(57)【要約】【課題】糖類の担体表面への固定化において、非特異吸着の抑制と、表面への強固な固定化を実現する糖類固定化体を提供する。【解決手段】糖類とポリエーテルとからなる糖化合物が、該ポリエーテルを介して担体表面に固定化された糖類固定化体。より具体的には、該糖化合物は、該ポリエーテルを介して共有結合又は生体関連物質間相互作用により担体表面に固定化される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖類とポリエーテルとからなる糖化合物が、該ポリエーテルを介して担体表面に固定化されていることを特徴とする、糖類固定化体。
【請求項２】
固定化が、共有結合により行われることを特徴とする、請求項１に記載の固定化体。
【請求項３】
固定化が、解離定数が１×１０-8以下の生体関連物質間相互作用を用いて行われることを特徴とする、請求項１に記載の固定化体。
【請求項４】
生体関連物質間相互作用がビオチン−アビジン相互作用である請求項３に記載の固定化体。
【請求項５】
糖化合物が、さらにスペーサーを介して担体表面に固定化されていることを特徴とする、請求項１〜４の何れか一項に記載の固定化体。
【請求項６】
スペーサーが、二価の炭化水素基、−Ｓ（硫黄原子）−、−Ｏ（酸素原子）−、カルボニル基、アミノ基、−Ｓｉ（珪素原子）−、マレイミド基、タンパク質及びこれらの組み合わせのいずれかからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の固定化体。
【請求項７】
スペーサーと担体との結合が、金属−Ｓ結合、Ｃ−Ｓｉ結合、Ｏ−Ｓｉ結合、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ結合、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）結合、Ｎ＝Ｃ結合、ＮＨ−ＣＨ結合、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）結合及びトリアゾールのいずれかからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項５又は６に記載の固定化体。
【請求項８】
スペーサーが、二官能性チオール又は二官能性トリアルコキシシランの担体表面への結合により形成されることを特徴とする、請求項５〜７の何れか一項に記載の固定化体。
【請求項９】
ポリエーテルが、これを構成する炭化水素基が２価のアルキレン基、２価のアリーレン基、及びこれらの組み合わせのいずれかからなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項１〜８の何れか一項に記載の固定化体。
【請求項１０】
ポリエーテルが、繰り返し単位が２以上のポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項１〜９の何れか一項に記載の固定化体。
【請求項１１】
糖類とポリエーテルの結合が、エーテル結合、グリコシド結合、硫黄グリコシド結合、Ｎ（窒素原子）グリコシド結合、Ｃ＝Ｎ二重結合、還元アミノ化反応生成物のいずれかからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１〜１０の何れか一項に記載の固定化体。
【請求項１２】
糖類が、単糖類又は多糖類であることを特徴とする、請求項１〜１１の何れか一項に記載の固定化体。
【請求項１３】
糖類が、シアル酸、ガラクトース、グルコース、フコース及びマンノースからなる群より選ばれる単糖若しくはその誘導体又はそれらを含む多糖であることを特徴とする、請求項１〜１２の何れか一項に記載の固定化体。
【請求項１４】
糖類が、置換基を有していてもよいシアル酸の誘導体を非還元末端糖として有することを特徴とする、請求項１〜１３の何れか一項に記載の固定化体。
【請求項１５】
請求項１〜１４の何れか一項に記載の固定化体がセンサー表面を形成していることを特徴とする、センサー。
【請求項１６】
水晶発振子微量天秤、カンチレバー、電界効果トランジスタ、発色、蛍光発光、光干渉、化学発光、表面プラズモン共鳴、光導波路及び表面弾性波からなる群より選ばれる少なくとも何れか一種の検出原理を利用して、検出を行なうものであることを特徴とする、請求項１５に記載のセンサー。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載のセンサーに、前記糖化合物と特異的に相互作用しうる被検出物質を含む検体を接触させ、該センサーと該被検出物質との相互作用を検出することを特徴とする、検体の解析方法。
【請求項１８】
請求項１〜１４の何れか一項に記載の固定化体を、前記糖化合物と特異的に相互作用しうる被検出物質を含有する検体と接触させ、該固定化体と該検体とを分離した後、前記糖化合物と特異的に結合した被検出物質を検出することを特徴とする、検体の解析方法。
【請求項１９】
請求項１〜１４の何れか一項に記載の固定化体を、前記糖化合物と特異的に相互作用しうる被検出物質を含有する検体と接触させ、該固定化体と該検体とを分離した後、前記糖化合物と特異的に結合した被検出物質を取得することを特徴とする、被検出物質の精製方法。
【請求項２０】
担体に磁性体を用いることを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
被検出物質が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、糖類、蛋白質、毒素、糖脂質、オリゴペプチド、ウイルス、細菌、及びそれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも何れか一種であることを特徴とする、請求項１７〜２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１５又は１６に記載のセンサーと、該センサーに検体を接触させるために該検体を供給する検体供給部と、該センサーと該検体の相互作用を検出するための検出部とを有することを特徴とする、検体の検出装置。
【請求項２３】
糖類、ポリエーテル、及びスペーサーを少なくとも備えた機能性分子であって、該ポリエーテルが、一方の片末端において該糖類と、他方の片末端で該スペーサーと結合し、該スペーサーが担体に共有結合もしくは生体関連物質間相互作用により結合しうることを特徴とする分子。
【請求項２４】
糖類を構成する単糖の数が１個以上２０個以下であり、ポリエーテルがこれを構成する炭化水素基が２価のアルキレン基、２価のアリーレン基、及びこれらの組み合わせのいずれかからなる群より選ばれるものであり、スペーサーが有する官能基が、アミノ基、メルカプト基、ビオチン、ヒドロキシカルボニル基、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、マレイミド基、ホルミル基、アジド基、アルコキシシリル基及び金属キレートポリアミンからなる群より選ばれる少なくとも何れか１つの官能基であることを特徴とする、請求項２３に記載の分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖類固定化体及びその利用に関する。詳しくは、糖類とポリエーテルとからなる糖化合物が、そのポリエーテルを介して担体表面に固定化させて得られる糖類固定化体及びそれを用いたセンサー、検体の解析方法、被検出物質の精製方法、検体の検出装置、並びに機能性分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖類が、生体内での果たす役割や、疾患、感染症とのかかわりにおける重要性から注目されている。生体分子と糖類の関係を明らかにすることや、それにより得られた情報を医療や診断などへ応用することは非常に有用である。一例として、生体内での特定の生体分子の濃度や動態を検査する方法や、検体中の細菌、ウイルス、毒素などを検出する方法への応用が考えられる。
【０００３】
検体中の被検出物質の濃度測定やバイオセンサーなどの用途に使用する目的で、固体である担体の表面に被検出物質と結合する能力のある機能性有機分子を固定化したもの（固定化体）が報告されてきた。「リガンド」とも称されるこれらの機能性有機分子としては、蛋白質を使用した例が多数報告されている。蛋白質を固定化した固定化体の用途としては、抗原−抗体反応や、糖類−レクチンの相互作用を利用した目的物質の検出が報告されてきた。
【０００４】
リガンドとして糖類を使用した例も報告されている。糖類を固定化した固定化体の用途としては、ウイルス、細菌、毒素の検出への応用等が報告されている。
担体に糖類を固定化して生体分子との相互作用の解析等を行う場合、重要なことは、糖類を固定化した表面における非特異吸着の抑制と固定化した糖類の安定度である。
一般に機能性分子として糖類を用いる場合には、固定化のために糖類と担体をつなぐ部分が必要である。蛋白質に比べて、糖類のような小分子の固定化ではそのつなぐ部分の割合が相対的に大きくなり、固定化体表面における糖類以外の部分が露出する割合が大きくなる。この露出した部分が非特異吸着と関係すると考えられる。非特異吸着の抑制は、被検出物質の検出を行う場合に、他の共存物の誤認識を低減するために重要である。
【０００５】
また、蛋白質は疎水部を有するために比較的疎水性が強く、疎水性相互作用で固定化することも行われているが、糖類自体は親水性のためにそのような手法はとれない。さらに蛋白質は、アミノ基、ヒドロキシカルボニル基、ジスルフィド基等の官能基を多数有しており、これらを使用して固定化することが容易であるが、糖類では多くの場合水酸基しかなく、固定化のためには官能基を導入する必要があり、適切な誘導体化を行うことが必要という点で困難が付きまとう。
【０００６】
これらの問題を解決するために、例えば、表面修飾の分野でポリエーテルが非特異吸着を抑制することが知られていたことから、これを応用して糖類の一部をポリエーテルとしたリガンドが報告されている（非特許文献１及び２参照）。非特許文献１に記載の固定化体は、糖類の一部をポリエーテルとし、これを疎水結合により担体に結合させたものである。一方、非特許文献２に記載の固定化体は、同様に糖類の一部をポリエーテルとしたリガンドが固定化されているが、予め複数の官能基を付加したポリエーテルを乾燥工程による物理吸着で担体に固定化し、固定化されたポリエーテルに該官能基を介して糖類を結合させることにより作製されている。
【非特許文献１】Pohl et al., J.Am.Chem.Soc., 2005，127，13162-13163
【非特許文献２】Kataoka, K., Langmuir, 2004, 20(26), 11285-11287
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記の通り、担体に糖類を固定化して生体分子との相互作用の解析等を行う場合、非特異吸着の抑制と固定化した糖類の安定度は重要である。
従来、糖化合物の固定化では疎水結合が多用されてきた。その理由としては、固定化する糖化合物に特定の官能基等を導入する工程が容易なために合成工程を簡素化でき、固定化も容易であることが挙げられる。しかし、疎水結合は強固な結合とは言えず、担体への結合が弱いと洗浄や検体との接触中に糖化合物が脱離する可能性があるので、実用上不適切な場合がある。生体分子の検出においては、結合した被検体と遊離の被検体に由来する信号を分離するための洗浄操作等が汎用され、洗浄時や検出時に界面活性剤を使用することも一般的であり、疎水結合のような弱い結合で固定化されている化合物は遊離する可能性がある。
【０００８】
一方、共有結合や生体関連物質間相互作用のような結合が強固で有用であることは知られていたが、糖化合物の合成は一般に難易度が高く、これらの強固な結合を行うための特定の官能基等の導入は工程をさらに煩雑にするものであった。
また、非特異吸着の抑制を目的として分子の一部にポリエーテルを導入することも知られていたが、糖類とポリエーテルを直接結合させた化合物の報告はほとんどなく、また、これにさらに適当な官能基等を結合させ、共有結合等に用い得るように調製された固定化体に好適な糖化合物の合成例はなかった。センサー等に用いるためには、生体中の反応を再現できるように糖類の機能を極力維持した状態で合成及び固定化を行わなければならず、さらに高度な技術を要する。
【０００９】
例えば非特許文献１に記載の固定化体は、糖類の一部をポリエーテルとすることで非特異吸着を抑制しようというものであるが、これを疎水結合を利用して担体へ固定化しているために、その結合力は十分とは言えず、洗浄操作により表面から失われてしまうという問題点を有していた。非特許文献２に記載の固定化体も、ポリエーテルの担体表面への固定化が乾燥による物理吸着法であるので強固とは言えず、また、作製方法が煩雑で、糖類の機能にも影響を及ぼす虞があった。
【００１０】
このように、非特異吸着を抑制することができ、強固な固定化がなされた糖類固定化体の報告は少なく、該固定化に使用するのに好ましい糖化合物の分子構造は明らかになっていなかった。このような問題点を解決した、センサー等の用途に好適に用い得る安定性の高い糖化合物や糖類固定化体の調製が求められていた。
本発明は、以上の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、非特異吸着の抑制と担体表面への強固な固定化を行うことが可能な糖類固定化体と、それを用いたセンサー、検体の検出方法及び検出装置、並びにそれに用いられる機能性分子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題に鑑み、新規な糖類固定化体を鋭意検討した結果、糖類とポリエーテルとからなる糖化合物を、担体表面に共有結合もしくは生体関連物質間相互作用により固定化させて得られる糖類固定化体を用いることにより、非特異吸着の抑制と担体表面への強固な固定化の両方を満足した固定化体の作製が可能となることを見出し、本発明に到達した。得られた固定化体は、これをセンサーとして用いた場合にも十分な感度を有していた。
【００１２】
即ち、本発明によれば、
（１）糖類とポリエーテルとからなる糖化合物が、該ポリエーテルを介して担体表面に固定化されていることを特徴とする、糖類固定化体、
（２）固定化が、共有結合により行われることを特徴とする、上記（１）に記載の固定化体、
（３）固定化が、解離定数が１×１０−８以下の生体関連物質間相互作用を用いて行われることを特徴とする、上記（１）に記載の固定化体、
（４）生体関連物質間相互作用がビオチン−アビジン相互作用である上記（３）に記載の固定化体、
（５）糖化合物が、さらにスペーサーを介して担体表面に固定化されていることを特徴とする、上記（１）〜（４）の何れか一項に記載の固定化体、
（６）スペーサーが、二価の炭化水素基、−Ｓ（硫黄原子）−、−Ｏ（酸素原子）−、カルボニル基、アミノ基、−Ｓｉ（珪素原子）−、マレイミド基、タンパク質及びこれらの組み合わせのいずれかからなる群より選ばれることを特徴とする、上記（５）に記載の固定化体、
（７）スペーサーと担体との結合が、金属−Ｓ結合、Ｃ−Ｓｉ結合、Ｏ−Ｓｉ結合、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ結合、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）結合、Ｎ＝Ｃ結合、ＮＨ−ＣＨ結合、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）結合及びトリアゾールのいずれかからなる群より選ばれることを特徴とする、上記（５）又は（６）に記載の固定化体、
（８）スペーサーが、二官能性チオール又は二官能性トリアルコキシシランの担体表面への結合により形成されることを特徴とする、上記（５）〜（７）の何れか一項に記載の固定化体、
（９）ポリエーテルが、これを構成する炭化水素基が２価のアルキレン基、２価のアリーレン基、及びこれらの組み合わせのいずれかからなる群より選ばれるものであることを特徴とする、上記（１）〜（８）の何れか一項に記載の固定化体、
（１０）ポリエーテルが、繰り返し単位が２以上のポリエチレングリコールであることを特徴とする、上記（１）〜（９）の何れか一項に記載の固定化体、
（１１）糖類とポリエーテルの結合が、エーテル結合、グリコシド結合、硫黄グリコシド結合、Ｎ（窒素原子）グリコシド結合、Ｃ＝Ｎ二重結合、還元アミノ化反応生成物のいずれかからなる群より選ばれることを特徴とする、上記（１）〜（１０）の何れか一項に記載の固定化体、
（１２）糖類が、単糖類又は多糖類であることを特徴とする、上記（１）〜（１１）の何れか一項に記載の固定化体、
（１３）糖類が、シアル酸、ガラクトース、グルコース、フコース及びマンノースからなる群より選ばれる単糖若しくはその誘導体又はそれらを含む多糖であることを特徴とする、上記（１）〜（１２）の何れか一項に記載の固定化体、
（１４）糖類が、置換基を有していてもよいシアル酸の誘導体を非還元末端糖として有することを特徴とする、上記（１）〜（１３）の何れか一項に記載の固定化体
が提供される。
【００１３】
さらに、本発明によれば、
（１５）上記（１）〜（１４）の何れか一項に記載の固定化体がセンサー表面を形成していることを特徴とする、センサー、
（１６）水晶発振子微量天秤、カンチレバー、電界効果トランジスタ、発色、蛍光発光、光干渉、化学発光、表面プラズモン共鳴、光導波路及び表面弾性波からなる群より選ばれる少なくとも何れか一種の検出原理を利用して、検出を行なうものであることを特徴とする、上記（１５）に記載のセンサー
が提供される。
【００１４】
また、本発明の別の態様によれば、
（１７）上記（１５）又は（１６）に記載のセンサーに、前記糖化合物と特異的に相互作用しうる被検出物質を含む検体を接触させ、該センサーと該被検出物質との相互作用を検出することを特徴とする、検体の解析方法、
