(57)【要約】【課題】副作用を抑えつつ、血管新生抑制効果を向上させることができる血管新生抑制剤を提供する。【解決手段】血管新生抑制剤は、溶媒によるプロポリスの抽出物に含まれるバッカリン、ドルパニン、クマル酸、アルテピリンＣ、３,４−ジカフェオイルキナ酸、３,５−ジカフェオイルキナ酸又はクロロゲン酸を有効成分とするものである。該有効成分は、３,４−ジカフェオイルキナ酸、３,５−ジカフェオイルキナ酸又はクロロゲン酸であることが好ましい。さらに、有効成分は、３,４−ジカフェオイルキナ酸又は３,５−ジカフェオイルキナ酸であることが最も好ましい。血管新生抑制は、管腔面積、管腔長、パス本数又は管腔交差点数で評価される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶媒によるプロポリスの抽出物に含まれるバッカリン、ドルパニン、クマル酸、アルテピリンＣ、３,４−ジカフェオイルキナ酸、３,５−ジカフェオイルキナ酸又はクロロゲン酸を有効成分とすることを特徴とする血管新生抑制剤。
【請求項２】
前記有効成分は、３,４−ジカフェオイルキナ酸、３,５−ジカフェオイルキナ酸又はクロロゲン酸であることを特徴とする請求項１に記載の血管新生抑制剤。
【請求項３】
前記有効成分は、３,４−ジカフェオイルキナ酸又は３,５−ジカフェオイルキナ酸であることを特徴とする請求項２に記載の血管新生抑制剤。
【請求項４】
前記血管新生抑制は、管腔面積、管腔長、パス本数又は管腔交差点数で評価されるものであることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の血管新生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば糖尿病網膜症などの増殖過程で形成される異常な血管新生を抑制するために用いられる血管新生抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内における腫瘍などの増殖、転移、リューマチなどの関節炎、糖尿病網膜症などの網膜症の進展過程において、その組織に栄養を補給するため新たな血管が形成される。そのような新生血管の形成は、腫瘍の増殖、組織の肥大化などに不可欠であることから、係る新生血管の形成を抑制することができれば、癌、関節炎、網膜症などを減少させることができる。血管新生の促進に際しては、生体内において血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、酸性又は塩基性線維芽細胞増殖因子などが病態とは関係なく共通して働いている。正常な生体内組織においても血管新生は行われているが、過度の血管新生は生じない。これは、血管新生促進性因子の働きを血管新生抑制性因子の働きが抑えるように制御しているためである。そして、血管新生促進性因子の働きが血管新生抑制性因子の働きを上回るときに、過剰な血管新生が生じ、種々の病態を発生することとなる。
【０００３】
このように、過剰な血管新生による症状は、病態組織へ繋がる血管新生を抑制することによって予防及び治療することができると考えられ、これまでに腫瘍又は癌の増殖に対する血管新生阻害物質が研究され、見い出されてきた。血管新生阻害物質としては、例えばフマギリン、エンドスタチン、サイトジェニン、インターフェロンなどが知られている。しかしながら、これらの血管新生阻害物質は副作用などを考慮しなければならないため、使用上に制約があった。そこで、副作用の少ない血管新生阻害物質として、シイタケ菌糸体抽出物を含む血管新生阻害物質が提案されている（例えば、特許文献１を参照）。
