(57)【要約】【課題】遺伝子の発現量を測定する際に、遺伝子に特異的で定量的な増幅方法を提供する。【解決手段】ｍＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡを合成してｃＲＮＡ増幅を行った後、遺伝子特異的なプライマーにより所望の遺伝子のみを逆転写する。さらに検体に含まれるｃＲＮＡを分解することで所望の遺伝子由来の一本鎖ＤＮＡだけからなる検体を調製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種類のＤＮＡの中から特定の配列を有するＤＮＡを増幅する方法であって、前記複数種類のＤＮＡに対して相補的なＲＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼを用いて増幅する工程と、前記増幅されたＲＮＡに対して前記特定の配列を有するプライマーを用いて逆転写を行い前記特定の配列を有するＤＮＡを得る工程と、を有することを特徴とするＤＮＡの増幅方法。
【請求項２】
試料から得られたｍＲＮＡから、該試料に含まれる標的遺伝子に特有の配列を有するＤＮＡを増幅する方法であって、（１）試料からｍＲＮＡを得る工程と、（２）前記ｍＲＮＡから、ＲＮＡポリメラーゼが認識するプロモーター領域を有するプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを得る工程と、（３）該ｃＤＮＡに対してＲＮＡポリメラーゼを用いてｃＲＮＡ増幅を行う工程と、（４）前記標的遺伝子に特異的、かつ前記ｃＲＮＡの塩基配列に相補的な配列を有するプライマーを用いて逆転写を行い、前記標的遺伝子に特有の配列を有する増幅されたＤＮＡを得る工程と、を有することを特徴とする、核酸の増幅方法。
【請求項３】
遺伝子特異的な配列を有するプライマーを用いた逆転写反応時に、基質の一部もしくは全部に標識基質を使用する請求項２に記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
遺伝子特異的なプライマーとして、標識されたプライマーを用いる請求項２に記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
標識がCy3、Cy5、ビオチンのいずれかである請求項３もしくは４に記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
ＲＮＡポリメラーゼが認識するプロモーター領域が、T7、T3、SP6のうちいずれかである請求項２に記載の核酸増幅方法。
【請求項７】
遺伝子特異的なプライマーを用いて逆転写したのち、残存するcRNAをRNA分解酵素により分解する請求項２に記載の核酸増幅方法。
【請求項８】
遺伝子特異的なプライマーのTm値を、逆転写対象となるcRNAの含有量に応じて調整する請求項２に記載の核酸増幅方法。
【請求項９】
遺伝子特異的なプライマーによる逆転写反応時のプライマー濃度を、逆転写対象となるcRNAの含有量に応じて調整する請求項２に記載の核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、mRNAを出発物質とした核酸の増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な解析技術の進歩により、生物の分子レベルの機能解明が進んでいる。なかでも疾病に関わる現象については、その解明による効果が大きいことから、積極的に取り組みがなされている。生物を司る物質は様々であり、核酸、タンパク質、糖、ホルモンなど多岐にわたっているが、なかでもDNAやmRNAなどの核酸については研究が進み、様々な疾病との関連が解明されている。
【０００３】
たとえば重要な疾病の一つである「がん」についても、様々な研究がなされており、mRNAの発現量ががん細胞と正常細胞とで異なることを利用して、mRNAの発現量を定量することで微少量のがん細胞を検出する手法などが考案されている。
【０００４】
このような、がん細胞で特異的な遺伝子を探す場合の有力な手法として、DNAマイクロアレイが一般に良く用いられる。DNAマイクロアレイとしては様々な方式のものが考案されているが、数万にもおよぶヒトの遺伝子発現状態やその配列を一度に解析可能なツールであり、網羅的な解析を行う場合などに特にその威力を発揮する。
【０００５】
