(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、天然物由来の表皮角化細胞エンドセリン-1産生抑制剤を提供することである。【解決手段】  スクテラレイン（scutellarein）、ユウパフォリン（upafolin）、あるいはシネンセチン（sinensetin）の１種以上を表皮角化細胞エンドセリン-1産生抑制剤の有効成分として用いる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクテラレイン（Scutellarein）、ユーパフォリン（Eupafolin）又はシネンセチン（Sinensetin）のいずれか一種以上を有効成分として含有することを特徴とする表皮角化細胞エンドセリン-1産生抑制剤。
【請求項２】
スクテラレイン（Scutellarein）、ユーパフォリン（Eupafolin）又はシネンセチン（Sinensetin）のいずれか一種以上を有効成分として含有することを特徴とする、美白化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シミ、ソバカスなどの疾患の治療または予防に利用できる表皮角化細胞エンドセリン-1産生抑制剤及び美白化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドセリン-1は血管内皮細胞の産生する強力な血管収縮ペプチドで21残基のアミノ酸からなる。エンドセリン-1は血管内皮細胞に存在するエンドセリン変換酵素の働きでビッグエンドセリンから生成する。エンドセリン-1は標的細胞のエンドセリン受容体を介してホスホリパーゼＣの活性化、カルシウムチャンネルの開口など多様な細胞内シグナル伝達系を活性化する。その結果、ホルモン・神経伝達物質分泌調節、細胞増殖・分化作用などさまざまな作用が奏される。一般的に、エンドセリン-1の濃度上昇は高血圧症や心疾患などの原因となる。
【０００３】
エンドセリン-1はまた、血管以外の種々の組織細胞で産生され、様々な生理的役割を担っている。例えば、紫外線が肌にあたると、表皮角化細胞（ケラチノサイトとも言う）でエンドセリン-1が産生され（非特許文献１参照）、産生されたエンドセリン-1は、表皮メラニン細胞（メラノサイトとも言う）を刺激して、シミ、ソバカスの原因となるメラニンを盛んに合成させる。したがって、表皮角化細胞のエンドセリン-1の合成を抑制することができればシミ、ソバカスを治療または予防することができる。
かかる市場の要求に応えるべく、エンドセリン-1産生抑制剤が研究されてきた。従来エンドセリン-1産生抑制剤として検討されたものは化学合成品が中心であるが、安全性を考慮すれば天然物で同様の効果を有するものが望まれる。
【０００４】
これまでに天然物として、赤ワイン抽出物に含まれるポリフェノール（ピセアタンノール、デルフィニジンなど）（非特許文献２参照）、大豆イソフラボン（ゲニステイン）（非特許文献３参照）、ルテオリンおよびクダモノトケイソウ抽出物（特許文献１）が血管内皮細胞エンドセリン-1の産生抑制剤として検討されてはいるものの、紫外線照射時（あるいは紫外線非照射時）の表皮角化細胞のエンドセリン-1産生を抑制することは報告されていない。
現在、市場にある美白化粧品の多くはチロシナーゼ活性を抑制する働きを持つが、カミツレの花から抽出して得られるカミツレエキスにはエンドセリン-1の働きを抑える作用（エンドセリン-1拮抗薬）があり、結果としてメラニンの産生を抑制することから新しいタイプの美白化粧品として販売されている。また、エンドセリン拮抗薬が請求項に記載された公開特許公報として特許文献２−５が例示される。
【０００５】
また、紫外線により生じる皮膚傷害を防止する化粧料として、表皮角化細胞から産生されるadult T cell leukemia derived factor（表皮メラニン細胞に働いてメラニン産生を促進させる）を抑制する効果を有する物質のなかにフラボン類及び/又はその配糖体が記載されている（特許文献６）。
このように美白効果のある物質は種々知られているが、紫外線照射時（あるいは紫外線非照射時）の表皮角化細胞のエンドセリン-1産生を抑制する天然物は報告されておらず、かかる原理に基づくエンドセリン-1産生抑制剤が必要とされている。
