(57)【要約】【課題】  血管平滑筋細胞の正常な機能を維持しながら培養する方法、そのための培養器材および再生医療用材料を提供する。【解決手段】  血管平滑筋細胞がエラスチンを細胞外基質として認識して生育することを利用する。本発明は、エラスチン上で血管平滑筋細胞を培養する方法、細胞が生育する表面にエラスチンが固定されている培養器材、細胞が生育する表面がエラスチン成形体で構成されている培養器材、およびこれらの培養器材を用いて血管平滑筋細胞を培養して得られる医療用材料である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エラスチン上で血管平滑筋細胞を培養することを特徴とする血管平滑筋細胞の培養方法。
【請求項２】
血管平滑筋細胞がエラスチンに接着するまで、エラスチンを伸張および収縮させない静的状態で血管平滑筋細胞を培養し、次いでエラスチンを伸張および収縮させる動的状態で血管平滑筋細胞を培養する請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
エラスチン上で血管平滑筋細胞と他の血管系細胞の混合物を培養することを特徴とする血管平滑筋細胞を選択的に増殖させる血管平滑筋細胞の培養方法。
【請求項４】
細胞が生育する面上にエラスチンが固定されている血管平滑筋細胞の培養器材。
【請求項５】
エラスチンが非伸縮性の材料表面に固定されている請求項４に記載の血管平滑筋細胞の培養器材。
【請求項６】
エラスチンが伸縮性の材料表面に固定されている請求項４に記載の血管平滑筋細胞の培養器材。
【請求項７】
伸縮性の材料がシリコンゴムシートである請求項６に記載の血管平滑筋細胞の培養器材。
【請求項８】
細胞が生育する面が架橋エラスチン成形体で構成されている血管平滑筋細胞の培養器材。
【請求項９】
細胞が生育する面の可視光または紫外光の透過率が５０〜１００％である請求項４〜８のいずれか１項に記載の血管平滑筋細胞の細胞培養器材。
【請求項１０】
細胞が生育する面上にエラスチンが固定されている血管平滑筋細胞の培養器材を用いて血管平滑筋細胞を培養して得られる医療用材料。
【請求項１１】
水溶性エラスチンを架橋した架橋エラスチンの成形体上で血管平滑筋細胞を培養して得られる医療用材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管平滑筋細胞の培養方法、そのための培養器材および培養によって得られる医療用材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、外傷や動脈硬化症などの血管疾患の外科治療として行われる代用血管置換術のうち、直径５mm以下の小口径血管に対しては、人工血管は実用化されるに至っていない。その理由は、人工材料の生体不適合性による代用血管内膜の肥厚や血栓形成等による閉塞を防ぐことができないからである。心臓冠状動脈や膝下末梢動脈などの弾性動脈のバイパス術あるいは血管置換術は、現行では主に自家静脈移植が行われている。しかし、血管置換術を必要とする総患者数の２〜３割は、適合する血管を持たず、自家静脈移植ができない状態にある。
【０００３】
近年、小口径に加工した合成繊維（ダクロン・ポリウレタン・延伸ポリテトラフルオロエチレン）からなる人工血管の内腔面、または生体吸収性の合成高分子（例えばポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリεカプロラクタム等）で作製した管状構造物の内腔面に、細胞接着性を付与するためにコラーゲンなどの細胞外基質をコーティングし、その細胞外基質上で内皮細胞を培養することが試みられている。しかしながら、内皮細胞が細胞外基質に安定的に固定されない、または人工血管が内膜肥厚する等の原因で小口径人工血管は実用化されるには至っていない。
【０００４】
血管内膜肥厚は、血管壁の障害に伴い血管内膜近傍に存在する平滑筋細胞が通常の収縮型から合成型へとフェノタイプ変換を引き起こし、増殖亢進および器質化促進を誘導し、病変を伸展させる。この血管平滑筋の基礎的な研究のため、血管平滑筋細胞の培養方法として多くの試みがなされてきた。例えば、ラミニンコーティングを有する培養皿にインスリン様増殖因子−Ｉを含む培養液で培養する方法（例えば特許文献１）や、平滑筋細胞の配向性も考慮した方法としてはフィブロネクチンコーティングしたガラス上に平滑筋細胞を接着させ、せん断流応力を適用させ培養する方法（例えば特許文献２）などである。
【０００５】
発明者らは、水溶性エラスチンを水溶性架橋剤で架橋したエラスチン架橋体を開発し、再生医療用の生体材料としての応用を可能とした（特許文献３）。それには、エラスチン架橋体を再生医療用培養基材として利用し、その膜表面、チューブ内に胚性幹（ＥＳ）細胞、体性幹細胞、間葉系幹細胞などを培養することで、希望する形態の臓器を形成させることが記載されている。また、エラスチン架橋体で作製したエラスチン膜を用いて神経細胞芽腫細胞の培養が行われているが、エラスチンと血管平滑筋細胞との特別な親和力に基づく生体材料については開示されていない。
【０００６】
生体内の細胞は、そのほとんどが力学的な付加を担う場所に存在するため、生体内における状況と近い状況で生育させるための細胞培養として、細胞が生育する面を伸張および収縮させながら培養する動的培養法も知られている（非特許文献１）。
【特許文献１】特開２００２−３３５９５５
【特許文献２】特表２００２−５３１１１８
【特許文献３】ＷＯ  ０２／０９６９７８
