(57)【要約】【課題】酵素の酸化還元中心からの電荷の取出しを高速化し、高い触媒電流を与える酵素電極を提供する。【解決手段】金属微粒子の一部が酵素の内部に入り込んだ酵素／金属微粒子複合体を使用することで、酵素からの電子の取出しが高速化することにより、触媒電流を向上させることが可能な酵素電極を提供することができる。【選択図】図１
2007121281.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性部材と酵素と金属粒子を有する酵素電極において、
前記酵素は、該酵素の内部に金属粒子を含むことを特徴とする酵素電極。
【請求項２】
前記金属粒子と前記酵素とは、該金属粒子の一部が、該酵素の内部に入り込んだ構造を有する酵素と金属粒子の複合体を形成していることを特徴とする請求項１記載の酵素電極。
【請求項３】
前記金属粒子は、前記酵素と該酵素に対する基質となる物質との反応に伴って金属を形成し得る金属前駆体の存在下に、前記酵素と前記基質とを反応させることによって粒子形成されていることを特徴とする請求項１に記載の酵素電極。
【請求項４】
前記導電性部材が多孔質構造を有し、該多孔質構造の細孔中に前記酵素と金属粒子の複合体が形成されている請求項１乃至３のいずれかに記載の酵素電極。
【請求項５】
前記金属粒子を構成する金属が金である請求項１乃至４のいずれかに記載の酵素電極。
【請求項６】
前記金属粒子の二次粒径が２００ｎｍ以下である請求項１乃至５のいずれかに記載の酵素電極。
【請求項７】
前記複合体と前記導電性部材との電荷の受け渡しの媒介を行うメディエータをさらに有する請求項２に記載の酵素電極。
【請求項８】
前記複合体と前記メディエータの少なくとも一方を前記導電性部材に固定化する担体をさらに有する請求項７に記載の酵素電極。
【請求項９】
アノード電極とカソード電極との間に電解液を保持し得る領域を設けた燃料電池において、前記アノード電極と前記カソード電極の少なくとも一方が請求項１乃至８のいずれかに記載の酵素電極であることを特徴とする燃料電池。
【請求項１０】
多孔質材料の孔中に酵素を導入し、
前記酵素の基質と、金属粒子の前駆体との存在下、
前記酵素と前記基質との反応によって、前記金属粒子の前駆体から金属粒子を析出させることを特徴とする
多孔質材料の孔中に金属粒子を製造する方法。
【請求項１１】
酵素と金属粒子を有する酵素電極の製造方法であって、
酵素を用意する工程と、
前記酵素と該酵素の基質との反応によって金属を形成し得る金属前駆体の存在下、酵素と前記基質とを反応させることにより、前記酵素内に金属粒子を備えている、酵素／金属粒子複合体を得る工程と、
を有することを特徴とする酵素電極の製造方法。
【請求項１２】
酵素と金属粒子を有する酵素電極の製造方法であって、
導電性を有する多孔質材料の孔中に酵素を導入する工程と、
前記酵素と該酵素の基質との反応によって金属を形成し得る金属前駆体の存在下、前記多孔質材料の孔中の酵素と前記基質とを反応させることにより、前記酵素内に金属粒子を備えている、酵素／金属粒子複合体を前記多孔質材料の孔中に得る工程と、
を有することを特徴とする酵素電極の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素電極に関し、より詳細には、酵素反応によって生成した酵素／金属粒子複合体を用いた酵素電極およびその製造方法、並びにその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
生細胞内で作られる蛋白質性の生体触媒である酵素は、通常の触媒と比べて温和な条件下で強力に作用する。また、基質の特異性が高く、一般に各酵素は、一定基質の一定反応のみを触媒する。酵素の中でも、酸化還元酵素と呼ばれる酵素は、基質の酸化還元反応を触媒する。この酸化還元酵素の反応で生成する電荷を、導電性部材に取出すことができれば、酵素の特徴を生かした、低過電圧、高選択性の電極が作成可能である。しかし、多くの酸化還元酵素の酸化還元中心は、蛋白質の３次元構造の奥深いところに閉じ込められた形態である。そのため、導電性部材との間で効果的な電子の授受を行うには、酸化還元中心と導電性部材間の距離が大きく、その結果、酸化還元酵素の活性部位と導電性部材との間で、直接の電子移動を行うことは、一般に困難であった。
【０００３】
そこで、酵素と導電性部材間をメディエータと呼ばれる物質によって電気的に繋ぐ手法が広く用いられてきた（例えば、非特許文献１）。メディエータ分子は、酵素の蛋白内部に入りこみ、酵素の酸化還元中心に充分に近い距離まできた時に、初めて酵素の酸化還元中心との間で電子の授受を行う。その後、酵素の活性部位、すなわち酸化還元中心と電子の授受を行ったメディエータが、拡散、電子ホッピング等を通して導電性部材へと電荷を輸送することで、酵素反応の電荷は導電性部材に取出されることになる。
【０００４】
ところで、近年のナノテクノロジーの進歩に伴い、多くの金属粒子の調製法が報告されている。この中で、酵素であるグルコースオキシダーゼの触媒反応により金粒子を生成させる手法が、非特許文献２に記載されている。本文献中においては、生成した金粒子に酵素が固定化されていることが赤外スペクトル、ゼータ電位測定により示唆されている。さらに、円二色スペクトル測定から酵素が変性していることが示唆されている。これとは別に、グルコースオキシダーゼの酵素反応で生成した過酸化水素による金粒子の成長と、この成長によるプラズモン吸収の増大を利用した光学的グルコースセンサも非特許文献３に記載されている。
【０００５】
一方、酵素と金属の複合体に関して、非特許文献４には、一般的に、酵素を含む機能性タンパク質は、金、シリカ等の粒子等に吸着することで、その活性が大幅に低下することが開示されている。
【非特許文献１】Adam Heller J. Phys. Chem. 1992, 96, 3579-3587
【非特許文献２】Kei Yasui, Nobuo Kimizuka Chem. Lett. 2005, 34, 416-417
【非特許文献３】Maya Zayats, Ronan Barton, Inna Popov, Itamar Willner Nano Lett. 2004,5, 21-25
【非特許文献４】Alexey A. Vertegel, Richard W.Siegel, Jonathan S. Dordick Langmuir 2004, 20, 6800-6807
