(57)【要約】【課題】成体哺乳動物の精巣において非常に確定度高くＡ型（未分化型）精祖細胞を同定し、分離回収する方法を提供する。【解決手段】ｃ−Ｋｉｔ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｎｏｔｃｈ−３、ＶＬＡ−６及びＲｅｔからなる群より選択されるマーカータンパク質に特異的親和性を有する１種又は２種以上の抗体を用いる。前記抗体は、少なくとも抗ｃ−Ｋｉｔ抗体及び抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体の何れか又は両方を含むことが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃ−Ｋｉｔ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｎｏｔｃｈ−３、ＶＬＡ−６及びＲｅｔからなる群より選択されるマーカータンパク質に特異的親和性を有する１種又は２種以上の抗体を用いて哺乳動物の精巣組織に於けるＡ型（未分化型）精祖細胞を同定する方法。
【請求項２】
前記抗体は、少なくとも抗ｃ−Ｋｉｔ抗体及び抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体の何れか又は両方を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｃ−Ｋｉｔ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｎｏｔｃｈ−３、ＶＬＡ−６及びＲｅｔからなる群より選択されるマーカータンパク質に特異的親和性を有する１種又は２種以上の抗体を用いて哺乳動物の精巣組織に於けるＡ型（未分化型）精祖細胞を分離及び／又は回収する方法。
【請求項４】
前記哺乳動物がヒトである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の方法により精巣組織から分離及び／又は回収されたＡ型（未分化型）精祖細胞。
【請求項６】
細胞のマーカータンパク質が、ｃ−Ｋｉｔ−、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋、Ｅｐ−ＣＡＭ＋、Ｎｏｔｃｈ−３＋、ＶＬＡ−６＋及びＲｅｔ＋からなる群より選択される少なくとも１つの発現様式を示す請求項５に記載のＡ型（未分化型）精祖細胞。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のＡ型（未分化型）精祖細胞、又は当該細胞から分化した細胞を含む不妊症の診断及び／又は治療用医薬組成物。
【請求項８】
Ａ型（未分化型）精祖細胞と候補物質とを接触させること、及び前記細胞についてｃ−Ｋｉｔ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｎｏｔｃｈ−３、ＶＬＡ−６及びＲｅｔからなる群より選択される１種又は２種以上のマーカータンパク質の発現を測定することを含む哺乳動物の精祖細胞の分化を誘導する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物のＡ型（未分化型）精祖細胞の同定、分離及び／又は回収する方法、ならびに当該細胞の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物では神経組織など一部を除いて、常時古い細胞が新しい細胞に置き換わっている。また、傷害や疾患などに伴い細胞・臓器に損傷が起こった場合、急速な修復が行われる。このような場合、当該組織に備わる幹細胞が大きな役割を果している。そこで幹細胞は再生医療の中心的素材として注目されている。幹細胞はある段階まで分化した状態で組織中に止まっており、自己を再生産する性質と機能を有する細胞に分化する性質の両方を持っている。幹細胞には、多くの種類の細胞に分化する大きな可塑性を有しているものと、皮膚、血球や筋など既に決定された特定の組織の細胞に分化するものが知られている。従って、幹細胞は上記の共通の性質と、組織によって異なる特徴を備えている。ここでは特に雄性生殖細胞、精子の幹細胞を含むＡ型（未分化型）精祖細胞について扱う。精子は常時大量に作られているのでその元となる精祖幹細胞及び此を含むＡ型（未分化型）精祖細胞は重要であり、その性状解析は不妊症の原因解明や治療などにとって必須である。精祖細胞には（Ａ型→中間型→Ｂ型などと）複数の分化段階を経ることが知られている。そしてＡ型（未分化型）精祖細胞の中に一番元になる精祖幹細胞が含まれていると考えられている。しかし詳細の大部分はまだ未解明である。この細胞の性質を解析し利用するためにはまずＡ型（未分化型）精祖細胞の正確な同定と分取が必要である。
【０００３】
哺乳動物に於けるＡ型（未分化型）精祖細胞は、精細管の内側最外周に存在する精祖細胞のうち核内が均質でヘテロクロマチンを含まないこと、クラスターを形成することなどが知られており、その性状解析は部分的に報告されている（非特許文献１、２）。しかし、その正確な同定、分取の成功例はない。また、体外での培養・分化誘導の例も報告されていない。
