(57)【要約】【課題】  検出感度を著しく向上することができ、更に抗原抗体反応の反応時間を短縮させることができる免疫測定方法を提供する。【解決手段】  反応容器及び抗体又は抗原を固定化した固相を用いた免疫測定方法であって、反応容器の下部を加熱し上部を冷却する条件下で抗原抗体反応を行う工程を含むようにした。前記固相及び反応容器がマイクロプレートであることが好ましい。前記反応容器の下部の加熱温度が２５℃以上５５℃以下であり、前記反応容器の上部の冷却温度が前記下部の加熱温度より低く且つ０℃以上２５℃以下であることが好適である。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応容器及び抗体又は抗原を固定化した固相を用いた免疫測定方法であって、該反応容器の下部を加熱し上部を冷却する条件下で抗原抗体反応を行う工程を含むことを特徴とする免疫測定方法。
【請求項２】
前記反応容器の下部の加熱温度は２５℃以上５５℃以下であり、前記反応容器の上部の冷却温度は前記下部の加熱温度より低く且つ０℃以上２５℃以下であることを特徴とする請求項１記載の免疫測定方法。
【請求項３】
前記反応容器及び前記固相がマイクロプレートであることを特徴とする請求項１又は２記載の免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体又は抗原を固定化した固相を用いた免疫測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査診断薬等の分野で使用される免疫測定法としては、抗体又は抗原を固定化した固相（固相）を用いた免疫測定法が比較的簡便な方法として用いられている。該方法は、一定の温度に保持して抗原抗体反応を行わせるものであり、例えば、室温（２０℃）又はインキュベーターや恒温槽等を用いて反応温度を均一に制御し、反応させる方法が一般的である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、検出感度の向上した免疫測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、従来行われてきた一定の温度条件とは逆に、反応容器の下部を加熱し上部を冷却する条件下で抗原抗体反応を行わせることにより、検出感度を著しく向上させることができることを見いだした。
即ち、本発明の免疫測定方法は、反応容器及び抗体又は抗原を固定化した固相を用いた免疫測定方法であって、該反応容器の下部を加熱し上部を冷却する条件下で抗原抗体反応を行う工程を含むことを特徴とする。
【０００５】
前記抗原抗体反応の温度条件は、反応容器の上部を下部よりも低温に設定した条件下であれば特に限定されないが、反応容器の下部の加熱温度が２５℃以上５５℃以下であり、前記反応容器の上部の冷却温度が前記下部の加熱温度より低く且つ０℃以上２５℃以下であることが好適である。
前記固相及び反応容器はそれぞれ特に限定されないが、マイクロプレートを固相及び反応容器として用いることが好ましい。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、簡便に免疫測定方法における検出感度を著しく向上することができる。また、本発明によれば抗原抗体反応の反応時間を短縮させることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。
【０００８】
本発明の免疫測定方法は、反応容器の下部を加熱し上部を冷却する条件下で抗原抗体反応を行う工程を含むことを特徴とする。前記反応容器の下部とは、反応容器の下面（底面）や下方側面等を含むものであり、反応容器の上部とは、反応容器の上面（例えば、蓋体）や上方側面等を含むものである。例えば、反応容器の下面全面を均一に加熱し、反応容器の上面全面を均一に冷却する条件下で反応を行うことが好ましい。反応容器は、抗原抗体反応が可能な反応器具であれば特に限定されないが、例えば、ポリスチレン等のマイクロプレートやマイクロアレイを用いることが好ましい。
【０００９】
本発明において、下部を加熱し上部を冷却するとは、上部を下部よりも低い温度に設定することを意味する。反応容器の上部と下部の温度差は、特に限定されないが、上部を下部より５℃以上、好ましくは１０℃以上、より好ましくは１５℃以上低く設定し、反応容器内の抗原抗体反応を行う液（反応溶液）中に上下に温度差、例えば、温度勾配を設けることが好適である。具体的には、反応容器の下部を２５℃以上５５℃以下、好ましくは３０℃以上５０℃以下、より好ましくは３５℃以上４０℃以下の温度範囲で加熱し、反応容器の上部を０℃以上２５℃以下、好ましくは４℃以上２５℃以下の温度範囲で冷却することが好ましい。
