(57)【要約】【課題】音響光学装置を用いたきめ細かい出力変調およびオンオフによる多様な光刺激や蛍光観察と、試料の深い部位における明るく鮮明な蛍光画像の取得を可能とする。【解決手段】パルスレーザ光源２と、極短パルスレーザ光Ｌを試料Ａに照射し、試料Ａにおいて発せられた蛍光Ｆを観察する観察装置本体３と、パルスレーザ光源２と観察装置本体３との間に配置され、パルスレーザ光源２から発せられ、観察装置本体３に導入される極短パルスレーザ光Ｌを調節する導入光学系４とを備え、導入光学系４が、パルスレーザ光源２から発せられる極短パルスレーザ光Ｌのオンオフまたは出力調整を行う音響光学装置３１を含む第１の光路２０と、音響光学装置３１を迂回する第２の光路２２とを並列に備えるとともに、これらの光路２０，２２の少なくとも一方に極短パルスレーザ光Ｌを通過させる光路選択装置２４を備える多光子励起型観察装置１を提供する。【選択図】      図１
2007127524.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
極短パルスレーザ光を出射するパルスレーザ光源と、
該パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光を試料に照射し、試料において発せられた蛍光を観察する観察装置本体と、
前記パルスレーザ光源と観察装置本体との間に配置され、パルスレーザ光源から発せられ、観察装置本体に導入される極短パルスレーザ光を調節する導入光学系とを備え、
該導入光学系が、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光のオンオフまたは出力調整を行う音響光学装置を含む第１の光路と、前記音響光学装置を迂回する第２の光路とを並列に備えるとともに、これらの光路の少なくとも一方に極短パルスレーザ光を通過させる光路選択装置を備える多光子励起型観察装置。
【請求項２】
前記光路選択装置が、前記第２の光路に配置されるシャッタを備える請求項１に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項３】
前記光路選択装置が、前記第１の光路と第２の光路との分岐点および合流点に挿脱可能に配置される全反射ミラーを備える請求項１に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項４】
極短パルスレーザ光を出射する２つのパルスレーザ光源と、
各パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光を試料に照射し、試料において発せられた蛍光を観察する観察装置本体と、
前記パルスレーザ光源と観察装置本体との間に配置され、パルスレーザ光源から発せられ、観察装置本体に導入される極短パルスレーザ光を調節する導入光学系とを備え、
該導入光学系が、一方のパルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光のオンオフまたは出力調整を行う音響光学装置を含む第１の光路と、他方のパルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光を通過させる音響光学装置を含まない第２の光路とを並列に備える多光子励起型観察装置。
【請求項５】
前記導入光学系の第１の光路および第２の光路に、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光の光束径およびビームダイバージェンスを調節する入射調節装置が備えられている請求項１から請求項４記載の多光子励起型観察装置。
【請求項６】
前記観察装置本体が、極短パルスレーザ光を試料に集光させる対物レンズを備え、
前記入射調節装置が、対物レンズの入射瞳位置に瞳径と略同等の光束径の極短パルスレーザ光を入射させるようその光束径およびビームダイバージェンスを調節する請求項５に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項７】
前記入射調節装置が、複数のレンズを備えるとともに、該レンズのうち少なくとも１枚のレンズを光軸方向に移動させる調節移動機構を備える請求項５または請求項６に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項８】
前記第１の光路の音響光学装置と前記パルスレーザ光源との間に配置され、極短パルスレーザ光の光束径を音響光学装置の有効範囲内に入射可能に縮小させる入射補正装置を備える請求項１から請求項７のいずれかに記載の多光子励起型観察装置。
【請求項９】
前記入射補正装置が、複数のレンズを備えるとともに、該レンズのうち少なくとも１枚のレンズを光軸方向に移動させる補正移動機構を備える請求項８に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項１０】
前記入射補正装置が、絞り、ピンホール、スリット等の空間フィルタにより構成されている請求項８に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項１１】
前記観察装置本体が、前記導入光学系の２つの光路を通過した極短パルスレーザ光をそれぞれ走査する２つの走査装置を備える請求項１から請求項１０のいずれかに記載の多光子励起型観察装置。
【請求項１２】
極短パルスレーザ光を出射するパルスレーザ光源と、
該パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光を調節する導入光学系とを備え、
該導入光学系が、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光のオンオフまたは出力調整を行う音響光学装置を含む第１の光路と、前記音響光学装置を迂回する第２の光路とを並列に備えるとともに、これらの光路の少なくとも一方に極短パルスレーザ光を通過させる光路選択装置を備える多光子励起型観察用光源装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多光子励起型観察装置および多光子励起型観察用光源装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体等の試料にその表面から励起光を照射して、試料の表面下の比較的深い位置から発せられる蛍光を検出することにより、細胞等の機能を観察する装置として、多光子励起型の測定装置が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照。）。
特許文献１においては、試料に照射する励起光の強度を調節し、あるいはオンオフするための手段として、音響光学変調器（ＡＯＭ：Acoust Optical
Modulator）のような音響光学装置を用いることが開示されている。音響光学装置を使用することにより、励起光の強度を制御できるとともに、高速シャッタ機能を利用することによって、光刺激が必要な部位にのみ励起光の高精度の照射が可能となり、不必要な場所に励起光を照射して試料にダメージを与える不都合を防止することができる。
【０００３】
また、特許文献２には、光ファイバ内における非線形効果により励起光のパルス形状が乱れることを防止するために、励起光を強く分散させるＡＯＭやＡＯＴＦ等の音響光学装置を光ファイバに隣接して配置した顕微鏡が開示されている。
【特許文献１】特開平１０−５１２９５９号公報
【特許文献２】特開２０００−２０６４１５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、音響光学装置を励起光の変調に用いる場合には、音響光学装置におけるパルスの分散、音響光学装置の開口に入射する際のケラレやＰＳＦ（点像分布関数）の乱れ対策および入射ビームアライメント光学系全体によるレーザ光の光量ロスが大きいという問題がある。レーザ光量が低下すると、試料の深い部位に高強度のレーザ光を供給することが困難となり、試料の深い部位の蛍光画像を得ることができないという問題がある。
【０００５】
この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、音響光学装置を用いたきめ細かい出力変調およびオンオフによる多様な光刺激や蛍光観察を行う一方、試料を移動させることなく、当該試料の深い部位における明るく鮮明な蛍光画像を取得することが可能な多光子励起型観察装置および多光子励起型観察用光源装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、極短パルスレーザ光を出射するパルスレーザ光源と、該パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光を試料に照射し、試料において発せられた蛍光を観察する観察装置本体と、前記パルスレーザ光源と観察装置本体との間に配置され、パルスレーザ光源から発せられ、観察装置本体に導入される極短パルスレーザ光を調節する導入光学系とを備え、該導入光学系が、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光のオンオフまたは出力調整を行う音響光学装置を含む第１の光路と、前記音響光学装置を迂回する第２の光路とを並列に備えるとともに、これらの光路の少なくとも一方に極短パルスレーザ光を通過させる光路選択装置を備える多光子励起型観察装置を提供する。
