(57)【要約】 【課題】縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）や遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）等のＧＮＥ遺伝子の機能喪失型変異による筋疾患の病態解析と治療法開発に有用な非ヒト哺乳動物の提供、前記非ヒト哺乳動物の製造方法の提供、並びに前記非ヒト哺乳動物を用いたこれらの筋疾患の治療薬についてのスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】ミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物であって、ＧＮＥ遺伝子の機能が染色体上で欠損し、かつ、ヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡを染色体内に含むことを特徴とする非ヒト哺乳動物、その製造方法、並びにそれを用いた筋疾患用治療薬のスクリーニング方法を提供する。また、ヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡを染色体内に含むことを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物およびその製造方法を提供する。【選択図】図３
2007312641.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物であって、ＧＮＥ遺伝子の機能が染色体上で欠損し、かつ、ヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡを染色体内に含むことを特徴とする非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
前記ミオパチーが縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチーであることを特徴とする請求項１に記載された非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
前記ヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡが、ｃ．１７１４Ｇ＞Ｃ変異を持つヒトＧＮＥｃＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載された非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
前記非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項１に記載された非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
ＧＮＥ遺伝子の変異により引き起こされる筋疾患の疾病モデルとする、請求項１に記載された非ヒト哺乳動物の使用方法。
【請求項６】
ヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡを染色体内に含むことを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、マウスであることを特徴とする請求項６に記載されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
前記ヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡを挿入したベクターを作製し、前記ベクターを受精卵に導入し発生させることを特徴とする、請求項６に記載されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項９】
（１）ＧＮＥ遺伝子またはその発現領域上における少なくとも一部の配列の欠失、置換、および／または他の配列の挿入を起こすようにターゲティングベクターを構築し、
（２）前記ベクターをＥＳ細胞に導入してＧＮＥ遺伝機能を欠損した組換えＥＳ細胞を得た後、該組換えＥＳ細胞を初期胚に導入し発生させてキメラ動物を作製し、
（３）前記キメラ動物と野生型動物とを交配させてへテロ接合体非ヒト哺乳動物（ＧＮＥ＋／−）を得、
（４）得られたへテロ接合体非ヒト哺乳動物またはその子孫（ＧＮＥ＋／−）と請求項６に記載されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物とを交配させて非ヒト哺乳動物（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ＋／−）を得、
（５）得られた非ヒト哺乳動物（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ＋／−）と前記へテロ接合体非ヒト哺乳動物またはその子孫（ＧＮＥ＋／−）とを交配させることを特徴とする請求項１に記載された非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項１０】
請求項１に記載された非ヒト哺乳動物に筋疾患治療候補薬を投与し、薬効を確認することを特徴とするＧＮＥ遺伝子の変異により引き起こされる筋疾患用治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なトランスジェニック非ヒト哺乳動物およびそれを用いて作製されたミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物に関し、特に、ＧＮＥ遺伝子の変異により引き起こされる縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）や遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）等の筋疾患の原因解明に利用する実験動物としてのみならず、治療薬の開発にも有用な非ヒト哺乳動物、その作製方法並びにそれを用いた筋疾患用治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）や遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）等の筋疾患は、シアル酸生合成経路の律速段階酵素ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ／ＭａｎＮＡｃ−ｋｉｎａｓｅをコードするＧＮＥ遺伝子の機能喪失型変異によって生じる疾患（非特許文献１〜３参照）であり、罹患筋の病理観察からは、リソソーム酵素活性を示す縁取り空胞の形成に加え、筋線維の大小不同、核内封入体形成、βアミロイドタンパク質の沈着などの特徴が見られることが知られている。
【０００３】
【非特許文献１】西野一三，ゲノム医学Vol.4No.1(2004-2)p.21-26
【非特許文献２】Eisenberg, I., Avidan, N.,Potikha, T., Hochner, H., Chen, M., Olender, T., Barash, M., Shemesh, M.,Sadeh, M., Grabov-Nardini, G. Shmilevich, I., Friedmann, A., Karpati, G.,Bradley, W. G., Baumbach, L., Lancet, D., Asher, E. B., Beckmann, J. S., Argov,Z. and Mitrani-Rosenbaum, S. (2001) Nat. Genet., 29, 83-87.
【非特許文献３】Nishino, I., Noguchi, S.,Murayama, K., Driss, A., Sugie, K., Oya, Y., Nagata, T., Chida, K., Takahashi,T., Takusa, Y. Ohi, T., Nishimiya, J., Sunohara, N., Ciafaloni, E., Kawai, M.,Aoki, M. and Nonaka, I. (2002) Neurology, 59, 1689-1693.
