(57)【要約】【課題】エネルギー代謝促進剤、肥満抑制剤および血糖低下剤、エネルギー代謝を促進させる物質のスクリーニング方法、ならびに非ヒトトランスジェニック動物を提供する。【解決手段】本発明のエネルギー代謝促進剤は、ＨＢ−ＥＧＦの発現または機能を促進する物質を含有してなるものである。また、本発明のスクリーニング方法は、被験物質が、骨格筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦの発現を増加させるか否かを評価することを含むものである。さらに、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、骨格筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦを強発現するように形質転換されたものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＢ−ＥＧＦの発現または機能を促進する物質を含有してなる、エネルギー代謝促進剤。
【請求項２】
上記物質が、骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現または機能を促進する、請求項１記載のエネルギー代謝促進剤。
【請求項３】
上記物質が、ＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターである、請求項１記載のエネルギー代謝促進剤。
【請求項４】
上記発現ベクター中のプロモーターが、骨格筋細胞特異的プロモーターである、請求項３記載のエネルギー代謝促進剤。
【請求項５】
ＨＢ−ＥＧＦの発現または機能を促進する物質を含有してなる、肥満抑制剤。
【請求項６】
ＨＢ−ＥＧＦの発現または機能を促進する物質を含有してなる、血糖低下剤。
【請求項７】
ＨＢ−ＥＧＦ又はその誘導体を有効成分として含有する、エネルギー代謝促進剤。
【請求項８】
ＨＢ−ＥＧＦ又はその誘導体を有効成分として含有する、血糖低下剤。
【請求項９】
ＨＢ−ＥＧＦ又はその誘導体を有効成分として含有する、肥満抑制剤。
【請求項１０】
被験物質が、骨格筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦの発現を増加させるか否かを評価することを含む、エネルギー代謝を促進させる物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、請求項１０記載の方法；
（ａ）被験物質とＨＢ−ＥＧＦの発現を測定可能な骨格筋細胞とを接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた上記細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量を測定し、その発現量を、被験物質を接触させない対照細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＨＢ−ＥＧＦの発現量を増加させる被験物質を選択する工程。
【請求項１２】
下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、請求項１０記載の方法；
（ａ）被験物質を動物に投与する工程；
（ｂ）被験物質を投与した動物の骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量を測定し、その発現量を、対照動物の骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＨＢ−ＥＧＦの発現量を増加させる被験物質を選択する工程。
【請求項１３】
被験物質が、骨格筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦの受容体であるＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４と結合し、該受容体を活性化させるか否かを判定することを含む、エネルギー代謝を促進させる物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
骨格筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦを強発現するように形質転換された非ヒトトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エネルギー代謝促進剤、肥満抑制剤および血糖低下剤、エネルギー代謝を促進させる物質のスクリーニング方法、ならびに非ヒトトランスジェニック動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
運動不足は、過食と並ぶエネルギー代謝異常の主要要因である。一方、習慣的な運動はインスリン感受性を高め、血中の糖・脂質プロファイルに様々な好影響を与える。運動は、骨格筋におけるグルコースの取り込みや脂肪酸の燃焼を促進することによって、直接的に糖尿病や高脂質症を改善する。また、肥満（特に、内臓肥満）に伴う脂肪毒性を解除してインスリン抵抗性を改善することも、よく知られた運動の効用である。そのため、運動による動物のエネルギー代謝促進機構の解明は、糖尿病、高脂血症などといった肥満に起因して発症する種々の疾患の予防法・治療法の開発につながると期待される。しかし、運動がどのような分子メカニズムを介して多彩なエネルギー代謝改善効果を発揮するのかについてはほとんど解明されていない。
【０００３】
ところで、細胞増殖因子としてＨＢ−ＥＧＦが知られている。このＨＢ−ＥＧＦはＥＧＦファミリーの増殖因子としてクローニングされた（非特許文献１参照）。本分子は、膜結合型の前駆体（ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦ）として合成され、細胞膜へと運ばれる。ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦがプロテアーゼによって切断されると、ＥＧＦ様ドメインを含む細胞外部分が遊離し、分泌型ＨＢ−ＥＧＦとなる（非特許文献２参照）。分泌型ＨＢ−ＥＧＦは、表皮、心筋、血管内皮、平滑筋、マクロファージなど種々の組織・細胞より生じ、ＥｒｂＢファミリー受容体に結合して細胞の増殖・分化・遊走、炎症反応など多岐にわたる生理機能を現す（非特許文献３参照）。さらに、最近、ＨＢ−ＥＧＦ欠損マウスの解析から、ＨＢ−ＥＧＦが心臓の形成に必要であることも示された（非特許文献４参照）。
【０００４】
以上のように、ＨＢ−ＥＧＦに関しては、種々の機能が知られているが、当該分子とエネルギー代謝との関連についてはほとんど知られていない。
【非特許文献１】Higashiyama et al., Science（１９９１）２５１：９３６−９３９
【非特許文献２】Goishi et al., Mol. Biol. Cell.（１９９５）６：９６７−９８０
【非特許文献３】Iwamoto and Mekada, Cytokine Growth Factor Rev.（２０００）１１：３３５−３４４
【非特許文献４】Iwamoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（２００３）１００：３２２１−３２２６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明では、動物のエネルギー代謝におけるＨＢ−ＥＧＦの役割を明らかにするとともに、エネルギー代謝におけるＨＢ−ＥＧＦの機能を利用したエネルギー代謝促進剤、肥満抑制剤、血糖低下剤などを提供することを目的とする。さらに本発明は、エネルギー代謝を促進させる物質のスクリーニング方法、動物のエネルギー代謝のメカニズム解明に利用できる非ヒトトランスジェニック動物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、上記の目的を達成すべく、運動の代謝改善作用を媒介する未知分子を探索するために、骨格筋において運動依存的に発現変動する遺伝子を網羅的に解析した。すなわち、糖・脂質代謝関連分子、ミトコンドリア関連分子、転写因子、分泌因子を中心に一万以上の遺伝子をｃＤＮＡマイクロアレイにてスクリーニングし、いくつかの候補遺伝子を選択した。
【０００７】
そして、本願発明者らは、これらの候補遺伝子のうち単回運動後早期に骨格筋で発現が増加するＨＢ−ＥＧＦ（ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）に着目し、骨格筋細胞（以下、単に骨格筋とも呼ぶ）特異的にＨＢ−ＥＧＦを強発現するトランスジェニックマウス（ＨＢ−ＥＧＦｍＴｇマウス）を作製した。そして、当該トランスジェニックマウスの解析を行った結果、野生型マウスと比較してエネルギー代謝機能に優れていることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の通りである。
〔１〕ＨＢ−ＥＧＦの発現または機能を促進する物質を含有してなる、エネルギー代謝促進剤。
〔２〕上記物質が、骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現または機能を促進する、上記〔１〕のエネルギー代謝促進剤。
〔３〕上記物質が、ＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターである、上記〔１〕のエネルギー代謝促進剤。
