(57)【要約】【課題】  糖鎖不全ＩｇＡ分子の簡便かつ迅速な定量方法及び定量キットを提供する。【解決手段】  連鎖球菌ＩｇＡ結合ペプチドが固定された担体に糖鎖を含む試料を接触させ、前記糖鎖に特異的に結合する物質を接触させる。そして、前記担体に結合した前記物質の量を測定する。また、少なくとも、連鎖球菌ＩｇＡ結合ペプチドと、連鎖球菌ＩｇＡ結合ペプチドを固定する担体と、糖鎖に特異的に結合する物質によりキットを構成する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
連鎖球菌ＩｇＡ結合ペプチドが固定された担体に糖鎖を含む試料を接触させ、前記糖鎖に特異的に結合する物質を接触させる接触工程と、前記担体に結合した前記物質の量を測定する測定工程と、を含むことを特徴とする試料中の糖鎖不全ＩｇＡ分子の定量方法。
【請求項２】
前記糖鎖に特異的に結合する物質がレクチンであることを特徴とする請求項１記載の定量方法。
【請求項３】
前記糖鎖に特異的に結合する物質が標識化されていることを特徴とする請求項１または２記載の定量方法。
【請求項４】
連鎖球菌ＩｇＡ結合ペプチドと、連鎖球菌ＩｇＡ結合ペプチドを固定する担体と、糖鎖に特異的に結合する物質と、を含むことを特徴とする試料中の糖鎖不全ＩｇＡ分子の定量キット。
【請求項５】
前記糖鎖に特異的に結合する物質がレクチンであることを特徴とする請求項４記載の定量キット。
【請求項６】
前記糖鎖に特異的に結合する物質が標識化されていることを特徴とする請求項４または５記載の定量キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖不全ＩｇＡ分子の定量方法及び定量キットに関する。より詳しくは、連鎖球菌ＩｇＡ結合ペプチド（ＳＡＰ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ＩｇＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）が固定された担体を用いて、糖鎖に特異的に結合する物質を検出することを特徴とする糖鎖不全ＩｇＡ分子の簡便かつ迅速な定量方法及び定量キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＡ腎症とは、腎臓の糸球体メサンギウム領域内に血液由来と考えられるＩｇＡ免疫複合体が沈着することを特徴とする慢性糸球体腎炎である。日本では原発性腎疾患の３０％以上を占め、単一の腎疾患としては最も多く、そのうちの１５〜３０％は予後不良で腎不全へ移行する。本発明者らを含む多数の研究により、ＩｇＡ腎症の発症・進行機序は部分的に明らかになってきたが、未だ不明な点が多い。近年、糖鎖不全ＩｇＡ分子が本症患者の血清中に存在し、この糖鎖不全状態が、病的な免疫複合体の形成や糸球体メサンギウム領域へのＩｇＡ沈着に関与することが明らかになってきている。糖鎖不全ＩｇＡでは、ＩｇＡのヒンジ部に存在するＯ結合型糖鎖におけるガラクトースやシアル酸の含量が、健常人のそれに比べて少ないことが報告されている。また、健常人に比べてＩｇＡ腎症患者は、Ｏ結合型糖鎖の産生においてＮ−アセチルガラクトサミンへのガラクトースの結合を担うβ−１，３−ガラクトシル転移酵素の酵素活性が低下している（非特許文献１）。しかし、糖鎖不全ＩｇＡ分子において、なぜ糖鎖不全が起こるのかの詳細は依然不明のままであった。その主な原因は、糖鎖不全ＩｇＡを検出・定量する方法が複雑かつ高コストであるため、多数の症例での解析や、治療経過による変化を解析することが十分にできないことにあった。
【０００３】
現在まで知られているＩｇＡ分子糖鎖修飾不全の定量方法は、血清からのＩｇＡの分離精製、蛋白質分解酵素を用いたヒンジ領域の分離精製（特許文献１）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置による解析など、きわめて複雑なステップを要する。そのため、大規模な装置と複雑な工程、糖鎖解析に関する高度の知識を要し、非常に専門性が高く、少数の限定された施設で研究が行われてきた。
【０００４】
ＩｇＡの血清からの分離においては、従来はレクチンであるジャカリン（Ｊａｃａｌｉｎ）を用いることが多かった。しかし、ジャカリンはＩｇＡの糖鎖Ｇａｌβ―１，３―ＧａｌＮＡｃを認識するレクチンであるため、精製の段階でガラクトースをもつＩｇＡが選択的に精製されるというバイアスが生じ、糖鎖不全ＩｇＡを検出するという目的には適していなかった。
【非特許文献１】日腎会誌２００２、４４：５１４−５２３
