(57)【要約】【課題】樹木等の植物からのサンプリングが容易であり、その際に植物に与える影響も少なく、簡単な前処理操作によって分析用サンプルの調製ができ、しかも、分析用サンプル中の微量のサイトカラシンＥを、簡易な測定手段によって、正確に且つ精度よく検出することができる、植物中のサイトカラシンＥの分析方法を提供し、これによって植物病害による被害を未然に防ぐことが可能な植物病害診断方法を提供すること。【解決手段】植物サンプルからサイトカラシンＥを抽出して分析用サンプルを得る前処理工程で少なくとも酢酸エチルを用い、得られた分析用サンプルをＨＰＬＣで分析し、上記サンプル中に含まれるサイトカラシンＥを測定する植物中のサイトカラシンＥの分析方法、及びこれを用いた植物病害診断方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物サンプルからサイトカラシンＥを抽出して分析用サンプルを得る前処理工程で少なくとも酢酸エチルを用い、得られた分析用サンプルを高速液体クロマトグラフで分析し、上記サンプル中に含まれるサイトカラシンＥを測定することを特徴とする植物中のサイトカラシンＥの分析方法。
【請求項２】
更に、高速液体クロマトグラフで分析を行う前に、分析用サンプルを分子インプリントカラムで分離する請求項１に記載の植物中のサイトカラシンＥの分析方法。
【請求項３】
高速液体クロマトグラフの分離カラムに分子インプリントカラムを用いる請求項１に記載の植物中のサイトカラシンＥの分析方法。
【請求項４】
前記サイトカラシンＥの測定を、ＵＶ検出器或いは質量分析計を用いて行う請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物中のサイトカラシンＥの分析方法。
【請求項５】
前記酢酸エチルを、植物サンプルからのサイトカラシンＥの抽出処理に用いるか、或いは、アルコール系又はエステル系の有機溶剤で植物サンプルからのサイトカラシンＥを抽出して得た抽出液を濃縮後、再溶解する際に用いる請求項１〜４のいずれか１項に記載の植物中のサイトカラシンＥの分析方法。
【請求項６】
前記植物サンプルが、樹木の幹或いは枝の地面からの高さ８０〜１００ｃｍの位置から採取した木片を粉砕した粉砕物である請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物中のサイトカラシンＥの分析方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のサイトカラシンＥの分析方法で植物中のサイトカラシンＥを検出し、該検出結果により植物への白紋羽病の感染程度を診断することを特徴とする植物病害診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物中のサイトカラシンＥ（Cytochalasin  Ｅ）の分析方法及び植物病害診断方法に関し、より詳しくは、果樹等の植物の白紋羽病への感染程度を早期に診断することを可能とする植物中のサイトカラシンＥの分析方法及び植物病害診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の根に寄生して、自ら分泌する毒性代謝産物によって植物を衰弱・枯死させる土壌伝染性の菌が存在する。その中でも近年、白紋羽菌（Rosellinia necatrix Prillieux）に起因する白紋羽病による被害が多く見受けられ、これによる経済的被害は年々深刻化している。白紋羽病は、リンゴ、ナシ、モモ、ブドウ、ウメ、サクランボ、ビワ、イチジク、カキ、及びクリなどほとんど全ての果樹、或いはサツマイモなどの草本植物で感染が確認されている。白紋羽病は、特に果樹園で、一本の樹木が白紋羽病に感染した場合、土壌を介して他の樹木へと感染が拡大する可能性が高く、その被害は甚大となる。そうした事態に陥らないようにするためには、早期に白紋羽病の感染を発見し、対策を施すことが重要である。白紋羽病の感染木は、外観調査で異常が認められた場合には、すでに感染がかなり進行しており手遅れであるとされている。
【０００３】
このため、白紋羽病の感染の早期発見方法の技術が要望されているが、感染初期における植物の根に寄生した白紋羽菌の検出は容易ではない。特に、サンプリングするためには根を掘り返す必要があり、非常に煩雑であるばかりでなく、検出操作そのものが植物の生育に多大な影響を及ぼすという問題がある。従って、前処理操作が容易で、植物の生育への影響が少なく、しかも、早期の段階で、白紋羽病の感染程度を簡易に且つ正確に診断できる手法が確立されれば、その被害が甚大な果樹等の白紋羽病害を未然に防ぐことができ、その経済的な効果は多大なものとなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ここで、白紋羽菌の代謝産物である下記の構造式（１）で表わされるサイトカラシンＥは、白紋羽病の発症に関与すると言われている。
