(57)【要約】    【課題】ヒトを含む生物由来単球株化細胞の培養方法を提供する。    【解決手段】本発明は、単球株化細胞の培養方法であって、（ａ）生物の細胞を準備する工程と、（ｂ）培養用栄養液中にて前記細胞を培養する工程とを含み、前記栄養液が、フラクトース及びマンノースを含む、培養方法を提供する。本発明に係る培養方法では、前記栄養液は、ガラクトースと、熱失活させたウシ胎児血清とをさらに含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球株化細胞の培養方法であって、
（ａ）生物の細胞を準備する工程と、
（ｂ）培養用栄養液中にて前記細胞を培養する工程と、を含み、
前記栄養液が、フラクトース及びマンノースを含む、培養方法。
【請求項２】
前記栄養液が、ガラクトースをさらに含む、請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記栄養液が、熱失活させたウシ胎児血清をさらに含む、請求項１又は２記載の培養方法。
【請求項４】
前記生物が、哺乳類である、請求項１ないし３のうち何れか一項に記載の培養方法。
【請求項５】
前記哺乳類が、ヒト、イヌ、ブタ、ネコ又はマウスである、請求項４に記載の培養方法。
【請求項６】
生物の単球株化細胞培養のための栄養液であって、
フラクトース及びマンノースを含む栄養液。
【請求項７】
前記栄養液が、ガラクトースをさらに含む、請求項６に記載の栄養液。
【請求項８】
前記栄養液が、熱失活させたウシ胎児血清をさらに含む、請求項６又は７に記載の栄養液。
【請求項９】
前記生物が、哺乳類である、請求項６ないし８のうち何れか一項に記載の栄養液。
【請求項１０】
前記哺乳類が、ヒト、イヌ、ブタ、ネコ又はマウスである、請求項９に記載の栄養液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物由来細胞の培養方法に係り、より詳細には、特定の栄養液を用いた生物由来の単球株化細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含む哺乳動物の免疫担当細胞は、単球−マクロファージ系、Ｔリンパ細胞及びＢリンパ細胞から構成されている。免疫機能を解明するためには、これら免疫担当細胞の動態を検査しなければならない。単球−マクロファージ系細胞の主要な機能は、抗原物質の捕捉、処理、Ｔ及びＢリンパ細胞への抗原情報の伝達であり、免疫学分野の研究には必須の細胞群である。
【０００３】
一方、培養細胞を用いた実験研究では、試験管や細胞培養フラスコ内で容易に長期培養できる株化細胞を用いると実験が容易に行えることが知られている。従前から、基礎免疫学の実験では、実験動物由来株化細胞を用い、その同種の実験動物で実験研究が行われてきた。そして、実際にある特定種類の動物では、単球株化細胞の樹立が確認されている（非特許文献１及び２参照）。
【０００４】
近年、ヒトを含めた生物の単球−マクロファージ系株化細胞も実験研究の用に供されるようになってきている。そのため、生物の免疫学及び感染症学の研究の観点から、生物、特にヒト由来株化細胞に関心が集まっている。
【非特許文献１】KADOI, K., MICROBIOLOGICA 23, 441-444, 2000
【非特許文献２】KADOI, K. et al,  MICROBIOLOGICA 24, 243-247, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、とりわけ、ヒト由来の株化細胞は、いずれも腫瘍由来の細胞であり、正常な血液由来株化細胞は皆無である。そこで、本発明者は、ヒトを含む生物由来単球株化細胞の培養方法を提供することを、本発明の第一の目的とする。また、本発明による培養方法に利用される栄養液を提供することを、本発明の第二の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記事情に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、特定の栄養液において生物由来単球株化細胞が培養することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）単球株化細胞の培養方法であって、（ａ）生物の細胞を準備する工程と、（ｂ）培養用栄養液中にて前記細胞を培養する工程と、を含み、前記栄養液が、フラクトース及びマンノースを含む、培養方法、
