(57)【要約】【課題】  安価なラクトン構造を有する物質を出発物質として使用し、より少ないステップで容易にアシルチオエステルを合成することで工業的に利用可能なポリヒドロキシアルカン酸を製造する方法およびポリヒドロキシアルカン酸を提供する。【解決手段】  ラクトン構造を有する物質から開環−チオエステル化反応によってアシルチオエステルを合成し、このアシルチオエステルをチオエステル交換反応によりＣｏＡ誘導体に変換後、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素により重合酵素反応させることでポリヒドロキシアルカン酸を合成することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。【選択図】  図１
2007302750.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトン構造を有する物質から開環−チオエステル化反応によってアシルチオエステルを合成し、このアシルチオエステルをチオエステル交換反応によりＣｏＡ誘導体に変換後、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素により重合酵素反応させることでポリヒドロキシアルカン酸を合成することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項２】
請求項１において、前記ラクトン構造を有する物質が、ジケテンであることを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項３】
請求項２において、前記開環−チオエステル化反応は、ジクロロメタン中でトリエチルアミン存在下、ジケテンとチオフェノールを反応させることにより、一段階で前記アシルチオエステルを合成することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。  
【請求項４】
請求項１において、前記ラクトン構造を有する物質が、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンベータラクトンであることを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項５】
請求項４において、前記開環−チオエステル化反応は、前記Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンベータラクトンを無水酢酸を用いたアセチル化反応により開環させた後、塩化メチレン中でジメチルアミノピリジン存在下、チオフェノールと反応させ脱保護することにより前記アシルチオエステルを合成することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項６】
α位に側鎖としてアミノ基を有するヒドロキシアルカン酸ユニットを分子中に含むポリヒドロキシアルカン酸。
【請求項７】
請求項６において、下記化学式（１）：
【化１】
2007302750.tif 000005
（式中、ｍは０〜６の整数を示す）で示されるα位に側鎖としてアミノ基を有するヒドロキシアルカン酸ユニットを分子中に含むポリヒドロキシアルカン酸。
【請求項８】
請求項６において、下記化学式（２）：
【化２】
2007302750.tif 000006
（式中、ｎは１〜４の整数を示す）で示されるα位に側鎖としてアミノ基を有するヒドロキシアルカン酸ユニットを分子中に含むポリヒドロキシアルカン酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法に関し、特に高価なヒドロキシアルカン酸のＲ体を出発原料とせずに安価なラクトン構造を有する物質を出発原料として、化学的にアシルチオエステルを調製し、精製ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素によりポリヒドロキシアルカン酸を工業的に利用可能に製造するポリヒドロキシアルカン酸の製造方法およびポリヒドロキシアルカン酸に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
石油など化石燃料由来の合成プラスチックは、自然環境中で分解されないために、環境中に半永久的に蓄積して、様々な環境問題を引き起こしている。このような背景から、自然界に存在する微生物によって分解される生分解性プラスチック（グリーンプラ）は、環境に負荷を与えない高分子材料として注目されはじめ、実用化に向け、優れた性能を持つ材料の開発が行われている。また、生体機能材料（バイオマテリアル）として、生物・医学領域への新たな展開も期待されている。
【０００３】
生分解性ポリエステルは、現在までに数多くの微生物において、糖や植物油のような再生可能な生物有機資源（バイオマス）を原料として合成され、菌体内に蓄積されることが知られている。その中で、ポリヒドロキシアルカン酸は、合成プラスチックと同様に熱可塑性を示し、優れた生分解性と生体適合性を有することから注目を集めているポリエステルであり、ポリマー中において９０種類以上のモノマー構造が確認されている（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．，１９９５，１２８，２１９−２２８）。
