(57)【要約】【課題】  タバコの煙をはじめとする繊維質を燃焼させた時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる様々な障害に対して効果が高く、副作用の少ない予防ないし治療剤の提供を主たる目的とする。【解決手段】  チオレドキシンファミリーのポリペプチド（ＴＲＸ）が、タバコの煙をはじめとする繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる炎症反応を抑制すること、並びに該有害成分を原因とする組織の繊維化を阻止することを見出し、ＴＲＸが繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分を原因とする障害に広く有効であるとの結論に達した。  従って、ＴＲＸ及びその誘導剤の１種以上を有効成分とする、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分による障害の予防ないし治療剤とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオレドキシンファミリーのポリペプチド及びその誘導剤の１種以上を有効成分とし、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分による障害の予防乃至治療剤。
【請求項２】
チオレドキシンファミリーのポリペプチドがヒトチオレドキシンである請求項１に記載の予防ないし治療剤。
【請求項３】
植物の繊維成分の煙が、タバコ、木材及び紙からなる群より選択されるいずれか１種を燃焼させた際に生じる煙である請求項１又は２に記載の予防乃至治療剤。
【請求項４】
繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる障害が、呼吸器及び／又は消化器における炎症である請求項１乃至３いずれか記載の予防ないし治療剤。
【請求項５】
呼吸器が、鼻腔、副鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支及び肺胞からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４に記載の予防ないし治療剤。
【請求項６】
消化器が、食道、胃、十二指腸、肝臓、小腸及び大腸からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４に記載の予防ないし治療剤。
【請求項７】
繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる障害が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）又は気管支喘息である請求項１乃至６いずれか記載の予防ないし治療剤。
【請求項８】
チオレドキシンファミリーのポリペプチド及びその誘導剤の１種または２種以上を有効成分とし、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分による障害の予防乃至治療のための製剤。
【請求項９】
チオレドキシン誘導剤が、スルフォラファンである請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
飲食品の形態である請求項８又は９に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チオレドキシンファミリーのポリペプチド（以下「ＴＲＸ」と略記する場合がある）及びその誘導剤の１種以上を有効成分とする、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる障害の予防乃至治療剤に関する。
また、本発明は、チオレドキシンファミリーのポリペプチド及びその誘導剤の１種以上を有効成分とする該障害の予防乃至治療のための製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
タバコをはじめとする繊維質を燃焼させた時に発生する煙には、一酸化炭素、一酸化窒素、ニコチン、タール等の有害物質が数多く含まれ、これらの有害物質によって、呼吸器機能、免疫機能の低下が引き起こされることが知られている。
また、長期にわたって有害成分の吸入又は吸収を続けることで、虚血性心疾患（狭心症、心筋梗塞等）、肺機能の低下、発癌等のリスクを高めることが報告されている。
さらに妊婦が有害成分を含む煙を吸入することによって、妊婦自身だけでなく胎児にも悪影響を与えることも知られている。
特にタバコの煙の場合には、タバコの副流煙を吸入すること（受動喫煙）による悪影響も指摘され、長期喫煙者の家族（非喫煙者）にみられる慢性気管支炎、呼吸機能低下、気管支喘息、動脈硬化、狭心症等は、受動喫煙との関連性が高いとされている。
また、火災現場等に取り残された人や消防士は、多量に煙を吸い込むことで呼吸器の障害を受けやすい。受動喫煙や火災現場での煙の吸入等の場合は防止することが難しく、問題となっている。
【０００３】
タバコの煙は、慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease：以下「ＣＯＰＤ」と略記）や、肺癌等の肺疾患の主要因として知られる（非特許文献１）が、近年では、増大する酸化ストレスによる炎症反応を惹起させ、動脈硬化症や冠状動脈症及び生活習慣病等のような全身性の炎症の誘発因子として関与することが報告されている（非特許文献２、３）。即ち、喫煙は、肺等の特定臓器における障害のみならず、広く体全体における障害の要因となることが知られている。
以上のことから、タバコの煙をはじめとする繊維質を燃焼させた時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる様々な障害に有効な予防乃至治療剤の開発が望まれている。
【０００４】
一方、チオレドキシン（Thioredoxin）は、その活性部位配列：−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−：の２つのシステイン残基間でのジスルフィド／ジチオール交換反応による酸化還元（レドックス）活性を有する１２ｋＤａの多機能ペプチドである（非特許文献４）。チオレドキシンは、リボヌクレオチドリダクターゼに対する水素イオン供与体、デオキシリボヌクレオチドの合成に重要な酵素として大腸菌から単離されて以来、多くの原核生物、真核生物から単離同定されてきた。
成人Ｔ細胞白血病誘導因子（ＡＤＦ）は、本発明者らがＨＴＬＶ−１に感染したＴリンパ球によって産生されるＩＬ−２受容体誘導因子として最初に同定したもので、ヒトチオレドキシンである。
細胞内チオレドキシンはラジカル消去や、activator protein‐1（ＡＰ−１）、nuclear factor‐kappa Ｂ（ＮＦ−κＢ）などのレドックスに関する転写因子の制御に重要な役割を果たしている（非特許文献５）。
ヒトチオレドキシンは、p38 mitogen activating protein kinase（ＭＡＰＫ）やapoptosis signal regulating kinase−1（ＡＳＫ−１）のシグナル伝達を制御する。
チオレドキシンが細胞外に放出され、サイトカインまたはケモカイン作用を示すこと（非特許文献６）、更には細胞外ＴＲＸが細胞内へ移行すること（非特許文献７）が本発明者らによって報告されてきた。
しかしながら、タバコの煙をはじめとする繊維質を燃焼させた時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる障害と、チオレドキシンファミリーのポリペプチド（ＴＲＸ）との関連性については、未だ報告されていない。
【０００５】
【非特許文献１】Pauwels R. A., Buist A. S., Ma P., Jenkins C. R. and Hurd S. S. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: National Heart, Lung, and Blood Institute and World Health Organization Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD): executive summary. Respir Care 46: 798-825, 2001.