【０００７】
本発明によれば、導入光学系の光路選択装置の作動により第１の光路または第２の光路の少なくとも一方が選択され、選択された光路に極短パルスレーザ光が通過させられ、観察装置本体に導入される。第１の光路が選択された場合には、極短パルスレーザ光は音響光学装置を通過させられる。これにより、極短パルスレーザ光は高速にオンオフまたは出力調整された状態で観察装置本体に導入され、観察装置本体を介して、試料に照射される。したがって、試料の所定の必要領域のみに精度よく、かつ、適正に出力調整された状態の極短パルスレーザ光を照射して、試料の光刺激あるいは蛍光観察を行うことができる。
【０００８】
一方、第２の光路が選択された場合には、極短パルスレーザ光は、音響光学装置を通過することなく迂回して、観察装置本体に導入され、試料に照射される。音響光学装置を通過しないので、極短パルスレーザ光は、さほど減衰することなく、高い強度に維持されたままで試料に照射されることになる。したがって、試料の深い部位まで高強度の極短パルスレーザ光を供給することが可能となり、試料の深い部位の蛍光画像を得ることができる。
【０００９】
この場合において、音響光学装置を通過する極短パルスレーザ光と音響光学装置を通過しない極短パルスレーザ光とを択一的にあるいは両方同時に同一の観察装置本体に入射させるので、同一の試料に対し、該試料を移動させることなく、きめ細かくオンオフあるいは出力変調された極短パルスレーザ光と、試料の深部まで届く高い強度の極短パルスレーザ光とを試料に照射することができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記光路選択装置が、前記第２の光路に配置されるシャッタを備えることとしてもよい。
第１の光路には音響光学装置が配置されているので、該音響光学装置のシャッタ機能を利用することで第１の光路の極短パルスレーザ光を容易にオンオフすることができる。一方、第２の光路にシャッタを配置することにより、第２の光路の極短パルスレーザ光を容易にオンオフすることができる。したがって、これらの音響光学装置とシャッタとを選択的に作動させることにより、２つの光路に択一的にまたは両方同時に極短パルスレーザ光を通過させることができる。シャッタとしては、極短パルスレーザ光を通過させる際に減衰を伴わないメカニカルシャッタが好ましい。
【００１１】
また、上記発明においては、前記光路選択装置が、前記第１の光路と第２の光路との分岐点および合流点に挿脱可能に配置される全反射ミラーを備えることとしてもよい。
このようにすることで、第１の光路と第２の光路の分岐点から全反射ミラーを外した状態に配すると、極短パルスレーザ光を第１の光路（あるいは第２の光路）に入射させることができる。一方、第１の光路と第２の光路の分岐点に全反射ミラーを挿入状態に配すると、極短パルスレーザ光が全反射ミラーによって反射されることにより、極短パルスレーザ光の通過する光路を第２の光路（あるいは第１の光路）に変更することができる。
【００１２】
また、第１の光路と第２の光路の合流点から全反射ミラーを外した状態に配すると、第１の光路（あるいは第２の光路）を通過してきた極短パルスレーザ光を通過させて観察装置本体に入射させることができる。一方、全反射ミラーを第１の光路と第２の光路の合流点に挿入状態に配すると、極短パルスレーザ光が全反射ミラーによって反射されることにより、第２の光路（あるいは第１の光路）を通過してきた極短パルスレーザ光を観察装置本体に入射させることができる。全反射ミラーを用いることにより、極短パルスレーザ光をほとんど減衰させることなく、光路を択一的に選択することが可能となる。
【００１３】
また、本発明は、極短パルスレーザ光を出射する２つのパルスレーザ光源と、各パルスレーザ光源から発せられた極短パルスレーザ光を試料に照射し、試料において発せられた蛍光を観察する観察装置本体と、前記パルスレーザ光源と観察装置本体との間に配置され、パルスレーザ光源から発せられ、観察装置本体に導入される極短パルスレーザ光を調節する導入光学系とを備え、該導入光学系が、一方のパルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光のオンオフまたは出力調整を行う音響光学装置を含む第１の光路と、他方のパルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光を通過させる音響光学装置を含まない第２の光路とを並列に備える多光子励起型観察装置を提供する。
【００１４】
本発明によれば、２つのパルスレーザ光源からそれぞれ別々に２つの光路を通過させた極短パルスレーザ光が同一の観察装置本体に導入される。第１のパルスレーザ光源から発せられ、第１の光路を通過する極短パルスレーザ光は音響光学装置を通過させられる。これにより、極短パルスレーザ光は高速にオンオフまたは出力調整された状態で観察装置本体に導入され、観察装置本体を介して、試料に照射される。したがって、試料の所定の必要領域のみに精度よく、かつ、適正に出力調整された状態の極短パルスレーザ光を照射して、試料の光刺激あるいは蛍光観察を行うことができる。
【００１５】
一方、第２のパルスレーザ光源から発せられ、第２の光路を通過する極短パルスレーザ光は、音響光学装置を通過することなく迂回して、観察装置本体に導入され、試料に照射される。音響光学装置を通過しないので、極短パルスレーザ光は、さほど減衰することなく、高い強度に維持されたままで試料に照射されることになる。したがって、試料の深い部位まで高強度の極短パルスレーザ光を供給することが可能となり、試料の深い部位の蛍光画像を得ることができる。
【００１６】
この場合において、音響光学装置を通過する極短パルスレーザ光と音響光学装置を通過しない極短パルスレーザ光とを択一的にあるいは両方同時に同一の観察装置本体に入射させることができ、同一の試料に対し、該試料を移動させることなく、きめ細かくオンオフあるいは出力変調された極短パルスレーザ光と、試料の深部まで届く高い強度の極短パルスレーザ光とを試料に照射することができる。
【００１７】
上記発明においては、前記導入光学系の第１の光路および第２の光路に、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光の光束径およびビームダイバージェンスを調節する入射調節装置が備えられていることとしてもよい。
このようにすることで、入射調節装置の作動により、パルスレーザ光源から伝播されてくる極短パルスレーザ光の光束径およびビームダイバージェンスが調節されて観察装置本体に入射される。
【００１８】
したがって、パルスレーザ光源が交換された場合の個体差により、あるいは、波長可変パルスレーザ光源や波長の異なる複数のパルスレーザ光源を並列に有する場合のように、異なる波長の極短パルスレーザ光を試料に照射する場合の波長の変更により、あるいは、波長の変更に伴う分散補償量の変更等によって、極短パルスレーザ光のビームウエスト位置が変動しても、入射調節装置の作動によって、観察装置本体に入射される際の極短パルスレーザ光の光束径およびビームダイバージェンスが調節されることにより、ビームウエスト位置を調節でき、試料の一定深さ位置において精度よく多光子励起効果を発生させることが可能となる。その結果、波長の変動等にかかわらず、試料の深さ方向の同一位置を観察することができる。
【００１９】
また、上記発明においては、前記観察装置本体が、極短パルスレーザ光を試料に集光させる対物レンズを備え、前記入射調節装置が、対物レンズの入射瞳位置に瞳径と略同等の光束径の極短パルスレーザ光を入射させるようその光束径およびビームダイバージェンスを調節することとしてもよい。
このようにすることで、対物レンズの前方に常に一定のビームウエスト位置を達成することに加えて、対物レンズに最も効率的に極短パルスレーザ光を入射させることができる。その結果、ビームウエスト位置における光子密度を向上し、効率的に多光子励起効果を発生させて、鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。
【００２０】
