(57)【要約】【課題】ＤＮＡシャフリングにおけるＤＮＡ断片試料の調製において、従来のデオキシリボヌクレアーゼＩを使用する方法に代えて、簡便でかつ再現性の良好な手段を開発する。【課題解決手段】ＤＮＡの塩基配列中、チミンをランダムにウラシルに置換したＤＮＡを調製した後、エンドヌクレアーゼＶを作用させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡの塩基配列中、チミンをランダムにウラシルで置換した後、エンドヌクレアーゼＶを作用させることによりＤＮＡを断片化することを特徴とする、ＤＮＡ断片試料の調製方法。
【請求項２】
請求項１により調製されたＤＮＡ断片試料を用いて、ＤＮＡシャフリングを行うことを特徴とする、ＤＮＡ シャフリング方法。
【請求項３】
デオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）およびエンドヌクレアーゼＶをそれぞれ試薬として含むことを特徴とする、ＤＮＡを断片化するための試薬キット
【請求項４】
さらに、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジンントリホスフェート（ｄＣＴＰ）およびデオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）、並びにＤＮＡポリメラーゼを試薬として含むことを特徴とする、請求項３に記載の試薬キット。
【請求項５】
ＤＮＡシャフリングにおける、ＤＮＡ断片化に使用するものである、請求項３または４に記載の試薬キット。
【請求項６】
デオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジンントリホスフェート（ｄＣＴＰ）およびデオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼ並びにびエンドヌクレアーゼＶをそれぞれ試薬として含むことを特徴とする、ＤＮＡシャフリング試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡの断片化方法、ＤＮＡシャフリング方法、およびこれら方法に使用するための試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡシャフリングは、全長ＤＮＡをランダムに切断し、適当な長さに切断されたＤＮＡが相互にプライマーあるいは鋳型となり、オーバーラップ伸長を行うことで、相同ＤＮＡ間の組換えを誘起する方法であり、変異遺伝子の作製方法として広く使用されている。従来、ＤＮＡをランダムに切断し、適当な長さのＤＮＡ断片を調製する方法として、例えばデオキシリボヌクレアーゼＩなど、基質特異性の低いヌクレアーゼを利用する方法があった。しかし、デオキシリボヌクレアーゼＩを用いる方法では、以下に述べるような幾多の問題があった。
【０００３】
すなわち、デオキシリボヌクレアーゼＩによる方法では、反応に関わるさまざまな因子（デオキシリボヌクレアーゼＩの酵素量、基質ＤＮＡの純度や濃度、反応温度、反応時間）を正確に制御し、適当な反応時間で反応を終結させ部分分解産物を取得する必要があった。また、ＤＮＡの部分分解産物と未分解産物とをアガロースゲル電気泳動などの手法により分画しなければならなかった。さらに、デオキシリボヌクレアーゼＩの酵素量、基質ＤＮＡの純度や濃度、反応温度、反応時間などのわずかな条件の違いにより断片の長さが変わり、再現性に欠けるという欠点も有していた。このようにデオキシリボヌクレアーゼＩを用いたＤＮＡの断片化は多大な労力を要する上、再現性にも乏しいという欠点を抱えていた。このため、煩雑な反応最適条件の検討を必要とせず、またアガロースゲルによる分離・抽出・精製等の煩雑な操作を必要としない、簡便な操作で再現性の高いＤＮＡの断片化および分画手法の開発が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記従来技術の問題点を解消し、ＤＮＡシャフリングにおけるＤＮＡ断片試料の調製において、簡便で、かつ再現性の高い手法を開発することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意研究の結果、ＤＮＡの塩基配列中、チミンをランダムにウラシルに置換したＤＮＡを調製した後、エンドヌクレアーゼＶを作用させることにより、ＤＮＡのランダムな切断を簡便かつ再現性よく行い得るとともに、さらに該エンドヌクレアーゼＶによるＤＮＡ断片化試料を用いて実際にＤＮＡシャフリングを行った結果、極めて有効にＤＮＡシャフリングを行えることを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（6）に関する。
