(57)【要約】【課題】簡素な電極構造を有しながら、安定した酵素固定能力と高い基質反応性とを兼ね備える酵素電極を提供する。【解決手段】特定の基質Ｓｕｂを酸化する基質脱水素酵素１０、基質脱水素酵素１０の補酵素からなる第１の電子メディエータ２０、第１の電子メディエータ２０を酸化する補酵素脱水素酵素３０、および補酵素脱水素酵素３０を酸化して電極５０への電子伝達を補助する第２の電子メディエータ４０が、電極５０上にそれぞれ層状に積層固定される構造とする。このうち、第１の電子メディエータ２０、補酵素脱水素酵素３０および第２の電子メディエータ４０は電極５０表面側の下層にエポキシ基を有する架橋剤により固定され、基質脱水素酵素１０は基質溶液側の上層に架橋剤および水溶性担体により固定される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の基質を酸化する基質脱水素酵素および該基質脱水素酵素を酸化して電極への電子伝達を補助する電子メディエータが、前記電子メディエータを下層として電極上にそれぞれ層状に積層固定されてなる
ことを特徴とする酵素電極。
【請求項２】
前記電子メディエータは、前記基質脱水素酵素の補酵素からなる第１の電子メディエータと、該第１の電子メディエータとなる補酵素を酸化する補酵素脱水素酵素と、該補酵素脱水素酵素を酸化して前記電極への電子伝達を補助する第２の電子メディエータとを備えてなる
請求項１に記載の酵素電極。
【請求項３】
前記第１の電子メディエータおよび前記補酵素脱水素酵素および前記第２の電子メディエータは、１つ以上のエポキシ基を有する架橋剤により固定されてなる
請求項２に記載の酵素電極。
【請求項４】
前記エポキシ基を有する架橋剤は、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルからなる
請求項３に記載の酵素電極。
【請求項５】
前記ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルからなる架橋剤は、前記第１の電子メディエータおよび前記補酵素脱水素酵素および前記第２の電子メディエータの総モル数に対して２０〜５０倍の量だけ含有されてなる
請求項４に記載の酵素電極。
【請求項６】
前記補酵素脱水素酵素および前記第２の電子メディエータは、最下層として、前記第１の電子メディエータよりも前記電極の表面寄りの層に固定されてなる
請求項２〜５のいずれか一項に記載の酵素電極。
【請求項７】
前記第１の電子メディエータは、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸のいずれかからなる
請求項２〜６のいずれか一項に記載の酵素電極。
【請求項８】
前記基質脱水素酵素は、該基質脱水素酵素と架橋反応可能な官能基を有する架橋剤および水溶性担体の少なくとも一方により前記基質側の層に固定されてなる
請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素電極。
【請求項９】
前記水溶性担体は、アニオン性およびカチオン性の少なくとも一方の電荷を有する水溶性ポリマーからなる
請求項８に記載の酵素電極。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、特定の基質を酸化する特性を有する酵素の酸化還元反応に伴う電子移動を利用した例えば電池、センサ、リアクター等に適用される酵素電極に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、化石燃料の枯渇や様々な環境問題の観点から、より環境負荷の少ないエネルギー生産技術を確立すべく燃料電池の開発が盛んに行われている。そしてその中でも、安全性やコストに優れた微生物や酵素等の生体触媒を利用した酵素電極、およびこうした酵素電極を用いた酵素センサおよび酵素燃料電池に関する提案は多い。ちなみに、酵素燃料電池などは、触媒として白金を必要としないため安価な供給が可能であるとともに、セパレータも不要で、ＤＭＦＣ（ダイレクトメタノール型燃料電池）で問題となるメタノールのクロスオーバーなども生じない利点がある。
【０００３】
一方、近年は、こうした酵素センサや酵素燃料電池の出力の向上や安定性の向上のため、それらの電極として用いられる酵素電極上に酵素を固定し、同電極近傍で起こる基質と酵素との反応を電気信号として効率よく抽出するための様々な方法も提案されている。例えば、特許文献１では、高分子電気伝導体等のペースト中に電子伝達体である電子メディエータを含有させたペースト状電極表面に酵素を固定し、その外面を基質透過膜（透析膜）で被覆することで酵素電極としての出力、並びに安定性を向上させる技術が提案されている。また、特許文献２では電極上にポリカチオン水溶液、ポリアニオン水溶液および酵素を展開してポリイオンコンプレックス膜を形成することで、酵素を固定化する電極製造方法が提案されている。このような電極製造方法の採用によって、基質溶液中への酵素の溶出が抑制できるようになり、酵素電極としての安定性が高められるようになる。さらに特許文献３では、架橋剤としてＧＡ（グルタルアルデヒド）を用い、ＰＬＬ（ポリ−Ｌ−リシン）と架橋させることで３次元的な構造を有するポリマーを形成し、このポリマーに酵素を電子メディエータと共々包括させることで、酵素電極としての出力向上を図る技術が提案されている。
