(57)【要約】【課題】蛋白質工学的手法を用いキチナーゼ触媒活性を増強するため必要となるキチナーゼ触媒ドメインの結晶と構造情報を提供する。【解決手段】キチナーゼ触媒ドメインの結晶であって、単位格子定数が、ａ＝８９．９６０、ｂ＝９２．７８２Å、ｃ＝１０７．２２８Åであるキチナーゼ触媒ドメインの結晶。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キチナーゼ触媒ドメインの結晶であって、単位格子定数が、ａ＝８９．９６０、ｂ＝９２．７８２Å、ｃ＝１０７．２２８Åであるキチナーゼ触媒ドメインの結晶。
【請求項２】
下記のいずれかのポリペプチド：
(1) 配列番号１のAsn409からPhe706位の298アミノ酸からなるポリペプチド；
(2) 配列番号１のAsn409からPhe706位の298アミノ酸からなるポリペプチドにおいて、１
または数個のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入され、かつ、キチナーゼ触媒ドメイン活性を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キチナーゼ触媒ドメインとその結晶、キチナーゼ触媒ドメインの触媒機能を改変する方法。
【背景技術】
【０００２】
キチナーゼは、植物や微生物などから得られる酵素であり、キチンを加水分解してN-アセチルグルコサミンを得るための工業的利用において非常に重要な役割を果たす酵素である。キチナーゼは、種々の由来のものが単離され、耐熱性キチナーゼについても知られている（特許文献１〜２）。
【０００３】
キチナーゼのキチナーゼ触媒ドメインは、キチナーゼの活性向上に重要なドメインであり、キチナーゼ触媒活性が向上したキチナーゼを得るために、キチナーゼ触媒ドメインの構造情報は非常に重要であるが、このような構造情報は知られていなかった。
【特許文献１】特開2001-54381
【特許文献２】特開2006-25701
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、蛋白質工学的手法を用いキチナーゼ触媒活性を増強するため必要となる結晶中での本ドメインの構造情報とキチナーゼの触媒ドメインの結晶を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、超好熱菌Pyrococcus furiosus由来のキチナーゼ遺伝子よりキチナーゼの
触媒ドメインを単離、精製し、結晶化に成功した。さらに、結晶中での立体構造をX線結
晶解析で決定し、結晶性キチン分解に重要なアミノ酸残基および触媒部位を同定した。
【０００６】
本発明は、以下の発明に関する。
１．  キチナーゼ触媒ドメインの結晶であって、単位格子定数が、ａ＝８９．９６０、ｂ＝９２．７８２Å、ｃ＝１０７．２２８Åであるキチナーゼ触媒ドメインの結晶。
２．  下記のいずれかのポリペプチド：
(1) 配列番号１のAsn409からPhe706位の298アミノ酸からなるポリペプチド；
(2) 配列番号１のAsn409からPhe706位の298アミノ酸からなるポリペプチドにおいて、１
または数個のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入され、かつ、キチナーゼ触媒ドメイン活性を有するポリペプチド。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、キチナーゼ触媒ドメインの結晶中での構造情報、並びにキチナーゼ触媒ドメインが、Asn409からPhe706位の298アミノ酸からなるポリペプチド（配列番号２に示す）
であることを明らかにした。さらに、Gln526、Asp524、Asp522がキチナーゼ触媒活性に必須のアミノ酸であることを明らかにした。
【０００８】
この情報に基づき、キチナーゼの触媒活性がさらに増強されることが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で使用したキチナーゼ触媒ドメインは、Pyrococcus furiosus由来のキチナーゼ(配列番号1)のキチナーゼ触媒ドメインである。本発明で得られたキチナーゼ触媒ドメイン
の結晶構造などの構造情報は、Pyrococcus furiosusなどの耐熱性古細菌由来のキチナー
ゼのキチナーゼ触媒ドメインに好適に適用できるが、他の微生物、植物、動物由来のキチナーゼにも有用である。
【００１０】
本発明者は、キチナーゼ触媒ドメインがAsn409からPhe706位の298アミノ酸からなるポ
リペプチドであることを実証した。キチナーゼ触媒ドメインがこの298アミノ酸からなる
ことは本発明者により初めて得られた知見である。
【００１１】
また、該298アミノ酸のうち、Gln526、Asp524、Asp522はキチナーゼ触媒活性に非常に
重要であり、キチナーゼ触媒能を向上した変異型ドメインを製造する場合、Gln526、Asp524、Asp522をまたはその周辺を改変するのが望ましい。変異型キチナーゼ触媒ドメインの触媒活性が向上すると、固体キチンをより速やかに分解することができ、キトサン等の有用物質の製造に非常に有利である。
