(57)【要約】【課題】温度の影響を受けず、かつ検出対象のみを測定する機構により、複数の温度域での測定が可能で、洗浄等の工程を省略できる、より簡便で高精度に分子間相互作用を測定する方法および装置を提供すること。【解決手段】検出目的分子と親和性を有する検定用分子が固定された複数の金属含有構造体と、この金属含有構造体が固定された基体とを有する検出素子を用意し、複数の温度域において、この検出素子と検体を接触させて反応せしめたのち、光を照射して検出する方法。さらに局在プラズモン共鳴を検出する素子を設置して用いる装置であって、反応容器と光源と受光機構と温度調整機構と光を信号に変換する変換機構と演算および検定する機構とを有する装置。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の目的分子と、該目的分子と親和性を有する検定用分子との分子間相互作用強度を検定する方法であって、
（工程１）任意の基体と、該基体の表面に互いに離隔した状態で固定された複数の金属含有構造体とを有し、前記金属含有構造体に前記検定用分子が固定された検出素子を用意する工程、
（工程２）所定の温度域において、前記検体を含む溶液と前記検出素子とを接触させ、前記目的分子と前記検定用分子とを反応せしめる工程、
（工程３）前記反応の後、前記検出素子へ光を照射して得られる前記検出素子からの透過光、反射光または散乱光から選択される一つ以上の光を検出する工程、
（工程４）前記検出により得られる光を信号に変換する工程、
（工程５）複数の温度域において工程２乃至工程４を行い、それぞれの温度域において得られた前記信号から分子間の相互作用の強度を演算、検定する工程、
を有することを特徴とする、分子間相互作用強度検定方法。
【請求項２】
検体中の目的分子と、該目的分子と親和性を有する検定用分子との分子間相互作用強度を検定する装置であって、
前記検定用分子を固定した検出素子を設置するための設置部位を有し、前記検体を含む溶液と前記検出素子とを接触させ、前記目的分子と前記検定用分子とを反応せしめる反応場を提供する反応容器と、
前記反応容器に設置された前記検出素子へ照射する光を供給する光源と、
前記光源から前記検出素子への光の照射により得られる前記検出素子からの透過光、反射光または散乱光から選択される一つ以上の光を受け取る受光機構と、
前記反応場の温度を調整する温度調整機構と、
複数の温度域において受光機構に得られる光を信号に変換する変換機構と、
複数の温度域において取得された信号から分子間の相互作用の強度を演算、検定する機構と、を有し、
前記検出素子として、任意の基体と、該基体の表面に互いに離隔した状態で固定された複数の金属含有構造体とを有し、前記検定用分子が前記金属含有構造体に固定されている
検出素子を用いることを特徴とする、分子間相互作用強度検定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の分子と、当該分子と相互作用を示す他の分子との間の分子間相互作用の強度を検定する方法、及び分子間相互作用の強度を検定する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患とは、免疫機構が正常に働かず、自己の細胞や組織に対して液性あるいは細胞性免疫応答が起こり、自己組織に対して反応する抗体（自己抗体）が出現する疾患である。自己免疫疾患のある領域の代表例である全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）では、次のような自己抗体が出現する。すなわち、細胞の核成分、特にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に対する抗体（抗ＤＮＡ抗体）、および、細胞膜成分、特にカルジオリピン（ＣＬ）に対する抗体（抗ＣＬ抗体）などの自己抗体が体液中に出現する。これらの出現する自己抗体は病態と関連があることが知られている。
【０００３】
また、自己免疫疾患として重要な慢性関節リウマチでは、リウマトイド因子やマトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＭＭＰ−３）、抗フィラグリン抗体（抗核周囲因子、抗ケラチン抗体）、抗ＣＣＰ抗体といった自己抗体関連体がある。その他自己免疫水疱症である天疱瘡等では、抗表皮細胞間抗体（抗デスモグレイン３  ＩｇＧ抗体）や抗表皮細胞間抗体（抗デスモグレイン１  ＩｇＧ抗体）、抗表皮基底膜部抗体（抗ＢＰ１８０  ＩｇＧ抗体）がその原因抗体であると考えられている。
【０００４】
これらの自己免疫疾患は、関連する自己抗体の量もさることながら、その抗原に対する相互作用の強度（抗体価、或いは抗体力価と称される）と疾患の重篤度に相関が見出され、従って、分子間相互作用を正確に評価することが求められている。
【０００５】
このような分子間相互作用を測定する方法として従来より、酵素標識免疫吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：以下ＥＬＩＳＡ法とも記載する）、或いはオクタローニ法（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法）が用いられてきた。ＥＬＩＳＡ法は次の手順で行う。まず、ＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに抗原を吸着させた後、抗体価を測定したい抗体を含む検体（抗血清等）を１０００倍から２倍段階希釈をおこなって、プレートに加え抗原抗体反応を行なわせる。更に第二抗体として、免疫動物の抗体に対するパーオキシダーゼ酵素標識した異種動物の抗体を反応させた後、発色させて信号を得る。最大発色吸光度の１／２の発色吸光度を示すときの希釈倍率を抗体の抗体価とする方法で、検体中の抗体の抗体価（力価）は各方法の判定基準による希釈倍率で表現され、希釈倍率が高いほど抗体の力価があることになる。またオクタローニ法は、寒天ゲル内に抗原および抗体が拡散して、免疫沈降反応を呈し白い沈降線が生じる現象を利用し、免疫沈降反応を呈した時の抗体の希釈倍率を抗体価とする方法である。
