(57)【要約】【課題】高流量送液を可能とする新規なマイクロ流路系を提供すること。【解決手段】内口径０．５ｍｍ以上のカラム層を有するマイクロ流路系１であって、該カラム層は、ビーズベット長４ｍｍ以下になるようビーズが充填されているハイブリット形成部１１１と、該ハイブリット形成部１１１の下流領域に設けられた送液の高速化に寄与する送液促進部１１２とからなり、マイクロ流路内での目詰まり、及び、内圧上昇を防止することにより、高流量送液を可能とするマイクロ流路系を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
内口径０．５ｍｍ以上のカラム層を有するマイクロ流路系であって、
該カラム層は、ビーズベット長４ｍｍ以下になるようビーズが充填されているハイブリット形成部と、
該ハイブリット形成部の下流領域に設けられた送液の高速化に寄与する送液促進部と、
からなるカラム層を有するマイクロ流路系。
【請求項２】
孔径０．６５μｍ以下のフィルターで濾過したサンプル液を送液することを特徴とする請求項１記載のマイクロ流路系。
【請求項３】
前記送液促進部には、パフュージョンクロマトグラフィー粒子が充填されていることを特徴とする請求項１記載のマイクロ流路系。
【請求項４】
前記送液促進部の下流において、減圧を行うことを特徴とする請求項１記載のマイクロ流路系。
【請求項５】
前記ビーズには、同種塩基配列を有するリンカーが固定されていることを特徴とする請求項１記載のマイクロ流路系。
【請求項６】
前記リンカーの同種塩基配列はポリＴであり、
前記ハイブリット形成部では、該ポリＴと全ＲＮＡサンプル中のポリＡテール部分を有するｍＲＮＡとが相補結合する第１ハイブリット形成と、
該ｍＲＮＡとプローブ核酸とが相補結合する第２ハイブリット形成とが行われることを特徴とする請求項５記載のマイクロ流路系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高流量送液を可能とするマイクロ流路系に関する。より詳しくは、マイクロ流路内での目詰まりを防止し、内圧上昇を防止することにより、高流量送液を可能とするマイクロ流路系に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析、遺伝子ネットワーク解明等に利用され得るバイオアッセイ技術の開発が進んでいる。例えば、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれる集積基板を用いた方法が挙げられる。
【０００３】
このＤＮＡチップやタンパク質を集積したプロテインチップなどに代表されるようなセンサーチップ技術は、検出用物質（プローブと称されることが多い。）とターゲット物質との間の特異的な相互作用を利用して、ターゲット物質の含有量、構成成分、効力を調べる方法である。
【０００４】
最近では、検出用物質とターゲット物質との間の特異的な相互作用を、流路やキャピラリーを利用して行う技術が提案されている。例えば、特許文献１には、基板上に形成された流路中で相互作用分析を行うようにすることで、分析に要する液体検体の量を少量に抑えることができる技術が提案されている。特許文献２には、キャピラリーの周辺に光学的な検出手段を形成し、このキャピラリー自体を検出用のセルとして利用する技術が開示されている。特許文献３には、毛細管通路内で相互作用を進行させ、その流れ特性を検出する技術が開示されている。
【０００５】
また、物質間相互作用の応用として、核酸間のハイブリダイゼーションを、流路や細管内で進行させる技術も提案されている。例えば、特許文献４には、ポリヌクレオチドの増幅を行う部分と、検出用オリゴヌクレオチドが固定されている多孔質層を有するハイブリダイゼーション部分とが、流路によって連結されているポリヌクレオチドの分析用部材が開示されている。特許文献５には、毛細管状の流路の内壁にプローブ化合物を固定して、被検ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションを進行させるポリヌクレオチドの分析方法が開示されている。
