(57)【要約】      （修正有）【課題】体液特に尿中に微量に存在し、しかもそのピーク付近に夾雑物が出る場合が多い8-OHdGを効率的に簡便に分離・濃縮する方法、簡便な8-OHdGの測定方法並びに測定方法のための装置を提供する。【解決手段】クロマトグラフィーの最適の組み合わせによって、8-OHdGを効率的に簡便に分離・濃縮する方法を提供することを特徴とする。具体的には、尿サンプルを、官能基として炭素数6〜30の直鎖の炭化水素基をもち、C％が18％以下である疎水性吸着体と接触させ、8−ヒドロキシ−2'−デオキシグアノシン（8-OHdG）を捕捉する処理を経ることを特徴とする体液からの8-OHdGの分離・濃縮方法からなる。また、電気化学的反応を利用してサンプル中の8-OHdG量を測定する。【選択図】図１
2007121271.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液サンプルを、官能基として炭素数6〜30の直鎖の炭化水素基をもち、C％が18％以下である疎水性吸着体と接触させ、8−ヒドロキシ−2'−デオキシグアノシン（8-OHdG）を捕捉する処理を経ることを特徴とする体液からの8-OHdGの分離・濃縮方法。
【請求項２】
疎水性吸着体の粒子サイズ径が１０〜７５μｍであることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
濃縮を、逆相クロマトグラフィーで行う請求項１又は２の方法。
【請求項４】
疎水性吸着体がオクタデシル基を化学結合させたシリカゲルを用い、洗浄液が０〜５％エタノール含有緩衝液であり、溶出液が５〜２０％エタノール含有緩衝液である請求項１〜３の何れか一に記載の方法。
【請求項５】
シリカゲルの粒子サイズ径が６０μｍ以下であることを特徴とする請求項４の方法。
【請求項６】
疎水性吸着体との接触処理で溶出された8-OHdGを含むサンプルを陽イオン交換体と接触させ、8-OHdGを回収する請求項１〜５の何れか一に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一に記載の方法によって得られた被検用8-OHdGの濃縮サンプル。
【請求項８】
請求項１〜６の何れか一に記載の方法によって得られた被検用8-OHdGの濃縮サンプルを使い分析する8-OHdGの測定方法。
【請求項９】
請求項１〜６の何れか一に記載の方法によって得られた被検用8-OHdGの濃縮サンプルを高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）により分析する8-OHdGの測定方法。
【請求項１０】
8-OHdGの濃縮サンプルに電極を浸漬させて電極間に一定電圧を供給し、電流を検出することによるサンプル中の8-OHdG量を測定する方法。
【請求項１１】
サンプルが請求項１〜６の何れか一に記載の方法によって得られた被検用8-OHdGの濃縮サンプルである請求項１０の方法。
【請求項１２】
官能基として炭素数6〜30の直鎖の炭化水素基をもち、C％が18％以下である疎水性吸着体を装填されたカラム容器、疎水性吸着体の洗浄液、疎水性吸着体からの溶出液、陽イオン交換体を装填されたカラム容器、陽イオン交換体の展開液を含む請求項１〜６の何れか一に記載の方法に用いる8-OHdGの前処理用試薬キット。
【請求項１３】
請求項１２の前処理試薬キット、炭素数１８〜３０の逆相担体を充填したＨＰＬＣ用カラム、移動相用ｐＨ６〜９の緩衝液を含む8-OHdG測定用キット。
【請求項１４】
少なくとも以下の作業工程を実施可能である、体液サンプル中の8-OHdGを分離・濃縮するための前処理装置；
（１）体液サンプルを、官能基として炭素数6〜30の直鎖の炭化水素基をもち、C％が18％以下である疎水性吸着体と接触させる工程、
（２）工程（１）の疎水性吸着体を0〜5％エタノール緩衝液で洗浄する工程、
（３）工程（２）で洗浄した疎水性吸着体から、5〜20％エタノール緩衝液により8-OHdGを含むサンプルを溶出する工程、
（４）工程（３）で溶出された8-OHdGを含むサンプルを陽イオン交換体と接触させ、8-OHdGを回収する工程。
【請求項１５】
請求項１４の前処理装置とＨＰＬＣ分析装置からなる8-OHdGの測定システム。
【請求項１６】
少なくとも以下の作業工程を実施可能である、サンプル中の8-OHdGを測定するための装置；
（１）体液サンプルを、官能基として炭素数6〜30の直鎖の炭化水素基をもち、C％が18％以下である疎水性吸着体と接触させる工程、
（２）工程（１）の疎水性吸着体を0〜5％エタノール緩衝液で洗浄する工程、
（３）工程（２）で洗浄した疎水性吸着体から、5〜20％エタノール緩衝液により8-OHdGを含むサンプルを溶出する工程、
（４）工程（３）で溶出された8-OHdGを含むサンプルを陽イオン交換体と接触させ、8-OHdGを回収する工程、
（５）工程（４）で回収された8-OHdGを含む溶液に電極を浸漬させて電極間に一定電圧を供給し、電流を検出する工程。
【請求項１７】