【０００６】
これらの方法は、従来法として多くの医療・研究期間で実施されてきている手法ではあるが、前者のＥＬＩＳＡ法では、検体の希釈系列毎の測定が必要なため煩雑さは免れず、後者のオクタローニ法は再現性の確保が十分にできないという問題点があった。
【０００７】
このような問題点を解決するために以下のような手法が考案されて来ている。
【０００８】
特開平１１−３１１６２５号公報には、被検血清中の抗体価を測定する方法が開示されている。この方法では参照抗体と参照抗原との混合物に抗体を固定化した微粒子を混合することにより参照する凝集像を得る。この凝集像と、被検血清と上記参照抗原との混合物に上記抗体を固定化した微粒子を混合することにより得られる凝集像を比較し、被検血清の抗体価を評価することを特徴とする方法である。
【０００９】
また、特許０３３７０７８６号公報には、次の工程を有する自己抗体の測定方法が開示されている。まず、イオン強度が異なる少なくとも３種以上の緩衝液中で体液と陰性荷電物質とを反応させて、該少なくとも３種以上の緩衝液中における自己抗体の該陰性荷電物質に対する結合量を測定する工程を行う。次に、該結合量の最低値と、該最低値を示すイオン強度より低イオン強度側での結合量の最高値との差をとることにより、該陰性荷電物質と結合する自己抗体の量を求める工程を行う。
【００１０】
上記のような相互作用強度測定方法においては、微粒子等の材料を新たに用いるために操作が煩雑になると共にその定量性が確保されない場合が生じる。或いは相互作用の強度に寄与する作用がイオン性結合や水素結合といったイオン強度に影響を受ける場合にのみ有効であるという課題があった。
【００１１】
この様な問題を解決するために特開２００４−２０２６７号公報には、全反射光を利用した測定装置において、環境因子を変化させた種々の環境における試料の状態の変化等を高速に測定可能とする方法が開示されている。即ち、誘電体ブロックの一面に形成された金属薄膜を用いた表面プラズモン共鳴法（以下ＳＰＲ法と記載する場合もある）、或いは誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層を用いた導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する方法を用いて、別に設けた試料保持部内の環境因子（ｐＨ、光度、温度、イオン濃度、ガス分圧、バイオ物質濃度、電気的信号）を変化させ、変化に応じた分子間相互作用の状態に基づく信号を取得、処理し、分子間相互作用の強度を検定する方法である。
【特許文献１】特開平１１−３１１６２５号公報
【特許文献２】特許０３３７０７８６号公報
【特許文献３】特開２００４−２０２６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記の特開２００４−２０２６７号公報においては、分子間相互作用を測定する方法がＳＰＲ法或いは全反射減衰状態検出法であるため、特に温度の変化に対し分子間相互作用状態の変化量以上の信号強度変化を生じる場合がある。そのため、対照を必要とする等の点で、簡便な測定には不向きであるといった問題点が挙げられる。
【００１３】
更に、いずれの手法もエバネッセント波に基づく検出方法であるため、エバネッセント波の存在する領域、即ち分子同士の結合が生じる表面から数百ｎｍの領域での屈折率変化を信号として検出する事となる。そのため、相互作用強度が減少し、結合が解離して近傍に浮遊した状態の分子も信号として検出してしまうため、事実上洗浄の操作が必要となり、一層の煩雑さが問題となる。
【００１４】
本発明は、上記課題点に鑑みなされたもので、より簡便に分子間相互作用の強度を検定可能な方法及び本法を実施するための装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第一は、検体中の目的分子と、該目的分子と親和性を有する検定用分子との分子間相互作用強度を検定する方法であって、
（工程１）任意の基体と、該基体の表面に互いに離隔した状態で固定された複数の金属含有構造体とを有し、前記金属含有構造体に前記検定用分子が固定された検出素子を用意する工程、
（工程２）所定の温度域において、前記検体を含む溶液と前記検出素子とを接触させ、前記目的分子と前記検定用分子とを反応せしめる工程、
（工程３）前記反応の後、前記検出素子へ光を照射して得られる前記検出素子からの透過光、反射光または散乱光から選択される一つ以上の光を検出する工程、
（工程４）前記検出により得られる光を信号に変換する工程、
（工程５）複数の温度域において工程２乃至工程４を行い、それぞれの温度域において得られた前記信号から分子間の相互作用の強度を演算、検定する工程、
を有することを特徴とする、分子間相互作用強度検定方法である。
【００１６】
本発明の第二は、検体中の目的分子と、該目的分子と親和性を有する検定用分子との分子間相互作用強度を検定する装置であって、
前記検定用分子を固定した検出素子を設置するための設置部位を有し、前記検体を含む溶液と前記検出素子とを接触させ、前記目的分子と前記検定用分子とを反応せしめる反応場を提供する反応容器と、
前記反応容器に設置された前記検出素子へ照射する光を供給する光源と、
前記光源から前記検出素子への光の照射により得られる前記検出素子からの透過光、反射光または散乱光から選択される一つ以上の光を受け取る受光機構と、
前記反応場の温度を調整する温度調整機構と、
複数の温度域において受光機構に得られる光を信号に変換する変換機構と、
複数の温度域において取得された信号から分子間の相互作用の強度を演算、検定する機構と、を有し、
前記検出素子として、任意の基体と、該基体の表面に互いに離隔した状態で固定された複数の金属含有構造体とを有し、前記検定用分子が前記金属含有構造体に固定されている
検出素子を用いることを特徴とする、分子間相互作用強度検定装置である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の検定方法及び検定装置を用いることによって、自己免疫疾患や感染症において非常に重要な指標である、抗体の抗原に対する抗体価（力価）等の生体分子間の相互作用強度を簡便かつ正確に検定可能である。
