(57)【要約】【課題】有機性廃棄物や廃水等のメタン発酵処理汚泥中に存在するメタン生成に関連するメタン生成細菌及び酸生成細菌を検出し、その活性を評価する方法を提供することにより、メタン発酵装置の適切な運転管理指標とプロセス制御方法を提供する。【解決手段】メタン発酵系における揮発性有機酸生成速度とメタン生成速度の比率を10.0以下に維持することを特徴とする嫌気性処理プロセスの制御方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタン発酵系における揮発性有機酸生成速度とメタン生成速度の比率を10.0以下に維持することを特徴とする嫌気性処理プロセスの制御方法。
【請求項２】
揮発性有機酸が酢酸であり、酢酸生成速度とメタン生成速度の比率を2.5以下に維持することを特徴とする請求項１記載の制御方法。
【請求項３】
メタン発酵微生物系における真正細菌群（Bact）とメタン生成菌群（MArch）のDNAおよびRNA濃度をPCR法を用いて網羅的に定量検出し、これらを経時的にモニタリングし、メタン生成菌群の単位ＤＮＡまたはＲＮＡ量当たりのメタン生成速度と、真正細菌群の単位ＤＮＡまたはＲＮＡ量当たりの揮発性有機酸生成速度の相対的変化から、メタン生成能を予測評価することを特徴とするメタン発酵系における嫌気性微生物活性の評価方法。
【請求項４】
メタン生成菌群の単位ＤＮＡまたはＲＮＡ量当たりのメタン生成速度をメタン生成菌群のメタン生成活性またはそのRNAのメタン生成効率として測定し、真正細菌群の単位ＤＮＡまたはＲＮＡ量当たりの揮発性有機酸生成速度を真性細菌群の酸生成活性またはそのRNAの酸生成効率として測定する請求項３記載の評価方法。
【請求項５】
真正細菌群とメタン生成菌群のDNA濃度および/またはＲＮＡ濃度比（Bact/MArch）の変動幅を経時的にモニタリングし、その変化からメタン発酵系における酸生成能を予測評価する方法。
【請求項６】
真正細菌群とメタン生成菌群のDNA濃度比の変動幅を（+/-）20以下、ＲＮＡ濃度比の変動幅を（+/-）300以下に維持することを特徴とする嫌気性処理プロセス制御方法。
【請求項７】
酸生成に関わる各種真正細菌と真正細菌群全体のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度の比率または各種メタン生成菌とメタン生成菌群全体のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度の比率を経時的にモニタリングし、その変化からメタン発酵系の活性の安定性と各菌種の系内の定着状況を予測評価する方法であって、以下の工程を含む方法：
１）下記（a）から（e）に記載の少なくともいずれか一組のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、メタン発酵微生物系における酸生成に関わる真正細菌の基質資化性により分類したグループごとのDNAおよびRNA濃度を特異的に定量検出する工程：
（a）セルロース分解酸生成細菌Clostridium  sp.  JC3株(AB093546)とその近縁株Clostridium  sp.  Clone  6-2-K（AB198871）、Clone 5-1-N(AB197849)をターゲットとした配列番号７の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（b）セルロース分解酸生成細菌Clostridium  sp.  JC94  clone(AB231801)をターゲットとした配列番号９の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（c）蛋白質分解酸生成細菌Coprothermobacter proteolyticus strain P1株(AB162803)をターゲットとした配列番号10の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号11の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（d）スターチとグルコースの分解に関わる酸生成細菌Uncultured  bacterium clone S1 (AB239188)をターゲットとした配列番号12の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号13の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（e）スターチとグルコースの分解に関わる酸生成細菌Uncultured  bacterium clone S2(AB239189)をターゲットとした配列番号14の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号15の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
２）配列番号1-3に記載の塩基配列またはそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、真正細菌群のDNAおよびRNA濃度をPCR法を用いて網羅的に定量検出する工程；
３）上記１）の工程で得られた酸生成に関わる各種真正細菌のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度と、上記工程２）で得られた真正細菌群全体のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度の比率を経時的にモニタリングし、その変化からメタン発酵系の活性の安定性と各種真正細菌の系内の定着状況を予測評価する工程；
あるいは
１’）下記（f）〜（j）に記載の少なくともいずれか一組のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、メタン発酵微生物系におけるメタン生成菌のDNAおよびRNA濃度を、属または科レベルで特異的に定量検出する工程：
（f）Methanosarcina属菌群をターゲットとした配列番号16の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号17の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（g）Methanosaetaceae科菌群をターゲットとした配列番号18の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号19の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド;
（h）Methanomicrobiaceae科のMethanoculleus属とMethanogenium属をターゲットとした配列番号20の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号21の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（i）Methanomicrobiales目のMethanospirillaceae科菌群をターゲットとした配列番号22の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号23の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（j）Methanobacteriaceae科菌群をターゲットとした配列番号24の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号25の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
２’）配列番号4-6に記載の塩基配列またはそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、メタン生成菌群のDNAおよびRNA濃度をPCR法を用いて網羅的に定量検出する工程；
３’）上記１’）の工程で得られた各種メタン生成菌のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度と、上記工程２’）で得られたメタン生成菌群全体のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度の比率を経時的にモニタリングし、その変化からメタン発酵系の活性の安定性と各種メタン生成菌の系内の定着状況を予測評価する工程。
【請求項８】
請求項7記載の方法により測定した、メタン生成菌群全体に対する各種メタン生成菌のＤＮＡ濃度およびＲＮＡ濃度の比率を一定の範囲に維持することにより、安定なメタン生成能を制御する嫌気性処理方法。
【請求項９】
メタン発酵系における、各酢酸資化性メタン生成菌のRNA濃度のメタン生成菌群全体のRNA濃度に対する比を、各水素資化性メタン生成菌のRNA濃度のメタン生成菌群全体のRNA濃度に対する比よりも高く維持することにより、安定的なメタン生成能を維持する嫌気性処理方法。
【請求項１０】
請求項7記載の方法により測定した、メタン生成菌群の全体に対するメタン生成菌MethanosarcinaのＲＮＡ濃度比を0.5以上、各水素資化性メタン生成菌のRNA濃度比を0.5以下に維持することによって、安定的なメタン生成能を制御する嫌気性処理方法。
【請求項１１】
メタン生成菌群の全体に対するメタン生成菌MethanosarcinaのＤＮＡ濃度比を0.2以上、およびRNA濃度比を0．5以上に維持することによって、系内の酢酸の蓄積を抑制することを特徴とする嫌気性処理プロセス制御方法。
【請求項１２】
