(57)【要約】【課題】癌および再狭窄を治療する組成物を提供する。【解決手段】治療が必要な癌患者をインビボで処置するための組成物であって、（ｉ）治療に有効な量の、ｐ２１をコードする遺伝子を含有する発現ベクター；および（ｉｉ）医薬担体を含有し、該発現ベクターが、免疫療法剤、遺伝子治療剤、サイトカインまたはプロドラッグ変換酵素をコードする第二遺伝子をさらに含み；該第二遺伝子が、該ｐ２１をコードする遺伝子と同じ読み枠にある組成物を提供することによって上記課題が解決された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療が必要な癌患者をｉｎ  ｖｉｖｏで処置するための組成物であって、
（ｉ）治療に有効な量の、ｐ２１をコードする遺伝子を含有する発現ベクター；および
（ｉｉ）医薬担体
を含有し、ここで、該発現ベクターが、免疫療法剤、遺伝子治療剤、サイトカインまたはプロドラッグ変換酵素をコードする第二遺伝子をさらに含み；
そして、ここで、該第二遺伝子が、該ｐ２１をコードする遺伝子と同じ読み枠にある、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐ２１をコードする遺伝子を含有する発現ベクターと医薬担体とを含有する組成物に関し、この組成物を投与することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで再狭窄および癌を治療および予防する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
細胞増殖と関係のある異常性を有する変異体イースト菌株の研究により、細胞周期調節タンパク質の同定は非常に容易になった。イーストにおいて規定されている遺伝子産生物の中で、Ｆａｒ  １（１）の哺乳類相同体、ｐ２１はサイクリン依存キナーゼの活性を変化させ、かつ細胞周期プログレッションおよび配列と関連づけられている（２〜１３）。
【０００３】
ＷＡＦ１、ＣＩＰ１またはＳＤＩ１としても公知のｐ２１は（１１、１２、１４、１５）、ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子の下流ターゲットであり、悪性トランスフォーメーションと間接的な関係があった（１５〜１８）。ＤＮＡダメージへの応答におけるｐ５３の誘発により、Ｇ１チェックポイントは静止するが（１６〜１９）、そのときＤＮＡ修復はＳ相におけるＤＮＡ複製の前に達成されている。ｐ５３の下流エフェクターとしての想像される役割と矛盾がなく、ｐ２１は増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）依存ＤＮＡ複製を抑制するがｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＤＮＡ修復は抑制しないことがわかっている（２０）。
【０００４】
Ｚｈａｎｇらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｐ２１の研究をしている（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９４）８：１７５０）。ｐ２１がキナーゼ阻害剤として作用するので、これまでは正常細胞が活性サイクリンキナーゼを実質的に全く含有しないことが予想されていた。ｐ２１含有サイクリンキナーゼが活性および不活性の両状態において存在することを示すことにより、Ｚｈａｎｇらは、ｐ２１が正常細胞における細胞周期プログレッションをコントロールするのに含まれると説明している。
【０００５】
Ｚｈａｎｇらは、種々の腫瘍ウイルス腫瘍性タンパク質でトランスホームした線維芽細胞において、サイクリンキナーゼは二成分状態で存在し［サイクリン／ＣＤＫ］；その一方、正常な線維芽細胞においては、ｐ２１を含有する第四級複合体に複数のサイクリンキナーゼが存在することを見いだした［サイクリン／ＣＤＫ／増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）／ｐ２１］。活性な複合体は、シングルｐ２１分子を含有する。対照的に、不活性な複合体は複数のｐ２１サブユニットを有している。
【０００６】
化学量論におけるｐ２１の変化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける複合体の活性から不活性への変換を説明するには十分であるが、Ｚｈａｎｇらは「ｐ２１とサイクリンキナーゼとの結合は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける他の調節機序と絡み合っているに違いない」と確信している。Ｚｈａｎｇらは「ｐ２１の非抑制レベルと結合することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてこれらのＣＤＫ改質酵素にどのような影響があったのかは知られていない」と示している。
【０００７】
国際公開第９４／０９１３５号公報には、サイクリン複合体のサブユニット成分の検出を含む、細胞のトランスフォーメーションを診断するための方法および診断キットが記載されている。特に、該方法はサイクリン、ＰＣＮＡ、ＣＤＫｓおよびｐ２１、ｐ１９およびｐ１６などの低分子量ポリペプチドの相互作用と関係する。
【０００８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるサイクリンキナーゼ抑制活性が明らかであるにも関わらず、腫瘍形成におけるｐ２１の役割およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける悪性表現型を逆転するその能力はこれまで規定されていなかった。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。   
【非特許文献１】Ｃｈａｎｇ  ＆  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｃｅｌｌ  ６３，９９９  （１９９０）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的の一つは癌（腫瘍形成）をｉｎ  ｖｉｖｏで治療および予防する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の第二の目的は、再狭窄をｉｎ  ｖｉｖｏで治療および予防する方法を提供することである。
【００１１】
本発明の第三の目的は、末期分化（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を誘発することにより細胞における抗腫瘍効果を誘発する方法を提供することである。この方法は、腫瘍の免疫認識を潜在的に容易にし得る細胞表面タンパク質の発現を変化させるのに、または二次的に細胞成長を阻害し得る因子の分泌を引き起こすのに有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明により、腫瘍細胞成長および再狭窄におけるｐ２１サイクリン依存キナーゼ阻害剤の役割が決定された。ｐ２１はｐ５３により誘発され（６，７，１５〜１８）、したがってｐ５３腫瘍抑制の下流エフェクターとして関係付けられていた（２３）。本発明者らは、ｐ２１発現はこれらの腫瘍および再狭窄抑制効果をｉｎ  ｖｉｖｏで生ずるのに十分であることを最初に直接的に示した。
