(57)【要約】【課題】  感度、特異性が高く、免疫ブロッティングや免疫沈降に適した、１６型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質に対するモノクローナル抗体を提供することを目的とする。【解決手段】  １６型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質に対するモノクローナル抗体またはその結合活性断片であって、１６型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質と結合し、１８型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質および／または１６型ヒトパピローマウイルスＥ７タンパク質と実質的に結合しない、モノクローナル抗体またはその結合活性断片、当該抗体を産生するハイブリドーマ、および当該ハイブリドーマを用いることを特徴とする、モノクローナル抗体またはその結合活性断片の調製方法が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１６型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質に対するモノクローナル抗体またはその結合活性断片であって、
１６型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質と結合し、
１８型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質および／または１６型ヒトパピローマウイルスＥ７タンパク質と実質的に結合しない、
モノクローナル抗体またはその結合活性断片。
【請求項２】
ハイブリドーマＣ−２６，Ｎ−２０Ｇ８，Ｎ−４６Ａ４またはＮ−４７Ｃ５（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２１，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２２，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２３またはＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２４）から産生され得る、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその結合活性断片。
【請求項３】
請求項１に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項４】
ハイブリドーマＣ−２６，Ｎ−２０Ｇ８，Ｎ−４６Ａ４またはＮ−４７Ｃ５（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２１，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２２，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２３またはＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２４）である、請求項３に記載のハイブリドーマ。
【請求項５】
請求項３または４に記載のハイブリドーマを用いることを特徴とする、モノクローナル抗体またはその結合活性断片の調製方法。
【請求項６】
請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその結合活性断片を含む、１６型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質を検出または定量するためのキット。
【請求項７】
請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその結合活性断片を用いることを特徴とする、１６型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質を検出または定量する方法。
【請求項８】
請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその結合活性断片を含む、子宮頸がんの素因、前がん病変および／またはがん病変を診断するためのキット。
【請求項９】
請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその結合活性断片を用いることを特徴とする、子宮頸がんの素因、前がん病変および／またはがん病変を診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１６型ヒトパピローマウイルス（以下、ＨＰＶ１６とも記す。）のＥ６タンパク質（以下、ＨＰＶ１６  Ｅ６とも記す。）に対するモノクローナル抗体またはその結合活性断片、ハイブリドーマおよびキットに関する。また、本発明は、ＨＰＶ１６  Ｅ６に対するモノクローナル抗体またはその結合活性断片の調製方法、および当該抗体を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１６型や１８型など一群のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は子宮頸がんの９０％以上において検出されている。これらのヒトパピローマウイルスは、発がんの原因ウイルスであり、ウイルスのＥ６とＥ７遺伝子がその責任遺伝子であることも明らかとなっている。特にＨＰＶ１６は約半数から検出され、子宮頸がんから最も高頻度に検出される。また、子宮頸がんにおいて発現しているウイルスタンパク質はＥ６とＥ７のみであることが報告されている。
【０００３】
これまで大腸菌や培養細胞で大量発現させたＥ６タンパク質と結合する抗体は存在し（非特許文献１：Banks L et al.(1987)、非特許文献２：Banks L et al.(1988)、非特許文献３：Matlashewski G et al）、現在、ＨＰＶ１６および１８のＥ６タンパク質と結合するとされる抗体が、Abcam，Novus Biologicals，GeneTexおよびBiogenesisから市販されている。しかしながら、子宮頸がんで発現しているレベルのＥ６タンパク質を検出できる抗体は存在しなかった。このため、腫瘍細胞におけるＥ６タンパク質発現を確認する手段は事実上なく、腫瘍細胞におけるＥ６タンパク質の検出は極めて困難であった。また、子宮頸がんはＨＰＶ感染良性病変である異形成（ＣＩＮ１，２）から進行するが、高度異形成や上皮内癌（ＣＩＮ３）でＥ６，Ｅ７タンパク質が高発現すると推定されている。このため、前がん病変からがん化への移行を研究し、または診断する上でもＥ６，Ｅ７タンパク質を検出することが重要だと考えられている。
【０００４】
【非特許文献１】Banks L et al., "Identification of human papillomavirus type 18 E6 polypeptide in cells derived from human cervical carcinomas.", J. Gen. Virol., 68, (Pt 5),pp1351-1359 (1987)
【非特許文献２】Banks L, Crawford L., "Analysis of human papillomavirus type 16 polypeptides in transformed primary cells.", Virology, 1988,165(1),pp326-328
【非特許文献３】Matlashewski G, Banks L, Wu-Liao J, Spence P, Pim D, Crawford L., "The expression of human papillomavirus type 18 E6 protein in bacteria and the production of anti-E6 antibodies.", J. Gen. Virol., 1986, 67 (Pt9) ,1909-1916
【非特許文献４】Ed Harlow and David Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor, Chapter 6
【非特許文献５】Steplewski, Z. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA，85, 4852, (1988)
【非特許文献６】Kearney JF, Radbruch A, Liesegang B, Rajewsky K., "A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines." J. Immunol., 1979, 123(4),1548-1550.
