(57)【要約】【課題】  遺伝子導入や染色を施さない生きたままの心筋細胞について、観察者に過大な労力をかけることなく、系時的にその面積を算出し数値化することのできる、心筋細胞のモニター方法およびモニター装置を提供する。【解決手段】  培養容器３１中の心筋細胞をモニターするために、以下のような装置とする。すなわち、心筋細胞を含む培養容器３１中の細胞または細胞集団を撮像手段１０が一定時間ごとに撮像し、撮像して得た細胞または細胞集団の画像を比較することにより、心筋細胞を、それ以外の細胞から区別してモニターする。培養容器３１は動かさないこととし、上記の撮像手段１０を移動手段２０によって３次元に移動させる。【選択図】      図１
2007121106.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器中の心筋細胞をモニターする方法であって、
心筋細胞を含む培養容器中の細胞または細胞集団を一定時間ごとに撮像し、撮像して得た細胞または細胞集団の画像を比較することにより、心筋細胞をそれ以外の細胞から区別してモニターすることを特徴とする心筋細胞のモニター方法。
【請求項２】
所定の細胞または細胞集団について時間差のある複数の画像を撮像手段が撮像し、当該複数の画像について入力を受けたコンピュータが、それら複数の画像間での変化領域を抽出することにより心筋細胞のビーティング域を画像上で特定することを特徴とする請求項１に記載した心筋細胞のモニター方法。
【請求項３】
上記のコンピュータが、ニューラルネットワークを用いるパターン認識によって画像上の心筋細胞を区別したうえ、上記複数の画像のうち２つの画像間で心筋細胞近傍につき差分処理を行うことにより画像間の変化領域を抽出して心筋細胞のビーティング域を画像上で特定し、特定した部分のピクセル数をカウントすることによりビーティング域の面積を求める
ことを特徴とする請求項２に記載した心筋細胞のモニター方法。
【請求項４】
培養容器における撮像範囲を当該範囲に重なりがあるように移動させることとし、移動の前後に上記の細胞または細胞集団を撮像手段が撮像し、それら撮像画像について入力を受けた画像結合手段が移動の前後の画像をつなぎ合わせて結合画像を作成し、
作成された結合画像を上記複数の画像の各々として上記のコンピュータが入力を受け、ビーティング域を特定することを特徴とする請求項２または３に記載した心筋細胞のモニター方法。
【請求項５】
培養容器中の心筋細胞をモニターするための装置であって、
心筋細胞を含む培養容器中の細胞または細胞集団を時間間隔をおいて撮像する撮像手段と、時間差のある複数の画像について撮像手段より入力を受け、それら複数の画像間での変化領域を抽出することにより、心筋細胞のビーティング域を画像上で特定するコンピュータとを含むことを特徴とする心筋細胞のモニター装置。
【請求項６】
上記の撮像手段と培養容器との間に相対移動をもたらす移動手段と、移動の前後に撮像手段が撮像した画像について入力を受けたうえ、移動の前後の画像をつなぎ合わせて結合画像を作成する画像結合手段とをさらに含むことを特徴とする請求項５に記載した心筋細胞のモニター装置。
【請求項７】
上記の移動手段が、培養容器を動かすことなく、上記の撮像手段を３次元に移動するものであることを特徴とする請求項５または６に記載した心筋細胞のモニター装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
請求項に係る発明は、培養容器中にある心筋細胞をモニターする（すなわち、系時的に観察したり画像データや面積等の数値データを残したりする）ための方法および装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マルチウェルプレート等の培養容器中にある細胞について培養状況を観察する作業は、一般に、決して容易なものではない。培養容器中の生きた心筋細胞を長期間にわたって観察し、心筋細胞の拍動するコロニー（いわゆるビーティング域）について面積を算出し記録することも、観察者に相当の労力を強いる。
【０００３】
心筋細胞（ビーティング域）について面積を算出する処理は、従来、生きたままの細胞に関しては、心筋特異的プロモーター下に蛍光遺伝子を導入したＥＳ細胞を心筋に分化誘導したものや、心筋特異的なタンパク質のみが光るトランスジェニックマウス由来の心筋細胞などを用い、蛍光顕微鏡下にて蛍光面積を測定することにより行っている。また、死んだ細胞に関しては、細胞をパラホルムアルデヒド等で固定（死滅させた）後、細胞に穴を開ける処理をして細胞内の心筋特異的タンパク質を抗体法にて染色することにより心筋の面積を測定する方法で実施している。つまり、生きたままの状態で系時的に変化する心筋細胞の面積を測定するには、遺伝子導入した細胞を使用するしかなかった。