【特許文献１】特開２００５−０３０９０６号公報。
【特許文献２】特開平１０−１７０４２７号公報。
【特許文献３】特開平０６−０９４７２２号公報。
【特許文献４】特開２００５−１３０７９５号公報。
【特許文献５】特開２００４−１２１２２６号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、流路やキャピラリーなどの細い流路内において、物質間相互作用を進行させる場合、サンプル溶液などの送液により、目詰まりなどを生じて流路内圧が上昇することがある。特に、生体細胞等から採取した全ＲＮＡサンプルには、ターゲット核酸以外の浮遊物質やハイブリダイゼーション検出には適さない長鎖の核酸などが存在するため、送液する際に目詰まりを起こし易い。
【０００７】
また、浮遊物質や長鎖の核酸が存在しない場合であっても、細い流路内で、ハイブリット形成などすることにより、流路の実質的体積が減少し、同様に、流路内圧が上昇することがある。
【０００８】
このように流路内圧が上昇すると、送液する溶液、例えばサンプル液などの漏れを生じ、溶液のロスが多くなる。また、サンプル溶液などに、有害物質を含む場合などは、溶液の漏れにより、安全性が低下するといった問題があった。
【０００９】
そこで、本発明では、マイクロ流路内での目詰まりを防止し、内圧上昇を防止することにより、通液する容液の漏れを防止し、高流量送液を可能とするマイクロ流路系を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者は、前記課題を解決するために、カラム層の形態、サンプル溶液の前処理などの好適な条件について、鋭意研究した結果、マイクロ流路内での目詰まりの防止、及び内圧上昇の防止により、高流量送液が可能となる新規なマイクロ流路系を開発した。
【００１１】
本発明では、まず、内口径０．５ｍｍ以上のカラム層を有するマイクロ流路系を提供する。カラム層の内口径を０．５ｍｍ以上とするのは、通液する溶液による目詰まりを防ぐためである。このカラム層は、ビーズが充填されているハイブリット形成部と、該ハイブリット形成部の下流領域に設けられた送液の高速化に寄与する送液促進部とからなる。
【００１２】
前記ハイブリット形成部には、ビースベット長が４ｍｍ以下、より好ましくは２ｍｍ以下となるようにビーズを充填することが好ましい。カラム長を短くすることにより、流路内圧の上昇を防止するためである。
【００１３】
本発明では、次に、フィルター濾過したサンプル液を送液することを特徴とするマイクロ流路系を提供する。サンプル液を濾過するフィルターは、その孔径が０．６５μｍ以下、より好ましくは０．１μｍ以下であることが望ましい。浮遊物質等を除去するためである。
【００１４】
本発明に係るマイクロ流路系のカラム層を形成する送液促進部には、パフュージョンクロマトグラフィー粒子を充填する構成を採用できる。また、送液促進部の下流において、減圧を行うこともできる。
【００１５】
本発明に係るマイクロ流路系のカラム層を形成するハイブリット形成部は、プローブ核酸とターゲット核酸とのハイブリダイゼーションを進行させる場として機能する。ハイブリット形成部に充填されたビーズ上に固定する核酸は、プローブ核酸または、ターゲット核酸のどちらを選択するのも自由である。
【００１６】
ビーズ上に核酸を固定する場合に、同種塩基配列を有するリンカーを介在させることもできる。例えば、ポリＴをリンカーとし、該ポリＴと全ＲＮＡサンプル中のポリＡテール部分を有するｍＲＮＡとを相補結合させることにより、ターゲット核酸であるｍＲＮＡをビーズ上に固定することができる。この状態で、該ｍＲＮＡと相補結合するプローブ核酸を含む溶液をマイクロ流路系に送液することにより、ハイブリット形成部において、ターゲット核酸であるｍＲＮＡとプローブ核酸とのハイブリダイゼーションが進行する。
【００１７】
このとき、プローブ核酸に、予めハイブリダイゼーション検出に利用できる蛍光物質、あるいは放射性物質などを標識（ラベル）しておくことで、該標識物質から得られる光情報や放射線情報を捕捉することによって、前記ハイブリダイゼーションを検出することが可能となる。
