(57)【要約】【課題】組織片培養を容易に行うことができる培養キットを提供する。【解決手段】組織片Ｔの培養キットを、組織片Ｔを培養する培養面６を有する培養基材４と、組織片Ｔを貫通して組織片を培養基材４に対して固定可能な組織片固定具２４と、を備えるようにする。組織片Ｔの培養開始時における組織片の培養面６への密着と培養終了時における培養組織の回収との双方の操作を容易化することができる。【選択図】図１
2007049954.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織片の培養キットであって、
前記組織片を培養する培養面を有する培養基材と、
前記組織片を貫通して前記組織片を前記培養基材に対して固定可能な組織片固定具と、
を備える、キット。
【請求項２】
前記組織片固定具は前記組織片を突き刺して貫通可能な先端部を有している、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記組織片固定具の前記先端部側が前記培養基材に対して固定される、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
前記先端部側には前記培養基材に対する抜け止め用のアンカー部を有する、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
前記培養基材は前記培養面から前記組織片固定具の前記先端部側を受容する孔部を有している、請求項２〜４のいずれかに記載のキット。
【請求項６】
前記培養基材は前記培養面の裏側の面からの前記組織片固定具の前記先端部側を受容する孔部を有している、請求項２〜４のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
前記組織片固定具を保持する固定具保持部材を備える、請求項１〜６に記載のキット。
【請求項８】
前記固定具保持部材は前記組織片固定具を脱着可能である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記組織片固定具の前記先端部を前記培養面上に突出可能に前記先端部の他端側が前記培養基材に対して固定可能に形成されている、請求項２に記載のキット。
【請求項１０】
前記組織片固定具は前記先端部を前記培養面上に突出させて前記培養基材に一体化されている、請求項２に記載のキット。
【請求項１１】
前記培養基材は、前記組織片固定具を固定可能な貫通孔を有している、請求項１〜１０のいずれかに記載のキット。
【請求項１２】
前記培養基材は、前記組織片が前記孔部上に載置されるとき、前記孔部の位置を明示又は予測可能なガイドを有する、請求項１〜１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記ガイドは、前記培養基材の表面又は裏面において前記孔部で交差する少なくとも２本の線状体を有している、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記培養基材を保持する培養基材保持部材を備える、請求項１〜１３のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
前記培養基材保持部材は前記培養基材を脱着可能である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
さらに、前記培養基材と前記組織片固定具と培養液とを収容可能な培養容器を備える、請求項１〜１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記培養容器は可撓性を有する袋状体である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記培養容器は、前記キャビティに液体を注入する注入部又は前記キャビティから液体を排出する排出部を備える、請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項１９】
組織片培養のための培養器具であって、
前記組織片を培養可能な培養面を有し、前記組織片を貫通した状態で前記培養面に固定する組織片固定具を保持可能な培養基材を有する、培養器具。
【請求項２０】
組織片培養のための培養器具であって、
前記組織片を突き刺して貫通可能な先端部を有し、前記組織片を培養する培養面に固定可能な組織片固定具を有する、培養器具。
【請求項２１】
培養組織の作製方法であって、
前記組織片を突き刺して貫通する組織片固定具により前記組織片を培養面に固定する固定化工程と、
固定した前記組織片に培地を供給して培養する培養工程と、
を備える、作製方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織片の培養のためのキット、組織片培養のための培養基材及び組織固定具などの培養器具、培養組織の作製方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を培養する方法には、器官培養（organ culture）、組織片培養（Explant culture）、細胞培養（Cell culture）などが知られている。ヒトなどの動物細胞には、細胞培養（Cell culture）が一般的におこなわれている。細胞培養（Cell culture）は、組織片を酵素処理などによって個々の細胞の状態まで分散した後、この細胞懸濁液を用いて培養を行う方法である。こうした細胞培養のためには多くの培養キットが提供されており、比較的容易に細胞を培養することができるようになっている。
