(57)【要約】【課題】砒素等を含む有害化合物を効率的に無害化する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の有害化合物の無害化方法は、幼生の動物性プランクトンを含む食物連鎖系を用いて砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも１種の元素を含有する有害化合物を無害な物質とすることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
幼生の動物性プランクトンを含む食物連鎖系を用いて砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも１種の元素を含有する有害化合物を無害な物質とする有害化合物の無害化方法。
【請求項２】
前記元素が砒素であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記食物連鎖系が、微細藻類−幼生の動物性プランクトンの食物連鎖系であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記有害化合物を前記微細藻類及び幼生の動物性プランクトンの生体内酵素によってメチル化することにより無害な物質とする請求項１〜３項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記微細藻類が海洋性微細藻類であることを特徴とする請求項１〜４項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記海洋性微細藻類がナノクロロプシス属に属する微細藻類であることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記動物性プランクトンがアルテミアであることを特徴とする請求項１〜６項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記メチル化によって、前記有害化合物をモノメチル化化合物、ジメチル化化合物、及び／又はトリメチル化化合物とする請求項４記載の方法。
【請求項９】
前記ジメチル化化合物が、アルセノシュガー、ジメチルアルシン酸、ジメチルアルシノイルアセテート（DMAA）、ジメチルアルシノイルエタノール（DMAE）、ジメチルアルシノイルプロピオネート（DMAP）からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記トリメチル化化合物がアルセノコリン、アルセノベタイン、及びトリメチルアルシンオキシドからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記トリメチル化化合物がアルセノベタインからなることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１２】
自然界に存在する海洋生物が含有する濃度以下に無機砒素を低減し、かつ無害な有機砒素に変換することを特徴とする請求項１〜１１項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有害化合物を無害化する方法に関し、特に、砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも一種を含有する有害化合物を無害化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
砒素、アンチモン、セレン等の重金属は、半導体等の工業材料として広く用いられている物質であるが、生物に有毒な物質であることから、環境中に流出することにより生物に与えられる影響が懸念されている。
【０００３】
従来、これらの重金属を除去する方法として、有毒な亜砒酸等の無機砒素を含む廃水にポリ塩化アルミニウム（PAC）等の凝集剤を添加し、該凝集剤と原水中の鉄分に砒素を凝集、吸着し、沈殿させた後、濾過により除去する方法や、活性アルミナ、セリウム系吸着剤により砒素化合物等を吸着させる方法等が一般に知られている。
【０００４】
一方、自然界において、環境中に含まれる無機砒素を取り込み、蓄積する藻類がいくつか存在する。これまでに、無機砒素を取り込み、蓄積する藻類として、クロレラ（Chlorella）等のいくつかの種の微細藻類が知られており、当該藻類の体内において砒素の大半が無機砒素として蓄積されているが、残りはメチル化された形態で蓄積されていることが知られている（非特許文献１及び２）。そして、一般に、メチル化された有機砒素化合物は哺乳動物に対して無機砒素よりも低い毒性を示すことが知られている。
これらの知見に鑑み、当該藻類を用いて砒素を回収する具体的な方法として、砒素耐性に関与するＰＴＢ１遺伝子を破壊することで藻類の砒素耐性を高め、環境中、排水中の砒素を回収し、無毒化する方法が提案されている（特許文献１）。
【０００５】
【非特許文献１】Maeda et al. 1990, Appl. Organomet. Chem., 4, 251-254
【非特許文献２】Gossler et al., 1997, Appl. Organomet. Chem., 11, 57-66
