(57)【要約】【課題】遺伝子の反復配列に起因する転写抑制を解除する方法およびキット等を提供し、タンパク質を大量に生産する系を樹立する。【解決手段】本発明の方法は、目的タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導するプロモーター活性を向上させる工程を含む。本発明の方法は、(a)遺伝子増幅が起こった細胞を漸増濃度の薬剤を含有する培地で培養し選抜する、(b)目的タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導するプロモーター活性を向上させる、(c)遺伝子増幅が起こった細胞を5-aza-2'-deoxycytidineで処理を行ないＤＮＡのメチル化のレベルを低下させる、(d)遺伝子増幅がダブルマイニュート染色体上で起こっている上記哺乳動物細胞を選択する、のいずれか１つ以上の工程がさらに含まれていてもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させる方法であって、
当該哺乳動物細胞は、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、並びに第６のポリヌクレオチドが同時に導入されており、
第６のポリヌクレオチドにおいて、プロモーター領域と発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとが制御可能に連結されており、
当該第１および第６のポリヌクレオチドを導入する際に、当該プロモーターの転写活性化因子をコードする第７のポリヌクレオチドを上記哺乳動物細胞へ同時に導入する工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、
上記第６のポリヌクレオチドは薬剤耐性遺伝子を含み、
上記哺乳動物細胞を漸増濃度の薬剤を含有する培地中で培養する工程
を包含することを特徴とする方法。
【請求項３】
上記遺伝子増幅がダブルマイニュート染色体上で起こっている上記哺乳動物細胞を選択する工程
を包含することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
5-aza-2'-deoxycytidineで上記哺乳動物細胞を処理する工程を包含することを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
上記真核生物細胞内で機能する複製起点が、c-myc遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、またはβ-グロビン遺伝子座の複製起点に由来することを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記核マトリックス結合領域が、Igκ遺伝子座、SV40初期領域、またはジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域に由来することを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させるためのキットであって、
真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、
プロモーター領域を含むポリヌクレオチド、および
当該プロモーターの転写活性化因子をコードする第７のポリヌクレオチド
を具備することを特徴とするキット。
【請求項８】
5-aza-2'-deoxycytidineをさらに含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
上記真核生物細胞内で機能する複製起点が、c-myc遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、またはβ-グロビン遺伝子座の複製起点に由来することを特徴とする請求項７または８に記載のキット。
【請求項１０】
上記核マトリックス結合領域が、Igκ遺伝子座、SV40初期領域、またはジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域に由来することを特徴とする請求項７ないし９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１】
真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチドと、
プロモーター領域と発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとが制御可能に連結されてなる第６のポリヌクレオチドと、
当該プロモーターの転写活性化因子をコードする第７のポリヌクレオチドと
が哺乳動物細胞に導入されてなる、形質転換体。
【請求項１２】
上記真核生物細胞内で機能する複製起点が、c-myc遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、またはβ-グロビン遺伝子座の複製起点に由来することを特徴とする請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
上記核マトリックス結合領域が、Igκ遺伝子座、SV40初期領域、またはジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域に由来することを特徴とする請求項１１または１２に記載の形質転換体。
【請求項１４】
上記哺乳動物細胞が、COLO 320DM細胞、COLO 320HSR細胞、Hela細胞、およびCHO細胞からなる群から選択されるいずれかの細胞である、請求項１１ないし１３のいずれか１項に記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させる方法およびキット等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本発明者は、哺乳動物複製開始領域（IR; initiation region）と核マトリックス結合領域（MAR; matrix attachment region）を持つプラスミド（以下「IR/MAR プラスミド」という）をヒト由来がん細胞（COLO 320 大腸がん細胞株、およびHeLa細胞株）にリポフェクション法で導入し、プラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子（ブラスティサイジン（Blasticidine）あるいはネオマイシン（Neomycine））を利用して選択するだけで、所望のタンパク質をコードする遺伝子（目的遺伝子）の細胞内コピー数を１万コピー程度にまで増幅できること、および目的遺伝子はIR/MAR プラスミドに対して同一の遺伝子構築物（シス）として導入した場合であっても、別の遺伝子構築物（トランス）として導入した場合であっても、高度に増幅することができるということを発見した（特許文献１、特許文献２、非特許文献１、および非特許文献２参照）。
【０００３】
しかしながら、上記IR/MAR プラスミド、および目的遺伝子を導入した細胞株について、目的遺伝子からのｍＲＮＡの転写量を定量したところ、目的遺伝子のコピー数が増加しているにも関わらず、ｍＲＮＡの転写量が増加していないということがわかった。このことは、目的遺伝子を含む領域が高度に増幅することによる反復配列に起因して転写の抑制が起こっているということが考えられた。
【０００４】
遺伝子の反復配列に起因する転写抑制を解除する方法としては、例えばtrichostatin A等のヒストンアセチル化酵素阻害剤で細胞を処理する方法が知られている（非特許文献３参照）。
【特許文献１】特開２００３−２４５０８３号公報（公開日：平成１５（２００３）年９月２日）
【特許文献２】特開２００４−３３７０６６号公報（公開日：平成１６（２００４）年１２月２日）
【非特許文献１】Noriaki Shimizu, et al. (2001) Plasmids with a Mammalian Replication Origin and a Matrix Attachment Region Initiate the Event Similar to Gene Amplification. Cancer Research vol.61, no.19, p6987-6990.
【非特許文献２】Noriaki Shimizu, et al (2003) Amplification of plasmids containing a mammalian replication initiation region is mediated by controllable conflict between replication and transcription. Cancer Research, vol.63, no.17, p5281-5290.
【非特許文献３】McBurney, M. W. et al, Exp Cell Res (2002), vol 274, p1-8
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のごとく、目的遺伝子を増幅することによりタンパク質を大量に生産させるために、その増幅した目的遺伝子を含むポリヌクレオチドを増幅させた場合であっても、反復配列が生じてしまえば目的遺伝子の転写が抑制されてしまい、最終目的であるタンパク質の発現に至らないという問題点がある。
【０００６】
しかしながら、上記非特許文献３に開示されたtrichostatin A等のヒストンアセチル化酵素阻害剤で細胞を処理する方法のみでは、数千から１万コピー程度にまで増幅した遺伝子の反復配列に起因する転写抑制を十分に解除することができなかった。
【０００７】
そこで本発明は、上記遺伝子の反復配列に起因する転写抑制を解除する方法およびキット等を提供し、遺伝子増幅により有用タンパク質を大量に生産する系を樹立することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく、上記IR/MAR プラスミドの系を用いて目的遺伝子の増幅を行ない、反復配列を生じた場合であっても、転写抑制が起こることなくタンパク質を発現することができる方法について鋭意検討を行なった。その結果、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち本発明にかかる方法は、上記課題を解決するために、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させる方法であって、当該哺乳動物細胞は、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、並びに発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドが同時に導入されており、当該第１および第２のポリヌクレオチドを導入する際に、１０ｋｂｐ以上の長さを有する第３のポリヌクレオチド、またはインシュレーター配列を含む第４のポリヌクレオチドの少なくとも一方を上記哺乳動物細胞に導入する工程を包含することを特徴としている。
【００１０】
また本発明にかかる方法は、上記課題を解決するために、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させる方法であって、当該哺乳動物細胞は、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、並びに第５のポリヌクレオチドが同時に導入されており、第５のポリヌクレオチドは、発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド、および薬剤耐性遺伝子を含んでおり、上記哺乳動物細胞を漸増濃度の薬剤を含有する培地中で培養する工程を包含することを特徴としている。
【００１１】
また本発明にかかる方法は、上記課題を解決するために、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させる方法であって、当該哺乳動物細胞は、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、並びに第６のポリヌクレオチドが同時に導入されており、第６のポリヌクレオチドにおいて、プロモーター領域と発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとが制御可能に連結されており、当該プロモーターの転写活性化因子をコードする第７のポリヌクレオチドを上記哺乳動物細胞に導入して転写活性化因子を発現させる工程を包含することを特徴としている。
【００１２】
また本発明にかかる方法は、上記課題を解決するために、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させる方法であって、当該哺乳動物細胞は、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、並びに第８のポリヌクレオチドが同時に導入されており、第８のポリヌクレオチドは、発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドおよびＬｏｘＰ遺伝子を含み、Cre Recombinase遺伝子を含む第９のポリヌクレオチドを上記哺乳動物細胞に導入してCre Recombinaseを発現させる工程を包含することを特徴としている。
【００１３】
また本発明にかかる方法は、上記課題を解決するために、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させる方法であって、当該哺乳動物細胞は、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、並びに発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドが同時に導入されており、5-aza-2'-deoxycytidineで上記哺乳動物細胞を処理する工程を包含することを特徴としている。
【００１４】
また本発明にかかる方法は、上記課題を解決するために、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させる方法であって、5-aza-2'-deoxycytidineで上記哺乳動物細胞を処理する工程を包含することを特徴としている。
【００１５】
また本発明にかかる方法は、上記課題を解決するために、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させる方法であって、当該哺乳動物細胞は、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、並びに発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドが同時に導入されており、上記遺伝子増幅がダブルマイニュート染色体上で起こっている上記哺乳動物細胞を選択する工程を包含することを特徴としている。
【００１６】
また本発明にかかる方法は、上記課題を解決するために、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させる方法であって、上記遺伝子増幅がダブルマイニュート染色体上で起こっている上記哺乳動物細胞を選択する工程を包含することを特徴としている。
【００１７】
また本発明にかかる方法は、上記課題を解決するために、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させる方法であって、当該哺乳動物細胞は、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、並びに第６のポリヌクレオチドが同時に導入されており、第６のポリヌクレオチドにおいて、プロモーター領域と発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとが制御可能に連結されており、当該第１および第６のポリヌクレオチドを導入する際に、当該プロモーターの転写活性化因子をコードする第７のポリヌクレオチドを上記哺乳動物細胞へ同時に導入する工程を包含することを特徴としている。
【００１８】
また本発明にかかる方法は、上記課題を解決するために、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させる方法であって、当該哺乳動物細胞は、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、並びに発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドが同時に導入されており、上記遺伝子増幅がダブルマイニュート染色体上で起こっている上記哺乳動物細胞を選択する工程、および5-aza-2'-deoxycytidineで上記哺乳動物細胞を処理する工程を包含することを特徴としている。
【００１９】
また本発明にかかる方法は、上記課題を解決するために、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させる方法であって、当該哺乳動物細胞は、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、並びに第６のポリヌクレオチドが同時に導入されており、第６のポリヌクレオチドにおいて、プロモーター領域と発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとが制御可能に連結されており、当該第１および第６のポリヌクレオチドを導入する際に、当該プロモーターの転写活性化因子をコードする第７のポリヌクレオチドを上記哺乳動物細胞へ同時に導入する工程、および5-aza-2'-deoxycytidineで上記哺乳動物細胞を処理する工程を包含することを特徴としている。
【００２０】
また本発明にかかる方法は、上記真核生物細胞内で機能する複製起点が、c-myc遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、またはβ-グロビン遺伝子座の複製起点に由来するものであってもよい。
【００２１】
また本発明にかかる方法は、上記核マトリックス結合領域が、Igκ遺伝子座、SV40初期領域、またはジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域に由来するものであってもよい。
【００２２】
一方、本発明にかかるキットは、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させるためのキットであって、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチドと、１０ｋｂｐ以上の長さを有する第３のポリヌクレオチド、またはインシュレーター配列を含む第４のポリヌクレオチドの少なくとも一方と、を具備することを特徴としている。
【００２３】
また本発明にかかるキットは、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させるためのキットであって、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、プロモーター領域を含むポリヌクレオチド、および当該プロモーターの転写活性化因子をコードする第７のポリヌクレオチドを具備することを特徴とするキットであってもよい。
【００２４】
また本発明にかかるキットは、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させるキットであって、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、ＬｏｘＰ遺伝子を含むポリヌクレオチド、およびCre Recombinase遺伝子を含む第９のポリヌクレオチドを具備することを特徴とするキットであってもよい。
【００２５】
また本発明にかかるキットは、上記構成に加え、5-aza-2'-deoxycytidineをさらに含む、キットであることが好ましい。
【００２６】