【特許文献１】特開２００４−１９６７９１号公報（第２頁、第３頁及び図１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前記特許文献１に記載の血管新生阻害物質であるシイタケ菌糸体抽出物は、例えば糖質約２５質量％、タンパク質約２０質量％、ポリフェノール約３質量％、糖質以外の可溶性無窒素物約２０質量％などが含まれ、それらの成分により副作用を抑えながら血管新生阻害活性を示すが、その抑制効果が不十分であった。すなわち、特許文献１の例えば図１に示すように、新生血管の長さについて、その長さをコントロールに対して５０％抑制できる濃度が５０〜１００μｇ／ｍｌであり、要求されている濃度の数十倍であって血管新生抑制効果が明らかに不足していた。従って、副作用を抑えながら血管新生抑制効果を一層高めることが望まれている。
【０００５】
本発明は、以上のような従来技術の問題点に着目してなされたもので、その目的とするところは、副作用を抑えつつ、血管新生抑制効果を向上させることができる血管新生抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の血管新生抑制剤は、溶媒によるプロポリスの抽出物に含まれるバッカリン、ドルパニン、クマル酸、アルテピリンＣ、３,４−ジカフェオイルキナ酸、３,５−ジカフェオイルキナ酸又はクロロゲン酸を有効成分とすることを特徴とするものである。
【０００７】
請求項２に記載の血管新生抑制剤は、請求項１に係る発明において、前記有効成分は、３,４−ジカフェオイルキナ酸、３,５−ジカフェオイルキナ酸又はクロロゲン酸であることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項３に記載の血管新生抑制剤は、請求項２に係る発明において、前記有効成分は、３,４−ジカフェオイルキナ酸又は３,５−ジカフェオイルキナ酸であることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項４に記載の血管新生抑制剤は、請求項１から請求項３のいずれか１項に係る発明において、前記血管新生抑制は、管腔面積、管腔長、パス本数又は管腔交差点数で評価されるものであることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、次のような効果を発揮することができる。
請求項１に記載の血管新生抑制剤では、溶媒によるプロポリスの抽出物に含まれるバッカリン、ドルパニン、クマル酸、アルテピリンＣ、３,４−ジカフェオイルキナ酸、３,５−ジカフェオイルキナ酸又はクロロゲン酸を有効成分としている。これらの有効成分は、プロポリス抽出物の既存の結果から副作用を引き起こす成分ではなく、さらにこれらの有効成分の特異な構造や官能基が複雑に作用して血管新生を抑える働きをするものと推測される。従って、血管新生抑制剤は、副作用を抑えつつ、血管新生抑制効果を向上させることができる。
【００１１】
請求項２に記載の血管新生抑制剤においては、前記有効成分が３,４−ジカフェオイルキナ酸、３,５−ジカフェオイルキナ酸又はクロロゲン酸である。これらの有効成分は、キナ酸にカフェ酸が１分子又は２分子付加した化合物であり、キナ酸やカフェ酸のもつ水酸基又はカルボキシル基の官能基及びキナ酸やカフェ酸に基づく特異な構造に起因して血管新生を抑える働きをするものと推測される。従って、請求項１に係る発明の効果に加えて、血管新生抑制効果をより有効に発揮させることができる。
【００１２】
請求項３に記載の血管新生抑制剤においては、前記有効成分が３,４−ジカフェオイルキナ酸又は３,５−ジカフェオイルキナ酸である。これらの有効成分は、キナ酸にカフェ酸が２分子付加した化合物であり、水酸基及びカルボキシル基の官能基がクロロゲン酸に比べて増えると共に、構造の特異性も大きく、血管新生を抑える働きが増大するものと考えられる。従って、請求項２に係る発明の効果に加えて、血管新生抑制効果を最も有効に発揮させることができる。
【００１３】