【非特許文献１】K. Naruse, T. Yamada, M. Sokabe, Am. J. Physiol. 274: H1532-1538 (1998) Involvement of SA channels in orienting response of cultured endothelial cells to cyclic stretch
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
血管平滑筋細胞に起因する血管内膜肥厚のメカニズム解明、薬剤に対する血管平滑筋細胞の反応の観察等の基礎的研究、代用血管の開発のための血管平滑筋細胞の培養方法および培養器具に対する要望は高い。本発明の課題は、たとえば、血管平滑筋細胞を容易に増殖させる培養方法、特には血管平滑筋細胞の正常型（分化型）を維持しながら血管平滑筋細胞を培養する方法およびそのための器材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、血管平滑筋細胞がエラスチンを足場として生育するという知見を応用するものである。したがって、本発明は、エラスチン上で血管平滑筋細胞を培養することを特徴とする血管平滑筋細胞の培養方法に関する。血管平滑筋細胞は、生体中においては、力学的ストレス下に置かれている。したがって、生体中の血管平滑筋細胞に近い性質の細胞を得るためには、生体条件に近い動的状態で培養することが望ましい。しかし、血管平滑筋細胞を生育させるには、最初に細胞を生育面に接着するまでは静的条件で生育する必要がある。したがって、この培養方法の好ましい態様においては、血管平滑筋細胞がエラスチンに接着するまで、エラスチンを伸張および収縮させない静的状態で血管平滑筋細胞を培養し、次いでエラスチンを伸張および収縮させる動的状態で血管平滑筋細胞を培養する。      
【０００９】
本発明は、また、血管平滑筋細胞が他の血管系細胞と比べてエラスチン上で特異的に生育するという知見を利用する。したがって、本発明は、エラスチン上で血管平滑筋細胞と他の血管系細胞の混合物を培養することを特徴とする血管平滑筋細胞を選択的に増殖させる血管平滑筋細胞の培養方法に関する。
【００１０】
本発明は、更に、細胞が生育する面上にエラスチンが固定されている血管平滑筋細胞の培養器材に関する。一つの態様は、エラスチンが非伸縮性の材料表面に固定されている血管平滑筋細胞の培養器材である。他の態様は、エラスチンが伸縮性の材料表面に固定されている血管平滑筋細胞の培養器材である。好ましくは、エラスチンがシリコンゴムシート上に固定されている血管平滑筋細胞の培養器材である。これらの培養器材は、顕微鏡観察下に置かれることが多いので、細胞が生育する面の可視光または紫外光の透過率は５０〜１００％であることが望ましい。
【００１１】
本発明は、更に、細胞が生育する面を架橋エラスチン成形体で構成した血管平滑筋細胞の培養器材に関する。この培養器材の細胞が生育する面の可視光または紫外光の透過率は、好ましくは５０〜１００％である。
【００１２】
本発明は、更に、細胞が生育する面上にエラスチンが固定されている血管平滑筋細胞の培養器材を用いて血管平滑筋細胞を培養して得られる医療用材料、および水溶性エラスチンを架橋した架橋エラスチンの成形体上で血管平滑筋細胞を培養して得られる医療用材料に関する。
【発明の効果】
【００１３】
エラスチン上で血管平滑筋細胞を培養することにより、特に、その培養に細胞を生育させる面にエラスチンを固定した培養器材を用いることにより、血管平滑筋細胞の選択的な細胞培養、血管平滑筋細胞の正常型（分化型）を維持した状態での細胞培養などを可能にする。更には、エラスチンが固定されている培養器材または架橋エラスチンの成形体上で血管平滑筋細胞を培養することにより、医療用材料を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
動脈血管壁は内膜、中膜、外膜の三層構造から構成され、平滑筋細胞が主成分を占める筋肉組織構造である。血液と直接接する内膜は内皮細胞の単層扁平上皮とその直下に基底膜、疎性結合組織と少数の縦走平滑筋細胞からなる内皮下層が存在する。内皮細胞層は血管の内腔を被っていて、細胞の長軸と血流方向が平行になるような配向をしている。中膜は血管壁で最も厚い層で、構成する同心円状の細胞層は、拍動方向に対して平行に配向している平滑筋細胞からなる。平滑筋細胞は血圧を維持し血流の分布をコントロールする重要な働きをしている。平滑筋の層の間にはエラスチン繊維、III型コラーゲン、プロテオグリカンが存在し、動脈壁中の豊富なエラスチンにより動脈が心臓の収縮に伴って収縮する性質が付加されている。この内膜と中膜の間には内弾性板と呼ばれる有窓状のエラスチン均質層からなる構造体が存在する。外膜は主に線維芽細胞、コラーゲン線維、縦走する弾性線維で構成され、中膜と外膜の間にも外弾性板と呼ばれる有窓状のエラスチン均質層からなる構造体が存在する。
【００１５】
以上のように血管平滑筋はエラスチン層と密接な関係にあり、血管平滑筋細胞をエラスチン層を有する培養器材で培養する時、エラスチンは血管平滑筋細胞の足場環境として働く。また、エラスチンは生体において血管平滑筋細胞をとりまく組織を形成するものであるため、血管平滑筋細胞が血管壁中膜構造中においてはエラスチンに接着し、かつエラスチンマトリックス内に存在し、力学刺激を受けながら生体では存在している点が、平滑筋細胞の正常型を支配している要因であると推測される。したがって、血管平滑筋細胞をエラスチン上で培養する場合には生体組織と近い条件で行うことができるので、正常型（分化型）を維持するのに好適である。