通常、サンプル中に含まれるmRNAなどは、無色であり、また一般的に回収されるサンプル量は微少量である。従って、DNAマイクロアレイにアプライするために増幅と標識を兼ねた検体処理を行うことが必要であり、一般的に行われている。核酸の標識増幅方法には各種の方法があるが、その中でPCRが増幅効率もよく取り扱いが便利である。しかし、定量的な測定がしにくいことや、一度に増幅可能な遺伝子数が限られることから、発現解析の場合全遺伝子を量比を維持したまま増幅できるcRNA増幅が用いられる場合が多い。cRNA法とは以下の手法によりmRNAを増幅、標識する方法である（特許文献１）。まずサンプル中から抽出されたmRNAからcDNAを合成する。逆転写反応を行う際にプライマーを用いるが、RNAポリメラーゼが認識可能なプロモーター配列を有するように、プロモーター配列を有するプライマーを用いて逆転写反応を行う。得られたcDNAに対し、組み込んだプロモーター領域を認識するRNAポリメラーゼにてRNA合成を行うが、その際、基質として標識基質をその一部に用いておき、標識cRNAを得るという方法である。
【０００６】
DNAマイクロアレイの製造メーカーは数多いが、その中のアフィメトリクス社やアマシャムバイオサイエンス社などが提供している発現解析用のDNAマイクロアレイなどは、検体調製方法として上記のcRNA法をその検体処理方法として推奨している。
【特許文献１】特開２０００−３１２５８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ところで、がんなどのマーカー遺伝子としてmRNAの発現量に着目し、その有無や存在量によりがんの診断を行う場合、選ばれる遺伝子の種類は、精度と感度の両面から数十程度になることが多い。これは、遺伝子の種類数が少ないと様々なタイプのがんに対応できず検出率が落ちるため、より多くのマーカー遺伝子を検出対象とするものの、反対に遺伝子数が多すぎる場合には、ノイズを生じ所望の検出が精度良くできない事が多いためである。
【０００８】
上記の理由から、がんの診断などにDNAマイクロアレイを使用する場合、マーカー遺伝子等の候補遺伝子だけを検出できるようなカスタムアレイを用いることが多い。網羅的な解析を行うためのDNAマイクロアレイは、一般的に1万種類以上の遺伝子を検出できるようになっており、カスタム化によりプローブ数を削減することで、大幅なコストダウンがはかれるからである。
【０００９】
こうしたカスタム化したマイクロアレイのための検体処理として、網羅的な遺伝子発現解析と同様にcRNA増幅法を用いることは可能である。cRNA増幅では、mRNAに含まれる全遺伝子を対象に定量的な増幅が可能であり、たとえ検出対象となる遺伝子がそのごく一部であっても、原理的には、検出対象となる遺伝子を検出可能なレベルまで増幅可能だからである。しかし、検出対象遺伝子の由来物以外のcRNA増幅産物が夾雑物として多く存在している場合、本来検出すべき遺伝子由来のcRNAとプローブとのハイブリダイゼーションに少なからず影響を与えることがある。具体的には次に示すような原因による各種現象が挙げられる。
【００１０】
アレイ上に結合したプローブは各遺伝子に固有の配列を持つように設計がなされているものの、遺伝子によっては極めて類似した配列を有しており、通常のハイブリダイゼーション条件ではミスハイブリダイゼーションが生じてしまうといった問題点がある。また、プローブ領域の配列特異性が確保できていたとしても、検体溶液中に多く存在するcRNA間で相互干渉し、固相上のプローブとのハイブリダイゼーションを阻害する場合がある。特にcRNAは一本鎖であるためそうした弊害が多く生じる可能性が高いことが知られている。また、標識がなされた不要なcRNAが多く存在している場合、非特異的な吸着などによりバックグランドの上昇を招き、マイクロアレイの感度や精度を下げてしまうといった問題点もある。
【００１１】
こうした問題点に対処するため、いくつかの解決案が考案されている。例えば、mRNAを逆転写する際に、プロモーター領域を有する共通プライマーで逆転写するのではなく、遺伝子特異的な配列を有するプライマーにより逆転写する方法が考案されている。この方法では、増幅したい遺伝子を任意に選択し、対応するプライマーを用いて逆転写することが可能で、検出対象外の遺伝子は逆転写されないことから、夾雑物のない一本鎖cDNAを合成することが可能となっている。しかしこの方法では、増幅工程が含まれないため発現量の少ない遺伝子を検出しようとする場合や、検体量が少ない場合などに利用することが出来ない。
【００１２】
従って、本発明の目的は、プローブを利用した分析などに用いる試料中の分析対象遺伝子を検出可能なレベルまで特異的に増幅できる核酸の増幅方法を提供することにある。本発明の他の目的は、試料中の分析対象遺伝子が発現量が少ないものであっても、検出可能なレベルまで特異的に増幅できる核酸の増幅方法を提供することにある。本発明の他の目的は、試料中のmRNAの存在量に比例した定量的な検出対象核酸の増幅を行うことのできる核酸の増幅方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記問題点を解決した核酸増幅方法として、研究を重ねた結果、特定の遺伝子のみを標識もしくは存在させ、mRNAの存在量に比例した定量的な核酸増幅方法を見いだすに至った。