【０００４】
ＤＭＲＶは、諸外国では埜中ミオパチーあるいは埜中型遠位型ミオパチーとして知られており、１５〜４０歳にかけて発症する常染色体劣性の筋疾患で、男女とも同様に侵される。前脛骨筋が特に侵され易く、頸部屈筋群、傍脊柱筋、大腿後面の膝屈筋群も侵されやすい。進行すれば、下腿後面の筋群や上肢筋も侵されるが、比較的後期まで大腿四頭筋が保たれることが特徴である。
また、ＤＭＲＶとＨＩＢＭは臨床病理学的にほぼ同一であり、遺伝子座も同一であることから、臨床病理学的に類似しているだけでなく、遺伝学的にも同一の疾患であると考えられる。
【０００５】
しかしながら、ＧＮＥ遺伝子の変異に起因するこれらの病理像や筋萎縮に至るプロセスは全く不明であり、これらの筋疾患の根本的な原因の解明と治療法の確立が望まれている。そこで本発明者らは、日本人患者で発見された変異を持つ組み換えＧＮＥタンパク質を発現させ、これらのタンパク質でＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅとＭａｎＮＡｃ ｋｉｎａｓｅ活性を測定した（非特許文献４参照）。その結果、変異タンパク質は変異の部位に応じて、前記したどちらかの活性が著しく低下しているものの、全く活性が失われるような変異はないことが判明した。
【非特許文献４】Noguchi S., Keira Y., MurayamaK., Ogawa M., Fujita M., Kawahara G., Oya Y., Imazawa M., Goto Y., HayashiY.K., Nonaka I., Nishino I. (2004) J. Biol. Chem., 279, 11402-11407.
【０００６】
また、ＤＭＲＶ患者からの骨格筋やその培養細胞では、シアル酸含量やシアリル化が減少していることから、ＧＮＥ遺伝子の変異によるタンパク質産物の酵素機能の低下および、その酵素反応産物の低下が確認された。
しかしながら、ＤＭＲＶ患者に見られる筋病理症状を説明するには、これらのデータのみでは不十分であり、ＧＮＥ遺伝子変異をもつ非ヒト哺乳動物を用いたｉｎ ｖｉｖｏでの解析の必要性が生じていた。
【０００７】
一方、ＧＮＥ遺伝子の機能解明のためノックアウトマウスなどのモデルマウスの作製も試みられているが、ＧＮＥ遺伝子ノックアウトマウスは胎生致死であるために（非特許文献５）、未だこれらの筋疾患の病態解析や治療法の開発に役立つ非ヒト哺乳動物が作製されていないのが現状である。
【非特許文献５】Schwarzkopf, M., Knobeloch, K.P., Rohde, E., Hinderlich, S., Wiechens, N., Lucka, L., Horak, I., Reutter, W.and Horstkorte, R. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99, 5267-5270.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の第１の目的は、縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）や遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）等の、ＧＮＥ遺伝子の機能喪失型変異による筋疾患の病態解析と治療法開発に有用な、非ヒト哺乳動物を提供することにある。
本発明の第２の目的は、縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）や遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）等の、ＧＮＥ遺伝子の機能喪失型変異による筋疾患の病態解析と治療法開発に有用な、非ヒト哺乳動物の製造方法を提供することにある。
更に本発明の第３の目的は、前記非ヒト哺乳動物を用いた縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）や遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）等の、ＧＮＥ遺伝子の機能喪失型変異による筋疾患用治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の諸目的を達成するために鋭意研究を行った結果、ＧＮＥ遺伝子ノックアウト非ヒト哺乳動物（ＧＮＥ−／−）は胎生致死であるものの、ヘテロ接合体非ヒト哺乳動物またはその子孫（ＧＮＥ＋／−）とヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡを染色体内に含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ）を掛け合わせて得られる非ヒト哺乳動物（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ＋／−）と、更に、前記へテロ接合体非ヒト哺乳動物またはその子孫（ＧＮＥ＋／−）とを掛け合わせることにより、ヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡのみを発現する非ヒト哺乳動物（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ−／−）が得られることを見出すと共に、該非ヒト哺乳動物が、ヒトの縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）や遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）等の筋疾患と同様の症状を示すことを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、ミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物であって、ＧＮＥ遺伝子の機能が染色体上で欠損し、かつ、ヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡを染色体内に含むことを特徴とする非ヒト哺乳動物、その作製方法および該非ヒト哺乳動物を用いた、ＧＮＥ遺伝子の変異により引き起こされる筋疾患用治療薬のスクリーニング方法、並びに、ヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡを染色体内に含むことを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物およびその作製方法である。