【０００４】
ポリヒドロキシアルカン酸の合成方法には、微生物発酵生産によるｉｎ  ｖｉｖｏ合成法と精製ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素とポリヒドロキシアルカン酸のモノマーを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成法がある。
【０００５】
現在、ポリヒドロキシアルカン酸は、一般にｉｎ  ｖｉｖｏ合成法によって製造されるが、微生物の発酵生産では微生物体内にポリヒドロキシアルカン酸を蓄積するためにその生産性は低く、また微生物を粉砕してポリヒドロキシアルカン酸を抽出して生成するには高いコストがかかるなど、問題点が多い。さらに微生物の発酵生産によるポリヒドロキシアルカン酸の製造方法では、複雑な微生物代謝経路を経るために必ずしも所望の性質を有するポリヒドロキシアルカン酸を作り出せるわけではなく、ポリヒドロキシアルカン酸の合成およびそのバリエーションも限定される。また、発酵生産の制御方法によっては所望のホモポリマーとならずにコポリマーになることもあり、また逆にコポリマー生産においても必ずしも所望のモル比の均質なコポリマーを生産できるわけではない（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，１９９２，１０３，２０７―２１４）。
【０００６】
一方、近年急速に進んだ遺伝子組換え技術により、ポリヒドロキシアルカン酸を重合する酵素であるポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の遺伝子が単離され、その発現を増強することによりｉｎ  ｖｉｖｏ合成法におけるポリヒドロキシアルカン酸の生産の向上が図られたり、基質特異性を変換することによりポリヒドロキシアルカン酸の共重合組成を制御する試みがされるようになった（特許文献１ないし特許文献３）。
【０００７】
さらに、遺伝子組換え技術を使うことでポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の大量調製が可能となり、補酵素Ａ（以下ＣｏＡ）のチオエステルであるヒドロキシアシルＣｏＡをモノマーとして重合させてポリヒドロキシアルカン酸合成酵素を合成するｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成法が開発された（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ｓｃｉ．，１９９５，９２，６２７９―６２８３、Ｉｎｔ．  Ｓｙｍｐ．  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ，１９９６，２８−３５，Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９４，２２６，７１−８０，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００１，３４，６８８９−６８９４）。
【０００８】
ポリヒドロキシアルカン酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成法は、前述の通り、精製ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素と基質となるモノマーを用いてポリヒドロキシアルカン酸を合成する方法であり、モノマーを化学的に調製することによってポリヒドロキシアルカン酸のモノマー構造を拡張したり、量の調整を高い精度で行うことができるため、前述のようなｉｎ  ｖｉｖｏの合成法による問題点が回避でき、これまでｉｎ  ｖｉｖｏの合成法では得ることのできなかった様々な物性や機能性を有するポリヒドロキシアルカン酸を合成することが期待される。
【０００９】
しかしながら、ポリヒドロキシアルカン酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成法では、基質となるモノマーとしてヒドロキシアシルＣｏＡのＲ体（以下（Ｒ）−ヒドロキシアシルＣｏＡ）を使用するため、この化合物を連続的に供給する必要があるが、（Ｒ）−ヒドロキシアシルＣｏＡは極めて高価で、その合成方法も非常に複雑である上、その合成にも高価なＣｏＡとヒドロキシアルカン酸のＲ体を用いなければならない。
【００１０】
そのため、安価な他の化合物を出発物質として用い、ポリヒドロキシアルカン酸を容易に合成できる工業的に生産可能な製造方法の開発が強く望まれている。
【００１１】
これらの問題に対して、ポリヒドロキシアルカン酸の重合と共に反応系内に遊離したＣｏＡをリサイクリングしたり、ヒドロキシアシルＣｏＡのＲ体を連続的に供給する試みもなされている。
【００１２】
例えば、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，１６８，３１９−３２４では、重合酵素反応液中に酢酸とアセチルＣｏＡシンターゼとＡＴＰを共存させることで遊離してくるＣｏＡをアセチルＣｏＡに変換し、さらにピロプオニルＣｏＡトランスフェラーゼと３−ヒドロキシブタン酸も共存させることで３−ヒドロキシブチルＣｏＡを得てＣｏＡをリサイクリングする方法が示されている。
