(57)【要約】【課題】  生体分子の非特異的吸着を抑制するアレイ解析を実現する事にある。特に表面プラズモンイメージング測定に用いた際に、信頼性の高いデータを得ることのできるアレイを得る。【解決手段】  生体分子が固定化されてなるアレイ上に、ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質を含む溶液を作用させることを特徴とするアレイのブロッキング方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子が固定化されてなるアレイ上に、ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質を含む溶液を作用させることを特徴とするアレイのブロッキング方法。
【請求項２】
ＡＴＰａｓｅドメインを除去した「ＨＳＰ７０ファミリータンパク質」がＤｎａＫ，Ｓｓａ１ｐ，Ｓｓｃ１ｐ，Ｋａｒ２ｐ，ＨＳＰ７０，Ｂｉｐ，ｍＨｓｐ７０およびＨＳＣ７０から選択されることを特徴とする請求項１に記載のアレイのブロッキング方法。
【請求項３】
「ＨＳＰ７０ファミリータンパク質」の基質結合ドメインを用いることを特徴とする請求項１又は２に記載のアレイのブロッキング方法。
【請求項４】
ＤｎａＫタンパク質由来のタンパク質を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のアレイのブロッキング方法。
【請求項５】
ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のアレイのブロッキング方法。
【請求項６】
ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４７２番目までのアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のアレイのブロッキング方法。
【請求項７】
ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４１８番目までのアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のアレイのブロッキング方法。
【請求項８】
ＤｎａＫタンパク質の４１９〜６０７番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のアレイのブロッキング方法。
【請求項９】
ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したタンパク質を用いることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のアレイのブロッキング方法。
【請求項１０】
ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質を用いることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のアレイのブロッキング方法。
【請求項１１】
ＤｎａＫタンパク質の３８４〜６０７番目のアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質を用いることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のアレイのブロッキング方法。
【請求項１２】
アレイ表面が金であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のアレイのブロッキング方法。
【請求項１３】
基板が透明基板であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載のアレイのブロッキング方法。
【請求項１４】
基板がガラスであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載のアレイのブロッキング方法。
【請求項１５】
アレイが表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析に用いられることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載のアレイのブロッキング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドチップを用いた物質相互作用の解析系において、「ＨＳＰ７０ファミリータンパク質」をブロッキングすることで生体分子の非特異的吸着を抑制することのできるアレイのブロッキング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。特に比較的分子量の小さなペプチドを基板上に固定化したペプチドアレイは、蛋白質のような変性の問題が比較的少なく、またコンビナトリアルケミストリーの側面が強いことから、近年酵素の基質探索や、あるいはインヒビターの探索などに広く用いられるようになってきている。
