(57)【要約】【課題】水溶性非電解質の薬剤物質を含むリポソーム製剤は、内包率として５０％が最高といわれているが、本発明は、水溶性非電解質を効率よく内包させたリポソームを提案し、高い内包率を示すリポソーム製剤を提供すること。【解決手段】本発明のリポソームは脂肪酸エステルをリポソーム膜の必須構成成分とすることで、膜安定性を向上させ、リポソーム膜内の水相に封入した水溶性非電解質を高い内包率で維持できる。さらに脂質膜表面の脂肪酸エステル残基と、リポソーム水相中の水溶性非電解質との間に生じる化学的相互作用を通じて、水溶性非電解質をリポソ−ムの膜表面に付着、吸着もしくは結合させ、該水溶性非電解質を効率よくリポソーム内に封入して、かつ、高い内包率を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質膜に脂肪酸エステルを含有するリポソーム。
【請求項２】
前記脂質膜の構成成分として、リン脂質およびステロール類などとともに脂肪酸エステルが含まれ、その脂肪酸エステルの少なくとも一部は該脂質膜の表面に存在することを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
前記脂質膜内に薬剤物質が内包されていることを特徴とする、請求項１または２に記載のリポソーム。
【請求項４】
前記脂質膜表面に存在する脂肪酸エステルと前記薬剤物質との間に化学的相互作用があることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項５】
超臨界二酸化炭素法により作製され、実質的に有機溶媒を含まないことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項６】
前記薬剤物質が水溶性非電解質である、請求項１〜５のいずれかに記載のリポソーム。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のリポソームを含むリポソーム含有製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸エステルを有するリポソ−ムに関し、詳しくはリポソーム膜を構成する一成分として脂肪酸エステルを含有し、薬剤物質の内包率が高いリポソーム、その製造方法および該リポソームを含む製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームはリン脂質などによって形成される二分子膜（リポソーム膜）の閉鎖小胞体であり、生体膜と類似の構造や機能を有する生体膜モデルと見なされている。リポソームは、その閉鎖空間内の水相に水溶性薬剤を、あるいは二分子膜中には油溶性薬剤を保持するというカプセル構造を構築できることから、薬物送達システムへの応用としてリポソーム製剤が盛んに研究されている。
【０００３】
薬物送達システムにおけるリポソームの利用は、封入された薬剤の薬理活性を最大限に発揮させつつもその副作用を最小限に抑制するために、その薬剤を標的部位に必要量だけ必要なときに適正に集積させることを意図している。このためリポソームに効率よく薬剤物質を封入し、該薬剤物質を漏出させることなく目的部位まで送達し、場合により放出の持続性を維持することが必要となる。薬剤物質の内包率が高いリポソームを得ることは容易でなく、所望の効果を得るために多量のリポソーム製剤を投与すると、患者の負担が大きくなる。
【０００４】
一般に脂溶性薬剤物質は容易にリポソーム中に封入されるが、封入量は他の要因にも左右されるために必ずしも多くはない。薬剤物質が水溶性電解質である場合には、その薬剤の電荷と荷電した脂質の電荷との相互作用を通じてリポソーム内部の水相に封入できるが、薬剤が水溶性の非電解質である場合には、そうした手段を採ることはできない。かかる水溶性非電解質をリポソーム中に封入する手段として、逆相蒸発法、エーテル注入法などが挙げられる。しかし有機溶剤を使用するために安全性の問題が残る。また、超臨界二酸化炭素を用いて水溶性電解質をリポソームに内包させる例は示されているが、水溶性非電解質でも効率よく内包できるか不明である。この方法でも内包率を上げるためにはエタノールなどの助溶剤の使用が望まれており（非特許文献１）、有機溶媒を使用せずに内包率の高いリポソームは作製できなかった。