また、上記発明においては、前記入射調節装置が、複数のレンズを備えるとともに、該レンズのうち少なくとも１枚のレンズを光軸方向に移動させる調節移動機構を備えることとしてもよい。
このように構成することで、調節移動機構の作動によりレンズ間距離を調節し、あるいは、複数のレンズを移動させることにより、光束径および／またはビームダイバージェンスを簡易に調節することができる。したがって、パルスレーザ光源の個体差、パルスレーザ光源から出射される極短パルスレーザ光の波長、プリチャープ光学系による分散補償量等の変動により、極短パルスレーザ光のビームウエストの位置が光軸方向に変動しても、調節移動機構の作動により光束径の縮小率および／またはビームダイバージェンスを調節でき、対物レンズの前方の一定のビームウエスト位置において、効率的に多光子励起効果を発生させることが可能となる。
【００２１】
また、上記発明においては、前記第１の光路の音響光学装置と前記パルスレーザ光源との間に配置され、極短パルスレーザ光の光束径を音響光学装置の有効範囲内に入射可能に縮小させる入射補正装置を備えることとしてもよい。
本発明によれば、音響光学装置とパルスレーザ光源との間に、入射補正装置を備えているので、該入射補正装置の作動により、パルスレーザ光源から伝播されてくる極短パルスレーザ光の光束径が縮小されて音響光学装置に入射される。これにより、音響光学装置に入射される極短パルスレーザ光が、音響光学装置を構成する結晶の大きさにより設定される有効範囲から外れることなく完全に入射されるので、結晶の側面における反射光や、結晶に入ることができずに外れた光が迷光となって結晶から出射される極短パルスレーザ光に混合されてしまうことが防止される。その結果、音響光学装置から出力される強度変調等された極短パルスレーザ光の試料の集光位置における点像分布関数が悪化することが防止され、試料において効率的に多光子励起効果を発生させて鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。
【００２２】
また、上記発明においては、前記入射補正装置が、複数のレンズを備えるとともに、該レンズのうち少なくとも１枚のレンズを光軸方向に移動させる補正移動機構を備えることとしてもよい。
このように構成することで、補正移動機構の作動によりレンズ間距離を調節し、あるいは、複数のレンズを移動させることにより、光束径の縮小率および／またはビームダイバージェンスを調節することができる。したがって、パルスレーザ光源の個体差、パルスレーザ光源から出射される極短パルスレーザ光の波長、分散補償光学系による分散補償量等の変動により、極短パルスレーザ光のビームウエストの位置が光軸方向に変動しても、補正移動機構の作動により光束径の縮小率および／またはビームダイバージェンスを調節することができ、音響光学装置の有効範囲内に確実に入射させて、効率的に多光子励起効果を発生させることが可能となる。
【００２３】
また、上記発明においては、前記入射補正装置が、絞り、ピンホール、スリット等の空間フィルタにより構成されていることとしてもよい。
このように構成することで、入射補正装置に入射される極短パルスレーザ光の光束径を簡易に縮小して、音響光学装置の有効範囲内に入射させることができる。
【００２４】
また、上記発明においては、前記観察装置本体が、前記導入光学系の２つの光路を通過した極短パルスレーザ光をそれぞれ走査する２つの走査装置を備えることとしてもよい。
このようにすることで、２つの光路を通過してきた極短パルスレーザ光を２つの走査装置によって個別に独立して走査させることができる。したがって、例えば、音響光学装置によりきめ細かくオンオフあるいは適正に出力調整された極短パルスレーザ光を所望の領域に精度よく照射する光刺激と、試料の深い部位まで極短パルスレーザ光を入射させた蛍光観察とを同時に行うことができる。
【００２５】
また、本発明は、極短パルスレーザ光を出射するパルスレーザ光源と、該パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光を調節する導入光学系とを備え、該導入光学系が、パルスレーザ光源から発せられる極短パルスレーザ光のオンオフまたは出力調整を行う音響光学装置を含む第１の光路と、前記音響光学装置を迂回する第２の光路とを並列に備えるとともに、これらの光路を切り替える光路選択装置を備える多光子励起型観察用光源装置を提供する。
【００２６】
本発明によれば、導入光学系の光路選択装置の作動により第１の光路または第２の光路の少なくとも一方が選択され、選択された光路に極短パルスレーザ光が通過させられて出射される。第１の光路が選択された場合には、極短パルスレーザ光は音響光学装置を通過させられる。これにより、極短パルスレーザ光は高速にオンオフまたは出力調整された状態で出射される。したがって、試料の所定の必要領域のみに精度よく、かつ、適正に出力調整された状態の極短パルスレーザ光を照射されることにより、試料の光刺激あるいは蛍光観察を行うことが可能な極短パルスレーザ光を出射することができる。
【００２７】
一方、第２の光路が選択された場合には、極短パルスレーザ光は、音響光学装置を通過することなく迂回して出射される。音響光学装置を通過しないので、極短パルスレーザ光は、さほど減衰することなく、高い強度に維持されたままで出射されることになる。したがって、試料の深い部位まで到達し、試料の深い部位の蛍光画像を得ることを可能とする高強度の極短パルスレーザ光を出射することができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、音響光学装置を用いたきめ細かい出力変調およびオンオフによる多様な光刺激や蛍光観察を行う一方、試料を移動させることなく、当該試料の深い部位における明るく鮮明な蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の第１の実施形態に係る多光子励起型観察装置１について、図１〜図７を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る多光子励起型観察装置１は、図１に示されるように、極短パルスレーザ光Ｌを出射可能な赤外パルスレーザ光源２と、試料Ａに極短パルスレーザ光Ｌを照射して、得られる蛍光Ｆを観察する蛍光顕微鏡本体（観察装置本体）３と、該蛍光顕微鏡本体３に前記赤外パルスレーザ光源２から発せられた極短パルスレーザ光Ｌを導入する導入光学系４とを備えている。
赤外パルスレーザ光源２と導入光学系４とにより本実施形態に係る多光子励起型観察用光源装置５が構成されている。
【００３０】
前記蛍光顕微鏡本体３は、導入光学系４から入射されてくる極短パルスレーザ光Ｌを２次元的に走査するガルバノミラー（走査装置）６と、該ガルバノミラー６により走査された極短パルスレーザ光Ｌを集光して中間像を結像させる瞳投影レンズ７と、中間像を結像した極短パルスレーザ光Ｌを集光して略平行光に変換する結像レンズ８と、該結像レンズ８により略平行光に変換された極短パルスレーザ光Ｌを集光して試料Ａに結像させる一方、試料Ａにおいて蛍光物質が励起されることにより発せられた蛍光Ｆを集光する対物レンズ９と、該対物レンズ９により集光された蛍光Ｆを極短パルスレーザ光Ｌから分岐する励起ダイクロイックミラー１０と、該励起ダイクロイックミラー１０により分岐された蛍光Ｆを集光する集光レンズ１１と、該集光レンズ１１により集光された蛍光Ｆ内の極短パルスレーザ光Ｌ成分を除去するバリアフィルタ１２と、バリアフィルタ１２を通過した蛍光Ｆを波長毎に分岐する蛍光分岐ダイクロイックミラー１３と、波長毎に分岐された蛍光Ｆをそれぞれ検出する、例えば、光電子増倍管（PMT：Photomultiplier tube）のような光検出器１４とを備えている。図中、符号１５はミラー、符号１６はバンドパスフィルタ、符号１７は集光レンズを示している。
【００３１】
前記導入光学系４は、赤外パルスレーザ光源２から入射されてくる極短パルスレーザ光Ｌを通過させることにより負の群速度分散を付与する分散補償光学系１８と、該分散補償光学系１８により分散補償された極短パルスレーザ光Ｌを入射させて、極短パルスレーザ光Ｌの光軸および角度を変更可能にするアライメント調節装置１９と、第１の光路２０を有する第１の光学系２１と、第２の光路２２を有する第２の光学系２３と、これら２つの光路２０，２２を択一的に選択可能な光路選択装置２４とを備えている。
【００３２】
前記分散補償光学系１８は、例えば、一対のプリズム２５，２６とミラー２７とから構成されている。図２に示されるように、プリズム２５，２６どうしの間隔を調節することで、波長ごとに分散補償量を調節して、赤外パルスレーザ光源２から蛍光顕微鏡本体３の対物レンズ９に至る全光学系における群速度分散を補償するようになっている。
【００３３】
