(57)【要約】【課題】  新規の有用な育毛剤を提供すること。【解決手段】  ダイズタンパク質のサーモリシン分解物を含有せしめることにより、顕著に高い育毛効果を有する新規の有用な育毛剤を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイズタンパク質のサーモリシン分解物を含有する育毛剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、育毛剤ならびにそれに関連する発明に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、老若男女を問わず毛髪への関心は強くなっている。特に美容上、頭髪量の減少は、精神的なコンプレックスを生むことが多く、ＱＯＬ（＝Quality of Life）の悪化を招きやすい。
【０００３】
ヒトを含む動物の毛組織は、ヘアサイクル（毛周期ともいう）と呼ばれる周期をもって絶えず変化している。このヘアサイクルを司り、各ステージの移行に深く影響を与えるのは、毛組織の中央底部に位置する間葉系組織由来の毛乳頭細胞とも言われている。また近年この毛乳頭細胞は、毛包の大きさに影響を与え、ひいては、その毛包から生えてくる毛の太さに影響を与えることも知られている（非特許文献１等）。
【０００４】
また毛組織では、かかる毛乳頭細胞を取り囲むようにして、毛包上皮細胞が存在する。毛包上皮細胞のうち毛乳頭細胞と接する部分にあるのが毛母細胞であり、ヘアサイクルの成長期にはこの毛母細胞が増殖して毛が作り出される。さらに毛包上皮細胞のうち毛の周囲を取り巻く外毛根鞘細胞は、毛母へ新しい細胞を供給したり、ヘアサイクルを円滑に進めるうえで重要な役割を担ったり、休止期毛がすぐに抜け落ちてしまわないように留めておく機能等があることが知られている。
【０００５】
ヘアサイクルでは、成長期が満ちると、毛母細胞にアポトーシスが誘導される。そして、ヘアサイクルは退行期へ、続いて休止期へと移行し、毛の成長は停止する。休止期においては、毛乳頭細胞は不明瞭になり、毛包は短く萎縮して皮膚の中で浅く位置する。そして一定期間経過後、再び毛母細胞の増殖が起こり、古い毛が抜け、新しい毛が生える早期成長期となる。そして時間が経つにつれ、毛包は大きく長くなって皮膚中深く位置する後期成長期毛包となる。健全な毛組織ではこのサイクルを繰り返して毛を作り出している。
【０００６】
一般には、毛の太さは成長期に生育する毛包の大きさにほぼ比例し、毛の長さは成長期の期間の長さに比例して決定されると考えられている。健康な毛髪の約90％以上は成長期にあると言われており、この時期に毛母細胞が盛んに分裂・増殖を繰り返して、毛は太く長く成長する。一方、この時期が短くなると、毛は細いまま十分に成長できず薄毛の原因となる。そして毛が十分に成長する前に抜け落ちてゆき、毛はどんどん細くなって産毛のような状態となり、また徐々に成長期に移行しない毛包も増えて、最終的に脱毛状態に至ることが知られている。
【０００７】
こうした薄毛・脱毛状態を予防又は改善するために、これまでにも様々な育毛剤が開発されている。例えば、毛包周辺組織の新陳代謝を促進したり、毛包周辺組織の血流を増大させて毛母細胞などの毛包上皮細胞の増殖を促進するために、プラセンタエキス、ニンジンエキス、センブリエキス、パントテン酸、ビタミンＥ、トウガラシチンキ、ニコチン酸誘導体、ミノキシジルなどが育毛剤に用いられている。また毛包組織間の相互作用に関与しうるパラクリン因子（特に、毛の発育を司る鍵となっている毛乳頭細胞に発現するパラクリン因子）である、繊維芽細胞成長因子ファミリーに属するFGF-10を有効成分として含む育毛剤も提案されている（特許文献１）。
【０００８】
【非特許文献１】Colin A.B.Jahoda、Development 115、1103-1109、1992
【特許文献１】特開平１０−２７９５０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、更なる有用な高い育毛効果を有する新規の育毛剤の開発が強く望まれている。またそうした育毛剤には、単に量的に高い育毛効果があるだけでなく、早期に育毛効果が認められるものであることも強く望まれている。さらに生体に適用するものであるので、安全な素材を利用したものであることも望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、ダイズタンパク質をサーモリシンで分解して得られる産物が、顕著に高い育毛効果を有し、しかもその育毛効果が非常に早期から認められ、尚且つ安全な素材であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
従って、本発明は以下を提供する。
（１）ダイズタンパク質のサーモリシン分解物を含有する育毛剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、顕著に高い育毛効果を有する新規の有用な育毛剤が提供される。特に本発明の育毛剤は、単に量的に高い育毛効果が認められるのみならず、生体に適用した後極めて早期から育毛効果が認められるという点においても、非常に有益である。また、ダイズタンパク質の分解物は、これまでにも食品添加物等として利用されてきた素材であり、生体に対して安全であるという点においても有益である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書の全体にわたって、単数形の表現は、特に他に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書中において使用される用語は、特に他に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられていることが理解されるべきである。