【０００６】
この出願に関係する先行技術文献情報としては次のものがある。
【非特許文献１】FEBSレターズ（FEBS letters），（オランダ），1995年，371巻，p.188-190
【非特許文献２】ネイチャー(Nature)，（英国），2001年，414巻，p. 863-864
【非特許文献３】アテロスクレロシス(Atherosclerosis)，（アイルランド），2002年，163巻，p.339-347
【特許文献１】公開特許広報2005−75766
【特許文献２】公開特許公報2000-212032
【特許文献３】公開特許公報2001-31558
【特許文献４】公開特許公報2002-265348
【特許文献５】公開特許公報2002-29929
【特許文献６】公開特許公報2001-48773
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、天然物由来の、安全でかつ有効性の高い表皮角化細胞エンドセリン-1産生抑制剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、天然物由来の物質中から、表皮角化細胞のエンドセリン-1産生を効果的に抑制する物質を鋭意探索した結果、スクテラレイン（Scutellarein）、ユーパフォリン（Eupafolin）及びシネンセチン（Sinensetin）が、表皮角化細胞エンドセリン-1産生を効果的に抑制するとともに、これらが安全で、美白化粧料の有効成分としても有効であることを見いだし、本発明を完成させた。
すなわち本発明以下のとおりである。
（１）スクテラレイン（Scutellarein）、ユーパフォリン（Eupafolin）又はシネンセチン（Sinensetin）のいずれか一種以上を有効成分として含有することを特徴とする表皮角化細胞エンドセリン-1産生抑制剤。
（２）スクテラレイン（Scutellarein）、ユーパフォリン（Eupafolin）又はシネンセチン（Sinensetin）のいずれか一種以上を有効成分として含有することを特徴とする、美白化粧料。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の使用化合物であるスクテラレイン（Scutellarein）、ユーパフォリン（Eupafolin）及びシネンセチン（Sinensetin）は、いずれも植物由来のものであって、安全性に優れ、高い表皮角化細胞エンドセリン-1産生抑制作用を有する。したがって、本発明によれば、より有用な表皮角化細胞エンドセリン-1産生抑制在及び美白化粧料が提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、上記発明について詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜実施し得る。
本発明は、スクテラレイン（scutellarein）、ユーパフォリン（eupafolin）、及びシネンセチン（sinensetin）の少なくとも一種以上を有効成分として含有する表皮角化細胞エンドセリン-1産生抑制剤、及び美白化粧料に関する。
本発明で使用するスクテラレイン（scutellarein）、ユーパフォリン（eupafolin）、及びシネンセチン（sinensetin）はいずれも、特に、紫外線で刺激した表皮角化細胞に作用してエンドセリン-1産生を抑制する効果を有する点で有用ではあるが、紫外線非照射下においても、表皮角化細胞におけるエンドセリン-1産生を抑制する。また、この表皮角化細胞におけるエンドセリン−１産生抑制作用に基づき、皮膚の美白作用をする。
【００１１】
スクテラレイン（Scutellarein；4',5,6,7-テトラヒドロキシフラボン）はフラボノイドの一種であり、Scutellaria barbata（半枝蓮）などのシソ科植物に含まれている天然物である。
