(57)【要約】【課題】新たな髄鞘形成異常を発症するモデル動物及びこれを用いる神経疾患治療薬のスクリーニング法を提供する。【解決手段】生後約２週間目から振戦を自然発生するマウス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生後約２週間目から振戦を自然発生するマウス。
【請求項２】
髄鞘形成が異常である請求項１記載のマウス。
【請求項３】
軸索形成は正常であり、髄鞘形成が異常である請求項１記載のマウス。
【請求項４】
ＫＪＲマウスとＢＬＧ２マウスとの交配により得られる子孫マウス及びＦ２集団から選択されるものである請求項１〜３のいずれか１項記載のマウス。
【請求項５】
Ｃａｓｐｒ３遺伝子に異常を有するものである請求項１〜４のいずれか１項記載のマウス。
【請求項６】
髄鞘形成異常に基づく中枢神経疾患のモデルマウスである請求項１〜５のいずれか１項記載のマウス。
【請求項７】
被検体を請求項１〜６のいずれか１項記載のマウスに投与することを特徴とする髄鞘形成異常に基づく中枢神経疾患治療薬のスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、髄鞘形成が異常であり、髄鞘形成異常に基づく振戦などの症状を呈するマウス及びこれを用いた医薬のスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経線維は軸索とそれを取り巻く髄鞘より形成され、効率の良い神経信号の伝達に重要な役割を果たしている。この髄鞘形成が異常になると、神経情報の伝導速度が減少し、様々な神経機能異常をきたす。髄鞘異常には、生後髄鞘が一度も完全に形成されない「髄鞘形成不全」と一度形成された髄鞘が崩壊する「脱髄疾患」に分けられる。いずれも運動機能や神経機能などに異常をきたし、有効な治療法は確立されていない難病である。この疾病の例としては、多発性硬化症、副腎白質ジストロフィー（Adrenoleukodystrophy, ALD）、異染性白質ジストロフィー（Metachromatic leukodystrophy, MLD）、Krabbe病（globoid cell leukodystrophy）、Pelizaeus-Merzbacher病（PMD）、Canavan病、Alexander病等が知られている。
【０００３】
これらの疾病の有効な治療法が確立されてない理由の一つとしては、治療法の確立に有用な動物モデルが十分に開発されていないことがある。最も有名な動物モデルとしては、ミエリン蛋白に対する自己免疫反応を誘導してミエリンを崩壊させるＥＡＥが知られている。ＥＡＥは、欧米で２０００人に一人の頻度で発症する代表的な脱髄疾患である多発性硬化症のモデルとして約５０年前に開発されたものである。しかし、多発性硬化症が自己免疫疾患であるとする説には異論もあり、完全に確定しているわけではない。また、遺伝的要因の関与も示唆されており、遺伝学的な観点からの髄鞘異常の研究も必要であると考えられている。しかし、その遺伝的要因の解明は困難を極めているが、その大きな理由は多くの髄鞘形成異常が複雑な遺伝的機構により生じ、これまでの遺伝学では解析ができなかったためである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明の目的は、新たな髄鞘形成異常を発症するモデル動物及びこれを用いる神経疾患治療薬のスクリーニング法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、順遺伝学的手法により新たなモデル動物を開発すべく種々検討してきたところ、野生マウスを系統化したＫＪＲとＢＬＧ２とを交配して得られたＦ２集団に高頻度で振戦を自然発症するマウスが発生することを見出した。更にこのマウスの遺伝子型解析及び組織学的解析を行ったところ、このマウスは軸索が正常であり、髄鞘において形成異常があり、髄鞘形成異常により振戦に代表される神経疾患特有の症状を呈することが判明した。更に、この髄鞘形成異常が、Ｃａsｐｒ３遺伝子の多型型蛋白質と他の未同定の遺伝子産物との相互作用異常によるものであることも判明した。従って、このマウスは髄鞘形成異常モデルマウスとして有用であり、このマウスを用いれば髄鞘形成異常に基づく中枢神経疾患治療薬のスクリーニングが可能になることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、生後約２週間目から振戦を自然発症するマウスを提供するものである。