疎水性吸着体、陽イオン交換体および電極が交換可能に設置されたことを特徴とする、請求項１６の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、8−ヒドロキシ−2'−デオキシグアノシンの測定方法及び測定のための装置に関するものである。さらに詳しくは、体液特に尿由来の8−ヒドロキシ−2'−デオキシグアノシンを測定するに際して行う前処理方法及び電気化学的反応を利用する8−ヒドロキシ−2'−デオキシグアノシンの測定方法並びに測定のための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
8−ヒドロキシ−2'−デオキシグアノシン（以下、8-OHdGと称することがある。）は、細胞中のDNA構成成分である2−デオキシグアノシンが酸化ストレスに曝されると活性酸素種・フリーラジカルと反応し、反応生成物として体液中特に尿中に排泄される物質である。一般的には、環境化学物質、紫外線、電離放射線等による外因性の活性酸素発生と、ガンや生活習慣病を引き起こすライフスタイルの乱れ等による内因性の活性酸素発生が、8-OHdG濃度の上昇を引き起こすことが知られている。具体的事例としては、大腸ガン、肺ガン、小児ガン、糖尿病、慢性肝炎、冠動脈疾患、アルツハイマー病、アトピー性皮膚炎、喫煙、飲酒に関して、8-OHdG濃度の増加が報告されている。これに対して、ビタミンE、ビタミンC、β―カロチン、クルクミン、緑茶、赤ワイン、トマトソース、芽キャベツ摂取による8-OHdG濃度の低下が報告されている。その他、運動による活性酸素生成に伴うDNA損傷の程度を検出する目的での研究も進められている。このように8-OHdGは、酸化ストレスマーカーとしての認知度が最も高く、酸化的DNA損傷のマーカーとして広く用いられている。測定は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に接続した電気化学検出器（ECD）によって測定される（HPLC-ECD法）のが一般的である。
【０００３】
8-OHdGの測定は、臓器や培養細胞及び末梢血白血球等の血液由来細胞を用いて測定することも可能であるが、尿中の量を測定することが試みられている（非特許文献１）。これまでに報告されている尿中8-OHdGの分析法は大きく分けて3種が知られている。１）8-OHdGに対する抗体を結合させたアフィニティーカラムで精製した分画をHPLC-ECD法で分析する（非特許文献２）。２）3本のカラムを接続し、カラムスイッチングにより8-OHdGを分離し、電気化学検出器(ECD)により検出する（特許文献１〜３、非特許文献３）。３）ELISA法により尿を直接分析する（特許文献４、非特許文献４）。
【０００４】
しかしながら、各々の方法にはそれぞれ問題点がある。上記１）の方法は、アフィニティーカラムが市販されていないため、一般的に用いることができない。また、回収率が低く放射性の内部標準物質を使って尿中濃度を計算する必要がある。上記２）の方法では、前処理が複雑で回収率についても不明確である。また、8-OHdGのピーク付近に夾雑物が出る場合が多く、研究室により測定値がかなり異なる。上記３）の方法は、特異性に問題があり、HPLC-ECD法より8倍高い値で測定値が報告されており、しかもデータのばらつきが大きい（非特許文献５）。
【特許文献１】特開平８−１８９９２
【特許文献２】特開２０００−３１０６２５
【特許文献３】特開２００１−２５８５９７
【特許文献４】特開平４−１３５４８４
【非特許文献１】Kasai et al., Mutation Res., 387, 147-163, 1997
【非特許文献２】Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89,3375-3379, 1992
【非特許文献３】Loft et al., Carcinogenesis, 13, 2241-2247, 1992
【非特許文献４】Erhola et al., FEBS Lett.,9, 287-291, 1997
【非特許文献５】Prieme et al., Natural antioxidants and food qualityinatherosclerosisand cancer prevention (Kumpulainen et al., eds.), TheRoyalSociety of Chemistry,pp78-82, 1996
【非特許文献６】Kato et al., Nephrol Dial Transplant., 18, 931-936, 2003
【非特許文献７】Inoue et al., J Health Sci., 49, 217-220, 2003
【非特許文献８】Suzuki et al. J Epidemiol. 13, 29-37, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、体液中特に尿中に微量に存在し、しかもそのピーク付近に夾雑物が出る場合が多い8-OHdGを効率的に簡便に分離・濃縮する方法、簡便な8-OHdGの測定方法及び測定方法のための装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、クロマトグラフィーの最適の組み合わせによって、8-OHdGを効率的に簡便に分離・濃縮する方法を提供することを特徴とする。また、本発明は電気化学的反応を利用して簡便に8-OHdGを測定する方法及び測定方法のための装置を提供することを特徴とする。
【０００７】
