(57)【要約】【課題】  蛍光標識や酵素標識など多様な標識が可能で汎用性が高く、非特異的シグナルが低く、高感度検出が可能であり、生分解性で人体や環境への安全性が高い免疫学的測定の手法を開発する。【解決手段】  自己組織化能を有するタンパク質が脂質２重膜を取り込むことにより形成され、自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合部位を有している免疫学的測定用ナノ粒子を用いる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己組織化能を有するタンパク質が脂質２重膜を取り込むことにより形成され、自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合部位を有している免疫学的測定用ナノ粒子。
【請求項２】
抗体結合部位に抗体が結合し、抗体結合部位と抗体との結合が、架橋剤による共有結合である請求項１に記載の免疫学的測定用ナノ粒子。
【請求項３】
ナノ粒子が標識されている請求項１または２に記載の免疫学的測定用ナノ粒子。
【請求項４】
抗体が標識されている請求項１から３のいずれかに記載の免疫学的測定用ナノ粒子。
【請求項５】
自己組織化能を有するタンパク質が、ウイルス由来タンパク質である請求項１から４のいずれかに記載の免疫学的測定用ナノ粒子。
【請求項６】
請求項１から５記載の免疫学的測定用ナノ粒子を用いる免疫学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願の発明は、直径がナノサイズの粒子である免疫学的測定用ナノ粒子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ、組織染色などに代表される免疫学的測定は、１９４１年、Ｃｏｏｎｓらによる蛍光色素を標識した抗体で形質細胞のＩｇＧを検出した蛍光抗体法の確立から端を発しており、次いでＮａｋａｎｅ、Ｐｉｅｒｃｅらによる酵素抗体法の開発（１９６６年）を受け、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ａｎｔｉ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＰＡＰ法（１９７０年）、ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｙｌａｔｅｄ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＡＢＣ法（１９８１年）、ｌａｂｅｌｅｄ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｂｉｏｔｙｎｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＬＳＡＢ法（１９８４年）などが開発されてきた（非特許文献１参照）。
【０００３】
免疫学的測定は、抗原に対する特異抗体を反応させ、さらなる抗原−抗体反応、あるいは化学反応を巧みに組み合わせて特異抗体と標識物質の免疫複合体を形成し、最終的に標識酵素の発色反応や標識蛍光の蛍光強度によって抗原の存在を可視化・定量化する原理に基づいており、抗体を用いることでクルードなサンプル中においても抗原（検出のターゲット物質；タンパク質、ペプチド、核酸、糖鎖、化合物など）のみを選択的に染色することができる優れた研究手法である。これによって、検出のターゲットである抗原を精製せずしてその存在量を定量したり、細胞内における抗原の局在場所を特定することができるため、免疫学的測定技術はライフサイエンス分野やバイオ研究分野において広く普及している。
【０００４】
免疫学的測定は直接染色法（直接法）と間接染色法（間接法）に大別される。直接法は、標識物質を直接標識した１次抗体（抗原を認識する抗体）を抗原と反応させ、抗原と結合した１次抗体由来の発光や蛍光信号を検出する方法である。従って、反応が１ステップで終了する上に、特異性が高いという利点がある。しかし、この直接法は標識物質が１次抗体に標識されていなければならないため、抗体の活性を害さずに標識物質で標識することが難しく、汎用性に乏しい上に、感度が低いという致命的な欠点がある。
【０００５】
直接法の感度の低さを改良する手法として、量子ドット（特許文献１、特許文献２、非特許文献２参照）と呼ばれる直径１０〜１５ｎｍの蛍光粒子体を用い、その表面に抗体やビオチン、またはストレプトアビジンタグなどを固定し、抗原と結合した粒子を粒子自体が発する蛍光によって検出する方法が知られている。しかし検出方法が高価な検出装置を要する蛍光検出に限られているため汎用性は低い。さらにカドミウムやセレンなどを含む非生分解性のナノマテリアルであり、環境への影響や人体への安全性に懸念が示されている（非特許文献３参照）。
【０００６】
また、生分解性の免疫学的測定用のナノ粒子として蛍光標識したリポソームを用い、イムノアッセイを行った例が開示されている（非特許文献４参照）。しかし標識の種類が蛍光標識に限られており、またリポソーム上には目的とする物質（抗原）を認識する抗体を高密度で整列提示することはできない。また、一般にリポソームなどの生体成分は安定性が低いことが知られている。
【０００７】
リポソームの安定性を補うため、ポリマーを結合させてリポソームを安定化し、さらにポリマーの働きにより非特異的シグナルを抑制した例が開示されている（特許文献３）。しかし目的とする物質（抗原）を認識する抗体を高密度で整列提示することはできない。
【０００８】
一般に、直接法の感度の低さを補うために間接法が用いられる。１次抗体を抗原と反応した後に標識物質を標識した２次抗体（１次抗体を認識する抗体）を反応させることにより抗原局在部に標識物質を導入することができるが、反応は２ステップとなるため検出までの時間がかかる。２次抗体の標識手法は蛍光に限らず酵素標識など多様な標識が可能であるため汎用性に優れ、さらにＡＢＣ法や酵素標識ポリマー法、ＬＳＡＢ法などを用いることにより標識量を増大させることができるため、直接法に比べて感度が高い点が長所となる。しかし、この間接染色法は２次抗体による非特異的結合などが増え、バックグラウンドが増大するなど特異性の面では直接法に劣る（非特許文献５）。また、検出までに長時間を要する。
【０００９】
