(57)【要約】【課題】走査型、透過型などの電子顕微鏡で使用する被観察試料の新規な調製方法を得ることを目的とする。【解決手段】金属元素をイオンとして含む金属イオン含有液を所定濃度で溶解してなる処理水を被観察試料に噴霧または塗布し、ついでこの被観察試料の表面水を放散させることにより調整する。この調製方法によれば、前処理時における真空引きを省略できるので短時間で調製することができ、生物試料（生もの）などもくずれたりすることがなく、経時的にしかもリアルタイムで観察を行うことができる。【選択図】図１
2007279010.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属元素をイオンとして含む金属イオン含有液を所定濃度で溶解してなる処理水を被観察試料に噴霧または塗布し、ついでこの被観察試料の表面水を放散させることを特徴とする電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法。
【請求項２】
処理水に対する金属イオン含有液の濃度を０．２％〜１００．０％の範囲に設定することからなる請求項１に記載の電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法。
【請求項３】
金属イオン含有液は、金属元素を含む鉱物質を機械的手段により微細化したのち、この微細化鉱物質に麹菌を加えて発酵させ、さらに酒石酸、クエン酸、乳酸、酢酸などアルキル基を有する有機酸を加えて混合攪拌することにより金属元素を有機酸溶液中にイオンとして解離させてなる請求項１または２に記載の電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法。
【請求項４】
金属イオン含有液として、金属元素としての金、銀、銅、チタン、ゲルマニウム、珪素、アルミニウム、鉄、カルシウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、バナジウムを単独もしくは２以上含む金属イオン含有液を使用することからなる請求項１〜３のいずれかに記載の電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  この発明は、顕微鏡における被観察試料の調製方法に関するものであり、一層詳細には、走査型、透過型などの電子顕微鏡において使用する被観察試料の新規な調製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  今日、微小物体を拡大して観察する手段として、光学レンズを使った光学顕微鏡やデジタルマイクロスコープなどのほか、電子レンズを使った電子顕微鏡の利用が広まっている。
電子顕微鏡は、電子の進行方向を自由に屈折させることにより光学顕微鏡のような結像システムを電子光学的に構成したものであり、被観察試料を透過した電子を電子レンズを用いて結像させる透過型電子顕微鏡のほか、試料表面で反射した電子を結像させる反射型電子顕微鏡、集束電子線を試料表面上に走査して各走査点からの二次電子を用いて結像させる走査型電子顕微鏡、加熱あるいはイオン照射によって試料から放出する電子を結像させる表面放出型の電界イオン顕微鏡などがその目的用途に応じて利用されている。【０００３】  これら各型式の電子顕微鏡のうち、透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＴＥＭ）は、薄膜試料に電子線を透過させ、その際に試料中で原子により散乱、回折された電子を電子回折パターンまたは透過電顕像として得ることによって主に物質の内部構造を観察することができる。【０００４】  一方、走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＥＭ）は、対象となる試料に細い電子線（電子プローブ）を照射した際に発生する二次電子や反射電子を、二次電子検出器、反射電子検出器などそれぞれの検出器を用いて取り出し、ブラウン管やＬＣＤなどの表示画面上に表示し、主として試料の表面形態を観察する装置である。【０００５】  電子線は固体試料に照射されたとき、電子のエネルギーによって固体中を透過するが、その際に試料を構成する原子核や電子との相互作用によって弾性的な衝突、弾性散乱やエネルギー損失を伴う非弾性散乱を生じる。そして非弾性散乱によって試料元素の殻内電子を励起したり、Ｘ線などを励起したり、また二次電子を放出し、それに相当するエネルギーを損失する。二次電子は衝突する角度によって放出される量が異なる。一方、弾性散乱によって後方に散乱し、試料から再び放出される反射電子は、原子番号に固有の量が放出される。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）はこの二次電子や反射電子を利用する。ＳＥＭは電子を試料に照射し、放出される二次電子や反射電子を検出して観察像を結像している。【０００６】  ＳＥＭによる試料の観察を妨げる要因は様々なものがあるが、試料に起因する主な要因は試料の観察時に発生する帯電（チャージアップ）現象である。チャージアップとは、入射する荷電粒子と放出される荷電粒子が有する電荷の差によって、照射面が正または負に帯電する現象であり、このチャージアップが発生すると、放出された二次電子が加速されたり引き戻されたりして、良好な結像特性が得られなくなり、まれではあるが全く結像しない場合さえ発生する。【０００７】  負の電荷を持つ電子線が塊（バルク）状試料に入射すると、試料が導電性であればその電荷は試料を伝ってアースされるが、試料が非導電性の場合は入射電子の電荷は試料表面から逃げることができず、試料自体がチャージアップしてしまう。チャージアップ現象としては、観察視野内に異常な明暗のコントラストが発生したり、明暗が帯状に現れ二次電子像の観察が困難となる。
チャージアップがさらに激しくなると、ゆっくりと視野が移動したり、いきなり視野が大きく移動する、所謂、観察視野のドリフトも発生する。
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  このような事情から、チャージアップした試料の帯電を除去する技術として、例えば、試料からの電子の発生効率が１を上回るような低い加速電圧の電子線を照射する方法、あるいは、試料表面に蓄積した電荷に対して反対極性の電荷が発生する加速電圧の電子線を照射することで消去する方法などが提案されている。
【０００９】  しかしながら、前者の方法では、試料に帯電したエネルギーが除電のために照射した電子線のエネルギーを上回る場合、照射した電子線が跳ね返されて試料に到達できず、除電できないという問題がある。
また、この方法では加速電圧の設定が難しいという問題もある。二次電子の発生効率が１になるような加速電圧に設定しなければならないが、試料の材質、形状によって、発生効率が１になる加速電圧が異なるため、加速電圧を調整しながら発生効率が１になるような加速電圧を見出さなければならない。
試料がチャージアップしている場合は、一次電子の初速度と試料に入射する時のランディング速度が異なるため、最適な加速電圧の設定が難しくなる。仮に発生効率が１になる加速電圧を見つけたとしても、それまでの観察過程で試料に高加速電圧の電子が照射された場合は既に試料が負の電荷に帯電しているため、チャージアップによる像障害が起こるとになる。長時間（例えば数時間程度）に亘って発生効率が１になる加速電圧の電子を照射し続ければ除電できる場合もあるが現実的とは言えない。
【００１０】  一方、後者の方法は、チャージがたまり始める前までに観察する方法、すなわち帯電を防止する対策であって帯電した電荷を除去するといった積極的な除電方法ではない。
【００１１】  別の方法として、試料がチャージアップしているかどうかを検知し、チャージアップしていると判定された場合に帯電対策を行う技術が開発されている。しかしながら、チャージアップの検知の問題として、検知のための専用の設備が必要となること、チャージアップの現象が様々であるため、正しく検知することが困難なことなどの問題がある。
【００１２】  また、試料室内を大気圧にして試料を空気に触れさせることで除電する方法もあるが、十分に除電しきれない場合があるだけでなく再度観察を行うために真空引きをやり直す必要があり、時間と手間がかかるという欠点もある。
【００１３】  さらに低真空で観察する方法、電子シャワー発生器やイオンシャワー発生器を用いる方法、制御電極を設ける方法なども提案されているが、これらの方法では専用の設備が別途に必要となり、簡単に実施することが困難であった。
【００１４】  このように、いずれの方法であっても問題点を有していることから試料の除電を簡便に行う方法が鋭意開発されているが、チャージアップ自体を防止する現実的な手段として、試料の表面に金Ａｕなどを素材とする導電性薄膜を蒸着（スパッタリング）する方法が採用されている。
しかしながら、この方法は試料を乾燥しり、蒸着時に真空引きする必要があるため処理作業が面倒で長時間を要するだけでなく、食品などの生物試料（生もの）の調製には適さず、しかも試料がくずれたりして観察後に元に戻らないといった問題点が指摘されていた。
【課題を解決するための手段】
【００１５】  ところで、本発明者は、醗酵技術を駆使して植物の種子などに含まれる金属元素を電解質として解離（イオン化）させる画期的な方法を開発し、特許第２８６５４１２号として登録を得ている。
また、静電磁場を形成した容器内において麹菌を加えて発酵させた金属元素（ミネラル）含有物とアルキル基を有する有機酸溶液とを混合攪拌し、この容器内の雰囲気を所定条件でかつ所定期間保持することにより、金属元素含有物質から金属元素を効率よく解離（イオン化）抽出する方法も開発している。
【００１６】  そして上記方法を利用することにより従来では考えられなかった、例えば、金、銀、銅、マグネシウム、亜鉛、マンガン、アルミニウム、ステンレス、プラチナなど多種多様の金属元素を電解質として解離（イオン化）抽出する技術も確立し、しかも、この方法によって得た抽出液中の各金属元素はオングストロームサイズ（１０のマイナス１０乗〜９乗メートル）であるため、素材の品質ないしは機能を飛躍的に向上させることができるだけでなく、例えば、衣類などの帯電防止加工手段としても有効であることが確認されている。
