ３３ｃ−ＤＭＡＥアッセイは、より早期の採血時期で、市販のアッセイまたは確認ＲＩＢＡ（登録商標）テストのいずれよりも、高感度であった。
【０１００】
本発明のＭＥＦＡ  ＣＬＩＡ法を、商業的供給元からのＥＬＩＳＡと比較し、ＭＥＦＡ  ＣＬＩＡが真の陽性および真の陰性サンプルを確実に検出することを確認した。図９の結果は、本発明のＭＥＦＡ  ＣＬＩＡを用いるＨＣＶ抗体検出は、商業的に使用されるＨＣＶ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の抗体検出と密接に相関することを示す。サンプルが、市販のアッセイによってＨＣＶ抗体について陽性と、そしてＭＥＦＡ  ＣＬＩＡによって陰性とアッセイされた場合、このサンプルは、確認ＲＩＢＡ（登録商標）テストによって陰性（非反応性）であることがわかった。このことは、本発明のＭＥＦＡ  ＣＬＩＡの正確性をさらに支持する。
【０１０１】
（表１０  セロコンバージョン感度）
【０１０２】
【表１０】
2007127671.tif 000012
セロコンバージョンパネルＩＤ：Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．抗ＨＣＶセロコンバージョンパネル（ＰＨＶ９０２）。
【０１０３】
ＨＣＶ抗体の検出の正確性を、ＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ  ＣＬＩＡを用いてさらに実証した（図１０を参照のこと）。献血センターからの２００のランダムな陰性サンプルおよび４２の既知のＨＣＶ陽性サンプルを、上記のＭＥＦＡ−ＤＭＡＥ  ＣＬＩＡプロトコルを用いて試験した。図１０に示すように、陰性サンプルを試験した場合、偽陽性は見出されず、そして既知の陽性サンプルを試験した場合、陰性結果は得られなかった。
【０１０４】
ビオチン化ＭＥＦＡ
ＭＥＦＡを検出可能なマーカーとしてのビオチンに付着させ、そしてビオチン−ストレプトアビジン−ＤＭＡＥ連結を介してＤＭＡＥに間接的に付着させた、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）を開発した。この方法に従って、上記の抗ヒトＩｇＧＦｃ−ＰＭＰ粒子を、ヒト抗ＨＣＶ抗体を含む生物学的液体と接触させた。ヒト抗体を、抗ヒトＩｇＧＦｃ−ＰＭＰ粒子に結合させ、そしてＭＥＦＡ−ビオチンを、ヒトＨＣＶ抗体に結合させた。次いで、ストレプトアビジン−ＤＭＡＥ結合体を、ＭＥＦＡ−ビオチンに結合させた。約２５×１０６光単位当量のストレプトアビジン−ＤＭＡＥを、各試験サンプルに添加した。未結合物質を、サンプルから洗浄し、そしてＮａＯＨ／Ｈ２Ｏ２とのＰＭＰ粒子結合ＤＭＡＥの反応により発せられた光を、２秒間測定した。
【０１０５】
このＭＥＦＡ  ＣＬＩＡ法では、本明細書中にまた記載されるＭＥＦＡ−ＤＭＡＥ  ＣＬＩＡとは、ＭＥＦＡ−ＤＭＡＥ  ＣＬＩＡが、ＭＥＦＡに直接付着したＤＭＡＥトレーサー分子を有するが、ビオチン化ＭＥＦＡ  ＣＬＩＡは、ＤＭＡＥトレーサー分子を抗ＨＣＶ／ＭＥＦＡ複合体に結合させるために、さらなるビオチン／ストレプトアビジン連結を含む点で異なる。アッセイ手順の概略図を、図６に提供する。
【０１０６】
ＭＥＦＡがビオチンに付着されているＣＬＩＡを、上記のＭＥＦＡ−ＤＭＡＥ  ＣＬＩＡについての記載のように自動化し得る。これらの状況の下で、ストレプトアビジン−ＤＭＡＥを、結合および検出のためにサンプルに添加する。約２５×１０６光単位当量のストレプトアビジン−ＤＭＡＥ結合体を、試験混合物に好ましく添加した。
【０１０７】
本発明は示されており、そして本明細書中に記載されており、そして最も実用的で好適な実施態様であると考えられた。しかし、本発明の範囲内にあるこの実施態様からの変更がなされ得、そして自明な改変が本開示を読むことで当業者に思い浮かぶことが認識される。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、ＭＥＦＡ−３、ＭＥＦＡ−５、およびＭＥＦＡ−６抗原における、エピトープの同定（アミノ酸）および配置を示す模式図である。
【図２】図２は、ＭＥＦＡ−５抗原エピトープおよびそれらのＨＣＶゲノム内の配置を示す模式図である。ｐｍｅｆａ−５（ＭＥＦＡ−５の発現ベクター）の略図もまた提供される。
【図３】図３は、ＭＥＦＡ−６抗原エピトープおよびそれらのＨＣＶゲノム内の配置を示す模式図である。ｐｍｅｆａ−６（ＭＥＦＡ−６の発現ベクター）の略図もまた提供される。
【図４】図４は、ＭＥＦＡが固相支持体の表面上に吸着されている酵素結合免疫吸着イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）の模式図である。
【図５】図５は、ＭＥＦＡが検出可能マーカー分子ＤＭＡＥに接着している、化学発光による抗ＨＣＶ抗体の検出のための抗体捕捉形式の模式図である。ＭＥＦＡ（ＭＥＦＡ−６）およびさらなるエピトープ（ｃ３３ｃ）がアッセイの抗原である形式も示す。
【図６】図６は、抗原（ＭＥＦＡ）が、ＤＭＡＥで標識されたストレプトアビジンを結合するビオチン（Ｂ）に接着している、ヒト抗病原体抗体を化学発光により検出するための抗体捕捉形式の模式図である。
【図７】図７は、ＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥおよびＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ＋ｃ３３ｃ−ＤＭＡＥの希釈感度を、市販のＥＬＩＳＡであるＨＣＶ  ２．０Ｇ（第二世代）ＥＬＩＳＡの希釈感度と比較するプロットである。
【図８】図８は、市販のＥＬＩＳＡ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＭＥＦＡ−６、ＭＥＦＡ−６＋ｃ３３ｃ、およびＲＩＢＡ（登録商標）  ３．０のセロコンバージョン感度を比較するプロットである。サンプルは時間が経つにつれて（採血日）慢性的に感染した患者から得られた。
【図９】図９は、ＨＣＶ第二世代ＥＬＩＳＡによるサンプル中のＨＣＶ抗体検出（陽性または陰性）と、ＭＥＦＡ化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）による検出との相関図である。
【図１０】図１０は、本発明のＭＥＦＡ−６−ＤＭＡＥ  ＣＬＩＡの正確さを例示するチャートである。すべての既知の陰性サンプルは、カットオフ値を下回る相対光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ）（ＲＬＵ）を示す一方、既知の陽性サンプルはカットオフ値を十分上回るＲＬＵを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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