(57)【要約】【課題】担体上に異なるプローブを固定したプローブ担体を製造する際に、担体上に形成されたスポットにおけるプローブの濃度を、簡便な操作で効率良く判定できるプローブ担体の製造装置及び製造方法を提供することにある。【解決手段】担体上に形成された液滴スポットの状態を測定し、これを既知のデータと対比して、液滴スポットでのプローブの有無やその濃度などのプローブの状態を簡便に判定することが可能となる。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを担体に固定したプローブ担体の製造装置において、
担体を保持する担体保持手段と、
担体保持手段に保持された担体の所定位置にプローブ溶液を付与して液滴スポットを形成するためのプローブ溶液付与手段と、
前記担体上の液滴スポットの状態を測定するための測定手段と、
前記液滴スポット測定手段で測定された液滴スポットの状態に基づいて、該液滴スポットを形成するプローブ溶液の状態を判定する判定手段と、
を有することを特徴とするプローブ担体の製造装置。
【請求項２】
前記測定手段は、前記液滴スポットの前記担体表面との接触領域の占める面積及び径、並びに前記液滴スポットの前記担体表面に対する接触角の少なくとも１つを測定する物性測定手段を有し、前記判定手段は、該物性測定手段から得られた情報を予め用意された情報と対比して前記液滴スポットを形成するプローブ溶液のプローブ濃度を判定する対比判定手段を有する請求項１に記載の製造装置。
【請求項３】
前記測定手段は、前記液滴スポットの前記担体表面との接触領域の占める面積及び径、並びに前記液滴スポットの前記担体表面に対する接触角の少なくとも１つを測定する物性測定手段を有し、前記判定手段は、該物性測定手段から得られた情報を予め用意された情報と対比して前記液滴スポットを形成するプローブ溶液中のプローブの有無を判定する対比判定手段を有する請求項１に記載の製造装置。
【請求項４】
前記プローブ溶液付与手段は、インクジェット法による液体付与手段を有する請求項１〜３のいずれかに記載の製造装置。
【請求項５】
前記プローブ溶液付与手段は、前記プローブ溶液を保持する貯蔵部と、該貯蔵部の液面に接触可能に設けられ、該液面への接触により該プローブ溶液の所定量を分取可能であるピンと、該ピンの先端を前記担体表面に物理的に接触させて、該ピンの先端に付着させた溶液を該担体表面に転写供給するためのピン位置制御手段と、を有する請求項１〜３のいずれかに記載の製造装置。
【請求項６】
前記プローブ溶液付与手段は、前記プローブ溶液を保持する貯蔵部と、該貯蔵部の液面に接触可能に設けられ、該液面への接触により該プローブ溶液の所定量を分取可能である毛細管と、該毛細管の先端を前記担体表面に物理的に接触させて、該毛細管内に分取された溶液を該担体表面に供給するための毛細管位置制御手段と、を有する請求項１〜３のいずれかに記載の製造装置。
【請求項７】
前記プローブは、ＤＮＡ、タンパク質または合成化学物質である請求項１〜６のいずれかに記載の製造装置。
【請求項８】
前記プローブ溶液は水性媒体を含み、前記担体は、前記プローブ固定用の疎水性の非吸水性の表面を有する請求項１〜７のいずれかに記載の製造装置。
【請求項９】
標的物質に対して特異的に結合可能なプローブ溶液を担体上にスポッティングしてプローブ担体を製造する方法でにおいて
担体上にプローブ溶液を付与して液滴スポットを形成する工程と、
前記担体上に形成された液滴スポットの状態を測定する工程と、
前記液滴スポットの状態に基づいて、該液滴スポットを形成するプローブ溶液の状態を判定する判定する工程と、
を有することを特徴とするプローブ担体の製造方法。
【請求項１０】
前記液滴スポットの状態の測定は、前記液滴スポットの前記担体表面との接触領域の占める面積及び径、並びに前記液滴スポットの前記担体表面に対する接触角の少なくとも１つの物性の測定であり、前記判定工程において該物性に関する情報を予め用意された情報と対比して前記液滴スポットを形成するプローブ溶液のプローブ濃度を判定する請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記液滴スポットの状態の測定は、前記液滴スポットの前記担体表面との接触領域の占める面積及び径、並びに前記液滴スポットの前記担体表面に対する接触角の少なくとも１つの物性の測定であり、前記判定工程において該物性に関する情報を予め用意された情報と対比して前記液滴スポットを形成するプローブ溶液中のプローブの有無を判定する請求項９に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記プローブ溶液の前記担体への付与は、インクジェット法により行われる請求項９〜１１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１３】
前記プローブ溶液の前記担体への付与は、前記プローブ溶液を保持する貯蔵部の液面に接触させたピンの先端に分取した所定量のプローブ溶液を、該ピンの先端を前記担体表面に接触させることにより、該担体表面に転写供給することで行なわれる請求項９〜１２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１４】