【００１７】  そこで、この発明では金属元素をイオンとして含む金属イオン含有液（抽出液）を所定の濃度で溶解した処理水を被観察試料に噴霧または塗布し、ついでこの被観察試料の表面水を放散させ、処理水に含まれている金属元素を導電性薄膜に代替するものとして利用することによりチャージアップを阻止できるようにしたものである。
【００１８】  この場合、処理水に対する金属イオン含有液の濃度は０．２％〜１００．０％の範囲に設定するのが好ましく、金属イオン含有液の濃度が０．２％未満では金属元素によるチャージアップを防止することが困難となり、また１００．０％に設定すると費用対効果の点で問題が生じることになる。
【００１９】  また、金属イオン含有液としては、金属元素を含む鉱物質を機械的手段などにより微細化したのち、この微細化鉱物質に麹菌を加えて発酵させ、さらに酒石酸、クエン酸、乳酸あるいは酢酸などアルキル基を有する有機酸溶液を加えて混合攪拌することにより、前記微細化鉱物質に含まれる金属元素を有機酸溶液中にイオンとして解離させた水溶液を使用するのが好ましい。
【００２０】  さらに、金属イオン含有液に含まれる金属元素としては、例えば、金、銀、銅、チタン、ゲルマニウム、珪素、アルミニウム、鉄、カルシウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、バナジウムなどが挙げられ、これらの金属元素を単独もしくは２以上含む金属イオン含有液を使用するのが好適である。
【発明の効果】
【００２１】  本発明方法によれば被観察試料に金属イオン含有水溶液を塗布し、ついでのこの被観察試料の表面水を放散させるという簡単な操作だけでチャージアップを充分阻止することができるだけでなく、その調製も１０分程度の短時間でできるので試料の観察を迅速にしかもリアルタイムで行うことができる。
また、チャージアップによる反射や分散が生じないので鮮明な結像を得ることができ、食品などの生物試料（生もの）でも前処理で真空引きする必要がないためくずれたりすることがなく、経時的な観察も好適に行うことができる。
さらには、オングストロームオーダーの金属元素が試料の微細組織まで浸透するので焦点深度がより深くなり、従って、対象となる試料のある程度内部まで微細にかつ鮮明に観察することが可能になるなど優れた種々の効果を奏するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】  次に、本発明に係る電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法の最良の形態を例示し、以下詳細に説明する。
すなわち、本発明に係る被観察試料の調製方法においては、図１に示すように、まず、容器１０に収容される浄化水に金（Ａｕ）イオン含有液１２を滴下することにより所定濃度の処理水１４を準備する。
この場合、浄化水は、例えば、上水を逆浸透膜（ＲＯ）で濾過することにより不純物を可及的に除去したものを使用する。【００２３】  また、金（Ａｕ）イオン含有液１２は以下の方法により得られた抽出液を使用するのが好適である。
すなわち、金箔および／もしくは金（Ａｕ）を含む鉱物質を予め細かく粉砕し、この微細化金箔および／もしくは微細化鉱物質と浄化水とを重量比で略等量用意して混合したのち、１０％〜２０％の麹菌を加えて摂氏３５度〜４０度に保持して醗酵させ、一定期間ねかせておく。
次に、このように前処理して得られた微細化金箔および／もしくは微細化鉱物質の醗酵原料と、アルキル基を有する有機酸溶液とを重量比で１０：１の割合で混合する。この場合、アルキル基を有する有機酸としては、例えば、酒石酸、クエン酸、乳酸あるいは酢酸などを適宜使用することができる。【００２４】  ついで、この微細化金箔および／もしくは微細化鉱物質の醗酵原料とアルキル基を有する有機酸溶液との混合液を容器中において適宜の手段で攪拌混合する。なお、この際、容器に配設した加熱ヒータおよび容器の素材自体が放射する遠赤効果を利用して微細化金箔および／もしくは微細化鉱物質の醗酵原料とアルキル基を有する有機酸との混合液を摂氏４５度〜５５度に保持するとともにポンプ装置などの循環系によって静電磁場、紫外線殺菌装置さらには太陽光照射機構などの制御下にゆっくりと所定時間循環させることにより金属元素としての金（Ａｕ）を０．３％〜０．５％程度解離（イオン化）させた抽出液、すなわち、金（Ａｕ）イオン含有液１２とする。【００２５】  なお、金（Ａｕ）イオン含有液１２を処理水１４に滴下する場合、金イオン含有液１２の濃度が処理水１４に対して０．２％以下になると金属元素である金によるチャージアップの阻止機能を充分期待することが難しくなる。また、金イオン含有液そのもの（１００％）も使用することもできるが、この場合は費用対効果の点で好ましくない。【００２６】  次に、用意された、例えば、生物試料（生もの）などの被観察試料１６を定法によって洗浄し、ついで刷毛などを使用して処理水１４をこの被観察試料１６に塗布する。この場合、処理水１４はスプレイなどで噴霧してもよいことは言うまでもない。
このようにして処理水を塗布された被観察試料１６は、その表面を風乾など公知の乾燥法を使用して２分〜５分間程度乾燥して表面水を放散させて形状保持を行ったのち、これをＳＥＭの試料台に移して定法により観察すればよい。
なお、得られた被観察試料１６の表面形態をＳＥＭで観察したところ、試料の表面に金Ａｕの導電性薄膜を蒸着（スパッタリング）した従来の調製方法と同等の導電性を有し、チャージアップするもことなく微細でしかも高解像度の結像が確認された。これは、処理水１４に含まれるオングストロームサイズの金属元素（本実施の態様においては金Ａｕ）が試料の細かい組織間に浸透しているからである。【００２７】実施例１
縦に切断したふぐ筋原繊維を定法で洗浄したのち、前記処理水１４を刷毛塗りして３分間の風乾によりその表面水を放散させた試料（本発明方法による調製試料）と、同様のふぐ筋原繊維を定法で洗浄し、真空引きして金Ａｕを蒸着（スパッタリング）することにより調製した従来法による試料（比較試料）とを用意し、ＳＥＭ電子顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＥ−９８００）による３００倍および１０００倍の表面形態結像写真を得た（図２ａおよび図２ｂ）。
得られた表面形態結像写真を比較したところ、本発明方法による調製試料では比較試料に比べてコントラストもよく詳細な表面形状とともに水分を含んだ試料にも拘わらずありのままの状態を微細にしかも正確に観察することができた。【００２８】実施例２
カニ筋原繊維を定法で洗浄したのち、処理水１４を刷毛塗りして５分間の風乾によりその表面水を放散させた試料（本発明方法による調製試料）と、同様のカニ筋原繊維を定法で洗浄したのち真空引きして金Ａｕを蒸着（スパッタリング）することにより調製した従来法による試料（比較試料）とを用意し、ＳＥＭ電子顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＥ−９８００）による３００倍および１０００倍の表面形態結像写真（図３ａおよび図３ｂ）を得、これらの表面形態結像写真を比較したところ、本発明方法による調製試料では前記の実施例と同様に観察できただけでなく、最表面の状態の微細な形状も比較試料に比べて鮮明に観察することができた。【００２９】実施例３
プラスチック板（ＰＴＦＥ）を定法で洗浄したのち、処理水１４を噴霧して５分間の風乾によりその表面水を放散させた試料（本発明方法による調製試料）と、同様のプラスチック板（ＰＴＦＥ）を定法で洗浄したのち真空引きして金Ａｕを蒸着（スパッタリング）した従来法による試料（比較試料）とを用意し、ＳＥＭ電子顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＥ−９８００）における３００倍および１０００倍の表面形態結像写真（図４ａおよび図４ｂ）を比較したところ、本発明方法による調製試料では比較試料に比べてコントラストもよく、同じ加速電圧（１．２ｋｖ）であってもダメージや変形が少なく、微細な形状を鮮明に観察することができた。【００３０】  以上、本発明に係る電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法の好適な実施の形態につき説明したが、本発明方法はこれらの実施の形態に限定されるものではなく、例えば、金属イオン含有液の金属元素としては金Ａｕだけでなく、銀、銅、チタン、ゲルマニウム、珪素、アルミニウム、鉄、カルシウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、バナジウムなど各種の金属元素やこれらの金属元素を２以上含んだ金属イオン含有液を使用することができることは言うまでもなく、また、対象となる試料も生物由来の生体サンプル、あるいはそのレプリカ像形成物質はもとより生体非由来の有機物質さらには無機試料などその種類や形態は制限されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明に係る電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法の最良の形態を示す概略手順説明図である。
【図２】ふぐ筋原繊維の電子顕微鏡（ＳＥＭ）結像写真であって、ａは図１に示す調製方法を使用して得られたふぐ筋原繊維縦断面の結像写真、ｂは従来方法により調製したふぐ筋原繊維縦断面の結像写真（拡大率３００倍、１０００倍）である。
【図３】カニ筋原繊維の電子顕微鏡（ＳＥＭ）結像写真であって、ａは図１に示す調製方法を使用して得られたカニ筋原繊維の結像写真、ｂは従来方法により調製したカニ筋原繊維の結像写真（拡大率３００倍、１０００倍）である。
【図４】プラスチック板（ＰＴＦＥ）の電子顕微鏡（ＳＥＭ）結像写真であって、ａは図１に示す調製方法を使用して得られたプラスチック板表面の結像写真、ｂは従来方法により調製したプラスチック板表面の結像写真（拡大率３００倍、１０００倍）である。
