(57)【要約】【課題】天然素材からなる安全な便秘の予防又は改善剤を提供する。【解決手段】以下のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む便秘の予防又は改善剤。オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来し、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有し、かつ水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である。本発明の便秘の予防又は改善剤は、モルヒネ投与患者の強固な便秘にも著効を示す。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(1)〜(3)の性質を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む便秘の予防又は改善剤。
(1)  オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来する。
(2)  １Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。
(3)  水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である。
【請求項２】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物がオーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)である請求項１に記載の便秘の予防又は改善剤。
【請求項３】
副交感神経刺激により便秘を予防又は改善する請求項１又は２に記載の便秘の予防又は改善剤。
【請求項４】
便秘がモルヒネ投与による便秘である請求項１〜３のいずれかに記載の便秘の予防又は改善剤。
【請求項５】
以下の(1)〜(3)の性質を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含み、便秘を予防又は改善する作用を有するものであることを特徴とし、便秘を予防又は改善するために用いられる旨の表示を付した飲食品組成物。
(1)   オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来する。
(2)  １Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。
(3)  水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である。
【請求項６】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物がオーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)である請求項５に記載の飲食品組成物。
【請求項７】
副交感神経刺激により便秘を予防又は改善する請求項５又は６に記載の飲食品組生物。
【請求項８】
便秘がモルヒネ投与による便秘である請求項４〜７のいずれかに記載の飲食品組生物。
【請求項９】
以下の(1)〜(3)の性質を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む副交感神経刺激剤。
(1)  オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来する。
(2)  １Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。
(3)  水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である。
【請求項１０】
以下の(1)〜(3)の性質を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含み、副交感神経を刺激する作用を有するものであることを特徴とし、副交感神経を刺激するために用いられる旨の表示を付した飲食品組成物。
(1)   オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来する。
(2)  １Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。
(3)  水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である。
【請求項１１】
以下の(1)〜(3)の性質を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを０．０１〜５重量％含む飲料組成物。
(1)   オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来する。
(2)  １Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。
(3)  水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である。
【請求項１２】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物がオーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)である請求項１１に記載の飲料組成物。
【請求項１３】
さらに、乳酸菌を含む請求項１１又は１２に記載の飲料組成物。
【請求項１４】
以下の(1)〜(3)の性質を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを０．０１〜５重量％、又は１０〜８０重量％含む固形、半固形、又はゲル状食品組成物。
(1)   オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来する。
(2)  １Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。
(3)  水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である。
【請求項１５】
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物がオーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)である請求項１４に記載の食品組成物。
【請求項１６】
さらに、乳酸菌を含む請求項１４又は１５に記載の食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、便秘の予防又は改善剤、副交感神経の刺激剤、及び便秘の予防又は改善のため、又は副交感神経刺激(若しくはストレス緩和）のために用いられる飲食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食習慣の変化、運動不足、過度のストレス、高齢化等の要因により、常習性便秘者が増加している。便秘者が増加していることは、厚生労働省の発表している、平成１４年患者調査（厚生労働省大臣官房統計情報部人口動態・保険統計課：平成１４年患者調査報告（疾病分類学））からも明らかである。常用性便秘者の中には、市販されている下剤を常用している人も少なくない。しかし、下剤の常用に対する副作用が問題視されている。
【０００３】
このような背景もあり、便通を改善する機能を持った食品素材の開発が盛んに行われており、おなかの調子を整える特定保健用食品も数多く見られる。例えば、乳酸菌類、オリゴ糖類、セルロースなどは、腸内細菌叢を改善することや、保水・膨潤作用により便を軟らかくすることなどによって、腸内環境を整え便秘を改善する。
【０００４】
また、近年の自然志向により、天然成分からなる便秘改善剤が求められている。
【０００５】
例えば、特許文献１は、β−１，３−１，６−グルカンを含むアウレオバシジウム属菌の培養物と乳酸菌とを含む便秘改善剤を開示している（請求項１）。また、アウレオバシジウム属培養物単独では便秘改善効果は認められないが、アウレオバシジウム属培養物は、乳酸菌による便秘改善効果を増強する作用を有することを教えている（段落００４１）。
【０００６】
また、特許文献２は、β−１，３−１，６−グルカンとフラクトオリゴ糖とを含むアウレオバシジウム属培養液が便秘防止などの健康維持飲料として利用できることを教えている（第１頁左欄第１５行〜同頁右欄第６頁）。
【０００７】
β−１，３−１，６−グルカンに着目すると、特許文献１にはβ−１，３−１，６−グルカン自体には便秘改善効果はないことが記載されている。また、特許文献２には、β−１，３−１，６−グルカンが便秘改善作用を示したというデータは示されていない。
【０００８】
また、便秘は薬剤の使用により引き起こされる場合もあるところ、薬剤の複数投与はできるだけ避ける方がよいことから、天然成分により便秘を改善できることが望まれる。例えば、モルヒネは癌患者の疼痛緩和のために投与されるが、副作用として強い便秘を引き起こす。このような強固な便秘は、一般の便秘治療薬では改善が難しく、特に天然成分からなる穏和な便秘治療薬では改善が難しい。従って、モルヒネを長期反復投与する場合は、強い便秘を長期にわたり抑制できる安全な便秘の予防又は改善剤が求められる。
【特許文献１】特開２００４−２６９４０７号公報
【特許文献２】特開昭６１−１４６１９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、天然素材からなる安全な便秘の予防又は改善剤、及び便秘の予防又は改善効果を有する飲食品組成物を提供することを課題とする。
【００１０】
また、本発明は、モルヒネ被投与者の便秘を予防又は改善できる天然素材からなる安全な便秘の予防又は改善剤、及び飲食品組成物を提供することも課題とする。
【００１１】
