(57)【要約】【課題】従来の細菌検出方法と同等以上の迅速性および感度を有すると共に、検出に影響を及ぼす可能性のある物質を含む試料においても細菌を正確に検出することができ、かつ、検出した細菌のグラム染色性を識別することができる細菌検出方法を提供する。【解決手段】細菌の細胞壁に結合するタンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質を用い、グラム陰性細菌の外膜の透過性亢進処理の有無により、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の検出、または、グラム陽性細菌のみの検出を行うことができる方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の細菌を検出し、かつ、検出された細菌がグラム陽性であるかグラム陰性であるかを識別する方法であって、
細菌の細胞壁に結合するタンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質を用いることを特徴とする方法。
【請求項２】
試料中の細菌と上記融合タンパク質とを接触させる接触工程；および
融合タンパク質中のレポータータンパク質を指標に細菌数を測定する計数工程
を包含し、
上記接触工程の前段に、試料中のグラム陰性細菌の外膜の透過性亢進処理工程を行う場合には、試料中の全細菌を検出し、
当該透過性亢進処理工程を行わない場合には、試料中のグラム陽性細菌のみを検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記計数工程の前段に、さらに融合タンパク質が結合した細菌を回収する回収工程を包含することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記融合タンパク質と細菌の細胞壁との解離定数Ｋｄが１００ｎＭ以下であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記融合タンパク質と細菌の細胞壁との解離定数Ｋｄが１０ｎＭ以下であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記細菌の細胞壁に結合するタンパク質が、細菌の自己分解酵素由来であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記細菌の細胞壁に結合するタンパク質が、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の自己分解酵素由来であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記細菌の細胞壁に結合するタンパク質が、
配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記細菌の細胞壁に結合するタンパク質が、
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質から選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
上記レポータータンパク質が、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ジアホラーゼ、アルカリホスファターゼおよびパーオキシダーゼから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
試料中の細菌を検出し、かつ、検出された細菌がグラム陽性であるかグラム陰性であるかを識別する試薬組成物であって、
細菌の細胞壁に結合するタンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質を含むことを特徴とする試薬組成物。
【請求項１２】
上記融合タンパク質と細菌の細胞壁との解離定数Ｋｄが１００ｎＭ以下であることを特徴とする請求項１１に記載の試薬組成物。
【請求項１３】
上記融合タンパク質と細菌の細胞壁との解離定数Ｋｄが１０ｎＭ以下であることを特徴とする請求項１１に記載の試薬組成物。
【請求項１４】
上記細菌の細胞壁に結合するタンパク質が、細菌の自己分解酵素由来であることを特徴とする請求項１１に記載の試薬組成物。
【請求項１５】
上記細菌の細胞壁に結合するタンパク質が、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の自己分解酵素由来であることを特徴とする請求項１４に記載の試薬組成物。
【請求項１６】
上記細菌の細胞壁に結合するタンパク質が、
配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする請求項１５に記載の試薬組成物。
【請求項１７】
上記細菌の細胞壁に結合するタンパク質が、
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の試薬組成物。
【請求項１８】
上記レポータータンパク質が、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ジアホラーゼ、アルカリホスファターゼおよびパーオキシダーゼから選択されることを特徴とする請求項１１に記載の試薬組成物。
【請求項１９】
請求項１１ないし１８に記載の試薬組成物を備えることを特徴とするグラム陽性／陰性細菌識別・検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌検出を行うと共に検出された細菌がグラム陽性細菌であるかグラム陰性細菌であるかを識別する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細菌などの微生物の検査は、食品製造現場、医薬品製造現場、病院、プール、浴場等の環境微生物検査、食品、医薬品等への微生物の混入検査、医療現場における感染症の検査など多くの場面で必要な検査である。特に、環境衛生分野、食品衛生分野、医療分野において非常に重要な検査である。
【０００３】
従来、微生物検査は栄養培地を用いて生細胞を増殖させて検出する方法が行われてきたが、この方法では微生物が増殖して検出可能となるまでにある程度の日数を要するため、迅速性に問題があった。
【０００４】
ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）は、動物、植物、微生物などの全ての生物に存在するエネルギー物質である。現在、ＡＴＰの測定には、ルシフェラーゼの存在下でＡＴＰと発光基質であるルシフェリンを反応させて発する光を測定する方法が用いられている（非特許文献１参照）。発光は、ルシフェラーゼと２価の金属イオン（Mg2+、Mn2+など）の存在下で以下の反応により生じる。
ルシフェリン＋ATP＋O2＋H2O→オキシルシフェリン＋AMP＋PPi＋CO2＋光
この生物発光法は、細菌などの微生物を迅速に検出する方法として普及し、迅速な衛生学的モニタリングとして用いられている（非特許文献２参照）。
【非特許文献１】DeLuca, M., and McElroy, W. D., Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions. Biochemistry, 26, 921-925 (1974).
