(57)【要約】【課題】細胞死誘導に有効なペプチド等を提供する。【解決手段】配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号３９〜２８１の領域から選ばれる連続した４〜１２個のアミノ酸からなるペプチドであって、以下の（ａ）及び（ｂ）に該当する細胞死誘導ペプチド。（ａ）ＳＮＬＨＬの内の連続した３個以上のアミノ酸を含まない。（ｂ）当該ペプチドを固定化したチップ上での４８時間の細胞培養による細胞死誘導検定後の生細胞数測定平均値が、コントロールとしてのペプチド非固定化チップ上での同一検定後の生細胞数測定平均値の８０％以下である。【選択図】      図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号３９〜２８１の領域から選ばれる連続した４〜１２個のアミノ酸からなるペプチドであって、以下の（ａ）及び（ｂ）に該当することを特徴とする細胞死誘導ペプチド。
（ａ）ＳＮＬＨＬの内の連続した３個以上のアミノ酸を含まない。
（ｂ）当該ペプチドを固定化したチップ上での４８時間の細胞培養による細胞死誘導検定後の生細胞数測定平均値が、コントロールとしてのペプチド非固定化チップ上での同一検定後の生細胞数測定平均値の８０％以下である。
【請求項２】
前記ペプチドの生細胞数測定平均値がコントロールの生細胞数測定平均値の７０％以下であることを特徴とする請求項１に記載の細胞死誘導ペプチド。
【請求項３】
以下の（１）〜（１４）のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする細胞死誘導ペプチド。
（１）ＹＳＫＳＧＩＡＣ
（２）ＫＳＧＩＡＣＦＬ
（３）ＧＩＡＣＦＬＫＥ
（４）ＡＣＦＬＫＥＤＤ
（５）ＫＥＤＤＳＹＷＤ
（６）ＳＰＣＷＱＶＫＷ
（７）ＣＷＱＶＫＷＱＬ
（８）ＱＶＫＷＱＬＲＱ
（９）ＫＷＱＬＲＱＬＶ
（１０）ＬＲＮＧＥＬＶＩ
（１１）ＮＧＥＬＶＩＨＥ
（１２）ＫＥＮＴＫＮＤＫ
（１３）ＮＴＫＮＤＫＱＭ
（１４）ＫＮＤＫＱＭＶＱ
【請求項４】
前記（１）〜（１４）のいずれかのアミノ酸配列において任意の１個又は２個のアミノ酸が置換・欠失・又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、当該ペプチドを固定化したチップ上での４８時間の細胞培養による細胞死誘導検定後の生細胞数測定平均値が、コントロールとしてのペプチド非固定化チップ上での同一検定後の生細胞数測定平均値の８０％以下であることを特徴とする請求項３に記載の細胞死誘導ペプチド。
【請求項５】
１個以上のＣを含む４〜１２個のアミノ酸からなり、かつ、前記Ｃのカルボキシル末端側には芳香族アミノ酸が結合していることを特徴とする細胞死誘導ペプチド。
【請求項６】
前記細胞死誘導ペプチドにおいて、前記芳香族アミノ酸のカルボキシル末端側には、任意の種類の１個又は２個のアミノ酸を介してＫが結合していることを特徴とする請求項５に記載の細胞死誘導ペプチド。
【請求項７】
前記細胞死誘導ペプチドが可溶化状態のものであり、あるいはそのアミノ基又はカルボキシル基において固定化された状態のものであることを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれかに記載の細胞死誘導ペプチド。
【請求項８】
請求項１〜請求項６のいずれかに記載の細胞死誘導ペプチドの１種又は２種以上をＭＡＰ（Multiple Antigenic Peptide）化したものであることを特徴とするＭＡＰ化細胞死誘導ペプチド。
【請求項９】
請求項１〜請求項７のいずれかに記載の細胞死誘導ペプチド、及び／又は、請求項８に記載のＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドを有効成分とすることを特徴とする細胞死誘導剤。
【請求項１０】
請求項１〜請求項７のいずれかに記載の細胞死誘導ペプチド、及び／又は、請求項８に記載のＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドを有効成分とすることを特徴とする抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞死誘導ペプチド、ＭＡＰ化細胞死誘導ペプチド、細胞死誘導剤及び抗癌剤に関し、更に詳しくは、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドＴＲＡＩＬ（TNF-related apotosis inducing ligand）の細胞外ドメインのアミノ酸配列に由来して、又はその配列に関する知見に基づいて発明された細胞死誘導ペプチドと、この細胞死誘導ペプチドをＭＡＰ化したＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドと、これらの細胞死誘導ペプチド及び／又はＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドを有効成分とする細胞死誘導剤及び抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＲＡＩＬは、ＴＮＦファミリーに属するサイトカインであり、２８１個のアミノ酸からなる２型膜透過性のタンパク質である。このＴＲＡＩＬは例えば下記の非特許文献１において報告されているように、受容体（デスレセプター）を介して癌細胞にアポトーシスを誘導する。しかも、ＴＲＡＩＬは正常細胞には余り影響を及ぼさない。
【０００３】
【非特許文献１】Wilev et al., Immunity, 3:673-682(1995), Pitti etal., J. Biol. Chem., 271:12697  従って、ＴＲＡＩＬは副作用のない癌治療に利用できることが考えられ、例えば下記の非特許文献に例示されるように、癌治療、免疫疾患等に関連した研究が進められている。
【０００４】
【非特許文献２】Garber, K., Arbor, A., Nat. Biotech., 23, 409-411(2005)  しかし、ＴＲＡＩＬの受容体との結合様式はまだ詳細に解明されてはおらず、その安定した大量生産プロセスもまだ未開発である。
【０００５】
一方、一般的に、タンパク質そのものに比べてペプチドのような小さい分子の方が生体吸収性が高く、標的化分子や他の薬剤分子による化学的修飾が簡便であることが知られている。又、ペプチドは、タンパク質と比較して、低分子でありながら生体内において様々な生理活性を有する。多くの生体ホルモンやサイトカインの他、抗菌性ペプチドや、細胞接着性ペプチドなど、多くの機能を持つペプチドがこれまで報告されている。又、ペプチドの有機合成化学は非常に発展しており、薬剤として安定供給が可能である。