さらに、本発明は、天然素材からなる安全な副交感神経刺激剤、及び副交感神経を刺激することができる飲食品組成物を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの健康維持・増進のための有効利用について研究を重ねた結果、このグルカンをアルカリ処理したものは、便秘症状の改善に優れた効果を示し、さらにモルヒネ投与により誘発される強固な便秘の予防ないしは改善にも優れた効果を示すことを見出した。
【００１３】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の便秘の予防又は改善剤などを提供する。
【００１４】
項１．  以下の(1)〜(3)の性質を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む便秘の予防又は改善剤。
(1)  オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来する。
(2)  １Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。
(3)  水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である。
【００１５】
項２．  オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物がオーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)である項１に記載の便秘の予防又は改善剤。
【００１６】
項３．  副交感神経刺激により便秘を予防又は改善する項１又は２に記載の便秘の予防又は改善剤。
【００１７】
項４．  便秘がモルヒネ投与による便秘である項１〜３のいずれかに記載の便秘の予防又は改善剤。
【００１８】
項５．  以下の(1)〜(3)の性質を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含み、便秘を予防又は改善する作用を有するものであることを特徴とし、便秘を予防又は改善するために用いられる旨の表示を付した飲食品組成物。
(1)   オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来する。
(2)  １Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。
(3)  水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である。
【００１９】
項６．  オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物がオーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)である項５に記載の飲食品組成物。
【００２０】
項７．  副交感神経刺激により便秘を予防又は改善する項５又は６に記載の飲食品組生物。
【００２１】
項８．  便秘がモルヒネ投与による便秘である項４〜７のいずれかに記載の飲食品組生物。
【００２２】
項９．  以下の(1)〜(3)の性質を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む副交感神経刺激剤。
(1)  オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来する。
(2)  １Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。
(3)  水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である。
【００２３】
項１０．  以下の(1)〜(3)の性質を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含み、副交感神経を刺激する作用を有するものであることを特徴とし、副交感神経を刺激するために用いられる旨の表示を付した飲食品組成物。
(1)   オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来する。
(2)  １Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。
(3)  水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である。
【００２４】
項１１．  以下の(1)〜(3)の性質を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを０．０１〜５重量％含む飲料組成物。
(1)   オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来する。
(2)  １Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。
(3)  水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である。
【００２５】
項１２．  オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物がオーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)である項１１に記載の飲料組成物。
【００２６】
項１３．  さらに、乳酸菌を含む項１１又は１２に記載の飲料組成物。
【００２７】
項１４．  以下の(1)〜(3)の性質を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを０．０１〜５重量％、又は１０〜８０重量％含む固形、半固形、又はゲル状食品組成物。
(1)   オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来する。
【００２８】
(2)  １Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。
(3)  水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である。
【００２９】
項１５．  オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物がオーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)である項１４に記載の食品組成物。
【００３０】
項１６．  さらに、乳酸菌を含む項１４又は１５に記載の食品組成物。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の便秘の予防又は改善剤は、オーレオバシジウム属に属する微生物に由来するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンであって、オーレオバシジウム属の天然型β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンに比べて低粘度の水溶液を与えるグルカンを有効成分として含み、便秘の予防、改善、又は治療に有効である。
【００３２】
また、モルヒネは癌患者などの疼痛を緩和するために投与されるところ、モルヒネはオピオイドμ受容体を遮断（ブロック）してアセチルコリンの遊離を低下させ、即ち副交感神経系を遮断ないしは抑制することにより、腸管の輪状筋を収縮させて蠕動運動を低下させる作用や、肛門括約筋の緊張を高める作用を有することから、強い便秘を引き起こす。上記のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、モルヒネを投与された患者の強固な便秘をも改善、又は治療することができる。さらに、モルヒネ投与前に投与しておくことにより、便秘の誘発を予防ないしは抑制することができる。このように本発明の便秘予防又は改善剤は、自律神経系、特に副交感神経系を亢進ないしは刺激することから、ストレス緩和との関連が示唆される。
【００３３】
このβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの水溶液は低粘度であるため、摂取や除菌を行い易い点で有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）便秘の予防又は改善剤
本発明の便秘の予防又は改善剤は、オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来するβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを含むものである。このβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンは、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有し、かつ水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下のものである。上記粘度の下限値は通常２０ｃＰ（ｍＰａ・s）程度である。
【００３５】
本発明の便秘の予防又は改善剤は、特に上記β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを有効成分として含む。
オーレオバシジウム属微生物が生産するβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン
オーレオバシジウム属の微生物が生産するβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンは、菌体外に分泌されるために回収が容易であり、また水溶性である点で好ましいものである。オーレオバシジウム属の微生物は、分子量が１００万以上の高分子量のグルカンから分子量が数万程度の低分子のグルカンまでを培養条件に応じて生産する。