【００１８】
以下、本発明で使用する技術用語の定義付けを行う。「塩基配列」とは、重合している２以上の塩基を意味する。「リンカー」とは、ビーズに対して核酸を保持するために利用される所定配列の核酸である。「ターゲット核酸」とは、プローブ核酸との間での相補鎖形成する核酸である。「プローブ核酸」とは、ハイブリダイゼーション検出に有用な情報を提供できる核酸であって、例えば、蛍光物質が標識された一本鎖核酸、あるいは放射性物質が標識された一本鎖核酸などを挙げることができ、前者では励起蛍光を検出し、後者では放射線を検出することによって、ハイブリダイゼーションを検出できる。
【００１９】
「ポリ」とは、塩基が２以上重合した塩基配列を有する核酸分子を意味する。「ポリＴ」とは塩基チミン（Ｔ）が２以上重合した塩基配列を有する核酸分子を意味する。「ポリＡテール（poli(A)tail）」とは、ｍＲＮＡの３’末端に付加されているアデニノシンの鎖である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、マイクロ流路内での目詰まりの防止、及びマイクロ流路内圧上昇の防止により、通液する容液の漏れを防止することができるので、安全に、反応効率のよい高流量送液が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２２】
まず、図１は、本発明に係るマイクロ流路系の好適な実施形態の一例を示す図である。
【００２３】
この図１に符号１で示すマイクロ流路系は、大別して、サンプル溶液の流路となる口径０．５ｍｍ程度の細管１１と、該細管１１の一端に形成された導入部１２と、該細管１１の他端側に形成された排出部１３と、から構成されている。なお、図１に示された矢印Ｗは、サンプル溶液等の流れる方向を示している。
【００２４】
この図示されたマイクロ流路系１には、導入部１２に近接する細管１１部分の内部に微小粒径のビーズ２が多数充填されている構成であるハイブリット形成部１１１が設けられている。このハイブリット形成部１１１は、ハイブリダイゼーションなどの所望の相互作用が進行する部分（領域）として機能する。
【００２５】
ハイブリット形成部１１１に充填するビーズ２のビーズベット長Ｂは、４ｍｍ以下、より好ましくは２ｍｍ以下にすることが望ましい。一般に、ビーズベット長Ｂが長くなるほど、マイクロ流路内圧も上昇するので、本発明に係るマイクロ流路系では、ハイブリット形成部１１１のビーズベット長Ｂを短くして、マイクロ流路内圧の上昇を防止している。
【００２６】
ハイブリット形成部１１１の下流側（即ち、排出部１３側）に送液促進部１１２が設けられている。この送液促進部１１２は、ハイブリット形成部１１１へ向けて送液されてくるサンプル溶液や洗浄用のバッファー溶液などの送液速度を促進するための役割を担う部分（領域）である。送液促進部に充填する粒子３は、送液を促進し得る機能を有するものであれば特に限定されないが、好適な一例を挙げると、パフュージョンクロマトグラフィー粒子を充填することができる。
【００２７】
このパフュージョンクロマトグラフィー粒子の典型的なものは、貫通孔（Through pore）と称される大きなポアと吸着孔（Diffusive pore）と称される小さなポアを持っている。これにより、バッファー溶液に溶け込んだ分子は、前記貫通孔を通りぬけ、吸着孔の隅々まで運ばれる。このため、分子と充填材表面の官能基との接触面積が大きくなり、バッファーの流れと官能基との距離は充填材の粒径に関係がなく非常に小さくなる（１μｍ以下）ので、高流速で、かつ低圧の送液を行うことができる。
【００２８】
また、送液促進部１１２を設けることにより、送液促進だけでなく、以下の効果も期待できる。一般に、導入部１２や排出部１３の近傍の細管部分では、外部ポンプ等との接続のためのナットなどの諸部材が設けられることが多いため、この部分にハイブリット形成部１１１を設けると観察や測定が困難となる。しかし、送液促進部１１２をハイブリット形成部１１１の下流側に設けることによって、検出・測定の対象となるハイブリット形成部１１１が流路系１の中央部近くに配置できるようになるので、検出が容易になるという利点が生まれる。