また、ユーパフォリン（eupafolin；6-メトキシルテオリン）もフラボノイドの一種でありキク科のEupatorium cannabinumなどに含まれている天然物であり、シネンセチン（Sinensetin；3',4',5,6,7-ペンタメトキシフラボン）もフラボノイドの一種でありシソ科のクミスクチン（Orthosiphon aristatus）や柑橘類の果皮などに含まれている天然物である。
【００１２】
これらスクテラレイン（scutellarein）、ユーパフォリン（eupafolin）、またはシネンセチン（sinensetin）がエンドセリン-1の産生を抑制する効果を有することは従来知られておらず、また、ポリフェノール類が表皮角化細胞のエンドセリン-1産生を抑制することも知られていない。
本発明におけるスクテラレイン（scutellarein）、ユーパフォリン（eupafolin）、シネンセチン（sinensetin）は市販品を用いることもできるが、種々の植物から単離して用いてもよい。
【００１３】
本発明の表皮角化細胞エンドセリン-1産生抑制剤は、それ自体を直接適用してもよく、また、溶液状、可溶化状、乳化状、粉末状、ペースト状、ムース状、ジェル状にして、化粧水、乳液、クリーム、パック、軟膏等として、例えば皮膚外用剤としてあるいは美白化粧料の形態で、皮膚に適用することができる。
また、本発明の表皮角化細胞のエンドセリン-1産生抑制剤には必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、通常、化粧料や医薬部外品、外用医薬品等の製剤に使用される成分、すなわち、精製水、アルコール類、水溶性高分子、油剤、界面活性剤、ゲル化剤、保湿剤、ビタミン類、抗菌剤、香料、塩類、ＰＨ調整剤等を加えることができる。
本発明の表皮角化細胞エンドセリン-1産生抑制剤の含有量は0.0001％〜1％が好ましく、より好ましくは0.0005％〜0.1％である。この場合、スクテラレイン（scutellarein、ユーパフォリン（eupafolin）またはシネンセチン（sinensetin）をそれぞれ単独で、あるいはこれらの２種、3種を適宜組み合わせて用いることができる。
【００１４】
本発明の表皮角化細胞エンドセリン-1産生抑制剤は、上記したように、美白化粧料として用いることができ、このためには、典型的には皮膚に直接塗布して用いられるが、こればかりでなく、美白効果のある医薬としても用いることもできる。また、さまざまな食品中に添加して美白効果のある機能性食品、特定保健用食品などとしても用いることができる。かかる食品として、清涼飲料、乳酸飲料、スープ、ジャム、菓子類などが挙げられる。
本発明の表皮角化細胞エンドセリン-1産生抑制剤の投与量は、特に限定されるものではなく、例えば、皮膚に直接塗布して用いる場合には表皮角化細胞エンドセリン-1産生抑制剤を0.0001％〜1％含有する化粧品を1日あたり１〜4回塗布する。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
〔試験例１〕（scutellareinが紫外線照射で刺激したヒト表皮角化細胞のエンドセリン-1産生を抑制する効果）
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（クラボウ株式会社から購入）を増殖用無血清液体培地HuMedia-KG2（クラボウ株式会社から購入、増殖添加剤としてインスリン、hEGF、ハイドロコーチゾン、ウシ脳下垂体抽出液、ゲンタマイシン、アンフォテリシンBを含む）にて、24穴（１穴2cm2）のプレートを用いて、5％ CO2存在下、37℃で培養を開始し（培養開始時の細胞数は１穴あたり2.8x104個）、１日後に培地の交換を行い、さらに２日間培養を行った。次にプレートの各穴の培地を捨て、１mlのPBS(-)溶液で2回洗浄し、1ml のPBS(-)溶液を添加した。フナコシ社より購入した紫外線照射機（EL Lamp UVM-16、波長302 nm）を用いて、このプレートに紫外線を5 mJ/cm2照射した。紫外線の照射量はフナコシ社のUVX RadiometerによりUV-Bの領域である310 nmの強度を測定した。
【００１６】