2007187653.tif 000002
【０００５】
このため、樹木等の根部より侵入した白紋羽菌が、徐々に樹木等に浸食する過程で自ら分泌し、樹木内に吸収されると考えられる二次代謝物質であるサイトカラシンＥの微量測定ができれば、感染の初期段階で、植物の白紋羽病に対する感染程度を知ることが可能になる。特に、植物からのサンプリングが容易であり、植物に対する影響も少なく、簡単な前処理操作によって分析用サンプルが調製でき、しかも、分析用サンプル中の微量のサイトカラシンＥを簡易な測定手段によって、正確に且つ精度よく検出できれば、白紋羽病の感染の早期診断が可能となり、果樹等の植物の白紋羽病害を未然に防ぐ有力な手段となり得る。
【０００６】
従って、本発明の目的は、果樹等の植物からのサンプリングが容易であり、その際に植物に与える影響も少なく、簡単な前処理操作によって分析用サンプルの調製ができ、しかも、分析用サンプル中の微量のサイトカラシンＥを、簡易な測定手段によって、正確に且つ精度よく検出することができる、植物中のサイトカラシンＥの分析方法を提供することである。また、本発明の最終的な目的は、植物中のサイトカラシンＥを簡易に分析することで、特に、早期における白紋羽病の感染を発見し、これによって果樹園等で発生する植物病害による甚大な被害を未然に防ぐことが可能な植物病害診断方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題は以下の本発明によって達成される。すなわち、本発明の分析方法の第１の形態は、植物サンプルからサイトカラシンＥを抽出して分析用サンプルを得る前処理工程で少なくとも酢酸エチルを用い、得られた分析用サンプルを高速液体クロマトグラフで分析し、上記サンプル中に含まれるサイトカラシンＥを測定することを特徴とする植物中のサイトカラシンＥの分析方法である。
【０００８】
また、本発明の分析方法の第２の形態は、上記において、更に、高速液体クロマトグラフで分析を行う前に、分析用サンプルを分子インプリントカラムで分離する植物中のサイトカラシンＥの分析方法である。
【０００９】
また、本発明の分析方法の第３の形態は、上記において、高速液体クロマトグラフの分離カラムに分子インプリントカラムを用いる植物中のサイトカラシンＥの分析方法である。
【００１０】
また、本発明の好ましい形態としては、下記の方法が挙げられる。上記第１〜３の形態において、サイトカラシンＥの測定を、ＵＶ検出器或いは質量分析計を用いて行う植物中のサイトカラシンＥの分析方法。上記第１〜３の形態において、酢酸エチルを、植物サンプルからのサイトカラシンＥの抽出処理に用いるか、或いは、アルコール系又はエステル系の有機溶剤で植物サンプルからのサイトカラシンＥを抽出して得た抽出液を濃縮後、再溶解する際に用いる植物中のサイトカラシンＥの分析方法。上記第１〜３の形態において、植物サンプルが、樹木の幹或いは枝の地面からの高さ８０〜１００ｃｍの位置から採取した木片を粉砕した粉砕物である植物中のサイトカラシンＥの分析方法。
【００１１】
また、本発明の別の実施形態は、上記のいずれかに記載のサイトカラシンＥの分析方法で植物中のサイトカラシンＥを検出し、該検出結果により植物への白紋羽病の感染程度を診断することを特徴とする植物病害診断方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の植物中のサイトカラシンＥの分析方法によれば、果樹等の植物からのサンプリングが容易であり、植物に与える影響も少なく、更に簡単な前処理操作によって分析用サンプルの調製ができ、しかも、分析用サンプル中の微量のサイトカラシンＥを、簡易な測定手段によって、正確に、高感度で精度よく検出することができる。また、本発明の分析方法によって、白紋羽菌が産生した植物中のサイトカラシンＥを簡易に検出することで、特に、白紋羽病への感染程度を早期に診断できる結果、果樹園等で生じる植物病害による甚大な被害を未然に防ぐことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
次に、発明を実施するための最良の形態を挙げて本発明を更に詳細に説明する。本発明者らは、上記した従来技術の課題に対して、その被害が甚大となる果樹を代表として検討を行った。そして、サイトカラシンＥの微量分析を、高感度で、繰り返し精度よく、正確に行うことのできる分析方法の検討、白紋羽病に対する感染程度の早期診断を可能にする樹木サンプルのサンプリング方法の検討、樹木からサンプリングした樹木サンプルからのサイトカラシンＥを抽出して分析用サンプルを調製する前処理方法の検討、更には、分析用サンプル中におけるサイトカラシンＥの分析結果と、実際の感染木の感染程度との相関についての検討を行った結果、本発明に至ったものである。