【００１８】
本発明においては複数の温度域において前記分子間の相互作用により生じる結合体を検出する工程が特徴である。本特徴により以下の効果が得られる。
（１）操作が簡便となる：従来の方法が特別な材料や反応液を必要としていたのに比べ、本発明の分子間相互作用強度検定装置は、次の構成を有する非常に簡便な系での検定が可能である。即ち、局在表面プラズモン共鳴法（詳細は後述する）を用いた検出装置に、複数の温度域に対応する温度調整機構および複数の温度域において取得された信号から分子間の相互作用の強度を検定する機構を加えた構成である。局在表面プラズモン共鳴法は、今後免疫検査装置やＤＮＡ検査装置としての可能性が高まっている。特に本発明の検出方法は、特開２００４−２０２６７号公報に開示の方法と比較し、反応温度の変化による信号への影響が少ない。そのため、温度変化に対する信号の補正や対照反応槽、或いは対照反応容器を必ずしも必要としない簡便な生体分子間相互作用強度の検定が可能となる。更に本発明の検出方法は、特開２００４−２０２６７号公報に開示の方法と比較し、当該分子間の相互作用（結合）が生じている極近傍の状態のみを信号として捉える。そのため、特別な洗浄工程、洗浄機構を必ずしも必要としない簡便な生体分子間相互作用強度の検定が可能となる。
（２）正確な分子間相互作用強度が検定できる：従来の方法では対照と比較した場合の懸濁度合いや凝集度合いを検定する方法や、反応溶液の異なる環境下での結合強度の測定が用いられてきた。それに対し、複数の温度域において前記分子間の相互作用により生じる結合体を検出する工程を含むものである。そのため、対照が必ずしも必要ではなく（対照を置くことももちろん可能である）、かつ、生体分子間の相互作用の本質的な要因である温度条件毎の相互作用を測定するため、より正確な分子間相互作用強度の検定が可能となる。
【００１９】
相互作用の指標である結合定数Ｋａとギブスの自由エネルギーΔＧとの関係は気体定数Ｒと絶対温度Ｔを用いて（１）式で与えられ、これはアフィニティ（結合自由エネルギー）とよばれる。
【００２０】
【数１】
2007298342.tif 000002
【００２１】
即ち、相互作用の指標である結合定数Ｋａは絶対温度Ｔの影響を受ける事となる。特に本発明の検定方法における検出工程に用いる検出方法は、特開２００４−２０２６７号公報に開示の方法と比較し、非特許文献Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．４（４），５２７？５３７（２００４）に記載の通り、反応温度の変化による信号への影響が少ない。そのため、温度変化に対する信号の補正や対照反応槽、或いは対照反応容器を必要としない分だけ工程、機構が少なくなり、その分の誤差が少なくなるため、より正確な分子間相互作用強度の検定が可能となる。更に本発明の検定方法における検出工程に用いる検出方法は、特開２００４−２０２６７号公報に開示の方法と比較し、当該分子間の相互作用（結合）が生じている極近傍の状態のみを信号として捉えることが可能である。そのため、特別な洗浄工程あるいは洗浄機構を必要としない分だけ工程あるいは機構が少なくなり、その分の誤差が少なくなるため、より正確な分子間相互作用強度の検定が可能となる。このことは、非特許文献Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，１０８（１），１０９−１１６（２００４）、及びＪ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，１０８（２２），６９６１−６９６８（２００４）に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明に係る分子間相互作用強度の検定方法は、検体中の目的分子と、該目的分子と親和性を有する検定用分子との分子間相互作用強度を検定する方法であって、
（工程１）任意の基体と、該基体の表面に互いに離隔した状態で固定された複数の金属含有構造体とを有し、前記金属含有構造体に前記検定用分子が固定された検出素子を用意する工程、
（工程２）複数の温度域において、前記検体を含む溶液と前記検出素子とを接触させ、前記目的分子と前記検定用分子とを反応せしめる工程、
（工程３）前記反応の後、前記複数の温度域のそれぞれにおいて前記検出素子へ光を照射して得られる前記検出素子からの透過光、反射光または散乱光から選択される一つ以上の光を検出する工程、
（工程４）前記複数の温度域において前記検出した光を信号に変換する工程、
（工程５）前記複数の温度域において得られた前記信号から分子間の相互作用の強度を演算、検定する工程、
を有することを特徴とする、分子間相互作用強度検定方法である。
【００２３】
ここで、工程３での検出するタイミングは、目的分子と検定用分子の相互作用反応が十分に進行して平衡状態になった後であってもよいし、相互作用反応の進行途中であってもよい。また、所定の時間を設定して検出してもよい。
【００２４】
本発明に係る分子間相互作用強度を検定する装置は、検体中の目的分子と、該目的分子と親和性を有する検定用分子との分子間相互作用強度を検定する装置であって、
前記検定用分子が固定された検出素子を設置するための設置部を有し、前記検体を含む溶液と前記検出素子とを接触させ、前記目的分子と前記検定用分子とを反応せしめる反応場を提供する反応容器と、
前記反応容器に設置された前記検出素子へ照射する光を供給する光源と、
前記光源から前記検出素子への光の照射により得られる前記検出素子からの透過光、反射光または散乱光から選択される一つ以上の光を受け取る受光機構と、
前記反応場の温度を調整する温度調整機構と、
複数の温度域において受光機構に得られる光を信号に変換する変換機構と、
複数の温度域において取得された信号から分子間の相互作用の強度を演算、検定する機構と、を有し、