【００１３】
また、再表２００４−０６５６０９号では、出発物質であるチオエステルからポリヒドロキシアルカン酸を合成する一連の反応過程において、ＣｏＡをリサイクリングしながら（Ｒ）−ヒドロキシアシルＣｏＡを連続的に供給する方法が開示されている。つまり、出発物質であるチオエステルはチオエステル交換反応によりＣｏＡと反応して（Ｒ）−ヒドロキシアシルＣｏＡに変換され、つづいて、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素により重合されてポリヒドロキシアルカン酸に合成される。この重合反応時にＣｏＡが遊離されるため、この遊離されたＣｏＡをチオエステルからのエステル交換反応に再利用して、（Ｒ）−ヒドロキシアシルＣｏＡを連続的に合成する方法である（特許文献４）。
【００１４】
【特許文献１】特開平７―２６５０６５号公報
【特許文献２】特許第３０６２４５９号
【特許文献３】特表２００１―５１６５７４号公報
【特許文献４】再表２００４−０６５６０９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，１６８，３１９−３２４では、精製の困難な３種類の酵素を使用しなければならず、さらに極めて高価なＡＴＰも必須であるため、たとえＣｏＡをリサイクリングできたとしても、工業的な生産を行うことは極めて難しい。
【００１６】
一方、再表２００４−０６５６０９では、出発物質であるチオフェニルエステルを、ヒドロキシアルカン酸を原料としてチオフェニルエステル化して合成しなければならず、このチオフェニルエステル化反応では、ヒドロキシアルカン酸の水酸基を一度保護し、反応後に脱保護するという手間の掛かる合成をしなければならず、やはり工業化が困難であるという点で問題が残る。
【００１７】
さらに、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素は（Ｒ）−ヒドロキシアシルＣｏＡのみを基質とするために、ポリヒドロキシアルカン酸の合成に使用できるのは、原料として高価なＲ体のヒドロキシアルカン酸のみであるため、未だ原価が高価であるという問題は解決されていない。
【００１８】
一方、これまで ｉｎ  ｖｉｖｏ合成およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成の両者において、ポリヒドロキシアルカン酸のモノマー構造として、側鎖にアミノ基を有する構造のものは合成されていない。
【００１９】
側鎖にアミノ基を有するヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカン酸は、アミノ基を介して様々な物質と結合させることができるため、多様な性質を備えるポリヒドロキシアルカン酸が得られることになる。さらに、このようなポリヒドロキシアルカン酸を安価な原料から工業的に生産可能な方法で得られることが望まれている。
【００２０】
本発明は、以上のような問題点を解決するためになされたものであって、本発明者らがすでに提案しているＣｏＡをリサイクリングしながら（Ｒ）−ヒドロキシアシルＣｏＡを連続的に供給してポリヒドロキシアルカン酸を合成する方法をさらに発展させたものであって、安価なラクトン構造を有する物質を出発物質として使用し、より少ないステップで容易にアシルチオエステルを合成することで工業的に利用可能なポリヒドロキシアルカン酸を製造する方法およびポリヒドロキシアルカン酸を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明に係るポリヒドロキシアルカン酸の製造方法の特徴は、ラクトン構造を有する物質から開環−チオエステル化反応によってアシルチオエステルを合成し、このアシルチオエステルをチオエステル交換反応によりＣｏＡ誘導体に変換後、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素により重合反応させることでポリヒドロキシアルカン酸を合成する点にある。
【００２２】
また、本発明において、前記ラクトン構造を有する物質が、ジケテンであることが好ましい。
【００２３】
そして、前記開環−チオエステル化反応は、ジクロロメタン中でトリエチルアミン存在下、ジケテンとチオフェノールを反応させることにより、一段階で前記アシルチオエステルを合成することが好ましい。
【００２４】
また、本発明において、前記ラクトン構造を有する物質が、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンベータラクトンであることが好ましい。
【００２５】
そして、前記開環−チオエステル化反応は、前記Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンベータラクトンを無水酢酸を用いたアセチル化反応により開環させた後、塩化メチレン中でジメチルアミノピリジン存在下、チオフェノールと反応させ脱保護することにより前記アシルチオエステルを合成することが好ましい。
【００２６】
