(57)【要約】  【課題】  ＷＮＫ１及びＷＮＫ４の基質を同定すること、両タンパク質の関連シグナル伝達経路を明らかにすること、両タンパク質の関連シグナル伝達経路を標的とする降圧剤を提供すること。  【解決手段】  本発明者らは、ＷＮＫ１及びＷＮＫ４とＳＰＡＫとが相互作用すること（相互に結合すること）、及び、ＷＮＫ１及びＷＮＫ４がＳＰＡＫを基質とし、ＳＰＡＫをリン酸化する作用があることを新規に見出した。そこで、本発明では、まず、ＳＰＡＫを基質とするＷＮＫ１、ＳＰＡＫを基質とするＷＮＫ４、ＷＮＫ１又は／及びＷＮＫ４の基質であるＳＰＡＫ、ＷＮＫ１及びＷＮＫ４とＳＰＡＫとが相互作用を促進又は抑制する降圧剤を提供する。  【選択図】  図２
2007074951.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＰＡＫと相互作用するＷＮＫ１。
【請求項２】
ＳＰＡＫと相互作用するＷＮＫ４。
【請求項３】
ＷＮＫ１又はＷＮＫ４と相互作用するＳＰＡＫ。
【請求項４】
ＷＮＫ１又はＷＮＫ４とＳＰＡＫとの相互作用を阻害又は抑制する降圧剤。
【請求項５】
ＷＮＫ１又はＷＮＫ４の立体構造中の、ＳＰＡＫとの結合部位に対して特異的に結合する物質であることを特徴とする請求項４記載の降圧剤。
【請求項６】
ＷＮＫ１又はＷＮＫ４と結合して、前記タンパク質の立体構造を変化させる物質であることを特徴とする請求項４記載の降圧剤。
【請求項７】
ＷＮＫ１又はＷＮＫ４のリン酸化を阻害又は抑制する物質であることを特徴とする請求項４記載の降圧剤。
【請求項８】
抗ＷＮＫ抗体であることを特徴とする請求項４記載の降圧剤。
【請求項９】
抗ＷＮＫアプタマーであることを特徴とする請求項４記載の降圧剤。
【請求項１０】
ＳＰＡＫの立体構造中の、ＷＮＫ１又はＷＮＫ４との結合部位に対して特異的に結合する物質であることを特徴とする請求項４記載の降圧剤。
【請求項１１】
ＳＰＡＫと結合して、ＳＰＡＫの立体構造を変化させる物質であることを特徴とする請求項４記載の降圧剤。
【請求項１２】
ＷＮＫ１又はＷＮＫ４による、ＳＰＡＫのリン酸化を阻害又は抑制する物質であることを特徴とする請求項４記載の降圧剤。
【請求項１３】
抗ＳＰＡＫ抗体であることを特徴とする請求項４記載の降圧剤。
【請求項１４】
抗ＳＰＡＫアプタマーであることを特徴とする請求項４記載の降圧剤。
【請求項１５】
イオンチャネルの立体構造中の、ＳＰＡＫとの結合部位に対して特異的に結合する物質であることを特徴とする請求項４記載の降圧剤。
【請求項１６】
イオンチャネルと結合して、イオンチャネルの立体構造を変化させる物質であることを特徴とする請求項４記載の降圧剤。
【請求項１７】
ＳＰＡＫによるイオンチャネルのリン酸化を阻害又は抑制することを特徴とする請求項４記載の降圧剤。
【請求項１８】
イオンチャネルのリン酸化部位に特異的に結合する抗イオンチャネル抗体であることを特徴とする請求項４記載の降圧剤。
【請求項１９】
イオンチャネルのリン酸化部位に特異的に結合する抗イオンチャネルアプタマーであることを特徴とする請求項４記載の降圧剤。
【請求項２０】
ＷＮＫ１又はＷＮＫ４の発現を抑制する物質であることを特徴とする請求項４記載の降圧剤。
【請求項２１】
ＷＮＫ１又はＷＮＫ４をコードする遺伝子の塩基配列の一部と同じ塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ干渉によって、前記タンパク質の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項２０記載の降圧剤。
【請求項２２】
ＳＰＡＫの発現を抑制する物質であることを特徴とする請求項４記載の降圧剤。
【請求項２３】
ＳＰＡＫをコードする遺伝子の塩基配列の一部と同じ塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ干渉によって、前記タンパク質の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項２２記載の降圧剤。
【請求項２４】
ＷＮＫ１又はＷＮＫ４とＳＰＡＫとの相互作用を用いた降圧剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＷＮＫ１又はＷＮＫ４とＳＰＡＫとの相互作用、前記相互作用を阻害または抑制する降圧剤、前記相互作用を用いたスクリーニング方法、などに関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧は、安静時の血圧が異常に上昇した状態をいい、本態性高血圧と二次的高血圧に分類される。本態性高血圧は、血圧上昇の原因となる基礎疾患が明らかでない高血圧をいい、高血圧の全体の９０〜９５％を占める。成人の２０％が本態性高血圧であると推測され、治療を行わないで放置すると脳卒中、心筋梗塞など重大な疾患を引き起こす要因になる。そのため、長年、発症機序に関する研究や治療剤（降圧剤）の開発が行われている。なお、二次的高血圧は、他の疾患により二次的に血圧が上昇した病態をいう。
【０００３】
本態性高血圧に関して、ＮａＣｌ（塩）代謝との関連性がよく知られている。ＮａＣｌ代謝は、主に、腎臓の尿細管に存在するイオンチャネルによって調節されている。イオンチャネルによるＮａＣｌ再吸収が過剰になると、腎臓における水分再吸収も過剰になるため、血圧が上昇する。なお、ＮａＣｌ再吸収に関連するイオンチャネルとして、例えば、ＮＫＣＣ１、ＮＫＣＣ２，ＮＣＣなどが知られている。
【０００４】
ＰＨＡ２（偽性アルドステロン症２型）は、高血圧、腎臓における塩再吸収の増大、Ｋ＋（カリウムイオン）及びＨ＋（水素イオン）の排泄不全、などを特徴とするメンデル遺伝型の疾患である。近年、ＰＨＡ２（偽性アルドステロン症２型）の原因遺伝子として、ＷＮＫ１及びＷＮＫ４が同定された（非特許文献１参照）。その後の報告では、ＷＮＫの機能亢進が、ＰＨＡ２（高血圧）を引き起こすと推測されている。なお、ＷＮＫは本態性高血圧の発症メカニズムにも関与すると推測されているが、具体的な作用機序は現在のところ不明である。
【０００５】
ＷＮＫ１及びＷＮＫ４は、ともに腎臓の遠位尿細管と皮質集合管に存在し、ＷＮＫ１は細胞内に、ＷＮＫ４はタイトジャンクション（密着結合、細胞間接着装置の一つ）に局在することが報告されている。また、両タンパク質は、ＮａＣｌ代謝と関連性を有することが報告されている。
【０００６】
両タンパク質は、セリン／スレオニンキナーゼのＷＮＫファミリー（ＷＮＫタンパク質群）に分類され、リン酸化酵素であることが明らかになっているが、両タンパク質の基質（酵素によって触媒作用を受ける化合物又は分子）は現時点で明らかになっていない。
【０００７】
ここで、本発明と関連性があるタンパク質、ＳＰＡＫについて、以下説明する。
【０００８】
ＳＰＡＫ（ＳＴＥ２０／ＳＰＳ１−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｌｉｎｅ−  ａｎｄ  Ａｌａｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  Ｋｉｎａｓｅ、ＰＡＳＫ（Ｐｒｏｌｉｎｅ−Ａｌａｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ＳＴＥ２０−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ）と呼ばれる場合もある。）は、ＳＴＫ３９（Ｓｅｒｉｎｅ／Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  ３９）のキナーゼ活性領域フラグメントとして同定された、ＳＴＥ２０／ＳＰＳ１キナーゼファミリー（酵母のＳＴＥ２０やＳＰＳ１と高いホモロジーを持つキナーゼファミリー）のタンパク質である（以下、「ＳＰＡＫ」とする）。
