(57)【要約】      （修正有）【課題】植物において花芽形成を制御する手段を提供する。【解決手段】以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのDNA：（ａ）特定の塩基配列からなるDNA、（ｂ）特定の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつ（ａ）のDNAと実質的に同一の花芽形成制御機能を有するDNA、（ｃ）特定の塩基配列の一部を含み、かつ（ａ）のDNAと実質的に同一の花芽形成制御機能を有するDNA、（ｄ）特定の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ（ａ）のDNAと実質的に同一の花芽形成制御機能を有するDNA。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのDNA：
（ａ）配列番号１〜３のいずれかの塩基配列からなるDNA、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかの塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつ（ａ）のDNAと実質的に同一の花芽形成制御機能を有するDNA、
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかの塩基配列の一部を含み、かつ（ａ）のDNAと実質的に同一の花芽形成制御機能を有するDNA、
（ｄ）配列番号１〜３のいずれかの塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ（ａ）のDNAと実質的に同一の花芽形成制御機能を有するDNA。
【請求項２】
配列番号１０又は１１の塩基配列からなるプロモーターDNA。
【請求項３】
請求項１に記載のDNAを含む、ベクター。
【請求項４】
さらに請求項２に記載のプロモーターDNAを含む、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のベクターが導入された形質転換微生物又は形質転換植物細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換植物細胞を含む、形質転換植物体。
【請求項７】
請求項１記載のDNAからなる遺伝子の発現を制御することにより、植物の花芽形成を制御する方法。
【請求項８】
請求項１記載のDNAからなる遺伝子の発現を抑制するDNAを含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターが導入された形質転換微生物又は形質転換植物細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換植物細胞を含む、形質転換植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユーカリ属植物由来の花芽形成制御機能を有するDNA、該DNAからなる遺伝子の発現を制御する方法、そのためのベクター、該ベクターが導入された形質転換体、並びに該遺伝子の発現が制御された植物体に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界の木材消費量は毎年増加傾向にあり、用途別にみると、薪炭用材の消費が過半数を占め、開発途上地域では今でも増加傾向を示している。製材、製紙用の木材チップなどの産業用材も、先進地域の消費量は若干の減少に転じたものの、開発途上国地域における消費量は増加している。先進地域では文明の発達とともに、森林の農地への転用や資材としての利用等により森林を大きく減少させてきたが、最近植林活動によってわずかながら増加している。しかし、開発途上地域では、かつては先進国の商業伐採により、近年は人口増加にともなって生活燃料や農地の需要が拡大し、その結果、世界全体における森林面積が急激に減少しつづけている。こうしたことから、二酸化炭素固定化能の低下による地球温暖化などの問題が取り上げられるようにもなってきた。これらの問題を解決しつつ、産業的に製材、製紙用木材チップの安定供給などを目指し、ユーカリ属等の早生樹種を活用した植林事業が世界各地で盛んに行われている。
【０００３】
一方、塩害、砂漠化などにより引き起こされる土壌劣化が急速に進んでおり、世界的に大きな問題となっている。有力な解決法の1つとして、これらの種々の浸透圧ストレスへの適応応答に関する遺伝子に着目し、遺伝子組換えを行った樹木を得ることができれば、乾燥や塩害により植物が生育できなくなってしまった土地に植林できる可能性がある。しかし、遺伝子組換えによる形質転換生物全般に対して、環境への影響を懸念する声も大きい。特に、遺伝子組換え体の野外植栽後、花芽形成により生ずる花粉を経由して、人工的に組換えられた新規遺伝子が飛散し、他の生物本来のゲノム構成に変異を与える可能性が示唆されている。
【０００４】
自然界には花粉形成能力の低い変異体（奇数倍体）の存在が認められ、人工的に不稔個体を作出できる技術もあるが、樹木については広く応用できるレベルではない。従って、植物の花芽形成を効率的かつ完全に制御する為の技術が求められていた。モデル植物等では全ゲノム情報が明らかにされ、花芽形成に関わる遺伝子も同定されている（例えば、非特許文献１及び２）。しかしながら、ユーカリ属植物由来の花芽形成に関わる遺伝子については報告されていない。