前記プローブ溶液の前記担体への付与は、前記プローブ溶液を保持する貯蔵部の液面に接触させた毛細管内に分取した所定量のプローブ溶液を、該毛細管の先端を前記担体表面に接触させることにより、該担体表面に供給することで行なわれる請求項９〜１２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１５】
前記プローブは、ＤＮＡ、タンパク質または合成化学物質である請求項９〜１４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１６】
前記担体は、前記プローブ固定用の疎水性の非吸水性の表面を有する請求項９〜１５のいずれかに記載の製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、担体上にプローブを固定したプローブ担体の品質保証工程を含む製造方法およびそのための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の塩基配列の決定、サンプル中の標的核酸の検出、各種細菌の同定などを、迅速かつ正確に行うための技術のひとつとして、プローブ・アレイを用いた各種検出方法がある。このプローブ・アレイは、標的核酸と特異的に結合し得る物質、いわゆるプローブを固相上に多数並べた構成を有する。
【０００３】
このようなプローブ・アレイの一般的な製造方法としては、米国特許（ＵＳＰ）第5,424,186号明細書に記載される、光分解性の保護基とフォトリソグラフイーを用いた固相基板上でのＤＮＡの逐次伸長反応により、互いに異なる塩基配列を有するＤＮＡプローブをアレイ状に作製する手法を挙げることができる。この手法を利用すると、例えば、１ｃｍ2当たり１００００種類以上の、配列が異なるＤＮＡを搭載したＤＮＡプローブ・アレイの製造も可能である。なお、この手法では、逐次伸長反応によりＤＮＡを合成する際、４種の塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）毎に、それぞれ専用のフォトマスクを用いてフォトリソグラフイー工程をおこない、アレイの所定箇所に何れかの塩基を選択的に伸長させる。この工程により、所望の塩基配列を有する複数種のＤＮＡを所定の配列で基板上に合成する。
【０００４】
前記の手法とは別な方法として、プローブ用のＤＮＡを予め合成、精製し、場合によってはその塩基長を確認した上で、基板上に供給してプローブ・アレイを製造する手法がある。基板上へのＤＮＡの供給は、マイクロディスペンサーのようなデバイスにより行なわれる。また、国際公開第９５／３５５０５号パンフレットには、キャピラリーを用いて、ＤＮＡをメンブラン上へ供給する手法が記載されている。この手法を適用すると、原理的には、１ｃｍ2当たり１０００個程度のスポットを有するＤＮＡアレイの製造が可能である。この手法では、基本的には、各プローブ毎に一本のキヤピラリー状ディスペンス・デバイスでプローブ溶液が基板上の所定位置へ供給される。この供給作業を繰返すことで、各プローブが基板上に配置さる。
【０００５】
薬剤のハイスループット・スクリーニングに利用される９６ウェル、あるいは、３８４ウェルのマイクロプレートに対して、個々のウェル毎に、異なる薬剤溶液を供給するためマイクロ・ディスペンサー・デバイスも、例えば、Robbins Scientific 社からHYDRATMの商品名で市販されている。これは、基本的には、マイクロシリンジを２次元状に配列したものであり、最少吐出量は１００ｎｌである。
【０００６】
その他の手法として、基板上においてＤＮＡの固相合成を行う際、各伸長段階毎に、インクジェット法により合成に必要な物質の溶液を基板上に供給する手法も提案されている。例えば、欧州特許出願公開第0 703 825 B1号明細書には、ヌクレオチドモノマー及びアクティベ−ターを、それぞれ別のピエゾ・ジェット・ノズルより合成用の固相上に供給することにより、それぞれ所定の塩基配列を有するＤＮＡの複数種を固相合成する方法が記載されている。このインクジェット法による供給（塗布）は、上記キャピラリーを用いた溶液の供給（塗布）に比べ、供給量の再現性など信頼性も高く、また、ノズルの構造も微細化が可能であり、プローブ・アレイの高密度化に適した特徴を有している。
【０００７】
一般的には、上記のような方法によって製造されたプローブ・アレイを、先に述べた用途に使用しようとする場合、解析の信頼性を保証するために各マトリクスを構成する互いに区分されたプローブの固定領域（スポットあるいはドットともいう）に存在するプローブの量、つまり固定密度を知ることが重要である。また、実際にどのようなマトリクス形状（形状、サイズ、状態）で存在するか、を知ること（イメージング）も、アレイに適用する分析装置や分析方法によっては重要となる。さらに、プローブ・アレイを多数供給する場合を考えると、各マトリクスに存在するプローブの量の製造ロット内、あるいはロット間のばらつきや、純度を把握することが信頼性を確保する上で極めて重要になる。
【０００８】
