(57)【要約】      （修正有）【課題】高アルカリ側で増殖が可能で、かつインジゴ還元能のより優れた微生物を提供すること。【解決手段】生育pHがpH 10〜pH 12で、インジゴ還元能を有するアルカリバクテリウム  ポリゴナムレデュセンス（Alkalibacterium polygonumreducens）に属するＡ１１株である微生物を提供する。また、合成インジゴを含有する生育培地、又は天然藍から調製した「すくも」を含有する発酵建液に、該微生物を接触させるインジゴの還元方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生育pHがpH 10〜pH 12で、インジゴ還元能を有するアルカリバクテリウム  ポリゴナムレデュセンス（Alkalibacterium polygonumreducens）に属する微生物。
【請求項２】
アルカリバクテリウム  ポリゴナムレデュセンス（Alkalibacterium polygonumreducens）に属する微生物が、アルカリバクテリウム  ポリゴナムレデュセンス（Alkalibacterium polygonumreducens）A11T株(FERM P-20596)である請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の微生物の菌体処理物を含有する、インジゴ還元用組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の微生物の菌体又は菌体処理物の固定化物を含有する、インジゴ還元用組成物。
【請求項５】
合成インジゴを含有する生育培地、又は天然藍から調製した「すくも」を含有する発酵建液に、請求項１又は２に記載の微生物を接触することを特徴とする、インジゴの還元方法。
【請求項６】
合成インジゴを含有する生育培地、又は天然藍から調製した「すくも」を含有する発酵建液に、請求項３又は４に記載のインジゴ還元用組成物を接触することを特徴とする、インジゴの還元方法。
【請求項７】
天然藍から調製した「すくも」を含有する発酵建液が、合成インジゴをさらに添加したものである、請求項５又は６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規インジゴ還元微生物及びその利用に関する。より詳細には、本発明は、pH 10〜pH 12の高アルカリ側で増殖が可能で、かつインジゴ還元能を有する新規なインジゴ還元好アルカリ性微生物及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、インジゴによる染色は、(i) 天然藍、すなわち植物の蓼藍（たであい）の葉を発酵させることによって調製した「すくも」に小麦ふすまや灰汁を入れた液（発酵建液）を発酵させる方法（発酵建）、(ii) (i)の発酵建液に化学合成した合成インジゴを添加する方法（割建）、(iii) 藍から調製した「すくも」及び合成インジゴをハイドロサルファイトで還元する化学建（ハイドロ建）による方法によって調製した染液に布を浸漬することによって行なわれている。
【０００３】
このうち、(i)の発酵建による方法や、(ii) 発酵建液に合成インジゴを加える方法により染色した製品は、関与する微生物の作用により、より優美にして鮮明な色調が得られ、また、(iii)の化学建による方法に比較して耐水性が強い、変色・褪色がないなど多くの利点を有している。しかしながら、これらの方法はいずれも発酵に長時間を要すこと、管理が非常に難しく相当の経験がないと建てることができないという欠点がある。従って、よりインジゴ還元能の優れた微生物を単離することができれば、そのような微生物を上記発酵建液に添加することにより、大幅に日数の短縮が可能となるばかりではなく、鮮明な色彩、深淵な色調、強い耐水性をもった商品を得ることが期待できる。
【０００４】
これまで、インジゴの微生物還元に関する特許としては、高原らによる「合成藍の微生物還元法」がある（特許文献１）。高原らは研究論文（非特許文献１）の中で、藍の発酵建液中に存在するインジゴ還元能を有する微生物を単離し、バチルス（Bacillus）属の新種、すなわちバチルス  アルカリフィラス（Bacillus alkaliphilus）を提案したが、現在では本微生物は何処にも保管されていない。さらに本微生物は藍玉（蓼藍から調製されたすくもを玉状にしたもの）の中に含まれる7種類のアミノ酸からなるペプチドが必須で、これらのペプチドが含まれていない培地では増殖できないと報告されている。
【０００５】
