(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞周期をコントロールする方法、組成物およびシステムを提供する。【解決手段】幹細胞を休止状態（Ｇ0期）に維持または誘導する方法であって、該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する工程を含む方法を提供する。該方法において、脂質ラフトの集積阻害が、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βファミリーのメンバー等によって達成される方法を提供する。該方法により、幹細胞の維持、増殖を容易にかつ計画的にすることができ、幹細胞の同定も容易になる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導する方法であって、該方法は：
Ａ）該細胞の膜上の脂質ラフト（ｒａｆｔ）の集積を阻害する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記集積は、細胞膜上でスフィンゴ脂質およびコレステロールが集積したミクロドメインの有無によって判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脂質ラフトの集積阻害は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βファミリーのメンバー、メチルβシクロデキストリン、ｃ−ｓｒｃインヒビター、ＰＩ３Ｋインヒビターおよびｃ−ｓｒｃインヒビターからなる群より選択される少なくとも１つの因子により達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＧＦβは、配列番号１に示すヌクレオチド配列またはその改変体もしくは断片によりコードされるかまたは配列番号２にアミノ酸配列またはその改変体もしくは断片を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記脂質ラフトの集積阻害は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βファミリーのメンバーの活性化因子により達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＧＦβファミリーのメンバーの活性化因子は、インテグリンβ６およびプラスミンからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記脂質ラフトは、ｃ−Ｋｉｔリガンド（ＫＬ）（配列番号３（核酸配列）または配列番号４（アミノ酸配列））および血小板刺激因子（ＴＰＯ）（配列番号５（核酸配列）または配列番号６（アミノ酸配列））刺激によって細胞膜上に集積される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記脂質ラフトは、ｃ−ｋｉｔ（配列番号７（核酸配列）または配列番号８（アミノ酸配列））、ガングリオシドＧＭ−１およびｃ−ｍｐｌ（配列番号９（核酸配列）または配列番号１０（アミノ酸配列））からなる群より選択される少なくとも１つの因子を観察することによって同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞は、造血幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞は、骨髄造血幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記阻害は、Ａｎｇ−１（配列番号１１（核酸配列）または配列番号１２（アミノ酸配列））添加時よりも大きな阻害であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記阻害は、ＴＧＦβファミリーのメンバーによって達成される阻害と少なくとも同程度の阻害であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記阻害は、Ａｎｇ−１では達成できないがＴＧＦβで達成できる阻害濃度を特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記脂質ラフトの集積は、幹細胞因子（ＳＣＦ）（配列番号１３（核酸配列）または配列番号１４（アミノ酸配列））によって生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記阻害工程は、ＳＣＦおよび血小板刺激因子（ＴＰＯ）（配列番号５（核酸配列）または配列番号６（アミノ酸配列））の存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
細胞を保存する方法であって、
Ａ）該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
幹細胞を濃縮または純化するための方法であって、
Ａ）幹細胞を含むか含むと予測される試料を提供する工程；
Ｂ）該試料を幹細胞が生存する条件で培養する工程；および
Ｃ）該試料を細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する条件に暴露する工程
を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法によって得られた濃縮または純化された幹細胞。
【請求項１９】
幹細胞が濃縮または純化された組成物を生産するための方法であって、
Ａ）幹細胞を含む試料を提供する工程；
Ｂ）該試料を細胞の膜上の脂質ラフトの形成を阻害する条件に暴露する工程；および
Ｃ）該試料を幹細胞が生存する条件で培養する工程
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法によって得られた組成物。
【請求項２１】
細胞増殖を促進または誘導する方法であって、該方法は：
Ａ）該細胞の膜上の脂質ラフト（ｒａｆｔ）の集積を生じさせるかまたは促進する工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
前記集積を、細胞膜上でスフィンゴ脂質およびコレステロールが集積したミクロドメインの有無によって判定する工程を包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記脂質ラフトの集積は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βインヒビター、ｃ−ｓｒｃアクチベーター、およびガングリオシドからなる群より選択される因子により達成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＴＧＦβは、配列番号１に示す配列（ＴＧＦβ１）またはその改変体もしくは断片である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＴＧＦβのインヒビターは、ＴＧＦβのアンチセンス核酸、ＲＮＡｉ、抗体、化合物および低分子からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記脂質ラフトの形成促進は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βのＲＮＡｉにより達成される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記脂質ラフトは、ＫＬおよびＴＰＯ刺激によって細胞膜上に集積される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞は、造血幹細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞は、骨髄造血幹細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記脂質ラフトは、ｃ−ｋｉｔ、ＧＭ−１およびｃ−ｍｐｌからなる群より選択される少なくとも１つの因子を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記脂質ラフトの集積は、ＳＣＦおよびＴＰＯからなる群より選択される少なくとも１つの因子の存在下で行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
細胞を休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導するための因子を同定するためのスクリーニング方法であって、該方法は：
Ａ）該因子の候補物質を提供する工程；
Ｂ）該目的の細胞における脂質ラフトを観察する工程；
Ｃ）該因子を目的の細胞に暴露させる工程；および
Ｄ）該因子への暴露後の該目的の細胞における脂質ラフトを観察し、脂質ラフトの集積阻害を引き起こす因子は、該目的の細胞を休止状態に維持または誘導するための因子であると決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
さらに
Ｅ）前記因子を目的の細胞に暴露して細胞周期を調節し得るかどうかを確認する工程、
をさらに包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記脂質ラフトの観察は、蛍光色素染色およびウエスタンブロッティングからなる群より選択される手法により行われる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記因子は、幹細胞の同定、濃縮または純化に使用される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
細胞増殖を維持または誘導する因子を同定するためのスクリーニング方法であって、該方法は：
Ａ）該因子の候補物質を提供する工程；
Ｂ）該目的の細胞における脂質ラフトを観察する工程；
Ｃ）該因子を目的の細胞に暴露させる工程；および
Ｄ）該因子への暴露後の該目的の細胞における脂質ラフトを観察し、脂質ラフトの集積を引き起こす因子は、該目的の細胞の増殖を維持または誘導するための因子であると決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
幹細胞を休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導するシステムであって、該細胞の膜上のラフトの集積を阻害する手段を備えるシステム。
【請求項３８】
幹細胞を休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導する培地であって、該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する因子を含む培地。
【請求項３９】
細胞を保存するための培地であって、該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する因子を含む培地。
【請求項４０】
幹細胞を濃縮または純化するためのシステムであって、
Ａ）幹細胞を含むか含むと予測される試料を提供する手段；
Ｂ）該試料を幹細胞が生存する条件で培養する手段；および
Ｃ）該試料を細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する条件に暴露する手段
を備える、システム。
【請求項４１】
幹細胞を同定、濃縮または純化するための培地であって、該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する因子を含む培地。
【請求項４２】
細胞増殖を維持または誘導するシステムであって：該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を生じさせるかまたは促進する手段を備える、システム。
【請求項４３】
細胞増殖を維持または誘導する培地であって：該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を生じさせるかまたは促進する因子を含む培地。
【請求項４４】
細胞を休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導するための因子を同定するためのスクリーニングシステムであって、該システムは：
Ａ）該因子の候補物質を提供する手段；
Ｂ）該目的の細胞における脂質ラフトを観察する手段；
Ｃ）該因子を目的の細胞に暴露させる手段；および
Ｄ）該因子への暴露後の該目的の細胞における脂質ラフトを観察し、脂質ラフトの集積阻害を引き起こす因子は、該目的の細胞を休止状態に維持または誘導するための因子であると決定する手段、
を備える、システム。
【請求項４５】
細胞増殖を維持または誘導する因子を同定するためのスクリーニングシステムであって、該システムは：
Ａ）該因子の候補物質を提供する手段；
Ｂ）該目的の細胞における脂質ラフトを観察する手段；
Ｃ）該因子を目的の細胞に暴露させる手段；および
Ｄ）該因子への暴露後の該目的の細胞における脂質ラフトを観察し、脂質ラフトの集積を引き起こす因子は、該目的の細胞の増殖を維持または誘導するための因子であると決定する手段、
を備える、システム。
【請求項４６】
細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する因子の、幹細胞を同定し、あるいはその休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導するための使用。
【請求項４７】
細胞の膜上の脂質ラフトの集積を促進する因子の、細胞増殖を促進または誘導するための使用。
【請求項４８】
幹細胞を同定する方法であって、該方法は：
Ａ）判定される細胞の膜上の脂質ラフトの集積を観察する工程；および
Ｂ）集積が観察されない場合、該判定される細胞が幹細胞であると判定する工程
を包含する、方法。
【請求項４９】
前記判定は、前記細胞が未分化細胞であることを確認し、かつ、前記脂質ラフトの集積が観察されない場合に該細胞が幹細胞であると判定する工程を包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
幹細胞を同定するシステムであって、該システムは、
Ａ）判定される細胞の膜上の脂質ラフトの集積を観察する手段；および
Ｂ）集積が観察されない場合、該判定される細胞が幹細胞であると判定する手段
を備える、システム。
【請求項５１】
前記判定は、前記細胞が未分化細胞であることを確認し、かつ、前記脂質ラフトの集積が観察されない場合に該細胞が幹細胞であると判定することを包含する、請求項５０に記載のシステム。
【請求項５２】
幹細胞を同定するシステムであって、該システムは、
Ａ）判定される細胞の膜上の脂質ラフトの集積を観察するための蛍光色素染色またはウエスタンブロッティングのためのキットを備え、ここで、集積が観察されない場合、幹細胞があると判定することを特徴とする、システム。
【請求項５３】
前記判定は、前記細胞が未分化細胞であることを確認し、かつ、前記脂質ラフトの集積が観察されない場合に該細胞が幹細胞であると判定すると判定する工程を包含する、請求項５２に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の細胞周期の調節およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物およびヒトのような高等生物の生命維持および発達において、細胞周期の調節は、重要な要因である。細胞周期の調節により、整然とした系統的な細胞分化がおこり、最終的には未分化の単細胞から多様な特殊組織を有する高等構造の生物が発達する。
【０００３】
一般に、細胞周期の適切な調節は、生物にとって、初期成長の段階のみならず、生物の一生を通じて非常に重要である。従って、生物が成熟した後も、正常な周期発達は健常であることについて非常に重要である。例えば、血液形成および生殖器官において特定の細胞を調節することは非常に重要であることなどからも明らかである。
【０００４】
血液形成において重要な役割を果たしている造血幹細胞は、自己複製能および多分化能を兼ね備えている細胞である。造血幹細胞は、この二つの性質を利用して、一生にわたって全ての血液細胞を供給する。未分化で高い増殖能を持つ細胞であるにもかかわらず、大部分の造血幹細胞は通常、骨髄のニッシェと呼ばれる微小環境中でＧ０期に入っている。しかし、長期Brduとり込み実験などから３週間に一度程度の頻度で非対称性分裂を行うことにより、自分自身と前駆細胞を供給していると考えられている（非特許文献１；非特許文献２）。しかし、ニッシェ中にある造血幹細胞は、決してG0期に入りっ放しではなく、定期的に細胞周期（cell cycle）に入ることから、冬眠様状態という方が適切である。
【０００５】
最近、骨髄ニッシェが骨芽細胞領域にあり、Ang-1とその受容体であるTie-2、あるいはカドヘリンなどが造血幹細胞の冬眠様状態維持に関与していることが報告されたが(非特許文献３）、造血幹細胞の冬眠様状態の分子機構についての詳細は不明である。造血幹細胞の分化や自己複製の機構は生物学的のみならず臨床的にもきわめて重要な問題である。しかし、造血幹細胞が骨髄細胞中に数万個に一個の頻度でしか存在せず、得られる細胞数に限度があるためタンパク質レベルでの実験が困難であることから、造血幹細胞に関するサイトカイン受容体またはシグナル伝達に関連する分子についての研究にとって大きな障害になっていた。
【０００６】
本発明者らは、過去にＦＡＣＳを用いて成体マウス骨髄中の造血幹細胞を高度に濃縮する方法を確立し、高度に濃縮された造血幹細胞（ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞）を用いればｉｎ  ｖｉｔｒｏ  だけでなくｉｎ  ｖｉｖｏにおいてもクローナルな解析が可能であることを示してきた。
【０００７】
本発明において、本発明者らは、これらの高度に濃縮した造血幹細胞を対象として免疫染色法を組み合わせることにより単細胞レベルでの分子の局在やリン酸化を示す技術を開発し、造血幹細胞におけるシグナル伝達系の解析に応用することが可能となった。
【０００８】
本発明者らが最初に対象としたのは、サイトカイン刺激後の造血幹細胞における脂質ラフト（脂質ラフト）領域（ＬＲ）の集積形成である。細胞膜上のスフィンゴ脂質が会合して脂質ドメインであるＬＲでは、Ｓｒｃファミリーのキナーゼと他のシグナル伝達物質とが会合しており（非特許文献４，５）、細胞内へのシグナル伝達において重要な役割を果たしている。ＬＲに関する先駆的研究は、Ｔ細胞においてなされた。ＭＨＣとＴＣＲとの結合がＴ細胞膜上にＬＲの集積を引き起こすこと、そしてＬＲへのＴＣＲが局在化することの有無によるシグナルの違いが、ＴＣＲがＬＲに移行することでチロシンリン酸化の増大を引き起こすことが報告されている（非特許文献４，６，７，８）。
【非特許文献１】Cheshier，S.H.，Morrison，S.J.，Liao，X.，and Weissman，I.L．(1999)．In vivo proliferation and cell cycle kinetics of long-term self-renewing hematopoietic stem cells．Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．96，3120-3125.
【非特許文献２】Sudo，K.，Ema，H.，Morita，Y.，and Nakauchi, H．(2000)．Age-associated characteristics of murine hematopoietic stem cells. J.Exp.Med.192，1273-1280
【非特許文献３】Zhang，J.，Niu，C.，Ye，L.，Huang，H.，He，X.，Tong，W.-G.，Ross，J.，Haug，J.，Johnson，T.，Feng，J.Q.，Harris，S.，Wiedemann，L.M.，Mishina，Y.，and Li，L．(2003)．Identification of the haematopoietic stem cell niche and control ofthe niche size．Nature 425，836-841.
【非特許文献４】Miceli，M.C.，Moran，M.，Chung，C.D.，Patel，V.P.，Low，T.，and Zinnanti，W．(2001)．Co-stimulation and counter-stimulation: lipid raft clustering controls TCR signaling and functional outcomes．Semin．Immunol．13，115-128．
【非特許文献５】Sotgia F，Razani B，Bonuccelli G，Schubert W，Battista M，Lee H，Capozza F，Schubert AL，Minetti C，Buckley JT，Lisanti MP.,Intracellular retention of glycosylphosphatidyl inositol-linked proteins in caveolin-deficient cells. Mol Cell Biol．2002 Jun;22(11):3905-26.
【非特許文献６】Guo B，Kato RM，Garcia-Lloret M，Wahl MI，Rawlings DJ. Engagement of the human pre-B cell receptor generates a lipid raft-dependent calcium signaling complex., Immunity．2000 Aug;13(2):243-53.
【非特許文献７】Lee CJ，LiaoCL，Lin YL., Flavivirus activates phosphatidylinositol 3-kinase signaling to block caspase-dependent apoptotic cell death at the early stage of virus infection., J Virol．2005 Jul;79(13):8388-99.
