(57)【要約】【課題】リバースジェネティック法を利用しタンパク質ワクチンとトリインフルエンザワクチンを開発する方法の提供。【解決手段】タンパク質ワクチンの調整法に係り、該方法は以下を含む。(a)ターゲット抗原タンパク質の少なくとも１個の抗原決定基ペプチドのアミノ酸配列を提供する。(b)該抗原決定基ペプチドの野生型核酸配列を改質する。(c)この合成型核酸配列の複数のプライマーを合成する。(d)体外においてこの合成型核酸を合成する。(e)この合成型核酸を結合しプラスミドを形成する。(f)このプラスミドを宿主細胞に導入し、抗原決定基ペプチドをエンコードされた合成型核酸を生成する。(g)該抗原決定基ペプチドを収集し純化する。上記本発明の「リバースジェネティック法」により、危険性の高い疾病に対して、抗体誘発効果を備えた高安全性ワクチンを迅速に生成することができる。【選択図】図１
2007282636.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法は以下を含み、
（ａ）ターゲット抗原タンパク質の少なくとも１個の抗原決定基ペプチドのアミノ酸配列を提供し、対応する該ペプチドの野生型拡散配列に転換し、
（ｂ）該抗原決定基ペプチドの野生型核酸配列を宿主細胞中において識別可能で、エンコードされた該抗原決定基ペプチドの合成型拡散配列に改質し、
（ｃ）該合成型核酸配列の複数のプライマーを合成し、該各プライマーは該合成型核酸配列と一部のフラグメントが相同で、或いは相補の5-80個の核酸配列で、しかも該プライマー中のフォワードプライマーの３’端とリバースプライマーの３’端には5-10個の相補の核酸配列があり、
（ｄ）該各プライマーを利用し、体外において該合成型核酸を合成し、
（ｅ）該合成型核酸を、結合と移動機能を備える核酸配列、カルボキシ末端核酸配列のプラスミドと結合し、合成プラスミドを形成し、
（ｆ）該合成プラスミドを該宿主細胞に導入し、該抗原決定基ペプチドをエンコードされた合成型核酸を生成し、
（ｇ）該抗原決定基ペプチドを収集し純化することを特徴とするタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法。
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法において、前記抗原決定基ペプチドのアミノ酸配列は自然に存在する配列ではないことを特徴とするタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法。
【請求項３】
請求項１記載のタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法において、前記抗原決定基ペプチドは該ターゲットの抗原タンパク質構造の親水部位であることを特徴とするタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法。
【請求項４】
請求項１記載のタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法において、前記抗原決定基ペプチドは該ターゲットの抗原タンパク質構造の疏水部位であることを特徴とするタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法。
【請求項５】
請求項１記載のタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法において、前記宿主細胞は微生物細胞、植物細胞、或いは動物細胞であることを特徴とするタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法。
【請求項６】
請求項１記載のタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法において、前記宿主細胞は大腸菌細胞或いは酵母菌細胞であることを特徴とするタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法。
【請求項７】
請求項１記載のタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法において、前記ターゲットの抗原タンパク質の野生型核酸配列と該合成型核酸配列は同一のペプチドをエンコードされることを特徴とするタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法。
【請求項８】
請求項１記載のタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法において、前記合成型核酸はポリメラーゼ連鎖反応方法により体外で合成されることを特徴とするタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法。
【請求項９】
請求項１記載のタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法において、前記結合と移動の機能を備えた核酸配列は緑膿菌外毒素の第一部位と第二部位であることを特徴とするタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法。
【請求項１０】
請求項１記載のタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法において、前記ターゲットの抗原遺伝子はワクチン株相似遺伝子の等位区に嵌入可能で、リバースジェネティック法及び類似のインフルエンザウィルス８プラスミドシステム技術を利用し、新型ウィルスに対抗可能なワクチン株を生成することができることを特徴とするタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法。
【請求項１１】
請求項９記載のタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法において、前記緑膿菌外毒素の第一部位は配位子であることを特徴とするタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法。
【請求項１２】
請求項１１記載のタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法において、前記配位子はターゲットの細胞のレセプターと結合することを特徴とするタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法。
【請求項１３】
請求項１２記載のタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法において、前記ターゲットの細胞は少なくとも以下の細胞が組成するグループ、すなわちT細胞、B細胞、樹状細胞、単核細胞、マクロファージから選択することを特徴とするタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法。
【請求項１４】
請求項１２記載のタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法において、前記レセプターは少なくとも以下のレセプターが組成するグループ、すなわちTGFレセプター、IL2レセプター、IL4レセプター、IL6レセプター、1GF1レセプター、CD4レセプター、IL18レセプター、IL12レセプター、EGFレセプター、LDLレセプター、α2球タンパクレセプター、或いはヒートショックタンパクから選択することを特徴とするタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法。