また1999年パデン（A. N. Padden）らは、大青（たいせい）というアブラナ科の植物の葉を大樽の中で発酵させた発酵液からインジゴ還元能を有する偏性嫌気性細菌クロストリジウム  イサチジス（Clostridium isatidis）を単離したことを報告している（非特許文献２）。しかし大青は蓼藍とは品種が異なっていること、本微生物は偏性嫌気性であるためその培養が困難であること、通常のインジゴの最適還元条件であるpH 10以上での培養が良好ではないなど問題が多い。このように、これまでインジゴ還元能を有する微生物は単離されているが、それらの微生物を用いて実際に発酵建が行なわれている例はいまだない。
【０００６】
一方、本発明者らは、蓼藍から調製した「すくも」を含有する発酵建液からpH 10〜pH 12で培養でき、インジゴ還元能を有する微生物アルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）IDR2-2T株（FERM P-19648)（特許文献２、非特許文献３）及びアルカリバクテリウム  イブリエンセ（Alkalibacterium iburiense）M3T、41A及び41C株を見い出している（非特許文献４）。
【０００７】
【特許文献１】特許第124188号（発行日：1959.5.14）
【特許文献２】特開2005-270028（公開日：2005.10.6）
【非特許文献１】「醗酵工学雑誌」第40巻、第2号、pp. 77−80（1962年）
【非特許文献２】インターナショナル  ジャーナルオブ  システマチック  バクテリオロジー、第49巻、pp. 1025−1031（1999年）
【非特許文献３】インターナショナル  ジャーナルオブ  システマチック  アンド  エボリューショナル  マイクロバイオロジー、第54巻、pp. 2379−2383（2004年）
【非特許文献４】インターナショナル  ジャーナルオブ  システマチック  アンド  エボリューショナル  マイクロバイオロジー、第55巻、pp. 1525−1530（2005年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前述のように、「すくも」を用いる発酵建や、「すくも」と合成インジゴを併用する割建は、化学建に比べて耐水性、耐退色性に優れるものの、工業的、実用的なレベルで実施できるには至ってないのが現状である。
【０００９】
従って、本発明の目的は、インジゴ還元能のより優れた微生物を単離し、これを用いてインジゴの還元をより短期間に効率的に行うことにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討を行った結果、徳島県板野郡藍住町で調製された発酵建液からインジゴ還元能に優れた微生物を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(1)  生育pHがpH 10〜pH 12で、インジゴ還元能を有するアルカリバクテリウム  ポリゴナムレデュセンス（Alkalibacterium polygonumreducens）に属する微生物。
(2)  アルカリバクテリウム  ポリゴナムレデュセンス（Alkalibacterium polygonumreducens）に属する微生物が、アルカリバクテリウム  ポリゴナムレデュセンス（Alkalibacterium polygonumreducens）A11T株(FERM P-20596)である（1)に記載の微生物。
(3)  (1)又は(2)に記載の微生物の菌体処理物を含有する、インジゴ還元用組成物。
(4)  (1)又は(2)に記載の微生物の菌体又は菌体処理物の固定化物を含有する、インジゴ還元用組成物。
(5)  合成インジゴを含有する生育培地、又は天然藍から調製した「すくも」を含有する発酵建液に、(1)又は(2)に記載の微生物を接触することを特徴とする、インジゴの還元方法。
(6)  合成インジゴを含有する生育培地、又は天然藍から調製した「すくも」を含有する発酵建液に、（3）又は（4）に記載のインジゴ還元用組成物を接触することを特徴とする、インジゴの還元方法。
(7)  天然藍から調製した「すくも」を含有する発酵建液が、合成インジゴをさらに添加したものである、(5)又は(6)に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、新規なインジゴ還元微生物、及び該微生物を用いたインジゴの還元方法が提供される。本発明のインジゴ還元微生物は、合成インジゴ単体のみならず、天然藍から調製した「すくも」を含有する培養液（発酵建液）及びそれに合成インジゴを加えた培養液に対しても優れた還元能を示す。従って、本発明のインジゴ還元微生物の使用により、発酵建液を染色可能な状態にするための日数が大幅に短縮できるほか、生成した還元型インジゴで耐退色性に優れた繊維の染色が可能となる。また、本発明のインジゴ還元微生物は好アルカリ性であるので、高アルカリ側でのインジゴの還元が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．本発明のインジゴ還元微生物