ところで、プローブ用のＤＮＡを合成、精製し、基板上に供給する場合、基板上に供給する前にその純度や濃度を測定することで、基板上に供給されたプローブ量を確認している。プローブ溶液に含まれる成分の純度の測定は、HPLC、あるいは、液体クロマトグラフィーの検出器として重量分析計を用いたLC−MS法（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  −  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、及びＭＡＬＤＩ法（マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型重量分析：Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）などによって行うことができる。
【０００９】
一方、一般にプローブ・アレイと呼ばれるプローブ固定担体には、用途などによって数種類から数万種類のプローブが固定されている。担体上の各プローブの濃度を測定すると測定数が多くなる。このことを考慮して、プローブ・アレイの場合には、プローブ媒体（プローブ溶液）を固相基材に付与するための付与装置内でもしくは付与装置にプローブ媒体を供給する分注装置内でプローブ媒体におけるプローブ濃度を測定している。
【００１０】
特開２００３−６３０１３号公報は、発光素子と受光素子を内蔵したインクジェットヘッドを開示している。プローブとしてオリゴヌクレオチドもしくはｃＤＮＡなどのＤＮＡを用いる場合は、２６０ｎｍの波長の光を発光素子から照射し、受光素子でその光を受光して吸光度を求める。求めた吸光度からプローブ濃度を算出することで、複数種のプローブ媒体の濃度を測定することが可能となる。吸光度から濃度への換算は、プローブによってモル吸光係数が異なるので、予め計算しておく必要がある。
【００１１】
また、複数のプローブ媒体を格納するマルチウェルプレート内あるいは、マルチウェルプレート等への分注過程でプローブ溶液のプローブ濃度を測定することも可能である。こうようにしてプローブ溶液の濃度をスポット前に予め測定することで、プローブ量を確認している。
【特許文献１】米国特許第5,424,186号明細書
【特許文献２】国際公開第９５／３５５０５号パンフレット
【特許文献３】欧州特許出願公開第0 703 825 B1号明細書
【特許文献４】特開２００３−６３０１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
多種類のプローブ溶液の各々についてその濃度等を測定して、検証することは非常に手間のかかる操作である。また、本来ならば実際に基板上に供給されたプローブ溶液から得られたプローブ量を確認することが重要である。しかしながら、供給された微小量のプローブ溶液（例えば、インクジェットで供給するような場合、数plと極少量）の濃度を測定するための簡便な装置及び方法は見当たらない。
【００１３】
本発明は上記のような従来技術における課題を解決するもので、その目的は、担体上に異なるプローブを固定したプローブ担体を製造する際に、担体上に形成されたスポットにおけるプローブの濃度を、簡便な操作で効率良く判定できる技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、前記課題の解決を図るべく、鋭意研究を進めた。その結果、検出用として疎水性、かつ非吸水性の表面を有する担体を用い、この表面上にプローブ溶液のスポットを形成した際に、その形成状態に基づいてプローブ溶液中でのプローブの有無やプローブ濃度を判定できることを見出した。具体的には、担体上の液滴からなるスポットの面積もしくはスポット径を、レーザー顕微鏡を用いて測定した場合、プローブを含む溶液は、プローブを含まない溶液に比べ、スポット面積もしくはスポット径が大きくなることが判明した。また、スポットの接触角を、三次元顕微鏡による形状測定に基づいて計算により算出した場合、プローブを含む溶液は、プローブを含まない溶液に比べ、スポットの接触角は小さくなることが判明した。これらのことにより、基板上に供給されたプローブ溶液からなるスポットの状態を示すデータを利用して、プローブ濃度を簡便に判定できることを見出した。これにより、本発明はなされた。
【００１５】
本発明にかかるプローブ担体製造装置は、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブを担体に固定したプローブ担体の製造装置において、
担体を保持する担体保持手段と、
担体保持手段に保持された担体の所定位置にプローブ溶液を付与して液滴スポットを形成するためのプローブ溶液付与手段と、
前記担体上の液滴スポットの状態を測定するための測定手段と、
前記液滴スポット測定手段で測定された液滴スポットの状態に基づいて、該液滴スポットを形成するプローブ溶液の状態を判定する判定手段と、
を有することを特徴とするプローブ担体の製造装置である。
【００１６】
本発明にかかるプローブ担体の製造方法は、標的物質に対して特異的に結合可能なプローブ溶液を担体上にスポッティングしてプローブ担体を製造する方法でにおいて
担体上にプローブ溶液を付与して液滴スポットを形成する工程と、
前記担体上に形成された液滴スポットの状態を測定する工程と、