【００１６】
本発明の第一の主題は、エラスチン上で血管平滑筋細胞を培養することを特徴とする血管平滑筋細胞の培養方法に関する。
【００１７】
その一つの態様は、細胞が生育する面にエラスチンを固定した培養器材で血管平滑筋細胞を培養するものである。他の態様は、細胞が生育する面として架橋エラスチンの成形体を用いるものである。
【００１８】
本発明には、水溶性エラスチン、水不溶性エラスチン、水溶性エラスチンを架橋剤で架橋した架橋エラスチンなど、何れのエラスチンであっても用いることができる。本発明においては、使いやすさの面から水溶性エラスチン、架橋エラスチンが好ましい。
【００１９】
細胞培養法には、動的培養方法と静的培養法がある。動的培養法とは、細胞が生育する表面を伸張および収縮させながら培養するものである。したがって、本発明における動的培養は、細胞が生育する面すなわち培養液を載置する面にエラスチンを固定し、その面を伸張および収縮を繰り返しながら培養する方法である。生体内では殆どの細胞が力学的負荷を担う場所に存在し、その力学的環境変化にさらされながら機能している。血管の場合には、血管壁を構成している内皮細胞にせん断流応力が生じ、血流が接触しない血管平滑筋細胞や線維芽細胞には、周期的な引っ張り負荷が関与する。血管平滑筋細胞の生体内における状況に近い状態で培養を行うのが動的培養法である。血管平滑筋細胞が力学的ストレス下に置かれる動的培養法は、脱分化の有無や細胞の配向性の現象を観察するために有効である。
【００２０】
静的培養法とは、細胞が生育する面を静的な状態、すなわち伸張および収縮させない状態で行う通常の培養方法である。これは、生体内環境とは異なる条件の培養法であるが、血管平滑筋細胞の基礎的な性質を調べる方法として依然として有用である。しかし、通常の静的培養を行うと、血管平滑筋細胞は合成型に脱分化し、増殖亢進することが知られている。この状態の細胞は生体内における正常型とは言い難い状況にあるため、薬剤のスクリーニングや組織再生用の細胞培養モデルとして利用すると、誤った結論を誘導する危険性が伴うことに注意が必要である。
【００２１】
血管平滑筋細胞を培養する場合、細胞は培養器材の底面に接着してから増殖していく。動的培養を行う場合であっても、血管平滑筋細胞が培養器材の底面に接着する迄は、静的培養を行う必要がある。したがって、本発明の有利な血管平滑筋細胞の培養方法は、血管平滑筋細胞がエラスチンに接着するまで静的状態で培養し、次いでエラスチンが固定された細胞が生育する面を伸張および収縮させる動的状態で培養する方法である。
【００２２】
静的培養および動的培養の培養温度、炭酸ガス濃度は通常の条件であり、温度は約３７℃、炭酸ガス濃度は５％程度が望ましい。動的培養における伸張と収縮の頻度は０.５Hzすなわち、２秒で１往復するのが標準であるが、頻度を高くしたり低くしてもよい。伸張と収縮は一方向に行う一軸伸展も二方向に行う二軸伸展も可能である。伸張および収縮の程度は、細胞が生育する面の長さの５〜５０％程度であるが、研究の必要上いかようにも変更が可能である。伸張および収縮の程度は、その頻度と関連して決定される。      
【００２３】
本発明の第二の主題は、エラスチン上で血管平滑筋細胞と他の血管系細胞（血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、線維芽細胞、血球細胞、マクロファージなど）の混合物を培養することを特徴とする、血管平滑筋細胞を選択的に培養する方法である。エラスチンを表面物質として使用した場合には、コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンなどの多くの主要な細胞外基質とは異なり、血管平滑筋細胞が特異的に生育するという特徴がある。血管系細胞の中で、エラスチンを認識しているのは平滑筋細胞のみと考えられる。一方コラーゲンには全ての種類の細胞が接着・伸展し、特異性がない。この性質を利用してエラスチン上で血管平滑筋細胞と他の血管系細胞の混合物を培養して、血管平滑筋細胞のみを生育させることができる。こうした現象は、血管平滑筋細胞表面に存在するエラスチン認識レセプターがその生育に重要な役割を果たしていると考えられる。
【００２４】
本発明の第三の主題は、上記の培養法に使用する血管平滑筋細胞の培養器材を提供することである。本発明における培養器材の特徴は、血管平滑筋細胞が生育する面（培養液を載置する面）にエラスチンを用いることである。細胞が生育する面に固定されたエラスチンは、血管平滑筋細胞活動のシグナル伝達において、細胞外基質認識性に関与する細胞表面レセプターとして働き、血管平滑筋細胞の生育に極めて好適な環境を与える。
【００２５】
培養器材の細胞が生育する面の材料としては、プラスチックやシリコンゴムシートにエラスチンを固定したものおよび水溶性エラスチンを架橋して製造されるエラスチン成形体を使用することができる。
【００２６】
静的培養のみを行う場合には、例えばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル等の非伸縮性のプラスチックを用いることが出来る。動的培養を行う場合には、多数回の伸張と収縮に耐える材料であればいかなる材料でも利用でき、例えば、シリコンゴム、天然ゴム、アクリルゴム、ポリウレタンゴム等を挙げることができる。水溶性エラスチンを架橋して製造されるエラスチン成形体は、伸縮性があるので、動的培養に使用できる。なお、動的培養に使用できるものは、静的培養にも使用できるのは当然である。
