(57)【要約】【課題】  光学顕微鏡下において、角層細胞の疎水領域を選択的に染色し、角層細胞の疎水性−親水性を鑑別する技術を提供することを課題とする。【解決手段】  皮膚より採取した角層細胞をズダンブラックＢの色素を含む、エタノールを３０〜５０質量％を含有する染色液で外界接触部分方向から染色し、光学顕微鏡下において、角層細胞の疎水性−親水性を鑑別することを特徴とする、角層細胞の鑑別法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肌の鑑別法であって、皮膚より採取した角層細胞をズダンブラックＢの色素で、外界接触部分方向から染色し、該色素で染色した光学顕微鏡によって角層細胞の疎水性−親水性を鑑別することを特徴とする、角層細胞の鑑別法。
【請求項２】
前記ズダンブラックＢの染色液において、該染色液中にエタノールを３０〜５０質量％を含有することを特徴とする、請求項１に記載の角層細胞の鑑別法。
【請求項３】
次に示す工程に従って行われることを特徴とする、請求項１又は２に記載の角層細胞の鑑別法。
（工程１）粘着テープを用いて、皮膚より角層細胞を採取する。
（工程２）前記粘着テープの粘着剤は有機溶剤により軟化・溶解させ、角層細胞をスライドグラス上に転写させて、角層細胞標本を作製する。
（工程３）該角層細胞標本をエタノール水溶液（約４０質量％）で馴染ませた後、室温にてズダンブラックＢ染色液中に２４〜４８時間放置して染色を行う。
（工程４）染色された角層細胞標本をエタノール水溶液で洗浄風乾後、バルサムに封入して光学顕微鏡下で鑑別を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の角層細胞を用いた肌の鑑別法に関し、更に詳しくは、本発明は角層細胞の疎水性領域を選択的に染色して角層細胞の疎水性−親水性を鑑別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化粧料を選択する上で、その適用されるべき肌の特性を知ることは非常に重要なことである。これは、肌状態の違いにより、同じ化粧料を使用しても、好ましい効果をもたらすことも存するし、却って好ましからざる効果をもたらすことも存するためである。即ち、肌の手入れに於いて、適切な化粧料を選択することは効果と安全性を確保する上で常用なテーマであると言える。この様な状況を反映して、種々の肌の鑑別法と化粧料の選択法が考案されている。中でも、容易に採取できて、肌状態を適切に反映し、且つ、肌情報を多く有している角層細胞を用いる方法は、近年重点的に研究が重ねられている。かかる角層細胞に関する技術としては、主として、形状、面積、核を有するか否か、どの程度のメラニン顆粒を有するか等、角層細胞の形状或いは病理学的特徴に関するものが主流を占めている。又、形状に加えて比較的マクロな肌の凹凸の状態などを補助因子として加えているものも存する（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５及び特許文献６参照）。
【０００３】
これらの技術に加えて、皮膚機能として重要な角層バリアー機能に着目した、バリアー機能と密接に関連する、角層細胞におけるコーニファイドエンベロープ（以下ＣＥと略す）の疎水性を選択的染色によって評価する技術が開示されている（例えば、特許文献７及び特許文献８参照）。この様に特殊な色素を用いて角層細胞の疎水域を染色しなければならない理由の一つとしては、角層細胞が既に生命を失って偏平化し、外部からの物質の侵入を阻止するために特殊化したものであるため、染色液の均一な浸透が困難であることが挙げられる。即ち、通常知られている疎水性部分を染色する染色液を用いても、角層細胞が全く染まらないか、角層細胞全面が染まってしまい、疎水性部分のみを選択的に染めることは出来なかったのが現状と言える。しかしながら、疎水性領域を選択的に染色できる色素であるナイルレッド等を用いた場合、蛍光顕微鏡での観察を余儀なくされ、高価な蛍光顕微鏡や遮光設備等の実用上の課題があった。即ち、低コストで実用的な光学顕微鏡で観察可能な、角層細胞の疎水性−親水性を選択的に染色を行う技術は全く知られていなかった。
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−１０５７００号公報
【特許文献２】特開２００４−５３４９１号公報
【特許文献３】特開２００２−６５６１６号公報
【特許文献４】特開２００１−１３１３８号公報
【特許文献５】特開２０００−１１６６２３号公報
【特許文献６】特開平１１−３４４４８９号公報
【特許文献７】特開２００１−９１５１４号公報
【特許文献８】再表０２／２５２７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はこの様な状況下為されたものであり、光学顕微鏡下において、角層細胞の疎水性−親水性を鑑別する技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような状況を鑑みて、本発明者らは、光学顕微鏡下において、角層細胞の疎水性−親水性を鑑別する技術を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、ズダンブラックＢの色素で染色することによって、光学顕微鏡によって角層細胞の疎水性−親水性を鑑別できることを見出し、発明を完成させるに至った。則ち、本発明は以下に示すとおりである。