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記非特許文献１には、メディエータを用いた酵素電極が開示されている。メディエータ分子は、通常、その分子サイズが小さいために、酵素の蛋白中の酸化還元中心近傍に容易に進入することができる。そして、酵素反応によって酵素の酸化還元中心に生じた電荷は、適当な酸化還元電位を持つメディエータ分子へ移動し、さらに、このメディエータ分子の拡散、もしくは、メディエータ分子間の電子ホッピングにより導電性部材近傍に輸送される。最後に導電性部材とメディエータ間の電子移動によって導電性部材に取出される。
【０００７】
ここで、酵素内部の酸化還元中心近傍へのメディエータの拡散は、酵素の蛋白の空隙が小さいために遅くなる。つまり、このメディエータの拡散速度が、酵素の酸化還元中心で生成した電荷のメディエータを介した電荷の取出しにおける律速段階となっている。従って、電荷の取り出し速度を更に向上させて電流値を上げるには、このメディエータのみを用いた酵素電極では限界があると考えられる。すなわち、より高度な性能を得る上で、メディエータを用いた酵素電極を使用したセンサの感度、この酵素電極を使用した生物燃料電池の出力には限界があった。
【０００８】
本発明の目的は、酵素の酸化還元中心からの電荷の取出しが高速化された酵素電極及びその製造方法を提供することにある。本発明の他の目的は、かかる酵素電極を用いたセンサ及び生物燃料電池を提供することにある。本発明の他の目的は、かかる酵素電極を用いた検出対象物質の検出及び定量方法を提供することにある。本発明の他の目的は、かかる酵素電極の構成材料として有用な酵素／金属粒子複合体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の本発明に係る、導電性部材と酵素とを有する酵素電極は、前記酵素が、その内部に金属粒子を含むことを特徴とする。第２の本発明に係る燃料電池は、アノード電極とカソード電極との間に電解液を保持し得る領域が設けられており、該アノード電極とカソード電極の少なくとも一方は、前記第1の本発明における酵素電極で構成されていることを特徴とする。
【００１０】
第３の本発明に係る金属粒子の製造方法は、
多孔質材料の孔中に酵素を導入し、
前記酵素の基質と、金属粒子の前駆体との存在下、
前記酵素と前記基質との反応によって、前記金属粒子の前駆体から金属粒子を析出させることを特徴とする多孔質材料の孔中に金属粒子を製造する方法である。
【００１１】
第４の本発明に係る酵素電極の製造方法は、酵素と金属粒子を有する酵素電極の製造方法であって、
酵素を用意する工程と、
前記酵素と該酵素の基質との反応によって金属を形成し得る金属前駆体の存在下、酵素と前記基質とを反応させることにより、前記酵素内に金属粒子を備えている、酵素／金属粒子複合体を得る工程と、
を有することを特徴とする酵素電極の製造方法である。
【００１２】
第５の本発明に係る酵素電極の製造方法は、酵素と金属粒子を有する酵素電極の製造方法であって、
導電性を有する多孔質材料の孔中に酵素を導入する工程と、
前記酵素と該酵素の基質との反応によって金属を形成し得る金属前駆体の存在下、前記多孔質材料の孔中の酵素と前記基質とを反応させることにより、前記酵素内に金属粒子を備えている、酵素／金属粒子複合体を前記多孔質材料の孔中に得る工程と、
を有することを特徴とする酵素電極の製造方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、金属粒子の少なくとも一部が酵素の内部に入り込んだ酵素／金属粒子複合体を得ることができる。そして、これを酵素電極として使用することで、酵素からの電子の取出しの高速化が可能となり、触媒電流を向上させることができる。なお、この酵素／金属粒子複合体を多孔質材料の孔中に固定化した場合は、環境に対する安定性の向上した酵素電極を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明においては、課題を解決するための手段として、酵素電極の有する酵素として、金属粒子の一部が酵素の内部に入り込んだ酵素／金属粒子複合体を使用する。
【００１５】
一般的に、酵素を含む機能性タンパク質は、金、シリカ等の粒子等に吸着することで、その活性が大幅に低下することが知られている（非特許文献４）。また、非特許文献２においても、安定化剤を用いない金粒子に吸着した酵素の変性が円二色スペクトルから示唆されている。これらの背景から、金属粒子と酵素を、修飾剤を用いずに相互作用させた複合体を通常、物質の検知、あるいは、エネルギーの発生デバイスとして用いることはない。ただし例外として、プラズモン吸収に代表される、金属粒子に固有の特性を利用した生物デバイスを作製する場合はある。これらの従来の知見に対して、本発明者等は、金属粒子を酵素反応によりその前駆体から酵素の活性中心近傍を基点として生成させる方法を採用して、必然的に酵素の酸化還元中心との間で電子が授受のできる距離に金属を得ることができるとの知見を得た。更に、本発明者等は、この金属が酵素の酸化還元中心からの電荷を引き出す、いわばリードとして機能できるとの知見を得た。そこで、酵素反応によって酵素／金属粒子複合体を調製し、この複合体を用いて酵素電極を調製し、金属粒子と複合していない酵素を用いて調製した酵素電極との特性の比較を行なった。その結果、酵素／金属粒子複合体を用いた酵素電極は、金属粒子と複合していない酵素を用いて調製した酵素電極と比較して高い特性を示すことを確認し、本発明を完成させた。
次に、本発明の好ましい実施の形態について詳細に説明する。
【００１６】
本発明の酵素電極は、導電性部材と酵素と金属粒子を有する酵素電極において、これらの金属粒子と酵素が、金属粒子の一部が酵素の内部に入りこんだ酵素／金属粒子複合体を形成していることを特徴とするものである。ここで、金属粒子が酵素の内部に入りこんだ酵素／金属粒子複合体とは、図１（Ａ）及び（Ｂ）に示すような構造を有する。すなわち、その断面形状を観察したときに、酵素１、金属粒子２とそれらを取り囲む溶液の３物質が交わる点を結んだ線（図中一点鎖線で記入）を金属粒子がまたいで存在するものである。これには、図１（Ａ）のように、酵素１の微小な空隙に金属粒子の一部３が入り込んだものや、図１（Ｂ）のように粒子２の一部３が酵素１の外縁を長い範囲にわたって入り込んだものが含まれる。
【００１７】
図１に示すような酵素と金粒子の位置関係は、たとえば透過型電子顕微鏡で酵素／金粒子複合体を観察することによって検証ができる。
【００１８】
金属粒子の一部が酵素の内部に入り込んだ構造は、酵素とその酵素の基質との作用（酵素反応）との相互作用により金属を形成し得る金属前駆体の存在下において、酵素反応を行うことにより得ることができる。金属前駆体の存在下で酵素反応を行うことで、酵素の活性部位（活性中心）を含む酵素内部で基質が反応し、それに伴って金属前駆体から金属が形成される。これらの反応が進行すると、酵素の内部を起点として金属が成長し、場合によっては酵素の外側で形成された金属と酵素内部の金属が合体して金属粒子が得られる。こうして得られた金属粒子はその一部が酵素の内部に入り込んだ形状となる。