【特許文献１】特開平８−２２８７９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したように、糖鎖不全ＩｇＡ分子がＩｇＡ腎症の疾患に関与していることは明らかであり、これを経時的にかつ定量性をもって簡便に定量できれば、病態解析のみならず、診断治療にも極めて有用である。そこで本発明は、糖鎖不全ＩｇＡ分子の簡便かつ迅速な定量方法及び定量キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を鑑みて鋭意検討した結果、ＩｇＡのＦｃ領域を特異的に認識する連鎖球菌ＩｇＡ結合ペプチド（ＳＡＰ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ＩｇＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を用いて、糖鎖不全ＩｇＡ分子を定量する方法を見出し、本発明を完成するに到った。すなわち、本発明は、以下の通りである。
【０００７】
請求項１の試料中の糖鎖不全ＩｇＡ分子の定量方法は、連鎖球菌ＩｇＡ結合ペプチドが固定された担体に糖鎖を含む試料を接触させ、前記糖鎖に特異的に結合する物質を接触させる接触工程と、前記担体に結合した前記物質の量を測定する測定工程と、を含むことを特徴とする。
【０００８】
請求項２の定量方法は、請求項１において、前記糖鎖に特異的に結合する物質がレクチンであることを特徴とする。
【０００９】
請求項３の定量方法は、請求項１または２において、前記糖鎖に特異的に結合する物質が標識化されていることを特徴とする。
【００１０】
請求項４の試料中の糖鎖不全ＩｇＡ分子の定量キットは、連鎖球菌ＩｇＡ結合ペプチドと、連鎖球菌ＩｇＡ結合ペプチドを固定する担体と、糖鎖に特異的に結合する物質と、を含むことを特徴とする。
【００１１】
請求項５の定量キットは、請求項４において、前記糖鎖に特異的に結合する物質がレクチンであることを特徴とする。
【００１２】
請求項６の定量キットは、請求項４または５において、前記糖鎖に特異的に結合する物質が標識化されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
請求項１の試料中の糖鎖不全ＩｇＡ分子の定量方法によれば、その構成が単純であり、その構成要素も少ないことより、糖鎖不全ＩｇＡ分子を簡便かつ迅速に定量できる。本定量方法は、病態解析のみならず、診断治療にも極めて有用である。
【００１４】
請求項２の定量方法によれば、糖鎖に特異的に結合する物質をレクチンとすることにより、より正確に糖鎖不全ＩｇＡ分子を検出できる。
【００１５】
請求項３の定量方法によれば、糖鎖に特異的に結合する物質を標識化することにより、糖鎖不全ＩｇＡ分子を簡便かつ迅速に定量することができる。
【００１６】
請求項４の試料中の糖鎖不全ＩｇＡ分子の定量キットによれば、その構成が単純であり、その構成要素も少ないことより、糖鎖不全ＩｇＡ分子を簡便かつ迅速に定量する定量キットを提供できる。また、本定量キットは、病態解析のみならず、診断治療にも極めて有用である。
【００１７】
請求項５の定量キットによれば、糖鎖に特異的に結合する物質をレクチンとすることにより、より正確に糖鎖不全ＩｇＡ分子を検出する定量キットを提供できる。
【００１８】
請求項６の定量キットによれば、糖鎖に特異的に結合する物質を標識化することより、糖鎖不全ＩｇＡ分子を簡便かつ迅速に定量する定量キットを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明について説明する。
１．糖鎖不全ＩｇＡ分子の定量方法
本発明の試料中の糖鎖不全ＩｇＡ分子の定量方法は、連鎖球菌ＩｇＡ結合ペプチドが固定された担体に糖鎖を含む試料を接触させ、前記糖鎖に特異的に結合する物質を接触させる接触工程と、前記担体に結合した前記物質の量を測定する測定工程と、を含むことを特徴とする。本発明により、糖鎖不全ＩｇＡ分子の簡便かつ迅速な定量方法が可能となった。
【００２０】
糖鎖不全ＩｇＡは、ＩｇＡのヒンジ部に存在するＯ結合型糖鎖におけるガラクトースやシアル酸の含量が、健常人のそれに比べて少ないヒトＩｇＡである。前述のように、糖鎖不全ＩｇＡ分子は、ＩｇＡ腎症に関与していることがわかっている。
【００２１】