一方、B型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質が、自己組織化によって細胞内の脂質２重膜を取り込むことにより形成した中空ナノ粒子が知られており、該中空ナノ粒子の表面に抗体を提示した例が知られているが（特許文献４参照）、組織特異的な薬剤の運搬や導入すなわちドラッグデリバリーシステムに関する発明であり、免疫学的測定を可能にするものではない。
【００１０】
このように、多様な標識が可能で汎用性が高く、かつ非特異的シグナルが低く高感度検出可能であり、さらに人体への安全性が高い免疫学的測定の手法を開発した例はない。
【非特許文献１】ウリケら（Ｕｌｒｉｋｅ、Ｋ．ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナルオブヒストケミストリアンドサイトケミストリ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００１年、第４９巻、ｐ６２３−６３０．
【非特許文献２】オズカン（Ｏｚｋａｎ、Ｍ．）、ドラックディスカバリートゥデイ（Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ）、２００４年、第９巻、ｐ１０６５−１０７１．
【非特許文献３】ホートら（Ｈｏｅｔ、Ｐ．ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナルオブナノバイオテクノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２００４年、第２巻．
【非特許文献４】シンら（Ａｎｕｐ  Ｋ．  Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオテクノロジープログレス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ）、１９９６年、第１２巻、ｐ２７２−２８０．
【非特許文献５】岡田雅人ら、タンパク質実験ノート第３版下、２００４年、ｐ１１８−１１９．
【特許文献１】特表２００２−５４４４８８号公報
【特許文献２】米国特許６２７４３２３号
【特許文献３】特表２００３−５０１６３１号公報
【特許文献４】特開２００４−２３１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上のような状況に鑑み、本発明では、
１）蛍光標識や酵素標識など多様な標識が可能で汎用性が高く、
２）非特異的シグナルが低く、高感度検出が可能であり、
３）生分解性で人体や環境への安全性が高い、
といった免疫学的測定の手法を開発することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決する手法を鋭意検討した結果、自己組織化能を有するタンパク質が脂質２重膜を取り込むことにより形成され、自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合部位を有している免疫学的測定用ナノ粒子を用いることにより、上記課題を解決できることを見出し本発明に至ったものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の免疫学的測定用ナノ粒子を、現在広く用いられているwestern解析やELISAなどの免疫学的測定に用いることにより、多様な標識が可能で汎用性が高く、かつ非特異的シグナルが低く高感度な検出が可能であり、さらに人体への安全性が高い免疫学的測定を行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。また、この発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，  １９９５等に記載されている。
【００１５】
本発明は、「自己組織化能を有するタンパク質」が脂質２重膜を取り込むことにより形成され、自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合部位を有している免疫学的測定用ナノ粒子である。
【００１６】
本発明における免疫学的測定とは、目的とする物質の存在や局在などの検出において、抗体を用い、かつ検出においては吸光、発光、蛍光、放射線、呈色、濁度などの変化を利用する手法を示す。本発明における免疫学的測定において、目的とする物質の種類は、特に制限はなく、ＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質、糖鎖などの生体物質、細胞、ウイルス、ファージ、および化学物質などが挙げられる。例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡを目的物質とする免疫学的測定の一例として、各種メンブレンもしくは樹脂包埋組織切片上の核酸にDigoxigeninやFluorescein、Biotinを取りこんだＤＮＡやＲＮＡをハイブリダイズさせ、DigoxigeninやFluorescein、Biotinに対する抗体を用いて目的とするＤＮＡもしくはＲＮＡを検出する工程を含むSouthern hybridizationやin situ hybridization、northern hybridizationなどが挙げられる。タンパク質を目的物質とする免疫学的測定の例としては、western blottingや免疫組織染色、免疫電子顕微鏡観察、ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  酵素免疫検定法）、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  固相酵素免疫検定法）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｓｓａｙ  放射線免疫検定法）、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  蛍光免疫検定法）、ＦＬＩＳＡ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  固相蛍光免疫検定法）、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｓｐｏｔ）、イムノクロマトなどが挙げられる。