また本発明にかかるキットは、上記真核生物細胞内で機能する複製起点が、c-myc遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、またはβ-グロビン遺伝子座の複製起点に由来するものであってもよい。
【００２７】
また本発明にかかるキットは、上記核マトリックス結合領域が、Igκ遺伝子座、SV40初期領域、またはジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域に由来するものであってもよい。
【００２８】
一方、本発明にかかる形質転換体は、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチドと、発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドと、１０ｋｂｐ以上の長さを有する第３のポリヌクレオチド、またはインシュレーター配列を含む第４のポリヌクレオチドの少なくとも一方とが哺乳動物細胞に導入されてなる、形質転換体である。
【００２９】
また本発明にかかる形質転換体は、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチドと、プロモーター領域と発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとが制御可能に連結されてなる第６のポリヌクレオチドと、当該プロモーターの転写活性化因子をコードする第７のポリヌクレオチドとが哺乳動物細胞に導入されてなる、形質転換体であってもよい。
【００３０】
また本発明にかかる形質転換体は、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチドと、発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドおよびＬｏｘＰ遺伝子を含む第８のポリヌクレオチドと、Cre Recombinase遺伝子を含む第９のポリヌクレオチドとが哺乳動物細胞に導入されてなる、形質転換体であってもよい。
【００３１】
また本発明にかかる形質転換体は、上記真核生物細胞内で機能する複製起点が、c-myc遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、またはβ-グロビン遺伝子座の複製起点に由来するものであってもよい。
【００３２】
また本発明にかかる形質転換体は、上記核マトリックス結合領域が、Igκ遺伝子座、SV40初期領域、またはジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域に由来するものであってもよい。
【００３３】
また本発明にかかる形質転換体は、上記哺乳動物細胞が、COLO 320DM細胞、COLO 320HSR細胞、Hela細胞、およびCHO細胞からなる群から選択されるいずれかの細胞であってもよい。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させることができる。それゆえ本発明によれば、遺伝子増幅の手法により、有用タンパク質を大量に生産する系を樹立することができるという効果を奏する。
【００３５】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、次の説明で明白になるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明の実施の形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３７】
本発明は、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させる方法である。ここで「反復配列」とは、ある単位塩基配列がリピートした塩基配列のことを意味する。かかる反復配列が染色体上に存在すると、その遺伝子領域のヘテロクロマチン化が起こり、遺伝子の転写が抑制される場合があることが知られている。
【００３８】
本発明者は、既述のごとく、哺乳動物複製開始領域（IR; initiation region）と核マトリックス結合領域（MAR; matrix attachment region）を持つプラスミド（以下「IR/MAR プラスミド」という）をヒト由来がん細胞（COLO 320 大腸がん細胞株、およびHeLa細胞株）にリポフェクション法で導入し、プラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子（BlasticidineあるいはNeomycine ）を利用して選択するだけで、所望のタンパク質をコードする遺伝子（目的遺伝子）の細胞内コピー数を１万コピー程度にまで増幅できる系（以下、「高度遺伝子増幅系」という）を開発した（特許文献１、特許文献２、非特許文献１、および非特許文献２参照）。
【００３９】
しかし、かかる高度遺伝子増幅系では、後述する比較例１に示すごとく、目的遺伝子であるブラスティサイジン抵抗性遺伝子のコピー数が増加しても、ブラスティサイジン抵抗性遺伝子のｍＲＮＡへの転写量の増加には至らないということが判明した。この現象は、目的遺伝子を含む遺伝子領域が高度に増幅することによって生じる反復配列により、転写抑制が起こっているということが考えられた。本発明は、(a)かかる反復配列に起因する転写抑制を解除すること、または(b)その大多数が上記転写抑制を起こしている細胞集団（クローン集団）の中から当該転写抑制が起こっていない（または転写抑制の程度が低い）細胞（クローン）を選択することによって、発現抑制されているタンパク質を発現させるためになされたものである。
【００４０】
したがって本発明において「発現抑制されているタンパク質を発現させる方法」とは、反復配列に起因する転写抑制を解除することによって発現抑制されているタンパク質を発現させる方法のみならず、その大多数が上記転写抑制を起こしている細胞集団（クローン集団）の中から当該転写抑制が起こっていない（または転写抑制の程度が低い）細胞（クローン）を選択することによって所望するタンパク質を発現させることをも含む意味である。
【００４１】
ここで本発明において「遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞」は、細胞内で遺伝子（ポリヌクレオチド）の増幅が誘導された哺乳動物細胞のことである。当該哺乳動物細胞としては、例えば上記IR/MAR プラスミドを導入した哺乳動物細胞が挙げられる。また上記哺乳動物細胞は、特に限定されるものではなく、例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞（入手先：例えば、ATCC CCL-61、RIKEN RCB0285、RIKEN RCB0403等）が挙げられる。ただし、上記哺乳動物細胞としては、無限増殖能を有する腫瘍細胞が特に好ましい。上記腫瘍細胞としては、例えば、ＨｅＬａ細胞（入手先：例えば、ATCC CCL-2、ATCC CCL-2.2、RIKEN RCB0007、RIKEN RCB0191等）、ヒト大腸がんCOLO 320DM細胞（入手先：例えば、ATCC CCL-220）、ヒト大腸がんCOLO 320HSR細胞（入手先：例えば、ATCC CCL-220.1）、ＮＳ０細胞（入手先：例えば、RIKEN RCB0213）等が挙げられる。
【００４２】
〔実施の形態１〕
本実施の形態にかかる方法は、上記遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞が、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、並びに発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドが同時に導入されており、当該第１および第２のポリヌクレオチドを導入する際に、１０ｋｂｐ以上の長さを有する第３のポリヌクレオチド、またはインシュレーター配列を含む第４のポリヌクレオチドの少なくとも一方を上記哺乳動物細胞に導入する工程を包含している。
【００４３】
第１のポリヌクレオチドには、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域が含まれている。かかる第１のポリヌクレオチドに含まれる複製起点としては真核生物細胞内で機能するものであれば特に限定されるものではなく、c-myc遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、β-グロビン遺伝子座等の複製起点が挙げられる。なおc-myc遺伝子座の複製起点については、例えば『McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res. vol. 18, p1233-1242 (1990) 』に記載されている。ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の複製起点については、例えば『Dijkwel, P.A. et al., Mol. Cell. Biol. vol.8, p5398-5409 (1988) 』に記載されている。β-グロビン遺伝子座の複製起点については、例えば『Aladjem, M. et al., Science vol. 281, p1005-1009 (1998) 』に記載されている。
【００４４】
またかかる第１のポリヌクレオチドに含まれる核マトリックス結合領域としては、真核生物細胞内で機能するものであれば特に限定されるものではなく、Igκ遺伝子座、SV40初期領域、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座等の核マトリックス結合領域に由来する配列が挙げられる。なお、Igκ遺伝子座の核マトリックス結合領域については、例えば『Tsutsui, K. et al., J. Biol. Chem. vol. 268, p12886-12894 (1993) 』に記載されている。SV40初期領域の核マトリックス結合領域については、例えば『Pommier, Y. et al., J. Virol., vol 64, p419-423 (1990) 』に記載されている。ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域については、例えば『Shimizu N. et al., Cancer Res. vol. 61, p6987-6990 』に記載されている。
【００４５】
なお第１のポリヌクレオチドには、この他、適宜目的に応じて、大腸菌内でクローニングを行なうために必要な配列、あるいは、マーカータンパク質として薬剤耐性遺伝子(ブラスティサイジン抵抗性遺伝子、ネオマイシン抵抗性遺伝子等)または緑色蛍光タンパク質遺伝子等を選択マーカーとして有してもよい。これらの選択マーカーを指標として第１のポリヌクレオチドが導入された細胞を選別できる。
【００４６】
一方、第２のポリヌクレオチドは、発現させるべきタンパク質をコードするポリヌクレオチド（適宜「目的タンパク質をコードする遺伝子」と称する）であり、特に限定されるものではなく、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適宜選択の上、採用すればよい。当該ポリヌクレオチドは、その塩基配列情報を元にＰＣＲ等の公知の技術を用いて取得すればよい。なお本発明の説明において「発現させるべきタンパク質」のことを「目的タンパク質」と称する。
【００４７】
上記第１のポリヌクレオチド、および発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドが、哺乳動物細胞へ同時に導入されることによって、本発明者が特許文献１等に開示した「高度遺伝子増幅系」を構成することができ、当該細胞は第２のポリヌクレオチドを増幅することが可能となる。ここで、上記第１および第２のポリヌクレオチドが同時に導入された哺乳動物細胞は、本発明でいう「遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞」である。当該第１および第２ポリヌクレオチドが導入される哺乳動物細胞は、特に限定されるものではなく、例えばＣＨＯ細胞等が挙げられる。ただし、上記哺乳動物細胞としては、無限増殖能を有する腫瘍細胞が特に好ましい。上記腫瘍細胞としては、例えば、ＨｅＬａ細胞、ヒト大腸がんCOLO 320DM細胞、ヒト大腸がんCOLO 320HSR細胞、ＮＳ０細胞等が挙げられる。ヒト大腸がんCOLO 320DM細胞およびヒト大腸がんCOLO 320HSR細胞については、例えば『Quinn, L.A., Moore, G.E., Morgan, R.T., and Woods, L.K. Cell lines from human colon carcinoma with unusual cell products, double minutes, and homogeneously staining regions. Cancer Res. 1979 39(12):4914-4924.』および『Shimizu, N., Kanda, T., and Wahl, G. M. Selective capture of acentricfragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat. Genet., 12: 65−71, 1996.』に記載されている。
【００４８】
なお、第１および第２のポリヌクレオチドを細胞に導入する際には、両ポリヌクレオチドが同時に哺乳動物細胞へ導入される態様であれば特に限定されるものではなく、両ポリヌクレオチドを連結して同一の遺伝子構築物として導入してもよいし、おのおの別々の遺伝子構築物として導入してもよい。また遺伝子構築物の形態については、プラスミドであってもコスミドであってもよい。
【００４９】
また第１および第２のポリヌクレオチドの細胞への導入方法は、特に限定されるものではなく、リポフェクション、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等公知の方法を適宜選択の上、利用可能である。
【００５０】
ところで、第１および第２のポリヌクレオチドが導入された哺乳細胞内で第２のポリヌクレオチドが増幅する際に反復配列が生じ、当該反復配列によって転写抑制が起こり、結果的にタンパク質の発現抑制が起こる。本発明者は、この現象を発がん過程の遺伝子増幅において生じる反復配列の場合と比較した（後述する「参考例１」）。その結果、発がん過程で生じた遺伝子増幅領域からｍＲＮＡへの転写は抑制されていないということがわかった。比較例１で示したIRとMARを持つプラスミド（pSFVdhfr）による反復配列と、発がん過程で生じた反復配列との相違点は、後者では反復している配列が長いこと（通常、１００〜２００kbp）、および反復配列が組み替え等により複雑になっていることである。したがって、比較例１および参考例１の結果から、IRとMARを持つプラスミドによって生ずる反復配列からｍＲＮＡの転写量を高めるためには、反復単位を長くし、反復構造を複雑化すれば良いということが考えられた。
【００５１】
本実施の形態のかかる方法は、上記検討を元にして考案された。すなわち、当該第１および第２のポリヌクレオチドを導入する際に、１０ｋｂｐ以上の長さを有する第３のポリヌクレオチド、またはインシュレーター配列を含む第４のポリヌクレオチドの少なくとも一方を上記哺乳動物細胞に導入する工程を包含している。
【００５２】
上記第３のポリヌクレオチドを、上記第１および第２のポリヌクレオチドを同時に哺乳動物細胞へ導入することによって、発現させるべきタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび第３のポリヌクレオチドが上記哺乳動物細胞内において共増幅する。その結果、ポリヌクレオチド（遺伝子）の増幅によって形成される反復配列の反復単位が長くなる、もしくは反復構造が複雑になる。したがって、反復配列に起因する転写抑制を解除することができ、ポリヌクレオチドのコピー数に応じたタンパク質を発現させることができるという効果を奏する。
【００５３】
ここで第３のポリヌクレオチドの長さは、１０ｋｂｐ以上が好ましく、５０ｋｂｐ以上がさらに好ましく、１００ｋｂｐ以上が最も好ましい。第３のポリヌクレオチドは、上記長さの条件を満たすものであれば、塩基配列については限定されるものではなく、タンパク質をコードするものであっても、コードしないものであってもよい。なお第３のポリヌクレオチドは任意のポリヌクレオチドを合成等の手法により適宜調製して適用してもよいし、例えば、λ−ファージＤＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡ、等の公知のポリヌクレオチドを適宜選択の上適用してもよい。
【００５４】
一方、第４のポリヌクレオチドを、上記第１および第２のポリヌクレオチドとを同時に哺乳動物細胞へ導入することによって発現させるべきタンパク質、およびインシュレーター配列のポリヌクレオチドが上記哺乳動物細胞内において共増幅すると、ポリヌクレオチド（遺伝子）の増幅によって形成される反復配列の反復単位が長くなる、もしくは反復構造が複雑になる。さらにはヘテロクロマチン化が周囲に拡散することがなくなり、反復配列に起因する転写抑制を解除することができ、ポリヌクレオチドのコピー数に応じたタンパク質を発現させることができるという効果を奏する。
【００５５】
ここで、「インシュレーター配列」はクロマチンの境界であり、遺伝子発現の独立性を保つＤＮＡ配列であるということが知られている。かかるインシュレーター配列としては、例えば、鳥類由来ＨＳ４インシュレーター配列（１２１０ｂｐ、『Recillas-Targa, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 99, p6883-6888, (2002)参照』）、ウニ由来ARS インシュレーター配列（５７５ｂｐ、『Akasaka K, et al., Cell. Mol. Biol. vol. 45, p555-565 (1999). 』参照）が挙げられる。
【００５６】
上記第３または第４のポリヌクレオチドは、第１または第２のポリヌクレオチドと同一の遺伝子構築物として哺乳動物細胞に導入してもよいし、おのおの別々の遺伝子構築物として導入してもよい。ただし、第３、第４のポリヌクレオチドは、サイズが比較的大きいこと、第１または第２のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物にさらに挿入する操作が必要となること等の理由により、おのおの別々の遺伝子構築物として哺乳動物細胞に導入することが好ましい。また第３または第４のポリヌクレオチドのいずれか１つを哺乳動物細胞内に導入してもよいが、両ペプチドを哺乳動物細胞内に導入した方が、さらに転写抑制を解除する効果を得ることができるために好ましい。なお遺伝子構築物の形態、哺乳動物細胞への導入方法については、第１および第２のポリヌクレオチドの場合と同様にすればよい。
【００５７】
本実施の形態にかかる方法の効果については、その一例として後述する実施例１、２において検討しており、確かに発現させるべきタンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写抑制が解除されており、目的タンパク質が高発現していることがわかった。
【００５８】
なお本発明は、本実施の形態にかかる方法によって得られた形質転換体を包含する。
【００５９】
〔実施の形態２〕
本実施の形態にかかる方法は、上記遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞が、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、並びに第５のポリヌクレオチドが同時に導入されており、第５のポリヌクレオチドは、発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド、および薬剤耐性遺伝子を含んでおり、上記哺乳動物細胞を漸増濃度の薬剤を含有する培地中で培養する工程を包含している。
【００６０】
