(57)【要約】【課題】  複数の試料から発生する蛍光を同時に測定するに際し、クロストークの発生を抑制することができる蛍光測定装置及び蛍光測定方法を提供する。【解決手段】    励起光供給部１０は、複数の試料それぞれに対し励起光を供給する。弁別部４０は、光検出部２０で検出された蛍光の光量が、蛍光閾値ＴＬ２を超えているか否かを弁別する。演算部５０は、光量が蛍光閾値ＴＬ２を超えている蛍光について、励起光の光量に基づき蛍光量を算出する。励起光供給部１０では、タイミング制御器３２からの指示により、光量が蛍光閾値ＴＬ２を超えている蛍光を放出した試料への励起光の供給を中止する。さらに、光量が蛍光閾値ＴＬ２を超えていない蛍光を放出した試料に供給する励起光の光量を増大させて、継続して測定を行う。【選択図】  図１
2007024604.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光源を有し、前記励起光源から出力される励起光を複数の試料それぞれに対して供給する励起光供給手段と、
前記複数の試料から放出される蛍光を検出する光検出手段と、
前記複数の試料それぞれから放出され、前記光検出手段で検出された前記蛍光の光量が、所定の蛍光閾値を超えているか否か弁別する弁別手段と、
前記弁別手段で光量が前記蛍光閾値を超えていると弁別された蛍光の光量を、当該蛍光を放出した試料に供給された前記励起光の光量に基づき算出するための処理を行う演算手段と、
前記弁別手段において光量が前記蛍光閾値を超えていると弁別された蛍光を放出した前記試料への前記励起光の供給を中止するとともに、前記弁別手段において光量が前記蛍光閾値を超えていないと弁別された蛍光を放出した試料に供給する前記励起光の光量を増大する励起光制御手段と、を備えていることを特徴とする蛍光測定装置。
【請求項２】
前記励起光制御手段は、前記励起光源に供給する電力を変化させることによって、前記励起光の光量を増大することを特徴とする請求項１に記載の蛍光測定装置。
【請求項３】
前記励起光源は複数であって、少なくとも前記複数の試料と1対1に対応しており、
前記励起光制御手段は、前記励起光源に供給する電力を変化させ、前記励起光源からの前記励起光の出力を中止することによって、前記励起光の供給を中止することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の蛍光測定装置。
【請求項４】
前記励起光源から出力される前記励起光に対して変調を与える光変調手段をさらに有し、前記光変調手段において前記励起光の強度を変調することにより、前記励起光の光量を増大することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光測定装置。
【請求項５】
前記励起光源から出力される前記励起光に対して変調を与える光変調手段をさらに有し、前記光変調手段において前記励起光の強度を変調することにより、前記複数の試料への前記励起光の供給を中止することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の蛍光測定装置。
【請求項６】
前記複数の試料は２次元に配列されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の蛍光測定装置。
【請求項７】
前記励起光源は、半導体発光素子であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の蛍光測定装置。
【請求項８】
前記励起光供給手段は、前記励起光を前記励起光源から前記複数の試料それぞれへと導く導光部をさらに有することを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の蛍光測定装置。
【請求項９】
前記光検出手段は、固体撮像素子であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の蛍光測定装置。
【請求項１０】
前記演算手段は、前記弁別手段で光量が前記蛍光閾値を超えていると弁別された前記蛍光の光量を、当該蛍光を放出した前記試料に供給された前記励起光の前記光量で割ることで、前記蛍光の光量を算出することを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の蛍光測定装置。
【請求項１１】
励起光源から出力される励起光を複数の試料それぞれに対して供給する励起光供給ステップと、
前記複数の試料から放出される蛍光を検出する光検出ステップと、
前記複数の試料それぞれから放出され、前記光検出ステップで検出された前記蛍光の光量が、所定の蛍光閾値を超えているか否か弁別する弁別ステップと、
前記弁別ステップで光量が前記蛍光閾値を超えていると弁別された蛍光の光量を、当該蛍光を放出した試料に供給された前記励起光の光量に基づき算出するための処理を行う演算ステップと、
前記弁別ステップにおいて光量が前記蛍光閾値を超えていると弁別された蛍光を放出した前記試料への前記励起光の供給を中止する供給中止ステップと、
前記弁別ステップにおいて光量が前記蛍光閾値を超えていないと弁別された蛍光を放出した試料に供給する前記励起光の光量を増大する励起光量増大ステップと、を含むことを特徴とする蛍光測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光測定装置及び蛍光測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡチップ等のように、複数の試料から発生する蛍光を測定する蛍光測定装置として、例えば特許文献１に記載された光学的読み取り装置、あるいは特許文献２に記載された光測定装置などがある。特許文献１に記載された光学的読み取り装置では、複数の試料それぞれに対して、時間を異ならせて励起光を供給して蛍光を発生させ、１つの光検出装置で発生した蛍光を検出している。
【０００３】
特許文献２に記載された光測定装置では、測定する試料を移動させて励起光の供給領域を変えることによって、複数の試料全体に対して励起光を供給し、蛍光を測定している。
【特許文献１】特開平１１−３１３６９８号公報
【特許文献２】特開２００４−２７９２５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、特許文献１に記載された光学的読み取り装置においては、試料ごとに複数回に分けて励起光を供給することによって複数の試料を測定しているため、試料の数が多くなるのに比例して、測定に長時間を要してしまう。
【０００５】
一方、特許文献２には、ＣＣＤカメラを用いて複数の試料から発生する蛍光を同時に測定する方法が記載されている。しかし、複数の試料から発生する蛍光をＣＣＤを用いて同時に測定する場合、各試料ごとにＣＣＤの画素群（または画素）を対応させて蛍光を測定する際に、近隣の異なる試料に対応すべき画素群（または画素）にも光が及び、近隣の異なる試料の測定に影響を及ぼしてしまうクロストークの問題が発生する。クロストークの問題は、ＣＣＤカメラを用いた場合のみならず、他の光検出器、例えば光電子増倍管を用いた場合においても発生する。特許文献２では、クロストークを抑制することについて、検討がなされていない。
【０００６】
本発明は、上記問題点を解消するためになされたものであり、複数の試料から発生する蛍光を同時に測定するに際し、クロストークの発生を抑制することができる蛍光測定装置及び蛍光測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような目的を達成するために、本発明による蛍光測定装置は、励起光源を有し、励起光源から出力される励起光を複数の試料それぞれに対して供給する励起光供給手段と、複数の試料から放出される蛍光を検出する光検出手段と、複数の試料それぞれから放出され、光検出手段で検出された蛍光の光量が、所定の蛍光閾値を超えているか否か弁別する弁別手段と、弁別手段で光量が蛍光閾値を超えていると弁別された蛍光の光量を、当該蛍光を放出した試料に供給された励起光の光量に基づき算出するための処理を行う演算手段と、弁別手段において光量が蛍光閾値を超えていると弁別された蛍光を放出した試料への励起光の供給を中止するとともに、弁別手段において光量が蛍光閾値を超えていないと弁別された蛍光を放出した試料に供給する前記励起光の光量を増大する励起光制御手段と、を備えていることを特徴とする。
【０００８】
