(57)【要約】【課題】  密度が増強されたタンパク質チロシンホスファターゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。【解決手段】  III型密度増強ホスファターゼに固有な結合および／または免疫学的特性を示す断片を含み、かつヒトホスファターゼｈｕＤＥＰ-１の酵素活性を有する新規のIII型密度増強タンパク質チロシンホスファターゼをコードするポリヌクレオチド。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンリン酸化基質を脱リン酸化し、かつ細胞の生育を促進するプロテインキナーゼ活性を阻害するヒトIII型受容体様密度増強タンパク質-１チロシンホスファターゼポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド、すなわち、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの単離されたアンチセンス鎖に対して、40mM Na2HPO4、１％SDSおよび１mM EDTAを含有する緩衝液中で、６５℃にて、ハイブリダイゼーションする、ことを特徴とするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には、精製され単離されたタンパク質チロシンホスファターゼ酵素(ＰＴＰ)および該酵素をコードするポリヌクレオチドに関する。  本発明のＰＴＰは、隣接する細胞との細胞接触増大の相関結果として、総細胞活性の増大へと導く、アップレギュレートされたｍＲＮＡの転写および／または翻訳、または転写後の修飾によって、その特徴が示される。  このような密度増強ＰＴＰは、ＤＥＰＴＰと称される。  例証となるヒトIII型受容体様密度増強タンパク質チロシンホスファターゼを、ｈｕＤＥＰ-１と命名している。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質チロシンリン酸化は、シグナルトランスダクション経路における必須要素であり、この経路が、成長および分化、細胞周期の進行、および細胞骨格の機能を包含する基本的な細胞のプロセスを制御する。  端的には、成長因子、またはその他のリガンドの同種の受容体タンパク質チロシンキナーゼ(ＰＴＫ)への結合により、受容体自身のチロシン残基の自己リン酸化および酵素の標的基質におけるチロシン残基のリン酸化が惹起される。  細胞内では、チロシンリン酸化は、可逆的なプロセスである。  すなわち、標的基質内の特定のチロシン残基のリン酸化状態は、リン酸化を触媒するＰＴＫ、および脱リン酸化を触媒するタンパク質チロシンホスファターゼ(ＰＴＰ)の双方の協調作用によって支配される。
【０００３】
ＰＴＰは、真核生物において遍在的に見出される酵素での大きく且つ多様性のあるファミリーである［CharbonneauおよびTonks、Ann.Rev.Cell Biol．8巻、463〜493頁(1993)］。  ＰＴＰファミリー内での構造上の多様性は、主として一つ以上の高度に保存された触媒ドメインに連結した非触媒(潜在的には調節性の)配列における多様性より生じる。  通常、可溶性の細胞質ＰＴＰフォームは、非受容体ＰＴＰと呼ばれ、細胞膜を貫通する少なくとも一つの非触媒領域を持つものは、受容体様ＰＴＰ(ＲＰＴＰ)と称される。
【０００４】
非触媒配列の隣に位置する単一の触媒ドメインを特徴的に保有する種々の非受容体ＰＴＰが、同定されてきている。  このような非触媒配列は、とりわけ、細胞骨格関連タンパク質［YangおよびTonks、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88巻、5949〜5953頁(1991)］または脂質結合タンパク質［Guら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 89巻、2980〜2984頁(1992)］に相同性を有する配列、および／または、酵素と特異的な細胞内膜との会合を媒介する配列［Frangioniら、Cell 68巻、545〜560頁(1992)］を包含することが示されており、ＰＴＰ活性の調節において亜細胞での局在性が重要な役割を果たしているかもしれないことが示唆されている。
【０００５】
ＲＰＴＰの非触媒ドメイン配列の分析によって、シグナルトランスダクション機構においてのそれら配列の関与が示唆されている。  しかしながら、ＲＰＴＰの細胞外セグメントへの特異的リガンドの結合は、わずかな事例においてしか明らかにされていない。  例えば、ＰＴＰμ［Brady-Kalneyら、J.Cell.Biol. 122巻、961〜972頁(1993)］の分子間で同好性結合が証明されている。  すなわち、細胞表面上で発現されるＰＴＰμに対するリガンドは、近接する細胞の表面上の別のＰＴＰμ分子である。  その他には、ＲＰＴＰの大半に特異的に結合し、活性をモジュレートするリガンドはほとんど知られていない。
【０００６】
多くの受容体様ＰＴＰは、２つの触媒ドメイン、すなわち、一つの膜貫通ドメインおよび細胞外アミノ末端セグメントを有する細胞内カルボキシルセグメントを含む［Kruegerら、EMBO J. 9巻、3241〜3252頁(1990)］。  ＲＰＴＰのサブクラスは、細胞外ドメインの「型」の範疇に基づいて互いに区別される［Fisherら、Science 253巻、401〜406頁(1991)］。  Ｉ型ＲＰＴＰは、複数のグリコシル化部位および保存されたシステインに富んだ領域を持つ、大きな細胞外ドメインを有する。  ＣＤ４５は、典型的なＩ型ＲＰＴＰである。  II型ＲＰＴＰは、タンデム構造を取る複数のフィブロネクチンIII型(FNIII)様反復配列に近接して、少なくとも一つのアミノ末端イムノグロブリン(Ｉｇ)様ドメインを含む。  タンパク質-タンパク質相互作用に関与すると考えられている類似の反復したFNIIIドメインが、IL２、IL４、IL６、GM-CSF、プロラクチン、エリスロポイエチンおよび成長ホルモンに対する受容体において同定されている［Patthy、Cell 61巻、13〜14頁(1992)］。  ＬＡＲとして知られている白血球の共通抗原関連ＰＴＰが、II型ＲＰＴＰ構造の例として挙げられ［Streuliら、J.Exp.Med. 168巻、1523〜1530頁(1988)］、その他のII型ＲＰＴＰと同様に、細胞接着分子のNCAMクラス［EdelmanおよびCrossin、Ann.Rev.Bjochem. 60巻、155〜190頁(1991)］を連想させる細胞外領域を含む。  ＨＰＴＰβ［Krugerら、EMBO J. 9巻、3241〜3252頁(1990)］などのIII型ＲＰＴＰは、細胞外ドメインに、タンデム構造を取る複数のFNIII反復配列のみを含む。  例えば、ＲＰＴＰα［Krugerら、(1990)、前出］のようなIV型ＲＰＴＰは、システイン残基を欠くが複数のグリコシル化部位を含む、比較的短い細胞外配列を有する。  ＰＴＰγ［Barnesら、Mol.Cell.Biol. 13巻、1497〜1506頁(1993)］およびＰＴＰζ［KrugerおよびSaito、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89巻、7417〜7421頁(1992)］によって例示されるＲＰＴＰの第五番目の型は、炭酸デヒドラターゼ(ＣＡＨ)に相同であるが、二酸化炭素の可逆的水和に必要な必須のヒスチジン残基を欠く、280アミノ酸のセグメントを含む細胞外ドメインによりその特徴が示される。
【０００７】
