(57)【要約】【課題】肺感染を処置するための、純粋な生物学的活性コリスチン、その成分、およびコリスチン処方物の提供。【解決手段】純粋な生物学的活性コリスチンおよびその全ての成分、それらの任意の混合物、およびそれらの薬学的に受容可能な塩、ならびに実質的に純粋な生物学的活性コリスチン、その生物学的に活性な成分のいずれか、それらの混合物、またはそれらの薬学的に受容可能な塩を含むエアロゾル処方物であって、この処方物は、霧状にするのに適切であり、この霧状形態は、Pseudomonas  aeruginosaおよび他の感受性肺感染（例えば、Stenotrophomonas  maltophilia）の効果的な処置および予防を提供する、処方物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書等に記載されるような、肺感染を処置するための、純粋な生物学的活性コリスチン、その成分、およびコリスチン処方物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、純粋な生物学的活性コリスチンおよびその全ての成分、それらの任意の混合物、およびそれらの薬学的に受容可能な塩、ならびに実質的に純粋な生物学的活性コリスチン、その生物学的に活性な成分のいずれか、それらの混合物、またはそれらの薬学的に受容可能な塩を含むエアロゾル処方物に関する。この処方物は、霧状にするのに適切であり、この霧状形態は、Pseudomonas  aeruginosaおよび他の感受性肺感染（例えば、Stenotrophomonas  maltophilia）の効果的な処置および予防を提供する。純粋なコリスチンには、不純物が存在せず、乾燥粉末の重量当たりの標準的な高い生物学的活性、高い温度安定性を有し、かつ、ジェットまたは超音波噴霧器を用いるエアロゾル化（aerosolization）および乾燥粉末または計量用量吸入器（metered  dose  inhaler）による送達に適切である。純粋なコリスチンは、処方物が予め混合されそして室温で貯蔵されることを可能にする、長期安定性を有する。
【０００２】
エアロゾル処方物は、5.0と7.0との間のpHを有する等張性水溶液に溶解された、0.1〜50mg/mlの純粋なコリスチン、その成分のいずれかまたはその薬学的に受容可能な塩の濃縮溶液を含む。治療的量の純粋なコリスチンは、エアロゾルまたは１〜５μの平均質量中央径（mass  medium  diameter）を有する乾燥粉末中で霧状にすることにより、肺の気管支内腔に送達される。
【０００３】
背景および関連する開示
トブラマイシンのエアロゾル化は、Pseudomonas  aeruginosa感染を抑制し、肺の炎症を低減し、かつ肺機能を改善するために、嚢胞性線維症の患者において以前に試みられた。嚢胞性線維症におけるP.  aeruginosa感染を、エアロゾル化トブラマイシン（これは、  P.  aeruginosa細菌に対し比較的高い活性を有する）で成功裡に処置することは、Ped.  Pulmonol.,  7:265(1989)に記載されている。
【０００４】
コリスチンは、少なくとも４つの活性成分（これらの全ては、環状ペプチド部分およびγ−ジアミノ酪酸に由来する５つのアルキルアミンの存在により特徴付けられる）からなる発酵産物である。未誘導体化状態におけるこれらのアミンの存在は、Pseudomonas  aeruginosaに対する生物学的活性のために不可欠である。コリマイシンは、コリスチンによって引き起こされる注射部位の痛みを低減するために、静脈内注射および筋肉内注射に一般的に用いられる、コリスチンのプロドラッグ形態であり、コリスチン発酵産物のペンタホルムアルデヒド亜硫酸ナトリウムアミン付加物からなる。コリマイシンは、それ自身では生物学的に活性ではなく、活性コリスチンを放出するために水溶液中での加水分解が必要である。ホルムアルデヒドおよび二亜硫酸塩が、加水分解の副生成物として形成される。
【０００５】
P.  aeruginosa病原体に対してコリスチンプロドラッグであるコリマイシンを用いる試みが、以前になされた。エアロゾル化コリマイシン（単独あるいは他の薬物または抗生物質処置との組み合わせ）によるP.  aeruginosa感染の処置は、あまり成功しなかった。このことは、コリマイシンそれ自身がコリスチンのプロドラッグであるにすぎず、そのためP.  aeruginosaに対して有効な薬物ではないという事実に主に起因する。プロドラッグの投与された量は、コリスチンの治療効力を予測できない。なぜなら、プロドラッグコリマイシンの薬物コリスチンへの転化は、インサイチュで進行し、そして、このような転化は制御することができないからである。インサイチュでの転化の間、コリマイシンは分解副生成物を生成し、２次的な望ましくない症状（例えば、気管支収縮および胸部圧迫感）の発症をそのエアロゾル送達の間にもたらす。コリマイシンは未精製の発酵産物であるので、不純物を含有する。
【０００６】
初期のPseudomonas感染に対する、霧状コリマイシン（500,000IU；17mg/１日２回）の予防的使用は、The  Lancet,  1(8433)：865,  (1985)に記載された。この処置は、  Pseudomonas生物の数の低減を示したが、霧状コリマイシンの送達後に、顕著な気管支痙攣が観察された。
【０００７】
Acta  Pediatr.,  82：308（1993）に記載されるP.  aeruginosaの組み合わせ処置は、シプロフロキサシンならびにコリマイシン／トブラマイシンのエアロゾル化混合物（それぞれ、1,000,000IU；33mg／100mg）の１日２回の全身投与を含む。この治療は、嚢胞性線維症の患者においてP.  aeruginosaの開始の遅延をもたらした。
【０００８】
別の研究において、全身またはエアロゾル化コリマイシンで処置された患者はまた、望ましくない２次的な症状を訴えた。例えば、Resp.  Med.,  88：145(1994)は、2000,000単位の霧状コリマイシンで処置された患者の約65％によって胸部圧迫感として訴えられた、気管支収縮応答の発症を記載している。コリマイシンを用いる、急性肺増悪（exacerbation）と診断された、嚢胞性線維症患者の全身静脈内処置は、約29％の症例において神経毒性の症状の発症をもたらし、そして約５％の症例で、腎毒性の症状の発症をもたらした（DICP,  Ann.  Pharmacother.,  25：1168（1991））。
【０００９】
患者を、シプロフラキシン（1,000,000IU）で経口的に、そしてコリマイシンを吸入で、１日に２回、３週間にわたって、初期に組み合わせ処置することにより、P.  aeruginosaの慢性のコロニー形成を部分的に予防することは、The  Lancet,  338：725（1991）に報告されている。
【００１０】
P.  aeruginosaの処置という主題についての最新の刊行物は、Monatsschr.  Kinderheilkd,  144：1028-1051(1996)に公表された、Abstracts,  International  Cystic  Fibrosis  Symposium,  （1996年９月26日〜28日）第1042頁公表のアブストラクトP12として出版される。この論文は、シプロフラキシン／コリマイシンの組み合わせ治療の効果を、各薬剤を単独で用いる単独治療に対して比較している。これらの研究は、経口シプロフラキシンと吸入コリマイシンとの組み合わせが、エアロゾルコリマイシン単独による治療よりも５倍以上効果的であったことを示している。
【００１１】
従って、現存するコリマイシン処置およびP.  aeruginosaの肺感染の処置および予防のための処方物は、効果的ではないか、予測不可能であるか、制御不可能であるか、望ましくない２次的な症状を引き起こすか、他の処置と組み合わせられなければならないか、あるいは非常に大量（霧状にするのが困難な量）の薬物を必要とするかのいずれかである。
【００１２】
効果的なエアロゾル投与は、現在、安定で効率的でかつ生理学的に平衡な処方物が存在しないことにより妥協しており、また、特定の噴霧器が治療量のコリマイシンを小さくかつ均一な粒子サイズのエアロゾルに霧状化することが不可能であることにより妥協している。薬物を気管支内腔（感染部位）に送達するのに必要とされるエアロゾル化粒子の範囲は、１μ〜５μの間である。大量の治療量のコリマイシンをエアロゾル化し得る多くの噴霧器は、多数の50〜100μの間の範囲のエアロゾル粒子を生じる。治療的に有効であるためには、エアロゾル化されたコリスチン粒子の大半は、１μ〜５μの間よりも大きい質量中央平均径（MMAD）を有してはならない。エアロゾルが、５μよりも大きいMMADを有する粒子を多数含む場合、これらは上気道中に堆積し、下気道の感染部位に送達される抗生物質の量を低減する。
【００１３】
現在、２つの型（ジェットおよび超音波）の入手可能な噴霧器が、１μ〜５μの間のサイズを有するエアロゾル粒子を形成および送達し得る。これらの粒子サイズは、Pseudomonas  aeruginosa感染の処置に最適である。しかし、治療の効果を得るには、この薬物を多量に投与することが必要とされる。それゆえ、コリマイシンの効率的な送達は不可能である。これらの噴霧器は、コリマイシンをいかなる効率的な様式で送達することも不可能である。なぜなら、コリマイシンの生物学的活性のために必要とされる高い濃度は、エアロゾル化の間に発泡を引き起こし、それにより薬物の効率的な送達が妨げられるからである。
【００１４】
加えて、プロドラッグのコリマイシンがエアロゾル化に用いられる場合、治療的に有効であるために、不活性なプロドラッグは、まず、活性薬物であるコリスチンに転化されなければならない。このような転化はインサイチュで進行し、かつ定量的に予測することが不可能である。加えて、コリマイシン水溶液のpHは、迅速に非生理学的レベルまで上昇し、そしてプロドラッグの加水分解の間に、ホルムアルデヒドおよび他の副生成物が形成される。これらの両方とも、気管支痙攣を誘発する。気管支痙攣は、嚢胞性線維症のような肺疾患を有する患者において望ましくないできごと（occurrence）である。
【００１５】
本発明は、実質的に純粋なコリスチンまたは／およびコリスチン活性成分またはそれらの混合物あるいはそれらの薬学的に受容可能な塩の濃縮処方物を提供する。この処方物は、プロドラッグの存在なしに、十分かつ過剰ではない濃度の活性薬物を含有する。この処方物は、ジェットおよび超音波噴霧器を用いる霧状化により、１μ〜５μの範囲内の粒子サイズを有するエアロゾルに効率的にエアロゾル化され得る。この処方物は、嚢胞性線維症の患者に良好に許容されるコリスチンエアロゾルの生成を可能にするように設計される。この処方物は、さらに、十分な貯蔵寿命を有する。
【００１６】
処方物の効力は、量に基づいて、乾燥粉末を用いる乾燥粉末として、または計量投与吸入器としてのコリスチンの代替の送達を可能にする。純粋なコリスチン、コリスチン成分、それらの混合物、または薬学的に受容可能な塩の、十分に効力のある処方物は、１ミクロン〜５ミクロンの範囲内の粒子サイズに粉砕された薬物粒子の乾燥粉末または計量投与吸入のために有利に用いられる、乾燥粉末を提供する。乾燥粉末処方物は簡便である。なぜなら、これはいかなる希釈も必要とせず、長い貯蔵寿命を有し、そして吸入送達デバイスが携帯可能であり、かつ、噴霧器で必要とされた空気圧縮機を必要としないからである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明によって以下が提供される：
（１）Pseudomonas  aeruginosaまたはStenotrophomonas  maltophiliaの感染を処置および予防するための乾燥粉末形態または溶液中の処方物であって、該処方物は、コリスチン成分Ｉ、コリスチン成分ＩＩ、コリスチン成分IIIおよびコリスチン成分ＩVからなる群から選択される実質的に純粋なコリスチン成分、その混合物またはその薬学的に受容可能な塩を含む、処方物。
（２）１日に２回投与される約５〜約250mgの前記コリスチン成分、前記混合物またはその塩を含む、項目１に記載の処方物。
（３）前記コリスチン成分、前記混合物またはその前記塩の濃度が約１〜約50mg/mlである、項目２に記載の処方物。
（４）前記精製されたコリスチン、前記コリスチン成分、前記混合物またはその前記塩の濃度が約２〜約20mg/mlである、項目２に記載の処方物。
（５）4.0と7.0との間のpHを有する、項目２に記載の処方物。
（６）6.5と7.5との間のpHを有する、項目５に記載の処方物。
（７）前記乾燥粉末が主として約１と約５ミクロンとの間の粒子サイズを有する粉末に製粉され、そして乾燥粉末吸入器または計量用量吸入器によって送達される、項目１に記載の処方物。
（８）前記コリスチン成分、その前記混合物またはその前記塩の溶液が、エアロゾル化のために処方される、項目１に記載の処方物。
（９）前記エアロゾル化溶液が、約１ミクロンと約５ミクロンとの間の粒子サイズに霧状化され、そしてジェット噴霧器または超音波噴霧器によって送達される、項目８に記載の処方物。
（１０）前記コリスチン成分の溶液が等張性である、項目９に記載の処方物。
（１１）エアロゾル化のために処方された前記コリスチン成分が、約0.45％〜約0.9％生理食塩水中に溶解されている、項目８に記載の処方物。
（１２）前記コリスチン成分の薬学的に受容可能な塩が、以下からなる群から選択される、項目１に記載の処方物：
酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、炭酸水素塩、硫酸水素塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カムシレート、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸塩、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシル酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸、ヨウ化物、イソチオネート、乳酸塩、ラクトビオネート、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシレート、臭化メチル、硝酸メチル、硫酸メチル、粘液酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パマオート、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩/二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、サブアセテート、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクレート、トシレート、トリエチオジドおよび吉草酸塩。
（１３）前記薬学的に受容可能な塩が、塩化物、塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、乳酸塩またはグルコン酸塩である、項目１２に記載の処方物。
（１４）実質的に純粋なコリスチン成分Ｉ硫酸塩または塩酸塩を含む、項目１に記載の処方物。
（１５）実質的に純粋なコリスチン成分III硫酸塩または塩酸塩を含む、項目１に記載の処方物。
（１６）実質的に純粋なコリスチン成分IV硫酸塩または塩酸塩を含む、項目１に記載の処方物。
（１７）遊離塩基コリスチン成分Ｉ、遊離塩基コリスチン成分II、遊離塩基コリスチン成分IIIおよび遊離塩基コリスチン成分IVからなる群から選択される実質的に純粋なコリスチン成分、その混合物またはその薬学的に受容可能な塩である、乾燥粉末吸入器または計量用量吸入器によるエアロゾル送達に適切な乾燥粉末形態または溶液中の抗Pseudomonas  aeruginosa剤であって、
ここで、該薬学的に受容可能な塩は、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、炭酸水素塩、硫酸水素塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カムシレート、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸塩、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシル酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸、ヨウ化物、イソチオネート、乳酸塩、ラクトビオネート、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシレート、臭化メチル、硝酸メチル、硫酸メチル、粘液酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パマオート、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩/二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、サブアセテート、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクレート、トシレート、トリエチオジドおよび吉草酸塩からなる群から選択される、抗Pseudomonas  aeruginosa剤。
（１８）前記薬学的に受容可能な塩が、塩化物、塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、乳酸塩またはグルコン酸塩である、項目１７に記載の薬剤。
