(57)【要約】【課題】定性のみならず定量性にも優れ、被験者への毒性や負担も少ない非侵襲的なアミロイド蓄積性疾患の診断を実現する。【解決手段】βシート構造をとるアミロイドβ蛋白の検出に使用する装置であって、長波長の光を検体に照射する手段、および該照射により得られる長波長蛍光を分析する手段を有することを特徴とする装置、およびその操作方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
βシート構造をとるアミロイドβ蛋白の検出に使用する装置であって、長波長の光を検体に照射する手段、および該照射により得られる長波長蛍光を分析する手段を有することを特徴とする装置。
【請求項２】
エキサイテーション波長が５００〜６６０ｎｍであり、エミッション波長が７５０ｎｍ〜１０００ｎｍである請求項１記載の装置。
【請求項３】
エキサイテーション波長が５５０〜６１０ｎｍであり、エミッション波長が８２０ｎｍ〜９００ｎｍである請求項１記載の装置。
【請求項４】
該長波長蛍光の分析がβシート構造をとるアミロイドβ蛋白による濃色効果を確認することを含む、請求項１ないし３のいずれか１項記載の装置。
【請求項５】
アミロイド蓄積性疾患を検査するために使用される請求項１ないし４のいずれか１項記載の装置。
【請求項６】
アミロイド蓄積性疾患がアルツハイマー病である請求項５記載の装置。
【請求項７】
βシート構造をとるアミロイドβ蛋白の検出に使用する装置において、長波長の光を検体に照射し、そのことにより得られる長波長蛍光を分析することを特徴とする、該装置の操作方法。
【請求項８】
長波長の光の波長が５００〜６６０ｎｍであり、長波長蛍光の波長が７５０ｎｍ〜１０００ｎｍである請求項７記載の方法。
【請求項９】
長波長の光の波長が５５０〜６１０ｎｍであり、長波長蛍光の波長が８２０ｎｍ〜９００ｎｍである請求項７記載の方法。
【請求項１０】
該長波長蛍光の分析がβシート構造をとるアミロイドβ蛋白による濃色効果を確認することを含む、請求項７ないし９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
アミロイド蓄積性疾患を検査するために使用される請求項７ないし１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
アミロイド蓄積性疾患がアルツハイマー病である請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイド蓄積性疾患の新規診断法、特定の波長を脳に照射することによって得られる特定の波長を指標とするアミロイド蓄積性疾患の診断に関する。より詳細には、本発明は、アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の新規診断に関するものであり、さらに詳細には、５００ナノメーター（ｎｍ）以上の励起光を脳に照射し、得られる７５０ｎｍ以上の蛍光を測定し、脳内のアミロイドβ蛋白の蓄積を定性および定量するとともに、その空間的分布からアミロイド蓄積性疾患を診断するための装置、該装置の操作方法、ならびに該装置を用いたアミロイド蓄積性疾患を診断に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドが蓄積する疾患には、体内の種々の器官や組織への不溶性原線維性蛋白（アミロイド）の沈着を特徴とする種々の疾病があり、アルツハイマー病、プリオン病、ダウン症候群等が含まれる。このうち、アルツハイマー病（ＡＤ）は現在最も治療の困難な疾病の１つとされており、正確な早期診断が望まれている。アルツハイマー病は主として初老期から老年期に起こる進行性の知的機能障害を特徴とする疾患である。病理学的には大脳の全体的な萎縮、神経細胞の著しい変性と脱落、老人斑と神経原線維変化の出現を特徴とする。アルツハイマー病の最大のリスクファクターは加齢であることが知られている。したがって、老齢人ロの増加に伴う患者数の増加は、特に、高齢化社会となっている日本、アメリカ、ヨーロッパ諸国において顕著であり、それに対する医療コストはこれらの国の医療システムを危機におとしめている。
【０００３】
なお、我が国においてはアルツハイマー病患者数は約１００万人と推定され、今後人口の高齢化に伴いその患者数は増大することが確実視されている。アルツハイマー病患者にかかわる費用は介護費用を含めると年間患者１人当たり１００万円から３００万円と考えられていることから、すでに我が国では１兆円から３兆円の社会経済的コストを払っていることになる。アルツハイマー病において症状が顕在化する以前ないしはできるだけ早期に治療を加えることにより、大きな医療経済学的節約効果をもたらすことはいまや世界の常識となっている。
【０００４】
近年、アルツハイマー病においてもワクチンなどの免疫療法およびβセクレターゼ阻害剤またはγセクレターゼ阻害剤に代表される根本治療法が開発されつつある。ワクチンなどの免疫療法関連論文としては非特許文献１〜４などがあり、βおよびγ−セクレターゼ阻害剤関連論文としては非特許文献５〜７などが挙げられる。
【０００５】
このことはできるだけ早期に診断し、これら根本治療を加えることにより、診断時点において発症前でさえあればアルツハイマー病に罹患せずに一生を送れる時代が到来しつつあることを示唆している。
【０００６】
そこで鍵をにぎるのがアルツハイマー病を発症前で検出する方法である。現状のアルツハイマー病診断方法は各種あるが、我が国においては長谷川式、ＡＤＡＳ、ＭＭＳＥ等の、アルツハイマー病が疑われる個体の認知機能の低下を定量的に評価する神経心理学的評価法が一般的であり、まれに画像診断法（ＭＲＩ、ＣＴ等）が補助的に用いられている。
【０００７】
アルツハイマー病においては患者を取り巻く家族または臨床家がこの疾病特有の臨床症状に気づいた時には、脳内病理像はすでに取り返しのつかない状態まで進行していることが知られている。上述のような病状の進行特性および患者数の激増を考え合わせると、アルツハイマー病の正確な早期診断の必要性ならびに意義は極めて大きい。