【非特許文献７】S.Sasai et al. :Abst. 3rd International Cell Culture Congress(Sendai) P.46, 1985. Establishment of a medium for mass culture of mammalian cells.
【非特許文献８】Terai, M., Uyama, T., Sugiki, T., Li, X. K., Umezawa, A., and Kiyono, T., "Immortalization of human fetal cells: the life span of umbilical cord blood-derived cells can be prolonged without manipulating p16KNK4a/RB braking pathway.", Mol Biol Cell, 16:1491-1499, 2005.
【非特許文献９】Kiyono T, Hiraiwa A, Fujita M, Hayashi Y, Akiyama T, Ishibashi M., "Binding of high-risk human papillomavirus E6 oncoproteins to the human homologue of the Drosophila discs large tumor suppressor protein.", Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 1997, 94(21), pp11612-11616
【特許文献１】特開昭60-145088号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、感度、特異性が高く、免疫ブロッティングや免疫沈降に適した、１６型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質に対するモノクローナル抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一の側面によると、１６型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質に対するモノクローナル抗体またはその結合活性断片であって、１６型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質と結合し、１８型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質および／または１６型ヒトパピローマウイルスＥ７タンパク質と実質的に結合しない、モノクローナル抗体またはその結合活性断片が提供される。また、本発明の他の側面によると、上記抗体を産生するハイブリドーマが提供される。また、本発明の他の側面によると、上記ハイブリドーマを用いることを特徴とする、モノクローナル抗体またはその結合活性断片の調製方法が提供される。
【０００７】
また、本発明の他の側面によると、上記モノクローナル抗体またはその結合活性断片を含む、１６型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質を検出または定量するためのキットが提供される。また、本発明の他の側面によると、上記モノクローナル抗体またはその結合活性断片を用いることを特徴とする、１６型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質を検出または定量する方法が提供される。
【０００８】
また、本発明の他の側面によると、上記モノクローナル抗体またはその結合活性断片を含む、子宮頸がんの素因、前がん病変および／またはがん病変を診断するためのキットが提供される。また、本発明の他の側面によると、上記モノクローナル抗体またはその結合活性断片を用いることを特徴とする、子宮頸がんの素因、前がん病変および／またはがん病変を診断する方法が提供される。
【発明の効果】
【０００９】
以下に詳細に説明するように、本発明によると、感度、特異性が高く、免疫ブロッティングや免疫沈降に適した、１６型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質に対するモノクローナル抗体が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。もっとも、本発明は、以下に説明する実施の形態によって限定されるものではない。
【００１１】