【非特許文献８】Encinas M，Tansey MG，Tsui-Pierchala BA，Comella JX，Milbrandt J，Johnson EM Jr., c-Src is required for glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) family ligand-mediated neuronal survival via a phosphatidylinositol-3 kinase (PI-3K)-dependent pathway., J Neurosci．2001 Mar 1;21(5):1464-72.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記状況に鑑み、幹細胞（特に造血幹細胞）について、細胞周期を調節し、その維持・増殖をコントロールすることができる技術への期待が高まっている。本発明は、そのような技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、種々のサイトカインで造血幹細胞を刺激し、その後のＬＲの集積について解析するとともに、Ａｋｔのリン酸化、Ｇ０期でのみ核内に局在するｆｏｒｋｈｅａｄファミリー分子（Seoane，J.，Le，H.V.，Shen，L.，Anderson，S.A，and Massague，J．(2004)．Integration of Smad and forkhead pathways in the control of neuroepithelial and glioblastoma cell proliferation．Cell 117，211-223）の核への局在、細胞周期関連タンパクの動向などについて解析を行った。その結果、造血幹細胞においてもＬＲの集積が細胞の分裂に重要であることが明らかとなった。さらに本研究ではＴＧＦ−βがＬＲの集積を阻害し造血幹細胞の冬眠様状態の誘導に関与している可能性が強く示唆された。
【００１１】
造血幹細胞は骨髄ニッシェに存在し、冬眠様状態にあってゆっくりと分裂しながら自分自身と前駆細胞を供給していると考えられている。しかしこの冬眠様状態の機構の詳細は不明である。高度に純化した造血幹細胞にサイトカイン刺激を与えて個々に観察したところ、ＫＬとＴＰＯ刺激によって造血幹細胞膜上に脂質ラフト（図６を参照）が形成されることが細胞分裂に必須であること、脂質ラフトの形成阻害剤を用いるとサイトカイン刺激下でも造血幹細胞が冬眠様状態に陥ることを明らかにした。脂質ラフトの形成はＡｎｇ−１によってもある程度阻害されたが、ＴＧＦ−βが脂質ラフト形成阻害に中心的な役割を果たしていた。ニッシェにおける造血幹細胞の冬眠様状態の維持にはＴＧＦ−βからのシグナルが脂質ラフトの集積を阻害することがクリティカルな役割を果たしていることが示唆された。
【００１２】
Ｚａｃｈａｒｉａｓら（ｐ．９１３；  ｖａｎ  Ｍｅｅｒによる展望記事を参照）は、シアン蛍光タンパク質  と黄色蛍光タンパク質分子とが通常の二量体形成をしないように遺伝子工学的に処理され  た、変異型シアン蛍光タンパク質（ｍＣＦＰ）および変異型黄色蛍光タンパク質分子  （ｍＹＦＰ）の間で、蛍光共鳴エネルギー転移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）をモニターすることにより、タンパク質の脂質ラフトへの標的化を研究  した。ＦＲＥＴは、ラフトに局在化することが知られている、ＣＦＰとカベオリン（ｃａｖｅｏｌｉｎ）との融合タンパク質と、そのアミノ末端をアシル化されたＹＦＰとの間で検出された。しかしながら、ＹＦＰのプレニル修飾によっては、タンパク質はラフトに標的化されなかった。したがって、タンパク質の脂質修飾は、局在化を制御することができ、そしてその結果、脂質ラフト中の様々なタンパク質の機能を制御することができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍａｙ  ３，２００２，Ｖｏｌ．２９６  （Ｄａｖｉｄ  Ａ．Ｚａｃｈａｒｉａｓ，Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｄ．Ｖｉｏｌｉｎ，Ａｌｅｘａｎｄｒａ  Ｃ．Ｎｅｗｔｏｎ，ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒ  Ｙ．Ｔｓｉｅｎ  ｐ．９１３−９１６．））。
【００１３】
造血幹細胞は骨髄ニッシェに存在し、冬眠様状態にあってゆっくりと分裂しながら自分自身と前駆細胞を供給していると考えられている。しかしこの冬眠様状態の機構の詳細は不明である。高度に純化した造血幹細胞にサイトカイン刺激を与えて個々に観察したところ、ＫＬおよびとＴＰＯの刺激によって造血幹細胞膜上に脂質ラフトが形成されることが細胞分裂に必須であること、脂質ラフトの形成阻害剤を用いるとサイトカイン刺激下でも造血幹細胞が冬眠様状態に陥ることを明らかにした。脂質ラフトの形成はＡｎｇ−１によってもある程度阻害されたが、ＴＧＦ−βが脂質ラフトの形成阻害に中心的な役割を果たしていた。ニッシェにおける造血幹細胞の冬眠様状態の維持にはＴＧＦ−βからのシグナルがｒａｆｔの集積を阻害することがクリティカルな役割を果たしていることが示唆された。
【００１４】
従って、本発明は、以下を提供する。
（１）幹細胞を休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導する方法であって、該方法は：
Ａ）該細胞の膜上の脂質ラフト（ｒａｆｔ）の集積を阻害する工程
を包含する、方法。
（２）前記集積は、細胞膜上でスフィンゴ脂質およびコレステロールが集積したミクロドメインの有無によって判定される、項目１に記載の方法。
（３）前記脂質ラフトの集積阻害は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βファミリーのメンバー、メチルβシクロデキストリン、ｃ−ｓｒｃインヒビター、ＰＩ３Ｋインヒビターおよびｃ−ｓｒｃインヒビターからなる群より選択される少なくとも１つの因子により達成される、項目１に記載の方法。
（４）前記ＴＧＦβは、配列番号１に示すヌクレオチド配列またはその改変体もしくは断片によりコードされるかまたは配列番号２にアミノ酸配列またはその改変体もしくは断片を含む、項目３に記載の方法。
（５）前記脂質ラフトの集積阻害は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βファミリーのメンバーの活性化因子により達成される、項目１に記載の方法。
（６）前記ＴＧＦβファミリーのメンバーの活性化因子は、インテグリンβ６およびプラスミンからなる群より選択される、項目５に記載の方法。
（７）前記脂質ラフトは、ｃ−Ｋｉｔリガンド（ＫＬ）（配列番号３（核酸配列）または配列番号４（アミノ酸配列））および血小板刺激因子（ＴＰＯ）（配列番号５（核酸配列）または配列番号６（アミノ酸配列））刺激によって細胞膜上に集積される、項目１に記載の方法。
（８）前記脂質ラフトは、ｃ−ｋｉｔ（配列番号７（核酸配列）または配列番号８（アミノ酸配列））、ガングリオシドＧＭ−１およびｃ−ｍｐｌ（配列番号９（核酸配列）または配列番号１０（アミノ酸配列））からなる群より選択される少なくとも１つの因子を観察することによって同定される、項目１に記載の方法。
（９）前記細胞は、造血幹細胞である、項目１に記載の方法。
（１０）前記細胞は、骨髄造血幹細胞である、項目１に記載の方法。
（１１）前記阻害は、Ａｎｇ−１（配列番号１１（核酸配列）または配列番号１２（アミノ酸配列））添加時よりも大きな阻害であることを特徴とする、項目１に記載の方法。
（１２）前記阻害は、ＴＧＦβファミリーのメンバーによって達成される阻害と少なくとも同程度の阻害であることを特徴とする、項目１に記載の方法。
（１３）前記阻害は、Ａｎｇ−１では達成できないがＴＧＦβで達成できる阻害濃度を特徴とする、項目１に記載の方法。
（１４）前記脂質ラフトの集積は、幹細胞因子（ＳＣＦ）（配列番号１３（核酸配列）または配列番号１４（アミノ酸配列））によって生じる、項目１に記載の方法。
（１５）前記阻害工程は、ＳＣＦおよび血小板刺激因子（ＴＰＯ）（配列番号５（核酸配列）または配列番号６（アミノ酸配列））の存在下で行われる、項目１に記載の方法。
（１６）細胞を保存する方法であって、
Ａ）該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する工程
を包含する、方法。
（１７）幹細胞を濃縮または純化するための方法であって、
Ａ）幹細胞を含むか含むと予測される試料を提供する工程；
Ｂ）該試料を幹細胞が生存する条件で培養する工程；および
Ｃ）該試料を細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する条件に暴露する工程
を包含する、方法。
（１８）項目１７に記載の方法によって得られた濃縮または純化された幹細胞。
（１９）幹細胞が濃縮または純化された組成物を生産するための方法であって、
Ａ）幹細胞を含む試料を提供する工程；
Ｂ）該試料を細胞の膜上の脂質ラフトの形成を阻害する条件に暴露する工程；および
Ｃ）該試料を幹細胞が生存する条件で培養する工程
を包含する、方法。
（２０）項目１９に記載の方法によって得られた組成物。
（２１）細胞増殖を促進または誘導する方法であって、該方法は：
Ａ）該細胞の膜上の脂質ラフト（ｒａｆｔ）の集積を生じさせるかまたは促進する工程
を包含する、方法。
（２２）前記集積を、細胞膜上でスフィンゴ脂質およびコレステロールが集積したミクロドメインの有無によって判定する工程を包含する、項目２１に記載の方法。
（２３）前記脂質ラフトの集積は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βインヒビター、ｃ−ｓｒｃアクチベーター、およびガングリオシドからなる群より選択される因子により達成される、項目２１に記載の方法。
（２４）前記ＴＧＦβは、配列番号１に示す配列（ＴＧＦβ１）またはその改変体もしくは断片である、項目２３に記載の方法。
（２５）前記ＴＧＦβのインヒビターは、ＴＧＦβのアンチセンス核酸、ＲＮＡｉ、抗体、化合物および低分子からなる群より選択される、項目２１に記載の方法。
（２６）前記脂質ラフトの形成促進は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βのＲＮＡｉにより達成される、項目２５に記載の方法。
（２７）前記脂質ラフトは、ＫＬおよびＴＰＯ刺激によって細胞膜上に集積される、項目２１に記載の方法。
（２８）前記細胞は、造血幹細胞である、項目２１に記載の方法。
（２９）前記細胞は、骨髄造血幹細胞である、項目２１に記載の方法。
（３０）前記脂質ラフトは、ｃ−ｋｉｔ、ＧＭ−１およびｃ−ｍｐｌからなる群より選択される少なくとも１つの因子を含む、項目２１に記載の方法。
（３１）前記脂質ラフトの集積は、ＳＣＦおよびＴＰＯからなる群より選択される少なくとも１つの因子の存在下で行われる、項目２１に記載の方法。
（３２）細胞を休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導するための因子を同定するためのスクリーニング方法であって、該方法は：
Ａ）該因子の候補物質を提供する工程；
Ｂ）該目的の細胞における脂質ラフトを観察する工程；
Ｃ）該因子を目的の細胞に暴露させる工程；および
Ｄ）該因子への暴露後の該目的の細胞における脂質ラフトを観察し、脂質ラフトの集積阻害を引き起こす因子は、該目的の細胞を休止状態に維持または誘導するための因子であると決定する工程、
を包含する、方法。
（３３）さらに
Ｅ）前記因子を目的の細胞に暴露して細胞周期を調節し得るかどうかを確認する工程、
をさらに包含する、項目３２に記載の方法。
（３４）前記脂質ラフトの観察は、蛍光色素染色およびウエスタンブロッティングからなる群より選択される手法により行われる、項目３２に記載の方法。
（３５）前記因子は、幹細胞の同定、濃縮または純化に使用される、項目３２に記載の方法。
（３６）細胞増殖を維持または誘導する因子を同定するためのスクリーニング方法であって、該方法は：
Ａ）該因子の候補物質を提供する工程；
Ｂ）該目的の細胞における脂質ラフトを観察する工程；
Ｃ）該因子を目的の細胞に暴露させる工程；および
Ｄ）該因子への暴露後の該目的の細胞における脂質ラフトを観察し、脂質ラフトの集積を引き起こす因子は、該目的の細胞の増殖を維持または誘導するための因子であると決定する工程、
を包含する、方法。
（３７）幹細胞を休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導するシステムであって、該細胞の膜上のラフトの集積を阻害する手段を備えるシステム。
（３８）幹細胞を休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導する培地であって、該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する因子を含む培地。
（３９）細胞を保存するための培地であって、該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する因子を含む培地。
（４０）幹細胞を濃縮または純化するためのシステムであって、
Ａ）幹細胞を含むか含むと予測される試料を提供する手段；
Ｂ）該試料を幹細胞が生存する条件で培養する手段；および
Ｃ）該試料を細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する条件に暴露する手段
を備える、システム。
（４１）幹細胞を同定、濃縮または純化するための培地であって、該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する因子を含む培地。
（４２）細胞増殖を維持または誘導するシステムであって：該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を生じさせるかまたは促進する手段を備える、システム。
（４３）細胞増殖を維持または誘導する培地であって：該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を生じさせるかまたは促進する因子を含む培地。
（４４）細胞を休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導するための因子を同定するためのスクリーニングシステムであって、該システムは：
Ａ）該因子の候補物質を提供する手段；
Ｂ）該目的の細胞における脂質ラフトを観察する手段；
Ｃ）該因子を目的の細胞に暴露させる手段；および
Ｄ）該因子への暴露後の該目的の細胞における脂質ラフトを観察し、脂質ラフトの集積阻害を引き起こす因子は、該目的の細胞を休止状態に維持または誘導するための因子であると決定する手段、
を備える、システム。
（４５）細胞増殖を維持または誘導する因子を同定するためのスクリーニングシステムであって、該システムは：
Ａ）該因子の候補物質を提供する手段；
Ｂ）該目的の細胞における脂質ラフトを観察する手段；
Ｃ）該因子を目的の細胞に暴露させる手段；および
Ｄ）該因子への暴露後の該目的の細胞における脂質ラフトを観察し、脂質ラフトの集積を引き起こす因子は、該目的の細胞の増殖を維持または誘導するための因子であると決定する手段、
を備える、システム。
（４６）細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する因子の、幹細胞を同定し、あるいはその休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導するための使用。
（４７）細胞の膜上の脂質ラフトの集積を促進する因子の、細胞増殖を促進または誘導するための使用。
（４８）幹細胞を同定する方法であって、該方法は：
Ａ）判定される細胞の膜上の脂質ラフトの集積を観察する工程；および
Ｂ）集積が観察されない場合、該判定される細胞が幹細胞であると判定する工程
を包含する、方法。
（４９）前記判定は、前記細胞が未分化細胞であることを確認し、かつ、前記脂質ラフトの集積が観察されない場合に該細胞が幹細胞であると判定する工程を包含する、項目４８に記載の方法。
（５０）幹細胞を同定するシステムであって、該システムは、
Ａ）判定される細胞の膜上の脂質ラフトの集積を観察する手段；および
Ｂ）集積が観察されない場合、該判定される細胞が幹細胞であると判定する手段
を備える、システム。
（５１）前記判定は、前記細胞が未分化細胞であることを確認し、かつ、前記脂質ラフトの集積が観察されない場合に該細胞が幹細胞であると判定することを包含する、項目５０に記載のシステム。
（５２）幹細胞を同定するシステムであって、該システムは、
Ａ）判定される細胞の膜上の脂質ラフトの集積を観察するための蛍光色素染色またはウエスタンブロッティングのためのキットを備え、ここで、集積が観察されない場合、幹細胞があると判定することを特徴とする、システム。
（５３）前記判定は、前記細胞が未分化細胞であることを確認し、かつ、前記脂質ラフトの集積が観察されない場合に該細胞が幹細胞であると判定すると判定する工程を包含する、項目５２に記載のシステム。
【００１５】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
【００１６】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、必要に応じて添付の図面等を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、幹細胞の細胞周期を調節する方法、組成物およびシステムを提供する。このような調節により、幹細胞の維持・制御・増殖をコントロールすることが容易になり、その維持・増殖を容易にかつ計画的にすることができるようになった。また、幹細胞の同定も容易にすることができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１９】
以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【００２０】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を記載する。
【００２１】
本明細書において「脂質ラフト」とは、Kai Simons らが提案したスフィンゴ脂質とコレステロールに富んだ脂質膜ドメインをいい，グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカータンパク質や膜を介する情報伝達に関与するタンパク質が集積した超分子構造を形成していると考えられている。脂質ラフトは情報伝達，細菌やウイルスの感染，細胞内小胞輸送等に重要な役割を果たしていることが示唆されている。ラフト形成はスフィンゴ脂質同士の会合がその引き金となっていると考えられる。実際モデル膜ではラフト様脂質ドメインの形成は容易に観察される。しかしながら細胞に実際にラフトが存在するか，という基本的な問題は未だに議論の的である。これは第一にスフィンゴ脂質を追跡する良い方法がないことに起因している。脂質ラフトは、細胞膜上でスフィンゴ脂質とコレステロールが集積したミクロドメインの有無によって判定される。