【００１０】
本発明において、免疫測定方法としては、抗体又は抗原を固相に固定化し用いる免疫学的測定法であれば特に限定されない。例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、化学発光免疫測定法、蛍光免役測定法（ＦＩＡ法）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）等が挙げられる。
【００１１】
本発明において前記固相とは不溶性担体であり、例えば、マイクロプレート、ビーズ、試験管、ラテックス、磁性粒子、ニトロセルロース膜等が挙げられるが、ポリスチレン等のマイクロプレートが好ましい。固相に固定する抗体又は抗原は、測定物質に応じて適宜選択すればよく特に限定されないものである。本発明において、測定物質は免疫学的測定法により測定可能な物質であれば特に限定されないものである。また、前記抗原はハプテン等の合成抗原、及び天然抗原のいずれも使用可能である。
【００１２】
以下、二抗体を用いるサンドイッチ法により抗原を測定する場合を例に、本発明の免疫測定方法をより具体的に説明する。
図１〜図５は本発明の免疫測定方法の一例を示す断面概略説明図であり、測定物質が抗原であり、固相及び反応容器としてマイクロプレートを用いる場合の例を示した。
図１は、抗体を固定化した固相の一例を示す断面概略説明図である。図１において符号１０は固相であり、固相としてマイクロプレートを用いた場合の例を示した。前記マイクロプレート１０は１又は複数のウェル（穴）１２を有する。なお、図１〜５では、６個のウェル１２ａ〜１２ｆを示したが、ウェルの数は特に限定されない。
【００１３】
図１に示した如く、まず、被測定抗原２０に対する第１の抗体２２が所定の固定化部位、例えば底部１４に固定化されたマイクロプレート１０のウェル１２等の固相を準備する。本発明に使用される抗体は、被測定抗原に対し特異的に結合することができる物質であれば特に限定されない。具体的には、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いることができる。
抗原又は抗体を固相に固定化する方法は特に限定されず、公知のいずれの方法も適用できる。なお、図１は、マイクロプレートの底部に抗体を固定化させた場合の例を示したが、本発明において、抗原又は抗体の固定化部位は特に限定されないものである。
【００１４】
図２は、固相１４に固定化された第１の抗体２２、被測定抗原２０、及び反応溶液２６を含む反応容器１６の一例を示す断面概略説明図である。
図２に示した如く、固相としてマイクロプレートを用いる場合、該マイクロプレートを反応容器としても用いることが可能である。前記準備した固相１０を反応容器１６として用い、該反応容器１６に被測定抗原２０を含む又は含む可能性のある試料及び反応溶液２６を加え、反応容器１６を蓋体１８等により封じる。図中、ウェル１２ａは被測定抗原を含まない試料を添加した場合を示し、ウェル１２ｂ〜１２ｆは被測定抗原を含む試料を添加した場合を示した。
【００１５】
本発明において反応溶液は特に限定されず、抗原抗体反応に使用される公知の反応用溶液を用いることが可能であり、緩衝液を用いることが好ましい。
なお、図１〜５はマイクロプレートを反応容器及び固相として用いる場合の例を示したが、反応容器と固相を別途用意する場合も本発明に含まれるものである。例えば、固相としてビーズや磁気粒子等を用い、該固相に抗体又は抗原を固定化させ、反応容器に添加してもよい。
【００１６】
その後、該反応容器１６の下部を加熱し上部を冷却する条件下で第１の抗原抗体反応（第１反応）を行う。前記抗原抗体反応において、反応容器の下部を加熱し上部を冷却する方法は特に限定されないが、反応容器の下部を加熱可能な加熱手段を備え且つ上部を冷却可能な冷却手段を備えた温度制御装置を用いることが好ましい。
【００１７】
図６は、本発明方法を実施するために好適に用いられる温度制御装置の一例を示す概略説明図である。図６において、符号３０は温度制御装置で、反応容器を収納する収納部３２と、該反応容器を加熱する加熱手段３４と、該反応容器を冷却する冷却手段３６とを有している。図６において、３８は基台であり、該基台３８の上面に前記加熱手段３４が設けられている。該加熱手段３４の上部には前記収納部３２及び該収納部の側壁３９が設けられており、前記収納部３２の上部には冷却手段３６が設けられている。
前記加熱手段３４及び冷却手段３６は温度を制御できることが好ましい。マイクロプレートで抗原抗体反応を行う場合は、図３及び６に示した如く、前記加熱手段３４及び冷却手段３６ともに平面でマイクロプレート１０と接触する構造であることが好ましい。