請求項４に記載の血管新生抑制剤では、前記血管新生抑制が新生血管の状態を直接表す管腔面積、管腔長、パス本数又は管腔交差点数で評価される。このため、請求項１から請求項３のいずれかに係る発明の効果に加えて、血管新生抑制の程度を有効に評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の最良と思われる実施形態について詳細に説明する。
本実施形態の血管新生抑制剤は、溶媒によるプロポリスの抽出物に含まれるバッカリン、ドルパニン、クマル酸、アルテピリンＣ、３,４−ジカフェオイルキナ酸、３,５−ジカフェオイルキナ酸又はクロロゲン酸を有効成分とするものである。これらの有効成分はいずれも血管新生に有効であり、血管新生抑制剤中にはこれら有効成分の少なくとも一種が含まれておればよく、複数種類含まれていることによりそれらの相乗効果が発現される場合がある。血管新生は、血管新生因子が既存の血管の内皮細胞に血管新生の情報を伝達し、その内皮細胞が遊走、増殖し、管腔を形成して毛細血管網を形成するものである。血管新生抑制剤は、そのような血管新生を抑制し、糖尿病網膜症、緑内障、固形腫瘍、血管腫、骨髄腫、慢性関節リューマチ、変形性関節症などの病態の発症及び進行を抑えるためのものである。
【００１５】
次に、溶媒によるプロポリスの抽出物及びその抽出物に含まれる化合物について説明する。プロポリス（プロポリス原塊）は蜂ヤニともいわれ、ミツバチが自然の中から樹液を集め自らの分泌物と合わせて作り上げた物質（抗菌物質）である。このプロポリスは、フラボノイド、アミノ酸、ミネラルなどの天然成分を多種多様に含んでおり、医薬品、健康食品、化粧品などの素材として用いられている。プロポリス原塊としては、ブラジルを含む南アメリカ諸国、中国や日本などのアジア諸国、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、オセアニア諸国で採取されるプロポリスなどあらゆる産地のものを使用することができるが、ブラジルのミナスジェライス州原産のグリーン・プロポリス原塊を使用することが好ましい。グリーン・プロポリス原塊は、キク科植物のバッカリス・ドラクンクリフォリア（伯名：アレクリン・ド・カンポ）を主たる起源植物としている。
【００１６】
プロポリスの主要な生理活性として抗酸化作用及び免疫賦活作用が知られている。プロポリス中には、フェノール性有機酸類、カフェオイルキナ酸類、フラボノイド類等の多くの化合物が含まれており、これらの化合物が相互に作用し、プロポリスの優れた生理活性が形成されると考えられている。
【００１７】
プロポリスの抽出物を得るための溶媒としては、水、親水性有機溶媒としてエタノール等のアルコール、含水エタノール等の含水アルコールのほか、液化炭酸ガスなども用いられる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノールなどの低級アルコールが好ましく、経口摂取する場合には、エタノールであることが特に好ましい。これらの溶媒による抽出操作で得られる抽出物は、それぞれ水抽出物、アルコール抽出物、含水アルコール抽出物、超臨界抽出物である。或いは、これらの抽出物を適宜選択し、それらを混合した混合物として用いることもできる。これらの抽出物に含まれる化合物の種類及び含有量は、主に溶媒の種類に応じて異なる。
【００１８】
上記の溶媒を使用してプロポリス抽出物を得る場合には、前記プロポリス原塊に溶媒を所定量加えた後、所定温度で所定時間撹拌し、次いで濾過などの操作をすることによって行われる。プロポリスに対する溶媒の量は、質量基準で０．５〜１０倍量が好ましく、１．０〜５倍量がより好ましく、１．５〜２倍量が特に好ましい。この溶媒量がプロポリスに対して０．５倍量を下回る場合、溶媒による抽出効率が低下すると共に、製造コストが嵩む傾向を示して好ましくない。その一方、溶媒量がプロポリスに対して１０倍量を上回る場合、抽出のための容器が大型となり、濃縮や乾燥に時間と人手を費やすことになって好ましくない。
【００１９】