この蛍光測定装置では、複数の試料それぞれに対して励起光を供給し、各試料から放出された蛍光の光量（以下、単に蛍光量という）を、複数の試料それぞれに供給した励起光の光量（以下、単に励起光量という）に基づいて算出している。したがって、複数の試料から放出された蛍光を同時に測定することができ、測定に要する時間を短縮することが可能となる。なお、ここでいう光量とは、光のエネルギー量をいう。また、この蛍光測定装置は、弁別手段において蛍光量が所定の蛍光閾値を超えているか否かの弁別を行い、蛍光閾値を超えているものについてのみ、演算手段で励起光量に基づき蛍光量を算出している。また、蛍光量が蛍光閾値を超えている試料に対しては励起光の供給が中止され、蛍光量が蛍光閾値を超えていない試料に対してのみ、継続して蛍光量が測定されることとなる。したがって、隣り合っている試料から発生する蛍光の光量の差が大きい場合であっても、クロストークの発生を抑制することが可能となる。このように、この蛍光測定装置は、複数の試料から発生する蛍光を同時に測定するに際し、クロストークの発生を抑制することが可能である。また、蛍光量が蛍光閾値を超えていない試料に対しては、供給される励起光の光量を増大している。そのため、微弱な蛍光量も、クロストークの影響を抑制しつつ測定することが可能である。また、こうして微弱な蛍光までクロストークの影響を抑制しつつ測定できることから、装置が測定できる感度幅（ダイナミックレンジ）を大きくすることが可能となる。
【０００９】
励起光制御手段は、例えば、励起光源に供給する電力を変化させることによって、励起光の光量を増大してもよい。また、例えば、励起光源は複数であって、少なくとも複数の試料と1対1に対応しており、励起光制御手段は、励起光源に供給する電力を変化させ、励起光源からの励起光の出力を中止することによって、励起光の供給を中止してもよい。
【００１０】
あるいは、例えば、励起光源から出力される励起光に対して変調を与える光変調手段をさらに有し、光変調手段において励起光の強度を変調することにより、励起光の光量を増大してもよい。また、例えば、励起光源から出力される励起光に対して変調を与える光変調手段をさらに有し、光変調手段において励起光の強度を変調することにより、複数の試料への励起光の供給を中止してもよい。
【００１１】
例えば、複数の試料は２次元に配列されていてもよい。この場合であっても、複数の試料から放出される蛍光について、クロストークの発生を抑制しつつ、同時に測定することができる。
【００１２】
励起光源は、半導体発光素子であることが好ましい。半導体発光素子を適用することによって、励起光量の制御が容易となり、加えて装置の小型化、さらには消費電力の低減が可能となる。
【００１３】
励起光供給手段は、励起光を励起光源から複数の試料それぞれへと導く導光部をさらに有することが好ましい。この場合、複数の試料それぞれに励起光を容易に供給できる。
【００１４】
光検出手段は、固体撮像素子であることが好ましい。この場合、多数の試料から発生する蛍光を同時に測定することが可能である。
【００１５】
演算手段は、弁別手段で光量が蛍光閾値を超えていると弁別された蛍光の光量を、当該蛍光を放出した試料に供給された励起光の光量で割ることで、蛍光の光量を算出してもよい。励起光の供給量を変化させたとしても、複数の試料から発生する蛍光について測定することが容易にできる。
【００１６】
また、本発明による蛍光測定方法は、励起光源から出力される励起光を複数の試料それぞれに対して供給する励起光供給ステップと、複数の試料から放出される蛍光を検出する光検出ステップと、複数の試料それぞれから放出され、光検出ステップで検出された蛍光の光量が、所定の蛍光閾値を超えているか否か弁別する弁別ステップと、弁別手段で光量が蛍光閾値を超えていると弁別された蛍光の光量を、当該蛍光を放出した試料に供給された励起光の光量に基づき算出するための処理を行う演算ステップと、弁別ステップにおいて光量が蛍光閾値を超えていると弁別された蛍光を放出した試料への励起光の供給を中止する供給中止ステップと、弁別ステップにおいて光量が蛍光閾値を超えていないと弁別された蛍光を放出した試料に供給する励起光の光量を増大する励起光量増大ステップと、を備えることを特徴とする。
【００１７】
この蛍光測定方法では、複数の試料それぞれに対して励起光を供給し、各試料から放出された蛍光の光量を、複数の試料それぞれに供給した励起光の光量に基づいて算出している。したがって、複数の試料から放出された蛍光を同時に測定することができ、測定に要する時間を短縮することが可能となる。また、この蛍光測定方法は、弁別ステップにおいて蛍光量が蛍光閾値を超えているか否かの弁別を行い、蛍光閾値を超えているものについてのみ、演算ステップで蛍光量を算出している。また、蛍光量が蛍光閾値を超えている試料に対しては励起光の供給が中止され、蛍光量が蛍光閾値を超えていない試料に対してのみ、継続して蛍光量が測定されることとなる。したがって、隣り合っている試料から発生する蛍光の光量の差が大きい場合であっても、クロストークの発生を抑制することが可能となる。このように、この蛍光測定方法は、複数の試料から発生する蛍光を同時に測定するに際し、クロストークの発生を抑制することが可能である。また、蛍光量が蛍光閾値を超えていない試料に対しては、供給する励起光の光量を増大している。そのため、微弱な蛍光量も、クロストークの影響を抑制しつつ測定することが可能である。また、こうして微弱な蛍光までクロストークの影響を抑制しつつ測定できることから、この測定方法によって測定できる感度幅（ダイナミックレンジ）を大きくすることが可能となる。なお、各ステップの順番は適宜入れ替えてもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、複数の試料から発生する蛍光を同時に測定するに際し、クロストークの発生を抑制することができる蛍光測定装置及び蛍光測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、図面とともに、本発明による蛍光測定装置及び蛍光測定方法の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。
【００２０】
（第１実施形態）
図１は、第１実施形態に係る蛍光測定装置について概略的に示す構成図である。本実施形態による蛍光測定装置１は、図１に示すように、励起光を複数の試料それぞれに対して供給する励起光供給部１０と、複数の試料から放出される蛍光を検出する光検出部２０と、複数の試料に供給する励起光を制御するタイミング制御器３２と、蛍光の光量が蛍光閾値を超えているか否か弁別する弁別部４０と、蛍光量を算出するための処理を行う演算部５０とを備えている。ここで、光量とは、光のエネルギー量をいう。
【００２１】
本実施形態における励起光供給部１０は、複数の半導体発光素子（ＬＥＤ）１１と、ＬＥＤパワーコントローラ１２と、光ファイバ１３とを含んでいる。図２に、蛍光測定装置１によって蛍光が測定される複数の試料Ｓ１と、半導体発光素子１１と、光ファイバ１３との関係を示す。複数の試料Ｓ１は、測定のためプレートＰ１上に配置されている。プレートＰ１はマイクロタイタプレートであり、プレートＰ１の一方の主面上には、複数のウェルが２次元アレイ状に形成されている。複数の試料Ｓ１はそれぞれ、プレートＰ１上の各ウェル内に収納されている。なお、ウェルの数は試料Ｓ１と同数もしくは多くてもよいが、本実施形態においてはウェルの数は試料Ｓ１の数と同数とする。
【００２２】
複数の半導体発光素子１１は、複数の試料Ｓ１それぞれに励起光を供給する励起光源として機能する。また、各半導体発光素子１１が複数の試料Ｓ１それぞれと１対１に対応するよう、複数の半導体発光素子１１はプレートＰ１に形成された複数のウェルと同じように２次元アレイ状に配置されている。なお、半導体発光素子１１の数は試料Ｓ１と少なくとも１対１に対応していればよく、試料Ｓ１の数と同じあるいはそれより多くてもよい。
【００２３】
ＬＥＤパワーコントローラ１２は、後述のタイミング制御器３２からの指示に基づき、複数の半導体発光素子１１のそれぞれに供給する電力を、各個に独立して制御することが可能となっている。ＬＥＤパワーコントローラ１２において、半導体発光素子１１に供給する電力が変化させられると、励起光の光量が変えられる。
【００２４】
光ファイバ１３は、複数であり、複数の試料Ｓ１（ウェル）と同数である。各光ファイバ１３は、図２に示すように、励起光を各半導体発光素子１１から各試料Ｓ１へと導く導光部として機能する。光ファイバ１３を通じて励起光が供給されることによって、各試料Ｓ１は蛍光を放出する。
【００２５】
再び図１に戻って、蛍光測定装置１の説明を続ける。光検出部２０は、複数の試料Ｓ１から放出された蛍光を検出する。本実施形態における光検出部２０は、ＣＣＤカメラ２１と、カメラコントローラ２２と、Ａ／Ｄ変換器２３とを含んでいる。ＣＣＤカメラ２１の受光面には、複数の試料Ｓ１から放出された蛍光による蛍光像が形成される。蛍光像は、ＣＣＤカメラ２１において電気信号に変換され、蛍光が検出される。ここで、複数の試料Ｓ１は２次元アレイ状に配置されているため、蛍光像は２次元画像として検出される。
【００２６】
ＣＣＤカメラ２１とカメラコントローラ２２は、信号線で接続されている。カメラコントローラ２２は、ＣＣＤカメラ２１の動作を制御する。
【００２７】