【特許文献１】特公平６−１２３５３号公報
【特許文献２】特許２６６９４９７号公報
【特許文献３】特開２００５−１３２１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述のように、電極上に酵素を固定する方法としてさまざまな方法が提案されている。ただし、例えば特許文献１に記載されている酵素電極は、電子メディエータを高分子電気伝導体のペースト中に含有させた後、その表面に酵素を固定し、さらにその溶出を防ぐために基質透過膜を利用しているため、その電極構造がかなり複雑となっている。また、特許文献２に記載されている酵素電極は、電極上に酵素を含有するポリイオンコンプレックス膜を形成するようにしているため、このポリイオンコンプレックス膜による酵素固定力が強く、酵素の働きが阻害されやすい。このことが原因によるものか、酵素電極としての出力が低下することが確認されている。一方、特許文献３に記載されている酵素電極は、架橋剤を用いた３次元的なポリマーを用いて電極上に酵素を固定しているため、採用する酵素によっては電極上への固定能力が増大する反面、やはり酵素の働きの阻害によるものか、この場合も酵素電極として出力が低下することがある。
【０００５】
この発明は、こうした実情に鑑みてなされたものであり、簡素な電極構造を有しながら、安定した酵素固定能力と高い基質反応性とを兼ね備える酵素電極を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
こうした目的を達成するため、請求項１に記載の発明では、酵素電極として、特定の基質を酸化する基質脱水素酵素および該基質脱水素酵素を酸化して電極への電子伝達を補助する電子メディエータが、前記電子メディエータを下層として前記電極上にそれぞれ層状に積層固定される構造とした。
【０００７】
酵素電極としてのこのような構造によれば、上記基質脱水素酵素が基質側（基質溶液側）に、また上記電子メディエータが電極表面側にそれぞれ層状に積層固定されることで、上記基質脱水素酵素による高い基質反応性が確保されるようになる。また、上記電子メディエータを上記基質脱水素酵素よりも電極表面側に固定することにより、電子メディエータから電極への電子伝達が円滑に実現され、酵素電極としての出力向上が図られるようにもなる。
【０００８】
また、こうした構造において、請求項２に記載の発明によるように、前記電子メディエータとしてこれを、前記基質脱水素酵素の補酵素からなる第１の電子メディエータと、該第１の電子メディエータとなる補酵素を酸化する補酵素脱水素酵素と、該補酵素脱水素酵素を酸化して前記電極への電子伝達を補助する第２の電子メディエータとを備える構造とすることが特に有効である。酵素電極としてのこのような構造によれば、上記基質脱水素酵素の基質反応性が阻害されることなく、同基質脱水素酵素から伝達される電子が、上記第１の電子メディエータ、補酵素脱水素酵素、および第２の電子メディエータを介して電極へと伝達されることで、上記基質から電極への電子伝達がより円滑に実現されるようになる。
【０００９】
またこの場合、請求項３に記載の発明によるように、前記第１の電子メディエータおよび前記補酵素脱水素酵素および前記第２の電子メディエータが、１つ以上のエポキシ基を有する架橋剤により固定されることとすれば、上記架橋剤の有するエポキシ基の開環付加反応によって上記第１の電子メディエータおよび補酵素脱水素酵素および第２の電子メディエータの有するアミノ基との間にアミド結合が生成され、それらをより容易かつ安定に上記電極上に固定することができるようになる。
【００１０】
さらにこの場合、請求項４に記載の発明によるように、前記エポキシ基を有する架橋剤は、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルからなることとすれば、上記第１の電子メディエータおよび補酵素脱水素酵素および第２の電子メディエータの各分子間で架橋構造を形成して３次元構造をとることも可能となる。これにより、これら第１の電子メディエータおよび補酵素脱水素酵素および第２の電子メディエータの電極上での固定がより安定に実現されるようになる。
【００１１】
