(57)【要約】【課題】基底膜レベルで一定レベルの皮膚潰瘍を容易に発症し、かつ実験動物モデルとして十分な寿命を有するマウスを提供すること。【解決手段】ＢＰ１８０遺伝子が不活性化された、１８０ｋＤ類天疱瘡抗原を発現できないノックアウトマウス、およびその製造方法であって、ＢＰ１８０が不活性化されたマウス胚幹細胞をマウスに導入して得られたキメラ胚を、マウスの子宮に着床させて得られるキメラマウス同士を交配させて、ヘテロ接合体またはホモ接合体のノックアウトマウスを得るステップを含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＰ１８０遺伝子の機能が欠損したノックアウトマウス。
【請求項２】
ＢＰ１８０遺伝子の少なくとも一部が欠失しているか、または他の遺伝子と置換されている、請求項１記載のノックアウトマウス。
【請求項３】
前記ＢＰ１８０遺伝子の少なくとも一部がエキソン２を含む、請求項２記載のノックアウトマウス。
【請求項４】
前記他の遺伝子が選択マーカー遺伝子である、請求項２記載のノックアウトマウス。
【請求項５】
ホモ接合体である、請求項１記載のノックアウトマウス。
【請求項６】
ＢＰ１８０遺伝子の機能が欠損したノックアウトマウスの製造方法であって、
ＢＰ１８０遺伝子が不活性化されたマウス胚幹細胞をマウス胚盤胞に導入して得られたキメラ胚を、メスマウスの子宮に着床させて得られるキメラマウス同士を交配させて、ヘテロ接合体のノックアウトマウス、またはホモ接合体のノックアウトマウスを得るステップを含む、ノックアウトマウスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＰ１８０遺伝子の機能が欠損しており、表皮基底膜を構成するタンパク質の一つである１８０ｋＤ類天疱瘡抗原を欠損したマウスに関する。
【背景技術】
【０００２】
潰瘍治療の実験をするために、潰瘍が形成された動物モデルが用いられる。これまでの動物モデルは、皮膚に物理的な衝撃を与えて潰瘍を形成させて作製されていた。このように作製された動物モデルの潰瘍の深さや大きさは、個々の動物によって一定ではなく、そのモデルから得られる実験データの信頼性が十分ではなかった。
【０００３】
皮膚潰瘍とは、表皮の部分的欠損が皮下組織にまで達した状態である。したがって、表皮と真皮の間に存在する表皮基底膜を構成するタンパク質が欠損すると、潰瘍が形成されやすくなる。基底膜タンパク質の例には、ＶＩＩ型コラーゲン、ラミニン５、β４インテグリンなどのほか、１８０ｋＤ類天疱瘡抗原（ＸＶＩＩコラーゲン）が含まれる。これらのうち、ラミニン５、ＶＩＩ型コラーゲン、またはα６インテグリンを欠損したマウスが報告されている（非特許文献１〜４参照）。しかしながら、これらのマウスは、生後間もなく（２〜３日）に死亡するため、潰瘍治療の実験の動物モデルには適さない。
【０００４】
一方、１８０ｋＤ類天疱瘡抗原は、ＢＰ１８０遺伝子にコードされたタンパク質である。ＢＰ１８０遺伝子のｃＤＮＡのアクセッション番号はＮＭ  ００７７３２であって、ゲノム情報は非特許文献５に記載されている。
【非特許文献１】J. Invest Dermatol. 2003 121 (4): 720-31
【非特許文献２】J. Cell Biol. 1999 145 (6): 1309-23.
【非特許文献３】J. Cell Sci. 1999 112 (Pt 21): 3641-8.
【非特許文献４】J. Cell Biol. 1998 143 (1):253-66.