【００１４】
以下、本発明にかかる分析方法を特徴づける分析用サンプルを得るための前処理方法について説明する。この前処理方法を採用することで、調製後の分析用サンプルを、高速液体クロマトグラフ（以下、ＨＰＬＣと略す）や分子インプリントカラム等の方法を用いて分析した場合に、微量なサイトカラシンＥの検出を、安定して、精度よく正確に測定することが可能となる。
【００１５】
検討に先立ち、ＵＶ検出器が装着されたＨＰＬＣを用いてサイトカラシンＥの定量法の確立を行った。前記式（１）で表わされるサイトカラシンＥはそれ自体は公知の物質であり、試薬として入手可能である。しかしながら、酸で処理した場合、分解することが懸念され、安定した定量をするためには、予め、測定条件を確立しておくことが必要である。本発明者らは、市販のサイトカラシンＥを用いて、ＨＰＬＣによって安定したサイトカラシンＥの定量分析が可能であるか否かについて検討した。この結果、先ず、サイトカラシンＥは、酸で処理した場合に分解するが、著しく早く分解することはなく、十分に分析の対象物質になり得る物質であることを確認した。
【００１６】
更に、ＨＰＬＣ分析の測定条件としては、メタノールと水を移動相として、逆相カラムで、検出波長２８０〜２８３ｎｍとすることが有効であり、０．１〜１．０ｍＭの範囲でサイトカラシンＥの定量が可能であることを確認できた。また、サンプルのカラム内での吸着を防ぐため、移動相に塩酸、酢酸、トリフルオロ酢酸などの酸を少量添加することができるが、本発明にかかる方法においては、０．１％程度の酸を添加することが有効であることがわかった。中でも特に、０．１％程度の酢酸を添加することが有効であった。このようにすれば、ＨＰＬＣ分析結果において、サイトカラシンＥのピーク位置が、非常に再現性のよいものとなる。更に、移動相のメタノールと水の２つの溶離液の混合比率を変化させて測定を行うグラジエント法を採用し、長めの時間をかけて測定することによって、良好な状態で定量が可能となることもわかった。
【００１７】
上記では、ＨＰＬＣの検出器としてＵＶを用いた場合について説明したが、本発明はこの方法に限定されない。例えば、ＨＰＬＣの検出器として、ＵＶに比べて、より高感度で高選択の検出が可能な質量分析計（以下、ＭＳと略す）を用いたＨＰＬＣ／ＭＳ分析法、或いはＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法によれば、より迅速に且つより微量のサイトカラシンＥの検出をすることが可能となる。より高感度で測定できる方法を開発することは、感染のより初期段階で、植物病害診断ができるようになることを意味する。この際に使用するＭＳとしては、例えば、医薬や食品や環境の分野で広く用いられているＨＰＬＣ用の検出器を用いることができる。サイトカラシンＥの検出には、４９６．３（Ｍ＋Ｈ)+ｍ／ｚに現れるＭＳスペクトルを使用すればよい。ＨＰＬＣ／ＭＳ分析法、或いはＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析法によれば、ＵＶ検出器によるよりも１，０００〜１０，０００倍程度の高感度の検出が可能となる。このことは、より早期における白紋羽病の感染を検知できることを意味する。
【００１８】
更に、より高感度の分析を目的として、本発明者らが開発した分子インプリント技術の利用について検討した。ここで、分子インプリント技術について簡単に説明する。分子インプリント法によれば、機能性モノマーを用いて高分子内に標的とする対象物質の鋳型を形成し、対象とする物質の分子の形状や化学的な性質を高分子内に記憶させることができ、これにより優れた人工認識材料（分子インプリントポリマー）が提供される。この技術を用いて、サイトカラシンＥを認識できる分子インプリントポリマーを製造して、これをＨＰＬＣのカラムに充填して使用すれば、種々の物質を含有している木片サンプルからの抽出物である分析サンプルから、サイトカラシンＥを迅速且つ確実に分離することができるようになる。また、ＨＰＬＣの分析に先立ち、分子インプリントポリマーを分子篩として用いることで、分析用サンプル中のサイトカラシンＥの濃度を高めれば、より高感度でサイトカラシンＥの分析が可能となる。
【００１９】
サイトカラシンＥを分離する分子インプリントポリマーは、例えば、図７に模式的に示したような方法で製造することができる。先ず、認識させたいサイトカラシンＥ分子と、該分子と相互作用可能な官能基をもつ機能性モノマーとを相互作用させた状態で架橋剤を加えて重合させる。サイトカラシンＥは、いくつかの水素結合可能な部位を有するので、上記において使用する機能性モノマーとしては、水素結合が可能なカルボキシル基やピリジル基、尿素誘導体等をもつ重合性モノマーを挙げることができる。上記の重合後、洗浄することでポリマーからサイトカラシンＥ分子を除去する。この結果、機能性モノマー由来の官能基がサイトカラシンＥと結合するのに適した位置と角度を保って形成された相補的な結合部位を有する分子インプリントポリマーが得られる。