また、上記構造では、請求項５に記載の発明によるように、前記ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルからなる架橋剤は、前記第１の電子メディエータおよび前記補酵素脱水素酵素および前記第２の電子メディエータの総モル数に対して２０〜５０倍の量だけ含有することが特に有効である。ここで、上記架橋剤の量が上記総モル数に対して２０倍未満である場合には、上記第１の電子メディエータと架橋される架橋剤としての量が不十分であるため、同第１の電子メディエータが基質溶液側の層を介して基質溶液中に溶出する懸念がある。そしてこの場合には、酵素電極としての出力低下も避けられない。一方、上記架橋剤の量が上記総モル数に対して５０倍を超える場合には、上記第１の電子メディエータの全量が架橋剤により架橋されて電極表面側の層に固定されるようになる。このため、基質溶液側の層に固定される基質脱水素酵素から同第１の電子メディエータへの電子伝達が進行しにくくなり、ひいては上記基質脱水素酵素による酵素基質反応も進行しにくくなる。この点、上記構造のように、上記架橋剤の量を上記総モル数に対して２０〜５０倍の範囲とすることにより、上記第１の電子メディエータの大部分が上記架橋剤により電極表面側の層に安定に固定されるものの、その全量が架橋されることはない。このため、それら架橋されない第１の電子メディエータを介して基質脱水素酵素から上記電極表面側の層に固定されている第１の電子メディエータへの電子伝達が円滑に行われるとともに、同電極表面側の層に固定されている第１の電子メディエータから電極への電子伝達も円滑に行われるようになる。
【００１２】
一方、これら請求項２〜５のいずれかに記載の酵素電極に関しては、請求項６に記載の発明によるように、前記補酵素脱水素酵素および前記第２の電子メディエータを、最下層として、前記第１の電子メディエータよりも前記電極の表面寄りの層に固定することが有効である。酵素電極としてのこのような構造によれば、上記基質脱水素酵素の基質反応性を阻害することなく、同基質脱水素酵素から第１の電子メディエータ、補酵素脱水素酵素、第２の電子メディエータへの電子伝達がより円滑に実現されるようになる。なおこの場合、当該酵素電極は、補酵素脱水素酵素および第２の電子メディエータが第１層に、第１の電子メディエータが第２層に、そして基質脱水素酵素が第３層にそれぞれ固定される３層構造をとることとなる。
【００１３】
また、これら請求項２〜６のいずれかに記載の構造に関しては、請求項７に記載の発明によるように、前記第１の電子メディエータとしては、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸のいずれかを採用することが特に望ましい。これにより、さまざまな酵素の補酵素として機能する電子伝達体として知られるこれらＮＡＤ＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）やＮＡＤＰ＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）がこの第１の電子メディエータとして採用されることとなり、上記電極構造の実現がより容易に図られるようになる。
【００１４】
また、請求項１〜７のいずれかに記載の酵素電極に関しては、請求項８に記載の発明によるように、前記基質脱水素酵素が、該基質脱水素酵素と架橋反応可能な官能基を有する架橋剤および水溶性担体の少なくとも一方により前記基質側の層に固定されることとすれば、上記基質脱水素酵素の電極上へのより安定な酵素固定が実現されるようになる。
【００１５】
なおこの場合、請求項９に記載の発明によるように、前記水溶性担体が、アニオン性およびカチオン性の少なくとも一方の電荷を有する水溶性ポリマーからなることとすれば、上記水溶性担体と上記基質脱水素酵素との間でイオン結合による架橋構造が生じることから、これら水溶性担体および基質脱水素酵素の間での３次元構造が形成されるようになる。すなわち、上記電極上に固定される基質脱水素酵素の酵素担持量の増大および酵素安定性の向上が図られるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（第１の実施の形態）
以下、この発明にかかる酵素電極を具現化した第１の実施の形態について図１および図２を参照して説明する。
【００１７】
この実施の形態にかかる酵素電極は、特定の基質（標的物質）を酸化する基質脱水素酵素を触媒として、上記基質から電極に電子を伝達するものである。そして図１は、この酵素電極（アノード極）における電子伝達態様を模式的に示したものである。同図１に示されるように、この酵素電極は、特定の基質Ｓｕｂを酸化する基質脱水素酵素１０と、同基質脱水素酵素１０の補酵素からなる第１の電子メディエータ２０と、同第１の電子メディエータ２０を酸化する補酵素脱水素酵素３０と、同補酵素脱水素酵素３０を酸化する第２の電子メディエータ４０とが、それぞれ電極５０の表面に層状に固定される構造からなる。このうち基質脱水素酵素１０が上記特定の基質Ｓｕｂを酸化（脱水素）すると、同基質Ｓｕｂから電子（ｅ−）が引き抜かれ、次いでこの基質脱水素酵素１０が第１の電子メディエータ２０により酸化されることで基質脱水素酵素１０から第１の電子メディエータ２０に電子が伝達される。