この際に、光路長の調節により、光軸がシフトし、波長の変化によって光軸の角度が変動するので、プリズム２５，２６およびミラー２７の位置および角度を矢印に示すように調節することにより、出射される極短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置および角度が調節されるようになっている。
図中、符号２８は、赤外パルスレーザ光源２から発せられた極短パルスレーザ光Ｌを反射して分散補償光学系１８に指向させる一方、分散補償光学系１８から出力された極短パルスレーザ光Ｌの光軸から外れた位置に配置されているミラーである。
【００３４】
前記アライメント調節装置１９は、図３に示されるように、例えば、２枚のミラー１９ａ，１９ｂとこれらミラー１９ａ，１９ｂをそれぞれ移動させる２つのミラー移動機構２９，３０とを備えている。第１のミラー１９ａは、第１の方向Ｚ１から矢印のように入射されてきた極短パルスレーザ光Ｌを、該第１の方向Ｚ１に略直交する第２の方向Ｚ２に偏向させるようになっている。また、第２のミラーは、第２の方向Ｚ２に入射される極短パルスレーザ光Ｌを、第１の方向Ｚ１および第２の方向Ｚ２に略直交する第３の方向Ｚ３に偏向させて出射するようになっている。
【００３５】
第１のミラー移動機構２９は、前記第１の方向Ｚ１に沿って第１のミラーを並進移動させる第１の並進機構２９ａと、前記第３の方向Ｚ３に平行な軸線回りに第１のミラー１９ａを揺動させる第１の揺動機構２９ｂとを備えている。第２のミラー移動機構３０は、前記第３の方向Ｚ３に沿って第２のミラー１９ｂを並進移動させる第２の並進機構３０ａと、前記第１の方向Ｚ１に平行な軸線回りに第２のミラー１９ｂを揺動させる第２の揺動機構３０ｂとを備えている。第１、第２の並進機構２９ａ，３０ａは、例えば、モータ２９ｃ，３０ｃおよびボールネジ２９ｄ，３０ｄにより駆動され、第１、第２の揺動機構２９ｂ，３０ｂは、例えば、モータ２９ｅ，３０ｅにより構成されている。
【００３６】
これにより、極短パルスレーザ光Ｌの光軸の角度が、第１の方向Ｚ１に対して、第１の方向Ｚ１および第２の方向Ｚ２を含む平面内においてずれている場合には、第１の揺動機構２９ｂを作動させてその角度を調節し、第１の方向Ｚ１に対して第２の方向Ｚ２および第３の方向Ｚ３を含む平面内においてずれている場合には、第２の揺動機構３０ｂを作動させてその角度を調節することができるようになっている。また、アライメント調節装置１９から出射される極短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置が第１の方向Ｚ１にずれている場合には、第１の並進機構２９ａを作動させ、第２の方向Ｚ２にずれている場合には第２の並進機構３０ａを作動させて、その位置ずれを調節することができるようになっている。
【００３７】
これにより、アライメント調節装置１９から出射される極短パルスレーザ光Ｌは、入射される極短パルスレーザ光Ｌの光軸の角度および位置の如何にかかわらず、その光軸の角度および位置を精度よく一定の位置に調節することができるようなっている。
【００３８】
前記第１の光学系２１は、分散補償光学系１８により分散補償された極短パルスレーザ光Ｌのオンオフあるいは強度変調を行う音響光学装置３１と、該音響光学装置３１と赤外パルスレーザ光源２との間に配置され、音響光学装置３１に入射させる極短パルスレーザ光Ｌを調節するビーム整形光学系（入射補正装置）３２と、音響光学装置３１から出射され、前記蛍光顕微鏡本体３に入射される極短パルスレーザ光Ｌを調節する顕微鏡入射補正装置３３とを備えている。
【００３９】
前記音響光学装置３１は、図４〜図６に示されるように、例えば、ＡＯＭであって、２酸化テルルからなる結晶３４と、該結晶３４を固定するケース３５と、結晶３４に接着された圧電素子からなるトランスデューサ３６と、該トランスデューサ３６に入力する電気信号Ｅを伝達する音響波発生用電気回路３７と、前記結晶３４に接着されたヒートシンク（放熱部材）３８とを備えている。結晶３４とケース３５との間、結晶３４とヒートシンク３８との間には、例えば、シリコーングリースのようなサーマルコンパウンドあるいはインジウム箔からなる界面材３９が介在させられている。また、図６中、符号４０は、トランスデューサ３６から発せられ、結晶３４内を伝播した音響波を吸収する吸音材である。
【００４０】
結晶３４を挟んで対向するケース３５の一対の側壁にはそれぞれ開口部４１が設けられており、一の開口部４１から極短パルスレーザ光Ｌを入射させ、結晶３４を通過した極短パルスレーザ光Ｌを他の開口部４１から出射させるようになっている。
前記ヒートシンク３８は、例えば、アルミニウムあるいはアルミニウム合金のような熱伝導率の高い材質からなり、図５に示されるように、平行間隔をあけて配置される複数の平板状のフィン３８ａを備えている。
【００４１】
前記ビーム整形光学系３２は、分散補償光学系１８を通過し、アライメント調節装置１９によって位置合わせされた極短パルスレーザ光Ｌの光束径を絞り、音響光学装置３１の結晶３４（図４参照）の有効範囲Ｘ内に漏れなく入射させるように構成されている。
本実施形態においては、ビーム整形光学系３２は、例えば、図４に示されるように、両凸レンズ４２と平凹レンズ４３とを組み合わせたガリレイ型のビームエキスパンダと、両凸レンズ４２および平凹レンズ４３をそれぞれ光軸方向に移動可能に支持するレンズ移動機構４４，４５とにより構成されている。また、ビーム整形光学系３２は、赤外パルスレーザ光源２と音響光学装置３１との間に、その中央よりも音響光学装置３１側に配置されていることが好ましい。
【００４２】
前記顕微鏡入射補正装置３３は、アライメント調節装置４６と第１の視準光学系４７とを備えている。
アライメント調節装置４６は、例えば、図３に示されるアライメント調節装置１９と同一構造を有し、蛍光顕微鏡本体３に入射させる極短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置と偏向を精度よく調節することができるようになっている。
【００４３】
また、第１の視準光学系４７は、例えば、図７に示されるように、複数の凸レンズ４８を有するケプラー型のビームエキスパンダと、該凸レンズ４８の少なくとも１つを光軸方向に移動可能に支持するレンズ移動機構４９とにより構成されている。これにより、第１の視準光学系４７は、極短パルスレーザ光Ｌが、蛍光顕微鏡本体３の対物レンズ９の瞳位置に瞳径と略同等の光束径で入射されるように、出射される極短パルスレーザ光Ｌの光束径およびビームダイバージェンスを調節することができるようになっている。
【００４４】
極短パルスレーザ光Ｌは、光束径Ｗ、波面の曲率ＲおよびビームダイバージェンスＤがＷ＝Ｒ・Ｄとなる関係を有している。これら３つの変数Ｗ，Ｒ，Ｄはいずれも極短パルスレーザ光Ｌの波長λ、ビームウエスト位置における光束径Ｗ０およびビームウエスト位置からの光軸方向距離の関数である。したがって、これら３つの変数Ｗ，Ｒ，Ｄのうち、いずれか２つを決定することにより、極短パルスレーザ光Ｌを一意に決定することができる。すなわち、光束径ＷとビームダイバージェンスＤとを調節することは、光束径Ｗと波面の曲率Ｒとを調節すること、および、波面の曲率ＲとビームダイバージェンスＤとを調節することと等価である。
【００４５】
前記第２の光学系２３は、第２の光路２２に入射されてくる極短パルスレーザ光Ｌをオンオフするメカニカルシャッタ５０と、上記第１の視準光学系４７と同一構造の第２の視準光学系５１とを備えている。該第２の視準光学系５１は、極短パルスレーザ光Ｌが、蛍光顕微鏡本体３の対物レンズ９の瞳位置に瞳径と略同等の光束径で入射されるように、出射される極短パルスレーザ光Ｌの光束径およびビームダイバージェンスを調節することができるようになっている。図中、符号５２は光路設定用のミラー、符号５３はＮＤフィルタである。
【００４６】
前記光路選択装置２４は、第１の光路２０と第２の光路２２との分岐点および合流点にそれぞれ挿脱可能に配置される２枚の全反射ミラー５４，５５と、該全反射ミラー５４，５５を移動させるミラー移動装置（図示略）とを備えている。光路選択装置２４の作動により、図１に鎖線で示すように、ミラー移動装置が全反射ミラー５４を移動させて第１の光路２０と第２の光路２２との分岐点に全反射ミラー５４を挿入配置すると、全反射ミラー５４によって第２の光路２２が遮られ、極短パルスレーザ光Ｌは全反射ミラー５４によって反射されて第１の光路２０に指向されるようになっている。一方、ミラー移動装置が全反射ミラー５４を移動させて、全反射ミラー５４を第１の光路２０と第２の光路２２との分岐点から外れた位置に配置すると、極短パルスレーザ光Ｌは、全反射ミラー５４によって遮られることなくそのまま第２の光路２２内に入射させられるようになっている。
【００４７】
