(57)【要約】【課題】試料吸引流路系と、ポンプ、分離カラム及び検出器を含む溶出流路系との分離及び接続を切換える流路切換えバルブを有する液体クロマトグラム装置において、移動相の分離カラムへの移動時間を短縮し、分析時間を短縮可能な液体クロマトグラム装置を実現する。【解決手段】サンプリング工程でバルブ８はポンプ３及び分離カラム５と、試料吸引系７との流路を分離する。サンプル注入工程でバルブ８の流路が切換えられ試料吸引流路系７とグラジェント溶出流路系とが接続され試料がグラジェント流路系に導入される。グラジェント分析工程で移動相組成変化がバルブ８に達するまでにバルブ８を作動させ試料吸引流路系７をグラジェント溶出流路系と切り離す。グラジェント分析工程で試料吸引流路系７をグラジェント溶出流路系と切り離し移動相を試料吸引流路系７を介すること無く分離カラム５に供給できる。【選択図】      図２
2007121192.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液を送液するポンプと、液体試料を吸引する試料吸引部と、注入された試料から被測定成分を分離する分離カラムと、この分離カラムにより分離された被測定成分を検出する検出器と、上記ポンプ、試料吸引部、分離カラムとの接続流路を切換える流路切換えバルブと、上記ポンプ、試料吸引部、検出器及び流路切換えバルブの動作を制御する制御部とを有する液体クロマトグラフ装置において、
上記制御部は、
上記流路切換えバルブを、上記試料吸引部から上記ポンプ、分離カラム及び検出器を分離するサンプリング流路に設定し、試料吸引部により試料を吸引させ、
上記流路切換えバルブの流路を切換えて、ポンプから、試料吸引部を介して、分離カラムに至るサンプル注入流路に設定し、ポンプからの送液により試料吸引部に吸引された試料を上記分離カラムに移動させて被測定成分を分離させ、
上記流路切換えバルブの流路を切換えて、上記試料吸引部を、上記ポンプ、分離カラム及び検出器と分離する分析流路に設定し、ポンプからの溶液の送液により、分離カラムにより分離された成分を上記検出器に移動させることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項２】
請求項１記載の液体クロマトグラフ装置において、
上記ポンプは、有機溶媒及び水を移動相として送液し、移動相の組成比率を時間と共に変化させることができるグラジェントポンプであることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項３】
請求項２記載の液体クロマトグラフ装置において、
上記制御部は、上記グラジェントポンプによる移動相の組成比率変化開始時点から所定の遅延時間が経過した後に、上記流路切換えバルブを、上記サンプル注入流路から、上記分析流路に切換えることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項４】
請求項３記載の液体クロマトグラフ装置において、
上記遅延時間は、上記移動相が上記ポンプから流路切換えバルブに達する時間に到達変動時間を加えた時間であることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項５】
請求項２記載の液体クロマトグラフ装置において、
上記制御部は、上記グラジェントポンプによる移動相の組成比率変化開始後、上記検出器が、特定のクロマトグラムピークを検出した後、上記流路切換えバルブを、上記サンプル注入流路から、上記分析流路に切換えることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項６】
請求項５記載の液体クロマトグラフ装置において、
上記制御部は、上記検出器が、特定のクロマトグラムピークの立ち上がりを検出した後、上記流路切換えバルブを、上記サンプル注入流路から、上記分析流路に切換えることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項７】
請求項２記載の液体クロマトグラフ装置において、
上記制御部は、上記グラジェントポンプによる移動相の組成比率変化開始後、上記検出器が、特定のクロマトグラムピークの頂点を検出した後、上記流路切換えバルブを、上記サンプル注入流路から、上記分析流路に切換えることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項８】
請求項２記載の液体クロマトグラフ装置において、
表示手段を備え、上記制御部は、上記流路切換えバルブが、サンプリング流路であるのか、サンプル注入流路であるのか、分析流路であるのかを上記表示手段に表示させることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項９】
