(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｂ型インフルエンザウイルスのＮＰ遺伝子を検出することができるポリヌクレオチドを提供すること。【解決手段】本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルスを検出するためのポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、（ａ）特定な配列から選択される連続した１０ｍｅｒ以上配列からなるポリヌクレオチド；及び（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記特定な配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、からなる群より選択される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型インフルエンザウイルスを検出するためのポリヌクレオチドであって、
（ａ）配列番号１の配列から選択される連続した１０ｍｅｒ以上の配列からなるポリヌクレオチド；及び
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記配列番号１の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、
からなる群より選択されるＢ型インフルエンザウイルス検出用ポリヌクレオチド。
【請求項２】
核酸増幅法によりＢ型インフルエンザウイルスを検出するための第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドセットであって、
前記第１ポリヌクレオチドが以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択され：
（ａ）配列番号１の１〜１００番目の配列から選択される連続した１０ｍｅｒ以上の配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記配列番号１の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、
前記第２ポリヌクレオチドが以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群より選択されるＢ型インフルエンザウイルス検出用ポリヌクレオチドセット：
（ｃ）配列番号１の配列において、前記（ａ）で選択された配列よりも下流の配列の相補配列から選択される連続した１０ｍｅｒ以上の配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）前記（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記配列番号１の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド。
【請求項３】
核酸増幅法によりＢ型インフルエンザウイルスを検出するための第１ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチド及び第３ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドセットであって、
前記第１ポリヌクレオチドが以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択され：
（ａ）配列番号１の１〜９０番目の配列から選択される連続した１０ｍｅｒ以上の配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記配列番号１の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、
前記第２ポリヌクレオチドが以下の（ｃ）〜（ｅ）からなる群より選択され：
（ｃ）配列番号１の配列において、前記（ａ）で選択された配列よりも下流の領域の相補配列から選択される連続した１０ｍｅｒ以上の配列からなるポリヌクレオチド；
（ｄ）前記（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記配列番号１の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、
（ｅ）前記（ｃ）又は（ｄ）の相補配列を有するポリヌクレオチド、
前記第３ポリヌクレオチドが以下の（ｆ）及び（ｇ）からなる群より選択され：
（ｆ）配列番号１の配列において、前記（ａ）で選択された配列よりも下流であり、前記（ｃ）で選択された配列の相補配列よりも上流の領域の配列から選択される連続した１０ｍｅｒ以上の配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）前記（ｆ）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記配列番号１の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、