同様に、この第１の電子メディエータ２０が補酵素脱水素酵素３０により酸化されることで第１の電子メディエータ２０から補酵素脱水素酵素３０に電子が引き抜かれ、さらにこの補酵素脱水素酵素３０が第２の電子メディエータ４０により酸化されることで補酵素脱水素酵素３０から第２の電子メディエータ４０に電子が伝達される。そして、この第２の電子メディエータ４０が電極５０表面で酸化されることで第２の電子メディエータ４０から電極５０に電子が伝達される。このように、上記特定の基質Ｓｕｂが検知されると、基質脱水素酵素１０、第１の電子メディエータ２０、補酵素脱水素酵素３０、第２の電子メディエータ４０を介して、電極５０へと電子が伝達される。なお、同図１中では、これら基質Ｓｕｂ、基質脱水素酵素１０、第１の電子メディエータ２０、補酵素脱水素酵素３０および第２の電子メディエータ４０の酸化還元反応に伴って得られる各酸化還元体を、それぞれ酸化体（ｒｅｄ）、還元体（ｏｘ）として示している。
【００１８】
上記酵素電極で検知される基質Ｓｕｂとしては、例えばグルコースや、メタノール、エタノール等のアルコールが用いられる。そして、これら各基質Ｓｕｂを特異的に酸化する基質脱水素酵素１０としては、例えばグルコース脱水素酵素やアルコール脱水素酵素等が用いられる。また、上記基質脱水素酵素１０を酸化する第１の電子メディエータ２０としては、例えば上記各基質脱水素酵素１０の補酵素であるＮＡＤ＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）やＮＡＤＰ＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）等が用いられる。ちなみに、これらＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋は、上記基質脱水素酵素１０を酸化することで、それぞれＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）およびＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）となる。また、これら第１の電子メディエータ２０を酸化する補酵素脱水素酵素３０としては、例えばＮＡＤ（Ｐ）Ｈ脱水素酵素であるジアホラーゼ等が用いられる。ちなみに、上記第１の電子メディエータ２０として上述した還元型のＮＡＤ（Ｐ）Ｈが用いられる場合には、補酵素脱水素酵素３０であるジアホラーゼを還元することにより再び酸化型のＮＡＤ（Ｐ）＋に戻る。なお、上記補酵素脱水素酵素３０を酸化する第２の電子メディエータ４０としては、例えばＯｓ（オスミウム）錯体等が用いられる。
【００１９】
一方、上記電極５０は導電性電極からなり、例えばカーボンペーパー等、基質脱水素酵素１０等の担持に適した多孔質の炭素系材料や、同基質脱水素酵素１０等の固定面積を増大させることのできるカーボンフェルトやカーボンブラック等の炭素系材料を用いることができる。また、その他の炭素系材料、導電性金属、半導体材料および金属酸化物なども導電性を有する物質であれば用いることができる。
【００２０】
ここで、この実施の形態にかかる酵素電極においては、上述したように、電極５０上に各酵素および各電子メディエータ等が積層固定されている。具体的には、電極５０表面側の下層となる第１層には、第１の電子メディエータ２０、補酵素脱水素酵素３０および第２の電子メディエータ４０が固定されており、基質側（基質溶液側）の第２層には、基質脱水素酵素１０が固定されている。図２は、こうした各酵素および電子メディエータ等が電極上に固定される酵素電極の一例についてその積層構造を模式的に示したものであり、次に、同図２を参照してその電極構造を詳細に説明する。
【００２１】
同図２に示されるように、この酵素電極は、電極５０上に固定される各酵素および電子メディエータが２層に積層固定される構造からなる。ちなみにこの酵素電極では、例えばグルコースを基質Ｓｕｂとしている。また、上記基質脱水素酵素１０としてはグルコース脱水素酵素１１を、第１の電子メディエータ２０としてはＮＡＤ＋２１を、上記補酵素脱水素酵素３０としてはジアホラーゼ３１を、上記第２の電子メディエータ４０としてはＯｓ錯体４１をそれぞれ用いている。そして、これら各酵素および電子メディエータが、例えばカーボンペーパーからなる電極５０上に２層に積層固定されている。具体的には、電極５０表面上の第１層には、ＮＡＤ＋２１、ジアホラーゼ３１およびＯｓ錯体４１が固定されており、この第１層の上層で基質溶液側にあたる第２層には、グルコース脱水素酵素１１が固定されている。
【００２２】
