(57)【要約】【課題】被検試料中の単数又は複数のサイトカインを効率よく確実に検出する。【解決手段】ＤＯ１１．１０トランスジェニックマウス脾臓細胞由来好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株、好ましくは、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５２の細胞株を、被検試料中で培養する培養工程、前記細胞株の増殖に基づいて、サイトカインを検出する検出工程を含む方法によって、被検試料中のサイトカインを検出し、又はサイトカインを産生するサイトカイン産生細胞をスクリーニングする。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中のサイトカインを検出する方法において、
ＤＯ１１．１０トランスジェニックマウス脾臓細胞由来好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株を、前記被検試料中で培養する培養工程、
前記細胞株の増殖に基づいて、サイトカインを検出する検出工程
を含むことを特徴とする当該検出方法。
【請求項２】
前記細胞株が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５２の細胞株であることを特徴とする請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
目的サイトカインがインターロイキンであることを特徴とする請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項４】
前記サイトカインが、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９及びＩＬ−１３からなる群より選択された少なくとも１つであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項５】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５２の細胞株。
【請求項６】
サイトカイン産生細胞のスクリーニング方法であって、
被検細胞を培養して、被検培養上清を調製する調製工程、
ＤＯ１１．１０トランスジェニックマウス脾臓細胞由来好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株を、前記被検培養上清を含有する培養液中で培養する培養工程、
前記細胞株の増殖に基づいて、前記被検細胞からサイトカイン産生細胞を選定する選定工程、
を含むことを特徴とする当該スクリーニング方法。
【請求項７】
前記細胞株が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５２の細胞株であることを特徴とする請求項６記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記サイトカインがインターロイキンであることを特徴とする請求項６記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記サイトカインが、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９及びＩＬ−１３からなる群より選択された少なくとも１つであることを特徴とする請求項６乃至８のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５２の細胞株を用いて検出されたサイトカイン。
【請求項１１】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５２の細胞株用いて得られたサイトカイン産生細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカインの検出方法、サイトカイン感受性細胞株及びサイトカイン産生細胞のスクリーニング方法に関し、特に、被検試料中のサイトカインを検出するための検出方法及びこの検出方法に使用可能なサイトカイン感受性細胞株、並びにサイトカイン産生細胞のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種細胞の分化及び増殖には、細胞が産生する各種サイトカインが大きく影響していることはよく知られている。このようなサイトカインには、インターフェロン（ＩＦＮ）、各種インターロイキン（ＩＬ）、各種成長因子（ＧＦ）などを挙げることができる。
これらのサイトカインは、生体において多くの疾患とも関連性が深く、疾患の発症機序や治療剤の開発における研究ツール及び候補化合物としても注目されている。また、前述のように多くのサイトカインが見いだされているが、未知のサイトカインも多く存在していると思われ、これら未知のサイトカインの検出及び同定も、今後の研究、ひいては各種疾患の治療剤開発に重要である。
現在、サイトカインの検出には、例えば、細胞培養液を濃縮してタンパク質レベルで検出する方法や、既知のサイトカイン感受性細胞の増殖速度を比較する方法、既知のサイトカイン検出用抗体を利用する方法などによって行われている（例えば、特許文献１及び２）。
【特許文献１】特開平５−２７６９８６号公報