【０００９】
ＳＰＡＫに関して、ＳＰＡＫがＮＫＣＣ１、ＮＫＣＣ２などのイオンチャネルと結合すること、及び、ＳＰＡＫのドミナントネガティブ変異タンパク質を過剰発現させるとＮＫＣＣ１の活性が低下すること、についての報告がある（非特許文献２、非特許文献３参照）。
【非特許文献１】Wilson et al, “Human Hypertension caused by Mutations in WNK Kinases”Science, Vol.293: 1107-1112
【非特許文献２】Piechotta K et al, “Cation chlpride cotransporters interact with thestress-related kinases Ste20-related proline-alanine-rich kinase (SPAK) andoxidative stress response 1 (OSR1)” J Biol Chem. 277(52):50812-9 (2002)
【非特許文献３】Dowd BF et al, “PASK (proline-alanine-rich STE20-related kinase), aregulatory kinase of the Na-K-Cl cotransporter (NKCC1)” J Biol Chem.278(30):27347-53 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
前記の通り、ＷＮＫタンパク質の基質は未同定である。従って、ＰＨＡ２の発症メカニズム、即ち、ＷＮＫタンパク質の亢進から高血圧などの病態に至るまでのシグナル伝達経路は未解明のままである。
【００１１】
一方、前記の通り、ＷＮＫは本態性高血圧の発症メカニズムにも関与すると推測されており、また、ＷＮＫタンパク質は、ＮａＣｌ代謝と関連性を有することが報告されている。従って、両タンパク質の基質を同定し、両タンパク質のシグナル伝達経路を明らかにすることにより、そのシグナル伝達経路を標的とした降圧剤を開発できる可能性がある。
【００１２】
そこで、本発明は、ＷＮＫタンパク質の基質を同定すること、ＰＨＡ２の発症機序を明らかにすること、両タンパク質のシグナル伝達経路を標的とする降圧剤を提供すること、を主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、ＷＮＫ１及びＷＮＫ４とＳＰＡＫとが相互作用すること（相互に結合すること）、ＷＮＫ１及びＷＮＫ４がＳＰＡＫを基質とし、ＳＰＡＫをリン酸化する作用を有すること、並びにＳＰＡＫがリン酸化されることにより活性化すること、を新規に見出した。
【００１４】
そこで、本発明では、まず、ＳＰＡＫと相互作用するＷＮＫ１、ＳＰＡＫと相互作用するＷＮＫ４、ＷＮＫ１又はＷＮＫ４と相互作用するＳＰＡＫを提供する。
【００１５】
前記相互作用は、ＰＨＡ２（偽性アルドステロン症２型、以下同じ）における高血圧が、次のようなメカニズムにより惹起されることを強く示唆する。まず、ＷＮＫタンパク質の亢進はＳＰＡＫのリン酸化を亢進する。次に、過剰にリン酸化されたＳＰＡＫは、ＮＫＣＣ１などのイオンチャネルに結合し、ＮＫＣＣ１などイオンチャネルの活性を亢進する。次に、イオンチャネルの活性が亢進することにより、ＮａＣｌ再吸収が過剰になり、高血圧が惹起される。以上のように、本発明は、ＮａＣｌ代謝に係わる高血圧発症メカニズムに関し、重要な知見である。
【００１６】
次に、本発明では、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの間の相互作用を阻害又は抑制する降圧剤を提供する。
【００１７】
上記の通り、本発明は、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの間の相互作用の亢進が高血圧を惹起することを強く示唆する。従って、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの間の相互作用を阻害又は抑制する物質、即ち、ＷＮＫタンパク質によるＳＰＡＫリン酸化を阻害又は抑制する物質は、単に、ＰＨＡ２予防剤若しくは治療剤として有効なだけでなく、本態性高血圧を改善する薬剤（降圧剤）としても有効である可能性がある。
【００１８】
ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの相互作用を阻害又は抑制する物質として、例えば、
（Ａ）ＷＮＫタンパク質に作用する物質（ＷＮＫタンパク質の立体構造中のＳＰＡＫとの結合部位に対して特異的に結合する物質、ＷＮＫタンパク質と結合してＷＮＫタンパク質の立体構造を変化させる物質、ＷＮＫタンパク質のリン酸化を阻害又は抑制する物質、抗ＷＮＫ抗体など）、
（Ｂ）ＳＰＡＫに作用する物質（ＳＰＡＫの立体構造中のＷＮＫタンパク質との結合部位に対して特異的に結合する物質、ＳＰＡＫと結合してＳＰＡＫの立体構造を変化させる物質、ＷＮＫタンパク質によるＳＰＡＫのリン酸化を阻害又は抑制する物質、抗ＳＰＡＫ抗体など）、
（Ｃ）イオンチャネルに作用する物質（イオンチャネルの立体構造中のＳＰＡＫとの結合部位に対して特異的に結合する物質、イオンチャネルと結合してイオンチャネルの立体構造を変化させる物質、ＳＰＡＫによるイオンチャネルのリン酸化を阻害又は抑制する物質など）、
（Ｄ）ＷＮＫタンパク質若しくはＳＰＡＫの発現を抑制する物質、などが考えられる。
【００１９】
続いて、本発明では、ＷＮＫ１又はＷＮＫ４とＳＰＡＫとの相互作用を用いた降圧剤のスクリーニング方法を提供する。
【００２０】
例えば、標的物質によって、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの結合が阻害又は抑制された場合、若しくはＷＮＫタンパク質によるＳＰＡＫリン酸化が阻害又は抑制された場合、その物質は、降圧剤として有効である可能性がある。
【００２１】
以下、本発明に係るタンパク質について、説明する。
【００２２】
本発明に係るＷＮＫ１は、配列表１のアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはＷＮＫ１のアミノ酸配列と相同性を有し、ＳＰＡＫリン酸化作用を保持するタンパク質である。即ち、例えば、ＷＮＫ１のスプライシング・バリアント（同一の遺伝子に由来するが、スプライシングにより、配列の一部が異なっているタンパク質、以下同じ）や、前記アミノ酸配列中の一部に、置換、欠損、挿入、付加部分が含まれる場合も、本発明に係るＷＮＫ１に包含される。
【００２３】
本発明に係るＷＮＫ４は、配列表２のアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはＷＮＫ４のアミノ酸配列と相同性を有し、ＳＰＡＫリン酸化作用を保持するタンパク質である。即ち、例えば、ＷＮＫ４のスプライシング・バリアントや、前記アミノ酸配列中の一部に、置換、欠損、挿入、付加部分が含まれる場合も、本発明に係るＷＮＫ４に包含される。