【非特許文献２】Bautista, D. A., Vaillancourt, J. P., Clarke, R. A., Renwick, S., and Griffiths, M. W., Adenosine triphosphate bioluminescence as a method to determine microbial levels in scald and chill tanks at a poultry abattoir. Poult. Sci., 73, 1673-1678 (1994).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、上述のルシフェリン／ルシフェラーゼによる生物発光法を利用した細菌検出方法は、非常に迅速かつ高感度な方法ではあるが、細菌以外のＡＴＰも検出してしまうという問題がある。すなわち、試料中に細菌に由来しないＡＴＰ（例えば、細胞外ＡＴＰや細菌以外の細胞に由来するＡＴＰ）が存在した場合、細菌の数として正確な結果を得ることができないといことが問題となっていた。
【０００６】
また、細菌はグラム陽性細菌とグラム陰性細菌とに分類され、細菌の同定に欠かせない第一項目となっている。またこの分類が抗菌剤の選択の一つの指標にもなっている。グラム陽性／陰性の識別は、実際には細菌に対してグラム染色を施すことにより行うことができるが、１２以上のステップと３種類の特殊な試薬を必要とし、その判定には熟練の技術が要求される。上述のルシフェリン／ルシフェラーゼによる生物発光法を利用した細菌検出方法では、当然のことながらグラム陽性細菌とグラム陰性細菌とを識別することはできない。
【０００７】
そこで、上記２つの問題点を同時に解決できる細菌検出方法の開発が望まれている。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、従来のルシフェリン／ルシフェラーゼによる生物発光法を利用した細菌検出方法と同等以上の迅速性および感度を有すると共に、検出に影響を及ぼす可能性のある物質を含む試料においても細菌を正確に検出することができ、かつ、検出した細菌のグラム染色性を識別することができる細菌検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の自己分解酵素由来タンパク質と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼとの融合タンパク質は、レポータータンパク質の機能を損うことなく、強固にグラム陽性細菌の細胞壁に結合可能であることを見出し、また、当該融合タンパク質は、外膜の透過性亢進処理をしたグラム陰性細菌の細胞壁とも結合できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち本発明に係る方法は、試料中の細菌を検出し、かつ、検出された細菌がグラム陽性であるかグラム陰性であるかを識別する方法であって、細菌の細胞壁に結合するタンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質を用いることを特徴としている。
【００１１】
また、本発明に係る方法は、試料中の細菌と上記融合タンパク質とを接触させる接触工程；および融合タンパク質中のレポータータンパク質を指標に細菌数を測定する計数工程を包含し、上記接触工程の前段に、試料中のグラム陰性細菌の外膜の透過性亢進処理工程を行う場合には、試料中の全細菌を検出し、当該透過性亢進処理工程を行わない場合には、試料中のグラム陽性細菌のみを検出することを特徴としている。
【００１２】
本発明に係る方法においては、上記計数工程の前段に、さらに融合タンパク質が結合した細菌を回収する回収工程を包含することが好ましい。
【００１３】
本発明の方法において、上記融合タンパク質と細菌の細胞壁との解離定数Ｋｄは１００ｎＭ以下であることが好ましく、１０ｎＭ以下であることがより好ましい。
【００１４】
また、本発明に係る方法において、上記細菌の細胞壁に結合するタンパク質は、細菌の自己分解酵素由来であることが好ましく、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の自己分解酵素由来であることがより好ましい。
【００１５】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の自己分解酵素由来の細胞壁結合タンパク質としては、配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質から選択される少なくとも１種を含むものであることが好ましく、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質から選択されることがより好ましい。
【００１６】
また、本発明に係る方法において、上記レポータータンパク質は、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ジアホラーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼから選択されることが好ましい。
【００１７】
本発明に係る試薬組成物は、試料中の細菌を検出し、かつ、検出された細菌がグラム陽性であるかグラム陰性であるかを識別する試薬組成物であって、細菌の細胞壁に結合するタンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質を含むことを特徴としている。
【００１８】
本発明に係る試薬組成物において、上記融合タンパク質と細菌の細胞壁との解離定数Ｋｄは１００ｎＭ以下であることが好ましく、１０ｎＭ以下であることがより好ましい。
【００１９】
また、本発明に係る試薬組成物において、上記細菌の細胞壁に結合するタンパク質は、細菌の自己分解酵素由来であることが好ましく、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の自己分解酵素由来であることがより好ましい。
【００２０】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の自己分解酵素由来の細胞壁結合タンパク質としては、配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質から選択される少なくとも１種を含むものであることが好ましく、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質から選択されることがより好ましい。
【００２１】
また、本発明に係る試薬組成物において、上記レポータータンパク質は、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ジアホラーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼから選択されることが好ましい。
【００２２】
本発明に係るグラム陽性／陰性細菌識別・検出キットは、上記本発明に係る試薬組成物を備えることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る方法、試薬組成物、キットを用いれば、煩雑な操作を必要とせず、短時間で細菌を検出できると共に、検出細菌のグラム陽性／陰性を識別できるという効果を奏する。