また、本発明のミオパチーは縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチーであることが好ましく、前記ヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡが、ｃ．１７１４Ｇ＞Ｃ変異を持つヒトＧＮＥｃＤＮＡであることが好ましい。更に、本発明の非ヒト哺乳動物がマウスであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＧＮＥ遺伝子の機能が染色体上で欠損し、かつ、ヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡを染色体内に含むことを特徴とする非ヒト哺乳動物は、縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）や遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）等のＧＮＥ遺伝子の機能喪失型変異による筋疾患と同様の臨床症状を示すことから、これらの筋疾患の病態解析と治療法開発に極めて有用である。
また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物を作製するために有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下本発明について詳細に説明する。
本発明のＧＮＥ遺伝子は、シアル酸生合成経路の律速段階酵素ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ／ＭａｎＮＡｃ−ｋｉｎａｓｅをコードする遺伝子である（図１）。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ／ＭａｎＮＡｃ−ｋｉｎａｓｅは、Ｎ末端側にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ  ２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ（ＧＮＥ）の活性ドメインを有し、Ｃ端側にＭａｎＮＡｃ  ｋｉｎａｓｅ（ＭＮＫ）の活性ドメインを有している。前者のＧＮＥドメインは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＭａｎＮＡｃへの反応を触媒し、後者のＭＮＫドメインは、次の反応であるＭａｎＮＡｃからＭａｎＮＡｃ−６−Ｐへの反応を触媒している。
【００１３】
ＤＭＲＶ、ＨＩＢＭ患者でこれまでに同定されている変異は、オープンリーディングフレームのほぼ全長に幅広く分布しており（図２）、ＧＮＥドメインあるいはＭＮＫドメインの単独障害の場合だけでなく、両者が組み合わさった複合へテロ接合体の場合にも発症する。日本人のＤＭＲＶ患者では、ｃ．１７１４Ｇ＞Ｃ（Ｖ５７２Ｌ）変異が最も多く、ユダヤ人のＨＩＢＭ患者の場合には、殆どが２１３５Ｔ＞Ｃ（Ｍ７１２Ｔ）変異を有している。
ここで、ｃ．１７１４Ｇ＞Ｃは、数字がスタートコドンのＡからのオープンリーディングフレームの塩基番号を、アルファベットが塩基を示しており、野生株の塩基Ｇが塩基Ｃに変異していることを示している。すなわち、スタートコドンのＡから数えて１７１４番目のグアニンがシトシンに変異していることを意味している。また、Ｖ５７２Ｌは、数字がＮ末端のメチオニンからのアミノ酸番号を、アルファベットがアミノ酸を示しており（一文字表記）、野生株のアミノ酸Ｖがアミノ酸Ｌに変異していることを示している。すなわち、Ｎ末端のメチオニンから数えて５７２番目のバリンがロイシンに変異していることを意味している。
【００１４】
本発明におけるヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡとは、ＧＮＥ遺伝子の変異により引き起こされる筋疾患の患者で認められる、変異したヒトＧＮＥ遺伝子のｃＤＮＡを意味する。具体的には、Ｒ１１Ｗ、Ｃ１３Ｓ、Ｐ２７Ｌ、Ｐ３６Ｌ、Ｇ８９Ｓ、Ｒ１２９Ｑ、Ｈ１３２Ｑ、Ｇ１３５Ｖ、Ｒ１６２Ｃ、Ｍ１７１Ｖ、Ｄ１７６Ｖ、Ｒ１７７Ｃ、Ｄ１８７Ｇ、Ｉ２００Ｆ、Ｒ２０２Ｌ、Ｇ２０６Ｓ、Ｖ２１６Ａ、Ｔ２２４Ｉ、Ｄ２２５Ｎ、Ｒ２４６Ｑ、Ｒ２４６Ｗ、Ｍ２６５Ｔ、Ｐ２８３Ｓ、Ｇ２９５Ｒ、Ｒ３０６Ｑ、Ｖ３３１Ａ、Ｖ３６７Ｉ、Ｄ３７８Ｙ、Ｌ３７９Ｈ、Ｐ３９０Ｓ、Ｖ４２１Ａ、Ａ４６０Ｖ、Ｇ４６９Ｒ、Ｉ４７２Ｔ、Ｐ５１１Ｌ、Ｎ５１９Ｓ、Ａ５２４Ｖ、Ｆ５２８Ｃ、Ｉ５５７Ｔ、Ｇ５５９Ｒ、Ｖ５７２Ｌ、Ｇ５７６Ｌ、Ｉ５８７Ｔ、Ａ６３０Ｔ、Ａ６３１Ｖ、Ａ６３１Ｔ、Ｙ６７５Ｈ、Ｖ６９６Ｍ、Ｇ７０８Ｓ、Ｍ７１２Ｔの何れかの変異を有するヒトＧＮＥ遺伝子のｃＤＮＡを意味する。変異は１箇所に限定されるものではなく、２箇所以上の変異を有するＧＮＥ遺伝子のｃＤＮＡを用いることも可能である。本発明においては、ＤＭＲＶ患者やＨＩＢＭ患者に多く見られる変異である、ｃ．１７１４Ｇ＞Ｃ（Ｖ５７２Ｌ）または２１３５Ｔ＞Ｃ（Ｍ７１２Ｔ）を有するＧＮＡ遺伝子のｃＤＮＡを用いることが特に好ましい。
【００１５】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ）は、ヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡを挿入したベクターを作製し、前記ベクターを受精卵に導入し発生させることにより作製することができる。
ヒト変異ＧＮＥ遺伝子の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドなど、公知の発現ベクターを用いることができる。
【００１６】