前記液滴スポットの状態に基づいて、該液滴スポットを形成するプローブ溶液の状態を判定する判定する工程と、
を有することを特徴とするプローブ担体の製造方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、プローブ溶液からなる液滴スポットの担体上での状態（例えば、スポット面積またはスポット径、あるいは接触角）が、プローブ担体の製造装置に備えられたレーザー顕微鏡などにより測定される。この測定により得られた情報を利用することで、短時間かつ簡便に、液滴スポット中でのプローブの有無やプローブ濃度を判定できる。この判定操作が付与されていることで、製造されたプローブ担体の品質を確認することができる。特に、プローブが溶液中に含有されているか否かを確認することができる。従って、本発明の製造装置及び製造方法は、プローブ担体製造における品質向上に好適に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に、本発明のプローブ担体の製造装置及び製造方法に関して、より詳しく説明する。
【００１９】
プローブ固定用の担体は、プローブを固定でき、得られたプローブ固定担体を用いて標的物質を検出あるいは分離するのに支障がなく、かつその表面に状態測定可能な液滴スポットを形成し得る物であれば特に限定されない。プローブ・アレイとする場合に標的物質の検出への適応性や汎用性を考慮すると、ガラス基板やプラスティック基板が担体として好ましい。アルカリ成分などが含まれない無アルカリガラス基板や石英基板などであって、プローブ固定用の面が疎水性で非吸水性であるものが担体として特に好ましい。担体の選定に当たっては、既知濃度の標準プローブ溶液及びプローブ溶液調製用の水性媒体を用いて液滴スポットを形成した場合に、プローブ濃度の差や、プローブの有無に応じて液滴スポットの状態が検出可能な範囲で変化し得る担体を選択するとよい。
【００２０】
プローブを担体上に固定する方法としてはさまざまな方法が知られている。プローブがDNAである場合には、担体表面に一端を固定した状態でDNAの合成を行うことによる固定方法と、予め用意されたDNAをピンもしくはスタンプによる転写法、あるいはインクジェット法などにより担体上に付与する固定方法などがある。
【００２１】
プローブとしては、ＤＮＡ、タンパク質または合成化学物質などから標的物質に応じて選択して用いる。
【００２２】
担体上にてDNAの合成を行う固定方法としては、例えば、米国特許第５１４３８５４５号明細書に記載されている方法が知られている。この合成方法では、担体としての基体の選択された領域からアクチベーターによって保護基を除去し、除去可能な保護基を有するモノマ−を前記領域に結合させることを繰返すことにより、基体上で種々の配列を有するポリマ−が合成される。
【００２３】
また、予め用意されたDNAなどの生物学的に活性な物質を担体上に付与して固定する方法としては、例えば、特開平８−２３９７５号公報に記載されている方法が知られている。この公報記載の方法では、担体としての基材上に担持されたカルボジイミド基を有する高分子化合物よりなる固定用の材料と、カルボジイミド基との反応性を有する生物学的に活性な物質を反応させることにより、該物質が固定される。また、特開平８−３３４５０９号公報に記載されているように、生物学的に活性な物質の検出において、カルボジイミドを有する化合物上にカルボジイミド基を介して生物学的活性物質を固定化してこれを検出する方法が知られている。
【００２４】
更に、特開２００１−１７８４４２号公報には、チオール基を利用してＤＮＡ断片を結合する方法が開示されている。この方法では、チオール基と反応して共有結合を形成し得る反応性置換基を有する鎖状分子が一方の末端で表面に固定された固相基材が用意される。この固相基材に、末端部にチオール基を有するＤＮＡ断片を液相にて接触させることによってＤＮＡ断片の固定化方法が行われる。この場合では、ＤＮＡ断片と鎖状分子との間で共有結合が形成されることでＤＮＡ断片が固相基材表面へ固定される。更に、この公報には、チオール基と反応して共有結合を形成し得る反応性置換基として、マレイミジル基、α、β−不飽和カルボニル基、α−ハロカルボニル基、ハロゲン化アルキル基、アジリジン基およびジスルフィド基からなる群より選ばれる基を含む置換基が記載されている。
【００２５】
プローブの固定化方法に関しては、上述のようにDNA断片の固定方法だけでも多くの方法が知られている。これらの方法から適宜選択した方法によりプローブの担体表面への固定を行なうことができる。なお、本発明で用いるプローブの種類やその固定メカニズムは特に限定されない。
【００２６】
一方、プローブ溶液を担体上に付与する方法としては、特開平１１−１８７９００号公報に開示されているようなインクジェット法やピン法などが利用できる。この場合、担体表面に塩基性基を配置することで、これと反応するプローブの固定を効果的に行なうことができる。
【００２７】