【００１４】
本発明の育毛剤は、ダイズタンパク質のサーモリシン分解物を含有することを特徴とする。
【００１５】
ダイズ（Glycin max）は、背丈約６０〜７０ｃｍ程度となるマメ科の一年草植物である。その種子は、枝豆などとして、あるいは豆腐や味噌、醤油などに加工されて、食用に供されることが多いことで知られる。
【００１６】
本発明に用いられるダイズタンパク質は、かかるダイズ植物に由来する任意のタンパク質であり得るが、好ましくは、ダイズ植物の種子に由来する任意のタンパク質であり得る。
【００１７】
本発明においては、ダイズタンパク質の供給源として、ダイズ植物そのものやダイズ植物の種子そのもの、或いは該植物や該種子の破砕物又は粉砕物等を用いてもよいが、好ましくはダイズ植物中の全成分からタンパク質成分を分離・精製したもの、より好ましくは、ダイズ植物の種子中の全成分からタンパク質成分を分離・精製したものが用いられる。このように分離・精製して得られたダイズタンパク質は、それをサーモリシンで分解して得られる産物が育毛効果を有する限り、ダイズ植物またはダイズ植物の種子中に含まれる実質的に全種類のタンパク質を含むものでもよいし、一部の種類のタンパク質を含むものであってもよい。
【００１８】
ダイズタンパク質としては、市販品も好適に用いることができ、例えば、日清コスモフーズ（株）、ＡＤＭファーイースト（株）、昭和産業（株）、不二製油（株）、（株）光洋商会などの製造業者または供給業者から容易に入手可能である。
【００１９】
なお本明細書において、ダイズ植物の種子とは、ダイズ種子と通常呼ばれる構造物全体を指すのみならず、例えば、脱皮ダイズ種子、脱脂ダイズ種子（粉末状のもの等）、ダイズ種子全体より得られる雪花菜（オカラ）、豆乳等でもあり得る。
【００２０】
本発明に用いられるサーモリシン（EC3.4.24.4）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓという耐熱性菌によって生産される耐熱性のプロテアーゼとして周知のものである。サーモリシンは一般に、大きな側鎖をもった疎水性のアミノ酸残基（例えば、イソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、アラニンなど）のアミノ基側のペプチド結合を切断することが知られている。
【００２１】
サーモリシンとしては、市販品も好適に用いることができ、例えば、大和化成（株）などの製造業者から容易に入手可能である。
【００２２】
また本発明においては、サーモリシンと同等のペプチド切断特性（切断配列特異性など）を有するプロテアーゼとして当該分野で公知のプロテアーゼもまた、サーモリシンとして用いることができる。
【００２３】
ダイズタンパク質をサーモリシンで分解する場合に用いられる反応条件は、特に制限されず、技術常識に従って当業者により適宜選択され得る。例えば、市販のサーモリシンを使用する場合には、その使用説明書に従って使用することができる。具体的な例としては、水などの溶媒に、ダイズタンパク質濃度が、一般的には０．１〜３０％（ｗ/ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ/ｖ）程度となるようにダイズタンパク質又はダイズタンパク質を含む原料を懸濁し、この懸濁液に、一般的には０．００１〜３％（ｗ/ｖ）、好ましくは０．０１〜０．１２５％（ｗ/ｖ）程度となるようにサーモリシンを加えて分解反応を行う態様が挙げられる。一般的には、３０〜８０℃、好ましくは４０〜７０℃、より好ましくは５０〜６０℃の反応温度が使用され得る。また一般的には、２〜３０時間、好ましくは３〜２４時間、より好ましくは１０〜２０時間、さらに好ましくは１２〜１８時間の反応時間が使用され得る。反応液のｐＨとしては、サーモリシンの至適ｐＨ付近であることが好ましく、例えば７．０〜８．５付近であることが好ましい。
【００２４】
反応の停止手段についても、特に制限はなく、公知の手段を用いることができる。かかる手段としては、例えば、加熱処理等が挙げられる。例えば、上記反応物を８０〜１００℃程度の温度で３〜２０分間、好ましくは５〜１５分間、加熱処理することにより、反応物中に含まれるサーモリシンを失活させることができる。例えば、かかる加熱処理としては、８５℃で１５分間の加熱処理や１００℃で５分間の加熱処理などが挙げられる。
【００２５】
上記のような分解反応により得られるサーモリシン分解物は、必要に応じて、当業者に公知の任意の方法によりさらに処理され得る。例えば、ろ過等の処理により、該分解物中の大きな固体粒子を取り除くことが好ましい。ろ過条件等は、特に制限されず、技術常識に従って当業者により適宜選択され得る。例えば、ろ紙が目詰まりを起こしやすい場合等には、ろ過助剤等も好適に用いられ得る。
【００２６】
また、前記分解物を減圧濃縮し、次いで凍結乾燥することにより、粉末化することもできる。減圧濃縮および凍結乾燥の際に使用される条件や機器類は、特に制限されず、技術常識に従って当業者により適宜選択され得る。このようにして粉末化された分解物は、そのまま又は水などの溶媒に溶かして、用いることができる。
【００２７】