メタン発酵系の酢酸蓄積濃度を１ｇＣＯＤ／L以下に維持することによってセルロース分解菌JC3株と真正細菌群全体のＤＮＡ濃度比率を0.025以上に保持することを特徴とする嫌気性処理プロセス制御方法。
【請求項１３】
メタン発酵系における酸発酵槽のｐＨを6.0〜8.0に維持することによって酸生成菌Ｓ１株と真正細菌群全体のＤＮＡ濃度比率を0.1以上、およびＲＮＡ濃度比率を0.02以上に保持することを特徴とする嫌気性処理プロセス制御方法。
【請求項１４】
請求項７に記載したプライマーセットと検出方法を用いて各種菌群のRNA対DNA濃度比（RNA/DNA）を経時的にモニタリングし、その相対変化からメタン生成効率と環境阻害因子を予測評価することを特徴とするメタン発酵系における嫌気性微生物活性の評価方法。
【請求項１５】
メタン発酵微生物系における各種菌群のRNAとDNA濃度比を一定範囲に維持することを特徴とする嫌気性処理プロセス制御方法。
【請求項１６】
メタン発酵微生物系におけるメタン生成菌群のRNA対DNA濃度比を2以下以下に；酸生成菌群のRNA対DNA濃度比を0.5以上に維持することによって、安定的な酸生成およびメタン生成能を維持することを特徴とする嫌気性処理プロセス制御方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
【０００２】
本発明は、有機性廃棄物や廃水等のメタン発酵処理汚泥中に存在するメタン生成に関連する細菌に由来する16S rRNA遺伝子の存在を、PCR法を用いて選択的に定量検出することにより、メタン発酵微生物系をモニタリングし、その情報に基づき、微生物の酸生成能またはメタン生成能を評価する方法に関する。また、系内の酸生成能とメタン生成能の比を一定数値範囲に保持することによって、安定且つ効率的な嫌気性処理を行う方法に関する。
【従来技術】
【０００３】
高濃度の有機性廃棄物や廃水等を含有する排水や有機性汚泥の処理には、従来から嫌気性処理方式（メタン発酵）が多用されている。この技術では、嫌気的な環境条件下で複数の嫌気性細菌群の連係プレーにより、有機物をエネルギーとしてのメタンガスにまで転換することができる。またメタン発酵は、焼却・埋め立て処理されてきた有機性廃棄物の処理及びエネルギー回収技術としても有効である。この方式は曝気動力が不要なのでエネルギー消費量が節約できること、余剰汚泥の発生量が少ないので処理費用が廉価であること、かつエネルギーとして有用なメタンガスを回収できることなどの利点がある。
【０００４】
効率良く嫌気性処理を行うためには、メタン発酵系内の微生物濃度、特に増殖が遅く、環境因子によって阻害を受けやすいメタン生成菌の濃度を一定に保つことが大切であることが知られている。メタン発酵系における汚泥の微生物濃度は、従来は有機性浮遊物質濃度（MLVSS）または蛋白質濃度を指標として用い、推測されてきた。汚泥の浮遊物質とは、試料中の浮遊物質濃度をmg/Lで表したものである。反応タンク内混合液の浮遊物質をMLSSと略称し、反応タンクの管理指標として用いられている。有機性浮遊物質（MLVSS）とは、汚泥浮遊物質中の強熱減量分をmg/Lで表したものである。反応タンク内混合液の有機性浮遊物質をMLVSSと略称する。しかし、高濃度有機物、特に固形性有機物のメタン発酵系では、未分解の有機物（MLVSSまたは蛋白質）が混在するために、微生物濃度の正しい推測が困難である。従って、メタン発酵汚泥中の総微生物濃度の定量検出法が求められている。
【０００５】
メタン発酵は、（１）高分子の有機物（炭水化物、蛋白質、脂質、セルロースなど）を可溶化や加水分解する過程、（２）可溶化や加水分解された低分子有機物（グルコース、アミノ酸、高級脂肪酸など）から揮発性有機酸（吉草酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、乳酸、ギ酸など）を生成する酸発酵過程、（３）揮発性有機酸（酢酸、ギ酸）と水素からメタンを生成する過程と大きく分けて３つのステップに分けられ、各ステップに様々な微生物が関与する複雑な生物反応系である。（１）および（２）のステップには、セルロース分解菌、蛋白質分解酸生成細菌、スターチとグルコースの分解に関わる酸生成細菌などの各種真正細菌が関与し、また（３）のステップには、種々のメタン生成菌が関与する。メタン生成菌のうち、酢酸を原料としてメタン発酵するものを酢酸資化性メタン生成菌といい、水素を原料としてメタン発酵するものを水素資化性メタン生成菌という。
【０００６】
有機物負荷が高くなると、メタン発酵汚泥中に有機酸の蓄積が生じ、バイオガス生成の安定性が失われる。すなわち、メタン発酵においてはメタン生成に係る微生物（メタン生成細菌）の活性または濃度が最終的なメタン発生速度・量を決定する重要な因子である。
【０００７】
さらに、有機性廃棄物のメタン発酵においては、高分子の有機物を可溶化する工程が律速になって、メタン発酵が十分に進まない場合が多く、高分子有機物の低分子化に係る微生物（酸生成細菌）の活性または濃度も、メタン生成に係る微生物の活性と共に、最終的なメタン発生速度・量を決定する重要な因子である。従って、高効率且つ安定なメタン発酵プロセスを開発するためには、酸生成細菌とメタン生成細菌の菌数と活性をモニタリングし、これを制御する方法が必要である。
【０００８】
そこで、本発明者らは操作が簡単で、短時間で多量検体の測定が可能である定量法として、PCR法を用いたメタン発酵に関わる酸生成細菌およびメタン生成菌の菌濃度と活性の検出法を開発した（特許文献１〜3、未公開特許文献１）。大量なメタン発酵汚泥試料の解析結果から、これらの検出法がそれぞれの嫌気性微生物の菌体濃度（DNA濃度を指標として測定）および活性（RNA濃度を指標として測定）の変動を経時的にモニタリングするのに有効であることが示唆された。しかし、原水組成や有機物負荷条件の変動によって、今までターゲットとした微生物群集から未知な微生物群集に変わることがあることも観察された。従って、真正細菌群とメタン生成菌群を網羅的にモニタリングする技術も必要であることがわかった。文献検索と実験検証を行った結果、澤山らが報告した真正細菌群とメタン生成菌群のDNAおよびRNA濃度を網羅的に定量検出するのに用いるプライマーセットとプローブ（非特許文献１）が適用可能であることを見出した。
【０００９】
これらの検出法を用いて、各種廃棄物の嫌気性処理微生物系における酸生成細菌（例えば、セルロース分解菌JC3株とJC94株）の優占状況を把握することができた。また、有機性廃棄物の高温メタン発酵連続処理系や回分実験系におけるメタン生成細菌の挙動解析を行い、菌体のDNAあるいはRNA濃度変化と、メタン生成活性や酸生成活性、セルロース分解率などの発酵特性とが相関性を有するとの知見が得られた。環境の変動によって、早い菌体濃度変動、または激しい菌群の動きをモニタリングすることにより、メタン発酵効率が低減する前にこれを予測することができた（非公開特許文献１）。
【００１０】
また、菌体濃度変動が小さいか、または少ない菌種については、そのRNA濃度の変動とメタン生成能に相関性があることも認められた（非公開特許文献１）が、菌体濃度（DNA濃度）の減少と同時にRNA濃度が減少しないことや、メタン生成活性が一定したのに対して菌体のRNA濃度が増加すること、または菌濃度が減少したのに対してRNA濃度が安定したといったような様々な現象も多く観察された。
【００１１】
これらの大量の情報や知見を総合的に解析し、菌体濃度や代謝活性の変化と酸生成活性およびメタン生成活性との相関性を適切に評価し、メタン生成に関わる各種菌群の反応系内の定着、活性安定化や阻害因子を防ぐための運転制御方法を見出すことが期待されている。
【非特許文献１】Sawayama et al, Effect of Ammonium Addition on Methanogenic Community in a Fluidized Bed Anaerobic Digestion, J. Bioscience and Bioengineering, 97(1), 65-70, 2004。
【非特許文献２】分子生物学の基礎、第4版、George  M.  Malacinski著、川喜田正夫  訳、東京化学同人、p.51 〜55、p．169〜171。
【非特許文献３】生物機能活用型循環産業システム創造プログラム新エネルーギ・産業技術総合開発機構委託プロジェクトの「生分解・処理メカニズムの解析と制御技術の開発」平成15〜16年度技術資料、p．40〜66
【特許文献１】特開2004-261125号公報、長屋  由亀ら、環境試料のセルロース分解能の評価方法及びその為のオリグヌクレオチド。
【特許文献２】特開2005-253429号公報、  長屋  由亀ら、高温嫌気性蛋白質分解細菌の検出法と検出用オリゴヌクレオチド。
【特許文献３】特開2005-245287号公報、  宮  晶子ら、メタン発酵微生物系の診断方法およびプライマー。
【未公開特許文献１】
【００１２】
特願2005‐127325号明細書、  ハオら、メタン発酵微生物系の評価のためのヌクレオチドプライマーおよびそれらを用いた評価法
〔発明が解決しようとする課題〕
【００１３】
以上に述べたように、複雑な微生物系であるメタン発酵の運転管理は、現在のところ、熟練したオペレーターの経験に頼っており、一旦、メタン生成が悪化すると原因の特定が難しく、回復するまでに長期間を要するという問題があった。
【００１４】
本発明の目的は、有機性廃棄物や廃水等のメタン発酵処理汚泥中に存在するメタン生成に関連するメタン生成細菌及び酸生成細菌を検出し、その活性を評価する方法を提供することにより、メタン発酵装置の適切な運転管理指標とプロセス制御方法を提供することにある。
〔課題を解決するための手段〕
【００１５】