【０００３】
しかしながら、相互作用を観察する際に問題になるのが非特異的吸着による影響である。非特異的吸着とは、本来であれば相互作用しない分子へ対象物質が非特異的に吸着する場合のことを言う。その結果、擬陽性の判定を与えるため好ましくない。非特異的な吸着を抑制するために、デキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性高分子が表面に固定化されたバイオチップが開発されている。これらの親水性高分子には生体分子の非特異的吸着を抑制する効果があることが知られている。
【０００４】
バイオセンサー表面に親水性高分子のゲルマトリックスを形成することで非特異的吸着を抑制したバイオセンサーが示されている。この方法ではゲルマトリックスに官能基が導入されており、その官能基を利用し共有結合によって生体分子を固定化している。具体的にはカルボキシメチルデキストランのカルボキシル基を水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化し、形成したスクシンイミド基と生体分子を固定化することに成功している（非特許文献１）。ただし、形成したスクシンイミド基は１００％反応しないため、残存したスクシンイミドをブロッキングする必要がある。ここではエタノールアミンを用いて、スクシンイミド基のブロッキングを行っており、ブロッキング材料に親水性高分子を用いる手法は示されていない。
【０００５】
生体分子を固定化した後に、基板上に親水性高分子を反応させる手段は公知である（特許文献１）。しかし、ここではチップ上のマレイミド基と対象分子が有するチオール基を反応させて、チップ上に対象分子を固定化しているが、その後、マレイミド基をブロッキングする工程は全く含んでいない。そのため、マレイミド基が残存したまま残っており、非特異的吸着の問題を引き起こす心配がある。また、固定化した生体分子と反応しうる親水性高分子を用いるため、生体分子が改質し変性する恐れがある。
【０００６】
また、従来免疫測定などで用いられるブロッキング剤としては生体成分から直接抽出したタンパク質が多く使用されてきた。特にウシ由来のアルブミンやカゼインなどが広く使用されてきた歴史がある。しかし近年、狂牛病などの問題から、様々な制限が加えられている現状である。一方、組換え体を用いてそれらを製造する方法は、病原体（物質）を排除できる利点はあるが、生産性などの問題点から実用に至っているものは少ない。
【０００７】
よって、大腸菌などに由来するタンパク質を、代替タンパク質として使用するという試みが、生産性という立場からは好ましいと言える。しかし、大量発現できるタンパク質が必ずしもブロッキング効率が良いわけではなく、組換え体で生産できるブロッキング効率に優れたタンパク質を見出さなければならないという問題点があった。
近年、様々な生物の遺伝子配列が明らかとなったが、予想されるアミノ酸配列よりブロッキング効率に優れたタンパク質を見出す法則は未だ知られておらず、そのようなタンパク質を探すには非常な手間が掛かる作業であると思われていた。  このような理由から、組換え体で大量生産できるブロッキング効率に優れた代替タンパク質が求められていた。
【０００８】
【非特許文献１】Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８，２６８，１９９１
【特許文献１】米国特許第６１２７１２９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、生体分子の非特異的吸着を抑制するためのバイオチップのブロッキング技術を提供することにある。その結果、基板上に固定化された生体分子との相互作用解析に用いた際に、正確に相互作用を評価できるブロッキング手段を得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、以下に示すような手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
【００１１】
すなわち本発明は、以下の構成からなる。
１．生体分子が固定化されてなるアレイ上に、ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質を含む溶液を作用させることを特徴とするアレイのブロッキング方法。
２．ＡＴＰａｓｅドメインを除去した「ＨＳＰ７０ファミリータンパク質」がＤｎａＫ，Ｓｓａ１ｐ，Ｓｓｃ１ｐ，Ｋａｒ２ｐ，ＨＳＰ７０，Ｂｉｐ，ｍＨｓｐ７０およびＨＳＣ７０から選択されることを特徴とする１のアレイのブロッキング方法。
３．「ＨＳＰ７０ファミリータンパク質」の基質結合ドメインを用いることを特徴とする１又は２のアレイのブロッキング方法。
４．ＤｎａＫタンパク質由来のタンパク質を用いることを特徴とする１〜３のいずれかのアレイのブロッキング方法。
５．ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いることを特徴とする１〜４のいずれかのアレイのブロッキング方法。