本発明に用いられる分解物は、ダイズタンパク質をサーモリシンで分解することにより生じた多種多様なペプチドを実質的に全て含んだ状態であってもよいし、又は、そのような多種多様なペプチドを、本発明の育毛効果の有無を指標として、公知の方法でさらに分画・精製して得られる一部分などであってもよい。そのような分画・精製して得られる一部分としては、例えば、水や親水性有機溶媒（メタノールやエタノールなど）又はこれらの混合溶媒などの一般的な抽出溶媒で抽出される一部分などを使用することができ、例えば、本願発明には、９０容量％エタノール抽出法、８０容量％エタノール抽出法、７０容量％エタノール抽出法、５０容量％エタノール抽出法、３０容量％エタノール抽出法などにより抽出して得られる一部分などを使用することができる。しかし簡便には、ダイズタンパク質をサーモリシンで分解して得られる多種多様なペプチドを実質的に全て含んだ状態でそのまま用いる。なお、本発明の育毛効果の有無は、例えば、後述の実施例等に記載のようにして確認することができる。
【００２８】
本発明に用いられるダイズタンパク質のサーモリシン分解物の平均分子量は、好ましくは３００〜１００００である。該平均分子量は、細胞への浸透性を高めてより高い効果を得る観点から、より好ましくは４００〜５０００であり、さらに好ましくは５００〜３５００であり、さらにより好ましくは５５０〜３２００であり、特に好ましくは１０００〜２０００である。分解物の平均分子量は、当業者に公知の任意の方法により測定することができ、例えば、後述の実施例に記載のようにしてゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法により容易に測定することができる。
【００２９】
本発明の育毛剤の適用量は、特に制限されないが、通常は、その中に含まれるダイズタンパク質のサーモリシン分解物の投与量が、０．００１〜１０００μｇ／ｃｍ２／日となるような量、好ましくは当該投与量が０．０１〜５００μｇ／ｃｍ２／日となるような量、さらに好ましくは当該投与量が０．１〜３００μｇ／ｃｍ２／日となるような量とするのがよい。
【００３０】
上記のような投与量とするために製剤処方する際の、本願育毛剤中におけるダイズタンパク質のサーモリシン分解物の含有量を例示すると、例えば、０．０００１〜１００重量％、より好ましくは０．００１〜８０重量％、さらに好ましくは０．０１〜５０重量％、特に好ましくは０．１〜３０重量％などであり得る。
【００３１】
後述の実施例に示すように、かかるダイズタンパク質のサーモリシン分解物を用いることにより、顕著な育毛効果が得られることが確認されている。
【００３２】
本明細書において用語「育毛」とは、発毛や養毛、脱毛予防などとも呼ばれる概念をも含む広義の意であり、例えば、毛包内で毛の新たな発生を促したり、また既に毛包内で発生した毛を健全に発育させたりすることなどのように、毛の発育・成長を促すように毛に有利にはたらく全ての作用を包含する。なお、ここで毛とは、ヒトを含む動物における身体に生える任意の毛を意味し、例えば、毛髪、頭髪、眉毛、睫毛、口髭、顎鬚、胸毛、背部毛などのあらゆる体毛を意味し得る。
【００３３】
育毛効果を有することの確認は、例えば、生体（例えば、ヒト頭皮やマウス背毛部など）に被験物を適用（例えば、塗布又は噴霧等）して、毛の発生量や発生速度の増加等を観察することによっても可能であるし、或いは後述の実施例に記載のようにして、毛乳頭細胞や毛包上皮細胞（毛母細胞や外毛根鞘細胞を含む）などに被験物を作用させて、その細胞数の増加等を観察することによっても可能であるし、または毛包器官培養系（例えば、ラットの髭器官培養毛）に被験物を作用させて、その培養毛の伸長度を観察することなどによっても可能である。
【００３４】
特定の好ましい実施形態において、本発明の育毛剤は、適用（例えば、塗布又は噴霧等）後、早期に育毛効果が認められるものである。例えば、本発明の育毛剤は、下記実施例５と同様にしてマウスに適用し剃毛部皮膚の明度(L*値)変化を見た場合に、塗布開始から約３週間目には早くもL*値の低下が認められるものである。また例えば、本発明の育毛剤は、下記実施例５と同様にしてマウスに適用し発毛面積率(％)の変化を見た場合に、塗布開始から３週間目には早くも約３０％程度の発毛面積率が認められるものである。さらに例えば、本発明の育毛剤は、下記実施例５と同様にしてマウスに適用し発毛個体数の変化を見た場合に、塗布開始から約１２日目には早くも発毛個体が現れ、また約２２日目には早くも塗布したほぼ全個体において発毛が認められるようなものである。
【００３５】
本発明の育毛剤は、有効成分としてダイズタンパク質のサーモリシン分解物のみを含むものであってもよいが、必要に応じてさらなる種々の他の有効成分を含んでいてもよい。このような他の有効成分としては、例えば、細胞賦活剤、血行促進剤、抗男性ホルモン剤、皮脂分泌抑制剤、免疫抑制剤、抗ヒスタミン剤、殺菌消毒剤、局所刺激剤、角質軟化剤、消炎剤、抗アポトーシス剤等が挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、例えば、パントテン酸およびその誘導体、プラセンタエキス、感光素、ニンジンエキス、ビオチン、モノニトログアヤコール、塩化カルプロニウムまたはその水和物、ビタミンＥおよびその誘導体、センブリエキス、トウガラシチンキ、セファランチン、ニコチン酸およびその誘導体、エストラジオール、エチニルエストラジオール、ランジック酸、ミノキシジルおよびその類縁体や誘導体、5α還元酵素阻害剤、12-テトラデカノイルフォルボル-13-アセテート（12-Tetradecanoylphorbol-13-acetate）、オウセイ、カギカズラ、オオアザミ、ヘンナ、カンゾウといった生薬、安息香酸エストラジオール、ジフェンヒドラミン、レゾルシン、ヒノキチオール、ｌ-メントール、トウガラシチンキ、サリチル酸、カシュウ成分、チクセツニンジン成分、パンテノール、二硫化セレン、塩酸ピリドキシン、ジピリジオンZn、オクトピロックス、ジンクピリチオン、イオウ、ピロクトンオラミン、グリチルレチン酸ステアリル、グリチルリチン酸ジカリウム、アラントイン、ジアルキルモノアミン誘導体、センブリ抽出液、シソエキス、ブクリョウエキス、β−グリチルレチン酸、硝酸ミコナゾール、安息香酸、サリチル酸ナトリウム、フィトステロール、ワイン酵母エキス、タカナール、エチニルエストラジオール、イソプロピルメチルフェノール、セファランチンビオチン、D-パントテニルアルコール、ジアルキルモノ誘導体、ヒウキオコシエキス、ボタンエキス、シナノエキス、エピネエキス、ソフォラ抽出エキス、クララエキス、クジンエキス、ショウキョウエキス、6-ベンジルアミノプリン、ペンタデカン酸グリセリド、ｔ-フラバノン、クアチャララーテエキス、アマチャ抽出エキス、アデノシン等が、１種または２種以上組合せて用いられ得る。