【０００５】
水溶性非電解質を効率的にリポソームに封入する方法として、特許文献１および特許文献２では、リポソーム膜構成成分として飽和脂肪酸残基を含む中性リン脂質と飽和脂肪酸残基を含む荷電リン脂質との重量比を２００：１〜３：１と調整することにより、水溶性非電解質を効率的に封入する手段が開示されている。しかしながら、水溶性非電解質の保持安定性およびリポソームの安定化についての改良が引き続き求められている。
【特許文献１】特開平７−３１６０４１号公報
【特許文献２】特開平７−３１６０７９号公報
【非特許文献１】Pharm Tech Japan 19巻、5号、91〜100（2003）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
リポソーム膜内の水相に薬剤物質、とりわけ水溶性非電解質を内包させる場合、低い封入効率と内包率、毒性、不充分な安定性などの問題を抱えており、実用化された製剤はほとんどない。内包率の向上という課題については水溶性薬剤物質の内包率が５０％であるのが最高といわれるが、それに近い高い内包率を示し、安定的に封入物を保持するリポソームは開示されていない。
【０００７】
本発明者は、脂質膜の構成成分としてさらに脂肪酸エステルを加えることにより、脂質膜構造の安定化を図るとともに、水溶性非電解質を高い封入効率でリポソーム水相に封入し、かつ内包率を維持できることを見出して本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のリポソームは、脂質膜に脂肪酸エステルを含有するリポソームである。前記脂質膜の構成成分として、リン脂質およびステロール類などとともに脂肪酸エステルが含まれ、その脂肪酸エステルの少なくとも一部は該脂質膜の表面に存在することを特徴としている。
【０００９】
さらに前記脂質膜内に薬剤物質が内包されている。前記脂質膜表面に存在する脂肪酸エステルと前記薬剤物質との間に化学的相互作用があることを特徴としている。前記薬剤物質が好ましくは、水溶性非電解質である。
【００１０】
前記リポソームは、超臨界二酸化炭素法により作製され、実質的に有機溶媒を含まないことが望ましい。
前記リポソームを含むリポソーム含有製剤も本発明に含まれる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のリポソームは、その膜表面に存在する脂肪酸エステルの極性部分が、リポソーム水相内に封入した薬剤物質、特に水溶性非電解質と化学的相互作用を形成することで、膜表面に該薬剤物質を付着、吸着もしくは結合させ、効率的な封入と高い内包率を実現する。さらに、脂肪酸エステルの非極性部分が他の膜構成成分の疎水性部分と相互作用をして膜構造の安定化をもたらす。
【００１２】
さらに本発明のリポソ−ムは有機溶剤を使用せずに製造されるため、毒性および副作用がはるかに軽減され、その製剤の投与を受ける患者の負担は少ない。
[発明の具体的説明]
本発明のリポソームは、脂質膜に脂肪酸エステルを含有するリポソームである。好ましくは前記脂質膜の構成成分として、脂肪酸エステルがリン脂質およびステロール類などとともに含まれ、その脂肪酸エステルの少なくとも一部は該脂質膜の表面に存在することを特徴としているリポソームである。
【００１３】
さらに本発明のリポソームは、前記脂質膜内に薬剤物質が内包されていることを特徴としており、また超臨界二酸化炭素法により作製されて実質的に有機溶媒を含まないことが望ましい。
【００１４】
本明細書において、「リポソーム」は、通常、脂質膜、すなわち脂質二重膜から形成されている構造物である。また本明細書では、リポソーム膜を「脂質膜」と言及することもある。リポソーム内に「内包」されるとは、リポソ−ムの疎水性部分と作用してリポソーム内に封入されて脂質膜と会合しているか、または、リポソ−ムの親水性残基と作用して脂質膜内部に閉じ込められている水相（内部水相）中に存在している状態あるいは脂質膜表面に保持される状態を含むものとする。また「内包率」は、リポソーム含有製剤中に存在する、ある薬剤物質の全質量に対する、リポソームに内包されている当該物質の質量％という。