【０００４】
なお、培養容器中の細胞の密度を検出するための装置については、下記の特許文献１に記載がある。
【特許文献１】特開２００５−１９２４８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生きた心筋細胞（ビーティング域）の面積を算出するための従来の方法、つまり、蛍光遺伝子を導入した心筋細胞等を用いて蛍光面積を測定する方法には、つぎのような課題がある。すなわち、
・  拍動するコロニーをカウントするには目視に頼るしかなく、観察者の主観性を排除することが難しい。したがって、データの確認をするにも観察時に複数の観察者が観察するしかなかった。
・  デジタルカメラ等で電子記録を保存するにしても、どのコロニーを選ぶかは観察者の主観に頼るしかない。そのため、真に客観的なデータを採取するには網羅的な撮影をするしかなく、非常に膨大な労力を必要とした。
・  生きたままの通常の細胞を対象とするのではないため、遺伝子導入による副次的効果を考慮しなければならない。
【０００６】
なお、上記した特許文献１に記載の装置は、培養容器中にある多数の細胞について密度検出をするためのものであり、心筋細胞など特定の細胞を培養容器中から特定してその面積を求めるといった処理を簡単化できるものではない。
【０００７】
本件出願に係る発明は、以上の点を考慮して完成したもので、遺伝子導入や染色を施さない生きたままの心筋細胞について、観察者に過大な労力をかけることなく、系時的にその面積を算出し数値化することのできる、心筋細胞のモニター方法およびモニター装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項に係る心筋細胞のモニター方法は、培養容器中の心筋細胞をモニターする方法であって、心筋細胞を含む培養容器中の細胞または細胞集団を一定時間ごとに撮像し、撮像して得た細胞または細胞集団の画像（一定時間ごとに撮像したもの）を比較することにより、心筋細胞をそれ以外の細胞から区別してモニターする（系時的に観察したり画像データや面積等の数値データを残したりする）ことを特徴とする。
一定時間ごとに撮像して得た細胞または細胞集団の画像を比較すると、拍動する心筋細胞の部分（ビーティング域）をそれ以外の細胞から区別することが可能である。その区別は高い客観性をもって行えるうえ、当該区別によって観察範囲を狭く特定することができる。そのため、上記により区別したうえで心筋細胞（ビーティング域）の部分のみをモニターするなら、少ない労力で客観的なモニタリングを行える。遺伝子導入や染色を施さない、生きたままの心筋細胞について観察できるという顕著なメリットもともなう。
【０００９】
上記モニター方法は、所定の細胞または細胞集団について時間差のある複数の画像を撮像手段（レンズやカメラ等で構成されるもの）が撮像し、当該複数の画像について入力を受けたコンピュータが、それら複数の画像間での変化領域を抽出することにより、心筋細胞のビーティング域を画像上で特定する、という手順によって実施するなら、なお好ましい。
そのようにすれば、撮像手段およびコンピュータの作用により、観察記録を自動的に、時間軸上の複数の地点（タイムラプス）で網羅的に、かつデジタルで保存することができる。特定した部分を識別した状態の画像をコンピュータに保存するのもよい。このような点は、客観的な記録を多数残す上で非常に効果的である。
なお、このように網羅的なデジタル記録を大量に保存・確保できることは、以下のような場合に優れた効果を発揮するものと期待される。たとえば、研究者がある実験系で思いもよらぬ現象に気づいたとする。それで、これまでの実験を別の角度から眺め直し、網羅的なデジタル記録ライブラリーから過去の実験データを抽出・比較することで、この思いもよらぬ現象が、過去の実験で見落としていただけなのか、頻度は少ないが確かにこのようなことが起きていたのか、全くこの現象はおきていなかったのかを判断することができる。このような場合、膨大な記録ライブラリーからデータを抽出し判断することにより、的確な実験系の組み立ておよび実験の省力化に有効な道具としての働きを発揮するものと考えられる。
【００１０】