このうち、第１層では、上記ＮＡＤ＋２１、ジアホラーゼ３１およびＯｓ錯体４１が、例えばＰＥＧＤＧＥ（ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル）６１等の架橋剤により上記電極５０表面上に固定されている。このＰＥＧＤＧＥ６１はエポキシ基を有する架橋剤であり、その開環付加反応により、上記ＮＡＤ＋２１、ジアホラーゼ３１およびＯｓ錯体４１の有するアミノ基と結合することで架橋構造を形成する。
【００２３】
一方、第２層では、上記グルコース脱水素酵素１１が、ＧＡ（グルタルアルデヒド）７１等の架橋剤およびＰＬＬ（ポリ−Ｌ−リシン）７２等の水溶性担体により固定されている。このうちＧＡ７１は、２つのアルデヒド基を有する架橋剤であり、少なくとも１つのアミノ基を有する物質同士を架橋させることが可能である。これにより、グルコース脱水素酵素１１の有するアミノ基とアミド結合することで架橋構造を形成する。また、ＰＬＬ７２はα−アミノ酸の一種であって、側鎖に１級アミノ酸を有する水溶性担体である。しかもこのＰＬＬ７２は、陽電荷が豊富であるため、グルコース脱水素酵素１１との間でイオン結合を生成して３次元構造のポリマー鎖を形成する。そして、第２層にこうしたＰＬＬ７２による３次元構造が形成されることで、上記電極５０上に固定されるグルコース脱水素酵素１１の酵素担持量が増大して、その量的な保持能力の向上が図られるようになるとともに、ＧＡ７１による架橋構造が形成されることで、上記グルコース脱水素酵素１１が電極５０上に安定に固定されるようになる。しかも、グルコース脱水素酵素１１がこのように基質溶液側の第２層に固定されることで、同酵素１１と基質との反応性も確保されるようになる。
【００２４】
ここで、上述のように第１層においては、ＮＡＤ＋２１がＰＥＧＤＧＥ６１により電極上に固定されるが、その全量が架橋構造を形成して固定されないことが好ましい。具体的には、第１層に固定されるＮＡＤ＋２１、ジアホラーゼ３１およびＯｓ錯体４１の総モル数に対して、ＰＥＧＤＧＥ６１が２０〜５０倍の量だけ含有されていることが好ましい。これにより、上記ＮＡＤ＋２１の大部分はＰＥＧＤＧＥ６１により架橋されて第１層に固定されることとなるが、同ＮＡＤ＋２１の一部は架橋されず、第１層だけでなく第２層にも取り込まれるようになる。そして、このＮＡＤ＋２１が第２層、特に上述したＰＬＬ７２からなるポリマー鎖内にとりこまれることで、基質溶液への溶出が防止されるとともに、同第２層に固定されているグルコース脱水素酵素１１との電子伝達が円滑に図られるようになる。これにより、グルコース脱水素酵素１１による高い酵素基質反応が確保されつつ、上記基質Ｓｕｂからグルコース脱水素酵素１１、ＮＡＤ＋２１、ジアホラーゼ３１、Ｏｓ錯体４１を介して電極５０への電子伝達が円滑に進行し、基質酸化電流の増加が図られるようになる。ちなみに、ここで用いられるＰＥＧＤＧＥ６１の量が上記総モル数に対して２０倍未満である場合には、上記ＮＡＤ＋２１と架橋される架橋剤としての量が不十分であるため、同ＮＡＤ＋２１が基質溶液側の層を介して基質溶液中に溶出する懸念がある。そしてこの場合には、酵素電極としての出力低下も避けられない。一方、上記ＰＥＧＤＧＥ６１の量が上記総モル数に対して５０倍を超える場合には、上記ＮＡＤ＋２１の全量がＰＥＧＤＧＥ６１により架橋されて電極５０表面側の層に固定されるようになる。このため、基質溶液側の層に固定されるグルコース脱水素酵素１１からＮＡＤ＋２１への電子伝達が進行しにくくなり、ひいてはグルコース脱水素酵素１１による酵素基質反応も進行しにくくなる。
【００２５】
なお、上記第１層において、ＮＡＤ＋２１、ジアホラーゼ３１およびＯｓ錯体４１の固定に用いられる架橋剤としては、ＰＥＧＤＧＥ６１の他にも１つ以上のエポキシ基を有するものであれば用いることができる。
【００２６】
また、上記第２層において、グルコース脱水素酵素１１の固定に用いられる架橋剤としては、ＧＡ７１の他にも、上記グルコース脱水素酵素１１との架橋反応が可能である官能基を１つ以上有するものであれば同様に用いることができ、例えばＥＤＣ（１−エチル−３−[３−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩）等を用いることもできる。このＥＤＣは、特にアミノ基とカルボキシル基を有する物質の架橋剤として利用することができる。
【００２７】
以上説明したように、この実施の形態にかかる酵素電極によれば、以下に列記するような効果が得られるようになる。
（１）カーボンペーパーからなる電極５０上に、グルコースを酸化するグルコース脱水素酵素１１と、同酵素１１の補酵素であるＮＡＤ＋２１と、同ＮＡＤ＋２１を酸化するジアホラーゼ３１と、同ジアホラーゼ３１を酸化するＯｓ錯体４１とを、２層に積層固定することとした。具体的には、電極５０表面側となる第１層にＮＡＤ＋２１、ジアホラーゼ３１およびＯｓ錯体４１を固定し、基質溶液側となる第２層にグルコース脱水素酵素１１を固定することとした。これにより、上記グルコース脱水素酵素１１の高い基質反応性を確保されるとともに、上記ＮＡＤ＋２１、ジアホラーゼ３１およびＯｓ錯体４１をグルコース脱水素酵素１１よりも電極５０表面側に固定したことで、これらから電極５０への電子伝達が円滑に実現され、酵素電極としての出力向上が図られるようになる。