【非特許文献２】Ishizaka N., Ishizaka Y., Toda E., Hashimoto H., Nagai R. and Yamakado M. Hypertension is the most common component of metabolic syndrome and the greatest contributor to carotid arteriosclerosis in apparently healthy Japanese individuals. Hypertens Res 28: 27-34, 2005.
【非特許文献３】Mizia-Stec K., Zahorska-Markiewicz B. and Gasior Z. Cigarette smoking and inflammatory indices in coronary artery disease. Int J Cardiol 93: 169-74, 2004.
【非特許文献４】Redox regulation of cellular activation Ann.Rev.Immunol.1997;15:351-369
【非特許文献５】AP-1 transcriptional activity is regulated by a direct association between thioredoxin and Ref-1 PNAS.1997;94:3633-3638
【非特許文献６】Circulating thioredoxin suppresses lipopolysaccharide-induced neutrophil chemotaxis PNAS.2001; 98: 15143-15148
【非特許文献７】Redox-sensing release of thioredoxin from T lymphocytes with negative feedback loops J.Immunol.2004;172:442-448
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、タバコの煙をはじめとする繊維質を燃焼させた時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる様々な障害に対して効果が高く、副作用の少ない予防ないし治療剤の提供を主たる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、チオレドキシンファミリーのポリペプチド（ＴＲＸ）が、タバコの煙をはじめとする繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる炎症反応を抑制すること、並びに該有害成分を原因とする組織の繊維化を阻止することを見出し、ＴＲＸが繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分を原因とする障害に広く有効であるとの結論に達した為、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、請求項１にかかる発明は、チオレドキシンファミリーのポリペプチド及びその誘導剤の１種以上を有効成分とし、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分による障害の予防乃至治療剤に関する。
請求項２にかかる発明は、チオレドキシンファミリーのポリペプチドがヒトチオレドキシンである請求項１に記載の予防ないし治療剤に関する。
請求項３にかかる発明は、植物の繊維成分の煙が、タバコ、木材及び紙からなる群より選択されるいずれか１種を燃焼させた際に生じる煙である請求項１又は２に記載の予防乃至治療剤に関する。
請求項４にかかる発明は、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる障害が、呼吸器及び／又は消化器における炎症である請求項１乃至３いずれか記載の予防ないし治療剤に関する。
請求項５にかかる発明は、呼吸器が、鼻腔、副鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支及び肺胞からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４に記載の予防ないし治療剤に関する。
請求項６にかかる発明は、消化器が、食道、胃、十二指腸、肝臓、小腸及び大腸からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項４に記載の予防ないし治療剤に関する。
請求項７にかかる発明は、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる障害が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）又は気管支喘息である請求項１乃至６いずれか記載の予防ないし治療剤に関する。
請求項８にかかる発明は、チオレドキシンファミリーのポリペプチド及びその誘導剤の１種または２種以上を有効成分とし、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分による障害の予防乃至治療のための製剤に関する。
請求項９にかかる発明は、チオレドキシン誘導剤が、スルフォラファンである請求項８に記載の製剤に関する。
請求項１０にかかる発明は、飲食品の形態である請求項８又は９に記載の製剤に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明にかかる予防乃至治療剤は、チオレドキシンファミリーのポリペプチド及びその誘導剤の１種以上を有効成分とするので、タバコの煙をはじめとする繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる炎症を抑制する効果、並びに該有害成分を原因とする組織の繊維化を阻止する効果を発揮することができる。
従って、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分を原因とする障害に広く有効である。
【００１０】
さらに本発明にかかる予防乃至治療剤は、体内でも発現する内因性チオールタンパク質であるＴＲＸ又は体内においてＴＲＸの発現を誘導する物質を有効成分とするため、副作用の心配がない、安全性の高い予防乃至治療剤であるといえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究の結果、チオレドキシンファミリーのポリペプチド（ＴＲＸ）の新たな機能として、（１）ＴＲＸが、タバコの煙をはじめとする繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる好中球の増加を抑えること、並びに（２）該有害成分により誘導される初期の炎症性サイトカインであるマクロファージ遊走阻止因子（Macrophage Migration Inhibitory Factor）（以下「ＭＩＦ」と略記）および腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor−alpha）（以下「ＴＮＦ−α」と略記）の発現を抑えることを発見し、（ＴＲＸが）該有害成分による炎症反応を低減し得ることを解明した。