（１９）約１〜約250mgの量で１日に２回、エアロゾルの噴霧によって投与される、項目１８に記載の薬剤。
（２０）項目１９に記載される薬剤であって、図１Ｂに示される一般式を有するコリスチン成分Ｉまたはその薬学的に受容可能な塩であり、
ここでＲ１は6-メチルヘプタノイルでありかつＲ２はイソブチルであり、該薬剤はさらに以下の特性：
UV吸光度が210〜220nmで最大であり；
光学偏光が左旋性-46°であり；および
１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルが以下である：(D2O中のppm)：
【００１８】
【化７】
2007302698.tif 000002
【００１９】
を有する、薬剤。
（２１）項目１９に記載される薬剤であって、図１Ｂに示される一般式を有するコリスチン成分ＩＩＩまたはその薬学的に受容可能な塩であり、
ここでＲ１は6-メチルオクタノイルでありかつＲ２はsec-ブチルであり、該薬剤はさらに以下の特性：
UV吸光度が210〜220nmで最大であり；
光学偏光が左旋性-42°であり；および
１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルが以下である：(D2O中のppm)：
【００２０】
【化９】
2007302698.tif 000003
【００２１】
を有する、薬剤。
（２２）項目１９に記載される薬剤であって、図１Ｂに示される一般式を有するコリスチン成分ＩＶまたはその薬学的に受容可能な塩であり、
ここでＲ１は6-メチルオクタノイルでありかつＲ２はイソプロピルであり、該薬剤はさらに以下の特性：
UV吸光度が210〜220nmで最大であり；
光学偏光が左旋性-47°であり；および
１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルが以下である：(D2O中のppm)：
【００２２】
【化１１】
2007302698.tif 000004
【００２３】
を有する、薬剤。
（２３）以下の工程を包含する抗Pseudomonas  aeruginosa剤の調製方法であって：
(a)Bacillus  polymyxa生成物を単離する工程；
(b)工程(a)の生成物をコリスチン成分に分離する工程；
(c)コリスチン成分を同定する工程；および
(d)コリスチン成分Ｉ、IIIおよびIVを、85％より高い均質性まで精製する工程；
を包含する方法。
（２４）前記工程(d)のコリスチン成分が、高速液体クロマトグラフィーを用いる分画により分離される、項目４６に記載の方法。
（２５）Pseudomonas  aeruginosa、Stenotrophomonas  maltophiliaおよび他のコリスチン感受性の細菌性肺感染を処置および予防する方法であって、治療有効量の項目１７に記載の抗Pseudomonas  aeruginosa剤を、約１〜約250mgの量で１日２回、乾燥粉末吸入器または計量用量吸入器を用いた乾燥粉末のエアロゾル化により、あるいはジェット噴霧器または超音波噴霧器を用いるエアロゾルとして、そのような処置を必要とする被験体に投与することによる、方法。
【００２４】
要旨
本発明の１つの局面は、実質的に純粋なコリスチン、その生物学的に活性な成分のいずれか、それらの混合物、もしくはそれらの薬学的に受容可能な塩である。
【００２５】
本発明の別の局面は、肺のPseudomonas  aeruginosa感染のエアロゾル処置のための活性化合物として用いられる、コリスチン成分Ｉ、III、もしくはIVと同定される硫酸コリスチンの、実質的に純粋な生物学的活性成分である。この成分は、細菌Bacillus  polymyxaまたはBacillus  polyaerogenusの発酵産物である。
【００２６】
本発明の別の局面は、嚢胞性線維症に罹患している患者の気管支内腔にコリスチンを効率的に送達するために適切な、実質的に純粋な生物学的活性コリスチン、コリスチン成分、それらの混合物、もしくはそれらの薬学的に受容可能な塩のエアロゾル処方物である。
【００２７】
本発明のさらに別の局面は、２分の１から完全な強度の範囲の生理食塩水または他の水性溶媒約１ml中、実質的に純粋な生物学的に活性なコリスチン、コリスチン成分、これらの混合物、またはこれらの薬学的に受容可能な塩約１〜50mgを含有するエアロゾル処方物であり、ここで、上記処方物は、5.0と7.0との間のpHを有し、約２〜５mlの濃縮された形状で、エアロゾル化により送達される。
【００２８】
本発明のさらに別の局面は、２分の１から完全な強度の範囲の生理食塩水または他の水性溶媒約１mlに溶解された、実質的に純粋な生物学的に活性なコリスチン、コリスチン成分、これらの混合物、またはこれらの薬学的に受容可能な塩約１〜50mgを含有する処方物であり、ここで、上記処方物は、5.0と7.0との間のpHを有し、主に約１μと５μとの間の質量中央平均径を有するエアロゾル粒子中、純コリスチン約５〜250mgを含有する溶液約２〜５mlで送達され、ここで上記処方物はジェットまたは超音波噴霧器を用いて噴霧される。
【００２９】
本発明のさらに別の局面は、実質的に純粋な生物学的に活性なコリスチン、コリスチン成分、これらの混合物、またはこれらの薬学的に受容可能な塩約１〜50mgを含有する処方物であり、
ここで、上記処方物は、微粉末に粉砕されており、約１μと５μとの間の質量中央平均径の粒子を有し、乾燥粉末または計量用量吸入器によって投与するのに用いられる。
【００３０】
本発明のさらにまた別の局面は、生成したコリスチン、任意のその成分、それらの混合物、またはそれらの薬学的に受容可能な塩を、高速液体クロマトグラフィーまたは他の適切な方法を用いて生成する方法である。
【００３１】
本発明のさらに別の局面は、Pseudomonas  aeruginosa感染または他の感受性微生物感染（例えば、Stenotrophomonas  maltophilia）の、完全なまたは２分の１の強度の生理食塩水または他の水溶液約１mlに溶解された、実質的に純粋な生物学的に活性なコリスチン、コリスチン成分、またはこれらの薬学的に受容可能な塩約１〜50mgを含有する処方物（ここで、上記処方物は、5.0と7.0との間のpHを有し、ジェットまたは超音波噴霧器により、エアロゾル中の２〜５mlの濃縮された形状で送達され、主に１μと５μとの間の質量中央平均径を有する粒子サイズを生じる）のこの様な処置を必要とする被験体への投与による処置法である。
【００３２】
本発明のさらに別の局面は、Pseudomonas  aeruginosa感染または他の感受性微生物感染（例えば、Stenotrophomonas  maltophilia）の、実質的に純粋な生物学的に活性なコリスチン、コリスチン成分、またはこれらの薬学的に受容可能な塩約１〜50mgを含有する処方（ここで、上記処方は、約１μと５μとの間の質量中央平均径を有する粒子を有する微粉末に製粉され、乾燥粉末または計量用量吸入器によって送達される）のこの様な処置を必要とする被験体への投与による処置法である。
【００３３】
定義
本明細書中で用いる時：
「コリマイシン」、「コリスチメタン」、「コリ-マイシン」、「硫酸コリスチンメタン」、「コリスチンスルホメタンナトリウム」、「トタジナ（totazina）」、「コロマイシン（colomycin）」、「コリラシン」、「コロマイシン（colomycine）」、「コリミシナ」、「コリスメチン」、「メタコリマイシン」、または「コリスチシン」は、Bacillus  polyaerogenus、Bacillus  colistinus、またはBacillus  polymyxaによって産生される殺菌性シクロポリペプチド抗生物質を意味し、これは生物学的に活性なコリスチンの化学的に誘導されたプロドラッグである。プロドラッグコリマイシンは、インサイチュで活性薬物コリスチンに変換される。コリマイシンは、図1Aに示す一般式を有する。
【００３４】
「純コリスチン」または「純粋な生物学的に活性なコリスチン」は、式1Bに示す一般式を有する活性薬物コリスチンを意味し、ここでＲは示すように置換され、通常、全てのコリスチン成分の混合物を包含する。
【００３５】
「コリスチン成分」、「コリスチン画分」は、Bacillus  polymyxaまたはBacillus  polyaerogenusの発酵産物から単離され、高速液体クロマトグラフィーまたはその他の分離手段によって、コリスチン成分I、II、III、IV、などとして同定される成分によって表される個々の化学的および物理的に同定可能な画分へ分離される、成分または画分を示す。各これらの成分は、図1Bに示すような異なるＲ置換基を表す。同様の発酵産物から得られる他の成分もまた、この定義に含まれる。
【００３６】
「純コリスチン成分」または「精製されたコリスチン成分」は、上記で定義したようなコリスチン成分を示し、これは、精製され、全質量の85％を越える単一の同定されたコリスチン成分またはその塩からなる。従って、例えば、「精製された成分IV」は、85％を越えるコリスチン成分IVからなる。好ましくは、成分は90％均質性を越えるまで精製され、そして最も好ましくは95％均質性を越えるまで精製される。成分は、85％を超える純度を達成し得るか、または85％を越える最終生成物の均質性を達成し得る当該分野で公知の任意の方法によって、精製され得る。
【００３７】
「コロニー化」は、気道の腔内での細菌Pseudomonas  aeruginosaの存在を示す。一般的には、細菌は痰の培養物および喉のスワブ（swab）から単離される。
【００３８】
「実質的に純粋な」または「実質的純度」は、Bacillus  polymyxaまたはBacillus  polyaerogenusの発酵産物から単離され精製される、90％を越える純粋な、生物学的に活性な化学的要素（entity）を示す。非精製の、約70％の活性コリスチンは、米国薬局方硫酸コリスチンとして市販で入手可能である。
【００３９】
「薬学的に受容可能な塩」は、本発明のコリスチン化合物の非毒性の塩、すなわちコリスチン遊離型塩基またはコリスチン成分を意味し、これは、遊離型塩基と適切な有機または無機酸とを反応させることにより調製される。代表的な薬学的に受容可能な塩は以下の物である：酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、炭酸水素塩、硫酸水素塩、酒石酸水素塩(bitartrate)、ホウ酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム(calcium  edetate)、カムシレート(camsylate)、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸塩(clavulanate)、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩(edisylate)、エストレート(estolate)、エシル酸塩(esylate)、フマル酸塩、グルセプト酸塩(gluceptate)、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート(glycollylarsanilate)、ヘキシルレゾルシン酸塩(hexylresorcinate)、ヒドラバミン(hydrabamine)、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸(hydroxynaphthoate)、ヨウ化物、イソチオネート(isothionate)、乳酸塩、ラクトビオネート(lactobionate)、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシレート、臭化メチル、硝酸メチル(methylnitrate)、硫酸メチル(methylsulfate)、粘液酸塩、ナプシル酸塩(napsylate)、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パマオート(pamaote)、パルミチン酸塩、パントテン酸塩(panthothenate)、リン酸塩/二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、サブアセテート(subacetate)、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクレート(teoclate)、トシレート(tosylate)、トリエチオジド(triethiodide)および吉草酸塩。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
本発明は、実質的に純粋なコリスチン、その単離されたおよび分離された成分、それらの混合物またはそれらの薬学的に受容可能な塩が、エアロゾル化によるかまたは本発明の処方物中の乾燥粉末として投与された場合、Pseudomonas  aeruginosaによって引き起こされる細菌肺感染に対して、高い効力を有するという発見に関する。この効力は、現在用いられているコリスチンプロドラッグコリマイシンの効力の数倍である。
【００４１】
本発明は、実質的に純粋なコリスチン、その成分もしくは塩の各々をまたは混合して利用して、ジェットもしくは超音波噴霧器によるか、または乾燥粉末またはメートル化された用量吸入器による、気管支内腔への霧状にされたコリスチンの効果的な送達のために、コリスチンエアロゾル処方物または乾燥粉末処方物を提供する。この処方が好ましくはいつも等張性であるように、処方物は、水溶液、好ましくは生理食塩水（完全（0.9％）から２分の１の範囲の強度）中、１〜50mg/ml、好ましくは約２〜20mg/mlを含有する。処方物は、２〜５mlの容積で、１日２回、送達される。
【００４２】
エアロゾル処方物は、容易に霧状化されて、１μと５μとの間の粒子サイズを有するコリスチンエアロゾルになる。これは、肺のPseudomonas  aeruginosaまたは他の感受性の細菌感染（例えば、Stenotrophomonas  maltophilia感染）の処置および防止のためのコリスチンの気管支内スペースへの有効な送達に必要である。エアロゾル処方物は、予め溶解された（predissolved）滅菌溶液中において温度安定であり、生理学的に受容可能な4〜7.5、好ましくは6.5〜7.0のpH、および５年を越える長いシェルフライフを有する。
【００４３】
本発明はまた、実質的に純粋なコリスチン、その成分または塩を、個々にもしくは混合物として利用して、乾燥粉末もしくは計量用量吸入器を用いる微細粉砕コリスチンの気管支内スペースへの有効な送達のためのコリスチン乾燥粉末処方物を提供する。コリスチン効力（質量(mass)基準で測定される）は、エアロゾルの代替治療として、コリスチン粉末の吸入を可能にする。投与される用量が10mg未満である場合、乾燥粉末吸入および計量用量吸入は、最も現実的である。
【００４４】
本発明は、純粋なコリスチン、コリスチン成分、それらの混合物または薬学的に受容可能な塩の充分に強力な処方物を提供するので、主に1〜5ミクロンの範囲内の粒子サイズに粉砕された薬物粒子の乾燥粉末もしくは計量用量吸入が可能であり、そして特に緊急吸入についてさらに好ましい。このような処方物は、好都合である。なぜなら、それは、さらなる取扱い、例えば、乾燥粉末を希釈することを必要としないからである。さらに、それは、充分に小さく、十分に携帯可能であり、そして例えば、ジェット噴霧器については必要であるエアーコンプレッサーを必要としないデバイスを使用する。さらに、乾燥粉末処方物は、エアロゾル化のための液体コリスチン処方物よりもさらに長いシェルフライフを有する。
【００４５】
乾燥粉末処方物は、0.5〜100mg、好ましくは、約1〜10mgの、Pseudomonas  aeruginosaまたは他の感受性の細菌感染、例えば、Stenotrophomonas  maltophiliaの処置および防止のためのコリスチンの気管支内スペースへの有効な送達のために必要な粉末を、非晶または結晶状態で、質量メジアン平均(median  average)直径で1ミクロンと5ミクロンとの間の粒子サイズで含む。乾燥粉末処方物は、毎日1〜4回、好ましくは毎日２回送達される。乾燥粉末処方物は、温度安定であり、そして生理学的に受容可能な4.0〜7.5、好ましくは6.5〜7.0のpH、および５年の長さを越えるシェルフライフを有する。
【００４６】
I.純粋な生物学的に活性なコリスチンおよびその成分
本発明の抗Pseudomonas  aeruginosa活性な化合物は、実質的に純粋なコリスチンであり、個々のコリスチン成分、それらの混合物およびそれらのそれぞれの薬学的に受容可能な塩として単離される。
【００４７】
A.  活性な化合物の同定およびキャラクタリゼーション
P.  aeruginosaもしくは他の感受性の細菌肺の感染の処理および防止のための本発明の液体もしくは乾燥粉末処方物の活性化合物は、コリスチン（Bacillus  polymyxaの発酵生成物から単離される化学的物質（chemical  entity))、またはその単離され精製された成分である。
【００４８】
本発明の活性な化合物は、分画化（fractionation）、精製、それらのＵＶ吸光度の決定により、そしてそれらの吸光度プロフィール、吸光度スペクトル、アミノ酸組成、質量スペクトル、光学偏光および１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルにより、分離され、単離され、精製され、そして同定され、そして定量される。
【００４９】