とくに、上記のコンピュータが、ニューラルネットワークを用いるパターン認識によって画像上の心筋細胞を区別したうえ、上記複数の画像のうち２つの画像間で心筋細胞近傍につき差分処理を行うことにより画像間の変化領域を抽出して心筋細胞のビーティング域を画像上で特定し、特定した部分のピクセル数をカウントすることによりビーティング域の面積を求める、という手順をとるなら、さらに好ましいモニタリングを行える。
心筋細胞を培養する場合、通常、培養容器中には心筋細胞以外の細胞または細胞集団が混在することが多い。そのような場合、撮像された画像中で心筋細胞をまず区別することが、精度の高いモニタリングを効率的に行ううえで重要である。上記のようにニューラルネットワークと差分処理を用いる画像処理をコンピュータに行わせれば、画像上で心筋細胞を区別することと、さらに心筋細胞のビーティング域を特定することとが迅速かつ効率的に実現する。そのコンピュータに、特定したビーティング域のピクセル数をカウントしてその面積を求めさせると、当該細部の培養状況を適切に数値化できる。なお、ニューラルネットワークを用いるパターン認識としては、たとえば、階層型ネットワークに、教師信号を用いるバックプロパゲーションによる学習をさせパターン認識させる手法等が採用できる。
【００１１】
上記のモニター方法においては、さらに、培養容器における撮像範囲を当該範囲に重なりがあるように移動させることとし、移動の前後に上記の細胞または細胞集団を撮像手段が撮像し、それら撮像画像について入力を受けた画像結合手段が移動の前後の画像をつなぎ合わせて結合画像を作成し（つまりいわゆるタイリングをし）、作成した結合画像を、上記複数の画像（つまり、時間差のある複数の画像）の各々として上記のコンピュータが入力を受けビーティング域を特定する、という手順をとるのもよい。
そのようにすれば、観察等すべき心筋細胞が撮像手段による単一の撮像範囲内に収まらない場合にも、当該心筋細胞のモニタリングを適切に行える。撮像範囲を適切に移動し、移動の前後に撮像手段が細胞または細胞集団を撮像したうえ、それらの撮像画像を画像結合手段がつなぎ合わせて結合画像を作成するからである。観察等すべき心筋細胞が結合画像中に収まるようになれば、その結合画像について上記のコンピュータが上述の手順を実施することにより、心筋細胞の必要なモニタリングが円滑に行える。そしてその結果、細胞等の全体についてのスクリーニングも可能になる。
【００１２】
請求項に係る心筋細胞のモニター装置は、培養容器中の心筋細胞をモニターするための装置であって、
・  心筋細胞を含む培養容器中の細胞または細胞集団を時間間隔をおいて撮像する撮像手段と、
・  時間差のある複数の画像について撮像手段より入力を受け、それら複数の画像間での変化領域を抽出することにより心筋細胞のビーティング域を画像上で特定するコンピュータと
を含むことを特徴とする。
【００１３】
また、このモニター装置については、
・  上記の撮像手段と培養容器との間に相対移動をもたらす移動手段と、
・  移動の前後に撮像手段が撮像した画像について入力を受けたうえ、移動の前後の画像をつなぎ合わせて結合画像を作成（タイリング）する画像結合手段と
をさらに含むよう構成するのが好ましい。
【００１４】
以上のようなモニター装置を用いれば、上述した各モニター方法を円滑に実施することができ、上述の作用効果がもたらされる。
【００１５】
とくに、上記の移動手段が、培養容器を動かすことなく、上記の撮像手段を３次元（すなわち、水平面に沿ったＸ方向とＹ方向とのほかに鉛直方向であるＺ方向を含む各方向）に移動するものであれば、さらに好ましい。
培養容器を動かさないことにより、同容器中の細胞や細胞集団が無用に変位・変形することがないので、培養中の細胞等の観察を適切に行うことができる。請求項に係る発明では、複数の画像間での変化領域を抽出することによりビーティング域を特定するのであるから、培養容器の移動によって細胞等の位置や形状・姿勢等が変化すると、それによってビーティング域の特定に誤差が生じる可能性が著しく高くなる。そのため、移動手段が培養容器ではなく撮像手段を移動させることには、上記装置においてきわめて重要な意義があるといえる。
撮像手段のその移動が、水平面に沿った２次元のものでなく鉛直方向を含む３次元のものであれば、培養容器中で細胞等が鉛直に盛り上がっている場合にも、その細胞等のうちビーティング域など最も観察したい部分に焦点を合わせた適切なモニタリングが実施できることになる。
【発明の効果】
【００１６】