【非特許文献５】J. Biol. Chem. 268 (12), 8825-8834 (1993)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
表皮基底膜を構成するタンパク質を欠損したマウスは、基底膜のレベルで皮膚潰瘍を一定に発症することができ、潰瘍治療の実験動物モデルとして有用であると考えられる。そこで本発明は、基底膜タンパク質を欠損したマウスであって、潰瘍治療の実験の動物モデルとして十分な寿命を有するマウスを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＢＰ１８０遺伝子を不活性化させて、１８０ｋＤ類天疱瘡抗原（以下、「ＢＰ１８０タンパク質」とも称する）の発現を抑制すると、基底膜レベルで一定の皮膚潰瘍を容易に発症し、かつ長寿命であるマウスが得られることを見出して完成された。
すなわち本発明は以下の通りである。
［１］ＢＰ１８０遺伝子の機能が欠損したノックアウトマウス。
［２］ＢＰ１８０遺伝子の機能が欠損したノックアウトマウスの製造方法であって、ＢＰ１８０遺伝子が不活性化されたマウス胚幹細胞をマウス胚盤胞に導入して得られたキメラ胚を、メスマウスの子宮に着床させて得られるキメラマウス同士を交配させて、ヘテロ接合体のノックアウトマウス、またはホモ接合体のノックアウトマウスを得るステップを含む、ノックアウトマウスの製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のマウスは、皮膚潰瘍治療の実験のための動物モデルとして用いることができるので、皮膚潰瘍の治療剤の開発や、皮膚再生治療の開発に応用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
１．本発明のマウス
本発明のマウスは、そのＢＰ１８０遺伝子の機能が欠損されていることを特徴とする。ＢＰ１８０遺伝子の機能が欠損されているとは、ＢＰ１８０遺伝子の少なくとも一部が欠失している；少なくとも一部が他の遺伝子と置換されている；任意の部位に外来シークエンスが挿入されている；または当該遺伝子のプロモーターが不活性化されている、ことを含む。
欠失または置換される、ＢＰ１８０遺伝子の少なくとも一部には、遺伝子のコード領域またはエキソンが含まれることが好ましく、特にエキソン２が含まれることが好ましい。また、置換している他の遺伝子は、選択マーカー遺伝子であることが好ましく、選択マーカー遺伝子の例には、ネオマイシン耐性遺伝子、単純ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子、およびジフテリアトキシンＡ断片遺伝子などが含まれるが、好ましくはネオマイシン耐性遺伝子である。
【０００９】
本発明のマウスは、ＢＰ１８０遺伝子における対立遺伝子のいずれか一方の機能が欠損されているヘテロ接合体でも、対立遺伝子の両方の機能が欠損されているホモ接合体のノックアウトマウスであってもよいが、１８０ｋＤ類天疱瘡抗原を欠損しているマウスはホモ接合体のノックアウトマウスである。
【００１０】
本発明のマウスは、そのＢＰ１８０遺伝子の機能が欠損されており、さらにホモ接合体である本発明のマウスはＢＰ１８０タンパク質を欠損している。ＢＰ１８０タンパク質は、皮膚基底膜を構成するタンパク質の一つであって、ＸＶＩＩコラーゲンまたは１８０ｋＤ類天疱瘡抗原と称されることもある。皮膚基底膜とは、表皮と真皮の間に存在し、表皮と真皮を結合させるほか、外界からの力学的ストレスから皮膚を守る働きなどを担っている。したがって、ＢＰ１８０タンパク質を発現できない本発明のマウスは、外界からの刺激によって、容易に皮膚潰瘍、またはびらんを発症する。組織学的に言えば、本発明のマウスは表皮と真皮の基底膜部に解離を生じさせやすい。
一方、本発明のマウスはＢＰ１８０タンパク質を発現しないが、通常は、その他の基底膜タンパク質を正常に発現する。
【００１１】
さらに、本発明のマウスは、実験動物モデルとして十分な寿命を有しうる。実験動物モデルとして十分な寿命とは、たとえば３〜４ヶ月以上である。