【特許文献１】特開２００３−２６５１８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記吸着剤による方法は、処理量が不足しており、マテリアルバランスから見れば処理として不十分であり、さらに、保管の安全対策も十分なものとはなっていない。
【０００７】
また、上記微細藻類を用いて砒素を回収する方法では、藻類の体内に取り込まれた砒素の大半が毒性の高い無機砒素のままであるという問題がある。
そこで、本発明は、上記問題点を解決すべく、砒素等を含む有害化合物を効率的に無害化する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明者らは、各種動物性プランクトンを含む食物連鎖系を用いて砒素等を含む有害化合物を無害な物質とすることを試み、動物性プランクトンが有する当該有害化合物の無害化能力について鋭意検討した結果、本発明を見出した。
【０００９】
すなわち、本発明の有害化合物の無害化方法は、幼生の動物性プランクトンを含む食物連鎖系を用いて砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも１種の元素を含有する有害化合物を無害な物質とすることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の無害化方法の好ましい実施態様において、前記元素が砒素であることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明の無害化方法の好ましい実施態様において、前記食物連鎖系が、微細藻類−幼生の動物性プランクトンの食物連鎖系であることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の無害化方法の好ましい実施態様において、前記有害化合物を前記微細藻類及び幼生の動物性プランクトンの生体内酵素によってメチル化することにより無害な物質とすることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の無害化方法の好ましい実施態様において、前記微細藻類が海洋性微細藻類であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明の無害化方法の好ましい実施態様において、前記海洋性微細藻類がナノクロロプシス属に属する微細藻類であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明の無害化方法の好ましい実施態様において、前記動物性プランクトンがアルテミアであることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明の無害化方法の好ましい実施態様において、前記メチル化によって、前記有害化合物をモノメチル化化合物、ジメチル化化合物、及び／又はトリメチル化化合物とすることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の無害化方法の好ましい実施態様において、前記ジメチル化化合物が、アルセノシュガー、ジメチルアルシン酸、ジメチルアルシノイルアセテート（DMAA）、ジメチルアルシノイルエタノール（DMAE）、ジメチルアルシノイルプロピオネート（DMAP）からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明の無害化方法の好ましい実施態様において、前記トリメチル化化合物がアルセノコリン、アルセノベタイン、及びトリメチルアルシンオキシドからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明の無害化方法の好ましい実施態様において、前記トリメチル化化合物がアルセノベタインからなることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明の無害化方法の好ましい実施態様において、自然界に存在する海洋生物が含有する濃度以下に無機砒素を低減し、かつ無害な有機砒素に変換することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の無害化方法によれば、砒素等を含む有害化合物を効率的に無害化する方法を提供し得るという有利な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に、本発明の詳細について説明する。本発明は、幼生の動物性プランクトンを含む食物連鎖系を用いて砒素、アンチモン、セレンからなる群から選択される少なくとも１種の元素を含有する有害化合物を無害な物質とすることを特徴とする。ここで、本明細書において、有害化合物とは、環境中に流出し、生物に暴露された際に、何らかの悪影響を生物に与える恐れがある化合物を意味する。
【００２３】
前記有害化合物のうち砒素を含有する有害化合物としては、亜ヒ酸、五酸化砒素、三塩化砒素、五塩化砒素、硫化砒素化合物、シアノ砒素化合物、クロロ砒素化合物、及びその他の砒素無機塩類等が挙げられる。これらの砒素は、例えばLD50(mg/kg)（マウスにおける50％致死量）が20以下であり、この値は一般に生物に対して有毒な値である。
【００２４】