直ちにPBS(-)溶液を除去し、380μlの増殖用無血清液体培地HuMedia-KB2（クラボウ株式会社から購入、増殖添加剤不含）に20μl の試料溶液を加えた溶液400μlを各穴に添加した。上記の20μlの試料溶液はscutellarein を10% DMSO (dimethyl sulfoxide)溶液に溶解し100、200、400μMの濃度としたものであり、対照として10% DMSO溶液を用いた（反応液中のDMSO濃度は0.5％になる）。この24穴プレートを5％CO2存在下、37℃で24時間静置した。その後、上清300μlを回収して、遠心により混入した細胞を除去した。上清中のエンドセリン-1量は、エンドセリン-1 ELISAキット（アマシャムバイオサイエンス社より購入）を用いた酵素免疫測定法により測定した。上清中のエンドセリン-1濃度を表１に示す。結果はn=3の平均値（平均値±標準偏差、紫外線照射した対照区とscutellarein添加区との間に有意差が認められた場合は*P<0.05、**p<0.01、***p<0.001）で示した。また、紫外線照射なしの対照区はn=6で行った。scutellareinにエンドセリン-1産生抑制効果が認められた。
【００１７】
次に、表１の濃度範囲のscutellarein添加24時間における細胞増殖に対する影響をロッシュ社のMTT (3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイキットにより測定したところ、この濃度範囲のscutellareinは細胞増殖に対して全く影響のないことが確認できた。
【００１８】
【表１】
2007223965.tif 000002
【００１９】
〔試験例２〕（scutellareinがヒト表皮角化細胞のエンドセリン-1産生を抑制する効果）
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（クラボウ株式会社から購入）を増殖用無血清液体培地HuMedia-KG2（クラボウ株式会社から購入、増殖添加剤としてインスリン、hEGF、ハイドロコーチゾン、ウシ脳下垂体抽出液、ゲンタマイシン、アンフォテリシンBを含む）にて、24穴（１穴2cm2）のプレートを用いて、5％ CO2存在下、37℃で培養を開始し（培養開始時の細胞数は１穴あたり2.8x104個）、１日後に培地の交換を行い、さらに２日間培養を行った。次にプレートの各穴の培地を捨て、1 mlの増殖用無血清液体培地HuMedia-KB2（クラボウ株式会社から購入、増殖添加剤不含）で２回洗浄した後、380μlの増殖用無血清液体培地（上記と同一のHuMedia-KB2）に20μl の試料溶液を加えた溶液400μlを各穴に添加した。上記の20μlの試料溶液はscutellarein を10% DMSO溶液に溶解し50、100、200、400μMの濃度としたものであり、対照として10% DMSO溶液を用いた（反応液中のDMSO濃度は0.5％になる）。
【００２０】
この24穴プレートを5％CO2存在下、37℃で24時間静置した。その後、上清300μlを回収して、遠心により混入した細胞を除去した。上清中のエンドセリン-1量は、エンドセリン-1 ELISAキット（アマシャムバイオサイエンス社より購入）を用いた酵素免疫測定法により測定した。上清中のエンドセリン-1濃度を表２に示す。結果はn=４の平均値（平均値±標準偏差、対照区とscutellarein添加区との間に有意差が認められた場合は*P<0.05、**p<0.01、***p<0.001）で示した。紫外線で刺激しない状態でもエンドセリン-1産生抑制効果がscutellareinに認められた。
【００２１】
【表２】
2007223965.tif 000003
【００２２】
〔試験例３〕（eupafolinが紫外線照射で刺激したヒト表皮角化細胞のエンドセリン-1産生を抑制する効果）