本発明に係るポリヒドロキシアルカン酸の特徴は、α位に側鎖としてアミノ基を有するヒドロキシアルカン酸ユニットを分子中に含む点にある。
【００２７】
また、本発明において、前記ヒドロキシアルカン酸ユニットは、下記化学式（１）：
【化１】
2007302750.tif 000003
（式中、ｍは０〜６の整数を示す）で示されるα位に側鎖としてアミノ基を有するヒドロキシアルカン酸ユニットであることが望ましい。
【００２８】
そして、本発明において、前記ヒドロキシアルカン酸ユニットは、下記化学式（２）：
【化２】
2007302750.tif 000004
（式中、ｎは１〜４の整数を示す）で示されるα位に側鎖としてアミノ基を有するヒドロキシアルカン酸ユニットであることが望ましい。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、安価なラクトン構造を有する物質を出発原料として、少ないステップで容易にポリヒドロキシアルカン酸を合成することができ、工業化に適するポリヒドロキシアルカン酸の合成が可能となる。また、アミノ基を側鎖に有するポリヒドロキシアルカン酸が安価に製造できるため、そのアミノ基を反応基点として様々な物質を結合させることが可能となり、多様なポリヒドロキシアルカン酸の合成が可能となって応用範囲が広がる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明に係るポリヒドロキシアルカン酸の製造方法およびポリヒドロキシアルカン酸の一実施形態について図１から図３を参照しつつ説明する。
【００３１】
図１に示すように、本実施形態におけるポリヒドロキシアルカン酸の製造方法は、主として、ラクトン構造を有する物質から開環−チオエステル化反応によってアシルチオエステルを合成するステップ（ステップ１）と、このアシルチオエステルをチオエステル交換反応によりＣｏＡ誘導体に変換するステップ（ステップ２）と、このＣｏＡ誘導体をポリヒドロキシアルカン酸合成酵素により重合反応させることによりポリヒドロキシアルカン酸を合成するステップ（ステップ３）とからなる。
【００３２】
ここで開環−チオエステル化反応（ステップ１）とは、ラクトンの環状構造を開環させてチオエステル構造を付加する反応を意味しており、当該反応は一段階で行える場合に限らず複数段階を経て行う場合も含む。
【００３３】
また、ＣｏＡ誘導体とは、ポリヒドロキシアルカン酸のモノマーとなる代謝中間体であり、ここでは、アシルＣｏＡや当該アシルＣｏＡを還元反応させて得られるヒドロキシアシルＣｏＡのことを示す。
【００３４】
そして、チオエステル交換反応によりＣｏＡ誘導体に変換するステップ（ステップ２）とは、ポリヒドロキシアルカン酸のモノマーとなる代謝中間体を合成する反応ステップであり、アシルチオエステルのフェニル基を遊離させると同時にＣｏＡを付加してアシルＣｏＡを合成する交換反応と、アシルＣｏＡレダクターゼを用いた還元反応によりアシルＣｏＡからヒドロキシアシルＣｏＡを合成する反応が含まれる。ただし、出発原料であるラクトン構造を有する物質の構造によっては、ポリヒドロキシアルカン酸のモノマーとなる代謝中間体の合成に上記還元反応を必要としない場合があり、このような場合には、当該反応ステップには、還元反応が含まれない。また、当該ステップにおける交換反応と還元反応は、一段階で行える場合に限らず二段階で行う場合も含む。
【００３５】
また、チオエステル交換反応によりＣｏＡ誘導体に変換するステップ（ステップ２）と重合反応によりポリヒドロキシアルカン酸を合成するステップ（ステップ３）は、別々の２つのステップとして行うこともできるし、２つのステップを合わせた１つのステップとしても行うことが可能である。１つのステップとして行う場合には、重合反応によりポリヒドロキシアルカン酸を合成するステップ（ステップ３）で遊離されたＣｏＡを用いて、チオエステル交換反応によりＣｏＡ誘導体に変換するステップ（ステップ２）を行うことができるため、ＣｏＡのリサイクリングが可能となる。
【００３６】
ラクトン構造を有する物質としては、例えば、ジケテン、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンベータラクトン等が挙げられる。
【００３７】
また、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の由来微生物としては、本発明における効果を奏すれば、特に限定されず、例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属等が挙げられる。
【００３８】
ここで、ジケテンを出発物質としてポリ３−ヒドロキシブタン酸を製造する反応経路について図２を参照しつつ説明する。
【００３９】
まず、ジケテンを出発物質とする場合において、ジケテンから３−ケトブチリルチオフェニルエステルを合成するステップ（ステップ１）について説明する。このステップでは、ジケテンをトリエチルアミンが存在するジクロロメタン中でチオフェノールと反応させることにより、一段階で３−ケトブチリルチオフェニルエステルを合成する。
【００４０】
