(57)【要約】【課題】  糖尿病合併症としての各種の疾患や、動脈硬化、悪性腫瘍、神経変成疾患、炎症性疾患等の血管障害による疾患の処方剤として有用な、合成可能で、より低分子物質としてその取扱いや処方も容易は、ＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用を阻害することのできる新しいＲＡＧＥ阻害剤を提供する。【解決手段】  たとえば、次式【化１】2007246520.tif 000005で表わされる化合物の少くとも１種を有効成分として含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式
【化１】
2007246520.tif 000004
で表わされる化合物群のうちの少くとも１種を有効成分として含有することを特徴とするＲＡＧＥ阻害剤。
【請求項２】
糖尿病合併症、悪性腫瘍、動脈硬化疾患、神経変成疾患または炎症性疾患の治療剤であることを特徴とする請求項１のＲＡＧＥ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、後期糖化反応生成物：ＡＧＥとそのレセプターとしてのＲＡＧＥとの相互作用を阻害する、血管障害性の糖尿病合併症の各種疾患や、動脈硬化疾患等の治療剤として有用なＲＡＧＥ阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生活習慣の欧米化等に伴い、糖尿病患者数は増加の一途を辿り、日本国内の推定罹患人口（２００５年）は予備軍を含め約１６００万人と推定されている。これに伴い、糖尿病合併症患者数もさらに増加すると予想される。糖尿病の三大合併症とされる網膜症、腎症、神経症の罹患率は、それぞれ約８０％、約４０％、約７０％である。世界的には、とくにアジアで、糖尿病合併症の未曾有の増加が推定されている。
【０００３】
糖尿病患者の平均寿命は、男性、女性とも一般人口よりは１０年以上短く、死因のトップは血管死である。糖尿病では死に至る以前にも、後天性失明の最多原因である糖尿病網膜症、透析原因のトップにランクされる糖尿病腎症等の血管合併症により生活の質(quality of life, QOL)が著しく損なわれる。逆に、糖尿病を発症しても、血管合併症の発症・憎悪を阻止できれば、患者の生命予後・ＱＯＬは著しく改善される。超高齢化社会の到来に向けて、糖尿病患者のＱＯＬを高め、社会人ならびに家庭人としての活力を保たせる手段を開発することは、医薬研究従事者に強く求められている課題である。
【０００４】
糖尿病自体がそうであるように糖尿病血管症も多因子病であるが、本発明者らはグルコースとタンパク質の非酸素的な反応により形成・蓄積される糖化蛋白(advanced glycation endproducts, AGE) が糖尿病血管症の主要環境因子であり、血管細胞表面に発現する糖化蛋白受容体（receptor for AGE,RAGE ）がそれに応答する細胞側の主要因子であることを、血管細胞培養系を用いたin vitroおよびＲＡＧＥトランスジェニックマウスを用いた個体レベルの研究により明らかにしてきた。
【０００５】
ＲＡＧＥは、１９９２年にＡＧＥ結合蛋白質として分離したimmunoglobulin superfamilyに属する膜貫通型受容体であることが報告され（非特許文献１）、その後、糖尿病血管合併症のみならず、免疫系の調節（非特許文献２）、アルツハイマー病の発症（非特許文献３）、がん増殖転移（非特許文献４）にも関与することが報告されている。
【０００６】
しかしながら、ＡＧＥ−ＲＡＧＥ系シグナル伝達経路についてはいまだに多くが不明である。
【０００７】
このような背景において本発明者らはこれまでに細小血管を構成する内皮細胞−周皮細胞間の相互作用とそれを担う因子の実体を明らかにし、血管恒常性の維持とその破綻の仕組みに関する検証を進め、上記のとおりの個体レベルでのＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用の解明とこの相互作用の阻害について詳細な検証を行ってきた。すなわちまず血管細胞のin vitro培養系を用いてＡＧＥがＲＡＧＥを介して血管細胞に糖尿病血管合併症に特徴的な細胞変化を引き起こすことを示した。そして、これらin vitroの成果に基づき、血管細胞でＲＡＧＥを過剰発現するトランスジェニックマウスを作製して病態の解析を行い、ＲＡＧＥ過剰発現が腎症などの糖尿病血管合併症の発症・憎悪を引き起こすことを示すとともに、ＲＡＧＥ阻害による糖尿病血管合併症の予防・治療が有効であることを示した。
