(57)【要約】【課題】虚血性消化器疾患や重症潰瘍性消化器疾患の傷害された消化管平滑筋細胞に特異的に結合し、生体外でこれらの疾患を検出するための抗体試薬の提供。【解決手段】ヒト平滑筋ミオシンに対する抗体またはその活性フラグメントを含有する、消化器疾患を検出するための抗体試薬及びキット、並びにこれらを用いる消化器疾患のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特性を有するヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを含有する、虚血性消化器疾患を検出するための抗体試薬。
（抗体の特性）
１）反応特異性：平滑筋ミオシン重鎖と反応し、平絹筋ミオシン軽鎖とは反応しない
２）交叉反応性：平滑筋ミオシンとは反応するが、骨格筋ミオシン、心筋ミオシンおよび血小板ミオシン（非筋型ミオシン）とは反応しない
３）種特異性  ：ヒト平滑筋ミオシンのみならずラット平滑筋ミオシンにも反応する
【請求項２】
請求項１記載の抗体試薬を構成試薬として含有する、虚血性消化器疾患を検出するためのキット。
【請求項３】
サンプル中の平滑筋ミオシンを請求項１記載の抗体試薬を使用したイムノアッセイにより測定し、得られた測定値から虚血性消化器疾患をスクリーニングする方法。
【請求項４】
以下の特性を有するヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを含有する、潰瘍性消化器疾患を検出するための抗体試薬。
（抗体の特性）
１）反応特異性：平滑筋ミオシン重鎖と反応し、平絹筋ミオシン軽鎖とは反応しない
２）交叉反応性：平滑筋ミオシンとは反応するが、骨格筋ミオシン、心筋ミオシンおよび血小板ミオシン（非筋型ミオシン）とは反応しない
３）種特異性  ：ヒト平滑筋ミオシンのみならずラット平滑筋ミオシンにも反応する
【請求項５】
請求項４記載の抗体試薬を構成試薬として含有する、潰瘍性消化器疾患を検出するためのキット。
【請求項６】
サンプル中の平滑筋ミオシンを請求項４記載の抗体試薬を使用したイムノアッセイにより測定し、得られた測定値から潰瘍性消化器疾患をスクリーニングする方法。
【請求項７】
サンプル中の平滑筋ミオシンをイムノアッセイにより測定し、得られた測定値から消化器疾患をスクリーニングする方法。
【請求項８】
消化器疾患が虚血性消化器疾患または潰瘍性消化器疾患である請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化器疾患をスクリーニングするための抗体試薬およびキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
虚血性大腸炎、腸閉塞は腸管の血行循環障害に基づいて生じる重篤な疾患である。その原因は動脈硬化や全身の血管炎などに基づく心血管障害による血栓塞栓症や絞扼性腸閉塞、腸重積、腸軸捻転などによる局所血行障害など多岐にわたる。とくに近年は動脈硬化性循環器疾患の増加を反映して腸循環障害は増加している。腸管への血行障害は広範な腸管組織、腸管平滑筋細胞の壊死を引き起こし、激しい腹痛を伴い、時に穿孔に至り死亡率が高く非常に重篤である。一方、潰瘍性大腸炎、クローン病や放射線、薬剤、膠原病、感染症、悪性新生物などによる潰瘍性消化器疾患も重症になると同様に腸管平滑筋細胞の壊死を伴って時には腹膜穿孔に至る。このように腸管壁の最深部で腹腔を防御している平滑筋層が傷害される病態は重篤なものが多く、これらの疾患に対して適切な治療を施すには迅速で正確な診断が不可欠である。
【０００３】
従来、これらの腸管平滑筋障害性疾患に特有の検査法はないため、腹部Ｘ線検査、内視鏡検査等の画像診断法や原疾患から派生する様々な一般血液生化学検査の異常値から推測診断するしかなく、その診断に苦慮することが多かった。
【０００４】
かかる診断法のうち、虚血性消化器疾患、重症潰瘍性消化器疾患の画像診断法としては、他の消化器疾患の場合と同様に、腹部Ｘ線写真、エコー検査、ＣＴ（Ｘ線コンピュータートモグラフィー）、消化管造影検査、内視鏡検査、血管造影検査などが用いられている。
しかし、消化管造影検査や血管造影検査は急性期には危険を伴うため一般的ではない。とくに、小腸の疾患に対しては消化管造影検査、内視鏡検査、血管造影検査は極めて診断能力が低い。また、エコー検査、ＣＴは胃や腸の疾患の診断には有用ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本願発明は、虚血性消化器疾患や重症潰瘍性消化器疾患の傷害された消化管平滑筋細胞に特異的に結合し、生体外でこれらの疾患を検出するための抗体試薬の提供を目的とするものである。
【０００６】
本発明者らは、このような消化器疾患においては、血液中に平滑筋ミオシンが遊離してくることに着目し検討を行った結果、平滑筋ミオシンの検出が本疾患の診断に有用なものであることを見いだし、本願発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の特性を有するヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを含有する、虚血性消化器疾患または潰瘍性消化器疾患を検出するための抗体試薬およびキットに関するものである。
