(57)【要約】  【課題】  プリオン病感染動物由来材料からダイレクトにPrPScを検出するモノクローナル抗体のスクリーニング方法を提供することを課題とする。また、そのようなスクリーニング方法を用いて、所望のモノクローナル抗体を簡便に取得するための方法を確立することも目的とした。  【解決手段】  本発明は、PrPScをダイレクトに検出する能力を有するモノクローナル抗体を作製する方法において、脳、脊髄、回腸、脾臓、扁桃などのPrPScが蓄積する生体組織のホモジネートなどの試料中のPrPScをチオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、尿素等の変性剤にて変性させた抗原と非変性抗原に対する反応性を比較し、変性抗原に対して反応性が低下した抗体を選択することを特徴とする、モノクローナル抗体のスクリーニング方法を提供することにより、上記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）試料中のPrPScを変性剤にて変性させた抗原と非変性抗原との反応性を比較し、
b）変性抗原に対して反応性が低下した抗体を選択する
ことを特徴とする、PrPScをダイレクトに検出する能力を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする方法。
【請求項２】
試料が、プリオン病に感染した動物、または感染が疑われる動物から採取した、脳、脊髄、回腸、脾臓、扁桃から選択される生体組織のホモジネートから選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
試料中のPrPScの変性を、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、尿素から選択されるタンパク質変性剤により行う、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
PrPScを検出するがPrPCは検出しない抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする際に、請求項1のスクリーニング方法を使用することにより、試料中のPrPをタンパク質分解処理することなく、PrPScをダイレクトに検出する能力を有するモノクローナル抗体を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、PrPScをダイレクトに検出するモノクローナル抗体のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プリオン病の病原体の主要構成成分である異常プリオンタンパク質（PrPSc）は、生体内に存在する正常プリオンタンパク質（PrPC）の立体構造異性体であり、両者のアミノ酸配列は同一である。PrPCおよびPrPScは、タンパク質分解酵素であるプロテイナーゼK（PK）に対する抵抗性に違いがあり、両者の識別にはPK処理を用いるのが一般的である。
【０００３】
これまで、プリオンタンパク質（PrP）欠損マウスを用いることにより、多数の抗PrP抗体が作成されてきた。しかしながら、これまでに作製されてきた抗PrP抗体のスクリーニングには、抗原としてリコンビナントPrPや合成ペプチドが用いられてきたため、この方法で得られた抗体の多くは、PrPの部分配列を認識するシークエンシャルなエピトープを有していた。PrPScとPrPCは同一のアミノ酸配列であることから、これらの抗体のほとんどは、両者に反応してしまう。従って、抗PrP抗体を用いて病原性に関与するPrPScのみを検出するためには、PK処理などの前処理が必要である。
【０００４】
PK処理を行わずに脳ホモジネートなどの試料からダイレクトにPrPScを検出することは、前処理の省略化を可能とし、PrPScの検出方法の簡略化につながる。また、このような抗体を用いることによりネイティブなPrPScを分離することができれば、PrPScの立体構造解析に非常に有用であると考えられる。そのため、これまでもPrPSc特異抗体を作出する試みが多数行われてきたが、目的とする抗体の作出に成功した報告は一部を除いてほとんどない（非特許文献1、非特許文献2、非特許文献3）。
【非特許文献１】Korth C. et al. Nature. 390:74-77 (1997)
【非特許文献２】Paramithiotis E. et al. Nat Med. 9:893-9 (2003)