本発明者等は、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、有機性廃棄物・廃水のメタン発酵処理汚泥中に存在するメタン生成に関連するメタン生成細菌及び酸生成細菌をモニタリングし、メタン生成速度と、揮発性有機酸生成速度および／または酢酸生成速度との相対的比率を把握することにより、メタン生成能を予測評価できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１６】
具体的には本発明は以下の評価方法および制御方法を提供する；
（Ａ）メタン発酵系の酸生成およびメタン生成速度の制御方法として
（1）メタン発酵系における揮発性有機酸生成速度とメタン生成速度の比率を10.0以下、好ましく5.0以下、さらに好ましくは2.5以下の範囲に維持することを特徴とする嫌気性処理プロセスの制御方法。
（2）揮発性有機酸が酢酸であり、酢酸生成速度とメタン生成速度の比率を2.5以下、好ましく2.0以下に維持することを特徴とする前記（１）記載の制御方法。
（Ｂ）メタン発酵系における嫌気性微生物群の酸生成またはメタン生成活性および効率の予測評価方法として
（3）メタン発酵微生物系における真正細菌群（Bact）とメタン生成菌群（MArch）のDNAおよびRNA濃度をPCR法を用いて網羅的に定量検出し、これらを経時的にモニタリングし、メタン生成菌群の単位ＤＮＡまたはＲＮＡ量当たりのメタン生成速度と、真正細菌群の単位ＤＮＡまたはＲＮＡ量当たりの揮発性有機酸生成速度の相対的変化から、酸生成またはメタン生成能を予測評価することを特徴とするメタン発酵系における嫌気性微生物活性の評価方法。
（4）メタン生成速度をメタン生成菌群のメタン生成活性またはそのRNAのメタン生成効率として測定し、揮発性有機酸生成速度を真正細菌群の酸生成活性またはそのRNAの酸生成効率として測定する前記（３）記載の評価方法。
【００１７】
上記方法において、真正細菌群を網羅的に検出するには、配列番号1〜3のプライマーセット、メタン生成菌群を網羅的に検出するには、配列番号4〜6のプライマーセットを使用する。
（Ｃ）酸生成菌とメタン生成菌群の菌濃度と活性のバランスの評価および制御方法として
（5）真正細菌群とメタン生成菌群のDNA濃度および/またはＲＮＡ濃度比（Bact/MArch）の変動幅を経時的にモニタリングし、その変化からメタン発酵系における酸生成能を予測評価する方法。
（6）真正細菌群とメタン生成菌群のDNA濃度比の変動幅を（+/-）20以下、好ましくは（+/-）10以下に、ＲＮＡ濃度比の変動幅を（+/-）300以下、好ましくは（+/-）200以下、さらに好ましくは（+/-）100以下に維持することを特徴とする嫌気性処理プロセス制御方法。
（Ｄ）酸生成菌とメタン生成菌の菌相構成からメタン生成能を評価し、これを制御する方法として
（7）酸生成に関わる各種真正細菌と真正細菌群全体のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度の比率または各種メタン生成菌とメタン生成菌群全体のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度の比率を経時的にモニタリングし、その変化からメタン発酵系の活性の安定性と各菌種の系内の定着状況を予測評価する方法であって、以下の工程を含む方法：
１）下記（a）から（e）に記載の少なくともいずれか一組のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、メタン発酵微生物系における酸生成に関わる真正細菌の基質資化性により分類したグループごとのDNAおよびRNA濃度を特異的に定量検出する工程：
（a）セルロース分解酸生成細菌Clostridium  sp.  JC3株(AB093546)とその近縁株Clostridium  sp.  Clone  6-2-K（AB198871）、Clone 5-1-N(AB197849)をターゲットとした配列番号７の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（b）セルロース分解酸生成細菌Clostridium  sp.  JC94  clone(AB231801)をターゲットとした配列番号９の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（c）蛋白質分解酸生成細菌Coprothermobacter proteolyticus strain P1株(AB162803)をターゲットとした配列番号10の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号11の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（d）スターチとグルコースの分解に関わる酸生成細菌Uncultured  bacterium clone S1 (AB239188)をターゲットとした配列番号12の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号13の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（e）スターチとグルコースの分解に関わる酸生成細菌Uncultured  bacterium clone S2(AB239189)をターゲットとした配列番号14の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号15の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
２）配列番号1-3に記載の塩基配列またはそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、真正細菌群のDNAおよびRNA濃度をPCR法を用いて網羅的に定量検出する工程；
３）上記１）の工程で得られた酸生成に関わる各種真正細菌のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度と、上記工程２）で得られた真正細菌群全体のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度の比率を経時的にモニタリングし、その変化からメタン発酵系の活性の安定性と各種真正細菌の系内の定着状況を予測評価する工程；
あるいは
１’）下記（f）〜（j）に記載の少なくともいずれか一組のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて、メタン発酵微生物系におけるメタン生成菌のDNAおよびRNA濃度を、属または科レベルで特異的に定量検出する工程：
（f）Methanosarcina属菌群をターゲットとした配列番号16の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号17の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（g）Methanosaetaceae科菌群をターゲットとした配列番号18の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号19の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド;
（h）Methanomicrobiaceae科のMethanoculleus属とMethanogenium属をターゲットとした配列番号20の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号21の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
（i）Methanomicrobiales目のMethanospirillaceae科菌群をターゲットとした配列番号22の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号23の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
（j）Methanobacteriaceae科菌群をターゲットとした配列番号24の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号25の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
２’）配列番号4-6に記載の塩基配列またはそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、メタン生成菌群のDNAおよびRNA濃度をPCR法を用いて網羅的に定量検出する工程；
３’）上記１’）の工程で得られた各種メタン生成菌のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度と、上記工程２’）で得られたメタン生成菌群全体のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度の比率を経時的にモニタリングし、その変化からメタン発酵系の活性の安定性と各種メタン生成菌の系内の定着状況を予測評価する工程。
（8）前記（7）記載の方法により測定した、メタン生成菌群全体に対する各種メタン生成菌のＤＮＡ濃度およびＲＮＡ濃度の比率を一定の範囲に維持することにより、安定なメタン生成能を制御する嫌気性処理方法。
（9）メタン発酵における、各酢酸資化性メタン生成菌のRNA濃度のメタン生成菌群全体のRNA濃度に対する比を、各水素資化性メタン生成菌のRNA濃度のメタン生成菌群全体のRNA濃度に対する比よりも高く維持することにより、安定的なメタン生成能を維持する嫌気性処理方法。