【０００８】
そしてまた、発明者らは、血管細胞を初めとする各種ヒト細胞が細胞保護作用を有する内在性可溶型ＲＡＧＥ蛋白（endogenous secretory RAGE, esRAGE)を産生・分泌していることを明らかにし、個人間でのｅｓＲＡＧＥ産生の差が合併症罹患感受性／抵抗性の個人差の要因のひとつである可能性を提唱した（非特許文献５）。実際にｅｓＲＡＧＥの定量法を開発し、血中ｅｓＲＡＧＥ量の低下が糖尿病網膜症、糖尿病腎症、動脈硬化に結びつく可能性を見出した（非特許文献６）。
【０００９】
そして、これらの知見に基づいて、可溶型ＲＡＧＥタンパク並びにＡＧＥ−ＲＡＧＥ拮抗剤についての発明を提示してもいる（特許文献１−２）。
【００１０】
だが、ＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用を阻害するのに有効な、合成可能な、より低分子物質としてその取扱いや処方も容易な、薬剤を開発することはこれまでのところ進展していない。このことは、糖尿病合併症等の各種疾患への対応として急務であって、大きな課題として残されている。
【非特許文献１】J.Biol.Chem., ２６７，１４９９８−１５００４，１９９２
【非特許文献２】Cell  ９７，８８９−９０１，１９９９
【非特許文献３】Nat.Med.６，６４３−６５１，２０００
【非特許文献４】Nature  ４０５，３５４−３６０，２０００
【非特許文献５】J.Pharmacol.Sci ９７（３），３０５−３１１（２００５）
【非特許文献６】Biochem.J.３７０（３），１０９７−１１０９（２００３）
【特許文献１】特開２００３−１２５７８６号公報
【特許文献２】特開２００３−２３０３８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、以上のとおりの背景から、発明者らによるこれまでの検討を踏まえて、糖尿病合併症としての各種の疾患や、動脈硬化、悪性腫瘍、神経変成疾患、炎症性疾患等の血管障害による疾患の処方剤として有用な、合成可能で、より低分子物質としてその取扱いや処方も容易は、ＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用を阻害することのできる新しいＲＡＧＥ阻害剤を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、上記の課題を解決するものとして以下の特徴を有している。
【００１３】
第１： 次式
【００１４】
【化１】
2007246520.tif 000002
【００１５】
で表わされる化合物群のうちの少くとも１種を有効成分として含有するＲＡＧＥ阻害剤。
【００１６】
第２：糖尿病合併症、悪性腫瘍、動脈硬化疾患、神経変成疾患または炎症性疾患の治療剤である上記いずれかのＲＡＧＥ阻害剤。
【発明の効果】
【００１７】
上記のとおりの本発明によれば、糖尿病合併症としての各種の疾患や、動脈硬化、悪性腫瘍、神経変成疾患、炎症性疾患等の血管障害による疾患の処方剤として有用な、合成可能で、より低分子物質としてその取扱いや処方も容易な、ＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用を阻害することのできるＲＡＧＥ阻害剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
【００１９】
本発明のＲＡＧＥ阻害剤は、前記の式で表わされる化合物を有効活性成分として含有するものである。これらの化合物には、有効なＲＡＧＥ阻害活性を有する限りは製剤上、あるいは薬効上の観点から、さらに許容される各種の官能基を有していてもよい。
【００２０】
上記有効成分化合物のうちの、カルボキシル基は、塩等を形成していてもよい。            
【００２１】
また、本発明の有効成分化合物は、市販品として入手できるものもあり、合成も容易であって、常法の各種の反応手段によって適宜に合成が可能とされる。たとえばこの化合物の分子構造の基本としてのイミノ結合は、周知のとおりのアミン化合物とアルヒデド化合物、もしくはケトン化合物との反応によって形成することができる。
【００２２】