連鎖球菌ＩｇＡ結合ペプチド（ＳＡＰ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ＩｇＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（以下、ＳＡＰと称する）は、ヒトＩｇＡのＦｃ領域を特異的に認識し結合する、連鎖球菌由来のペプチドである（The Journal of Immunology, 2002, 169: 1357-1364）。ＳＡＰカラムにおいて、９９％以上のヒトＩｇＡが吸着することが報告されており、ＳＡＰは、ヒトＩｇＡと高いアフィニティーを有するペプチドである。
【００２２】
（Ａ）ＳＡＰが固定された担体
担体の形状としては、プレート、チューブ、ビーズ、ゲル等が挙げられる。例えば、９６ウェルのマイクロプレートを担体として用いて、多数の試料を一挙に定量してもよい。
【００２３】
担体をＳＡＰに固定させる方法として、物理的吸着法、共有結合法等の当技術分野で従来から知られている方法を用いることができる。例えば、ＳＡＰをｐＨ７〜９程度の緩衝液（例えばリン酸緩衝液、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）、炭酸緩衝液等）に溶解して固相に加え、４℃で一晩静置してインキュベートすることにより固定できる。
【００２４】
担体にＳＡＰを固定した後、ブロッキング物質を担体に添加して、ＳＡＰが固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン等が挙げられる。
【００２５】
以上の方法で、ＳＡＰが固定された担体を製造することができる。
（Ｂ）接触工程
接触工程について述べる。試料としては、糖鎖不全ＩｇＡ分子を含有する又は含有する可能性があるものである限り限定されない。具体的には、例えば、血清等の生体試料が挙げられる。
【００２６】
まず、ＳＡＰを固定した担体と試料を接触させる。ＳＡＰは前述のようにＩｇＡと高いアフィニティーを有するペプチドであるため、ＳＡＰを固定した担体と試料を接触させることにより、試料中のＩｇＡは、ＳＡＰと特異的に反応し、結合する。そして、ＩｇＡ分子は、ＳＡＰを介して担体に結合される。このとき、ＳＡＰに結合した糖鎖不全ＩｇＡ分子は、ヒンジ領域でＮ‐アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｆｃ領域でマンノース（Ｍａｎ）等を露出する。これらは、糖鎖不全ＩｇＡ分子がガラクトースやシアル酸が欠乏した際に見られるものである。
【００２７】
次の段階で、ＩｇＡが結合したＳＡＰが固定された担体に、露出した糖鎖に特異的に結合する物質を接触させる。これにより、糖鎖に特異的に結合する物質は、糖鎖不全ＩｇＡ分子と特異的に反応し、結合する。そして、糖鎖に特異的に結合する物質は、糖鎖不全ＩｇＡ分子及びＳＡＰを介して担体に結合される。糖鎖に特異的に結合する物質としては、これらＧａｌＮＡｃ、Ｍａｎ等と特異的に結合する物質がよい。例えば、ＳＢＡ（ｓｏｙｂｅａｎ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＣｏｎＡ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ）等のレクチンを挙げることができる。ＳＢＡは、ＧａｌＮＡｃに特異的に結合するレクチンである。また、ＣｏｎＡは、Ｍａｎに特異的に結合するレクチンである。
【００２８】
これらを接触させたとき、十分に反応させるため、約０℃〜約４５度、例えば３７℃程度でインキュベートすることが好ましい。インキュベートの時間は、十分に反応できる限りにおいて特に限定されない。
【００２９】
また接触工程の反応の後は、担体の表面を洗浄液で洗浄することが好ましい。この洗浄は、前述の特異的な結合をしなかった分子を除くためであり、糖鎖に特異的に結合する物質、ＩｇＡ分子、ＳＡＰ等が遊離しない条件で行う。洗浄液としては、特に限定されないが、例えば、Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を添加した緩衝液(例えばリン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液等)を用いることができる。
【００３０】
（Ｃ）測定工程
