(57)【要約】【課題】  小胞体ストレスを検出する新規な評価方法の提供。【解決手段】  小胞体ストレス依存的なフレームスイッチ型スプライシングを受けることによる、動物組織又は細胞において発現するスプライシングされたＸＢＰ１遺伝子の変化をin vitroで検出する方法を提供する。特に、ＸＢＰ１ ｍＲＮＡ配列のフレームスイッチ型スプライシングを受けるイントロン配列の５’上流の任意のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列から成るオリゴヌクレオチドプライマー及び当該イントロン配列の３’下流の任意のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列から成るオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを、ＸＢＰ１遺伝子をＲＴ−ＰＣＲで検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせとして使用することを特徴とする、上記の方法を提供する。【選択図】      図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
小胞体ストレス依存的なフレームスイッチ型スプライシングを受けることによる、動物組織又は細胞において発現するスプライシングされたＸＢＰ１遺伝子の変化をin vitroで検出する方法。
【請求項２】
ＸＢＰ１ ｍＲＮＡ配列のフレームスイッチ型スプライシングを受けるイントロン配列の５’上流の任意のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列から成るオリゴヌクレオチドプライマー及び当該イントロン配列の３’下流の任意のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列から成るオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを、ＸＢＰ１遺伝子をＲＴ−ＰＣＲで検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせとして使用することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＲＴ−ＰＣＲの際、前記動物組織又は細胞に由来するＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成した１本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡから任意のプライマーを用いて、当該１本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡに相補的なＤＮＡを合成し、当該１本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡとそれに相補的なＤＮＡとからなる２本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡの、ＸＢＰ１ ｍＲＮＡ配列のフレームスイッチ型スプライシングを受けるイントロン配列に対応する配列を任意の制限酵素で１ヶ所以上切断した後に、前記オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いてＰＣＲ反応を行うことを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
動物組織又は細胞を被験物質と既知小胞体ストレス誘発物質とにより一緒に処理し、小胞体ストレス依存的なフレームスイッチ型スプライシングを受けることによる、当該組織又は細胞において発現するスプライシングされたＸＢＰ１遺伝子の変化を指標に、当該被験物質が当該小胞体ストレス誘発物質の小胞体ストレス誘発活性を阻害又は活性化するかを決定することを含む、小胞体ストレス誘発物質の阻害物質又は活性化物質を評価又はスクリーニングする方法。
【請求項５】
ＸＢＰ１ ｍＲＮＡ配列のフレームスイッチ型スプライシングを受けるイントロン配列の５’上流の任意のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列から成るオリゴヌクレオチドプライマー及び当該イントロン配列の３’下流の任意のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列から成るオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを、ＸＢＰ１遺伝子をＲＴ−ＰＣＲで検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせとして使用することを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＲＴ−ＰＣＲの際、ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成した１本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡ由来の任意のプライマーを用いて、１本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡに相補的なＤＮＡを合成し、当該１本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡとそれに相補的なＤＮＡとからなる２本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡの、ＸＢＰ１ ｍＲＮＡ配列のフレームスイッチ型スプライシングを受けるイントロン配列に対応する配列を任意の制限酵素で１ヶ所以上切断した後に、前記オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いてＰＣＲ反応を行うことを特徴とする、請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小胞体ストレス誘発物質のin vitro 評価法、及び小胞体ストレスを活性化又は抑制する物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体においてタンパク質は、ＤＮＡからＲＮＡへの転写、リボゾームで翻訳合成され、さらに細胞小器官である小胞体で、タンパク質各々に固有の高次構造を形成して、初めてタンパク質としての機能を発揮することができる。小胞体では、多くの分子シャペロンタンパク質が存在しており、タンパク質の折りたたみにその機能を発揮している。このタンパク質の折り畳みが正常に機能している場合は問題ないが、外部からのストレスなどにより、タンパク質の折り畳みが正常に機能しない場合は、小胞体内に正常な高次構造を形成していない異常タンパク質が蓄積する。これが、いわゆる小胞体ストレスであり、細胞の強い負荷となる。
【０００３】
細胞が小胞体ストレスに陥った場合、細胞は、取るべき高次構造を形成できなかったタンパク質の分解、タンパク質の翻訳抑制、分子シャペロンタンパク質遺伝子の活性化による異常タンパク質の折り畳み促進などにより対応を図るか、アポトーシスによる細胞死を起こす。
【０００４】
このような小胞体ストレス応答の中で、異常タンパク質の折り畳み促進を担う分子シャペロンタンパク質遺伝子の発現は、ATF6（Activating transcription factor 6）とＸＢＰ１（X-box binding protein-1、以下、ＸＢＰ１と略）によって、転写制御を受けている。さらに、ＸＢＰ１は、小胞体ストレスのセンサータンパク質であるIRE1とATF6によって制御されている。この二つのタンパク質は小胞体膜に存在するが、小胞体ストレス状態になると、ＡＴＦ６タンパク質の一部が切断され、細胞質に遊離し、転写因子として機能する。そして、分子シャペロンタンパク質であるＧＲＰ７８やＧＲＰ９４、さらに転写因子ＸＢＰ１の発現を誘導する。一方、IRE1は小胞体ストレス状態になると、活性化し、ＲＮＡ切断酵素活性を持ち、この活性によりＸＢＰ１ ｍＲＮＡをフレームスイッチ型スプライシングという様式でスプライシングする。ＸＢＰ１ ｍＲＮＡは、このスプライシングにより転写因子活性をもつタンパク質をコードするようになり、分子シャペロンタンパク質の誘導をさらに協力に促進する。フレームスイッチ型スプライシングとは、スプライシングによりタンパク質の読み枠が変わり、新しいタンパク質が翻訳されるスプライシング形式である。ＸＢＰ１ ｍＲＮＡには、26bpのイントロンが存在し、小胞体ストレス状態に陥ると、活性化したＩＲＥのＲＮＡ切断酵素活性により、26bpのイントロンがスプライスアウトされ、これによりＸＢＰ１ ｍＲＮＡは転写因子活性をもつＸＢＰ１タンパク質をコードするようになる。
【０００５】
近年、小胞体ストレスがアルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患に関与する可能性が示唆されており、さらに、癌、虚血、糖尿病などのさまざまな疾患に関与する可能性も示唆されている。このような疾患に対して、診断または治療薬を探索するためのスクリーニング手段として、小胞体ストレスを測定することは重要と考えられる。
【０００６】
小胞体ストレスの指標は、いくつかあるが、小胞体ストレスのセンサータンパク質であるＩＲＥ、ＡＴＦ６、ＡＴＦ６、ＸＢＰ１、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４などが挙げられる。この中で、ＸＢＰ１は、ＡＴＦ６によって転写誘導され、さらにＩＲＥによってフレームスイッチ型スプライシングを受けることから、小胞体ストレスによるＩＲＥとＡＴＦ６のシグナル両方を反映する転写因子であると考えられる。
【０００７】
ＸＢＰ１を指標とする小胞体ストレスを検出する方法は、これまでにいくつか開発されているが、フレームスイッチ型スプライシングというＸＢＰ１ ｍＲＮＡの性質から、スプライシングされた ＸＢＰ１ ｍＲＮＡとunスプライシングされた ＸＢＰ１ ｍＲＮＡの区別することが難しく、どの組織でも測定でき、かつ簡便、定量的、さらに特異的に測定する方法は開発されていない。現在までに開発されている方法としては、レポーター遺伝子を用いた方法が知られているが、測定対照が遺伝子導入をする操作など、煩雑性に課題が残る。