次に、３−ケトブチリルチオフェニルエステルをチオエステル交換反応により（Ｒ）−３ヒドロキシブチルＣｏＡに変換するステップ（ステップ２）と重合反応によりポリ３−ヒドロキシブタン酸を合成するステップ（ステップ３）を組み合わせて、３−ケトブチリルチオフェニルエステルからポリ３−ヒドロキシブタン酸を一つのステップで反応をさせるステップ（ステップ２＋３）について説明する。このステップでは、ヘキサンを用いた有機溶媒層に３−ケトブチルチオフェニルエステルを溶解し、水層にポリ３−ヒドロキシブタン酸合成酵素とＣｏＡ、３−ケトアシルＣｏＡレダクターゼ、ＮＡＤＰＨを溶解し、界面でエステル交換反応を行い、水層で還元反応および重合反応を行うことにより、ポリ３−ヒドロキシブタン酸を合成する。
【００４１】
また、ステップ２とステップ３を別々に行う場合について説明する。まず、ステップ２について説明する。このステップでは、３−ケトブチリルチオフェニルエステルを溶解したアセトニトリル溶液を、ＣｏＡと３−ケトアシルＣｏＡレダクターゼとＮＡＤＰＨを溶解したリン酸緩衝溶液に添加し、一段階で交換反応および還元反応を行い、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを合成する。
【００４２】
なお、ステップ２は、交換反応した後に還元反応をする二段階で反応させることもできる。つまり、３−ケトブチリルチオフェニルエステルをアルカリ条件下でＣｏＡと接触させチオフェノールとＣｏＡの間で交換反応させアセトアセチルＣｏＡを得る。その後、得られたアセトアセチルＣｏＡをリン酸緩衝溶液に溶解し、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼとＮＡＤＰＨを加えて還元反応させて（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを合成する。
【００４３】
最後にステップ３について説明する。このステップでは、微生物から単離したポリ３−ヒドロキシブタン酸合成酵素を用いて、ステップ２で得られた（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡをリン酸緩衝液中にて重合反応させて、ポリ３−ヒドロキシブタン酸を合成する。
【００４４】
ポリ３−ヒドロキシブタン酸合成酵素は、３−ヒドロキシブタン酸を重合してポリ３−ヒドロキシブタン酸を合成することのできる酵素を有する微生物由来であれば特に限定しないが、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属に属する微生物由来の合成酵素、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、特にラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＡＴＣＣ１７６９９由来のものを用いることが好ましい。
【００４５】
次に、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンベータラクトンを出発物質としてα位に側鎖としてアミノ基を有するヒドロキシアルカン酸ユニットを分子中に含むポリヒドロキシアルカン酸を製造する反応経路について図３を参照しつつ説明する。
【００４６】
まず、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンベータラクトンを出発物質とする場合において、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンベータラクトンからＬ−セリン チオフェニルエステルを合成するステップ（ステップ１）について説明する。このステップでは、まず、無水酢酸を用いたアセチル化反応により、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンベータラクトンの環状構造を開環させて、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを合成する。次に、ジメチルアミノピリジンが存在する塩化メチレン中において、得られたＮ−カルボベンゾキシ−Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンとチオフェノールとを反応させることにより、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリン チオフェニルエステルを合成する。最後に、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリン チオフェニルエステルを脱保護することにより、Ｌ−セリン チオフェニルエステルを合成する。
【００４７】
次に、Ｌ−セリン チオフェニルエステルをチオエステル交換反応により３−ヒドロキシ−２−アミノプロピオニルＣｏＡに変換するステップ（ステップ２）と重合反応によりα位に側鎖としてアミノ基を有するヒドロキシアルカン酸ユニットを分子中に含むポリヒドロキシアルカン酸を合成するステップ（ステップ３）を組み合わせて、Ｌ−セリン チオフェニルエステルからα位に側鎖としてアミノ基を有するヒドロキシアルカン酸ユニットを分子中に含むポリヒドロキシアルカン酸を一つのステップで反応をさせるステップ（ステップ２＋３）について説明する。このステップでは、ヘキサンを用いた有機溶媒層にＬ−セリン チオフェニルエステルを溶解し、水層にポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素とＣｏＡを溶解し、界面でエステル交換反応を行い、水層で重合反応を行うことにより、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸を合成する。