【非特許文献３】Curin Serbec V. et al. J Biol Chem. 279:3694-8 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上のことから、PrPScをダイレクトに検出するモノクローナル抗体を、簡便に選択するためのスクリーニング方法を確立することを目的とした。また、そのようなスクリーニング方法を用いて、所望のモノクローナル抗体を簡便に取得するための方法を確立することも目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の上記の目的は、PrPScをダイレクトに検出する能力を有するモノクローナル抗体を作製する方法において、脳、脊髄、回腸、脾臓、扁桃から選択される生体組織のホモジネートなどの試料中のPrPScをチオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、尿素等の変性剤にて変性させた抗原と非変性抗原に対する反応性を比較し、変性抗原に対して反応性が低下した抗体を選択することを特徴とする、モノクローナル抗体のスクリーニング方法により達成される。
【０００７】
本発明はまた、PrPScを検出するがPrPCは検出しない抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする際に、上述のスクリーニング方法を使用することにより、試料中のPrPをタンパク質分解処理することなく、PrPScをダイレクトに検出する能力を有するモノクローナル抗体を作製する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法を利用することにより、プロテイナーゼK（PK）処理を使用することなく、プリオン病感染動物由来材料からPrPScをダイレクトに検出するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする方法を提供することができる。
【発明の実施の形態】
【０００９】
本発明は、a）試料中のPrPScを変性剤にて変性させた抗原と非変性抗原との反応性を比較し、b）変性抗原に対して反応性が低下した抗体を選択する、ことを特徴とする、PrPScをダイレクトに検出する能力を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする方法を提供する。
【００１０】
異常プリオンタンパク質（PrPSc）は、生体内に存在する正常プリオンタンパク質（PrPC）の立体構造異性体であり、両者のアミノ酸配列は同一である。そのため、単にプリオンタンパク質の部分配列を免疫原として抗体を作製しても、PrPCとPrPScの立体構造を識別し、PrPScのみを検出する抗体を作製することは難しい。PrPScを検出するがPrPCは検出しない抗体を得るためには、ネイティブなPrPScを免疫原として利用し、得られた抗体の中からPrPScの立体構造を認識する抗体を選択する必要がある。
【００１１】
そのような立体構造を認識する抗体を選択するため、本発明のスクリーニング方法は、a）試料中のPrPScを変性剤にて変性させた抗原と非変性抗原との反応性を比較し、b）変性抗原に対して反応性が低下した抗体を選択する、ことを特徴とする。変性剤により変性した抗原は、一次配列はそのままであるが、ネイティブなPrPScが持つ立体構造を失っているため、本発明のスクリーニング方法で選択された抗体は、PrPScの部分配列を認識しているのではなく、立体構造を認識していることが示唆される。
【００１２】
本発明は、ハイブリドーマ培養上清の抗体価を、試料中のネイティブなPrPScと、これをタンパク質変性剤により変性させたPrPScとに対する反応性を比較して確認する。例えば以下の手順で行う。
【００１３】
マイクロタイタープレート（96穴）等の担体に何らかの方法でPrPScを固定化し、ウシ血清アルブミン（BSA）等でブロッキングした後、1検体あたり2ウェルを使用する。うち1ウェルにタンパク質変性剤、1ウェルにトリス緩衝食塩水（TBS）を添加し、変性抗原、非変性抗原とする。ここに、ハイブリドーマ培養上清を反応させた後、HRP標識した抗マウスIg抗体などの二次抗体を反応させ、発色反応により定量し、比較する。比較に際して、変性抗原に対する反応性が、非変性抗原に対する反応性よりも低下した抗体を、目的とする抗体として選択する。
【００１４】
本発明におけるPrPScの固相化のためには、市販のBSE診断キット、試験研究用PrP検出用キットを使用することができる。
【００１５】