（１８）上記（１）〜（１４）の何れか一項に記載の固定化体を、前記糖化合物と特異的に相互作用しうる被検出物質を含有する検体と接触させ、該固定化体と該検体とを分離した後、前記糖化合物と特異的に結合した被検出物質を検出することを特徴とする、検体の解析方法、
（１９）上記（１）〜（１４）の何れか一項に記載の固定化体を、前記糖化合物と特異的に相互作用しうる被検出物質を含有する検体と接触させ、該固定化体と該検体とを分離した後、前記糖化合物と特異的に結合した被検出物質を取得することを特徴とする、被検出物質の精製方法、
（２０）担体に磁性体を用いることを特徴とする、上記（１８）又は（１９）に記載の方法、
（２１）被検出物質が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、糖類、蛋白質、毒素、糖脂質、オリゴペプチド、ウイルス、細菌、及びそれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも何れか一種であることを特徴とする、上記（１７）〜（２０）の何れか一項に記載の方法、
（２２）上記（１５）又は（１６）に記載のセンサーと、該センサーに検体を接触させるために該検体を供給する検体供給部と、該センサーと該検体の相互作用を検出するための検出部とを有することを特徴とする、検体の検出装置
が提供される。
【００１５】
さらに別の態様によれば、
（２３）糖類、ポリエーテル、及びスペーサーを少なくとも備えた機能性分子であって、該ポリエーテルが、一方の片末端において該糖類と、他方の片末端で該スペーサーと結合し、該スペーサーが担体に共有結合もしくは生体関連物質間相互作用により結合しうることを特徴とする分子、
（２４）糖類を構成する単糖の数が１個以上２０個以下であり、ポリエーテルがこれを構成する炭化水素基が２価のアルキレン基、２価のアリーレン基、及びこれらの組み合わせのいずれかからなる群より選ばれるものであり、スペーサーが有する官能基が、アミノ基、メルカプト基、ビオチン、ヒドロキシカルボニル基、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、マレイミド基、ホルミル基、アジド基、アルコキシシリル基及び金属キレートポリアミンからなる群より選ばれる少なくとも何れか１つの官能基であることを特徴とする、上記（２３）に記載の分子
が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、糖類化合物を表面に固定化した糖類固定化体であって、非特異吸着が抑制され、担体表面への固定化が強固な固定化体が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではなく、その要旨の範囲内において種々に変更して実施することができる。
［Ｉ．本発明の基本概念］
本発明の固定化体は、糖化合物が共有結合や生体関連物質間相互作用のような強固な結合により固定化されており、通常の保存条件下や、洗浄、固定化体を用いたセンサーによる検体測定条件下での変質を防ぐことができる。また、これらの結合を行う場合には、疎水結合等の場合とは異なり、糖化合物及び担体表面に結合させるための特定の官能基等が必要となるが、担体表面の特定の場所を予め処理することにより特定の領域のみに糖化合物を結合させることが可能となり、固定化担体の作成において糖化合物を固定化する位置を特定できるというメリットもある。
また、糖類とポリエーテルとからなる糖化合物を用いることも本発明の固定化体の大きな特徴の一つである。ポリエーテルを適切に用いていることから、該固定化体は非特異吸着を抑制する効果を有する。
【００１８】
［II．糖類固定化体］
本発明に係る糖類固定化体（以下「本発明の固定化体」もしくは単に「固定化体」等と略称する場合がある。）は、糖類−ポリエーテルの構造を有する糖化合物が、該ポリエーテルを介して担体の表面に固定化されてなるものである。
【００１９】
〔II−１．糖化合物及びスペーサー〕
本発明の固定化体に使用される糖化合物としては、分子内に糖類−ポリエーテル構造を有するものであればその種類に特に制限は無い。
また、糖化合物は、担体への固定化のための官能基（結合基）等を含むスペーサーをさらに有することが好ましい。以下、これらの各構成要素及びその好ましい組み合わせについて詳細に説明する。
【００２０】
＜II−１−１．糖類＞
本発明において「糖類」とは、単糖及びその誘導体（以下これらを総称して「単糖類」という。）、並びに、２以上の単糖類がグリコシド結合で繋がってなる化合物（以下これらを総称して「多糖類」という。）を指す。また、多糖類を「糖鎖」という場合もある。糖類は、天然由来の分子でも合成された分子でもよい。また、天然に存在する分子構造を持つ単糖もしくはそれにより構成される多糖でもよく、それらに官能基の付加や置換等の修飾を加えたものでもよいが、天然に存在する分子構造を持つ単糖もしくはそれにより構成される多糖が好ましい。
【００２１】
・単糖類
単糖の種類は特に制限されず、任意の単糖を使用することが可能である。具体的に、アルドース、ケトースの何れであってもよい。また、その主骨格の炭素数も特に制限されないが、通常３以上、好ましくは４以上、更に好ましくは５以上、また、通常９以下、好ましくは８以下、更に好ましくは６以下である。即ち、ペントース（炭素数５）及びヘキソース（炭素数６）が特に好ましく、中でもヘキソース（炭素数６）が最も好ましい。ペントースの具体例としては、キシロース、リボース、リブロース、キシルロース等が挙げられる。また、ヘキソースの具体例としては、グルコース、マンノース、フルクトース、ガラクトース等が挙げられる。その他の天然由来の糖としては、シアル酸（炭素数９）が好ましい。
【００２２】
また、天然に存在する分子構造を持つ単糖の例としては、グルコサミン、ガラクトサミン、ノイラミン酸等のアミノ糖（グリコサミン）；グルクロン酸、イズロン酸等のウロン酸；グルコン酸等のアルドン酸；グルシトール（ソルビトール）、リビトール、キシリトール等の糖アルコール；オキシリボース、フコース等のデオキシ糖などが挙げられる。また、上述の単糖の窒素原子又は酸素原子上にアセチル基等の置換基を有する自然に存在する分子構造を持つ単糖も使用できる。このようなものとして、窒素原子上にアセチル基などを有する単糖の誘導体の例としては、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、９−Ｏ−アセチル−Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコイルノイラミン酸等のシアル酸などが挙げられる。
【００２３】
なお、上述の単糖及びその誘導体には、各々、Ｄ型及びＬ型という２種類の異性体が存在する（以下、Ｄ型異性体を「Ｄ体」、Ｌ型異性体を「Ｌ体」と略称する）。これらは何れを使用することも可能であり、目的に応じて適宜選択すればよいが、天然での存在比率が大きいＤ体の方が、検体との相互作用を有利に出来る場合が多い。
【００２４】
・多糖類
多糖（糖鎖）とは、上述の様に、単糖類（単糖及びその誘導体）が２つ以上、グリコシド結合で直接繋がったものである。多糖を構成する単糖類の数に特に制限はなく、調製の容易さとその機能など、実用的な観点から選べばよいが、本発明においては、２０個以下の単糖類が直接結合してなる多糖（これを「オリゴ糖」と呼ぶ場合がある。）が特に好適に用いられる。オリゴ糖を構成する単糖類の数は、中でも１０個以下、更には５個以下、特に４個以下、とりわけ３個以下であることが好ましい。
多糖を構成する単糖類の種類は任意であり、目的に応じて、上述の単糖類（単糖又はその誘導体）の中から任意に選択できる。また、多糖は一種類の単糖類から構成されるもの（ホモ多糖、単純多糖）であってもよく、二種類以上の単糖類から構成されるもの（ヘテロ多糖、複合多糖）であってもよい。
また、各単糖類間のグリコシド結合の種類も特に制限されず、α結合、β結合の何れであってもよい。
【００２５】
なお、多糖を構成する単糖類の中でも、特に非還元末端の糖としては、特定の単糖類を用いることが好ましい。具体的には、シアル酸、ガラクトース、ガラクトサミン、グルコース、フコース、マンノース等が挙げられる。その中でもシアル酸、およびガラクトサミンが好ましく、特にシアル酸が好ましい。シアル酸は、ノイラミン酸のアミノ基上や水酸基上に置換基を有するものであるが、その中でも、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコイルノイラミン酸、９−Ｏ−アセチル−５−Ｎ−アセチルノイラミン酸が挙げられる。
【００２６】
非還元末端の糖がシアル酸である多糖（オリゴ糖）は「シアリル糖鎖」と総称される。シアリル糖鎖の例としては、シアリルラクト系糖鎖、シアリルガングリオ系糖鎖、シアリルラクトース糖鎖等が挙げられる。
シアリルラクト系糖鎖としては、Ｉ型及びII型が挙げられ、Ｉ型としては、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６（３）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−及びＮｅｕ５Ａｃα２−６（３）Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１が挙げられ、II型としては、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６（３）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−、及びＮｅｕ５Ａｃα２−６（３）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１が挙げられる。なお、前記式中「２−６（３）」は、糖の結合位置が２−６結合でも２−３結合でもよいことを示し、目的により使い分ければよい。以下記載は同じである。
【００２７】
シアリルガングリオ系糖鎖としては、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６（３）Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃβ１−やＮｅｕ５Ａｃα２−６（３）Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌβ１−や、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６（３）Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−や、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６（３）Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌβ１−が挙げられる。
シアリルラクトース糖鎖としては、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６（３）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−やＮｅｕ５Ａｃα２−６（３）Ｇａｌβ１−３Ｇｌｃβ１−が挙げられる。その他のシアリルラクト系糖鎖としては、９−Ｏ−ＮｅｕＡｃα２−６（３）Ｇａｌβ１−や、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−や、５−Ｎ−グリコイルＮｅｕα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−が挙げられる。
【００２８】
酸性オリゴ糖としては、ＨＯ３Ｓ−３Ｇａｌ１−を非還元末端に持つものが挙げられ、スルファチドに含まれる糖鎖が該当する。
その他のオリゴ糖としては、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇｌｃβ１−や、ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇｌｃβ１−を有するものが挙げられる。
プロテオグリカン及びグリコサミノグリカンとしては、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸等が挙げられる。
上記糖類の中で、上述した単糖類、又は、２０個以下の単糖類が直接結合してなる多糖を有するものが好ましく、シアル酸、ガラクトース、グルコース、フコース及びマンノースからなる群より選ばれる単糖若しくはその誘導体又はそれらを含む多糖を有するものがとりわけ好ましい。
【００２９】
＜II−１−２．ポリエーテル＞
本発明の固定化体に用いる糖化合物は、上記糖類（単糖類又は多糖類）と、ポリエーテルとからなり、これらが直接結合していることを特徴としている。固定化する糖化合物は、糖以外の部分で非特異吸着を起こさず、親水性の高いものを用いることが好ましく、この観点からポリエーテルが選択された。また、糖類に直接ポリエーテルを結合させることで、糖類の機能に影響を与える事なく非特異吸着の要因を排除し、かつ固定化の能力を有する化合物とすることが出来る。
【００３０】
本発明で用いられるポリエーテルとは、２価の炭化水素基が複数、酸素原子を介して交互に結合してなるものである（以下これらを「ポリエーテル基」と称することがある）。これを構成する２価の炭化水素基はアルキレン基又はアリーレン基から選ばれる少なくとも一種類の基を含むポリエーテル基が好ましく、これらの組み合わせよりなるものでもよい。特に、アルキレン基からなるものが好ましい。
【００３１】
ポリエーテル基の構成単位となる２価の炭化水素基の炭素数は、通常２以上が好ましく、また、通常１２以下、中でも６以下、更には４以下、特に３以下が好ましく、炭素数２が最も好ましい。このような２価の炭化水素基としては、ヘキサデシレン基（−ｎ−Ｃ16Ｈ32−）、ペンタデシレン基（−ｎ−Ｃ15Ｈ30−）、テトラデシレン基（−ｎ−Ｃ14Ｈ28−）、トリデシレン基（−ｎ−Ｃ13Ｈ26−）、ドデシレン基（−ｎ−Ｃ13Ｈ26−）、ウンデシレン基（−ｎ−Ｃ11Ｈ22−）、デシレン基（−ｎ−Ｃ10Ｈ20−）、ノニレン基（−ｎ−Ｃ9Ｈ18−）、オクチレン基（−ｎ−Ｃ8Ｈ16−）、ヘプチレン基（−ｎ−Ｃ7Ｈ14−）、ヘキシレン基（−ｎ−Ｃ6Ｈ12−）、ペンチレン基（−ｎ−Ｃ5Ｈ10−）、ブチレン基（−ｎ−Ｃ4Ｈ8−）、プロピレン基（−ＣＨ3ＣＨ6−）、エチレン基（−ＣＨ2ＣＨ4−）が好ましく、中でもブチレン基、プロピレン基、エチレン基が好ましく、特にはプロピレン基、エチレン基が好ましく、中でも特にエチレン基が好ましい。エチレン基は、親水性が最も高く、非特異吸着を起こしにくい場合が多いためである。
【００３２】
また、ポリエーテル基の構成単位となる炭化水素基は、置換基を有していてもよい。置換基としては、炭化水素基、アミノ基、ハロゲン原子、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミノカルボニル基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、アルキルカルボニル基が挙げられる。炭化水素基が有する置換基は１つであっても２つ以上であってもよく、２つ以上の置換基を有する場合には、それらの置換基は互いに同じものであってもよく、異なっていてもよい。なお、これらの置換基が糖化合物の固定化時に望ましくない副反応を起こしたりすることは避ける、或いは最小限にとどめるように選択することが好ましく、固定化条件や官能基との関係で選べばよい。経済的には、置換基の無いものが好ましい場合が多い。
【００３３】
ポリエーテル基を構成する複数の炭化水素基は、置換基を有する場合にはその置換基も含め、互いに同じものであってもよく、異なっていてもよい。製造上の容易性の観点からは、構成単位が全て同じであることが好ましいが、検体との相互作用の強さ、親水性／疎水性の性質、非特異吸着、耐性などの目的とする機能との兼ね合いで選べばよい。経済的には、同じ物である方が好ましい場合が多い。
【００３４】
ポリエーテル基を構成する炭化水素基の数（ポリエーテル基の繰り返し単位の数）は特に制限されず、炭化水素基の種類とポリエーテル全体の長さに応じて選択すればよいが、通常２以上、好ましくは３以上、特に好ましくは４以上、その中でも特に好ましくは５以上である。また、通常５０以下、好ましくは２０以下、更に好ましくは８以下、特に好ましくは６以下の範囲である。
【００３５】
ポリエーテル基の長さについては、ポリエーテル基が長すぎると、機能性を有する糖類の部分がポリエーテル基に覆われてしまい、反応条件によっては検体との相互作用に支障をきたす場合がある。一方、ポリエーテル基が短すぎると、受容体と相互作用するに十分な長さとならない場合がある。ポリエーテルの長さは、主鎖の原子数で、通常８以上、更には１１以上、特に１４以上、通常６０以下、中でも４５以下、更には３６以下、特に２４以下の範囲とすることが好ましい。糖が単糖の場合は、多糖の場合に比べ、その大きさが小さいことから、長いポリエーテルが好ましく、主鎖の原子数で、通常１１以上、更には１４以上、特に１７以上、通常６０以下、中でも４５以下、特に２４以下の範囲とすることが好ましい。但し、本態様におけるポリエーテル基の長さとは、担体に結合する官能基の原子から糖類に結合するポリエーテル基末端の原子まで、共有結合を順に辿った場合における最短経路上の原子の数と定義する。
【００３６】