【００２４】
また、従来法では検出感度の低下の原因となるような因子が含まれる試料を用いても、高感度かつ正確に目的の細菌を検出できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明に係る方法は、試料中の細菌を検出し、かつ、検出された細菌がグラム陽性であるかグラム陰性であるかを識別する方法であって、細菌の細胞壁に結合するタンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質を用いるものであればよい。
【００２６】
また、本発明に係る試薬組成物は、試料中の細菌を検出し、かつ、検出された細菌がグラム陽性であるかグラム陰性であるかを識別する試薬組成物であって、細菌の細胞壁に結合するタンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質を含むものであればよい。
【００２７】
グラム陽性細菌は、グラム染色反応でアセトン処理によって脱色されない細菌の総称であり、代表的なグラム陽性細菌としては、乳酸菌、放線菌、枯草菌、Staphylococcus属、Streptococcus属などが挙げられる。また、グラム陰性細菌は、グラム染色で染色されず、対比染色で染まる細菌の総称であり、代表的なグラム陰性細菌としては、大腸菌、サルモネラ菌、Pseudomonas属などが挙げられる。
【００２８】
最初に、上記細菌の細胞壁に結合するタンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質について説明する。
【００２９】
〔細菌の細胞壁に結合するタンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質〕
本明細書において、用語「タンパク質」は、「ポリペプチド」または「ペプチド」と交換可能に使用される。「タンパク質」には、タンパク質の部分断片（フラグメント）が含まれるものとする。また、「タンパク質」には、融合タンパク質が含まれるものとする。「融合タンパク質」は、２つ以上の異種タンパク質の一部（フラグメント）または全部が結合したタンパク質である。
【００３０】
細菌の細胞壁に結合するタンパク質（以下「細胞壁結合タンパク質」と記す。）は、細菌の細胞壁に結合できるものであればよいが、細菌の表層に非特異的かつごく短時間の一過性に結合（付着）し得るタンパク質は含まれない。また、すべての細菌の細胞壁に結合し得ることを要するものではなく、一部の細菌の細胞壁に結合し得るものでもよい。
【００３１】
細胞壁結合タンパク質は、例えば、細菌を高濃度の塩溶液（５Ｍ ＬｉＣｌなど）で処理することにより細胞壁から溶出するタンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離して、得られた各バンドに由来するタンパク質の細胞壁結合能を分析することにより取得することができる（参考文献：Molecular cloning and sequencing of a major Bacillus subtilis autolysin gene, Kuroda A, Sekiguchi J, J Bacteriol. 173巻, 7304-7312ページ, 1991年.）。
【００３２】
取得した細胞壁結合タンパク質は、公知の方法を用いて同定、アミノ酸配列決定を行うことができる。例えば、トリプシン消化物をマトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOFMS）により分析し、ペプチドマスフィンガープリント解析により同定することができ、公知のタンパク質データベースからアミノ酸配列を取得することができる。また、例えば、自動ペプチドシーケンサを用いてアミノ酸配列を決定することができる。
【００３３】
アミノ酸配列が決定すれば、当該細胞壁結合タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、公知の遺伝子データベースから取得することができる。また、当該細胞壁結合タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、プライマーまたはプローブを設計し、当該細胞壁結合タンパク質コードするＤＮＡ断片をクローニングして、ＤＮＡシーケンサを用いて塩基配列を決定することができる。
【００３４】
レポータータンパク質は、上記細胞壁結合タンパク質と融合タンパク質を形成してもそのレポーター機能を維持できるものであればよい。なかでも、レポーター機能を容易に検出できるものであることが好ましい。例えば、蛍光性タンパク質、酵素などを挙げることができる。より具体的には、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ジアホラーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼなどを挙げることができる。
【００３５】
融合タンパク質は、例えば、細胞壁結合タンパク質をコードする遺伝子とレポータータンパク質をコードする遺伝子とを人工的に連結した融合遺伝子（ハイブリッド遺伝子）を作製し、当該融合遺伝子を、発現ベクターのプロモーターの下流に挿入し、大腸菌などの宿主細胞に導入して発現させることにより取得することができる。融合タンパク質発現ベクターの構築、融合タンパク質の発現および精製の具体例としては、後述の実施例に記載の方法を挙げることができる。
【００３６】
ここで、細胞壁結合タンパク質は、細菌の自己分解酵素由来であることが好ましい。自己分解酵素は、自己溶解酵素、自己溶菌酵素とも称され、自己の細胞壁に結合し、その細胞壁を分解できるペプチドグリカン加水分解酵素の総称である。
【００３７】
なかでも、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus、以下「ＳＡ」と略記する場合がある）の自己分解酵素（autolysin）由来の細胞壁結合タンパク質を好適に用いることができる。このＳＡの自己分解酵素は、Ｎ末端側のアミダーゼドメインとＣ末端側のグルコサミニダーゼドメインとが３つの繰り返し配列を介して結合している構造を有している。なお、当該ＳＡの自己分解酵素（autolysin）のアミノ酸配列（1256アミノ酸）は、GenPeptにACCESSION:BAA04185として登録されており、塩基配列（6140塩基）はGenBankにACCESSION:D17366として登録されている。
【００３８】
発明者は、後述の実施例において詳細に説明するように、当該ＳＡの自己分解酵素の３つの繰り返し配列部分と緑色蛍光タンパク質（以下「ＧＦＰ」と略記する）との融合タンパク質が細菌の細胞壁に結合できると共にＧＦＰの機能を損わないことを見出している。また、当該融合タンパク質はＳＡの細胞壁と強固に結合できることを確認している。
【００３９】