【００１４】
すなわち、本発明のＤＮＡ増幅方法は、RNAポリメラーゼを用いて相補的なRNAを形成可能な複数種類のDNAの中から特定の配列を有するDNAを増幅する方法であって、前記複数種類のDNAに対して相補的なRNAを、RNAポリメラーゼを用いて増幅する工程と、前記増幅されたRNAに対して前記特定の配列を有するプライマーを用いて逆転写を行い前記特定の配列を有するDNAを得る工程と、を有することを特徴とするDNAの増幅方法である。
【００１５】
本発明の核酸の増幅方法は、試料から得られたmRNAから、該試料に含まれる標的遺伝子に特有の配列を有するＤＮＡを増幅する方法であって、（１）試料からmRNAを得る工程と、（２）前記mRNAから、RNAポリメラーゼが認識するプロモーター領域を有するプライマーを用いた逆転写反応によりcDNAを得る工程と、（３）該cDNAに対してRNAポリメラーゼを用いてcRNA増幅を行う工程と、（４）前記標的遺伝子に特異的、かつ前記cRNAの塩基配列に相補的な配列を有するプライマーを用いて逆転写を行い、前記標的遺伝子に特有の配列を有する増幅されたＤＮＡを得る工程と、を有することを特徴とする、核酸の増幅方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によって、増幅対象としての標的遺伝子に特異的であり、発現量の少ない遺伝子であっても増幅可能な核酸調製方法を提供することができる。本発明による核酸の増幅方法を行うことにより、標的遺伝子の特異的な増幅が可能になるため、検出対象としない不要な遺伝子の増幅を排除することができ、特に発現量の少ない遺伝子をマイクロアレイ等を用いて検出する場合などに効果的である。また、cRNAを排除するRNA分解の工程を追加して行うことにより、完全に標的遺伝子の増幅産物だけの検体を得ることが可能で、より精密かつ高感度な核酸の増幅が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の核酸の増幅方法は、特異的な増幅対象としての標的DNAを含む複数種のDNAに対してRNAポリメラーゼによるcRNA増幅を行う工程と、得られたcRNAから標的DNAに特異的なプライマーを用いた逆転写を行い標的DNAを得る工程を少なくとも有する。
【００１８】
試料が細胞、組織、これらの処理物等である場合には、本発明による核酸増幅方法を試料から抽出したmRNAに対して行うことにより、mRNAの量に応じた定量的な増幅がなされ、標的遺伝子に限定された一本鎖の核酸（DNA）を得ることができる。
【００１９】
逆転写反応による一本鎖核酸の合成に当たって、基質としてその一部または全部に、標識付きの基質を用いることも可能である。標識としてはあらゆる種類の標識が利用可能であるが、Cy3、Cy5、ビオチンなどはその代表例である。標識の方法としては、基質を標識しておく手法以外にも、遺伝子特異的なプライマーを同様な標識物質により標識する手法もある。本発明による核酸増幅方法は、固相ハイブリダイゼーションを利用した核酸検出方法に供する、標識核酸の調製方法とすることができる。
【００２０】
また、本発明の核酸増幅方法では、cRNAからの逆転写を行った後、残存するcRNAをRNA分解酵素により分解する工程を更に行ってもよい。この分解工程を付加することで逆転写した一本鎖DNAだけをサンプル中に存在させることができ、より精度の高い増幅が可能となる。例えば固相ハイブリダイゼーションなどに本発明の方法により得られた増幅産物を検体として用いる場合、ハイブリダイゼーションを阻害する様々な反応を回避することが可能となる。また、逆転写工程において、増幅対象あるいは検出対象としての標的遺伝子に特異的なプライマーを同一反応系中で複数種用いることができる。その際、複数種のプライマーのTm値や濃度を同一にすることも可能であるが、逆転写の効率等を考慮して、複数種のプライマー間で異なるTm値や濃度とすることも可能である。標的遺伝子に特異的なプライマーを目的に応じて適切に選択することで、mRNA（ｃRNA）の含有量や状態に応じた核酸増幅の調整が可能となる。
【００２１】