（10）前記（7）記載の方法により測定した、メタン生成菌群の全体に対するメタン生成菌MethanosarcinaのＲＮＡ濃度比を0.5以上、各水素資化性メタン菌のRNA濃度比を0.5以下に維持することによって、安定的なメタン生成能を制御する嫌気性処理方法。
（11）メタン生成菌群の全体に対するメタン生成菌MethanosarcinaのＤＮＡ濃度比を0.2以上、およびRNA濃度比を0．5、好ましくはＤＮＡ濃度比0.3以上、およびＲＮＡ濃度比0.8以上、さらに好ましくはDNA濃度比0.4以上、およびRNA濃度比1.0以上に維持することによって、系内の酢酸の蓄積を抑制することを特徴とする嫌気性処理プロセス制御方法。
（12）メタン発酵系の酢酸蓄積濃度を１ｇＣＯＤ／L以下に維持することによってセルロース分解菌JC3株と真正細菌群全体のＤＮＡ濃度比率を0.025以上に保持することを特徴とする嫌気性処理プロセス制御方法。
（13）メタン発酵系における酸発酵槽のｐＨを6.0〜8.0、好ましくは6.3〜7.5、さらに好ましくは6.5〜7.2に維持することによって酸生成菌Ｓ１株と真正細菌群全体のＤＮＡ濃度比率を0.1以上、およびＲＮＡ濃度比率を0.02以上に保持することを特徴とする嫌気性処理プロセス制御方法。
（Ｅ）各種微生物菌群の活性および環境因子に対する対応性の評価と制御方法として
（14）前記（７）に記載したプライマーセットと検出方法を用いて各種菌群のRNA対DNA濃度比（RNA/DNA）を経時的にモニタリングし、その相対変化からメタン生成効率と環境阻害因子を予測評価することを特徴とするメタン発酵系における嫌気性微生物活性の評価方法。
（15）メタン発酵微生物系における各種菌群のRNAとDNA濃度比を一定範囲に維持することを特徴とする嫌気性処理プロセス制御方法。
（16）メタン発酵微生物系におけるメタン生成菌群のRNA対DNA濃度比を2以下に；酸生成菌群のRNA対DNA濃度比を0.5以上維持することによって、安定的な酸生成およびメタン生成能を維持することを特徴とする嫌気性処理プロセス制御方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００１９】
本発明は、有機性廃棄物や廃水等のメタン発酵処理汚泥中に存在するメタン生成に関連する細菌に由来する16S rRNA遺伝子の存在を、PCR法を用いて選択的に定量検出することを特徴とする、メタン発酵微生物系をモニタリングし、その情報に基づき、微生物の酸生成能またはメタン生成能を評価する方法に関する。また、系内の酸生成能とメタン生成能の比を一定数値に保持することによって、安定且つ効率的な嫌気性処理を行う方法を提供する。
【００２０】
本発明では、酸生成細菌が属する真正細菌群またはメタン生成能を持つメタン生成菌群を網羅的に定量検出する方法を利用して、汚泥中のメタン発酵に関わる嫌気性微生物濃度変動をモニタリングすることが実現できる。これら全菌の検出法を利用することによって、現在単離、同定、培養できないために、遺伝子や生理学的な情報がない菌群の発酵槽内における動きもモニタリングすることができる。
【００２１】
本発明の方法により検出可能な菌種をまとめると以下の通りである：
酸生成に関わる真正細菌
・真正細菌（全体網羅）
・セルロース分解酸生成細菌：JC3、JC94
・蛋白質分解酸生成細菌：P
・スターチやグルコース分解に関わる菌群：S1、S2
メタン生成菌群
・メタン生成菌（全体網羅）
・酢酸資化性メタン生成菌群：Methanosaetaceae（Msaet)
・メタノール、酢酸、水素資化性メタン生成菌群：Methanosarcina（Msar）
・水素資化性メタン生成菌群：Methanomicrobiaceae（Mtb）、Methanoculleusと Methanogenium（Mcul）、、Methanospirillaceae（Msp）
本発明において、酸生成細菌が属する真正細菌群（Bact）を網羅的に定量検出するPCR法に使用されるプライマーセットまたはプローブとして配列番号1-3に記載の塩基配列またはそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることができる。また、メタン生成菌群（MArch）を網羅的に定量検出するPCR法に使用されるプライマーセットまたはプローブとして配列番号4-6に記載の塩基配列またはそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることができる（非特許文献1）。ただし、本発明の目的に使用できるものである限り、これらの配列に限定されない。
【００２２】
また、本発明において、PCR法に使用される配列番号7-9のプライマーセットは、所定のPCR条件下で、メタン発酵汚泥中で優占化するようなセルロースの分解に係りの深い真正細菌群のうち、Clostridium  sp.  JC3株(AB093546)とその近縁株Clostridium  sp.  Clone  6-2-K（AB198871）、Clone 5-1-N(AB197849)（JC3）とJC94細菌由来の16S rRNA遺伝子にはそれぞれアニールできるが、それと同一の条件下では、その他の真正細菌、及びメタン生成菌由来の16S rRNA遺伝子にはアニールしないような塩基配列を有するように設計され、JC3とJC94に対して特異性を有する（特許文献2）。
【００２３】
配列番号10-11のプライマーセットは、所定のPCR条件下で、メタン発酵汚泥中で優占化する蛋白質の分解に係りの深い真正細菌のうち、Coprothermobacter proteolyticus strain P1株(AB162803)（P株）細菌由来の16S ｒRNA遺伝子にはそれぞれアニールできるが、それと同一の条件下では、その他の真正細菌、及びメタン生成細菌由来の16S rRNA遺伝子にはアニールしないような塩基配列を有するように設計され、P株に対して特異性を有する（特許文献２）。
【００２４】
配列番号12-13のプライマーセットは、所定のPCR条件下で、メタン発酵汚泥中で優占化するスターチとグルコースの分解に係りの深い真正細菌のうち、Uncultured  bacterium clone S1 (AB239188)（S1株）細菌由来の16SrRNA遺伝子にはそれぞれアニールできるが、それと同一の条件下では、その他の真正細菌、及びメタン生成菌由来の16S rRNA遺伝子にはアニールしないような塩基配列を有するように設計され、S1株に対して特異性を有する（非特許文献3）。
【００２５】
配列番号14-15のプライマーセットは、所定のPCR条件下で、メタン発酵汚泥中で優占化するスターチの分解に係りの深い真正細菌のうち、Uncultured  bacterium clone S2 (AB239188)（S2株）細菌由来の16SrRNA遺伝子にはそれぞれアニールできるが、それと同一の条件下では、その他の真正細菌、及びメタン生成細菌由来の16S rRNA遺伝子にはアニールしないような塩基配列を有するように設計され、Ｓ２株に対して特異性を有する（非特許文献3）。
【００２６】
また、配列番号16-25のプライマーセットは、メタン生成菌のうち、水素資化性メタン生成菌Methanobacteriaceae科、Methanoculleus属、Methanogenium属、Methanospirilliaceae科と酢酸資化性メタン生成菌Methanosarcina属、Methanosaetaceae科菌由来の16S rRNA遺伝子にはアニールできるが、それと同一の条件下では、真正細菌及びその他のメタン生成菌由来の16SrRNA遺伝子にはアニールしないような塩基配列を有するように設計され、特異性を有する（非公開特許文献1）。
【００２７】
ただし、本発明の目的に使用できるものである限り、これらの配列に限定されない。
【００２８】
メタン発酵連続処理プロセスでは、バイオガス生成量、ガス組成、揮発性有機酸組成のオンライン分析が可能であり、反応系内の汚泥を経時的に採集し、微生物のDNAおよびRNAを抽出する。DNAの抽出には、一般的なフェノール/クロロホルム―エタノール沈殿法も利用できるし、市販のDNA抽出用キットやDNA抽出装置を使用してもよい。微生物RNAは分解され易いため、新鮮試料採取後に（2４時間以内）抽出することが望ましいが、市販のRNA安定剤を添加して、冷凍保存した試料からの抽出も可能であり、また、逆転写合成法によりRNAをcDNAに転写し、DNA液として安定的に保存することが可能である。さらに、最近市販されているDNAとRNAを同時に抽出するキットを用いて短時間で簡単にDNAとRNA液を得ることも可能である。これらのDNAまたはcDNA抽出液から各種微生物菌群の16S rRNA濃度およびRNA（cDNA）濃度の定量測定をするには市販の定量PCR用キットと装置を用いて、多検体で1〜2時間に行うことも可能である。
【００２９】
微生物の菌体内には一定量のDNAを含むため、DNA濃度は菌体濃度と比例関係があり、DNA濃度が菌体濃度を反映でき、汚泥の微生物濃度を評価する指標として利用できる。メタン発酵汚泥のメタン生成能を評価するための最も直接な指標は単位時間当たりのメタンガスの生成量であり、汚泥中のメタン生成菌体濃度を把握することによって、単位菌体あたりのメタン生成活性の評価が可能になる。または、汚泥の単位時間当たりの酸生成量や有機物分解量のデータを採って、菌体の酸生成活性や有機物加水分解活性の評価も可能になる。
【００３０】
