(57)【要約】【課題】  生細胞を対象とするＦＲＡＰ実験とその実験結果の定量的解析とを容易に行えるようにする。【解決手段】  コンピュータ２は、レーザ装置４によるレーザ光の照射の制御を行って観察試料１０８における標本の部分領域にフォトブリーチを施す一方で、共焦点レーザ走査型顕微鏡本体１を制御してそのときの当該標本における当該フォトブリーチが施された領域の蛍光の回復の時間変化を観測する。そして、生細胞である当該標本に対する当該観測の結果に基づいて当該標本の拡散係数を算出する。【選択図】      図１
2007024801.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光の照射の制御を行って標本における部分領域にフォトブリーチを施すフォトブリーチ実行制御手段と、
共焦点レーザ走査型顕微鏡を制御して前記標本における前記フォトブリーチが施された領域の蛍光の回復の時間変化を観測する観測制御手段と、
生細胞である標本に対する前記観測の結果に基づいて当該標本の拡散係数を算出する拡散係数算出手段と、
を有することを特徴とする顕微鏡制御装置。
【請求項２】
固定細胞である標本に対する前記観測の結果に基づいて、当該フォトブリーチに使用したレーザ光の実効半径を算出する実効半径算出手段を更に有し、
前記拡散係数算出手段は、前記実効半径に基づいて前記拡散係数を算出する、
ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡制御装置。
【請求項３】
前記共焦点レーザ走査型顕微鏡を制御して前記標本の画像を取得させる標本画像取得手段と、
前記標本の画像の表示を行う標本画像表示手段と、
前記標本の画像の表示に対してなされる領域の設定を取得する領域設定取得手段と、
を更に有し、
前記フォトブリーチ制御手段は、前記領域設定取得手段によって取得された領域に対応する前記部分領域にフォトブリーチが施されるように前記制御を行う、
ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡制御装置。
【請求項４】
前記領域設定取得手段は、前記標本におけるフォトブリーチを施す第一の領域の設定、前記表示における当該標本が表されている第二の領域の設定、及び当該表示における当該標本が表されていない第三の領域の設定を取得し、
前記拡散係数算出手段は、前記第三の領域の蛍光の強度を基準としたときの前記第一及び前記第二の領域各々の蛍光の強度の相対値に基づいて前記拡散係数を算出する、
ことを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡制御装置。
【請求項５】
前記フォトブリーチの実行条件の設定要求画面を表示する設定要求画面表示手段と、
前記設定要求画面での要求に対応する前記実行条件の入力を取得する実行条件取得手段と、
を更に有し、
前記フォトブリーチ実行制御手段は、前記実行条件取得手段によって取得された前記実行条件に従うように前記制御を行う、
ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡制御装置。
【請求項６】
生細胞である標本に対する前記観測の結果に基づいて、当該標本のモバイル／インモバイル率を算出するモバイル／インモバイル率算出手段を更に有することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡制御装置。
【請求項７】
前記フォトブリーチが施された領域の蛍光が回復してプラトーに達したか否かの判定を行う判定手段を更に有し、
前記観測制御手段は、前記フォトブリーチが施された領域の蛍光がプラトーに達したとの判定がされたときに、前記標本についての前記制御を完了する、
ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡制御装置。
【請求項８】
蛍光の強度の閾値の設定を取得する蛍光強度閾値取得手段を更に有し、
前記フォトブリーチ実行制御手段は、前記部分領域の蛍光の強度が前記閾値に達したときにフォトブリーチを完了させる制御を行う、
ことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡制御装置。
【請求項９】
レーザ光の照射の制御を行って標本における部分領域にフォトブリーチを施す処理と、
共焦点レーザ走査型顕微鏡を制御して前記標本における前記フォトブリーチが施された領域の蛍光の回復の時間変化を観測する処理と、
生細胞である標本に対する前記観測の結果に基づいて当該標本の拡散係数を算出する処理と、
をコンピュータに行わせるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡技術に関し、特に、共焦点レーザ走査型顕微鏡システムを用いて行うＦＲＡＰ（Fluorescence Recovery After Photobleaching：フォトブリーチング後の蛍光回復）法によるデータ取得、及びその解析の技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
標本におけるフォトブリーチした領域の蛍光強度を測定し、その蛍光強度の回復曲線を解析することで、移動する蛍光分子の移動速度、及び、移動する分子の割合を求める、ＦＲＡＰ（Fluorescence Recovery After Photobleaching：フォトブリーチング後の蛍光回復）法が知られている。
【０００３】