【０００３】
一方、細胞種によっては、細胞培養が困難である等の理由により組織片培養の方が好ましいものも存在する。また、特定の細胞を選択的に増殖させたい場合などにも組織片培養を利用することがある。組織片培養は、組織片を培養容器底面に載置した後、組織片が乾燥しないように注意を払いながら接着するまで静置し、その後に培地を供給して培養を行う方法である。しかしながら、培養を開始する前の組織片の容器底面への接着は非常に繊細であるために乱暴に扱うと容易に剥がれてしまい、接着作業には作業者の熟練が必要であった。また、たとえ接着作業がうまくいったとしても、培地の供給時にさえ組織片が剥離しないように注意深く行う必要があるので、作業者の負担となっていた。そこで、容易に組織片を接着させて培養するための装置が案出されてきている。こうした装置としては、例えば、組織片を挟持する部材が容器の開閉と連動させて、培養容器を閉鎖すると同時に組織片を挟持し、組織片を容器内の培養面に容易に固定し密着させる培養キットが開示されている（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００５−８７０２９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この装置のように、挟持又は押さえを組織片の固定具として用いることのメリットは、固定操作の簡易化のため容器の開閉と組織片の開放／固定とを連動させることであったが、その反面、培養後の培養組織の培養面からの回収操作が必ずしも容易ではなかった。さらに、容器の開閉と培養面への組織片の開放／固定とが連動していることは組織を簡易に固定できる一方で組織片を正確に又は確実に固定するには慣れが必要であった。また、挟持による固定では、組織片が接着した後であっても、何らかの拍子で挟持部材同士がずれるような動きをした場合には、接着した組織片が剥がれてしまうことも懸念される。
【０００５】
そこで、本発明の一つの目的は、組織片培養を容易に行うことができる培養キット及び組織片培養器具を提供することである。また、本発明の他の一つの目的は、組織片を容易に固定化することのできる培養キット及び組織片培養器具を提供することを一つの目的とする。また、本発明の他の一つの目的は、培養後の培養組織を容易に回収することのできる培養キット及び組織片培養器具を提供することである。本発明のさらに他の一つの目的は、組織片を正確に又は確実に固定して組織片培養を行うことができる培養キット及び組織片培養器具を提供することである。本発明のさらに他の一つの目的は、組織片培養を行うに際して、コンタミネーションの可能性を低減することができる培養キット及び組織片培養器具を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、組織片の培養開始時における組織片の培養面への密着と培養終了時における培養組織の回収との双方の操作を容易化することについて検討した結果、組織片を培養基材に密着させるのに組織片を貫通する固定具を用いることが有利であることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば以下の手段が提供される。
【０００７】
本発明によれば、組織片の培養キットであって、前記組織片を培養する培養面を有する培養基材と、前記組織片を貫通して前記組織片を前記培養基材に対して固定可能な組織片固定具と、を備える、キットが提供される。
【０００８】
この形態においては、前記組織片固定具は前記組織片を突き刺して貫通可能な先端部を有することが好ましい態様である。この態様においては、前記組織片固定具の前記先端部側が前記培養基材に対して固定されていてもよい。この場合、前記先端部側には前記培養基材に対する抜け止め用のアンカー部を有していてもよい。さらに、この態様においては、前記培養基材は前記先端部側を固定可能な孔部を有していてもよい。この場合、前記培養基材は前記培養面から前記組織片固定具の前記先端部側を受容する孔部を有していてもよいし、前記培養基材は前記培養面の裏側の面からの前記組織片固定具の前記先端部側を受容する孔部を有していてもよい。
【０００９】
この形態においては、前記組織片固定具を保持する固定具保持部材を備えることができる。この態様においては、前記固定具保持部材は前記組織片固定具を脱着可能としてもよい。
【００１０】
この形態においては、前記組織片固定具の前記先端部を前記培養面上に突出可能で前記先端部の他端側が前記培養基材に対して固定可能に形成されていてもよい。
【００１１】
この形態においては、前記組織片固定具は前記先端部を前記培養面上に突出させて前記培養基材に一体化されていてもよい。
【００１２】
この形態においては、前記培養基材は、前記組織片固定具を固定可能な貫通孔を有していてもよい。また、前記培養基材は、前記組織片が前記孔部上に載置されるとき、前記孔部の位置を明示又は予測可能なガイドを有していてもよい。この場合には、前記ガイドは、前記培養基材の表面又は裏面において前記孔部で交差する少なくとも２本の線状体を有することができる。