本発明において使用する試料は、PrPScが蓄積されやすい部位であればどのような部位に由来するものであってもよく、例えばプリオン病に感染した動物、または感染が疑われる動物から採取した、脳、脊髄、回腸、脾臓、扁桃などから選択される、PrPScが蓄積する生体組織のホモジネートを使用することができる。
【００１６】
本発明において試料中のPrPScを変性させるために使用することができるタンパク質変性剤としては、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、尿素などが挙げられる。
【００１７】
本発明はまた、PrPScを検出するがPrPCは検出しない抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする際に、上述したスクリーニング方法を使用することにより、試料中のPrPをタンパク質分解処理することなくPrPScをダイレクトに検出する能力を有するモノクローナル抗体を作製する方法を提供する。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例により説明するが本発明は以下に述べる実施例により限定されるものではない。
【００１９】
実施例1  抗体の作製
本実施例においては、PrPScを認識する抗体を作製することを目的とした。
【００２０】
1.  免疫原の調製
スクレイピー帯広株に感染したマウス脳を用いて、Caugheyらの方法（Caughey B. et al. Molecular Biotech, 13:45-55 (1999)）に従って、以下の通り免疫原となるPrPScの精製を行った。
【００２１】
マウス脳（重量0.8g）を、10％サルコシルを含む8mlのTEND緩衝液（20 mMトリス緩衝液（pH8.3）、2 mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）、266 mM塩化ナトリウム、1 mMジチオスレイトール）中で、室温にて２分間以上ホモジナイズし、10％w/vの脳ホモジネートを作製した。
【００２２】
ホモジネートを4℃にて28,000×g、30分間遠心した後、上清を新しいチューブに移し、さらに4℃にて180,000×g、2.5時間遠心した。得られた沈殿を10％塩化ナトリウム（NaCl）および1％Zwittergentを含むTEND緩衝液中で分散した後、20℃にて250,000×g、90分間遠心して得られた沈殿を、0.5mlのTMS緩衝液（10 mMトリス塩酸（pH 7.4）、5 mM塩化マグネシウム、100 mM塩化ナトリウム）で再分散した。100μg/ml RNase Aで37℃、2時間反応後、5 mMとなるように塩化カルシウム（CaCl2）を添加し、20μg/ml DNaseで37℃、2時間または4℃、一晩反応させた。
【００２３】
最終濃度20 mMとなるようにEDTAを添加して反応を停止後、1％となるようにZwittergentを加え、SNSB溶液（1 Mショ糖、0.1 M塩化ナトリウム、0.5％Zwittergent）に重層した後、20℃にて250,000×g、90分間遠心した。得られた沈殿をリン酸緩衝食塩水（PBS）にて分散し、免疫原としてのPrPSc溶液とした。
【００２４】
2.  免疫
前記「1.  免疫原の調製」で調製した免疫原としてのPrPSc溶液を、油水中型アジュバントを用いてエマルジョン化し、脳重量80 mg相当の精製PrPScをPrP欠損マウスの尾の付根に接種し、さらに同様の接種を2週間間隔で3回行った。
【００２５】
2週間経過後、免疫化したマウスから採血し、PrPScに対する抗体価の上昇を確認した。高い抗体価を示したマウスに対して、さらにアジュバントなしの同量のPrPScを眼静脈から接種する最終免疫を行った。最終免疫を行った1週間後または2日後および1日後に、ミエローマ細胞との細胞融合を行った。具体的には、抗体価が上昇した免疫化マウスから脾細胞を回収し、マウスミエローマSP2/0細胞（大日本製薬社製）と定法に従って細胞融合を行った。
【００２６】
3.  抗体のスクリーニング
次に、前記「2.  免疫」において作製したハイブリドーマにおいて産生される抗体のスクリーニングを行った。帯広株感染マウス脳の1％ホモジネートを固相化したマイクロプレートを5％BSAでブロッキングしたのち、1検体あたり2ウェルを用いて抗体のスクリーニングを行った。
【００２７】
2ウェルのうち1ウェルには100μlの4 Mチオシアン酸グアニジンナトリウム溶液、もう1ウェルには100μlのTBSをそれぞれ分注し、室温にて10分間放置し、変性抗原ウェルおよび非変性抗原ウェルを作製した。このようにして作製したそれぞれのウェルを、0.05％Tween-10を含むTBS(TBST)で洗浄後、ハイブリドーマ培養上清を変性抗原ウェルおよび非変性抗原ウェルにそれぞれ100μlずつ分注し、室温にて1時間反応させた。