メタンガスの生成量と酢酸を含む揮発性有機酸量を簡単、かつ迅速にオンラインモニタリグすることが可能である。しかし、高分子有機物（セルロース、脂質、糖質、蛋白質など）の分析測定方法は煩雑で、時間が掛かるため、嫌気性処理プロセスの現地でオンラインモニタリングすることが困難である。そこで、有機物の分解反応に関わる各種代謝酵素の蛋白質を合成する際に遺伝子情報を伝えるためのメッセンジャーRNA（ｍRNA）を定量検出し、有機物の分解能を評価することが考えられる。しかし、ｍRNAは寿命が短く、普通は合成後数分以内にヌクレアーゼで分解されてしまう（非特許文献2）。この特徴があるため、ｍRNAの取り扱いはし難いことが知られている。これに対して、蛋白質の合成工場であるリボソーム（ribosome）粒子に含むRNA（rRNA）は代謝的に安定なRNAである。その発現量の増減は菌体の蛋白質合成活性を反映できると考えられる。従って、本発明では、真正細菌およびメタン生成菌全体または各種菌群のRNA対DNA濃度比を、菌体の蛋白質合成活性を評価することによって、間接的に菌体の有機物分解活性または酸生成活性を評価する方法を見出した。ここで、蛋白質合成活性は、リボソーム小サブユニットを構成するRNA、つまり16S rRNAの発現量を指標として測定する。有機物分解量や酸生成量、各種ガス生成量および速度との相関性を検討した上で、微生物菌群の活性および環境因子に対する対応性を評価することが可能である。
【００３１】
これらの定量検出法を利用することによって、嫌気性微生物菌体当たりの代謝活性（酸生成、メタン生成）をそれぞれ個別に評価することが可能になり、酸生成活性とメタン生成活性の相対的比率の経時的な変動をモニタリングすることが可能になった。ガス生成が安定した系においても、微生物菌体の濃度および活性変動から処理負荷、環境阻害因子の存在などの運転条件の予測が実現できる。さらに、酸生成活性とメタン生成活性の比率を一定となるように制御することによって、メタン発酵反応のバランスを崩さず、効率良く処理することが期待できる。
【００３２】
また、各種菌群のDNAおよびRNA濃度と真正細菌とメタン生成菌全体の相対比率の比較によって、酸生成菌群やメタン生成菌群の菌相構成や各種菌群の活性度の評価が実現できる。これらの情報と発酵系の酸生成およびメタン生成能の相関関係を把握することによって、発酵系の制御条件を見出すことが期待できる。
【００３３】
従って、本発明では、下記の８種のパラメータを用いて嫌気性微生物のメタン生成能や、酸生成能およびメタン生成に対する寄与度および潜在的な環境阻害因子の予測指標を見出した。
【００３４】
（１）単位時間および単位反応槽容積当たりの揮発性有機酸、酢酸、メタン生成量を用いて、揮発性有機酸、酢酸、メタン生成速度を評価する。
【００３５】
（２）揮発性有機酸、酢酸生成速度対真正細菌群の全菌DNA濃度比およびメタン生成速度対メタン生成菌群の全菌DNA濃度比を用いて、揮発性有機酸、酢酸生成活性およびメタン生成活性を評価する。
【００３６】
（３）揮発性有機酸、酢酸生成速度対真正細菌の全菌RNA濃度比およびメタン生成速度対メタン生成菌の全菌RNA濃度比を用いて、微生物体のRNAの揮発性有機酸、酢酸生成効率およびメタン生成効率を評価する。
【００３７】
（４）真正細菌とメタン生成菌のDNA濃度比を用いて、その菌群の菌濃度比を評価する。
【００３８】
（５）真正細菌とメタン生成菌のRNA濃度比を用いて、その菌群の蛋白質合成活性比（以降活性比と略称する。）を評価する。
【００３９】
（６）各種メタン生成菌群とメタン生成菌群全体のDNA濃度比および各種酸生成菌群と真正細菌全体のDNA濃度比を用いて、それらの分別的な含有度を評価する。
【００４０】
（７）各種メタン生成菌群とメタン生成菌群全体のRNA濃度比および各種酸生成菌群と真正細菌全体のRNA濃度比を用いて、それらの分別的な蛋白質合成活性度（以降活性度と略称する。）を評価する。
【００４１】
（８）各種微生物菌群のRNA対DNA濃度比（RNA/DNA）を各種微生物菌群の蛋白質合成活性（RNA/DNA比と略称する。）とする。
【００４２】
これらの評価指標を経時的にモニタリングすることによって、嫌気性微生物菌体当たりの代謝活性（酸生成、メタン生成）をそれぞれ分別的に評価することが可能になり、酸生成活性とメタン生成活性の比例の経時的な変動をモニタリングすることが可能になった。ガス生成が安定した系においても、微生物菌体の濃度および活性変動から処理負荷、環境阻害因子の存在など運転条件の予測が実現できる。さらに、発酵系の酸生成速度とメタン生成速度の相対比率を一定範囲に制御することによって、メタン発酵反応のバランスを崩さず、効率良く処理することが期待できる。
【００４３】
また、各種のメタン生成細菌の菌数あるいは活性の変動の監視により、連続処理系の限界負荷や、原水由来の阻害因子の存在を予測し、バイオガス生成量やpH等の従来の管理パラメータによる対応より早くメタン発酵系の安定性が失われることを回避できる。
【００４４】
本発明によって、連続処理系のメタン生成効率を経時的に評価するには、下記の実施態様が挙げられる。
【００４５】
第１の実施態様
メタン発酵連続処理系における発酵槽の揮発性有機酸、酢酸生成速度とメタン生成速度を経時的にモニタリングし、その相対比率を一定範囲に維持することによって、メタン発酵の安定性を制御する。揮発性有機酸生成速度とメタン生成速度の比率を、10.0以下、好ましく5.0以下、さらに好ましくは2.5以下の範囲に、酢酸生成速度とメタン生成速度の比率は2.5以下、好ましく2.0以下に維持することによって、揮発性有機酸（プロピオン酸、酢酸など）の蓄積を防ぐことが期待できる。
【００４６】
ここで、揮発性有機酸（VFA）生成速度は化学的酸素要求量（COD）で換算して表し、以下の式によって求めることができる。
VFA生成速度（gCOD/L/Day）＝発酵系中のVFAの増加速度（ｇCOD△VFA/L/Day）＋メタン生成速度（ｇCOD△CH4/L/Day）＋水素生成速度（ｇCOD△H2/L/Day）
ただし、発酵系中のVFAが減少する場合、本式中のVFAの増加速度を”０”として計算する。
【００４７】
メタン発酵系内のpHが7.5以上になると酸生成速度が大幅に上昇し、メタン生成速度との比率値が5〜28まで高くなることがわかった。この結果から、メタン発酵系のpH値はpH7.5以上になると酸生成速度を抑え（有機物負荷を下げる）またはメタン生成速度を向上させる（メタン生成菌の補充や、メタン生成菌活性の向上させる方法）制御が必要となることが判明した。
【００４８】
第2の実施態様
酸生成とメタン生成速度を制御するため、メタン発酵反応に関わる嫌気性微生物の活性と効率を把握する必要がある。従来は全ての高温メタン発酵に関連する微生物情報を得ることはできなかったが、本発明では真正細菌およびメタン生成菌全体の活性と効率の評価方法を見出した。この方法を用いて、メタン生成活性またはメタン生成効率と酸生成活性または酸生成効率を経時的にモニタリングし、その相対変化から、発酵系の酸生成能およびメタン生成能を予測評価することができた。揮発有機酸や酢酸の生成の加速を予測することにより、系内の揮発性有機酸の蓄積を防ぐ対応が可能になる。食品工場の現地処理装置では、原水の組成が大きく変動することが考えられ、また、原水の組成分析に煩雑な操作と時間が掛かるのが現状である。したがって、発酵槽内の微生物のメタン生成活性と効率を把握することが処理性能の安定性を維持するための有利な手段である。
【００４９】
酸生成菌群の全体をモニタリングするために、真正細菌群を網羅的に検出する配列番号1-3の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；メタン生成菌群の全体をモニタリングするために、メタン生成菌群を網羅的に検出する配列番号4-6の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを利用できる。
第３の実施態様
従来のメタン発酵処理プロセスでは、低分子の揮発性有機酸については簡易なオンライン分析が可能であるが、高分子有機物の有機酸までの分解反応に関しては、基質としての有機物、例えばセルロースや脂質などの減少量の経時変化をモニタリングする必要があった。しかし、セルロース、脂質の定量分析には、溶媒抽出、洗浄処理から、抽出物の重量測定、全糖量測定や機器による各種脂質組成の定量測定までに煩雑な操作を要し、また1回の分析に1週間以上の時間が掛かるので、反応情況を迅速に把握するのは非常に困難である。また、汚泥の有機物分解能を評価する指標として、従来化学的酸素要求量（COD）の除去率や浮遊性有機物量（MLVSS）の除去率が使われているが、これらの分析値の中に微生物自身の有機物分も含み、しかも水滞留時間（HRT）の長いメタン発酵プロセスでは、汚泥の分解活性の減少が始まった時点から、有機物が系内で蓄積してくる結果としてCODやMLVSSの除去率の減少を認められるまでに長い時間差があるので、これらの指標で系内の微生物の活性を正しく評価することは不可能である。
【００５０】
本発明では、真正細菌群とメタン生成菌群（Bact/MArch）のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度比の変動幅を経時的にモニタリングし、その変化から有機物の分解能および酸生成能を予測評価できることを見出した。
【００５１】
揮発性有機酸生成速度とメタン生成速度の比率が大幅に上昇する前に、真正細菌群とメタン生成菌群のRNA濃度比の激しい変化が認められた。このモニタリングした情報を解析した結果、揮発性有機酸生成活性（または効率）とメタン生成活性（または効率）の比率と真正細菌群とメタン生成菌群のRNA濃度比との間に負の相関関係が認められた。これは、揮発性有機酸の生成反応は酸生成細菌群による高分子有機物の嫌気性分解反応の最終段階であり、反応に必要な酵素系や微生物菌相が単純化することにより、真正細菌群全体の蛋白質合成活性が低減したことが示唆された。
【００５２】