前記第３ポリヌクレオチドの５’末端及び３’末端のうち何れかに第１標識物質を有し、他方に第２標識物質を有する、Ｂ型インフルエンザウイルス検出用ポリヌクレオチドセット。
【請求項４】
前記第１標識物質及び前記第２標識物質は、所定の波長の光を照射することにより蛍光を発することができる物質であり、
前記第１標識物質と前記第２標識物質とが所定の距離未満に存在する場合、前記第１標識物質が前記所定の波長の光によって発せられる蛍光により前記第２標識物質の蛍光が消光され、
前記第１標識物質と前記第２標識物質とが所定の距離以上離隔して存在する場合、前記第１標識物質及び前記第２標識物質の両方が蛍光を発する、請求項３記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項５】
前記第１ポリヌクレオチドの融解温度よりも前記第３ポリヌクレオチドの融解温度の方が高く、
前記第２ポリヌクレオチドの融解温度よりも前記第３ポリヌクレオチドの融解温度の方が高い、請求項３又は４記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項６】
前記（ａ）のポリヌクレオチドが、配列番号１１であり、
前記（ｃ）のポリヌクレオチドが、配列番号１２であり、
前記（ｆ）のポリヌクレオチドが、配列番号１３である、
請求項３〜５の何れかに記載のポリヌクレオチドセット。
【請求項７】
請求項２〜６の何れかに記載のポリヌクレオチドセットと、ｄＮＴＰｓと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとを備えるＢ型インフルエンザウイルス検出用試薬キット。
【請求項８】
前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する請求項７記載の試薬キット。
【請求項９】
検体と請求項２〜６の何れかに記載のポリヌクレオチドセットとを混合し、前記検体中の配列番号１のヌクレオチド配列を検出することにより、前記検体中のＢ型インフルエンザウイルスを検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中のＢ型インフルエンザウイルスを検出するために用いられるポリヌクレオチド及びこのポリヌクレオチドを用いて検体中のＢ型インフルエンザウイルスを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科に属するウイルスであり、呼吸器疾患の病原体である。このウイルスは、ヘマグルチニン（ＨＡ：赤血球凝集素）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、Ｍ１タンパク質などのタンパク質を含むエンベロープを有し、エンベロープ内には一本鎖ＲＮＡ（マイナス鎖）ゲノムが含まれている。インフルエンザウイルスゲノムは核タンパク質（ＮＰ）に螺旋状に巻き付いており、これがインフルエンザウイルスのヌクレオカプシドに相当する。インフルエンザウイルスは主にこのＮＰの抗原性の違いに基づいて、主に３種類の型（Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス及びＣ型インフルエンザウイルス）に分類される。Ｂ型インフルエンザウイルスは、宿主に寄生すると、宿主細胞内でウイルス由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの作用によりゲノムＲＮＡ（virus RNA：以下、ｖＲＮＡとする）からｍＲＮＡを合成する。このｍＲＮＡの配列に基づき、ウイルスの増殖に必要な様々なタンパク質が宿主のリボソームで生成される。
【０００３】
Ａ型インフルエンザの症状とＢ型インフルエンザの症状は殆ど同じであり、症状からこれらを区別することは困難である。しかし、薬剤の中には何れかの型のみに奏効するものがある（例えば、アマンタジンはＡ型インフルエンザのみに薬効を示す）ため、インフルエンザ患者がＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザの何れに罹患しているかを識別するのは臨床上非常に重要である。
【０００４】
近年、Ｂ型インフルエンザウイルスを特異的に検出することができるＰＣＲプライマが開発された（特許文献１参照）。特許文献１記載のプライマはゲノムのＨＡをコードする領域（以下、ＨＡ遺伝子とする）にハイブリダイズし、ＨＡ遺伝子を検出する。しかしながら、インフルエンザウイルスの分類の基準となるのはＮＰの抗原性、即ちゲノムのＮＰをコードする領域（ＮＰ遺伝子）のヌクレオチド配列であるため、ＨＡ遺伝子に基づいて検出しても、高い信頼性で型特異的な検出結果が得られるとは限らない。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−２５０５８９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルスの分類の基準となるＮＰ遺伝子を検出することができるポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルスを検出するためのポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１の配列から選択される連続した１０ｍｅｒ以上配列からなるポリヌクレオチド；及び