本発明によれば、生育pHがpH 10〜pH 12で、インジゴ還元能を有するアルカリバクテリウム  ポリゴナムレデュセンス（Alkalibacterium polygonumreducens）に属する微生物が提供される。このような微生物の例としては、本発明者らが蓼藍から調製した「すくも」を含有する発酵建液より単離したアルカリバクテリウム  ポリゴナムレデュセンス（Alkalibacterium polygonumreducens）A11T株（以下、「A11T株」という）を挙げることができる。 また、本発明のインジゴ還元微生物には、上記のA11T株の変異種・変異株も含まれる。
【００１４】
A11T株の分離は、ペプトン／酵母エキス／合成インジゴ／無機塩類／アルカリを含むPYA培地及び強化クロストリジウム寒天（RCA）培地を使用し、PYA培地で還元型インジゴを生成させ、その還元能を指標として選択した。
【００１５】
本明細書において、「インジゴ」とは、化学的に合成された合成インジゴのみならず、天然インジゴのいずれをも含む。天然インジゴとしては、インジゴ成分を含有している植物（蓼藍、大青、琉球藍、インド藍など）由来のインジゴ、微生物由来インジゴが挙げられる。
【００１６】
A11T株の菌学的性質は、次のとおりである。
〔１〕形態学的性質
（１）グラム染色：陰性（性質は陽性、染色は陰性）
（２）芽胞：無し
（３）運動性：有（弱い）
（４）菌形：桿菌
〔２〕培地における培養特性
色調はクリームホワイトであり、コロニーの形状は円形であり、コロニーの表面は平滑である。
〔３〕化学分類学的特性
ＤＮＡのＧ＋Ｃモル含有量は４７．１％である。
〔４〕生理・生化学的特性
カタラーゼ試験：陰性
オキシダーゼ試験：陰性
アミノペプチダーゼ試験：陰性
各pHにおける培養
10：＋
11：＋
12：＋
各温度における培養
10℃：−
15℃：±
20℃：＋
30℃：＋
40℃：＋
45℃：−
各炭素源の資化性
D-アラビノース：      ＋
D-キシロース：        ＋
D-グルコース：        ＋
D-グルコース６リン酸：−
D-セロビオース：      ＋
酵母エキス：          ＋
【００１７】
A11T株は、D-アラビノース、D-キシローズ、D-グルコース、マンニトール及びシュークロースのいずれからも酸を産生しない。
【００１８】
A11T株のDNAを抽出し、PCR法により16S rRNA遺伝子を増幅し、増幅して得られた16S rRNA遺伝子の塩基配列をオートシークエンサーで解析し、ブラストサーチにより類似した塩基配列を調べた。類似した塩基配列と多重アラインメントを取り、得られた結果に基づいて近隣結合法（neighbor-joining）により系統樹を作成したところ、A11T株はアルカリバクテリウム（Alkalibacterium）属細菌に分類されることが判明した。作成した系統樹を図１に示す。図１は、Alkalibacterium polygonumreducens A11T株の16S rRNA遺伝子に基づく系統的位置を示す図であり、系統樹内の数字はブートストラップ値が500以上を示す。バーは、0.1 Kuncユニットを示す。
【００１９】
A11T株はアルカリバクテリウム  オリボアプロリテイカス（Alkalibacterium olivoaprovliticus）と98%、アルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）IDR2-2T株とは97%の高い相同性が示された。
【００２０】
上記16S rRNA遺伝子の塩基配列における相同性において相同性の高かったアルカリバクテリウム  オリボアプロリテイカス（Alkalibacterium olivoaprovliticus）及びアルカリバクテリウム  サイクラルカリフィラス（Alkalibacterium psychralcaliphilus）IDR2-2T株について、それらとのDNAの相同性を比較するためA11T株からDNAを抽出し、A11T株のDNAをフォトビオチンでラベルしプローブを作成し、ブラックマイクロプレートに被検DNAを固定し、相同性を蛍光測定により算出した。その結果、A11T株はAlkalibacterium olivoaprovliticus及びAlkalibacterium psychralcaliphilus IDR2-2T株とそれぞれ18.9%及び36.3%の相同性を示した。DNA−DNA相同性試験において70%以上であると同一種と考えられるが、A11T株はAlkalibacterium属に属する新種であると判断した。種名である「ポリゴナムレデュセンス（polygonumreducens）」は、蓼藍（ポリゴナム；蓼藍の属名、語源はギリシャ語）を還元する（レジュセンス）に由来する。
【００２１】
上記A11T株は、2005年7月15日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IPOD）（茨城県つくば市東１−１−３）に受託番号FERM P-20596として寄託されている。