【請求項１５】
請求項１記載のタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法において、前記カルボキシ末端部分の核酸配列は緑膿菌外毒素の一部分であることを特徴とするタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法。
【請求項１６】
請求項１記載のタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法において、前記カルボキシ末端部分はKDELのアミノ酸配列或いは対応する核酸配列を含むことを特徴とするタンパク質ワクチン或いは新型ウィルスワクチン株の調整方法。
【請求項１７】
その構造はトリインフルエンザウィルスタンパク質の抗原決定基ペプチド、
結合と移動の機能を備えるペプチド、
カルボキシ末端ペプチドを含むことを特徴とするトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチン。
【請求項１８】
請求項１７記載のトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチンにおいて、前記エンコードされたトリインフルエンザウィルスタンパク質の抗原決定基ペプチドは人工合成であることを特徴とするトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチン。
【請求項１９】
請求項１７記載のトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチンにおいて、前記トリインフルエンザウィルスはオルトミクソウィルスH5N1であることを特徴とするトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチン。
【請求項２０】
請求項１７記載のトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチンにおいて、前記トリインフルエンザウィルスタンパク質の抗原決定基の核酸配列は改質を経ていることを特徴とするトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチン。
【請求項２１】
請求項１７記載のトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチンにおいて、前記トリインフルエンザウィルスタンパク質の抗原決定基は少なくとも以下の抗原決定基が組成するグループ、すなわち、H5N1-NS1、H5N1-NP、H5N1-HA中和力価区、H5N1-M2、H5N1-HA酵素反応区より選択することを特徴とするトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチン。
【請求項２２】
請求項１７記載のトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチンにおいて、前記結合と移動の機能を備えた核酸配列は緑膿菌外毒素の第一部位と第二部位であることを特徴とするトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチン。
【請求項２３】
請求項２２記載のトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチンにおいて、前記緑膿菌外毒素の第一部位は配位子であることを特徴とするトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチン。
【請求項２４】
請求項２３記載のトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチンにおいて、前記配位子はターゲットの細胞のレセプターと結合することを特徴とするトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチン。
【請求項２５】
請求項２４記載のトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチンにおいて、前記ターゲットの細胞は少なくとも以下の細胞が組成するグループ、すなわちT細胞、B細胞、樹状細胞、単核細胞、マクロファージから選択することを特徴とするトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチン。
【請求項２６】
請求項２４記載のトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチンにおいて、前記レセプターは少なくとも以下のレセプターが組成するグループ、すなわちTGFレセプター、IL2レセプター、IL4レセプター、IL6レセプター、1GF1レセプター、CD4レセプター、IL18レセプター、IL12レセプター、EGFレセプター、LDLレセプター、α2球タンパクレセプター、或いはヒートショックタンパクから選択することを特徴とするトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチン。
【請求項２７】
請求項１７記載のトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチンにおいて、前記カルボキシ末端部分の核酸配列は緑膿菌外毒素の一部分であることを特徴とするトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチン。
【請求項２８】
請求項１７記載のトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチンにおいて、前記カルボキシ末端部分はKDELのアミノ酸配列或いは対応する核酸配列を含むことを特徴とするトリインフルエンザウィルスを抑制可能なタンパク質ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一種の機能性タンパク質或いはワクチンの製造法方法に関する。特に一種の流行性疾病の予防或いは抑制に適用するタンパク質サブユニットワクチン或いはワクチンウィルス株の調整法に係る。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学の分野では画期的な研究及び各種高性能な実験機器、方法の研究開発が続いており、研究者は簡単にかつ迅速に各物質の遺伝子配列を解析することができるようになっている。生命の暗号を象徴する遺伝子配列を用い、人類全体の健康の増進に関する研究が進められているが、中でも最主要部分は、機能性タンパク質の生成或いはワクチンの研究開発である。
伝統的な流行疾病ワクチンの開発プロセスは非常に煩雑で、新型流行疾病ワクチンの開発は容易ではない。一般的には、この種の危険性の高い伝染病の研究開発作業は多くは多重防護の下において、病体中から取り出したサンプルから、野生型ウィルス株を分離及び培養した後、初めて鑑定、分類、薬物抵抗性分析などの研究を行うことができる。しかし、操作が不適切であれば、高流行性のウィルス株は実験機関から拡散し易く、大流行を引き起こす恐れがある。これでは研究人員、さらには社会全体にとって、極めて重大な危険性を備えると言わざるを得ない。
該流行病の伝染の広がりを防止するために、ワクチンの開発は唯一の良法であるが、無毒化、弱体化しワクチン株とするためには一定の長い研究開発時間が必要である。しかし、急速に伝播し世界的大流行を引き起こす恐れのある疾病においては、時間は人類にとってキーポイントであるが、危険性の高い新型病原の上記のような各種制限は、人類がこれら疾病に立ち向かおうとする積極性を無形の内に阻害している。