【符号の説明】
【００３２】      １０…容器、
１２…イオン含有液（金Ａｕ）、
１４…処理水、
１６…被観察試料、
【図１】
2007279010.tif 000003
【図２】
2007279010.tif 000004
【図３】
2007279010.tif 000005
【図４】
2007279010.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成18年10月27日(2006.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属元素をイオンとして含む金属イオン含有液を所定濃度で溶解してなる処理水を被観察試料に噴霧または塗布し、ついでこの被観察試料の表面水を放散させることを特徴とする走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法。
【請求項２】
処理水に対する金属イオン含有液の濃度を０．２％〜１００．０％の範囲に設定することからなる請求項１に記載の走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法。
【請求項３】
金属イオン含有液は、金属元素を含む鉱物質を機械的手段により微細化したのち、この微細化鉱物質に麹菌を加えて発酵させ、さらに酒石酸、クエン酸、乳酸、酢酸などアルキル基を有する有機酸を加えて混合攪拌することにより金属元素を有機酸溶液中にイオンとして解離させてなる請求項１または２に記載の走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法。
【請求項４】
金属イオン含有液として、金属元素としての金、銀、銅、チタン、ゲルマニウム、珪素、アルミニウム、鉄、カルシウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、バナジウムを単独もしくは２以上含む金属イオン含有液を使用することからなる請求項１〜３のいずれかに記載の走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  この発明は、顕微鏡における被観察試料の調製方法に関するものであり、一層詳細には、走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の新規な調製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  今日、微小物体を拡大して観察する手段として、光学レンズを使った光学顕微鏡やデジタルマイクロスコープなどのほか、電子レンズを使った電子顕微鏡の利用が広まっている。
電子顕微鏡は、電子の進行方向を自由に屈折させることにより光学顕微鏡のような結像システムを電子光学的に構成したものであり、被観察試料を透過した電子を電子レンズを用いて結像させる透過型電子顕微鏡のほか、試料表面で反射した電子を結像させる反射型電子顕微鏡、集束電子線を試料表面上に走査して各走査点からの二次電子を用いて結像させる走査型電子顕微鏡、加熱あるいはイオン照射によって試料から放出する電子を結像させる表面放出型の電界イオン顕微鏡などがその目的用途に応じて利用されている。【０００３】  これら各型式の電子顕微鏡のうち、透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＴＥＭ）は、薄膜試料に電子線を透過させ、その際に試料中で原子により散乱、回折された電子を電子回折パターンまたは透過電顕像として得ることによって主に物質の内部構造を観察することができる。【０００４】  一方、走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＥＭ）は、対象となる試料に細い電子線（電子プローブ）を照射した際に発生する二次電子や反射電子を、二次電子検出器、反射電子検出器などそれぞれの検出器を用いて取り出し、ブラウン管やＬＣＤなどの表示画面上に表示し、主として試料の表面形態を観察する装置である。【０００５】  電子線は固体試料に照射されたとき、電子のエネルギーによって固体中を透過するが、その際に試料を構成する原子核や電子との相互作用によって弾性的な衝突、弾性散乱やエネルギー損失を伴う非弾性散乱を生じる。そして非弾性散乱によって試料元素の殻内電子を励起したり、Ｘ線などを励起したり、また二次電子を放出し、それに相当するエネルギーを損失する。二次電子は衝突する角度によって放出される量が異なる。一方、弾性散乱によって後方に散乱し、試料から再び放出される反射電子は、原子番号に固有の量が放出される。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）は試料に照射されたのち放出されるこの二次電子や反射電子を検出して観察像を結像している。【０００６】  ＳＥＭによる試料の観察を妨げる要因は様々なものがあるが、試料に起因する主な要因は試料の観察時に発生する帯電（チャージアップ）現象である。チャージアップとは、入射する荷電粒子と放出される荷電粒子が有する電荷の差によって、照射面が正または負に帯電する現象であり、このチャージアップが発生すると、放出された二次電子が加速されたり引き戻されたりして、良好な結像特性が得られなくなり、まれではあるが全く結像しない場合さえ発生する。【０００７】  負の電荷を持つ電子線が塊（バルク）状試料に入射すると、試料が導電性であればその電荷は試料を伝ってアースされるが、試料が非導電性の場合は入射電子の電荷は試料表面から逃げることができず、試料自体がチャージアップしてしまう。チャージアップ現象としては、観察視野内に異常な明暗のコントラストが発生したり、明暗が帯状に現れ二次電子像の観察が困難となる。
チャージアップがさらに激しくなると、ゆっくりと視野が移動したり、いきなり視野が大きく移動する、所謂、観察視野のドリフトも発生する。
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  このような事情から、チャージアップした試料の帯電を除去する技術として、例えば、試料からの電子の発生効率が１を上回るような低い加速電圧の電子線を照射する方法、あるいは、試料表面に蓄積した電荷に対して反対極性の電荷が発生する加速電圧の電子線を照射することで消去する方法などが提案されている。
【０００９】  しかしながら、前者の方法では、試料に帯電したエネルギーが除電のために照射した電子線のエネルギーを上回る場合、照射した電子線が跳ね返されて試料に到達できず、除電できないという問題がある。
また、この方法では加速電圧の設定が難しいという問題もある。二次電子の発生効率が１になるような加速電圧に設定しなければならないが、試料の材質、形状によって、発生効率が１になる加速電圧が異なるため、加速電圧を調整しながら発生効率が１になるような加速電圧を見出さなければならない。
試料がチャージアップしている場合は、一次電子の初速度と試料に入射する時のランディング速度が異なるため、最適な加速電圧の設定が難しくなる。仮に発生効率が１になる加速電圧を見つけたとしても、それまでの観察過程で試料に高加速電圧の電子が照射された場合は既に試料が負の電荷に帯電しているため、チャージアップによる像障害が起こるとになる。長時間（例えば数時間程度）に亘って発生効率が１になる加速電圧の電子を照射し続ければ除電できる場合もあるが現実的とは言えない。
【００１０】  一方、後者の方法は、チャージがたまり始める前までに観察する方法、すなわち帯電を防止する対策であって帯電した電荷を除去するといった積極的な除電方法ではない。
【００１１】  別の方法として、試料がチャージアップしているかどうかを検知し、チャージアップしていると判定された場合に帯電対策を行う技術が開発されている。しかしながら、チャージアップの検知の問題として、検知のための専用の設備が必要となること、チャージアップの現象が様々であるため、正しく検知することが困難なことなどの問題がある。
【００１２】  また、試料室内を大気圧にして試料を空気に触れさせることで除電する方法もあるが、十分に除電しきれない場合があるだけでなく再度観察を行うために真空引きをやり直す必要があり、時間と手間がかかるという欠点もある。
【００１３】  さらに低真空で観察する方法、電子シャワー発生器やイオンシャワー発生器を用いる方法、制御電極を設ける方法なども提案されているが、これらの方法では専用の設備が別途に必要となり、簡単に実施することが困難であった。
【００１４】  このように、いずれの方法であっても問題点を有していることから試料の除電を簡便に行う方法が鋭意開発されているが、チャージアップ自体を防止する現実的な手段として、試料の表面に金Ａｕなどを素材とする導電性薄膜を蒸着（スパッタリング）する方法が採用されている。
しかしながら、この方法は試料を乾燥しり、蒸着時に真空引きする必要があるため処理作業が面倒で長時間を要するだけでなく、食品などの生物試料（生もの）の調製には適さず、しかも試料がくずれたりして観察後に元に戻らないといった問題点が指摘されていた。
【課題を解決するための手段】
【００１５】  ところで、本発明者は、醗酵技術を駆使して植物の種子などに含まれる金属元素を電解質として解離（イオン化）させる画期的な方法を開発し、特許第２８６５４１２号として登録を得ている。
また、静電磁場を形成した容器内において麹菌を加えて発酵させた金属元素（ミネラル）含有物とアルキル基を有する有機酸溶液とを混合攪拌し、この容器内の雰囲気を所定条件でかつ所定期間保持することにより、金属元素含有物質から金属元素を効率よく解離（イオン化）抽出する方法も開発している。
【００１６】  そして上記方法を利用することにより従来では考えられなかった、例えば、金、銀、銅、マグネシウム、亜鉛、マンガン、アルミニウム、ステンレス、プラチナなど多種多様の金属元素を電解質として解離（イオン化）抽出する技術も確立し、しかも、この方法によって得た抽出液中の各金属元素はオングストロームサイズ（１０のマイナス１０乗〜９乗メートル）であるため、素材の品質ないしは機能を飛躍的に向上させることができるだけでなく、例えば、衣類などの帯電防止加工手段としても有効であることが確認されている。