【００１３】
ｐ２１発現により、分化に関連して、ｐ２１が接着分子等の遺伝子発現に直接影響を与え得るメカニズムをＮＦ−κＢが提供することにより、転写活性が容易になることを見いだした。腫瘍成長および再狭窄の抑制並びに分化した表現型の誘発は、遺伝子発現のパターンの変化から生じ、ＮＦ−ｋＢにより一部分媒介されており、これは、末期分化および成長静止に到るｐ２１誘発転写制御に起因する。末期分化の誘発により抗腫瘍効果を誘発するこれまでの試みは、細胞毒性薬剤またはホルモンの使用を含むものであり（２５〜２８）、この効果を達成するのに変化しやすい成功を有するものであった。
【００１４】
本発明は、治療が必要な癌患者をｉｎ  ｖｉｖｏで処置するための組成物に関し、この組成物は、（ｉ）治療に有効な量の、ｐ２１をコードする遺伝子を含有する発現ベクター；および（ｉｉ）医薬担体を含有し、ここで、該発現ベクターは、免疫療法剤、遺伝子治療剤、サイトカインまたはプロドラッグ変換酵素をコードする第二遺伝子をさらに含み；そして、ここで、該第二遺伝子は、該ｐ２１をコードする遺伝子と同じ読み枠にある。
【００１５】
本発明はまた、治療が必要な再狭窄患者をｉｎ  ｖｉｖｏで処置するための組成物に関し、この組成物は、（ｉ）治療に有効な量の、ｐ２１をコードする遺伝子を含有する発現ベクター；および（ｉｉ）医薬担体を含有し、ここで、該発現ベクターは、免疫療法剤、遺伝子治療剤、サイトカインまたはプロドラッグ変換酵素をコードする第二遺伝子をさらに含み；そして、ここで、該第二遺伝子は、該ｐ２１をコードする遺伝子と同じ読み枠にある。
【００１６】
本発明はまた、治療が必要な再狭窄患者をｉｎ  ｖｉｖｏで処置するための組成物に関し、この組成物は、治療に有効な量の、プロドラッグ転換酵素をコードする遺伝子に融合させたｐ２１をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む。
【００１７】
好ましくは、前記プロドラッグ変換酵素は、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼまたはβ−グルクロジナーゼである。
【００１８】
好ましくは、前記組成物は、医薬上許容できる担体をさらに含む。
【００１９】
好ましくは、前記発現ベクターは、ウイルスベクターである。
【００２０】
本発明はまた、治療が必要な再狭窄患者をｉｎ  ｖｉｖｏで処置するための組成物に関し、この組成物は、治療に有効な量の、ｐ２１をコードする遺伝子を含有する発現ベクターを含み、ここで、該ｐ２１をコードする遺伝子は、プロドラッグ変換酵素をコードする遺伝子に融合している。
【００２１】
好ましくは、前記プロドラッグ変換酵素は、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼまたはβ−グルクロジナーゼである。
【００２２】
好ましくは、前記組成物は、医薬上許容できる担体をさらに含む。
【００２３】
好ましくは、前記発現ベクターは、真核生物ベクターまたはウイルスベクターである。
【００２４】
好ましくは、前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。
【発明の効果】
【００２５】
ｐ２１遺伝子は、細胞周期プログレッションに影響を与えるサイクリン依存キナーゼ阻害剤をコードするが、腫瘍成長を変えることにおけるこの遺伝子産生物の役割はこれまで確立されていなかった。本発明により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける悪性細胞の成長は、ｐ２１の発現により抑制されることが見いだされた。ｐ２１の発現により、Ｇ０／Ｇ１における細胞の蓄積は、形態変化およびおよび細胞分化となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、治療が必要な患者に、（ｉ）ｐ２１をコードする遺伝子を含有する発現ベクター；および（ｉｉ）医薬的に許容できる担体を含有する組成物の腫瘍抑制量を投与することを含む、癌または再狭窄の治療方法を提供する。
【００２７】
Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：７０１（１９９３）に記載のｐ２１をコードするｃＤＮＡは、本明細書に含まれるものとする。
【００２８】
本発明に有用な適当な発現ベクターとしては、真核生物またはウイルスベクターがあげられる。有用な真核生物ベクターとしては、ｐＲｃＲＳＶおよびｐＲｃＣＭＶまたは他のＲＳＶ、ＣＭＶまたは細胞増強剤および種々のポリアテニレート配列を有するｐ２１の発現を推進するプロモーターがあげられる。ウイルスベクターを使用するのが好ましい。
【００２９】
ウイルスベクター系は、不完全遺伝子を含有する哺乳類に遺伝子をトランスファーするのに非常に効率的として示されてきた。例えば、本明細書に含まれる、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．９２（６Ａ）：４４Ｓ−５２Ｓ（１９９２）；  Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（１４）：６４８２−６４８６（１９９２）を参照のこと。複製およびトランスホーム能力を付与したレトロウイルスを使用するのが好ましい。
【００３０】
本発明に有用なｐ２１を発現する適当なウイルスベクターとしては、（本明細書に含まれる）Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎ．３：２１９（１９９３）に記載されているアデノウイルスベクター、ｐＡｄ−ＢｇｌＩＩと組み合わせたＡｄ５−３６０が挙げられる。アデノウイルスベクターを使用するのが好ましい。
【００３１】
好ましいアデノウイルスベクターとしては：（本明細書に含まれる）Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎ．３：２１９（１９９３）に記載されているＡＤＶ；またはタイプ７００１、またはタイプ１または１２を含む他のアデノウイルスタイプ（Ｒａｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６７：２１５９（１９９３）；  Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：７０１（１９７０）に記載されている）があげられる。
【００３２】
本明細書に含まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ”（２ｎｄ  ｅｄ）：ｐｐ．Ｅ．５５．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）に記載されているような従来の組換え技術を使用して、ｐ２１をこれらの発現ベクターに挿入し、細胞トランスフェクションに使用することができる。また、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎ．３：２１９−２２３またはＬｅｍａｒｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（１４）：６４８２−６４８６（１９９２）に記載されている相同組換え技術を使用して発現ベクターを調製することができる。