【０００８】
【特許文献１】特開平１１−２４３９５９号公報
【特許文献２】特開２０００−１４３５３９号公報
【特許文献３】特表２００４−５２７２１３号公報
【特許文献４】特開２００４−３０９１８６号公報
【０００９】
【非特許文献１】S.H.Back et al., Methods 35 (2005) 395-416
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明は、スプライシングされた ＸＢＰ１遺伝子の変化を特異的・かつ簡便に検出する方法、及びスプライシングされた ＸＢＰ１遺伝子を指標として、小胞体ストレスをin vitroで評価する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の目的を達成するため、種々検討した結果、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現測定の方法において、ＰＣＲ反応操作段階の中に制限酵素処理を加えることで、スプライシングされた ＸＢＰ１遺伝子を特異的に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
従って、本発明は、以下の発明の態様を包含する。
（１）小胞体ストレス依存的なフレームスイッチ型スプライシングを受けることによる、動物組織又は細胞において発現するスプライシングされたＸＢＰ１遺伝子の変化をin vitroで検出する方法。
【００１３】
（２）ＸＢＰ１ ｍＲＮＡ配列のフレームスイッチ型スプライシングを受けるイントロン配列の５’上流の任意のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列から成るオリゴヌクレオチドプライマー及び当該イントロン配列の３’下流の任意のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列から成るオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを、ＸＢＰ１遺伝子をＲＴ−ＰＣＲで検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせとして使用することを特徴とする、（１）の方法。
【００１４】
（３）ＲＴ−ＰＣＲの際、前記動物組織又は細胞に由来するＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成した１本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡから任意のプライマーを用いて、当該１本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡに相補的なＤＮＡを合成し、当該１本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡとそれに相補的なＤＮＡとからなる２本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡの、ＸＢＰ１ ｍＲＮＡ配列のフレームスイッチ型スプライシングを受けるイントロン配列に対応する配列を任意の制限酵素で１ヶ所以上切断した後に、前記オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いてＰＣＲ反応を行うことを特徴とする、（２）の方法。
【００１５】
（４）動物組織又は細胞を被験物質と既知小胞体ストレス誘発物質とにより一緒に処理し、小胞体ストレス依存的なフレームスイッチ型スプライシングを受けることによる、当該組織又は細胞において発現するスプライシングされたＸＢＰ１遺伝子の変化を指標に、当該被験物質が当該小胞体ストレス誘発物質の小胞体ストレス誘発活性を阻害又は活性化するかを決定することを含む、小胞体ストレス誘発物質の阻害物質又は活性化物質を評価又はスクリーニングする方法。
【００１６】
（５）ＸＢＰ１ ｍＲＮＡ配列のフレームスイッチ型スプライシングを受けるイントロン配列の５’上流の任意のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列から成るオリゴヌクレオチドプライマー及び当該イントロン配列の３’下流の任意のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列から成るオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを、ＸＢＰ１遺伝子をＲＴ−ＰＣＲで検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせとして使用することを特徴とする、（４）の方法。
【００１７】