また、ミラー移動装置が全反射ミラー５５を移動させて第１の光路２０と第２の光路２２との合流点に全反射ミラー５５を挿入配置すると、第１の光路２０を通過してきた極短パルスレーザ光Ｌが全反射ミラー５５によって反射されて蛍光顕微鏡本体３に指向されるようになっている。一方、ミラー移動装置が全反射ミラー５５を移動させて、全反射ミラー５５を第１の光路２０と第２の光路２２との合流点から外れた位置に配置すると、第２の光路２２を通過してきた極短パルスレーザ光Ｌが、全反射ミラー５５によって遮られることなくそのまま蛍光顕微鏡本体３内に入射させられるようになっている。これにより、第２の光路２２は、音響光学装置３１を備える第１の光路２０を迂回して、音響光学装置３１を通過させることなく、極短パルスレーザ光Ｌを蛍光顕微鏡本体３内に入射させることができるようになっている。
【００４８】
なお、前記各調節装置（分散補償光学系１８、アライメント調節装置１９，４６、ビーム整形光学系３２、第１、第２の視準光学系４７，５１、音響光学装置３１および光路選択装置２４）には、図示しない制御装置が接続されている。該制御装置には、赤外パルスレーザ光源２から出射される極短パルスレーザ光Ｌの波長とその波長が選択されたときの前記各調節装置の最適な作動状態、例えば、分散補償光学系１８のプリズム２５，２６の位置および角度、アライメント調節装置１９，４６のミラー移動機構２９，３０の移動位置、ビーム整形光学系３２および視準光学系４７，５１を構成するレンズ移動機構４４，４５，４９の移動位置、音響光学装置３１のトランスデューサ３６により結晶３４に入力する音響波の周波数等とを対応づけて記憶するメモリ装置（図示略）が備えられている。各調節装置の作動状態は相互に関連している場合があるので、全ての調節装置に対して、波長と作動状態とが設定されていることが好ましい。
【００４９】
そして、赤外パルスレーザ光源２から出射される極短パルスレーザ光Ｌの波長が、例えば、赤外パルスレーザ光源Ｌから出力される波長情報（あるいは、外部から入力される極短パルスレーザ光Ｌの波長情報）によって取得されると、制御装置は、取得された波長情報に基づいてメモリ装置内を検索し、波長に対応する作動状態となるように各調節装置を自動調節するようになっている。
【００５０】
これにより、赤外パルスレーザ光源２の波長の変化にかかわらず、簡易かつ精度よく極短パルスレーザ光Ｌを漏れなく音響光学装置３１の結晶３４の有効範囲Ｘ内に通過させ、あるいは、対物レンズ９の瞳位置に瞳径と略同等の極短パルスレーザ光Ｌを入射させて、試料Ａにおける多光子励起効果を効率的に発生させることができるようになっている。
【００５１】
このように構成された本実施形態に係る多光子励起型観察装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る多光子励起型観察装置１によれば、観察の種類が決定されると、赤外パルスレーザ光源２から発せられる極短パルスレーザ光Ｌの波長が決定され、その波長情報が赤外パルスレーザ光源２から、あるいは、外部の入力装置から制御装置に入力される。
【００５２】
制御装置は、観察の種類に応じて、光路選択装置２４を作動させ、ミラー移動機構の作動により、全反射ミラー５４，５５を第１、第２の光路２０，２２の分岐点および合流点に挿脱する。具体的には、音響光学装置３１を用いて、試料Ａの比較的浅い位置に精度よく、かつ、きめ細かく調節された領域内に極短パルスレーザ光Ｌを照射する場合には、全反射ミラー５４，５５を挿入して第１の光路２０に極短パルスレーザ光Ｌを通過させる。逆に、試料Ａの比較的深い位置に極短パルスレーザ光Ｌを照射する場合には、全反射ミラー５４，５５を抜き出して第２の光路２２に極短パルスレーザ光Ｌを通過させる。
【００５３】
次いで、制御装置においては、入力された極短パルスレーザ光Ｌの波長情報に基づいて、メモリ装置内が検索され、その波長情報に関連づけて記憶されている各調節装置の作動状態が取得される。
制御装置は、取得された作動状態となるように各調節装置を制御する。
【００５４】
具体的には、まず、赤外パルスレーザ光源２から出射される極短パルスレーザ光Ｌの波長が決定されると、赤外パルスレーザ光源２から出射される極短パルスレーザ光Ｌの多光子励起型観察装置１の光学系全体における群速度分散量が定まるので、その群速度分散を補償するような分散補償量となる作動状態に分散補償光学系１８が制御される。分散補償光学系１８においては、２つのプリズム２５，２６間の距離および２つのプリズム２５，２６の角度およびミラー２７の位置が制御装置により指示される作動状態となるように制御される。これにより、適正に分散補償された極短パルスレーザ光Ｌが分散補償光学系１８から出力される。
【００５５】
次に、赤外パルスレーザ光源２から出射される極短パルスレーザ光Ｌの波長が決定されると、赤外パルスレーザ光源２からの出射方向および分散補償光学系１８から出射方向が決定される。したがって、制御装置は、メモリ装置から取得したミラー移動機構１９ａ，１９ｂの作動状態となるようにアライメント調節装置１９を制御して、ビーム整形光学系３２に入射される極短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置および角度が、極短パルスレーザ光Ｌの波長の如何にかかわらず一定となるように調節する。
【００５６】
ここで、光路選択装置２４により第１の光路２０が選択された場合について説明する。
赤外パルスレーザ光源２から出射される極短パルスレーザ光Ｌの波長が決定されると、分散補償光学系１８から出力される極短パルスレーザ光Ｌのビームウエスト位置およびビームダイバージェンスが決定されるので、制御装置は、メモリ装置から取得したレンズ移動機構４４，４５の作動状態となるようにビーム整形光学系３２を制御して、出射される極短パルスレーザ光Ｌの光束径を調節する。
【００５７】
この場合において、ビーム整形光学系３２は、極短パルスレーザ光Ｌの光束径を縮小して、音響光学装置３１の結晶３４の有効範囲Ｘ内に入射させるように構成されているので、極短パルスレーザ光Ｌが漏れなく結晶３４を通過させられる。
【００５８】
また、赤外パルスレーザ光源２から出射される極短パルスレーザ光Ｌの波長が決定されると、音響光学装置３１からの変調後の極短パルスレーザ光Ｌの出射方向が所定の方向となるような音響波の周波数が決定されるので、制御装置は、メモリ装置から取得した音響波発生用電気回路３７の作動状態となるように音響光学装置３１を制御して、オンオフあるいは出力調節された極短パルスレーザ光Ｌを所定の方向に出力させる。
【００５９】
音響光学装置３１においては、音響波発生用電気回路３７の作動により、所定周波数の電気信号Ｅがトランスデューサ３６に入力され、トランスデューサ３６において発生させられた音響波によって、結晶３４内における極短パルスレーザ光Ｌの音響光学効果が発生する。また、トランスデューサ３６により発生する音響波の振幅を変更することにより、結晶３４内における極短パルスレーザ光Ｌの回折強度を変化させ、音響光学装置３１から出射される極短パルスレーザ光Ｌの強度を音響波の振幅に応じた所定の割合で変調する。
【００６０】
これにより、入射された極短パルスレーザ光Ｌが結晶３４を通過してケース３５の開口部４１から、所定の強度に変調された状態で出射されることになる。
この場合において、ビーム整形光学系３２によって極短パルスレーザ光Ｌが結晶３４の有効範囲Ｘ内に漏れなく入射されているので、結晶３４に入射されない極短パルスレーザ光Ｌや結晶３４の側面によって乱反射等される極短パルスレーザ光Ｌが存在しない。したがって、これらの極短パルスレーザ光Ｌが迷光となって、正常に結晶３４を通過する極短パルスレーザ光Ｌに混入することがない。
【００６１】
その結果、結晶３４から出射される極短パルスレーザ光Ｌにおける波面の乱れの発生が抑制され、試料Ａの集光位置におけるＰＳＦ（点像分布関数）の悪化が抑制される。すなわち、対物レンズ９の前方に形成される試料Ａにおける集光位置において、光子密度の低下が防止され、多光子励起効果を効率的に発生させることが可能となる。
【００６２】
また、トランスデューサ３６により結晶３４に入力する音響波をオンオフすることにより、極短パルスレーザ光Ｌの出射と遮断とを切り替えてオンオフすることができる。例えば、蛍光顕微鏡本体３のガルバノミラー６による極短パルスレーザ光Ｌの２次元的な走査と同期させて極短パルスレーザ光Ｌをオンオフすることにより、試料Ａに対して所定の走査範囲のみに極短パルスレーザ光Ｌを照射することが可能となる。
【００６３】
また、極短パルスレーザ光Ｌは音響光学装置３１の結晶３４内を通過させられる際に音響光学効果によって回折させられる。このとき、結晶３４にはトランスデューサ３６から音響波が入力されるので、そのエネルギによって結晶３４が局所的に発熱する。
【００６４】