６．ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４７２番目までのアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いることを特徴とする１〜５のいずれかのアレイのブロッキング方法。
７．ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４１８番目までのアミノ酸配列を除去したタンパク質を用いることを特徴とする１〜６のいずれかのアレイのブロッキング方法。
８．ＤｎａＫタンパク質の４１９〜６０７番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることを特徴とする１〜７のいずれかのアレイのブロッキング方法。
９．ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したタンパク質を用いることを特徴とする１〜８のいずれかのアレイのブロッキング方法。
１０．ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質を用いることを特徴とする１〜９のいずれかのアレイのブロッキング方法。
１１．ＤｎａＫタンパク質の３８４〜６０７番目のアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質を用いることを特徴とする１〜１０のいずれかのアレイのブロッキング方法。
１２．アレイ表面が金であることを特徴とする１〜１１のいずれかのアレイのブロッキング方法。
１３．基板が透明基板であることを特徴とする１〜１２のいずれかのアレイのブロッキング方法。
１４．基板がガラスであることを特徴とする１〜１３のいずれかのアレイのブロッキング方法。
１５．アレイが表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析に用いられることを特徴とする１〜１４のいずれかのアレイのブロッキング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明におけるアレイのブロッキング方法を採用することにより、非特異的吸着が抑制されたアレイを用いた精度のよい測定系を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は分子シャペロンとして知られているＤｎａＫ，Ｓｓａ１ｐ，Ｓｓｃ１ｐ，Ｋａｒ２ｐ，ＨＳＰ７０，Ｂｉｐ，ｍＨｓｐ７０およびＨＳＣ７０などから構成される、いわゆる「ＨＳＰ７０ファミリータンパク質」を用いるアレイのブロッキング方法に関する。
【００１４】
なかでも、大腸菌のヒートショックタンパク質の一種であるＨＳＰ７０（ＤｎａＫ）の基質結合ドメインが好適に用いられる。このタンパク質は６３８アミノ酸から構成され、１〜３８５番目のアミノ酸より構成される「ＡＴＰａｓｅ（ＡＴＰ結合）ドメイン」と３８６〜６３８番目のアミノ酸より構成される「基質結合ドメイン」からなっている（図１）。配列番号１にＤｎａＫのタンパク質の配列を示す。このタンパク質（ＤｎａＫ３８４−６０７）は、既にＮＭＲ解析で構造が明らかとなっており、２つの構造的な領域（ドメイン）、すなわちＮ末端側のβシート領域（ドメイン）とＣ末端側のαへリックス領域（ドメイン）からなっていることが分かっている。また、配列のＮ末端側の親水／疎水率が０．５であり、Ｃ末端側では０．８９で、その差は０．３９と高い値を示すことが計算によって明らかにされた。このタンパク質（ＤｎａＫ３８４−６０７）がブロッキングに際して有用なものである。
【００１５】
本発明では、ＨＳＰ７０ファミリータンパク質由来のタンパク質が好ましく用いられ、更に好ましくは大腸菌のＤｎａＫタンパク質由来のタンパク質が用いられる。また、好ましくは、ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質の基質結合ドメインが好ましく用いられ、更に好ましくは大腸菌のＡＴＰａｓｅドメインを除去したＤｎａＫタンパク質の基質結合ドメインが用いられる。
【００１６】
本発明に用いるＨＳＰ７０ファミリーに属するタンパク質としては、特に指定はないが、大腸菌のＤｎａＫ、酵母細胞質に存在する  Ｓｓａ１ｐ、酵母ミトコンドリアに存在する  Ｓｓｃ１ｐ、酵母小胞体に存在するＫａｒ２ｐ、哺乳類細胞質に存在するＨＳＰ７０，哺乳類小胞体に存在する  Ｂｉｐ、哺乳類ミトコンドリアに存在する  ｍＨｓｐ７０  および熱ショックの有無に関わらず恒常的に発現しているＨＳＰ７０のホモログであるＨＳＣ７０などから選択される。ＨＳＰ７０ファミリーには数多くのホモログが知られており、上に挙げたものはそのうちの一部であり、上に列挙した以外のホモログにも同様の効果が期待できることは容易に予想可能である。
【００１７】