つまり本発明は以下よりなる。
「１．体液サンプルを、官能基として炭素数6〜30の直鎖の炭化水素基をもち、C％が18％以下である疎水性吸着体と接触させ、8−ヒドロキシ−2'−デオキシグアノシン（8-OHdG）を捕捉する処理を経ることを特徴とする体液からの8-OHdGの分離・濃縮方法。
２．疎水性吸着体の粒子サイズ径が１０〜７５μｍであることを特徴とする前項１の方法。
３．濃縮を、逆相クロマトグラフィーで行う前項１又は２の方法。
４．疎水性吸着体がオクタデシル基を化学結合させたシリカゲルを用い、洗浄液が０〜５％エタノール含有緩衝液であり、溶出液が５〜２０％エタノール含有緩衝液である前項１〜３の何れか一に記載の方法。
５．シリカゲルの粒子サイズ径が６０μｍ以下であることを特徴とする前項４の方法。
６．疎水性吸着体との接触処理で溶出された8-OHdGを含むサンプルを陽イオン交換体と接触させ、8-OHdGを回収する前項１〜５の何れか一に記載の方法。
７．前項１〜６の何れか一に記載の方法によって得られた被検用8-OHdGの濃縮サンプル。
８．前項１〜６の何れか一に記載の方法によって得られた被検用8-OHdGの濃縮サンプルを使い分析する8-OHdGの測定方法。
９．前項１〜６の何れか一に記載の方法によって得られた被検用8-OHdGの濃縮サンプルを高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）により分析する8-OHdGの測定方法。
１０．8-OHdGの濃縮サンプルに電極を浸漬させて電極間に一定電圧を供給し、電流を検出することによるサンプル中の8-OHdG量を測定する方法。
１１．サンプルが前項１〜６の何れか一に記載の方法によって得られた被検用8-OHdGの濃縮サンプルである前項１０の方法。
１２．官能基として炭素数6〜30の直鎖の炭化水素基をもち、C％が18％以下である疎水性吸着体を装填されたカラム容器、疎水性吸着体の洗浄液、疎水性吸着体からの溶出液、陽イオン交換体を装填されたカラム容器、陽イオン交換体の展開液を含む前項１〜６の何れか一に記載の方法に用いる8-OHdGの前処理用試薬キット。
１３．前項１２の前処理試薬キット、炭素数１８〜３０の逆相担体を充填したＨＰＬＣ用カラム、移動相用ｐＨ６〜９の緩衝液を含む8-OHdG測定用キット。
１４．少なくとも以下の作業工程を実施可能である、体液サンプル中の8-OHdGを分離・濃縮するための前処理装置；
（１）体液サンプルを、官能基として炭素数6〜30の直鎖の炭化水素基をもち、C％が18％以下である疎水性吸着体と接触させる工程、
（２）工程（１）の疎水性吸着体を0〜5％エタノール緩衝液で洗浄する工程、
（３）工程（２）で洗浄した疎水性吸着体から、5〜20％エタノール緩衝液により8-OHdGを含むサンプルを溶出する工程、
（４）工程（３）で溶出された8-OHdGを含むサンプルを陽イオン交換体と接触させ、8-OHdGを回収する工程。
１５．前項１４の前処理装置とＨＰＬＣ分析装置からなる8-OHdGの測定システム。
１６．少なくとも以下の作業工程を実施可能である、サンプル中の8-OHdGを測定するための装置；
（１）体液サンプルを、官能基として炭素数6〜30の直鎖の炭化水素基をもち、C％が18％以下である疎水性吸着体と接触させる工程、
（２）工程（１）の疎水性吸着体を0〜5％エタノール緩衝液で洗浄する工程、
（３）工程（２）で洗浄した疎水性吸着体から、5〜20％エタノール緩衝液により8-OHdGを含むサンプルを溶出する工程、
（４）工程（３）で溶出された8-OHdGを含むサンプルを陽イオン交換体と接触させ、8-OHdGを回収する工程、
（５）工程（４）で回収された8-OHdGを含む溶液に電極を浸漬させて電極間に一定電圧を供給し、電流を検出する工程。
１７．疎水性吸着体、陽イオン交換体および電極が交換可能に設置されたことを特徴とする、前項１６の装置。」
【発明の効果】
【０００８】
本発明の分離・濃縮方法は、8-OHdGを含むサンプルについて、測定前の前処理を行なうことで体液中特に尿中の夾雑物が除去され、単純なHPLCシステムにおいて同定、定量が可能となった。また、前処理において選択されたエタノールを溶出液として使用することにより、サンプルの減圧濃縮操作を省くことが可能となり、前処理時間の短縮が可能となった。さらに、本発明の電気化学的反応を利用する8-OHdGの測定方法及び測定のための装置により、8-OHdGを含むサンプル中の8-OHdGの量をより簡便かつ効率的に測定することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の一は、体液サンプルを、官能基として炭素数6〜30の直鎖の炭化水素基をもち、C％が18％以下好ましくは15％以下で、より好適にはエンドキャッピングを行った疎水性吸着体と接触させ、8-OHdGを捕捉する処理を経ることを特徴とする体液からの8-OHdGの分離・濃縮方法に関する。すなわち、本発明は、酸化ストレスマーカーである8-OHdGを測定するために、体液サンプルから8-OHdGを効率的に分離・濃縮する方法である。