本実施形態に係る多光子励起型観察装置１によれば、結晶３４自体の熱容量が小さいが、該結晶３４に熱容量の大きなヒートシンク３８が接着されているので、結晶３４において発生した熱はヒートシンク３８によって吸収される。また、ヒートシンク３８には複数のフィン３８ａが設けられているので、結晶３４から吸収した熱は、これらのフィン３８ａを介して外気に効率的に放散される。これにより、結晶３４の局所的な温度上昇が抑制され、結晶３４内の屈折率の変動が大幅に抑制されることになる。
【００６５】
結晶３４の屈折率が変動すると、結晶３４内における極短パルスレーザ光Ｌの回折が変化するため、音響光学装置３１からの出射方向が変化する。したがって、何ら対策を施さない場合には、アライメント調節装置１９，４６によって極短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置と偏向を厳密に調節しておいても、トランスデューサ３６から入力される音響波によって、結晶３４の温度が経時的に変化し、それによって結晶３４からの出射方向がずれて適正な位置に出射されなくなってしまうことになる。
【００６６】
また、結晶３４に入力する音響波の振幅は、その強度変調の程度やオンオフの頻度等の使用状態によって相違するため、使用状態ごとに極短パルスレーザ光Ｌの出射方向が変化する。
特に、音響光学装置３１がＡＯＭの場合には、音響波を発生させるためにトランスデューサ３６に入力する駆動電力が高いこと、および、極短パルスレーザ光Ｌを入射させる有効範囲の面積が小さいことにより、対策を施さない場合には結晶３４内は局所的に加熱される。
【００６７】
本実施形態によれば、熱容量の大きなヒートシンク３８によって結晶３４の温度変化が抑制されるので、音響波を発生させるためにトランスデューサ３６に入力する駆動電力が高くても、結晶３４における局所的な加熱状態が防止され、極短パルスレーザ光Ｌの出射方向を一定に維持することができる。その結果、結晶３４の経時的な温度変化を検出したり、検出された結晶３４の温度に基づいてアライメント調節装置１９，４６をその都度調節したりする必要がなく、簡易な構成で、観察開始時に設定されたアライメント状態のままで、試料Ａの適正な照射範囲に極短パルスレーザ光Ｌを照射して、蛍光観察を行うことができる。
なお、本実施形態においては、ヒートシンク３８の形態として、平板状のフィン３８ａを備えるものを例示したが、これに代えて、他の任意の形態のヒートシンクを採用することができる。
【００６８】
また、赤外パルスレーザ光源２から出射される極短パルスレーザ光Ｌの波長が決定されると、音響光学装置３１から極短パルスレーザ光Ｌの出射方向が決定される。したがって、制御装置は、メモリ装置から取得したミラー移動機構の作動状態となるようにアライメント調節装置４６を制御して、第１の視準光学系４７に入射される極短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置および角度が、極短パルスレーザ光Ｌの波長の如何にかかわらず一定となるように調節する。
【００６９】
また、赤外パルスレーザ光源２から出射される極短パルスレーザ光Ｌの波長が決定されると、音響光学装置３１から出力される極短パルスレーザ光Ｌのビームウエスト位置およびビームダイバージェンスが決定される。したがって、制御装置は、メモリ装置から取得したレンズ移動機構４９の作動状態となるように第１の視準光学系４７を制御して、出射される極短パルスレーザ光Ｌの光束径およびビームダイバージェンスを調節する。
【００７０】
第１の視準光学系４７においては、赤外パルスレーザ光源２から発せられ、分散補償光学系１８、アライメント調節装置１９、ビーム整形光学系３２、音響光学装置３１およびアライメント調節装置４６を通過してきた極短パルスレーザ光Ｌの光束径およびビームダイバージェンスを再度補正し直すことにより、蛍光顕微鏡本体３の対物レンズ９の瞳位置に、その瞳径と略同等の光束径を有するように補正する。これにより、赤外パルスレーザ光源２から発せられた極短パルスレーザ光Ｌを最も無駄なく効率的に試料Ａに集光させ、試料Ａ内に形成されるビームウエスト位置における光子密度を向上させて、効率的に多光子励起効果を発生させることができる。
【００７１】
蛍光顕微鏡本体３に入射された極短パルスレーザ光Ｌは、ガルバノミラー６によって２次元的に走査され、あるいは、所定の照射位置に位置決めされ、瞳投影レンズ７、結像レンズ８および対物レンズ９を介して、試料Ａの所定の照射位置に集光される。これにより、試料Ａの光刺激を行うことができる。すなわち、本実施形態によれば、音響光学装置３１によりきめ細かくオンオフあるいは出力調整された極短パルスレーザ光Ｌが試料Ａに照射されるので、試料の所望の領域を精度よく、かつ、適正な光量の極短パルスレーザ光Ｌによって光刺激することができる。
【００７２】
一方、観察の種類が、蛍光観察である場合には、試料Ａ内に形成されるビームウエスト位置において多光子励起効果を発生させ、発生した蛍光Ｆが対物レンズ９によって集められ、励起ダイクロイックミラー１０によって極短パルスレーザ光Ｌから分岐させられて、ミラー１５、集光レンズ１１およびバリアフィルタ１２を透過した後に、蛍光分岐ダイクロイックミラー１３によって波長毎に分岐させられて光検出器１４により検出される。これにより、試料Ａの蛍光画像を取得することができる。
【００７３】
この場合に、音響光学装置３１の作動により、必要な領域のみに精度よく、かつ、適正な強度の極短パルスレーザ光Ｌを照射することができ、試料Ａの褪色等の不都合の発生を防止することができる。
【００７４】
次に、光路選択装置２４によって第２の光路２２が選択された場合について説明する。
制御装置は、メカニカルシャッタ５０を制御して、アライメント調節装置４６から出射されてきた極短パルスレーザ光Ｌをオンオフする。メカニカルシャッタ５０がオフ状態とされて、極短パルスレーザ光Ｌが第２の光路２２を通過させられると、極短パルスレーザ光ＬはＮＤフィルタ５３を通過することによって、強度調整された後に、第２の視準光学系５１に入射される。メカニカルシャッタ５０を使用することで、メカニカルシャッタ５０がオフ状態の場合に極短パルスレーザ光Ｌを減衰させることなく透過させることができる。
【００７５】
赤外パルスレーザ光源２から出射される極短パルスレーザ光Ｌの波長が決定されると、アライメント調節装置１９から出射されてくる極短パルスレーザ光Ｌのビームウエスト位置およびビームダイバージェンスが決定される。したがって、制御装置は、メモリ装置から取得したレンズ移動機構の作動状態となるように第２の視準光学系５１を制御して、出射される極短パルスレーザ光Ｌの光束径およびビームダイバージェンスを調節する。
【００７６】
第２の視準光学系５１においては、赤外パルスレーザ光源２から発せられ、分散補償光学系１８およびアライメント調節装置１９を通過してきた極短パルスレーザ光Ｌの光束径およびビームダイバージェンスを再度補正し直すことにより、蛍光顕微鏡本体３の対物レンズ９の瞳位置に、その瞳径と略同等の光束径を有するように補正する。これにより、赤外パルスレーザ光源２から発せられた極短パルスレーザ光Ｌを最も無駄なく効率的に試料Ａに集光させ、試料Ａ内に形成されるビームウエスト位置における光子密度を向上させて、効率的に多光子励起効果を発生させることができる。
【００７７】
この場合において、第２の光路２２を通過する極短パルスレーザ光Ｌは、音響光学装置３１のように減衰の大きな光学素子を通過しないので、赤外パルスレーザ光源２からの極短パルスレーザ光Ｌをほとんど減衰させることなく蛍光顕微鏡本体３内に導入することができる。したがって、試料Ａの深い部位まで高強度の極短パルスレーザ光Ｌを供給することが可能となり、試料Ａの深い部位の明るく鮮明な蛍光画像を得ることができる。
【００７８】
このように、本実施形態に係る多光子励起型観察装置１および多光子励起型観察用光源装置５によれば、赤外パルスレーザ光源２から出射される極短パルスレーザ光Ｌの波長が変更されても、制御装置が、その波長情報に基づいて各調節装置を制御する。したがって、極短パルスレーザ光Ｌの波長が変更されても、蛍光顕微鏡本体３の対物レンズ９の瞳位置に、その瞳径と略同等の光束径を有する極短パルスレーザ光Ｌを入射させることができ、試料Ａにおける多光子励起効果を効率的に発生させて鮮明な多光子励起画像を得ることができるという効果を奏する。
【００７９】
また、本実施形態に係る多光子励起型観察装置１および多光子励起型観察用光源装置５によれば、光路選択装置２４の作動により、第１の光路２０または第２の光路２２が択一的に選択される。したがって、観察の種類に応じて、音響光学装置３１により、きめ細かいオンオフおよび出力調整を行った極短パルスレーザ光Ｌを試料Ａに入射させて、高い精度の光刺激や蛍光観察を行う観察方法と、減衰のない高い強度の極短パルスレーザ光Ｌにより、試料Ａの深い部位の蛍光観察を行う観察方法とを選択することができる。
【００８０】