前記検出素子として、任意の基体と、該基体の表面に互いに離隔した状態で固定された複数の金属含有構造体とを有し、前記検定用分子が前記金属含有構造体に固定されている
検出素子を用いることを特徴とする、分子間相互作用強度検定装置である。
【００２５】
ここで反応容器の設置部は、光源からの光が検出素子に達し、更に検出素子を経由して受光機構に入射することができるように検出素子を保持することができればよく、例えば、光路にあたる箇所に中空部を設けたり、光を透過する材質を用いることができる。
【００２６】
本発明に係る検定方法の一例の概略を、図１を用いて説明する。図１では、抗原１に対し親和性を有する抗体３、４、及び５（抗原１に対する相互作用強度：３＞４＞５）を含む検体の全体の相互作用強度を検定する方法を示す。まず反応容器２の側面および／或いは底面に抗原１を固定し、抗体３、４、及び５を含む検体を導入して温度Ａでの抗体と抗原との結合を検出する。次に、不図示の温度調整機構により温度を上昇させ、温度Ｂにおいて同様の操作、検出を行う。次いで、同様に不図示の温度調整機構により温度を上昇させ、温度Ｃにおいて同様の操作、検出を行う。これら３種類の温度での結合より得られる信号を解析することにより、抗原１に対する検体の相互作用強度（力価）が検定される。
【００２７】
本発明に係る検定方法の他の一例の概略を、図２を用いて説明する。図２では、抗原６に対し親和性を有する抗体８、９、及び１０（抗原１に対する相互作用強度：８＞９＞１０）を含む検体の全体の相互作用強度を検定する方法を示す。まず、側面および／或いは底面に抗原６を固定した反応容器７を３つ用意し、それぞれの容器に抗体８、９、及び１０の３種類を含む検体を導入する。次に、各反応容器に対し個別に対応した不図示の温度調整機構により各反応容器の温度をそれぞれ温度Ｄ，Ｅ，Ｆとし、抗体と抗原との結合を検出する。これら３種類の温度での結合より得られる信号を解析することにより、抗原１に対する抗体の相互作用強度（力価）が検定される。
【００２８】
生体内には、抗体３，４，５、或いは抗体８，９，１０のような、力価（抗原１に対する相互作用強度）が異なる複数の抗体が同時に存在しており、これら全体の相互作用強度を検定する手法は、疾病の重篤度を検討する手法として好適に利用できる。ここで、全体の相互作用強度は、例えば全体のみかけの結合強度として測定可能であり、その場合には解離定数（単位：Ｍ（モル/Ｌ））が既知の抗体より検量線を用いて、解離定数を求めることができる。
【００２９】
次に本発明の方法、装置につき各詳細に説明する。
＜分子間相互作用の種類＞
本発明の検定方法及び検定装置が利用可能な分子間相互作用は、当該分子間相互作用が熱力学的性質に起因しているものであれば如何なる分子間相互作用についても利用可能である。そのような分子間相互作用として好ましくは、生体分子間の相互作用、あるいは生体分子が関与する分子間相互作用が利用可能である。特に、上述のように、既知の抗原に対する検体中の抗体の相互作用強度、即ち抗体価、或いは力価を検定する際に特に有用である。抗原−抗体の相互作用以外に、ＤＮＡのハイブリダイゼーションや抗核抗体のような遺伝子と抗体との相互作用、ウイルスの感染のような糖鎖とタンパク質との相互作用、糖鎖同士の相互作用に関しても利用可能である。更に、アレルギー検査等の場合には、抗原としてアレルゲンを固定し、検体中のＩｇＥの力価を検定することも可能であるし、ＰＣＢやダイオキシン等の環境汚染物質と抗体との相互作用を検定することも可能である。この場合、環境汚染物質はアシストタンパクをアジュバントとして用いても良い。
【００３０】
尚、本発明で用いる抗原は、天然物由来のものであれば、精製されたものでも良いし、細胞等の他の生体部成分の断片を含んでいても良い。また、近年開発が進んで来ている所謂リコンビナント抗原も用いることができる。
＜温度調整機構及び信号取得機構＞
本発明の検定装置により分子間相互作用強度検定を実施するためには、温度調整機構が重要である。本発明に係る温度調整機構としては、通常の臨床検査装置、生化学反応装置、免疫測定装置等、生体分子間の反応、あるいは生体分子が関与する反応を測定する装置に設置されているものと同等の温度調整機構を有していればよい。たとえばペルチエ素子とサーミスタの組み合わせが一般的であるが、この組み合わせに限定されるものではない。
【００３１】
また、本発明の方法の特徴としては、複数の温度領域毎に分子間結合に由来する信号を取得、処理することである。例えば前述の図１のような、ひとつの反応容器で逐次温度を変化させてそれぞれの温度領域に達した度に分子間結合に由来する信号を取得、処理する機構が必要である。目的の温度に調整する機構と信号を取得、処理する機構が連動していることが望ましい。本発明においては、分子間相互作用に由来する信号を取得、処理する機構の構成として例えば、分子間相互作用の反応場に照射するための光を供給する光源と、この光源から照射され、反応場を通して得られる光を受光する受光機構と、この受光機構により受光した光を信号に変換する変換機構とを有する構成が利用できる。
【００３２】
一方、前述の図２のような、反応容器毎に異なる温度領域を設定し、それぞれの容器における、分子間結合に由来する信号を取得、処理する場合には、複数の信号を同時に取得、処理する機構であってもよい。或いは、各温度域の信号を順次スキャンしながら取得・処理する機構であってもよい。またこれ以外の効率的に信号を取得・処理する機構があれば問題なく用いることができる。本発明の本質は、複数の温度領域毎の分子間結合に由来する信号をそれぞれ取得、処理し、それらより総合的に分子間の相互作用の強度を検定する方法及び装置である。
【００３３】
更に、本発明の検定方法においても、複数の温度領域において得られた、分子間の結合に由来する信号を処理することにより、全体としての分子間相互作用の強度を算出し、検定を行う工程、及び／或いは機構を含む、いかなる手法、或いは装置等も本発明に含まれる。
＜検出素子及び検出方法＞