【００２８】
（２）ＮＡＤ＋２１、ジアホラーゼ３１およびＯｓ錯体４１は、エポキシ基を有する架橋剤であるＰＥＧＤＧＥ６１によって電極５０の表面に固定されることとした。これにより、ＰＥＧＤＧＥ６１の有する２個のエポキシ基の開環付加反応により、これらＮＡＤ＋２１、ジアホラーゼ３１およびＯｓ錯体４１の有するアミノ基との間にアミド結合が生成されるとともに、これら各分子間で架橋構造を形成して３次元構造をとることも可能となり、それらの電極５０上での固定がより安定に実現されるようになる。
【００２９】
（３）ＰＥＧＤＧＥ６１は、ＮＡＤ＋２１、ジアホラーゼ３１およびＯｓ錯体４１の総モル数に対して２０〜５０倍の量だけ用いることとした。これにより、上記ＮＡＤ＋２１の全量がＰＥＧＤＧＥ６１により架橋されて第２層に固定されることなく、架橋されないＮＡＤ＋２１が第２層にも存在可能となる。これにより、グルコース脱水素酵素１１からＮＡＤ＋２１への電子伝達が円滑に実現されるようになる。
【００３０】
（４）グルコース脱水素酵素１１は、架橋剤であるＧＡ７１および水溶性担体であるＰＬＬ７２により電極５０上に固定されることとした。これにより、グルコース脱水素酵素１１とＧＡ７１との架橋構造が形成されることで、電極５０に固定される酵素安定性の向上が図られるとともに、ＰＬＬ７２とのイオン結合による３次元構造が形成されることで、上記酵素１１の担持量の増加が図られるようになる。
【００３１】
（第２の実施の形態）
次に、この発明にかかる酵素電極の第２の実施の形態について、図３を参照して説明する。この実施の形態にかかる酵素電極も、酵素電極としての基本的な電子伝達態様は先の第１の実施の形態と同様であるが、電極に固定される各酵素および電子メディエータの層構造が異なる。
【００３２】
すなわち、第１の実施の形態では、電極に固定される各酵素および電子メディエータが２層に積層固定されることとしたが、この第２の実施の形態では、３層に積層固定されるようにしている。具体的には、電極５０表面上の最下層である第１層には、ジアホラーゼ３１およびＯｓ錯体４１が固定されており、同第１層の上層である第２層にはＮＡＤ＋２１が固定されており、同第２層の上層でありもっとも基質溶液側の第３層にはグルコース脱水素酵素１１が固定されている。このうち第１層では、上記ジアホラーゼ３１およびＯｓ錯体４１が、例えばＰＥＧＤＧＥ６１等の架橋剤により上記電極５０表面上に固定されている。また第２層では、上記ＮＡＤ＋２がＧＡ７１等の架橋剤およびＰＬＬ７２等の水溶性担体により固定されており、さらに第３層でも、上記グルコース脱水素酵素１１が第２層と同様にＧＡ７１等の架橋剤およびＰＬＬ７２等の水溶性担体により固定されている。
【００３３】
そして、この実施の形態にかかる酵素電極でも、先の第１の実施の形態と同様、グルコース脱水素酵素１１がもっとも基質溶液側にあたる第３層に固定されることで、同酵素１１と基質との反応性が確保されている。さらにこの実施の形態にかかる酵素電極では、ＮＡＤ＋２１よりもジアホラーゼ３１およびＯｓ錯体４１が電極表面側の第１層に固定されることで、グルコース脱水素酵素１１からＮＡＤ＋２１への電子伝達、並びにＮＡＤ＋２１からジアホラーゼ３１およびＯｓ錯体４１への電子伝達が順次円滑に行われるようになる。
【００３４】
このように、酵素電極に使用される酵素や電子メディエータ等の数によっては、各酵素および電子メディエータが固定される層を２層から３層に増加させてもよく、酵素と基質との反応特性を考慮しつつ基質から電極への電子伝達を円滑に進行させることで、基質酸化電流の向上および電極安定性の向上を図ることができる。
【００３５】
以上説明したように、この第２の実施の形態にかかる酵素電極によっても、先の第１の実施の形態による前記（１）〜（４）の効果と同等、もしくはそれに準じた効果が得られるようになる。
【実施例】
【００３６】
以下に、実施例を挙げてこの発明を具体的に説明する。ただし、下記の実施例はこの発明を例示するだけであって、この発明の範囲を限定するものではない。
（酵素電極のグルコース酸化能の評価）
グルコース脱水素酵素、ＮＡＤ＋、ジアホラーゼおよびＯｓ錯体を使用した酵素電極を３電極式の電気化学セルに用いることにより、上記酵素電極のグルコース酸化能の評価を行った。
【００３７】