脂肪酸エステル
本発明のリポソーム膜に構成成分の一つとして含有される脂肪酸エステル（Ｒ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ'）は、特に限定されないが、好ましい脂肪酸エステルとして以下のものが例示さ
れる。
【００１５】
脂肪酸エステルの脂肪酸残基であるＲは、飽和脂肪酸残基または不飽和脂肪酸残基のいずれでもよい。好ましくは直鎖であるか、または分岐していてもよい飽和脂肪酸残基である。その脂肪酸残基の炭素数は、５〜２６であることが望ましい。炭素数が少なくとも１４、好ましくは１５から２４である。炭素数が５未満であると脂質膜中に充分に取り込まれなくなり、膜構造から遊離して安定性に欠け、一方で炭素数が２８以上であると生体適合性が低くなる。
【００１６】
具体的に、脂肪酸エステルを構成する脂肪酸としては、バレリアン酸（吉草酸）(炭素
数が５) 、カプロン酸 (炭素数が６) 、エナント酸 (炭素数が７) 、カプリル酸 (炭素数が８) 、ペラルゴン酸 (炭素数が９)、 カプリン酸 (炭素数が１０) 、ラウリン酸 (炭素数が１２) 、ミリスチン酸 (炭素数が１４) 、ペンタデシル酸 (炭素数が１５) 、パルミチン酸 (炭素数が１６) 、マルガリン酸 (炭素数が１７) 、ステアリン酸 (炭素数が１８) 、アラキジン酸 (炭素数が２０) 、ベヘン酸 (炭素数が２２) 、リグノセリン酸 (炭素数が２４)などが挙げられる。
【００１７】
また、脂肪酸エステルのＲ'基は、直鎖でも枝分かれしてもよい炭素数１〜４のアルキ
ル基もしくはアルケニル基であり、アルキル基（特にメチル基またはエチル基）が好ましい。このアルキル基は、さらにハロゲン原子、アミノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基、ニトロ基、アルコキシ基、カルボキシル基、カルバモイル基、スルホン酸基、ピリジル基などによって置換されていてもよい。Ｒ'が親水基により置換された脂肪酸エステル（
Ｒ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ'）は両親媒性であり、内包される薬剤物質と特異的な相互作用を生じ
得るために好ましい。
【００１８】
したがって使用される脂肪酸エステルは、例示されたＲ'と脂肪酸部分との任意の組み
合わせであるが、好ましい脂肪酸エステルとして、パルミチン酸メチルエステル、アラキジン酸メチルエステル、リグノセリン酸メチルエステルなどが例示される。さらに糖エステルである脂肪酸ショ糖エステルや脂肪酸ソルビタンエステル、ポリオキシエチレン基を有するポリオキシエチレン・脂肪酸エステルなども使用できる。
【００１９】
さらに本発明のリポソームにおける上記脂肪酸エステルは、１種類の脂肪酸エステルを使用してもよく、あるいは２種類以上の脂肪酸エステルを含有してもよい。
リポソームにおける脂肪酸エステルの含有量は、全脂質量に対し0.1〜50質量％、好ま
しくは全脂質量に対し1〜10質量％の割合で含有することが望ましい。ここでいう全脂質
量とは、脂質膜を構成するリン脂質類、ステロール類、脂肪酸エステル類、その他の添加した脂質類すべてを対象とした総和の質量である。
リポソーム膜成分物質
本発明のリポソーム膜は、上記脂肪酸エステルの他に、リポソーム膜成分物質として、リン脂質、ステロール類、グリコール類のうち、少なくとも２種を含有する。さらに必要に応じて糖脂質、カチオン性脂質、ポリエチレングリコール基を有する脂質（例えばＰＥＧ-リン脂質）、脂肪族アミンなどを含めてもよい。
【００２０】
本発明のリポソームに含まれるリポソームの脂質膜成分として、一般にリン脂質および／または糖脂質が好ましく使用される。好ましい中性リン脂質として、大豆、卵黄などから得られるレシチン、リゾレシチンおよび／またはこれらの水素添加物、水酸化物の誘導体を挙げることができる。
【００２１】
その他のリン脂質として、卵黄、大豆またはその他の動植物に由来するか、または半合成のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、合成