以上の接触工程を経た後、定量工程に移行する。定量工程は、担体に結合した糖鎖に特異的に結合する物質を定量する工程である。なお、糖鎖に特異的に結合する物質は標識物質で標識化されていることが、測定工程において測定が容易となることから好ましい。糖鎖に特異的に結合する物質は、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等の従来から当技術分野で知られている標識をすることができる。例えば、ビオチンで糖鎖に特異的に結合する物質を標識した場合、ストレプトアビジン等を結合させた酵素（例えばペルオキシダーゼ等）を添加してビオチンとストレプトアビジンとを結合させ、次いでストレプトアビジン等を結合させた酵素の基質や発色基質等を加え、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化を測定することができる。また、糖鎖に特異的に結合する物質を蛍光物質や化学発光物質で標識化した場合は、蛍光や発光を測定することができる。
【００３１】
本発明の定量方法は、試料による上記測定結果と、既知の標準物質による上記測定結果と、を相関させることができることによる。つまり、予め既知濃度の糖鎖標準液（例えば、ＧａｌＮＡｃを含む糖鎖）による上記の測定結果より検量線を作成することにより、試料における前記糖鎖の定量が可能となる。前述のように、ＳＡＰに結合した糖鎖不全ＩｇＡ分子は、ヒンジ領域でＧａｌＮＡｃ、Ｆｃ領域でＭａｎ等を露出するため、これらを定量することにより、糖鎖不全ＩｇＡ分子を定量できる。
【００３２】
２．糖鎖不全ＩｇＡ分子の定量キット
本発明の試料中の糖鎖不全ＩｇＡ分子の定量キットは、連鎖球菌ＩｇＡ結合ペプチドと、連鎖球菌ＩｇＡ結合ペプチドを固定する担体と、糖鎖に特異的に結合する物質と、を含むことを特徴とする。本発明の糖鎖不全ＩｇＡ分子の定量方法と同様に、以下連鎖球菌ＩｇＡ結合ペプチドをＳＡＰと称する。ＳＡＰと、ＳＡＰを固定する担体と、糖鎖に特異的に結合する物質についての説明は、本発明糖鎖不全ＩｇＡ分子の定量方法と同様である。
【００３３】
本発明定量キットは、上記ＳＡＰと、ＳＡＰを固定する担体及び糖鎖に特異的に結合する物質を少なくとも含む限りにおいて特に限定されず、さらに検量線作成のための標準となる既知濃度の糖鎖に特異的に結合する物質、糖鎖に特異的に結合する物質を標識する試薬、糖鎖に特異的に結合する物質を検出する試薬、又は標識された糖鎖を検出する試薬等を構成成分として加えることができる。また、ＳＡＰを予め担体に固定し、又は糖鎖に特異的に結合する物質に予め標識し、定量キットの構成要素とすることができる。これらの構成成分の他に、ブロッキング物質、洗浄液、検体希釈液、酵素反応停止液、器具（マイクロタイタープレート、ピペット等）等が含まれていてもよい。
【００３４】
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明定量方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
【００３５】
以下、具体的な実施例について説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
１．材料
ルミヌンク化学発光用プレート：（ルミヌンクＦ９６−ｐｏｌｙｓｏｒｐ白＃４３６１１１）。
洗浄液：Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ）：１ｍｌの１０％Ｔｗｅｅｎ２０を２００ｍｌのＰＢＳと混合した。
ブロッキング溶液および血清希釈用バッファー（１％ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）：ＢＳＡ０．５ｇをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳ５０ｍｌ中に溶解して冷凍保存をした。数ヶ月保存可能であった。
ビオチン化レクチン溶液（ブロッキング溶液中に５μｇ／ｍｌ）：ビオチン化レクチン（１ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌとって、２ｍｌの１％ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳに溶解した。
ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ブロッキング溶液中に５μｇ／ｍｌ）：ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを４μｌとって、２ｍｌの１％ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳに溶解した。
ペルオキシダーゼ用発光基質：ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＲＰＮ２１３２）(Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社)