抽出時の温度は、１〜５０℃が好ましく、５〜２５℃がより好ましい。この温度が１℃を下回る場合、抽出物が氷結したりして抽出効率が低下し、目的とする抽出物が十分に得られなくなる。その一方、温度が５０℃を上回る場合、アルコールの蒸発が著しく、かつ高温による物性の低下が生じ、目的とする抽出が行なわれない場合がある。
【００２０】
抽出時間は、通常１〜７２時間であるが、３〜４８時間が好ましく、６〜２４時間がより好ましい。この抽出時間が１時間未満の場合、抽出効率が低下し、目的とする抽出物が得られないときがある。一方、この抽出時間が７２時間を越える場合には、細菌や微生物の繁殖が生じ、不純物による汚染のおそれがある。
【００２１】
上記の方法により得られるプロポリス抽出物は製剤化を効率的に行なう目的で以下のような後処理を行なうことが好ましい。すなわち、得られるプロポリス抽出物は濾過又は遠心分離等の固液分離に供される。濾過の手段としては、濾紙又は珪藻土等を敷いた濾紙を用いた吸引、真空ポンプによる減圧下での濾過又は常圧下での自然濾過のいずれでも良い。濾過の代わりに遠心分離を利用しても良い。さらに、濾過と遠心分離の組み合わせが好ましい。得られた濾液又は上清は、減圧濃縮機、真空乾燥機又は凍結真空乾燥機により濃縮液又は粉末にされる。以上の後処理により、液体又は粉末状態のプロポリス抽出物が得られる。
【００２２】
このようにして得られるプロポリスの抽出物中には、バッカリン、ドルパニン、クマル酸（オキシケイ皮酸）、アルテピリンＣ、３,４−ジカフェオイルキナ酸、３,５−ジカフェオイルキナ酸又はクロロゲン酸が含まれている。これらの化合物はいずれも血管新生抑制作用を示すが、それらの作用には程度の差があり、ジカフェオイルキナ酸はその他の化合物よりもその程度が高いため好ましく、３,４−ジカフェオイルキナ酸、３,５−ジカフェオイルキナ酸又はクロロゲン酸はより好ましく、３,４−ジカフェオイルキナ酸又は３,５−ジカフェオイルキナ酸は最も好ましい。それらの化合物はキナ酸にカフェ酸が１分子又は２分子付加された特異な構造を有すると共に、キナ酸又はカフェ酸に基づく水酸基やカルボキシル基が含まれている。なお、キナ酸には１つのカルボキシル基と４つの水酸基が含まれ、カフェ酸には１つのカルボキシル基と２つの水酸基が含まれている。従って、その特異な構造とそれらの官能基が、官能基はその種類、数、位置により変わるが、複雑に作用し、血管新生を抑える方向に働くものと考えられる。ちなみに、プロポリス抽出物に含まれるキナ酸、カフェ酸、４，５−ジカフェオイルキナ酸なども血管新生抑制作用を示すものと予測される。
【００２３】
プロポリスの抽出物中に含まれる成分（化合物）を、具体的には水抽出物、エタノール抽出物、２５％エタノール（７５％水）抽出物及び７０％エタノール（３０％水）抽出物について、それぞれ表１に示す。これらの抽出物は、以下のようにして調製及び分析したものである。
（プロポリス抽出物の調製）
細かく砕いたプロポリスの原塊１５ｇに対して水又は２５％エタノール７５ｍｌを添加し、４０℃で１６時間撹拌した。得られた抽出液を２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、分取した上清を４℃で一晩静置した。分取された上清を濃縮後、凍結乾燥して粉末を得た。同様に、細かく砕いたプロポリスの原塊１５ｇに対してエタノール又は７０％エタノールを添加し、４０℃で１６時間撹拌した。抽出液を２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、分取された上清を−２０℃で一晩静置した。分取された上清を濃縮後、減圧加熱乾燥して粉末を得た。
（プロポリス抽出物についての高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析）