〔４〕上記発現ベクター中のプロモーターが、骨格筋細胞特異的プロモーターである、上記〔３〕のエネルギー代謝促進剤。
〔５〕ＨＢ−ＥＧＦの発現または機能を促進する物質を含有してなる、肥満抑制剤。
〔６〕ＨＢ−ＥＧＦの発現または機能を促進する物質を含有してなる、血糖低下剤。
〔７〕ＨＢ−ＥＧＦ又はその誘導体を有効成分として含有する、エネルギー代謝促進剤。
〔８〕ＨＢ−ＥＧＦ又はその誘導体を有効成分として含有する、血糖低下剤。
〔９〕ＨＢ−ＥＧＦ又はその誘導体を有効成分として含有する、肥満抑制剤。
〔１０〕被験物質が、骨格筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦの発現を増加させるか否かを評価することを含む、エネルギー代謝を促進させる物質のスクリーニング方法。
〔１１〕下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、上記〔１０〕の方法；
（ａ）被験物質とＨＢ−ＥＧＦの発現を測定可能な骨格筋細胞とを接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた上記細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量を測定し、その発現量を、被験物質を接触させない対照細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＨＢ−ＥＧＦの発現量を増加させる被験物質を選択する工程。
〔１２〕下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、上記〔１０〕の方法；
（ａ）被験物質を動物に投与する工程；
（ｂ）被験物質を投与した動物の骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量を測定し、その発現量を、対照動物の骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＨＢ−ＥＧＦの発現量を増加させる被験物質を選択する工程。
〔１３〕被験物質が、骨格筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦの受容体であるＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４と結合し、該受容体を活性化させるか否かを判定することを含む、エネルギー代謝を促進させる物質のスクリーニング方法。
〔１４〕骨格筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦを強発現するように形質転換された非ヒトトランスジェニック動物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のエネルギー代謝促進剤は、生体におけるエネルギー代謝を促進し肥満抑制効果を示すため、肥満抑制剤、さらには肥満に起因して発症する疾患の予防・治療剤として有用である。また、本発明のエネルギー代謝促進剤は、高脂肪食摂取時におけるインスリンの血糖低下作用を向上させるものであると考えられるため、血糖低下剤としても利用することができる。本発明のエネルギー代謝を促進させる物質のスクリーニング方法によれば、肥満抑制剤、血糖低下剤、または肥満に関連する疾患の予防・治療剤の新規な有効成分、あるいは該疾患の新規な研究用試薬の開発を行うことができる。さらに、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、動物のエネルギー代謝機構の解明、およびエネルギー代謝を促進させる物質のスクリーニングなどに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の内容をより具体的に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００１１】
（１）エネルギー代謝促進剤
本発明のエネルギー代謝促進剤は、ＨＢ−ＥＧＦの発現または機能を促進する物質を含有してなるものである。
【００１２】
本発明におけるエネルギー代謝促進剤とは、生体がエネルギーを得るために行う糖、脂質などの代謝を促進する機能を有する剤を意味する。本発明のエネルギー代謝促進剤は、ＨＢ−ＥＧＦの発現または機能を促進する物質を含有することによって、骨格筋、肝臓などにおけるエネルギー消費を促進し、その結果として肥満（内臓脂肪蓄積）を抑制することができる。したがって、本発明のエネルギー代謝促進剤は、肥満抑制剤や肥満に起因して発症する各種疾患の予防・治療薬として有効利用することができる。また、本発明のエネルギー代謝促進剤は、高脂肪食摂取時におけるインスリンの血糖低下作用を向上させるものであると考えられるため、血糖低下剤としても利用することができる。
【００１３】
また、本発明のエネルギー代謝促進剤に含まれる物質は、好ましくは「骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現を促進する物質」である。ここで骨格筋細胞とは、骨格筋を形成する細胞のことを意味する。骨格筋としてより具体的には、腓腹筋、前脛骨筋、ヒラメ筋、長肢伸筋、外側広筋、大腿二頭筋などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１４】
また、本発明において、「ＨＢ−ＥＧＦの発現または機能を促進する」とは、ＨＢ−ＥＧＦの通常の発現状態、あるいは、ＨＢ−ＥＧＦが生体において通常の機能を発揮している状態（すなわち、野生型の各種動物においてＨＢ−ＥＧＦが通常に発現し、機能を発揮している状態）と比較して、ＨＢ−ＥＧＦの発現または機能が増強されているような状態にすることを意味する。
【００１５】
ここで、ＨＢ−ＥＧＦの発現とは、ＨＢ−ＥＧＦからの翻訳産物（即ち、蛋白質）が産生され且つ機能的な状態で発現していることをいう。
【００１６】
そして、本発明のエネルギー代謝促進剤において、「ＨＢ−ＥＧＦの発現を促進する物質」としては、ＨＢ−ＥＧＦをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクター（すなわち、ＨＢ−ＥＧＦをコードするポリヌクレオチドを機能的に含有する発現ベクター）、ＨＢ−ＥＧＦ誘導因子などが挙げられる。
【００１７】
上記ＨＢ−ＥＧＦをコードするポリヌクレオチドには、ＨＢ−ＥＧＦ又はその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含むものとする。ここで、ＨＢ−ＥＧＦは、膜結合型のｐｒｏＨＢ−ＥＧＦであっても、該ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦがプロテアーゼによって切断された分泌型のＨＢ−ＥＧＦであってもよい。
【００１８】
ＨＢ−ＥＧＦをコードするポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号１に示すヒトＨＢ−ＥＧＦの全コード領域の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１９４５）、あるいは、配列番号３に示すマウスＨＢ−ＥＧＦの全コード領域の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１０４１５）から実質的になるＤＮＡの全部又は一部を含むＤＮＡ等が例示される。また、上記塩基配列中の任意の塩基を置換、欠失させる技術（例えばインビトロ突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発等）を利用することもできる。
【００１９】
ここで、「実質的になるＤＮＡ」とは、上記特定の塩基配列からなるＤＮＡに加えて、高度にストリンジェントな条件において、上記の特定塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズし得る塩基配列からなるＤＮＡを意味する。
【００２０】
ストリンジェントな条件は、所望する相同性やオリゴヌクレオチドの長さ等をもとに適宜当分野で利用されている計算式に当てはめて算出することができる。ここで、高度にストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１５Ｍ  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、０．２×ＳＳＣで５０−６０℃にて洗浄するような条件（高ストリンジェントな条件；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｈｏｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６．参照）を挙げることができる。
【００２１】
得られたポリヌクレオチドを原核細胞及び／又は真核細胞の各種の宿主内で複製保持又は自律増殖できるプラスミドベクター及びファージベクター等に適当な制限酵素部位を利用して挿入することによって、ＨＢ−ＥＧＦをコードするポリヌクレオチドを機能的に含有する発現ベクターを得ることができる。
【００２２】
ここで「機能的に」とは、そのベクターに適合する宿主細胞内で該遺伝子（ＤＮＡ）が転写され、それにコードされるタンパク質が産生され得るように該遺伝子が配置されていることを意味する。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、ＨＢ−ＥＧＦまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド、終止コドン及びターミネーター領域が連続的に配列された発現カセットを有するベクターである。形質転換体選択のためには選択マーカー遺伝子をさらに含有することが好ましい。