ここで、本発明の前処理とは、体液サンプルを疎水性吸着体と接触させる工程（第１ステップ）、続いて、陽イオン交換体と接触させる工程（第２ステップ）を含む処理を意味する。そして、本発明の前処理により、体液中の8-OHdGが効率的に分離・濃縮される。また、体液サンプルとなるのは主に尿であるが、血清などの他の体液においても本発明の効果が得られる。なお、血清中の8-OHdG測定の場合は、8-OHdGの正常値が尿中の100分の1程度であるため、さらに濃縮操作が必要になるが、たとえば本発明の前処理後の血清サンプルを50℃のヒートブロックにセットし、窒素気流下で溶媒を飛ばすなど、１００倍の濃縮操作を追加することで血清中の8-OHdGのピークが明瞭に観察できる。さらに、採取された原尿そのものを使うことが可能である。尿は採取後直ちに濃縮されることが好ましいが、一般的には数時間から数日後であってもよい。採取する尿の量は、0.5〜50 mL、好適には1.0〜10 mL、より好適には1.5〜5.0 mLで十分である。
【００１０】
尿と捕捉物質との接触担体はカラム状のものが好ましいが、バッチ法であってもよい。捕捉物質とは、少なくとも8-OHdGを捕捉できるものであり、疎水性吸着体が好適に例示される。疎水性は比較的少ないモノメリックな結合様式のものが望ましい。また、好適には、オクタデシル基を化学結合させたシリカゲルを用いることが良い。さらに、該シリカゲルの粒子サイズ径が６０μｍ以下であることが好ましい。官能基としての炭素数は6〜30、好ましくは8〜22、より好ましくは10〜20が好適な8-OHdG保持力をもつ。そしてC％は、18％以下好ましくは15％以下であることが好適な疎水性条件を保有する。かくして、尿サンプルと本発明の疎水性吸着体とを接触させると効率的に8-OHdGが捕捉される。
【００１１】
本発明の8-OHdGを捕捉する際の、体液サンプルと本発明の疎水性吸着体との接触は、逆相クロマトグラフィーで行うことが好適である。逆相クロマトグラフィーは、固定相が移動相より、極性の小さい系をいい、代表的には、オクタデシル（ODS）基を化学結合させたシリカゲルと水−アセトニトリル混合溶媒の組み合わせが知られている。この系では、溶質は疎水性結合により固定相に捕捉され、疎水性の大きい溶質ほど遅れて溶出してくる。本発明では予めコンディショニングされた逆相クロマトグラフィー用担体と体液サンプルを接触させ、選択された洗浄液で非捕捉物質の洗い流しを行う。なお、非捕捉物質とは、疎水性吸着体に捕捉されない、または、8-OHdGの測定を阻害する夾雑物を意味する。
【００１２】
疎水性吸着体のコンディショニングは、水及びアルコールで十分に行う。洗浄液は、pH 5.5〜8.5、好ましくは6〜8、より好ましくは6.5〜7.5に調節された緩衝液（例えばリン酸緩衝液）で、約0〜5、好ましくは1〜4、より好ましくは1〜3％（W/V）のエタノール、アセトニトリル、メタノール等の溶媒を含有する。洗浄液の量は、1〜100、好ましくは1〜50、より好ましくは1〜20 mL程の液量で十分である。洗浄後、次いで溶出液を展開し、目的の8-OHdGを溶出させる。溶出液は上記同等の緩衝液にエタノール、アセトニトリル、メタノール等を5％（W/V）濃度以上に含有する。その濃度は、5〜20％、好ましくは6〜10％が一般的である。溶出液は、2.5〜10 mLを通液させ、1.5〜2.5 mLにかけて溶出する1 mLを回収する。なお、溶出液量及び回収液量は使用するカラムの大きさ、サンプル量等に応じて自体実験的繰り返しにより、増減可能である。
【００１３】
疎水性吸着体との接触処理で回収された8-OHdGを含むサンプルは、次いで陽イオン交換体特に好ましくは強酸性陽イオン交換体との接触処理によって、夾雑物を吸着させ、目的の8-OHdGを回収する。陽イオン交換体としては、広く公知のイオン交換体を利用でき、特に限定されるものではない。好適な陽イオン交換体としては、強酸性陽イオン交換体が例示され、スルフォン酸基を導入した交換体が例示される。好適なものとしては、ベンゼンスルフォン酸基等が例示される。
【００１４】
陽イオン交換体との接触は、バッチ法でも、カラム法でも特に限定されないが、カラム法が好適である。疎水性吸着体との接触処理から溶出された8-OHdGを含むサンプルは、好適には約1 mLが陽イオン交換体と接触させる。陽イオン交換体は、予めコンディショニングされ、十分な水及びアルコールでの処理、さらにpH 5.5〜8.5、好ましくは6.0〜8.0、より好ましくは6.5〜7.5に調節された緩衝液（例えばリン酸緩衝液）で、約6％（W/V）以上、好ましくは7％（W/V）以上、より好ましくは8％（W/V）のエタノール、アセトニトリル、メタノール等のアルコールを含有する溶液で平衡化されている。エタノール等の濃度は、前記疎水性吸着体からの溶出液中のエタノール等の濃度以上であることが必要である。すなわち、その濃度は、5〜40％、好ましくは6〜30％、より好ましくは7〜30％が一般的である。
【００１５】
カラム法の場合では、このコンディショニングされた陽イオン交換体にサンプルを展開し、ついで展開液によって展開を行う。展開液は、上記コンディショニングのための溶液と同一、又は略同一でよく、その使用量は1〜10 mLを通液させ、0.5から2.0 mLにかけて溶出する選択された約1.5 mLを回収する。なお、展開液量及び回収液量は使用するカラムの大きさ、サンプル量等に応じて自体実験的繰り返しにより、増減可能である。
【００１６】