一方、本発明のマウスは陰部にびらんを発症しているため、通常は生殖能力を有さない。
【００１２】
本発明のマウスは種々の用途で用いられうるが、たとえば実験動物モデルとして用いられる。動物モデルとして用いるとは、抗潰瘍剤；皮膚の再生治療；表皮水疱症の遺伝子治療の効果を検討するために、これらのモデルを用いることを含む。
【００１３】
２．本発明のマウスの製造方法
本発明のマウスの製造方法は特に制限されないが、たとえばＢＰ１８０遺伝子が不活性化されたマウス胚幹細胞をマウス杯盤胞に導入して得られるキメラ胚を、メスマウスの子宮に着床させて得られるキメラマウスを得るステップを含む。より具体的には、たとえば以下のＡ）〜Ｇ）の工程で、本発明のマウスが得られる。
Ａ）ＢＰ１８０ゲノムＤＮＡのフラグメントをクローニングする工程；
Ｂ）得られたフラグメントの少なくとも一部を欠失させるか、または他の遺伝子と置換させて、ＢＰ１８０遺伝子を不活性化する改変フラグメントを得る工程；
Ｃ）得られた改変フラグメントをベクターに組み込み、ターゲッティングベクターを得る工程；
Ｄ）得られたターゲティングベクターをマウス胚幹細胞に導入して、ＢＰ１８０遺伝子が不活性化されたマウス胚幹細胞を得る工程；
Ｅ）得られたマウス胚幹細胞をマウス杯盤胞に導入して、キメラ胚を得る工程；および
Ｆ）得られたキメラ胚をメスマウスの子宮に着床させて、キメラマウスを発生させる工程。
【００１４】
さらに本発明のマウスの製造方法は、Ｇ）前記キメラマウス同士を交配させて、ヘテロ接合体のノックアウトマウス、またはホモ接合体のノックアウトマウスを得る工程を含みうる。以下、それぞれの工程について説明する。
【００１５】
Ａ）ＢＰ１８０のゲノムＤＮＡフラグメントをクローニングする工程
ＢＰ１８０の、所望のゲノムＤＮＡフラグメントは、マウスゲノムライブラリーから、クローニング、さらに必要に応じてサブクローニングすることによって得られる。クローニングまたはサブクローニングされるフラグメントには、コード領域（好ましくは、ＡＴＧ開始コドンを有する第２エキソン）が含まれることが好ましい。
たとえば、１２９Ｓｖ／Ｅｖマウスライブラリーから１４．７ｋｂのフラグメントをクローニングして、さらに１１．５ｋｂのＮｈｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントをサブクローニングすれば、所望のフラグメントが得られる。
【００１６】
Ｂ）ＢＰ１８０遺伝子を不活性化する改変フラグメントを得る工程
工程Ａ）で得られたフラグメントの一部を欠失させるか、または他の遺伝子と置換させることで、ＢＰ１８０遺伝子を不活性化するフラグメント（以下、「改変フラグメント」ともいう）を得ることができる。欠失または置換される部分は、コード領域（好ましくはエキソン２）を含むことが好ましい。
【００１７】
置換する他の遺伝子を、選択マーカーすなわち薬剤耐性遺伝子（たとえば、ＰＧＫ−ｎｅｏ：ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター／ネオマイシン抵抗遺伝子カセット）とすれば、後述するマウス胚幹細胞の選択が容易になりうる。
【００１８】
Ｃ）改変フラグメントを組み込まれたターゲッティングベクターを得る工程
改変フラグメントを、任意のベクターに導入してターゲッティングベクターを得る。ベクターの種類は特に制限されないが、改変フラグメントの上流領域と下流領域の相同配列を含むことが好ましい。ベクターの例には、プラスミドベクターｐＳＰ７２（プロメガ株式会社）を適宜改変したものが含まれる。これらのベクターに改変遺伝子断片を通常の手段で組み込むことにより、ターゲッティングベクターが得られる。なお、ターゲッティングベクターはマウス胚幹細胞に相同組み換えを起こすことができるものであれば、特に制限されない。
【００１９】
Ｄ）ＢＰ１８０遺伝子が不活性化されたマウス胚幹細胞を得る工程
ＢＰ１８０遺伝子が不活性化されたマウス胚幹細胞は、前記ターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞に導入し；遺伝子断片が組み込まれた組み換えマウス胚幹細胞を選別する；ことにより得られる。