伝染病は感染が一端爆発的に広がると、ワクチンによる助けを待つのはもちろんであっても、流行地区の市民は患者の疾病の処理に手を取られ、薬物或いはワクチンの研究開発に費やす時間は全くなくなってしまう。また流行地区の市民は、病原との接触を恐れるため、限定的な救助を提供できるのみである。
【０００３】
この種の発生し得る地球規模での伝染病の大流行の危機に備えるため、安全性と有効性が確認されているワクチンの製造法を確立することは非常に重要である。ウィルス大量生成に対する安全性への考慮において、近年研究が進んでいるリバースジェネティクス（Reverse Genetics）型ウィルス株を使用する方法が、現在最も期待されるワクチン生成の方法である。リバースジェネティクス（Reverse Genetics）型ウィルス株は、固有のワクチン株を基礎とし、その遺伝子をH1N1 PA、PB1、PB2、NP、M、NS2、HA、NA遺伝子を含む８個のベクターに移植し、H1N1ウィルス体を生成することができ、また適当な培養によりH1N1ウィルスを大量生成することができる。
Hoffmann E.は2002年に再組合せ法を利用し、H3N2、H6N1、H9N2のHAとNA構造タンパク遺伝子ベクターを含み、H1N1のPA、PB1、PB2、NP、Mを含むベクターを組合せ、新型ワクチン株を生成した。この発明はもちろん使用可能であるが、しかし遺伝子全体の置換えはウィルス株を人工的に誘発してしまう危険性が存在する。
過去の免疫学の研究により、抗原は特定の抗原レセプターを備えるリンパ球を刺激することができ、増殖を引き起こして免疫力を合成し、この後、これら抗原を消滅させることが分かっている。これは免疫システムが抗原特異性（antigen specificity）を備えるためである。抗原の抗体により識別或いは結合される場所を抗原決定基（antigenic determinant 或いはepitope）と呼ぶ。抗原上の抗原決定基は通常は6〜8のアミノ酸を含み、それは3D構造(conformation structure)である。
T-細胞が識別した抗原決定基はこの種の直列アミノ酸組成の抗原決定基ペプチドで、それは主要組織相容抗原（major histocompatibility complex, MHC）上のclassI/IIと一緒で、T-細胞上のT-細胞レセプター（T cell receptor, TCR）と結合する。１個の抗原は通常は多くの抗原決定基を持ち、構造が複雑で分子量が大きければ、その抗原決定基も多い。よって、発表されたあらゆるデータ中より得られた抗原決定基ペプチドのアミノ酸配列により、直接抗体に対して抗原決定基ペプチドの移転を行うことができれば、研究開発作業においてカギとなる影響がある。
同時に、抗原決定基ペプチドが宿主細胞の拡大システム中において高いパフォーマンスが可能とするため、宿主細胞がターゲットの抗原決定基ペプチドが持つコドン（codon）を識別可能か否かもカギである。宿主が体外においてタンパク質の合成を行うことにより、前置ステップの他に、後続の操作もまた先にある手段を利用し、順調に量産、純化、分離、生成を行う必要がある。
抗原決定基以外に、病原中和力価の発見もワクチン開発成功の重要条件である。ワクチンは比較的高い中和力価の結成を一端誘発可能であれば、ウィルスの感染と繁殖を効果的に抑制することができる。人類ワクチンにおいては、以上の素因を考慮する他に、ワクチン成分も安全性を備え、毒性がなく、免疫失調をもたらさず、免疫毒性或いは過敏反応を引き起こさないなども非常に重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は下記のリバースジェネティック法を利用しタンパク質ワクチンとトリインフルエンザワクチンを開発する方法を提供する。
それは次世代のジェネティック技術を利用し、核酸合成技術、タンパク質技術、或いはリバース遺伝学などを結合し、リバースジェネティック法(reverse genetic engineering platform)と呼称する。
この技術を利用し、感染性及び生命に危害を及ぼす恐れのある生物材料を存在させる必要なく、学術インターネットシステムを通して関連情報を得ることにより、ワクチン抗原或いはあらゆるターゲットのタンパク遺伝子の修飾形態のDNA配列を設計及び完成することができる。該DNA配列は設計の制限酵素接点に応じて、公知或いは伝送システム(緑膿桿菌外毒素タンパク質など)をすでに含む、或いは高抗体表現を誘発可能な配列(KDEL族配列)のDNAプラスミドを接続し、融合型遺伝子を形成することができる。
該プラスミド上の融合遺伝子は、適当な宿おいて、機能性タンパク質或いはサブユニットワクチンを生成することができる。この他、「リバースジェネティック法新型ワクチンRNAウィルス体生成」技術を派生させることができ、これにより既に安全と免疫有効性が確認されている新型ワクチンウィルス株を生成することができる。このワクチン株は学術情報を参考後、高伝染性及び高危険性を備えるウィルス遺伝子配列中において、中和力価或いは特殊機能をの決定基を供え、原ワクチン株相同遺伝子の相対位置に差し替え、ワクチン用の８プラスミドシステム中の相似遺伝子属性のプラスミド上にクローンする。さらに、他のワクチン遺伝子を含む７個のプラスミドと一緒に宿主細胞或いは胚嚢中に移植する。これら複合プラスミドは宿主細胞内において新型のワクチン株を合成することができる。
【０００５】
高病原性及び高危険性の疾病に対して、以上の「リバースジェネティック法」発明により、抗体誘発効果と安全性を同時にを備えるワクチンを迅速に開発することができる。これにより研究人員の身に危険が及ぶ恐れを考慮する必要なく、各種新型流行疾病のワクチン開発に全力で取組むことができ、疾病の蔓延を効果的に防止することができ、人類に危害を及ぼす疾病災禍に対して、迅速で効果的なワクチン発明技術を提供することができる。
本発明が掲示する技術は以下の重点を備える。
ａ．先ず、ターゲットのアミノ酸配列が対応するヌクレオチド対応配列を整理しターゲット核酸配列を確認する。アミノ酸配列対応のヌクレオチド配列は非常に多くあるため、学術資料（http://www.kazusa.or.jp/codonなど）により大腸菌（E.coli）宿主システムにおいて比較的適したヌクレオチド対応配列を知り、大腸菌により識別、表現が難しいヌクレオチド対応配列を避けることができる。同様の原理で、この配列が酵母菌において表現されるなら、酵母菌システム(Saccharomyces, or Pichia spp.)に適した表現の配列を選択しなければならない。
ｂ．コンピュータソフトウエア(DNA strider)を利用し、ターゲットの核酸配列の制限酵素のマップを分析する。該マップに基づき、ターゲットのヌクレオチド配列の両側に以後、切断と接続を行う時に用いる制限酵素配列切断位置を接続し、ターゲットのヌクレオチド配列内に含まれるべきでない制限酵素切断位置配列に対して、相同のアミノ酸配列が対応する異なるヌクレオチド配列を利用し交換しなければならない。これにより、該配列は制限酵素切断位置を含まない状態となる。
ｃ．ターゲットのタンパク質が毒性を備え、或いは免疫失調、免疫毒性、過敏反応を引き起こす可能性がある部位に関するレポートに基づき、もしあるアミノ酸配列点の突然変異或いは削除により、改善可能である時には、修正する。例えば、アルカリ性アミノ酸がインフルエンザウィルス構造タンパクに存在し、インフルエンザウィルスの毒性を超強力にしているなら、突然変異により他の非アルカリ性アミノ酸に交換後、毒性は明らかに低下する。あらゆる位置の修正により、該ターゲットタンパクの修正を完成することができ、流行性ウィルスを抑制するタンパク質ワクチンの設計を効果的に提供することができる。