本発明のＲＡＧＥ阻害剤は、医薬品としての組成物として各種の配合組成を有していてもよい。好ましくは、経口投与、局所投与、または非経口投与等の使用に適した製剤調製物の形態で投与され、目的に応じていずれの投与形態（吸入法、あるいは直腸投与も包含される）によってもよい。また、本発明の活性成分化合物は、従来公知の利尿剤合併症用剤、動脈硬化症用剤、抗高脂血症剤、抗腫瘍剤（抗がん剤）、腫瘍移転阻害剤、血栓形成阻害剤、アルツハイマー治療剤、関節破壊治療剤、消炎剤及び／又は免疫抑制剤と配合して使用することもでき、それらは、有利な働きを持つものであれば制限なく使用でき、たとえば当該分野で知られたものの中から選択することができる。
【００２３】
非経口的な投与形態としては、局所、経皮、静脈内、筋肉内、皮下、皮内もしくは腹腔内投与を包含し得るが、患部への直接投与も可能であり、またある場合には好適でもある。好ましくはヒトを含む哺乳動物に経口的に、あるいは非経口的（例、細胞内、組織内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、胸腔内、脊髄腔内、点滴法、注腸、経直腸、点耳、点眼や点鼻、歯、皮膚や粘膜への塗布など）に投与することができる。具体的な製剤調製物の形態としては、溶液製剤、分散製剤、半固形製剤、粉粒体製剤、成型製剤、浸出製剤などが挙げられ、たとえば、錠剤、被覆錠剤、糖衣を施した剤、丸剤、トローチ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、マイクロカプセル剤、埋込剤、粉末剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、エマルジョン剤、灌注剤、シロップ剤、水剤、乳剤、懸濁剤、リニメント剤、ローション剤、エアゾール剤、スプレー剤、吸入剤、噴霧剤、軟膏製剤、硬膏製剤、貼付剤、パスタ剤、パップ剤、クリーム剤、油剤、坐剤（たとえば、直腸坐剤）、チンキ剤、皮膚用水剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、塗布剤、輸液剤、注射用液剤などのための粉末剤、凍結乾燥製剤、ゲル調製品等が挙げられる。医薬用の組成物は通常の方法に従って製剤化することができる。たとえば、適宜必要に応じて、生理学的に認められる担体、医薬として許容される担体、アジュバント剤、賦形剤、補形剤、希釈剤、香味剤、香料、甘味料、ベヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、界面活性剤、基剤、溶剤、充填剤、増量剤、溶解補助剤、可溶化剤、等張化剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、増粘剤、ゲル化剤、硬化剤、吸収剤、粘着剤、弾性剤、可塑剤、崩壊剤、噴射剤、保存剤、抗酸化剤、遮光剤、保湿剤、緩和剤、帯電防止剤、無痛化剤などを単独もしくは組合わせて用い、それとともに本発明の有効成分化合物等を混和することによって、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態にして製造することができる。非経口的使用に適した製剤としては、有効成分化合物と、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る媒体との無菌性溶液、または懸濁液剤など、たとえば注射剤等が挙げられる。一般的には、水、食塩水、デキストロース水溶液、その他関連した糖の溶液、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのグリコール類が好ましい注射剤用液体担体として挙げられる。注射剤を調製する際は、蒸留水、リンゲル液、生理食塩液のような担体、適当な分散化剤または湿化剤及び懸濁化剤などを使用して当該分野で知られた方法で、溶液、懸濁液、エマルジョンのごとき注射しうる形に調製する。
【００２４】