スポッティング方法に関し、上述した方法の中でも特にインクジェット法は、高速、高密度で尚且つ正確なスポッティングができることから好適である。インクジェット法とは、ごく細いノズルの中にプローブ溶液を入れ、ノズルの先端近くを瞬間的に加圧ないし加熱し、ノズルの先端から正確に極微量のプローブ溶液を飛び出させて担体面に付着させることによる液体付与方法である。インクジェット法によるスポッティング方法に用いるプローブ溶液に含まれるプローブ以外の成分は、所望とするスポッティグを行うことができるものであれば特に限定されない。具体的には、液滴吐出に際してプローブに対して実質的に影響を与えず、且つ担体上の所望の位置に所定量での吐出を可能とする溶液組成を満たし、更に、担体上で状態測定可能な溶液スポットの形成が可能なものが好ましい。例えば、インクジェットヘッドがプローブ溶液に熱エネルギーを付与して吐出させる機構を備えるバブルジェットヘッドである場合、水と水溶性有機溶媒とを含む水性媒体が好ましい。この水溶性有機溶媒としては、グリセリン、チオジグリコール、イソプロピルアルコールま及びアセチレンアルコールを挙げることができる。具体的には、水中に、グリセリンを５〜３０重量％、チオジグリコールを５〜１５重量％、イソプロピルアルコールまたはアセチレンアルコールを０．０２〜５重量％含む水性媒体が好ましい。
【００２８】
このようにして得られたプローブ溶液をインクジェットヘッドより吐出させ、先に挙げた構成の担体上に付着させた時には、液滴からなるスポット（液滴スポット）の形状（担体表面との接触領域の形状）が円形で、また吐出された範囲が広がることがない。高密度にプローブ溶液をスポッティングした場合にも、隣接するスポットとの連結を有効に抑えることができる。
【００２９】
プローブ溶液からなる液滴スポットの形成状態の好ましい測定項目としては、
（１）液滴スポット面積（担体表面との接触領域（通常円形）の面積）
（２）液滴スポット径（担体表面との円形接触領域の直径）
（３）液滴スポットの担体表面に対する接触角
を挙げることができる。
【００３０】
液滴スポット面積及び液滴スポット径は、例えば、スポッティング装置に備えられたレーザー顕微鏡などにより測定可能である。また、接触角は三次元顕微鏡などから担体上のスポット形状を立体的に測定した後、その形状から計算により求めることができる。
【００３１】
先に述べたとおり、担体の種類及びプローブ溶液の組成は、上記の各項目の測定が可能となるように選択すればよい。例えば、後述する実施例における構成などにおいては、面積で1200μm2〜3200μm2、径（直径）で40μm〜60μm、接触角で30°以上のスポットが形成されるように設定することが好ましい。
【００３２】
プローブ濃度やプローブの有無を担体上に形成した液滴スポットの形成状態から判定する方法としては、上記の（１）〜（３）の物理特定の少なくとも１つにかかる情報（データ）を、既知濃度のプローブ溶液や水性媒体のみでの情報（データ）と比較する方法が好適である。例えば、液滴スポット面積または径が大きく、液滴スポット接触角が小さくなっているかを判定することでプローブ濃度やプローブの存在を確認することができる。なお、ここでは液滴スポット面積または径、あるいは液滴スポットの接触角を高精度に測定できれば良い。従って、測定装置及び測定法は特に限定されず、公知の測定装置及び測定方法を利用することができる。
【００３３】
本発明のプローブ製造装置の一例の概略を図６に示す。この装置は、液滴スポット２が形成される担体１を保持する担体保持手段３と；担体１の表面に液滴スポット２を形成するためのプローブ溶液付与手段４、５と；担体１上の液滴スポット２の状態を測定するための測定手段６と；液滴スポット測定手段で測定された液滴スポットの状態に基づいて、液滴スポットを形成するプローブ溶液の状態を判定する判定手段７と；を有している。測定手段６は、液滴スポット２の担体１の表面との接触領域の占める面積（スポット面積）及び径（スポット径）、並びに液滴スポット２の担体１の表面に対する接触角の少なくとも１つを測定する物性測定手段を有する。判定手段７は、既知試料でのデータを保持するメモリーからの既知試料データと、測定手段６に取り込まれた測定結果とを対比して、液滴スポット２におけるプローブの有無やプローブ濃度を判定するための構成を有する。
【００３４】
プローブ溶液付与手段は、プローブ溶液を担体１の表面の所定位置に付与するための付与部４とその位置や付与のタイミングを制御する制御部５を有して構成されている。
【００３５】
付与手段としては、
（１）インクジェット法による液体付与手段、
（２）プローブ溶液を保持する貯蔵部と、該貯蔵部の液面に接触可能に設けられ、この液面への接触によりプローブ溶液の所定量を分取可能であるピンと、ピンの先端を担体１の表面に物理的に接触させて、ピンの先端に付着させた溶液を担体１の表面に転写供給するためのピン位置制御手段と、を有する液体付与手段、及び
（３）プローブ溶液を保持する貯蔵部と、貯蔵部の液面に接触可能に設けられ、この液面への接触によりプローブ溶液の所定量を分取可能である毛細管と、毛細管の先端を担体１の表面に物理的に接触させて、毛細管内に分取された溶液を担体１の表面に供給するための毛細管位置制御手段と、を有するプローブ溶液付与手段、
などを用いることができる。
【００３６】