また、ヒト変異ＧＮＥ遺伝子の発現を調節するプロモーターは特に制限されるものではなく、例えば、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＴＫプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１αプロモーターなど、公知のプロモーターの中から適宜選択して使用することができる。なお、ヒト変異ＧＮＥ遺伝子を各種臓器で全身性に発現させることができるという理由から、本発明においては特にＣＡＧプロモーターを用いることが好ましい。
ベクターの受精卵への導入方法としては、マイクロインジェクション法などを用いることができる。
【００１７】
本発明のヒト変異ＧＮＥ遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物から抽出したゲノムＤＮＡを用いて特定した。特定の方法は、特異的な標識化プローブを用いたサザンブロット法や、特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法などにより行なうことができる。
なお、本発明のトランスジェニック非ヒト動物としては、上記の方法により得られたトランスジェニック非ヒト哺乳動物またはその子孫を用いることができる。
【００１８】
本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物の作製に際しては、先ず、ＧＮＥ遺伝子またはその発現領域上における少なくとも一部の配列の欠失、置換、および／または他の配列の挿入を起こすようにターゲティングベクターを構築し、前記ターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入することによりＧＮＥ遺伝機能を欠損した組換えＥＳ細胞を得る。
【００１９】
ターゲティングベクターは、ＧＮＥ遺伝子またはその発現領域上、少なくとも一部の配列の欠失、置換、および／または他の配列の挿入を起こすように設計される。その際、組み換えＥＳ細胞の選別のために、ポジティブおよび／またはネガティブ選別を行うマーカーとして機能する遺伝子の配列が挿入されるように、ターゲットベクターを設計することができる。この場合、ＧＮＥ遺伝子又はその発現制御領域に挿入される前記他の配列の挿入場所は、内在性ＧＮＥ遺伝子の発現を抑制しうる位置であれば、特に限定されることはない。
【００２０】
ポジティブ選択マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性により選択）などを用いることができる。また、ネガティブ選択マーカー遺伝子としては、チミジンキナーゼ遺伝子（ガンシクロビル耐性により選択）などを用いることができる。
このようなターゲティングベクターを構築する際に、ターゲティングベクター構築用として市販されているプラスミドベクターを利用してもよい。
ベクターの導入方法としては、電気パルス法などの公知の方法を用いることができる。
【００２１】
得られた組み換えＥＳ細胞の選別は、例えば、ＧＮＥ遺伝子またはその発現領域上に挿入されたポジティブ／ネガティブ選別を行なうためのマーカーにより行なうことができる。さらに、これらのマーカーにより選別したＥＳ細胞の組み換え確認は、ＰＣＲ法、サザンブロット法等の公知の遺伝子解析法により行うことができる。
【００２２】
次に、前記組み換えＥＳ細胞を初期胚に導入し発生させてキメラ動物を作製し、上記キメラ動物と野生型動物とを交配させてへテロ接合体非ヒト哺乳動物（ＧＮＥ＋／−）を得る。
さらに該ヘテロ接合体非ヒト哺乳動物またはその子孫（ＧＮＥ＋／−）と本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ）と交配させて非ヒト哺乳動物（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ＋／−）を得る。
次いで、得られた非ヒト哺乳動物（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ＋／−）と前記へテロ接合体非ヒト哺乳動物（ＧＮＥ＋／−）を交配させることにより本発明の非ヒト哺乳動物を得ることができる（図３参照）。
【００２３】
本発明の非ヒト哺乳動物及びトランスジェニック非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、サルなどのヒト以外の哺乳動物が挙げられるが、特にマウスが好ましい。
【００２４】
本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物は、ヒトでみられるＧＮＥ遺伝子の変異により引き起こされる縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）や遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）等の筋疾患と同様の症状を示すことから、上記の筋疾患モデル用非ヒト哺乳動物として用いることができる。
【００２５】
これらの筋疾患モデル用非ヒト哺乳動物について種々の分析や観察を行なうことにより、前記筋疾患の病態解析を行なうことができる。分析や観察の方法は、特に制限されるものではないが、例えば、各臓器における血清シアル酸量の測定、骨格筋の測定、筋力測定、血清クレアチニンキナーゼ活性測定、ヘマトキシリン−エオジン染色、改良型ゴモリートリクローム染色、酸フォスファターゼ活性染色、ＮＡＤＨ活性染色、免疫組織染色などによる組織標本の筋病理観察、電子顕微鏡での観察等が挙げられる。
また、様々な週齢・月齢・年齢における分析データを得ることも可能であり、前記筋疾患の病態解析・解明に非常に有効である。
【００２６】
さらに、本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物に筋疾患治療候補薬を投与し、薬効を確認することによって、筋疾患の治療薬のスクリーニングを行なうことができる。投与の方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、腹腔内注射、経皮投与等、公知の方法を挙げることができる。