注射用の水性液としては、例えば生理食塩液、ブドウ糖やその他の補助薬（たとえば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）を含む等張液などが挙げられ、薬理的に許容される適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノールなど）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（たとえば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）又は浸透圧調節のための試薬、無痛化剤（たとえば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（たとえば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、アスコルビン酸などの酸化防止剤、吸収促進剤などとと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
【００２５】
非経口投与には、界面活性剤及びその他の薬学的に許容される助剤を加えるか、あるいは加えずに、水、エタノール又は油のような無菌の薬学的に許容される液体中の溶液あるいは懸濁液の形態に製剤化される。製剤に使用される油性ベヒクルあるいは溶剤としては、天然あるいは合成あるいは半合成のモノあるいはジあるいはトリグリセリド類、天然、半合成あるいは合成の油脂類あるいは脂肪酸類が挙げられ、たとえばピーナッツ油、トウモロコシ油、大豆油、ゴマ油などの植物油が挙げられる。たとえば、この注射剤は、通常本発明化合物を０．１〜１０重量％程度含有するように調製されることができる。局所的、例えば口腔、又は直腸的使用に適した製剤としては、例えば洗口剤、歯磨き剤、口腔噴霧剤、吸入剤、軟膏剤、歯科充填剤、歯科コーティング剤、歯科ペースト剤、坐剤等が挙げられる。洗口剤、その他歯科用剤としては、薬理的に許容される担体を用いて償用の方法により調製される。口腔噴霧剤、吸入剤としては、本発明化合物自体又は薬理的に許容される不活性担体とともにエアゾール又はネブライザー用の溶液に溶解させるあるいは、吸入用微粉末として歯などへ投与できる。軟膏剤は、通常使用される基剤、例えば、軟膏基剤（白色ワセリン、パラフィン、オリーブ油、マクロゴール４００、マクロゴール軟膏など）等を添加し、慣用の方法により調製される。
【００２６】
歯、皮膚への局所塗布用の薬品は、適切に殺菌した水または非水賦形剤の溶液または懸濁液に調剤することができる。添加剤としては、たとえば亜硫酸水素ナトリウムまたはエデト酸二ナトリウムとのような緩衝剤；酢酸または硝酸フェニル水銀、塩化ベンザルコニウムまたはクロロヘキシジンのような殺菌および抗真菌剤を含む防腐剤およびヒプロメルローズのような濃厚剤が挙げられる。坐剤は、当該分野において周知の担体、好ましくは非刺激性の適当な補形剤、たとえばポリエチレングリコール類、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリライド等の、好ましくは常温では固体である腸管の温度では液体で直腸内で融解し薬物を放出するものなどを使用して、慣用の方法により調製されるが、通常本発明化合物を０．１〜９５重量％程度含有するように調製される。使用する賦形剤および濃度によって薬品は、賦形剤に懸濁させるかまたは溶解させることができる。局部麻酔剤、防腐剤および緩衝剤のような補助薬は、賦形剤に溶解可能である。経口的使用に適した製剤としては、たとえば錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、トローチのような固形組成物や、液剤、シロップ剤、懸濁剤のような液状組成物等が挙げられる。製剤調製する際は、当該分野で知られた製剤補助剤などを用いる。錠剤及び丸剤はさらにエンデリックコーティングされて製剤されることもできる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。
【００２７】
本発明の有効成分化合物は、その投与量を広範囲にわたって選択して投与できるが、その投与量及び投与回数などは、処置患者の性別、年齢、体重、一般的健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組み合わせ、患者のその時に治療を行なっている病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。
【００２８】