細胞、ウイルス、ファージ、および化学物質などを目的物質とする免疫学的測定としては、免疫組織染色、免疫電子顕微鏡観察、ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  酵素免疫検定法）、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  固相酵素免疫検定法）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｓｓａｙ  放射線免疫検定法）、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  蛍光免疫検定法）、ＦＬＩＳＡ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  固相蛍光免疫検定法）、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｓｐｏｔ）、フローサイトメトリー、イムノクロマトなどが挙げられる。
【００１７】
本発明における免疫学的測定は、目的に応じて、
１）標識した抗体により目的とする物質を直接認識し検出する直接法、
２）目的とする物質を抗体により認識し、目的物質と結合した抗体を、標識した抗体により認識し検出する間接法、
３）競合法、
４）目的とする物質を固相化した抗体により捕捉し、さらに別の標識した抗体により検出する二抗体サンドイッチ法、
５）目的とする物質を固相化した抗体により捕捉し、さらに別の抗体により目的とする物質を認識し、目的とする物質を認識した抗体を標識した抗体により検出する三抗体サンドイッチ法、
６）ナノ粒子が直接もしくは間接的に標識されており、目的とする物質を認識した抗体と結合した粒子を検出する標識粒子法
などが選択される。
【００１８】
本発明において「自己組織化能を有するタンパク質」とは、疎水的相互作用などのタンパク質間相互作用により自己集合する性質をもつタンパク質である。タンパク質間相互作用により自己集合する性質をもつタンパク質であることは、タンパク質が溶解した溶液の温度やｐＨ、塩濃度や溶媒を変化させることでタンパク質どうしで多量体を形成することにより確認することができる。
【００１９】
「自己組織化能を有するタンパク質」としては、種々のウィルスから得られるウィルス粒子構成タンパク質などのウイルス由来タンパク質を適用することができる。具体的には、Ｂ型肝炎ウィルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ：ＨＢＶ）やＣ型肝炎ウィルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ）、Ｍｉｃｒｏ ｖｉｒｕｓ、ｐｈａｇｅ ｖｉｒｕｓ、ａｄｅｎｏ ｖｉｒｕｓ、ｈｅｐａｄｎａ ｖｉｒｕｓ、Ｐａｒｖｏ ｖｉｒｕｓ、ｐａｐｏｖａ ｖｉｒｕｓ、Ｒｅｔｒｏ ｖｉｒｕｓ、 Ｒｅｏ ｖｉｒｕｓ、Ｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ、カイコ細胞質多角体病ウイルス（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、カリシウイルス、ノロウイルス、サポウイルスなどの構成タンパク質や膜タンパク質、表面抗原タンパク質、または多角体タンパク質等が例示される。
【００２０】
「自己組織化能を有するタンパク質」は、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、ウィルス、ファージ、細菌類、菌類等に由来する天然タンパク質や遺伝子工学的に組み替えられたタンパク質、種々の合成タンパク質等である。「自己組織化能を有するタンパク質」は、好ましくは、ウイルス由来タンパク質、更に好ましくは肝炎ウイルス由来のタンパク質、更に好ましくはＢ型肝炎ウイルス由来のタンパク質が用いられる。最も好ましくはＢ型肝炎ウイルス表面抗原タンパク質が用いられる。このとき、自己組織能が失われない限りにおいて、種々の変異を持つ変異体であってもよく、ｐｒｅＳ領域のアミノ酸の一部を欠失させることにより、ナノサイズの粒子の生産量や安定性を高めることができる。
【００２１】
本発明において、「自己組織化能を有するタンパク質」が、ウイルス由来タンパク質であることか好ましく、ウイルス（特にＢ型肝炎ウイルス）の表面抗原タンパク質を用いることがより好ましい。「自己組織化能を有するタンパク質」として、ウイルス（特にＢ型肝炎ウイルス）の表面抗原タンパク質を用いることで、真核細胞内でこのタンパク質が脂質２重膜を取り込みながら自己組織化を起こし、物理的にも強度の強い、直径がナノサイズの粒子を効率的に作ることができる。このタンパク質を酵母内で発現させることで、数〜数十ｍｇ／Ｌ培養のナノ粒子を生産できるため、非常に高効率な粒子の生産が可能であり、粒子生産のコストを非常に低くすることができる。これは、産業的に該粒子を利用する上でも重要なことである。
【００２２】
ウイルス表面抗原タンパク質が作り出すナノ粒子は物理的に非常に安定で、６０〜８０℃といった高温や８Ｍのウレア、または種々の界面活性剤存在下でもその形態を維持できる。このような粒子の安定性は様々な免疫学的測定手法に適用が可能になるため汎用性が高い、また保存性が高く、ハンドリングしやすい、さらには、測定中に他の不純物を除去する、あるいは非特異的結合を軽減するための洗浄処理（例えば、変成剤や界面活性剤による洗浄が可能になる）を加えることが可能になるため、検出の精度を上げられる。従って、ウイルス表面抗原タンパク質が作り出すナノ粒子を使うことで、免疫学的測定手法の幅が格段に広がる効果が期待できる。
【００２３】
本発明における「自己組織化能を有するタンパク質」は、抗体結合部位を有している。
【００２４】
本発明における抗体結合部位は、抗体の抗原認識部位以外の領域と結合もしくは相互作用し得るポリペプチドである。本発明における抗体結合部位は、好ましくはFcレセプター、protein A、Protein G、Protein A/G、protein L、ＺＺタグのいずれかの全長もしくは一部であり、より好ましくはこれらの持つ「抗体Fc領域との結合部位」もしくはその変異体である。
【００２５】
抗体結合部位は「自己組織化能を有するタンパク質」と疎水的に結合していてもよく、化学結合などにより共有的に結合しても良い。抗体結合部位は、融合タンパク質として「自己組織化能を有するタンパク質」に融合していることが好ましい。また融合の部位は、自己組織化能を失わない限りにおいて、Ｎ末端からＣ末端までの全ての場所に存在し得る。