（抗体の特性）
１）反応特異性：平滑筋ミオシン重鎖と反応し、平絹筋ミオシン軽鎖とは反応しない
２）交叉反応性：平滑筋ミオシンとは反応するが、骨格筋ミオシン、心筋ミオシンおよび血小板ミオシン（非筋型ミオシン）とは反応しない
３）種特異性  ：ヒト平滑筋ミオシンのみならずラット平滑筋ミオシンにも反応する
【０００８】
また、本発明はサンプル中の平滑筋ミオシンを測定し、得られた測定値から消化器疾患をスクリーニングする方法に関するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（１）ヒト平滑筋ミオシンに対する抗体
本発明に使用する抗体は、ヒト平滑筋ミオシン、特にヒト平滑筋ミオシン重鎖に対して特異的に結合するものであれば特に限定されないが、他のミオシンに交差反応性が小さいものを使用するのが好ましい。
【００１０】
このような抗体、特にモノクローナル抗体は、後述の実施例に示すように公知の方法を適宜用いることにより調製することができる（例えば、「免疫生化学研究法（続生化学実験講座５）」、日本生化学会編、１〜８８頁（１９８６年）、Biochemistry,27,3807-3811(1988)、Eur.J.Biochem.,179,79-85(1989)、J.Mol.Biol.,198,143-157(1987)、J.Biol.Chem.,264,9734-9737(1989)、J.Biol.Chem.,264,18272-18275(1989) 、J.Biol.Chem.,266,3768-3773(1991)、Circulation,88,1804-1810(1993) 等参照）。
使用する抗体は、抗体そのものでもよいが、活性フラグメントを使用することもできる。活性フラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどの各種フラグメントで、本発明の抗体の特徴を有するものであればよい。このような活性フラグメントを使用することで、非特異的な吸着を抑制し、測定誤差を最少限にすることができる。また、血中に投与した場合には、血中の半減期を早め、生体内クリアランスを高めることも可能である。
【００１１】
これらの活性フラグメントの調製には、精製抗体、特に精製モノクローナル抗体に対してパパイン、ペプシン、トリプシン処理などの公知の方法を適用することができる（「免疫生化学研究法（続生化学実験講座５）」、日本生化学会編、８９頁（１９８６年）等参照）。
【００１２】
このように調製された抗体または活性フラグメントは、以下の抗体試薬あるいは画像診断薬に使用される。
（２）抗体試薬および検出用キット
本発明の抗体試薬は、被検サンプル中のヒト平滑筋ミオシンをイムノアッセイにより測定し、その測定値から消化器疾患をスクリーニングするために使用するものである。したがって、本発明の抗体試薬は、少なくともヒト平滑筋ミオシンに対する抗体またはその活性フラグメントを含んでいなければならない。使用する抗体およびその活性フラグメントとしては、上記（１）で説明したものを例示することができる。
抗体試薬としては、溶液状または凍結乾燥状の抗体またはその活性フラグメントを使用することができ、必要に応じて採用したアッセイ法に適した形態（固相化抗体、標識化抗体など）に修飾したものであってもよい。
【００１３】
抗体またはその活性フラグメントの修飾は、それぞれ常法に従って行うことができる。例えば、固相化抗体を調製する場合、使用できる担体の材質としては、抗体またはその活性フラグメントとの結合性の高いものであれば特に制限されず、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレンなどの合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体（セファデックスなど）、アガロースゲル（セファロース、バイオゲルなど）、セルロース（ペーパーディスク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコーンなどの無機高分子化合物が挙げられ、これらはアミノ基、アミノアルキル基、カルボキシル基、アシル基、水酸基などの官能基を導入したものであってもかまわない。
【００１４】
担体の形状としては、マイクロタイタープレート、ディスクなどの平板状、ビーズなどの粒子状、試験管、チューブなどの管状、その他繊維状、膜状などが例示され、測定法に応じて適宜選択することができる。
固相担体への抗体またはその活性フラグメントの固定化は、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法など公知の方法（「固定化酵素」千畑一郎編、昭和５０年３月２０日、（株）講談社発行など参照）を用いて行えばよい。
【００１５】