【００２４】
本発明に係る「ＷＮＫタンパク質」は、ＷＮＫ１、ＷＮＫ４、若しくは前記タンパク質のいずれか又は両方とアミノ酸配列と相同性を有し、ＳＰＡＫリン酸化作用を保持するタンパク質である。即ち、例えば、前記タンパク質のいずれかのスプライシング・バリアントや、前記アミノ酸配列中の一部に、置換、欠損、挿入、付加部分が含まれる場合も、本発明に係るＷＮＫタンパク質に包含される。
【００２５】
本発明に係るＳＰＡＫは、配列表３のアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくはＳＰＡＫのアミノ酸配列と相同性を有し、ＷＮＫによってリン酸化される領域を保持するタンパク質である。即ち、例えば、前記タンパク質のスプライシング・バリアントや、前記アミノ酸配列中の一部に、置換、欠損、挿入、付加部分が含まれる場合も、本発明に係るＳＰＡＫに包含される。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、新規な作用機序に基づく降圧剤又はそのスクリーニング方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
まず、本発明に係るＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの相互作用について、図１を用いて、以下説明する。
【００２８】
上記の通り、ＷＮＫタンパク質（符号１）は、ＳＰＡＫ（符号２）と相互作用し（符号Ａ）する。ＷＮＫタンパク質（符号１）は、立体構造中に、ＳＰＡＫ（符号２）との結合部位１１を有する。一方、ＳＰＡＫ（符号２）も、立体構造中に、ＷＮＫタンパク質（符号１）との結合部位２１を有する。
【００２９】
次に、前記相互作用を阻害又は抑制する物質について、引き続き、図１を用いて説明する。
【００３０】
上記の通り、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの相互作用（符号Ａ）を阻害又は抑制する物質としては、例えば、
（Ａ）ＷＮＫタンパク質に作用する物質（ＷＮＫタンパク質の立体構造中のＳＰＡＫとの結合部位に対して特異的に結合する物質、ＷＮＫタンパク質と結合してＷＮＫタンパク質の立体構造を変化させる物質、ＷＮＫタンパク質のリン酸化を阻害又は抑制する物質、抗ＷＮＫ抗体など）、
（Ｂ）ＳＰＡＫに作用する物質（ＳＰＡＫの立体構造中のＷＮＫタンパク質との結合部位に対して特異的に結合する物質、ＳＰＡＫと結合してＳＰＡＫの立体構造を変化させる物質、ＷＮＫタンパク質によるＳＰＡＫのリン酸化を阻害又は抑制する物質、抗ＳＰＡＫ抗体など）、
（Ｃ）イオンチャネルに作用する物質（イオンチャネルの立体構造中のＳＰＡＫとの結合部位に対して特異的に結合する物質、イオンチャネルと結合してイオンチャネルの立体構造を変化させる物質、ＳＰＡＫによるイオンチャネルのリン酸化を阻害又は抑制する物質など）、
（Ｄ）ＷＮＫタンパク質若しくはＳＰＡＫの発現を抑制する物質、などが考えられる。
【００３１】
＜（Ａ）ＷＮＫタンパク質に作用する物質について＞
ＷＮＫタンパク質に作用する物質として、例えば、ＷＮＫタンパク質の立体構造中のＳＰＡＫとの結合部位に対して特異的に結合する物質、ＷＮＫタンパク質と結合しＷＮＫタンパク質の立体構造を変化させる物質、ＷＮＫタンパク質のリン酸化を阻害又は抑制する物質、抗ＷＮＫ抗体、などが考えられる。
以下、順に説明する。
【００３２】
（１）ＷＮＫタンパク質の立体構造中の、ＳＰＡＫとの結合部位に対して特異的に結合する物質について：
この物質（符号Ｍ１）が、ＷＮＫタンパク質の立体構造中の、ＳＰＡＫ結合部位１１に結合した場合、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの結合が競合的に阻害される。従って、降圧剤として適用できる可能性がある。
【００３３】
なお、物質Ｍ１には、ＳＰＡＫデコイも含まれる。ここで、ＳＰＡＫデコイとは、ＳＰＡＫ立体構造中のＷＮＫタンパク質結合部位２１と類似の構造を有し、ＳＰＡＫのおとりとして、ＷＮＫタンパク質立体構造中のＳＰＡＫ結合部位１１と結合することができる物質をいう。ＳＰＡＫデコイには、ＳＰＡＫ立体構造中の、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの結合部位２１又はその一部分と同様の立体構造を含むタンパク質又はポリペプチドも含まれる。
【００３４】
（２）ＷＮＫタンパク質と結合して、前記タンパク質の立体構造を変化させる物質について：
この物質（符Ｍ２）が、ＷＮＫタンパク質と結合することにより、前記タンパク質の立体構造が変化する場合、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの結合が阻害又は抑制される。従って、降圧剤として適用できる可能性がある。
【００３５】
（３）ＷＮＫタンパク質のリン酸化を阻害又は抑制する物質について：
例えば、この物質（図示せず）が、ＷＮＫタンパク質のリン酸化部位又はその近傍に結合し、ＷＮＫタンパク質のリン酸化を抑制する場合、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの相互作用が阻害又は抑制される。従って、降圧剤として適用できる可能性がある。
【００３６】
このような物質として、例えば、ＷＮＫタンパク質のリン酸化部位又はその近傍に特異的に結合する抗ＷＮＫ抗体又は抗ＷＮＫアプタマーなども想定できる。ここで、アプタマーは、抗体代替分子であり、標的分子を特異的に認識するオリゴヌクレオチドである（以下同じ）。
なお、ＷＮＫタンパク質のリン酸化部位に特異的に結合する抗ＷＮＫ抗体には、抗原抗体反応により、該部位と特異的に結合するタンパク質が全て包含される。また、ＷＮＫタンパク質のリン酸化部位に特異的に結合する抗ＷＮＫアプタマーには、該部位と特異的に結合するオリゴヌクレオチドが全て包含される。
抗体又はアプタマーは、公知の方法により作製できる（以下同じ）。
【００３７】
（４）抗ＷＮＫ抗体について：
抗ＷＮＫ抗体又は抗ＷＮＫアプタマー（符号Ｍ３）を用いて、ＷＮＫタンパク質の機能を阻害又は抑制することにより、ＷＮＫとＳＰＡＫとの相互作用を阻害又は抑制できる。従って、降圧剤として適用できる可能性がある。
なお、抗ＷＮＫ抗体には、抗原抗体反応により、ＷＮＫタンパク質又はリン酸化されたＷＮＫタンパク質と特異的に結合するタンパク質が全て包含される。抗ＷＮＫアプタマーには、ＷＮＫタンパク質又はリン酸化されたＷＮＫタンパク質と特異的に結合するオリゴヌクレオチドが全て包含される。
【００３８】
＜（Ｂ）ＳＰＡＫに作用する物質について＞
ＳＰＡＫに作用する物質として、例えば、ＳＰＡＫの立体構造中のＷＮＫタンパク質との結合部位に対して特異的に結合する物質、ＳＰＡＫと結合してＳＰＡＫの立体構造を変化させる物質、ＷＮＫタンパク質によるＳＰＡＫのリン酸化を阻害又は抑制する物質、抗ＳＰＡＫ抗体、などが考えられる。
以下、順に説明する。
【００３９】
（１）ＳＰＡＫの立体構造中の、ＷＮＫタンパク質との結合部位に対して特異的に結合する物質について：