【００２７】
顕微鏡による観察下に行う血管平滑筋細胞の基礎的な研究のためには、細胞が生育する面の材料は透明であることが望ましい。細胞が生育する面の可視光または紫外光の透過率が５０〜１００％のものが特に好ましい。しかし、材料の透明性が必要でない場合もあり、その場合には透明性を無視して材料を選択することができる。
【００２８】
本発明において用いられる水溶性エラスチンは、エラスチンを加水分解して得られるものであり、具体的には、動物の頚靭帯などを熱シュウ酸処理して得られるα−エラスチン若しくはβ−エラスチン、エラスチンをアルカリエタノール処理して得られるκ−エラスチン、エラスターゼにより酵素処理した水溶性エラスチンおよびエラスチン生合成経路における前駆体であるトロポエラスチンなどの少なくとも１種以上のエラスチンを使用することができる。水不溶性エラスチンは市販されており、これを熱シュウ酸処理して水溶性エラスチンとすることもできる。
【００２９】
エラスチンを培養器材に固定するには、細胞が生育する面、すなわち培養液を載置する面を化学的にまたは物理的に活性化し、そこに水溶性エラスチン溶液を載置し、活性化された面と水溶性エラスチンを一定時間反応させた後、過剰のエラスチン溶液を捨て、乾燥させることによって得ることができる。
【００３０】
固定化反応には、一般的に報告されている化学反応（水素結合、イオン結合、共有結合）またはラジカルを利用した結合反応が利用できる。
【００３１】
培養器材の表面を活性化する方法としては、一般に反応性の高い官能基（アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基など）またはラジカルを発生させる方法であればどんな方法でも利用できる。例えば、不活性表面に対し、クロム酸、硫酸、次亜塩素酸などの薬品によるカルボニル化あるいはカルボキシル基の導入処理、または官能基を有するシランカップリング剤をコーティングすることで、培養基材の表面を活性化することが出来る。シランカップリング剤の実例としては、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルメチルジメトキシシラン等が挙げられる。またポリマー被覆による方法、例えば特開２００３−１８９８４３に記載のアジド基を導入したポリアクリル酸等で不活性表面を被覆して活性基を導入する方法でもよい。この場合は、固定化するエラスチンを予めアジド化しておくことで光反応による固定化が可能になる。また宮本等によるInt. Biol. Macromol., 30, 75-80(2002)記載の、アンモニアプラズマによる官能基（主にアミン）導入による表面活性化方法も固定化には有効である。なかでも不活性表面をコロナ放電処理による活性化を行った直後に、水溶性エラスチンを反応させたものが好ましい。コロナ放電処理は、ガラス基盤上に不活性表面を有する材料を置き、コロナ炎吹き出し部の先端を約５〜１０mm程度近づけ、約１０〜４０秒程度の間コロナ炎を素材表面に放電出力（約９kV）する。コロナ放電により一旦活性化された表面に、水溶性エラスチンを固定化させた箇所以外の活性化部位では、数時間以内に活性ラジカルが消失し、元の不活性表面になる。したがって、細胞を成育させる際の培養液中に存在する他の物質の固定化を抑え、エラスチン固定化表面の効果を持続させることが容易である。
【００３２】
水溶性エラスチンは、上記のように表面処理された材料と反応して固定されるため、その後の培養液と接触してもそれが培養液中に溶出することはない。
【００３３】
本発明の他の好ましい培養器材は、細胞が生育する面（底面）に水溶性エラスチンを架橋した架橋エラスチンの成形体を用いた血管平滑筋細胞の培養器材である。水溶性エラスチンを架橋剤で架橋したエラスチン架橋体は、ＷＯ ０２／０９６９７８に記載の方法で製造できる。この方法で製造した架橋エラスチン成形体は、収縮性のある多孔性（スポンジ状）のものである。また、このエラスチン架橋体は、透明な薄板状に成形することが出来る。したがって、これを細胞が生育する面に使用した培養器材は、血管平滑筋細胞を静的培養および動的培養するのに好適である。エラスチン濃度を重量比率で５０％以上になるようにして作製することで、水溶性エラスチンの特徴的な性質であるコアセルべーション現象を阻害することが可能になり、その結果、光透過性の高いゲルシートが作製できる。このエラスチン成形体は多孔性であるため、血管平滑筋細胞の３次元培養条件下で顕微鏡観察を可能とする。
【００３４】
好適な水溶性エラスチンの架橋剤は、下記の一般式で表される。
【化１】
2007312663.tif 000002
式中、
Ｒ1、Ｒ3は下記の構造式で表される＜Ａ＞または＜Ｂ＞の何れかであり、Ｒ1とＲ3とは同じであっても異なっていてもよく、
【化２】
2007312663.tif 000003
（Ｒ4、Ｒ5はＨ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5のいずれかであり、Ｒ4とＲ5とは同じであっても異なっていてもよい）
【化３】
2007312663.tif 000004
（Ｒ2は下記の構造式で表される＜Ｃ＞または＜Ｄ＞の何れかで表される化合物であり）
【化４】
2007312663.tif 000005
（ｎは１〜２０までの整数である）
【化５】
2007312663.tif 000006
