(57)【要約】【課題】気泡の発生を極力抑制することができる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法を実現することを目的とする。【解決手段】第一の貫通孔２を有した薄板１と、第二の貫通孔４を有した保持プレート３と、第一の貫通孔２の下部に流体を流出入させるための流路を形成した流路プレート５とを有し、薄板１を第二の貫通孔４を塞ぐように固着し、流路プレート５を保持プレート３の下部に固着させた細胞電気生理センサであって、流路プレート５に第三の貫通孔６を第二の貫通孔４と同軸上に設け、この第三の貫通孔６を通して外部より中空管プローブ７を挿入した構成とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の貫通孔を有した薄板と、第二の貫通孔を有した保持プレートと、前記第一の貫通孔の下部に流体を流出入させるための流路を形成した流路プレートとを有し、前記薄板を前記第二の貫通孔を塞ぐように固着し、前記流路プレートを前記保持プレートの下部に固着させた細胞電気生理センサであって、前記流路プレートに第三の貫通孔を前記第二の貫通孔と同軸上に設け、この第三の貫通孔を通して外部より中空管プローブを挿入し、且つこの中空管プローブの先端を第二の貫通孔の内部に前記流路とシール性を保持して挿入した細胞電気生理センサ。
【請求項２】
中空管プローブの外形を第三の貫通孔より小さくし、且つその先端を第二の貫通孔の内部に前記流路とシール性を保持して挿入した請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項３】
中空管プローブの先端の外形を、第二の貫通孔より小さくし、第三の貫通孔より小さくするとともに、且つ第二の貫通孔より第三の貫通孔に向かって大きくなるテーパ形状とした請求項２に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項４】
中空管プローブを挿入する前に、第三の貫通孔を搾孔可能な封止材によって封止した請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項５】
中空管プローブの先端の内壁面にスリットを設けた請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項６】
薄板を第二の貫通孔の内部へ挿入し、保持プレートの平面と同一平面となるように固着して第二の貫通孔を塞いだ請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項７】
中空管プローブの中空管の内壁面に電極を設けた請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項８】
中空管プローブの中空管の内部を吸引する手段に連結した請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項９】
薄板を保持プレートの内部に複数保持し、これら複数の薄板を共通の流路と繋いだ請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項１０】
第一の貫通孔を有した薄板と、第二の貫通孔を有した保持プレートと、前記第一の貫通孔の下部に流体を流出入させるための流路を形成した流路プレートとを有し、前記薄板を前記第二の貫通孔を塞ぐように固着し、前記流路プレートを前記保持プレートの下部に固着させ、前記流路プレートに第三の貫通孔を前記第二の貫通孔と同軸上に設け、この第三の貫通孔を通して外部より中空管プローブを挿入し、且つこの中空管プローブの先端を第二の貫通孔の内部に前記流路とシール性を保持して挿入した細胞電気生理センサを準備する第一の工程と、
前記薄板の上部と前記流路の内部に流体を流入させる第二の工程と、
前記中空管プローブを前記流路プレートの一部に挿入して第三の貫通孔を作製する第三の工程と、前記中空管プローブの先端を前記第二の貫通孔の内部に挿入する第四の工程と、
前記保持プレートの前記薄板の上下の領域間の電位、電流または抵抗を測定する第五の工程を含み、前記第一の貫通孔の開口部に細胞を保持させて測定する細胞電気生理現象の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞内電位あるいは細胞外電位等の細胞電気生理現象を測定するための細胞電気生理センサおよびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、このイオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。
【０００３】
しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要であり、高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。
【０００４】