ここで第５のポリヌクレオチドとは、発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド、および薬剤耐性遺伝子を含むポリヌクレオチドである。薬剤耐性遺伝子としては、ブラスティサイジン抵抗性遺伝子、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、等が挙げられる。かかる第５のポリヌクレオチドを上記遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞に導入する際は、第１または第５のポリヌクレオチドと同一の遺伝子構築物として哺乳動物細胞に導入してもよいし、おのおの別々の遺伝子構築物として導入してもよい。なお遺伝子構築物の形態、哺乳動物細胞への導入方法については、既述の第１および第２のポリヌクレオチドの場合と同様にすればよい。
【００６１】
本実施の形態は、上記第１および第５のポリヌクレオチドが導入された哺乳動物細胞を、漸増濃度の薬剤を含有する培地中で培養する工程を包含している。上記第１および第５のポリヌクレオチドが導入された哺乳動物細胞においては、発現させるべきタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび薬剤耐性遺伝子が共増幅される。漸増濃度の薬剤を含有する培地中で上記哺乳動物細胞を培養すれば、反復配列に起因する転写抑制が起こっていない（もしくは、転写抑制の程度が低い）哺乳動物細胞を、薬剤耐性を指標に選抜することができる。したがって、発現させるべきタンパク質をコードするポリヌクレオチドについても転写抑制が起こっていない（もしくは、転写抑制の程度が低い）哺乳動物細胞を選抜することができ、当該ポリヌクレオチドのコピー数に応じたタンパク質を発現させることができるという効果を奏する。
【００６２】
ここで、細胞培養を行なう際の薬剤の漸増方法としては、特に限定されるものではなく、薬剤濃度の高い培地に段階的に植え継いでいく方法であっても、培地中に薬剤を連続的に添加していく方法であってもよい。より具体的には、前者の場合３日〜７日間隔で植え継いでいくことが好ましく、薬剤濃度の増加率は３０〜１００％増が好ましい。また後者の場合は、薬剤濃度が２４時間当り１０〜３０％増となるように薬剤を添加することが好ましい。後述する実施例３においては、３〜５日間隔の植え継ぎ毎に薬剤（ブラスティサイジン）濃度を倍増させている。
【００６３】
なお培地中に添加する薬剤の上限は、薬剤の種類、細胞の種類、状態等によって異なるために限定されるものではなく、適宜検討の上、決定すればよい。
【００６４】
本実施の形態にかかる方法の効果については、その一例として後述する実施例３において検討しており、確かに発現させるべきタンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写抑制が解除されており、目的タンパク質が高発現していることがわかった。
【００６５】
〔実施の形態３〕
本実施の形態にかかる方法は、上記遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞が、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、並びに第６のポリヌクレオチドが同時に導入されており、第６のポリヌクレオチドにおいて、プロモーター領域と発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとが制御可能に連結されており、当該プロモーターの転写活性化因子をコードする第７のポリヌクレオチドを上記哺乳動物細胞に導入して転写活性化因子を発現させる工程を包含している。
【００６６】
ここで第６のポリヌクレオチドとは、プロモーター領域と発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとが制御可能に連結されているものである。プロモーター領域としては、第６のポリペプチドが導入される哺乳動物細胞において機能し、かつ転写活性化因子によって転写調節されるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、ＴＲＥプロモーター（クロンテック社製）、Ｔ−ＲＥＸプロモーター（インビトロジェン社製）等が利用可能である。第６のポリヌクレオチドを上記遺伝子増幅能を有する哺乳動物細胞に導入する際は、第１のポリヌクレオチドと同一の遺伝子構築物として哺乳動物細胞に導入してもよいし、おのおの別々の遺伝子構築物として導入してもよい。なお遺伝子構築物の形態、哺乳動物細胞への導入方法については、既述の第１および第２のポリヌクレオチドの場合と同様にすればよい。
【００６７】
本実施の形態は、当該プロモーターの転写活性化因子をコードする第７のポリヌクレオチドを上記哺乳動物細胞に導入して転写活性化因子を発現させる工程を包含している。かかる工程によれば、発現させるべきタンパク質の発現を制御するプロモーターの活性自体を向上させることができ、反復配列によって発現抑制されているタンパク質を発現させることができるという効果を奏する。ここで第７のポリヌクレオチドとは、上記第６のポリヌクレオチドに含まれるプロモーターの転写活性化因子をコードするポリヌクレオチドのことである。例えば、プロモーターとしてＴＲＥプロモーターを用いた場合には、Ｔｅｔ−ＯＮ遺伝子（クロンテック社製）を第７のポリヌクレオチドとすればよい。
【００６８】
第７のポリヌクレオチドを上記哺乳動物細胞に導入して転写活性化因子を発現させる工程では、かかる第７のポリヌクレオチドと当該ポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとを制御可能に連結して構築した遺伝子構築物を上記哺乳動物細胞に導入すればよい。当該第７のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターは、哺乳動物細胞において機能するものであれば特に限定されるものではなく、誘導型プロモーターであっても、非誘導型プロモーターであってもよい。また第７のポリネクレオチドを含む遺伝子構築物の哺乳動物細胞への導入の時期は、上記第１および第６のポリヌクレオチドの導入後に第７のポリヌクレオチドを導入してもよいし、またその逆であってもよい。なお遺伝子構築物の形態、哺乳動物細胞への導入方法については、既述の第１および第２のポリヌクレオチドの場合と同様にすればよい。
【００６９】
本実施の形態にかかる方法の効果については、その一例として後述する実施例４において検討しており、確かに発現させるべきタンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写抑制が解除され、目的タンパク質が高発現していることがわかった。
【００７０】
なお本発明は、本実施の形態にかかる方法によって得られた形質転換体を包含する。
【００７１】
〔実施の形態４〕
本実施の形態にかかる方法は、上記遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞が、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、並びに第８のポリヌクレオチドが同時に導入されており、第８のポリヌクレオチドは、発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド、およびＬｏｘＰ遺伝子を含み、Cre Recombinase遺伝子を含む第９のポリヌクレオチドを上記哺乳動物細胞に導入してCre Recombinaseを発現させる工程を包含している。
【００７２】
ここで第８のポリヌクレオチドとは、第２のポリヌクレオチドおよびＬｏｘＰ遺伝子を含むポリヌクレオチドである。ＬｏｘＰ遺伝子は、公知のCre-LoxP System（クレ・ロックスピー系）にかかる遺伝子である(『"Molecular Cloning----a laboratory manual 3rd Ed.", by J. Sambrook and D.W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), page 4.82-4.85.』 参照)。なお上記ＬｏｘＰ遺伝子の両端（５’末端および３’末端）にはクローニングのための制限酵素認識配列または制限酵素切断配列が付加されていてもよい。
【００７３】
また第９のポリヌクレオチドは、同Cre-LoxP System（クレ・ロックスピー系）にかかるCre Recombinase遺伝子を含むポリヌクレオチドである。当該第９のポリヌクレオチドには、Cre Recombinase遺伝子を発現させるためのプロモーターが含まれていることが好ましい。
【００７４】
第１のポリヌクレオチド、第８のポリヌクレオチド、および第９のポリヌクレオチドが哺乳動物細胞に導入されることによって、ＬｏｘＰ遺伝子と発現させるべきタンパク質をコードするポリヌクレオチドとが増幅される。この時、哺乳動物細胞において発現したCre RecombinaseがＬｏｘＰ遺伝子を認識して、発現させるべきタンパク質をコードするポリヌクレオチドが染色体外に切り出され、環状体分子を形成する。染色体外の環状分子は、転写抑制等の影響を受けにくいため、反復配列に起因する転写抑制を回避でき、ポリヌクレオチドのコピー数に応じたタンパク質を発現させることができるという効果を奏する。
【００７５】
なお各ポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入方法については、既述の第１および第２のポリヌクレオチドの場合と同様にすればよい。また導入の時期は、上記第１および第８のポリヌクレオチドの導入後に第９のポリヌクレオチドを導入してもよいし、またその逆であってもよい。
【００７６】
本実施の形態にかかる方法の効果については、その一例として後述する実施例５において検討しており、確かに発現させるべきタンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写抑制が解除されており、目的タンパク質が高発現していることがわかった。
【００７７】
なお本発明は、本実施の形態にかかる方法によって得られた形質転換体を包含する。
【００７８】
〔実施の形態５〕
本実施の形態にかかる方法は、上記遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞が、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、並びに発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドが同時に導入されており、5-aza-2'-deoxycytidineで上記哺乳動物細胞を処理する工程を包含している。
【００７９】
本発明者は、ＲＮＡｉにおけるＤＮＡのサイレンシング（転写抑制）がＤＮＡのメチル化を伴っているということから、逆にＤＮＡのメチル化のレベルを低下させれば転写抑制を解除することができるのではないかということを独自に考え、本実施の形態にかかる方法を考案するに至った。5-aza-2'-deoxycytidineは、ＤＮＡのメチル化のレベルを低下させるということが知られており、本発明者はこれを採用することとした。当該5-aza-2'-deoxycytidine は市販のものを適宜購入の上、利用すればよい。例えば、Sigma社より購入することができる。
【００８０】
5-aza-2'-deoxycytidineで哺乳動物細胞を処理する方法は、5-aza-2'-deoxycytidineと哺乳動物細胞とが接触する方法であれば特に限定されるものではないが、例えば、5-aza-2'-deoxycytidineを含む培地中で哺乳動物細胞を培養すればよい。この時の5-aza-2'-deoxycytidineの濃度は、細胞の種類や状態によって好適な条件が異なるため、適宜検討の上、決定すればよいが、通常０．２μＭ〜１０μＭが好ましく、１μＭ〜２μＭがさらに好ましい。上記好ましい範囲を超えると、哺乳動物細胞に対して毒性を発揮する場合があり、上記好ましい範囲未満であると、転写抑制を十分に解除することはできない。なお、5-aza-2'-deoxycytidineを添加する培地は、哺乳類動物細胞を培養することができるものであれば特に限定されるものではなく、例えばDulbecco's modified Eagle's培地(ＤＥＭ培地；インビトロゲン社製)、RPMI1640培地（日水製薬社製）、等が利用可能であり、１０％の牛胎児血清を加えて使用する。
【００８１】
なお哺乳動物細胞の処理時間については、5-aza-2'deoxycytidineの濃度、細胞の種類や状態によって異なるために限定されるものではないが、３日〜１０日が好ましい。
【００８２】
本実施の形態にかかる方法の効果については、その一例として後述する実施例６において検討しており、確かに発現させるべきタンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写抑制が解除され、目的タンパク質が高発現していることがわかった。
【００８３】
なお、上記5-aza-2'-deoxycytidineで哺乳動物細胞を処理する方法は、第１のポリヌクレオチド、および第２のポリヌクレオチドが導入された哺乳動物細胞のみに適用されるものではなく、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞に広く適用が可能である。例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO； Chinese Hamster Ovary)細胞に、タンパク質をコードする遺伝子とジヒドロ葉酸リダクターゼ(DHFR； Dihydrofolate reductase)遺伝子とを同時に導入して遺伝子増幅が可能となった哺乳動物細胞にも適用可能である。
【００８４】
〔実施の形態６〕
本実施の形態にかかる方法は、上記遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞が、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、並びに発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドが同時に導入されており、上記遺伝子増幅がダブルマイニュート染色体上で起こっている上記哺乳動物細胞を選択する工程を包含している。
【００８５】
本発明者は、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド（遺伝子）およびIR/MARプラスミドを導入した哺乳動物細胞の安定形質転換細胞集団から、目的タンパク質を発現するクローンを単離してその目的タンパク質の発現量を比較したところ、染色体の均一染色領域（Homogeneously staining regeon；以下「ＨＳＲ」という）上で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド（遺伝子）の増幅が起こっているクローンに比して、染色体外のダブルマイニュート染色体（以下「ＤＭ」という）上で目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド（遺伝子）の増幅が起こっているクローンの方がはるかに高い発現量を示すということを発見した。すなわち、高度遺伝子増幅系を用いて目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド（遺伝子）が高度に増幅された哺乳動物細胞から、ＤＭ上で当該ポリヌクレオチド（遺伝子）の増幅増幅が起こっているクローンを選択すれば、反復配列に起因する転写抑制が起こっていないクローンを選択することができ、当該クローンを培養することによって、目的タンパク質を高発現させることができるといえる。
【００８６】
ＤＭ上で遺伝子増幅が起こっている哺乳動物細胞（クローン）を選択する方法は、特に限定されるものではないが、例えば分裂期の染色体について公知のＦＩＳＨ法（fluorescence in situ hybridization）を行ない、哺乳動物細胞へ導入した第１〜９のうちいずれかのポリヌクレオチドを検出して、ＤＭ上に蛍光を示す哺乳動物細胞（クローン）を単離するという方法が挙げられる。ＨＳＲは染色体上の領域であるのに対して、ＤＭは染色体外に存在するため、蛍光顕微鏡観察により染色体以外の領域に蛍光を示す哺乳動物細胞（クローン）を選抜すればよい。ＦＩＳＨ法を実施する際の具体的な方法については特に限定されるものではなく、従来公知の方法を適宜選択の上、採用すればよい。
【００８７】
またその他、ＤＭ上で遺伝子増幅が起こっている哺乳動物細胞（クローン）を選択する方法としては、Lactose Operator (LacO) 配列を第１〜９のうちいずれかのポリヌクレオチドに組み込み、上記の方法で増幅させ、それをLactose Repressor (LacR)-Green Fluorescence Protein (GFP)融合遺伝子の発現により可視化する方法が挙げられる（『Kanda, T., and G.M. Wahl. 2000. The dynamics of acentric chromosomes in cancer cells revealed by GFP- based chromosome labeling strategies. J Cell Biochem. Suppl:107-114.』；『Li, G., G. Sudlow, and A.S. Belmont. 1998. Interphase cell cycle dynamics of a late-replicating, heterochromatic homogeneously staining region:  Precise choreography of condensation/decon densation and nuclear positioning. J Cell Biol. 140:975-989.』；および『Shimizu, N., K. Shingaki, Y. Kaneko-Sasaguri, T. Hashizume, and T. Kanda. 2005. When, where and how the bridge breaks: anaphase bridge breakage plays a crucial role in gene amplification and HSR generation. Exp Cell Res. 302:233-243.』参照）。
【００８８】
