(57)【要約】【課題】簡便に効率よくＨＩＶのようなレトロウイルスの感染性クローンを作製する手法を開発し、ＡＩＤＳのようなレトロウイルス疾患の病態の解明及び有効な治療薬の選択等に有用なレトロウイルスの感染性クローン及び試験方法等を提供する。【解決手段】５以上に分割されたレトロウイルス全長ゲノムの各フラグメントから再構築された感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５以上に分割されたレトロウイルス全長ゲノムの各フラグメントから再構築された感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡ。
【請求項２】
前記５以上に分割されたレトロウイルス全長ゲノムのフラグメントが、各フラグメントの両端に、各フラグメントがゲノムにおける順序と同じ順序で連結しうるように選択された制限酵素配列を有するフラグメントである、請求項１記載の感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡ。
【請求項３】
前記５以上に分割されたレトロウイルス全長ゲノムのフラグメントが、２以上のレトロウイルス株から由来する、請求項１又は２記載の感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡを含むベクター。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載の感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡから得られた感染性レトロウイルスウイルス粒子。
【請求項６】
５以上のゲノムフラグメントから再構築された感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡを含む形質転換用タンデムリピートＤＮＡを作製する方法であって、
１）５以上に分割されたレトロウイルス全長ゲノムの各フラグメントを、各フラグメントの両端に各フラグメントがゲノムにおける順序と同じ順序で連結しうるように選択された制限酵素配列を有するフラグメントとして用意し、
２）前記各フラグメントとバチルス属細菌のベクターとの連結反応を行なって、
３）ゲノムにおける順序と同じ順序で連結した前記各フラグメントからなるレトロウイルス全長ゲノムとバチルス属細菌のベクターとが直鎖状に連結したユニットを２以上含むタンデムリピートＤＮＡを得ること、
を含む方法。
【請求項７】
前記５以上のゲノムフラグメントが、２以上のレトロウイルス株から由来するものである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項６又は７記載の方法によって作製された形質転換用タンデムリピートＤＮＡ。
【請求項９】
５以上のゲノムフラグメントから再構築された感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡを含むベクターを作製する方法であって、請求項８記載のタンデムリピートＤＮＡをバチルス属細菌のコンピテント細胞に導入して、再構築されたレトロウイルスゲノムクローンＤＮＡを含むベクターを回収することを含む方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法によって作製された感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡを含むベクター。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか１項記載の感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡ、請求項４記載のベクター、請求項５記載のウイルス粒子、請求項８記載のタンデムリピートＤＮＡ及び請求項１０記載のベクターからなる群から選択されるいずれか１つを含む微生物。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか１項記載の感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡ、請求項４記載のベクター、請求項５記載のウイルス粒子、請求項８記載のタンデムリピートＤＮＡ及び請求項１０記載のベクターからなる群から選択されるいずれか１つを、哺乳類細胞又はレトロウイルス感受性細胞に添加して培養し、この細胞中又は培養液中のレトロウイルスタンパクの発現又は活性を検出又は測定することを含む、感染性レトロウイルスゲノムクローン又はその遺伝子の特性の試験方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はレトロウイルスゲノム、特にＨＩＶゲノムの感染性クローンＤＮＡ、それを含むベクター及び微生物、ならびにそれらの製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病態の詳細な理解のためには、その原因であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、特に主要なウイルスであるＩ型のＨＩＶ（ＨＩＶ−１）の感染性クローンを感染者から回収し、解析することが求められている。
【０００３】
しかし、ＨＩＶ感染性クローンの作製は、その組換え効率、ＤＮＡの安定性等の問題のため、容易ではない。
【０００４】
現在、感染性クローンの作製は、細胞からのウイルス分離、又はウイルスＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物のクローニングにより行なわれている。
【０００５】
感染細胞からのＨＩＶ分離はウイルス回収技術として用いられるが、この方法で得られるウイルスはクローンではない。また、同じ感染細胞を用いて分離を行なった場合でも、回収されるウイルスはその都度異なり、同じウイルスを回収することは不可能である。
【０００６】
また、ＲＴ−ＰＣＲ、すなわちＨＩＶ感染者血漿中から抽出したＲＮＡを逆転写することによってｃＤＮＡを得る方法では、一度にＨＩＶのゲノムすべてをＰＣＲによって増幅することは困難である。その理由としては、第一に、ＨＩＶのゲノムの両端に長い末端反復配列（long terminal repeat；ＬＴＲ）が存在することが挙げられる。この相同な配列が存在することによって、両端からのＰＣＲが阻害されてしまうため、ＰＣＲに用いることが出来るプライマーセットが存在しないことになる。第二に、ＨＩＶは非常に多様性があり、感染者ごと、また、サブタイプごとにＨＩＶの塩基配列が異なっており、すべてのウイルスに対して使用出来るプライマーセットが限られている点がある。第三に、数kbに及ぶＲＴ−ＰＣＲでは、テンプレートとして、純度が高く、濃度が高いＲＮＡが要求されるが、感染者由来のＲＮＡは、その質、量共にまちまちであるため、常に好条件でＤＮＡを増幅出来るとは限らず、サンプルごとに条件が異なる。
【０００７】