【０００５】
【特許文献１】Yanofsky et al. Nature, 346, 35-39, 1990
【非特許文献２】Br,adley et.al. Cell, 72, 85-95, 1993
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、植物において花芽形成を制御する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ユーカリagamous相同遺伝子がユーカリの花芽形成組織において特異的に高発現していること、該遺伝子を植物において過剰発現させることにより花芽形成が促進されることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのDNA：
（ａ）配列番号１〜３のいずれかの塩基配列からなるDNA、
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかの塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつ（ａ）のDNAと実質的に同一の花芽形成制御機能を有するDNA、
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかの塩基配列の一部を含み、かつ（ａ）のDNAと実質的に同一の花芽形成制御機能を有するDNA、
（ｄ）配列番号１〜３のいずれかの塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ（ａ）のDNAと実質的に同一の花芽形成制御機能を有するDNA。
（２）配列番号１０又は１１の塩基配列からなるプロモーターDNA。
（３）（１）に記載のDNAを含む、ベクター。
（４）さらに（２）に記載のプロモーターDNAを含む、（３）に記載のベクター。
（５）（３）又は（４）に記載のベクターが導入された形質転換微生物又は形質転換植物細胞。
（６）（５）に記載の形質転換植物細胞を含む、形質転換植物体。
（７）（１）記載のDNAからなる遺伝子の発現を制御することにより、植物の花芽形成を制御する方法。
（８）（１）記載のDNAからなる遺伝子の発現を抑制するDNAを含むベクター。
（９）（８）に記載のベクターが導入された形質転換微生物又は形質転換植物細胞。
（１０）（９）に記載の形質転換植物細胞を含む、形質転換植物体。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、植物の花芽形成を制御することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
一実施形態において本発明は、花芽形成制御機能を有するDNAに関する。花芽形成制御機能とは、植物における花芽形成を促進又は阻害する機能をいう。例えば、植物の花器官において、花被部分（がく、花弁）を生殖器官（おしべ、めしべ）へ変換する機能、又は生殖器官（おしべ、めしべ）を花被部分（がく、花弁）に変換する機能が含まれる（Mizukami and Ma Cell 71 119-131, 1992; Kempin et al. Plant Physiol. 103 1041-1046, 1993; Rutledge et al. Plant J. 15 625-634, 1998）。
【００１１】
本発明において花芽形成を制御する対象となる植物は、好ましくはアラビドプシス（Arabidopsis）属植物又はユーカリ（Eucalyptus globulus）属植物である。アラビドプシス属植物としては、特に制限されないが、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）が挙げられる。
【００１２】
ユーカリ属植物としては、特に制限されないが、例えば、ユーカリ・グロブラス（Eucalyptus globulus）、ユーカリ ・グランディス （Eucalyptus grandis）、ユーカリ ・ユーロフィラ（Eucalyptus urophylla）、ユーカリ・カマルドレンシス（Eucalyptus camaludulensis）、ユーカリ・ニテンス（Eucalyptus nitens）、ユーカリ・ガンニー（Eucalyptus gunni）、ユーカリ・ラジアータ（Eucalyptus radiata）、ユーカリ・アンプリフォリア（Eucalyptus amplifolia）、ユーカリ・アーチェリ（Eucalyptus archeri）、ユーカリ・バクステリ（Eucalyptus baxteri）、ユーカリ・ビコスタータ（Eucalyptus bicostata）、ユーカリ・ブラッケリー（Eucalyptus blakelyi）、ユーカリ・ボツリオイデス（Eucalyptus botryoides）、ユーカリ・ブリジェシアーナ（Eucalyptus bridgesiana）等が挙げられる。
【００１３】