（１）肌の鑑別法であって、皮膚より採取した角層細胞をズダンブラックＢの色素で外界接触部分方向から染色し、該色素で染色した光学顕微鏡によって角層細胞の疎水性−親水性を鑑別することを特徴とする、角層細胞の鑑別法。
（２）前記ズダンブラックＢの染色液において、該染色液中にエタノールを３０〜５０質量％を含有することを特徴とする、（１）に記載の角層細胞の鑑別法。
（３）次に示す工程に従って行われることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の角層細胞の鑑別法。
（工程１）粘着テープを用いて、皮膚より角層細胞を採取する。
（工程２）前記粘着テープの粘着剤は有機溶剤により軟化・溶解させ、角層細胞をスライドグラス上に転写させて、角層細胞標本を作製する。
（工程３）該角層細胞標本をエタノール水溶液（約４０質量％）で馴染ませた後、室温にてズダンブラックＢ染色液中に２４〜４８時間放置して染色を行う。
（工程４）染色された角層細胞標本をエタノール水溶液で洗浄風乾後、バルサムに封入して光学顕微鏡下で鑑別を行う。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の鑑別法によって、光学顕微鏡下において角層細胞の疎水性−親水性を鑑別することが可能となり、高価な蛍光顕微鏡、高感度カメラ及び暗室等の遮光設備が不要となり、コストダウンや省スペース化等、より実用的技術を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、皮膚より採取した角層細胞をズダンブラックＢの色素を含む染色液で外界接触部分方向から染色することによって、光学顕微鏡下において、角層細胞の疎水性−親水性を鑑別することを特徴とする。以下に、更に詳細に説明を加える。
【０００９】
前記角層細胞の採取及び染色の工程は、以下のように行うことが好ましい。
（工程１）粘着テープを用いて、皮膚より角層細胞を採取する。
（工程２）前記粘着テープの粘着剤は有機溶剤により軟化・溶解させ、角層細胞をスライドグラス上に転写させて、角層細胞標本を作製する。
（工程３）該角層細胞標本をエタノール水溶液（約４０質量％）で馴染ませた後、室温にてズダンブラックＢ染色液中に１２〜４８時間放置して染色を行う。
（工程４）染色された角層細胞標本をエタノール水溶液で洗浄風乾後、バルサムに封入して光学顕微鏡下で鑑別を行う。このとき、染色した結果が濃すぎたり沈殿が付着した場合には、エタノール溶液で分別することが好ましい。 
上記の工程３において、染色を行う室温条件を３７〜６０℃で変更して実施すると、染色時間を短縮することもできる。前記工程２において、生体側を上部に向けて採取された角層細胞が、この面をスライドグラス上に接するように配列し、これによって外界接触部分方向から染色することが出来るようになる。
【００１０】
前記ズダンブラックＢ（Sudan Black B）は、非蛍光性の脂肪分に溶ける染料（lysochrome）で、構造式は、2,3-ジヒドロ-2,2-ジメチル-6-[[1-ナフチル-4-(フェニルアゾ)]アゾ]-1H-ペリミジン(2,3-dihydro-2,2-dimethyl-6-[[1-naphthyl-4-(phenylazo)]azo]-1H-perimidine)で、分子量は４５６．５４である。ズダンブラックＢは、水に不溶でエタノールに可溶であるため、水-エタノール混合溶液として物理的染色のメカニズムによって、中性脂肪の他、各種複合脂質まで染色することができる。他のズダン染色に比較して、染色性が安定していること、並びにＯＨ基持たないため塩基性色素として働き、疎水性及び親水性色素としての性質によって、リン脂質及び糖脂質等の中極性脂質も染色可能等、優れた特徴がある（ズダン染色法：月刊Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ別冊 P.47,医歯薬出版）。
【００１１】
角層細胞の疎水性−親水性を選択的に染色できる色素として、ナイルレッド、ナイルブルー、オイルレッドＯ、又はズダンIIIがよく知られている。これらの色素は、病理検査における脂肪染色に使用されているものであり、脂肪に対する染色性が極めて良い反面、タンパク質を主成分とする角層細胞では染色性が十分でなく、そのため光学顕微鏡での角層細胞の鑑別が非常に困難という課題がある。これらの色素については、外界接触部分方向からの染色によっても選択的に角層細胞の生体接触側に存する疎水性部分を染色することは難しい。このため、ナイルレッドによって染色した角層細胞の蛍光を、遮光条件下での蛍光顕微鏡によって観察することを余儀なくされるが、設備コストアップに加え、角層細胞自体からの蛍光との区別を要する等の新たな課題も生じる。かようなことから、スダンブラックＢを染色剤として用いて、外界接触部分方向から染色し、光学顕微鏡下での角層細胞を鑑別することが極めて好ましい。
【００１２】
本発明の染色液におけるエタノールの好ましい含有量は、染色液全量に対して、総量で３０〜５０質量％であり、より好ましくは３５〜４５質量％である。非蛍光性のズダンブラックＢ等を用いた脂肪染色においては、一般的に約７０質量％エタノール水溶液が用いられているが、本発明の角層細胞の染色においては、かようなエタノールを高濃度に配合すると十分な染色性を得ることができない（図２参照）。これは、脂肪染色条件のような高濃度のエタノール配合系においては、ズダンブラックＢの疎水性−親水性色素としての性質が十分に発揮できないためであり、エタノール量を減じることによって、タンパク質を主成分とする角層細胞への色素分配が促進され染色性が向上するものと推察される（図１参照）。