【００２３】
また、本発明のエネルギー代謝促進剤において、発現ベクターは特に限定されないが、骨格筋細胞で発現可能なものであることが好ましい。骨格筋細胞で発現可能な発現ベクター中のプロモーターは、骨格筋細胞において特異的に遺伝子の転写を促進する骨格筋特異的プロモーターであることが好ましい。骨格筋特異的プロモーターとして具体的には、ＭＣＫ（ｍｕｓｃｌｅ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）プロモーター、ＨＳＡ（ｈｕｍａｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｃｔｉｎ）プロモーターなどが例示される。
【００２４】
但し、本発明のエネルギー代謝促進剤が骨格筋細胞（例えば、腓腹筋細胞、前脛骨筋細胞）へ局所的に投与される場合には、用いられるプロモーターは必ずしも上記のような骨格筋特異的プロモーターである必要はなく、一般に用いられるプロモーターであればよい。
【００２５】
そして、本発明のエネルギー代謝促進剤に含まれる物質は、好ましくは「骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現を促進する物質」であることから、上記発現ベクターは、特に骨格筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦの発現を促進させるものであることが好ましい。上記発現ベクターとしてより具体的には、ＨＢ−ＥＧＦをコードするポリヌクレオチドを組み込んだｐ３３００ＭＣＫ−ＣＡＴベクター（非特許文献５；Jaynes et al., Mol. Cell. Biol.（１９８８）８：６２−７０参照）を挙げることができる。ｐ３３００ＭＣＫベクターは、特定の遺伝子を骨格筋特異的に発現させることを目的として開発されたベクターである。
【００２６】
本発明のエネルギー代謝促進剤において、「骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの機能を促進する物質」としては、ＨＢ−ＥＧＦまたはＨＢ−ＥＧＦの機能的断片などが挙げられる。つまり、本明細書で使用される場合、ＨＢ−ＥＧＦの機能の促進としては、ＨＢ−ＥＧＦ（蛋白質）の補充をも含むものとする。つまり、本発明のエネルギー代謝促進剤は、ＨＢ−ＥＧＦ又はその誘導体を有効成分として含有するものであってもよい。
また、本発明において、骨格筋細胞に対して局所的に投与されるＨＢ−ＥＧＦ（蛋白質）についても、「骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの機能を促進する物質」に含まれるものとする。なお、本明細書において、ＨＢ−ＥＧＦの機能的断片とは、ＨＢ−ＥＧＦタンパク質の断片であって当該断片がエネルギー代謝促進機能を発揮する形態のものを意味する。
【００２７】
ＨＢ−ＥＧＦは、上述したように膜結合型のｐｒｏＨＢ−ＥＧＦ（前駆体）として合成され、プロテアーゼによって切断されて分泌型タンパク質（成熟ＨＢ−ＥＧＦともいう）となる。本発明において、ＨＢ−ＥＧＦは膜結合型のｐｒｏＨＢ−ＥＧＦであってもよいし、分泌型の成熟ＨＢ−ＥＧＦであってもよい。
【００２８】
ＨＢ−ＥＧＦとしてより具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるもの、あるいは、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるものが挙げられる。配列番号２で表されるアミノ酸配列は、ヒト由来のＨＢ−ＥＧＦタンパク質の一例であり、膜結合型のｐｒｏＨＢ−ＥＧＦである。また、配列番号４で表されるアミノ酸配列は、マウス由来のＨＢ−ＥＧＦタンパク質の一例であり、膜結合型のｐｒｏＨＢ−ＥＧＦである。
【００２９】
そして、上記分泌型タンパク質の一例としては、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列において、第６３番目から第１４８番目までのアミノ酸配列を少なくとも有するポリペプチドなどが挙げられる。
【００３０】
また、ＨＢ−ＥＧＦは、上記のヒトＨＢ−ＥＧＦ又はマウスＨＢ−ＥＧＦのオルソログ、あるいはそれらの変異体（ＳＮＰ、ハプロタイプを含む）をも含む。ＨＢ−ＥＧＦのオルソログは特に限定されず、例えば任意の動物、具体的には哺乳動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、マウス）に由来するものであり得る。
【００３１】
さらに、ＨＢ−ＥＧＦは上述のものに限定されることはなく、ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４と結合し、該受容体を活性化させ、エネルギー代謝を促進させる機能を有するものである限り、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列において、１又は２以上（好ましくは、１〜３０個程度、好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸を欠失、置換、及び／又は付加してなるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。なお、上記のＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４を活性化させるというＨＢ−ＥＧＦの機能は、該受容体を活性化させることによって活性化されるセリン・スレオニンキナーゼＥＲＫの活性を測定することによって、確認することができる（Ｂｅｓｎｅｒ  ＧＥら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１２９、Ｎｏ．２、ｐ６０９−６２５（２００５））。
【００３２】
あるいは、ＨＢ−ＥＧＦとしては、例えば、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列と、６０％以上、７０％以上、８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表わされるタンパク質であり、かつ、エネルギー代謝を促進させる機能を有するタンパク質が挙げられる。
【００３３】
本明細書において、「相同性」とは、二つのポリペプチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものである。二つのポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、「相同性」（「同一性」とも言われる）なる用語は、当業者には周知である。
【００３４】
また、ＨＢ−ＥＧＦは、天然蛋白質又は組換え蛋白質であり得る。ＨＢ−ＥＧＦは、自体公知の方法により調製できる。
また、ＨＢ−ＥＧＦの誘導体としては、ＨＢ−ＥＧＦと酸または塩基との生理学的に許容される塩、ＨＢ−ＥＧＦのＣ末端がアミド化（−ＣＯＮＨ２）またはエステル化（−ＣＯＯＲ：ここでＲとしては、例えば、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ６−１２アリール基、Ｃ７−１４アラルキル基など）されているもの、ＨＢ−ＥＧＦのＮ末端のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、ＨＢ−ＥＧＦのＮ末端のアミノ基がＣ１−６アルキル化されているもの、ＨＢ−ＥＧＦ分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質などが挙げられる。
【００３５】
さらに、本発明のエネルギー代謝促進剤において、「骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの機能を促進する物質」には、骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの受容体であると考えられるＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ４と特異的に結合し、該受容体を活性化させる物質、すなわち、該受容体のアゴニストも含むものとする。
【００３６】
本発明のエネルギー代謝促進剤は、上記のようなＨＢ−ＥＧＦの発現または機能を促進する物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含むことができる。
【００３７】
医薬上許容される担体としては、当業者に周知の担体を適宜使用することができ特に限定されない。
【００３８】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００３９】
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与等）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。
【００４０】
また、本発明のエネルギー代謝促進剤が非経口的投与される場合には、骨格筋細胞（例えば、腓腹筋細胞、前脛骨筋細胞）への局所投与もまた好ましいので、かかる局所投与に適当な製剤化処理が行われる。
【００４１】