【００２７】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
本発明のヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡを染色体内に含むトランスジェニックマウス（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ）の作製
（１）ヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡの合成
ヒト骨格筋ＲＮＡを鋳型として、ｏｌｉｇｏ−ｄＴ１５プライマーを用いて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ リバーストランスフェラーゼ（インビトロジェン）で、４２℃、２時間ＲＴ反応させた。次に、ＰＣＲによりオープンリーディングフレーム全長を増幅し、ヒトＧＮＥｃＤＮＡを得た。
ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  ＬＡ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、熱変性９４℃，２分、［熱変性９４℃，４０秒；アニーリング６２℃，３０秒；伸張反応７２℃，２分］×３５サイクル、伸張反応７２℃，１０分の条件で行なった。使用したプライマー配列は以下の通りである。Ｆ：ＣＧＧＣＧＴＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＡＴＴＴＴＡＡＧＡＡ；Ｒ：ＣＧＧＴＣＡＴＣＣＴＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＣＴＴＧＡ。
得られたヒトＧＮＥｃＤＮＡは、ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔベクターにクローニングした。ヒトＧＮＥｃＤＮＡの配列を確認した後、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのマニュアルに従って、ＰＣＲを用いたｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓにより変異を導入し、ｃ．１７１４Ｇ＞Ｃ（Ｖ５７２Ｌ）変異を有する変異ＧＮＥｃＤＮＡを得た。
【００２９】
（２）ヒト変異ＧＮＥトランスジェニックマウス作製用ベクターの構築
ヒト変異ＧＥＮトランスジェニックマウス作製用ベクターは、ｃ．１７１４Ｇ＞Ｃ（Ｖ５７２Ｌ）の変異を有するヒト変異ＧＮＥをすべての臓器で発現できるように、ｐＣＡＧＧＳベクターのＥｃｏＲＩサイトにヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡを挿入することによって構築した（図４参照）。なお、後で遺伝子欠失ができるように、ｃＤＮＡの両端にｌｏｘＰ配列を挿入した。
【００３０】
（３）ヒト変異ＧＮＥトランスジェニックマウス作製用ベクターの受精卵への導入
ＳａｌIにて直鎖状にしたベクターを、２００個以上のＣ５７Ｂｌａｃｋ６の受精卵にインジェクションした。受精卵は、ＩＣＲマウスに移植され、その結果、４０匹のＦ０マウスが得られた。これらのマウスの尾から調整したゲノムＤＮＡについてＰＣＲ法により増幅を行い、導入した遺伝子組み込みの有無を検出してトランスジェニックマウスの同定を行なった。
ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、サーマルサイクラー９７００（アプライドバイオシステムズ製）を用い、熱変性９４℃，５分，［熱変性９４℃，３０秒；アニーリング５６℃，３０秒；伸張反応７２℃，１分］×３５サイクル、伸張反応７２℃，５分の条件で行なった。使用したプライマー配列は、次の通りである。Ｆ：ＣＴＣＣＣＴＧＴＧＴＧＧＧＴＡＧＡＣＡＡＴ；Ｒ：ＣＡＡＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＴ。なお、ＤＮＡフラグメントの検出には、アガロース電気泳動を用いた。
４０匹中９匹がヒト変異ＧＮＥ遺伝子導入マウス（Ｆ０）であることが確認された。
【００３１】
（４）トランスジェニックマウスの同定
上記ヒト変異ＧＮＥ遺伝子導入マウス（Ｆ０）９匹と野生型Ｃ５７Ｂｌａｃｋ６マウスとを掛け合わせて本発明のトランスジェニックマウス（Ｆ１）を得た。得られたトランスジェニックマウス（Ｆ１）の尾から調製したゲノムＤＮＡについてＰＣＲ法により増幅を行い、導入した遺伝子組み込みの有無を検出して、トランスジェニックマウスの同定を行なった。なお、トランスジェニックマウスの同定は、上記のトランスジェニックマウスの同定と同様の方法により行なった。
上記９匹のうち、４匹に産仔個体が得られたが、それらＦ１世代にトランスジーンが継代されていることが確認された。
【００３２】
（５）トランスジェニックマウスにおけるトランスジーン（ｈｕｍｔＧＮＥＴｇ）の発現
トランスジェニックマウスの各組織から、ｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した後、ｈｍｕｔＧＮＥＴｇの量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を使用し、サーマルサイクラーＩ  Ｃｙｃｌｅｒ−ＩＱ（バイオラット社製）を用い、熱変性９４℃，１５分、［熱変性９４℃，１５秒；アニーリング５８℃，３０秒；伸張反応７２℃，３０秒］×４５サイクルの条件で行なった。
ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ  ｍＲＮＡ増幅用プライマーとしては、Ｆ：ＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＣＡＣＴＧＣＡＡ、Ｒ：ＣＡＡＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴを用い、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡの発現を内部標準として用いた。また、ＧＡＰＤＨプライマーとしては、Ｆ：ＣＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧ、Ｒ：ＴＴＧＡＡＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＴＧを用いた。