ｄ．設計を修正後は、なおアミノ酸交換を監視し、並びに核酸配列後ターゲットの遺伝子全体の制限酵素のマップに転換する。もし、該修飾後のターゲット遺伝子中に新しい制限酵素切断位置が現れ、しかも以後の遺伝子切断と接続或いはプラスミドへのクローンの困難度に影響を及ぼすなら、相同のアミノ酸により転換する他の三ヌクレオチド遺伝子コドンに交換し、この制限酵素切断位置を除去する。
【０００６】
上記ステップの要点を、トリインフルエンザ（Avian Influenza virus,或いはBird flu）を例として説明する。トリインフルエンザはA型インフルエンザ(Influenza A)の一種で、ウィルスの粒径は約0.08〜0.12μmで、RNAウィルスである。通常は、ウィルス表面の赤血球凝集素（HA/hemagglutinin）とノイラミニターゼ(NA/neuraminidase)２種のタンパク質のタイプにより分類し、１５種のHA亜種と９種のNA亜種がある。ヒトインフルエンザのウィルスは一般にH1N1とH3N2型で、流行は既に長く、大部分の人が抵抗力を持っている。通常トリインフルエンザは遺伝子上、ヒトインフルエンザウィルスとは区別されるが、H9、H7、H5は動物により感染した例がある。
A型インフルエンザウィルスに被る３個のタンパクは赤血球凝集素（HA糖タンパク/hemagglutinin）、ノイラミニターゼ(NA糖タンパク/neuraminidase)、タンパクM 2で、oseltamivir(NA)とrimantadine(M2)などの宿主抗体或いは抗ウィルス薬物が主要識別のターゲットである。HA糖タンパクはウィルス表面において突出物を形成し、付着宿主レセプター（sialoside receptors）細胞を調整制御する過程において、さらに細胞膜融合により細胞に進入する。NA糖タンパクはウィルス分子表面において球状突出物を形成し、ウィルスが感染した細胞内から出て行くように促し、ウィルスは拡散する。M2は膜タンパクで、膜上においてイオンの通り道を形成し、これによりウィルス遺伝子は放出され、出現する。
【０００７】
A/H5N1新型トリインフルエンザウィルスは別名「H5N1ウィルス」とも呼ばれ、鳥類に存在するA型インフルエンザウィルスの亜種である。トリインフルエンザウィルスは鳥類において伝染が広がっており、このウィルスは変異を生じ易いという能力を備える。これに鳥類と家畜、人類の活動範囲は接近しているため、ウィルスは生物種間の壁を超え他種に感染し易い。ブタ、ヒトはそれぞれ異なるウィルス遺伝子を獲得するため、患者は同時にヒトインフルエンザウィルスとトリインフルエンザウィルスの感染を受けるなどし、ウィルスの「混合ルート」になる可能性があり、遺伝子の再構築を招き、新たな種のウィルスを生み出してしまう。このウィルスはヒトに感染する能力を有し、重大な疾病を引き起こす時、インフルエンザ大流行ウィルス株の特質を既に具備することになる。現在、出現し得る危機は、該タイプのウィルスは遺伝子フロー（gene flow）現象が極めて起き易く、もし突然変異、入れ替えを経てヒトに再感染すれば、ヒトからヒトへの大流行に発展する可能性がある。ヒトの体内において未だ一切の抗体生み出されていない状況において、極めて重大な世界的大流行を引き起こすと予想されている。
【０００８】
本発明は新型インフルエンザワクチンの研究開発において、２種の形式のワクチンの開発と応用を生み出すことができる。
一つは、公知のインフルエンザ８プラスミド（eight-plasmid flu system）リバースジェネティック技術を応用し、先ずH1N1ウィルス体のHA構造タンパク遺伝子を中和力価区が置換え可能なHAプラスミドに改変する。続いてH5N1或いは他の新型高病原性インフルエンザ遺伝子を、中和力価区ターゲットの配列と、核酸合成法により該区域を製造する。さらに、これをH1N1ワクチン株が置換え可能なHAプラスミドに挿入する。この種の抗原組成は新型インフルエンザ高病原性株H5N1の赤血球凝集素（HA/hemagglutinin）の全長タンパク質を含まず、H5N1- HA中和力価区に置き換えただけであるため、該ウィルス特性はH1N1ワクチン株に比較的類似しており、高病原性ウィルスに変化する可能性はより低い。よって、ワクチン製造工程においてより安全で、しかも該新型インフルエンザワクチン注射後にはH5N1- HA中和力価抗体を生成することができる。上記を利用し、H5N1- HA中和力価区のターゲットの抗原遺伝子を、ワクチン株相似遺伝子の等位区に嵌入し、さらに、リバースジェネティック学及びインフルエンザウィルス８プラスミドシステムに類似の技術を利用し、新型病原に対応するワクチン株を生み出すことができる。これにより今後、人類は新型流行性疾病に対して最適な戦略を持つことができる。
中和力価区以外に、H5N1- HA非中和力価区の特異抗体反応のELISA検査を応用しても、H5N1ウィルス自然感染の種別性抗体を区別することができる。よってこの類のワクチン注射はさらにこの特異抗体反応のELISA検査システムを利用し分析し、当然現在の防疫検査システム区分の新型インフルエンザ感染時の状況を干渉しない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のもう一種のワクチン調整方法はターゲットの型のサブユニットワクチンの調整方法である。それは以下のステップを含む。
（ａ）ターゲットの抗原タンパク質の少なくとも１個の抗原決定基ペプチドのアミノ酸配列を取り、対応しペプチドの野生型核酸配列に転換する。
（ｂ）抗原決定基ペプチドの野生型核酸配列を宿主細胞中において識別、エンコード可能な抗原決定基ペプチドの合成型核酸配列に改変する。
（ｃ）この合成型核酸配列の複数のプライマーを合成し、該プライマーは合成型核酸配列と一部の区域が相同或いは相互に補う5-80個の核酸配列を備え、しかも該各プライマー中の、フォワードプライマーの3’端とリバースプライマーの3’端には5-10個の相補の核酸配列がある。
（ｄ）該各プライマーを利用し、体外においてこの合成型核酸を合成する。
（ｅ）該合成型核酸を結合と移動機能を備える核酸配列に結合し、カルボキシ末端核酸配列のプラスミドと合成プラスミドを形成する。
（ｆ）該合成プラスミドを宿主細胞に転入させ、合成型核酸がエンコードする抗原決定基ペプチドを精製する。
（ｇ）抗原決定基ペプチドを収集し純化する。
【００１０】
本領域中の公知技術中では、タンパク質中の小さな区域のアミノ酸順序が既に知られており、これを用いこのペプチドチェーンに対抗する抗体を製造する。すなわち、この抗体はまた元の完全なタンパク質を認識することができる。よって、本発明のサブユニットワクチン調整法が掲示するのは、抗原決定基配列上のある区域を選択し、これをターゲットの合成ペプチドとするもので、配列の全長を使用するものではない。よって、本方法に適用する配列には制限がなく、機能性区域配列を主とする。例えば、B-細胞或いはT-細胞免疫を触発するタンパク質決定基もまた構造の親水性或いは疏水性に基づき取ろうとする区域を決定することができる。タンパク質構造中において、高親水性を備える部位は一般に細胞内の各ユニットとより良好な反応を生じるため、本発明の最適な抗原決定基ペプチドは、抗原タンパク質構造の親水部位をターゲットとする。使用する区域には制限がなく、選択した数個の区域を合成し、再び接合し大きな区域ペプチドとすることもでき、また抗原決定基配列中において単一の区域を選択することもできる。また、B-細胞或いはT-細胞免疫を触発するタンパク質決定基を接続し融合タンパクとすることができる。
【００１１】