【００１３】
この形態においては、前記培養基材を保持する培養基材保持部材を備えていることが好ましい態様である。この態様においては、前記培養基材保持部材は前記培養基材を脱着可能としてもよい。
【００１４】
この形態においては、さらに、前記培養基材と前記組織片固定具と培養液とを収容可能な培養容器を備えることが好ましい態様である。この態様においては、前記培養容器は可撓性を有する袋状体としてもよい。また、前記培養容器は液密性を有していてもよい。さらに、前記培養容器は、前記キャビティに液体を注入する注入部又は前記キャビティから液体を排出する排出部を備えていてもよい。
【００１５】
また、本発明によれば、組織片培養のための培養器具であって、前記組織片を培養可能な培養面を有し、前記組織片を貫通した状態で前記培養面に固定する組織片固定具を保持可能な培養基材を有する、培養器具が提供される。
【００１６】
本発明によれば、組織片培養のための培養器具であって、前記組織片を突き刺して貫通可能な先端部を有し、前記組織片を培養する培養面に固定可能な組織片固定具を有する、培養器具が提供される。
【００１７】
本発明によれば、組織片培養のための培養装置であって、上記いずれかに記載の培養基材を培養容器内に備える培養装置が提供され、さらに、組織片固定具も備える培養装置も提供される。
【００１８】
また、本発明によれば、組織片の培養方法であって、前記組織片を突き刺して貫通する組織片固定具により前記組織片を培養面に固定する固定化工程と、固定した前記組織片に培地を供給して培養する培養工程と、を備える、培養方法が提供される。
【００１９】
また、本発明によれば、培養組織の作製方法であって、前記組織片を突き刺して貫通する組織片固定具により前記組織片を培養面に固定する固定化工程と、固定した前記組織片に培地を供給して培養する培養工程と、を備える、作製方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の組織片培養キットは、前記組織片を培養する培養面を有する培養基材と、前記組織片を貫通して前記組織片を前記培養基材に対して固定可能な組織片固定具と、を備えることを特徴としている。また、本発明の組織片培養器具は、前記組織片を培養可能な培養面を有し、前記組織片を貫通させた状態で固定する組織片固定具を保持可能な培養基材を備えることができる。
【００２１】
図１に本発明における組織片の固定状態の一例を概念的に示す。本発明の組織片培養キットおよび組織片培養器具によれば、いずれも、培養しようとする組織片Ｔを組織片固定具２により貫通させた状態で培養面６に固定するものである。こうした組織片固定具２を用いることで組織片Ｔを容易に固定することができる。また、こうした組織片固定具２を用いることで、組織片Ｔを正確にまた確実に固定することができる。したがって、本発明によれば、組織片培養を容易に行うことができる。
【００２２】
なお、図１には、組織片Ｔの上方から組織片固定具２で組織片を突き刺して固定した状態を示したが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明において組織片Ｔを貫通して固定する状態には、図１に示す形態の他、少なくとも（１）組織片固定具２が培養面６の裏面から組織片Ｔを突き刺して貫通して固定する形態、（２）培養面６に予め備えられる先鋭な先端部に対して組織片Ｔが貫通されるように組織片Ｔを置いて固定する形態、（３）別個の場所にて組織片固定具で貫通して固定された組織片Ｔをそのままの状態で培養面６に固定する形態及び（４）予め所定部位に貫通孔が形成された組織片Ｔを図１に示す形態、上記（１）及び（２）に記載の形態で固定する形態が包含される。
【００２３】
以下、発明の実施の形態について適宜図面を参照しながら説明する。図２及び図３は、第１の実施形態の組織片培養キット及びキットを構成する組織片培養器具を示す図であり、図４は、こうした組織片培養キットを用いた組織片の固定化工程の一例を示す図である。
【００２４】
（第１の実施形態）
本実施形態の組織片培養キットは、培養基材４と、組織片固定具２４とを備えている。
【００２５】
（組織片）
本発明における組織片とは、骨膜組織片、皮膚組織、真皮組織片、上皮組織片、骨組織片などの接着依存性細胞で構成される組織片が挙げられ、ヒト細胞あるいは非ヒト動物細胞を含む。
【００２６】
（培養基材）
図２に示すように、培養基材４は、組織片を固定して培養する培養面６を備えている。培養基材４は、培養用として使用可能な公知の高分子材料や無機材料で形成されたものを用いることができる。したがって、培養基材４は、例えば、ガラスやプラスチックなどの材料で構成される。培養基材４の形状は特に限定しないで、培養しようとする組織片の種類や大きさ、培養により得ようとする培養組織の大きさ等によって適宜選択すればよいが、組織片の固定や回収における操作性など各種操作における取り扱いを考慮すれば、平坦面を有することが好ましく、好ましくは全体として平板状である。培養基材４が平板状である場合の培養基材４の幾何学的形状は特に限定されない。
【００２７】
（培養面）
培養面６は、培養基材４の少なくとも一部に備えられている。培養面６は培養しようとする組織片の種類によるが平坦であることが好ましい。組織片の固定や増殖を促進するために細胞接着性を向上する化合物のコーティング処理や物理的及び／又は化学的処理がされていてもよく、また、培養基材４自体がこうした材料で構成されていてもよい。