【特許文献２】特開２００４−２７９４２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、特定のサイトカインのみを検出するには、そのサイトカインに対して感受性の高い細胞株等を用いて検出すればよいが、存在するサイトカインの種類が不明である場合や、複数種のサイトカインが混在していることもある。また、サイトカインがごく微量に存在している場合には、細胞自身の作用であるのかサイトカインによる影響なのかを正確に識別する必要がある。
従って、本発明の目的は、被検試料中の単数又は複数のサイトカインを効率よく確実に検出すること又は、そのようなサイトカインを産生する産生細胞を効率よくスクリーニングすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明のサイトカイン検出方法は、被検試料中のサイトカインを検出する方法において、ＤＯ１１．１０トランスジェニックマウス脾臓細胞由来好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株を、前記被検試料中で培養する培養工程、前記細胞株の増殖に基づいて、サイトカインを検出する検出工程を含むことを特徴としている。
本発明のサイトカイン産生細胞のスクリーニング方法は、被検細胞を培養して、被検培養上清を調製する調製工程、ＤＯ１１．１０トランスジェニックマウス脾臓細胞由来好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株を、前記被検培養上清を含有する培養液中で培養する培養工程、前記細胞株の増殖に基づいて、前記被検細胞からサイトカイン産生細胞を選定する選定工程、を含むことを特徴としている。
本発明の細胞株は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５２の細胞株である。
本発明のサイトカインは、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５２の細胞株を用いて検出されたものである。
本発明のサイトカイン産生細胞は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５２の細胞株用いて得られたものである。
【０００５】
本発明では、ＤＯ１１．１０トランスジェニックマウス脾臓細胞由来好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株、特に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５２株を用いている。この細胞株は、複数種のサイトカインに対して感受性を有しているので、被検試料中に含有されるサイトカイン又は産生されるサイトカインの数や種類が不明であっても、広いレンジで被検試料中に含有されるサイトカインを検出することができ、又はサイトカイン産生細胞を効率よくスクリーニングすることができる。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、被検試料中の単数又は複数のサイトカインを効率よく確実に検出することができ、又はそのようなサイトカインを産生する産生細胞を効率よくスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明のサイトカイン検出方法は、被検試料中のサイトカインを検出する方法において、ＤＯ１１．１０トランスジェニックマウス脾臓細胞由来好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株（以下、「単に好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株」という）を、前記被検試料中で培養する培養工程、前記細胞株の増殖に基づいてサイトカインを検出する検出工程を含む。
【０００８】
本発明にかかる好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株は、複数種のサイトカインに対して感受性を有するものである。このような細胞株を用いることによって、被検試料中に含まれるサイトカインの数や種類が不明であっても、広いレンジで確実にサイトカインを検出することができる。
本発明にかかる好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株は、ＤＯ１１．１０トランスジェニックマウスの脾臓細胞を卵白アルブミン（ＯＶＡ抗原ペプチド）で刺激しながら誘導して得られた好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株である。本好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株を得るために用いられるＯＶＡ抗原ペプチドとしては、３２３番目−３３９番目のアミノ酸残基で構成されたものを挙げることができる。
これらの細胞株のうち、更に、Ｒ細胞（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター  受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５２、２００５年９月１日付で受領）が感受性の高さ及び感受性を示すサイトカインの種類の観点から特に好ましい。
【０００９】