により得られるホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジミリストリルホスファチジルコリン（DMPC）、ジオレイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）、ジステアロイルホスファチジルセリン（DSPS）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（DSPＧ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（DPPI）、
ジステアロイルホスファチジルイノシトール（DSPI）、ジパルミトイルホスフチジン酸（DPPA）、ジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）などが挙げられる。
【００２２】
本発明において使用するカチオン性脂質として、１、２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（DOTAP）、Ｎ、Ｎ−ジオクタデシルアミドグリシル
スペルミン（DOGS）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）、Ｎ−［１−（２、３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、２、３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）
エチル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA
）およびＮ−［１−（２、３−ジミリスチルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（DMRIE）、さらにジパルミトイルホ
スファチジン酸（DPPA）とヒドロキシエチレンジアミンとのエステル、またはジステアロイルホスファチジン酸（DSPA）とヒドロキシエチレンジアミンとのエステルなども挙げられる。
【００２３】
これらのカチオン性脂質は全脂質量に対し0.1〜5質量％、好ましくは全脂質量に対し0.3〜3質量％、より好ましくは全脂質量に対し0.5〜2質量％の割合で含有するように添加すればよい。
【００２４】
これらのリン脂質は通常、単独で使用されるが、２種以上併用してもよい。ただし２種以上の荷電リン脂質を使用する場合には、負電荷のリン脂質同士または正電荷のリン脂質同士で使用することが、リポソームの凝集防止の観点から望ましい。中性リン脂質と荷電リン脂質を併用する場合、重量比として通常、２００：１〜３：１、好ましくは１００：１〜４：１、より好ましくは４０：１〜５：１である。
【００２５】
糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステルなどのグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドG7、ガングリオシドG6、ガングリオシドG4などのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。
【００２６】
リポソーム膜の構成成分として、上記脂質の他に必要に応じて他の物質を加えることもできる。例えば、脂質膜を強固にする役割を果たすステロール類、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロール、コレステロールエステル、フィトステロール、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、コレスタノール、またはラノステロールなどが挙げられる。また１−Ｏ−ステロールグルコシド，１−Ｏ−ステロールマルトシドまたは１−Ｏ−ステロールガラクトシドといったステロール誘導体もリポソーム膜構造の安定化に効果があることが示されている（特開平5-245357号公報）。これらの中で、特にコレステロールが好ましい。
【００２７】