【００１７】  そこで、この発明に係る走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法では、金属元素をイオンとして含む金属イオン含有液（抽出液）を所定の濃度で溶解した処理水を被観察試料に噴霧または塗布し、ついでこの被観察試料の表面水を放散させ、処理水に含まれている金属元素を導電性薄膜に代替するものとして利用することによりチャージアップを阻止できるようにしたものである。
【００１８】  この場合、処理水に対する金属イオン含有液の濃度は０．２％〜１００．０％の範囲に設定するのが好ましく、金属イオン含有液の濃度が０．２％未満では金属元素によるチャージアップを防止することが困難となり、また１００．０％に設定すると費用対効果の点で問題が生じることになる。
【００１９】  また、金属イオン含有液としては、金属元素を含む鉱物質を機械的手段などにより微細化したのち、この微細化鉱物質に麹菌を加えて発酵させ、さらに酒石酸、クエン酸、乳酸あるいは酢酸などアルキル基を有する有機酸溶液を加えて混合攪拌することにより、前記微細化鉱物質に含まれる金属元素を有機酸溶液中にイオンとして解離させた水溶液を使用するのが好ましい。
【００２０】  さらに、金属イオン含有液に含まれる金属元素としては、例えば、金、銀、銅、チタン、ゲルマニウム、珪素、アルミニウム、鉄、カルシウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、バナジウムなどが挙げられ、これらの金属元素を単独もしくは２以上含む金属イオン含有液を使用するのが好適である。
【発明の効果】
【００２１】  本発明に係る走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法によれば、被観察試料に金属イオン含有水溶液を塗布し、ついでのこの被観察試料の表面水を放散させるという簡単な操作だけでチャージアップを充分阻止することができるだけでなく、その調製も１０分程度の短時間でできるので試料の観察を迅速にしかもリアルタイムで行うことができる。
また、チャージアップが原因となる反射や分散が生じないので鮮明な結像を得ることができ、食品などの生物試料（生もの）でも前処理で真空引きする必要がないためくずれたりすることがなく、経時的な観察も好適にかつ好適に行うことができる。
さらには、オングストロームオーダーの金属元素が試料の微細組織まで浸透するので焦点深度がより深くなり、従って、対象となる試料のある程度内部まで微細にかつ鮮明に観察することが可能になるなど優れた種々の効果を奏するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】  次に、本発明に係る走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法の最良の形態を例示し、以下詳細に説明する。
すなわち、本発明に係る被観察試料の調製方法においては、図１に示すように、まず、容器１０に収容される浄化水に金（Ａｕ）イオン含有液１２を滴下することにより所定濃度の処理水１４を準備する。
この場合、浄化水は、例えば、上水を逆浸透膜（ＲＯ）で濾過することにより不純物を可及的に除去したものを使用する。【００２３】  また、金（Ａｕ）イオン含有液１２は以下の方法により得られた抽出液を使用するのが好適である。
すなわち、金箔および／もしくは金（Ａｕ）を含む鉱物質を予め細かく粉砕し、この微細化金箔および／もしくは微細化鉱物質と浄化水とを重量比で略等量用意して混合したのち、１０％〜２０％の麹菌を加えて摂氏３５度〜４０度に保持して醗酵させ、一定期間ねかせておく。
次に、このように前処理して得られた微細化金箔および／もしくは微細化鉱物質の醗酵原料と、アルキル基を有する有機酸溶液とを重量比で１０：１の割合で混合する。この場合、アルキル基を有する有機酸としては、例えば、酒石酸、クエン酸、乳酸あるいは酢酸などを適宜使用することができる。【００２４】  ついで、この微細化金箔および／もしくは微細化鉱物質の醗酵原料とアルキル基を有する有機酸溶液との混合液を容器中において適宜の手段で攪拌混合する。なお、この際、容器に配設した加熱ヒータおよび容器の素材自体が放射する遠赤効果を利用して微細化金箔および／もしくは微細化鉱物質の醗酵原料とアルキル基を有する有機酸との混合液を摂氏４５度〜５５度に保持するとともにポンプ装置などの循環系によって静電磁場、紫外線殺菌装置さらには太陽光照射機構などの制御下にゆっくりと所定時間循環させることにより金属元素としての金（Ａｕ）を０．３％〜０．５％程度解離（イオン化）させた抽出液、すなわち、金（Ａｕ）イオン含有液１２とする。【００２５】  なお、金（Ａｕ）イオン含有液１２を処理水１４に滴下する場合、金イオン含有液１２の濃度が処理水１４に対して０．２％以下になると金属元素である金によるチャージアップの阻止機能を充分期待することが難しくなる。また、金イオン含有液そのもの（１００％）も使用することもできるが、この場合は費用対効果の点で好ましくない。【００２６】  次に、用意された、例えば、生物試料（生もの）などの被観察試料１６を定法によって洗浄し、ついで刷毛などを使用して処理水１４をこの被観察試料１６に塗布する。この場合、処理水１４はスプレーなどで噴霧してもよいことは言うまでもない。
このようにして処理水を塗布された被観察試料１６は、その表面を風乾など公知の乾燥法を使用して２分〜５分間程度乾燥して表面水を放散させて形状保持を行ったのち、これをＳＥＭの試料台に移して定法により観察すればよい。
なお、得られた被観察試料１６の表面形態をＳＥＭで観察したところ、試料の表面に金Ａｕの導電性薄膜を蒸着（スパッタリング）した従来の調製方法と同等の導電性を有し、チャージアップするもことなく微細でしかも高解像度の結像が確認された。これは、処理水１４に含まれるオングストロームサイズの金属元素（本実施の態様においては金Ａｕ）が試料の細かい組織間に浸透しているからである。【００２７】実施例１
縦に切断したふぐ筋原繊維を定法で洗浄したのち、前記処理水１４を刷毛塗りして３分間の風乾によりその表面水を放散させた試料（本発明方法による調製試料）と、同様のふぐ筋原繊維を定法で洗浄し、真空引きして金Ａｕを蒸着（スパッタリング）することにより調製した従来法による試料（比較試料）とを用意し、ＳＥＭ電子顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＥ−９８００）による３００倍および１０００倍の表面形態結像写真を得た（図２ａおよび図２ｂ）。
得られた表面形態結像写真を比較したところ、本発明方法による調製試料では比較試料に比べてコントラストもよく詳細な表面形状とともに水分を含んだ試料にも拘わらずありのままの状態を微細にしかも正確に観察することができた。【００２８】実施例２
カニ筋原繊維を定法で洗浄したのち、処理水１４を刷毛塗りして５分間の風乾によりその表面水を放散させた試料（本発明方法による調製試料）と、同様のカニ筋原繊維を定法で洗浄したのち真空引きして金Ａｕを蒸着（スパッタリング）することにより調製した従来法による試料（比較試料）とを用意し、ＳＥＭ電子顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＥ−９８００）による３００倍および１０００倍の表面形態結像写真（図３ａおよび図３ｂ）を得、これらの表面形態結像写真を比較したところ、本発明方法による調製試料では前記の実施例と同様に観察できただけでなく、最表面の状態の微細な形状も比較試料に比べて鮮明に観察することができた。【００２９】実施例３
プラスチック板（ＰＴＦＥ）を定法で洗浄したのち、処理水１４を噴霧して５分間の風乾によりその表面水を放散させた試料（本発明方法による調製試料）と、同様のプラスチック板（ＰＴＦＥ）を定法で洗浄したのち真空引きして金Ａｕを蒸着（スパッタリング）した従来法による試料（比較試料）とを用意し、ＳＥＭ電子顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＥ−９８００）における３００倍および１０００倍の表面形態結像写真（図４ａおよび図４ｂ）を比較したところ、本発明方法による調製試料では比較試料に比べてコントラストもよく、同じ加速電圧（１．２ｋｖ）であってもダメージや変形が少なく、微細な形状を鮮明に観察することができた。【００３０】  以上、本発明に係る走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で使用する被観察試料の調製方法の好適な実施の形態につき説明したが、本発明方法はこれらの実施の形態に限定されるものではなく、例えば、金属イオン含有液の金属元素としては金Ａｕだけでなく、銀、銅、チタン、ゲルマニウム、珪素、アルミニウム、鉄、カルシウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、バナジウムなど各種の金属元素やこれらの金属元素を２以上含んだ金属イオン含有液を使用することができることは言うまでもなく、また、対象となる試料も生物由来の生体サンプル、あるいはそのレプリカ像形成物質はもとより生体非由来の有機物質さらには無機試料などその種類や形態は制限されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明に係る走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で使用する被観察試料の調製方法の最良の形態を示す概略手順説明図である。
【図２】ふぐ筋原繊維の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による結像写真であって、ａは図１に示す調製方法を使用して得られたふぐ筋原繊維縦断面の結像写真、ｂは従来方法により調製したふぐ筋原繊維縦断面の結像写真（拡大率３００倍、１０００倍）である。
