(57)【要約】【課題】微生物等により５，６−ジヒドロ−５−トリフルオロメチルウラシル（ＤＨＴＦＵ）を選択的に分解する方法を提供する。【解決手段】５，６−ジヒドロ−５−トリフルオロメチルウラシルと、５−トリフルオロメチルウラシルとが共存する水性媒体を、ｐＨ５からｐＨ７において、かつ２０℃から６０℃において、微生物の培養物、菌体、または菌体内容物と接触させることにより、５，６−ジヒドロ−５−トリフルオロメチルウラシルを選択的に分解し、５−トリフルオロメチルウラシルを回収する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
５，６−ジヒドロ−５−トリフルオロメチルウラシルと、微生物の培養物、菌体、または菌体内容物とを、水性媒体中で接触させることを特徴とする、５，６−ジヒドロ−５−トリフルオロメチルウラシルの分解方法。
【請求項２】
ｐＨ５からｐＨ７の水性媒体中で接触させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２０℃から６０℃の水性媒体中で接触させることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
水性媒体中に５−トリフルオロメチルウラシルが共存することを特徴とする、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５，６−ジヒドロ−５−トリフルオロメチルウラシル（以下、ＤＨＴＦＵという）の分解方法に関するものである。特に５−トリフルオロメチルウラシル（以下、ＴＦＵという）とＤＨＴＦＵとが共存する場合に、選択的にＤＨＴＦＵを分解して、ＴＦＵの純度を高めることができる方法に関するものである。ＴＦＵは、制癌剤、抗ウイルス剤などの用途で使用されるトリフルオロメチルウリジン類の重要な製造原料である。
【背景技術】
【０００２】
ジヒドロウラシルやジヒドロチミンなどのジヒドロピリミジン類は、各種動物の肝臓や腎臓、植物、あるいは微生物に広く存在するジヒドロピリミジナーゼ（ＥＣ３．５．２．２）によって加水分解されることが知られており研究例も多い。ジヒドロピリミジナーゼは中性から弱アルカリ性領域に至適ｐＨを有しており、多くの場合ｐＨ７からｐＨ１０の範囲で加水分解が行われている。対象となるジヒドロピリミジン類としては５−置換ジヒドロウラシル類以外に、６−置換ジヒドロウラシル類（例えば特許文献１参照）を加水分解する微生物なども知られている。しかしトリフルオロメチル基を有するＤＨＴＦＵを微生物を用いて選択的に分解できるか否かについてはまったく知られていない。
【０００３】
一方、ＴＦＵの製造方法には、ＤＨＴＦＵと臭素を反応させる方法（例えば特許文献２、非特許文献１参照）、ＤＨＴＦＵとハロゲン化第二銅を反応させる方法（例えば特許文献３参照）、ＤＨＴＦＵとアルキルスルホキシドをハロゲンの存在下および酸触媒下に反応させる方法（例えば特許文献４参照）などが知られている。それらの従来技術によるＴＦＵの製造方法においては、合成されたＴＦＵに不純物としてＤＨＴＦＵが混在していることがある。しかしＴＦＵとＤＨＴＦＵは各種溶媒への溶解性などの諸物性が極めて類似しているため、ＴＦＵとＤＨＴＦＵの混合物からＤＨＴＦＵを除去する簡便な方法は知られていない。例えば両者は逆相クロマトグラフィーにより分離が可能であるが、両者の溶出位置が非常に近いため逆相クロマトグラフィーで大量調製を行うのは非常に困難である。
【０００４】
【特許文献１】特開平６−２６１７８７号公報
【特許文献２】特開昭５８−１７４３７１号公報
【特許文献３】特開昭６０−９４９７１号公報
【特許文献４】特開平７−３３７５０号公報
【非特許文献１】Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ  Ｃ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９６４、５５号、（１−５頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、微生物等によりＤＨＴＦＵを選択的に分解する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＤＨＴＦＵに特定の微生物等を接触させることによりＤＨＴＦＵを分解できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、５，６−ジヒドロ−５−トリフルオロメチルウラシルと、微生物の培養物、菌体、または菌体内容物とを、水性媒体中で接触させることを特徴とする、５，６−ジヒドロ−５−トリフルオロメチルウラシルの分解方法である。
【０００８】
本発明において、ＤＨＴＦＵと接触させる微生物の培養物、菌体、または菌体内容物とは、例えば微生物培養後の培地であってもよく、またその中に菌体を含むものであってもよい。また微生物菌体そのものであってもよく、微生物菌体を破砕して得られる内容物であってもよく、更にその内容物を精製したものでもよい。
【０００９】
ＤＨＴＦＵは、例えばメタノール、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、２−ブタノン、４−メチル−２−ペンタノン、シクロヘキサノン、ベンジルアルコール、酢酸エチルなどの溶媒を含んだ溶媒を用いて溶解させることができる。
【００１０】