【００３６】
中でも、オーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)が生産するものが好ましく、オーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株、又はGM-NH-1A2株（独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センターにそれぞれFERM P-19285及びFERM P-19286として寄託済み）が生産するものが好ましい。GM-NH-1A1株及びGM-NH-1A2株は、オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）K-1株の変異株である。オーレオバシジウム属K-1株は、分子量２００万以上と１００万程度の２種類のβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを生産することが知られている。
【００３７】
また、オーレオバシジウム属細菌が生産するβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、通常、硫黄含有基を有するところ、K-1株の生産するβ−グルカンはスルホ酢酸基を有することが知られている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）,科学と工業,64,131-135（1990））。GM-NH-1A1株、及びGM-NH-1A2株が生産するβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンもスルホ酢酸基を有すると考えられる。オーレオバシジウム属微生物の中には、リン酸基のようなリン含有基、リンゴ酸基などを含むβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを生産する菌種、菌株も存在する。
【００３８】
GM-NH-1A1株及びGM-NH-1A2株は、後に実施例において示すようにメインピークが見かけ上５０〜２５０万の高分子量のβ−グルカン（微粒子グルカン）とメインピークが２〜３０万の低分子量のβ−グルカンの両方を生産する菌株である。この微粒子状グルカンは、一次粒子径が０．０５〜２μｍ程度である。
【００３９】
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの溶解度は、ｐＨ及び温度に依存する。このβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、ｐＨ３．５、温度２５℃の条件で２ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製しようとすると、その５０重量％以上が一次粒子径０．０５〜２μｍの微粒子を形成し、残部は水に溶解する。本発明において粒子径は、レーザー回折散乱法により測定した値である。
【００４０】
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが水溶液として製剤中に含まれている場合は、レシチンのような乳化剤や、環状デキストリンのような安定化剤を水溶液に添加することにより、微粒子をさらに安定化させることができる。
【００４１】
また、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンがオーレオバシジウム・プルランス由来のものである場合は、β-１，３結合／β-１，６結合の結合比は、１〜１．５程度、特に１．１〜１．４程度である。
本発明の便秘の予防又は改善剤に含まれるβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカン
本発明の便秘の予防又は改善剤に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、水溶液にしたときの粘度が、オーレオバシジウム属微生物が生産する天然型β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンより低い。この低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、好ましくは１０ｃＰ以下である。本発明において、粘度はＢＭ型回転粘度計で測定した値である。
【００４２】
この低粘度グルカンは、オーレオバシジウム属微生物が生産する天然型β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンと同じ一次構造を有する。具体的には、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである。
【００４３】
このグルカンがオーレオバシディウム・プルランス（例えばＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株）由来のものである場合、得られたβ−１，３−１，６−D−グルカンをエキソ型のβ−１，３−グルカナーゼ（キタラーゼ Ｍ、ケイアイ化成製）で加水分解処理すると、分解生成物としてグルコースとゲンチオビコースの遊離が確認できた。このこと及びNMRの積算比から、オーレオバシディウム・プルランス由来のβ−１，３−１，６−D−グルカンはβ−１，３結合の主鎖に対し、β−１，６結合でグルコ−スが１分子側鎖に分岐した構造で、１，３−結合主鎖に対する１，６−結合の側鎖分岐度は、５０〜１００％程度、特に５０〜９０％と推測された。
【００４４】
本発明の便秘の予防又は改善剤に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、金属イオン濃度が、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの固形分１ｇ当たり０．４ｇ以下であることが好ましく、０．２ｇ以下であることがより好ましく、０．１ｇ以下であることがさらにより好ましい。製剤中にβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが水溶液状態で含まれる場合は、金属イオン濃度は、水溶液の１００ｍｌ当たり１２０ｍｇ以下であることが好ましく、５０ｍｇ以下であることがより好ましく、２０ｍｇ以下であることがさらにより好ましい。
【００４５】
ここでいう金属イオンには、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、第３〜第５族金属イオン、遷移金属イオンなどが含まれるが、混入する可能性のある金属イオンとしては、代表的には、低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造において使用されるアルカリ由来のカリウムイオン、ナトリウムイオンなどが挙げられる。金属イオン濃度は、限外ろ過や透析により調整できる。金属イオン濃度が上記範囲であれば、水溶液状態で保存する場合や、水溶液状態で加熱滅菌する際に、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンのゲル化、凝集、沈殿が生じ難い。また、固形製剤においても、再溶解させる場合に凝集などが生じ難い。
【００４６】
このような低粘度β−１，３−１，６−D−グルカンは、以下に示す方法で得ることができる。
【００４７】
なお、ここでいう低粘度β−１，３−１，６−D−グルカンは、水溶液としたときの粘度が、天然型β−１，３−１，６−D−グルカンより低いことを意味し、本発明の便秘予防又は改善剤が低粘度β−１，３−１，６−D−グルカン水溶液を含むことは必ずしも意味していない。本発明の便秘の予防又は改善剤は、低粘度β−１，３−１，６−D−グルカンを固体状態で含んでいてもよく、又は水溶液のような液体ないしは流動状で含んでいてもよい。
オーレオバシジウム属のβ−１，３−１，６−D−グルカンの生産方法
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法は、周知である。例えば、これを生産する微生物の培養上清に有機溶媒を添加することによりβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを沈殿物として得ることができる。
【００４８】
また、オーレオバシジウム属の微生物を培養して、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる方法は種々報告されている。使用できる炭素源としては、シュークロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源を挙げることができる。
【００４９】
窒素源としては、硫酸アンモニウムや硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源を挙げることができる。場合によってはβ−グルカンの生産量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、更には鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類を添加するのも有効な方法である。
【００５０】
オーレオバシジウム属微生物を、炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加した培地で培養した場合、高濃度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産することが報告されている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）；科学と工業,64,131-135（1990）；特開平７−５１０８２号公報）。しかし、培地は、微生物が生育し、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産するものなら特に限定されない。必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加してもよい。