【実施例２】
【００３３】
本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ−／−）の作製
（１）ＧＮＥ遺伝子破壊マウス作製用ベクターの構築
ＧＮＥ遺伝子破壊マウス作製用のベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）は、マウスＧＮＥ遺伝子の８６番アミノ酸でフレームシフトを起こすように設計した。具体的には、マウスＧＮＥ遺伝子のエクソン３からエクソン５までを含む１０．５ｋｂｐフラグメントを用い、エクソン３をＮｅｏ遺伝子で置換するように（エクソン３の１．４ｋｂｐ上流から１２４ｂｐ下流まで）、ＥｃｏＲＩ−ＰａｃIサイトにＰＧＫ−Ｎｅｏカセットを導入することによって構築した（図５参照）。
【００３４】
（２）ＧＮＥ遺伝子破壊マウス作製用ベクターのマウスＥＳ細胞への導入、キメラマウスの作製およびヘテロマウス（ＧＮＥ＋／−）の作製
ＮｏｔI消化した直鎖状ベクターを、１２９ｓｖｊマウスｉＴＬ１ＥＳ細胞（１２９Ｓｖ／Ｅｖ）に電気穿孔法で導入した後、Ｇ４１８で選択することにより、遺伝子組み換え体を得た。なお、組み換え体は、ＰＣＲ法によって確認した。
定法に従い、得られた組み換えＥＳ細胞をブラストシストにインジェクションし、更に、胚を仮親へ移植することによりキメラマウスを作製した。
得られたキメラマウスと野生型マウスとの交配によりへテロマウス（ＧＮＥ＋／−）を得た。なお、マウスの維持、交配は定法に従って行った。
【００３５】
（３）ＰＣＲ法によるへテロマウスの同定
得られたへテロマウス（ＧＮＥ＋／−）の遺伝子を確認するために、尾から調整したゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ法により増幅を行い、同定を行なった。
ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、熱変性９４℃，５分、［熱変性９４℃，３０秒；アニーリング６０℃，３０秒；伸張反応７２℃，１分］×３５サイクル、伸張反応７２℃，５分の条件で行なった。使用したプライマー配列は、次の通りである。ＧＮＥ−Ｓ２：５’−ＴＧＧＣＧＴＴＣＴＴＡＣＡＣＴＣＴＣＴＡＧＧ−３’；Ｎｅｏ１：５’−ＴＧＣＧＡＧＧＣＣＡＧＡＧＧＣＣＡＣＴＴＧＴＧＴＡＧＣ−３’；ＵＤＰ  ＷＴ３：５’−ＧＧＧＡＧＴＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＴＡＣＧＧＡ−３’なお、増幅ＤＮＡフラグメントの検出には、アガロース電気泳動を用いた。  
野生型遺伝子の生成物は１１５０ｂｐ、破壊された遺伝子は７５０ｂｐの産物を与えることから、得られた上記へテロマウスは、ＧＮＥ＋／−を有するへテロマウスであることが確認された。
【００３６】
（４）本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ−／−）の作製
実施例１で得られたトランスジェニックマウス（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ）と上で得られたへテロマウス（ＧＮＥ＋／−）を掛け合わせることにより、産出動物として、ヒト変異ＧＮＥトランスジェニック−ＧＮＥ遺伝子へテロ破壊マウス（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ＋／−）を得た。
【００３７】
遺伝子型が確かめられたヒト変異ＧＮＥトランスジェニック−ＧＮＥ遺伝子へテロ破壊マウス（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ＋／−）と上で得られたへテロマウス（ＧＮＥ＋／−）の掛け合わせにより、本発明のヒト変異ＧＮＥトランスジェニック−ＧＮＥ遺伝子破壊マウス（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ−／−）が得られた（図３）。本発明のヒト変異ＧＮＥトランスジェニック−ＧＮＥ遺伝子破壊マウス（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ−／−）には、大きさや形態上の異変などは見られなかった。
なお、上記かけ合わせによる離乳マウスは合計３２５匹であり、そのうち２８匹がｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ−／−であった。
【実施例３】
【００３８】
本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ−／−）の各臓器におけるシアル酸量の測定
原ら（Hara S et al. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids.(1987)Analytical Biochemistry 164,138-145）の方法に準じて、蛍光ラベル後、ＨＰＬＣ、２０８０ポンプシステム、ＦＯ−２０２０検出器（日本分光社製）及びＣ１８逆相カラム（Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ；アジレント製）を用いて測定した。測定には血清１μｌを用い、標準として、Ｎ−アセチルノイラミン酸とＮ−グリコリルノイラミン酸を用いた。
【００３９】
その結果、野生株マウスに比べ、ヒト変異ＧＮＥトランスジェニック−ＧＮＥ遺伝子破壊マウス（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ−／−）におけるシアル酸量は顕著に低下しており、骨格筋においても有意な低下が見られた（図６）。
【実施例４】
【００４０】
本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ−／−）における血清クレアチンキナーゼの測定