また本発明は、被検体を、このマウスに投与することを特徴とする髄鞘形成異常に基づく中枢神経疾患治療薬のスクリーニング法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のモデルマウスを用いれば、多くの髄鞘形成異常に基づく疾患の原因解明、更には治療法の確立が可能になる。多くの髄鞘形成異常に基づく疾患の原因が不明であったことを考慮すれば、このモデルマウスは極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のマウスは、例えばＫＪＲマウスとＢＬＧマウスとの交配により得られる子孫マウス及びＦ２集団から選択することに得られる。ここで、ＫＪＲマウスは、韓国で捕獲された野生マウスから国立遺伝学研究所において系統化されたマウスであり、国立遺伝学研究所及び理化学研究所から、国立遺伝学研究所とＭＴＡを取り交わした上で入手可能である。ＫＪＲマウスは、韓国のコジュリ(Kojuri)で捕獲された野生マウスを１９８４年に国立遺伝学研究所に導入し、その後２０世代以上の兄妹交配を続けて近交系統として樹立された。
【０００９】
ＢＬＧ２マウスは、ブルガリアで捕獲された野生マウスから国立遺伝学研究所において系統化されたマウスであり、国立遺伝学研究所及び理化学研究所から国立遺伝学研究所とＭＴＡを取り交わした上で入手可能である。ＢＬＧ２マウスは、ブルガリアのGeneral Toshevoで捕獲されたマウスを１９８１年に国立遺伝学研究所に導入し、以降兄妹交配を続け２０世代後に近交系統として樹立された。
【００１０】
ＫＪＲマウスとＢＬＧ２マウスの交配にあたっては、保育・子育て行動の安定性などからＫＪＲのメスとＢＬＧ２のオスを用いるのが好ましく、得られたＦ１（ＫＬＦ１）個体同士を交配したＦ２（ＫＬＦ２）を得る（図１）。また、Ｆ１マウスをＢＬＧ２系統に戻し交配したＮ２世代や、更に戻し交配したＮ３世代同士の交配でも本発明のマウスが得られる。
【００１１】
得られたＫＬＦ２の約７％が生後約２週間目から振戦を自然発症する。振戦以外の症状としては、てんかんがある。また、生後約２週間目から成長不良が生じる。更に、その他の症状としては、目の発達異常、生殖能力の低下が見られる。これらの症状のうち、振戦と発育不良が異形的である。
【００１２】
振戦の症状は生後約２週間目から生じるが、その後も継続するので、１ヶ月目以降まで継続する個体を選択するのが好ましい。
【００１３】
本発明マウスは、神経における軸索形成は正常であり、髄鞘形成が異常である。より詳細には、軸索線維は正常であるが、ミエリンシートが正常個体のように多層にしっかりと軸索を巻き込む形態を示さず、不十分な髄鞘形成となっている。特に、最も内側のミエリン層ではオリゴデンドロサイトの細胞質が少しシート内に残り、完全な薄層のシートになっていないものが多い。
【００１４】
これらの振戦及び成長不良の症状と、髄鞘形成異常の組織学的所見とは、多発性硬化症やＰＭＤ等の髄鞘形成異常に基づく中枢神経疾患患者における症状と一致する。従って、本発明マウスは、髄鞘形成異常に基づく種々の中枢神経疾患のモデルマウスとして有用である。なお、本発明でいう髄鞘形成異常には、髄鞘形成不全及び脱髄の両者が含まれる。
【００１５】
また、遺伝子解析の結果から１３番染色体のD13Mit22とD13Nig5の間の領域が、本発明モデルマウス全ての個体においてＫＪＲホモになっている。更に、この領域について正常個体を含めた全ＫＬＦ２個体の遺伝子型を調べたところ、ＫＪＲホモアレルを持つ個体は、半数が致死であり、１／４が正常個体、残りの１／４が異常個体になっていることがわかった。したがって、この領域は、振戦及び成長不良、更に致死の原因遺伝子座と考えられるため、Genetic incompatibility 1 (Genic1)と名付けた。Genic1K/KはＫＪＲのバックグラウンドを持つ場合には正常な機能を持つが、バックグラウンドがＢＬＧに置き換わった場合、つまり相互作用している何らかの遺伝子座がＢＬＧに置き換わった場合に、異常な作用を起こしていると考えられる。Genic1と明確に相互作用していると考えられる遺伝子座は見つからなかった。
【００１６】
このGenic1についてNCBI Build34、１の遺伝子情報を検索した結果、このGenic1に該当する遺伝子はCaspr3（Contactin associated protein３）であることが判明した。すなわち、Caspr3遺伝子の異常と他の遺伝子との相互作用により、髄鞘形成異常が生じていると考えられる。
【００１７】