（６）ＲＴ−ＰＣＲの際、ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成した１本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡ由来の任意のプライマーを用いて、１本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡに相補的なＤＮＡを合成し、当該１本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡとそれに相補的なＤＮＡとからなる２本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡの、ＸＢＰ１ ｍＲＮＡ配列のフレームスイッチ型スプライシングを受けるイントロン配列に対応する配列を任意の制限酵素で1ヶ所以上切断した後に、前記オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いてＰＣＲ反応を行うことを特徴とする、（５）の方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、小胞体ストレスを検出する簡易な評価方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明において用いる動物の組織又は細胞は、小胞体ストレスの特性を反映して該組織及び細胞からＸＢＰ１遺伝子を発現するものであれば特に限定されない。
【００２０】
本発明の実施するに当たり、細胞を用いる場合、細胞を培養するための培地としては、これらの細胞を培養することができる常用の任意の培地を使用することができるが、例えば具体例としてRPMI1640培地、MEM培地、ダルベッコ改変イーグル培地等が挙げられる。これらの培地にはおよそ１０％程度のウシ胎児血清を添加することが必要な場合がある。
【００２１】
小胞体ストレス誘発物質の評価又はスクリーニングにおいては、細胞を用いる場合は、培地中の細胞に被験物質を加え、例えばＣＯ2インキュベーター中で、３７℃にて０．１〜７２時間培養（インキュベーション）を行う。細胞の初期濃度は１×１０5〜１×１０6細胞／mLが好ましい。この場合、好ましくは、被験物質を加えないで、上記の同様の培養を行い、対照とする。また、小胞体ストレスを阻害又は活性化する物質の評価又はスクリーニングにおいては、培地中の細胞に、既知の小胞体ストレス誘発物質と被験物質とを加えて、上記条件で培養（インキュベーション）を行う。この場合も、好ましくは、被験物質を加えないで上記と同様の培養を行い、対照とする。ヒト及び動物の組織を用いる場合は、経口、静脈等、一般的に用いられる投与経路により、被験物質を投与する。この場合は、被験物質を投与しない対照群を設けることが好ましい。
【００２２】
細胞を用いる場合、培養（インキュベーション）が終了した後、細胞からＲＮＡを抽出し、スプライシングされたＸＢＰ１分子を検出又は測定する。ヒト及び動物の組織を用いる場合は、測定が必要と判断される任意の器官よりＲＮＡを抽出し、スプライシングされたＸＢＰ１分子を検出又は測定する。ＸＢＰ１の検出又は測定方法は、細胞における遺伝発現を検出する定量的又は定性的ＲＴ−ＰＣＲ法、マイクロアレイ、ノーザンブロッティング等の方法やスプライシングされた ＸＢＰ１に対する抗体との反応性に基づくエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウスタンブロッティング等の方法を用いることができる。いずれの方法によってもＸＢＰ１の測定が可能であるが、操作の簡便性、感度、設備等の点から細胞から発現されたＸＢＰ−１分子を定性的または定量的ＲＴ-ＰＣＲ法で測定するのが好ましい。
【００２３】
ヒトスプライシングされたＸＢＰ１の発現の測定においては、上記の細胞を常法に従って破壊し、常法に従ってＲＮＡを調製し、このＲＮＡに対するｃＤＮＡを合成し、ＸＢＰ１（スプライシングされた形態、スプライシングされていない形態の両方）をコードする遺伝子に対して特異的なプライマーによるＰＣＲ反応を数サイクル行い、増幅された１本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡに相補的なＤＮＡを合成し、両者からなる２本鎖ＸＢＰ１ ｃＤＮＡの、スプライシングされていない形態のＸＢＰ１ ｍＲＮＡ配列のフレームスイッチ型スプライシングを受けるイントロン配列に対応する配列を制限酵素で切断した後に、再度、スプライシングされたＸＢＰ１遺伝子のみをＰＣＲ反応によって増幅し、検出すればよい。また、内部標準としては、一般的に知られているGAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）遺伝子、CypA（CyclophilinA）またはβ-アクチン遺伝子に対して特異的なプライマーによるＰＣＲ増幅の検出を行えばよい。制限酵素としては特に限定するわけではないが、例えばＰｓｔＩ、ＡｐａＬＩ、ＢｓａＡＩ等が使用できる。
【００２４】