標識化抗体またはその活性フラグメントを調製する場合、使用する標識体としては、放射性同位体（32Ｐ、3Ｈ、14Ｃ、125Ｉなど）、酵素（β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、補酵素・補欠分子族（ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘムなど）、蛍光色素（フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体など）、金属粒子（金、銀、白金など）などを使用することができる。
抗体またはその活性フラグメントの標識化は、選択した標識剤に適した公知の方法（「続生化学実験  講座５免疫生化学研究法」（株）東京化学同人、（１９８６年発行）第１０２〜１１２頁など参照）に従って行えばよい。
【００１６】
本発明の検出用キットは、被検サンプル中の平滑筋ミオシンをイムノアッセイにより測定し、得られた測定値から消化器疾患を検出する方法に使用するものである。このため、キットの構成試薬としては、少なくとも上述した本発明の抗体試薬を含有し、さらに界面活性剤を含む洗浄液が構成試薬として添付されていることを特徴とする。
【００１７】
本発明の検出用キットに添付する抗体試薬としては、上述した抗体試薬の中からキットで採用するイムノアッセイ法に好適な形態のものを適宜選択し、それをキットに添付すればよい。
【００１８】
洗浄液に添加する界面活性剤としては、水溶性のものであれば特に制限されず、特に両性界面活性剤または非イオン性界面活性剤が好ましい。より具体的には、両性界面活性剤としては、卵黄リゾレシチン等を例示することができ、非イオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ系（Ｔｗｅｅｎ２０、同４０、同６０、同８０、同８５など；ナカライテスク社製）、Ｓｐａｎ系（Ｓｐａｎ２０、同８０、同８５、同８０など；ナカライテスク社製）、Ｂｒｉｊ系（Ｂｒｉｊ３５、同５８など；ナカライテスク社製）、（ｎ）ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル系（ＴｒｉｔｏｎＣＦ−１０、同Ｎ−１０１、同Ｘ−１００、同Ｘ−１１４、同Ｘ−３０５、同Ｘ−４０５、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０など；ナカライテスク社製）等を例示することができる。界面活性剤の添加量は、０．００３％（重量／容量）以上が適当である。
【００１９】
このような界面活性剤を添加した洗浄液を本発明の検出用キットに添付し、これをアッセイ時に使用することにより、サンプル中の平滑筋ミオシンをより高感度に測定することが可能となる。
【００２０】
上記試薬以外は、採用したアッセイ法で通常使用しているもの（標準抗体液、酵素溶液、基質溶液、反応停止液、検体希釈液など）の中から、適宜選択して使用すればよい。
【００２１】
本発明キットで採用できるアッセイ法としては、イムノアッセイで既に採用されている公知方法であれば特に限定されず、競合法、サンドイッチ法、凝集法、プロットオーバレイ法などいずれのアッセイ法も採用することができる。
【００２２】
採用したアッセイ法における詳細な測定法に関しては、たとえば下記の文献を参照にして行えばよい。
(a)入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（（株）講談社、昭和５４年５月１日発行）
(b)石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（（株）医学書院、１９８２年１２月１５日発行）
(c)臨床病理 臨時増刊 特集第５３号「臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、１９８３年発行）
(d)「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、１９８６年１０月９日発行）
(e)特公平６−４３９９８号公報、特開昭５５−１５１００号公報、特開昭５２−１４８６２０号公報及び特開昭５４−９１２９６号公報
(f)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」（Immunochemical techniques (Part A) ）
(g)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」（Immunochemical techniques (Part B)）
(h)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」（Immunochemical techniques (Part C)) (i)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」（Immunochemical techniques (Part D:Selected Immunoassay)）
(j)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」（Immunochemical techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)）
［（ｆ）〜（ｊ）はアカデミックプレス社発行］