【００１２】
キチナーゼ触媒ドメインに導入されるアミノ酸変異は、１個〜数個、例えば１〜９個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、特に１〜２個である。
【００１３】
本発明において、キチナーゼ触媒ドメインの結晶化及び得られた結晶の構造解析は公知の方法を広く適用できる。例えば結晶化は、クリスタルスクリーニングＫｉｔ（Hampton research社）などを使用して好適に行うことができる。また、結晶構造は、Ｘ線解析により行うことができる。
【００１４】
本発明では、キチナーゼ触媒ドメインの結晶構造を、Ｘ線解析による構造解析により決定した。本発明で得られた構造情報は、結晶中だけでなく、溶液中の構造も反映していると考えられ、非常に有用である。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例に基づき本発明をより詳細に説明する。
実施例１
（１）実験方法
大腸菌の発現系を用いた場合、本蛋白質単体では十分な量の発現が得られなかった。そこで、チオレドキシンと融合させることにより大腸菌での高発現系の確立に成功した。この融合発現系はNovagen社からpET32ベクターとして販売されているものを用いた。本ベクターにはHisタグがチオレドキシン下流に存在しているがプレシジョンプロテアーゼ認識配
列は挿入されていないため、以下のPCRプライマー（下線部分がプレシジョン認識配列（PS配列）に相当するDNA）に5'-GACGACGACAAGATCCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCAATGCAAATCCAATACCAG -3'(配列番号３)とその相補鎖5'-GAGGAGAAGCCCGGTTTATGTTGGAACACTAGCTTCGCG-3'(
配列番号４)を用いLigation Independent Cloning法(LIC法)を用いて発現形の構築を行った。本発現系からチオレドキシン−Hisタグ−PS配列−キチナーゼ触媒ドメインの順から
なる融合蛋白質が生産される。
【００１６】
（２）サンプル調製
・キチナーゼの触媒ドメインに対応する遺伝子の増幅
キチナーゼの触媒ドメインと推定されるポリペプチド(図1)｛遺伝子データベース(http://gib.genes.nig.ac.jp)中のPF1233遺伝子中アミノ酸番号では409番のアスパラギンから717番のスレオニンに対応｝を大腸菌内で大量に発現させるために、PreScission Protease
認識配列（ L  I  V  L  F  Q  G  P）をコードする塩基配列を含む合成DNA(5'-GACGACGACAAGATCCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCAATGCAAATCCAATACCAG -3'(配列番号３)とその相補鎖5'-GAGGAGAAGCCCGGTTTATGTTGGAACACTAGCTTCGCG-3'(配列番号４)、下線部分がプレシジョン
認識配列（PS配列）に相当する。)を用いPCR法により増幅した。発現ベクターへの組み込
みはLICクローニングキット(NOVAGEN)を用い大腸菌(XL-1Blue)(NOVAGEN社)を形質転換し
、発現プラスミドを作成した。形質転換体は、(0.05 mg/ml アンピシリン)を含むLB寒天
プレート上でのコロニー形成を指標に選択した。形質転換体から触媒ドメイン遺伝子含有プラスミドをアルカリ法で抽出した。
【００１７】
・キチナーゼの触媒ドメインを含有する形質転換体の作製
1.5ml容チューブ内に、大腸菌(E. coli)Rosetta(DE3)株(Novagen社)のコンピテントセル0.04ｍl(20,000,000cfu/mg)と、上記調製した触媒ドメイン遺伝子含有プラスミドDNA溶液0.003ｍl(プラスミドDNA 8.4ng)を加え氷中に30分間放置した後、42℃で30秒間ヒートショックを与えた。次いで、チューブ内にSOC medium を0.25ml加え、37℃で1時間振とう培養した。次いで、アンピシリンを含むLB寒天プレートに塗布し、37℃で一晩培養することにより形質転換体を得た。
【００１８】
・キチナーゼの触媒ドメインの精製
得られた形質転換体をアンピシリンを含むLB培地に接種し、600ｎｍにおける吸光度が0.5に達するまで、37℃で培養した後、キチナーゼの触媒ドメインの発現量を高めるためにIPTG（isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside）を加えさらに19時間培養した。培養液を8,000rpmで10min遠心分離することにより集菌した。集菌した菌体10gに、BugBuster溶液(NOVAGEN社)100mlを加え、菌体を90Wの出力で30分間超音波破砕した。破砕した菌液を 15,000rpmで30分間遠心分離し、上清を採取した。BugBuster溶液で平衡化した金属キレートカラムHiTrap-Chelating(アマシャム  バイオサイエンス社製)カラム（事前に100ｍM  NiCl2