回収された溶液中には、8-OHdGが濃縮されており、溶媒を適宜除去し、8-OHdGの定量が可能となる。8-OHdGの定量は、HPLCによる測定方法が挙げられる。図２に示すように、HPLC分画によって、8-OHdGが単一ピークとして確認できる。
【００１７】
本発明の8-OHdGの分離・濃縮法は、8-OHdGを確実に簡便に測定可能とするものであり、官能基として炭素数6〜30の直鎖の炭化水素基をもち、C％が18％以下好ましくは15％以下である疎水性吸着体を装填されたカラム容器、疎水性吸着体の洗浄液、疎水性吸着体からの溶出液、イオン交換体特に強陽イオン交換体を装填されたカラム容器、イオン交換体の溶出液特に強陽イオン交換体の溶出液を含む組み合わせは、8-OHdGの前処理用試薬キットとして使用できる。
さらに、上記の前処理試薬キット、炭素数１８〜３０の逆相担体を充填したＨＰＬＣ用カラム、移動相用ｐＨ６〜９の緩衝液を含むことにより、8-OHdG測定用キットとして使用することができる。
【００１８】
本発明の一は、電気化学的反応を利用して、8-OHdGを含むサンプル中の8-OHdG量を測定する方法である。本測定方法は、実施例８で得られた前処理フラクションの総電流値が8-OHdG量に比例する結果に基づいている。より詳しくは、電気化学的反応により、8-OHdGの酸化または還元に伴う電流を検出する手法である。本測定方法の好適な具体例として、電流検出型化学センサを利用する測定方法が挙げられる。
【００１９】
前記測定方法においては、測定対象である8-OHdGについて、電気化学的反応を利用して、8-OHdGの酸化または還元に伴う電流を検出することによって、測定対象である8-OHdGの濃度を直接的に測定する手法を用いることができる。具体的には、作用極として、例えば、白金やカーボンなどの導電体電極を利用し、銀／塩化銀電極等からなる参照極との間に、所定の電位を印加して、サンプル中に含有される8-OHdGを、該作用極と参照極との間に印加されている電位により、8-OHdG量に応じた電流を発生させる。このときの測定条件は、作用極、対極の二電極測定が好ましく、より正確な測定をするためには作用極、対極、参照極の三電極測定が特に好ましい。
【００２０】
また、本発明の一は、8-OHdGを分離・濃縮するための前処理装置である。当該測定装置は、実施例１に示した分離原理、及び実施例８で得られた前処理フラクションの総電流値が8-OHdG量に比例する結果に基づくものである。当該測定装置は、図９に示すように、少なくとも、3つの液体槽〔体液（尿）サンプル（図９の１）、0〜5％エタノール緩衝液（図９の２）、及び5〜20％エタノール緩衝液（図９の３）〕、液体槽からの液体の流れの方向を変えるためのバルブ手段（図９の５）、疎水性吸着体（図９の４）、陽イオン交換体（図９の６）を含む。
さらに、上記前処理装置とＨＰＬＣ分析装置からなる8-OHdGの測定システムも本発明に含まれる。
加えて、上記前処理装置、電極（図９の７）、電極に印加する手段、電極間の電流を検出する手段を含む8-OHdGを測定するための装置も本発明に含まれる。該装置において、電極は作用極、対極が好ましく、作用極、対極、参照極の三電極が特に好ましい。
【００２１】
より詳しくは、前記装置は以下の作業工程が実施可能であり、それにより8-OHdG量を測定できる；（１）体液（尿）サンプルを官能基として炭素数6〜30の直鎖の炭化水素基をもち、C％が18％以下好ましくは15％以下である疎水性吸着体と接触させる工程（図９においてサンプル注入工程であり、バルブは陽イオン交換体方向へは閉じられ、疎水性吸着体と接触後に液は廃液される）、（２）工程（１）の疎水性吸着体を0〜5％ エタノール緩衝液で洗浄する工程（図９においてカラム洗浄工程であり、バルブは陽イオン交換体方向へは閉じられ、疎水性吸着体と接触後に液は廃液される）、（３）工程（２）で洗浄した疎水性吸着体から、5〜20％ エタノール緩衝液により8-OHdGを含むサンプルを溶出する工程（図９において8-OHdGの測定工程であり、バルブは陽イオン交換体方向へ解放され、液は陽イオン交換体へと流れる）、（４）工程（３）で溶出された8-OHdGを含むサンプルを陽イオン交換体と接触させ、8-OHdGを回収する工程（図９において8-OHdGの測定工程）、（５）工程（４）で回収された8-OHdGを含む溶液に電極を浸漬させて電極間に一定電圧を供給し、電極上で8-OHdGが電極反応を起こすことにより8-OHdG量に応じた電流を検出し定量を行う工程（図９において8-OHdGの測定工程）。
【００２２】
さらに、前記装置においては、尿サンプルに接触する、官能基として炭素数6〜30の直鎖の炭化水素基をもち、C％が18％以下である疎水性吸着体（図９の４）、陽イオン交換体（図９の６）、および電極（図９の７）は交換可能に設置することが好ましい。
【実施例】
【００２３】
以下で本発明を実施例によって説明するが、これらは最良の態様を例示したもので本発明はこれに限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
＜逆相カラムによる尿の分離（第１ステップ）＞