そのため、ＲＴ−ＰＣＲに基づいて感染者からＨＩＶの全長ゲノムをクローニングするためには、主にいくつかの領域を断片的にクローニングし、後に制限酵素を用いて段階的にゲノムを再構築する手法が取られている。その際の断片化は、その後の操作を簡単にするためになるべく少なくする必要がある。したがって、従来得られてきたいくつかのＨＩＶクローンは、いずれも２又は３のフラグメントを再構築したものである。
【０００８】
しかし、ＰＣＲによって長いフラグメントを増幅した場合、１０％程度の高い確率で変異が入ることが知られている。この方法では、長いフラグメントを増幅出来るＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行うが、増幅する長さが伸びるにつれてフィデリティが低くなる傾向があり、変異が入りやすいため、得られたクローンが感染者のものと同一である可能性は低くなる。ＨＩＶの場合、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）や逆転写酵素阻害剤（ＲＴＩ）のような薬剤に対する薬剤耐性のように、一塩基異なっただけでも劇的に表現型が変わる場合があり、ＤＮＡに変異が入ることによって正確な病態及び遺伝子の解析が出来なくなるおそれがある。
【０００９】
一方、高いフィデリティを保つＤＮＡポリメラーゼは長いフラグメントを増幅出来ず、せいぜい数kb程度のいくつものフラグメント化されたクローンしか得ることができないため、ゲノムの再構築が困難となる。
【００１０】
つまり、ＨＩＶの全長ゲノムのクローニングは、操作を簡便にするために長い領域を増幅したい一方で、高いフィデリティを保つために短い領域しか増幅できないというジレンマに陥っているのである。
【００１１】
ＨＩＶのＤＮＡクローニングのツールとしては、一般的に大腸菌が使われてきた。大腸菌を使うメリットとしては、操作が最適化されおり、誰もが簡便かつ確実に核酸の操作を行える点がある。また、細胞生物学的研究が進んでおり、多分野で様々な研究材料として活用されている実績がある。しかし、大腸菌は、ＤＮＡの変異や欠失等が起こりやすく、長いＤＮＡによる形質転換効率が低いため、長い分子のクローニングに適さない。
【００１２】
同等に細胞生物学的研究が進んでいるグラム陽性細菌として、枯草菌（B. subtilis）がある。枯草菌もまた、大腸菌と同様にタンパク質の合成にも利用出来、他分野で様々な研究材料として活用されている実績があり、バイオツールとして有用性が高い。ＨＩＶの研究においても、過去にｐｏｌを発現し、ＲＴの回収を行う研究に用いられていた。枯草菌は、大腸菌にない特徴として、容易にＤＮＡの形質転換を行える能力を有する。
【００１３】
この高いＤＮＡ形質転換能を利用したクローニング方法として、柘植・板谷らによる「Ordered Gene Assembly in B. subtilis」（ＯＧＡＢ法）が以前に報告されている。この方法は、いくつものフラグメントに分断されたＤＮＡと枯草菌のプラスミドとを、一度に直線状にライゲーションし、それを枯草菌に導入して一連の遺伝子を一度にクローニングする方法である。この方法は、特に配列に制限がなく、５０kb以上の大きさのＤＮＡのクローニングについても利用できるとされている。
【００１４】
しかし、ＯＧＡＢ法は、ＬＴＲを有するウイルスゲノムへの応用は行なわれていなかった。その要因として、多様性を保持したままのＨＩＶゲノムの断片化設計が難しかったことと、ゲノム両端の相同配列であるＬＴＲが組み換えの基点になってしまうことが危惧されていたこと等が挙げられる。
【００１５】
上記でＨＩＶについて説明したような背景は、ＬＴＲを有する他のウイルス、即ち他のレトロウイルスについても同様であり、このようなウイルスについて全長ゲノムを含む感染性クローンを容易に取得することが求められてきた。
【００１６】
【特許文献１】特開２００２−１７３５０号公報
【特許文献２】特開２００３−２５０５６３号公報
【特許文献３】特開２００４−１２９６５４号公報
【非特許文献１】Virology, 345(2006) 328-336
【非特許文献２】AIDS Research and Human Retroviruses, vol.20, No.9,  2004, pp.1015-1018
【非特許文献３】Virology, 326(2004) 329-339
【非特許文献４】AIDS Research and Human Retroviruses, vol.18, No.8, 2002, pp.585-589
【非特許文献５】Vaccine 20(2002) 1181-1185
【非特許文献６】AIDS Research and Human Retroviruses, vol.16, No.12, 2000, pp.1175-1178
【非特許文献７】Virology 278, 103-110(2000)
【非特許文献８】Nature Medicine, vol.5, No.2 (1999) pp.239-242
【非特許文献９】J. Virol. 1997, pp.5140-5147
【非特許文献１０】Tsuge, K. et.al., Nucl. Acids Res. 2003 Vol 31:No 21: e133
【非特許文献１１】Gene, 55 (1987) 95-103
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、簡便に効率よくＨＩＶのようなレトロウイルスの感染性クローンを作製する手法を開発し、ＡＩＤＳのようなレトロウイルス疾患の病態の解明及び有効な治療薬の選択等に有用なレトロウイルスの感染性クローン及び試験方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、枯草菌をはじめとするバチルス属細菌（Bacillus sp.）の保持する高い遺伝子組換え能力を活用して、ＯＧＡＢ法に基づいて両端にＬＴＲを含むウイルスゲノムの全長を容易にクローニングできることを見出し、本発明を完成した。
【００１９】
即ち、本発明は、
〔１〕  ５以上に分割されたレトロウイルス全長ゲノムの各フラグメントから再構築された感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡ；
〔２〕  前記５以上に分割されたレトロウイルス全長ゲノムのフラグメントが、各フラグメントの両端に、各フラグメントがゲノムにおける順序と同じ順序で連結しうるように選択された制限酵素配列を有するフラグメントである、前記〔１〕記載の感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡ；
〔３〕  前記５以上に分割されたレトロウイルス全長ゲノムのフラグメントが、２以上のレトロウイルス株から由来する、前記〔１〕又は〔２〕記載の感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡ；
〔４〕  前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡを含むベクター；