また、アンチモンを含有する有害化合物としては、三酸化アンチモン、五酸化アンチモン、三塩化アンチモン、五塩化アンチモン等が挙げられる。
【００２５】
さらに、セレンを含有する有害化合物としては、二酸化セレン、三酸化セレン等が挙げられる。
【００２６】
本発明において、上記有害化合物の無害化は、幼生の動物性プランクトンを含む食物連鎖系を用いて行う。「幼生の動物性プランクトンを含む食物連鎖系を用いて」というのは、広く、生物中の各種酵素などを利用して有害化合物を無害な物質へと変換することを意味する。
【００２７】
本発明において、幼生の動物性プランクトンを含む食物連鎖系としては、動物プランクトンの餌として培養が容易であるという観点から、例えば、微細藻類−幼生の動物性プランクトンを挙げることができる。「微細藻類−幼生の動物性プランクトンの食物連鎖系」とは、砒素等を含む有害化合物を微細藻類に取り込ませ、有害化合物を取り込んだその微細藻類を幼生の動物性プランクトンに摂取せしめるという食物連鎖系を意味するものである。
【００２８】
前記微細藻類−幼生の動物性プランクトンの食物連鎖系を用いた上記有害化合物の無害化は、具体的には、上記有害化合物を微細藻類及び幼生の動物性プランクトンの生体内酵素によってメチル化することにより無害な物質とすることによって行うことができる。
ここで、例として砒素を含有する有害化合物と当該有害化合物をメチル化した化合物の毒性に関して述べると、無機砒素である亜ヒ酸のマウス急性毒性値LD50は4.5mg/kg、ヒ酸のLD50は14〜18mg/kgである。これに対し、モノメチル化された砒素（モノメチルアルソン酸）のLD50は1800mg/kg、ジメチル化された砒素（ジメチルアルシン酸）では1200mg/kgである。そして、トリメチル化された砒素においては、アルセノコリンのLD50が6000mg/kg、トリメチルアルシンオキシドのLD50が10600mg/kg、アルセノベタインのLD50が10000mg/kgである。したがって、これらLD50の値から、有害化合物の毒性がメチル化によって低下することが分かる。本発明は、これらの作用を有用な微細藻類及び幼生の動物性プランクトン、とりわけ生体内酵素によって達成可能であることを本発明者らが見出したものである。
【００２９】
上記微細藻類には、淡水性微細藻類及び海洋性微細藻類があり特に限定されるものではないが、本発明においては、上記有害化合物をメチル化する能力がより高い海洋性微細藻類が好ましい。しかしながら、淡水性微細藻類も、適宜培養条件を変えることによってメチル化する能力を高めることができるので本発明に使用することが充分可能である。
【００３０】
上記海洋性微細藻類としては、ナノクロロプシス属に属する微細藻類が挙げられる。このナノクロロプシス属に属する微細藻類は、上記有害化合物をメチル化する能力、特にジメチル化する能力が高い。ナノクロロプシス属に属する微細藻類としては、例えば、Nannochloropsis oculate、Nannochloropsis salina、Nannochloropsis gaditana、Nannochloropsis granulata等が挙げられる。これらのナノクロロプシス属に属する微細藻類は、栽培漁業などで稚魚の飼料として使用され、大量培養技術が確立されていることから、上記有害化合物を工業的に無害化するのに適している。
【００３１】
上記淡水性微細藻類としては、クロレラ属に属する微細藻類が挙げられる。クロレラ属に属する微細藻類としては、例えば、Chlorella regularis、Chlorella vulgaris、Chlorella ellipsoidea、Chlorella fusca var fusca、Chlorella fusca var vacuolata、Chlorella kessleri、Chlorella protothecoides var mannophila、Chlorella protothecoides、Chlorella pyrenoidosa、Chlorella saccharophila、Chlorella sorokiniana、Chlorella zofingiensis等が挙げられる。これらのクロレラ属に属する微細藻類も大量培養技術が確立されており、有害化合物を工業的に無害化することに適している。
【００３２】
上記動物性プランクトンとしては、例えばアルテミアが挙げられる。上記動物性プランクトンの幼生は、上記微細藻類の藻体内でメチル化された有害化合物をさらにメチル化してより無害な物質とすることができ、孵化直後より飼料を短期間給餌することで容易に調整できる。一方、成体は数週間から１ヶ月程度給餌する必要があり、調整に時間がかかる上、孵化した個体を成体にすることは非常に困難であり、その歩留まりも悪い。ここで、本発明においては、幼生の動物性プランクトンは、死ぬ個体の増加、歩留まりの低下及び死んだ個体の飼料への混入を防ぐという観点から、孵化後７日以内の動物性プランクトンであることが好ましく、孵化後１〜４日の動物性プランクトンであることがより好ましい。なお、よりメチル化する能力が高く、孵化させるのみで簡単に利用できるという観点から、上記動物性プランクトンとしてはアルテミアが好ましい。さらに、アルテミアは栽培漁業などで稚魚の試料として使用されており、その大量培養技術が確立されている。そのため、アルテミアは工業的に有害化合物を無害化することに適している。