（ｍ、ｌは０〜１５までの整数であり、Ｘ、Ｙは、ＣＨ2またはＯの何れかであり、ＸとＹとは同じであっても異なっていてもよく、ＺはＣまたはＮの何れかであり、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2Ｈ5の何れかであり、それぞれ同じであっても異なっていても良い）。
【００３５】
動的培養のための装置は、培養液を入れた培養器材全体を伸張および収縮させることが出来る伸縮性材料で構成する。その際、細胞が生育する面にエラスチンを固着させた伸縮性の素材、または架橋エラスチンで構成した伸縮性のエラスチン成形体が用いられる。その形状は如何なるものであってもよい。伸張および収縮を一軸方向に加える場合には、四角形のものが便利である。伸張および伸縮の方向を不均一にするため、六角形の形状などにすることも可能である。四角形の培養器材を作製するには、肉厚の天然ゴム、シリコンゴムシートのような多数回の伸張と収縮に耐える比較的肉厚の材料で四角な箱の外枠を形成する。一つの態様においては、薄いシリコンゴムシートをその外枠に接着剤で張り合わせ、その後、細胞が生育する面をコロナ放電等で活性化し、エラスチンを固定する。他の態様は、その外枠に架橋エラスチンシートを底面として貼り合わせる。培養器全体を伸張および収縮させるためには、その向かい合う外枠部分に引っ張り器具を装てんする。
【００３６】
動的培養のための装置は、両端を絞った円筒形のものであっても良い。絞った両端部に開孔を設け、その開口部付近に伸張力および収縮力を加える器具を装着し、開口部から培養液を加え、回転させながら培養することにより、円筒形内部にのみ血管平滑筋細胞を生育させることができる。円筒形のシリコンゴムを用いる場合には、その内面のみを表面処理し、そこにエラスチンを固定する。架橋エラスチンで円筒を作製し、その内面に血管平滑筋細胞を生育させることもできる。
【００３７】
細胞が生育する面を伸張および収縮させる動的培養装置としては、市販の装置、例えばストレックス社製を利用することができる。また、リニアアクチゥエーターとリニアスライダを用いた装置を組み立てることも可能である。
【００３８】
本発明の第四の主題は、エラスチン上に血管平滑筋細胞を培養して得られる医療用材料である。その一つの態様は、細胞が生育する面上にエラスチンが固定されている培養器材を用いて血管平滑筋細胞を培養させて得られるものである。例えばシリコンゴム製の細管の内面のみを化学的な方法で活性化し、それにエラスチンを固定させ、それを培養液中で伸張と収縮を繰り返しながら回転させれば、その内面のみが血管平滑筋細胞で覆われるので、代用血管として利用することができる。
【００３９】
他の態様は、水溶性エラスチンを架橋した架橋エラスチンの成形体上で血管平滑筋細胞を培養して得られる医療用材料である。水溶性エラスチンを架橋したエラスチンゲルでシートを作り、これを例えば天然ゴム、シリコンゴムで作製した四角な箱の外枠の底面に貼り付けて、全体を箱型の培養器材を構成する。血管平滑筋細胞を培養した後、血管平滑筋細胞が成長した部分を切り取れば、それはそのまま生体に埋め込むための材料として応用できる。成形された架橋エラスチンを使用する他の例としては、架橋エラスチンで小口径動脈と同程度の管を作り、その内面に血管平滑筋を均一に培養し成長させれば、小口径動脈の代替品となる組織工学用移植片を製造することが可能となる。エラスチン上に血管平滑筋細胞を培養し成長させたものの医用材料としての用途は広い範囲のものが想定される。本発明の架橋エラスチンを用いる血管平滑筋細胞の培養方法により得られた材料を用いて行いることにより、血管置換術の困難な患者に対する治療をも可能にする。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例をもって本発明を詳細に説明するが、以下よって示される方法は、作用確認において用いたものであり、これに限定されるものではなく、その要旨を変更することなく様々に改変して実施することができる。
［製造例１]
（水溶性エラスチンの作製）
ブタ大動脈血管から脂肪を除去し水洗した後、５〜１０重量％塩化ナトリウム水溶液に浸し２４時間冷蔵庫内で静置し、コラーゲンを溶解除去した。水洗後水を加え圧力鍋で１時間煮沸後、血管付着物を除去し、ミキサーに入れ組織片が１〜５mm片になるまで破砕した。その後、再度圧力鍋で１時間加熱し水洗した。メッシュ状袋に移し電動洗浄機で洗浄した後、エタノールを最終濃度５０容量％になるように加え３０分間静置した。その後エタノールを最終濃度７０容量％になるように加え９０分間静置した。更にエタノールを最終濃度９０容量％になるように加えた後１０時間静置した。最終的にエタノールを取り除き、デシケーターにて減圧乾燥し不溶性エラスチン（血管２kgより乾燥重量で約３３０ｇの収量）を得た。  この不溶性エラスチン１０ｇに対し０.２５Ｍシュウ酸を４５mL加え１００℃で１時間加熱した。氷水で冷やし遠心分離し、上澄み液を集め、分子量１０,０００〜１４,０００の透析チューブで脱イオン水に対し、外液のｐＨが５〜６程度になるまで透析を行ってシュウ酸を除去した。上澄み液をガラスフィルターで吸引ろ過し、ろ液を凍結乾燥して水溶性エラスチン（約３ｇ）を得た。
【００４１】
［製造例２]
（架橋剤の製造）
水溶性エラスチンを用いてエラスチン構造体を作製するための化学架橋剤を、公開ＷＯ ０２／０９６９７８に記載されている方法に従って作製した。この方法は、ドデカンジカルボン酸のカルボキシル基を４−ヒドロキキシフェニルジメチル−スルホニウムメチルサルフェート（以下ＤＳＰ）により活性エステル化させるものである。具体的には１モルのドデカンジカルボン酸と２モルのＤＳＰおよび２モルのジシクロヘキシルカルボジイミド（以下ＤＣＣＤ）をアセトニトリルに溶解し２５℃で５時間撹拌し反応させる。反応過程で生じたジシクロヘキシル尿素をガラスフィルターで除去した。更に反応溶液（ろ液）をエーテルに滴下して固化させた。該固形物を減圧乾燥して目的の架橋剤を得た。化学構造および純度は1Ｈ−ＮＭＲにより確認した。