本発明のDNAの例としては、配列番号１〜３のいずれかの塩基配列からなるDNAが挙げられる。本発明のDNAには、配列番号１〜３のいずれかの塩基配列からなるDNAと機能的に同等のDNAも包含される。あるDNAと機能的に同等のDNAを調製する当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press(1989)）を利用する方法が挙げられる。
【００１４】
配列番号１〜３のいずれかの塩基配列からなるDNAと機能的に同等のDNAには、配列番号１〜３のいずれかの塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつ配列番号１〜３のいずれかの塩基配列からなるDNAと実質的に同一の花芽形成制御機能を有するDNAが含まれる。ここで数個とは、通常２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個を意味する。
【００１５】
配列番号１〜３のいずれかの塩基配列からなるDNAと機能的に同等のDNAには、配列番号１〜３のいずれかの塩基配列の一部を含み、かつ配列番号１〜３のいずれかの塩基配列からなるDNAと実質的に同一の花芽形成制御機能を有するDNAも含まれる。ここで一部とは、配列番号１〜３の塩基配列の80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上を含む部分配列を意味する。当該部分配列は、好ましくは配列番号１〜３の塩基配列において連続する配列である。
【００１６】
配列番号１〜３のいずれかの塩基配列からなるDNAと機能的に同等のDNAには、配列番号１〜３のいずれかの塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１〜３のいずれかの塩基配列からなるDNAと実質的に同一の花芽形成制御機能を有するDNAも包含される。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、低ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件が挙げられるが、高ストリンジェントな条件が好ましい。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば42℃、5×SSC、0.1% SDSで洗浄する条件であり、好ましくは50℃、5×SSC、0.1% SDSで洗浄する条件である。高ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば65℃、0.1×SSC及び0.1% SDSで洗浄する条件である。上記のようなストリンジェントな条件下では、配列番号１〜３のいずれかの塩基配列と高い相同性（相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上）を有する塩基配列からなるDNAが、該DNAと相補的な塩基配列からなるDNAとハイブリダイズすることができる。
【００１７】
本発明はまた、配列番号１０又は１１の塩基配列からなるプロモーターDNAに関する。本発明のプロモーターDNAは、ユーカリの花芽組織においてのみ顕著に発現している遺伝子の発現制御を支配するプロモーター機能を有する。すなわち、花芽組織特異的プロモーターDNAとして機能する。
【００１８】
本発明のDNAは、ユーカリ属植物の花芽組織から得ることができる。なお、実験手法に関しては、例えば、「Molecular Cloning（Sambrookら(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）」などに基づいて実施することができる。例えば、以下のようにして得ることができる。抽出・精製したRNAから、cDNAを作製し、ライブラリー化する。そして既知のデータベース情報から既に単離されている花芽形成遺伝子情報を得て、これらの遺伝子の塩基配列を基に作成したオリゴヌクレオチドプライマーを利用するPCR法（例えば、Inverse-PCR法、アンカーPCR法・TAIL-PCR法）、あるいは該遺伝子のDNA配列をプローブに用いたハイブリダイゼーション法を実施することにより、該遺伝子に相同なcDNAを得ることができる。本発明のDNAには、cDNAも包含される。さらに、ユーカリ属植物の花芽組織から抽出・精製したDNAをライブラリー化し、本発明の花芽形成制御機能を有する遺伝子のDNA配列をプローブに用いたハイブリダイゼーションを実施することにより、該遺伝子をコードするゲノムクローンのDNA配列を得ることができる。この配列にはプロモーターDNAが含まれる。
【００１９】
本発明者らは、上記本発明のDNAからなる遺伝子（以下、花芽形成制御遺伝子と称する場合もある）が、花芽形成を促進することを見出した。従って、一実施形態において本発明は、上記本発明のDNAからなる遺伝子の発現を制御することにより、植物の花芽形成を制御する方法に関する。遺伝子の発現の制御には、遺伝子の発現を促進すること及び遺伝子の発現を抑制することが包含され、花芽形成の制御には、花芽形成を促進すること及び花芽形成を抑制することの双方が包含される。すなわち、本発明のDNAからなる遺伝子の発現を促進することにより花芽形成を促進することができ、本発明のDNAからなる遺伝子の発現を抑制することにより花芽形成を抑制することができる。