好適には、本発明において、ＸＢＰ１ ｍＲＮＡ配列のフレームスイッチ型スプライシングを受けるイントロン配列の５’上流の任意のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列から成るオリゴヌクレオチドプライマー及び当該イントロン配列の３’下流の任意のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列から成るオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを、ＸＢＰ１遺伝子をＲＴ−ＰＣＲで検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせとして使用する。
【００２５】
例えば本発明の具体例として、スプライシングされた ＸＢＰ１を検出するためには、スプライシングされた形態のＸＢＰ１をコードするＤＮＡの５’−末端側領域である図１（配列番号１）及びスプライシングされていない形態のＸＢＰ１をコードするＤＮＡの５’−末端側領域である図２（配列番号２）に示す塩基配列において、例えば□で囲ったイタリック体の部位（配列番号３：5'-ccttgtagttgagaaccagg-3'）に対応するオリゴヌクレオチドをフォーワードプライマーとして用い、１本下線を付した部位（5'-ccacatatataccaagcccc-3'）に対応するオリゴヌクレオチド（配列番号５：5'-ggggcttggtatatatgtgg-3'）をリバースプライマーとして用いることができる。しかしながら、本発明はそのような態様に限定されるものではなく、フォーワードプライマーは例えばＸＢＰ１ ｍＲＮＡ配列のフレームスイッチ型スプライシングを受けるイントロン配列の５’上流の任意のヌクレオチド配列に対応することを条件に、上記配列番号３の一部もしくはその全体を含んでも含まなくてもよく、又は上記配列番号３において１もしくは数個のヌクレオチドが置換、欠失もしくは付加されたものであってもよく、又は高ストリンジェント条件下で上記配列番号３から成る配列に対応するオリゴヌクレオチドにハブリダイゼーション可能な対応する配列から成るオリゴヌクレオチドであってもよく、またその長さも特に制限されるものではなく、一般にヌクレオチド数が１０個以上であればプライマーとして使用できるものであるため、例えば長さ１０〜１００ヌクレオチド、好ましくは１５〜５０ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドであってよい。また、リバースプライマーも例えばＸＢＰ１ ｍＲＮＡ配列のフレームスイッチ型スプライシングを受けるイントロン配列の３’下流の任意のヌクレオチド配列であることを条件に、上記配列番号４の一部もしくはその全体を含んでも含まなくてもよく、又は上記配列番号４において１もしくは数個のヌクレオチドが置換、欠失もしくは付加されたものであってもよく、又は高ストリンジェント条件下で上記配列番号４から成る配列に対応するオリゴヌクレオチドにハブリダイゼーション可能な対応する配列から成るオリゴヌクレオチドであってもよく、またその長さも特に制限されるものではなく、その長さも特に制限されるものではなく、例えば長さ１０〜１００ヌクレオチド、好ましくは１５〜５０ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドであってよい。なお、ここでいう高ストリンジェント条件とは、例えばナトリウム濃度が約１０〜４０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ、温度が約５０〜70℃、好ましくは約６０〜６５℃であることを含む条件をいう。
【００２６】
GAPDH遺伝子発現の測定のためには、GAPDHをコードするＤＮＡの５’−末端側の領域である図３（配列番号：６）に示す塩基配列において、例えば□で囲った部位（配列番号７：5'-gaaggtgaaggtcggagtc-3'）に対応するオリゴヌクレオチドをフォーワードプライマーとして用い、一本下線を付した部位（5'-gaaatcccatcaccatcttc-3'）に示す塩基配列に対応するオリゴヌクレオチド（配列番号８：5'-gaagatggtgatgggatttc-3'）をリバースプライマーとして用いることができる。
【実施例】
【００２７】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１
THP-1細胞（ATCC (American Type Culture Collection)より供与）をRPMI1640（含10％FBS）培地を用いて１×１０6細胞/ｍLに調製し、２４穴プレートに１ mL/wellずつ播種した。被験物質は、滅菌水、RPMI1640（含10％FBS）培地あるいはDMSOを用いて適当な濃度に希釈した。被験物質で処理した細胞はＣＯ2インキュベーター中で２時間培養し、培養後の培養液を遠心分離し、遠心分離後の細胞をＰＢＳ（−）により洗浄し、１mlのイソゲン（Ｉｓｏｇｅｎ）（ニッポンジーン社）により細胞を破壊し、プラスチックチューブに回収した。この細胞破壊物を用いて、次のようにしてＲＮＡを調製し、さらにｃＤＮＡを合成した。
