(57)【要約】      （修正有）【課題】フコースにグルコースを転移するタンパク質の単離、遺伝子工学的手法による該酵素の生産や該酵素による糖鎖の合成、該遺伝子に基づく癌疾患の診断を可能にする。【解決手段】特定の配列に示されるアミノ酸配列又は該アミノ配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、基質となるフコースにグルコースをβ１，３結合で転移する活性を有するタンパク質および該タンパク質を含む糖転移作用剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、フコースにグルコースをβ１，３結合で転移する糖転移作用剤。
【請求項２】
前記タンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と３０％以上の相同性を有する、請求項１に記載の糖転移作用剤。
【請求項３】
前記タンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の糖転移作用剤。
【請求項４】
前記タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列においてアミノ酸残基１−２８の全部又は一部が削除されている、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の糖転移作用剤。
【請求項５】
前記タンパク質が、配列番号１におけるアミノ酸残基２９−４９８のアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の糖転移作用剤。
【請求項６】
前記タンパク質が、下記の反応：
フコース−Ｒ  ＋  グルコース−ヌクレオチド  →  グルコース−フコース−Ｒ  ＋  ヌクレオチド
を触媒する活性を有し、ここで、Ｒは、セリン、スレオニン、糖鎖、ペプチド、タンパク質、ベンジル基、パラニトロフェニル基、オルトニトロフェニル基、およびオルトメトキシフェニル基からなる群から選択される、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の糖転移作用剤。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の糖転移作用剤を使用して、グルコース−フコース−Ｒ（ここで、Ｒは、セリン、スレオニン、糖鎖、ペプチド、タンパク質、ベンジル基、パラニトロフェニル基、オルトニトロフェニル基、およびオルトメトキシフェニル基からなる群から選択される）で示される構造を有する糖鎖を合成する方法。
【請求項８】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸を含む、フコースにグルコースを転移する糖転移作用剤。
【請求項９】
前記核酸が、配列番号２の塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項８に記載の糖転移作用剤。
【請求項１０】
前記核酸が、配列番号２の塩基配列のヌクレオチド８５−１４９４を有する、請求項８又は９に記載の糖転移作用剤。
【請求項１１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列、該アミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列において少なくとも３０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質の遺伝子発現が、一部又は完全に抑制されていることを特徴とするノックアウト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコース転移酵素を含む、フコースにグルコースをβ１，３結合で転移する糖転移作用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｏ−結合型糖鎖の中で、タンパク質中のセリン残基にフコース（以下、「Ｆｕｃ」とも記載する）が結合したＯ−Ｆｕｃ糖鎖は、Ｎｏｔｃｈのシグナリングなどの様々な生物機能に関与していることが報告されている。Ｏ−Ｆｕｃ糖鎖には２種類あり、上皮増殖因子（以下、「ＥＧＦ」とも記載する）様リピート配列とトロンボスポンジン様リピート配列上にそれぞれ異なったＯ−Ｆｕｃ糖鎖が報告されている。
【０００３】
ＥＧＦ様リピート配列中のセリン残基には下記式（１）で表される糖鎖構造が存在する（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら、１９９２）。
Ｓｉａ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｆｕｃ−Ｓｅｒ  （１）
式（１）中、「Ｓｉａ」はシアル酸残基を示し、「Ｇａｌ」はガラクトース残基を示し、「ＧｌｃＮＡｃ」はＮ−アセチルグルコサミン残基を示し、「Ｆｕｃ」は前記Ｓｅｒで示されるセリン残基の側鎖にα結合したフコース残基を示し、「Ｓｅｒ」は前記Ｆｕｃで示されるフコース残基が側鎖に結合したセリン残基（ペプチド鎖中の場合を含む）を示し、「−」はグリコシド結合を示す。式（１）の構造中でＳｅｒにＦｕｃを転移するのは、プロテイン−Ｏ−フコース転移酵素１（以下、「ＰＯＦＵＴ１」とも記載する）であり、ＦｕｃにＧｌｃＮＡｃを転移するのはマニックフリンジ、ラジカルフリンジ、ルナチックフリンジと呼ばれる３種類のβ１，３Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素である（Ｍｏｌｏｎｅｙ，Ｄ．Ｊ．ら、２０００）。Ｎｏｔｃｈのシグナリングの場合、これらフリンジによってＮ−アセチルグルコサミンが転移されるか否かで、結合するリガンドが選択され、それぞれのシグナル伝達が引き起こされる。
【０００４】
一方、トロンボスポンジン様リピート配列中のセリン残基には、ＥＧＦ様リピート配列中の糖鎖構造とは異なる下記式（２）で表される糖鎖構造が存在する（Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅ，Ｊ．ら、２００１）。
Ｇｌｃ−Ｆｕｃ−Ｓｅｒ  （２）
式（２）中、「Ｇｌｃ」はグルコース残基を示し、「Ｆｕｃ」は前記Ｓｅｒで示されるセリン残基の側鎖にα結合したフコース残基を示し、「Ｓｅｒ」は前記Ｆｕｃで示されるフコース残基が側鎖に結合したセリン残基（ペプチド鎖中の場合を含む）を示し、「−」はグリコシド結合を示す。式（２）の構造中でＳｅｒにＦｕｃを転移するのは、プロテイン−Ｏ−フコース転移酵素２（以下、「ＰＯＦＵＴ２」とも記載する）であるが（Ｌｕｏ，Ｙ．ら、２００３）、ＦｕｃにＧｌｃを転移する活性を有する酵素は、これまで単離／精製されていない。また、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ細胞（ＣＨＯ細胞）には、まだ同定されていないが、内在性のβ３Ｇｌｃ−Ｔ活性を有する物質が存在し、ＣＨＯ細胞抽出物を酵素源とし、Ｆｕｃ−α−ｐＮｐとＵＤＰ−Ｇｌｃと反応させるとＧｌｃβ１，３Ｆｕｃ−α−ｐＮｐが生成することが報告されている（Ｍｏｌｏｎｅｙ，Ｄ．Ｊ．ら、１９９９）。
【特許文献１】特開２００４−２１５６１９
【非特許文献１】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．，Ｔ．Ｔａｋａｏ，Ｓ．Ｈａｓｅ，Ｙ．Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｉｗａｎａｇａ，Ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｈａｓ  ａ  ｔｅｔｒａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃａｌｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｓｅｒｉｎｅ  ６１  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｆｕｃｏｓｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１７５２０−１７５２５（１９９２）
【非特許文献２】Ｍｏｌｏｎｅｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｖ．Ｍ．Ｐａｎｉｎ，Ｓ．Ｈ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｌ．Ｓｈａｏ，Ｒ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｐ．Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｋ．Ｄ．Ｉｒｖｉｎｅ，Ｒ．Ｓ．Ｈａｌｔｉｗａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｔ．Ｆ．Ｖｏｇｔ，Ｆｒｉｎｇｅ  ｉｓ  ａ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｔｈａｔ  ｍｏｄｉｆｉｅｓ  Ｎｏｔｃｈ．Ｎａｔｕｒｅ，４０６，３６９−３７５（２０００）
【非特許文献３】Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅ，Ｊ．，Ｋ．Ｇ．Ｈｕｗｉｌｅｒ，Ｂ．Ｍａｃｅｋ，Ｄ．Ｈｅｓｓ，Ｊ．Ｌａｗｌｅｒ，Ｄ．Ｆ．Ｍｏｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｊ．Ｐ．Ｋａｔａｌｉｎｉｃ，Ｃ−ｍａｎｎｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏ−ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｍｏｄｕｌｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，６４８５−６４９８（２００１）
【非特許文献４】Ｌｕｏ，Ｙ．，Ｗ．Ｖｏｒｎｄａｍ，Ｖ．Ｐａｎｉｎ，Ｓ．Ｓｈｉ，Ｐ．Ｓｔａｎｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒ．Ｓ．Ｈａｌｔｉｗａｎｇｅｒ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  Ｏ−ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｒｅｐｅａｔｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３：ａｂｓｔｒａｃｔ  １８０（２００３）
【非特許文献５】Ｍｏｌｏｎｅｙ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｒ．Ｓ．Ｈａｌｔｉｗａｎｇｅｒ，Ｔｈｅ  Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ  ｆｕｃｏｓｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｕｒｉｄｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ：ｆｕｃｏｓｅ−β１，３−ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｒｏｍ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，９，６７９−６８７（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
フコースにグルコースを転移する活性を有するタンパク質（以下、「グルコース転移酵素」、「Ｇｌｃ−Ｔ」とも称する）を単離し、その遺伝子の構造を明らかにすることにより、遺伝子工学的手法による該酵素等の生産や、該遺伝子等に基づく疾患の診断が可能になる。しかしながら、該酵素は未だ知られておらず、該酵素の単離および遺伝子の同定についての手がかりはない。そのために、該酵素に対する抗体も作製されていない。
従って、本発明の目的は、フコースにグルコースを転移する活性を有するタンパク質を同定し、該タンパク質又はそれをコードする核酸を含む糖転移作用剤を提供することである。また、遺伝子工学的に発現させた該タンパク質は、抗体作製用に利用することもできる。さらに、本発明のタンパク質や該タンパク質に対する抗体は、免疫組織染色、ＲＩＡおよびＥＩＡ等の免疫測定法に応用できる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の通り、目的とするグルコース転移酵素は未だ知られていない。これまでに、本発明者らのグループは、Ｎ−アセチルグルコサミンにガラクトースを転移する活性を有する転移酵素を単離することに成功している（特開２００４−２１５６１９）。その後、この酵素のｃＤＮＡの部分配列を発現させた場合に、該酵素が非還元末端にフコースを有する受容体基質に対してグルコースをβ１，３結合で転移する活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明によれば、フコース残基にグルコースをβ１，３結合で転移する活性を有するタンパク質（グルコース転移酵素）、又はそれをコードする核酸が提供される。本発明の糖転移作用剤は、グルコース転移酵素（Ｇｌｃ−Ｔ）を直接使用してもよいし、あるいは、Ｇｌｃ−Ｔをコードする核酸を例えば適切な発現ベクターに挿入したものを使用してもよい。本発明の糖転移作用剤に使用されるＧｌｃ−Ｔタンパク質又はそれをコードする核酸は、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト、マウス、黄色ショウジョウバエ、線虫、さらにより好ましくはヒト、マウス由来である。なお、本明細書中において「Ｇｌｃ−Ｔ」は、特に言及しない限りＧｌｃ−Ｔタンパク質、又は当該タンパク質をコードする核酸、あるいは、タンパク質と核酸の双方を示す。
【０００８】
本発明の一態様において、本発明の糖転移作用剤に使用されるＧｌｃ−Ｔタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であるか、あるいは当該配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、または当該配列において１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、このようなアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する。
【０００９】
本発明によれば、配列番号１に示されるアミノ酸配列においてアミノ酸残基１−２８の全部又は一部が削除されているアミノ酸配列を有し、フコースにグルコースを転移する活性を有するタンパク質が提供される。好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基２９−４８９のアミノ酸配列からなるタンパク質である。なお、本明細書において用語「本発明のタンパク質」というときは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の全長を有するタンパク質に限定されず、該アミノ酸配列の部分配列を含むタンパク質が含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
本発明によれば、フコースにグルコースをβ１，３結合で転移する活性を有するタンパク質又はそれをコードする核酸を含む糖転移作用剤が提供される。
【００１１】
（１）Ｇｌｃ−Ｔタンパク質
本発明者らのグループは、前述の通り、Ｎ−アセチルグルコサミンにガラクトースを転移する酵素をコードする遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列および推定アミノ酸配列を決定している（特開２００４−２１５６１９）。その後、本発明者らは、このガラクトース転移酵素（特開２００４−２１５６１９に開示される「Ｇａｌ−Ｔ７」に対応する）と同一のアミノ酸配列又はその部分配列を有するタンパク質が、前記活性に加えて、フコースにグルコースをβ１，３結合で転移する、より強い活性を有することを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
本発明の糖転移作用剤に使用されるＧｌｃ−Ｔタンパク質は、典型的には、本明細書中の配列表の配列番号１（特開２００４−２１５６１９の配列番号１に対応する）に示されるアミノ酸配列を有し、それをコードする核酸の塩基配列は配列番号２（特開２００４−２１５６１９の配列番号２に対応する）に示す。
【００１３】
本発明の一態様において、本発明の糖転移作用剤に使用されるＧｌｃ−Ｔタンパク質は、配列番号１において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、または当該配列において１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、このようなアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する。
