(57)【要約】【課題】同一検体中の多種類の物質を同時に検出することを可能とする新規かつ斬新なマイクロ流体デバイスを提供すること。【解決手段】被検物質を移送するための第１のマイクロチャネルと、ラベル化のための機能性微粒子を移送するための第２のマイクロチャネルと、該第１のマイクロチャネルと、第２のマイクロチャネルとが合流する合流前記機能性微粒子を軌跡の相違によって分級する分級チャンバーと、部と、該合流部から延設した被検物質と前記機能性微粒子とを移送しつつ結合させるための第3のマイクロチャネルと、該第3のマイクロチャネルよりも幅広で、被検物質が結合した状態の前記第１のマイクロチャネルと連結した酵素固定チャンバー１又は複数と、を含むマイクロ流体チップ。【選択図】  図４
2007121103.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質を移送するための第１のマイクロチャネルと、
ラベル化のための機能性微粒子を移送するための第２のマイクロチャネルと、
該第１のマイクロチャネルと、第２のマイクロチャネルとが合流する合流前記機能性微粒子を軌跡の相違によって分級する分級チャンバーと、部と、
該合流部から延設した被検物質と前記機能性微粒子とを移送しつつ結合させるための第3のマイクロチャネルと、
該第3のマイクロチャネルよりも幅広で、被検物質が結合した状態の
前記第１のマイクロチャネルと連結した酵素固定チャンバー１又は複数と、を
含むマイクロ流体チップ。
【請求項２】
前記酵素固定チャンバーの周囲壁面の少なくも一部に酵素がエレクトロンスプレーデポジション法（ESD法）にて固定されている請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項３】
前記酵素は、肝細胞において薬物代謝に関与する酵素である請求項２に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項４】
被検物質を移送するための第１のマイクロチャネルと、
前記第１のマイクロチャネルと連結した酵素固定チャンバー１又は複数と、を
含むマイクロ流体チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体チップに関し、検出タグとして、機能性微粒子を用いたマイクロ流体チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロ流体デバイスの開発が盛んである。マイクロ流体デバイスを使った、生体成分の検出や、環境成分の検出を行おうと目指すものである。極微量で、高感度分析が可能であるという利点、装置の小型化が可能であるという利点など数多くの利点がある。開発が盛んな背景には、従来から培われてきたMEMSの技術を技術の境界を越えて、医療、バイオ、分析の分野でも活かし、次世代の分析デバイス、検査デバイスの開発につなげようという動きがあるからである。
【０００３】
MEMSの技術を使うと、小さなチップ上に所望のパターンにマイクロチャネルを形成したマイクロ流体チップを簡単に作製することができ、用途に応じて、様々な設計が可能である。
その一例として、アレイ状にマイクロチャネルを形成し、その内側壁面に抗体を予めコートしておき、被検体との抗体―抗原反応によるELISA法と類似の原理で迅速・高感度に多サンプルを検出しようとするシステムも開発されている。また、他の例として、マイクロチャネル内に堰止め構造を形成し、ここに抗体でコートした微粒子を予め配置して或いは機械的に出し入れすることで配置し、ELISA法と類似の方法乃至他の光学的な手法で検出しようとするシステムも開発されている。
【特許文献１】特開2005-257597号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記いずれの技術及びその他の多くの取り組まれているマイクロ流体チップでは、基本的には、迅速・高感度に検出が可能であるとされるものだが、他のサンプルとの同じ被検体に混在する多種の物質を同時に高感度に検出する用途としては、不十分な点が多い。詳しくは、チャネル毎にひとつの物質しか検出できないことから、多種を検出しようとするとその物質数分のマイクロチャネルを形成しなければならなくなる。とすると、多数の検体を同時に調べる上では、自ずと限度が生まれる。また、構造的に類似した物質を検出する場合に、その違いを認識しにくく、包括的な値として検出され、有害な物質がない場合でもあるとして検出される誤検出の可能性も残る。