医薬品製造にあたっては、その添加剤等や調製法などは、たとえば日本薬局方解説書編集委員会編、第十四改正  日本薬局方解説書、平成１３年６月２７日発行、株式会社廣川書店：一番ヶ瀬  尚  他編  医薬品の開発１２巻（製剤素剤〔Ｉ〕）、平成２年１０月１５日発行、株式会社廣川書店、同、医薬品の開発１２巻（製剤素材〔II〕）平成２年１０月２８日発行、株式会社廣川書店などの記載を参考にしてそれらのうちから必要に応じて適宜選択して適用することができる。本発明の有効成分化合物は、ＡＧＥとＲＡＧＥとの間の相互作用を抑制あるいは阻害するといった生物学的活性をもつものであり、ＡＧＥとＲＡＧＥとの間の相互作用に起因する障害、異常及び／又は疾患の予防あるいは治療に有用である。また、ＡＧＥとＲＡＧＥとの間の相互作用が関与する腫瘍細胞などの移動、浸潤、遊走及び／又は転移の制御、たとえば抑制に有用であると期待される。該成分は、悪性腫瘍、すなわち、がんの移動、浸潤及び／又は転位の阻止及び／又は抑制するのに有用で、血管形成・新生阻害剤、抗腫瘍剤及び／又はがん転移抑制剤として期待できる。また、血液系細胞の、ＡＧＥが関与した障害、異常及び／又は疾患の予防あるいは治療にも有用で、糖尿病合併症治療・予防剤・動脈硬化剤治療・予防剤、血栓症治療・予防剤・消炎剤及び／又は免疫抑制剤としても期待できる。さらに、アルツハイマー治療剤、関節破壊治療剤などとしても期待できる。
【００２９】
腸尿病合併症、老化に付随した各種疾患、アルツハイマー病、動脈硬化症、生体内タンパク質のグリケーション化に起因した疾患あるいは病気の発症及び／又は進展、及び腫瘍の浸潤又は拡散などの病的な状態あるいは症状の予防及び／又は治療に有用である。そして、糖尿病、糖尿病合併症、糖尿性腎症、糖尿性網膜症、糖尿性血管症、糖尿性細小血管症、腎糸球硬化症、高脂質アテローム性動脈硬化症、神経細胞毒性、ダウン症候群、頭部外傷に伴う痴呆、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、アミロイドーシス、自己免疫疾患、炎症、腫瘍癌、男性勃起不全症、創傷治療、歯周病、ニューロパーシ及び神経の変性症などの予防及び／又は治療に使用することが期待できる。本発明の有効成分化合物は、（１）血管内皮細胞増殖制御の破綻を阻害あるいは抑制する作用、（２）プロスタサイクリン産生能の低下を抑制する作用、（３）血管周皮細胞喪失あるいは減少の阻止あるいは抑制作用、（４）血管新生の阻害あるいは抑制作用、（５）血栓形成の阻害あるいは抑制作用、（６）オートサイクリン血管内皮増殖因子の誘導の阻止あるいは抑制作用、（７）微小血管内皮細胞の増殖の阻害あるいは抑制作用、（８）微小血管内皮細胞による管腔形成に対する阻害あるいは抑制作用、（９）プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１の亢進の阻害あるいは抑制作用、（１０）細胞外マトリックス蛋白産生の亢進を阻害あるいは抑制する作用、（１１）血管透過性の亢進の阻害あるいは抑制作用などの作用を期待できる。
【００３０】
そこで以下に試験実施例を示し、さらに詳しく説明する。もちろん以下の例によって本発明が限定されることはない。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例においては、次の被験化合物が用いられている。符号は、対応化合物の略称として付したものである。被検化合物Ｆ１１０９は、Sigma-Aldrich（米国）SALOR-S517879を、Ｆ１１１２は、Tim Tec LLC.（米国）:ST024806を、Ｆ１１１８は、Tim Tec LLC.（米国）:ST2019718を、Ｆ１１４１は、ASINEX（ロシア）:BAS01855873を使用した。 
【００３２】
【化２】
2007246520.tif 000003
【００３３】
＜プレートアッセイ＞
ＢＳＡ(bovine serum albumin)：ウシ血清アルブミンとglyceraldehydeを３７℃で１週間反応させて生成したＡＧＥを９６穴プレートに吸着させて、ＡＧＥ固相化プレートを作製した。そこに被験化合物と内在性分泌型ＲＡＧＥ（ｅｓＲＡＧＥ）を添加した。２５℃で１時間静置した後プレートを洗浄し、蛍光標識したｅｓＲＡＧＥ抗体を添加した。１時間静置した後洗浄し、蛍光測定をおこなった。蛍光強度は固相化されたＡＧＥと結合したｅｓＲＡＧＥの量に比例するため、被験化合物がＡＧＥとｅｓＲＡＧＥとの結合を阻害した場合、蛍光強度の減少として検出される。
【００３４】
その結果、被験化合物のＦ１１０９、Ｆ１１１２、Ｆ１１１８あるいはＦ１１４１を加えた場合、蛍光強度は濃度依存的に減少し、ＡＧＥとｅｓＲＡＧＥとの結合を阻害していることが示された。蛍光強度が化合物非添加時の半分となる化合物濃度をＩＣ５０とすると、これらの化合物はそれぞれ６９、１５０、５.８、及び６２μＭのＩＣ５０を示した。