また、レーザ光源からの光を対物レンズで微小なスポットに絞り、このスポットで標本上を走査し、標本からの蛍光や反射光を光検出器で捕らえて電気信号へと変換し、その電気信号に基づいて画像モニタ上に標本像を表示する共焦点レーザ走査型顕微鏡が知られている。
【０００４】
このような共焦点レーザ走査型顕微鏡では、音響光学変調フィルタ（ＡＯＴＦ）を用いて任意の領域を素早く指定することができるので、生細胞を用いてもＦＲＡＰ実験ができるようになった。
【０００５】
近年、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein ）などの蛍光タンパク質の利用と顕微鏡技術の進歩とにより、細胞内におけるタンパク質の挙動を比較的簡単に解析できるようになった。例えば非特許文献１及び非特許文献２に記載されているように、生細胞に対してＦＲＡＰ法の実験を行うことによって、蛍光分子の拡散速度（拡散係数）を得る手法や、蛍光分子における動く（移動する）分子と動かない（移動しない）分子との割合を得る手法など、定量的な解析手法も確立されつつある。
【０００６】
また、前述したように、ＡＯＴＦが共焦点レーザ走査型顕微鏡システムに搭載されたことや、ブリーチレーザとスキャンレーザとを独立に走査するできるシステムが開発されたこと、更には、高速ＣＣＤ（Charge Coupled Device：電荷撮像素子）による画像取得システムにブリーチ用レーザを追加したシステムが開発されたことによって、ＦＲＡＰ実験を高速に行うことが可能となった。
【非特許文献１】木村宏、「フォトブリーチング法による蛍光標識タンパク質の細胞内動態解析１―固定細胞を用いた条件設定−」、実験医学、羊土社、２００４年８月１日、第２２巻、第１２号、ｐ．１７３９−１７４５
【非特許文献２】木村宏、「フォトブリーチング法による蛍光標識タンパク質の細胞内動態解析２―生細胞における測定と定量的解析のためのアプローチ−」、実験医学、羊土社、２００４年９月１日、第２２巻、第１３号、ｐ．１８５１−１８５６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
レーザ走査型共焦点顕微鏡システムを用いてＦＲＡＰ実験を行い、上述したようなデータを取得するためには、フォトブリーチ領域の指定、フォトブリーチ条件の設定、リカバリー観察時間の設定など、煩雑な操作を要するため、実験の難度が高い。
【０００８】
また、上述したようにして分子の拡散定数やMobile/Immobile 率を求めるには、実効ブリーチ領域（実効半径）の計測や回復時間の計測など、複雑な計測を行うこととなる上に、定量的な解析を行うものであるから、同一の計測を複数の試料に対して繰り返し実施する必要がある。
【０００９】
本発明は上述した問題に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、生細胞を対象とするＦＲＡＰ実験とその実験結果の定量的解析とを容易に行えるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の態様のひとつである顕微鏡制御装置は、レーザ光の照射の制御を行って標本における部分領域にフォトブリーチを施すフォトブリーチ実行制御手段と、共焦点レーザ走査型顕微鏡を制御して当該標本における当該フォトブリーチが施された領域の蛍光の回復の時間変化を観測する観測制御手段と、生細胞である標本に対する当該観測の結果に基づいて当該標本の拡散係数を算出する拡散係数算出手段と、を有することを特徴とするものであり、この特徴によって前述した課題を解決する。
【００１１】
なお、上述した本発明に係る顕微鏡制御装置において、固定細胞である標本に対する当該観測の結果に基づいて、当該フォトブリーチに使用したレーザ光の実効半径を算出する実効半径算出手段を更に有し、当該拡散係数算出手段は、当該実効半径に基づいて当該拡散係数を算出する、ように構成してもよい。
【００１２】
また、前述した本発明に係る顕微鏡制御装置において、当該共焦点レーザ走査型顕微鏡を制御して当該標本の画像を取得させる標本画像取得手段と、当該標本の画像の表示を行う標本画像表示手段と、当該標本の画像の表示に対してなされる領域の設定を取得する領域設定取得手段と、を更に有し、当該フォトブリーチ制御手段は、当該領域設定取得手段によって取得された領域に対応する当該部分領域にフォトブリーチが施されるように当該制御を行う、ように構成してもよい。
【００１３】
なお、このとき、当該領域設定取得手段は、当該標本におけるフォトブリーチを施す第一の領域の設定、当該表示における当該標本が表されている第二の領域の設定、及び当該表示における当該標本が表されていない第三の領域の設定を取得し、当該拡散係数算出手段は、当該第三の領域の蛍光の強度を基準としたときの当該第一及び当該第二の領域各々の蛍光の強度の相対値に基づいて当該拡散係数を算出する、ように構成してもよい。
【００１４】
また、前述した本発明に係る顕微鏡制御装置において、当該フォトブリーチの実行条件の設定要求画面を表示する設定要求画面表示手段と、当該設定要求画面での要求に対応する当該実行条件の入力を取得する実行条件取得手段と、を更に有し、当該フォトブリーチ実行制御手段は、当該実行条件取得手段によって取得された当該実行条件に従うように当該制御を行う、ように構成してもよい。
【００１５】
また、前述した本発明に係る顕微鏡制御装置において、生細胞である標本に対する当該観測の結果に基づいて、当該標本のモバイル／インモバイル率を算出するモバイル／インモバイル率算出手段を更に有するように構成してもよい。
【００１６】