【０００８】
アルツハイマー病の病理組織像は２つの主徴に代表される。すなわち老人斑および神経原線維変化である。前者の主構成成分はβシート構造をとったアミロイドβ蛋白であり、後者のそれは過剰リン酸化されたタウ蛋白である。アルツハイマー病の確定診断は死後脳においてこれらの病理学的特徴が出現することをよりどころとしている。
【０００９】
ヒトアミロイドβ蛋白には４０個のアミノ酸から構成されるアミロイドβ蛋白１−４０と４２個のアミノ酸から構成されるアミロイドβ蛋白１−４２とがある。アミロイドβ蛋白１−４０とアミロイドβ蛋白１−４０のアミノ酸配列は４０個目までは全く同一であり、アミロイドβ蛋白１−４０にイソロイシン（Ｉｌｅ）およびアラニン（Ａｌａ）が追加されたのがアミロイドβ１−４２である。これらの蛋白のアミノ酸配列を参考までに示す。
【００１０】
ヒトアミロイドβ蛋白１−４０
Asp- Ala- Glu- Phe- Arg- His- Asp- Ser- Gly- Tyr- Glu- Val- His- His- Gln- Lys- Leu- Val- Phe- Phe- Ala- Glu- Asp- Val- Gly- Ser- Asn- Lys- Gly- Ala- Ile- Ile- Gly- Leu- Met- Val- Gly- Gly- Val- Val
【００１１】
ヒトアミロイドβ蛋白１−４２
Asp- Ala- Glu- Phe- Arg- His- Asp- Ser- Gly- Tyr- Glu- Val- His- His- Gln- Lys- Leu- Val- Phe- Phe- Ala- Glu- Asp- Val- Gly- Ser- Asn- Lys- Gly- Ala- Ile- Ile- Gly- Leu- Met- Val- Gly- Gly- Val- Val- Ile- Ala
【００１２】
アミロイドβ蛋白はアルツハイマー病を包含するアミロイドが蓄積する疾患に特徴的であり、密接な関連性を有している。したがって、体内、特に脳内でβシート構造をとったアミロイドβ蛋白をマーカーとして検出することが、アミロイドが蓄積する疾患、特にアルツハイマー病の重要な診断方法の1つとなる。
【００１３】
近年、アルツハイマー病をはじめとするアミロイドが蓄積する疾患の診断を目的として、体内、特に脳内アミロイドβ蛋白に特異的に結合する化合物を［11Ｃ］、［18Ｆ］等の陽電子断層撮影装置（ＰＥＴ）で扱えるような放射性同位体、または［123Ｉ］等のＳＰＥＣＴ扱えるような放射性同位体で標識し、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴで撮影する技術が脚光を浴びている。このような化合物には［18Ｆ］ＤＤＮＰ［非特許文献８］、［11Ｃ］ＰＩＢ［非特許文献９］、［11Ｃ］ＳＢ−１３［非特許文献１０］、［123Ｉ］ＩＭＰＹ[非特許文献１１]などが挙げられる。
【００１４】
また近年、アミロイドβ蛋白に結合し、且つ長波長蛍光を発する化合物を全身投与して脳内アミロイドβ蛋白と化合物の結合を、長波長蛍光測定装置を用いてイン ビボで定量化するとともにその空間的分布からアミロイド蓄積性疾患を診断しようとする試みがある。かかる化合物にはＡＯＩ−９８７［非特許文献１２］、ＮＩＡＤ−４［非特許文献１３］などがある。
【００１５】
一般に長波長の光は生体透過性が高いことが知られているが、６００ｎｍ以下ではヘモグロビンの吸収が、また１０００ｎｍ以上では水の吸収が存在するために、６００から１０００ｎｍの波長を有する化合物に限定される（この６００ｎｍから１０００ｎｍの領域は「生体の分光的窓」と呼ばれている（図１参照）。
しかしながら、定性のみならず定量性にも優れ、被験者への毒性や負担も少ないアミロイド蓄積性疾患の診断方法および装置はこれまで皆無であった。
【非特許文献１】シェンク（Schenk）ら、ネーチャー（Nature）、400巻、173−177ページ、1999年
【非特許文献２】バード（Bard）ら、ネーチャー メデスン（Nature Medcine）、6巻、916−919ページ、2000年
【非特許文献３】ホック（Hock）ら、ネーチャー メデスン（Nature Medcine）8巻、1270−1275ページ、2002年
【非特許文献４】フォックス（Fox）ら、ニューロロジイ（Neurology）、64巻、1563−1572ページ、2005年
【非特許文献５】ジョン（John）ら、ジャーナル オブ メディシナル ケミストリー（Journal of Medicinal Chemistry）、46巻、4625−4630ページ、2003年
【非特許文献６】チアン（Tian）ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、277巻、31499−31505ページ、2002年
【非特許文献７】キムラ（Kimura）ら、バイオオーガニック アンド メディシナル ケミストリー レターズ（Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters）、15巻、211−215ページ、2005
【非特許文献８】ショギ−ジャディド（Shoghi-Jadid）ら、アメリカン ジャーナルオブ ジェリアトリック サイキアトリィ（Am J Geriatr Psychiatry）、10巻、24-35ページ、2002年
【非特許文献９】クルンク（Klunk）ら、アナルス オブ ニューロロジイ（Ann Neurol）、55巻、306-319ページ、2004年
【非特許文献１０】ヴェルホエフ（Verhoeff）ら、アメリカン ジャーナルオブ ジェリアトリック サイキアトリィ（Am J Geriatr Psychiatry）、12巻、584-595ページ、2004年
【非特許文献１１】クング（Kung）ら、ブレイン リサーチ（Brain Research）、956巻、202−210ページ、2002年