【００２３】
アッセイ法の中でも好適な方法の一つであるサンドイッチ法を例に挙げ、更に本発明の測定法及びキットを説明すれば、たとえば以下に示すキットＡを例示することができる。
キットＡ；
１．固相化第一抗体
２．第二抗体
３．標識化抗イムノグロブリン抗体
４．既知濃度の抗原
５．洗浄液
【００２４】
キットＡの第二抗体と標識化抗イムノグロブリン抗体の代わりに標識化第二抗体を使用することもでき、その場合には、下記のキットＢが例示される。
キットＢ；
１．固相化第一抗体
２．標識化第二抗体
３．既知濃度の抗原
４．洗浄液
【００２５】
また、ビオチン−アビジン法を採用した場合には、下記のキットＣが例示される。
キットＣ；
１．固相化第一抗体
２．ビオチン化第二抗体
３．標識化アビジン
４．既知濃度の抗原
５．洗浄液
【００２６】
上述のキットを使用した血清などの血液サンプル中の平滑筋ミオシンの測定法は、サンドイッチ法を採用した他の公知の検査用キットと何等かわるところがない。即ち、固相化抗体試薬と被検サンプルを反応させ、必要によりＢＦ分離後、さらに（標識化）抗体試薬を反応させる（ツーステップ法）か、固相化抗体試薬、被検サンプルおよび（標識化）抗体試薬を同時に反応させ（ワンステップ法）、反応後いずれの場合でも標識化に応じたそれ自体公知の方法によりサンプル中の平滑筋ミオシンを検出または定量することができる。
【００２７】
測定対象の被検サンプルとしては、消化器疾患の疑いのある患者から採血した血液、またはその分画物（血清など）であり、これらは必要に応じてＰＢＳなどの適当な緩衝液で希釈して測定に用いてもよい。
測定の結果、健常人の平均値よりも高い値を得た場合には、消化器疾患の可能性があると判断し、さらに精密な検査を行う必要がある。また、測定の結果が、健常人の平均値と同等またはそれ以下の場合には、消化器疾患ではない可能性が高いと判断できる。
【００２８】
（３）画像診断薬
本発明の画像診断薬は、放射性同位元素で標識されたヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体を消化器疾患の疾患部位に特異的に結合させることにより、その正確な疾患部位の画像診断を行うために使用するものである。従って、少なくとも放射性同位元素で標識されたヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体を含んでいなければならない。
本発明に使用するモノクローナル抗体は、上記（１）で説明したものを利用でき、モノクローナル抗体又はその活性フラグメントを放射性同位元素で標識し、本発明の画像診断薬として使用する。
【００２９】
放射性同位元素の核種としては、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、インジウム−１１３ｍ、テクネチウム−９９ｍ、ガリウム−６７、鉛−２０３、ルテニウム−９７、水銀−１９７、タリウム−２０１、ビスマス−２１２などが挙げられ、その標識化法としては、種々の公知の方法の中から、それぞれの核種に応じて選択し用いることができる。
例えば、クロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法など放射性同位元素を抗体または活性フラグメントに直接標識する方法、あるいは、抗体または活性フラグメントに二官能基性キレート剤を共有結合させ、このカップリング化合物を上記核種で標識する方法などが挙げられる。
ここで使用される二官能基性キレート剤としては、１−アミノ−６，１７−ジヒドロキシ−７，１０，２８，２１−テトラオキソ−２７−（Ｎ−アセチルヒドロキシイミノ）−６，１１，１７，２２−テトラアザヘプタエイコサン（デスフェリオキサミン）、８−ヒドロキシキノリン、エチレンジアミンテトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ジアミノシクロヘキシルテトラ酢酸、などが例示され、これらと抗体または活性フラグメントとのカップリング法は、カルボジイミド法、酸無水物法、グルタルアルデヒド法など通常使用している方法を使用すればよい。
【００３０】
本発明の画像診断薬は、放射性同位元素により標識されたヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを消化器疾患の疾患部位に特異的に結合させることにより、その正確な疾患部位の画像診断を行うために使用するものであり、少なくとも放射性同位元素で標識されたヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを含んでいればよいが、その態様の１つとして、ヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントと二官能性キレート化剤との結合物と放射性同位元素溶液を含有するキットも包含する。
【００３１】
本発明画像診断薬およびキットには、上記試薬の他、核種を精製するためのクロマトグラフィー用カラム、投与形態に調製するための塩化ナトリウム溶液やグルコース溶液などの担体、その他安定化剤などを構成させることもできる。