【００４８】
次に、本実施形態におけるポリヒドロキシアルカン酸の製造方法およびポリヒドロキシアルカン酸について具体的な実施例を説明する。
【実施例１】
【００４９】
実施例１では、ジケテンを出発原料としてポリヒドロキシアルカン酸を製造する方法を示す。
【００５０】
『３−ケトブチリルチオフェニルエステルの合成について』
まず、ジケテンを原料として、３−ケトブチリルチオフェニルエステルを合成した。
【００５１】
つまり、ナス型フラスコ中に２５ｍＬのジクロロメタンを入れ、１０ｍＬの９．７４Ｍチオフェノール溶液を添加し、さらに３．８ｍＬの１２．８Ｍジケテンを加えて、ジケテンとチオフェノールのモル比が１：２になるようにした。そこに、氷冷、窒素気流下でトリエチルアミンを一滴加えて一晩撹拌し、反応物中の溶媒を減圧留去し生成物を得た。得られた生成物をシリカゲル６０のカラムクロマトグラフィー（溶離液はヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、少し赤いオイル状の精製３−ケトブチリルチオフェニルエステルを得た。この化合物の構造確認をＮＭＲによって行った。
【００５２】
『ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素（ＰｈａＣ）について』
次に、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の過剰発現系を構築して精製し、精製ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素を得た。つまり、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＡＴＣＣ１７６９９のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｍａＩによって処理し、ｐＵＣ１８を用いてポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を含む約５ｋｂｐの遺伝子断片をクローニングし、プラスミドｐＴＩ３０５を取得した。
【００５３】
次に、ｐＴＩ３０５における約１．６ｋｂｐのＮｏｔＩ／ＳｔｕＩ断片と、ｐＴＩ３０５をテンプレートして下記条件にてＰＣＲにより増幅した１４０ｂｐのＢａｍＨＩサイトとＳｍａＩサイトを有する断片と、ＢａｍＨＩとＳｍａＩで処理したベクターｐＱＥ３０（キアゲン社製）の３つを混合してライゲーションし、この反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、形質転換体からポリヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子を有するプラスミドｐＱＥＲＥＣを得た。このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１に導入し、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素調製用の大腸菌を作製した。
【００５４】
上記ＰＣＲは、プライマーとして、
センスプライマーaaggatccatggcgaccggcaaaggcgcgg（配列番号１）
アンチセンスプライマーtgcagcggaccggtggcctcggcc（配列番号２）
を用いて、９４℃で４５秒、５８℃で３０秒、７２℃で６０秒の反応を１サイクルとして３０サイクル行った。
【００５５】
得られたポリヒドロキシアルカン酸合成酵素調製用の大腸菌をアンピシリンを含む１０００ｍＬのＬＢ培地中において、３０℃で１６時間培養し、菌体内にポリヒドロキシアルカン酸合成酵素を蓄積させ、超音波破砕によって菌体を破壊した後、菌体内の可溶性タンパク質を回収した。この回収したタンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロースゲルカラムに供し、（６ＸＨｉｓ）−ＰｈａＣをワンステップで精製した。
【００５６】
『３−ケトアシルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）について』
また、３−ケトアシルＣｏＡレダクターゼの過剰発現系を構築して精製し、精製３−ケトアシルＣｏＡレダクターゼを得た。
【００５７】
つまり、３−ケトアシルＣｏＡレダクターゼ遺伝子を上記ｐＴＩ３０５をテンプレートして、下記条件にてＰＣＲによって増幅した７５０ｂｐのＢａｍＨＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトを有する断片を、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ処理したベクターｐＱＥ３０（キアゲン社製）に連結した。得られたプラスミドｐＱＥＲＥＢを大腸菌ＢＬ２１に導入し、３−ケトアシルＣｏＡレダクターゼ調製用の大腸菌を得た。
