(57)【要約】【課題】腎症関連疾患を適切に診断ないし検出する。【解決手段】哺乳動物由来のサンプル中のヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド（HODE）類及びα−トコフェロールからなる群から選ばれる少なくとも１種を測定することを特徴とする腎症関連疾患の診断方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物由来のサンプル中のヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド（HODE）類及びα−トコフェロールからなる群から選ばれる少なくとも１種を測定することを特徴とする腎症関連疾患の診断方法。
【請求項２】
前記HODE類が、9-HODE, 10-HODE, 12-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の診断方法。
【請求項３】
前記HODE類が、9-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２に記載の診断方法。
【請求項４】
HODE）類とα−トコフェロールの比に基づいて腎症関連疾患を診断することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の診断方法。
【請求項５】
腎症関連疾患が糖尿病性腎症、非糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれかに記載の診断方法。
【請求項６】
哺乳動物由来のサンプルを還元剤で処理後、アルカリ処理してHODE類を測定することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の診断方法。
【請求項７】
還元剤がNaBH4である請求項６に記載の診断方法。
【請求項８】
アルカリ処理をアルカリ金属水酸化物を用いて行う請求項６に記載の診断方法。
【請求項９】
還元剤とアルカリ処理剤を含むHODE類を測定して腎症関連疾患を診断するための診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病性腎症、非糖尿病性腎症及び糖尿病などの腎症関連疾患の検出、評価ないし診断方法及び診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
腎症は、特効薬がなく、進行すると人工透析療法が必要になるなど、患者に著しい苦痛を与えるものであった。また、人工透析患者の医療費は非常に高いため、医療費を抑制する観点からも腎症を早期発見し、透析が必要な程度にまで腎症が進行するのを抑制することは非常に重要である。例えば、糖尿病性腎症は、糖尿病の患者が増えるにつれて深刻な問題となってきており、糖尿病を抑制することは、腎症患者を減少させるためにも重要である。
【０００３】
また、腎症の治療は、糖尿病性腎症と非糖尿病性腎症で大きく異なるため、これらの腎症を区別して診断する方法が求められていた。
【０００４】
糖尿病に関しては、HODE類、イソプロスタン類、７−ヒドロキシコレステロール(7-FCOH)類などの酸化ストレスマーカーが糖尿病、動脈硬化、パーキンソン病、アルツハイマー病などの神経変性疾患、虚血再灌流障害、眼科疾患、呼吸器疾患、肝疾患、歯科疾患、不妊症などの酸化ストレスに関連する疾患の診断に有用であることが特許文献1に示唆されている。
【特許文献１】WO05/59566
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、腎症関連疾患、特に、糖尿病性腎症、非糖尿病性腎症及び糖尿病を適切に診断ないし検出、評価するための方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題に鑑み検討を重ねた結果、HODE類及びαトコフェロールのサンプル中のレベルが腎症関連疾患と相関し、これらのサンプル中のレベルを調べることで腎症関連疾患の診断が可能になることを見出した。
【０００７】
本発明は、以下の診断方法及び診断キットを提供することを目的とする。
１．  哺乳動物由来のサンプル中のヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド（HODE）類及びα−トコフェロールからなる群から選ばれる少なくとも１種を測定することを特徴とする腎症関連疾患の診断方法。
２．  前記HODE類が、9-HODE, 10-HODE, 12-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも１種である項１に記載の診断方法。
３．  前記HODE類が、9-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる少なくとも１種である項２に記載の診断方法。
４．  HODE）類とα−トコフェロールの比に基づいて腎症関連疾患を診断することを特徴とする、項１〜３のいずれかに記載の診断方法。
５．  腎症関連疾患が糖尿病性腎症、非糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選ばれる少なくとも１種である、項１〜４のいずれかに記載の診断方法。
６．  哺乳動物由来のサンプルを還元剤で処理後、アルカリ処理してHODE類を測定することを特徴とする、項１〜５のいずれかに記載の診断方法。