【０００５】
ところで、薬物動態を検査にこのようなマイクロ流体チップを利用できないか発明者らは提案してきた。この提案は、マイクロ流体チップに薬物の代謝を行う肝細胞（ヒト由来、動物由来いずれでも可）を固定しておき、そこに薬物を循環させて代謝生成物を検出するというものである。検出は、特に限定しないが、例えば、金ナノ微粒子の光学的な特性を利用できるというものである。しかし、この提案には、大きな問題がある。それは、細胞の活性を一定期間維持した状態でかつ増殖を適度に抑制させて固定することが難しいことである。このため、実現するにはいたっていない。このように、未だ、オンチップで薬物動態をモニタできるマイクロ流体チップは存在しない。
【０００６】
本発明は、このような問題点等に鑑みてなされ、同一検体中の多種類の物質を同時に検出することを可能とする新規かつ斬新なマイクロ流体デバイスであって、薬物動態をオンチップでモニタできる画期的なチップを提供することを目的としてなされた発明である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、
（１）被検物質を移送するための第１のマイクロチャネルと、
ラベル化のための機能性微粒子を移送するための第２のマイクロチャネルと、
該第１のマイクロチャネルと、第２のマイクロチャネルとが合流する合流部と、
該合流部から延設した被検物質と前記機能性微粒子とを移送しつつ結合させるための第3のマイクロチャネルと、
該第3のマイクロチャネルよりも幅広で、被検物質が結合した状態の前記機能性微粒子を軌跡の相違によって分級する分級チャンバーと、
前記第１のマイクロチャネルと連結した酵素固定チャンバー１又は複数と、を
含むマイクロ流体チップ、
（２）前記酵素固定チャンバーの周囲壁面の少なくも一部に酵素がエレクトロンスプレーデポジション法（ESD法）にて固定されている（１）に記載のマイクロ流体チップ、
（３）  前記酵素は、肝細胞において薬物代謝に関与する酵素である（２）に記載のマイクロ流体チップ、
とした。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、
（１）被検物質を移送するための第１のマイクロチャネルと、ラベル化のための機能性微粒子を移送するための第２のマイクロチャネルと、該第１のマイクロチャネルと、第２のマイクロチャネルとが合流する合流部と、該合流部から延設した被検物質と機能性微粒子とを移送しつつ結合させるための第3のマイクロチャネルと、該第3のマイクロチャネルよりも幅広で、被検物質が結合した状態の機能性微粒子を軌跡の相違によって分級する分級チャンバーと、第１のマイクロチャネルと連結した酵素固定チャンバー１又は複数と、を含むマイクロ流体チップ、としたので、酵素反応による生成物と基質とをを同時に検出することを可能とする。つまり、このチップでは、被検物質が付着した機能性微粒子がサイズの違いによってその移送の軌跡を異として分離されるので、同時に被検体中に多くの被検物質が存在した場合でも、粒子サイズ毎に光学的な特性の相違を生じるので、被検物質をひとつのマイクロチャネル内で、同時に検出することが可能となる。
【０００９】
また、上記本発明において、分級チャンバーが、第３のマイクロチャネルを中心部分として同程度の幅広がったチャネル幅を有すれば、分級を確実に行うことができる。  つまり、第３のマイクロチャネルが中央部にないと、一方の側壁での流れがチャンバー全体の流れに影響を及ぼし、分級がうまくいかない可能性が高くなる。また、第３のマイクロチャネルとチャンバーの位置関係が一方の側面において面一であると、壁に沿って一つの流れに沿って移送される可能性も高くなり、分級されるにいたらないが、第３のマイクロチャネルが中央部にあると、分級を確実行うことができる。。また、中心部を軸として対象にチャンバー幅を規定することで、左右対称の検出結果を平均するなどして、検出の信頼性を高めることが可能となる。
【００１０】
