(57)【要約】【課題】  副作用が弱く、優れたコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体、それからなる食品製剤、化粧品及び抗炎症剤を提供する。【解決手段】  ウルソ酸誘導体は、ウルソ酸とベタイン、ガンマ−アミノ酪酸、没食子酸、エイコサペンタエン酸、ケイヒ酸、パラ−クマル酸のいずれから選択される一つがエステル結合した誘導体である。また、ウルソ酸誘導体は、柿の葉の粉砕物、ベタイン、ガンマ−アミノ酪酸、没食子酸をエステル交換反応用リパーゼと反応してアルカリ還元して得られるものである。さらに、ウルソ酸誘導体は、ローズマリーの粉砕物、ベタイン、大豆粉砕物と納豆菌を発酵させてこれをアルカリ還元して得られるものである。食品製剤、化粧品及び抗炎症剤はウルソ酸誘導体を含有するものである。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）で示されるコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体。
【化１】
2007099714.tif 000010
Ｘは、ベタイン、ガンマ−アミノ酪酸、没食子酸、エイコサペンタエン酸、ケイヒ酸、パラ−クマル酸のいずれから選択される一つ。
【請求項２】
柿の葉の粉砕物にベタインを添加し、エステル交換反応用リパーゼを添加して加温した反応物をアルカリ還元して得られる請求項１に記載の誘導体のうち、Ｘがベタインである下記の式（２）で示されるコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体。
【化２】
2007099714.tif 000011
【請求項３】
柿の葉の粉砕物にガンマ−アミノ酪酸を添加し、エステル交換反応用リパーゼを添加して加温した反応物をアルカリ還元して得られる請求項１に記載の誘導体のうち、Ｘがガンマ−アミノ酪酸である下記の式（３）で示されるコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体。
【化３】
2007099714.tif 000012
【請求項４】
柿の葉の粉砕物に没食子酸を添加し、エステル交換反応用リパーゼを添加して加温した反応物をアルカリ還元して得られる請求項１に記載の誘導体のうち、Ｘが没食子酸である下記の式（４）で示されるコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体。
【化４】
2007099714.tif 000013
【請求項５】
ローズマリーの粉砕物、ベタイン、大豆粉砕物及び納豆菌を添加して発酵させた発酵物をアルカリ還元して得られる請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項４に記載のコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体。
【請求項６】
請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項４又は請求項５に記載のコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体１重量、グルコサミン０．３〜３重量、コンドロイチン硫酸０．２〜２重量を添加し、攪拌し、加温して得られる組成物からなる食品製剤。
【請求項７】
請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項４又は請求項５に記載のコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体１重量、ビタミンＣ０．０１〜０．１重量、大豆発酵エキス０．２〜２重量を添加し、攪拌し、加温して得られる組成物からなる化粧品。
【請求項８】
請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項４又は請求項５に記載のコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体からなる抗炎症剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、炎症改善効果又は予防効果、シワ改善効果を有し、コラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体、ローズマリーを発酵させ、又は、柿の葉をエステル交換して得られるウルソ酸誘導体、それからなる食品製剤、化粧品及び抗炎症剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、皮膚、骨、軟骨、血管や種々の組織内の膜組織に存在するたんぱく質であり、その種類は１０以上にのぼり、その働きは、実質組織の骨格の構築、骨構築、炎症から組織を防御、癌の浸潤の抑制や転移の防御などである。
【０００３】
線維芽細胞がコラーゲンを産生させ、その産生には線維芽細胞の増殖刺激、成長因子が関与し、転写因子の活性化により遺伝子レベルでコラーゲン生成が誘導される（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
生体はコラーゲンを分解する酵素、コラゲナーゼやマトリックスメタロプロテアーゼにより、分解され、ペプチドまたはアミノ酸となり、その働きが消失する。このコラゲナーゼは炎症や癌細胞により誘導され、活性化される。
【０００５】
また、関節炎によっても、軟骨部位や筋肉周囲で生じた炎症組織や好中球などの炎症細胞によりコラゲナーゼが産生されて、コラーゲンを分解し、消失させ、組織の構築が乱れる（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００６】
コラーゲンを増加させる方法として線維芽細胞のコラーゲン産生を高める方法及びコラゲナーゼの活性の阻害又は誘導の抑制などがあり、両者の方法を併用することは、好ましく、両者の作用を有する原料や有効成分の抽出方法の研究と開発が行われている。
【０００７】
コラーゲンを増加させる方法、薬剤、食品、化粧品は、癌細胞の転移、癌の転移に関わる血管新生の抑制、癌細胞の増殖抑制、関節炎の抑制、炎症の改善、骨粗鬆症の抑制、セルライトの抑制や改善、シワやタルミの改善や予防などに効果を発揮することから、コラーゲンを増加させる方法が研究されている。
【０００８】
植物やハーブにはコラーゲンを増加させる有効成分が含有されており、これらの有効成分の単離や精製が進められている（例えば、非特許文献３参照。）。
【０００９】
化学合成されたコラゲナーゼ阻害物質としては、フェンブヘン、インドメタシンやイプフロアェンなどの抗炎症剤が知られているものの、それぞれに空咳や消化管障害などの副作用が報告されており、より副作用の少ない成分や製剤が望まれている（例えば、非特許文献４参照。）。
【００１０】
コラーゲンを増加させる発明としては、ミモザ由来のフェノール化合物を含有する組成物があり、オジギソウより得られる生物学的に活性なフェノール化合物含有抽出物またはその活性画分を有効量含んでなる前記組成物がある（例えば、特許文献１参照。）。
【００１１】
コラゲナーゼを阻害する物質の発明としてマグノロール、ホオノキオールのうち少なくとも一種を有効成分とするコラゲナーゼ活性抑制剤があり、ここでは、ホオノキの葉、樹皮（厚朴）、幹材、根皮などの部位及びこれらに含まれる成分を利用している（例えば、特許文献２参照。）。
【００１２】
また、ハーブや植物由来のテルペン類として、真皮表皮接合部中のコラーゲンを増加させる為の化粧剤としての化粧学上許容されるサポニン又はサポゲノールの少なくとも１種の使用についての発明がある（例えば、特許文献３参照。）。
【００１３】
しかし、いずれの発明もコラーゲン産生の亢進又はコラゲナーゼの阻害のいずれかに起因するものであり、その効果は限定されており、産業としての利用には制限がある。
【特許文献１】特許第３６２６７２７号
【特許文献２】特許第２８８６５２３号
【特許文献３】特表２００２−５１６８３７
【非特許文献１】Ｂｏｏｔｈ  Ｂら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、６０７、１４５−１６０、１９８０。
【非特許文献２】Ｐｅｅｌ  Ｎら、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、６、３５１−３７２、１９９２。
【非特許文献３】Ｎｉｉｚａｗａ  Ａら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、２１、５７−６２、２００３。
【非特許文献４】Ｃｒｏｓｓｌｅｙ  Ｒ、Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ、７５、８４−９０、１９８３。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
前記したように化学合成されたコラゲナーゼ阻害作用を呈する抗炎症剤には、空咳や消化管障害などの副作用が生じるという問題がある。
【００１５】
一方、天然由来の物質についてその安全性は高いものの、その効果が軽度であるという問題がある。そこで、副作用が弱く、抗炎症効果の優れたコラーゲン増加作用を呈する天然物由来物質が望まれている。
【００１６】
この発明は上記のような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、副作用が弱く、優れたコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体を提供することである。
【００１７】
ローズマリーの粉砕物、ベタイン、大豆粉砕物及び納豆菌を添加して発酵させた発酵物をアルカリ還元して得られる副作用が弱く、優れたコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体を提供することである。
【００１８】
柿の葉の粉砕物にベタインを添加し、エステル交換反応用リパーゼを添加して加温した反応物をアルカリ還元して得られる副作用が弱く、優れたコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体を提供することである。
【００１９】
柿の葉の粉砕物にガンマ−アミノ酪酸を添加し、エステル交換反応用リパーゼを添加して加温した反応物をアルカリ還元して得られる副作用が弱く、優れたコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体を提供することである。
【００２０】
柿の葉の粉砕物に没食子酸を添加し、エステル交換反応用リパーゼを添加して加温した反応物をアルカリ還元して得られる副作用が弱く、優れたコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体を提供することである。
【００２１】
コラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体１重量、グルコサミン０．３〜３重量、コンドロイチン硫酸０．２〜２重量を添加し、攪拌し、加温して得られる組成物からなる副作用が弱く、優れた食品製剤を提供することである。
【００２２】
コラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体１重量、ビタミンＣ０．０１〜０．１重量、大豆発酵エキス０．２〜２重量を添加し、攪拌し、加温して得られる組成物からなる副作用が弱く、優れた化粧品を提供することである。
【００２３】
コラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体からなる副作用が弱く、優れた抗炎症剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は、下記の式（１）で示されるコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体に関するものである。
【００２５】
【化１】
2007099714.tif 000002
Ｘは、ベタイン、ガンマ−アミノ酪酸、没食子酸、エイコサペンタエン酸、ケイヒ酸、パラ−クマル酸のいずれから選択される一つ。
【００２６】
請求項２に記載の発明は、柿の葉の粉砕物にベタインを添加し、エステル交換反応用リパーゼを添加して加温した反応物をアルカリ還元して得られる請求項１に記載の誘導体のうち、Ｘがベタインである下記の式（２）で示されるコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体に関するものである。
【００２７】
【化２】
2007099714.tif 000003
【００２８】
請求項３に記載の発明は、柿の葉の粉砕物にガンマ−アミノ酪酸を添加し、エステル交換反応用リパーゼを添加して加温した反応物をアルカリ還元して得られる請求項１に記載の誘導体のうち、Ｘがガンマ−アミノ酪酸である下記の式（３）で示されるコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体に関するものである。
【００２９】
【化３】
2007099714.tif 000004
【００３０】
請求項４に記載の発明は、柿の葉の粉砕物に没食子酸を添加し、エステル交換反応用リパーゼを添加して加温した反応物をアルカリ還元して得られる請求項１に記載の誘導体のうち、Ｘが没食子酸である下記の式（４）で示されるコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体に関するものである。
【００３１】
【化４】
2007099714.tif 000005
【００３２】
請求項５に記載の発明は、ローズマリーの粉砕物、ベタイン、大豆粉砕物及び納豆菌を添加して発酵させた発酵物をアルカリ還元して得られる請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項４に記載のコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体に関するものである。
【００３３】
請求項６に記載の発明は、請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項４又は請求項５に記載のコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体１重量、グルコサミン０．３〜３重量、コンドロイチン硫酸０．２〜２重量を添加し、攪拌し、加温して得られる組成物からなる食品製剤に関するものである。
【００３４】
請求項７に記載の発明は、請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項４又は請求項５に記載のコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体１重量、ビタミンＣ０．０１〜０．１重量、大豆発酵エキス０．２〜２重量を添加し、攪拌し、加温して得られる組成物からなる化粧品に関するものである。
【００３５】
請求項８に記載の発明は、請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項４又は請求項５に記載のコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体からなる抗炎症剤に関するものである。
【発明の効果】
【００３６】
この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。請求項１又は請求項２又は請求項３又は請求項４又は請求項５に記載のコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体によれば、副作用が弱く、優れた抗炎症効果が発揮される。
【００３７】
請求項６に記載の食品製剤によれば、副作用が弱く、優れた抗炎症効果が発揮される。
【００３８】
請求項７に記載の化粧品によれば、副作用が弱く、優れたシワ改善効果が発揮される。
【００３９】
請求項８に記載の抗炎症剤によれば、副作用が弱く、優れた抗炎症効果が発揮される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
以下、この発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
【００４１】
まず、本実施形態のコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体は、下記の式（１）で示されるものである。
【００４２】
【化５】
2007099714.tif 000006
Ｘは、ベタイン、ガンマ−アミノ酪酸、没食子酸、エイコサペンタエン酸、ケイヒ酸、パラ−クマル酸のいずれから選択される一つ。
【００４３】
コラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体の基本的な構造は、トリテルペンであるウルソ酸の３位の水酸基とベタイン、ガンマ−アミノ酪酸、没食子酸、エイコサペンタエン酸、ケイヒ酸、パラ−クマル酸のいずれのカルボキシル基がエステル結合したものである。
【００４４】
ウルソ酸は天然に存在するテルペノイドであり、（３ベータ）−３−ヒドロキシ−１２−エン−２８−オイック  アシドの化学名で、また、ウルソル、プルノール、ミクロメノール、マロールと呼ばれる場合もある天然の物質である。
【００４５】
ベタイン、ガンマ−アミノ酪酸、没食子酸、エイコサペンタエン酸、ケイヒ酸、パラ−クマル酸も自然界に豊富に存在する物質であり、それぞれの安全性が確認されていることから、天然の物質からなる上記のウルソ酸誘導体は、安全性が高い。
【００４６】
前記のウルソ酸誘導体は、ウルソ酸のトリテルペン部分がコラゲナーゼの活性中心に作用してコラゲナーゼを阻害する性質を有する。特に、タイプ１、タイプ２、タイプ３、タイプ４のコラーゲンを分解するコラケナーゼを抑制する作用に優れている。
【００４７】
前記のウルソ酸誘導体は、ウルソ酸に結合したベタイン、ガンマ−アミノ酪酸、没食子酸、エイコサペンタエン酸、ケイヒ酸、パラ−クマル酸の有機酸部分が線維芽細胞増殖因子の受容体の近傍に働き、受容体活性を増加させ、線維芽細胞増殖因子としてより強い刺激を与えることにより、線維芽細胞を増殖させる特長を有する。
【００４８】
前記のウルソ酸誘導体は、脂溶性が高いことから線維芽細胞内に取り込まれ、コラーゲン合成系を構築する細胞内情報伝達経路を活性化する特長を有する。
【００４９】
前記のウルソ酸誘導体は、単球やマクロファージに働き、細菌やウイルス刺激による細胞内情報伝達経路を遮断することにより、インターロイキン１アルファやインターロイキン６などの炎症性サイトカインの産生を抑制して抗炎症作用を発揮する特長を有する。
【００５０】
前記のウルソ酸誘導体のうち、Ｘがベタインの場合、得られるウルソ酸誘導体は、ウルソ酸ベタイネートである。このウルソ酸ベタイネートは、ベタインの４級アンモニウム塩がウルソ酸誘導体の構造を電気的に安定に維持させる。
【００５１】
前記のウルソ酸誘導体のうち、Ｘがガンマ−アミノ酪酸の場合、得られるウルソ酸誘導体は、ウルソ酸ガンマ−アミノブチレートである。このウルソ酸ガンマ−アミノブチレートは、ガンマ−アミノ酪酸が脳内で神経機能を改善することにより、免疫機能を調整する働きがあることから、相乗的な効果が期待される。
【００５２】
前記のウルソ酸誘導体のうち、Ｘが没食子酸の場合、得られるウルソ酸誘導体は、ウルソ酸ガロネートである。このウルソ酸ガロネートは、没食子酸の強い抗酸化力により炎症反応が抑制され、抗炎症作用が相乗的に増加される。
【００５３】
前記のウルソ酸誘導体のうち、Ｘがエイコサペンタエン酸の場合、得られるウルソ酸誘導体は、ウルソ酸エイコサペンタエートである。このウルソ酸エイコサペンタエートは、エイコサペンタエン酸の側鎖が血管に作用して血流改善作用があることから、ウルソ酸誘導体の分布が改善される。
【００５４】
前記のウルソ酸誘導体のうち、Ｘがケイヒ酸の場合、得られるウルソ酸誘導体はウルソ酸シンナメートである。このウルソ酸シンナメートは、ケイヒ酸側鎖が抗炎症作用を呈することから、抗炎症作用が相乗的に増加される。
【００５５】
前記のウルソ酸誘導体のうち、Ｘがパラ−クマル酸の場合、得られるウルソ酸誘導体はウルソ酸パラ−クマロネートである。このウルソ酸パラ−クマロネートは、パラ−クマル酸の側鎖が抗炎症作用を呈することから、抗炎症作用が相乗的に増加される。
【００５６】
前記のウルソ酸誘導体は、過剰に摂取された場合には、肝臓において脂質分解酵素により分解され、ウルソ酸とその他の部分が生成される。したがって、このウルソ酸誘導体は、体内に過剰に蓄積されないことから、その安全性も高い。
【００５７】
前記のウルソ酸及びその他の部分はいずれも安全性が確認されており、その食経験や医薬品としての経験も豊富であることから、ウルソ酸誘導体の安全性も高い。
【００５８】
前記のウルソ酸誘導体は、化学的に合成することができる。化学的に合成する場合、ウルソ酸とベタイン、ガンマ−アミノ酪酸、没食子酸、エイコサペンタエン酸、ケイヒ酸、パラ−クマル酸のいずれか、溶媒、ジシクロヘキシルカルボジイミド、４−ジメチルアミノピリジンを添加し、１０〜３０℃で６〜２４時間攪拌して反応物を得る。
【００５９】
得られた反応液をシリカゲルクロマトに供し、ｎ−ヘキサンを溶媒として目的とするウルソ酸誘導体を分離する。
【００６０】
ウルソ酸は柿の葉よりｎ−ヘキサン及び酢酸エチルで抽出し、抽出物をシリカゲルクロマトに供し、ｎ−ヘキサン及び酢酸エチルで溶出させて得られる。
【００６１】
ベタインとしては天然のサトウキビから抽出されたものが安全性が高く、日本甜菜製糖株式会社製のニッテンベタインが安価で高い品質で好ましい。
【００６２】
ガンマ−アミノ酪酸としては、米発酵物、米糠から得られた製品は安全性が高い。たとえば、オリザ油化製の製品は好ましい。
【００６３】
没食子酸としては、酸化防止剤及び酸化防止製剤の原料などとして利用されるものは安全性が高く、高い品質である。たとえば、岩手ケミカル株式会社製の没食子酸は使用例も豊富で好ましい。
【００６４】
エイコサペンタエン酸、ケイヒ酸、パラ−クマル酸は、いずれも、食品としての利用が豊富であり、安全性が確認されている。日水製薬株式会社、日本バイオコン株式会社やエステック株式会社から提供されている品質の高い製品を用いることは好ましい。
【００６５】
また、目的とするウルソ酸誘導体をウルソ酸とベタイン、ガンマ−アミノ酪酸、没食子酸、エイコサペンタエン酸、ケイヒ酸、パラ−クマル酸を原料として酵素化学的に製造することができる。
【００６６】
前記のウルソ酸とベタイン、ガンマ−アミノ酪酸、没食子酸、エイコサペンタエン酸、ケイヒ酸、パラ−クマル酸をエステル変換反応用リパーゼやエステル結合反応を生じる酵素、たとえば、アマノエンザイム製のリパーゼＡＹ「アマノ」３０Ｇ、リパーゼＧ「アマノ」５０、リパーゼＦ−ＡＰ１５、ニューラーゼＦ３Ｇなどと反応させてエステル結合を生成させて目的とするウルソ酸誘導体が生成される。
【００６７】
これらの原料は、反応槽に入れられ、溶媒とともに、反応が行われる。また、前記の反応物は、溶媒を除去されて粗生成物として得ることは、精製に要するコストを削減できることから、好ましい。