【００２６】
本発明の免疫学的測定用ナノ粒子は、好ましくは、抗体結合部位が「抗体Fc領域との結合部位」である。また、本発明の免疫学的測定用ナノ粒子は、より好ましくは、抗体Fc領域との結合部位が、ＺＺタグである。
【００２７】
また、本発明の免疫学的測定用ナノ粒子は、好ましくは、「抗体Fc領域との結合部位」が、プロテインＡもしくはプロテインＧの抗体結合部位である。
【００２８】
本発明において、抗体結合部位は、立体障害を少なく抗体を結合させるため、さらに好ましくはＺ領域と呼ばれるprotein Aのもつ「抗体Fc領域との結合部位」がタンデムにならんだＺＺ領域（ＺＺタグ）と呼ばれるポリペプチドもしくはその変異体であり、次のような繰返し配列もしくはその変異体である。ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ。
【００２９】
本発明の免疫学的測定用ナノ粒子では、「自己組織化能を有するタンパク質」が抗体結合部位を有することにより、「自己組織化能を有するタンパク質」の自己組織化の効果により抗体結合部位を高密度で整列させることが可能となり、その結果免疫学的測定に用いる抗体を高密度で整列固定することが可能となるため、高感度で高精度な免疫学的測定が可能となる。
本発明において脂質２重膜とは５〜２０ｎｍの厚さで２枚の脂質の層からなっており、それぞれの層の中で、両親媒性脂質の極性の頭が親水系の溶媒と接触しており、非極性の炭化水素の部分が２重層の内部を向いているものをいう。脂質２重膜の例としては、細胞膜や核膜、小胞体膜、ゴルジ体膜、液胞膜のような生細胞における生体膜、または人工的に作製したリポソーム等が挙げられる。中でも小胞体膜由来の脂質２重膜がより好ましい。脂質２重膜としては、真核生物、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞など由来のものが好ましく、特に好ましくは酵母由来の脂質２重膜が用いられる。
【００３０】
本発明においてナノ粒子とは２０〜５００ｎｍの粒子である。本発明のナノ粒子は、好ましくは５０〜２００ｎｍ、更に好ましくは８０〜１５０ｎｍの直径を持つ粒子である。また、本発明のナノ粒子は、好ましくは内部に中空の空間を持つ中空ナノ粒子であり、その空間は必ずしも気体系の空間である必要はなく、溶液系の空間であってもよい。
【００３１】
すでに記載したように、本発明は、自己組織化能を有するタンパク質が脂質２重膜を取り込むことにより形成され、自己組織化能を有するタンパク質が抗体結合部位を有している免疫学的測定用ナノ粒子である。
【００３２】
本発明の免疫学的測定用ナノ粒子が、脂質２重膜を取りこみながら形成されることにより、目的とする物質以外の物質が免疫学的測定用ナノ粒子に非特異的に吸着・相互作用することを抑制し、免疫学的測定のノイズを低下させる効果や精度を向上させることができる。また、目的とする物質が抗体を介さず、直接、免疫学的測定用ナノ粒子と吸着・相互作用することによるノイズ抑制の効果を持つ。このことは免疫学的測定において非常に重要なことであり、検出の精度を決める最重要因子となる。
【００３３】
本発明の免疫学的測定用ナノ粒子は、好ましくは、主にタンパク質と脂質、糖を主要な構成成分とし、そのうち主要な成分はタンパク質である。
【００３４】
抗体結合部位を持つタンパク質が自己組織化する能力を有することは、抗体の高密度整列、高密度提示をを可能にし、免疫学的測定における感度の向上において重要な性質である。さらに、自己組織化する能力を有することは、自己組織化の過程で、他の夾雑タンパク質を排除することを示し、これは免疫学的測定の精度を向上（非特異的シグナルを抑制）させる上で重要な性質である。さらに、脂質２重膜を取りこむことで、非特異的吸着や相互作用を抑制し、免疫学的測定の精度を向上（非特異的シグナルを抑制）させることもできる。
【００３５】
本発明の免疫学的測定用ナノ粒子を生産する生物種にとくに制限はなく、真核生物、原核生物いずれによる生産であっても良いが、自己組織化能を高めるため、真核生物による生産が好ましく、さらに好ましくは酵母細胞による生産である。ウイルス、ファージなどの感染工程を含むことや、組換え体も、本発明の免疫学的測定用ナノ粒子を生産する生物種の範囲である。
【００３６】
本発明の免疫学的測定用ナノ粒子は、好ましくは、抗体結合部位に抗体が結合し、抗体結合部位と抗体との結合が、架橋剤による共有結合である。
【００３７】
本発明において抗体とは、天然に産生されるか、または全体的にもしくは部分的に合成され産生されるかのいずれかの免疫グロブリンを意味する。抗原認識能を維持するその全ての誘導体や変異体も含まれる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。好ましくはFc領域を持つ抗体であり、さらに好ましくはFcレセプター、protein A、Protein G、Protein A/G、protein L、ＺＺタグのいずれかと結合し得る抗体を示す。
【００３８】
本発明における抗体Fc領域とは、抗体をパパインで消化して得られる抗原認識能を持たないフラグメントであり、一般に抗体のＨ鎖のＣ末端フラグメントの２量体である。
【００３９】
本発明における「自己組織化能を有するタンパク質」と抗体との結合様式は、抗体の抗原認識能が失われない限りにおいてとくに制限はなく、イオン結合、疎水結合、水素結合、金属結合、あるいはジスルフィド結合などの共有結合等、あるいはこれらの組み合わせであって良い。本発明の免疫学的測定用ナノ粒子の抗体結合部位と抗体との結合は、好ましくは免疫学的測定の過程での抗体の脱落を防止する目的から、共有結合であることが好ましく、さらに好ましくは架橋剤による共有結合である。
【００４０】
本発明における架橋剤とは、「自己組織化能を有するタンパク質」と抗体とを共有結合させる働きをするものを示し、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基などを利用して結合させるための試薬が市販されており、抗体の抗原認識能が失われない限りにおいて、特に制限はない。
【００４１】