逆相担体（YMC社製、ODS-AQ）を800 mg充填したカラムを作製し、エタノール、水の順で通液しコンディショニングを行なった。このカラムに尿3 mLと緩衝液としてのＢｕｆｆｅｒ（80 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0、4mM EDTA)） 1.0 mLを混ぜ合わせたトータル4 mLのサンプルをアプライし、洗浄液として10mM リン酸緩衝液（pH 7.0、2%エタノールを含有）を10 mL通液させた。続いて溶出液として10 mMリン酸緩衝液（pH 7.0、8%エタノールを含有）を3 mL通液させ、1.5から2.5 mLにかけて溶出する1mLを8-OHdGフラクションとして回収した。
【００２５】
＜陽イオン交換カラムによる8-OHdGの回収（第２ステップ）＞
陽イオン交換体（Varian社製、SCX）を500 mg充填したカラムを使用し、エタノール、水、10 mMリン酸緩衝液（pH7.0、8%エタノールを含有）を通液しコンディショニングを行なった。第１ステップで得られた8-OHdGフラクションを陽イオン交換体（SCX）へアプライし、続いて10 mMリン酸緩衝液（pH 7.0、8%エタノールを含有）を移動相として通液させた。この移動相の0.5から2.0 mLの1.5mLを8-OHdGフラクションとして回収した。尿サンプルが2倍濃縮された形となる。
【００２６】
＜HPLCでの測定＞
第２ステップで得られた8-OHdGフラクション 25 μlをHPLCシステムへ注入した。HPLCシステムは、東ソー社製HPLCシステムのように脱気装置（SD-8022）、グラジエント可能なポンプ（CCPM-II）、オートサンプラー（AS-8020）、カラムオーブン（CO-8020）、UV検出器（UV-8020）、電気化学検出器（EC-8020）（ECD）で構成され、分離カラムとして逆相カラムHydrosphere C18（4.6×150 mm、5 μm、YMC社製）を使用した（図１）。移動相は、10 mM リン酸緩衝液（pH 7.0、1 mM EDTA、2% アセトニトリルを終濃度として含む）、同様のリン酸緩衝液で8% アセトニトリルを含有した緩衝液を使用した。この2種類の緩衝液のリニアグラジエントで分析を行なった。8% アセトニトリル溶液が、0→5分が0%、5→20分が100%、20→25分が100%、25→30分が0%になるようにグラジエントプログラムを行なった。流速は1 mL/分、UV検出器の波長は254 nm、ECDの印加電圧は+500 mV、カラムオーブンは35℃で測定を行なった。なお1測定の時間は洗浄を含めて50分であった。
【００２７】
その結果を図２のクロマトグラムに示す。図２の上から参考例としてAgilent社製C18カラム、ODS-AQ（第１ステップのみ）、ODS-AQとSCX処理（本発明の前処理（第１ステップ及び第２ステップ）の3パターンについて前処理を行った後にHPLCで測定した。まず、参考例のC18カラム処理とODS-AQ処理のサンプルを比較するとODS-AQ処理後の尿サンプルは、夾雑物の除去が充分に行なわれており、電極応答面積値では、参考例C18カラム処理が90,000近い値であったのに対し、ODS-AQ処理は20,000で約4分の1の応答面積であった。さらに、陽イオン交換処理（第２ステップ）を行なうことで、電極応答面積は3756にまで減少した。そのとき8-OHdG溶出付近では、他のピークが減少し8-OHdGの同定が簡便に出来た。
【００２８】
実施例２
実施例１をスケールダウンして行なった。これにより前処理時間の短縮が図れる。前処理の方法は、以下の通りである。
【００２９】
＜逆相カラムによる尿の分離（第１ステップ）＞
逆相担体（YMC製、ODS-AQ）を400 mg充填したカラムを作製し、エタノール、水の順で通液しコンディショニングを行なった。このカラムに尿1.5 mLとＢｕｆｆｅｒ（80 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0、4mM EDTA) ）0.5 mL を混ぜ合わせたトータル2 mLをアプライし、洗浄液として10 mM リン酸緩衝液（pH 7.0、2%エタノールを含有）を6 mL通液させた。続いて溶出液として10 mMリン酸緩衝液（pH 7.0、8% エタノールを含有）を2 mL通液させ、0.75から1.25 mLにかけて溶出する0.5 mLを8-OHdGフラクションとして回収した。
【００３０】
＜陽イオン交換カラムによる8-OHdGの回収（第２ステップ）＞
陽イオン交換体（Varian社、SCX）を250 mg充填したカラムを作製し、エタノール、水、10 mMリン酸緩衝液（pH7.0、8%エタノールを含有）を通液しコンディショニングを行なった。第１ステップで得られた8-OHdGフラクションを陽イオン交換体（SCX）へアプライし、続いて10 mMリン酸緩衝液（pH 7.0、8%エタノールを含有）を移動相として通液させた。この移動相の0.25から1.0 mLの0.75mLを8-OHdGフラクションとして回収した。尿サンプルが2倍濃縮された形となる。この8-OHdGフラクションをHPLCシステムへ供した。
実施例１と同様に、8-OhdGの同定が簡便に出来た。
【００３１】
実施例３
＜より簡便なHPLC条件による8-OHdGの測定＞