II型およびIII型ＲＰＴＰの細胞外ドメインに特徴的に見出されるFNIII配列は、Ｉｇ様ドメインについて観察されるものに類似した折りたたみパターンを有する約90個のアミノ酸残基を含む［BorkおよびDoolittle、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89巻、8990〜8994頁(1992)］。  50個を越える真核生物および原核生物の相異なるタンパク質において、高度に保存されたFNIII配列が同定されている［BorkおよびDoolittle、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89巻、8990〜8994頁(1992)］が、これらのドメインについて概括された機能は確立されていない。  フィブロネクチンそれ自体が、15個〜17個のFNIIIドメイン配列を保有しており、第二のFNIIIドメイン(FNIII２)が、ヘパリン硫酸プロテオグリカンに対する結合部位を含むこと［Schwarzbauer、Curr.Opin.Cell Biol. 3巻、786〜791頁(1991)］、そして、FNIII1３およびFNIII1４が、イオン性相互作用を介したヘパリン結合に対応するものであること［Schwarzbauer、Curr.Opin.Cell Biol. 3巻、786〜791頁(1991)］が立証されている。  おそらくは、フィブロネクチンのFNIIIドメインに対する、最も明瞭にその特徴が明らかにされた相互作用には、細胞接着に対する主要部位であるFNIII10が関与する［EdelmanおよびCrossin、Ann.Rev.Biochem 60巻、155〜190頁(1991)；Leahyら、Science 258巻、987〜991頁(1992)；Mainら、Cell 71巻、671〜678頁(1992)］。  FNIII10は、タンパク質のインテグリンスーパーファミリーの特定のメンバーへの結合を介して細胞接着の促進に関与する、アミノ酸配列Arg-Gly-Asp(ＲＧＤ)を含む。
【０００８】
可溶性ＰＴＰおよびＲＰＴＰの双方が共有する特徴には、ホスフォチロシン残基に対する絶対的な特異性、基質タンパク質に対する高い親和性、およびin vitroでのＰＴＫの比活性の強さの１桁〜３桁を越える強い比活性が包含される［Fisherら、Science 253巻、401〜406頁(1991)；Tonks、Curr.Opin.Cell.Biol. 2巻、1114〜1124頁(1990)］。  この最後に記載した特徴により、in vivoでのＰＴＫの作用に対してＰＴＰ活性が拮抗的な影響を及ぼしており、かくして、ＰＴＰとＰＴＫと間のバランスで、細胞内チロシンリン酸化レベルが決定されるかもしれないことが示唆される。  ＰＴＰ活性についての支配的な生理学上の役割は、ＰＴＰ活性の強い阻害剤であるバナジン酸塩でＮＲＫ-１細胞を処理した結果、ホスフォチロシンのレベルの増大と、形質転換した細胞の形態の発生が惹起こされるという観察によって支持される［Klarlund、Cell 41巻、707〜717頁(1985)］。  この観察によって、ＰＴＫ活性(ひいては細胞のホスフォチロシンレベル)の間接的な修飾剤としての、ＰＴＰおよび、ＰＴＰ活性をモジュレートする薬剤が潜在的に有する治療学上の価値が暗示される。
【０００９】
近年の研究で、ＰＴＰ活性の生理学的重要性の局面が脚光を浴びている。  例えば、非受容体造血細胞タンパク質チロシンホスファターゼであるＨＣＰをコードする遺伝子における変異によって、マウスで虫食い状表現型を特徴とする重篤な免疫不全が惹起されることが示されている［Schulz、Cell 73巻、1445〜1454頁(1993)］。  正常の条件下で、ＨＣＰはＰＴＫで誘導されるシグナル伝達経路の抑制剤として作用するかもしれない［Schulz、Cell 73巻、1445〜1454頁(1993)］。  いくつかのＰＴＰ酵素は、腫瘍抑制遺伝子の産物であるかもしれず、そして、それらの変異または欠損が、ある新成物形成に関連する細胞性ホスフォチロシンの上昇に寄与するかもしれない［Brown-Shimerら、Cancer Res. 52巻、478〜482頁(1992)；Waryら、Cancer Res. 53巻、1498〜1502頁(1993)］。  ネズミＬ細胞のＲＰＴＰγに対する遺伝子で観察される変異は、この仮説に矛盾しないものである［Waryら、Cancer Res. 53巻、1498〜1502頁(1993)］。  正常なＴ細胞受容体で誘導されるシグナル伝達にとって、受容体様ＰＴＰ-ＣＤ４５が必要とされるという観察［PingelおよびThomas、Cell 58巻、1055〜1065頁(1989)］によって、細胞性のシグナル伝達応答の正のメディエータとしてのＰＴＰ活性を暗示する証拠が提供される。
【００１０】
培養状態にある正常細胞は、成長の接触阻害を呈する。  すなわち、単層内に密集した隣合う細胞が互いに接するにつれ、それらの成長が阻害されるのである［StokerおよびRubin、Nature 215巻、171〜172頁(1967)］。  ＰＴＫは、細胞の成長を促進するので、ＰＴＰの作用は、成長阻害の機構の基礎となるものかもしれない。  スイスマウス３Ｔ３細胞において、高密度での培養より採取した密集細胞では、膜画分に会合しているホスファターゼ活性は、低密度または中程度の密度での培養より採取した細胞に比して８倍増大している［PallenおよびTong、Proc.Natl．Acad.Sci.(USA)88巻、6996〜7000頁(1991)］。      
【００１１】
このような活性の増大は、血清を除いて休止状態とした亜密集の細胞培養では観察されなかった。  増強されたホスファターゼ活性は、ゲル濾過により確認したところ、３７kDのタンパク質に帰属していたが、それ以上にその特徴は明らかにされなかった。  同様に、ＰＴＰは、細胞成長の密度による阻止に直接的に結びついている。  すなわち、バナジウム酸塩でNRK-１細胞を処理すると、密度依存性の成長阻害を克服し、形質転換細胞または不死化細胞において独自の特徴である足場非依存性の増殖を促進することができた［Klarland、Cell 41巻、707〜717頁(1985)；Rijksenら、J. Cell Physiol. 154巻、343〜401頁(1993)］。
【００１２】
これらの観察とは対照的に、国際出願公開第WO 94/03610号において、ＰＴＰ３５と称された膜貫通型ＰＴＰは、活発に成長している細胞で定常状態のｍＲＮＡレベルが最高値に達することが観察されたことが開示されている。  密集細胞では、ＰＴＰ３５のｍＲＮＡ発現は、ほとんどまたは全く検出されなかった。  かかる調節の態様は、マウスの３Ｔ３細胞においても観察された。  このように、同じ細胞型の２つのＲＰＴＰが、見かけ上は相反するプロセスに関与する。  すなわち、一つ(ＰＴＰ３５)は細胞の成長に寄与しており、他方(PallenおよびTongsの３５kDのＰＴＰ)は細胞の休止に寄与している。
【００１３】
興味深いことに、II型ＲＰＴＰ ＬＡＲのメッセンジャーＲＮＡの転写は、密集した線維芽細胞の培養でアップレギュレーションを受けることが立証されている［Longo、J.Biol. Chem. 268巻、26503〜26511頁(1993)］。  ＬＡＲは、タンパク質分解によるプロセシングを受けて、非共有結合で会合する２つのサブユニットの複合体である成熟タンパク質として産生され、このサブユニットの一つは、細胞接着分子様細胞外ドメインの大半を含むものであり［Yuら、Oncogene 7巻、1051〜1057頁(1992)；Streuliら、EMBO J. 11巻、897〜907頁(1992)］、細胞が密集状態に近づくにつれて放出される［Streuliら、EMBO J. 11巻、897〜907頁(1992)］。  これらの観察から、細胞骨格の全体性の調整のみならず、形質転換、腫瘍の侵入、転移、細胞接着、および、炎症時の内皮細胞層に沿った白血球細胞の動きや内皮細胞での変化などといった、その他の関連する細胞での現象におけるＰＴＰの関与が推察されることとなる。  これら細胞での事象のいずれかまたは全てを調節することができるＰＴＰ活性のモジュレーターが、治療的側面で暗示されることは意義がある。