【００２２】
本明細書において「脂質ラフトの集積」とは、脂質ラフトが、例えば、ミクロドメインのＧＭ１（ガラクトース（Ｇａｌ）−Ｎアセチルガラクトサミン−ガラクトース（Ｇａｌ）−グリコシル（Ｇｌｃ）−セラミド（Ｃｅｒ）という糖脂質）という領域としてそのセラミドに結合している部分を観察していることによって観察することができる。従って、その存在自体が指標となる。ＧＭ１は例示的なものであり、合成されるラフト分画によってこの境界となる部分は変動する。脂質ラフトの集積は、細胞膜上でスフィンゴ脂質とコレステロールが集積したミクロドメインの有無によって判定することができ、観察がされれば本明細書において集積があると判定することができる。このような脂質ラフトの集積は、幹細胞因子（ＳＣＦ）（配列番号１３（核酸配列）または配列番号１４（アミノ酸配列））、血小板刺激因子（ＴＰＯ）（配列番号５（核酸配列）または配列番号６（アミノ酸配列））などの因子によって促進されることが知られている。従って、本発明では、このような因子を用いて脂質ラフトの集積を促進させて、その後のアッセイに用いることができる。
【００２３】
本明細書において「スフィンゴ脂質」とは、スフィンゴイド（スフィンゴシン＝２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ−２−アミノ−４−オクタデセン−１，３−ジオール）などの長鎖塩基を共通構成成分として含む複合脂質を総称した用語である。グリセロールを共通構成成分とするグリセロ脂質とともに複合脂質界を二大別する。スフィンゴイドに脂肪酸が酸アミド結合したセラミドの１位の水酸基に，さらに置換基として，糖がグリコシド結合したスフィンゴ糖脂質（セレブロシド、各種の糖を含むガングリオシド、血液型糖脂質などの複雑な糖鎖構造の糖脂質などがあり、糖鎖全体の性質によって、中性糖からなる中性スフィンゴ糖脂質群とシアル酸、硫酸化糖などを含む酸性スフィンゴ糖脂質群（ガングリオシド，スルファチドなど））と、置換基としてリン酸と塩基（コリン，エタノールアミンなど）が結合したスフィンゴリン脂質（スフィンゴミエリン，セラミドホスホエタノールアミン、セラミドシリアチン、セラミドアミノエチルホスホン酸など）に分類されている。
【００２４】
本明細書において「コレステロール」とは、当該分野において通常使用されるのと同じ意味を有し、Ｃ２７Ｈ４６Ｏで表される物質およびその誘導体（エステル（例えば、脂肪酸とのエステル））をいう。ヒトではほとんど全細胞の通常成分として遊離状もしくは脂肪酸とのエステルの形で存在．とくに脳、神経組織および脊髄などに多く含まれる．血中では，主として低密度リポタンパク質および高密度リポタンパク質に存在する。ジギトニンで沈澱する。
【００２５】
本明細書において、スフィンゴ脂質およびコレステロールは、ウェスタンブロット、蛍光色素染色などの免疫学的アッセイによって同定することができる。
【００２６】
本明細書において「ミクロドメイン」とは、スフィンゴ脂質およびコレステロールが集積した集合物をいい、例えば、数十ナノメートルという大きさであり、脂質が豊富に存在するという特性を有し、そしてカベオリン抗体にてウェスタンブロットするという判定方法によって確認することができる。
【００２７】
脂質ラフトの集積は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βインヒビター、ｃ−ｓｒｃアクチベーター、およびガングリオシドからなる群より選択される因子によっても達成され得る。
【００２８】
本明細書において通常脂質ラフトは、ｃ−Ｋｉｔリガンド（ＫＬ）（配列番号３（核酸配列）または配列番号４（アミノ酸配列））および血小板刺激因子（ＴＰＯ）（配列番号５（核酸配列）または配列番号６（アミノ酸配列））刺激によって細胞膜上に集積されると言われている。従って、本発明において、脂質ラフトの集積は、これら因子の刺激によって促進させることができる。
【００２９】
本明細書において通常脂質ラフトは、ｃ−ｋｉｔ（配列番号７（核酸配列）または配列番号８（アミノ酸配列））、ガングリオシドＧＭ１（Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃβ１→４（ＮｅｕＡα２→３）Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１’Ｃｅｒ；）およびｃ−ｍｐｌ（配列番号９（核酸配列）または配列番号１０（アミノ酸配列））からなる群より選択される少なくとも１つの因子を同定することによって確認することができる。
【００３０】
ここで、  本発明において糖を記載するために使用する命名法は、通常の命名法に従う。例えば、ガラクトース
【００３１】
【化１】
2007116926.tif 000002
【００３２】
は、Ｇａｌ；
Ｎアセチルガラクトサミン
【００３３】
【化２】
2007116926.tif 000003
【００３４】
は、ＧａｌＮＡｃ；
グルコース
【００３５】
【化３】
2007116926.tif 000004
【００３６】
は、Ｇｌｃ；
Ｎアセチルノイラミン酸
【００３７】
【化４】
2007116926.tif 000005
【００３８】
は、Ｎｅｕ５Ａｃ（あるいはＮｅｕＡと記す。）；
セラミド
【００３９】
【化５】
2007116926.tif 000006
【００４０】
は、Ｃｅｒである。
【００４１】
本明細書において「脂質ラフトの集積の阻害」は、通常脂質ラフトの集積を生じる条件において、ある因子との相互作用によって集積が進行しないかまたは集積が解離することをいう。脂質ラフトの集積の阻害は、Ａｎｇ−１（配列番号１１（核酸配列）または配列番号１２（アミノ酸配列））添加によって観察されているが、本発明では、さらに、ＴＧＦβファミリーメンバー（好ましくはＴＧＦβ）によって達成される阻害によって、Ｇ０期への移行が促進されることが見出された。従って、好ましくは、本明細書では、脂質ラフトの集積の阻害は、ＴＧＦβファミリーのメンバーによって達成される阻害と少なくとも同程度の阻害であることが必要であり得、そして、阻害は、Ａｎｇ−１では達成できないがＴＧＦβで達成できる阻害濃度であり得る。
【００４２】
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞（たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など）もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。
【００４３】
由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄球系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄球系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。
【００４４】
本明細書において「幹細胞が生存する条件」とは、幹細胞が生存する任意の条件をいい、例えば、培地、培養条件、フィーダー細胞の存在などが挙げられる。代表的な条件としては、例えば、培地としてはアルファーＭＥＭ、培養条件としては、ＳＣＦ＋ＴＰＯ、フィーダー細胞としては、ＯＰ細胞株などを挙げることができるがこれに限定されない。
【００４５】
本明細書において「造血幹細胞」とは、造血組織および腸上皮組織などの細胞新生系において細胞生産のもとになる細胞をいう。この造血幹細胞は、自己を保存するとともに、すべての血液系細胞に分化することができる。そのような血液細胞としては、例えば、単球系幹細胞、Ｂリンパ球系幹細胞、Ｔリンパ球系幹細胞、骨髄球系幹細胞、Ｔリンパ系細胞、Ｂリンパ系細胞、血小板系細胞、赤血球系細胞、単球系細胞などを挙げることができる。
【００４６】
造血細胞は骨髄の中でつくられ、分化して、赤血球、血小板、白血球などになり末梢血液の中を流れる。骨髄球系細胞の分化を見ると、一番大元には多能性幹細胞があり、次に造血系細胞に特化した造血幹細胞があり、多能性前駆細胞へと分化し、さらに骨髄球系前駆細胞およびリンパ球系前駆細胞へと分化する。
【００４７】
本明細書では、造血幹細胞は、通常骨髄に存在する造血幹細胞（骨髄造血幹細胞）をさすが、近年その他にも造血幹細胞の範疇に入るものがある可能性があり、本発明では、そのような幹細胞も標的とすることが企図される。
【００４８】
骨髄球系では多能性幹細胞からＣＦＵ−ＧＥＭＭという細胞へ分化する。そのＣＦＵ−ＧＥＭＭという細胞からＣＦＵ−ＧＭという細胞へ、次いで骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球という形で分化する。これらは骨髄中に存在する細胞であり、これが分化すると好中球となって末梢血中を流れる。ＣＦＵ−ＧＭからは単球の方へ行き、単芽球、前単球、単球と分化する。この単球が末梢血へあらわれる。またＣＦＵ−ＧＥＭＭという細胞からＢＦＵ−Ｅ細胞へと分化し、それから前赤芽球、赤芽球、赤血球へと分化する。また、巨核球系への分化し、ＣＦＵ−Ｍｅｇ（巨核球、メガカリオサイトの略）、巨核芽球、巨核球、血小板へと分化する。
【００４９】
リンパ球系では、多能性幹細胞からリンパ系の幹細胞へと分化し、Ｂリンパ球系とＴリンパ球系とに分かれる。それと別個にＮＫ細胞の方へ分かれていくというラインが存在する。Ｂリンパ球系のラインとしてはｐｒｅ−ｐｒｏ−Ｂ細胞、ｐｒｏ−Ｂ細胞、ｐｒｅ−Ｂ細胞へと分化し、ｉｍｍａｔｕｒｅ−Ｂ細胞、ｍａｔｕｒｅ−Ｂ細胞を経て、抗体を産生する形質細胞（ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ）へと分化する。Ｔリンパ球系としては、胸腺前駆細胞、未成熟胸腺細胞、共通胸腺細胞（ｃｏｍｍｏｎ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ）、成熟胸腺細胞へと分化する。成熟胸腺細胞からヘルパー／インデューサーＴリンパ球へいく系統と、抑制／細胞傷害性Ｔリンパ球へと分化する系統が存在する。したがって、これらのＴリンパ球および／またはＢリンパ球の異常の処置または予防についても本発明の因子または組成物は有効であり得る。このような分化に関するより詳細な説明については、赤司浩一、最新医学  ５６（２）、１５−２３，２００１を参照のこと。この文献は、本明細書において参考として援用される。
【００５０】
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、単離された細胞とは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸またはポリペプチドについていう場合、「単離された」とは、たとえば、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。
【００５１】
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。
【００５２】
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。
【００５３】
本明細書において、「分化」または「細胞分化」とは、１個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的および／または機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団（細胞系譜）が、特定のタンパク質の産生などはっきりした特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を，ゲノム中の特定の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態をもたらす細胞内あるいは細胞外の因子または条件を探索することにより細胞分化を同定することができる。細胞分化の結果は原則として安定であって、特に動物細胞では，別のタイプの細胞に分化することは例外的にしか起こらない。
【００５４】
本明細書において「多能性」または「多分化能」とは、互換可能に用いられ、細胞の性質をいい、１以上、好ましくは２以上の種々の組織または臓器に分化し得る能力をいう。従って、「多能性」および「多分化能」は、本明細書においては特に言及しない限り「未分化」と互換可能に用いられる。通常、細胞の多能性は発生が進むにつれて制限され、成体では一つの組織または器官の構成細胞が別のものの細胞に変化することは少ない。従って多能性は通常失われている。とくに上皮性の細胞は他の上皮性細胞に変化しにくい。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）と呼ばれる。しかし間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。胚性幹細胞は、多能性を有する。組織幹細胞は、多能性を有する。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は全能性といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ある細胞が多能性を有するかどうかは、たとえば、体外培養系における、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ）の形成、分化誘導条件下での培養等が挙げられるがそれらに限定されない。また、生体を用いた多能性の有無についてのアッセイ法としては、免疫不全マウスへの移植による奇形腫（テラトーマ）の形成、胚盤胞への注入によるキメラ胚の形成、生体組織への移植、腹水への注入による増殖等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５５】
従って、本明細書において「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」とは、交換可能に用いられ、初期胚に由来する任意の多能性幹細胞をいう。通常胚性幹細胞は、全能性またはほぼ全能性を有するとされる。この胚性幹細胞を正常な宿主胚盤胞へ導入し仮親子宮へ戻すことによってキメラ作製を行ったところ、高いキメラ形成能を持つ、生殖系列キメラ（胚性幹細胞由来の機能的生殖細胞を持つキメラマウス）が得られた（Ａ．Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，３０９，２５５，１９８４）。胚性幹細胞株は、培養下で、種々の遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、レトロウイルスベクター法、リポゾーム法、エレクトロポレーション法等）の適用が可能である。また、遺伝子が組込まれた細胞を選別する方法を工夫し、相同遺伝子組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を利用し、特定の遺伝子を狙って改変（置換、欠失、挿入）させた細胞のクローンを得ることもできる。インビトロでこのような処理をした胚性幹細胞株は生殖系列への分化能を保持することから、ある特定の遺伝子の機能を個体レベルで調べる研究が現在盛んに行われている（Ｍ．Ｒ．Ｃａｐｅｃｃｈｉ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２８８，１９８９）。胚性幹細胞を利用したトランスジェニックマウス作出法は、ある特定の遺伝子のみを任意に改変させた個体を得ることを可能にした点でマイクロインジェクション法によるトランスジェニック動物作出法にはない多くの利点が考えられる。特に、特定の遺伝子を不活化させたノックアウト動物を作出できるようになり、遺伝子の機能を解明したり、外来性の遺伝子のみを発現させることができる。従って、胚性幹細胞の樹立が容易になれば、その効果は図り知れない。このような胚性幹細胞は、受精３．５日目のマウス胚盤胞の内部細胞塊の細胞をインビトロ培養に移し，細胞塊の解離と継代を繰り返すことにより，多分化能を保持し，正常核型を維持したまま無制限に増殖しつづける幹細胞を樹立することに作製することができる。通常、胚性幹細胞の多分化能を維持するには、ＳＴＯ細胞株および／またはマウス胎仔から調製した初代培養繊維芽細胞などのフィーダー細胞層上で胚性幹細胞を培養することが好ましいとされる。
【００５６】
このように、本発明の診断において、当該分野において公知の技法（抗原抗体反応に基づく検出など）を用いて診断、検出の補助とすることができる。
【００５７】
本明細書において「細胞周期」とは、真核生物において、有糸分裂、細胞質分裂および間期を含む細胞分裂を構成する事象のサイクルを言う。代表的には、細胞分裂およびＤＮＡ複製に見られる周期性である。歴史的には、増殖中の体細胞では細胞周期を分裂期（Ｍ期）と間期に分けていたが、ＤＮＡ合成が間期の一部で行われていることを見出され、この時期（Ｓ期）をはさんで，Ｇ１期、Ｓ期およびＧ２期の３期に従来のＭ期を加えて、細胞周期全体を４期に分けるようになり、通常はこのサイクルのことを細胞周期という。従って、１つの局面では、細胞周期は、Ｓ期に倍加した遺伝情報をＭ期に等分配して細胞を複製していくサイクルを意味する。本明細書において、１細胞周期の各期の所要時間は生体細胞の直接観察、分裂指数、オートラジオグラフ法の導入、セルソーターによる各細胞内ＤＮＡ含量の測定などによって算出され得る。増殖を停止した多くの細胞種ではＧ１期の途中から細胞周期を離脱し，Ｇ０期にあると称する。Ｇ１期の途中には、もはやＧ０期には離脱せずＳ期に進むことを決定される点として、酵母ではスタート（ｓｔａｒｔ），哺乳類細胞では制限点（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ）が想定されている。通常の細胞周期ではＭ期とＳ期とは、必ず１回ずつ交替しておこるが，これを保障するフィードバック機構として、チェックポイント（ｃｈｅｃｋ  ｐｏｉｎｔ）という概念が提唱されており、本明細書においても必要に応じて適用する。チェックポイントとしては，（１）Ｇ１期中のスタート（制限点）；（２）Ｇ２期にあってＳ期の完了をモニターしてＭ期への移行を了承する点；（３）Ｍ期の中期にあって分裂装置の完成をモニターしてＭ期終結への移行を了承する点、の少なくとも３点が想定されている。
【００５８】