ＨＰＬＣカラムCAPCELL PAK C18 AG-120（（株）資生堂ファインケミカル製、φ4.6×250mm）を用いた。そして、移動相Ａを１％酢酸含有精製水、移動相Ｂを１％酢酸含有アセトニトリルとし、初期条件Ｂ液１０％で５分間保持、その後６０分間でＢ液を６５％まで直線的に増加させ、１０分間保持するグラジェント法により溶出を行った。ＨＰＬＣ装置としてWaters社製616Pump及び486Tunable Absorbance Detectorを用い、流速１．０ml／min、カラム温度３０℃、３２５nmの波長にて検出した。
（カフェオイルキナ酸の分画及び精製）
２５％エタノール抽出プロポリスの粉末８ｇを１０％エタノール２５ｍｌに溶解し、アンバーライトXAD−2ゲル（オルガノ（株）製）を充填したカラム（φ62mm×270mm）に吸着させた。精製水、１０％、２０％、４０％エタノール及びエタノールを溶出溶媒とし、各２．４Ｌにて溶出し、得られた溶出液を濃縮後に凍結乾燥した。２０％エタノール溶出画分をＨＰＬＣカラムCAPCELL PAK C18 ACR（（株）資生堂ファインケミカル製、φ20mm×250mm）を用い、移動相として１７．５％アセトニトリルを用いて溶出し、３，４−ジカフェオイルキナ酸（３，４−ｄｉＣＱＡ）及び３，５−ジカフェオイルキナ酸（３，５−ｄｉＣＱＡ）をそれぞれ単離した。そして、凍結乾燥によりそれぞれの粉末を得た。
【００２４】
４０％エタノール溶出画分を上記カラムを用い、移動相として３０％アセトニトリルを用いて溶出し、３，４−ｄｉＣＱＡと３，５−ｄｉＣＱＡの混合液及び３，４，５−トリカフェオイルキナ酸（３，４，５−ｔｒｉＣＱＡ）を単離し、凍結乾燥により粉末を得た。２種類のジカフェオイルキナ酸類の混合液は前述の２０％エタノール溶出画分と同様にしてそれぞれ単離し、粉末を得た。ＨＰＬＣ装置としてJASCO製PU-980 pump及びUV-970 UV/VIS Detectorを用い、流速6.5 ml／min、カラム温度室温、325nmの波長にて検出した。
（カフェオイルキナ酸類のＨＰＬＣ分析）
２５％エタノールで抽出したプロポリス抽出粉末のカフェオイルキナ酸類含量を調べるため、ＨＰＬＣによる分析を行った。ＨＰＬＣカラムCAPCELL PAK C18 AG-120（資生堂ファインケミカル（株）製、φ4.6×250mm）を用いた。そして、移動相Ａを１％酢酸含有精製水、移動相Ｂを１％酢酸含有アセトニトリルとし、初期条件Ｂ液７．５％で１０分間保持、その後５０分間でＢ液を２５％まで直線的に増加させ、さらに２０分間でＢ液を４５％まで直線的に増加させ、５分間保持するグラジェント法により溶出を行った。Waters製600 Pump及び996 Photodiode Array Detectorを用い、流速１．０ml／min、カラム温度４０℃、３２５ｎｍの波長にて検出した。
【００２５】
【表１】
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表１に示したように、溶媒で抽出されるプロポリス中の成分は、溶媒の種類、すなわち水及びエタノールによって異なる。３，４−ジカフェオイルキナ酸、３，５−ジカフェオイルキナ酸、クロロゲン酸及びｐ−クマル酸は、エタノールより水によって抽出されやすく、２５％エタノールによって最も抽出されやすい。バッカリン、ドルパニン及びアルテピリンＣは、水よりエタノールによって抽出されやすく、バッカリン及びドルパニンは７０％エタノールに最も抽出されやすく、アルテピリンＣはエタノールに最も抽出されやすい。
【００２６】
以上のようにして得られる血管新生抑制剤は、健康食品のような飲食品、医薬品、医薬部外品などの用途に利用可能であり、糖尿病網膜症、緑内障、黄斑変性症、網膜色素変性症などの網膜疾患、固形腫瘍、血管腫などの腫瘍、リューマチ様関節炎、乾癬などの慢性炎症の治療及び予防に有効である。血管新生抑制剤をこのような用途に利用する場合の投与経路は、経口及び非経口のいずれでもよい。具体的な剤型としては、錠剤、点眼剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、散剤などが挙げられる。これらの剤型は、汎用の製剤化技術によって得られる。投与量は、症状、年令、剤型などによって適宜選択されるが、１回又は数回に分けて投与すればよい。