この物質（符号Ｍ４）が、ＳＰＡＫの立体構造中の、ＷＮＫタンパク質との結合部位２１に対して特異的に結合した場合、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの結合が競合的に阻害される。従って、降圧剤として適用できる可能性がある。
【００４０】
なお、物質Ｍ４には、ＷＮＫデコイも含まれる。ここで、ＷＮＫデコイとは、ＷＮＫタンパク質立体構造中のＳＰＡＫ結合部位１１と類似の構造を有し、ＷＮＫタンパク質のおとりとして、ＳＰＡＫ立体構造中のＷＮＫタンパク質結合部位２１に結合することができる物質をいう。ＷＮＫデコイには、ＷＮＫタンパク質立体構造中の、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの結合部位１１又はその一部分と同様の立体構造を含むタンパク質又はポリペプチドも含まれる。
【００４１】
（２）ＳＰＡＫと結合して、ＳＰＡＫの立体構造を変化させる物質について：
この物質（符号Ｍ５）がＳＰＡＫと結合して、ＳＰＡＫの立体構造を変化させた場合、ＳＰＡＫとＷＮＫタンパク質との結合が阻害又は抑制される。従って、降圧剤として適用できる可能性がある。
【００４２】
（３）ＷＮＫ１又はＷＮＫ４による、ＳＰＡＫのリン酸化を阻害又は抑制する物質について：
例えば、この物質（符号Ｍ６）がＳＰＡＫのリン酸化部位２２又はその近傍に結合し、ＳＰＡＫのリン酸化を阻害又は抑制する場合、ＳＰＡＫによるイオンチャネルのリン酸化が阻害又は抑制される。従って、降圧剤として適用できる可能性がある。
【００４３】
このような物質として、例えば、ＳＰＡＫのリン酸化部位２２に特異的に結合する抗ＳＰＡＫ抗体又は抗ＳＰＡＫアプタマーなども想定できる。
なお、ＳＰＡＫのリン酸化部位に特異的に結合する抗ＳＰＡＫ抗体には、抗原抗体反応により、該部位と特異的に結合するタンパク質が全て包含される。また、ＳＰＡＫのリン酸化部位に特異的に結合する抗ＳＰＡＫアプタマーには、該部位と特異的に結合するオリゴヌクレオチドが全て包含される。
【００４４】
（４）抗ＳＰＡＫ抗体について：
抗ＳＰＡＫ抗体又は抗ＳＰＡＫアプタマー（符号Ｍ７）を用いて、ＳＰＡＫの機能を阻害又は抑制することにより、ＷＮＫとＳＰＡＫとの相互作用を阻害又は抑制できる。従って、降圧剤として適用できる可能性がある。
なお、抗ＳＰＡＫ抗体には、抗原抗体反応により、ＳＰＡＫ又はリン酸化されたＳＰＡＫと特異的に結合するタンパク質が全て包含される。抗ＳＰＡＫアプタマーには、ＳＰＡＫ又はリン酸化されたＳＰＡＫと特異的に結合するオリゴヌクレオチドが全て包含される。
【００４５】
＜（Ｃ）イオンチャネルに作用する物質について＞
イオンチャネル（ＮＫＣＣ１、ＮＫＣＣ２、ＮＣＣなど、以下同じ）に作用する物質として、例えば、イオンチャネルの立体構造中のＳＰＡＫとの結合部位に対して特異的に結合する物質、イオンチャネルと結合してイオンチャネルの立体構造を変化させる物質、ＳＰＡＫによるイオンチャネルのリン酸化を阻害又は抑制する物質などが考えられる。
以下、順に説明する。
【００４６】
（１）イオンチャネルの立体構造中の、ＳＰＡＫとの結合部位に対して特異的に結合する物質について：
この物質（図示せず）が、イオンチャネルの立体構造中の、ＳＰＡＫとの結合部位に対して特異的に結合した場合、ＳＰＡＫによるイオンチャネルのリン酸化が阻害又は抑制されるため、ＷＮＫとＳＰＡＫとの相互作用も阻害又は抑制される。従って、降圧剤として適用できる可能性がある。
【００４７】
なお、この物質には、ＳＰＡＫデコイも含まれる。ここで、ＳＰＡＫデコイとは、ＳＰＡＫ立体構造中のイオンチャネル結合部位と類似の構造を有し、ＳＰＡＫのおとりとして、イオンチャネル立体構造中のＳＰＡＫ結合部位に結合することができる物質をいう。ＳＰＡＫデコイには、ＳＰＡＫ立体構造中の、ＳＰＡＫとイオンチャネルとの結合部位又はその一部分と同様の立体構造を含むタンパク質又はポリペプチドも含まれる。
【００４８】
（２）イオンチャネルと結合して、イオンチャネルの立体構造を変化させる物質について：
この物質（図示せず）が、イオンチャネルの立体構造を変化させた場合、ＳＰＡＫによるイオンチャネルのリン酸化が阻害又は抑制される。これにより、リン酸化したＳＰＡＫが過剰になるため、ＷＮＫタンパク質によるＳＰＡＫのリン酸化も阻害又は抑制される。従って、降圧剤として適用できる可能性がある。
【００４９】
（３）ＳＰＡＫによるイオンチャンネルのリン酸化を阻害又は抑制する物質について：
この物質（図示せず）が、ＳＰＡＫによるイオンチャネルのリン酸化を阻害又は抑制した場合、イオンチャネルの活性化が阻害又は抑制される。これにより、リン酸化したＳＰＡＫが過剰になるため、ＷＮＫタンパク質によるＳＰＡＫのリン酸化も阻害又は抑制される。
【００５０】
このような物質として、例えば、イオンチャネルのリン酸化部位に特異的に結合する抗イオンチャネル抗体又は抗イオンチャネルアプタマーなども想定できる。
なお、イオンチャネルのリン酸化部位に特異的に結合する抗イオンチャネル抗体には、抗原抗体反応により、該部位と特異的に結合するタンパク質が全て包含される。また、イオンチャネルのリン酸化部位に特異的に結合する抗イオンチャネルアプタマーには、該部位と特異的に結合するオリゴヌクレオチドが全て包含される。
【００５１】
＜（Ｄ）ＷＮＫタンパク質若しくはＳＰＡＫの発現を抑制する物質について＞
この物質（図示せず）が、ＷＮＫタンパク質の発現を抑制した場合、ＷＮＫタンパク質によるＳＰＡＫリン酸化が減少するため、ＳＰＡＫの活性を低下させることができる。ＳＰＡＫの発現を抑制した場合も、リン酸化ＳＰＡＫが減少するため、ＳＰＡＫの活性を低下させることができる。
【００５２】
ＷＮＫタンパク質の発現を抑制する物質として、例えば、ＷＮＫタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列の一部と同じ塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ干渉によって、ＷＮＫタンパク質の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡがある。また、ＳＰＡＫの発現を抑制する物質として、例えば、ＳＰＡＫをコードする遺伝子の塩基配列の一部と同じ塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡであって、ＲＮＡ干渉によって、ＳＰＡＫの発現を抑制する二本鎖ＲＮＡがある。なお、ＲＮＡ干渉に基づく二本鎖ＲＮＡは、公知方法により作製できる。
【００５３】
続いて、本発明に係るスクリーニング方法の一例について、以下説明する。
【００５４】
ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの相互作用を用いたスクリーニング方法としては、例えば、（１）ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫが存在する特定の反応領域中に、候補物質を供給した後、相互作用を検出し、候補物質の中から標的物質をスクリーニングする方法、（２）特定の反応領域中に、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫと候補物質を供給した後、相互作用を検出し、候補物質の中から標的物質をスクリーニングする方法、などがある。
