(57)【要約】【課題】      従来の方法に代わる、簡易・迅速でかつコストを低減し得る抗酸化力（活性酸素消去能力）の測定方法及びそのための測定装置を開発する。【解決手段】      電気化学発光を利用して被検物による活性酸素の消去量の定量を行うことを基本とする抗酸化力評価方法ならびに評価装置を開発する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質の抗酸化力を評価するため、該被検物質の一定量を含む液体に所定量の過酸化物等の活性酸素若しくは活性酸素発生源を添加し、該被検物質が活性酸素を消去する能力を測定する方法において、被検物質の一定量を含む液体に所定量の過酸化物等の活性酸素若しくは活性酸素発生源を添加し、これに試薬を加えたものに電気化学発光（電極反応に発光を伴う現象）を生起させ、発光強度を測定して該被検物質が活性酸素を消去する能力を評価することを特徴とする抗酸化力評価方法。
【請求項２】
請求項１記載の抗酸化力評価方法において、添加する過酸化物が過酸化水素であり、添加する試薬がルミノールであり、測定時に測定対象液体のｐＨ値が７．５〜９．５、好ましくは８．０〜９．０に保持されることを特徴とする抗酸化力評価方法。
【請求項３】
請求項２記載の抗酸化力評価方法において、添加する過酸化水素濃度及びルミノール濃度が１０〜１００μＭ／ｌ、好ましくは４５〜５５μＭ／ｌであることを特徴とする抗酸化力評価方法。
【請求項４】
請求項１〜３記載の抗酸化力評価方法の何れかにおいて、測定のための液体容器として、体積１０００μｌ〜５０μｌの容器中に作用電極（電気化学反応を起こし、電気化学発光を生起させるための電極）、対電極（作用電極との間に電位差を設け、電流を流すための電極）及び参照電極（液中において一定の電位を示す基準電極）を設置した微小電気化学セルを使用することを特徴とする抗酸化力評価方法。
【請求項５】
請求項４記載の作用電極がグラッシーカーボンであり、対電極が白金線であり、参照電極が銀線若しくは銀線表面が塩化銀で修飾されたものであることを特徴とする抗酸化力評価方法。
【請求項６】
請求項１〜５記載の抗酸化力評価方法の何れかのための、電気化学発光部、発光制御（電極電位制御）部、測光デバイス、計測値処理部、オートサンプラー、添加剤（過酸化物及び試薬）タンク、添加剤供給・混合・液流制御装置及び液体試料流路等により構成される、連続自動測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】近時、生体内活性酸素が健康上の危険因子として注目され、これを消去する能力、即ち抗酸化力を持つ食品に関心が集まりつつある。本発明は、この抗酸化力を評価するための測定方法及び測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】抗酸化力の測定方法の原理は、生体内活性酸素に被検物質を作用させ、その結果どの程度活性酸素が消去されたかを測定して、被検物質の抗酸化力の評価基準とするものである。これらは、大別してａ．被検物質を生体内に入れ、その結果生体と活性酸素との反応にどのような変化を生じたかを測定するもの（例えば特許文献１，２，３）と、ｂ．被検物質を活性酸素（活性酸素モデル物質）に添加し、どの程度活性酸素が消去されるかを測定するもの（例えば特許文献４，５，６）に分類されるが、測定の容易さの点で、多くは後者の方法が採用されている。【０００３】健康障害の原因となる活性酸素（酸素ラジカル）としては、スーパーオキシド、スーパーオキシドアニオンラジカル、一重項酸素、過酸化水素及びヒドロキシラジカルがあり、これらの存在量を測定する手段としては、例えば電子スピン共鳴法は直接スーパーオキシドアニオンラジカルを測定することが出来るが、装置が高価・操作が煩雑・精度が粗といった欠点が指摘されている（非特許文献１）。このため、近時一般に用いられるのは化学発光法であって、発光物質を活性酸素に添加して化学的に発光させ、発光強度によって活性酸素の定量を行うものである（特許文献５、非特許文献２，３）。ただし、化学的な発光は発光物質とスーパーオキシドとの反応で起きるので、この方法では、活性酸素のモデルとして特殊な酵素系でスーパーオキシドを発生させ、これに被検物質を添加して、スーパーオキシドの消去量を測定する。このため、試薬が高価かつ取り扱いが煩雑であることに加えて、介在物質による妨害を受けやすい等の欠点がある。また、より簡易な方法としては試薬による発色の度合を吸光度によって測定する方法が一般に行われているが、高い精度は期待出来ず、介在物質の影響を受けやすい。（特許文献４、６）。【０００４】一方、最近研究が進みつつある電気化学発光（電極反応に発光を伴う現象）は、液中で電極間に電流を流した時、電極表面での反応に発光を伴う現象であり、介在物の影響が少なく、蛍光分析に比べても極めてバックグラウンドが小さいことから、種種の高感度分析への応用が期待されている（非特許文献４）。