請求項に係るモニター方法によれば、心筋細胞に関し、少ない労力で客観的なモニタリングを行うことができる。また、遺伝子導入や染色などの特別な操作を必要とせず、生きたままの状態で、細胞を全く侵襲することなく、系時的に心筋細胞の観察を行える。撮像手段とコンピュータとを適切に使用するなら、網羅的な観察記録を大量に保存・確保することができ、またはさらに観察を効率化してその結果を適切に数値化することも可能になる。撮像範囲を適切に移動するとともにコンピュータに適切に画像処理を行わせるなら、観察等すべき心筋細胞が撮像手段による単一の撮像範囲内に収まらない場合にも適切なモニタリングが行える。
【００１７】
請求項に係るモニター装置によれば、請求項に係るモニター方法を円滑に実施することができ、上述の効果を得ることができる。移動手段が、培養容器を動かすことなく撮像手段を３次元に移動するようにすれば、培養中の細胞等の観察をとくに適切に行えるほか、細胞等が鉛直に盛り上がっている場合にも適切なモニタリングが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の実施についての一形態を図１〜図９に示す。図１は、モニター装置の概略構成を示す正面図であり、図２は、そのモニター装置で使用する培養容器を示す平面図に、同容器中の撮像範囲（観察視野範囲）の移動態様を示す模式図（拡大引出し図）を併記したものである。また、図３〜図９のそれぞれは、モニター装置における撮像画像、またはコンピュータによる処理が加えられた画像を示す図（顕微鏡写真）である。
【００１９】
図１に示すモニター装置は、培養容器３１（図２参照）中の細胞または細胞集団を、撮像手段１０によって顕微鏡観察することを基本機能とするものである。同装置は、図示のように固定フレーム１と移動フレーム３、ならびに撮像手段１０および移動手段２０等により構成している。移動手段２０であるＸステージ２１・Ｙステージ２２・Ｚステージ２３の上に撮像手段１０を組み付け、培養容器３１を含むたとえばマルチウェルプレート３０（図２参照）を、固定フレーム１の上部に設けた支持部２に交換可能に取り付けることとしている。
【００２０】
撮像手段１０は、対物レンズ１１と光学筒１２およびＣＣＤカメラ１３を主要部とし、レンズ１１を上に向けて上記支持部２の下方に設けている。移動手段２０は、Ｘ方向（水平面内の一方向）への移動を行うためのＸステージ２１と、Ｙ方向（Ｘ方向と直交する水辺面内の一方向）への移動のためのＹステージ２２、およびＺ方向（鉛直方向）への移動のためのＺステージ２３を、この順に下から上へと積み上げたものである。各ステージ２１〜２３には、ボールネジによる移動機構と当該ネジを駆動するステッピングモータ等を組み込んでいる（図示省略）。撮像手段１０は、Ｚステージ２３の可動部に組み付けているため、各ステージ２１〜２３の作用によりＸ方向・Ｙ方向・Ｚ方向の三次元に移動することができる。光源１６は、撮像手段１０とは別にその上方（支持部２のさらに上）に配置したが、つねに撮像手段１０の真上に位置する必要があるので、Ｘステージ２１上のＹステージ２２に取り付けた移動フレーム３に支持させ、Ｘ方向およびＹ方向に撮像手段１０とともに移動するようにしている。
【００２１】
図示のモニター装置にはさらに、演算部や記憶部、入力部、ディスプレイ、インターフェース等を含むコンピュータ（パソコン等。図示省略）を組み込み、撮像手段１０や移動手段２０の各駆動用モータ等をそのコンピュータに接続している。そして当該コンピュータには、撮像手段１０から入力される時間差のある複数の画像同士を比較してそれらの変化領域を抽出するためのソフトウェアや、撮像範囲の隣接する複数の画像をつなぎ合わせるためのソフトウェアを搭載し、それらによってコンピュータ内にそれぞれ画像抽出手段および画像結合手段（いずれも図示省略）を形成している。
【００２２】
このように構成したモニター装置では、以下の手順によって、培養容器３１内の心筋細胞の観察（モニタリング）を行うことができる。
【００２３】
1)  まず、たとえば図２のようなマルチウェルプレート３０（ウェルに相当する各培養容器３１中に心筋細胞等を含むもの）を、図１のモニター装置における支持部２に取り付ける。マルチウェルプレート３０は所定のチャンバーに入れ、このチャンバー内に温度、湿度、ガス濃度が最適に制御されたＣＯ2ガスを導入する。この状態で、長期間細胞を培養しながら、設定された位置でタイムラプス観察をするのである。
【００２４】