（ｂ）前記（ａ）のポリヌクレオチドにおいて１個又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記配列番号１の相補鎖にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、
からなる群より選択される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、Ｂ型インフルエンザウイルスのＮＰ遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の一実施形態は、配列番号１のヌクレオチド配列（5'-TGGAACCAGTGGGACAACCAGACCAATCATTAGACCAGCAACCCTTGCCCCACCAAGCAACAAACGAACCCGTAACCCATCCCCGGAAAGAGCAACCACAAGCAGTGAAG-3'）から選択される連続した１０ｍｅｒ以上のポリヌクレオチドである。配列番号１の配列は、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）に登録されているB/Yamagata13112003（Accession No. AB120239）の６９〜１７８番目の配列であり、ｖＲＮＡのＮＰ遺伝子に対応するｍＲＮＡの部分配列である（ただし、配列中のＵをＴに変換して記載している）。即ち、配列番号１の配列から選択されたポリヌクレオチドは、ｖＲＮＡのＮＰ遺伝子の部分領域（以下、領域Ｘとする）に相補的であり、領域Ｘにハイブリダイズ可能である。
【００１０】
インフルエンザウイルスは、上述したようにＮＰ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて分類されている。このため、ＮＰにハイブリダイズする本実施形態のポリヌクレオチドを用いることにより、他の領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドを用いるよりも高い信頼性で型特異的に検体中のＢ型インフルエンザウイルスを検出することができる。
【００１１】
検体としては、Ｂ型インフルエンザに感染したことが疑われる患者から採取した、血液、血清、糞便、尿、唾液、鼻腔吸引液、気管支洗浄液、喀痰などの生体試料や、この生体試料に前処理（フィルターによる夾雑物の除去やウイルス培養など）を施した試料等を用いることができる。患者がＢ型インフルエンザウイルスに感染していた場合は、この検体にはｖＲＮＡ及びｍＲＮＡが含まれている。
【００１２】
本実施形態のポリヌクレオチドを、後述する核酸増幅法におけるプライマとして用いることもできる。また、プローブとしてメンブレンやガラスなどに固定してＤＮＡマクロアレイやＤＮＡマイクロアレイ（以下、ＤＮＡチップとする）を作製し、これを用いて検体中のウイルスを検出することができる。
【００１３】
ＤＮＡチップを用いたウイルス検出は、例えば以下のようにして行うことができる。先ず、検体中のｍＲＮＡの３’末端に存在するポリＡ配列を利用して逆転写反応を行う。逆転写反応の際に例えばＣｙ３やＣｙ５などの蛍光物質で標識されたヌクレオチドを用いることにより、蛍光標識されたｃＤＮＡが合成される。これを本実施形態のポリヌクレオチドを固定化したチップと接触させると、このポリヌクレオチドと標識されたｃＤＮＡとが二本鎖を形成する。二本鎖を形成させた後、ｃＤＮＡの蛍光を検出することにより、ウイルスの存否を判定することができる。
【００１４】
ｍＲＮＡにおいて、領域Ｘｃ（ｖＲＮＡの領域Ｘに相補的なｍＲＮＡの領域）よりも下流に存在する領域Ｙｃにハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、第２ポリヌクレオチドとする）をさらに用いて検体中のウイルスを検出することが好ましい。第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドは少なくとも１０ｍｅｒの長さであり、好ましくは１２ｍｅｒ以上、より好ましくは１５ｍｅｒ以上である。このため、領域Ｘｃは配列番号１の１〜１００番目の領域内に存在し、好ましくは１〜９８番目、より好ましくは１〜９５番目の領域内に存在する。また、これらのポリヌクレオチドは４０ｍｅｒ以下であることが好ましく、３０ｍｅｒ以下であることがより好ましい（なお、本明細書では、ポリヌクレオチドの長さを「ｍｅｒ」で表している。即ち、モノマーであるヌクレオチドが１０個連結した一本鎖ポリヌクレオチドの長さは１０ｍｅｒとなる）。
【００１５】
第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドは、融解温度（melting temperature：Ｔｍ値）が好ましくは５０〜６５℃、より好ましくは５５〜６５℃となるよう設計される。また、ＮＰ遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができれば配列中に１個以上のヌクレオチドの変異（置換、欠失、挿入、付加など）を有していてもよい。変異の割合は、好ましくは４０％以下であり、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下である。