試験例１と同様に、正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞を増殖用無血清液体培地HuMedia-KG2（増殖添加剤としてインスリン、hEGF、ハイドロコーチゾン、ウシ脳下垂体抽出液、ゲンタマイシン、アンフォテリシンBを含む）にて、24穴（１穴2cm2）のプレートを用いて、5％ CO2存在下、37℃で培養を開始し（培養開始時の細胞数は１穴あたり2.8x104個）、１日後に培地の交換を行い、さらに２日間培養を行った。次にプレートの各穴の培地を捨て、１mlのPBS(-)溶液で2回洗浄し、1ml のPBS(-)溶液を添加した。紫外線照射機（EL Lamp UVM-16、波長302 nm）を用いて、このプレートに紫外線を5 mJ/cm2照射した。紫外線の照射量はUVX RadiometerによりUV-Bの領域である310 nmの強度を測定した。直ちにPBS(-)溶液を除去し、380μlの増殖用無血清液体培地HuMedia-KB2（増殖添加剤不含）に20μl の試料溶液を加えた溶液400μlを各穴に添加した。上記の20μlの試料溶液はeupafolin を10% DMSO溶液に溶解し100、200、400μMの濃度としたものであり、対照として10% DMSO溶液を用いた（反応液中のDMSO濃度は0.5％になる）。
【００２３】
この24穴プレートを5％CO2存在下、37℃で24時間静置した。その後、上清300μlを回収して、遠心により混入した細胞を除去した。上清中のエンドセリン-1量は、エンドセリン-1 ELISAキット（アマシャムバイオサイエンス社より購入）を用いた酵素免疫測定法により測定した。上清中のエンドセリン-1濃度を表３に示す。結果はn=3の平均値（平均値±標準偏差、紫外線照射した対照区とeupafolin添加区との間に有意差が認められた場合は*P<0.05、**p<0.01、***p<0.001）で示した。また、紫外線照射なしの対照区はn=6で行った。eupafolinにエンドセリン-1産生抑制効果が認められた。
次に、表３の濃度範囲のeupafolin添加24時間における細胞増殖に対する影響をMTTアッセイキットにより測定したところ、この濃度範囲のeupafolinは細胞増殖に対して全く影響のないことが確認できた。
【００２４】
【表３】
2007223965.tif 000004
【００２５】
〔試験例４〕（eupafolinがヒト表皮角化細胞のエンドセリン-1産生を抑制する効果）
試験例２と同様に、正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞を増殖用無血清液体培地HuMedia-KG2（増殖添加剤としてインスリン、hEGF、ハイドロコーチゾン、ウシ脳下垂体抽出液、ゲンタマイシン、アンフォテリシンBを含む）にて、24穴（１穴2cm2）のプレートを用いて、5％ CO2存在下、37℃で培養を開始し（培養開始時の細胞数は１穴あたり2.8x104個）、１日後に培地の交換を行い、さらに２日間培養を行った。次にプレートの各穴の培地を捨て、1 mlの増殖用無血清液体培地HuMedia-KB2（クラボウ株式会社から購入、増殖添加剤不含）で２回洗浄した後、380μlの増殖用無血清液体培地（上記と同一のHuMedia-KB2）に20μl の試料溶液を加えた溶液400μlを各穴に添加した。上記の20μlの試料溶液はeupafolin を10% DMSO溶液に溶解し50、100、200、400μMの濃度としたものであり、対照として10% DMSO溶液を用いた（反応液中のDMSO濃度は0.5％になる）。この24穴プレートを5％CO2存在下、37℃で24時間静置した。その後、上清300μlを回収して、遠心により混入した細胞を除去した。［０００１］上清中のエンドセリン-1量は、エンドセリン-1 ELISAキット（アマシャムバイオサイエンス社より購入）を用いた酵素免疫測定法により測定した。上清中のエンドセリン-1濃度を表４に示す。結果はn=4の平均値（平均値±標準偏差、対照区とeupafolin添加区との間に有意差が認められた場合は*P<0.05、**p<0.01、***p<0.001）で示した。紫外線で刺激しない状態でもエンドセリン-1産生抑制効果がeupafolinに認められた。
【００２６】
【表４】
2007223965.tif 000005
【００２７】
〔試験例５〕（sinensetinが紫外線照射で刺激したヒト表皮角化細胞のエンドセリン-1産生を抑制する効果）