【非特許文献１２】ヒンタースタイナー（Hintersteiner）ら、ネイチャー バイオテクノロジイ（Nature Biotechnology）、23巻、577-583、2005年
【非特許文献１３】ネステロフ（Nesterov）ら、Angew Chem int.Ed、44巻2-5、2005年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の解決課題は、定性のみならず定量性にも優れ、被験者への毒性や負担も少ない非侵襲的なアミロイド蓄積性疾患の診断を実現することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、アミロイドβ蛋白に対して長波長の光を照射することによって、長波長蛍光が得られること、しかもこの蛍光はアミロイドβ蛋白がβシート構造をとることによって増強される、すなわち濃色効果が得られることを初めて見いだした。βシート構造をとったアミロイドβ蛋白がアミロイド蓄積性疾患の病理像であることから本発明はアルツハイマー病、ダウン症侯群、プリオン病などの正確な早期診断を可能にするものといえる。
【００１８】
具体的には、脳内アミロイドβ蛋白に長波長の光を照射することよって得られる長波長蛍光を長波長蛍光測定装置を用いて測定し、脳内のアミロイドβ蛋白の蓄積を定性・定量するとともに、その空間的分布からアルツハイマー病、ダウン症、プリオン病等のアミロイド蓄積性疾患を診断する。
【００１９】
したがって、本発明は：
（１）βシート構造をとるアミロイドβ蛋白の検出に使用する装置であって、長波長の光を検体に照射する手段、および該照射により得られる長波長蛍光を分析する手段を有することを特徴とする装置；
（２）エキサイテーション波長が５００〜６６０ｎｍであり、エミッション波長が７５０ｎｍ〜１０００ｎｍである（１）記載の装置；
（３）エキサイテーション波長が５５０〜６１０ｎｍであり、エミッション波長が８２０ｎｍ〜９００ｎｍである（１）記載の装置；
（４）該長波長蛍光の分析がβシート構造をとるアミロイドβ蛋白による濃色効果を確認することを含む、（１）ないし（３）のいずれかに記載の装置；
（５）アミロイド蓄積性疾患を検査するために使用される（１）ないし（４）のいずれかに記載の装置；
（６）アミロイド蓄積性疾患がアルツハイマー病である（５）記載の装置；
（７）βシート構造をとるアミロイドβ蛋白の検出に使用する装置において、長波長の光を検体に照射し、そのことにより得られる長波長蛍光を分析することを特徴とする、該装置の操作方法；
（８）長波長の光の波長が５００〜６６０ｎｍであり、長波長蛍光の波長が７５０ｎｍ〜１０００ｎｍである（７）記載の方法；
（９）長波長の光の波長が５５０〜６１０ｎｍであり、長波長蛍光の波長が８２０ｎｍ〜９００ｎｍである（７）記載の方法；
（１０）該長波長蛍光の分析がβシート構造をとるアミロイドβ蛋白による濃色効果を確認することを含む、（７）ないし（９）のいずれかに記載の方法；
（１１）アミロイド蓄積性疾患を検査するために使用される（７）ないし（１０）のいずれかに記載の方法：
（１２）アミロイド蓄積性疾患がアルツハイマー病である（１１）記載の方法
を提供するものである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明において、定性のみならず定量性にも優れ、被験者への毒性や負担も少ないアミロイド蓄積性疾患の非侵襲的診断が提供される。該診断は、脳内アミロイドβ蛋白に長波長の光を照射することよって得られる長波長蛍光を分析することにより行われる。したがって、本発明によれば、そのための装置、該装置の操作方法、ならびに脳内アミロイドβ蛋白に長波長の光を照射することよって得られる長波長蛍光を測定することを特徴とする、アミロイド蓄積性疾患の診断方法も提供される。本発明によれば、アルツハイマー病、ダウン症侯群、プリオン病などのアミロイド蓄積性疾患の、正確でしかも被験者に対する負担の少ない検査・早期診断が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明者らはアルツハイマー病診断法に関して、永年研究を重ねてきた結果、アルツハイマー病の病理像としてのアミロイドβ蛋白は、長波長の光で励起することによって長波長蛍光を発すること、さらにアミロイドβ蛋白はβシート構造をとることによって蛍光強度が飛躍的に増加すること、すなわちβシート構造をとるアミロイドβ蛋白は濃色効果（hyperchromic effect）を示すことを見いだした。アルツハイマー病の病理像としてのアミロイドβ蛋白はβシート構造をとっていることから、イン ビボにおいて長波長の光を検体、例えばヒトの脳に照射し、これを長波長蛍光測定装置で測定して、βシート構造をとるアミロイドβ蛋白を定量するとともにそれらの空間分布を測定することにより、アルツハイマー病を検査・診断することが可能となる。アミロイドβ蛋白の濃色効果は実際のイン ビボでの検査・診断においては、非病理像であるβシート構造をとらないアミロイドβ蛋白に関してはほとんど無視できることから、本発明によりβシートに対して非常に特異性の高い検査・診断が可能になる。
【００２２】
本発明は、１の態様において、βシート構造をとるアミロイドβ蛋白の検出に使用する装置であって、長波長の光を検体に照射する手段、および該照射により得られる長波長蛍光を分析する手段を有することを特徴とする装置に関するものである。本明細書において、「長波長の光」とは検体に照射される光を意味し、その波長をエキサイテーション波長（Ex.波長）ということがある。また本明細書において「長波長蛍光」とは長波長の光を検体に照射した際に検体から発せられる蛍光を意味し、その波長をエミッション波長（Em.波長）ということがある。
【００２３】
検体はいずれの形態であってもよく、例えば、生検体、死検体、生体から取り出した試料等が挙げられる。すなわち、本発明の装置を用いる検出はインビボおよびインビトロいずれも様式であってもよい。検体はいずれの哺乳動物種、あるいはそれに由来するものであってもよいが、好ましくは霊長類、さらに好ましくはヒト、あるいはそれに由来するものである。例えば、生きたヒト被験者の脳に対して本発明の装置を適用してβシート構造をとるアミロイドβ蛋白の検出を行うことができる。