【００５８】
上記ＰＣＲは、プライマーとして、
センスプライマーaaggatccatgactcagcgcattgcgtatg（配列番号３）
アンチセンスプライマーaaaagcttgaattggcgcaaaaagcgagga（配列番号４）
を用いて、９４℃で４５秒、５８℃で３０秒、７２℃で６０秒の反応を１サイクルとして３０サイクル行った。
【００５９】
得られた３−ケトアシルＣｏＡレダクターゼ調製用の大腸菌をアンピシリンを含む１０００ｍＬのＬＢ培地中において、３０℃でＯＤ値が０．５まで培養した後、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピルチオガラクトシドを加えて、さらに５時間培養して、菌体内に３−ケトアシルＣｏＡレダクターゼを蓄積させた。超音波破砕によって菌体を破壊した後、菌体内の可能性タンパク質を回収した。この回収したタンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロースゲルカラムに供し、（６ＸＨｉｓ）−ＰｈａＢをワンステップで精製した。
【００６０】
『ポリ３−ヒドロキシブタン酸の合成について』
そして、上記にて得られたポリヒドロキシアルカン酸合成酵素と３−ケトアシルＣｏＡレダクターゼを用いて、３−ケトブチリルチオフェニルエステルからポリ（３−ヒドロキシブタン酸）を合成した。
【００６１】
つまり、２５ｍＬの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）に５００μｇのポリヒドロキシアルカン酸合成酵素と、１ｍＭのＣｏＡ、３−ケトアシルＣｏＡレダクターゼと、５ｍＭのＮＡＤＰＨを添加した。１００ｍＭの３−ケトブチリルチオフェニルエステルを含むヘキサン溶液２５ｍＬを重層し、３０℃で７２時間反応させた。反応後にヘキサン層を除去し、水層中から５ｍＬのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出した。これを２回繰り返した。抽出液をフィルターろ過した後、１００ｍＬのメタノールを加えて４℃で一晩放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥器で乾燥し、ポリ３−ヒドロキシブタン酸を得た。この化合物の構造確認をＮＭＲにより行い、その分析結果を以下に示す。
1H NMR (400 Mhz, CDCl3) d 5.26 (m, H), 2.53 (m, 2H), 1.25 (s, 3H)
【００６２】
以上のように、本実施形態によれば、ジケテンを出発原料としているため、従来のポリ３−ヒドロキシブタン酸の製造方法に比べて、原料が非常に安価となる。
【００６３】
さらに、ジケテンを出発物質としてポリ３−ヒドロキシブタン酸を合成する反応は、何段階もの工程を経て反応させる必要がなく、３−ケトブチリルチオフェニルエステルを合成する反応と３−ケトブチリルチオフェニルエステルからポリ３−ヒドロキシブタン酸を合成する、わずか２つの反応工程によって最終目的物質であるポリ３−ヒドロキシブタン酸を得ることができるため、より工業化に適するポリヒドロキシアルカン酸の合成が可能となる。
【実施例２】
【００６４】
実施例２では、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンベータラクトンを出発原料としてポリヒドロキシアルカン酸を製造する方法を示す。
【００６５】
『Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンの合成について』
まず、下記式のとおり、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンベータラクトンを原料として、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを合成した。
【００６６】
酢酸ナトリウムの無水物５ｇ（６０．０ｍｍｏｌ）を溶かした７５ｍＬの氷酢酸に、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンベータラクトンを１ｇ（４．５２ｍｍｏｌ）を加えた。４５℃で７時間反応した後、真空下において３５ ℃にて溶媒を留去した。残留物に５０ｍＬの１Ｍ 塩酸を加えてｐＨを２にした後、１５０ｍＬの塩化メチレンで抽出した。この抽出操作を３回行った。塩化メチレンを真空で留去することにより、無色透明なシロップ状のＮ−カルボベンゾキシ−Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを得た。収量は１．１６ｇであり、モル数は４．１２ｍｍｏｌ、収率は９１．２％であった。この化合物の構造確認をＮＭＲにより行い、その分析結果を以下に示す。
1H NMR (400 Mhz, CDCl3) d 7.22 (s, 5H), 5.42 (d, 1H), 5.00 (s, 2H), 4.56-4.52 (m, 1H), 4.40-4.23 (m, 2H), 1.92 (s, 3H).