このRNA発現量の変化特性を利用して、基質の分解活性の測定が困難である有機物の加水分解反応と酸生成反応の切り替え時期を間接的に推測できる。有機物の高負荷または環境因子（pH条件など）の影響によって、真正細菌群による高分子有機物の分解反応が加速し、揮発性有機酸の生成に至るまで、大量に水素が生成され、水素資化性メタン菌群によるメタン生成活性または効率の上昇が早く観察されることが考えられる。
【００５３】
この指標を把握することによって、真正細菌群とメタン生成菌群のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度比の変動幅を一定範囲内に維持することによって、酸生成とメタン生成速度のバランスを崩さないように発酵系の制御をすることが考えられる。変動幅は、ｎ日目のＤＮＡまたはＲＮＡ濃度比と、（n-1）日目のＤＮＡまたはＲＮＡ濃度比との差によって求めることができる。真正細菌群とメタン生成菌群のDNA濃度比が一定範囲内（変動幅は（+/-）20以下、好ましくは（+/-）10以下）、およびＲＮＡ濃度比の変動幅を一定範囲内（変動幅は（+/-）300以下、好ましくは（+/-）200以下、さらに好ましくは（+/-）100以下）に維持することが望ましい。
【００５４】
また、酸生成菌とメタン生成菌相構成からメタン生成能および環境因子による菌種の濃度と活性の影響の評価と制御をすることも実現できた。
【００５５】
第4の実施態様
微生物全体の活性と効率を制御するために、各反応段階に関わる主な微生物の活性と効率の変化を把握し、それらの酸生成およびメタン生成反応への寄与度を評価し、それに対応した制御方法と結び付けることが考えられる。
【００５６】
各種酸生成菌群と真正細菌全体およびメタン生成菌群とメタン生成菌全体のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度の比率を経時的にモニタリングし、その変化からメタン発酵系の安定性と各菌種の系内の定着状況を予測評価することが期待できる。
【００５７】
酸生成菌を基質資化性により分別したグループを特異的に定量検出するために、配列番号7〜15の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；各種メタン生成菌を分別的にモニタリングするために、配列番号16〜25の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを利用できる。
【００５８】
系内の有機酸が蓄積する前に水素資化性メタン生成菌群のRNA発現量の上昇も見られた。これは高分子有機物の分解反応によって、大量に水素が生成された反応と考えられる。
【００５９】
各種メタン生成菌群の挙動とメタン生成活性および効率の比較により、メタン生成菌群中における酢酸資化性メタン生成菌Methanosarcina（Msar）の含有度とメタン生成活性との間に正の相関関係が認められた。また、Msarの菌濃度含有度が減少した場合、そのRNA発現量を高く維持することによって、酢酸の蓄積を回避することが可能であることが示唆された。
【００６０】
これらの情報から、メタン生成菌の全体に対して各種メタン生成菌群のＤＮＡ濃度およびＲＮＡ濃度の比率を一定の範囲に維持することによって、安定なメタン生成能を制御する方法を見出した。酢酸と水素資化性メタン生成菌群Msarのメタン生成菌群の全体に対してＲＮＡ濃度比は0.5以上、各水素資化性メタン菌のRNA濃度比は0.5以下に維持することによって、安定的なメタン生成能を制御することができる。
【００６１】
また、メタン生成菌群の全体に対してメタン生成菌MsarのＤＮＡ濃度比を0.2以上、およびRNA濃度比を0.5以上、好ましくはＤＮＡ濃度比0.3以上、およびＲＮＡ濃度比0.8以上、さらに好ましくはDNA濃度比0.4以上、およびRNA濃度比1.0以上に維持することによって、系内の酢酸の蓄積を抑制することが可能である指標も見出した。
【００６２】
これらの数値範囲に維持するためには、メタン発酵系のｐＨを7.0-7.5に維持することによって実現できることも示唆された。
【００６３】
一方、酸生成細菌群の挙動をモニタリングした結果、HRTの短縮によってS1株の真正細菌群中の含有度が減少したことが認められた。有機酸特に酢酸生成活性と各種菌群含有度を解析した結果、酢酸の蓄積により、JC3株の含有度の減少したことが認められた。メタン発酵系の酢酸蓄積濃度を１gCOD／L以下に維持することによってセルロース分解菌JC3株と真正細菌全体のＤＮＡ濃度比率を0.025以上に保持することが望ましい。
【００６４】
また、pHの上昇につれて、S1株の菌群含有度および活性の減少が認められた。S1株を反応系内に定着させるために、メタン発酵系における酸発酵槽のｐＨを6.0〜8.0、好ましくは6.3〜7.5、さらに好ましくは6.5〜7.2に維持することによって酸生成菌Ｓ１株と真正細菌群全体のＤＮＡ濃度比率を0.1以上、およびＲＮＡ濃度比率を0.02以上に保持するようにプロセスの制御を行うことも望ましい。
第5の実施態様
各種微生物菌群の活性および環境因子に対する対応性の予測評価方法として、各種菌群のRNA対DNA濃度比（RNA/DNA）を経時的にモニタリングし、その相対変化からメタン生成効率と環境阻害因子を予測評価することを見出した。メタン生成菌群全体のRNA/DNA比は揮発性有機酸特にプロピオン酸の蓄積する時期に一時的に上昇したことが観察された。そのうち、MsarとMculでは同様なRNA/DNA比変化が認められた。Mtbでは反応性が低い時期に、またMspでは水素分圧が異常に高い時期にRNA/DNA比の上昇が認められた。このように、環境因子に対する反応性の違いを明らかにすることによって、発酵能の阻害因子の同定や促進因子の究明などを評価する指標として利用できる。また、Mspのような通常は完全混合型高温メタン発酵系における含有度が低い菌種の活性や増殖条件の検討にも有効な手段を提供した。
【００６５】
メタン生成活性と各種メタン生成菌群のＲＮＡ/ＤＮＡ比の相関性を解析した結果、メタン生成活性と菌のＲＮＡ／ＤＮＡ比はメタン生成活性の一定範囲（7gCOD/copiesDNA以下）に、メタン生成活性が高くなると同時に、各種メタン菌のRNA/DNA比が１〜2まで上昇し、正相関関係が認められた。その領域より高いメタン生成活性の領域ではRNA/DNA比が一定であった。また、メタン生成効率が14〜40の間で、RNA/DNAと正の相関関係があり、RNA/DNA比率は2〜1以上の場合、メタン生成効率が低いという知見も得られた。メタン生成活性が6.6gCOD/copiesDNAの付近ではMsar、MculのRNA/DNA比が相関曲線と離れる高い領域に測定点も現れた。これらの時点でのメタン生成効率が14 gCOD/copiesDNAより低いことから、この時点の条件では菌体が環境阻害か過剰負荷の影響を受けていることが推測できる。この特徴を利用して、制御条件の評価指標としたメタン生成菌、Msar、MculのRNA/DNA比は2以下、好ましくは1以下に維持する条件がメタン発酵の安定な条件であることが判定できる。
【００６６】
酸生成細菌の活性変動をモニタリングしたところ、真正細菌群とＳ１株の活性の変動傾向がほぼ一致したが、ＪＣ３株とＰ株がそれぞれ違うパタンで変動したことがわかった。さらに、酸生成速度とメタン生成速度の相対的比率と各菌群の蛋白質合成活性の相関性を解析した結果、酢酸生成活性が＜10、生成効率<20の領域では、真正細菌群のRNA/DNA比＞0.5、揮発性有機酸生成活性＜15、生成効率<25、真正細菌群のRNA/DNA比＞0.5という知見がはじめて得られた。メタン生成菌と異なり、揮発性有機酸（または酢酸）生成活性が10以下の領域では活性比とRNA/DNA比の負相関関係が認められた。これは、真正細菌の代謝経路は低分子の揮発性有機酸を生成する反応に集中することによって、代謝酵素の単純化によって、RNA/DNA比の減少したことが考えられる。この場合、酸生成速度が異常に上昇することによって、系内のメタン生成速度のバランスが崩れる可能性が生じると考えられる。酸生成活性の上昇が望まれる酸発酵系では真正細菌群のRNA/DNAを0.5以上に保持できる条件を制御する必要があることがわかった。また、メタン発酵系における瞬間的に酸生成速度の上昇に対応するには、メタン菌の濃度や活性を制御する必要がある。
【００６７】
従って、メタン発酵微生物系におけるメタン生成菌群のRNAとDNA濃度比を2以下、好ましくは1以下に；酸生成菌のRNAとDNA濃度比を0.5以上、好ましくは1以上に維持することが望ましい。
【００６８】
ｐＨ条件による、ＲＮＡ/ＤＮＡ濃度比に対する影響を調べた結果は、pHが7.5の付近ではメタン生成菌群のRNA/DNAが2以上になる点数が増え、pH7.5以上になると、真正細菌のRNA/DNA比が0.5以下に落ちる傾向が認められたので、ｐH7.5から8.0の条件では、酸生成菌のRNA/DNA濃度比の低減とメタン生成菌のRNA/DNA濃度比の上昇する確率が高くなることを見出した。安定なメタン発酵を保持するため、pH7.5以下の条件が適当であることが推測できる。
【００６９】
本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
【実施例】
【００７０】
実施例１：コーヒー粕高温メタン発酵連続処理実験系における酸生成速度、メタン生成速度とその比率の経時変動
コーヒー粕の連続処理実験は、今まで1槽式のメタン発酵装置で行ってきた。しかしより効率的なメタン生成を目指して、主要酸生成菌群の増殖・発酵特性に応じた運転制御を行うために、酸発酵槽、メタン発酵槽の2槽式で連続処理を行った。酸発酵槽の有効容積は5 L, メタン発酵槽の有効容積は10 Lであり、温度はどちらも55℃に維持した。また、酸発酵槽では原水投入後水酸化ナトリウムを加えpHを7.0に調整した。この系ではコーヒー粕原水を酸発酵槽へ、酸発酵槽原水をメタン発酵槽へというようにして原水投入を行った。酸発酵槽のHRT（平均水理学的滞留時間）は33, 25, 24日に、メタン発酵槽のHRTは67, 50日に設定した。実験開始からほぼ毎日各発酵槽のガス生成量測定とサンプリングを行い、採集したサンプルは揮発性有機酸組成分析および各種菌群のDNAとRNAの定量測定を行った。