また、前述した本発明に係る顕微鏡制御装置において、当該フォトブリーチが施された領域の蛍光が回復してプラトーに達したか否かの判定を行う判定手段を更に有し、当該観測制御手段は、当該フォトブリーチが施された領域の蛍光がプラトーに達したとの判定がされたときに、当該標本についての当該制御を完了する、ように構成してもよい。
【００１７】
また、前述した本発明に係る顕微鏡制御装置において、蛍光の強度の閾値の設定を取得する蛍光強度閾値取得手段を更に有し、当該フォトブリーチ実行制御手段は、当該部分領域の蛍光の強度が当該閾値に達したときにフォトブリーチを完了させる制御を行う、ように構成してもよい。
【００１８】
なお、レーザ光の照射の制御を行って標本における部分領域にフォトブリーチを施す処理と、共焦点レーザ走査型顕微鏡を制御して当該標本における当該フォトブリーチが施された領域の蛍光の回復の時間変化を観測する処理と、生細胞である標本に対する当該観測の結果に基づいて当該標本の拡散係数を算出する処理と、をコンピュータに行わせるためのプログラムも本発明に係るものであり、コンピュータで当該プログラムを実行させることにより、前述した前述した本発明に係る顕微鏡制御装置と同様の作用効果を当該コンピュータが生じさせる結果、前述した課題が解決される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、以上のように構成することにより、生細胞を対象とするＦＲＡＰ実験とその実験結果の定量的解析とが容易に行えるようになるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
図１は本発明を実施する共焦点レーザ走査型顕微鏡のシステム構成の概略を示している。
【００２１】
図において、共焦点レーザ走査型顕微鏡本体１には、コンピュータ２が接続されている。また、コンピュータ２には操作パネル３、レーザ装置４、及び画像モニタ５が接続されている。
【００２２】
共焦点レーザ走査型顕微鏡１では、レーザ装置４から入射したレーザ光を励起用ダイクロイックミラー１０２で反射させて走査ユニット１０４へ入射させる。走査ユニット１０４は、Ｘ軸方向走査用のガルバノメータミラーとＹ軸方向走査用のガルバノメータミラーとを有しており、コンピュータ２からの走査制御信号に応じてレーザ装置４からのレーザ光をＸＹ走査させると共に、Ｘ軸方向走査による１ラインの走査毎に走査制御終了信号をコンピュータ２へ出力する。また、ＸＹ軸方向走査されたレーザ光は、レボルバ１０５に取り付けられている対物レンズ１０６を経た後、ステージ１０７上に載置されている観察試料１０８上へスポット光として照射される。
【００２３】
このスポット光による観察試料１０８からの光（例えば反射光、あるいは観察試料１０８から発生した蛍光）は入射光路へ戻され、ミラー１０３で反射されて、レンズ１０９で集光される。レンズ１０９の集光位置にはコンフォーカルアパーチャ１１０が配置されており、共焦点光学系が形成されている。コンフォーカルアパーチャ１１０を通過した光はバリアフィルタ１１１により波長が選択され、観察者が所望する波長の光のみがフォトマルチプライヤなどの光電変換器１０１へ入力される。光電変換器１０１が入力された光をアナログ信号化すると、そのアナログ信号は、コンピュータ２に設置されているＡ／Ｄ入力ＣＨ２ｂにより、光量に応じたデジタルデータへと変換される。このデータはメモリ２ｃに記憶され、必要に応じて画像情報として画像モニタ５へ出力する。
【００２４】
レボルバ１０５及びステージ１０７のうちの少なくとも一方には、図に記載しない、顕微鏡内部若しくは外部に設置された電動準焦部を使用することで、Ｚ方向（光軸方向）の位置制御を行うことができる。なお、Ｚ方向の移動制御は、コンピュータ２によって制御される。
【００２５】
操作パネル３は、キーボードの他に、トラックボールやジョイスティック、あるいはマウスなどのポインティングデバイスを有しており、観察者の指示により、コンピュータ２に対して各種の指示、例えばレーザ光の走査開始命令、画像入力指令、あるいは光電変換器１０１の感度の調整指令など、を出力する。
【００２６】
コンピュータ２は、図１に示したシステム全体の制御を司るものであり、特に、操作パネル３から走査指示命令が入力されると、走査制御信号を走査ユニット１０４へ出力し、また、光電変換器１０１から出力される観察試料１０８のアナログ信号をＡ／Ｄ入力ＣＨ２ｂでデジタルデータに変換させてメモリ２ｃへ転送すると共に、そのデータで表されている画像や、各種の走査条件の設定メニュー画面を画像モニタ５で表示させる。更に、コンピュータ２は、操作パネル３からの感度調整指令に応じ、光電変換器１０１に対する印加電圧、アンプゲイン、及びオフセットなどの設定を行う。なお、操作パネル３からの所定の入力に応じて行われる、共焦点レーザ顕微鏡装置１における走査ユニット１０４の制御、レーザ光源装置４から共焦点レーザ顕微鏡装置１へのレーザ光の入射の制御、画像モニタ５へのメモリ内画像情報の出力制御等の各種の制御は、コンピュータ２内の計算・処理部２ａに備えられているＣＰＵ（中央演算装置）が、制御プログラム２ｄを実行することによって実現される。
【００２７】
次に、図１に示したように構成されている上述したシステムを使用して行うＦＲＡＰ実験において採用する、前掲した非特許文献１及び非特許文献２に記載されている解析手法について、簡単に説明する。
【００２８】
まず、レーザ光によるブリーチ特性が正規分布特性を示すものと仮定する。すなわち、図２の（ａ）に示すように、レーザ光の強度分布が照射点を中心として正規分布するものと仮定する。