更に、本発明者らは、（３）ＴＲＸが、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされるマトリックスメタロプロテアーゼ（Matrix Metallo Proteinase）ー１２（以下「ＭＭＰ−１２」と略記）の発現を抑えることを発見し、（ＴＲＸが）該有害成分によって誘導されたＭＭＰ−１２による炎症初期の肺胞構築の破壊を抑制し、結果として（各臓器における）組織の繊維化を低減し得ることを解明した。
【００１２】
以上のことから、本発明者らは、ＴＲＸが、タバコの煙をはじめとする繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる炎症反応抑制効果、並びに該有害成分を原因とする組織の繊維化を阻止する効果を発揮することによって、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分を原因とする障害（喫煙によって引き起こされる障害が例示される）に広く有効であるとの結論に達し、本発明を完成するに至った。
以下、本発明に係るチオレドキシンファミリーのポリペプチド及びその誘導剤の１種以上を有効成分とする予防乃至治療剤の実施形態について詳説する。
【００１３】
本発明におけるチオレドキシンとしては、ヒトチオレドキシン以外に「チオレドキシンファミリー」に属するものであればよく、その活性中心に−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を有するポリペプチド類を有するものが例示される。
これらの中でも活性中心に配列−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を有するチオレドキシン又はチオレドキシン２（ミトコンドリア特異的チオレドキシン）が好ましい。
【００１４】
上記の活性中心を有するものであれば、チオレドキシンの由来は特に限定されず、ヒトを含む動物のチオレドキシン（ヒトを含む動物のＡＤＦ）、大腸菌などの細菌のチオレドキシン、酵母のチオレドキシン；ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチド（ヒトＡＤＦＰ）；ヒト，大腸菌等のグルタレドキシン等が含まれる。特にヒトチオレドキシン及び酵母チオレドキシンが好ましい。酵母チオレドキシンは、酵母から単離したものでもよいが、チオレドキシンを多く含む酵母の形態で使用することもできる。
【００１５】
本明細書において、ヒトチオレドキシン（ｈＴＲＸ）とは、配列番号１に示される１０５個のアミノ酸からなるポリペプチドを指す。ｈＴＲＸの塩基配列は、配列番号２に示される。
【００１６】
また、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分による障害を抑制するものであれば、配列番号１のヒトチオレドキシンをもとにして公知の遺伝子工学的手法により作製されたＴＲＸ改変体であってもよい。
該改変体としては、配列番号１の３２位と３５位以外、好ましくは３２位〜３５位以外のアミノ酸の１又は複数個、好ましくは１又は数個が置換、欠失、付加、挿入されているものがあげられる。
【００１７】
上記のチオレドキシンファミリーに属するポリペプチド（ＴＲＸ）を、単独又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００１８】
本発明において、繊維質とは、植物の葉、幹、茎、根等の繊維質の部分を指し、繊維質の燃焼時に発生する煙とは、タバコ、木材、紙等を燃焼した際に生じる煙を指す。
タバコには、紙巻きタバコ、葉巻、噛みタバコ等が含まれる。木材には、天然木の他に、合板、樹脂等との複合材等も含まれる。また、紙には、樹脂等と複合しているものも含まれる。
【００１９】
繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分としては、ニコチン、タール、ベンゾ（ａ）ピレン、トルエン、フェノール、メチルナフタレン、ピレン、アニリン、２−ナフチルアミン、二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、アセチレン、アンモニア、アセトアルデヒド、シアン化水素、メチルフラン、アセトニトリル、ピリジン、ジメチルニトロサミン等が含まれている。
【００２０】
また、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分による障害とは、該有害成分の吸入又は吸収によって引き起こされる障害を指す。ここで、有害成分の吸入には、能動的に吸入する場合（例えば、タバコの主流煙の吸入等）及び受動的に吸入する場合（例えばタバコの副流煙の吸入等）の両方が含まれる。該有害成分の吸入又は吸収の期間は特に限定されず、１回〜数日程度の急性、１〜３週間程度の亜急性、数ヶ月以上の慢性的に吸入又は吸収することを含む。
【００２１】
本発明に係る予防乃至治療剤の投与経路としては、経口および非経口のいずれでも投与することができ、臨床医によって適宜選択される。また有効成分であるチオレドキシンを単独または通常使用される担体と共に投与することができる。
【００２２】
本発明の予防乃至治療剤を経口投与する場合は、薬剤の形態として、錠剤、丸剤、散剤、被覆錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形製剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の液状製剤、エアゾール剤、アトマイザー、ネブライザー等の吸入剤、およびリポソーム封入剤等があげられる。
【００２３】
本発明に係る予防乃至治療剤は、上記の有効成分と共に薬学的に許容される製剤担体を用いて、医薬製剤の形態として実用される。該製剤担体としては、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、吸収促進剤、保湿剤、吸着剤、滑沢剤、充填剤、増量剤、付湿剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節する塩、緩衝剤等の希釈剤又は賦形剤を例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。
【００２４】
錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウム等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等の崩壊剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等の界面活性剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用できる。