ここでＤＭおよびＨＳＲについては以下のことが知られている。遺伝子増幅は、腫瘍細胞の分限増殖または薬剤抵抗性を獲得する主要な機構であり（『Benner, S. E., Wahl, G. M., and Von Hoff, D. D. Double minute chromosomes and homogeneously staining regions in tumors taken directly from patients versus in human tumor cell lines. Anti-Cancer Drugs, 2: 11−25, 1991』参照）、細胞遺伝学的に言えば、増幅遺伝子は、インビボにおいて、染色体外のダブルマイニュート染色体（ＤＭ）上で最も頻繁に検出される。しかし、長期にわたるインビトロでの継代によって、通常は染色体の均一染色領域（ＨＳＲ；homogeneously staining region）に増幅遺伝子を有する細胞の優勢的増殖に至る。これまでの研究により、腫瘍細胞からＤＭ上の増幅遺伝子を除去すると、腫瘍表現型および細胞分化を呈する状態から正常状態に復帰することが示されている（『Shimizu, N., Nakamura, H., Kadota, T., Kitajima, K., Oda, T., Hirano,T., and Utiyama, H. Loss of amplified c-myc genes in the spontaneouslydifferentiated HL-60 cells. Cancer Res., 54: 3561−3567, 1994.』、『Von Hoff, D. D., McGill, J. R., Forseth, B. J., Davidson, K. K., Bradley, T. P., Van Devanter, D. R., and Wahl, G. M. Elimination of extrachromosomally amplified MYC genes from human tumor cells reduces their tumorigenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8165−8169, 1992.』、および 『Eckhardt, S. G., Dai, A., Davidson, K. K., Forseth, B. J., Wahl, G. M., and Von Hoff, D. D. Induction of differentiation in HL60 cells by thereduction of extrachromosomally amplified c-myc. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 91: 6674 − 6678, 1994.』参照）。この種の除去過程は、分裂細胞から放出される微小核へのＤＭの選択的取り込みによって仲介される（『Von Hoff, D. D., McGill, J. R., Forseth, B. J., Davidson, K. K., Bradley, T. P., Van Devanter, D. R., and Wahl, G. M. Elimination of extrachromosomally amplified MYC genes from human tumor cells reduces their tumorigenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8165−8169, 1992.』、『 Shimizu, N., Kanda, T., and Wahl, G. M. Selective capture of acentricfragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat. Genet., 12: 65−71, 1996.』、および 『Shimizu, N., Shimura, T., and Tanaka, T. Selective elimination of acentric double minutes from cancer cells through the extrusion of micronuclei. Mutat. Res., 448: 81−90, 2000.』参照）。このような微小核形成（micronucleation）過程は、細胞周期の際におけるＤＭの細胞内挙動と密接に関連していることが理解されている(『Tanaka, T., and Shimizu, N. Induced detachment of acentric chromatinfrom mitotic chromosomes leads to their cytoplasmic localization at G1 and the micronucleation by lamin reorganization at S phase. J. Cell Sci.,113: 697−707, 2000.』参照)。ＤＭは様々なサイズの無動原体環状ＤＮＡから構成され(『 Levan, A., and Levan, G. Have double minutes functioning centromeres?Hereditas, 88: 81−92, 1978.参照』)、無動原体性であるにもかかわらず、有糸分裂する染色体に付着して娘細胞へと安定に分離される（『 Tanaka, T., and Shimizu, N. Induced detachment of acentric chromatinfrom mitotic chromosomes leads to their cytoplasmic localization at G1 and the micronucleation by lamin reorganization at S phase. J. Cell Sci.,113: 697−707, 2000.』、『 Levan, A., and Levan, G. Have double minutes functioning centromeres?Hereditas, 88: 81−92, 1978.』、および 『Kanda, T., Sullivan, K. F., and Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammaliancells. Curr. Biol., 8: 377−385, 1998.』参照）。最近の関連する重要な知見として、牛パピローマウイルス( 『Lehman, C. W., and Botchan, M. R. Segregation of viral plasmids depends on tethering to chromosomes and is regulated by phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 4338−4343, 1998.』参照)、EBウイルス (『Marechal, V., Dehee, A., Chikhi-Brachet, R., Piolot, T., Coppey-Moisan, M., and Nicolas, J. C. Mapping EBNA-1 domains involved in binding tometaphase chromosomes. J. Virol., 73: 4385−4392, 1999.』参照)、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(『 Ballestas, M. E., Chatis, P. A., and Kaye, K. M. Efficient persistence of extrachromosomal KSHV DNA mediated by latency-associated nuclear antigen. Science (Wash. DC), 284: 641−644, 1999.』参照) およびSV40（『Baiker, A., Maercker, C., Piechaczek, C., Schmidt, S. B., Bode, J.,Benham, C., and Lipps, H. J. Mitotic stability of an episomal vector containing a human scaffold/ matrix-attached region is provided by association with nuclear matrix. Nature Cell Biol., 2: 182−184, 2000.』参照）を含むいくつかのウィルス性核内プラスミド（viral nuclear plasmid）が、細胞分裂の際に同様の機構を利用することが示されている。さらに、最近の興味深い研究では、EBウイルス・レプリコンを有するプラスミドが、腫瘍細胞でＤＭに組込まれ得ることが示されている（『Kanda, T., Otter, M., and Wahl, G. M. Mitotic segregation of viral and cellular acentric extrachromosomal molecules by chromosome tethering.J. Cell Sci., 114: 49−58, 2001.』参照）。
【００８９】
なお、第１および第２のポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入方法、当該ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞へ導入する際の遺伝子構築物については、〔実施の形態１〕の項で説示した場合と同様にすればよい。
【００９０】
本実施の形態にかかる方法の効果については、その一例として後述する実施例７において検討しており、確かに発現させるべきタンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写抑制が解除され、目的タンパク質が高発現していることがわかった。
【００９１】
また上記本実施の形態にかかる方法は、第１のポリヌクレオチド、および第２のポリヌクレオチドが導入された哺乳動物細胞のみに適用されるものではなく、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞に広く適用が可能である。例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO； Chinese Hamster Ovary)細胞に、タンパク質をコードする遺伝子とジヒドロ葉酸リダクターゼ(DHFR； Dihydrofolate reductase)遺伝子とを同時に導入して遺伝子増幅が可能となった哺乳動物細胞にも適用可能である。
【００９２】
〔実施の形態７〕
本実施の形態にかかる方法は、上記遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞が、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、並びに第６のポリヌクレオチドが同時に導入されており、第６のポリヌクレオチドにおいて、プロモーター領域と発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとが制御可能に連結されており、当該第１および第６のポリヌクレオチドを導入する際に、当該プロモーターの転写活性化因子をコードする第７のポリヌクレオチドを上記哺乳動物細胞に同時に導入する工程を包含することを特徴としている。
【００９３】
ここで第６のポリヌクレオチドとは、プロモーター領域と発現させるべきタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとが制御可能に連結されているものである。プロモーター領域としては、第６のポリペプチドが導入される哺乳動物細胞において機能し、かつ転写活性化因子によって転写調節されるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、ＴＲＥプロモーター（クロンテック社製）、Ｔ−ＲＥＸプロモーター（インビトロジェン社製）等が利用可能である。第６のポリヌクレオチドを上記遺伝子増幅能を有する哺乳動物細胞に導入する際は、第１のポリヌクレオチドと同一の遺伝子構築物として哺乳動物細胞に導入してもよいし、おのおの別々の遺伝子構築物として導入してもよい。なお遺伝子構築物の形態、哺乳動物細胞への導入方法については、既述の第１および第２のポリヌクレオチドの場合と同様にすればよい。
【００９４】
本実施の形態は、当該第１および第６のポリヌクレオチドを導入する際に、当該プロモーターの転写活性化因子をコードする第７のポリヌクレオチドを上記哺乳動物細胞に同時に導入する工程を包含している。かかる工程によれば、目的タンパク質の発現を制御するプロモーターの活性自体を向上させることができ、反復配列によって発現抑制されているタンパク質を発現させることができるという効果を奏する。ここで第７のポリヌクレオチドとは、上記第６のポリヌクレオチドに含まれるプロモーターの転写活性化因子をコードするポリヌクレオチドのことである。例えば、プロモーターとしてＴＲＥプロモーターを用いた場合には、Ｔｅｔ−ＯＮ遺伝子（クロンテック社製）を第７のポリヌクレオチドとすればよい。
【００９５】
第７のポリヌクレオチドを上記哺乳動物細胞に導入して転写活性化因子を発現させる工程では、かかる第７のポリヌクレオチドと当該ポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとを制御可能に連結して構築した遺伝子構築物を上記哺乳動物細胞に導入すればよい。当該第７のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターは、哺乳動物細胞において機能するものであれば特に限定されるものではなく、誘導型プロモーターであっても、非誘導型プロモーターであってもよい。また第７のポリネクレオチドを含む遺伝子構築物の哺乳動物細胞への導入の時期は、上記第１および第６のポリヌクレオチドの導入する際に第７のポリヌクレオチドを同時に導入すればよい（コトランスフェクション）。簡単には、第１のポリヌクレオチドおよび第６のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物と第７のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物を混合し、リポフェクション法等により哺乳動物細胞へ遺伝子導入を行なえばよい。もしくは、第１のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物、第６のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物、および第７のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物をそれぞれ混合し、リポフェクション法等により哺乳動物細胞へ遺伝子導入を行なえばよい。なお、遺伝子構築物の形態、哺乳動物細胞への導入方法については、既述の第１および第２のポリヌクレオチドの場合と同様にすればよい。
【００９６】
本実施の形態にかかる方法の効果については、その一例として後述する実施例８において検討しており、確かに発現させるべきタンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写抑制が解除され、目的タンパク質が高発現していることがわかった。
【００９７】
なお本発明は、本実施の形態にかかる方法によって得られた形質転換体を包含する。
【００９８】
また上記実施の形態１〜７に示した各工程を適宜組み合わせて行なうことも可能である。かかる場合には、反復配列による転写抑制を解除する効果をさらに得ることができ、発現抑制されていたタンパク質をさらに高発現させることができるという効果を奏する。
【００９９】
〔実施の形態８〕
本発明は、上記実施の形態１〜７において説示した各ポリヌクレオチド、試薬等を適宜組み合わせることによって構成した、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させるためのキットをも包含する。本発明にかかるキットによれば、簡便に、遺伝子増幅が誘導された哺乳動物細胞内において形成された反復配列から、発現抑制されているタンパク質を発現させることができる。
【０１００】
本発明のキットは特に限定されるものではないが、例えば、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチドと、１０ｋｂｐ以上の長さを有する第３のポリヌクレオチド、またはインシュレーター配列を含む第４のポリヌクレオチドの少なくとも一方とを具備するキットが挙げられる。上記キットは実施の形態１に記載した方法にしたがって使用することができる。なお、上記第１のポリヌクレオチドと、第３および／または第４のポリヌクレオチドとは、同一の遺伝子構築物として構成されていてもよい。
【０１０１】
また、本発明にかかるキット（一例）は、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、プロモーター領域を含むポリヌクレオチド、および当該プロモーターの転写活性化因子をコードする第７のポリヌクレオチドを具備することを特徴とするキットであってもよい。上記キットは、上記プロモーター領域と目的遺伝子とを連結することによって第６のポリヌクレオチドを調製した後、実施の形態３または７に記載した方法にしたがって使用すればよい。なお、上記第１のポリヌクレオチドと、上記プロモーター領域を含むポリヌクレオチドとは、同一の遺伝子構築物として構成されていてもよい。
【０１０２】
さらに本発明にかかるキット（一例）は、真核生物細胞内で機能する複製起点および核マトリックス結合領域を含む第１のポリヌクレオチド、ＬｏｘＰ遺伝子を含むポリヌクレオチド、およびCre Recombinase遺伝子を含む第９のポリヌクレオチドを具備することを特徴とするキットであってもよい。上記キットは、上記ＬｏｘＰ遺伝子を含むポリヌクレオチドと目的遺伝子とを連結することによって第８のポリヌクレオチドを調製した後、実施の形態４に記載した方法にしたがって使用すればよい。なお、上記第１のポリヌクレオチドと、上記ＬｏｘＰ遺伝子を含むポリヌクレオチドとは、同一の遺伝子構築物として構成されていてもよい。
【０１０３】
また上記キットには、5-aza-2'-deoxycytidineが含まれていてもよい。上記5-aza-2'-deoxycytidineによれば、既述のように、目的タンパク質をさらに高発現することができる。
【０１０４】
その他、上記本発明にかかるキットには、上記実施の形態１〜７において説示した本発明の方法を実施するために必要な試薬、器具等が含まれていてもよい。例えば、上記各ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するために必要な試薬、器具が、本発明にかかるキットに含まれていてもよい。さらに上記キットには、哺乳動物細胞、当該哺乳動物細胞を培養するための培地等が含まれていてもよい。
【０１０５】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１０６】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【０１０７】
比較例１、参考例１、実施例１〜１０において使用する材料および方法を以下に示す。
【０１０８】
（プラスミド）
pSFVdhfr（11.0kbp）は、John Kolman 博士および Geoffrey M. Wahl 博士(The Salk Institute, San Diego, CA)から供与された。PSFVdhfrはヒドロ葉酸リダクターゼに対して3'-下流の領域に由来するOriβを含む4.6kbp断片を有している（『Dijkwel, P. A., and Hamlin, J. L. Matrix attachment regions are positioned near replication initiation sites, genes, and an interamplicon junction in the amplified dihydrofolate reductase domain of Chinese hamster ovary cells. Mol. Cell Biol., 8: 5398−5409, 1988.』参照）。
【０１０９】
複製起点を欠くpSFV-Vプラスミド（6.4kbp）は、NotI消化で全てのジヒドロ葉酸リダクターゼ由来配列を削除することによってpSFVdhfrから構築された。
【０１１０】
pSFVdhfr(GAP-GFP)は、pSFVdhfrのヒグロマイシン抵抗性遺伝子発現ユニットを除去し、その位置に、pEPBG plasmid (Salk Institute Geoffrey M. Wahl博士より受領)から切り出したGAP-GFP 発現ユニットを、転写がIRの方向に向かうように組み込むことにより構築した。
【０１１１】
pSFVdhfr/d2EGFPは、pSFVdhfrのヒグロマイシン抵抗性遺伝子発現ユニットを除去し、その位置にTREプロモーター、d2EGFP構造遺伝子、SV40 poly A配列（pTRE-d2EGFP (クロンテック)由来）を、この順で、転写がIRの方向に向かうように組み込むことにより構築した。
【０１１２】
（細胞）
ヒト結腸直腸のCOLO 320DMおよびCOLO 320HSR腫瘍細胞株（ヒト大腸がんCOLO 320DM細胞株およびヒト大腸がんCOLO 320HSR細胞株）は、『Shimizu, N., Kanda, T., and Wahl, G. M. Selective capture of acentricfragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat. Genet., 12: 65−71, 1996.』の記載に従い獲得し、維持した。
【０１１３】
また上記細胞および当該形質転換細胞の培養についても上記文献に従って行なった。簡単には、上記細胞株をRPMI 1640培地（日水製薬社製）へ１０％牛胎児血清を添加した培地中で、３７℃、５％ ＣＯ2存在下で培養した。