本発明の好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株は、好塩基球に特徴的な形態とマスト細胞に特徴的な形態との双方を兼ね備えた細胞株である。
例えばＲ細胞は、光学又は電子顕微鏡観察による形態観察では、顆粒密度の低い嚢胞状構造やトルイジンブルー（ＴＢ）染色では染まらない点で好塩基球様の形態を示し（図１参照）、細胞表面分子の解析では、ｃ−ｋｉｔ、ＦｃεＲＩαが共に陽性というマスト細胞様の形態を示すことが確認されている。このようにＲ細胞は、好塩基球に似た形態とマスト細胞に似た形態とを共に示しており、好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株であると言える。
Ｒ細胞は、ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞株の培養上清又はＩＬ−３による刺激により維持することができるが、特徴的な活性を良好に維持できる観点からＤＯ１１．１０細胞株の培養上清により維持することが好ましい。
【００１０】
また、Ｒ細胞の維持条件としては、ＯＶＡ抗原ペプチド刺激Ｔ細胞との共培養を挙げることができる。
共培養に用いられるＴ細胞は、表面マーカーＣＤ４＋ＣＤ８−のヘルパーＴ細胞であればよく、その起源としては、哺乳類、特に齧歯類を挙げることができ、好ましくはマウス、特に好ましくは、同一の遺伝的系統を有するマウスである。この用途に用いられるＴ細胞は、上記条件のものであればいずれのものであってもよいが、Ｒ細胞を確立するために使用した親細胞であり、ＤＯ１１．１０のＴＣＲトランスジェニックマウスの脾臓細胞中のＴ細胞（以下、同系Ｔ細胞という）であることが特に好ましい。
共培養中でのＯＶＡ抗原ペプチドの濃度は、１００ｎＭ〜１０００ｎＭとすることができ、１００〜３００ｎＭであることが好ましい。
更に、ヘルパーＴ細胞のＴＣＲの刺激を行うことによって得られたＴＣＲ刺激Ｔ細胞との共培養でも、同様にＲ細胞を維持及び増殖させることができる。
【００１１】
Ｒ細胞の維持条件としては、細胞の操作及び単離の観点から、上記細胞の培養上清を含有する培養液を用いることが好ましい。
ＯＶＡ抗原ペプチド刺激Ｔ細胞の培養上清又はＴＣＲ刺激Ｔ細胞の培養上清は、Ｒ細胞用培養液中に含有してあればよく、Ｒ細胞の状態に応じて適宜変更することができるが、好ましくは０．０１容量％〜１０容量％、特に０．０１容量％〜０．５容量％とすることができる。
また、ＯＶＡ抗原ペプチド刺激Ｔ細胞の培養上清の代わりにＩＬ−３含有培地を用いる場合、培養液中に含まれるＩＬ−３は、Ｒ細胞の状態に応じて適宜設定可能であるが、例えば約５ｎｇ／ｍｌの濃度であればＲ細胞を維持・増殖させることができる。
【００１２】
Ｒ細胞は、複数のサイトカインに対して高い感受性を有しており、中でもＴｈ２型サイトカインを中心とするＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５などのインターロイキンに対して増殖能を示し、このうち、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、特にＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−９に対して高い増殖能を示す。ただし、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＦＳやＩＦＮ−γに対しては感受性を示さない。
これらのサイトカインに対する感受性は、対応する周知のサイトカイン感受性細胞、例えばＭＣ−９（ＩＬ−３）、ＣＴ．４Ｓ（ＩＬ−４）による感受性試験（それぞれ２０ｐｇ／ｍｌ以上：ＥＬＩＳＡ）よりも高い。例えばＩＬ−３に対しては１〜５０ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−４に対しては１０〜１０００ｐｇ／ｍｌの範囲でそれぞれ検出可能である。
【００１３】
特に、Ｒ細胞は２０〜２００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−９を確実に検出することができる。ＩＬ−９は、マスト細胞の増殖活性を増強する因子として知られ、アレルギー反応を促進する重要なサイトカインであるにも拘わらず、これまでＩＬ−９を高い感度で検出可能な細胞株は得られてない。このため、ＩＬ−９を精度よく検出するにはＥＬＩＳＡや抗体を用いなければならなかった。しかしながら、本発明のＲ細胞を用いることによって、細胞を用いた高い精度の検出が可能になった。
【００１４】
本発明のサイトカイン検出方法における培養工程では、検出対象となる被検試料の存在下で上記細胞株の培養が行われる。サイトカインの含有が疑われる各種液体試料、例えば、緩衝液、培養液、培養上清等を挙げることができ、サイトカイン産生細胞の検出を行う場合には、被検細胞の培養上清（特定試薬による刺激実験後の上清を含む）であってもよい。
被検試料が被検細胞の培養上清であるので、被検試料のみを用いて上記細胞株を培養することができる。この場合には、被検試料を希釈せずに被検試料中のサイトカインを検出することができるため、好ましい。
【００１５】