このため、微細加工技術を利用した平板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。例えば、２つの領域を分離するキャリアに穴を有し、このキャリアの上下に設置した電極によって電界を発生させることで細胞を穴に効率よく保持し、上下の電極間で電気的測定を行うことで細胞の電気生理的測定を可能にしている。これは、平板に作製された貫通孔はガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たし、高精度な細胞の電気生理現象を記録できるとともに、平板の裏面側からの吸引などの方法により細胞が自動的に引きつけられ、細胞を容易に保持できるという利点を有している（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特表２００２−５０８５１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記従来の構成では、細胞の電気生理現象を測定する場合、細胞は溶液中で存在し、この細胞は溶液の状態、例えば薬剤の溶解濃度、イオン濃度などには極めて敏感に反応する。このとき、溶液の内部に残留する気泡などの状態は測定結果に悪影響を及ぼすことが分かっている。このため、溶液の流れの制御は極めて重要である。
【０００６】
特に、細胞の電気生理現象の一つである細胞膜を流れるイオン電流を測定する工程において、二つの領域それぞれに蓄積されている液体の種類を交換する必要性がしばしば存在する。このため、ピペットによって内部に蓄積される液体を交換する方法、平板の上下の領域を閉空間の流路に閉じこめて、この閉空間の流路の内部の溶液を置換する方法などがあるが、閉空間の内部の圧力制御が難しく、流路の内部に気泡が発生することによって測定が不安定になるという課題を有していた。
【０００７】
本発明は、気泡の発生を極力抑制することによって高精度に測定することができる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記従来の課題を解決するために、本発明は、第一の貫通孔を有した薄板と、第二の貫通孔を有した保持プレートと、第一の貫通孔の下部に流体を流出入させるための流路を形成した流路プレートとを有し、前記薄板を第二の貫通孔を塞ぐように固着し、前記流路プレートを保持プレートの下部に固着させた細胞電気生理センサであって、流路プレートに第三の貫通孔を第二の貫通孔と同軸上に設け、この第三の貫通孔を通して外部より中空管プローブを挿入し、且つこの中空管プローブの先端を第二の貫通孔の内部に流路とシール性を保持して挿入したものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法は、流路に溶液を流出入させて薄板の一方の領域内の溶液を迅速に交換できるとともに、第三の貫通孔から中空管プローブを挿入することによって、薄板の一方の領域周辺の圧力制御を気泡が発生することを極力抑えながら制御することができることから、効率よく高精度に測定することができる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法について図面を参照しながら説明する。
【００１１】
図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図であり、測定時における細胞電気生理センサのセンサ構造の様子を示している。図１において、１はシリコン、二酸化シリコン、ガラスなどからなる薄板であり、上下の面に貫通するように第一の貫通孔２を設けている。３は樹脂よりなる保持プレートであり、この保持プレート３には上下に貫通する第二の貫通孔４を設けている。
【００１２】
そして、この第二の貫通孔４の内部に薄板１を第二の貫通孔４を塞ぐように保持している。これによって、保持プレート３の上下の空間は第一の貫通孔２を通してのみ、連通している。
【００１３】
また、５は樹脂材料等よりなる流路プレートであり、この流路プレート５を保持プレート３の下面に当接させることで、この内部に流路１２ａを形成しており、この流路１２ａは流入孔１０および流出孔１１を通して外部と連通している。
【００１４】
さらに、流路プレート５には第三の貫通孔６を設けており、この第三の貫通孔６には中空管プローブ７を挿入して設置することができるように構成している。
【００１５】
また、この中空管プローブ７の内部には第一の測定電極８を形成し、薄板１の上部には第二の測定電極１３を形成している。そして、これら測定電極８，１３はそれぞれの領域に蓄積された第二の溶液１６または第一の溶液１５と接している。これによって、二つの領域間で発生する電位差、電流、抵抗値などを測定することができるように構成している。
【００１６】
なお、測定時においては中空管プローブ７の先端は第二の貫通孔４の開口部に密着して設置することによって、前記流路とシール性を保持している。
【００１７】
これによって、中空管プローブ７の内部に蓄積された第二の溶液１６は流路１２ａ側へ漏れることなく、電気的にも絶縁が保たれることから、薄板１の上下領域で発生する電気化学的変化を高精度に測定することができる。ここで、上下領域で発生する電気化学的変化とは、被検体細胞１８を第一の貫通孔２へ保持させることによって、被検体細胞１８が細胞の内外へ各種イオンを透過させることによって生じる細胞膜電流、細胞膜電位などを含むものである。