本発明画像診断薬は、静脈内注射により人体に投与するものである。従って、本発明薬剤は、上述のような担体などを使用することによって、注射投与に適した形態で用いられる。
【００３２】
本発明薬剤の投与量は、標識に使用する放射性同位元素の各種にもよるが、通常１００μＣｉ〜３０ｍＣｉ、好ましくは５００μＣｉ〜３ｍＣｉの範囲で投与される。
本発明薬剤を使用した画像診断の方法は、本発明薬剤投与後１〜４８時間後に、オートラジオグラフィー、シンチレーションスキャナー、シンチレーションカメラなどにより、患者の腹部などの消化器疾患の疾患部位を走査して、本発明薬剤由来の放射能を検出し、それを画像描写することにより行うことができる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を、実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。
【００３４】
実施例１（各種ミオシンの調製）
ヒト子宮平滑筋ミオシン、ヒト小腸平滑筋ミオシン、ヒト大動脈平滑筋ミオシン、ヒト血小板ミオシン及びヒト骨格筋ミオシンは佐賀医科大学、松村先生より分与された。ヒト心筋ミオシンは矢崎の方法（Circ.Res.,36:208,1975）により精製した。各種ミオシンともＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を確認後、ローリー法（J.Biol.Chem.,193:265-275,1951）によりウシ血清アルブミンを標準物質としてタンパク定量を行い濃度を求めた。
【００３５】
実施例２（モノクローナル抗体の作製）
１）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
ヒト子宮平滑筋ミオシン２５〜５０μｇをフロインド完全アジュバントと共に、６〜８週令のＢＡＬＢ／ｃマウスに、２〜４週間おきに４〜７回腹腔内に投与し、最後にヒト子宮平滑筋ミオシン１０μｇを静脈内投与した。
最終免疫から３日後にマウスの脾臓を摘出し、この脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３×６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９７）を１０：１で混合後、遠心分離して得たペレットに、５０％ポリエチレングリコール含有ＲＰＭＩ１６４０溶液１ｍｌを徐々に加えて細胞融合を行った。さらにＲＰＭＩ１６４０培地を加えて１０ｍｌとし、遠心分離して得たペレットを１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地にＰ３Ｕ１として３×１０4 個／０．１ｍｌとなるように懸濁させ、９６ウェルマイクロプレートに各ウェル０．１ｍｌずつ分注した。
１日後、ＨＡＴ培地を０．１ｍｌ添加し、その後３〜４日おきに培地の半分量を新しいＨＡＴ培地で交換した。
【００３６】
融合後７〜１０日目に培養上清をサンプリングし、あらかじめヒト子宮平滑筋ミオシンでコートし、３％ゼラチンでブロッキングしてある９６ウェルポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）プレートに５０μｌ添加し室温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（ベクター社製）を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳで１／５００に希釈した溶液を、５０μｌずつ分注し室温で１時間静置した。ＰＢＳで３回洗浄後、ペルオキシダーゼ−アビジンＤ（ベクター社製）を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１／２０００に希釈した溶液を、５０μｌずつ分注し室温で１５分間静置した。ＰＢＳで３回洗浄後、基質溶液（４−アミノアンチピリン，０．２５ｍｇ／ｍｌ、フェノール，０．２５ｍｇ／ｍｌ，０．４Ｍ過酸化水素）２００μｌを加え室温で発色させた。マイクロプレートフォトメーターを用いて５５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ヒト子宮平滑筋ミオシンに特異的に反応するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選択した。
【００３７】
このようにして選択した各ハイブリドーマは限界希釈法によりクローニングを行いヒト子宮平滑筋ミオシンに対する抗体産生ハイブリドーマ５株（１Ｈ６，４Ｅ１２，９Ａ１２，９Ｄ７，１０Ｇ２）を樹立した。特異抗体陽性ウェル数、増殖ウェル数及び全ウェル数を表１に示す。この中で、ハイブリドーマ１Ｈ６とハイブリドーマ４Ｅ１２は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５））にＳＭＨＭＷ１Ｈ６およびＳＭＨＭＷ４Ｅ１２としてブタペスト条約に基づき１９９４年１０月１３日に国際寄託され、１９９４年１０月１３日付けで受託番号としてＦＥＲＭＢＰ−４８２９およびＦＥＲＭＢＰ−４８３０が付与されている。
【００３８】
【表１】
2007121308.tif 000002