上記のうち、本発明の糖類固定化体には、繰返し単位が２以上のポリエチレングリコールが好ましく用いられ、その中でも繰返し単位が３以上のポリエチレングリコールが好ましく用いられ、その中でも繰返し単位が４以上のポリエチレングリコールが特に好ましく用いられ、繰返し単位が５以上のポリエチレングリコールが最も好ましく用いられる。ポリエチレングリコールの繰り返し単位は上限に制限は無いが、繰返し単位が２００以下のポリエチレングリコールが好ましく用いられ、その中でも繰返し単位が１００以下のポリエチレングリコールが好ましく用いられ、その中でも繰返し単位が５０以下のポリエチレングリコールが特に好ましく用いられ、繰返し単位が１４以下のポリエチレングリコールが最も好ましく用いられる。
【００３７】
ポリエーテルは、一方の片末端において糖類と結合し、他方の片末端で担体もしくは後述するスペーサーと結合する。
糖類とポリエーテルの結合は、例えば、エーテル結合、グリコシド結合、硫黄グリコシド結合、Ｎ（窒素原子）グリコシド結合、Ｃ＝Ｎ二重結合等により形成される。また、還元アミノ化反応生成物であってもよい。Ｃ＝Ｎ二重結合および還元アミノ化反応生成物は、糖の還元末端と、末端にアミノ基を有するポリエーテルの反応により得られる。
【００３８】
ポリエーテルは、糖類のどの位置で結合していてもよい。糖化合物内で糖類−ポリエーテル結合が存在する位置は、機能発現に深くかかわる部位からは遠いほど目的にはかなうが、調製の容易さ等の観点も鑑みて選択すればよい。例としては、アノマー位と呼ばれる炭素原子や、それ以外の位置がありうるが、アノマー位でポリエーテルと結合（グリコシド結合）している事が好ましく、多糖の場合は、グリコシド結合もしくは還元的アミノ化反応により還元末端の糖が開環する形式で結合していることが好ましい。
【００３９】
糖類とポリエーテルとがグリコシド結合している場合、糖類のアノマー位炭素に結合する原子が、ポリエーテルの末端の原子として共用されることになる。この原子（これを以下「結合原子」という。）の例としては、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、炭素原子が挙げられる。中でも、酸素原子、硫黄原子、窒素原子が好ましく、酸素原子、硫黄原子が特に好ましく、酸素原子が最も好ましい。この場合、糖化合物の構造は「糖類−［結合原子］−ポリエーテル−［官能基］」となる。
【００４０】
＜II−１−３．スペーサー＞
本発明の糖類固定化体においては、糖類とポリエーテルとからなる糖化合物が、該ポリエーテルを介して担体に固定化されているが、該糖化合物はさらにスペーサーを介して固定化されることが好ましい。すなわち、この場合、固定化体の構造は「糖類−ポリエーテル−スペーサー−担体」である。
【００４１】
本明細書においてスペーサーとは、上記の構造においてポリエーテルと担体とを結合させる能力を有するもの全てを包含する。ここでいう結合とは、好ましくは共有結合もしくは生体関連物質間相互作用を利用する結合である。
共有結合とは、原子同士が電子を共有することによって、それぞれの原子が閉殻構造を取り安定化することにより生ずる結合である。したがってその原子同士の結合は非常に強固である。生体関連物質間相互作用とは、天然の生体内に存在する生体物質もしくはそれを原料とし合成されるものと、有機化合物との間に生じる強固な親和力であって、本明細書においては、その解離定数が１×１０−８以下以下であるものを指す。該生体関連物質間相互作用を示す物質の組み合わせには多くの種類があるが、特に１×１０−１４以下のものが好ましく、例えば、ビオチン−アビジン結合等が挙げられる。
【００４２】
スペーサーとしては、例えば、二価の炭化水素基、−Ｓ（硫黄原子）−、−Ｏ（酸素原子）−、カルボニル基、アミノ基、−Ｓｉ（珪素原子）−、マレイミド基、タンパク質及びこれらの組み合わせからなるもの等が挙げられる。このようなスペーサーを用いて形成されるスペーサーと担体との結合としては、例えば、金属−Ｓ結合、Ｃ−Ｓｉ結合、Ｏ−Ｓｉ結合、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ結合、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）結合、Ｎ＝Ｃ結合、ＮＨ−ＣＨ結合、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）結合及びトリアゾール等が挙げられる。また、二官能性チオール又は二官能性トリアルコキシシランの担体表面への結合により形成される構造を有するスペーサーも用いられる。
【００４３】
より具体的には、共有結合による固定化に用いられるスペーサーとしては、官能基のみを使用する場合や、蛋白質、ジエノファイル等を利用する場合が挙げられる。例えば、該官能基としては、アミノ基、アジド基、メルカプト基、ジスルフィド基、ヒドロキシカルボニル基、マレイミド基、ホルミル基、アルコキシシリル基、水酸基、ビニル基、アセチレン基、ブタジエニル基、オキシエチレン基等が挙げられ、これらの中でもアミノ基、アジド基、メルカプト基、ビニル基等が好適であり、さらにはアミノ基、もしくはアジド基が好適であり、特にアミノ基が好適である。蛋白質としては、アビジン、アルブミン等が例示され、アビジンの場合は、その種類に制限は無いが、ストレプトアビジンが好ましい。アルブミンではウシ血清アルブミン（bovine serum albumin：以下「ＢＳＡ」と略することがある。）、ブタ血清アルブミン（pig serum albumin：以下「ＰＳＡ」と略することがある。）が好ましく、特にＢＳＡが好ましい。また、ジエノフィルとしては、例えば、アセチレン基等が例示される。
【００４４】
例えば、スペーサーとして前記した２価の炭化水素基を選択し、これを担体と共有結合させる場合には、糖化合物の構造は、［糖類］−［ポリエーテル基］−［炭化水素基］−［共有結合のための官能基］という構造になる。このような糖化合物において炭化水素基として炭素数が多い２価の炭化水素基を用いれば、官能基と担体の材質との組み合わせを適切に選択することにより、糖化合物を担体と接触させるだけで、炭化水素基の部分が単分子膜を形成することになる。従って、後述のように担体表面に単分子膜を形成した後に糖化合物を固定化する工程に比較して、固定化の工程を簡素化することが可能となる。このような二価の炭化水素基の炭素数は４以上が好ましく、特に６以上が好ましく、その中でも特に１０以上が好ましい。また、糖化合物が担体に固定化されたとき、［糖類］−［ポリエーテル基］−［炭化水素基］−［担体］という構造をとることとなり、炭化水素基はポリエーテル基で被われているのと同様の状態となる。従って、得られた本発明の固定化体をセンサー等に使用する場合に、非特異吸着をさらに低減することが可能となる。また、このような糖化合物は、水中ではリポソームを形成するので、それをそのまま担体に結合させてもよいし、担体と接触させて単分子膜を形成させることにより、担体に結合させてもよい。
【００４５】
また、この場合ポリエーテルに結合させる２価の炭化水素基の炭素数は、通常２以上であり、また、通常２０以下、中でも１６以下、更には１２以下、特に６以下が好ましい。このような２価の炭化水素基としては、ヘキサデシレン基、ペンタデシレン基、テトラデシレン基、ドデシレン基、ウンデシレン基、デシレン基、ノニレン基、オクチレン基、ヘプチレン基、ヘキシレン基、ペンチレン基、ブチレン基、プロピレン基、エチレン基、フェニレン基、ビフェニレン基、ナフチレン基などが挙げられる。中でもデシレン基、ブチレン基、プロピレン基、エチレン基、フェニレン基、ビフェニレン基、ナフチレン基などが好ましく、その中でもデシレン基、ブチレン基、プロピレン基、エチレン基が特に好ましい。
【００４６】
メルカプト基又はジスルフィド基は、担体の表面に金、銀や白金等の金属が存在する場合の官能基として好適に用いられる。例えば、官能基としてメルカプト基又はジスルフィド基を有するスペーサーが担体表面の金と接触すると、金原子−硫黄原子結合が生じ、これによって糖化合物が担体表面に固定化される。
また、ビニル基、アセチレン基、ブタジエニル基、オキシエチレン基は、担体表面がシリコン等で形成されている場合の官能基として好適に用いられる。官能基としてこれらの基を有するスペーサーが担体表面のシリコンと接触すると、シリコン表面のＳｉ−Ｈ基との反応によりＳｉ−アルキル基が形成され、これによって糖化合物が担体表面に固定化される。
【００４７】
生体関連物質間相互作用による固定化に用いられるスペーサーとしては、小分子もしくは蛋白質等が挙げられる。小分子としては、例えば、ビオチン、金属キレートポリアミン基、ポリヒスチジン、フラグタグ、グルタチオン等の、前記したような解離定数で蛋白質と強固に結合する分子が例示されるが、その中でもビオチンが好適である。蛋白質としては、アビジン、ＧＳＴ蛋白等が挙げられ、その中でもアビジンが好ましく、さらにその中でもストレプトアビジンが好ましい。ポリヒスチジン、フラグタグ、グルタチオンはオリゴペプチドであり、その中でもポリヒスチジンおよびグルタチオンが好ましく用いられる。
これらのスペーサーの例は、下記具体例及び固定化方法の説明において、さらに詳述する。
【００４８】
＜II−１−４．糖化合物及びスペーサーの具体例＞
本発明の糖類固定化体に使用される糖化合物及びスペーサーの中でも特に好ましい具体例を以下に示す。これらは、スペーサーに含まれる官能基により担体表面に固定化される。但し、本発明はその要旨を超えない限り、以下の例によって限定されるものではない。また、以下の式中、「Ｍｅ」はメチル基を表わし、「Ｅｔ」はエチル基を表わし、「Ａｃ」はアセチル基を表わす。
【００４９】
【化１】
2007298334.tif 000002
【００５０】
【化２】
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【００５１】
【化３】
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【００５２】
【化４】
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【００５３】
【化５】
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【００５４】
【化６】
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【００５５】
【化７】
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【００５６】
【化８】
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【００５７】
【化９】
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【００５８】
【化１０】
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【００５９】
【化１１】
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【００６０】
【化１２】
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【００６１】
また、糖化合物を担体に固定化した状態における構造の具体例を以下に示す。なお、構造式の右端には担体表面の原子が表示されている（「Ａｕ」もしくは「Ｓｉ−Ｏ」がそれに該当する）。 
【００６２】
【化１３】
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【００６３】
【化１４】
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【００６４】
アビジンを金表面に作成された自己組織膜にアミド結合で固定化し、さらにビオチンアビジン相互作用にて糖化合物を固定化したものを示す。自己組織膜を構成する１６−メルカプトパルミチン酸由来の部分は代表的に３つ例示した。
【００６５】
【化１５】
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【００６６】
〔II−２．担体〕
本発明の固定化体に使用される担体の材料に特に制限はなく、上述の糖化合物を固定化できるものであれば、任意の材料を用いることが可能である。例としては、ガラス、水晶、シリコン、金属、金属酸化物、プラスチック等が挙げられる。これらの材料は、通常は固定化体の用途や糖化合物の種類、用いる結合方法等に応じて適宜使い分ければよい。
【００６７】
例えば、本発明の固定化体をＱＣＭ（Quartz Crystal Microbalance：水晶発振子微量天秤）センサーに使用する場合であれば、担体材料としては水晶や金などが好適に使用される。
また、本発明の固定化体をＦＥＴ（field-effect transistor：電界効果トランジスタ）センサーに使用する場合であれば、担体材料としては金やシリコンや官能基化されたカーボンナノチューブなどが好適に使用される。
【００６８】
また、本発明の固定化体をＳＰＲ（Surface Plasmon Resonance：表面プラズモン共鳴）センサーに使用する場合であれば、担体材料としては金などが好適に使用される。
また、本発明の固定化体をＭＥＭＳ（Micro-Electro-Mechanical Systems）技術によるセンサーに使用する場合であれば、担体材料としてはシリコンなどが好適に使用される。
また、磁性粒子へ本発明の糖化合物を固定化して使用する場合であれば、担体材料としては金属酸化物などの磁性体が好適に使用される。
【００６９】
また、本発明の固定化体をＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay：酵素免疫検定法）用途に使用する場合であれば、担体材料としてはプラスチックやガラスなどが好適に使用される。
なお、以上列記した担体材料を、別の材質からなる支持体上に固定化し、これを担体として目的の糖化合物を固定化してもよい。例えば、ＳＰＲセンサー用途であれば、ガラスやプラスチックからなる支持体上に金薄膜を形成し、これを担体として用いることができる。また、ＱＣＭセンサー用途であれば、水晶からなる支持体上に金薄膜を成膜し、これを担体として使用できる。
【００７０】
また、プラスチックを担体材料として使用する場合には、プラスチックの表面にアミノ基等の官能基を固定化する（官能基化する）ことにより、後述する方法で糖化合物を固定化することが可能である。このような例としては、M. Schwarz et al., Glycobiology, 2003年, Vol.13, No.11, pp.749-754に例示されている。
担体の形状については特に制限は無く、固定化体の機能や用途等に応じて適宜選択すれば良い。例としては、平板状、粒子状等が挙げられる。また、担体の寸法についても特に制限は無く、機能性や経済性などを加味して選択すればよい。例えば、支持体上に金を成膜し、これを担体として用いる場合には、金薄膜の厚さは通常１ｎｍ以上、中でも５ｎｍ以上、また、通常１０μｍ以下、中でも１μｍ以下の範囲が好ましい。
【００７１】
担体を粒子状とすると、糖化合物と特異的に結合する被検出物質の分離精製あるいはそれを応用した検出に有用な場合がある。このような粒子の材質としては、例えば、ポリマー、金属、金属酸化物、あるいはこれらの複合物等が挙げられる。ポリマーとしては、ラテックス、ポリエステル、ポリアミド等が挙げられる。金属としては、金、銀、白金、鉄、錫、希土類金属を含むものが挙げられる。強磁性を有するものとしては、鉄や希土類金属を含むものが好適であり、その中でも特に鉄を含む合金が好適である。強磁性を有しないものとしては、金、銀、白金が好適であり、中でも金を含むものが好適である。
【００７２】
抗原抗体反応の検出等に汎用される市販の不溶性担体を用いることもできる。例えば、磁性粒子、ポリスチレン等の高分子またはそのラテックス、ゼラチン、リポソーム等が好ましく用いられる。中でも、磁力を応用した迅速簡便な固液分離を実現する観点においては磁性粒子が特に好ましく、具体的には、例えば、四酸化三鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、三酸化二鉄（Ｆｅ２Ｏ３）、種々のフェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる微粒子等の磁性粒子が好ましく用いられる。また、これらの磁性粒子を、ポリスチレン等の高分子のラテックスや、ゼラチン、リポソーム等の内部に含まれる形で調製したり、表面に固定化したものを好ましく用いることができる。
【００７３】
〔II−３．糖化合物の固定化の手法〕
以上説明した担体に本発明の糖化合物を固定化する手法としては、例えば以下の（ｉ）〜（ｖ）の手法が挙げられる。
（ｉ）担体表面に糖化合物を直接もしくは前記スペーサーを介して固定化する方法。
（ii）担体表面に形成された自己組織化膜に糖化合物を直接もしくは前記スペーサーを介して固定化する方法。
（iii）担体表面に形成された自己組織化膜の表面に固定化された高分子等を用いて、糖化合物を直接もしくは前記スペーサーを介して固定化する方法。
（iｖ）担体表面に蛋白質等を固定化し、この蛋白質等に糖化合物を直接もしくは前記スペーサーを介して固定化する方法。
（ｖ）その他。
【００７４】
以下、（ｉ）〜（ｖ）の各手法について説明する。
（ｉ）担体表面に糖化合物を直接もしくは前記スペーサーを介して固定化する方法
本発明の糖化合物を担体表面に直接固定化する場合、使用できる結合及び反応としては、金属−硫黄原子結合、Ｏ−Ｓｉ結合、エステル結合、アミド結合、ビオチン−アビジン結合、シッフ塩基化反応、還元アミノ化反応、ヒドロシリル化反応、ディールス・アルダー反応、アジド基とアセチレン基との反応等が挙げられる。この中でも、金属−硫黄原子結合、アミド結合、ビオチン−アビジン結合、シッフ塩基化反応が好適であり、その中でも特に金属−硫黄原子結合、アミド結合が好適であり、その中でもさらに特に金属−硫黄原子結合が好適である。