血清クレアチニンキナーゼ測定は、協和メディックスの試薬キット（商品名：デタミナーＬＣＰＫ）を使用して行なった。測定には血清１μｌを用い、３７℃において、クレアチンリン酸とＡＤＰから一連の反応で生成するＮＡＤＰＨの量を、波長３４０ｎｍの吸光度増加測定により行なった。なお、吸光度増加測定には、ＤＵ６４０（ベックマン社製）を使用した。
【００４１】
３０週齢マウスにおいては、野生株マウスに比べ、ヒト変異ＧＮＥトランスジェニック−ＧＮＥ遺伝子破壊マウス（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ−／−）の血清クレアチニンキナーゼ活性が高値を示した（図７）。
【実施例５】
【００４２】
本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ−／−）における筋力測定
マウスの筋力測定は、前肢での鉄棒よじ上りテストにより行なった。３ｍｍ径の金属棒に、マウスを上肢でつかまらせ、水平位置にマウスを保持したのち手を離す。その後、マウスが上肢のみで、３秒以内に体を金属棒の上に持ち上げることができた場合を「成功」として数えた。連続１５回の試技での成功回数で評価を行なった。
【００４３】
３−１７週齢マウスにおいては、ヒト変異ＧＮＥトランスジェニック−ＧＮＥ遺伝子破壊マウス（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ−／−）の成功回数は、野生型マウスの成功回数より低かった（図８）。
また、ヒト変異ＧＮＥトランスジェニック−ＧＮＥ遺伝子破壊マウス（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ−／−）をテイルでつり下げた場合には、神経疾患マウスに通常見られる後肢のホールドが観察された（図９Ａ）。なお、後肢のホールドとは、体の中に上下肢を丸めて保持する姿勢をいい、これは「ｈｕｇｇｅｒｓ」とも呼ばれる。野生型マウスでは、テイルでつり下げた場合、上下肢を伸ばす姿勢をとる（図９Ｂ）のに対し、ある神経性の欠損マウスでは体の中に上下肢を丸めて保持する前記ホールド姿勢をとることが知られている。
【実施例６】
【００４４】
本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ−／−）における骨格筋の病理解析
ヒト変異ＧＮＥトランスジェニック−ＧＮＥ遺伝子破壊マウス（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ−／−）について、骨格筋の病理解析を行なった。
骨格筋（主に、腓腹筋および大腿四頭筋）の凍結試料を作製し、更に、クリオスタット（ＣＭ３０５０Ｓライカ社製）を用いて６−１０μｍの横断切片を作製した。
作製した横断切片について、臨床のための筋病理（埜中征哉著，日本医事新報社）に従って、ヘマトキシリン−エオジン染色、改良型ゴモリートリクローム染色、酸フォスファターゼ活性染色及びＮＡＤＨ活性染色を行なった。
また、免疫組織染色については、Sasaoka T., Imamura M., Araishi K., Noguchi S., Mizuno Y., Takagoshi N., Hama H., Wakabayashi-Takai E., Yoshimoto-Matsuda Y., Nonaka I., Kaneko K., Yoshida M., Ozawa E.: Pathological analysis of muscle hypertrophy and degeneration in muscular dystrophy in γ-sarcoglycan-deficient mice. Neuromus. Disord., 13, 193-206, 2003.に記載された方法に従って、β−アミロイドタンパク質、タウタンパク質、リソソーム結合タンパク質、ポリユビキチンや筋鞘膜タンパク質ジストログリカンに対する抗体、及び、蛍光ラベル二次抗体を用いて間接蛍光抗体法で行なった。
【００４５】
その結果、筋線維の大小不同が観察されるとともに、筋線維内にβアミロイドタンパク質の蓄積が観察された。さらに、５０週齢以上のマウスの腓腹筋及び大腿四頭筋では縁取り空胞が観察され、リソソーム結合タンパク質の筋繊維内での強い免疫反応も観察された（図１０）。また、ポリユビキチン、筋鞘膜タンパク質についても同様に筋線維内での強い免疫反応が観察された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いて作製された、本発明のミオパチーの症状を呈する非ヒト哺乳動物は、ヒトの縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）や遺伝性封入体ミオパチー（ＨＩＢＭ）等の筋疾患と同様の症状を示すことから、これらの筋疾患の病態解析と治療法開発に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＧｌｕｃｏｓｅとＦｒｕｃｔｏｓｅからシアル酸を含む複合糖質（Ｓｉａｌｙｌ−ＯＧＳ）を生成するシアル酸生合成経路を説明する図である。
【図２】ＤＭＲＶおよびＨＩＢＭにおけるＧＮＥ遺伝子の変異を表した図である。
【図３】本発明の非ヒト哺乳動物を作製する経路を示した模式図である。
【図４】ヒト変異ＧＮＥトランスジーンの構造を示した図である。
【図５】マウスＧＮＥ遺伝子の構造とノックアウトベクターの構造を示した図である。
【図６】各臓器における血清シアル酸量の測定結果を示す表である。
【図７】血清クレアチニンキナーゼの測定結果を示す表である。
【図８】筋力測定結果を示す表である。
【図９】マウスをテイルでつり下げた場合の写真である。Ａ：ヒト変異ＧＮＥトランスジェニック−ＧＮＥ遺伝子破壊マウス（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ−／−）の場合，Ｂ：野生型マウスの場合