【００３５】
添付の図１は、Ｆ１１１８のＡＧＥ−ＲＡＧＥ結合の阻害曲線を例示したものである。ＩＣ５０は５.８μＭであることが示されている。
＜ビアコアアッセイ＞
被験化合物とＲＡＧＥの結合を表面プラズモン共鳴センサーであるビアコア(BIAcore2000）を用いて直接検出した。ｅｓＲＡＧＥは、ＣＭ５センサーチップ表面のカルボキシメチルデキストランにアミンカップリング法によって５，５００ＲＵ（１１０ｆｍｏｌ／ｍｍ2）固定した。ランニング緩衝液は１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡ  ａｎｄ  ０．００５％ surfactant Ｐ−２０を使用し、２５℃、流速２０ｍＬ／ｍｉｎで被験化合物をセンサーチップ表面に流した。センサーチップ表面に被験化合物が結合し停留すると、チップ上の質量増加により表面プラズモン共鳴が変化しＲＵ値として検出される。結合はリアルタイムに観測され、その反応速度及び親和性が算出できる。
【００３６】
その結果、化合物Ｆ１１０９、Ｆ１１１２及びＦ１１１８はいずれも固定化したｅｓＲＡＧＥと結合し、センサーグラム上でＲＵ値の上昇が観測された。Ｆ１１１８について１：１  Langmuir binding modelによってセンサーグラム（図２）を解析したところ、２．５×１０−７Ｍ程度の解離定数が得られた。
＜ＮＦｋＢ−luciferaseアッセイ＞
アッセイに用いたＣ６−ＲＡＧＥ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞は、Ｃ６gliomaにレポーターベクターｐＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃ（ＮＦｋＢ応答配列の下流にluciferase遺伝子を含む）とＲＡＧＥ  ｃＤＮＡ発現ベクターをTrans ＩＴ−ＬＴ１（TaKaRa、リポソーム型導入試薬）を用いて同時に導入し作製した。ＲＡＧＥへのリガンド結合により、下流のシグナル伝達が起こりＮＦｋＢが活性化することは既に知られている。従って本系を用いれば、ＲＡＧＥとリガンドとの相互作用をluciferase活性の上昇として検出することができる。得られた細胞を数週間継代培養し、transient の効果消失後、限界希釈法により、約１００個のコロニーを単離した。９６well plateでduplicate にまき、無刺激時と、ＩＬ１ｂ刺激時のluciferase活性を測定し、ベースのluciferase漏れが少なく、刺激時の上昇率の良いクローンを選択した。
【００３７】
樹立したクローン株を９６穴プレートにてサプコンフルエントにまで培養し、ＲＡＧＥｓｉＲＮＡあるいはdominant negative ＲＡＧＥ発現ベクターを導入（GenomeONE-neo)した。２日後コンフルエントの状態で、０．１％ウシ血清培地に置換し、ＡＧＥ及び化合物（ＡＧＥ，Glyceraldehyde由来ＡＧＥ−ＢＳＡ  ５０ｍｇ／ｍｌ；ＢＳＡ，５０ｍｇ／ｍｌ；ｓＲＡＧＥ，２００ｍｇ／ｍｌ；Ｆ１１０９−Ｆ１１１８，０．１ｍＭ；Ｚ−ｌｙｓ−ＡＧＥ２，３００Ｕ／ｍｌ）で刺激した。刺激開始４時間後にLuciferase活性を測定した。
【００３８】
その結果、Ｃ６−ＲＡＧＥ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ細胞においては、ウエスタンプロッティング法により導入したＲＡＧＥ遺伝子の過剰発現が認められた。またＲＡＧＥ  ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉によってその発現は抑制された。dominant negative ＲＡＧＥ発現ベクターを導入した細胞においてその発現を確認した。
【００３９】
図３は、luciferaseアッセイの結果を示したものである。図中における符号ＢＳＡは、ＡＧＥ化していないＢＳＡで、培養時に添加してネガティブコントロールとして用いた場合を示している。
【００４０】
また、図中のＡＧＥは、ＢＳＡをグリセルアルデヒドでＡＧＥ化したＡＧＥ−ＢＳＡの場合を示している。そして図中のｓＲＡＧＥ（soluble ＲＡＧＥ）は、遺伝子工学的に膜結合領域を欠失させ、可溶型としたマウスのＲＡＧＥ蛋白質であって、このｓＲＡＧＥは細胞外領域のＡＧＥ結合領域はそのまま持っていることから、培養液中にＡＧＥと一緒に添加すると、先にＡＧＥと結合して細胞表面の膜結合型ＲＡＧＥへのＡＧＥの結合を阻害する。そこで、ここでは、ＮＦ− kappaＢの活性化が、ＡＧＥ−dependent であることを示すために用いている。