【００１４】
かくのごとく、当該技術分野において、酵素のＰＴＰファミリーのメンバーを同定すること、そして、これらタンパク質を、そのアミノ酸配列およびそれらをコードするＤＮＡ配列として特徴付けることが必要とされている。  このような情報によって、これらタンパク質の大量生産が可能となり、天然にこれらホスファターゼを発現している細胞の同定が可能となり、そして、これらホスファターゼとの特異的な反応性を有する抗体の製造ができるようになるであろう。  さらには、これらＰＴＰの基質、調節機構、および亜細胞における局在性を解明することで、正常細胞の成長に関する理解に貢献し、異常および／または悪性細胞の成長に干渉する上で有用な治療剤の開発に欠かすことのできない情報が提供されるであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
タンパク質チロシンホスファターゼに関して本明細書中で用いられる「密度増強」の表現は、近隣の細胞との接触増大の相関結果として、アップレギュレーションを受けた細胞性ｍＲＮＡの転写または翻訳および／または総細胞活性を示すものであり、当該技術分野では、このような密度増強ホスファターゼの開発が待望されている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本願発明の一つの特徴において、III型密度増強ホスファターゼに固有な結合および／または免疫学的特性を備えるその断片(すなわち、断片および、欠失、付加または置換による類似体)を含んで、ヒトホスファターゼｈｕＤＥＰ-１およびその変異体で例示される酵素活性を有するIII型密度増強タンパク質チロシンホスファターゼをコードする、精製され単離されたポリヌクレオチド(例えば、センスおよびアンチセンス鎖の双方を含む、ＤＮＡおよびＲＮＡ転写物)を提供する。  現在のところ好ましいＤＮＡ分子として、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび全体的または部分的に化学合成されたＤＮＡ分子がある。  本願発明で好ましいポリヌクレオチドは、配列番号：２に記載のヒトＤＥＰ-１ポリペプチドをコードする、配列番号：１に記載のＤＮＡである。  さらに本願発明で提供されるのは、III型密度増強ホスファターゼをコードする配列を含む組換えプラスミドおよびウイルス性ＤＮＡ構築体(発現構築体)であって、特に、III型密度増強ホスファターゼをコードする配列が、一つまたは一つ以上のホモまたはヘテロの転写調節エレメントに作動可能に連結された構築体である。
【００１７】
本願発明のその他の特徴において、III型密度増強ホスファターゼポリペプチドまたはその変異体を発現する、本願発明のＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェクトされた原核性または真核性の宿主細胞が提供される。  本願発明の宿主細胞は、その宿主細胞自体またはその宿主細胞が生育している培地のいずれかより単離することができる、III型密度増強ホスファターゼポリペプチドの大量生産のために、特に有用である。  細胞外膜表面上のIII型密度増強ホスファターゼポリペプチドを発現する宿主細胞はまた、抗III型密度増強ホスファターゼ抗体の製造における免疫原としても有用である。
【００１８】
本願発明によりさらに提供されるのは、精製され単離されたIII型密度増強ホスファターゼポリペプチド、ならびにその断片および変異体である。  好ましいIII型密度増強ホスファターゼポリペプチドは、配列番号：２で示されている。  新規のIII型密度増強ホスファターゼポリペプチドおよび変異体ポリペプチドは、天然の供給源からの単離物として得られるかもしれないが、好ましくは、本願発明の宿主細胞が関わる組換え手法によって製造される。  III型密度増強ホスファターゼポリペプチドの、完全にグリコシル化されたフォーム、部分的にグリコシル化されたフォームおよび全体にグリコシル化されていないフォームは、組換え製造用に選択される宿主細胞を変えること、および／または、単離後のプロセシングによって作製することができる。  本願発明のIII型密度増強ホスファターゼポリペプチドの変異体は、(１)III型密度増強ホスファターゼに特異的な一つ以上の生物学的活性または免疫学的特徴を喪失することなく、そして、好ましくはそれらの増強を伴い、または(２)特定のリガンド／受容体結合またはシグナル伝達機能の特異的な抑止を伴って、アミノ酸の内の一つ以上が欠失または置換を受けた類似体を包含する、水に可溶性および不溶性のポリペプチドを含むことができる。
【００１９】
本願発明によりさらに企図されるのは、本願発明のIII型密度増強ホスファターゼに特異的に結合する、ペプチド、ポリペプチド、および他の非ペプチド分子である。  好ましい結合分子には、抗体(例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ抗体、ＣＤＲ-移植抗体など）、対向受容体（例えば、膜会合性フォームおよび可溶性フォーム)ならびに、抗III型密度増強ホスファターゼモノクローナル抗体および／または特異的な対向受容体の存在下にIII型密度増強ホスファターゼに競合的に結合するリガンドを含めた、その他のリガンド(例えば、天然に存在する分子または合成分子)が含まれる。  結合分子は、本願発明のIII型密度増強ホスファターゼポリペプチドの精製や、このポリペプチドを発現する細胞型の同定に有用である。  結合分子はまた、III型密度増強ホスファターゼのin vivoでの結合および／またはシグナルトランスダクション活性をモジュレートする(すなわち、阻害、阻止または刺激する)のにも有用である。
【００２０】
III型密度増強ホスファターゼに対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も、本願発明により企図される。  モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの製造技術は、当該技術分野において周知である。  ハイブリドーマ細胞系は、精製したIII型密度増強ホスファターゼまたはその類似体、または細胞外膜表面上にIII型密度増強ホスファターゼもしくはその変異体を発現する細胞を用いて、動物を免疫感作した後に作製することができる。  免疫原の細胞系には、in vivoでIII型密度増強ホスファターゼを発現する細胞、またはin vivoで正常時にこのタンパク質を発現していない、トランスフェクトされたもしくは形質転換された原核性もしくは真核性の宿主細胞が含まれる。
【００２１】
その他の特徴において、その他のIII型密度増強ホスファターゼをコードするポリヌクレオチド、ｈｕＤＥＰ-１対立変異体および異種の(例えば、ラットまたはマウス)ＤＮＡを同定することも企図される。
【発明の効果】
【００２２】
ヒトＤＥＰ-１のＤＮＡおよびアミノ酸配列を開示することにより与えられる情報の価値は明白である。  その一例として、開示されたヒトＤＥＰ-１ｃＤＮＡの配列により、転写制御エレメントを含むヒトＤＥＰ-１ゲノムＤＮＡ配列を単離することが可能となる。  本願発明により企図される転写制御エレメントとして、例えば、プロモーターエレメント、エンハンサーエレメントのみならず、ｍＲＮＡ転写の抑止、またはダウンレギュレーションに寄与するエレメントも含まれる。  このタイプの制御エレメントは、タンパク質をコードする構造遺伝子配列に対して５'ＤＮＡ配列または３'ＤＮＡ配列、および／またはイントロン内に位置するＤＮＡ配列であるかもしれない。  ５'および／または３'の制御エレメントは、構造遺伝子のタンパク質をコードする配列に近接し、および／または遠位にあるかもしれない。  順次に、ｍＲＮＡ転写をモジュレートするＤＮＡ配列を同定することで、転写のモジュレーションをもたらすことができる薬剤の同定が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