【００５１】
オーレオバシジウム属の微生物を上記培地で好気培養するための条件としては、１０〜４５℃程度、好ましくは２０〜３５℃程度の温度条件、３〜７程度、好ましくは３．５〜５程度のｐＨ条件が挙げられる。
【００５２】
効果的に培養ｐＨを制御するためにアルカリ、あるいは酸で培養液のｐＨを制御するのも得策である。更に培養液の消泡のために適宜、泡消剤を添加してもよい。培養時間は通常１〜１０日間程度、好ましくは1〜４日間程度も培養すればβ−グルカンを生産することが可能である。なお、β−グルカンの生産量を測定しながら培養時間を決めてもよい。
【００５３】
上記条件下オーレオバシジウム属の微生物を４〜６日間程度通気攪拌培養すると、培養液にはβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを主成分とするβ−グルカン多糖が０．１％から数％(w/v)含有されており、その培養液の粘度はＢＭ型回転粘度計（東機産業社製）により３０℃では数百ｃＰ([ｍＰａ・s])から数千ｃＰ（[ｍＰａ・s]）という非常に高い粘度を有する。この培養を遠心分離して得られる上清に例えば有機溶媒を添加することにより、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを沈殿物として得ることができる。
低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法
上記の高粘度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含む培養液を、常温で攪拌しながら、これにアルカリを添加すると、急激に粘度が低下する。
【００５４】
アルカリは、水溶性で、かつ医薬品や食品添加物として用いることができるものであればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液；あるいはアンモニア水溶液などを使用できる。アルカリは、培養液のｐＨが１２以上、好ましくは１３以上になるように添加すればよい。例えば水酸化ナトリウムを使用して培養液のｐＨを上げる場合は、水酸化ナトリウムの最終濃度が０．５％(w/v)以上、好ましくは１．２５％(w/v)以上になるように添加すればよい。培養液にアルカリを添加し、良く攪拌すると、瞬時に培養液の粘度が低下する。
【００５５】
次いで、アルカリ処理後の培養液から菌体などの不溶性物質を分離する。培養液の粘度が低いため、菌体を自然沈降させて上澄みを回収する方法（デカント法）、遠心分離、ろ紙あるいはろ布を利用した全量ろ過、フィルタープレス、更に膜ろ過（ＭＦ膜などの限外ろ過）などの方法で、容易に不溶性物質とグルカンとを分離できる。ろ紙あるいはろ布による全量ろ過の場合は、セライトなどろ過助剤を利用するのも一つの手段である。工業的にはフィルタープレスによる菌体除去が好ましい。
【００５６】
次いで、グルカンを含む溶液に酸を添加して中和する。中和は、不溶物の除去前に行ってもよい。酸は、医薬や食品添加物として使用できるものであればよく、特に限定されない。例えば、塩酸、燐酸、硫酸、クエン酸、リンゴ酸などを使用できる。酸の使用量は、溶液又は培養液の液性が中性（ｐＨ５〜８程度）になるような量とすればよい。即ち、中和はｐＨ７に合わせることを必ずしも要さない。
【００５７】
ｐＨ１２以上のアルカリ処理後、中和して得られるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が通常２００ｃＰ以下、場合によっては５０ｃＰ以下である。粘度は製造方法ないしは精製方法によって変動する。
【００５８】
アルカリ処理された低粘度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、中和しても粘度が高くなることがない。さらに、常温（１５〜３５℃）では、液性をｐＨが４を下回るような酸性にしても、粘度が高くなることがない。
【００５９】
また、培養上清をアルカリ処理、及び中和した後に、菌体などを除去するのに代えて、培養上清から菌体などを除去した後に、アルカリ処理、及び中和を行うこともできる。
【００６０】
得られるグルカン水溶液からグルカンより低分子量の可溶性夾雑物（例えば塩類など）を除去する場合は、例えば限外ろ過を行えばよい。
【００６１】
また、アルカリ処理、除菌した後、中和せずに、アルカリ性条件下で限外ろ過することもでき、これにより透明性、熱安定性、長期保存性に一層優れる精製β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが得られる。アルカリ性条件は、ｐＨ１０以上、好ましくは１２以上であり、ｐＨの上限は通常１３．５程度である。
【００６２】
このようにして得られる水溶液に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、乾燥させて固形製剤にする場合も、また水溶液のまま製剤として使用する場合も、一旦、水溶液から析出させることができる。β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの析出方法は、特に限定されないが、例えば、限外ろ過などにより濃縮してグルカン濃度を１ｗ／ｗ％以上にした水溶液に、エタノールのようなアルコールを、水溶液に対して容積比で等倍以上、好ましくは２倍以上添加することにより、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを析出させることができる。
【００６３】
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを低粘度化することにより、限外ろ過などによる濃縮を容易に行えることから、アルコール沈殿に使用するアルコール量を少なくすることができる。
【００６４】
固形製剤にする場合は、低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液を直接乾燥させてもよく、析出させたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを乾燥させてもよい。乾燥は、噴霧乾燥法、凍結乾燥法等公知の方法で行うことができる。
製剤
本発明の便秘の予防又は改善剤において、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、必要に応じて薬学的に許容される担体とともに適当な製剤とすることができる。このような担体として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、付湿剤等が挙げられる。また、酸化防止剤のような慣用の添加剤なども含まれていてよい。
【００６５】
製剤の形態は特に限定されず、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等のどのような形態であってもよい。アルカリ処理された低粘度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを使用する場合は、高濃度の水溶液を調製できることから、シロップ剤にする場合にも、１日に無理なく摂取できる量に有効量のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含ませることができる。
【００６６】
賦形剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖等の各種の糖類；バレイショデンプン、コムギデンプン、トウモロコシデンプン等の各種デンプン類、；結晶セルロース等の各種セルロース類；無水リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等の各種無機塩類等が挙げられる。
【００６７】
結合剤としては、公知のものを使用でき、例えば、結晶セルロース、プルラン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。
【００６８】
崩壊剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、デンプン、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００６９】
潤沢剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油などが挙げられる。
【００７０】
付湿剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、ココナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、大豆リン脂質、グリセリン、ソルビトール等が挙げられる。
【００７１】
製剤中に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの量は、投与対象又は患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、１日摂取量が１〜１０００ｍｇ程度、特に１０〜２００ｍｇ程度になるような量含まれていればよい。特に、モルヒネ投与により引き起こされる便秘のように強固な便秘の場合は、１日摂取量が１〜１０００ｍｇ程度、特に１０〜５００ｍｇ程度になるような量含まれていればよい。上記摂取量の範囲であれば、十分に便秘予防又は改善効果が得られるとともに、下痢のような副作用や毒性が現れるということがない。
【００７２】
１日１回投与する製剤である場合は、１日必要量が一つの製剤に含まれていればよく、例えば１日３回投与する製剤である場合は、１日必要量の３分の１が製剤に含まれていればよい。
【００７３】