さらに錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることができる。この剤皮の層の数によって二重錠、多層錠とすることができる。
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。
【００２５】
本発明の予防乃至治療剤を非経口投与する場合は、薬剤の形態として静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射および腹腔内注射などに使用される注射剤（液剤、乳剤、懸濁剤等）、液剤（例えば、点眼剤、点鼻薬等）、懸濁剤、乳剤、点滴剤、吸入剤（エアロゾル剤、粉末吸入剤等）等があげられる。
【００２６】
本発明の予防ないし治療剤が液剤、乳剤、懸濁剤等の注射剤として調製される場合、これらは殺菌され且つ血液と等張であるのが好ましく、これらの形態に成形するに際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用できる。
尚、この場合、等張性の溶液を調整するに充分な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを本発明薬剤中に含有させてもよい。
また、通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。
【００２７】
本発明の予防乃至治療剤が液状製剤である場合は、凍結保存または凍結乾燥等により水分を除去して保存してもよい。凍結乾燥製剤は、使用時に注射用蒸留水等を加え、再度溶解して使用される。
【００２８】
本発明の予防乃至治療剤を吸入剤として用いる場合、一般的に使用される従来公知の吸入剤用添加剤を使用して調製すればよい。この様な添加剤としては、例えば、噴射剤；白糖、乳糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の固形賦形剤：プロピレングリコール等の不活性液体のような液状賦形剤；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、白糖等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム、軽質無水ケイ酸、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑沢剤；安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤；クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定化剤；メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、レシチン、トリオレイン酸ソルビタン等の懸濁化剤；界面活性剤等の分散剤；水等の溶剤；塩化ナトリウム等の等張化剤；硫酸、塩酸等のｐＨ調整剤；エタノール等の可溶化剤等があげられる。
【００２９】
さらに、本発明に係る予防乃至治療剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させて調製することもできる。
【００３０】
ＴＲＸファミリーに属するポリペプチドの有効量は、当業者が従来の技術を参考に容易に決定することができるが、例えば、成人１人１日あたり０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ程度、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ程度、より好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ程度である。
これを１日あたり１回又は数回に分けて投与することができるが、各種製剤の形態、患者の性別、年齢、疾患の程度に合わせて適宜調節することが好ましい。
【００３１】
［ＴＲＸ誘導剤］
本発明の予防乃至治療剤として、体内でＴＲＸを誘導する物質を用いて繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分による障害を抑制することもできる。この様な物質としては、スルフォラファンがあげられる。
スルフォラファンは、例えば、キャベツ、ムラサキキャベツ、ブロッコリー、ケール、ロケット菜、カリフラワー、ダイコン、ハクサイ、カブ、コマツナ、チンゲンサイ等に含まれ、これらの植物の新芽を用いることが好ましい。
中でも、スルフォラファンは、ブロッコリーの新芽（ブロッコリースプラウト）、ダイコンの新芽（カイワレダイコン）、ムラサキキャベツの新芽等に多く含まれている。
【００３２】
スルフォラファンは、従来公知の抽出方法に従って上記の植物から得ることができ、必要に応じて精製、凍結乾燥等の処理を加えてもよい。
得られたスルフォラファン含有抽出物は、スルフォラファンを０．００１〜２００ｍｇ／ｇ程度、好ましくは０．００５〜８０ｍｇ／ｇ程度、より好ましくは０．０１〜５０ｍｇ／ｇ程度含むことが望ましい。
【００３３】
又、摂取されるスルフォラファンの量は、その用法、摂取する人の年齢、性別、体重、健康状態、その他の条件、症状の程度等により適宜選択されるが、成人１人当り１日当り０．００１〜１０００μｇ／ｋｇ程度、好ましくは０．００５〜２００μｇ／ｋｇ程度、より好ましくは０．０１〜６０μｇ／ｋｇ程度となるようにすることが望ましい。
【００３４】
上記のスルフォラファンの他に、ＴＲＸ誘導剤であるゲラニルゲラニルアセトン（ＧＧＡ）を組み合わせて使用することも可能である。
【００３５】
上記の抽出物をそのまま使用してもよく、ＴＲＸ誘導剤を有効成分とする医薬製剤の形態で用いてもよい。医薬製剤の形態で使用する場合は、上記［ＴＲＸ］で記載した製剤担体と共に調製することができる。
【００３６】
また、本発明のＴＲＸ誘導剤を有効成分とする製剤を、飲食品の形態で使用することもできる。飲食品の形態で使用する場合には、上記の抽出物に、原料である植物を加えて調製してもよい。
【００３７】
飲食品としては、例えば、健康食品、栄養補助食品（バランス栄養食、サプリメント等）、栄養機能食品、特定保健用食品、病者用食品等があげられる。これらの食品の製造方法は、チオレドキシン発現の誘導という所期の効果が得られるものであれば特に限定されず、各用途で当業者によって使用されている方法に従えばよい。
【００３８】
飲食品としては、例えば、ガム、キャンディー、グミ、錠菓、クッキー、ケーキ、チョコレート、アイスクリーム、ゼリー、ムース、プリン、ビスケット、コーンフレーク、チュアブルタブレット、ウエハース、煎餅等の菓子類；炭酸飲料、清涼飲料、乳飲料、コーヒー飲料、紅茶飲料、果汁飲料、栄養飲料、アルコール飲料、ミネラルウォーター等の飲料類；粉末ジュース，粉末スープ等の粉末飲料；バランス栄養食；粉末、カプセル、錠剤等の形態を有するサプリメント；ドレッシング、ソース等の調味料；パン類；麺類；かまぼこ等の練り製品；ふりかけ等があげられる。