【００２８】
800μlのTBSTを用いて3回、各ウェルを洗浄後、HRP標識抗マウスIgG抗体（ジャクソン社製）溶液を100μlずつ分注し、室温1時間反応させた。反応後、800μlのTBSTを用いて3回、各ウェルを洗浄し、その後TMB溶液（TMB 1-Component Microwell Peroxidase Substrate, SureBlue、カッペル社製）を100μlずつ分注し、室温で30分間放置した。その後、1 Nリン酸を100μlずつ添加して発色反応を停止し、450 nmの吸光度を測定した。各検体の変性抗原/非変性抗原に対する反応性を比較した。
【００２９】
その結果、本発明者らは、比較的高い親和性でPrPScと反応することができる9種類のモノクローナル抗体を得た。これらのモノクローナル抗体の中から、本発明者らは、元々の立体構造が失われた変性抗原との反応性が低下した4種類のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローン、3B7、3H6、2C4、1B12を選択した。
【００３０】
変性抗原に対して反応性が低下したハイブリドーマの産生する抗体の反応性を図1に示した。図1において、選択された4種類の抗体の変性／非変性抗原に対する反応性を示す。この図において、「Gdn(-)」は非変性抗原、「Gdn(+)」はチオシアン酸グアニジンナトリウムでの変性抗原をそれぞれ示す。そして「3B7」、「3H6」、「2C4」、「1B12」はそれぞれ、選択されたクローンから得られた抗体を示し、「6H4」は既存の抗PrP抗体（プリオニクス社製）を示す。
【００３１】
本発明においては、これら4種類のハイブリドーマクローン、3B7、3H6、2C4、1B12を「4.  抗体の精製」以降に用いた。
【００３２】
4.  抗体の精製
変性抗原に対して反応性の低下した抗体を産生したハイブリドーマの培養上清を回収し、HiTrapGIIキット（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて抗体の精製を行い、PBSに対し透析後、精製抗体、mAb 3B7、3H6、2C4、1B12をそれぞれ調製した。
【００３３】
実施例2  免疫沈降によるPrPScのダイレクトな検出の確認
本実施例においては、実施例1において作製されたモノクローナル抗体を使用して、PrPScを酵素処理を経ることなくダイレクトに検出することができるかどうかを調べることを目的として行った。
【００３４】
スクレイピー非感染マウスの脳または感染マウスの脳から10％w/vの脳ホモジネートを調製した。両者に含まれるPrP量が同じになるように、各脳ホモジネートを2％Triton X-100を含むPBSを用いてそれぞれ1.25％、0.16％に希釈し、2,000 rpm、1分間の遠心後、上清を免疫沈降用試料とした。PrP量はイムノブロット上で同じ強度を示すことで確認した。
【００３５】
非感染マウスまたは感染マウスに由来する免疫沈降用試料250μlに2μgの精製抗体（mAb 3B7、3H6、2C4、または1B12）を加え、室温にて転倒混和させながら1時間反応させた。ついで、ダイナビーズM-280 Sheep anti-Mouse IgG（インビトロジェン社製）25μlを加え、同様に1時間反応させた。回収したビーズを2％トライトンX-100を含むPBSにて4回洗浄後、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）に供するため、1×サンプルバッファー（62.5 mMトリス塩酸(pH 6.8)、5％グリセロール、3 mM EDTA、5％SDS、4 M尿素、4％メルカプトエタノール、0.04％ブロモフェノールブルー）10μlに懸濁し、100℃、10分間加熱したものをSDS-PAGE試料とした。
【００３６】
試料をウェスタンブロッティングに供した。具体的には、NuPAGE（インビトロジェン社製）にて電気泳動後、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に電気的に転写し、ブロックエースにてブロッキングした後、HRP標識抗PrP抗体（T2）を、4℃にて1時間反応させた。膜を0.05％Tweenを含むPBSで洗浄した後、化学発光試薬（SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate、ピアス社製）と反応させ、PrPのバンドを検出した結果を図2に示した。