前記ターゲッティングベクターのマウス胚幹細胞への導入は、エレクトロポレーション法のほか任意の方法によって行われうる。ターゲッティングベクターは、導入前に線状化されることが好ましい。ベクターを導入するマウス胚幹細胞の種類は特に制限されないが、フラグメントをクローニングしたマウスと同系統のマウスであることが好ましい。
【００２０】
さらに、ターゲッティングベクターを導入されたマウス胚幹細胞から、組み換えマウス胚幹細胞を選択する。たとえば前述の遺伝子断片が薬剤（たとえばネオマイシン）耐性遺伝子を含む場合は、ターゲッティングベクターを導入されたマウス胚幹細胞を、当該薬剤を含む培地で培養することで、組み換えマウス胚幹細胞を選択することができる。選択されたマウス胚幹細胞は、公知の遺伝子解析法により組み換え体であることを確認され得る。
【００２１】
Ｅ）マウス胚幹細胞を、マウス杯盤胞に導入してキメラ胚を得る工程
得られた組み換えマウス胚幹細胞は、所望する種類のマウス初期胚に導入される。マウス初期胚への導入は、マイクロインジェクションなどの公知の方法で行うことができる。好ましいマウスの種類の例には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊが含まれる。
【００２２】
Ｆ）キメラ胚をメスマウスの子宮に着床させて、キメラマウス発生させる工程
マウス胚幹細胞を導入されたマウス初期胚を、仮親として用いるメスマウスの子宮内に着床させ、Ｆ１のキメラマウスを得ることができる。仮親として用いるメスマウスは、キメラ胚を得るために用いたマウスと同系統のマウスとすればよい。
【００２３】
Ｇ）Ｆ１のキメラマウス同士を交配させて、ヘテロ接合体マウスまたはホモ接合体マウスを得る工程
前記キメラマウス同士を交配させることにより、１）ヘテロ接合体のノックアウトマウス、または２）ホモ接合体のノックアウトマウスを得ることができる。得られたノックアウトマウスが、ヘテロ接合体か、またはホモ接合体であるかは、サザンブロット法などの公知の遺伝子解析法により行うことができる。
【００２４】
以下、実施例を参照して本発明をさらに説明するが、これにより本発明の範囲は限定されない。
【００２５】
［実施例１］  ノックアウトマウスの製造
マウス１２９Ｓｖ／Ｅｖゲノムライブラリー（Stratagene, La Jolla, CA）から、１４．７ｋｂマウスゲノムＤＮＡフラグメントをクローニングした。このフラグメントは、ＢＰ１８０ゲノムＤＮＡの５’ＵＴＲおよびｅｘｏｎ２を有する。さらに、１４．７ｋｂマウスゲノムＤＮＡフラグメントから、１１．５ｋｂのＮｈｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントをサブクローニングした。
【００２６】
エキソン２のＡＴＧ開始コドンの６ｂｐ上流部位から、エキソン２の１．２ｋｂ下流部位（イントロン２内部）までの領域を、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター／ネオマイシン抵抗遺伝子カセット（ＰＧＫ−ｎｅｏ）で置換した。置換された領域は、５’−ＴＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＧ−３’（配列番号２）で開始しており、５’−ＡＡＧＣＣＡＧＣＧＧＴＴＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＣＡＣＧＣＴ−３’（配列番号３）で終結している。
このストラテジーによって、ＡＴＧ開始コドンを含むｅｘｏｎ２のコード領域と、イントロン２の一部とが、ＰＧＫ−ｎｅｏで置換された改変フラグメントを得た。これにより、遺伝子転写がＰＧＫ−ｎｅｏでトラップされ、第２エキソンよりも下流のエキソン配列が発現されなかった。さらに改変フラグメントを、プラスミドベクターｐＳＰ７２（プロメガ株式会社）の改変物（図１を参照）に組み込んで、ターゲッティングベクターｐＴＶＣＯＬ１７を得た。ｐＳＰ７２の改変物の塩基配列を、後述の配列表に示した（配列番号１）。ターゲッティングベクターの前記ターゲッティングベクターは、"in Genious Targeting Laboratory, Inc." に委託して製造された。