【００２９】
このレーザ光を用い、十分に短時間であるブリーチを試料に対して実施したときに、ブリーチを行ってから時間ｔが経過したときに分子が発する蛍光の強度ＦK (t)は次式で表せることが知られている。
【００３０】
【数１】
2007024801.tif 000003
上式において、(qＰ0Ｃ0/Ａ)はブリーチ前のとき若しくはプラトー（plateau：安定状態）に達したときにおける蛍光強度、Ｋはブリーチコンスタント（ブリーチの実験条件によって定まる定数）、τD は拡散時間である。なお、拡散時間τD は次式のように定義される。
【００３１】
【数２】
2007024801.tif 000004
ここで、ｗは実効半径であり、図２の（ａ）に示すように、レーザ光の強度が照射点の中心よりｅ-2まで低下する位置までの距離を表す。また、Ｄは拡散係数であり、分子の移動の速さを表すものである。
【００３２】
ところで、上掲した［数１］及び［数２］式のうち、ブリーチコンスタントＫ及び実効半径ｗについては、同一のブリーチの実験条件の下で、固定した（分子が移動できないようにした）細胞を試料としてブリーチを実施したときにおける、ブリーチ中心からの蛍光強度の変化から求めることができる。
【００３３】
ブリーチ中心から距離ｒだけ離れた位置の分子においてブリーチされなかったもの（退色しなかったもの）の割合、つまり、言い換えれば、相対蛍光強度（ブリーチ前の蛍光強度に対するブリーチ後の蛍光強度の割合）Ｃｒは、次式によって表される。
【００３４】
【数３】
2007024801.tif 000005
上式において、Ｉ(ｒ)はブリーチ中心から距離ｒだけ離れた位置の蛍光強度であり、Ｉ(０)はブリーチ中心の蛍光強度であるが、ここで、
【００３５】
【数４】
2007024801.tif 000006
と表すことができる。従って、［数３］式は、
【００３６】
【数５】
2007024801.tif 000007
と表される。
つまり、固定した細胞である試料に対してブリーチを行って上述した距離ｒと相対蛍光強度Ｃｒとの関係を観測してプロットする。そして、複数の試料（例えば１０〜２０細胞程度）に対するブリーチによって得られたプロットデータと、ブリーチコンスタントＫ及び実効半径ｗを変数とした［数５］式のグラフとの間で、汎用の数値グラフ解析ソフトによるカーブフィッティング解析を行う。この解析によって両者が適切にフィットするときの両変数の値を得ることにより、ブリーチコンスタントＫと実効半径ｗとが求まる。
【００３７】
次に、生細胞である試料に対してブリーチを行い、時間ｔと蛍光強度ＦK (t)との関係を観測してプロットする。
そして、このブリーチを複数の試料（例えば１０〜２０細胞程度）に対して行って得られたデータと、拡散係数Ｄ、プラトーＰ、及びベースライン（ｔ＝０のときの蛍光強度）ａの３つを変数とした［数１］式のグラフ（［数２］式の定義を適用した［数１］式のグラフ）との間で、汎用の数値グラフ解析ソフトによるカーブフィッティング解析を行う。
【００３８】
このとき、Σの項としては、例えばｎ＝０から４０程度までを展開する。
この解析によって［数１］式のグラフがプロットデータに適切にフィットするときの変数の値を得ることにより、拡散係数Ｄ、プラトーＰ、及びベースラインａが求まる。
【００３９】
なお、蛍光分子における動く分子と動かない分子との割合（なお、本願においてはこの割合を「Mobile/Immobile 率（モバイル／インモバイル率）」と称することとする。）は次のようにして求めることができる。すなわち、ベースラインａ、プラトーに達したときの蛍光強度Ｐ、及びブリーチ前の生細胞の蛍光強度と上記の割合とは、図３に示されているような関係にある。従って、Mobile/Immobile 率は、これらの蛍光強度より容易に求めることができる。
【００４０】
なお、レーザによるブリーチ特性を、図２の（ｂ）に示すようなサーキュラ・ディスク（circular disc ）特性を呈するものと仮定するのであれば、拡散係数Ｄは次式で算出することができる。
【００４１】
【数６】
2007024801.tif 000008
なお、上式において、ｗは実効半径であり、ｔ1/2 は、図３に示されているように、ブリーチ後の蛍光強度がプラトー時の蛍光強度の１／２だけ回復するまでの時間である。
【００４２】
図１に示したように構成されている上述したシステムを使用し、上述した解析手法に基づいたＦＲＡＰ実験を行うには、以下の手順となる。すなわち、まず、固定した細胞を対象としてＦＲＡＰ法による実験を行い、実効半径ｗ及びブリーチコンスタントＫを求める。以降、この処理を“準備処理”と称することとする。そしてこの後、生細胞（固定していない細胞）を対象としてＦＲＡＰ法による実験を行い、この実験により得られたデータと、先に求めた実効半径ｗ及びブリーチコンスタントＫとから、生細胞における拡散定数、蛍光回復時間、及びMobile/Immobile 率を求める。以降、この処理を“実測処理”と称することとする。
【００４３】
操作者は画像モニタ５上に表示される、図４や後述する図８に示すようなウィザード形式（対話形式）のＧＵＩ（Graphical User Interface）機能による指示、すなわち、処理ステップ毎に必要な操作を操作者に対して要求しながら実験を進めていく機能による指示に従うことにより、上記準備処理及び実測処理の流れに沿って実験を遂行し、必要な計測結果を求めることができる。
【００４４】