実施例１において、本発明の前処理で処理したサンプルをHPLCグラジエント条件によって測定し、得られたクロマトグラムを評価すると10分以前、8-OHdGピーク付近にも他のピークが少ない結果が得られた（図２）。本発明者らは、該前処理に適したHPLCの条件を設定することで、短時間により簡単なシステムで測定が可能であると考えた。そこでHPLC条件をアイソクラティク方式に、カラムサイズを変更することでシステムの簡素化、測定時間の短縮を図った。
【００３２】
実施例１の第2ステップで得られた8-OHdGフラクション25 μlをHPLCシステムへ注入した。HPLCシステムは、東ソー社製HPLCシステムのように脱気装置（SD-8022）、ポンプ（CCPM-II）、オートサンプラー（AS-8020）、カラムオーブン（CO-8020）、電気化学検出器（EC-8020）（ECD）で構成され、分離カラムとして逆相カラムCapcellpakTM C18MGII（4.6×100 mm、3 μm、資生堂製）を使用した（図３）。移動相は、10 mM リン酸緩衝液（pH 7.0、1 mM EDTA、5％ アセトニトリルを終濃度として含む）を使用した。その結果、図４に示すクロマトグラムが得られた。このクロマトグラムから8-OHdGの溶出時間は3分、1測定時間は15分で終了し、グラジエントを使用した条件より30分早く測定が終了する結果となった。本発明の前処理に適したHPLC条件を利用することで、8-OHdGの測定がより簡単なシステムで行なうことが可能となった。
【００３３】
実施例４
＜従来法との相関＞
尿サンプルを既に報告のあるカラムスイッチング法  (Nakano et al., Free Radic. Biol. Med., 35, 826-832, 2003) と実施例２、３を使用した本発明の方法においてそれぞれ測定し、比較評価した。また、同様に尿サンプルを酵素免疫測定法 (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay,ELISA、日研ザイル製) と実施例２、３を使用した本発明の方法でそれぞれ測定し、比較評価を行なった。測定結果を図６に示す。同じ尿サンプルを測定した際の相関として、カラムスイッチング法との相関は図６Ａ、ELISA法との相関は図６Bに示す。双方ともX軸は本法で測定した結果、Y軸は各従来法の値である。その結果、カラムスイッチング法と本法との相関係数は、r = 0.96、ELISA法と本法とはr = 0.86であった。この測定結果は、本発明の方法が十分に8-OHdGを定量する事ができることを示している。
【００３４】
実施例５
実施例１、２をさらにスケールダウンして行った。これにより、さらに前処理時間の短縮を図ることができる。前処理の方法は、以下の通りである。
【００３５】
＜逆相カラムによる尿の分離（第１ステップ）＞
逆相担体（YMC製、ODS-AQ、粒子径 20μm）を200mg充填したカラムを作製し、エタノール、水の順で通液しコンディショニングを行なった。このカラムに尿0.9 mLとＢｕｆｆｅｒ（80 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0、4mM EDTA) ）0.3 mLを混ぜ合わせたトータル1.2 mLをアプライし、洗浄液として液A（10 mM リン酸緩衝液（pH 7.0, 2%エタノールを含有））を1.5 mL通液させた。続いて、溶出液として液Ｂ（10 mMリン酸緩衝液（pH 7.0, 8%エタノールを含有））を0.7 mL通液させ、0.4から0.7 mLにかけて溶出する0.3 mLを8-OHdGフラクションとして回収した。
【００３６】
＜陽イオン交換カラムよる8-OHdGの回収（第２ステップ）＞
陽イオン交換体（Varian社、SCX）を150 mg充填したカラムを作製し、エタノール、水、10 mMリン酸緩衝液（pH 7.0, 8%エタノールを含有）を通液しコンディショニングを行なった。第１ステップで得られた8-OHdGフラクションを陽イオン交換体（SCX）へアプライし、続いて液Ｂ（10 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0, 8%エタノールを含有））を通液させた。この液Ｂの0.15から0.9 mLの0.75 mLを8-OHdGフラクションとして回収した。得られたフラクションは尿サンプルが濃縮されている。この8-OHdGフラクションをHPLCシステムへ供した。第１ステップと第２ステップを通した一連の前処理工程を図５に示す。この一連の前処理工程の時間は、80-120分で終了できた。
【００３７】
実施例６
＜より簡便なHPLC条件による8-OHdGの測定２＞
実施例３において、HPLCシステムの簡素化、測定時間の短縮を行なったが、さらに測定時間の短縮が可能であると考えた。図４のHPLCクロマト図を評価すると8-OHdGより速い時間に溶出する成分が少ない。よって、8-OHdGの溶出を速めるための条件を設定し、さらにカラムのサイズを変更することによって測定時間の短縮を図った。
【００３８】