細胞周期の進行を制御する主な因子群は、従来、ＣＤＫ、サイクリン、ＣＤＫ阻害因子（ＣＫＩ）が知られている。ＣＤＫがタンパク質リン酸化酵素の触媒サブユニットである。細胞周期進行の駆動装置であるともいえる。ＣＤＫの調節因子として、サイクリンは活性化因子であり、ＣＫＩは抑制因子ということができる。ＣＤＫとサイクリンとは、それぞれタンパク質ファミリーを構成し、それらのサブタイプの組合せに応じて細胞周期の進行を促す時期が異なる。哺乳類体細胞における代表例としては、サイクリンＢ−Ｃｄｃ２（ＣＤＫ１）複合体（Ｃｄｃ２キナーゼ）はＭ期、サイクリンＤ−ＣＤＫ４複合体およびサイクリンＥ−ＣＤＫ２複合体はＧ１期、サイクリンＡ−ＣＤＫ２複合体はＳ期の進行をもたらすとされている。ＣＫＩは、Ｇ１期とＳ期の進行の抑制あるいはＧ０期への離脱をもたらすとされている。
【００５９】
本明細書において「Ｇ０期」とは、細胞が細胞周期の進行をＧ１期で止めている状態にある期間をいう。細胞周期の進行の停止はＧ１期、Ｇ２期、Ｍ期などで起こるが、通常Ｇ０期はＧ１期で細胞周期を離脱した場合をさし、本明細書においても通常の定義に従う。細胞が分化あるいは老化して増殖停止したときが代表例である。Ｇ０期とＧ１期との出入は，Ｇ１期中で上述したチェックポイントの前で起こり、哺乳類細胞では、サイクリンＤとＥ、ＣＤＫ２とＣＤＫ４、ＣＤＫ阻害因子（ＣＫＩ）などによって制御されていると考えられている。
【００６０】
本明細書において「トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βファミリー」とは、「トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βスーパーファミリー」とも呼ばれ、他のサイトカインと干渉し、またはコラーゲン沈着を高めるような多機能性をもつ調節サイトカインとして知られているサイトカインのファミリーである。このファミリーのメンバーとしては、代表的には、ＴＧＦβ、アクチビン、骨形成誘導因子（ＭＢＰ；bone morphogenic proteins）、インヒビン、増殖分化因子（ＧＤＦ）、神経膠由来神経栄養性因子（ＧＤＮＦ）などが含まれる。ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、細胞表面の２種類のセリン／スレオニンキナーゼ型受容体を介して、細胞内のＳｍａｄと呼ばれるタンパク質を活性化し、そのシグナルを伝える。レセプターによって活性化されたＳｍａｄは、複合体を形成して核内移行し、ＤＮＡに結合して標的遺伝子の転写活性を調整しているといわれている。この調節には、種々の転写因子、コアクチベーターｐ３００、コリプレッサーｃＳｋｉがＳｍａｄに結合して活性を制御しているといわれている。ＴＧＦ−βファミリーの詳細については、総説、宮澤恵二ら、著、新細胞増殖因子のバイオロジー、実験医学バイオサイエンスシリーズ３４：羊土社、２００１を参照のこと。本明細書では、ＴＧＦβと少なくとも７５％の相同性を有しており、細胞増殖調節に関与していれば、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの一つと考えることができる。
【００６１】
ＴＧＦ−βは、分子量約２５ｋＤａの二量体構造を有するタンパク質とされており、そのモノマーは、配列番号１（核酸）および配列番号２（アミノ酸）を有する（これは、ＴＧＦ−β１の配列を示す。）とされている。
【００６２】
本明細書において「因子」としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００６３】
本明細書において、「ＴＧＦβ結合タンパク質」とは、ＴＧＦβファミリーのメンバーに対して結合し、好ましくはその機能を調節するタンパク質をいう。そのようなＴＧＦβ結合タンパク質としては、例えば、米国特許第６，３９５，５１１号、同第６，４８９，４４５号、および同第６，４９５，７３６号などに記載されているＴＧＦβファミリーのメンバーの結合タンパク質、ＷＯ２００４／０８２６０８に記載のスクレロスチン（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）、コーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）（赤ｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：１，Ｏｅｌｇｅｓｃｈｌａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：７５７等を参照）、シスチンノットタンパク質（ｎｏｇｇｉｎ）（Ｇｒｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｎａｔｕｒｅ  ４２０：６３６を参照）、ＤＡＮファミリータンパク質（例えば、ＤＡＮ、Ｃｅｒｅｂｒｕｓ、Ｇｅｒｍｌｉｎなどを含む、Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １：  ６７３を参照）などを挙げることができる。
【００６４】
本明細書において「ＴＧＦβファミリーメンバーの活性化因子（アクチベーター）」とは、ＴＧＦβファミリーの任意のメンバーを活性化することができる任意の因子をいう。そのような因子としては、例えば、ＴＧＦβの産生を促進する因子などを挙げることができる。
【００６５】
ＴＧＦβアクチベーターであるかどうかは、以下の試験手法により確認することができる。潜在型ＴＧＦβとアクチベーターとを細胞株を培養している培地に加え細胞増殖能力が阻害されるか否かの実験方法で証明することができる。
【００６６】
本明細書において「ＴＧＦβファミリーメンバーの阻害因子（インヒビター）」とは、ＴＧＦβファミリーの任意のメンバーを阻害することができる任意の因子をいう。そのような因子としては、例えば、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジンヒドロクロリド）（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６５：７４４−７５２，２００４）を挙げることができる。
【００６７】
ＴＧＦβインヒビターであるかどうかは、以下の試験手法により確認することができる。潜在型ＴＧＦβとアクチベーターとを、細胞株を培養している培地に加え細胞増殖能力が阻害されるか否かの実験方法で証明することができる。
【００６８】
本明細書において使用される「アルキル化βシクロデキストリン」は、アルキル基を有する、７つのＤ‐グルコピラノース基がα１→４グリコシド結合によって王冠状に環化した構造を有する糖をいう。
【００６９】
本明細書において使用される「メチルβシクロデキストリン」は、メチル基を有する、７つのＤ‐グルコピラノース基がα１→４グリコシド結合によって王冠状に環化した構造を有する糖をいう。
【００７０】
本明細書において「ｃ−ｓｒｃ」とは、チロシンプロテインキナーゼであり、がん遺伝子産物の一種であり、本明細書において通常使用されるのと同じ定義で用いられる。
【００７１】
本明細書において「ｃ−ｓｒｃインヒビター」とは、シグナル伝達因子であるｃ−ｓｒｃを阻害する任意の因子（例えば、コスモバイオ株式会社のカタログ番号ＳＣ−３０５０として入手可能なインヒビター、ＰＰ２（４−アミノ−５−（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン；コスモバイオ株式会社のカタログ番号５２９５７３）、ＰＰ３（４−ａアミノ−７−フェニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン；コスモバイオ株式会社のカタログ番号５２９５７４など）、ＰＰ１（４−アミノ−１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−（１′−ナフチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン；コスモバイオ株式会社のカタログ番号５２９５７９）など）をさす。
【００７２】
ｃ−ｓｒｃインヒビターであるかどうかは、ウェスタンブロット法およびリン酸化抗体にて免疫染色法を用いた試験手法により確認することができる。
【００７３】
本明細書において「ＰＩ３Ｋ」または「ホスファチジルイノシトール３キナーゼ」とは、イノシトール環３位をリン酸化する酵素をさす。リン酸化という分子構造の変化は、それまでになかった活性を発揮させたりする。ホスファチジルイノシトール／ＰＩは生体膜の主成分のひとつでリン脂質の一種である。生体膜からイノシトール部分を突き出したような形で存在する。リン酸化されうる水酸基を多数有しており、いろいろな形のリン酸化イノシトール（ＰＩＰ２、ＰＩＰ３など）ができることから、さまざまなシグナルを出すのに最適である。
【００７４】
本明細書において「ＰＩ３Ｋインヒビター」とは、シグナル伝達因子であるＰＩ３Ｋを阻害する任意の因子（例えば、Ｌｙ２９４００２（２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン；Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（カタログ番号７０９２０）などから入手可能）をさす。
【００７５】
ｃ−ｓｒｃインヒビターであるかどうかは、ウェスタンブロット法およびリン酸化抗体にて免疫染色法を用いた試験手法により確認することができる。
【００７６】
（詳細な説明）
本発明の研究において、以下のことが提供される。
【００７７】
（脂質ラフトの形成）
Ｔ細胞においてはＡＰＣ上のＭＨＣに提示された抗原と結合したＴＣＲは脂質ラフトへ移行することにより効率よくシグナルを伝達し、分裂およびサイトカイン産生を開始するが、この集積が阻害された場合シグナル伝達効率は低下し細胞の増殖やサイトカイン産生能が阻害される（Ｍｉｃｅｌｉ，Ｍ．Ｃ．，Ｍｏｒａｎ，Ｍ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｃ．Ｄ．，Ｐａｔｅｌ，Ｖ．Ｐ．，Ｌｏｗ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｚｉｎｎａｎｔｉ，Ｗ．（２００１）．Ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ：  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ＴＣＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ．Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３，１１５−１２８．）。この現象を幹細胞（代表的には、造血幹細胞）に置き換えた実験を本発明において実施することによって確認した。ニッチに存在する（骨髄から分離されたばかりの）幹細胞（代表的には、造血幹細胞）はＧ０期に存在し、ｃ−ｋｉｔ，ｃ−ｍｐｌという増殖シグナル受容体の脂質ラフトへの集積がおきていない。しかし、これらの幹細胞（代表的には、造血幹細胞）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではｃ−ｋｉｔ，ｃ−ｍｐｌのシグナルに即座に反応して脂質ラフトを集積しｃ−ｋｉｔ，ｃ−ｍｐｌの脂質ラフトへの移行が観察される。この際、ＫＬのみの刺激によってもｃ−ｍｐｌが、またＴＰＯのみの刺激によってもｃ−Ｋｉｔがそれぞれ脂質ラフトに集積することから、それぞれの受容体は散在している脂質ラフトにあらかじめ結合していることが示唆される。またこのような脂質ラフトが観察された細胞は強い細胞内シグナル分子のリン酸化が起こる。ｃ−ｋｉｔと脂質ラフトとの関与を示唆する報告が近年報告されている。またｃ−ｋｉｔと脂質ラフトとの関与を示唆する報告が近年報告されていることから（Ｂｒｏｕｄｙ  ＶＣ，Ｌｉｎ  ＮＬ，Ｌｉｌｅｓ  ＷＣ，Ｃｏｒｅｙ  ＳＪ，Ｏ’Ｌａｕｇｈｌｉｎ  Ｂ，Ｍｏｕ  Ｓ，Ｌｉｎｎｅｋｉｎ  Ｄ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｖｉａ  Ｓｒｃ  ｆａｍｉｌｙ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉ赤  ｆｏｒ  ｎｏｒｍａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃ−Ｋｉｔ．Ｂｌｏｏｄ．１９９９  Ｓｅｐ  １５；９４（６）：１９７９−８６．１６，Ｊａｈｎ  Ｔ，Ｓｅｉｐｅｌ  Ｐ，Ｃｏｕｔｉｎｈｏ  Ｓ，Ｕｒｓｃｈｅｌ  Ｓ，Ｓｃｈｗａｒｚ  Ｋ，Ｍｉｅｔｈｉｎｇ  Ｃ，Ｓｅｒｖｅ  Ｈ，Ｐｅｓｃｈｅｌ  Ｃ，Ｄｕｙｓｔｅｒ  Ｊ．Ａｎａｌｙｓｉｎｇ  ｃ−ｋｉｔ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃ−ｋｉｔ−ＥＧＦＰ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ）、幹細胞（代表的には、造血幹細胞）の脂質ラフト集積は細胞分裂を促すきっかけとなる。
【００７８】
（冬眠様状態の重要性）
造血幹細胞はなぜ大部分の細胞が冬眠様状態にあるのであろうか？  幹細胞（代表的には、造血幹細胞）の冬眠様状態は線虫やリスの冬眠状態に非常に良く似ている。それは本発明者らが今回のデータで示したＦｏｒｋｈｅａｄファミリーのＦＯＸＯ分子の核への局在である。線虫の研究において冬眠状態（ｄａｕｅｒ  ａｒｒｅｓｔ）の研究は盛んであり、哺乳類のＦｏｒｋｈｅａｄファミリーに相当するＤａｆ−１６の核への移行が冬眠状態を誘導する（Ｏｇｇ  Ｓ，Ｐａｒａｄｉｓ  Ｓ，Ｇｏｔｔｌｉｅｂ  Ｓ，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ＧＩ，Ｌｅｅ  Ｌ，Ｔｉｓｓｅｎｂａｕｍ  ＨＡ，Ｒｕｖｋｕｎ  Ｇ．、Ｔｈｅ  Ｆｏｒｋ  ｈｅａｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＤＡＦ−１６  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９７  Ｏｃｔ  ３０；３８９（６６５４）：９９４−９．；Ｉｎｏｕｅ  Ｔ，Ｔｈｏｍａｓ  ＪＨ．    Ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｄａｕｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２０００  Ｊａｎ  １；２１７（１）：１９２−２０４．；Ｌｅｅ  ＲＹ，Ｈｅｎｃｈ  Ｊ，Ｒｕｖｋｕｎ  Ｇ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＤＡＦ−１６  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｏｒｔｈｏｌｏｇ  ＦＫＨＲＬ１  ｂｙ  ｔｈｅ  ｄａｆ−２  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．２００１  Ｄｅｃ  １１；１１（２４）：１９５０−１９５７．；およびＧｅｒｉｓｃｈ  Ｂ，Ｗｅｉｔｚｅｌ  Ｃ，Ｋｏｂｅｒ−Ｅｉｓｅｒｍａｎｎ  Ｃ，Ｒｏｔｔｉｅｒｓ  Ｖ，Ａｎｔｅｂｉ  Ａ．Ａ  ｈｏｒｍｏｎａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄ  ｌｉｆｅ  ｓｐａｎ．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ．２００１  Ｄｅｃ；１（６）：８４１−８５１）。またリスにおいても冬眠状態では同じＦｏｒｋｈｅａｄファミリー遺伝子の核内移行が重要とされている（Ｃａｉ  Ｄ，ＭｃＣａｒｒｏｎ  ＲＭ，Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋ  Ｊ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅ，ＦｏｘＯ１ａ，ｆｒｏｍ  ｔｈｉｒｔｅｅｎ−ｌｉｎｅｄ  ｇｒｏｕｎｄ  ｓｑｕｉｒｒｅｌ．Ｇｅｎｅ．２００４  Ｄｅｃ  ８；３４３（１）：２０３−９．）。また、冬眠状態のリスや線虫においてもＡＫＴのリン酸化が低下しているとの報告もある（Ｃａｉ  Ｄ，ＭｃＣａｒｒｏｎ  ＲＭ，Ｙｕ  ＥＺ，Ｌｉ  Ｙ，Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋ  Ｊ．，Ａｋｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｒｅ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｉｂｅｒｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  １３−ｌｉｎｅｄ  ｇｒｏｕｎｄ  ｓｑｕｉｒｒｅｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２００４  Ｊｕｌ  １６；１０１４（１−２）：１４−２１．）。線虫やげっ歯類のように冬眠する生物は比較的寿命が長いことが知られ���いる。幹細胞（代表的には、造血幹細胞）は一生にわたり造血を維持する機能を持つ寿命の長い細胞である。このような細胞を大切に維持していくためには冬眠様状態は有効であることが示唆される。さらにＦＯＸＯ分子は最近リン酸化したｓｍａｄと結合し核内に移行するという報告がある（Ｓｅｏａｎｅ  Ｊ，Ｌｅ  ＨＶ，Ｓｈｅｎ  Ｌ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＳＡ，Ｍａｓｓａｇｕｅ  Ｊ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａｄ  ａｎｄ  ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ．２００４  Ａｐｒ  １６；１１７（２）：２１１−２２３．）。セリン／スレオニンキナーゼであるＴＧＦ−βＲはｓｍａｄをリン酸化し幹細胞（代表的には、造血幹細胞）の冬眠様状態の維持に一役かっていると示唆される。
【００７９】
（冬眠様状態を誘導するのが微小環境の役割である）