【００３３】
なお、本発明の無害化方法においては、有害化合物の毒性を低下させるという観点から、上記微細藻類でのメチル化によって、前記有害化合物をモノメチル化化合物及び／又はジメチル化化合物とすることが好ましい。なお、LD50の値を高めより一層無害な化合物とするという観点と、より無害なトリメチル化化合物としやすいという観点から、上記微細藻類において、前記有害な化合物をジメチル化化合物とすることがより好ましい。
また、本発明の無害化方法においては、有害化合物の毒性をさらに低下させるという観点から、幼生の上記動物性プランクトンでのメチル化によって、前記微細藻類でのメチル化によりモノメチル化及び／又はジメチル化された有害化合物をジメチル化化合物及び／又はトリメチル化化合物とすることが好ましい。なお、LD50の値をさらに高めより一層無害な化合物とするという観点から、幼生の上記動物性プランクトンにおいて、前記モノメチル化及び／又はジメチル化された有害化合物をトリメチル化化合物とすることがより好ましい。
【００３４】
砒素を含有する有害化合物から無害化されたモノメチル化化合物としては、モノメチルアルソン酸、モノメチルアルシン酸等が挙げられる。また、砒素を含有する有害化合物のジメチル化化合物としては、アルセノシュガー、ジメチルアルシン酸、ジメチルアルシノイルアセテート（DMAA）、ジメチルアルシノイルエタノール（DMAE）、ジメチルアルシノイルプロピオネート（DMAP）等が挙げられる。
【００３５】
また、砒素を含有する有害化合物のトリメチル化化合物としては、アルセノコリン、アルセノベタイン、及びトリメチルアルシンオキシド等が挙げられる。これらの中でも、化学的に安定であり、自然界においても分解されにくく、毒性が極めて低いという観点から、前記トリメチル化した化合物がアルセノベタインからなることが好ましく、トリメチル化した化合物のうち60％以上がアルセノベタインからなることがより好ましく、さらに90％以上がアルセノベタインからなることがより好ましい。
【００３６】
アンチモンを含有する有害化合物から無害化されたモノメチル化化合物としては、モノメチルアンチモン等が挙げられる。また、アンチモンを含有する有害化合物のジメチル化化合物としては、ジメチルアンチモン等が挙げられる。また、アンチモンを含有する有害化合物のトリメチル化化合物としては、トリメチルアンチモン、トリメチルアンチモニ２水酸化物、トリメチルアンチモニ２塩化物等が挙げられる。
【００３７】
セレンを含有する有害化合物から無害化されたモノメチル化化合物としては、モノメチルセレノール、モノメチルセレン含有有糖化合物等が挙げられる。また、セレンを含有する有害化合物のジメチル化化合物としては、ジメチルセレン、ジメチルセレニド等が挙げられる。また、セレンを含有する有害化合物のトリメチル化化合物としては、トリメチルセレノニウム等が挙げられる。
【００３８】
上記微細藻類−幼生の動物性プランクトンを用いた上記有害化合物の無害化は、例えば、以下のようにして行うことができる。すなわち、まず、上記有害化合物が含まれる培養液で上記微細藻類を培養して有害化合物を微細藻類の体内に取り込ませ、取り込ませた有害化合物を、当該微細藻類の生体内酵素によってメチル化し、無害な物質であるモノメチル化化合物及び／又はジメチル化化合物とすることができる。次に、モノメチル化化合物及び／又はジメチル化化合物を含有する微細藻類を幼生の動物性プランクトンに摂取させ、モノメチル化化合物及び／又はジメチル化化合物を当該幼生の動物性プランクトンの生体内酵素によってメチル化し、より無害な物質であるジメチル化化合物及び／又はトリメチル化化合物とすることができる。
【００３９】
微細藻類の培養方法については、特に限定されることはなく、常法を用いることができる。
【００４０】
幼生の動物性プランクトンは、動物性プランクトンの卵を孵化することによって得ることができ、その孵化方法及び培養方法は、特に限定されることなく、常法を用いることができる。
【００４１】
また、好ましい態様において、自然界に存在する海洋生物が含有する濃度以下に無機砒素を低減し、かつ無害な有機砒素に変換する。ここで、「自然界に存在する海洋生物が含有する濃度以下」とは、砒素などによる汚染が無い環境下において、海洋生物が天然に含有する無機砒素の濃度以下であることを意味するものである。すなわち本発明の方法によれば、幼生の動物性プランクトンを含む食物連鎖系を用いて、無機砒素の濃度を天然の海洋生物の濃度以下に低減し、同時に上述した無害な有機砒素へと変換することが可能である。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。
【００４３】
実施例１
本実施例では、微細藻類ナノクロロプシスに砒素を含有する化合物として亜ヒ酸を取り込ませ、当該亜ヒ酸を無害化することを試みた。以下にその手順及び結果を説明する。
【００４４】
（１）微細藻類培養
対数増殖期まで前培養した微細藻類ナノクロロプシス（Nannochloropsis oculata）をダイゴ人工海水SP（和光純薬）とダイゴIMK培地（和光純薬）からなる１Lの培地に１×１０６cells/mlとなるように植菌し、蛍光灯照射下、温度25度でバブリングを行い培養した。