細胞破壊物に０．２mlのクロロホルムを加え、撹拌後、室温に２〜３分間静置したのち、１２，０００×ｇで１５分間遠心した。上部の水層にＲＮＡが含まれるのでこれを採取し、０．５mlのイソプロパノールを加え室温に５〜１０分間静置した後、１２，０００×ｇで１０分間遠心した。生じた沈殿に１mlの７５％エタノールを加え撹拌後１２，０００×ｇで５分間遠心した。沈殿を風乾し、滅菌水に溶解し、ＲＮＡ試料とした。
【００２８】
ＲＮＡ試料１μｇ、GeneAmp ＲＮＡ ＰＣＲ kit（Applied Biosystems社）に付属された試薬（ランダムヘキサマー、ＲＮＡseインヒビター、逆転写酵素（ＭｕＭＬＶ−ＲＴ）、10×ＰＣＲバッファーII、dATP、dCTP、dGTP、dTTP）を３７℃、１時間反応させることにより、ｃＤＮＡを合成する。次に、ＸＢＰ１の発現については、フォーワードプライマーとして配列番号：３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号：４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、AmpliTaq ＤＮＡ Polymeraseを用いてＰＣＲ反応（95℃ 5分(1 cycle)、95℃ 30秒→60℃ 30秒→72℃ 30秒（2 cycle））を行った。次に反応液に制限酵素PstＩを加え、37℃でインキュベーション後、再度、ＰＣＲ反応（95℃ 5分(1 cycle)、95℃ 30秒→60℃ 30秒→72℃ 30秒（27 cycle）、72℃ 7分(1cycle)）を行った。ＰＣＲ反応産物を２％アガロース電気泳動に供し、遺伝子の発現量を測定した。なお、対照として、制限酵素処理を行わない以外は、同様の操作を行い、制限酵素の効果を検討した。
結果を図４に示す。
【００２９】
実施例２
THP-1細胞（ATCC (American Type Culture Collection)より供与）をRPMI1640（含10％FBS）培地を用いて１×１０6細胞/ｍLに調製し、２４穴プレートに１mL/wellずつ播種した。被験物質は、滅菌水、RPMI1640（含10％FBS）培地あるいはDMSOを用いて適当な濃度に希釈した。被験物質で処理した細胞はＣＯ2インキュベーター中で２時間培養し、培養後の培養液を遠心分離し、遠心分離後の細胞をＰＢＳ（−）により洗浄し、１mlのイソゲン（Ｉｓｏｇｅｎ）（ニッポンジーン社）により細胞を破壊し、プラスチックチューブに回収した。この細胞破壊物を用いて、次のようにしてＲＮＡを調製し、さらにｃＤＮＡを合成した。
細胞破壊物に０．２mlのクロロホルムを加え、撹拌後、室温に２〜３分間静置したのち、１２，０００×ｇで１５分間遠心した。上部の水層にＲＮＡが含まれるのでこれを採取し、０．５mlのイソプロパノールを加え室温に５〜１０分間静置した後、１２，０００×ｇで１０分間遠心した。生じた沈殿に１mlの７５％エタノールを加え撹拌後１２，０００×ｇで５分間遠心した。沈殿を風乾し、滅菌水に溶解し、ＲＮＡ試料とした。
【００３０】
ＲＮＡ試料１μｇ、GeneAmp ＲＮＡ ＰＣＲ kit（Applied Biosystems社）に付属された試薬（ランダムヘキサマー、ＲＮＡseインヒビター、逆転写酵素（ＭｕＭＬＶ−ＲＴ）、10×ＰＣＲバッファーII、dATP、dCTP、dGTP、dTTP）を３７℃、１時間反応させることにより、ｃＤＮＡを合成した。次に、ＸＢＰ１の発現については、フォーワードプライマーとして配列番号：３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号：４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、Platinum SYBER Green qＰＣＲ SuperMix UDG(Invitrogen社)、ROX Reference Dye(Invitrogen社)を用いてＰＣＲ反応（95℃ 5分(1 cycle)、95℃ 30秒→60℃ 30秒→72℃ 30秒（2〜5 cycle））を行った。次に反応液に制限酵素PstＩを加え、37℃でインキュベーション後、ABI PRISM（登録商標）7900HT Sequence Detection Systemを用いたReal-time ＰＣＲ反応により、遺伝子の発現量を測定した。
結果を図５に示す。
【００３１】
実施例３
THP-1細胞（ATCC (American Type Culture Collection)より供与）をRPMI1640（含10％FBS）培地を用いて１×１０6細胞/ｍLに調製し、２４穴プレートに１ mL/wellずつ播種した。被験物質は、滅菌水、RPMI1640（含10％FBS）培地あるいはDMSOを用いて適当な濃度に希釈した。被験物質で処理した細胞はＣＯ2インキュベーター中で２時間培養し、培養後の培養液を遠心分離し、遠心分離後の細胞をＰＢＳ（−）により洗浄し、１mlのイソゲン（Ｉｓｏｇｅｎ）（ニッポンジーン社）により細胞を破壊し、プラスチックチューブに回収した。この細胞破壊物を用いて、次のようにしてＲＮＡを調製し、さらにｃＤＮＡを合成した。