試料吸引部と、溶液を送液するポンプと、試料から被測定成分を分離する分離カラと、分離カラムにより分離された被測定成分を検出する検出器とを用いて、液体試料を吸引し、溶液を送液して分離カラムにより液体試料から被測定成分を分離し、この分離カラムにより分離された被測定成分を検出する液体クロマトグラフィ分析方法において、
上記試料吸引部から上記ポンプ、分離カラム及び検出器を分離するサンプリング流路に設定し、試料吸引部により試料を吸引させ、
上記ポンプから、試料吸引部を介して、分離カラムに至るサンプル注入流路に設定し、ポンプからの送液により試料吸引部に吸引された試料を上記分離カラムに移動させて被測定成分を分離させ、
上記試料吸引部を、上記ポンプ、分離カラム及び検出器と分離する分析流路に設定し、ポンプからの溶液の送液により、分離カラムにより分離された成分を上記検出器に移動させることを特徴とする液体クロマトグラフィ分析方法。
【請求項１０】
請求項９記載の液体クロマトグラフィ分析方法において、
上記ポンプは、有機溶媒及び水を移動相として送液し、移動相の組成比率を時間と共に変化させることができるグラジェントポンプであることを特徴とする液体クロマトグラフフィ分析方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の液体クロマトグラフィ分析方法において、
上記グラジェントポンプによる移動相の組成比率変化開始時点から所定の遅延時間が経過した後に、上記サンプル注入流路から、上記分析流路に切換えることを特徴とする液体クロマトグラフィ分析方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の液体クロマトグラフィ分析方法において、
上記遅延時間は、上記移動相が上記ポンプから分離カラムに達する時間に到達変動時間を加えた時間であることを特徴とする液体クロマトグラフィ分析方法。
【請求項１３】
請求項１０記載の液体クロマトグラフィ分析方法において、
上記グラジェントポンプによる移動相の組成比率変化開始後、上記検出器が、特定のクロマトグラムピークを検出した後、上記サンプル注入流路から、上記分析流路に切換えることを特徴とする液体クロマトグラフィ分析方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の液体クロマトグラフィ分析方法において、
上記検出器が、特定のクロマトグラムピークの立ち上がりを検出した後、上記サンプル注入流路から、上記分析流路に切換えることを特徴とする液体クロマトグラフィ分析方法。
【請求項１５】
請求項１０記載の液体クロマトグラフィ分析方法において、
上記グラジェントポンプによる移動相の組成比率変化開始後、上記検出器が、特定のクロマトグラムピークの頂点を検出した後、上記サンプル注入流路から、上記分析流路に切換えることを特徴とする液体クロマトグラフィ分析方法。
【請求項１６】
請求項１０記載の液体クロマトグラフィ分析方法において、
サンプリング流路であるのか、サンプル注入流路であるのか、分析流路であるのかを表示手段に表示させることを特徴とする液体クロマトグラフィ分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフ装置に関し、特に、試料容量が多い分取システムやサンプルを短時間で多量の処理が要求される液体クロマトグラフ装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフ装置は、溶液を送液するポンプと、分析すべき試料を試料吸引部と、分離カラムと、検出器と、試料吸引部と分離カラム及びポンプとの接続及び分離を選択する流路切換えバルブとが備えられている。
【０００３】
このような装置構成における液体クロマトグラムの試料分析においては、分析開始後、オートサンプラ（試料吸引部と切換えバルブ）にて測定試料をある一定量、試料吸引部に吸引する。
【０００４】
次に、流路切換えバルブの流路を切換えることにより、試料吸引部とポンプ及び分離カラムとが接続され、試料吸引部内の試料が切換えバルブを介して分離カラムに導入される。
【０００５】
それと同時に、ポンプにおいてグラジェントプログラムが開始され、多種類の移動相が時間とともにそれらの移動相の互いの混合比率が変化される。これにより、分離カラムにて分離した各成分は、その後、検出器に導入され、この検出器でピークとして検出される。
【０００６】
上記クロマトグラフ装置の構成及び分析方法は、例えば、特許文献１に記載されている。
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−９８６７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記従来技術においては、ポンプにて移動相混合比を変更した場合、変更した移動相は、流路切換えバルブ→試料吸引部→流路切換えバルブを経て分離カラムに到達する。従って、ポンプにて変更した移動相混合比が分離カラムに到達して分離に影響を与えるまでに、試料吸引部を経由していた。