図４について簡単に説明すると、まず、（１−１）の画面は、固定細胞である標本を含む観察試料１０８を共焦点レーザ走査型顕微鏡１のステージ１０７上へセットすることを促す画面である。操作者がこの画面での指示に応じて観察試料１０８をステージ１０７上へセットし、操作パネル３を操作して画面上の「次へ」と記されているボタンを押下すると、画像モニタ５の表示は（２−１）の画面へと切り替わる。
【００４５】
（２−１）の画面は、観察試料１０８の画像を一旦取得するために行われるレーザ光の走査条件の設定画面である。操作者は、走査方向（単一方向走査と双方向走査とのいずれかを選択）、走査速度、取得画像のアスペクト比及びサイズ、顕微鏡視野内における画像の取得範囲、観察試料１０８のＺ方向位置を変更して走査を繰り返す走査動作と、所定の時間間隔毎に同一のＺ方向位置で走査を繰り返す走査動作との切り替え、各走査動作における走査の繰り返しの条件等の設定をこの画面に対して行う。そして、操作パネル３を操作して画面上の「次へ」と記されているボタンを押下すると、観察試料１０８の画像の取得動作が開始され、（２−２）のような観察試料１０８の画像が画像モニタ５に別ウィンドウで表示されると共に、（２−１）の画面が（３−１）の画面へと切り替わる。
【００４６】
（３−１）の画面は、観察試料１０８に対するフォトブリーチの条件設定を行う設定画面である。操作者は、フォトブリーチのためのレーザ光の走査速度、走査時間間隔、走査回数、及び強度の設定、並びに、観察試料１０８の画像に対する各種領域の範囲の設定をこの画面に対して行う。ここで、この各種領域の範囲の設定を（３−１）の画面に対して行う代わりに、操作パネル３を操作して、（３−２）の画像のように、表示中の観察試料１０８の画像に対し範囲を特定する線を描画することで行うようにしてもよい。なお、この例では、ブリーチ領域、細胞領域、及びバックグラウンド領域の３つの領域の設定を行う。ここで、ブリーチ領域は、フォトブリーチのためのレーザ光を照射する領域であり、細胞領域は、画像において標本である細胞が表されている（すなわち細胞の外形の輪郭を表している）領域であり、バックグラウンド領域は、画像において細胞が含まれていない（すなわち画像における背景部分の）領域である。
【００４７】
以上の設定を行った後、操作者が操作パネル３を操作して（３−１）の画面上の「次へ」と記されているボタンを押下すると、ＦＲＡＰ実験が開始される。この実験が開始されると、画像モニタ５には、（４−１）に示すような、実験中の観察試料１０８の画像が表示されると共に、（４−２）に示すような、上述した各領域の蛍光強度の時間変化を示すグラフが併せて表示されていく。
【００４８】
次に、上述したＧＵＩ機能を利用したＦＲＡＰ法の実験を進めるために、コンピュータ２によって行われる処理について説明する。なお、以下の処理は、コンピュータ２内の計算・処理部２ａに備えられているＣＰＵ（中央演算装置）が、制御プログラム２ｄを実行することによって実現される。
【００４９】
まず図５について説明する。同図はＦＲＡＰ実験処理の処理内容をフローチャートで示したものである。
図５の処理が開始されると、まず、図示しない準備処理ボタンと実測処理ボタンとが画像モニタ５に表示される。ここで、Ｓ１０１において、操作者が操作パネル３を操作して行うこれらのボタンに対する押下操作を検出し、検出された押下操作が準備処理ボタンに対するものであったか否かを判定する処理が行われる。このとき、検出された押下操作が準備処理ボタンに対するものであったとき（判定結果がＹｅｓのとき）には、準備処理の実行指示を操作者から取得したものとみなし、Ｓ１０２に処理を進める。一方、検出された押下操作が実測処理ボタンに対するものであったとき（判定結果がＮｏのとき）には、実測処理の実行指示を操作者から取得したものとみなし、Ｓ１０４に処理を進める。
【００５０】
Ｓ１０２では準備処理が行われる。この処理の詳細は後述する。
準備処理が完了すると、Ｓ１０３において、図示しない実測処理ボタンを画像モニタ５に表示させる処理が行われる。そして、操作者が操作パネル３を操作して行う、このボタンに対する押下操作を検出したか否かを判定する処理が行われる。ここで、実測処理ボタンに対する押下操作を検出したとき（判定結果がＹｅｓのとき）には、実測処理の実行指示を操作者から取得したものとみなし、Ｓ１０４に処理を進める。一方、実測処理ボタンに対する押下操作を検出しなかったとき（判定結果がＮｏのとき）には、図５の処理を終了する。
【００５１】
Ｓ１０４では実測処理が行われ、その後はこの図５の処理を終了する。なお、この実測処理の詳細は後述する。
以上までの処理が、ＦＲＡＰ実験処理である。
【００５２】
次に図６について説明する。同図は、図５のＳ１０２の準備処理の処理内容をフローチャートで示したものである。
図６の処理が開始されると、まず、図４の（１−１）に示すような画面が画像モニタ５に表示される。ここで、操作者がこの画面の指示に応じて固定細胞である標本を含む観察試料１０８をステージ１０７上へセットし、操作パネル３で所定の操作を行うと、画像モニタ５の表示は（２−１）の画面へと切り替わる。この画面が表示されているときに、操作者が操作パネル３を操作して所定の設定を行うと、観察試料１０８の画像の取得動作が開始され、（２−２）のような観察試料１０８の画像が画像モニタ５に別ウィンドウで表示される。
【００５３】