【００６７】
『Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリン チオフェニルエステルの合成について』
次に、下記式のとおり、上記にて得られたＮ−カルボベンゾキシ−Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンから、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリン チオフェニルエステルを合成した。
【００６８】
０．７０ｇ（２．４９ｍｍｏｌ）のＮ−カルボベンゾキシ−Ｏ−アセチル−Ｌ−セリンを３ｍＬの無水塩化メチレンに溶解し、これに５０ｍｇ（０．４１ｍｍｏｌ）のジメチルアミノピリジンと０．２８ｇ（２．５５ｍｍｏｌ）のチオフェノールを加えた。この溶液を０℃にした後、１．０３ｇ（４．９９ｍｍｏｌ）のジシクロヘキシルカルボジイミドを加えた。この溶液を０℃で５分、２０℃で３時間攪拌した後、析出した尿素誘導体を濾過で取り除いた。真空下において溶媒を留去した後、塩化メチレンを加え、この溶液を１００ｍＬの０．５Ｍ塩酸で２回洗浄し、さらに１００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。塩化メチレン層を硫酸マグネシウムで乾燥して溶媒を留去した後、塩化メチレンを移動相に用いたカラムクロマトグラフィー（Ｒｆ値が０．３０（塩化メチレン）、シリカゲル）により白色結晶のＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリン チオフェニルエステルを得た。収量は０．５０ｇであり、モル数は１．５１ｍｍｏｌ、収率は６０．６％であった。この化合物の構造確認をＮＭＲにより行い、その分析結果を以下に示す。
1H NMR (400 Mhz, CDCl3) d 7.48-7.17 (s, 10H), 5.65 (d, 1H), 5.12 (s, 2H), 4.75-4.70 (m, 1H), 3.45-3.35 (m, 2H).
【００６９】
『Ｌ−セリン チオフェニルエステルの合成について』
つづいて、下記式のとおり、上記にて得られたＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリン チオフェニルエステルから、Ｌ−セリン チオフェニルエステルを合成した。
【００７０】
０．４ｇ（１．２１ｍｍｏｌ）のＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリン チオフェニルエステルを１０ｍＬ無水メタノールに溶かした後、０．３ｇ（０．３７ｍＬ）のシクロヘキセン溶液と０．４ｇの１０％パラジウム炭素触媒を加えた。この溶液を１５分間加熱還流した後、セライトを用いた濾過により触媒を取り除いた。真空下において溶媒を留去することにより、Ｌ−セリン チオフェニルエステルを得た。収量は０．２１ｇであり、モル数は１．１０ｍｍｏｌ、収率は９１．０％であった。この化合物の構造確認をＮＭＲにより行い、その分析結果を以下に示す。
（1H NMR (400 Mhz, CDCl3) d 7.30-7.15 (s, 5H), 4.70-4.62 (m, 1H), 3.40-3.34 (m, 2H), 2.5 (br. s, 2H).）。
【００７１】
『ポリ３−ヒドロキシ−２−アミノプロピオン酸の合成について』
つづいて、下記式のとおり、上記にて得られたＬ−セリン チオフェニルエステルから、ポリ３−ヒドロキシ−２−アミノプロピオン酸を合成した。
【００７２】
つまり、２５ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に５００μｇのポリヒドロキシアルカン酸合成酵素と、１ｍＭのＣｏＡを添加した。１０ｍＭのＬ−セリン チオフェニルエステルを含むヘキサン溶液２５ｍＬを重層し、３０℃で７２時間反応させた。反応後にヘキサン層を除去し、水層中から５ｍＬのクロロホルムで溶液中の生成物を抽出した。これを２回繰り返した。抽出液をフィルターろ過した後、１００ｍＬのメタノールを加えて４℃で一晩放置した。生成した沈殿物をフィルターろ過して回収し、真空乾燥器で乾燥し、ポリ３−ヒドロキシ−２−アミノプロピオン酸を得た。
【００７３】
以上のように、本実施形態によれば、これまでｉｎ  ｖｉｖｏ合成法およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成法においても、合成されたことのないα位に側鎖としてアミノ基を有するヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとして含むポリヒドロキシアルカン酸が得られる。そして、アミノ基を側鎖に有するポリヒドロキシアルカン酸が安価に製造できるため、そのアミノ基を反応基点として様々な物質を任意に結合させる可能性が広がり、ニーズに応じた多様な性質を有するポリヒドロキシアルカン酸の合成が可能となって実用性・応用性が高まる。
【００７４】
なお、本発明に係るポリヒドロキシアルカン酸の製造方法およびポリヒドロキシアルカン酸は、前述した実施形態に限定されるものではなく、適宜変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】ラクトン構造を有する物質からポリ３−ヒドロキシアルカン酸の合成スキームを示した図である。
【図２】ジケテンを出発原料として３−ケトブチリルチオフェニルエステルを経由し、ポリヒドロキシアルカン酸を製造する反応経路図である。
【図３】Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンベータラクトンを出発原料としてポリヒドロキシアルカン酸を製造する反応経路図である。
【図１】
2007302750.tif 000007
【図２】
2007302750.tif 000008
【図３】
2007302750.tif 000009
【配列表】
2007302750000001.app