リポソーム膜中のコレステロールは、ポリアルキレンオキシド導入用のアンカーにもなり得る。特開平09−3093号公報には、ポリオキシアルキレン鎖の先端に、種々の機能性物質を共有結合により固定化することができ、リポソーム形成用の成分として利用することができる新規なコレステロール誘導体が開示されている。
【００２８】
ステロール類の使用量として、リン脂質（ＰＥＧ-リン脂質を含まず）/ステロール類の
モル比が100/60〜100/90、好ましくは100/70〜100/85である。このモル比は、ＰＥＧ-リ
ン脂質を除くリン脂質量を基準としている。モル比が100/60未満であると混合脂質の分散性を向上させるステロール類による安定化が充分に発揮されない。
【００２９】
上記ステロール類の他にリポソーム膜の構成成分として、グリコール類を加えてもよい。リポソームを作製する際に、リン脂質などともにグリコール類を添加すると、リポソーム内での水溶性ヨウド系化合物の保持効率が上昇する。グリコール類として、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリメチレングリコール、1,4-ブタンジオールなどが挙げられる。グリコール類の使用量として、脂質全質量に対して0.01〜20質量％、好ましくは0.5〜10質量％の割合が望ましい。
【００３０】
また、製薬学的に許容される直鎖または分岐した炭素数2〜22の第1級アミン、第2級ア
ミンなどの脂肪族アミンを添加してもよい。例えばリポソームの荷電の調整に使用される。具体的にはステアリルアミン、オクチルアミン、オレイルアミン、リノレイルアミンなどが挙げられる。その添加量は脂質全質量に対して0.01〜0.5質量％、好ましくは0.05〜0.1質量％である。
【００３１】
本発明のリポソームにおいて、脂肪酸エステルは、リン脂質などとともに膜構成成分としてリポソーム膜を形成する。そうした脂肪酸エステルの少なくとも一部はリポソーム膜の表面に存在する。その表面とは、リポソームの脂質膜のうち、外部環境に接する脂質膜の表面と、脂質膜が形成する閉鎖空間内に面する表面のいずれも指しており、特に区別されない。おそらく脂質膜中の脂肪酸エステル分子において、そのような膜表面に出るのはエステル部分であると考えられる。他方、脂肪酸エステルの脂肪酸残基は、脂質膜のリン脂質、ステロール部分の疎水性部分と相互作用（疎水結合、van der Waals相互作用など
を主体とする化学的結合による）を行い、脂質膜構造の維持と安定化に寄与するであろう。その結果、リポソームに封入された薬剤物質の内包率向上につながることとなる。
薬剤物質
本発明は脂肪酸エステルをリポソーム膜構成の必須成分として加えることで、膜構造の安定化を図り、脂質膜内の水相に薬剤物質を高い内包率で内包している。内包させる薬剤物質としては特に制限なく使用されるが、特に水溶性非電解質物質が望ましい。以下、その具体例を挙げるが、本発明はこれらの例示に限定されるものではない。
【００３２】
Ｘ線造影剤：水溶性の非イオン型ヨウド系化合物として、特にヨウ化フェニルを含み、例えば2,4,6−トリヨウドフェニル基を少なくとも1個有する非イオン型ヨウド系化合物が好適である。Ｘ線造影剤に応用する脂肪酸エステルを含むリポソ−ム製剤に封入する造営物質において特に好ましいヨウド系化合物は、イオメプロール、イオパミドール、イオヘキソール、イオペントール、イオプロミド、イオキシラン、イオシミド、イオベンゾール、イオトロラン、イオジキサノール、イオデシモル、イオタスル、メトリザミド、1，3−ビス−（Ｎ−3，5−ビス−（2，3−ジヒドロキシプロピルアミノカルボニル）−2，4，6
−トリヨードフェニル）−Ｎ−ヒドロキシアセチル−アミノ）−プロパンなどが挙げられる。
【００３３】
これらの化合物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。またその例示に限定されるものではない。前記ヨウド系化合物のうち、特にイオメプロール、イオパミドール、イオヘキソール、イオプロミド、イオキシラン、イオタスル、イオトロランまたはイオジキサノールが好ましい。
【００３４】