【０００６】
従来、抗菌活性、細胞接着の促進、アポトーシスや、その他のタンパク質活性阻害剤等、細胞機能性ペプチドの多くの研究例がある。しかし、短いペプチドであって細胞障害性を有するペプチドの報告例は、下記の非特許文献３や非特許文献４が挙げられるとしても、非常に少ない。更に、そのような活性を有するペプチドであっても、ペプチド末端が固定化された状態で活性を保持するものは報告がなかった。
【０００７】
【非特許文献３】Buckley CD, et al., RGD peptides induce apoptosisby direct caspase-3 activation., "Nature", (UK), 1999, Vol.397(6719)p.534-9
【非特許文献４】Terui Y, et al., NH2-terminal pentapeptide ofendothelial interleukin 8 is responsible for the induction ofapoptosis in leukemic cells and has an antitumor effect in vivo.,"Cancer Res.", 1999, Vol.59(22), p.5651-5
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明は、細胞死誘導ペプチド及びこのようなペプチドを多量体化したＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドを提供すること、更には、これらのペプチドを有効成分とする細胞死誘導剤及び抗癌剤を提供することを、解決すべき技術的課題とする。
【０００９】
本願発明者は、ＴＲＡＩＬにおける受容体との相互作用部位である細胞外ドメインのアミノ酸配列を部分重複的に網羅したペプチドライブラリーを構築した。そしてこれらのペプチドについて、白血病細胞の細胞死誘導性の検定を通じて細胞死誘導ペプチドのスクリーニングを行い、複数の有力な細胞死誘導ペプチドを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（第１発明）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号３９〜２８１の領域から選ばれる連続した４〜１２個のアミノ酸からなるペプチドであって、以下の（ａ）及び（ｂ）に該当する、細胞死誘導ペプチドである。
（ａ）ＳＮＬＨＬの内の連続した３個以上のアミノ酸を含まない。
（ｂ）当該ペプチドを固定化したチップ上での４８時間の細胞培養による細胞死誘導検定後の生細胞数測定平均値が、コントロールとしてのペプチド非固定化チップ上での同一検定後の生細胞数測定平均値の８０％以下である。
【００１２】
なお、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列はＴＲＡＩＬのアミノ酸配列であって、その内、アミノ酸番号３９〜２８１の領域は細胞外ドメインである。
【００１３】
第１発明の細胞死誘導ペプチドは、ペプチド固定化チップ上での細胞死誘導検定において、コントロールであるペプチド非固定化チップ上での同一検定の場合に比較して、生細胞数測定平均値が８０％以下であると言う有意な細胞死誘導性を示す。従って、ペプチドドラッグとしての細胞死誘導剤や抗癌剤の有効成分として、十分に利用できると考えられる。又、これらの細胞死誘導ペプチドは新薬リード化合物としても有用である。
【００１４】
又、前記したように、ＴＲＡＩＬは正常細胞には余り影響を及ぼさないことが知られており、従って、その部分アミノ酸配列からなる第１発明の細胞死誘導ペプチドも、正常細胞には殆ど影響を及ぼさないと考えられる。
【００１５】
（第２発明）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に係るペプチドの生細胞数測定平均値がコントロールの生細胞数測定平均値の７０％以下である、細胞死誘導ペプチドである。
【００１６】
本発明の細胞死誘導ペプチドとして、ペプチドの生細胞数測定平均値がコントロールの生細胞数測定平均値の７０％以下であると言う、特に細胞死誘導活性の高いペプチドも相当数に見出されている。これらの細胞死誘導ペプチドは、とりわけ有効である。このパーセンテージは、更に好ましくは６５％以下である。
【００１７】
（第３発明）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、以下の（１）〜（１４）のいずれかのアミノ酸配列を有する、細胞死誘導ペプチドである。
（１）ＹＳＫＳＧＩＡＣ
（２）ＫＳＧＩＡＣＦＬ
（３）ＧＩＡＣＦＬＫＥ
（４）ＡＣＦＬＫＥＤＤ
（５）ＫＥＤＤＳＹＷＤ
（６）ＳＰＣＷＱＶＫＷ
（７）ＣＷＱＶＫＷＱＬ
（８）ＱＶＫＷＱＬＲＱ
（９）ＫＷＱＬＲＱＬＶ
（１０）ＬＲＮＧＥＬＶＩ
（１１）ＮＧＥＬＶＩＨＥ
（１２）ＫＥＮＴＫＮＤＫ
（１３）ＮＴＫＮＤＫＱＭ
（１４）ＫＮＤＫＱＭＶＱ
第３発明に規定する上記（１）〜（１４）のいずれかの細胞死誘導ペプチドのアミノ酸配列は、いずれも配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号３９〜２８１の領域から見出されたものである。後述の実施例において述べるように、これらの細胞死誘導ペプチドは、いずれも第１発明の（ｂ）に該当する細胞死誘導活性が具体的に確認されている。
【００１８】
（第４発明）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、前記第３発明に係る（１）〜（１４）のいずれかのアミノ酸配列において任意の１個又は２個のアミノ酸が置換・欠失・又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、当該ペプチドを固定化したチップ上での４８時間の細胞培養による細胞死誘導検定後の生細胞数測定平均値が、コントロールとしてのペプチド非固定化チップ上での同一検定後の生細胞数測定平均値の８０％以下である、細胞死誘導ペプチドである。
【００１９】
任意の機能を有するタンパク質やペプチドのアミノ酸配列において、あるいは任意の機能を有する遺伝子等の塩基配列において「配列のゆらぎ」として一般的に見られるように、上記の第３発明に係る細胞死誘導ペプチドに関しても、そのアミノ酸配列中の任意の１個又は２個のアミノ酸が置換・欠失・又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ機能同等である多数の細胞死誘導ペプチド群が存在する。