ＣＣＤカメラ２１で得られた電気信号は、Ａ／Ｄ変換器２３に送られる。Ａ／Ｄ変換器２３は、アナログ信号である電気信号に対してＡ／Ｄ変換を行い、デジタル信号であるビデオ信号を生成する。Ａ／Ｄ変換器２３は、光検出部２０で検出された蛍光の光量を示すビデオ信号をビデオ信号レベル検出器３１へ出力する。
【００２８】
ビデオ信号レベル検出器３１において、ビデオ信号閾値ＴＬ１が設定されている。ビデオ信号レベル検出器３１は、ビデオ信号のレベルがビデオ信号閾値ＴＬ１を超えている場合、タイミング制御器３２に対して信号を送る。
【００２９】
タイミング制御器３２は、ビデオ信号レベル検出器３１からの信号を受けて、ＬＥＤパワーコントローラ１２に対し半導体発光素子１１に供給する電力についての指示信号（例えば、供給電力を一定にする指示信号など）を送る。タイミング制御器３２は、後述するように励起光制御手段として機能するとともに、本実施形態においては、蛍光測定装置１を構成する各部からの出力を入力とし、入力値に応じて他の部へ指示信号を出力するような制御手段としても機能する。
【００３０】
本実施形態における弁別部４０は、画像処理器４１と、ドットエリア加算器４２と、蛍光量弁別器４３とを含んでいる。画像処理器４１は、ビデオ信号レベル検出器３１から出力されるビデオ信号を入力として取り込み、蓄積するフレームメモリを含む。画像処理器４１のフレームメモリでは、蓄積されたビデオ信号を画像データとして記憶している。画像処理器４１は、フレームメモリにおいて記憶されている画像データを、ドットエリア加算器４２に出力する。また、画像処理器４１は、ビデオ信号レベル検出器３１からのビデオ信号の取り込みが終わると、タイミング制御器３２に対し取り込み終了信号を送る。
【００３１】
ドットエリア加算器４２は、画像処理器４１のフレームメモリにおいて記憶されている画像データを入力とする。ドットエリア加算器４２は、取り込み終了信号を受けたタイミング制御器３２からの指示信号を受け、画像データから、各ドットエリア内の画素データを加算したドットエリア加算値を求める。ここで、ドットエリアとは、各試料Ｓ１を含む、プレートＰ１に形成されたウェル部分に相当する画像データ上のエリアをいう。ドットエリア加算値とは、各ドットエリア内にある全ての画素データを加算した値をいう。したがって、ドットエリア加算値とは、このドットエリア加算値が求められたドットエリアに対応するプレートＰ１のウェル部分に収納された試料Ｓ１から放出された蛍光の光量に相当する。
【００３２】
ドットエリア加算器４２は、こうして得られた各ドットエリア加算値を、２次元アレイ状に配列された半導体発光素子１１のアドレスと対応させて、蛍光量弁別器４３に出力する。ここで、半導体発光素子１１のアドレスとは、２次元アレイ状に配置された半導体発光素子１１の位置を、例えば列数及び行数で指し示して特定するポインタである。また、ドットエリア加算値と対応する半導体発光素子１１のアドレスとは、このドットエリア加算値を求めたドットエリアに対応する試料Ｓ１に、励起光を供給している半導体発光素子１１のアドレスをいう。
【００３３】
蛍光量弁別器４３は、ドットメモリを含んでいる。蛍光量弁別器４３は、半導体発光素子１１のアドレスと対応をとりつつ、ドットエリア加算器４２から出力されたドットエリア加算値をドットメモリに記憶する。
【００３４】
また、蛍光量弁別器４３において、蛍光閾値ＴＬ２が設定されている。蛍光量弁別器４３は、タイミング制御器３２からの指示信号を受け、ドットメモリに記憶されている各ドットエリア加算値が蛍光閾値ＴＬ２を超えているか否か弁別する。蛍光量弁別器４３は、蛍光閾値ＴＬ２を超えるドットエリア加算値を、このドットエリア加算値に対応する半導体発光素子１１のアドレスとともに、演算部５０に出力する。
【００３５】
本実施形態における演算部５０は、割り算器５１と、光検出モニタ５２と、Ａ／Ｄ変換器５３とを含む。光検出モニタ５２は、光ファイバ１３Ａと結合された１つの半導体発光素子１１から出力される励起光を、光ファイバ１３Ａを通じて検出することにより、半導体発光素子１１から試料Ｓ１に供給される励起光を検出する。光検出モニタ５２は、例えば光電子倍増管などである。光検出モニタ５２は、検出した励起光に応じた電気信号をＡ／Ｄ変換器５３に出力する。Ａ／Ｄ変換器５３は、アナログ信号である電気信号を、デジタル信号である励起光量データに変換し、割り算器５１に出力する。
【００３６】
割り算器５１は、タイミング制御器３２からの指示信号を受け、蛍光量弁別器４３でドットエリア加算値が蛍光閾値ＴＬ２を超えていると弁別された蛍光の光量を、当該蛍光を放出した試料Ｓ１に供給された励起光の光量に基づき算出する。そのためにまず、割り算器５１は、蛍光量弁別器４３から出力されるドットエリア加算値及び半導体発光素子１１のアドレスと、Ａ／Ｄ変換器５３から出力される励起光量データとを入力とする。割り算器５１は、ドットエリア加算値を試料Ｓ１に供給された励起光の光量である励起光量データで割ることによって、励起光の光量に基づいて算出された蛍光の光量である補正蛍光量を算出する。割り算器５１は、算出された補正蛍光量と、各補正蛍光量に対応する半導体発光素子１１のアドレスとを、記憶装置６０に出力する。ここで、補正蛍光量に対応する半導体発光素子１１のアドレスとは、この補正蛍光量を求める際に用いられたドットエリア加算値に対応する半導体発光素子１１のアドレスをいう。
【００３７】
記憶装置６０は、割り算器５１からの出力である補正蛍光量と、各補正蛍光量に対応する各半導体発光素子１１のアドレスとを入力とする。記憶装置６０はメモリを含み、このメモリに補正蛍光量を半導体発光素子１１のアドレスと対応させて記憶する。
【００３８】
割り算器５１から出力される補正蛍光量をすべてメモリに記憶した後、記憶装置６０は、補正蛍光量と対応させて記憶した半導体発光素子１１のアドレス、及び終了信号をタイミング制御器３２に対して出力する。
【００３９】
これを受けてタイミング制御器３２は、記憶装置６０から出力されたアドレスに対応する半導体発光素子１１への電力の供給を中止するよう、ＬＥＤパワーコントローラ１２に対して指示信号を出力する。すなわち、タイミング制御器３２は、弁別部４０において光量が蛍光閾値ＴＬ２を超えていると判断された蛍光を放出した試料Ｓ１への励起光の供給を中止する指示信号を、ＬＥＤパワーコントローラ１２に対して出力する。この指示信号を受けて、ＬＥＤパワーコントローラ１２は、該当する試料Ｓ１に励起光を供給している半導体発光素子１１に供給する電力を変化させて、励起光の出力を中止する。
【００４０】
タイミング制御器３２はさらに、記憶装置６０から出力されたアドレスとは異なるアドレスの半導体発光素子１１への電力の供給を増大するよう、ＬＥＤパワーコントローラ１２に対して指示信号を出力する。すなわち、タイミング制御器３２は、弁別部４０において光量が蛍光閾値ＴＬ２を超えていないと判断された蛍光を放出した試料Ｓ１に供給する励起光の光量を増大させる指示信号を、ＬＥＤパワーコントローラ１２に対して出力する。この指示信号を受けて、ＬＥＤパワーコントローラ１２は、該当する試料Ｓ１に励起光を供給している半導体発光素子１１に供給する電力を変化させ、励起光の光量を増大させる。このように、タイミング制御器３２は、励起光制御手段として機能する。
【００４１】
次に、蛍光測定装置１を用いた蛍光測定方法について説明する。まず最初に、ビデオ信号レベル検出器３１においてビデオ信号閾値ＴＬ１が、蛍光量弁別器４３において蛍光閾値ＴＬ２が、それぞれ設定される。ビデオ信号閾値ＴＬ１は、蛍光を捉えたビデオ信号が、光検出部２０において飽和レベルを超えないようにするために設定される閾値である。そのため、ビデオ信号閾値ＴＬ１は、最大ビデオ信号レベルの８０〜９０％の値に設定される。
【００４２】
一方、蛍光閾値ＴＬ２は、ドットエリア加算値を複数個同時に取り込んでも、互いにクロストークが影響しない程度のドットエリア加算値だけを取り込むための閾値である。したがって、蛍光閾値ＴＬ２は、最大ドットエリア加算値の１／４〜１／８程度の低い値に設定される。
【００４３】
ビデオ信号閾値ＴＬ１及び蛍光閾値ＴＬ２の設定後、タイミング制御器３２からの指示信号を受け、ＬＥＤパワーコントローラ１２は半導体発光素子１１に対し、供給量を増大させながら電力を供給し始める。これにより、半導体発光素子１１から発せられる励起光が、光量を増大させながら複数の試料Ｓ１それぞれに対し供給されることとなる（励起光供給ステップ）。なお、この際、少なくとも各半導体発光素子１１の光量の増大量が、より好ましくは各半導体発光素子１１の光量がいずれも等しい状態を維持するように電力を供給するのが好ましい。また、半導体発光素子１１は必ずしもその全てを点灯する必要はなく、試料Ｓ１に対応する領域のみ点灯しても良い。
【００４４】
試料Ｓ１は、供給された励起光で励起され、蛍光を放出する。放出された蛍光は、光検出部２０のＣＣＤカメラ２１で検出される（光検出ステップ）。蛍光は、ＣＣＤカメラ２１で蛍光像が撮像され、電気信号に変換されることで検出される。ＣＣＤカメラ２１から出力された電気信号は、Ａ／Ｄ変換器２３でデジタル信号であるビデオ信号に変換される。