【００１６】
これら２種類のポリヌクレオチドを用いると、ＤＮＡチップや公知の核酸増幅法を用いることによってウイルス検出を行うことができる。ＤＮＡチップを用いる場合は、２種類のポリヌクレオチドを基板に固定し、上記と同様にしてウイルス検出を行うことができる。核酸増幅法を用いる場合、第１及び第２ポリヌクレオチドはプライマとして用いられる。ここで、「プライマ」とは、上記核酸増幅法において、ｖＲＮＡ又はｍＲＮＡの特定の領域にハイブリダイズし、ポリメラーゼによる増幅反応の起点となることのできる機能（以下、プライマ機能とする）を有するポリヌクレオチドのことである。「ハイブリダイズ」とは、ストリンジェントな条件下で塩基の相補性に基づいて二種類の一本鎖ポリヌクレオチドが水素結合によって二本鎖ポリヌクレオチドを形成することをいう。「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行う際に当業者が一般的に用いる条件であって、本実施形態のプライマがｖＲＮＡ又はｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる条件であれば特に限定されない。ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プライマの鎖長、プライマのヌクレオチド配列のＧＣ含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。具体的には、「５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌの核酸を含む溶液中、ハイブリダイゼーション温度４２℃」を例示することができるが、これに限定されない。
【００１７】
核酸増幅法としては、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法（Loop mediated isothermal amplification：国際公開ＷＯ  ００／２８０８２号）などの公知の方法を用いることができる。増幅の標的となるのはｖＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡであるため、検出には逆転写反応を含む核酸増幅法が用いられる。このような核酸増幅法としては、ＲＴＰＣＲ法（Reverse Transcription PCR）やＲＴＬＡＭＰ法（Reverse Transcription LAMP）などが挙げられる。例えば、核酸増幅法としてＲＴＰＣＲを用いる場合、先ず検体、上記ポリヌクレオチドセット、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下、逆転写酵素とする）、及びＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下、ＤＮＡポリメラーゼとする）を混合して反応液を調製する。なお、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを用いる代わりに、逆転写酵素の活性及びＤＮＡポリメラーゼの活性の両方を有する酵素（例えば、Bca DNA polymeraseなど）を用いることもできる。検体がＢ型インフルエンザ患者に由来する場合、検体には、ｖＲＮＡ及びｍＲＮＡが含まれている。従って、第２ポリヌクレオチドはｖＲＮＡにハイブリダイズし、第１ポリヌクレオチドはｍＲＮＡにハイブリダイズする。次に逆転写酵素の作用によってそれぞれ対応するｃＤＮＡ（ｖＲＮＡに対応するｃＤＮＡ及びｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ）が合成される。さらにＤＮＡポリメラーゼの作用によって第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドをプライマとしてｃＤＮＡが増幅される。増幅産物をアガロースゲル電気泳動などの公知の方法によって検出することにより、検体中のウイルスが検出される。また、反応液に予め二本鎖ＤＮＡに結合可能なインターカレータ（例えば、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎなど）を添加しておくと、二本鎖ｃＤＮＡの増幅に伴って反応液の蛍光強度が強くなっていく。この蛍光をリアルタイムでモニターすることにより、定量的に検体中のウイルスを検出することも可能である。
【００１８】
ポリヌクレオチドをプライマとして用いる場合、ポリヌクレオチドの３’末端側の３ｍｅｒがハイブリダイズする領域と完全に相補的であることが好ましく、３’末端側の５ｍｅｒが完全に相補的であることがより好ましい。
【００１９】
さらに、領域Ｍ（領域Ｘ及び領域Ｙの間に存在）又は領域Ｍｃ（領域Ｘｃ及び領域Ｙｃの間に存在）にハイブリダイズする第３ポリヌクレオチドと、上記の第１及び第２ポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドセットを用いてウイルス検出を行うことができる。上述のようにポリヌクレオチドセットを基板に固定したＤＮＡチップや公知の核酸増幅法によりウイルスの検出を行うことができる。このポリヌクレオチドセットを用いた核酸増幅法としては、例えばTaqMan（ロシュダイアグノスティクス社の登録商標）PCR法（Heid et al, 1996, Genome Research, Vol.6(10), 986-994）が好適に用いられる。