【００２２】
２．インジゴの還元法
上記のインジゴ還元微生物は、合成インジゴを直接還元することができるほか、「すくも」を含有する発酵建液中のインジゴや、該インジゴと合成インジゴの混合物も同様に還元することができる。
【００２３】
従って、本発明のインジゴ還元方法は、合成インジゴを含有する生育培地、又は天然藍から調製した「すくも」を含有する発酵建液に、上記のインジゴ還元微生物を接触することより実施することができる。合成インジゴ単独を還元する場合は、インジゴ還元微生物が生育可能な適当な生育培地で接触を行えばよく、「すくも」を含有する発酵建液中のインジゴや、該インジゴと合成インジゴの混合物を還元する場合は、発酵建液中で接触を行えばよい。ここで、「接触」とは、インジゴ還元微生物を前記生育培地又は発酵建液に添加し、一定時間培養することを意味する。インジゴ還元微生物の生育培地又は発酵建液への添加量は特に制限はなく、生育培地又は発酵建液中のインジゴを還元できる量であればよい。また、上記培養は、例えば、20〜40℃の範囲で、24〜120時間、行えばよい。生育培地又は発酵建液のpHは10〜12が好ましい。同範囲内でpHを低めにすると菌の繁殖が促進されて速く建つが、pHが10より低いと雑菌が入り腐敗しやすく、またpHが12より高いと菌の活動が抑制され、時間がかかるので好ましくない。
【００２４】
また、本発明のインジゴ還元微生物は、その菌体処理物を含有するインジゴ還元用組成物として用いてもよい。ここで「菌体処理物」とは、菌体破砕物、培養物、又は培養物（菌体、培養上清を含む）から抽出した酵素などをいい、その形態としては、液状製剤や粉末製剤が挙げられる。
【００２５】
液状製剤は、例えば、本発明のインジゴ還元微生物を培養し、この培養液を遠心分離し、菌体を回収し、pH10に調整した生理食塩水を加えて適当な濃度となるように懸濁することによって調製できる。また、必要に応じてpH調整剤等を加えてもよい。
【００２６】
粉末製剤は、例えば、本発明のインジゴ還元微生物を培養し、この培養液を凍結乾燥等によって乾燥することよって調製できる。また、培養液から菌体を遠心分離によって回収し、pH 10に調整した生理食塩水や新鮮な培地と懸濁した後、凍結乾燥等によって乾燥してもよい。また、凍結乾燥前にpH調整剤等を加えてもよい。
【００２７】
本発明のインジゴ還元用組成物は、上記インジゴ還元微生物の菌体又は菌体処理物を固相担体に固定して製造することもできる。インジゴ還元微生物の菌体又は菌体処理物を固定するための固相担体としては、微生物の固定に使用できるものであればいずれでも良く、特に限定されるものではないが、例えば、光硬化性樹脂、ウレタンプレポリマー、エポキシ樹脂、寒天、キトサン、アルギン酸、活性炭、珪藻土セラミック多孔体等が挙げられる。また、このような固相担体の形状としては、球状又は円柱等が好適であり、球状の場合、粒径は好ましくは0.3〜2.8 mm程度であり、さらに好ましくは0.3〜1.2 mm程度である。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例にその技術範囲が限定されるものではない。なお、以下の実施例において%は、特に断りのない限り質量%を表す。
【００２９】
（実施例１）
徳島県板野郡藍住町の「藍の館」で調製された天然蓼藍を原料としたインジゴを含む発酵建液を、インジゴ還元微生物を単離するための材料として用いた。
【００３０】
インジゴ還元能の優れた微生物を取得するための集積培養には、PYA培地 [PY培地（ペプトン 8 g；酵母エキス 3 g；合成インジゴ 0.1 g；K2HPO4 1 g；EDTA 3.5 mg；ZnSO4・7H2O 3 mg；FeSO4・7H2O 10 mg；MnSO4・nH2O 2 mg；CuSO4・5H2O 0.1 mg；Co(NO3)2・6H2O 2 mg；H3BO3 1 mg；蒸留水 900 ml）900ml及びpH 10に調整するためのアルカリ緩衝液（1 M のNaHCO3／Na2CO3）100 mlをそれぞれ別滅菌し、滅菌後混合したもの]を用いた。
【００３１】
また、集積培養で得られたインジゴ還元微生物の単離には、アルカリ−RCA培地 [RCA培地（Reinforced Clostridial Agar培地：シグマ）900 ml及びpH 10に調整するためのアルカリ緩衝液（1 MのNaHCO3／Na2CO3）100 mlをそれぞれ別滅菌し、混合したもの]を、シャーレに分注し固化してインジゴ還元微生物単離用培地とした。
【００３２】
まず、インジゴ還元微生物を取得するためPYA培地100 mlを入れた三角フラスコ（100ml容）に、前記発酵建液5 mlを加え、さらに別途滅菌した流動パラフィン15mlを加え、27℃で静置培養を行った。微生物によりインジゴ還元が行なわれたのを確認後、この培養液を5 mlとり、PYA培地100 mlを入れた別の三角フラスコ（100ml容）に加えた。このような操作を5度行い、インジゴ還元能の優れた微生物を選別した。