７．  還元剤がNaBH4である項６に記載の診断方法。
８．  アルカリ処理をアルカリ金属水酸化物を用いて行う項６に記載の診断方法。
９．  還元剤とアルカリ処理剤を含むHODE類を測定して腎症関連疾患を診断するための診断キット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、腎症関連疾患の診断方法及び診断キットを提供することができ、糖尿病性腎症、非糖尿病性腎症及び糖尿病の診断が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、哺乳動物（特にヒト）の腎症関連疾患を検出もしくは診断するための方法として有用である。非ヒト哺乳動物の腎症関連疾患の診断ないし評価は、例えば腎症関連疾患の治療薬のスクリーニング系に応用することができる。
腎症関連疾患は、サンプル中のヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド（HODE）類及び／又はα−トコフェロールを測定ないし定量することにより評価、検出もしくは診断することができる。
【００１０】
本発明において、サンプルは、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、ラット、マウスなどの哺乳動物由来のものであり、好ましくはヒト由来である。
サンプルとしては、血液（血漿、血清、血球（赤血球、白血球）を含む）、尿、脳脊髄液、涙液、精液、唾液、リンパ液、組織の一部（生検等により得られる）などが挙げられ、好ましくは血液（血漿、血清、血球を含む）、尿、特に血漿または血清が例示される。
【００１１】
本発明で診断可能な腎症関連疾患は、糖尿病性腎症、非糖尿病性腎症及び糖尿病である。非糖尿病性腎症としては、糸球体疾患（急性腎炎症候群、持続性蛋白尿・血尿症候群、慢性腎炎症候群、ネフローゼ症候群、急性進行性腎炎症候群）、ループス腎炎（全身性エリテマトーデスに認められる糸球体病変）、腎硬化症・高血圧性腎障害が例示される。これら腎症関連疾患は、HODE類、α−トコフェロールなどのサンプル中のレベルを測定することにより診断可能である。
【００１２】
ＨＯＤＥ類としては、水酸基を有するオクタデカジエノイックアシッド（octadecadienoic acid）が挙げられ、該ＨＯＤＥの２つの二重結合は、(E, E)、(E, Z)もしくは(Z, E)のいずれか或いはこれらの混合物であってもよい。HODEとしては、具体的には9-hydroxyoctadecadienoic acid (9-HODE), 13-hydroxyoctadecadienoic acid (13-HODE), 10-hydroxyoctadecadienoic acid (10-HODE), 12-hydroxyoctadecadienoic acid (12-HODE)が挙げられ、これらは(E, E)体、(E, Z)体、(Z, E)体のいずれであってもよい。診断方法の測定対象として好ましいHODEは、9-(E, E)-HODE, 13-(E, E)-HODE, 9-(E, Z)-HODE, 13-(Z, E)-HODE, 10-(E,Z)-HODEおよび12-(Z, E)-HODEである。HODE類としては、9-(E, E)-HODE, 13-(E, E)-HODE, 9-(E, Z)-HODE, 13-(Z, E)-HODE, 10-(E,Z)-HODEおよび12-(Z, E)-HODEを含む総HODEを測定するのが好ましい。
【００１３】
リノール酸（２つの二重結合がZ, Z(シス型)）が酸化されると、ZEないしEZ、或いはEEのHODE類に異性化する。このときのHODE類において、(Z, E)体と(E, Z)体の合計量と、(E, E)体の比（R）は
R＝｛(Z, E)体と(E, Z)体の合計量｝／(E, E)体の量
により計算できる。HODE類の上記比（R）が高い方が腎症関連疾患に罹患している可能性が高く、該比(R)が高いほど腎症関連疾患が重篤である可能性が高い。
【００１４】
本発明の１つの実施形態において使用され得る好ましいHODE類の構造式を以下に示す。
【００１５】
【化１】
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【００１６】
HODE類は、例えば以下のようにして定量することができる。なお、α−トコフェロールは、HPLC法などの常法に従い測定できる。
【００１７】
サンプルは、まず還元剤で処理されて、ヒドロペルオキシド、ペルオキシド等の活性酸素との反応生成物をその還元体に導き、それ以上の分解を抑制するのが好ましい。例えば、HODEの原料であるリノール酸などは、活性酸素と反応してヒドロペルオキシドになる。
【００１８】
これを還元体に導くと、9-HODEまたは13-HODEなどに変換される。なお、HODEは、哺乳動物生体内の活性酸素と反応し、さらに還元されて9-HODE、13-HODEなどに導かれるが、一重項酸素と反応すると10-HODEまたは12-HODEに変換され得る。
【００１９】
生体サンプルを還元して過酸化物を安定なＨＯＤＥ類、イソプロスタン類(IsoPs)に導くための還元剤としては、ヒドロペルオキシドを還元できるが、炭素−炭素二重結合、カルボキシル（ＣＯＯＨ）基、エステル基などは還元しない還元剤が使用され、例えば水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、ソディウムシアノボロヒドリド（NaCNBH3）などが挙げられる。
