(57)【要約】      （修正有）【課題】継続的に摂取しても副作用の心配がない、優れたホスホリパーゼＡ２阻害効果を有する物質、さらに、当該物質を含む機能性食品や健康食品、また化粧品、さらには医薬品あるいは医薬部外品等を提供する。【解決手段】下記一般式（１）で示されるリゾリン脂質を含むことを特徴とするホスホリパーゼＡ２阻害剤。2007119361.tif 000004（式中、Ｒは炭素数１０〜３０の飽和又は不飽和の脂肪族アシル基を表し、Ｘは水素原子又は極性基を表す。）【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で示されるリゾリン脂質を含むことを特徴とするホスホリパーゼＡ２阻害剤。
【化１】
2007119361.tif 000003
（式中、Ｒは炭素数１０〜３０の飽和又は不飽和の脂肪族アシル基を表し、Ｘは水素原子又は極性基を表す。）
【請求項２】
前記リゾリン脂質がリゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルエタノールアミン又はリゾホスファチジルコリンであることを特徴とする請求項１記載のホスホリパーゼＡ２阻害剤。
【請求項３】
前記リゾリン脂質がリゾホスファチジン酸であることを特徴とする請求項１又は２記載のホスホリパーゼＡ２阻害剤。
【請求項４】
請求項１から３の何れか１項に記載のホスホリパーゼＡ２阻害剤を含む食品。
【請求項５】
請求項１から３の何れか１項に記載のホスホリパーゼＡ２阻害剤を含む化粧品。
【請求項６】
請求項１から３の何れか１項に記載のホスホリパーゼＡ２阻害剤を含む医薬品及び医薬部外品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホリパーゼＡ２阻害剤に関する。より詳しくは、リゾリン脂質を含むホスホリパーゼＡ２阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種炎症性疾患の原因や発症機構は多種多様であるが、その原因の一つとしてホスホリパーゼＡ２の活性化が知られている。
ホスホリパーゼＡ２は、アラキドン酸の代謝経路であるアラキドン酸カスケードの重要酵素であって、ホスホリパーゼＡ２が過剰に活性化するとアラキドン酸の代謝に異常が起こり、炎症、アレルギー、喘息、虚血、心筋梗塞等を引き起こす。
【０００３】
ホスホリパーゼＡ２は、生体膜の主要構成分であるグリセロリン脂質のグリセロール骨格の２位に結合した脂肪酸を優先的に加水分解する酵素の総称である。本酵素は生体膜脂質の新生代謝に関わると同時に、その生成物およびその代謝物が強力かつ多様な生理活性を示す脂質性メディエーターであることも知られている。
【０００４】
ホスホリパーゼＡ２による生成物であるアラキドン酸は、それ自身もメディエーターとして働くが、各々の炎症担当細胞において更にプロスタグランジン類、トロンボキサン類、ロイコトリエン類等に代謝されて種々特徴ある生理反応を引き起こす。
プロスタグランジン類、トロンボキサン類、ロイコトリエン類等の脂質性メディエーターは、本来は生体の恒常性維持のために機能しているが、これらは炎症が発症している病態においては過剰生産されて症状の増悪に関与する。事実、これらのアラキドン酸カスケードに作用する薬剤として、ステロイド性抗炎症薬や種々の非ステロイド性抗炎症薬が広く臨床にて使用されているが、ホスホリパーゼＡ２はこのアラキドン酸カスケードの上流に位置し、これらの脂質性メディエーター産生における律速段階の酵素であることから抗炎症薬開発の有望なターゲットとして期待されている。
【０００５】
ホスホリパーゼＡ２の阻害剤は、炎症性疾患を発症している病態において亢進している脂質性メディエーターの産生を抑制することができ、ひいては炎症性疾患の治療および／または予防が可能であると考えられる。
【０００６】
ホスホリパーゼＡ２には２０種以上の分子種が存在し、構造上の特徴から分泌性ホスホリパーゼＡ２、細胞質ホスホリパーゼＡ２及びＣａ２＋非依存性ホスホリパーゼＡ２に大別される。ホスホリパーゼＡ２の機能として、哺乳細胞の膜に作用してアラキドン酸由来のエイコサノイドやリゾリン脂質などの脂質メディエーターの産生を惹起する作用が注目されてきた。一方で、多くのホスホリパーゼＡ２分子種は異なる組織、細胞内局在性及び酵素学的特徴を示すことから、それぞれの異なる膜構造物に作用して膜リン脂質の再構成や固有免疫などの様々な生命現象に関与することを示唆する知見が蓄積してきた（非特許文献１参照）。
【０００７】