〔５〕  前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡから得られた感染性レトロウイルスウイルス粒子；
〔６〕  ５以上のゲノムフラグメントから再構築された感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡを含む形質転換用タンデムリピートＤＮＡを作製する方法であって、
１）５以上に分割されたレトロウイルス全長ゲノムの各フラグメントを、各フラグメントの両端に各フラグメントがゲノムにおける順序と同じ順序で連結しうるように選択された制限酵素配列を有するフラグメントとして用意し、
２）前記各フラグメントとバチルス属細菌のベクターとの連結反応を行なって、
３）ゲノムにおける順序と同じ順序で連結した前記各フラグメントからなるレトロウイルス全長ゲノムとバチルス属細菌のベクターとが直鎖状に連結したユニットを２以上含むタンデムリピートＤＮＡを得ること、
を含む方法；
〔７〕  前記５以上のゲノムフラグメントが、２以上のレトロウイルス株から由来するものである、前記〔６〕記載の方法；
〔８〕  前記〔６〕又は〔７〕記載の方法によって作製された形質転換用タンデムリピートＤＮＡ；
〔９〕  ５以上のゲノムフラグメントから再構築された感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡを含むベクターを作製する方法であって、前記〔８〕記載のタンデムリピートＤＮＡをバチルス属細菌のコンピテント細胞に導入して、再構築されたレトロウイルスゲノムクローンＤＮＡを含むベクターを回収することを含む方法；
〔１０〕  前記〔９〕記載の方法によって作製された感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡを含むベクター；
〔１１〕  前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡ、前記〔４〕記載のベクター、前記〔５〕記載のウイルス粒子、前記〔８〕記載のタンデムリピートＤＮＡ及び前記〔１０〕記載のベクターからなる群から選択されるいずれか１つを含む微生物；
〔１２〕  前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡ、前記〔４〕記載のベクター、前記〔５〕記載のウイルス粒子、前記〔８〕記載のタンデムリピートＤＮＡ及び前記〔１０〕記載のベクターからなる群から選択されるいずれか１つを、哺乳類細胞又はレトロウイルス感受性細胞に添加して培養し、この細胞中又は培養液中のレトロウイルスタンパクの発現又は活性を検出又は測定することを含む、感染性レトロウイルスゲノムクローン又はその遺伝子の特性の試験方法、
を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のクローニング方法は、ＯＧＡＢ法に基づいている。したがって、ＯＧＡＢ法の原理として、全長ゲノムをフラグメントの末端配列の組み合わせの数（三塩基突出末端の場合、４３／２＋１＝３３個）までのＤＮＡフラグメントとしてそれを順番に繋ぎ合わせることが出来る。本発明によれば、ＨＩＶなどのレトロウイルス感染者からの全長ウイルスゲノムクローニングの問題点の一つである、様々な条件のＲＮＡから長いフラグメントをクローニングしなくてはならないという問題が回避され、短いフラグメントからレトロウイルスゲノムの感染性クローン全長を含むプラスミドを容易に得ることができる。短いフラグメントであれば、質の悪いＲＮＡからもクローニングすることが出来るため、例えば数十年が経過した感染者血漿からＲＴ-ＰＣＲによってフラグメントを分離し、それを最終的に集積して感染クローンとして構築することが可能となる。
【００２１】
また、本発明のクローンＤＮＡは、各フラグメントの作製時に変異が入り難いため、感染者におけるゲノム配列を正確に反映するものとなる。また、培養細胞株を用いた種々の実験に使用することができるため、実際の感染性クローンの各遺伝子と病態との関係などについての詳細な解析が可能となる。
【００２２】
さらに、遺伝子ごと、あるいは特定の領域ごとにライブラリーを作製し、それを自由に組み合わせることによって、種々の組合せの遺伝子をもつゲノムを自由に創出することができ、このようなゲノムのクローンは、これまで解析が困難であったウイルス遺伝子同士の相互作用の研究に有効なツールとして活用することができる。
【００２３】
例えば、ｇａｇ、ｐｒｏ、ＲＴなどの特定の領域のライブラリーから所望の組合せの遺伝子をもつ感染性クローンを作製し、薬剤耐性を調べることができ、その結果、患者のクローンに合わせてより効果的な薬剤の組合せを選択することができる。
【００２４】
また、多くの研究から、ＰＩやＲＴIによって生じた薬剤耐性が外の遺伝子にも変異を促していることが明らかになりつつあり、薬剤耐性ウイルスの出現のメカニズムを探る上では、様々な配列の組み合わせを作る必要がある。組み合わせる領域がある程度決まっているのであれば、その領域をクローニングしたものをいくつも用意し、総当たりで組み合わせを作っていくことが出来る。このような膨大な数の組み合わせを作るのには大変な労力を必要とするが、本発明の方法を利用することによって短時間かつ省スペースで実行することが出来る。
【００２５】
さらに、バチルス属細菌、特に枯草菌を利用することにより、以下のような効果がある。枯草菌の取り扱いは大腸菌とほとんど同じであり、試薬や培地、設備を共用出来る。したがって、大腸菌を取り扱える環境であるならば、本発明の方法の導入の際の初期投資はごくわずかであり、しかも使用する試薬が安価なものが多いため、一つの実験にかかる費用も低く抑えることが出来る。また、胞子形成させることにより、高温、乾燥、放射線など厳しい環境においてもＤＮＡを安定的に保存することが出来る。そのため、プラスミドやそれで形質転換した大腸菌を保存できるようなフリーザーがないような場所においても、サンプルを安定的に保存することが出来る。また、胞子の保存には数cm2の濾紙があれば良いので、狭いスペースで多くのサンプルを保存することが出来る。したがって、本発明のクローン等及び方法は、非常に経済性が高く、これはレトロウイルス、特にＨＩＶ感染者の多くが住む発展途上国においては特に重要な効果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明においては、レトロウイルス全長ゲノムは、５以上のフラグメントから再構築される。再構築されるべきレトロウイルスゲノムは、ＬＴＲを有するものであれば特に限定されない。レトロウイルスとしては、例えばレンチウイルス（Lentivirus）に属するもの、例えばＨＩＶ（human immunodeficiency virus type）１型及び２型、ＳＩＶ(Simian immunodeficiency virus) Chimpanzee, Sooty Mangabey, African green monkey, Macaque, Mandrill, Syke's monkey、ＦＩＶ(Feline immunodeficiency virus)、ＥＩＡＶ(Equine inectious anemia virus)；ＨＴＬＶ／ＢＬＶに属するもの、例えばＨＴＬＶ−１(Human T-cell Leukemia virus type 1)、ＢＬＶ(Bovine Leukemia virus)；スプマウイルス（Spumavirus）に属するもの、例えばＨＦＶ(Human Foamy Virus)；マウス白血病関連ウイルス（Murine Leukemia virus-related）に属するもの、例えばＭＳＶ／ＭＬＶ（Murine sarcoma and leukemia virus）が挙げられる。感染例の多さ及び医学・公衆衛生学的な重要性などの点からはＨＩＶ、特にＨＩＶ−１が典型的に用いられる。また、野生型株、変異型株のいずれであってもよく、臨床検体に由来する株であってもよい。