コリスチンは、遊離塩基として、図lBに見られる一般式を有する。ここで、置換基Ｒは、主要なコリスチン成分I、II、III、IV、および他の少量成分を区別するために使用される。コリスチン成分IのＲ１置換基は、6-メチルヘプタノイルであり、R２置換基は、イソブチルである。コリスチン成分IIIのR１置換基は、6-メチルオクタノイルであり、R２置換基は、sec-ブチルである。コリスチン成分IVのＲｌ置換基は、6-メチルオクタノイルであり、R２置換基は、イソブチルである。コリスチン成分I、IIIおよびIVの化学構造は、図１に見られる。
【００５０】
生物学的に活性な本発明のコリスチンは、従って、いくつかの化学物質（chemical  entities）を含み、これらは、本発明の目的のために、コリスチンI、コリスチンII、コリスチンIII、コリスチンIV、またはコリスチン成分I、II、III、IV、および他の少量成分などとして同定される。すべてのこれらの物質（entities）は、同じ生物学的活性を、モル基準で、P.  aeruginosaに対して有する。Bacillus  polymyxaから単離されたそれらのそれぞれの量は、同一ではない。それぞれの単一コリスチン物質は、既に同定およびキャラクタリゼーションされていてもいなくても、ならびにそれらの混合物、ならびに任意のおよびすべてのそれらの薬学的に受容可能な塩および塩基が、本発明の範囲内であることが意図される。
【００５１】
米国薬局方コリスチン中の個々の成分の数は、分析的HPLCにより、実施例１に説明されているように、決定される。分析的HPLC米国薬局方硫酸コリスチンの典型的な溶出プロフィールは、図２に見られる。
【００５２】
分析的HPLCのために、米国薬局方硫酸コリスチンは、10mg/mlで脱イオン水中に溶解された。100マイクログラムのコリスチンを含む１０マイクロリットルを、直径4.6mm×長さ150mmの分析的C-18逆相高速液体クロマトグラフ(HPLC)カラムに注入し、そして2.0ml/min、23%アセトニトリルおよび77%硫酸アンモニウム、pH  2.0中で溶出する。溶出を、ＵＶ検出器により、220nmにおける吸光度で検出する。典型的な溶出プロフィールは、図２に見られる。
【００５３】
図２に見られるように、少なくとも10の独立した成分が、これらの条件下で観察され、４成分(標識I〜IV)が、220nmにおいて吸収する物質の90%を越える部分を占める。説明された条件下で、成分Iは、約2.2分で溶出し、成分IIは、2.5分で溶出し、成分IIIは、3.4分で溶出し、そして成分IVは、4.0〜4.5分で溶出する。
成分I、II、III、およびIVについて220nmにおけるそれぞれの吸光度は、およそ0.70、0.20、0.25、および1.2であった。
【００５４】
米国薬局方硫酸コリスチンの３つの最も顕著な成分、図２の成分I、III、およびIVは、分画されて均一にされ、そして化学的にキャラクタリゼーションされた。使用された分取HPLC分画化技術は、実施例2において詳細に説明される。300mgの硫酸コリスチンを、1.0mlの脱イオン水中に溶解し、そして分取C-18逆相HPLCカラムに注入し、そして20ml/minで、23%アセトニトリルおよび77%硫酸アンモニウム、pH  2.0中で溶出する。溶出は、220nmにおける吸光度により、ＵＶ検出器によってによりモニターされた。分取分画のための典型的な溶出プロフィールは、図3に示される。成分I(100ml)、III、(50ml)、およびIV(300ml)の分画溶液を、ロトエバポレーション（rotoevaporation）により、減少させて乾燥させそして成分を、無機塩から、50mlの純粋なメタノール中への溶解により、抽出する。単離されたそれぞれの成分の相対的量は、各物質（entity）が220nmにおいて同様の吸光係数を有することを仮定することにより決定された。図４に示すように、正確な吸光係数を決定するために、十分な物質を、成分IVから、単離した。図４に示すように、1.0mgの乾燥成分IV硫酸塩を、1.0mlの水に溶解することにより、220nmにおいて2.25の吸光度を得た。0.5mg／mlに、1容量の脱イオン水で希釈される場合、溶液は、1.20の光学密度を有した。さらなる希釈0.25mg/mlにより、0.63の光学密度を有する成分IV硫酸塩の溶液を得た。220nmにおける光学密度の線形性は、図４に見られるように、0.5mg/mlの成分IVと0.25mg/mlの成分IVの間で観察され、約1.0未満の吸光度の読みが、線形の範囲内であり、そして成分濃度を決定するのに適切であることを実証する。
【００５５】
成分I、IIIおよびIVについての濃度1mg/mlにおけるUV吸収スペクトルを図５に示す。
【００５６】
図５に見られるように、コリスチン成分I、IIIおよびIVは、非常に類似した吸光度スペクトルを200〜250nmの間の波長で有する。相対的吸光度シグナルにおける変動は、分析される物質のそれぞれの量に起因する。
【００５７】
それぞれの成分の相対的量の決定に加えて、これらの成分およびそれらの相対的量のアミノ酸分析を、成分I、IIIおよびIVについて、２０時間の加水分解の後に行った。アミノ酸分析は、ニンヒドリンを有するポストカラム誘導体化（post-column  derivatization）により、7300に更新されそしてSystem  GoldソフトウエアシステムにカップリングされたBeckman  System  6300  Amino  Acid  Analyzerを用いて行われた。この方法は、Anal.  Chem.、35:2055  (1963)に従う単一カラム分析に適応されるAnal.  Chem.、30:1190(1958)に記載された方法の修飾である。
【００５８】
16個の共通のアミノ酸についての一般的手順は、サンプルを清浄な管に量り入れる工程、内部標準(一般的には、ノルロイシン)を添加する工程、6N  HCl、フェノール、およびチオールを添加する工程、管を排気する工程、および115゜で２０時間加水分解する工程を包含する。システインおよびシスチンのサンプルは、Methods  in  Enzymology、XI:58  (1967)に従い、50℃において15分間、過ホルミル酸（performic  acid）で酸化され、その後、J.  Biol.  Chem.、247:2828  (1972)に従って加水分解される。トリプトファンについてのサンプルは、4.2N  NaOH中で、135℃において48時間、中和および分析の前に加水分解される。
【００５９】
この方法を用いて、成分IおよびIVは、アミノ酸ジアミノ酪酸、ロイシン、およびスレオニンを、適切に3:1:1の比で含むことがわかった。対照的に、成分IIIは、ロイシン、スレオニン、およびジアミノ酪酸に加えて、イソロイシンを含むことがわかった。
【００６０】
図６に見られるコリスチン成分I、IIIおよびIVのイオン-スプレー質量分析は、380〜600の範囲の顕著な分子種質量対電荷比を示した。図６Ａに見られるように、コリスチン成分Iにおいて、Ｃ５２Ｈ９８Ｎ１６Ｏ３の分子式に対応する1155amuの種の三重プロトン化(triply-protonated)および二重プロトン化(doubly-protonated)形態に対応する386.1amuおよび578.7amuの質量を有する顕著な分子種が観察された。加えて、小さいレベルの三重プロトン化硫酸塩付加物(418.7amu)、および二重プロトン化硫酸塩付加物(627.5amu)もまた観察された。
【００６１】
図６Ｂに見られるコリスチン成分IIIのイオン-スプレー質量分光は、Ｃ５３Ｈ１００Ｎ１６Ｏ１３の分子式に対応する1169amuの種の三重プロトン化および二重プロトン化形態に対応する390.7amuおよび585.5amuの質量の顕著な分子種を示した。
【００６２】
図６Ｃに見られるコリスチン成分IV硫酸塩のイオンスプレー質量分光は、Ｃ５３Ｈ１００Ｎ１６Ｏ１３(その成分IIIと同じである)の分子式に対応する1169amuの種の二重プロトン化および一プロトン化形態に対応する585.5および1169.9amuにおける顕著な種を示した。さらに、404.3および417.9amuの比較的量が少ない種は、1169amuの三重プロトン化種、１つまたは２つのアセトニトリル付加物をそれぞれ表す。
【００６３】
成分I、IIIおよびIVについてのスペクトルおよび意味が図6A〜6Cに示される。
【００６４】
単離されたコリスチン成分のさらなる同定が、光学的偏光により行われた。この目的のために、成分I〜IIIの乾燥画分を、滅菌洗浄（irrigation）水中に、約5mg/mlの濃度で懸濁した。成分I〜III溶液が平面偏光光線を、ナトリウムＤ線(589nm波長)から回旋する能力を、Perkin-Elmer  241偏光計および1dcmキュベットを用いて決定した。測定は、25℃において行われた。次いで、観察され、グラム/mLで表された回旋を化合物濃度で割ることにより得られる規格化された回旋を決定した。以下の値を得た。コリスチン成分Iは、-47゜に回旋する左旋性の化合物である;コリスチン成分IIIは、左旋性の化合物であるが-42゜に回旋する;コリスチン成分IVもまた、左旋性であるが-46゜にだけ回旋する。
【００６５】
個々のコリスチン成分のさらなる同定は、13Ｃ核磁気共鳴(NMR)分光法により達成された。３つの成分のそれぞれについての核磁気共鳴を、１３Ｃ分光法のために、0.5mL容量のD２O(99.9%  D、Cambridge  Isotope  Laboratories、Woburn、MA)中に懸濁した成分I、IIIまたはIVの乾燥画分で決定した。ナトリウム3-(トリメチルシリル)-プロピオネート-2,2,3,3-d4を、内部標準として使用した。それぞれの化合物についての少なくとも200,000の積算(acquisitions)を、１３Cについて観察された75.5MHzの周波数、29.66度の先端角度、181msecのリサイクルタイム、および10000Hzのスペクトル幅で、データプロセッサを備えたNMR分光計において行った。成分I、IIIおよびIVについての代表的な１３C-NMRスペクトルを、図７に示す。成分Iは、他の２つの種から、０ppmと20ppmとの間の化学シフトを有する炭素が存在しないことにより、区別され得る。他方、成分IIIは、３つのそのような炭素(13.1ppm、13.4ppm、および18.1ppm)を示し、そして成分IVは、0ppmと20ppmとの間の化学シフトを有する１つの炭素(13.2ppm)を有する。
【００６６】
コリスチン成分(D2O中のppm)の１３炭素NMRスペクトルは、以下の値を有する:
コリスチン成分I
１３Ｃ  NMR  (D２O中ppm)  :175.81、175.65、175.54、175.08、174.97、174.30、69.88、69.31、68.97、62.57、62.54、61.93、56.09、55.96、55.93、55.01、54.97、54.66、54.61、54.56、54.53、54.49、54.36、54.21、54.17、54.06、53.78、53.65、39.59、39.48、39.40、39.33、39.31、38.38、31.54、31.51、31.47、31.40、31.20、31.08、29.92、28.92、28.27、27.38、27.32、27.26、25.17、24.73、24.68、23.98、23.24、23.18、22.04、21.67。
【００６７】
コリスチン成分III
１３Ｃ  NMR  (D２O中ppm):177.64、177.30、177.19、175.76、175.60、175.25、175.04、174.99、174.81、174.65、174.27、69.87、69.49、62.60、61.92、55.79、54.91、54.64、54.59、54.37、54.19、54.07、53.86、53.82、39.63、39.43、39.32、38.38、38.22、36.41、31.65、31.48、28.67、28.33、27.32、27.25、25.13、24.75、24.68、23.97、23.78、22.04、21.98、21.65、21.44、18.11、13.40、13.06.
コリスチン成分IV
１３Ｃ  NMR  (D２O中ppm):180.33、177.66、177.32、176.07、175.73、175.58、175.51、175.04、174.93、174.58、174.23、69.78、69.15、62.41、61.78、55.97、55.8、54.78、54.55、54.4、54.03、53.91、53.58、42.48、41.81、39.42、39.23、39.14、38.82、38.26、38.11、36.3、33.33、32.46、31.58、31.46、31.4、31.07、31.03、28.54、28.28、27.19、27.14、25.11、24.55、23.83、22.99、21.94、21.55、21.34、13.36。
【００６８】
実質的に純粋な成分I、IIIおよびIVは、それらの抗-Pseudomonas  aeruginosa活性について試験された。
【００６９】
Ｂ．コリスチンおよびコリスチン成分の生物学的活性
分画されたコリスチン成分の相対的な抗Pseudomonal活性は、図２で示される1.0分から5.0分を経るもののような分析用ＨＰＬＣ運転の0.4mlフラクション（0.2分増加量）を集めることによって決定された。実験は、実施例３で略述したように行われた。
【００７０】
簡潔には、ＨＰＬＣフラクションは、真空遠心分離によって乾燥され、400マイクロリットルの細菌増殖媒体中に懸濁され、0.45ミクロンのセルロースアセテートメンブランを通して濾過殺菌され、次いで一連の２倍希釈物が、Pseudomonas  aeruginosa菌株27853に対する、マイクロタイター細胞濁度アッセイの相対的な抗Pseudomonal活性を評価するのに使用された。
【００７１】
結果は、図８に見られ、個々のコリスチン成分の220nmでの吸光度および溶出プロフィールの上に重ね合わされた（superimposed）それらの相対的な抗Pseudomonal活性を示す。図８は、集められた各フラクション（最も活性なフラクションが、１．０の値を与えられ、そして不活性のフラクションが０．０の値を与えられるように規格化される）に対する相対的な抗Pseudomonal活性のプロットを示し、そして、それをUV検出器により220nmでモニターされたＨＰＬＣ溶出プロフィールと比較する。
【００７２】
図８は、各々の主要コリスチン成分（Ｉ〜IV）が、そのUV吸光度の面積に比例する生物学的活性を示すこと、そして従って任意の個々のコリスチン成分がPseudomonas  aeruginosa感染を処置することにおいて比較的治療効果を有することを表す。
【００７３】
同定および特徴付けられたコリスチン成分は、市販の供給源からのこれらの成分の回復の再生性についてさらに研究された。
【００７４】
以上の結果は、硫酸コリスチンが、異なる化学的および物理的特性を有するいくつかの成分の混合物として存在し、これらの成分が、分離、単離および精製され得ることを示す。
【００７５】
異なるロットの市販の非殺菌非経口硫酸コリスチン粉末が一貫して活性成分の同じスペクトル、およびおおよそ同じ相対量を与えるかどうかを決定するために、硫酸コリスチン粉末の５つの異なるロットが研究された。実験手順は、実施例１に記載されている。結果は、図９に見られる。
【００７６】
図９に見られる米国薬局方硫酸コリスチンの５つの別々のロットのプロフィールは、組成においてほとんど同じあることが見出された。全ての５つのロットにおいて、重量による主要成分は、コリスチン成分IVであるようであり、これは、これらのクロマトグラフィー条件下では、約３．５分から約５．０分まで
に典型的に溶出する。すべての５つのロットからの成分Ｉは、約１．８分から約２．３分に溶出する。成分IIおよびIIIは同様に、すべての５つの研究されたロットにおいて、一致する溶出を有する。図９に見られるように、コリスチン成分IVは、一貫して重量による米国薬局方硫酸コリスチンの主要成分である。
【００７７】
これらの結果は、市販の硫酸コリスチンが、一貫して同じ結果を生じること、そして本発明の精製単離コリスチン成分を得る供給源（source）として使用され得ることを示す。
【００７８】
II．コリスチンとコリマイシンとの比較
本発明は、実質的に純粋なコリスチン、コリスチン成分またはそれらの混合物が、抗Pseudomonas  aeruginosa剤、または抗Stenotrophomonas  maltophilia剤として、高い治療的効力を有することを見出すことに基づいている。エアロゾル化精製コリスチンの治療的効力は、一般に使用されるコリスチンのプロドラッグのコリマイシン（エアロゾル処方物で投与される）の数倍高い。コリマイシンエアロゾルは、そのエアロゾル化処置を予測不可能および制御不可能にするいくつかのひどい欠点を有する。
【００７９】
Ａ．コリスチンおよびコリマイシンのエアロゾル処方物
コリマイシンは、Parke-Davisから非経口コリマイシン  M（静脈内または筋肉内注射に500,000および1,000,000単位用量で処方される殺菌乾燥粉末）として、市販されている。エアロゾル化の典型的な用量は、１日３回８時間毎、2,000,000単位、または１日あたり6,000,000単位である。それは、８時間あたり約150mgのコリマイシン、または１日あたり450mgのコリマイシン投与量を示す。エアロゾル化のために、このコリマイシンの量が、溶解され、そしてエアロゾル化されねばならない。
【００８０】