ＳＡの自己分解酵素の３つの繰り返し配列のうち、第１の繰り返し配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列である。詳細には、ＳＡのautolysinのアミノ酸配列の第４４１位〜第５８４位に相当するアミノ酸配列である。第２の繰り返し配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列である。詳細には、ＳＡのautolysinのアミノ酸配列の第６１０位〜第７５３位に相当するアミノ酸配列である。第３の繰り返し配列は、配列番号３に示されるアミノ酸配列である。詳細には、ＳＡのautolysinのアミノ酸配列の第７８４位〜第９２７位に相当するアミノ酸配列である。また、配列番号４には、ＳＡの自己分解酵素の３つの繰り返し配列部分の全てを含むアミノ酸配列が示されている。詳細には、ＳＡのautolysinのアミノ酸配列の第４４１位〜第９３２位に相当するアミノ酸配列である。
【００４０】
細胞壁結合タンパク質は、配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質から選択される少なくとも１種を含むものであることが好ましい。少なくとも１種を含むものであればよく、同種のものを複数含んでいるものでもよい。また、組み合わせ、結合順序、結合個数などは限定されない。
【００４１】
また、細胞壁結合タンパク質は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質から選択されることが好ましい。
【００４２】
ここで「１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。このような変異タンパク質は、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００４３】
タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００４４】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチド活性を変化させない。
【００４５】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００４６】
細胞壁結合タンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質は、細菌の細胞壁と強固に結合できるものであることが好ましい。具体的には、結合の強さを解離定数Ｋｄで表した場合、Ｋｄ＝１００ｎＭ以下であることが好ましく、Ｋｄ＝１０ｎＭ以下であることがより好ましい。Ｋｄ＝１００ｎＭ以下であれば、融合タンパク質と細胞壁とが強固に結合でき、後述する洗浄操作においても細菌表層から剥がれなくすることができる。
【００４７】
解離定数（Ｋｄ）は解離反応速度定数（Ｋｏｆｆ）／結合反応速度定数（Ｋｏｎ）で表される。通常、結合反応速度定数（Ｋｏｎ）が約１０５Ｍ−１Ｓ−１であると仮定すると、Ｋｄが１００ｎＭ（１０−７）の場合、解離反応速度定数（Ｋｏｆｆ）は１０−２Ｓ−１となる。この数字（Ｋｏｆｆが１０−２Ｓ−１）の意味は結合状態のものが自然対数分の一（１／e、約０．３７）に減少するのに１００秒かかることを意味する。本件の実験では結合したものを遠心操作で沈殿するのに６０秒かかるので、少なくとも１００秒間ほど結合状態が維持されることが必要である。したがって、Ｋｄ＝１００ｎＭ以下であることが必要となる。望ましくはＫｄ＝１０ｎＭであれば、１０００秒程度結合体は安定なので、遠心操作にかかる時間は問題にならない。
【００４８】
なお、本発明者が用いたＳＡのautolysinの細胞壁結合ドメイン（３つの繰り返し配列部分）とＧＦＰとの融合タンパク質がＳＡの細胞壁に結合する強さは、Ｋｄ＝約６ｎＭである。
【００４９】
解離定数（Ｋｄ）は、例えば、実施例に記載のスキャッチャードプロットにより求めることができる。
【００５０】
ここで、Oshidaらの論文（Oshida, T., M. Sugai, H. Komatsuzawa, Y. M. Hong, H. Suginaka, and A. Tomasz. 1995. A Staphylococcus aureus autolysin that has an N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase domain and an endo-b-N-acetylglucosaminidase domain: Cloning, sequence analysis, and characterization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 285-289.）には、ＳＡの自己分解酵素（autolysin）の塩基配列およびアミノ酸配列が開示されており、３つの繰り返し配列部分が細胞壁結合に関与する可能性が示唆されている。しかしながら、本論文においては、当該３つの繰り返し配列部分が細胞壁結合ドメインであることは実証されていない。また、当該３つの繰り返し配列部分のみを取り出して、他のタンパク質との融合タンパク質を形成した場合に、当該融合タンパク質が細胞壁と強固（Ｋｄ＝６ｎＭの結合力）に結合できること、さらに当該融合タンパク質がＳＡ以外のグラム陽性細菌やグラム陰性細菌の細胞壁にも結合できることは、本論文に基づいて当業者が容易に予想できるものではない。
【００５１】
また、特表２００２−５１４３８１号公報（公表日：平成１４年５月２１日）には、微生物の細胞壁と付着し得るアミノ酸配列を有するタンパク質性物質が開示されている。しかしながら、当該公報には、ＳＡのアミノ酸配列としては、プロテインＡの部分配列が開示されているのみで、ＳＡの自己分解酵素（autolysin）のアミノ酸配列は記載されていない。
【００５２】
〔本発明に係る方法〕
本発明に係る方法は、上述の細胞壁結合タンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質を用いて、試料中の細菌を検出し、かつ、検出された細菌がグラム陽性であるかグラム陰性であるかを識別する方法である。なお、本発明に係る方法の検出対象である細菌には芽胞（spore）が含まれる。
【００５３】
本発明に係る方法は、試料中の細菌と上記融合タンパク質とを接触させる接触工程；および融合タンパク質中のレポータータンパク質を指標に細菌数を測定する計数工程を包含し、上記接触工程の前段に、試料中のグラム陰性細菌の外膜の透過性亢進処理工程を行う場合には、試料中の全細菌を検出し、当該透過性亢進処理工程を行わない場合には、試料中のグラム陽性細菌のみを検出する方法であればよい。上記計数工程の前段には、融合タンパク質が結合した細菌を回収する回収工程を包含することが好ましい。なお、本方法には上記以外の工程が設けられていてもよく、上記以外の工程の内容は限定されない。
【００５４】
以下、本発明に係る方法について、各項工程について説明する。
【００５５】
＜透過性亢進処理工程＞
透過性亢進処理工程は、グラム陰性細菌を検出する場合に必須の工程であるが、グラム陽性細菌のみを検出する場合には必要としない。
【００５６】
グラム陰性細菌は、グラム陽性細菌と異なり細胞壁（ペプチドグリカン層）の外側に膜（外膜）が存在する。透過性亢進処理工程では、この外膜の透過性を亢進させ、融合タンパク質を外膜内の細胞壁に到達させるための処理を行う。
【００５７】
処理方法としては、界面活性剤や有機溶媒による処理法、酵素処理法、加熱処理法、タンパク質変性処理法等を挙げることができる。ただし、これらに限定されるものではない。本発明者は、後述の実施例において、１００℃３分間の熱処理、界面活性剤処理、タンパク質変性処理により、外膜の透過性を亢進させている。界面活性剤としてはベンザルジルコニウム（benzalkonium chloride）が好ましく、タンパク質変性剤としてはトリクロロ酢酸（trichloroacetic acid）が好ましい。