【００１４】
本発明によれば、配列番号１のアミノ酸配列においてアミノ酸残基１−２８の全部又は一部が削除されたアミノ酸配列を有するタンパク質が提供される。好ましくは、配列番号１におけるアミノ酸残基２９−４９８のアミノ酸配列からなるタンパク質である。なお、本明細書においては、これらの部分配列を有するタンパク質を「短鎖型Ｇｌｃ−Ｔタンパク質」と称することがある。これら短鎖型Ｇｌｃ−Ｔタンパク質は、フコースにグルコースをβ１，３結合で転移する活性を有する限りにおいて、本発明の糖転移作用剤に使用することができる。
【００１５】
本発明のＧｌｃ−Ｔは、そのアミノ酸配列のＮ−末端側に疎水的なアミノ酸残基のクラスターが存在し、膜貫通領域又はシグナル配列の可能性が考えられる。その領域を除いたアミノ酸残基２９−４９８の領域が糖転移酵素活性の領域と予想される。このアミノ酸残基２９−４９８の領域にはβ３結合で糖を転移する糖転移酵素ファミリーに保存されている３つのアミノ酸モチーフ（ｂｅｔａ３ＧＴモチーフ）が存在し、モチーフ間の配列はβ１，３Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素であるｍ−Ｆｒｉｎｇｅやβ１，３ガラクトース転移酵素であるｃｏｒｅ１  Ｇａｌ−Ｔ１、β１，３グルクロン酸転移酵素であるＣｈＳｙとそれぞれ２７％、２６％、２３％の相同性がある。ｂｅｔａ３ＧＴモチーフの中の２番目のモチーフ中には、２価カチオンとの結合に必要とされるＤＸＤ配列に相当すると思われるＤＤＤが存在する。
【００１６】
本発明の一態様において、本発明の糖転移作用剤に使用される短鎖型Ｇｌｃ−Ｔタンパク質は、配列番号１におけるアミノ酸残基２９−４９８のアミノ酸配列のおいて１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、または当該配列において１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。また、このようなアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する。
【００１７】
本明細書においては、本発明の理解のために、本発明の糖転移作用剤に使用するＧｌｃ−Ｔ及び短鎖型Ｇｌｃ−Ｔの性質を以下に説明する。
作用：  非還元末端のフコースにグルコースをβ１，３結合で転移する。触媒する反応を反応式で記載すると、
フコース−Ｒ  ＋  ＵＤＰ−グルコース  →  グルコース−フコース−Ｒ  ＋  ＵＤＰ
（Ｆｕｃ−Ｒ  ＋  ＵＤＰ−Ｇｌｃ  →  Ｇｌｃ−Ｆｕｃ−Ｒ  ＋  ＵＤＰ）
基質特異性：  フコース、例えば、フコース−Ｒ（Ｒは、セリン、スレオニン、糖鎖、ペプチド、タンパク質、ベンジル基、パラニトロフェニル基、オルトニトロフェニル基、オルトメトキシフェニル基である）。
【００１８】
本発明によれば、フコースにグルコースを転移する活性を有するタンパク質が提供される。本発明のタンパク質は、本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法等は限定されない。即ち、本発明のタンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現されたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。
【００１９】
本発明のタンパク質は、典型的には、配列番号１に記載したアミノ酸残基４９８個からなるアミノ酸配列を有する。しかしながら、天然のタンパク質の中には、それを生産する生物種の品種の違いや、生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在等に起因して、１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。なお、本明細書で使用する用語「変異タンパク質」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、または該アミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、フコースにグルコースを転移する活性を有するタンパク質等を意味する。ここで、「複数個」とは、好ましくは１−１００個、より好ましくは１−５０個、最も好ましくは１−２０個である。一般的には、部位特異的な変異によってアミノ酸が置換された場合に、元々のタンパク質が有する活性は保存される程度に置換が可能なアミノ酸の個数は、好ましくは１−１０個である。
【００２０】
本発明のタンパク質は、クローニングされた核酸の塩基配列からの推定に基づいて、配列番号１、及び配列番号２（下段）のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特徴を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。同一性は、少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上である。
【００２１】
本明細書において、同一性のパーセントは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラム、あるいはＰｅａｒｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｐ．２４４４−２４４８，１９８８）に記載されているＦＡＳＴＡを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。各プログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。なお、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
【００２２】
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質はもとのタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００２３】
本発明の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、特開２００４−２１５６１９に開示される方法に従って得ることができる。また、配列番号１のアミノ酸残基１−２８の全部または一部が削除されているアミノ酸配列を有する本発明のタンパク質は、当業者であれば、常法に従って容易に調製することができる。配列番号１のアミノ酸残基１−２８が削除されているアミノ酸配列を有する本発明のタンパク質は、例えば、後述の実施例１に従って、本発明のタンパク質をコードする核酸を示す配列番号２に記載の塩基配列を大腸菌、酵母、昆虫、または動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入および発現させることにより、当該タンパク質を大量に得ることができる。
【００２４】
本発明によって、これらタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列又はその一部を利用して、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の核酸増幅反応等の遺伝子工学的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、それらの遺伝子がコードする新規タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００２５】
なお、本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列が上述した通りのものであり、前記酵素活性を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合していてもよい。
本発明のタンパク質は、後述の実施例２に記載したように、本発明のタンパク質における受容体基質および供与体基質の探索からＧｌｃをＦｕｃに転移する活性を有するものである。より具体的には、本発明のタンパク質は、下記の性質を有する：
【００２６】
（Ａ）受容体基質の特異性