実施例５の第2ステップで得られた8-OHdGフラクション10 μLをHPLCシステムへ注入した。HPLCシステムは、実施例３と同様で東ソー社製HPLCシステムのように脱気装置（SD-8022）、ポンプ（CCPM-II）、オートサンプラー（AS-8020）、カラムオーブン（CO-8020）、電気化学検出器（EC-8020）（ECD）で構成され、分離カラムとして逆相カラムDevelosil C30（4.6×50 mm、3 μm、野村化学製）を使用した。移動相は、10 mM リン酸緩衝液（pH 7.0、1 mM EDTA、5％ アセトニトリルを終濃度として含む）を使用した。その結果、図７に示すクロマトグラムが得られた。このクロマトグラムから8-OHdGの溶出時間は2分、1測定時間は9分で終了し、グラジエントを使用した条件より30分以上早く測定が終了することができた。
以上により、本発明の前処理に適したHPLC条件を利用することで、8-OHdGの測定がより簡単なシステムで行なうことが可能となった。
【００３９】
実施例７
＜前処理工程＞
実施例５の第１ステップと第２ステップの前処理工程（図５）の概要を以下に示す。
体液中特に尿中の8-OHdGを測定するために必要な前処理は、まずカラムにODS-AQ（疎水性吸着体）を200 mg充填し、３mLエタノール、3mL蒸留水を順次通液し、活性化させた。
１．ODS-AQに尿サンプル0.9 mLと終濃度4 mM  EDTAを含有した80 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0)（Buffer）を0.3 mL合致させ、アプライした。
２．終濃度2%エタノールを含有した10 mM リン酸緩衝液 (pH 7.0)（液Ａ）を洗浄液として1.5 m通液させた。
３．さらに終濃度8%エタノールを含有した10 mM リン酸緩衝液 (pH 7.0)（液Ｂ）を洗浄液として0.4 mL通液させた。
４．終濃度8%エタノールを含有した10 mM リン酸緩衝液 (pH 7.0) （液Ｂ）を溶出液として0.3 mL通液させ、溶出液を回収した。
５．引き続き、SCX（陽イオン交換体）をカラムに150 mg充填し、ODS-AQと同様に活性化させ、4工程によって回収したサンプルをアプライした。
６．終濃度8%エタノールを含有した10 mM リン酸緩衝液 (pH 7.0) （液Ｂ）を洗浄液として0.15 mL通液させた。
７．終濃度8%エタノールを含有した10 mM リン酸緩衝液 (pH 7.0) （液Ｂ）を溶出液として0.75 mL通液させ、溶出液を回収した。
８．7工程で得られた溶出液を8-OHdG前処理済溶液としてHPLCに供した。
上記前処理工程は、必要部材である疎水性吸着体（ODS-AQカラム）、陽イオン交換体（SCXカラム）、液Ａ、液Ｂ、Bufferを含む前処理用試薬キットにより手動で行うことができる。また、前処理装置は、少なくとも３−７工程を自動的に行うことができる。
【００４０】
実施例８
＜前処理サンプル中の8-OHdG量と総電流値との関係＞
実施例１の方法に従って前処理を行なった尿サンプルを実施例3のHPLC法で8-OHdGを定量した。また、前処理フラクションについて電気化学測定を行なった。測定条件は、+500  mV、5分後の電流値を測定した。そして、8-OHdG量をX軸に、前処理フラクションの総電流値をY軸に設定し、測定結果のプロットした結果、図８に示すグラフが得られた。このグラフから8-OHdG、総電流値の間には相関関係が認められた。この結果より、前処理フラクションの総電流値を測定することでも、間接的に8-OHdGの定量が可能となった。また、この総電流値は、実施例１の前処理によって得られたフラクションに含まれている印加電圧+500 mVで電極反応を起こす物質の総電流値と言い換えることが出来る。よって、分離を目的としたHPLCを利用しなくとも、前処理済のサンプルを電極上で電気化学的な測定法により総電流値を測定することで間接的な8-OHdGの測定が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、8-OHdGの簡便な測定方法並びに測定のための装置を提供するものであり、酸化ストレスの検査手法として極めて有用である。これにより、大腸ガン、肺ガン、小児ガン、糖尿病、慢性肝炎、冠動脈疾患、アルツハイマー病、アトピー性皮膚炎、喫煙、飲酒、運動による酸化ストレス状態の評価や、ビタミンＥ、ビタミンＣ、β―カロチン、クルクミン、緑茶、赤ワイン、トマトソース、芽キャベツ摂取による酸化ストレス状態の改善に関して、尿による非侵襲的な測定方法及び装置が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】測定系システムを示す。
【図２】実施例１でのHPLCクロマト図を示す。
【図３】測定系システムを示す。
【図４】実施例３でのHPLCクロマト図を示す。
【図５】スケールダウンした前処理工程の概要図を示す。
【図６】本発明の方法と従来法との相関を示す。
【図７】実施例６でのHPLCクロマト図を示す。
【図８】前処理済みサンプル中の8-OHdG量と総電流値との関係を示す。
【図９】本発明の8-OHdGの測定のための装置の略図を示す。
【符号の説明】
【００４３】
図９の符号の説明を以下に記す。
１．尿サンプル槽
２．0〜5％ エタノール緩衝液槽
３．5〜20％ エタノール緩衝液槽
４．疎水性吸着体
５．バルブ手段
６．陽イオン交換体
７．電極
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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