なお、本発明のエネルギー代謝促進剤がＨＢ−ＥＧＦをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターを含有してなる場合、その投与方法として、例えばパーティクルガン法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、陽イオン性脂質等の脂質を使用する方法などの自体公知の遺伝子導入法を採用することも可能である。これによれば、エネルギー代謝促進剤を骨格筋細胞へ局所的に投与することができる。
【００４２】
本発明の製剤の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、例えば、成人１日あたり有効成分量として約０．００１〜約５００ｍｇ／ｋｇであり得る。
【００４３】
上述のような本発明のエネルギー代謝促進剤は、生体におけるエネルギー代謝を促進し肥満抑制効果を示すため、肥満抑制剤、さらには肥満に起因して発症する疾患の予防・治療剤として有用である。ここで、肥満に起因して発症する疾患の予防・治療剤とは、肥満に起因して発症する種々の疾患（例えば高脂血症、糖尿病、痛風、脂肪肝、高血圧、狭心症、心筋梗塞、脳血管障害（脳梗塞、脳塞栓、脳出血）、睡眠時無呼吸症候群、脂肪萎縮症（先天性、後天性、抗ウィルス薬によるもの等）、高尿酸血症、変形性関節症、腰痛症などの疾患）の治療あるいは予防の少なくとも何れかに有効な剤のことをいう。なお、後述の実施例にも示すように、骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの強発現は、高脂肪食を摂取した場合に特に脂肪蓄積抑制効果が高い。このことから、本発明の肥満抑制剤は、高脂肪食摂取に起因した肥満の抑制に使用することが好ましい。
【００４４】
さらに、本発明のエネルギー代謝促進剤は、後述の実施例に示すように、骨格筋において糖代謝を促し、高脂肪食摂取時におけるインスリンの血糖低下作用を向上させるものであると考えられるため、血糖低下剤としても利用することができる。本発明の血糖低下剤は、糖尿病などの予防・治療に好適に用いることができる。
【００４５】
また、本発明の範疇には、上述したＨＢ−ＥＧＦの発現または機能を促進する物質を含有してなる肥満抑制剤、および血糖低下剤も含まれる。本発明の肥満抑制剤は、ＨＢ−ＥＧＦ又はその誘導体を有効成分として含有するものであってもよい。また、本発明の血糖低下剤は、ＨＢ−ＥＧＦ又はその誘導体を有効成分として含有するものであってもよい。ＨＢ−ＥＧＦ及びその誘導体としては、上述したものを用いることができる。
そして、ＨＢ−ＥＧＦの発現または機能を促進する物質は、骨格筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦの発現または機能を促進する物質であることが好ましい。
【００４６】
（２）スクリーニング方法
本発明はまた、被験物質が、骨格筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦの発現を増加させるか否かを評価することを含む、エネルギー代謝を促進させる物質のスクリーニング方法、ならびに、該スクリーニング方法によって得られうる物質に関する。
【００４７】
本発明のスクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００４８】
一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は細胞を用いて行うことができる。この場合、本発明のスクリーニング方法は下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む；
（ａ）被験物質とＨＢ−ＥＧＦの発現を測定可能な骨格筋細胞とを接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた上記細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量を測定し、その発現量を、被験物質を接触させない対照細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＨＢ−ＥＧＦの発現量を増加させる被験物質を選択する工程。
【００４９】
ここで、「発現を測定可能な骨格筋細胞」とは、ＨＢ−ＥＧＦの産物、例えば、転写産物、翻訳産物の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な骨格筋細胞をいう。ＨＢ−ＥＧＦの産物の発現レベルを直接的に評価可能な骨格筋細胞は、ＨＢ−ＥＧＦを天然で発現可能な骨格筋細胞であり得、一方、ＨＢ−ＥＧＦの産物の発現レベルを間接的に評価可能な骨格筋細胞は、ＨＢ−ＥＧＦ転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする骨格筋細胞であり得る。ＨＢ−ＥＧＦの発現を測定可能な骨格筋細胞は、動物の骨格筋細胞、例えば哺乳動物の骨格筋細胞であり得る。
【００５０】
ＨＢ−ＥＧＦを天然で発現可能な骨格筋細胞は、ＨＢ−ＥＧＦを潜在的に発現するものである限り特に限定されない。かかる細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。当該細胞として具体的には、マウスＣ２Ｃ１２細胞、ラットＬ６細胞などを挙げることができる。
【００５１】
ＨＢ−ＥＧＦ転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする骨格筋細胞は、ＨＢ−ＥＧＦ転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。ＨＢ−ＥＧＦ転写調節領域、レポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入され得る。ＨＢ−ＥＧＦ転写調節領域は、ＨＢ−ＥＧＦの発現を制御し得る領域である限り特に限定されない。レポーター遺伝子は、検出可能な蛋白質又は検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）遺伝子、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。
【００５２】
ＨＢ−ＥＧＦ転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される骨格筋細胞は、ＨＢ−ＥＧＦ転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、ＨＢ−ＥＧＦに対する生理的な転写調節因子を発現し、ＨＢ−ＥＧＦの発現量の増加の有無の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、ＨＢ−ＥＧＦを天然で発現可能な骨格筋細胞が好ましい。
【００５３】
被験物質とＨＢ−ＥＧＦの発現を測定可能な骨格筋細胞との接触は培地中で行われることが好ましく、当該培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択される。
【００５４】
上記方法の工程（ｂ）では、先ず、被験物質を接触させた骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量が測定される。発現量の測定は、用いた骨格筋細胞の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。例えば、ＨＢ−ＥＧＦの発現を測定可能な骨格筋細胞として、ＨＢ−ＥＧＦを天然で発現可能な骨格筋細胞を用いた場合、発現量は、ＨＢ−ＥＧＦの産物、例えば、転写産物又は翻訳産物を対象として自体公知の方法により測定できる。例えば、転写産物の発現量は、骨格筋細胞からtotal ＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。一方、ＨＢ−ＥＧＦの発現を測定可能な細胞として、ＨＢ−ＥＧＦ転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。
【００５５】
次いで、被験物質を接触させた骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量が、被験物質を接触させない対照細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させない対照細胞（骨格筋細胞）におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量は、被験物質を接触させた骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【００５６】
上記方法の工程（ｃ）では、ＨＢ−ＥＧＦの発現量を増加させる被験物質が選択される。ここで選択された物質は、骨格筋においてＨＢ−ＥＧＦの発現量を増加させてエネルギー代謝を促進させる物質であるため、肥満抑制剤、血糖低下剤、または肥満に関連する疾患の予防・治療剤、あるいは該疾患の研究用試薬のための候補物質となり得る。
【００５７】
本発明のスクリーニング方法の他の実施形態として、動物を用いて行われる方法が挙げられる。この場合、本発明のスクリーニング方法は、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、；
（ａ）被験物質を動物に投与する工程；