受容体基質は、本発明のタンパク質がグルコース供与体基質からグルコース残基を転移し得る基質である限り特に限定されないが、好ましくは、Ｆｕｃα−Ｒ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−Ｒ（以下、「Ｈ抗原タイプ２」と称することがある）、Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ−Ｒ（以下、「Ｌｅａ」）、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ−Ｒ（以下、「Ｈ抗原タイプ１」）、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ−Ｒ（以下、「Ｌｅｘ」）、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ−Ｒ（以下、「Ｌｅｂ」）、ＧａｌＮＡｃα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ−Ｒ（以下、「Ａ抗原」）、Ｇａｌα１−３（Ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ−Ｒ（以下、「Ｂ抗原」）、より好ましくはＦｕｃα−Ｒ、Ｈ抗原タイプ２、Ｌｅａ、さらにより好ましくはＦｕｃα−Ｒである。ここで、使用される省略形は、Ｆｕｃ、フコース；  Ｇａｌ、ガラクトース；  ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミンである。また、Ｒは、限定されないが、典型的には、セリン、スレオニン、糖鎖、ペプチド、タンパク質、ベンジル（Ｂｚ）基、パラニトロフェニル（ｐＮｐ）基、オルトニトロフェニル基、オルトメトキシフェニル基である。
【００２７】
（Ｂ）供与体基質の特異性
供与体基質は、本発明のタンパク質によって前述の受容体基質に転移し得る基質として、好ましくはグルコースである。より好ましくは、グルコースを有する糖ヌクレオチドである。糖ヌクレオチドには、ウリジン二リン酸−グルコース（ＵＤＰ−Ｇｌｃ）、アデノシン二リン酸−グルコース（ＡＤＰ−Ｇｌｃ）、グアノシン二リン酸−グルコース（ＧＤＰ−Ｇｌｃ）、シチジン二リン酸−グルコース（ＣＤＰ−Ｇｌｃ）等が例示され、ＵＤＰ−Ｇｌｃが最も好ましい。
【００２８】
（Ｃ）組織発現
本発明のタンパク質は、哺乳動物の組織、好ましくはヒトの組織で発現される。
（ｉ）好ましくは、精巣、子宮で高い発現を示す。
（ｉｉ）好ましくは、脳、脊髄、胎児脳、副腎、甲状腺、脾臓、骨格筋、肺、胃、大腸、膵臓で中程度の発現を示す。
（ｉｉｉ）好ましくは、小脳、骨髄、胸腺、心臓、気管、乳腺、肝臓、胎児肝臓、唾液腺、小腸、腎臓、前立腺、胎盤で低い発現を示す。
【００２９】
（２）Ｇｌｃ−Ｔタンパク質の単離／精製
配列番号１に示されるアミノ酸配列の全長を有する本発明のタンパク質は、特開２００４−２１５６１９に開示されたＧａｌ−Ｔ７タンパク質の調製方法に従って、タンパク質を発現させ、単離／精製することができる。
【００３０】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のうちアミノ酸残基１−２８の全部又は一部が削除されているアミノ酸配列を有するタンパク質は、後述の実施例１に記載されるように、本明細書及び特開２００４−２１５６１９において本発明の全長のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列が開示されているため、当業者であれば、該塩基配列の一部を所定の発現ベクターに組み込み、該発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞を適宜選択した培養条件下で培養することによって、目的とするタンパク質を大量に発現させることができる。
【００３１】
本発明のタンパク質は、上記の宿主細胞の培養によって得られる培養物より以下の方法に基づいて取得することができる。すなわち、本発明のタンパク質が宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば濃度が１０ｍＭ〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液。ｐＨは用いる緩衝液によって異なるが、ｐＨ５．０〜９．０の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明のタンパク質が宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、本発明のタンパク質の単離・精製に供することができる。単離／精製の方法としては、以下の方法が挙げられる。即ち、当該タンパクに６×ヒスチジンやＧＳＴ、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げられる。一方、そのようなタグを付けずに本発明のタンパク質を生産した場合には、イオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げられる。
【００３２】
本発明のタンパク質はまた、精製および同定を容易にするために添加されるペプチドを含んでもよい。こうしたペプチドには、例えば、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４，１９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれる。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号３）であり、該ペプチドは非常に抗原性であり、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号ＨＢ  ９２５９下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネチカット州ニューヘブンより入手可能である。
【００３３】
具体的には、後述される実施例１に記載されるように、本発明のタンパク質を発現する発現ベクターにＦＬＡＧのｃＤＮＡを挿入し、ＦＬＡＧ標識したタンパク質を発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体によって、該タンパク質の発現を確認することができる。
【００３４】
（３）Ｇｌｃ−Ｔタンパク質に結合する抗体
本発明のタンパク質に免疫反応性である抗体が本明細書に提供される。こうした抗体は、抗体の抗原結合部位を介して、該タンパク質に結合する。したがって、上述のような、配列番号１のタンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などを、それと免疫反応性である抗体を産生する際の「免疫原」として使用することが可能である。より具体的には、タンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などは、抗体形成を引き出す抗原決定基またはエピトープを含む。これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖でも高次構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）（断続的）でもどちらでもよい。なお、該抗原決定基またはエピトープは、当該技術分野に知られるいかなる方法によって同定してもよい。
【００３５】
したがって、本発明の１つの側面は、本発明のタンパク質の抗原性エピトープに関する。こうしたエピトープは、以下により詳細に記載されるように、抗体、特にモノクローナル抗体を作成するのに有用である。さらに、本発明のタンパク質由来のエピトープは、アッセイにおいて、そしてポリクローナル抗体（抗血清）または培養ハイブリドーマ由来の上清などの物質から特異的に結合する抗体を精製する研究試薬として使用可能である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、タンパク質の化学的または酵素的切断などの、当該技術分野に公知の技術を用いて、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて、産生することが可能である。
【００３６】
本発明のタンパク質によって誘導される可能性がある抗体に関しては、該タンパク質の全部若しくは一部が単離されていても、またはエピトープが単離されていても、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はどちらも、慣用的技術によって調製することが可能である。例えば、Ｋｅｎｎｅｔら（監修），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９８０を参照されたい。