【００２９】
更に、パフュージョンクロマトグラフィー粒子の種類を選択することによって、余剰物質や有害物質（例えば、放射性物質）を吸着させてトラップし、外部へ排出されないようにできる。従って、このような粒子３を選択すれば、マイクロ流路系１を通過した溶液を、そのまま廃棄することができるという利点も生まれる。
【００３０】
本発明に係るマイクロ流路系１へサンプル液を送液する場合、そのまま送液することも可能であるが、サンプル液を濾過した後にマイクロ流路系１へ送液することがより好ましい。浮遊物質などを除去するためである。サンプル液中の浮遊物質などを予め濾過しておけば、マイクロ流路系１の目詰まりを防止できる。
【００３１】
濾過に用いるフィルターは、浮遊物質や長鎖の核酸を除去するために、その孔径が０．６５μｍ以下、より好ましくは０．１μｍ以下が望ましい。フィルター濾過する前に、濾過の精度を上げるために、遠心分離を行うことも自由である。
【００３２】
本発明に係るマイクロ流路系１では、送液促進部１１２の下流において、減圧を行うことも可能である。一般に、上流からの送液により、ハイブリット形成部１１１の上流側に圧力が集中するが、下流側を陰圧に保つことで、マイクロ流路系１中の液相の流れを改善することができる。
【００３３】
減圧の仕方の一例を挙げると、排出部１３に図示しないがシリンジなどを接続し、該シリンジを吸引することで排出側を陰圧に保つことができる。
【００３４】
図２は、ハイブリット形成部１１１内に充填されているビーズ２１の表面上の物質構成の一例を模式的に示す図である。
【００３５】
ビーズ２１は、ポリスチレンなどの材料で形成された微小なマイクロビーズである。このビーズ２１の表面は、核酸の一末端を化学的に結合させるのに好適な構成を備えている。
【００３６】
このビーズ２１は、該ビーズ２１の表面に対して、例えば、アビジン-ビオチン結合やカップリング反応（例えば、ジアゾカップリング反応）などを介して結合されたプローブ核酸Ｐを備えている。この状態で、ビーズ２１をマイクロ流路系１のハイブリット形成部１１１に充填する。プローブ核酸Ｐは、ビーズ２１に保持された状態で、ハイブリット形成部１１１において待ち受けており、該ハイブリット形成部１１１に送液されてくるサンプル液中の相補的なターゲット核酸Ｘとハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーションの様子を、図３に示す。
【００３７】
図３では、ビーズ２１に保持された状態のプローブ核酸Ｐの一本鎖部分に対して、ターゲット核酸Ｘがハイブリダイゼーションし、二本鎖を形成している様子を模式的に示す。図示しないが、プローブ核酸Ｐ、又はターゲット核酸Ｘに、予めハイブリダイゼーション検出に利用できる蛍光物質、あるいは放射性物質などを標識（ラベル）しておくことで、該標識物質から得られる光情報や放射線情報を捕捉することによって、前記ハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００３８】
図４は、図２とは異なる実施形態の、ハイブリット形成部１１１内に充填されているビーズ２２の表面上の物質構成を模式的に示す図である。
【００３９】
このビーズ２２は、該ビーズ２２の表面に対して、例えば、アビジン-ビオチン結合やカップリング反応（例えば、ジアゾカップリング反応）などを介して結合されたオリゴ核酸であるリンカーＬを備えている。該リンカーＬは、ターゲット核酸Ｘと相補結合する塩基配列を有していれば特に限定されないが、一例を挙げると、同種塩基配列であるポリＴを有するものが好適である。
【００４０】
図５は、リンカーＬとターゲット核酸Ｘが相補結合する様子を模式的に示す図である。例えば、図５に示すように、リンカーＬがポリＴ塩基配列部分を有する場合、ターゲット核酸ＸのポリＡ部位がポリＡセレクションプロセスに基づいて、前記ポリＴ部分と相補結合する。ターゲット核酸Ｘの好適例の一つとして、ポリＡテールを有するｍＲＮＡを挙げることができる。
【００４１】