【００３３】
本発明の発現ベクターは、さらにプロモーター等の調節要素および抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーを含有することができる。
【００３４】
ウイルスベクターがｉｎ  ｖｉｖｏで摂取されて組み込まれ、挿入された作成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を含むウイルスＤＮＡを発現することは詳しく確立されている。例えば、本発明に含まれる、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（４）：２３００−２３０３（１９９３）；Ｃｒｙｓｔａｌ  Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．９２（６Ａ）：４４５−５２５（１９９２）；  Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（１４）：６４８２−６４８６（１９９２）を参照のこと。
【００３５】
別の態様において、発現ベクターの他にも他の送達システムを使用してｐ２１タンパク質を送達できることもまた理解される。主に、リポソームおよびＤＮＡ接合体の使用を含むこれらの技術は、上述した発現ベクターにより提供されるものと同様の送達率を提供することが期待されている。すなわち、発現ベクターを介してｐ２１遺伝子を発現するよりも、ビヒクルにｐ２１の治療量を混合することも可能なのである。
【００３６】
第二の別の態様において、ｐ２１を融合タンパク質として発現することができる。この態様において、ｐ２１をコードする遺伝子は、免疫療法剤、遺伝子治療剤（ＨＬＡ−Ｂ７等）、タンパク質（サイトカイン、好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１２等）、プロドラッグ変換酵素（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼおよびβ−グルクロジナーゼ）またはシス−プラチナ等の抗癌剤をコードする遺伝子に融合する。
【００３７】
融合遺伝子は、本明細書に含まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｒｌ”（２ｎｄ  ｅｄ）：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，特に、１７章に記載されているものから産生されるタンパク質である。
【００３８】
チミジンキナーゼは、本明細書に含まれるＡＵ  ８７７６０７５に記載されているようにして得ることができる。β−グルクロニダーゼおよびそれらの融合タンパク質は、本明細書に含まれる米国特許第５，２６８，４６３号および第４，８８８，２８０号公報に記載されている。シトシンデアミナーゼおよびそれらの融合タンパク質は、本明細書に含まれる国際公開第９４２８１４３号公報に記載されている。
【００３９】
また、ウイルスベクターとリポソームとの複合治療は、非常に見込みがあり、本発明における使用が予想される。Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８（４）：２３００−２３０３（１９９３）は、本明細書に含まれる。
【００４０】
リポソームは、非常に効率的に病気の組織へ活性剤を送達することが知られている。例えば、医薬的または他の生物学的に活性な薬剤を効率的にリポソームに組み込ませて細胞に送達する。このように、本発明の作成物を適当にリポソームに形成して、選択した組織に送達することもできる。例えば商標名ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）で入手できるカチオン性脂質から製造されるリポソームが好ましい。リポソームベースの治療について特に興味深いのは、系または代謝から通過する前は、リポソームは比較的安定で、比較的寿命が長いという事実である。さらに、リポソームは主要な免疫応答を生じることはない。
【００４１】
したがって、本発明の一観点において、ｐ２１をコードする遺伝子を含有するベクターをリポソームに組み入れて、特定の組織へ作成物を送達するのに使用する。リポソームは、作成物が細胞をトランスフェクトし、該細胞により発現され、最終的にはｐ２１タンパク質を産生する手助けをするであろう。
【００４２】
本発明の組成物は、治療上効果的な量のｐ２１発現ベクターおよび医薬上許容できる担体である。ウイルスベクターを投与するために、適当な担体、賦形剤、および他の薬剤を製剤に混合してｐ２１の発現を向上させることができる。
【００４３】
多くの適当な製剤を、全ての薬品化学者に公知の処方集に見いだすことができる：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７５），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８０４２（Ｃｈａｐｔｅｒ  ８７：
Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒ）。これらの製剤としては、例えば、散剤、ペースト、軟膏剤、ゼリー、ワックス、脂質、無水吸収塩基（ａｎｈｙｄｒｏｕｓ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｂａｓｅｓ）、水中油滴型または油中水滴型エマルション、エマルションカルボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカルボワックスを含有する半固体混合物があげられる。
【００４４】
ウイルス粒子が製剤中で失活し、該製剤が生理学的に相溶性である場合、前述した任意の製剤がウイルスベクターによる治療に適当である。
【００４５】
投与されるｐ２１の量は、患者の大きさおよび癌の進行に対する状態に依存する。従来技術を使用してベクターの制御要素を変更したり、投与されるウイルスベクター力価の量を変えることにより、ｐ２１発現量を患者の要求にあわせて調節することができる。一般的には、治療する細胞当たりおよそ５０ウイルスベクターを送達するのが望ましい。アデノウイルスについては、製剤は一般的に１ｍＬ当たり１０10ウイルス感染ユニットのオーダーで含有する。レトロウイルスについては、わずかにことなる力価を適用できる。本明細書に含まれる、Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  ３８：２０７−２１３（１９８７）を参照のこと。適当な投与量レベルを決定するのに、本明細書に含まれる、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：６４１−６４７（１９９２）；Ｌｉｕ
ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１８：８９−９６（１９９２）；  ａｎｄ  Ｌｅｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：３３１−３５８（１９９１）をさらに参考にできる。