（ｂ）被験物質を投与した動物の骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量を測定し、その発現量を、対照動物の骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＨＢ−ＥＧＦの発現量を増加させる被験物質を選択する工程。
【００５８】
上記方法の工程（ａ）では、動物として、例えば哺乳動物が使用される。被験物質の動物への投与は自体公知の方法により行われ得る。また、投与の方法としては、経口投与、非経口投与など種々の投与形態が可能であるが、非経口投与を採用した場合には、骨格筋への局所的な投与が好ましい。
【００５９】
上記方法の工程（ｂ）では、ＨＢ−ＥＧＦの発現量は、自体公知の方法により測定され得る。また、本工程（ｂ）における対照動物は、例えば、被験物質が投与されていない動物であり得る。また、上記対照動物として、後述する本発明の非ヒトトランスジェニック動物を利用することもできる。対照動物として本発明の非ヒトトランスジェニック動物を用いる場合、本工程（ｂ）において、被験物質を投与した動物の骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量が、該トランスジェニック動物の骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量と同程度（あるいはそれ以上）であれば、該被験物質は、スクリーニング対象のエネルギー代謝を促進させる物質に該当する。対照動物として被験物質が投与されていない動物を用いる場合、本工程（ｂ）において、被験物質を投与した動物の骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量が、該対照動物の骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現量以上であれば、該被験物質は、スクリーニング対象のエネルギー代謝を促進させる物質に該当する。本工程（ｂ）における発現量の比較及び本工程（ｃ）は、ＨＢ−ＥＧＦの発現を測定可能な細胞を用いるスクリーニング方法におけるものと同様に行われ得る。
【００６０】
上記の工程（ｃ）で選択された物質は、骨格筋においてＨＢ−ＥＧＦの発現量を増加させてエネルギー代謝を促進させる物質であるため、肥満抑制剤、血糖低下剤、または肥満に関連する疾患の予防・治療剤、あるいは該疾患の研究用試薬のための候補物質となり得る。
【００６１】
また、本発明のスクリーニング方法の他の形態として、被験物質が骨格筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦの受容体であるＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４（文献：Ｏｌａｙｉｏｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．（２０００）１９：３１５９−３１６７参照）と結合し、該受容体を活性化させるか否かを判定することを含む、エネルギー代謝を促進させる物質のスクリーニング方法が挙げられる。このスクリーニング方法によれば、ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４のアゴニストを、本発明の肥満抑制剤、血糖低下剤、または肥満に関連する疾患の予防・治療剤、あるいは該疾患の研究用試薬のための候補物質としてスクリーニングすることができる。
【００６２】
上記のスクリーニング方法は、例えば下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む方法によって実施することができる。
（ａ）被験物質を、ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４に接触させる工程；
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して被験物質がＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４と結合するか否かを判定する工程；
（ｃ）上記（ａ）の工程に起因して生じるＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４の活性を測定し、該活性を被験物質を接触させない場合のＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４の活性と比較する工程；
（ｄ）上記（ｂ）および（ｃ）の結果に基づいて、ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４と結合し、該ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４を活性化させる被験物質を選択する工程。
【００６３】
上記工程（ｂ）において、被験物質がＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４と結合するか否かは、当該分野で周知の種々の方法により判定することができる。この判定方法として具体的には、表面プラズモン共鳴による方法、適切な放射性同位体又は蛍光物質で標識された被験物質とＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４に対する抗体を用いたバインディングアッセイなどが挙げられる。
【００６４】
上記工程（ｃ）において、ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４の活性を測定する方法としては、例えば、ＥｒｂＢ１（またはＥｒｂＢ４）活性に関連する細胞内現象を指標とする方法が挙げられる。例えば、被験物質をＥｒｂＢ１（またはＥｒｂＢ４）を発現している細胞に接触させ、接触により生じるＥｒｂＢ１（またはＥｒｂＢ４）活性に関連する細胞内現象を測定し、該現象を対照細胞の細胞内現象と比較する。ここで対照細胞は、例えば、被験物質が接触されていない細胞であり得る。ＥｒｂＢ１（またはＥｒｂＢ４）活性に関連する細胞内現象は、例えば、セリン・スレオニンキナーゼであるＥＲＫの活性化であり得る。なお、セリン・スレオニンキナーゼＥＲＫの活性は、Ｂｅｓｎｅｒ  ＧＥら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１２９、Ｎｏ．２、ｐ６０９−６２５（２００５）に記載の方法によって測定することができる。
【００６５】
次いで、上記工程（ｂ）および工程（ｃ）の結果に基づいて、ＥｒｂＢ１（またはＥｒｂＢ４）の活性の調節をもたらす被験物質を選択する。活性の比較は、例えば、有意差の有無に基づいて行なわれ得る。
【００６６】
（３）トランスジェニック動物
本発明はまた、骨格筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦを強発現するように形質転換された非ヒトトランスジェニック動物を提供する。
【００６７】
本発明のトランスジェニック動物の種は、ヒトを除く動物種である限り特に限定されないが、哺乳動物が好ましい。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。
【００６８】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物において、「骨格筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦを強発現する」とは、各種動物の骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの通常の発現状態（すなわち、野生型の各種動物の骨格筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦが正常に発現している状態）と比較して、骨格筋細胞でＨＢ−ＥＧＦの発現量が増加していることを意味する。
【００６９】
それゆえ、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、本発明のエネルギー代謝促進剤に関する説明で上述した「骨格筋細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現を促進する物質」が発現可能に導入されて形質転換された非ヒトトランスジェニック動物であり得る。
【００７０】
一実施形態において、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、マウスであり得る。
【００７１】
後述の実施例に示すように、本発明のトランスジェニック動物は、高脂肪食を摂取した場合に、野生型の動物と比較してエネルギー消費が亢進され内臓脂肪の蓄積を抑制させることが確認されている。また、本発明のトランスジェニック動物は、高脂肪食を摂取した場合に、野生型の動物と比較してインスリン投与に対する血糖低下を促進させる（すなわち、インスリン抵抗性を改善する）ことが確認されている。
なお、ここで用いる「高脂肪食」とは、例えば、総エネルギーの中で脂質の占める割合が通常の食事と比較して約３〜５倍の食事のことを意味する。
【００７２】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、例えば下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む方法により製造できる。