前記ターゲット核酸Ｘは、リンカーＬを介してビーズ２２に保持された状態で、反応部１１１において待ち受けており、該反応部１１１に送液されてくるサンプル溶液中の相補的なプローブ核酸Ｙとのハイブリダイゼーションを進行する。ハイブリダイゼーションの様子を図６に示す。
【００４２】
図６は、ビーズ２２にリンカーＬを介して保持されたターゲット核酸Ｘの一本鎖部分に対して、プローブ核酸Ｙがハイブリダイゼーションし、二本鎖を形成している様子を模式的に示している。
【００４３】
この図６に示すように、プローブ核酸Ｙには、予めハイブリダイゼーション検出に利用できる蛍光物質Ｆ、あるいは放射性物質（図示せず）などを標識（ラベル）しておくことで、該標識物質から得られる光情報や放射線情報を捕捉することによって、前記ハイブリダイゼーションを検出することが可能となる。
【００４４】
このようなハイブリダイゼーションアッセイは、例えば、被験者の細胞などから抽出されたｍＲＮＡをビーズ２２に、リンカーＬを介して保持しておき、このｍＲＮＡに対して、公知の疾病発現原因遺伝子に係わる塩基配列を有するプローブ核酸Ｙがハイブリダイズするか否かを判定する目的の検査などに利用できる。
【００４５】
以上のアッセイは、例えば、図７の工程図に示された方法に基づいて実施できる。まず、流路系１を構成する細管１１の所定位置に向けて、パフュージョンクロマトグラフィー粒子のような送液の促進を担う粒子３を充填し、カラム状の送液促進部１１２を形成する第一工程を行う（図７中の（Ｉ）工程）。
【００４６】
次に、送液促進部１１２の上流側に向けて、リンカーＬが固定化されているビーズ２２を充填し、カラム状のハイブリット形成部１１１を形成する第二工程を行う（図７中の（II）工程）。
【００４７】
そして、ビーズ２２が充填されているハイブリット形成部１１１に向けて、ターゲット核酸Ｘを含む第１サンプル溶液Ｓ１を送液する（図７中の（III）工程）。このとき、ビーズ２２に保持されているリンカーＬ（例えば、ポリＴ）とターゲット核酸Ｘ（例えば、ポリＡテール部分）とが、相補結合する（第１ハイブリット形成、図７中の（IV）工程）。
【００４８】
続いて、プローブ核酸Ｙを含有する第２サンプル溶液Ｓ２を、ハイブリット形成部１１１へ向けて送液する（図７中の（Ｖ）工程）。そして、所定温度、ｐＨ条件で所定時間、ターゲット核酸Ｘとプローブ核酸Ｙとの間のハイブリダイゼーションを進行させる（第２ハイブリット形成、図７中の（VI）工程）。このときのプローブ核酸Ｙから得られる情報（例えば、標識された蛍光物質からの励起蛍光情報）により、ハイブリダイゼーションを検出する。
【実施例１】
【００４９】
実施例１では、本発明に係るマイクロ流路系のカラム層を形成するハイブリット形成部に充填するビーズベットの長さの影響を調べた。
【００５０】
＜マイクロカラムの作製＞
まず、流路系を構成する細管として、内径０．５３ｍｍ、外径０．６８ｍｍ、長さ６ｃｍのフューズド・シリカ・キャピラリー・チューブ（ジーエルサイエンス株式会社製）を用意した。
【００５１】
そして、送液の下流側端部に、孔径１μｍのフィルターをセットした排出部、上流側にはフィルターをセットしない導入部を、それぞれチュービングスリーブ、フェラル、ナットを用いて取り付けた。また、上流側の導入部には、レオダイン型シリンジに対応するフィルポートを取り付け、下流側の排出部にはルアー・ロック・ニードルを取り付けた。
【００５２】
＜パフュージョンクロマトグラフィー粒子の調整＞
パフュージョンクロマトグラフィー粒子として、ＰＯＲＯＳ ２０ Ｒ１（Applied Biosystems）を用いた。これを１０％エタノール溶液に分散させて、粒子分散溶液（以下、「ＰＯＲＯＳ溶液」）を調製した。
【００５３】
＜ポリヌクレオチド結合マイクロビーズの調整＞
Streptavidin Coated Microsphere plain（直径６μｍ、Polysciences）の水溶液に、５'末端にビオチンを修飾したデオキシチミジン（ｄＴ）のポリヌクレオチド（２１ｍｅｒ）を加えて、アビジン−ビオチン結合によりポリｄＴが固定されたビーズ（以下、「ポリｄＴビーズ」と称する。）を調製した。
【００５４】
＜送液促進部の形成＞