細胞膜の脂質ラフトが集積し多々の分子が接近すると分子間の相互作用などにより強いシグナル伝達がおきる。脂質ラフトの集積を阻害した条件下において幹細胞（代表的には、造血幹細胞）は生存して冬眠様状態に入ることができるが、前駆細胞はすぐ死滅する。サイトカインが無いと脂質ラフト集積の有無を問わず、全ての細胞は直ちに死滅する。したがって脂質ラフトが形成されないという条件下でもｃ−Ｋｉｔやｃ−Ｍｐｌ受容体は少なくとも生存シグナルを伝えるうること、そしてこの生存シグナルは幹細胞（代表的には、造血幹細胞）に特異的であって前駆細胞では機能しないことが示唆された。この違いがシグナルの強さの違いなのか、それとも質的な違いなのかは不明であるが、集積形成しない場合とする場合とでは異なるシグナル伝達経路が存在するという可能性は他の幹細胞にもあてはまる可能性があり、興味深い。幹細胞（代表的には、造血幹細胞）の活性化を促すＫＬやＴＰＯは生体内のどの場所にも存在しえる。しかし、それに幹細胞（代表的には、造血幹細胞）がむやみに反応して増殖しないようにｃ−ｋｉｔ，ｃ−ｍｐｌの集積を阻害して冬眠様状態にしているのがニッチ細胞の役割ではないか。ニッチ細胞から離れた幹細胞（代表的には、造血幹細胞）は脂質ラフトが集積されやすくなり、サイトカインに反応して効率良く増殖するようになる。
【００８０】
（ＴＧＦ、オステオブラストによるＴＧＦの産生、Ａｎｇ−１、ＴＧＦの活性化と局所濃度）
（ＴＧＦ−βによる冬眠様状態の誘導）
ＴＧＦシグナルが幹細胞（代表的には、造血幹細胞）の分裂を阻害するという報告は多数ある。また、ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌデータベースもＴＧＦスーパーファミリーのメンバーが幹細胞（代表的には、造血幹細胞）に多数発現していることを示している。実際、今回の実験でＴＧＦ−βが脂質ラフトの集積阻害をすることを確認できた。ＴＧＦ−βがどのように脂質ラフトの集積を阻害するかについては不明な点が多いが、ＴＧＦ−βの刺激がＪＮＫ，カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）を活性化してｃ−ｓｒｃの活性を阻害することが原因かもしれない（Ａｔｆｉ  Ａ，Ｄｒｏｂｅｔｓｋｙ  Ｅ，Ｂｏｉｓｓｏｎｎｅａｕｌｔ  Ｍ，Ｃｈａｐｄｅｌａｉｎｅ  Ａ，Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  Ｓ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｓｒｃ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４  Ｄｅｃ  ２；２６９（４８）：３０６８８−９３．；．Ｐａｒｋ  ＳＳ，Ｅｏｍ  ＹＷ，Ｋｉｍ  ＥＨ，Ｌｅｅ  ＪＨ，Ｍｉｎ  ｄｏ  Ｓ，Ｋｉｍ  Ｓ，Ｋｉｍ  ＳＪ，Ｃｈｏｉ  ＫＳ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃ−Ｓｒｃ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ１−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００４  Ａｕｇ  １９；２３（３７）：６２７２−８１．；Ｅｎｃｉｎａｓ  Ｍ，Ｔａｎｓｅｙ  ＭＧ，Ｔｓｕｉ−Ｐｉｅｒｃｈａｌａ  ＢＡ，Ｃｏｍｅｌｌａ  ＪＸ，Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ  Ｊ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＥＭ  Ｊｒ．ｃ−Ｓｒｃ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉ赤  ｆｏｒ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  （ＧＤＮＦ）  ｆａｍｉｌｙ  ｌｉｇａｎｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｖｉａ  ａ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−３  ｋｉｎａｓｅ  （ＰＩ−３Ｋ）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００１  Ｍａｒ  １；２１（５）：１４６４−７２．）。ｃ−ｓｒｃインヒビターを加えた時にも脂質ラフトの集積阻害がみられた事もこの仮説を支持する。ＴＧＦ−βは多くの細胞で産生されているが、オステオブラストもその一つである。またＴＧＦ−βは他のサイトカインとは違い多くが潜在型として体内に存在する。この潜在型ＴＧＦ−βはプラスミンやインテグリンβ６によって活性化されることが知られている。興味深い事ことβ６は骨髄細胞のなかでもストローマ細胞に特異的に発現している。このように幹細胞（代表的には、造血幹細胞）を冬眠状態に維持する場所はＴＧＦ−βが最も活性化しやすい場所と考えることができる。最近、Ｋａｒｓｓｏｎ等はＴＧＦ−βＲ１のコンディショナルＫＯマウスを用いた実験からｖｉｖｏにおいてＴＧＦ−βのシグナルは造血幹細胞の停止（ｑｕｉｅｓｃｅｎｓｅ）に無関係であると報告している。しかし、彼らが使用したマウスはＴＧＦ−Ｒ１のみのＫＯマウスであり、ＴＧＦＲ２を介したシグナルについては解析していない。ＴＧＦＲ２ドミナントネガティヴ（ＴＢＲＩＩＤＮ）マウスの実験では造血異常がみられること（Ｏｈ  ＳＰ，Ｓｅｋｉ  Ｔ，Ｇｏｓｓ  ＫＡ，Ｉｍａｍｕｒａ  Ｔ，Ｙｉ  Ｙ，Ｄｏｎａｈｏｅ  ＰＫ，Ｌｉ  Ｌ，Ｍｉｙａｚｏｎｏ  Ｋ，ｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅ  Ｐ，Ｋｉｍ  Ｓ，Ｌｉ  Ｅ．  Ａｃｔｉｖｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  １  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０００  Ｍａｒ  １４；９７（６）：２６２６−３１．）から彼らのデータと本発明者らのデータを合わせて考えると、ＴＧＦＲ１以外にもＴＧＦＲ２と結合してシグナルを伝える分子が考えられる。ＴＧＦＲ２はＴＧＦβＲ１のほかにＡＫＬ−１と結合することが報告されている（Ｓｈａｈ  ＡＨ，Ｔａｂａｙｏｙｏｎｇ  ＷＢ，Ｋｉｍｍ  ＳＹ，Ｋｉｍ  ＳＪ，Ｖａｎ  Ｐａｒｉｊｓ  Ｌ，Ｌｅｅ  Ｃ．Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｔｈａｌｌｙ  ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ａｄｕｌｔ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２  Ｏｃｔ  １；１６９（７）：３４８５−９１）ことからＴＧＦβからのシグナルが造血幹細胞の脂質ラフト集積阻害および冬眠様状態の誘導に関与していることが強く示唆される。
【００８１】
一方、ＡｒａｉらはＡｎｇ−１／Ｔｉｅ−２が幹細胞（代表的には、造血幹細胞）冬眠様状態の維持に関与していることを報告している（Ａｒａｉ  Ｆ，Ｈｉｒａｏ  Ａ，Ｏｈｍｕｒａ  Ｍ，Ｓａｔｏ  Ｈ，Ｍａｔｓｕｏｋａ  Ｓ，Ｔａｋｕｂｏ  Ｋ，Ｉｔｏ  Ｋ，Ｋｏｈ  ＧＹ，Ｓｕｄａ  Ｔ．Ｔｉｅ２／ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｎｉｃｈｅ．Ｃｅｌｌ．２００４  Ｊｕｌ  ２３；１１８（２）：１４９−１６１．）。実際、本発明者らの実験系においてもＡｎｇ−１を加えると脂質ラフトの集積が部分的にではあるが阻害された。しかしＡｎｇ−１の添加ではＡｋｔのリン酸化の阻害までは誘導できず、コロニー形成を阻止することはできなかった（ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｄａｔａ）。本発明者らのデータは幹細胞（代表的には、造血幹細胞）の冬眠様状態の誘導に関してＡｎｇ−１よりもＴＧＦ−βの方が中心的な役割を果たしていることを強く示唆している。しかし、Ａｎｇ−１は不溶性であることから本発明者らの使用したＡｎｇ−１自体の活性が低いという可能性は残されている。
【００８２】
（自己複製との関連）
本発明において、本発明者らは幹細胞（代表的には、造血幹細胞）の冬眠様状態への導入にＴＧＦ−β／ＴＧＦβＲを介したシグナルによる脂質ラフトの集積阻害が重要な役割をはたしていることを明らかにした。骨髄ニッシェにおける造血の機構を解明する上できわめて重要な知見である。しかしながら、本発明者らの一つの目的は幹細胞（代表的には、造血幹細胞）の自己複製の分子機構の解明である。ＴＧＦ−βは脂質ラフトの集積を阻害することにより幹細胞（代表的には、造血幹細胞）の分裂を阻害するが、自己複製するためには細胞分裂が必須である。長期ＢｒｄＵ取り込み実験はほぼ全ての幹細胞（代表的には、造血幹細胞）が平均して３週間に一度分裂していることを示している。どのようなシグナルがニッシェ上で冬眠様状態にある幹細胞（代表的には、造血幹細胞）を順次分裂させていくかに関わらず、本発明では、Ｇ０期への誘導を可能にしたことは意義深い。
【００８３】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，緑ｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，緑ｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ  ＥＳ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，緑ｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，緑ｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００８４】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００８５】
（発明を実施するための好ましい形態）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。
【００８６】
１つの局面において、本発明は、幹細胞を休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導する方法を提供する。この方法は：Ａ）該細胞の膜上の脂質ラフト（ｒａｆｔ）の集積を阻害する工程を包含する。脂質ラフトの集積の阻害は、本明細書において記載される種々の因子によって達成することができる。
【００８７】
１つの実施形態において、脂質ラフトの集積は、細胞膜上でスフィンゴ脂質およびコレステロールが集積したミクロドメインの有無によって判定される。スフィンゴ脂質およびコレステロールは、ウェスタンブロット、蛍光色素染色などの種々の手法によって測定することができる。
【００８８】
別の実施形態において、本発明において観察される脂質ラフトの集積阻害は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βファミリーのメンバー、メチルβシクロデキストリン、ｃ−ｓｒｃインヒビター、ＰＩ３Ｋインヒビター（例えば、Ｌｙ２９４００２）およびｃ−ｓｒｃインヒビター（例えば、ＰＰ２）からなる群より選択される少なくとも１つの因子により達成され得るがこれらに限定されない。このような因子は、集積の阻害をみることによって、当業者は、任意の等価物を入手することができることに留意すべきである。
【００８９】
別の実施形態において、本発明において使用されるＴＧＦβは、配列番号１に示すヌクレオチド配列またはその改変体もしくは断片によりコードされるかまたは配列番号２にアミノ酸配列またはその改変体もしくは断片を含む。そのような改変体は、以下のような物を使用することができる。
【００９０】
ＴＧＦβなどの核酸分子もしくはポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１などの核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。好ましいアクチビンまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４２℃の温度で  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ  ＮａＣｌ；６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１などに示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
【００９１】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件で入手されるポリヌクレオチドをいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（例えば、アクチビン）をコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００９２】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【００９３】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
【００９４】
あるタンパク質分子（例えば、アクチビンなど）において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【００９５】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【００９６】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
【００９７】
親水性指数もまた、本発明のアミノ酸配列を改変するのに有用である。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【００９８】
本明細書において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、±２以内のもの同士、好ましくは±１以内のもの同士、より好ましくは±０．５以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９９】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、１または数個の置換、付加および／または欠失、あるいは１つ以上の置換、付加および／または欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種において、もとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【０１００】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ  Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
【０１０１】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、または１もしくは数個、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、または１もしくは数個、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、短縮化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、ホスホリル化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【０１０２】
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、マウスのＴＧＦβなどの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（ヒト、ラット、ブタ、ウシなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウスのＴＧＦβなどの遺伝子）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。そのようなＴＧＦβなどの因子は、当業者が本明細書において記載されるような表をもとに、検索することが可能である。
【０１０３】
１つの実施形態では、脂質ラフトの集積阻害は、例えば、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βファミリーのメンバーの活性化因子により達成される。このような活性化因子は、当該分野において周知の技法によって決定することができ、例えば、インテグリンβ６およびプラスミンなどを挙げることができる。
【０１０４】
別の実施形態では、脂質ラフトは、ｃ−Ｋｉｔリガンド（ＫＬ）（配列番号３（核酸配列）または配列番号４（アミノ酸配列））および血小板刺激因子（ＴＰＯ）（配列番号５（核酸配列）または配列番号６（アミノ酸配列））刺激によって細胞膜上に集積される。
【０１０５】
別の実施形態では、脂質ラフトは、ｃ−ｋｉｔ（配列番号７（核酸配列）または配列番号８（アミノ酸配列））、ＧＭ−１およびｃ−ｍｐｌ（配列番号９（核酸配列）または配列番号１０（アミノ酸配列））からなる群より選択される少なくとも１つの因子を観察することによって同定される。理論に束縛されないが、これらの因子は、脂質ラフトの集積と同調する傾向が見られたからである。
【０１０６】
１つの実施形態では、本発明が対象とする幹細胞は、造血幹細胞（特に骨髄からとれる骨髄造血幹細胞）であるがそれに限定されない。理論に束縛されることを望まないが、幹細胞は、どのような細胞であっても同様の脂質ラフトの形成およびその集積がみられるからである。
【０１０７】
１つの実施形態では、本発明において達成されるべき脂質ラフトの集積の阻害は、Ａｎｇ−１（配列番号１１（核酸配列）または配列番号１２（アミノ酸配列））添加時よりも大きな阻害であり得る。このような阻害は、本明細書において記載されたアッセイ方法によって定量することができる。脂質ラフトの集積の阻害は、ＴＧＦβファミリーのメンバーによって達成される阻害と少なくとも同程度の阻害であり得る。
【０１０８】
好ましい実施形態では、脂質ラフトの集積の阻害は、Ａｎｇ−１では達成できないがＴＧＦβで達成できる阻害濃度であり得る。本発明では、特に、脂質ラフトの集積の阻害を、ＴＧＦβまたはその等価物により達成可能なレベルにまで阻害することによって細胞のＧ０期への導入が好ましいことも見出されているからである。
【０１０９】
他方で、本発明において好ましい実施形態では、脂質ラフトの集積は、幹細胞因子（ＳＣＦ）（配列番号１３（核酸配列）または配列番号１４（アミノ酸配列））によって生じさせることができる。  
【０１１０】
１つの実施形態では、阻害工程は、ＳＣＦおよび血小板刺激因子（ＴＰＯ）（配列番号５（核酸配列）または配列番号６（アミノ酸配列））の存在下で行うことができる。これらの因子は、通常の培養培地に添加して使用することができる。
【０１１１】