試験例１と同様に、正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞を増殖用無血清液体培地HuMedia-KG2（増殖添加剤としてインスリン、hEGF、ハイドロコーチゾン、ウシ脳下垂体抽出液、ゲンタマイシン、アンフォテリシンBを含む）にて、24穴（１穴2cm2）のプレートを用いて、5％ CO2存在下、37℃で培養を開始し（培養開始時の細胞数は１穴あたり2.8x104個）、１日後に培地の交換を行い、さらに２日間培養を行った。次にプレートの各穴の培地を捨て、１mlのPBS(-)溶液で2回洗浄し、1ml のPBS(-)溶液を添加した。紫外線照射機（EL Lamp UVM-16、波長302 nm）を用いて、このプレートに紫外線を5 mJ/cm2照射した。紫外線の照射量はUVX RadiometerによりUV-Bの領域である310 nmの強度を測定した。直ちにPBS(-)溶液を除去し、380μlの増殖用無血清液体培地HuMedia-KB2（増殖添加剤不含）に20μl の試料溶液を加えた溶液400μlを各穴に添加した。上記の20μlの試料溶液はsinensetin を10% DMSO溶液に溶解し100、200、400μMの濃度としたものであり、対照として10% DMSO溶液を用いた（反応液中のDMSO濃度は0.5％になる）。この24穴プレートを5％CO2存在下、37℃で24時間静置した。その後、上清300μlを回収して、遠心により混入した細胞を除去した。
【００２８】
上清中のエンドセリン-1量は、エンドセリン-1 ELISAキット（アマシャムバイオサイエンス社より購入）を用いた酵素免疫測定法により測定した。上清中のエンドセリン-1濃度を表５に示す。結果はn=3の平均値（平均値±標準偏差、紫外線照射した対照区とsinensetin添加区との間に有意差が認められた場合は*P<0.05、**p<0.01、***p<0.001）で示した。また、紫外線照射なしの対照区はn=6で行った。sinensetinのエンドセリン-1産生抑制効果については20μMの濃度で有意差が認められた。
次に、表５の濃度範囲のsinensetin添加24時間における細胞増殖に対する影響をMTTアッセイキットにより測定したところ、この濃度範囲のsinensetinは細胞増殖に対して全く影響のないことが確認できた。
【００２９】
【表５】
2007223965.tif 000006
【００３０】
〔試験例６〕（sinensetinがヒト表皮角化細胞のエンドセリン-1産生を抑制する効果）
試験例２と同様に、正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞を増殖用無血清液体培地HuMedia-KG2（増殖添加剤としてインスリン、hEGF、ハイドロコーチゾン、ウシ脳下垂体抽出液、ゲンタマイシン、アンフォテリシンBを含む）にて、24穴（１穴2cm2）のプレートを用いて、5％ CO2存在下、37℃で培養を開始し（培養開始時の細胞数は１穴あたり2.8x104個）、１日後に培地の交換を行い、さらに２日間培養を行った。次にプレートの各穴の培地を捨て、1 mlの増殖用無血清液体培地HuMedia-KB2（クラボウ株式会社から購入、増殖添加剤不含）で２回洗浄した後、380μlの増殖用無血清液体培地（上記と同一のHuMedia-KB2）に20μl の試料溶液を加えた溶液400μlを各穴に添加した。上記の20μlの試料溶液はsinensetin を10% DMSO溶液に溶解し100、200、400、800μMの濃度としたものであり、対照として10% DMSO溶液を用いた（反応液中のDMSO濃度は0.5％になる）。この24穴プレートを5％CO2存在下、37℃で24時間静置した。
【００３１】
その後、上清300μlを回収して、遠心により混入した細胞を除去した。上清中のエンドセリン-1量は、エンドセリン-1 ELISAキット（アマシャムバイオサイエンス社より購入）を用いた酵素免疫測定法により測定した。上清中のエンドセリン-1濃度を表６に示す。結果はn=4の平均値（平均値±標準偏差、対照区とsinensetin添加区との間に有意差が認められた場合は*P<0.05、**p<0.01、***p<0.001）で示した。紫外線で刺激しない状態でもエンドセリン-1産生抑制効果がsinensetinに認められた。
【００３２】
【表６】
2007223965.tif 000007