【００２７】
本発明においては、特に、再構築されるゲノムが、２以上の異なる株に由来するフラグメントを連結してなるものが有利である。本発明の方法によれば、特定の領域に関するフラグメントのライブラリーを作製しておいて、各フラグメントのランダムな組合せのゲノムを容易に得ることができ、このようなキメラゲノムを用いてウイルス粒子を産生させたり、酵素活性を測定したりすることによって、ある領域のある変異が表現型に及ぼす影響を簡便に調べることができる。
【００２８】
ここで、「株」は天然に存在するもの（例えば臨床検体から分離されたウイルスが有する塩基配列）であってもよく、また、天然の配列に基づいて所望の変異を導入したものであってもよい。
【００２９】
ゲノムを分割して得られるこれらの各フラグメントは、１つのゲノムを構成するすべてのフラグメントがゲノムにおける順序と同じ順序で次々に連結されるように制限酵素配列を、各フラグメントの両端に有するように設計される。したがって、１つのゲノムを分割可能な最大数は、制限酵素によって異なり、例えば３塩基突出末端を生じる制限酵素を利用する場合、４３／２＋１＝３３個である。
【００３０】
制限酵素としては、目的のレトロウイルスゲノム配列内で単一なもの（その部分だけに存在し、他には同一の配列のないユニークな配列）であれば特に制限されない。例えば、本発明の方法において使用可能な制限酵素であって、３塩基突出末端を生じるものの例としては、以下の制限酵素が挙げられる（カッコ内は制限部位の配列を表す）：Ｂｇｌ  Ｉ（ＧＣＣＮＮＮＮ／ＮＧＧＣ）、ＡｌｗＮ  Ｉ（ＣＡＧＮＮＮ／ＣＴＧ）、ＢｓａＸ  Ｉ（／９（Ｎ）ＡＣＮＮＮＮＮＣＴＣＣ（Ｎ）１０／）、Ｂｓｌ  Ｉ（ＣＣＮＮＮＮＮ／ＮＮＧＧ）、Ｄｒａ  III（ＣＡＣＮＮＮ／ＧＴＧ）、Ｍｗｏ  Ｉ（ＧＣＮＮＮＮＮ／ＮＮＧＣ）、ＰｆｌＭ  Ｉ（ＣＣＡＮＮＮＮ／ＮＴＧＧ）、Ｓｆｉ  Ｉ（ＧＧＣＣＮＮＮＮ／ＮＧＧＣＣ）、ＢｓｔＡＰ  Ｉ（ＧＣＡＮＮＮＮ／ＮＴＧＣＯ）。
【００３１】
特に、ＢｓａＸＩは、認識配列の外側を切断するという特徴的な制限酵素であり、これによりＰＣＲによって組み込まれた配列が全く残らないＤＮＡのフラグメントを作ることが出来るので好ましい。ＢｓａＸ  Ｉと他の３’−３塩基突出の末端を作る制限酵素（例えばＢｇｌ  Ｉ及びＳｆｉ  Ｉ）とを組み合わせることにより、再構築した際に全く制限酵素配列を残さないクローンを作ることが出来る。また、ＢｓａＸ  Ｉは、その特徴からあらゆる場所を継ぎ目にすることが出来るため、クローニング対象のゲノムにある制限酵素配列上からＰＣＲを行なわなくても、後にＢｓａＸ  Ｉの配列を加えることによって所望の位置でライゲーションを行なうことが出来る点でも有利である。
【００３２】
本発明においては、このような各フラグメントを１度のライゲーション反応で順番どおりに連結させることにより、全長ゲノムを含むＤＮＡに再構築する。また、このライゲーションの際に適切な制限酵素で線状化したベクターをライゲーション混合物中に含ませることにより、全長ゲノムとベクターとの連結したユニットを含む形質転換用のタンデムリピートＤＮＡを形成させる。このライゲーションは、公知の方法で一般的な条件下で行なうことができるが、各フラグメント及びベクターのそれぞれが、互いに２倍程度の差以内のモル濃度で含まれるようにすると効率よくタンデムリピートＤＮＡを得ることができる。
【００３３】
ここで、「タンデムリピートＤＮＡ」は、少なくとも２以上のユニットをタンデムに連なった状態で含んでいる必要がある。これは組換えを起こすためには相同領域が必要だからである。
【００３４】
ベクターとしては、バチルス属細菌において有効な複製起点を有するベクター（線状プラスミドベクター）であればよい。本発明において使用されるバチルス属細菌としては、例えば、枯草菌（B. subtilis）、巨大菌（B. megaterium）、脾脱疽菌（B. anthracis）、B. cereus、B. brevis、B. amyloliquefaciens、B. licheniformis、B. stearothermophilusなどが挙げられる。ＤＮＡ取り込み能力及び組換え能力の点、ならびに入手や維持の容易性などの点から、枯草菌が特に好ましい。したがって、ベクターとしては、これらの細菌において複製可能なものであればよいが、クローニング後の大量調製等の操作の便宜のためには、大腸菌においても複製可能なシャトルベクターが好ましい。
【００３５】
ベクターの具体例としては、ｐＨＹ３００ＰＬＫ  ＤＮＡ(TaKaRaカタログ番号3060)、ｐＧＥＴＳ１０３（J Bacteriol. 2001 Sep;183(18):5453-8.）、ｐＧＥＴＳ１０９（Nucleic Acids Res. 2003 Nov 1;31(21):e133.）、ｐＧＥＴＳ１１３（Appl Environ Microbiol. 2004 Apr;70(4):2508-13.）、ｐＧＥＴＳ１１８（J Mol Biol. 2005 Jun 24;349(5):1036-44.）が挙げられる。
【００３６】
上記のようにして作製した形質転換用のタンデムリピートＤＮＡをバチルス属細菌のコンピテント細胞に公知の方法で導入することにより、細菌内で環状プラスミドとして回収されるようにする。このようにして、本発明のタンデムリピートＤＮＡ及び感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡ、それらを含むベクターは、ＤＮＡの形態で、又はそれを含む大腸菌、枯草菌などのバチルス属細菌のような微生物の形態で、適宜維持・保存することができる。
【００３７】
こうして得たプラスミドを哺乳類細胞に遺伝子導入することにより、プラスミド中にクローニングされたレトロウイルスゲノムからウイルス粒子を産生させることができる。使用できる哺乳類細胞としては培養細胞であればよく、例えばＨＩＶについては２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞などの付着系細胞が挙げられるが、これに限らない。
【００３８】