図１に、本発明の核酸増幅方法におけるｃRNAの逆転写工程及びRNA分解工程での反応の概要を示す。図示したように、まず、特異的増幅の対象としての標的遺伝子に特異的なプライマー（遺伝子特異的プライマー）Ａ及びＢを増幅されたｃRNAにアニールさせる。その状態で、標識された基質を含む逆転写反応に必要な基質の存在下で逆転写反応を生じさせる。逆転写反応終了後には、プライマーＡに基づくDNAと、プライマーＢに基づいてDNAが生成しており、この状態でRNA分解酵素を作用させると、cRNAは分解され、逆転写により得られたDNAが残される。すなわち、プライマーＡ及びＢに対応する標的遺伝子を増幅されたDNAとして得ることができる。なお、mRNAから最終的に増幅取得されるDNA（DNA鎖）は、増幅対象あるいは検出対象としての標的遺伝子そのものでもよいし、標的遺伝子に特異的な領域からなる断片でもよい。
【００２２】
以下、本発明の増幅方法における各工程について詳細に説明する。
【００２３】
（cRNAの合成）
本発明による核酸の増幅方法の最初の工程である、細胞などのサンプル中に含まれるmRNAの逆転写反応は定法に従って行えばよい。サンプル中に含まれる核酸成分のうちmRNAの成分の構成比率が低く、DNA成分等の他の成分が多く含まれる場合には、市販のRNA精製のためのキットを用いて精製を行えば良い。
【００２４】
次にしかるべき精製がなされたmRNAの逆転写反応を行う。mRNAの逆転写反応としてはランダムプライマーを用いる方法など各種の方法が考案されている。しかしながら、本発明による核酸増幅方法においては、cDNAをテンプレートとしてRNAポリメラーゼによるcRNA合成を行うため、RNAポリメラーゼが認識するプロモーター領域を有するプライマーを用いる必要がある。プロモーターの種類としては、目的とする増幅効果が得られるプロモーターであれば特に制限なく、利用可能である。なかでも、T7プロモーター、さらにT3、SP6プロモーターなどが好適に利用可能である。
【００２５】
また、全てのmRNAを同じ効率で増幅する場合には、mRNAが共通で有するポリアデニン(A)領域を認識する、ポリチミン(T)配列を有するプライマーが好ましい。ポリTの鎖長は、ポリAの鎖長に応じて任意に設定可能であるが、一般的には24merのポリTが利用可能である。
T7プロモータとポリ（T）24を有する代表的なプライマーの配列を下記に示す。
5'GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'（配列番号:１）
逆転写に用いる酵素としては各種の逆転写酵素が利用できる。中でもインビトロジェン社から市販されている「SuperScript」シリーズの酵素は広く用いられており、本発明においても好適に用いることが可能である。逆転写反応は2ndストランド合成まで行うが、最後にT4 DNA ポリメラーゼ等を使用し末端を平滑化すれば、より安定したｃDNAを得ることが出来る。
【００２６】
得られたプロモーター領域を有するcDNAは、必要に応じて精製処理を行った後、その一部もしくは全部を用いて、次の工程であるcRNA増幅を行う。cRNA合成においては組み込んだプロモーターを認識するRNAポリメラーゼを用いて、cRNA合成を行えばよい。Ambion社から市販されている「MEGAscript」などは、上述のプロモーターを認識する酵素が含まれるcRNA合成のキットであり、広く用いられている。このようなキットを含めて、組み込んだプロモーター領域を認識できる酵素が含まれるものであれば、あらゆるキットや酵素を用いることが可能である。
【００２７】
得られたcRNAは精製処理を行い、酵素等の夾雑物や、必要に応じてテンプレートとしたcDNA成分を排除する。
【００２８】
（遺伝子特異的なプライマーによる逆転写）
遺伝子特異的なプライマーの設計は、増幅したい遺伝子配列に特異的な配列に関する情報を有し、かつｃRNAに相補的である配列からなるように設計する。この増幅したい遺伝子配列に特異的な配列に関する情報は、増幅対象の遺伝子がRNAであるかDNAであるかで異なり、増幅対象遺伝子に特異的な配列そのもの、あるいはそれと相補的な配列としてプライマーに組み込まれる。
【００２９】
また、本発明の核酸増幅方法を、プローブを用いた分析における検体の調製に利用する場合には、標的遺伝子（標的核酸）のプローブによって検出される領域が少なくとも増幅されるように逆転写用のプライマーの配列を設定する。
【００３０】
プライマーの有する特異性の確認は、一般に公開されている各種の配列情報データベース等を参照して行うことができる。例えば、設計されたプライマーの配列と、各種データベースに格納された配列情報とを対比して、設計されたプライマーの標的遺伝子に対する特異性を検証することがきる。更に、その結果に基づいて、必要に応じて、標的遺伝子に対して出来る限り特異性の高いプライマー配列に設計変更する。データベースとしては米国のNCBI(National Center of Biotechnology Information)などを利用することができる。