ｈｕＤＥＰ-１ゲノムＤＮＡおよび異種のＤＮＡを単離することは、プローブとしてＤＥＰ-１ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の全てまたは一部を用い、適切な厳密さの条件下で適切なライブラリーをスクリーニングする、標準的な核酸ハイブリダイゼーション技術によって成し遂げられよう。  もしくは、既知のヌクレオチド配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を用いて、その他のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ配列を増幅および同定することができる。  断片およびその他の変異体を含めたIII型密度増強ホスフアターゼポリペプチドをコードする合成ＤＮＡは、旧来の方法によって合成できる。
【００２４】
本願発明のＤＮＡ配列情報で、相同的組換えまたは「ノックアウト」戦略［例えば、Capecchi、Science 244巻、1288〜1292頁(1989)を参照されたい］によって、機能を有するIII型密度増強ホスファターゼポリペプチドを発現しない齧歯類または変異型のIII型密度増強ホスファターゼポリペプチドを発現する齧歯類を開発することが可能となる。  このような齧歯類は、in vivoでのIII型密度増強ホスファターゼの活性およびそのモジュレーターを研究するためのモデルとして有用である。
【００２５】
本願発明のＤＮＡおよびアミノ酸配列により、対向受容体の結合に活発に関与するIII型密度増強ホスファターゼの領域や、それのみならず、結合に活発に関与するというより、むしろ結合を調節することができる配列を、分析することが可能となる。  膜貫通シグナルトランスダクションに関与するモチーフの同定もまた、本願発明により企図される。      
【００２６】
さらに企図されるのは、未成熟および成熟III型密度増強ホスファターゼタンパク質の亜細胞での局在性を確定するモチーフを同定することである。
【００２７】
本願発明のＤＮＡは、III型密度増強ホスファターゼポリペプチドを発現する細胞型の検出のためにも有用である。  このような細胞型の同定は、治療剤および予防剤の開発において重要な役割を果たすかもしれない。  例えば、ｈｕＤＥＰ-１ＤＮＡを利用して対応するＲＮＡを検出する、標準の核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて、細胞内のIII型密度増強ホスファターゼ転写の構成的レベルのみならず、内在または外来の薬剤に応答した転写レベルの変化を定量できよう。  III型密度増強ホスファターゼの転写、翻訳および／または活性を修飾する薬剤を同定することで、次に、それらに潜在する治療的または予防的価値を評価できる。  本願発明のＤＮＡは、複雑な細胞集団および組織内のIII型密度増強ホスファターゼ特異的メッセージの、細胞での局在性を調べるために、例えば、ｈｕＤＥＰ-１ＤＮＡで細胞ＲＮＡへのin situハイブリダイゼーションを行うことを可能とする。
【００２８】
本願発明のポリヌクレオチドにより、III型密度増強ホスファターゼと相互作用する基質またはその他の分子を同定する方法も提供される。  相互作用する分子を同定するための現在のところ好ましい方法は、以下の工程を含むものである。  すなわち、ａ)ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを保有する転写因子により調節されるプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築体で、適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする；ｂ)下記の(ｄ)にて導入される、潜在性を有する相互作用成分および／または基質をリン酸化するために、タンパク質チロシンキナーゼ（例えば、v-src、c-srcなど)で(ａ)の宿主細胞を共形質転換またはコトランスフェクトする任意の工程；ｃ)例えば、ｈｕＤＥＰ-１イソフォームの一部または全てと、転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとの第一の融合体をコードする第一のハイブリッドＤＮＡ配列を、宿主細胞内で発現する；ｄ)ＤＥＰ-１イソフォーム結合性タンパク質と推定されるタンパク質の一部または全てと、第一の融合体で取り込まれていない転写因子の活性化ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインのいずれかとの、第二の融合体をコードする第二のハイブリッドＤＮＡ配列のライブラリーを宿主細胞内で発現する；ｅ)宿主細胞内でのレポーター遺伝子産物の生産を検出することによって、特定の宿主細胞内における、ＤＥＰ-１イソフォームへのＤＥＰ-１イソフォーム結合性タンパク質の結合を検出する；および、ｆ)特定の宿主細胞からＤＥＰ-１イソフォーム結合性タンパク質をコードする第二のハイブリッドＤＮＡ配列を単離する工程を含む。  例えば、転写因子ドメインのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、ｈｕＤＥＰ-１イソフォームおよびｈｕＤＥＰ-１イソフォーム結合性タンパク質として推定されるタンパク質とが該転写因子に融合される、順序を変えるというような、前述した方法の変法も、企図される。  好ましい方法において、プロモーターはADHIプロモーターであり、ＤＮＡ結合ドメインはlexＡ ＤＮＡ結合ドメインであり、活性化ドメインはGAL４トランス活性化ドメインであり、レポーター遺伝子はlacＺ遺伝子であって、そして、宿主細胞は酵母宿主細胞である。  当業者であれば、多数のその他のレポーター遺伝子や宿主細胞のいずれでも、この技術に容易に導入できることを容易に想到するであろう。  同様に、別のＤＮＡ結合および活性化ドメインを持つ数多くの転写因子のいずれでも、この手法に利用することが可能であり、ＤＮＡ結合および活性化ドメインの双方は、同じ転写因子に由来するものでも、また異なるが適合性を有する転写因子に由来するものでも用いることができる。  この方法の別の変法として、触媒ドメイン内のシステイン残基をセリン残基に置換した、変異型ＤＥＰ-１ポリペプチドを、この技術において用いることができる。  その他のホスファターゼを用いたこのタイプの変異では、基質の認識および結合は行うが、変異の結果ホスファターゼが不活性となるので、基質の脱リン酸化は行わないことが証明されている。
【００２９】
III型密度増強ホスファターゼイソフォームに結合するタンパク質を検出するために、本願発明により企図される前記方法に代わる同定方法は、以下の工程を含む。  すなわち、ａ)III型密度増強ホスファターゼイソフォーム結合性タンパク質と推定されるタンパク質と、特異的な対向受容体と高い親和性をもって結合することができるリガンドとの融合体をコードするハイブリッドＤＮＡ配列で、適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする；ｂ)適切な条件下で宿主細胞内のハイブリッドＤＮＡ配列を発現する；ｃ)固定化された状態にある特異的な対向受容体に融合タンパク質を曝すことにより、宿主細胞によって発現される融合タンパク質を固定化する；ｄ)III型密度増強ホスファターゼイソフォームを、固定化された融合タンパク質と接触させる；および、ｅ)III型密度増強ホスファターゼイソフォームに対して特異的な試薬を用いて、融合タンパク質に結合したIII型密度増強ホスファターゼイソフォームを検出する工程を含むものである。  この方法を実施する上で現在のところ好ましいリガンド／対向受容体の組合せは、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ／グルタチオン、ヘマグルチニン／ヘマグルチニン特異抗体、ポリヒスチジン／ニッケルおよびマルトース結合性タンパク質／アミロースである。