本発明では、任意の培地を含む任意の培養液を用いることができる。そのような培養液としては、例えば、ＤＭＥＭ、Ｐ１９９、ＭＥＭ、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ平衡化塩溶液）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、ＢＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ１０４、ＭＣＤＢ１５３（ＫＧＭ）などが挙げられるがそれらに限定されない。このような培養液には、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）などの副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、アスコルベート−２−ホスフェート（ａｓｃｏｒｂａｔｅ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、ａＦＧＦ・ｂＦＧＦ・ＥＧＦ・ＩＧＦ・ＴＧＦβ・ＥＣＧＦ・ＢＭＰ・ＰＤＧＦをはじめとする増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、子牛血清、馬血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸（亜セレン酸ナトリウムなど）、リノレン酸、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、５−アザンシチジンなどの脱メチル化剤、トリコスタチンなどのヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、ＬＩＦ・ＩＬ−２・ＩＬ−６などのサイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジブチルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、ポリブレン、セレニウムなどを１つまたはその組み合わせとして含ませておいてもよい。
【０１１２】
（保存法）
別の局面において、本発明は、細胞を保存する方法を提供する。この方法は、Ａ）該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する工程を包含する。理論に束縛されることを望まないが、脂質ラフトの集積を阻害することによって、細胞がＧ０期に導入され、いわゆる「休眠」または「冬眠」期に入ることから、細胞の寿命が延長されるからである。その保存効果は、休眠によって予期される任意の効果であり得る。
【０１１３】
（濃縮・純化方法）
別の局面において、本発明は、幹細胞を濃縮または純化するための方法を提供する。この方法は、Ａ）幹細胞を含むか含むと予測される試料を提供する工程；Ｂ）該試料を幹細胞が生存する条件で培養する工程；およびＣ）該試料を細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する条件に暴露する工程を包含する。理論に束縛されることを望まないが、脂質ラフトの集積を阻害することによって、いわゆる「休眠」または「冬眠」期に入ることから、細胞の分別が容易になるからである。脂質ラフトの集積の阻害は、本明細書に記載される任意の具体的な条件およびその改変を用いることができ、そのような条件は本発明の濃縮純化方法に使用することができることが理解される。
【０１１４】
１つの局面において、本発明は、本発明の幹細胞を濃縮または純化するための方法によって得られた濃縮または純化された幹細胞を提供する。
【０１１５】
（幹細胞濃縮・純化組成物の生産）
別の局面において、本発明は、幹細胞が濃縮または純化された組成物を生産するための方法を提供する。この方法は、Ａ）幹細胞を含む試料を提供する工程；Ｂ）該試料を細胞の膜上の脂質ラフトの形成を阻害する条件に暴露する工程；およびＣ）該試料を幹細胞が生存する条件で培養する工程を包含する。理論に束縛されることを望まないが、脂質ラフトの集積を阻害することによって、いわゆる「休眠」または「冬眠」期に入ることから、細胞の分別が容易になり、それにより分離することができるからである。脂質ラフトの集積の阻害は、本明細書に記載される任意の具体的な条件およびその改変を用いることができ、そのような条件は本発明の濃縮純化方法に使用することができることが理解される。分離には、例えば、フローサイトメトリーなどの技術を用いることができる。濃縮または純化は、例えば、所望の幹細胞が、存在する細胞のうち、少なくとも約５０％以上、少なくとも約６０％以上、少なくとも約７０％以上、少なくとも約８０％以上、少なくとも約９０％以上、少なくとも約９５％以上、少なくとも約９９％以上であることが好ましい。
【０１１６】
１つの局面において、本発明は、本発明の幹細胞が濃縮または純化された組成物を生産するための方法によって得られた組成物を提供する。
【０１１７】
（細胞増殖の促進または誘導）
別の局面において、本発明は、細胞増殖を促進または誘導する方法を提供する。この方法は：Ａ）該細胞の膜上の脂質ラフト（ｒａｆｔ）の集積を生じさせるかまたは促進する工程を包含する。ここでは、集積は、細胞膜上でスフィンゴ脂質およびコレステロールが集積したミクロドメインの有無によって判定され得る。
【０１１８】
１つの実施形態では、脂質ラフトの集積は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βインヒビター、ｃ−ｓｒｃアクチベーター、およびガングリオシドからなる群より選択される因子により達成され得る。
【０１１９】
別の実施形態では、ＴＧＦβは、配列番号１に示す配列（ＴＧＦβ１）またはその改変体もしくは断片であるがそれに限定されない。このような改変体は、本明細書において上記された形態のうち任意のものを使用することができることが理解される。
【０１２０】
別の実施形態では、ＴＧＦβのインヒビターは、ＴＧＦβのアンチセンス核酸、ＲＮＡｉ、抗体、化合物および低分子などであり得る。
【０１２１】
好ましい実施形態では、脂質ラフトの形成促進は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βのＲＮＡｉにより達成され得る。
【０１２２】
本明細書において「ＲＮＡｉ」とは、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの略称で、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書においてＲＮＡｉはまた、場合によっては、ＲＮＡｉを引き起こす因子と同義に用いられ得る。
【０１２３】
本明細書において「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、ＲＮＡｉを引き起こすことができるような任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子」に対して「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関するＲＮＡｉを引き起こし、ＲＮＡｉがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのようなＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約７０％の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。このようなＲＮＡｉは、本明細書において、生物中のエラープローン頻度を調節するために有用であり得る。
【０１２４】
１つの実施形態では、本発明において利用される脂質ラフトは、ＫＬおよびＴＰＯ刺激によって細胞膜上に集積されてもよいがそれに限定されない。
【０１２５】
１つの実施形態では、本発明が対象とする幹細胞は、造血幹細胞（特に骨髄からとれる骨髄造血幹細胞）であるがそれに限定されない。理論に束縛されることを望まないが、幹細胞は、どのような細胞であっても同様の脂質ラフトの形成およびその集積がみられるからである。
【０１２６】
別の実施形態では、脂質ラフトは、ｃ−Ｋｉｔリガンド（ＫＬ）（配列番号３（核酸配列）または配列番号４（アミノ酸配列））および血小板刺激因子（ＴＰＯ）（配列番号５（核酸配列）または配列番号６（アミノ酸配列））刺激によって細胞膜上に集積される。
【０１２７】
別の実施形態では、脂質ラフトは、ｃ−ｋｉｔ（配列番号７（核酸配列）または配列番号８（アミノ酸配列））、ＧＭ−１（ガラクトース（Ｇａｌ）−Ｎアセチルガラクトサミン−ガラクトース（Ｇａｌ）−グリコシル（Ｇｌｃ）−セラミド（Ｃｅｒ））およびｃ−ｍｐｌ（配列番号９（核酸配列）または配列番号１０（アミノ酸配列））からなる群より選択される少なくとも１つの因子を観察することによって同定される。理論に束縛されないが、これらの因子は、脂質ラフトの集積と同調する傾向が見られたからである。別の実施形態では、阻害工程は、ＳＣＦおよび血小板刺激因子（ＴＰＯ）（配列番号５（核酸配列）または配列番号６（アミノ酸配列））の存在下で行うことができる。これらの因子は、通常の培養培地に添加して使用することができる。
【０１２８】
（スクリーニング）
別の局面において、本発明は、細胞を休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導するための因子を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は：Ａ）該因子の候補物質を提供する工程；Ｂ）該目的の細胞における脂質ラフトを観察する工程；Ｃ）該因子を目的の細胞に暴露させる工程；およびＤ）該因子への暴露後の該目的の細胞における脂質ラフトを観察し、脂質ラフトの集積阻害を引き起こす因子は、該目的の細胞を休止状態に維持または誘導するための因子であると決定する工程、を包含する。
【０１２９】
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよく、インシリコ（コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。
【０１３０】
このようなスクリーニングまたは同定の方法は、当該分野において周知であり、例えば、そのようなスクリーニングまたは同定は、マイクロタイタープレート、ＤＮＡまたはプロテインなどの生体分子アレイまたはチップを用いて行うことができる。スクリーニングの試験因子を含む対象としては、例えば、遺伝子のライブラリー、コンビナトリアルライブラリーで合成した化合物ライブラリーなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１３１】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、疾患または障害の調節因子を同定する方法を提供する。このような調節因子は、それぞれの疾患の医薬またはそのリード化合物として用いることができる。そのような調節因子ならびにその調節因子を含む医薬およびそれを利用する治療法もまた、本発明の範囲内にあることが意図される。
【０１３２】
したがって、本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。
【０１３３】
本発明は、他の実施形態において、本発明の化合物に対する調節活性についての有効性のスクリーニングの道具として、コンピュータによる定量的構造活性相関（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ＝ＱＳＡＲ）モデル化技術を使用して得られる化合物を包含する。ここで、コンピューター技術は、いくつかのコンピュータによって作成した基質鋳型、ファーマコフォア、ならびに本発明の活性部位の相同モデルの作製などを包含する。一般に、インビトロで得られたデータから、ある物質に対する相互作用物質の通常の特性基をモデル化することに対する方法は、最近ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭ  ファーマコフォア法（Ｅｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：４７７〜４８９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８８：２１〜２９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９０：４２９〜４３８，１９９９；Ｅｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９１：４２４〜４３３，１９９９）および比較分子電界分析（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｉｅｌｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ；ＣｏＭＦＡ）（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ＆  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，２４：１〜６，１９９６）などを使用して示されている。本発明において、コンピュータモデリングは、分子モデル化ソフトウェア（例えば、ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭバージョン４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）など）を使用して行われ得る。
【０１３４】
活性部位に対する化合物のフィッティングは、当該分野で公知の種々のコンピュータモデリング技術のいずれかを使用してで行うことができる。視覚による検査および活性部位に対する化合物のマニュアルによる操作は、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，１９９２）、ＳＹＢＹＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，１９９２）、ＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０６：７６５−７８４，１９８４）、ＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，４：１８７〜２１７，１９８３）などのようなプログラムを使用して行うことができる。これに加え、ＣＨＡＲＭＭ、ＡＭＢＥＲなどのような標準的な力の場を使用してエネルギーの最小化を行うこともできる。他のさらに特殊化されたコンピュータモデリングは、ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８：８４９〜８５７，１９８５）、ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１：２９〜３４，１９９１）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ｏｌｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓ  ｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：１９５〜２０２，１９９０）、ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１：２６９〜２８８，（１９８２））などを含む。さらなる構造の化合物は、空白の活性部位、既知の低分子化合物における活性部位などに、ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６：６１〜７８，１９９２）、ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ  ａｎｄ  Ｉｔａｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７：８９８５，１９９１）、ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などのようなコンピュータープログラムを使用して新規に構築することもできる。このようなモデリングは、当該分野において周知慣用されており、当業者は、本明細書の開示に従って、適宜本発明の範囲に入る化合物（例えば、所望の校正機能を付与する化合物など）を設計することができる。
【０１３５】
好ましい実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、前記因子を目的の細胞に暴露して細胞周期を調節し得るかどうかを確認する工程、をさらに包含し得る。
【０１３６】
１つの実施形態では、脂質ラフトの観察は、蛍光色素染色およびウエスタンブロッティングからなる群より選択される手法により行われ得る。
【０１３７】
本発明のスクリーニング方法によって使用される因子は、幹細胞の同定、濃縮または純化に使用され得る。
【０１３８】
別の局面において、本発明は、細胞増殖を維持または誘導する因子を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は：Ａ）該因子の候補物質を提供する工程；Ｂ）該目的の細胞における脂質ラフトを観察する工程；Ｃ）該因子を目的の細胞に暴露させる工程；およびＤ）該因子への暴露後の該目的の細胞における脂質ラフトを観察し、脂質ラフトの集積を引き起こす因子は、該目的の細胞の増殖を維持または誘導するための因子であると決定する工程、を包含する。スクリーニング方法は、上記された任意の形態を用いて行うことができる。
【０１３９】
（Ｇ０期維持・誘導システム）
１つの局面において、本発明は、幹細胞を休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導するシステムであって、該細胞の膜上のラフトの集積を阻害する手段を備えるシステムを提供する。ここでは、細胞の膜上のラフトの集積を阻害する手段としては、本明細書において上記される任意の因子などを挙げることができるがそれに限定されない。
【０１４０】
（濃縮・純化システム）
別の局面において、本発明は、幹細胞を濃縮または純化するためのシステムを提供する。このシステムは、Ａ）幹細胞を含むか含むと予測される試料を提供する手段；Ｂ）該試料を幹細胞が生存する条件で培養する手段；およびＣ）該試料を細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する条件に暴露する手段を備える。
【０１４１】