【００２０】
より具体的には、本発明のDNAを含むベクターを植物細胞に導入し、得られた形質転換植物細胞から植物を再生することにより、花芽形成が促進された形質転換植物体を得ることができる。あるいは、本発明のDNAからなる遺伝子の発現を抑制するDNAを含むベクターを植物細胞に導入し、得られた形質転換植物細胞から植物を再生することにより、花芽形成が抑制された形質転換植物体を得ることができる。植物細胞は好ましくはユーカリ属植物細胞であり、形質転換植物細胞は好ましくは形質転換ユーカリ属植物細胞であり、形質転換植物体は好ましくは形質転換ユーカリ属植物体である。
【００２１】
本発明のDNAからなる遺伝子の発現を抑制するDNAは、例えば、アンチセンス法、共抑制法、リボザイム法又はRNA干渉法に基づく機構により、遺伝子の発現を抑制するものである。
【００２２】
本発明は、本発明のDNAを含むベクター又は本発明の花芽形成制御遺伝子の発現を抑制するDNAを含むベクターに関する。これらのベクターは、ベクターの所定の部分に該当するDNA断片を結合又は挿入することによって得ることができる。ベクターの種類は特に限定されないが、自律複製可能又は染色体中に相同組換え可能なベクターを使用することができる。プラスミド、ファージを含むウイルス、コスミドなどである。ベクターは、選択マーカー、複製開始点、ターミネーター、ポリリンカー、エンハンサー、リボゾーム結合部位などを適宜含むことができる。種々のベクターが市販されているか、あるいは、文献等に記載されている。具体的には、大腸菌で増幅可能なベクター（pUC誘導体等）、大腸菌とアグロバクテリウムの双方で増幅可能なシャトルベクター（pBI101（クロンテック社）等）、植物ウイルス（例えば、カリフラワーモザイクウイルス等）を利用することができ、宿主細胞に応じて選択すればよい。
【００２３】
本発明は、また、前記ベクターが導入された形質転換微生物又は形質転換植物細胞に関する。本発明の「形質転換微生物」とは、前記ベクターを宿主細胞としての微生物に導入して得られた微生物である。宿主微生物としては、例えば、アグロバクテリウム属菌などが挙げられる。本発明の「形質転換植物細胞」とは、前記ベクターを宿主細胞としての植物由来細胞に導入して得られた形質転換細胞である。また、植物細胞が由来する組織としては、種子、塊茎、切穂などの繁殖媒体が好ましい。
【００２４】
上記ベクターを宿主微生物又は植物細胞中に導入する方法としては、当該技術分野における常法を用いることができるが、例えば、プロトプラスト法(エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法等)、パーティクルガン法、あるいは、形質転換因子としてアグロバクテリウム（Agrobacterium）属菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes））を用いたT-DNAによる植物細胞の形質転換方法等を用いることができる。
【００２５】
なお、プロトプラスト法、パーティクルガン法、形質転換因子としてアグロバクテリウム（Agrobacterium）属菌を用いる方法については、例えば、植物代謝工学ハンドブック（NTS（株）社）に基づいて実施することができる。
【００２６】
また、本発明においては、ベクターとして植物ウイルス（カリフラワーモザイクウイルス等）を用いることによって形質転換植物細胞を得ることもできる。すなわち、まず、植物ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、植物ウイルスゲノム中に、導入するDNAを挿入する。このように調製された植物ウイルスゲノムを制限酵素によって該組換え体から切り出し、植物細胞に接種することによって、これらのDNAを導入することができる。なお、方法の詳細については、Hohnらの方法（Molecular Biology of Plant Tumors（Academic Press、New York）1982、pp549）、米国特許第4,407,956号明細書等を参考にすることができる。
【００２７】
また、本発明は、前記形質転換植物細胞を含む形質転換植物体を提供する。本発明の「形質転換植物体」とは、前記形質転換植物細胞を有する植物体であれば特に制限されないが、例えば、前記形質転換細胞から再生された形質転換植物体が挙げられる。形質転換植物細胞から植物体を再生する方法は、土肥らの方法（特願平11-127025号公報）を参照することができる。また、本発明の形質転換植物体は、該形質転換植物体から得られる種子、及び該種子から得られる植物体をも含む。
【００２８】
本発明の形質転換植物体から種子を得る方法としては、例えば、形質転換植物体を適当な培地において発根させ、その発根体を水分含有の土を入れたポットに移植する。適当な栽培条件下で生育させ、最終的に種子を形成させて、該種子を得る。また、種子から植物体を得る方法としては、例えば、前記のようにして得られた形質転換植物体由来の種子を、水分含有の土に播種し、適当な栽培条件下で生育させることにより植物体を得ることができる。
【００２９】