また、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤のような固形製剤の場合は、製剤中にβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが０．１〜１００重量％程度、特に1〜５０重量％程度含まれていることが好ましい。特にモルヒネ投与患者の便秘のための固形製剤の場合は、製剤中にβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが０．１〜１００重量％程度、特に１〜５０重量％程度含まれていることが好ましい。
【００７４】
また、シロップ剤のような液体又は流動状の製剤の場合は、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが０．０１〜２重量％程度、特に０．０５〜０．５重量％程度含まれていることが好ましい。なお、液体又は流動状の製剤中のグルカンは一部が溶解していない場合もある。
【００７５】
上記範囲であれば、摂取し易い製剤量中に、便秘予防又は改善効果が十分に得られるとともに副作用や毒性が現れない程度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが含まれることになる。またシロップ剤の場合は、上記範囲であれば、飲み易い粘度のシロップ剤が得られる。
【００７６】
また、本発明の便秘の予防又は改善剤には、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンによる便秘予防又は改善効果を損なわない範囲で、便秘予防剤又は改善剤に通常含まれる成分や添加剤が含まれていてもよい。
投与対象
本発明の便秘予防又は改善剤は、便秘のヒトに好適に投与できる。この中には、便秘である以外は健康なヒトの他に、他の疾患を併発している患者も含まれる。特に、モルヒネを投与されることにより便秘になったヒトは好適な投与対象である。また、本発明の便秘の予防又は改善剤は、モルヒネ投与予定のヒトにも好適に投与することができ、モルヒネによる便秘の誘発を完全に又はある程度抑えることができる。さらに、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは安全な天然成分であることから、便秘になり易い生活環境の健常人も予防的に適時又は常時摂取することができる。
【００７７】
本発明の便秘の予防剤は、便秘を完全に予防する作用の他、便秘の発症をある程度抑える作用も有するものである。また、本発明の便秘の改善剤は、便秘症状を完全に回復する作用の他、便秘症状を緩和する作用も有する。
（ＩＩ）副交感神経刺激剤・ストレス緩和剤
上記説明したオーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来するβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンは、モルヒネ投与による便秘を解消することから、副交感神経を刺激しており、副交感神経刺激剤として使用することができる。また、副交感神経を刺激するためストレスを緩和することができ、ストレス緩和剤としても使用することができる。
【００７８】
前述したように、このβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンは、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが４．７ｐｐｍ及び４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有し、かつ水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下のものである。
【００７９】
投与対象は、交感神経亢進が悪影響を及ぼす種々の疾患に羅患しているヒトの他、ストレスを感じているヒトが好適である。また、上記グルカンは天然の安全な成分であることから、健常人が常時摂取することもできる。
（ＩＩＩ）飲食品組成物
本発明の飲食品組成物は、上記説明したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含む。この飲食品組成物は、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含むことから便秘を予防又は改善する作用、及び副交感神経を刺激しストレスを緩和する作用を有するため、栄養機能食品又は特定保健用食品のような保健機能食品として好適に使用できる。
【００８０】
従って、本発明の飲食品組成物は、便秘を予防又は改善するために使用される旨の表示、又は副交感神経を刺激するため、若しくはストレスを緩和するために使用される旨の表示が付されたものとすることができる。
【００８１】
本発明の飲食品組成物に含まれる飲食品の種類は特に限定されない。β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを添加できるものであれば、栄養ドリンク、ジュース、茶、スープのような各種飲料品はもちろんのこと、クッキー、飴、ガム、ゼリー、寒天、プリン、グミ、チョコレート、澱粉加工食品などいかなる飲食品でも用いることができる。パン、うどんのような麺類、ヨーグルトやチーズなどの乳製品、ドレッシングやマヨネーズなどの加工食品、嚥下用補助食品等も好適である。各飲食品の特性や目的に応じ、製造工程の適切な段階で配合すればよい。
【００８２】
本発明の飲食品組成物中には、１日摂取量が通常１〜１０００ｍｇ程度、好ましくは１０〜２００ｍｇ程度になるようにβ−１，３−１，６−グルカンが含まれていればよい。特に、モルヒネ投与により引き起こされる便秘のように強固な便秘の患者に与えるためのものである場合は、１日摂取量が１〜１０００ｍｇ程度、特に１０〜５００ｍｇ程度になる量のβ−１，３−１，６−グルカンが含まれていればよい。
【００８３】
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは人体に対して無毒性であるから、その添加割合に特に制限はないが、各飲食品の特性、呈味性あるいは経済性等を考慮して、固形、半固形又はゲル状食品の場合、その添加量は組成物全体量に対して通常０．０１〜５重量％程度、好ましくは０．０1%〜２重量％程度であればよい。ヨーグルトのような半固形状の食品も、食する上で流動性が求められない点で固形状食品に含まれる。上記の範囲であれば、無理なく摂取できる食品量中に、便秘の予防又は改善に有効な１日摂取量のβ−１，３−１，６−グルカンが含まれることになる。また、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの上記含有比率であれば、グルカンの溶解性が良好であり粘度が低く吸収され易い。
【００８４】
また同様の理由で、液体、流動状、又は半流動状の飲料組成物にβ−１，３−１，６−グルカンを含ませる場合のその含有量は、組成物全体に対して、０．０１〜５重量％程度が好ましく、０．０１〜２重量％程度がより好ましい。上記の範囲であれば、無理なく摂取できる食品量中に便秘の予防又は改善に有効な１日摂取量のβ−１，３−１，６−グルカンが含まれることになる。また、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの含有比率が上記範囲であれば、殺菌などの熱処理によってもゲル化や粘度上昇を起こす恐れがない。なお、飲料組成物中のグルカン濃度が高い場合は一部が溶けずに含まれる場合もある。
【００８５】
本発明の飲食品組成物には、本発明の効果を損なわない範囲で、食品分野で慣用の補助成分が含まれていて良い。このような補助成分として、例えばフラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、イソマルトースのようなオリゴ糖；ビフィドバクテリウム、ラクトバチラス、エンテロコッカス属のような乳酸菌；アガリクス、マイタケ、シイタケ、メシマコブ、チャーガ、ハナビラタケのようなキノコ類、またはその抽出物；α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンのようなシクロデキストリンや直鎖デキストリンおよび難消化デキストリン；クエン酸、リンゴ酸、ヒアルロン酸のような有機酸；トリプトファン、メチオニン、テアニン、GABA（γ‐アミノ酪酸）などのアミノ酸、β‐カロテン、ルテイン、アスタキサンチン、フコキサンチンなどのβ‐カロチノイド類、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンEのようなビタミン類；亜鉛、鉄、マグネシウム、セレン、クロム、銅、マンガン、モリブデン、ヨウ素のようなミネラル；ラクトフェリン；ローヤルゼリー；プロポリス；カテキン；ウコン；トレハロース；高麗ニンジン；ショウガ；紅花；イチョウ葉またはイチョウ葉エキス；アロエ；サイリウム；シャンピニオン；黒酢；各種香料などが挙げられる。
【００８６】
特に、β−１，３−１，６−D−グルカン０．０１〜５重量％(特に０．０１〜２重量％）程度と乳酸菌（中でも、殺菌乳酸菌粉末）、オリゴ糖、又は／及びアミノ酸をそれぞれ０．０１〜２重量％程度とを含む飲食品組成物が好ましい。この場合の飲食品組成物は、固形、半固形、ゲル状、液体状、流動状、半流動状のいずれの飲食品組成物であってもよい。
【００８７】
また、本発明の飲食品組成物は、一般の飲食品を主体とするものではなく、賦形剤又は担体等とともにβ−１，３−１，６−グルカンを錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などの形状に成形した、例えば固形のいわゆるサプリメント製剤(栄養補助製剤）であってもよい。賦形剤は製剤の項目で例示したものを使用できる。この場合のβ−１，３−１，６−グルカンの含有量は、組成物全体に対して、１０〜８０重量％程度が好ましく、１０〜５０重量％程度がより好ましい。
【００８８】
特に、β−１，３−１，６−D−グルカン１０〜８０重量％（特に１０〜５０重量％）程度と乳酸菌（中でも、殺菌乳酸菌粉末）、オリゴ糖、又は／及びアミノ酸をそれぞれ１〜１０重量％程度とを含むものが好ましい。
【００８９】
本発明の飲食品組成物は、便秘又は便秘気味のヒト、ストレスを感じているヒト、交感神経亢進による疾患に羅患しているヒトが必要時、又は日常的に摂取するのに好適である。また、モルヒネ投与患者又はモルヒネ投与予定患者が必要時、又は日常的に摂取することもできる。