【００２０】
（第５発明）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、１個以上のＣを含む４〜１２個のアミノ酸からなり、かつ、前記Ｃのカルボキシル末端側には芳香族アミノ酸が結合している、細胞死誘導ペプチドである。
【００２１】
ＴＲＡＩＬの細胞外ドメインのアミノ酸配列中には合計３個のＣ（システイン：Cys ）が含まれるが、これらのＣはいずれも第３発明において前記した典型的に有効な細胞死誘導ペプチドの構成要素となっている。しかも、前記３個のＣのカルボキシル末端側には、いずれの場合にも芳香族アミノ酸（Ｆ：Phe 又はＷ：Trp ）が結合している。そのため、未だ実験的に確認していないが、細胞死誘導ペプチドにおいては、システイン残基とそのカルボキシル末端側に結合した芳香族アミノ酸とを含むことが細胞死誘導性の重要な要素の１つであると考えることが、一層合理的である。
【００２２】
（第６発明）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、前記第５発明に係る細胞死誘導ペプチドにおいて、前記芳香族アミノ酸のカルボキシル末端側には、任意の種類の１個又は２個のアミノ酸を介してＫが結合している、細胞死誘導ペプチドである。
【００２３】
上記した第５発明に関して、前記Ｃのカルボキシル末端側に結合した芳香族アミノ酸に対して、そのカルボキシル末端側には、いずれの場合にも任意の種類の１個又は２個のアミノ酸を介してＫ（リシン：Lys ）が結合している。そのため、未だ実験的に確認していないが、細胞死誘導ペプチドにおいては、システイン残基と、そのカルボキシル末端側に結合した芳香族アミノ酸と、任意の種類の１個又は２個のアミノ酸を介してリシンが結合すると言うアミノ酸配列部分を含むことが細胞死誘導性の重要な要素の１つであると考えることが、特に合理的である。
【００２４】
（第７発明）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、前記第１発明〜第６発明のいずれかに係る細胞死誘導ペプチドが可溶化状態のものであり、あるいは、そのアミノ基又はカルボキシル基において固定化された状態のものである、細胞死誘導ペプチドである。
【００２５】
上記した第１発明〜第６発明のいずれかに係る細胞死誘導ペプチドは、可溶化状態（遊離状態）であっても、Ｎ末端側又はＣ末端側が固定化された状態であっても、有効な細胞死誘導活性を示す。固定化とは、ベースとなる任意の化合物や材料に対する化学的結合又はこれに準ずる状態の固定化を言う。固定化された細胞死誘導ペプチドが有効である点から、次に述べるＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドの発明が成立する。
【００２６】
（第８発明）
上記課題を解決するための本願第８発明の構成は、第１発明〜第６発明のいずれかに係る細胞死誘導ペプチドの１種又は２種以上をＭＡＰ化したものである、ＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドである。
【００２７】
ここに「ＭＡＰ」とは、「Multiple Antigenic Peptide」のことであり、細胞死誘導ペプチドの複数の単位を相互に化学結合させたものを言う。ＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドにおいては、同一種類の細胞死誘導ペプチドを複数結合させても良いし、２種以上の異なる細胞死誘導ペプチドを複数結合させても良い。
【００２８】
ＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドにおいては、細胞死誘導ペプチドが細胞に対して高密度に作用するので、実施例において確認されているように、細胞死誘導活性を一層向上させることができる。
【００２９】
ＭＡＰ化の形態としては、例えば、塩基性アミノ酸における複数のアミノ基にそれぞれ細胞死誘導ペプチドのカルボキシル基を結合させることにより、又は、酸性アミノ酸における複数のカルボキシル基にそれぞれ細胞死誘導ペプチドのアミノ基を結合させることにより、細胞死誘導ペプチドが各枝を構成するＭＡＰ化形態を例示できる。１個の塩基性アミノ酸又は酸性アミノ酸により１個の分枝部分を構成できるから、これらを直列式に２段階に結合させれば２段階の分枝部分を構成でき、結果的に合計４個の細胞死誘導ペプチドを分枝状にＭＡＰ化させることができる。
【００３０】
又、下記の非特許文献５に開示された方法に従い、細胞死誘導ペプチドをパルミチン酸等の脂質と結合させたもとでリポソームに取り込ませ、抗癌剤等としてより有効な親油性（細胞親和性）のＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドとすることもできる。
【００３１】
【非特許文献５】FEBS Lett. 2003; 540(1-3): 133-40.Liposome entrapment and immunogeni studies of a synthetic lipophilicmultiple antigenic peptide bearing VP1 and VP3 domains of thehepatitis A virus: a robust method for vacccine design. Haro I, et al.  更に、任意のベース材料に固定化された細胞死誘導ペプチドも細胞死誘導活性を維持することから、例えばチップ基板に多数の細胞死誘導ペプチドを固定化させ、あるいはｍｍ〜μｍオーダーの微小なベース材粒子（例えば粘度鉱物粒子）に多数の細胞死誘導ペプチドを固定化させた形態のＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドとすることもできる。官能基を備える有機高分子材料の当該官能基に対して多数の細胞死誘導ペプチドを固定化させた形態のＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドとすることもできる。
【００３２】
（第９発明）
上記課題を解決するための本願第９発明の構成は、第１発明〜第７発明のいずれかに係る細胞死誘導ペプチド、及び／又は、第８発明に係るＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドを有効成分とする、細胞死誘導剤である。
【００３３】
（第１０発明）