【００１８】
また、前記中空管プローブ７の第二の貫通孔４の開口部に密着して挿入するために、図２に示したように中空管プローブ７の先端の内壁面にスリットを設けることによって第二の貫通孔４への挿入を容易にするとともに、よりシール性の高い気密性を保持することができる。
【００１９】
なお、このような構成において、中空管プローブ７の設置の際の密着度をゆるめれば、簡単に流路１２ａの内部の液体を中空管プローブ７の内部へ導入することも可能である。すなわち、流入孔１０および流出孔１１を通して流路１２ａの内部に流入蓄積させた第二の溶液１６は、図３に示すように中空管プローブ７を第二の貫通孔４の設置位置から抜いて隙間を作ることで、中空管プローブ７の内部に蓄積していた第一の溶液１５を押し出して第二の溶液１６を内部へ導入することができる。
【００２０】
このとき、好ましくは中空管プローブ７の根元側に吸引システム９を接続しておくことで、より簡単に流路１２ａの液体を中空管プローブ７の内部へ導入することができる。
【００２１】
そして、再度中空管プローブ７を第二の貫通孔４へ密着させれば、再び中空管プローブ７の内部の液体は流路１２ａ側とシール性を保持して隔離することが可能であることから電気的にも絶縁することができ、薄板１の上下領域で発生する電気化学的変化を高精度に測定することができる。
【００２２】
このように、前記構成を用いれば、溶液の種類を培養液、薬液あるいは試薬などの液体などに自由に変えることが容易となる細胞電気生理センサを実現することができる。
【００２３】
なお、前記構成のような構成および方法によって溶液を交換することが可能となることから、一度中空管プローブ７の内部の液体を抜き取ったりする必要がなくなり、気泡の発生を効率よく抑制することができる。
【００２４】
次に、本実施の形態１における細胞電気生理センサを用いて細胞の電気生理現象を測定する方法について図面を用いて説明する。
【００２５】
図４は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサに中空管プローブ７を挿入する前の状態を示している。この中空管プローブ７を挿入する前には、第三の貫通孔６をフィルム１４によって塞いでおり、流路１２ａの内部に液体を流入・蓄積させても液体が漏れ出さないようにしている。
【００２６】
まず始めに、図５に示すように薄板１の上部領域と下部領域に第一の溶液１５を導入する。例えばこの第一の溶液１５は細胞外液である。
【００２７】
次に、図６に示すように中空管プローブ７を第三の貫通孔６の内部に挿入する。このとき、フィルム１４を搾孔することとなるが、フィルム１４の材質をポリエチレン、シリコンゴムなどの弾力性の高い材料にしておけば、搾孔された場合でも外部に第一の溶液１５が漏れ出すことはないので好都合である。
【００２８】
そして、図７に示すように中空管プローブ７の根元側の吸引システム９から吸引することによって、第一の溶液１５を速やかに中空管プローブ７の内部へ導入することができる。
【００２９】
なお、第二の貫通孔４の付近、あるいは中空管プローブ７の内部に気泡を残留させないためには、流入孔１０から流出孔１１あるいは中空管プローブ７へ向かって第一の溶液１５を流し続けることが極めて効果的である。
【００３０】
次に、図８に示すように中空管プローブ７を第二の貫通孔４の内部へ十分密着するように突き当てる。このとき、別の例として、十分に密着させるためには図１１に示すように中空管プローブ７の先端をテーパ形状とすることが好ましい。そして、中空管プローブ７の先端の外形を第二の貫通孔４より小さくし、第三の貫通孔６よりも小さくし、且つ第二の貫通孔４より第三の貫通孔６に向かって大きくなるテーパ形状としておくことが好ましい。これによって、挿入を容易にできるのと、シール性を容易に高めることができる。
【００３１】
また、図８に示す状態において、薄板１の上下の領域、第一の貫通孔２の内部、中空管プローブ７の内部は、いずれも第一の溶液１５で満たしており、第一の測定電極８と第二の測定電極１３間で所定の抵抗値、代表的には１ＭΩから１０ＭΩの値が観測される。
【００３２】
次に、図９に示すように薄板１の上部領域に被検体細胞１８を投入する。このとき、被検体細胞１８は薄板１の上部領域にある第一の溶液１５中を浮遊しているが、その後、図１０に示すように中空管プローブ７に連結した吸引システム９から吸引を行うと、被検体細胞１８は第一の貫通孔２へと引き込まれる。
【００３３】
しかしながら、被検体細胞１８の大きさは第一の貫通孔２より大きいことから、第一の貫通孔２を通り抜けることはできず、第一の貫通孔２の開口部の表面で保持される。この状態で、被検体細胞１８の第一の貫通孔２の開口部への密着力が十分に高いと、第一の測定電極８と第二の測定電極１３との間で観測される抵抗値は１００ＭΩ以上、好ましくは１ＧΩ以上となる。
【００３４】