また、上記本発明において、機能性微粒子が、粒子のサイズ又はその凝集体のサイズによって、光学的特性を異にすれば、高感度な検出を可能とする。詳しくは、粒子サイズにより光学的特性を異にする蛍光体微粒子（CdSe、SiO2など）、金ナノロッド（ロッドのアスペクト比などの相違により特性を異にする）など、また、凝集状態の相違により光学的特性を異にする貴金属ナノ粒子（金、銀など）を用いて、高感度検出を実現することができる。このように、サイズにより光学的特性の異なる機能性微粒子を用いるので、類似物質の検出も精度良く行うことができる。つまり、違うサイズの機能性微粒子に類似物質も含めた被検物質が同様に結合すると、その光学的な特性が異なるため、同じサイズの機能性微粒子だけでは分からない類似物質の判別を行うことが可能となる。
【００１１】
また、上記本発明のマイクロ流体チップにおいて、分級チャンバーにて分級された前記機能性微粒子を並列的に光学的検出に供すれば、並列検出が可能となる。
また、本発明は、
（２）酵素固定チャンバーの周囲壁面の少なくも一部に酵素がエレクトロンスプレーデポジション法（ESD法；例えば、株式会社FUENCE製のESPLAYER（製品名）で実施可能）にて固定されている（１）に記載のマイクロ流体チップ、としたので、酵素を強固にかつ失活させることなく基板に固定させることができる。また、反応表面積の大きな状態に固定できるので、反応効率が極めて高いという利点もある。なお、酵素固定は、特筆する場合を除き、純度の高い単一のものでもいいし、ミクスチャーでもいいし、細胞、組織などの状態のままであっても良い。
【００１２】
また、本発明は、
（３）  前記酵素が、肝細胞において薬物代謝に関与する酵素である（２）のマイクロ流体チップ、としたので、チップ上で薬物動態をモニタすることが可能である。
薬物動態は通常、シャーレで培養した肝細胞を使って調べるが、上記本発明の方法で酵素のみを固定する方法をとった場合、特定の酵素による分解を検査する点で、肝細胞を使って調べる方法と比べて機能面で劣ると思われる。また、ヒト肝細胞を有する動物が開発され、この系であれば、動物によりヒトを想定した薬物動態の実験をすることができるという利点があるのに対して、本発明の方法では、特定の酵素での動態しかわからない。しかし、肝細胞を使った検査ではコストがかなりかさむことから、本発明の方法で予備的に薬物動態実験にかける薬剤をスクリーニングできれば、全体としてのコスト低減につながると思われる。一方、酵素の固定方法として、代謝酵素を含む肝細胞（ヒト由来、動物由来いずれでも可）を固定する場合には、上記のような問題点はないが、細胞の活性を維持しつつ増殖を抑制することが一般には難しい。本件では、培養液の組成の工夫や、チャンバーからマイクロチャネルに至る壁面乃至チャンバーの壁面を細胞がチャンバーよりも付着しにくいよう乃至チャンバーにより付着しやすいよう表面加工（プラズマ処理など）を施すこという工夫をすることによりこの問題点を克服して、代謝酵素を含む肝細胞を固定することに成功し、薬物動態をオンチップで実現した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
図１は、本発明に係るマイクロ流体チップ及びその周辺デバイスからなるマイクロ流体チップシステム１の構成を示すブロック図である。
この図に示すとおり、マイクロ流体チップシステム１は、マイクロ流体チップ１０と、送液手段２０と、検出手段３０と、制御手段４０とから構成されている。
送液手段２０は、シリンジポンプ、プランジャーポンプ、圧電素子を使用したマイクロポンプ、油圧式のポンプ何れでも使用でき、特に限定されるものではない。この送液手段は、被検物質を移送するための媒体を移送するための移送ユニットU1と、機能性微粒子を移送するための移送ユニットU2とからなる。各ユニットは、独立的に駆動する。
【００１４】
検出手段３０は、使用する機能性微粒子の光学的特性によって変わりえるが、蛍光検出器、ラマン散乱検出器、熱レンズ検出器などを用いることができる。
制御手段４０は、システムの動作を制御する部分であり、ユーザからの入力を受け付けるインターフェースとしても機能するよう通常市販のパソコンに制御用ソフトウェアをインストールしたものである。
【００１５】