本発明マウスを用いて、髄鞘形成異常に基づく中枢神経疾患治療薬をスクリーニングするには、本発明マウスに被検体を投与し、その症状、組織所見等を観察すればよい。すなわち、被検体投与により、振戦などの症状改善の有無、髄鞘の組織を観察すればよい。被検体の投与は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与等により行うことができる。
【実施例】
【００１８】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。
【００１９】
実施例１（振戦マウス（ＫＬＦ２）の作製）
ＫＪＲ系統のメスとＢＬＧ２系統のオスの交配により得られたＦ１個体同士を交配してＫＬＦ２個体群を得た（図１）。ＫＬＦ２個体群は、生後成長の程度と振戦の有無を目視により観察した。成長が悪く振戦を示している個体は、親からの離乳後死亡する確立が高いため、高栄養のオートミールを与えて成長を補助した。ＫＬＦ２個体は生後１ヶ月目以降に正式に振戦の有無を確定した。
その結果、１４６６個体中１０２個体（約７％）に発育不良と振戦の症状が観察された。主な表現型は、１）生後２週間目からの成長不良、２）振戦とてんかん、３）目の発達異常、及び４）生殖能力の低下であった。
【００２０】
野生由来のマウス２系統、ＫＪＲとＢＬＧ２系統を交配して得られたＦ２集団において、高頻度で発育不良と振戦を示すマウスが発生する事を発見した。親系統であるＫＪＲとＢＬＧ２及びその交配により得られたＦ１世代では異常が全く見られないことから、交配により生じた特定の遺伝的組成の時に異常が生じるものと考えられ、ここではその現象を遺伝的不適合と呼ぶ事にした。
振戦マウスの出現頻度はＫＪＲとＢＬＧ２及びその交配により得られたＦ１マウスをＢＬＧ２系統に戻し交配して得られたＮ２世代や更に戻し交配したＮ３世代同士の交配では更に振戦マウス発生頻度は上昇した。
【００２１】
実施例２（髄鞘形成異常）
生後１０週齢に達した振戦マウス（ＫＬＦ２）を５％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流固定した後、脳及び脊髄を摘出した。取り出した脳は１晩５％ＰＦＡで固定後、凍結し切片を作製した。それらの切片を用いて免疫染色を行った（J. Neurosci. 2003 Jul 30；27(17)：6671-6680）。軸索に反応する抗体として抗β−tubulin抗体を用い、髄鞘を染める抗体として、抗Myelin basic protein（ＭＢＰ）抗体を用いて二重染色を行った。抗体染色したサンプルは蛍光色素でラベルした２次抗体で反応させ、蛍光顕微鏡及び共焦点レーザー顕微鏡により観察した。
【００２２】
脊髄、脳梁及び視神経を観察したところ、軸索線維は抗β−tubulin抗体で染色される事からほぼ正常に存在する事が示された（図２、３）。一方、髄鞘においては抗ＭＢＰ抗体で染色される事からミエリンの発現はみられるものの、髄鞘の層は薄くなり神経線維全体が細くなっている事が分かった。特に、脳梁においては、横行する神経線維束が細くなっていた。また、視神経においては、髄鞘形成を司るグリア細胞である、オリゴデンドロサイトの異常が示唆された。以上のことから、振戦マウスの発症には、髄鞘の形成不全が関与していることが示された。
【００２３】
実施例３（電子顕微鏡による神経線維の微細構造解析）
マウスをネンブタールの腹腔内投与により深麻酔して開胸し、２％パラホルムアルデヒド／２．５％グルタルアルデヒドのリン酸緩衝液溶液を心室から注入して灌流固定を行った。脳、脊髄ならびに視神経を取り出して更に一晩、上記の固定液中で浸漬固定した。ついで、マイクロスライサーを用いて脳、脊髄の１００μｍ厚の切片を作成した。前脳横断面、脊髄横断面を作成しエポキシレジンに包埋した。視神経は切片にすることなく、そのまま包埋した。包埋した試料につき、脳梁、脊髄後索、視神経の横断面につき、ウルトラミクロトームを用いて超薄切片を作成した。この切片をクエン酸鉛、酢酸ウランの溶液で電子染色し、日立透過型電子顕微鏡Ｈ−６００で観察した。
【００２４】
視神経の断面を解析した結果、軸索線維は存在し、またミエリンは合成されている事がわかった（図４、５）。しかし、ミエリンシートは正常個体で見られるような多層にしっかりと軸索を巻き込む形態を示さず、不十分な髄鞘形成となっている事が分かった。特に、最も内側のミエリン層ではオリゴデンドロサイトの細胞質がまだ少しシート内に残り、完全な薄層のシートになっていない像が数多く見られ、グリア細胞の機能異常が検出された。
【００２５】