【００５８】
＜接触工程＞
接触工程においては、検出対照の細菌を含むまたは含む可能性のある試料に、細胞壁結合タンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質（以下単に「融合タンパク質」と記す）を細菌の細胞壁と接触可能なように添加すればよい。
【００５９】
試料の形態は特に限定されず、細菌を含む可能性のある液体、個体、粒状体、粉状体、流動体、組織切片などの形態を試料として好適に用いることができる。例えば、食品、医薬品等への細菌の混入を検査する場合は、検査対象自体（液体、個体など）を試料とすることができる。また、検査対象を適当な緩衝液などに懸濁することで試料を調製することができる。環境衛生分野など他の分野の検査においても同様に試料を調製することができる。
【００６０】
例えば、試料が細菌の懸濁液であれば、懸濁液に精製された融合タンパク質を添加すればよい。また、添加後に振盪等によって混和することが好ましい。添加後、次の回収工程までの時間は特に限定されず、直ちに回収工程に進んでもよいが、１〜５分間程度の接触時間を設けることが好ましい。接触時間は長くてもよいが迅速性を考慮すると１〜５分間で十分である。また温度についても特に管理する必要はなく、室温で細菌と融合タンパク質を接触させればよい。
【００６１】
＜回収工程＞
回収工程は、主に細菌の細胞壁に結合していない融合タンパク質を除去することを目的とする。回収工程は必須の工程ではなく、試料の形態や融合タンパク質に用いられるレポータータンパク質の種類により必要に応じて設ければよい。例えば、レポータータンパク質としてＧＦＰを用い、細胞懸濁液を試料とした場合、回収工程を設けなくても蛍光顕微鏡の暗視野観察で細菌を検出することが可能である。
【００６２】
回収工程においては、試料中の細菌を回収すればよい。例えば試料が細菌懸濁液であれば、遠心分離により容易に細菌を回収することができる。細菌を回収することにより、細菌の細胞壁に結合していない融合タンパク質を容易に除去することができる。また、フィルターろ過によっても容易に細菌を回収することができる。この方法の場合も細菌の細胞壁に結合していない融合タンパク質を容易に除去することができる。
【００６３】
さらに、細菌回収後に洗浄操作を行うことが好ましい。洗浄は例えば適当な緩衝液（例えばＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩液）などを回収した細菌に加えて混和し、再度遠心分離すればよい。あるいは、細菌を回収したフィルターに適当な洗浄用緩衝液を通せばよい。洗浄を行うことにより、細菌の細胞壁に結合していない融合タンパク質をほぼ完全に除去することが可能となる。
【００６４】
例えば、レポータータンパク質としてルシフェラーゼを用いた場合には、本回収工程によって、細菌と結合していない余分なルシフェラーゼを除去し、次の計数工程において細菌と結合したルシフェラーゼのみを、十分なＡＴＰとルシフェリンを添加して発光により検出すれば、細菌だけが検出できる。本方法の場合、検出対象はＡＴＰではなくルシフェラーゼであるので、細菌に由来しないＡＴＰを測定してしまうという、従来のルシフェリン／ルシフェラーゼによる生物発光法を利用した細菌検出方法における問題点を解決することができる。さらに、細菌にはルシフェリンを基質にして発光させるルシフェラーゼがないので、バックグラウンドを考慮する必要がなく、非常に有利である。
【００６５】
＜計数工程＞
計数工程においては、上記回収工程で回収した細菌に結合している融合タンパク質のレポータータンパク質部分の機能を検出することにより細菌数を計測すればよい。
【００６６】
例えば、融合タンパク質のレポータータンパク質部分にＧＦＰを用いた場合は、蛍光顕微鏡を用いて緑色蛍光を発光している細菌の数をカウントすることができる。また、ルシフェラーゼを用いた場合は、フィルター上に回収した細菌に十分なＡＴＰとルシフェリンを添加して、発光点を１個の細菌としてカウントすることができる。
【００６７】
また、回収した細菌に結合した融合タンパク質の総量を、例えば蛍光量、発光量、発色量として測定することも可能である。例えば、融合タンパク質のレポータータンパク質部分にベータガラクトシダーゼ、ジアホラーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼなどの酵素を用いた場合には、回収した細菌に基質を添加することで発色量を測定することができる。この場合、細菌数と測定量との検量線を作成することで細菌数の概数を求めることができる。
【００６８】
ここで、グラム陽性／陰性の識別は以下のように行うことができる。
【００６９】
試料より２つの検査用サンプルを分取する。このとき２つの検査用サンプルの細菌数に偏りが生じないように、試料をよく混和する等の操作を行うとが好ましい。一方のサンプル（サンプル１）については透過性亢進処理工程を行い、他方（サンプル２）については透過性亢進処理工程を省く。以後の工程は両サンプルとも同様に行う。
【００７０】
サンプル１より、試料中の全細菌数（グラム陽性細菌数＋グラム陰性細菌数）が得られる。サンプル２より、試料中のグラム陽性細菌数が得られる。この結果を解析することにより、資料中に存在する細菌が、グラム陽性菌のみであるか、グラム陰性菌のみであるか、または両者がどのような比率で混在するか、という情報を得ることができる。
【００７１】
しかも、後述の実施例に示すように、透過性亢進処理工程を実施しない場合は、最短１分間で完了でき、透過性亢進処理工程を実施しても最短５分間程度で実施できるという点で、非常に有用であると考えられる。
【００７２】
〔本発明に係る試薬組成物およびキット〕
本発明に係る試薬組成物は、細菌の細胞壁に結合するタンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質を含むものであればよい。融合タンパク質以外に組成物中に含まれるものは特に限定されず、融合タンパク質の細胞壁結合機能およびレポーター機能を阻害しないものであればよい。本発明に係る試薬組成物に含まれる融合タンパク質は既に説明したとおりである。また、本試薬組成物は、上述の本発明に係る方法に準じて使用することができる。
【００７３】
本発明に係る試薬組成物は、例えば、細胞壁結合タンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質を含む試薬溶液、凍結乾燥物などの形態で実施することができる。
【００７４】
本発明に係るキットは、上記本発明に係る試薬組成物を備えるものであればよい。これ以外の具体的なキットの構成については特に限定されるものではなく、必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成とすればよい。例えば、洗浄用緩衝液、基質溶液、反応用チューブ、フィルターなどを挙げることができる。なお、細胞壁結合タンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質発現用ベクターを備えるキットとすることも可能である。
【００７５】