【００７５】
また、本発明の糖化合物を担体表面に固定化する手法としては、スペーサーに含まれる官能基としてメルカプト基を有する糖化合物を用い、金もしくは銀もしくは白金原子を有する担体表面に対して、金属原子−硫黄原子結合により固定化する手法や、官能基としてアルコキシシリル基を有する糖化合物を用い、ガラスや水晶等からなる担体表面のＳｉ−ＯＨ基と反応させ、Ｏ−Ｓｉ結合を形成させることにより固定化する手法や、官能基としてビニル基、アセチレン基、ブタジエニル基、オキシエチレン基等を有する糖化合物を用い、シリコンからなる担体表面に対して反応させ、Ｓｉ−Ｃ結合を形成させることにより固定化する手法などが挙げられる。金属原子−硫黄原子結合により固定化する手法では、金原子−硫黄原子結合により固定化する手法が好適である。官能基としてアルコキシシリル基を有する糖化合物においては、官能基としてトリエトキシキシシリル基が好適である。
【００７６】
また、スペーサーとして２価の炭化水素基を選択した場合は、前記の通り糖化合物の構造は、［糖類］−［ポリエーテル基］−［炭化水素基］−［共有結合のための官能基］となり、特定の炭化水素数においては、２価の炭化水素基が自己組織化膜を形成することもありうる。このような炭化水素基を選択することにより、後述するような予め自己組織化膜を形成させておく工程を省くことができる。
【００７７】
また、アジド基とアセチレン基との反応を利用する場合には、官能基としてアジド基を有する糖化合物を用い、金、ガラス、シリコン、プラスチック等の担体表面に存在するアセチレン基に対して１，３−環化付加反応を生じさせ、対応するトリアゾールを形成させることにより、糖化合物の固定化が可能である。このような例としては、C-H. Wong et al., Journal of the American Chemical Society, 2002年, Vol.124, No.48, pp.14397-14402等に例示されている。
担体表面に固定化された糖化合物の固定化層の担体表面からの厚さに制限はないが、通常１ｎｍ以上、また、通常１００μｍ以下、中でも１０μｍ以下、更には１０００ｎｍ以下、特に１００ｎｍ以下の範囲が好ましい。
【００７８】
（ii）担体表面に形成された自己組織化膜に糖化合物を直接もしくは前記スペーサーを介して固定化する方法
担体表面に自己組織化膜（Self-Assembled Monolayer：以下「ＳＡＭ」と略する場合がある。）を形成する方法としては、例えば、金もしくは銀もしくは白金原子を有する担体表面に対してチオールやジスルフィドを有する化合物を反応させる方法や、ガラスや金属酸化物からなる担体表面に対してアルコキシシリル基やクロロシリル基を有する化合物を反応させる方法などが挙げられる。これら自己組織化膜の作製に使用される化合物は、末端官能基を有していてもよく、このような末端官能基としては、ヒドロキシカルボニル基、スクシンイミドカルボニル基、アミノ基、水酸基が挙げられる。金属原子−硫黄原子結合により固定化する手法では、金原子−硫黄原子結合により固定化する手法が好適である。官能基としてアルコキシシリル基を有する糖化合物においては、官能基としてトリエトキシシリル基が好適である。
【００７９】
また、担体表面に形成された自己組織化膜に糖化合物を結合させる方法としては、例えば、金原子を有する担体表面にω−ヒドロキシカルボニルα−チオール又はビス（ω−ヒドロキシカルボニルアルキル）ジスルフィドを自己組織化し、得られた自己組織化膜のヒドロキシカルボニル基に対して、アミド結合やエステル結合、アジド基との反応等を用いて糖化合物を固定化する方法などが挙げられる。ω−ヒドロキシカルボニルα−チオールの例としては、１６−メルカプトパルミチン酸、１４−メルカプトミリスチン酸、１２−メルカプトラウリン酸、１１−メルカプトウンデカン酸、１０−メルカプトカプリン酸、９−メルカプトペラルゴン酸、８−メルカプトカプリル酸、７−メルカプトエナント酸、６−メルカプトカプロン酸、５−メルカプト吉草酸、４−メルカプト酪酸、３−メルカプトプロピオン酸等が挙げられる。ビス（ω−ヒドロキシカルボニル）ジスルフィドの例としては、４，４’−ジチオ二酪酸（4,4'-Dithiodibutyric acid）等が挙げられる。
【００８０】
自己組織化膜への糖化合物の固定化時には、様々な縮合剤を使用することが可能であるが、中でも、自己組織化膜が有するヒドロキシカルボニル基を一旦Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（N-hydroxysuccinimide：以下適宜「ＮＨＳ」と略する。）化した後に、糖化合物のアミノ基と反応させアミド化する方法が好ましい。ＮＨＳ化の際には、ＮＨＳに加え、縮合剤として１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidehydrochloride：以下適宜「ＥＤＣ」と略する。）を併用することが出来る。但し、自己組織化膜の作製時に、末端がＮＨＳ化されたカルボニル基を有するチオール若しくはジスルフィドを用いれば、このＮＨＳ化の工程は不要となる。
【００８１】
また、金原子を有する担体表面へω−アミノα−チオール若しくはビス（ω−アミノアルキル）ジスルフィドを自己組織化した場合は、担体表面がアミノ基となり、糖化合物のヒドロキシカルボニル基のアミド結合による固定化や、糖化合物のホルミル基のシッフ塩基結合や還元アミノ化反応による固定化が出来る。本アミド化においても様々な反応剤を使用することが可能であるが、糖化合物のヒドロキシカルボニル基を先にＮＨＳ化する方法も可能である。シッフ塩基で結合する場合は、脱水剤を使用してもよい。還元アミノ化反応は、生成したシッフ塩基を還元し炭素原子−窒素原子間を一重結合とするものであり、還元試薬としては水素化シアノホウ素ナトリウム、ジボラン、ピコリンボランなどが好適である。還元アミノ化反応時においては、還元試薬は最初から共存させても、シッフ塩基生成後に共存させてもよい。
【００８２】
担体上の自己組織化膜は、糖化合物と結合させる前に官能基変換を行なってもよい。このような方法として、アミノ基のホルミル基への変換や、ヒドロキシカルボニル基のＮＨＳカルボニル基、アビジンへの変換や、水酸基のホルミル基への変換、ＮＨＳカルボニル基、アビジンへの変換などが挙げられる。これらの変換は、試薬を用いて行なってもよく、２官能性の化合物と反応させることにより実施してもよい。このような例としては、担体表面がアミノ基である自己組織化膜にグルタルアルデヒドを反応させるという手法が挙げられる。この場合、アミノ基と反応した部分はシッフ塩基又はアミノメチレン基となり、未反応官能基はホルミル基のまま残存するため、アミノ基を有する糖化合物の固定化に使用することが可能である。
【００８３】
アルコキシシリル基やクロロシリル基を有する化合物を、ガラスや金属酸化物等からなる担体表面と反応させる方法においては、Ｓｉ（ガラス）−Ｏ−Ｓｉや、金属原子−Ｏ−Ｓｉの形式で担体表面に固定化することが出来る。このような反応剤としては、アミノプロピルトリエトキシシランなどが挙げられる。
糖化合物の末端の官能基としてジエンを使用した場合は、自己組織化膜に含まれるジエノファイルとディールス・アルダー反応させることにより、糖化合物の固定化が可能である。ジエンとしてはシクロペンタジエニル基が挙げられ、ジエノフィルとしてはキノンが挙げられる。このような例は、M. Mrksih et al., Chemistry & Biology, 2002年, Vol.9, pp.443-454に例示されている。
【００８４】
糖化合物の末端の官能基としてマレイミド基を使用した場合は、自己組織化膜に含まれるω−メルカプト基と糖化合物のマレイミド基の炭素−炭素間二重結合（Ｃ＝Ｃ）とを反応させることにより、糖化合物の固定化が可能である。このような例は、I. Shin et al., Angewandte Chemie [International Edition], 2002年, Vol.41, No.17, pp.3180-3182に例示されている。
【００８５】
糖化合物の末端の官能基としてジエンを使用した場合は、自己組織化膜に含まれるジエノファイルとディールス・アルダー反応させることにより、糖化合物の固定化が可能である。ジエンとしてはシクロペンタジエニル基が挙げられ、ジエノフィルとしてはキノンが挙げられる。このような例は、M. Mrksih et al., Chemistry & Biology, 2002年, Vol.9, pp.443-454に例示されている。
【００８６】
糖化合物の末端の官能基としてアジド基を使用した場合は、自己組織化膜に含まれるアセチレン基と反応させることにより、トリアゾールを形成し糖化合物の固定化が可能である。また、逆に糖化合物の末端の官能基としてアセチレン基を使用し、自己組織化膜の官能基をアジド基とすることも可能である。
【００８７】
（iii）担体表面に形成された自己組織化膜の表面に固定化された高分子等を用いて、糖化合物を直接もしくは前記スペーサーを介して固定化する方法
固体表面に作製された自己組織化膜に高分子を固定化し、その高分子に糖化合物を固定化する場合、使用できる高分子の種類に特に制限は無いが、例としては多糖類や有機ポリマーが挙げられる。多糖類の例としては、アガロース、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、セルロース等が挙げられる。有機ポリマーの例としては、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド等が挙げられる。これらの官能基は、メチル化などの誘導体化処理をなされていてもよい。
【００８８】
高分子へ、糖化合物を固定化するための結合としては、一般的な結合が利用できる。例としては、エステル結合、アミド結合、シッフ塩基化反応、還元アミノ化反応、ディールス・アルダー反応、アジド基−アセチレン基反応等が挙げられる。このような手法の例として、糖化合物をニトロセルロース膜に固定化する手法が、T. Feizi et al., Nature Biotechnology, 2002年, Vol.20, pp.1011-1017に例示されている。
【００８９】
（iｖ）担体表面に蛋白質等を固定化し、この蛋白質等に糖化合物を直接もしくは前記スペーサーを介して固定化する方法
担体表面の官能基を利用し、タンパク質を共有結合により固定化し、固定化されたタンパク質に糖化合物を固定化することも可能である。このような担体材料としては、プラスチック、金属、ガラスが挙げられるが、プラスチック若しくは金属が好ましい。プラスチックの中では、特にポリスチレンが好ましい。金属の中では、特に金が好ましい。
【００９０】
タンパク質を共有結合により固定化する方法としては、前述の方法により、担体表面をヒドロキシカルボニル基とした後に、ＮＨＳ化し、蛋白質中のアミノ基とアミド結合を形成する方法が挙げられる。担体表面は前述の方法により自己組織化膜により官能基変換されていてもよい。蛋白質としては、非特異吸着を起こしにくいものが好ましい。具体的にはアルブミンもしくはアビジンが好適である。固定化された蛋白質に糖化合物を固定化する方法としては、蛋白質上のヒドロキシカルボニル基をＮＨＳ基に変換した後に、糖化合物のアミノ基と反応させアミド結合とする方法が例示される。さらに蛋白質がアビジンの場合は、ビオチンを有する糖化合物の使用によりビオチンーアビジン結合により固定化することも出来る。アルブミンではウシ血清アルブミン（bovine serum albumin：以下適宜「ＢＳＡ」と略する。）、ブタ血清アルブミン（pig serum albumin：以下適宜「ＰＳＡ」と略する。）が好ましく、特にＢＳＡが好ましい。アビジンの種類に制限は無いが、ストレプトアビジンが挙げられる。このような例としては、H. Seeberger, Angewandte Chemie [International Edition], 2002年, Vol.41, No.19, pp.3583-3586に例示されている。タンパク質の固定化の方法は緩衝溶液若しくは純水に溶かしたタンパク質を、適切な温度にて適切な時間、官能基された担体に接触させればよいが、緩衝溶液の使用が好ましい。このような方法としては、W. G. T. Willats et al., Proteomics, 2002年, Vol.2, pp.1666-1671に例示されている。また、アビジンは、担体表面をビオチン化した後にビオチンーアビジン相互作用により固定化してもよい。
【００９１】
（ｖ）その他：
その他の手法として、例えば、糖化合物を結合させたモノマーを用い、これを重合させて得られた重合体を担体表面に固定化する、という手法などが挙げられる。
【００９２】
〔II−４．糖化合物の固定化の条件〕
センサー面に本発明の糖化合物の固定化を行なう際の反応条件としては、従来用いられてきた条件が使用できる。具体的に、反応温度は通常０℃以上、中でも４℃以上、更には１０℃以上、特に２０℃以上、通常１００℃以下、中でも６０℃以下、更には４０℃以下、特に３０℃以下の範囲が好ましい。反応圧力は、大気圧が好ましい。固定化に使用する溶媒としては、水系溶媒又は有機溶媒が使用できる。水系溶媒としては、水、緩衝溶液、希薄なＤＭＳＯ水溶液等が使用できる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン等が好ましく、その中でもメタノール又はエタノールが好ましい。
【００９３】
〔III．センサー〕
以上説明した本発明の固定化体は、各種の用途に用いることが可能であるが、特に好ましい用途として、バイオセンサー（以下、単に「センサー」と記すことがある。）への応用が挙げられる。バイオセンサーのセンサー面を担体表面として、上述の手順で本発明の糖化合物を固定化することにより、本発明の固定化体を有するバイオセンサー（以下、これを「本発明のセンサー」ということがある。）が得られる。
【００９４】
以下、本発明のセンサーの詳細について説明する。
〔III−１．センサーの種類〕
本発明が適用可能なバイオセンサーの種類としては、ＱＣＭ、カンチレバー、ＦＥＴ、化学発光、ＳＰＲ、磁性体、光導波路、表面弾性波等を利用したセンサーが挙げられる。
本発明のセンサーを水晶発振子微量天秤として構成する場合、センサー面となる水晶発振子表面に糖化合物を固定化し、又は、水晶発振子表面に金薄膜を形成してから、その金薄膜上に糖化合物を固定化する。或いは、水晶発振子表面又は金薄膜表面に高分子膜等を形成し、その上に糖化合物を固定化してもよい。これにより、糖化合物と検体との相互作用を、周波数の変化として観測することが可能となる。
【００９５】
本発明のセンサーをカンチレバーセンサーとして構成する場合、センサー面となるカンチレバーの表面をシリコン、金、酸化シリコン等の材料で形成し、その表面に糖化合物を固定化する。これにより、糖化合物と検体との相互作用を、カンチレバーの反り等の形状変化として観測することができる。カンチレバーの形状変化を観測する手法としては、レーザー光を当ててその反射光の変化を検出する手法や、カンチレバーをピエゾ素子として構成し電気的に観測する手法などが挙げられる。また、カンチレバーを振動させた場合には、周波数の変化や振幅の変化として糖化合物と検体との相互作用を検出することも可能である。また、固体表面に固定化された検体を、糖化合物が固定化されたカンチレバーを用いて、原子間力顕微鏡（atomic force microscope：以下「ＡＦＭ」と略する。）のように検出することも可能である。
【００９６】
本発明のセンサーをＦＥＴセンサーとして構成する場合、センサー面となるゲート電極上或いはその近傍に糖化合物を固定化することにより、糖化合物と検体との相互作用を、電位の変化として検出することができる。
本発明のセンサーをＳＰＲセンサーとして構成する場合、センサー面となる金表面に糖化合物を直接、或いは高分子等を介して固定化することにより、糖化合物と検体との相互作用を、表面プラズモン共鳴による反射角の変化、若しくは特定の反射角における反射強度の変化等として検出することができる。
【００９７】
本発明の糖化合物を磁性体へ固定化した場合、磁性体を磁性粒子や磁性ナノ粒子とし、その表面に糖化合物を固定化することにより、糖化合物と検体との相互作用を、超伝導量子干渉素子（superconducting quantum interference device：以下「ＳＱＵＩＤ」と略する。）やホール素子を用いた装置により検出することが出来る。
本発明のセンサーを光導波路センサーとして構成する場合、センサー面となる光路を２つに分けて、一方の表面に糖化合物を固定化する。糖化合物と検体との相互作用が生じると、光の速度又は位相の変化が生じるので、これを他方の光との干渉として検出することが出来る。
【００９８】
本発明のセンサーを表面弾性波検出装置に適用する場合には、センサー面に糖化合物を固定化することにより、糖化合物と検体との相互作用を定常弾性波の変化として検出することが出来る。
【００９９】
〔III−２．検体〕
本発明のセンサーを用いて検出可能な物質（検体、被検出物質）としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、糖鎖、蛋白質、レクチン、原虫、ウイルス、細菌、毒素、糖脂質等、或いはそれらの断片や、これらの混合物が挙げられる。目的とする被検出物質に応じて糖化合物を選べばよい。
【０１００】
・ウイルス：