また、産生されたウイルス粒子は、そのウイルスに感受性の細胞に感染させて増殖させることが可能である。例えば、ＨＩＶ感受性細胞としては、ＨＩＶの標的となりうることが公知のヒト由来の培養細胞、特に免疫系の細胞、例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＭＴ２細胞、ＭＴ４細胞、Ｍ８１６６細胞等の樹立株細胞が挙げられるが、これらに限らない。
【００３９】
本発明によれば、タンデムリピートＤＮＡ、感染性レトロウイルスゲノムクローンＤＮＡ又はそれらを含むベクターを哺乳類細胞に導入するか、あるいは感染させた細胞の培養上清などから回収したウイルス粒子を上記のようなレトロウイルス感受性細胞に添加して、これらの細胞を培養し、この細胞中又は培養液中のレトロウイルスタンパクの発現又は活性を検出又は測定することにより、細胞に導入された感染性レトロウイルスゲノムクローン又はその遺伝子がどのような特性のものであるかを調べることができる。ここで用いるレトロウイルスゲノムは、単一の株由来のものであっても、２以上の株由来のフラグメントの混成物であるキメラゲノムであってもよい。また、検出又は測定する対象としては、例えばＨＩＶについてはＲＴ活性、ｐ２４産生、ＨＩＶ−ＲＮＡコピー数などが挙げられるが、目的のレトロウイルスの機能又は構造に関するものであれば特に制限はされない。
【００４０】
このことを利用して、例えば臨床検体から本発明の方法によってクローニングした全長レトロウイルス(例えばＨＩＶ)ゲノムがどのようなＲＴ活性、増殖力等を持っているかを調べ、その患者における病態とそのレトロウイルスクローンの配列やｇａｇ、ｐｒｏ、ＲＴなどの特定の遺伝子の変異とを関連づけることができる。
【００４１】
また、多数のフラグメントのライブラリーから合成した種々の組み合せの遺伝子からなるキメラゲノムのレトロウイルス又は患者検体由来のレトロウイルス株を用いて感染させた細胞を、種々の薬剤の存在下で培養することにより、各レトロウイルスの薬剤耐性を調べることができ、さらにはその薬剤耐性に寄与している配列を同定することができる。この場合、添加する薬剤としては、レトロウイルスに対する効果が公知のものであっても未知のものであってもよい。薬剤として、公知のレトロウイルス治療薬を用いて上記の試験を行うことにより、患者の感染しているレトロウイルスゲノムのタイプに応じて有効な最適な治療薬を選択することができる。一方、薬剤として、そのレトロウイルスに対する効果が未知の物質（例えば単離された新規化合物、漢方エキスのような混合物など）を用いることにより、新規なレトロウイルス治療薬のスクリーニングを行なうことができる。
【００４２】
キメラゲノムのレトロウイルスを用いて感染させた細胞について、レトロウイルスタンパクの発現又は活性を検出又は測定することにより、これまで解析が困難であったレトロウイルス（例えばＨＩＶ）遺伝子同士の相互作用を解明することができる。また、多くの研究から、ＰＩやＲＴＩによって生じた薬剤耐性が外の遺伝子にも変異を促していることが明らかになりつつあるが、本発明の方法を用いて様々な配列の組み合わせのゲノムを調べることにより、薬剤耐性ウイルスの出現のメカニズムを探ることが容易になる。また、様々な配列の組み合わせの中から多剤耐性、強度耐性キメラウイルスを選択することにより、耐性ウイルスに効果のある新薬開発の標的ウイルスとしても利用することが可能である。
以下においてはＨＩＶ−１を例として本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００４３】
１．ＨＩＶ−１ゲノム（ＨＸＢ２株）の再構築及び枯草菌への導入
野性株であるＨＸＢ２を用いて全長ゲノムの再構築及び枯草菌への導入を行なった。
【００４４】
１）細菌株及び培地
組換えプラスミドの構築には、枯草菌（B. subtilis）RM125 ΔspoIIIAA [arg-15 leuA8 hsdR- hsdM- spoIIIAA::pUCspc]を用いた。
ＨＸＢ２ゲノムフラグメントのクローニングには、大腸菌（E. coli）TOP10 [F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) f3 80lacZΔM15 lacX74 recA1 deoR araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG]を用いた。
再構築されたＨＸＢ２ゲノムプラスミドの増幅（大量調製）には、大腸菌（E. coli）Stbl4 [hmcrA Δ(mcrBC-hsdRMS-mrr) recA1 endA1 gyrA96 gal- thi-1 supE44 λ- relA1 delta(lac-proAB)/F' proAB+ lacIqZΔM15 Tn10 (TetR )](Invitrogen)を用いた。
【００４５】
細菌培養用の培地としては、Luria-Bertani（ＬＢ）培地、Luria-Bertani （ＬＢ）寒天培地、Antibioticmedium３(AIII)(BD DIFCO)、及びモディファイド・コンピテンス（Modified Competence；ＭＣ）培地を用いた。培地に添加した選択抗生物質は、大腸菌については２５μg/ml  アンピシリン（ampicillin；Ａｍｐ）であり、枯草菌については１０μg/ml  テトラサイクリン（tetracycline；Ｔｅｔ） 及び１００μg/ml  スペクチオマイシン（spectionmycin；Ｓｐｃ）であった。
各細菌は、大腸菌は３０℃、枯草菌は３７℃で生育させた。
【００４６】
２）プラスミド
プラスミドとしては、柘植らによって構築された大腸菌−枯草菌シャトルベクター、ｐＧＥＴＳ１０９ＳｆｉＩを用いた（Nucleic Acids Res. 2003 Nov 1;31(21):e133.）。
ＨＸＢ２ゲノムの供給源としてはＨＸＢ２ｃｖを用いた。ＨＸＢ２ｃｖは、先に記載されたＨＸＢ２バックボーン上に構築されたＨＩＶ−１ゲノムＤＮＡクローニングベクタープラスミド（Wataru Sugiura et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 46, p708-715, 2002）であった。
【００４７】
３）ＨＸＢ２フラグメントのクローニング
ＨＸＢ２ゲノムのフラグメントは、再構築してつなぎ合わせた際に元の配列と全く同じになるように、ＰＣＲを行なう際に加える制限酵素配列を設計して、図２に示すようにＨＸＢ２のゲノム全長９．７kbpを以下の５つのフラグメント（ＦＧ１〜ＦＧ５）に分割して増幅した。各フラグメントの長さと制限酵素配列は以下のとおりであった：
【００４８】
ＦＧ１（５’ＬＴＲ）：  ８３７bp  （ＢｓａＸ  Ｉ）；
ＦＧ２（ｇａｇ−ｐｏｌ）：  １．９kbp  （Ｂｇｌ  Ｉ）；
ＦＧ３（ｐｏｌ−ｅｎｖ）：  ３．８kbp  （ＢｓａＸ  Ｉ）；
ＦＧ４（ｅｎｖ−ｒｅｖ）：  １．４kbp  （ＢｓａＸ  Ｉ）；
ＦＧ５（ｒｅｖ−３’ＬＴＲ）：  ２．１kbp  （Ｓｆｉ  Ｉ）。
【００４９】