ここで、操作者は、ブリーチ実行条件の設定を行う。まず、図示しないスポットブリーチボタンとＲＯＩ（Region Of Interest：興味領域）ブリーチボタンとが画像モニタ５に表示され、Ｓ２０１において、操作者が操作パネル３を操作して行うこれらのボタンに対する押下操作を検出し、検出された押下操作がスポットブリーチボタンに対するものであったか否かを判定する処理が行われる。このとき、検出された押下操作がスポットブリーチボタンに対するものであったとき（判定結果がＹｅｓのとき）には、スポットブリーチの結果に基づいて実効半径を算出する指示を操作者から取得したものとみなし、Ｓ２０２に処理を進める。一方、検出された押下操作がＲＯＩブリーチボタンに対するものであったとき（判定結果がＮｏのとき）には、ＲＯＩブリーチの結果に基づいて実効半径を算出する指示を操作者から取得したものとみなし、Ｓ２０３に処理を進める。
【００５４】
このとき、画像モニタ５には、図４の（２−２）の画像と共に、（３−１）のブリーチ実行条件の設定要求画面が表示される。操作者は、画像モニタ５上のこれらの表示に対して所定の設定を行う。
【００５５】
Ｓ２０２では、操作者によってなされた上記の設定のうち、前述したブリーチ領域の位置の設定を、「ブリーチ位置」として取得する処理が行われ、その後はＳ２０４に処理を進める。
【００５６】
Ｓ２０３では、操作者によってなされた上記の設定のうち、前述したブリーチ領域の位置を、「ＲＯＩ位置」として取得する処理が行われる。
Ｓ２０４では、フォトブリーチ前の各領域の輝度を測定する処理が行われる。
【００５７】
Ｓ２０５では、図４の（３−１）の画面に対して操作者によってなされた設定のうち、レーザ条件（レーザの走査速度やレーザ光の強度など）の設定を取得する処理が行われ、続くＳ２０６では、当該設定のうち、ブリーチ時間の設定を取得する処理が行われる。なお、これらの設定内容は、コンピュータ２のメモリ２ｃに保存される。
【００５８】
Ｓ２０７では、以上のようにして取得した各種条件に従ってレーザ光を制御してフォトブリーチを観察試料１０８に対して施し、所定のデータ（フォトブリーチ後の観察試料１０８の画像の各画素の輝度）を光電変換器１０１で計測し、前述した各領域における蛍光の回復の時間変化を観測する処理が行われる。
【００５９】
Ｓ２０８では、実験対象である全ての観察試料１０８についての計測を完了したか否かを判定する処理が行われ、完了したと判定したとき（判定結果がＹｅｓのとき）にはＳ２０９に処理を進める。一方、未完と判定したとき（判定結果がＮｏのとき）にはＳ２０１へと処理を戻し、未計測である観察試料１０８を対象とする上述した計測のための処理が再度行われる。
【００６０】
Ｓ２０９では、上述したようにして得られた観測の結果に基づいて、フォトブリーチに使用したレーザ光の実効半径を算出する処理が行われ、続くＳ２１０ではブリーチコンスタントを算出する処理が行われる。これらの算出処理は以下のようにして行われる。
【００６１】
まず、フォトブリーチの実行によって計測された輝度値より、ブリーチ位置の中心からの距離ｒと、観察試料１０８において当該距離の位置における前述した相対蛍光強度Ｃｒとの関係を、観察試料１０８毎に求める。なお、前掲した非特許文献２によれば、この関係は以下のようにして求められる。
【００６２】
まず、観察試料１０８の画像において、前述した各領域の画素の平均輝度を算出する。ここで、細胞領域の画素の輝度をＩtotal とし、バックグラウンド領域の画素の輝度をＩBGとする。また、ブリーチ領域において、ブリーチ位置の中心から距離ｒの位置に同心円状に位置している画素の輝度をＩr とする。
【００６３】
このとき、バックグラウンド領域の蛍光強度を基準としたときの細胞領域の蛍光強度 netＩtotal 及びブリーチ領域の蛍光強度 netＩr は、前掲した非特許文献２によれば、次式によって求められる。
【００６４】
【数７】
2007024801.tif 000009
この蛍光強度 netＩtotal 及び netＩr を、ブリーチの前後について求める。
ここで、ブリーチ前の細胞領域の蛍光強度の平均をＩtotal (before)とし、ブリーチ後の細胞領域の蛍光強度の平均をＩtotal (after) とし、ブリーチ前のブリーチ領域の蛍光強度の平均をＩr (before)とし、ブリーチ後のブリーチ領域の蛍光強度の平均をＩr (after )とすると、前掲した非特許文献２によれば、相対蛍光強度Ｃｒは次式で求められる。
【００６５】
【数８】
2007024801.tif 000010
従って、この［数８］式を用いることにより、観察試料１０８に対するフォトブリーチの計測結果より、観察試料１０８において、ブリーチ位置の中心からの距離ｒの位置における相対蛍光強度Ｃｒの値を得ることができる。ここで、汎用の数値グラフ解析ソフトを実行し、このようにして得られた距離ｒと相対蛍光強度Ｃｒとの関係と、実効半径ｗ及びブリーチコンスタントＫを変数にした前掲した［数５］式のグラフとの間で、カーブフィッティング解析を行う。この解析によって両者が適切にフィットするときの両変数の値を得ることにより、実効半径ｗ及びブリーチコンスタントＫが求まる。
【００６６】
以上の演算を計測した全ての観察試料１０８について行い、観察試料１０８の各々について得られた結果の平均を求めることにより、実効半径ｗ及びブリーチコンスタントＫの最終的な値が得られる。
【００６７】
図６の説明へ戻ると、Ｓ２１１において、上述したようにして得られた結果を、コンピュータ２のメモリ２ｃに保存する処理が行われ、その後はこの図６の処理が終了する。
次に図７について説明する。同図は、図５のＳ１０４の実測処理の処理内容をフローチャートで示したものである。
【００６８】
まず、Ｓ３０１において、前述した準備処理においてコンピュータ２のメモリ２ｃに保存しておいた情報（レーザ条件、ブリーチ時間や、実効半径ｗ及びブリーチコンスタントＫの値など）を読み出す処理が行われる。