【０００４】
精祖細胞に含まれる精子の幹細胞の分化成熟過程は幾段階も経る複雑な過程であり、その中でも元になるＡ型（未分化型）精祖細胞の同定は未だ確立されていない。例えば、Ｅｐ−ＣＡＭ＋が精祖細胞で発現しているとの報告がある（非特許文献３）一方、幹細胞や幼若な細胞のマーカーとされているｃ−Ｋｉｔ抗原はＡ型（未分化型）精祖細胞では発現していない（非特許文献４）とする報告もある。我々も精祖細胞でＮｏｔｃｈ３が活性化していることを報告した（非特許文献５）。一方Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗原の発現については組織化学的に生後８日マウスの精細管では確認されたが（非特許文献６）、それ以後の発現について組織化学的には確認されていない。ＲＴ−ＰＣＲによる解析でも２１日齢以後は検出不能で否定的である（非特許文献７）。また、幹細胞のマーカーであるＲｅｔ陽性細胞がＡ型（未分化型）精祖細胞に含まれている可能性もある（非特許文献８）。
【０００５】
【非特許文献１】Oakberg、EF., Anat. Rec. (1971), 169, 515-532.
【非特許文献２】de Rooji, DG., Russell, LD., J. Androl. (2000) 21, 776-798.
【非特許文献３】Anderson, R.,外２名、J. Reprod. Fertil. (1999) 116, 379-384.
【非特許文献４】Yoshinaga, K., 外６名、Development (1991), 113、 689-699.
【非特許文献５】Mori, S. 外３名、Devlop. Growth & Differ. (2003), 45、7-13.
【非特許文献６】Wu、 J.,外２名、Biol. Reprod. (1993), 49、 1353-1361.
【非特許文献７】Munro, S., & Blashuk, OW. Biol. Reprod. (1993), 55, 822-827.
【非特許文献８】Meng, X., 外１３名、Science (2000), 287,1489-1493.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上のように、報告された何れの従来技術においても未だ十分にＡ型（未分化型）精祖細胞を同定し分離することができない。また、他の組織の幹細胞についてもそのマーカータンパク質は、各組織によって異なっており、それらも未だ十分には明らかにされていない。それ故、効率よく幹細胞、とりわけＡ型精祖細胞を分離できるマーカータンパク質の発見が望まれている。
【０００７】
かかる状況下において、本発明は、従来の技術上の問題点を解決し、哺乳動物の精巣におけるＡ型（未分化型）精祖細胞を同定し、効率よく分離・回収する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
精細管基底膜上のＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋かつｃ−Ｋｉｔ−の細胞はＡ型（未分化型）精祖細胞を含む
そこで発明者らは上記目的の為に鋭意かつ慎重に研究を重ねた。成体の精細管基底膜上の細胞は大部分ＶＬＡ−６＋、Ｎｏｔｃｈ３＋、及びＥｐ−ＣＡＭ＋であるが、この中に此まで見逃されてきたＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋（且つｃ−Ｋｉｔ−）の細胞が僅かながら含まれており、それらの８割以上は単独または２、４、８、１６個の細胞によるクラスターを形成していることなどを発見した。このクラスター分画がＡ型（未分化型）精祖細胞である可能性が強く、さらにこのクラスター分画の中にＲｅｔ陽性の細胞が含まれていることも確認した。これらの結果により精細管基底膜上細胞からＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎを含む上記マーカーを１種又は２種以上組み合わせることで、Ａ型（未分化型）精祖細胞の同定、分離の可能性を飛躍的に向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、哺乳動物の精巣組織に於けるＡ型（未分化型）精祖細胞を同定、分離及び／又は回収する方法であって、ｃ−Ｋｉｔ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｎｏｔｃｈ−３、ＶＬＡ−６及びＲｅｔからなる群より選択されるマーカータンパク質に特異的親和性を有する１種又は２種以上の抗体を用いることを特徴とする。好ましい実施形態において、上記抗体には、少なくとも抗ｃ−Ｋｉｔ抗体及び抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体の何れか又は両方が含まれる。