上記したように、本発明の一の側面によると、１６型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質に対するモノクローナル抗体またはその結合活性断片が提供される。ヒトパピローマウイルスは、子宮頸がん等の発がんの原因ウイルスであり、現在、１００種類以上が確認されている。ヒトパピローマウイルスは、その感染部位により、上皮型（ＨＰＶ１，５，８，１４，２０，２１，２５，４７型等）、粘膜型（ＨＰＶ６，１１，１６，１８，３１，３３，３５，３９，４１，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６８，７０型等）に分類され、また、その発癌性により、低リスク群（６，１１，４１，４２，４３，４４型等）、高リスク群（１６，１８，３１，３３，３５，３９，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６８，７０型等）に分類される。
【００１２】
ＨＰＶと子宮頸癌との関係は完全には明らかにされていないが、ＨＰＶのＥ６とＥ７遺伝子がその責任遺伝子であることが明らかとなっている。すなわち、発がん過程においてＥ６タンパク質がｐ５３の不活化の他テロメラーゼの活性化や細胞トランスフォーメションを引き起こすなど、ＨＰＶのＥ６，Ｅ７タンパク質が癌タンパク質の性質を備え、細胞の不死化に関与していることが報告されている。具体的には、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７ならびにＨＰＶ１８  Ｅ６は、それぞれ配列番号１〜３に示すアミノ酸配列を有する。
【００１３】
本発明者は、従来存在する抗体よりも感度および特異性に優れ、また、免疫ブロッティングや免疫沈降などの免疫化学的手法に適した、ＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製した。
【００１４】
従来市販の抗体Ｃ１Ｐ１は、ＨＰＶ１８  Ｅ６に対する抗体として作成されたものであるが（非特許文献１: Banks L et al. (1987)参照）、ＨＰＶ１８および１６双方のＥ６タンパク質を認識するものとして市販されている。一方で、本発明にかかるモノクローナル抗体は非常に特異性が高く、ＨＰＶ１６  Ｅ６とは結合するが、ＨＰＶ１８  Ｅ６および／またはＨＰＶ１６  Ｅ７とは実質的に結合しない。
【００１５】
また、好ましくは、本発明にかかるモノクローナル抗体は、感度が非常に高く、通常の免疫ブロッティングにより３０ｐｇレベルのＨＰＶ１６  Ｅ６を検出できる。一方で、市販の抗体Ｃ１Ｐ１のＨＰＶ１６  Ｅ６に対する感度はおおよそ１μｇである。子宮頸がんでは、約５ｐｇ／μｇ総タンパク質のＨＰＶ１６  Ｅ６が発現しているが、本発明にかかるモノクローナル抗体によると、従来はできなかった子宮頸がんで発現しているレベルのＥ６タンパク質を容易に検出できる。
【００１６】
上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製にあたっては、通常のハイブリドーマ作製方法を用いることができる（非特許文献４：Ed Harlow et al.等参照）。一般に、抗原として天然または合成のＨＰＶ１８  Ｅ６またはその断片で動物を免疫し、得られた抗体産生細胞を骨髄腫細胞などと融合させる方法が用いられる。
【００１７】
免疫動物として、例えば哺乳動物（例、マウス，ラット，モルモット，ネコ，イヌ，サル，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ハムスターなど），鳥類（例、ニワトリ，ガチョウ，アヒルなど）などを用いることができる。特に、マウス，ラット，ウサギなどが好ましい。免疫動物に誘導される抗体産生細胞としては、抗体を産生する細胞であれば脾臓，リンパ節，末梢血リンパ球などいずれ由来のものでもよいが、特に脾臓細胞が好適に用いられる。免疫方法は、例えばマウスを免疫する場合、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内等のいずれのルートからでも可能であるが、主として皮下、腹腔内、静脈内に（とりわけ皮下）投与することが好ましい。また、免疫間隔、免疫量等は適宜設定することができるが、例えば２週間隔で約２〜６回免疫し、最終免疫後、約１〜５回、好ましくは約２〜４日後に脾臓細胞を摘出する方法がよく用いられる。免疫量は１回にペプチド量として、マウス当り約０．１μｇ以上、好ましくは約１０μｇ〜３００μｇ用いることが望ましい。また、脾臓を摘出する前に、部分採血を行い、血中の抗体価の上昇を確認した上で、脾臓細胞を用いる融合実験を行うことが望ましい。