【００２８】
培養基材４の培養面６を形成した領域内には、組織片Ｔを後述する組織片固定具２４により固定するために、組織片固定具２４を固定又は保持する孔部１０などの固定手段を備えることができる。すなわち、組織片固定具２４の先端部２６側を受容する孔部を有していてもよい。この孔部１０は、貫通孔とすることができ、特に、組織片固定具２４のテーパー状に形成された先端部側の一部の形状に対応するテーパー状の貫通孔に形成してもよい。なお、固定手段は、こうした貫通孔などの孔部に限定するものではなく、凹部であってもよく、組織片固定具２４の形態に応じて各種形態を採ることができる。なお、孔部１０の近傍は後述する組織固定具２４の先端部２６が貫通しやすいような適度な弾性変形性（構造上及び／又は材料上の）を備えていることが好ましい。
【００２９】
組織片固定具２４を培養基材４に対して固定するのにあたり、培養基材４の組織片固定具２４を固定すべき領域が、組織片固定具２４の培養基材４への固定部位を受容して保持可能な可塑性又は弾性を有しているか、あるいは組織片固定具を係合可能な形状を有している場合には、必ずしもこうした孔部１０などの固定手段は必要とされない。例えば、培養基材４の組織片固定具２４の固定部位をシリコンゴムなどで構成し、組織片固定具２４を先鋭なニードル状とした場合には、固定部位におけるシリコンゴム自体が固定手段として機能するため、特別な係合構造は不要となる。
【００３０】
培養基材４が固定手段として組織片固定具２４の先端側を貫通させる孔部１０を備える場合、孔部１０を貫通して培養基材４の裏面に突出される組織片固定具２４の先端側を被覆するカバー部１２を有していてもよい。カバー部１２を備えることで、培養基材４の裏面から突出する鋭利な組織片固定具２４の先端部２６が露出されないため、取り扱い上の安全性が確保される。さらに、培養容器に対して損傷を与えることを防ぐことができる。
【００３１】
培養面６の領域内に形成された組織片固定具２４の固定手段としての孔部１０の位置を明示する又は予測可能とするガイド１４を有していてもよい。ガイド１４は、孔部１０の位置を明示又は予測可能とすることで、組織片Ｔを組織片固定具２４で培養面６に固定するのを容易にし、正確にかつ速やかな固定を可能とすることができる。
【００３２】
例えば、ガイド１４は、孔部１０の位置で交差する少なくとも２本の溝状ラインを培養面６の裏面に描画することができる。培養基材４は透明基材であるので裏面に溝状に形成しても培養面６側から容易に視認することができる。ガイド１４を構成するラインは、直線状であることが好ましいが、連続的である必要はなく、断続的に形成されたものであってもよい。なお、ラインは、溝状である必要はなく、培養基材４に対する印刷層であってもよい。印刷層は、実線でなくともよく、ドット状体の連続であってもよい、溝と印刷層とが組み合わされていてもよい。また、ガイド１４は、孔部１０の位置を着色することでもよく、培養面６上に形成され孔部１０に特定の座標を与える座標軸であってもよい。また、ガイド１４は、孔部１０を中心とした同心円形状であってもよい。
【００３３】
こうした培養基材４の裏面には組織片固定具２４を固定した状態で培養基材４を安定して培養容器内に収容できるような基部１６を有することができる。基部１６を備えることで、培養基材４に組織片Ｔを固定する際に組織片固定具２４を介して培養基材４にかかる荷重を分散して安定して支持することができる。基部１６は、例えば、培養基材４の裏面の角部近傍に設けることができる。
【００３４】
（組織片固定具）
図３に示すように、組織片固定具２４は、組織片Ｔを突き刺し可能な程度に先鋭に形成された先端部２６を有する。なお、先端部２６は、組織片Ｔを突き刺し可能である限り、テーパー状でなくてもよく、ニードル状であってもメス状であってもよい。
【００３５】
先端部２６の最先端から離れた部位には、先端部２６を培養基材４に形成した孔部１０から抜け止め可能な張り出し状のアンカー部２８を有していてもよい。アンカー部２８は、孔部１０の裏面側における開口径よりも外側に張り出した部分を有し、この張り出し部分が孔部１０の裏面側の開口端縁に係合されることで、アンカー部２８によって孔部１０に固定された組織片固定具２４が孔部１０から抜け落ちることを防止している。なお、このアンカー部２８の張り出し寸法は、孔部１０及び／又はアンカー部２８の弾性変形によりアンカー部２８が孔部１０を通過可能な程度に形成されていることが好ましい。張り出し部分を小さくするには、孔部１０が裏面側に向かって先細りするテーパー状であることが好ましい。本実施形態では、先端部２６からアンカー部２８まで連続的にテーパー状に形成されるとともに、テーパー形態が終結する端部がアンカー部２８を形成している。
【００３６】
なお、先端部２６が培養基材４を貫通した状態で培養面６に固定される場合、先端部２６の最先端は培養基材４の下面に貫通し、最先端から離れた部位が培養基材４の孔部１０に固定保持されることになる。また、アンカー部２８を形成した場合には、アンカー部２８に隣接する部分が培養基材４の孔部１０に固定される部位となる。こうした固定部位は、特に形態を問わないが、先端部２６と同様の先端側に先細りするテーパー状とすることで、組織片固定具２４が過度に培養基材４に侵入することを防いで一定位置での組織片Ｔの固定を容易化できる。