【００２７】
血管新生抑制剤による血管新生抑制をin vitro（試験管内）において調べる場合には、血管内皮細胞と線維芽細胞とを、血管新生誘導性因子であるＶＥＧＦの存在下で共培養させることにより管腔形成初期段階の増殖状態が作り出された培養中に血管新生抑制剤を添加し、血管新生の抑制が生じるか否かを確認することにより行われる。具体的には管腔を染色することにより、管腔形成が抑制されているかどうかを調べることができる。このようなin vitroにおける血管新生の抑制効果を調べるためのキットとしては血管新生キットが用いられる。管腔を染色するためには、抗ＣＤ３１抗体、抗フォン−ウィルブランド因子などの抗体を使用する管腔染色キットが使用される。血管新生抑制のための評価項目としては、管腔面積、管腔長、パス本数又は管腔交差点数が挙げられ、それら評価項目のいずれか又は全てに基づいて評価される。
【００２８】
また、血管新生抑制をin vivo（生体内）において調べるためには、マウス又はラットを使用した背部皮下法、ウサギなどの角膜を使用したコルネア法、受精鶏卵の漿尿膜を使用したＣＡＭ法、ハムスターの頬袋を使用したチークポーク法などが用いられる。例えば、背部皮下法では、腫瘍細胞を封入したミリポアチャンバーを、マウス又はラットの側背部皮下に予め作製したポーチ中に移植し、そのチャンバーに血管が分布する程度を測定することによって行われる。
【００２９】
血管新生抑制剤には、他の成分を添加することもでき、特に食品の形態として使用する場合、他の成分としてカルシウム剤、ビタミン剤、アルコール類、ポリフェノール類、香料などを添加することもできる。
【００３０】
さて、本実施形態における作用について説明すると、プロポリスの抽出物は例えばプロポリスの原塊を砕いてそれに水を添加し、撹拌して抽出を行ない、得られた抽出液を遠心分離した後、乾燥することにより水抽出物の粉末が得られる。この水抽出物の粉末中には、３，４−ジカフェオイルキナ酸、３，５−ジカフェオイルキナ酸などの化合物が含まれている。血管新生抑制剤は、これらのプロポリスの抽出物に含まれる化合物を有効成分とするものである。これらの化合物はそれぞれ特異な構造を有すると同時に、カフェ酸が２つ含まれ、カフェ酸には１つのカルボキシル基と２つの水酸基が含まれている。そのため、これらの構造及び官能基が相俟って血管新生における管腔形成やその増殖に対してそれを阻止するように働くものと推測される。
【００３１】
前記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・  本実施形態の血管新生抑制剤では、溶媒によるプロポリスの抽出物に含まれるバッカリン、ドルパニン、クマル酸、アルテピリンＣ、３,４−ジカフェオイルキナ酸、３,５−ジカフェオイルキナ酸又はクロロゲン酸を有効成分としている。これらの有効成分は、プロポリス抽出物の既存の結果から副作用を引き起こす成分ではなく、さらにこれらの有効成分の特異な構造や官能基が複雑に作用して血管新生を抑える働きをするものと推測される。従って、血管新生抑制剤は、副作用を抑えつつ、血管新生抑制効果を向上させることができる。
【００３２】
・  前記有効成分が３,４−ジカフェオイルキナ酸、３,５−ジカフェオイルキナ酸又はクロロゲン酸である場合、これらの有効成分は、キナ酸にカフェ酸が１分子又は２分子付加した化合物である。このため、キナ酸やカフェ酸のもつ水酸基又はカルボキシル基の官能基及びキナ酸やカフェ酸に基づく特異な構造に起因して血管新生を抑える働きをするものと推測される。従って、血管新生抑制効果をより有効に発揮させることができる。
【００３３】