架橋剤は、「自己組織化能を有するタンパク質」の持つ抗体結合部位に対して、弱い結合や相互作用を示す種類の抗体であっても強固に結合させることが可能となる。さらに、免疫学的測定の工程での洗浄作業で抗体が脱落することを防止することができる。架橋剤として、例えば臭化シアン化合物、カルボジイミド基を持つ化合物、アルデヒド基を持つ化合物、イミドエステル基を持つ化合物、マレイミド基を持つ化合物、N-ヒドロキシサクシイミドエステル基を持つ化合物、ハロアセチル基を持つ化合物、ピリジルジスルフィド基を持つ化合物、アリルアザイド化合物などが単独もしくは組み合わせて用いられる。架橋剤は、好ましくは、抗原認識能の低下を引き起こしにくい穏やかな条件下で一級アミンとのみ反応することから、イミドエステル基を持つ化合物が持いられ、さらに好ましくはＤＭＡ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）化合物、ＤＭＰ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ）化合物、ＤＭＳ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ）化合物、ＤＭＢＰ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ３，３’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｄａｔｅ）化合物が用いられる。
【００４２】
本発明の免疫学的測定用ナノ粒子は、好ましくは、ナノ粒子が標識されている。
【００４３】
本発明の免疫学的測定用ナノ粒子への標識にとくに制限はなく、抗体との結合能が失われておらず、かつ検出可能な標識であれば良い。標識はナノ粒子の外表面におこなわれていても内面に行われていてもよく、また粒子内部に行われていても良い。粒子内部の標識の手法としては、予め内部もしくは表面を標識したリポソームとの融合や、エレクトロポレーション、圧力変化や温度変化などが単独または組み合わせて用いられる。
【００４４】
ナノ粒子の標識の一例として、例えば、アルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼなどの酵素やその変異体による標識などが挙げられ、またナノ粒子を形成している「自己組織化能を有するタンパク質」との融合であってもよい。フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ダンシル、ルシファーイエローＶＳ、ウンベリフェリル、希土キレート、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＴＲＩＴＣ、ＡＬＥＸＡ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）、量子ドットなどの蛍光物質による標識であっても良い。もしくはＨ3やＣ１４、Ｎ１５、Ｐ３２、Ｓ３５、Ｃｏ５７、Ｓｅ７５、Ｉ１２５などの放射性物質による標識であっても良い。さらに、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、金粒子、鉄粒子、磁性粒子、磁気ビーズによる標識であっても良い。様々な環境に合わせて容易に標識物質を選ぶことが可能であり、複数の標識を組み合わせて用いることも可能である。汎用性と安全性の点から、好ましくはアルカリフォスファターゼやホースラディッシュペルオキシダーゼ、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＡＬＥＸＡ（登録商標）、ビオチン、金粒子が用いられる。ナノ粒子がビオチンで標識されており、ビオチンをアビジンと酵素の複合体で標識するナノ粒子の間接標識を用いることもできる。
【００４５】
本発明の免疫学的測定用ナノ粒子は、好ましくは、抗体が標識されている。
【００４６】
本発明における抗体の標識に特に制限はなく、抗体の抗原認識能が失われておらず、かつ検出可能な標識であれば良い。例えば、アルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼなどの酵素やその変異体による標識であっても良く、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ダンシル、ルシファーイエローＶＳ、ウンベリフェリル、希土キレート、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＴＲＩＴＣ、ＡＬＥＸＡ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）、量子ドットなどの蛍光物質による標識であっても良い。もしくはＨ3やＣ１４、Ｎ１５、Ｐ３２、Ｓ３５、Ｃｏ５７、Ｓｅ７５、Ｉ１２５などの放射性物質による標識であっても良い。さらに、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、金粒子、鉄粒子、磁性粒子、磁気ビーズによる標識であっても良い。様々な環境に合わせて容易に標識物質を選ぶことが可能であり、複数の標識を組み合わせて用いることも可能である。汎用性と安全性の点から、好ましくはアルカリフォスファターゼやホースラディッシュペルオキシダーゼ、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＡＬＥＸＡ（登録商標）、ビオチン、金粒子が用いられる。
【００４７】
本発明の免疫学的測定用ナノ粒子は、免疫学的測定用ナノ粒子が抗体結合部位を持ち、例えば、標識された抗体と結合可能なことにより、標識した抗体により目的とする物質を直接認識し検出する免疫学的測定方法である直接法において、非特異性を抑えたまま、従来は困難であった高感度化が可能となる。
【００４８】
本発明の免疫学的測定用ナノ粒子は、好ましくは、真核細胞内でのタンパク質の自己組織化によって形成されるものであり、遺伝子工学的手法を駆使することで、その表面や内面に様々なタンパク質やペプチドプローブを共有的に提示することができる。しかも、本発明の自己組織化能を有するタンパク質は粒子を形成する際、一定の方向性を保ったまま自己組織化するため、抗体認識部位も一定の向きに整列した状態で粒子に固定される。
【００４９】
また、本発明の免疫学的測定用ナノ粒子は、「自己組織化能を有するタンパク質」を酵母などの真核細胞内で発現させるだけで、酵母１Ｌ培養で数〜数十ｍｇの粒子をルーチン的に生産することが可能である。このことが意味する研究、あるいは産業上の意味は大きい。下記に、本発明の免疫学的測定用ナノ粒子の有用性を列記する。