細胞質ホスホリパーゼＡ２αの欠損マウスの表現型は、プロスタグランジンＥ２の産生抑制の結果、コラーゲン誘導関節炎が顕著に低下したり、腸管ポリープの形成が抑制されたりする。しかし一方で、消化性潰瘍の形成が促進し、加齢と伴い腎機能が低下する。またロイコトリエンの産生抑制の結果、アレルギー性気道過敏症や肺線維症の軽減が認められる（非特許文献１参照）。
【０００８】
Ｃａ２＋非依存性ホスホリパーゼＡ２は、脂肪細胞分化培養系において、Ｃａ２＋非依存性ホスホリパーゼＡ２β及びγの発現が分化に伴って顕著に増大する。ｓｉＲＮＡ法によって各Ｃａ２＋非依存性ホスホリパーゼＡ２β及びγの発現を低下させると脂肪細胞に関わる遺伝子群の発現が抑制されるとともに、トリアシルグリセリドの細胞への蓄積も抑制される。さらに先天的肥満ラット（Ｚｕｃｋｅｒ）の白色脂肪細胞ではＣａ２＋非依存性ホスホリパーゼＡ２β及びγが高発現しており、これらの分子種が脂肪細胞の分化と機能に関与している可能性が考えられる（非特許文献１参照）。
【０００９】
分泌性ホスホリパーゼＡ２については、癌との関連性が考えられており、例えば先天的ＩＩＡ型分泌性ホスホリパーゼＡ２欠損マウスは大腸癌発症率が高く、また人為的にＩＩＡ型分泌性ホスホリパーゼＡ２を発現させることによって大腸癌が抑制される。一方で前立腺癌においては悪性度が高いほどＩＩＡ型分泌性ホスホリパーゼＡ２の発現量が高い（非特許文献１参照）。
【００１０】
また、炎症性疾患に関連する転写因子であるＮｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化にはホスホリパーゼＡ２が関与していることが報告されている（非特許文献２参照）。
【００１１】
これまで、ホスホリパーゼＡ２を阻害する物質により上記疾患に対処する試みがなされており、ホスホリパーゼＡ２阻害物質として、メパクリン、パラブロモフェナシルブロミド、デキサメタゾン等が抗炎症剤として広く使用されてきた。しかし、これらの物質はいずれも合成品であり、特にステロイド剤は副作用が問題となっていた。従って、安全性の高いホスホリパーゼＡ２阻害作用を有する新規な物質が期待されている。
【００１２】
ステロイド剤のような副作用のないホスホリパーゼＡ２阻害剤として、近年リン脂質が注目されている。このようなリン脂質として、例えば、グリセロールの１位に脂肪族アシル基を有し、２位にイコサペンタエノイル基又はドコサヘキサエノイル基を有するリン脂質（特許文献１参照）、グリセロールの１位に−ＣＨ＝ＣＨＲ１（Ｒ１はアルキル基又はアルケニル基）を有するリン脂質（特許文献２参照）、グリセロールの２位にアルキル、アルキル脂肪酸又はアルキルアミンを有するリン脂質（特許文献３参照）が知られている。
しかしながら、グリセロールの１位にアシル基を有するリゾリン脂質がホスホリパーゼＡ２阻害作用を有することはまだ知られていない。
【特許文献１】特開平７−２２４０７６号公報
【特許文献２】特開平７−１２６１６６号公報
【特許文献３】特開平２−７０７０３号公報
【非特許文献１】「実験医学」（２００５）、２３（６）、８７８−８８５
【非特許文献２】Ｍａｒｉｔ  Ｗ．  Ａｎｔｈｏｎｓｅｎら（２００１）、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６：３０５２７−３０５３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、継続的に摂取しても副作用の心配がない、優れたホスホリパーゼＡ２阻害効果を有する物質を天然物の中から見出し、さらに、当該物質を機能性食品や健康食品、また化粧品、さらには医薬品あるいは医薬部外品等に添加するための素材として利用することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、上記現状に鑑み、継続的に摂取しても副作用の心配がない新規のホスホリパーゼＡ２阻害剤と、当該阻害剤からなる食品、化粧品、医薬品及び医薬部外品を提供する。
すなわち本発明は、下記一般式（１）で示されるリゾリン脂質を含むことを特徴とするホスホリパーゼＡ２阻害剤である。
【００１５】
【化１】
2007119361.tif 000002
【００１６】
（式中、Ｒは炭素数１０〜３０の飽和又は不飽和の脂肪族アシル基を表し、Ｘは水素原子又は極性基を表す。）
【００１７】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のホスホリパーゼＡ２阻害剤は、上記一般式（１）で示されるリゾリン脂質を含むものである。