【００６８】
さらに、原料が安全であることから好ましく、一方、前記の反応物から、目的とするウルソ酸誘導体を精製することは純度の高い物質として１回当たりの摂取量を減少させることができる点から好ましい。
【００６９】
この精製の方法としては、分離用の樹脂などの精製操作を利用することが好ましい。
【００７０】
すなわち、分離用担体又は樹脂により分離され、分取される。分離用担体又は樹脂としては、表面が後述のようにコーティングされた、多孔性の多糖類、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。０．１〜３００μｍの粒度を有するものが好ましく、粒度が細かい程、精度の高い分離が行なわれるが、分離時間が長い欠点がある。
【００７１】
例えば、逆相担体又は樹脂として表面が疎水性化合物でコーティングされたものは、疎水性の高い物質の分離に利用される。陽イオン物質でコーティングされたものは陰イオン性に荷電した物質の分離に適している。
【００７２】
また、陰イオン物質でコーティングされたものは陽イオン性に荷電した物質の分離に適している。特異的な抗体をコーティングした場合には、特異的な物質のみを分離するアフィニティ担体又は樹脂として利用される。
【００７３】
アフィニティ担体又は樹脂は、抗原抗体反応を利用して抗原の特異的な調製に利用される。分配性担体又は樹脂は、シリカゲル（メルク社製）等のように、物質と分離用溶媒の間の分配係数に差異がある場合、それらの物質の単離に利用される。
【００７４】
これらのうち、製造コストを低減することができる点から、吸着性担体又は樹脂、分配性担体又は樹脂、分子篩用担体又は樹脂及びイオン交換担体又は樹脂が好ましい。さらに、分離用溶媒に対して分配係数の差異が大きい点から、逆相担体又は樹脂及び分配性担体又は樹脂はより好ましい。
【００７５】
分離用溶媒として有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒に耐性を有する担体又は樹脂が用いられる。また、医薬品製造又は食品製造に利用される担体又は樹脂は好ましい。
【００７６】
これらの点から吸着性担体としてダイヤイオン（三菱化学（株）社製）及びＸＡＤ−２又はＸＡＤ−４（ロームアンドハース社製）、分子篩用担体としてセファデックスＬＨ−２０（アマシャムファルマシア社製）、分配用担体としてシリカゲル、イオン交換担体としてＩＲＡ−４１０（ロームアンドハース社製）、逆相担体としてＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）がより好ましい。これらのうち、ダイヤイオン、セファデックスＬＨ−２０及びＤＭ１０２０Ｔはさらに好ましい。
【００７７】
得られた抽出物は、分離前に分離用担体又は樹脂を膨潤化させるための溶媒に溶解される。その量は、分離効率の点から抽出物の重量に対して１〜５０倍量が好ましく、３〜２０倍量がより好ましい。分離の温度としては物質の安定性の点から４〜３０℃が好ましく、１０〜２５℃がより好ましい。
【００７８】
分離用溶媒には、水、又は、水を含有する低級アルコール、親水性溶媒、親油性溶媒が用いられる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが用いられるが、食用として利用されているエタノールが好ましい。
【００７９】
セファデックスＬＨ−２０を用いる場合、分離用溶媒には低級アルコールが好ましい。シリカゲルを用いる場合、分離用溶媒にはクロロホルム、メタノール、酢酸又はそれらの混合液が好ましい。
【００８０】
ダイヤイオン及びＤＭ１０２０Ｔを用いる場合、分離用溶媒はメタノール、エタノール等の低級アルコール又は低級アルコールと水の混合液が好ましい。
【００８１】
採取後、乾燥又は真空乾燥により溶媒を除去し、目的とする結合体を粉末又は濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから、好ましい。
【００８２】
また、目的とするウルソ酸誘導体を天然の素材から抽出し、あるいは、精製することにより得ることができる。天然の素材には、植物、海藻、キノコ、食用動物、食用魚類、軟体動物、昆虫、甲殻類などがある。特に、柿の葉、大豆発酵物は、抽出しやすいという特徴がある。
【００８３】
柿の葉は腐葉土としての利用される以外は、廃棄され、有効に利用されていない。この柿の葉を原料として抽出、又は、精製することは廃棄物を有効に利用し、廃棄物の量を軽減することから好ましい。
【００８４】
前記のウルソ酸誘導体を微生物や酵母を用いた発酵により得ることは食用として安全性が確認されており、食経験も豊富であることから好ましい。この場合、用いる微生物としては、納豆菌、乳酸菌、紅麹、枯草菌があり、酵母としてはビール酵母や酒精酵母があり、これらはいずれも食品、医薬品、化粧品原料として使用経験が豊富で、安全性も担保されていることから好ましい。
【００８５】
前記の発酵は大豆や牛乳などの発酵原料に前記の微生物又は酵母を添加して発酵タンクを用いて実施される。この発酵後、反応物から目的とする前記のウルソ酸誘導体を得ることができる。また、魚油、魚肉、緑茶、コーヒー、タンポポ、大麦若葉、葛の花、トウガラシ、ローヤルゼリー、プロポリスなどを加えて前記のように発酵させて目的とするウルソ酸誘導体を得ることができる。
【００８６】
また、前記のウルソ酸誘導体を柿の葉、ギョウジャニンニク、タマネギ、ニンニクとともに発酵させ、アルカリ還元させて得ることができる。たとえば、柿の葉、ギョウジャニンニク、タマネギ又はニンニクの粉砕物、食用魚類の粉砕物、大豆粉砕物及び納豆菌を添加して発酵させた発酵物をアルカリ還元化して得ることは、廃棄される柿の葉、魚類の頭部や内臓を有効利用できることから好ましい。
【００８７】
植物から抽出する場合、柿の葉、ギョウジャニンニク、タマネギ、ニンニク、大豆、ギジギシ、カンゾウ、ツリフネソウ、ハナイカダ、大麦若葉、葛の花、トウガラシ、カキ、梨、栗、緑茶、タラ、ワサビ、ワラビ、稲、小麦、トウモロコシ、ダイコン、菜の花、サクラ、マツ、アオキ、アカネ、アカメガシワ、アケビ、アマチャズル、アマドコロ、アロエ、イカリソウ、イタドリ、イノコズチ、イブキジャコウソウ、ウコギ、ウツボグサ、ウド、ウメ、ウラジロガシ、エビスグサ、オウレン、オオバコ、オケラ、オクラ、オトギリソウ、オナモミ、オミナエシ、カキドオシ、カラスウリ、カラスビシャク、カワラケツメイ、カワラナデシコ、カンアオイ、キクイモ、キキョウ、キササゲ、キハダ、キランソウ、キンミズヒキ、クガイソウ、クコ、クサボケ、クズ、クチナシ、コウホネ、コブシ、サイカチ、サボンソウ、サルトリイバラバッケツ、サンシュユ、ジャノヒゲ、シラン、スイカズラ、セリ、センブリ、タムシバ、タラノキ、タンポポ、チガヤ、ツリガネニンジン、ツワブキ、ドクダミ、トチノキ、トチバニンジン、ナンテン、ノイバラ、ハコベ、ハトムギ、ハハコグサ、ヒキオコシ、ヒシ、ヒトツバ、ビワ、フキ、フクジュソウ、フジ、マタタビ、メハジキ、ヤマノイモ、ユキノシタ、ヨモギ、リンドウ、レンギョウ、ロウバイ、ワレモコウの葉、花又は根は、入手しやすいことから好ましい。
【００８８】
藻類から抽出する場合、アオサ、アオノリ、アマノリ、アラメ、イワノリ、エゴノリ、オゴノリ、カワノリ、エナガオニコンブ、ガゴメコンブ、ナガコンブ、ホソメコンブ、マコンブ、ミツイシコンブ、リシリコンブ、スイゼンジノリ、テングサ、トサカノリ、ヒジキ、ヒトエグサ、フノリ、マツモ、ムカデノリ、オキナワモズク、モズク、ワカメ、クキワカメ、メカブワカメの葉部、茎又は根は、入手しやすいことから好ましい。
【００８９】
このようにして得られたウルソ酸誘導体は、液体又は粉末として得られる。得られたウルソ酸誘導体は医薬品、食品製剤又は化粧品に利用される。医薬品としては、抗炎症剤、抗動脈硬化剤、癌転移抑制剤、シワ除去剤などに利用される。
【００９０】
食品製剤としては、コラーゲンの増加を目的として炎症の抑制や予防の目的に用いられる。
【００９１】
化粧品としては、コラーゲンの減少に起因したシワやタルミ、二重アゴの改善又は予防の目的で利用される。
【００９２】
次に、柿の葉の粉砕物にベタインを添加し、エステル交換反応用リパーゼを添加して加温した反応物をアルカリ還元して得られる前記の誘導体のうち、Ｘがベタインである下記の式（２）で示されるコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体について説明する。
【００９３】
【化６】
2007099714.tif 000007
【００９４】
ここでいうウルソ酸誘導体とは、前記のウルソ酸誘導体のうち、Ｘがベタインからなるものであり、すなわち、ウルソ酸ベタイネートである。
【００９５】
ウルソ酸ベタイネートは、ウルソ酸のトリテルペン部分がコラゲナーゼの活性中心に作用してコラゲナーゼを阻害する性質を有する。特に、タイプ１、タイプ２、タイプ３、タイプ４のコラーゲンを分解するコラケナーゼを抑制する作用に優れている。
【００９６】
ウルソ酸ベタイネートは、ウルソ酸の有機酸部分が線維芽細胞増殖因子の受容体の近傍に働き、受容体活性を増加させ、線維芽細胞増殖因子としてより強い刺激を与えることにより、線維芽細胞を増殖させる特長を有する。
【００９７】
ウルソ酸ベタイネートは、脂溶性が高いことから線維芽細胞内に取り込まれ、コラーゲン合成系を構築する細胞内情報伝達経路を活性化する特長を有する。
【００９８】
ウルソ酸ベタイネートは、単球やマクロファージに働き、細菌やウイルス刺激による細胞内情報伝達経路を遮断することにより、インターロイキン１アルファやインターロイキン６などの炎症性サイトカインの産生を抑制して抗炎症作用を発揮する特長を有する。
【００９９】
ウルソ酸ベタイネートは、ベタインの４級アンモニウム塩がウルソ酸誘導体の構造を電気的に安定に維持させる。
【０１００】
ウルソ酸ベタイネートは、過剰に摂取された場合には、肝臓において脂質分解酵素により分解され、ウルソ酸とベタインが生成される。したがって、ウルソ酸ベタイネートは、体内に過剰に蓄積されないことから、その安全性も高く、その毒性は軽度である。
【０１０１】
前記のウルソ酸誘導体は、柿の葉の粉砕物にベタインを添加し、エステル交換反応用リパーゼを添加して加温した反応物をアルカリ還元して得られる。
【０１０２】
ここでいう柿の葉の粉砕物とは、日本産、中国産、アメリカ産、アフリカ産の柿の葉のいずれも用いられる。
【０１０３】
ここでいう柿とは、カキノキ科カキノキ属の富有柿、次郎柿、平核無柿、甲州百目柿、四溝柿、堂上蜂屋柿のいずれでも良い。
【０１０４】
柿の葉の粉砕物は、乾燥後、粉砕機により粉砕されることは、反応を有効に実施できることから好ましい。乾燥機として西村鐵工所製のＣＤドライヤー、株式会社大川原製作所製のバイブロンやロートスルー、株式会社奈良機械製作所製の旋回気流乾燥機、トルネッシュドライヤー、流動層乾燥機、粉砕機として株式会社奈良機械製作所製の自由ミル、スーパー自由ミル、サンプルミル、ゴブリン、スーパークリーンミル、マイクロス、減圧乾燥機として東洋理工製の小型減圧乾燥機、株式会社マツイ製の小型減圧伝熱式乾燥機ＤＰＴＨ−４０、エーキューエム九州テクノス株式会社製のクリーンドライＶＤ−７、ＶＤ−２０などが用いられる。
【０１０５】
ここで用いるベタインは食品用として利用される高い品質のものが用いられる。たとえば、天然のサトウキビから抽出されたものが安全性が高く、日本甜菜製糖株式会社製のニッテンベタインが安価で高い品質であることから好ましい。
【０１０６】
前記のエステル交換反応用リパーゼは、脂肪酸などのカルボキシル基とアルコールの水酸基をエステル結合させる天然由来の酵素である。ウルソ酸の３位の水酸基とベタインのカルボキシル基をエステル結合させ、目的とするウルソ酸誘導体を生成する。