付与部４と担体１は相対的に位置移動可能に制御され、担体１の表面の所定の位置に液滴スポット２が形成され、また、液滴スポットの状態の測定時に測定の障害とならない位置に配置可能となっている。
【００３７】
測定手段６としては、先に述べたとおり、レーザー顕微鏡や三次元顕微鏡を有する測定装置を好適に利用することができる。
【００３８】
この装置においては、プローブ濃度やプローブ含有の有無の判定を自動化することも可能である。例えば、予め取得しておいた標準試料での液滴スポット面積、液滴スポット径、液滴スポットの接触角などのデータをメモリー８に格納保存しておく。判定に際して、予めプログラムした操作に従って、判定手段を構成するコンピュータの演算部に保存データを呼び出し、これを実際に担体１の表面から測定手段６によって取得したデータ（例えばイメージ化されたデータ）を自動的に読み取って対比し、対比結果からプローブ濃度やプローブ含有の有無を判定する。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明する。なお、ここに示す実施例は、本発明の最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明は、これら実施例により限定されるものではない。
【００４０】
[実施例１]
(1)検出用基板の作製
担体としてのスライドガラスを予め６０℃に加温した１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液に１０分間浸した。次に、スライドガラスを純水流水中で十分にすすぎ、そこに付着した水酸化ナトリウムを水洗、除去した。十分にすすいだ後、純水中にスライドガラスを浸漬し、超音波洗浄を１０分間行った。超音波洗浄後、純水流水中で十分にすすぎ、スライドガラスに付着したパーティクルを水洗、除去した。その後、このスライドガラスをスピンドライで乾燥させた。
【００４１】
アミノシランカップリング剤(商品名：KBM-903；信越化学工業(株)社製)を１重量％になるように溶解して３０分間撹拌し、この水溶液にスライドガラスを３０分間浸漬させた後取り出して水で洗浄し、オーブン中に入れ１２０℃で１時間乾燥させた。
【００４２】
(2)プローブの合成
プローブとしては、検出しようとする標的核酸の全部または一部に対して相補的な塩基配列を有し、標的核酸の塩基配列と特異的にハイブリダイズ（交雑反応）することで標的核酸を検出可能とする１本鎖核酸を用いた。ＤＮＡ自動合成機を用いて配列番号１で示す配列を有する以下の構造の一本鎖DNA断片を合成した。
5'HS-(CH2) 6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3'
なお、この一本鎖ＤＮＡ末端には、ＤＮＡ自動合成機での合成時にチオールモディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（グレンリサーチ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）社製）を用いる事によってメルカプト基を導入した。続いて通常の脱保護を行い、ＤＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の実験に用いた。
【００４３】
(3)プローブ溶解用の溶液
インクジェットヘッドを用いて担体上に正常に吐出可能である水性媒体として、グリセリン３０重量％、イソプロピルアルコール４重量％、アセチレンアルコール(商品名：アセチレノールE１００；川研ファインケミカル(株)社製)０．０１重量％（残部：水）からなる水性媒体を用いた。
【００４４】
(4)プローブの固定
上記(2)で合成した一本鎖DNA断片を上記（3）の水性媒体に、１μＭ、２μＭ、４μＭ、８μＭ、８μＭ、１０μＭ、２０μＭになるよう溶解させた。
【００４５】
これらのDNA断片を含む水溶液と、水性媒体（DNA断片を含まない）のそれぞれをバブルジェットプリンターで、上記(1)の方法によって作製したスライドガラスにスポットした。１スポットを形成する液滴量はすべての試料において同一とした。
【００４６】
(5)スポット面積及びスポット径の測定
上記（4）で液滴スポットを形成したスライドガラスをガラス基板面積計（構成：画像処理装置（ソフトワークス）、ＣＣＤカメラ（フローベル  ＡＤ-５２０）、顕微鏡L２００Ａ＋オートフォーカスユニット（三啓）、ステージ＋冶具（安曇野設計））からなる測定装置の所定位置に保持し、スポット面積及びスポット径を測定した。スポット面積の測定結果を図１、スポット径の測定結果を図２に示す。図１の結果より、DNA断片を含む水溶液の面積は、スポットした濃度範囲内において２０００μｍ2〜２１００μｍ2程度であった。一方、DNA断片を含まない水性媒体でのスポット径は、１８００μｍ2程度であった。また、図２の結果より、DNA断片を含む水溶液のスポット径は、スポットした濃度範囲内において５１μｍ〜５２μｍ程度であった。一方、DNA断片を含まない水性媒体のスポット径は、４８μｍ程度であった。以上より、DNA断片を含む水溶液とDNA断片を含まない水性媒体では、スライドガラスにスポットされたスポット面積およびスポット径に違い見られた。よって、これらを比較することで溶液中にプローブが含有されているか否かを判定することができた。