（ａ）ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子と骨格筋細胞において当該遺伝子を強発現させる配列とを連結した発現ベクター（すなわち、ＨＢ−ＥＧＦをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクター）を調製する工程；
（ｂ）上記発現ベクターを受精卵に導入し、遺伝子導入受精卵を仮親動物に移植する工程；
（ｃ）上記動物から出生した子孫からトランスジェニック動物を選別する工程；
（ｄ）上記選別した動物（ファウンダー）から系統を樹立する工程。
【００７３】
上記の工程（ａ）において、骨格筋細胞においてＨＢ−ＥＧＦ遺伝子を強発現させる配列としては、例えば、ＭＣＫ（ｍｕｓｃｌｅ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）プロモーター（上記非特許文献５参照）、ＨＳＡ（ｈｕｍａｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｃｔｉｎ）プロモーターなどが挙げられる。ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子としては、本発明のエネルギー代謝促進剤に使用されるＨＢ−ＥＧＦをコードするポリヌクレオチドを使用することができる。
【００７４】
発現ベクターの作製は、上記プロモーターを含む公知のベクターを用いて、自体公知の方法により行うことができる。得られた発現ベクターは、制限酵素等により線状化して工程（ｂ）に供することが好ましい。
【００７５】
上記の工程（ｂ）において、上記発現ベクターを受精卵に導入する方法は、例えば、交配後の雌の卵管を洗浄して受精卵を採取し、精子または卵子由来の前核にマイクロインジェクション法により上記発現ベクターを直接注入する方法が挙げられる。この受精卵を偽妊娠させた仮親の輸卵管に移植し、子宮内で発生を続けさせる。
【００７６】
上記の工程（ｃ）において、工程（ｂ）で移植した動物が出生した子孫からトランスジェニック動物を選別する方法としては、例えば、注入した発現ベクターが染色体ＤＮＡに組み込まれているか否かについて、産仔の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンブロット法またはＰＣＲ法によりスクリーニングする方法が挙げられる。
【００７７】
上記の工程（ｄ）において、工程（ｃ）で選別した動物（ファウンダー）から遺伝的背景の均一な系統を樹立する方法としては、発現ベクターが組み込まれた動物とＣ５７ＢＬ／６、ＦＶＢなどの近交系の野生型動物とを戻し交配する方法が挙げられる。
【００７８】
このようにして得られた本発明の非ヒトトランスジェニック動物をさらに交配して得られる子孫動物、これら動物に由来する組織または細胞も本発明に含まれる。上記組織としては、すべての組織（脳、神経、骨髄、筋肉、心臓、腎臓、肝臓、血球およびその前駆体、幹細胞など）が挙げられるが、本発明のトランスジェニック動物は骨格筋におけるＨＢ−ＥＧＦの強発現に特徴を有することから骨格筋の組織が好ましい。また、上記細胞としては、上記組織中に含まれる細胞、組織中から単離された細胞、これら細胞から樹立した細胞株が挙げられ、具体的には骨格筋細胞が好ましい。
【００７９】
また、本発明には、ＨＢ−ＥＧＦを強発現するように形質転換された動物細胞、すなわち、トランスジェニック細胞も含まれる。該トランスジェニック細胞は、ヒトを含む任意の動物に由来する細胞であり得るが、哺乳動物に由来する細胞が好ましい。
【００８０】
本発明のトランスジェニック細胞は、任意の組織に由来する細胞であり得るが、好ましくは骨格筋細胞である。該骨格筋細胞は、野生型の細胞と比較してエネルギー代謝機能が亢進し得る。
【００８１】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、例えば、動物のエネルギー代謝機構の解明（特に、動物のエネルギー代謝におけるＨＢ−ＥＧＦの機能の解明）、およびエネルギー代謝を促進させる物質のスクリーニングなどに有用である。
【実施例】
【００８２】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８３】
〔実施例１〕
（運動による骨格筋におけるＨＢ−ＥＧＦ遺伝子の発現）
Ｃ５７Ｂ６マウスに１４ｍ／分のトレッドミル運動を４５分間×２回負荷した後、約３時間経過した時点で各種骨格筋より全ＲＮＡを抽出し、マウスＨＢ−ＥＧＦ  ｃＤＮＡ（配列番号３参照）をプローブとしてノザンブロット解析を行った。
【００８４】
その結果を図１に示す。本図に示すように、９０分間のトレッドミル運動を負荷したＣ５７Ｂ６マウスの腓腹筋において、運動終了後３時間の時点でＨＢ−ＥＧＦ  ｍＲＮＡの発現が著しく増加していることが確認された。本実施例の結果により、本願発明者らが既に行っていたｃＤＮＡマイクロアレイ解析の結果（データ示さず）が追認された。
【００８５】
〔実施例２〕
（ＨＢ−ＥＧＦｍＴｇマウスの作製）
特定の遺伝子を骨格筋特異的に発現させることを目的として開発されたベクターｐ３３００ＭＣＫ−ＣＡＴ（上記非特許文献５参照）にマウスＨＢ−ＥＧＦ  ｃＤＮＡを組み込んだ。制限酵素ＳＳＴ−１およびＨｉｎｄＩＩＩにて発現カセットを切り出し、精製フラグメントをトランスジーンとしてＣ５７Ｂ６マウス由来受精卵に注入し、従来公知の方法に従ってＨＢ−ＥＧＦｍＴｇマウス（以下、Ｔｇマウスと呼ぶ）を作製した。
【００８６】
図２には、Ｔｇマウスの作製に用いたトランスジーンを模式的に示す。トランスジーンは、図２に示すように、ＭＣＫ（ｍｕｓｃｌｅ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ１８８００２）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｖ００６２２）、およびＳＶ４０ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎシグナル（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｊ０２４００）より構成される発現カセットを含むプロモーター（ｐ３３００ＭＣＫ−ＣＡＴ）にマウスＨＢ−ＥＧＦ  ｃＤＮＡ（配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド）を組み込んだものである。
【００８７】
トランスジーンを注入した受精卵を移植した偽妊娠マウスから４９匹のＦ０マウスが出生した。出生したマウスのうち、ＰＣＲ法による一次スクリーニングによって９匹のマウスが陽性であることが確認された。続いて、ゲノムＤＮＡへのトランスジーンの挿入様式を検討するために、マウスＨＢ−ＥＧＦ  ｃＤＮＡをプローブとしてサザンブロット解析を実施した。
【００８８】
その結果を図３Ａ、Ｂに示す。なお、図３ＡはＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理を行ったものであり、図３Ｂは、ＥｃｏＲＩで制限酵素処理を行ったものである。また、図中、ＮＣはネガティブコントロールを、ＰＣはポジティブコントロールを示す。図３Ａ、Ｂに示すように、２系統（＃１１、＃４５）のマウスに適切なトランスジーンの挿入が確認された。
【００８９】
〔実施例３〕
（＃４５ＴｇマウスにおけるｍＲＮＡ発現解析）
実施例２において得られた＃４５のＴｇマウスについて、様々な組織、あるいは骨格筋（肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、心臓（Ｈｅａｒｔ）、白色脂肪組織（ＷＡＴ）、前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋（ＧＣ）、ヒラメ筋（Ｓｏｌ）、長肢伸筋（ＥＤＬ））における、トランスジーンに由来するＨＢ−ＥＧＦ  ｍＲＮＡの発現を解析した。比較のために野生型マウスについても同様の解析を行った。
【００９０】
その結果を図４に示す。なお、図４では、Ｔｇマウスを「Ｔ」と、野生型マウスを「Ｗ」と示す。図４に示すように、腓腹筋および前脛骨筋においてトランスジーンに由来するＨＢ−ＥＧＦ  ｍＲＮＡ（外因性ＨＢ−ＥＧＦ）が強く発現していた。外因性ＨＢ−ＥＧＦはヒラメ筋（Ｓｏｌ）、長肢伸筋（ＥＤＬ）にも有意に発現し、わずかながら心臓（Ｈｅａｒｔ）にも認められた。一方、肝臓（Ｌｉｖｅｒ）や白色脂肪組織（ＷＡＴ）には検出されなかった。このように、トランスジーンに由来するＨＢ−ＥＧＦ遺伝子の発現は、筋肉に特異的かつ白筋（ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｆｉｂｅｒ）優位であった。
【００９１】
さらに、細胞内部分を認識する特異的抗体を用いたウエスタンブロット解析を行った。なお、比較のために野生型マウスについても同様の解析を行った。その結果を図５Ａに示す。図５Ａでは、Ｔｇマウスを「Ｔｇ」と、野生型マウスを「ＷＴ」と示す。図５Ａに示すように、Ｔｇマウスの腓腹筋においてトランスジーンに由来するＨＢ−ＥＧＦタンパク質の発現が確認された。
【００９２】
また、Ｔｇマウスおよび野生型マウスについて、細胞内部分を認識する特異的抗体を用いた蛍光免疫染色を行った。その結果を図５Ｂに示す。図５Ｂでは、Ｔｇマウスを「Ｔｇ」と、野生型マウスを「ＷＴ」と示す。図５Ｂに示すように、Ｔｇマウスの腓腹筋線維周辺を中心に明らかなＨＢ−ＥＧＦの免疫蛍光が検出された。
【００９３】