【００４２】
［試験例１]
（水溶性エラスチンおよび架橋剤の細胞障害試験）
水溶性エラスチンおよび架橋剤の血管平滑筋細胞に対する障害試験として、生細胞が３−(４,５−ジメチル−２−チアゾリル)−２,５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（以下ＭＴＴ）をホルマザン産物に転換する原理を利用するＭＴＴ法を用いた。ＭＴＴなどのテトラゾリウム塩はミトコンドリアの酸化的リン酸化反応であるＴＣＡ回路の脱水素酵素の基質になるので、サンプル物質の細胞活性障害を測定することができる。測定にはCell Proliferation Kit I (Roche社製)を用いた。
具体的測定方法としては、９６well細胞培養プレートに対し１０容量％ウシ胎児血清を含むＣＳＣ培地（血管平滑筋細胞用培地：大日本製薬社製）を１００μL／well添加してプレインキュベートし、平滑筋細胞懸濁液(細胞密度１.５×１０5cells／mL)を１０μL／well播種し、３７℃、５容量％ＣＯ2インキュベーター内で培養した。サブコンフルエントとなった後、培地を吸引し、０.１容量％ウシ胎児血清を含むＣＳＣ培地１００μLを添加し、更に細胞増殖が停止するまでインキュベーター内で２４時間培養した。ＰＢＳで洗浄後、製造例１で製造した水溶性エラスチンの水溶液（濃度０.１〜５重量％）、製造例２で製造したＤＳＰ活性化ドデカンジカルボン酸架橋剤（５０〜５００μM）および製造例２で使用したＤＳＰ（０.０５〜２０mM）をそれぞれ１００μL／well添加し、インキュベーター内で２４時間培養した。その後、サンプル溶液を吸引、ＰＢＳで洗浄後、１０容量％ウシ胎児血清を含むＣＳＣ培地を１００μL／well添加し、ＭＴＴ液を規定量添加し、インキュベーター内で一晩静置し、マイクロプレートリーダーを用いて、測定波長５５０nmおよび参考波長６５５nmの吸光度を測定した。試料未添加をコントロールとして、測定値と対比した。結果を[図１]、[図２]、および[図３]に示す。水溶性エラスチン、架橋剤および活性エステル基部分(ＤＳＰ)のいずれも測定濃度範囲内では、コントロールとほぼ変化がなく、即ち細胞活性に影響は無く障害性を示さないことがわかった。
【００４３】
［試験例２]
（水溶性エラスチンのコアセルべーション温度の測定）
水溶性エラスチンには、溶液温度の上昇に応じて分子内および分子間における疎水性相互作用が発現し、凝集する感熱現象が観察される。これはコアセルべーションと呼び、水溶性エラスチンの重要な現象の一つとして知られている。コアセルべーション温度は、溶液の濁度を測定することで決定できる。具体的には温度可変装置つきの分光光度計を用いて、特定波長（６４０nm）を試料溶液に照射し入射光強度に対する透過光強度の割合を透過率として算出した。温度を１０〜８０℃まで変化させ透過率を測定し透過率の減少が全体の５０％になる温度をコアセルべーション温度と定義した。エラスチン濃度を０.１〜７０重量％まで変化させてコアセルべーション温度を測定した。結果を[図４]に示した。水溶性エラスチン濃度の上昇とともにコアセルべーション温度も上昇し、６０重量％以上では凝集しないことが確認された。この結果から水溶性エラスチン濃度を６０重量％以上とした場合には、水溶性エラスチンを１００℃以上の温度で架橋し透明な成形体が得られることが判明した。
【００４４】
［実施例１］
（静的細胞培養用のエラスチンでコーティングしたシャーレの作成）
クリーンベンチ内での無菌操作下で以下の操作を行った。浮遊培養用３５φシャーレ（住友ベークライト株式会社、ポリスチレン製）の表面に、コロナ放電装置（コロナフィット：信光電気計装株式会社製）のコロナ炎吹き出し口が、培養用シャーレ表面から１０mmの距離を保った状態で、４５秒間放電（９kV）処理を行い、その後１００μg／mL水溶性エラスチン溶液１mLを８時間載置した。その後エラスチン溶液を捨て、シャーレを室温で約１時間乾燥した。この処理により、コロナ放電で活性化したシャーレ表面にエラスチンが反応して固定され、エラスチンがコーティングされる。同様に対照実験用としてコラーゲンでコーティングしたシャーレを製造した。コーティング状態の評価は、表面の水滴の接触角測定により行った。具体的には、接触角測定器（ＥＲＭＡ社製）の載物台上のスライドガラス上に浮遊培養用３５φシャーレを載せ、脱イオン水をマイクロビュレットで２０μL添加し、数秒静置後に接触角を測定した。５回の接触角の平均値を測定値とした。
コロナ放電により疎水性表面が活性化され、水中のタンパク質が反応することで表面にエラスチン、コラーゲンが固定化される。放電後は大気中では約８時間程度で元の疎水性に戻る（接触角約８０°）ことが観測される。放電直後に水のみを加えた場合（コントロール）は、元の疎水性に戻る際に徐々に水分子の一部が反応して親水化し、８時間程度で表面変化は安定し、接触角で約４２°になる。放電直後にエラスチン水溶液またはコラーゲン水溶液を浸漬させた場合は、８時間後ではそれぞれ２５°、３４°とコントロールより親水性の状態で安定化表面が形成された[図５]。この結果からコロナ放電されてシャーレ表面にエラスチンおよびコラーゲンがコーティングされたことが確認された。
【００４５】
［実施例２］