【００４５】
ビデオ信号は、ビデオ信号レベル検出器３１に入力される。ビデオ信号レベル検出器３１において、入力されたビデオ信号とビデオ信号閾値ＴＬ１とが比較される。ビデオ信号がビデオ信号閾値ＴＬ１を超えている場合、ビデオ信号レベル検出器３１は、タイミング制御器３２に対し信号を送る。この信号を受けて、タイミング制御器３２は励起光の光量を一定にするため、ＬＥＤパワーコントローラ１２に対し半導体発光素子１１への供給電力の上昇を停止し、供給電力を一定にするよう指示信号を送る。
【００４６】
また、ビデオ信号がビデオ信号閾値ＴＬ１を超えている場合、ビデオ信号レベル検出器３１は、タイミング制御器３２に対し信号を送ると同時に、画像処理器４１に対しビデオ信号を出力する。ビデオ信号レベル検出器３１から出力されたビデオ信号が画像処理器４１に取り込まれ、画像処理器４１に含まれるフレームメモリに蓄積されることによって、画像データが生成される。
【００４７】
ビデオ信号の蓄積が終了すると、取り込み終了信号が画像処理器４１からタイミング制御器３２に対して出力される。これを受けて、タイミング制御器３２からドットエリア加算器４２に対し、画像データを画像処理器４１から入力し、画像データのドットエリア内の画素データを加算してドットエリア加算値を求め、半導体発光素子１１のアドレスと対応させて蛍光量弁別器４３に出力する、という指示信号が出力される。
【００４８】
この指示信号を受けて、ドットエリア加算器４２において、画像データのドットエリア内にある全ての画素データが加算される。ドットエリア内の画素データを加算する方法について、図３及び図４を用いて、詳細に説明する。
【００４９】
図３（ａ）は光検出部２０で検出された蛍光の光量の一部を試料の配置と対応させて示すグラフであり、図３（ｂ）は画像処理器４１によって生成された画像データの図である。図３（ａ）に示すように、試料Ｓ１ごとに発生する蛍光の光量が異なる。その結果、図３（ｂ）に示すように、複数の試料Ｓ１それぞれを含む画像データのドットエリアＤＡでは、そこに含まれる信号量が異なり、蛍光の光量を表す濃淡が異なる。図３（ｂ）では、蛍光の光量が大きいほど、ドットエリアを濃く表している。
【００５０】
図４は、拡大して表示した１つのドットエリアＤＡについて、このドットエリアＤＡを横切る水平ビデオラインＶＬ１〜ＶＬ８上の輝度信号を表す図である。各ドットエリア内にある全ての画素データを加算した値であるドットエリア加算値は、ドットエリア加算器４２において以下のようにして求められる。すなわち、１つのドットエリアＤＡ内を横切る水平ビデオラインＶＬ２〜ＶＬ７上の輝度信号のうち、ドットエリアＤＡ内にある輝度信号をすべて加算することにより求められる。ドットエリア加算器４２では、すべてのドットエリアＤＡについて、それぞれ蛍光の光量に相当するドットエリア加算値が求められる。なお、各ドットエリアは複数の試料Ｓ１それぞれと１対１で対応しているので、各ドットエリア加算値は各試料Ｓ１に励起光を供給する各半導体発光素子１１と対応して求められる。したがって、各ドットエリア加算値は、対応する半導体発光素子１１のアドレスを伴う。
【００５１】
再び図１に戻って、本実施形態に係る蛍光測定方法の説明を続ける。ドットエリア加算器４２で求められたドットエリア加算値は、対応する半導体発光素子１１のアドレスと関連づけて、蛍光量弁別器４３に入力され、蛍光量弁別器４３に含まれるドットメモリに記憶される。その後、蛍光量弁別器４３において、各ドットエリア加算値と蛍光閾値ＴＬ２とが比較され、蛍光閾値ＴＬ２を超えているドットエリア加算値だけが割り算器５１に出力される（弁別ステップ）。
【００５２】
割り算器５１には、上記のドットエリア加算値の他、光検出モニタ５２で検出された励起光の光量である励起光量データがＡ／Ｄ変換器５３から入力される。タイミング制御器３２からの指示信号を受け、割り算器５１では、蛍光量弁別器４３でドットエリア加算値が蛍光閾値ＴＬ２を超えていると弁別された蛍光の光量が、当該蛍光を放出した試料Ｓ１に供給された励起光の光量に基づき算出される（演算ステップ）。このように励起光の光量に基づいて算出される蛍光の光量である補正蛍光量は、具体的には、割り算器５１においてドットエリア加算値を励起光量データで割ることにより求められる。
【００５３】
こうして求められた補正蛍光量は、対応する半導体発光素子１１のアドレスと関連づけて、記憶装置６０に入力され、記憶装置６０に含まれるメモリに記憶される。その後、終了信号とともに、蛍光閾値ＴＬ２を超えていると判断されたドットエリア加算値に対応する半導体発光素子１１の全アドレスが、記憶装置６０からタイミング制御器３２へ出力される。
【００５４】
タイミング制御器３２は、弁別ステップにおいて蛍光閾値ＴＬ２を超えていると弁別されたドットエリア加算値に対応する半導体発光素子１１から試料Ｓ１への励起光の供給を中止するよう、ＬＥＤパワーコントローラ１２に対し指示信号を出力する。ＬＥＤパワーコントローラ１２は、この指示信号を受け、該当する半導体発光素子１１への電力の供給を中止する。これにより、弁別ステップにおいて光量が蛍光閾値ＴＬ２を超えていると弁別された蛍光を放出した試料Ｓ１への励起光の供給が中止される（供給中止ステップ）。
【００５５】
さらに、タイミング制御器３２は、弁別ステップにおいて蛍光閾値ＴＬ２を超えていないと弁別されたドットエリア加算値に対応する半導体発光素子１１から試料Ｓ１への励起光の供給を増大するよう、ＬＥＤパワーコントローラ１２に対し指示信号を出力する。この指示信号を受け、ＬＥＤパワーコントローラ１２は、光検出部２０で検出される蛍光の光量を示すビデオ信号がビデオ信号閾値ＴＬ１を超えるまで半導体発光素子１１への電力の供給を増大していく。こうして、弁別ステップにおいて光量が蛍光閾値ＴＬ２を超えていないと弁別された蛍光を放出した試料Ｓ１に供給する励起光の光量が増大される（励起光量増大ステップ）。
【００５６】
その後、上記の励起光供給ステップから励起光量増大ステップまでの一連のステップが、ＬＥＤパワーコントローラ１２の出力が最大になるまで繰り返される。ＬＥＤパワーコントローラ１２の出力が最大になった時点で、タイミング制御器３２から蛍光量弁別器４３に指示信号が送られる。この指示信号を受けて、蛍光量弁別器４３に設定された蛍光閾値ＴＬ２の値は０に設定される。これにより、すべてのドットエリア加算値が割り算器５１に入力され、蛍光閾値ＴＬ２以下の微弱な蛍光しか放出しないような試料Ｓ１に関しての測定が行われる。このようにして、すべての試料Ｓ１からの蛍光について補正蛍光量が求められる。このようにして求められた補正蛍光量はその後、記憶装置６０に入力され、記憶装置６０に含まれるメモリに記憶される。こうして、複数の試料Ｓ１から放出される蛍光の測定が終了する。なお、本実施形態における補正蛍光量は相対的な値であるので、予め実際の蛍光量と補正蛍光量とを対応させたテーブルと照らし合わせたり、実際の蛍光量に換算可能な式を求めておき、それを適用することによって実際の蛍光量を求めても良い。
【００５７】
図５を参照して、励起光供給ステップから励起光量増大ステップまでの一連のステップを繰り返すことにより、複数の試料Ｓ１から放出される蛍光が測定されることについて説明する。図５は、蛍光閾値ＴＬ２を超えるドットエリア加算値（蛍光量）を示す試料に対する励起光の供給を中止し、蛍光閾値ＴＬ２を超えないドットエリア加算値（蛍光量）を示す試料に対する励起光の光量を増大して、継続してドットエリア加算値（蛍光量）を求める方法を模式的に説明するための図である。
【００５８】
図５（ａ）は、１２のドットエリアＤＡ１〜ＤＡ１２におけるドットエリア加算値を示す。一点鎖線は蛍光閾値ＴＬ２を表しており、ドットエリアＤＡ１、ＤＡ３、ＤＡ４、ＤＡ６、ＤＡ８、ＤＡ１０、ＤＡ１２におけるドットエリア加算値が蛍光閾値ＴＬ２を超えている。
【００５９】
図５（ｂ）は、蛍光閾値ＴＬ２を超えるドットエリア加算値を示していたドットエリアＤＡ１、ＤＡ３、ＤＡ４、ＤＡ６、ＤＡ８、ＤＡ１０、ＤＡ１２に対応する試料Ｓ１への励起光の供給を中止したときのドットエリア加算値を示す。励起光の供給が中止された試料Ｓ１に対応するドットエリアにおけるドットエリア加算値は０を示す。
【００６０】
図５（ｃ）は、ドットエリアＤＡ２、ＤＡ５、ＤＡ７、ＤＡ９、ＤＡ１１に対応する試料Ｓ１に供給する励起光の光量を増大したときのドットエリア加算値を示す。一点鎖線は蛍光閾値ＴＬ２を表しており、ドットエリアＤＡ２、ＤＡ５、ＤＡ９におけるドットエリア加算値が蛍光閾値ＴＬ２を超えている。
【００６１】
図５（ｄ）は、蛍光閾値ＴＬ２を超えるドットエリア加算値を示していたドットエリアＤＡ２、ＤＡ５、ＤＡ９に対応する試料Ｓ１への励起光の供給を中止したときのドットエリア加算値を示す。励起光の供給が中止された試料Ｓ１に対応するドットエリアにおけるドットエリア加算値は０を示す。
【００６２】