また、ＤｎａＫのβシート構造部分に変異を加えて、βシート部分の疎水性を向上させることにより、ブロッキング効率のより優れたタンパク質を得ることができる。すなわち、（１）βシートのＮ末端の一部を除去することで、βシートのより疎水的な部分を露出させる（βシート構造を破壊して疎水性を向上させる）、（２）βシート上の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換する、というものである。その結果、βシート構造のＮ末端部分を除去したＤｎａＫ４１９−６０７と、βシート上の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したＤｎａＫ３８４−６０７（Ｄ４７９Ｖ，Ｄ４８１Ｖ）にブロッキング効率の顕著な向上を認めることができる。特に、ＤｎａＫ  ４１９−６０７に顕著なブロッキング効率の向上を認めることが出来る。すなわち、疎水性ドメインの構造が変化することで、疎水性ドメインの構造が変化し、疎水性ドメインの疎水性を向上させることが、ブロッキング能の向上につながるものと考えられる。
【００１８】
本発明においては、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４７２番目までのアミノ酸配列を除去したことを特徴とするブロッキング効率の向上したＤｎａＫタンパク質がより好ましい。また、本発明は少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４１８番目までのアミノ酸配列を除去したことを特徴とするブロッキング効率の向上したＤｎａＫタンパク質であることが好ましい。特に好ましくは、ＤｎａＫタンパク質の４１９〜６０７番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００１９】
また、本発明においては、ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したタンパク質を用いてもよい。更に詳しくは、ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したブロッキング効率の向上したタンパク質である。また更に好ましくは、ＤｎａＫタンパク質の３８４〜６０７番目のアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質が使用される。
【００２０】
本発明に用いるタンパク質もしくはタンパク質フラグメントは、本発明の効果を損なわない範囲内であればヒスチジンタグなどのタグを有していても良い。さらに、本発明の効果を損なわない範囲内であれば一般的に知られていないタグや、任意のアミノ酸配列を付加しても良い。
【００２１】
本タンパク質の発現方法は特に限定されないが、原核生物を用いて発現させる方法が好ましく、さらには、大腸菌を用いて発現させる方法がさらに好ましい。また、発現ベクターに関しても特に限定はされず、一般的に発現に使用されているものであればよい。
【００２２】
本発明に用いるＨＳＰ７０ファミリーに属するタンパク質としては、特に限定はされないが、大腸菌のＤｎａＫ，酵母細胞質に存在するＳｓａ１ｐ，酵母ミトコンドリアに存在するＳｓｃ１ｐ，酵母小胞体に存在するＫａｒ２ｐ，哺乳類細胞質に存在するＨＳＰ７０，哺乳類小胞体に存在するＢｉｐ，哺乳類ミトコンドリアに存在するｍＨｓｐ７０および熱ショックの有無に関わらず恒常的に発現しているＨＳＰ７０のホモログであるＨＳＣ７０などが例示される。ＨＳＰ７０ファミリーには数多くのホモログが知られており、上に挙げたものはそのうちの一部であり、上に列挙した以外のホモログであってもよい。
【００２３】
本発明に用いるＨＳＰ７０フラグメントはＡＴＰａｓｅドメインを除去されていることを特徴としている。但し、十分なブロッキング活性を示すならば、ＡＴＰａｓｅドメインの全領域が除去されていなくてもよい。例えば、ＡＴＰａｓｅドメインは、ＤｎａＫではＣ末端側の１−３８３の領域を指し、そのＡＴＰａｓｅ活性を失う程度にＡＴＰａｓｅドメインの一部を除去していれば、本発明におけるＨＳＰ７０フラグメントに含まれる。例えば、ＤｎａＫにおいては３８４−６３８のフラグメントも使用することができる。
【００２４】
本発明におけるブロッキング方法は様々な用途に応用可能であるが、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）や和周波発生（ＳＦＧ）、局在プラズモン共鳴（ＬＰＲ）、エリプソメトリなどの光学的検出方法に絶大な効果を発揮する。なかでも、ＳＰＲによる解析系において特に有用である。一般的なチップ、アレイにおいては、相互作用の検出方法として蛍光物質や放射線同位体によるラベル手段による検出が用いられる。この場合、最終的にラベル物質が結合したかどうかだけを検出することができ、相互作用に関係のない物質が非特異的に吸着しても、誤って検出されることはない。従って、相互作用する対象物質がネガティブコントロールに対して非特異的に吸着しなければ、正確に測定できていると判断することができる。
【００２５】