【００３７】
組織片固定具２４の先端部２６の近傍又は先端部２６から所定距離はなれた部位には、組織片Ｔを培養面６上に固定する際に組織片Ｔを貫通保持する組織片保持部３０を有している。組織片固定具２４の培養基材４への侵入度合いが大きければ先端部２６の先端からより遠い部分が組織片保持部３０となり、逆の場合には先端からより近い部分が組織片保持部３０となる。組織片保持部３０は、組織片固定具２４の孔部１０に固定される部位に隣接することから、テーパー状に形成されていることが好ましい。
【００３８】
組織片保持部３０の先端部２６とは反対側には、組織片押さえ部３２を有していてもよい。組織押さえ部３２は、組織片Ｔを組織片保持部３０にて培養面６上に固定したときに組織片Ｔを押さえて培養面６に確実に密着させることができる。組織片押さえ部３２の形態は特に限定しない。
【００３９】
図３に示すように、こうした組織片固定具２４は、組織片固定具２４を脱着可能に保持する固定具保持部材４０に備えられていてもよい。固定具保持部材４０は、把持可能な把持部４２を有し、組織片固定具２４を分離可能に保持することで組織片固定具２４による組織片Ｔの固定化操作を容易化することができるとともに、雑菌との接触可能性を低減してコンタミネーションを抑制できる。固定具保持部材４０は、把持部４２と固定部４４とこれらを接続する連結部４６とを有している。固定部４４は、その先端側に突起状の係合部４４ａを備えており、この係合部４４ａを組織片固定具２４の先端部２６の他端側に設けた所定の凹部３４に係合させることで一体化可能に構成されることができる。
【００４０】
なお、固定具保持部材４０は、必ずしも組織片固定具２４と分離可能でなくてもよい。また、上記した固定形態でなくともよく、従来公知の各種の固定形態を採用できる。さらに、組織片Ｔを固定後に、連結部４６等に設けた脆弱部で切断することを前提として、組織片固定部２４は固定具保持部材４０を一体的に有していてもよい。また、把持部４２及び連結部４６についてもその形態を限定するものではない。
【００４１】
次に、こうしたキット、すなわち、培養基材４と組織片固定具２４とを用いて組織片Ｔを培養面６に固定して組織片を固定化し培養する工程について図４に基づいて説明する。
【００４２】
まず、図４（ａ）〜（ｃ）に示すように、組織片Ｔの固定化工程を実施する。組織片Ｔをピンセット等で把持して、培養基材４の培養面６の中央部分、孔部１０が形成された領域を含む中央部分に載置する（図４（ａ）及び（ｂ）参照）。次いで、この状態で組織片固定具２４の先端部２６で組織片Ｔを突き刺して貫通させ、さらに、先端部２６を培養基材４の孔部１０に固定する（図４（ｃ）参照）。
【００４３】
図４（ａ）に示すように、組織片固定具２４で組織片Ｔを突き刺ししようとする際、培養面６上に載置された組織片Ｔを培養面６から見ると、組織片Ｔの周囲には、組織片Ｔの中央部に向かうガイド１４を構成する溝状ラインが視認される。ガイド１４は、孔部２０を交差するように構成されているため、組織片Ｔの周囲に溝状ラインが視認されることで、組織片Ｔの下にある孔部１０の位置を容易に予測又は把握でき、組織片Ｔの上からであっても組織片固定具２４の先端部２６を孔部１０に確実に一致するように組織片Ｔを突き刺して貫通させることができる。
【００４４】
組織片固定具２４の先端部２６が組織片Ｔを貫通して孔部１０に差し込まれると、アンカー部２８が孔部１０の開口端縁１０ａに係合して組織片固定具２４は抜け止めされて固定される。組織片Ｔは、組織片固定具２４の組織片保持部３０に保持されて培養面６の表面に固定される。同時に、組織片押さえ部３２により組織片Ｔが培養面６から浮き上がるのを抑制できる。
【００４５】
次に、固定具保持部材４０を組織片固定具２４から分離させる。組織片固定具２４は、アンカー部２８により培養基材４に固定されている。このため、固定具保持部材４０の把持部４２を保持して組織片固定具２４から離れるように引っ張ることで固定部４４における係合部４４ａと組織片固定具２４の凹部３４との係合は容易に解除され、固定具保持部材４０は、組織片固定具２４から分離される（図３（ａ）参照）。
【００４６】
こうして図４（ｃ）に示すように、組織片Ｔを培養面６に固定したら、適当な培養容器に組織片Ｔを固定した状態の培養基材４を収容し、培地を供給する。組織片Ｔは組織片固定具２４によって確実に培養面６に接触しているため、培地供給も容易におこなうことができ、さらに組織片Ｔが乾燥しないように気にしながら接着工程をおこなう必要もなく、このまま培養を実施することができる。
【００４７】
培地を適宜交換しながら培養すると、組織片に由来する細胞により培養組織が培養面６上に形成される。
【００４８】
培養を終了した後、目的に応じて細胞を回収することができる。たとえば、細胞懸濁液として回収したい場合には、組織片Ｔを組織片固定具２４で固定した状態のまま、酵素処理によって個々の細胞に分散して回収することができる。また、培養組織として回収したい場合には、組織片固定具２４で固定された組織片Ｔの周辺を切断し、培養によってアウトグロースした培養組織のみを回収することができる。この場合、培養組織の強度がある場合には、そのままピンセット等で物理的に剥離すればよいが、培養組織が脆弱な場合には、酵素処理等によって培養面６から剥離することで回収することができる。さらに、組織片固定具２４を培養基材４の孔部１０から取り外すことによって回収しても良い。このとき、アンカー部２８が設けられている場合には、所定荷重以上が加えられた場合に係合が外れるような構造や材質でアンカー部２８を作製することが好ましい。例えば、アンカー部２８を弾性材料で作製したり、アンカー部２８が折れるようにしたりすることが考えられる。アンカー部２８が折れるように構成した場合には、先端部２６はカバー部１２内に収まるため、安全でもある。