【００１９】
ここで、酵素の基質としては、酵素の作用による化学的変化が金属前駆体から金属を生じさせることができるものが利用される。好ましい酵素と基質の組合せとしては、酵素の基質への作用によって酸化還元酵素の酸化還元中心に電荷を与えることができる酵素と基質の組合せを挙げることができる。このような酵素の基質としては、酵素の本来の基質（例えばグルコースオキシダーゼに対するグルコース、アルコールデヒドロゲナーゼに対するエタノール）のほかに、酵素が反応の基質として酵素反応を起こしうる、天然、人工の化合物が含まれる。
【００２０】
また、金属前駆体からの金属粒子の形成には、酵素、酵素の基質及び金属前駆体を含む溶液を調製し、酵素反応の進行に伴って金属前駆体から金属粒子が生成されると同時に、金属粒子と酵素とを複合体化する手法が好適に用いられる。また、このときの金属粒子とは、酵素の基質への作用によって直接生成する金属粒子だけでなく、酵素の基質への作用によって生成する生成物が金属前駆体に作用して副次的に生成する金属粒子を含む。
【００２１】
具体的な例としては、グルコースオキシダーゼ、グルコース、塩化金酸塩を加えた溶液を挙げることができる。この場合、グルコースオキシダーゼにおけるグルコースの酸化反応によって生成したグルコースオキシダーゼの酸化還元中心であるＦＡＤＨ2によって、塩化金酸が還元される。それだけでなく、グルコースオキシダーゼにおける、グルコースと酸素の反応よって生じる過酸化水素による塩化金酸の還元が生じる。上記の反応にはこのような場合を含むことが挙げられる。なお、このことは、本発明の酵素電極に酵素／金属粒子複合体に加えて金属粒子と複合していない酵素や、酵素と複合していない金属粒子を含むことを排除するものではない。
【００２２】
酵素／金属粒子複合体に用いる酵素としては、酸化還元酵素が好適に使用できる。この酵素は基質の酸化還元反応を触媒する酵素である。
【００２３】
酵素電極には、目的とする特性を得る上で、１種の酵素を固定しても、複数の異なる酵素を固定してもよい。更に、１つの金属粒子に複合させる酵素についても、１種の酵素を複合化しても、複数の異なる酵素を複合化してもよい。
【００２４】
本発明に用い得る酵素の例としては、グルコースオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼが挙げられる。
その他にも、シトクロムオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼが挙げられる。更に、蟻酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、チオレドキシンレダクターゼが挙げられる。また、酸化還元酵素でない酵素と酸化還元酵素を同時に用いることも可能である。この場合、例えば、酸化還元酵素でない酵素の生成物を酸化還元酵素で検出するといったことも可能である。
【００２５】
酵素／金属粒子複合体に用いる金属としては、水溶液中、電極が使用される条件において充分な電気化学安定性を有する材料が好適に使用でき、同一電極中に、目的とする特性を得る上で、複数の異なる金属の組合せを用いることもできる。例としては、Ａｕ、Ｐｔ、Ａｇ、Ｃｏ、Ｐｄ、Ｒｈ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｏ、Ｔｉ、Ｃｕ及びＷ、ならびにこれらの２種以上を含む合金があげられる。
【００２６】
酵素／金属粒子複合体の調製に用いる金属前駆体としては、水溶液中でも急速には反応せず、緩やかな金属粒子の生成が可能な化合物が好適に使用できる。例えば、金属の塩化物塩、クエン酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、蟻酸塩、酢酸塩、亜硫酸塩が挙げられる。 またこれらの塩から中間体を経由して金属粒子を生成してもよい。
【００２７】
酵素／金属粒子複合体の金属粒子は、一次粒子の分散体が最も好適に用いられるが、それらが凝集した二次粒子であっても良い。金属粒子の一次粒子の粒径は、２nm〜50nmの範囲にあることが好ましく、2nm〜20nmの範囲にあることがより好ましい。金属粒子が二次粒子を形成しているときは、その粒径が、２００ｎｍを超えないことが好ましく、５０ｎｍを超えないことがより好ましい。二次粒子径の下限については、二次粒子径が2ｎｍ以上であることが好ましい。なお、金属粒子は、金属微粒子ということもできる。
【００２８】
導電性部材は、酵素反応で生成した電荷を外部回路に取出す働きを担う。この導電性部材の構成材料としては、導電性が高く、電極が使用される条件において充分な電気化学安定性を有する材料が好適に使用できる。このような導電性部材の構成材料の例としては、金属、導電性高分子、金属酸化物、及び炭素材料などを挙げることができる。金属の例としては、Ａｕ、Ｐｔ、Ａｇ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｏ、Ｔｉ、Ａｌ、Ｃｕ、Ｖ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｗの元素を含むものがあげられ、これらは、合金であっても、めっきを施したものであってよい。導電性高分子の例としては、ポリアセチレン類、ポリアリーレン類、ポリアリーレンビニレン類、ポリアセン類、ポリアリールアセチレン類、ポリジアセチレン類、ポリナフタレン類、ポリピロール類、ポリアニリン類、ポリチオフェン類が挙げられる。その他にも導電性高分子の例として、ポリチエニレンビニレン類、ポリアズレン類、ポリイソチアナフテン類のうち少なくともひとつの化合物を含むものが挙げられる。金属酸化物の例としては、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｚｎ、Ｔｉ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｍｏ、Ｗ、Ｖ、Ｓｒのうち、少なくとも一種類の元素を含むものがあげられる。炭素材料の例としては、グラファイト、カーボンブラック、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、フラーレン化合物およびこれらの誘導体が挙げられる。
【００２９】