【００４５】
（２）砒素取込試験
培養開始48時間後に金属砒素として１ｐｐｍとなるように亜ヒ酸ナトリウムを添加し、蛍光灯照射下、温度25度でバブリングを行い、砒素添加後１２０時間培養することで、砒素の取込試験を実施した。
【００４６】
（３）砒素含有量測定
遠心分離により藻体を経時的にサンプリングし、藻体内の無機砒素および有機砒素を形態別砒素分析システム（島津製作所製  原子吸光分光光度計AA-6800、前処理装置ASA-2sp）により定量した。
【００４７】
図１に藻体内に取込まれた無機砒素、有機砒素濃度と藻体濃度の経時変化を示す。ここでiAsは無機砒素、MMAはモノメチル化砒素化合物、DMAはジメチル化砒素化合物を示す。
【００４８】
この図から、ナノクロロプシスの藻体内に添加した砒素が取込まれたことが分かる（砒素無添加の場合の藻体内の総砒素濃度は０．０２μｇ／ｇ  ｗｅｔ  ｃｅｌｌｓ）。培養時間と共に砒素の取込量が多くなる傾向となった。藻体内に取込まれた無機砒素は大部分がジメチル化された形で存在した。
【００４９】
図２に藻体内に取り込まれた無機砒素、モノメチル化砒素化合物、ジメチル化砒素化合物の比率を示す。
培養の何れの時間においても取り込まれた砒素の80％以上がジメチル化砒素化合物として存在し、無機砒素の残留が非常に少ないという結果となった。
【００５０】
実施例２
次に、動物性プランクトンとしてアルテミアを用い、実施例１のジメチル化砒素化合物を含有するナノクロロプシスを摂取させ、より無害なトリメチル化砒素化合物をすることを試みた。以下にその手順及び結果を説明する。
【００５１】
（１）アルテミアの孵化
ダイゴ人工海水SP（和光純薬）１Lにアルテミア（テトラ社製テトラブラインシュリンプエッグ）１ｇを添加し、温度２５℃でバブリングし、４８時間孵化を行った。孵化したアルテミアの幼生（ノーブリウス期）３ｇをナイロンメッシュ（１００μｍ）で分離し、人工海水で洗浄した。
このうち約１．５ｇのアルテミア幼生を砒素無添加の対照の試料とした。
【００５２】
（２）アルテミア成体の調整
上記と同様に孵化させたアルテミアに２ヶ月間、砒素化合物を含まないナノクロロプシスを摂取させて、体長１ｃｍ程度の成体に成長させた。このアルテミアの成体０．７ｇをナイロンメッシュ（１００μｍ）で分離し、人工海水で洗浄した。
【００５３】
（３）砒素取込試験
上記の孵化直後のアルテミア幼生約１．５ｇおよび上記アルテミア成体約０．７ｇを人工海水２００ｍｌに入れ、２５℃でエアレーションして飼育した。実施例１で作製したジメチル化砒素化合物含有ナノクロロプシス湿重量で１００ｍｇを２４時間おきに3回添加し、前記アルテミア幼生と前記アルテミア成体に摂取させ、4日間砒素取込試験を実施した。
【００５４】
（４）砒素分析試料の調整
上記砒素取込試験を実施したアルテミア幼生およびアルテミア成体をナイロンメッシュで分離し、１．５５ｇのアルテミア幼生と０．７５５ｇのアルテミア成体を得た。分離した各アルテミアはナイロンメッシュ上で蒸留水で洗浄した。
【００５５】
分離洗浄後の各アルテミアを２０ｍｌの５０％メタノール溶液で３回抽出し、抽出液をエバポレーターで減圧乾固し、生成した固形抽出物を純水１ｍｌに溶解し、分析試料を調整した。また孵化直後に分離した１．５ｇのアルテミア幼生を、砒素を添加していないコントロールとし、同様の抽出処理を行い分析試料を調整した。
【００５６】
（５）砒素の形態別分析
砒素の形態別分析はアジレント社製HPLC（Agilent1100 System）に砒素の検出器としてICP-MS（Agilent7500ce System）を用いて分析を行った。アルテミアの抽出試料を陽イオン交換カラムShodex Rspak NN-414(4.6mm I.D.×150mm)を用いてHPLC-ICP-MSにて砒素化合物の分析を行った結果を表１に示す。
【００５７】
【表１】
2007190532.tif 000002
【００５８】
アルテミアの幼生は砒素無添加の条件でもジメチル化砒素化合物（アルセノシュガー）とアルセノベタインをバックグラウンドとして含有することが確認された。砒素取込試験を行った結果、アルテミア幼生ではジメチル化砒素化合物およびアルセノベタインの濃度が増加した。ジメチル化砒素化合物の増加はジメチル化砒素化合物を含有するナノクロロプシスを摂取したことに起因し、アルセノベタインの増加はアルテミア幼生体内での砒素のジメチル体からトリメチル体のアルセノベタインへの生合成の結果であり、アルセノベタインが砒素無添加の条件で培養したアルテミア幼生のものより約１．６倍増加した。これに対し、アルテミアの成体はジメチル化砒素化合物およびアルセノベタインの濃度が低く、アルセノベタイン生合成の能力は低いと推定された。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、ナノクロロプシスの藻体内に取込まれた無機砒素、有機砒素濃度と藻体濃度の経時変化を示すグラフである。
【図２】図２は、ナノクロロプシスの藻体内に取り込まれた無機砒素、モノメチル化砒素化合物、ジメチル化砒素化合物の比率を示すグラフである。
【図１】
2007190532.tif 000003
【図２】
2007190532.tif 000004