実施例
次に実施例及び試験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（１）低粘度β−１，３−１，６−グルカンの調製
（１-1）β-グルカンの培養生産
後掲の表１に示す組成を有する液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の肩付きフラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った後、オーレオバシジウム  プルランス（Aureobasidium pullulans）GM-NH-1A1株（FERM P-19285）を同培地組成のスラントより無菌的に１白金耳植菌し、１３０ｒｐｍの速度で通気攪拌しつつ、３０℃で２４時間培養することにより種培養液を調製した。
【００９０】
次いで、同じ組成の培地２００Ｌを３００Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌し、上記のようにして得られた種培養液２Ｌを無菌的に植菌し、２００ｒｐｍ、２７℃、４０L／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。なお、培地のｐＨは水酸化ナトリウム及び塩酸を用いてｐＨ４．２〜４．５の範囲内に制御した。９６時間後の菌体濁度はＯＤ６６０ｎｍで２３ ＯＤで、多糖濃度は０．５％(w/v)で、置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
＜多糖濃度測定＞
多糖濃度は、培養液を数ｍｌサンプリングし、菌体を遠心分離除去した後、その上清に最終濃度が６６％(v/v)となるようにエタノールを加えて多糖を沈殿させて回収した後、イオン交換水に溶解し、フェノール硫酸法で定量した。
＜置換スルホ含量測定＞
同様にして菌体を除去した培養上清にエタノールを最終濃度が６６％となるように添加し、β-グルカンを沈殿回収した。その後、再度イオン交換水に溶解し、再度遠心分離後、その上清に最終濃度が０．９％になるように食塩を加えた後、再度６６％エタノールでβ−グルカンを回収した。このβ−グルカン回収精製操作を更に２回繰り返し、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ−グルカン粉末を得た。
【００９１】
このβ−グルカン粉末を燃焼管式燃焼吸収後、イオンクロマト法で組成分析した結果、Ｓ含量は２３９ｍｇ／ｋｇであり、この値から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
【００９２】
【表１】
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【００９３】
（１−２）アルカリ処理
上記のようにして得られた培養液の濃度をＢＭ型回転粘度計（東京計器製）を用いて、３０℃、１２ｒｐｍで測定したところ、１５００ｃＰ（(ｍＰａ・ｓ)）であった。測定に用いるロータは粘度にあわせて適当なものを選択した。
【００９４】
この培養液に水酸化ナトリウム最終濃度が２．４％(w/v)となるように２５％(w/w)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところ（ｐＨ１３．６）、瞬時に粘度が低下した。引き続いて５０％(w/v)クエン酸水溶液でｐＨ５．０となるように中和してから粘度を測定したところ、そのときの粘度（３０℃）は２０ｃＰ([ｍＰａ・s])であった。
【００９５】
次いで、この培養液にろ過助剤としてＫＣフロック（日本製紙社製）を１ｗｔ％添加し、薮田式ろ過圧搾機（薮田機械製）を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液（約２３０Ｌ）を得た。その多糖濃度は０．５％(w/v)で、ほぼ１００％の回収率であった。
（１−３）β−グルカン水溶液の脱塩
上記のβ−グルカン水溶液（培養ろ液）を０．３％に希釈後、限外ろ過（ＵＦ）膜（分子量カット５万、日東電工社製）を用いて脱塩を行い、最終的にナトリウムイオン濃度を２０ｍｇ／１００ｍｌに落とした後、５０％(w/v)クエン酸水溶液によりｐＨを３．５に調整した。
【００９６】
引き続いて、ホット充填用加熱ユニット（日阪製作所製）を用いて９５℃で、３分間保持することにより殺菌処理を行い、最終製品のβ−グルカン水溶液を得た。この時のβ−グルカンの濃度をフェノール硫酸法により測定したところ０．２２％(w/v)であった。また、培養液からのトータル収率は約７３％であった。
＜硫黄含有量の測定＞
また、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ-グルカン粉末を得た。本β-グルカンの組成分析結果からＳ含量は３３０ｍｇ／ｋｇであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は０．１２％であった。
＜結合状態の確認＞
また、脱塩を行った上記培養ろ液について、コンゴーレッド法によって、４８０ｎｍから５２５ｎｍ付近への波長シフトを確認することができたのでβ−１，３結合を含むグルカンを含有していることが証明された（K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67, 527-535 (1978)、今中忠行  監修, 微生物利用の大展開, 1012-1015, エヌ・ティー・エス（2002））。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.48/500μｇ多糖であった。
【００９７】
上記培養ろ液１５ｍｌを取り出し、３０ｍｌのエタノールを添加し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心して、沈殿する多糖を回収した。６６％エタノールで洗浄し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０分間遠心して、沈殿する多糖に２ｍｌのイオン交換水と、１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加撹拌後、６０℃、１時間保温して沈殿を溶解させた。次に-８０℃にて凍結後、一晩、真空凍結乾燥を行い、乾燥後の粉末を１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、２次元ＮＭＲに供した。
【００９８】
２次元ＮＭＲ（１３Ｃ−１Ｈ  ＣＯＳＹ ＮＭＲ）１０６ｐｐｍと相関関係を有する１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図１に示す。このスペクトルにおいて４．７ｐｐｍと４．５ｐｐｍ付近との２つのシグナルが得られた。
【００９９】
この結果、本β−グルカンがβ−１，３−１，６−Ｄグルカンであることが証明された（今中忠行  監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。それぞれの１Ｈ  ＮＭＲシグナルの積分比から、β−１，３結合／β−１，６結合の比は１．１５であることが判明した。
＜粒度測定＞
次に、レ−ザ回折/散乱式粒度分布測定装置(ＨＯＲＩＢＡ製ＬＡ−９２０)を用いて培養液の粒度を測定したところ、粒子としては０．３μｍと１００μｍ程度の大きさのところにピ−クが見られた。続いて、超音波を照射しながら、粒度測定を行うと、１００μｍのピ−クはみるみるうちに消失し、０．３μｍのピ−クが増え、最終的に０．３μｍのみとなった。超音波照射したときの培養液の粒度分布を図２に示す。
【０１００】
０．３μｍのピークはβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの一次粒子によるピークであり、１００〜２００μｍのピークはβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの一次粒子が凝集した二次粒子によるピークであると考えられる。
【０１０１】
また、二次粒子はマグネチックスタラ−による攪拌、軽い振とうでも同じように消失し、容易に砕けて一次粒子になることが確認された。よって、二次粒子は非常に緩い凝集(緩凝集状態)と考えられる。
＜分子量測定＞
また、東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））を用いて、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、溶解β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンとβ−１，３−１，６−Ｄグルカンの１次粒子とを含む溶液の分子量を測定したところ、溶解β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンに由来する２〜３０万のピークの低分子画分と、１次粒子に由来する見かけ上５０〜２５０万の高分子画分との二種類が検出された。分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
【０１０２】
水溶性β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンと微粒子とを分離するため、上記の微粒子画分と可溶性画分とを含むβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン溶液をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。このことから、高分子画分はβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの一次粒子や一次粒子が凝集した二次粒子に相当することが判明した。よって、水溶性β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの分子量は２〜３０万と考えられる。