本明細書中において用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは当該材料を使用するための使用説明書を備える。使用説明書は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、CD-ROMなどのような電子媒体に付されてもよい。
【００７６】
本発明に係るキットは、上述の本発明に係る方法に準じて使用することができる。
【００７７】
本発明に用いられる細胞壁結合タンパク質とレポータータンパク質との融合タンパク質は、グラム陰性細菌の外膜の透過性を亢進させる物質のスクリーニング方法に適用することができる。すなわち、グラム陰性細菌に対して透過性処理工程において被検物質処理を行い、その後当該細菌と融合タンパク質を接触させ、細胞壁に結合した融合タンパク質が検出された場合、当該被検物質はグラム陰性細菌の外膜透過性亢進能を有する物質であるといえる。
【００７８】
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
【００７９】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００８０】
〔実施例１：ＳＡ自己分解酵素（Autolysin）の細胞壁結合ドメイン（cell wall bainding domain、以下「ＣＷＢ」と略記する）とＧＦＰとの融合タンパク質発現ベクターの構築〕
まず、GFP発現ベクターの構築を行った。既知のgfp遺伝子配列より２種のオリゴヌクレオチドプライマーP1:AGAAAAGCTTAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACT（HindIIIサイト付加、配列番号５）およびP2:TCATGCGGCCGCAAGCTCATCCATGCCATGTGTA（NotIサイト付加、配列番号６）を作製し、pGFPuv(クロンテック)を鋳型としてPCRを行った。反応はKOD Plus DNAポリメラーゼ(TOYOBO)を用い、同社のプロトコルに従った。反応条件は、94℃で3分間保持した後、97℃で30秒間、55℃で40秒間、72℃で2分間の反応を37サイクル繰り返し、72℃で10分保持した。
【００８１】
PCR産物および発現ベクターpET21-b(Novagen)を制限酵素HindIIIおよびNotIにより３７℃２時間処理した後、アガロースゲル電気泳動を行った。ゲルから切り出したそれぞれのDNA断片をLigation High(TOYOBO)により１６℃２時間ライゲーションし、大腸菌MV1184株に形質転換した。得られたコロニーから目的のDNA断片が挿入されたプラスミドを抽出し、pET GFPを構築した。図１にpET GFPの構成を示した。
【００８２】
次にCWB-GFP発現ベクターの構築を行った。ＳＡの自己分解酵素（autolysin）の塩基配列（GenBank ACCESSION:D17366）に基づいて、２種のオリゴヌクレオチドプライマーP３:CATCGAATTCTAAATTAACAGTTGCTGCAAACAA（EcoRIサイト付加、配列番号７）およびP４:AGTTGAGCTCGTTAAATCTTTTGCATTTACCCA（SacIサイト付加、配列番号８）を作製し、Staphylococcus aureus JCM2141（理化学研究所から入手）の染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。方法はベクターにpET GFPを用いたこと、制限酵素にEcoRIおよびSacIを用いたこと以外は上述と同じである。最終的に抽出したプラスミドをpET CWB-GFPと名付けた。図２にCWB-GFP発現ベクター（pET CWB-GFP）の構成を示した。
【００８３】
〔実施例２：ＣＷＢとルシフェラーゼとの融合タンパク質発現ベクターの構築〕
既知のルシフェラーゼ遺伝子配列より２種のオリゴヌクレオチドプライマーP5:CCGGGTCGACATGGAAGACGCCAAAAAC（SalIサイト付加、配列番号９）およびP6:GTTGCGGCCGCCAATTTGGACTTTCCGCC（NotIサイト付加、配列番号１０）を作製し、Luciferase T7 Control DNA(promega)を鋳型としてPCRを行った。
【００８４】
PCR産物および上記ベクターCWB-GFP発現ベクター（pET CWB-GFP）を制限酵素SalIおよびNotIにより３７℃２時間処理した後、アガロースゲル電気泳動を行った。ゲルから切り出したそれぞれのDNA断片をLigation High(TOYOBO)により１６℃２時間ライゲーションし、大腸菌MV1184株に形質転換した。得られたコロニーから目的のDNA断片が挿入されたプラスミドを抽出し、pET CWB-LUCと名付けた。図３にCWB-Luciferase発現ベクター（pET CWB-LUC）の構成を示した。
【００８５】
〔実施例３：融合タンパク質（CWB-GFP、CWB-Luciferase）の発現および精製〕
pET CWB-GFP、pET CWB-LUCでそれぞれ形質転換したBL21(DE3) (Novagen)を、ＬＢ培地でOD600が0.5になるまで37℃で培養後、0.3ｍＭ IPTGを添加してさらに６時間培養を行った。集菌後、リゾチームと超音波で破砕を行い、遠心上清をHisTrap HP 1ml（ＧＥヘルスサイエンス）カラムにより精製を行った。10mMのイミダゾールを含む緩衝液Ａ（20mMリン酸ナトリウム  pH7.4，0.5M NaCl，15%グリセロール）10mlで洗浄後、0.5Mイミダゾールを含む緩衝液Ａで溶出した。最終的に融合タンパク質を含む1mlのフラクションを得た。
【００８６】
〔実施例４：ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質の細菌結合性に関する検討〕
黄色ブドウ球菌(S. aureus)108cell/ml 0.1mlを遠心で集菌し、純水0.1mlで菌を懸濁した。そこに濃度が660nMになるようにCWB-GFP（約5.5μg）を添加した。室温で５分経過後、蛍光顕微鏡（オリンパスBX-60、励起光470-490 nm）で観察した。
【００８７】
結果を図４に示した。図４から明らかなように、黄色ブドウ球菌にCWB-GFPが集積することが明らかとなった。
【００８８】
〔実施例５：ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質の菌選択性に関する検討（１）〕
菌懸濁液として黄色ブドウ球菌（S. aureus、グラム陽性）、大腸菌（E. coli、グラム陰性）、緑濃菌（Pseudomonas aeruginosa、グラム陰性）、枯草菌（Bacillus subtilis、グラム陽性）108cell/mlの混合懸濁液を20mMリン酸緩衝液(pH7)で調製し、濃度が660nMとなるようにCWB-GFPを添加した。室温で５分経過後、蛍光顕微鏡（オリンパスBX-60、励起光470-490 nm）で観察した。
【００８９】
結果を表１に示した。表１から明らかなように、CWB-GFPはS.aureus および B.subtilis に結合し、E.coli および P.aeruginosa には結合しなかった。
【００９０】
【表１】
2007121282.tif 000002
【００９１】