マイクロカラムの排出部のルアー・ロック・ニードルにシリンジを取り付けた。ＰＯＲＯＳ溶液を吸い込んだレオダイン型シリンジを、マイクロカラムの導入部のフィルポートに取り付けた。そして、排出部に取り付けた前記シリンジを吸引し、前記チューブ内に、パフュージョンクロマトグラフィー粒子である「ＰＯＲＯＳ粒子」を注入した。
【００５５】
＜送液促進部の漏れテスト＞    
ＰＯＲＯＳの注入量を１．２５ｍｇ前後で可変して、ＰＯＲＯＳのみのベッドを持つマイクロカラムを作製した。超純水を送液に用い、流量を５μＬ／ｍｉｎから順に上げ、１００μＬ／ｍｉｎの流量まで送液したが、下流側の廃液は流量に応じて排出され，漏れ等は見られなかった。
【００５６】
＜ハイブリット形成部の形成＞
続いて、上記手順で調整したポリｄＴビーズ１．３ｍｇを、送液促進部の上流側へ同様の方法で注入した。このときのビーズベット長は４ｍｍであった。また、ポリｄＴビーズの注入量を減らし、ビーズベット長２ｍｍのマイクロカラムも形成した。
【００５７】
＜ハイブリット形成部の漏れテスト＞
送液促進部と同様に、超純水を送液したところ、１００μＬ／ｍｉｎまで流量に応じて排出され、漏れ等は見られなかった。  
【００５８】
＜マイクロカラムのセット＞
前記で作製したマイクロカラムからルアー・ロック・ニードルとフィルポートを取り外し、蛍光顕微鏡のステージであるヒートプレート上に固定した。片側のみフェラルとナットを取り付けた細管、両側にフェラルとナットを持つ細管、シリンジ・ポンプ、排液瓶を用意した。
【００５９】
まず、両側にフェラルとナットを持つ細管を、マイクロカラムの上流側の導入部に取り付けた。そして、この細管の反対側のフェラルとナットをインターナル・ユニオンを介してルアー・ロック・ニードルに取り付け、シリンジ・ポンプにセットされるシリンジと接続した。次に、マイクロカラムの下流側には、片側のみフェラルとナットを取り付けた細管を取り付け、この細管の反対側を排液瓶に導入した。
【００６０】
＜漏れテスト＞
前記でセットしたマイクロカラムの送液時の漏れ等をチェックした。マイクロカラムに超純水を送液し、漏れがないか調べたところ、漏れは生じなかった。
【００６１】
＜全ＲＮＡの抽出＞
標準的な全ＲＮＡキットであるRneasy Protect kit（Qiagen）を用い、１０ｃｍディッシュで培養したHeLa細胞から全ＲＮＡを超純水で抽出し、全ＲＮＡ水溶液を得た。
【００６２】
＜全ＲＮＡサンプル液の調整＞
前記で得た全ＲＮＡ水溶液に塩化ナトリウム水溶液を加え、塩化ナトリウムの濃度が終濃度０．５Ｍになるように調整した。
【００６３】
＜全ＲＮＡサンプル液の遠心濾過＞
フィルタの孔径が、０．１μｍ、０．２２μｍ、０．４５μｍ、０．６５μｍ、５μｍの遠心濾過カラム（アミコンウルトラＭＣ、日本ミリポア株式会社製）を用意した。フィルタの孔径の大きい順に遠心濾過し、濾液をサンプル液とした。
【００６４】
＜ポリｄＴと全ＲＮＡ濾過サンプルのポリＡ部位のハイブリット形成＞
マイクロカラムに０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を通液し、マイクロカラム内の液相を置換した。前記で調整したサンプル液をシリンジに採取し、カラムの上流側の細管のルアーロック・ニードルと接続した。シリンジポンプで３００μＬ送液し、ポリｄＴと全ＲＮＡ濾過サンプルのポリＡ部位をハイブリット形成させた。送液後、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液７００μＬを送液し、マイクロカラム内を洗浄した。
【００６５】
＜プローブとターゲット間の複合体形成＞
ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールに近接した２１塩基の配列に相補的な配列を持ち、５’側にＣｙ３を標識したポリデオキシヌクレオチドをベータ・アクチンのプローブとして用いた。配列の決定には、日本ＤＮＡデータバンクを利用した。０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液に溶解して、５μＭのプローブ溶液を調製した。このプローブ溶液をシリンジに採取し、上記と同様にマイクロカラムに３００μＬ送液した。送液後、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液７００μＬを送液し、マイクロカラム内を洗浄した。