【０１０３】
（２）粉末化グルカンの調製
（１）において、アルカリ処理および菌体除去処理により調製された微粒子β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含むβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液に、最終濃度が６６％(v/v)となるようにエタノールを添加して、多糖グルカンを沈殿させ、遠心分離法により回収した。次いで凍結乾燥法によりエタノールと水分を除去し、乾燥β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを得た。そのときの収率はエタノール沈殿前の全糖濃度と比較して９５％以上であった。
【０１０４】
次いで、得られた乾燥β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを最終濃度が０．３％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解分散後、前述したと同様にして東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ  ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））により０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルクロマトグラフィーを行い、分子量を測定したところ、得られた多糖の分子量は２〜３０万のピークの低分子画分と見かけ上５０〜２５０万の高分子画分の二種類からなることが判明した。ここで、分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
【０１０５】
一方、水溶性β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンと微粒子を分離するため、本法で調製したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液（微粒子と可溶化グルカンを含むもの）をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。よって、本法により得られたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを乾燥させても、再溶解させれば乾燥前のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンと同様の物理的挙動を再現することが実証された。
【０１０６】
（３）高純度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン粉末の製造
（１）において得られた培養液（多糖濃度０．５％（５ｍｇ／ｍｌ））９０Ｌを５０％クエン酸水溶液９ｋｇで中和後、濾過助剤（日本製紙ケミカル製粉末セルロ−スＫＣフロック）を１．８ｋｇプレコートした薮田式濾過圧搾機40D-4を通して、菌体を取り除いた。ろ液を限外濾過スパイラルエレメント（日東電工製ＮＴＵ３１５０−Ｓ４）で９Ｌまで濃縮した。本濃縮液を攪拌しながら、エタノール１８Ｌを加え、グルカン／エタノール／水スラリーを得た。スラリーの粘度はＢＭ型粘度計で２２ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。室温で３時間静置し、上澄み液（エタノール／水）約１７Ｌを取り除いた。残ったスラリーの粘度は４５ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。本濃縮スラリー１０Ｌを坂本技研型の噴霧乾燥装置R-3を用いて噴霧乾燥し、３６０ｇのβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン粉末を得た（回収率８０％）。得られたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの純度はＮＭＲスペクトルの解析の結果、９０％以上であった。
【０１０７】
（４）便秘予防・改善効果の検討
ヒトの便秘に対する効果
1)検体の調整
使用した本発明品のドリンク（検体）は以下のものである。β―１，３−１，６−グルカン水溶液（上記（３）の項目で得た高純度β―１，３−１，６−グルカン粉末０．２％、クエン酸０．８％）１L、アセスルファムK１００ｍｇ、レモンエッセンス０．５ｍｌからなる水溶液を調製した。この水溶液を加温状態で撹拌混合し、約８５℃で加温終了後、２０分間放置したものを１μｍフィルターを通した。このものを５０ｍｌ（β―１，３−１，６−グルカン１００ｍｇ）ずつ充填し、滅菌槽にて９０℃で３０分間滅菌した。
2)便秘に対する作用
便秘症状を有する他は健康な男女４０人（男性２９人、女性１１人）を対象に、前記検体に相当するドリンクをそれぞれ１回当り５０ｍｌ（（β―１，３−１，６−グルカン１００ｍｇ）を１日１回、連日１４日間服用させた。１４日間服用終了後、４０％の被験者に便通改善効果が得られた。
ラットのモルヒネ誘導性便秘に対する効果
低粘度化β―１，３−１，６−グルカンが、モルヒネにより誘発される便秘を抑制することを以下のようにして確認した。
1) 使用物質
低粘度化処理グルカンとして、上記（３）の項目で得た高純度β―１，３−１，６−グルカン粉末を蒸留水を用いて６ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液を調製したものを用いた。
【０１０８】
また、未処理グルカンについては、実施例の（1−1）に示したβ−グルカンの培養生産法に従ってβ−グルカン培養液を得た。ついで培養液を遠心分離操作により菌体を除去して、その上清に最終濃度が66％となるようにエタノールを添加して、多糖としてβ−グルカンを沈殿させ後、遠心分離操作により回収した。再度、得られたβ−グルカンを適当な水に溶解させた。上記に従って、エタノールによりβ−グルカンを沈殿させ回収し、凍結乾燥法により低粘度化未処理β−グルカンサンプルを得た。このβ―１，３−１，６−グルカンを蒸留水を用いて６０ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液に調製したものを用いた。
【０１０９】
塩酸モルヒネは、三共株式会社製の塩酸モルヒネを蒸留水を用いて２ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液に調製したものを用いた。
【０１１０】
色素のカルミンは、東京化成工業株式会社製カルミンを蒸留水を用いて２００ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液に調製したものを用いた。
2) 使用動物
Slc:SD系の雄ラットを6週齢で日本エスエルシー株式会社より購入し、2週間の検疫馴化飼育後、健康状態に異常の認められなかった動物（体重範囲：302〜347g）を試験に使用した。
【０１１１】
ラットはステンレススチール製金網５連ケージ（14 cm×24 cm×16 cm）に個別飼育し、温度：23±2℃、湿度：30〜80％、換気回数：12回／時間以上、照明時間：12時間（明期；午前６時30分〜午後６時30分）の環境の一定した動物飼育室（田辺製薬(株)加島研究２号館616号室）で、固形飼料（CRF-１、オリエンタル酵母工業(株)）および水道水の自由摂取下に飼育した。
3) ラットの個体識別および群分け方法
被験物質投与前に、ラットの体重を測定し、体重の平均値が各群でほぼ等しくなるように群分けした。ラットは個別にケージカードで識別した。
4) 試験方法
8週齢ラットを1群3〜10匹からなる９群に分けた。群構成を以下に示す。「n」は1群中のラットの数を示す。また、「mg/kg」はラットの体重１ｋｇ当たり単回投与されたβ―１，３−１，６−グルカンの重量を示す。
(群構成)：
第１群  無処置対照群                              n=10
第２群  モルヒネ対照群                           n=7
第３群  未処理グルカン300mg/kg群                 n=3
第４群  未処理グルカン30mg/kg +モルヒネ群         n=7
第５群  未処理グルカン300mg/kg +モルヒネ群        n=7
第６群  低粘度化処理グルカン30mg/kg群             n=4
第７群  低粘度化処理グルカン300mg/kg群            n=4
第８群  低粘度化処理グルカン30mg/kg +モルヒネ群    n=7
第９群  低粘度化処理グルカン300mg/kg +モルヒネ群   n=7
ラットへの投与液量はいずれの物質も5 mL/kg/単回とし、ラット用ゾンデを用いて経口投与した。即ち、
第１群（無処置対照群）には、通常の飲料水の摂取に加えて、蒸留水を1日1回連続５日間5 mL/kg/単回経口投与し、最終日には蒸留水投与の１時間後にカルミン5 mL/kgを経口投与した。
【０１１２】
第２群（モルヒネ対照群）には、通常の飲料水の摂取に加えて、蒸留水を1日1回連続５日間5 mL/kg/単回経口投与した後、最終日には蒸留水投与の１時間後に、モルヒネ10mg/kgとカルミン5 mL/kgとを同時に経口投与した。
【０１１３】
第３群（未処理グルカン300mg/kg群）には、未処理グルカンを1日1回連続５日間300mg /kg/単回となるように経口投与した後、最終日には未処理グルカン投与の１時間後に、蒸留水5 mL/kgとカルミン5 mL/kgとを同時に経口投与した。
【０１１４】
第４群（未処理グルカン30mg/kg +モルヒネ群)には、未処理グルカンを1日1回連続５日間30mg/kg/単回となるように経口投与した後、最終日には未処理グルカン投与の１時間後に、モルヒネ10mg/kgとカルミン5 mL/kgとを同時に経口投与した。
【０１１５】