【０１１４】
（リポフェクション）
上記全てのプラスミドをQiagenプラスミド精製キット(Qiagen Inc., Valencia, CA)により精製し、GenePorter 2リポフェクションキット(Gene Therapy Systems, San Diego, CA)により細胞にトランスフェクトした。
【０１１５】
（セルソーターによる解析）
セルソーターを用いて各細胞の蛍光強度を測定した。測定は、生細胞のみをゲートにかけ、２万個の細胞をソートした。なおセルソーターは、Becton Dickinson 社製を用い、運転条件は付属のマニュアルに従った。
【０１１６】
〔比較例１〕IRおよびMARを有するプラスミドを用いた遺伝子増幅、およびｍＲＮＡの転写量の測定
（方法）
ヒト大腸がんCOLO 320DM細胞株に、ヒトDHFR（dihydrofolate reductase）遺伝子座由来のIRとMARを持つプラスミド（pSFVdhfr）をリポフェクション法で導入した。またコントロールとして、ヒトDHFR遺伝子座由来のIRとMARを除いたベクタープラスミド(pSFV)を同様にリポフェクション法により、ヒト大腸がんCOLO 320DM細胞株に導入した。
【０１１７】
両プラスミドは、ブラスティサイジン（Blasticidine）抵抗性遺伝子を有しており、5μg/mlのブラスティサイジン（フナコシ社製）で形質転換細胞を選択した。
【０１１８】
（結果）
pSFVdhfrで形質転換した細胞からは、プラスミド配列がダブルマイニュート（ＤＭ）上で遺伝子増幅したクローン（clone 12）と均一染色体領域（ＨＳＲ）上で増幅したクローン（clone 22）を得た。また、ベクタープラスミドpSFV-Vで形質転換した細胞は、IRとMARを持たないために遺伝子コピー数は増加しないが、多コピー導入形質転換細胞を得た。
【０１１９】
これらの細胞について、ブラスティサイジン抵抗性遺伝子のＤＮＡ量と、転写されたｍＲＮＡ量をCmpetitive PCR法により定量した。この結果を表１に示す。
【０１２０】
【表１】
2007312782.tif 000002
表１に示すように、IRとMARを持つプラスミド（pSFVdhfr）の効果によりブラスティサイジン抵抗性遺伝子のコピー数が増加しても、ブラスティサイジン抵抗性遺伝子のｍＲＮＡの転写量の増加には至らないということが判明した。このことは、目的遺伝子を含む遺伝子領域が高度に増幅することによって反復配列が生じ、該反復配列によって転写抑制が起こっているということが考えられた。
【０１２１】
〔参考例１〕発がん過程で生じた遺伝子増幅領域からのｍＲＮＡへ転写
ヒト大腸がん細胞株COLO 320DM （ATCC CCL220）は、患者体内での発がん過程においてc-mycがん遺伝子が増幅し、ＤＭかＨＳＲに局在することが知られている（『Alitalo, Kari, Schwab, Manfred, Lin, C.C., Varmus, Harold, Bishop, J. Michael、Homogenously staining chromosomal regions contain amplified copies of an abundantly expressed cellular oncogene(c-myc) in malignant neuroendocrine cells from a human colon carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. v80., p1701-1711』参照）。そこで当該細胞においてc-mycがん遺伝子のコピー数と、ｍＲＮＡの転写量とをcompetitive PCR法で定量した。なおcompetitive PCRは、『shimizu et al., nature genetics 1996』に記載の方法に準じて行なった。
【０１２２】
その結果を表２に示す。
【０１２３】
【表２】
2007312782.tif 000003
表２によればヒト大腸がん細胞株COLO 320DM、およびヒト大腸がん細胞株COLO 320HSRについて、c-mycがん遺伝子のコピー数に比例したｍＲＮＡの転写が検出された。なおコントロールとして、ヒト正常２倍体繊維芽細胞株WI-38を用いた。
【０１２４】
以上の結果より、発がん過程で生じた遺伝子増幅領域からｍＲＮＡへの転写は、抑制されていないということがわかった。
【０１２５】
上述の比較例１で示したIRとMARを持つプラスミド（pSFVdhfr）による反復配列と、発がん過程で生じた反復配列との相違点は、後者では反復している配列が長いこと（通常、１００〜２００kbp）、および反復配列が組み替え等により複雑になっていることである。したがって、比較例１および参考例１の結果から、IRとMARを持つプラスミドによって生ずる反復配列からｍＲＮＡの転写量を高めるためには、反復単位を長くし、反復構造を複雑化すれば良いということが示唆された。
【０１２６】
〔実施例１〕λ−ファージＤＮＡおよび目的遺伝子を宿主細胞に導入した場合の効果
ヒトDHFR（dihydrofolate reductase）遺伝子座由来IRおよびMARを有し、恒常的プロモーター（CAプロモーター）の制御下に、GFP (Green Fluorescence Protein)遺伝子とGAP (G-associated polypeptide)遺伝子の融合タンパク質を発現するプラスミド（pSFVdhfr (GAP-GFP)）とλ−ファージＤＮＡとを重量比１：２で混合し、これをヒト大腸がん細胞COLO 320DM細胞にリポフェクション法で導入した。遺伝子導入２日後から、プラスミド上のブラスティサイジン耐性遺伝子に対応する5μg/mlのブラスティサイジン（フナコシ社製）で選択し、３〜４週間後に多数のコロニーからなる形質転換細胞を得た。
【０１２７】
図１にGFPの蛍光強度をセルソーターで解析した結果を示す。図１（ａ）はコントロールとしてλ−ファージＤＮＡを混合せずにpSFVdhfr (GAP-GFP)のみを細胞に導入した場合の結果を示し、図１（ｂ）はpSFVdhfr (GAP-GFP)、およびλ−ファージＤＮＡを混合して細胞に導入した場合（コトランスフェクション）の結果を示す。同図中の括弧内に蛍光強度の平均値を示した。
【０１２８】
コントロールの蛍光強度が６５．５１であったのに対して、pSFVdhfr (GAP-GFP)およびλ−ファージＤＮＡを混合して細胞に導入した場合（コトランスフェクション）の蛍光強度が８５．２７であった。したがってコトランスフェクションすることにより、目的タンパク質であるGFPが明らかに高発現しているということがわかった。換言すれば、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、λ−ファージＤＮＡとが共増幅することによって、反復配列に起因するタンパク質の発現抑制を解除することができるということがわかった。
【０１２９】
〔実施例２〕インシュレーター配列および目的遺伝子を宿主細胞に導入した場合の効果
（方法）
ヒトDHFR遺伝子座由来のIRおよびMAR、並びにブラスティサイジン（Blasticidine）抵抗性遺伝子を持ち、かつ、TRE-promoter（テトラサイクリン誘導プロモーター）の支配下にd2EGFP遺伝子を持つプラスミド（pSFVdhfr/d2EGFP）と、鳥類由来HS4インシュレーター配列（『Recillas-Targa, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 99, p6883-6888, (2002)』参照）を持つプラスミドDNAとを混合して、ヒト大腸がん細胞COLO 320DM細胞にリポフェクション法で導入した。なお鳥類由来HS4インシュレーター配列を持つプラスミドDNAは、上記Recillas-Targa, F.らの論文に記載された1.2 kbpの5' HS4 インシュレーター配列を持つプラスミドを用いた。遺伝子導入２日後から、プラスミド上のブラスティサイジン耐性遺伝子に対応する5μg/mlのブラスティサイジン（フナコシ社製）で選択し、３〜４週間後に多数のコロニーからなる形質転換細胞を得た。
【０１３０】
遺伝子導入２日後から、プラスミド上のブラスティサイジン耐性遺伝子に対応する5μg/mlのブラスティサイジン（フナコシ社製）で選択し、３〜４週間後に多数のコロニーからなる形質転換細胞を得た。その後、植え継ぎ（３〜６日毎）のたび段階的に培地中のブラスティサイジンの濃度を倍増させて形質転換細胞の選択を行なった（最終濃度320μg/ml）。
【０１３１】
（結果）
図２にGFPの蛍光強度をセルソーターで解析した結果を示す。
【０１３２】
図２（ａ）はコントロールとしてpSFVdhfr/d2EGFPのみを細胞に導入した場合の結果を示し、図２（ｂ）はpSFVdhfr/d2EGFPのみを細胞に導入し、80μg/mlのブラスティサイジンで選択をさらに行なった場合の結果を示し、図２（ｃ）はpSFVdhfr/d2EGFPと、鳥類由来HS4インシュレーター配列を持つプラスミドDNAとを混合して細胞に導入した結果を示し、図２（ｄ）はpSFVdhfr/d2EGFPと、鳥類由来HS4インシュレーター配列を持つプラスミドDNAとを混合して細胞に導入し、80μg/mlのブラスティサイジンで選択をさらに行なった場合の結果を示す。同図中の括弧内に蛍光強度の平均値（平均蛍光強度）を示した。
【０１３３】
なお当該方法による蛍光強度の検出限界は１であり、それ以下の蛍光強度は全て１として検出されてしまう。かかる事情に鑑みて、図２（ａ）〜（ｄ）の結果をより詳細に検討すべく、それぞれの試験区について、全生細胞（１万個）中の蛍光強度が２以上の細胞の割合 （cell ％）と、蛍光強度が２以上の細胞の蛍光強度の平均値との積を求め、その値（以下「積算蛍光強度」という。以下に示す他の実施例においても同じ。）を同図中に四角囲み文字で示した。
【０１３４】
図２（ａ）に示すコントロールの平均蛍光強度が２．７３であり、積算蛍光強度が６１．５であるのに対し、図２（ｃ）に示すpSFVdhfr/d2EGFPと、鳥類由来HS4インシュレーター配列を持つプラスミドDNAとを混合して細胞に導入した場合の平均蛍光強度が７．１４であり、積算蛍光強度が３１２であった。よって、目的タンパク質をコードする遺伝子と鳥類由来HS4インシュレーター配列とをコトランスフェクションし、共増幅することにより、目的タンパク質であるd2EGFPが明らかに高発現しているということがわかった。
【０１３５】
また、図２（ａ）に示すコントロールの平均蛍光強度が２．７３であり、積算蛍光強度が６１．５であったのに対して、図２（ｂ）に示すpSFVdhfr/d2EGFPのみを細胞に導入し、80μg/mlのブラスティサイジンで選択をさらに行なった場合の平均蛍光強度が６．０９であり、積算蛍光強度が５４２であった。一方、図２（ｃ）に示すpSFVdhfr/d2EGFPと、鳥類由来HS4インシュレーター配列を持つプラスミドDNAとを混合して細胞に導入した場合の平均蛍光強度が７．１４であり、積算蛍光強度が３１２であったのに対して、図２（ｄ）に示すpSFVdhfr/d2EGFPと、鳥類由来HS4インシュレーター配列を持つプラスミドDNAとを混合して細胞に導入し、80μg/mlのブラスティサイジンで選択をさらに行なった場合の平均蛍光強度が９．６５であり、積算蛍光強度が９４１であった。
【０１３６】
よって、遺伝子増幅が起こった細胞をブラスティサイジンの濃度を段階的に高めながら選択することによって、目的タンパク質の発現を高めることができるということがわかった。さらには、目的タンパク質をコードする遺伝子と鳥類由来HS4インシュレーター配列とをコトランスフェクションし、共増幅させた上で、さらにブラスティサイジンの濃度を段階的に高めながら細胞を選択することによって、目的タンパク質であるd2EGFPの発現がさらに高まるということがわかった。換言すれば、目的タンパク質の発現を高めるための手段を複数組み合わせることによって、さらなるタンパク質の高発現を行なうことができるということがわかった。
【０１３７】
〔実施例３〕段階的に選択薬剤濃度を高めて形質転換細胞を選択する効果
（方法）
ヒトDHFR遺伝子座由来のIRおよびMAR、並びにブラスティサイジン（Blasticidine）抵抗性遺伝子を持ち、かつ、TRE-promoter（テトラサイクリン誘導プロモーター）の支配下にd2EGFP遺伝子を持つプラスミド（pSFVdhfr/d2EGFP）を、ヒト大腸がん細胞COLO 320DM細胞にリポフェクション法で導入した。形質転換した細胞を、5 μg/mlのブラスティサイジン（フナコシ社製）で選択し、形質転換した多数のクローンを取得した。当該クローンを混合後、培養を継続した。３〜５日間隔の植え継ぎのたびに、培地中のブラスティサイジン濃度を倍増させた（5μg/ml〜320μg/ml）。種々のブラスティサイジン濃度において選択された細胞のそれぞれについて、Doxycycline（クロンテック社製）を１μg/mlとなるように培地中へ添加することによりTRE-promoterを活性化し、d2EGFP（半減期が通常のEGFPに比べて遥かに短い）の発現を誘導した。
【０１３８】
（結果）
細胞当たりのd2EGFP発現量を、セルソーターで解析した結果を図３に示す。
【０１３９】
図３（ａ）は5μg/mlのブラスティサイジンで選択を行なった場合の結果を示し、図３（ｂ）は10μg/mlのブラスティサイジンで選択を行なった場合の結果を示し、図３（ｃ）は40μg/mlのブラスティサイジンで選択を行なった場合の結果を示し、図３（ｄ）は160μg/mlのブラスティサイジンで選択を行なった場合の結果を示し、図３（ｅ）は320μg/mlのブラスティサイジンで選択を行なった場合の結果を示した。同図中の括弧内に蛍光強度の平均値（平均蛍光強度）を示した。また同図中、四角囲み文字で積算蛍光強度を示した。
【０１４０】
図３（ａ）より5μg/mlのブラスティサイジンで選択を行なった細胞の平均蛍光強度は、２．９４、積算蛍光強度は２２２であり、図３（ｂ）より10μg/mlのブラスティサイジンで選択を行なった細胞の平均蛍光強度は３．７７、積算蛍光強度は３２２であり、図３（ｃ）より40μg/mlのブラスティサイジンで選択を行なった細胞の平均蛍光強度は６．６７、積算蛍光強度は６４０であり、図３（ｄ）より160μg/mlのブラスティサイジンで選択を行なった細胞の平均蛍光強度は９．４７、積算蛍光強度は９２９であり、図３（ｅ）より320μg/mlのブラスティサイジンで選択を行なった細胞の平均蛍光強度は１８．５５、積算蛍光強度は１８５０であった。
【０１４１】
よって形質転換した細胞を選択する際に薬剤濃度を漸増させることによって、目的タンパク質の発現量を増加させることができるということがわかった。
【０１４２】
〔実施例４〕目的タンパク質の発現を制御するプロモーターの転写活性化因子を高発現させる効果
（方法）
TRE-promoterの転写活性化因子（Tet-ONタンパク質）をコードするTet-ON遺伝子を有するpTet-ON plasmid（クロンテック社製）を、ヒト大腸がんCOLO 320DM細胞にリポフェクション法で導入し、安定な形質転換細胞をヒグロマイシンで選択した。このような細胞（以下「Tet-ON細胞」という）に、ヒトDHFR遺伝子座由来のIRおよびMAR、並びにブラスティサイジン（Blasticidine）抵抗性遺伝子を持ち、かつ、TRE-promoter（テトラサイクリン誘導プロモーター）の支配下にd2EGFP遺伝子を持つプラスミド（pSFVdhfr/d2EGFP）と、鳥類由来HS4インシュレーター配列を持つプラスミドとを混合し、リポフェクション法で導入し、ブラスティサイジンで安定な形質転換体を選択した。なお当該鳥類由来HS4インシュレーター配列を持つプラスミドは、実施例２に記載のものを用いた。
【０１４３】
次に、このような細胞について、さらにpTet-ON plasmidを再度リポフェクション法で導入して２日後の一過性発現の時期に、d2EGFP発現量の検討を行なった。
【０１４４】
一般に、当該安定な形質転換細胞はTet-ONタンパク質（rtTA）の発現レベルは低いのに対して、一過性発現の場合はその発現レベルが高い。したがって、安定な形質転換細胞のd2EGFPの発現量をTet-ONタンパク質通常発現の場合の結果とし、一過性発現の場合のd2EGFPの発現量をTet-ONタンパク質高発現の場合の結果として比較した。
【０１４５】
（結果）
図４に各種細胞の位相差顕微鏡像、蛍光顕微鏡像を示す。また各細胞当たりのd2EGFP発現量を、セルソーターで解析した結果を図５に示す。
【０１４６】
図４（ａ）はTet-ONタンパク質通常発現の細胞についての位相差顕微鏡像（×200）であり、図４（ｂ）はTet-ONタンパク質高発現の細胞についての位相差顕微鏡像（×200）であり、図４（ｃ）はTet-ONタンパク質通常発現についての蛍光顕微鏡像（×200）であり、図４（ｄ）はTet-ONタンパク質高発現の細胞についての蛍光顕微鏡像（×200）である。
【０１４７】
また図５（ａ），（ｂ）は、複製起点も核マトリックス結合領域も持たない上記pSFV-VプラスミドにTRE-promoterに支配されたd2EGFP遺伝子を組み込むことによって構築したプラスミドを導入した細胞についてTet-ONタンパク質通常発現の場合（図５（ａ））、およびpSFV-VプラスミドにTRE-promoterに支配されたd2EGFP遺伝子を組み込むことによって構築したプラスミドを導入した細胞についてTet-ONタンパク質高発現の場合（図５（ｂ））の蛍光強度をそれぞれ示し、図５（ｃ），（ｄ）は、鳥類由来HS4インシュレーター配列をpSFVdhfr/d2EGFPと同時増幅させた細胞についてTet-ONタンパク質通常発現の場合の結果（図５（ｃ））、および鳥類由来HS4インシュレーター配列をpSFVdhfr/d2EGFPと同時増幅させた細胞についてTet-ONタンパク質高発現の場合（図５（ｄ））の蛍光強度を示した。同図中の括弧内に蛍光強度の平均値（平均蛍光強度）を示した。また同図中、四角囲み文字で積算蛍光強度を示した。
【０１４８】
図４（ａ）〜（ｄ）によれば、Tet-ONタンパク質が通常発現している安定な形質転換細胞の蛍光に対して、Tet-ONタンパク質が高発現している細胞の蛍光が明らかに増加していることがわかった（特に図４（ｃ）、（ｄ）参照）。
【０１４９】
また図５（ａ）の平均蛍光強度が１．０２、積算蛍光強度が０．７８７であるのに対して、図５（ｂ）の平均蛍光強度が１．２１、積算蛍光強度が１８．１となっており、また図５（ｃ）の平均蛍光強度が５．８０、積算蛍光強度が５３２であるのに対して、図５（ｄ）の平均蛍光強度が８．１５、積算蛍光強度が７６６となっていることから、遺伝子増幅のコピー数によらず、Tet-ONタンパク質が高発現している場合に蛍光強度が増加する、すなわち目的タンパク質の発現量が増加するということがわかった。さらに鳥類由来HS4インシュレーター配列と同時増幅させ、かつTet-ONタンパク質が高発現している細胞の蛍光強度（図５（ｄ））が最も高かった（平均蛍光強度：８．１５、積算蛍光強度：７６６）ことから、目的タンパク質の発現を高めるための手段を複数組み合わせることによって、さらなるタンパク質の高発現を行なうことができるということがわかった。
【０１５０】
〔実施例５〕増幅領域中の目的タンパク質をコードする遺伝子を、染色体外に切り出す効果
（方法）
pSFVdhfr/d2EGFPプラスミドのヒグロマイシン（Hygromycine）抵抗性遺伝子を除き、合成loxP 配列(46 bp)をブラスティサイジン（Blasticidine）抵抗性遺伝子の下流に組み込んだプラスミドを構築した。なお上記loxP 配列(46 bp)は、5'-GCGCGGCCGCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGCGGCCGCGC-3'（配列番号１）に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を公知のＤＮＡ合成機により合成したものを用いた。なお上記loxP配列における両端（５’末端および３’末端）のGCGGCCGCは、クローニングのためのNot I 認識配列である。
【０１５１】