【００３７】
２．ＥＬＩＳＡプレートへのＳＡＰペプチドの固定
ＳＡＰペプチド５ｍｇをＰＢＳ（ｐＨ７．５）５０ｍｌで溶解（１００μｇ／ｍｌ）させた。１ｍｌずつ分注した後、−８０℃で凍結保存した。ルミヌンク化学発光用プレートに１ウェルあたり１００μｌずつ前記ＳＡＰ溶液を入れ、プレートシーラーでシールした。そして、４℃で一晩インキュベートした。その後、反応後ＳＡＰ溶液を除き、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ洗浄液で３回洗浄した。ブロッキング溶液（１％ＢＳＡ−Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）２００μｌを前記プレートの各ウェルに加え、室温１時間静置した後、ブロッキング溶液を除去した。
【００３８】
３．ＩｇＡ分子、ビオチン化レクチンの吸着
ブロッキング溶液で５００倍希釈した血清を、各ウェルに１００μｌ加えた。室温で１時間インキュベートした後、希釈血清を除き、洗浄液で５回洗浄した（５回目は１％ＢＳＡ−Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）。ビオチン化レクチン溶液として、Ｂ−１２３５（ビオチン化レクチン：１％ＢＳＡ−ＰＢＳ）を１００μｌ加えた。Ｂ−１２３５はｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のＶｉｃｉａ  ｖｉｌｌｏｓａレクチンであり、ガラクトースが結合していないＮ−アセチルガラクトサミンへ結合する。Ｂ−１２３５は、原液２ｍｇ／ｍｌを４００倍希釈し５μｇ／ｍｌに調整した。対照のＨＲＰ抗ＩｇＡを用いるウェルにはブロッキング溶液を入れた。室温１時間インキュベートし、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで５回洗浄した。
【００３９】
４．化学発光による測定
ＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液（ＶＥＣ ＳＡ−５００４ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ, ＨＲＰ結合、１ｍｇ／ｍｌ、１４０００）（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ―Ｔｗｅｅｎで２μｇ／ｍｌ（５００倍）に希釈）を１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートした。対照のＨＲＰ抗ＩｇＡを用いるウェルには１：１００００希釈のＨＲＰ抗ＩｇＡを入れた。その後、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。プレートの各ウェルに検出溶液（ＥＣＬ  ｐｌｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１００μｌ加え、反応開始後５分よりＭｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０にて化学発光を検出した。
【００４０】
５．結果
不全ＩｇＡ糖鎖を有するＩｇＡ腎症患者１１人と、コントロールとして健常者１１人とに上記１〜４による工程を実施した。図１、図２にその結果を示す。図１、図２より、健常者と比較して、ＩｇＡ腎症患者のＮ−アセチルガラクトサミン量は有意に高いことが明らかとなった。このことは、連鎖球菌ＩｇＡ結合ペプチド（ＳＡＰ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ＩｇＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）が固定された担体を用いて、糖鎖に特異的に結合する物質を検出することを特徴とする本発明の糖鎖不全ＩｇＡ分子の定量方法の有効性を示している。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、不全ＩｇＡ糖鎖を有するＩｇＡ腎症患者と健常者による化学発光の結果より得られた箱ヒゲ図を示した図である。ＩｇＡＮは、不全ＩｇＡ糖鎖を有するＩｇＡ腎症患者、ｃｏｎｔｒｏｌは健常者を表す。
【図２】図２は、不全ＩｇＡ糖鎖を有するＩｇＡ腎症患者と健常者による化学発光についてのｔ検定の結果を示した図である。
【図１】
2007024661.tif 000002
【図２】
2007024661.tif 000003