（１）ＤＮＡの塩基配列中、チミンをランダムににウラシルで置換した後、エンドヌクレアーゼＶを作用させることによりＤＮＡを断片化することを特徴とする、ＤＮＡ断片試料の調製方法。
（２）上記（１）により調製されたＤＮＡ断片試料を用いて、ＤＮＡシャフリングを行うことを特徴とする、ＤＮＡ シャフリング方法。
（３）デオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）およびエンドヌクレアーゼＶをそれぞれ試薬として含むことを特徴とする、ＤＮＡシャフリングにおけるＤＮＡを断片化するために用いる試薬キット
（４）さらに、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジンントリホスフェート（ｄＣＴＰ）およびデオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）、並びにＤＮＡポリメラーゼを試薬として含むことを特徴とする、請求項３に記載の試薬キット。
（５）ＤＮＡシャフリングにおける、ＤＮＡ断片化に使用するものである、請求項３または４に記載の試薬キット。
（６）デオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジンントリホスフェート（ｄＣＴＰ）およびデオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼ並びにエンドヌクレアーゼＶをそれぞれ試薬として含むことを特徴とする、ＤＮＡシャフリング試薬キット。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明においては、遺伝子ＤＮＡ塩基配列中のチミンをランダムにウラシルに置換したＤＮＡを調製した後、エンドヌクレアーゼＶを作用させるが、このエンドヌクレアーゼＶはウラシルを含むＤＮＡを基質とし、ウラシル位置の２‐３塩基下流のホスホジエステル結合を切断する活性を有する酵素である（Huang, J., Lu, J.,Barany, F., and Cao, W. 2001. Multiple Cleavage activities of endonuclease V from Thermotoga maritima: recognition and strand nicking mechanism, Biochemistry, 40, 8738-8748、Yao, M. and Kow, Y. W. 1997. Further characterization of Escherichia coli endonuclease V. Mechanism of recognition for deoxyinosine, deoxyuridine, and base mismatches in ＤＮＡ. J. Biol. Chem. 272, 30774-30779）。このため、ＤＮＡ塩基のチミンをランダムにウラシルに置換したＤＮＡを調製しエンドヌクレアーゼＶを作用させることで、ＤＮＡのランダムな断片化が達成される。このようなエンドヌクレアーゼＶによる切断反応は、取り込まれたウラシルの量に依存して進行し、基質を消費した段階で反応が終結する。このように、完全消化により断片化がおこなわれるため、デオキシリボヌクレアーゼＩを使用した反応時におけるような部分消化ではなく、反応の進行状況のモニターの必要がない。また、再現性よく反応が進行する。
【０００８】
本発明によるＤＮＡシャフリングは、（１）ランダムなＤＮＡの切断によるＤＮＡ断片試料の調製工程と、（２）得られたＤＮＡ断片試料を用いたＤＮＡシャフリング工程からなる。
（１）ＤＮＡ断片試料の調製工程
本発明においては、ＤＮＡシャフリングの対象となる遺伝子ＤＮＡを鋳型とし、上流プライマーおよび下流プライマー、並びにデオキシアデノシントリホスフェート（以下、ｄＡＴＰという。）、デオキシグアノシントリホスフェート（以下、ｄＧＴＰという。）、デオキシシチジンントリホスフェート（以下、ｄＣＴＰという。）およびデオキシチミジントリホスフェート（以下、ｄＴＴＰという。）と、さらにデオキシウリジントリホスフェート（以下、ｄＵＴＰという。）を含む反応溶液にＤＮＡポリメラーゼを加えＰＣＲ増幅を行う。得られるＰＣＲ産物は、上記遺伝子ＤＮＡの塩基配列中チミンがウラシルにランダムに置き換えられた二本鎖のＤＮＡ分子である。