【特許文献１】特開２００５−５２２３２
【特許文献２】特開２００４−２３３１６２
【特許文献３】特開２００３−３１５３２７
【特許文献４】特開２００６−６４６３０
【特許文献５】特開２００４−２５１８７０
【特許文献６】特許第３１１００１７号
【非特許文献１】Ｍ．Ｈｉｓａｍａｔｓｕ他：ＪＥＯＬ  ＮＥＷＳ２３Ａ，ｐ．７（１９８７）
【非特許文献２】小林：ＯＰＴＲＯＮＩＣＳ，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１２，ｐ．１３９
【非特許文献３】フナコシ試薬ニュース２００５．２．１５号，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎａｋｏｓｈｉ．ｃｏ．ｊｐ
【非特許文献４】Ｊ．Ｊｉｎ他：Ａｎａｌ．Ｓｃｉ．Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１，ｐ．２０５（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】従来の方法に代わる、簡易・迅速でかつコストを低減し得る抗酸化力測定方法及びそのための測定装置を開発する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】本発明者は、電気化学発光の研究を進める過程において、これが抗酸化力の測定に有力な手段を提供するものであることを見出し、以下のごとき発明を行った。
（１）被検物質の抗酸化力を評価するため、該被検物質の一定量を含む液体に所定量の過酸化物等の活性酸素若しくは活性酸素発生源を添加し、該被検物質が活性酸素を消去する能力を測定する方法において、被検物質の一定量を含む液体に所定量の過酸化物等の活性酸素若しくは活性酸素発生源を添加し、これに試薬を加えたものに電気化学発光（電極反応に発光を伴う現象。以下、ＥＣＬと略記）を生起させ、発光強度を測定して該被検物質が活性酸素を消去する能力を評価することを特徴とする抗酸化力評価方法。
（２）（１）記載の抗酸化力評価方法において、添加する過酸化物が過酸化水素であり、添加する試薬がルミノールであり、測定時に測定対象液体のｐＨ値が７．０〜９．５、好ましくは８．０〜９．０に保持されることを特徴とする抗酸化力評価方法。
（３）（２）記載の抗酸化力評価方法において、添加する過酸化水素濃度及びルミノール濃度が１０〜１００μＭ／ｌ、好ましくは４５〜５５μＭ／ｌであることを特徴とする抗酸化力評価方法。
（４）（１）〜（３）記載の抗酸化力評価方法の何れかにおいて、測定のための液体容器として、体積１０００μｌ〜５０μｌの容器中に作用電極（電気化学反応を起こし、ＥＣＬを生起させるための電極）、対電極（作用電極との間に電位差を設け、電流を流すための電極）及び参照電極（液中において一定の電位を示す基準電極）を設置した微小電気化学セルを使用することを特徴とする抗酸化性評価方法。
（５）（４）記載の作用電極がグラッシーカーボンであり、対電極が白金線であり、参照電極が銀線若しくは銀線表面が塩化銀で修飾されたものであることを特徴とする抗酸化性評価方法。
（６）（１）〜（５）記載の抗酸化力評価方法の何れかのための、電気化学発光部、発光制御（電極電位制御）部、測光デバイス、計測値処理部、オートサンプラー、添加剤（過酸化物及び試薬）タンク、添加剤供給・混合・液流制御装置及び液体試料流路等により構成される、連続自動測定装置。
【発明の効果】
【０００７】従来の化学発光法に比べて、試薬が安価であり、操作が容易で迅速な抗酸化力測定が可能な方法の確立により、活性酸素による健康阻害の機作の解明・予防面に大きな寄与が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】第１の実施の形態：第１の実施の形態は、（１）に述べた如く、被検物質の抗酸化力を評価するため、一定量の該被検物質を含む液体に所定量の過酸化物等の活性酸素若しくは活性酸素発生源を添加し、該被検物質が活性酸素を消去する能力を測定する方法において、被検物質及び過酸化物を含む液体試料にＥＣＬのための試薬を添加し、該液試料体中に設置された作用電極及び対電極間に電位差を与え、作用電極面でＥＣＬを生起させてその強度を測定し、この測定値と該被検物質を添加しない時のＥＣＬ強度の測定値との差をもって該被検物質の抗酸化力の評価指標とするものである。活性酸素モデルとして添加される過酸化物若しくは活性酸素発生源及びＥＣＬのために添加される試薬は特に一定されず、目標とするＥＣＬが生起される組み合わせであればよい。