【００３７】
図2は、実施例1において選択された抗体、mAb 3B7、3H6、2C4、1B12を用いてスクレイピー非感染マウスまたは感染マウスの脳ホモジネートの免疫沈降を行った結果を示す。この図において、「N」は非感染マウス由来の脳ホモジネートを、そして「Sc」は感染マウス由来の脳ホモジネートをそれぞれ示す。「T2」は既存の抗PrP抗体であり（Hayashi, H. et al. J Vet. Med. Sci. 66:515-520 (2004)；Hayashi HK. et al. Biochem Biophys Res Commun. 328:1024-7 (2005)）、「IgG」はPrPとは反応しない抗体（4E3、IgG2a）である。
【００３８】
対照として用いた既存の抗PrP抗体、T2では、非感染マウス由来免疫沈降用試料および感染マウス由来免疫沈降用試料のどちらからもPrPを検出した。これに対して、実施例1において選択した変性抗原に対する反応性の低下したモノクローナル抗体（mAb 3B7、3H6、2C4、1B12）は、スクレイピー感染マウス由来脳ホモジネート免疫沈降用試料のみからPrPを検出し、正常マウス由来の脳ホモジネートのPrPを沈降させなかった。これは、感染マウス由来免疫沈降用試料のみから検出されたことからPrPScを特異的に検出していると考えられる。
【００３９】
実施例3  PrP立体構造認識の確認
本実施例においては、実施例1において得られたモノクローナル抗体が、PrPScの立体構造を認識することができるかどうかを調べることを目的として行った。
【００４０】
スクレイピー感染マウスの脳から10％w/vの脳ホモジネートを調製した。このように調製した脳ホモジネートに関して、タンパク質分解酵素（PK）処理群（PK（+）群）はPK処理を行った。PK処理後の脳ホモジネートを2％Triton X-100を含むPBSを用いて0.16％に希釈し、2,000 rpm、1分間の遠心後、上清を免疫沈降用試料とした。PK非処理群（PK(-)）は、PK処理を行うことなく、脳ホモジネートを上述と同様に処理し、免疫沈降用試料とした。
【００４１】
このようにして調製した免疫沈降用試料に関して、実施例2に記載した方法と同一の方法により、抗体（mAb 3B7、3H6、2C4、または1B12）を使用した免疫沈降を行い、その後抗PrP抗体（T2）を用いて検出するウェスタンブロッティングに供した。
【００４２】
PrPCおよびPrPScは、タンパク質分解酵素であるプロテイナーゼK（PK）に対する抵抗性に違いがあり、PK処理を行うと、PrPCはタンパク質分解を生じて抗体により認識されなくなるが、PrPScはタンパク質分解が生じないためPK処理後も抗体により認識される、という特徴がある。
【００４３】
結果を図3に示した。図3は、実施例1において選択された抗体、mAb 3B7、3H6、2C4、1B12を用いてスクレイピー感染マウスの脳ホモジネートの免疫沈降を行った結果を示す。この結果、実施例1において得られた抗体（mAb 3B7、3H6、2C4、または1B12）を使用して免疫沈降をした場合、得られたPrPのバンド濃度が、PK処理後においても低下しないことが明らかになった。このことは、免疫沈降されたPrPが、PK抵抗性、すなわちPrPScであり、PrPCは免疫沈降されなかったことを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の方法を利用することにより、プロテイナーゼK（PK）処理を使用することなく、プリオン病感染動物由来材料からPrPScをダイレクトに検出するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図1は、選択された4種類の抗体の変性抗原／非変性抗原に対する反応性を示す図である。
【図２】図2は、図1と同じハイブリドーマ培養上清から精製したIgGを用いて、スクレイピー非感染マウス由来脳ホモジネートまたは感染マウス由来脳ホモジネートの免疫沈降を行った結果を示す図面である。
【図３】図3は、実施例1において選択された抗体、mAb 3B7、3H6、2C4、1B12を用いて、PK処理前後のスクレイピー感染マウスの脳ホモジネートの免疫沈降を行った結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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