【図３】カニ筋原繊維の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による結像写真であって、ａは図１に示す調製方法を使用して得られたカニ筋原繊維の結像写真、ｂは従来方法により調製したカニ筋原繊維の結像写真（拡大率３００倍、１０００倍）である。
【図４】プラスチック板（ＰＴＦＥ）の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による結像写真であって、ａは図１に示す調製方法を使用して得られたプラスチック板表面の結像写真、ｂは従来方法により調製したプラスチック板表面の結像写真（拡大率３００倍、１０００倍）である。
【符号の説明】
【００３２】  １０…容器、
１２…イオン含有液（金Ａｕ）、
１４…処理水、
１６…被観察試料、
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月6日(2007.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属元素をイオンとして含む金属イオン含有液を所定濃度で溶解してなる処理水を被観察試料に噴霧または塗布し、ついでこの被観察試料の表面水を放散させることを特徴とする走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法。
【請求項２】
処理水に対する金属イオン含有液の濃度を０．２％〜１００．０％の範囲に設定することからなる請求項１に記載の走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法。
【請求項３】
金属イオン含有液は、金属元素を含む鉱物質を機械的手段により微細化したのち、この微細化鉱物質に麹菌を加えて発酵させ、さらに酒石酸、クエン酸、乳酸、酢酸などアルキル基を有する有機酸を加えて混合攪拌することにより金属元素を有機酸溶液中にイオンとして解離させてなる請求項１または２に記載の走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法。
【請求項４】
金属イオン含有液として、金（Ａｕ）イオン含有液を使用することからなる請求項１〜３のいずれかに記載の走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  この発明は、顕微鏡における被観察試料の調製方法に関するものであり、一層詳細には、走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の新規な調製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  今日、微小物体を拡大して観察する手段として、光学レンズを使った光学顕微鏡やデジタルマイクロスコープなどのほか、電子レンズを使った電子顕微鏡の利用が広まっている。
電子顕微鏡は、電子の進行方向を自由に屈折させることにより光学顕微鏡のような結像システムを電子光学的に構成したものであり、被観察試料を透過した電子を電子レンズを用いて結像させる透過型電子顕微鏡のほか、試料表面で反射した電子を結像させる反射型電子顕微鏡、集束電子線を試料表面上に走査して各走査点からの二次電子を用いて結像させる走査型電子顕微鏡、加熱あるいはイオン照射によって試料から放出する電子を結像させる表面放出型の電界イオン顕微鏡などがその目的用途に応じて利用されている。【０００３】  これら各型式の電子顕微鏡のうち、透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＴＥＭ）は、薄膜試料に電子線を透過させ、その際に試料中で原子により散乱、回折された電子を電子回折パターンまたは透過電顕像として得ることによって主に物質の内部構造を観察することができる。【０００４】  一方、走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＥＭ）は、対象となる試料に細い電子線（電子プローブ）を照射した際に発生する二次電子や反射電子を、二次電子検出器、反射電子検出器などそれぞれの検出器を用いて取り出し、ブラウン管やＬＣＤなどの表示画面上に表示し、主として試料の表面形態を観察する装置である。【０００５】  電子線は固体試料に照射されたとき、電子のエネルギーによって固体中を透過するが、その際に試料を構成する原子核や電子との相互作用によって弾性的な衝突、弾性散乱やエネルギー損失を伴う非弾性散乱を生じる。そして非弾性散乱によって試料元素の殻内電子を励起したり、Ｘ線などを励起したり、また二次電子を放出し、それに相当するエネルギーを損失する。二次電子は衝突する角度によって放出される量が異なる。一方、弾性散乱によって後方に散乱し、試料から再び放出される反射電子は、原子番号に固有の量が放出される。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）は試料に照射されたのち放出されるこの二次電子や反射電子を検出して観察像を結像している。【０００６】  ＳＥＭによる試料の観察を妨げる要因は様々なものがあるが、試料に起因する主な要因は試料の観察時に発生する帯電（チャージアップ）現象である。チャージアップとは、入射する荷電粒子と放出される荷電粒子が有する電荷の差によって、照射面が正または負に帯電する現象であり、このチャージアップが発生すると、放出された二次電子が加速されたり引き戻されたりして、良好な結像特性が得られなくなり、まれではあるが全く結像しない場合さえ発生する。【０００７】  負の電荷を持つ電子線が塊（バルク）状試料に入射すると、試料が導電性であればその電荷は試料を伝ってアースされるが、試料が非導電性の場合は入射電子の電荷は試料表面から逃げることができず、試料自体がチャージアップしてしまう。チャージアップ現象としては、観察視野内の明暗のコントラストに異常が発生したり、その明暗が帯状に現れて二次電子像の観察が困難となる。
チャージアップがさらに激しくなると、ゆっくりと視野が移動したり、いきなり視野が大きく移動する、所謂、観察視野のドリフトも発生する。
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  このような事情から、チャージアップした試料の帯電を除去する技術として、例えば、試料からの電子の発生効率が１を上回るような低い加速電圧の電子線を照射する方法、あるいは、試料表面に蓄積した電荷に対して反対極性の電荷が発生する加速電圧の電子線を照射することで消去する方法などが提案されている。
【０００９】  しかしながら、前者の方法では、例えば、試料に帯電したエネルギーが除電のために照射した電子線のエネルギーを上回る場合などは照射した電子線が跳ね返されて試料に到達できず、除電できないという問題がある。
また、この方法では加速電圧の設定が難しいという問題もある。二次電子の発生効率が１になるような加速電圧に設定しなければならないが、試料の材質、形状によって、発生効率が１になる加速電圧が異なるため、加速電圧を調整しながら発生効率が１になるような加速電圧を見出さなければならない。
試料がチャージアップしている場合は、一次電子の初速度と試料に入射する時のランディング速度が異なるため、最適な加速電圧の設定が難しくなる。仮に発生効率が１になる加速電圧を見つけたとしても、それまでの観察過程で試料に高加速電圧の電子が照射された場合は既に試料が負の電荷に帯電しているため、チャージアップによる像障害が起こるとになる。長時間（例えば数時間程度）に亘って発生効率が１になる加速電圧の電子を照射し続ければ除電できる場合もあるが現実的とは言えない。
【００１０】  一方、後者の方法は、チャージがたまり始める前までに観察する方法、すなわち帯電を防止する対策であって帯電した電荷を除去するといった積極的な除電方法ではない。
【００１１】  別の方法として、試料がチャージアップしているかどうかを検知し、チャージアップしていると判定された場合に帯電対策を行う技術が開発されている。しかしながら、チャージアップの検知の問題として、検知のための専用の設備が必要となること、チャージアップの現象が様々であるため、正しく検知することが困難なことなどの問題がある。
【００１２】  また、試料室内を大気圧にして試料を空気に触れさせることで除電する方法もあるが、十分に除電しきれない場合があるだけでなく再度観察を行うために真空引きをやり直す必要があり、時間と手間がかかるという欠点もある。
【００１３】  さらに低真空で観察する方法、電子シャワー発生器やイオンシャワー発生器を用いる方法、制御電極を設ける方法なども提案されているが、これらの方法では別途に専用の設備が必要となり、簡単に実施することが困難であった。
【００１４】  このように、いずれの方法であっても問題点を有していることから試料の除電を簡便に行う方法が鋭意開発されており、チャージアップ自体を防止する現実的な手段として、例えば、試料の表面に金Ａｕなどを素材とする導電性薄膜を蒸着（スパッタリング）する方法が採用されている。
しかしながら、この方法は試料を乾燥しり、蒸着時に真空引きする必要があるため処理作業が面倒で長時間を要するだけでなく、食品などの生物試料（生もの）の調製には適さず、しかも試料がくずれたりして観察後に元に戻らないといった問題点が指摘されていた。
【課題を解決するための手段】
【００１５】  ところで、本発明者は、醗酵技術を駆使して植物の種子などに含まれる金属元素を電解質として解離（イオン化）させる画期的な方法を開発し、特許第２８６５４１２号として登録を得ている。
また、静電磁場を形成した容器内において麹菌を加えて発酵させた金属元素（ミネラル）含有物とアルキル基を有する有機酸溶液とを混合攪拌し、この容器内の雰囲気を所定条件でかつ所定期間保持することにより、金属元素含有物質から金属元素を効率よく解離（イオン化）抽出する方法も開発している。
