(57)【要約】      （修正有）【課題】抗ガン性白金複合体に耐性を示すガン細胞に対しても、前記複合体の効果を発揮することを可能とするｓｉＲＮＡを提供する。【解決手段】１９塩基対と２塩基の３’末端オーバーハングとからなる２１塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡであり、前記１９塩基対の配列が特定の配列を有する、ＴＢＣＥ遺伝子またはＣＩＴＥＤ２遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡである。前記二本鎖ｓｉＲＮＡを抗ガン性白金複合体と併用することによって、前記複合体に耐性を示すガン細胞においても、前記複合体の抗ガン作用を向上することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１９塩基対と２塩基の３'末端オーバーハングとからなる２１塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡであり、
前記１９塩基対の配列が、配列表の配列番号１から６のいずれかである、ＴＢＣＥ遺伝子またはＣＩＴＥＤ２遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
前記３'末端オーバーハング部分の２塩基の配列が、ＴＴ、ＡＵおよびＡＧからなる群から選択された少なくとも一つの配列である請求項１記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号１から６の配列において、１もしくは数個の塩基が修飾、置換、付加もしくは欠失し、かつ、ＴＢＣＥ遺伝子特異的またはＣＩＴＥＤ２遺伝子特異的なＲＮＡ干渉を誘導する請求項１または２に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
ＴＢＣＥ遺伝子またはＣＩＴＥＤ２遺伝子に特異的な阻害剤であって、請求項１から３のいずれか一項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡを含み、ＲＮＡ干渉によりＴＢＣＥ遺伝子またはＣＩＴＥＤ２遺伝子の発現を特異的に阻害するＴＢＣＥ遺伝子またはＣＩＴＥＤ２遺伝子特異的阻害剤。
【請求項５】
ガン治療用の医薬組成物であって、請求項１から３のいずれか一項に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡを含む医薬組成物。
【請求項６】
さらに、抗ガン性白金複合体を含む請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記抗ガン性白金複合体が、オキサリプラチン、シスプラチン、Ｄｉｐｌａｔｉｎおよびカルボプラチンからなる群から選択された少なくとも一つの複合体である請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
治療対象のガンが、直腸ガン、結腸ガン、睾丸腫瘍、膀胱ガン、腎盂腫瘍、尿管腫瘍、前立腺ガン、卵巣ガン、頭頚部ガン、肺ガン、食道ガン、子宮顎ガン、線維芽細胞種、胃ガン、乳ガン、肝臓ガンおよび悪性リンパ腫からなる群から選択された少なくとも一つである請求項６または７記載の医薬組成物。
【請求項９】
ガン細胞における抗ガン性白金複合体に対する耐性を示すマーカーであって、
ＴＢＣＥ遺伝子のＴＢＣＥｍＲＮＡ、ＣＩＴＥＤ２遺伝子のＣＩＴＥＤ２ｍＲＮＡ、ＴＢＣＥタンパク質、および、ＣＩＴＥＤ２タンパク質からなる群から選択された少なくとも一つのマーカーである耐性マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＢＣＥ遺伝子またはＣＩＴＥＤ２遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、様々なガンの治療薬として、オキサリプラチン等のプラチナを含む薬剤（以下、「抗ガン性白金複合体」ともいう）が臨床に使用されている（特許文献１、特許文献２参照）。しかしながら、これらの抗ガン性白金複合体は、優れた効能が期待されているものの、ガン細胞によっては、前記複合体に耐性を示すものがある。このため、抗ガン性白金複合体を用いた治療において、十分な効果が得られない場合が生じている。
【０００３】
現在、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）技術は、ライフサイエンスの研究において盛んに利用されており、特に、医薬品への応用やガンを含む種々の疾患治療への応用が期待されている。ＲＮＡｉとは、二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって、配列特異的にｍＲＮＡが分解され、その結果、遺伝子発現が抑制される現象をいい、標的遺伝子の発現抑制方法として確立されつつある。