元の配列上にＢｓａＸ  Ｉの認識配列があるＦＧ２とＦＧ５は、制限酵素で処理した際に切り出される外側の部分にＰＣＲで認識配列が組み込まれるように、また、フラグメントを切り出した際には元の配列と同じ配列が残るように設計した。その他のフラグメント（ＦＧ１、ＦＧ３、ＦＧ４）は、切断面が一致するようにＢｓａＸ  Ｉの認識配列がＰＣＲで組み込まれるように設計した。
【００５０】
ＨＸＢ２ｃｖをテンプレートとして、ＦＧ１、ＦＧ２、ＦＧ４及びＦＧ５についてはＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（TOYOBO、大阪、日本）、ＦＧ３についてはＬＡ−Ｔａｑ（TaKaRa、カタログ番号RR002A）をそれぞれ用い、それぞれ以下のプライマー対を用いてＰＣＲによって両端に制限酵素配列を組み込み、増幅した。
【００５１】
ＦＧ１：
p16147_BX-F (5' AAA ATC ATC CCA AAC TTC CCC TCC CAT ACC CAC TTA CTT GGC CTG C)（配列番号１）及び
WGPF_BX-R (5' TTT GGC GTA CTC AGG AGT CGC CGT CCC TCG CCT CTT)（配列番号２）；
ＦＧ２：
WGPF2_BG1-F (5' TTG CTG AAG CGC GCA GCC CAA GAG GC)（配列番号３）及び
DRPRO6_BG1-R (5' ATT GCC TCA ATG GCC ATT GTT TAA CTT TTG GGC CAT CCA T)（配列番号４）；
ＦＧ３：
DRPRO_BX-F (5' ATG GAT GGC CCA ACA GTT ACT CCA TGG CCA TTG)（配列番号５）及び
env6498_BX-R (5' TTT TCT GTC ACA ACT ACC ACT CCT ACT TCT TGT)（配列番号６）；
ＦＧ４：
env6443_BX-F (5' TGT GTA CCC ACA CTC CCC AAC CCA CA)（配列番号７）及び
env7874_BX-R (5' ACT GCA CTA TAC CGG AGA ATA AGT GTC TGG CCT GTA)（配列番号８）
ＦＧ５：
env7823_SF-F (5' TCA ATG ACG CTG GCC GTA CAG GCC)（配列番号９）及び
p9929_SF-R (5' TAT GGC CTA GAC GGC CTT AAT TGA ATT CTA GAT AG)（配列番号１０）。
【００５２】
ＰＣＲ条件は、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合は９８℃で１分の後、９８℃で１０秒及び６８℃で３０秒を３０サイクル、６８℃で１分、Ｌａ−Ｔａｑを用いた場合は９２℃で１分の後、９２℃で１分と５５℃で１分と７２℃で５分とからなる３０サイクルであった。
【００５３】
増幅されたＰＣＲ産物を、それぞれ、ＦＧ１、ＦＧ２、ＦＧ４及びＦＧ５のシークエンシング用には「Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit」（Invitrogen、カタログ番号K2800-20）を用い、ＦＧ３用には「TOPO XL PCR Cloning Kit」（Invitrogen、カタログ番号K4700-10）を各々のキットに添付の指示書にしたがって用いて、それぞれ大腸菌ＴＯＰ１０にクローニングした。それぞれのフラグメントをクローニングしたクローンを、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＦＧ１、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＦＧ２、ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ−ＦＧ３、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＦＧ４、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＦＧ５と名付けた。
【００５４】
大腸菌からのプラスミドの少量調製（miniprep preparation）は、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System（Promega、カタログ番号A1330）を用いて行なった。
調製したプラスミドをシークエンスした結果、予想されたとおりの領域のフラグメントがクローニングされたことが確認された。
【００５５】
４）ＨＸＢ２の全長分子クローンの再構築
ＦＧ１及びＦＧ５の上記大腸菌クローンからそれぞれ得たプラスミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＦＧ１及びｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＦＧ５、及び枯草菌−大腸菌シャトルベクターであるｐＧＥＴＳ１０９ＳｆｉＩ（特開２００４−１２９６５４、〔００３９〕に記載のもの）を、Ｓｆｉ  Ｉで消化した。クローンＦＧ２から得たプラスミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＦＧ２はＢｇｌ  Ｉで、クローンＦＧ３及びＦＧ４からそれぞれ得たプラスミドｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ−ＦＧ３及びｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＦＧ４はＢｓａＸ  Ｉで、それぞれ消化した。
【００５６】
これらの各ＤＮＡを、ＴＡＥ緩衝液（４０mM  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ８）、１mM  ＥＤＴＡ）中で０．７％低融点アガロースゲル（SIGMA type IV）を用いたアガロースゲル電気泳動で泳動し、目的のフラグメントを切り出して精製した。
【００５７】
精製されたフラグメントの濃度は、段階的に希釈したフラグメントを１％アガロースゲルで泳動し、エチジウム・ブロマイドで染色したバンドの濃さを視覚的に比較することによって決定した。モル濃度は、ＤＮＡの各フラグメントの分子量から算出した。これらの各フラグメントが同じモル濃度になるように適当な容量で混合した。
【００５８】
上記で混合したフラグメントの等モル溶液を、「線状連結システム（linear ligation system）」によって連結した。このシステムは、２倍高濃度の緩衝液（１３２mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１３．２mM  ＭｇＣｌ２、２０mM  ジチオスレイトール、０．２mM  ＡＴＰ、３００mM  ＮａＣｌ、２０％（w/v）ポリエチレングリコール６０００(Wako pure chmical)含有）及びＴ４−ＤＮＡリガーゼ(ToYoBo)を用いた。