【０００９】
しかしながら、移動相が試料吸引部を経由すると、試料吸引部及びこの試料吸引部に至る配管の容量分だけ、移動相の分離カラムへの遅れが発生し、測定対象物の検知器への到達も遅れて、検出時間の遅れが発生する。
【００１０】
大量の試料サンプルを注入する必要がある分取システムなどでは必然的に試料吸引流路系の容量が大きくなってしまうため、グラジェント応答性の遅れが分析時間において無視できないほど長くなってしまう場合がある。
【００１１】
例えば、試料吸引部とその配管系の容量が３ｍＬで、ポンプ流量が３ｍＬ／ｍｉｎであれば、試料吸引部とその配管系だけで計算上、１分のグラジェント遅れが発生してしまうこととなる。
【００１２】
また、多量の試料を短時間で分析しなければならない場合では、少しでもスループットを上げるために、なるべくポンプ、分離カラム間の容量を少なくし、グラジェント応答性を良くしなければならない。
【００１３】
そのためには配管の内径を小さくしたり、長さを短くしたりといった方法が用いられるが、それにも限界があり、特に、試料吸引部やその配管系は、導入する試料の分、容量を確保しなければならないため、ある程度のグラジェント遅れが発生するのは避けられなかった。
【００１４】
本発明の目的は、試料吸引流路系と、ポンプ、分離カラム及び検出器を含む溶出流路系との分離及び接続を切換える流路切換えバルブを有する液体クロマトグラム装置において、移動相の分離カラムへの移動時間を短縮し、分析時間を短縮可能な液体クロマトグラム装置及び液体クロマトグラフィ分析方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明による液体クロマトグラフ装置は、溶液を送液するポンプと、液体試料を吸引する試料吸引部と、注入された試料から被測定成分を分離する分離カラムと、この分離カラムにより分離された被測定成分を検出する検出器と、ポンプ、試料吸引部、分離カラムとの接続流路を切換える流路切換えバルブと、ポンプ、試料吸引部、検出器及び流路切換えバルブの動作を制御する制御部とを有する。
【００１６】
そして、上記制御部は、流路切換えバルブを、試料吸引部からポンプ、分離カラム及び検出器を分離するサンプリング流路に設定し、試料吸引部により試料を吸引させ、流路切換えバルブの流路を切換えて、ポンプから、試料吸引部を介して、分離カラムに至るサンプル注入流路に設定し、ポンプからの送液により試料吸引部に吸引された試料を上記分離カラムに移動させて被測定成分を分離させ、流路切換えバルブの流路を切換えて、上記試料吸引部を、上記ポンプ、分離カラム及び検出器と分離する分析流路に設定し、ポンプからの溶液の送液により、分離カラムにより分離された成分を上記検出器に移動させる。
【００１７】
本発明による液体クロマトグラフィ分析方法は、試料吸引部と、溶液を送液するポンプと、試料から被測定成分を分離する分離カラと、分離カラムにより分離された被測定成分を検出する検出器とを用いて、液体試料を吸引し、溶液を送液して分離カラムにより液体試料から被測定成分を分離し、この分離カラムにより分離された被測定成分を検出する。
【００１８】
そして、上記試料吸引部から上記ポンプ、分離カラム及び検出器を分離するサンプリング流路に設定し、試料吸引部により試料を吸引させ、上記ポンプから、試料吸引部を介して、分離カラムに至るサンプル注入流路に設定し、ポンプからの送液により試料吸引部に吸引された試料を上記分離カラムに移動させて被測定成分を分離させ、上記試料吸引部を、上記ポンプ、分離カラム及び検出器と分離する分析流路に設定し、ポンプからの溶液の送液により、分離カラムにより分離された成分を上記検出器に移動させる。
【００１９】
好ましくは、上記液体クロマトグラフ装置及び液体クロマトグラフィ分析方法において、上記ポンプは、有機溶媒及び水を移動相として送液し、移動相の組成比率を時間と共に変化させることができるグラジェントポンプである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、試料吸引流路系と、ポンプ、分離カラム及び検出器を含む溶出流路系との分離及び接続を切換える流路切換えバルブを有する液体クロマトグラム装置において、移動相の分離カラムへの移動時間を短縮し、分析時間を短縮可能な液体クロマトグラム装置及び液体クロマトグラフィ分析方法を実現することができる。
【００２１】
また、グラジェント分析において、特別な装置なしに簡単にグラジェント分析でのグラジェント開始を早め、分析サイクルを短くすることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の実施形態を添付図面を参照して説明する。  