【０１０７】
前記のエステル交換反応用リパーゼとしては、たとえば、ノボザイム社製のリポザイムやノボザイム４３５、名糖産業社製のリパーゼＰＬやリパーゼＱＬＭ、アマノエンザイム社製のリパーゼＡＹ「アマノ」３０Ｇ、リパーゼＧ「アマノ」５０、リパーゼＦ−ＡＰ１５、ニューラーゼＦ３Ｇなどの品質が高いこと、安全性が確認されていることから、好ましい。
【０１０８】
前記に記載された柿の葉の粉砕物１重量に対し、前記のベタインは０．０５〜０．１５重量が好ましく、前記のエステル交換反応用リパーゼは０．００５〜０．０２重量が好ましい。
【０１０９】
前記に記載された柿の葉の粉砕物１重量に対し、前記のベタイン重量が０．０５重量を下回る場合、ベタイン量が不足してウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０１１０】
前記に記載された柿の葉の粉砕物１重量に対し、前記のベタイン重量が０．１５重量を上回る場合、ウルソ酸量が不足してウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０１１１】
前記に記載された柿の葉の粉砕物１重量に対し、前記のエステル交換反応用リパーゼ重量が０．００５重量を下回る場合、酵素反応が不十分となりウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０１１２】
前記に記載された柿の葉の粉砕物１重量に対し、前記のエステル交換反応用リパーゼ重量が０．０２重量を上回る場合、逆反応であるエステル分解反応が進行してウルソ酸量が不足してウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０１１３】
柿の葉の粉砕物、ベタイン、エステル交換反応用リパーゼは、加温される。加温は水溶液の方が混合されて反応性が高くなるために、好ましい。
【０１１４】
前記の加温の温度として、１０〜３０℃が好ましく、１５〜２６℃がより好ましい。
【０１１５】
前記の加温の時間として、１〜２４時間が好ましく、３〜１３時間がより好ましい。
【０１１６】
前記の加温は、攪拌されながら、行うことが好ましく、１分間当たり１９〜９０回の速度が好ましい。
【０１１７】
加温後、冷却されることは、次のアルカリ還元を行いやすくすることから好ましい。
【０１１８】
加温された反応物は、アルカリ還元化される。
【０１１９】
ここで、ウルソ酸とベタインの結合を安定化させるために、アルカリ還元化される。アルカリ還元化によりエステル結合が還元されて、安定な構造を呈する。
【０１２０】
このアルカリ還元装置としては、株式会社ゼノン製の家庭用電解水生成装置であるセルラキッス、アクアステラ、アリビオ、日本トリム社製のＴＩ−７００型やＴＩ−８００型などが用いられる。
【０１２１】
前記の反応物を配管に流してアルカリ還元装置に供して得られる。目的とするウルソ酸ベタイネートが液体として得られる。
【０１２２】
前記のように得られたアルカリ還元化されたウルソ酸ベタイネートを凍結乾燥装置、たとえば、日本エフディ製凍結乾燥機、株式会社ユスジマ製凍結乾燥機、東洋技研製ＴＧＤ−２５０ＬＦ２などに供し、ウルソ酸ベタイネートが粉末として得られる。
【０１２３】
前記の反応物から、目的とするウルソ酸ベタイネートを精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。この精製の方法としては、分離用の樹脂などの精製操作を利用することが好ましい。
【０１２４】
このようにして得られたウルソ酸ベタイネートは、液体又は粉末として得られる。得られたウルソ酸ベタイネートは医薬品、食品製剤又は化粧品に利用される。医薬品としては、抗炎症剤、抗動脈硬化剤、癌転移抑制剤、シワ除去剤などに利用される。
【０１２５】
食品製剤としては、コラーゲンの増加を目的として炎症の抑制や予防の目的に用いられる。
【０１２６】
化粧品としては、コラーゲンの減少に起因したシワやタルミ、二重アゴの改善又は予防の目的で利用される。
【０１２７】
次に、柿の葉の粉砕物にガンマ−アミノ酪酸を添加し、エステル交換反応用リパーゼを添加して加温した反応物をアルカリ還元して得られる前記の誘導体のうち、Ｘがガンマ−アミノ酪酸である下記の式（３）で示されるコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体について説明する。
【０１２８】
【化７】
2007099714.tif 000008
【０１２９】
ここでいうウルソ酸誘導体とは、前記のウルソ酸誘導体のうち、Ｘがガンマ−アミノ酪酸からなるものであり、すなわち、ウルソ酸ガンマ−アミノブチレートである。
【０１３０】
ウルソ酸ガンマ−アミノブチレートは、ウルソ酸のトリテルペン部分がコラゲナーゼの活性中心に作用してコラゲナーゼを阻害する性質を有する。特に、タイプ１、タイプ２、タイプ３、タイプ４のコラーゲンを分解するコラケナーゼを抑制する作用に優れている。
【０１３１】
ウルソ酸ガンマ−アミノブチレートは、ガンマ−アミノ酪酸の有機酸部分が線維芽細胞増殖因子の受容体の近傍に働き、受容体活性を増加させ、線維芽細胞増殖因子としてより強い刺激を与えることにより、線維芽細胞を増殖させる特長を有する。
【０１３２】
ウルソ酸ガンマ−アミノブチレートは、脂溶性が高いことから線維芽細胞内に取り込まれ、コラーゲン合成系を構築する細胞内情報伝達経路を活性化する特長を有する。
【０１３３】
ウルソ酸ガンマ−アミノブチレートは、単球やマクロファージに働き、細菌やウイルス刺激による細胞内情報伝達経路を遮断することにより、インターロイキン１アルファやインターロイキン６などの炎症性サイトカインの産生を抑制して抗炎症作用を発揮する特長を有する。
【０１３４】
ウルソ酸ガンマ−アミノブチレートは、ガンマ−アミノ酪酸が脳内で神経機能を改善することにより、免疫機能を調整する働きがあることから、相乗的な効果が発揮される。
【０１３５】
ウルソ酸ガンマ−アミノブチレートは、過剰に摂取された場合には、肝臓において脂質分解酵素により分解され、ウルソ酸とガンマ−アミノ酪酸が生成される。
【０１３６】
したがって、ウルソ酸ガンマ−アミノブチレートは、体内に過剰に蓄積されないことから、その安全性も高く、その毒性は軽度である。
【０１３７】
前記のウルソ酸誘導体は、柿の葉の粉砕物にベタインを添加し、エステル交換反応用リパーゼを添加して加温した反応物をアルカリ還元して得られる。
【０１３８】
ここでいう柿の葉の粉砕物とは、日本産、中国産、アメリカ産、アフリカ産の柿の葉のいずれも用いられる。
【０１３９】
ここでいう柿とは、カキノキ科カキノキ属の富有柿、次郎柿、平核無柿、甲州百目柿、四溝柿、堂上蜂屋柿のいずれでも良い。
【０１４０】
柿の葉の粉砕物は、乾燥後、粉砕機により粉砕されることは、反応を有効に実施できることから好ましい。
【０１４１】
ここで用いるガンマ−アミノ酪酸は食品用として利用される高い品質のものが用いられる。たとえば、米発酵物、米糠から得られた製品は安全性が高い。たとえば、米から精製されたオリザ油化製の製品は好ましい。
【０１４２】
前記のエステル交換反応用リパーゼは、脂肪酸などのカルボキシル基とアルコールの水酸基をエステル結合させる天然由来の酵素である。ウルソ酸の３位の水酸基とガンマ−アミノ酪酸のカルボキシル基をエステル結合させ、目的とするウルソ酸誘導体を生成する。
【０１４３】
エステル交換反応用リパーゼとしては、たとえば、ノボザイム社製のリポザイムやノボザイム４３５、名糖産業社製のリパーゼＰＬやリパーゼＱＬＭ、アマノエンザイム社製のリパーゼＡＹ「アマノ」３０Ｇ、リパーゼＧ「アマノ」５０、リパーゼＦ−ＡＰ１５、ニューラーゼＦ３Ｇなどの品質が高いこと、安全性が確認されていることから、好ましい。
【０１４４】
前記に記載された柿の葉の粉砕物１重量に対し、前記のガンマ−アミノ酪酸は０．０４〜０．１６重量が好ましく、前記のエステル交換反応用リパーゼは０．００４〜０．０３重量が好ましい。
【０１４５】
前記に記載された柿の葉の粉砕物１重量に対し、前記のガンマ−アミノ酪酸重量が０．０４重量を下回る場合、ガンマ−アミノ酪酸量が不足してウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０１４６】
前記に記載された柿の葉の粉砕物１重量に対し、前記のガンマ−アミノ酪酸重量が０．１６重量を上回る場合、ウルソ酸量が不足してウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０１４７】
前記に記載された柿の葉の粉砕物１重量に対し、前記のエステル交換反応用リパーゼ重量が０．００４重量を下回る場合、酵素反応が不十分となりウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０１４８】
前記に記載された柿の葉の粉砕物１重量に対し、前記のエステル交換反応用リパーゼ重量が０．０３重量を上回る場合、逆反応であるエステル分解反応が進行してウルソ酸量が不足してウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０１４９】
柿の葉の粉砕物、ガンマ−アミノ酪酸、エステル交換反応用リパーゼは、加温される。加温は水溶液の方が混合されて反応性が高くなるために、好ましい。
【０１５０】
前記の加温の温度として、１０〜３０℃が好ましく、１３〜２７℃がより好ましい。
【０１５１】
前記の加温の時間として、１〜２４時間が好ましく、２〜１４時間がより好ましい。
【０１５２】
前記の加温は、攪拌されながら、行うことが好ましく、１分間当たり８〜１２０回の速度が好ましい。
【０１５３】
加温後、冷却されることは、次のアルカリ還元を行いやすくすることから好ましい。
【０１５４】
加温された反応物は、アルカリ還元化される。
【０１５５】
ここで、ウルソ酸とガンマ−アミノ酪酸の結合を安定化させるために、アルカリ還元化される。アルカリ還元化によりエステル結合が還元されて、安定な構造を呈する。
【０１５６】
このアルカリ還元装置としては、株式会社ゼノン製の家庭用電解水生成装置であるセルラキッス、アクアステラ、アリビオ、日本トリム社製のＴＩ−７００型やＴＩ−８００型などが用いられる。
【０１５７】
前記の反応物を配管に流してアルカリ還元装置に供して得られる。目的とするウルソ酸ガンマ−アミノブチレートが液体として得られる。
【０１５８】
前記のように得られたアルカリ還元化されたウルソ酸ガンマ−アミノブチレートを凍結乾燥装置、たとえば、日本エフディ製凍結乾燥機、株式会社ユスジマ製凍結乾燥機、東洋技研製ＴＧＤ−２５０ＬＦ２などに供し、ウルソ酸ガンマ−アミノブチレートが粉末として得られる。
【０１５９】
前記の反応物から、目的とするウルソ酸ガンマ−アミノブチレートを精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。この精製の方法としては、分離用の樹脂などの精製操作を利用することが好ましい。
【０１６０】
このようにして得られたウルソ酸ガンマ−アミノブチレートは、液体又は粉末として得られる。得られたウルソ酸ガンマ−アミノブチレートは医薬品、食品製剤又は化粧品に利用される。医薬品としては、抗炎症剤、抗動脈硬化剤、癌転移抑制剤、シワ除去剤などに利用される。
【０１６１】
食品製剤としては、コラーゲンの増加を目的として炎症の抑制や予防の目的に用いられる。
【０１６２】
化粧品としては、コラーゲンの減少に起因したシワやタルミ、二重アゴの改善又は予防の目的で利用される。
【０１６３】