【００２０】
還元反応は、還元剤を１当量から過剰量用い、メタノール、エタノールなどのアルコール又は含水アルコール中で、０℃〜５０℃程度の温度下に１分から５時間程度反応させることにより有利に進行する。
【００２１】
上記の還元処理により生成する9-HODE、10-HODE、12-HODE、13-HODEなどのHODE類は比較的安定な化合物であり、それ以上の分解は抑制される。
【００２２】
上記で得られた還元体は、HODE類の脂肪酸型のものも存在するが、多くはホスファチジルコリンなどのリン脂質、コレステロールエステル、トリグリセライド、ジグリセライドなどのグリセリンエステルとして存在する。従って、このエステルを加水分解して高級脂肪酸に導くために、アルカリ処理剤、好ましくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどのアルカリ金属水酸化物と反応させてHODEを脂肪酸に導く。
【００２３】
アルカリ処理により３位の水酸基がエステル化されていた７−ヒドロキシコレステロールエステルが対応する７−ヒドロキシコレステロールに変換される。
【００２４】
アルカリ加水分解は塩基の存在下に、室温から溶媒の沸騰する程度の温度下に１０分間から２４時間程度行うことにより有利に進行する。塩基としては、溶液をアルカリ性にしてエステルを加水分解できるものであれば特に限定されないが、例えばアルカリ金属水酸化物（NaOH, KOH, LiOHなど）、アルカリ土類金属水酸化物（Ca(OH)2, Mg(OH)2, Ba(OH)2）など）、アルカリ金属炭酸水素塩（NaHCO3, KHCO3, LiHCO3）, アルカリ金属炭酸塩（Na2CO3, K2CO3, Li2CO3）などが挙げられる。好ましい塩基はNaOH, KOH, LiOHなどのアルカリ金属水酸化物である。
【００２５】
加水分解は、水中で行ってもよく、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、ＤＭＦ，ＤＭＳＯ，Ｎ−メチルピロリドン、などの溶媒を水と混合して行うこともできる。
【００２６】
このような加水分解によって、遊離形態と共にエステル形態の酸化物（HODE類）を測定することができる。
【００２７】
ＨＯＤＥが生体内で生成するメカニズムを以下に示す。
【００２８】
【化２】
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【００２９】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、一方が(ＣＨ２)４ＣＨ３を示し、他方が(ＣＨ２)７ＣＯＯＨを示す。ｈｐｏはヒドロペルオキシドを示す。）
アルカリ処理後のサンプルは、HPLC等の通常の分離手段により分離し、GC/MSのような通常の分析手段を用いて、HODE類、α−トコフェロールなどの物質を定量し、腎症関連疾患を診断ないし評価することができる。
【００３０】
本発明は、さらに、HODE類を測定し、腎症関連疾患を検出、診断ないし評価するためのキットに関する。
【００３１】
該キットは、哺乳動物（特に好ましくはヒト）由来のサンプルを還元し、ヒドロペルオキシド等の過酸化物をアルコールに導くための還元剤、および、エステル型のヒドロペルオキシドを遊離のカルボン酸に鹸化するためのアルカリ処理剤を含む。
【００３２】
キットに含まれる還元剤は、サンプルの過酸化物を還元するための過剰量含まれるのが好ましく、例えば１サンプルあたり０．１〜１００mg程度（或いは3マイクロモル〜3ミリモル）使用される。好ましい還元剤は、NaBH4である。
【００３３】
また、アルカリ処理剤はエステルを加水分解できる量であれば特に限定されないが、例えば１〜１０００mg程度（或いは0.2〜20ミリモル）使用される。
【００３４】
本発明のキットは、さらに還元剤をサンプルに加えた還元反応に使用される溶剤を含むことができる。好ましい溶剤としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールなどのアルコール系溶剤が例示される。
【００３５】
後述する実施例に示されるように、HODEは糖尿病に直接関与するだけでなく、糖尿病の診断指標であるHBA1cとも有意に相関する。このように、HODEは糖尿病と密接に関係することが明らかにされた。さらに、糖尿病性腎症と非糖尿病性腎症はいずれもHODEと密接に関連し、HODEの測定により腎症の診断が可能であることが明らかにされた。特に非糖尿病被験者のHODEが高い値を示す場合、腎症との関連が疑われることになる。
【００３６】
一方、HODEと同様な酸化ストレスマーカーであるイソプロスタン類は腎症関連疾患との関連性がないことが明らかになった。従って、HODEは腎症関連疾患に特異的な指標である。
【００３７】
さらに、α−トコフェロールも腎症関連疾患の診断に有用であり、特にHODEとαトコフェロールの比を取ることにより、健常者と腎症関連疾患患者を容易に診断することができる。
【００３８】
HODEとαトコフェロールは、腎症関連疾患の病態と密接に関連しており、これらを測定することで、腎症関連疾患の治療の有効性、動物のスクリーニング系においては薬物候補化合物の有用性の判断に使用することが可能であり、このような使用も本発明の診断方法に含まれる。