【００３９】
２）モノクローナル抗体の調製及び精製
次に、樹立した各ハイブリドーマを培養し、あらかじめプリスタンを投与してあるマウスの腹腔内に１匹当り３×１０6個を投与した。約２週間後マウス１匹当り５ｍｌの腹水を採取した。 ３Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン塩酸緩衝液，ｐＨ８．９にて平衡化した、プロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）カラムに、等量の同グリシン塩酸緩衝液と混合した腹水を流した。充分量の同グリシン塩酸緩衝液で洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にて抗体を溶出した。溶出液をＰＢＳにて透析後、ＳＤＳ−ポリアクリアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて純度を確認し、精製モノクローナル抗体とした。
【００４０】
実施例３（モノクローナル抗体の性質）
１）アイソタイプ
ヒト子宮平滑筋ミオシンをコートし、３％ゼラチンでブロッキング処理してある９６ウェルＰＶＣプレートに各ハイブリドーマの培養上清を添加し、ＭｏｎｏＡｂ−ＩＤ ＥＩＡキット（ザイメッド社製）を用いて抗体のアイソタイプの検索を行った。
【００４１】
【表２】
2007121308.tif 000003
【００４２】
２）ウエスタンブロッティングによる特異性の解析
各モノクローナル抗体の特異性をウエスタンブロッティングにより解析した。 ヒト子宮平滑筋ミオシン１ｍｇ／ｍｌを同量の還元処理液を加えて１００℃で５分間加熱処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１０％分離ゲル、５％濃縮ゲルを用い、ミニゲル電気泳動装置（マリソル社製）で１０ｍＶ、約３時間、を行った。ブロッティングはミニゲル用ブロッティング装置（マリソル社製）を用い、３７Ｖで約１８時間通電してニトロセルロース膜にタンパク質を転写させた。このニトロセルロース膜を試料の泳動ラインに沿って短冊状に切断し、一部はアミドブラックを用いてタンパク質を染色した。残りは３％ゼラチンでブロッキング後、各ハイブリドーマの培養上清と室温で１時間反応させた。
０．０５％ツイーン２０含有２０ｍＭトリス、５００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５緩衝液（Ｔ−ＴＢＳ）で１０分ずつ２回洗浄後、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（ベクター社製）の１／５００希釈液と室温で１時間反応させた。Ｔ−ＴＢＳで１０分ずつ２回洗浄後、ペルオキシダーゼ−アビジンＤ（ベクター社製）の１／２０００希釈液と室温で１５分間反応させた。Ｔ−ＴＢＳで１０分ずつ２回洗浄後、発色液（ＨＲＰ発色試薬（バイオラッド社製）３０ｍｇ、メタノール１０ｍｌ、ＴＢＳ５０ｍｌ、３０％過酸化水素水３０μｌ含有）にて発色後、蒸留水で洗浄した。
【００４３】
アミドブラックによるタンパク染色の結果、２００Ｋ（子宮平滑筋ミオシン重鎖）、１４０Ｋ（子宮平滑筋ミオシン重鎖のフラグメント）、７０Ｋ（子宮平滑筋ミオシン重鎖のフラグメント）、２０Ｋ（子宮平滑筋ミオシン軽鎖）、１７Ｋ（子宮平滑筋ミオシン軽鎖）５本のバンドがみられた。いずれの抗体もヒト子宮平滑筋ミオシン重鎖に反応し、軽鎖には反応しないことが確認された。
【００４４】
実施例４（サンドイッチ法を利用した検出用キット）
１）ビオチン化抗体の調製
上記各モノクローナル抗体を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に透析後、セントリフロー（アミコン製）により２ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。ビオチン（ロングアーム）ＮＨＳ試薬（ベクター社製）を１０ｍｇ／ｍｌになるようにジメチルフォルムアミドに溶解し、その２０μｌと上記抗体溶液１ｍｌを混合し、室温で２時間反応させた。エタノールアミン５μｌを加え反応を止めた後、ＰＢＳに２回透析し、ビオチン化抗体を得た。このビオチン化抗体を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈し、ビオチン化抗体溶液を得た。
【００４５】
２）固相化抗体の調製
抗平滑筋ミオシンモノクローナル抗体（４Ｅ１２）をＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレート（Ｈタイプ：住友ベークライト社製）に５０μｌずつ分注し、４℃で一晩静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、０．５％スキムミルクを３００μｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
スキムミルク溶液を除去し、固相化抗体試薬を得た。
【００４６】
３）その他の試薬の調製およびキットの調製
・平滑筋ミオシン標準液；