【００２０】
上記のようにして得られたサイトカラシンＥ認識ポリマー材料をステンレスカラムへ充填して、ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析システムに組み込めば、効率的な短時間分析が可能となる。そして、このような分析法によれば、ＵＶ検出器によるよりも１，０００〜１０，０００倍程度の高感度の検出が可能である。これらのことは、更に早期における白紋羽病の感染の検知が可能となることを意味している。
【００２１】
先に述べたように、白紋羽菌は、植物の根に寄生して自ら分泌する毒素により植物を衰弱・枯死させる土壌微生物であるが、植物の根からサンプルを採取することは、非常に困難である。また、植物の生育への影響も避けられない。サイトカラシンＥは、樹木等の根部より侵入した白紋羽菌が、徐々に樹木等に浸食する過程で分泌され、樹木内に吸収されると考えられる。そこで、樹木からサンプリングした木片サンプルを使用して分析を行うことについての検討を行った。
【００２２】
本発明者らは、実際に、白紋羽病に感染している樹木からサイトカラシンＥの検出ができるか否かについての検討を行った。その結果、樹木の幹或いは枝の地面からの高さ８０〜１００ｃｍの、比較的に根に近い位置から採取した木片をサンプルとして使用し、特定の前処理を行って分析用サンプルを調製することが有効であることがわかった。すなわち、このようにすれば、樹木からのサンプリングが容易であり、樹木の生育への影響も少なく、しかも、後述する前処理方法で分析用サンプルを調製し、先述したような検出方法で測定すれば、サイトカラシンＥを定量できることがわかった。
【００２３】
ＨＰＬＣで測定するためには、分析用サンプルは液状であることを要する。このため、上記のようにして採取した木片サンプルについて前処理することが必要となる。そこで、有機溶剤で、木片からサイトカラシンＥを抽出して液状の分析用サンプルを調製する前処理操作について鋭意検討を行った。この結果、下記に説明する第１或いは第２の方法によって前処理し、得られた分析用サンプルを用いることで、正確で且つ精度のよい迅速な分析が可能となることが確認できた。
【００２４】
先ず、木片を粉砕して粉砕物とし、得られた粉砕物を有機溶剤で抽出する方法について検討した。この結果、前処理工程で酢酸エチルを使用することが有効であることを見いだした。具体的には、下記の２方法が有効であり、特に、第２の方法によれば、より迅速な前処理が可能であり、簡易分析が行えることがわかった。図１及び図２に、それぞれ、第１及び第２の方法のフローチャートを示した。
【００２５】
図１に示した第１の方法では、先ず、木材サンプルを粉砕機等で充分に粉砕し、これをアセトン等のエステル系の有機溶剤中に入れて、振とう機にかけて抽出処理を行う。この際の有機溶剤の量は限定されず、抽出効率と、その後に、減圧下で有機溶剤を除去する減圧濃縮操作の効率との兼ね合いで決定すればよい。具体的には、例えば、粉砕物２ｇに対して、アセトン２００ミリリットル程度で、１〜４時間、抽出処理を行い、その後の処理をすることで、前記した分析方法に使用する分析用サンプルを調製できる。本発明にかかる方法では、このように、少量の木材サンプルを使用するだけでサイトカラシンＥの微量分析が可能であるため、果樹等の幹や枝から木材サンプルを採取したとしても、樹木の生育への影響は少なくてすむ。上記においては、抽出溶剤にアセトンを使用した例を示したが、本発明はこれに限定されず、その他のエステル系の溶剤、或いは、アルコール系の有機溶剤を使用することもできる。具体的には、メタノール等を使用することができる。
【００２６】
次に、上記した抽出処理の終了後、ロータリーエバポレータでこれを減圧濃縮する。その後、濃縮物を酢酸エチルに再溶解後、濾過して、再度、ロータリーエバポレータで減圧濃縮する。そして、最終的にメタノールに溶解して、これをＨＰＬＣ用の分析用サンプルとする。
【００２７】
図３は、無感染木を用いて、上記した第１の方法で抽出処理を行い、得られた分析用サンプルに、市販のサイトカラシンＥを適宜に添加して検量線を作成した結果である。図３に示したように、木材抽出液のような複雑な系でも、先に述べた測定条件でＨＰＬＣ−ＵＶの分析を行えば、サイトカラシンＥについての検量線の作成が可能であり、これを用いれば、木片中に存在するサイトカラシンＥの定量が可能となることが確認できた。
【００２８】