その結果、高分子量タンデムリピートＤＮＡが生成されたことが電気泳動によって確認された（図３）。
【００５９】
５）枯草菌のトランスフォーメーション及び再構築プラスミドの調製
枯草菌のコンピテント細胞をＭＣ培地培養で調製した。上記のようにして得られた高分子量タンデムリピートＤＮＡを、コンピテント細胞を含む５００μLのＭＣ培地に添加し、３７℃で３０分間、インキュベートした。このインキュベート後のコンピテント細胞に、１mLのAIII培地を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
【００６０】
この培養物を、選択のためにテトラサイクリンを含有するＬＢプレート上に展開して、一晩培養した。続いて、出現したコロニーを、テトラサイクリン含有ＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００６１】
枯草菌からのプラスミドの調製は、アルカリ−ＳＤＳ（alkaline-sodium dodecyl sulfate）法を用いて行なった。抽出したプラスミドをＨｉｎｄ  IIIで切断し、そのパターンを電気泳動で確認した。
その結果、シークエンスから予想される位置にバンドが出現し、フラグメント化したＤＮＡを順番どおりに再構築することに成功したことが確認された（図４）。このプラスミドを、ｐＧＨＸＢ２と名付けた。
【００６２】
６）大腸菌Ｓｔｂｌ４の形質転換及びプラスミドの大量調製
再構築されたプラスミドを大量調製するために、枯草菌によって再構築されたプラスミド（ｐＧＨＸＢ２）で、BTX electro cell manipulator 600（ＢＴＸ、ＢＴ６００、Rev.６）を用いた電気穿孔法(１．５kV、２５μF)によって大腸菌（エレクトロマックスＳｔｂｌ４(登録商標)；Invitrogen）を形質転換した。
【００６３】
形質転換後、培養物を、アンピシリン含有ＬＢプレート上に展開し、一晩培養した。続いて、出現したコロニーを、アンピシリン含有ＬＢ培地に接種して、３７℃で一晩培養した。大腸菌からのプラスミドの大量調製は、Hispeed Plasmid Maxi Kit（QIAGEN、カタログ番号12663）を用いて行なった。得られたプラスミドを、枯草菌の場合と同様にＨｉｎｄ  IIIで切断し、そのパターンを電気泳動で確認した。
【００６４】
その結果、シークエンスから予想される位置にバンドが出現し、大腸菌においても再構築したプラスミドを増幅出来ることが確認された（図５及び図６）。また、このプラスミドの配列を決定した結果、予想される配列のとおりであることが確認された（データは示していない）。
【００６５】
２．ＨＩＶ−１感染者由来フラグメントとＨＸＢ２株由来フラグメントとからなるＨＩＶ−１ゲノムの再構築
ＨＩＶ−１感染者由来のｇａｇ−ｐｒｏ（ＦＧ２に相当する）領域のフラグメントと上記でクローニングしたＨＸＢ２の各フラグメント（ＦＧ１、ＦＧ３、ＦＧ４、ＦＧ５）とを結合した。
【００６６】
国立感染症研究所で収集したＨＩＶ感染者血漿２検体より抽出したＨＩＶ−ＲＮＡをテンプレートとし、前記と同じプライマー対を用いて、ＲＴ−ＰＣＲでＦＧ２に相当する領域の遺伝子フラグメントを増幅した。増幅後、このフラグメントを上記と同様にしてクローニング（TOPOクローニング）し、塩基配列を確認した後、制限酵素Ｂｇｌ  Ｉで切り出したこのフラグメントを、ＨＸＢ２の各フラグメント（ＦＧ１、ＦＧ３、ＦＧ４、ＦＧ５）及び直鎖状にしたｐＧＥＴＳ１０９ＳｆｉＩ（Nucleic Acids Res. 2003 Nov 1;31(21):e133.）と、上記と同様に混合してＤＮＡリガーゼでライゲーションした。
【００６７】
電気泳動による確認によって、ライゲーション産物（タンデムリピートＤＮＡ）が臨床検体１、２のいずれにおいても認められた（図７）。
タンデムリピートＤＮＡを上記と同様にして枯草菌に取り込ませ、ｐＧＥＴ１０９ＳｆｉＩとともに環状になったＨＩＶ全長ゲノムを含むクローンを回収した。これを上記と同様に大腸菌で増やした。
【００６８】
図８は、寒天培地上での臨床検体のＤＮＡを取り込ませた枯草菌トランスフォーメーションコロニーの形成を示す図である。「Ｗ．Ｔ」はＨＸＢ２ｃｖ、「Ｃａｓｅ１」は臨床検体１、「Ｃａｓｅ２」は臨床検体２をそれぞれ用いてトランスフォーメーションしたプレートである。「Ｎｏ−ＤＮＡ」はコントロール（ＤＮＡなし）である。
【００６９】
これらの感染性クローンのプラスミドをＨｉｎｄ  IIIで切断し、そのパターンを電気泳動で確認した（図９）。図９において、「１」はｐＧＨＸＢ２、「２」「３」は同じ臨床検体１より得られた異なるクローンであり、それぞれＨｉｎｄ  III切断サンプルである。ｐＧＨＸＢ２、臨床検体１について同じパターンであった。
【００７０】
枯草菌より回収し、大腸菌で増やした感染性クローンのＨｉｎｄ  III切断パターンは、ＨＸＢ２ｃｖ、臨床検体１について同じであった。
臨床検体１については、ＦＧ２領域の塩基配列解析を行ない、臨床検体１由来のフラグメントがＨＸＢ２由来フラグメントと組み換えられたことを確認した。
【００７１】
３．再構築されたＨＩＶゲノムからのウイルスの確認
１）細胞株及び培地
以下の実験において、ＨＩＶ感受性培養細胞としては、２９３Ｔ、ＭＴ２及びＭ８１６６細胞株を用いた。用いた培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したRoswell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）１６４０培地であった。培養細胞は、５％ＣＯ２の存在下で３７℃で培養した。培地に添加した抗生物質は、１０units/mlのペニシリンＧ（Ｐｃ）及び１０μg/mlのストレプトマイシン（Ｓｍ）であった。
【００７２】
２）ｐＧＨＸＢ２での２９３Ｔ細胞のトランスフェクション
再構築されたクローンのウイルス粒子形成を確認するために、４μgの再構築されたｐＧＨＸＢ２を、CalPhos Mammalian Transfection Kit (CLONETECH)をキットの指示書にしたがって用いて５×１０６個の２９３Ｔ細胞に導入した。比較のため、プラスミドＨＸＢ２ｃｖを用いて同様にトランスフェクションした。２４時間後、培地を収穫して、２日ごとに新鮮な培地と交換した。培養上清を、ｐ２４  ＥＬＩＳＡによってアッセイした。また、収穫した上清を、ＭＴ２細胞における複製動態のアッセイに用いた。
【００７３】
３）ｐ２４  ＥＬＩＳＡアッセイ
１００μLの培養上清を、９００μLのＰＢＳ及び１μLの溶解緩衝液（lysis buffer）と混合した。RETRO-TEK HIV-１p24 Antigen ELISA（ZeptoMetrix）をキットの指示書にしたがって用いて、ｐ２４  ＥＬＩＳＡアッセイを行なった。
【００７４】
その結果、ＨＸＢ２ｃｖ、ｐＧＨＸＢ２共にＨＩＶウイルスを産生することが確認された（図１０）。