一実施形態において、花芽形成制御遺伝子の発現を抑制するDNAは、該遺伝子から転写されるmRNAの全部又はその一部に対して実質的に相補的な配列を有するRNA（アンチセンスRNA）をコードするアンチセンスDNAである。アンチセンスDNAの転写産物であるアンチセンスRNAは、宿主内に存在した場合に、その相補鎖である花芽形成制御遺伝子のmRNAと結合し、それによって花芽形成制御遺伝子の翻訳を阻害し、発現を抑制する。
【００３０】
実質的にとは、このアンチセンスRNAがmRNAとハイブリダイズして二本鎖を形成し、それがmRNAの翻訳を阻害する限り、このmRNAに相補的な配列に欠失、置換又は付加等の変異があってもよいことを意味する。より詳しくは、アンチセンスRNAが、対象となる花芽形成制御遺伝子mRNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを意味する。ここでストリンジェントな条件とは、上記と同様である。
【００３１】
アンチセンスRNAをコードするアンチセンスDNAの塩基配列の長さは、対象となる花芽形成制御遺伝子の発現を抑制し得る長さであれば適宜設定可能であり、花芽形成制御遺伝子mRNAの塩基配列の全部と等しい長さである必要は必ずしもない。一部とは、花芽形成制御遺伝子mRNAの塩基配列全体の通常30％、好ましくは50％、より好ましくは80％、さらに好ましくは90％に該当する長さである。
【００３２】
花芽形成制御遺伝子mRNAに対するアンチセンスDNAは、花芽形成制御遺伝子の塩基配列のエクソン部分が得られるようにPCR法にて増幅を行い、適当な制限酵素で消化することにより得ることができる。また、花芽形成制御遺伝子cDNAからも取得可能である。さらには、このアンチセンスDNAは、花芽形成制御遺伝子の塩基配列をもとに人工的に作られた合成DNAであってもよい。
【００３３】
このようなアンチセンスDNAを、ベクターにおいてアンチセンスの方向に連結する。連結は、直接でも、又はリンカーを介した連結でもよい。アンチセンスDNAは、宿主内で転写されたときに、花芽形成制御遺伝子の転写産物であるmRNAに対してハイブリダイズするアンチセンスRNAが生成するように宿主に導入する。通常、アンチセンスDNAを、アンチセンスRNAが生成するようにベクターに連結し、該ベクターを宿主に導入する。アンチセンスRNAが生成するようにベクターに連結するには、プロモーター配列を有するDNA断片の下流にアンチセンスの方向（逆向き方向）にアンチセンスDNAを連結し、プロモーターの作動によりRNAに転写されるようにする。得られるRNAは、花芽形成制御遺伝子mRNAに対するアンチセンスRNAである。
【００３４】
一実施形態において、花芽形成制御遺伝子の発現を抑制するDNAは、リボザイムをコードするDNAである。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。標的を切断できるよう設計されたリボザイムをコードするDNAは、宿主中で転写されるようにプロモーター及び転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である (K.Taira et al., Protein Eng., 3:733(1990); A.M.Dzianott 及びJ.J.Bujarski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86:4823(1989); C.A.Grosshans 及びR.T.Cech, Nucleic Acids Res., 19:3875(1991); K.Taira et al., Nucleic Acids Res., 19 :5125(1991))。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的mRNA内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(N.Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 186:1271, 1992)。このようなリボザイムを用いて花芽形成制御遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００３５】
一実施形態において、花芽形成制御遺伝子の発現を抑制するDNAは、共抑制により花芽形成制御遺伝子の発現を抑制するRNAをコードするDNA、すなわち、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNAである。共抑制とは、宿主に標的遺伝子と同一もしくは類似した配列を有するDNAを形質転換により導入すると、導入した外来遺伝子及び標的遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上の配列の同一性を有する。
【００３６】