図２は、上記した第１の前処理方法よりも、より簡易な第２の前処理方法のフローチャートである。図２に示したように、第２の方法では、先に述べたと同様の方法で粉砕した木材サンプルを、酢酸エチルによって抽出処理することを特徴とする。酢酸エチルによる抽出処理は、例えば、粉砕物２ｇに対して、酢酸エチル２００ミリリットル程度で、１〜１．５時間程度の抽出処理を行えばよい。このように、第２の方法では、図１に示したフローチャートの第１の方法と比較して、抽出処理の時間が短くてすみ、また、図２に示したように減圧濃縮する回数を減らすことができる。この結果、第２の前処理方法によれば、前処理操作の簡略化、時間の短縮化ができる。
【実施例】
【００２９】
以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
［実施例１及び２］
＜前処理方法＞
実際に、明らかに白紋羽病に感染していることが確認された梨の、中程度の感染木（実施例１）と枯れ死寸前の木（実施例２）について、サイトカラシンＥの分析を行った。先ず、それぞれの樹木の幹の、地面から約１００ｃｍの高さの部分から、ドリルを使用して木片を５グラムずつ採取した。採取した木片を粉砕機で粉砕した。このようにして得られた粉砕物をそれぞれ用いて下記の操作を行って、それぞれ分析用サンプルを調製した。
【００３０】
先ず、上記のようにして得た粉砕物２グラムを分液ロートに入れ、これにアセトン２００ミリリットルを入れて振とう機にかけて４時間振とうした。振とうを停止した後、これを濾過した。次に、濾液をフラスコに入れ、３０℃に保持したロータリーエバポレータにかけて減圧濃縮した。更に、濃縮物を、２００ミリリットルの酢酸エチルに溶解し、得られた溶解液を濾過した後、濾液をフラスコに入れ、３０℃に保持したロータリーエバポレータにかけて再び減圧濃縮した。次に、得られた濃縮物を、１０ミリリットルのメタノールに溶解して分析用サンプルとした。
【００３１】
＜定量方法＞
上記のようにして得られる分析用サンプル中のサイトカラシンＥの定量方法として、ＨＰＬＣ−ＵＶ分析及びＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を適用し、それぞれ測定を行った。
【００３２】
（１）ＨＰＬＣ−ＵＶ分析
ＨＰＬＣの測定条件としては、移動相をメタノール／水とし、逆相カラムで、流量を０．２ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で測定した。移動相を構成するメタノールと水にそれぞれ０．１％の酢酸を添加した。また、メタノールと水の２つの溶離液の混合比を時間とともに変化させるグラジエント法を用いて測定した。本実施例においては、移動相におけるメタノールの割合を、１分間当たり１．３３％ずつ増加させるグラジエントを用いた。分析用サンプルのＨＰＬＣへの注入量は１０μｌとした。また、ＵＶの検出波長は２８３ｎｍとした。
【００３３】
図３は、無感染木を用いて、上記した手順で抽出処理を行い、得られた分析用サンプルに、市販のサイトカラシンＥを適宜な濃度になるように添加して検量線溶液を作成し、ＵＶ検出によって検量線を作成した結果である。図３（ａ）及び（ｂ）に示したように、分析用サンプルが木材抽出液のような複雑な系の場合にも、上記の測定条件でＨＰＬＣ−ＵＶの分析によって、再現性よく、同一の保持時間でサイトカラシンＥのピークが検出された。図３（ｂ）に示したように、これによって検量線の作成が可能であり、得られた検量線を用いれば、木片中に存在するサイトカラシンＥの定量が可能となることを確認した。
【００３４】
（２）ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析
ＨＰＬＣ−ＵＶ分析で説明したと同様の方法で、サイトカラシンＥの検量線溶液を作成し、これを用いて検出器をＭＳに代えた以外はＨＰＬＣ−ＵＶ分析の場合と同様の条件で、検量線を作成した。この結果、図４に示したように、ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によっても検量線の作成が可能であり、得られた検量線を用いれば、ＨＰＬＣ−ＵＶ分析の場合と比較して、１０，０００倍程度の高感度の定量が可能となることが確認できた。
【００３５】
そこで、先に調製した白紋羽病の中程度の感染木と枯れ死寸前の木（いずれも梨）の分析用サンプルについて、ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。図５は、中程度の感染木（実施例１）についての結果であり、図６は、枯れ死寸前の木（実施例２）ついての結果である。そして、図４に示した検量線を使用して定量を行ったところ、中程度の感染木（実施例１）では、サイトカラシンＥの量が１１．８ｎｇ／ｇであり、枯れ死寸前の木（実施例２）では、サイトカラシンＥの量が１４９ｎｇ／ｇであった。上記のことから、感染状態と、サイトカラシンＥの量の相関が明確に認められた。このことは、上記した測定方法によって、木片サンプル中のサイトカラシンＥの量を定量することで、白紋羽病の感染状態を診断できることを意味している。