【００７１】
ガス組成はTCDガスクロマトグラフ（ジーエルサイエンス株式会社  GC-323）で週に一回の頻度で分析した。ガスクロマトグラフの操作条件は、ガスボンベ2次圧5kg・f /cm2、アルゴンガスCarrier圧力1.2 kg・f /cm2、カラム（Unibeads 60/80、GLScience）温度150℃、極性マイナス、検出器（TCD）電流値50mAとした。
【００７２】
揮発性有機酸（Volatile Fatty acids; VFA）測定は、サンプルを10000rpmで10分間遠心分離した後、上澄みを0.8μmメンブレンフィルターで濾過したものを用いた。VFA濃度は高速液体クロマトグラフ（HPLC ERC-8710、エルマ光学社）で測定した。HPLCの操作条件は、溶離液0.1%リン酸溶液、溶離液流速0.7mL/分、カラム (RSpak KC-811, Shodex) 温度60℃、検出器は高感度示差屈折計（SCI製ERC-7515A）とした。
【００７３】
得られた結果を図１に示す。
【００７４】
メタン発酵槽では、ガス生成速度がコーヒー粕原水投入期間中の後半で減少傾向が見られたが、酸発酵原水投入により生成量は再び増加した。その後のHRT50日の運転期間ではほぼ一定となっていた。揮発性有機酸については、プロピオン酸は実験開始時から蓄積しており、HRT50日に設定後2週間で一旦は減少するもののその後再び蓄積し始め最後まで高濃度（5〜8gCOD/L）で蓄積していることが確認できた。酢酸は、HRT50日期間中の後半で徐々に増加していることも認められた。これらの揮発性有機酸が蓄積すると同時に、発酵系の揮発性有機酸生成速度が激しく増加したことが分かった。
【００７５】
メタン発酵槽の揮発性有機酸、酢酸生成速度とメタン生成速度を経時的にモニタリングした結果、揮発性有機酸生成速度および/または酢酸生成速度とメタン生成速度の比率は1〜2以上になったことが明らかになった。ここで、揮発性有機酸または酢酸の生成速度として、汚泥中の単位容積と単位時間当たりに増加した揮発有機酸または酢酸量とその同一期間中に生産されたメタンと水素量を合わせて計算した。経時的なメタン発酵槽内の有機酸の蓄積を防ぐために、酢酸生成速度とメタン生成速度の比率は2.5以下、好ましく2.0以下に、揮発性有機酸生成速度とメタン生成速度の比率は10.0以下、好ましく5.0以下、さらに好ましくは2.5以下に維持する必要があることが示唆された。酸生成速度が加速した場合、それに対応してメタン生成菌の濃度または活性を増加させる対策が考えられる。メタン生成菌濃度の増加には活性の高いメタン生成菌体（純菌または集積培養液）の添加やメタン発酵汚泥の返送、膜型装置の使用により槽内菌体濃度を高く保持するなどの手段が挙げられる。一方、酸発酵槽では、酸生成反応によって大量の水素が生産され、系内の水素分圧が上昇し、難分解性プロピオン酸が蓄積することが予測できる。また、大量の有機酸生成によって、系内のpHが極端に下がり、酸生成反応自体や高分子有機物の加水分解反応も阻害されることが考えられ、これに対処するには、一定比率の有機酸と水素を除去する手段として、メタン生成菌や硫酸還元菌の菌液の添加や、活性を促進する因子（硫酸塩、フマル酸塩、ビタミンなど）の添加のほかに、HRTやpHなどの運転条件の制御も必要である。
実施例2：コーヒー粕高温メタン発酵連続処理実験系における微生物菌体のメタン生成活性とそのRNAのメタン生成効率の経時変動
実施例１の実験開始からほぼ毎日各発酵槽のガス生成量測定とサンプリングを行い、採集したサンプルは揮発性有機酸組成分析以外に各種菌群のDNAとRNAの定量測定も行った。
【００７６】
発酵槽汚泥のDNAをフェノール/クロロホルム法により抽出した。RNAprotect Bacteria Reagent（Qiagen  No. 76506）による前処理した汚泥試料からRNeasy Mini Kit (Qiagen No.74106)を用いてRNAの抽出を行った。そのRNA抽出液をテンプレートとして用い、Transcriptor  First  Strand  cDNA  Synthesis  Kit（Roche  4379012）による汚泥試料のcDNAを逆転写した。これらの汚泥のDNAおよびcDNA液に対して、LightCycler-Faststart  DNA  Master  SYBR  Green  I（Roche  No.2239264）DNA増幅キットとLight Cycler System  (Roche Diagnostics)を用い、それぞれ最適化されたアニーリング温度、伸長反応時間とマグネシウム濃度条件下でリアルタイムPCR法による定量測定を行った。真正細菌群全体に対する網羅的な検出には、配列番号1-3；メタン生成菌群全体に対する網羅的な検出には、配列番号4-6のプライマーセットを用いた。
【００７７】
メタン発酵槽でのメタン生成活性またはメタン生成効率と酸生成活性または酸生成効率を経時的にモニタリングした結果を図2に示す。メタン生成活性はHRTの上昇と投入原水性状の変化によって、上昇したことが認められたが、有機酸の蓄積した時期に大きな変動が見られなかった。これに対して、激しい酸生成活性や効率が上昇する前約1週間に、メタン生成効率の上昇が認められた。このメタン生成効率の動きから、揮発有機酸や酢酸の生成が加速することが予測でき、系内の揮発性有機酸の蓄積を防ぐ対応が可能になる。
実施例３：コーヒー粕高温メタン発酵連続処理実験系における真正細菌群とメタン生成菌群のDNAおよびRNA濃度比の変動幅の経時変動
真正細菌群とメタン生成菌群（Bact/MArch）のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度比の変動幅を経時的にモニタリングし、その変化から有機物の分解能および酸生成能を予測評価した。
【００７８】
得られた結果を図3に示す。酢酸生成速度とメタン生成速度の比率が大幅に上昇する約1週間前に、真正細菌群とメタン生成菌群のDNA濃度比の変動幅が20で上昇した、ＲＮＡ濃度比が約400の幅で上昇した、その後の揮発性有機酸（主にプロピオン酸）生成速度が激しく増加した時点で、また約500の幅で減少したことから、真正細菌群とメタン生成菌群のＤＮＡ濃度比の変動幅を（+/-）20以下、好ましくは（+/-）10以下、ＲＮＡ濃度比の変動幅を（+/-）300以下、好ましくは（+/-）200以下、さらに好ましくは（+/-）100以下に維持する必要があることが示唆された。
実施例４-１：各種メタン生成菌群の含有度および活性度と揮発性有機酸生成、メタン生成速度の経時変動
各種酸生成菌と真正細菌群全体およびメタン生成菌とメタン生成菌群全体のＤＮＡおよびＲＮＡ濃度の比率を経時的にモニタリングし、その変化からメタン発酵系の安定性と各菌種の系内の定着状況を予測評価した。得られた結果を図４に示す。各種酸生成に関わる真正細菌に対する特異的な検出には、配列番号7-13；各種メタン生成菌に対する特異的な検出には、配列番号16−25のプライマーセットを用いた。
【００７９】
系内の有機酸が蓄積する前に水素資化性メタン生成菌群のRNA発現量の上昇も見られた。これは高分子有機物の分解反応および揮発性有機酸生成反応によって、大量に水素が生成された反応と考えられる。
実施例４-２：各種メタン生成菌群の含有度および活性度とメタン生成活性および効率の経時変動
各種メタン生成菌群の含有度および活性度とメタン生成活性および効率の経時変動を検討して得られた結果を図５に示す。
【００８０】
各種メタン生成菌群の挙動とメタン生成活性および効率をモニタリングし、メタン生成菌群中に酢酸資化性メタン生成菌Methanosarcina（Msar）の含有度とメタン生成活性との相関関係があることが判明した。また、Msarの菌濃度含有度が減少したが、そのRNA発現量は約2ヶ月間高く維持された、その後MsarのRNA発現量の減少につれ、発酵槽内の酢酸の蓄積が認められた。
実施例４−３：各種メタン生成菌の含有度および活性度と発酵系のメタン生成活性または効率の相関解析
各種メタン生成菌群の挙動とメタン生成活性および効率の比較を行った結果を図６に示す。メタン生成菌群中に酢酸資化性メタン生成菌Methanosarcina（Msar）の含有度とメタン生成活性との間に正の相関関係が認められた。これは、Msar菌体のメタン生成活性が高いことを意味する。
【００８１】
また、メタン生成菌群のメタン生成活性が一定値（8gCOD）以下の場合、Msar/MArchのRNA濃度比は0.5から1.5であり、水素資化性メタン生成菌が約0.5以下となるように構成されている。メタン生成活性は8 gCOD以上の場合には、検出したメタン生成菌のRNA寄与度がすべて小さくなり、これら以外のメタン生成菌種の存在と活性化が示唆される。
【００８２】
メタン生成菌群の効率は14から40の領域内に正相関があり、効率＜14の領域では、MsarのRNA寄与度が高くなっており、この現象は、Msarではメタン生成以外の活性が高いことを意味する。効率＞40の領域において、各種のメタン生成菌のRNAの寄与度が低くなることはこれらの菌種以外のメタン生成菌がメタン生成活性に寄与していることが示唆された。
実施例４−４：各種メタン生成菌の含有度および活性度と発酵系のメタン生成速度の相関解析
各種メタン生成菌群の挙動とメタン生成速度の比較を行った結果を図7に示す。メタン生成速度が0.8から1.6  gCOD/L/Dayの領域では、メタン生成菌群の全体に対してメタン生成菌MsarのＲＮＡ濃度比は0.5〜1.5の範囲であり、各水素資化性メタン菌のRNA濃度比は0.5以下であることがわかった。この菌相構成を維持することにより安定な運転に制御することができる。