【００３７】
本発明のタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生しそして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を該タンパク質で免疫し；免疫された動物から脾臓細胞を採取し；前記脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し；そして該タンパク質に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。
【００３８】
本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。こうしたヒト化抗体を既知の技術によって調製し、そして抗体がヒトに投与されるとき、免疫原性の減少という利点を提供してもよい。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変領域（またはその抗原結合部位のみ）およびヒト抗体由来の定常領域を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、ネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変領域断片（抗原結合部位を欠く）を含んでもよい。
【００３９】
慣用的技術によって産生可能な、抗体の抗原結合断片もまた、本発明に含まれる。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。遺伝子工学技術によって産生される抗体断片および誘導体もまた提供される。
【００４０】
１つの態様において、抗体は本発明のタンパク質に特異的であり、そして他のタンパク質と交差反応しない。こうした抗体を同定することが可能なスクリーニング法が公知であり、そして例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィーを伴ってもよい。
【００４１】
本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかで、本発明のタンパク質または断片の存在を検出するアッセイで用いることが可能である。抗体はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、本発明のポリペプチドまたは断片を精製する際にも使用可能である。
【００４２】
さらに、結合パートナー、例えば受容体基質への本発明のタンパク質の結合を遮断することが可能な抗体を用いて、こうした結合から生じる生物学的活性を阻害することが可能である。こうした遮断抗体は、受容体基質を発現している特定の細胞への該タンパク質の結合を阻害する能力に関して、抗体を試験することによるなど、いかなる適切なアッセイ法を用いて、同定してもよい。あるいは、遮断抗体は、標的細胞の結合パートナーに結合している本発明のタンパク質から生じる生物学的影響を阻害する能力に関するアッセイにおいて、同定することが可能である。
【００４３】
こうした抗体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法で使用するか、またはｉｎ  ｖｉｖｏで投与して、抗体を生成した実体によって仲介される生物学的活性を阻害することが可能である。したがって、本発明のタンパク質と結合パートナーとの相互作用によって、（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される障害を治療することが可能である。療法は、結合パートナー仲介生物学的活性を阻害するのに有効な量の遮断抗体を、哺乳動物にｉｎ  ｖｉｖｏ投与することを伴う。一般的に、こうした療法の使用には、モノクローナル抗体が好ましい。１つの態様において、抗原結合抗体断片が使用される。
【００４４】
（４）Ｇｌｃ−Ｔタンパク質をコードする核酸
本発明によれば、Ｇｌｃ−Ｔタンパク質をコードする核酸を含む、フコースにグルコースをβ１，３結合で転移する糖転移作用剤が提供される。上記核酸は、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡ、およびそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組合せが含まれる。使用する核酸としては、ＤＮＡが好ましい。本明細書において、ある特定の塩基配列について記載する場合、特に言及しない限り、その相補鎖も含む。
【００４５】
本発明の糖転移作用剤に使用する核酸は、好ましくは配列番号１に示されるヒトのアミノ酸配列をコードする核酸（その相補体を含む）である。典型的には、配列番号２の塩基配列（その相補体を含む）を有する。天然の核酸の中には、それを生産する生物種の品種の違いや、生態型の違いに起因する少数の変異やよく似たアイソザイムの存在に起因する少数の変異が存在することは当業者に周知である。使用可能な核酸は、配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸に限定されるわけではなく、Ｇｌｃ−Ｔタンパク質をコードする全ての核酸を包含する。本発明の糖転移作用剤に使用する核酸は、好ましくは、配列番号２の塩基配列におけるヌクレオチド１−１４９４、より好ましくはヌクレオチド８５−１４９４を有する。
【００４６】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６−７章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。当業者に知られていて、以下にさらに記載したように、ハイブリダイゼーション反応と二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するためには、洗浄温度と洗浄塩濃度を必要に応じて調整することが可能であると理解すべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１を参照されたい）。核酸を未知配列の標的核酸へハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはハイブリダイズする核酸のそれであると仮定される。既知配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは核酸の配列を並列し、最適な配列相補性をもつ単数または複数の領域を同定することによって決定可能である。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５−２５℃低くなければならず、Ｔｍは、以下の等式により決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関して、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８塩基対を超える長さのハイブリッドに関しては、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋４１（モル分率［Ｇ＋Ｃ］）−０．６３（％ホルムアミド）−５００／ｎであり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸は各々、少なくとも８ヌクレオチド（または、より好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）、またはそれがハイブリダイズする核酸の長さの少なくとも１％（より好ましくは少なくとも２５％、または少なくとも５０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０）である長さを有し、それがハイブリダイズする核酸と少なくとも５０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも  ７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。ここで配列同一性は、上記により詳しく記載されるように、重複部分と同一性を最大化する一方、配列ギャップを最小化するように並列された、ハイブリダイズする核酸の配列を比較することによって決定される。
【００４７】