【００４９】
以上説明したように、本実施形態によれば、組織片Ｔを突き刺して貫通した状態で固定するため、組織片Ｔを容易に培養基材４に対して固定できる。また、組織片Ｔを正確に又は確実に固定することができる。さらにまた、組織片Ｔへのダメージを抑制して固定することができる。さらに、培養容器の外に取り出した培養基材４に対して培養組織の回収操作を行えばよいので、培養組織の回収も容易に行うことができる。これらの結果、本実施形態の組織片培養キットによれば、組織片培養を容易に行うことができる。
【００５０】
また、本実施形態によれば、組織片Ｔを培養面６に載置した後、培養面６の表面から組織片固定具２４を突き刺して組織片Ｔを固定するため、組織片Ｔを容易に固定することができる。また、本実施形態では、培養容器外で組織片Ｔの固定化工程を実施したが、培養容器内に培養基材４を収容した状態で固定化工程を実施してもよい。さらに、本実施形態によれば、組織片Ｔを組織片固定具２４の組織片保持部３０で貫通保持するとともに組織片押さえ部３２で押さえて固定するために、安定して組織片Ｔを固定化して、早期に培養面６に密着させることができるとともに安定して培養できる。
【００５１】
本実施形態では、組織片固定具２４を分離可能に保持する固定具保持部材４０を利用するものとしたが、固定具保持部材４０を用いることなく、組織片固定具２４自体を把持することにより組織片Ｔを固定することもできる。
【００５２】
また、本実施形態は、培養基材４と組織片固定具２４とからなるキットを構成するものとしたが、培養容器も予めキット化しておくこともできる。なお、培養容器は特に限定しないで、培養基材４と組織片固定具２４とを収容できる限り、従来公知のシャーレ等の各種の培養容器を用いることができる。
【００５３】
（第２の実施形態）
次に、本発明の組織片培養キットの第２の実施形態として、培養基材と組織片固定具とを備えるとともに、培養容器として可撓性を有する袋状体の培養容器を利用する形態について説明する。図５には、本実施形態で用いる培養基材の一例を示し、図６には、培養容器の一例を示し、図７には、本実施形態の培養容器に対する培養基材の収容操作について示す。
【００５４】
本実施形態では、第１の実施形態と同様の組織片固定具２４を用いる。また、本実施形態において用いる培養基材６４については、第１の実施形態とは異なる部分についてのみ説明し、その他の構成については同じ符号を用いて説明する。
【００５５】
図５に示すように、培養基材６４は、培養基材６４が培養容器５０内に収容されたとき、組織片Ｔが可撓性の袋状体である培養容器５０の一部と接触しないような隔壁６６を培養面６側の周囲に備えることができる。この隔壁６６を備えることにより、培養容器５０が変形しても組織片Ｔに接触されることが防止されるため、組織片Ｔに障害が及ぶことが抑制される。
【００５６】
培養基材６４は、培養基材６４を保持するための保持部材７０を有することができる。保持部材７０は、把持部７２と培養基材６４との固定部７４とを備えている。固定部７４は、培養基材６４を安定して保持可能に、培養基材６４を上下で支持するようにすることができる。例えば、図５に示すように、培養基材６４の裏面に沿って伸びる第１のアーム７６ａと培養基材６４の表面に沿って伸びる第２のアーム７６ｂとを備えることができる。第１のアーム７６ａは第２のアーム７６ｂより長く形成することでより安定して培養基材６４を保持できる。こうした上下セットのアーム７６ａ、７６ｂは、固定部７４に対して２セット以上設けることでより安定して培養基材６４を保持できる。なお、上側のアームである第２のアーム７６ｂには、培養基材６４の所定位置に設けた孔部に係合する突起状係合部７８を備えることもできる。こうした係合構造により、保持状態を安定化できるとともに培養基材６４に対して保持部材７０を位置決めすることができる。
【００５７】
本実施形態で用いる培養容器５０の一例を図６に示す。図６に示すように、培養容器５０は、内部に該培養キャビティ５２を形成できる可撓性の袋状体とすることができる。可撓性を有することで、液体培地などを充填する場合でも、容器内の圧力変化に対応して容器が変形するため、容易に培地を充填できる。
【００５８】
こうした袋状体は、培養キャビティ５２を形成しうる液不透過性材料で形成されている。こうした袋状体の材料としては、従来この種の材料として用いられている公知の材料を各種使用できる。
【００５９】
培養容器５０は袋状体の一部を開閉可能な開閉部５４を有することができる。開閉部５４は、液密性を確保可能な封止部位を有している。封止構造は、例えば、互いに係合する凹凸部を有する二本の係合部材からなるジッパーを開閉部５４の対向面に設けることができる。このような封止構造は、当業者において周知であり、当業者であれば周知技術から適宜選択して、開閉部５４に適用することができる。なお、開閉部５４はジッパー等の繰り返し封止が可能な封止構造でなくともよく、例えば、ヒートシール等で封止してもよい。培養終了後に、培養容器５０の封止部等を切開等すれば培養組織等を回収することができる。