以上の結果より、Ｔｇマウスにおいてトランスジーンに由来するＨＢ−ＥＧＦタンパク質の発現が確認された。
【００９４】
〔実施例４〕
（＃４５Ｔｇマウスの表現型解析）
実施例２において得られた＃４５のＴｇマウスについて、表現型の解析を行った。なお、本実施例で使用された通常飼料とは、１００ｇあたりの熱量が約３６０キロカロリーであり、そのうち炭水化物が６０％、脂質が１３％、タンパク質が２７％を占める飼料のことをいう。一方、本実施例で使用された高脂肪飼料とは、１００ｇあたりの熱量が約４８０キロカロリーであり、そのうち炭水化物が２２％、脂質が５８％、タンパク質が２０％を占める飼料のことをいう。
【００９５】
通常飼料飼育条件におけるＴｇマウスの体重変化を野生型マウスと比較した。その結果を図６に示す。図６では、雄の野生型マウスを「ＷＴＭ」、雄のＴｇマウスを「ＴｇＭ」、雌の野生型マウスを「ＷＴＦ」、雌のＴｇマウスを「ＴｇＦ」、とそれぞれ示す。図６に示すように、通常飼料飼育条件におけるＴｇマウスの体重は、生後１５週齢まで雌雄ともに野生型マウスに比較してやや軽い傾向にあった。
【００９６】
高脂肪飼料飼育条件におけるＴｇマウスの体重変化を野生型マウスと比較した。その結果を図７に示す。図７では、雄の野生型マウスを「ＷＴＭ」、雄のＴｇマウスを「ＴｇＭ」、雌の野生型マウスを「ＷＴＦ」、雌のＴｇマウスを「ＴｇＦ」、とそれぞれ示す。図７に示すように、高脂肪飼料飼育下におけるＴｇマウスの体重増加は、雌雄ともに野生型マウスに比較して有意に抑制されていた。
【００９７】
図８Ａには、高脂肪飼料飼育下の野生型マウスおよびＴｇマウス（２３週齢の雌）の外観を示す。また、図８Ｂには、高脂肪飼料飼育下の野生型マウスおよびＴｇマウス（２３週齢の雌）の腹腔内および皮下脂肪の蓄積の様子を示す。図８ＡおよびＢでは、Ｔｇマウスを「Ｔｇ」と、野生型マウスを「ＷＴ」と示す。図８ＡおよびＢに示すように、高脂肪飼料飼育下のＴｇマウスは、同条件の野生型マウスに比べて痩せており、腹腔内および皮下への脂肪蓄積は野生型マウスに比べて外見上明らかに少なかった。
【００９８】
図９Ａ〜Ｃには、高脂肪飼料飼育下の野生型マウスおよびＴｇマウス（２３週齢の雌）の各組織の重量（体重に対する比率）を示す。図９Ａ〜Ｃでは、Ｔｇマウスを「Ｔｇ」と、野生型マウスを「ＷＴ」と示す。また、図９Ａ〜Ｃにおいて、前脛骨筋は「ＴＡ」、ヒラメ筋は「Ｓｏ」、長肢伸筋は「ＥＤＬ」、白色脂肪組織は「ＷＡＴ」、肝臓は「ｌｉｖｅｒ」、心臓は「ｈｅａｒｔ」、褐色脂肪組織は「ＢＡＴ」、腓腹筋は「ｇａｓｔｒｏ」と示す。図９Ａ〜Ｃに示すように、野生型マウスに比較して、腹腔内および皮下の白色脂肪組織の重量がＴｇ群において著しく減少していた。一方、前脛骨筋を除く各種骨格筋、褐色脂肪組織、心臓、および肝臓の重量は、両群間に有意差を認めなかった。
【００９９】
図１０ＡおよびＢには、通常飼料飼育下および高脂肪飼料飼育下における体重あたりの摂食量をそれぞれ示す。図１０ＡおよびＢでは、雄の野生型マウスを「ＷＴＭ」、雄のＴｇマウスを「ＴｇＭ」、雌の野生型マウスを「ＷＴＦ」、雌のＴｇマウスを「ＴｇＦ」、とそれぞれ示す。図１０Ａに示すように、通常飼料飼育下（９週齢）における体重あたりの摂食量は、雌雄とも両群で同等であった。一方、図１０Ｂに示すように、高脂肪飼料飼育下（１０週齢）における体重あたりの摂食量は、雄では両群で同等であったが、雌ではＴｇ群でやや減少傾向にあった。
【０１００】
以上の結果から、骨格筋特異的なＨＢ−ＥＧＦの強発現が高脂肪食で誘発される肥満を抑制することが明らかとなった。さらに、このようなＨＢ−ＥＧＦの作用は、エネルギー摂取量の低下に起因するものではなく、エネルギー消費の亢進に起因することが示唆された。
【０１０１】
続いて、骨格筋特異的に強発現したＨＢ−ＥＧＦが糖代謝に及ぼす影響を検討した。
【０１０２】
図１１ＡおよびＢには、通常飼料飼育下におけるＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢）の随時血糖レベルを示す。図１１ＣおよびＤには、高脂肪飼料飼育下におけるＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢）の随時血糖レベルを示す。図１１Ａ〜Ｄでは、雄の野生型マウスを「ＷＴＭ」、雄のＴｇマウスを「ＴｇＭ」、雌の野生型マウスを「ＷＴＦ」、雌のＴｇマウスを「ＴｇＦ」、とそれぞれ示す。図１１Ａ〜Ｄに示すように、通常飼料、高脂肪飼料何れの飼育条件においても、２２週齢での随時血糖レベルは雌雄とも野生型に比べてＴｇ群において低値を示した。本実施例において血糖レベルの測定は、小型血糖測定機専用電極グルテストセンサー（三和化学研究所社製）および小型血糖測定機グルテストエース（三和化学研究所社製）を用いて行った。
【０１０３】
さらに、図１２ＡおよびＢには、通常飼料飼育下におけるＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢）の空腹時血糖レベルを示す。図１２ＣおよびＤには、高脂肪飼料飼育下におけるＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢）の空腹時血糖レベルを示す。図１２Ａ〜Ｄでは、雄の野生型マウスを「ＷＴＭ」、雄のＴｇマウスを「ＴｇＭ」、雌の野生型マウスを「ＷＴＦ」、雌のＴｇマウスを「ＴｇＦ」、とそれぞれ示す。図１２Ａ〜Ｄに示すように、通常飼料、高脂肪飼料何れの飼育条件においても、２２週齢での空腹時血糖レベルは雌雄とも野生型に比べてＴｇ群において低値を示した。
【０１０４】
以上の結果から、骨格筋特異的にＨＢ−ＥＧＦを強発現することによって血糖値が低下することが明らかになった。
【０１０５】
また、図１３ＡおよびＢには、通常飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢）のグルコース負荷後の血糖上昇反応を示す。図１３ＣおよびＤには、通常飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢）のグルコース負荷後のインスリン分泌反応（ＩＲＩ）を示す。図１３Ａ〜Ｄでは、雄の野生型マウスを「ＷＴＭ」、雄のＴｇマウスを「ＴｇＭ」、雌の野生型マウスを「ＷＴＦ」、雌のＴｇマウスを「ＴｇＦ」、とそれぞれ示す。図１３Ａ〜Ｄに示すように、通常飼料飼育下では、グルコース負荷後の血糖上昇反応およびインスリン分泌反応に雌雄とも両群間で有意差を認めなかった。なお、本実施例においてインスリン分泌反応（ＩＲＩ）の定量は、レビスインスリンキット（シバヤギ社製：Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＡＫＲＩＮ−０１１Ｔ）を用いて行った。
【０１０６】
また、図１４ＡおよびＢには、高脂肪飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢）のグルコース負荷後の血糖上昇反応を示す。図１４ＣおよびＤには、高脂肪飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢）のグルコース負荷後のインスリン分泌反応（ＩＲＩ）を示す。図１４Ａ〜Ｄでは、雄の野生型マウスを「ＷＴＭ」、雄のＴｇマウスを「ＴｇＭ」、雌の野生型マウスを「ＷＴＦ」、雌のＴｇマウスを「ＴｇＦ」、とそれぞれ示す。図１４ＡおよびＢに示すように、高脂肪飼料飼育下では、グルコース負荷後の血糖上昇反応に雌雄とも両群間で有意差を認めなかった。一方、図１４ＣおよびＤに示すように、高脂肪飼料飼育下では、グルコース負荷前（空腹時）および負荷後の血中インスリンレベルは、雌雄ともＴｇ群で有意に低いことが確認された。
【０１０７】
これらの結果は、骨格筋特異的に強発現したＨＢ−ＥＧＦが耐糖能に明らかな影響を与えないことを示す一方、高脂肪食により生じる高インスリン血症を軽減する（つまり、インスリン抵抗性の出現を抑制する）可能性を示唆するものである。
【０１０８】
さらに、インスリン感受性に対するＨＢ−ＥＧＦの効果を調べるために、引き続きインスリン負荷試験を実施した。その結果を図１５Ａ〜Ｄに示す。図１５Ａには、通常飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢、雄）のインスリン投与後の血糖低下率を示す。図１５Ｂには、通常飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢、雌）のインスリン投与後の血糖低下率を示す。図１５Ｃには、高脂肪飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢、雄）のインスリン投与後の血糖低下率を示す。図１５Ｄには、高脂肪飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢、雌）のインスリン投与後の血糖低下率を示す。
【０１０９】
図１５ＡおよびＢに示すように、通常飼料飼育下では、雌雄ともに両群間でインスリン投与後の血糖低下率に有意差を認めなかった。つまり、骨格筋特異的に強発現したＨＢ−ＥＧＦは、通常飼料飼育下における個体レベルでのインスリン感受性に有意な影響を与えなかった。一方、図１５ＣおよびＤに示すように、高脂肪飼料飼育下では、雌雄ともにＴｇ群においてインスリンの血糖低下作用が亢進していた。
【０１１０】
以上の結果から、骨格筋特異的なＨＢ−ＥＧＦの強発現が高脂肪食で誘発されるインスリン抵抗性を改善することが明らかとなった。
【０１１１】
〔結論〕