【００５０】
１）化学的に合成し、精巧な分散技術によって作られるナノ粒子やリポソームのように脂質の両親媒性を利用した自己組織化の原理を使ってナノ粒子を作製するには煩雑な行程を経ることが多く、均一な粒子をルーチン的に形成させるためには熟練が必要とされる。しかし、本発明の免疫学的測定用ナノ粒子は、酵母などの細胞を一定条件で培養するだけで非常に均一なナノ粒子を細胞内に形成させることができ、アフィニティーカラムを利用して精製することでピュアなナノ粒子を簡単に得ることができる。
【００５１】
２）加えて、化学合成やリポソームは、粒子作製に必要な材料をその都度取りそろえなければならず、均一な材料を常に安定して調達することは極めて難しいため、粒子の質はバッチによって影響を受けやすい。特に、ナノ粒子を作るには一般的に高度な技術を要し、また時間とコストがかかる。これに対して、本発明の免疫学的測定用ナノ粒子は、その粒子を作り出す酵母や細胞の種を冷凍などで半永久的に保存することが可能であり、必要な際はその種を培地上で増殖させることで、常に同一品質のナノ粒子を生産し続けることが可能である。
【００５２】
３）また、特に、免疫学的測定のようなバイオ研究の材料としてのナノ粒子はその作製時にタンパク質などの生体材料を内包させる、あるいは表面提示させる行程を必要とすることが多いが、タンパク質はそれが置かれた環境因子に非常に鋭敏に反応し、機能を失ってしまうため、その取り扱いには注意が必要である。この点、本発明の免疫学的測定用ナノ粒子は、粒子に提示または内包させるタンパク質をも粒子を生産する酵母（または他の真核細胞）に作らせることができるため、その機能を害することなく粒子に取り込ませる（表面提示または内包）ことが可能である。
【００５３】
４）また、タンパク質を粒子に取り込ませる際、他の粒子では、その都度、精製したタンパク質を調達し、粒子の作製時に添加する必要があり、これが、粒子の品質安定性とコストを左右する大きな因子になる。これに対して、真核細胞を使って生産する本発明の免疫学的測定用ナノ粒子は、粒子に取り込ませるタンパク質を別途精製または供給する必要がないため、安定な品質と低コストで目的の粒子を作成することができる。まとめると、本発明のナノ粒子は細胞内でのタンパク質の自己組織化を利用して生産することで、半永久的且つ簡便に保存が可能で、安定な品質の粒子を低コスト・高効率に生産できる。特に、本発明で解決しようとする課題である免疫学的測定分野では酵素などのタンパク質を利用することが多いため、この方法は有用である。
【００５４】
本発明において抗体の変異体もしくは「自己組織化能を有するタンパク質」の変異体もしくは抗体結合部位の変異体、「抗体Fc領域との結合部位」の変異体、ＺＺタグの変異体、酵素の変異体とは、
１）これらタンパク質に遺伝子工学的に点、あるいは複数のアミノ酸置換を起こしたもの、
２）タンパク質の全長から一部を削り取るか、新しくタンパク質配列を付け加えたもの、
３）核酸・糖・脂質・化合物等によってタンパク質の一部に修飾を施したもの、
であって、
４）変異を起こす前の抗体と同一の物質を認識する能力を持つ抗体変異体、
５）「自己組織化能を有するタンパク質」と同様に脂質２重膜を取りこんで自己組織化によりナノ粒子を形成する能力を有する変異体、
６）抗体結合部位や「抗体Fc領域との結合部位」、ＺＺタグと同様に、抗体のFc領域と相互作用する能力を有する変異体、
７）酵素と同様に基質を変化させる変異体を示す。
このような変異体を作製するには該タンパク質を発現する遺伝子を含む環状プラスミド上でアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を行うためのプライマーとＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ、またはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｍｕｌｔｉ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ、またはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）等の変異を起こすためのキットを用いて１２〜１８サイクルのＰＣＲを行い、その産物を制限酵素ＤｐｎＩで切断し、大腸菌に形質転換することにより可能である。
【００５５】
さらに、ランダム変異導入法、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて行うことができる。例えば亜硫酸水素ナトリウムを用いた化学的な処理によりシトシン塩基をウラシル塩基に置換する方法や、マンガンを含む反応液中でPCRを行い、DNA合成時のヌクレオチドの取り込みの正確性を低くする方法、部位特異的変異導入のための市販されている各種キットを用いることもできる。例えばSambrook等編［Molecular Cloning-A Laboratory Manual、第２版］Cold Spring Harbor Laboratory、1989、村松正實編［ラボマニュアル遺伝子工学］丸善株式会社、１９８８、エールリッヒ、ＨＥ．編［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］ストックトンプレス、１９８９等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができる。また、核酸・糖・脂質・化合物等によってタンパク質の一部に修飾を施したものとして具体的にはリン酸化酵素によるタンパク質中のセリン、またはスレオニン残基のリン酸化、糖鎖付加酵素によるアスパラギン、またはセリン、またはスレオニン残基の糖鎖付加、または還元・アルキル試薬によるシステイン残基の還元・アルキル化のようなものを例示することができ、これらのものを作製するにはタンパク質にリン酸、または糖鎖等を混ぜて、リン酸化酵素や糖鎖付加酵素を加え、その酵素が働く最適な条件（温度、ｐＨ、塩濃度等）を維持したり、タンパク質の入った溶液に還元剤であるジチオツレイトールやメルカプトエタノール等を終濃度で５ｍＭ濃度になるように入れ、温度６０℃付近、ｐＨ中性以上で１時間反応させ、更にアルキル化剤として５〜１５ｍＭ濃度のヨードアセトアミドを加え室温で１時間以上反応させることにより可能である。もちろん例示した上記の修飾以外にもタンパク質に対する様々な修飾が考えられる。