【００２４】
長波長の光を発生させる手段はいずれのものであってもよく、例えば、可視〜赤外光を発生するランプ、特定の波長を照射するための分光系等の手段を使用してもよい。一般的には、該装置から照射される長波長の光の波長（本明細書において「エキサイテーション波長」、「励起波長」または「Ｅｘ．波長」と称することがある）は約５００〜約６６０ｎｍである。発生させた長波長の光を効率よく検体に照射するためのフォーカシング手段、例えば、レンズ、スリット等の公知手段を用いてもよい。該装置から照射される長波長の光の強度や照射時間についても、検体の種類や状態により適宜変更することができる。
【００２５】
検体から生じる長波長蛍光を分析する手段もいずれのものであってもよい。長波長蛍光の分析は、長波長蛍光を検出すること、その強度、ピーク波長を測定すること等を包含する。長波長蛍光を分析する手段として、例えば、励起系としては該励起波長領域に特性を有する半導体レーザー照射装置、該励起波長領域に特性を有するフィルターと組み合わせた水銀またはキセノンランプ照射装置等を搭載し、測定系としては該測定長波長蛍光領域に高い量子収率（Quantum Efficiency）を有する光電子倍増管（フォトマルチプライヤーチューブ）、または該測定長波長蛍光領域に高い量子収率を有するＣＣＤカメラを搭載した画像撮影装置等を使用することができる。一般的には、該装置から照射されるエキサイテーション波長は約５００〜約６６０ｎｍであり、その場合、検体から発せられる長波長蛍光の波長（本明細書において「エミッション波長」または「Ｅｍ．波長」と称することがある）は約７５０ｎｍ〜約１０００ｎｍであるので、その範囲をカバーしうる分析手段を用いて分析を行うことができる。このように、エキサイテーション波長とエミッション波長とが離れていて重複することがないので、長波長蛍光の検出が容易に行える。
【００２６】
さらに本発明の装置は、長波長の光を検体に照射する手段および該照射により得られる長波長蛍光を分析する手段が他の手段と連結されている、いわゆるシステムの形態であってもよい。例えば、被験者を固定する手段、長波長蛍光の分析結果（例えば、そのピーク波長、強度等のデータ）を処理し、画像化する手段、あるいは処理データを印刷する手段等が連結されていてもよい。これらの手段は１つにまとめられていてもよく、いくつかのブロックに分けられていてもよい。
【００２７】
上述のごとく、一般的には、エキサイテーション波長は５００〜６６０ｎｍであり、エミッション波長は７５０ｎｍ〜１０００ｎｍであるが、好ましくは、エキサイテーション波長は５５０〜６１０ｎｍであり、エミッション波長は８２０ｎｍ〜９００ｎｍあるいはそれ以上、例えば、８２０ｎｍ〜９５０ｎｍである。
【００２８】
本発明の装置では複数波長の長波長の光で励起し、得られる複数波長の長波長蛍光を分析することを除外するものではない。
【００２９】
上述のごとく、アミロイドβ蛋白はβ構造をとることによって蛍光強度が飛躍的に増加すること、すなわち濃色効果を示すことが本発明者により明らかにされている。したがって、本発明の装置を用いる際に、βシートをとっていないアミロイドβ蛋白を対照とし、発生する長波長蛍光の濃色効果を確認することが好ましい。本発明の装置を用いて濃色効果が確認されれば、β構造をとったアミロイドβ蛋白が検体中に存在することが確認できる。濃色効果の確認は、検体と対照（βシート構造をとっていないアミロイドβ蛋白）を試料として用いて得られる長波長蛍光の強度を比較することにより行うことができる。例えば、検体と対照（βシート構造をとっていないアミロイドβ蛋白）を試料として用いて実施例に示すような等高線図や波長対強度のグラフを描き、比較することにより、濃色効果を確認することができる。β構造をとったアミロイドβ蛋白の身体、特に脳における蓄積は、アルツハイマー病、ダウン症侯群、プリオン病などのアミロイド蓄積性疾患を引き起こすので、本発明の装置はこれらの疾患の検査または診断に非常に有用である。本発明の装置は、特にアルツハイマー病の検査または診断に好適である。ヒトの診断に本発明の装置を用いた場合、検査時間は約５分〜約３０分であり非常に短くてすむ。さらに上述のごとく本発明の装置を用いるとβシート構造をとったアミロイド蛋白を特異的に検出することができ、検査の精度も非常に高い。
【００３０】
もう１つの態様において、本発明は、βシート構造をとるアミロイドβ蛋白の検出に使用する装置において、長波長の光を検体に照射し、そのことにより得られる長波長蛍光を分析することを特徴とする、該装置の操作方法に関するものである。本発明の操作方法に使用される装置には、βシート構造をとるアミロイドβ蛋白の検出に使用する装置であって、長波長の光を検体に照射する手段、および該照射により得られる長波長蛍光を分析する手段を有するものであればいずれのものであってもよい。好ましくは、上で説明した装置を用いる。かかる装置の詳細については上で説明したとおりであり、長波長の光および長波長蛍光についても上で説明したとおりである。検体についても同様である。本発明の操作方法を用いて、アルツハイマー病、ダウン症侯群、プリオン病などのアミロイド蓄積性疾患の検査・診断を行うことができる。本発明の操作方法は、アルツハイマー病の検査または診断に好適である。ヒト被験者に対して本発明の操作方法を用いた場合、検査時間は約５分〜約３０分であり非常に短くてすむ。さらに上述のごとく本発明の操作方法を用いるとβシート構造をとったアミロイド蛋白を特異的に検出することができ、検査の精度も非常に高い。
【００３１】