【００６９】
ここで、画像モニタ５には、図８の（１）に示すような、前述した準備処理における図４の（１−１）と同様の画面、すなわち、共焦点レーザ走査型顕微鏡１の各部をコンピュータ２が制御して取得させた観察試料１０８の画像が表示される。ここで、操作者がこの画面の指示に応じて生細胞である観察試料１０８をステージ１０７上へセットし、操作パネル３で所定の操作を行うと、観察試料１０８の画像の取得動作が開始され、画像モニタ５の表示は図８の（２）に示すような観察試料１０８の画像が表示される。
【００７０】
操作者は、画像モニタ５上のこれらの画像に対してＲＯＩの作成、すなわち、ブリーチ領域、細胞領域、及びバックグラウンド領域の３つの領域の設定を行う。図８の（３）は、このＲＯＩの作成の様子を示している。
【００７１】
Ｓ３０２では、これらのＲＯＩの作成結果を取得する処理が行われる。
Ｓ３０３では、実験のための処理、すなわち、Ｓ３０１の処理によって取得された各種条件に従ってフォトブリーチを観察試料１０８に対して施し、所定のデータ（フォトブリーチ後の観察試料１０８の画像の各画素の輝度）を計測して蛍光強度の回復の時間変化を観測する処理が行われる。
【００７２】
Ｓ３０４では、この観察により、蛍光強度がプラトーに達したか否かを判定する処理が行われる。この判定処理では、例えば、所定時間ごとに蛍光強度の観測を行い、前回に観測された蛍光強度値と今回観測された蛍光強度値との差が所定値以下となった場合には蛍光強度がプラトーに達したと判定する。また、この代わりに、所定時間ごとに蛍光強度の観測を行い、直近の所定回数（例えば５回）に観測された蛍光強度値の平均と、それ以前の所定回数（例えば５回）に観測された蛍光強度値の平均との差を求め、当該差が所定値以下となった場合には蛍光強度がプラトーに達したと判定するようにしてもよい。
【００７３】
このＳ３０４の判定処理において、蛍光強度がプラトーに達したと判定されたときにのみ（判定結果がＹｅｓのときにのみ）、現在の観測対象である観察試料１０８についての蛍光強度の回復の時間変化の観測が完了したとみなしてＳ３０５に処理を進める。このＳ３０４の判定処理により、過不足のないデータの取得が可能となり、当該データ保持のために消費されるメモリ２ｃの記憶容量の圧迫が軽減されると共に、蛍光回復時間の定量的な測定が可能となる。
【００７４】
Ｓ３０５では、用意されている観察試料１０８の全て（例えば１０〜２０細胞程度）に対する上記の実験を終えたか否かを判定する処理が行われ、実験を全て終えたと判定したとき（判定結果がＹｅｓのとき）にはＳ３０６に処理を進める。一方、未実験の観察試料１０８が残されていると判定したとき（判定結果がＮｏのとき）にはＳ３０２へと処理を戻して上述した処理が繰り返される。
【００７５】
Ｓ３０６では、拡散定数Ｄを算出する処理が行われる。すなわち、生細胞である複数の観察試料１０８に対してブリーチを行って得られた、時間ｔと蛍光強度ＦK (t)との関係を示す平均のプロットデータと、拡散係数Ｄ、プラトーＰ、及びベースラインａを変数とした［数１］式のグラフ（［数２］式の定義を適用した［数１］式のグラフ）との間で、汎用の数値グラフ解析ソフトによるカーブフィッティング解析処理を実行する。このとき、Σの項としては、例えばｎ＝０から４０程度までを展開する。そして、この解析によって、［数１］式のグラフがプロットデータに適切にフィットするときの変数の値を得ることで、拡散係数ＤプラトーＰ、及びベースラインａが求められる。なお、蛍光強度の時間変化のプロットデータからプラトー強度（qＰ0Ｃ0/Ａ）を明確に特定できる場合には、当該プラトー強度をプロットデータから直接求めるようにしてもよい。
【００７６】
Ｓ３０７では、蛍光回復時間を算出する処理が行われる。この処理は、時間ｔと蛍光強度ＦK (t)との関係を示す平均のプロットデータからプラトーに達するまでの時間を求めることによって得られる。
【００７７】
Ｓ３０８では、Mobile/Immobile 率を算出する処理が行われる。この処理は、ｔ＝０のときの蛍光強度ａとプラトーに達したときの蛍光強度Ｐとを、図３に示した動く分子と動かない分子との割合の関係に基づいて求めるようにすればよく、また、時間ｔと蛍光強度ＦK (t)との関係を示す平均のプロットデータから図３に示した関係に基づいて求めるようにしてもよい。
【００７８】
Ｓ３０９では、以上のようにして得られた拡散定数、蛍光回復時間、及びMobile/Immobile 率を画像モニタ５に表示する等して出力する処理が行われ、その後はこの図７の処理が終了する。
【００７９】
上述した図５、図６、及び図７の処理をコンピュータ２内の計算・処理部２ａに備えられているＣＰＵが行うことにより、ＧＵＩ機能を利用したＦＲＡＰ法の実験が図１に示したシステムで可能となる。
【００８０】
なお、上述した実施形態においては、レーザによるブリーチ特性が図２の（ａ）に示した正規分布特性を示すものとしていたが、レーザによるブリーチ特性が図２の（ｂ）に示すようなサーキュラ・ディスク特性を呈するものとみなせるときには、［数６］式を利用することにより、拡散係数Ｄの算出処理を簡素化することができる。
【００８１】
また、前述した実施形態においては、図６のＳ２０６の処理において取得したフォトブリーチの時間の設定に従ってフォトブリーチを実行するようにしていたが、この代わりに、操作者によって設定される、ブリーチを実行したときの到達輝度値（蛍光強度の閾値）の設定を取得し、取得した輝度値に到達するまでブリーチを行い、設定された輝度値に到達したときにブリーチを完了させる制御処理を行うようにしてもよい。こうすることによっても、フォトブリーチの完了後直ちに蛍光回復の観測を開始することができ、蛍光の回復時間の計測も精度良く行うことができる。