ＥＣＬの発現機構は関連する化学種によっては必ずしも完全に解明されていないが、活性酸素と試薬とが電極表面で酸化され、活性酸素と試薬双方の酸化物中間体の間の反応によって発光が生起するものと考えられる。作用電極表面での酸化は該電極の電位によって制約されるので、該電位を当該化学種に適した値に制御することによって、当該化学種以外の介在物が発光に関与する機会を排除し、測定精度を向上させることが可能である。電極電位の制御は通常参照電極を基準とし、これと電極との間の電位差が所定値を保持するよう、ポテンシオスタットによって制御される。参照電極としては、一般の電気化学計測においては銀塩化銀電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）や飽和カロメル電極（ＳＣＥ）が用いられることが多いが、ＥＣＬ測定においては銀線（若しくは銀線表面に修飾を加えたもの）を参照電極として用い、電極電位を精度よく制御できる。銀線は銀塩化銀電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）や飽和カロメル電極（ＳＣＥ）に比べて著しく小型化することが可能なので、ＥＣＬセル全体を微小化できることや電極の保守が簡単になるなどの利点を有する。【０００９】第２の実施の形態：第２の実施の形態は、（２）及び（３）に述べた如く、ＥＣＬを利用して被検物質の抗酸化力を測定する方法において、過酸化物として過酸化水素を、ＥＣＬのために添加される試薬としてルミノール（３−アミノフタノール酸ヒドラジッド：ルミノールは強アルカリ性環境で金属イオンが存在すると青色の化学発光を起こすが、中性環境では発光しない）を使用するものである。前項に述べた如く、本方法で使用される過酸化物及び試薬は特に一定されるものではないが、広く使用されるためには入手しやすく、安価で安定した発光を示すものが望ましい。過酸化水素及びルミノールは共に容易に市販品として入手出来、安全で取り扱いやすく、高感度で安定した発光を示す（発光波長４３０ｎｍ）。発光強度は過酸化水素濃度０〜０．１μＭ／ｌの範囲において酸化水素濃度との間に良好な直線性を示し（図１）、高い再現性を有する。ルミノールと過酸化水素とによるＥＣＬの機構は未解明の部分があり、如何なる理論にも拘束されることを好むものではないが、一つの考え方として、ルミノールが電極表面で酸化されてアザセミキノンを生じ、過酸化水素が同じく電極表面で酸化されて生じるスーパーオキシドラジカルと反応して３−アミノフタレイトジア���オンが生成し、同時に光子が放出されて発光が起きるとされる。この方法において、ＥＣＬが他の発光機構と重複せず、かつ十分な強度の発光が得られるためには、測定時の液体試料のｐＨが一定範囲（７．５〜９．５、好ましくは８．０〜９．０）にあることが重要であって、このため、被検物質、過酸化水素及びルミノールが添加される液体としては緩衝作用のあるもの、例えば炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム系緩衝液等が用いられる。また、添加される過酸化水素及びルミノールは共に少量で十分な発光強度が得られ、過大な添加量では反って安定な発光が阻害されるので、適当な濃度範囲を選ぶ必要があり、その範囲としては過酸化水素・ルミノールとも１０〜１００μＭ／ｌ、好ましくは４５〜５５μＭ／ｌである。【００１０】第３の実施の形態：第３の実施の形態は、（３）及び（４）に述べた如く、微量試料に対応するため、極めて容量の小さい試料液体容器（電気化学セル）を使用するものである。容器には通常作用電極、対電極及び参照電極を設け、作用電極面に正対して発光強度測定のための光デバイスを設置する。図２に示した１例は容量約１００μｌの台形若しくは円錐台形のＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）製容器に、直径約１ｍｍのグラッシーカーボン作用電極、白金線対電極及び塩化銀で修飾された銀線の参照電極を設け、電極面に対向して光ファイバー（５００μｍφ）を設置してＥＣＬの光を外部の光電子倍増管等の光測定デバイスに導く形式のものである。容器形状は特に限定されず、目的に応じて設計される。図３ａには連続測定のため薄層状の空隙に被測定液を流す形式の一例を示す。この場合には、参照電極は容器外部に容器と液路によって連接する適宜の個所に設置される。図３ｂは、構造を簡易化するため、図３ａの対電極を省略し、液体試料流路の一部をステンレス管とし、これを対電極するものである。薄層状の空隙は、必要な容積に対応する孔を設けたけたテフロンフィルムをスペーサーとして上下ブロック間に挿入する等の方法で容易に作ることが出来る。【００１１】第４の実施の形態：第４の実施の形態は、（４）に述べた如く、ＥＣＬを利用した抗酸化力の測定を連続的に自動で行うための装置であって、電気化学発光部、発光制御（電極電位制御）部、測光デバイス、計測値処理部、オートサンプラー、添加剤（過酸化物及び電気化学発光物質）タンク、添加剤供給・混合・液流制御装置及び液体試料流路等により構成される。構成の一例を図４に示す。本例では、電気化学発光部には、図３ａに示した連続測定容器を使用している。