次に、柿の葉の粉砕物に没食子酸を添加し、エステル交換反応用リパーゼを添加して加温した反応物をアルカリ還元して得られる前記の誘導体のうち、Ｘが没食子酸である下記の式（４）で示されるコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体について説明する。
【０１６４】
【化８】
2007099714.tif 000009
【０１６５】
ここでいうウルソ酸誘導体とは、前記のウルソ酸誘導体のうち、Ｘが没食子酸からなるものであり、すなわち、ウルソ酸ガロネートである。
【０１６６】
ウルソ酸ガロネートは、ウルソ酸のトリテルペン部分がコラゲナーゼの活性中心に作用してコラゲナーゼを阻害する性質を有する。特に、タイプ１、タイプ２、タイプ３やタイプ４のコラーゲンを分解するコラケナーゼを抑制する作用に優れている。
【０１６７】
ウルソ酸ガロネートは、没食子酸の有機酸部分が線維芽細胞増殖因子の受容体の近傍に働き、受容体活性を増加させ、線維芽細胞増殖因子としてより強い刺激を与えることにより、線維芽細胞を増殖させる特長を有する。
【０１６８】
ウルソ酸ガロネートは、脂溶性が高いことから線維芽細胞内に取り込まれ、コラーゲン合成系を構築する細胞内情報伝達経路を活性化する特長を有する。
【０１６９】
ウルソ酸ガロネートは、単球やマクロファージに働き、細菌やウイルス刺激による細胞内情報伝達経路を遮断することにより、インターロイキン１アルファやインターロイキン６などの炎症性サイトカインの産生を抑制して抗炎症作用を発揮する特長を有する。
【０１７０】
ウルソ酸ガロネートは、没食子酸の強い抗酸化力により炎症反応が抑制され、抗炎症作用が相乗的に増加される。
【０１７１】
ウルソ酸ガロネートは、過剰に摂取された場合には、肝臓において脂質分解酵素により分解され、ウルソ酸と没食子酸が生成される。したがって、ウルソ酸ガロネートは、体内に過剰に蓄積されないことから、その安全性も高く、その毒性は軽度である。
【０１７２】
前記のウルソ酸誘導体は、柿の葉の粉砕物にベタインを添加し、エステル交換反応用リパーゼを添加して加温した反応物をアルカリ還元して得られる。
【０１７３】
ここでいう柿の葉の粉砕物とは、日本産、中国産、アメリカ産、アフリカ産の柿の葉のいずれも用いられる。
【０１７４】
ここでいう柿とは、カキノキ科カキノキ属の富有柿、次郎柿、平核無柿、甲州百目柿、四溝柿、堂上蜂屋柿のいずれでも良い。
【０１７５】
柿の葉の粉砕物は、乾燥後、粉砕機により粉砕されることは、反応を有効に実施できることから好ましい。
【０１７６】
ここで用いる没食子酸としては、酸化防止剤及び酸化防止製剤の原料などとして利用されるものは安全性が高く、高い品質である。たとえば、岩手ケミカル株式会社製の没食子酸は使用例も豊富で好ましい。
【０１７７】
前記のエステル交換反応用リパーゼは、脂肪酸などのカルボキシル基とアルコールの水酸基をエステル結合させる天然由来の酵素である。ウルソ酸の３位の水酸基と没食子酸のカルボキシル基をエステル結合させ、目的とするウルソ酸誘導体を生成する。
【０１７８】
エステル交換反応用リパーゼとしては、たとえば、ノボザイム社製のリポザイムやノボザイム４３５、名糖産業社製のリパーゼＰＬやリパーゼＱＬＭ、アマノエンザイム社製のリパーゼＡＹ「アマノ」３０Ｇ、リパーゼＧ「アマノ」５０、リパーゼＦ−ＡＰ１５、ニューラーゼＦ３Ｇなどの品質が高いこと、安全性が確認されていることから、好ましい。
【０１７９】
前記に記載された柿の葉の粉砕物１重量に対し、前記の没食子酸は０．０５〜０．１５重量が好ましく、前記のエステル交換反応用リパーゼは０．００５〜０．０２重量が好ましい。
【０１８０】
前記に記載された柿の葉の粉砕物１重量に対し、前記の没食子酸重量が０．０５重量を下回る場合、没食子酸量が不足してウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０１８１】
前記に記載された柿の葉の粉砕物１重量に対し、前記の没食子酸重量が０．１５重量を上回る場合、ウルソ酸量が不足してウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０１８２】
前記に記載された柿の葉の粉砕物１重量に対し、前記のエステル交換反応用リパーゼ重量が０．００５重量を下回る場合、酵素反応が不十分となりウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０１８３】
前記に記載された柿の葉の粉砕物１重量に対し、前記のエステル交換反応用リパーゼ重量が０．０２重量を上回る場合、逆反応であるエステル分解反応が進行してウルソ酸量が不足してウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０１８４】
柿の葉の粉砕物、没食子酸、エステル交換反応用リパーゼは、加温される。加温は水溶液の方が混合されて反応性が高くなるために、好ましい。
【０１８５】
前記の加温の温度として、５〜３７℃が好ましく、１５〜２５℃がより好ましい。
【０１８６】
前記の加温の時間として、１〜２４時間が好ましく、３〜１６時間がより好ましい。
【０１８７】
前記の加温は、攪拌されながら、行うことが好ましく、１分間当たり６〜１２０回の速度が好ましい。
【０１８８】
加温後、冷却されることは、次のアルカリ還元を行いやすくすることから好ましい。
【０１８９】
加温された反応物は、アルカリ還元化される。
【０１９０】
ここで、ウルソ酸と没食子酸の結合を安定化させるために、アルカリ還元化される。
【０１９１】
アルカリ還元化によりエステル結合が還元されて、安定な構造を呈する。
【０１９２】
このアルカリ還元装置としては、株式会社ゼノン製の家庭用電解水生成装置であるセルラキッス、アクアステラ、アリビオ、日本トリム社製のＴＩ−７００型やＴＩ−８００型などが用いられる。
【０１９３】
前記の反応物を配管に流してアルカリ還元装置に供して得られる。
【０１９４】
これにより目的とするウルソ酸ガロネートが液体として得られる。
【０１９５】
前記のように得られたアルカリ還元化されたウルソ酸ガロネートを凍結乾燥装置、たとえば、日本エフディ製凍結乾燥機、株式会社ユスジマ製凍結乾燥機、東洋技研製ＴＧＤ−２５０ＬＦ２などに供し、ウルソ酸ガロネートが粉末として得られる。
【０１９６】
前記の反応物から、目的とするウルソ酸ガロネートを精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。
【０１９７】
この精製の方法としては、分離用の樹脂などの精製操作を利用することが好ましい。
【０１９８】
このようにして得られたウルソ酸ガロネートは、液体又は粉末として得られる。
【０１９９】
得られたウルソ酸ガロネートは医薬品、食品製剤又は化粧品に利用される。医薬品としては、抗炎症剤、抗動脈硬化剤、癌転移抑制剤、シワ除去剤などに利用される。
【０２００】
食品製剤としては、コラーゲンの増加を目的として炎症の抑制や予防の目的に用いられる。
【０２０１】
化粧品としては、コラーゲンの減少に起因したシワやタルミ、二重アゴの改善又は予防の目的で利用される。
【０２０２】
次に、ローズマリーの粉砕物、ベタイン、大豆粉砕物及び納豆菌を添加して発酵させた発酵物をアルカリ還元して得られるコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体について説明する。
【０２０３】
用いるローズマリーの粉砕物は、ローズマリーを乾燥して粉砕したものである。
【０２０４】
ここで用いるローズマリーは、日本産、ヨーロッパ産、アメリカ産、中国産のいずれでも良い。
【０２０５】
用いるベタインは、食品用として利用される高い品質のものが用いられる。たとえば、天然のサトウキビから抽出されたものが安全性が高く、日本甜菜製糖株式会社製のニッテンベタインが安価で高い品質で好ましい。
【０２０６】
用いる大豆粉砕物は、日本産、中国産、アメリカ産などの海外産のいずれも、用いられる。洗浄、乾燥した後、加熱され、さらに、ミキサーで粉砕して用いられる。
【０２０７】
この大豆粉砕物は、大豆を洗浄後、蒸す又は煮ることにより、加熱処理されることは、発酵を効率良く実施することができることから、好ましい。
【０２０８】
ここで用いる納豆菌は、枯草菌の一種であり、古来より日本人の食生活に関与してきた有用菌であり、その安全性も担保されている。
【０２０９】
特に、食品加工用に用いられるものが好ましい。たとえば、納豆素本舗製の納豆菌は品質的に安定していることから好ましい。
【０２１０】
ローズマリーの粉砕物１重量に対し、ベタインは０．０１〜０．１重量であり、大豆粉砕物は３〜２０重量であり、納豆菌は０．００５〜０．０３重量である。
【０２１１】
ローズマリーの粉砕物１重量に対し、ベタインの重量が０．０１重量を下回る場合、ベタイン量が不足して目的とするウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０２１２】
ローズマリーの粉砕物１重量に対し、ベタインの重量が０．１重量を上回る場合、ウルソ酸量が不足して目的とするウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０２１３】
ローズマリーの粉砕物１重量に対し、大豆粉砕物の重量が３重量を下回る場合、発酵が十分に進行せず、目的とするウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０２１４】
ローズマリーの粉砕物１重量に対し、大豆粉砕物の重量が２０重量を上回る場合、ウルソ酸量が不足して目的とするウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０２１５】
ローズマリーの粉砕物１重量に対し、納豆菌の重量が０．００５重量を下回る場合、発酵が十分に進行せず、目的とするウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０２１６】
ローズマリーの粉砕物１重量に対し、納豆菌の重量が０．０３重量を上回る場合、発酵が進行しすぎて目的とするウルソ酸誘導体が分解され、ウルソ酸誘導体が十分得られないおそれがある。
【０２１７】
ローズマリーの粉砕物、ベタイン、大豆粉砕物及び納豆菌を添加されて発酵される。
【０２１８】
前記の発酵の温度として、１０〜４０℃が好ましく、２０〜３７℃がより好ましい。
【０２１９】
前記の発酵の時間として、２４〜９６時間が好ましく、３０〜６０時間がより好ましい。
【０２２０】
前記の発酵は、攪拌されながら、行うことが好ましく、１分間当たり１２〜１２０回の速度が好ましい。
【０２２１】
発酵後、冷却されることは、次のアルカリ還元を行いやすくすることから好ましい。
【０２２２】
次いで、発酵された発酵物は、アルカリ還元化される。
【０２２３】
ここで、ウルソ酸誘導体のエステル結合を安定化させるために、アルカリ還元化される。
【０２２４】
アルカリ還元化によりエステル結合が還元されて、安定な構造を呈する。
【０２２５】
このアルカリ還元装置としては、株式会社ゼノン製の家庭用電解水生成装置であるセルラキッス、アクアステラ、アリビオ、日本トリム社製のＴＩ−７００型やＴＩ−８００型などが用いられる。
【０２２６】
前記の反応物を配管に流してアルカリ還元装置に供して得られる。
【０２２７】
目的とするウルソ酸誘導体が液体として得られる。
【０２２８】
前記のように得られたアルカリ還元化されたウルソ酸誘導体を凍結乾燥装置、たとえば、日本エフディ製凍結乾燥機、株式会社ユスジマ製凍結乾燥機、東洋技研製ＴＧＤ−２５０ＬＦ２などに供し、ウルソ酸誘導体が粉末として得られる。
【０２２９】