【００３１】
プライマーが認識する特異的な配列は、増幅（検出）対象としての標的遺伝子配列中の任意の位置に設定することが可能である。しかしながら、cRNAは由来となったmRNAのポリA側(3'側)から約2000bp程度までしか合成されないことが一般的に知られており、より精度の高いmRNAの定量を行う場合には、標的遺伝子を含むcRNAが確実に合成される領域内に設定されることが望ましい。
【００３２】
プライマーのTm値としては逆転写反応の反応温度において特異性を維持できる温度に設定することが望ましい。また、図１に示すように複数のプライマーを用いる場合には、相互に同じ領域のTm値を有することが、定量性の観点から望ましい。
【００３３】
プライマーがアニールしにくい場合や、逆転写の効率が低い場合、あるいはcRNA含有量が極めて低い場合においては、定量性がある程度失われる事を前提に定性性を重視して、Tm値が高いプライマーを用いることも可能である。反対に、逆転写の効率が他の遺伝子に比べて際だって高い場合や、cRNAの含有量が極めて高い場合などは、同様の前提の上に、Tm値が低いプライマーを用いることも可能である。
【００３４】
遺伝子特異的なプライマーによる逆転写の効率は、プライマーの濃度を変えることによっても調整することが可能である。高い効率で逆転写を行う必要がある場合にはプライマー濃度を高く設定し、反対に効率を下げたい場合にはプライマー濃度を下げることで、逆転写効率を調整することが可能である。
【００３５】
プライマーの有するcRNAに対して相補的な配列に組み込む標的遺伝子に特異的な配列に関する情報によって種々の増幅を行うことができる。例えば、増幅したい遺伝子が、部分的に共通の配列を有するファミリー遺伝子のような場合、各遺伝子に固有の配列領域を設定し、この配列領域を認識するプライマーをそれぞれ用意することで、各遺伝子を個別に増幅することができる。一方、同一遺伝子ファミリーの各遺伝子に共通領域の配列をプライマーとして選択し、ファミリー遺伝子を一括して増幅することも可能である。
【００３６】
同時に逆転写反応を行う事の出来る遺伝子数は１つ以上で任意であり、増幅したい複数種の遺伝子にそれぞれプライマーを設計し、同一反応系内で各プライマーが関与する逆転写反応を同時に行うことが可能である。
【００３７】
設計したプライマーを用いた逆転写反応は、所定のバッファー条件下、逆転写酵素と基質を用いて定法に従って行うことが可能である。mRNAからの逆転写反応と同様に、目的に応じた逆転写酵素を選択して利用することが可能である。中でもインビトロジェン社から市販されている「SuperScript」シリーズの酵素は広く用いられていおり、本発明においても好適に用いることが可能である。
【００３８】
逆転写反応に用いる基質としては、DNAの構成要素であるアデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、チミン(T)等を用いることで、通常の逆転写反応を行うことが出来るが、それ以外のウラシル(U)なども用いることも可能である。
【００３９】
また、得られる一本鎖のDNAを何らかの標識物質で標識したい場合、標識付きの基質の存在下で逆転写反応を行うことにより、標識された一本鎖DNAを得ることが出来る。標識付きの基質を標識されていない基質と共存させても良いし、標識の種類によっては全ての基質を標識基質としても構わない。標識物質としては、一般に良く用いられるCy3やCy5、ビオチンなどを好適に用いることが可能であり、また放射性同位元素などにより標識しておくことも可能である。
【００４０】
また標識基質を用いる方法以外に、遺伝子特異的なプライマーの5'末端などに標識物質を結合させておくことも可能である。
【００４１】
（RNA分解酵素によるｃRNA成分の分解）
逆転写反応後の反応液は、得られた一本鎖DNAとともにそのテンプレートとして利用したcRNAを含むため、必要に応じて目的とするDNAを単離する処理を行う。このDNAの単離には、cRNA分解処理が好適に利用できる。cRNAの分解に当たっては、一般に用いられているRNA分解酵素を用いることが可能である。例えば第一化学薬品社などから市販されているRNase Ifなどは一本鎖RNAを特異的に分解する活性を有するため好適に用いることが可能である。
【００４２】