本発明のセンサーの検体となり得るウイルスの例としては、肝炎ウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、センダイウイルス、ニューカッスル病ウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、日本脳炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、ヘルペスウイルスウイルス等が挙げられる。肝炎ウイルスとしては、Ｂ型肝炎ウイルス等が挙げられる。インフルエンザウイルスとしては、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、或いはそれらの共存体が挙げられる。レオウイルスとしては、１型及び２型が挙げられる。ＨＩＶとしては、ＨＩＶ−１型、ＨＩＶ−２型、ＳＩＶ等が挙げられる。ヘルペスウイルスとしては、ヘルペス１型ウイルス等が挙げられる。これらのウイルスのうち何れか一種類のみを検出対象としてもよいが、二種類以上のウイルスを検出対象としてもよい。
【０１０１】
・レクチン：
本発明のセンサーの検体となり得るレクチンの例としては、ニホンニワトコレクチン、コンカバナリンＡ等が挙げられる。
・細菌：
本発明のセンサーの検体となり得る細菌の例としては、大腸菌、ヘリコバクター・ピロリ菌等が挙げられる。
【０１０２】
・毒素：
毒素とは、生物の正常な代謝に影響を与え、その機能を停止させるものの総称である。本発明のセンサーの検体となり得る毒素の例としては、例えば、ベロ毒素、ボツリヌス毒素等が挙げられる。
・糖脂質
本発明のセンサーの検体となり得る糖脂質の例としては、糖鎖とセラミドが結合したスフィンゴ糖脂質や、糖鎖とジシアシログリセロールやアルキルアシルグリセロールが結合したグリセロ糖脂質が挙げられる。
【０１０３】
また、本発明の固定化体を有するセンサー（本発明のセンサー）を用いて分析を行なう際には、通常は各種の装置（検体の検出装置）を用いて分析を行なう。このような装置の構成は特に制限されず、使用する分析方法や検体の種類に応じて適当に選択すればよいが、代表的な装置の構成としては、上述した本発明のセンサーと、該センサーに糖類と特異的に相互作用しうる検体を接触させるために該検体を供給する検体供給部と、該センサーと該検体の相互作用を検出するための検出部とを有する構成が挙げられる。この場合、センサーを着脱可能に構成しても良い。
【０１０４】
〔IV．検体の解析方法〕
上記した本発明のセンサーを用いれば、前記糖化合物と特異的に相互作用しうる被検出物質を含む検体を接触させ、該センサーと該被検出物質との相互作用を検出することにより、検体の解析を行うことができる。
用いるセンサー及び検体については、上記のとおりである。検出の手法は、それ自体公知の通常用いられる手法を任意に選択しあるいは組み合わせて行うことができる。
本発明のセンサーは、本発明の糖類固定化体がセンサー表面を形成しているものであって、糖類の機能が高く維持された状態で安定的に固定化されている。従って、該糖化合物と特異的に相互作用しうる被検出物質を含む検体を接触させれば、該センサーと該被検出物質との相互作用を検出することができる。本発明の固定化体は非特異吸着が抑制されており、このような反応にも好ましく用いることができる。また、特に生体試料等を検体として用いた場合には、該検体中に存在する夾雑物質が非特異反応を起こすことがしばしば問題となるが、本発明の固定化体では糖化合物が安定的に固定化されていることから、洗浄、分離等の操作を行っても糖化合物が遊離する可能性が低く、さらに感度と特異性の高い検出を行うことができる。
【０１０５】
〔V．被検出物質の精製方法〕
また、本発明の固定化体は、被検出物質の精製方法にも用いることができる。
前記固定化体と、前記糖化合物と特異的に相互作用しうる被検出物質を含有する検体とを接触させ、該固定化体と該検体とを分離した後、洗浄することにより前記糖化合物と特異的に結合した被検出物質を取得する。本発明の固定化体では糖化合物が安定的に固定化されているので、洗浄、分離等の操作を行っても糖化合物が遊離する可能性が低く、感度と特異性の高い精製を行うことができる。
【０１０６】
精製の手法は、それ自体公知の通常用いられる手法を任意に選択して行うことができる。
このような場合には、例えば、固定化体の調製に用いる担体として、前記したような粒子状の担体を用いることが好ましい。より具体的には、ラテックス等の樹脂よりなる粒子、さらには、該粒子中に金属を含む磁性粒子等が好ましく用いられる。一例として、その後該粒子を分離剤が含まれた液と接触させることや温度やｐＨなどの条件を変えることにより、被検出物質を解離させることも出来る。粒子を取り除けば、純粋に被検出物質のみが含まれた溶液を作成することが出来るため、被検出物質の精製が可能である。磁性粒子を担体として用いる場合、磁場により容易に搬送されると言う利点を有し洗浄や分離の工程が簡便化される。該磁性粒子等を用いた精製操作についても、公知の技術を応用して適宜行うことができる。
【０１０７】
また、被検出物質が固定化された該固定化体を、分光学的手法や、質量分析法等により分析することにより、被検出物質を特定することや、濃度に関する情報を得る事が可能となる。また、固定化された被検出物質を遊離させた液を、診断などの検出に用いることが出来る。
被検出物質としては糖に結合するものであればよく、蛋白質、ウイルス、細菌、毒素などが挙げられるが、タンパク質が好適である。
【０１０８】
〔VI．検体の検出装置〕
本発明の検体の検出装置は、上記本発明のセンサーと、該センサーに検体を接触させるために該検体を供給する検体供給部と、該センサーと該検体の相互作用を検出するための検出部とを有することを特徴としている。
各部の構成及び機能は、公知の技術から任意に選択して用いることができる。
このような装置の構成を取ることにより、本発明の糖類固定化体を用いた自動解析等が可能になる。
【０１０９】
以下、本発明について、実施例を用いて更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
なお、以下の記載では、反応式中に表される化合物について言及する際に、その化合物に付された番号を括弧つきで付記し、「化合物（１）」のように記すものとする。また、以下の式中、「Ｍｅ」はメチル基を表わし、「Ｅｔ」はエチル基を表わし、「Ａｃ」はアセチル基を表わし、「Ｂｎ」はベンジル基を表わす。また、反応に用いられる試薬及び溶媒としては、全て市販品を使用した。
【０１１０】
［実施例１：糖化合物の合成］
糖化合物の固定化状態と固定化量の経時変化を調査する目的で、末端がアミノ基で、かつフッ素原子が導入された単糖の糖化合物を２点合成し、その固定化反応および表面分析を行った。さらに末端がアミノ基の多糖を含む糖化合物、及び、末端がビオチンの単糖又は多糖を含む糖化合物の合成を行った。
【０１１１】
〔糖化合物の合成１〕
まず、以下の工程１〜１３の通り、末端がアミノ基で、かつフッ素原子が導入された単糖の糖化合物として、化合物（９）及び（１６）を合成した。
・工程１（フッ素化反応）：
【０１１２】
【化１６】
2007298334.tif 000017
【０１１３】
まず、Ito et al., Tetrahedron, 1990年, Vol.46, pp.89-102に記載の方法により、出発化合物（化合物（１））を合成した。得られた化合物（１）１．０２ｇ（１．５ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下にて、脱水ＤＭＦ（N,N‐dimethylformamide）１３．５ｍｌに溶解し、Selectfluor（登録商標：1-chloromethyl-4-fluoro-1,4-diazoniabicyclo-[2.2.2]-octane / bis-(tetrafluoro borate)）２．１７ｇ（６．１ｍｍｏｌ）及び水４．５ｍｌを加え、６０℃で１時間半撹拌した。室温に冷却した後、酢酸エチルで希釈し、水、続いて飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムを加えて乾燥した。溶媒を留去した後に、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝３／２）により、目的とするフッ素化体（化合物（２））を単離した。収量は７３９ｍｇであり、収率は６９％であった。得られた化合物の同定はＮＭＲにより行なった。その結果を以下に示す。
1H NMR (400MHZ, CDCl3, J in Hz); 4.88 (dd, 1H, J = 2.1 & 50.0), 4.85 (d, 1H, J =11.8), 4.64 (d, 1H, J = 11.8), 4.64 (s, 2H), 4.59 (s, 2H), 4.55 (s, 1H, J = 11.8), 4.51 (d, 1H, J = 10.9), 4.42 (d, 1H, J = 11.8), 3.99 (dd, 1H, J = 2.2 & 10.8), 3.99 (m, 1H), 3.81 (t, 1H, J = 8.3), 3.80 (dd, 1H, J = 1.4 & 6.5), 3.77 (s, 3H), 3.72 (dd, 1H, J = 4.5 & 10.7), 1.60 (s, 3H).
13C NMR (100MHz, CDCl3, J in Hz); 94.22 (d, J = 24.7), 86.07 (d, J = 184.1), 78.47, 73.47 (d, J = 17.5), 70.09, 60.48, 53.26, 48.66, 23.60.
・工程２（ＴＭＳ化反応）：
【０１１４】
【化１７】
2007298334.tif 000018
【０１１５】
窒素雰囲気下にて、前工程にて得られたフルオロヒドリン（化合物（２））５５０ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、−２０℃に冷却した。トリメチルシリルジエチルアミン０．３０ｍｌ（８．０ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拌した。氷水で０．０１Ｎに調整した塩酸に反応液を注ぎ、塩化メチレンで抽出した。硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去した後に、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて目的のメチル化体（化合物（３））を単離した。収量は４７０ｍｇであり、収率は７８％であった。得られた化合物の同定はＮＭＲにより行なった。その結果を以下に示す。
1H NMR (400MHz, CDCl3, J in Hz); 5.02 (dd, 1H, J = 1.5 & 51.2), 4.72 (d, 1H, J =10.9), 4.70 (d, 1H, J = 11.1), 4.67 (s, 2H), 4.05 (m, 1H), 3.95 (m, 1H), 3.79 (dd, 1H, J = 2.1 & 10.7), 3.72 (d, 1H, J = 8.7), 3.67 (dd, 1H, J = 3.4 & 10.7), 3.58 (s, 3H), 1.77 (s, 3H), 0.20 (s, 9H).
13C NMR (100MHz, CDCl3, J in Hz); 96.67 (d, J = 17.3), 86.95 (d, J = 187.5), 77.68, 74.46, 74.42 (d, J = 18.9), 73.65, 73.30, 72.20, 71.08, 72.28, 68.04, 52.44, 47.40, 21.04.
・工程３（アジド化反応）：
【０１１６】
【化１８】
2007298334.tif 000019
【０１１７】
窒素雰囲気下にて、テトラエチレングリコールジトシレート（化合物（４））５．０１１８ｇ（９．９７ｍｍｏｌ）を、還流管を取り付けた５０ｍｌの２つ口フラスコに入れた脱水ＤＭＦ１０．０ｍｌに加えて溶解させた。外部より氷水バスで０℃に冷却した。撹拌しながら、窒素雰囲気下にてアジ化ナトリウム０．３２９９ｇ（５．０７ｍｍｏｌ）を加え、５０分後に５０℃に昇温した。適宜反応液のサンプリングを行ない、薄層クロマクロマトグラフィー（thin layer chromatography：以下「ＴＬＣ」と略す。）（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて反応を追跡した。５０℃で１時間半反応させたところで室温に冷却し、反応液を水１００ｍｌ／酢酸エチル２００ｍｌの混合溶媒に加えた。油水分離後に水相を酢酸エチル１００ｍｌで２回抽出し、全ての酢酸エチル抽出相を合わせ、飽和水酸化ナトリウム水溶液１００ｍｌで洗浄した。抽出液を硫酸ナトリウムで一晩乾燥した後に溶媒を留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて目的のモノアジド（化合物（５））を単離した。収量は１．０９１９ｇ（２．９２ｍｍｏｌ）であり、収率は２９．３％であった。得られた化合物の同定はＮＭＲにより行なった。その結果を以下に示す。
1H NMR (400MHz, CDCl3, J in Hz); 7.80 (dd, 2H, J = 8.20), 7.34 (dd, 2H, J = 8.20), 4.16 (t, 2H, J = 4.8), 3.69 (t, 6H, J = 5.0), 3.67 (t, 6H, J = 5.0), 3.60 (S, 4H), 3.38 (t, 2H, J = 5.1), 2.45 (S, 3H).
13C NMR (100MHz, CDCl3, J in Hz); 144.78, 132.99, 129.79, 127.96, 70.74, 70.65, 70.58, 70.02, 69.21, 68.66, 50.65, 21.62.
・工程４（ヨード化反応）：
【０１１８】
【化１９】
2007298334.tif 000020
【０１１９】
窒素雰囲気下にて、前工程にて得られたモノアジド（モノトシレート、化合物（５））０．５０６９ｇ（１．３６ｍｍｏｌ）を、還流管を取り付けた５０ｍｌの２つ口フラスコに入れた脱水アセトン５．０ｍｌに加えた。室温にて、窒素雰囲気下、ヨウ化ナトリウム０．２９８７ｇ（１．９９ｍｍｏｌ）を加え撹拌した。一旦溶解した後に、１０分後に白色沈殿が生じてきた。ヨウ化ナトリウム添加１５分後からオイルバスで加熱し、同２２分後に還流が始まった。次第に沈殿の量が増えてきたが、１時間後に冷却し反応を停止した。溶媒流去後に、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて目的のヨード体（化合物（６））を単離した。収量は０．３５１２ｇ（１．０７ｍｍｏｌ）であり、収率は７９．７％であった。得られた化合物の同定はＮＭＲにより行なった。その結果を以下に示す。
1H NMR (400MHz, CDCl3, J in Hz); 3.76 (t, 2H, J = 7.0), 3.70-3.68 (m, 10H), 3.40 (t, 2H, J = 5.1), 3.27 (t, 2H, J = 6.8).
13C NMR (100MHz, CDCl3, J in Hz); 71.95, 70.70, 70.66, 70.21, 70.04, 50.67, 2.90.
・工程５（カップリング反応）：
【０１２０】
【化２０】
2007298334.tif 000021
【０１２１】
窒素雰囲気下にて、工程２で得られたシアル酸誘導体（ＯＴＭＳ体、化合物（３））０．３０３８ｇ（０．３９ｍｍｏｌ）、工程４で得られたモノヨード体（化合物（６））０．２５４５ｇ（０．７７ｍｍｏｌ）、及び、脱水ＤＭＦ１．３ｍｌを１０ｍｌフラスコに入れて溶解させた。溶解後に−１０℃に冷却し、フッ化セシウム（ＣｓＦ）０．１０５４ｇ（０．６９ｍｍｏｌ）を加えた。１５時間反応度に、氷水で０．０１Ｎに調整した塩酸１００ｍｌに開け、酢酸エチル１００ｍｌで抽出した。有機相を分離後に再度酢酸エチル５０ｍｌで抽出した。有機相を合わせて、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒流去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝９／１〜４／６、目的物は５／５〜４／６）にて目的のカップリング体（化合物（７））を単離した。収量は０．１７０７ｇ（０．１８９０ｍｍｏｌ）であり、収率は４８．１％であった。得られた化合物の同定はＮＭＲにより行なった。その結果を以下に示す。
1H NMR (400MHz, CDCl3, J in Hz); 7.4-7.2 (m, 20H), 5.12 (dd, 1H, J = 38.6 & 1.6), 4.74 (s, 2H), 4.70 (s, 1H), 4.64 (s, 2H), 4.58 (d, 2H, J = 3.9), 4.44 (m, 1H),4.35 (s, 1H), 4.33 (s, 1H), 4.24 (dd, 1H, J = 8.1 & 1.3), 4.00 (m, 1H), 3.91 (m, 2H), 3.80 (m, 1H), 3.66-3.52 (m, 15H), 3.62 (s, 3H), 3。36 (t, 2H, J = 3.8), 1.56 (s, 3H).
13C NMR (100MHz, CDCl3, J in Hz); 170.48, 166.52 (d, J = 3.3), 138.80, 138.40, 138.28, 137.64, 129.57, 128.52, 128.40, 128.17, 128.01, 127.97, 127.97, 127.84, 127.73, 127.61, 127.34, 127.29, 97.93 (d, J = 19.1), 89.00 (d, J = 170.0), 79.63,74.13, 73.31 (d, J = 17.1), 73.38, 72.73, 71.89, 71.63, 70.65, 70.50, 70.48, 70.29, 69.97, 69.50, 69.41, 52.59, 50.66, 48.62, 46.62, 23.57.