一実施形態において、花芽形成制御遺伝子の発現を抑制するDNAは、RNA干渉により花芽形成制御遺伝子の発現を抑制するRNAをコードするDNA、すなわち、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を逆位反復に配置したDNAである。RNA干渉とは、植物に標的花芽形成制御遺伝子と同一もしくは類似した配列を逆位反復に配置したDNAを形質転換により導入すると、外来DNAに由来する二本鎖RNAが発現し、標的遺伝子の発現が抑制される現象のことをいう。RNA干渉の機構としては、第一段階として標的遺伝子のmRNAと導入配列由来の二本鎖RNAが複合体を形成し会合した配列をプライマーとして相補的なRNAが合成され、第二段階として内在性RNase によってこの複合体が断片化され、第三段階として20〜30塩基対に断片化した二本鎖RNAが二次的なRNA干渉のシグナルとして機能することによって再び、標的遺伝子のmRNAを分解すると考えられている(Curr. Biol., 7:R793, 1997; Curr. Biol., 6:810, 1996)。RNA干渉に用いるDNAの長さとしては、標的遺伝子の全長を使用してもよいが、少なくとも20塩基、好ましくは30塩基以上、より好ましくは50塩基以上であればよい。
【００３７】
一実施形態において、花芽形成制御遺伝子の発現を抑制するDNAは、細胞中の花芽形成制御遺伝子を標的遺伝子としてノックアウトするDNAである。標的遺伝子をノックアウトする方法としては、標的遺伝子の任意の位置で相同組換えを起こすベクター（ターゲティングベクター）を用いて当該遺伝子を破壊する方法（ジーンターゲティング法）や、標的遺伝子の任意の位置にトラップベクター（プロモーターを持たないレポーター遺伝子）を挿入して当該遺伝子を破壊しその機能を失わせる方法などがある。
【実施例】
【００３８】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３９】
本発明のDNA断片は、以下のようにして製造し、利用した。なお、実験手法に関しては、特に記載のない限り、「Molecular Cloning（Sambrookら(1989),  Cold Spring Harbor Laboratory Press）」等の当該技術分野において公知の実験書に基づいて実施した。
【００４０】
（実施例１）ユーカリからのユーカリagamous相同cDNAの取得
（１）蕾total RNAの抽出
王子製紙(株)森林資源研究所内に成育中の10年生ユーカリ・グランディス（Eucalyptus grandis）蕾を液体窒素中で粉砕し、Concert Plant RNA Regent (インビトロジェン社)を用いてRNAを抽出し、1 mgのtotal RNAを得た。
【００４１】
（２）mRNAの精製
total RNA画分からのmRNAの精製は、PolyA Tract mRNA Isolation System (プロメガ社)を用いて行い、1 mgのtotal RNAから6 μgのmRNAを得た。
【００４２】
（３）cDNAライブラリーの作製
cDNAライブラリーの作製は、SMART cDNA Library Construction Kit (タカラバイオ社)を用いて行った。1 μgのmRNAにoligo dTプライマーをアニールさせた後、逆転写酵素によりcDNAを合成した。cDNAを制限酵素Sfi Iで消化した後、カラムによるサイズ分画を行い、λTriplEx2ベクターと連結した。その後Gigapack Gold III (ストラータジーン社)を用いてλ−ファージパッケージング反応を行い、5 X 105の独立したクローンからなるcDNAライブラリーを作製した。
【００４３】
（４）ユーカリagamous相同cDNA遺伝子の単離
ユーカリagamous相同遺伝子を単離するため、シロイヌナズナ及びポプラagamous遺伝子の配列（Yanofsky et al. Nature 346 35-39, 1990; Brunner et al. Plant Mol. Biol. 44 619-634, 2000）を参考に、以下のPCR用プライマーを設計した。
プライマー配列：
5’-ATCAAGCGGATCGAGAACAC-3’
5’-GCTTTCTTGAGCAAACCACT-3’
作製したプライマーを用いて、ユーカリtotal RNAを鋳型にRT-PCRを行い、ユーカリagamous相同遺伝子を増幅した。増幅した断片をZerp Blunt TOPO PCR Cloning Kit (インビトロジェン社)を用いて、pCR-Blunt II-TOPOベクター(インビトロジェン社)にサブクローニングした。挿入断片の塩基配列は、ベックマン・コールター社製、CEQ8000遺伝子解析システムにより決定した。その結果得られたcDNA断片はシロイヌナズナagamous遺伝子と相同性が認められたので、この遺伝子をEAGL1と名付けた。
さらに作製したcDNAライブラリーより、約11,000クローンの塩基配列を決定し、Blast (Basic Local Alignment Search Tool)による検索の結果、EAGL1と異なる２つのシロイヌナズナagamous相同遺伝子を見出し、それぞれEAGL2及びEAGL3と名付けた。
【００４４】
（実施例２）全長cDNA配列の決定
実施例１で得られたEAGL1遺伝子は部分長であったため、全長cDNA配列の決定を行った。得られているEAGL1遺伝子に対して上流方向と下流方向にそれぞれ特異的な以下のプライマーを作製した。
プライマー配列：