【００４６】
発現ベクターを投与するために調製される特定の製剤に依存して、本発明の組成物の投与は種々の方法により達成することができる。本発明の組成物は発現ベクター（または発現ベクターを含有するリポソーム）を、本明細書に含まれる米国特許第５，３２８，４７０号明細書に記載されているように、腫瘍に直接投与するのが好ましい。
【００４７】
乳房、腎臓、メラノーマ、前立腺、グリア芽腫、ヘプトカルシノーマ（ｈｅｐｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大腸および肉腫癌タイプを本発明により治療することができる。これらのタイプの癌を診断およびモニターすることは当該技術分野において周知である。
【００４８】
血管形成由来の動脈外傷としては、再狭窄に到り得る一連の増殖性（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）、血管作動性および炎症応答があげられる。この方法をｉｎ  ｖｉｖｏで刺激する数種の因子がこれまでに規定されてきたが、応答を制限する特定の細胞遺伝子産生物の役割はよく理解されていない。本発明者らは、ｐ２１がバルーンカテーテル外傷への増殖性応答を限定するように作用することを見いだした。血管内皮および平滑筋細胞成長を、ｐ２１  ＣＫＩがサイクリン依存キナーゼおよび細胞周期のＧ１相の進行を抑制する能力により静止させた。再狭窄は、本明細書に含まれる、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＣＣ  ２３（６）：１２７８（１９９４）ａｎｄ  Ｌａｎｄａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ３３０（１４）：９８１（１９９４）に記載されているように診断およびモニターすることができる臨床的な状態である。
【００４９】
本発明の組成物を使用して全ての哺乳類、特にヒトを治療することができる。
【００５０】
本発明の組成物は、免疫療法剤、遺伝子治療剤（ＨＬＡ−Ｂ７等）、タンパク質（サイトカイン、好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１２）等、プロドラッグ変換酵素（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼおよびβ−グルクロジナーゼ等）およびシス−プラチナ等の抗癌剤と組み合わせて投与することができる。また、本発明の組成物は、上述の免疫療法剤、遺伝子治療剤、タンパク質、プロドラッグ変換酵素および抗癌剤をコードする遺伝子を含有する発現ベクターと組み合わせて投与することもできる。また、該組成物は養子細胞移入治療中に投与することもできる。
【００５１】
これまで本発明について一般的に記載してきたが、具体的なものとして与えたある特定の実施例を参照することによりさらに本発明を理解できる。特に規定しない限り、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００５２】
（実施例１：ｉｎ  ｖｉｖｏで再狭窄を治療するためのｐ２１サイクリン依存キナーゼの使用）
本研究において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける内皮および平滑筋細胞およびｉｎ
ｖｉｖｏにおける動脈バルーン外傷のブタモデルにおいてｐ２１発現が与える影響を分析した。
【００５３】
（細胞培養およびトランスフェクション）
発達の第一段階にある（ｐｒｉｍａｒｙ）ブタ血管内皮および平滑筋細胞を、６月齢の国産のヨークシャーブタの大動脈からとり出し、第２と第５継代（ｐａｓｓａｇｅ）の間のものを使用した。内皮および平滑筋細胞を、１０％ＦＢＳと混合した培地１９９で７０％集密まで増殖させた。ＤＭＥＭおよび２％ＦＣＳ中で１時間、細胞をＡＤＶ−ｐ２１またはＡＤＶ−△Ｅ１（ＭＯＩ３００／ｃｅｌｌ）に感染させ、普通培地を１時間後に添加した。コントロール細胞は感染させないままであり、１０％ＦＢＳと混合したＭ１９９中で保有した。２４時間後、１ウェルあたり６×１０4ｃｅｌｌで６枚のウェルに細胞を分けた。細胞を０、２、５、７および１０日で収集し、血球計数器で測定した。細胞生存力をトリパンブルーエクスクルージョンにより評価した。
【００５４】
（細胞周期分析）
上述したように、細胞を、ＭＯＩ３００／ｃｅｌｌにおいてＡＤＶ−△Ｅ
１またはＡＤＶ−ｐ２１ベクターに感染させ、収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、７０％エタノール（ＥｔＯＨ）中（Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７９，５６３−５７１（１９９４））、４℃において３０分間固定した。その細胞を、ＰＢＳ１ｍＬ中、３７℃において３０分間、１Ｕのデオキシリボヌクレアーゼ−フリーリボヌクレアーゼで処理し、０．０５ｍｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＢＳ中で１０×ストックとして調製したもの）に再懸濁した。細胞を、ＦＡＣＳｃａｎモデル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてフローサイトメトリーにより分析した。蛍光測定を集積してＤＮＡ含有量の分布曲線を作成した。細片のため蛍光発生は分析前に減じた。
【００５５】
（アデノウイルスベクター）
組換えアデノウイルスベクター、ＡＤＶ−ｐ２１を、サブゲノム３６０  ＤＮＡ、Ｅ３領域において欠失しているＡｄ５誘導体とｐ２１発現プラスミド、ｐＡｄ−ｐ２１との間で相同組換えにより構成した。つまり、ｐ２１の発現を制御するラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）を使用して、ｐ２１発現ベクターのＨｉｎｄ  ＩＩＩ−ＸｂａＩ  フラグメントをｐＡｄ−Ｂｇｌ  ＩＩのＢｇｌ
ＩＩサイトに導入することにより、ｐＡｄ−ｐ２１プラスミドを調製した（Ｈｅｉｃｈｍａｎ  ＆  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  Ｃｅｌｌ  ７９，５５７−５６２（１９９４））。これらの複製欠損Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ欠失ウイルスの構造を、サザンブロッティングにより確認した。組換えウイルスは全て、上述したように２９３  ｃｅｌｌで増殖させ、精製した（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎ．３：２１９−２２３）。塩化セシウム精製ウイルスをＰＢＳに対して透析し、１３％グリセロール−ＰＢＳ溶液中で貯蔵用に希釈し、最終濃度１〜３×１０12ウイルス粒子／ｍＬ（０．８〜５×１０10ｐｆｕ／ｍＬ）を得た。全てのストックを０．４５μｍフィルターで滅菌し、３Ｔ３細胞上、ＭＯＩ１０で、感染により複製成分アデノウイルスの存在について評価した。これらの実験で使用したストックは、複製成分ウイルスを全く生じなかった。
【００５６】