【００１６】  そして上記方法などを利用することにより従来では考えられなかった、例えば、金、銀、銅、マグネシウム、亜鉛、マンガン、アルミニウム、ステンレス、プラチナなど多種多様の金属元素を電解質として解離（イオン化）抽出する技術も確立し、しかも、この方法によって得られた抽出液中の各金属元素はオングストロームサイズ（１０のマイナス１０乗〜９乗メートル）であるため、素材の品質ないしは機能を飛躍的に向上させることができるだけでなく、例えば、衣類などの帯電防止加工手段としても有効であることが確認されている。
【００１７】  そこで、この発明に係る走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法では、金属元素をイオンとして含む金属イオン含有液（抽出液）を所定の濃度で溶解した処理水を被観察試料に噴霧または塗布し、ついでこの被観察試料の表面水を放散させ、処理水に含まれている金属元素を導電性薄膜に代替するものとして利用することによりチャージアップ自体を阻止できるようにしたものである。
【００１８】  この場合、処理水に対する金属イオン含有液の濃度は０．２％〜１００．０％の範囲に設定するのが好ましく、金属イオン含有液の濃度が０．２％未満では金属元素によるチャージアップを防止することが困難となり、また１００．０％に設定すると費用対効果の点で問題が生じることになる。
【００１９】  また、金属イオン含有液としては、金属元素を含む鉱物質を機械的手段などにより微細化したのち、この微細化鉱物質に麹菌を加えて発酵させ、さらに酒石酸、クエン酸、乳酸あるいは酢酸などアルキル基を有する有機酸溶液を加えて混合攪拌することにより、前記微細化鉱物質に含まれる金属元素を有機酸溶液中にイオンとして解離させた水溶液を使用するのが好ましい。
【００２０】  さらに、金属イオン含有液としては金（Ａｕ）イオン含有液を使用するのが好適である。
【発明の効果】
【００２１】  本発明に係る走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法によれば、被観察試料に金属イオン含有水溶液を塗布し、ついでのこの被観察試料の表面水を放散させるという簡単な操作だけでチャージアップ自体を充分阻止することができるだけでなく、１０分程度の短時間で試料の調製をできるので観察を迅速にしかもリアルタイムで行うことができる。
また、チャージアップが原因となる反射や分散が生じないので鮮明な結像を得ることができ、食品などの生物試料（生もの）であっても真空引きなどの前処理が不要であるためくずれたりすることがなく、経時的な観察も迅速にかつ好適に行うことができる。
さらには、オングストロームオーダーの金属元素（金Ａｕイオン）が試料の微細組織まで浸透するので焦点深度がより深くなり、従って、対象となる試料のある程度内部まで微細にかつ鮮明に観察することが可能になるなどの優れた効果を奏するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】  次に、本発明に係る走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法の最良の形態を例示し、以下詳細に説明する。
すなわち、本発明に係る被観察試料の調製方法においては、図１に示すように、まず、容器１０に収容される浄化水に金（Ａｕ）イオン含有液１２を滴下することにより所定濃度の処理水１４を準備する。
この場合、浄化水は、例えば、上水を逆浸透膜（ＲＯ）で濾過することにより不純物を可及的に除去したものを使用する。【００２３】  また、金（Ａｕ）イオン含有液１２は以下の方法により得られた抽出液を使用するのが好適である。
すなわち、金箔および／もしくは金（Ａｕ）を含む鉱物質を予め細かく粉砕し、この微細化金箔および／もしくは微細化鉱物質と浄化水とを重量比で略等量用意して混合したのち、１０％〜２０％の麹菌を加えて摂氏３５度〜４０度に保持して醗酵させ、一定期間ねかせておく。
次に、このように前処理して得られた微細化金箔および／もしくは微細化鉱物質の醗酵原料と、アルキル基を有する有機酸溶液とを重量比で１０：１の割合で混合する。この場合、アルキル基を有する有機酸としては、例えば、酒石酸、クエン酸、乳酸あるいは酢酸などを適宜使用することができる。【００２４】  ついで、この微細化金箔および／もしくは微細化鉱物質の醗酵原料とアルキル基を有する有機酸溶液との混合溶液を容器中において適宜の手段で攪拌混合する。なお、この際、容器に配設した加熱ヒータおよび容器の素材自体が放射する遠赤効果を利用して混合溶液液を摂氏４５度〜５５度に保持するとともにこの混合溶液液をポンプ装置などの循環系によって静電磁場、紫外線殺菌装置さらには太陽光照射機構などの制御下にゆっくりと所定時間循環させることにより金属元素としての金（Ａｕ）を０．３％〜０．５％程度解離（イオン化）させた抽出液、すなわち、金（Ａｕ）イオン含有液１２とする。
なお、このような手順により微細化金箔などから金が解離するのは、「細菌類、酵母類、糸状菌類、藻菌類そのものか、あるいはその酵母類が有機物または無機物に作用して有機化合物や無機化合物を生じ、なおかつその現象がなんらかの物質を生成する」という醗酵、具体的には、麹菌の醗酵増殖時に生じる酢酸などが混合液中の微細な金箔を溶解解離するからであります。【００２５】  また、金（Ａｕ）イオン含有液１２を処理水１４に滴下する場合、金イオン含有液１２の濃度が処理水１４に対して０．２％以下になると金属元素である金によるチャージアップの阻止機能を充分期待することが難しくなる。また、金イオン含有液そのもの（１００％）も使用することもできるが、この場合は費用対効果の点で好ましくない。【００２６】  次に、用意された、例えば、生物試料（生もの）などの被観察試料１６を定法によって洗浄し、ついで刷毛などを使用して処理水１４をこの被観察試料１６に塗布する。この場合、処理水１４はスプレーなどで噴霧してもよいことは言うまでもない。
このようにして処理水を塗布された被観察試料１６は、その表面を風乾など公知の乾燥法を使用して２分〜５分間程度乾燥して表面水を放散させて形状保持を行ったのち、これをＳＥＭの試料台に移して定法により観察すればよい。
なお、得られた被観察試料１６の表面形態をＳＥＭで観察したところ、試料の表面に金Ａｕの導電性薄膜を蒸着（スパッタリング）した従来の調製方法と同等の導電性を有し、チャージアップするもことなく微細でしかも高解像度の結像が確認された。これは、処理水１４に含まれるオングストロームサイズの金属元素（本実施の態様においては金Ａｕ）が試料の細かい組織間に浸透しているからである。【００２７】実施例１
縦に切断したふぐ筋原繊維を定法で洗浄したのち、前記処理水１４を刷毛塗りして３分間の風乾によりその表面水を放散させた試料（本発明方法による調製試料）と、同様のふぐ筋原繊維を定法で洗浄し、真空引きして金Ａｕを蒸着（スパッタリング）することにより調製した従来法による試料（比較試料）とを用意し、ＳＥＭ電子顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＥ−９８００）による３００倍および１０００倍の表面形態結像写真を得た（図２ａおよび図２ｂ）。
得られた表面形態結像写真を比較したところ、本発明方法による調製試料では比較試料に比べてコントラストもよく詳細な表面形状とともに水分を含んだ試料にも拘わらずありのままの状態を微細にしかも正確に観察することができた。【００２８】実施例２
カニ筋原繊維を定法で洗浄したのち、処理水１４を刷毛塗りして５分間の風乾によりその表面水を放散させた試料（本発明方法による調製試料）と、同様のカニ筋原繊維を定法で洗浄したのち真空引きして金Ａｕを蒸着（スパッタリング）することにより調製した従来法による試料（比較試料）とを用意し、ＳＥＭ電子顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＥ−９８００）による３００倍および１０００倍の表面形態結像写真（図３ａおよび図３ｂ）を得、これらの表面形態結像写真を比較したところ、本発明方法による調製試料では前記の実施例と同様に観察できただけでなく、最表面の状態の微細な形状も比較試料に比べて鮮明に観察することができた。【００２９】実施例３
プラスチック板（ＰＴＦＥ）を定法で洗浄したのち、処理水１４を噴霧して５分間の風乾によりその表面水を放散させた試料（本発明方法による調製試料）と、同様のプラスチック板（ＰＴＦＥ）を定法で洗浄したのち真空引きして金Ａｕを蒸着（スパッタリング）した従来法による試料（比較試料）とを用意し、ＳＥＭ電子顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＥ−９８００）における３００倍および１０００倍の表面形態結像写真（図４ａおよび図４ｂ）を比較したところ、本発明方法による調製試料では比較試料に比べてコントラストもよく、同じ加速電圧（１．２ｋｖ）であってもダメージや変形が少なく、微細な形状を鮮明に観察することができた。【００３０】  以上、本発明に係る走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で使用する被観察試料の調製方法の好適な実施の形態につき説明したが、本発明方法はこれらの実施の形態に限定されるものではなく、対象となる試料も生物由来の生体サンプル、あるいはそのレプリカ像形成物質はもとより生体非由来の有機物質さらには無機試料などその種類や形態は制限されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明に係る走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で使用する被観察試料の調製方法の最良の形態を示す概略手順説明図である。
【図２】ふぐ筋原繊維の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による結像写真であって、ａは図１に示す調製方法を使用して得られたふぐ筋原繊維縦断面の結像写真、ｂは従来方法により調製したふぐ筋原繊維縦断面の結像写真（拡大率３００倍、１０００倍）である。
【図３】カニ筋原繊維の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による結像写真であって、ａは図１に示す調製方法を使用して得られたカニ筋原繊維の結像写真、ｂは従来方法により調製したカニ筋原繊維の結像写真（拡大率３００倍、１０００倍）である。