2)  特定の培養容器３１における観察範囲Ｍ内を、撮像手段１０によって撮像する。撮像手段１０によって一度に観察できる視野範囲Ｖ（撮像範囲）は通常２ｍｍ×２ｍｍ程度であって、一般的には３ｃｍ×３ｃｍ程度に及ぶ観察範囲Ｍよりもせまいので、移動手段２０にて撮像手段１０を図２（拡大引出し図）のように移動させながら撮像する。このとき、隣接する視野範囲Ｖが前回の視野範囲Ｖに対し面積比で５％ずつ重なる（つまりラップ範囲が５％になる）ように撮像手段１０を移動することとし、各停止箇所で数秒の間に５回の撮像をする。なお、このような移動と撮像のためには、移動手段２０と撮像手段１０とを前記のコンピュータがコントロールし、また、撮像した画像とその撮像箇所のデータ（ＸＹ座標）をもそのコンピュータが保存する。
【００２５】
3)  広い観察範囲Ｍを網羅して観察するために、各視野範囲Ｖで撮像し保存した画像をつなぎ合わせて、１つの結合画像を作成する。つまり、上記コンピュータにおける前記の画像結合手段によって、各画像の平行移動・回転移動を行い画像のマッチングを判別（パターンマッチング）しながら並べ合わせて（タイリング）、新たな大きな１枚の画像とするのである。パターンマッチングは、
i) 各箇所での撮像画像を並べて（図３）、画像データの処理する順番を決める、
ii) オーバーラッピング量を入れる、
iii) 特徴量の抽出をする（図４）、
iv) パターンの合致箇所を見つけて最終位置（ＸＹ）を決め、画像をつなぐ（図５）
という要領で行う。ここで、iii)の特徴量の抽出は、実画像の一部分から取り出して使用する濃淡パターンマッチング（周囲と輝度が異なる部分に輪郭ができることを利用する方法）とか、この輪郭データに基づく形状ベースパターンマッチングなどの手法を用いる。
【００２６】
4)  培養容器３１中には心筋細胞とそうでない細胞とが混在するので、それらのうちから心筋細胞を区別する。この作業を、上記のコンピュータ内に細胞認識手段として形成した、学習能力のあるニューラルネットワークと差分処理を用いた画像処理によって行う。ニューラルネットワークは、もっともらしい値を色々な統計処理回路を経由して求めていく方法であるので、まず、
i) 得られた実画像で代表的な心筋細胞のコロニーとそうでない部分を教師信号として観察者がコンピュータに入力し、学習のスタートをきる。図６は、心筋細胞のコロニー（丸囲みの部分）とそうでない細胞である背景部分（四角囲みの部分）とを入力する過程を示している。
ii) 学習を経てそのコンピュータが、心筋細胞のコロニーを次々と規定していくと共にその面積計算も行う（図７）。心筋細胞の一つのコロニーが複数の撮像画像間にまたがる場合には、上記3)のタイリング処理により作成された結合画像より当該コロニーを特定する（図８）。
【００２７】
5)  次に、規定されたコロニー内で動いている（ビーティング）細胞と動いていない細胞との識別を行う。この識別は、上記のコンピュータ（画像抽出手段）が、同じコロニー内の画像を複数枚取り込み、上記2)で５回撮像した画像のうち１枚目の画像と２枚目以降の画像の差分処理（画像中の細胞のエッジ、即ち濃淡の変化のある領域につき横差分・縦差分をとり境界線を抽出する方法）を行うことにより実施する。そうして動きのある部分を抜き出してその部分の面積計算を行う（図９）とともに、当該部分を識別した画像をコンピュータが保存する。同じコロニー内の画像データは、多い方が精度的に有利であるが、計算処理時間の短縮のため、数枚の画像で解析する。
【実施例１】
【００２８】
以上に紹介したモニター装置によって心筋細胞の拍動コロニー（ビーティング域）を識別するとともに、熟練観察者の目視によっても同じ心筋細胞の拍動コロニーを識別し、双方で識別された拍動コロニー数の比較を行った。実験の内容と結果等はつぎのとおりである。
【００２９】
（実験）
マウス胚性幹細胞株 EB5（理化学研究所  神戸発生再生科学総合センター  丹羽仁史氏  供与）の未分化維持状態での培養では、0.1％ゼラチンコートしたφ60mm培養皿上で、1％ウシ胎児血清（EQUITECH）、10％Kckout Serum Replacement (GIBCO/BRL)、1％ピルビン酸ナトリウム(Sigma)、1％非必須アミノ酸(GIBCO/BRL)、1％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)、100μM 2-メルカプトエタノール(Sigma)、1000  U/mL  Leukemia Inhibitory Factor (Chemicon International Inc.)