また、図５は、黄色ブドウ球菌（S.aureus）および大腸菌（E.coli）の混合懸濁液にＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質を添加した後、顕微鏡にて観察した画像である。図５（ａ）は明視野での観察像であり、黄色ブドウ球菌および大腸菌のいずれもが確認できる。一方、図５（ｂ）は同じ視野を蛍光で観察した像であり、球形の黄色ブドウ球菌のみが緑色蛍光を発していることが確認できる。
【００９２】
以上の結果から、ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質はグラム陽性細菌を検出できることが示された。
【００９３】
〔実施例６：ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質のグラム陰性細菌への結合に関する検討（１）〕
グラム陰性細菌は、細胞壁（ペプチドグリカン層）の外膜が存在するため、ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質が結合できないことを確認する目的で、以下の実験を行った。すなわち、グラム陰性細菌の外膜の透過性を亢進させ、ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質が透過できるような処理を施せば、ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質を用いてグラム陰性細菌を検出できるか否かを検討した。
【００９４】
大腸菌（E.coli）の懸濁液を１００℃で３分間処理した後、実施例５と同様にCWB-GFPを添加した。室温で５分経過後、蛍光顕微鏡で観察した。
【００９５】
結果を図６に示した。図６から明らかなように、１００℃３分間の処理を行うことによりグラム陰性細菌である大腸菌にもCWB-GFPが結合することが明らかとなった。
【００９６】
本実施例および実施例５の結果より、同一試料について、１００℃３分間の処理を行う方法と行わない方法とを同時に実施することで、試料中の全細菌数およびグラム陽性細菌とグラム陰性細菌との比率が簡便かつ迅速に検出可能であることが示された。かつこの処理により一般細菌全体が検出可能になった。
【００９７】
〔実施例７：ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質の菌結合力の検討〕
ＳＡ懸濁液（108cell/ml）を20mMリン酸緩衝液(pH7)で調製し、40nM、60nM、140nMの濃度となるようにCWB-GFPを添加し、室温で５分経過後、GFP蛍光を測定した（全体のGFP）。直ちに0.2μmのフィルターでろ過したろ液の蛍光を測定した（非結合GFP）。結合GFPは（全体のGFP）−（非結合GFP）で算出できる。測定には日本分光FP-6500分光蛍光光度計を用いた。
【００９８】
結果を図７に示した。縦軸に結合ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質／非結合ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質の比、横軸にＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質濃度をプロットした（スキャチャードプロット）。プロットした傾きから解離定数Ｋｄを算出した。Ｋｄ値は６ｎＭであった。
【００９９】
〔実施例８：ＣＷＢ−ルシフェラーゼ融合タンパク質による細菌検出の検討〕
ＳＡ懸濁液（105cell/ml）を20mMリン酸緩衝液(pH7)で調製し、この懸濁液１mlにCWB-LUCを5μg添加した。室温で５分経過後、0.2μmのフィルターでろ過した。10mlのリン酸緩衝液で洗浄後、フィルターを取りだし、プレミックス（60mM Tris-HCl, pH7.4, 8mM MgCl2, 2mM ATP, 1 mM luciferin）50μlをフィルター表面に塗布した。フィルター上の発光は超高感度CCDカメラ（スペクトラルインスツルメント社、クライオタイガー）で１０分間感光させて画像を取得した。
【０１００】
結果を図８に示した。図８から明らかなように、細菌１個を発光点として計数可能であることが示された。
【０１０１】
〔実施例９：ＣＷＢ−ルシフェラーゼ融合タンパク質を用いた短時間細菌検出法の検討〕
CWB-LUCを0.3μg含む20mMリン酸緩衝液(pH7)0.5mlに、ＳＡ108cell/mlを含む20mMリン酸緩衝液(pH7)を0.1ml添加した。直ちに遠心し（15,000rpm、30秒）、上清を完全に除いた（非結合のCWB-LUCを除く目的）。0.5mlの20mMリン酸緩衝液(pH7)で洗浄後、プレミックス（60mM Tris-HCl, pH7.4, 8mM MgCl2, 2mM ATP, 1 mM luciferin）を50μl添加して、発光を検出した（検出器キッコーマンルミテスターＣ−１００、約１０秒）。
【０１０２】
図９に、手順および結果を示した。図９より明らかなようにＳＡが存在するときに、高い発光が検出された。また、この方法により、最短１分間で細菌の検出が可能であることが示された。
【０１０３】
〔実施例１０：ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質の菌選択性に関する検討（２）〕
ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質の菌選択性について、多数の菌株を用いてより詳細に検討した。
【０１０４】
１７株の細菌（８株のグラム陽性細菌、９株のグラム陰性細菌）および１株の酵母を用いて検討した（表２参照）。各菌株の培養液から遠心により集菌し、100mM NaClを含む20mM Tris HCl (pH 7.4) 緩衝液で洗浄した後、同じ緩衝液100μlで108cell/mlの菌懸濁液を調製した。そこに濃度が660nMになるようにCWB-GFP（約5.5μg）を添加し、室温で５分経過後、蛍光顕微鏡（オリンパスBX-60、励起光470-490 nm）で観察した。
【０１０５】
結果を表２に示した。表２の「未処理」欄に記載のように、ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質はグラム陰性細菌および酵母に結合しなかった。一方、ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質は用いた８株のグラム陽性細菌の全てに結合した。
【０１０６】
〔実施例１１：ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質のグラム陰性細菌への結合に関する検討（２）〕
上記実施例６では、１００℃で３分間の熱処理によりグラム陰性細菌の外膜透過性亢進処理を行ったが、本実施例では界面活性剤処理およびタンパク質変性処理について検討した。
【０１０７】
（１）界面活性剤処理
界面活性剤として、ベンザルジルコニウム（benzalkonium chloride:以下「ＢＣ」と記す）を用いた。
【０１０８】
上記未処理の操作と同様に100mM NaClを含む20mM Tris HCl (pH 7.4) 緩衝液で菌を洗浄した後、0.01％のベンザルジルコニウムを含む同じ緩衝液100μlで108cell/mlの菌懸濁液を調製し、３分間室温で処理した。その後、濃度が660nMになるようにCWB-GFP（約5.5μg）を添加し、室温で５分経過後、蛍光顕微鏡（オリンパスBX-60、励起光470-490 nm）で観察した。なお、グラム陽性細菌は枯草菌（Bacillus subtilis）のみを用いた。