【００３６】
また上述のような他の有効成分の含有量は、所望される効果や適用される被験体の年齢、性別、状態などの種々の要因により適宜変動され得るが、例えば、育毛剤の全体重量に対して０．００１〜５０重量％、好ましくは０．００１〜１０重量％、より好ましくは０．００１〜５重量％などであり得る。
【００３７】
本発明の育毛剤は、本願効果や製剤的安定性、生体への安全性などを損なわない限りにおいて、上記成分の他に用途あるいは剤形などに応じて、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品などに通常使用され得る任意の成分を適宜配合しても良い。配合できる成分としては、特に制限されないが、例えば、担体、基剤、添加剤などが挙げられる。具体的には、例えば、糖類(例えば、マンニトール、乳糖、デキストラン等)、セルロース類(例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、結晶性セルロース等)、水難溶性ガム類(例えば、アラビアガム、トラガントガム等)、架橋ビニル重合体、脂質類、水、油脂類、鉱物油類、ロウ類、脂肪酸類、シリコーン油類、ステロール類、エステル類、金属石鹸類、アルコール、界面活性剤、可溶化成分、乳化剤、油分、安定化剤、増粘剤、防腐剤、結合剤、滑沢剤、分散剤、ｐＨ調整剤、保湿剤、紫外線吸収剤、キレート剤、経皮吸収促進剤、抗酸化剤、崩壊剤、可塑剤、緩衝剤、ビタミン類、アミノ酸類、着色剤、香料等が、１種または２種以上組合せて用いられ得る。さらに本発明の育毛剤は、より効果的に用いるために、リポソームのような公知のＤＤＳ担体とともに用いることも好ましい。
【００３８】
本発明の育毛剤は、当該分野で公知の任意の方法を利用して、ダイズタンパク質のサーモリシン分解物を配合し、さらに必要に応じて上述のような他の有効成分や担体、基剤、添加剤等を配合することにより、常法で製造することができる。
【００３９】
本発明の育毛剤は、医薬品、医薬部外品、食品、化粧品などとして幅広く利用可能な任意の製剤であり得るが、好ましくは、医薬品、医薬部外品、または化粧品として利用可能な製剤である。
【００４０】
本発明の育毛剤の剤形は特に制限されず、任意の剤形をとることができる。例えば、本発明の育毛剤は、内服剤、外用剤、注射用剤などであり得るが、好ましくは外用剤である。
【００４１】
外用剤としては、医薬品、医薬部外品、化粧品などで一般的な任意の形態をとり得、例えば、液状、乳液状、クリーム状、ローション状、ペースト状、ムース状、ジェル状、シート状（基材担持）、エアゾール状、スプレー状、オイル状、パック状、ゲル状、軟膏状などの形態であり得るが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明の育毛剤は常法に従って用いられる。例えば、外用剤の場合には、育毛効果の望まれる箇所（例えば、頭部）の部分の皮膚に、直接塗布又は噴霧等をすることによって適用することができる。また本発明の育毛剤は、その形態や所望される効果の程度等に応じて、１日あたり１回から複数回（例えば、２回、３回など）に分けて投与することができる。
【実施例】
【００４３】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４４】
［実施例１：ダイズタンパク質のプロテアーゼ分解物の調製］
＜１＞  ダイズタンパク質のサーモリシン分解物の調製
粉末状分離ダイズタンパク質（製品名「PR-800」、不二製油株式会社製）50gを2Ｌの蒸留水に分散し、0.1N NaOHでpH8.0に調整した。500mgのサーモリシン（EC3.4.24.4、Bacillus thermoproteolyticus由来、製品名「サモアーゼPC10F」、大和化成株式会社製、100 units/mg）を添加して、60℃で15時間での分解を行なった。反応後、100℃で10分間煮沸してサーモリシンを失活させた。放冷後、25gのろ過助剤（ラジオライト500、昭和化学工業株式会社）を添加し、撹拌した後、ろ過を行なった。得られたろ液を500ｍｌまで減圧濃縮し、その後凍結乾燥をして、最終的に約26ｇのダイズタンパク質サーモリシン分解物を得た。
【００４５】
このようにして得られた分解物の平均分子量をＧＰＣ法により測定した。凍結乾燥後のサーモリシン分解物１００ｍｇを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２．０ｍｌ中に溶解し、被験溶液とした。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５（Ｍｅｄｉｕｍタイプ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を充填したカラム（φ２．６×１００ｃｍ）を、同じ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した。このカラムに被験溶液を２．０ｍｌ負荷して、流速１．０ｍｌ／分で溶出した。分子量既知のペプチド標品として、Ｉｎｓｕｌｉｎ（ウシ膵臓由来、シグマ社製、分子量５７３３）、Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ａ  ｃｈａｉｎ（ウシ膵臓由来、シグマ社製、分子量２５３２）、およびＢｒａｄｙｋｉｎｉｎ（シグマ社製、分子量１０５０）を用いた。２１４ｎｍでペプチドを検出し、溶出時間から分子量分布および平均分子量を推定した。その結果、上記方法により得られたダイズタンパク質のサーモリシン分解物の平均分子量は、約１５００であることが推定された。