図５（ｅ）は、ドットエリアＤＡ７、ＤＡ１１に対応する試料Ｓ１に供給する励起光の光量を増大したときのドットエリア加算値を示す。一点鎖線は蛍光閾値ＴＬ２を表しており、ドットエリアＤＡ７、ＤＡ１１におけるドットエリア加算値は蛍光閾値ＴＬ２を超えている。これにより、１２つのドットエリアＤＡ１〜ＤＡ１２すべてのドットエリア加算値、すなわち蛍光の光量が求められる。
【００６３】
次に、本実施形態に係る蛍光測定装置及び蛍光測定方法の効果について説明する。蛍光測定装置１及び本実施形態に係る蛍光測定方法では、複数の試料Ｓ１それぞれに対して励起光を供給し、各試料から放出された蛍光の光量を、複数の試料Ｓ１それぞれに供給した励起光の光量に基づいて各々算出している。したがって、複数の試料Ｓ１から放出された蛍光を同時に測定することができ、測定に要する時間を短縮することが可能となる。
【００６４】
また、蛍光測定装置１及び本実施形態に係る蛍光測定方法は、弁別部４０の蛍光量弁別器４３において、ドットエリア加算値（蛍光量）が蛍光閾値ＴＬ２を超えているか否かの弁別を行い、蛍光閾値ＴＬ２を超えているものについてのみ、割り算器５１で補正蛍光量を算出している。また、ドットエリア加算値（蛍光量）が蛍光閾値ＴＬ２を超えている試料Ｓ１に対する励起光の供給は中止され、ドットエリア加算値が蛍光閾値ＴＬ２を超えていない試料Ｓ１に対してのみ、継続して蛍光量が測定される。したがって、実際に小さい蛍光量を測定する際には、大きい蛍光量を示す試料への励起光の供給は中止されている。そのため、蛍光測定装置１及び本実施形態に係る蛍光測定方法では、ある試料Ｓ１の蛍光が近接の別の試料Ｓ１のための測定領域に及んで影響を及ぼすクロストークの発生を抑制することができ、クロストークの影響の小さい蛍光量データを取得することが可能となる。
【００６５】
特に、隣り合っている試料Ｓ１から発生する蛍光量の差が大きい場合（蛍光量において試料Ｓ１＞試料Ｓ１‘とする）、クロストークの影響により、小さい蛍光量を示す試料Ｓ１‘の正確な測定がより難しくなる。何故なら、試料Ｓ１の蛍光が試料Ｓ１‘の検出領域にも及び、試料Ｓ１‘の本来の蛍光量に加算されてしまうことが起こり得るからである。しかし、蛍光測定装置１及び本実施形態に係る蛍光測定方法では、小さい蛍光量の測定時には、大きい蛍光量を示す試料への励起光の供給は中止されているため、クロストークによる問題の発生は大幅に抑制される。
【００６６】
このように、蛍光測定装置１及び本実施形態に係る蛍光測定方法は、複数の試料から発生する蛍光を同時に測定するに際し、クロストークの発生を抑制することが可能である。
【００６７】
また、蛍光測定装置１及び本実施形態に係る蛍光測定方法では、ドットエリア加算値（蛍光量）が蛍光閾値ＴＬ２を超えていない試料Ｓ１に供給する励起光の光量を増大して、再度ドットエリア加算値（蛍光量）を測定している。そのため、一律な光量で励起光を供給した場合には強い蛍光によって隠れてしまう微弱な蛍光しか放出できないような試料、あるいはその励起光量では蛍光が放出されないような試料についても、その蛍光量を、クロストークによる影響を抑えつつ測定することが可能となる。
【００６８】
また、上記したように、微弱な蛍光までクロストークによる影響を抑えつつ測定できることから、蛍光測定装置１及び本実施形態に係る蛍光測定方法によって測定できる感度幅（ダイナミックレンジ）は著しく大きくなる。特に、ＣＣＤカメラ２１による蛍光の検出では、ＣＣＤの各ピクセルの容量が小さいため、ダイナミックレンジが小さくなってしまうのが一般的である。しかし、蛍光測定装置１及び本実施形態に係る蛍光測定方法では、蛍光の検出にＣＣＤカメラを用いても、相対的に微弱な蛍光については励起光の供給量を増大して測定を行っているため、ダイナミックレンジを大きくすることが可能である。
【００６９】
また、このように、蛍光測定装置１及び本実施形態に係る蛍光測定方法では、冷却ＣＣＤなどを用いることなく、ダイナミックレンジを大きくできる。そのため、装置のコスト及び測定に必要なコストを低減することが可能である。
【００７０】
励起光制御手段として機能するタイミング制御器３２は、個々の半導体発光素子１１に供給する電力を変化させることによって、励起光の供給量を増大させている。例えば、このようにして励起光の供給量を増大させることができる。
【００７１】
励起光源である半導体発光素子１１は複数であって、複数の試料Ｓ１と1対1に対応している。また、励起光制御手段として機能するタイミング制御器３２は、個々の半導体発光素子１１からの励起光の出力を中止するようＬＥＤパワーコントローラ１２に対して指示信号を出し、これにより試料Ｓ１に対する励起光の供給が中止される。例えば、このようにして励起光の供給を中止することができる。
【００７２】
また、複数の試料Ｓ１は２次元に配列されている。蛍光測定装置１では、このような場合でも、クロストークの発生を抑制しつつ、複数の試料から発生する蛍光を同時に測定することができる。
【００７３】
蛍光測定装置１では、励起光源として半導体発光素子１１を用いている。そのため、励起光量の制御が容易となり、加えて装置の小型化、さらには消費電力の低減などが可能となる。
【００７４】
また、励起光供給部１０は、励起光を半導体発光素子１１から複数の試料Ｓ１へと導く導光部として機能する光ファイバ１３を有する。そのため、複数の試料Ｓ１それぞれに対し、容易に励起光を供給することができる。
【００７５】
光検出部２０は、固体撮像素子であるＣＣＤカメラ２１を備える。したがって、蛍光測定装置１では、多数の試料から発生する蛍光を同時に測定することを容易に行える。
【００７６】
蛍光測定装置１では、蛍光閾値ＴＬ２を超えていると弁別されたドットエリア加算値（蛍光量）を、対応する試料Ｓ１に供給された励起光量データ（励起光の光量）で割ることにより、補正蛍光量を算出している。そのため、供給された励起光の光量が異なる試料の蛍光についても、励起光量で規格化された補正蛍光量によって、容易に比較、検討等することができる。
【００７７】
なお、個々の半導体発光素子１１の発光効率、及び光量を増大させるときの増大度合いをより正確にそろえるため、初期補正処理及び中間補正処理を行ってもよい。
【００７８】
初期補正の一例として、取得した蛍光データの処理による補正がある。例えば、プレートＰ１に形成されたウェルすべてに標準の試料を入れ、全試料から発生した蛍光について、ドットエリア加算器４２でドットエリア加算値を求め、これを校正値とする。これにより、すべてのドットエリアに対して校正値を有することになり、この校正値をもとに補正を行うことができる。
【００７９】
初期補正の他の例として、励起光源の光量による補正がある。例えば、プレートＰ１に形成されたウェルすべてに標準の試料を入れ、すべての試料から発生した蛍光について、ドットエリア加算器４２でドットエリア加算値を求める。タイミング制御器３２は、これらのドットエリア加算値がすべて同じ値となるような大きさの電力を半導体発光素子１１に供給するようＬＥＤパワーコントローラ１２に指示を出す。この指示を受け、半導体発光素子１１に供給される電力が調整される。
【００８０】
また、中間補正の一例として、例えば、複数の半導体発光素子１１のうちの１つの半導体発光素子１１から発せられた励起光を、光検出モニタ５２で検出、測定する。そして、その値を、他の半導体発光素子１１から発せられる励起光と同じであるとして、校正値として用いることにより、補正が行われる。本実施形態に係る蛍光測定装置では、この中間補正の手法を採用している。
【００８１】
また、中間補正を行わなくても、初期補正を行った上で、半導体発光素子１１から試料Ｓ１に供給される励起光の光量を、供給電力によってではなく、パルス光発振のＯＮ／ＯＦＦ比で変化させることにより対応してもよい。この場合、半導体発光素子１１すべてが同じ光量変化をするため、中間補正を行うのと同じ効果が得られる。
【００８２】
（第２実施形態）
図６及び図７を参照して、第２実施形態に係る蛍光測定装置の構成について説明する。第２実施形態に係る蛍光測定装置は、励起光源に供給する電力の供給を中止することによって励起光の供給を中止するのではなく、光変調部で励起光の強度を変調することによって励起光の供給を中止する点で、第１実施形態に係る蛍光測定装置と相違する。
【００８３】
図６は、第２実施形態に係る蛍光測定装置について概略的に示す構成図である。本実施形態による蛍光測定装置７０は、図６に示すように、励起光を複数の試料それぞれに対して供給する励起光供給部８０と、励起光に対して変調を与える光変調部８５と、複数の試料から放出される蛍光を検出する光検出部９０と、複数の試料に供給する励起光を制御するタイミング制御部１０２と、蛍光の光量が蛍光閾値を超えているか否か弁別する弁別部１１０と、補正蛍光量を算出する演算部１２０とを備えている。
【００８４】