別の局面において、本発明は、細胞増殖を維持または誘導するシステムであって：該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を生じさせるかまたは促進する手段を備える、システムを提供する。
【０１４２】
他の局面において、本発明は、細胞を休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導するための因子を同定するためのスクリーニングシステムを提供する。このシステムは：Ａ）該因子の候補物質を提供する手段；Ｂ）該目的の細胞における脂質ラフトを観察する手段；Ｃ）該因子を目的の細胞に暴露させる手段；およびＤ）該因子への暴露後の該目的の細胞における脂質ラフトを観察し、脂質ラフトの集積阻害を引き起こす因子は、該目的の細胞を休止状態に維持または誘導するための因子であると決定する手段、を備える。
【０１４３】
さらに別の局面において、本発明は、細胞増殖を維持または誘導する因子を同定するためのスクリーニングシステムを提供する。このシステムは：Ａ）該因子の候補物質を提供する手段；Ｂ）該目的の細胞における脂質ラフトを観察する手段；Ｃ）該因子を目的の細胞に暴露させる手段；およびＤ）該因子への暴露後の該目的の細胞における脂質ラフトを観察し、脂質ラフトの集積を引き起こす因子は、該目的の細胞の増殖を維持または誘導するための因子であると決定する手段、を備える。ここで使用され得る手段としては、本明細書において記載された任意の形態を用いて使用することができる。
【０１４４】
（培地）
１つの局面において、本発明は、幹細胞を休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導する培地であって、該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する因子を含む培地を提供する。
【０１４５】
別の局面において、本発明は、細胞を保存するための培地であって、該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する因子を含む培地を提供する。
【０１４６】
さらに別の局面において、本発明は、幹細胞を同定、濃縮または純化するための培地であって、該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する因子を含む培地を提供する。
【０１４７】
さらに別の局面において、本発明は、細胞増殖を維持または誘導する培地であって：該細胞の膜上の脂質ラフトの集積を生じさせるかまたは促進する因子を含む培地を提供する。
【０１４８】
このような培地において、基本となる成分としては、幹細胞が成長する成分であれば、どのようなものでも使用可能であることが理解され得る。
【０１４９】
（使用）
１つの局面において、本発明は、細胞の膜上の脂質ラフトの集積を阻害する因子の、幹細胞を同定し、あるいはその休止状態（Ｇ０期）に維持または誘導するための使用を提供する。ここで使用され得る因子としては、本明細書において記載された任意の形態を用いて使用することができる。
【０１５０】
他の局面において、本発明は、細胞の膜上の脂質ラフトの集積を促進する因子の、細胞増殖を促進または誘導するための使用を提供する。ここで使用され得る因子としては、本明細書において記載された任意の形態を用いて使用することができる。
【０１５１】
（幹細胞同定方法・システム）
１つの局面において、本発明は、幹細胞を同定する方法を提供する。この方法は：Ａ）判定される細胞の膜上の脂質ラフトの集積を観察する工程；およびＢ）集積が観察されない場合、幹細胞があると判定する工程を包含する。ここで、幹細胞の有無と、集積の度合いとは、以下のような関係であると理解される。
【０１５２】
本発明の成果により、集積が有るとき細胞は活性化状態にあると考えられ、集積が無いとき細胞は静止状態で有ると考えられることが明らかになった。集積の度合いが大きいほど細胞がより活性化しており効率的に分裂するが集積の度合いが少なければ細胞の分裂効率も良くないと考えられる。未分化細胞の内脂質ラフトの集積が起きていない細胞を幹細胞であると判定する。また培養において脂質ラフトが集積されていてなくても生き残っているものが幹細胞であると判定する。生体内に存在する幹細胞は脂質ラフトの集積が起きていないものが幹細胞ということになる。詳しく言えば、生体内ではまた分離した直後の細胞の未分化細胞の一部に脂質ラフトの集積が起きていない細胞が幹細胞だということである。
【０１５３】
好ましい実施形態では、幹細胞が未分化であり、かつ、脂質ラフトが観察されていないときに幹細胞であると判定する。
【０１５４】
別の局面において、本発明は、幹細胞を同定するシステムを提供する。このシステムは、Ａ）判定される細胞の膜上の脂質ラフトの集積を観察する手段；およびＢ）集積が観察された場合、幹細胞があると判定する手段を備える。このような手段としては、例えば、集積を確認・観察する装置が電気回線を通じて信号送信可能な状態で接続されているコンピュータを備えるデバイスを挙げることができる。
【０１５５】
ここで、このようなコンピュータには、幹細胞が未分化であり、かつ、脂質ラフトが観察されていないときに幹細胞であると判定する手段またはプログラムが備えられ得る。
【０１５６】
さらに別の局面において、本発明は、幹細胞を同定するシステムを提供する。このシステムは、Ａ）判定される細胞の膜上の脂質ラフトの集積を観察するための蛍光色素染色またはウエスタンブロッティングのためのキットを備え、ここで、集積が観察された場合、幹細胞があると判定することを特徴とする。このような手段としては、例えば、集積を確認・観察する装置が電気回線を通じて信号送信可能な状態で接続されているコンピュータを備えるデバイスを挙げることができる。
【０１５７】
このようにして、本発明を利用して、「幹細胞」を、「幹細胞」と判定することができることが理解される。
【０１５８】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１５９】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１６０】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬、支持体などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ、和光純薬（大阪、日本）などから市販されるものを用いた。以下において使用した動物は、日本の大学において規定される飼育規準を遵守して飼育および実験した。
【０１６１】
（実験手順）
（マウス）
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６−Ｌｙ５．２）マウスは日本ＳＬＣから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６−Ｌｙ５．１）マウスは三共ラボから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６−Ｌｙ５．２ｘＬｙ５．１−Ｆ１）マウスは本発明者らの研究室でかけ合わせて作製した。動物のために東京大学医科学研究所の組み換えＤＮＡ実験の指導に従って、本発明者らは動物を世話した。
【０１６２】
（マーカー）
Ａｌｅｘａ−４８８およびＡｌｅｘａ−６４７、Ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  Ｂ  ｓｕｂｕｎｉｔ  およびＡｌｅｘａ−６４７  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  およびｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）；  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｃ−Ｍｐｌ，Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ  ＡｋｔおよびＲａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ＦＫＨＲＬ１，ＦＫＨＲ；  （ｕｐｓｔａｔｅ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）；ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−サイクリンＤ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅ）；ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｐ５７（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）；  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｓｍａｄ２／３（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）；  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ  ｐＹ４１８  ｓｒｃ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ）。
【０１６３】
（Ｋｉ−６７のＨＳＣにおける発現パターン）
最初にマウスの足の骨から骨髄細胞をとりだし、比重遠心法によりリンパ球分画を回収し血液細胞の分化マーカーを混ぜたビオチン標識の抗体を加え３０分反応した後に抗ｒａｔ−ＩｇＧマグネットビーズを加えた。未分化の細胞の選択はＭＡＣＳカラムを用いカラムにトラップされない細胞を回収した。回収した細胞にストレプトアビジンテキサスレッド，抗ｃ−ｋｉｔ（ＡＰＣ標識），ｓｃａ−１（ＰＥ  ｃｙ５．５標識），ＣＤ３４（ＦＩＴＣ標識）抗体を加え１時間反応させた。その後ＦＩＸ＆ＰＥＲＭ  ｃｅｌｌ  ＰＥＲＭＥＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ  ｋｉｔ（ｃａｌｔａｇ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ）を用いＫｉ−６７（ＰＥ標識）抗体を細胞内染色した。５カラー解析はＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（ＢＤ）で行った。
【０１６４】
（ＨＳＣの分離と免疫染色）
ＨＳＣの分離はマウスの足の骨から骨髄細胞をとりだし、比重遠心法によりリンパ球分画を回収し血液細胞の分化マーカーを混ぜたビオチン標識の抗体を加え３０分反応した後に抗ｒａｔ−ＩｇＧマグネットビーズを加えました。未分化の細胞の選択はＭＡＣＳカラムを用いカラムにトラップされない細胞を回収した。
【０１６５】
その後、本発明者らの一般的な染色法はストレプトアビジンテキサスレッド，抗ｃ−ｋｉｔ（ＡＰＣ標識），ｓｃａ−１（ＰＥ標識），ＣＤ３４（ＦＩＴＣ標識）抗体を加えＣＤ３４−，ｃ−ｋｉｔ＋，ｓｃａ−１＋，Ｌｉｎ−の細胞集団をソーティングした。ｃ−ｋｉｔの局在を観察する場合は異なり、ストレプトアビジンテキサスレッド，抗ｃ−ｋｉｔ（ＰＥ標識），ｓｃａ−１（ＡＰＣ標識），ＣＤ３４（ＦＩＴＣ標識）抗体とした。ＨＳＣの免疫染色法はＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（ＢＤ）のクローンソーティング技術によって実現できた。まずスライドガラス上にポリリジンをコーティングし水で洗い乾かします。乾かした後スライドガラス上に培地または４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／  ＰＢＳのドロップを作った。このドロップの中にＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅのクローンソートを用いＨＳＣを入れた。ソーティングしたＨＳＣは３０分から１時間４℃の条件下で置きます。サイトカインの反応は４℃の条件下から取り出し３７℃，５％ＣＯ２条件で３０分（サイトカインによっては１時間）反応させた後に４％ＰＦＡをドロップに加え１０分間反応し細胞の動きを停止させた。ＰＢＳで洗った後にサポニンまたは０．５％トライトンＸ／ＰＢＳで細胞に穴をあけた。ＰＢＳで洗った後、１０％Ｇｏａｔ血清＋ＣＤ１６／３２（ｍｏｕｓｅ  Ｆｃ  ｂｌｏｃｋ）抗体で３０分ブロッキングした。１次抗体は抗ｐＡｋｔ，ＦＯＸＯ３Ａ，ＦＯＸＯ１Ａ，サイクリンＤ１抗体をｏｖｅｒｎｉｇｈｔで反応させた。二次抗体はＣＤ３４−，ｃ−ｋｉｔ＋，ｓｃａ−１＋，Ｌｉｎ−の細胞集団なので蛍光が重ならないａｌｅｘａ４８８，６４７を用いた。これらの抗体を３０分反応させた後ＤＡＰＩ入りマウント液で標本を完成させた。Ｃ−ｋｉｔの局在はＦＡＣＳでソーティングしたＰＥの標識で観察した。
【０１６６】
（ＬＲ集積阻害培養）
ＬＲ阻害剤としてメチルβシクロデキストリン（ＭＢＣＤ）を用いた。ＨＳＣにおいて最も良くＬＲの集積阻害を阻害し細胞傷害がない濃度は１ｍＭと検定した。培養液はｓ−ｃｌｏｎｅに１％ｓ−ｃｌｏｎｅ添加剤，１０％ＦＣＳ，Ｌ−グルタミン／ペニシリンにｍｏｕｓｅ−ＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ），ｈｕｍａｎ−ＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）の培地をコントロール培地としＬＲ阻害培地はコントロール培地条件に１ｍＭ−ＭＢＣＤを加えたものを用いた。ＬＲ阻害培地を９６ｗｅｌｌプレート（ＴＰＰ）に２００ｕｌ／ｗｅｌｌ入れた。ＨＳＣを１−ｃｅｌｌ／ウェルになるようにＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅでクローンソートした。細胞がウェルに入っていることは顕微鏡で確かめた。確かめた後に３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。培養を初めて〜１０日まで顕微鏡で細胞を観察して１ｗｅｌｌに存在する細胞の生死、細胞の数を確かめた。
【０１６７】
（単細胞培養コロニーアッセイ）
ＬＲ阻害培地とリカバリー培地としてｓ−ｃｌｏｎｅに１％ｓ−ｃｌｏｎｅ添加剤，１０％ＦＣＳ，Ｌ−グルタミン／ペニシリンにｍｏｕｓｅ−ＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ），ｈｕｍａｎ−ＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ），ＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ），ＥＰＯ（２Ｕ）を加えた培地を用いた。９６ｗｅｌｌプレート（ＴＰＰ）にＨＳＣを１−ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌになるようにＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅでクローンソートした。細胞がｗｅｌｌに入っていることは顕微鏡で確かめた。確かめた後に３７℃、５％ＣＯ２の条件で１１日培養した。コントロールは最初からリカバリー培地で培養した。ＬＲ阻害培地でＨＳＣを５日間，７日間培養したものは上清を取り除きリカバリー培地に換え１１日培養させコロニーを形成させました。ＴＧＦ−β１でのＬＲ集積阻害培地はリカバリー培地にＴＧＦ−β１を５ｎｇ／ｍｌ加えたものを用いた。コロニーが形成した細胞についてサイトスピンを行いヘマカラーで染色し各血球形態（ｎ，ｍ，Ｅ，Ｍ）の存在をしらべた。
【０１６８】
（ＬＲ集積阻害ＨＳＣの骨髄再構築能）
ＬＲ阻害培地を９６ウェルプレート（ＴＰＰ）に２００μｌ／ウェル入れた。ドナーマウスはＬｙ５．２  マウスから採取したＨＳＣを１細胞／ウェルになるようにＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅでクローンソートした。ＬＲ阻害培地で５日，７日培養し顕微鏡で生きていて細胞が一個だったＨＳＣを移植用に選び出した。５日間培養したものは単細胞移植を５０匹，２０個細胞移植を２０匹行った。７日間培養したものは２０個細胞移植を２０匹行った。コントロールはソーティングしたばかりのＨＳＣを用い単細胞移植を５０匹，２０個細胞移植を２０匹行った。レシピエントマウスはＬｙ５．１マウスを用いた。あらかじめ９５０Ｒの致死量の放射線を放射した。コンペジター細胞はＬｙ５．１ｘＬｙ５．２マウスのＦ−１マウスの骨髄細胞を一匹の移植あたり２×１０５個用いました。骨髄再構築能の解析は、３週目のマウスの末梢血でのＬｙ５．２マウス由来の細胞がどのくらいの頻度で生着しているかをＦＡＣＳも用い解析した。マウスから末梢血を採取し抗Ｂ２２０，ＣＤ４，ＣＤ８，Ｍａｃ−１，Ｇｒ−１，Ｌｙ５．１，Ｌｙ５．２抗体をもちい解析した。解析したデータから全ての血球細胞のうちＬｙ５．２陽性の細胞が０．１％以上で、かつ全ての血球系に分化できたものに関して陽性と判断した。
【０１６９】
（実施例１：造血幹細胞における脂質ラフトの役割の解明）
まず、造血幹細胞における脂質ラフトの役割を明らかにするために実験を行った。実験条件は、上記材料および方法に準じた。
【０１７０】
造血幹細胞の増殖には脂質ラフトの集積形成が必要である：造血幹細胞の骨髄中での頻度は３万個に一個ときわめて低いが、ＣＤ３４−ＫＳＬ分画では高度に濃縮されていて、これらの細胞を一個致死量放射線照射したマウスに移植すると３匹に１匹は長期骨髄再建がみられる。これらの細胞の細胞周期の状態を調べるため、５カラー解析を行って骨髄細胞におけるＫｉ６７の発現を調べた。造血前駆細胞であるＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞では約８３．２％の細胞がＫｉ６７陽性でｃｙｃｌｉｎｇしているが、ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞では９３．６％以上の細胞がＫｉ６７陰性でＧ０期にあることが示された（図１ａ）。
【０１７１】
次に成体マウス骨髄細胞よりＦＡＣＳで取り出したＣＤ３４−ＫＳＬ細胞およびＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞５０個を固定して免疫染色を行った。ＣＤ３４−ＫＳ細胞を脂質ラフトの形成の指標であるＧＭ−１を染色すると、９２％の細胞において膜全体でｄｉｆｆｕｓｅに認められ脂質ラフトの集積形成は認められない（図１ｂ）。また、もう一つのＧ０期の指標であるＦＯＸＯ３Ａの核内への局在も確認された。一方でＫＬの受容体であるｃ−Ｋｉｔの集積ならびに細胞内シグナル伝達分子であるＡｋｔのリン酸化もみられない。しかし、ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞では９８％の細胞においてＧＭ−１およびＣ−Ｋｉｔの脂質ラフト形成およびＡｋｔのリン酸化、ＦＯＸＯ３Ａの細胞質への局在が認められた。このように成体骨髄中の造血幹細胞の大部分がＧ０期にあって、脂質ラフトの形成は認められない。