また、上述の培養上清は、マスト細胞及び好塩基球系細胞株の培養に通常用いられる培養液に添加して検出対象としてもよい。マスト細胞及び好塩基球系細胞株の培養に通常用いられる培養液には、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）や、ＲＰＭＩ１６４０などを挙げることができる。これらの培養液に対しては、通常、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。
【００１６】
培養温度及び湿度などの培養条件は、一般的なマスト細胞又は好塩基球系細胞株に対して用いられる培養条件をそのまま適用することができる。また、培養工程の前に細胞株に対して前培養を行ってもよい。
培養期間は、細胞株の種類や状態によって異なるが、一般に、２日〜７日、好ましくは３〜５日とすることができる。
【００１７】
サイトカインの有無は、上記細胞株の増殖に基づいて検出される。
細胞株の増殖の速度は、通常、この目的のために用いられている各種の手段をそのまま適用することができ、例えば、目視又は顕微鏡による血球計算盤等を用いた細胞数の計測、放射性同位元素（例えば、３Ｈ−チミジン）の取り込み量などを挙げることができる。
【００１８】
本発明のサイトカイン検出方法は、同時にサイトカイン産生細胞のスクリーニング方法としても利用することができる。この場合、被検細胞を培養して、被検試料を調製する調製工程、上記本発明の好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株を、前記被検試料を含有する培養液中で培養する培養工程、前記細胞株の増殖に基づいて、前記被検細胞からサイトカイン産生細胞を選定する選定工程、を含むものであることが、効果的なスクリーニングを行うことができるため、好ましい。
本発明のスクリーニング方法におけるＤＯ１１．１０トランスジェニックマウス脾臓細胞由来好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株、培養工程などについては、前述した事項をそのまま適用することができる。
【００１９】
調製工程では、被検細胞を培養して、上述の被検試料が調製される。被検細胞としては、サイトカインを産生する可能性がある細胞であればいずれであってもよく、例えばＴ細胞、マクロファージ、好塩基球細胞、好酸球細胞、単球、マスト細胞等を挙げることができる。
被検試料としては、上記被検細胞を培養して得られた培養上清の他、前述したものが挙げられる。
選定工程では、被検細胞の増殖に基づいてサイトカイン産生細胞を選択することができる。この増殖については前述した事項をそのまま適用することができる。
【００２０】
また、本スクリーニング方法では、既知のサイトカイン、例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９及びＩＬ−１３からなる群より選択された少なくとも１つのサイトカインを産生する細胞をスクリーニングするものであってもよいが、未知のサイトカインを産生する細胞をスクリーニングするものであってもよい。
未知のサイトカインを産生する細胞をスクリーニングする場合には、既知のサイトカインに感受性を有する感受性細胞株を用いる。これらの既知の感受性細胞株のいずれも増殖能を示さない被検試料を得る工程と、この被検試料を含有する培養液中で、本発明における好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株、好ましくはＲ細胞を培養する工程と、細胞株の増殖に基づいて未知のサイトカインを含有する試験試料から、サイトカイン産生細胞を選定する工程とを含む。
これにより、未知のサイトカインを産生するサイトカイン産生細胞を容易にスクリーニングすることができる。
【００２１】
本発明の好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株が反応する既知のサイトカインについては、本細胞株を用いたスクリーニングの後に、被検試料を濃縮するなどした後にＥＬＩＳＡ法などの既知の方法を用いて定量及び／又は定性を行う。このような方法で、既知のサイトカインの存在が証明できない場合には、新たなサイトカインの存在の可能性が示唆される。このような可能性は、既知のサイトカイン中和抗体を、本発明の好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株を用いた系に充分加えても試験試料中に本発明の好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株の増殖性が認められる場合にも同様である。
【００２２】
本発明によって検出可能なサイトカインは、天然由来のものであってもよく、リコンビナントによって得たものであってもよい。また、マウス由来のものであってもよく、ヒト由来のものであっても、感受性を示すことができる。
本発明では、本発明にかかる好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株は複数のサイトカインに高い感受性を有するので、サイトカインの数及び量が不明な被検試料に対するサイトカインを効率よく検出する場合に好適に使用することができる。
【実施例】
【００２３】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００２４】
［実施例１］
Ｒ細胞の作製