【００１８】
図３は図６に示した温度制御装置を利用したサンドイッチ法における第１の抗原抗体反応の一例を示す断面概略説明図である。図３において、温度制御装置３０は図６と同様に構成されている。図３に示した如く、温度制御装置３０の収納部３２に反応容器１６を載置し、加熱手段３４により反応容器１６の下面全面を均一に加熱し且つ冷却手段３６により反応容器１６の上面（蓋体１８）全面を均一に冷却する条件下で所定時間反応させることが好ましい。該第１の抗原抗体反応により、被測定抗原２０を固相抗体である第１の抗体２２に結合させる。
【００１９】
前記第１の抗原抗体反応後、未反応物を洗浄除去し、標識物質で標識された第２の抗体及び反応溶液を加え、反応容器の下部を加熱し上部を冷却する条件下で第２の抗原抗体反応（第２反応）を行う。該第２の抗原抗体反応は、図４に示した如く、前記第１の抗原抗体反応と同様、反応容器の下部を加熱可能な加熱手段を備え且つ上部を冷却可能な冷却手段を備えた温度制御装置を用いて行うことが好ましい。
【００２０】
図４は、本発明方法を実施するために用いられる温度制御装置を利用した前記第２の抗原抗体反応の一例を示す断面的概略説明図である。図４において、温度制御装置３０は図６と同様に構成されている。
図４において、２４は標識物質で標識された第２の抗体、２５は標識物質、２７は反応溶液である。前記第２の抗体を標識する方法は特に限定されず、公知の標識法を使用することができ、標識物質２５としては、例えば、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、金属等が挙げられる。図４に示した如く、温度制御装置３０の収納部３２に反応容器１６を載置し、加熱手段３４により反応容器１６の下面全面を均一に加熱し且つ冷却手段３６により反応容器１６の上面（蓋体１８）全面を均一に冷却する条件下で所定時間反応させることが好ましい。該第２の抗原抗体反応により、前記第１の抗体２４と被測定抗原２０の複合体に第２の抗体２６を結合させ、固相化された第１の抗体−被測定抗原−標識された第２抗体からなる複合体２８を形成させる。
【００２１】
前記第２の抗原抗体反応後、未反応物を洗浄除去する。図５は、第２の抗原抗体反応及び洗浄工程後の固相の一例を示す断面概略説明図である。図５において、符号２８は固相化された第１の抗体２２−被測定抗原２０−標識された第２抗体２４からなる複合体である。図５に示した如く、被測定抗原２０を含まない試料を添加したウェル１２ａは複合体２８が形成されず、標識物質２５が存在しないのに対し、被測定抗原２０を含む試料を添加したウェル１２ｂ〜１２ｆは複合体２８が形成され、標識物質２５が存在する。従って、標識物質２５を測定することにより、被測定抗原を測定することができる。また、標識物質２５の量を測定することにより、被測定抗原２０の量を測定することができる。
【００２２】
なお、前記方法においては、第１の抗原抗体反応及び第２の抗原抗体反応を共に下部を加熱し上部を冷却する温度条件下で行う例を示したが、本発明においては、複数の抗原抗体反応を行う場合は少なくとも１の抗原抗体反応を該温度条件下で行えばよいものであり、例えば、一方の抗原抗体反応を該温度条件下で行い、他方の抗原抗体反応を均一な温度条件下で行う方法も本発明に含まれるものである。本発明方法において２ステップのサンドイッチ型免疫測定法を用いる場合、少なくとも第１の抗原抗体反応を下部を加熱し上部を冷却する条件下で行うことが効果的である。
【実施例】
【００２３】
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。
【００２４】
（実施例１）
市販の血清中のシアル化糖鎖抗原ＫＬ−６測定用キット（三光純薬（株）製、商品名：エイテスト（エーザイ（株）の登録商標）ＫＬ−６）を用いて、反応温度条件以外はキット添付の操作法に準じてサンドイッチ型酵素免疫測定法により下記の如く測定を行った。
【００２５】
反応用溶液（正常ウサギ血清を含むトリス緩衝液）１００μＬを分注した抗体コートカップ（ポリスチレン製カップ（Ｕ型）に抗ＫＬ−６マウスモノクローナル抗体を固相化したマイクロプレート、以下、カップと称する。）に、各濃度の標準抗原（ＫＬ−６抗原を０，１，２．５，５，１０又は２０Ｕ／ｍＬ含むトリス緩衝液）を各２０μＬ注入し、よく混和した。
カップにアルミシールをした後、図６と同様の装置を用いてＵ型に対応できるアルミブロックに設置し、下部を３７℃、上部を５℃に制御した条件下で第１反応を２時間行った。
【００２６】