本発明のコリスチンは、Bacillus  polymyxaの精製された発酵生成物である実質的に純粋なコリスチン、またはコリスチン成分である。本発明のコリスチンは、１日の総投与量の約2〜250mgのコリマイシンに対して数倍高い相対抗Pseudomonas  aeruginosa活性を有する。
【００８１】
Ｂ．コリマイシンエアロゾル処方の不利益
既に以上に記載のコリマイシンは、コリスチンの唯一のプロドラッグであり、それ自身では、Pseudomonas  aeruginosaに対して不活性である。従って、それは、まず、加水分解によって、活性化合物コリスチンに変換されねばならない。そのような変換は、レシピエントの患者体内のインサイチュで、薬剤の約３％のみが１時間に変換されるように、ゆっくり起こる。このインサイチュ変換により、転換率（rate）は予想不可能かつ測定不可能であり、従って、コリマイシンの実際の治療的効力は、決定され得ない。さらに、コリマイシン溶液の効力は、種々の外部からの条件（例えば、コリマイシンの溶媒中への溶解時間の長さ、溶液ｐＨ、温度など）による再構成の後、変化する。従って、不可能ではないとしても、送達用量の正確な計算を非常に困難にするので、その効力は容易に立証され得ない。さらに、送達の前、または送達の間に、コリマイシンが、水溶液中に溶解される場合、種々の不純物、および分解副生成物（例えば、ホルムアルデヒド、既知の毒素および発がん物質、ならびに亜硫酸塩、既知の気管支収縮剤）が生成され、放出される。これらの副生成物は、上記の二次的な望ましくない症候を引き起こす。
【００８２】
さらに、コリマイシンからコリスチンへの転換率がわからず、決定不可能であるので、そしてコリマイシンが、かなりの量の不純物を含むので、さらなる治療的効果を達成するために、かなりより多くの量のコリマイシンが、エアロゾル化されねばならない。これは、約20mg/mlを越えるコリマイシンの濃度が、噴霧化される際、発泡する傾向があり、結果として患者への薬剤の一貫性のない送達となるため、エアロゾル化にコリマイシンを使用することのさらなる不利益に通じる。発泡の発生率を減らすために、より希釈された溶液が必要とされ、そのことは、結果として、かなりより長いエアロゾル化時間、患者への顕著な不便となる。さらに、非経口コリマイシンが、エアロゾル化のために、溶解される場合、そのｐＨは、7.5を越える非生理学的レベルに即座に上昇し始める。生理学的ｐＨを越えるｐＨを有する溶液は、呼吸系によって十分に許容されず、そして、顕著に患者の不快なものとなり得る。
【００８３】
以上の理由のために、現在の利用可能なプロドラッグコリマイシンのエアロゾルまたは乾燥粉末処方は、厳しい制限を有し、それは、処方を、不便に、予測不可能に、そしてさらに患者にとって危険にする。精製コリスチン、その成分の一つ、およびそれらの混合物、またはそれらの薬学的に受容可能な塩に比較して、Pseudomonas  aeruginosaまたは他の感受性細菌感染の効果的な治療のために必要なコリマイシンの顕著により高い用量は、それを、乾燥粉末吸入または計量投与吸入による送達のための乾燥粉末における処方のためにより不利とする。これが、このようなデバイスの現在の最大積み込み量（payload）が10から20mgの物質である理由である。さらに、予測不可能な加水分解速度（rate）および水和コリマイシンの非生理学的pHが、吸入乾燥粉末としてのその投与を、潜在的に危険にする。
【００８４】
１．コリマイシン中に存在する不純物および汚染物
コリマイシンの総質量に対するコリスチン塩基の実際の比率を決定するために、市販のコリマイシン中の不純物および汚染物の存在が研究された。
【００８５】
この研究は、以下の仮定および計算に基づいたものであった。第１に、コリマイシン（非経口Coly-Mycin  M）の標準投与量は、150mgコリスチン塩基等価物を含む。計算の目的のために、すべてのこの活性が、成分IVのプロドラッグ形態として存在するなら、プロドラッグは、分子量1749.8g/mol(C58H105N16Na5O28S5)を有し、一方、コリスチン成分IVベース（base）（C53H100N16O13）は、分子量1169.4g/molを有する。従って、コリマイシンの150mgコリスチン塩基等価物に対応するプロドラッグの計算重量の簡単な概算は、おおよそ224.4ｇである（すなわち、150×［1749.8/1169.4］）。コリマイシン処方の標準投与量中に存在する物質の実際の質量を決定するために、研究が行われ、実施例１０による市販のコリマイシンのバイアルあたりの平均の実際の重量を決定した。
【００８６】
調査されたバイアル中に含まれる平均質量は、402.3mgであると決定され、理論的投与量224.4gを重量177.9mg越えた、平均過剰を示した。従って、平均で、各々のバイアルは、約44%の不純物を含み、そして約56%のみの活性コリスチンを含む。従って、コリマイシンの任意のエアロゾル化投与量は、約60％薬剤のみであり、そして、エアロゾル化量は、この希釈を考慮しなければならない。
【００８７】
本発明のコリスチンは、活性薬剤に変換される必要がなく、かつ活性を希釈する不純物または汚染物の任意の実質量を含まない、実質的に純粋な生物学的活性コリスチンまたはコリスチン成分である。従って、その効力は、標準的かつ一定的であり、そして2〜5mlで送達される投与量1〜50mg/mlが、Pseudomonas  aeruginosaを処置するのに効果的であり、エアロゾルによって肺に送達され、コリマイシンの量よりも少なくとも約２倍小さいこと、が見出された。さらに、溶解される固体の減少量および増加効力のために、活性化合物の量は、さらにより小さい。これは、エアロゾル化中の、より少ないかほとんどない発泡となる、より小さい界面活性物質活性に、直接的に通じる。
【００８８】
２．エアロゾル化中の発泡
コリマイシンエアロゾル処方の別の不利益は、コリマイシン中に含まれる顕著な量の同定されていない物質によって引き起こされるエアロゾル化中の多量の発泡である。注射用の乾燥粉末の典型的な150mg投与量は、400mgを越える実際の重量を有する。この物質が、約20mg/mlを越えるコリスチン当量濃度で、溶解される場合、溶液は、噴射吸入器で、顕著に発泡し、かつ飛散する（sputtering）傾向があり、これはエアロゾル化剤の量を減らす。
【００８９】
３．コリマイシン溶液のpH不安定性
コリマイシン溶液と関係がある別の問題は、そのpH不安定性である。塩基性溶液は、ヒト肺系によりほとんど緩衝されず、従って、エアロゾルとしてあまり耐性でない。従って、エアロゾル溶液のpHは安定であり、かつ生理学的に受容可能なレベル内であることが重要である。
【００９０】
コリマイシン溶液の酸性安定性は、実施例11に従って決定された。簡潔には、コリマイシン(405mg)は新たに水に溶解され、10.0mg/ml、15.0mg/ml、および20.0mg/ml溶液を達成した。これらの値は、3.7mg/ml、5.6mg/mlおよび7.4mg/mlコリスチン塩基等価物の濃度に対応する。溶液pHは、１分〜180分の種々の時間で連続してモニターされ、そしてpH値および時間が記録された。
【００９１】
全ての場合において、コリマイシン溶液のpHは、３分以内で6.80の開始pHからpH7.5を越えるレベルまで急速に増加し、そして7.70と8.00との間の生理学的に受容できないレベルまで、２時間にわたって上昇し続けた。結果を図10に示す。
【００９２】
本発明の精製したコリスチンは、5.5と7.5との間の安定かつ安全なpH範囲、最も最適には約6.5のpHを有する。溶液中の精製したコリスチンのpH値は、容易に調節可能であり、そして調節されると、図10に示すように、それらは安定である。予備混合し、長期間保存した溶液中のコリスチンは、安定であり、コリマイシンの場合に観察されたように上昇しない。
【００９３】
４．コリマイシン溶液のホルムアルデヒド／亜硫酸塩含量
ホルムアルデヒドは、一般的な呼吸刺激物であり、かつ発癌物質の疑いがある。亜硫酸塩は、気管支痙攣および胸苦しさを引き起こす公知の気管支刺激物である。従って、エアロゾル化のための溶液中のこれらの化合物の存在またはエアロゾル化中のそれらの生成は、非常に望ましくない。
【００９４】
コリマイシンは、コリスチンのプロドラッグのナトリウムスルホメチル誘導体であり、ここでコリスチン塩基は、５モルまでのホルムアルデヒドおよび５モルまでの亜硫酸ナトリウムと結合する（British  J.  Pharmacol.,  23:552-574(1964)）。コリマイシンは、水中で加水分解して生物学的に活性なコリスチン塩基を放出するように設計される。放出されたコリスチン塩基の各分子について、５モルまでのホルムアルデヒドおよび５モルまでの亜硫酸塩が同時に放出される。
【００９５】
本発明の精製したコリスチンは、誘導体化されず、従って、亜硫酸塩およびホルムアルデヒドを含まないか、またはこれらの刺激物の量は無視し得るかのいずれかである。これらのエアロゾル処方物は、気管支痙攣または他の肺刺激を引き起こさない。
【００９６】
５．非経口コリマイシンの複雑性
非経口コリマイシンは、単一の物質(entity)ではなく、種々の条件で別々に反応する複雑な形態である。これは、治療的に実行可能であり、かつ経済的に実用的であり、かつ適切であるために、異なる条件下で安定かつ標準の活性および安定性を有する必要がある処方のためには望ましくない。
【００９７】
非経口形態のコリマイシンの複雑性は、実施例12に従って、402.9mgの非経口コリマイシンと等価の150mgのコリスチン塩基を、10mlの105mM硫酸アンモニウム緩衝液、pH2.0に溶解することにより、調査された。この溶媒の低いpHは、コリマイシンのスルホメチル結合体を迅速に加水分解することが予想された。
【００９８】
溶解後の種々の時点で、150μgのコリスチン塩基に等価なアリコートを、逆相HPLCに供した。溶出液は、UV検出器により220nmでの吸光度によりモニターされた。
【００９９】
図11に見られるコリマイシンのHPLC溶出プロフィールは、少なくとも８つの異なる種の存在を示し、これらの種は、150マイクログラムのコリマイシンのコリスチン塩基等価物を分析した場合、220nmで吸収する。予想されるように、図11に見られるピーク高さにより近似されるように、各種の相対量は、pH2.0緩衝液中でのインキュベーションの間に変化した。図11に見られるように、個々の種の量は、室温でのインキュベーション時間と共に減少した；パネルＡは、45分でのコリマイシンのHPLC溶出プロフィールを示す；パネルＢは、２時間でのHPLC溶出プロフィールを示す；パネルＣは、３時間でのHPLC溶出プロフィールを示す；そしてパネルＤは、４時間でのHPLC溶出プロフィールを示す。このデータは、コリマイシンの化学組成が時間が経過するにつれて変化することを示す。これらの結果は、Pseudomonas  aeruginosaのエアロゾル処理に使用されるコリマイシンのさらに別の欠点を示す。コリスチン溶液のエアロゾル化、エアロゾル化のためのコリスチン処方物の安定性、エアロゾル化したコリスチンの全身的吸収、および吸収されたコリスチンの代謝プロフィールを正確に特徴付けるために、溶液および生物学的流体および組織における試験薬剤レベルのための分析アッセイを開発する必要がある。コリマイシンHPLCプロフィールの複雑性は、この処方物のエアロゾル化、安定性、吸収、および代謝の特徴付けが、不可能ではないが困難であることを示す。
【０１００】
本発明のコリスチンは、成分の混合物中、またはそのように特徴付けられた個々の単離された成分としてのいずれかで、安定であり、従って、エアロゾル化についてのそれらの特徴付けは可能である。
【０１０１】
Ｃ．エアロゾル処方物のための精製したコリスチン
最も有効なエアロゾル処方物は、最小の可能な治療有効量の薬物を含み、この薬物は、最短の可能な時間で最小の可能な容量で送達される。
【０１０２】
エアロゾル処方物のための実質的に純粋なコリスチンまたはその成分を提供するために、硫酸コリスチンはその個々の成分に分画され、そしてこれらの成分は上記のように特徴付けられ、そして実施例２〜４に従って分取HPLCにより95％を越える純度まで精製された。
【０１０３】
コリスチンおよびその個々の成分の精製は、逆相分取カラムHPLCを使用して達成された。代表的には、前もって脱イオン水に溶解した100〜300mgの市販の米国薬局方硫酸コリスチンは、20ml/分の流速で分離され、そして生成物の溶出は、実施例４に記載のように220nmに設定したUV検出器により追跡した。
【０１０４】
第１の段階において、個々のコリスチン成分は、米国薬局方硫酸コリスチンから分取分画により単離された。この工程は、図３に示され、図３は、市販の米国薬局方硫酸コリスチンからのコリスチンIVの分取分画のHPLCプロフィールを示す。図３に示すラン(run)において、210mgの物質が分画され、そして成分I、IIIおよびIVを含む溶出液が別々の容器に収集された。
【０１０５】
収集された画分は、分析逆相HPLCカラムに再度再注入され、生成物純度が確認された。図12は、図３に従って分取HPLCにより収集された分画されたコリスチン成分IVの分析HPLCプロフィールを示す。図12に見られるように、コリスチン成分IV溶出と一致する保持時間を有する単一の物質のみが存在した。
【０１０６】
他のコリスチン成分は、単一の物質のみが存在するまで同じ方法で精製される。精製したコリスチンは、本発明のエアロゾル処方物の活性成分として使用される。
【０１０７】
Ｄ．薬学的に受容可能なコリスチン塩
エアロゾル処方物に使用される精製した活性コリスチン成分は、代表的には、容易に溶解し、そしてしばしば生物学的活性を増強する塩として調製される。これらの塩は、薬学的に受容可能でなければならない。
【０１０８】
未精製のコリスチンは、米国薬局方硫酸コリスチンとして市販されている。次いで、このコリスチンは、上記のように精製され、そして薬学的に受容可能な塩は、好ましくは定義で挙げられた塩から選択される薬学的に受容可能な塩として調製される。最も好ましい塩は、硫酸塩および塩酸塩である。
【０１０９】
１．分画されたコリスチンの脱塩
コリスチン成分の分取HPLC分画により、混合アセトニトリル／硫酸アンモニウム溶液中の単一成分の希釈溶液が得られる。これらの溶液から精製された成分を回収するために、アセトニトリルはエバポレーションにより除去され、コリスチン成分および無機塩の両方がより濃縮された溶液が残る。無機塩は、逆相脱塩カラムの使用によりコリスチン成分から分離され得る。コリスチン成分の脱塩は、実施例５に記載されている。
【０１１０】
コリスチン成分IVにより例示されるこの成分は、任意の適切なエバポレーターを用いて画分の容量を約10分の１に減少させることによって、上記で得られたプールした溶出液から抽出された。約1.0グラムのコリスチン成分IVを含む濃縮した成分IVは、C-18逆相樹脂を充填したクロマトグラフィーカラムにロードされた。この樹脂は、前もって４ボイド(void)容量のアセトニトリル、次いで４ボイド容量の脱イオン水で洗浄された。溶媒は、１ml/分で稼動している蠕動ポンプによりカラムを通され、そして画分が収集された。カラムにコリスチン成分IVをロードした後、樹脂は１ボイド容量の水で洗浄され、そして50mlの40％アセトニトリルで溶出された。画分は、２マイクロリットルのアリコートをシリカＧ薄層クロマトグラフィープレート上にスポットし、乾燥後、100％エタノール中の0.75％ニンヒドリン溶液を噴霧し、そして100℃まで加熱することにより、コリスチン成分IV含量についてアッセイされた。１級アルキルアミン（コリスチンを含む）の存在を示す紫色の存在が観察された。ニンヒドリン陽性画分は、プールされ、乾燥され、水に溶解され、清潔な予め重量を測定した20mlのガラススクリューカップバイアルに移され、ドライアイス上で凍結され、そして乾固するまで凍結乾燥された。他のコリスチン成分は、同じ方法で処理された。
【０１１１】
代表的な脱塩反応は、脱塩樹脂上にロードされた各1.0グラムについて、１グラムあたり約650mgの乾燥硫酸コリスチン成分IV（220nmでの吸光度により決定される）を生成した。精製物質の吸光度スペクトルが得られ、図５に見られる。
【０１１２】
２．コリスチン遊離塩基の沈澱
C18樹脂上での精製したコリスチン画分の脱塩に対する別のストラテジーは、溶液のpHが11.0に達するまでの塩基（例えば、10N  NaOH）の添加による個々の濃縮したコリスチン成分の沈澱であった。コリスチン遊離塩基は、実施例６に従って得られた。沈澱は収集され、洗浄され、そして真空下で少なくとも24時間乾燥された。1.0M  HClを用いるこの物質の滴定は、この手順によりコリスチン遊離塩基が得られ得たが、均一には生成せず、残留NaOHが完全に除去されず、そしてこの手順の合計収量が脱塩を用いるよりも低く、分画したコリスチン１グラムあたり平均200〜300mgの回収であったことを示唆した。
【０１１３】
３．コリスチン成分塩対イオンの交換
コリスチンおよびコリスチン成分の薬学的に受容可能な塩は、実質的に実施例７に記載のようにコリスチン塩対イオンの交換により調製される。
【０１１４】
一般に、精製した硫酸コリスチンまたは硫酸コリスチン成分は、約20g/リットル（50mlあたりグラム)の濃度で、２Mの所望のアニオンのナトリウムまたはカリウム塩（例えば、２M  NaH2PO4）を含む溶液に溶解される。アニオン交換は、以下の基準で進行する。例えば、硫酸コリスチン成分IVは、コリスチン１モルあたり３モルの硫酸塩対イオンを含み、1554グラム／モルの式量を有する。従って、20.0グラムの硫酸コリスチン成分IVは、(20×3/1554)=0.0386モルすなわち38.6mmolの、２モルのホスフェートイオンと競合する硫酸塩イオンを有し、50倍を越える過剰のホスフェートイオンを生成する。
【０１１５】