【特許文献１】特表２００５−５１５２号公報
【特許文献２】特開平６−２１１８８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、抗ガン性白金複合体に耐性を示すガン細胞に対してｓｉＲＮＡを使用し、遺伝子レベルで前記耐性による影響を解除することにより、前記抗ガン性白金複合体の効果を発揮させることに着目した。
【０００５】
そこで、本発明は、抗ガン性白金複合体に耐性を示すガン細胞に対しても、前記複合体の効果を発揮することを可能とするｓｉＲＮＡの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明のｓｉＲＮＡは、ＴＢＣＥ遺伝子またはＣＩＴＥＤ２遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡであり、１９塩基対と２塩基の３'末端オーバーハングとからなる２１塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡであって、前記１９塩基対の配列が、配列表の配列番号１から６のいずれかであることを特徴とする。なお、本発明において、前記１９塩基対の配列が配列番号１から３のいずれかの配列であるｓｉＲＮＡは、ＴＢＣＥ遺伝子を標的とし、前記１９塩基対の配列が配列番号４から６のいずれかの配列であるｓｉＲＮＡは、ＣＩＴＥＤ２遺伝子を標的とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明者らは、抗ガン性白金複合体に耐性を示すガン細胞について鋭意研究を重ねた。その結果、（１）抗ガン性白金複合体であるシスプラチンに耐性を示す卵巣ガン細胞（ＫＦＲ）において、Ｔｕｂｌｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  Ｅ（ＴＢＣＥ）遺伝子およびＣＢＰ／Ｐ３００−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＣＩＴＥＤ２）遺伝子の発現量が、感受性卵巣ガン細胞（ＫＦ−１）と比較して、特異的に増加していること、ならびに、（２）抗ガン性白金複合体であるオキサリプラチンに耐性を示す胃ガン細胞（ＭＫＮ７４）において、ＴＢＣＥ遺伝子およびＣＩＴＥＤ２遺伝子の発現量が、感受性胃ガン細胞（ＭＫＮ２８）と比較して、特異的に増加していることをそれぞれ見出した。そこで、本発明者らは、これらの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを設計し、これと共に抗ガン性白金複合体を前記耐性ガン細胞に投与することによって、抗ガン性白金複合体による効果を向上できることを確認し、本発明に到達した。なお、ＴＢＣＥ遺伝子およびＣＩＴＥＤ２遺伝子と、抗ガン性白金複合体に対するガン細胞の耐性との関係は、本発明者らが初めて見出したことである。
【０００８】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡによれば、抗ガン性白金複合体に対する耐性ガン細胞であっても、ＲＮＡｉ効果によりＴＢＣＥ遺伝子やＣＩＴＥＤ２遺伝子の発現を抑制できるため、これによって前記耐性ガン細胞の抗ガン性白金複合体に対する耐性能を抑制できる。このため、前記抗ガン性白金複合体の効果を前記耐性ガン細胞に対しても十分に発揮させることができる。したがって、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡによれば、抗ガン性白金複合体の十分な効果を発揮できなかった耐性ガン細胞に対しても適用が可能となるため、ガンの治療、ガン治療用の医薬組成物等として、臨床面で極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明における二本鎖ｓｉＲＮＡは、前述のように、ＴＢＣＥ遺伝子またはＣＩＴＥＤ２遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡであり、１９塩基対と２塩基の３'末端オーバーハングとからなる２１塩基の二本鎖ｓｉＲＮＡであり、前記１９塩基対の配列が、配列表の配列番号１から６のいずれかであることを特徴とする。
【００１０】
ＴＢＣＥ遺伝子およびＣＩＴＥＤ２遺伝子としては、好ましくはヒトＴＢＣＥ遺伝子、ヒトＣＩＴＥＤ２遺伝子である。ＴＢＣＥ遺伝子の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０７９５１５及びＮＭ＿００３１９３等から入手可能である。また、ＣＩＴＥＤ２遺伝子の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６０７９等から入手可能である。
【００１１】
本発明において、「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡｉを媒介可能な短鎖のＲＮＡ分子であって、一般には、２１塩基〜２７塩基の二本鎖低分子ＲＮＡをいう。