ｐ２４産生量（ng/ml）は、ＨＸＢ２ｃｖの方が高かった。その原因としては、おそらく、ＨＸＢ２ｃｖのベクターがｐＧＨＸＢ２よりも約５kb小さいため、トランスフェクションの効率に差があったこと、そしてＨＸＢ２ｃｖはＬＴＲ以外にＳＶ４０をプロモーターとして持つため、トランスフェクション後のウイルスの発現量に差が出たことが考えられる。
しかし、ｐＧＨＸＢ２によって産生されたウイルスの量は、実用的には十分な量であり、この産生量の差は問題とはならない結果である。
【００７５】
４）ＭＴ２細胞株におけるｐＧＨＸＢ２の複製動態
再構築されたウイルスの生育動態を評価するために、上記で収穫した１mLの２９３Ｔ細胞の上清を用いて、１．５mLのマイクロチューブ内で３７℃で２時間のインキュベーションによって３×１０６個のＭＴ２細胞を感染させた。インキュベーション後、感染したＭＴ２細胞を洗浄し、予め温めた９mLの１０％  ＲＰＭＩ１６４０培地を含むＴ１２．５培養フラスコ（BD Falcon、カタログ番号353107）に移した。２〜３日ごとに培地の半分を新鮮な培地と交換した。培養上清を、以下のようにしてＲＴ活性についてアッセイした。
【００７６】
５μLの培養上清を、２５μLのＲＴ反応混合物（０．１３μg/mlオリゴｄＴ、４．２μg/ml  ポリＡ、５０mM Tris(ｐＨ７．８)中、６３mM  ＫＣｌ、４．２mM  ＭｇＣｌ２、０．８５mM  ＥＤＴＡ、０．０８％  Nonidet P-40、及び０．５μCiの［３２Ｐ］ｄＴＴＰ（４００Ci/mmol））と混合した。３７℃で１２０分間のインキュベーションの後、５μLの反応液をＤＥＡＥイオン交換紙上にスポットし、２×ＳＳＣ（１×のＳＳＣは、０．１５M  ＮａＣｌ及び０．０１５Mクエン酸ナトリウム）中で３回洗浄し、取り込まれなかった［３２Ｐ］ｄＴＴＰを除去した。紙をシンチレーションカウンターでカウントした。
【００７７】
その結果、ｐＧＨＸＢ２の生育曲線はＨＸＢ２ｃｖと同じパターンで同等の増殖を示し、形質転換によって全く同じウイルスが産生されたことが確認された（図１１）。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、本発明において使用したＯＧＡＢ法の原理を説明する図である。
【図２】図２は、ＨＩＶ−１（ＨＸＢ２株）の全長ゲノムと、それを挿入するべきプラスミドｐＧＥＴＳ１０９ＳｆｉＩの構成を示す図である。「ＦＧ１」はＬＴＲ、「ＦＧ２」は構造タンパクＧａｇ及びプロテアーゼ、「ＦＧ３」は逆転写酵素（ＲＴ、インテグラーゼ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、「ＦＧ４」はエンベロープタンパクｇｐ１２０、ＦＧ５はｇｐ４１、ｎｅｆ及びＬＴＲを、それぞれ含む。
【図３】図３は、ライゲーションの前後の遺伝子フラグメントの変化を示すゲル電気泳動像である。「１０００bp  ｌａｄｄｅｒ」はマーカー、「Ｌｉｇａｔｉｏｎ前」はライゲーション前、「Ｌｉｇａｔｉｏｎ後」はライゲーション後のサンプルをそれぞれ示す。「Ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」は連結産物である。ライゲーション前に見られたフラグメントと受け手であるベクターのバンドは、ライゲーション後はほとんど確認できなくなり、その代わりに大きな遺伝子（「Ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」）が認められるようになり、遺伝子フラグメントが直鎖状に連結したことが確認された。
【図４】図４は、枯草菌から回収されたｐＧＨＸＢ２をＨｉｎｄ  IIIで消化して生じた各フラグメントのゲル電気泳動像を示す図である。ｐＧＨＸＢ２は目的のＨＩＶ−１ゲノムの全フラグメントを含むことが確認された。
【図５】図５は、大腸菌で増幅させたｐＧＨＸＢ２をＨｉｎｄ  IIIで消化して生じた各フラグメントのゲル電気泳動像を示す図である。大腸菌に導入されたｐＧＨＸＢ２は目的のＨＩＶ−１ゲノムの全フラグメントを含み、大腸菌からも同様にプラスミドを回収できることが確認された。
【図６】図６は、電気泳動により、枯草菌から回収されたＨＩＶ全長ゲノムクローン（ｐＧＨＸＢ２）と今回の実験で模擬的に用いたＨＸＢ２ゲノムのＨｉｎｄ  III切断によるフィンガープリンティング像を比較した図である。「Ｍａｒｋｅｒ」はマーカー、「ＨＸＢ２ｃｖ／Ｈｉｎｄ  III」はＨＸＢ２ｃｖをＨｉｎｄ  IIIで切断したもの、「ｐＧＨＸＢ２（B.subtilis）／Ｈｉｎｄ  III」は枯草菌から回収したｐＧＨＸＢ２をＨｉｎｄ  IIIで切断したもの、「ｐＧＨＸＢ２（E.coli）／Ｈｉｎｄ  III」は枯草菌から回収後、改めて大腸菌で増殖し回収したpＧＨＸＢ２をＨｉｎｄ  IIIで切断したものをそれぞれ示す。  ベクターのバンド以外は、両者のＨｉｎｄ  III切断パターンは一致している。
【図７】図７は、ＨＸＢ２及び臨床検体のリニアライゲーションを示す電気泳動像である。「１」及び「２」はＨＸＢ２、「３」及び「４」は臨床検体１、「５」及び「６」は臨床検体２の、それぞれＦＧ１、ＦＧ２、ＦＧ３、ＦＧ４、ＦＧ５のライゲーション前及びライゲーション後のサンプルである。  ＨＸＢ２ｃｖと同じように、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ感染者の血液より増幅したフラグメントを用いた場合においても、ライゲーション反応後、５つのフラグメントが結合した大きな遺伝子産物（「Ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」）が認められる。
【図８】図８は、寒天培地上での臨床検体のＤＮＡを取り込ませた枯草菌トランスフォーメーションコロニーの形成を示す図である。「Ｗ．Ｔ」はＨＸＢ２ｃｖ、「Ｃａｓｅ１」は臨床検体１、「Ｃａｓｅ２」は臨床検体２をそれぞれ用いてトランスフォーメーションしたプレートである。「Ｎｏ−ＤＮＡ」はコントロール（ＤＮＡなし）である。
【図９】図９は、大腸菌に導入した臨床検体１のプラスミドの確認を示す電気泳動像である。「１」はｐＧＨＸＢ２、「２」及び「３」は臨床検体１の、それぞれＨｉｎｄ  III切断サンプルである。枯草菌より回収し、大腸菌で増やした感染性クローンのＨｉｎｄ  III切断パターンは、ＨＸＢ２及び臨床検体１の両方について同じであった。
【図１０】図１０は、ｐ２４アッセイの結果を示す図である。枯草菌で再構築されたＨＩＶ全長ゲノムクローン（ｐＧＨＸＢ２）は、オリジナルのＨＸＢ２ｃｖと同様に粒子形成することが可能であった。
【図１１】図１１は、ＭＴ２細胞でのウイルスの増殖を示す図である。枯草菌で再構築されたＨＩＶ全長ゲノムクローン（ｐＧＨＸＢ２）（●）は、ＭＴ２細胞でオリジナルのＨＸＢ２ｃｖ（△）と同等の増殖を示した。
【図１】
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【図２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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