この場合において、得られるＤＮＡ分子中のウラシルの置換量は、使用するｄＴＴＰとｄＵＴＰの量比に対応して変化し、この量比を変化させることにより、ウラシルの置換量を制御できる。すなわち、ウラシルの割合を多くすれば、ウラシルの置換量は増大する。
【０００９】
次いで、ウラシル置換ＤＮＡ分子を、エンドヌクレアーゼＶにより切断することにより、該ＤＮＡ分子は断片化される。得られるＤＮＡ断片試料は、分子長が異なる切断ＤＮＡ分子の集合体であり、各切断ＤＮＡ分子の分子長は、ランダムに置換されたウラシルの間に挟まれた領域に対応する。したがって、ウラシルの置換量が多ければ、より短い分子長の切断ＤＮＡ分子が多くなり、反対に少なければ、より長い分子長の切断ＤＮＡ分子が多くなる。
一方、上記したようにウラシルの置換量は、ＰＣＲ増幅において、使用するｄＴＴＰとｄＵＴＰの量比を変化させることにより制御可能であるから、単に、ＰＣＲ増幅において、ｄＴＴＰとｄＵＴＰの量比を制御するという極めて簡便な手段のみで、所定の分子長分布のＤＮＡ断片を再現性よく得ることが可能となる。また、この方法によれば、従来のようなＤＮＡ切断後のアガロースによる分離、抽出、精製等の煩雑な操作は、実質上必ずしも必要としないので、エンドヌクレアーゼＶによる切断後のＤＮＡ断片試料を、そのまま用いてＤＮＡ シャフリングを行うことができる。
上記においては、遺伝子ＤＮＡのウラシル置換の手法としてＰＣＲを使用する方法について説明したが、本発明においては、ウラシル置換の方法はこれにとどまらない。例えば、ＤＮＡ複製の際、チミンの代わりに誤って取り込まれたウラシルを除去修復する機能の欠損した宿主菌内でＤＮＡを複製させることによっても得られる。このような宿主菌としては、例えば、エシェリシア コリーＣＪ２３６あるいはエシェリシア コリーＢＷ３１３等が挙げられる。この場合、該宿主菌を定法に従って目的遺伝子を含むプラスミドなどで形質転換し、宿主菌内でプラスミドを増幅し、定法に従ってプラスミドを抽出・精製すればよい。
【００１０】
（２）ＤＮＡシャフリング工程
上記（１）の工程によって得られたＤＮＡ断片試料（分子長が異なる切断ＤＮＡ分子の集合体）を用い、ＰＣＲ法によりＤＮＡシャフリングを行う。ＰＣＲは、上記ＤＮＡ断片試料、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼを含む反応溶液を用いて行う。
これによれば、上記ＤＮＡ断片試料中の二本鎖の各切断ＤＮＡ分子は、 相互に鋳型あるいはプライマーとなり、オーバーラップ伸長することにより、相同ＤＮＡ間の組換えが行われ、上記（１）の工程中、最初に用いた鋳型遺伝子の変異遺伝子が形成される。このことは、後記実施例における、終止コドンを導入した緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰｕｖ）遺伝子を用いた実験により確かめられている。
【００１１】
一方、本発明の試薬キットは、少なくとも、ｄＵＴＰおよびエンドヌクレアーゼＶをそれぞれ試薬として含み、このキットは、ＤＮＡシャフリングにおける、上記（１）のＤＮＡ断片試料の調製工程に使用する。この工程においては、この試薬キットのほかに、ＰＣＲに使用する試薬として、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼ等も使用するが、これらは既存のものを使用してもよいし、これら試薬を、本発明の試薬キットに組み込んでもよい。
さらに、本発明の上記（２）のＤＮＡシャフリング工程においては、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲに通常使用する試薬を使用するが、これらを１つの試薬セットとして、上記本発明の試薬キットと組み合わせて、ＤＮＡシャフリング試薬キットとしてもよい。
【００１２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
下記実施例の実験系の概略を図１に示す。本実施例においては、ＧＦＰｕｖ遺伝子のコード領域内に終止コドンを有する２種の変異体を用いた。一つの変異体は６０番目のロイシンがオーカー終止コドンに変わったものであり、もう一つは１２０番目のバリンがオーカー終止コドンに変わったものである。以下これらの変異体を６０＊、１２０＊と記す。これらの変異体は、構造遺伝子が分断されているため不活性であり、全長のＧＦＰｕｖのように緑色蛍光を発することはない。一方、これらの遺伝子が両終止コドンの間で組換わり、終止コドンを含まない配列が生成され全長のＧＦＰｕｖの構造遺伝子が復活すれば蛍光を回復する。このような実験系のもと、エンドヌクレアーゼＶを用いたこれらの２種類の遺伝子の断片化、ならびに各断片を混合しＤＮＡシャフリングを行うことで、蛍光を回復する遺伝子があらわれるか否かを検定したものである。
