(57)【要約】【課題】虚血性疾患に対する新規な血管新生促進治療薬を提供する。【解決手段】１−ベンジル−４−［（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル］メチルピペリジン（ドネペジル）及び／又はその塩を含む虚血性疾患に対する血管新生促進治療薬。ドネペジルは血管内皮細胞、心筋細胞、骨格筋細胞に作用して、血管内皮増殖因子の発現を誘導し、血管新生を促進する。本発明による血管新生促進治療薬を用いた血管新生療法の場合、患部への直接的な投与以外に、経口投与、経血管投与が可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−ベンジル−４−［（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル］メチルピペリジン及び／又はその塩を含むことを特徴とする虚血性疾患に対する血管新生促進治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血性疾患に対する血管新生促進治療薬に関する。
【０００２】
本発明に係る具体的な適応症としては、脳梗塞、狭心症、心筋梗塞、慢性閉塞性動脈硬化症が例示される。
【０００３】
本発明による血管新生促進治療薬を用いた血管新生療法の場合、患部への直接的な投与以外に、経口投与、経血管投与等が可能である。
【背景技術】
【０００４】
虚血性疾患は、動脈硬化を基本的な病態として、慢性的に進行し、動脈の支配領域に虚血を招き、最終的には細胞死や壊死をもたらす。このような病態が進行し、臨床的に問題となる動脈として、脳、心臓、四肢が知られている。
【０００５】
脳の場合は、脳梗塞、心臓の場合には、狭心症や心筋梗塞、四肢の場合には、慢性閉塞性動脈硬化症が主たる疾患名となる。
【０００６】
これらの疾患に対して、現在、血管新生療法が試行されている。骨髄幹細胞、末梢血幹細胞、肝細胞増殖因子を患部に直接注入する方法が用いられている。骨髄幹細胞、末梢血幹細胞、肝細胞増殖因子は、血管新生を促進する効果を有していると考えられている。
【０００７】
なお、１−ベンジル−４−［（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル］メチルピペリジンは、アルツハイマー型老年痴呆等の各種老人性痴呆症治療・予防剤として公知である（下記特許文献１）。
【特許文献１】特許第２５７８４７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
骨髄幹細胞や末梢血幹細胞を用いた血管新生療法の場合、幹細胞を骨髄や末梢血管から採取するために、特別の手技や器具・施設、時間を要するとともに、患者に侵襲を加える必要がある。
【０００９】
骨髄幹細胞や末梢血幹細胞を用いた血管新生療法の場合、採取した骨髄液や末梢血から幹細胞を分離抽出する作業のために特別の手技や器具・施設、時間を要する。
【００１０】
骨髄幹細胞、末梢血幹細胞、肝細胞増殖因子を用いた血管新生療法の場合、患部に直接的にこれらを注入するための特別の手技や器具・施設、時間を要する。
【００１１】
本発明の目的は、虚血性疾患に対する新規な血管新生促進治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、従来、各種老人性痴呆症治療・予防剤として公知のドネペジル（ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ：１−ベンジル−４−［（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル］メチルピペリジン）が血管新生を著しく促進することを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
即ち、本発明の虚血性疾患に対する血管新生促進治療薬は、１−ベンジル−４−［（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル］メチルピペリジン及び／又はその塩を含むことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１４】
１−ベンジル−４−［（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル］メチルピペリジン：ドネペジルは、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤であり、
(1)  血漿中濃度消失半減期が長いこと、
(2)  末梢性の副作用が少ないこと、
(3)  生体利用率が高く脳移行性も良いこと、
の３項目を満たし、軽度及び中等度のアルツハイマー型痴呆における痴呆症状の進行を抑制する効能を有する化合物として探索研究された結果、見出されたものである。
【００１５】
ドネペジルの血管新生促進治療薬としての作用機序については必ずしも明らかではないが、ドネペジルが血管内皮細胞、心筋細胞、骨格筋細胞に作用して、血管内皮増殖因子の発現を誘導し、血管新生を促進する等が考えられる。
【００１６】
即ち、ドネペジルは、アセチルコリンエステラーゼのインヒビターとして作用し、間接的に脳内アセチルコリン濃度を上昇させることで、痴呆症状を緩和している。
【００１７】
本発明に係るドネペジルは、インヒビターがアセチルコリン濃度を上昇させることで内皮細胞の膜表面のアセチルコリン・レセプターを活性化することにより血管新生を促進するものと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００１９】
本発明の虚血性疾患に対する血管新生促進治療薬は、下記構造式（Ｉ）で表される１−ベンジル−４−〔（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル〕メチルピペリジン及び／又はその薬理学的に許容できる塩を有効成分とするものである。
【００２０】
【化１】
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【００２１】
本発明において、薬理学的に許容できる塩とは、例えば塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、燐酸塩などの無機酸塩、蟻酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。
【００２２】
また、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩などの有機アミン塩、アンモニウム塩などを形成する場合もある。
【００２３】
ドネペジルには、幾何異性体、光学異性体、ジアステレオマーなどが存在しうるが、何れも本発明の範囲に含まれる。