本実施形態における励起光供給部８０は、励起光源パネル８１と、励起光源駆動回路８２とを含んでいる。また、本実施形態における光変調部８５は、液晶パネル８６と、液晶パネル駆動回路８７とを含んでいる。図７に、蛍光測定装置１によって蛍光が測定されるゲル状の試料Ｓ２と、励起光源パネル８１と、液晶パネル８６との関係を示す。ゲル状の試料Ｓ２は、測定のため、プレートＰ２の一方の主面上に拡げられている。プレートＰ２は、液晶パネル８６の上に載置される。励起光源パネル８１は励起光源駆動回路８２によって駆動され、ゲル状の試料Ｓ２に励起光を供給する。励起光源パネル８１から発せられる励起光の光量は、励起光源駆動回路８２を駆動することによって変化する。
【００８５】
液晶パネル８６は、液晶パネル駆動回路８７によってＯＮあるいはＯＦＦされることにより、励起光の強度を変調する。具体的には、ピクセルをＯＮすることで、対応する試料Ｓ２の領域に対して励起光を供給することができ、ピクセルをＯＦＦすることで、対応する試料Ｓ２の領域に対して励起光の供給を中止することができる。このように、液晶パネル８６及び液晶パネル駆動回路８７は、励起光に対して変調を与える光変調部８５として機能する。
【００８６】
また、本実施形態においては、液晶パネル８６のピクセルごとに、試料Ｓ２の複数の領域に１対１に対応する。したがって、励起光供給部８０は、複数の試料に相当する試料Ｓ２の複数の領域それぞれに励起光を供給することができる。なお、複数ピクセルを一単位として、試料Ｓ２の複数の領域と１対１に対応させても良い。
【００８７】
再び図６に戻って、蛍光測定装置７０の説明を続ける。光検出部９０は、試料Ｓ２の複数の領域から放出された蛍光を検出する。本実施形態における光検出部９０は、ＣＣＤカメラ９１と、カメラコントローラ９２と、Ａ／Ｄ変換器９３とを含んでいる。ＣＣＤカメラ９１で蛍光を検出することによって得られた電気信号は、Ａ／Ｄ変換器９３に送られ、ビデオ信号が生成される。Ａ／Ｄ変換器９３は、光検出部９０で検出された蛍光の光量を示すビデオ信号をビデオ信号レベル検出器１０１へ出力する。
【００８８】
ビデオ信号レベル検出器１０１には、ビデオ信号閾値ＴＬ１が設定されている。ビデオ信号レベル検出器１０１は、ビデオ信号のレベルがビデオ信号閾値ＴＬ１を超えている場合、タイミング制御器１０２に対して信号を送る。
【００８９】
タイミング制御器１０２は、ビデオ信号レベル検出器１０１からの信号を受けて、励起光源駆動回路８２に対し励起光源パネル８１に供給する電力についての指示信号（例えば、供給電力を一定にする指示信号等）を送る。タイミング制御器１０２は、後述するように励起光制御手段として機能するとともに、本実施形態においては、蛍光測定装置１を構成する各部からの出力を入力とし、入力値に応じて他の部へ指示信号を出力する制御手段としても機能する。
【００９０】
本実施形態における弁別部１１０は、画像処理器１１１と、ビデオ信号弁別器１１２とを含んでいる。画像処理器１１１は、ビデオ信号レベル検出器１０１から出力されるビデオ信号を入力として取り込み、蓄積するフレームメモリを含む。画像処理器１１１のフレームメモリでは、蓄積されたビデオ信号を画像データとして記憶している。画像処理器１１１は、フレームメモリにおいて記憶されている画像データを、ビデオ信号弁別器１１２に出力する。また、画像処理器１１１は、ビデオ信号レベル検出器１０１からのビデオ信号の取り込みが終わると、タイミング制御器１０２に対し取り込み終了信号を送る。
【００９１】
ビデオ信号弁別器１１２において、蛍光閾値ＴＬ２が設定されている。ビデオ信号弁別器１１２は、タイミング制御器１０２からの指示信号を受け、画像データにおける液晶パネル８６の各ピクセルに対応するデータ（以下、単にピクセルデータという）が蛍光閾値ＴＬ２を超えているか否か弁別する。ビデオ信号弁別器１１２は、蛍光閾値ＴＬ２を超えるピクセルデータを、このピクセルデータに対応するＣＣＤカメラ９１の画素のアドレスとともに、演算部１２０に出力する。ここで、ＣＣＤカメラの画素のアドレスとは、ＣＣＤカメラ２１において２次元アレイ状に配置されている画素の位置を、例えば列数及び行数で特定するポインタである。なお、ピクセルデータは、液晶パネルの各ピクセルに対応するデータに限らず、画像データにおける所望の単位領域に対応するデータでもよい。したがって、例えば、液晶パネルの複数のピクセルに対応するデータでもよい。
【００９２】
なお、本実施形態においては、液晶パネル８６のピクセル数と、ＣＣＤカメラ９１の画素数とは、同じ数である。さらに、液晶パネル８６の各ピクセルと、ＣＣＤカメラ９１の各画素とは光学的に被写体面と結像面との関係に相当する。したがって、液晶パネル８６の各ピクセルとＣＣＤカメラ９１の各画素とは、１対１で対応する。また、本実施形態においては、液晶パネル８６の各ピクセルと試料Ｓ２の各領域とは１対１で対応しているため、試料Ｓ２の各領域とＣＣＤカメラ９１の各画素とは、１対１で対応しているといえる。ただし、必ずしも各要素単位（液晶パネル８６における各ピクセル、ＣＣＤカメラ９１における各画素、試料Ｓ２における各領域）の数が同じである必要はなく、少なくとも試料Ｓ２に対応するために必要な数以上あれば良い。また、試料Ｓ２の所望の単位領域に対して、複数のピクセル及び画素が対応しても良い。
【００９３】
本実施形態における演算部１２０は、割り算器１２１と、光検出モニタ１２２と、Ａ／Ｄ変換器１２３とを含む。励起光源パネル８１から試料Ｓ２の各領域に供給する励起光は、例えばミラー等を含む光学系によって光検出モニタ１２２に導かれ、光検出モニタ１２２で検出される。光検出モニタ１２２は、検出した励起光に応じた電気信号をＡ／Ｄ変換器１２３に出力する。Ａ／Ｄ変換器１２３は、アナログ信号である電気信号を、デジタル信号である励起光量データに変換し、割り算器１２１に出力する。
【００９４】
割り算器１２１は、タイミング制御器１０２からの指示信号を受け、ビデオ信号弁別器１１２でピクセルデータが蛍光閾値ＴＬ２を超えていると弁別された蛍光の光量を、当該蛍光を放出した試料Ｓ２の領域に供給された励起光の光量に基づき算出する。そのためにまず、割り算器１２１は、ビデオ信号弁別器１１２から出力されるピクセルデータ及びＣＣＤカメラ９１の画素のアドレスと、Ａ／Ｄ変換器１２３から出力される励起光量データとを入力とする。割り算器１２１は、ピクセルデータを、試料Ｓ２の該当領域に供給された励起光の光量である励起光量データで割ることによって、励起光の光量に基づいて算出された蛍光の光量である補正蛍光量を算出する。割り算器１２１は、算出された補正蛍光量と、各補正蛍光量に対応するＣＣＤカメラ９１の画素のアドレスとを出力する。ここで、各補正蛍光量に対応するＣＣＤカメラ９１の画素のアドレスとは、各補正蛍光量を求める際に用いられたピクセルデータに対応するＣＣＤカメラ９１の画素のアドレスをいう。
【００９５】
記憶装置１３０は、割り算器１２１からの出力である補正蛍光量と、各補正蛍光量に対応するＣＣＤカメラ９１の画素のアドレスとを入力とする。記憶装置１３０はメモリを含み、このメモリに補正蛍光量をＣＣＤカメラ９１の画素のアドレスと対応させて記憶する。
【００９６】
割り算器１２１から出力される補正蛍光量をすべてメモリに記憶した後、記憶装置１３０は、終了信号、及び補正蛍光量と対応させて記憶したＣＣＤカメラ９１の画素のアドレスをタイミング制御器１０２に出力する。
【００９７】
これを受けてタイミング制御器１０２は、記憶装置１３０から出力されたＣＣＤカメラ９１の画素のアドレスに対応する液晶パネル８６のピクセルにおいて励起光の強度を変調することにより、励起光の供給を中止するよう液晶パネル駆動回路８７に対して指示信号を出力する。すなわち、タイミング制御器１０２は、弁別部１１０において光量が蛍光閾値ＴＬ２を超えていると判断された蛍光を放出した試料Ｓ２の該当領域への励起光の供給を中止するため、記憶装置１３０から出力されたＣＣＤカメラ９１の画素のアドレスに対応する液晶パネル８６のピクセルをＯＦＦにする指示信号を、液晶パネル駆動回路８７に対して出力する。この指示信号を受けて、液晶パネル駆動回路８７は、該当する液晶パネル８６のピクセルをＯＦＦにし、試料Ｓ２の該当領域への励起光の供給を中止する。なお、上記したように、液晶パネル８６の各ピクセルとＣＣＤカメラ９１の各画素とは１対１で対応するため、ＣＣＤカメラ９１の画素のアドレスを指定することによって対応する液晶パネル８６のピクセルを指定することができる。
【００９８】
タイミング制御器１０２はさらに、励起光の光量を増大するため、励起光源駆動回路８２に対して、励起光源パネル８１に供給する電力を変化、すなわち増大するよう、指示信号を出力する。記憶装置１３０から出力されたＣＣＤカメラ９１の画素のアドレスに対応する液晶パネル８６のピクセルはＯＦＦになっているため、記憶装置１３０から出力されたＣＣＤカメラ９１の画素のアドレスとは異なるアドレスに対応する液晶パネル８６のピクセルを通じて供給される励起光が増大されて、試料Ｓ２に供給されることとなる。その結果、弁別部１１０において光量が蛍光閾値ＴＬ２を超えていないと判断された蛍光を放出した試料Ｓ２の領域に供給される励起光の光量が増大されることとなる。このように、液晶パネル８６及び液晶パネル駆動回路８７は光変調部８５として、また、タイミング制御器１０２は励起光制御手段として機能する。