【００３３】
合成インジゴは水に不溶性の粉末で培養前にはフラスコの底に沈んでいるが、微生物により還元されると沈殿していたインジゴは可溶化し、培養液中に溶け、インジゴの還元が進むにつれて、培養液の色は深緑色から緑色に変化する。従って、上記のインジゴ還元能の優れた微生物の選別は、培養液の色の変化（深緑又は緑色への変化）を指標に行った。
【００３４】
上記インジゴ還元微生物を単離するため、インジゴ還元能の優れた微生物を含む培養液を１白金耳採り、上記アルカリ−RCA培地に画線（接種）した。さらにそれらを嫌気ジャーに移し、ジャー内部をアルゴンガスで置換後、27℃で培養を行った。そして5日間培養後に単一のコロニーを採取し、再度アルカリ−RCA培地に画線、単一コロニーを生成させた。この単離操作を５度繰り返し、インジゴ還元能の優れた微生物を単離した。
【００３５】
得られた単離微生物のインジゴ還元能をチェックするため、インジゴ0.01%を含むアルカリ−RCB培地 [RCB培地（Reinforced Clostridial Broth培地：シグマ）90mlをオートクレ−ブで滅菌後、アルカリ緩衝液（1MのNaHCO3／Na2CO3）10mlを加えpH10に調製したもの] 100mlの入った三角フラスコに本微生物菌体を接種後、さらに別途滅菌した流動パラフィン15mlを加え、27℃で静置培養を行い、培養液が深緑色又は緑色へ変化することを観察した。
【００３６】
このようにして得られた単離微生物をA11T株と命名した。このA11T株は独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号FERM P-20596として寄託されている。
【００３７】
（実施例２）
実施例１で示したアルカリ−RCA培地をシャーレに分注して固化したプレートに、アルカリバクテリウム  ポリゴナムレデュセンス（Alkalibacterium polygonumreducens）A11T株を無菌的に１白菌耳接種し、27℃で5日間静置培養を行った。得られた培養物から菌体を分離し、この菌体をインジゴ還元用組成物とした。
【００３８】
（実施例３）
実施例１で示したアルカリ−RCA培地の斜面（スラント）を作成し、このスラントにアルカリバクテリウム  ポリゴナムレデュセンス（Alkalibacterium polygonumreducens）A11T株を無菌的に１白菌耳接種し、27℃で5日間静置培養を行った。得られた培養物から菌体を分離し、この菌体をインジゴ還元用組成物とした。
【００３９】
（実施例４）
アルカリ−RCB培地 [RCB培地（Reinforced Clostridial Broth培地：シグマ）225 mlを肩付きフラスコ(500ml容)に入れてオートクレーブで滅菌後、アルカリ緩衝液（1MのNaHCO3／Na2CO3）25mlを加えpH10に調整したもの]に、アルカリバクテリウム  ポリゴナムレデュセンス（Alkalibacterium polygonumreducens）A11T株を無菌的に１白菌耳接種し、27℃で2日（約48時間）振とう培養（120往復）を行った。得られた培養液をそのまま、或いはこの培養液を遠心分離（6,000rpm,30分間）にかけ集菌したものをインジゴ還元用組成物とした。
【００４０】
（実施例５）
アルカリ−RCB培地 [RCB培地（Reinforced Clostridial Broth培地：シグマ）90 mlを三角フラスコ(100ml容)に入れてオートクレ−ブで滅菌後、アルカリ緩衝液（1MのNaHCO3／Na2CO3）10mlを加えpH10に調整したもの]に、実施例２で得られたインジゴ還元用組成物を加え、さらに別途滅菌した流動パラフィン15mlを加え、培地が微好気あるいは嫌気状態になるように調整し、27℃で静置培養を行った。培養1日目で培養液の色が変化し始め、5日目には培養液の色は深緑色に変化し、インジゴの還元が完全に行われたことが確認できた。
【００４１】
さらに、上層の流動パラフィンを培養フラスコから除いた後、200ml容のビーカーに移し一般に使われている発酵建液と同様に布切れの染色を試みたところ、同様の染色結果が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】アルカリバクテリウム  ポリゴナムレデュセンス（Alkalibacterium polygonumreducens）A11T株の16S rRNA遺伝子に基づく系統的位置を示す図である。系統樹上の数値は1000回繰り返しによるbootstrap values が500以上を示している。バーは、0.1 Kuncユニットを示す。
【図１】
2007110913.tif 000002