【００３０】
III型密度増強ホスファターゼと特異的に相互作用するタンパク質(すなわち、基質、リガンド、モジュレーター等)を同定するためのさらなる方法もまた、本願発明により企図される。  一例として、精製され単離されたIII型密度増強ホスファターゼポリペプチド(例えば、ｈｕＤＥＰ-１ポリペプチド)を、固定化された支持体(すなわち、カラム樹脂、ビーズ等)へ共有結合によりカップリングさせ、細胞溶解物とともにインキュベートして、タンパク質／タンパク質相互作用を許容することができる。  その後、固定化されたＤＥＰ-１ポリペプチドと相互作用するタンパク質は、当該技術分野において標準的な、濃度勾配洗浄技術で、支持体より溶出させることができる。
【００３１】
その他の例としては、タンパク質オーバーレイ技術を用いることができる。  例えば、ｈｕＤＥＰ-１を発現している細胞か、またはｈｕＤＥＰ-１をモジュレートするかもしくはｈｕＤＥＰ-１に結合することができるポリペプチドを発現している細胞のいずれかより、ＤＮＡを単離し、標準法によってライブラリーを構築することができる。  次いで、このライブラリーを異種細胞系において発現し、得られたコロニーを固定化支持体に転写することができる。  その後、これらのコロニーから発現されたタンパク質をＤＥＰ-１と接触させ、適切な条件下にてインキュベートし、ＤＥＰ-１／タンパク質相互作用を許容する。  その結果得られた、形成されたIII型密度増強ホスファターゼ／タンパク質複合体は、特異的なIII型密度増強ホスファターゼ抗体とともにインキュベートすることにより、検出することができる。  前記特異抗体と相互作用するコロニーは、III型密度増強ホスファターゼと相互作用するタンパク質をコードするＤＮＡを含むものである。  あるいは、この技術において細胞または組織溶解物を用いてもよく、ここで、正常時にＤＥＰ-１を発現する細胞もしくは組織、または予めＤＥＰ-１をコードするＤＮＡでトランスフェクトもしくは形質転換した細胞が用いられうる。
【００３２】
本願発明の多くのその他の特徴および利点は、添付の図面を参照しつつ、以下の発明の詳細な説明を考慮することで、明らかになるであろう。  すなわち、本願発明を、III型密度増強ホスファターゼポリペプチドをコードする遺伝子の単離および特徴付けに関する以下の実施例によって説明することとする。
【実施例】
【００３３】
実施例１は、ヒトＤＥＰ-１をコードするｃＤＮＡの単離に関する。  実施例２において、ノザンブロット分析により調べたｈｕＤＥＰ-１の臓器分布を検討する。  実施例３には、ＤＥＰ-１およびその断片に対して特異的な抗体の作製を述べる。  実施例４では、ＣＯＳ細胞におけるｈｕＤＥＰ-１ｃＤＮＡクローンの発現を示す。  実施例５は、線維芽細胞におけるｈｕＤＥＰ-１の内在性発現の検出に関する。  実施例６には、細胞培養密度の相関結果としての、ｈｕＤＥＰ-１の発現を述べる。  実施例７は、ｈｕＤＥＰ-１のリガンドの同定に関する。  実施例８では、ｈｕＤＥＰ-１活性のモジュレーターおよび基質の同定を検討する。  実施例９では、ゲノムｈｕＤＥＰ-１ＤＮＡの特徴付けを詳説する。
【００３４】
実施例１：ｈｕＤＥＰ-１ｃＤＮＡの単離および特徴付け
細胞密度依存性の機構により調節される新規ヒトホスファターゼをコードするｃＤＮＡを単離するための最初の工程として、以前に同定された多くのホスファターゼに共通の、保存されたアミノ酸配列に基づいて、ＰＣＲプライマーを合成した。  次いで、これらのプライマーを、ｃＤＮＡライブラリーからポリヌクレオチドを増幅するのに用い、得られた増幅産物を配列決定し、これら配列を以前に報告されたＤＮＡ配列と比較した。
【００３５】
配列番号：３および配列番号：４で示される、保存されたＰＴＰアミノ酸配列に対応する縮重プライマーを合成して、HeLa細胞のｃＤＮＡライブラリーを用いたＰＣＲの鋳型として、プライムするのに用いた。
【００３６】
KCAQYWP （配列番号：３）
HCSAGIG （配列番号：４）
ＰＣＲ反応で用いた対応するプライマーは、それぞれ配列番号：５および配列番号：６に示してある。  ここで用いたヌクレオチドの表記は、米国特許法施行規則§1.882の規定に従ったものである。
【００３７】
５'-AARTGYGCNCARTAYTGGCC-３' （配列番号：５）
３'-GTRACRTCRCGNCCITADCC-５' （配列番号：６）
77個の別のサブクローンを配列決定し、七つの異なる配列が明らかになり、その内の六つがそれ以前にＤＮＡ配列が公表されていたＰＴＰに対応するものであって、それらには、ＰＴＰＩＢ［Tonksら、J.Biol.Chem. 263巻、6722〜6730頁(1988)］、ＴＣＰＴＰ［Coolら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)86巻、5257〜5261頁(1989)］、ＲＰＴＰα［Kruegerら、EMBO J. 9巻、3241〜3252頁(1990)］、ＬＡＲ［Streuliら、J.Exp.Med. 168巻、1523〜1530頁(1988)］、ＰＴＰＨ１［YangおよびTonks、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88巻、5949〜5953頁(1991)］、およびＰＴＰμ［Gebbinkら、FEBS Lett．290巻、123〜130頁(1991)］が含まれていた。  第七のクローンは、独特な300bpのＰＣＲ断片を含んでなることが判明し、このクローンに対応する全長のｃＤＮＡを単離する試みで、オリゴ-ｄＴでプライムしたHeLa細胞のｃＤＮＡライブラリー(Stratagene,，La Jolla、カリフォルニア州)をスクリーニングするのに用いた。  先に報告されているように［YangおよびTonks、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88巻、5949〜5953頁(1991)］、約１.８×１０6個のファージプラークをスクリーニングし、２４個の陽性プラークを同定した。  ５.１kbの最大インサートをpUC119にクローニングし、ジデオキシチェーンターミネーター法により配列決定して、1337個のアミノ酸からなる新規受容体様ＰＴＰをコードする、4011個のヌクレオチドからなる読取り枠を含むことが見出された。  この５.１kbのインサートのＤＮＡ配列を配列番号：１に示し、また、その予測されるアミノ酸配列を配列番号：２に示してある。  このヒト密度増強ＰＴＰを、ｈｕＤＥＰ-１と命名した。
【００３８】