【図４】プラスチック板（ＰＴＦＥ）の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による結像写真であって、ａは図１に示す調製方法を使用して得られたプラスチック板表面の結像写真、ｂは従来方法により調製したプラスチック板表面の結像写真（拡大率３００倍、１０００倍）である。
【符号の説明】
【００３２】      １０…容器、
１２…イオン含有液（金Ａｕ）、
１４…処理水、
１６…被観察試料、
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月27日(2007.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金イオン含有液を所定濃度で溶解してなる処理水を被観察試料に噴霧または塗布し、ついでこの被観察試料の表面水を放散させることを特徴とする走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法。
【請求項２】
処理水に対する金イオン含有液の濃度を０．２％〜１００．０％の範囲に設定することからなる請求項１に記載の走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法。
【請求項３】
金イオン含有液は、金元素を含む鉱物質を機械的手段により微細化したのち、この微細化鉱物質に麹菌を加えて発酵させ、さらに酒石酸、クエン酸、乳酸、酢酸などアルキル基を有する有機酸を加えて混合攪拌することにより金元素を有機酸溶液中にイオンとして解離させてなる請求項１または２に記載の走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  この発明は、顕微鏡における被観察試料の調製方法に関するものであり、一層詳細には、走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の新規な調製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  今日、微小物体を拡大して観察する手段として、光学レンズを使った光学顕微鏡やデジタルマイクロスコープなどのほか、電子レンズを使った電子顕微鏡の利用が広まっている。
電子顕微鏡は、電子の進行方向を自由に屈折させることにより光学顕微鏡のような結像システムを電子光学的に構成したものであり、被観察試料を透過した電子を電子レンズを用いて結像させる透過型電子顕微鏡のほか、試料表面で反射した電子を結像させる反射型電子顕微鏡、集束電子線を試料表面上に走査して各走査点からの二次電子を用いて結像させる走査型電子顕微鏡、加熱あるいはイオン照射によって試料から放出する電子を結像させる表面放出型の電界イオン顕微鏡などがその目的用途に応じて利用されている。【０００３】  これら各型式の電子顕微鏡のうち、透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＴＥＭ）は、薄膜試料に電子線を透過させ、その際に試料中で原子により散乱、回折された電子を電子回折パターンまたは透過電顕像として得ることによって主に物質の内部構造を観察することができる。【０００４】  一方、走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＥＭ）は、対象となる試料に細い電子線（電子プローブ）を照射した際に発生する二次電子や反射電子を、二次電子検出器、反射電子検出器などそれぞれの検出器を用いて取り出し、ブラウン管やＬＣＤなどの表示画面上に表示し、主として試料の表面形態を観察する装置である。【０００５】  電子線は固体試料に照射されたとき、電子のエネルギーによって固体中を透過するが、その際に試料を構成する原子核や電子との相互作用によって弾性的な衝突、弾性散乱やエネルギー損失を伴う非弾性散乱を生じる。そして非弾性散乱によって試料元素の殻内電子を励起したり、Ｘ線などを励起したり、また二次電子を放出し、それに相当するエネルギーを損失する。二次電子は衝突する角度によって放出される量が異なる。一方、弾性散乱によって後方に散乱し、試料から再び放出される反射電子は、原子番号に固有の量が放出される。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）は試料に照射されたのち放出されるこの二次電子や反射電子を検出して観察像を結像している。【０００６】  ＳＥＭによる試料の観察を妨げる要因は様々なものがあるが、試料に起因する主な要因は試料の観察時に発生する帯電（チャージアップ）現象である。チャージアップとは、入射する荷電粒子と放出される荷電粒子が有する電荷の差によって、照射面が正または負に帯電する現象であり、このチャージアップが発生すると、放出された二次電子が加速されたり引き戻されたりして、良好な結像特性が得られなくなり、まれではあるが全く結像しない場合さえ発生する。【０００７】  負の電荷を持つ電子線が塊（バルク）状試料に入射すると、試料が導電性であればその電荷は試料を伝ってアースされるが、試料が非導電性の場合は入射電子の電荷は試料表面から逃げることができず、試料自体がチャージアップしてしまう。チャージアップ現象としては、観察視野内の明暗のコントラストに異常が発生したり、その明暗が帯状に現れて二次電子像の観察が困難となる。
チャージアップがさらに激しくなると、ゆっくりと視野が移動したり、いきなり視野が大きく移動する、所謂、観察視野のドリフトも発生する。
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  このような事情から、チャージアップした試料の帯電を除去する技術として、例えば、試料からの電子の発生効率が１を上回るような低い加速電圧の電子線を照射する方法、あるいは、試料表面に蓄積した電荷に対して反対極性の電荷が発生する加速電圧の電子線を照射することで消去する方法などが提案されている。
【０００９】  しかしながら、前者の方法では、例えば、試料に帯電したエネルギーが除電のために照射した電子線のエネルギーを上回る場合などは照射した電子線が跳ね返されて試料に到達できず、除電できないという問題がある。
また、この方法では加速電圧の設定が難しいという問題もある。二次電子の発生効率が１になるような加速電圧に設定しなければならないが、試料の材質、形状によって、発生効率が１になる加速電圧が異なるため、加速電圧を調整しながら発生効率が１になるような加速電圧を見出さなければならない。
試料がチャージアップしている場合は、一次電子の初速度と試料に入射する時のランディング速度が異なるため、最適な加速電圧の設定が難しくなる。仮に発生効率が１になる加速電圧を見つけたとしても、それまでの観察過程で試料に高加速電圧の電子が照射された場合は既に試料が負の電荷に帯電しているため、チャージアップによる像障害が起こるとになる。長時間（例えば数時間程度）に亘って発生効率が１になる加速電圧の電子を照射し続ければ除電できる場合もあるが現実的とは言えない。
【００１０】  一方、後者の方法は、チャージがたまり始める前までに観察する方法、すなわち帯電を防止する対策であって帯電した電荷を除去するといった積極的な除電方法ではない。
【００１１】  別の方法として、試料がチャージアップしているかどうかを検知し、チャージアップしていると判定された場合に帯電対策を行う技術が開発されている。しかしながら、チャージアップの検知の問題として、検知のための専用の設備が必要となること、チャージアップの現象が様々であるため、正しく検知することが困難なことなどの問題がある。
【００１２】  また、試料室内を大気圧にして試料を空気に触れさせることで除電する方法もあるが、十分に除電しきれない場合があるだけでなく再度観察を行うために真空引きをやり直す必要があり、時間と手間がかかるという欠点もある。
【００１３】  さらに低真空で観察する方法、電子シャワー発生器やイオンシャワー発生器を用いる方法、制御電極を設ける方法なども提案されているが、これらの方法では別途に専用の設備が必要となり、簡単に実施することが困難であった。
【００１４】  このように、いずれの方法であっても問題点を有していることから試料の除電を簡便に行う方法が鋭意開発されており、チャージアップ自体を防止する現実的な手段として、例えば、試料の表面に金Ａｕなどを素材とする導電性薄膜を蒸着（スパッタリング）する方法が採用されている。
しかしながら、この方法は試料を乾燥しり、蒸着時に真空引きする必要があるため処理作業が面倒で長時間を要するだけでなく、食品などの生物試料（生もの）の調製には適さず、しかも試料がくずれたりして観察後に元に戻らないといった問題点が指摘されていた。
【課題を解決するための手段】
【００１５】  ところで、本発明者は、醗酵技術を駆使して植物の種子などに含まれる金属元素を電解質として解離（イオン化）させる画期的な方法を開発し、特許第２８６５４１２号として登録を得ている。
また、静電磁場を形成した容器内において麹菌を加えて発酵させた金属元素（ミネラル）含有物とアルキル基を有する有機酸溶液とを混合攪拌し、この容器内の雰囲気を所定条件でかつ所定期間保持することにより、金属元素含有物質から金属元素を効率よく解離（イオン化）抽出する方法も開発している。
【００１６】  そして上記方法などを利用することにより従来では考えられなかった、例えば、金、銀、銅、マグネシウム、亜鉛、マンガン、アルミニウム、ステンレス、プラチナなど多種多様の金属元素を電解質として解離（イオン化）抽出する技術も確立し、しかも、この方法によって得られた抽出液中の各金属元素はオングストロームサイズ（１０のマイナス１０乗〜９乗メートル）であるため、素材の品質ないしは機能を飛躍的に向上させることができるだけでなく、例えば、衣類などの帯電防止加工手段としても有効であることが確認されている。