【０１７２】
次にサイトカインで刺激による影響を調べるため、ＦＡＣＳで分取したＣＤ３４−ＫＳＬ細胞をＳＣＦ，ＴＰＯ，ＩＬ−３，ＥＰＯ存在下で３０分培養してから同様な方法で解析を行った。ＩＬ−３，ＥＰＯで刺激しても大きな変化は見られなかったが、ＳＣＦおよびＴＰＯの存在下で培養した場合、全ての細胞でサイトカインの種類に関係なくＧＭ−１、ｃ−Ｋｉｔ、ｃ−ｍｐｌの脂質ラフトへの集積が確認された。さらにＦＯＸＯ３Ａの細胞内局在ならびにＡｋｔのリン酸化を解析した。ＳＣＦ、ＴＰＯ，ＳＣＦ＋ＴＰＯ、いずれの場合においても脂質ラフトの形成とＡｋｔのリン酸化、ＦＯＸＯ３Ａの細胞質への移行が観察され。細胞の分裂と脂質ラフト形成の強い相関が示唆された。
【０１７３】
（実施例２：脂質ラフトの形成を阻害することによっておこる造血幹細胞内イベントの分析）
次に、脂質ラフトの形成を阻害することによっておこる造血幹細胞内イベントを分析した。実験条件は、上記材料および方法に準じた。
【０１７４】
生体内から分離した直後のＨＳＣの細胞膜上の脂質ラフトにはｃ−ｋｉｔ，ｃ−ｍｐｌが集積していない。大部分の造血幹細胞がＧ０期にあることを考えると、これは脂質ラフトの集積が細胞分裂を誘導している可能性を示唆している。
【０１７５】
そこでサイトカインシグナルの存在下において、メチルβ−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）を用いて細胞膜のコレステロールを除去し、脂質ラフトの形成阻害が細胞分裂に与える影響を調べた。ＨＳＣをＳＣＦ＋ＴＰＯ＋１ｍＭ−ＭβＣＤを加えた液滴にソーティングし４℃下で３０分置いたのちに、ＣＯ２インキュベーターで３０分反応させ、共焦点顕微鏡法でラベルされた抗体とＣＴｘＢの局在を観察した。その結果、ＧＭ−１、ｃ−Ｋｉｔおよびｃ−Ｍｐｌの細胞膜上での局在は、生体内から分離した直後のＨＳＣと同様に、広く局在し、Ａｋｔのリン酸化も強く起こっておらず、ＦＯＸＯ３Ａが核内で局在するパターンを示した（図２−ａ）。ＭβＣＤを加えたＨＳＣにおいても、ＧＭ−１の集積が起こっているものが少数存在したものの、ほとんどのＨＳＣではＧＭ−１の集積がみられなかった。また、Ｇ０期では細胞質に局在し細胞周期が開始されると核に移行するサイクリンＤ１（の局在を観察してみたところやはり骨髄中に存在するＨＳＣと同様に、細胞質での局在が観察された（図２−ｂ）。ＭβＣＤ以外のＧＭ−１の集積を阻害すると思われる試薬（アクチン重合の阻害薬サイトカラシンＤ，ＰＩ３−ＫインヒビターＬｙ２５６５６４，ｓｒｃファミリーインヒビターＳＵ６６５６，ＰＰ２など）を試したところ、同様の現象がみられた。
【０１７６】
（実施例３：脂質ラフトの形成阻害は造血幹細胞を冬眠状態にする）
次に、脂質ラフトの形成阻害によって、造血幹細胞が冬眠状態にされるかどうかを確認した。実験条件は、上記材料および方法に準じた。
【０１７７】
上記から脂質ラフト（ＧＭ−１）の集積が起こらない条件下では、サイトカイン存在下でもＦＯＸＯ３Ａの局在やＡｋｔのリン酸化の状態は骨髄中と同様に維持される事が示された。そこで本発明者らは、脂質ラフトの集積阻害がＨＳＣのニッシェにおける冬眠様状態をｍｉｍｉｃできるのではないかという仮説のもと、ＨＳＣ単一細胞培養系を用い造血幹細胞としての機能を維持しつづけることができるかｉｎ  ｖｉｔｒｏで検証した。
【０１７８】
ＨＳＣを１−ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌソーティングして、ＳＣＦ＋ＴＰＯ＋１ｍＭ−ＭβＣＤ存在下で５〜７日間培養した。その結果、ＭβＣＤ存在下で５日培養した群では５２％、７日培養群では６８％、１０日培養群では９４％死滅した。サイトカイン無しではＨＳＣ、ＣＤ３４＋ともに２４時間以内に１００％死滅した。また、ＣＤ３４＋の細胞群ではサイトカイン存在下でも２日で９９％死滅したことから、ＨＳＣでは脂質ラフトの形成が無くても生存シグナルが入るが、ＣＤ３４＋細胞ではそのシグナルを入れることができないと考えられる（図３−ａ）。
【０１７９】
その後の生存した細胞でＭβＣＤを抜きＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３およびＥＰＯ存在下の培養液に換えコロニーアッセイを行なった結果５６．９％という高頻度でｎｍＥＭコロニーができ、相対的に未分化な造血前駆細胞が増加していた。興味深いことに生存した細胞の９３％が細胞分裂を起こさず単一細胞のままで維持されていることから、脂質ラフトを阻害することにより造血幹細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて冬眠様状態に誘導されうることが示唆された。この系でもＭβＣＤ以外のＧＭ−１の集積を阻害する試薬（サイトカラシンＤ，Ｌｙ２９４００２，ＳＵ６６５６，ＰＰ２）などを試したが、細胞傷害性が高いため５〜７日間の培養は不可能だった。
【０１８０】
脂質ラフトの集積がサイトカイン存在下での増殖に必要であるというｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果は脂質ラフト集積阻害が骨髄内におけるＨＳＣの冬眠様の状態を再現するという仮説の妥当性を示唆する。培養後のＨＳＣ活性をさらに確実に証明するため骨髄移植の系によって長期骨髄再構築能を調べた。ここで本発明者らは、ＨＳＣをＳＣＦ，ＴＰＯ，１ｍＭ−ＭβＣＤを含む培地にクローンソーティングし５〜７日３７℃でシングルセルカルチャーを行った。培養後も４８％の細胞が生き残り、そのうち９３％が一個の状態で維持されていた。これらの細胞を回収し、５日培養した群では致死量の放射線を照射したマウス５０匹に、回収した培養後のＨＳＣを一個あるいは２０個尾静脈から、７日培養した群では２０匹に各２０細胞移植した。６週間後ＦＡＣＳを用いて末梢血中のドナー細胞のキメリズム解析を行った。コントロールとしては、ソーティングした直後のＨＳＣを一個または２０個移植した。その結果、コントロール単一細胞群では５０匹中１２匹（２４％）で生着が認められたのに対し５日培養単一細胞群においては５０匹中２４匹（４８％）で生着が認められ、有意に生着率の向上が見られた。このような脂質ラフトを作らせない条件下で造血幹細胞が相対的に濃縮されたということは、造血幹細胞だけが冬眠様状態に入るためのマシナリーを備えていることをあらためて強く示唆する。２０個の移植を行った群ではコントロール群でも全例で生着が認められたため、このような違いを見ることはできなかった。これらの結果は分裂しない状態で造血幹細胞が７日間にわたって機能を維持し続けうることを示しており、脂質ラフトの形成阻害が冬眠様状態の誘導に重要な役割をはたいていることが示された。
【０１８１】
（実施例４：ＴＧＦ−βが脂質ラフトの形成を阻害する（ＴＧＦＲは造血幹細胞により多く発現されている））
次に、本実施例では、ＴＧＦ−βが脂質ラフトの形成を阻害する（ＴＧＦＲは造血幹細胞により多く発現されている）ことを実証した。実験は、上記材料および方法に記載されているものに準じた。
【０１８２】
本発明では、骨髄ニッシェにおいてどのような分子が脂質ラフトの形成阻害を司っているかをさらに研究した。Ａｒａｉ等は骨髄ニッシェにおける造血幹細胞がＧ０期にある機構としてＡｎｇ−１／Ｔｉｅ−２からのシグナルの関与を報告した（非特許文献３）。また、ＲｅｙａはＮｏｔｃｈのリガンドが造血幹細胞の未分化性維持に関与を、ＫａｒｌｓｓｏｎらはＴＧＦベータシグナルがｉｎ  ｖｉｔｒｏでの造血幹細胞のｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅに関与していると報告している。
【０１８３】
そこで本発明者らは脂質ラフトの集積を阻害に関与しそうな分子、Ｎｏｔｃｈ  ｌｉｇａｎｄ，Ａｎｇ−１，Ｎ−ｃａｌｄｈｅｒｉｎなどをスクリーニングした。方法としてはこれらのサイトカイン存在下でＨＳＣを１時間培養し、その後ＳＣＦ＋ＴＰＯで３０ｍｉｎ刺激してからＣｔｘＢおよびＦＯＸＯ３Ａの局在、Ａｋｔのリン酸化について共焦点顕微鏡法で観察した。
【０１８４】
その結果、Ａｎｇ−１は部分的ではあるが脂質ラフトの形成を阻害したが、Ａｋｔのリン酸化は阻害しなかった。ところが、驚いたことにＴＧＦ−βシグナルは脂質ラフトの集積を強力に阻害した。最初からＴＧＦ−β、ＳＣＦ、ＴＰＯで刺激すると脂質ラフトの集積が見られるが、あらかじめＴＧＦ−β１だけで刺激しておくと  ＳＣＦ，ＴＰＯを加えても脂質ラフトの集積は阻止された。またＡｋｔ，ＦＯＸＯ３Ａなどでも免疫染色を行った結果ＭβＣＤで脂質ラフトの集積阻害をおこなった結果と合致した（図５−ａ）。実際にＴＧＦ−β１存在下で単一細胞コロニーアッセイを行ったところ予想通りコロニーの形成阻害がみられた（図５−ｂ）。しかしＴＧＦ−βに対する抗体を加えるとコロニーは形成されることからＴＧＦ−βが脂質ラフト集積を阻害することによって冬眠様状態を誘導しうることが明らかとなった。
【０１８５】
（実施例５：他の幹細胞での実証）
他の幹細胞で行う場合まずＴＧＦ−βレセプターの発現を確認する。確認ができた場合ＴＧＦ−ｂを培養液中に加え培養してみる。その結果、造血幹細胞と同様な結果が得られると期待できる。
【０１８６】
（実施例６：自動化）
本発明の仕組みを利用して実施するスクリーニングは、ロボットを用いて自動化することができる。この場合、例えば、ベックマンコールターのＢｉｏｍｅｋシリーズを用いて、マイクロプレートを用いたシステムを構築するか、またはＺｙｍａｒｋのＳｔａｃｃａｔｏ  Ｍｉｎｉ−Ｓｙｓｔｅｍシリーズを用いてシステムを構築することができる。
【０１８７】
このようにして得られたリード化合物は、動物実験に用いることができる。あるいは、このようなリード化合物をもとに、他の化合物を設計することができる。
【０１８８】
（実施例７：動物実験）
実施例６などで、脂質ラフトの集積阻害に関連することが判明した化合物について、マウス、ラットまたはサルなどの動物に投与して幹細胞を調節する化合物をスクリーニングする。
【０１８９】
このようなスクリーニングにより、幹細胞を実際に調節する物質をスクリーニングすることができる。
【０１９０】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１９１】
本発明は、幹細胞の細胞周期を調節する方法、組成物およびシステムを提供する。このような調節により、幹細胞の維持・制御・増殖をコントロールすることが容易になり、その維持・増殖を容易にかつ計画的にすることができるようになった。また、幹細胞の同定も容易にすることができるようになった。これらの有用性は、バイオ関連の産業において有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】図１は、骨髄中のＨＳＣが静止状態であり静止状態ＨＳＣは脂質ラフトの集積が起きていないと示した。（Ａ）骨髄中のＣＤ３４−，ｃ−ｋｉｔ＋，ｓｃａ−１＋，Ｌｉｎ−（ＨＳＣ）細胞を固定し抗Ｋｉ６７抗体で染色したものを示した。（Ｂ）分離した直後のＨＳＣをＣＴｘＢ、抗ｃ−ｋｉｔ，リン酸化Ａｋｔ，Ｆｏｘｏ３ａ抗体で免疫染色した。左側のパネルは核をＤＡＰＩ（青）で染色したものを示した。左から２番目パネルはＧＭ１領域（緑）を示した。左から３番目のパネルは上からｃ−ｋｉｔ，リン酸化Ａｋｔ，Ｆｘｏ３ａ（赤）を示した。右側のパネルは３色を重ね合わせたものを示した。パネル右側のグラフはＨＳＣとＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞とでのＧＭ１集積の有無を示した。黒棒はＧＭ１領域の集積を起こしていないもので、灰色棒はＧＭ１領域の集積を起こしているものを示した。
【図２】図２は、ＨＳＣはＳＣＦとＴＰＯの刺激がＧＭ１領域を集積させＨＳＣを活性化させることを示した。（Ａ）ＳＣＦとＴＰＯとでＨＳＣを刺激しＧＭ１領域とｃ−ｋｉｔの局在を示した。左側のパネルから順番に分離直後のＨＳＣ、ＳＣＦで３０分刺激した後のＨＳＣ，ＴＰＯで３０分刺激した後のＨＳＣ、ＳＣＦ＋ＴＰＯで３０分刺激した後のＨＳＣ、分離直後のＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞の免疫染色を示した。上から核（青），ＧＭ１領域（緑），ｃ−ｋｉｔ（赤），で染色したものを示した。下のパネルは３色を重ね合わせたものを示した。パネルの右側のグラフは分離直後のＨＳＣとＳＣＦで３０分刺激した後のＨＳＣ，ＴＰＯで３０分刺激した後、ＳＣＦ＋ＴＰＯで３０分刺激した後のＨＳＣでのＧＭ１領域集積の有無を示した。黒棒はＧＭ１領域の集積を起こしていないもので、灰色棒はＧＭ１領域の集積を起こしているものを示した。（Ｂ）ＳＣＦとＴＰＯとでＨＳＣを刺激しＧＭ１領域とＦｏｘｏ３ａの局在とＡｋｔのリン酸化強度を示した。ＧＭ１領域の局在とＡｋｔのリン酸化の強度を示したのが左側の３列のパネルでＧＭ１領域とＦｏｘｏ３ａの局在を示したのが中間の３つのパネル、右側２つのパネルはＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞でのＧＭ１領域とＦｏｘｏ３ａの局在とＡｋｔのリン酸化強度を示した。上のパネルから核（青），ＧＭ１（緑），ｐＡｋｔまたはＦｏｘｏ３ａ（赤）で染色したものを示した。下のパネルは３色を重ね合わせたものを示した。パネルの下ヒストグラムＮＩＨイメージで染色した蛍光の強度解析し示した。ＧＭ１を緑線、リン酸化ＡｋｔとＦｏｘｏ３ａは赤線で示した。
【図３】図３は、ＨＳＣの脂質ラフトの集積を阻害することよるＨＳＣの特徴を示した。（Ａ）左側３つのパネルはＧＭ１の局在とＡｋｔのリン酸化を免疫染色で示した。左側から分離直後のＨＳＣ，ＳＣＦとＴＰＯで３０分刺激したものとＭｂＣＤで３０分反応させた後にＳＣＦとＴＰＯで３０分刺激したものを示した。右側の３つのパネルはＧＭ１とＦｏｘｏ３ａの局在を免疫染色で示した。左側から分離直後のＨＳＣ，ＳＣＦとＴＰＯで３０分刺激したものとＭｂＣＤで３０分反応させた後にＳＣＦとＴＰＯで３０分刺激したものを示した。上のパネルから核（青），ＧＭ１（緑），ｐＡｋｔまたはＦｏｘｏ３ａ（赤）で染色したものを示した。下のパネルは３色を重ね合わせたものを示した。パネルの左側に示したグラフはＧＭ１集積の有無を示したもので黒棒が集積なしを示していてはいい灰色棒は集積ありを示した。（Ｂ）では細胞周期を動かす分子サイクリンＤ１が脂質ラフト阻害剤によりどのような局在をするのかを示した。右側から分離直後のＨＳＣ，ＭｂＣＤで３０分反応後ＳＣＦとＴＰＯで３０分刺激したＨＳＣ，ＳＣＦ＋ＴＰＯで３０分刺激したもの、ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞を示した。上のパネルから核（青），サイクリンＤ１（赤）で染色したものを示した。下のパネルは２色を重ね合わせたものを示した。（Ｃ）はＨＳＣで細胞周期を止めていると考えられるＣＤＫＩのｐ２１，ｐ２７，ｐ５７のＲＴＰＣＲでの発現の確認と免疫染色でのｐ５７のタンパク質での発現を示した。上のパネルは左から分離直後のＨＳＣ、ＭｂＣＤで３０分反応後ＳＣＦとＴＰＯで１２時間刺激したＨＳＣ，ＳＣＦ＋ＴＰＯで１２時間刺激したもの、ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞を示した。核（青），ｐ５７（緑）で染色したものを示した。ＲＴＰＣＲは分離直後のＨＳＣ、ＣＤ３４＋ＫＳＬ細胞、Ｌｉｎ−細胞で行った。
【図４】図４は、ＨＳＣの脂質ラフトの集積を阻害することよるＨＳＣの多分化性の維持。（Ａ）  ＭｂＣＤとＳＣＦとＴＰＯ存在下で培養を行い生き残る細胞と死んでいく細胞の比を示した。左から５日、７日、１０日培養した時点での細胞の生死を観察したものを示した。（Ｂ）  ＨＳＣの脂質ラフトの集積を阻害することよるＨＳＣの多分化性の維持を示した。左から分離直後のＨＳＣ，ＭｂＣＤ＋ＳＣＦ＋ＴＰＯで５日〜７日間培養を行い細胞分離せずに１個であったＨＳＣをＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＩＬ−３＋ＥＰＯ存在下で単一細胞コロニーアッセイを行った結果を示した。
【図５】図５は、ＨＳＣの脂質ラフトの集積を阻害することよるＨＳＣの多分化性の維持。（Ａ）脂質ラフトの阻害が細胞の分裂を阻害し多分化能力を維持していることを示した。左から分離直後のＨＳＣと５日間ＭｂＣＤ＋ＳＣＦ＋ＴＰＯ存在下で培養し１つであったＨＳＣを単一細胞移植したものを示し。真ん中から右は２０個のＨＳＣを移植した群を示した。
【図６】図６は、脂質ラフトの模式図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１９３】
配列番号１は、ＴＧＦβの核酸配列である。
配列番号２は、ＴＧＦβのアミノ酸配列である。
配列番号３（核酸配列）または配列番号４（アミノ酸配列）は、ｃ−Ｋｉｔリガンド（ＫＬ）のそれぞれの核酸配列およびアミノ酸配列である。
配列番号５（核酸配列）または配列番号６（アミノ酸配列）は、マウスTPOのそれぞれの核酸配列およびアミノ酸配列である。
配列番号７（核酸配列）または配列番号８（アミノ酸配列）は、マウスc-kitのそれぞれの核酸配列およびアミノ酸配列である。
配列番号９（核酸配列）または配列番号１０（アミノ酸配列）は、マウスc-mplのそれぞれの核酸配列およびアミノ酸配列である。
配列番号１１（核酸配列）または配列番号１２（アミノ酸配列）は、マウスAng-1のそれぞれの核酸配列およびアミノ酸配列である。
配列番号１３（核酸配列）または配列番号１４（アミノ酸配列）は、マウス幹細胞因子（ＳＣＦ）のそれぞれの核酸配列およびアミノ酸配列である。
配列番号１は、Mouse-TGF-β1の核酸配列である。
配列番号２は、Mouse-TGF-β1のアミノ酸配列である。
配列番号３（核酸配列）および配列番号４（アミノ酸配列）は、それぞれ、ｃ−Ｋｉｔリガンド（ＫＬ）の核酸配列およびアミノ酸配列である。
配列番号５（核酸配列）および配列番号６（アミノ酸配列）は、それぞれ、マウスTPOの核酸配列およびアミノ酸配列である。
配列番号７（核酸配列）および配列番号８（アミノ酸配列）は、それぞれ、マウスc-kitの核酸配列およびアミノ酸配列である。
配列番号９（核酸配列）および配列番号１０（アミノ酸配列）は、それぞれ、マウスc-mplの核酸配列およびアミノ酸配列である。
配列番号１１（核酸配列）および配列番号１２（アミノ酸配列）は、それぞれ、マウスAng-1のアミノ酸配列および核酸配列である。
配列番号１３（核酸配列）および配列番号１４（アミノ酸配列）は、それぞれ、マウス幹細胞因子（ＳＣＦ）のアミノ酸配列および核酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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