第5群（未処理グルカン300mg/kg +モルヒネ群)は、第４群において、未処理グルカン投与量を300mg/kg/単回とした他は第4群と同様にした。
【０１１６】
第6群（低粘度化処理グルカン30mg/kg群）は、低粘度化処理グルカンを1日1回連続５日間30mg/kg/単回となるように経口投与した後、最終日には低粘度化処理グルカン投与の１時間後に、蒸留水5 mL/kgとカルミン5 mL/kgとを同時に経口投与した。
【０１１７】
第７群（低粘度化処理グルカン300mg/kg群）は、第６群において、未処理グルカン投与量を300mg/kg/単回とした他は第６群と同様にした。
【０１１８】
第８群（低粘度化処理グルカン30mg/kg +モルヒネ群）には、低粘度化処理グルカンを1日1回連続５日間30mg/kg/単回となるように経口投与した後、最終日には未処理グルカン投与の１時間後に、モルヒネ10mg/kgとカルミン5 mL/kgとを同時に経口投与した。
【０１１９】
第９群（低粘度化処理グルカン300mg/kg+モルヒネ群）は、第８群において、低粘度化処理グルカン投与量を300mg/kg/単回とした他は第８群と同様にした。
【０１２０】
各群ラットについて、赤色色素カルミンが便中に排泄されるまでの時間を測定し、第１群（無処置対照群）の糞排泄時間平均値（8.6時間）からの排泄時間の変化量を求めた。
5)結果
＜下痢の誘発の有無＞
図３に、第１群（無処置対照群）、第３群（未処理グルカン300mg/kg群）、第６群（低粘度化処理グルカン30mg/kg群）、及び第７群（低粘度化処理グルカン300mg/kg群）の糞排泄時間を平均値±標準偏差で示す。有意差検定には、一元配置分散分析後、Dunnett型多重比較検定を用いた（解析ソフト：StatView）。
【０１２１】
第１群（無処置対照群）の糞排泄時間は8.6±0.7時間であった。第６群（低粘度化処理グルカン30 mg/kg群）、第７群（低粘度化処理グルカン300mg/kg群）、及び第３群（未処理グルカン300mg/kg群）は、それぞれ9.4±0.8時間、8.1±0.9時間、及び7.7±0.3時間で、いずれも無処置対照群との間に有意差は認められなかった。即ち、低粘度化処理グルカンおよび未処理グルカン投与による糞排泄時間への影響は認められなかった。
【０１２２】
このことから、いずれのグルカンも下痢を引き起こさないことが分かる。
＜モルヒネによる便秘の予防＞
図４に、第２群（モルヒネ対照群）、第４群（未処理グルカン30mg/kg +モルヒネ群）、第５群（未処理グルカン300mg/kg +モルヒネ群）、第８群（低粘度化処理グルカン30mg/kg +モルヒネ群）、第９群（低粘度化処理グルカン300mg/kg +モルヒネ群）について、第１群（無処置対照群）からの糞排泄時間変化量を平均値±標準偏差で示す。有意差検定には、一元配置分散分析後、Dunnett型多重比較検定を用いた（解析ソフト：StatView）。
【０１２３】
図４から明らかなように、第２群（モルヒネ対照群）と第４群（未処理グルカン30mg/kg +モルヒネ群）及び第５群（未処理グルカン300mg/kg +モルヒネ群）との間には、有意差は認められなかった。一方、第２群（モルヒネ対照群）に比べて、第８群（低粘度化処理グルカン30mg/kg +モルヒネ群）及び第９群（低粘度化処理グルカン300mg/kg +モルヒネ群）では、排泄時間変化量が有意に小さかった。
【０１２４】
詳述すれば、第１群（無処置対照群）の糞排泄時間8.6±0.7時間に対して、モルヒネ10mg/kgの経口投与により第２群（モルヒネ対照群）の糞排泄時間は12.5±0.5時間となり、約4時間の延長がみられた。
【０１２５】
このモルヒネによる排泄時間の延長に対して、低粘度化処理グルカンの30 mg/kg/単回および300mg/kg/単回の5日間連続経口投与による糞排泄時間の延長はそれぞれ2.6±0.5時間および2.8±0.4時間となり、ともにモルヒネ単独投与よりも糞排泄時間を有意に短縮した。
【０１２６】
一方、未処理グルカンの30 mg/kg/単回および300mg/kg/単回の5日間連続経口投与による糞排泄時間の延長はそれぞれ4.5±0.5時間および4.2±0.4時間となり、モルヒネ単独投与による糞排泄時間の延長と有意差は認められなかった。
【０１２７】
モルヒネによる糞排泄時間の延長のメカニズムは、腸管神経叢でのアセチルコリンの遊離抑制（ＮＥＷ薬理学（改訂第３版）、p355〜357、1997、田中千賀子、加藤隆一編、南江堂；臨床薬理学、麻薬性鎮痛薬および関連薬、p327、1981、笹征史、金芳堂）、腸管壁からのセロトニン遊離促進による腸管平滑筋の緊張亢進（ＮＥＷ薬理学（改訂第３版）、p440〜451、1997、田中千賀子、加藤隆一編、南江堂）などによる腸管運動の抑制によると考えられている。グルカンを低粘度化することにより、モルヒネの上記作用に拮抗する作用が発現したと考えられる。
【０１２８】
この結果、低粘度化処理グルカンはラットのモルヒネ誘発腸管運動抑制に対して拮抗作用を有することが分かる。
【０１２９】
以上のヒト及びラットを用いた試験結果から明らかなように、オーレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）由来の細胞外分泌成分であるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含む本発明品は便通予防・改善に顕著な効果を示した。
（５）飲食品組成物の処方例
処方例１（クッキー）
粉末β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン  1重量％
殺菌乳酸菌末                          0.2重量％
カテキン                              1重量％
クッキー                              残量
処方例２（サプリメント）
粉末β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン  10重量％
コラーゲンペプチド                    42重量％
ヒアルロン酸                          0.06重量％
殺菌乳酸菌末                          １重量％
ビタミンC                             10重量％
ビタミンB2                              0.03重量％
ビタミンB6                              0.03重量％
賦形剤（デンプンなど）                   残量
処方例３（サプリメント）
粉末β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン   1重量％
コラーゲンペプチド                     42重量％
ヒアルロン酸                            0.06重量％
ビタミンC                              10重量％
ビタミンB2                             0.03重量％
ビタミンB6                              0.03重量％
ナイアシン                              0.15重量％
賦形剤（デンプンなど）                  残量
処方例４（ドリンク剤）
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液
（0.2重量％β‐グルカン水溶液）        61.5重量％
殺菌乳酸菌末                            0.03重量％
ミルクオリゴ糖                          0.8重量％
ラクトフェリン                          0.09重量％
甘味料（スクラロース）                  0.03重量％
クエン酸                                0.22重量％
香料                                    0.37重量％
水                                       残部
処方例４（ドリンク剤）
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液
（0.2重量％β‐グルカン水溶液）        61.5重量％
殺菌乳酸菌末                            0.03重量％
テアニン                                0.8重量％
GABA                                    0.09重量％
甘味料（スクラロース）                  0.03重量％
クエン酸                                0.22重量％
香料                                    0.37重量％
水                                       残部
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】β−１，３−１，６−グルカンの２次元ＮＭＲ（１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ  ＮＭＲ）スペクトルを示す。
【図２】β−１，３−１，６−グルカンの超音波照射後の粒度分布（メジアン径０．２３μｍ）を示す。
【図３】β―１，３−１，６−グルカンのラットの糞排泄時間に与える影響を示す図である。
【図４】モルヒネにより引き起こされる糞排泄時間の延長に対するβ―１，３−１，６−グルカンの影響を示す図である。
【図１】
2007099752.tif 000004
【図２】
2007099752.tif 000005
【図３】
2007099752.tif 000006
【図４】
2007099752.tif 000007