図１は、本発明が適用される液体クロマトグラフ装置の概略構成図である。  
図１において、試料を吸引して流路に導入するための試料吸引流路系７は、流路切換えバルブ８の流路切換えにより、ポンプ３からの送液が、試料吸引流路系７に供給され、この試料吸引流路系７から試料等が分離カラム５に供給される。
【００２３】
また、移動相（有機溶媒、水）１、２は、グラジェント装置（移動相１と２との混合比率を時間経過と共に変化可能な装置）を内蔵したポンプ３により、ある混合比率と流量により、配管９、流路切換えバルブ８、配管１０を介して分離カラム５に送液される。
【００２４】
分離カラム５にて分離した各分離成分はその後、検出器６に送液され、この検出器６により検知される。
【００２５】
なお、流路切換えバルブ８及び試料吸引流路系７によりオートサンプラ４が構成されている。
【００２６】
制御部１３は、ポンプ３、オートサンプラ４（切換えバルブ８の流路切換え動作）の動作を制御する。また、制御部１３は、検出器６による検出結果や、バルブ８の流路切換え状態等を表示部１４に表示させる。
【００２７】
図２は、本発明の第１の実施形態における流路切換えバルブ８の流路切換え動作説明図である。
【００２８】
図２の（Ａ)に示すサンプリング工程において、分析開始後、まず、試料が試料吸引流路系７に導入される。このとき、流路切換えバルブ８は、ポンプ３及び分離カラム５と、試料吸引系７との流路を分離する設定となっている。
【００２９】
次に、図２の（Ｂ）に示すサンプル注入工程において、流路切換えバルブ８の流路が切換えられ、試料吸引流路系７とグラジェント溶出流路系（ポンプ３、分離カラム５、検出器６）とが接続され、試料がグラジェント流路系に導入される。
【００３０】
次に、図２の（Ｃ）に示すグラジェント分析工程において、グラジェントプログラム開始による移動相組成変化が、流路切換えバルブ８に到達するまでに流路切換えバルブ８を作動させ、試料吸引流路系７をグラジェント溶出流路系と切り離してしまう。
【００３１】
ここで、流路切換えバルブ８による、試料吸引流路系７からグラジェント溶出流路系からの切換えタイミングについて説明する。
【００３２】
移動相がポンプ３から流路切換えバルブ８に到達するまでの時間は、ポンプ３の送液能力、配管９の径及び長さ、送液する移動相の種類から算出することができる。この移動相到達時間と、余裕時間（到達変動時間）とを考慮して、流路切換えバルブ８の切換えタイミングを決定することができる。
【００３３】
したがって、グラジェント分工程が開始されるタイミング、つまり、ポンプ３からの移動相１、２の送液開始タイミングから、上記移動相到達時間、余裕時間を加味した時間だけ遅延して、流路切換えバルブ８を、図２の（Ｂ）から（Ｃ）に切換える。
【００３４】
ここで、上記余裕時間は、測定条件や測定時間等により、移動相到達時間が常に設定時間とは限らないため、安全を考慮した時間である。
【００３５】
以上のようにして、流路切換えバルブ８の切換えタイミングを設定すれば、グラジェント分析工程で、試料吸引流路系７をグラジェント溶出流路系と切り離し、移動相を、試料吸引流路系７を介すること無く、分離カラム５に供給することができる。
【００３６】
これにより、移動相１、２のポンプ３から分離カラム５への移動時間（到達時間）を短縮して、分析時間を短縮することができ、分析時間を短縮可能な液体クロマトグラム装置及び液体クロマトグラフィ分析方法を実現することができる。
【００３７】
図３は、本発明の一実施形態が適用された液体クロマトグラフ装置であるＰＴＨ−アミノ酸分析システムの概略構成図である。
【００３８】
ペプチドのＮ末端からアミノ酸残基を切り出す所謂エドマン分解では、３−フェニル−２−チオヒダントイン誘導体（ＰＴＨ−アミノ酸）が生成される。
【００３９】
本発明による分析システムは、ペプチドのシーケンシングを実施するわけではないが、遊離のアミノ酸単分子をＰＴＨアミノ酸に誘導体化し測定するものである。プレカラム誘導体化試薬にはフェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）を用い、試料を分離カラム５に注入する前に、オフラインで、即ちオートサンプラ４上の５４℃の恒温状態にした反応ポート１１の上で１０分間誘導体化反応を行わせる。
【００４０】
誘導体化されたＰＴＨアミノ酸は１０μＬオートサンプラ４のニードルから吸引され、流路切換えバルブ８を経由して、逆相クロマトグラフィ用分離カラム５（内径２．１ｍｍ、長さ５０ｍｍ）に送り込まれる。
【００４１】