上記課題を解決するための本願第１０発明の構成は、第１発明〜第７発明のいずれかに係る細胞死誘導ペプチド、及び／又は、第８発明に係るＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドを有効成分とする、抗癌剤である。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によって、血球系癌細胞等の癌細胞に対して有効な細胞死誘導ペプチドが提供される。これらの細胞死誘導ペプチドは、可溶化状態だけでなく固定化状態においても有効な細胞死誘導活性を示すので、種々の機能性材料等への応用が可能であり、応用範囲が広い。又、本発明によって更に効果の高いＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドが提供される。これらの細胞死誘導ペプチドやＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドは、細胞死誘導剤や抗癌剤の有効成分として利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
次に、本発明の実施の形態を、その最良の形態を含めて説明する。
【００３６】
〔細胞死誘導ペプチドのスクリーニング〕
本願発明者は、細胞死誘導活性を有するペプチドを同定するための手法として、ハイスループットコンビナトリアルケミストリーにおいてペプチドチップを使用した。この方法は、新規な生理活性を持つペプチドのスクリーニングに有用であり、チップ上での細胞培養を可能にする。
【００３７】
細胞死誘導ペプチドのスクリーニング対象として、配列表の配列番号１に示すＴＲＡＩＬにおける細胞外ドメイン（アミノ酸番号３９〜２８１の領域）のアミノ酸配列を対象として、細胞死誘導部位の探索を行った。探索に当たり、細胞外ドメインの全領域を網羅するように、８残基のアミノ酸からなるペプチドのライブラリーを構築した。ライブラリーを構成する各ペプチドは、その両端の２残基のアミノ酸が、配列中において両側に隣接するアミノ酸配列をカバーするペプチドと互いに２残基ずつのアミノ酸が重複するように（即ち、２残基ずつ順次ズラして）設定した。
【００３８】
その結果、前記第３発明の（１）〜（１４）に列挙するアミノ酸配列を有するペプチドがガン細胞に対して高い細胞死誘導活性を示すことを見出した。これらの細胞死誘導ペプチドはチップ上への固定化状態において、及び、可溶化状態において、高い細胞死誘導活性を示した。ＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドとして固定化された状態では、同時に作用するペプチドの密度が高いため、特に強い細胞死誘導活性を示す。
【００３９】
上記（１）〜（１４）に列挙するアミノ酸配列を有するペプチドは、いずれも、当該ペプチドを固定化したチップ上での４８時間の細胞培養による細胞死誘導検定後の生細胞数測定平均値が、コントロールとしてのペプチド非固定化チップ上での同一検定後の生細胞数測定平均値の８０％以下である。
【００４０】
上記の細胞死誘導ペプチドは互いに末端の２残基ずつのアミノ酸が重複するように設定されたものであり、しかも特定の数残基のアミノ酸を共通して包含する細胞死誘導ペプチドが幾つも見出されている。このため、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸番号３９〜２８１の領域から選ばれる連続した４〜１２個のアミノ酸からなるペプチドであって、以下の（ａ）及び（ｂ）に該当する細胞死誘導ペプチドも提案することができる。
（ａ）ＳＮＬＨＬの内の連続した３個以上のアミノ酸を含まない。
（ｂ）当該ペプチドを固定化したチップ上での４８時間の細胞培養による細胞死誘導検定後の生細胞数測定平均値が、コントロールとしてのペプチド非固定化チップ上での同一検定後の生細胞数測定平均値の８０％以下である。
【００４１】
「ＳＮＬＨＬの内の連続した３個以上のアミノ酸を含まない」ことを条件とする理由は、これらの細胞死誘導ペプチドが、特開２００５−３０６７６２号公報（特願２００４−１２４３３８号）において既に開示されているためである。
【００４２】
以上の第１発明に係る細胞死誘導ペプチド群の内、特に好ましいものとして、上記した細胞死誘導ペプチドの生細胞数測定平均値が、コントロールの生細胞数測定平均値の７０％以下であるものを挙げることができる。
【００４３】
更に、前記（１）〜（１４）のいずれかのアミノ酸配列において任意の１個又は２個のアミノ酸が置換・欠失・又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、当該ペプチドを固定化したチップ上での４８時間の細胞培養による細胞死誘導検定後の生細胞数測定平均値が、コントロールとしてのペプチド非固定化チップ上での同一検定後の生細胞数測定平均値の８０％以下である細胞死誘導ペプチド群も提案することができる。
【００４４】
一般的に言えば、上記の「アミノ酸の置換」として、置換されたポリペプチドの活性に対してほとんど影響を有さず、総電荷、疎水性／親水性、及び／又は、置換したアミノ酸の立体的な大きさをほぼ保存するような、いわゆる保存的置換を好ましく例示することができる。
【００４５】
更に本願発明者は、第５発明又は第６発明で前記したように、ＴＲＡＩＬ由来の細胞死誘導ペプチドにおけるシステイン（Ｃ）の役割に注目した。即ち、１個以上のシステインを含む４〜１２個のアミノ酸からなるペプチドは、有力な細胞死誘導ペプチドである可能性が高い。そのようなペプチドであって、システインのカルボキシル末端側に芳香族アミノ酸が結合しているものは、更に有力な細胞死誘導ペプチドである可能性が高い。しかも、その芳香族アミノ酸のカルボキシル末端側に、任意の種類の１個又は２個のアミノ酸を介してリシン（Ｋ）が結合している場合、とりわけ有力な細胞死誘導ペプチドである可能性が高い。
【００４６】
本発明の細胞死誘導ペプチドは、例えば固相合成法や液相合成法等の公知の各種ペプチド合成法によって製造することができる。当該ペプチドの一部を構成し得るペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することで目的のペプチドを製造できる。ペプチドの合成には公知の任意の自動合成機を使用しても良い。
【００４７】
具体的には、例えばFmoc法を使用して、樹脂に固定したアミノ酸誘導体に１個ずつアミノ酸をカルボキシル末から結合させていく固相合成で合成することができる。Fmoc法では、塩基（例えばピペリジン）で除去できるFmoc基によってα−アミノ基が保護されているペプチド誘導体を使用する。この保護基を除いた後、N,N ‐ジメチルホルムアミド（DMF ）等で洗浄して乾燥させ、次の縮合剤（例えば HOBt ）でカルボキシル基を活性化させたアミノ酸誘導体（たとえば、HOBtとのエステル）を縮合させる。次いで、DMF 等で洗浄後、次のサイクルのための脱保護を行う。上記サイクルを繰り返して所望の配列の合成ペプチドを得ることができる。