【００６０】
培養容器５０は、開閉部５４とは別個に液体注排出部５６を備えることができる。注排出部５６を備えることで、液体培地の充填及び交換、洗浄液の充填及び交換を、開閉部５４を開閉しないで行うことができる。なお注排出部５６は、適当なバルブ５８によりシール性を維持しつつ開閉可能に形成されていることが好ましい。このような機能を備えたものとしては、例えば、クレーブロックコネクター（商標、パルメディカル社製）などが挙げられ、こうしたコネクターは１つだけでなく、２つ以上を用いることができる。
【００６１】
次に、こうしたキット、すなわち、培養基材６４と組織片固定具２４と培養容器５０を用いて組織片Ｔを培養面６に固定して組織片を培養する工程について図７を参照して説明する。
【００６２】
組織片Ｔの固定化工程は、第１の実施形態と同様に実施することができる。すなわち、固定具保持部材４０を把持して組織片固定具２４を組織片Ｔに突き刺して培養基材６４に組織片Ｔを固定した後、保持部材７０で培養基材６４を保持する。すなわち、保持部材７０の固定部７４の第１のアーム７６ａ及び第２のアーム７６ｂを第２のアーム７６ｂの突起状係合部７８を用いて培養基材６４の所定位置を把持する。これにより、培養基材６４は保持部材７０により安定して保持され移動可能となる。なお、組織片固定具２４で組織片Ｔを培養基材６４に固定するのに先立って、保持部材７０で培養機材６４を予め保持しておいてもよい。
【００６３】
次に、図７（ａ）に示すように、保持部材７０の把持部７２を把持して、培養基材６４を培養容器５０の開閉部５４から培養キャビティ５２内に挿入させ所定位置に配置する。その後、把持部７２を操作して、把持部７２を固定部７４のアーム７６ａ、７６ｂに対して上方に軽く引き上げるようにして、アーム７６ｂの突起状係合部７８と培養基材６４との凹部との係合を解除するとともに、アーム７６ａの培養基材６４に対する係合も解除する。これにより、培養基材６４から保持部材７０が分離される。
【００６４】
この後、図７（ｂ）に示すように、培養容器５０の開閉部５４を閉鎖し封止して、培養基材６４の培養容器５０への収容を完了する。培養容器５０に培養基材６４を収容したら液体注排出部５６を介して培地を供給し、組織片Ｔが培養面６に接着するようにキットを静置して培養する。
【００６５】
培地を適宜交換しながら所定期間培養すると、組織片に由来する細胞により培養組織が培養面６上に形成される。
【００６６】
培養を終了するときには、まず、培地を除去した後、開閉部５４を開放して、保持部材７０を挿入して、その固定部７４によって培養基材６４を把持し、培養容器５０から培養基材６４を取り出す。その後は、第１の実施形態と同様にして、目的に応じて培養組織や培養細胞を回収することができる。
【００６７】
以上説明したように、本実施形態によれば、第１の実施形態における作用を奏することができるほか、可撓性の袋状体の培養容器５０を用いる場合などにおいて、培養基材保持部材７０を用いることにより、培養容器５０への培養基材６４の出し入れを容易に行うことができる。この結果、袋状体の培養容器５０を用いた場合であっても、培養容器５０から培養基材６４を取り出してから培養組織を回収すればよいため、回収を容易に行えるようになる。また、組織片Ｔの固定化も培養容器の外で行うことができるので、操作がしやすく、容易に行うことができる。さらに、培養基材保持部材や固定具保持部材を使用することによって、培養に供する培養基材や組織片固定具への接触を最小限にすることができるので、培養中や組織回収時のコンタミネーションを効果的に抑制できる。
【００６８】
本実施形態によれば、組織片Ｔを組織片固定具２４の組織片保持部３０で貫通保持するとともに組織片押さえ部３２で押さえて固定するために、培養容器５０を立てた状態で培養しても、組織片は安定して固定される。
【００６９】
なお、本実施形態における培養基材保持部材７０は、本実施形態に示すものに限定するものではなく、各種の形態のものを使用できる。例えば、保持部材７０の固定部としては、培養基材６４に裏面に沿って当接されて培養基材６４を載置して支持する載置部材を備えるようにしてもよい。こうした載置部材は、培養基材６４の裏面に当接されるプレート状であってもよいし、アーム状であってもよい。また、トング状に培養基材６４の端部を挟持する挟持部材を有する保持部材としてもよい。
【００７０】
なお、これらの実施形態においては、図３に例示する組織片固定具２４を用いるものとして主として説明したが、例えば、図８に例示する組織片固定具８４を用いることもできる。この組織片固定具８４は、組織片押さえ部８７から先端部８６とは反対側に突出する突状部８８を備える点が図３に例示する組織片固定部２４と相違している。この突状部８８を備えることで、組織片固定具２４とは異なって容易に手で組織片固定具８４を把持できるようになっている。このため、固定具保持部材なしでも組織片Ｔの固定操作を容易に行えることができるようになる。また、組織片Ｔの回収もこの突状部８８を把持することで容易化される。さらに、この突状部８８を固定具保持部材９０の固定部９２との連結部位として利用できる。この場合、突状部８８内の弾性変形可能な素材部位に奥側が細くなるテーパー状の孔部８８ａを形成し、保持部材９０の固定部９２の棒状の先端部を挿入固定することで、当該先端部を容易に弾性保持でき、組織片Ｔを突き刺した後はアンカー部によって組織片固定具８４が培養面に固定されるため、保持部材９０を引き抜くことによって、保持部材９０を突状部８８から容易に乖離させることができる。また、組織片固定具８４が突状部８８を備えることにより、可撓性の袋状体の培養容器を用いた場合に、組織片Ｔへの変形した培養容器の接触を防止できる。