（２）前記栄養液が、ガラクトースをさらに含む、前記（１）に記載の培養方法、
（３）前記栄養液が、熱失活させたウシ胎児血清をさらに含む、前記（１）又は（２）に記載の培養方法、
（４）前記生物が、哺乳類である、前記（１）ないし（３）のうち何れか一に記載の培養方法、
（５）前記哺乳類が、ヒト、イヌ、ブタ、ネコ又はマウスである、前記（４）に記載の培養方法、
（６）生物の単球株化細胞培養のための栄養液であって、フラクトース及びマンノースを含む栄養液、
（７）前記栄養液が、ガラクトースをさらに含む、前記（６）に記載の栄養液、
（８）前記栄養液が、熱失活させたウシ胎児血清をさらに含む、前記（６）又は（７）に記載の栄養液、
（９）前記生物が、哺乳類である、前記（６）ないし（８）のうち何れか一に記載の栄養液、
（１０）前記哺乳類が、ヒト、イヌ、ブタ、ネコ又はマウスである、前記（９）に記載の栄養液等、
を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、生体由来単球株化細胞の培養方法およびその培養に利用される栄養液が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
次に、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない、本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することできる。
【００１０】
本発明に係る培養方法は、特定の栄養液を用いる単球株化細胞に係るものである。具体的には、本発明に係る培養方法は、ヒトに限定されず、イヌ、ブタ、ネコ、又はマウス等の哺乳類を含む生物の単球株化細胞の培養利用できる方法である。とりわけ、本発明に係る栄養液は、フラクトース、マンノースを含むものであり、また、ガラクトースをさらに含むことが好ましい。
【００１１】
本発明に係る栄養液では、後述する溶媒１リットル中におけるフラクトースの添加量を、８００〜１２００ｍｇ、好ましくは９００〜１１００ｍｇ、より好ましくは９５０〜１０５０ｍｇである、フラクトースの添加量が、溶媒１リットル中において、８００ｍｇ以下若しくは１２００ｍｇ以下では、単球株価細胞の培養に適さない。
また、本発明に係る栄養液では、後述する溶媒１リットル中におけるマンノースの添加量を、４００〜６００ｍｇ、好ましくは４５０〜５５０ｍｇ、より好ましくは４８０〜５２０ｍｇである、フラクトースの添加量が、溶媒１リットル中において、４００ｍｇ以下若しくは６００ｍｇ以下では、単球株価細胞の培養に適さない。
さらに、本発明に係る栄養液では、後述する溶媒１リットル中におけるガラクトースの添加量を、８００〜１２００ｍｇ、好ましくは９００〜１１００ｍｇ、より好ましくは９５０〜１０５０ｍｇである、フラクトースの添加量が、溶媒１リットル中において、８００ｍｇ以下若しくは１２００ｍｇ以下では、単球株価細胞の培養に適さない。４００〜６００ｍｇ、好ましくは４５０〜５５０ｍｇ、より好ましくは４８０〜５２０ｍｇである、フラクトースの添加量が、溶媒１リットル中において、４００ｍｇ以下若しくは６００ｍｇ以下では、単球株価細胞の培養に適さない。
なお、本発明に係る栄養液は、熱失活されたウシ胎児血清を、溶媒１リットルに対して、１０〜２０％の割合で、さらに添加させることが、培養の観点から好ましい。
【００１２】