メディエータは、酵素／金属粒子複合体と導電性部材間の電子の受け渡しを促進させるものであり、必要に応じて用いることができる。このメディエータの例としては、金属錯体、キノン類、複素環式化合物、ニコチンアミド誘導体、フラビン誘導体、導電性高分子が挙げられる。この金属錯体としては、中心金属に遷移金属を用いたものが挙げられる。例としては、Ｏｓ、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｖ、Ｍｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｐｔ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｉｒが挙げられる。また、この金属錯体の配位子としては、窒素、酸素、リン、硫黄、炭素原子を含有し、少なくともこれらの原子を介して中心金属と錯体形成するもの、または、シクロペンタジエニル環を骨格として有する物が挙げられる。ピロール、ピラゾール、イミダゾール、１、２、３−または１、２、４−トリアゾール、テトラゾール、２、２'−ビイミダゾール、ピリジン、２、２'−ビチオフェン、２、２'−ビピリジン、２、２'：６'、２"−ターピリジンなどである。更に、エチレンジアミン、ポルフィリン、フタロシアニン、アセチルアセトン、キノリノール、アンモニア、シアンイオン、トリフェニルホスフィンオキサイドおよびそれらの誘導体が挙げられる。キノン類の例としては、キノン、ベンゾキノン、アントラキノン、ナフトキノン、ピロロキノリンキノン、テトラシアノキノジメタン、およびそれらの誘導体が挙げられる。複素環式化合物の例としては、フェナジン、フェノチアジン、ビオローゲン、およびそれらの誘導体が挙げられる。ニコチンアミド誘導体の例としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸が挙げられる。フラビン誘導体の例としては、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）が挙げられる。ここで、導電性高分子の例としては、ポリアセチレン類、ポリアリーレン類、ポリアリーレンビニレン類、ポリアセン類、ポリアリールアセチレン類が含まれる。更にポリジアセチレン類、ポリナフタレン類、ポリピロール類、ポリアニリン類、ポリチオフェン類、ポリチエニレンビニレン類、ポリアズレン類、ポリイソチアナフテン類適用し得る。
【００３０】
担体は、酵素／金属粒子複合体とメディエータの少なくとも一方を導電性部材に固定化するものであり、必要に応じて用いることができる。例としては、（１）高分子化合物、（２）無機化合物、及び（３）分子内に複数の結合基を有する有機化合物が挙げられる。
【００３１】
高分子化合物は、酵素を静電的に固定する担体として用いられるものであってもよく、その場合は、電極の使用条件下で酵素／金属粒子複合体が持つ表面電荷と反対の電荷を有していることが好ましい。この高分子の例として、導電性高分子の例としては、ポリアセチレン類、ポリアリーレン類、ポリアリーレンビニレン類、ポリアセン類、ポリアリールアセチレン類がある。更に、ポリジアセチレン類、ポリナフタレン類、ポリピロール類、ポリアニリン類、ポリチオフェン類、ポリチエニレンビニレン類、ポリアズレン類、ポリイソチアナフテン類がある。なお、その他の高分子の例としては、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニル硫酸、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリマレイン酸、ポリフマル酸、ポリエチレンイミンなどである。また、ポリアリルアミン塩酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド、ポリビニルピリジン、ポリビニルイミダゾール、ポリリシン、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ペクチンも適用できる。更に、シリコーン樹脂、セルロース、アガロース、デキストラン、キチン、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ナイロンも適用できる。
【００３２】
担体用の無機化合物の例としては、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｚｎ、Ｔｉ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｍｏ、Ｗ、Ｖ、Ｓｒから選択される少なくとも１つの元素を含む金属カルコゲナイド化合物が挙げられる。この分子内に複数の結合基を有する有機化合物の例としては、少なくとも以下に示される官能基を含む化合物が該当する。ここでいう官能基には、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、ヒドラジノ基、チオシアネート基、エポキシ基、ビニル基、ハロゲン基、酸エステル基、リン酸基、チオール基、ジスルフィド基が含まれる。更に、ジチオカルバメート基、ジチオホスフェート基、ジチオホスホネート基、チオエーテル基、チオ硫酸基、チオ尿素基のうちから選択される官能基を含む化合物があげられる。代表例としては、グルタルアルデヒド、 ポリエチレングリコールジグリシデルエーテル、塩化シアヌール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジメチルー３、３'−ジチオプロピオニミデート塩酸塩である。更に、３、３'−ジチオ−ビス（サルホスクシンイミジルプロピオネート）、シスタミン、アルキルジチオール、ビフェニレンジチオール、ベンゼンジチオールなども挙げられる。
【００３３】
本発明の酵素電極は、前記酵素／金属粒子複合体を多孔質材料の孔中に固定化した構造を有してもよい。この多孔質体の孔は、一次元、二次元、もしくは三次元的に連結したもので、これらの連結形態の２以上が混在しているものであってもよい。一次元に連結した空隙の例としては柱状の空隙、二次元に連結した空隙の例としては、網状の空隙、三次元に連結した空隙の例としては、スポンジ状、微小粒子を接合した後に生じる空隙、またそれらをテンプレートにして作成した構造材料の空隙が挙げられる。この多孔質体の材料としては、導電性を有し、保存、測定時に充分な剛性を有し、電極が使用される条件において充分な電気化学安定性を有する材料であれば用いることができる。この多孔質体は、他の導電性材料によって導電性が向上したものであるか、もしくは、導電性が付与されたものであってもよい。多孔質材料の例としては、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｚｎ、Ｔｉ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｍｏ、Ｗ、Ｖ、Ｓｒのうち、少なくとも一種類の元素を含む金属酸化物があげられる。また、導電性材料の例としては、金属、導電性高分子、炭素材料が挙げられる。これらの代表的な例としては、酸化スズのメソポーラス材料や導電処理を施した陽極酸化アルミナ等が挙げられる。この多孔質材料の孔径は、酵素が導入できる程度に大きい、２〜５０ｎｍ程度の材料が好ましく用いられる。