【００４６】
＜２＞  ダイズタンパク質のトリプシン分解物の調製
トリプシンは、サーモリシンとは異なるペプチド切断配列特異性（具体的には、塩基性アミノ酸残基のカルボキシル基側のペプチド結合を切断する）を有する、公知のプロテアーゼである。
そこで比較のため、サーモリシンの代わりにトリプシンを使用した以外は実質的に上記調製方法と同様にして、ダイズタンパク質のトリプシン分解物を調製した。
【００４７】
具体的には、粉末状分離ダイズタンパク質（製品名「PR-800」、不二製油株式会社製）50gを2Ｌの蒸留水に分散し、0.1N NaOHでpH8.0に調整した。500mgのトリプシン（EC3.4.21.4、製品名「トリプシンＶ」、日本バイオコン（株）製、1200units/mg）を添加して、55℃で23時間での分解を行なった。反応後、100℃で10分間煮沸してトリプシンを失活させた。放冷後、25gのろ過助剤（ラジオライト500、昭和化学工業株式会社）を添加し、撹拌した後、ろ過を行なった。得られたろ液を500ｍｌまで減圧濃縮し、その後凍結乾燥をして、最終的に約28ｇのダイズタンパク質トリプシン分解物を得た。
【００４８】
［実施例２：ヒト毛乳頭細胞増殖促進試験］
近年、生体における毛包の大きさは毛乳頭細胞の体積に影響されるという報告がされている。また毛乳頭細胞は、毛周期の各ステージの移行に影響を与えることも知られている。従ってこれらの知見より、毛乳頭細胞の増殖を活性化することにより、毛包を大きくして毛を太くでき、またヘアサイクルを健全にして育毛効果を高めることができる。そこで、ヒト毛乳頭細胞の増殖に対する本発明のサーモリシン分解物の効果を調べるために、以下の実験を行った。
【００４９】
まず、ヒト頭髪毛乳頭細胞（東洋紡績(株)製、ヒト頭髪毛乳頭細胞adult 、Code No.CA60205）を10％FCS-DMEMで懸濁し、コラーゲンＩをコーティングした96穴培養プレート（旭テクノグラス(株)製、IWAKIマイクロプレート96穴）に2500 細胞/100μL/ウェルで播種し、37℃、5％CO2および95％空気の環境下で一晩培養した。翌日、培養液を吸引除去し、その後1％FCS-DMEMを各ウェルに100μLづつ添加して、さらに一晩37℃、5％CO2および95％空気の環境下で一晩培養した。その翌日、各ウェルをPBSで２回洗浄した。次いで、実施例１で調製したダイズタンパク質のサーモリシン分解物を、0.1ｍｇ/ｍLとなるように1％FCS-DMEMで希釈し、それを100μLづつ各被験ウェル群（n=6）に添加した。一方、1％FCS-DMEMのみを各ウェルに100μLづつ添加したウェル群も作成し、これをコントロール群（n=6）とした。その後２日間にわたり、37℃、5％CO2および95％空気の環境下で培養し、毛乳頭細胞の増殖促進効果を調べた。
【００５０】
毛乳頭細胞の増殖促進効果は、BrdUの取り込み量で評価した。BrdUの定量は、Cell proliferation ELISA,BrdU(colorimetric)キット(ロシュ・ダイアグノスティックス(株)製、製品コード1647299)を用いて行った。このキットをプロトコールに従って使用し、各細胞のBrdU取り込み量をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００５１】
この結果を図１に示す。図１に示される通り、本発明のサーモリシン分解物を添加した被験群では、コントロール群に比べ約116％となり、統計学的にも有意に高いヒト毛乳頭細胞増殖促進効果が有ることが認められた。よって、本発明のサーモリシン分解物は毛乳頭細胞増殖促進効果を奏することにより、毛包を大きくして毛を太くすることができ、またヘアサイクルを健全にして育毛効果を高めることができるものであることが推察された。
【００５２】
［実施例３：マウス毛包上皮細胞増殖促進試験］
毛包において実際に増殖分化して毛になるのは毛母細胞であることが周知である。また、毛の周囲を取り巻く外毛根鞘は、毛母へ新しい細胞を供給したり、ヘアサイクルを円滑に進めるうえで重要な役割を担ったり、休止期毛がすぐに抜け落ちてしまわないように留めておく機能等があることが知られている。従って、毛母細胞や外毛根鞘細胞の数を増加させることにより、育毛効果が高められると考えられる。そこで、毛母細胞や外毛根鞘細胞に対する本発明のサーモリシン分解物の効果を検討すべく、マウス胎児の背部皮膚から、毛母細胞と外毛根鞘細胞とを高密度で含有する毛包上皮細胞を採取し、以下の実験を行った。
【００５３】