上記プラスミドをヒト大腸がん細胞COLO 320DM細胞にリポフェクション法で導入した。形質転換した細胞を、5μg/mlのブラスティサイジンで選択した。当該形質転換細胞を、Cre Recombinase遺伝子を持つプラスミド（Rolf Sprengel博士（Max-Planck-Institut, Germany）より受領した。『Shimshek, D.R., J. Kim, M.R. Hubner, D.J. Spergel, F. Buchholz, E. Casanova, A.F. Stewart, P.H. Seeburg, and R. Sprengel. 2002. Codon-improved Cre recombinase (iCre) expression in the mouse. Genesis. 32:19-26.』参照）で形質転換し、一週間培養を行なった。
【０１５２】
（結果）
図６に各種細胞の位相差顕微鏡像、蛍光顕微鏡像を示す。図６（ａ）はCre Recombinase遺伝子を導入する前の細胞についての位相差顕微鏡像（×200）であり、図６（ｂ）はCre Recombinase遺伝子を導入後の細胞についての位相差顕微鏡像（×200）であり、図６（ｃ）はCre Recombinase遺伝子を導入する前の細胞についての蛍光顕微鏡像（×200）であり、図６（ｄ）はCre Recombinase遺伝子を導入後の細胞についての蛍光顕微鏡像（×200）である。
【０１５３】
図６（ａ）〜（ｄ）によれば、Cre Recombinase遺伝子を導入する前の細胞の蛍光に対して、Cre Recombinase遺伝子を導入後の細胞の蛍光が明らかに増加していた（特に図６（ｃ）、（ｄ）参照）。したがって、遺伝子増幅により反復配列を生じている遺伝子領域を染色体外へ切り出すことで、発現が抑制されていた目的タンパク質を発現させることができるということがわかった。
【０１５４】
〔実施例６〕5-aza-2'-deoxycytidineで細胞を処理する効果
（方法）
ヒトDHFR遺伝子座由来のIRおよびMAR、並びにブラスティサイジン（Blasticidine）抵抗性遺伝子を持ち、かつ、TRE-promoter（テトラサイクリン誘導プロモーター）の支配下にd2EGFP遺伝子を持つプラスミド（pSFVdhfr/d2EGFP）と、鳥類由来HS4インシュレーター配列を持つプラスミドDNA（実施例２に記載のものと同様）とを混合して、ヒト大腸がん細胞COLO 320DM細胞にリポフェクション法で導入した。遺伝子導入２日後から、プラスミド上のブラスティサイジン耐性遺伝子に対応する5μg/mlのブラスティサイジン（フナコシ社製）で選択し、３〜４週間後に多数のコロニーからなる形質転換細胞を得た。
【０１５５】
当該形質転換細胞の培養液中に、１μMまたは３μMの5-aza-2'deoxycytidine（適宜「5-aza」という。Sigma社製）を添加して３日間処理を行なった。また比較として、反復配列からの遺伝子発現を高める物質として公知のTrichostatin A（適宜「TSA」という; ヒストン脱アセチル化阻害剤、Sigma社製）を形質転換細胞の培養液中に20nM添加した場合についても検討した。
【０１５６】
（結果）
図７に各種細胞の位相差顕微鏡像、蛍光顕微鏡像を示す。また各細胞当たりのd2EGFP発現量を、セルソーターで解析した結果を図８に示す。
【０１５７】
図７（ａ）は5-aza処理前の細胞についての位相差顕微鏡像（×200）であり、図７（ｂ）は１ μMの5-aza処理後の細胞についての位相差顕微鏡像（×200）であり、図７（ｃ）は5-aza処理前の細胞についての蛍光顕微鏡像（×200）であり、図７（ｄ）は１μMの5-aza処理後の細胞についての蛍光顕微鏡像（×200）である。
【０１５８】
また図８（ａ）は5-aza処理前の細胞の蛍光強度を示し、図８（ｂ）は20 nMのTSA処理後の細胞の蛍光強度を示し、図８（ｃ）は１μMの5-azaで処理した細胞の蛍光強度を示し、図８（ｄ）は１μMの5-azaおよび20 nMのTSAで処理した細胞の蛍光強度を示し、図８（ｅ）は３μMの5-azaで処理した細胞の蛍光強度を示し、図８（ｆ）は3 μMの5-azaおよび20 nMのTSAで処理した細胞の蛍光強度を示した。同図中の括弧内に蛍光強度の平均値（平均蛍光強度）を示した。また同図中、四角囲み文字で積算蛍光強度を示した。
【０１５９】
図７（ａ）〜（ｄ）によれば、5-aza処理前の細胞の蛍光に対して、5-aza処理後の細胞の蛍光が明らかに増加していることがわかった（特に図７（ｃ）および（ｄ）参照）。
【０１６０】
また図８（ａ）に示す5-aza処理前の細胞の平均蛍光強度が４．２９、積算蛍光強度３６４であるのに対して、図８（ｃ）に示す１μMの5-azaで処理した細胞の平均蛍光強度が９．４８、積算蛍光強度が８９５であった。したがって5-azaによる処理によって明らかに目的タンパク質であるd2EGFPが高発現するということがわかった。また図８（ｅ）に示すとおり、3μMの5-azaで処理した細胞の平均蛍光強度が１０．９３、積算蛍光強度１０４０と1μMの5-azaで処理した細胞の蛍光強度よりもさらに増加していることより、処理を行なう5-azaの濃度を増加することによって、目的タンパク質の発現をさらに増加させることができるということがわかった。
【０１６１】
一方、図８（ｂ）に示す20nMのTSA処理後の細胞の平均蛍光強度が３．０２、積算蛍光強度２２８であり、処理前の細胞の平均蛍光強度が４．２９、積算蛍光強度３６４（図８（ａ））であったことから、20nMのTSA処理によっては目的タンパク質を高発現させることができないということがわかった。また１μMの5-azaで処理した細胞の平均蛍光強度が９．４８、積算蛍光強度８９５（図８（ｃ））に対して、１μMの5-azaおよび20nMのTSAで処理した細胞の平均蛍光強度が９．４０、積算蛍光強度８７８（図８（ｄ））であり、3μMの5-azaで処理した細胞の平均蛍光強度が１０．９３、積算蛍光強度１０４０（図８（ｅ））に対して、3μMの5-azaおよび20nMのTSAで処理した細胞の平均蛍光強度が１１．０９、積算蛍光強度１０５０（図８（ｆ））であった。したがって、5-azaとTSAとを併用した場合であっても目的タンパク質の発現を増加させることができないということがわかった。
【０１６２】
〔実施例７〕遺伝子増幅がＤＭ上で起こっているクローンを選択する効果
（方法）
TRE-promoterの転写活性化因子（Tet-ONタンパク質）をコードするTet-ON遺伝子を有するpTet-ON plasmid（クロンテック社製）を、ヒト大腸がんCOLO 320DMにリポフェクション法で導入し、Tet-ONタンパク質を安定に発現する形質転換細胞（以下「Tet-ON細胞」という）をヒグロマイシンで選択した。
【０１６３】
次にpSFVdhfr/d2EGFP プラスミドを、上記Tet-ON細胞にリポフェクション法で導入し、５μg/mlブラスティサイジンで約３週間選択することにより、安定形質転換細胞の多クローン性集団を得た。
【０１６４】
上記多クローン性集団について、Doxycycline（クロンテック社製）を１μg/mlとなるように培地中へ添加することによりTRE-promoterを活性化し、d2EGFPの発現を誘導した。この時のd2EGFP発現量を、セルソーターで解析した結果を図９に示した。同図中の括弧内に蛍光強度の平均値（平均蛍光強度）を示した。また同図中、四角囲み文字で積算蛍光強度を示した。同図の結果より、上記多クローン性集団は確かにd2EGFPを発現する集団であるということを確認した（平均蛍光強度：６．２５、積算蛍光強度：５３６）。
【０１６５】
上記多クローン性集団から、限界希釈法により任意の３０クローンを得た。限界希釈法は、３０細胞／ｍｌの低細胞濃度で6 well plateに蒔き、1０日〜２週間培養することによりコロニーを形成させることにより行なった。
【０１６６】
次に各クローンについて、蛍光顕微鏡で観察してd2EGFP発現レベルの高い４クローン（クローン４、クローン５、クローン６、およびクローン９）を選択した。当該４クローンについて分裂期染色体標本を調製し、導入したpSFVdhfr/d2EGFP プラスミド由来の塩基配列をＦＩＳＨ法により検出した。分裂期染色体標本の作製とＦＩＳＨ法は、『Shimizu, N., Kanda, T., and Wahl, G. M. Selective capture of acentricfragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nature Genet., 12: 65−71, 1996.』に記載の方法により行なった。
【０１６７】
ＦＩＳＨ法によりpSFVdhfr/d2EGFP プラスミド由来の塩基配列を検出した結果を図１０に示す。図１０（ａ）はクローン４の結果であり、図１０（ｂ）はクローン５の結果であり、図１０（ｃ）はクローン６の結果であり、図１０（ｄ）はクローン９の結果である。なお検出したpSFVdhfr/d2EGFP プラスミド由来の塩基配列を、同図中矢印で示す。
【０１６８】
図１０の結果より、クローン４、クローン５、およびクローン６ではpSFVdhfr/d2EGFP プラスミド由来の塩基配列がＨＳＲ上で増幅されていたのに対し、クローン９はＤＭ上で増幅していたことがわかった。
【０１６９】
次に上記４クローンにつき、Doxycycline（クロンテック社製；１μg/ml）による誘導を行なうとともに、5-aza（０μM、１μM、または３μM）を培地中に加えた。培養一週間後、各クローンのd2EGFP発現量をセルソーターにより解析した。
【０１７０】
その結果を図１１、１２、１３、および１４に示す。図１１はクローン４の結果を示しており、同図（ａ）は5-azaを培地中に加えなかった場合（０μM）の結果を示し、同図（ｂ）は5-azaを１μMとなるように培地中に加えた場合の結果を示し、同図（ｃ）は5-azaを３μMとなるように培地中に加えた場合の結果を示す。
【０１７１】
図１２はクローン５の結果を示しており、同図（ａ）は5-azaを培地中に加えなかった場合（０μM）の結果を示し、同図（ｂ）は5-azaを１μMとなるように培地中に加えた場合の結果を示し、同図（ｃ）は5-azaを３μMとなるように培地中に加えた場合の結果を示す。
【０１７２】
図１３はクローン６の結果を示しており、同図（ａ）は5-azaを培地中に加えなかった場合（０μM）の結果を示し、同図（ｂ）は5-azaを１μMとなるように培地中に加えた場合の結果を示し、同図（ｃ）は5-azaを３μMとなるように培地中に加えた場合の結果を示す。
【０１７３】
図１４はクローン９の結果を示しており、同図（ａ）は5-azaを培地中に加えなかった場合（０μM）の結果を示し、同図（ｂ）は5-azaを１μMとなるように培地中に加えた場合の結果を示し、同図（ｃ）は5-azaを３μMとなるように培地中に加えた場合の結果を示す。
【０１７４】
図１１〜１３中の括弧内に蛍光強度の平均値（平均蛍光強度）を示した。また同図中、四角囲み文字で積算蛍光強度を示した。
【０１７５】
図１１より、クローン４について、5-azaを培地中に加えなかった場合（０μM）のd2EGFPの発現レベルを示す平均蛍光強度は１．８９、積算蛍光強度は９０．０であり、5-azaを１μMとなるように培地中に加えた場合の平均蛍光強度は５．４６、積算蛍光強度は４５３であり、5-azaを３μMとなるように培地中に加えた場合の平均蛍光強度は２３．７６、積算蛍光強度は２３００であった。
【０１７６】
図１２より、クローン５について、5-azaを培地中に加えなかった場合（０μM）のd2EGFPの発現レベルを示す平均蛍光強度は１．０２、積算蛍光強度は１．１１であり、5-azaを１μMとなるように培地中に加えた場合の平均蛍光強度は２．２３、積算蛍光強度は１２６であり、5-azaを３μMとなるように培地中に加えた場合の平均蛍光強度は１０．４４、積算蛍光強度は９６２であった。
【０１７７】
図１３より、クローン６について、5-azaを培地中に加えなかった場合（０μM）のd2EGFPの発現レベルを示す平均蛍光強度は１．１６、積算蛍光強度は８．８４であり、5-azaを１μMとなるように培地中に加えた場合の平均蛍光強度は２．０９、積算蛍光強度は１１１であり、5-azaを３μMとなるように培地中に加えた場合の平均蛍光強度は１０．８７、積算蛍光強度は１０００であった。
【０１７８】
図１４より、クローン９について、5-azaを培地中に加えなかった場合（０μM）のd2EGFPの発現レベルを示す平均蛍光強度は４１．４６、積算蛍光強度は４１３０であり、5-azaを１μMとなるように培地中に加えた場合の平均蛍光強度は１３１．８６、積算蛍光強度は１３２００であり、5-azaを３μMとなるように培地中に加えた場合の平均蛍光強度は２４８．６０、積算蛍光強度は２４９００であった。
【０１７９】
図１１〜１４の結果から、pSFVdhfr/d2EGFP プラスミド由来の塩基配列がＨＳＲ上で増幅しているクローン（クローン４、クローン５、クローン６）では、d2EGFPの発現レベルは極めて低いが、5-azaを培地中に加えることにより向上するということが示された。一方、pSFVdhfr/d2EGFP プラスミド由来の塩基配列がＤＭ上で増幅しているクローン（クローン９）では、5-azaを培地中に加えなくともd2EGFPの高い発現レベル（平均蛍光強度：４１．４６、積算蛍光強度：４１３０）であり、さらに5-azaを培地中に加えることによりそれが飛躍的に高まることがわかった（平均蛍光強度：１３１．８６または２４８．６０、積算蛍光強度：１３２００または２４９００）。
【０１８０】
したがって、遺伝子増幅がＤＭ上で起こっているクローンを選択することによって、目的タンパク質を高発現させることができるということがわかった。
【０１８１】
〔実施例８〕コトランスフェクションによって、目的タンパク質の発現を制御するプロモーターの転写活性化因子を高発現させる効果
（方法および結果）
ヒトDHFR遺伝子座由来のIRおよびMAR、並びにBlasticidine抵抗性遺伝子を持ち、かつ、TRE-promoter（テトラサイクリン誘導プロモーター）の支配下にd2EGFP遺伝子を持つプラスミド（pSFVdhfr/d2EGFP）とTRE-promoterの転写活性化因子（Tet-ONタンパク質）をコードするTet-ON遺伝子を有するpTet-ON plasmid（クロンテック社製）とを等量混合し、同時にリポフェクション法によりヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入した。５μg/mlブラスティサイジンで選択することにより、形質転換細胞の多クローン性集団を得た。当該多クローン性集団の細胞養液に、Doxycycline（クロンテック社製）を１μg/mlとなるように培地中へ添加することによりTRE-promoterを活性化し、d2EGFPの発現を誘導した。
【０１８２】
上記多クローン性集団について、Doxycycline添加前の位相差顕微鏡像（×200）を図１５（ａ）に示し、蛍光顕微鏡像（×200）を図１５（ｂ）に示した。また、同多クローン性集団について、Doxycycline添加後の位相差顕微鏡像（×200）を図１５（ｃ）に示し、蛍光顕微鏡像（×200）を図１５（ｄ）に示した。
【０１８３】
図１５（ａ）〜（ｄ）によれば、Doxycycline添加前には微弱な発現しか見られなかったd2EGFPの蛍光に対し、Doxycycline添加によりd2EGFPの蛍光が強く見られるようになった。よってpSFVdhfr/d2EGFP とpTet-ON plasmid とを同時に導入した形質転換細胞の多クローン性集団に関し、Doxycycline（クロンテック社製）を培地中へ添加することによりTRE-promoterを活性化し、d2EGFPの発現を誘導することができるということを確認した。
【０１８４】
次に、Doxycycline添加によるd2EGFPの発現誘導を行なった後の、d2EGFPの発現量の経時変化をセルソーターにて解析を行なった。その結果を図１６に示す。図１６（ａ）はDoxycycline添加前の結果であり、図１６（ｂ）はDoxycycline添加１時間後の結果であり、図１６（ｃ）はDoxycycline添加３時間後の結果であり、図１６（ｄ）はDoxycycline添加６時間後の結果であり、図１６（ｅ）はDoxycycline添加１５時間後の結果であり、図１６（ｆ）はDoxycycline添加２４時間後（１日後）の結果であり、図１６（ｇ）はDoxycycline添加４８時間後（２日後）の結果であり、図１６（ｈ）はDoxycycline添加１２０時間後（５日後）の結果であり、図１６（ｉ）はDoxycycline添加２週間後の結果である。同各図中の括弧内に蛍光強度の平均値（平均蛍光強度）を示した。また同図中、四角囲み文字で積算蛍光強度を示した。
【０１８５】
さらに、d2EGFP発現量の平均値（すなわち平均蛍光強度：図中黒丸のシンボルで示す）および生細胞率（全細胞数に対する生細胞の割合：図中白丸のシンボルで示す）を時間に対してプロットしたグラフを図１７に示す。図１７によれば、上記で取得した多クローン性集団ではDoxycyclineを添加前にはd2EGFPの発現量は極めて低いが、Doxycycline添加後１〜２日後に発現量はピークに達し、その発現量は２週間（同図中「２ｗｋ」で表記）を経過しても高いレベルにあった。また同多クローン性集団はDoxycyclineによるd2EGFPの発現誘導により、細胞の生存率が低下することはなく、高いレベルでd2EGFPを発現しながら正常に増殖を続けていた。
【０１８６】
なお陰性対照として、複製起点も核マトリックス結合領域も持たない上記pSFV-VプラスミドにTRE-promoterに支配されたd2EGFP遺伝子を組み込むことによって構築したプラスミドを、Tet-ON細胞に導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団について、上記と同様にDoxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を行ない、セルソーターによりd2EGFPの発現を解析した結果を図１６（ｊ）に示した。図１６（ｊ）によれば、陰性対照のd2EGFP発現レベルを示す平均蛍光強度は１．０２、積算蛍光強度は０．７８７であった。
【０１８７】
これに対して、Doxycycline添加１時間後の平均蛍光強度は２．９９、積算蛍光強度は２１６であり（図１６（ｂ））、Doxycycline添加３時間後の平均蛍光強度は３．７２、積算蛍光強度は２９３であり（図１６（ｃ））、Doxycycline添加６時間後の平均蛍光強度は４．２２、積算蛍光強度は３４１であり（図１６（ｄ））、Doxycycline添加１５時間後の平均蛍光強度は９．２４、積算蛍光強度は８４１であり（図１６（ｅ））、Doxycycline添加２４時間後の平均蛍光強度は２８．７７、積算蛍光強度は２８００であり（図１６（ｆ））、Doxycycline添加４８時間後（２日後）の平均蛍光強度は５３．９７、積算蛍光強度は５３２０であり（図１６（ｇ））、Doxycycline添加１２０時間後（５日後）の平均蛍光強度は３９．５６、積算蛍光強度は３８８０であり（図１６（ｈ））、Doxycycline添加２週間後の平均蛍光強度は３５．３２、積算蛍光強度は３５００であった（図１６（ｉ））。
【０１８８】
この結果から、本実施例にかかる方法を用いて得られた多クローン性集団の発現誘導後の発現レベルは極めて高く、それは積算蛍光強度の比較において、陰性対照の場合の約３００倍から約７０００倍に達していることがわかった。
【０１８９】
さらに本実施例にかかる方法を用いて得られた多クローン性集団から、任意に選抜した５つのクローンについて、発現誘導前後のd2EGFP発現量をセルソーターにて解析を行なった。その結果の代表例（３つのクローン）を図１８に示す。図１８（ａ）および（ｂ）はクローンＡについての結果であり、（ａ）は発現誘導前の結果を示し、（ｂ）は発現誘導後の結果を示している。図１８（ｃ）および（ｄ）はクローンＢについての結果であり、（ｃ）は発現誘導前の結果を示し、（ｄ）は発現誘導後の結果を示している。図１８（ｅ）および（ｆ）はクローンＣについての結果であり、（ｅ）は発現誘導前の結果を示し、（ｆ）は発現誘導後の結果を示している。同各図中の括弧内に蛍光強度の平均値（平均蛍光強度）を示した。また同図中、四角囲み文字で積算蛍光強度を示した。
【０１９０】
図１８によれば、本実施例にかかる方法を用いて得られた多クローン性集団から、目的タンパク質（d2EGFP）の発現量が非常に高いクローンを簡便に得ることができるということがわかった。
【０１９１】