【００４８】
こうして得られたペプチドは、リンカーによって末端の位置で樹脂に結合している。又、ペプチドの側鎖には保護基が付いている。次に、この樹脂との結合を切断することによって遊離のペプチドが得ることができる。例えば、還元条件下でトリフルオロ酢酸処理をし、側鎖保護基の脱保護および樹脂からの切断を行えば良い。脱保護及び切断処理後のペプチドは、ジエチルエーテル等で数回洗浄することによって遊離した保護基を除去することができる。又、メンブレンに固定化されたペプチドを得るためには、以下の実施例に記載したようにペプチドを合成し、切断処理を行わずに使用すればよい。
【００４９】
本発明の細胞死誘導ペプチドは、これをコードするDNA を導入した形質転換体の培養によっても製造できる。例えば、本発明のペプチドをコードするDNA を適切な発現ベクター内のプロモーターの制御下に組み込み、該ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることにより、本発明のペプチドを発現させることができる。このように発現されたペプチドを精製し単離して使用すれば良い。ペプチドの精製には、公知の分離・精製法を適切に組合わせて採用できる。分離・精製法として、塩析、溶媒沈殿、透析、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動を例示できる。
【００５０】
得られた細胞死誘導ペプチドは、細胞死誘導活性が損なわれない限り、透析、凍結乾燥を行い、乾燥粉末とすることもできる。又、本発明の細胞死誘導ペプチドはＣ末端が固定化されていても細胞死誘導活性を有し、従って官能基を有する様々な化合物に結合（修飾）することができ、又、担体に固定化されていてもよい。担体としては、例えば、脂質を利用したリポソーム、糖質デンドリマーを利用した多価ペプチドポリエチレングリコール、無機質のベース材への固定化が挙げられる。
【００５１】
又、本発明の細胞死誘導ペプチドはＣ末端（カルボキシル基）又はＮ末端（アミノ基）が固定化されていても細胞死誘導活性を有するので、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合させることによって、ＰＥＧハイブリット体とすることもできる。この方法については、下記の非特許文献６を参照されたい。
【００５２】
【非特許文献６】Gene Ther. 2000; 7(11): 1183-92Protective copolymers for nonviral gene vectors: synthesis, vectorcharacterization and application in gene delivery. Finsinger D et al.  放射状に分岐したリシンのデンドリマーからなる小型コア分子を基本構造にして、その上に一連のペプチドを結合させることにより、三次元配座を有する巨大な高分子を作製することができる。このような高分子にデザインすることにより、細胞認識機能が向上する。従って、細胞に（特に、癌細胞に）投与したときの殺細胞効果を増強することができる。
【００５３】
次に、本発明に係る細胞死誘導剤及び抗癌剤について述べる。これらの細胞死誘導剤及び抗癌剤は上記いずれかの細胞死誘導ペプチド（の１種又は２種以上）、及び／又は、上記いずれかのＭＡＰ化細胞死誘導ペプチド（の１種又は２種以上）を有効成分とする。有効成分のみを単独に用いても良く、あるいは薬理学的に許容される担体に固定化又は混合されていても良い。
【００５４】
これらの薬剤は、当業者であれば、当該技術分野において既知の方法を使用して、容易に製剤とすることができる。これらの細胞死誘導剤および抗癌剤は経口的又は非経口的（例えば、局所、直腸、静脈投与等）に安全に投与することができる。
【００５５】
本発明の細胞死誘導剤や抗癌剤は、合成高分子を利用したメンブレン、天然高分子を利用したハイドロゲル、ヒドロキシアパタイトのような無機担体に固定化されたペプチド単独であっても良く、担体に固定化されたペプチドを含む製剤としても良い。近年、ペプチドはそれ自身が自己組織化することでゲルを形成することが知られるため、ペプチドそのものをマテリアルとして利用しても良い。これらの態様の場合、細胞死を誘導したい細胞、組織等に直接適用しても良い。
【００５６】
本発明の細胞死誘導剤及び抗癌剤の製造に用いられても良い薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機高分子あるいは無機担体物質が挙げられ、例えば液状製剤における溶剤、溶解補助剤、及び懸濁化剤、あるいは固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤等が挙げられる。更に必要に応じ、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を含むこともできる。
【００５７】
賦形剤としては、例えば、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。
【００５８】
滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。結合剤としては、例えば結晶セルロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等が挙げられる。
【００５９】
崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
【００６０】
溶剤としては、例えばプロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。
【００６１】
溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン等が例示される。
【００６２】
懸濁化剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
【００６３】
本発明の細胞死誘導剤および抗癌剤において、有効成分（細胞死誘導ペプチド及び／又はＭＡＰ化細胞死誘導ペプチド）は、通常、製剤全体に対して約０．１〜１００重量％、好ましくは約１０〜９９．９重量％、更に好ましくは約２０〜９０重量％程度に配合される。有効成分やその担体以外の成分の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約１０〜９９．９重量％、好ましくは約２０〜９０重量％程度である。