本発明の検定方法及び検定装置における分子間相互作用の状態を検出する工程に用いる検出方法は、局在表面プラズモン共鳴、或いは局在プラズモン共鳴と称される検出方法である。局在表面プラズモン共鳴（Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）はＬＳＰＲと、局在プラズモン共鳴（Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）はＬＰＲと略して以下記載することもある。この検出方法では、任意の基体と、この基体の表面に互いに離隔した状態で固定された複数の金属含有構造体とを有する検出素子を用いる。
【００３４】
本発明の検出方法に用いる検出素子の典型例を図３に示す。
【００３５】
まず図３（ａ）に示す検出素子は、任意の基体３０２ａ表面に、複数の金属含有構造体の一例として複数の金属含有微粒子３０１ａが互いに離隔した状態で固定されているものである。
【００３６】
金属含有微粒子３０１ａの形状は球形、ロッド型、針状、中空粒子、異なる金属からなる層状構造、誘電体を含む層状構造、チューブ型、もしくはそれらの形状に更に凹凸または突起を有する形状等を含む、本発明の効果を達成し得る形状であれば制限無く用いることが出来る。
【００３７】
更に基体３０２ａの形状は、図３（ａ）中の３０２ａで示す平面状基体以外にも、本発明の効果を達成し得る形状であれば制限無く用いることが出来る。そのような形状として、多孔質構造体、オパール構造体、逆オパール構造体、微粒子集合構造体、柱状構造体、中空カラム状構造体、凸状構造体、凹状構造体、突起状構造体または繊維状構造体からなる群から選ばれる何れか１以上の形状を含んでいても良い。
【００３８】
これら基体の形状の例を図４に示す。
・多孔質構造体：任意の形状の穴がランダムに多数あいている構造体（図４（ａ））。
・オパール構造体：球状のものが最密に堆積した構造体（図４（ｂ））。
・逆オパール構造体：オパール構造体の空間部分の方に物質が詰まっている構造体（図４（ｃ））。
・微粒子集合構造体：球状のものが最密ではないように堆積した構造体（不図示）。
・柱状構造体：任意の形状をした柱が多数並んでいる構造体（図４（ｄ））。
・凸状構造体：基板から複数の凸状の突起物が存在している構造体であり、その凸状の突起物の形状は任意である（図４（ｅ）、ここでは突起物は凸レンズのような形状をしている）。
・凹状構造体：基板に複数の凹状の穴が存在している構造体であり、その凹状の穴の形状は任意である（図４（ｆ）ここでは穴は凹レンズのような形状をしている）。
・突起状構造体：針状の突起物が多数存在し、絡まっている構造体（図４（ｇ））。
・繊維状構造体：ひも状のものが多数、複雑に絡まっている構造体（図４（ｈ））。
・中空カラム状構造体：任意の形状をした筒が多数並んでいる構造体（図４（ｉ））。
【００３９】
図３（ａ）に示す検出素子における、基体への金属含有微粒子の固定方法は、基体の表面に前記金属含有微粒子に含まれる金属と特異的に結合を形成するための官能基を導入し、前記金属含有微粒子懸濁液を加えて反応させることにより行う。具体的な一例を挙げれば、基体がガラスで、金属含有微粒子が金微粒子である場合、ガラス表面をアミノプロピルトリメトキシシランのような末端がアミノ基のシラン化剤で処理した後、金微粒子の懸濁溶液を添加して、固定を行う。この様な手法で固定した場合、一部に微粒子同士の凝集が見られる場合があるが、本発明の検出素子として問題なく用いることができる範囲で適用可能である。金属含有構造体の大きさについては後に詳細に説明する。
【００４０】
次に図３（ｂ）に示す検出素子について説明する。
【００４１】
本検出素子は、任意の基体３０２ｂ表面に、複数の金属含有構造体の一例として複数の扁状金属含有構造体３０１ｂが互いに離隔した状態で固定されているものである。
【００４２】
扁状金属含有構造体３０１ｂの上面形状は、図３（ｂ）に示す円のほか、楕円、多角形、長方形のほか、リング構造、井桁構造、クロス構造等の、ループ部及び分岐部の少なくとも１つを有するような構造を有することが可能である。ほかにも、本発明の効果を達成し得る形状であれば制限無く用いることが出来る。また、厚み方向としては、１０−１００ｎｍ程度が望ましく、同一金属で構成されていてもよいし、異なる金属、或いは誘電体膜との多層構造になっていてもよい。
【００４３】
図３（ｂ）に示す検出素子の作製方法の例を図５から図７を用いて以下に説明する。
【００４４】
図５に示すように、まず、基体５０１（図５（Ａ））上に金属薄膜５０２をスパッタ法あるいは蒸着法により成膜する（図５（Ｂ））。その上に電子線レジスト５０３をスピンコートにより成膜し（図５（Ｃ））、電子線描画装置で露光し、現像後レジストパターンを得る（図５（Ｄ））。その後、不要な金属薄膜をエッチングし（図５（Ｅ））、レジストを除去して、アレイ状に配置した金属構造体５０４を形成する（図５（Ｆ））。電子線描画装置の他、集束イオンビーム加工装置、Ｘ線露光装置、紫外線露光装置、エキシマ露光装置によるパターニングで作製することもできる。
【００４５】
また、図６に示すように、モールド法により作製した微細な凹凸の基体６０１（図６（Ａ））を用いた作製方法も可能である。この場合、基体６０１上に金属薄膜６０２をスパッタ法あるいは蒸着法により成膜する（図６（Ｂ））。次に表面の金属膜を研磨し、所望の金属構造体を基体上に形成する（図６（Ｃ））。同様に図７は、金属薄膜７０２が基体７０１の凹凸よりも薄い場合の作製方法を示すものである。この場合、基体７０１の凸部が金属薄膜７０２表面より上部にあってもよいし、凹凸部の壁面に金属薄膜７０２が成膜されていてもよい。ここで、研磨する代わりに金属膜をドライエッチングによるエッチバックを利用して除去することも可能である。
【００４６】