核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５））、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ  Ｄ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９）；  Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  Ｋ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９，１１７−１２２（１９９０）；  Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１８９−１９３（１９９１））および転写に基づく増幅（Ｋｗｏｈ  Ｄ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９））等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）；  Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２））、自己保持配列複製（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８（１９９０））およびＱβレプリカーゼシステム（Ｌｉｚａｒｄｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，ｐ．１１９７−１２０２（１９８８））等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
【００４８】
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列表の配列番号２に示される塩基配列又は配列番号２におけるヌクレオチド８５−１４９４の塩基配列に対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する。
【００４９】
核酸の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列のパーセント同一性は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マジソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌｓ．ｈｔｍｌにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定され；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：５４４−７１も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００５０】
（５）Ｇｌｃ−Ｔタンパク質をコードする核酸を測定するための核酸
本発明によれば、本発明のＧｌｃ−Ｔタンパク質をコードする核酸とハイブリダイズする核酸（以下、「測定用核酸」と称する）が提供される。本発明の測定用核酸は、典型的には、本発明のＧｌｃ−Ｔタンパク質をコードする核酸の天然由来の又は合成されたフラグメントであり、プライマーまたはプローブを含むが、これらに限定されるものではない。なお、本明細書において使用される用語「測定」には、検定、検出、増幅、定量、および半定量のいずれもが包含される。
【００５１】
（ａ）プライマー
本発明の測定用核酸を核酸増幅反応用のプライマーとして使用する場合、本発明の測定用核酸は、オリゴヌクレオチドであって、
Ｇｌｃ−Ｔタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を示す配列番号２に基づいて、以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−５０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−７０％であること；
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。
【００５２】
本発明のプライマーは、本発明の核酸の部分領域と相同的な配列を有することが好ましいが、１または２塩基の不一致があっても差し支えない。
なお、本発明のプライマーの塩基数は１５塩基以上、好ましくは１８塩基以上、より好ましくは２１塩基以上であり、５０塩基以下である。
【００５３】
本発明のプライマーは、典型的には、配列番号４−６の塩基配列を有し、単独、または適当な２種を組み合せたプライマー対として用いることができる。このヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列に基づいて、各々のタンパク質をコードする遺伝子断片のクローニングのためのＰＣＲ用プライマーとして設計したものであり、当該アミノ酸をコードすることが可能な全ての塩基をミックスしたプライマーである。
【００５４】
（ｂ）プローブ
本発明測定用核酸をプローブとして使用する場合、本発明測定用核酸は、配列番号２に記載の塩基配列の全体又は部分領域と相同的な配列を有することが好ましい。本発明の測定用核酸が、ｃＤＮＡプローブの場合、塩基数は、１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上で、最長で、コード領域の全長、即ち、１４９７塩基である。配列番号２に記載した塩基配列又はその相補的な塩基配列と２０％以下、好ましくは１０％以下の不一致があっても、プローブとしての機能を果たし得る。また、本発明の測定用核酸が、合成オリゴヌクレオチドの場合、塩基数は１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２４塩基以上である。合成オリゴヌクレオチドの場合、長さによるが、配列番号２に記載した塩基配列又はその相補的な塩基配列と１または２塩基程度の不一致があってもプローブとしての機能を果たし得る。
【００５５】
本発明のプローブは、例えば、配列番号７に記載された塩基配列を有する。これは、配列番号２の塩基番号１３２８−１３５１に相当する。プローブは天然由来の核酸より、制限酵素処理によって得てもよいし、合成したオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００５６】
本発明のプローブには、該プローブが標的配列とハイブリダイズしたことを検出または確認するために、蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブが含まれる。被検核酸またはその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するかを決定することができる。あるいは、測定用核酸を固相化し、被検核酸をハイブリダイズさせ、固相に結合した被検核酸を標識プローブ等で検出することも可能である。このような場合、固相に結合した測定用核酸もプローブと呼ぶ。
【００５７】
一般的に、ＰＣＲのような核酸増幅法自体は、この分野において周知であり、そのための試薬キットおよび装置も市販されているので容易に行うことができる。上記した本発明の測定用核酸の一対をプライマーとして用い、被検核酸を鋳型として用いて核酸増幅法を行うと、被検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出することにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知ることができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。また、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いたいわゆるリアルタイム検出ＰＣＲを行うことにより、検体中の被検核酸の量を定量することも可能である。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ用のキットも市販されているので、容易に行うことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて被検核酸を半定量することも可能である。なお、被検核酸は、ｍＲＮＡでも、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡであってもよい。被検核酸としてｍＲＮＡを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いたＮＡＳＢＡ法（３ＳＲ法、ＴＭＡ法）を採用することもできる。ＮＡＳＢＡ法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。