【００１０】
異なる観点において、本発明は上記方法により精巣組織から分離及び／又は回収されたＡ型（未分化型）精祖細胞、及びそれを含む不妊症の診断及び／又は治療用医薬組成物を提供することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、哺乳動物の精巣にあるＡ型（未分化型）精祖細胞を従来の技術に比べて、効率よく同定し、分離及び回収することが可能となった。以上より、本発明は、不妊症の原因解明やその治療の分野に於いて大きく貢献できるものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において、「哺乳動物」とは、ヒトをはじめとする霊長類の他、ウシ、ウマ、イヌ、モルモット、マウス、ラット等を含む。
【００１３】
ｃ−Ｋｉｔタンパク質は、stem cell factor(幹細胞因子)に対する受容体でチロシンキナーゼ活性を有し、プロトオンコジーン産物でもある。Ｒｅｔタンパク質はGDNF(glial cell line-derived neurotrophic factor) の受容体で、カドヘリンモチーフを有し細胞膜に存在する。Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎは大きなカドヘリンファミリーのメンバーの１つである。細胞間接着に最も重要な働きをしているカルシウム依存性の接着分子である。Ｅｐ−ＣＡＭは同種親和性の接着タンパク質の１つであり、生殖系列の発生段階で重要な役割を果たすことが知られている。Ｎｏｔｃｈ−３は哺乳動物で４種存在するＮｏｔｃｈファミリーの１つである。細胞膜結合型の受容体分子であり、同じく膜結合型のリガンドであるDeltaやJaggedなどのシグナルを核に伝え、幹細胞の維持や分化の調節に関わっている。ＶＬＡ−６はα６−インテグリンとβ１−インテグリンより構成される２量体で細胞膜に存在し、ラミニンの特異的な受容体として細胞外マトリクスからのシグナルを細胞内へ伝える。本明細書において、「マーカータンパク質」とは、このような細胞表面に発現するタンパク質であって、精巣組織において特徴的な発現様式を示すものである。これらのマーカータンパク質に「特異的親和性を有する」とは、抗原抗体反応によりこれらのタンパク質を特異的に認識し、結合する能力のことである。「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、又はそれらの機能的断片の何れを用いてもよい。これらの抗体又はその断片は、蛍光物質、酵素、又は放射性同位元素等で標識されていてもよい。さらに、これらは市販されているものを用いることができ、例えば、Chemicon International、 UK-Serotec、 Santa Cruz Biotech、 Developmental Studies Hybridoma Bank(University Iowa)、 R &Dsystems、及びタカラバイオ社等から入手することが可能である。
【００１４】
本発明のＡ型（未分化型）精祖細胞の同定、分離及び／又は回収方法は、上記６つのマーカータンパク質に特異的に親和性を有する夫々の抗体のうち、少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を組み合わせて、マーカータンパク質の発現を調べることにより行われる。このようなマーカータンパク質の発現様式のうち、ｃ−Ｋｉｔ非発現（ｃ−Ｋｉｔ−）、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ発現（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋）、Ｅｐ−ＣＡＭ発現（Ｅｐ−ＣＡＭ＋）、Ｎｏｔｃｈ−３発現（Ｎｏｔｃｈ−３＋）、ＶＬＡ−６発現（ＶＬＡ−６＋）及びＲｅｔ発現（Ｒｅｔ＋）なる特徴のうち少なくとも１つ、好ましくは２つ以上を満たす細胞をＡ型（未分化型）精祖細胞として同定、分離及び／又は回収することができる。
【００１５】
上記マーカータンパク質に対して特異的親和性を有する抗体を用いて、夫々のマーカータンパク質の発現様式を示す細胞を分離／回収する方法は、当該分野で行われている方法及びそれらを組み合わせた方法が用いられる。例えば、後述する実施例で記載した抗体結合ビーズを用いる方法や、パニング法、あるいはスケールアップする場合にはセルソーター等を利用することができる。例えば、抗体を適当な色素や蛍光物質で標識して蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いることにより目的とする細胞を自動で分離、回収する。抗体の標識には蛍光標識二次抗体を用いてもよい。
【００１６】