ＰＴＨアミノ酸の各成分は、流量０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液される溶離液（Ａ液１：０．０２ｍｏｌ／Ｌ、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、Ｂ液２：３％（Ｖ／Ｖ）、ジクロロエタン添加アセトニトリル）によりグラジエント溶出され、カラムオーブン１２内の分離カラム５内で分離展開された後に紫外検出器６（波長：２５０ｎｍ）で検出される。クロマトグラム分析時間は１０分間で測定される。
【００４２】
図４は、本発明と従来技術とを比較するための、標準試料での測定結果を示す図である。図４の（Ａ）が従来技術により得られたクロマトグラムであり、図４の（Ｂ）が、本発明により得られたクロマトグラムである。本発明においては、サンプル注入後、３０秒後に流路切換えバルブ８により試料吸引流路系をグラジェント溶出流路系から切り離した場合のクロマトグラムである。
【００４３】
図４の（Ａ）に示すクロマトグラムに比べて、図４の（Ｂ）に示す下段のクロマトグラムは、分離精度が同等の状態で、ピーク溶出時間（特に後半のピーク）が早期に検出されていることが分かる。
【００４４】
また、本発明が適用される他の例としては、分取システムが挙げられる。
【００４５】
この分取システムでは、例えば、ポンプ流量３ｍＬ／ｍｉｎ、試料吸引流路系７の容量３ｍＬ、分離カラム５が内径１０ｍｍ、長さ１００ｍｍ、分析時間１０ｍｉｎの分析の場合、従来技術による結果と本発明技術による結果では、試料吸引流路系容量／流速＝１（ｍｉｎ）のグラジェント溶出遅れに差が出ることになり、分析サイクル時間の実に１／１０を短縮することが可能となる。
【００４６】
さらに、高速分析を目的とする実施形態として、特定のクロマトグラム・ピークを検出してから、速やかに試料吸引流路系をグラジェント溶出流路系から切り離す、即ち、切換えバルブ８を切換える所謂フィードバック切換え方式がある。
【００４７】
上述のように、タイムプログラムにより、流路切換えバルブ８を切換える方式では、測定条件や測定時間等により、移動相到達時間が常に設定時間とは限らないため、安全を考慮した余裕時間が必要である。
【００４８】
つまり、バルブ８の切換え時間に、若干余裕を持たせる必要があるため、数秒〜数十秒の遅れが出ると考えられる。
【００４９】
この余裕時間は、必要であると考えるが、できる限り短時間とすることが望ましい。
【００５０】
本発明の実施形態であるフィードバック切換え方式では、上記余裕時間を短縮するため、特定のピークの立ち上がり時間またはピーク頂点時間を、検出器６による検出値を制御部１３が検知して、一定の短時間のディレイタイム（余裕時間）を設けて、流路切換えバルブ８を切換える。
【００５１】
あるいは、一つ前の出現ピークを検出し、一定のディレイタイム後に流路切換えバルブ８を切換える構成であってよい。
【００５２】
このフィードバック切り替え方式は、遅れ時間を最小化できるため分析サイクルの高速化を実現できる。
【００５３】
本発明の液体クロマトグラム装置において、上記サンプリング工程、サンプル注入工程、グラジェント分工程の各工程毎に、表示部１４により、その工程期間中であることを表示させることもできる。そして、その期間中における流路切換えバルブ８の設定流路を、例えば、図２に示すように、表示することも可能である。
【００５４】
上述した液体クロマトグラム装置の一連の動作は、コンピュータプログラムに基づき、動作制御部１３（コンピュータ））が実行する。
【００５５】
なお、上述した例は、本発明をグラジェント分析装置及び方法の適用した場合の例であるが、グラジェント分析のみならず、混合比を変化させない有機溶媒等の溶液をポンプ３で送液する液体クロマトグラフ装置及びこの液体クロマトグラフ装置の動作方法に適用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明が適用されるる液体クロマトグラフ装置の概略構成図である。
【図２】本発明の一実施形態の各動作工程における流路切換えバルブの流路設定状態の説明図である。
【図３】本発明が適用されるＰＴＨ−アミノ酸分析システムの概略構成図である。
【図４】本発明と従来技術との効果を比較するためのクロマトグラムを示す図である。
【符号の説明】
【００５７】
１、２        移動相
３            ポンプ
４            オートサンプラ
５            分離カラム
６            検出器
７            試料吸引流路系
８            流路切換えバルブ
９、１０      配管
１１          反応ポート
１２          カラムオーブン
【図１】
2007121192.tif 000003
【図２】
2007121192.tif 000004
【図３】
2007121192.tif 000005
【図４】
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