このような、本発明の検出方法に用いるための、図３（ｂ）に示すような素子の作製方法は上記方法に制限されるものではなく、本発明の検定方法の効果を達成するための素子作製方法であれば如何なる作製方法も用いることができる。そのような方法として、例えば、非特許文献Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，１４（４），３５５−３６７（２００４）等に記載の「ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ  ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ」と称される方法がある。或いは、非特許文献Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，１０７（２４）,５７６８−５７７２（２００３）等に記載の「Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ」と称される方法がある。
【００４７】
本発明の検出手法で用いる金属含有構造体に含有される金属元素は、ＬＳＰＲ現象が生じうる金属元素であれば如何なる金属元素でも良いが、その中でも金や銀、銅、白金、アルミニウムなどが好ましい。またこれら金属の存在状態は、金属同士、或いは金属と誘電体との混合物、アロイ、合金、層状構造等、本発明の方法を達成する事が可能な存在状態であればいかなる存在状態でも用いる事ができる。
【００４８】
本発明の検出手法で用いる金属含有構造体の大きさは、外周部における任意の一点から他の点までの距離が、１０ｎｍ以上１４５０ｎｍ以下の範囲内にあることが好ましい。更には、５０ｎｍ以上４５０ｎｍ以下の範囲内にあることが好ましい。この場合、任意の２点間の最大距離がこの範囲に入っていればよい。
【００４９】
本発明の検出手法で用いる金属含有構造体同士は離隔した状態で基体に固定されていることが好ましく、金属含有微粒子間の最外辺同士の距離が５０ｎｍ以上２０００ｎｍ以下で離隔されていることがさらに好ましい。
【００５０】
本発明の検出手法で用いる基体を構成する材料は、シリコン、ガラス、金属酸化物、プラスチック等、本発明の効果を達成し得る形状であれば制限無く用いることが出来るが、透過光測定の場合は測定に使用する領域の光に対して透明であることが望ましい。
【００５１】
本発明の検定方法及び検定装置における、検体中の目的分子と特異的に相互作用を示す分子（検体中の抗体価検定の場合は抗原；以下検定用分子と記載する場合もある）は、前記金属含有構造体の表面に固定した形態で用いる。図８に金属含有構造体として金属矩形構造体を用いた場合の模式図を示す。検定用分子８０２の固定された金属含有構造体８０１の表面に検体中の目的分子８０３が近づくと、検定用分子８０２と目的分子８０３とが特異的に結合し、複合体８０４を形成し、基体表面における誘電率（屈折率）を変化させる。その結果、局在表面プラズモン共鳴に起因する吸収スペクトルのシフト及び強度変化が起こり、それを信号として捉える事により特異的に形成された複合体の量が算出される。この場合、図８（Ａ）では検定用分子８０２の固定された金属含有構造体８０１と目的分子８０３とが離れた状態を示し、図８（Ｂ）では目的分子８０３が検定用分子８０２と特異的に結合し、複合体を形成している模式図を示している。図８（Ｃ）には、図８（Ａ）の状態と図８（Ｂ）の状態での局在表面プラズモン共鳴に起因する吸収スペクトルの模式図を示している。図８（Ａ）の状態でのスペクトル８０５に対し、複合体を形成し屈折率が増大した際図８（Ｂ）の状態のスペクトル８０６は波長が長波長側にシフトし、吸光度そのものも増大する。本発明の検定方法においては、これらの検出操作を複数の温度域で行うことにより、温度上昇による解離に基づくスペクトルの短波長シフト、及び／或いは吸光度の減少を信号として捉え処理する。それによって、検体中の目的分子と検出素子上の検定用分子の相互作用、即ち、検定用分子に対する検体中の目的分子の力価を検定する事が可能となる。
【００５２】
これらの検定用分子は、物理的あるいは化学的な方法により、金属含有構造体の表面に固定化される。例えば、末端にサクシンイミド、カルボジイミド等の活性基を有するアルカンチオールを、チオールと金属（主に金）との相互作用により金属含有構造体に固定した後、前記サクシンイミド、カルボジイミド等の活性基により検定分子を共有結合により固定する。
【００５３】
また、金属含有構造体の表面は、いわゆる非特異吸着による共雑物の吸着によるシグナルを防止するために、スキムミルクやカゼイン、ウシ血清アルブミン、リン脂質、ポリエチレングリコール及びそれらの誘導体などによるコーティングを行うと、なお好適である。
＜検定装置及び検定方法＞
上記検出用素子を用いた本発明の検定装置の一例（透過光による測定）につき図９を用いて説明する。光源９０１から入射された光はコリメートレンズ９０２を通して、検出素子９０８が設置され、分子間相互作用のための反応を行う反応容器９０３に入射される。
反応容器９０３に設置された検出素子９０８を通して得られる光はコリメートレンズ９０４を通して分光測定器９０５に出射される。分光測定器が受光した光は、変換機構によりスペクトル信号に変換される。検出素子９０８近傍で生じた分子間相互作用に基づく結合反応前後のスペクトル信号は中央演算機構９０７に送られ、予め取得された検量線に基づきその強度が算定される。一方反応容器９０３は中央演算機構９０７より制御される温度調整機構９０６により温度制御され、反応容器９０３中の反応溶液の温度が制御される。
【００５４】
本検定装置は、必要に応じて目的分子を金属含有構造体上に固定していない素子を用いて同時に反応、信号取得を行う参照用の機構（別の反応容器、及び／或いは別の信号取得系）を設けることも可能である。また、検体溶液を自動的に搬送、導入するための機構（分注器、或いはマイクロ流路構成）を設けることも可能である。場合によっては反応溶液を洗浄する機構を設ける事も可能である。
【００５５】
この様な検定装置を用いて検体中の目的分子と検出素子上に固定された検定用分子との相互作用を検定する方法の一例を、図９及びフローチャート図１０を用いて説明する。
【００５６】