前記第１反応後のカップ内を洗浄液（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを含む生理食塩水）で洗浄後、酵素標識抗体液（西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗ＫＬ−６マウスモノクローナル抗体を含む液）を１００μＬ加えてアルミシールをし、図６に示す装置を用い、下部を３７℃、上部を５℃に制御した条件下で第２反応を１時間行った。
【００２７】
発色剤（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）を含む凍結乾燥品）１バイアルに精製水１２ｍＬを加えて溶解し、酵素基質（日局オキシドール）を３０μＬ加え、基質液を調製した。
前記第２反応後のカップ内を洗浄液で洗浄後、基質液を１００μＬ加えてアルミシールし、２５℃で第３反応を３０分行った後、反応停止液（アジ化ナトリウム液）を１００μＬ加えて、４０５ｎｍの吸光度測定を行った。結果を図７に示す。なお、本実施例及び下記実施例及び比較例において、吸光度の測定結果は、各測定値から標準抗原の濃度０の場合の測定値を差引いた値を示した。
【００２８】
（比較例１）
第１反応及び第２反応を３７℃のインキュベーター内で行った以外は実施例１と同様に測定を行った。結果を図７に示す。
【００２９】
図７に示した如く、下部を加熱し上部を冷却して温度差（３２℃）を設けた条件の実施例１は、一定温度条件の比較例１に比べて感度が向上した。
【００３０】
（実施例２及び比較例２）
実施例２は、第１反応及び第２反応を下部を３７℃、上部を１０℃に制御した条件下で行った以外は実施例１と同様の手順により実験を行った。
また、比較例２として、第１反応及び第２反応を３７℃のインキュベーター内で行った以外は実施例２と同様の手順により実験を行った。
実施例２及び比較例２の結果を図８に示す。図８に示した如く、下部を加熱し上部を冷却して温度差（２７℃）を設けた条件の実施例２は、一定温度条件の比較例２に比べて感度が向上した。
【００３１】
（実施例３及び比較例３）
実施例３は、第１反応及び第２反応を下部を３７℃、上部を１５℃に制御した条件下で行った以外は実施例１と同様の手順により実験を行った。
また、比較例３として、第１反応及び第２反応を３７℃のインキュベーター内で行った以外は実施例３と同様の手順により実験を行った。
実施例３及び比較例３の結果を図９に示す。図９に示した如く、下部を加熱し上部を冷却して温度差（２２℃）を設けた条件の実施例３は、一定温度条件の比較例３に比べて感度が向上した。
【００３２】
（実施例４及び比較例４）
実施例４は、第１反応及び第２反応を下部を３７℃、上部を２０℃に制御した条件下で行った以外は実施例１と同様の手順により実験を行った。
また、比較例４として、第１反応及び第２反応を３７℃のインキュベーター内で行った以外は実施例４と同様の手順により実験を行った。
実施例４及び比較例４の結果を図１０に示す。図１０に示した如く、反応溶液の上下に温度差（１７℃）を設けた条件の実施例４は、一定温度条件の比較例４に比べて感度が向上した。
【００３３】
（実施例５及び比較例５）
実施例５は、第１反応及び第２反応を下部を３７℃、上部を２５℃に制御した条件下で行った以外は実施例１と同様の手順により実験を行った。
また、比較例５として、第１反応及び第２反応を３７℃のインキュベーター内で行った以外は実施例５と同様の手順により実験を行った。
実施例５及び比較例５の結果を図１１に示す。図１１に示した如く、反応溶液の上下に温度差（１２℃）を設けた条件の実施例５は、一定温度条件の比較例５に比べて感度が向上した。
【００３４】
図１２は実施例１〜５の結果を示すグラフであり、図１３は比較例１〜５の結果を示すグラフである。図１２及び１３に示した如く、実施例１〜５は再現性の高い結果が得られたのに対し、比較例１〜５は日差変動が高く、再現性が低かった。したがって、本発明の方法に用いた下部を均一に加熱し、上部を均一に冷却する装置は、インキュベーターを用いる方法と比較して、再現性にも優れることが明らかとなった。
【００３５】
（実施例６及び比較例６）
実施例６は、第１反応の反応時間を６０分間に変更した以外は実施例２と同様の手順により実験を行った。また、比較例６として、第１反応の反応時間を９０分間に変更し、第１反応及び第２反応を３７℃のインキュベーター内で行った以外は実施例６と同様の手順により実験を行った。結果を図１４に示す。
図１４に示した如く、反応溶液の上下に温度差（２７℃）を設けた条件の実施例６は、一定温度条件の比較例６に比べて短い反応時間で同等の感度が得られた。よって、本発明により、抗原抗体反応の反応時間を短縮させることができることが判明した。
【００３６】
（実施例７）