・工程６（加水分解反応）：
【０１２２】
【化２１】
2007298334.tif 000022
【０１２３】
前工程で得られたカップリング体（メチルエステル、化合物（７））０．１６０１ｇ（０．１７７ｍｍｏｌ）を２５ｍｌフラスコに入れ、メタノール１２．２ｍｌを加えて溶解させ、０℃に冷却した。別途調製した、水酸化リチウム・１水和物０．０３８０ｇ（０．９１ｍｍｏｌ）／水３．１ｍｌの均一溶液を加えた。氷水バスを外し、徐々に室温まで自然昇温させた。１時間半後の時点では、ＴＬＣ（ヘキサン／酢酸エチル＝２／８）により反応の進行は確認されなかった。３日後に反応の終了を確認し、イオン交換樹脂（三菱化学（株）社製ダイアイオン（登録商標）ＳＫ１ＢＨ、Ｈ+型）を加えて、ｐＨを４とした。室温で３０分撹拌後に濾別し、溶媒留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール＝１／１）にて目的の脱メチル体（化合物（８））を単離した。収量は１１８．６ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ）であり、収率は７５．２％であった。
【０１２４】
得られた化合物の同定はＮＭＲにより行なった。その結果を以下に示す。
1H NMR (400MHz, CDCl3, J in Hz); 7.4-7.2 (m, 20H), 5.18 (dd, 1H, J = 38.7 & 1.2), 4.69 (s, 2H), 4.67 (s, 1H), 4.64 (s, 2H), 4.55 (d, 2H, J = 3.6), 4.54-4.38 (m,4H), 4.31 (dd, 1H, J = 21.1 & 8.1), 4.03 (dt, 1H, J = 2.1 & 3.9), 3.93 (m, 2H), 3.73 (m, 1H), 3.67-3.51 (m, 15H), 3.35 (m, 2H), 1.53 (s, 3H)
13C NMR (100MHz, CDCl3, J in Hz); 171.17, 167.19 (d, J = 3.6), 138.67, 138.32, 138.16, 137.76, 129.32, 128.40, 128.34, 128.32, 128.24, 128.06, 127.97, 127.85, 127.81, 127.78, 127.57, 127.46, 97.72 (d, J = 16.0), 87.04 (d, J = 187.7), 79.01, 74.34, 73.98 (d, 17.5), 73.35, 73.01, 72.50, 71.7, 71.49, 70.53, 70.50, 70.27, 70.09, 69.95, 69.79, 69.71, 64.30, 50.45, 48.45, 23.28.
・工程７（還元脱保護反応）：
【０１２５】
【化２２】
2007298334.tif 000023
【０１２６】
前工程で得られた加水分解体（Ｂｎ保護アジド体、化合物（８））０．０８２４ｇ（０．０９３ｍｍｏｌ）を１０ｍｌフラスコに入れ、メタノール６．０ｍｌを加えて溶解させた。別途調製した１Ｎ塩酸１．８ｍｌを加え、更に１０％パラジウムカーボン（Ｐｄ／Ｃ）触媒０．０１５８ｇを加え、内部を水素置換した。ＴＬＣ（メタノールで展開）により反応をモニターした。２８時間後に反応の終了を確認し、濾過後に溶媒留去した。ゲル濾過（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製ＬＨ−２０、メタノール）により精製した。溶媒留去後に、メタノールに溶解し、等量の２０ｍＭ酢酸ナトリウム／メタノール溶液（４．８ｍｌ）を加えて、３０分室温にて撹拌した。ゲル濾過（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製ＬＨ−２０、メタノール）により精製し、目的とする化合物（化合物（９））を得た。収量は４８．７ｇ（０．０９１ｍｍｏｌ）であり、収率は９７．７％であった。得られた化合物の同定はＮＭＲ及び質量分析により行なった。その結果を以下に示す。1H NMR (400MHz, CDCl3, J in Hz); 5.06 (dd, 1H, J = 51.0 & 2.0), 5.23 (s, 1H), 5.10 (s, 1H), 4.18 (t, 1H, J = 10.7), 4.08 (t, 1H, J = 10.3), 3.98 (m, 2H), 3.39-3.67 (m, 16H), 3.54 (m, 2H), 2.02 (s, 3H).
13C NMR (100MHz, CDCl3, J in Hz); 175.89, 163.80 (d, J = 5.3), 99.88 (d, J = 46.4), 93.66 (d, J = 181.9), 75.04, 73.41, 71.81, 71.76, 71.46, 71.17 (d, J = 24.3), 70.82, 70.34, 68.21, 66.28, 64.92, 49.22, 41.00, 23.11.
質量分析：ＥＳＩ−ＭＳ法（Micromass type-ZMD）
質量走査条件：５０〜１５００ｍ／ｅ、４．０ｓｅｃ／ｓｃａｎ
印加電圧：２．０ｋＶ、Ｃｏｎｅ電圧：３０Ｖ
ＥＳＩ（＋）法で、ｍ／ｚ５０３（Ｍ＋Ｈ）が観測された。その後、ｍ／ｚ５２５（Ｍ＋Ｎａ）、ｍ／ｚ５４１（Ｍ＋Ｋ）が観測された。また、ＥＳＩ（−）法 により、ｍ／ｚ５０１（Ｍ−Ｈ）が観測された。目的物質の質量数はＭＷ５０２であり、合成目的物に相当する質量数と一致した。
・工程８（トシル化反応）：
【０１２７】
【化２３】
2007298334.tif 000024
【０１２８】
四口丸底フラスコに５．２Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液２４ｍｌを入れて、氷浴につけた。ヘキサエチレングリコール（Hexaethyleneglycol、化合物（１０））１０．００ｇ（３５．４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（以下「ＴＨＦ」と略す。）溶液２４ｍｌをゆっくりと加え、撹拌した。塩化トシル（ＴｓＣｌ）１４．８６ｇ（７８．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液３６ｍｌを１時間かけて滴下し、２３時間撹拌した。１０％塩酸（ＨＣｌ）水溶液を加えｐＨを４にした後、トルエンで抽出した（１００ｍｌ×３）。有機相を集め、水（１００ｍｌ×２）、０．５Ｎ炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3）水溶液（１００ｍｌ）、水（１００ｍｌ）の順で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4）で脱水し、ろ過した後、溶媒留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（球シリカ１００ｇ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）により、ジトシル体（化合物（１１）、収量８．８４ｇ、収率８３％）を単離した。得られた化合物の同定はＮＭＲにより行なった。その結果を以下に示す。
1H NMR (400MHz, CDCl3, J in Hz); 7.80 (d, J = 8.3, 4H), 7.34 (d, J = 7.8, 4H), 4.15 (t, J = 3.9, 4H), 3.68 (t, J = 4.8, 4H), 3.62 (s, 8H), 3.58 (s, 8H), 2.45 (s, 6H).
13C NMR (100MHz, CDCl3, J in Hz); 144.77, 133.04, 129.81, 127.97, 70.74, 70.60, 70.54, 70.50, 69.22, 68.67, 21.62.
・工程９（アジド化反応）：
【０１２９】
【化２４】
2007298334.tif 000025
【０１３０】
前工程で得られたジトシラート（化合物（１１））８．００ｇ（１３．６ｍｍｏｌ）を四口丸底フラスコに入れフラスコ内を窒素置換した後、脱水ＤＭＦ２７ｍｌを加えた。窒化ナトリウム（ＮａＮ3）０．８８２ｇ（１３．６ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、５０℃に加熱し３時間撹拌した。室温まで冷やした後、トルエン２００ｍｌ及び水１００ｍｌを加え有機相を抽出した。更に、水相からトルエンで抽出した（１００ｍｌ×２）。有機相を集め、水（１００ｍｌ×３）で洗浄し、硫酸ナトリウム（Ｎａ2ＳＯ4）で脱水しろ過した後、溶媒留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（球シリカ２００ｇ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝７：１３）を２回行なうことにより、モノアジド体（化合物（１２）、１．９３ｇ、収率３１％）を単離した。得られた化合物の同定はＮＭＲにより行なった。その結果を以下に示す。
1H NMR (400MHz, CDCl3, J in Hz); 7.80 (d, J = 8.3, 2H), 7.34 (d, J = 7.8, 2H), 4.16 (t, J = 6.1, 2H), 3.69 (t, J = 5.9Hz, 2H), 3.66 (s, 6H), 3.65 (s, 4H), 3.63 (m, 4H), 3.59 (s, 4H), 3.38 (t, J = 5.1Hz, 2H), 2.45 (s, 3H).
13C NMR (100MHz, CDCl3, J in Hz); 144.77, 133.04, 129.81, 127.98, 70.76, 70.70, 70.67, 70.63, 70.58, 70.56, 70.52, 70.02, 69.22, 68.69, 50.70, 21.62.
・工程１０（ヨード化反応）：
【０１３１】
【化２５】
2007298334.tif 000026
【０１３２】
前工程で得られたモノトシレート（モノアジド体、化合物（１２））１．９３ｇ（４．１９ｍｍｏｌ）を四口丸底フラスコに入れ、窒素置換した後、脱水アセトン１５ｍｌを加えた。ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）０．７５３ｇ（５．０２ｍｍｏｌ）を加えて５０℃に加熱し、２時間撹拌した。反応液を溶媒留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）により、ヨウ素化体（化合物（１３）、収量１．３８ｇ、収率７９％）を単離した。
【０１３３】
得られた化合物の同定はＮＭＲにより行なった。その結果を以下に示す。
1H NMR (400MHz, CDCl3, J in Hz); 3.76 (t, J = 6.9, 2H), 3.68 (t, J = 5.8, 2H), 3.67-3.66 (m, 16H), 3.39 (t, J = 5.1, 2H), 3.26 (t, J = 6.9, 2H).
13C NMR (100MHz, CDCl3, J in Hz); 72.00, 70.69, 70.64, 70.61, 70.24, 70.03, 50.71, 2.87.
・工程１１（カップリング反応）：
【０１３４】
【化２６】
2007298334.tif 000027
【０１３５】
フッ化セシウム（ＣｓＦ）２０８ｍｇ（１．３７ｍｍｏｌ）を四つ口丸底フラスコに入れ、−１０℃のバスで冷却した。前工程で得られたモノヨウ素化体（化合物（１３））１．３５ｇ（３．２３ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ溶液１ｍｌ、及び、工程２で得られたシアル酸誘導体（化合物（３））５０２ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ溶液１．２ｍｌを、何れも−１０℃に冷却した状態で、上記のフッ化セシウムに加え、そのままの温度で５時間撹拌し、冷蔵庫（−２０℃）中に一晩放置した。ＴＬＣより反応の進行は５時間後には終了していたと考えられる。反応開始から２２時間後、氷冷した酢酸エチルを加えて反応液を希釈し、氷冷した０．０１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）１００ｍｌを加えた。酢酸エチルで抽出し（１５０ｍｌ、１００ｍｌ×２）、硫酸ナトリウム（Ｎａ2ＳＯ4）で脱水しろ過した後、溶媒留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝５：９５）によって、カップリング体（化合物（１４））３６０ｍｇを収率５６％で得た。得られた化合物の同定はＮＭＲにより行なった。その結果を以下に示す。
1H NMR (400 MHz, CDCl3, J in Hz); 7.39-7.26 (m, 20H), 5.07 (dd, J = 51.5&1.8, 1H), 4.74 (s, 2H), 4.70 (s, 1H), 4.63-4.57 (m, 4H), 4.38 (d, J = 10.6, 1H), 4.09 (m, 1H), 3.91 (m, 2H), 3.77-3.72 (m, 2H), 3.69-3.52 (m, 25H), 3.36 (t, J = 5.3, 2H), 1.56 (s, 3H)．
13C NMR (100 MHz, CDCl3, J in Hz); 170.41, 166.46 (d, J = 3.6), 138.75, 138.23, 138.17, 137.58, 129.45, 128.44, 128.33, 128.29, 128.21, 128.10, 127.92, 127.89, 127.78, 127.65, 127.54, 127.38, 127.22, 97.78 (d, J = 16.0), 86.94 (d, J = 189.1), 78.61, 73.91, 73.32, 72.83, 72.66, 72.34, 71.59, 71.51, 70.59, 70.56, 70.53, 70.48, 70.44, 69. 92, 69.81, 69.44, 64.34, 52.52, 50.60, 48.50 (d, J = 3.6), 23.49．
・工程１２（加水分解反応）：
【０１３６】
【化２７】
2007298334.tif 000028
【０１３７】
前工程で得られたメチルエステル体（カップリング体、化合物（１４））３４９ｍｇ（０．３５２ｍｍｏｌ）を四口丸底フラスコに入れ、窒素置換した後、メタノール（ＭｅＯＨ）２３ｍｌを加えて撹拌した。反応容器を氷浴につけた後、６０ｍＭ水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）水溶液６ｍｌをゆっくりと加えた。反応容器を室温に戻し、１．５時間撹拌した。１４時間室温で放置した後、その温度のまま再び４．５時間撹拌した。反応容器を氷浴につけて、イオン交換樹脂（オルガノ社製Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ １２０Ｂ、Ｈ+型）を加えｐＨ＝４とした後、室温で３０分撹拌し、ろ過し溶媒を留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝８５：１５）によって、加水分解体（化合物（１５））を単離した。収量は３１５ｍｇ、収率は９２％であった。得られた化合物の同定はＮＭＲにより行なった。その結果を以下に示す。
1H NMR (400 MHz, CDCl3, J in Hz); 7.45-7.19 (m, 20H), 5.43 (d, 53.3, 1H), 4.82 (t, J = 9.6), 4.69 (d, J = 10.4), 4.58 (d, J = 10.9), 4.53 (s, 4H), 4.00 (m, 1H), 3.94 (m, 2H), 3.91 (s, 1H), 3.88 (m, 1H), 3.75 (m, 2H), 3.56-3.45 (m, 21H), 3.30 (t, J = 4.8, 2H), 1.86 (s, 3H)．
13C NMR (100 MHz, CDCl3, J in H); 170.47, 138.98, 138.71, 138.48, 138.41, 128. 65, 128.31, 128.13, 128.08, 128.03, 127.99, 127.56, 127.51, 127.26, 127.17, 99.51, 88.87 (d, J = 173.5), 78.95, 74.45, 73.14, 73.05, 71.16, 70.47, 69.68, 69.38, 69.01, 68.76, 68.53, 63.19, 50.22, 46.07, 23.46．
・工程１３（還元脱保護反応）：
【０１３８】
【化２８】
2007298334.tif 000029
【０１３９】
四口丸底フラスコに、前工程で得られた加水分解体（Ｂｎ保護アジド体、化合物（１５））３１０．４ｍｇ（０．３２０ｍｍｏｌ）を入れて、メタノール６４ｍｌを加えた。氷浴下に、１０％パラジウムカーボン（Ｐｄ／Ｃ）触媒４０．８ｍｇ（０．２９１ｍｍｏｌ）、１Ｎ塩酸１９ｍｌを加えた。反応容器を室温に戻し、水素置換した後に、７時間撹拌した。室温で一晩放置して窒素置換した。ろ過後、溶媒留去した。ゲル濾過（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製ＬＨ−２０、メタノール）により精製した。溶媒留去後、メタノール１０ｍｌに溶解させ、０．１Ｍ水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）水溶液３．２ｍｌをゆっくりと加えた。氷浴中で、イオン交換樹脂（オルガノ社製Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ １２０Ｂ、Ｈ+型）を加えｐＨ＝６とした後、室温で３０分撹拌した後、ろ過し、溶媒を留去した。ゲル濾過（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製ＬＨ−２０、メタノール）により精製し、脱保護還元体（化合物（１６））を得た。収量は１６３．８ｍｇ、収率は８７％であった。得られた化合物の同定はＮＭＲにより行なった。その結果を以下に示す。
1H NMR (400 MHz, CD3OD, J in Hz); 5.20 (dd, J = 52.3 & 2.3, 1H), 4.11 (t, J = 10.6, 1H), 3.99 (dt, J = 12.4 & 3.8, 1H), 3.88-3.79 (m, 5H), 3.77-3.60 (m, 22H), 3.51 (dd, J = 9.1 & 1.5, 1H), 3.25 (dt, J = 6.5 & 2.3, 2H), 2.01 (s, 3H).
13C NMR (100 MHz, CD3OD, J in Hz); 175.59, 174.25 (d, J = 2.9), 100.98 (d, J = 13.8), 93.03 (d, J = 183.3), 74.60, 73.02, 71.36, 71.32, 71.26, 71.17, 71.08, 70.96, 70.76, 70.68, 70.57, 70.52, 70.02, 68.12, 65.41, 64.51, 49.84, 22.68.