（ブタ動脈外傷）
麻酔および挿管後、国産ヨークシャーブタ（１２〜１５ｋｇ）に腸骨大腿骨動脈の無菌外科曝露（ｓｔｅｒｉｌｅ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ）を行い、二重バルーンカテーテル（Ｃ．Ｒ．Ｂａｒｄ，Ｉｎｃ．）を腸骨大腿骨動脈に挿入した。近位のバルーンを５００ｍｍＨｇ圧までふくらませて、５分間、オンライン圧力変換器により測定した。外傷から１、７および２１日後に動物を犠牲にした。
【００５７】
（ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子トランスファー）
上述したように、二重バルーンカテーテルを使用してヨークシャーブタの腸骨大腿骨動脈において直接遺伝子トランスファーを行った（Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１２８５−１２８８）。各動物において、両腸骨大腿骨動脈を力価１×１０10ｐｆｕ／ｍＬにおいて同じベクターで感染させ、各動物に０．７ｍＬを使用した（最終投与量７×１０9ｐｆｕ）（Ｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：７８１−７８４；  Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：５１８−５２２）。
【００５８】
ＡＤＶ−ｐ２１（ｎ＝２８  動脈）またはＡＤＶ−△Ｅ１（ｎ＝２８  動脈）ベクターに感染させた血管セグメントを７または２１日後に切除した。内膜細胞増殖を評価するために、７日で犠牲にした動物に、死の１時間前に５−ブロモ−２’−デオキシシトシン（ＢｒｄＣ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を全投与量２５ｍｇ／ｋｇで静脈内注入した。各動脈は、記載されているようにして同じ方法で処理した（Ｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：７８１−７８４）。ＮＩＨガイドラインに従い、動物実験はすべて、動物の使用および保護に関するミシガン大学委員会の認可を得て行った。
【００５９】
（ＲＴ−ＰＣＲ分析）
トリゾール試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を使用し、製造業者の手順にしたがって全ＲＮＡを調製した。つまり、動脈サンプルをトリゾール試薬中でホモジナイズした。ＲＮＡをエタノール（ＥｔＯＨ）中で沈殿させて、冷やした７５％ＥｔＯＨで３回洗浄し、乾燥およびリボヌクレアーゼフリーＴＥ緩衝液中に再懸濁した。逆転写酵素（ＲＴ）が存在する場合としない場合とで、プライマー：５’−ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  Ｇ−３’
（センス）；５’−ＧＧＧ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＣＡＡ  Ｃ−３’（アンチセンス）と共にｐ２１遺伝子についてＰＣＲを行った（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７５：１０３９−１０４９）。アンチセンスプライマーは、内因性ブタｐ２１ＲＮＡではなく組換えｐ２１ＲＮＡに特異的であった。
【００６０】
（細胞増殖および形態測定）
細胞増殖の測定を、ＢｒｄＣに対するモノクローナル抗体を用いてバルーン外傷およびアデノウイルス感染後７日で行った。動脈切片を固定、包埋および切断し、モノクローナル抗−５−ブロモ−２’−デオキシシチジン抗体を使用して免疫組織化学を行い（Ｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：７８１−７８４）、増殖性細胞の核をラベルした。各動脈について、内膜のラベルした核およびラベルしていない核の数を、顕微鏡ベースのビデオイメージ分析システム（Ｉｍａｇｅ  Ｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｅｓｔｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）を使用して測定した。増殖指数を、全細胞数に対するラベルした細胞の比として計算した。
【００６１】
内膜および内側の横断面積を、イメージ分析システムを使用して動脈外傷およびアデノウイルス感染の２ｃｍ領域にわたる各動脈からの４つの切片について測定した（Ｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：  ７８１−７８４）。各動脈について培地に対する内膜（Ｉ／Ｍ）面積比を、４つの切片の平均Ｉ／Ｍ面積比として測定した。
【００６２】
（免疫組織化学）
記載された方法（Ｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：７８１−７８４；  Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７５：１０３９−１０４９）を使用して、ＢｒｄＣ、平滑筋α−アクチンおよびｐ２１に対する抗体について免疫組織化学的研究を行った。以下の発達の第一段階にある（ｐｒｉｍａｒｙ）抗体を使用した：モノクローナルマウス抗−ＢｒｄＣ抗体、１：１０００希釈（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；モノクローナルマウス抗−平滑筋αアクチン抗体、１：１５００希釈（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）；およびポリクローナルマウス抗−ヒトｐ２１抗体、１：１５００希釈（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）。動脈片を染色しない、精製したマウスＩｇＧ２ｂ抗体、１：１００希釈（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してコントロール実験を行った。スライドをストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはベクタステインＡＢＣ−アルカリホスファターゼ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のいずれかにより展開し、メチルグリーンで対比染色した。
【００６３】
（統計学的分析）
ＡＤＶ−ｐ２１およびＡＤＶ−△Ｅ１動脈間の内膜ＢｒｄＣラベル指数およびＩ／Ｍ面積比を、２つの尾状、不対のｔ−試験により比較した。０．０５レベルにおいて仮説が拒否され得ないとき、統計学的に有意であった。
【００６４】
（結果）
（ｐ２１の発現が血管細胞増殖を抑制し、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞周期静止を誘発する）