以上のように、骨格筋特異的なＨＢ−ＥＧＦの強発現がインスリン感受性に影響を与えることなく通常飼料摂取マウスの血糖値を低下させたことから、ＨＢ−ＥＧＦがインスリンとは独立した機序で骨格筋による糖利用を促進する可能性が示唆された。一方、高脂肪飼料飼育条件においては、骨格筋特異的なＨＢ−ＥＧＦの強発現がエネルギー消費の亢進を介して肥満の発症を抑制する効果を示すことが示唆された。高脂肪飼料摂取下のＨＢ−ＥＧＦｍＴｇマウスで観察されたインスリン抵抗性の改善は、このような肥満（内臓脂肪蓄積型の肥満）の抑制から二次的に生じたと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
上述したように、本発明のエネルギー代謝促進剤は、例えば肥満抑制剤および血糖低下剤として利用できるとともに、肥満に起因して発症する疾患の予防・治療に有用である。また、本発明のエネルギー代謝を促進させる物質のスクリーニング方法は、肥満抑制剤、血糖低下剤、または肥満に関連する疾患の予防・治療剤、あるいは該疾患の研究用試薬の開発に有用である。さらに、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、動物のエネルギー代謝機構の解明、およびエネルギー代謝を促進させる物質のスクリーニングなどに有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、ノザンブロット解析を行った結果を示す図である。
【図２】図２は、Ｔｇマウスの作製に用いたトランスジーンを示す模式図である。
【図３Ａ】図３Ａは、サザンブロット解析を行った結果を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、サザンブロット解析を行った結果を示す図である。
【図４】図４は、Ｔｇマウスの種々の骨格筋および組織において外因性ＨＢ−ＥＧＦの発現解析を行った結果を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｔｇマウスの腓腹筋についてウエスタンブロット解析を行った結果を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｔｇマウスの腓腹筋について蛍光免疫染色を行った結果を示す図である。
【図６】通常飼料飼育条件におけるＴｇマウスの体重変化を示すグラフである。
【図７】高脂肪飼料飼育条件におけるＴｇマウスの体重変化を示すグラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、高脂肪飼料飼育条件下の野生型マウスおよびＴｇマウス（２３週齢の雌）の外観を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、高脂肪飼料飼育条件下の野生型マウスおよびＴｇマウス（２３週齢の雌）の腹腔内および皮下脂肪の蓄積の様子を示す図である。
【図９Ａ】図９Ａは、高脂肪飼料飼育下の野生型マウスおよびＴｇマウス（２３週齢の雌）の各組織の重量（体重に対する比率）を示すグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、高脂肪飼料飼育下の野生型マウスおよびＴｇマウス（２３週齢の雌）の各組織の重量（体重に対する比率）を示すグラフである。
【図９Ｃ】図９Ｃは、高脂肪飼料飼育下の野生型マウスおよびＴｇマウス（２３週齢の雌）の各組織の重量（体重に対する比率）を示すグラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、通常飼料飼育下における体重あたりの摂食量をそれぞれ示すグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、高脂肪飼料飼育下における体重あたりの摂食量をそれぞれ示すグラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、通常飼料飼育下におけるＴｇマウスおよび野生型マウスの随時血糖レベルを示すグラフである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、通常飼料飼育下におけるＴｇマウスおよび野生型マウスの随時血糖レベルを示すグラフである。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、高脂肪飼料飼育下におけるＴｇマウスおよび野生型マウスの随時血糖レベルを示すグラフである。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、高脂肪飼料飼育下におけるＴｇマウスおよび野生型マウスの随時血糖レベルを示すグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、通常飼料飼育下におけるＴｇマウスおよび野生型マウスの空腹時血糖レベルを示すグラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、通常飼料飼育下におけるＴｇマウスおよび野生型マウスの空腹時血糖レベルを示すグラフである。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、高脂肪飼料飼育下におけるＴｇマウスおよび野生型マウスの空腹時血糖レベルを示すグラフである。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、高脂肪飼料飼育下におけるＴｇマウスおよび野生型マウスの空腹時血糖レベルを示すグラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、通常飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢）のグルコース負荷後の血糖上昇反応を示すグラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、通常飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢）のグルコース負荷後の血糖上昇反応を示すグラフである。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、通常飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢）のグルコース負荷後のインスリン分泌反応を示すグラフである。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、通常飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢）のグルコース負荷後のインスリン分泌反応を示すグラフである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、高脂肪飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢）のグルコース負荷後の血糖上昇反応を示すグラフである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、高脂肪飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢）のグルコース負荷後の血糖上昇反応を示すグラフである。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、高脂肪飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢）のグルコース負荷後のインスリン分泌反応を示すグラフである。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、高脂肪飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢）のグルコース負荷後のインスリン分泌反応を示すグラフである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、通常飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢、雄）のインスリン投与後の血糖低下率を示すグラフである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、通常飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢、雌）のインスリン投与後の血糖低下率を示すグラフである。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、高脂肪飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢、雄）のインスリン投与後の血糖低下率を示すグラフである。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、高脂肪飼料飼育下でのＴｇマウスおよび野生型マウス（２２週齢、雌）のインスリン投与後の血糖低下率を示すグラフである。
【図６】
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【図７】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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