【００９９】
次に、蛍光測定装置７０を用いた蛍光測定方法について説明する。まず最初に、ビデオ信号レベル検出器１０１においてビデオ信号閾値ＴＬ１が、ビデオ信号弁別器１１２において蛍光閾値ＴＬ２が、それぞれ設定される。ビデオ信号閾値ＴＬ１は、蛍光を捉えたビデオ信号が、光検出部２０において飽和レベルを超えないようにするために設定される閾値である。そのため、ビデオ信号閾値ＴＬ１は、最大ビデオ信号レベルの８０〜９０％の値に設定される。
【０１００】
一方、蛍光閾値ＴＬ２は、取り込むビデオ信号について、Ｓ／Ｎ比を損なわない程度のデータとしての最低レベルを保証するために設定される閾値である。したがって、蛍光閾値ＴＬ２は、最大ビデオ信号の１／４〜１／８程度の低い値に設定される。
【０１０１】
ビデオ信号閾値ＴＬ１及び蛍光閾値ＴＬ２の設定後、タイミング制御器１０２からの指示信号を受け、励起光源駆動回路８２は励起光源パネル８１に対し、供給量を増大させながら電力を供給し始める。また、液晶パネル駆動回路８７により、液晶パネル８６の全ピクセルがＯＮにされる。これにより、励起光源パネル８１から発せられる励起光が、光量を増大させながら、複数の試料である試料Ｓ２の複数の領域それぞれに対し供給されることとなる（励起光供給ステップ）。なお、液晶パネル８６のピクセルは必ずしもその全てをＯＮにする必要はなく、試料Ｓ２に対応する領域のみをＯＮにするようにしても良い。
【０１０２】
試料Ｓ２は、供給される励起光に応じて蛍光を放出する。放出された蛍光は、光検出部９０のＣＣＤカメラ９１で検出される（光検出ステップ）。蛍光は、ＣＣＤカメラ９１で撮像された後、Ａ／Ｄ変換器９３でデジタル信号であるビデオ信号に変換される。
【０１０３】
ビデオ信号は、ビデオ信号レベル検出器１０１に入力される。ビデオ信号レベル検出器１０１において、入力されたビデオ信号とビデオ信号閾値ＴＬ１とが比較される。ビデオ信号がビデオ信号閾値ＴＬ１を超えている場合、ビデオ信号レベル検出器１０１は、タイミング制御器１０２に対し信号を送る。この信号を受けて、タイミング制御器１０２は励起光の光量を一定にするため、励起光源駆動回路８２に対し励起光源パネル８１への供給電力の上昇を停止し、供給電力を一定にするよう指示信号を送る。
【０１０４】
また、ビデオ信号がビデオ信号閾値ＴＬ１を超えている場合、ビデオ信号レベル検出器１０１は、タイミング制御器１０２に対し信号を送ると同時に、画像処理器１１１に対しビデオ信号を出力する。出力されたビデオ信号が画像処理器１１１で取り込まれ、画像処理器１１１に含まれるフレームメモリに蓄積されることによって、画像データが生成される。図８は、画像処理器１１１で生成される画像データを模式的に表す図である。
【０１０５】
ビデオ信号の蓄積が終了すると、取り込み終了信号が画像処理器１１１からタイミング制御器１０２に対して出力される。これを受けて、タイミング制御器１０２からビデオ信号弁別器１１２に対し、画像データを画像処理器１１１から入力し、画像データの各ピクセル（画素）のデータと蛍光閾値ＴＬ２とを比較し、蛍光閾値ＴＬ２よりも大きなピクセルデータのみ割り算器１２１に出力する、という指示信号が出力される。
【０１０６】
この指示信号を受けて、ビデオ信号弁別器１１２は、ピクセルデータが蛍光閾値ＴＬ２を超えているか否か弁別し、蛍光閾値ＴＬ２を超えているピクセルデータだけを割り算器１２１に出力する（弁別ステップ）。
【０１０７】
割り算器１２１には、上記のピクセルデータの他、光検出モニタ１２２で検出された励起光の光量である励起光量データがＡ／Ｄ変換器１２３から入力される。タイミング制御器１０２からの指示信号を受け、割り算器１２１では、ビデオ信号弁別器１１２でピクセルデータが蛍光閾値ＴＬ２を超えていると弁別された蛍光の光量が、当該蛍光を放出した試料Ｓ２の領域に供給された励起光の光量に基づき算出される（演算ステップ）。このように励起光の光量に基づいて算出される蛍光の光量である補正蛍光量は、具体的には、ピクセルデータを励起光量データで割ることにより求められる。
【０１０８】
こうして求められた補正蛍光量は、対応するＣＣＤカメラ９１の画素のアドレスと関連づけて、記憶装置１３０に入力され、記憶装置１３０に含まれるメモリに記憶される。その後、終了信号とともに、蛍光閾値ＴＬ２を超えていると判断されたピクセルデータに対応するＣＣＤカメラ９１の画素の全アドレスが、記憶装置１３０からタイミング制御器１０２へ出力される。
【０１０９】
タイミング制御器１０２は、弁別ステップにおいて蛍光閾値ＴＬ２を超えていると弁別されたピクセルデータに対応する液晶パネル８６のピクセルをＯＦＦにし、試料Ｓ２の該当領域へ励起光を供給することを中止するよう、液晶パネル駆動回路８７に対し指示信号を出力する。液晶パネル駆動回路８７は、この指示信号を受け、液晶パネル８６の該当するピクセルをＯＦＦにする。これにより、弁別ステップにおいて光量が蛍光閾値ＴＬ２を超えていると弁別された蛍光を放出した試料Ｓ２の領域への励起光の供給が中止される（供給中止ステップ）。
【０１１０】
さらに、タイミング制御器１０２は、弁別ステップにおいて蛍光閾値ＴＬ２を超えていないと弁別されたピクセルデータに対応する試料Ｓ２の領域へ供給される励起光の光量を増大するため、励起光源駆動回路８２に対し指示信号を出力する。この指示信号を受け、励起光源駆動回路８２は、光検出部９０で検出される蛍光の光量を示すビデオ信号がビデオ信号閾値ＴＬ１を超えるまで励起光源パネル８１の出力を上げる。蛍光閾値ＴＬ２を超えていると弁別された蛍光を放出した試料Ｓ２の領域に対応する液晶パネル８６のピクセルはＯＦＦになっているため、弁別ステップにおいて光量が蛍光閾値ＴＬ２を超えていないと弁別された蛍光を放出した試料Ｓ２の領域に供給される励起光の光量が増大される（励起光量増大ステップ）。
【０１１１】
その後、上記の励起光供給ステップから励起光量増大ステップまでの一連のステップが、励起光源駆動回路８２の出力が最大になるまで繰り返される。励起光源駆動回路８２の出力が最大になった時点で、タイミング制御器１０２からビデオ信号弁別器１１２に指示信号が送られる。この指示信号を受けて、ビデオ信号弁別器１１２に設定された蛍光閾値ＴＬ２の値は０に設定される。これにより、すべてのピクセルデータが割り算器１２１に入力され、蛍光閾値ＴＬ２以下の微弱な蛍光しか放出しないような試料Ｓ２に関しての測定が行われる。このようにして、試料Ｓ２のすべての領域からの蛍光について補正蛍光量が求められる。このようにして求められた補正蛍光量はその後、記憶装置１３０に入力され、記憶装置１３０に含まれるメモリに記憶される。こうして、試料Ｓ２の複数の領域から放出される蛍光の測定が終了する。なお、本実施形態における補正蛍光量は相対的な値であるので、予め実際の蛍光量と補正蛍光量とを対応させたテーブルと照らし合わせたり、実際の蛍光量に換算可能な式を求めておき、それを適用することによって実際の蛍光量を求めても良い。
【０１１２】
図９を参照して、励起光供給ステップから励起光量増大ステップまでの一連のステップを繰り返すことにより、試料Ｓ２の複数の領域から放出される蛍光が測定されることについて説明する。図９は、蛍光閾値ＴＬ２を超える蛍光量を示す試料の領域に対する励起光の供給を中止し、蛍光閾値ＴＬ２を超えない蛍光量を示す試料の領域に対する励起光量を増大して、継続して蛍光量を求める方法を、光検出部９０で検出されるビデオ信号によって模式的に説明する図である。
【０１１３】
図９（ａ）は、図８のＩ−Ｉ’線上に相当する部分のビデオ信号を表す。一点鎖線は蛍光閾値ＴＬ２を表している。微小部分Ｒ２、Ｒ４におけるビデオ信号が蛍光閾値ＴＬ２を超えている。微小部分Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５におけるビデオ信号が蛍光閾値ＴＬ２を超えていない。
【０１１４】
図９（ｂ）は、蛍光閾値ＴＬ２を超えるビデオ信号を示していた微小部分Ｒ２、Ｒ４に対応する試料Ｓ２の領域への励起光の供給を中止したときのビデオ信号を示す。励起光の供給が中止された試料Ｓ２の領域に対応する微小部分におけるビデオ信号は０を示す。
【０１１５】
図９（ｃ）は、微小部分Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５に対応する試料Ｓ２の領域に供給する励起光の光量を増大したときのビデオ信号を示す。一点鎖線は蛍光閾値ＴＬ２を表している。微小部分Ｒ１２、Ｒ３１、Ｒ３３、Ｒ５１におけるビデオ信号が蛍光閾値ＴＬ２を超えている。微小部分Ｒ１１、Ｒ３２、Ｒ５２におけるビデオ信号が蛍光閾値ＴＬ２を超えていない。
【０１１６】
図９（ｄ）は、蛍光閾値ＴＬ２を超えるビデオ信号を示していた微小部分Ｒ１２、Ｒ３１、Ｒ３３、Ｒ５１に対応する試料Ｓ２の領域への励起光の供給を中止したときのビデオ信号を示す。励起光の供給が中止された試料Ｓ２の領域に対応する微小部分におけるビデオ信号は０を示す。
【０１１７】