まず、直径５［ｍｍ］にくりぬいたカーボンペーパー、またはカーボンブラックを塗布したカーボンペーパー電極上に、Ｏｓ錯体である１５［ｍｇ／ｍＬ（ミリグラム／ミリリットル）］のＰＶＩ［Ｏｓ（ｄｐａ）２Ｃｌ］が１．５［μＬ（マイクロリットル）］、２０［μＭ（マイクロモル／リットル）］のジアホラーゼが３［μＬ］、０．１［Ｍ］のＮＡＤ＋が２．５［μＬ］、および１００［ｍｇ／ｍＬ］のＰＥＧＤＧＥが５［μＬ］からなる混合液を塗布し、遮光状態にて３０［℃］で６時間反応させることで電極表面上に第１層を形成した。次いで、この第１層の上面に１．９［ｍＭ］のグルコース脱水素酵素が５［μＬ］、１％のＰＬＬが５［μＬ］、および０．１２５［％］のＧＡが５［μＬ］からなる混合液を塗布し、これを遮光状態にて室温で乾燥させることで基質溶液側の第２層を形成した。これにより、先の図２に示されるように、電極上に各酵素および電子メディエータ等が２層に積層固定された酵素電極Ｅ１を得た。次に、この酵素電極Ｅ１を３電極式の電気化学測定セルに用いた。具体的には、反応槽として５［ｍＬ（ミリリットル）］容量のパイレックスガラス（登録商標）製電解セルを用い、この反応槽にリン酸ナトリウムバッファおよび塩化カリウム溶液を注入した。そして、上記酵素電極Ｅ１を作用電極として上記反応槽に浸し、参照電極に銀／塩化銀電極、対極に白金電極を用いて、−０．２〜０．４［Ｖ（ｖｓ銀／塩化銀電極）］の間でサイクリックボルタンメトリ（ＣＶ、電位走査法）およびクロノアンペロメトリにて電位掃引した。なお、上記反応槽にはグルコースを添加し、その添加前後におけるＣＶ測定を行った。
【００３８】
図４は、このＣＶ測定の結果を示したものであり、グルコース添加後のＣＶ曲線を実線で、グルコース添加前のＣＶ曲線を二点鎖線でそれぞれ示している。ここで、グルコース添加後のＣＶ曲線（実線）は、作用電極の電位を順方向に掃引したときの酸化電流曲線Ｌ１および逆方向に掃引したときの還元電流曲線Ｌ２からなり、グルコース添加前のＣＶ曲線（二点鎖線）は、同様に酸化電流曲線Ｌ３および還元電流曲線Ｌ４からなっている。同図４に示されるように、基質としてグルコースが添加されることで、酵素電極Ｅ１の酸化電流が大きく増加し、最大で約０．５３４５［ｍＡ／ｃｍ２（ミリアンペア／平方センチメートル）］の酸化電流が確認されている。
【００３９】
次に、同様にして、電極表面上にＯｓ錯体、ジアホラーゼおよびＰＥＧＤＧＥを固定した第１層を形成し、その上層にＰＬＬ、ＧＡおよびＮＡＤ＋を固定した第２層を形成し、さらに、その上層にＰＬＬ、ＧＡおよびグルコース脱水素酵素を固定した第３層を形成することで、先の図３に示されるように、電極上に各酵素および電子メディエータ等が３層に積層固定された酵素電極Ｅ２を得た。
【００４０】
また、この実施の形態にかかる酵素電極Ｅ１およびＥ２と、そのグルコース酸化能を比較するための比較例として、図５および図６に示すような電極構造を有する酵素電極Ｅ３およびＥ４を作製した。このうち、酵素電極Ｅ３は、図５に示されるように、電極５０表面上に、グルコース脱水素酵素１１、ジアホラーゼ３１、およびＯｓ錯体４１をＰＥＧＤＧＥ６１により固定して第１層を形成し、その上層にＮＡＤ＋２１をＧＡ７１およびＰＬＬ７２により固定して第２層を形成したものである。この酵素電極Ｅ３は、上記酵素電極Ｅ２と同様に、各酵素および電子メディエータ等が２層に積層固定されている酵素電極であるが、グルコース脱水素酵素１１が電極表面側の第１層に固定され、ＮＡＤ＋２１が同酵素１１よりも基質溶液側の第２層に固定されている点が異なっている。一方、酵素電極Ｅ４は、図６に示されるように、電極５０上に、グルコース脱水素酵素１１、ＮＡＤ＋２１、ジアホラーゼ３１、およびＯｓ錯体４１を、ＰＥＧＤＧＥ６１によって全て同一の層（第１層）に固定したものである。なお、これら酵素電極Ｅ１〜Ｅ４の電極構成の一覧を図７に示している。
【００４１】
図８は、これら酵素電極Ｅ１〜Ｅ４を用いて上述した条件と同一条件下でＣＶ測定を行い、得られたグルコース酸化電流の最大値をそれぞれ示したものである。同図８に示されるように、グルコース脱水素酵素１１を基質溶液側の層に固定し、かつ各酵素および電子メディエータ等が２層あるいは３層に積層固定されている酵素電極Ｅ１およびＥ２では、これらを１層に固定した酵素電極Ｅ４よりも大きな酸化電流が得られることがわかる。また、２層構造からなる酵素電極Ｅ１と酵素電極Ｅ３とを比較すると、グルコース脱水素酵素１１とその補酵素であるＮＡＤ＋２１との固定位置の違いにより、酵素電極Ｅ１では酵素電極Ｅ３の約２倍近くの大きな酸化電流が得られている。このように、電極５０上に固定されるグルコース脱水素酵素１１を基質溶液側の層に固定することで同酵素１１と基質との基質反応性が向上し、また、ＮＡＤ＋２１、ジアホラーゼ３１およびＯｓ錯体４１等を同酵素１１よりも電極５０表面側の層に固定することで、これら各酵素および電子メディエータから電極５０への電子伝達がより円滑に進行することが確認された。
【００４２】
（その他の実施の形態）
なお、この発明にかかる酵素電極は、上記各実施の形態として示した構成に限らず、これらを適宜変更した、以下の態様にて実施することもできる。
【００４３】