細胞破壊物に０．２mlのクロロホルムを加え、撹拌後、室温に２〜３分間静置したのち、１２，０００×ｇで１５分間遠心した。上部の水層にＲＮＡが含まれるのでこれを採取し、０．５mlのイソプロパノールを加え室温に５〜１０分間静置した後、１２，０００×ｇで１０分間遠心した。生じた沈殿に１mlの７５％エタノールを加え撹拌後１２，０００×ｇで５分間遠心した。沈殿を風乾し、滅菌水に溶解し、ＲＮＡ試料とした。
【００３２】
ＲＮＡ試料１μｇ、GeneAmp ＲＮＡ ＰＣＲ kit（Applied Biosystems社）に付属された試薬（ランダムヘキサマー、ＲＮＡseインヒビター、逆転写酵素（ＭｕＭＬＶ−ＲＴ）、10×ＰＣＲバッファーII、dATP、dCTP、dGTP、dTTP）を３７℃、１時間反応させることにより、ｃＤＮＡを合成する。次に、ＸＢＰ１の発現については、フォーワードプライマーとして配列番号：５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号：４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、AmpliTaq ＤＮＡ Polymeraseを用いてＰＣＲ反応（95℃ 5分(1 cycle)、95℃ 30秒→60℃ 30秒→72℃ 30秒（30 cycle）、72℃ 7分(1cycle)）を行った。ＰＣＲ反応産物を２％アガロース電気泳動に供し、遺伝子の発現量を測定した。
結果を図６に示す。
【００３３】
結果
実施例１では、代表的な小胞体ストレス誘発物質であるDTT（ジチオスレイトール）、ツニカマイシンによるスプライシングされたＸＢＰ１の発現の発現を、フォーワードプライマーとして配列番号：３に示す塩基配列を、リバースプライマーとして配列番号：４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応で検出した（図４）。図４（Ａ）に示すように、制限酵素PstＩ反応を行わないと、ＤＴＴ、ツニカマイシン（Tunicamycin）によるスプライシングされたＸＢＰ１発現は、コントロールや溶媒コントロール（DMSO処理）と差が見られないが、図４（Ｂ）に示すように、制限酵素PstＩ反応を行うと、ＤＴＴ、ツニカマイシンによるスプライシングされたＸＢＰ１発現を検出できることが明らかとなった。また、内部標準として検出しているGAPDHは、図４（Ｃ）、（Ｄ）に示すように制限酵素によって発現量に変化は見られない。また、実施例２の操作で、定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応（図５）でも、ＤＴＴ、ツニカマイシン、ブレフェルディンＡ（Brefeldin A）によるスプライシングされたＸＢＰ１発現を検出できることが明らかとなった。また、既知の方法である実施例３で示す方法を用いて、フォーワードプライマーとして配列番号：５に示す塩基配列を、リバースプライマーとして配列番号：４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応で、実施例１及び２のように制限酵素反応を行わないで、スプライシングされたＸＢＰ１発現の発現を検出した。実施例３は非特許文献１（S.H.Back et al.）に示された方法であり、プライマー設計の工夫により、スプライシングされたＸＢＰ１遺伝子を検出する方法である。図６に示すように、ＤＴＴ、ツニカマイシンによるスプライシングされたＸＢＰ１発現を検出が可能であることが確認された。一方、図４（Ａ）は、フォーワードプライマーとして配列番号：３に示す塩基配列を、リバースプライマーとして配列番号：４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応であり、実施例１及び２のように制限酵素反応を行わない条件下である。この条件下では、ＤＴＴ、ツニカマイシンによるスプライシングされたＸＢＰ１発現は、コントロールや溶媒コントロール（DMSO処理）と差が見られない。本発明の方法による結果である図４（Ｂ）と既知の方法の結果である図６を比較すると、コントロールや溶媒コントロール（DMSO処理）のスプライシングされたＸＢＰ１の発現が図６に比べて、図４（Ｂ）の方が低いことが分かる。つまり本発明は、既知の方法に比べて、バックグラウンドが低く定量的であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】スプライシングされた形態のＸＢＰ１をコードするＤＮＡの５’−末端側領域。
【図２】スプライシングされていない形態のＸＢＰ１をコードするＤＮＡの５’−末端側領域。
【図３】ヒトGAPDH ｍＲＮＡ 遺伝子配列。
【図４】制限酵素処理した場合と制限酵素処理しない場合との、各種感作性物質のスプライシングされたＸＢＰ１の発現量に対する影響を示す。
【図５】制限酵素処理した場合の、各種感作性物質のスプライシングされたＸＢＰ１の発現量に対する影響を示すＲＴ−ＰＣＲ結果。
【図６】制限酵素処理しない場合の、各種感作性物質のスプライシングされたＸＢＰ１の発現量に対する影響を示すＰＣＲ結果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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