【００４７】
以上の操作によって、担体に付与したプローブ溶液に液滴から形成された液滴スポットでのプローブの有無やその濃度を簡便に確認でき、確認された液滴スポットに対して乾燥処理などの固定化のための処理を行なうことで品質保証されたプローブ担体を提供することができる。
【００４８】
[実施例２]
(1)検出用基板の作製
担体としてのスライドガラスを予め６０℃に加温した１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液に１０分間浸した。次に、スライドガラスを純水流水中で十分にすすぎ、そこに付着した水酸化ナトリウムを水洗、除去した。十分にすすいだ後、純水中にスライドガラスを浸漬し、超音波洗浄を１０分間行った。超音波洗浄後、純水流水中で十分にすすぎ、スライドガラスに付着したパーティクルを水洗、除去した。その後、このスライドガラスをスピンドライで乾燥させた。
【００４９】
アミノシランカップリング剤(商品名：KBM-903；信越化学工業(株)社製)を１重量％になるように溶解して３０分間撹拌し、この水溶液にスライドガラスを３０分間浸漬させた後取り出して水で洗浄し、オーブン中に入れ１２０℃で１時間乾燥させた。
【００５０】
(2)プローブ
プローブとしては、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いた。
【００５１】
(3)プローブ溶解用の溶液
インクジェットヘッドを用いて担体上に正常に吐出可能である水性媒体として、グリセリン３０重量％、イソプロピルアルコール４重量％、（残部：水）からなる水性媒体を用いた。
【００５２】
(4)プローブの固定
上記(2)のＢＳＡを上記（3）の水性媒体に、０．１ｍｇ/ｍｌ、１ｍｇ/ｍｌになるよう溶解させた。
【００５３】
これらのＢＳＡを含む水溶液と、水性媒体（ＢＳＡを含まない）のそれぞれをバブルジェットプリンターで、上記(1)の方法によって作製したスライドガラスにスポットした。１スポットを形成する液滴量はすべての試料において同一とした。
【００５４】
(5)スポット面積及びスポット径の測定
上記（4）で液滴スポットを形成したスライドガラスをガラス基板面積計（構成：画像処理装置（ソフトワークス）、ＣＣＤカメラ（フローベル  ＡＤ-５２０）、顕微鏡L２００Ａ＋オートフォーカスユニット（三啓）、ステージ＋冶具（安曇野設計））からなる測定装置の所定位置に保持し、スポット面積及びスポット径を測定した。スポット面積の測定結果を図３、スポット径の測定結果を図４に示す。図３の結果より、ＢＳＡを含む水溶液の面積は、スポットした濃度範囲内において２２００μｍ2〜２５００μｍ2程度であった。一方、ＢＳＡを含まない水性媒体でのスポット径は、２０００μｍ2程度であった。また、図４の結果より、ＢＳＡを含む水溶液のスポット径は、スポットした濃度範囲内において５４μｍ〜５５．５μｍ程度であった。一方、ＢＳＡを含まない水性媒体のスポット径は、５１．５μｍ程度であった。以上より、ＢＳＡを含む水溶液とＢＳＡを含まない水性媒体では、スライドガラスにスポットされたスポット面積およびスポット径に違い見られた。さらに、スポットした濃度範囲内において、濃度とスポット面積あるいはスポット径に線形性が見られた。よって、これらを比較することで溶液中にプローブが含有されているか否かを判定することができた。
【００５５】
以上の操作によって、担体に付与したプローブ溶液に液滴から形成された液滴スポットでのプローブの有無やその濃度を簡便に確認でき、確認された液滴スポットに対して乾燥処理などの固定化のための処理を行なうことで品質保証されたプローブ担体を提供することができる。
【００５６】
[実施例3]
(1)検出用基板の作製
担体としてのスライドガラスを予め６０℃に加温した１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液に１０分間浸した。次に、スライドガラスを純水流水中で十分にすすぎ、そこに付着した水酸化ナトリウムを水洗、除去した。十分にすすいだ後、純水中にスライドガラスを浸漬し、超音波洗浄を１０分間行った。超音波洗浄後、純水流水中で十分にすすぎ、スライドガラスに付着したパーティクルを水洗、除去した。その後、このスライドガラスをスピンドライで乾燥させた。
【００５７】
アミノシランカップリング剤(商品名：KBM-903；信越化学工業(株)社製)を１重量％になるように溶解して３０分間撹拌し、この水溶液にスライドガラスを３０分間浸漬させた後取り出して水で洗浄し、オーブン中に入れ１２０℃で１時間乾燥させた。
【００５８】
(2)プローブの合成
プローブとしては、検出しようとする標的核酸の全部または一部に対して相補的な塩基配列を有し、標的核酸の塩基配列と特異的にハイブリダイズ（交雑反応）することで標的核酸を検出可能とする１本鎖核酸を用いた。ＤＮＡ自動合成機を用いて配列番号１で示す配列を有する以下の構造の一本鎖DNA断片を合成した。
5'HS-(CH2) 6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3'