さて、本システムの特徴は、マイクロ流体チップにある。図２は、その詳細図を示す。マイクロ流体チップ１０は、被検物質Sを移送するための第１のマイクロチャネル１０１と、ラベル化のための機能性微粒子Pを移送するための第２のマイクロチャネル１０２と、該第１、第２のマイクロチャネルとが合流する合流部１０３と、該合流部から延設した被検物質と前記機能性微粒子とを移送しつつ結合させて被検物質・微粒子結合体SPを生成するための第3のマイクロチャネル１０４と、該第3のマイクロチャネルを中心部分として同程度の幅W1、W2（W1=W2）相当広がった、被検物質が結合した状態の前記機能性微粒子（被検物質・微粒子結合体SP）を軌跡の相違によって分級する分級チャンバー１０５と、を第1の基板１０６上に備えている。第1の基板は、上面に封着用の第2の基板（不図示）で覆われて、液密に封着されている。
【００１６】
被検物質Sは、通常、血清、粗抽出物など被検体として様々な検査対象物質（被検物質）のミクスチャーとして移送され、検出に供される。ここで、以下の実施例にて述べるように、薬物の代謝に関与する酵素複数をそれぞれのチャンバー壁面の一部又は全体にコートしておき、この空間で薬物との酵素反応を行わせ、この反応生成物を被検物質として注入することも可能である。これにより、オンチップでの薬物動態のモニタリングが可能となる。
【００１７】
また、酵素としては、精製された酵素の他に、酵素を含む細胞を用いてもよい。この場合は、細胞がチャンバー壁面上で増殖しないようにしておくことが好ましい。
移送は、上記送液手段により媒体を介して行われるが、チャネルへの注入は、注入ポート１０１Pを通じて行われて、マイクロチャネル１０１の本流に混合することとなる。移送媒体は、純水、バッファー、有機溶剤など検体が安定する媒体であれば、何れでも使用することが可能である。
【００１８】
また、機能性微粒子の注入も同様であり、注入ポート１０２Pを通じて行われて、マイクロチャネル１０２の本流に混合することとなる。ここで、移送するための媒体は、機能性微粒子の種別により異なるが、微粒子の一つ一つの凝集状態を制御して、光学特性の違いを検出しようとする場合には、凝集制御用の媒体を用いることとなる。ここで、同じ機能性微粒子を同一の凝集制御媒体で異なる凝集状態（サイズ）に制御する手法として、機能性微粒子それぞれの表面をA群は、吸着力が大きくなるよう処理し（例えば、粒子表面に親水基あるいは疎水基を導入する）、B群は何も処理しないというような表面処理方法を異ならせることによって、同じ凝集制御剤を加えた場合でも凝集状態（サイズ）を異ならせることが可能となる。また、微粒子の全体ないし部分的に疎水面と親水面（ESD法にて）形成して、つまり、微粒子の表面処理を一定のパターンに形成して、凝集性を制御することができる。
【００１９】
合流部１０３は、形状として特に何れにも限定されるものではないが、Y字型、T字型、円筒型など様々なタイプのものを用いることができる（なお、図では、Y字型を図示）。
第3のマイクロチャネル１０４は、被検物質と前記機能性微粒子とを移送しつつ結合させて被検物質・微粒子結合体SPを生成するための空間であり、１）ストレート状として、被検物質の流れと、微粒子の流れとを層流状態として、その界面で結合を促進させる場合、２）  蛇行状として、被検物質の流れと、微粒子の流れとを乱流状態として、結合を促進させる場合、何れも適応可能である（図では、ストレート状を図示）。また、３〉微粒子を充填するか、壁面に微粒子を集積させるなどして形成した構造体をチャネル内に設け、乱流を発生させて結合を促進させることも可能である。結合が温度に依存するような場合には、４）  ペルチェ素子を上面にチャネルに沿って設け、加熱あるいは冷却するようにすることも可能である。
【００２０】
図３は、分級チャンバー１０５で粒子が分級される様子に示す図である。分級チャンバー１０５は、第３のマイクロチャネルよりも幅広であり、その両端に中心部からW1、W2（＝W1）と同等の幅広がったチャンバーとなっている。このように、第3のマイクロチャネルが中心にくるようにすることで、サイズの大きい粒子が中心部分を移動し、サイズが小さくなるにつれて、中心部から遠い位置を移動するというサイズの相違によって中心部を軸として放射状の軌跡を描いて微粒子が移送されることになる。つまり、サイズ、凝集状態の相違により軌跡が異なり、分級が行われることになる。
【００２１】
ここで分級された微粒子乃至その凝集体は、被検物質が結合した被検物質・微粒子結合体SPであり、この結合体SPは、光学的な特性が異なることから、同じ被検体中の多種の被検物質が微粒子を分級することによって並列的に検出されることとなる。