本発明による核酸の増幅方法は、DNAマイクロアレイなどの検体調製方法として特に好適に用いることが可能である。DNAマイクロアレイは複数のプローブを有する特定の核酸の検出用デバイスであり、検体調製も複数の遺伝子を対象にすることが多い。検出対象ではない多数の核酸がハイブリダイゼーションに与える影響は無視できない。所望の遺伝子だけを一本鎖DNAとして合成することが可能である本発明による検体調製方法は、こうしたマイクロアレイを用いた解析に好適に用いることが可能である。
【００４３】
特に、RNA分解酵素によりcRNA成分を全て除去する方法は、検出対象の遺伝子も含めたcRNA成分全てを除去することが可能であり、プローブと検出対象一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションに対する阻害が格段に少なくなることから、精度の高い検出が要求された場合に特に好適に適用することが可能である。
【実施例】
【００４４】
以下具体的な実施例を示し、本発明を更に詳細に説明する。
＜実施例１＞
（１）細胞からのtotal RNA回収とｃDNAの調製
（１）-1    total RNAの回収
ヒト胃より採取された胃がん由来細胞株(セルライン) KATO IIIを入手して、所定のプロトコルに従って培養を行い、約1×105個の培養細胞を得た。
【００４５】
続いてアマシャムファルマシア社製 total RNA抽出キットのプロトコルに従って、培養細胞中より、total RNAを抽出した。すなわち、LiCL溶液、抽出バッファー、ベーターメルカプトエタノールを加えてホモジナイズし、氷上にてCsTFA溶液を添加し、ボルテックス、遠心分離させたのち、上清を除去した。続いて、抽出バッファー、LiCs溶液、CsTFA溶液を加え遠心分離し上清を除去したのち、エタノール沈殿(70%エタノール)によりtotal RNAを得た。
得られたtotal RNAをDEPC水に溶解し吸収測定により回収量を計算したところ、約1×105個の培養細胞から0.2μｇのtotal RNAを回収できた。
（１）-2    逆転写(1st strandの合成)
得られたtotal RNA 0.2 μg全量を、インビトロジェン社製SuperScript Choice System for cDNA Synthesisを用いてT7-(dT)24プライマー(アマシャムファルマシア製) による逆転写を行った。具体的には下記の方法で行った。なお、反応は最終液量が20μlとなるように調製した。
【００４６】
11μlの液量としたtotal RNA 0.2μgにT7-(dT)24プライマー（100μM）1μlを加え、70℃で10分間熱変性させた。急冷後、酵素に添付の5×バッファー4μl、0.1MのDTT2μl、10mMのdNTP Mix 1μlを加えたのち、逆転写酵素Superscript II RTを1μl加え、42℃で1時間インキュベートした。1時間後、急冷し1st strand溶液約20μlを回収した。
（１）-3    逆転写(2nd strandの合成)
得られた1st strand溶液約20μl全量を、精製せずにSuperScript Choice System for cDNA Synthesisのマニュアルに従って2nd strand 合成した。具体的には、5×バッファー30μl、10mMのdNTP Mix 3μl、DNAリガーゼ1μl(10ユニット)、DNAポリメラーゼI4μl(40ユニット
)、RNaseH1μl(2ユニット)を加えたのち、16℃で２時間反応させた。これにより得られた二本鎖cDNAは、末端が平滑化されていないため、T4 DNA ポリメラーゼ2μl(10ユニット)により平滑化処理した。
【００４７】
得られた二本鎖cDNAは、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽出精製し、フェーズロックゲルにて核酸成分を精製した。
（２）cRNAの合成
得られたcDNAをテンプレートとした、cRNAの合成はAmbion社のMEGAscript High Yield Transcription Kitを用いて行った。テンプレートとしたcDNAは、吸光度測定によりあらかじめ濃度を測定しておき、含有量を確定し、MEGAscriptのマニュアルに従って1μgを使用した。cRNAの合成条件は、MEGAscriptのマニュアルに従って標識無しの条件で行われ、cRNAの粗生成物を得た。得られたcRNAの精製は、キアゲン社の精製キット RNeasyを用いて、所定のプロトコルに従って行った。
（３）遺伝子特異的プライマーによる逆転写
（３）-1    プライマーの設計