【実施例】
【００１２】実施例１、ルミノール／過酸化水素系におけるＥＣＬ挙動：図２に示した微小電気化学セルを用い、１００μｌの０．１ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）に、それぞれ濃度が５０μＭ／ｌになるようルミノールと過酸化水素とを添加した試料について電極電位とＥＣＬ強度との関係を求めたところ、電極電位０．６Ｖ付近（ルミノール酸化電位）で発光が観測され、そのスペクトルはルミノールの化学発光に特有のもの（波長４２５ｎｍ）と一致した。（図５）【００１３】実施例２、アスコルビン酸の抗酸化力：抗酸化物質のモデルとしてアスコルビン酸を用い、その濃度とＥＣＬ強度との関係を測定した。実施例１と同様の方法を用い、ルミノール／過酸化水素系にアスコルビン酸をそれぞれ濃度０、１ｍＭ／ｌ、２ｍＭ／ｌ及び３ｍＭ／ｌとなるように添加して、各々の場合のＥＣＬ強度（ピーク値）を、で測定した結果、それぞれ９６０ａｒｂ．ｕ．、５００ａｒｂ．ｕ．、１９０ａｒｂ．ｕ．及び９０ａｒｂ．ｕ．であって、アスコルビン酸が共存するとＥＣＬ強度は著しく減少し、その減少幅はアスコルビン酸濃度と一定の関係があることが認められた。このことはＥＣＬ強度の測定により抗酸化剤の存在の検出が可能であることを示すものである。【００１４】実施例３、ニンニクの抗酸化力の評価：通常のニンニク及び麹発酵処理を施したニンニクついて、実施例２と同様の方法でＥＣＬ強度の測定を行った。各々の抽出液１０μｌを別個にルミノール／過酸化水素系に添加してＥＣＬ強度を測定した結果を図６に示す。ニンニクの存在によってＥＣＬ強度は減少し、ニンニクに抗酸化力があること、酵素処理によって抗酸化力が増加することが認識され、本測定法が有効なものであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００１５】本測定法は簡易かつ高精度で操作も易しく、容易に自動化されるので、関係方面での広範囲な利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＥＣＬ強度と過酸化水素濃度との直線関係を示す測定結果である。
【図２】ＥＣＬ強度の測定に使用する微小容量容器の１例を示す模式図である。
【図３ａ】ＥＣＬ強度の連続測定に使用する微小容量容器の１例を示す模式図である。
【図３ｂ】ＥＣＬ強度の連続測定に使用する微小容量容器の１例を示す模式図である。
【図４】本方法による連続自動測定装置の構成の１例を示す概念図である。
【図５】過酸化水素のＥＣＬ強度と電極電位との関係を示す測定結果である。
【図６】ニンニクの抗酸化力（ＥＣＬ強度の減少効果）の測定結果である。
【符号の説明】
【００１７】  １    対電極（白金線）
２    作用電極（グラッシーカーボン）
３    参照電極（塩化銀修飾銀線）
４    容器容量部
５    ＰＥＥＫ製ブロック
６    光ファイバー
７    光電子倍増管
８ａ  対電極
８ｂ  対電極（ステンレス管）
９    石英窓
１０    作用電極
１１    参照電極
１２    薄層型容器容量部
１３    被検液入口（テフロン管）
１４    被検液出口（テフロン管）
１５    計測値処理部（ＰＣ等）
１６    測光デバイス（光電子倍増管等）
１７    電気化学発光部（薄層型電気化学セル）
１８    参照電極（塩化銀修飾銀線）
１９    添加剤供給・混合・液流制御装置（送液ポンプ、液体計量・混合バルブ等）
２０    発光制御（電極電位制御）部（ポテンシオスタット等）
２１    オートサンプラー
２２    添加剤（ルミノール等）タンク
２３    添加剤（過酸化水素等）タンク
２４    ドレンバルブ
２５    添加剤（過酸化水素等）流路（テフロン管）
２６    添加剤（ルミノール等）流路（テフロン管）
２８    被検物質流路（テフロン管）
２９    ＥＣＬ被測定液流路（テフロン管）
３０    光計測用電気ケーブル
３１    発光制御（電極電位制御）用電気ケーブル
３２    酵素処理ニンニク抽出液添加時のＥＣＬ強度
３３    通常ニンニク抽出液添加時のＥＣＬ強度
３４    ブランク（無添加）のＥＣＬ強度
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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