【００５６】
本発明の免疫学的測定用ナノ粒子を用いる免疫学的測定方法は、各種のwestern blottingや免疫組織染色、免疫電子顕微鏡観察、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ、ＦＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、イムノクロマト、免疫電子顕微鏡観察、フローサイトメトリーなどに有効である。
【実施例】
【００５７】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。本発明は下記実施例に限定されない。
【００５８】
後述の参考例２に示すとおり、遺伝子組換え酵母で前記ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質）を発現させることにより、発現されたＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質から酵母小胞体由来の脂質２重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた短径約２０ｎｍ、長径約１５０ｎｍの楕円状のナノ粒子が形成されることを見出し、報告している（J. Bio. Chem., Vol.267, No.3, 1953-1961, 1992）。このような粒子は、ＨＢＶゲノムや他のＨＢＶタンパク質を全く含まないので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性は極めて高い。また、ｐＨや温度、界面活性剤などに対して安定性が極めて高いという特徴を持つ。
【００５９】
さらに、クローン化することで均一な品質の「自己組織化能を有するタンパク質」と脂質２重膜からなるナノ粒子を常に生産可能であり、またハンドリングしやすい酵母などを生産系として利用できるため、生産性や生産コストの面でも優れている。
【００６０】
参考例１
（大腸菌でのＣ末端ポリヒスチジンタグつきＣＡＴタンパク質の合成と精製）
Ｃ−末端に６個のヒスチジンを融合させたＣＡＴタンパク質は、発現ベクターによって大腸菌ＢＬ２１内で合成させた。ＬＢプレート上で３７℃、１６時間培養したシングルコロニーを滅菌した爪楊枝で取り、カナマイシン添加したＬ−Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ培地）１０ｍｌにて３７℃前培養した。前培養液をカナマイシン添加した１Ｌ  ＬＢ培地に加え３７℃にて２〜３時間培養した。ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように添加し、さらに３７℃にて５ｈｒ培養した。３０００ｒｐｍ  ５ｍｉｎ  ４℃遠心分離し菌体を沈澱させ、沈澱した菌体を６０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０にて洗浄し、再び遠心分離し菌体を沈澱させた。菌体に６０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０溶液を加え懸濁後、氷中にて冷却しながらデジタルソニケーター（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用い、添付のプロトコルにしたがって菌体を破砕した。破砕液トータル、９０００ｒｐｍ  １５ｍｉｎ  ４℃遠心分離後の上清（可溶性画分）、沈澱（不溶性画分）を分画した。大腸菌破砕液可溶性画分中のＣＡＴタンパク質を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で平衡化したニッケルセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）１０ｍｌ容量に通過させ、ポリヒスチジンタグ付きＣＡＴタンパク質を吸着させた。カラムを１００ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で洗浄後、さらに１００ｍｌの５０ｍＭイミダゾール／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で洗浄した。５０ｍｌの５００ｍＭイミダゾール／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で溶出し、ポリヒスチジンタグ付きＣＡＴタンパク質を含む画分を回収した。その後１０００倍量のＰＢＳに対して終夜透析し、フィルター滅菌した。
【００６１】
参考例２
（遺伝子組換え酵母によるＺＺタグを付加したナノ粒子（ＺＺ粒子）の発現）
特開２００４−００２３１３号公報実施例記載の方法に基づいて、ＺＺタグをもつナノ粒子を作製した。
【００６２】
実施例１
（ＺＺタグタグを付加したナノ粒子と標識抗体を用いた免疫学的測定）
参考例１で作製したＣ末端ポリヒスチジンタグつきＣＡＴタンパク質4,500ng/mlをマルチウエルプレート中でPBSにより約141 ng/mlまで順次２段階希釈し、４℃にて終夜静置し固層化させた。PBSで３回洗浄後、1/4vol.ブロックエースを含むPBS中で、FITC標識された、Ｃ末端ポリヒスチジンタグに対する抗体（FITC標識―抗ヒスチジンタグ抗体）3μg/mlを加え室温にて１時間振とうした。このとき、ＺＺ粒子4μg/mlを添加したもの、FITCラベルしたＺＺ粒子4μg/mlを添加したものを同時に処理し比較対象とした。FITC標識にはPIERCE社製EZ-Label Fluorescein Labeling Kitを用い、添付のプロトコルにしたがってFITCラベルした。１時間振とう後PBSTにて３回洗浄し、FITCの蛍光を蛍光プレートリーダーにより測定した。ＺＺ粒子の添加により検出感度はおよそ８倍向上した。また、FITCラベルしたＺＺ粒子の添加により検出感度はおよそ１０倍向上した（図１）。図３は、本実施例に示したような、免疫学的測定におけるＺＺ粒子の効果を示す図である。図３は、標識物質（図３の２）により標識された標識抗体のみによる抗原（図３の１）の検出系と比較し、標識抗体にＺＺ粒子（図３の３）を添加する場合、抗原（図３の１）を認識した標識抗体とＺＺ粒子および抗原を認識しなかった標識抗体が結合し、検出感度が向上することを示す。
【００６３】
実施例２