一般式（１）におけるＲは、炭素数１０〜３０の飽和又は不飽和の脂肪族アシル基を表す。炭素数１０〜３０の飽和の脂肪族アシル基としては特に限定されず、例えば、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、エイコサノイル基、ヘンエイコサノイル基、ドコサノイル基、トリコサノイル基、テトラコサノイル基、ペンタコサノイル基、ヘキサコサノイル基、ヘプタコサノイル基、オクタコサノイル基、ノナコサノイル基、トリアコンタノイル基等が挙げられる。炭素数１０〜３０の不飽和の脂肪族アシル基としては、モノ不飽和又はポリ不飽和のものが挙げられ、例えばドコサモノエノイル基、ドコサジエノイル、ドコサトリエノイル基、ドコサテトラエノイル基、ドコサペンタエノイル基、ドコサヘキサエノイル基、トリコサモノエノイル基、トリコサジエノイル基、オレオイル基、リノレオイル基、リノレノイル基、アラキドノイル基等が挙げられる。上記アシル基としては、パルミトイル基、ステアロイル基、リノレオイル基、オレオイル基、リノレノイル基等が好ましい。
【００１８】
一般式（１）におけるＸは、水素原子又は極性基を表す。上記極性基としては、例えば、コリン、エタノールアミン、イノシトール、セリン、グリセロール、エタノール等のヒドロキシル基含有化合物の炭素骨格に結合しているＯＨ基を除いた残基が挙げられる。上記Ｘとしては、水素原子や、エタノールアミン、コリンの残基が好ましく、水素原子がより好ましい。
本発明で用いるリゾリン脂質としては、上記一般式（１）で表されるもののなかでもリゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルエタノールアミン又はリゾホスファチジルコリンが好ましく、リゾホスファチジン酸がより好ましい。なお、上記リン脂質は、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００１９】
本発明で用いるリゾリン脂質は、大豆等の植物や動物由来のリン脂質にホスホリパーゼＤを作用させて、塩基交換反応あるいは加水分解反応を行った後、ホスホリパーゼＡ２を作用させて、グリセロールの２位に結合した脂肪酸等を加水分解することにより得ることができる。なお、生成したリゾリン脂質の組成は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析することができる。
【００２０】
本発明のホスホリパーゼＡ２阻害剤には、更に、上記リゾリン脂質の他に薬剤学的および食品衛生学的に許容される他の素材を常法により適宜添加混合してもよい。このようなものとしては特に限定されず、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、コーティング剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤、健康食品素材、栄養補助食品素材、ビタミン、漢方薬（生薬エキス）を含む薬剤ならびにこれらの組み合わせなどが挙げられる。
【００２１】
本発明のホスホリパーゼＡ２阻害剤におけるリゾリン脂質の含有量は特に限定されず、好ましくは１重量％以上、より好ましくは１０重量％以上である。
本発明のリゾリン脂質を含有するホスホリパーゼＡ２阻害剤を作製する際のリゾリン脂質の含有量、剤型、保存方法および保存形態は、医薬品、医薬部外品、食品、機能性食品、化粧品などの後述の用途に応じて適宜決定できる。
【００２２】
本発明のホスホリパーゼＡ２阻害剤は、食品、機能性食品、化粧品、医薬品、医薬部外品に使用することができる。ここでいう機能性食品とは、サプリメント、特定保健用食品、健康食品、栄養補助食品など医薬品以外で経口的に摂取することにより、健康の維持あるいは改善を目的とする製品を意味している。
【００２３】
本発明の阻害剤は、経口的あるいは非経口的に投与することができる。経口投与剤としては散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤などの液状製剤が挙げられる。また、非経口投与剤としては、貼付剤、パップ剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、点眼剤、坐剤、注射剤などが挙げられる。
【００２４】
本発明の阻害剤の投与量としては特に制限されず、疾患の種類や程度によって適宜調整すればよく、例えばリゾリン脂質の量に換算して成人一人当たり１日に９０（卵１／２個分）〜１８００（卵１０個分）ｍｇ程度を投与すればよい。