ヒト大動脈平滑筋ミオシンを２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６３、０．７８１、０．３９１ｎｇ／ｍｌとなるように１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈して調製した。
・洗浄液；
Ｔｗｅｅｎ２０をＰＢＳに０．０５％（重量／容量）になるように溶解させて調製した。
・酵素標識アビジン溶液；
ペルオキシダーゼ標識アビジンＤ（Ａ−２００４：ベクター社製）を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１／５０００に希釈して調製した。
・基質溶液；
０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）に３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン二塩酸塩（ＴＭＢＺ）が０．３ｍＭ、過酸化水素水が０．００５％（重量／重量）になるように溶解させて調製した。
・酵素反応停止液；
１Ｎ硫酸を用いる。
上記各試薬を１つのキットに添付し、本発明の検出用キットを調製した。
【００４７】
実施例５
１）標準曲線
固相化抗体試薬の各ウェルに１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを１００μｌずつ分注後、平滑筋ミオシン標準液を５０μｌずつ分注し撹拌後、室温で４時間静置した。洗浄液で３回洗浄後、ビオチン化抗体（１Ｈ６）溶液を５０μｌずつ分注し、室温で３０分間静置した。洗浄液で３回洗浄後、酵素標識アビジン溶液を５０μｌずつ分注し、室温で１５分間静置した。洗浄液で３回洗浄後、基質溶液を１００μｌずつ分注し、室温で１０分間静置して発色させた。酵素反応停止液を１００μｌずつ加えて反応を停止させ、マイクロプレートフォトメーターを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた標準曲線を図１に示す。
【００４８】
２）界面活性剤の効果
上記１）の操作法において、Ｔｗｅｅｎ２０の洗浄剤への添加量につき検討した結果、図２に示すように、０．００３％（重量／容量）以上の濃度で測定感度を著しく高めることができることが明らかとなった。また、Ｔｗｅｅｎ２０以外の各種界面活性剤の効果をＴｗｅｅｎ２０の場合と比較検討した。すなわち、洗浄液に各種界面活性剤を０．０５％（重量／容量）となるように添加し、標準曲線を作成した。その結果、図３〜７に示されているように、両性界面活性剤および非イオン性界面活性剤を洗浄液に添加することにより、Ｔｗｅｅｎ２０と同様に顕著な効果が得られることが判明した。
【００４９】
３）再現性
上記１）の操作法に準じ、３種類の検体を用いて同時再現性及び測定日間再現性を検討した。その結果表３及び４に示すように、いずれの再現性においてもＣＶ値が１０％以内となり、良好な再現性を示すことが明らかとなった。
【００５０】
【表３】
2007121308.tif 000004
【００５１】
【表４】
2007121308.tif 000005
【００５２】
４）交叉反応性
上記１）の操作法に準じ、各種ミオシンとの交叉反応性を検討した。その結果、図８に示すように、子宮平滑筋ミオシンおよび小腸平滑筋ミオシンとは同等に反応するが、骨格筋ミオシン、心筋ミオシンおよび血小板ミオシン（非筋型ミオシン）とはほとんど反応しないことが確認された。
【００５３】
５）モデルケースにおける平滑筋ミオシンの測定
雄のウィスターラットを用いて、ペントバルビタール麻酔下に開腹し、腸間膜動脈を結紮、２時間後に解除して腸梗塞を作成した。結紮解除後１５分、３０分、１時間、２時間、４時間後に上記１）の操作法に準じ、血中平滑筋ミオシン濃度を測定した。
その結果、血中の平滑筋ミオシン濃度は、結紮解除後３０分で上昇し、１時間後には、ピークとなった。（３０分後０．５５３±０．０１２ｎｇ／ｍｌ、１時間後２．３３４±０．０２ｎｇ／ｍｌ）
【００５４】
６）健常人血清の測定
上記１）の操作法に準じ、健常人血清７５例の平滑筋ミオシン濃度を測定した結果、平均０．９ｎｇ／ｍｌ、標準偏差０．９ｎｇ／ｍｌであった。
【００５５】
７）患者血清の測定
上記１）の操作法に準じ、消化器疾患における術前及び術後の平滑筋ミオシンを測定し、その変化を表５に示す。表５から明らかなように、術前に高値であったものが、術後ではいずれも正常域まで低下し、治療の効果をよく反映するものであることが確認された。
【００５６】
【表５】
2007121308.tif 000006
【００５７】
実施例６
１）モノクローナル抗体の標識化
１ｍｇ／ｍｌの抗平滑筋ミオシンモノクローナル（９Ｄ７）抗体溶液２０μｌとＮａ125Ｉ  ３．７ＭＢｑを混合し、さらに０．３％クロラミンＴ溶液５μｌを加えて正確に３０秒間ボルテックスで混合した。この混合液に０．５％ピロ亜硫酸ナトリウム溶液１０μｌ、１％ヨウ化カリウム溶液５μｌ、１％ＢＳＡ溶液５μｌを順次加え混合した。反応液を１％ＢＳＡ溶液で平衡化してあるＰＤ１０カラム（ファルマシア社製）にかけ、１％ＢＳＡ溶液で溶出し、１ｍｌずつ分取した。各フラクションをオートガンマカウンターで測定した結果、２つのピークがみられたため、最初のピークのフラクションを集めて125Ｉ抗平滑筋ミオシンモノクローナル抗体とした。