【実施例】
【００６４】
次に、本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲は実施例によって制約されない。
【００６５】
〔実施例の前提〕
ペプチドチップは、非常に高密度で網羅的なチップの作製が可能であり、現在、8000spot/ membraneが可能である。ハイスループットコンビナトリアルケミストリーとして新規生理活性を持つペプチドのスクリーニングに有用であることが期待される。
【００６６】
本実施例では、細胞死誘導活性（特に、抗腫瘍性の機能）を有する新規ペプチドの探索手法としてペプチドチップを使用し、腫瘍細胞に対する細胞死誘導活性のスクリーニングを行った。スクリーニング対象として、アポトーシス誘導因子として知られるＴＲＡＩＬの細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列表の配列番号１におけるアミノ酸番号３９〜２８１の領域）を用いた。
【００６７】
〔実施例１〕
ＴＲＡＩＬの細胞外ドメインの全領域を網羅し、かつアミノ酸を前記のように２残基ずつ順次ズラして、それぞれ８残基のアミノ酸からなるペプチドを、合計１１９種類、前記の Fmoc 法で固相合成した。これらのペプチドには、配列表の配列番号１におけるアミノ酸番号の若い方から順に Peptide number （ペプチド試料としての通し番号）を付与した。即ち、Peptide No. １はアミノ酸番号３９〜４６に相当するアミノ酸配列を持つペプチド、Peptide No. ２はアミノ酸番号４１〜４８に相当するアミノ酸配列を持つペプチド、・・・である。セルロースメンブレンに、固相合成したペプチドのスポットを直径６ｍｍに切り出して、９６穴プレートの底面に入れた。
【００６８】
無血清培地 RPMI （Gibco ）を使用して、Jurkat細胞（ヒトＴリンパ球培養細胞) をその上で培養した。細胞濃度２．０×１０５  cell／ｍＬに調整し、プレート１wellに対し１００μＬ入れた。この細胞を、３７°Ｃ、５％ＣＯ２  の条件下、各チップ上で４８時間培養した。
【００６９】
その後、蛍光試薬により細胞を染色し、Labsystems社製の蛍光プレートリーダー Fluoroskan Ascentを用いて培養後の生細胞及び細胞死の様子を測定した。蛍光試薬には、生細胞数については calcein AM （molecular probes）（測定：励起４８５ｎｍ、蛍光５３８ｎｍ）、細胞死については Cytotoxone （Promega ）（測定：励起５６０ｎｍ、蛍光５９０ｎｍ）を使用した。
【００７０】
ペプチドチップは、ペプチド自動合成機 ASP 222（Intavis 社製）を使用して、β- アラニンでコートしたセルロースメンブレン上に以下のように作成した。即ち、メンブレン上のβ−アラニンのアミノ基に Fmoc アミノ酸溶液（濃度０．２５ｍｏｌ／Ｌ）を１．５μＬスポッティングし、最初のアミノ基のカルボキシル基をメンブレンに結合させる。洗浄操作の後、次のアミノ酸を Fmoc アミノ酸として反応して固定化させる。以下、順次アミノ酸を結合させて、目的の配列を持つペプチドを合成した。合成したペプチドのＣ末端部分はメンブレンと結合した状態で固定されている。
【００７１】
以上の実施例のプロセスに関し、ペプチドチップの作成について説明する図１、及び実施例の方法について説明する図２を、それぞれ参考に提示する。
【００７２】
〔実施例１の結果〕
図３に、ペプチドチップによる増殖阻害活性、即ち細胞死誘導活性の解析結果を示す。図３の横軸は Peptide No.を示す。図３の縦軸は、コントロール（チップ上にペプチドを固定化せずに行った測定例）における蛍光強度の測定値を１とした場合の、各 Peptide No.の比蛍光強度である。実際には各 Peptide No.についてそれぞれ９回の測定を行っており、図３にはそれらの平均値を表記した。又、図３中の上下に挿入した破線は、効果判定の一つの指標として記載したものである。
【００７３】
各 Peptide No.の内、相対的に優れた測定値を示した例に係る Peptide No.とそのアミノ酸配列及び測定の平均値と誤差範囲を図４に棒グラフ形式で列挙し、一方で、特に優れた測定値を示した例に係る Peptide No.とそのアミノ酸配列及び測定の平均値と誤差範囲を図５に数値で示した。
【００７４】
本願発明者は、実際のところ、比蛍光強度が０．８０以下のもの、即ち、当該ペプチドを固定化したチップ上での４８時間の細胞培養による細胞死誘導検定後の生細胞数測定平均値が、コントロールとしてのペプチド非固定化チップ上での同一検定後の生細胞数測定平均値の８０％以下であるペプチドは、細胞死誘導ペプチドとして実用可能であると考えている。
【００７５】
又、実施例１の考察から、第５発明〜第７発明に関して前記したように、以下の３点が合理的に推測された。
【００７６】
１）１個以上のＣを含み、そのＣのカルボキシル末端側に芳香族アミノ酸が結合している、４〜１２個のアミノ酸からなるペプチドが、細胞死誘導ペプチドとして有効に利用できる可能性。
【００７７】
２）上記の１）の細胞死誘導ペプチドにおいて、芳香族アミノ酸のカルボキシル末端側に任意の種類の１個又は２個のアミノ酸を介してＫが結合しているペプチドが、細胞死誘導ペプチドとしてとりわけ有効に利用できる可能性。
【００７８】
〔実施例２〕
実施例１は固定化状態にある細胞死誘導ペプチドについての活性測定であるため、次に、実施例１で効果が確認された幾つかの細胞死誘導ペプチドについて、その可溶化状態における細胞死誘導活性を検定した。
【００７９】
簡単に述べると実施例２は次の要領で行った。Jurkat細胞２．０×１０５  cell／ｍＬを含む RPMI 培地（血清有り）に可溶性ペプチドを２ｍＭの濃度で添加し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２  のインキュベータで４８時間培養した。そして、培養開始から２４時間後及び４８時間後の細胞を前記蛍光色素 calcein AM により染色し、その蛍光強度により、生細胞数を算出した。
【００８０】
実施例２の結果を図６に説明する。図６（ａ）は、ペプチドチップ上で比蛍光強度が低下した配列のものについて行った例であって、アミノ酸配列を表示した３種類の細胞死誘導ペプチドについての測定結果を示す。図６（ａ）の右端部分に表記したように、「no peptide」とはペプチド無添加のコントロールを意味している。又「１ｍＭ，２ｍＭ，０．１ｍＭ」とは、上記の実施例２の実施要領における RPMI 培地中に、可溶性ペプチドを、それぞれ表示した濃度に添加した例を意味している。又、「TRAIL 」とは、図６（ａ）に示す三つの図の下部に表記したアミノ酸配列を有する細胞死誘導ペプチドの添加例を示し、その添加濃度は２ｍＭ，１ｍＭ，０．１ｍＭである。更に、図６（ａ）に示す三つの図について、横軸は培養開始後の経過時間を、縦軸は生存している（増殖した）細胞数のカウント結果である。