抗菌剤：リソマイシン、レボフロキサシン、ストレプトマイシン、リファンピシン、アムホテリシンB、ナイスタチン、ミデカマイシン；
生体内物質：インターフェロン、エリスロポエチン、インターロイキン、ポルフィリンなど；
他に、水溶性ビタミン、アスコルビン酸ジパルミタート、ヘスペリジン、ルチン、ナリンギン、ジゴキシンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
本発明のリポソームでは、水溶性非電解質を効率よく脂質膜により形成される閉鎖空間内の水相に封入し、しかも高い内包率で維持できる。これは、脂質膜、特にその表面に存在する脂肪酸エステル残基、具体的にはエステル残基部分と水溶性非電解質との間に、何らかの化学的相互作用が生じることにより、おそらく水溶性非電解質がリポソ−ムの膜表面の脂肪酸エステル残基に付着、吸着もしくは結合のいずれか態様によって高い封入効率および内包率が達成されると考えられる。そのような化学的相互作用の実体は明らかではないが、エステル残基の極性部分と、水溶性非電解質の水酸基、アミノ基などが、水素結合、イオン性結合、その他の相互作用により、付着、吸着もしくは結合しているのであろう。
リポソ−ムの製造方法
リポソームを作製する方法として、これまで種々の方法が提案されている。作製方法が異なると、最終的にでき上がったリポソームの形態および特性も著しく異なることが多い（特開平6-80560号公報）。そのため所望するリポソームの形態、特性に応じて製造方法
が選択される。一般にリポソームの調製は、まずリン脂質、ステロールといった脂質膜成分を、ほとんど例外なく有機溶媒（例えばクロロホルム、ジクロロメタン、エチルエーテル、四塩化炭素、酢酸エチル、ジオキサン、THFなど）とともに容器中で混合、溶解する
ことから始まる。
【００３６】
他方、超臨界二酸化炭素を利用してリポソームを調製する方法は、二酸化炭素の臨界温度が31.1℃、臨界圧力が7.38 ＭＰa と比較的扱いやすく、不活性なガスゆえ残存しても
人体に無害であり、高純度流体が安価で容易に入手できるなどの理由により魅力ある製造方法であると言える。しかしながら、有機溶媒を使用しないとする従来の超臨界二酸化炭素法でも、脂質類を超臨界二酸化炭素に効率よく分散させるためにエタノールなどの使用が推奨されていた（非特許文献１参照）。
【００３７】
残存するこれらの有機溶媒を除去するために、複数の工程および長時間の処理を要しているのが現状である。そうした残留する有機溶媒、特にクロル系有機溶媒については、生体に及ぼす悪影響、例えば副作用が懸念される。
【００３８】
本発明によるリポソーム含有製剤の製造方法において、リポソームは超臨界二酸化炭素を混和媒体としたリポソームの調製方法（以下、超臨界二酸化炭素法）に基づき、有機溶媒の溶解助剤を用いない方法により調製される。その際に薬剤物質、特に上記水溶性非電解質および製剤助剤をリポソーム膜内に内包させる。本発明のリポソームの製造方法は、次の通りである。
（i）圧力容器内で32〜65℃の下、リポソーム膜構成成分と超臨界二酸化炭素とを混合し
て懸濁液を得る第１工程、
（ii）次いで、該懸濁液に薬剤物質の溶液もしくは懸濁液を添加して混合する第２工程
あるいは次の順序でもよい。
（i）リポソーム膜構成成分と薬剤物質の溶液もしくは懸濁液とを混合することにより得
られた懸濁液を収容している圧力容器内に、液化二酸化炭素を供給する第１工程、
（ii）次いで、前記の懸濁液と液化二酸化炭素とを混合させながら、該圧力容器内を32〜65℃の下、加圧して液化二酸化炭素を超臨界二酸化炭素とする第２工程
さらに次の第３工程および第４工程が続く。
（iii）その後圧力容器内を減圧して二酸化炭素を排出し、薬剤物質および製剤助剤を内
部に含有するリポソームの水性分散液を作製する第３工程、
（iv）前記の第３工程の後で、0.1〜1μｍの孔径を有するろ過膜を装着した静圧式押出し装置で、50〜90℃、0.01〜0.8ＭＰaの圧力下で、該薬剤物質が内包されたリポソームの水性分散液をろ過して、平均粒径が0.05〜0.8μｍのリポソームに整粒する第４工程。
【００３９】