【００２５】
本発明の阻害剤はホスホリパーゼＡ2に対して優れた阻害活性を有しており、炎症性の治療薬として、例えば抗炎症剤あるいは抗アレルギー剤として期待できる。
炎症性の疾患としては、例えば、炎症性疾患（慢性関節リウマチ、変形性関節症及び肩関節周囲炎等の関節炎）、膵炎、虚血性血管障害、潰瘍、皮膚炎（接触性皮膚炎（かぶれ）、乾癬、尋常性天疱瘡、その他肌荒れ）、痛風、外傷誘発炎症等が挙げられる。また、種々の炎症性刺激により引き起こされるアナフィラキシー、敗血症性ショック、発熱並びに疼痛；気管支炎、肺炎、成人呼吸窮迫症候群等の呼吸器疾患；炎症性腸管疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、肝炎、腎炎等の消化器系疾患；血管炎、動脈硬化等の循環器系疾患；鼻炎、喘息、アトピー等のアレルギー性炎症疾患やリュウマチなどの自己免疫疾患；脳梗塞、心筋梗塞等の虚血時或いは虚血―再灌流時の傷害；その他、神経変性疾患、紫外線角化症、乾癬等も挙げられる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のホスホリパーゼＡ２阻害剤は、継続的に摂取しても副作用の心配がないリゾリン脂質からなるので、食品、機能性食品、化粧品、さらには医薬品あるいは医薬部外品等に添加するための素材として利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
製造例１（リゾホスファチジン酸の製造）
５００ｍＬの緩衝液（蒸留水：４９０ｇ、酢酸：０．９ｇ、酢酸ナトリウム８．７ｇ、ｐＨ＝５．５）に、１２０ｇの大豆レシチンＵｌｔｒａｌｅｃＰ（エー・ディー・エム・ファーイースト社製）とホスホリパーゼＤ溶液２４０ｇ（１０，０００Ｕ／ｍＬ、ナガセケムテックス社製）を添加し、５０℃で８時間、撹拌しながら酵素反応を行い、ホスファチジン酸（略語：ＰＡ）を生成させる。酵素反応後、ヘプタン４１０ｇ、アセトン９５０ｇで抽出を行い、ＰＡを含む溶媒層を得た。
上記で得られた溶媒層に２８０ｇの１５％塩化ナトリウム水溶液、２１０ｇのアセトンを添加し、１時間撹拌後、静置し、分液後、溶媒層を得た。さらに２８０ｇの蒸留水、２１０ｇのアセトンを添加し、１時間撹拌後、静置し、分液後、溶媒層を得た。エバポレーターで溶媒層を減圧濃縮（約２倍濃縮）し、ＰＡを含むレシチン溶液を３８０ｍＬ得た。
ＰＡを含むレシチン溶液３８０ｍＬに酢酸エチル１９０ｍＬを添加、さらにホスホリパーゼＡ２酵素（９０，０００Ｕ、ＰＬＡ２ナガセ、ナガセケムテックス社製）を含む６０ｍＬの緩衝液（０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．５）を添加し、３０℃で２０時間、撹拌しながら酵素反応を行い、リゾホスファチジン酸（略語：ＬＰＡ）を生成させた。
酵素反応後、３８０ｍＬのエタノールを添加し、不溶物をろ過で除去した後、溶媒を減圧下で留去し、ＬＰＡ含有レシチンの試料を調製した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析した結果、ＬＰＡの含量は４０％であった。試料の組成は、ＬＰＡ  ４０．０％、リゾホスファチジルエタノールアミン  ４．０％、リゾホスファチジルイノシトール  ８．７％、ホスファチジン酸  １９％、ホスファチジルエタノールアミン  ０．６％、ホスファチジルイノシトール  ０．９％、その他  ２６．８％であった。
【００２８】
製造例２（リゾホスファチジルエタノールアミンの製造）
大豆レシチンＳＬＰ−ＰＣ７０（辻製油社製）２００ｇをヘプタンとアセトンの混液（３：１）に溶解し、２Ｌになるように調製した。２０，０００ＵのホスホリパーゼＤ（ナガセケムテックス社製）、２．７モルのエタノールアミンを含む酵素溶液（ｐＨ＝８．０）を７４０ｍＬ調製し、大豆レシチン溶液に添加し、３０℃で２０時間、撹拌しながら酵素反応を行い、ホスファチジルエタノールアミン（略語：ＰＥ）を生成させた。分液後、ＰＥを含む溶液を得た。得られた溶液をエバポレーターで減圧濃縮（約３倍濃縮）し、５倍量のアセトンを添加し、不溶物として得られるＰＥをろ過により回収、減圧乾燥して、ＰＥ晶析物１８０ｇを得た。