くわえて、前記栄養液は、無機塩、アミノ酸やビタミン類、さらには抗生物質等の他の添加剤を含んでもよい。具体的な添加剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、重炭酸ナトリウム、硝酸第一鉄・９水和物、硝酸第一鉄・６水和物、硫酸銅、・５水和物、硫酸亜鉛・６水和物、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、コハク酸、コハク酸ナトリウム、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン塩酸塩、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒドロシキプロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−バリン、グルタチオン、ｐ−アミノ安息香酸、ビオチン、コリン二酒石酸、葉酸、ｉ−イノシトール、パントテン酸カルシウム、ニコチンアミド、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキシン塩酸塩、チアミン塩酸塩、リボフラビン、ヒポキサンチン、シアノコバラミン、プトレッシン、フェノールレッド、ゲンタマイシンスルフェート、カナマイシンスルフェート、ペニシリンＧカルシウム、ストレプトマイシンスルフェート等が挙げられる。
なお、本発明に係る栄養液を構成する溶媒は、脱イオン化し、２回蒸留後に、オートクレープ処理した水であることが好ましい。そして、栄養液の無菌化は、メンブレムフィルター処理により行われる。
【００１３】
出発材料として、本発明に利用する生物の単球細胞は、健常な成人の上皮細胞系に由来するものであるが、必要に応じて、血液単球由来の単球株化細胞を起源とするものも利用できる。
【００１４】
得られた単球株化細胞の継代培養し、特に増殖性の優れた系統を選別して、その基本的な細胞学的性状を検査した。検査対象項目としては、核型分析、細胞化学、貧食能やレセプターマーカ等の検査を行った。
【００１５】
[実施例]
以下では、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１６】
まず、実験に供する生物材料として、血液材料からの単球細胞、具体的には、ヒト由来単球細胞について説明する。健常な成人（男性６３歳、血液型ＡＲｈ−）を出発材料とし、後述する細胞培養法によりヒト単球株化細胞を樹立させた。
本発明者は、種々の研究結果から、図１に示す組成の栄養液を考案し、脱イオン化水を用い、２００ｎｍの細孔のメンブレムフィルタにより無菌化した。そして、この栄養液に熱失活させたウシ胎児血清を１０〜２０％添加したものを、本発明に係る細胞増殖用栄養液(以下「ＧＭ」と称する。)として利用した。
【００１７】
初代単球細胞培養は、次のように行った。すなわち、ヒトの採取直後の約３０ｍｌの血液にヘパリンを添加し、二価の陽イオン不含有の冷ダベルッコリン酸緩衝化生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という。）で希釈した。このようにして得られた血液を、等量の比重液（ρ＝１．０７７ｇ/ｍｌ）の上に、上澄部を静かに重層し、遠心分離（８００ｘｇ  １５分）に供したところ、遠心管のほぼ中央にリンパ細胞と単球からなるバンドが形成された。このバンドを、前述のＧＭにて懸濁させ、遠心分離を繰り返した。その後、１ｍｌ当たりの細胞が約２００万個となるように、１０ｍｌずつ、再度ＧＭ中にて懸濁させ、ガラス製の細胞培養フラスコ（培養面積：３２ｃｍ2）にて分配し、３６．５℃にて静止培養した。接着性細胞のみを入手するため、２０時間培養後、少なくとも１日２回、半分量のＧＭをリフレッシュした。２週間後、数多の接着性クローン細胞の成長が確認された。そして、ＧＭのｐＨを略中性に維持することに特に留意し、重炭酸ナトリウムを少量ずつ添加しながら、ＧＭのｐＨを略中性に保持した。その際、別途に７．５％の重炭酸ナトリウムのストック溶液を準備し、１００ｍｌのＧＭ当たり、２．０〜２．５ｍｌの割合で添加した。実際には、前記ストック溶液の半分以下の量を初代培養に添加した。