【００６６】
＜複合体形成の計測＞
Ｃｙ３の蛍光をＣｙ３用蛍光フィルターを備えた蛍光顕微鏡（ニコンインステック）に接続した顕微分光システム（大塚電子）を用いて計測し、複合体形成量とした。０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の影響を除くため、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液に液相を置換して測定を行った。ハイブリット形成部のポリｄＴビーズのビーズベット長４ｍｍの場合の測定結果を図８に、ポリｄＴビーズベット長２ｍｍの場合の測定結果を図９に示す。
【００６７】
＜結果＞
図８、図９は、プローブ溶液の送液前と送液後の蛍光スペクトルの差を示している。図８、図９ともに、Ｃｙ３の蛍光の増加が明瞭に観察されている。図８、図９に示すとおり、ビーズベットの長さは、蛍光測定には影響が無いことが分かった。また、ビーズベット長２ｍｍの場合、５０μＬ／ｍｉｎでの送液でも漏れは生じず、ビーズベット長４ｍｍの場合と比べて、内圧が低下していることが確認できた。
【００６８】
実施例１では、本発明に係るマイクロ流路系のカラム層を形成するハイブリット形成部に充填するビーズベット長は、４ｍｍ以下、より好ましくは、２ｍｍ以下にすることが望ましいことが分かった。マイクロ流路内圧は、ビーズベット長が短い方が低下し、また、ビーズベット長は、マイクロカラムの内径分の長さがあれば、蛍光測定に支障がないと考えられる。
【実施例２】
【００６９】
実施例２では、本発明に係るマイクロ流路系において、全ＲＮＡサンプル液をフィルター濾過する際の、好適なフィルター孔径について調べた。
【００７０】
＜全ＲＮＡサンプル液の遠心濾過＞
実施例１と同様に、フィルターの孔径が、０．１μｍ、０．２２μｍ、０．４５μｍ、０．６５μｍ、５μｍの遠心濾過カラム（アミコンウルトラＭＣ、日本ミリポア株式会社製）を用意した。実施例１と同様の手順で調整した全ＲＮＡサンプル液を、フィルターの孔径の大きい順に遠心濾過したところ、全フィルター上で残液が観察されたが、特に０．６５μｍフィルター上への残液が多かった。濾液を濾過サンプル液とした。比較対象として、無濾過のサンプル液を用いた。
【００７１】
＜漏れ観察＞
実施例１と同様の手順でセットしたマイクロカラムへ、濾過サンプル液を送液したときと、無濾過サンプル液を送液したときの、漏れ状況を観察した。ポリｄＴビーズのビーズベッド長は４ｍｍとした。流量に対する漏れ状況の結果を表１に示す。漏れを生じた場合を×、漏れを生じなかった場合を○、送液は可能であるが若干の漏れを生じた場合を△で示す。
【表１】
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【００７２】
表１に示す通り、濾過サンプル液は、５０μＬ／ｍｉｎの高流量では、若干の漏れを生じることもあったが、１０μＬ／ｍｉｎ以上の流量の送液が可能であることが分かる。これに対し、無濾過サンプル液は、５０μＬ／ｍｉｎの高流量で送液すると、配管の接続部などで頻繁に漏れが生じた。流量を低下させれば送液は可能となったが、漏れを生じさせずに送液するには、５μＬ／ｍｉｎをきり、２μＬ／ｍｉｎまで低下させる必要がある場合もあった。
【００７３】
実施例２では、サンプル液を送液する前に濾過を行うことにより、サンプル液中の浮遊物質などを除去することができ、流路の目詰まりを防止することが分かった。また、サンプル液を遠心濾過する過程において、孔径０．６５μｍのフィルター上に残液が多かったことから、濾過フィルターの好適な孔径は、０．６５μｍ以下、より好ましくは０．１μｍ以下であることが分かった。なお、濾過サンプル液を５０μＬ／ｍｉｎで送液したときに、若干の漏れを生じたのは、ポリｄＴビーズにポリＡセレクションされたｍＲＮＡにより、ビーズ間の流路の抵抗が大きくなり、内圧が上昇したためと考えられる。