このように、被検体細胞１８が十分高い密着度で第一の貫通孔２へ保持されると、被検体細胞１８の内外で、例えばＮａ+，Ｃａ2+，Ｋ+などのイオンの流出入によって発生する膜電流、あるいは細胞膜の内外の電位差の変化は、第一の測定電極８と第二の測定電極１３間に観測される電流値、電圧値の変化として高精度に測定することができる。
【００３５】
なお、前記抵抗値や電流や電圧を測定する際、薄板１の上下領域で溶液の種類を変える必要がある場合には、図３に示すように、一度、中空管プローブ７を第二の貫通孔４から離し、流路１２ａの内部へ第二の溶液１６を投入して、流路１２ａの内部、中空管プローブ７の内部を置換した後、再度、中空管プローブ７を第二の貫通孔４へ密着させて吸引を行うことができる。このように、前記工程は被検体細胞１８が密着して抵抗値が十分高くなった後でも随時行うことができ、例えば、さらに薄板１の下部領域および中空管プローブ７内を第三の溶液（図示せず）に置換することも可能である。
【００３６】
以上説明してきたように、本実施の形態１における細胞電気生理センサの構成によって、薄板１とこれに保持された被検体細胞１８によって仕切られた上下の領域に蓄積される溶液の種類を簡単に変えることができることから、細胞が発する物理化学的現象である電気生理現象をより効率的に高精度に測定することができる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法を提供することができる。
【００３７】
（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法について図面を用いて説明する。
【００３８】
特に、本実施の形態２が実施の形態１と異なる点は、図１２に示すように保持プレート３に複数の第二の貫通孔４が設けられており、それぞれに薄板１が保持固着されており、これら複数の薄板１の下部側は共通の流路１２ｂ、流入孔１０、流出孔１１を持つことである。なお、薄板１の上部側は隔壁１９によって個別に仕切られていても良い。
【００３９】
そして、それぞれの薄板１の位置に対応するように、流路プレート５に第三の貫通孔６を第二の貫通孔４と同軸上に設け、この第三の貫通孔６の下部より中空管プローブ７を挿入することができる。
【００４０】
また、それぞれに測定のための第一の測定電極８と第二の測定電極１３を設けており、各薄板１に保持された被検体細胞１８の電気生理現象を個別に測定することができる。
【００４１】
また、このような複数の中空管プローブ７を一括して挿入するためには測定電極である第一の測定電極８を中空管プローブ７の内壁面に電極を接着、埋設などの方法によって固着しておくことによって測定操作の簡便化を向上することができる。
【００４２】
本実施の形態２においても、実施の形態１と同様に薄板１の下部領域と中空管プローブ７の内部の溶液を交換することができるが、本実施の形態２では、特に流路１２ｂを共通にしていることから、同じ溶液をそれぞれの中空管プローブ７の内部に置換することが可能である上、測定時においては中空管プローブ７が第三の貫通孔６の内部へ十分密着すれば、それぞれの中空管プローブ７の内部の溶液は互いに電気的に遮断されることから、それぞれの領域における測定が他の領域に及ぼす影響をなくすことができる。
【００４３】
一方、流路１２ｂ、流入孔１０および流出孔１１が共通であることから、設置される薄板１の数を増やした場合においても、流路１２ｂ、流入孔１０および流出孔１１の占有面積を減らすことができ、細胞電気生理センサの小型化・簡素化に効果的である。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
以上のように、本発明にかかる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法は、細胞の電気生理現象の測定を効率的に行えることから、例えば高速で薬理判定を行う薬品スクリーニングシステムに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図
【図２】同断面図
【図３】同断面図
【図４】同断面図
【図５】同断面図
【図６】同断面図
【図７】同断面図
【図８】同断面図
【図９】同断面図
【図１０】同断面図
【図１１】同別の例の細胞電気生理センサの断面図
【図１２】本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサの断面図
【符号の説明】
【００４６】
１  薄板
２  第一の貫通孔
３  保持プレート
４  第二の貫通孔
５  流路プレート
６  第三の貫通孔
７  中空管プローブ
８  第一の測定電極
９  吸引システム
１０  流入孔
１１  流出孔
１２ａ，１２ｂ  流路
１３  第二の測定電極
１４  フィルム
１５  第一の溶液
１６  第二の溶液
１８  被検体細胞
１９  隔壁
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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