ｐ２１が血管細胞成長および細胞周期分布に与える影響を検討するために、静止状態のブタ血管内皮および平滑筋細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアデノウイルスベクター、ＡＤＶ−ｐ２１すなわちＥ１欠失を含有するコントロールベクター、ＡＤＶ−△Ｅ１を感染させ、１０％ＦＢＳ中でインキュベーションにより刺激して増殖させた。未感染またはＡＤＶ−△Ｅ１感染細胞を血清に曝露することにより、内皮および平滑筋細胞の増殖が早くなった。対照的に、血管内皮および平滑筋細胞におけるｐ２１の発現は、＞９０％で細胞増殖が抑制された；これらの細胞は、トリパンブルーエクスクルージョンにより評価されたように、なお生存可能であった（＞９５％）。血管内皮および平滑筋細胞におけるｐ２１の発現はまた、ヨウ化プロピジウム染色により評価されたように、Ｇ０／Ｇ１において細胞を集積させた。これらのデータから、細胞は、ｐ２１が引き起こす細胞死よりもｐ２１発現による細胞周期において抑制されることが示唆される。
【００６５】
（ｐ２１はｉｎ  ｖｉｖｏにおけるバルーン外傷動脈において誘発される）
ｐ２１がｉｎ  ｖｉｖｏで血管細胞成長を調節する能力を検討するために、まず、ｐ２１発現が外傷動脈において誘発されるかどうかを測定した。ブタ腸骨大腿骨動脈を、傷つけないかまたはバルーン血管形成により傷つけて、ｐ２１発現後、１、７および２１日に外傷セグメントを分析し、ｐ２１抗体により免疫組織化学により評価した。この動脈外傷のブタモデルは、３週間で内膜肥厚となった（Ｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：７８１−７８４）。外傷の特徴は、動脈に傷をつけてから最初の７日間は平滑筋細胞増殖が早く、次の２週間で細胞外基質の生成のため内膜が拡大することである。通常の、傷をつけていないブタ動脈はｐ２１を全く発現しなかった。動脈に傷をつけて１日後、ｐ２１タンパク質は内膜に存在していなかった；しかしながら、７日で、内膜平滑筋細胞のおよそ５０％にｐ２１タンパク質が存在した。２１日で、ｐ２１発現は内弾性薄膜の隣の、内膜の低領域に存在するが、その領域では細胞増殖は存在しなかった（Ｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：７８１−７８４）。実際、ｐ２１発現は一般的に平滑筋細胞増殖と逆の相関関係を有した。これらの知見から、ｐ２１発現は外傷動脈における血管細胞増殖の静止と関連することが示唆される。
【００６６】
（外傷動脈におけるｐ２１発現は内膜肥厚化の発達を制限する）
ｐ２１がｉｎ  ｖｉｖｏで血管細胞成長に直接与える影響を評価するために、ｐ２１ベクターを、外傷直後のブタ動脈に導入した。国産ブタの右および左の腸骨大腿骨動脈をバルーン外傷させ、二重バルーンカテーテルを用いて、ＡＤＶ−ｐ２１またはＡＤＶ−△Ｅ１で感染させた（全投与量、１×１０10ｐｆｕ／ｍＬ、０．７×１０10ｐｆｕ）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＤＶ−ｐ２１の遺伝子移入を、外傷を与えたブタ動脈において、感染して７日後にＲＴ−ＰＣＲ分析により実験した。ｐ２１ＲＮＡを、感染させた左および右腸骨大腿骨動脈においてＲＴ−ＰＣＲにより検出したが、同じ動物からの未感染の頸動脈およびＡＤＶ−△Ｅ１未感染および感染させた動脈においては検出されなかった。
【００６７】
次に、ｐ２１発現がｉｎ  ｖｉｖｏにおける内膜細胞成長に与える影響を、遺伝子移入から７日後にＢｒｄＣの内膜細胞への導入量を測定し、３週間でＩ／Ｍ面積比を測定することにより２月評価した。遺伝子移入から７日後、ＡＤＶ−△Ｅ１動脈と比較して、ＡＤＶ−ｐ２１感染動脈において内膜ＢｒｄＣ導入が３５％減少した（５．３±０．９％  ｖｓ．８．１±０．４％，ｐ＝０．０３５）。これらのＢｒｄＣラベル内膜細胞を、平滑筋αアクチンに対するモノクローナル抗体で共染色（ｃｏｓｔａｉｎ）したが、これは内膜平滑筋細胞増殖の抑制はＡＤＶ−ｐ２１動物に存在することを示唆している。ＡＤＶ−△Ｅ１動脈と比較して、ＡＤＶ−ｐ２１感染動脈においてＩ／Ｍ面積比が有意に３７％減少した（０．３７±０．０６  ｖｓ．０．５９±０．０６，ｐ＝０．０１５）。これらの結果から、バルーン外傷時のＡＤＶ−ｐ２１による動脈感染により、内膜平滑筋細胞の増殖が抑制され、かつネオ内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）の発達を有意に制限することが示唆される。
【００６８】
（実施例２：ｐ２１サイクリン依存キナーゼ阻害剤を使用してｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍形成能を抑制する）
この研究において、ｐ２１発現がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスモデルにおける腫瘍成長に与える影響を分析した。
【００６９】
（細胞周期分析）
細胞を、ＭＯＩ２００〜３００においてＡＤＶ−△Ｅ１またはＡＤＶ−ｐ２１ベクターに感染させるか、またはＤＮＡ／リポソーム複合体によりｐ２１発現ベクターでトランスフェクトした。上述したように、細胞を感染、収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、７０％ＥｔＯＨ中、４℃において３０分間固定した。その細胞を、ＰＢＳ１ｍＬ中、３７℃において３０分間、１Ｕのデオキシリボヌクレアーゼ−フリーリボヌクレアーゼで処理し、最終的に、０．０５ｍｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＢＳ中で１０×ストックとして調製したもの）に再懸濁し、細胞を、ＦＡＣＳｃａｎモデル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてフローサイトメトリーにより分析した。蛍光測定を集積してＤＮＡ含有量の分布曲線を作成した。細片のため蛍光発生は分析前に減じた。
【００７０】
（ｐ２１のウェスタンブロット検出）
３〜５×１０6ｃｅｌｌを示した時間において収集し、１ｍＬの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ  ＤＴＴ、２％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、１０％グリセロールで溶解し、５分間煮沸した。最終的に、サンプルを１０，０００ｒｐｍにおいて５分間回転させ、上澄みを捕集した。２０μＬを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに装入し、ニトロセルロース膜にブロットした。抗ウサギ西洋わさびペルオキシダーゼ二次抗体および二次（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ）ＥＣＬ化学発光検出器（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に抗タンパク質ウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を使用してｐ２１タンパク質を目に見えるようにした。
【００７１】
（ｐ２１の遺伝子移入）