【００５５】
相互作用の検出は、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの結合を検出することによって行ってもよいし、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫリン酸化を検出することによって行ってもよい。相互作用の検出は、既知の方法を用いることができる。ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの結合によって相互作用を検出する場合、例えば、共免疫沈降法などを適用できる。ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫのリン酸化によって相互作用を検出する場合、例えば、共免疫沈降法、ウエスタンブロットなどを適用できる。
【００５６】
本発明に係るスクリーニング方法は、キット化が可能である。その場合、例えば、ＷＮＫタンパク質、ＳＰＡＫ、抗ＷＮＫ抗体、抗ＳＰＡＫ抗体、リン酸化ＳＰＡＫと特異的に結合する抗体、相互作用検出（共免疫沈降法、ウエスタンブロットなど）に用いる試薬、などを、相互作用検出方法に応じて適宜組み合わせ、キット化する。
【実施例１】
【００５７】
実施例１では、ＷＮＫ１とＳＰＡＫとの相互作用について、実験を行った。
【００５８】
本実験は、共免疫沈降法により行った。実験手順の概要は次の通りである。
まず、公知方法により、抗ＷＮＫ１抗体、及び、抗ＳＰＡＫ／ＯＳＲ１抗体を作製した。
次に、培養したＨＥＫ２９３細胞又はＭＤＣＫ細胞（イヌ腎尿細管上皮細胞）を、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを用いて溶解し、細胞抽出液を得た。
次に、抗ＳＰＡＫ／ＯＳＲ１抗体を用いて、細胞抽出液からＳＰＡＫの相互作用複合体を、特異的に免疫沈降させた。次に、回収した相互作用複合体についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、以下同じ）を行った後、抗ＷＮＫ１抗体を用いて免疫プロットを行い、ＷＮＫ１を検出した。同様に、細胞抽出液からＷＮＫ１の相互作用複合体を、抗ＷＮＫ１抗体を用いて特異的に免疫沈降させた後、回収した免疫沈降物について抗ＳＰＡＫ／ＯＳＲ１抗体を用いて免疫プロットを行い、ＳＰＡＫを検出した。
【００５９】
結果を図２に示す。
図中、「ＨＥＫ２９３」及び「ＭＤＣＫ」は、用いた培養細胞の種類を示す。
図中、「ＩＰ（ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）」は、免疫沈降を行ったことを示し、「ＣｏｎｔｒｏｌＩｇＧ」は、コントロールとして、ＩｇＧ（免疫グロブリン）を用いて免疫沈降を行った後、免疫ブロットを行ったレーンであることを、「ＳＰＡＫ／ＯＳＲ１」は、抗ＳＰＡＫ／ＯＳＲ１抗体を用いて免疫沈降を行った後、免疫ブロットを行ったレーンであることを、「ＷＮＫ１」は、抗ＷＮＫ１抗体を用いて免疫沈降を行った後、免疫ブロットを行ったレーンであることを、それぞれ示す。なお、「Ｌｙｓａｔｅ」は、免疫沈降を行わず、細胞抽出液について、免疫ブロットを行ったレーンであることを示す。
図中、「ＩＢ（ＩｍｍｕｎｏＢｌｏｔ）」は、免疫ブロットを行ったことを示し、「ＩＢ：αＷＮＫ１」は、免疫沈降、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、抗ＷＮＫ１抗体を用いて免疫ブロットを行ったことを、「ＩＢ：αＳＰＡＫ／ＯＳＲ１」は、免疫沈降、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、抗ＳＰＡＫ／ＯＳＲ１抗体を用いて免疫ブロットを行ったことを、それぞれ示す。
図中、矢印は、各タンパク質のバンドの位置を、各写真の右側に記載された数字は分子量（ｋＤ）を、それぞれ示す。
【００６０】
図２の左側の免疫ブロット写真では、抗ＳＰＡＫ／ＯＳＰ１抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）を行ったレーンにおいて、ＷＮＫ１のバンドが検出された（その写真中、ＩＢ：αＷＮＫ１の部分を参照）。
同様に、図２の右側の免疫ブロット写真（ＭＤＣＫ細胞を用いた場合）でも、抗ＳＰＡＫ／ＯＳＰ１抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）を行ったレーンにおいて、ＷＮＫ１のバンドが検出された（その写真中、ＩＢ：αＷＮＫ１の部分を参照）。
即ち、この結果は、ＨＥＫ２９３細胞又はＭＤＣＫ細胞中に存在するタンパク質について、抗ＳＰＡＫ／ＯＳＲ１抗体を用いて免疫沈降を行うと、その免疫沈降物中に、ＷＮＫ１が存在することを示す。
【００６１】
一方、図２の真ん中の免疫ブロット写真では、抗ＷＮＫ１抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）を行ったレーンにおいて、ＳＰＡＫのバンドが検出された（その写真中、ＩＢ：αＳＰＡＫ／ＯＳＲ１の部分を参照）。
即ち、この結果は、ＨＥＫ２９３細胞又はＭＤＣＫ細胞中に存在するタンパク質について、抗ＷＮＫ１抗体を用いて免疫沈降を行うと、その免疫沈降物中に、ＳＰＡＫが存在することを示す。
【００６２】
従って、以上の結果は、ＷＮＫ１とＳＰＡＫが相互に結合すること、即ち、両タンパク質が相互作用することを強く示唆する。
【実施例２】
【００６３】
実施例２では、ＷＮＫ１及びＷＮＫ４とＳＰＡＫとの相互作用について、実験を行うとともに、ＷＮＫタンパク質の配列における、ＳＰＡＫとの相互作用部位について、検討を行った。
【００６４】
実験手順の概要は次の通りである。
【００６５】
まず、ＳＰＡＫ発現プラスミド、ＯＳＲ１発現プラスミド、及び、ＷＮＫタンパク質発現プラスミドを作製した。
ＳＰＡＫ発現プラスミド及びＯＳＲ１発現プラスミドは、プラスミドｐＲＫ５−Ｔ７に、ＳＰＡＫ又はＯＳＲ１の配列を組み込んで作製した。なお、ｐＲＫ５−Ｔ７は、挿入した配列にＴ７−タグを付加させた形で発現させるプラスミドである。
ＷＮＫ発現プラスミドは、プラスミドｐＲＫ５−ｆｌａｇに、ＷＮＫの配列を組み込んで作製した。なお、ｐＲＫ５−ｆｌａｇは、挿入した配列にｆｌａｇ−タグを付加させた形で発現させるプラスミドである。
【００６６】
ＷＮＫ１発現プラスミドとして、次のものを作製した。
（１）ＷＮＫ１の全長配列を挿入したもの（Ｗｉｌｄ  Ｔｙｐｅ）、
（２）ＷＮＫ１のアミノ酸配列の１２５８番目のフェニルアラニンをアラニンに置換した配列を挿入したもの（Ｆ１２５８Ａ）、
（３）ＷＮＫ１のアミノ酸配列の１８６９番目のフェニルアラニンをアラニンに置換した配列を挿入したもの（Ｆ１８６９Ａ）、
（４）ＷＮＫ１のアミノ酸配列の１９４６番目のフェニルアラニンをアラニンに置換した配列を挿入したもの（Ｆ１９４６Ａ）、
（５）ＷＮＫ１のアミノ酸配列の１９５８番目のフェニルアラニンをアラニンに置換した配列を挿入したもの（Ｆ１９５８Ａ）、
（６）ＷＮＫ１のアミノ酸配列の１２５８、１８６９、１９４６、１９５８番目の各フェニルアラニンを全てアラニンに置換した配列を挿入したもの（４ＦＡ）。
また、ＷＮＫ４発現プラスミドとして、次のものを作製した。
（１）ＷＮＫ４の全長配列を挿入したもの（Ｗｉｌｄ  Ｔｙｐｅ）、