【００１２】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡとしては、ＴＢＣＥ遺伝子を標的とする３種類の二本鎖ｓｉＲＮＡ、ＣＩＴＥＤ２遺伝子を標的とする３種類の二本鎖ｓｉＲＮＡがあげられる。これらのｓｉＲＮＡは、それぞれ、１９塩基対と２塩基の３'末端オーバーハングとからなる二本鎖ｓｉＲＮＡである。ＴＢＣＥ遺伝子を標的とする２本鎖ｓｉＲＮＡにおける前記１９塩基対の配列、および、ＣＩＴＥＤ２遺伝子を標的とする２本鎖ｓｉＲＮＡにおける前記１９塩基対の配列を、下記表１にそれぞれ示す。表１において、左欄が、それぞれのｓｉＲＮＡのコードネームであり、中欄が、ｓｉＲＮＡにおける１９塩基対の配列、右欄が、配列表の配列番号を示す。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
本発明の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡにおいて、前記３'末端のオーバーハングとは、５'末端から１９ｍｅｒが相補的な配列である２本の２１ｍｅｒのＲＮＡ鎖が対合して二本鎖を形成したとき、１９塩基対の両端から突出する３'末端の２ｍｅｒの部分をいう。前記３'末端オーバーハングの２塩基の配列は、特に制限されないが、ＴＴ（−チミン・チミン）、ＡＵ（−アデニン・ウラシル）、ＡＧ（−アデニン・グアニン）等があげられる。また、ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖におけるオーバーハング部分が、同じ塩基配列でも、異なる塩基配列でもよい。例えば、センス鎖のオーバーハングがＡＧ、アンチセンス鎖のオーバーハングがＡＵでもよいし、センス鎖のオーバーハングがＡＵ、アンチセンス鎖のオーバーハングがＡＧでもよい。
【００１５】
なお、前記３’オーバーハングの２塩基の配列は、これに制限されず、ＲＮＡｉ効果や細胞増殖抑制効果に実質的に影響を及ぼさない範囲であれば、任意の天然核酸塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシシル）、並びに、天然及び人工の公知の修飾塩基であってもよい。また、前記３’末端オーバーハング部分のヌクレオチドは、通常、リボヌクレオチドを使用できるがこれに制限されず、ＲＮＡｉ効果や細胞増殖抑制効果に実質的に影響を及ぼさない範囲であれば、デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、その他の公知のヌクレオチド類似体を使用してもよい。さらに、本発明の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡは、必要に応じて、前記３’末端オーバーハングに代えて、５’末端オーバーハングとしてもよい。
【００１６】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、例えば、その他の態様として、前記表１の配列番号１から６の配列において、１又は数個の塩基が修飾、置換、付加若しくは欠失し、かつ、ＴＢＣＥ遺伝子特異的またはＣＩＴＥＤ２遺伝子特異的なＲＮＡ干渉を誘導する二本鎖ｓｉＲＮＡがあげられる。前記数個とは、例えば、２、３、４個である。
【００１７】
本発明の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡの１９塩基対の配列は、前記表１に記載のとおりであるが、この中でも、ＴＢＣＥ−３、ＣＩＴＥＤ２−６が好ましい。また、これらのｓｉＲＮＡは、いずれか一種類を使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００１８】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの製造方法は、インビトロで化学的又は酵素的に合成してもよく、また、インビボで合成してもよく、特に制限されないが、従来公知の方法により化学合成して製造することが好ましい。合成二本鎖ｓｉＲＮＡであれば、例えば、濃度調節が容易であり、また、コンタミネーションの防止が容易であるため、安全性においても利点がある。例えば、本発明の２１塩基オーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡのＴＢＣＥ−３を製造する場合、まず、配列番号３の配列の３’末端に２塩基のオーバーハングを加えた２１ｍｅｒのＲＮＡ鎖と、前記配列番号３の配列と相補的な配列の３’末端に２塩基のオーバーハングを加えた２１ｍｅｒのＲＮＡ鎖とをそれぞれ化学合成する。次に、前記２本のＲＮＡ鎖が対合する条件で対合させ、２１塩基のオーバーハング二本鎖ｓｉＲＮＡを得る。使用に際しては、必要に応じて、従来公知の方法により適宜精製することが好ましい。