所望する形態のリポソームが効率的に形成されるためには、脂質類が超臨界二酸化炭素中に良好に分散し、両者間の乳化が進んで均質な状態を形成することが重要な鍵である。そのための溶解助剤（または助溶剤、分散促進剤）として、リン脂質、コレステロールなどの脂質膜成分と親和性を示し、これらと充分混合するものが望ましい。効力および安全性を考慮してより好ましい溶解助剤は、ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール基を有する化合物である。このような化合物を、超臨界状態もしくは亜臨界状態にする二酸化炭素の0.01〜1質量％、好ましくは、0.1〜0.8質量％の割合で溶解助剤として
使用するのがよい。
【００４０】
本発明の製造方法で使用する超臨界状態（亜臨界状態を含む）の二酸化炭素の温度は、一般には30〜70℃に設定されるが、好ましくは32〜65℃、より好ましくは45〜65℃である。また、超臨界状態の二酸化炭素の好適な圧力は、上記温度範囲に対応して適宜選択されるが、5〜50 ＭＰａ、好ましくは10〜30 ＭＰａである。
【００４１】
リポソームの粒径の調整は、処方またはプロセス条件を変更することにより行なうことができる。例えば、上記の超臨界状態の圧力を大きくすると形成されるリポソームの粒径は小さくなる。作製するリポソームの粒径分布をより狭い範囲に揃えるには、ポリカーボネート膜、セルロース系の膜などでろ過してもよい。このため第４工程では、圧力容器内を空気などの導入により大気圧に調整すること（第３工程）により得られたリポソームの水性分散液を、0.1〜1.0μmの孔径を有する複数のろ過膜を通す。ろ過膜の孔径は大きい
ものから小さいものへと順次小さくしていくことが好ましく、最終的には0.05〜0.4μｍ
、好ましくは0.1〜0.4μｍ、さらに好ましくは0.15〜0.2μｍの範囲まで孔径を小さくし
ていくことが望ましい。
【００４２】
超臨界二酸化炭素を用いる方法により作製された本発明のリポソームは、実質的にクロル系溶剤、エタノールおよびその他の有機溶媒を含有せず、薬剤物質を内包するのに種々の好ましい特性、すなわち、従来法に比べて封入する薬物の内包率、内包されている薬物のリポソーム内の保持率が高いことが示されている。なお「実質的に」とは、リポソーム含有製剤における残存有機溶媒の濃度の上限値が10μg/Ｌであることを意味する。
リポソーム含有製剤
本発明のリポソーム含有製剤における好ましい態様は、リポソームの脂質膜内部の水相およびリポソームを懸濁する水性媒体（水をベースとする溶媒）中に、１種類以上の生理的に許容され得る製剤助剤を含有している。
【００４３】
生理的に許容され得る製剤助剤は、リポソーム製剤化のために水溶性薬剤とともに添加される物質であり、これまでの製剤製造技術に基づいて各種の物質が必要に応じて使用される。具体的には生理学的に許容される各種のｐＨ緩衝剤（水溶性アミン系緩衝剤または炭酸塩系緩衝剤が好ましい）、ＥＤＴＡNa2−Ca、ＥＤＴＡNa2などといったエデト酸系のキレート化剤、無機塩類、薬理的活性物質（例えば血管拡張剤、凝固抑制剤など）、さらには浸透圧調節剤、安定化剤、抗酸化剤（例えばα‐トコフェロール、アスコルビン酸）、粘度調節剤、保存剤なども挙げられる。好ましくは、アミン系緩衝剤およびキレート化剤をともに含めるのがよい。キレート化剤はＥＤＴＡNa2−Ca（エデト酸カルシウム２ナ
トリウム）が好ましい。
【００４４】
上記水性媒体の好ましいｐＨ範囲は、室温で6.5〜8.5、さらに好ましくは6.8〜7.8である。好ましいｐＨ緩衝液は、米国特許第4278654号に記載されているような負の温度係数
を有する緩衝液である。アミン系緩衝液はこのような要求を満たす性質を有しており、好ましくはトロメタモールである。このタイプの緩衝液は、オートクレーブ温度で低いｐＨを有し、このことがオートクレーブ中のリポソームの安定性を増し、他方、室温では生理的に許容されるｐＨに戻る。したがって、注射用無菌製剤を製造するために、リポソーム調製物をオートクレーブ滅菌できることは極めて便利であり、貯蔵安定性なども確保できる。本発明のリポソームおよびその製剤は、好ましくは滅菌した形態として上市される。その場合、滅菌ろ過、オートクレーブ滅菌、または加熱滅菌により無菌製剤を得る。
【００４５】