【００３４】
また、本発明で用いられる金属前駆体からの金属粒子の形成方法によれば、微細空間内に金属粒子を温和な条件で、高密度に、少ない工程で調製することができる。一般的に微細空間内に金属粒子を導入する手法としては、金属の塩化物塩等の金属前駆体の溶液を微細空間内に導入し、その後に、この前駆体を還元剤で処理するか、もしくは加熱還元することで金属を微細空間内に析出させる方法が行われている。この場合、金属前駆体の微細空間内への導入工程と還元工程を同時に行うと、多孔質材料の孔の内外を問わず溶液中に金属粒子が析出してしまうために、金属前駆体の導入工程と還元工程を別工程として行う必要がある。このため、一サイクルの金属前駆体溶液の導入工程で微細空間内へ導入できる金属量には限界があり、高密度に金属粒子を固定化するには、サイクルを繰り返す必要がある。本発明においては、基質として、金属前駆体とは容易に反応しないものを選択し、この基質に対応する酵素を多孔体細孔内部に導入または固定化した上で、基質と金属前駆体を細孔内に添加する。これにより、酵素の存在する位置でのみ選択的に金属を析出させて金属粒子を形成することが可能である。つまり、金属前駆体の導入と、金属粒子を形成するための金属の析出工程を同時に進行させることを可能とする。また、このときの反応時間を変化させることで、金属粒子のサイズを制御でき、粒径の大きな粒子も１サイクルで調製することを可能となる。
【００３５】
本発明の酵素電極の用途として好ましいひとつの形態であるセンサは、酵素電極を、物質を検知するための検知部位として用いることを特徴とする。代表的な構成としては、酵素電極を作用電極として、対極と組合せ、必要に応じて参照電極を使用する。電極に固定した酵素の基質認識能、酵素触媒作用により発生する電流を検知して、これらの電極が接している液体中の物質の定性的検出、濃度の測定に利用する構成を挙げることができる。センサの構成は、酵素電極での検知が可能であるものであれば特に制限されない。このセンサは、酵素に起因する基質の高い選択性に加え、酵素／金属粒子複合体の適用に起因する、高い電流密度によって、検出可能な濃度領域の拡大、検出装置の簡略化、検知部位の小型化が可能となる。
【００３６】
本発明の好ましいひとつの形態である生物燃料電池は、酵素電極を、アノードまたはカソードの少なくとも一方として用いることを特徴とする。代表的な構成としては、燃料となる物質を含む電解液を貯溜し得る反応槽と、反応槽中に電気的に隔離して配置されたアノードとカソードとを有し、このアノード及びカソードの少なくとも一方に本発明にかかる酵素電極を用いた構成を挙げることができる。なお、この生物燃料電池は電解液を補充するタイプ、循環させるタイプや、電解液の補充や循環をしないタイプとすることができる。この生物燃料電池は、酵素電極が使用できるものであれば、燃料の種類、構造、機能などは制限されない。この生物燃料電池は、電極反応の触媒として用いる酵素に特有の高い触媒作用によって、物質を低い過電圧で酸化還元できることにより、高い駆動電圧を得ることが可能であり、また、酵素／金属粒子複合体の適用に起因する高い電流密度を得ることが可能である。その結果、高出力密度を得ることが可能となる。
【実施例】
【００３７】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明の方法は、これらの実施例のみに限定されるものではない。また、以下の実施例の実験温度は、特に記載がない限り室温（２５℃）である。実施例に先立って、実施例で使用される錯体ポリマーの調製例について記述する。
【００３８】
調製例１
以下の式（１）に示す錯体ポリマーの合成法を記述する。
【００３９】
【化１】
2007121281.tif 000003
【００４０】
還流管をつけた１００ｍＬのナスフラスコに、以下の成分を加えた。
・２０ｍＬのエチレングリコール、０．０８ｇの（ＮＨ4）2［ＯｓＣｌ6］・０．３８ｇの４，４'−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ。
【００４１】
スターラ攪拌し、窒素気流下マイクロ波合成器（Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅ  ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ）で３００Ｗを２０分間照射した。得られた溶液を室温までさました後、０．４ｇのＮａ2Ｓ2Ｏ4を溶解させた２５ｍＬの水を加えた。室温で１時間攪拌した後に生じた黒紫沈殿をろ過、水洗して過剰の塩を除いた後に、ジエチルエーテルで洗浄し、未反応の配位子を除き、減圧下、６０℃に加熱した。こうして、乾燥、Ｏｓ（４，４'−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）2Ｃｌ2を得た。
【００４２】
温度計、還流管を取り付けた１００ｍＬの三口フラスコに１５ｍＬの水、２．６３ｇのアクリルアミド、０．４０３ｍＬの１−ビニルイミダゾール、０．０６９ｍＬのＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｎｅｄｉａｍｉｎｅを加えた。更に、窒素気流下、０．０６ｇの過硫酸アンモニウムを加えた。ウォーターバスで４０℃，３０分間加温し、その後、反応容器を空冷した。生じた粘調な液体を強攪拌下の５００ｍＬのメタノールに滴下し沈降させ、沈降物を遠心分離で回収した。沈降物を溶かしうる最小量の水を加えて溶かし、さらに強攪拌下の５００ｍＬのメタノールにこの水溶液を滴下し沈降させた。沈降物を再び遠心分離で回収し、減圧下、６０℃に加熱することで乾燥、ポリアクリルアミドーポリビニルイミダゾールの７．４９／１共重合体を得た。分子の生成、ユニット比は、1ＨＮＭＲ測定（Ｄ2Ｏ）によって決定した。
【００４３】
還流管をつけた１００ｍＬのナスフラスコに以下の成分を加えた。
・２５ｍＬのエチレングリコール、１７．５ｍＬのエタノール
・先に調製した０．１９ｇのＯｓ（４，４'−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）2Ｃｌ2，０．２２ｇのポリアクリルアミドーポリビニルイミダゾールの共重合体。