【００１８】
得られた抗体産生細胞を増殖性の細胞と融合してハイブリドーマとすることにより、安定的に抗体を産生することが可能になる。融合相手の細胞としては特に骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ−１，Ｐ３−Ｘ６３−ＡgＵＩ，Ｘ４５，ＳＰ２，Ｘ６８−Ａg８）が好適に用いられる。特にＭＯＰＣ２１（ＢＡＬＢ/ｃマウス）由来の骨髄腫細胞、Ｘ６８−Ａｇ８およびその改良株が好ましく用いられる。これら改良株あるいは他の骨髄腫由来の細胞株は８−アザグアニン耐性であり、ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠くため、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン含有培地）では成育できず、融合後のハイブリドーマの選択に有利である。
【００１９】
細胞融合は公知の方法に従って実施することができる。融合剤として、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ），センダイウイルスなどを用いることができる。特にＰＥＧが好適に用いられる。ＰＥＧは、平均分子量１０００〜６０００のものが好ましく、特に好ましくはＰＥＧ４０００が用いられる。ＰＥＧは好ましくは１０〜８０％さらに好ましくは４０〜５０％の濃度範囲で用いる。細胞融合は以下のように行うことができる。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞をＲＰＭＩ１６４０等の培地で洗い、これらを通常２：１〜１０：１の比率で混合し、室温で７００×ｇ，５分間遠心して細胞ペレットを得る。細胞ペレットを３７℃の恒温槽で温めながらほぐし、予め温めておいたＰＥＧ溶液を徐々に加えながら良く混ぜる。通常、ＰＥＧ量は１０8個細胞当たり１ｍＬ加えられる。ついで、予め温めておいた培地を徐々に滴下、混和し、ＰＥＧ濃度を下げる。通常は１０分位の時間をかけ１〜３０ｍＬの培地を加える。室温で遠心して細胞を集め、１０％ウシ胎児血清（以下、ＦＣＳと略記することがある）を含む培地で脾細胞として１〜２×１０6／ｍＬの細胞濃度で９６穴プレートに１００μＬずつ分注する。一夜放置後、ＨＡＴおよび１０％ＦＣＳを含む培地（ＨＡＴ培地）１００μＬを加える。この操作を省略するため細胞融合後、細胞をＨＡＴ培地に懸濁してまいても良い。２〜３週間の間に数回の培地交換を行う。培地交換の方法としては通常プレートの各穴から培地１００〜２００μＬを除き、新鮮なＨＡＴ培地１００〜２００μＬを加える。この間、ハイブリドーマの出現が認められれば、出来るだけ早くスクリーニングを行い、目的とする抗体を産生しているハイブリドーマの成育しているウェルを検出する。得られたハイブリドーマは直ちにクローニングを行う。
【００２０】
このような抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには、ＥＬＩＳＡ法など公知の種々の方法が使用できる。抗体活性陽性のハイブリドーマは直ちにクローニングに供されるが、通常これは限界希釈法などで容易に実施される。クローン化されたハイブリドーマの培養上清については、上記の方法でその抗体価を測定し、安定的に力価の高い抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。さらに、交差することが望まれないタンパク質（ＨＰＶ１８  Ｅ６等）への結合活性に基づいて抗体のスクリーニングをさらに行うことができる。
【００２１】
上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、ハイブリドーマＣ−２６，Ｎ−２０Ｇ８，Ｎ−４６Ａ４またはＮ−４７Ｃ５（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２１，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２２，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２３またはＦＥＲＭ  ＡＰ−２０９２４）が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００２２】