【０１０９】
結果を表２に示した。表２の「ＢＣ」欄に記載のように、ＢＣ処理により未処理では結合しなかったグラム陰性細菌の全てがＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質と結合するようになった。一方、酵母はＢＣ処理を行ってもＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質と結合しなかった。また、ＢＣ処理は、グラム陽性細菌であるB.subtilisとＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質との結合性に影響を及ぼさなかった。
【０１１０】
図１０に、ＢＣ処理したグラム陰性細菌にＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質が結合していることを示す蛍光顕微鏡画像を示した。（ａ）は大腸菌（E.coli）、（ｂ）はアグロバクテリウム（A.tumefacience）、（ｃ）は緑濃菌（P.aeruginosa）である。
【０１１１】
（２）タンパク質変性処理
タンパク質変性剤として、トリクロロ酢酸（trichloroacetic acid：以下「ＴＣＡ」と記す）を用いた。
【０１１２】
上記未処理の操作と同様に100mM NaClを含む20mM Tris HCl (pH 7.4) 緩衝液で菌を洗浄した後、0.1％のＴＣＡを含む同じ緩衝液100μlで108cell/mlの菌懸濁液を調製し、９０℃で１０分間加熱した。その後、濃度が660nMになるようにCWB-GFP（約5.5μg）を添加し、室温で５分経過後、蛍光顕微鏡（オリンパスBX-60、励起光470-490 nm）で観察した。なお、グラム陽性細菌はB.subtilisのみを用いた。
【０１１３】
結果を表２に示した。表２の「ＴＣＡ」欄に記載のように、ＴＣＡ処理により未処理では結合しなかったグラム陰性細菌の全てがＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質と結合するようになった。一方、酵母はＴＣＡ処理を行ってもＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質と結合しなかった。また、ＴＣＡ処理は、グラム陽性細菌であるB.subtilisとＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質との結合性に影響を及ぼさなかった。
【０１１４】
以上の結果より、グラム陰性細菌の外膜透過性亢進処理には、界面活性剤処理およびタンパク質変性処理が有効であることが示された。したがって、これらの処理を行うことにより一般細菌全体が検出可能であることが示された。さらに、細菌と酵母との識別が可能であることが示された。
【０１１５】
【表２】
2007121282.tif 000003
【０１１６】
〔実施例１２：ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質の芽胞結合性に関する検討〕
細菌の芽胞（spore）に対してＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質が結合するか否かを検討した。
【０１１７】
Bacillus thuringiensis（グラム陽性細菌）をSchaeffer培地を用いて３７℃で２日間培養し、芽胞を形成させた。遠心により芽胞を集め、100mM NaClを含む20mM Tris HCl (pH 7.4) 緩衝液で洗浄した後、同じ緩衝液100μlで108cell/mlの菌懸濁液を調製した。そこに濃度が660nMになるようにCWB-GFP（約5.5μg）を添加し、室温で５分経過後、蛍光顕微鏡（オリンパスBX-60、励起光470-490 nm）で観察した。また、上記実施例１１と同様の手順で、ＢＣ処理、ＴＣＡ処理を行った。
【０１１８】
結果を表３および図１１に示した。ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質は無処理のBacillus thuringiensisの芽胞に結合することが確認された。また、ＢＣ処理、ＴＣＡ処理はＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質と芽胞との結合性に影響を及ぼさなかった。
【０１１９】
以上の結果から、ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質は芽胞の検出に利用可能であることが示された。したがって、ＣＷＢ−ＧＦＰ融合タンパク質は、Bacillus thuringiensisと近縁種であり、バイオテロに利用される炭疽菌（Bacillus anthracis）の検出に利用可能である。よって、本発明は、バイオテロの予防に貢献できる。
【０１２０】
【表３】
2007121282.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明は、細菌の検査が必要な様々な分野において利用可能である。特に、食品産業、医薬品産業、臨床検査分野、環境衛生分野などでの利用に好適であり、迅速、簡便かつ高感度な細菌検査を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】GFP発現ベクター（pET GFP）の構成を示した図である。
【図２】CWB-GFP発現ベクター（pET CWB-GFP）の構成を示した図である。
【図３】CWB-Luciferase発現ベクター（pET CWB-LUC）の構成を示した図である。
【図４】黄色ブドウ球菌にCWB-GFPが集積していることを示す画像である。
【図５】CWB-GFPが黄色ブドウ球菌のみに結合することを示す画像である。
【図６】熱処理によりCWB-GFPが大腸菌に結合することを示す画像である。
【図７】CWB-GFPの菌結合力（スキャッチャードプロット）を測定した結果を示すグラフである。
【図８】CWB-Luciferaseによりフィルター上の黄色ブドウ球菌を検出したことを示す画像である。
【図９】本発明の方法を用いて、細菌を短時間検出する手順および結果を示す図である。
【図１０】BC処理によりCWB-GFPがグラム陰性細菌に結合することを示す画像であり、（ａ）は大腸菌、（ｂ）はアグロバクテリウム、（ｃ）緑膿菌である。
【図１１】CWB-GFPがBacillus thuringiensisの芽胞に結合することを示す画像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図９】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
2007121282.tif 000013
【図１０】
2007121282.tif 000014
【図１１】
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【配列表】
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