前記の反応物から、目的とするウルソ酸誘導体を精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。この精製の方法としては、分離用の樹脂などの精製操作を利用することが好ましい。
【０２３０】
このようにして得られたウルソ酸誘導体は、液体又は粉末として得られる。得られたウルソ酸誘導体は医薬品、食品製剤又は化粧品に利用される。医薬品としては、抗炎症剤、抗動脈硬化剤、癌転移抑制剤、シワ除去剤などに利用される。
【０２３１】
食品製剤としては、コラーゲンの増加を目的として炎症の抑制や予防の目的に用いられる。
【０２３２】
化粧品としては、コラーゲンの減少に起因したシワやタルミ、二重アゴの改善又は予防の目的で利用される。
【０２３３】
次に、前記に記載のコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体１重量、グルコサミン０．３〜３重量、コンドロイチン硫酸０．２〜２重量を添加し、攪拌し、加温して得られる組成物からなる食品製剤について説明する。
【０２３４】
ここでいうコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体とは、前記に記載されたウルソ酸とベタイン、ガンマ−アミノ酪酸、没食子酸、エイコサペンタエン酸、ケイヒ酸、パラ−クマル酸のいずれから選択される一つがエステル結合したものであり、コラーゲン増加作用を有する。
【０２３５】
このウルソ酸誘導体は、粗生成物、混合物、合成された物、抽出して精製された純度の高い物質のいずれもでもよい。
【０２３６】
グルコサミンはカニやエビの甲羅から抽出して得られるキトサンを分解して得られるアミノ糖である。グルコサミンは関節や軟骨の増強作用及び抗炎症作用を有することから、ウルソ酸誘導体と相乗作用を呈し、抗炎症作用が増強される。
【０２３７】
たとえば、焼津水産化学工業製のグルコサミンが天然由来で、高い品質であることから好ましい。
【０２３８】
コンドロイチン硫酸は、骨や軟骨の滑膜を形成する硫酸糖であり、サメの軟骨から抽出される。コンドロイチン硫酸には、骨形成を促進し、関節炎、神経炎や筋肉炎などの炎症を改善し、又は予防する働きがある。
【０２３９】
たとえば、生化学工業製のコンドロイチン硫酸が天然由来で、医薬品原料としての高い品質であることから好ましい。
【０２４０】
ウルソ酸誘導体とグルコサミンとコンドロイチン硫酸は、ウルソ酸の１７位に結合したカルボキシル基とグルコサミンのアミノ基が結合してさらに、コンドロイチン硫酸の硫酸基が結合した複合体として組成物を形成することから、それぞれの働きが相乗的に発揮される。
【０２４１】
ウルソ酸誘導体とグルコサミンとコンドロイチン硫酸は、いずれも作用機序の異なる抗炎症作用を呈することから、発症原因の異なる各種の炎症に対して抑制作用を示すことから、ウルソ酸誘導体とグルコサミンとコンドロイチン硫酸の組成物は抗炎症作用に優れている。
【０２４２】
ウルソ酸誘導体１重量に対し、グルコサミンの重量は０．３〜３重量である。
【０２４３】
ウルソ酸誘導体１重量に対し、グルコサミンの重量が０．３重量を下回る場合、グルコサミンが不足し、組成物形成が十分に行われなくなるおそれがある。
【０２４４】
ウルソ酸誘導体１重量に対し、グルコサミンの重量が３重量を上回る場合、ウルソ酸誘導体が不足し、組成物形成が十分に行われなくなるおそれがある。
【０２４５】
ウルソ酸誘導体１重量に対し、コンドロイチン硫酸の重量は０．２〜２重量である。
【０２４６】
ウルソ酸誘導体１重量に対し、コンドロイチン硫酸の重量が０．２重量を下回る場合、コンドロイチン硫酸が不足し、組成物形成が十分に行われなくなるおそれがある。
【０２４７】
ウルソ酸誘導体１重量に対し、コンドロイチン硫酸の重量が２重量を上回る場合、ウルソ酸誘導体が不足し、組成物形成が十分に行われなくなるおそれがある。
【０２４８】
ウルソ酸誘導体、グルコサミン、コンドロイチン硫酸は攪拌され、加温される。
【０２４９】
この攪拌は、混合機を用いて行われ、攪拌速度は１分間あたり１０〜１００回が好ましい。
【０２５０】
この加温は、加温温度として、７〜４０℃が好ましく、１５〜２５℃がより好ましい。
【０２５１】
前記の加温の時間として、１〜２４時間が好ましく、３〜１２時間がより好ましい。
【０２５２】
さらに、前記の組成物が他の原料とともに加工され、食品製剤になる。この場合、種々の食品素材又は飲料品素材に添加することによって、例えば、粉末状、錠剤状、液状（ドリンク剤等）、カプセル状等の形状の食品製剤にすることができる。また、基材、賦形剤、添加剤、副素材、増量剤等を適宜添加してもよい。
【０２５３】
前記の食品製剤は、１日数回に分けて経口摂取される。１日の摂取量は０．２〜１０ｇが好ましく、０．３〜６ｇがより好ましく、０．５〜４ｇがさらに好ましい。１日の摂取量が、０．２ｇを下回る場合、十分なコラーゲン増加作用が発揮されないおそれがある。１日の摂取量が、１０ｇを越える場合、コストが高くなるおそれがある。上記の他に、飴、せんべい、クッキー、飲料等の形態で使用することができる。
【０２５４】
ここでいう食品製剤とは、人間が食する保健機能食品、健康補助食品、一般食品、病院で用いる病院用食品、また、動物用の飼料又はペット用サプリメント、ペットフードである。
【０２５５】
これらの食品製剤は、関節炎、筋肉炎、神経炎などの炎症の予防又は改善の目的で、また、シワやタルミの予防や改善の目的で利用される。
【０２５６】
次に、前記に記載のウルソ酸誘導体１重量、ビタミンＣ０．０１〜０．１重量、大豆発酵エキス０．２〜２重量を添加し、攪拌し、加温して得られる組成物からなる化粧品について説明する。
【０２５７】
ここでいうコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体とは、前記に記載されたウルソ酸とベタイン、ガンマ−アミノ酪酸、没食子酸、エイコサペンタエン酸、ケイヒ酸、パラ−クマル酸のいずれから選択される一つがエステル結合したものであり、コラーゲン増加作用を有する。
【０２５８】
このウルソ酸誘導体は、粗生成物、混合物、合成された物、抽出して精製された純度の高い物質のいずれもでもよい。
【０２５９】
ビタミンＣは、武田薬品工業社の製品が高い品質のため、好ましい。ビタミンＣは真皮や骨膜で、線維芽細胞の細胞外に細胞外マトリックスとしてコラーゲンの生成を促進する。
【０２６０】
ウルソ酸誘導体はコラゲナーゼ阻害作用を介してビタミンＣにより生成されたコラーゲンを守り、維持する働きがあることから、ウルソ酸誘導体とビタミンＣの配合はコラーゲンを増加させるために、効果的である。
【０２６１】
大豆発酵エキスは、大豆たんぱく質を発酵課程で生じるプロテアーゼで切断してアミノ酸を生じる。生じたアミノ酸は真皮の線維芽細胞で、コラーゲンを生成する原料として利用される。
【０２６２】
たとえば、大豆発酵エキスは東洋発酵製のものが品質が良いことから、好ましい。
【０２６３】
大豆発酵エキスとビタミンＣを混合することは、線維芽細胞でのコラーゲン合成のアミノ酸原料とコラーゲン生成の促進作用により、生成されるコラーゲンが増す。
【０２６４】
ウルソ酸誘導体と大豆発酵エキスとビタミンＣを混合することは、ウルソ酸誘導体はコラゲナーゼ阻害作用を介して、生成されたコラーゲンを分解から防御することから、コラーゲン量が増加する特長を有する。
【０２６５】
コラーゲンの増加により、肌の真皮の炎症が抑制され、ハリ感と弾力が増加し、美肌を形成する。
【０２６６】
ウルソ酸誘導体１重量に対し、ビタミンＣの重量は０．０１〜０．１重量である。
【０２６７】
ウルソ酸誘導体１重量に対し、ビタミンＣの重量が０．０１重量を下回る場合、線維芽細胞により生成されるコラーゲン量が低下するおそれがある。
【０２６８】
ウルソ酸誘導体１重量に対し、ビタミンＣの重量が０．１重量を上回る場合、線維芽細胞により生成されるコラーゲンがコラゲナーゼにより分解されるおそれがある。
【０２６９】
ウルソ酸誘導体１重量に対し、大豆発酵エキスの重量は０．２〜２重量である。
【０２７０】
ウルソ酸誘導体１重量に対し、大豆発酵エキスの重量が０．２重量を下回る場合、アミノ酸が不足して線維芽細胞により生成されるコラーゲン量が低下するおそれがある。
【０２７１】
ウルソ酸誘導体１重量に対し、大豆発酵エキスの重量が２重量を上回る場合、線維芽細胞により生成されたコラーゲンが過剰発酵物により分解されるおそれがある。
【０２７２】
ウルソ酸誘導体、ビタミンＣ、大豆発酵エキスは攪拌され、加温される。
【０２７３】
この攪拌は、混合機を用いて行われ、攪拌速度は１分間あたり１０〜１００回が好ましい。
【０２７４】
この加温は、加温温度として、１０〜２０℃が好ましく、１２〜１８℃がより好ましい。
【０２７５】
前記の加温の時間として、１〜１８時間が好ましく、２〜１０時間がより好ましい。
【０２７６】
ついで、化粧品として前記の組成物が他の原料とともに加工される。その後、常法に従って油分、界面活性化剤、ビタミン剤、紫外線吸収剤、増粘剤、保湿剤、副素材等とともに用いることができる。
【０２７７】
化粧水、クリーム、軟膏、ローション、乳液、パック、オイル、石鹸、洗顔料、香料、オーディコロン、浴用剤、シャンプー、リンス等の形態とすることができる。化粧品製剤の形態は任意であり、溶液状、クリーム状、ペースト状、ゲル状、ジェル状、固形状又は粉末状として用いることができる。
【０２７８】
化粧品として皮膚に１日数回に分けて塗布される。１日の塗布量は０．０１〜１０ｇが好ましく、０．０５〜３ｇがより好ましく、０．１〜２ｇがさらに好ましい。１日の塗布量が、０．０１ｇを下回る場合、シワやタルミの治療または防止効果が発揮されないおそれがある。１日の塗布量が、１０ｇを越える場合、コストが高くなるおそれがある。
【０２７９】
ここでいう化粧品とは、人間に用いる化粧品である基礎化粧品、美白化粧品、毛髪洗浄剤、トリートメント剤、染め剤、育毛剤、養毛剤、ボディウォッシュ、医薬部外品である。その他に、動物に用いる皮膚改善剤又はペット用シャンプー、ボディウォッシュである。
【０２８０】
この化粧品はコラーゲンを増加させることにより、シワやタルミを防ぎ、改善する。
【０２８１】
次に、ウルソ酸誘導体からなる抗炎症剤について説明する。
【０２８２】
ここでいうウルソ酸誘導体とは、前記に記載のコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体である。このウルソ酸誘導体は製造された混合物、抽出して精製された高い純度の物質、酵素反応により合成された物質のいずれも用いることができる。
【０２８３】
医薬品として用いる場合には、不純物による影響を除去することが必要となるために、酵素反応により合成され、溶媒の残留の少ない前記の構造のウルソ酸誘導体を用いることが好ましい。
【０２８４】
医薬品として経口剤又は非経口剤として利用され、医薬部外品としては、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、歯磨き粉等に配合されて利用される。
【０２８５】
経口剤としては、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。前記の錠剤及びカプセル剤に混和される場合には、結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等とともに用いることができる。前記の錠剤は、シェラック又は砂糖で被覆することもできる。
【０２８６】
また、前記のカプセル剤の場合には、上記の材料にさらに油脂等の液体担体を含有させることができる。前記のシロップ剤及びドリンク剤の場合には、甘味剤、防腐剤、色素香味剤等を含有させることができる。
【０２８７】