生後５日齢のC3H/He N Slc マウス（日本エスエルシー（株）から購入）６匹の背部皮膚を剥ぎ取り、10ｍL  PBSで3回洗浄した。洗浄した背部皮膚は、5％DMEM中に溶解した500 Units/mL  ディスパーゼＩ（持田科学）中で一晩処理した。処理後、表皮と真皮を分離し、5％DMEM中に溶解した0.25％コラゲナーゼＩ(新田ゼラチン（株）製)中において、真皮を37℃で1時間にわたり処理した。処理後1000rpm で５分間遠心分離し、上清を除去後、細胞群をPBS中に懸濁し、その後15分間静置した。次いで上清を除去し、さらに15分間静置した。この操作を3回繰り返した。その後、PBSで懸濁した細胞を1000rpmで遠心したのち上清をすて、3ｍL  0.25％トリプシン-1mM EDTAを添加し、室温で5分間懸濁した。5分後、3ｍL  FCS及び20ｍL PBS を添加し、次いで100μm メッシュを用いて残渣を除去した。濾液に存在する毛包上皮細胞を1000rpmで５分間遠心分離した後、10％DMEM中に懸濁し、コラーゲンＩをコーティングした96穴培養プレート（旭テクノグラス(株)製、IWAKIマイクロプレート96穴）に6×105細胞/100μL/ウェルで播種し、37℃、5％CO2および95％空気の環境下で一晩培養した。翌日、培養した各ウェルをPBSで２回洗浄した。5μg/mL Insulin（シグマアルドリッチジャパン(株)製）、10μg/mL hTransferin（シグマアルドリッチジャパン(株)製）、5ng/mL EGF（シグマアルドリッチジャパン(株)製）、35μg/mL BPE（極東製薬工業(株)製）、0.5μg/L Hydrochortizone（シグマアルドリッチジャパン(株)製）、6.1μg/L thanolamine（シグマアルドリッチジャパン(株)製）、および14mg/L o-phenylenediamine（シグマアルドリッチジャパン(株)製）を配合した、MCDB153培地（(株)機能性ペプチド研究所製）を用いて、実施例１で調製した本発明のサーモリシン分解物を段階希釈し、これを100μLづつ各被験ウェル群（n=6）に添加した。一方、上記の各成分を配合したMCDB153培地のみを各ウェルに100μLづつ添加したウェル群も作成し、これをコントロール群（n=6）とした。その後２日間、37℃、5％CO2および95％空気の環境下でこれらのウェルを培養し、毛包上皮細胞の増殖促進効果を調べた。
【００５４】
毛包上皮細胞の増殖能はBrdUの取り込み量で評価した。BrdUの定量は、Cell proliferation ELISA,BrdU(colorimetric)キット(ロシュ・ダイアグノスティックス(株)製、製品コード1647299) を用いて行った。このキットをプロトコールに従って使用し、各細胞のBrdU取り込み量をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００５５】
この結果を図２に示す。図２に示される通り、本発明のサーモリシン分解物を添加した被験群では、コントロール群に比べそれぞれ約150％及び約137％と濃度依存的に毛包上皮細胞増殖促進効果が有ることが認められた。これらはいずれも統計学的にも有意なものであった。
【００５６】
上述のようにして得られた毛包上皮細胞は、その大部分が毛母細胞と外毛根鞘細胞で構成される。従って本実施例の結果から、本発明のサーモリシン分解物が、毛母細胞及び外毛根鞘細胞に対する細胞増殖効果があり、即ち毛髪の基となる毛母細胞を増加させ、またその毛母細胞への細胞供給を高め、ヘアサイクルを健全に移行させることができ、休止期毛の脱毛が防止でき、それらの結果として育毛効果を高めることができる可能性が非常に高いものであることが推察された。
【００５７】
［実施例４：ラット髭器官培養毛の伸長促進試験］
本発明のサーモリシン分解物の育毛効果をさらに確証づけるため、毛包の器官培養系としてラットの髭器官培養毛を用いて、以下の実験を行った。
【００５８】
５日齢のWistarラット（日本エスエルシー（株）から購入）を氷冷麻酔し、70％エタノールでその皮膚を消毒した。上皮組織をリン酸緩衝液中に切り出し、実体顕微鏡下において皮下組織側より毛包周囲を微細ピンセットで切り出し、毛包をGIBCO RPMI1640培地（インビトロジェン(株)製）に集めた。採取した髭毛包を器官培養シャーレ（日本ベクトン・ディッキンソン(株)製）のステンレスグリッド上に４本ずつ並べた。次いで、被験ウェル群（n=4）には、GIBCO RPMI1640培地で1mg/mL に調製した実施例１のサーモリシン分解物を500μL添加した。一方、GIBCO RPMI1640培地のみを500μL添加したウェルも作成し、これをコントロール群（n=4）とした。その後、31℃、90％O2、5％CO2及び5％空気条件下で培養を開始した。髭器官培養毛の伸長は培養開始時並びに培養開始から4日後に、毛球部基底部から毛幹先端までをマイクロスコープで測定した。
【００５９】
この結果を図３に示す。図３に示される通り、４日後のコントロール群の平均毛伸長量は101μｍであったのに対し、本発明のサーモリシン分解物を添加した被験ウェル群では平均毛伸長量が731μｍと驚くべきことに７倍にもなり、コントロールと比較して統計学的にも有意な差が認められた。以上のように、本発明のサーモリシン分解物は、器官培養系での成長期毛の顕著な伸長促進効果を有することが認められたことから、生体においても同様に顕著に高い育毛効果を奏し得ることが強く期待された。
【００６０】
［実施例５：マウス背毛部毛の発毛促進試験］
C3Hマウスの背部毛は生後45〜95日が休止期にあたり、この時期に背部毛を剃毛すると、皮膚はピンク色に呈することが知られている。そして毛包が成長期に入ると、皮膚は次第に灰色に変化し、徐々に再生毛が皮膚上に観察されるようになる。この成長期の色調変化は、剃毛部の局所から全体へ拡大するので、剃毛部の面積に対する成長期に入った部分の面積比（％）で算出することにより、育毛促進作用を評価することができる。そこで、本発明のサーモリシン分解物を用いて、C3Hマウスに対する育毛促進効果を評価した。
【００６１】