そして、この場合において、本実施形態に係る多光子励起型観察装置１および多光子励起型観察用光源装置５によれば、全反射ミラー５４，５５を挿脱するだけで、上記選択を行うことができ、異なる種類の観察間において試料Ａを移動させる必要がない。したがって、高倍率の微細な領域の観察に際して、異なる種類の観察間において、観察範囲を見失うことなく観察できるという利点がある。
【００８１】
また、波長の変更等が生じても、極短パルスレーザ光Ｌのビームウエスト位置が光軸方向にずれるのを防止でき、波長にかかわらず、試料Ａの同一位置にピントを合わせることができる。
さらに、制御装置は、メモリ装置に波長と対応づけて記憶されている各調節装置の作動状態によって各調節装置を制御する。したがって、波長が変更されても、簡易かつ迅速に、試料Ａにおいて多光子励起効果を効率的に発生させるように極短パルスレーザ光Ｌを調節することができる。
【００８２】
なお、本実施形態に係る多光子励起型観察用光源装置５においては、分散補償光学系１８として、２つのプリズム２５，２６とミラー２７とを有する構造のものを採用したが、これに代えて、グレーティング対により構成されていてもよい。この場合、グレーティングどうしの間隔を調節することにより、波長ごとに分散補償量を調節して、赤外パルスレーザ光源２から蛍光顕微鏡本体３の対物レンズ９に至る全光学系における群速度分散を補償することができる。
また、プリズム２５，２６およびミラー２７の組合せの他、複数のプリズムの組合せ、複数のグレーティングの組合せ、プリズムとグレーティングとの組合せからなる分散補償光学系を採用することにしてもよい。
【００８３】
また、本実施形態においては、波長と作動状態とを予め関連づけてメモリ装置に記憶しておくこととしたが、これに代えて、極短パルスレーザ光Ｌのアライメント状態を測定し、その測定結果をフィードバックしてアライメント調節装置１９，４６を制御することにしてもよい。このようにすることで、波長が連続的に変化する場合においても極短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置および方向が一定となるように調節することができる。
【００８４】
また、ビーム整形光学系３２に入力される極短パルスレーザ光Ｌあるいはビーム整形光学系３２から出力される極短パルスレーザ光Ｌの光束径を測定し、その測定結果に基づいて、所定の光束径やビームダイバージェンスが達成できるようにレンズ移動機構を自動調節することにしてもよい。また、波長の変更により生ずるビームウエスト位置の移動、ビームダイバージェンスの変動を検出し、それぞれ所望のビームウエスト位置およびビームダイバージェンスが達成できるように各調節装置を自動調節することにしてもよい。
【００８５】
また、本実施形態に係る多光子励起型観察装置１および多光子励起型観察用光源装置５においては、ガリレイ型のビーム整形光学系３２およびケプラー型の視準光学系４７，５１を採用したが、これに代えて、ケプラー型のビーム整形光学系およびガリレイ型の視準光学系を採用してもよい。
また、ビーム整形光学系３２は、図８に示されるように、一対の凹面鏡５６，５７を対向配置することにより構成してもよい。このように構成することで反射光学系によって極短パルスレーザ光Ｌの光束径を縮小させるので、ビーム整形光学系３２を通過する際に群速度分散を生じることがなく、パルス幅が広がることを防止できる。
【００８６】
また、図９に示すように、ビーム整形光学系３２として、絞り５８（あるいはスリットまたはピンホール等の空間フィルタ）を採用してもよい。このようにすることで、簡易な構成により極短パルスレーザ光Ｌの光束径を縮小させることができ、また調節も簡単であるという利点がある。
【００８７】
また、ビーム整形光学系３２および視準光学系４７，５１が、２以上のレンズ４２，４３，４８により構成される場合には、レンズ移動機構４４，４５，４９はその少なくとも１つのレンズ４２，４３，４８を光軸方向に移動させるように構成されていればよい。
【００８８】
さらに、極短パルスレーザ光Ｌの採用し得る波長が有限個に限られる場合には、図１０に示されるように、各波長に適合する距離や角度に予め調節された状態に固定されたレンズ群あるいは凹面鏡からなる複数の補正光学ユニット３２Ａ〜３２Ｃと、該補正光学ユニット３２Ａ〜３２Ｃを切り替える切替機構５９とを備えるものとしてもよい。この場合においても、波長と補正光学ユニット３２Ａ〜３２Ｃとを対応づけてメモリ装置に記憶しておき、得られた波長情報に基づいてメモリ装置内を検索して対応する補正光学ユニット３２Ａ〜３２Ｃを選択し、切替機構５９により切り替えることとすれば、上記と同様に、簡易に高精度の多光子蛍光画像を取得することが可能となる。
【００８９】
なお、視準光学系４７，５１についても同様の構造を採用することができる。また、この構造を採用するビーム整形光学系３２および視準光学系４７，５１において、補正光学ユニットについては、その数は２以上でよい。
また、視準光学系４７，５１，ビーム整形光学系３２のレンズ構成は、いずれも図示のような組合せに限られるものではなく、正または負のパワーを持つ任意のレンズの組合せにより構成されるものであってもよい。
【００９０】
次に、本発明の第２の実施形態に係る多光子励起型観察装置１００および多光子励起型観察用光源装置１０１について、図１１を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る多光子励起型観察装置１および多光子励起型観察用光源装置５と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００９１】
本実施形態に係る多光子励起型観察装置１００および多光子励起型観察用光源装置１０１は、その導入光学系１０２に設けられた光路選択装置１０３において、第１の実施形態に係る多光子励起型観察装置１および多光子励起型観察用光源装置５と相違している。
本実施形態においては、光路選択装置１０３は、第１の光路２０と第２の光路２２との分岐点に配置されるハーフミラー１０４と、第１の光路２０と第２の光路２２との合流点に配置される偏光ビームスプリッタ１０５と、第１の光路２０の極短パルスレーザ光Ｌの偏光面を９０°回転させるローテータ１０６と、第１の光学系２１に備えられた音響光学装置３１と、第２の光学系２３に備えられたメカニカルシャッタ５０とにより構成されている。
【００９２】
このように構成された本実施形態に係る多光子励起型観察装置１００および多光子励起型観察用光源装置１０１によれば、赤外パルスレーザ光源２から発せられた極短パルスレーザ光Ｌが、分散補償光学系１８により群速度分散を予め補償され、アライメント調節装置１９により、その光軸の角度および位置を精度よく一定の位置に調節された状態で、第１の光路２０と第２の光路２２との分岐点に配置されたハーフミラー１０４により所定の光量割合で分岐される。
【００９３】
ハーフミラー１０４により第１の光路２０に分岐された極短パルスレーザ光Ｌは、ビーム整形光学系３２により光束径を絞られた状態で、音響光学装置３１の結晶３４の有効範囲Ｘ内に漏れなく入射させられ、音響光学装置３１においてきめ細かいオンオフあるいは出力調整を受ける。その後、極短パルスレーザ光Ｌは、アライメント調節装置４６によって再度その光軸の位置および角度を精度よく調節された状態で、第１の視準光学系４７により、光束径およびビームダイバージェンスを再度補正し直され、蛍光顕微鏡本体３の対物レンズ９の瞳位置に、その瞳径と略同等の光束径を有するように補正される。
【００９４】
そして、第１の視準光学系４７を通過した極短パルスレーザ光Ｌは、ローテータ１０６を通過させられることによりその偏光面を９０°回転させられて偏光ビームスプリッタ１０５に入射される。偏光ビームスプリッタ１０５は、その偏光面を９０°回転させられた極短パルスレーザ光Ｌを反射し、偏光面が回転されていない極短パルスレーザ光Ｌを透過するように設定されている。したがって、第１の光路２０を通過してきた極短パルスレーザ光Ｌは偏光ビームスプリッタ１０５により反射されて、蛍光顕微鏡本体３内に導入される。
【００９５】
一方、ハーフミラー１０４によって第２の光路２２に分岐された極短パルスレーザ光Ｌは、メカニカルシャッタ５０によりオンオフされ、ＮＤフィルタ５３によって強度調整された後、第２の視準光学系５１により、光束径およびビームダイバージェンスが、蛍光顕微鏡本体３の対物レンズ９の瞳位置に、その瞳径と略同等の光束径を有するように補正される。そして、偏光ビームスプリッタ１０５をそのまま透過して蛍光顕微鏡本体３内に導入される。
【００９６】