本発明においては、このような方法で同定、及び分離されたＡ型（未分化型）精祖細胞の生体内外での増殖や成熟過程の解析を通してどの様な因子や環境が精祖細胞の増殖や分化に必要であるかを解析することができる。また、本発明によれば、Ａ型（未分化型）精祖細胞を生存状態で選択的に、且つ高効率で得ることができるので、癌などの重篤な疾患や傷害に遭遇し全身の治療を必要とする場合に一時期Ａ型（未分化型）精祖細胞を採取し体外に保存する方法の開発をして臨床的に利用することが可能となる。すなわち、本発明の方法で分離、回収したＡ型（未分化型）精祖細胞、又はこれより分化誘導した細胞を用いて不妊症の診断や治療に用いることができる。これらの細胞は、培地等の水性媒体に浮遊させた状態で、あるいは滅菌水や緩衝化生理食塩水等の薬学的に許容可能な担体や希釈液中に混合した注射可能な調製物の形態でありうる。上記担体の他に実質的に無毒の賦形剤や助剤、安定化剤などの添加物を配合することも可能である。上記成分を含む医薬組成物は、必要に応じてろ過等の方法により滅菌し、無菌アンプルの容器に満たすことができる。また、その他の使用に適した剤形でありうる。なお、本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減して用いる必要があるが、当業者であれば、必要な量を適宜設定することが可能である。
【００１７】
さらに本発明は、本発明の方法により分離、回収されたＡ型（未分化型）精祖細胞を用いて、哺乳動物の分化を誘導する物質のスクリーニング方法を提供する。当該方法は、少なくとも以下の工程を含む。
（ａ）Ａ型（未分化型）精祖細胞と候補物質とを接触させる工程、
（ｂ）前記候補物質と接触させた細胞についてｃ−Ｋｉｔ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｎｏｔｃｈ−３、ＶＬＡ−６及びＲｅｔからなる群より選択される１種又は２種以上のマーカータンパク質の発現を測定する工程。
上記「接触させる」とは、Ａ型（未分化型）精祖細胞と候補物質とが相互作用しうるような条件であれば特に限定されないが、例えば、上記細胞の培養液に候補化合物を添加し、３３〜３７℃、数分〜数十日間CO2孵卵器中で培養する。Ａ型（未分化型）精祖細胞が分化したか否かは、上記マーカータンパク質の発現を測定することにより確認することができる。あるいは、その他適当なマーカータンパク質を用いてもよい。本発明のスクリーニング方法において用いられる候補物質は、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアルケミストリー技術、又は通常の合成技術によって得られた化合物群、あるいは、ファージディスプレイ法を応用して作成されたランダムペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然物質又は動物組織抽出物などもスクリーニングの候補物質として用いることができる。さらには、本発明のスクリーニング方法により得られた物質を化学的又は生物学的に修飾した化合物も用いることができる。
【００１８】
次に本発明を詳細に説明する為に具体的且つ詳細な実施例を挙げるが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
ＶＬＡ−６＋でＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋かつｃ−Ｋｉｔ−のＡ型（未分化型）精祖細胞
８週齢のＩＣＲマウスの精細管の内側最外周には基底膜に密着していてＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋、ｃ−Ｋｉｔ−かつＶＬＡ−６＋の性質を示す細胞が少数存在することを発見した（図１、２、３）。抗α６−ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体や、抗β１−ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体に対しては陽性反応を示した（図３a, b）が、項ｃ−Ｋｉｔ抗体に対しては陰性（図３ｃ）であった。この細胞は核内にヘテロクロマチンを含まないこと（図２）や、細胞の形態学的特徴からこれまで記載されてきたＡ型（未分化型）精祖細胞である可能性が強く示唆された。
【００２０】
なおこの際用いた免疫組織化学的方法は通常の方法である。即ち、マウスをジエチルエーテルで麻酔後、１０％メタノールを含む１０％中性緩衝ホルマリン液で潅流固定、１０〜１８％蔗糖液に浸漬、液体窒素中で包埋、クリオスタットにて薄切したサンプルを用いた。
【実施例２】
【００２１】
成熟過程に於ける解析
Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋細胞をマウスの成熟段階を追って経時的に観察した結果、Ａ型（未分化型）精祖細胞の予想される動態と一致した。即ち、生後直後（１日齢）の精細管中央に位置するｇｏｎｏｃｙｔｅの段階、周囲に移動を開始した４日齢、精細管の基底膜に接着した７日齢の全てはＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性を示した（図４−ａ、ｂ、ｃ）。減数分裂の開始する生後２週齢では基底膜上の一部の細胞はＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陰性となり、４、８週齢と陽性細胞が徐々に減少し４８０日齢では精細管断面あたり約１〜２個の陽性細胞が検出されるのみとなった（図４−ｄ、ｅ、ｆ、ｇ）。なおこの間基底膜上に位置する精祖細胞母集団は全てＥｐ−ＣＡＭ陽性であり、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋やＲｅｔ＋の細胞の割合が減少した。
【実施例３】
【００２２】
ミュータントを用いた解析
Steel factor(stem cell factor)の受容体であるｃ−Ｋｉｔのミュータント、Ｗ／Ｗｖやsteel factorの遺伝子座の変異体、Ｓｌ／Ｓｌｄマウスではｃ−Ｋｉｔの機能不全により未分化型精祖細胞の段階で成熟過程が停止することが知られている。これらの両系統の８週齢（成体）のマウスではすべての精細管内の生殖細胞が、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性を示した（図５−ａ、ｂ）。
【実施例４】
【００２３】
Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞の分離と移植
８週齢（成体）マウスの精細管内のＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞（それは以下の実施例５で述べるように、Ａ型（未分化型）精祖細胞と一致するが）に精祖幹細胞が含まれていることを確認する為にＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞を分離し、移植実験を行った。ホストとしてsteel factorは正常に合成出来るが、その受容体に欠陥のあるｃ−Ｋｉｔミュータントマウス（Ｗ／Ｗｖ）を用い、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞としてＧＦＰを発現しているｃ−Ｋｉｔ正常のマウスから抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体結合磁気ビーズを用いて調製した。約１〜４ｘ１０４細胞／精巣の割合でＷ／Ｗｖマウスに移植した。移植８週間後に精巣内のＧＦＰ陽性コロニー数を計測した。対照として同数のＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陰性細胞を反対側の精巣に移植した。結果は、ＧＦＰ陽性Ａ型（未分化型）精祖細胞を移植した全ての精巣においてコロニーが観察され、対照の移植精巣では全く検出されなかった（図６−ａ、ｂ及び表１）。なお、ここで得られたコロニー形成率はこれまで報告されている最高率（Shinohara、 T. 外２名、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 (1999)、 96、 5504-5509参照）の１０倍以上であった。
【００２４】
【表１】
2007129991.tif 000002
【実施例５】
【００２５】
Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞は精細管基底膜上でクラスターを形成
８週齢（成体）マウス精細管内のＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞の存在状態を調べる目的で精細管ホールマウント法による免疫組織化学実験を行った。他の表面抗原との関係も明らかにするために抗ｃ−Ｋｉｔ抗体との二重染色を行った。Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞はｃ−Ｋｉｔ陰性であること及び細胞の突起を介して隣接の陽性細胞とクラスター状に接続していることが示された（図７）。また抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体との二重染色を行ったところ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞はＥｐ−ＣＡＭ陽性であり、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞の大半は単独または２、４、８、１６個の細胞のクラスターを形成していた（図８）。また、抗ｃ−Ｒｅｔ抗体との二重染色を行ったところ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞の内約２割はｃ−Ｒｅｔ陽性であった。この存在状態は、成体精細管のＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞がＡ型（未分化型）精祖細胞とほぼ一致し、さらにこの中にＲｅｔ陽性の精祖幹細胞を含んでいることを示唆している。