を10ml添加しNiを結合）を用いてカラムクロマトグラフィーを行った。溶出は0.5Mイミダゾールを含む25ｍMトリスヒドロキシメチルアミノメタン、 500mM NaCl (pH8.5)の直線グラジエントを用いた。得られた目的分画にPreScission  Protease(アマシャム バイオサ
イエンス社)を添加し、透析チューブ(分画サイズMw.3500)に入れ、25mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン、25mM NaCl (pH8.5)溶液で4℃、16時間、透析をおこなった。
【００１９】
透析終了後、再び、25mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン、25mM NaCl  （pH8.5）溶液で平衡化した金属キレートカラムHiTrap-Chelating(アマシャム  バイオサイエンス
社)カラム(事前に100ｍM  NiCl2を10ml添加しNiを結合)に添加し、カラムを素通りした分画を回収し、２５ｍMトリスヒドロキシメチルアミノメタン, 25ｍM NaCl(pH8.5)緩衝液で平衡化した陰イオン交換樹脂のHiTrapQ(アマシャム  バイオサイエンス社)カラムに回収
した分画を添加し、イオン交換クロマトグラフィーを行った。目的タンパク質を含む分画にはSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単一バンドを与える均一標品が含まれ
ていた。
【００２０】
結晶化条件の検索
結晶化剤のスクリーニングを行った。その結果、サンプル溶液1.5μl(1mM以上の蛋白質を含む25mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン、25mM NaCl(pH 8.5))と結晶化剤1.5μl(0.1M MES pH6.5, 1.6M Magnesium Sulfate heptahydrate）を混合し、ハンギングドロップ法で良質な結晶を得ることが出来た(図２)。
【００２１】
X線結晶解析を用いた結晶中での構造解析
X線回折データは播磨SPring-8のBL44XUビームラインを使用した。回折像はHKL2000プログラムを用い解析を行った。MAD法を用いSOLVEプログラムにより初期位相をつけた。CNSプ
ログラムによる構造精密化により結晶中でのキチナーゼの触媒ドメインの構造を決定した。
【００２２】
蛋白質結晶化条件の検索と結晶学的パラメーターの解析
結晶化条件の検討を行ったところ、0.1M MES pH6.5, 1.6M Magnesium Sulfate heptahydr
ateを結晶化剤として用いたときに図２に示す棒状の結晶を得た。
得られた結晶を用いX線結晶解析を行い、その結晶学的パラメーターを決定した（表１）
。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
結晶中での構造
図３にＸ線構造解析から得られた結晶中での構造を示す。本触媒ドメインの大まかな構造（グローバルフォールド）はTIMバレル構造(8本のβストランドからなるβシートを中心
に８本のαへリックスが囲む)であった。結晶構造から409番のアスパラギンから706番ま
でのフェニルアラニンまでが構造ドメインを形成することがわかった(配列番号2)。本構
造からキチン分解を中心的に担う触媒残基（グルタミン酸526）を予測することが出来た
。更に、グルタミン526周辺には本アミノ酸と共同的に触媒を行うアミノ酸(例えばアスパラギン酸524,522等)があることからグルタミン526のα炭素を中心におよそ半径10Å以内
のアミノ酸を置換することにより本触媒機能の改変を行えることは容易に推測できる(図
４）。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
キチナーゼの触媒ドメインはキチン分解を直接触媒する重要なドメインである。したがって、本ドメインを利用し、より高活性のキチナーゼを作成或いはセルラーゼ等に機能変換をおこなうためには本特許に記している範囲のアミノ酸変異を行うことで有効であると考えられる。本発明は廃棄されたキチンの有効利用につながるキチンの処理あるいはセルロース分解等の触媒機能変換に重要な材料かつ構造情報を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】キチナーゼの触媒ドメインのアミノ酸配列．PF1233遺伝子中アミノ酸番号では409番のアスパラギンから706番のフェニルアラニンに対応。10残基おきにアミノ酸番号を下付文字で表示。下線はキチン分解を中心的に担う触媒残基（グルタミン酸526）。
【図２】キチナーゼの触媒ドメインの結晶。
【図３】結晶中でのキチナーセの立体構造。簡略化のため主鎖（Ｎ，Ｃα、ＣＯ原子）のみを示す。
【図４】触媒残基グルタミン526と共同的に働くアスパラギン酸524,522の位置。機能改変のターゲットとなりうるアミノ酸の範囲を半径約10Åの円で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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