【００２０】
以下、本実施形態の一例としてTaqManPCR法に用いられるポリヌクレオチドセットについて説明する。このポリヌクレオチドセットと、検出対象となるｍＲＮＡ及びｖＲＮＡの模式図を図１に示す。このポリヌクレオチドセットは、ｖＲＮＡの領域Ｘにハイブリダイズする第１ポリヌクレオチド（第１プライマ）と、ｍＲＮＡの領域Ｙｃにハイブリダイズ可能な第２ポリヌクレオチド（第２プライマ）と、領域Ｍにハイブリダイズ可能な第３ポリヌクレオチド（TaqManプローブ、以下単にプローブともいう）とを含む。
【００２１】
第１プライマ及び第２プライマは上記の第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドと同様のものを用いることができる。
プローブの５’末端及び３’末端の一方には第１標識物質が結合しており、もう一方には第２標識物質が結合している（図１には、５’末端に第１標識物質、３’末端に第２標識物質が結合したプローブを示した）。前記第１標識物質及び前記第２標識物質は、所定の波長の光を照射することにより蛍光を発することができる物質（蛍光物質）であることが好ましい。第１標識物質と第２標識物質とが所定の距離未満に位置する場合、第１標識物質が前記所定の波長の光によって蛍光を発し、この蛍光によって、第２標識物質の蛍光が消光される。また、これらが所定の距離以上離れている場合は、第１標識物質の蛍光が第２標識物質まで達しないため、反応液に所定の波長の光を照射することによって反応液中の第１標識物質及び第２標識物質の両方が蛍光を発する。
【００２２】
第１標識物質の蛍光を第２標識物質が消光できれば、第１標識物質及び第２標識物質の組み合わせは特に限定されない。例えば、第１標識物質としては、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）等が挙げられ、第２標識物質としては、６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）等が挙げられる。
【００２３】
第２標識物質が第１標識物質の発する蛍光を消光するためには、これらの物質が所定の距離以内である必要がある。この所定の距離は、標識物質の種類によって異なるが、約１００Å以下であることが好ましい。この距離は約３０ｍｅｒのポリヌクレオチドに相当するため、プローブの長さは３０ｍｅｒ以内であることが好ましい。また、第１プライマ及び第２プライマと同様に特異性を維持するために、このプローブは１０ｍｅｒ以上、好ましくは１２ｍｅｒ以上、より好ましくは１５ｍｅｒ以上の長さである。
【００２４】
TaqMan PCR法を用いた場合は、Ｂ型インフルエンザウイルスに由来する核酸を含む検体に、上記のポリヌクレオチドセット、ｄＮＴＰｓ、逆転写酵素、及びＤＮＡポリメラーゼ（５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する）を添加し、標識物質の励起波長を照射しながら以下の反応を進行させる。
先ず検体に含まれるｖＲＮＡの領域Ｘに第１プライマが結合し、ｍＲＮＡの領域Ｙｃに第２プライマが結合する。逆転写酵素によって、それぞれのプライマの３’末端からｖＲＮＡに対応するｃＤＮＡとｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡとが合成される（逆転写反応）。このｃＤＮＡにさらにプライマが結合し、ｃＤＮＡが増幅される（核酸増幅反応）。
核酸増幅反応が始まると、ｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡに第１プライマ及びプローブが結合する。プローブの両末端には第１標識物質及び第２標識物質が結合しているが、この時点では第１標識物質の蛍光は第２標識物質によって消光されているため、反応液の蛍光は実質的に検出されない。ＤＮＡポリメラーゼはこの第１プライマの３’末端を基点として、このｃＤＮＡの上流に向かってＤＮＡを伸長させる。この伸長鎖がｃＤＮＡにハイブリダイズしているプローブの５’末端に到達すると、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって、プローブが分解され、プローブを構成するヌクレオチドが反応液中に遊離する。この場合、プローブの５’末端のヌクレオチドに結合している第１標識物質とプローブの３’末端のヌクレオチドに結合している第２標識物質との距離が、所定の距離以上となるため、第１標識物質の蛍光を第２標識物質が消光できず、第１標識物質及び第２標識物質の両方が蛍光を発する。以上のように、核酸増幅反応が進むと、第１標識物質及び第２標識物質の両方に由来する蛍光が検出されるため、ｃＤＮＡの増幅に伴って反応液の蛍光強度が上昇していく。この蛍光強度をリアルタイムでモニターし、蛍光強度が所定の値に達した時間に基づいて検体に含まれているＲＮＡを定量的に検出することができる。
【００２５】