このように、本実施形態に係る多光子励起型観察装置１００および多光子励起型観察用光源装置１０１によれば、ハーフミラー１０４によって常に第１の光路２０および第２の光路２２の両方に極短パルスレーザ光Ｌが供給され、第１の光路２０に設けられた音響光学装置３１および第２の光路に設けられたメカニカルシャッタ５０によって、両方の光路２０，２２を通過した極短パルスレーザ光Ｌを択一的にあるいは同時に蛍光顕微鏡本体３内に導入することができる。したがって、第１の実施形態の効果に加え、第１の光路２０を通過した極短パルスレーザ光Ｌによって高精度に試料Ａに光刺激を与えつつ、第２の光路２２を通過した極短パルスレーザ光Ｌによって、試料Ａの深い部位の明るく鮮明な蛍光画像を取得することができるという利点がある。
【００９７】
次に、本発明の第３の実施形態に係る多光子励起型観察装置１１０および多光子励起型観察用光源装置１１１について、図１２を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第２の実施形態に係る多光子励起型観察装置１００および多光子励起型観察用光源装置１０１と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。
【００９８】
本実施形態に係る多光子励起型観察装置１１０は、蛍光顕微鏡本体１１２が２つのガルバノミラー６，１１３を備え、第１，第２の光路２０，２２を通過してきた極短パルスレーザ光Ｌがそれぞれ別々のガルバノミラー６，１１３に導入される点において、第２の実施形態に係る多光子励起型観察装置１００と相違している。また、本実施形態に係る多光子励起型観察用光源装置１１１は、２つの光路２０，２２を通過してきた極短パルスレーザ光Ｌが合波されることなく、別個に出力される点において第２の実施形態に係る多光子励起型観察用光源装置１０１と相違している。図中、符号１１４は、第２の瞳投影レンズ、符号１１５は偏光ビームスプリッタ、符号１１６は導入光学系である。
【００９９】
このように構成された本実施形態に係る多光子励起型観察装置１１０および多光子励起型観察用光源装置１１１の作用について以下に説明する。第１の光路２０を通過してきた極短パルスレーザ光Ｌは、蛍光顕微鏡本体１１２内に導入されると、第１のガルバノミラー１１３によって２次元的に走査される。一方、第２の光路２２を通過してきた極短パルスレーザ光Ｌは、蛍光顕微鏡本体１１２内に導入されると、第２のガルバノミラー６によって２次元的に走査される。第１の光路２０には、偏光面を９０°回転させるローテータ１０６が設けられているので、第１および第２のガルバノミラー６，１１３によって別個に２次元的に走査された２つの極短パルスレーザ光Ｌは、蛍光顕微鏡本体１１２内に設けられた偏光ビームスプリッタ１１５によって合波され、同一の対物レンズ９を介して試料Ａに照射されることになる。
【０１００】
したがって、本実施形態に係る多光子励起型観察装置１１０および多光子励起型観察用光源装置１１１によれば、第２の実施形態の効果に加え、第１の光路２０を通過した極短パルスレーザ光Ｌによって、試料Ａの所望の領域に高精度に光刺激を与えつつ、第２の光路２２を通過した極短パルスレーザ光Ｌによって、光刺激領域とは異なる領域に配される試料Ａの深い部位の明るく鮮明な蛍光画像を取得することができるという利点がある。
【０１０１】
次に、本発明の第４の実施形態に係る多光子励起型観察装置１２０および多光子励起型観察用光源装置１２１について、図１３を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第３の実施形態に係る多光子励起型観察装置１１０および多光子励起型観察用光源装置１１１と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。符号１２２は導入光学系である。
【０１０２】
本実施形態に係る多光子励起型観察装置１２０および多光子励起型観察用光源装置１２１は、２つの赤外パルスレーザ光源２を備え、各赤外パルスレーザ光源２にそれぞれ第１の光路２０と第２の光路２２とが別々に接続されている点において、第３の実施形態に係る多光子励起型観察装置１１０および多光子励起型観察用光源装置１１１と相違している。したがって、本実施形態に係る多光子励起型観察装置１２０および多光子励起型観察用光源装置１２１は、第３の実施形態において、共通に設けられていた分散補償光学系１８およびアライメント調節装置１９が、各光路２０，２２，に別個に設けられる一方、２つの光路２０，２２を分岐させていたハーフミラー１０４を有していない。
【０１０３】
第１の赤外パルスレーザ光源２から発せられた極短パルスレーザ光Ｌは、第１の光路２０を通過して第１のガルバノミラー１１３によって走査される。また、第２の赤外パルスレーザ光源２から発せられた極短パルスレーザ光Ｌは、第２の光路２２を通過して第２のガルバノミラー６によって走査される。
【０１０４】
このように構成された本実施形態に係る多光子励起型観察装置１２０および多光子励起型観察用光源装置１２１によれば、ハーフミラー１０４によって分岐することなく赤外パルスレーザ光源２からの極短パルスレーザ光Ｌを第２の光路２２に通過させ、そのまま蛍光顕微鏡本体１１２内に導入することができる。したがって、さらに高強度の極短パルスレーザ光Ｌを試料Ａに照射することができる。その結果、試料Ａのさらに深い部位の明るく鮮明な蛍光画像を取得することができるという効果がある。
【０１０５】
なお、本実施形態においては、２つの光路２０，２２に別個に分散補償光学系１８を備えた場合について説明したが、音響光学装置３１を備えていない第２の光学系２３は分散量が少ないので、分散補償光学系１８を省略することとしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る多光子励起型観察装置および多光子励起型観察用光源装置を模式的に示す全体構成図である。
【図２】図１の多光子励起型観察装置および多光子励起型観察用光源装置に備えられた分散補償光学系を模式的に示す図である。
【図３】図１の多光子励起型観察装置および多光子励起型観察用光源装置に備えられたアライメント調節装置を示す斜視図である。
【図４】図１の多光子励起型観察装置および多光子励起型観察用光源装置に用いられるビーム整形光学系および音響光学装置を拡大して示す図である。
【図５】図１の多光子励起型観察装置および多光子励起型観察用光源装置に用いられる音響光学装置の一例を示す斜視図である。
【図６】図５の音響光学装置の内部構造を示す縦断面図である。
【図７】図１の多光子励起型観察装置および多光子励起型観察用光源装置に用いられる視準光学系を拡大して示す図である。
【図８】図４のビーム整形光学系の変形例を示す図である。
【図９】図４のビーム整形光学系の他の変形例を示す図である。
【図１０】図４のビーム整形光学系の変形例であって、予め調節された複数の補正光学ユニットを交換する切替機構を備えるものを示す図である。
【図１１】本発明の第２の実施形態に係る多光子励起型観察装置および多光子励起型観察用光源装置を模式的に示す全体構成図である。
【図１２】本発明の第３の実施形態に係る多光子励起型観察装置および多光子励起型観察用光源装置を模式的に示す全体構成図である。
【図１３】本発明の第４の実施形態に係る多光子励起型観察装置および多光子励起型観察用光源装置を模式的に示す全体構成図である。
【符号の説明】
【０１０７】
Ａ  試料
Ｆ  蛍光
Ｌ  極短パルスレーザ光
１，１００，１１０，１２０  多光子励起型観察装置
２  パルスレーザ光源
３，１１２  観察装置本体
４，１０２，１１６，１２２  導入光学系
５，１０１，１１１，１２１  多光子励起型観察用光源装置
６，１１３  ガルバノミラー（走査装置）
９  対物レンズ
２０  第１の光路
２２  第２の光路
２４  光路選択装置
３１  音響光学装置
３２  ビーム整形光学系（入射補正装置）
３３  顕微鏡入射補正装置（入射調節装置）
４２，４３，４８  レンズ
４４，４５  レンズ（補正移動機構）
４６  アライメント調節装置（入射調節装置）
４７  第１の視準光学系（入射調節装置）
４９  レンズ移動機構（調節移動機構）
５０  メカニカルシャッタ（シャッタ）
５１  第２の視準光学系（入射調節装置）
５４，５５  全反射ミラー
５８  絞り（空間フィルタ）
【図１】
2007127524.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2007127524.tif 000010
【図９】
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【図１０】
2007127524.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
2007127524.tif 000014
【図１３】
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