市販の血清・血漿中ペプシノゲンＩ測定用キット（栄研化学（株）製、商品名：Ｅプレート‘栄研’ペプシノゲンＩ）を用いて、反応温度条件以外はキット添付の操作法に準じてプレート固相による２ステップサンドイッチ型酵素免疫測定法により下記の如く測定を行った。
【００３７】
ペプシノゲンＩ抗体固相化プレート（抗ペプシノゲンＩマウスモノクローナル抗体を固相化したプレート）の各ウェルに緩衝液（リン酸水素二ナトリウム・１２水塩及びリン酸二水素カリウムを含む液）を１００μＬずつ加え、各濃度の標準抗原（ペプシノゲンＩを０，２，６，２０，６０又は２００ｎｇ／ｍＬ含む標準液）を２０μＬずつ加えた。
プレートにアルミシールをし、１０分間攪拌後、図６と同様の装置を用い、下部を３７℃、上部を５℃に制御した条件下で第１反応を１１０分間行った。
【００３８】
前記第１反応後、ウェルから反応液を除去し、洗浄液（モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタンを含む水溶液）で３回洗浄する。
洗浄後、各ウェルに酵素標識抗体液（ペルオキシダーゼ標識抗ペプシノゲンＩマウスモノクローナル抗体を含む液）を１００μＬずつ加え、プレートにアルミシールをし、図６と同様の装置を用い、下部を３７℃、上部を５℃に制御した条件下で第２反応を５５分間行った。
【００３９】
前記第２反応後、反応液を除去し、洗浄液で３回洗浄した後、各ウェルに基質液を１００μＬずつ加える。プレートにアルミシールをして、遮光して室温で３０分間酵素反応を行った後、反応停止液（硫酸を含む液）を１００μＬ加えた。なお、基質液の調製は、基質剤（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩を含む錠剤）を溶解液（過酸化水素水を含む液）に加えて溶解し、基質液とした。
マイクロプレート用分光光度計（パーキンエルマー社製、Wallac Arvo.8X 1420 Multilabel Counter）を用いて、波長４９０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１５に示す。
【００４０】
（比較例７）
第１反応及び第２反応を３７℃のインキュベーター内で行った以外は実施例７と同様の手順で実験を行った。結果を図１５に示す。
【００４１】
図１５に示した如く、下部を加熱し上部を冷却して温度差（３２℃）を設けた条件の実施例７は一定温度条件の比較例７に比べて感度が向上した。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】抗体を固定化した固相の一例を示す断面概略説明図である。
【図２】固相に固定化された抗体、被測定抗原、及び反応溶液を含む反応容器の一例を示す断面概略説明図である。
【図３】本発明方法を実施するために用いられる温度制御装置を利用したサンドイッチ法における第１の抗原抗体反応の一例を示す断面概略説明図である。
【図４】本発明方法を実施するために用いられる温度制御装置を利用したサンドイッチ法における第２の抗原抗体反応の一例を示す断面概略説明図である。
【図５】第２の抗原抗体反応及び洗浄工程後の固相の一例を示す断面概略図である。
【図６】本発明方法を実施するために好適に用いられる温度制御装置の一例を示す断面概略説明図である。
【図７】実施例１及び比較例１の結果を示すグラフである。
【図８】実施例２及び比較例２の結果を示すグラフである。
【図９】実施例３及び比較例３の結果を示すグラフである。
【図１０】実施例４及び比較例４の結果を示すグラフである。
【図１１】実施例５及び比較例５の結果を示すグラフである。
【図１２】実施例１〜５の結果を示すグラフである。
【図１３】比較例１〜５の結果を示すグラフである。
【図１４】実施例６及び比較例６の結果を示すグラフである。
【図１５】実施例７及び比較例７の結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００４３】
１０：固相、マイクロプレート、１２，１２ａ〜１２ｆ：ウェル、１４：マイクロプレートの底部、１６：反応容器、マイクロプレート、１８：蓋体、２０：被測定抗原、２２：第１の抗体、２４：標識された第２の抗体、２５：標識物質、２６、２７：反応溶液、２８：固相化された第１の抗体−被測定抗原−標識された第２抗体からなる複合体、３０：温度制御装置、３２：反応容器収納部、３４：加熱手段、３６：冷却手段、３８：基台、３９：反応容器収納部の側壁。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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