【００１３】
【実施例１】
（１）基質ＤＮＡの調製
ａ．断片化の基質となるＧＦＰｕｖ遺伝子変異体を含むプラスミドの作成；
ＧＦＰｕｖ遺伝子以外のベクター部分は、Ｄａｔｅら（Date, T., Tanihara, K., and Numura, N. 1990. Construction of Escherichia coli vectors for expression and mutagenesis: synthesis of human c-Myc protein that is initiated at a non-AUG codon in exon 1. Gene. 90, 141-144）により作成されたｐＴＤ−ｔａｃをもとに、該プラスミドの有する唯一のＮｃｏＩ部位をＮｄｅＩ認識部位に変換したプラスミドｐＴＤ−ｔａｃＮｄを作成した（ｐＴＤ−ｔａｃのCCATGG配列がCATATGと置き換わっている）。次に、ＧＦＰｕｖ遺伝子の該ベクターへのクローニングは、以下のように行われた。即ち、２つのプライマー（5’-GGCATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTT-3’、配列表の配列番号１及び5’-GGTAATGGTAGCGACCGGCG-3’、同配列番号２）を用いて、クロンテック社製のＧＦＰｕｖをコードするプラスミドpＧＦＰｕｖよりＧＦＰ遺伝子領域を定法に従いＰＣＲ法により増幅した。次に、増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、先に同様の制限酵素により切断しておいたｐＴＤ−ｔａｃＮｄを定法に従いライゲーションにより連結した。こうして得られたＧＦＰｕｖを発現する組み換えプラスミドｐＴＧｕｖ１の塩基配列を配列表の配列番号３に示す。また、ＧＦＰ遺伝子領域の塩基配列を同配列番号４に示す。
【００１４】
ｂ．終止コドンの導入；
こうして得られたＧＦＰｕｖを発現する組み換えプラスミドに対し、ストラタジーン社製ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットにより部位指定突然変異を行い、６０番目及び１２０番目の位置のアミノ酸置換を行った。即ち、２組のプライマー（６０番目に対して5'-CTACCTGTTCCATGGCCAACATAAGTCACTACTTTCTCTTATGG-3’、同配列番号５及び5'-CCATAAGAGAAAGTAGTGACTTATGTTGGCCATGGAACAGGTAG-3’、同配列番号６、１２０番目に対して5'-GAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTTAAAATCGTATCGAGTTAAAAGGTATTG-3'、同配列番号７、及び5'-CAATACCTTTTAACTCGATACGATTTTAAAGGGTATCACCTTCAAACTTGACTTC-3'、同配列番号８）を用い、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットのマニュアルに従い実験を行った。こうして得られた不活性型のＧＦＰｕｖ遺伝子を組み込んだプラスミドをｐＴＧｕｖ６０＊およびｐＴＧｕｖ１２０＊と名付けた。
【００１５】
ｃ．ウラシルによる置換；
断片化の基質となるウラシルを含むＤＮＡは、ｐＴＧｕｖ６０＊及びｐＴＧｕｖ１２０＊より、ＧＦＰｕｖ遺伝子をはさむ上流（ｐＴＤ−ｆｗｄ、5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'、同配列番号９）及び下流プライマー（ｐＴＤ−ｒｅｖ、5'-GTAAAACGACGGCCAGTGCC-3'、同配列番号１０）を用い、ｄＵＴＰ存在下で各変異体のＧＦＰ遺伝子領域をＴａｑ２０００ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）によりＰＣＲ増幅することにより増幅された二本鎖ＤＮＡ断片を用いた。その際、ｄＴＴＰとｄＵＴＰの合計濃度を０．２mMとし、両ヌクレオチドの比率を種々に変えて行った（１：０、０．７５：０．２５、０．５：０．５、０．２５：０．７５、０：１）。すなわち、ｄＴＴＰとｄＵＴＰの濃度の組み合わせは、０．２ｍＭ：０ｍＭ、０．１５ｍＭ：０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ：０．１ｍＭ、０．０５ｍＭ：０．１５ｍＭ、０ｍＭ：０．２ｍＭとした。