【０１４０】
〔糖化合物の合成２〕
次に、以下の工程１４〜１９の通り、末端がアミノ基の多糖を含む糖化合物として、化合物（２０）の合成を行った。
・工程１４（ジアジド化）
【０１４１】
【化２９】
2007298334.tif 000030
【０１４２】
テトラエチレングリコールから合成したジトシル化体（化合物（４））２５．３７ｇ（５０．５ｍｍｏｌ）を四口丸底フラスコに入れフラスコ内を窒素置換した後、脱水ＤＭＦ１５０ｍｌを加えた。窒化ナトリウム（ＮａＮ３）９．７２ｇ（１５０ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、５０℃に加熱し２．５時間撹拌した。室温まで冷やした後、酢酸エチル２５０ｍｌ及び水３５０ｍｌを加え有機相を抽出した。さらに、水相から酢酸エチル１００ｍｌで抽出した。有機相を集め水で洗浄し（４００ｍｌ×３）、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で脱水し、ろ過した後、溶媒留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（球シリカ  １００ｇ，酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１）により、ジアジド体（化合物（１７）、収量９．７６ｇ，収率７９％）を単離した。得られた化合物の同定はＮＭＲにより行なった。その結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，Ｊ  ｉｎ  Ｈｚ）δ  ３．６８（ｍ，１２Ｈ），３．３９（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，４Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７０．６２，６９．９４，５０．６１．
・工程１５（アジドの還元）
【０１４３】
【化３０】
2007298334.tif 000031
【０１４４】
前工程で得られたジアジド体（化合物（１７））２５．３７ｇ（５０．５ｍｍｏｌ）を四口丸底フラスコに入れ窒素置換した後、メタノール１３１ｍｌを加えた。氷浴下で、１０％パラジウムカーボン（Ｐｄ／Ｃ）２３２．４ｍｇ（０．１６５ｍｍｏｌ）、１N塩酸３９ｍｌを加えた。反応容器を室温に戻し水素置換した後、７時間撹拌した。窒素置換した後、パラジウムカーボン（Ｐｄ／Ｃ）１００．２ｍｇ（０．０７１４ｍｍｏｌ）をさらに加え、水素置換し、１７時間撹拌した。窒素置換した後、ろ過し、ろ液量が約３０ｍｌになるまで溶媒を留去した。１Ｎ−水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）水溶液４０ｍｌをゆっくりと加え、室温で３０分撹拌した後、溶媒を留去した。ゲルろ過（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製ＬＨ−２０、メタノール)を二回行なうことで、ジアミン（化合物（１８）、収量２．５１ｇ、収率１００％）を得た。得られた化合物の同定はＮＭＲにより行なった。その結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，Ｊ  ｉｎ  Ｈｚ）δ  ３．６６（ｂｒｓ，８Ｈ），３．５８（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，４Ｈ），３．３５（ｓ，４Ｈ），２．８８（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，４Ｈ）．
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７１．６７，６９，４４，６９．０８，４０．５６．
・工程１６（還元的アミノ化）
【０１４５】
【化３１】
2007298334.tif 000032
【０１４６】
前工程で得られたジアミン（化合物（１８））０．５３１ｇ（２．７５ｍｍｏｌ）を一口ナスフラスコに入れて窒素置換させた後、三糖（化合物（１９））５０ｍｇ（０．０７４ｍｍｏｌ）、エタノール及び酢酸の混合溶媒（１０：１）１．０ｍｌを加えた。乳白色懸濁液を室温で１７時間撹拌した。それから、２−ピコリンボラン３７ｍｇ（０．３４９ｍｍｏｌ）を加えて、５０℃で８時間撹拌した。反応液をゲルろ過（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製ＬＨ−２０、メタノール)を４回行なうことで、糖化合物（化合物（２０））及びジアミン（化合物（１８））の混合物を得た。同定はＮＭＲ及びＥＳＩ−ＭＳにより行った。
質量分析：ＥＳＩ−ＭＳ法（Micromass type-ZMD）
質量走査条件：５０〜２０００ｍ／ｅ，４．０ｓｅｃ／ｓｃａｎ
印加電圧：３．８ｋＶ、Ｃｏｎｅ電圧：３０，８０Ｖ
溶媒：メタノール
ＥＳＩ（−）法で、ｍ／ｚ８４９（Ｍ−Ｈ）が観測された。目的物質の質量数はＭＷ８５０であり、合成目的物に相当する質量数と一致した。
・工程１７（還元）
【０１４７】
【化３２】
2007298334.tif 000033
【０１４８】
前工程で得られたジアジド体（化合物（１７））１．５０ｇ（６．１７ｍｍｏｌ）を１００ｍｌ四口丸底フラスコに入れ、窒素置換した後、０．６５Ｍリン酸水溶液１４ｍｌを加えて、撹拌した。トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）１．３９ｇ（５．３０ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）溶液１１ｍｌを８０分かけて滴下し、室温で１８時間撹拌した。Ｈ２Ｏ（１５ｍｌ）を加え、Ｅｔ２Ｏ（５０ｍｌ×３）で水相を洗浄した。水相に水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）０．８６７ｇ（２１．７ｍｍｏｌ）を加えて塩基性にした後、水相に含まれる残留Ｅｔ２Ｏを留去した。水相を氷浴で冷やし、析出した白色結晶をろ過し、Ｈ２Ｏ（３０ｍｌ×３）で洗浄した。ろ液に水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）１７．５ｇ（４３８ｍｍｏｌ）を加えて４Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液にした後、塩化メチレンで抽出した（１００ｍｌ×１２）。塩化メチレン相を硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させ、ろ過後に、溶媒を留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（球シリカ  １０ｇ，酢酸エチル：メタノール：ＮＥｔ３＝１：０：０〜４５：５０：５）により、モノアミン（化合物（２１）、収量６０１ｍｇ、収率４４％）を単離した。得られた化合物の同定はＮＭＲにより行なった。その結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，Ｊ  ｉｎ  Ｈｚ）δ  ３．６８（ｍ，８Ｈ），３．６３（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），３．３９（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），２．８６（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），１．３９（ｓ，２Ｈ）
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７３．４１，７０．６１，７０．５６，７０．５３，７０．１８，６９．９２，５０．５７，４１．７１
・工程１８（還元的アミノ化）
【０１４９】
【化３３】
2007298334.tif 000034
【０１５０】
三糖（化合物（１９））８６．８ｍｇ（０．１２９ｍｍｏｌ）、モノアミン（化合物（２１））２５ｍｇ（０．１１５ｍｍｏｌ）を１０ｍｌナスフラスコに入れて窒素置換した後、メタノール及び酢酸の混合溶媒（１０：１）１ｍｌを加えて、室温で４５時間撹拌した。モノアミン（化合物（２１））３９３ｍｇ（１．８０ｍｍｏｌ）を追加し、４０℃で２．５時間、５０℃で２．５時間加熱した。２−ピコリンボラン４５．９ｍｇ（０．４２９ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で６時間加熱した後、溶媒を留去した。ゲルろ過（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製ＬＨ−２０、メタノール)を行なった。ベンズアルデヒドポリスチレン２９．３ｇ（３１．６ｍｍｏｌ）を加え、窒素置換した後、塩化メチレン２８．０ｍｌを加えた。４０℃で１５時間撹拌し、ろ過をした。レジンを塩化メチレン（３０ｍｌ×５）、メタノール（３０ｍｌ×５）で洗浄し、ろ液を溶媒留去することにより、糖化合物（化合物（２２）、収率４０ｍｇ、収量６８％）を単離した。得られた化合物の同定はＮＭＲ及びＥＳＩ−ＭＳにより行なった。その結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，Ｊ  ｉｎ  Ｈｚ）δ  ４．４５（ｍ，１Ｈ），４．１７〜４．０９（ｍ，２Ｈ），３．８７〜３．７７（ｍ，８Ｈ），３．７４〜３．６０（ｍ，２４Ｈ），３．５３〜３．４６（ｍ，３Ｈ），３．３９（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ），３．１６（ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），２．８２（ｂｒｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ），１．６３（ｔ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ）
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７５．３９，１７２．６９，１６５．７２，１０５．２４，９８．５０，８２．６０，７４．４９，７３．１４，７１．６２，７１．５４，７１．４８，７１．３７，７１．０７，６７．４５，６４．７３，５１．７７４７．６６，２２．６６
質量分析：ＥＳＩ−ＭＳ法（Micromass type-ZMD）
質量走査条件：５０〜１５００ｍ／ｅ，４．０ｓｅｃ／ｓｃａｎ
印加電圧：３．８ｋＶ、Ｃｏｎｅ電圧：＋／−５０，−１００Ｖ
溶媒：メタノール
ＥＳＩ（＋）法で、ｍ／ｚ８７７（Ｍ＋Ｈ）が観測された。その後、ｍ／ｚ８９９（Ｍ＋Ｎａ）、ｍ／ｚ９２１（Ｍ−Ｈ＋２Ｎａ）が観測された。またＥＳＩ（−）法で、ｍ／ｚ８７５（Ｍ−Ｈ）が観測された。目的物質の質量数はＭＷ８７６であり、合成目的物に相当する質量数と一致した。
・工程１９（還元）
【０１５１】
【化３４】
2007298334.tif 000035
【０１５２】
１００ｍｌ四口丸底フラスコに、糖化合物（化合物（２２））２１．４ｍｇ（０．０２４４ｍｍｏｌ）を入れて、メタノール５ｍｌを加えた。１０％パラジウムカーボン（Ｐｄ／Ｃ）６．４ｍｇ（０．００５ｍｍｏｌ）を加え、氷浴下にて、１Ｎ塩酸１．３ｍｌを加えた。反応容器を室温に戻し、水素置換した後、１２時間撹拌した。窒素置換した後、ろ過をし、ろ液を溶媒留去した。ゲルろ過(ゲルろ過（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製ＬＨ−２０、メタノール）をし、溶媒留去した。メタノール４．３ｍｌに溶解させ、氷浴下で０．０１Ｍ酢酸ナトリウムのメタノール溶液４．３３ｍｌをゆっくりと加えて、１時間撹拌した。溶媒を留去した後、ゲルろ過（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製ＬＨ−２０、メタノール)によって、還元体（化合物（２０）、収量１９．９ｍｇ，収率９６％）を得た。得られた化合物の同定はＮＭＲ及びＥＳＩ−ＭＳにより行なった。その結果を以下に示す。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，Ｊ  ｉｎ  Ｈｚ）δ  ４．５３〜４．４６（ｍ，１Ｈ），４．１７〜４．０９（ｍ，２Ｈ），３．８７〜３．７７（ｍ，８Ｈ），３．７４〜３．６０（ｍ，２４Ｈ），３．５３〜３．４６（ｍ，３Ｈ），３．２２〜３．１６（ｍ，３Ｈ），２．８２（ｂｒｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，１Ｈ），２．０２（ｓ，６Ｈ），１．６０（ｍ，１Ｈ），１．１４（ｂｒｓ，２Ｈ）
質量分析：ＥＳＩ−ＭＳ法（Micromass type-ZMD）
質量走査条件：５０〜２０００ｍ／ｅ，４．０ｓｅｃ／ｓｃａｎ
印加電圧：３．８ｋＶ、Ｃｏｎｅ電圧：３０，８０Ｖ
溶媒：メタノール
ＥＳＩ（−）法で、ｍ／ｚ８４９（Ｍ−Ｈ）が観測された。目的物質の質量数はＭＷ８５０であり、合成目的物に相当する質量数と一致した。
【０１５３】
〔糖化合物の合成３〕
最後に、以下の工程２０及び２１の通り、末端がビオチンの単糖又は多糖を含む糖化合物として、化合物（２４）及び（２５）の合成を行った。化合物（２４）は前記化合物（１６）のビオチン化体、化合物（２５）は前記化合物（２０）のビオチン化体である。
・工程２０（ビオチン化）
【０１５４】
【化３５】
2007298334.tif 000036
【０１５５】
１ｍｌのナスフラスコに、前工程で得られたシアル酸誘導体（化合物（１６））１．６ｍｇ（２．７μｍｏｌ）、市販のビオチン化剤（化合物（２３））１．５ｍｇ（２７μｍｏｌ）を入れて、窒素雰囲気下でジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、０．２５ｍｌ）、トリエチルアミン（０．０２０ｍｌ）を加えた。室温で６時間撹拌した後、溶媒留去した。ゲルろ過（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製ＬＨ−２０、メタノール）による精製を行い、ビオチン化体（化合物（２４）、収量２．５ｍｇ、収率１０１％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，Ｊ  ｉｎ  Ｈｚ）δ  ５．１７（ｄｄ，Ｊ＝５２．３、２．０Ｈｚ，１Ｈ），４．５０（ｄｄ，Ｊ＝７．８，５．０Ｈｚ，１Ｈ），４．３１（ｄｄ，Ｊ＝７．８，４．３Ｈｚ，１Ｈ），４．１０（ｔ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｍ，１Ｈ），３．９０〜３．８１（ｍ，４Ｈ），３．７７〜３．６２（ｍ，３０Ｈ），３．５６〜３．５０（ｍ，３Ｈ），２．９２（ｄｄ，Ｊ＝１２．９，５．０Ｈｚ，１Ｈ），２．７０（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），２．２１（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），２．１９（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．００（ｓ，３Ｈ），１．６９〜１．５９（ｍ，４Ｈ），１．５２（ｑｎ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．４６（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．３８〜１．３２（ｍ，２Ｈ）１．２７（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）
・工程２１（ビオチン化）
【０１５６】
【化３６】
2007298334.tif 000037
【０１５７】
５ｍｌのナスフラスコに、前工程で得られた糖化合物（化合物（２０））２．０ｍｇ（２．３μｍｏｌ）、市販のビオチン化剤（化合物（２３））１．３ｍｇ（２．３μｍｏｌ）を入れて、窒素雰囲気下でＤＭＦ（０．２５ｍｌ）、トリエチルアミン（０．０２０ｍｌ）を加えた。室温で４．５時間撹拌した後、溶媒留去した。ゲルろ過（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製ＬＨ−２０、メタノール）による精製を行い、ビオチン化体（化合物（２５）、収量０．９ｍｇ、収率３２％）を得た。
【０１５８】
得られた化合物の同定はＥＳＩ−ＭＳにより行なった。その結果を以下に示す。
質量分析：ＥＳＩ−ＭＳ法（Micromass type-ZMD）
質量走査条件：２００〜１８００ｍ／ｅ，４．０ｓｅｃ／ｓｃａｎ
印加電圧：＋／−３．８ｋＶ、Ｃｏｎｅ電圧：＋／−３０，＋／−８０Ｖ
溶媒：メタノール
ＥＳＩ（−）法で、ｍ／ｚ１１８８（Ｍ−Ｈ）が観測された。目的物質の質量数はＭＷ１１８９であり、合成目的物に相当する質量数と一致した。
【０１５９】
［実施例２：糖類固定化体の作製］