5’-AAACTGAGTGTTCACTTCAG-3’（上流方向）
5’-GGCAGGTCACCTTTTGTAAACGCC-3’（下流方向）
ユーカリtotal RNAを鋳型に上流方向のプライマーを用いて、5’ RACE System version 2.0 (インビトロジェン社)によるPCR増幅を行い、EAGL1遺伝子の5’領域を単離した。さらにユーカリtotal RNAを鋳型に下流方向のプライマーを用いて、3’ RACE System (インビトロジェン社)によるPCR増幅を行い、EAGL1遺伝子の3’領域を単離した。得られたPCR産物の塩基配列を決定し、EAGL1 cDNAの全長塩基配列を決定した（配列番号１）。EAGL2遺伝子及びEAGL3遺伝子についてはcDNAライブラリーより取得したクローンが全長cDNAであったため、それぞれのクローンの全塩基配列を決定した（それぞれ配列番号２及び３）。
【００４５】
（実施例３）ユーカリagamous相同遺伝子の発現解析
得られたEAGL1遺伝子、EAGL2遺伝子、EAGL3遺伝子のユーカリ蕾における発現量を調べるため、ノーザンハイブリダイゼーション法による転写産物の解析を実施した。実施例１と同様の方法でユーカリ蕾からtotal RNAを抽出し、さらにmRNAの精製を行った。mRNA 400 ngをゲル電気泳動に供し、ハイブリダイゼーション用メンブレンにブロッティングした。プローブDNAは、それぞれの遺伝子に特異的な3’非翻訳領域を増幅した断片を使用した。プローブDNAの標識とハイブリダイゼーションの検出は、Gene Image Random-Prime Labelling and Detection Reagent（アマシャム社）の方法に従い、ハイブリダイゼーションと洗浄は65℃で実施した。その結果、ユーカリ蕾においては、EAGL1遺伝子とEAGL2遺伝子が強く発現しているのに対し、EAGL3遺伝子の発現は弱いものであることが明らかとなった（図１）。
【００４６】
（実施例４）ユーカリagamous相同遺伝子のプロモーター領域の単離
（１）ユーカリゲノムライブラリーの作製
王子製紙(株)森林資源研究所内に成育中の10年生ユーカリ・グランディス（Eucalyptus grandis）新芽を液体窒素中で粉砕し、Zhangらの方法（Plant J., 7, 175-184,2005）に従い、高分子量DNAを調製した。制限酵素Sau3AI(タカラバイオ社)を使用して、高分子DNAの部分消化を行い、アガロースゲル電気泳動により100kbのDNA断片を回収し、pcc1BAC/BamHベクターI(エピセンター社)と連結した。品質確認の結果、平均インサートDNA鎖長86kbpで、約4000Mbp相当のゲノムを包含するユーカリゲノムライブラリーを作製した。
【００４７】
（２）ユーカリEAGL1及びEAGL2遺伝子の単離
EAGL1及びEAGL2遺伝子の全長cDNA配列を用いて、PCR法によりEAGL1及びEAGL2相同配列を含むゲノムクローンをそれぞれ選抜した。これらのクローンの全塩基配列を決定した。いずれもEAGL1及びEAGL2の全長cDNA配列と相同な塩基配列を確認し、各々、開始コドンより上流側（5’側非翻訳領域）の約1kbpおよび8kbpを取得した（それぞれ、配列番号１０及び１１）。
実施例３において、EAGL1及びEAGL2遺伝子の花芽組織特異的発現が実証されていることから、得られた約1kbpおよび8kbpのDNA領域は、花芽組織特異的プロモーターDNAとして機能することがわかる。
【００４８】
（実施例５）EAGL1遺伝子の花芽形成制御効果の検証（形質転換植物の作成）
（１）発現ベクターの作成
EAGL1全長cDNAをPCRにより増幅取得した。以下のプライマーを作製した。
プライマー配列：
5'-GGTTCAAGAACACACCAAAG-3'
5'-ATTGCAATAACCCTTGTACAACACG-3'
これらのプライマーを用いて、上述のEAGL1遺伝子を含むcDNAクローンを鋳型とするPCR反応を耐熱性DNAポリメラーゼPlatium Pfx DNA Polynerase （Invitrogen社）にて実施した。このcDNAをバイナリーベクター  pBI121（クロンテック社）のGUS遺伝子を除いた部分に挿入し、大腸菌DH5α株を形質転換した。次に組換えプラスミドを保有するクローンよりプラスミドDNAを調製し、インサート内部の塩基配列を解析することにより、EAGL1全長cDNAの全塩基配列が誤りなく挿入されているプラスミドを取得したことを確認した。さらにこの組換えプラスミドを保有するクローンよりプラスミドDNAを調製し、発現ベクターとした。
【００４９】
（２）EAGL1遺伝子を高発現させた形質転換植物の作成