【００３９】
腎症関連疾患ではαトコフェロール、HODEなどの酸化ストレスに関連する指標が診断の根拠になるので、α−トコフェロールを含むビタミンE、あるいは他の抗酸化物質を投与することで、糖尿病、糖尿病性腎症、糸球体腎炎などの腎症関連疾患の予防、あるいは症状の軽減が期待される。特に腎症は有効な治療薬がないので、抗酸化物質の摂取は有用と考えられる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
実施例1
腎症患者の内で非糖尿病患者21名（平均年齢65.9歳SD13.8歳）、腎症患者の内で糖尿病患者23名（平均年齢70.1歳SD7.8歳）さらに腎症を伴わない糖尿病患者16名（平均年齢52.3歳SD13.7歳）から採血し、即座に遠心機にて血漿を採取した（3500ｒｐｍ×10分）。血漿2ｍｌを正確に測りとり、内部標準物質として8-アイソ-プロスタグランジンF2a-ｄ4および9-ヒドロキシオクタデカジエノイック酸-ｄ4をそれぞれ50ｎｇ添加した。メタノールを1ｍｌ添加した後、窒素気流下でソディウムボロハイドライドを0.01ｇ添加し1分間激しく攪拌した後、4分間室温下で放置した。続いて窒素下で1ｍｏｌ／ｌに調整した水酸化カリウムのメタノール溶液を1ｍｌ添加し密栓した後、40℃で30分間攪拌した。続いて4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上澄み液を採取した後塩酸水溶液によってｐＨを3に調整した。さらに4℃にて3000Ｇで10分間遠心し、上澄み液をメタノールおよびｐＨ3の水（各2ｍｌ）によって前調整したＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ18（Ｗａｔｅｒｓ社製、体積1ｍｌ）へ充填し、各々10ｍｌのpH3水およびアセトニトリル／水（１５／８５、体積）混合液によって洗浄した。続いて4ｍｌのヘキサン／酢酸エチル／イソプロピルアルコール（３０／６５／５、体積）混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を5ｍｌのヘキサンによって前調整したＳｅｐ−Ｐａｋ  ＮＨ２（Ｗａｔｅｒｓ社製、体積1ｍｌ）へ充填し、各々5ｍｌのヘキサン／酢酸エチル（３／７、体積）およびアセトニトリルによって洗浄した。続いて5ｍｌの酢酸エチル／メタノール／酢酸（１０／８５／５、体積）混合液で目的成分を溶出した。溶出した液を窒素気流下で溶媒留去を行った。蒸発乾固した成分にＮ、Ｏ-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（和光純薬社製）を30μｌ加え、60℃にて1時間反応した。得られたＴＭＳ化サンプルの3μｌをマス検出装置（アジェレント社製5973）を備えたガスクロマトグラフィー（アジェレント社製6890Ｎ）によって分析し、血漿中の濃度として、トータルヒドロキシオクタデカジエノイック酸および8-アイソ-プロスタグランジンF2aを得た。一方、疾病歴がない健常者21名（平均年齢64.2歳SD11.4歳）の血漿をまったく同様に測定した。図1に示すように、ANOVA-Tukeyによる統計解析の結果、トータルヒドロキシオクタデカジエノイック酸は健常者に比べて非糖尿病性腎症および糖尿病性腎症患者さらに非腎症である糖尿病で有意に高いことがわかった。また、図2に示すようにトータル8-アイソ-プロスタグランジンF2aの値は健常者群に比べていずれの疾患も統計学上有意な変化は認められなかった。また、同様に遠心処理によって得られた血漿を2倍体積量のクロロホルム／メタノール（２／１体積）によって抽出し、下層のクロロホルム層の10μｌを高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法によってα-トコフェロールの分析を行った。HPLC法は、資生堂社製電気化学検出器（NANOSPACE SI-1）によって800 mV、オクタデシルシリカカラムにより50ｍMの過塩素酸ナトリウムを含むメタノール／t-ブチルアルコール（95/5体積）を1ml/分の流速で通液することによって分析した。図3に示すようにこのように、健常者に比べて非糖尿病性腎症および糖尿病性腎症患者さらに非腎症である糖尿病で有意に低いことがわかった。図4にはHODE／α-トコフェロールの値を図示する。ここに示すように、HODEおよびα-トコフェロールを組み合わせることによってより明確に疾患を診断することが可能であった。さらに、図5には糖尿病患者22人に対してヘモグロビンA1ｃ（HbA1c）とHODEとの相関を図示する。ここに示すように、HbA1cとHODEとが統計学上有意に正の相関を示すことが判明し、糖尿病発症の推定に有用であることが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】HODEについての分析結果を示す。
【図２】IsoPsについての分析結果を示す。
【図３】α-トコフェロールについての分析結果を示す。
【図４】HODEとα-トコフェロールの比についての分析結果を示す。
【図５】HODEとHbA1ｃの関係についての分析結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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