・上記各実施の形態では、グルコース脱水素酵素１１を架橋剤であるＧＡ７１との架橋構造および水溶性担体であるＰＬＬ７２による３次元構造を通じて電極５０上に固定することとしたが、一般に、基質脱水素酵素１０の固定に用いられる架橋剤の有効性は、酵素電極に採用される同基質脱水素酵素１０の種類によって有効か否かが異なる。例えば、基質脱水素酵素１０としてアルコール脱水素酵素を用いる場合には、架橋剤としてＧＡ７１を用いると同脱水素酵素の失活が起こり、酵素電極としての出力が低下することが発明者らによって確認されている。このため、こうした基質脱水素酵素１０と架橋剤および水溶性担体との反応性に応じて、上記基質脱水素酵素１０の固定には架橋剤および水溶性担体のうちの一方を用いるようにしてもよいし、上記電極５０上への十分な酵素固定が可能であればこれらの使用を割愛するようにしてもよい。
【００４４】
・上記各実施の形態では、グルコースを基質Ｓｕｂとする酵素電極について例示し、基質脱水素酵素１０としてグルコース脱水素酵素１１を用いることとした。これに代えて、基質Ｓｕｂにメタノールやエタノールなどのアルコールを使用する場合には、基質脱水素酵素１０としてもアルコール脱水素酵素に加えてアルデヒド脱水素酵素を利用することができる。そしてこの場合には、酵素電極を３層構造として、アルコール脱水素酵素を基質溶液側の第３層に、またアルデヒド脱水素酵素を第２層に、さらにＮＡＤ＋を第１層に固定するようにしてもよい。このように、基質Ｓｕｂを酸化する基質脱水素酵素１０を複数用いるようにしてもよく、また採用する基質脱水素酵素１０と基質Ｓｕｂとの反応性を考慮して同酵素１０を固定する層を適宜選択し、それらを電極５０上の異なる層に固定するようにしてもよい。
【００４５】
・上記各実施の形態では、電極５０上に各酵素および電子メディエータを２層あるいは３層に積層固定する酵素電極について例示したが、これら電極５０上に固定する酵素および電子メディエータやその種類によっては、４層以上の積層構造とすることも可能である。要は、酵素の基質反応性を確保しつつ、同酵素から電極への電子伝達反応を円滑に進行させることのできる構造であればよい。
【００４６】
・上記各実施の形態では、基質Ｓｕｂから引き抜かれた電子が、基質脱水素酵素１０、第１の電子メディエータ２０、補酵素脱水素酵素３０、および第２の電子メディエータ４０を介して電極５０に伝達されることとしたが、基質脱水素酵素１０から電極への電子伝達態様は上記の例に限られない。すなわち、上記第１の電子メディエータ２０、補酵素脱水素酵素３０、および第２の電子メディエータ４０に相当する機能を一つの電子メディエータにて担保することができ、上記基質脱水素酵素１０からこの一つの電子メディエータを介して電極５０に直接電子伝達が可能であれば、電極５０上にこれらを積層固定する電極構造を採用することもできる。要は、特定の基質を酸化する基質脱水素酵素および該基質脱水素酵素を酸化して電極への電子伝達を補助する電子メディエータが、上記電子メディエータを下層として電極上にそれぞれ層状に積層固定される構造であればよい。このような構造であれ、上記基質脱水素酵素による高い基質反応性が確保されるとともに、上記電子メディエータを上記基質脱水素酵素よりも電極表面側に固定することにより、電子メディエータから電極への電子伝達が円滑に実現され、酵素電極としての出力向上が図られるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】この発明にかかる酵素電極の第１の実施の形態について、電子伝達態様を模式的に示す図。
【図２】同実施の形態にかかる酵素電極の積層構造を模式的に示す斜視図。
【図３】この発明にかかる酵素電極の第２の実施の形態についてその積層構造を模式的に示す斜視図。
【図４】この発明にかかる酵素電極の実施例についてグルコース添加前後におけるＣＶ測定の結果を比較して示すグラフ。
【図５】この発明にかかる酵素電極の比較例としてその電極構造を模式的に示す斜視図。
【図６】この発明にかかる酵素電極の比較例としてその電極構造を模式的に示す斜視図。
【図７】この発明にかかる酵素電極の実施例および比較例の電極構成を一覧して示す図。
【図８】この発明にかかる酵素電極の実施例および比較例についてグルコースを添加したときの最大酸化電流を一覧して示す図。
【符号の説明】
【００４８】
１０…基質脱水素酵素、１１…グルコース脱水素酵素、２０…第１の電子メディエータ、２１…ＮＡＤ＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、３０…補酵素脱水素酵素、３１…ジアホラーゼ、４０…第２の電子メディエータ、４１…Ｏｓ（オスミウム）錯体、５０…電極、６１…ＰＥＧＤＧＥ（ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル）、７１…ＧＡ（グルタルアルデヒド）、７２…ＰＬＬ（ポリ−Ｌ−リシン）、Ｓｕｂ…基質。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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