【００３９】
又、チオレドキシンファミリーのポリペプチド（ＴＲＸ）とチオレドキシン誘導剤を、組み合わせて本発明の予防乃至治療剤又は製剤として調製してもよい。
【００４０】
本発明の限定的解釈を望むものではないが、今回解明されたＴＲＸの新たな作用効果として、第一に、ＴＲＸが、タバコの煙をはじめとする繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる障害において、該有害成分によって増大した好中球等の増加を抑えることが挙げられる。
即ち、タバコ等の煙に含まれる有害成分による障害の一要因に増大した好中球によって引き起こされる炎症反応があるが、ＴＲＸは、これら好中球の増加を抑えることによって（増大した好中球を原因とする）炎症反応を抑制することができる。
本発明に係る予防乃至治療剤は、ＴＲＸ及びその誘導剤の１種以上を有効成分とするので、タバコ等の煙に含まれる有害成分によって引き起こされる（好中球増大に起因する）炎症反応を抑制する効果を（特定臓器においてのみならず、体全体において）発揮することができ、該有害成分を原因とする障害に広く有効である。
【００４１】
第二に、ＴＲＸが、タバコの煙をはじめとする繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって、その発現が誘導される初期の炎症性サイトカインである「ＴＮＦ−α」及び「ＭＩＦ」の発現を抑制することが挙げられる。
即ち、タバコ等の煙に含まれる有害成分によって引き起こされる障害の一要因に、該有害成分によって、その発現が誘導される「ＴＮＦ−α」及び「ＭＩＦ」による（全身性の）炎症反応があるが、ＴＲＸは、これら炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α及びＭＩＦ）の発現を抑制することによって、体内の炎症反応を軽減させることができる。
【００４２】
ＴＮＦ−αは、喫煙により引き起こされる全身の炎症反応に重要な役割を果たすが、今回の研究成果によって、ＴＲＸが、タバコ等の煙に含まれる有害成分によって引き起こされるＴＮＦ−αのｍＲＮＡの発現、並びにＴＮＦ−α蛋白の発現を抑制することが示された。
ＭＩＦは、マクロファージを炎症部位に集め、炎症、免疫反応を惹起し、特に遅延型アレルギー反応に密接に関与することが知られている他、ＴＮＦ−α同様、喫煙により引き起こされる全身の炎症反応に重要な役割を果たすが、今回の研究成果によって、ＴＲＸが、タバコ等の煙に含まれる有害成分によって引き起こされるＭＩＦのｍＲＮＡの発現、並びにＭＩＦ蛋白の発現を抑制することが示された。
本発明に係る予防乃至治療剤は、ＴＲＸ及びその誘導剤の１種以上を有効成分とするので、タバコ等の煙に含まれる有害成分によって引き起こされる（ＴＮＦ−α、ＭＩＦに起因する）炎症反応を抑制する効果を（肺、気管支、肝臓、心臓、脾臓、食道、胃等において）発揮することができ、該有害成分を原因とする障害に広く有効である。
【００４３】
第三に、ＴＲＸが、タバコの煙をはじめとする繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって、ＭＭＰ−１２の発現を抑制することが挙げられる。
即ち、タバコ等の煙に含まれる有害成分によって引き起こされる障害の一要因に、該有害成分によって、その発現が誘導されるＭＭＰ−１２による炎症初期の肺胞構築の破壊、並びにその結果として（各臓器における）組織の繊維化があるが、ＴＲＸは、ＭＭＰ−１２の発現を抑制することによって炎症初期の肺胞構築の破壊を抑制し、結果として、組織の繊維化を軽減させることができる。
尚、組織の繊維化は、感染、慢性疾患および薬物処理に伴って発症し、一般に、慢性炎症に伴う炎症反応の後期反応と考えられており、あらゆる慢性疾患の共通因子として知られている。
【００４４】
ＭＭＰ−１２は、主にマクロファージから分泌されており、エラスチン（靱帯、肺、動脈などに多く存在）をはじめとする様々な細胞外マトリックスを分解する働きを持っている。マクロファージは、組織に炎症が起こる際、その病変部に集合するので、マクロファージから分泌されるＭＭＰ−１２は、各種炎症性疾患（関節炎、肺気腫、動脈瘤、動脈硬化等）の発生や進展と深い関わりがある。
ＭＭＰ−１２は、マクロファージの遊走、浸潤を促進して慢性炎症性疾患を悪化させる作用をもつこと（Transgenic Res 13:261-9, 2003）の他、喫煙等によりＭＭＰ−１２の活性が亢進されると、生体内でのエラスターゼとそのインヒビターの平衡バランスが崩れ、肺気腫、慢性気管支炎、繊維症等の原因となることが知られている。
即ち、ＭＭＰ−１２の活性を阻害できれば、組織の繊維化という点において共通するこれら疾患の治療に役立つ。
【００４５】
上述したとおり、ＭＭＰ−１２は、タバコの煙をはじめとする繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分により引き起こされる組織の繊維化等に重要な役割を果たすが、今回の研究成果によって、ＴＲＸが、タバコ等の煙に含まれる有害成分によって引き起こされるＭＭＰ−１２のｍＲＮＡの発現を抑制することが示された。
本発明に係る予防乃至治療剤は、ＴＲＸ及びその誘導剤の１種以上を有効成分とするので、（ＭＭＰ−１２に起因する）炎症初期の肺胞構築の破壊を抑制することができ、結果として、組織の繊維化を抑制する効果を発揮することができる。
従って、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分を原因とする障害（特に慢性疾患）に広く有効である。尚、ＴＲＸがＭＭＰ−１２の発現を抑制することは、好中球浸潤抑制機序の１つの可能性であると同時に、肺構造の破壊―肺気腫病変の進展抑制効果を有することを示唆する。
【００４６】
本発明にかかる予防乃至治療剤が適用可能な疾患群、即ち、タバコをはじめとする繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる障害について説明する。繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる障害とは、該有害成分によって起きる「炎症反応」、並びに「組織の繊維化」を引き起こすものであれば、特に限られるものではないが、後述する疾患を列挙することができる。
【００４７】
［疾患］
本発明の予防乃至治療剤が適用される疾患としては、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分を吸入することによる呼吸器系、循環器系、消化器系及び脳における障害（例えば炎症等）があげられる。このような障害には、呼吸器系の器官又は臓器、食道、胃等において該有害成分の取り込みによって直接的に引き起こされる障害、及び呼吸により取り込まれた該有害成分が体内に吸収されることによって各種器官、臓器、組織等において間接的に引き起こされる障害が含まれるものとする。また、これらの障害に加え、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分による、全身性の障害（例えば、全身性の炎症、アレルギー性疾患、胎児の奇形等）も含まれるものとする。