まず、金属含有構造体表面に検定用分子を固定した素子９０８を反応容器９０３に挿入し、検体を加えた後、温度調整機構９０６により反応容器中の検体溶液を一定の温度に調整する。この場合、一般的な生体分子間相互作用反応を行う温度が好ましい。抗原抗体反応であれば２０℃以上３７℃以下、ＤＮＡハイブリダイゼーションでは５０℃以上７０℃以下が好ましいが、予め用いる反応系の最適温度を検討し、その温度に調整することが望ましい。温度が一定になり、生体分子間相互作用反応が十分に進行した段階でのスペクトル信号を取得する。次に、温度調整機構９０６により異なる温度に調整し（通常は昇温）、その温度での生体分子間相互作用反応が十分に進行した段階でのスペクトル信号を取得する。必要に応じて本操作を繰り返す。この様にして得られたスペクトル信号は中央演算機構９０７に伝送され、予め取得しておいた検量線により、本目的分子の、検定用分子に対する相互作用強度を検定する。
【００５７】
上記検定方法を自動化する場合には、中央演算機構により温度調整とスペクトル信号取得操作を連動させ、目的温度調整後、一定時間後に自動的に信号を取得するような機構を設ける事も可能である。
【００５８】
上記のような検定方法が基本的であるが、ＬＳＰＲの利点、即ち温度に対する信号の変化量が少ない事、金属含有構造体の極近傍で生じる屈折率変化のみを検出すること、を生かしたより効率的な相互作用検定を行う事も可能である。即ちある温度（相互作用反応における至適温度である事が望ましい）での相互作用反応を十分に生じせしめ、温度を徐々に変化させて、スペクトルシフトを連続的に取得する方法である。この場合も、中央演算機構により温度調整とスペクトル信号取得操作を同期させる機構を設ける。
【００５９】
次に、本発明に係る検定装置の、他の一例につき図１１を用いて説明する。
【００６０】
光源９０１、コリメートレンズ９０２及び９０４、分光測定器９０５は図９と同様の形態で用いる。本装置では、反応容器１１０３がａからｃまで複数設けられ、それぞれ多チャンネル温度調整機構１１０６により異なる温度に制御されている。反応容器１１０３ａ−ｃは、可変ステージ１１０８上に配置され、逐次光源―分光検出器の光学系を用いたスペクトル信号取得の光路に配置される。前記可変ステージ１１０８によりそれぞれの反応容器では各１回乃至複数回スペクトル信号が取得される。これら複数の反応容器中での素子上で生じる分子間相互作用に基づく結合反応のスペクトル信号は中央演算機構９０７に送られ、予め取得された検量線に基づきその強度が算定される。この様な、複数の反応容器での分子間相互作用を測定する場合には、光を光源から光ファイバーにより分岐し、それぞれの反応容器に個別に入射することも可能である。
【００６１】
図９，１１においては、スペクトル信号を透過光で取得する構成を例示したが、本発明の検定方法及び検定装置においては、図１２（Ａ）に示すような反射光取得光学系、図１２（Ｂ）に示すような散乱光取得光学系を用いる事もできる。更には、これらの図１２（Ａ）では、入射光は光源９０１からコリメートレンズ９０２を通して反応容器９０３中の検出素子９０８に斜め方向より入射され、その反射光をコリメートレンズ９０４を通して分光測定器９０５に導入する構成になっている。図１２（Ｂ）では入射光の部分は同様の構成であり、散乱光を反射光路と異なる位置に配置されたコリメートレンズ９０４、分光測定器９０５により取得する。
【実施例】
【００６２】
以下では、実施例をもって本発明を説明するが、これらは本発明の範囲をなんら限定するものではない。
（実施例１）ＬＳＰＲ素子の温度に対する信号変化の影響評価
本実施例では、ＬＳＰＲ法の温度に対する信号変化の影響を評価する。本評価の対照としてはＳＰＲ法を用いる。
＜金微粒子を用いたＬＳＰＲ素子の作製＞
予め底面にアミノ基が導入されたマイクロタイタープレート（住友ベークライト社製）に、平均粒径４０ｎｍの金微粒子の溶液（田中貴金属社製）を導入し、２４時間浸漬後、純水で洗浄した後チッソガスで乾燥することでＬＳＰＲ素子を作製する。純水を導入し、室温で吸収スペクトルを測定すると、５１３ｎｍ付近に最大吸収波長を有する、図１３に示すスペクトルを得る。
＜温度に対する信号変化の影響評価＞
上記のようにして得られたＬＳＰＲ素子に純水を加え、温度を２５、３０、３５および４０℃に設定した際のスペクトルを測定する。
【００６３】
対照として用いたＳＰＲはＢｉａｃｏｒｅ社のＢｉａＣｏｒｅ−Ｘを用い、同様の温度設定を施した純水を流路に導入し、Ｂｉａｃｏｒｅ社のプロトコルに則り信号値であるＲＵを測定する。本発明のＬＳＰＲ素子では２５℃で得られるスペクトルの最大吸収波長における吸光度を１とし、各温度で得られるスペクトルの最大吸収波長における吸光度の変化率を求める。ＳＰＲでも同様に２５℃で得られるＲＵ値を１とし、各温度で得られるＲＵ値の変化率を求める。その結果を図１４に示す。結果から明らかなように、ＳＰＲの信号が温度により影響を受けるのに対し、本発明のＬＳＰＲでは本温度範囲ではその信号にほとんど影響を及ぼさないことが示される。
（実施例２）金微粒子型ＬＳＰＲ素子によるモデル抗体溶液の力価検定：昇温法
＜異なる解離定数を有するモデル抗体の作製およびそれを用いたモデル抗体溶液の作製＞
マウス抗ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）モノクローナル抗体（解離定数：５×１０-8程度）を、抗体のアミノ基と特異的に化学結合を生じるＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルと反応させる。反応条件の違いにより解離定数の異なる２種類のモデル抗体を作製する。解離定数はそれぞれ５×１０-7程度、５×１０-6程度のものを選択する。
【００６４】
上記のようにして得られる２種類のモデル抗体及び未処理の抗体をそれぞれ同濃度で含む溶液を以下のように異なる割合で混合し、全体としての力価の異なるモデル抗体溶液試料を作製する。親和性の高い順に、ａ：未処理の抗体を含む溶液、ｂ：解離定数５×１０-7程度の抗体を含む溶液、ｃ：解離定数５×１０-6程度の抗体を含む溶液、とする。
【００６５】
即ち
Ａ溶液  ａ：ｂ：ｃ＝７：２：１
Ｂ溶液  ａ：ｂ：ｃ＝２：７：１
Ｃ溶液  ａ：ｂ：ｃ＝１：２：７  （容積比）
の溶液を調製する。
【００６６】
これら３種類のモデル抗体溶液を、通常のＥＬＩＳＡ法を用いたマイクロタイター手法でそれぞれの力価を測定し、力価としてＡ溶液＞Ｂ溶液＞Ｃ溶液である事を確認する。