本発明の抗原タンパク質構造或いは配列は自然界の最近或いはウィルス株を直接分離するものではないため、宿主細胞によりターゲットタンパク質の合成と生産を行う必要がある。適用される宿主細胞には制限はないが、微生物細胞、植物細胞、動物細胞が適し、最適な宿主細胞は大腸菌細胞或いは酵母菌細胞である。この他、宿主が生成するターゲットのヌクレオチド（合成型核酸配列を帯びる）は、野生型核酸配列コドンと同一ターゲットのタンパク質の抗原決定基ペプチドでなければならない。さもなければ、本発明方法により調整される抗原の専一性効果を発揮することはできない。実験室内で高安全性の抗原ワクチンの調整に有利である他に、野生型ウィルス株抗原と同様の専一性を達成することができる。但し、ある種の病原のタンパク質は免疫毒性を備え、或いは免疫失調を引き起こすため、あるアミノ酸配列点の突然変異或いは削除により、該毒性を削除することができる時、修正することができる。修正後は、該抗原は安全性と免疫保護性を備える。
【００１２】
本発明中では、野生型のターゲットタンパク質抗原決定基ペプチドを改質した合成型核酸に基づき、その体外合成方法には制限がない。最適な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction, PCR）方法による体外合成である。本発明中の合成型核酸配列中に帯びるカルボキシ末端部分の核酸配列の出所には制限がないが、緑膿菌外毒素の一部分が適し、適用されるカルボキシ末端部分がKDELのアミノ酸配列或いはそれが対応する核酸配列を含むことが最適である。
本発明ターゲットのサブユニットワクチンの調整方法は、さらにサブユニットタンパク質ワクチンの発明を含む。それは保護力価を誘発可能で、トリインフルエンザウィルス（Avian Influenza virus） の感染を効果的に抑制することができる。このタンパク質ワクチン構造は、トリインフルエンザウィルスタンパク質の抗原決定基ペプチド、結合及び移動機能を備えるヌクレオチド、カルボキシ末端がKDELタイプのヌクレオチドを含む。
【００１３】
本発明中において、エンコードされたトリインフルエンザウィルスタンパク質の抗原決定基ペプチドは人工合成で、自然界の鳥類のインフルエンザウィルス株中から分離及び生成したものではない。よって、人体に危害を及ぼす病原に直接接触することはないため、研究者の作業環境の安全性を高め、関連ワクチン或いは薬物研究開発の速度を向上させることができる。
本発明の方法中において、トリインフルエンザウィルスはオルトミクソウィルス  H5N1(orthomyxoviridae H5N1)である。適用されるトリインフルエンザウィルスタンパク質の抗原決定基の核酸配列は改質を経ており、それがエンコードする抗原決定基ペプチドは自然界に存在するウィルス株とは相同であるが、指定使用の宿主細胞中において高度表現の効果を獲得することができる。
同時に、ターゲットのサブユニットワクチン中に使用する合成抗原ターゲットの抗原は、ある野生型ウィルスタンパク質の決定基ペプチドの全長をヌクレオチドに転換後、機能需要に基づき、内一部分のヌクレオチド配列を選択取得し、或いは数部分のヌクレオチド配列を結合し、体外合成方式により合成型ヌクレオチド配列を完成する。同時に、微生物により対応するウィルスタンパク質決定基ペプチド(合成型ペプチド)を生成する。
本発明方法に基づき調整される合成型ペプチドは活体内抗体を誘発する機能を備えるが、該活体は免疫過程において感染されることはないため、相対的に安全な良好なワクチン或いは抗体組成物である。
本発明中に含むターゲットのサブユニットワクチンにおいて、適用されるトリインフルエンザウィルスタンパク質の抗原決定基に制限はないが、少なくとも以下の抗原決定基が組成するグループ、すなわち、H5N1-NS1、H5N1-NP、H5N1-HA中和力価区、H5N1-M2、H5N1-HA酵素反応区より選択することが望ましい。
【００１４】
本発明のターゲットのサブユニットワクチン中は、抗原との相互作用を以外に、このターゲットのサブユニットワクチンはさらにワクチン伝送システム機能と関連があり、また同時に、抗原と細胞の結合と移動などの機能を備える。この結合と移動機能の核酸配列の出所に制限はないが、緑膿菌外毒素(pseudomonas exotoxin)の第一部位（domainI）と第二部位（domainII）が望ましい。この緑膿菌外毒素の第一部位は配位子（ligand）で、この配位子部位の機能はターゲットの細胞のレセプターと結合することで、適用されるターゲット細胞は公知のあらゆる種とすることができるが、少なくとも以下の細胞が組成するグループ、すなわちT細胞、B細胞、樹状細胞、単核細胞、マクロファージから選択することが望ましい。適用されるレセプターは少なくとも以下のレセプターが組成するグループ、すなわちTGFレセプター、IL2レセプター、IL4レセプター、IL6レセプター、1GF1レセプター、CD4レセプター、IL18レセプター、IL12レセプター、EGFレセプター、LDLレセプター、α2球タンパクレセプター、或いはヒートショックタンパクから選択することが望ましい。
本発明のターゲットのサブユニットワクチン中のターゲットの抗原遺伝子の位置は、ワクチン株と相似遺伝子の等位区に嵌入し、本発明が掲示するリバースジェネティック技術を利用し、或いは公知のインフルエンザウィルス８プラスミドシステムに類似の技術を利用し、新型ウィルスに対抗するワクチン株を生成することができる。
本発明の融合タンパクの概念は、別にM2抗原類のワクチンなどの保留共通抗原（conserved common immunuogen）を開発することができる。言い換えれば、本発明融合タンパクを含むワクチンが誘発する免疫反応は、様々な型のインフルエンザウィルス（H5N1、H5N2、H1N1など）を識別可能で、これにより、ウィルスの過度に急速な突然変異に対応可能で、伝統的な方法のように一年おきに別のワクチンに交換する必要はなくなる。この種の考え方は、インフルエンザワクチンの開発における将来のトレンドである。一般の伝統的なワクチン製造の方法は、抗体中和力価（neutralizing antibody titer）の保護効果をのみ重視し、何年か後の該型ウィルスの新たな突然変異株の出現を待つが、この公知方式により製造されるワクチンは新たな突然変異株ウィルスに対応する時、元もとの効果を備えない。しかし、本発明が発展させる融合タンパクを含むワクチンは、様々なタイプのウィルスに対してすべて効果を備える。
【発明の効果】
【００１５】
本発明が掲示するワクチン調整方法は、危険性の高い生物サンプル及びウィルス材料と接触する必要がなく、インターネットを通して該ターゲットの遺伝子のアミノ酸配列を直接獲得することができるため、研究人員は試験管中において安全で効果的なワクチンを完成することができる。この技術を確立し、伝染性疾病に対して高い危険性を備える非感染区国家に対して、ワクチンの準備を行うことは非常に重要な技術である。しかも本発明の融合タンパクの概念は、保留共通抗原（conserved common immunuogen）を開発することができる。言い換えれば、本発明融合タンパクを含むワクチンが誘発する免疫反応は、様々な型のインフルエンザウィルスを識別可能で、これにより、ウィルスの過度に急速な突然変異に対応可能で、伝統的な方法のように一年おきに別のワクチンに交換する必要はなくなる。この種の考え方は、インフルエンザワクチンの開発における将来のトレンドである。一般の伝統的なワクチン製造の方法は、抗体中和力価の保護効果をのみ重視し、何年か後の該型ウィルスの新たな突然変異株の出現を待つが、この公知方式により製造されるワクチンは新たな突然変異株ウィルスに対しては効果を持たない。しかし、下記実施例から分かるように、本発明の融合タンパクを含むワクチンは、様々なタイプのウィルスに対してすべて効果を備える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明が掲示するターゲットのサブユニットワクチンの調整技術はターゲットのタンパク質の配列を取得後、転換と改質を経て、結合と移動機能を含むペプチド配列及びカルボキシ末端KDELタイプペプチドのカプセルを利用し、体外調整されるターゲットタンパク質のプラスミド完成することができる。