【００１６】
反応溶液の組成は、１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．３）、５０ｍＭ  塩化カリウム、１．５ｍＭ  塩化マグネシウム、各２５μＭ  プライマー（ｐＴＤ−ｆｗｄ及びｐＴＤ−ｒｅｖ）、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及び各種濃度のｄＴＴＰ・ｄＵＴＰ混合溶液、１ｎｇ  鋳型プラスミド、および０．２５ユニットのＴａｑ２０００ ＤＮＡポリメラーゼである。増幅反応は、９５℃で１分間保温後、９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒の温度サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温することにより行った。
【００１７】
（２）エンドヌクレアーゼＶによるＤＮＡの断片化
上記（１）ｃ．で得られた各ＰＣＲ産物（各１．５μｇ）を精製後、１０ｍＭＨＥＰＥＳ‐ＫＯＨ（ｐＨ ７．４）、５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．５ｍＭ  塩化マンガン、０．５ユニットのエンドヌクレアーゼＶ（トレビジェン社製）中、３７℃で２４時間反応させた。反応液をキアゲン社製ＱＩＡｑｕｉｃｋキットにより精製し、３０μｌの水に溶解した。６０＊の試料に関し、一部（３μｌ）をアガロースゲル電気泳動により分離し、断片のサイズを見積もった（図２）。なお、図中Ｍレーンは、分子量マーカーついて行った泳動図である。  その結果、ｄＴＴＰ＝０．２ｍＭ、ｄＵＴＰ＝０ｍＭ条件下で得られたＤＮＡ試料では全長ＤＮＡのままであるが（レーン１）、ｄＴＴＰ＝０．１５ｍＭ、ｄＵＴＰ＝０．０５ｍＭ（レーン２），ｄＴＴＰ＝０．１ｍＭ、ｄＵＴＰ＝０．１ｍＭ（レーン３）とｄＵＴＰの濃度が高くなるにつれＤＮＡ断片長が短くなり，ｄＴＴＰ＝０．０５ｍＭ、ｄＵＴＰ＝０．１５ｍＭ条件下で得られたＤＮＡ断片試料が２００〜４００ｂｐの断片サイズを与え（図２，レーン４）、このＤＮＡ断片試料を用いて以下のＤＮＡ シャフリング実験を行った。
【００１８】
（３）ＤＮＡシャフリング
上記（２）で得られたレーン４に対応するＤＮＡ断片試料を用い、ＰＣＲ反応によるＤＮＡシャフリングを行った。反応溶液の組成は、１０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ ８．３）、５０ｍＭ  塩化カリウム、１．５ｍＭ  塩化マグネシウム、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、各変異体のＤＮＡ断片各０．５μg、および０．２５ユニットのＴａｑ２０００ ＤＮＡポリメラーゼである。増幅反応は、９５℃で１分間保温後、９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒の温度サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温することにより行った。
【００１９】
【実施例２】
（１）ＤＮＡシャフリング産物から全長遺伝子の増幅
上記（２）で得られたＤＮＡシャフリング産物から全長遺伝子を再増幅するため、ＧＦＰ遺伝子をはさむプライマーを用いてＰＣＲを行った。反応溶液の組成は、１０ｍＭ  トリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ ８．３）、５０ｍＭ  塩化カリウム、１．５ｍＭ  塩化マグネシウム、各２５μＭ  プライマー（ｐＴＤ−ｆｗｄ及びｐＴＤ−ｒｅｖ）、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、上記（３）で得られた反応溶液１μｌ、および０．２５ユニットのＴａｑ２０００ ＤＮＡポリメラーゼである。増幅反応は、９５℃で１分間保温後、９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒の温度サイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃で５分間保温することにより行った。