【００８２】
また、操作者がこの到達輝度値の設定を行う代わりに、バックグラウンド領域の平均値を算出し、この値を到達輝度値として自動的に設定するようにしてもよい。
また、前述した実施形態においては、図７のＳ３０２からＳ３０５の処理の繰り返しにおいて、観察試料１０８をひとつずつ入れ替えるようにしていたが、その代わりに、観察試料１０８である複数の細胞を予め登録しておいて各細胞に対するＲＯＩの作成をまとめて行っておくようにし、Ｓ３０２の処理ではこのＲＯＩの作成結果を一括取得するようにし、電動ＸＹステージ装置と組み合わせた多点タイムラプスシステムを併用して、ＦＲＡＰ実験と解析とを自動的に繰り返すように図７の処理を変更することもできる。
【００８３】
以上のように、ＦＲＡＰ法を用いて蛍光分子の拡散定数を計測する場合には、煩雑な実験や複雑な計算式を解読する作業を実施する必要があるため、結果を算出するまでに多大な労力を要するところ、本実施形態によれば、ウィザード形式のＧＵＩ機能によりＦＲＡＰ実験のための一連の作業の流れが進むように構成されているので、操作者は画面に表示される指示に従って作業を進めていけば、的確な実験と、定量的な拡散定数の算出とを容易に行うことが可能になる。
【００８４】
ところで、図５、図６、及び図７にフローチャートで示した処理を、標準的な構成のコンピュータ、すなわち、制御プログラムを実行することで各構成要素を制御するＣＰＵと、ＲＯＭやＲＡＭ及び磁気記憶装置などからなり、ＣＰＵに各構成要素を制御させる制御プログラムの記憶やＣＰＵが制御プログラムを実行する際のワークエリアあるいは各種データの記憶領域として使用される記憶部と、ユーザによる操作に対応する各種のデータが取得される入力部と、ディスプレイなどに各種のデータを提示してユーザに通知する出力部と、他の機器とのデータ授受のためのインタフェース機能を提供するＩ／Ｆ部と、を備えるコンピュータに行わせることが可能である。そのためには、これらの処理をＣＰＵに行わせるための制御プログラムを作成してコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録させておき、そのプログラムを記録媒体からコンピュータに読み込ませてＣＰＵで実行させるようにすればよい。
【００８５】
記録させた制御プログラムをコンピュータで読み取ることの可能な記録媒体としては、例えば、コンピュータに内蔵若しくは外付けの付属装置として備えられるＲＯＭやハードディスク装置などの記憶装置、コンピュータに備えられる媒体駆動装置へ挿入することによって記録された制御プログラムを読み出すことのできるフレキシブルディスク、ＭＯ（光磁気ディスク）、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭなどといった携帯可能記録媒体等が利用できる。
【００８６】
また、記録媒体は通信回線を介してコンピュータと接続される、プログラムサーバとして機能するコンピュータシステムが備えている記憶装置であってもよい。この場合には、制御プログラムを表現するデータ信号で搬送波を変調して得られる伝送信号を、プログラムサーバから伝送媒体である通信回線を通じてコンピュータへ伝送するようにし、コンピュータでは受信した伝送信号を復調して制御プログラムを再生することでこの制御プログラムをコンピュータのＣＰＵで実行できるようになる。
【００８７】
以上、本発明の実施形態を説明したが、本発明は、上述した各実施形態に限定されることなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の改良・変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明を実施する共焦点レーザ走査型顕微鏡のシステム構成の概略を示す図である。
【図２】レーザ光によるブリーチ特性の例を示す図である。
【図３】フォトブリーチ後の蛍光回復曲線の例を示す図である。
【図４】画像モニタでの表示例（その１）を示す図である。
【図５】ＦＲＡＰ実験処理の処理内容を示すフローチャートである。
【図６】準備処理の処理内容を示すフローチャートである。
【図７】実測処理の処理内容を示すフローチャートである。
【図８】画像モニタでの表示例（その２）を示す図である。
【符号の説明】
【００８９】
１  共焦点レーザ走査型顕微鏡本体
２  コンピュータ
２ａ  計算・処理部
２ｂ  Ａ／Ｄ入力ＣＨ
２ｃ  メモリ
２ｄ  制御プログラム
３  操作パネル
４  レーザ装置
５  画像モニタ
１０１  光電変換器
１０２  励起用ダイクロイックミラー
１０３  ミラー
１０４  走査ユニット
１０５  レボルバ
１０６  対物レンズ
１０７  ステージ
１０８  観察試料
１０９  レンズ
１１０  コンフォーカルアパーチャ
１１１  バリアフィルタ
【図１】
2007024801.tif 000011
【図３】
2007024801.tif 000012
【図５】
2007024801.tif 000013
【図６】
2007024801.tif 000014
【図７】
2007024801.tif 000015
【図２】
2007024801.tif 000016
【図４】
2007024801.tif 000017
【図８】
2007024801.tif 000018