【００４４】
スターラ攪拌し、窒素気流下マイクロ波合成器で４００Ｗを２時間照射した。得られた溶液を室温までさました後、２０ｍＬのエタノールを加えた溶液を、強攪拌下の５００ｍＬのジエチルエーテル溶液に滴下した。こうして生じる粘調な沈殿にさらに２０ｍＬのエタノールを加えた。これを再び、強攪拌下の５００ｍＬのジエチルエーテル溶液に滴下した。得られた粘調な沈殿を減圧下、６０℃に過熱することで乾燥し、目的とする式（１）に記載の錯体ポリマーを得た。
【００４５】
調製例２
以下の式（２）に示す錯体ポリマーの合成法を記述する。
【００４６】
【化２】
2007121281.tif 000004
【００４７】
還流管をつけた１００ｍＬのナスフラスコに３ｇの２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ−Ｎ，Ｎ'−ｄｉｏｘｉｄｅを入れ、ここに、氷浴上、濃硫酸６ｍＬ、発煙硫酸３ｍＬを加えた。スターラで攪拌を行い２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ−Ｎ，Ｎ'−ｄｉｏｘｉｄｅを溶解させた。更に、発煙硝酸（１．５２）６ｍＬを加え、その後１００℃に昇温、４時間保持した。反応溶液を空冷後、砕氷上に注ぎ、生じた黄色い粉末をろ過で回収した。粉末を水で洗浄し、減圧下、６０℃に過熱乾燥することで、４，４'−ｄｉｎｉｔｒｏ−２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ−Ｎ，Ｎ'−ｄｉｏｘｉｄｅを得た。
【００４８】
還流管をつけた１００ｍＬのナスフラスコに４．３ｍＬの氷酢酸、２．９ｍＬのアセチルクロライド、０．２７ｇの４，４'−ｄｉｎｉｔｒｏ−２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ−Ｎ，Ｎ'−ｄｉｏｘｉｄｅを入れ、湯浴上７０℃で４時間加熱した。反応溶液を空冷後、砕氷上に注ぎ、３０％ＮａＯＨで中和し、生じた白色沈殿をろ過で回収した。粉末を水で洗浄し、減圧下、６０℃に加熱して乾燥させた。こうして、４，４'−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ−Ｎ，Ｎ'−ｄｉｏｘｉｄｅを得た。
【００４９】
還流管をつけた１００ｍＬのナスフラスコに２ｍＬのクロロホルム、０．３２６ｍＬの三塩化リン、０．０８２ｇの４，４'−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ−Ｎ，Ｎ'−ｄｉｏｘｉｄｅを入れ、湯浴上７５分還流させた。反応溶液を氷冷後、砕氷上に注ぎ、２５％ＮａＯＨでｐＨ７以上に中和する。この溶液から減圧溜去でクロロホルムを除去、析出した白色粉末をろ過で回収、さらに水で洗浄した。これを少量の石油エーテルに溶かし、冷凍庫で一晩再結晶を行い、白色針状結晶を得た。そして、減圧下、６０℃に加熱して乾燥させた。こうして、４，４'−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅを得た。
【００５０】
還流管をつけた１００ｍＬのナスフラスコに２０ｍＬのエチレングリコール、０．０８ｇの（ＮＨ4）2［ＯｓＣｌ6］，０．０８２ｇの４，４'−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅを加えた。スターラ攪拌、窒素気流下マイクロ波合成器で３００Ｗを２０分間照射した。溶液を室温までさました後、０．１ｇのＮａ2Ｓ2Ｏ4を溶解させた１０ｍＬの水を加えた。室温で１時間攪拌した後に生じた黒紫沈殿をろ過、水洗して過剰の塩を除いた後に、ジエチルエーテルで洗浄し、未反応の配位子を除き、減圧下、６０℃に加熱して乾燥させた。こうして、乾燥、Ｏｓ（４，４'−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）2Ｃｌ2を得た。
【００５１】
還流管をつけた１００ｍＬのナスフラスコに以下の成分を加えた。
・１３ｍＬのエチレングリコール、９ｍＬのエタノール。
・先に調製した０．０２ｇのＯｓ（４，４'−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−２，２'−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）2Ｃｌ2。
・調製例１で調製した０．０１９ｇのポリアクリルアミドーポリビニルイミダゾールの共重合体。
【００５２】
スターラ攪拌、窒素気流下マイクロ波合成器で３００Ｗを２時間照射した。溶液を室温までさました後、これに２０ｍＬのエタノールを加えた溶液を、強攪拌下の５００ｍＬのジエチルエーテル溶液に滴下した。こうして生じる粘調な沈殿にさらに２０ｍＬのエタノールを加え、これを再び、強攪拌下の５００ｍＬのジエチルエーテル溶液に滴下、得られた粘調な沈殿を減圧下、６０℃に加熱して乾燥させた。こうして、目的とする式（２）に記載の錯体ポリマーを得た。
【００５３】
実施例に先立って、実施例で使用される多孔質材料の調製法について記述する。
【００５４】
調製例３
カーボン被覆アルミナナノホールの調製法について記述する。１０-2Ωｃｍの抵抗値を有する鏡面研磨されたｎ型のリンドープ単結晶Ｓｉ基板上に、ＲＦスパッタ法によりに厚さ１００ｎｍのＮｂ膜を成膜する。その後、Ａｌを５００ｎｍ成膜する。Ｓｉの裏側全面から電極を取り０．３Ｍの硫酸水溶液中、３℃で、電圧ＤＣ２５Ｖを印加することで陽極酸化を行う。この工程中、陽極酸化がＡｌ表面から進行しＮｂ膜まで到達したことを示す電流を検知するため、陽極酸化電流をモニターしながら酸化を行う。反応が進行するに連れてＡｌが酸化され、絶縁層のアルミナになっていくのと同時に、ホールが成長し、最終的には下地Ｎｂが導電パスで上部と導通する。陽極酸化処理後、純水、およびイソプロピルアルコールによる洗浄を行うことでアルミナナノホールを調製する。このときのホール径は走査型電子顕微鏡像から約２０ｎｍであることがわかる。調製したアルミナナノホールを管状炉内に入れ、設定温度まで毎分５℃ずつ上昇させる。熱処理中は、常に２％Ｈ2／９８％Ｈｅ（容量比）を３３ｓｃｃｍで流し、炭化水素ガスとして１％Ｃ2Ｈ2／９９％Ｈｅ、１％Ｃ2Ｈ4／９９％Ｈｅ（容量比）を６６ｓｃｃｍで流して使用する。炭化水素熱分解時は、合計１００ｓｃｃｍのガスが流れ、混合比はＣ2Ｈ4：Ｈ2：Ｈｅ＝１：１：１×１０2である。２％Ｈ2／９８％Ｈｅ（容量比）雰囲気で１０００℃まで３時間２０分かけて加熱し、１０分間１０００℃で保持する。その後１％Ｃ2Ｈ2／９９％Ｈｅ（容量比）を１０分間流す。その後、１０００℃で１時間保持した後、３時間２０分かけて冷却させる。その結果、図２に示すようなカーボン被覆アルミナナノホールが形成される。