さらにもう１つの態様において、本発明は、脳内アミロイドβ蛋白に長波長の光を照射することよって生じる長波長蛍光を分析することを特徴とする、アミロイド蓄積性疾患の診断方法に関するものである。診断は、βシート構造をとるアミロイドβ蛋白に特有の濃色効果をよりどころとして行われる。したがって、本発明の診断方法を用いる際に、βシートをとっていないアミロイドβ蛋白を対照とし、発生する長波長蛍光の濃色効果を確認することが好ましい。本発明の診断方法に使用される装置には、βシート構造をとるアミロイドβ蛋白の検出に使用する装置であって、長波長の光を検体に照射する手段、および該照射により得られる長波長蛍光を分析する手段を有するものであればいずれのものであってもよい。好ましくは、上で説明した装置を用いる。かかる装置の詳細については上で説明したとおりであり、長波長の光および長波長蛍光についても上で説明したとおりである。検体についても同様である。好ましくは、上で説明した装置を上で説明した記操作方法に従って操作することにより、本発明の診断方法を実施する。本発明の診断方法を用いて、アルツハイマー病、ダウン症侯群、プリオン病などのアミロイド蓄積性疾患の診断を行うことができる。本発明の診断方法は、アルツハイマー病の診断に好適である。ヒト被験者に本発明の診断方法を用いた場合、診断時間は約５分〜約３０分であり非常に短くてすむ。被験者に対しても非侵襲的な方法なので、負担が少なくてすむ。さらに本発明の診断方法はβシート構造をとったアミロイド蛋白を特異的に検出することができるので、診断の精度も非常に高く、アミロイド蓄積性疾患の早期診断も可能である。
【００３２】
以下に、実施例に使用した主な実験方法を説明する。それ以外の実験方法についても、当業者であれば適宜選択して用いることができる。
【００３３】
測定方法
（Ａ）βシート構造をとらないアミロイドβ蛋白を用いた検討
ヒトアミロイドβ蛋白１−４０（ペプチド研究所４３０７−ｖ）およびヒトアミロイドβ蛋白１−４２（ペプチド研究所４３４９−ｖ）は５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で５μＭの濃度に溶解して、直ちに蛍光分光光度計（日本分光ＦＰ−６３００−ＷＲＥ−３６２）にてエキサイテーションおよびエミッション波長を以下の通り測定した。
１）アミロイドβ蛋白１−４０およびアミロイドβ蛋白１−４２の３次元蛍光スペクトル（等高線図）
２）５５０から６１０ｎｍのエキサイテーション波長によって得られるアミロイドβ蛋白１−４０の蛍光スペクトル
３）５５０から６１０ｎｍのエキサイテーション波長によって得られるアミロイドβ蛋白１−４２の蛍光スペクトル
【００３４】
（Ｂ）βシート構造をとったアミロイドβ蛋白を用いた検討
ヒトアミロイドβ蛋白１−４０（ペプチド研究所４３０７−ｖ）およびヒトアミロイドβ蛋白１−４２（ペプチド研究所４３４９−ｖ）は５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で２０μＭの濃度に溶解して、ダブルシェーカー（ＴＡＩＴＥＣ  ＮＲ−３）を用いて８５回転／分で攪拌し、それぞれ４日間および２日間３７℃でインキュベートして、両蛋白にβシート構造をとらせた。インキュベートしたアミロイドβ蛋白１−４０およびアミロイドβ蛋白１−４２を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で５μＭに希釈し、蛍光分光光度計（日本分光ＦＰ−６３００−ＷＲＥ−３６２）にてエキサイテーションおよびエミッション波長を以下の通り測定した。
１）アミロイドβ蛋白１−４０およびアミロイドβ蛋白１−４２の３次元蛍光スペクトル（等高線図）
２）５５０から６１０ｎｍのエキサイテーション波長によって得られるアミロイドβ蛋白１−４０の蛍光スペクトル
３）アミロイドβ蛋白１−４０の濃色効果
４）５５０から６１０ｎｍのエキサイテーション波長によって得られるアミロイドβ蛋白１−４２の蛍光スペクトル
５）アミロイドβ蛋白１−４２の濃色効果
【００３５】
（Ｃ）陽性対照化合物クレシル バイオレット アセテートの蛍光スペクトル
クレシル バイオレット アセテート（Cresyl Violet actate; Sigma-Aldrich C1791）はメチルアルコールを用いて０．０１μＭの濃度に溶解して蛍光分光光度計（日本分光ＦＰ−６３００−ＷＲＥ−３６２）にてエキサイテーションおよびエミッション波長を以下の通り測定した。
１）３次元蛍光スペクトル（等高線図）およびエキサイテーション波長を５９８ｎｍに固定した際の蛍光スペクトル
【００３６】
以下に実験例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は単なる説明であって、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００３７】
βシート構造をとらないアミロイドβ蛋白を用いた検討
１）アミロイドβ蛋白１−４０およびアミロイドβ蛋白１−４２の３次元蛍光スペクトル（等高線図）
図２−ａに５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、図２−ｂに５μＭアミロイドβ蛋白１−４０、図２−ｃに５μＭアミロイドβ蛋白１−４２の、それぞれ３次元蛍光スペクトル（等高線図）を示した。図２の縦軸はエキサイテーション波長（Ex.波長）を、また横軸はエミッション波長（Em.波長）をいずれもナノメーター（ｎｍ）で示した。
５μＭのアミロイドβ蛋白１−４０および同濃度のアミロイドβ蛋白１−４２により、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液には見られなかった新たな等高線図が得られた（破線の楕円で示した部分）。
【００３８】
２）５５０から６１０ｎｍのエキサイテーション波長によって得られるアミロイドβ蛋白１−４０の蛍光スペクトル
アミロイドβ蛋白１−４０の３次元蛍光スペクトル解析の結果、緩衝液には見られなかった新たな等高線図が認められたことから、エキサイテーション波長を動かして更なる詳細な解析をおこなった。