まず、毛周期が休止期にある8週齢のC3H系雄性マウスの背部被毛を，動物用バリカンと、皮膚表面を傷つけない穏和なタイプの回転式シェーバー (松下電工(株)製、National  ES612)とを用いて丹念に刈り取った。被験群（n=6）では、除毛翌日より週5日間で1日2回、刈毛した背部皮膚に、実施例１で調製した本発明のサーモリシン分解物を40％エタノールで１％に調製したものを0.1 ml塗布し、ゴム手袋をした指で薄く塗り広げてから、30回ほど軽くたたくようにして浸透させた。こうした薬剤の塗布とともに、発毛の前兆である皮膚の黒化が起こった日を記録し、発毛個体数の変化を毎日調べた。実験は除毛後5週間行い、1週間ごとに、背部の明度(L*値)の測定と写真撮影を行った。明度(L*値)は、背部の３点においてハンディ型簡易分光色差計NF333（日本電色工業（株）製）を用いて測定し、その平均値を算出した。また別途、背中心部で全個体において固定した８cm2枠内において発毛面積率（％）の算出を行った。発毛面積率（％）の算出は、８cm2枠内の部分をデジタルカメラ（商品名：サイバーショットDSC-S75、SONY（株）製）で撮影し、取り込んだ画像ファイルをマイクロスコープVHX-100（（株）キーエンス製）に移した後、当該マイクロスコープに付属の画像解析ツールで発毛部位の面積比率（（発毛の確認できた面積／背部８cm2枠）×100（％））を算出することにより実施した。また、コントロール群（n=6）については40％エタノール溶液を同様に塗布し測定を行った。さらに比較群（n=6）として、実施例１で調製したダイズタンパク質のトリプシン分解物を40％エタノールで１％に調製したものを同様に塗布して測定を行った。
【００６２】
剃毛部皮膚の明度(L*値)変化を示したものが図４である。図４に示される通り、本発明のサーモリシン分解物を塗布した群では、早くも3週目からL*値は減少し始め、剃毛部皮膚の黒化が始まったこと、即ち毛周期が休止期から成長期へと移行し始めたことが確認された。一方、コントロール群においては、その変化は遅く、5週目にL*値の低下が確認できたものの、その低下の度合いは軽微なものであった。また、トリプシン分解物を与えた比較群でも、その変化は遅く4〜5週目にかけてL*値の低下が認められたものの、その減少の度合いはサーモリシン分解物に比べれば明らかに小さいものであった。
【００６３】
上述のようにして算出された8cm2枠内における発毛面積率(％)の変化を示したものが図５である。図５に示される通り、本発明のサーモリシン分解物を塗布した群では、早くも3週目で約38％の値を示し、試験終了時の5週目においては約62％と極めて高い発毛効果が認められた。一方、コントロール群では5週目においても約29％と小さく、わずかばかりの発毛が認められるに過ぎなかった。またトリプシン分解物を与えた比較群でも、4週間目になってやっと約25％とわずかな発毛が認められ、5週間目においても約47％までしかその増加は認められなかった。
【００６４】
さらに肉眼により発毛の認められた個体数の変化を示したものが図６である。図６に示される通り、本発明のサーモリシン分解物を塗布した群では、早くも12日目から再生毛が観察できる個体が認められ、22日目には全6個体のすべてにおいて発毛が認められた。一方、コントロール群においては、遅れて23日目になってようやく2個体の発毛個体が認められ、試験終了の35日目になっても発毛個体はわずか4個体に留まった。またトリプシン分解物を与えた比較群でも、遅く15日目にようやく発毛個体が認められ、全6個体全てに発毛が認められたのは遅く29日目になってからであった。
【００６５】
さらに、試験終了時の5週間目における各群のマウスの背毛部を写真撮影したものが図７である。この写真からも判るように、コントロール群では、発毛の認められた個体においてもその量は極めて少なく、剃毛面積の３割を超えて発毛の認められる個体は存在しなかった。一方、本発明のサーモリシン分解物を塗布した群では、全個体において明らかな発毛が認められ、その量も非常に多かった。特にそのうちの１個体においては、剃毛面積のほぼ全体にわたって大量の発毛が確認でき、別の２個体においても剃毛面積の８〜９割近くで発毛が認められた。また、トリプシン分解物を塗布した比較群では、コントロール群に比べればやや発毛量は多かったものの、サーモリシン分解物を塗布した群に比べるとその量は明らかに少なく、剃毛面積全体にわたって発毛の認められる個体は存在せず、剃毛面積の７〜８割に発毛が認められるものが、かろうじて１個体確認できたに過ぎなかった。以上のとおり、本発明のサーモリシン分解物を塗布した群では、コントロール群や比較群に比べて、明らかに顕著に高い発毛効果が観察された。
【００６６】
以上の結果から、本発明のダイズタンパク質のサーモリシン分解物は、ヘアサイクルの休止期から成長期への移行を促進し、著しく高い育毛効果を有するものであることが認められた。また興味深いことに、サーモリシン分解物を用いた場合には、トリプシン分解物を用いた場合に比べ、極めて早期に育毛効果が認められ、また量的にも育毛効果が顕著に高いことが明らかとなった。このことから、ダイズタンパク質のプロテアーゼ分解物であっても、その分解処理に用いたプロテアーゼの種類によって、得られる産物の育毛効果に有意な差があることが明らかとなった。そして、プロテアーゼとしてサーモリシンを用いてダイズタンパク質を分解することにより得られる本発明の分解物が、育毛剤として用いるのに極めて有益であることが明らかとなった。
【００６７】
以下に製剤実施例を挙げるが、本発明はこれらの実施例に限られるものではない。
【００６８】
［実施例６（外用育毛剤）］
下記の各成分を秤量し、精製水にて100ｍＬに調製した。
ダイズタンパク質のサーモリシン分解物（平均分子量約1500）  1.0ｇ
レゾルシン                                                1.0ｇ
パントテニルエチルエーテル                                0.1ｇ
プロピレングリコール                                     10.0ｇ