さらに本実施例にかかる方法によれば、ＨＳＲ上の増幅遺伝子からも目的タンパク質（d2EGFP）の高発現が期待できる。このことは以下の実験により確認するこができる。すなわち、複製起点配列と核マトリックス結合領域配列をともに持つプラスミドである上記pSFVdhfrと、LacO (lactose operator)-repeat配列とTRE-promoterの下流にMS2結合配列を持つプラスミドであるpECMS2Beta (Susan Janicki博士とDavid Spector博士（cold Spring Harbor Laboratory）より入手した。『Janicki, S.M., T. Tsukamoto, S.E. Salghetti, W.P. Tansey, R. Sachidanandam, K.V. Prasanth, T. Ried, Y. Shav-Tal, E. Bertrand, R.H. Singer, and D.L. Spector. 2004. From silencing to gene expression: real-time analysis in single cells. Cell. 116:683-698.』参照)とを混合し、リポフェクション法により、ヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へコトランスフェクションを行なった。
【０１９２】
この際に用いたヒト大腸がんCOLO 320DM 細胞は、あらかじめLacR (lactose repressor)とCFP (cyan fluorescence protein)の融合タンパク蛋白質を発現するpLacR-CFP プラスミド(Susan Janicki博士とDavid Spector博士（cold Spring Harbor Laboratory）より入手した。『Janicki, S.M., T. Tsukamoto, S.E. Salghetti, W.P. Tansey, R. Sachidanandam, K.V. Prasanth, T. Ried, Y. Shav-Tal, E. Bertrand, R.H. Singer, and D.L. Spector. 2004. From silencing to gene expression: real-time analysis in single cells. Cell. 116:683-698.』参照）をリポフェクション法で導入し、ネオマイシン（Neomycine）耐性となったクローン化細胞を用いた。
【０１９３】
その結果、上記両プラスミドが同時増幅してＨＳＲを形成したクローンを取得した。当該クローンではＨＳＲ中のLacO配列にLacR-CFPが結合するために、ＨＳＲがシアン色の蛍光を呈している。
【０１９４】
さらに、pTet-ON plasmid（クロンテック社製）、およびMS2とYFP (yellow fluorescecnce protein)との融合タンパク質を発現するためのプラスミド(Susan Janicki博士とDavid Spector博士（cold Spring Harbor Laboratory）より入手した。『Janicki, S.M., T. Tsukamoto, S.E. Salghetti, W.P. Tansey, R. Sachidanandam, K.V. Prasanth, T. Ried, Y. Shav-Tal, E. Bertrand, R.H. Singer, and D.L. Spector. 2004. From silencing to gene expression: real-time analysis in single cells. Cell. 116:683-698.』参照）を、上記クローンへエレクトロポレーション法により同時に導入し、２．５時間後にDoxycycline（クロンテック社製）を１μg/mlとなるように培地中へ添加した。この時、発現したTet-ONタンパク質とDoxycyclineとがＨＳＲ中のTRE-promoterを活性化し、MS2とYFP (yellow fluorescecnce protein)との融合タンパク質をコードするＲＮＡが転写される。かかるＲＮＡにはMS2結合配列があるため、MS2とYFPとの融合蛋白質が結合して黄色の蛍光を呈する。
【０１９５】
この結果を示す代表的な写真を図１９に示す。同図中Ａ、ＢおよびＣはDoxycyclineによる発現誘導前のクローンの蛍光顕微鏡像であり（「−Ｄｏｘ」を図左端に付した）、ＤおよびＥはDoxycyclineによる発現誘導１．５時間後のクローンの蛍光顕微鏡像である（「＋Ｄｏｘ  １．５ｈｒ」を図左端に付した）。また同図の上部に「ＬａｍｉｎＢ」を付したものは抗Ｌａｍｉｎ  Ｂ抗体（Santa Cruz Biotechnologies社製）を用いた間接蛍光抗体法で核膜ラミナを可視化したものであり、「ＣＦＰ−ＨＳＲ」を付したものはＨＳＲをCFP (cyan fluorescence protein)で可視化したものであり、「ＹＦＰ-ＭＳ２  ＲＮＡ」を付したものはＲＮＡをYFP (yellow fluorescecnce protein)により可視化したものであり、「Ｍｅｒｇｅ」を付したものは上記３つの像を重ね合わせたものである。
【０１９６】
CFP (cyan fluorescence protein)のシアン色で可視化されたＨＳＲ（同図中、矢印で示す）はヘテロクロマチン化しているために、Doxycyclineによる発現誘導前には小さな凝縮した球状の構造で核内に存在していた。Doxycyclineによる発現誘導を行なうと、シアン色のＨＳＲが大きくゆるみ、そこから黄色蛍光で可視化されたＲＮＡが出てくる様子がはっきりと示された（同図中、丸で囲む）。
【０１９７】
上記結果から、Tet-ONタンパク質とDoxycyclineによるTRE-promoterの活性化は、IRとMARを持つプラスミドにより形成され、ヘテロクロマチン化していたＨＳＲをほどき、ＲＮＡの転写を活性化できることがわかった。
〔実施例９〕コトランスフェクションによって目的タンパク質の発現を制御するプロモーターの転写活性化因子を高発現させ、5-aza-2'-deoxycytidineで細胞を処理する効果
（方法および結果）
ヒトDHFR遺伝子座由来のIRおよびMAR、並びにBlasticidine抵抗性遺伝子を持ち、かつ、TRE-promoter（テトラサイクリン誘導プロモーター）の支配下にd2EGFP遺伝子を持つプラスミド（pSFVdhfr/d2EGFP）とTRE-promoterの転写活性化因子（Tet-ONタンパク質）をコードするTet-ON遺伝子を有するpTet-ON plasmid（クロンテック社製）とを等量混合し、同時にリポフェクション法によりヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入した。５μg/mlブラスティサイジンで選択することにより、形質転換細胞の多クローン性集団を得た。上記多クローン性集団から、限界希釈法により任意の１０クローンを選抜し、さらに上記１０クローンからpSFVdhfr/d2EGFP プラスミド由来の塩基配列がＨＳＲ上で増幅されているクローン（便宜上、「ＨＳＲクローン」という）、および同塩基配列がＤＭ上で増幅しているクローン（便宜上、「ＤＭクローン」という）を選抜した。図２０（ａ）および図２０（ｂ）は、ＨＳＲクローンおよびＤＭクローンについて、導入したpSFVdhfr/d2EGFP プラスミドの塩基配列をＦＩＳＨ法により検出した結果をそれぞれ示している。同図中、検出したpSFVdhfr/d2EGFP プラスミド由来の塩基配列を、矢印で示す。なお、限界希釈法、並びにＨＳＲクローンおよびＤＭクローンの選抜方法は、実施例７に記載の方法と同様にして行なった。
【０１９８】
次に上記２クローンの各培養液中に、３μMの5-azaを添加して３日間処理を行なったのち、Doxycycline（クロンテック社製；１μg/ml）を培養液に添加して２日間、d2EGFPの発現誘導を行なった。培養後、各クローンのd2EGFP発現量をセルソーターにより解析した。また陰性対照として、複製起点も核マトリックス結合領域も持たないpSFV-VプラスミドをpSFVdhfr/d2EGFPの代わりに用い、上記と同様にして形質転換細胞の多クローン性集団を取得した。上記形質転換細胞の多クローン性集団について、上記と同様にDoxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を行ない、d2EGFP発現量をセルソーターにより解析した。その結果を図２１（ａ）〜（ｃ）に示す。図２１（ａ）はＨＳＲクローンについてDoxycycline添加２日後の蛍光強度を測定した結果であり、図２１（ｂ）はＤＭクローン（5-aza処理無し）についてDoxycycline添加２日後の蛍光強度を測定した結果であり、図２１（ｃ）はＤＭクローン（5-aza処理有り）についてDoxycycline添加２日後の蛍光強度を測定した結果である。同各図中の括弧内に蛍光強度の平均値（平均蛍光強度）を示し、四角囲み文字で積算蛍光強度を示した。また図２１（ｄ）は、陰性対照、ＨＳＲクローン、およびＤＭクローン（5-aza処理有りの場合と無しの場合）について、Doxycycline添加２日後の積算蛍光強度を示す棒グラフである。
【０１９９】
図２１（ｄ）によれば、陰性対照（同図中「Ｎ」で示す）の積算蛍光強度が１８２６であったのに対して、ＨＳＲクローン（同図中「ＨＳＲ」で示す）の積算蛍光強度が２２１１９であり、ＤＭクローン（5-aza処理無し：同図中「ＤＭ（−）」で示す）の積算蛍光強度が７５０９９であり、ＤＭクローン（5-aza処理有り：図中「ＤＭ（＋）」で示す）の積算蛍光強度が２３８１１３であった。よって、ＨＳＲクローンおよびＤＭクローンは、陰性対照のクローンに比してd2EGFP発現レベルが顕著に高く、ＤＭクローンの方がＨＳＲクローンに比してさらに高いということが分かった。また5-aza処理によって、d2EGFP発現レベルがさらに向上するということが分かった。
〔実施例１０〕ＣＨＯ細胞における本発明の効果
（方法および結果）
プラスミドが導入される細胞がＣＨＯ−Ｋ１細胞（入手先：東北大学加齢医学研究所・医用細胞資源センターより入手）である以外は、実施例９と同様にした。
【０２００】
その結果、ＣＨＯ細胞においても、pSFVdhfr/d2EGFP プラスミド由来の塩基配列がＨＳＲ上で増幅されているクローン（便宜上、「ＨＳＲクローン」という）、および同塩基配列がＤＭ上で増幅しているクローン（便宜上、「ＤＭクローン」という）を単離することができた。このことは、本発明がCOLO 320DM細胞等の腫瘍細胞以外においても適用可能であることを示している。単離したＣＨＯ細胞のＨＳＲクローンについて、導入したpSFVdhfr/d2EGFP プラスミドの塩基配列をＦＩＳＨ法により検出した結果を図２２（ａ）に示し、ＣＨＯ細胞のＤＭクローンの結果を図２２（ｂ）に示した。なお検出したpSFVdhfr/d2EGFP プラスミド由来の塩基配列を、同図中矢印で示す。
【０２０１】
セルソーターによるd2EGFPの発現量が最も高かったクローン（便宜上「最高クローン」という）について、Doxycycline添加２日後の蛍光強度を測定した結果を図２３（ａ）に示す。また図２３（ｂ）に、陰性対照における形質転換細胞の多クローン性集団、本実施例における形質転換細胞の多クローン性集団、および最高クローンについて、Doxycycline添加２日後の積算蛍光強度の結果を示した。
【０２０２】
図２３（ｂ）によれば、陰性対照における形質転換細胞の多クローン性集団（同図中「ＮＰ」で示す）の積算蛍光強度が２９６であったのに対して、本実施例における形質転換細胞の多クローン性集団（同図中「Ｐ」で示す）の積算蛍光強度が１４０２２であり、最高クローン（同図中「Ｍ」で示す）の積算蛍光強度が１６７８６５であった。よって、本実施例における形質転換細胞の多クローン性集団および最高クローンは、陰性対照における形質転換細胞の多クローン性集団に比してd2EGFP発現レベルが顕著に高いということが分かった。特に、多クローン性集団から単離した最高クローンのd2EGFP発現レベルは、陰性対照の場合に比してさらに顕著に高かった。
【０２０３】
最高クローンについて、導入したpSFVdhfr/d2EGFP プラスミドの塩基配列を、ＦＩＳＨ法により検出した結果を図２３（ｃ）に示した。なお検出したpSFVdhfr/d2EGFP プラスミド由来の塩基配列を、同図中矢印で示す。図２３（ｃ）によれば、上記最高クローンは、pSFVdhfr/d2EGFP プラスミド由来の塩基配列がＨＳＲ（比較的短い形状のＨＳＲ）上で増幅されているクローンであるということがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０２０４】
上記説示したように本発明にかかる方法およびキットによれば、遺伝子の反復配列に起因する転写抑制を解除する方法および手段を提供し、遺伝子増幅により有用タンパク質を大量に生産することができる。よって本発明は、タンパク質の生産を行なう産業、例えば医薬品、化学、食品、化粧品、繊維等の産業に利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１（ａ）】実施例１において、コントロールとしてλ−ファージＤＮＡを混合せずにpSFVdhfr (GAP-GFP)のみを細胞に導入した場合の蛍光強度を示す図である。
【図１（ｂ）】実施例１において、pSFVdhfr (GAP-GFP)、およびλ−ファージＤＮＡを混合して細胞に導入した場合（コトランスフェクション）の蛍光強度を示す図である。
【図２（ａ）】実施例２において、コントロールとしてpSFVdhfr/d2EGFPのみを細胞に導入した場合の蛍光強度を示す図である。
【図２（ｂ）】実施例２において、pSFVdhfr/d2EGFPのみを細胞に導入し、80μg/mlのブラスティサイジンで選択をさらに行なった場合の蛍光強度を示す図である。
【図２（ｃ）】実施例２において、pSFVdhfr/d2EGFPと、鳥類由来HS4インシュレーター配列を持つプラスミドDNAとを混合して細胞に導入した場合の蛍光強度を示す図である。
【図２（ｄ）】実施例２において、pSFVdhfr/d2EGFPと、鳥類由来HS4インシュレーター配列を持つプラスミドDNAとを混合して細胞に導入し、80μg/mlのブラスティサイジンで選択をさらに行なった場合の蛍光強度を示す図である。
【図３（ａ）】実施例３において、5μg/mlのブラスティサイジンで選択を行なった細胞の蛍光強度を示す図である。
【図３（ｂ）】実施例３において、10μg/mlのブラスティサイジンで選択を行なった細胞の蛍光強度を示す図である。
【図３（ｃ）】実施例３において、40μg/mlのブラスティサイジンで選択を行なった細胞の蛍光強度を示す図である。
【図３（ｄ）】実施例３において、160μg/mlのブラスティサイジンで選択を行なった細胞の蛍光強度を示す図である。
【図３（ｅ）】実施例３において、320μg/mlのブラスティサイジンで選択を行なった細胞の蛍光強度を示す図である。
【図４（ａ）】実施例４における、Tet-ON遺伝子通常発現の細胞についての位相差顕微鏡像（×200）である。
【図４（ｂ）】実施例４における、Tet-ON遺伝子高発現の細胞についての位相差顕微鏡像（×200）である。
【図４（ｃ）】実施例４における、Tet-ON遺伝子通常発現についての蛍光顕微鏡像（×200）である。
【図４（ｄ）】実施例４における、Tet-ON遺伝子高発現の細胞についての蛍光顕微鏡像（×200）である。
【図５（ａ）】実施例４における、pSFVdhfr/d2EGFPを導入した細胞について、Tet-ONタンパク質通常発現の場合の蛍光強度を示す図である。
【図５（ｂ）】実施例４における、pSFVdhfr/d2EGFPを導入した細胞について、Tet-ONタンパク質高発現の場合の蛍光強度を示す図である。
【図５（ｃ）】実施例４における、鳥類由来HS4インシュレーター配列をpSFVdhfr/d2EGFPと同時増幅させた細胞について、Tet-ONタンパク質通常発現の場合の蛍光強度を示す図である。
【図５（ｄ）】実施例４における、鳥類由来HS4インシュレーター配列をpSFVdhfr/d2EGFPと同時増幅させた細胞について、Tet-ONタンパク質高発現の場合の蛍光強度を示す図である。
【図６（ａ）】実施例５における、Cre Recombinase遺伝子を導入する前の細胞の位相差顕微鏡像（×200）である。
【図６（ｂ）】実施例５における、Cre Recombinase遺伝子を導入後の細胞の位相差顕微鏡像（×200）である。
【図６（ｃ）】実施例５における、Cre Recombinase遺伝子を導入する前の細胞の蛍光顕微鏡像（×200）である。
【図６（ｄ）】実施例５における、Cre Recombinase遺伝子を導入後の細胞の位相差像（×200）である。
【図７（ａ）】実施例６における、5-aza-2'deoxycytidine （5-aza）処理前の細胞の位相差顕微鏡像（×200）である。
【図７（ｂ）】実施例６における、１μMの5-aza処理後の細胞の位相差顕微鏡像（×200）である。
【図７（ｃ）】実施例６における、5-aza処理前の細胞の蛍光顕微鏡像（×200）である。
【図７（ｄ）】実施例６における、１μMの5-aza処理後の細胞の蛍光顕微鏡像（×200）である。
【図８（ａ）】実施例６における、5-aza-2'deoxycytidine （5-aza）処理前の細胞の蛍光強度を示す図である。
【図８（ｂ）】実施例６における、20nMのTrichostatin A （TSA）処理後の細胞の蛍光強度を示す図である。
【図８（ｃ）】実施例６における、１μMの5-azaで処理した細胞の蛍光強度を示す図である。
【図８（ｄ）】実施例６における、１μMの5-azaおよび20nMのTSAで処理した細胞の蛍光強度を示す図である。
【図８（ｅ）】実施例６における、3μMの5-azaで処理した細胞の蛍光強度を示す図である。
【図８（ｆ）】実施例６における、3μMの5-azaおよび20nMのTSAで処理した細胞の蛍光強度を示す図である。
【図９】実施例７における、pSFVdhfr/d2EGFPを導入したTet-ON細胞の多クローン性集団について、Doxycyclineによりd2EGFPの発現誘導を行なった時のd2EGFP発現量を、セルソーターで解析した結果を示す図である。
【図１０（ａ）】実施例７において、pSFVdhfr/d2EGFPを導入したTet-ON細胞の多クローン性集団から選択したクローン４について、ＦＩＳＨ法によりpSFVdhfr/d2EGFP プラスミド由来の塩基配列を検出した結果を示す蛍光顕微鏡像である。
【図１０（ｂ）】実施例７において、pSFVdhfr/d2EGFPを導入したTet-ON細胞の多クローン性集団から選択したクローン５について、ＦＩＳＨ法によりpSFVdhfr/d2EGFP プラスミド由来の塩基配列を検出した結果を示す蛍光顕微鏡像である。
【図１０（ｃ）】実施例７において、pSFVdhfr/d2EGFPを導入したTet-ON細胞の多クローン性集団から選択したクローン６について、ＦＩＳＨ法によりpSFVdhfr/d2EGFP プラスミド由来の塩基配列を検出した結果を示す蛍光顕微鏡像である。
【図１０（ｄ）】実施例７において、pSFVdhfr/d2EGFPを導入したTet-ON細胞の多クローン性集団から選択したクローン９について、ＦＩＳＨ法によりpSFVdhfr/d2EGFP プラスミド由来の塩基配列を検出した結果を示す蛍光顕微鏡像である。
【図１１（ａ）】実施例７において取得したクローン４について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を行なうとともに、5-azaを培地に添加せずに、培養を一週間行なった後のd2EGFP発現量をセルソーターにより解析した結果を示す図である。
【図１１（ｂ）】実施例７において取得したクローン４について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を行なうとともに、5-aza（最終濃度１μM）を培地に添加し、培養を一週間行なった後のd2EGFP発現量をセルソーターにより解析した結果を示す図である。
【図１１（ｃ）】実施例７において取得したクローン４について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を行なうとともに、5-aza（最終濃度３μM）を培地に添加し、培養を一週間行なった後のd2EGFP発現量をセルソーターにより解析した結果を示す図である。