ＤＨＴＦＵと微生物の培養物、菌体、または菌体内容物とを接触させるときには、水溶性の有機溶媒、例えばジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦという）やジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯという）等を含んだ水性媒体中で行う。水性媒体に用いる水溶性の有機溶媒の濃度は、微生物の酵素がＤＨＴＦＵを分解する活性に影響を及ぼさない濃度であれば特に制限はない。例えばＤＭＦやＤＭＳＯでは０．１％から１０％の範囲の濃度が好ましく用いられる。
【００１１】
ＤＨＴＦＵの溶解度は、水性媒体の温度や水性媒体中の有機溶媒の種類と濃度により変動する。またＤＨＴＦＵは反応開始時には完全に溶解していなくてもよく、ＤＨＴＦＵの分解の進行にともない見かけ上溶解度は上昇していく。そのため水性媒体中のＤＨＴＦＵの濃度はとくに限定しないが、微生物の酵素を効果的に働かせるためにはＤＨＴＦＵが完全に溶解していることが好ましく、０．１％から５０％の範囲で完全に溶解する濃度を採用すればよい。
【００１２】
ＤＨＴＦＵを溶解させる溶媒の濃度の影響が、微生物の培養物、菌体、または菌体内容物に含まれる酵素活性を低下させ、あるいは失活させるものでない限り、ＤＨＴＦＵと水性媒体中で接触させるときの手順はどのようなものであってもよい。例えば微生物の培養物、菌体、または菌体内容物は、適当な緩衝液で懸濁液（あるいは溶液）とし、ＤＨＴＦＵは水性媒体に均一に溶解する有機溶媒で溶液として調製し、その両者を混合すればよい。
【００１３】
微生物の培養物、菌体、または菌体内容物に用いられる微生物は、細菌、放線菌、かび、酵母の中から採用できる。例えば細菌に属するものとしてはアクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アエロバクター属（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラストバスター属（Ｂｌａｓｔｏｂａｃｔｅｒ）、ブルクホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウイニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ゲオバチラス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クレブシーラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロタミノバクター属（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、サルシナ属（Ｓａｒｃｉｎａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）などがあげられる。
【００１４】
また、放線菌に属するものとしてはアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アクチノプラネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）など、かびに属するものとしてはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、パエシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）など、酵母に属するものとしてはキャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）などがある。
【００１５】
これらの中でもアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブラストバスター属（Ｂｌａｓｔｏｂａｃｔｅｒ）、ブルクホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ゲオバチラス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）の細菌が好適に選択され、特にシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ゲオバチラス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の細菌がさらに好ましい。
【００１６】
ｐＨに関しては、微生物の酵素はｐＨが低くなると活性が低下することもあることから、ｐＨ５からｐＨ７の範囲のｐＨが好ましい。
【００１７】
なおＤＨＴＦＵを微生物の培養物、菌体、または菌体内容物と水性媒体中で接触させるとｐＨの低下が観察されることから、水性媒体としては適当な緩衝液を用いることが好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液や酢酸緩衝液が例示できるが、これらに限定されない。また水性媒体のｐＨを適宜調製しながらＤＨＴＦＵの分解をおこなってもよい。ｐＨの調製には炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウムなどの水溶液を用いればよい。
【００１８】
反応温度は使用する微生物の酵素に適した温度を採用すればよく、好ましくは８０℃以下、より好ましくは２０℃〜６０℃の範囲である。
【００１９】
ＤＨＴＦＵの分解の程度は、反応液中のＤＨＴＦＵを逆相クロマトグラフィーで調べればよい。
【００２０】
反応時間は、ＤＨＴＦＵの濃度、微生物や酵素の種類、微生物や酵素の濃度、温度などの反応条件により異なるが、通常数分から数日間である。