クローン細胞が十分な大きさに成長し、約３週間の培養で見かけ上安定に成長した。その細胞を、常法により、ＥＤＴＡ−トリプシン溶液（０．０５％のＥＤＴＡと細胞培養グレードのＰＢＳ中のト０．０２５％のトリプシン）処理により分散させた。その分散細胞をＧＭ中で再懸濁させて、１ｍｌ当たり約５〜６細胞になるように細胞数を調整し、１穴、２５０μｌを有する９６穴のマイクロプレート（Flow laboratories Inc社製）にて分散し、薄ポリ塩化ビニルフィルム（旭化成製）で被い、培養した。クローン細胞の成長を、毎日、顕微鏡にて観察した。このようにしてクローン細胞を樹立した。そのクローン細胞のうち、特に増殖性の優れた系を「Ｋ６３」と命名し、前述のＧＭを用いて、少なくとも２６代までは継代培養に成功した。そして、後述する単球細胞の基本的な細胞学的性状の研究に供した。
なお、１０ｍｌのＧＭを含むフラスコに、Ｋ６３の細胞を約１００万個播種すると、３〜４日の培養で、８〜９倍の成長が規則的に観測された。また、各継代における生存率をトリパンブリー排除試験により検査し、９５％以上のコロニー形成率が確保された。
【００１８】
図２は、本発明によるＫ６３細胞の集密的細胞単層を、メタノール固定し、ギムザ染色法にて染色したものを示す図である。図２に示す結果から、Ｋ６３細胞は接触素子によって単層以上に増殖していない性質を有する正常細胞であることが分かる。
【００１９】
図３は、１０％のＦＣＳ（fetal calf serumの略であって、ウシ胎児血清を指す。）６．５℃で静止培養させた結果を示す図である。具体的には、１ｍｌ当たりの細胞が１００，０００個となるように、１ｍｌずつ、１０％のＦＣＳを含有するＧＭ中にて懸濁させ、ガラス製の細胞培養フラスコ（培養面積：３２ｃｍ2）にて分配し、３６．５℃にて静止培養した。図３に示す結果から明らかなように、静止培養４日後には、単位ｍｌ当たり約９ｘ１０4個数の細胞が成長したことが分かる。
【００２０】
以下、既出の「Ｋ６３」の単球株化細胞の各種の細胞学的性質を検討した。
[核型分析]
１２代及び２４代と継代培養させたＫ６３の単球株化細胞に、少量のコルヒチンを添加することにより、染色体研究を実施した。各時点の核型分析では、４６（２ｎ）ヒト、男性の性状で、ほぼ２倍体の細胞であることが確認された。
【００２１】
[細胞学的形態]
単一クローン細胞の大多数は、三角形の形態を有し、代数を重ねた継代培養後の単層の細胞は、上皮様形態を示し、極めて接着性の高い細胞であった。
【００２２】
[細胞化学]
市販されているキット（Muto pharm製）を利用して、Ｋ６３細胞が、非特異的エステラーゼ陽性細胞であることが判明した。図４は、細胞化学反応により得られた、Ｋ６３が非特異的エステラーゼ陽性細胞であることを示す結果である。そして、Ｋ６３が非特異的エステラーゼ陽性細胞であることから、Ｋ６３が単球細胞であることが支持された。
【００２３】
[貧食能]
ＦＣＳ添加のＧＭで増殖させてＫ６３細胞は貧食能を示さないが、ドナー非加熱血清と大腸菌内毒素添加により活性化した細胞には、Saccharomyces cerevisiae（以下「ＳＣ」という。）に対して、顕著な貧食能が認められた。
【００２４】
図５は、活性化されたＫ６３細胞によるＳＣの食作用の結果を示す。なお、図５に示す結果は、アセトン固定し、ギムザ染色法にて染色したものを示す。なお、白黒表示の図５において、黒色に表示された部分は、実際には赤紫色である。
【００２５】
[レセプターマーカ]
タンニン酸処理した固定山羊赤血球に、モルモット補体あるいはヒトＩｇＧを吸着されたものを用いて、各レセプターのＫ６３細胞への接着性から、各リガンドに対するＫ６３のレセプターの有無を判定した。
【００２６】
図６は、山羊赤血球にモルモット補体を吸着させた細胞膜に補体レセプターが発現していることを示す図である。
図７は、山羊赤血球にモルモット補体を吸着させた細胞膜に、ＩｇＧレセプターは発現していることを示す図である。なお、図６及び図７では、メタノール固定し、ギムザ染色法にて染色した結果を示し、白黒表示の図６及び図７における黒表示は、実際には青紫色である。