ｈｕＤＥＰ-１遺伝子の想定された開始ATGコドンは、−３位でプリン(Ｇ)に隣接しており、従って、開始についてのコザック則［Kozak、J.Cell Biol. 108巻、229〜241頁(1989)］に符合するものである。  予測された開始部位の約290bp上流に、枠内停止コドンがあり、開始のATGの次に、シグナル配列として機能するかもしれない疎水性領域が続く。  シグナルペプチダーゼについての既知の切断部位の統計的分析［von Heijne、Nuc.Acids Res. 14巻、4683〜4690頁(1986)］に基づくと、成熟ｈｕＤＥＰ-１ポリペプチドのアミノ末端はGly37に特定される。  第２の疎水性領域は、第977位から第996位のアミノ酸の間に見出され、それに続いて停止トランスファー配列に特徴的な、顕著に塩基性である残基の連なりが続く。  従って、成熟ｈｕＤＥＰ-１タンパク質について、940個のアミノ酸からなる細胞外領域および341個のアミノ酸からなる細胞内部分が予測される。  細胞外ドメインは八つのFNIIIドメインを含み、そして33個のＮ-結合グリコシル化の可能性を有する部位が予測される。  このように、ｈｕＤＥＰ-１は、Fisherら(前出)の体系に従ったIII型ＲＰＴＰのトポグラフィーに一致する。  触媒ドメインのタンデム構造の反復配列を有するほとんどのＲＰＴＰとは異なり、細胞質領域には第1060位から第1296位のアミノ酸残基にわたる単一の触媒ドメインが含まれる。  従って、ヒトＤＥＰ-１は、単一の触媒ドメインを有するＲＰＴＰの拡大群の典型であり、この群には、ＰＴＰβ［Kruegerら、EMBO J. 9巻、3241〜3252頁(1990)］、ドロソフィアのＤＰＴＰ１０Ｄ［Tianら、Cell 76巻、675〜685頁(1991)；Yangら、Cell 67巻、661〜673頁（1991月、ドロソフィアのＤＰＴＰ４Ｅ［Oonら、J.Biol.Chem. 268巻、23964〜23971頁(1993)］、および、最近報告されたＳＡＰ-１酵素［Matozakiら、J.Biol.Chem. 269巻、2075〜2081頁(1994)］が含まれる。  その他のＰＴＰドメインとｈｕＤＥＰ-１の触媒ドメインのアミノ酸配列の比較によって、ｈｕＤＥＰ-１はＰＴＰβおよびＳＡＰ-１と最も密接に関連することが明らかになった。  この配列は、いくつかのSer-Proモチーフのみならず、カゼインキナーゼIIによるリン酸化が可能な部位をも包含するものである。
【００３９】
実施例２：ｈｕＤＥＰ-１組織分布のノザン分析
ＰＴＰの発現は真核生物において遍在的であることがこれまでに立証されているので、ｈｕＤＥＰ-１のｍＲＮＡ発現の相対的な程度を調べるために種々のヒト組織を分析した。
【００４０】
メガプライムＤＮＡラベリングキット(Amersham、Arlington Heights、イリノイ州)を用いて、予め１.５×１０6cpm/ngの比活性に放射性ラベルしたｈｕＤＥＰ-１ｃＤＮＡの１.６kbのHindIII/EcoRI断片を、種々のヒト組織由来の固定化されたＲＮＡを含むＲＮＡマルチティッシュノザンブロットフィルター(Clontech、Palo Alto、カリフォルニア州)に対してプローブとして用いた。  このプローブは、単離されたｈｕＤＥＰ-１ｃＤＮＡの全長に相当するものであった。  0.5M Na2HPO4、７％ SDS、１mM EDTA、およびラベルしたプローブを106cpm/mlの濃度で含有するハイブリダイゼーション用緩衝液で、65℃で、16時間、ハイブリダイゼーションを実施した。  次いで、40mM Na2HPO4、１％ SDS、および１mM EDTAで、65℃で、５分間、フィルターを洗浄した。  次いで、膜をオートラジオグラフィーに供した。  その結果を、図１Ａおよび１Ｂに示すが、図中、固定化されたＲＮＡのヒト組織の由来は、以下の通りである。  図１Ａにおいて、レーン２のＲＮＡは心臓由来、レーン３は脳由来、レーン４は胎盤由来、レーン５は肺由来、レーン６は肝臓由来、レーン７は骨格筋由来、レーン８は腎臓由来、そしてレーン９は膵臓由来のものである。  図１Ｂにおいて、レーン２のＲＮＡは脾臓由来、レーン３は胸腺由来、レーン４は前立腺由来、レーン５は精巣由来、レーン６は卵巣由来、レーン７は小腸由来、レーン８は結腸由来、そして、レーン９は末梢血白血球由来のものである。
【００４１】
ノザン分析により、分析したほとんどの組織でｈｕＤＥＰ-１が発現しており、特に、胎盤、腎臓、脾臓および末梢血白血球において高いｍＲＮＡレベルが検出されることが示された。
【００４２】
実施例３：ｈｕＤＥＰ-１ポリクローナル抗体の作製
ｈｕＤＥＰ-１に独特であり、配列番号：２の第1297位から第1315位までのアミノ酸残基および第1321位から第1334位までのアミノ酸残基(触媒領域から下流)に対応する二つのペプチドを、追加のアミノ末端システイン残基を加えて合成し、ｍ-マレイミド安息香酸Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミドエステル(ＭＢＳ)(Pierce、Rockford、イリノイ州)を用いてウサギ血清アルブミン(ＲＳＡ)と接合させた。  これらペプチドを用いた免疫感作のプロトコルは、コカリコバイオロジカルズ(Reamstown、ペンシルベニア州)によって行った。  まず、免疫感作に先立って、ウサギの予備採血を行った。  第１回目の免疫感作には、フロインド完全アジュバントと500μgの接合したペプチドまたは100μgの精製したペプチドを用いた。  その後の免疫感作は全て、前回の注射から４週間後に行い、同量のタンパク質を含むフロインド不完全アジュバントを用いた。  免疫感作後７〜10日で採血をした。
【００４３】
抗体のアフィニティー精製のために、ＭＢＳを用いてＲＳＡに接合したｈｕＤＥＰ-１ペプチドを、CNBrで活性化したセファロース(Pharmacia、Uppsala、スウェーデン)にカップリングさせた。  10mMトリス塩酸、pH7.5で抗血清を10倍に希釈し、アフィニティーマトリックスとともに、一晩インキュベートした。  洗浄後、100mMグリシン、pH2.5で、結合した抗体を樹脂から溶出した。
【００４４】
第1297位から第1315位の、接合したアミノ酸残基に対して作製された抗体を抗-CSH-241と命名し、第1321位から第1334位のアミノ酸残基に対応する接合したペプチドに対して作った抗体を抗-CSH-243と命名した。
【００４５】
実施例４：トランスフェクトした宿主細胞によるｈｕＤＥＰ-１の発現
ｈｕＤＥＰ-１ｃＤＮＡのタンパク質産物を調べるために、５.１kb EcoRIインサートを、発現ベクターpMT２へとクローニングし［Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)16.17〜16.22頁］、１０％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭ中で生育したＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。  トランスフェクションは、リン酸カルシウム法［Sambrookら(1989)、前出、16.32〜16.40頁］を用いて行い、トランスフェクトしたＣＯＳ細胞およびトランスフェクトしなかったＣＯＳ細胞の双方から、トランスフェクション後48時間目に、細胞溶解物を調製した。  溶解物は、下記の通りに、抗-CHS-243抗体を用いたイムノブロッティングによる分析、および免疫複合体のＰＴＰアッセイに供した。
【００４６】
イムノブロッティング実験において、細胞溶解物の調製および電気泳動を実施した。  タンパク質濃度は、バイオラッドタンパク質アッセイ溶液を用いて定量した。  ニトロセルロースに対して、セミドライの電気泳動転写を行った後、５％ドライミルクを含む500mM NaCl、20mM トリス、pH 7.5、0.05％ Tween-20(TTBS)で、膜をブロッキングした。  ＴＴＢＳで洗浄し、二次抗体(Amersham)とインキュベートした後、エンハンス化学発光(ECL)プロトコル(Amersham)を製造業者の記載に従って行って、検出を可能ならしめた。
【００４７】