【００１９】
このように、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、配列表の配列番号１から６のいずれかの配列およびその相補配列に、それぞれ２塩基のオーバーハングを加えた２本のＲＮＡ鎖を合成する合成工程と、合成した前記２本のＲＮＡ鎖を対合して二本鎖ＲＮＡとする対合工程とを含む製造方法により製造できる。
【００２０】
次に、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡの使用方法について説明する。本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡは、インビトロにおいて細胞や組織に対して使用できることに加えて、ヒトやヒトを除く哺乳類に対して臨床への応用が可能である。ヒトへの投与方法は、特に制限されず、目的部位に応じて、例えば、患部への注射、局所投与、患部や皮下へ埋め込む外科的処置等による投与が選択できる。また、投与部位に応じた従来公知のデリバリーシステムを利用してもよい。さらに、必要に応じて、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを発現するｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、遺伝子治療技術を利用したデリバリーシステムを利用することもできる。
【００２１】
したがって、本発明の他の形態としては、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを使用することを特徴とするガンの治療方法があげられる。治療対象としては、特に制限されないが、ヒトおよびヒトを除く哺乳類等があげられ、ガン細胞としては、後述の通りである。
【００２２】
つぎに、本発明の阻害剤は、ＴＢＣＥ遺伝子またはＣＩＴＥＤ２遺伝子特異的阻害剤であって、本発明の前記二本鎖ｓｉＲＮＡを含み、ＲＮＡ干渉によりＴＢＣＥ遺伝子またはＣＩＴＥＤ２遺伝子の発現を特異的に阻害することを特徴とする。本発明の阻害剤は、インビトロ、インビボのいずれで使用してもよく、その形態も特に制限されない。
【００２３】
本発明の医薬組成物は、ガン治療用の医薬組成物であって、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを含む医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡが、抗ガン性白金複合体に対する耐性を抑制することで、前記白金複合体の効果を発揮させることができる。このため、本発明の医薬組成物は、さらに抗ガン性白金複合体を含むことが好ましい。前記抗ガン性白金複合体としては、例えば、オキサリプラチン（以下、「Ｌ−ＯＨＰ」という）、シスプラチン（以下、「ＣＤＤＰ」という）、Ｄｉｐｌａｔｉｎ、カルボプラチン等があげられる。Ｄｉｐｌａｔｉｎは、オキサリプラチンをシスプラチンと反応させることによって合成した抗ガン性白金複合体であって、（ｃｉｓ−ｄｉａｍｍｉｎｅ）（ｌ−１，２−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｄｉａｍｉｎｅ）（ｍｕ−ｄｉｃｈｌｏｒｏ）−ｄｉｐｌａｔｉｎｕｍ（ＩＩ）ｏｘａｌａｔｅ、又は、［Ｐｔ2Ｃｌ2（ＮＨ3）2（Ｌ−ｄａｃｈ）］（ＣＯＯ）2（Ｌ−ＯＨＰ／ＣＤＤＰ）で表される。なお、Ｌ−ｄａｃｈとは、１Ｒ，２Ｒ−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｄｉａｍｉｎｅである。
【００２４】
本発明の医薬組成物において、治療対象となるガンは、特に制限されず、例えば、使用する抗ガン性白金複合体の種類に応じて適宜決定できる。具体例としては、直腸ガン、結腸ガン、睾丸腫瘍、膀胱ガン、腎盂腫瘍、尿管腫瘍、前立腺ガン、卵巣ガン、頭頚部ガン、肺ガン、食道ガン、子宮顎ガン、線維芽細胞種、胃ガン、乳ガン、肝臓ガン、悪性リンパ腫等があげられる。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、さらに、薬学的に許容されるキャリアを含んでもよい。前記薬学的キャリアとしては、特に制限されないが、例えば、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡが、標的の部位、組織、細胞等に侵入する効率を高めることができるキャリア（例えば、リポソーム、カチオンリポソーム等）があげられる。本発明の医薬組成物の剤形は、特に制限されず、例えば、注射剤、クリーム剤、軟膏、錠剤、懸濁剤等があげられる。また、投与方法も特に制限されず、例えば、注射、経口、局所、鼻内、直腸投与等があげられる。
【００２６】