（ＺＺタグタグを付加した標識ナノ粒子と抗体を用いた免疫学的測定）
参考例１で作製したＣ末端ポリヒスチジンタグつきＣＡＴタンパク質溶液4,500ng/mlをマルチウエルプレート中でPBSにより約141 ng/mlまで順次２段階希釈し、４℃にて終夜静置し固層化させた。PBSで３回洗浄後、1/4vol.ブロックエースを含むPBS中で、FITC標識されたＣ末端ポリヒスチジンタグに対する抗体もしくは未標識のＣ末端ポリヒスチジンタグに対する抗体各3μg/mlを加え室温にて１時間振とうした。抗体を含まない溶液で同様に処理したものを比較対象とした。PBSTにて３回洗浄後、1/4vol.ブロックエースを含むPBS中で、FITC標識したＺＺ粒子および未標識ＺＺ粒子各4μg/mlを添加し、１時間振とうした。粒子を含まない溶液で同時に処理し比較対象とした。FITC標識にはPIERCE社製EZ-Label Fluorescein Labeling Kitを用い、添付のプロトコルにしたがってFITCラベルした。１時間振とう後PBSTにて３回洗浄し、FITCの蛍光を蛍光プレートリーダーにより測定した。
標識したＺＺ粒子の添加により検出感度は向上した。また、FITCラベルした抗体と標識したＺＺ粒子の協調により検出感度はさらに向上した（図２）。このとき抗体を含まない比較対象においてはシグナルが見られなかったことから、ＺＺ粒子による非特異的なシグナルは見られなかった。図４は、本実施例に示したような、免疫学的測定におけるＺＺ粒子の効果を示す図である。図４は、標識物質（図４の２）により標識された標識抗体のみによる抗原（図４の１）の検出系と比較し、未標識抗体（図４の４）により抗原（図４の１）を認識し、標識されたＺＺ粒子（図４の３）を添加した場合、未標識抗体と標識されたＺＺ粒子が結合することにより検出感度が向上することを示す。
【００６４】
実施例３
（ＺＺタグタグを付加したナノ粒子と酵素標識抗体を用いた免疫学的測定）
参考例１で作製したＣ末端ポリヒスチジンタグつきＣＡＴタンパク質（抗原）溶液560ng/mlをマルチウエルプレート中でPBSにより約0.27 ng/mlまで順次２段階希釈し、100μlを４℃にて終夜静置し固層化させた。PBSTで３回洗浄後、1/4vol.ブロックエースを含むPBSTで希釈した、Ｃ末端ポリヒスチジンタグに対するマウスモノクローナル抗体（Invitrogen社製）250ng/mlを１次抗体として加え、室温にて２時間振とうした。PBSで３回洗浄後、1/4vol.ブロックエースを含むPBSTで希釈した酵素標識抗体、HRP標識Rabbit抗マウスIgG抗体（SIGMA社製）溶液0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/mlを室温にて１時間振とう反応させた。このとき、各酵素標識抗体溶液にＺＺ粒子を1.5μg/ml添加することにより、ＺＺ粒子が与える効果について調べた。酵素標識抗体反応後、PBSTで３回洗浄、TMBと硫酸による発色を吸光度（450nm）により測定した。ＺＺ粒子による検出感度の上昇倍率は、吸光度（450nm）が1.5を与えるときの抗原濃度から算出した。ＺＺ粒子を用いないときと比較し、ＺＺ粒子の添加により検出感度は最大で約５倍向上した。このときＺＺ粒子が基板に吸着することにより生じるバックグラウンドはほとんど見られなかった。また、直線性を保ったまま低濃度領域を測定可能であることがグラフから読みとれる（図５、図７）。図７は、抗原（図７の１）を、１次抗体（図７の５）と標識物質（図７の２）により標識された標識抗体により検出する検出系と比較し、ＺＺ粒子（図７の３）を添加した場合、標識抗体とＺＺ粒子が結合することにより検出感度が向上することを示す。ＺＺ粒子の分子量を4400kDa、酵素標識抗体の分子量を200kDaとし、酵素標識抗体とＺＺ粒子のモル比が感度向上倍率に与える影響を調べた（図６）。
【００６５】
実施例４
（ＺＺタグタグを付加したナノ粒子と酵素標識抗体を用いた免疫学的測定）
Ovalbumin（SIGMA社製）（抗原）溶液500μg/mlをマルチウエルプレート中でPBSにより約0.12ng/mlまで順次２段階希釈し、100μlを４℃にて終夜静置し固層化させた。PBSTで３回洗浄後、1/4vol.ブロックエースを含むPBSTで希釈した、Ovalbuminに対するマウスモノクローナル抗体（Abcam社製）400ng/mlを１次抗体として加え室温にて２時間振とうした。PBSで３回洗浄後、1/4vol.ブロックエースを含むPBSTで希釈した酵素標識抗体、HRP標識Rabbit抗マウスIgG抗体（SIGMA社製）溶液2μg/mlを室温にて１時間振とう反応させた。このとき、酵素標識抗体溶液にＺＺ粒子を2.4μg/ml添加することにより、ＺＺ粒子が与える効果について調べた。酵素標識抗体反応後、PBSTで３回洗浄、TMBと硫酸による発色を吸光度（450nm）により測定した。ＺＺ粒子による検出感度の上昇倍率は、吸光度（450nm）が1.5を与えるときの抗原濃度から算出した。ＺＺ粒子を用いないときと比較し、ＺＺ粒子の添加により検出感度は約１５倍向上した。このときＺＺ粒子が基板に吸着することにより生じるバックグラウンドはほとんど見られなかった（図８）。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、免疫学的測定におけるＺＺ粒子の効果を示す図である。
【図２】図２は、免疫学的測定におけるＺＺ粒子の効果を示す図である。
【図３】図３は、免疫学的測定におけるＺＺ粒子の効果を示す図である。
【図４】図４は、免疫学的測定におけるＺＺ粒子の効果を示す図である。
【図５】図５は、免疫学的測定におけるＺＺ粒子の効果を示す図である。
【図６】図６は、ＺＺ粒子と酵素標識抗体の最適モル比を示す図である。
【図７】図７は、免疫学的測定におけるＺＺ粒子の効果を示す図である。
【図８】図８は、免疫学的測定におけるＺＺ粒子の効果を示す図である。
【符号の説明】
【００６７】
１  抗原
２  標識物質
３  ＺＺ粒子
４  抗体
５  １次抗体
【図１】
2007127626.tif 000002
【図２】
2007127626.tif 000003
【図３】
2007127626.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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