１０週齢のメスＤＯ１１．１０トランスジェニックマウス（米国ワシントン大学、Ken Murphy教授より供与）から脾臓細胞を摘出し、ＲＰＭＩ培地（１０容量％ＦＣＳ、ペニシリンＧカリウム１００Ｕ／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌ添加：以下、単に１０％血清含有培地という）にＯＶＡ抗原ペプチド（ニワトリＯＶＡ（ｃＯＶＡ）３２３−３３９ ペプチド：ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ：配列番号１）を１０００ｎＭ又は２５０ｍＭの最終濃度となるように添加した培養条件下で培養した。
得られた培養物から、ＯＶＡ抗原ペプチド反応性を示すＴ細胞を得た。このＴ細胞を抗ＣＤ３抗体で刺激しながら培養して、培養上清（Ｒ細胞増殖因子含有液：ＲＣＧＦ）を得た。以下、ＲＣＧＦを培養に用いる際には、２日間培養して得たＲＣＧＦを０．５容量％の濃度で新規培地と混合して使用した。
【００２５】
また、得られた培養物に、抗Ｔｈｙ１．２抗体（Pharmingen社製）と補体（ウサギ血清、Pel-Freeze社製）をそれぞれ１μｇ／ｍｌ及び最終１０容量％の濃度で１×１０７個／１００μＬの細胞に対して添加して、約３０分間反応させ、Ｔ細胞を除去し、上記ＲＣＧＦを添加しながら培養を継続して、Ｒ細胞を得た。
Ｒ細胞は、０．５容量％のＲＣＧＦを含有する１０容量％血清含有ＲＰＭＩ培地（又は５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３を含有するＲ細胞用培地）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で培養し、維持した。Ｒ細胞は、培養環境からＲＣＧＦ及びＴ細胞を除去すると、死滅した。
【００２６】
［実施例２］
Ｒ細胞の特徴解析
上記のようにして得られたＲ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０６５２）に対して各種抗体を用いた表面抗原解析を行った。
蛍光色素（ＦＩＴＣ）結合抗体として、抗マウスｃ−ｋｉｔ抗体（e-Bio社製）、抗マウスＦｃεＲＩ抗体（e-Bio社製）、抗マウスＢ２２０抗体（e-Bio社製）、抗マウスＣＤ３抗体（e-Bio社製）、抗マウスＦｃγＲII／III抗体（Pharmingen社製）、抗ＣｌａｓｓＩ抗体（Pharmingen社製）、抗マウスＤＸ５抗体（e-Bio社製）、抗ＣｌａｓｓII抗体（Pharmingen社製）を使用し、それぞれ約５〜１０μｇをＲ細胞１×１０６／１００μＬ対して氷上で３０分間反応させた。抗体の結合状態は、ＦＡＣＳを用いて解析した。
その結果、Ｒ細胞は、ＦｃεＲＩα、ＦｃγＲII／III、ｃ−ｋｉｔ、ＣｌａｓｓＩは陽性、ＣＤ３、Ｂ２２０、ＤＸ５、ＣｌａｓｓIIは陰性であることがわかった。
【００２７】
また光学顕微鏡及び電子顕微鏡を用いて形態観察を行った（図１及び２）。ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）では、Ｒ細胞の細胞質はピンクに染色された。細胞質内には多数の顆粒が詰まっているが、その一部は空胞状顆粒構造を示している（図１（Ａ）参照、矢印）。また、トルイジンブルー染色（ＴＢ染色）では、マスト細胞（図１（Ｃ）参照）と異なり染色されなかった（図１（Ｂ）参照。矢印は空胞構造を示す）。
また図２（Ａ）に示されるように、電子顕微鏡像では、細胞質に多数の嚢胞状構造（矢印）をもち、その内部には、好塩基球（図２（Ｂ）参照）と同様に粒状構造物を含んでいた。また、粒状構造物はやや大型であるが、マスト細胞に見られるような指紋状・渦巻状構造（図２（Ｃ）参照。矢印）は認められなかった。細胞質内に多数の顆粒が詰まっているが、一部は空胞に抜けており（空胞状顆粒構造）、高密度の粒状構造を有するマスト細胞とは異なっていた。
これらのことから、Ｒ細胞は好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株であることが示された。
【００２８】
［実施例３］
Ｒ細胞のサイトカイン感受性実験
９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに、１×１０３個／ウェルの播種密度でＲ細胞を配置し、各種リコンビナントサイトカイン（ＩＬ−２［PeproTech社製］、ＩＬ−３［PeproTech社製］、ＩＬ−４［PeproTech社製］、ＩＬ−７［PeproTech社製］、ＩＬ−９［PeproTech社製］、ＩＬ−１５［PeproTech社製］）又は、スタンダードとしてＲＣＧＦをそれぞれ含有する培地（サイトカインの量は、５０ｐｇ／ｍｌからの１／２段階的希釈。ＲＣＧＦは、０．５容量％含有培地からの１／２段階的希釈）を各ウェルに添加して、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で４８時間培養した。培地には、３Ｈ−チミジンが含まれており、常法に従って、３Ｈの取り込み量を測定した。
【００２９】
図３に示されるように、Ｒ細胞は、被検サイトカインのうち、ＩＬ−３、ＩＬ−４及びＩＬ−９に対して反応を示した。このうちＩＬ−４に対する反応性は濃度依存的であったが、ＩＬ−３及びＩＬ−９に対する反応性は、極微量（６４倍希釈）であって安定した反応性を示した。また、ＩＬ−３に対するＲ細胞の感受性が特に高いことが示された。
従って、Ｒ細胞を用いることによって、培養液中に存在するサイトカインを効率よく検出することができ、またＩＬ−３の検出については、特に高い感度で検出できることは明らかであった。