つぎに、本発明のマーカーは、ガン細胞における抗ガン性白金複合体に対する耐性を示すマーカーであって、ＴＢＣＥ遺伝子のＴＢＣＥｍＲＮＡ、ＣＩＴＥＤ２遺伝子のＣＩＴＥＤ２ｍＲＮＡ、ＴＢＣＥタンパク質、および、ＣＩＴＥＤ２タンパク質からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする。本発明において「マーカー」とは、ガン細胞の抗ガン性白金複合体に対する耐性の目印になる物質を意味する。ＴＢＣＥｍＲＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０７９５１５及びＮＭ＿００３１９３に登録されている。また、ＣＩＴＥＤ２ｍＲＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６０７９に登録されている。
【００２７】
本発明のマーカーの使用方法は、被検試料を準備する準備工程と、前記被検試料中における本発明のマーカーを検出する検出工程と、前記マーカーが陽性か否かを判定する判定工程とを含む。本発明において「陽性」とは、マーカーの測定値が、所定のしきい値より大きいことを意味する。このしきい値は、例えば、抗ガン性白金複合体に対する耐性ガン細胞と感受性ガン細胞とにおけるマーカーを測定し、これを統計的に処理することによって求めることができる。例えば、抗ガン性白金複合体（ＣＤＤＰ）に耐性を示す卵巣ガン細胞（ＫＦＲ）は、感受性卵巣ガン細胞（ＫＦ−１）に比べて、ＴＢＣＥｍＲＮＡの発現量が約１３倍程度高く、ＣＩＴＥＤ２ｍＲＮＡの発現量が約２倍程度高くなるため、この値をしきい値とすることもできる。したがって、例えば、被検試料におけるｍＲＮＡマーカーの発現量を測定すれば、抗ガン性白金複合体に耐性（陽性）であるか、感受性（陰性）であるかを判定することが可能である。
【００２８】
マーカーの検出手段としては、特に制限されないが、ｍＲＮＡの検出の場合、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、ドットプロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、マイクロアレイを用いる方法、リアルタイムＰＣＲ法等のＰＣＲを利用する方法等、従来公知の方法があげられる。タンパク質の検出の場合は、例えば、特異的な抗体を用いた免疫学的測定方法（例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、サンドウィッチＥＬＩＳＡ、免疫組織化学染色等）等があげられる。
【００２９】
本発明の検出キットは、本発明のマーカーを検出するための検出キットであって、前記ＴＢＣＥｍＲＮＡまたはＣＩＴＥＤ２ｍＲＮＡを検出するためのプローブ及びプライマーの少なくとも一方であるポリヌクレオチド、および、前記ＴＢＣＥタンパク質またはＣＩＴＥＤ２タンパク質を検出するための抗体からなる群から選択される少なくとも一つを含む検出キットである。
【００３０】
以下に、本発明について、実施例を用いて説明する。
【実施例１】
【００３１】
ＴＢＣＥ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡまたはＣＩＴＥＤ２遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡと共に、抗ガン性白金複合体を耐性ガン細胞に投与し、抗ガン性白金複合体の効果の向上を確認した。なお、抗ガン性白金複合体としては、Ｌ−ＯＨＰおよびＤｉｐｌａｔｉｎを使用した。耐性ガン細胞としては、ＣＤＤＰ耐性卵巣ガン細胞（ＫＦＲ）を使用した。
【００３２】
（ｓｉＲＮＡ）
使用した二本鎖ｓｉＲＮＡについて、１９塩基対の配列とオーバーハング部分の２塩基の配列とを、下記表２および表３に示す。下記表２は、ＴＢＣＥ遺伝子を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ、表３は、ＣＩＴＥＤ２遺伝子を標的とする２本鎖ｓｉＲＮＡの配列である。また、表２および３において、コードネームとは、それぞれのｓｉＲＮＡのコードネームであり、コードネームにおいて「Ｓ」がセンス鎖、「ＡＳ」がアンチセンス鎖を示し、「ＯＨ」とは、３'末端のオーバーハングの２塩基を示し、配列番号とは、１９塩基対の配列番号を示す。
【００３３】
【表２】
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【００３４】
【表３】
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【００３５】
（抗ガン性白金複合体溶液）
Ｌ−ＯＨＰを溶媒に混合し、Ｌ−ＯＨＰ液を調製した。また、Ｄｉｐｌａｔｉｎを溶媒に混合し、Ｄｉｐｌａｔｉｎ液を調製した。
【００３６】
（方法）
細胞へのｓｉＲＮＡトランスフェクションは、ＱＩＡＧＥＮ社のＲＮＡｉ  Ｓｔａｒｔｅｒ  ｋｉｔを用いて、そのプロトコールに従って行った。
【００３７】