本発明にかかるモノクローナル抗体の生成および蓄積は、本発明にかかるハイブリドーマを通常液体培地、好ましくは無血清培地中、またはヒト以外の温血動物（通常はマウス）の腹腔内で培養し実施することができる。特に高純度の抗体が必要な場合、無血清培地を使用することが望ましい。具体的には、液体培地として、例えば、抗生物質（ゲンタマイシン等）およびＩＬ−６を添加したＧＩＴ培地（日本製薬株式会社）などを用いることができる。培養は通常約３〜６０日間、好ましくは約３〜１０日間、約３０〜３８℃、好ましくは約３７℃で実施される。また、マウス腹腔内への移植については、１匹当り約２×１０5〜５×１０7個，好ましくは約１〜５×１０6個の抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に移入し、約１０〜３５日間の飼育で十分量の抗体含有腹水液３〜１０ｍｌが得られる。
【００２３】
液体培地あるいは腹水液中の抗体の精製は、公知の生化学的手法を組み合わせることにより実施できる。例えば、抗体含有液を遠心分離後、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いて上清液を塩析する。得られたタンパク質沈殿物を適当な緩衝液に溶解し透析後カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥイオン交換カラム，ヒドロキシアパタイトカラム，ゲルろ過カラム，プロテインＡカラム，プロテインＧカラムなど），イムノアフィニティークロマトグラフィーなどに供し、目的とする抗体を分離し、精製することができる。以上のような分離および精製操作により、例えば５００ｍＬの液体培地からタンパク質重量比で９０％以上の純度の抗体を約５〜３０ｍｇ得ることができる。また５０ｍＬの腹水液からは同様の抗体が１０〜２００ｍｇ得られる。特に、プロテインＡあるいはＧカラムを用いたクロマトグラフィーにゲルろ過カラム担体、ＤＥＡＥイオン交換カラム担体、ヒドロキシアパタイトなどを用いたクロマトグラフィーを組み合わせることによりさらに高純度の抗体を得ることができる。
【００２４】
以上のようにして得られた抗体は、タンパク質分解酵素（パパイン，ペプシンなど）処理ならびに還元剤処理などにより、結合能を保持したままＦａｂ，Ｆａｂ’あるいはＦ（ａｂ’）2断片を得ることができ、本発明にかかる抗体と同様の目的で用いることができる。また、抗体の抗原認識部位を含む可変領域をコードするＤＮＡを取得し、これに遺伝子操作技術（非特許文献５：Steplewski Z et al.）を用いてヒトＩｇＧの定常領域コードする遺伝子を結合させ、マウス−ヒトキメラ抗体を作製することもできる。
【００２５】
上記したように、本発明にかかるモノクローナル抗体には、より高い感度および特異性で、１６型ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質を検出または定量することができ、ひいては、子宮頸がんの素因、前がん病変および／またはがん病変の診断に好適に適用することができる。被検試料として、血漿、血清、尿、脳脊髄液、腹水、胸水、羊水等の体液や、痰、便などを用いることができる。これらの試料は、そのまま、または各種緩衝液で希釈または抽出後濃縮し、免疫学的測定の試料とすることができる。また、本発明にかかるモノクローナル抗体によると、これらのためのキットを提供することができる。キットは、免疫化学的測定に用いられるその他の試薬をさらに含むことができる。
【実施例】
【００２６】
以下に、本発明の実施例を、添付図面を参照しながら説明する。もっとも、本発明は、以下に説明する実施例によって限定されるものではない。
【００２７】
［実験例１：免疫感作］
〔材料〕
・抗原：抗体作成のために、ＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質のアミノ末端１６アミノ酸残基またはカルボキシ末端１２アミノ酸残基からなる合成ペプチド１、２を免疫原として使用した（図１参照）。
ペプチド１：MFQDPQERPRKLPQLC（配列番号４）
ペプチド２：CRSSRTRRETQL（配列番号５）
・ミエローマ細胞株：ハイブリドーマ作成のために、マウス骨髄腫細胞株（P3-X63-Ag8.653）を使用した（非特許文献６：Kearney JF et al.参照）。
・培地：ハイブリドーマの培養のために、ゲンタマイシンを終濃度０．１ｍｇ／ｍｌで、rHuman IL-6(Invitrogen Diaclone #IM-14)を終濃度１ｎｇ／ｍｌで含む無血清培地ＧＩＴ（日本製薬株式会社）を使用した（非特許文献７：S.Sasai et al.、特許文献１：特開昭60-145088号参照）。
【００２８】
〔プロトコール〕