（２）ＷＮＫ４のアミノ酸配列の１０１７番目のフェニルアラニンをアラニンに置換した配列を挿入したもの（Ｆ１０１７Ａ）。
【００６７】
次に、実施例１と同様に、ＨＥＫ２９３細胞に、ＳＰＡＫ発現プラスミド又はＯＳＲ１発現プラスミドとＷＮＫタンパク質発現プラスミドをトランスフェクトし、両タンパク質を共発現させ、細胞溶解後、免疫沈降を行った。そして、免疫沈降物（相互作用複合体）について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、免疫ブロットを行った。
本実験では、抗Ｆｌａｇ抗体を用いてＷＮＫの相互作用複合体を回収した後、抗Ｔ７抗体を用いて免疫ブロットを行い、ＳＰＡＫ又はＯＳＲ１を検出した。同様に、抗Ｔ７抗体を用いてＳＰＡＫ又はＯＳＲ１の相互作用複合体を回収した後、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫ブロットを行い、ＷＮＫタンパク質を検出した。
【００６８】
結果を図３に示す。
【００６９】
図３Ａは、ＷＮＫ１及びＷＮＫ４のアミノ酸配列モチーフを模式的に記載した図である。
図３ＡのＷＮＫ１の配列中、左から、「ＲＦＩＶ」は１２５８番目のフェニルアラニン（Ｆ）及びその近傍のアミノ酸配列を、「ＲＦＱＶ」は１８６９番目のフェニルアラニン（Ｆ）及びその近傍のアミノ酸配列を、同じく「ＲＦＱＶ」は１９４６番目のフェニルアラニン（Ｆ）及びその近傍のアミノ酸配列を、「ＲＦＳＶ」は１９５８番目のフェニルアラニン（Ｆ）及びその近傍のアミノ酸配列を、それぞれ示す。なお、「２３８２ａａ」は、ＷＮＫ１のアミノ酸配列の全長が２３８２個であることを示す。
同様に、図３ＡのＷＮＫ４の配列中、「ＲＦＱＶ」は１０１７番目のフェニルアラニン（Ｆ）及びその近傍のアミノ酸配列を示す。なお、「１２４３ａａ」は、ＷＮＫ４のアミノ酸配列の全長が１２４３個であることを示す。
【００７０】
図３Ｂは、実験結果を示す免疫ブロット写真である。
図３Ｂ中、左側の６つの写真は、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとを共発現させた場合の免疫ブロット写真であり、右側の６つの写真は、ＷＮＫタンパク質とＯＳＲ１とを共発現させた場合の免疫ブロット写真である。
図中、「Ｆｌａｇ−ｈＷＮＫ」の項目は、ＨＥＫ２９３細胞において、Ｆｌａｇタグで標識したヒトＷＮＫタンパク質を発現させたかどうかを示し、「−」は発現させていないことを、その他は、それぞれ記載されたＷＮＫタンパク質又はその変異タンパク質を発現させたことを示す。
「Ｔ７−ｒＳＰＡＫ」の項目は、ＨＥＫ２９３細胞において、Ｔ７タグで標識したラットＳＰＡＫを発現させたかどうかを示し、「−」は発現させていないことを、「＋」は発現させたことを示す。
図中、「Ｔｏｔａｌ」は、免疫沈降を行わず、細胞抽出液についてそのまま免疫ブロットを行った結果であることを、「ＩＰ：αＦｌａｇ」は、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降を行い、ＷＮＫタンパク質の相互作用複合体を回収した場合の結果であることを、「ＩＰ：αＴ７」は、抗Ｔ７抗体を用いて免疫沈降を行い、ＳＰＡＫ又はＯＳＲ１の相互作用複合体を回収した場合の結果であることを、それぞれ示す。
「ＩＢ：αＦｌａｇ」は、免疫沈降物を回収した後、抗Ｆｌａｇ抗体で免疫ブロットを行い、免疫沈降物中のＷＮＫタンパク質を検出した結果であることを、「ＩＢ：αＴ７」は、免疫沈降物を回収した後、抗Ｔ７抗体で免疫ブロットを行い、免疫沈降物中のＳＰＡＫ又はＯＳＲ１を検出した結果であることを、それぞれ示す。
【００７１】
図３Ｂの左側の免疫ブロット写真では、ＷＮＫ１を発現させたレーン（左から３番目）及びＷＮＫ４を発現させたレーン（右から２番目）において、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）を行った後、抗Ｔ７抗体を用いて免疫ブロット（ＩＢ）を行った場合、ＳＰＡＫのバンドが検出された（上から４段目、左から３番目のバンド、及び、上から４段目、右から２番目のバンドを参照）。
即ち、この結果は、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降を行い、ＷＮＫタンパク質の相互作用複合体を回収すると、その免疫沈降物中にＳＰＡＫが存在することを示す。
【００７２】
同様に、ＷＮＫ１を発現させたレーン（左から３番目）及びＷＮＫ４を発現させたレーン（右から２番目）において、抗Ｔ７抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）を行った後、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫ブロット（ＩＢ）を行った場合、ＷＮＫタンパク質のバンドが検出された（上から５段目、左から３番目のバンド、及び、上から５段目、右から２番目のバンドを参照）。
即ち、この結果は、抗Ｔ７抗体を用いて免疫沈降を行い、ＳＰＡＫの相互作用複合体を回収すると、その免疫沈降物中にＷＮＫタンパク質が存在することを示す。
【００７３】
従って、以上の結果は、実施例１と同様、ＷＮＫ１とＳＰＡＫが相互に結合すること、即ち、両タンパク質が相互作用することを強く示唆する。
【００７４】
また、ＷＮＫタンパク質の変異タンパク質を発現させ（左から４番目から９番目のレーン、及び、一番右側のレーン）、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）を行った後、抗Ｔ７抗体を用いて免疫ブロット（ＩＢ）を行った場合、ＳＰＡＫのバンドが減弱した（上から４段目の免疫ブロット写真を参照）。
同様に、ＷＮＫタンパク質の変異タンパク質を発現させ（左から４番目から９番目のレーン、及び、一番右側のレーン）、抗Ｔ７抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）を行った後、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫ブロット（ＩＢ）を行った場合、ＷＮＫタンパク質のバンドが減弱した。
【００７５】
このことは、ＷＮＫ１のアミノ酸配列中、１２５８番目、１８６９番目、１９４６番目、１９５８番目のフェニルアラニンの部分、並びにＷＮＫ４のアミノ酸配列中、１０１７番目のフェニルアラニンの部分が、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの相互作用に関与していることを示唆する。
【００７６】
なお、この新知見（ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの相互作用部位に関する示唆）は、例えば、ＷＮＫデコイを作製する上で重要な知見である。即ち、この知見に基づいて、ＷＮＫデコイ（例えば、ＷＮＫタンパク質立体構造中の、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの結合部位又はその一部分と同様の立体構造を含むタンパク質又はポリペプチド）を作製した場合、その物質は、降圧剤として適用できる可能性が高い。
【００７７】
その他、図３Ｂの右側の免疫ブロット写真が示す通り、ＷＮＫタンパク質とＯＳＲ１を共発現させた場合も、ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫを共発現させた場合とほぼ同様の結果が得られた。