リポソーム脂質膜内部の水相以外の水溶液（すなわち該リポソームを懸濁する水性媒体）にも上記の薬剤物質および製剤助剤が含まれている場合、脂質膜内外の水相に薬剤物質および製剤助剤が実質的に同一の濃度で含有されている状態が好ましい。該膜内外で著しい浸透圧差が生じることはなく、リポソームの構造安定性が保たれるからである。
【００４６】
本発明において、薬剤物質の内包効率および内包の安定性に加えてリポソームの膜脂質の重量も考慮されねばならない。リポソームの膜脂質の重量が多くなると製剤の粘度が大きくなる。リポソーム内への薬剤の封入量として、リポソーム内に封入された水溶液中に、全薬剤（薬剤物質および製剤助剤を含む）がリポソーム膜脂質に対して、1〜8、好ましくは3〜8、より好ましくは5〜8の重量比（g/g）で含有されていることが望ましい。
【００４７】
[実施例]
本発明を以下の実施例によって、より具体的に説明する。しかし、実施例は、実例を挙げて説明しようとするものであり、本発明の範囲を何ら限定しようとする意図のものではない。
【実施例１】
【００４８】
温めた（80℃）リグノセリン酸メチルエステル25mgを容器に採り、そこへエタノール0.2mlを加えて、80℃の湯浴中でリグノセリン酸メチルエステルを溶かした。エタノールに
溶かしたリグノセリン酸メチルエステルへ、予め温めておいた（50℃）オムニパーク240
（コニカミノルタエムジー株式会社製造影剤：イオヘキソールを517.7mg/ml含有）6.5gを加えて混合した。この混合物に、脂質としてジパルミトイルフォスファチジルコリン（DPPC）500mgとジパルミトイルフォスファチジルセリン（DPPS）50mgを加え、これを50℃に
設定した恒温槽に入れ、ホモジナイザーを差し込んで毎分16000回転により撹拌した。脂
質が混合された後に60分間放置し、生成したリポソ−ム製剤の内包率を測定した。その結果を表１に示す。
[比較例１]
添加剤としてリグノセリン酸エステルを加えないリポソームを、実施例１と同様にして作製し、リポソーム含有造影剤を得た。
【００４９】
【表１】
2007261984.tif 000002
【実施例２】
【００５０】
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）1000mgと、ジパルミトイルホスファチジルセリン(DPPS)100mg、アラキジン酸メチルエステル50mgの混合物をステンレス製の特製
オートクレーブに仕込み、オートクレーブ内を60℃に加熱し、次いで液体二酸化炭素13g
を加えた。撹拌を行いながら、50kg/cm2であったオートクレーブ内の圧力を、オートクレーブ内の体積を減ずることにより、120kg/cm2にまで上げて、二酸化炭素を超臨界状態に
し、撹拌しながら脂質類を分散・溶解させた。撹拌しながら、さらに造影剤溶液として、オムニパーク240（コニカミノルタエムジー株式会社製造影剤：イオヘキソール517.7mg/mlを含有）、13ｇを定量ポンプで連続的に注入した。注入終了後、系内を減圧して二酸化
炭素を排出し、造影剤溶液を含有するリポソームの分散液を得た。この試料を60℃まで加熱し、アドバンテック社製のセルロース系フィルター、1.0μmで加圧濾過した。続いて、同様に60℃まで加熱し、アドバンテック社製のセルロース系フィルター、0.45μmで加圧
濾過してリポソーム含有造影剤を得た。この試料を60分間放置し、内包率を測定した。その結果を表２に示す。
【００５１】
【表２】
2007261984.tif 000003
【００５２】
＜内包率の評価＞
得られた試料を20mLの小瓶に入れ、蓋をして、蓋の周囲をシールテープで密閉した。そのサンプルを23℃、湿度55％の雰囲気で、60分間暗所保管した。その後、その試料を等張の食塩水で透析し、透析終了後にエタノールを添加してリポソームを破壊して、吸光度の測定によりリポソーム内のヨウド化合物量を求めた。試料中の全ヨウド化合物量に対する比率を内包率（質量％）として表した。
＜平均粒径の評価＞
粒径は、水溶性薬剤を内包するリポソームを含む分散液を、動的光散乱粒径測定器（シスメックス社、Malvern HPPS）を用いて、25℃の条件下で測定した。