ポリオレフィンの板に、Ｎｉ（８０重量％）／Ｃｒ（２０重量％）からなる合金を５ｎｍの厚さとなるように蒸着させた後に、金を９０ｎｍの厚さで蒸着させた。得られた担体について、オゾンクリーナー（（株）レーザーテクノ社製）により５分間清浄化処理を行なった後、室温にて直ちに１６−メルカプトヘキサデカン酸／エタノール溶液（５．０ｍＭ）中に７０時間浸漬した（ＳＡＭ化工程）。浸漬後の担体をエタノールで十分に洗浄し、一晩乾燥させた。乾燥後の担体を、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）がそれぞれ５．０ｍＭ及び２０．０ｍＭとなるように調製した水溶液に１時間浸漬した（ＮＨＳ化工程）。浸漬後の担体を水で十分に洗浄し、乾燥してから、［実施例１］で得られた化合物（９）の１０ｍＭメタノール溶液に所定の時間（後述の表１−１の最左行に記載の時間）浸漬した（糖化合物固定化工程）。その後、メタノールで十分に洗浄し、乾燥することにより、糖化合物である化合物（９）が担体に固定化された固定化体を得た。
上述の各処理の内容を下記反応式に模式的に示す。
【０１６０】
【化３７】
2007298334.tif 000038
【０１６１】
また、［実施例１］で得られた化合物（１６）についても、１０ｍＭ及び３０ｍＭの濃度のメタノール溶液を調製し、上記と同様の手順で固定化を行なった。浸漬の時間は、後述の表１−２の最左行に記載の通りである。
【０１６２】
［実施例３：表面分析による糖類固定化体の評価］
・ＴｏＦ−ＳＩＭＳでの定量：
［実施例２］にて作製した固定化体について、飛行時間型二次イオン質量分析（ＴｏＦ−ＳＩＭＳ）による表面分析を行なった。測定装置としてはＩＯＮ−ＴＯＦ社製ＴＯＦ−ＳＩＭＳ ＩＶを使用し、一次イオンはＡｕ+、加速エネルギーは２５ｋｅＶ、照射電流は０．５ｐＡであった。二次イオンは正及び負イオンを収集し、分析面積は２００μｍ角、積算時間は１５０秒であった。上述の糖化合物固定化工程（実施例２）における浸漬時間（化合物（９）又は化合物（１６）のメタノール溶液に担体を浸漬させた時間）とＴｏＦ−ＳＩＭＳにより測定されたフッ素イオン（Ｆ-）の強度との関係を、下記表１−１及び表１−２、並びに図１のグラフに示す。なお、図１のグラフにおいて、横軸は担体の浸漬時間を、縦軸はＴｏＦ−ＳＩＭＳにより測定されたフッ素イオン強度をそれぞれ示しており、また、Ａは化合物（９）の１０ｍＭメタノール溶液を用いた場合、Ｂは化合物（１６）の３０ｍＭメタノール溶液を用いた場合、Ｃは化合物（１６）の１０ｍＭメタノール溶液を用いた場合のグラフをそれぞれ表わしている。表１及び図１から明らかなように、化合物（９）又は化合物（１６）の固定化量の経時変化を明確に得ることが出来た。この実験条件下では、化合物（１６）よりも化合物（９）の方が高い密度で固定化されたと考えられた。
【０１６３】
なお、浸漬時間が０とは、上述の糖化合物固定化工程における浸漬処理前の担体（ＳＡＭ化工程及びＮＨＳ化工程後の担体）を指す。
【０１６４】
【表１】
2007298334.tif 000039
【０１６５】
・ＸＰＳでの定量：
［実施例２］にて作製した化合物（９）の固定化体について、ＸＰＳ分析を行なった。測定装置としてはＰＨＩ社製Ｑｕａｎｔｕｍ２０００を用いた。Ｘ線源は単色化Ａｌ−Ｋα，出力は１６ｋＶ−３０Ｗ（Ｘ線発生面積１５０μｍφ）、分光系のパスエネルギーは１８７．８５ｅＶ（ワイドスペクトル）及び５８．７ｅＶ（ナロースペクトル）、測定領域は５００μｍ角、取り出し角は４５°（表面より）であった。［実施例２］の各工程（ＳＡＭ化工程、ＮＨＳ化工程、糖化合物固定化工程）における分析結果を表２に記載した。
【０１６６】
【表２】
2007298334.tif 000040
【０１６７】
［実施例４：糖類固定化体を用いたＱＣＭセンサーチップの作成］
・センサーチップの作製：
測定装置は、水晶発振子微量天秤として、イニシアム社製Ａｆｆｉｎｉｘ−Ｑを使用した。共振周波数は２７ＭＨｚである。センサーチップのセンサー部分は表面が金で形成されており、この金表面上に以下の工程で上述の化合物（９）を固定化した。
【０１６８】
センサーチップのセンサー部分を硫酸／過酸化水素水（＝３／１）に５分間接触させる事により洗浄した。水にて十分に洗浄後、窒素気流により水分を吹き飛ばし、乾燥させた。その後、センサー部分を、１６−メルカプトヘキサデカン酸／エタノール溶液（５．０ｍＭ）中に７０時間浸漬した（ＳＡＭ化工程）。浸漬後の担体をエタノールで十分に洗浄し、３時間乾燥させた。乾燥後、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）がそれぞれ５．０ｍＭ及び２０ｍＭとなるように調製した水溶液をセンサー部分に滴下し、高湿度条件下で１５分間室温にて静置した。水で十分に洗浄し、窒素気流により水分を吹き飛ばし、乾燥させた。センサー部分を、［実施例１］で得られた化合物（９）の９．０ｍＭメタノール溶液に２３時間浸漬した（糖化合物固定化工程）。その後、メタノールで十分に洗浄し、乾燥した。その後エタノールアミン水溶液（１Ｍ）をセンサー部分に滴下し（エタノールアミン処理）、水で十分に洗浄した。続いて、センサーチップを測定装置にセットした。測定用のウェルにウイルス培養のための培地（０．３％ＢＳＡを含む）を７．２ｍｌ入れ、液の温度を２５℃にコントロールし、６００ｒｐｍで攪拌しながら１時間浸漬した（ＢＳＡ処理）。なお、ＢＳＡ処理は、非特異吸着の抑制を目的としたものである。
【０１６９】
また、同様の方法で化合物（１６）を固定化したセンサーチップ、化合物（２０）を固定化したセンサーチップも作製した。なお、化合物（１６）のメタノール溶液を１３．５ｍとし、浸漬時間を４８時間とし、化合物（２０）の１３．６ｍＭとし、浸漬時間を２１時間とした以外は同様の条件で行った。
上述のエタノールアミン処理の内容を下記反応式に模式的に示す。
【０１７０】
【化３８】
2007298334.tif 000041
【０１７１】
［実施例５：ＱＣＭを用いた、糖類固定化体によるウイルスの検出］
上記手順で得られた、リガンドとして化合物（９）、化合物（１６）、又は化合物（２０）を固定化したセンサーチップを用いて、引き続き、以下の手順でウイルスの検出実験を行なった。
・ウイルス検体液の調製：
インフルエンザＡ型（Ｈ３Ｎ２）／Ｆｕｋｕｏｋａ／Ｃ２９／８５を用いて、ウイルスを以下の手順で培養した。まず、フラスコでイヌ腎臓由来細胞株（ＭＤＣＫ細胞）を３７℃で３日間培養した後、細胞増殖培地を除去した。次に、ウイルスをＭＤＣＫ細胞に接種して、室温で１時間吸着させた後、ウイルスを除去し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を０．３％の濃度で含有するインフルエンザ培地を加え、３７℃で３日間培養した。細胞変性効果（ＣＰＥ）３〜４＋を示した感染細胞と培養上清とを回収し、４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心処理をした。上清をウイルス液として０．５ｍｌずつ小分け分注した。ウイルス力価を測定したところ、１．３×１０７［ＴＣＩＤ／ｍｌ］であった。
【０１７２】
・糖化合物とウイルスとの相互作用の測定：
上記実施例４で作製したＱＣＭセンサーチップを装置にセットした後、ウイルス培養のための培地（７．２ｍｌ）に浸漬し、周波数の測定を開始した。周波数の変化がなくなり安定化したところで、ウイルス培養液（０．５ｍｌ）を滴下した。ウイルス培養液は培地と攪拌混合され、ウイルスの濃度は６．５％に薄まるため、その力価は、８．４×１０５［ＴＣＩＤ／ｍｌ］と算出できる。温度は終始２５℃であり、攪拌速度は６００ｒｐｍであった。ウイルスの添加後に、周波数の減少を観測した。比較として、ＱＣＭセンサーに糖化合物を固定化しない以外は上記と同様に処理したセンサーチップ（即ち、センサー表面をＮＨＳ化した後にエタノールアミンのみを固定化したセンサーチップ）を用いて、上と同様の手順でウイルスの検出実験を行なった。
【０１７３】
測定結果を図２に示す。なお、図２のグラフにおいて、Ａはエタノールアミンを固定化した比較用のセンサーチップを用いた場合、Ｂは化合物（９）を固定化したセンサーチップを用いた場合、Ｃは化合物（１６）を固定化したセンサーチップを用いた場合、Ｄは化合物（２０）を固定化したセンサーチップを用いた場合をそれぞれ示している。図２から、検体液中のインフルエンザウイルスと、糖化合物である化合物（９）、化合物（１６）、化合物（２０）との相互作用により、インフルエンザウイルスの吸着量が時間の経過と共に変化していることが分かる。比較のエタノールアミンのみを固定化したものでは、周波数に変化は認められなかった。
【０１７４】
上記実施例３では、化合物（１６）よりも化合物（９）の方が高い密度で固定化されると考えられたが、本測定の結果、化合物（９）を固定化したチップよりも化合物（１６）を固定化したチップの方がウイルスの吸着量が多かった。ウイルスの吸着量は必ずしも糖化合物の固定化量と比例するとは限らず、糖類、糖化合物あるいは被検出物質によって至適な糖化合物の固定化量があると推察された。また、糖化合物に含まれるポリエーテルの長さや、糖類の相違が反応性に影響を与えることが明確に示された。すなわち、糖類と被検出物質との組み合わせや反応条件等により適宜糖化合物の構造や固定化量を調節することにより、目的に応じたセンサーを作製できることがわかった。
【０１７５】
［実施例６：ＱＣＭを用いた、糖類固定化体によるレクチンの検出］
・レクチン検体液の調製：
ニホンニワトコレクチン（Jオイルミルズ社製、ＳＳＡ、凍結乾燥粉末）をＰＢＳ緩衝液に溶解させ、２ｍｇ/ｍＬの濃度の溶液を調製した。
【０１７６】
・糖化合物とレクチンとの相互作用の測定：
上記実施例４で作成した化合物（２０）を固定化したＱＣＭセンサーチップを用いた。センサーチップを装置にセットした後、ＰＢＳ緩衝溶液（７．９５ｍｌ）に浸漬し、周波数の測定を開始した。周波数の安定化後に、液を０．３％ＢＳＡ緩衝溶液に入れ替え、６０分間攪拌した（ブロッキング）。プローブをＰＢＳ緩衝溶液で洗浄した後に、再びＰＢＳ中で６０分間安定化させた。その後、Mouse IgGを１００μＬ添加し、３０分間周波数の挙動を観察したが、Mouse IgG添加による顕著なシグナルの変動は確認されなかった。その後、上述のニホンニワトコレクチン溶液を１００μＬ添加したところ、周波数の変化が観測された。
測定結果を図３に示す。検体中のニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）と化合物（２０）との相互作用により、ニホンニワトコレクチンの吸着量が時間の経過と共に変化していることが分かった。
【０１７７】
［実施例７：ハイドロゲルへの糖化合物の固定化による糖類固定化体の作製］
次に、担体表面に形成された自己組織化膜の表面に固定化されたハイドロゲルへ糖化合物を固定化する方法を用いて固定化体を作製した。なお、ここで「蛋白質・高分子複合ハイドロゲル」とは、蛋白質と、水分を多く含むことの出来る親水性ポリマーとから作製された、その構造中に蛋白質を含むハイドロゲルを指す。
【０１７８】
・ポリマーの調製
モノマーとして、N-アクリロイルモルホリン（KOHJIN社製、以下ＮＡＭと略すこともある）０．２８３４ｇとＮ-アクリロイロキシスクシンイミド（ACROS ORGANIC社製、以下ＮＡＳと略すこともある）０．８４５７ｇと、脱水ジオキサン（和光純薬工業社製）２０．８１６０ｇとをよく混合し、５０ｍＬ四つ口フラスコにそそぎ入れ、室温で３０分間窒素にて脱気を行い、モノマー溶液を調製した。このモノマー溶液をオイルバスにて６０℃に昇温し、重合開始剤であるアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、キシダ化学株式会社製）０．０１２３１ｇを脱水ジオキサン０．５ｇに溶かした溶液を入れることにより、重合を開始した。重合は窒素雰囲気下、８時間行った。
【０１７９】
重合後の反応溶液を、０．５Ｌのジエチルエーテル（国産化学株式会社製）に滴下することにより目的のポリマーを再沈殿させ、溶媒を除去することにより粉末化した。
得られたポリマーについて、標準ポリスチレンで校正されたＳＥＣ測定を行った結果、重合平均分子量（Ｍｗ）が約８６，０００と見積もられた。また、得られたポリマーに含まれるＮＡＳとＮＡＭのモル比（ＮＡＳ／ＮＡＭ）は、ＮＭＲ測定からＮＡＳ／ＮＡＭ＝３０／７０と見積もられた。
【０１８０】
・蛋白質・高分子複合ハイドロゲルの作製と固定化、及び、化合物（２５）の固定化
ストレプトアビジン(WAKO社製)を炭酸緩衝液（ｐＨ＝９．０，１００ｍＭ）に溶解させ、3.0, 1.0, 0.5, 0.25, 0.13 wt%の濃度の水溶液をそれぞれ調製した。ポリマーを水に溶解させ、3.0, 1.0, 0.5, 0.25, 0.13 wt%の濃度の水溶液をそれぞれ調製した。同じ濃度同士のポリマー水溶液とストレプトアビジン水溶液を１：１０の量の割合で混合し、５種類の混合溶液とした。
【０１８１】
樹脂製金蒸着基板（２．５ｃｍ×２．５ｃｍ）を１６−メルカプトヘキサデカン酸のエタノール溶液（５．０ｍＭ）に１６時間浸漬させた。その後、エタノールで洗浄、水にて洗浄し、窒素にて乾燥させた。続いて、上記実施例４と同様にＥＤＣ／ＮＨＳ水溶液によりスクシンイミド基を導入した。これに、各濃度の前記混合溶液を３μＬずつスポットした。室温にて３０分静置し乾燥させ、蛋白質・高分子複合ハイドロゲルを形成させた。その後、エタノールアミン水溶液（ｐＨ＝８．５、１Ｍ）に基板を浸漬させ、未反応のスクシイミド基をエタノールアミノ基へと変換した。続いて、ＢＳＡ（SIGMA社製）のＰＢＳ水溶液（１Ｍ，ｐＨ＝７．４）に金基板を３０分間浸漬させた後、水にて洗浄し、窒素にて乾燥させた。
【０１８２】
ポリマーとストレプトアビジンとからなる蛋白質・高分子複合ハイドロゲルのスポット上に、化合物（２５）の緩衝溶液（１ｍＭ，３μＬ、ｐＨ＝９．０）をスポットし、３０分間、室温にて静置した。その後、水にて洗浄し、窒素にて乾燥させた。これにより、基板上に固定化された蛋白質・高分子複合ハイドロゲルに化合物（２５）がビオチン−アビジン結合により結合した固定化体が作製された。
【０１８３】
［実施例８：ハイドロゲルを用いて作製された糖類固定化体によるレクチンの検出］
上記実施例７で作製した固定化体を用いて、蛍光によるレクチンの検出を行った。
・測定
上記で作製した金基板を、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）ラベル化されたニホンニワトコレクチン（Jオイルミルズ社製、ＦＩＴＣ−ＳＳＡ）の緩衝溶液（ｐＨ＝７．４、１０μｇ／ｍＬ）に３０分間、室温にて浸漬し、糖−レクチンの反応を行った。反応終了後、水にて洗浄し、窒素にて乾燥させた。最後に、蛍光測定装置FX PRO PLUS （BioRAD社製）を用いて、結合したニホンニワトコレクチンに由来する蛍光量を測定した。この時の励起光波長は５４７ｎｍであり、検出波長は５６３ｎｍであった。
【０１８４】
その結果を、図４に示す。なお、横軸の固形分濃度とは、蛋白質・高分子複合ハイドロゲルの調製時に使用した混合溶液に含まれるストレプトアビジンとポリマーを合わせた重量濃度である。固形分濃度の上昇に伴い、蛍光強度が増強することが見出された。すなわち、ストレプトアビジン量の増加に伴って化合物（２５）の固定化量が増加し、化合物（２５）と相互作用するニホンニワトコレクチンの吸着量が増加したことがわかった。
このように、様々な固定化方法や表面処理技術を組み合わせて用いて、本発明の糖類固定化体を作製できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１８５】
糖類とポリエーテルとからなる糖化合物が固定化された本発明の固定化体は、固定化された糖類の安定度や非特異吸着の抑制の点で優れており、例えば、この担体表面をセンサー等として好適に利用することができる。本発明のセンサーは、検体中の被検出物質の検出、解析、精製等に好適に使用することが出来る。よって、本発明は産業上の任意の分野で用いることが可能であるが、中でも、診断、医療、製薬開発、食品分析、環境測定などの分野においてとりわけ好適に使用することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】実施例２において担体を浸漬した各糖化合物溶液に浸漬時間と、実施例３においてＴｏＦ−ＳＩＭＳにより測定されたフッ素イオン強度との関係を表わすグラフである。
【図２】実施例５において測定された、ウイルスと糖化合物との相互作用に基づくＱＣＭセンサー上へのウイルスの付着による周波数の時間変化を表すグラフである。
【図３】実施例６において測定された、レクチンと糖化合物との相互作用に基づくＱＣＭセンサー上へのレクチンの付着による周波数の時間変化を表すグラフである。
【図４】実施例８において測定された、レクチンと糖化合物との相互作用に基づく、ラベル化レクチンの付着による蛍光発光強度変化を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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