【００８１】
次に、図６（ｂ）は、細胞死の見られなかったペプチド（ＲＥＲＧＰＱＲＶ）について行った例であって、図の見方は図６（ａ）と同様であるが、図６（ｂ）の「TRAIL 」は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドである。
【００８２】
図６（ａ）から、本発明の細胞死誘導ペプチドは可溶化状態においても濃度依存的に細胞死誘導活性を示すことが分かる。
【００８３】
〔実施例３〕
図７に示す４種類のペプチドを用い、Jurkat細胞１．０×１０５  cell／ｍＬを含む RPMI 培地（血清有り）に可溶性ペプチドを２ｍＭの濃度で添加し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２  の条件下で２４時間培養した後に、前記 Cytotoxone を添加し、１０分間インベートした。次に反応停止液を加えて１０秒間攪拌してから５６０ｎｍの励起で５９０ｎｍの蛍光を測定し、死細胞の放出するＬＤＨを測定した。なお「No peptide」とは、上記において Jurkat の培地にペプチドを添加しなかった例である。
【００８４】
図７の結果から、ペプチドによって細胞増殖が抑制されているのではなく、積極的に細胞死が誘導されていることが分かる。
【００８５】
〔実施例４〕
図８（ｂ）に示すＭＡＰ化細胞死誘導ペプチド（Lys 残基の側鎖によって枝別れをしたＭＡＰ）を合成した。ＭＡＰに用いられた４単位の細胞死誘導ペプチドのアミノ酸配列も、図８（ｂ）に示されている。一方、これと同じ細胞死誘導ペプチドを直鎖状に多量体化したものも合成した。
【００８６】
これらを用いて前記の実施例２と同様の検定を行い、図８（ａ）に示す結果を得た。図８（ａ）の見方は図６の場合と同様である。又、図８（ａ）において、「MAP(0.5mM)」とあるのは上記の枝別れをしたＭＡＰを０．５ｍＭ添加した例を意味する。「linear」は上記の直鎖状に多量体化したペプチドを意味する。又、「TRAIL 」は、１００ｎｇ／ｍＬ濃度に添加した結果を示す。
【００８７】
図８から分かるように、「TRAIL 」と「MAP(0.5mM)」がほぼ同等の強い細胞死誘導活性を示している。そして両者のモル濃度を考慮した場合、分枝状のＭＡＰが、直鎖状の細胞死誘導ペプチドに比較して、実質的に細胞死誘導活性が大きく増強されていることが分かる。
【００８８】
〔実施例全体の評価〕
上記の各実施例の結果から、本発明の細胞死誘導ペプチド及びＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドは、癌細胞に対する有効な細胞死誘導活性を有することが明らかとなった。従って、癌細胞を殺滅するペプチド医療への応用の可能性があり、又、本研究によって確立したスクリーニング法を用いた更なる有用な細胞死誘導ペプチドの発見が期待される。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本願発明によって、癌細胞に対する有効な細胞死誘導活性を有する細胞死誘導ペプチド及びＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドと、これらを有効成分とする細胞死誘導剤及び抗癌剤が提供される。
〔配列表〕
ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＩＳＴＩＮＧ
<110> National University Corporation Nagoya University
<120> 細胞死誘導ペプチド、ＭＡＰ化細胞死誘導ペプチド、細胞死誘導剤及び抗癌剤
<130> POK-05-028
<160> 17
<210> 1
<211> 281
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 1
Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys   16
Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala   32
Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys   48
Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr   64
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val   80
Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser   96
Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro  112
Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly  128
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu  144
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly  160
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile  176
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe  192
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln  208
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys  224
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr  240
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile  256
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala  272