図９（ｅ）は、微小部分Ｒ１１、Ｒ３２、Ｒ５２に対応する試料Ｓ２の領域に供給する励起光の光量を増大したときのビデオ信号を示す。一点鎖線は蛍光閾値ＴＬ２を表している。微小部分Ｒ１１２、Ｒ３２、Ｒ５２１におけるビデオ信号は蛍光閾値ＴＬ２を超えている。微小部分Ｒ１１１、Ｒ５２２におけるビデオ信号は蛍光閾値ＴＬ２を超えていない。
【０１１８】
次に、本実施形態に係る蛍光測定装置及び蛍光測定方法の効果について説明する。蛍光測定装置７０及び本実施形態に係る蛍光測定方法では、試料Ｓ２の複数の領域それぞれに対して励起光を供給し、各領域から放出された蛍光の光量を、複数の領域それぞれに供給した励起光の光量に基づいて各々算出している。したがって、試料Ｓ２の複数の領域から放出された蛍光を同時に測定することができ、測定に要する時間を短縮することが可能となる。
【０１１９】
また、蛍光測定装置７０及び本実施形態に係る蛍光測定方法は、蛍光閾値ＴＬ２を超えているピクセルデータ（蛍光量）についてのみ、割り算器１２１で補正蛍光量を算出している。また、ピクセルデータが蛍光閾値ＴＬ２を超えている試料Ｓ２の領域に対する励起光の供給が中止された後、ピクセルデータが蛍光閾値ＴＬ２を超えていない試料Ｓ２の領域に対して蛍光量が継続して測定される。したがって、実際に小さい蛍光量を測定する際には、大きい蛍光量を示す試料の領域への励起光の供給は中止されている。そのため、蛍光測定装置７０及び本実施形態に係る蛍光測定方法では、クロストークの発生を抑制することができ、クロストークの影響の小さい蛍光量データを取得することが可能となる。
【０１２０】
特に、試料Ｓ２の隣り合っている領域から発生する蛍光量の差が大きい場合であっても、蛍光測定装置７０及び本実施形態に係る蛍光測定方法では、小さい蛍光量の測定時には、大きい蛍光量を示す試料の領域への励起光の供給は中止されているため、クロストークによる問題の発生は大幅に抑制される。
【０１２１】
このように、蛍光測定装置７０及び本実施形態に係る蛍光測定方法は、複数の試料から発生する蛍光を同時に測定するに際し、クロストークの発生を抑制することが可能である。
【０１２２】
また、蛍光測定装置７０及び本実施形態に係る蛍光測定方法では、ピクセルデータ（蛍光量）が蛍光閾値ＴＬ２を超えていない試料Ｓ２の領域に対して励起光の光量を増大してから、再度蛍光を測定している。そのため、強い蛍光によって隠れてしまうような微弱な蛍光しか放出できないような試料、あるいは増大前の励起光量では蛍光が放出されないような試料についても、その蛍光量をクロストークによる影響を抑えつつ測定することが可能となる。
【０１２３】
また、上記したように、微弱な蛍光までクロストークによる影響を抑えつつ測定できることから、蛍光測定装置７０及び本実施形態に係る蛍光測定方法によって測定できる感度幅（ダイナミックレンジ）は大きくなる。また、このように、蛍光測定装置７０及び本実施形態に係る蛍光測定方法では、冷却ＣＣＤなどを用いることなく、ダイナミックレンジを大きくできる。そのため、装置のコストを低減することが可能である。
【０１２４】
蛍光測定装置７０では、液晶パネル駆動回路８７によって液晶パネル８６の各ピクセルをＯＮあるいはＯＦＦして励起光の強度の変調を行っている。すなわち、ＯＮになっている液晶パネル８６のピクセルに対応する試料Ｓ２の領域には、励起光が供給され、ＯＦＦになっているピクセルに対応する試料Ｓ２の領域には、励起光が供給されない。例えば、このように、光変調部として機能する液晶パネル８６及び液晶パネル駆動回路８７によって、励起光の供給を中止することが実現される。
【０１２５】
光検出部９０は、固体撮像素子であるＣＣＤカメラ９１を備える。したがって、蛍光測定装置７０では、多数の試料から発生する蛍光を同時に測定することを容易に行える。
【０１２６】
蛍光測定装置７０では、蛍光閾値ＴＬ２を超えていると弁別されたピクセルデータ（蛍光量）を、対応する試料Ｓ２の領域に供給された励起光量データ（励起光の光量）で割ることにより、補正蛍光量を算出している。そのため、供給された励起光の光量が異なる試料の蛍光についても、励起光量で規格化された補正蛍光量によって、容易に比較、検討等することができる。
【０１２７】
なお、光変調部は、液晶パネルに限らず、例えばＤＭＤ（Digital Micromirror Device）などを有していてもよく、単純なシャッタ構造でもよい。また、光変調部で励起光の強度を変調することにより、励起光の光量を増大させてもよい。この場合、励起光源の出力を一定にしても良いし、励起光源の出力の強度調整とあわせることにより、より細かい制御を行っても良い。
【０１２８】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、光検出部が備える固体撮像素子は、ＣＣＤカメラに限らず、ＭＯＳや複数検出域を有する光電子増倍管であってもよい。また、複数の試料は、２次元アレイ状に配置されていなくてもよい。
【０１２９】
また、励起光源（半導体発光素子、励起光源パネル等）をパルス点灯させ、そのデューティ比を変えることで、励起光量を増大させてもよい。また、励起光量を増大させる量は、ビデオ信号閾値ＴＬ１を基準として決定する方法に限らず、例えば、予め設定された倍数だけ励起光源の出力を上げることで対応してもよい。
【０１３０】
また、演算部５０、１２０における補正蛍光量の算出を、蛍光量を表すデータ（例えば、ドットエリア加算値、ピクセルデータ等）を励起光量を表すデータで割る以外の方法で行ってもよい。例えば、予めデータが分かっている標準試料を同時に測定し、そのデータと照らし合わせても良い。また、補正蛍光量の算出を演算部５０、１２０では行わず、例えば、演算部５０、１２０では励起光量と蛍光量とを出力し、他のコンピュータ等で補正蛍光量を算出してもよい。また、補正蛍光量の算出は、蛍光量が蛍光閾値ＴＬ２を超えているか否かの弁別をするたびに行わず、例えば、一部又はすべての試料について蛍光量を取得し検出し終えてから、その一部又はすべての試料についてまとめて補正蛍光量を算出してもよい。あるいは、例えば、他の試料からの蛍光の検出と並行して、補正蛍光量の算出処理を行ってもよい。
【０１３１】
また、測定が終了した試料（または試料の領域）に対しては、励起光の照射を遮断することに加え、当該試料（または試料の当該領域）に対応した検出側でのデータ取得も中止しても良い。この場合、検出器での制御だけでなく、データ処理部での制御によりデータ取得を中止しても良い。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明は、複数の試料から発生する蛍光を同時に測定するに際し、クロストークの発生を抑制することができる蛍光測定装置及び蛍光測定方法として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】第１実施形態に係る蛍光測定装置について概略的に示す構成図である。
【図２】複数の試料と半導体発光素子と光ファイバとの関係を説明するための図である。
【図３】（ａ）光検出部で検出された蛍光量を示すグラフと、（ｂ）試料の蛍光量を表した画像データである。
【図４】拡大して表示したドットエリアを横切る水平ビデオライン上の輝度信号を表す図である。
【図５】複数の試料から放出される蛍光を測定する方法を説明するための図である。
【図６】第２実施形態に係る蛍光測定装置について概略的に示す構成図である。
【図７】プレート上の試料と励起光源パネルと液晶パネルとの関係を説明するための図である。
【図８】フレームメモリで生成される画像データである。
【図９】試料の複数の領域から放出される蛍光を測定する方法を説明するための図である。
【符号の説明】
【０１３４】
１、７０…蛍光測定装置、１０、８０…励起光供給部、１１…半導体発光素子、１２…ＬＥＤパワーコントローラ、１３、１３Ａ…光ファイバ、２０、９０…光検出部、２１、９１…ＣＣＤカメラ、２２、９２…カメラコントローラ、２３、９３…Ａ／Ｄ変換器、３１、１０１…ビデオ信号レベル検出器、３２、１０２…タイミング制御器、４０、１１０…弁別器、４１、１１１…画像処理器、４２…ドットエリア加算器、４３…蛍光量弁別器、５０、１２０…演算部、５１、１２１…割り算器、５２、１２２…光検出モニタ、５３、１２３…Ａ／Ｄ変換器、６０、１３０…記憶装置、８１…励起光源パネル、８２…励起光源駆動回路、８５…光変調部、８６…液晶パネル、８７…液晶パネル駆動回路、１１２…ビデオ信号弁別器、Ｓ１、Ｓ２…試料、Ｐ１、Ｐ２…プレート
【図１】
2007024604.tif 000003
【図２】
2007024604.tif 000004
【図３】
2007024604.tif 000005
【図４】
2007024604.tif 000006
【図５】
2007024604.tif 000007
【図６】
2007024604.tif 000008
【図７】
2007024604.tif 000009
【図８】
2007024604.tif 000010
【図９】
2007024604.tif 000011