ＨＰＶ１６  Ｅ６に対する抗体を産生するハイブリドーマを、非特許文献４（Ed Harlow et al.）に記載の手順に準じて作製した。前記免疫原をフロイントコンプリートアジュバンド（ＦＣＡ）とともに投与することで、マウスを免疫感作した。このマウスから採取した脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞株(P3-X63-Ag8.653)とをＰＥＧを用いて細胞融合させることで、ハイブリドーマを作製した。得られたハイブリドーマを、抗原として用いた上記ペプチド、および全長Ｅ６タンパク質を用いてスクリーニングおよびクローニングした。ペプチド１を抗原としたものからはハイブリドーマＮ−２０Ｇ８，Ｎ−４６Ａ４およびＮ−４７Ｃ５が、ペプチド２を抗原としたものからはハイブリドーマＣ−２６が得られた。
【００２９】
［実験例２：抗体の特徴づけ］
〔実験例２−１：免疫ブロッティング〕
得られたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体の検出感度および特異性を試験した。プラスミドまたはレトロウイルスベクターを用いてＨＰＶ１６  Ｅ６を発現させた細胞、および子宮頸がん細胞株を用いた。免疫ブロッティングは、非特許文献８（Terai et al.）に記載された方法に準じて行った。５％（ｖ／ｖ）プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク株式会社）を添加したリシスバッファー(0.5% NP4O，1mM DTT，50mM NaCl，25mM Tris-HCl，pH8.0，0.02% NaN3)を用いて全細胞タンパク質を抽出した。細胞タンパク質をSDS-PAGEにより分離し、セミドライトランスファーシステム（アトー株式会社）によりJmmobilon-Pメンブレン(Millipore，Bedford，MA)にブロットした。上記ハイブリドーマ細胞株の調整培地、および市販の抗Ｅ６モノクローナル抗体(C1P5, Carbiochem, Ab-1)を、それぞれ１／２および１／１００の希釈率でプローブとして用いた。二次抗体として、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識した抗マウス免疫グロブリンを用いた。ローディングコントロールとして、１／１０００の希釈率の抗βアクチンヤギポリクローナル抗体(Santa Cruz, sc-1616)および抗ヤギ免疫グロブリンでβアクチンをプローブした。また、ローディングコントロールとして、抗ＨＡ抗体（クローン16B12）でＨＡタグをプローブした。Lumi-light plusウェスタンブロッティング基質(Roche)により視覚化したタンパク質を、LAS3000 CCDイメージングシステム（富士写真フイルム株式会社）により検出および定量化した。
【００３０】
図２に示すように、ハイブリドーマ細胞株Ｃ−２６から産生された抗体は、プラスミドを用いて発現させたＥ６タンパク質を、最もよく使われている市販抗体（Ｃ１Ｐ５）よりも約１０倍の感度で検出できた。しかしながら、Ｃ−２６から産生された抗体は、レトロウイルスベクターを用いて発現させたＥ６タンパク質や子宮頸がん細胞株で発現するＥ６タンパク質を検出することはできなかった（図示せず）。
【００３１】
また、図３に示すように、図２においてＣ１Ｐ５（市販抗体）がかろうじて検出できた量の１／１０００量（１０ｎｇ）のＥ６タンパク質をＮ−４６Ａ４等は余裕を持って検出できた。その他のクローンも同様にＥ６タンパク質を高い感度で検出可能であった。しかし、得られた抗体はＮ末端に変異を導入したＥ６タンパク質（Ｎ末端から８番目（Arg）、９番目（Pro）、１０番目（Arg）のアミノ酸残基をそれぞれSer，Ala，Thrに置換したもの）は認識しなかった。ここから、これらの抗体はＥ６タンパク質のＮ末端を特異的に認識していることが確認される。
【００３２】
また、図４に示すように、ハイブリドーマＮ−４６Ａ４から産生された抗体は、ＨＰＶ１６陽性である全ての子宮頸がん細胞株（ＣａＳｋｉ，ＳｉＨａ，ＱＧ−Ｕ，Ｑｇ−Ｈ，ＳＫＧＩＩＩｂ）で発現するＥ６タンパク質を１０μｇの細胞タンパク質を用いて検出できた。しかし、ハイブリドーマＮ−４６Ａ４から産生された抗体は、ＨＰＶ１８陽性のＨｅＬａ細胞のＥ６は認識しなかった。
【００３３】