【実施例３】
【００７４】
実施例３では、本発明に係るマイクロ流路系の下流において、減圧を行いながら、サンプル液を送液した場合の漏れを調べた。
【００７５】
＜シリンジの取り付け＞
実施例１と同様の手順でマイクロカラムをセットし、マイクロカラムの下流側に、フェラルとナットを両側に持つ細管を取り付けた。細管の下流側は、インターナル・ユニオンとルアー・ロック・ニードルを介して、シリンジと接続した。
【００７６】
＜サンプル液の送液と結果＞
前記で取り付けたシリンジを吸引し、排出側を陰圧に保ったまま、サンプル液を送液した。ポリｄＴビーズのビーズベッド長は４ｍｍとした。実施例２と同様、漏れを生じた場合を×、漏れを生じなかった場合を○、送液は可能であるが若干の漏れを生じた場合を△とし、結果を表２に示す。表２に示す通り、濾過したサンプル液を送液した場合、２、５、１０、２０μＬ／ｍｉｎの流量で漏れは生じず、２０μＬ／ｍｉｎ以上での送液が可能であることが分かった。無濾過のサンプル液を送液した場合も、吸引を行うことにより、若干ではあるが、改善が見られた。
【表２】
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【００７７】
実施例３では、本発明のマイクロ流路系の下流側を減圧することで、より高流量の送液が可能となることが分かった。これは、上流からの送液により、上流側に圧力が集中するが、下流側を陰圧に保つことで、液相の流れが改善されるためと示唆される。
【００７８】
なお、実施例１で調べたビーズベット長の好適な長さ（２ｍｍ）と、本実施例の減圧を併用する場合は、更に送液が改善される傾向がみられた。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明に係るマイクロ流路系では、マイクロ流路内での目詰まり、及びマイクロ流路内圧上昇の防止ができるため、高流量送液が可能である。特に、様々な浮遊物、長鎖の核酸などを含む全ＲＮＡサンプルの送液にも有効に利用できる。また、マイクロ流路内に充填されたビーズ表面において、ハイブリット形成が行われるため、反応効率がよく、更にビーズを洗浄等することにより、繰り返し利用可能なハイブリダイゼーション検出技術として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】本発明に係るマイクロ流路系１の好適な実施形態の一例を示す図である。
【図２】ハイブリット形成部１１１内に充填されているビーズ２１の表面上の物質構成の一例を模式的に示す図である。
【図３】ビーズ２１に保持されたプローブ核酸Ｐとターゲット核酸Ｘがハイブリダイゼーションする様子を模式的に示す図である。
【図４】図２とは異なる実施形態の、ハイブリット形成部１１１に充填されているビーズ２２の表面上の物質構成の一例を模式的に示す図である。
【図５】ビーズ２２に保持されたリンカーＬとターゲット核酸Ｘが相補結合する様子を模式的に示す図である。
【図６】ビーズ２２にリンカーＬを介して保持された状態のターゲット核酸Ｘとプローブ核酸Ｙがハイブリダイゼーションする様子を模式的に示す図である。
【図７】本発明に係るマイクロ流路系１を用いたアッセイの工程例を示す図である。
【図８】実施例１において、ポリｄＴビーズベット長４ｍｍの場合の蛍光測定結果を示す図面代用グラフである。
【図９】実施例１において、ポリｄＴビーズベット長２ｍｍの場合の蛍光測定結果を示す図面代用グラフである。
【符号の説明】
【００８１】
１  マイクロ流路系
１１  細管
１２  導入部
１３  排出部
２、２１、２２  ビーズ
３  送液促進粒子
１１１  ハイブリット形成部
１１２  送液促進部
Ｐ  プローブ核酸
Ｘ  ターゲット核酸
Ｌ  リンカー
Ｆ  蛍光物質
Ｓ１  第１サンプル液
Ｓ２  第２サンプル液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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