遺伝子特異的なプライマーによる逆転写を行うため、逆転写反応のプライマーの設計を行った。逆転写の対象とした遺伝子は、CEA（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion）、ACTB（actin, beta）、GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）の３種の遺伝子である。なお、これらの３つの遺伝子は、胃がん標準細胞KATO IIIにおいて、高い発現、すなわち多くのmRNAが存在することが、各種の解析結果から知られている遺伝子である。
【００４８】
プライマーの設計は、合成されたcRNAの配列を参照し、特異性、Tm値、GC%、鎖長を考慮して設計した。特異性に関しては、NCBI(National Center of Biotechnology Information)などで提供されているデータをもとに確認し、下記の配列とした。
CEA：5'ctgcttgatcttggtggacagtttcatga3'（配列番号:２）
ACTB：5'acttgggagaggactgggccattct3'（配列番号:３）
GAPDH：5'tgctgtagccaaattcgttgtcatacc3'（配列番号:４）
設計した遺伝子特異的なプライマーは、それぞれ定法に従って合成し、100μMの濃度となるように水に溶解した。
（３）-2  遺伝子特異的プライマーによる逆転写
得られたtotal RNAを、インビトロジェン社製SuperScript Choice System for cDNA Synthesisを用いて（１）-2と同様な手順で逆転写した。
【００４９】
（２）cRNAの合成により得られたcRNA全量を濃縮し、9μlの液量となるよう調製した。続いて、３種の遺伝子特異的なプライマー（100μM）を各1μlを加え、70℃で10分間熱変成したのち氷上にて急冷した。次に、インビトロジェン社から提供されたマニュアルに従って、バッファー、DTT、dNTPを加え、さらに、標識のための基質として、アマシャムバイオサイエンス社製のCy3dUTP（1mM）を1μl加えた。酵素の活性温度である42℃で2分間おき反応に支障のない温度にした後、逆転写酵素Superscript II RTを1μl加えた。逆転写反応はマニュアルに従って1時間行い、反応後、定法に従ってエタノール沈殿法により精製し、得られた固形物を50μlの水に溶解して、Cy3標識検体（標識検体１）を得た。
（４）RNA分解酵素によるcRNAの分解
（３）-2で得られた標識検体１のうち10μlを用いて、サンプル中に含まれるcRNA成分の酵素分解を行った。
【００５０】
標識検体１の10μlに対し、第一化学薬品社製、RNA分解酵素Ribonuclease If（RNase If）に添付されているバッファー1×NEBuffer3を10μl加え、20μlの検体溶液とした。溶液を37℃に加熱した後、Ribonuclease If 10Unitを加え、37℃で1時間暗所にて反応させた。得られたサンプルは、定法に従ってエタノール沈殿法により精製し、得られた固形物を10μlの水に溶解して、cRNAを含まないCy3標識検体（標識検体2）を得た。
＜実施例２＞
実施例１で得られた標識検体が固相プローブにより検出できることを確認するため、実施例１で選択した3遺伝子に対応するプローブ3種を搭載したDNAカスタムアレイを作製したのち、実施例１の２つの検体をアプライ（ハイブリダイゼーション）した。
（１）カスタムアレイの作製
カスタムアレイの作製は、特開平-１８７９００号公報に記載の方法により行った。以下にその概略を記述する。
（１）-1    プローブの設計と合成
各遺伝子を検出するためのプローブは、遺伝子特異的なプライマーの設計と同様、各遺伝子の特異性が維持されるように設計を行い、それぞれ下記の配列とした。
CEA：5' ttcttttaagctatccactcttacagcaatttgataaaatatacttttgt 3'（配列番号:５）
ACTB：5' ttgtcccccaacttgagatgtatgaaggcttttggtctccctgggagtg 3'（配列番号:６）
GAPDH：5' tctcccctcctcacagttgccatgtagaccccttgaagaggggaggggc 3'（配列番号:７）
各プローブの合成は、定法に従って行ったが、カスタムアレイ表面への固定化を行うため、各プローブの5'末端をチオール化（SH基）したものを合成した。合成したプローブは、HPLC精製により精製を行った。
（１）-2    カスタムアレイの作製
合成石英のガラス基板（サイズ：２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）を超音波洗浄用の洗浄液で洗浄し、続けて８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で洗浄した。さらに純水洗浄と超純水洗浄を行い、DNAマイクロアレイ用の石英ガラス基板を用意した。