（エラスチンコーティングしたシリコンシートを用いた動的培養器材の作製）
厚さ１０mmのシリコンゴムシートを加工し、縦３cm×横３cm×高さ１cmの培養皿の箱型の外枠を作製した。その底面に厚さ５０μmのシリコンゴムシートをバスコーク（ＨＪ−１３２ セメダイン株式会社）を用いて接着させ、一日静置することで完全に接着させた。脱イオン水で充分洗浄した後、１２１℃でオートクレーブ処理を３０分間行い滅菌する。実施例１と同じコロナ放電装置により表面処理を４５秒間行い、１００μg／mL水溶性エラスチン溶液およびコラーゲン溶液を１mL加え８時間静置した。同様に対照実験用としてコラーゲンでコーティングしたシャーレを製造した。コーティングの評価は、接触角の測定から行った[図６]。浮遊培養用シャーレと同様にシリコンシートに対しても、接触角の有意な低下が見られるため、エラスチンおよびコラーゲンがコーティングされたことが確認された。
【００４６】
［実施例３］
（エラスチンゲルシートを用いた動的培養器材の作製）
水溶性エラスチン６００mgに対し、製造例２で製造した架橋剤３４０mM水溶液を２４０μL加え、更に脱イオン水を加え最終エラスチン濃度が６５重量％になるように溶液を調整した。両面を撥水処理したガラス板で鋳型を作成し、上記エラスチン溶液をシート状に成型するように流し込み１００℃で３０分間加熱架橋させ、膜厚約１００μmの光透過性エラスチンゲルシートを得た。本条件はコアセルべーションを起こさない状態であるため、得られたエラスチンゲルシートの可視光の透過率が６０〜９０％程度で、光学顕微鏡下での観察が可能である。実施例２で作製したと同じく、厚さ１０mmのシリコンゴムシートで、縦３cm×横３cm×高さ１cmの培養皿の外枠を作製し、上記のエラスチンゲルシートを接着剤で接着した。脱イオン水で充分洗浄した後、１２１℃でオートクレーブ処理を３０分間行い滅菌した。
【００４７】
［実施例４］
（血管系細胞培養接着・伸展試験）
市販の正常ヒト血管平滑筋細胞、正常ヒト線維芽細胞、正常ヒト血管内皮細胞をそれぞれ無血清の専用培地と共に、１.０×１０4（cells／mL）で、実施例１で作製したエラスチンでコーティングしたシャーレおよびコラーゲンでコーティングしたシャーレ上に播種した。５％ＣＯ2培養装置（OLYMPUS MI-IBC）で培養しながら、光学顕微鏡（OLYMPUS IMT-2）でパソコンのＸＣＡＰソフトに画像を取り込み、撮影枚数や撮影インターバルを設定した。播種した時間を０とし、撮影した画像はAdobe Photoshopにて解析処理した。細胞接着率および接着した細胞の伸展は、を撮影した画像の解析より算出した。これは経時間的に撮影した細胞画像から各時間における細胞接着総数および細胞伸展数を測定し、接着率（％）＝（接着細胞数／全細胞数）×１００および伸展率（％）＝（伸展細胞数／全接着細胞数）×１００により算出した。
【００４８】
接着の判定は、以下のように行った。播種直後の細胞は球状の形をしているが、第１の変化としてまず接着斑が発生する。細胞がマトリックスに対して偽足を出し表面レセプターであるインテグリンがマトリックスに接着すると、インテグリンが集合して一部に高密度領域の点として接着斑が形成される。細胞の形状はほぼ球状である。この状態を接着とした。第２の変化として細胞とマトリックスが面した部分のインテグリンがほぼ全部に接着すると、面した細胞膜全体に接着斑が形成され、細胞の形状が球以外の形へと変化する。この状態が伸展である。この２つの変化から、接着および伸展を評価した。
【００４９】
各細胞のエラスチン（またはコラーゲン）でコーティングしたシャーレに対する接着率と伸展率の結果を[図７]に示す。血管平滑筋細胞は、エラスチン表面とコラーゲン表面に対し高い接着率（１時間後；６３％以上）と伸展率（４時間後；６２％以上）を示すことが観察された。特に、接着は約１時間以内で、また伸展は４時間以内でほぼ終了していることがわかった。線維芽細胞ではコラーゲン表面に対しては、高い接着率（１時間後；８０％以上）と伸展率（４時間後；８０％以上）が確認されたが、エラスチン表面に対してはコロナ放電のみのシャーレと同等の低い接着率（１時間後；３４.８％）および伸展率（４時間後；１３.０％）であることがわかった。また、血管内皮細胞でも、線維芽細胞と同様の傾向を示した。すなわち、コラーゲン表面に対しては高い接着率（１時間後；７２％以上）および伸展率（４時間後；７２％以上）を示したが、エラスチン表面に対しては低い接着率（１時間後；２０.０％）と伸展率（４時間後；１３.３％）であった。
【００５０】
以上の結果を１時間後接着率５０％以上かつ４時間後伸展率５０％以上を○とし、１時間後接着率５０％以下かつ、４時間後伸展率５０％以下を×として[表１]に示した。本発明品であるエラスチンを表面に有する細胞器材は、血管平滑筋細胞に対し高い細胞外基質認識性を有していることが明らかである。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
［実施例５］
（エラスチンでコーティングしたシリコンシートを用いた動的培養器材による動的培養試験）