【００２１】
本発明は、ＤＨＴＦＵとＴＦＵとが共存する場合にも適用することができ、その中のＤＨＴＦＵを選択的に分解することができる。その結果として、ＴＦＵを効率よく回収することができ、ＴＦＵの精製をすることができる。共存する際のＴＦＵとＤＨＴＦＵの比率に関しては、特に制限はない。
【００２２】
またＤＨＴＦＵを分解したあとの反応溶液は、共存するＴＦＵをより安定に保つために、適当な酸を用いてｐＨを４．５以下にすることが望ましい。用いる酸としては硫酸、塩酸、リン酸、酢酸などが例示できる。
【００２３】
更に反応溶液からＴＦＵを単離する場合は、反応溶液を濃縮したのち、水を加えてＴＦＵを再結晶させればよい。また反応に菌体を用いた場合には遠心分離やフィルターろ過等により予め菌体を除いてから、反応溶液を濃縮したのち水を加えてＴＦＵを再結晶させればよい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、ＤＨＴＦＵを効率よく分解することができる。特にＴＦＵとＤＨＴＦＵとが共存する場合、その中のＤＨＴＦＵを選択的に分解することができ、結果としてＴＦＵを容易に効率よく精製することができる。
【実施例】
【００２５】
以下に、発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例１
シュードモナス・プチダＤＳＭ８４（以下、ＤＳＭ８４という）とシュードモナス・プチダＫＴ２４４０（以下、ＫＴ２４４０という）のそれぞれを２％ペプトン、１％Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％塩化ナトリウムからなるｐＨ７の液体培地２５ｍｌに植菌して温度３０℃で１９時間振とうして培養した。培養物を遠心分離して集菌したのち、菌をイオン交換水で２回洗浄し、さらに０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で２回洗浄してから、菌密度がＯＤ６００ｎｍの吸光度で１０．６になるように同緩衝液を加えて菌懸濁液を調製した。
【００２７】
その菌懸濁液９５０μｌと１８．７％ＴＦＵ／１．３３％ＤＨＴＦＵのＤＭＳＯ溶液（ＴＦＵ率９３．３％）５０μｌを８ｍｌ容栓付試験管に加えて混合後、２０μｌを採取し、その残りを振とうしながら３０℃で反応させ、反応１時間後にも反応液２０μｌを採取した。採取した反応液は０．５％リン酸／３％アセトニトリルの水溶液で直ちに１０倍希釈し、それを遠心分離して得た上清中に存在するＴＦＵとＤＨＴＦＵをＨＰＬＣで分析した。
【００２８】
ＨＰＬＣには、カラムにＯＤＳ−８０Ｔｓ（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ、東ソー（株）製）を用い、カラム温度５０℃、流速１ｍｌ／分、検出は波長２２５ｎｍの吸光度でおこなった。溶離液は試料ロードから５分間は０．１％リン酸／３％アセトニトリルの水溶液、次の１７分間で０．１％リン酸／３％アセトニトリルの水溶液から０．１％リン酸／２０％アセトニトリルの水溶液への直線濃度勾配とした。
【００２９】
分析の結果を表１に示した。反応前のＴＦＵとＤＨＴＦＵのそれぞれの量を１００％としたときの、ＤＳＭ８４とＫＴ２４４０を用いた場合の１７時間反応後のＴＦＵ残存率とＤＨＴＦＵ残存率、および、それぞれのＴＦＵとＤＨＴＦＵの量の和に対するＴＦＵ量の百分率をＴＦＵ率とした。表１からわかるようにＤＳＭ８４とＫＴ２４４０のいずれを用いた場合においても反応前に比べてＴＦＵ率が上がっていた。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
実施例２  
「Ｙｅａｇｅｒ，Ｃ．Ｍ．らＡｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９、６５号（２）、（６３２−６３９頁）」に記載のＢａｓａｌ  Ｓａｌｔｓ  Ｍｅｄｉｕｍに乳酸（２０ｍＭ）を加えた培地１００ｍｌにＫＴ２４４０を植菌して、温度３０℃で２１時間振とうして培養した。培養物を遠心分離して集菌したのち、菌を０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄してから同緩衝液で菌懸濁液を調製した。菌懸濁液の菌密度はＯＤ６００ｎｍの吸光度で２１．４であった。その菌懸濁液（９．４ｍｌ）を超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ２１０Ｍ、（株）クボタ製）を用いて菌を超音波破砕した。菌懸濁液の破砕前のＯＤ６００ｎｍの吸光度値と、破砕後の吸光度値の比較から９７％が破砕されたと見積もられた。その破砕物をマイクロ遠心チューブに分取して１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離してその上清を得た。上清はさらにポアサイズ０．２μｍのフィルターでろ過した。そのろ液５０μｌに１．８７％ＴＦＵ／１．３３％ＤＨＴＦＵ／１０％ＤＭＳＯ／０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）（ＴＦＵ率９３．３％）を５０μｌ加えて、３０℃で１時間反応させた。反応液は０．５％リン酸／３％アセトニトリルの水溶液で直ちに１０倍希釈し、それを遠心分離して得た上清中に存在するＴＦＵとＤＨＴＦＵを実施例１と同様に分析した。
【００３２】
その結果、表２に示したようにＤＨＴＦＵはなくなり、ＴＦＵ率は１００％に上昇した。
【００３３】
【表２】