図３−ａから図３−ｅにエキサイテーション波長を５５０ｎｍから６１０ｎｍまで動かした際の５μＭアミロイドβ蛋白１−４０の蛍光スペクトルを示した。図３の縦軸は蛍光強度（int.）を、また横軸はエミッション波長をナノメーター（ｎｍ）で示した。図３中の２本の曲線の内、上の曲線はアミロイドβ蛋白１−４０のスペクトルを、下の曲線は緩衝液のスペクトルを示す。
表１に各エキサイテーション波長で励起した際の最適エミッション波長（最も強い蛍光強度が得られた波長）、最適エミッション波長でのアミロイドβ蛋白１−４０および緩衝液の蛍光強度、アミロイドβ蛋白１−４０の真の蛍光強度を示した。
図３および表１に示したように５５０から６１０ｎｍのエキサイテーション波長では８２０から９００ｎｍに最適波長が見られ、それらの真の蛍光強度は概ね１０から１５の範囲内であった。
測定機器の性能上、９００ｎｍ以上のエミッション波長の蛍光強度は測定できなかったが、図２−ｂ（等高線図）の破線で示したように、また図３−ａから図３−ｅの最適エミッション波長のピークの推移からみて、６１０ｎｍ以上の波長のエキサイテーションによって、９００ｎｍ以上にピークをもつエミッション波長の存在が強く示唆された。
【表１】
2007127592.tif 000002
アミロイドβ蛋白１−４０の真の蛍光強度＝
（アミロイドβ蛋白１−４０の見かけの蛍光強度）−（緩衝液の蛍光強度）
【００３９】
３）５５０から６１０ｎｍのエキサイテーション波長によって得られるアミロイドβ蛋白１−４２の蛍光スペクトル
アミロイドβ蛋白１−４２の３次元蛍光スペクトル解析の結果、緩衝液には見られなかった新たな等高線図が認められたことから、エキサイテーション波長を動かして更なる詳細な解析をおこなった。
図４−ａから図４−ｅにエキサイテーション波長を５５０ｎｍから６１０ｎｍまで動かした際の５μＭアミロイドβ蛋白１−４２の蛍光スペクトルを示した。図４の縦軸は蛍光強度（int.）を、また横軸はエミッション波長をナノメーター（ｎｍ）で示した。図４中の２本の曲線の内、上の曲線はアミロイドβ蛋白１−４２のスペクトルを、下の曲線は緩衝液のスペクトルを示す。
表１に各エキサイテーション波長で励起した際の最適エミッション波長（最も強い蛍光強度が得られた波長）、最適エミッション波長でのアミロイドβ蛋白１−４２および緩衝液の蛍光強度、アミロイドβ蛋白１−４０の真の蛍光強度を示した。
図４および表２に示したように５５０から６１０ｎｍのエキサイテーション波長では８２０から９００ｎｍに最適波長が見られ、それらの真の蛍光強度は概ね１５から３０の範囲内であった。
測定機器の性能上、９００ｎｍ以上のエミッション波長の蛍光強度は測定できなかったが、図２−ｃ（等高線図）の破線で示したように、また図４−ａから図４−ｅの最適エミッション波長のピークの推移からみて、６１０ｎｍ以上の波長のエキサイテーションによって、９００ｎｍ以上にピークをもつエミッション波長の存在が強く示唆された。
【表２】
2007127592.tif 000003
アミロイドβ蛋白１−４２の真の蛍光強度＝
（アミロイドβ蛋白１−４２の見かけの蛍光強度）−（緩衝液の蛍光強度）
【実施例２】
【００４０】
βシート構造をとったアミロイドβ蛋白を用いた検討
１）アミロイドβ蛋白１−４０およびアミロイドβ蛋白１−４２の３次元蛍光スペクトル（等高線図）
図５−ａに５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、図５−ｂに５μＭアミロイドβ蛋白１−４０、図５−ｃに５μＭアミロイドβ蛋白１−４２の、それぞれ３次元蛍光スペクトル（等高線図）を示した。図５の縦軸はエキサイテーション波長（Ex.波長）を、また横軸はエミッション波長（Em.波長）をいずれもナノメーター（ｎｍ）で示した。
５μＭのアミロイドβ蛋白１−４０および同濃度のアミロイドβ蛋白１−４２により、βシート構造をとらないアミロイドβ蛋白１−４０または１−４２を用いた検討と同様、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液には見られなかった新たな等高線図が、ほぼ同じ座標位置で得られたが、βシート構造をとらない両蛋白の等高線に比較して、βシート構造をとった両蛋白の等高線の方が明らかに蜜であった（破線の楕円で示した部分）。
このことはアミロイドβ蛋白１−４０および１−４２は、βシート構造をとることによって蛍光強度が増強されることを示している。このような現象は一般に濃色効果（Hyperchromic effct）と呼ばれている。
【００４１】
２）５５０から６９０ｎｍのエキサイテーション波長によって得られるアミロイドβ蛋白１−４０の蛍光スペクトル
３次元蛍光スペクトル解析の結果、βシート構造をとることによってアミロイドβ蛋白１−４０に濃色効果が認められたことから、エキサイテーション波長を動かして更なる詳細な解析をおこなった。
図６−ａから図６−ｅにエキサイテーション波長を５５０ｎｍから６１０ｎｍまで動かした際の５μＭアミロイドβ蛋白１−４０蛍光スペクトルを示した。図６の縦軸は蛍光強度（int.）を、また横軸はエミッション波長をナノメーター（ｎｍ）で示した。図６中の２本の曲線の内、上の曲線はアミロイドβ蛋白１−４０のスペクトルを、下の曲線は緩衝液のスペクトルを示す。
表３に各エキサイテーション波長で励起した際の最適エミッション波長（最も強い蛍光強度が得られた波長）、最適エミッション波長でのアミロイドβ蛋白１−４０および緩衝液の蛍光強度、アミロイドβ蛋白１−４０の真の蛍光強度を示した。
図６および表３に示したように５５０から６１０ｎｍのエキサイテーション波長では８２０から９００ｎｍに最適波長が見られ、それらの真の蛍光強度は概ね１７０から３５０の範囲内であった。
測定機器の性能上、９００ｎｍ以上のエミッション波長の蛍光強度は測定できなかったが、図５−ｂ（等高線図）の破線で示したように、また図６−ａから図６−ｅの最適エミッショヨン波長のピークの推移からみて、βシート構造をとったアミロイドβ蛋白１−４２は、６１０ｎｍ以上の波長のエキサイテーションによって、９００ｎｍ以上にピークをもち、しかもかなり蛍光強度の強いエミッションを生じることが強く示唆された。