【図１２（ａ）】実施例７において取得したクローン５について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を行なうとともに、5-azaを培地に添加せずに、培養を一週間行なった後のd2EGFP発現量をセルソーターにより解析した結果を示す図である。
【図１２（ｂ）】実施例７において取得したクローン５について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を行なうとともに、5-aza（最終濃度１μM）を培地に添加し、培養を一週間行なった後のd2EGFP発現量をセルソーターにより解析した結果を示す図である。
【図１２（ｃ）】実施例７において取得したクローン５について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を行なうとともに、5-aza（最終濃度３μM）を培地に添加し、培養を一週間行なった後のd2EGFP発現量をセルソーターにより解析した結果を示す図である。
【図１３（ａ）】実施例７において取得したクローン６について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を行なうとともに、5-azaを培地に添加せずに、培養を一週間行なった後のd2EGFP発現量をセルソーターにより解析した結果を示す図である。
【図１３（ｂ）】実施例７において取得したクローン６について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を行なうとともに、5-aza（最終濃度１μM）を培地に添加し、培養を一週間行なった後のd2EGFP発現量をセルソーターにより解析した結果を示す図である。
【図１３（ｃ）】実施例７において取得したクローン６について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を行なうとともに、5-aza（最終濃度３μM）を培地に添加し、培養を一週間行なった後のd2EGFP発現量をセルソーターにより解析した結果を示す図である。
【図１４（ａ）】実施例７において取得したクローン９について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を行なうとともに、5-azaを培地に添加せずに、培養を一週間行なった後のd2EGFP発現量をセルソーターにより解析した結果を示す図である。
【図１４（ｂ）】実施例７において取得したクローン９について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を行なうとともに、5-aza（最終濃度１μM）を培地に添加し、培養を一週間行なった後のd2EGFP発現量をセルソーターにより解析した結果を示す図である。
【図１４（ｃ）】実施例７において取得したクローン９について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を行なうとともに、5-aza（最終濃度３μM）を培地に添加し、培養を一週間行なった後のd2EGFP発現量をセルソーターにより解析した結果を示す図である。
【図１５】実施例８において、pSFVdhfr/d2EGFPとpTet-ON plasmidとを同時にヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を行なう前後の位相差顕微鏡像および蛍光顕微鏡像であり、（ａ）はDoxycycline添加前の位相差顕微鏡像（×200）であり、（ｂ）はDoxycycline添加前の蛍光顕微鏡像（×200）であり、（ｃ）はDoxycycline添加後の位相差顕微鏡像（×200）であり、（ｄ）はDoxycycline添加後の蛍光顕微鏡像（×200）である。
【図１６（ａ）】実施例８において、pSFVdhfr/d2EGFPとpTet-ON plasmidとを同時にヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を行なう前に、セルソーターによりd2EGFPの発現を解析した結果を示す図である。
【図１６（ｂ）】実施例８において、pSFVdhfr/d2EGFPとpTet-ON plasmidとを同時にヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を１時間行ない、セルソーターによりd2EGFPの発現を解析した結果を示す図である。
【図１６（ｃ）】実施例８において、pSFVdhfr/d2EGFPとpTet-ON plasmidとを同時にヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を３時間行ない、セルソーターによりd2EGFPの発現を解析した結果を示す図である。
【図１６（ｄ）】実施例８において、pSFVdhfr/d2EGFPとpTet-ON plasmidとを同時にヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を６時間行ない、セルソーターによりd2EGFPの発現を解析した結果を示す図である。
【図１６（ｅ）】実施例８において、pSFVdhfr/d2EGFPとpTet-ON plasmidとを同時にヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を１５時間行ない、セルソーターによりd2EGFPの発現を解析した結果を示す図である。
【図１６（ｆ）】実施例８において、pSFVdhfr/d2EGFPとpTet-ON plasmidとを同時にヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を２４時間行ない、セルソーターによりd2EGFPの発現を解析した結果を示す図である。
【図１６（ｇ）】実施例８において、pSFVdhfr/d2EGFPとpTet-ON plasmidとを同時にヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を４８時間行ない、セルソーターによりd2EGFPの発現を解析した結果を示す図である。
【図１６（ｈ）】実施例８において、pSFVdhfr/d2EGFPとpTet-ON plasmidとを同時にヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を１２０時間行ない、セルソーターによりd2EGFPの発現を解析した結果を示す図である。
【図１６（ｉ）】実施例８において、pSFVdhfr/d2EGFPとpTet-ON plasmidとを同時にヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を２週間行ない、セルソーターによりd2EGFPの発現を解析した結果を示す図である。
【図１６（ｊ）】実施例８における、陰性対照の多クローン性集団について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を行ない、セルソーターによりd2EGFPの発現を解析した結果を示す図である。
【図１７】実施例８において、pSFVdhfr/d2EGFPとpTet-ON plasmidとを同時にヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団について、d2EGFP発現量の平均値と生細胞率とを時間に対してプロットしたチャート図である。
【図１８（ａ）】実施例８において、pSFVdhfr/d2EGFPとpTet-ON plasmidとを同時にヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団から任意に選抜したクローンＡについて、発現誘導前のd2EGFP発現量をセルソーターにて解析を行なった結果を示す図である。
【図１８（ｂ）】実施例８において、pSFVdhfr/d2EGFPとpTet-ON plasmidとを同時にヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団から任意に選抜したクローンＡについて、発現誘導後のd2EGFP発現量をセルソーターにて解析を行なった結果を示す図である。
【図１８（ｃ）】実施例８において、pSFVdhfr/d2EGFPとpTet-ON plasmidとを同時にヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団から任意に選抜したクローンＢについて、発現誘導前のd2EGFP発現量をセルソーターにて解析を行なった結果を示す図である。
【図１８（ｄ）】実施例８において、pSFVdhfr/d2EGFPとpTet-ON plasmidとを同時にヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団から任意に選抜したクローンＢについて、発現誘導後のd2EGFP発現量をセルソーターにて解析を行なった結果を示す図である。
【図１８（ｅ）】実施例８において、pSFVdhfr/d2EGFPとpTet-ON plasmidとを同時にヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団から任意に選抜したクローンＣについて、発現誘導前のd2EGFP発現量をセルソーターにて解析を行なった結果を示す図である。
【図１８（ｆ）】実施例８において、pSFVdhfr/d2EGFPとpTet-ON plasmidとを同時にヒト大腸がんCOLO 320DM細胞へ導入して取得した形質転換細胞の多クローン性集団から任意に選抜したクローンＣについて、発現誘導後のd2EGFP発現量をセルソーターにて解析を行なった結果を示す図である。
【図１９】実施例８にかかる方法を実施することにより、ヘテロクロマチン化していたＨＳＲ上の増幅遺伝子からＲＮＡの転写が活性化されることを示す蛍光顕微鏡像である。
【図２０（ａ）】実施例９において単離したＨＳＲクローンについて、導入したpSFVdhfr/d2EGFP プラスミドの塩基配列をＦＩＳＨ法により検出した結果を示す蛍光顕微鏡像である。
【図２０（ｂ）】実施例９において単離したＤＭクローンについて、導入したpSFVdhfr/d2EGFP プラスミドの塩基配列をＦＩＳＨ法により検出した結果を示す蛍光顕微鏡像である。
【図２１（ａ）】実施例９において単離したＨＳＲクローンについて、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を２日間行ない、セルソーターによりd2EGFPの発現を解析した結果を示す図である。
【図２１（ｂ）】実施例９において単離したＤＭクローン（5-aza処理無し）について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を２日間行ない、セルソーターによりd2EGFPの発現を解析した結果を示す図である。
【図２１（ｃ）】実施例９において単離したＤＭクローン（5-aza処理有り）について、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を２日間行ない、セルソーターによりd2EGFPの発現を解析した結果を示す図である。
【図２１（ｄ）】実施例９における、陰性対照、ＨＳＲクローン、およびＤＭクローン（5-aza処理有りの場合と無しの場合）について、Doxycycline添加２日後の積算蛍光強度を示す棒グラフである。
【図２２（ａ）】実施例１０において単離したＣＨＯ細胞のＨＳＲクローンについて、導入したpSFVdhfr/d2EGFP プラスミドの塩基配列をＦＩＳＨ法により検出した結果を示す蛍光顕微鏡像である。
【図２２（ｂ）】実施例１０において単離したＣＨＯ細胞のＤＭクローンについて、導入したpSFVdhfr/d2EGFP プラスミドの塩基配列をＦＩＳＨ法により検出した結果を示す蛍光顕微鏡像である。
【図２３（ａ）】実施例１０において単離した最高クローンについて、Doxycyclineによるd2EGFPの発現誘導を２日間行ない、セルソーターによりd2EGFPの発現を解析した結果を示す図である。
【図２３（ｂ）】実施例１０における、陰性対照における形質転換細胞の多クローン性集団、本実施例の形質転換細胞の多クローン性集団、および最高クローンについて、Doxycycline添加２日後の積算蛍光強度を示す棒グラフである。
【図２３（ｃ）】実施例１０において単離した最高クローンについて、導入したpSFVdhfr/d2EGFP プラスミドの塩基配列をＦＩＳＨ法により検出した結果を示す蛍光顕微鏡像である。
【図１（ａ）】
2007312782.tif 000004
【図１（ｂ）】
2007312782.tif 000005
【図２（ａ）】
2007312782.tif 000006
【図２（ｂ）】
2007312782.tif 000007
【図２（ｃ）】
2007312782.tif 000008
【図２（ｄ）】
2007312782.tif 000009
【図３（ａ）】
2007312782.tif 000010
【図３（ｂ）】
2007312782.tif 000011
【図３（ｃ）】
2007312782.tif 000012
【図３（ｄ）】
2007312782.tif 000013
【図３（ｅ）】
2007312782.tif 000014
【図５（ａ）】
2007312782.tif 000015
【図５（ｂ）】
2007312782.tif 000016
【図５（ｃ）】
2007312782.tif 000017
【図５（ｄ）】
2007312782.tif 000018
【図８（ａ）】
2007312782.tif 000019
【図８（ｂ）】
2007312782.tif 000020
【図８（ｃ）】
2007312782.tif 000021
【図８（ｄ）】
2007312782.tif 000022
【図８（ｅ）】
2007312782.tif 000023
【図８（ｆ）】
2007312782.tif 000024
【図９】
2007312782.tif 000025
【図１１（ａ）】
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【図１１（ｂ）】
2007312782.tif 000027
【図１１（ｃ）】
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【図１２（ａ）】
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【図１２（ｂ）】
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【図１２（ｃ）】
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【図１３（ａ）】
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【図１３（ｂ）】
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【図１３（ｃ）】
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【図１４（ａ）】
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【図１４（ｂ）】
2007312782.tif 000036
【図１４（ｃ）】
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【図１６（ａ）】
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【図１６（ｂ）】
2007312782.tif 000039
【図１６（ｃ）】
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【図１６（ｄ）】
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【図１６（ｅ）】
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【図１６（ｆ）】
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【図１６（ｇ）】
2007312782.tif 000044
【図１６（ｈ）】
2007312782.tif 000045
【図１６（ｉ）】
2007312782.tif 000046
【図１６（ｊ）】
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【図１７】
2007312782.tif 000048
【図１８（ａ）】
2007312782.tif 000049
【図１８（ｂ）】
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【図１８（ｃ）】
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【図１８（ｄ）】
2007312782.tif 000052
【図１８（ｅ）】
2007312782.tif 000053
【図１８（ｆ）】
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【図２１（ａ）】
2007312782.tif 000055
【図２１（ｂ）】
2007312782.tif 000056
【図２１（ｃ）】
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【図２１（ｄ）】
2007312782.tif 000058
【図２３（ａ）】
2007312782.tif 000059
【図２３（ｂ）】
2007312782.tif 000060
【図４（ａ）】
2007312782.tif 000061
【図４（ｂ）】
2007312782.tif 000062
【図４（ｃ）】
2007312782.tif 000063
【図４（ｄ）】
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【図６（ａ）】
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【図６（ｂ）】
2007312782.tif 000066
【図６（ｃ）】
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【図６（ｄ）】
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【図７（ａ）】
2007312782.tif 000069
【図７（ｂ）】
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【図７（ｃ）】
2007312782.tif 000071
【図７（ｄ）】
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【図１０（ａ）】
2007312782.tif 000073
【図１０（ｂ）】
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【図１０（ｃ）】
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【図１０（ｄ）】
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【図１５】
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【図１９】
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【図２０（ａ）】
2007312782.tif 000079
【図２０（ｂ）】
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【図２２（ａ）】
2007312782.tif 000081
【図２２（ｂ）】
2007312782.tif 000082
【図２３（ｃ）】
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【配列表】
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