非経口剤としては、軟膏剤、クリーム剤、水剤等の外用剤の他に、注射剤が挙げられる。ここで用いる外用剤の基材としては、ワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴールド等が用いられ、通常の方法によって軟膏剤やクリーム剤等とすることができる。注射剤には、液剤があり、その他、凍結乾燥剤がある。これは使用時、注射用蒸留水や生理食塩液等に無菌的に溶解して用いられる。
【０２８８】
ここでいう抗炎症剤とは、炎症に伴う種々の疾患の改善又は予防を目的とした医薬品又は医薬部外品製剤である。炎症は、体内の各部で発生し、皮膚では、皮膚炎やアトピー性皮膚炎、口鼻腔では副鼻腔炎、鼻炎、花粉症やアレルギー性鼻炎、耳鼻では中耳炎や内耳炎、神経では神経炎や脳炎、筋肉では筋肉炎、肝臓では肝炎、腎臓では腎炎、膀胱では膀胱炎、肺では肺炎、気管支炎などである。
【０２８９】
前記のウルソ酸誘導体からなる抗炎症剤は、前記の皮膚炎、アトピー性皮膚炎、副鼻腔炎、鼻炎、花粉症、アレルギー性鼻炎、中耳炎、内耳炎、神経炎、脳炎、筋肉炎、肝炎、腎炎、膀胱炎、肺炎や気管支炎の治療又は予防を行う薬剤として利用される。
【０２９０】
加えて、家畜、ペットに生じる炎症の治療と予防を目的とした獣医用医薬品としても利用できる。
【０２９１】
以下、前記実施形態を実施例及び試験例を用いて具体的に説明する。ただし、以下の説明は例であり、形態を変化させて実施することができる。
【０２９２】
以下に、酵素化学的に得られるウルソ酸誘導体であるウルソ酸ベタイネートについて説明する。
【実施例１】
【０２９３】
日本産の富有柿の農園（岐阜県）で廃棄される柿の葉１０ｋｇを得て、これを乾燥機（西村鐡工所製、ＣＤドライヤー）により乾燥させ、粉砕機（奈良機械製作所製の自由ミル）により粉砕して柿の葉の粉砕物４ｋｇを得た。
【０２９４】
この柿の葉の粉砕物４ｋｇを寸胴に入れ、精製水１０Ｌとともに、日本甜菜製糖株式会社製のニッテンベタイン４００ｇを添加した。これにエステル交換反応用リパーゼとしてアマノエンザイム社製のニューラーゼＦ３Ｇの４０ｇを精製水に溶解して添加した。
【０２９５】
これに加温機を設置して、２０℃の温度で、６時間、１分間当たり５０回の攪拌速度で、攪拌装置（ヤマト科学製、ラボスターラーＬＲ５００）を用いて攪拌した。
【０２９６】
加温後、水冷により冷却し、ろ紙によりろ過して、ろ液を得た。このろ液を日本トリム社製のＴＩ−７００型に供し、アルカリ還元化された溶液を得た。
【０２９７】
この溶液を日本エフディ製の凍結乾燥機により、凍結乾燥し、ウルソ酸誘導体であるウルソ酸ベタイネートを粉体として９４０ｇを得た。
【０２９８】
以下に、酵素化学的に得られるウルソ酸誘導体であるウルソ酸ガンマ−アミノブチレートについて説明する。
【実施例２】
【０２９９】
日本産の富有柿の農園（岐阜県）で廃棄される柿の葉９ｋｇを得て、これを乾燥機（株式会社大川原製作所製のバイブロン）により乾燥させ、粉砕機（株式会社奈良機械製作所製のゴブリン）により粉砕して柿の葉の粉砕物４．５ｋｇを得た。
【０３００】
この柿の葉の粉砕物４．５ｋｇを寸胴に入れ、精製水１０Ｌとともに、オリザ油化社製のガンマ−アミノ酪産４５０ｇを添加した。これにエステル交換反応用リパーゼとして名糖産業社製のリパーゼＰＬの４５ｇを精製水に溶解して添加した。
【０３０１】
これに加温機（フジマック製、投げ込みヒーター）を設置して、２５℃の温度で、６時間、１分間当たり５０回の攪拌速度で、攪拌装置を用いて攪拌した。
【０３０２】
加温後、水冷により冷却し、ろ紙によりろ過して、ろ液を得た。このろ液を日本トリム社製のＴＩ−７００型に供し、アルカリ還元化された溶液を得た。
【０３０３】
この溶液を日本エフディ製の凍結乾燥機により、凍結乾燥し、ウルソ酸誘導体のウルソ酸ガンマ−アミノブチレートを粉体として６４９ｇを得た。
【０３０４】
以下に、酵素化学的に得られるウルソ酸誘導体であるウルソ酸ガロネートについて説明する。
【実施例３】
【０３０５】
日本産の富有柿の農園（岐阜県）で廃棄される柿の葉１１ｋｇを得て、これを乾燥機（株式会社大川原製作所製のバイブロン）により乾燥させ、粉砕機（株式会社奈良機械製作所製のゴブリン）により粉砕して柿の葉の粉砕物５ｋｇを得た。
【０３０６】
この柿の葉の粉砕物５ｋｇを寸胴に入れ、精製水１０Ｌとともに、岩手ケミカル株式会社製の没食子酸５００ｇを添加した。これにエステル交換反応用リパーゼとしてアマノエンザイム社製のリパーゼＦ−ＡＰ１５の５０ｇを精製水に溶解して添加した。
【０３０７】
これに加温機（フジマック製、投げ込みヒーター）を設置して、２０℃の温度で、６時間、１分間当たり４５回の攪拌速度で、攪拌装置を用いて攪拌した。
【０３０８】
加温後、水冷により冷却し、ろ紙によりろ過して、ろ液を得た。このろ液を日本トリム社製のＴＩ−７００型に供し、アルカリ還元化された溶液を得た。
【０３０９】
この溶液を日本エフディ製の凍結乾燥機により、凍結乾燥し、ウルソ酸誘導体のウルソ酸ガロネートを粉体として７７８ｇを得た。
【０３１０】
以下に、ウルソ酸ベタイネートの精製について説明する。
【実施例４】
【０３１１】
実施例１で得られたウルソ酸ベタイネートの粉末２０ｇを１０％エタノール２００ｍＬに溶解した。事前に１０％エタノールに懸濁したダイヤイオン（三菱化学製）をガラス製カラムに充填した。
【０３１２】
このカラムにウルソ酸ベタイネート溶液を供し、１０％エタノール１Ｌを流した。さらに、３０％エタノール溶液を１Ｌ流した。
【０３１３】
次いで、５０％エタノール溶液を１Ｌ流し、この画分を採取した。
【０３１４】
この画分を減圧乾燥機（東洋理工製）に供し、乾燥させ、ウルソ酸ベタイネートの精製品を粉末として１．３ｇ得た。これを実施例４の検体とした。
【０３１５】
以下に、ウルソ酸ガンマ−アミノブチレートの精製について説明する。
【実施例５】
【０３１６】
実施例２で得られたウルソ酸ガンマ−アミノブチレートの粉末２０ｇを２０％エタノール２００ｍＬに溶解した。事前に２０％エタノールに懸濁したダイヤイオン（三菱化学製）をガラス製カラムに充填した。
【０３１７】
このカラムに前記のウルソ酸ガンマ−アミノブチレート溶液を供し、２０％エタノール１Ｌを流した。さらに、３０％エタノール溶液を１Ｌ流した。
【０３１８】
次いで、５０％エタノール溶液を１Ｌ流した。７０％エタノール溶液を１Ｌ流し、この画分を採取した。
【０３１９】
この画分を減圧乾燥機（東洋理工製）に供し、乾燥させ、ウルソ酸ガンマ−アミノブチレートを粉末として２．１ｇ得た。これを実施例５の検体とした。
【０３２０】
以下に、ウルソ酸ガロネートの精製について説明する。
【実施例６】
【０３２１】
実施例３で得られたウルソ酸ガロネートの粉末２０ｇを２０％エタノール２００ｍＬに溶解した。事前に２０％エタノールに懸濁したダイヤイオン（三菱化学製）をガラス製カラムに充填した。
【０３２２】
このカラムにウルソ酸ガロネート溶液を供し、２０％エタノール１Ｌを流した。さらに、３０％エタノール溶液を１Ｌ流し、この画分を採取した。
【０３２３】
この画分を減圧乾燥機（東洋理工製）に供し、乾燥させ、ウルソ酸ガロネートを粉末として２．４ｇ得た。これを実施例６の検体とした。
【０３２４】
以下に、ウルソ酸誘導体の同定試験について説明する。
（試験例１）
【０３２５】
上記のように得られた実施例１、実施例２、実施例３、実施例４、実施例５及び実施例６の検体を精製エタノールに溶解し、質量分析器付き高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所）で分析し、さらに、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ、ブルカー製、ＡＣ−２５０）で解析した。
【０３２６】
その結果、実施例１の検体からは、ウルソ酸誘導体としてウルソ酸ベタイネートが同定され、その含有率は２３．１％であった。
【０３２７】
また、実施例２の検体からは、ウルソ酸誘導体としてウルソ酸ガンマ−アミノブチレートが同定され、その含有率は２８．９％であった。
【０３２８】
実施例３の検体からは、ウルソ酸誘導体としてウルソ酸ガロネートが同定され、その含有率は２９．２％であった。
【０３２９】
実施例４の検体からは、ウルソ酸誘導体としてウルソ酸ベタイネートが同定され、その含有率は７９．３％であった。
【０３３０】
実施例５の検体からは、ウルソ酸誘導体としてウルソ酸ガンマ−アミノブチレートが同定され、その含有率は８１．３％であった。
【０３３１】
実施例６の検体からは、ウルソ酸誘導体としてウルソ酸ガロネートが同定され、その含有率は８０．７％であった。
【０３３２】
以下に、ローズマリー、ベタイン、大豆粉砕物、納豆菌の発酵により得られるウルソ酸誘導体について説明する。
【実施例７】
【０３３３】
アメリカで栽培されたローズマリーを新鮮な状態で入手後、乾燥機（カワサキ機工製、棚式乾燥機）により乾燥し、さらに、粉砕機（奈良機械製作所製、スーパー自由ミル）により粉砕物してローズマリーの粉砕物１ｋｇを得た。これを２５℃に加温して、精製水１０Ｌを添加した寸胴に、このローズマリーの粉砕物１ｋｇを添加し、日本甜菜製糖株式会社製のニッテンベタイン５０ｇを添加した。
【０３３４】
これに北海道産の大豆を粉砕機（奈良機械製作所製、スーパー自由ミル）により粉砕した大豆粉砕物５ｋｇを添加し、さらに、納豆素本舗製の納豆菌１０ｇを添加し、清浄な攪拌棒にて攪拌した。
【０３３５】
これに加温機を設置して、３２℃の温度で、４８時間、１分間当たり３０回の攪拌速度で、攪拌装置を用いて攪拌した。
【０３３６】
加温後、水冷により冷却し、ろ紙によりろ過して、ろ液を得た。得られたろ液を日本トリム社製のＴＩ−７００型に供し、アルカリ還元化された溶液を得た。
【０３３７】
この溶液を日本エフディ製の凍結乾燥機により、凍結乾燥し、ウルソ酸誘導体を粉体として５９ｇを得た。
【０３３８】
以下に、ウルソ酸誘導体の精製について説明する。
【実施例８】
【０３３９】
実施例７で得られたウルソ酸誘導体の粉末１０ｇを１０％エタノール１００ｍＬに溶解した。事前に１０％エタノールに懸濁したダイヤイオン（三菱化学製）をガラス製カラムに充填した。
【０３４０】
このカラムにウルソ酸ガンマ−アミノブチレート溶液を供し、１０％エタノール１Ｌを流した。さらに、３０％エタノール溶液を１Ｌ流した。
【０３４１】
次いで、５０％エタノール溶液を１Ｌ流した。７０％エタノール溶液を１Ｌ流し、それぞれの画分を採取した。
【０３４２】
ぞれぞれの画分を減圧乾燥機（東洋理工製）に供し、乾燥させ、１０％エタノール画分からウルソ酸ベタイネート及びウルソ酸シンナメート、３０％エタノール画分からウルソ酸ガロネート及びウルソ酸パラ−クマロネート、ならびに７０％エタノール画分からウルソ酸ガンマ−アミノブチレート及びウルソ酸エイコサペンタエートを得た。
【０３４３】
以下に、ウルソ酸誘導体の同定試験について説明する。
（試験例２）
【０３４４】
上記のように得られた実施例７及び実施例８の検体を精製エタノールに溶解し、質量分析器付き高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所）で分析し、さらに、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ、ブルカー製、ＡＣ−２５０）で解析した。
【０３４５】
その結果、実施例７の検体からは、ウルソ酸誘導体としてウルソ酸ベタイネート、ウルソ酸シンナメート、ウルソ酸ガンマ−アミノブチレート、ウルソ酸パラ−クマロネート、ウルソ酸エイコサペンタエート及びウルソ酸ガロネートが同定された。それぞれの含有率は、８．３％、３．４％、８．１％、４．４％、０．９％及び６．７％であった。