同様に、大腸菌で発現させ、すでに定量されたＭＢＰ融合タンパク質を用いて、免疫ブロッティング法により抗体の感度を定量した。図５に示すように、ハイブリドーマＮ−４６Ａ４から産生された抗体は、ＭＢＰ−１６Ｅ６  １００ｐｇ（Ｅ６タンパク質の重量に換算すると約３０ｐｇ）を２分の露出で検出できた。しかしながら、ハイブリドーマＮ−４６Ａ４から産生された抗体は、その１００倍量（１０ｎｇ）のＭＢＰ−１８Ｅ６、ＭＢＰ−１６Ｅ７およびＭＢＰ−ｌａｃＺタンパク質とは２分の露出でも全く反応しなかった。市販の抗体Ｃ１Ｐ５は、１０ｎｇのＭＢＰ−１８Ｅ６を１分の露出で検出できたが（図示せず）、１０ｎｇのＭＢＰ−１６Ｅ６を６０分の露出によっても全く検出できなかった。
【００３４】
なお、大腸菌での合成に用いたＭＢＰ−Ｅ６の遺伝子にはＥ６の開始コドンが残っており、非融合のＥ６タンパク質も一部産生されたと思われる。クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色の結果から（図示せず）、非融合１６Ｅ６タンパク質の量はＭＢＰ−１６Ｅ６の約１０％程度であった。図５の結果と併せると、上記抗体Ｎ−４６Ａ４による非融合１６Ｅ６タンパク質の検出感度は約３０ｐｇであり、融合タンパク質から推定される感度と大きな開きはなかった。
【００３５】
このように、上記抗体は約３０ｐｇのＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質を検出できる一方で、その１００倍量のＨＰＶ１８  Ｅ６およびＨＰＶ１６  Ｅ７であっても免疫ブロッティングで検出しない。すなわち、ＨＰＶ１８  Ｅ６およびＨＰＶ１６  Ｅ７と比べて１００倍以上の感度で、上記抗体はＨＰＶ１６  Ｅ６を検出できることがわかる。
【００３６】
これらの結果を基にＳｉＨａ細胞タンパク質２０μｇ中の１６Ｅ６タンパク質量を半定量すると約１００ｐｇとなった。なお、ＭＢＰ融合タンパク質の定量は、総タンパク質量とＭＢＰ−Ｅ６の位置のバンドの濃さから判定した。
【００３７】
なお、Ｃ１Ｐ５は１８Ｅ６とβガラクトシダーゼとの融合タンパク質を抗原として取られた抗体であり、１６Ｅ６にも反応すると報告されている（実際図２でも検出できている）。また、非特許文献１（Banks L et al. (1987)）においては［３５Ｓ］システイン標識したHeLa細胞で発現しているＨＰＶ１８  Ｅ６タンパク質を免疫沈降で検出できることが示されている。Ｃ１Ｐ５はＨＰＶ１８  Ｅ６タンパク質に対してはかなり良い抗体であることが分かったが、ＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質に対しては免疫ブロッティングでも免疫沈降法でも非常に感度の悪い（ほぼ使い物にならない）抗体であることが分かった。具体的には、Ｃ１Ｐ５は１０ｎｇのＭＢＰ−１８Ｅ６タンパク質を１分以内の露光で楽々検出できた、おそらく１ｎｇも検出できると推定されるのに対し、ＭＢＰ−１６Ｅ６は１０ｎｇを６０分の露光でも全く検出できなかった。図２，３の結果と併せると、Ｃ１Ｐ５の１６Ｅ６タンパク質の検出感度は約３００ｎｇ（ＭＢＰ−１６Ｅ６の重量で約１μｇ）と推定される。
【００３８】
〔実験例２−２：免疫沈降〕
得られたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体の免疫沈降の効率を試験した。レトロウイルスベクターを用いてＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質を発現させた細胞、および子宮頸がん細胞株を用いた。免疫沈降は、非特許文献９（Kiyono T）に記載された方法に準じて行った。２％（ｖ／ｖ）プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク株式会社）を添加したリシスバッファー(10mM Tris-HCl(pH7.8），1% NP-40，150mM NaCl，1mM EDTA)を用いて全細胞タンパク質を抽出した。得られた抽出液と、上記ハイブリドーマ細胞株の調整培地１ｍＬまたは市販の抗Ｍｙｃ抗体（9E10.2）もしくは抗ＨＡ抗体（16B12）との混合物にプロテインＧセファロース４Ｂ(Pharmacia)を加え４℃で１時間インキュベートした。その後、プロテインＧセファロース４Ｂを洗浄し、SDS-PAGEおよび抗ＨＡ抗体(16B12)による免疫ブロッティングにより免疫沈降の効率を確認した。
【００３９】
図６に示すように、各抗体はＨＡタグを３個もつＥ６タンパク質を効率よく免疫沈降した。抗ＨＡ抗体の方が免疫沈降効率が高いが、これはエピトープを３個持つため相乗的に効率が上がっているためと考えられる。各抗体も約１０〜１４％のＥ６タンパク質を免疫沈降しており、一般的にその効率は高いと考えられる
【００４０】