実施例4-5：各種メタン生成菌の含有度および活性度と汚泥中酢酸濃度の相関解析
汚泥中の酢酸が蓄積した状態下における、各種メタン生成菌の含有度および活性度を比較した結果を図8に示す。Msarの菌濃度含有度の増減と酢酸の蓄積濃度との間に負相関関係が認められた。酢酸濃度が1gCOD/L以下の環境では、水素資化性メタン生成菌群の含有度と正の相関関係があった。それぞれの活性度も同様な相関関係が認められた。メタン生成菌群の全体に対してMsarのＤＮＡ濃度比を0.2以上、好ましくは0.3以上、さらに好ましくは0.4以上、および/またはＲＮＡ濃度比を、0.5以上、好ましくは0.8以上、さらに好ましくは1.0以上に維持することによって、系内の酢酸の蓄積を抑制することが可能になる。
実施例4-6：各種酸生成菌の含有度と活性度の経時変動
酸生成細菌群の含有度と活性変化をモニタリングした結果を図9に示す。HRTの短縮によってS1株の真正細菌群中の含有度が減少したことが認められた。JC3株の活性度上昇は有機酸生成速度の上昇時点との時間差はあることがわかった。酢酸生成速度の急上昇と同時にJC3株の含有度が減少した。
実施例4-７：各種酸生成菌の含有度および活性度と汚泥中の酢酸濃度の相関解析
有機酸特に酢酸生成活性と各種菌群含有度を解析した結果を図１０に示す。酢酸の蓄積により、JC3株の含有度が減少したことが認められた。酢酸蓄積濃度が1.0以下では、JC3株の活性度と正相関；酢酸蓄積濃度＞１では、JC3株の活性度と負相関関係も認められた。
ＪＣ３株がセルロース分解の重要な酸生成菌であるため、ＪＣ３株の減少がセルロース系有機物の分解速度が低減する原因になると考えられるので、その阻害環境因子を回避する制御が必要になる。
実施例4-８：pH条件の制御によるメタン生成菌の含有度と活性度の影響
汚泥のpH変動とメタン生成菌の含有度と活性度の変化を比較した結果を図11に示す。pH7.0〜8.0の範囲ではMsarの含有度と負相関、Mculの含有度と正の相関関係が認められた。PH7.4〜7.6の範囲ではMsarの活性度が0.5以上に高く、これはMsarの最適pH条件であることが判定できる。
【００８３】
各ｐHの運転条件でのそれぞれメタン生成菌の複合微生物系における含有度と活性寄与度を把握することによって、安定運転の最適ｐH条件を判断することができる。
実施例4-9：pH条件の制御による酸生成菌の含有度と活性度の影響
汚泥のpH変動と酸生成菌の含有度と活性度の変化を比較した結果を図12に示す。pHの上昇につれて、S1株の菌群含有度および活性度の減少が認められた。S1株の最適pH範囲は6.5〜7.0であることがわかった。また、JC3株とP株の最適pH範囲がpH7.0〜7.2であることも示唆された。
【００８４】
メタン発酵においてｐＨ条件の制御は安定運転を保持するための一つの一般的な手段であることは良く知られている。しかし、単離培養できないグルコースやスターチの分解に関わる酸生成菌Ｓ１株の最適条件はこれまで知られておらず、本発明によりはじめて知見が得られた。メタン発酵槽でのｐＨ範囲はＳ１の最適ｐＨ範囲になっているが、酸発酵槽のｐＨ条件は一般的に制御しない場合、ｐＨ3〜4の範囲になるので、Ｓ１を酸発酵槽内に増殖、定着させて、グルコースのような中間代謝物から酢酸までの生成を進めるためには、ｐＨ6.5以上に制御することが必要になると考えられる。従って、酸発酵槽において、炭水化物の分解速度および揮発性有機酸の生成速度を向上するためには、これらの酸生成菌群を適当なpH範囲に制御する必要がある。
【００８５】
この解析の結果では、ＪＣ３とＰ株のｐＨ最適範囲はそれらの純菌培養液で調べた結果と一致した。Ｓ１株は単離することが出来ず、今回複合微生物系でのｐＨ条件がはじめて得られたことから、この菌の制御条件の判断に活用することができる。従って、本発明の評価方法は単離培養が不可能な新規微生物の性状調査には有効な評価法であると考える。
実施例5-1：各種メタン生成菌群のRNA/DNA比の経時変動
各種メタン生成菌群の活性変動をモニタリングした結果を図１３で示す。汚泥中のプロピオン酸濃度の上昇につれて、メタン生成菌特にMsarとMculの蛋白質合成活性が上昇したことがわかった。メタン生成菌濃度が非常に低いMspが、系内の一時的に水素分圧が高くなった時期に蛋白質合成活性が高いことが観察された。
実施例5-２：各種酸生成菌群のRNA/DNA比の経時変動
酸生成細菌の活性変動をモニタリングした結果を図14に示す。
【００８６】
真正細菌群とＳ１株のRNA/DNA比の変動傾向がほぼ一致した。Ｐ株が揮発性有機酸特にプロピオン酸の激しい上昇時期にRNA/DNA比の上昇が見られた。ＪＣ３株ではプロピオン酸濃度の上昇した後にRNA/DNA比の上昇があった。このようにそれぞれ違うパタンで変動したことがわかった。
実施例5-3：各種メタン生成菌のRNA/DNA比と発酵系のメタン生成活性または効率の相関解析
各種メタン生成菌のRNA/DNA比と発酵系のメタン生成活性または効率の相関解析した結果を図15に示す。メタン生成活性と各種メタン生成菌群のＲＮＡ/ＤＮＡ比の相関性を解析した結果、メタン生成活性が7ｇＣＯＤ／ｃｏｐｉｅｓMArchＤＮＡ以下で、RNA/DNA比と正の相関関係があり、相関曲線の最大値は2〜1あるいはそれ以下であることがわかった。メタン生成活性が6.6ｇＣＯＤ／ｃｏｐｉｅｓMArchＤＮＡの付近ではMsar、MculのRNA/DNA比が相関曲線と離れる高い領域にも現れた。RNA/DNA比が2以上の汚泥では、メタン生成効率が14ｇＣＯＤ／ｃｏｐｉｅｓＤＮＡより低いことも示唆された。メタン生成効率が14〜40ｇＣＯＤ／ｃｏｐｉｅｓＤＮＡの範囲内にRNA/DNA比と正の相関関係があった。
実施例5-4：各種酸生成菌のRNA/DNA比と発酵系の酸生成活性または効率の相関解析
酸生成速度とメタン生成速度の相対的比率と各種酸生成菌群のRNA/DNA比の相関性を解析した結果図16に示す。メタン生成菌と異なり、酢酸生成活性＜１０、生成効率<20の領域では、真正細菌群のRNA/DNA比＞0.5；揮発性有機酸生成活性＜15、生成効率<25、真正細菌群のRNA/DNA比＞0.5という知見がはじめて得られた。活性比とRNA/DNA比の負相関関係が認められた。
【００８７】
この数値範囲以上にメタン生成菌のＲＮＡ/ＤＮＡ濃度比が上昇する場合、メタン生成菌が環境阻害因子の影響か過負荷条件を受けていることを示唆する。また、酸生成菌のＲＮＡ/ＤＮＡ濃度比が設定数値より低くなる場合、酸生成菌群の菌種や菌体活性が低分子の揮発性有機酸を生成する単一な代謝活動に集中して、酸生成速度が異常に上昇することによって、系内のメタン生成速度のバランスが崩れる可能性が生じると考えられる。
実施例5-5：pH条件の制御によるメタン生成菌及び酸生成菌の蛋白質合成活性（RNA/DNA比）の影響
ｐH条件の制御によって、RNA/DNA比の影響を検討した結果図17に示す。pHが7.5の付近ではメタン生成菌のRNA/DNAが2以上になる点数が増え、pH7.5以上になると、真正細菌のRNA/DNA比が0.5以下に落ちる傾向が認めらたことから、安定なメタン発酵を保持するため、pH7.5以下の条件が適当であることが推測できる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】コーヒー粕高温メタン発酵連続処理実験系における酸生成速度、メタン生成速度とその比率の経時変動を示す図である。（実施例１）
【図２】コーヒー粕高温メタン発酵連続処理実験系における微生物菌体のメタン生成活性とそのRNAのメタン生成効率の経時変動を示す図である。（実施例２）
【図３】コーヒー粕高温メタン発酵連続処理実験系における真正細菌群とメタン生成菌群のDNAおよびRNA濃度比の変動幅の経時変動を示す図である。（実施例３）
【図４】各種メタン生成菌群の含有度および活性度と揮発性有機酸生成、メタン生成速度の経時変動を示す図である。（実施例４−１）
【図５】各種メタン生成菌群の含有度および活性度とメタン生成活性および効率の経時変動を示す図である。（実施例４−２）
【図６】各種メタン生成菌の含有度および活性度と発酵系のメタン生成活性または効率の相関解析を示す図である。（実施例４−３）
【図７】各種メタン生成菌の含有度および活性度と発酵系のメタン生成速度の相関解析を示す図である。（実施例４−４）
【図８】各種メタン生成菌の含有度および活性度と汚泥中酢酸濃度の相関解析を示す図である。（実施例４−５）
【図９】各種酸生成菌の含有度と活性度と酸生成活性および効率の経時変化を示す図である。（実施例４−６）
【図１０】各種酸生成菌の含有度および活性度と汚泥中の酢酸濃度の相関解析を示す図である。（実施例４−７）
【図１１】pH条件の制御によるメタン生成菌の含有度と活性度の影響を示す図である。（実施例４−８）
【図１２】pH条件の制御による酸生成菌の含有度と活性度の影響を示す図である。（実施例４−９）
【図１３】各種メタン生成菌群のRNA/DNA比の経時変動を示す図である。（実施例５−１）
【図１４】各種酸生成菌群のRNA/DNA比の経時変動を示す図である。（実施例５−２）
【図１５】各種メタン生成菌のRNA/DNA比と発酵系のメタン生成活性または効率の相関解析を示す図である。（実施例５−３）
【図１６】各種酸生成菌のRNA/DNA比と発酵系の酸生成活性または効率の相関解析を示す図である。（実施例５−４）
【図１７】pH条件の制御によるメタン生成菌及び酸生成菌の蛋白質合成活性（RNA/DNA比）の影響を示す図である。（実施例５−５）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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