【００５５】
実施例１
グルコースオキシダーゼ／金粒子複合体を用いた酵素電極と、これを用いたグルコースセンサ、生物燃料電池について記述する。
【００５６】
まず、アノードの調製について記述する。１０ｍＬのサンプル瓶に以下の成分を加えた。
・２ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）。
・５０ｍＭのグルコース、１０ｍｇｍＬ-1のグルコースオキシダーゼ（以降ＧＯＤと表記）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（１９０Ｕｍｇ-1，Ｓｉｇｍａ）、
・０（ゼロ：ＮａＡｕＣｌ4添加なし）、４．８または８．０、６４ｍｇｍＬ-1のＮａＡｕＣｌ4
これを３日間放置して、ＧＯＤ／金粒子複合体を調製した。直径３ｍｍのグラッシーカーボン電極（ＢＡＳ）をアルミナペーストで研磨し、超音波水洗後、調製例１の錯体ポリマーの１０ｍｇｍＬ-1水溶液を６μＬ滴下した。乾燥後、先に調製したＧＯＤ／金粒子複合体を１．２μＬ、更には、２．５ｍｇｍＬ-1のポリエチレングリコールジグリシデルエーテル（以降ＰＥＧＤＧＥと表記）１．６μＬを滴下し、一晩乾燥させた。その後、調製した電極を０．１５ＭのＮａＣｌを加えた２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０（以降ＰＢＳと表記）で洗浄した。調製サンプルをそれぞれのＮａＡｕＣｌ4濃度（なし、４．８または８．０ｍｇｍＬ-1）に対し次のようにいう。即ち、比較例のアノード（NaAuCl4 なし：アノードＡ）、実施例のアノード（NaAuCl4 濃度 4.8 mg mL-1: アノードＢ、8.0 mg mL-1: アノードＣ）である。
【００５７】
次に、カソードの調製について記述する。マイクロチューブに以下の成分を混合した。
・１０ｍｇｍＬ-1の調製例２に記載の錯体ポリマーの水溶液：１０．３μＬ。
・２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）：２μＬ。
・５５ｍｇｍＬ-1のビリルビンオキシダーゼ（以降ＢＯＤと表記）。
・Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ（１５−６５Ｕｍｇ-1、シグマ）の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液：１．７μＬ。
・７ｍｇｍＬ-1のＰＥＧＤＧＥ水溶液：２μＬ。
溶液をアルミナペーストで研磨、超音波水洗した直径３ｍｍのグラッシーカーボン電極上に６μＬ滴下し、一晩乾燥させた。その後、調製した電極をＰＢＳで洗浄した。
【００５８】
調製したＧＯＤ／金粒子複合体の透過型電子顕微鏡写真を図３に示す。生成した金粒子は、添加したＮａＡｕＣｌ4濃度によって、一次粒子のときと、一次粒子が会合した二次粒子を形成している場合があった。本実施例の実施条件では、ＮａＡｕＣｌ4濃度が８．０ ｍｇ ｍＬ-1のときに一次粒子（図３Ａ）、４．８ ｍｇ ｍＬ-1のときに二次粒子（図３Ｂ）を形成した。金粒子の平均粒径は、それぞれ１８ｎｍ（一次粒径）、４５ｎｍ（二次粒径）であった。また、透過型電子顕微鏡観測によって、金属粒子の一部が酵素の内部に入りこんだ酵素／金属粒子複合体を形成していることが確認できた。（図３Ｃ）  64 mg mL-1 のNaAuCl4 濃度で調製したサンプルは、溶液に金属光沢が見られ、粒子がおおよそ 300  nm 以上のサイズになっていることが推測された。
【００５９】
次に、調製した酵素電極を用いた基質センサについての詳細を記述する。図４に示すように、調製したアノードを作用電極１９、白金線を対電極１８、銀／塩化銀電極を参照電極２１として３電極セルを構成し、ポテンショスタット１２に接続することで、基質センサとした。電解液２０としてＰＢＳを使用し、３０分以上Ｎ2ガスを吹き込むことで電解液から酸素を除去した。作用電極１９に３００ｍＶ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌの電位を印加して定常電流（触媒電流）を観測する。アノードＡ、Ｂ及びＣをそれぞれ個々に作用電極１９として用いて観測される定常電流の５ｍＭのグルコース濃度における、それぞれのアノードから観測される定常電流値は、アノードＡ、Ｂ及びＣに対し、それぞれ１．１μＡ、２．６μＡ及び４．０μＡであった。また、６４ｍｇ mL-1 のNaAuCl4 から生成した酵素を含む金粒子を用いて調製したアノードからは、有意の酵素電流は観測されなかった。これにより、適当な条件でＧＯＤ／金粒子複合体を用いることで、電流が４倍近くになることが観測された。
【００６０】
この金属粒子と複合した酵素を用いて作製した酵素電極の触媒電流は、金属粒子と複合していない酵素を用いて調製した酵素電極と比較して、高い値を示した。これは、酵素反応によって生成した金属粒子によって、酵素の酸化還元中心からの電荷の取り出し速度が向上したためと考えられる。
【００６１】
この酵素の酸化還元中心からの電荷の取り出し速度が向上した酵素電極を用いることで、測定可能な濃度範囲の広い（測定濃度範囲の上限が高く、下限が低い）センサを調製することができる。この理由は以下のように説明できる。
【００６２】
一般に酵素電極を用いたセンサにおいては、酵素電流値の基質濃度依存性を観測したときに、基質濃度の増大と共に、酵素反応が律速となる領域が現れ、電流値が基質濃度の増大と比例して増大しない現象が観測される。ここで、金属粒子と複合した酵素を用いて作製した酵素電極では、金属粒子が酵素の酸化還元中心から電荷を取り出し速度を向上させる。そのため、金属粒子と複合していない酵素電極を用いた場合（例えば比較例）と比較して、酵素の活性中心から導電性部材への電荷輸送の高速化が可能となる。この活性中心から導電性部材への高速の電荷輸送によって、酵素反応が律速となる基質の濃度を向上させ、酵素電極を用いたセンサの測定可能な濃度範囲の上限を向上させることができる。
【００６３】