まず、トランスフェクション前日、細胞を培地に懸濁し、懸濁液０．５ｍｌを２４ウェルプレートに撒き、５％ＣＯ2雰囲気下で培養した。
【００３８】
トランスフェクション当日、１μｇのｓｉＲＮＡを培地で１００μｌに希釈し、これに前記キットの試薬ＲＮＡｉＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（６μｌ）を混合した。この混合液を、トランスフェクションコンプレックス形成のため、室温で１０〜１５分間インキュベートした。他方、細胞を培養しているプレートのウェルより培地を吸引除去し、新たな培地３００μｌを添加した。そして、ウェル中の細胞に、インキュベートにより得られたトランスフェクションコンプレックス（１滴）と、抗ガン性白金複合体溶液とを添加し、プレートを静かにまわしてトランスフェクションコンプレックスと抗ガン性白金複合体の分布を均一にした。そして、５％ＣＯ2雰囲気下、細胞をトランスコンプレックスとインキュベートした。そして、細胞の生存率を確認した。
【００３９】
ｓｉＲＮＡは、ＴＢＣＥ−１、ＴＢＣＥ−２、ＴＢＣＥ−３、ＣＩＴＥＤ２−４、ＣＩＴＥＤ２−５、ＣＩＴＥＤ２−６をそれぞれ単独で、または、２種類もしくは３種類組合せて使用した。ｓｉＲＮＡを２種類以上組合せた場合には、合計１μｇのｓｉＲＮＡを培地で１００μｌに希釈した。
【００４０】
トランスフェクションコンプレックスおよび抗ガン性白金複合体溶液を添加しない以外は同様に培養を行ったものをコントロールとし、トランスフェクションコンプレックスを添加しない以外は同様に培養を行ったものを比較例とした。そして、コントロールの生存細胞を１００％とした場合の相対的な割合を生存率（％）とした。この結果を図１および図２のグラフに示す。図１は、ｓｉＲＮＡとＬ−ＯＨＰ(0.2μg/ml)を併用した際のＫＦＲ細胞の生存率を示すグラフである。また、図２は、ｓｉＲＮＡとＤｉｐｌａｔｉｎ(4μg/ml)を併用した際のＫＦＲ細胞の生存率を示すグラフである。また、両図において「ｓｉＲＮＡ（−）」は、抗ガン性白金複合体を添加し、ｓｉＲＮＡを添加していない比較例である。
【００４１】
両図に示すように、ＴＢＣＥ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡまたはＣＩＴＥＤ２遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを、Ｌ−ＯＨＰまたはＤｉｐｌａｔｉｎと併用した場合、コントロールおよび比較例ｓｉＲＮＡ（−）に比べて、細胞の生存率が減少した。すなわち、ｓｉＲＮＡとの併用によって、Ｌ−ＯＨＰやＤｉｐｌａｔｉｎに対する耐性が抑制され、効率よく抗ガン作用が発揮されているといえる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
以上のように、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡによれば、抗ガン性白金複合体に対する耐性ガン細胞であっても、ＲＮＡｉ効果によりＴＢＣＥ遺伝子やＣＩＴＥＤ２遺伝子の発現を抑制し、これによって前記耐性ガン細胞の抗ガン性白金複合体に対する耐性能を抑制できる。このため、前記抗ガン性白金複合体の効果を前記耐性ガン細胞に対しても十分に発揮させることができる。したがって、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡによれば、抗ガン性白金複合体の十分な効果を発揮できなかった耐性ガン細胞に対しても適用が可能となるため、ガンの治療、ガン治療用の医薬組成物等として、臨床面で極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを併用することによるＬ−ＯＨＰの抗ガン作用を、細胞の生存率により確認した結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡを併用することによるＤｉｐｌａｔｉｎの抗ガン作用を、細胞の生存率により確認した結果を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００４４】
配列番号１  オーバーハングｓｉＲＮＡ  ＴＢＣＥ−１
配列番号２  オーバーハングｓｉＲＮＡ  ＴＢＣＥ−２
配列番号３  オーバーハングｓｉＲＮＡ  ＴＢＣＥ−３
配列番号４  オーバーハングｓｉＲＮＡ  ＣＩＴＥＤ２−４
配列番号５  オーバーハングｓｉＲＮＡ  ＣＩＴＥＤ２−５
配列番号６  オーバーハングｓｉＲＮＡ  ＣＩＴＥＤ２−６
【図１】
2007275052.tif 000006
【図２】
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【配列表】
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