【００４８】
本発明において呼吸器とは、鼻腔、副鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺等の肺胞におけるガス交換に関係する全ての器官を指す。呼吸器系の疾患としては、肺気腫、慢性気管支炎等の慢性閉塞性肺疾患（COPD：chronic obstructive pulmonary disease）、気管支喘息、気管支拡張症、慢性副鼻腔炎、呼吸機能低下、呼吸不全、肺炎（好酸球性肺炎、間質性肺炎等を含む）、肺線維症、成人呼吸促迫症候群、慢性喉頭炎、呼吸細気管支炎、アレルギー性鼻炎等があげられる。また、歯周病、口内炎等の口腔内の障害も含まれる。
【００４９】
循環器としては、心臓、血管、血管内皮等の血液循環に関係する全ての器官が含まれる。循環器系の疾患としては、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、心不全等があげられる。
【００５０】
また、消化器としては、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸、肝臓等の消化・吸収に関係する全ての器官が含まれる。消化器系疾患としては、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、慢性胃炎、萎縮性胃炎、びらん性胃炎、大腸ポリープ、肝繊維化等があげられる。尚、肝繊維化は慢性肝疾患に共通の事象であり、繊維化の進行は発癌のリスクにもつながる。
【００５１】
脳の疾患としては、脳梗塞、クモ膜下出血、脳血管性痴呆等があげられる。
【００５２】
加えて、肺癌、口腔癌、咽頭癌、副鼻腔癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、腎盂癌、膀胱癌、子宮頚癌等の悪性腫瘍も含まれる。
【００５３】
本発明の予防乃至治療剤は、例えば、黄班変性症、網膜塞栓症、網膜静脈閉塞症、白内障、緑内障、視力低下、難聴、嗅覚鈍麻、味覚鈍麻等の感覚器における障害にも有用である。
【００５４】
さらに本発明の治療剤は、繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分を、一過性に多量に吸入又は吸収することによって引き起こされる、痰等の粘液の分泌、末梢血管循環障害等にも有効である。また、本発明の予防乃至治療剤は、繊維質の燃焼時に発生する煙に直接接触することによって引き起こされる障害にも有効である。この様な症状としては、気道の熱傷等があげられる。
【００５５】
ＴＲＸは、妊娠初期に血清中の濃度が高くなるｅａｒｌｙ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｆａｃｔｏｒの１つであり、また、胎盤におけるＴＲＸ発現が高いこと等から妊娠維持に重要であることが知られている。さらに、ＴＲＸ過剰発現マウスでは、奇形発生率が低く、胎児の正常発生にＴＲＸが重要であることが示唆されている。
【００５６】
従って、本発明の予防乃至治療剤は、妊婦が繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分を吸入することによって引き起こされる胎児の障害の予防又は治療にも有効である。胎児の障害として、例えば、低出生体重、流産、早産、周産期死亡、先天奇形、子宮内発育遅延、小児癌、乳幼児突然死症候群等があげられる。
【００５７】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００５８】
実験動物には、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（コントロールとして使用：清水実験動物より購入）及びチオレドキシン−トランスジェニックマウス（ＴＲＸ−Ｔｇ：京都大学ウイルス研究所作製）（それぞれ月齢２ヶ月の雄）を用いた。
ＳＩＳ−ＣＳ喫煙暴露装置（柴田科学製）を使用して、タバコ２０本分の煙を３％に希釈して３０分間マウスの全身に暴露させ、３０分休憩させた後、再び３％に希釈したタバコ２０本分の煙に３０分間全身暴露させた。
この条件で、喫煙暴露を連続３日間実施した。
【００５９】
［肺組織障害］
上記の喫煙暴露を行ったマウスの左肺を摘出してホルマリン伸展固定を行い、切片（４μｍ）を作成した。この切片にヘマトキシリン・エオジン染を（ＨＥ染色）を行った。結果を図１に示す。
炎症細胞の浸潤によりＣ５７ＢＬ／６の気管支上皮では、粘膜上皮の反応が亢進していることがわかった。これに対して、ＴＲＸ−Ｔｇでは、喫煙暴露後も喫煙による障害を示すような所見は見られなかった。
【００６０】
［ＢＡＬＦ中の炎症性細胞の計測］
上記の喫煙暴露スケジュール終了の翌日に、マウスを屠殺し、肺の洗浄液（ＢＡＬＦ；５ｍｌ）を回収した。サイトスピン（Ｓｈａｎｄｏｎ社製）によるＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色標本を用いてＢＡＬＦ中の細胞総数及び炎症の指標である好中球（ＰＭＮ）数を計測した。計測結果を、図２に示す。
【００６１】
ＢＡＬＦ中の好中球数は、喫煙によって増加する。ＴＲＸ−Ｔｇマウスでは、喫煙後のＢＡＬＦ中の好中球増加が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに比べて有意に少なかった。
肺組織障害及びＢＡＬＦ中の炎症性細胞の計測の結果より、喫煙による有害成分の直接刺激によって引き起こされる肺、気管支、食道、胃等の炎症に対し、ＴＲＸが有効であることが示された。
【実施例２】
【００６２】
野生型のマウスにＴＲＸを投与することによって、喫煙によるＢＡＬＦ中の好中球の増加が抑制されるかどうかを確認した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週齢：雄）に喫煙暴露の直前及び喫煙暴露の３時間後にそれぞれＴＲＸ２０μｇ／０．１ｍｌ生理食塩水を腹腔投与した（ＴＲＸ投与群：合計４０μｇ／日／マウス）。同様のスケジュールで生理食塩水を投与したＣ５７ＢＬ／６マウスを、コントロール群として用いた。喫煙暴露は、実施例１と同様に行った。喫煙暴露スケジュール終了の翌日に、マウスを殺し、肺の洗浄液（ＢＡＬＦ；５ｍｌ）を回収した。結果を図３に示す。
【００６３】
図３より、喫煙暴露を行ったＴＲＸ投与群（図３中、ＴＲＸ喫煙暴露）において、喫煙暴露を行った生理食塩水投与群（図３中、生理食塩水喫煙暴露）よりもＢＡＬＦ中の総細胞数が、少ない傾向にあった。また、ＰＭＮ数については、喫煙暴露を行ったＴＲＸ投与群の方が、コントロール群に比べ、有意に少なかった。
従って、ＴＲＸを投与された場合でも、喫煙による有害成分の直接刺激によって引き起こされる肺、気管支、食道、胃等の炎症に対し、ＴＲＸが有効であることが示された。
【実施例３】
【００６４】