【００５１】
続いてシランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌後、先に洗浄したガラス基板を浸し、２０分間室温で放置した。純水で表面を洗浄した後、120℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製の二価性試薬であるＥＭＣＳの溶液中にベークの終了したガラス基板を浸した。ここで、EMCS溶液は、DMSOとエタノールの1:1混合溶媒に対し、EMCSを50μg/mlの濃度で溶解した溶液である。以上の工程により、ガラス基板表面にマレイミド基が導入されたカスタムアレイ用のガラス基板を得た。
【００５２】
次に、先に合成したチオール化したプローブをそれぞれ、ＢＪプリンター用の溶液（グリセリン７．５質量％、チオジグリコール７．５質量％、尿素７．５質量％、アセチレノールＥＨ１．０質量％）に５μMの濃度となるように溶解した。得られたDNA（プローブ）溶液をバブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０、キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００５３】
続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて、１枚のガラス基板に対して、印字操作を行い、DNAマイクロアレイを作製した。用いたバブルジェットプリンターは平板への印刷が可能なように改造を施したもので、各プローブごとに、約５ピコリットルのDNA溶液をスポッティングすることが可能となっている。本実施例においては、各プローブごとに１枚のカスタムアレイあたり１８スポットの印字ができるように設定し、カスタムアレイの作製を行った。
（２）ハイブリダイゼーション
実施例１で得られた標識検体のうち、標識検体１に関しては10μl、標識検体２については全量を用いてそれぞれハイブリダイゼーションを行った。各標識検体に対しバッファー等を加え、最終濃度が下記の構成となるようハイブリダイゼーション溶液を調製した。
<ハイブリダイゼーション溶液>
6×SSPE/10%  ホルムアミド/0.05% SDS/標識検体
(6×SSPEの組成は、NaCl  900mM、NaH2PO4・H2O  60mM、EDTA  6mM、pH：7.4)
実施例２-（１）で作製したカスタムアレイを、ハイブリダイゼーション装置(Genomic  Solutions  Inc.  Hybridization  Station)にセットし、上記組成のハイブリダイゼーション溶液を用いて、下記表１に示す手順・条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００５４】
【表１】
2007129916.tif 000002
【００５５】
ハイブリダイゼーション反応終了後、スピンドライしたカスタムアレイについて、DNAチップ用蛍光検出装置(Axon社製、Genepix 4000B)を用いて、各プローブごとにCy3由来の蛍光輝度測定を行った。Genepixの感度設定は、レーザー強度100%である。ホトマル感度蛍光輝度を測定した結果を下記の表２に示す。
【００５６】
輝度の算出にあたっては、プローブ（スポット）周辺部から測定される蛍光輝度値をバックグランド値として、各スポットから得られる輝度値からバックグランド値を差し引いた値を実測値とした。各プローブごとに18個の輝度値が得られるが、各プローブごとに平均値を算出し、これを蛍光輝度値とした。
【００５７】
【表２】
2007129916.tif 000003
【００５８】
（３）輝度の解析
標識検体１および標識検体２、いずれからも一定の輝度値を得ることができた。理論上等量ずつハイブリダイゼーションしているにもかかわらず標識検体2の方が輝度が高いのは、標識検体1に含まれているcRNAが標識検体2には含まれないためであると考えられる。本発明による検体処理方法においては、最終工程である、遺伝子特異的なプライマーによる逆転写の工程でのみ標識基質を添加しており、本発明により調製された一本鎖DNAが確実に合成されていることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ｃRNAを原料とした本発明の検体調製方法を示す図（ｃRNAから標識一本鎖DNAを合成する概念図）である。
【図１】
2007129916.tif 000004
【配列表】
2007129916000001.app