【表３】
2007127592.tif 000004
アミロイドβ蛋白１−４０の真の蛍光強度＝
（アミロイドβ蛋白１−４０の見かけの蛍光強度）−（緩衝液の蛍光強度）
【００４２】
３）アミロイドβ蛋白１−４０の濃色効果
図７−ａから図７−ｅにエキサイテーション波長を５５０ｎｍから６１０ｎｍまで動かした際の５μＭアミロイドβ蛋白１−４０の濃色効果を示した。図７中の２本の曲線の内、上の曲線はβシート構造をとったアミロイドβ蛋白１−４０のスペクトルを、下の曲線はβシート構造をとらないアミロイドβ蛋白１−４０スペクトルを示す。
図７および表４に示したように５５０から６１０ｎｍのエキサイテーション波長におけるβシート構造をとったアミロイドβ蛋白１−４０の濃色効果は概ね１６５から３３５の範囲内であった。
【表４】
2007127592.tif 000005
濃色効果＝（βシート構造をとったアミロイドβ蛋白1-40の真の蛍光強度）
−（βシート構造をとらないアミロイドβ蛋白1-40の真の蛍光強度）
【００４３】
４）５５０から６１０ｎｍのエキサイテーション波長によって得られるアミロイドβ蛋白１−４２の蛍光スペクトル
３次元蛍光スペクトル解析の結果、βシート構造をとることによってアミロイドβ蛋白１−４２に濃色効果が認められたことから、エキサイテーション波長を動かして更なる詳細な解析をおこなった。
図８−ａから図８−ｅにエキサイテーション波長を５５０ｎｍから６１０ｎｍまで動かした際の５μＭ  アミロイドβ蛋白１−４２の蛍光スペクトルを示した。図７の縦軸は蛍光強度（int.）を、また横軸はエミッション波長をナノメーター（ｎｍ）で示した。図８中の２本の曲線の内、上の曲線はアミロイドβ蛋白１−４２のスペクトルを、下の曲線は緩衝液のスペクトルを示す。
表５に各エキサイテーション波長で励起した際の最適（最も強い蛍光強度が得られた）エミッション波長および蛍光強度を示した。
図８および表５に示したように５５０から６１０ｎｍのエキサイテーション波長では８２０から９００ｎｍに最適波長が見られ、それらの真の蛍光強度は概ね２９０から５５０の範囲内であった。
測定機器の性能上、９００ｎｍ以上のエミッション波長の蛍光強度は測定できなかったが、図５−ｃ（等高線図）の破線で示したように、また図８−ａから図８−ｅの最適エミッション波長のピークの推移からみて、βシート構造をとったアミロイドβ蛋白１−４２は、６１０ｎｍ以上の波長のエキサイテーションによって、９００ｎｍ以上にピークをもち、しかもかなり蛍光強度の強いエミッションを生じることが強く示唆された。
【表５】
2007127592.tif 000006
アミロイドβ蛋白１−４２の真の蛍光強度＝
（アミロイドβ蛋白１−４２の見かけの蛍光強度）−（緩衝液の蛍光強度）
【００４４】
５）アミロイドβ蛋白１−４２の濃色効果
図９−ａから図９−ｅにエキサイテーション波長を５５０ｎｍから６１０ｎｍまで動かした際の５μＭアミロイドβ蛋白１−４２の濃色効果を示した。図９中の２本の曲線の内、上の曲線はβシート構造をとったアミロイドβ蛋白１−４０のスペクトルを、下の曲線はβシート構造をとらないアミロイドβ蛋白１−４０スペクトルを示す。
図９および表５に示したように５５０から６１０ｎｍのエキサイテーション波長におけるβシート構造をとったアミロイドβ蛋白１−４２の濃色効果は概ね２７０から５２０の範囲内であった。
【表６】
2007127592.tif 000007
濃色効果＝（βシート構造をとったアミロイドβ蛋白１−４２の真の蛍光強度）
−（βシート構造をとらないアミロイドβ蛋白１−４２の真の蛍光強度）
【００４５】
６）陽性対照化合物クレシルバイオレットアセテートの３次元蛍光スペクトル（等高線図）およびエキサイテーション波長を５９８ｎｍに固定した際の蛍光スペクトル
図１０−ａに０．０１μＭクレシルバイオレットアセテート３次元蛍光スペクトル（等高線図）を示した。図１０−ａの縦軸はエキサイテーション波長（Ex.波長）を、また横軸はエミッション波長（Em.波長）をいずれもナノメーター（ｎｍ）で示した。
３次元解析の結果、クレシルバイオレットアセテートの最適エキサイテーション波長は５９８ｎｍであった。
図１０−ｂにエキサイテーション波長を５９８ｎｍに固定した際の０．０１μＭクレシルバイオレットアセテートの蛍光スペクトルを示した。
エキサイテーション波長５９８ｎｍにおける０．０１μＭクレシルバイオレットアセテートの最適エキサイテーション波長は６２１．５ｎｍ、蛍光強度は６３４．９０２であった。
【表７】
2007127592.tif 000008
真の蛍光強度＝（クレシルバイレットの蛍光強度）−（メチルアルコールの蛍光強度）
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、アミロイド蓄積性疾患の研究分野、特にそのための診断装置の製造分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は生体の光吸収の概要を示す図である。
【図２】図２−ａは５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、図２−ｂは５μＭアミロイドβ蛋白１−４０（βシート構造をとっていない）、図２−ｃは５μＭアミロイドβ蛋白１−４２（βシート構造をとっていない）の、それぞれ３次元蛍光スペクトル（等高線図）を示す。縦軸はエキサイテーション波長（Ex.波長）を、また横軸はエミッション波長（Em.波長）をいずれもナノメーター（nm）で示す。図２−ｂおよび図２−ｃ中の破線の楕円で示した部分は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（図２−ａ）では見られなかった新たな等高線を示す。