【００５８】
（６）糖転移作用剤
本発明によれば、上記に定義されるタンパク質（グルコース転移酵素）、又はそれをコードする核酸を含む糖転移作用剤が提供される。本発明の糖転移作用剤は、グルコース転移酵素（Ｇｌｃ−Ｔ）を直接使用してもよいし、あるいは、Ｇｌｃ−Ｔをコードする核酸を例えば適切な発現ベクターに挿入したものを使用してもよい。
【００５９】
（７）ノックアウト動物
本発明によりＧｌｃ−Ｔの発現が癌の発現に関与していることが明らかとなったので、実験動物においてＧｌｃ−Ｔタンパク質をコードする遺伝子の発現を一部または完全に抑制することによって、インビボにおける詳細な癌転移メカニズムの解明に使用されるノックアウト動物を調製することも可能である。ノックアウト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サルなどの哺乳動物が好ましく、ノックアウト動物調製の手法がある程度確立していることから、マウス又はラットが最も好ましいが、これに限定はされない。例えば、ノックアウトマウスは、「ジーンターゲティングの最新技術」（八木健編集、羊土社、２０００年）、ジーンターゲティング（野田哲生監訳、メディカル・サイエンス・インターナショナル社、１９９５年）などの記載に従って行うことができる。また、ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ法（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，５５０１−５５３（２００２））などの「遺伝子発現を抑制する方法」でもノックアウトマウスを作製することができる。
【００６０】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
実施例１  Ｇｌｃ−Ｔの調製
１．短鎖型Ｇｌｃ−Ｔの調製
（１）短鎖型Ｇｌｃ−Ｔ遺伝子の発現ベクターへの組み込み
短鎖型Ｇｌｃ−Ｔの発現系を作成するため、まずＧｌｃ−Ｔ遺伝子をシグマ社のｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１ベクターに組込み、ｐＦＡＬＧ−Ｇｌｃ−Ｔを作製した。配列番号２に示される塩基配列に従い設計した２種類のプライマーＧＰ−１０５２（５’−ｇｇａａｔｔｃｔｇａａｇａｔａｃａａａｇａａａｇａｇｇｔ−３’）（配列番号４）（ヌクレオチド５−２８は、配列番号２のヌクレオチド８４−１０７に相当する）とＧＰ−１０４９（５’−ｇｃｔｃｔａｇａｇｔｇａｔｔｔａｔａａｃｔｃｃｔｃｔｃｇａａａａ−３’）（配列番号５）（ヌクレオチド１４−３２は、配列番号２のヌクレオチド１４９７−１４７９に相当する）を用い、酵素活性に必要なＤＮＡ断片を、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ）を鋳型として増幅した。これらのプライマー中には制限酵素Ｅｃｏ ＲＩあるいはＸｂａ Ｉ切断部位を含むためｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１ベクターのＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ Ｉ部位にＰＣＲ増幅断片を挿入することが可能である。しかし、ＰＣＲ増幅断片中にＥｃｏ ＲＩが１ヵ所存在するため、最初に３’側のＥｃｏ ＲＩ−Ｘｂａ Ｉ断片を、続いて５’側のＥｃｏ ＲＩ−Ｅｃｏ ＲＩ断片を常法により挿入し、Ｇｌｃ−Ｔ発現ベクターを構築した。作製したベクターをｐＦＬＡＧ−Ｇｌｃ−Ｔと命名した。なお、この操作により、Ｇｌｃ−ＴはＦＬＡＧタグに引きつづき、２９番目のセリンからタンパク質が産生されることになる。
【００６２】
（２）トランスフェクションとリコンビナント酵素の発現
２×１０６のＨＥＫ２９３細胞を予め１０％ ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）で１晩培養後、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）を用いて、同社のプロトコールに従って、該細胞に１５μｇのｐＦＬＡＧ−Ｇｌｃ−Ｔを導入した。培養４８時間から７２時間後の培養上清を回収し、上清１０ｍｌにＮａＮ３（０．０５％）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）、抗Ｍ１レジン（シグマ社）（５０μｌ）を混合し、４℃で一夜攪拌した。反応混合液を遠心分離して（３０００ｒｐｍ、５分、４℃）ペレットを回収し、２ｍＭのＣａＣｌ２・ＴＢＳを９００μｌ加えて再度遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分、４℃）し、ペレットを２００μｌの１ ｍＭ ＣａＣｌ２ ・ＴＢＳ に浮遊させ活性測定のサンプル（Ｇｌｃ−Ｔ酵素液）とした。
酵素液は常法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッテイングを行い、目的とするタンパク質が発現していることを確認した。抗体は抗ＦＬＡＧ
Ｍ２−ペルオキシダーゼ（Ａ−８５９２、ＳＩＧＭＡ社）を用いた。
【００６３】
２．全長Ｇｌｃ−Ｔの調製
（１）全長Ｇｌｃ−Ｔ遺伝子の発現ベクターへの組み込み
全長Ｇｌｃ−Ｔは２種類のプライマーＧＰ−１０５３（５’−ｇｇａａｔｔｃａｇｇａｔｇｃｇｇｃｃｇｃｃｃｇｃｃｔｇｃｔ−３’）（配列番号６）（ヌクレオチド１１−２９は、配列番号２のヌクレオチド１−１９に相当する）とＧＰ−１０４９を用い、全長のＤＮＡ断片を、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ）を鋳型として増幅した。これらのプライマー中には制限酵素Ｅｃｏ ＲＩあるいはＸｂａ Ｉ切断部位を含み、上記と同じ方法でインビトロジェン社のｐｃＤＮＡ３．１（＋）にライゲーションし、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｇｌｃ−Ｔを構築した。
【００６４】
（２）トランスフェクションとリコンビナント酵素の発現
２×１０６のＣＨＯ細胞を予め１０％ ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むＲＰＭＩ１６４０で１晩培養後、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）を用いて、同社のプロトコールに従って、該細胞に１５μｇのｐｃＤＮＡ３．１−Ｇｌｃ−Ｔを導入した。翌日、０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を培地中に加え、さらに数日培養することによりトランスフェクタントを選別した。１ｘ１０６のＧｌｃ−Ｔ導入ＣＨＯ細胞は、ＰＢＳで洗浄後、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃａｃｋｔａｉｌ（シグマ社）を含むＴＢＳ  Ｂｕｆｆｅｒに縣濁、４℃で１５分間超音波破砕した。これを４℃、１４０００×Ｇ、１０分間遠心分離し、その上清を細胞抽出液とし、細胞内Ｇｌｃ−Ｔ活性測定の酵素源として用いた。
【００６５】
実施例２  Ｇｌｃ−Ｔタンパク質の基質特異性
１．短鎖型Ｇｌｃ−Ｔタンパク質の基質特異性
（１）供与体基質の探索
各種単糖受容体基質の混合液に対し、酵素液５μｌと様々な供与体基質を用いて、短鎖型Ｇｌｃ−Ｔタンパク質の供与体基質の探索を行った（表１）。受容体基質は、Ｇａｌ−α−ｐＮｐ、Ｇａｌ−β−ｏＮｐ、ＧａｌＮＡｃ−α−Ｂｚ、ＧａｌＮＡｃ−β−ｐＮｐ、ＧｌｃＮＡｃ−α−ｐＮｐ、ＧｌｃＮＡｃ−β−Ｂｚ、Ｇｌｃ−α−ｐＮｐ、Ｇｌｃ−β−ｐＮｐ、ＧｌｃＡ−β−ｐＮｐ、Ｆｕｃ−α−ｐＮｐ、Ｍａｎ−α−ｐＮｐ（以上、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）、Ｘｙｌ−α−ｐＮｐ、Ｘｙｌ−β−ｐＮｐ（以上、シグマ社）が各２．５ｎｍｏｌ／２０μｌ含まれるように調製した。ここで、「Ｇａｌ」とはＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｇｌｃ」とはＤ−グルコース残基を示し、「Ｆｕｃ」とはＤ−フコース残基を示し、「Ｍａｎ」とはＤ−マンノース残基を示し、「ｐＮｐ」はｐ−ニトロフェニル基を示し、「Ｂｚ」はベンジル基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。また、「α」及び「β」は、糖環１位の前記グリコシド結合のアノマーを示し、５位ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ３との位置関係がトランスのものを「α」、シスのものを「β」で示す。また、各種供与体基質（ＵＤＰ−Ｇｌｃ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＵＤＰ−ＧｌｃＡ、ＵＤＰ−Ｘｙｌ及びＧＤＰ−Ｆｕｃ、何れもシグマ社）に対する反応液は表１に示したとおりである。