また、上記のように、プライマの伸長反応中、プローブはｃＤＮＡに結合している状態である必要があるため、プライマのＴｍ値よりもプローブのＴｍ値の方が高いことが好ましい。より好ましくは、プローブのＴｍ値はプライマのＴｍ値よりも８〜１２℃高い。これにより、同じストリンジェンシーではプライマよりもプローブの方がＤＮＡに強固に結合することができる。
【００２６】
Ｔｍ値はプライマの配列や長さに左右される。プライマの配列中にＧＣが多いほど、及び／又は、プライマの長さが長いほどＴｍ値が高くなる。また、プローブにＤＮＡの副溝（Minor groove）に結合する副溝結合物質（ＭＧＢ：Minor groove binder）を結合させるとプローブのＴｍ値が上昇するため、同じＴｍ値でより短いプローブを設計することができる。
【００２７】
なお、領域Ｘと領域Ｙとの間（又は領域Ｘｃと領域Ｙｃとの間）に２種類のプローブ（第１プローブ及び第２プローブ）を設計してもよい。この場合、第１プローブに第１標識物質を結合させ、第２プローブに第２標識物質を結合させる。また、第１プローブの両末端にそれぞれ上記のような第１標識物質及び第２標識物質を結合させ、さらに第２プローブの両末端にもそれぞれ第１標識物質及び第２標識物質を結合させることもできる。これによって反応液の蛍光強度を増大させることができる。
【００２８】
上述したポリヌクレオチドは公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。具体的には、ＡＢＩ社製  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  Ｍｏｄｅｌ  ８９０９  ＤＮＡ合成機等を用いて合成することができる。また、上記のような塩基配列で構成されるように天然の核酸を制限酵素などによって切断し、本実施形態のポリヌクレオチドとして用いることも可能である。
【００２９】
＜実施例＞
（１）ポリヌクレオチドセットの設計
ＧｅｎＢａｎｋに登録されている表１のＢ型インフルエンザウイルス分離株の配列を用いてマルチプルアラインメントを行い、TaqMan PCR用ポリヌクレオチドセットを設計した。これらの配列はＢ型インフルエンザウイルスのｍＲＮＡの配列であり、マルチプルアラインメントにはＮＰ遺伝子に対応するｍＲＮＡの部分配列（配列番号１〜１０）に対して行われた。図２にマルチプルアラインメント結果を示す。なお、マルチプルアラインメントは、Ｇｅｎｅｔｙｘ−ｗｉｎ（ソフトウェア開発株式会社）により行った。
【００３０】
【表１】
2007282592.tif 000002
【００３１】
図２において、矩形に囲まれた部分の配列に基づいて下記の第１プライマ、第２プライマ及びプローブからなるＢ型インフルエンザウイルス検出用ポリヌクレオチドセット（以下、ポリヌクレオチドセットＢ）を設計した。
【００３２】
＜ポリヌクレオチドセットＢ＞
第１プライマ
5'-GTGGGACAACCAGACCAATCAT-3'（配列番号１１）
第２プライマ
5'-CACTGCTTGTGGTTGCTCTTTC-3'（配列番号１２）
プローブ
ＦＡＭ−5'-CCCCACCAAGCAACAAACGAACCC-3'−ＴＡＭＲＡ（配列番号１３）
【００３３】
上記配列を有するポリヌクレオチドを化学合成し、プローブの５’末端にはＦＡＭを、３’末端にはＴＡＭＲＡを結合させた。第１プライマのＴｍ値は５９．６℃、第２プライマのＴｍ値は５８．６℃、プローブのＴｍ値は６９．７℃であった。
【００３４】
（２）ウイルス株の検出
上記（１）で設計されたポリヌクレオチドセットＢと、検出用キット（タカラバイオ社：One-Step RT-PCR Kit Perfect Realtime）とを用いて、検体中のウイルスの検出を行った。検体は、ヨハネスブルクで分離されたウイルス株B/Johannesburg/5/99（以下、ＪＨとする）、茨城県で分離されたウイルス株B/Ibaraki/2/85（以下、ＩＢとする）、及び 中国の山東で分離されたウイルス株B/Shandong/7/97（以下、ＳＤとする）であり、何れもＢ型インフルエンザウイルスに感染した患者から分離されたものである。各検体を１０／５５倍に段階希釈してそれぞれ８検体ずつ調製した。検体番号を、濃度の高い順にＳＤ１〜８、ＩＢ１〜８、ＳＤ１〜８とした。
【００３５】
以下の組成を含む反応液（計２５μＬ）を調製し、7500 Realtime PCR system（アプライドバイオシステムズ社）によりリアルタイムＲＴＰＣＲを行った。
検体  ５μＬ
RNase free dH2O  ３．２５μＬ
２× One step RT-PCR buffer（ｄＮＴＰｓ及びＭｇ２＋を含む）  １２．５μＬ
M-MLV RTase（RNase H free）  ０．２５μＬ
RNase Inhibitor  ０．５μＬ
Takara ExTaq  ０．５μＬ
ROX Reference DyeII  ０．５μＬ
０．２ｐｍｏｌ／μＬプライマ溶液（第１及び第２プライマを含む）  １．２５μＬ
０．２５ｐｍｏｌ／μＬプローブ溶液  １．２５μＬ
【００３６】
ＰＣＲ条件は以下の通りである。
４２℃  １５分
９５℃    ２分
以下の工程を５０サイクル
９５℃  １０秒
６０℃  ４５秒
【００３７】