【００４１】
siＲＮＡ(small interfering  ＲＮＡ)は、ＲＡＧＥ  ｍＲＮＡに対するsiＲＮＡを細胞に導入したものであって、このＲＡＮＡ  siＲＮＡを細胞に導入すると、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）によりＲＡＧＥ  ｍＲＮＡが分解され、ＲＡＧＥ蛋白の産生が阻害される。実際には、最終的に細胞内でsiＲＮＡに変換されるshＲＮＡ(small hairpin  ＲＮＡ)をコードする発現ベクターを細胞に導入しているが、ここでは、ＡＧＥによるＮＦ− kappaＢの活性化がＲＡＧＥ−dependent であることを示すために用いている。
【００４２】
dnＲＡＧＥ(dominant negativeＲＡＧＥ)は、遺伝子工学的に、膜結合型ＲＡＧＥの細胞内シグナリングに必要な細胞内ドメインを欠失させた変異ＲＡＧＥをコードする発現ベクターを細胞に導入したものである。発現ベクターからこのdnＲＡＧＥが産生されると、細胞外領域のＡＧＥ結合領域はそのまま持っているので、ＡＧＥを結合して本来の膜結合型ＲＡＧＥへの結合を阻害する。そのため、ここでは、ＡＧＥによるＮＦ− kappaＢの活性化がＲＡＧＥ−dependent であることを示すために用いている。
【００４３】
また、細胞の刺激に用いているＡＧＥ−ＢＳＡは高分子で間−分子中に複数のＡＧＥ構造が存在する。つまりＲＡＧＥのリガンドとして、polyvalentあるいはmultivalent であり、ＲＡＧＥのpolymerization/multimerizationを引き起こして、シグナルを発生させる。図中のＺ−Ｌｙｓ−ＡＧＥは、ａアミノ基をブロックしたリジン（モノマーアミノ酸）をグリセルアルデヒドでＡＧＥ化したものであって、低分子でｍonovalent である。ここでは、低分子でのmonovalentのＡＧＥ化合物は、ＲＡＧＥに対して拮抗的に働くことを示している。
【００４４】
アッセイの結果からは、無刺激の対象群（図３：Control)と比較しGlyceraldehyde由来ＡＧＥ−ＢＳＡで刺激した細胞においては顕著なluciferase活性の上昇が認められた（図３：ＡＧＥ）。またこの活性上昇は、ＲＡＧＥ  ｓｉＲＮＡあるいはdominant negativeＡＧＥの特異的な相互作用によるもの
であると結論できる（図３：ｓｉＲＮＡ、ｄｎＲＡＧＥ）。これは分泌型ＲＡＧＥの添加によってluciferase活性が抑制されることからも確認できた（図３：ｓＲＡＧＥ）。本系に被験化合物を加えると、luciferase活性は有意（Ｐ＜０．０００１）に抑制された（図３：Ｆ１１０９、１１１２、１１１８）。従ってこれら化合物はＡＧＥ−ＲＡＧＥの特異的な相互作用を抑制し、ＡＧＥ存在下でのＲＡＧＥを介したシグナル伝達を阻止することが示された。
【００４５】
そこで、細胞レベルにおいて、ＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用の阻害活性の容量依存性をルシフェラーゼアッセイによって検証した。
【００４６】
その結果を図４に示した。
【００４７】
図３のアッセイの場合とは、細胞の培養液に添加したＦＢＳ（ウシ胎児血清）の濃度が相違している。そして、被験化合物薬剤はＤＭＳＯに溶解している。薬剤処理ありの培養液中のＤＭＳＯ濃度は１％に統一している。また、ＡＧＥは、Glyceraldehyde−ＡＧＥ−ＢＳＡで濃度は５０μｇ／ｍｌである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】プレートアッセイによるＦ１１１８のＡＧＥ−ＲＡＧＥ結合阻害曲線を例示した図である。
【図２】ビアコア法によるＦ１１１８とＲＡＧＥの結合曲線を例示した図である。
【図３】被験化合物によるＡＧＥ−ＲＡＧＥ相互作用阻害のルシフェラーゼアッセイの結果を例示した図である。
【図４】阻害活性の容量依存性を例示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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