および10 μg/mL  ブラストサイジン (FUNAKOSHI)を添加したGlasgow最小必須培地 (GMEM) (GIBCO/BRL) 中で、5％CO2、温度37℃で培養した。未分化ES細胞株EB5から中胚葉系細胞の分化誘導には、EB5細胞を0.1％ゼラチンコートしたφ100mm培養皿上で、10％ウシ胎児血清（GIBCO/BRL）、100μM 2-メルカプトエタノール(Sigma)、100U/mlペニシリン(GIBCO/BRL)、100mg/mlストレプトマイシン(GIBCO/BRL)、100μM 2-メルカプトエタノール(Sigma)を添加したα最小必須培地（α-MEM）（分化培地）中で、5％CO2、温度37℃で5日間培養した。ゼラチンコート培養皿上での分化誘導5日後に、0.05％Tripsin/EDTA液(GIBCO/BRL)にて細胞を回収し、37℃30分間分化培地とともに培養した後、PE標識抗マウスFlk-1抗体（クローン名：Avas12α1、理化学研究所  西川伸一氏供与または日本ベクトン・ディッキンソンより購入）にて染色し、日本ベクトン・ディッキンソン社製FACS AriaにてFlk-1陽性細胞を採取し、6-well culture plateにconfluentな状態になったストローマ細胞株OP9細胞上に播種した（播種密度は1x104/well）。ストローマ細胞株OP9細胞との共培養5-10日後、目視およびモニター装置にて、拍動するコロニー数を測定した。
【００３０】
（結果と考察）
目視観察にて識別した拍動コロニー数と上記モニター装置（観察装置）にて識別したものの数との比較を図１０に示す。同図の縦軸の数字は拍動コロニー数であり、横軸の数字は培養容器３１（図２）の番号である。目視での評価の場合とモニター装置での評価において有意な差は認められなかったが、小型の拍動コロニーを確実に評価する点で、モニター装置の優位性が示唆された。すなわち、目視による評価では小型のコロニーに対する見落としが懸念されるが、モニター装置では見落としがないため、分化誘導初期の心筋細胞が拍動を開始する時点など、拍動面積が小さい時の評価には上記したモニター装置の方が有効であると考えられる。
【実施例２】
【００３１】
心筋特異的プロモーター下に蛍光遺伝子をぶら下げたES細胞の分化実験（心筋のみが蛍光を発している）を行い、上記のモニター装置が識別する拍動エリアと蛍光面積に基づくそれとの比較を行った。この実験の内容と結果等はつぎのとおりである。
【００３２】
（実験）
【００３３】
心筋特異的遺伝子であるαMHCのプロモーター下に赤色蛍光を発するタンパク質であるDs-Redの遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだconstractを作製し、エレクトロポレーション法にてマウス胚性幹細胞株 EB5（理化学研究所  神戸発生再生科学総合センター  丹羽仁史氏  供与）に打ち込みG418による選択後、コロニーを選択し、心筋細胞に分化すると赤色蛍光を発するEB5-αMHC-DsRedを作製した。
EB5-αMHC-DsRedの未分化維持状態での培養は、EB5細胞同様、0.1％ゼラチンコートしたφ60mm培養皿上で、1％ウシ胎児血清（EQUITECH）、10％Kckout Serum Replacement (GIBCO/BRL)、1％ピルビン酸ナトリウム(Sigma)、1％非必須アミノ酸(GIBCO/BRL)、1％ペニシリン−ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)、100μM 2-メルカプトエタノール(Sigma)、1000  U/mL  Leukemia Inhibitory Factor (Chemicon International Inc.)および10 μg/mL  ブラストサイジン (FUNAKOSHI)を添加したGlasgow最小必須培地 (GMEM) (GIBCO/BRL) 中で、5％CO2、温度37℃で培養した。未分化ES細胞株EB5-αMHC-DsRedから中胚葉系細胞の分化誘導には、EB5細胞同様、0.1％ゼラチンコートしたφ100mm培養皿上で、10％ウシ胎児血清（GIBCO/BRL）、100μM 2-メルカプトエタノール(Sigma)、100U/mlペニシリン(GIBCO/BRL)、100mg/mlストレプトマイシン(GIBCO/BRL)、100μM 2-メルカプトエタノール(Sigma)を添加したα最小必須培地（α-MEM）（分化培地）中で、5％CO2、温度37℃で5日間培養した。