実験動物には、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（コントロールとして使用：清水実験動物より購入）及びチオレドキシン−トランスジェニックマウス（ＴＲＸ−Ｔｇ：京都大学ウイルス研究所作製）（それぞれ９〜１２週齢の雄）を用いた。ＳＩＳ−ＣＳ喫煙暴露装置（柴田科学製）を使用して、タバコ２０本分の煙を３％に希釈して３０分間マウスの全身に暴露させ、３０分休憩させた後、再び３％に希釈したタバコ２０本分の煙に３０分間全身暴露させた。この条件で、喫煙暴露を連続３日間実施した。
【００６５】
〔総ＲＮＡ抽出およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析〕
総ＲＮＡの抽出は、上記の喫煙暴露を行ったマウスの脾臓から「Rneay Mini Kit（キアゲン社製）」を用いて行った。総ＲＮＡの抽出手順は「Rneay Mini Kit」に添付のプロトコールに従った。得られたＲＮＡの内、１μｇを１本鎖ｃＤＮＡの合成に利用した。逆転写反応は、ＲＮＡ１μｇに対し、ランダムへキサマー ２５０ｎｇとRnase OUT inhibitor ４０ユニット、逆転写酵素として、Super Script III Rnase H minus reverse transcriptase（インビトロゲン社製）を加えて、２０μＬの反応系で行った。
逆転写反応の後、得られたｃDNAの全てをリアルタイム定量ＰＣＲに用いた。リアルタイム定量ＰＣＲは、ABI Prism 7000シークエンス検出システム（アプライドバイオシステム社製）を使用して、マウスのＭＩＦ遺伝子およびＴＮＦ−α遺伝子の発現を、TaqMan逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法にて検出した。結果を図４に示す。
【００６６】
図４（ａ）より、喫煙暴露を行ったＴＲＸトランスジェニックマウス群（ＴＲＸ−ｔｇ）において、喫煙暴露を行ったコントロールマウス群（Wild-type）よりも（初期の）炎症性サイトカインである「ＭＩＦ」のｍＲＮＡの転写活性が有意（p＝0.05）に抑えられていた。
図４（ｂ）より、喫煙暴露を行ったＴＲＸトランスジェニックマウス群（ＴＲＸ−ｔｇ）において、喫煙暴露を行ったコントロールマウス群（Wild-type）よりも（初期の）炎症性サイトカインである「ＴＮＦ−α」のｍＲＮＡの転写活性が有意（p＝0.025）に抑えられていた。
以上より、ＴＲＸは、タバコをはじめとする繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる炎症性サイトカイン（ＭＩＦ、ＴＮＦ−α）のｍＲＮＡの発現を抑えることが示された。
【実施例４】
【００６７】
〔ウエスタンブロッティング解析〕
実験動物としては、上記リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析の場合と同様、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Wild-type群、ｎ＝３）及びチオレドキシン−トランスジェニックマウス（ＴＲＸ−Ｔｇ群、ｎ＝３）（それぞれ９〜１２週齢の雄）を用い、タバコ２０本分の煙を３％に希釈して３０分間マウスの全身に暴露させ、３０分休憩させた後、再び３％に希釈したタバコ２０本分の煙に３０分間全身暴露させた。この条件で、喫煙暴露を連続３日間実施した。その後、それぞれの群から脾臓を取り出し、後述する解析に用いた。
【００６８】
抗体としては、抗マウスＭＩＦポリクローナル抗体および抗マウスＭＩＦポリクローナル抗体（何れもサンタクルズ社製）を使用し、Towbinら（1979）の方法に従って、ウエスタンブロッティング解析を行った。
マウスのＭＩＦ蛋白及びＴＮＦ−α蛋白の発現を確認した結果を図５（ａ）に示す。
【００６９】
図５（ａ）は、喫煙暴露後のチオレドキシン−トランスジェニックマウス（ＴＲＸ−Ｔｇ、ｎ＝３）、並びにコントロールとしてのＣ５７ＢＬ／６マウス（Wild-type、ｎ＝３）の脾臓組織中におけるＭＩＦ蛋白およびＴＮＦ−α蛋白の発現を、ウエスタンブロッティング法で確認した結果である。
前記結果より、喫煙暴露後のＭＩＦ蛋白の発現レベルは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと比して、ＴＲＸ−Ｔｇマウスでは、顕著に減退していることが示された。
ＴＮＦ−αについても同様、喫煙暴露後のＴＮＦ−α蛋白の発現レベルは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと比して、ＴＲＸ−Ｔｇマウスでは、減退していることが示された。
【００７０】
図５（ｂ）は、喫煙暴露後のＴＲＸ−Ｔｇマウス、並びにコントロールとしてのＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓組織中におけるＭＩＦ蛋白およびＴＮＦ−α蛋白の発現活性を、デンシトメトリー法で確認した結果である。
前記結果より、喫煙暴露後のＴＲＸ−ＴｇマウスにおけるＭＩＦ蛋白およびＴＮＦ−α蛋白の発現レベルは、喫煙暴露後のＣ５７ＢＬ／６マウスのそれと比して、減退していることが確認された。
以上より、ＴＲＸは、タバコをはじめとする繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる炎症性サイトカインであるＭＩＦ蛋白およびＴＮＦ−α蛋白の発現を抑えることが示された。
【実施例５】
【００７１】
〔オキシブロット解析〕
（ウエスタンブロッティング解析で行った）脾臓以外の臓器において、酸化ストレスを評価するために、喫煙暴露後のＴＲＸ−Ｔｇマウス群（ｎ＝３）及びＣ５７ＢＬ／６マウス（コントロール）群（ｎ＝３）の「心臓」および「肝臓」において、オキシブロット解析を行った。ここでオキシブロット解析とは、酸化タンパク質分子内のcarbonyl基と2,4-dinitrophenylhydrazine（DNPH）を反応させ、生じた2,4-dinitrophenylhydrazone（DNP-hydrazone）を、ＤＮＰ特異的抗体および二次抗体（ＨＲＰ標識抗体）を用いて、化学発光で検出するものである。ウエスタンブロッティング解析でタンパク質の酸化レベルを解析できるキットである「OxyBlot Protein Oxidation Detection Kit（インビトロゲン社製）」を用いて、オキシブロット解析を行った。実験手順はキット添付のプロトコールに従った。結果を図６に示す。
【００７２】
図６は、喫煙暴露後のＴＲＸ−Ｔｇマウス群（ｎ＝３）、並びにコントロールとしてのＣ５７ＢＬ／６マウス群（ｎ＝３）の酸化ストレスを心臓（ａ）と、肝臓（ｂ）において確認した結果を示したものである。これにより、タンパク質の酸化レベルは、喫煙により、心臓（ａ）および肝臓（ｂ）において、強められるが、ＴＲＸ−Ｔｇマウス群では、コントロール群よりも、タンパク質の酸化レベルが強められていなかった。