次いで、混合物は、上記のような脱塩樹脂に通され、１カラム用量の水で洗浄され、そして例えば40％アセトニトリル／水で、例えば１ml/分の流速で溶出される。溶出されたフラクション（例えば、７mL)は回収され、ニンヒドリン反応によってコリスチン成分に関してアッセイされる。ニンヒドリン-ポジティブフラクションは、プールされ、乾燥され、水中に溶解され、ドライアイスで凍結され、そして乾燥するまで凍結乾燥される。この手順によって回収される物質は、95％より多い精製コリスチン塩またはコリスチン成分塩を含む。
【０１１６】
実施例７に記載される手順を用いて、コリスチン成分IVをこの方法で処理し、そして回収した物質は、99％より多いコリスチン成分IVリン酸塩（残りは微量レベルのコリスチン成分IV硫酸塩）からなることを見出した。この物質の分析用HPLC分析により、コリスチン成分IVの存在が確認された。結果は図13に示され、これは硫酸イオンをリン酸イオンに交換し、そしてC-18逆相樹脂で脱塩することによって調製される、コリスチン成分IVリン酸塩の分析用HPLCプロフィールを示す。図13に示される単一要素の保持時間は、コリスチン成分IVに関して一定である。
【０１１７】
他の塩（例えば、塩酸塩およびクエン酸塩）は、同一の様式で、一塩基性のリン酸ナトリウムを任意の他の塩（例えば、ナトリウム、カリウムなど）の過剰で置換することによって調製された。置換塩の量の計算は、一塩基性のリン酸ナトリウムに関する上記の計算によってなされる。
【０１１８】
あるいは、コリスチンおよびコリスチン成分の薬学的に受容可能な塩は、コリスチン遊離塩基またはコリスチン成分遊離塩基を対イオン結合酸で滴定することによって調製される。一般に、コリスチンまたはコリスチン成分遊離塩基は、脱イオン水に10g/lの濃度で懸濁され、マグネチックスターラーによって撹拌され、そして溶液のpHは校正pH電極によってモニターされる。濃対イオン結合酸（例えば、1.21  M  HCl）の滴下は、５モル当量のプロトンが加えられるか、またはpHが4.5の平衡点に達するまで、続けられる。次いで、溶液は濾過され、例えば、0.45ミクロンの酢酸セルロースフィルターで微粒子は除去され、凍結され、そしてすべての過剰水分が除去されるまで凍結乾燥される。成分IV遊離塩基からコリスチン成分IVのペンタヒドロクロリド塩を生成するためのこの滴定方法は、図16に示され、そして実施例９に記載される。
【０１１９】
４．精製コリスチン成分IV硫酸塩の質量スペクトル特性の決定
コリスチン成分IVの硫酸塩の質量スペクトル特性の決定は、実施例８に従って行われた。結果を図6Cに示す。
【０１２０】
５．精製コリスチンの重量滴定
精製コリスチン成分IVのpKａを決定するために、コリスチン成分IVを、実施例９に記載の手順を用いる重量滴定に供した。107mgの乾燥遊離塩基を10.7mlの脱イオン水に懸濁し、そして1.21MのHClをpH一定測定下で添加した。懸濁液の開始pHを11.74であると観察し、そして２つの変曲点を滴定の間観察した。１つは40μモルのHCl添加（10.2のpH）のところ、そして２つめは505μモルのHCl添加（4.5のpH）のところである。結果を図14に示す。第１の変曲点は、固体物質中に残存する微量のNaOHの中和を確認すると推測された（40μモル×40μグラム／μモル＝1.6mgまたは約1.5重量％）。これは、溶液のpHに一致した。なぜならば、10.7ml中の40μモル水酸化物イオン＝3.75e-3モル水酸化物であるからである。[Ｈ＋]×[ＯＨ−]＝1e-14であるので、プロトン濃度は2.67e-12であり、そしてpH＝-log[Ｈ＋]なので、pH＝-log(2.67e-12)＝11.57であり、11.47のコリスチンＡ塩基懸濁液の観察されたpHにかなり近づく。550μMOLのHCl付近に観察されるの第２の変曲点は、コリスチン成分IVの完全なプロトン化を表す。
【０１２１】
これらの結果は、コリスチン成分IVが約9.0のpKａを有し、それ故6.5の最適処方pHで、ある緩衝能を提供し得ることを例示する。
【０１２２】
III．実質的に純粋な生物学的に活性なコリスチンおよびそれらのＡ成分の調製
本発明の目的である、実質的に純粋なコリスチンまたはコリスチン成分遊離塩基あるいは塩（すなわち、コリスチン成分Ｉ、コリスチン成分II、コリスチン成分III、コリスチン成分IVなど）（図1Bを参照のこと）を単離し、そして非滅菌経口米国薬局方硫酸コリスチン粉末（Dumex,  Ltd.,  Denmarkから市販されるかまたは任意の他のコリスチン源由来）から調製する。市販の粉末をクロマトグラフまたは任意の他の適切な精製に供する。
【０１２３】
代表的に、経口コリスチン粉末を、脱イオン水または任意の他の適切な溶媒に約0.1g〜300g/lの範囲の濃度で溶解する。粒子を除去するために、溶液を任意の適切なフィルター（好ましくは0.45ミクロンの酢酸セルロースフィルターで）で濾過し、この時点で必要であれば不定期間４℃で保管し得る。
【０１２４】
次いで、上記溶液を、分離する溶液の容量に依存して適切な長さおよび寸法の、逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）カラム（例えば、Vydac  218TP  C-18またはBeckman  Ultrasphere  ODS  C-18逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）カラムのような）による分取に供する。大きなスケールおよび容量の分離では、分離カラムを改変し最適化させる。あるいは、硫酸コリスチンを本発明のコリスチン成分に分離し得る任意の他の分離手段が使用され得る。これらおよび任意の他の適切な分離手段、装置、および技術は本発明の範囲内であることが意図される。
【０１２５】
次いで、溶液を溶媒（例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、スクシノニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、および他の水混和性の有機溶媒（好ましくは硫酸アンモニウムのようなランニングバッファーの存在下約20％〜25％アセトニトリルで、バッファーは好ましくは約75％〜80％で、好ましくは約50mM〜120mMの、好ましくは105mMの硫酸アンモニウムを含む）で、酸性pH（好ましくは約pH  2.0〜3.0）で溶出する。代替のランニングバッファーは、0.05％〜0.15％のトリフルオロ酢酸、好ましくは0.1％のリン酸ナトリウム、リン酸アンモニウム、硫酸ナトリウムおよび酢酸を含む。溶出液を、UV検出器（例えば、Beckman  Diodide  Array  detector  module  168のような）によって220nmの吸光度でモニターする。
【０１２６】
溶出されたコリスチンの標準品質を確認するために、それぞれ新規のロットの経口粉末をモニターし、そしてその分析用プロフィールを先のコリスチンバッチと比較する。硫酸コリスチンの分析用プロフィールを220nmUVで約５〜10分間あるいは溶出が完了するまでモニターする。
【０１２７】
次いで、各活性コリスチンの溶出フラクションを回収し、必要に応じて濃縮または乾燥させ、必要であれば４℃で保管し、凍結乾燥し、そして下記のように、液体または乾燥粉末処方物の調製に用いる。
【０１２８】
IV.  純粋コリスチンの抗菌活性
本発明の有用性は、精製コリスチン、コリスチン成分、その混合物またはその薬学的に受容可能な任意の塩が、Pseudomonas  aeruginosaに対して、現在使用されている抗Pseudomonas  aeruginosa薬剤であるコリマイシンよりも少なくとも2倍以上活性であるという知見に基づく。これはコリスチンまたはコリマイシンをエアロゾル中で投与した場合に特に当てはまる。
【０１２９】
A.  コリマイシンの抗Pseudomonas  aeruginosa活性
既に上で記載したように、コリマイシンは、コリスチン1モル当たり5モルまでのホルムアルデヒドおよび5モルまでの亜硫酸ナトリウムが結合したコリスチンのスルホメチル誘導体である。既に以前にBritish  J.  Pharmacol.,  23:  552-574(1964)に、スルホメチルコリスチン誘導体がコリスチン塩基に比べるとKlebsiella  pneumoniaに対する活性が少なくとも20倍低いこと、そして有意な生物学的活性のためには、加水分解してコリスチン塩基となることが必要とされることが記載されている。この理由のために、これらの誘導体の局所的適用のための使用が禁避されることが示唆されている。
【０１３０】
これらの知見を確認または反論するために、実施例13に従い、活性に増殖しているPseudomonas  aeruginosa株27853に対して、新たに溶解した試験物質の系列希釈をインキュベートすることによって、非経口コリマイシンおよび精製コリスチン成分IV硫酸塩の生物学的活性を比較した。結果を図15に示し、そして以下説明する。
【０１３１】
B.  コリスチンの抗Pseudomonas  aeruginosa活性
成分I、III、およびIVの相対生物学的活性を決定し、そしてこれらの活性をコリマイシンの活性と比較することによって、コリスチンまたはコリスチン成分の抗Pseudomonas  aeruginosa活性を研究した。
【０１３２】
実施例13に従い、国家臨床研究所規格委員会(NCCLS)の認可規格に従う種菌、培地、インキュベーション条件および終点を用いて、ブロスミクロ希釈法(broth  microdilution  method)によって、試験された精製コリスチン成分I、III、およびIV硫酸塩、ならびに精製コリスチン成分IV塩酸塩のPseudomonas  aeruginosa  ATCC  27853に対する最少阻止濃度(MIC)を決定した。
【０１３３】
試験のために、最終濃度の100倍のストックを調製し、そしてカチオン調節されたMueller  Hintonブロス中で、系列2倍希釈で希釈した。試験コリスチン成分を調節して、最終種菌が試験ブロス1ミリリットル当たり105コロニー形成単位となるようにした。試験をマイクロタイタートレイ中で行い、最終試験容量を100マイクロリットルとした。
【０１３４】
試験の質の保証は、最初にPseudomonas  aeruginosa  ATCC  27853およびEscherichia  coli  ATCC  25922を、同一条件下、カチオン調節されたMueller  Hintonブロス中で、アンピシリン、ゲンタマイシン、およびシプロフロキサシンに対して試験することによって達成された。得られた結果は、これらの薬物のMICがNCCLSによって刊行された許容範囲内にある場合に許容された。個々のコリスチン成分の試験は、同一試験条件下で行われた。
【０１３５】
得られた結果は、Pseudomonas  aeruginosa  ATCC  27853に対するコリスチン成分I、IIIおよびIV活性が有意に異ならないことを示し(質量で(by  mass)、MIC値は0.5μg/mlと1.0μg/mlとの間であった。換言すれば、すべてのコリスチン成分はPseudomonas  aeruginosaに対して定性的にも定量的にも同じ活性を示した。この活性は、画分I、III、およびIVが元々それから単離された米国薬局方硫酸コリスチンの活性に匹敵することが観察され、このことは、図8に示すように、どの有意な硫酸コリスチンも単独の物質としてエアロゾル化に適するであろうことを示す。
【０１３６】
C.  コリマイシンおよびコリスチンの抗Pseudomonas  aeruginosa活性の比較
コリマイシンおよびコリスチン塩酸塩の抗Pseudomonas  aeruginosa活性の比較を、殺滅時間動力学的研究(time  kill  kinetic  studies)を用いて、抗細菌感受性試験、第5.16節：細菌活性の評価試験、Clinical  Microbiology  Procedure  Handbook、Henry  D.  Isenberg編、ASM、Washington,  DC(1992)に記載のようにして行った。抽出手順を実施例14に記載する。
【０１３７】
簡単にいえば、試験はMICの決定のために用いられる試験と同様であったが、例外的に、最終試験容量をもっと多くして(10mL)、種々の時点でのサンプリングができるようにした。非経口コリマイシンを試験の直前に新たに希釈した。培養物（culture）を37℃でインキュベートした。初期設定時、および種々の時点で、培養物を、さらに希釈するかあるいは希釈なしで、ヒツジ血液寒天プレート上に播種した。プレートを18〜24時間インキュベートし、そしてCFU/mLの数を決定し、そしてプロットして、生存微生物のパーセントおよび99.9％殺滅を達成するために必要な時間を決定した。結果を図15に示す。
【０１３８】
図15は、コリスチン成分IV塩酸塩およびコリマイシン非経口の抗Pseudomonas  aeruginosa細菌活性の比較を示す。この研究では、Pseudomonas  aeruginosa微生物を図15に示す種々の濃度のコリスチンまたはコリマイシンに曝露した。コリマイシンの濃度は8〜64μg/mlであった。コリスチン成分IV塩酸塩の濃度は0.25μg/mlおよび0.5μg/mlでり、これはコリマイシンの濃度より32〜256倍(0.25μg/mlの場合)および16〜128倍(0.5μg/mlの場合)低濃度であった。1ml当たりのコロニー形成単位(CFU)を決定し、そして薬物曝露時間に対して時間単位でプロットした。
【０１３９】
図15に示されるように、0.5μg/mlの精製コリスチン成分IV塩酸塩溶液はインキュベーション2時間以内で試験微生物を5  logを越えて殺滅させることが観察された。新たに溶解されたコリマイシンで同じレベルまで殺滅させるために必要とされるのは32μg/ml溶液であり、これはコリスチン成分IV塩酸塩が新たに希釈した非経口コリマイシンよりも質量で約64倍強力であることを示す。1.5時間でこのような殺滅を示す唯一のコリマイシンは128倍も高濃度の64μg/mlコリマイシンのみであった。低濃度の16μg/mlのコリマイシンは5  logを越える殺滅を3時間で達成した。8μg/mlのコリマイシンは、試験の4時間の時点でさえ、Pseudomonas  aeruginosa生物を全滅させなかった。
【０１４０】
これらの研究は明らかに、エアロゾル化のために現在使用されている経口コリマイシンよりも精製コリスチンが優れていることを示す。
【０１４１】
V．  コリスチンエアロゾル処方物
Pseudomonas  aeruginosaは下気道に存在する細菌である。これを全身投与された薬物によって処置することも可能ではあるが、このような処置は特に有効なわけではなく、患者を不必要に多用量の薬物に曝露し、そして他の望ましくない症候を有し得る。そのため、Pseudomonas  aeruginosaの好ましい処置は、エアロゾル化された薬物を直接患者の肺に投与することによる処置である。
【０１４２】
先に示したように、精製コリスチンはインビトロ条件下でPseudomonas  aeruginosaに対して非常に有効である。エアロゾル化に備えて予め溶解された滅菌溶液として予備処方した場合、精製コリスチンはまた、インビボでのPseudomonas  aeruginosaのエアロゾル化処置としても非常に有効である。
【０１４３】
本発明のエアロゾル処方物は、Pseudomonas  aeruginosa肺感染の根絶のために治療的に有効であり、これはPseudomonas  aeruginosaのための現在利用可能なコリマイシンエアロゾル処置に比べていくつかの利点がある。
【０１４４】
第一に、本処方物は実質的に精製されたコリスチン、その成分、成分の混合物またはその塩を含む。
【０１４５】
好ましい処方物は、市販の硫酸コリスチンから単離された、単一の、実質的に(すなわち95％を越える)純粋な生物学的に活性な化学的コリスチン物質を含み、ここでこのコリスチンの生物学的活性は一定して標準的であり、かつ再現性があり、そして現在利用可能なプロドラッグコリマイシンの処方物の生物学的活性より数倍高い活性である。
【０１４６】
処方物が精製コリスチンのみを含むので、最小限かつ有効量(典型的には約1mg/mlから約50mg/ml)のコリスチンを少量(典型的には約2mlから約5ml)の生理学的に受容可能な水溶液として処方して使用することが可能である。この水溶液は処方物が等張性となるように好ましくは等張強度から半分の強度の範囲の等張生理食塩水である。最も好ましくは、約1〜50mg/mlのコリスチンが2〜5mlの十分な強度の生理食塩水中で処方される。
【０１４７】
さらに、本処方物の純度、塩分およびpHは、ホルムアルデヒドまたは亜硫酸塩のような気管支刺激物質の存在なしでコリスチンエアロゾルを生成することができる範囲内であり、そのため患者は本処方物に対して十分に耐える。本発明のコリスチン処方物は、気管支痙攣、気管支刺激、胸痛、および咳のような所望されない二次的副作用の発生を防ぐ。これらは典型的にエアロゾル化コリマイシンの投与の際に観察される。これらの症候はコリマイシン溶液において溶解の際に急激にpHが上昇することによって明らかな高いアルカリ性によって引き起こされ、そしてまたコリマイシン中の不純物の存在に起因する。
【０１４８】
エアロゾルコリスチン処方物は水中に濃縮形態で容易に溶解し得、そのためほとんどまたはほとんど全てのコリスチン溶液は、Pseudomonas  aeruginosaまたはStenotrophomonas  maltophilia細菌が存在する末端および呼吸気管支梢に送達される粒子サイズで噴霧される。