以下の実施例はトリインフルエンザウィルスH5N1亜種の数個のタンパク質を抗原ターゲットとする。
上記知己のウィルス感染メカニズムにより、本発明実施例はその内の数個の免疫を誘発するキータンパク質（すなわち、抗原決定基、epitope）中に高度保留（highly conserved）を利用しテストを行う、活体免疫効果の誘発を達成しながら、ワクチン研究開発過程或いはワクチン注射時に該ウィルスの感染が起こらないという最重要課題を解決する。本実施例中で選択する数個のターゲットのタンパク質はH5N1-NS1、H5N1-NP、H5N1-HA、H5N1-M2、H5N1-ＮAの５種である。
内、実験過程で発見されたH5N1-M2ターゲットのサブユニットプラスミドは、宿主大腸菌体内において合成タンパク質を誘発し生成する効率は不良である。この原因は、恐らくM2タンパクそのものが毒性を備えるためで、よってM2中の親脂性に属する部位を除去し、親水性部位のタンパク質だけを残す。修正後に別にH5N1-eM2と命名し、しかもこの修正を経て、大腸菌において大量に表現することができる。配列比較対照がエンコードされたアミノ酸は影響を受けないことが証明しており、しかも高免疫抗原区域はすべて保留されているため、本文中のH5N1-M2抗原はすべてH5N1-eM2を主要代表抗原とする。
【００１７】
実施例１：ターゲットの配列フラグメントの選択
米国国立生物技術データセンター（NCBI）データベース中からH5N1-NS1、H5N1-NP、H5N1-HA、  H5N1-M2、H5N1-ＮAのDNA配列及びその対応するアミノ酸配列を見つける。
ワクチン調整の理論に基づき、抗原タンパク質のペプチドチェーン中、全部が抗原タンパク質全体の反応を備える抗体に対して誘発可能なわけではない。しかし、少なくともタンパク質表面に位置し、しかも水分子と接触可能である。よって、本実施例中では該DNA配列をタンパク質構造の親水疏水区域の判定に用いるソフトウエア（DNA strider V1.0）中に一つ一つ入力し、さらに分析されたマップに基づき、合成を行う区域を選択する。本実施例中においては、親水区域を選択し合成ペプチドの製造を行うが、本実施例の説明は区域選定の条件を制限するものではない点に注意が必要である。すなわち、疏水区など他の類似効果を誘発する可能性のある区域も本発明の保護範囲に含まれる。
上記ソフトの分析結果に基づき、本実施例中では各ターゲットのタンパク質からそれぞれ数個の親水区域を選択する。そのアミノ酸配列は以下を含む。H5N1-NS1は1セクション(SEQ.ID.NO.1) を選択、H5N1-NPはa,b,c,dの4セクションを選択(SEQ.ID.NO.2,3,4,5)、H5N1-HAは1セクション(SEQ.ID.NO.6) を選択、H5N1-eM2は1セクション(SEQ.ID.NO.7) を選択、H5N1-NAは1セクション(SEQ.ID.NO.8) を選択。
導かれたターゲット物は制限酵素の切断と接続を行うため、ターゲットのDNA配列内には切断と接続に用いる必要な制限酵素切断位置が出現しないことが望ましい。よって、常用のソフトを用いDNA配列中にこれら切断位置(restriction map)が存在するかどうかを分析する必要がある。もしあるなら、さらにアミノ酸情報が相同の別の１組の核酸コドンに代える必要がある。また該類ソフトを利用し本DNA両端に設計した制限酵素切断位置が確実に存在することを確認し、切断と接続作業の進行に続く。
【００１８】
実施例２：ターゲットの配列の体外合成
特許文献１が掲示する方法を利用し、野生型アミノ酸がエンコードするヌクレオチド配列に基づき改質を行い、これにより上記タンパク質は大腸菌システムにより大量に表現される。改質の重点は、野生型ウィルス株のヌクレオチドフラグメントにおいて、それが元々表現するアミノ酸に影響しない状況により、また大腸菌宿主システム中において効果的に表現される状況において、単一ヌクレオチドの改質を行う。この改質後のヌクレオチド配列は、多数組のプライマーをそれぞれ利用することができ、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction, PCR）方法により合成を行い、すべてのプライマーが対応する番号は表１の通りである。
【００１９】
【特許文献１】台湾特許第092126644号明細書
【００２０】
【表１】
2007282636.tif 000003
【００２１】
先ず、DNAテンプレートのない重合方式を利用し、フォワード及びリバースプライマーを利用し酵素反応ヌクレオチドフラグメント重合を行う。内、各プライマーの3’端部分にはそれぞれ10-15個のアルカリ基があり、相補の結合に設計されている。重合酵素の読取りと補足を経てPCR DNAプロダクトとなる。
第一回PCRの完成後、0.01〜1μlの重合産物を取り、第二回PCRのテンプレートDNAとする。同時に、適量の第二組のプライマーにdNTPsと反応試験剤、Pfuポリメラーゼを一緒に加え、第二回PCRを開始する。続いて相同の方式により、回を分けて異なる組のプライマーを加えPCRを行った後、改質後のヌクレオチド配列をそれぞれ合成することができる。
それぞれ合成されたヌクレオチドフラグメントは電気泳動試験後、その産物のフラグメントの大きさが予期のものと符合することを確認することができる。図１に示すように、H5N1-NS1は1セクション(396Mb) 、図２ａ-２ｄに示すように、H5N1-NPはa,b,c,dの4セクション(a段は256bp、b段は365bp、c段は464bp、d段は488bp)、図３に示すように、H5N1-HAは1セクション(486bp)、図４に示すように、H5N1-eM2は1セクション、H5N1-NAは1セクション(501bp)である。
【００２２】
実施例３：ターゲットを含む配列のプラスミドを構築
上記の合成された配列計８段(内、NP-a〜d計4段配列)を、それぞれ制限酵素Ecor1、Xho1により修飾後、既に結合と移動機能を備えるペプチド配列及びカルボキシ末端ペプチドの大腸菌プラスミド中に接続する。完成したプラスミドは以下の通りである。
1.pPE-H5N1-NS1-K3プラスミド:
T7起動子を含み、及び抗生物質(Ampicilin)抗性フラグメントを備えるpET15プラスミドシステムにおいて構築し、H5N1-NS1の融合タンパクを表現することができる(プラスミドマップは図５を参照)。
2. pPE-H5N1-NP,a,b,c,d- K3プラスミド:
pET15プラスミドシステムは、H5N1-NP1A~ H5N1-NP1Dの融合タンパクを表現することができる(プラスミドマップは図６ａ-６ｄを参照)。
3. pPE-H5N1-HA-K3プラスミド:
pET15プラスミドシステムは、H5N1-HAの融合タンパクを表現することができる(プラスミドマップは図７を参照)。
4. pPE-H5N1-eM2-K3プラスミド:
pET15プラスミドシステムは、H5N1-eM2の融合タンパクを表現することができる(プラスミドマップは図８を参照)。
5. pPE-H5N1-NA-K3プラスミド:
pET15プラスミドシステムは、H5N1- NAの融合タンパクを表現することができる(プラスミドマップは図９を参照)。
最後に上記プラスミドをそれぞれ異なる菌株細胞中に移植する。