実施例４（振戦マウスの遺伝子型解析（KLF2 typing））
これらの異常を示す個体の中でサンプル採取まで生存していた８９個体と正常なＫＬＦ２個体群の遺伝子型の違いを調べるために、ゲノムＤＮＡを調整し、マイクロサテライトマーカーのゲノムワイドタイピングを行った。
【００２６】
ＫＬＦ２メス正常個体及び、成長不良もしくは震戦を示した個体、８９個体について、採取したテールからＤＮＡを抽出した。これらのＤＮＡを用いて、マイクロサテライトマーカーもしくは繰り返し配列を検出するプライマーを用いてＰＣＲを行った（Mamm Genome, 2002 Aug；13(8)：411-415）。これらのマーカーは、各染色体に１０〜２０ｃＭおきに設定した（図６、７）。D1Mit4, D1Mit211, D1Mit414, D1Mit134, D1Mit309, D1Mit100, D2Mit2, D2Mit82, D2Mit203, D2Mit9, D2Mit97, D2Mit401, D2MIT22, D2Mit226, D2Mit265, D3Mit131, D3Mit224, D3Mit51, D3MIT73, D3Mit11, D3MIT286, D3Mit216, D3MIT14, D3MIT350, D3MIT257, D3Mit18, D3Mit219, D3MIT163, D4Mit235, D4Mit2, D4Mit288, D4Mit31, D4Mit251, D4Mit42, D5Mit48, D5Mit3, D5Mit79, D5Mit255, D5mit311, D5Mit403, D5Mit242, D5Mit101, D6MIT83, D6Mit268, D6Mit94, D6Mit102, D6Mit254, D7Mit76, D7Mit229, D7Mit31, D7Mit66, D7Mit108, D7Mit12, D8Mit1, D8Mit24, D8Mit128, D8Mit240, D8Mit113, D8Mit120, D8Mit280, D9Mit218, D9Mit67, D9Mit23, D9Mit155, D9Mit151, D10Mit2, D10Mit5, D10Mit186, D10Mit264, D10Mit233, D11Mit226, D11Mit215, D11Mit22, D11Mit28, D11Mit327, D11Mit98, D11Mit214, D12Mit37, D12Mit147, D12Mit4, D12Mit7, D14Mit140, D14Mit102, D14Mit69, D14Mit107, D15Mit82, D15Mit5, D15Mit156, D15Mit159, D16Mit34, D16Mit3, D16Mit189, D16Mit106, D17Mit46, D17Mit22, D17Mit66, D17Mit139, D17Mit93, D17Mit76, D18Mit192, D18Mit224, D18Mit121, D18Mit186, D18Mit1, D19Mit1, D19Mit137, DXMit114, DXMit3, DXMit186, D13Mit1, D13Mit123, D13Mit126, D13Mit179, D13Mit186, D13Mit188, D13Mit23, D13Mit231, D13Mit248, D13Mit262, D13Mit281, D13Mit311, D13Mit313, D13Mit52, D13Mit66, D13Mit88, D13Mit9, D13Nig11, D13Nig14, D13Nig15, D13Nig16, D13Nig19, D13Nig22, D13Nig23 , D13Nig3 , D13Nig5 , D13Nig7 , D13Nig8 , D13Nig9 ＰＣＲの結果得られた多型データから、各マーカーにおける遺伝子型頻度を調べた。
【００２７】
ゲノムワイドなタイピングの結果、１３番染色体のD13Mit22とD13Nig5の間の領域が、振戦マウス全ての個体においてＫＪＲホモになっていることが明らかになった（図６、７）。更に、この領域について正常個体を含めた全ＫＬＦ２個体の遺伝子型を調べたところ、ＫＪＲホモアレルを持つ個体は、半数が致死であり、１／４が正常個体、残りの１／４が異常個体になっていることがわかった（表１）。従って、この領域は、振戦及び成長不良、更に致死の原因遺伝子座と考えられるため、Genetic incompatibility 1 (Genic1)と名付けた。Genic1K/KはＫＪＲのバックグラウンドを持つ場合には正常な機能を持つが、バックグラウンドがＢＬＧに置き換わった場合、つまり相互作用している何らかの遺伝子座がＢＬＧに置き換わった場合に、異常な作用を起こしていると考えられる。Genic1と明確に相互作用していると考えられる遺伝子座は見つからなかった（図７）。