【００２７】
得られたターゲッティングベクターをＮｏｔＩによって線状化して、１２９Ｓｖ／Ｅｖ胎生期幹細胞（WW1 cell line, NIH[National Institutes of Health]に登録されている）に、エレクトロポレーションによってトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、抗生物質Ｇ４１８を含む（５００ｍｇ／ｍｌ）、ＥＳ細胞用の１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地において３７℃で培養し、組み換えクローンを選択した。
【００２８】
選択された２００の抵抗性コロニーを拡張させ、以下の条件でＰＣＲを行い、組み換えクローンを同定した。
まず、ターゲッティング構築物を得るために用いられる領域外のショートホモロジーアーム（short homology arm）の下流側（３’）へのプライマーＹＡ１（５’−ＣＡＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＡＡＣＴＴＴＧＡ−３’）（配列番号４）と、Ｎｅｏカセットの５’末端へのプライマーＮ１（５’−ＴＴＧＴＧＴＡＧＣＧＣＣＡＡＧＴＧＣＣＡ−３’）（配列番号５）を得た。
プライマーＹＡ１とＮ１を用いて、０．７５ｍＭのＭｇＣｌ２存在下、「９４℃で１分間、６０℃で１分間、さらに７２℃で１分間」３５サイクルのＰＣＲ反応により、５６２ｂｐフラグメントを増幅させた。
【００２９】
適切にターゲッティングされたマウス胚幹細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Jackson Laboratories; Bar Harbor, ME）から得られた胚盤胞にマイクロインジェクトして、キメラ胚を得た。得られたキメラ胚を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊメスマウスに着床して、キメラマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊメスと交雑されている）を発生させた。
【００３０】
Ｆ１のヘテロ接合体を、６週齢を超えるＣ５７ＢＬ／６Ｊと交雑させ、インタークロスさせてＢＰ１８０−／−マウス（ホモ接合体）とした。
【００３１】
成体マウス、および新生仔マウスについて、３つのＰＣＲプライマー［ＹＡ１，Ｎ１，ＷＴ１（５’−ＣＣＴＴＡＴＡＴＣＣＣＴＴＧＡＣＴＧＣＣ−３’）（配列番号６）］を用いて、その遺伝子型を同定した。
ＹＡ１およびＮ１のプライマーペアを用いたＰＣＲでは５６２ｂｐ突然変異バンドが増幅され、一方、ＹＡ１およびＷＴ１のプライマーペアを用いたＰＣＲでは、野生型ゲノムＢＰ１８０ＤＮＡの４９６ｂｐフラグメントが増幅された。
【００３２】
［実施例２］  マウスの生存試験
ＢＰ１８０−／−マウスの生存曲線と、正常マウスの生存曲線を図３に示す。図３に示されたように、ＢＰ１８０−／−マウスの約２０％が５０日以上、約１０％が１００日以上生存したので、潰瘍治療の実験動物として十分に用いられうる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明のマウスを動物モデルとして用いることで、新たな皮膚潰瘍治療剤の開発が行われうる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例１で用いられたターゲッティングベクターのベクター図である。
【図２】図１に示されたターゲッティングベクターのバックボーンの配列である。
【図３】本発明のノックアウトマウス（ホモ接合体）と、正常マウスの生存曲線を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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