【０１４９】
この処方物はエアロゾル化のために準備された予め溶解された滅菌溶液中でさえも非常に安定である。処方物の活性化合物、すなわち精製コリスチンはその生物学的活性を薄める不純物または混入物を含まず、そのため投与用量は制御可能であり、そして最高度の効果が最低量の薬物で達成される。コリスチンは精製されているので、このエアロゾル処方物は上記の二次的症候および合併症を引き起こさない。さらに、過剰摂取および過少摂取の両方が防止される。処方物は、最適な生理学的に受容可能なpH範囲である6.0から7.0で安定である。
【０１５０】
従って、本処方物はエアロゾル処方物に関する第一の要求、例えば安全性および効力ならびに使用の利便性および実用性、長い貯蔵寿命、処方された製品の貯蔵および取り扱い、ならびに全体としての低コスト、に合致する。
【０１５１】
A.  コリスチンエアロゾル処方物の具体的特性
本発明のコリスチン処方物は安定なpHを有し、エアロゾル化の際に起泡せず、そしてその熱安定性のために容易に滅菌が可能である。一旦処方されると、これは非常に安定である。
【０１５２】
1.  pHの調節および安定性
生理学的pHでの成分IVの安定性の測定を、精製コリスチン成分IV硫酸塩または塩酸塩を濃度20mg/mlで120mMのNaClを含む滅菌水中に溶解して行った。溶液を混合し、pHをモニターした。10NのNaOH溶液を用いて溶液pHを6.95〜7.00に調節した。結果を図16に示す。
【０１５３】
図16は、コリスチン成分IV硫酸塩およびコリスチン成分IV塩酸塩をNaOHで滴定すると、pH6.9〜7.0の20mg/mL溶液が得られることを示す。図16に示されるように、両コリスチン成分IV塩とも、生理学的に受容可能なpHである6.5および7.0の間で緩衝能を示す。一旦特定のpHで処方されると、アルカリを添加なしで、本発明のコリスチン溶液のpHは図10に示すように安定であり、そして変化しない。
【０１５４】
2.  起泡
コリマイシンは既に上述のように、有意な量の未同定物質を含む。例えば、典型的な150mg用量の注射用乾燥粉末は実際の量が400mgより多く、それゆえそれが含むべき物質以外に約250mgの物質を含む。この物質をコリスチンと等価な濃度の、約20mg/mlを超える濃度で溶解すると、特にジェット噴霧器を用いた場合に、溶液は顕著に起泡しやすく、そして飛び散り(sputter)やすい。この起泡は、エアロゾル化される薬物の量を減少させ、そしてまた噴霧器を詰まらせやすい。
【０１５５】
3.  コリスチン処方物の滅菌
溶液状の処方物が実用的な使用可能寿命(viable  life-span)および貯蔵寿命を有するようにするために、任意の適切な滅菌手段(例えば0.2ミクロンの酢酸セルロースフィルターでの濾過)を用いて溶液を滅菌する。溶液は高温下でさえも安定であることが見いだされ、従って、処方物および／または活性薬剤を劣化させない任意のタイプの滅菌が、精製コリスチンの予備処方溶液の滅菌のために有利に使用される。
【０１５６】
4.  コリスチン処方物の安定性
実際的な目的のためには、エアロゾル処方物は予備混合され、そしてエンドユーザーがすぐに使用できる形で提供されることが好ましい。そうすると、患者は、新鮮な溶液を作製する必要なしに、可能性のあるコンタミネーションおよび他のそのような厄介な問題に対応して、処方物を使用することができる。従って、予備混合エアロゾル処方物の安定性はひとつの論点である。従って、これらの理由のため、長期安定性が研究された。
【０１５７】
20mg/mlコリスチン成分IV処方物の長期安定性を、ポリアロマー(polyallomer)のねじ蓋遠沈チューブに入れた0.4mlのアリコートを室温、50℃、60℃、70℃、80℃、および90℃で連続的にインキュベートすることによって研究した。アリコート(0.1mg)を、種々のインキュベーション時間で19日まで分析HPLCで分析した。結果を図17に示す。
【０１５８】
図17に示すHPLC溶離プロファイルは、20mg/mlコリスチン成分IV硫酸塩処方物が、pH6.9〜7.0、60℃で19日間安定であることを示し、微量の分解生成物の生成が70℃で19日で目視観察された。これらの分解生成物の相対量は70℃から90℃の間でインキュベート温度の関数として増加することが観察された。
【０１５９】
温度が10倍上昇することは、低い方の温度で安定性が時間で10倍増大することにおおよそ対応すると見積もると、これらのデータは、20mg/mlの等張性のpH6.9〜7.0のコリスチン処方物が室温で少なくとも5年間を越えて安定であることを示す。
【０１６０】
B.  予備処方されたコリスチンおよびコリマイシンの噴霧特性
成功した予備処方エアロゾル処方物であるためには、また、このような処方物が、処置される組織に釣り合った粒子サイズに容易にエアロゾル化され得ることが必要である。Pseudomonas  aeruginosaおよびStenotrophomonas  maltophilia  の場合、これらの細菌は下部気管支内空間に存在する。従ってこの空間に進入し、そしてそこに薬物を送達し得る粒子サイズを有するエアロゾルを提供することが重要である。気管支内空間のためには、エアロゾル粒子は、2μより小さくてはならず、かつ5μより大きくてはならず、2〜5μの間のMMADを有さなければならない。これらの理由のために、噴霧条件を研究し、そして処方物のエアロゾルを特徴づけた。
【０１６１】
1.  コリスチンおよびコリマイシンエアロゾル処方物
コリマイシンを、20mg/mlのコリスチンを基準にして等価な濃度に、噴霧の直前に新たに37.5mMのNaClに溶解した。コリスチン成分IV硫酸塩を120mM塩化ナトリウム中に溶解し、そして1モル濃度の水酸化ナトリウムでpHを7.0に調節した。
【０１６２】
2.  噴霧条件
抗Pseudomonas  aeruginosa剤のエアロゾル化は、高濃度の活性コリスチンまたはコリマイシンを低い全身吸収で直接気道に送達できるという利点がある。これはより安全な長期の治療の開発を可能とする。この目的のために、噴霧条件をジェット噴霧器を用いて研究した。
【０１６３】
噴霧される溶液4mlをPulmonaide  Compressor(DeVilbiss  Model  5650D)を装着したPari  LCジェット噴霧器の中に、４〜６リットル/分の気流速度で入れた。発生したエアロゾルをレーザー回折粒子分析装置(Malvern  Mastersizer  X)を通して特徴づけた。各処方物を複数回分析して、結果の再現性を決定した。これは、総オブスキュレーション(total  obscuration)時間、質量メジアン平均直径(mass  median  average  diameter)、および呼吸可能画分(respirable  fraction)で表された。
【０１６４】
3.  コリスチンおよびコリマイシンエアロゾル特性
コリスチンエアロゾルを特徴付けするため、およびコリマイシンとコリスチンエアロゾル処方物との間の差異を研究するために、150mM(等張性)NaCl単独、120mMのNaCl中の20mg/mlコリスチン成分IV硫酸塩、または39.5mMのNaCl中の20mg/mlコリマイシンのエアロゾル化の比較を行った。結果を図18に示す。これは3種の溶液4mLのエアロゾル化に必要な時間の比較である。2種の薬物溶液は3回分析し、そして生理食塩水は4回分析した。バーは測定の標準偏差を示す。図18に示す結果は、平均エアロゾル化時間が3つの物質で異なることを示した。生理食塩水対照のエアロゾル化は平均6.92分(標準偏差1.22分、n=4)で達成された。等張性pHでバランスをとった20mg/mlコリスチン成分IV硫酸塩のエアロゾル化は8.31分(標準偏差1.12分、n=3)で達成され、これに対して1/4N生理食塩水中で処方された20mg/mLのコリマイシンは10.53分(標準偏差1.49分、n=3)でエアロゾル化された。
【０１６５】
エアロゾルの質量メジアン粒子直径は各エアロゾルについて平均±標準偏差(n)で表され、生理食塩水、コリスチン成分IV硫酸塩、およびコリマイシンについて各々、4.57±0.13ミクロン(4)、4.30±0.13(3)、および4.11±0.29(3)であった。エアロゾルの平均呼吸可能画分は、エアロゾルのうち直径が1ミクロンから6ミクロンまでの範囲の粒子の時間での平均百分率であり、生理食塩水、コリスチン成分IV硫酸塩、およびコリマイシンについて各々、57.00±2.71(4)、58.90±1.56(3)、および58.77±2.03(3)であった。
【０１６６】
4.  噴霧器
先行技術の、より高濃度の薬物(150mg/ml以上)を含むエアロゾル化コリマイシン処方物は、上記の種々の理由のためあまり効率的に噴霧されなかった。
【０１６７】
従って、本発明の不可分の部分は、本発明の処方物を1〜5μの範囲のエアロゾル粒子サイズに噴霧することができる噴霧器の選択である。
【０１６８】
広範囲の噴霧器が入手可能であるが、本発明の目的に適した噴霧器は限られた数のみである。
【０１６９】
本発明で用いるために効率的かつ適切な噴霧器を同定するために、入手可能な噴霧器の研究を行い、インビトロで、どの噴霧器がエアロゾル化されたコリスチンの送達のために重要な基準を満たすかを決定した。超音波噴霧器およびジェット噴霧器の両方が適切である。
【０１７０】
ジェット噴霧器および超音波噴霧器のような2つのタイプの噴霧器が現在入手可能であり、これらはPseudomonas  aeruginosa感染の処置に最適な1μから5μの間の粒子サイズを生成および送達し得る。ジェット噴霧器は空気圧で作動して溶液を破断してエアロゾル小滴にする。超音波噴霧器は圧電結晶によって作動し、これが液体を剪断して小さいエアロゾル小滴とする。しかし、両方の噴霧器で効率的に噴霧され得るのはいくつかの処方のみである。両装置とも処方物のpHおよびそのイオン強度に感度が高いからである。
【０１７１】
コリスチン処方物の送達に使用されるUltraneb  99(DeVilbiss)超音波噴霧器の主たる制限は、そのコストが高いこと、薬物の浪費、および不便であることである。表1に示すように、この噴霧器は30mlの薬物溶液を必要とし、そして大きな1200mlのエアロゾルリザーバーを有する。コリスチンエアロゾル療法が広範囲に利用可能となり、外来患者または在宅患者に使用されるためには、噴霧器の使用がより効率的かつ容易であることが必要とされる。
【０１７２】
Ultraneb  99  DeVilbiss(超音波)および2つのジェット噴霧器(SidestreamおよびPari  LCとPulmoAideコンプレッサー)の特性の比較を表1に示した。
【０１７３】
（表１）
表1
異なる噴霧器の特性の比較
噴霧器                  DeVilbiss  99      Sidestream        Pari  LC
タイプ                    超音波            ジェット          ジェット
空気流                    8  L/m            8  L/m            8  L/m
液体リザーバー            30  ml            5  ml              5  ml
噴霧までの時間            10-12分          〜13分(*)          10分(**)
エアロゾルリザーバー      1,200  ml        30  ml              30  ml
ＭＭＡＤ＊＊            〜4-5ミクロン    〜2.2ミクロン        〜4-5ミクロン
＊ジェットのスパッタリング時間  ＊＊質量メジアン空気力学的直径
表１から分かるように、超音波系およびジェット噴霧器系の間には実質的な違いがある。2つのジェット噴霧器が必要とする溶液の容量は約6倍少なく、そしてエアロゾルがそこから吸入され得る大きいリザーバーを必要としない。
【０１７４】
表1で比較される2つの噴霧器のうち、Sidestreamの方がより小さい(2.2μ)粒子サイズのアウトプットのために、コリスチンを下部気道に送達するにはより効率的であり得る。反対に、Pari  LCはより大きな粒子サイズ(4.5μ)をより高いアウトプットで生成するので、送達時間が低減され、そして患者の不快感も軽減される。両方のジェット噴霧器とも、吸気中の薬物送達を増加させるベンチュリ設計を有する。より小さい装置のサイズは、患者が吸息する前に降下する(fallout)エアロゾル粒子を少なくする。ジェット噴霧器SidestreamおよびPari  LCはまた、両方とも再利用可能なディスポーザブルのユニットが入手できるという利点がある。
【０１７５】
上記ジェット噴霧器に加えて、2つの小容量の超音波噴霧器DeVilbissのAerosonicおよびOmronのUltraAireもまた、本発明の処方物の送達に適する。これらの超音波噴霧器は、より小さなリザーバーを有し、そしてより小容量の溶液を使用し得る点で、UltraNebb  99超音波とは異なる。
【０１７６】
VI.  コリスチン乾燥粉末処方物
本発明の独特の特性として、コリスチンを乾燥粉末として処方および送達する能力が包含される。本発明のコリスチン乾燥粉末処方物は、精製コリスチンまたはその成分が非常に高い治療効力を有し、そしてそのため、乾燥粉末の送達が可能となるような低用量で治療的に有効であるという知見に基づく。
【０１７７】
A.  乾燥粉末処方物
本発明の乾燥粉末処方物のために、精製コリスチン、精製コリスチン成分、およびその混合物、またはその薬学的に受容可能な塩は、メディアミリング(media  milling)、ジェットミリング、スプレードライ、または粒子沈降技術によって製粉され、質量メジアン平均直径が1〜5ミクロンの範囲の粉末とされる。粒子サイズ測定は、多段Andersonカスケードインパクタまたは他の適切な方法を用いて行われる。
【０１７８】
メディアミリングは、薬物物質を例えばステンレス鋼またはセラミックのボールを入れたミル中に入れ、そして所望の薬物粒子サイズ範囲が達成されるまでこの物質を回転またはタンブリングすることによって達成される。メディアミリングの利点としては、サイズ制御が良好なこと、生成物のサイズ範囲が狭いこと、回収効率が高いこと、および容易に計測可能なプロセスであることが挙げられる。欠点としては、処理時間が長いこと(数時間から数日のオーダー)、ミリングメディアを完了時に生成物から分離する必要があること、および生成物にメディアが混入する可能性があることが挙げられる。
【０１７９】
ジェットミリングは、非常に高圧の空気流を用いて粒子を互いに衝突させて、所望のサイズの微細粒子をミルから回収する。利点としては、迅速性(完了まで数秒から数分)、およびミリングの間のエネルギー移動がより少ないことによりもたらされる薬物生成物のより少ない温度上昇が挙げられる。欠点としては、採取効率が低いこと(50％から80％の回収率が典型的である)が挙げられる。
【０１８０】
両方の技術およびそのいかなるそして全ての改良が、本発明の範囲内であることが意図される。
【０１８１】
スプレードライは、薬物溶液の微細な霧を支持体上にスプレーし、そして粒子を乾燥させることによって達成される。次に粒子を採取する。スプレードライは化学物質を劣化させる傾向が最も少ないという利点を有する。
【０１８２】
溶液沈殿は、均一な薬物溶液に薬物の溶解度を低下させる共溶媒を添加することによって行われる。十分な共溶媒が添加されたとき、薬物の溶解度は固体薬物粒子が形成される点まで下がり、この固体薬物粒子は濾過または遠心分離によって採取され得る。沈殿は、再現性が高く、そして劣化を減らす低温度条件下で行われ得るという利点がある。
【０１８３】
上記のように調製される、1〜100mg、好ましくは1〜10mgの乾燥粉末の剤形のコリスチン乾燥粉末は、計量用量(metered  dose)または乾燥粉末吸入器中で直接使用される。
【０１８４】
B．  計量用量吸入器
計量用量吸入器は、3つの構成要素：噴射剤／薬物懸濁液を含む缶、正確に計量された容量の噴射剤懸濁液を送達するように設計された計量弁(metering  valve)、およびスプレーオリフィスを含む経口アダプター(計量された用量がそこから送達される)からなる。静止位置(rest  position)で、弁の計量室は、充填溝(filling  groove)またはオリフィスを経て薬物懸濁液リザーバーに接続する。弁を押し下げると、この充填溝がシールされ、そして計量室が経口アダプター中のスプレーオリフィスおよび弁後部のオリフィス(valve  stern  orifice)を介して大気圧に曝露される。この急激な圧力低下の結果、噴射剤が瞬時に沸騰し、そして急激に膨張した混合物が計量室から排出される。この液体／蒸気混合物は次に膨張室に入る。膨張室は弁棒の内部容積と経口アダプターから構成される。混合物は、スプレーノズルから発射される前に、それ自身の圧力下でさらに膨張される。スプレーオリフィスから出ると、噴射剤蒸気に囲まれた液体の拘束力が空気力学的力によって分断される。典型的には、この段階で小滴は20〜30ミクロンの直径（micron  sin  diameter）であり、そして2相蒸気液体混合物の音の速度(約30メートル／秒)で移動している。
【０１８５】
小滴の雲がスプレーノズルから離れて移動するにつれ、これは周囲の空気を巻き込み（entrain）、そして減速する。この間、噴射剤は蒸発によって蒸発し、巻き込まれた小滴は最終的にその残余の直径に達する。この時点で、粒子／小滴は界面活性剤で被覆された粉末薬物のコアから構成される。懸濁された物質の濃度およびサイズに応じて、粉末薬物コアは独立した薬物粒子または凝集体のいずれかから構成され得る。