ＳＰＲ、ＳＦＧ、ＬＰＲ、エリプソメトリにおいては、金属基板が使用される。本発明において、基板の素材は、酸・アルカリ・有機溶媒などに非常に安定な金が好ましい。実際、金は上記光学的検出方法で多用される物質である。また、金を支持する物質は透明である方が好ましく、透明なガラスであるとより好ましい。透明なガラスは容易に入手できるだけでなく、ＳＰＲやＬＰＲの測定に極めて適しているからである。
【００２６】
金属基板を形成する方法としては、金属薄層をコーティングする方法が好ましい。金属をコーティングする方法は特に限定されるものではないが、一般的に蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが選択される。光学的な検出方法に供するために、金属薄層の厚みをナノレベルでコントロールする必要がある。金属薄層の厚みも特に限定されるものではないが、一般的には３０ｎｍから８０ｎｍの範囲で選択される。金属薄層の剥離を抑制するため、０．５ｎｍから１０ｎｍのクロム層やチタン層を予め基板にコーティングしておいてもよい。
【００２７】
このＳＰＲを応用したＳＰＲイメージング法は、広範囲に偏光光束を照射し、その反射像を解析することで、物質間の相互作用の様子を、画像処理技術等を駆使することによりモニター化する方法であり、複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することが可能である。ＳＰＲイメージング法においては、反射像を解析するためにチップに広範囲で偏光光束を照射し、かつ光束の照度を十分に確保するための手段が必要である。図２においてその一例を示した。偏光光束の照度は明るいほどセンサーの感度が上昇してより好ましい。
【００２８】
光源の種類は特に限定されるものではないが、ＳＰＲ共鳴角の変化が特に敏感になる近赤外光を含む光を用いるのが好ましい。具体的には、メタルハライドランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、蛍光灯、白熱灯などの広範囲に光を照射することのできる白色光源を用いることができるが、なかでも得られる光の強度が十分に高く、光の電源装置が簡易で安価なハロゲンランプが特に好ましい。
【００２９】
通常の白色光源はフィラメント部に光の明暗ムラが生じる欠点がある。光源の光をそのまま照射すると、反射して得られる像に明暗ムラが生じ、スクリーニングやモルホロジー変化を評価するのが困難となる。したがって、チップに均一に光を照射する手段として、光をピンホールに通してから平行光にする方法が好ましい。ピンホールを通す手段は、明るさの均一な光束を得る手段としては好ましいが、そのままピンホールに光を通すと照度が低下する欠点がある。そこで、十分な照度を確保する手段として、ピンホールと光源の間に凸レンズを設置し、集光してピンホールを通す方法を用いることが好ましい。
【００３０】
白色光源は放射光であるため、集光する前に凸レンズを用いて平行光にする必要がある。凸レンズの焦点距離近傍に光源を設置することで、平行光を得ることができる。もう一枚凸レンズを設置し、そのレンズの焦点距離近傍にピンホールを設置することで集光した光をピンホールに通すことが可能である。ピンホール内で交差し、通過した光はカメラ用のＣＣＴＶレンズで平行光とするが、その際に得られる平行光束の断面面積は１０〜１０００ｍｍ２に調節するのが好ましい。この方法によって広範囲にわたるスクリーニングやモルホロジー観察が可能となる。
【００３１】
相互作用をモニターする際に、上記偏光光束は物質あるいは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射される。上記偏光光束は物質もしくは物質の集合体が固定化されている金属薄膜の反対面に照射され、その反射光束が得られる。金属薄膜からの反射光束は近赤外波長の光干渉フィルターを通し、ある波長付近の光のみを透過させてからＣＣＤカメラで撮影される。
【００３２】
光干渉フィルターの中心波長は、ＳＰＲの感度が高い６００〜１０００ｎｍが好ましい。光干渉フィルターの透過率が極大時の半分になる波長の波長幅を半値巾と呼ぶが、半値巾は小さい方が波長の分布がシャープとなり好ましく、具体的には半値巾１００ｎｍ以下が好ましい。光干渉フィルターを通してＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。
【００３３】
本発明において用いるＳＰＲ用のチップは好ましくは透明な基板上に金属薄膜が形成された金属基板からなり、上記金属薄膜上に直接的もしくは間接的に、化学的もしくは物理的に、物質もしくは物質の集合体が固定化されているスライドが用いられる。基板の素材は特に限定されるものではないが、透明なものを用いるのが好ましい。具体的にはガラス、あるいはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類が挙げられる。中でもガラスが特に好ましい。
【００３４】