【００２６】
以上のように本発明で明らかにしたＥｐ−ＣＡＭ陽性細胞のうちＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性（且つｃ−Ｋｉｔ陰性）細胞はＡ型（未分化型）精祖細胞とほぼ一致するので、この方法はこの細胞の同定と分離、回収に極めて有用であり、今後のＡ型（未分化型）精祖細胞や他の幹細胞の研究にも大きく貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例１で作成した８週齢のＩＣＲマウスの精巣の抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体による染色。Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ＋細胞（矢印）は精細管内側の基底膜上にのみ密着して僅かに存在する。白線は１０μｍ。
【図２】実施例１で作成した８週齢のＩＣＲマウスの精巣の抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体（ａ）とＤＡＰＩ（ｂ）による染色及び両者の二重染色（ｃ）。Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞の核（ｂの中央）は楕円形でヘテロクロマチンがない。矢印はＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陰性細胞、矢頭は精母細胞を示す。白線は１０μｍ。
【図３】実施例１で作成した８週齢のＩＣＲマウスの精細管の抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体とＶＬＡ−６のｓｕｂｕｎｉｔ、α６−ｉｎｔｅｇｒｉｎ（ａ）、β１−ｉｎｔｅｇｒｉｎ（ｂ）またはｃ−Ｋｉｔ（ｃ）抗体による二重染色。ａ、ｂ、ｃ共に左図はＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（緑）、中央図は各抗体、右図は二重染色像。白線は１０μｍ。
【図４】実施例２で作成した正常マウスの発生過程における精巣の抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体による染色。１日齢（ａ）、４日齢（ｂ）、７日齢（ｃ）、２週齢（ｄ）、４週齢（ｅ）、８週齢（ｆ）、４８０日齢（ｇ）。白線は１０μｍ。
【図５】実施例３で作成したミュータントマウス、Ｓｌ／Ｓｌｄ（ａ）とＷ／Ｗｖ（ｂ）の精巣の抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体による染色。白線は１０μｍ。
【図６】実施例４で行った精細管内のＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞の移植実験。８週齢のＷ／Ｗｖマウスの精巣にＧＦＰマウスの精巣から分離採取したＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞（ａ）または陰性細胞（ｂ）を移植し、８週後の精巣を蛍光実態顕微鏡下に撮影した。精巣内にＧＦＰ陽性のコロニーが多数観察された。Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陰性細胞の移植ではコロニーが形成されなかった。白線は１０μｍ。
【図７】実施例５で示した８週齢のＩＣＲマウス精細管におけるＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｃ−Ｋｉｔに対するホールマウント染色。Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（ａ、緑）、ｃ−Ｋｉｔ（ｂ、赤）、二重染色（ｃ）、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞が１、２、８個のクラスターを形成し、ｃ−Ｋｉｔ陰性である。白線は１０μｍ。
【図８】実施例５で示した８週齢のＩＣＲマウス精細管におけるＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅｐ−ＣＡＭに対するホールマウント染色。Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（ａ、緑）、Ｅｐ−ＣＡＭ（ｂ、赤）、二重染色（ｃ）、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞はクラスターを形成し、全てＥｐ−ＣＡＭ陽性である。白線は１０μｍ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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