【図３】図３−ａから図３−ｅは、それぞれ、エキサイテーション波長を５５０ｎｍ、５７０ｎｍ、５９０ｎｍ、６００ｎｍ、および６１０ｎｍとした際の５μＭアミロイドβ蛋白１−４０（βシート構造をとっていない）の蛍光スペクトルを示す。縦軸は蛍光強度（int.）を、また横軸はエミッション波長をナノメーター（nm）で示す。図３中の２本の曲線の内、上の曲線はアミロイドβ蛋白１−４０（βシート構造をとっていない）のスペクトルを、下の曲線は緩衝液のスペクトルを示す。
【図４】図４−ａから図４−ｅは、それぞれ、エキサイテーション波長を５５０ｎｍ、５７０ｎｍ、５９０ｎｍ、６００ｎｍ、および６１０ｎｍとした際の５μＭアミロイドβ蛋白１−４２（βシート構造をとっていない）の蛍光スペクトルを示す。縦軸は蛍光強度（int.）を、また横軸はエミッション波長をナノメーター（nm）で示す。図４中の２本の曲線の内、上の曲線はアミロイドβ蛋白１−４２（βシート構造をとっていない）のスペクトルを、下の曲線は緩衝液のスペクトルを示す。
【図５】図５−ａは５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、図５−ｂは５μＭアミロイドβ蛋白１−４０（βシート構造をとっている）、図５−ｃは５μＭアミロイドβ蛋白１−４２（βシート構造をとっている）の、それぞれ３次元蛍光スペクトル（等高線図）を示す。縦軸はエキサイテーション波長（Ex.波長）を、また横軸はエミッション波長（Em.波長）をいずれもナノメーター（nm）で示す。図５−ｂおよび図５−ｃ中の破線の楕円で示した部分は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（図５−ａ）では見られなかった新たな等高線を示す。
【図６】図６−ａから図６−ｅは、それぞれ、エキサイテーション波長を５５０ｎｍ、５７０ｎｍ、５９０ｎｍ、６００ｎｍ、および６１０ｎｍとした際の５μＭアミロイドβ蛋白１−４０（βシート構造をとっている）の蛍光スペクトルを示す。縦軸は蛍光強度（int.）を、また横軸はエミッション波長をナノメーター（nm）で示す。図６中の２本の曲線の内、上の曲線はアミロイドβ蛋白１−４０（βシート構造をとっている）のスペクトルを、下の曲線は緩衝液のスペクトルを示す。
【図７】図７−ａから図７−ｅは、エキサイテーション波長を５５０ｎｍ、５７０ｎｍ、５９０ｎｍ、６００ｎｍ、および６１０ｎｍとした際の５μＭアミロイドβ蛋白１−４０の濃色効果を示した。図７中の２本の曲線の内、上の曲線はβシート構造をとったアミロイドβ蛋白１−４０のスペクトルを、下の曲線はβシート構造をとらないアミロイドβ蛋白１−４０スペクトルを示す。
【図８】図８−ａから図８−ｅは、それぞれ、エキサイテーション波長を５５０ｎｍ、５７０ｎｍ、５９０ｎｍ、６００ｎｍ、および６１０ｎｍとした際の５μＭアミロイドβ蛋白１−４２（βシート構造をとっている）の蛍光スペクトルを示す。縦軸は蛍光強度（int.）を、また横軸はエミッション波長をナノメーター（nm）で示す。図６中の２本の曲線の内、上の曲線はアミロイドβ蛋白１−４２（βシート構造をとっている）のスペクトルを、下の曲線は緩衝液のスペクトルを示す。
【図９】図９−ａから図９−ｅは、エキサイテーション波長を５５０ｎｍ、５７０ｎｍ、５９０ｎｍ、６００ｎｍ、および６１０ｎｍとした際の５μＭアミロイドβ蛋白１−４２の濃色効果を示した。図７中の２本の曲線の内、上の曲線はβシート構造をとったアミロイドβ蛋白１−４２のスペクトルを、下の曲線はβシート構造をとらないアミロイドβ蛋白１−４２のスペクトルを示す。
【図１０】図１０−ａは０．０１μＭクレシルバイオレットアセテート３次元蛍光スペクトル（等高線図）を示す。図１０−ａの縦軸はエキサイテーション波長（Ex.波長）を、また横軸はエミッション波長（Em.波長）をいずれもナノメーター（nm）で示す。図１０−ｂはエキサイテーション波長を５９８ｎｍに固定した際の０．０１μＭクレシルバイオレットアセテートの蛍光スペクトルを示す。
【図１】
2007127592.tif 000009
【図２】
2007127592.tif 000010
【図３−ａ】
2007127592.tif 000011
【図３−ｂ】
2007127592.tif 000012
【図３−ｃ】
2007127592.tif 000013
【図３−ｄ】
2007127592.tif 000014
【図３−ｅ】
2007127592.tif 000015
【図４−ａ】
2007127592.tif 000016
【図４−ｂ】
2007127592.tif 000017
【図４−ｃ】
2007127592.tif 000018
【図４−ｄ】
2007127592.tif 000019
【図４−ｅ】
2007127592.tif 000020
【図５】
2007127592.tif 000021
【図６−ａ】
2007127592.tif 000022
【図６−ｂ】
2007127592.tif 000023
【図６−ｃ】
2007127592.tif 000024
【図６−ｄ】
2007127592.tif 000025
【図６−ｅ】
2007127592.tif 000026
【図７−ａ】
2007127592.tif 000027
【図７−ｂ】
2007127592.tif 000028
【図７−ｃ】
2007127592.tif 000029
【図７−ｄ】
2007127592.tif 000030
【図７−ｅ】
2007127592.tif 000031
【図８−ａ】
2007127592.tif 000032
【図８−ｂ】
2007127592.tif 000033
【図８−ｃ】
2007127592.tif 000034
【図８−ｄ】
2007127592.tif 000035
【図８−ｅ】
2007127592.tif 000036
【図９−ａ】
2007127592.tif 000037
【図９−ｂ】
2007127592.tif 000038
【図９−ｃ】
2007127592.tif 000039
【図９−ｄ】
2007127592.tif 000040
【図９−ｅ】
2007127592.tif 000041
【図１０】
2007127592.tif 000042