以上より、ＴＲＸは、タバコをはじめとする繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる酸化ストレスによる障害を抑えることが示された。
【実施例６】
【００７３】
［ＭＭＰ−１２を抑制する実験］
実験動物としては、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（コントロール群、ｎ＝３）及びチオレドキシン−トランスジェニックマウス（ＴＲＸ−Ｔｇ群、ｎ＝３）（夫々９〜１２週齢の雄）を、タバコ２０本分の煙を３％に希釈して３０分間マウスの全身に暴露させ、３０分休憩させた後、再び３％に希釈したタバコ２０本分の煙に３０分間全身暴露させる条件で、喫煙暴露を連続３日間実施したものを使用した。
その後、それぞれの群から肺を取り出し、後述する解析に用いた。
【００７４】
ＭＭＰ−１２を抑制する実験として、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。
総ＲＮＡの抽出は、Rneay Mini Kit（キアゲン社製）を用い、上記喫煙暴露を行ったマウスの肺から、キットに添付のプロトコールに従い、総ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡ１μｇを１本鎖ｃＤＮＡの合成に利用し、逆転写反応の後、リアルタイム定量ＰＣＲを行った。リアルタイム定量ＰＣＲは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００シークエンス検出システム（アプライドバイオシステム社製）を使用して、マウスのＭＭＰ−１２遺伝子の発現を、ＴａｑＭａｎ逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法にて検出した。
結果を図７に示す。
【００７５】
図７より、喫煙暴露を行ったＴＲＸトランスジェニックマウス群（ｎ＝３）において、喫煙暴露を行ったコントロールマウス群（ｎ＝３）よりも、繊維化助長因子であるＭＭＰ−１２のｍＲＮＡの転写活性が有意に抑えられていた。
以上より、ＴＲＸは、タバコをはじめとする繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる炎症、並びに炎症に伴う繊維化を抑制することが示された。
【実施例７】
【００７６】
実験動物には、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（コントロールとして使用：清水実験動物より購入）及びチオレドキシン−トランスジェニックマウス（ＴＲＸ−Ｔｇ：京都大学ウイルス研究所作製）を用いた。月齢２ヶ月オスを通常飼育室で１ヶ月飼育後、月齢３ヶ月から喫煙曝露を開始した。
ＳＩＳ−ＣＳ喫煙暴露装置（柴田科学製）を使用して、１日あたりタバコ１０本、連続で５０分間曝露した。
尚、上記喫煙暴露プロトコールは、血中ＨｂＣＯを喫煙者のレベル１０％前後にあわせることを目標として行われたものである。
【００７７】
［マウス喫煙肺気腫モデル］
上記の喫煙暴露を行ったマウス左肺を２５ｃｍ Ｈ２ＯのＯＣＴで進展固定し、凍結切片（５ミクロン）を作製した。
この切片をヘマトキシリン染色し、形態学的評価を行った。
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）では、６月間の喫煙暴露によって、肺気腫の症状である著明な気腔の拡大、肺胞壁の断裂が確認された。結果を図８に示す。
【００７８】
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）とＴＲＸ−Ｔｇマウスの６ヶ月喫煙暴露後の肺組織を比較した結果（図８）、Ｃ５７ＢＬ／６で認められる著明な気腔の拡大、肺胞壁の断裂は、ＴＲＸ−Ｔｇマウスにおいては抑制されていた。
即ち、（喫煙３日暴露の動物モデルと比して）より慢性期の病態を反映する喫煙６月暴露のマウス喫煙肺気腫モデルにおいて、ＴＲＸ−Ｔｇマウスが肺気腫を抑制する傾向が確認された。
このことから、ＴＲＸの喫煙による障害（特に慢性）に対する治療効果が証明された。
尚、肺気腫は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の主たる病態の一つであることから、実施例７は、ＴＲＸのＣＯＰＤの予防乃至治療薬としての効果を直接証明するものである。
【００７９】
上記実験例１乃至７の結果により、ＴＲＸが、タバコの煙をはじめとする繊維質の燃焼時に発生する煙に含まれる有害成分によって引き起こされる障害（急性疾患および慢性疾患）に、広く有効であることが結論付けられた。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】喫煙暴露後（３日）のＴＲＸ−Ｔｇマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスの肺切片の顕微鏡写真を示す。
【図２】喫煙暴露後のＴＲＸ−Ｔｇマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスのＢＡＬＦ中における好中球（ＰＭＮ）及び総細胞数（ｔｏｔａｌ  ｃｅｌｌ）の計測結果を示す。
【図３】ＴＲＸ又は生理食塩水を投与したＣ５７ＢＬ／６マウスのＢＡＬＦ中における好中球（ＰＭＮ）及び総細胞数（ｔｏｔａｌ  ｃｅｌｌ）の計測結果を示す。
【図４】喫煙暴露後のＴＲＸ−Ｔｇマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓組織中におけるＭＩＦ（ａ）と、ＴＮＦ−α（ｂ）のｍＲＮＡの転写活性、並びにｍＲＮＡの転写活性抑制効果を示す。
【図５】（ａ）喫煙暴露後のＴＲＸ−Ｔｇマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓組織中におけるＭＩＦ蛋白およびＴＮＦ−α蛋白の発現を、ウエスタンブロッティング法で確認した結果を示す。（ｂ）喫煙暴露後のＴＲＸ−Ｔｇマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓組織中におけるＭＩＦ蛋白およびＴＮＦ−α蛋白の発現活性を、デンシトメトリー法で確認した結果を示す。
【図６】喫煙暴露後のＴＲＸ−Ｔｇマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスの酸化ストレスを心臓（ａ）と、肝臓（ｂ）において確認した結果を示す。
【図７】喫煙暴露後のＴＲＸ−Ｔｇマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスのＭＭＰ−１２蛋白の発現を、肺組織において確認した結果を示す。
【図８】長期喫煙暴露後（６月）のＴＲＸ−Ｔｇマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスの肺切片の顕微鏡写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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