基板の厚さは０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく１〜２ｍｍ程度がより好ましい。金属薄膜からの反射像を評価する目的を達成するために、ＳＰＲ共鳴角はできるだけ小さい方が撮影される画像がひしゃげる恐れがなく解析がしやすい。したがって、透明基板あるいは透明基板とそれに接触するプリズムの屈折率ｎＤは１．５以上であることが好ましい。
【００３５】
本発明において用いられるアレイに固定化される生体分子とは特に限定されるものではなく、一般に生体構成成分の範疇とされている物質は全て包含される。具体的には、蛋白質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、脂質などが例示される。また、上述したようなＳＰＲアレイのみならず、蛍光、ラジオアイソトープによる検出に用いられるアレイにおいても有用である。この場合には、アレイ表面は必ずしも金でなくてもよい。
【００３６】
本発明において、ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質を含む溶液の濃度は、０．１〜２０ｍｇ／ｍｌ程度が好ましく、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは２から１０ｍｇ／ｍｌである。溶解液は特に限定されるものではないが、中性付近の緩衝液が好ましい。ｐＨとしては、６〜８、好ましくは６．５〜７．５の範囲である。緩衝液の種類は特に限定されるものではなく、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液など様々なものが適用可能である。
【実施例】
【００３７】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。
【００３８】
［実施例１］
（アレイ作製）
末端官能基がチオール基であるＰＥＧ３−ＯＨアルカンチオール（ＳｅｎｓｏＰａｔｈ製；以下、ＰＥＧチオールという。）を１ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。末端のチオール基は、特に金に対する優れた金属結合性を示す。１８ｍｍ四方、２ｍｍ厚のＳＦ１５ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記ＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体にＰＥＧチオールを結合させた。
【００３９】
このスライドの上にフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、ＵＶ照射部のＰＥＧチオールを除去した。フォトマスクは５００μｍ四方の正方形の穴が９６個有し（８個×１２個のパターンからなる。）、穴の中心間のピッチは１ｍｍに設計されている。フォトマスクの穴があいている部分はＵＶ光が透過し、スライドに照射されパターン化される。照射されなかった部分は、ＰＥＧが残り、チップのバックグラウンド（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）部分としてレファレンス部として機能する。
【００４０】
８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ， Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１時間浸漬し、ＵＶ照射部に８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。ＰＢＳ及び水で洗浄した後、末端がビオチンで修飾されてなる、アミノ基との反応性を有するリンカーを作用させた。リンカーとしては、Ｂｉｏｔｉｎ−ＡＣ５  Ｓｕｌｆｏ−Ｏｓｕ（同仁化学製）及びＮＨＳ−ｄＰＥＧ４−ＯＳｕ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ製）の２種類を用いた。それぞれの化学構造を式（Ｉ）及び（ＩＩ）に示した。以下、式（Ｉ）をＡＣ５、式（ＩＩ）をＰＥＧと示す。
【００４１】
【化１】
2007024831.tif 000002
【００４２】
【化２】
2007024831.tif 000003
【００４３】
ＡＣ５、ＰＥＧいずれも１ｍＭ濃度にＰＢＳに溶解した溶液を調製した。またそれぞれを等量混合した溶液も準備した。これら３種のリンカー溶液を、図３に示したような配置、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ自動スポッター（東洋紡績製）により１０ｎｌずつスポッティングを行った。その後、ウェットな環境下で室温、３時間金表面の８−ＡＯＴに反応させた。こうして、ビオチンを金表面に導入することができた。
【００４４】