免疫複合体ＰＴＰアッセイのために、25μlのプロテイン-Ａセファロース(Pharmacia)に結合した、20μlの抗-CSH-243抗血清または免疫前のウサギ血清を用いて、60μgの細胞溶解物を免疫沈降した。  ４℃にて一晩インキュベートした後、洗浄用緩衝液(１％ Triton X-100、150mM NaCl、20mM Hepes、pH 7.5、５μg/ml アプロチニン、５μg/ml ロイペプチン、１mM ベンズアミジン、および１mM ＤＴＴ)中で３度、そして、アッセイ用緩衝液(25mMイミダゾール、pH 7.2、0.5mg/ml BSA、および１mM ＤＴＴ)中で１度、免疫複合体を洗浄した。  次いで、プロテイン-Ａセファロース免疫複合体は、150μlのアッセイ用緩衝液中に再懸濁し、三重試験にてＰＴＰ活性をアッセイした。  基質として３μMの［32Ｐ-Tyr］-還元型カルボキシメチル化(ＲＣＭ)ライソゾームを用い、総容量60μl中で、30℃にて、６分間アッセイを行った［Flintら、EMBO J. 12巻、1937〜1946頁(1993)］。
【００４８】
トランスフェクトされた細胞からの溶解物において、アフィニティー精製した抗-CSH-243抗体で180kDの分子量のタンパク質が特異的に検出された。  さらに、免疫複合体をＰＴＰ活性について分析すると、トランスフェクトしなかった細胞に比してトランスフェクトした細胞からの抗-CSH-243複合体において、約10倍もの高い活性が検出された。  このＰＴＰ活性は、ブロックした抗血清または免疫前の血清を用いた免疫沈降物由来の免疫複合体ではほとんど認められなかった。  ｈｕＤＥＰ-１ｃＤＮＡは、本来のＰＴＰ活性を有する180kDのタンパク質をコードすることが結論付けられた。
【００４９】
実施例５：ｈｕＤＥＰ-１の内在性発現
内在性に発現されるｈｕＤＥＰ-１の特徴を明らかにするために、実施例４に記載のごとく、抗-CSH-243抗体を用いたイムノブロッティングにより、CEM(ATCC CCL 119）、HeLa(ATCC CCL 2)、293(ATCC CRL 1573)、Jurkat(ATCC TIB 152)、K562(ATCC CCL243)、HL60(ATCC CCL 240)、WI38(ATCC CCL 75)およびAG 1518(Coriell Cell Repositories、Camden、ニュージャージー州)を含む、異なる細胞系からの溶解物を分析した。
【００５０】
寿命が限られている二倍体の胎児肺線維芽様細胞系であるWI38細胞が、最も高い発現量を示した。  AG 1518包皮線維芽細胞においても、同様の発現レベルが検出された。
【００５１】
ｈｕＤＥＰ-１の発現をさらに精査するために、免疫沈降およびSDS-ゲル電気泳動によって、代謝的にラベルした細胞からの溶解物を分析した。  WI38およびAG 1518細胞からの密集な培養物を、１mg/mlウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)および0.15mCi/mlトランスラベル(ICN、Costa Mesa、カリフォルニア州)を補ったメチオニン不含のＤＭＥＭ中で、４時間、代謝的にラベルした。  細胞は、0.5％ DOC、0.5％ Triton X-100、150mM NaCl、20mM Hepes、pH 7.5、５μg/ml アプロチニン、５μg/ml ロイペプチン、１mMベンズアミジン、１mM ＤＴＴ(溶解用緩衝液)中で溶解し、その溶解物を、15,000×ｇにて15分間遠心した。  次いで、約２×106個の細胞に相当する溶解物を、20μlの抗-CSH-243または抗-CSH-243とともにインキュベートした。  ４℃にて４時間インキュベートした後、50μlの１：１プロテイン-Ａセファローススラリーを添加してタンパク質／抗体複合体を結合させ、60分間インキュベーションを続けた。  プロテイン-Ａセファロースに吸着した免疫複合体を遠心によって集め、１％ Triton X-100、150mM NaCl、20mM Hepes、pH 7.5、５μg/ml アプロチニン、５μg/ml ロイペプチン、１mM ベンズアミジン、１mM ＤＴＴ(洗浄用緩衝液)中で三度、そして、20mMトリス、pH 7.5中で一度洗浄した。  還元SDS-試料用緩衝液中で95℃にて３分間インキュベートすることにより、樹脂から試料を溶出させ、７％ゲルでのSDS-ゲル電気泳動と、それに続くフルオログラフィーにより分析した。
【００５２】
WI38およびAG 1518細胞の双方において、ブロックしていない抗血清により180kDのタンパク質が特異的に認識された。  WI38細胞溶解物を用いた抗-CSH-243抗血清沈降物でもまた、予め200μg/mlのペプチド接合体とインキュベートしておいた免疫前の血清または抗血清を用いた沈降物よりも有意に高い(約10〜20倍高い)活性量が得られた。
【００５３】
［32Ｐ］-無機リン酸塩で代謝的にラベルしておいたWI38細胞の細胞溶解物からの、［32Ｐ］でラベルされた180kDタンパク質を、抗-CSH-243抗体が免疫沈降させることができるという事実のゆえに、ｈｕＤＥＰ-１はin vivoにおいてホスフォタンパク質であると考えられる。
【００５４】
実施例６：ｈｕＤＥＰ-１の細胞密度依存性の発現および活性
散在培養(7,000細胞／cm2未満)または密集培養(25,000細胞／cm2を越える)に由来するWI38細胞溶解物を、実施例４に記載のごとく抗-CSH-243抗体を用いたイムノブロッティングにより、発現されたｈｕＤＥＰ-１タンパク質のレベルについて比較した。  図２に示すように、10から20倍ものｈｕＤＥＰ-１発現の劇的な増大が、密集培養で検出された。      
【００５５】
密集度のさらに大きな培養に由来する総細胞溶解物３μgで比較的強いシグナルが与えられ、散在培養に由来する溶解物15μgでは検出限界を下回っていたので、密集培養に由来する細胞で少なくとも10倍高い量のｈｕＤＥＰ-１が存在すると見積もられた。  抗-CSH-241を用いても同様の結果が得られた。  散在細胞と密集細胞からの細胞溶解物中のＰＴＰ１Ｂの量を抗-ＰＴＰ１Ｂモノクローナル抗体ＦＧ６(Oncogene Science、Uniondale、ニューヨーク)を用いて比較すると、差異は観察されなかった。  AG 1518細胞でも同様の結果が得られたので、ｈｕＤＥＰ-１発現に対して観察された効果は、WI38細胞に限定されるものではない。
【００５６】
酵素活性もまた密度依存性の機構によって調節されるのか否かを調べるために、ｈｕＤＥＰ-１およびＰＴＰ１Ｂ免疫複合体ならびに散在および密集の双方のWI38およびAG 1518細胞培養由来の総細胞溶解物の、ＰＴＰアッセイを用いたホスファターゼ活性についての分析も行った。  免疫複合体のＰＴＰアッセイには、25μlのプロテイン-Ａセファロースに結合させた、20μlの抗-CSH-243抗血清(抗原による前処置をしたものとしなかったもの)または免疫前の血清を用いて、60μgの細胞溶解物の免疫沈降を行った。  ４℃にて一晩インキュベートした後、免疫複合体は洗浄用緩衝液中で三度洗浄し、25mMイミダゾール、pH 7.2、0.5mg/ml ＢＳＡ、１mM ＤＴＴ(アッセイ用緩衝液)中で一度洗浄した。  次いで、プロテイン-Ａセファロース免疫複合体は、150μlのアッセイ用緩衝液に懸濁し、三重試験でＰＴＰ活性についてアッセイした。  アッセイは基質として３μMの［32Ｐ-Tyr］ＲＣＭライソゾームを用い、総容量60μlで、30℃にて、６分間実施した［Flintら、前出］。
【００５７】
イムノブロッティング実験で実証されたｈｕＤＥＰ-１タンパク質発現の増大に一致して、ｈｕＤＥＰ-１酵素活性もまた密集細胞培養において増大していた。  密集培養由来のｈｕＤＥＰ-１/ＣＳＨ-２４３免疫沈降物において観察された活性の増大(約２〜３倍)は、密集培養において観察されるタンパク質発現の増大ほどには大きくなく、これは概ね、抗-CSH-243抗血清を用いた全ＰＴＰの沈降が不完全であったことによるのであろうと考えられる。  ＰＴＰ１Ｂ/ＦＧ６免疫沈降物または散在細胞および密集細胞培養由来の総細胞溶解物の活性においては、差異は観察されなかった。