【００１３】
角層細胞の疎水性−親水性の鑑別は、その染色性の強弱の程度によって行うことができる。例えば、染色性が均一且つ良好であれば、ＣＥが成熟した状態であり、角層細胞の基本的な評価項目である、角層細胞の配列規則性、重層剥離の有無程度、角層細胞面積及び有核細胞の有無等は相対的に良好な値を示し、バリアー機能が十分で良好な肌状態と判断できる。逆に、染色性が不均一で不良であれば、角層細胞の上記の評価項目は相対的に悪い値を示し、バリアー機能が不十分で肌荒れ等を起こしている肌状態と判断される。かよう鑑別結果を用いて、肌状態のカウンセリングや個々に適した化粧料の選択にも適用することができる。以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明が、これら実施例にのみ限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００１４】
本発明の角層細胞の採取及び染色の工程に従い、３５才の女性被験者の頬部より角層細胞を採取し、以下に示すズダンブラックＢの染色液処方１，２を使用して角層細胞標本の光学顕微鏡の画像を得た（図１，２参照）。また、同時に比較例として、ズダンブラックＢをナイルレッドに置換した染色液処方３を作製して光学顕微鏡を蛍光顕微鏡に変え、同様に画像を得た（図３参照）。図１〜３より明らかに、本発明の角層細胞の画像は、従前の方法であるナイルレッド染色で蛍光顕微鏡で観察した場合と、同様の印象を有しつつも、この方法よりも、染色性がよく、角層細胞の疎水性−親水性を鑑別できることが分かる。
【００１５】
（染色液の処方１）
ズダンブラックＢ                                  ０．１  質量％
エタノール                                      ４０．０  質量％
純水                                            ５９．９  質量％
【００１６】
（染色液の処方２）
ズダンブラックＢ                                  ０．１  質量％
エタノール                                      ７０．０  質量％
純水                                            ２９．９  質量％
【００１７】
（染色液の処方３）
ナイルレッド                                      ０．１  質量％
エタノール                                      ７０．０  質量％
純水                                            ２９．９  質量％
【実施例２】
【００１８】
実施例１において、被験者を増やし、１８〜６０才の女性３０名を対象に、染色処方１を使用して角層細胞の染色画像を得た。角層細胞染色画像より疎水性−親水性レベル（疎水性が大きい方を１とする５段階）の評価を行い、及び頬部のＴＥＷＬ（経表皮水分透過量）との相関関係を検討した。
【００１９】
図４及び５に疎水性の最大（濃い染色状態）及び最小（薄い染色状態）の画像を、また、図６に疎水性−親水性レベル評価値とＴＥＷＬとの散布図を示す。図４及び５より、疎水性領域における染色の強弱が明瞭に示されることが分かる。また、図６の散布図の順位相関係数は０．６１５で有意な相関関係を示し、バリアー機能やＣＥの成熟の度合との関連性が示唆される。これらのことから、本発明の角層細胞の疎水性−親水性が精度良く鑑別できることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明によって、光学顕微鏡下において角層細胞の疎水性−親水性を鑑別することが可能となり、高価な蛍光顕微鏡、高感度カメラ及び暗室等の遮光設備が不要となって、コストダウンや省スペース化等に貢献できる。更には、デパートや店頭等においても、肌状態のカウンセリングやアドバイス等の有用な情報を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例１における染色液処方１の角層細胞標本の光学顕微鏡の画像を示す図である（図面代用写真）。
【図２】実施例１における染色液処方２の角層細胞標本の光学顕微鏡の画像を示す図である（図面代用写真）。
【図３】比較例としての、染色液処方３の角層細胞標本の蛍光顕微鏡の画像を示す図である（図面代用写真）。
【図４】実施例２における角層細胞標本で、疎水性が高い染色画像を示す図である（図面代用写真）。
【図５】実施例２における角層細胞標本で、疎水性が低い染色画像を示す図である（図面代用写真）。
【図６】実施例２における疎水性−親水性レベル（１〜５）とＴＥＷＬ（ｇ／ｍ２／ｈ）との関係を示す散布図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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