【００５８】
２）モデルケースにおける虚血性消化器疾患の画像診断
実施例５と同様にして腸梗塞を作成したラットに、結紮解除後125Ｉ抗平滑筋ミオシンモノクローナル抗体１．８５ＭＢｑを静注し、１．５時間後、６時間後、２４時間後に屠殺して、各臓器を摘出し、組織１ｇ当たりの125Ｉのカウントを比較するとともに、オートラジオグラフィーによるイメージングを行った。
その結果、表６に示すように梗塞部のカウントは正常部に比べ、１．５時間後で既に高値で、オートラジオグラフィーでは、梗塞部に一致して125Ｉの集積がみられた。
【００５９】
【表６】
2007121308.tif 000007
【００６０】
実施例７
ヒト子宮平滑筋ミオシンの代わりにヒト小腸平滑筋ミオシンを用い、実施例２の１）と同様の方法でヒト小腸平滑筋ミオシンに特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ８Ｂ８を樹立した。このハイブリドーマ８Ｂ８は通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名；日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５））にＩＭＨ８Ｂ８としてブタペスト条約に基づき１９９６年３月５日に国際寄託され、１９９６年３月５日付けで受託番号としてＦＥＲＭ ＢＰ−５４４４が付与されている。
このハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を実施例２の２）と同様の方法で精製後、モノクローナル抗体の諸性質を実施例３に記載の方法と同様の方法を用いて調べた。その結果を以下に示す。
１．アイソタイプ：ＩｇＧ２ｂ／κ
２．反応特異性 ：平滑筋重鎖と反応し、軽鎖とは反応しない
３．交叉反応性 ：小腸平滑筋ミオシン、子宮平滑筋ミオシンおよび大動脈平滑筋ミオシンとは反応するが、骨格筋ミオシン、心筋ミオシン及び血小板ミオシン（非筋型ミオシン）とは反応しない
４．種特異性 ：ヒト平滑筋ミオシンのみならずラット平滑筋ミオシンにも反応する
【００６１】
次に、このモノクローナル抗体（８Ｂ８）を実施例６の１）と同様の方法で標識化し、実施例６の２）に記載の方法に従ってラットを用いたモデル実験における腸管梗塞部位の画像診断を試みた。その結果、図９に示すように腸管の梗塞部位に一致して125Ｉの集積が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
被検サンプル中の平滑筋ミオシンを測定することにより、消化器疾患を生化学的に診断できること、及び放射性同位元素で標識されたヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体が消化器疾患の疾患部位に特異的に結合・集積させることにより、その正確な疾患部位の画像診断を行えることは本願発明者らによって初めて見いだされたことである。
従って、本願発明の抗体試薬および画像診断薬は、虚血性大腸炎、腸閉塞などの虚血性消化器疾患、潰瘍性大腸炎などの潰瘍性消化器疾患などの消化器疾患の診断に有用なものであり、これらを使用することにより、緊急検査および疾患部位の特定が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】標準曲線を示したものである。
【図２】本発明キットに用いられる洗浄液としてTween 20溶液を用いた場合のTween 20の各濃度におけるミオシン濃度に対する吸光度の変化を示す図である。
【図３】本発明キットに用いられる洗浄液としてリゾレシチン溶液を用いた場合におけるミオシン濃度に対する吸光度の変化を示す図である。
【図４】本発明キットに用いられる洗浄液としてTriton CF-10、Triton N-101、Triton X-100、Triton X-114、Triton X-305、Triton X-405及びNonidet P-40の各々の溶液を用いた時のミオシン濃度に対する吸光度の変化を示す図である。
【図５】本発明キットに用いられる洗浄液としてBrij35及びBrij58の各々の溶液を用いた時のミオシン濃度に対する吸光度の変化を示す図である。
【図６】本発明キットに用いられる洗浄液としてTween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80及びTween 85の各々の溶液を用いた時のミオシン濃度に対する吸光度の変化を示す図である。
【図７】本発明キットに用いられる洗浄液としてSpan 20、Span 80及びSpan 85の各々の溶液を用いた時のミオシン濃度に対する吸光度の変化を示す図である。
【図８】交叉反応性を検討した結果を示したものである。
【図９】オートラジオグラフィーによるイメージングの結果を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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