【００２４】
ドネペジルの製造方法は上記特許文献１に記載されているところである。
【００２５】
本発明の血管新生促進治療薬は、錠剤、丸剤、散剤、粉剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、カプセル剤等として患者に経口投与できる。また、注射剤として静脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、動脈内、脊髄腔内等に投与できる。さらに、座薬として直腸内に投与しても良いし、ペレットによる埋め込みも可能である。噴霧剤、吸入剤等として投与することもできるし、軟膏、クリーム、粉状もしくは液状塗布剤、貼付剤等の外用剤として経皮的に投与しても良い。
【００２６】
上述したうち、好ましい製剤形態や投与形態等は、患者の年齢、性別、体質、症状、処置時期等に応じて、医師によって適宜選択される。
【実施例】
【００２７】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
［実施例１：ラット冠状動脈結紮による慢性心筋虚血モデルにおける心臓での血管新生促進効果の確認］
〈方法〉
生後８週齢のラットの左冠状動脈を結紮して慢性心筋虚血モデルとした。術後２週経過したところで、ラットを無作為にドネペジル投与群とドネペジル非投与群との２群に分け、ドネペジル投与群の飲み水にはドネペジルを溶かし、一日の経口用量が体重１ｋｇ当たり、４．８ｍｇになるようにした。
【００２８】
６週間の投与の後に、血管新生に関連すると考えられているvon  Willebrand  Factor（vWF）およびnicotinic  acetylcholine  receptor  a7  subunit（a7-nAChR）分子に着目し、心筋組織に対して免疫組織化学法を適用した。摘出した心臓より１ｍｍ厚のスライス標本を作製し、直ちに4%  paraformaldehydeに浸漬、標本のマクロ撮影を行った。４℃で１２時間固定後、パラフィンに包埋し４μｍ厚の連続切片を作製、間接蛍光抗体法に供した。脱パラフィン後、０．０１Ｍクエン酸緩衝液中で９０℃以上・１０分間処理し、１０％ヤギ正常血清で１時間ブロッキングを行った。抗vWF抗体（ウサギポリクローナル）および抗a7-nAChR抗体（マウスモノクローナル）で４℃・１２時間処理した後、それぞれの２次抗体であるAlexa546標識ヤギ抗ウサギIgGおよびAlexa488標識ヤギ抗マウスIgGで室温・４時間インキュベーションし、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。
【００２９】
図１にドネペジルを投与した慢性心筋虚血モデルの心臓標本を示す。図１中、Ａ図、Ｂ図はマクロ撮影の結果であり、虚血領域に血管の著しい新生を認める。Ｃ図、Ｄ図及びＥ図はそれぞれ同視野の透過像、vWF免疫組織像、a7nAChR免疫組織像であり、血球成分が存在する管腔構造物が血管であることを示す。
【００３０】
〈結果〉
ドネペジル非投与群の左心室の慢性心筋虚血領域には、血管構造は確認されなかった。一方、ドネペジル投与群では、図１のように、左心室の慢性心筋虚血領域に新生血管網が観察された。同一標本を免疫組織化学的手法により観察したところ、血管構造に沿ってvWFおよびa7-nAChRの陽性シグナルが認められ、同一視野の透過像より管腔側に血球成分が詰まっているのが確認された。
【００３１】
〈結論〉
以上より、ドネペジルが血管新生効果を有することがわかった。
【００３２】
［実施例２：マウス大腿動脈結紮による下肢慢性虚血モデルにおける下肢での血管新生促進効果の確認］
〈方法〉
生後８週齢のマウスの左大腿動脈を鼠径部と膝関節部の両方で結紮して下肢慢性虚血モデルとした。右大腿動脈は結紮せず比較対照にした。術後、マウスを無作為にドネペジル投与群とドネペジル非投与群との２群に分け、ドネペジル投与群の飲み水にはドネペジルを溶かし、一日の経口用量が体重１ｋｇ当たり、４．８ｍｇになるようにした。４週間の投与の後に血管新生の程度について評価した。
【００３３】
図２のＡにドネペジル投与群とドネペジル非投与群との慢性下肢虚血モデルの下肢肉眼所見、図２のＢに同ＨＥ染色による組織所見、図２のＣに同ＶＥＧＦ免疫組織像を示す。
【００３４】
〈結果〉
図２に示すように、ドネペジル非投与群では大腿動脈の結紮を行った虚血肢の大腿四頭筋をはじめとする骨格筋の著しい萎縮がみられた。
【００３５】
一方、ドネペジル投与群では、血肢の大腿四頭筋をはじめとする骨格筋の萎縮が認められず、組織像では、新生血管が多く認められた。ＶＥＧＦ免疫組織像では、ドネペジル投与群では非投与群と比べて虚血、非虚血側いずれにおいてもＶＥＧＦ蛋白が多く染色された。
【００３６】
〈結論〉
以上より、ドネペジルが血管新生効果を有することがわかった。
【００３７】
［実施例３：ヒト臍帯静脈内皮細胞による血管新生効果の確認］
〈方法〉
マトリゲル（登録商標）（BD  Biosciences社製）とDulbecco  Modified  Eagle's  Mediumを容積比１：１で混合し、ゲル状にした培地で、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を培養し、管腔構造形成およびＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ産生に与えるドネペジルの効果について評価した。
【００３８】
図３のＡ，Ｂに、ドネペジル被処理及びドネペジル処理における培養開始後４時間後の結果をそれぞれ示す。
【００３９】
〈結果〉
図３より、ドネペジル処理（０．１〜１マイクロモル濃度）により、管腔構造の著しい成長が認められた。またドネペジル処理により、ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦ産生が促進されていた。
【００４０】
〈結論〉
以上より、ドネペジルが血管新生効果を有することがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、実施例１におけるドネペジルを投与した慢性心筋虚血モデルの心臓標本を示し、Ａ図はそのマクロ撮影写真、Ｂ図はＡ図の部分拡大図である。Ｃ図は透過像、Ｄ図はvWF免疫組織像、Ｅ図はa7nAChR免疫組織像をそれぞれ示す写真である。
【図２】図２のＡ図、Ｂ図、Ｃ図は、それぞれ、ドネペジルを投与した部分と投与しない場合の下肢肉眼所見、ＨＥ染色による組織所見、ＶＥＧＦ免疫組織像を示す写真である。
【図３】図３は、実施例３におけるドネペジル処理とドネペジル非処理のＨＵＶＥＣ管腔を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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