一般に酵素電極においては、測定下限を決定する主要な指標として、酵素電流／バックグラウンド電流比が挙げられる。このバックグラウンド電流は、一般的に導電性部材の面積に比例する。このため、バックグラウンド電流を低減するためには、導電性部材の面積を小さくすることが有効である。さらに、導電性部材の面積の低減は、基質の拡散律速の影響を低下させるが、全体の酵素電流も同時に低下させてしまう。ここで、金属粒子と複合した酵素を用いて作製した電極では、金属粒子が、酵素の酸化還元中心からの電荷を取り出し速度を向上させる。そのため、金属粒子と複合していない酵素電極を用いた場合（例えば比較例）と比較して、酵素の活性中心から導電性部材への電荷の輸送の高速化が可能となる。これによって、酵素電極の酵素電流密度（導電性部材の単位面積あたりの電流値）を向上させることで、同じ酵素電流値を、より小さな導電性部材の面積で与えることが可能となる。その結果、酵素電流／バックグラウンド電流比を向上させ、測定下限を低下させることができる。
【００６４】
実施例のアノードまたは比較例アノードを用いて観測される定常電流の溶液中グルコース濃度依存性の傾向を図５に示す。それぞれのアノードにおいては、あるグルコース濃度まで直線的に定常電流が増大し、その後飽和傾向となる。この直線性の範囲は、実施例の酵素電極において、比較例の酵素電極よりも上下限共に広く、グルコースセンサのグルコース濃度の測定可能範囲が拡大する。
【００６５】
次に、調製した実施例のアノード、比較例のアノードとカソードを組み合わせて用いた生物燃料電池についての詳細を記述する。図６に示すように、調製したアノードを作用電極１９、カソードを対電極２３として生物燃料電池とする。グルコース１０ｍＭを含むＰＢＳを電解液２０として使用し、空気をバブリングしながら、アノードＡ、Ｂ及びＣをそれぞれ個々に作用電極１９として用いて生物燃料電池特性を測定する。電池の最大出力は、電圧、電流、フィルファクターの積であらわされる。
【００６６】
ここで、金属粒子と複合した酵素を用いて作製した電極では、金属粒子と複合していない酵素電極を用いた場合（例えば比較例）と比較して、金属粒子が、酵素の酸化還元中心から電荷を取り出し速度を向上させるため、高い電流と出力を得ることができる。
【００６７】
図８に、実施例の酵素電極を用いた場合と、比較例の酵素電極を用いた場合の生物燃料電池の電流−電位曲線について特性の傾向を示す。その結果、実施例の酵素電極を用いた生物燃料電池では、比較例の酵素電極を用いた生物燃料電池よりも、電流値が高いために、高い出力がえられる。
【００６８】
実施例２
調製例３のカーボン被覆アルミナナノホール基板を１ｃｍ角に切断し、ＵＶ−オゾン処理を行って親水化した後に、サンプル瓶中、１ｍｇｍＬ-1のＧＯＤのＰＢＳ溶液に２４時間浸漬を行う。基板を引き上げ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で１０回洗浄を行った。更に、基板を０（ＮａＡｕＣｌ4添加なし）もしくは８ｍｇｍＬ-1のＮａＡｕＣｌ4の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）溶液に浸漬し、５０ｍＭのグルコースを加え３日間静置する。基板を引き上げＰＢＳで１０回洗浄を行った後、カーボンペースト（旭化学研究所）を用いてリードとなる銅線とのコンタクトを取る。カーボンペースト、銅線等の導電部位のうち溶液に接触する部位には、シリコーンゴム（信越シリコーン）を塗布し絶縁する。実施例2において、調製サンプルをそれぞれのＮａＡｕＣｌ4濃度（なし、８．０ｍｇｍＬ-1）に対し比較例のアノード、実施例のアノードと呼称する。
【００６９】
次に、調製した酵素電極を用いた基質センサについての詳細を記述する。図４に示すように、調製したアノードを作用電極１９、白金線を対電極１８、銀／塩化銀電極を参照電極２１としてポテンショスタットに接続することで、基質センサとする。電解液２０としてＰＢＳを使用し、３０分以上Ｎ2ガスを吹き込むことで電解液から酸素を除去する。作用電極１９に６００ｍＶ  ｖｓＡｇ／ＡｇＣｌ  の電位を印加して定常電流（酵素触媒電流）を観測する。アノードＤ及びＦをそれぞれ個々に作用電極１９として用いて観測される定常電流の溶液中グルコース濃度依存性の傾向を図７に示す。その結果、比較例のアノードを用いた場合には、酵素触媒電流が小さい、もしくは、観測されないのに対し、実施例のアノードを用いた場合には、電流値が大きく、一定のグルコース濃度範囲で、グルコース濃度に対して直線的に増大する。この結果は、アルミナナノホール中に酵素が担持されただけで金粒子が生成されない比較例のアノードでは、酵素の酸化還元中心と、基材の壁面のカーボンが効果的には、電気的に接続されないことを示している。そして、このためにグルコースの酸化に起因する酵素触媒電流を外部回路に効果的に取り出すことが困難なこと示している。一方、実施例のアノードでは、ＧＯＤ／金粒子複合体がカーボン被覆アルミナナノホール中で形成されることにより、酵素の酸化還元中心と基材の壁面のカーボンが電気的に接続され、酵素触媒電流が観測される。また、多孔質材料の孔中に酵素を導入し、酵素の基質と金属前駆体の存在下、酵素における酵素の基質の関与する反応によって、金属前駆体から金属粒子を析出させることができる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、新規な酵素電極、およびそれを用いたセンサ、生物燃料電池を提供でき、例えば、バイオセンサ、酵素の基質を燃料として用いる燃料電池に使用可能な部材として極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】金属粒子が前記酵素の内部に入りこんだ酵素／金属粒子複合体についての概念図である。
【図２】カーボン被覆アルミナナノホールの構造を示す概念図である。
【図３】実施例１で調製した金粒子の透過型電子顕微鏡写真である。
【図４】３電極セルの概略図である。
【図５】実施例１の基質センサの定常電流／基質濃度の関係を示したグラフである。
【図６】２電極セルの概略図である。
【図７】実施例２の基質センサの定常電流／基質濃度の関係を示したグラフである。
【図８】実施例１の電池の電流−電位曲線について特性の傾向を示すグラフである。
【符号の説明】
【００７２】
１  酵素
２  金属微粒子
３  酵素の内部に入りこんだ金属微粒子
４  陽極酸化アルミナ
５  カーボン
６  Ｎｂ（導電パス）
７  Ｎｂ膜
８  Ｓｉ基板
９  参照電極のリード
１０  作用電極のリード
１１  対電極のリード
１２  ポテンショスタット
１３  ガス供給口
１４  温調セルのカバー
１５  ガス供給管
１６  温調セル
１７  温調水供給口
１８  白金対電極
１９  アノード
２０  電解液
２１  参照電極
２２  温調水排出口
２３  カソード
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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