【実施例３】
【００７８】
実施例３では、ＷＮＫ１が実際にＳＰＡＫをリン酸化しているかどうかを調べた。
【００７９】
ＷＮＫ１にキナーゼ活性（ＳＰＡＫリン酸化作用）がある場合、ＷＮＫ１はＡＴＰのリン酸基をＳＰＡＫに移動させ、ＳＰＡＫをリン酸化すると予想される。
【００８０】
そこで、まず、ＷＮＫ１にＳＰＡＫとγ−３２Ｐ−ＡＴＰを加え、３０℃、３０分間、インキュベートした後、ＳＤＳを添加して酵素反応を止め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。そして、オートラジオグラフィー及びイメージ解析（ＢＡＳ２５００）により、γ−３２Ｐを検出し、放射性リン酸基がＳＰＡＫへ移動したかどうかを調べた。
【００８１】
結果を図４に示す。
【００８２】
図４は、実験結果を示すオートラジオグラフである。
図中、上側の写真（「３２Ｐ」と記載された写真）は、オートラジオグラフである。下側の写真（「ＣＢＢ」と記載された写真）は、同じものをＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）染色した写真である。
図中、「ＧＳＴ−ＷＮＫ１（１−６６６）」は、用いたＷＮＫ１を示す。「−」のレーンは、ＷＮＫ１を添加しなかった場合の結果を、「Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ」のレーンは、ＷＮＫ１を用いた場合の結果を、「ＷＮＫ１（Ｋ２３３Ｍ）」のレーンは、ＷＮＫ１のアミノ酸配列の２３３番目のリシン残基をメチオニンに置換した変異タンパク質を用いた場合の結果を、「ＷＮＫ１（Ｄ３６８Ａ）」のレーンは、ＷＮＫ１のアミノ酸配列の３６８番目のアスパラギン酸残基をアラニンに置換した変異タンパク質を用いた場合の結果を、「ＷＮＫ１（Ｓ３８２Ａ）」のレーンは、ＷＮＫ１のアミノ酸配列の３８２番目のセリン残基をアラニンに置換した変異タンパク質を用いた場合の結果を、それぞれ示す。なお、ＷＮＫ１のアミノ酸配列の２３３番目、３６８番目、３８２番目の残基は、それぞれ、キナーゼ活性部位として、既知の配列である。
「ＧＳＴ−ＷＮＫ１（１−６６５）」はＷＮＫ１のバンドの位置を、「ＧＳＴ−ＳＰＡＫ（ＫＭ）」はＳＰＡＫのバンドの位置を、それぞれ示す。なお、「ＧＳＴ−」はＧＳＴタグで標識した変異タンパク質であることを、「（ＫＭ）」はキナーゼ活性を失った変異タンパク質であることを、それぞれ示す。
【００８３】
図４では、「Ｗｉｌｄ  Ｔｙｐｅ」のレーンでは、ＳＰＡＫの位置に３２Ｐのバンドが検出された（オートラジオグラフ中、下側のバンド）。また、ＷＮＫ１の変異タンパク質を用いた場合、ＳＰＡＫの位置に３２Ｐのバンドは検出されなかった。
上述の通り、ＷＮＫ１にキナーゼ活性がある場合、ＷＮＫ１はＡＴＰのリン酸基をＳＰＡＫに移動させると推測される。また、上述の通り、ＷＮＫ１のアミノ酸配列のうち、本実験で変異させた部分は、キナーゼ活性部位であることが既知である。
従って、以上の結果は、ＷＮＫ１がＳＰＡＫをリン酸化することを示唆する。
【実施例４】
【００８４】
実施例４では、ＳＰＡＫの配列中の、ＷＮＫタンパク質によってリン酸化される部位について、検討した。
【００８５】
実験手順の概要は次の通りである。
まず、ＳＰＡＫ又はＯＳＲ１のアミノ酸配列の一部を置換した変異タンパク質を作製した。次に、実施例３と同様に、ＷＮＫタンパク質に、その変異ＳＰＡＫ又は変異ＯＳＲ１とγ−３２Ｐ−ＡＴＰを加え、インキュベートし、ＳＤＳを添加して酵素反応を止めた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。そして、オートラジオグラフィー及びイメージ解析（ＢＡＳ２５００）により、γ−３２Ｐを検出し、放射性リン酸基が変異ＳＰＡＫへ移動するかどうかを調べた。
【００８６】
結果を図５に示す。
【００８７】
図５Ａは、ＳＰＡＫのアミノ酸配列のうち、ＷＮＫ１によるリン酸化部位を模式的に示す図である。
「ｒＳＰＡＫ」はラットのＳＰＡＫのアミノ酸配列であることを、「ｍＯＳＲ１」はマウスのＯＳＲ１のアミノ酸配列であることを、「Ｆｒａｙ」はハエにおけるファミリータンパク質のアミノ酸配列であることを、それぞれ示す。
「ＷＮＫ１  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ」は、ＷＮＫ１によるリン酸化部位であることを示す（詳細は後述する）。
ＳＰＡＫのアミノ酸配列の３８０番目のセリン、及び、ＯＳＲ１のアミノ酸配列の３２５番目のセリンは、その近傍の配列も含め、高度に保存されている。
【００８８】
図５Ｂは、実施例４の実験結果を示すオートラジオグラフである。
図中、左側の二つの写真は「ＷＮＫ１」を用いた場合の写真、右側の二つの写真は「ＷＮＫ４」を用いた場合の写真、である。
また、上側の２つの写真（「３２Ｐ」と記載された写真）は、それぞれ、オートラジオグラフ、下側の２つの写真（「ＣＢＢ」と記載された写真）は、同じものをＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）染色した写真である。
「ｒＳＰＡＫ（ＫＭ）」は、キナーゼ活性を失活させたラットＳＰＡＫを用いたことを、「ｒＳＰＡＫ（ＫＭ／Ｓ３８０Ａ）」は、キナーゼ活性を失活させかつアミノ酸配列の３８０番目のセリン残基をアラニンに置換した変異タンパク質を用いたことを、それぞれ示す。また、「ｍＯＳＲ１（ＫＭ）」は、キナーゼ活性を失活させたマウスＯＳＲ１を用いたことを、「ｍＯＳＲ１（ＫＭ／Ｓ３２５Ａ）」は、キナーゼ活性を失活させかつアミノ酸配列の３２５番目のセリン残基をアラニンに置換した変異タンパク質を用いたことを、それぞれ示す。
【００８９】
図５Ｂでは、ＷＮＫタンパク質とｒＳＰＡＫ（ＫＭ）とを放射性リン酸基の存在下でインキュベートした場合、３２Ｐのバンドが検出されたのに対し（上側の２つの写真中、それぞれ、一番左側のレーンを参照）、ＷＮＫタンパク質とｒＳＰＡＫ（ＫＭ／Ｓ３８０Ａ）とを放射性リン酸基の存在下でインキュベートした場合、３２Ｐのバンドが検出されなかった（上側の２つの写真中、それぞれ、左から２番目のレーンを参照）。
また、ＷＮＫタンパク質とＯＳＲ１とを放射性リン酸基の存在下でインキュベートした場合も、同様の結果であった。
【００９０】
従って、以上の結果は、ＳＰＡＫのアミノ酸配列の３８０番目のセリン残基、及び、ＯＳＲ１のアミノ酸配列の３２５番目のセリン残基が、ＷＮＫタンパク質によるＳＰＡＫ又はＯＳＲ１のリン酸化に、深く関与することを示唆する。
【００９１】
なお、この新知見（リン酸化部位に関する示唆）は、ＳＰＡＫのリン酸化部位又はその近傍に特異的に結合する抗ＳＰＡＫ抗体又は抗ＳＰＡＫアプタマー、該部位又はその近傍に特異的に結合するその他の化合物、などを作製する上で重要な知見である。即ち、この新知見に基づいて、それらの物質の設計・作製を行った場合、それらの物質は、降圧剤として適用できる可能性が高い。
【実施例５】
【００９２】
実施例５では、ＳＰＡＫ及びＯＳＲ１が、イオンチャネルを活性化するかどうかについて、検討した。
【００９３】
イオンチャネルとして知られているＮＫＣＣ１、ＮＫＣＣ２、ＮＣＣなどは、アミノ酸配列中のスレオニン残基のリン酸化により、活性化することが知られている。そこで、本実験では、ＳＰＡＫ及びＯＳＲ１が、イオンチャネルをリン酸化するかどうかについて、調べた。