【００２３】
実施例４：ターゲットのたんぱく質の表現と分析
以上のプラスミドを含む菌種の90％以上の細菌はプラスミドと特殊遺伝子：NS1、NP-a〜d、HA、M2、NAを含むことが確認された後、個別にグリセロール保存法により2ml瓶に入れ-70℃で保存する。
無菌室において、以上の保存菌苗を2ml取り、滅菌した500mlフラスコに接種する。その内部には200ml LB(+500μg/ml Amp)を含み、37℃回転式培養箱において150rpm回転速度で10〜12時間培養し、種菌培養を完成する。該菌苗のOD600は1.0±0.3に達する。
無菌室において、50ml菌種駅をそれぞれ滅菌した3000 mlフラスコ、計８本に接種する。該フラスコ内には1250ml LB(+500μg/ml Amp＋50 ml 10% Glucose)を含み、37℃回転式培養箱において150rpm回転速度で2〜3時間培養し、測定OD600が0.3±0.1である時、最終濃度が80mmpのIPTGタンパク質誘導剤を注入し、37℃回転式培養箱において150rpm回転速度で2時間培養し、タンパク生産のステップを完成する。
続いて、8M尿素法を利用し、インクルージョン体(inclusion bodies)内の、PE-H5N1-NS1-K3、PE-H5N1-NP-a-K3~ PE-H5N1-NP-d-K3(図１０参照)、PE-H5N1-HA-K3(図１１参照)、PE-H5N1-eM2-K3(図１２参照)、PE-H5N1-NA-K3(図１３参照)などの抗原タンパク質フラグメントを抽出及び溶出する。該抗原タンパク質フラグメントはそれぞれ10l細菌液（1回量、lot）を抽出し、300〜400mgの抗原量を得ることができ、合計各300mg抗原は3〜9000剤量以上の注射量を獲得することができる。
ウエスターンブロッティング法(Western-blotting method)、coomasie blue染色法、SDS-PAGE電気泳動分析法を利用し、並びに密度計（densitometer）により電気泳動棒が帯びる密度を測定し、各抗原溶液のタンパク質定量とする。上記抗原タンパク質を各0.03±0.003mg取り、注射薬剤高剤量の主成分とする(総抗原のタンパク量は0.12±0.01mg)。各0.01±0.0001mgを取り、注射薬剤低剤量の主成分とする(総抗原のタンパク量は0.04±0.004mg)。
【００２４】
実施例５：トリインフルエンザワクチンの製造
クリーンレベル100の無菌操作台内において、各抗原溶液を8M尿素40c.cまで添加する。40c.cのISA206を添加し、無菌撹拌バケツにおいて50rpmで10分間撹拌後、無菌水を徐徐に400c.c.まで注入し、撹拌速度は100rpmまで撹拌後、１時間撹拌する。
撹拌バケツを調剤室に送り、剤量１c.c.の滅菌済み注射ボトルに入れ、蓋をし、ラベルを貼り、100剤のトリインフルエンザワクチン注射剤を製造する。
【００２５】
実施例６：マウスによるワクチンの免疫テスト
PE-H5N1-eM2-K3抗原を例とする。0.3±0.03mgの注射剤超高剤量(VH)を取り、0.1±0.01mgを注射剤高剤量(H)とし、0.03±0.003mgを注射剤中剤量(M)とし、0.01±0.001mgを注射剤低剤量(L)とする。異なる剤量のアジュバント(Sepec ISA 206)を混合後、それぞれ免疫を６週間与えたBalc/Cマウス、各組計１２匹に、免疫を与えた後２週間以内に再度一回免疫を計３〜４回与える。
イミュニゼーション後、２週間以内に採血し、ELISAの免疫テストを行う。M2 anti-specific IgGから言えば、抗eM2-ELISAの１０倍希釈終点力価検査から、マウスは二回目のイミュニゼーション後、IgG抗体力価が測定され始め、高剤量(H)（0.1±0.01mgと超高剤量(VH)（0.3±0.03mg）の誘発力価指数は相似し、三回目のイミュニゼーション後は最高に達し、四回目後の力価は増加しないことが分かった。中剤量(M)と低剤量(L)が誘発する抗体力価は比較的低いが、イミュニゼーション四回目は共に10万倍の力価に達した。結果は図１４に示す。
【００２６】
実施例７：産卵レッグホーン種鶏によるワクチンの免疫テスト
PE-H5N1-eM2-K3抗原タンパク質を例とする。
この融合抗原0.1±0.01mgを注射剤剤量とし、適当なアジュバントと調整し、産卵期のレッグホーン種鶏にイミュニゼーション注射し、３〜４回のイミュニゼーション後、その黄身はトリインフルエンザの高力価IgY抗体を蓄積することができる。ELISAの１０倍希釈終点力価は10万倍以上である。しかし、もし免疫抗原がKDEL配列の無いPE-H5N1-eM2或いはサブユニットeM2タンパク抗原である時には、そのIgY力価は非常に低く、およそ無イミュニゼーションの空白組の10から100倍に過ぎない。結果は図１５に示す。
【００２７】
実施例８：ICRマウスを利用し行うワクチン免疫及び攻毒テスト
本発明が表現する融合タンパクはH5N1型トリインフルエンザウィルスの共通免疫抗原(conserved common immunuogen)である。本領域中の通常知識を備える者はみなH1N1型はH5N1型のN1特性を有しH5N2型にはH5N1型のH５特性を有することを知っている。よって本発明が表現する融合タンパクはH5N1型トリインフルエンザウィルス抗原であるが、本発明融合タンパクのワクチンはH1N1型、或いはH5N2型に対しても有効性を備える。H5N1型トリインフルエンザウィルスは人体にとっては極めて強力なウィルス株であるため、このウィルスにより実験を行うことには適していない。よって、本実施例は本発明のワクチンを使用しイミュニゼーション後、それぞれH1N1型、或いはH5N2型トリインフルエンザウィルスを用い攻毒を行う。H1N1型、或いはH5N2ウィルスはそれぞれH5N1型ウィルスのN1型及びH5型の特性を備えるため、本発明のワクチンがH5N1型インフルエンザウィルスに対して有効であることを証明することができる。
【００２８】
Ａ．H1N1型ヒトインフルエンザウィルス攻毒：
先ず、ICRマウスを５グループに分ける。各グループは６匹のICRマウスである。抗原タンパク質をそのそれぞれの注射剤量と適当なアジュバントとを以下のように調合する。グループIは注射抗原タンパク質PE-H5N1-eM2-K3（H、0.1±0.01mg）、グループIIは注射抗原タンパク質PE-H5N1-NP(a+b+c+d) -K3（H、0.1±0.01mg）、グループIIIは注射抗原タンパク質PE-H5N1-HA-K3（H、0.1±0.01mg）、グループIVは注射抗原タンパク質PE-H5N1-NS1-K3（L、0.01±0.001mg）、グループVは空白組とする。
３〜４回のイミュニゼーション後、H1N1型ウィルスを使用し、既にイミュニゼーションしたICRマウスに攻毒を行う。攻毒４日後に、各組ICRマウスの唾液にウィルスが存在するかどうかを検査し、各組ICRマウスの健康状態を観察する。その結果は表２に示す。
【００２９】
【表２】
2007282636.tif 000004
【００３０】
上記表２から見ると、本発明の抗原タンパク質イミュニゼーション後のICRマウスは、H1N1型ヒトインフルエンザウィルス攻毒を受けて４日後、その唾液にウィルスを分泌するICRマウス数は空白組に比べ少ない。しかも、高剤量のPE-H5N1-eM2-K3及びPE-H5N1-NP-K3２種の抗原タンパク質効果は最高で、ICRマウスのウィルス分泌と病気にかかったICRマウス数を減少させることができる。
他の抗原タンパク質の効果は上記２種の抗原タンパク質の効果には及ばないが、それでも空白組よりは良い。
【００３１】
Ｂ．H5N2型トリインフルエンザウィルス攻毒：