（１）で作成したEAGL1全長cDNAの塩基配列を含む発現ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌C58C1株にエレクトロポレーション法を用いて導入した。10％グリセロール溶液に懸濁したアグロバクテリウム・ツメファシエンスC58C1株菌体と発現ベクターDNAを混合し、2mm幅のキュベット電極中で、25μF・600Ω・2.5kV設定にて電気パルスを印加した後、50μg/mlのカナマイシン、100μg/mlのジェンタマイシンを添加したLB寒天培地（1％バクトトリプトン、0.5％酵母抽出物、0.5％塩化ナトリウム、1.5％バクトアガー）上で、29℃、2日間培養し、pBI121ベクター上のカナマイシン耐性遺伝子に起因するカナマイシン耐性を示す菌体のコロニーを選抜した。次いで、この発現ベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を50μg/mlのカナマイシン、100μg/mlのジェンタマイシンを添加したLB液体培地（1％バクトトリプトン、0.5％酵母抽出物、0.5％塩化ナトリウム）で、29℃、24時間培養した培養液を用意した。培養液を遠心してアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌の菌体を回収し、感染用培地（1/2 B5培地、１％シュークロース、1/1000ハイポネックス、0.044μMベンジルアミノプリン、0.02% Tween20、pH5.7）でアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌体をOD600=１になるように再懸濁した。
【００５０】
シロイヌナズナの種子を500倍希釈したハイポネックスで湿らせたロックウールに播種し、24℃、16時間明期、8時間暗期の条件で４週間栽培した。花茎がほぼ出そろった時点で最初の花茎の先端部を切除し、裏返した状態でアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌の懸濁液に漬けこんだ後、24℃、16時間明期、8時間暗期の条件で4週間栽培し、採種した。
【００５１】
採種した種子は、除菌のために70％エタノールで2分間、2％次亜塩素酸、0.05%Tween20で、8分間攪拌し、その後、滅菌水で5回振とう洗浄した。この種子を滅菌したスクリーニング用培地（1/2 B5培地、１％シュークロース、1/1000ハイポネックス、0.8%寒天、50μg/mlカナマイシン、250μg/mlクラフォラン、pH5.7）に播種した。14日後、抗生物質耐性のある形質転換シロイヌナズナ植物体を得、さらに栽培して種子を採取した。得られた種子は以下の解析に用いた。
【００５２】
（３）導入EAGL1遺伝子の発現確認
形質転換シロイヌナズナ植物体を播種して栽培し、花がつき始めた植物体からRNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）を用いてtotal RNAを調製した。次いでRNA 10μgをゲル電気泳動に供し、ハイブリダイゼーション用メンブレンにブロッティングして、ノーザンハイブリダイゼーション法により遺伝子転写物の検出を実施した。プローブDNAは、EAGL1遺伝子に特異的な断片を使用した。プローブDNAの標識とハイブリダイゼーションの検出は、Gene Image Random-Prime Labelling and Detection Reagent（アマシャム社）の方法に従い、ハイブリダイゼーションと洗浄は65℃で実施した。その結果、形質転換植物体由来試料には、遺伝子転写物の強いシグナルが検出された。
【００５３】
（実施例６）EAGL1遺伝子の花芽形成制御効果の検証（花芽形成に対する影響）
EAGL1遺伝子が強く発現している形質転換シロイヌナズナ植物体を栽培し、花器官を詳細に解析した。その結果、形質転換シロイヌナズの花器官では、花被部分（がく、花弁）から生殖器官（おしべ、めしべ）への変換が観察された。これは、シロイヌナズナのagamous遺伝子及び他の植物のagamous相同遺伝子を恒常的に発現させた場合に見られる現象と同じ現象である（Mizukami and Ma Cell 71 119-131, 1992; Kempin et al. Plant Pysiol. 103 1041-1046, 1993; Rutledge et al. Plant J. 15 625-634, 1998）。以上から、今回単離したEAGL1遺伝子は、花芽形成制御遺伝子であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の遺伝子の発現機構を破壊することにより、生殖器官（おしべ、めしべ）が花被部分（がく、花弁）に変換した植物体の作製が可能になる。このような植物は花粉がないため、花粉の飛散による環境への影響を排除できる点で非常に有用であると考えられる。
【００５５】
また、花芽形成等の繁殖栄養に伴い、植物体の栄養成長が抑止されるが、本発明による花芽形成抑止により結果的に、栄養成長を継続させる効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ユーカリ蕾由来のmRNA 400 ngを電気泳動し、RNAをナイロンメンブランにブロティングしたのち、EAGL1遺伝子、EAGL2遺伝子、EAGL3遺伝子の3’非翻訳領域をプローブとしたハイブリダイゼーションを行い、それぞれの遺伝子に特異的な転写産物を検出した結果を示す。
【図１】
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【配列表】
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