【００３６】
［実施例３及び４］
実施例１及び２で分析した中程度の感染木と枯れ死寸前の木について、図２に示したフローチャートに従って酢酸エチルで抽出操作を行った。すなわち、実施例１及び２と同様にして得た木片の粉砕物を用い、粉砕物２グラムに酢酸エチルを２００ミリリットルを加えて、振とう機に約１時間かけて抽出処理をした。その後、濾過して濾液を減圧濃縮後、５ミリリットルのメタノールに溶解して分析用サンプルとした。得られた分析用サンプルを用いてサイトカラシンＥのＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行った。この結果、実施例１及び２とほぼ同様の結果が得られた。このことは、より簡易な前処理方法によっても良好な定量分析が可能であり、白紋羽病の感染状態を診断できることを意味している。
【００３７】
上記したように、木材抽出液のような複雑な系の分析用サンプルであっても、ＨＰＬＣ−ＵＶ分析或いはＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によってサイトカラシンＥの定量が行えることを確認した。又、より早期の診断を行うためには、酢酸エチルでの抽出操作を採用することが有効であることを確認した。又、より早期の診断を行うためには、ＨＰＬＣ−ＵＶ分析よりも、より高感度のＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析システムの利用が有効であることを確認した。更に、これらのシステムに、サイトカラシンＥ認識ポリマー材料を使用する分離（分子インプリントカラム）を組み入れる方法によれば、より短時間の精度のよい分析を可能とすることができる。例えば、サイトカラシンＥ認識ポリマー材料を、ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析システムのＨＰＬＣの固定相として用いることで、分析サンプル内の他成分による影響を軽減できるため、分析サンプルの範囲を拡大することが可能となる。これによって、より一般性の高い白紋羽病の早期診断システムの構築が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の活用例としては、定期的に、果樹園の樹木から複数本をサンプリングして、樹木の幹から木片粉砕サンプルを数グラム採取して、これを本発明の分析方法によって分析するシステムが挙げられる。この結果、白紋羽病への感染を早期に発見でき、感染被害が拡大することを未然に防止することができ、その経済的な効果は多大である。本発明の活用例としては、分子インプリントポリマーをマイクロメートルオーダーの球状に形成することで、サイトカラシンＥに対する人工高分子センサーを得ることが可能となることが挙げられる。このことは、現場分析によって、より簡易に白紋羽病の感染を早期診断できる方法の提供の可能性を示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明で行う植物サンプルからサイトカラシンＥを抽出して分析用サンプルを得る前処理工程の一例を示すフロー図である。
【図２】本発明で行う植物サンプルからサイトカラシンＥを抽出して分析用サンプルを得る前処理工程の別の一例を示すフロー図である。
【図３】（ａ）は、ＨＰＬＣ−ＵＶ、ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるサイトカラシンＥの検量線の作成に使用した液体クロマトグラムであり、（ｂ）は、ＨＰＬＣ−ＵＶによる検量線である。
【図４】ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる検量線である。
【図５】白紋羽病の中程度の感染木についての、ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行ったクロマトグラムの結果である。
【図６】白紋羽病による枯れ死寸前の木についての、ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行ったクロマトグラムの結果である。
【図７】サイトカラシンＥ認識ポリマー材料について説明するための図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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