先ず、ICRマウスを６グループに分ける。各グループは５匹のICRマウスである。抗原タンパク質をそのそれぞれの注射剤量と適当なアジュバントとを以下のように調合する。グループIは注射抗原タンパク質PE-H5N1-eM2-K3（H、0.1±0.01mg）、グループIIは注射抗原タンパク質PE-H5N1-NP(a+b+c+d) -K3（H、0.1±0.01mg）、グループIIIは注射抗原タンパク質PE-H5N1-HA-K3（L、0.01±0.001mg）、グループIVは注射抗原タンパク質PE-H5N1-NS1-K3（L、0.01±0.001mg）、グループVは注射抗原タンパク質PE-H5N1-NA-K3（H、0.1±0.01mg）、グループVIは空白組とする。
３〜４回のイミュニゼーション後、H1N2型ウィルスを使用し、既にイミュニゼーションしたICRマウスに攻毒を行う。攻毒４日後に、各組ICRマウスの唾液にウィルスが存在するかどうかを検査し、各組ICRマウスの健康状態を観察する。その結果は表３に示す。
【００３２】
【表３】
2007282636.tif 000005
【００３３】
上記表３から見ると、空白組に比べ、本発明の抗原タンパク質イミュニゼーション後のICRマウスは、H5N2型トリインフルエンザウィルス攻毒を受けて４日後、どの種の抗原タンパク質をワクチンとして使用したとしても、すべてその唾液にウィルスを分泌するICRマウス数は減少している。しかも、各種抗原タンパク質の効果は空白組より明らかに優れている。
この他、攻毒１４日後において、PE-H5N1-eM2-K3イミュニゼーションのICRマウスを解剖し、その肺を組織切片とし、未イミュニゼーションで攻毒を受け、及び未イミュニゼーションで未攻毒のマウスと比較し、肺に発生する間質性肺炎の重大性を判断した。その結果はそれぞれ図１６、表４に示す。
点数標準：最低は１、軽微は２、中度は３、重篤は４で、これ以外にもし多所性なら１を加え、拡散性なら２を加え、亜急性なら１を加える。最重篤の総点数は７点で、間質性肺炎が軽微な状態は３点である。
図１６と表４から分かるように、PE-H5N1-eM2-K3イミュニゼーションを経た組は、未イミュニゼーションであるがH5N2ウィルスの感染を受けた組に比べ、間質性肺炎の症状が軽微な状態で、未攻毒組のマウスの状態に近い。
【００３４】
【表４】
2007282636.tif 000006
【００３５】
実施例９：養鶏場におけるフィールドテスト
H5N2型トリインフルエンザウィルスが感染が爆発した養鶏場において、フィールドテストを行う。使用する複合ワクチンの各剤量には、0.05mg PE-H5N1-eM2-K3、0.01mgのPE-H5N1-NP-a-K3、0.01mgのPE-H5N1-NP-b-K3、0.01mgのPE-H5N1-NP-c-K3、0.01mgのPE-H5N1-NP-d-K3、0.05mgのPE-H5N1-HA-K3、0.05mgのPE-H5N1-NA-K3、10％のISA２０６を含む。その製作方式は実施例５の通りである。該養鶏場の鶏に対して予防注射を行い、しかもイミュニゼーションが４〜５回になるまで、２週間毎に１回注射した。予防注射を行っていない空白組の鶏と比較すると、図１７に示すように、上記複合ワクチン予防注射を行ったイミュニゼーション組鶏の死亡率は５%以下に低下したが、予防注射を行っていない空白組の鶏の死亡率は時間に従い徐徐に６０〜７０％にまで上がった。
別に、イミュニゼーション組の雌鶏の産卵率も、多数回のイミュニゼーションに従い徐々に上がった。その結果は図１８に示す。さらに、３、４、５回のイミュニゼーションを行った組の雌鶏が産んだ卵を取り出し、その黄身が生み出すIgY抗体力価を測定し、10倍配列希釈終点力価テスト(ten-fold serial end-point diffusion test)を行った。図１９に示すように、HA、NA、M2、PE或いは大腸菌に対して、その力価は多数回のイミュニゼーションに従い徐々に上昇することが分かった。しかも５回のイミュニゼーションを行った雌鶏が産んだ卵を、ELISA方式を使用し、その黄身が生み出すIgYのH5N1- M2、H5N1- HAに対する抗体力価を測定したところ、500倍希釈を経て、明らかな正反応が出現することが分かった。その結果はそれぞれ図２０、２１に示す。
本発明関連生物性材料は既に2007年にドイツのDSMZに寄託してある。その取得番号を表５に示す。
【００３６】
【表５】
2007282636.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】PCRが合成するH5NI-NS1フラグメントの電気泳動図(396bp)である。
【図２ａ】PCRが合成するH5NI-NＰフラグメントの電気泳動図(256bp)である。
【図２ｂ】PCRが合成するH5NI-NＰフラグメントの電気泳動図(365bp)である。
【図２ｃ】PCRが合成するH5NI-NＰフラグメントの電気泳動図(464bp)である。
【図２ｄ】PCRが合成するH5NI-NＰフラグメントの電気泳動図(488bp)である。
【図３】PCRが合成するH5NI-HAフラグメントの電気泳動図(486bp)である。
【図４】PCRが合成するH5NI-NAフラグメントの電気泳動図(501bp)である。
【図５】H5NI-NS1のプラスミドマップである。
【図６ａ】H5NI-NPのプラスミドマップ（aフラグメント）である。
【図６ｂ】H5NI-NPのプラスミドマップ（bフラグメント）である。
【図６ｃ】H5NI-NPのプラスミドマップ（cフラグメント）である。
【図６ｄ】H5NI-NPのプラスミドマップ（dフラグメント）である。
【図７】H5NI-HAのプラスミドマップである。
【図８】H5NI-eM2のプラスミドマップである。
【図９】H5NI-NAのプラスミドマップである。
【図１０】PE-H5N1-NP-A-K3〜PE-H5N1-NP-d-K3タンパク質の表現結果図である。内、a-dフラグメントの結果はそれぞれ図上に示す。
【図１１】PE-H5N1-HA-K3タンパク質の表現結果図である。
【図１２】PE-H5N1-eM2-K3タンパク質の表現結果図である。
【図１３】PE-H5N1-NA-K3タンパク質の表現結果図である。
【図１４】実施例６中において、各種様々な剤量のPE-H5N1-eM2-K3ワクチンをマウスに与えた後のM2抗体レベルの変化状況を示す。
【図１５】実施例７中において、レッグホーン種の鶏にイミュニゼーション後にその黄身中のIgY抗体の改変状況を示す。
【図１６】実施例８中において、攻毒１４日後のマウス肺の病理解剖図である。
【図１７】実施例９中において、イミュニゼーション期間の鶏の死亡率を示す。
【図１８】実施例９中において、イミュニゼーション期間の鶏の産卵率を示す。
【図１９】実施例９中において、イミュニゼーション期間の鶏が産卵した卵の抗体力価変化状況を示す。
【図２０】実施例９中において、イミュニゼーション期間の鶏が産卵した卵の抗体を500倍に希釈後、H5N1-M2抗原に対するEＬISAテストの結果を示す。
【図２１】実施例９中において、イミュニゼーション期間の鶏が産卵した卵の抗体を500倍に希釈後、H5N1-HA抗原に対するEＬISAテストの結果を示す。
【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１５】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【外国語明細書】
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【配列表】
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