【００１７】  そこで、この発明に係る走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法では、金元素をイオンとして含む金属イオン含有液、すなわち、金イオン含有液（抽出液）を所定の濃度で溶解した処理水を被観察試料に噴霧または塗布し、ついでこの被観察試料の表面水を放散させ、処理水に含まれている金属元素を導電性薄膜に代替するものとして利用することによりチャージアップ自体を阻止できるようにしたものである。
【００１８】  この場合、処理水に対する金イオン含有液の濃度は０．２％〜１００．０％の範囲に設定するのが好ましく、金イオン含有液の濃度が０．２％未満では金元素によるチャージアップを防止することが困難となり、また１００．０％に設定すると費用対効果の点で問題が生じることになる。
【００１９】  また、金イオン含有液としては、金元素を含む鉱物質を機械的手段などにより微細化したのち、この微細化鉱物質に麹菌を加えて発酵させ、さらに酒石酸、クエン酸、乳酸あるいは酢酸などアルキル基を有する有機酸溶液を加えて混合攪拌することにより、前記微細化鉱物質に含まれる金元素を有機酸溶液中にイオンとして解離させた水溶液を使用する。
【発明の効果】
【００２０】  本発明に係る走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法によれば、被観察試料に金イオン含有水溶液を塗布し、ついでのこの被観察試料の表面水を放散させるという簡単な操作だけでチャージアップ自体を充分阻止することができるだけでなく、１０分程度の短時間で試料の調製をできるので観察を迅速にしかもリアルタイムで行うことができる。
また、チャージアップが原因となる反射や分散が生じないので鮮明な結像を得ることができ、食品などの生物試料（生もの）であっても真空引きなどの前処理が不要であるためくずれたりすることがなく、経時的な観察も迅速にかつ好適に行うことができる。
さらには、オングストロームオーダーの金元素（金Ａｕイオン）が試料の微細組織まで浸透するので焦点深度がより深くなり、従って、対象となる試料のある程度内部まで微細にかつ鮮明に観察することが可能になるなどの優れた効果を奏するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】  次に、本発明に係る走査型電子顕微鏡で使用する被観察試料の調製方法の最良の形態を例示し、以下詳細に説明する。
すなわち、本発明に係る被観察試料の調製方法においては、図１に示すように、まず、容器１０に収容される浄化水に金（Ａｕ）イオン含有液１２を滴下することにより所定濃度の処理水１４を準備する。
この場合、浄化水は、例えば、上水を逆浸透膜（ＲＯ）で濾過することにより不純物を可及的に除去したものを使用する。【００２２】  また、金（Ａｕ）イオン含有液１２は以下の方法により得られた抽出液を使用するのが好適である。
すなわち、金箔および／もしくは金（Ａｕ）を含む鉱物質を予め細かく粉砕し、この微細化金箔および／もしくは微細化鉱物質と浄化水とを重量比で略等量用意して混合したのち、１０％〜２０％の麹菌を加えて摂氏３５度〜４０度に保持して醗酵させ、一定期間ねかせておく。
次に、このように前処理して得られた微細化金箔および／もしくは微細化鉱物質の醗酵原料と、アルキル基を有する有機酸溶液とを重量比で１０：１の割合で混合する。この場合、アルキル基を有する有機酸としては、例えば、酒石酸、クエン酸、乳酸あるいは酢酸などを適宜使用することができる。【００２３】  ついで、この微細化金箔および／もしくは微細化鉱物質の醗酵原料とアルキル基を有する有機酸溶液との混合溶液を容器中において適宜の手段で攪拌混合する。なお、この際、容器に配設した加熱ヒータおよび容器の素材自体が放射する遠赤効果を利用して混合溶液液を摂氏４５度〜５５度に保持するとともにこの混合溶液液をポンプ装置などの循環系によって静電磁場、紫外線殺菌装置さらには太陽光照射機構などの制御下にゆっくりと所定時間循環させることにより金属元素としての金（Ａｕ）を０．３％〜０．５％程度解離（イオン化）させた抽出液、すなわち、金（Ａｕ）イオン含有液１２とする。
なお、このような手順により微細化金箔などから金が解離するのは、「細菌類、酵母類、糸状菌類、藻菌類そのものか、あるいはその酵母類が有機物または無機物に作用して有機化合物や無機化合物を生じ、なおかつその現象がなんらかの物質を生成する」という醗酵、具体的には、麹菌の醗酵増殖時に生じる酢酸などが混合液中の微細な金箔を溶解解離するからであります。【００２４】  また、金（Ａｕ）イオン含有液１２を処理水１４に滴下する場合、金イオン含有液１２の濃度が処理水１４に対して０．２％以下になると金によるチャージアップの阻止機能を充分期待することが難しくなる。また、金イオン含有液そのもの（１００％）も使用することもできるが、この場合は費用対効果の点で好ましくない。【００２５】  次に、用意された、例えば、生物試料（生もの）などの被観察試料１６を定法によって洗浄し、ついで刷毛などを使用して処理水１４をこの被観察試料１６に塗布する。この場合、処理水１４はスプレーなどで噴霧してもよいことは言うまでもない。
このようにして処理水を塗布された被観察試料１６は、その表面を風乾など公知の乾燥法を使用して２分〜５分間程度乾燥して表面水を放散させて形状保持を行ったのち、これをＳＥＭの試料台に移して定法により観察すればよい。
なお、得られた被観察試料１６の表面形態をＳＥＭで観察したところ、試料の表面に金Ａｕの導電性薄膜を蒸着（スパッタリング）した従来の調製方法と同等の導電性を有し、チャージアップするもことなく微細でしかも高解像度の結像が確認された。これは、処理水１４に含まれるオングストロームサイズの金元素が試料の細かい組織間に浸透しているからである。【００２６】    実施例１
縦に切断したふぐ筋原繊維を定法で洗浄したのち、前記処理水１４を刷毛塗りして３分間の風乾によりその表面水を放散させた試料（本発明方法による調製試料）と、同様のふぐ筋原繊維を定法で洗浄し、真空引きして金Ａｕを蒸着（スパッタリング）することにより調製した従来法による試料（比較試料）とを用意し、ＳＥＭ電子顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＥ−９８００）による３００倍および１０００倍の表面形態結像写真を得た（図２ａおよび図２ｂ）。
得られた表面形態結像写真を比較したところ、本発明方法による調製試料では比較試料に比べてコントラストもよく詳細な表面形状とともに水分を含んだ試料にも拘わらずありのままの状態を微細にしかも正確に観察することができた。【００２７】    実施例２
カニ筋原繊維を定法で洗浄したのち、処理水１４を刷毛塗りして５分間の風乾によりその表面水を放散させた試料（本発明方法による調製試料）と、同様のカニ筋原繊維を定法で洗浄したのち真空引きして金Ａｕを蒸着（スパッタリング）することにより調製した従来法による試料（比較試料）とを用意し、ＳＥＭ電子顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＥ−９８００）による３００倍および１０００倍の表面形態結像写真（図３ａおよび図３ｂ）を得、これらの表面形態結像写真を比較したところ、本発明方法による調製試料では前記の実施例と同様に観察できただけでなく、最表面の状態の微細な形状も比較試料に比べて鮮明に観察することができた。【００２８】    実施例３
プラスチック板（ＰＴＦＥ）を定法で洗浄したのち、処理水１４を噴霧して５分間の風乾によりその表面水を放散させた試料（本発明方法による調製試料）と、同様のプラスチック板（ＰＴＦＥ）を定法で洗浄したのち真空引きして金Ａｕを蒸着（スパッタリング）した従来法による試料（比較試料）とを用意し、ＳＥＭ電子顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＶＥ−９８００）における３００倍および１０００倍の表面形態結像写真（図４ａおよび図４ｂ）を比較したところ、本発明方法による調製試料では比較試料に比べてコントラストもよく、同じ加速電圧（１．２ｋｖ）であってもダメージや変形が少なく、微細な形状を鮮明に観察することができた。【００２９】  以上、本発明に係る走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で使用する被観察試料の調製方法の好適な実施の形態につき説明したが、本発明方法はこれらの実施の形態に限定されるものではなく、対象となる試料も生物由来の生体サンプル、あるいはそのレプリカ像形成物質はもとより生体非由来の有機物質さらには無機試料などその種類や形態は制限されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明に係る走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で使用する被観察試料の調製方法の最良の形態を示す概略手順説明図である。
【図２】ふぐ筋原繊維の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による結像写真であって、ａは図１に示す調製方法を使用して得られたふぐ筋原繊維縦断面の結像写真、ｂは従来方法により調製したふぐ筋原繊維縦断面の結像写真（拡大率３００倍、１０００倍）である。
【図３】カニ筋原繊維の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による結像写真であって、ａは図１に示す調製方法を使用して得られたカニ筋原繊維の結像写真、ｂは従来方法により調製したカニ筋原繊維の結像写真（拡大率３００倍、１０００倍）である。
【図４】プラスチック板（ＰＴＦＥ）の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による結像写真であって、ａは図１に示す調製方法を使用して得られたプラスチック板表面の結像写真、ｂは従来方法により調製したプラスチック板表面の結像写真（拡大率３００倍、１０００倍）である。
【符号の説明】
【００３１】  １０…容器、
１２…金（Ａｕ）イオン含有液、
１４…処理水、
１６…被観察試料、