95％エタノール                                           60.0ｇ
精製水にて全量                                          100ｍＬ
【００６９】
［実施例７（外用育毛剤）］
下記の各成分を秤量し、95％エタノールにて100ｍＬに調製した。
ダイズタンパク質のサーモリシン分解物（平均分子量約1000）  1.0ｇ
ヒノキチオール                                            0.05ｇ
酢酸トコフェロール                                        0.5ｇ
プロピレングリコール                                     10.0ｇ
95％エタノールにて全量                                   100ｍＬ
【００７０】
［実施例８（外用育毛剤）］
下記の各成分を秤量し、精製水にて100ｍＬに調製した。
ダイズタンパク質のサーモリシン分解物（平均分子量約1200）  1.0ｇ
ヒノキチオール                                            0.05ｇ
プロピレングリコール                                     10.0ｇ
95％エタノール                                           50.0ｇ
精製水にて全量                                          100ｍＬ
【００７１】
［実施例９（外用育毛剤）］
下記の各成分を秤量し、精製水にて100ｍＬに調製した。
ダイズタンパク質のサーモリシン分解物（平均分子量約1800）  1.0ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム                                0.05ｇ
セファランチン                                            0.05ｇ
プロピレングリコール                                     10.0ｇ
95％エタノール                                           50.0ｇ
精製水にて全量                                          100ｍＬ
【００７２】
［実施例１０（外用育毛剤）］
下記の各成分を秤量し、精製水にて100ｍＬに調製した。
ダイズタンパク質のサーモリシン分解物（平均分子量約1500）  1.0ｇ
Ｌ−メントール                                            0.01ｇ
プロピレングリコール                                     10.0ｇ
95％エタノール                                           60.0ｇ
精製水にて全量                                          100ｍＬ
【００７３】
［実施例１１（外用育毛剤）］
下記の各成分を秤量し、精製水にて100ｍＬに調製した。
ダイズタンパク質のサーモリシン分解物（平均分子量約2000）  1.0ｇ
塩酸ピリドキシン                                          5.0ｍｇ
パントテニルエチルエーテル                                0.1ｇ
プロピレングリコール                                     10.0ｇ
95％エタノール                                           60.0ｇ
精製水にて全量                                          100ｍＬ
【００７４】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示した。しかし本願発明は、添付の特許請求の範囲の記載によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、それらの内容が具体的に本明細書に記載されているのと同様に、その内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、ヒト毛乳頭細胞増殖促進試験の結果を示す図である。
【図２】図２は、マウス毛包上皮細胞増殖促進試験の結果を示す図である。
【図３】図３は、ラット髭器官培養毛の４日後の伸長促進試験の結果を示す図である。
【図４】図４は、マウス背毛部毛の発毛促進試験において、剃毛部皮膚の明度(L*値)変化を示す図である。
【図５】図５は、マウス背毛部毛の発毛促進試験において、背中心部での全個体特定の8cm2枠内における発毛面積率(％)の変化を示す図である。
【図６】図６は、マウス背毛部毛の発毛促進試験において、発毛個体数の変化を示す図である。
【図７】図７は、マウス背毛部毛の発毛促進試験において、試験終了時の5週間目における各群のマウスの背毛部を撮影した写真図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2007302655.tif 000006
【図６】
2007302655.tif 000007
【図７】
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