【０３４６】
実施例８の検体から精製された１０％エタノール画分からはウルソ酸ベタイネート及びウルソ酸シンナメートが同定され、ぞれぞれの含有率は、６４．７％及び１２．８％であった。
【０３４７】
実施例８の検体から精製された３０％エタノール画分からはウルソ酸ガロネート及びウルソ酸パラ−クマロネートが同定され、ぞれぞれの含有率は、６６．１％及び９．３％であった。
【０３４８】
実施例８の検体から精製された７０％エタノール画分からはウルソ酸ガンマ−アミノブチレート及びウルソ酸エイコサペンタエートが同定され、ぞれぞれの含有率は、６７．１％及び３．４％であった。
【０３４９】
以下に、ヒト皮膚由来線維芽細胞を用いた実験について説明する。これはヒト皮膚由来の線維芽細胞を用いることにより、その活性化作用を評価する試験方法である。
（試験例３）
【０３５０】
正常ヒト成人皮膚繊維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｃｅｌｌ  ＮＨＤＦ（ＡＤ）、クラボウ株式会社製）を専用培養液にて培養し、実施例１、実施例２、実施例３、実施例４、実施例５、実施例６及び実施例７で得られた検体をジメチルスルホキシド（和光純薬製）に溶解し、それぞれの０．１ｍｇを添加し、３７℃で、４８時間培養した。
【０３５１】
溶媒対照としてジメチルスルホキシドを用いた。なお、陽性対照としてフィブロブラスト成長因子（ＦＧＦ、コスモバイオ製）を精製水に溶解して０．１ｍｇを添加した。細胞数を計数し、さらに、コラーゲン量を抗体法（コンドレックス社製）により観察した。
【０３５２】
その結果、細胞数について、溶媒対照の値に対して、実施例１、実施例２、実施例３、実施例４、実施例５、実施例６及び実施例７の検体０．１ｍｇの値は、それぞれ１７６％、１６７％、１７０％、２８３％、２６４％、２８８％及び１７６％であり、いずれの検体も線維芽細胞の増殖性を示した。
【０３５３】
陽性対照のＦＧＦの０．１ｍｇの添加では、溶媒対照の値に対して、１５９％であったことから、実施例１、実施例２、実施例３、実施例４、実施例５、実施例６及び実施例７の検体は、ＦＧＦよりも強い線維芽細胞の増殖性を示すことが判明した。
【０３５４】
コラーゲン量について、溶媒対照の値に対して、実施例１、実施例２、実施例３、実施例４、実施例５、実施例６及び実施例７の検体０．１ｍｇの値は、それぞれ２０１％、２１８％、２０６％、３２０％、３１７％、３０８％及び２４４％であり、いずれの検体もコラーゲンの増加作用を示した。
【０３５５】
陽性対照のＦＧＦの０．１ｍｇの添加では、溶媒対照の値に対して、１８７％であったことから、実施例１、実施例２、実施例３、実施例４、実施例５、実施例６及び実施例７の検体は、ＦＧＦよりも強いコラーゲン増加作用を示すことが判明した。
【０３５６】
以下に、ウルソ酸誘導体からなる食品製剤について説明する。
【実施例９】
【０３５７】
清浄な寸胴に、精製水を１０Ｌ添加し、これを２０℃に加温した。これに前記の実施例７で得られた検体１ｋｇを添加し、さらに、焼津水産化学工業製のグルコサミン１ｋｇ、生化学工業製のコンドロイチン硫酸１ｋｇを添加した。これを１０回／分の速度で、攪拌し、２０℃に６時間加温した。これを冷却して乾燥機に供して組成物２．８ｋｇを得た。
【０３５８】
食品用混合機（ＮＶ型、西村製作所製）に前記の組成物１ｋｇ、緑茶の抽出物１０ｇ、ステビア粉末（ダイエーワーク製）３０ｇ、食用セルロース（旭化成製）１．８ｋｇ、アスコルビン酸（武田食品製）０．１ｇを添加し、混合した。
【０３５９】
これを常法によりブタゼラチン由来１号カプセル（カプスゲル製）に３００ｍｇずつ充填し、食品製剤を得た。これを実施例９の食品製剤とした。
【０３６０】
以下に、ウルソ酸誘導体からなる食品製剤の試験について説明する。
（試験例４）
４０〜６０才のスギ花粉によりクシャミやハナミズを呈する男性５例に、前記の実施例９で得られた食品製剤を１日１回２ｇずつ、１４日間摂食させた。摂食前及び摂食１４日目に、スギ花粉による反応性を観察した。さらに、摂食前及び摂食１４日目に、血液を採取し、ＩｇＥ量及び血中インターロイキン６量を免疫抗体法により測定した。
【０３６１】
その結果、実施例９の食品製剤を摂食後、スギ花粉によるクシャミやハナミズの発現数は、摂食前に比して平均で、４０％になり、反応性の現象が認められた。さらに、血液中ＩｇＥ量は、摂食前に比して平均値で４５％となり、ＩｇＥ量の減少が認められた。
【０３６２】
また、血中インターロイキン６量は、実施例８の食品製剤を摂食後に、摂取前に比し、６７％となり、インターロイキン６量の減少が認められた。
【０３６３】
これらの結果、実施例９の食品製剤の摂取により、花粉症の症状が軽度となり、ＩｇＥ量及び炎症の指標となるサイトカインであるインターロイキン６も減少したことから、実施例９の食品製剤は、抗炎症作用と花粉症抑制作用を呈することが判明した。
【０３６４】
なお、食品製剤摂取による体調の変化はなく、血液検査、その他の血液生化学検査、尿検査の検査値にも、いずれも、副作用は認められなかった。
【０３６５】
次に、ウルソ酸誘導体からなる化粧品について説明する。
【実施例１０】
【０３６６】
清浄なステンレス製寸胴に、ナチュラルラボラトリーズ製ヤシ油１ｋｇを添加し、ここに、実施例７で得られたウルソ酸誘導体１００ｇを添加した。さらに、武田薬品工業製のビタミンＣ５ｇ、東洋発酵製の大豆発酵エキス１００ｇを添加した。これを１６℃に加温して１分間に２０回の速度で６時間攪拌し、減圧乾燥してウルソ酸誘導体を含有する組成物１．８ｋｇを得た。
【０３６７】
小型混合機（ホソカワ粉体製）にモノステアリン酸ポリエチレングリコール１０ｇ、親油型モノステアリン酸グリセリン１０ｇ、馬油エステル２０ｇ及びオレイン酸３０ｇを加熱し、溶解した。得られた溶液に、前記のウルソ酸誘導体を含有する組成物２００ｇ、プロピレングリコール２０ｇ、グリチルリチン酸ジカリウム１ｇ、α−トコフェロール１ｇ及び精製水７００ｇを添加した。これらを溶解した後、冷却して化粧液を得た。
【０３６８】
一方、前記のウルソ酸誘導体を含有する組成物を除外した基材のみからなる化粧液を製造し、対照検体として調製した。
【０３６９】
以下に、ウルソ酸誘導体からなる化粧品の試験について説明する。
（試験例５）
実施例１０で得られた化粧液を使用して、４１〜６８才の女性６例を対象に、紫外線に対するシワ改善及び炎症改善試験を行なった。すなわち、前記実施例１０の化粧液を１日当たり１ｇずつ、７日間、顔面部に塗布させた。
【０３７０】
さらに、前記の女性に、１３時〜１４時の間、太陽光を浴びさせた。使用前及び使用７日後に、皮表角層水分量測定装置（ＩＢＳ社製、ＳＫＩＣＯＮ２００）を用いて角質水分量、弾力計（クトメーター）を用いて肌弾性及び単位面積当たりのシワの長さを計測した。さらに、汗に含有される炎症性物質であるプロスタグランジンＥ２量を免疫酵素法（カイマン製）により測定した。
【０３７１】
その結果、使用前の太陽光照射に比し、実施例１０の使用後には、皮表角層水分量は、実施例１０の使用後に、１８９％となった。
【０３７２】
また、弾力計による弾力は、使用前に比して実施例１０の使用後では、１７６％となった。
【０３７３】
さらに、シワの長さは、使用前に比し、７０％になり、シワの減少が認められた。
【０３７４】
加えて、プロスタグランジンＥ２量は、使用前に比して、７８％に減少した。
【０３７５】
一方、使用感においても特に問題は聞かれなかった。
【０３７６】
これらの結果、実施例１０で得られた化粧液は、抗炎症作用、水分増加作用、シワの改善効果および炎症物質の抑制作用が認められた。
【０３７７】
なお、ウルソ酸誘導体を含有する組成物を除外した基材のみからなる化粧液では、抗炎症作用、水分増加作用、シワの改善効果および炎症物質の抑制作用はいずれも認められなかった。
【０３７８】
次に、ウルソ酸誘導体からなる抗炎症剤について説明する。
【実施例１１】
【０３７９】
清浄なステンレス製溶解槽に、前記の実施例４で得られたウルソ酸誘導体５０ｇ、ラノリン３００ｇ、マクロゴールド２００ｇ、ミツロウ２０ｇ、オゾケライト３０ｇを添加し、１時間溶解した。これを混練機に供し、混合した。これを再度、溶解槽で溶解して、過熱し、脱気装置により脱気させて、目的とする抗炎症剤を軟膏剤として得た。
【０３８０】
なお、対照として前記の実施例４で得られたウルソ酸誘導体をラノリンに替えた対照となる検体を対照検体として得た。
【０３８１】
以下に、ウルソ酸誘導体からなる抗炎症剤の試験について説明する。
（試験例６）
４８〜７３才の慢性関節炎を呈する男性２１例に、前記の実施１１で得られた抗炎症剤を１日１回２ｇずつ、１４日間関節に塗布させた。塗布前及び塗布１４日目に、関節の状態を観察した。さらに、塗布前及び塗布１４日目に、血液を採取し、血中インターロイキン６量を免疫抗体法により測定した。
【０３８２】
その結果、実施例１１の抗炎症剤を１４日間塗布後、２１例中１７例で関節炎の症状は軽度になり、その改善率は８１％であった。
【０３８３】
なお、基材のみからなる基材群では、改善率は、０％であった。
【０３８４】
また、血中インターロイキン６量は、実施例１１の抗炎症剤を塗布した後に、塗布前に比し、５６％となり、インターロイキン６量の減少が認められた。なお、基材のみからなる基材群では、塗布前の値の９５％であり、変化は認められなかった。
【０３８５】
これらの結果、実施例１１の抗炎症剤の塗布により、関節炎の症状が軽度となり、炎症性サイトカインであるインターロイキン６も減少したことから、実施例１１の抗炎症剤は強い抗炎症作用を呈することが判明した。
【０３８６】
なお、この抗炎症剤の使用による副次的な体調の変化はなく、血液検査、その他の血液生化学検査、尿検査の検査値にも、いずれも、副作用は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【０３８７】
本発明であるコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体は、コラーゲンの増加、線維芽細胞の増殖刺激、コラゲナーゼの抑制という複合的な機序により、コラーゲン増加作用を呈することから、新しい機序の物質であり、様々な領域で利用される。
【０３８８】
また、本発明であるコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体は、副作用の弱い優れた抗炎症作用を示すことから、コラーゲンを増加させる食品、シワを防止する化粧品、炎症を抑制する医療分野などで利用され、食品、化粧品、医療の分野の発展に寄与できるものと期待される。
【０３８９】
本発明であるコラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体は、産業廃棄物として処分される柿の葉を有効的に利用するものであり、廃棄物を減らして、有用物質を産生する新しい産業の育成にも貢献できる。
【０３９０】
コラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体からなる食品製剤は、人、動物、ペット用にも、利用できる安全性の高いものであり、関節炎、鼻炎、花粉症、気管支炎、風邪などの改善又はその発症を予防し、国民生活の質的向上に寄与するものである。
【０３９１】
さらに、コラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体からなる化粧品は、コラーゲン量を増加させることにより、シワに対して改善又は予防効果を示し、女性、特に、高齢者の生活の質を向上させる。
【０３９２】
加えて、コラーゲン増加作用を呈するウルソ酸誘導体からなる抗炎症剤によれば、種々の炎症の改善又は予防ができ、国民生活を向上させる。