なお、Ｒ細胞は、ｐｇオーダーのＩＬ−１５に対しては上記のように反応性を示さなかったが、それよりも濃い場合、例えば１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−１５に対しては感受性を示した。
【００３０】
［実施例４］
Ｒ細胞のＩＬ−３に対する反応性
リコンビナントＩＬ−３（カタログ＃１４−８０３１、eBioScience社製）を、０ｐｇ／ｍｌ、１ｐｇ／ｍｌ、５ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ、５０ｐｇ／ｍｌ、２００ｐｇ／ｍｌ及び５００ｐｇ／ｍｌの各濃度に調整した培地に２０μＣｕの３Ｈ−チミジンを含有させて、１×１０４個／ウェルのＲ細胞を、３７℃８〜１２時間、インキュベートした。反応後３Ｈ−チミジンの取り込み量をMicroBeta TRILUX（ＷＡＬＬＡＣ社製）を用いて測定した。結果を図４に示す。
図４に示されるように、Ｒ細胞は、１ｐｇ／ｍｌからＩＬ−３の刺激に応答して増殖能を示し、高い感度を有することが示された。
【００３１】
［実施例５］
Ｔ細胞培養上清中のサイトカインの検出
反応性Ｔ細胞の培養上清中のサイトカインを、Ｒ細胞及びＣＴＬＬ−２を用いて検出した。
反応性Ｔ細胞は、ＤＯ１１．１０の脾臓細胞を、抗原提示細胞と１０００ｎＭのＯＶＡ抗原ペプチドの存在下で１週間培養した後、培養細胞から死細胞を取り除いて調製した。抗原提示細胞としては、１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスから単離されると共に放射線照射により増殖不能化された脾細胞を使用した。
上記のようにして調製された反応性Ｔ細胞２×１０４個／ウェルを、上記と同様にして調製した抗原提示細胞５×１０５個／ウェルと、ＯＶＡ抗原ペプチド（１０００ｎＭ、２５０ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２．５ｎＭ）とを含有する培地１００μＬ中で３７℃４８時間培養し、培養上清を採取した。
この培養上清を、１×１０４個／ウェルのＲ細胞又は１×１０４個／ウェルのＣＴＬＬ−２に、最終濃度１０容量％で加えて３６時間反応させた。それぞれ培地には３Ｈ−チミジンが０．５μＣｕの濃度で含有されており、反応後、常法に従って３Ｈ−チミジンの取り込み量を測定した。コントロールとして、培養上清後の上記反応性Ｔ細胞（２×１０４個／ウェル）に３Ｈ−チミジンを同量で添加して、反応性Ｔ細胞の増殖反応を同様に測定した。結果を図５にそれぞれ示す。
【００３２】
その結果、Ｔ細胞培養上清中のサイトカインは、Ｒ細胞の増殖に基づいて精度よく容易に検出できることが示された（図５参照）。特に、１０ｎＭの抗原ペプチド濃度で刺激した培養上清であっても高い増殖能を示しているので、精度よく検出できることは明らかである。また、このＴ細胞培養上清には、どのようなサイトカインが存在しているか未確認であるが、Ｒ細胞が複数のサイトカインに対して感受性を有しているため、広いレンジで効率よく検出できることも明らかである。
一方、ＣＴＬＬ−２は、ＩＬ−２に対しては高い感受性を有しているが、ＩＬ−２以外のサイトカインにはほとんど反応しないため、ＩＬ−２が培養上清中になければ増殖することができない。このため、本実施例では、培養上清中に全くサイトカインが存在しないのか、ＩＬ−２のみが存在しないのか、を判断することができない。
また、反応性Ｔ細胞は、培養上清中のサイトカインに対して反応性を示していたが、２５０ｎＭ未満の濃度では増殖能が低く、精度よく検出することができない。
【００３３】
このように本発明にかかるＲ細胞は、微量なサイトカインに対して高い感度を有すると共に複数のサイトカインに対して感受性を有するので、被検試料中のサイトカインに検出を効率よく行うことができる。
また、このようなＲ細胞による検出と、既存のサイトカイン検出用細胞株による検出を組み合わせることによって、より一層効率よく被検試料中のサイトカインを検出することができると共に、既存のサイトカイン検出用細胞株のいずれを用いても反応性を示さない被検試料に対してＲ細胞を反応させることによって、未知のサイトカインを検出することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】（Ａ）は本発明にかかるＲ細胞のＨＥ染色像、（Ｂ）は本発明にかかるＲ細胞のＴＢ染色像、（Ｃ）はマスト細胞のＴＢ染色像である。
【図２】（Ａ）は本発明にかかるＲ細胞の電子顕微鏡写真像、（Ｂ）は好塩基球の電子顕微鏡写真像、（Ｃ）はマスト細胞の電子顕微鏡写真像である。
【図３】本発明の実施例にかかるＲ細胞の各種サイトカインに対する反応性を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例にかかるＲ細胞のＩＬ−３に対する反応性を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例にかかる抗原刺激Ｔ細胞培養上清に対するＲ細胞（白丸）、ＣＴＬＬ−２（黒丸）及び反応性Ｔ細胞（白三角）の反応性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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