なお、この一本鎖ＤＮＡ末端には、ＤＮＡ自動合成機での合成時にチオールモディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（グレンリサーチ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）社製）を用いる事によってメルカプト基を導入した。続いて通常の脱保護を行い、ＤＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の実験に用いた。
【００５９】
(3)プローブ溶解用の溶液
インクジェットヘッドを用いて担体上に正常に吐出可能である水性媒体として、グリセリン３０重量％、イソプロピルアルコール４重量％、アセチレンアルコール(商品名：アセチレノールE１００；川研ファインケミカル(株)社製)０．０１重量％（残部：水）からなる水性媒体を用いた。
【００６０】
(4)プローブの固定
上記(2)で合成した一本鎖DNA断片を上記（3）の水性媒体に、０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭになるよう溶解させた。
【００６１】
これらのDNA断片を含む水溶液と、水性媒体（DNA断片を含まない）のそれぞれをバブルジェットプリンターで、上記(1)の方法によって作製したスライドガラスにスポットした。１スポットを形成する液滴量はすべての試料において同一とした。
【００６２】
(5)スポット面積及びスポット径の測定
上記（4）で液滴スポットを形成したスライドガラスをガラス基板面積計（構成：画像処理装置（ソフトワークス）、ＣＣＤカメラ（フローベル  ＡＤ-５２０）、顕微鏡L２００Ａ＋オートフォーカスユニット（三啓）、ステージ＋冶具（安曇野設計））からなる測定装置の所定位置に保持し、スポット面積を測定した。スポットした濃度におけるスポット面積の測定結果を図５に示す。図５はスポットした濃度範囲における校正曲線として使用した。
(6)スポット溶液の濃度の測定
上記(2)で合成した一本鎖DNA断片を上記（3）の水性媒体に溶解させた水溶液１、水溶液２、水溶液３の３種類を用意した。
【００６３】
これらのDNA断片を含む水溶液をバブルジェットプリンターで、上記(1)の方法によって作製したスライドガラスにスポットした。１スポットを形成する液滴量はすべての試料において同一とした。
【００６４】
上記（4）で液滴スポットを形成したスライドガラスをガラス基板面積計（構成：画像処理装置（ソフトワークス）、ＣＣＤカメラ（フローベル  ＡＤ-５２０）、顕微鏡L２００Ａ＋オートフォーカスユニット（三啓）、ステージ＋冶具（安曇野設計））からなる測定装置の所定位置に保持し、スポット面積を測定した。
【００６５】
測定結果より、DNA断片を含む水溶液１の面積は、１８５０μｍ2程度であった。また、DNA断片を含む水溶液２の面積は、１９５０μｍ2程度であった。さらに、DNA断片を含む水溶液３の面積は、１７５０μｍ2程度であった。
【００６６】
水溶液１、水溶液２、水溶液３のスポット面積から図５より各水溶液の濃度を算出した。その結果、水溶液１の濃度は、０．０１μＭ、水溶液２の濃度は、５μＭ、水溶液３の濃度は、０．００１μＭであった。
【００６７】
また、スポットした水溶液１、水溶液２、水溶液３の吸光度を測定し、求めた吸光度からプローブ濃度を算出した。その結果、水溶液１の濃度は、０．０１μＭ程度、水溶液２の濃度は、ほぼ５μＭ程度、水溶液３の濃度は、ほぼ０．００１μＭ程度であった。これらの濃度は、スポット面積から図５より算出した濃度とほぼ同じであった。よって、スポット面積からスポットされた水溶液の濃度を算出することができた。
【００６８】
以上の操作によって、担体に付与したプローブ溶液に液滴から形成された液滴スポットでのプローブの有無やその濃度を簡便に確認でき、確認された液滴スポットに対して乾燥処理などの固定化のための処理を行なうことで品質保証されたプローブ担体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】プローブ濃度とスポット面積の関係を示すグラフである。
【図２】プローブ濃度とスポット径の関係を示すグラフである。
【図３】プローブ濃度とスポット面積の関係を示すグラフである。
【図４】プローブ濃度とスポット径の関係を示すグラフである。
【図５】プローブ濃度とスポット面積の関係を示すグラフである。
【図６】プローブ担体製造装置の一例の構成を示す概略図である。
【符号の説明】
【００７０】
１  担体１
２  液滴スポット
３  担体保持手段
４、５  プローブ溶液付与手段
５  制御部
６  測定手段
７  判定手段
８  メモリー
【図１】
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【図２】
2007010499.tif 000004
【図３】
2007010499.tif 000005
【図４】
2007010499.tif 000006
【図５】
2007010499.tif 000007
【図６】
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