【０１８６】
現在、計量容量吸入器技術は、質量80〜100マイクログラムの薬物を送達するように至適化され、上限で1mgの薬物が送達可能である。コリスチン、コリスチン成分、その混合物、またはその薬学的に受容可能な塩のより強力な処方物の発見により、計量容量吸入器技術は、コリスチン送達のための好適なビヒクルとなることができる。
【０１８７】
C.  乾燥粉末吸入器
乾燥粉末送達のための別の経路は、乾燥粉末吸入器による。
【０１８８】
乾燥粉末吸入器には2つの主要な設計がある。装置計量設計(device-metering  design)および工場で計量された装置(factory-metered  device)である。装置計量設計においては、薬物のリザーバーが装置内に収納され、そして患者は、一用量の装置を吸入室中に「格納(load)」する。工場で計量された装置においては、各々独立した用量が別々の容器に入れられて製造されている。両方のシステムとも、質量メジアン直径が1ミクロンから5ミクロンの小さい粒子への薬物の処方に依存し、そして通常、より大きな賦形剤粒子(典型的には直径100ミクロンの乳糖粒子)を共に処方することを伴う。薬物粉末を吸入室中に入れ(装置計量によって、または工場で計量された用量を開封することによってのいずれかで)、そして患者の吸気流によって、粉末が装置から出て口腔に入ることが促進される。粉末軌道の非層流特性により、賦形剤−薬物凝集体の分解が起こり、そして大きい賦形剤粒子の固まりは、咽頭の後ろに嵌入し、他方、より小さい薬物粒子は肺の深部に堆積する。
【０１８９】
乾燥粉末吸入のための現在の技術は、有効搭載(payload)限界が粉末約10mg(そのうち、薬物は通常、質量で少量成分である)であるような技術である。現在エアロゾル化されているコリマイシンよりも数倍強力なコリスチン、コリスチン成分、その混合物、またはその薬学的に受容可能な塩の処方物の発見により、乾燥粉末吸入器技術がコリスチン乾燥粉末のための好ましい送達ビヒクルとなることが可能になる。
有用性
本発明の処方物は、急性および慢性のPseudomonas  aeruginosa感染の処置および予防に十分な、有効量の精製コリスチン、その成分またはその薬学的に受容可能な塩の送達に適する。新規処方物は小容量であるが、有効用量のコリスチンを感染部位に送達する。
【０１９０】
嚢胞性線維症患者およびPseudomonas  aeruginosisまたはStenotrophomonas  maltophilia  によって引き起こされる慢性気管支内感染に罹患した他の患者は、気管支痙攣反応の頻度が高い。その気道は、従って、低張性または高張性のエアロゾルに対して、永久イオンの存在に対して、ならびに酸性または塩基性のエアロゾルに対して非常に感受性が高い。気道の刺激の影響は、咳または気管支痙攣によって臨床的に現れ得る。これらの症状は両方ともエアロゾル化コリスチンを気管支内空間に効率的に送達することを妨げる。従って、本エアロゾル処方物がこれらの症状を誘発しないことが重要である。
【実施例】
【０１９１】
実施例１
コリスチン成分の分析用HPLC
本実施例は、コリスチン成分の特性付けに使用するクロマトグラフィー手順を例示する。
【０１９２】
米国薬局方硫酸コリスチン(Dumex,  Ltd.、Denmarkから得た非滅菌経口粉末ロットA1620275、A11620277、A1620278、A1620273またはA1620280)を、分析用HPLCに対して10  mg/mlから分取用HPLCに対して300  mg/mlまでの範囲の濃度で、脱イオン水に溶解した。試料を0.45ミクロンの注射器末端酢酸セルロースフィルターで濾過し、そして各使用の間は４℃で保存した。
【０１９３】
米国薬局方硫酸コリスチン(100μｇ)を含有する10μlを、直径4.6  mm×長さ150  mmのVydac  218TP  C-18逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムまたは直径4.6  mm×長さ150  mmのBeckman  Ultrasphere  ODS  C-18逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムのいずれかに注入し、そしてBeckman  System  Goldプログラム可能溶媒モジュール#126を用いて、2.0  ml/分の23％アセトニトリルおよび77％  105  mM硫酸アンモニウム(pH  2.0)で溶出した。溶出液を、Beckman  Diode  Array検出器モジュール168を用いたUV検出器により、220  nmでの吸光度をモニターした。Beckman  Phi-10  pHメーターおよびBeckman  Futura  Plusコンビネーション電極(これは、製造業者の使用説明書に従ってpH  4.0および7.0の緩衝液で較正した)を用いてpHをモニターしつつ、50  mM硫酸アンモニウム水溶液に濃硫酸を添加することにより、硫酸アンモニウムランニングバッファー(pH  2.0)を調製した。各硫酸コリスチンロットの溶出プロフィールを得て、他のロットおよび硫酸コリスチンのHPLCに関する文献に記載のプロフィールと比較した。
【０１９４】
実施例２
主要硫酸コリスチン成分の単離および特性付け
本実施例は、硫酸コリスチンの主要成分の単離および特性付けに使用する手順を記述する。
【０１９５】
米国薬局方硫酸コリスチンの分取用HPLCにより、硫酸コリスチン成分Ｉ、IIIおよびIVの画分を得た。
【０１９６】
成分の分離を、23％アセトニトリル(High  Purity  Acetonitrile  UV、Burdick  &  Jacksonから得た)および77％  105  mM硫酸アンモニウム(pH  2.0)の移動相を用いて、Waters  Corporationから得た逆相分取用カラム(Prep  Nova-Pak  HR  C18  40×100  mmカートリッジ)上で実施した。
【０１９７】
脱イオン水1.0  mLにあらかじめ溶解した米国薬局方硫酸コリスチン(Dumex,  Ltd.、Denmark)300  mgを、20  ml/分の流速で分離した。生成物の溶出に続いて、UV検出器を200  nmに設定した。分画した成分Ｉ(100  ml)、III(50  mL)およびIV(300  mL)の溶液を、ロータリーエバポレーションにより、乾燥状態まで減らした。純メタノール50  mLに溶解することにより、無機塩から化合物を抽出し、これを別の容器に濾過した。各画分中のコリスチンの相対量を、各要素が、成分IVについてあらかじめ決定した吸光係数に等しい吸光係数を有すると仮定することにより、決定した。
【０１９８】
I.A章で上記のようにして、６N  HCl、0.05％メルカプトエタノール、0.02％フェノール中にて、115℃で、20時間の加水分解に続いて、成分Ｉ、IIIおよびIVについてのアミノ酸分析を実施した。
【０１９９】
実施例８に記載の方法に従って、成分Ｉ、IIIおよびIVのイオンスプレー質量分析を実施した。精製したコリスチン成分硫酸塩(1.6μg)の333μg/ml溶液５μlを、Upchurch  Scientificから得た小型C-18逆相C-135-Bガードカラム(これは、Finnigan  SSQ  7000質量分析計と連結した)に注入した。この試料を、0.1％酢酸を含有する30：70(アセトニトリル/水)にて、0.5  ml/分で、このカラムから溶出し、そして図12で示すように、陽イオンエレクトロスプレーにより分析した。
【０２００】
成分Ｉ、IIIおよびIVの乾燥画分を、およそ５mg/mlの濃度で、滅菌洗浄水に懸濁し、そして0.45ミクロンの注射器末端酢酸セルロースフィルターで濾過した。成分Ｉ、IIIおよびIVの溶液が589  nmの波長のナトリウムＤ線からの平面偏光を回転させる能力を、25℃で、Perkin-Elmer241偏光計および１dcmキュベットを用いて測定した。観察された旋光を、g/mLで表わした化合物濃度で割ることにより、規格化した旋光が得られた。これらの値を、旋光度として表わす。
【０２０１】
各成分の個々の組成を決定するために、NMRスペクトル測定を実施した。その目的のために、成分Ｉ、IIIおよびIVの乾燥画分15  mgを、99.9％のDを含有するD2O(0.5  mL)(これは、13C  NMRスペクトル分析のための、Cambridge  Isotope  Laboratories、Woburn  MAから得た)に懸濁した。内部標準として、3-(トリメチルシリル)プロピオン酸ナトリウム-2,2,3,3-d4(98％)(これもまた、Cambridge  Isotope  Laboratoriesから得た)を添加した。13Cに対する観測周波数75.5  Mhz、先端角度29.66度、リサイクル時間(recycle  time)181  msecおよびスペクトル幅10000  Hzにて、Nicolet  1280データプロセッサーを有する、General  ElectricモデルQE-300  NMR分光器にて、各化合物に対して、少なくとも200,000個の捕捉を行った。
【０２０２】
コリスチン成分Ｉ、IIIおよびIVに対する代表的な１３C-NMRスペクトルを図７に示し、それらの値を上記に列記した。
【０２０３】
実施例３
米国薬局方硫酸コリスチン成分の相対的抗Pseudomonas菌活性(anti-Pseudomonal  Activity)の測定
本実施例は、硫酸コリスチンの異なる画分がPseudomonas  aeruginosaの増殖を阻害する能力を比較するのに使用する方法を記述する。
【０２０４】
米国薬局方硫酸コリスチンの100μg(50μl)試料を、分析用HPLCカラムに注入し、そして23％アセトニトリル、77％硫酸アンモニウム(pH  2.0)を用いて、2.0  ml/分で溶出した。1.0分で開始し、Gilson  FC  203Bフラクションコレクターを用いて、0.2分間隔で、1.5  mlスナップ-キャップ遠心管に画分を集めた。1.0分から5.0分の溶出時間で、0.4  ml容量の画分を全体で20個集めた。このUV検出器セルとフラクションコレクターとの間の管材の容量を測定したところ、0.4  mlであり、その結果、画分#１は、0.8分と1.0分の間のUV痕跡の領域に対応していた。各画分を、Savant  SC110A真空コンセントレーターにより乾燥し、0.4  ml増殖培地に懸濁し、そしてフィルター滅菌した。
【０２０５】
各滅菌再懸濁画分の一連の２倍希釈物を滅菌増殖培地にして、各希釈物がPseudomonas  aeruginosa株27853の増殖を阻害する能力を、37℃で18時間インキュベーション後の培養物の濁度を調査することにより、測定した。最小阻止濃度は、濁度が阻害される画分の最低希釈率として、定義した。
【０２０６】
実施例４
コリスチン成分IVの精製のための分取用HPLC分画
本実施例は、コリスチン成分IVの充分な精製のために使用する手順を記述する。
【０２０７】
コリスチン成分IVは、実施例１および３に記載の分析用HPLCにより測定したように、重量基準での米国薬局方硫酸コリスチンの主要成分である。
【０２０８】
コリスチン成分IV硫酸塩を、分取用HPLCにより、95％より高い純度まで精製した。
【０２０９】
23％アセトニトリルおよび77％  105  mM硫酸アンモニウム(pH  2.0)の移動相を用いて、逆相分取用カラム(Prep  Nova-Pak  HR  C18  40×100  mmカートリッジ)を使用した。100〜300  mgの米国薬局方硫酸コリスチン(これは、脱イオン水にあらかじめ溶解した)を、20  ml/分の流速で分離し、生成物の溶出に続いて、UV検出器を220  nmに設定した。溶出液を、16分〜23分で集めた。プールし収集した画分を分析用逆相HPLCカラムに再注入して、図12で示すようにして、生成物の純度を確認した。
【０２１０】
実施例５
分画したコリスチンの脱塩
本実施例は、分画したコリスチンの脱塩に使用する手順を記述する。
【０２１１】
23％アセトニトリルおよび77％  105  mM硫酸アンモニウム(pH  2.0)からなる画分の容量を、Buchi  R-114ロータリーエバポレーターを用いて10分の１に減らすことにより、プールした溶出物から、コリスチン成分IVを抽出した。段階希釈物の220  nmにおける吸光度によって分光光度的に決定されるような、コリスチン成分IV(1.0g)を含有する濃縮物質を、３cm×22  cmのガラス製Bioradクロマトグラフィーカラム(これは、４ボイド容量のアセトニトリルに続いて４ボイド容量の脱イオン水であらかじめ洗浄したC-18逆相樹脂(Whatman  LRP-2、ロット03035)を詰めた)にロードした。溶媒は、１ml/分および９ml画分で運転している蠕動ポンプを介して、このカラムを通るが、Kimaxホウケイ酸塩13×100  mm管に集めた。分画したコリスチン成分IV(1.0g)をこのカラムにロードした後、この樹脂を、１ボイド容量の洗浄水で洗浄し、そして水中の40％アセトニトリル50  mlで溶出した。
【０２１２】
２μlのアリコートをシリカＧ薄層クロマトグラフィープレートにスポットし、100％エタノール中のニンヒドリン(Mallinckrodtから得た)の0.75％溶液を噴霧し、そしてこのプレートを100℃まで加熱することにより、画分を、コリスチン含量についてアッセイした。ニンヒドリンとアミノ基との反応による紫色の存在は、第一級アルキルアミン(コリスチンを含めて)の陽性指標(identifier)と見なした。ニンヒドリン陽性画分をプールし、Buchi  R-114ロータリーエバポレーターで乾燥し、滅菌洗浄水に溶解し、秤量済みの清浄な20  mlガラス製ネジ蓋付きバイアルに移し、ドライアイスで凍結させ、そして乾燥状態まで凍結乾燥した。
【０２１３】
典型的な脱塩反応により、脱塩樹脂上にロードした各1.0gに対して、約650  mgの乾燥コリスチン成分IV硫酸塩が得られた。精製物質の吸収スペクトルは、Beckmann  DU分光光度計および１cm経路長石英キュベットを用いて得た。1.0  mg/mlの試料を、600  nm/分の走査速度で、200  nm〜500  nmで走査した(図５)。220  nmでの吸光係数は、1.0  mg/mlのコリスチン成分IV硫酸塩の水への段階希釈により決定した。0.5  mg/mlまでで、濃度と220  nmでの光学的密度との間の比較的に線形な関係が得られた(図４)。0.5  mg/mlより濃い溶液は、分光測光による正確な定量のためには、希釈する必要がある。室温で８時間乾燥後の生成物の微量元素分析は、C  41.16％、H  7.77％、N  14.59％、S  5.77％およびH２O  5.34％であった。この組成は、成分IV  １モルあたり３モルの硫酸塩および５モルの水を含有する固形物と一致している(理論組成：C  40.97％、H  7.53％、N  14.42％、O  30.89％、S  6.19％およびH２O  5.79％、分子式C５３H１１８N１６O３０S３および式量1553.8g/mol)。
【０２１４】
実施例６
コリスチン遊離塩基の沈殿
本実施例は、精製したコリスチン画分を脱塩する別のストラテジーを記述する。
【０２１５】
Beckman  Phi-10  pH計およびFutura  Plusコンビネーション電極により測定した溶液pHが11.0に達するまで、濃縮した画分カラムに、NaOH(１N)を滴下した。沈殿物が形成され、これを、Beckman  JA-20ローターを用いるBeckman  J2-MI冷却遠心管にて、35  ml「Oak  Ridge」型ポリアロマー管で、25,000×ｇで、15分間にわたって遠心分離することにより、集めた。この沈殿物を、１容量の冷水で２回洗浄し、そして真空下にて、少なくとも24時間乾燥した。
【０２１６】
1.0  M  HClを用いたこの物質の滴定により、この手順によっては、完全なコリスチン遊離塩基は均一には生成されないこと、また、このプロセスによると、残留NaOHは完全には除去されないことが示唆された。さらに、この手順の全体的な収率は低く、分画した硫酸コリスチン１gあたり、平均して200〜300  mgが回収された。
【０２１７】
実施例７
コリスチン塩対イオンの交換
本実施例は、対イオンを交換することによるコリスチン塩の調製を例示する。
【０２１８】
精製したコリスチン成分IV硫酸塩(1.2g)を、2.0  M  NaH２PO４(50  ml)に溶解した。この溶液を、実施例６に記載したC-18逆相脱塩クロマトグラフィーカラムに通し、続いて、脱イオン水60  mlを通した。このカラムの流速は、最初から最後まで、0.875  ml/分に維持した。７mlの画分を集めた(８分ごとに集めた)。コリスチン成分IVリン酸塩の溶出は、40％アセトニトリル/水100  mlを用いて達成し、シリカＧTLCプレート上の２μl画分のニンヒドリンアッセイにより、モニターした。コリスチン成分IVリン酸塩(21〜27)を含有する画分をプールし、そして回転蒸発により得た。この固形物を脱イオン水10  mlに懸濁し、0.45ミクロン酢酸セルロースフィルターで濾過し、秤量済みの20  mlガラス製ネジ蓋付きバイアルに移し、ドライアイスで凍結させ、そして72時間凍結乾燥した。およそ700  mgの物質が得られた。元素分析により、C  37.46％、H  7.28％、N  13.05％、P  10.12％、S  0.16％およびH２O  3.12％の組成が明らかとなり、これは、コリスチン成分IV  １モルあたりおよそ５モルのリン酸塩および３モルの水を含有する固形物と一致している(理論組成：C  37.15％、H  7.12％、N  13.08％、O  33.61％、P  9.04％、H２O  3.15％、分子式C５３H１２１N１０O３６P５および式量g/mol)。この0.16％の観察されたイオウ含量は、成分IV１モルあたりの0.003モルの残留硫酸塩と相関しており、このことは、この手順での硫酸塩をリン酸塩で置き換えたときの効率(＞99％)を示している。成分IVリン酸塩の分析用HPLC分析により、この溶液の組成は、この脱塩プロセス中にも変化はなかったことが確認された(図13)。