・  前記有効成分が３,４−ジカフェオイルキナ酸又は３,５−ジカフェオイルキナ酸である場合、これらの有効成分は、キナ酸にカフェ酸が２分子付加した化合物であり、水酸基及びカルボキシル基の官能基が増えると共に、構造の特異性も大きく、血管新生を抑える働きが増大するものと考えられる。従って、血管新生抑制効果を最も有効に発揮させることができる。
【００３４】
・  血管新生抑制が新生血管の状態を直接表す管腔面積、管腔長、パス本数又は管腔交差点数で評価されることにより、血管新生抑制の程度を有効に評価することができる。
・  前記のように血管新生抑制剤は血管新生における管腔形成抑制などに有効であることから、糖尿病網膜症、緑内障などの網膜疾患、癌などの腫瘍の予防及び治療に効果的である。従って、血管新生抑制剤を医薬組成物、食品組成物などとして有効に利用することができる。
【実施例】
【００３５】
以下に実施例を挙げ、前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１〜４）
（１）プロポリスの水抽出物の調製
細かく砕いたプロポリスの原塊１５ｇに対して水７５ｍｌを添加し、４０℃で１６時間撹拌して抽出を行った。得られた抽出液を２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、分取した上清を濃縮後、凍結乾燥により水抽出物の粉末を得た。この水抽出物中に含まれる化合物は、前記表１に示される水抽出物の通りである。
（２）試料の調製
１）ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）−Ａを含有する血管新生専用培地−２〔クラボウ（株）製〕を用い、プロポリスの水抽出物を０．３〜１００μｇ／ｍｌの濃度に希釈して試料とした。
（３）試験方法
１）血管新生キット
ヒトさい帯静脈血管内皮細胞と線維芽細胞の共培養系である血管新生キット〔クラボウ（株）製〕を用いて試験を実施した。すなわち、ＶＥＧＦ−Ａ、血管新生専用培地−２及びＣＤ（血小板−内皮細胞接着分子）３１抗体は本血管新生キットに付属のものを使用し、血管新生キットの付属説明書に従って試験を実施した。
【００３６】
２）培養及び固定並びに染色
１群当たり３ウェル（ｗｅｌｌ）を使用し、培地交換は１日目（キット搬入日）、４日目、７日目及び９日目に行った。培地交換は前記血管新生専用培地−２を用いた。１１日目に細胞をエタノールで固定した後、ＣＤ３１抗体により血管内皮細胞を染色した。
【００３７】
３）管腔形成スコアリングの評価
ＣＤ３１抗体による血管内皮細胞の染色後、顕微鏡〔オリンパス（株）製、ＩＸ７０〕下で各ウェルの上、下、左、右及び中央の５点をデジタルカメラ〔ニコン（株）製、クールピクス4500〕で撮影した。撮影画像の解析は、血管新生定量ソフトウェアＶｅｒ．２〔クラボウ（株）製〕を用いて行い、管腔面積、管腔長、管腔交差点数及びパス本数の４項目について評価した。なお、パス本数とは、例えば１本の血管が２本に分かれている場合には、パス本数は２、管腔交差点数は１になる。そして、管腔面積の結果（実施例１）を図１、管腔長の結果（実施例２）を図２、管腔交差点数の結果（実施例３）を図３及びパス本数の結果（実施例４）を図４に示した。各結果は、撮影した上記５点の平均値を各ウェル値とし、平均値±標準誤差で示した。
【００３８】
４）統計処理
プロポリスの水抽出物の血管新生抑制効果を評価するため、ＶＥＧＦ群とプロポリスの水抽出物群をダネット多重検定法（Dunnett’s multiple comparison test）で、ＶＥＧＦ群と各成分群をスチューデントｔテスト（Student’s t test）で解析した。両検定とも有意水準は５％とした。図１〜図４において、ＷＥＰは水抽出プロポリスを表し、その濃度はμｇ／ｍｌである。各成分の略号を次に示す。各成分の濃度はμＭである。また、＃及び＊は５％以下の誤差をもって有意であることを示し、＃＃及び＊＊は１％以下の誤差をもって有意であることを示し、＊＊＊は０．１％以下の誤差をもって有意であることを示す。