ここで、微粒子への被検物質の結合の選択性を粒子サイズ毎に異ならせるようにすることもできる。具体的には、粒子サイズ毎に表面処理方法（有機リガンド修飾、抗体修飾など）を変える方法が挙げられる。ある微粒子には、抗体Aをある微粒子には抗体Bを結合させておき、抗体の結合特異性を利用して、所望の物質のみを特異的に結合させるようにすることもできる。このようにした場合、抗原―抗体反応の生じた機能性微粒子の光学的な特性はその結合がない場合と比べて変化するので、検体中の対象物質の検出が可能となる。
【００２２】
また、ここで用いる抗体として、類似の構造を持つ物質のものを準備しておけば当然に類似物質を検出することが可能であるが、これは通常考えられる手段で簡便である反面、抗体は高価であるので、コスト的に見合わない場合が多い。一方、サイズにより光学的特性の異なる機能性微粒子を用いれば、違うサイズの機能性微粒子に類似物質も含めた被検物質が同様に結合しても、その光学的な特性が異なるため、同じサイズの機能性微粒子だけでは分からない類似物質の判別を行うことが可能となる。
【００２３】
上記したマイクロチャネル１０１、１０２、合流部１０３、マイクロチャネル１０４、分級チャンバーは一対でなく、複数対として、複数の検体を検査することとすれば、よりいっそう、効率的な検出が可能となる。
【実施例】
【００２４】
図４に、薬物動態を想定した実施例にかかるマイクロ流体チップの構造を示した。こ
の図のように、上記した構成に加えて、酵素が固定化されたチャンバー１０７を複数
備えている。ここで固定する酵素は、薬物代謝に関与する肝細胞（ヒト由来、動物由
来いずれでも可）に含まれている酵素である。例えば、薬物代謝酵素P450のファミ
リーには次のようなものがある。CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2B6,
CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP19。固定
化方法は、エレクトロンスプレーデポジション法が望ましい。この理由は上述のとお
りである。酵素の固定は、一つのチャンバーに単品毎、ミクスチャーで固定すること
もできる。また、酵素を含有する肝細胞を固定しても良い。なお、本実施例ではそれ
ぞれのチャンバー１０７に連通する循環ループ108を設け、酵素反応中、該ループに
て反応液を循環させることができる。これにより、反応生成物が酵素・細胞表面に蓄
積することがないという利点がある。
このチップは、チャンバー１０７に薬物を導入し、酵素反応を行わせた後、マイクロ
チャネルを通過して、検出タグでラベル化され検出タグの粒子径に応じて分級されて
検出に供される。このチップによれば、１又は複数の固定化酵素との反応物を同時に
検出に供するので、同時に複数の物質（複数の薬剤（基質）と複数の代謝生成物）を
高感度・迅速に検出することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明は、医療、バイオ、環境などの分野における微量成分の高感度・迅速・多サンプル検出に利用可能であり、新産業の創出に資するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】マイクロ流体チップシステム１の構成を示すブロック図である。
【図２】マイクロ流体チップ１０の詳細図である。
【図３】分級チャンバー１０５で粒子が分級される様子に示す図である。
【図４】、薬物動態を想定した実施例にかかるマイクロ流体チップの構造を示す図である。
【符号の説明】
【００２７】
１      マイクロ流体チップシステム
１０    マイクロ流体チップ
２０    送液手段
３０    検出手段
４０    制御手段
１０１  第１のマイクロチャネル
１０２  第２のマイクロチャネル
１０３  合流部
１０４  第3のマイクロチャネル
１０５  分級チャンバー
１０６  第1の基板
１０７  酵素固定チャンバー
【図１】
2007121103.tif 000003
【図２】
2007121103.tif 000004
【図３】
2007121103.tif 000005
【図４】
2007121103.tif 000006