１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッコ改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）において細胞を維持した。組換えアデノウイルスベクター、ＡＤＶ−ｐ２１を、サブ３６０ゲノムＤＮＡ、Ｅ３領域において欠失しているＡｄ５誘導体と、ｐ２１発現プラスミド、ｐＡｄ−ｐ２１との間で相同組換えにより構成した。これらの組換えアデノウイルスベクターは、欠失したＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域に配列を有し、このウイルスに非許容細胞を複製およびトランスホームする能力を付与する。つまり、Ｄ．Ｂｅａｃｈ博士およびＧ．Ｈａｎｎｏｎ博士から親切にも提供された、ｐＲｃ／ＣＭＶ−ｐ２１由来のＮｒｕ  ＩおよびＤｒａ  ＩＩＩ  フラグメント（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６６，７０１（１９９３）；
Ｓｅｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６６，７０４（１９９３））を、Ａｄ５ゲノムの左手側の配列は有するが、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂは有しない、ｐＡｄ−Ｂｇｌ  ＩＩのＢｇｌ  ＩＩサイト（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．３，２１９（１９９４））に導入することにより、ｐＡｄ−ｐ２１プラスミドを調製した。上述したようにしてウイルスを調製した（Ｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５，７８１（１９９４））。これらのウイルスの構造は、サザンブロッティングにより確認した。組換えウイルスは全て２９３細胞で増殖させ、記載されているようにして精製した（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３，２１９（１９９４））。塩化セシウム精製ウイルスをＰＢＳに対して透析し、１３％グリセロール−ＰＢＳ溶液中で貯蔵用に希釈し、最終濃度１〜３×１０12ウイルス粒子／ｍＬ（０．８〜５×１０10ｐｆｕ／ｍＬ）を得た。ストックは全て０．４５μｍフィルターで滅菌し、３Ｔ３細胞上、ＭＯＩ１０で、感染により複製成分アデノウイルスの存在について評価した。これらの実験で使用したストックは、複製成分ウイルスを全く生じなかった。
【００７２】
ｐＲｃ／ＣＭＶ−ｐ２１由来のｐ２１  ｃＤＮＡをｐＲＣ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入することにより真核生物発現プラスミド、ｐＲＣ／ＲＳＶ
ｐ２１を調製し、カルシウムホスフェートトランスフェクションを使用することにより２９３細胞のトランスフェクトを行った（Ｐｅｒｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，提出原稿）。
【００７３】
（バイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）アッセイ）
Ｄｒ．Ｋ．Ｍｕｒａｚｋｏにより親切にも提供された、Ｕ３７３ヒトグリア芽腫細胞を、ＡＤＶ−ｐ２１で感染させた（ＭＯＩ２００）。１日後、細胞をトリプシン処理し、計測し、示した数の未感染のＵ３７３細胞と共に混合した。混合した集合それぞれについて１０，０００ｃｅｌｌを９６ウェルディスクに置いた。５日後、ＭＴＴアッセイ（Ｍｏｓｍａｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５，５５（１９８３））を行って、これらの細胞集団の増殖率を測定した。
【００７４】
（悪性細胞におけるｐ２１の遺伝子移入および細胞周期プログレッションに与える影響）
ｐ２１が細胞周期分布に与える影響を、アデノウイルスベクター、ＡＤＶ−ｐ２１、または組換えｐ２１を有しない同様のＥ１欠失ウイルス、ＡＤＶ−△Ｅ１で感染させることにより腫瘍細胞系において検討した。アデノウイルスベクターにおけるｐ２１の発現は、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化配列により調節した。典型的な悪性腫瘍細胞系、Ｂ１６ＢＬ６メラノーマ内でのｐ２１の発現により、細胞周期のＧ０／Ｇ１相における細胞の集積となり、これは、Ｇ１／Ｓ境界において優勢的に静止することを示唆している（図１Ａ）。組換えｐ２１発現を、マウス（Ｒｅｎｃａ）またはヒト（２９３）腎細胞癌ライン、およびマウス（Ｂ１６ＢＬ６）メラノーマ細胞系において、ウェスタンブロット分析を使用することにより確認した。アデノウイルスベクター由来の容易に検出できるタンパク質発現は、遺伝子を導入後、〜１日で達成された（図１Ｂ、レーン４、５、１３、１４ｖｓ．１〜３、１０〜１２）。また、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー／プロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化部位により調節した真核生物発現プラスミドは、２９３細胞に匹敵する発現を示した（図１Ｂ、レーン７、９  ｖｓ．６、８）。どちらの場合も、細胞分裂の抑制と相関関係がある組換えタンパク質および同じ調節要素を有する他のベクターの発現は、本明細書において記載したｐ２１の効果を示さなかった。
【００７５】
（ｐ２１の分化および形態学的影響）
細胞成長に与えるｐ２１の影響をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検討したとき、ＡＤＶ−ｐ２１に感染した腫瘍細胞は、細胞質比に対して核が増加したり、接着および成長静止が増加したような、分化した表現型と矛盾のない形態学的変化を示した（図２、図３Ａおよび図３Ｂ）。ヒトメラノーマ細胞、ＵＭ−３１６は、核凝縮およびＡＤＶ−ｐ２１に感染後の電子顕微鏡によるメラノソーム形成において４倍よりも多く増加した（図２、ｐ≦０．００５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ  ｔｅｓｔ）。これらの細胞において、メラニン生成における〜５倍の増加は、細胞およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの上澄み画分において、遺伝子を移入後２日内に観察された（図３Ａおよび図３Ｂ）。
【００７６】
２、３の系において、長期の細胞培養後の末期分化の結果として細胞死が観察されたが、ＤＮＡ断片化のパターン（図４）、ヨウ化プロピジウム染色またはＴｄＴ免疫染色により決定されるようにアポトーシスの形跡は全くなかった。また、未感染および感染した細胞の混合物は、バイスタンダー効果がないことがわかったが（図４）、これはレシピエント細胞における遺伝子移入および発現が必要とされており、かつｐ２１の効率的な感染が樹立腫瘍の成長を撲滅するのに必要とされることを示唆している。
【００７７】
（ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍細胞成長の抑制）