図６とほぼ同じ条件でハイブリドーマＣ−２６から産生された抗体と市販の抗体Ｃ１Ｐ５の免疫沈降の効率を比較した。図７に示すように、Ｃ−２６から産生された抗体は、ＨＡタグを３個もつＥ６タンパク質を約５％免疫沈降した。これに対し、Ｃ１Ｐ５は抗原をほとんど（１％以下）免疫沈降できなかった。図５の結果と併せると、少なくとも我々の実験条件ではＣ１Ｐ５はＨＰＶ１８  Ｅ６タンパク質に特異的な抗体ではあるが、免疫ブロッティングでも免疫沈降でもＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質の検出感度は著しく低いことが分かる。対照と     して市販の抗ＨＡ抗体(16B12)を用いた。図６と同様に抗ＨＡ抗体の方が免疫沈降効率が高いが、これはエピトープを３個持つため相乗的に効率が上がっているためと考えられる。なお、Ｃ−２６から産生された抗体は免疫沈降にも使えるが、その効率は、図６のＮ−２０Ｇ８，Ｎ−４６Ａ４，Ｎ−４７Ｃ５から産生された抗体の方が優れていた。
【００４１】
表１に以上の結果の概要を示す。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ＨＰＶ１６  Ｅ６のＯＲＦがコードするタンパク質と抗原に用いたペプチドのアミノ酸配列を示す。ペプチド１：MFQDPQERPRKLPQLC（配列番号１），ペプチド２：CRSSRTRRETQL（配列番号２）。
【図２】本発明にかかるモノクローナル抗体（Ｃ−２６）による免疫ブロッティングの結果を示す。比較として従来市販の抗体Ｃ１Ｐ５によるものも示す。レーン１：293FT/p2816:pEF-MYC16E6SD（293FT細胞にMYCタグ融合HPV16 E6の発現ベクターを導入したもの。）；レーン２：293FT/p5735:pEF6/16E6SD（293FT細胞にHPV16 E6の発現ベクターを導入したもの。）。各々、総細胞タンパク質１０μｇ。露光時間：Ｃ−２６＝６０分；Ｃ１Ｐ５＝１６４分。
【図３】本発明にかかるモノクローナル抗体（Ｎ−２０Ｇ８，Ｎ−４６Ａ４，Ｎ−４７Ｃ５）による免疫ブロッティングの結果を示す。レーン１：293FT/p5735:pEF6/16E6SD；レーン２：HMEC4/3HA-16E6（HMEC4細胞に3HAタグ融合HPV16 E6発現ベクターを導入したもの。）；レーン３：HMEC4/3HA-16E6-SAT（HPV16 E6のＮ末端変異体を発現する以外はレーン２と同じ）；レーン４：HMEC4/mock（HMEC4細胞に発現ベクターを導入していないもの。）。総細胞タンパク質：レーン１  １０ｎｇ，レーン２〜３  ２０μｇ。
【図４】本発明にかかるモノクローナル抗体（Ｎ−４６Ａ４）による免疫ブロッティングの結果を示す。293FT/p5735/16E6（293FT細胞にHPV16 E6の発現ベクターを導入したもの。）；0:mock（293FT細胞に発現ベクターを導入していないもの。）；HMEC4/3HA-16E6（HMEC4細胞に3HA-16E6の発現ベクターを導入したもの。）；3Y1/PG10/3HA-16E6（3Y1/PG10細胞に3HA-16E6の発現ベクターを導入したもの。）。総細胞タンパク質：293FT/p5735/16E6 1/100, 1/1000は各々１００ｎｇ，１０ｎｇ，その他は１０μｇ。
【図５】本発明にかかるモノクローナル抗体（Ｎ−４６Ａ４）による免疫ブロッティングの結果を示す。比較として従来市販の抗体Ｃ１Ｐ５によるものも示す。総細胞タンパク質：HelaおよびSiHa  ２０μｇ，その他図示の通り。
【図６】本発明にかかるモノクローナル抗体（Ｎ−２０Ｇ８，Ｎ−４６Ａ４，Ｎ−４７Ｃ５）による免疫沈降の結果を示す。293FT/3HA-16E6SD（293FT細胞に一過性遺伝子導入により3HA-16E6を高発現させた細胞）の細胞抽出液を用いた。免疫沈降のネガティブコントロールとして抗Ｍｙｃ抗体（9E10.2）を、ポジティブコントロールとして抗ＨＡ抗体（16B12）を用いた。定量のために、用いた細胞抽出液の２容量％をSDS-PAGEおよび免疫ブロッティングに供した。
【図７】本発明にかかるモノクローナル抗体（Ｃ−２６）による免疫沈降の結果を示す。免疫沈降のネガティブコントロールとして抗Ｍｙｃ抗体（9E10.2）を、ポジティブコントロールとして抗ＨＡ抗体（16B12）を用いた。定量のために、用いた細胞抽出液の２、１０容量％をSDS-PAGEおよび免疫ブロッティングに供した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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