【００７１】
また、これらの実施形態では、いずれも、単一の先端部を有する組織片固定具を用いるものとしたが、これに限定するものではなく、２個以上の先端部を有する組織片固定具を用いていてもよいし、単一の先端部を有する組織片固定具を２個以上用いることもできる。本発明のように組織片を貫通状態で支持することは、比較的小さい傷害で大きな固定効果が得られるため、複数の先端部により組織片を固定することの傷害性は比較的小さいものと思われる。
【００７２】
また、これらの実施形態においては、いずれも、組織片Ｔを培養面に載置した後に、組織片固定具で培養面に対して固定するものとしたが、組織片Ｔを培養面以外において組織片固定具で突き刺して一旦保持した後、組織片Ｔを保持した状態の組織片固定具を培養面に固定するようにすることもできる。
【００７３】
また、これらの実施形態においては、組織片Ｔを培養面に載置した後、培養面側から組織片固定具を組織片Ｔに突き刺して固定するものとしたが、培養面と反対側、すなわち、培養基材の裏面から組織片固定具を培養基材に設けた孔部等を介して培養基材を貫通させた先端部で組織片Ｔを突き刺して固定してもよい。この場合、培養基材に形成する組織片固定具を固定するための孔部はこうした裏面からの固定に適した形態とされる。さらに、予め所定位置に貫通孔を形成した組織片Ｔを培養面上に組織片固定具で貫通保持して固定するようにしてもよい。
【００７４】
さらに、これらの実施形態では、いずれも組織片固定具を培養基材とは別個の部材としたが、培養基材に予めあるいは組織片固定化前に先端部を培養面から突出させた形態で一体化されるものであってもよい。この場合、組織片Ｔを突出する先端部に組織片Ｔを載置することで先端部にて組織片Ｔを突き刺しさせて貫通させることになる。なお、この場合においては、組織片固定具の先端部以外のアンカー部や組織片押さえ部を設けないことが好ましい。また、培養基材は、組織片固定具の先端部の他端側を固定可能な孔部等を備えている。
【００７５】
また、これらの実施形態では、培養基材及び組織片固定具、また、場合によっては培養容器も備えるキットの構成と使用例としての組織片の培養方法として説明したが、組織片培養に用いる個々の培養器具としても製造し使用することができる。さらに、こうした培養器具の１種類又は２種類以上（具体的には、培養容器と培養基材、培養基材と組織片固定具、培養容器と組織片固定具、少なくとも培養容器と培養基材、さらには組織片固定具）を一体化して備える組織片培養を実施できる培養装置としても実施できる。さらにまた、これらの培養器具を用いた組織片の培養方法及び培養組織の作製方法としても実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明の培養基材と組織片固定具とによる組織片の固定状態を概念的に示す図である。
【図２】第１の実施形態における培養基材の一例を示す図（ａ）及び（ｂ）である。
【図３】第１の実施形態における組織片固定具の一例を示す図であり、組織片固定具と固定具保持部材とを分離して示す図（ａ）及び組織片固定具を固定具保持部材に固定した状態を示す図（ｂ）である。
【図４】第１の実施形態における組織片を培養基材上に載置した状態を示す図（ａ）及び（ｂ）と組織片固定具による固定状態を示す図（ｃ）である。
【図５】第２の実施形態における培養基材及び固定具保持部材の一例を示す図（ａ）及び（ｂ）である。
【図６】第２の実施形態における培養容器の一例を示す図である。
【図７】第２の実施形態における培養基材の培養容器への収容操作を示す図（ａ）及び収容後の状態を示す図（ｂ）である。
【図８】本発明における組織片固定具及び保持部材の他の例を示す図（ａ）とその使用例を示す図（ｂ）である。
【符号の説明】
【００７７】
４，６４  培養基材、６  培養面、１０  孔部、１２  カバー部、１４  ガイド、１６  基部、２、２４、８４  組織片固定具、２６、８６  先端部、２８  アンカー部、３０  組織片保持部、３２、８７  組織片押さえ部、３４  凹部、４０、９０  固定具保持部材、４２  把持部、４４、９２  固定部、４４ａ  係合部、４６  連結部、５０  培養容器、５２  キャビティ、５４  開閉部、５６  注排出部、５８  バルブ、６６  隔壁、７０  培養基材保持部材、７２  把持部、７４  固定部、７６ａ  第１のアーム、７６ｂ  第２のアーム、７８  突起状係合部、８８  突状部。
【図１】
2007049954.tif 000003
【図２】
2007049954.tif 000004
【図３】
2007049954.tif 000005
【図４】
2007049954.tif 000006
【図５】
2007049954.tif 000007
【図６】
2007049954.tif 000008
【図７】
2007049954.tif 000009
【図８】
2007049954.tif 000010