実施例２で作製した、エラスチンでコーティングしたシリコンシートを用いた動的培養器材にＣＳＣ培地（血管平滑筋細胞用培地：大日本製薬社製）で細胞濃度を１.０×１０5(cells／mL）に調節した血管平滑筋細胞懸濁液を1mL播種した。細胞を播種してから２０時間、３７℃、５％ＣＯ2培養装置（OLYMPUS MI-IBC）で静的培養した。動的培養器材を取り出し位相差顕微鏡により細胞が接着していることを確認後、ＣＳＣ培地３mLで培地交換し、再び３７℃、５％ＣＯ2で４時間静的培養によりインキュベートした。その後、顕微鏡ステージ上に固定した動的細胞培養用装置に静的培養した動的培養器材をセットし、伸展条件を２秒で一往復（０.５Hz）、伸展率１０％で動的細胞培養（１軸伸展培養）を４時間行い同一箇所の撮影を繰り返した。撮影した画像の解析より、動的培養中の各時間における血管平滑筋細胞の引っ張り付加方向に対する配向角度を測定した。[図８]には静的培養時の配向角度変化（０〜４時間）を[図９]動的培養時の配向角度変化（０〜４時間）を示した。静的培養ではほとんど角度を変える割合の変化が無いが、動的培養では、時間とともに、配向角度の分布が引っ張り付加方向に対して垂直の角度を向く細胞の割合が多くなることがわかる。この現象は同様の方法で、０.５Hz、０.２％程度の伸展条件では静的培養と同様に変化が見られなかった。
【００５３】
［実施例６］
（血管平滑筋の分化誘導試験）
血管平滑筋細胞の細胞骨格構造変化に関する実験として、細胞内骨格タンパク質であるα−アクチン、β−アクチンの免疫染色を行い、その取り込み画像のピクセル解析から、タンパクの定量を行った。一般に、α−アクチンは分化型の特徴とされ、β−アクチンは脱分化型で多いとされている。実施例１の方法で作製したエラスチンをコーティングしたシャーレで培養した血管平滑筋細胞中に発現している両アクチン量を、コントロールとして一般に使用されている接着性細胞用シャーレ（住友ベークライト株式会社、ポリスチレン：親水性処理済）で培養した血管平滑筋細胞中に発現している両アクチン量で割った比を[図１０]に示した。
【００５４】
具体的には、以下のように行った。実施例１の方法で作製したエラスチンをコーティングした培養皿に対し、平滑筋細胞を播種しサブコンフルエントになるまで培養を行い、培地を吸引除去し、ＰＢＳにて洗浄後グルタルアルデヒドを含む固定液に３０分間浸し固定液を除き乾燥させた。細胞に２００μLの１次抗体（マウス抗ヒトα−アクチン抗体）および（マウス抗ヒトβ−アクチン抗体）を添加し一晩浸した。その後α−アクチンに対する緑色の２次抗体であるＦＩＴＣラベルした抗マウス抗体、およびβ−アクチンはに対する赤色の２次抗体であるローダミンラベルした抗マウス抗体をそれぞれ２００μL用いて、暗所で６０分間結合させた後、洗浄し乾燥させ、蛍光顕微鏡で観察した。
エラスチン上で培養した平滑筋細胞は、動的培養でないにもかかわらず、未処理培養皿中のアクチンと比較するとα−アクチンが増加しβ−アクチン比が低下する現象が見られ、分化誘導が促進されていることがわかった。
【００５５】
［実施例７］
（エラスチンゲルシートを用いた動的培養器材によるによる動的培養試験）
実施例３で作製したエラスチンゲルシートを用いた動的培養器材を用いて、実施例５と同様に血管平滑筋細胞を培養した。エラスチンゲルシート上に生育する細胞の３次元的な顕微鏡観察を行うことができた。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ＭＴＴを用いた水溶性エラスチンの細胞障害試験結果を表す図である。水溶性エラスチンには、細胞障害性がないと判断される。
【図２】ＭＴＴを用いた架橋剤(ＤＯＤＥ−ＤＳＰ)の細胞障害試験結果を表す図である。架橋剤(ＤＯＤＥ−ＤＳＰ)には、細胞障害性がないと判断される。
【図３】ＭＴＴを用いた活性エステル基(ＤＳＰ)の細胞障害試験結果を表す図である。活性エステル基(ＤＳＰ)には、細胞障害性がないと判断される。
【図４】コアセルべーション温度（エラスチン濃度０.１〜７０重量％）の測定結果を示す図である。６０％以上は非凝集性液体のためコアセルべーション温度は存在しない。
【図５】ポリスチレン製培養シャーレに、コロナ放電のみを施したもの（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、コロナ放電後エラスチン処理したもの（Ｅｌａｓｔｉｎ）、コロナ放電後コラーゲン処理したもの(Ｃｏｌｌａｇｅｎ)の表面における水滴の接触角を測定した結果を示した図である。（**Ｐ＜0.0001 vs. control）
【図６】シリコンシートを底面とする培養シャーレに、コロナ放電のみを施したもの（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、コロナ放電後エラスチン処理したもの（Ｅｌａｓｔｉｎ）、コロナ放電後コラーゲン処理したもの(Ｃｏｌｌａｇｅｎ)の表面における水滴の接触角を測定した結果を示した図である。
【図７】表面処理されたポリスチレン製培養シャーレに対する、血管系細胞の接着率および伸展率を測定した結果を示す図である。血管平滑筋細胞のａ）接着率、ｂ）伸展率、線維芽細胞のｃ）接着率ｄ）伸展率、および血管動脈内皮細胞のｅ）接着率、ｆ）伸展率が示されている。○はコロナ放電後コラーゲン処理したもの、■はコロナ放電後エラスチン処理したもの、×はコロナ放電のみを施したものを表す。
【図８】静的培養時の配向角度変化（０〜４時間）を測定した結果を示す図である。
【図９】動的培養時の配向角度変化（０〜４時間）を測定した結果を示す図である。伸展条件は、周期０.５Hz、伸展率１０％。
【図１０】エラスチンコートシャーレ上で培養した平滑筋細胞中の、α−アクチン、β−アクチンの定量結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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