＜モデル抗体溶液の力価検定＞
実施例１と同様の作製方法で得られるＬＳＰＲ素子に抗原であるＢＳＡを物理吸着法により固定する。具体的には、ＢＳＡ溶液を各素子のウエルに導入し、２４時間放置後、ＰＢＳバッファーで洗浄した後、非特異的吸着を防止するため、カゼイン溶液を導入してブロッキングを行う。
【００６７】
この様にして調整した８連ウエルのＬＳＰＲ素子マイクロタイタープレートを９セット用意する。各プレート３セットずつに上記のように調製したＡ溶液、Ｂ溶液、Ｃ溶液を加え、２５℃に調整した後、２時間後に各吸収スペクトルを測定する。その後、温度を順次３０℃、３５℃、４０℃に調整し、それぞれのスペクトルを測定する。
【００６８】
各溶液における各温度域での最大吸収波長をプロットし、その結果、昇温によりスペクトルの短波長シフト量の大きい順にＣ溶液、Ｂ溶液、Ａ溶液の結果が得られ、力価としてＡ溶液＞Ｂ溶液＞Ｃ溶液である事が検定される。
（実施例３）金パターン構造体型ＬＳＰＲ素子によるモデル抗体溶液の力価検定：昇温法
＜金パターン構造体型ＬＳＰＲ素子の作製＞
膜厚２０ｎｍの金薄膜を、予めＴｉやＣｒの接着層を表面に施した０．７２５ｍｍ厚の石英基板上にスパッタリングにて形成し、これを２００ｎｍ×２００ｎｍの正方形方に電子線描画装置を用いてパターニングすることで製作する。尚ここでは電子線描画装置を用いたが、集束イオンビーム加工装置、Ｘ線露光装置、紫外線露光装置またはエキシマ露光装置を用いてパターンを形成してもかまわない。レジスト形成後、ＩＣＰエッチャにて、レジスト除去部の金をエッチングする。エッチング後、残っているレジストをアッシング装置にて除去することで、金パターン構造体型ＬＳＰＲパターンを得る。尚、ここでは、エッチングによる方法を記載したが、リフトオフ法で作製してもかまわない。
【００６９】
この様にして得られたパターンに、貫通型マイクロプレートを貼りあわせ、金パターン構造体型ＬＳＰＲ素子を得る。
＜モデル抗体溶液の力価検定＞
実施例２で用いた方法と同様の方法で、モデル抗体溶液の力価を検定する。その結果、力価としてＡ溶液＞Ｂ溶液＞Ｃ溶液である事が検定される。
（実施例４）金微粒子型ＬＳＰＲ素子によるモデル抗体溶液の力価検定：個別温度法
実施例２と同様の方法で調整した８連ウエルのＬＳＰＲ素子マイクロタイタープレートを１２セット用意する。各プレート４セットずつに２５℃、３０℃、３５℃および４０℃に調整したＡ溶液、Ｂ溶液、Ｃ溶液を加え、２時間反応後の、それぞれの溶液でのそれぞれの温度の吸収スペクトルを測定する。
【００７０】
実施例２で用いた方法と同様の方法で、モデル抗体溶液の力価を検定する。その結果、力価としてＡ溶液＞Ｂ溶液＞Ｃ溶液である事が検定される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】抗体−抗原の相互作用強度を検定する方法の一例を示す概略図である。
【図２】抗体−抗原の相互作用強度を検定する方法の一例を示す概略図である。
【図３】本発明の光学的特性の検出に用いる検出素子の例を示す模式図である。（ａ）金属含有微粒子が基体に固定されている。（ｂ）扁状金属含有構造体が基体に固定されている。
【図４】検出素子の基体の形状を示す図である。（ａ）多孔質構造体。（ｂ）オパール構造体。（ｃ）逆オパール構造体。（ｄ）柱状構造体。（e）凸状構造体。（f）凹状構造体。（g）突起状構造体。（h）繊維状構造体。（i）中空カラム状構造体。
【図５】検出素子の作製方法を示す図である。（Ａ）基体。（Ｂ）金属薄膜の成膜。（Ｃ）電子線レジストの成膜。（Ｄ）レジストパターンの取得。（Ｅ）不要な金属薄膜のエッチング。（Ｆ）電子線レジストの除去。
【図６】検出素子の作製方法を示す図である。（Ａ）基体。（Ｂ）金属薄膜の成膜。（Ｃ）金属構造体の形成。
【図７】検出素子の作製方法を示す図である。（Ａ）基体。（Ｂ）金属薄膜の成膜。（Ｃ）金属構造体の形成。
【図８】本発明の金属含有構造体として金属矩形構造体を用いた場合の検定用分子と目的分子の状態を示す模式図、及び吸収スペクトル変化を示すグラフである。（Ａ）解離時。（Ｂ）複合体形成時。（Ｃ）吸収スペクトル。
【図９】本発明の検定装置の一例を示す図である。
【図１０】本発明の検定方法の工程を示すフローチャートである。
【図１１】本発明の検定装置の一例を示す図である。
【図１２】本発明の検定装置に用いる光学系の例を示す図である。（Ａ）反射光取得光学系。（Ｂ）散乱光取得光学系。
【図１３】実施例１のＬＳＰＲ素子の吸収スペクトルを示すグラフである。
【図１４】実施例１のＬＳＰＲ素子とＳＰＲ素子において温度による吸光度変化を比較したグラフである。
【符号の説明】
【００７２】
１  抗原
２  反応容器
３  抗体
４  抗体
５  抗体
６  抗原
７  抗体
８  抗体
９  抗体
１０  抗体
３０１ａ  金属含有微粒子
３０１ｂ  扁状金属含有構造体
３０２ａ  基体
３０２ｂ  基体
５０１  基体
５０２  金属薄膜
５０３  電子線レジスト
５０４  金属構造体
６０１  基体
６０２  金属薄膜
７０１  基体
７０２  金属薄膜
８０１  金属含有構造体
８０２  検定用分子
８０３  目的分子
８０４  検定用分子と目的分子からなる複合体
８０５  吸収スペクトル（解離時）
８０６  吸収スペクトル（複合体形成時）
９０１  光源
９０２  コリメートレンズ
９０３  反応容器
９０４  コリメートレンズ
９０５  分光測定器
９０６  温度調整機構
９０７  中央演算機構
９０８  検出素子
１１０３ａ  反応容器
１１０３ｂ  反応容器
１１０３ｃ  反応容器
１１０６  多チャンネル温度調整機構
１１０８  可変ステージ
【図１】
2007298342.tif 000003
【図２】
2007298342.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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