【００２０】
（２）ライブラリの構築とスクリーニング
得られた増幅断片を精製し、制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断した。同様に、ｐＴＤ−ｔａｃＮｄベクターに関しても同様の制限酵素で消化し、両ＤＮＡ断片をライゲーション反応により連結させた。
反応液の一部をエシェリシア コリーＪＭ１０９のコンピテントセルに導入し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び０．５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含むＬＢ寒天プレート上、３７℃で１６時間培養しコロニーを形成させた。形成したコロニー数を白色光下で計測し、また緑色蛍光を発するコロニー数を３６５nmの紫外線を照射し計測した。その結果、全１００クローンのうち、１０個が蛍光性であった。
【００２１】
（３）ＤＮＡシャフリングライブラリーにより得られた蛍光性クローンの塩基配列
（２）で得た蛍光性コロニー１０個を培養し、定法によりプラスミドを精製し、定法によりＧＦＰ遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、蛍光性コロニーのいずれにおいても６０番目、１２０番目の位置に終止コドンを含まない全長のＧＦＰｕｖ遺伝子をコードするものであった。すなわち、ＤＮＡシャフリングの基質として用いた終止コドンを含む遺伝子はもともと存在した終止コドン間で組換わっており、ＤＮＡシャフリングが行われていることが判明した。
【００２２】
【発明の効果】
従来、ＤＮＡ シャフリングにおける遺伝子ＤＮＡの断片化工程においては、基質特異性の低いデオキシリボヌクレアーゼによる方法がよく用いられているが、この方法では、反応に関わるさまざまな因子（デオキシリボヌクレアーゼＩの酵素量、基質ＤＮＡの純度や濃度、反応温度、反応時間）を正確に制御し、適当な反応時間で反応を集結させ部分分解産物を取得する必要があった。これに対して、本発明は、ＤＮＡ シャフリングにおける遺伝子ＤＮＡの断片化工程において、遺伝子ＤＮＡの塩基配列中、チミンをウラシルに所定の量置換させた後、エンドヌクレアーゼＶを作用させ、置換されたウラシル部位の２−３塩基下流において該ＤＮＡを切断して、ＤＮＡ断片試料を得るものであり、基質を消費した段階で反応が終結するため、完全消化により断片化がおこなわれ、反応の最適条件の検討や反応の進行状況のモニターの必要がないものであり、得られるＤＮＡ断片試料の分子長の分布状態は、ウラシルの置換量を制御することにより行うものであり、極めて簡便な操作でよく、しかも再現性が良好なものである。
【００２３】
【配列表】
2007129902.tif 000002
2007129902.tif 000003
2007129902.tif 000004
2007129902.tif 000005
2007129902.tif 000006
2007129902.tif 000007
2007129902.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例における実験系の概略を示す図である。
【図２】ウラシル置換量が各々異なるＧＦＰ遺伝子ＤＮＡを、エンドヌクレアーゼＶにより切断して得られたＤＮＡ断片試料の電気泳動図である。
【図１】
2007129902.tif 000009
【図２】
2007129902.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成18年9月21日(2006.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡの塩基配列中、チミンをランダムにウラシルで置換した後ＤＮＡに、エンドヌクレアーゼＶを作用させて完全消化し、得られたＤＮＡ断片試料から未分解産物の分離操作を行うことなく、該断片化試料を用いて、ＰＣＲによるＤＮＡシャフリングを行うことを特徴とする、ＤＮＡシャフリング方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
すなわち、本発明は、以下のとおりのものである。
ＤＮＡの塩基配列中、チミンをランダムにウラシルで置換した後ＤＮＡに、エンドヌクレアーゼＶを作用させて完全消化し、得られたＤＮＡ断片試料から未分解産物の分離操作を行うことなく、該断片化試料を用いて、ＰＣＲによるＤＮＡシャフリングを行うことを特徴とする、ＤＮＡシャフリング方法。