ｐ２１がｉｎ  ｖｉｖｏで悪性細胞に与える影響を評価するために、Ｒｅｎｃａ細胞をＡＤＶ−ｐ２１、ＡＤＶ−△Ｅ１コントロールに感染させ、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と共にインキュベートし、レシピエントマウスに接種した。ｐ２１発現は、２×１０5ｃｅｌｌを接種した全ての動物において腫瘍の成長を完全に抑制した（図５のＡ、Ｂ）。ｐ２１の発現が感染した細胞の免疫原性を変化させ、その結果、免疫機構を通して作動することが可能であるため、ＣＤ−１  ｎｕ／ｎｕ免疫不完全マウスにおいて同様の研究は行わなかった。腫瘍成長の同様の抑制がこれらの動物において観察され（図５のＣ、Ｄ）、これは細胞増殖に直接影響を与えることと矛盾がない。
【００７８】
ＡＤＶ−ｐ２１が樹立腫瘍の成長を変化し得るかどうかを検討するために、Ｒｅｎｃａ腫瘍小結節（〜０．５ｃｍ）を、ＰＢＳ、ＡＤＶ−△Ｅ１またはＡＤＶ−ｐ２１のいずれかと共に注入した。ヒト胎盤アルカリホスファターゼレポーターをコードするアデノウイルスベクターの樹立腫瘍への直接移入により、毎日５回繰り返す１０9ＰＦＵの注入後、定量的な形態計測により確立された細胞の９５％まで感染を引き起した。この処置もまた腫瘍成長を抑制し、注入を繰り返して行うとき（毎日５回、１週間後に繰り返した）、生存および予め検出し得る小結節と共にマウスに肉眼でみえる腫瘍を検出する能力がないことにより決定した長期間の治療（＞４０日）に到り得る。いずれの場合も、これらの結果は統計学的に有意であった。
【００７９】
（参考文献）
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１６．Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９，２２６１  （１９９４）．
１７．ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４，１１６９
（１９９４）．
１８．Ｄｉ  Ｌｅｏｎａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８，２５４０  （１９９４）．
１９．Ｄｕｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ７６，１０１３  （１９９４）．
２０．Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７１，５３４  （１９９４）．
２３．Ｓｙｍｏｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ７８，７０３  （１９９４）．２５．Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４３，７６３
（１９８３）．
２６．Ｓａｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２，１９８８  （１９９２）．
２７．Ｐｉｅｒｃｅ  ＆  Ｓｐｅｅｒｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８，１９９６  （１９８８）．
２８．Ｌｅｆｔｗｉｃｈ  ＆  Ｈａｌｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６，３７８９  （１９８６）．
２９．  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎ．３，２１９  （１９９３）．
３０．Ｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５，７８１  （１９９４）
これまで十分に本発明を説明してきたが、本件明細書に記載した本発明の趣旨または範囲から離れずに多くの変更および修飾が可能であることは当業者にとって明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１Ａ】悪性細胞系における細胞周期分析およびｐ２１発現を示すグラフである。
【図１Ｂ】アデノウイルスおよび真核生物発現ベクターにより形質導入したＲｅｎｃａ細胞系のウェスタンブロットを示す電気泳動ゲルの写真である。
【図２】ＡＤＶ  ｐ２１をＲｅｎｃａ腫瘍細胞に導入し、接種後の腫瘍成長の抑制を示すグラフである。腫瘍の存在（Ａ、Ｃ）と腫瘍の直径（Ｂ、Ｄ）の評価を行った。
【図３Ａ】ＡＤＶ  ｐ２１を樹立（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）Ｒｅｎｃａ腫瘍細胞にｉｎ  ｖｉｖｏ導入した場合に腫瘍成長を抑制する影響を示すグラフである。腫瘍直径は、ノギスを使用して垂直方向の大きさを２カ所測定した。
【図３Ｂ】ＡＤＶ  ｐ２１を樹立（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）Ｒｅｎｃａ腫瘍細胞にｉｎ  ｖｉｖｏ導入した場合に腫瘍成長を抑制する影響を示すグラフである。腫瘍直径は、ノギスを使用して垂直方向の大きさを２カ所測定した。
【図４】悪性細胞成長および分化に与えるｐ２１のｉｎ  ｖｉｔｒｏの影響を示す写真である。示した処置を行って５日後の細胞を位相差顕微鏡により観察した。倍率（２０×）。
【図５】ＡＤＶ  ｐ２１またはコントロールベクターで処理した樹立腫瘍を有するマウスの生存率を示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ａ、Ｂ）またはｎｕ／ｎｕ  ＣＤ−１マウス（Ｃ、Ｄ）に、ＭＯＩ３００で、ＰＢＳ（白四角、黒四角）、ＡＤＶ−ｐ２１（白菱形、黒菱形）、ＡＤＶ−△Ｅ１（白三角、黒三角）でｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートしたＲｅｎｃａ細胞を注入した。
【００８１】
（配列表）
【００８２】
SEQUENCE LISTING
<110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MICHIGAN.
<120> A pharmaceutical composition for treating a cancer or restenosis, 
comprising an expression vector containing a gene encoding p21.
<130>
<160> 2
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<300>
<400> 1
gagacaccac tggagggtga cttcg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 2
gggcaaacaa cagatggctg gcaac 25
【図１Ａ】
2007314582.tif 000002
【図１Ｂ】
2007314582.tif 000003
【図２】
2007314582.tif 000004
【図３Ａ】
2007314582.tif 000005
【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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