【００９４】
実験手順の概要は実施例３又は実施例４とほぼ同様である。即ち、ＳＰＡＫ又はＯＳＲ１に、イオンチャネル（ＮＫＣＣ１、ＮＫＣＣ２、ＮＣＣ）とγ−３２Ｐ−ＡＴＰを加え、インキュベートし、ＳＤＳを添加して酵素反応を止めた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、そして、オートラジオグラフィー及びイメージ解析（ＢＡＳ２５００）により、γ−３２Ｐを検出し、放射性リン酸基がイオンチャネルへ移動するかどうかを調べた。
【００９５】
結果を図６に示す。
【００９６】
図６Ａは、イオンチャネルのアミノ酸配列のうち、リン酸化されるスレオニン残基の位置を示す図である。それぞれ、「ＮＫＣＣ１（ｓｈａｒｋ）」には、サメのＮＫＣＣ１のアミノ酸配列が、「ＮＫＣＣ１（ｈｕｍａｎ）」には、ヒトのＮＫＣＣ１のアミノ酸配列が、「ＮＫＣＣ２（ｈｕｍａｎ）」には、ヒトのＮＫＣＣ２のアミノ酸配列が、「ＮＣＣ（ｈｕｍａｎ）」には、ヒトのＮＣＣのアミノ酸配列が、「ＮＣＣ（ｍｏｕｓｅ）」には、マウスのＮＣＣのアミノ酸配列の一部が、それぞれ記載されている。
図６Ａに示す通り、リン酸化されるスレオニン残基は、イオンチャネルの種類、動物種を超えて、高度に保存されている。
【００９７】
図６Ｂは、ＳＰＡＫ又はＯＳＲ１と、各イオンチャネルを用いた場合のオートラジオグラフである。
図中、左側の二つの写真は「ｒＳＰＡＫ（ラットＳＰＡＫ）」を用いた場合の写真、右側の二つの写真は「ｍＯＳＲ１（マウスＯＳＲ１）」を用いた場合の写真、である。
また、上側の２つの写真（「３２Ｐ」と記載された写真）は、それぞれ、オートラジオグラフ、下側の２つの写真（「ＣＢＢ」と記載された写真）は、同じものをＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）染色した写真である。
「ＧＳＴ−ＰＡＫ３（６５−１３５）」は、ＧＳＴタグで標識したＰＡＫ３（アミノ酸配列の６５番目から１３５番目までの断片）を用いたことを、「ＧＳＴ−ｈＮＫＣＣ２（１−１８１）」は、ＧＳＴタグで標識したヒトＮＫＣＣ２（アミノ酸配列の１番目から１８１番目までの断片）を用いたことを、「ＧＳＴ−ｈＮＫＣＣ１（１−２８９）」は、ＧＳＴタグで標識したヒトＮＫＣＣ１（アミノ酸配列の１番目から２８９番目までの断片）を用いたことを、「ＧＳＴ−ｍＮＣＣ（１−１３８）」は、ＧＳＴタグで標識したマウスＮＣＣ（アミノ酸配列の１番目から１３８番目までの断片）を用いたことを、それぞれ示す。なお、ＰＡＫ３は、ＳＰＡＫ及びＯＳＲ１の基質として公知のタンパク質であり、ポジティブコントロールである。
図中のアスタリスク（「＊」）は、基質のバンドの位置を表す。
【００９８】
図６Ｃは、ＮＣＣのスレオニン残基を置換した変異タンパク質を用いた場合のオートラジオグラフである。
図中、上側の写真（「３２Ｐ」と記載された写真）は、オートラジオグラフ、下側の写真（「ＣＢＢ」と記載された写真）は、同じものをＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）染色した写真である。
「ＧＳＴ−ｍＮＣＣ（１−１３８）」は、ＧＳＴタグで標識したマウスＮＣＣ（アミノ酸配列の１番目から１３８番目までの断片）を用いたことを示し、「Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ」は、そのＮＣＣをそのまま用いたことを、「Ｔ５３Ａ」はそのＮＣＣのアミノ酸配列中、５３番目のスレオニン残基をアラニンに置換した変異タンパク質を用いたことを、「Ｔ５８Ａ」は同じく５８番目のスレオニン残基をアラニンに置換した変異タンパク質を用いたことを、「Ｓ７１Ａ」は同じく７１番目のセリン残基をアラニンに置換した変異タンパク質を用いたことを、「Ｔ５３Ａ／Ｔ５８Ａ／Ｓ７１Ａ」は前記の全ての部位を置換した変異タンパク質を用いたことを、それぞれ示す。
【００９９】
図６Ｂでは、ＳＰＡＫ又はＯＳＲ１と各イオンチャネルとを放射性リン酸基の存在下でインキュベートした場合、３２Ｐのバンドが検出された（アスタリスクが付された部分を参照）。このことは、ＳＰＡＫ及びＯＳＲ１がイオンチャネルをリン酸化すること、即ち、両タンパク質がイオンチャネルを活性化することを強く示唆する。
【０１００】
図６Ｃでは、ＮＣＣのリン酸化部位のアミノ酸残基を置換することにより、３２Ｐのバンドがやや減弱した（上側の写真の左から２〜４番目のバンドを参照）。そして、ＮＣＣのリン酸化部位のアミノ酸残基を３箇所全て置換することにより、３２Ｐのバンドがより減弱した（上側の写真の一番右側のバンドを参照）。このことは、ＳＰＡＫ及びＯＳＲ１が、イオンチャネルのリン酸化部位に作用していることを示唆する。
【０１０１】
なお、この新知見（リン酸化部位に関する示唆）は、イオンチャネルのリン酸化部位に特異的に結合する抗イオンチャネル抗体又は抗イオンチャネルアプタマー、該部位又はその近傍に特異的に結合するその他の化合物、などを作製する上で重要な知見である。即ち、この新知見に基づいて、それらの物質を設計・作製した場合、それらの物質は、降圧剤として適用できる可能性が高い。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明に係るタンパク質及び物質は、降圧剤に適用可能である。また、本発明に係る相互作用は、生体内における重要なシグナル伝達経路を新規に見出したものであり、降圧剤のスクリーニングにも適用可能である。
【０１０３】
本発明に係るスクリーニング方法は、例えば、用いるタンパク質、試薬などをセットにすることにより、降圧剤スクリーニングキットとして、適用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】ＷＮＫタンパク質とＳＰＡＫとの相互作用を示す模式図。
【図２】実施例１の実験結果を示す免疫ブロット写真。
【図３Ａ】ＷＮＫ１及びＷＮＫ４のアミノ酸配列モチーフを模式的に記載した図。
【図３Ｂ】実施例２の実験結果を示す免疫ブロット写真。
【図４】実施例３の実験結果を示すオートラジオグラフ。
【図５Ａ】ＳＰＡＫのアミノ酸配列のうち、ＷＮＫ１によるリン酸化部位を模式的に示す図。
【図５Ｂ】実施例４の実験結果を示すオートラジオグラフ。
【図６Ａ】イオンチャネルのアミノ酸配列のうち、リン酸化されるスレオニン残基の位置を示す図。
【図６Ｂ】ＳＰＡＫ又はＯＳＲ１と、各イオンチャネルを用いた場合のオートラジオグラフ。
【図６Ｃ】ＮＣＣのスレオニン残基を置換した変異タンパク質を用いた場合のオートラジオグラフ。
【図１】
2007074951.tif 000003
【図２】
2007074951.tif 000004
【図３Ａ】
2007074951.tif 000005
【図３Ｂ】
2007074951.tif 000006
【図４】
2007074951.tif 000007
【図５Ａ】
2007074951.tif 000008
【図５Ｂ】
2007074951.tif 000009
【図６Ａ】
2007074951.tif 000010
【図６Ｂ】
2007074951.tif 000011
【図６Ｃ】
2007074951.tif 000012
【配列表】
2007074951000001.app