上記ビオチン表面チップをＰＢＳ及び水で洗浄した後、ストレプトアビジンの固定化を行った。ストレプトアビジンをリン酸緩衝液（２０ｍＭ  リン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に１ｍｇ／ｍｌで溶解して、ビオチンの導入された図３における１，２及び３のスポットに対して、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ自動スポッター（東洋紡績製）により１０ｎｌずつスポッティングを行った。その後、ウェットな環境下で室温、３０分間静置させて固定化反応を行った。こうして、ストレプトアビジンを表面に固定化することができた。
【００４５】
（ブロッキング処理）
ストレプトアビジンを固定化した表面をＰＢＳ及び水で洗浄した後、ＤｎａＫ（４１９−６０７）を２ｍｇ／ｍｌの濃度でリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に溶解して、３００μｌをチップ上に注出して室温で１時間反応させた。
【００４６】
（ＳＰＲイメージング法による測定）
こうして得られたペプチド固定化チップを、ＳＰＲイメージング機器（ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ：東洋紡績製）にセットし、ランニングバッファーとして、リン酸緩衝液（２０ｍＭ  リン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を１００μｌ／ｍｉｎの速度でフローセル内に流した。ＳＰＲからのシグナルが安定したのを確認した後に、抗ストレプトアビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ製）をＳＰＲ装置内のセルへ注入して作用させた。抗体は上記のランニングバッファーで１０μｇ／ml濃度に調整して用いた。シグナル上昇がプラトー状態になった時点で再度ランニングバッファーを送液して洗浄を行った。その際のＳＰＲシグナルの変化を観察した。シグナル変化の観察は、各基質のスポット部位に加え、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄにおいても実施した。
【００４７】
上記測定終了後、ＳＰＲイメージングによる解析も検討した。上記ＳＰＲ解析に際して、ＣＣＤカメラによりアレイ表面を撮像した画像の取り込みを２秒ごとに行い、抗体反応後における時点で取り込まれた画像から、反応前の時点での画像を画像演算処理ソフトウエアＳｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．製）を用いて引き算処理を行うことにより、アレイ全体においての抗体が結合している様子を示すことができる。
【００４８】
（観察の結果と考察）
結果を図４に示した。（Ａ）にＳＰＲセンサーグラム、（Ｂ）にＳＰＲイメージングを行った結果を示した。いずれのリンカーを用いた場合にも、ストレプトアビジンの固定化された図３の１，２，３のスポットにおいては、抗体のシャープな結合シグナルが確認されている。一方、ストレプトアビジンの固定化されていない図３の４，５，６のブランクスポットに対しては、ほとんど抗体の結合は見られず、非常に特異性に優れた結果が得られている。
【００４９】
［比較例１］
（アレイ作製）
実施例１と同様に行った。
（ブロッキング処理）
ここではブロッキング操作は行わず、そのまま次のステップに進んだ
（ＳＰＲイメージング法による測定）
実施例１と同様に行った。
【００５０】
（観察の結果と考察）
結果を図５に示した。（Ａ）にＳＰＲセンサーグラム、（Ｂ）にＳＰＲイメージングを行った結果を示した。この場合は、ストレプトアビジンの固定化された図３の１，２，３のスポットのみならず、ストレプトアビジンの固定化されていない図３の４，５，６のブランクスポットにおいても非特異的な抗体の吸着が認められる。特に、ＡＣ５を用いた場合に、その傾向が顕著である。また、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ部分においても、シグナルの増加がみられている。以上の結果より、本発明におけるブロッキング処理の優れた効果を確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のブロッキング方法により処理されたアレイは、非特異的吸着が効果的に抑制され、正確な測定が可能となる。また方法も容易であり、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】大腸菌ＤｎａＫタンパク質の概要を示す図である。
【図２】ＳＰＲイメージングの原理を示す図である。
【図３】実施例１において作製したＳＰＲアレイの用いたリンカーの配置パターンを示す図である。
【図４】実施例１における、ＳＰＲイメージングの解析結果を示す図である（Ａ：センサーグラム、Ｂ：イメージング結果）。
【図５】比較例１における、ＳＰＲイメージングの解析結果を示す図である（Ａ：センサーグラム、Ｂ：イメージング結果）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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