【００３９】
Ｂａ：バッカリン
Ｄｒｕ：ドルパニン
Ｃｏｕ：ｐ−クマル酸
Ａｒｔｅ：アルテピリンＣ
３,４−：３,４−ジカフェオイルキナ酸
３,５−：３,５−ジカフェオイルキナ酸
Ｃｈｌｏ：クロロゲン酸
（結果についての考察）
図１〜図４の実施例１〜４に示したように、プロポリスの水抽出物はＶＥＧＦに比べ、管腔面積、管腔長、管腔交差点数及びパス本数の４項目の全ての項目で有意な血管新生抑制効果が認められた。すなわち、濃度が１００μｇ／ｍｌであるプロポリスの水抽出物の場合には、ＶＥＧＦに比べて８８〜９１％の抑制率であった。
【００４０】
また、プロポリスの水抽出物１００μｇ／ｍｌ中における各成分濃度での評価において、バッカリン（Baccharin）、ドルパニン（Drupanin）、クマル酸（Coumaric acid）及びアルテピリン（Artepillin）Ｃは、ＶＥＧＦに対して各評価項目で有意な結果が認められたが、その抑制率は３〜３７％であった。これに対して、３,４−ジカフェオイルキナ酸、３,５−ジカフェオイルキナ酸及びクロロゲン酸については、ＶＥＧＦに対して各評価項目で抑制率が５０〜７５％という高い結果であり、３,４−ジカフェオイルキナ酸及び３,５−ジカフェオイルキナ酸については、抑制率が６０〜７５％という最も高い結果であった。従って、プロポリスの水抽出物による血管新生抑制効果は、主に３,４−ジカフェオイルキナ酸、３,５−ジカフェオイルキナ酸及びクロロゲン酸に基づくものであることが示され、特に３,４−ジカフェオイルキナ酸及び３,５−ジカフェオイルキナ酸に基づくものであることが示された。
【００４１】
なお、本実施形態は、次のように変更して実施することも可能である。
・  プロポリスの水抽出物、エタノール抽出物又は含水エタノール抽出物中に含まれている成分はそれぞれ異なることから、目的に応じてそれらを適宜組合せて使用することができる。
【００４２】
・  溶媒によるプロポリスの抽出物に含まれている化合物、例えば３,４−ジカフェオイルキナ酸又は３,５−ジカフェオイルキナ酸を単離し、血管新生抑制効果を高めるように使用することもできる。
【００４３】
・  血管新生抑制を、管腔面積、管腔長、パス本数又は管腔交差点数の平均値ではなく、総和（積算値）を求めて評価することもできる。
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
【００４４】
・  網膜疾患の治療又は予防に用いられるものであることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の血管新生抑制剤。このように構成した場合、請求項１から請求項４のいずれかに係る発明の効果を網膜疾患の治療又は予防において発揮することができる。
【００４５】
・  溶媒によるプロポリスの抽出物に含まれるバッカリン、ドルパニン、クマル酸、アルテピリンＣ、３,４−ジカフェオイルキナ酸、３,５−ジカフェオイルキナ酸又はクロロゲン酸を血管新生抑制の有効成分として含有することを特徴とする飲食品。この飲食品によれば、副作用を抑えつつ、優れた血管新生抑制効果を発揮させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】水抽出プロポリス及び各成分の濃度と、管腔面積との関係を示す棒グラフ。
【図２】水抽出プロポリス及び各成分の濃度と、管腔長との関係を示す棒グラフ。
【図３】水抽出プロポリス及び各成分の濃度と、管腔交差点数との関係を示す棒グラフ。
【図４】水抽出プロポリス及び各成分の濃度と、パス本数との関係を示す棒グラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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