ＰＥ１８０ｇを２７０，０００ＵのホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２ナガセ、ナガセケムテックス株式会社製）を含む緩衝液（０．１Ｍトリス緩衝液、５０ｍＭ塩化カルシウム）に分散し、１．８Ｌになるように調製した。３０℃で２０時間、撹拌しながら酵素反応を行い、リゾホスファチジルエタノールアミン（略語：ＬＰＥ）を生成させた。１６Ｌのエタノールを添加し、ＬＰＥを抽出後、減圧濾過でＬＰＥ抽出液を得た。エバポレーターにより３倍濃縮後、５倍量のアセトンを添加し、不溶物として得られるＬＰＥをろ過により回収、減圧乾燥して、ＬＰＥ晶析物１２０ｇを得た。ＨＰＬＣにて分析した結果、ＬＰＥ含量は約７０％であった。ＬＰＥ晶析物の組成は、ＬＰＥ＝６９．４％、リゾホスファチジルコリン＝３．８％、ホスファチジルエタノールアミン＝４．５％、ホスファチジルコリン＝０．１％、リゾホスファチジン酸＝３．８％、その他１８．４％であった。
【００２９】
実施例１（微生物由来ホスホリパーゼＡ２阻害効果試験）
１ｇ大豆レシチン（４０％  Ｌ−α−ホスファチジルコリン、Ｓｉｇｍａ社製）に１６ｍＬの０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＬの０．１Ｍ塩化カルシウム溶液、２ｍＬ蒸留水、２０ｍＬの０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ＝８．０）を添加し、超音波処理したものをホスホリパーゼＡ２の基質溶液として調製した。試験管内に０．５ｍＬの基質溶液を入れ３７℃で保温し、最終濃度０．０１重量％〜０．８３重量％となるように、製造例１で得られたＬＰＡ含有レシチン、製造例２で得られたＬＰＥ晶析物、ＳＩＧＭＡ社製のＬ−α−リゾホスファチジルコリン（純度９９％）をそれぞれ添加し、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２ナガセ、ナガセケムテックス社製）を添加して酵素反応を開始した。遊離脂肪酸の濃度は、ＮＥＦＡ  Ｃ−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて測定した。すなわち、反応１０分後に発色試液Ａ（ＮＥＦＡ  Ｃ−テストワコー、和光純薬工業社製）０．５ｍＬ中に酵素反応液５０μＬを添加し、さらに１０分後に発色試液Ｂ（ＮＥＦＡ  Ｃ−テストワコー、和光純薬工業社製）１ｍＬを添加した後、５５０ｎｍにおいて色素の吸光度を測定し、遊離脂肪酸の濃度を求めた。リゾリン脂質を添加しない条件での酵素活性を１００％とし、リゾリン脂質存在下の酵素活性を相対値で示した。結果を図１に示す。
【００３０】
測定の結果、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルエタノールアミン及びリゾホスファチジルコリンによる微生物由来ホスホリパーゼＡ２の阻害効果が認められた。特にリゾホスファチジン酸による顕著なホスホリパーゼＡ２の阻害効果が認められた。
【００３１】
実施例２（ブタ膵臓由来ホスホリパーゼＡ２阻害効果試験）
ホスホリパーゼＡ２としてＳｉｇｍａ社製のＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｆｒｏｍ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ（０．０２５Ｕ）を用いる以外は実施例１と同様にしてリゾリン脂質存在下の酵素活性を測定した。リゾリン脂質を添加しない条件での酵素活性を１００％とし、リゾリン脂質存在下の酵素活性を相対値で示した。結果を図２に示す。
【００３２】
測定の結果、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルエタノールアミン及びリゾホスファチジルコリンによるブタ膵臓由来ホスホリパーゼＡ２の阻害効果が認められた。特にリゾホスファチジン酸による顕著なホスホリパーゼＡ２の阻害効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明のホスホリパーゼＡ２阻害剤は、継続的に摂取しても副作用の心配がないリゾリン脂質からなるので、食品、機能性食品、化粧品、さらには医薬品あるいは医薬部外品等に添加するための素材として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例１でのホスホリパーゼＡ２の酵素活性の相対値を表すグラフである。
【図２】実施例２でのホスホリパーゼＡ２の酵素活性の相対値を表すグラフである。
【図１】
2007119361.tif 000005
【図２】
2007119361.tif 000006