図６及び図７に示す結果から、Ｋ６３細胞膜には、補体レセプター及びＩｇＧレセプターが存在していることが判明した。
【００２７】
以上の結果から、Ｋ６３細胞は、ヒト単球株化細胞であると同定された。
【００２８】
次に、ネコにおける初代単球細胞培養を、以下のように行った。すなわち、レトロウイルス及びコロナウイルス感染に対して血清学的に陰性な２歳令のオスネコの採取直後の約１０ｍｌの血液にヘパリンを添加し、約２０ｍｌの冷ＰＢＳで希釈した。このようにして得られた血液を、LymphoprepTM (ρ＝１．０７７ｇ/ｍｌ,ノルウェー国、Nycomed parma社製）の上に、上澄部を静かに重層し、遠心分離（８００ｘｇ  １５分）に供したところ、遠心管のほぼ中央にリンパ細胞と単球からなるバンドが形成された。このバンドを、前述のＧＭにて懸濁させ、遠心分離を繰り返した。その後、１ｍｌ当たりの細胞が約２００万個となるように、１０ｍｌずつ、再度ＧＭ中にて懸濁させ、ガラス製の細胞培養フラスコ（培養面積：３２ｃｍ2）にて分配し、３６．５℃にて静止培養した。接着性細胞のみを入手するため、２０時間培養後、少なくとも１日２回、半分量のＧＭをリフレッシュした。２週間後、数多の接着性クローン細胞の成長が確認された。そして、ＧＭのｐＨを略中性に維持することに特に留意し、重炭酸ナトリウムを少量ずつ添加しながら、ＧＭのｐＨを略中性に保持した。その際、別途に７．５％の重炭酸ナトリウムのストック溶液を準備し、１００ｍｌのＧＭ当たり、２．０〜２．５ｍｌの割合で添加した。実際には、前記ストック溶液の半分以下の量を初代培養に添加した。クローン細胞が十分な大きさに成長し、約３週間の培養で見かけ上安定に成長した。その細胞を、常法により、ＥＤＴＡ−トリプシン溶液（０．０５％のＥＤＴＡと細胞培養グレードのＰＢＳ中のト０．０２５％のトリプシン）処理により分散させた。その分散細胞をＧＭ中で再懸濁させて、１ｍｌ当たり約５〜６細胞になるように細胞数を調整し、１穴、２５０μｌを有する９６穴のマイクロプレート（Flow laboratories Inc社製）にて分散し、薄ポリ塩化ビニルフィルム（旭化成製）で被い、培養した。クローン細胞の成長を、毎日、顕微鏡にて観察した。このようにしてクローン細胞を樹立した。そのクローン細胞のうち、特に増殖性の優れた系を「ＦＬ・Ｋ０２」と命名し、前述のＧＭを用いて、少なくとも１４代までは継代培養に成功した。そして、前述の単球細胞の基本的な細胞学的性状の研究に供したところ、ネコ単球細胞であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、本発明に係る培養方法に用いられる栄養液の組成を示す。
【図２】図２は、本発明によるＫ６３細胞の集密的細胞単層を、メタノール固定し、ギムザ染色法にて染色したものを示す。なお、図２中のバーは、５０μｍの長さを示す。
【図３】図３は、本発明において、１０％のＦＣＳを含有するＧＭ中におけるＫ６３細胞を、３６．５℃で静止培養させた結果を示す。
【図４】図４は、本発明において、細胞化学反応により得られた、Ｋ６３細胞が非特異的エステラーゼ陽性細胞である結果を示す。なお、図４中のバーは、５０μｍの長さを示す。
【図５】図５は、本発明において、活性化されたＫ６３細胞によるＳＣの食作用の結果を示す。なお、図５中のバーは、５０μｍの長さを示す。
【図６】図６は、本発明において、山羊赤血球にモルモット補体を吸着させた細胞膜に補体レセプターが発現していることを示す。なお、図６中のバーは、５０μｍの長さを示す。
【図７】図７は、本発明において、山羊赤血球にモルモット補体を吸着させた細胞膜にＩｇＧレセプターが発現していることを示す。なお、図７中のバーは、５０μｍの長さを示す。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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