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【００３４】
実施例３
実施例１と同様にして調製したＫＴ２４４０の懸濁液５ｍｌに１８．７％ＴＦＵ／２１．３％ＤＨＴＦＵのＤＭＳＯ溶液（ＴＦＵ率４６．８％）１２５μｌを加えて撹拌しながら、室温（２５℃から２６℃）で反応を行い、反応の途中に反応液のｐＨ測定とサンプリングをおこなった。サンプリングした反応液は０．５％リン酸／３％アセトニトリルの水溶液で直ちに１０倍希釈し、それを遠心分離して得た上清中に存在するＴＦＵとＤＨＴＦＵをＨＰＬＣで分析した。
【００３５】
その結果、表３に示したように反応時間の経過とともにＴＦＵ率は向上した。しかし反応の経過とともにｐＨが低下し、３時間後においてもＤＨＴＦＵが６１％残存していた。
【００３６】
【表３】
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【００３７】
実施例４
実施例３と同様にして反応と分析を行った。但し、反応中のｐＨが６．６から７．０の間になるように随時２Ｍ  ＮａＯＨで反応液のｐＨを調節した。２Ｍ  ＮａＯＨは１回に５μｌから１５μｌを加え、合計１９５μｌを用いた。
【００３８】
その結果、表４に示したように反応３時間後にはＤＨＴＦＵ残存率は０になった。また、実施例３の結果との比較から反応液のｐＨを調整した効果が認められた。
【００３９】
【表４】
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【００４０】
実施例５
ＫＴ２４４０を実施例１と同様の培地１００ｍｌに植菌して、温度３０℃で１６時間振とうして培養した。培養物を遠心分離して集菌したのち、菌をイオン交換水で３回洗浄してからイオン交換水に菌を懸濁し、その懸濁液と１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を７対３の割合で混合した。その菌懸濁液の菌密度はＯＤ６００ｎｍの吸光度で３９．１であった。その菌懸濁液（７．３ｍｌ）を超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ２１０Ｍ、（株）クボタ製）にかけて菌を超音波破砕した。菌懸濁液の破砕前のＯＤ６００ｎｍの吸光度値と、破砕後の吸光度値の比較から８９％が破砕されたと見積もられた。その破砕物をマイクロ遠心チューブに分取して１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離してその上清を得た。上清はさらにポアサイズ０．２μｍのフィルターでろ過した。そのろ液４．１１ｍｌに同緩衝液０．６４ｍｌと３９．６％ＴＦＵ／９．０６％ＤＨＴＦＵのＤＭＦ溶液（ＴＦＵ率８１．４％）を０．２５ｍｌ加えて、３０℃で振とうしながら２時間反応させた。その反応液に硫酸０．２ｇを加えたのち、遠心分離して上清を回収した。それを減圧濃縮したのちイオン交換水を加えてＴＦＵを晶析させた結果、ＴＦＵ率９８．２７％のＴＦＵ６７．４ｍｇ（ＴＦＵ回収率６７％）を得た。
【００４１】
実施例６
実施例５と同様の反応を、０．３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液の代わりに０．３Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を用いて実施した。その結果、ＴＦＵ率９９．９３％のＴＦＵ７５．０ｍｇ（ＴＦＵ回収率７６％）を得た。
【００４２】
参考例１
２％ＴＦＵ／１０％ＤＭＳＯの水溶液に、同体積の緩衝液を加えて３０℃で反応させた。緩衝液にはｐＨが４．６、５．０、５．５、６．０、６．５、６．８のそれぞれの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、あるいは０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を用いた。
【００４３】
反応開始から４時間後に反応液の一部を採取して０．５％リン酸／３％アセトニトリルの水溶液で１０倍希釈して残存するＴＦＵをＨＰＬＣで分析した。
【００４４】
図１には反応前の試料中のＴＦＵの量を１００％としたときの４時間インキュベート後試料中の残存率を示した。この結果からはｐＨが低いほうがＴＦＵの安定性は高いことがわかる。
【００４５】
参考例２
４０％ＴＦＵのＤＭＦ溶液に、２倍体積の０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０あるいは、ｐＨ６．０あるいは、ｐＨ７．０）を加えて、６０℃あるいは８０℃で反応したのち、反応液の一部を採取して０．５％リン酸／３％アセトニトリルの水溶液で１００倍希釈して残存するＴＦＵをＨＰＬＣで分析した。
【００４６】
図２には反応前の試料中のＴＦＵの量を１００％としたときの１時間反応後試料中の残存率を示した。図中の白丸と黒丸はそれぞれ６０℃と８０℃で反応させたときの結果を示す。この結果からはｐＨ７においては８０℃より６０℃のほうがＴＦＵの安定性が高いことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】参考例１で得られた、ｐＨがＴＦＵの安定性に及ぼす影響を示す図である。
【図２】参考例２で得られた、反応温度とｐＨがＴＦＵの安定性に及ぼす影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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