【００６６】
【表１】
2007282586.tif 000002
【００６７】
反応液中には適量の１４Ｃ標識供与体基質も混在させた。また、反応時間はすべて１６時間とした。反応後、ＳｅｐＰａｃｋ Ｃ１８カラム（ウォーターズ社）で未反応の放射活性を有する供与体基質を除去し、受容体に取り込まれた供与体由来の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。その結果、Ｇｌｃ−ＴはＵＤＰ−Ｇｌｃを供与体基質に用いたときのみ有意な活性が検出できた（表２）。
【００６８】
【表２】
2007282586.tif 000003
【００６９】
（２）受容体基質の探索
受容体基質を探索する目的で、それぞれの受容体基質を単独で使用し（１０ｎｍｏｌ／２０μｌ）、反応を行った。その結果、Ｇｌｃ−ＴはＦｕｃ−α−ｐＮｐを用いたときのみ、有意な放射活性が検出された。以上の結果から、Ｇｌｃ−ＴはＦｕｃにＧｌｃを転移する糖転移酵素であることが明らかになった（表３）。
【００７０】
【表３】
2007282586.tif 000004
【００７１】
さらに、Ｆｕｃを含む受容体基質の特異性を検討するために、表４に記載する受容体基質を用いて、Ｇｌｃ−Ｔの活性を測定した。Ｇｌｃ−Ｔによる各基質に対するグルコースを転移する活性は、Ｆｕｃα−ｐＮｐを用いた場合を１００％として、相対的に評価した。表４の結果から、Ｇｌｃ−Ｔは、Ｆｕｃα−ｐＮｐの他に、少なくともＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮｐ（Ｈ抗原タイプ２）（活性６１％）、Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮｐ（Ｌｅａ）（活性５２％）に対して基質特異性を示すことが明らかとなった。
【００７２】
【表４】
2007282586.tif 000005
【００７３】
２．全長Ｇｌｃ−Ｔタンパク質の基質特異性
内在性のβ３Ｇｌｃ−Ｔ活性を有する物質を含むとされるＣＨＯ細胞抽出物を酵素源とした場合、上述したようにＦｕｃ−α−ｐＮｐとＵＤＰ−Ｇｌｃとを反応させるとＧｌｃβ１，３Ｆｕｃ−α−ｐＮｐが生成することが報告されている（Ｍｏｌｏｎｅｙ，Ｄ．Ｊ．ら、上述）。そこで、本発明のリコンビナントの全長Ｇｌｃ−Ｔによる反応生成物をクロロホルム：メタノール：ＣａＣｌ２（６５：３５：８）を展開溶媒に用いて薄層クロマトグラフィーで展開すると、ＣＨＯ細胞抽出物による反応生成物と同じ位置に展開された。また、それぞれの反応生成物はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．由来のｅｘｏ−１，３−β−グルカナーゼおよびＡｌｍｏｎｄ  ｓｐ．由来のβ−グルコシダーゼ（データ示さず）により消化された。さらにＣＨＯ細胞にｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み換えた全長Ｇｌｃ−Ｔをトランスフェクションし、トランスフェクタントの細胞抽出物を酵素源とした時には、ＣＨＯ細胞抽出物による反応生成物と同じ位置の放射活性が増大していた（図１）。以上より、本発明の全長Ｇｌｃ−Ｔの反応生成物は、ＣＨＯ細胞抽出物による反応生成物と同様にＧｌｃβ１，３Ｆｕｃ−α−ｐＮｐであると示唆された。
【００７４】
実施例３  ヒト組織でのＧｌｃ−Ｔの発現解析
ヒト正常組織のｃＤＮＡを用いて、定量的ＰＣＲにより該遺伝子の発現量を定量した。正常組織のｃＤＮＡは、クロンテック社の総ＲＮＡから逆転写を行ったものを使用し、株化細胞に関しては総ＲＮＡを抽出し、常法によりｃＤＮＡを作製し使用した。Ｇｌｃ−Ｔ遺伝子の定量的発現解析に使用したプライマーはＧＰ−Ｋ１４−Ｆ２（５’−ｇａｃａｃａｃａｇｃｃｃｔｃｔｃｔｔｃｃａ−３’）（配列番号７）（配列番号２のヌクレオチド１３０５−１３２５に相当する）、ＧＰ−Ｋ１４−Ｒ２（５’−ｔｇｇｇａａｃｔｔｇａｔｇａｇａａａｇｇｔａｇｔｃ−３’）（配列番号８）（配列番号２のヌクレオチド１３７８−１３５４に相当する）、プローブはＧＰ−Ｋ１４−Ｐ２（５’−ａｇｇｃｔｃｇｇｃｃｇｇｔｇｇａｔｔａｃｃｃｔａ−３’）（配列番号９）（配列番号２のヌクレオチド１３２８−１３５１相当する）である。酵素及び反応液にはＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ともにアプライドバイオシステムズ社）により反応液量２５μｌで定量を行った。定量の標準遺伝子としてはグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を使用し、既知濃度の鋳型ＤＮＡにより定量の検量線を作成し該遺伝子の発現量の標準化を行った。また、Ｇｌｃ−Ｔの標準ＤＮＡとして、ｐＦＬＡＧ−Ｇｌｃ−Ｔを用いた。反応温度は５０℃２分、９５℃１０分の後、９５℃１５秒・６０℃１分を５０サイクル行った。結果を図２に示した。Ｇｌｃ−Ｔは精巣や子宮での発現が高かったが、調べた全ての組織で発現は確認できた。
【００７５】
実施例４  ノックアウトマウスの作製
ノックアウトマウスの作製のためのターゲットベクターは、酵素活性に必須であると予想されるＤＤＤ配列を含む第１１エクソンとその隣の第１０エクソンを含む２ｋｂの領域をＰＣＲで増幅し、図３のように２つのｌｏｘ配列の間に組み入れた。ｃｒｅトランスジェニックマウスとの交配により、ノックアウトマウスではこの領域が欠失する事になる。相同組み替えのために、その両側のそれぞれ３．７ｋｂと３ｋｂの領域もＰＣＲで増幅し、図３のようなベクターを構築した。このベクターには、他にトランスフェクタントのセレクションのためのＤＴ３，Ｎｅｏ遺伝子をも含んでいる。このベクターをＣ５７ＢＬ／６由来のＥＳ細胞にトランスフェクトし、組み換わったＥＳ細胞を用いてキメラマウスを作製することができる。ｃｒｅ−ｌｏｘシステムで全身あるいは組織特異的、細胞特異的にノックアウトすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
非還元末端にフコースを有する基質に対してグルコース残基を転移する十分な作用を有するＧｌｃ−Ｔを含む糖転移作用剤が提供され、これにより糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク質等に効率よくグルコースを付加することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、Ｇｌｃ−Ｔによる反応生成物の解析を示す。バンドはＦｕｃ−α−ｐＮｐに取り込まれた［１４Ｃ］Ｇｌｃの放射能活性を示す。各レーンの酵素源にはレーン１：ｍｏｃｋ（ネガティブコントロール、レーン２，３：リコンビナントＧｌｃ−Ｔ、レーン４，５：ＣＨＯ細胞破砕抽出物、レーン６，７：Ｇｌｃ−ＴをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞破砕抽出物を用いた。さらにレーン３，５，７は反応生成物をｅｘｏ−β１，３ｇｌｕｃａｎａｓｅ処理を行った。
【図２】図２は、各種組織におけるＧｌｃ−Ｔ遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ法により定量した結果を示すグラフである。縦軸はコントロールのグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の発現量に対するＧｌｃ−Ｔ遺伝子の相対比をあらわす。
【図３】図３は、ノックアウトマウスを作製するためのベクターの概略図を示す。酵素活性に必須であると予想されるＤＤＤ配列を含む第１１エクソンとその隣の第１０エクソンを含む２ｋｂの領域をｌｏｘ配列で挟んだ。組織特異的あるいは細胞特異的にｃｒｅが発現するｃｒｅトランスジェニックマウスとの交配により、この領域がノックアウトされる。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【配列表】
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