【００５８】
最後に、ｈｕＤＥＰ-１発現の密度依存性アップレギュレーションの動力学を探るために、中等度の細胞密度にあるWI38細胞およびAG 1518細胞の溶解物を、イムノブロッティング分析に加えた。  飽和密度にある細胞において最も高い発現が認められたが、散在細胞培養に対して中等度の細胞密度でも発現の増大が観察された。  このように、ｈｕＤＥＰ-１発現のアップレギュレーションは飽和密度に至るに先んじて開始されており、生育阻止の結果ではないであろうと考えられる。
【００５９】
ｈｕＤＥＰ-１発現が誘導される機構は未だ不明のままであるが、二つの別個の細胞系において、細胞が密集状態に近づくにつれて発現が誘導されるという実証がなされたことにより、ｈｕＤＥＰ-１が、生育を促進するＰＴＫ活性の効果とは反対に、タンパク質の正味の脱リン酸化の促進に関与することが示唆される。  ｈｕＤＥＰ-１発現の広範な分布と合わせて、前記の可能性により、ｈｕＤＥＰ-１が細胞生育の接触阻害についての一般的な機構に関与するかもしれないことが示唆される。
【００６０】
実施例７：ＤＥＰ-１リガンドの同定
接着分子としてＤＥＰ-１が機能するという可能性は、Ｓｆ９細胞システム［Brady-Kalnayら、J.Cell Biol. 122巻、961〜972頁(1993)］を用い、続いてＤＥＰ-１ｃＤＮＡでトランスフェクトして、調べられよう。  一過性発現による研究に加えて、ＤＥＰ-１を過剰発現する安定な細胞系を作製できよう。
【００６１】
ＤＥＰ-１が接着分子として機能するのであれば、細胞外対向受容体が同定されよう。      
【００６２】
一つの可能性としては、ＰＴＰμのようにＤＥＰ-１結合は同好性であり、一つのＤＥＰ-１分子が近接する細胞上の他のＤＥＰ-１分子に結合するものである。  さもなくば、ＤＥＰ-１は異好性結合機構において、非ＤＥＰ-１分子を特異的に認識するものである。
【００６３】
加えて、結合特異性を与えるタンパク質内の重要なセグメントを同定するために、当該技術分野においてよく知られている、多くの欠失および部位特異的突然変異の戦略が適用されよう。  同種結合性相互作用または抗体結合のいずれかにおけるＰＴＰ細胞外セグメントへの係合に関する活性に対する効果についての研究を開始するために、例えば、モノクローナル抗体４Ｇ１０(UBI、Lake Placid、ニューヨーク)といった、抗ホスフォチロシン抗体と反応するタンパク質の２Ｄゲルの分析が用いられよう。
【００６４】
ＤＥＰ-１と相互作用するペプチド配列を同定するために、「エピトープ」ライブラリー技術［ScottおよびSmith、Science 249巻、386〜390頁(1990)］の使用が採用されよう。  この方法は、複数のFNIII反復配列を含む細胞外セグメントが低分子量因子と結合するかもしれないＤＥＰ-１に対するリガンドを探索する上で、特に有用である。
【００６５】
FNIII配列と特異的結合タンパク質について、タンパク質／タンパク質相互作用が以前に報告されており、ＤＥＰ-１の細胞外ドメインと特異的に相互作用するタンパク質を同定するための種々のアプローチにおいて、この情報が利用されよう。  特に、細胞「パンニング」実験［SeedおよびAruffo、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)84巻、3365〜3369頁(1987)］、ゲルオーバーレイアッセイ［Hirschら、J.Biol.Chem. 267巻、2131〜2134頁(1992)；CarrおよびScott、Trends in Biochemical Sci. 17巻、246〜249頁(1992)］、バンドシフトアッセイ［Carrら、J.Biol.Chem 267巻、13376〜13382頁(1992)］、アフィニティークロマトグラフィー、発現ライブラリーのスクリーニング［YoungおよびDavis、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)80巻、1194〜1195頁(1983)］等で、タンパク質／タンパク質相互作用が研究されるであろう。
【００６６】
実施例８：ＤＥＰ-１のモジュレーター／基質の同定
生理学的関連性が予見される、潜在性を有する基質は、in vitroでの触媒ドメインに対する活性について調べられよう。
【００６７】
これに加えて、特に、ＤＥＰ-１活性の調節能を有するタンパク質を単離するために、例えば、v-srcまたはc-srcなどのタンパク質チロシンキナーゼでの共発現に関し、酵母スクリーニングシステム［FieldsおよびSong、Nature 340巻、245〜246頁(1989)；Yangら、Science 257巻、pp.681-682(1992)；Vojtekら、Cell 74巻、205〜214頁(1993)］が利用されよう。
【００６８】
ＤＥＰ-１に対する基質を同定するためのさらなる試みでは、活性中心のシステイン残基がセリンで置換された変異体フォームの発現がなされよう。  近年の実験により、基質は不活性ホスファヤーゼに結合して複合体としてとどまることが示唆されている。  変異体ＰＴＰは、基質分子に結合することができるが、標準の免疫沈降技術によって単離することができる「ゆきどまり」複合体内にそれら分子を閉じ込めてしまう［Sunら、Cell 75巻、487〜493頁(1993)］。  潜在性を有する基質は、35Ｓ-でラベルした細胞から、変異体のＰＴＰで共免疫沈降されるかもしれない。  もしくは、野生型または天然型のＤＥＰ-１酵素を、この技術において利用しうる。  この方向性で端緒となる研究では、細胞外成長因子結合ドメインセグメントへの抗体が市販されているキメラ分子を利用することができ、一方で、真正のＤＥＰ-１配列に対して抗体が作製される。
【００６９】
実施例９：ゲノムＤＥＰ-１遺伝子の特徴付け
ＤＥＰ-１に対するｃＤＮＡ配列を単離すると、ＤＥＰ-１に対応するゲノム配列の単離および精製が可能となるであろう。  予備実験で、ｈｕＤＥＰ-１はヒトクロモソーム11ｐ、バンド11.２、または11.２と11.３との境界にマッピングされることが証明されている。  これらゲノムＤＥＰ-１配列の単離により、ＤＥＰ-１転写調節配列と推定される配列の同定、およびおそらくはＤＥＰ-１発現のトランス作用転写モジュレーターの同定が可能となるであろう。  加えて、ヒトゲノムクローンの単離および精製により、相同な相対物が他の種に存在するか否かを調べるために、その他の種においてライブラリーのスクリーニングを行うことが可能となるであろう。  ノックアウト系を作製できる可能性があるので、マウスで相同な相対物を同定することが特に重要視されよう。  特定のタンパク質を発現しないマウスの系は、動物生体内でそのタンパク質が存在しないことに関わる兆候を調べることを可能ならしめるという点で、極めて重要である。
【００７０】
これまでに、本願発明の特定の方法および組成物について説明してきたが、当業者であれば、これらに対する変更や修飾を想起するものと理解される。  従って、本願発明に対しては、特許請求の範囲の欄に記載の限定のみが付加されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１−１】ノザンブロット分析のオートラジオグラムを示す図である。
【図１−２】ノザンブロット分析のオートラジオグラムを示す図である。
【図２】ＤＥＰ-１の密度依存性の発現を示す図である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【配列表】
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