反応液の蛍光強度がThreshold（7500 Realtime PCR systemに搭載されたＳＤＳソフトウェアで自動的に設定された値）を超えた時のサイクル数（以下、検出サイクル数とする）を表２に示す。また、各検体の検出サイクル数のグラフを図２に示す（縦軸：サイクル数、横軸：各検体の希釈系列（対数目盛））。表２の「傾き」は、図２に示すグラフの傾きを示す。
【００３８】
【表２】
2007282592.tif 000003
【００３９】
ＰＣＲにおいては、プライマが特異的に標的核酸に結合して増幅反応が行われていれば理論的にｎサイクルでｃＤＮＡが２ｎ倍増幅されるため、検体を１０倍に希釈すると検出サイクル数が約３〜３．５サイクル増加する。しかし、プライマの、鋳型に対する特異性が低いとＰＣＲ効率が低下しｎサイクルでも２ｎ倍以下の増幅効率となる。
【００４０】
表２及び図３より、ＪＨの希釈系列における検出サイクル数の傾きは−３．３９であり、ＩＢの希釈系列における検出サイクル数の傾きは−３．５０であり、ＳＤの希釈系列における検出サイクル数の傾きは−３．３１であった。これは、１０倍に希釈したＪＨを検体として用いると、希釈前の検体よりも平均で検出サイクル数が３．３９サイクル増加することを示す。同様に、ＩＢの場合は平均で検出サイクル数が３．５０サイクル増加し、ＳＤの場合は平均で検出サイクル数が３．３１サイクル増加する。これらの値は、１０倍希釈した際の理論的な値とほぼ同等であり、本実施形態のポリヌクレオチドが高い特異性で標的の核酸に結合したことがわかる。従って、本実施形態のポリヌクレオチドを用いるとＰＣＲの増幅反応が効率的に行われることが確認された。また、異なる場所で分離された異なる株間でも反応の特異性に差がなかった。
【００４１】
（３）Ｂ型インフルエンザ陽性の臨床検体を用いた検出
ポクテムインフルエンザＡ／Ｂ（シスメックス社）により、Ｂ型インフルエンザ陽性が確認された３２人の患者から採取した鼻腔拭い液（検体番号１〜３２）を用い、上記（２）と同様の条件で検出を行った。検出サイクル数を表３に示す。
【００４２】
【表３】
2007282592.tif 000004
【００４３】
表３より、全ての検体においてＢ型インフルエンザウイルスが検出された。従って、本実施形態のポリヌクレオチドを用いると、Ｂ型インフルエンザ陽性と判定された患者から採取した臨床検体のウイルス検出を正確に行うことができることが確認された。  
【００４４】
（４）Ａ型インフルエンザ陽性又はインフルエンザ陰性の検体を用いた検出
インフルエンザが疑われる２０人の患者から採取された鼻腔拭い液（検体番号３３〜５２）を検体とし、ポリヌクレオチドセットＢを用いて上記（２）と同様の条件で検出を行った。
また、検体番号３３〜５２を検体とし、ポリヌクレオチドセットＢではなく、Ａ型インフルエンザウイルスを検出できることが確認された下記Ａ型インフルエンザウイルス検出用ポリヌクレオチドセット（以下、ポリヌクレオチドセットＡとする）（配列番号１４〜１６：Watzinger et al, 2004, Journal of Clinical Microbiology, 5189-5198参照）を用いること以外は上記（２）と同様にしてウイルス検出を行った。
【００４５】
＜ポリヌクレオチドセットＡ＞
第１プライマ
5'-AGACCAGAGGGAAACTATGCCC-3' （配列番号１４）
第２プライマ
5'-TCCGGATGTAACAGGTCTGACTT-3'（配列番号１５）
プローブ
ＦＡＭ−5'-ACCTTCGGCAAAAGCTTCAATACTCCA-3'−ＴＡＭＲＡ （配列番号１６）
【００４６】
ポリヌクレオチドセットＢを用いた際の検出結果、及びポリヌクレオチドセットＡを用いた際の検出結果を表４に示す。
【００４７】
【表４】
2007282592.tif 000005
【００４８】
表４において、ＮＤは、５０サイクル以内に蛍光が所定の値まで検出されず、インフルエンザウイルスが含まれないと判定されたことを示す。
【００４９】
表４より、検体番号３３〜３９は、ポリヌクレオチドセットＡ及びポリヌクレオチドセットＢの何れを用いてもＮＤであり、検体にはインフルエンザウイルスが含まれない陰性検体であると判定された。検体番号４０〜５１は、ポリヌクレオチドセットＡを用いたときのみウイルス検出されたため、Ａ型インフルエンザウイルスが含まれているＡ型インフルエンザ陽性検体であると判定された。
【００５０】
以上より、ウイルスを含まない検体の場合は、本実施例のポリヌクレオチドセットＢを用いてもウイルス検出は行われず、Ａ型インフルエンザウイルスが含まれる検体の場合でも、ウイルス検出は行われなかった。従って、Ａ型インフルエンザ陽性検体及び陰性検体を用いた場合、本実施例のポリヌクレオチドでは核酸増幅が起こらないことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、及びポリヌクレオチドの模式図である。
【図２】実施例（１）におけるマルチプルアラインメントの結果である。
【図３】実施例（２）の結果を示すグラフである。
【図１】
2007282592.tif 000006
【図２】
2007282592.tif 000007
【図３】
2007282592.tif 000008
【配列表】
2007282592000001.app