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly                              281
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 2
Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys                                    8
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 3
Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu                                    8
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 4
Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu                                    8
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 5
Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp                                    8
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 6
Lys Glu Asp Asp Ser Tyr Trp Asp                                    8
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 7
Ser Pro Cys Trp Gln Val Lys Trp                                    8
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 8
Cys Trp Gln Val Lys Trp Gln Leu                                    8
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 9
Gln Val Lys Trp Gln Leu Arg Gln                                    8
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 10
Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val                                    8
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 11
Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile                                    8
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 12
Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu                                    8
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 13
Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys                                    8
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 14
Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met                                    8
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 15
Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln                                    8
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 16
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser                                    8
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 17
Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp                                    8
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】実施例１におけるペプチドチップの作成を説明する図である。
【００９１】
【図２】実施例１におけるプロセス方法を説明する図である。
【００９２】
【図３】実施例１における細胞死誘導活性の解析結果を示す図である。
【００９３】
【図４】実施例１におけるペプチドの細胞死誘導活性測定値を棒グラフ形式で示す図である。
【００９４】
【図５】実施例１における特に優れた効果を示すペプチドを列挙する図である。
【００９５】
【図６】実施例２における可溶化状態のペプチドの細胞死誘導活性を示す図である。
【００９６】
【図７】実施例３における細胞死誘導の証拠を示す図である。
【００９７】
【図８】実施例４におけるＭＡＰ化細胞死誘導ペプチドの効果を示す図である。
【図１】
2007223958.tif 000003
【図２】
2007223958.tif 000004
【図３】
2007223958.tif 000005
【図４】
2007223958.tif 000006
【図５】
2007223958.tif 000007
【図６】
2007223958.tif 000008
【図７】
2007223958.tif 000009
【図８】
2007223958.tif 000010