【００２８】
全ＫＬＦ２集団について、Genic1の遺伝子座をD13Mit66遺伝子マーカーでタイピングした結果と振戦マウスの出現頻度を表１に示す。理論値から計算するとＫＪＲ由来アレルホモ個体のうち約半数は致死になっている事が推定される。致死の原因については現在のところ不明であるが、生後直後はホモ個体がいるため発育の初期に致死になっているものと予想される。
【００２９】
【表１】
2007116965.tif 000002
【００３０】
実施例５（神経線維髄鞘形成不全の原因となるGenic1遺伝子）
ゲノムワイドタイピングで同定された１３番染色体上の原因遺伝子座について、組換え体を用いた連鎖解析から約３．３Mbpの領域内に存在していることが明らかになった（図８）。NCBI Build34.1の遺伝子情報を検索した結果、この領域内には６７個の遺伝子が存在し、annotationができている遺伝子は３０個であった。この中に、Caspr3遺伝子が存在していた。Caspr3遺伝子はニューレキシンスーパーファミリーの中のNCPファミリーに属することが知られている。哺乳動物においてNCPファミリーにはCaspr、Caspr2、Caspr3、Caspr4が属する事が知られている。これらの蛋白は保存されたドメインを有するが、発現場所は微妙に異なり、機能的には分化していると考えられている。Casprは神経線維のパラノードで発現し、神経細胞とオリゴデンドロサイトがミエリン鞘の端で結合するために必須の蛋白質である。Caspr2 はパラノードに近接した領域で発現し、カリウムチャネル蛋白質の局在に関与している。今回候補領域に見いだされたCaspr3の機能はまだ不明であるが、Caspr、Caspr2、及び機能的が未知のCaspr4と相同性を示す膜結合蛋白であり、神経細胞やグリア細胞であるオリゴデンドロサイトで発現が見られることが既に報告されている。今回、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＫＪＲ系統とＢＬＧ２系統に由来するCaspr3の転写産物を増幅し、塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、アプライドバイオシステムズジャパン社製の３７００を用いて行なった。Caspr3転写産物の増幅は、遺伝子を９つの断片に分けて、表２のプライマーセットで増幅した（配列番号１〜１８）。
【００３１】
【表２】
2007116965.tif 000003
【００３２】
Caspr3にはＫＪＲ系統とＢＬＧ２系統の間で８つのアミノ酸残基にアミノ酸多型が見いだされた（図９、図１０）。これらの多型が遺伝的不適合の原因となっている事が分かった。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】振戦マウス（ＫＬＦ２）の作製方法を示す図である。
【図２】コントロールと振戦マウス（ＫＬＦ２）の脊髄の免疫染色結果を示す図である。
【図３】コントロールと振戦マウス（ＫＬＦ２）の脳梁の免疫染色結果を示す図である。
【図４】電子顕微鏡による神経線維の微細構造解析結果を示す図である。
【図５】コントロールと振戦マウス（ＫＬＦ２）の脊髄の免疫染色結果を示す図である。
【図６】振戦マウスと正常マウスのゲノムワイドなタイピング結果を示す図である。
【図７】図６のゲノムワイドタイピングの１３番染色体上の拡大図である。
【図８】１３番染色体上の遺伝子座の解析結果を示す図である。
【図９】ＫＪＲとＢＬＧ２のCaspr3のアミノ酸多型の位置を簡略化している。
【図１０】ＫＪＲとＢＬＧ２のCaspr3のアミノ酸配列をアライメントして比較した図である。多型を示すアミノ酸はピンク色で示している。
【図１】
2007116965.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2007116965.tif 000011
【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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