【０２１９】
実施例８
精製したコリスチン成分IV硫酸塩の質量スペクトル特性付け
本実施例は、質量スペクトル特性付けを記述する。
【０２２０】
精製したコリスチン成分IV硫酸塩(1.6μg)の333μg/ml溶液の５μlを、Upchurch  Scientificから得た小型C-18逆相C-135-Bガードカラム(これは、Finnigan  SSQ  7000質量分析計と連結した)に注入した。この試料を、0.1％酢酸を含有する30：70(アセトニトリル：水)にて、0.5  ml/分で、このカラムから溶出し、そして図12で示すように、正イオンエレクトロスプレーにより分析した。
【０２２１】
実施例９
精製したコリスチン成分IVの重量滴定
本実施例は、精製したコリスチン成分IVの重量滴定を記述する。
【０２２２】
コリスチン成分IVのpKaを滴定により決定するために、無水遊離塩基107  mgを、20  mlガラス製ネジ蓋付きバイアル中にて、脱イオン水10.7  mlに懸濁し、そしてマグネチックスターラーで攪拌した。この懸濁液中に、Beckman  Futura  Plusコンビネーション電極を備えた較正されたBeckman  Phi-10  pH計を配置し、この溶液のpHを、1.21  M  HClの添加中にモニターした。この懸濁液の初期pHを観察したところ、11.47であり、この滴定中に２箇所の屈折点が認められ、１つは、40μmolのHClを添加したpH  10.2の点であり、第二のものは、505μmolのHClを添加したpH  4.5の点であった。第一の屈折点は、この固体物質中に残留している痕跡量のNaOHの中和に一致すると推察される(40μmol×40μg/μmol＝1.6  mg、すなわち、約1.5重量％)。これはまた、10.7  ml中の40μmolの水酸化物イオン＝3.75e−３モルの水酸化物であるので、この溶液のpHに一致する。[H＋]×[OH−]＝1e−14であるので、そのプロトン濃度は、2.67e−12となり、そしてpH＝−log[H＋]であるので、pH＝−log(2.67e−12)＝11.57となり、これは、このコリスチン成分IV塩基懸濁液の観測pH  11.47と非常に近い。
【０２２３】
第二の屈折点は、コリスチン成分IVの完全なプロトン化を表わしている。この実験での成分IVのpKaを観察したところ、およそ9.0であった。
【０２２４】
実施例10
コリマイシンM中に存在する不純物質量の測定
本実施例は、コリマイシン処方物中に存在する不純物質量または非活性物質の測定を示す。
【０２２５】
この処方物中に存在する物質の実際の質量を測定するために、市販のコリマイシンのバイアルを開き、その乾燥内容物を、Metter  Top  Loading  Balanceに置いた秤量済みのプラスチック製秤量ボート(weigh-boat)にて、直ちに秤量した。
【０２２６】
以下のデータが得られた：
バイアル１：コリマイシン(Coly-Mycin  M  Parenteral、Parke-Davis、ロット#  01966P)は、399.0  mgを含んでいた。
【０２２７】
バイアル２：コリマイシン(Coly-Mycin  M  Parenteral、Parke-Davis、ロット#  01966P)は、405.0  mgを含んでいた。
【０２２８】
バイアル３：コリマイシン(Coly-Mycin  M  Parenteral、Parke-Davis、ロット#  01966P)は、402.9  mgを含んでいた。
【０２２９】
これらの３個のParke-Davis  Coly-Mycin  M  Parenteralバイアルに含まれる平均質量を、402.3  mgであると決定し、この値は、生成物活性に従って存在したはずのコリマイシンの理論投薬量224.4  mgよりも、平均質量で177.9  mg過剰であることを示している。
【０２３０】
実施例11
コリマイシン溶液のpHの決定
本実施例は、溶解に続いたコリマイシン溶液のpHの決定に使用する手順を記述する。
【０２３１】
20  mlガラス製ネジ蓋付きシンチレーションバイアルに405  mgを含むColy-Mycin  M  Parenteral、Parke-Davis、ロット#  01966Pの新たに開けたバイアルを秤量し、そして適当な容量の滅菌洗浄水を添加して、10.0  mg/ml、15.0  mg/mlおよび20.0  mg/mlの溶液を得ることにより、新たに溶解したコリマイシンのpHを決定した。これらの値は、3.7  mg/ml、5.6  mg/mlおよび7.4  mg/mlの濃度のコリスチン塩基当量に相当する。次いで、Beckman  Futura  Plusコンビネーション電極を備えたBeckman  Phi-10  pH計(使用前に製造業者の指示によりpH  4.0および7.0で検定した)を用いて、溶液のpHを連続的にモニターした。１分から180分の種々の時点で、pH値および時間を記録した。
【０２３２】
実施例12
コリマイシンの複雑性の決定
本実施例は、コリマイシン成分の複雑性の決定に使用する手順を記述する。
【０２３３】
コリマイシン溶液の複雑性を特性付けるために、コリマイシンのコリスチン塩基等価物(Coly-Mycin  M  Parenteral、Parke-Davis、ロット#  01966P、402.9  mgを含有する)150  mgを、105  mM硫酸アンモニウム緩衝液(pH  2.0)10  mlに溶解した。この溶媒のpHが低いことから、コリスチンのスルホメチル共役物を急速に加水分解すると予測された。
【０２３４】
溶解後の種々の時点で、コリスチン塩基150μgに等しい10μlのアリコートを、直径4.6  mm×長さ150  mmのVydac  218TP  C-18逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムに注入し、そしてBeckman  System  Goldプログラム可能溶媒モジュール#126を用いて、2.0  ml/分の23％アセトニトリルおよび77％  105  mM硫酸アンモニウム(pH  2.0)で溶出した。溶出液を、上記のようなUV検出器により、220  nmでの吸光度をモニターした。Beckman  Phi-10  pH計およびBeckman  Futura  Plusコンビネーション電極(これは、製造業者の指示に従ってpH  4.0および7.0緩衝液で検定した)を用いてpHをモニターしつつ、50  mM硫酸アンモニウム水溶液に濃硫酸を添加することにより、硫酸アンモニウムランニングバッファー(pH  2.0)を調製した。
【０２３５】
実施例13
コリスチンの抗菌活性試験
本実施例は、コリスチン成分Ｉ、IIIおよびIVの相対的な生体活性の試験を例示する。
【０２３６】
National  Committee  for  Clinical  Laboratory  Standards(NCCLS)  Antimicrobial  Susceptibility  Testing,  Section  5.2,  broth  Microdilution  MIC  testing,  in  Clinical  Microbiology  Procedure  Handbook,  Henry  D.  Isenberg編,  ASM,  Washington  DC.,  (1992);  National  Committee  for  Clinical  Laboratory  Standards;  Methods  for  Dilution  Antimicrobial  Susceptibility  Tests  for  Bacteria  that  Grow  Aerobically,  第３版の認可された規格に従った接種材料、培地、接種条件および終点を用いる液体微量希釈法により、試験物質(コリスチン成分Ｉ、IIIおよびIVだけでなく、精製コリスチン成分IV硫酸塩およびコリスチン成分IV塩酸塩)のPseudomonas  aeruginosaATCC  27853に対する最小阻止濃度を測定した。認可された規格M7-A-3,  Villanova,  PA.  (1993)。
【０２３７】
最終濃度の100倍でストックを調製し、そしてカチオン調整Mueller  Hintonブロス中にて、連続的な２倍希釈で希釈した。この試験生物を、試験ブロス１mlあたり、10５コロニー形成単位の最終接種材料に調整した。試験は、100μlの最終試験容量で、マイクロタイタートレイにて実施した。
【０２３８】
この試験の品質保証には、厳格に従った。Pseudomonas  aeruginosa  ATCC  27853およびEscherichia  coli  ATCC  25922を、同一条件下にて、カチオン調整Mueller  Hintonブロス中にて、アンピシリン、ゲンタマイシンおよびシプロフロキサシンに対して試験した。結果は、これらの薬剤のMICが、NCCLS(同書中に)により公開された受容可能範囲内にあるとき、得られた。
【０２３９】
実施例14
コリマイシンの活性とコリスチン成分IV塩酸塩の活性との比較
本実施例は、コリスチン成分IV塩酸塩およびプロドラッグであるコリマイシンの抗Pseudomonas  aeruginosa活性の測定および比較に使用する手順を記述する。
【０２４０】
Clinical  Microbiology  Procedure  Handbook(前出)のAntimicrobial  Susceptibility  Testing,  Section  5.16、殺菌活性を評価するための試験に記載されているようにして、タイムキル(time  kill)動力学研究を実施した。
【０２４１】
試験は、種々の時点でのサンプリングを可能にするように最終試験容量を大きくした(10  mL)こと以外は、MICを測定するのに使用した方法(実施例13)と同じ方法に設定した。培養物を37℃でインキュベートした。初期セットアップおよび種々の所望の時点にて、培養物をサンプリングし、そして(さらに希釈するかまたは希釈せずに)、ヒツジ血液寒天プレートに平板培養した。プレートを18〜24時間インキューベートし、CFU/mL数を測定しプロットして、生存している生物の割合および99.9％の死滅を達成するのに必要な時間を測定した。
【０２４２】
実施例15
エアロゾル化のための等張性コリスチン成分IV溶液の処方物
本実施例は、エアロゾル化のための等張性コリスチン成分IV処方物の調製に使用する手順を記述する。
【０２４３】
精製し乾燥したコリスチン成分IV硫酸塩またはコリスチン成分IV塩酸塩を、120  mmol塩化ナトリウム中に、20  mg/mlの濃度で溶解した。この溶液をマグネチック攪拌棒により混合し、溶液のpHを、キャリブレートされたBeckman  Phi-10  pH計およびBeckman  Futura  Plusコンビネーション電極によりモニターした。10  N  NaOH溶液を使用して、この溶液のpHを6.95〜7.00の間に調整した。
【０２４４】
次いで、10  ml注射器に取り付けた0.2ミクロン酢酸セルロースフィルターによる濾過または121℃で20分間にわたるオートクレーブ処理のいずれかにより、この溶液を滅菌した。滅菌溶液の完全性を、実施例１に記載のようにして、220  nmでの溶液の吸光度をモニターし、そして分析用HPLCプロフィールにより決定した。
【０２４５】
実施例16
コリスチン処方物の長期安定性
本実施例は、コリスチン処方物の長期安定性および寿命の決定を例示する。
【０２４６】
コリスチンIV処方物の長期安定性は、0.6  mlポリアロマーネジ蓋付き微量遠心管にて、その0.4  mlアリコートを、室温、50℃、60℃、70℃、80℃および90℃で連続的にインキュベートすることにより、決定した。0.1  mgのアリコートを、分析用HPLCにより、19日までの種々のインキュベーション時間で分析した。HPLC溶出プロフィールにより、このIV硫酸塩処方物は、pH  6.9〜7.0では、60℃で19日間安定であることが立証され、70℃では、19日目に、目に見える劣化産物が微量で発生した。これらの劣化産物の相対量は、70℃と90℃との間では、インキュベーション温度の関数として増加することが認められた。
【０２４７】
長期安定性の予測は、10倍の温度上昇は、大体、低い温度での一定時間における10倍の安定性増加に相当するという仮定に基づいている。得られたデータから、20  mg/mlの等張性pH  6.9〜7.0コリスチン処方物が、室温で５年より長く安定であることが分かる。
【０２４８】
実施例17
予備処方されたコリスチンおよびコリマイシンエアロゾル処方物のジェット噴霧特性
本実施例は、エアロゾル処方物のためのコリマイシンおよびコリスチン成分IVの噴霧を記述する。
【０２４９】
コリマイシンを、噴霧直前に、20  mg(コリスチン塩基等価物)/(溶液１ml)の濃度で、37.5  mM(等張性)NaClに新たに溶解した。コリスチン成分IV硫酸塩または塩酸塩処方物は、実施例15で上記のものを使用した。
【０２５０】
噴霧する溶液４mlを、Pulmonaide  Compressor、DeVilbiss  Model  5650Dを備えたPari  LC  Jet噴霧器(４〜６l/分の空気流速)に入れた。発生したエアロゾルは、Malvern  Mastersizer  Xレーザー回折粒子分析器に通すことにより、特性付けた。各処方物を複数回分析して、結果の再現性を決定し、これらを、全暗黒化時間、質量中間値粒子直径および呼吸可能画分(respirable  fraction)として表わした。
【０２５１】
質量中間値粒子直径を、エアロゾルに対する平均±標準偏差(ｎ)として、表わした。
【０２５２】
平均呼吸可能画分を、時間の経過と共に、このエアロゾル内の直径１ミクロン〜６ミクロンの範囲の粒子の平均割合として、算出した。
【図面の簡単な説明】
【０２５３】
【図１】図１は、プロドラッグコリマイシン（図1A）の一般的構造、ならびに薬物コリスチンおよびその成分置換基の一般式（図1B）を示す。
【図２】図２は、硫酸コリスチンの分析用HPLC分画の典型的溶出プロフィールのグラフを示す。
【図３】図３は、米国薬局方硫酸コリスチンからの、コリスチン成分I、III、およびIVの分取分画（preparative  fractionation）のHPLCプロフィールである。
【図４】図４は、コリスチン成分IVの吸光係数を示すグラフである。
【図５】図５は、コリスチン成分I（図5A）、コリスチン成分III（図5B）、およびコリスチン成分IV（図5C）のUV吸光スペクトルのグラフである。
【図６Ａ】図６は、コリスチン成分I（図6A）、コリスチン成分III（図6B）、およびコリスチン成分IV（図6C）の陽イオンスプレー質量スペクトルである。
【図６Ｂ】図６は、コリスチン成分I（図6A）、コリスチン成分III（図6B）、およびコリスチン成分IV（図6C）の陽イオンスプレー質量スペクトルである。
【図６Ｃ】図６は、コリスチン成分I（図6A）、コリスチン成分III（図6B）、およびコリスチン成分IV（図6C）の陽イオンスプレー質量スペクトルである。
【図７】図７は、コリスチン成分I（図7A）、コリスチン成分III（図7B）、およびコリスチン成分IV（図7C）の13C  NMRスペクトルである。
【図８】図８は、これらの分析用HPLC溶出プロフィールを有する米国薬局方硫酸コリスチン画分の相対抗Pseudomonas  aeruginosa活性の比較である。
【図９】図９は、５個の個々のコリスチンロットの分析用HPLCプロフィールである。
【図１０】図10は、コリマイシン溶液のpHの経時的変化およびコリスチン成分IV溶液のpH安定性を示す。
【図１１】図11は、室温で、45分間、２時間、３時間、および４時間のインキュベーション後に分析した、pH2.0で硫酸アンモニウムに溶解したコリマイシンのHPLCプロフィールのグラフである。
【図１２】図12は、分取HPLCによって集められた分画化されたコリスチン成分IVの分析用HPLCプロフィールである。
【図１３】図13は、硫酸イオンをリン酸イオンに交換し、C-18逆相樹脂で脱塩することによって調製された、コリスチン成分IVリン酸塩の分析用HPLCプロフィールである。
【図１４】図14は、コリスチン成分IV遊離型塩基の重量滴定を示す。
【図１５】図15は、コリスチン成分IV塩酸塩およびコリマイシン調製物のPseudomonas  aeruginosaに対する殺菌活性の比較である。
【図１６】図16は、コリスチン成分IV硫酸塩およびコリスチン成分IV塩酸塩の、NaOHでの滴定を比較している。
【図１７】図17は、様々な温度で19日間インキュベートした後のコリスチン成分IV硫酸塩溶液の安定性を示す。
【図１８】図18は、生理食塩水、コリスチン成分IV硫酸塩およびコリマイシンの4.0ml溶液のエアロゾル化に必要なエアロゾル化時間を比較するグラフである。
【図１】
2007302698.tif 000005
【図２】
2007302698.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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