【図１０】５７週−ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ−ＧＮＥ−／−マウスの骨格筋横断面顕微鏡像を示す。ｍＧＴで、筋繊維中央に空胞が見られ、この空胞はリソソームの性質を有する。Ｈ＆Ｅ：ヘマトキシリン−エオジン染色，ｍＧＴ：改良型ゴモリートリクローム染色，ＡＣＰ：酸性ホスファターゼ活性染色，ＬＡＭＰ２：免疫組織染色（リソソーム結合タンパク質）
【図１】
2007312641.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年2月13日(2007.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本発明のヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡを染色体内に含むトランスジェニックマウス（ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ）の作製
（１）ヒト変異ＧＮＥｃＤＮＡの合成
ヒト骨格筋ＲＮＡを鋳型として、ｏｌｉｇｏ−ｄＴ１５プライマーを用いて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  リバーストランスフェラーゼ（インビトロジェン）で、４２℃、２時間ＲＴ反応させた。次に、ＰＣＲによりオープンリーディングフレーム全長を増幅し、ヒトＧＮＥｃＤＮＡを得た。
ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  ＬＡ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、熱変性９４℃，２分、［熱変性９４℃，４０秒；アニーリング６２℃，３０秒；伸張反応７２℃，２分］×３５サイクル、伸張反応７２℃，１０分の条件で行なった。使用したプライマー配列は以下の通りである。Ｆ：配列番号１；Ｒ：配列番号２。
得られたヒトＧＮＥｃＤＮＡは、ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔベクターにクローニングした。ヒトＧＮＥｃＤＮＡの配列を確認した後、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのマニュアルに従って、ＰＣＲを用いたｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓにより変異を導入し、ｃ．１７１４Ｇ＞Ｃ（Ｖ５７２Ｌ）変異を有する変異ＧＮＥｃＤＮＡを得た。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
（３）ヒト変異ＧＮＥトランスジェニックマウス作製用ベクターの受精卵への導入
ＳａｌIにて直鎖状にしたベクターを、２００個以上のＣ５７Ｂｌａｃｋ６の受精卵にインジェクションした。受精卵は、ＩＣＲマウスに移植され、その結果、４０匹のＦ０マウスが得られた。これらのマウスの尾から調整したゲノムＤＮＡについてＰＣＲ法により増幅を行い、導入した遺伝子組み込みの有無を検出してトランスジェニックマウスの同定を行なった。
ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、サーマルサイクラー９７００（アプライドバイオシステムズ製）を用い、熱変性９４℃，５分，［熱変性９４℃，３０秒；アニーリング５６℃，３０秒；伸張反応７２℃，１分］×３５サイクル、伸張反応７２℃，５分の条件で行なった。使用したプライマー配列は、次の通りである。Ｆ：配列番号３；Ｒ：配列番号４。なお、ＤＮＡフラグメントの検出には、アガロース電気泳動を用いた。
４０匹中９匹がヒト変異ＧＮＥ遺伝子導入マウス（Ｆ０）であることが確認された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
（５）トランスジェニックマウスにおけるトランスジーン（ｈｕｍｔＧＮＥＴｇ）の発現
トランスジェニックマウスの各組織から、ｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した後、ｈｍｕｔＧＮＥＴｇの量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を使用し、サーマルサイクラーＩ  Ｃｙｃｌｅｒ−ＩＱ（バイオラット社製）を用い、熱変性９４℃，１５分、［熱変性９４℃，１５秒；アニーリング５８℃，３０秒；伸張反応７２℃，３０秒］×４５サイクルの条件で行なった。
ｈｍｕｔＧＮＥＴｇ  ｍＲＮＡ増幅用プライマーとしては、Ｆ：配列番号５のプライマーと、Ｒ：配列番号６のプライマーを用い、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡの発現を内部標準として用いた。また、ＧＡＰＤＨプライマーとしては、Ｆ：配列番号７のプライマーと、Ｒ：配列番号８のプライマーを用いた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
（３）ＰＣＲ法によるへテロマウスの同定
得られたへテロマウス（ＧＮＥ＋／−）の遺伝子を確認するために、尾から調整したゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ法により増幅を行い、同定を行なった。
ＰＣＲ反応は、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、熱変性９４℃，５分、［熱変性９４℃，３０秒；アニーリング６０℃，３０秒；伸張反応７２℃，１分］×３５サイクル、伸張反応７２℃，５分の条件で行なった。使用したプライマー配列は、次の通りである。ＧＮＥ−Ｓ２：配列番号９；Ｎｅｏ１：配列番号１０；ＵＤＰ  ＷＴ３：配列番号１１。なお、増幅ＤＮＡフラグメントの検出には、アガロース電気泳動を用いた。
野生型遺伝子の生成物は１１５０ｂｐ、破壊された遺伝子は７５０ｂｐの産物を与えることから、得られた上記へテロマウスは、ＧＮＥ＋／−を有するへテロマウスであることが確認された。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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