ゼラチンコート培養皿上での分化誘導5日後に、0.05％Tripsin/EDTA液(GIBCO/BRL)にて細胞を回収し、37℃30分間分化培地とともに培養した後、PE標識抗マウスFlk-1抗体（クローン名：Avas12α1、理化学研究所  西川伸一氏供与または日本ベクトン・ディッキンソンより購入）にて染色し、日本ベクトン・ディッキンソン社製FACS AriaにてFlk-1陽性細胞を採取し、6-well culture plateにconfluentな状態になったストローマ細胞株OP9細胞上に播種した（播種密度は1x104/well）。ストローマ細胞株OP9細胞との共培養7日後、モニター装置にて各コロニーの拍動する面積を算出した。比較対照群として、蛍光顕微鏡下での蛍光観察（撮像）した赤色蛍光画像を画像処理（２値化および蛍光部分の面積測定）し、両者の比較を行った。図１１は、２値化処理したその蛍光画像を示している。
【００３４】
（結果と考察）
図１２は、上記モニター装置にて導き出された拍動エリアと、蛍光観察による撮像結果とを合成した図である。同図の例では、概ね外側に位置する明度の高い線がモニター装置の識別したもので、やや内側に位置する中明度の線が蛍光観察で識別したものである。この図からわかるように、両方式で特定されたエリアは非常に似通っている。２５個のコロニーについて両方式で得られた面積を比較したところ、相関性の高い結果が得られた（図１３。横軸はモニター装置が求めた面積、縦軸は蛍光観察で求められた面積を示す）。両者に多少の相違があるのは、モニター装置が拍動エリア（ビーティング域）の面積を求めているのに対して、蛍光観察では拍動エリアに限らない心筋細胞の面積を求めていることに主として起因すると考えられる。培養中の心筋細胞に関する情報として関心がもたれるのは一般に前者（拍動エリア）であるため、モニター装置による観察結果にそれだけ高い有用性があると考えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】発明のモニター装置について概略構成を示す正面図である。
【図２】図１のモニター装置で使用する培養容器を示す平面図であって、同容器中の撮像範囲（観察視野範囲Ｖ）の移動態様を示す模式図を拡大引出し部分に併記したものである。
【図３】撮像画像を、結合画像にする前に並べた状態を示す図である。
【図４】図３の画像について特徴量の抽出をする過程を示す図である。
【図５】タイリングによって作成した１枚の結合画像を示す図である。
【図６】心筋細胞を区別させるための学習としてニューラルネットワークに入力する画像を示す図である。
【図７】コンピュータが心筋細胞のコロニーを特定した過程を示す図である。
【図８】タイリング処理された結合画像上で心筋細胞のコロニーを特定した過程を示す図である。
【図９】心筋細胞付近で動きのあるビーティング域を特定した過程を示す図である。
【図１０】目視観察にて識別した拍動コロニー数と発明のモニター装置にて識別した拍動コロニー数との比較を示す図である。
【図１１】比較対照群として、蛍光顕微鏡下で蛍光観察（撮像）した赤色蛍光画像を２値化した画像を示す図である。
【図１２】モニター装置にて導き出された拍動エリアと、蛍光観察による撮像結果とを合成した図である。
【図１３】識別されたコロニーの面積について、モニター装置が求めたものと蛍光観察で求められたものとの相関を示す図である。
【符号の説明】
【００３６】
１０  撮像手段
２０  移動手段
３１  培養容器
【図１】
2007121106.tif 000003
【図２】
2007121106.tif 000004
【図３】
2007121106.tif 000005
【図４】
2007121106.tif 000006
【図５】
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【図６】
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【図７】
2007121106.tif 000009
【図８】
2007121106.tif 000010
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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