(57)【要約】【課題】  ＩＬ−１０遺伝子および／またはＴＮＦ−α遺伝子の遺伝子多型を検出する方法を提供すること、さらに該遺伝子多型を指標として長寿の素因の存在を判定する方法を提供することをその主な課題とする。【解決手段】  ＩＬ−１０遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子から選ばれる、（ａ）ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−８１９位の多型、（ｂ）ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−５９２位の多型、（ｃ）ＴＮＦ−α遺伝子の塩基番号−１０３１位の多型、のうち１種または２種以上の遺伝子多型を検出し、これを指標として長寿の素因の存在を判定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１０遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子から選ばれる１種または２種以上の遺伝子多型を検出し、これを指標として長寿の素因の存在を判定する方法。
【請求項２】
ＩＬ−１０遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子から選ばれる１種または２種以上の遺伝子多型の存在を指標として長寿の素因を判定するための、当該遺伝子の遺伝子多型を検出する方法。
【請求項３】
検出する遺伝子多型が、下記（ａ）−（ｃ）から選ばれる少なくとも１つである請求項1または２に記載の方法。
（ａ）ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−８１９位の多型
（ｂ）ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−５９２位の多型
（ｃ）ＴＮＦ−α遺伝子の塩基番号−１０３１位の多型
【請求項４】
検出する遺伝子多型が、下記（ａ）−（ｃ）から選ばれる少なくとも１つである請求項１または２に記載の方法。
（ａ）ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−８１９位がＴ／Ｔである遺伝子多型
（ｂ）ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−５９２位がＡ／Ａである遺伝子多型
（ｃ）ＴＮＦ−α遺伝子の塩基番号−１０３１位がＴ／Ｔである遺伝子多型
【請求項５】
遺伝子多型の検出が、Ｔｅｔｒａ−ｐｒｉｍｅｒ  ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法から選ばれる少なくとも１つの方法により行われる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
請求項1〜５に記載の方法において、ＩＬ−１０遺伝子および／またはＴＮＦ−α遺伝子にハイブリダイズすることができる遺伝子多型検出用プライマーまたはプローブとしてのオリゴヌクレオチドであって、下記（ａ）−（ｃ）からから選ばれるいずれか少なくとも1つを含むように設定されたDNAに対応する部分オリゴヌクレオチド。
（ａ）ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−８１９位の多型
（ｂ）ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−５９２位の多型
（ｃ）ＴＮＦ−α遺伝子の塩基番号−１０３１位の多型
【請求項７】
ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−８１９位における多型を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１から配列番号４で示される塩基配列の少なくとも１つを有するプライマーセット。
【請求項８】
ＴＮＦ−α遺伝子の塩基番号−１０３１位における多型を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号５から配列番号８で示される塩基配列の少なくとも１つを有するプライマーセット。
【請求項９】
請求項６に記載のオリゴヌクレオチドを、ＩＬ−１０遺伝子および／またはＴＮＦ−α遺伝子の多型検出用プライマーとして含む長寿判定用キット。
【請求項１０】
請求項７および／または請求項８に記載のプライマーセットを含む、請求項９に記載の長寿判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症関連遺伝子の遺伝子多型の存在を指標として長寿の素因を判定する方法、該判定の指標となる遺伝子多型の検出方法、それらの方法に利用するオリゴヌクレオチドおよび判定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子と長寿との関連研究は多くなされているが、主にヒトの長寿に必要な遺伝子を明らかにする観点からである。例えば、ＤＮＡ修復の遺伝子、薬物や脂質代謝の遺伝子、免疫応答に関与する遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、血液凝固遺伝子などが調査された。（非特許文献１）このような研究背景の中で、炎症関連遺伝子が、注目を浴びている。老齢者集団で、炎症関連遺伝子である腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＮＦ）−αとインターロイキン（ＩＬ）−６の血中での存在量の上昇が明らかにされたからである。（非特許文献２）
【０００３】
また一方、遺伝子中の多型と疾患との関係が注目されている。ゲノム解析の進歩と共に、遺伝子における一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：ＳＮＰｓ）と薬剤感受性／応答性との関連研究が個々の患者について行われており、オーダーメイドの治療法が将来的には行われると予測されている。心筋梗塞のリスク診断法として遺伝子多型を用いる方法（特許文献１）、慢性間接リュウマチの発症危険度を予測する方法として遺伝子多型を用いる方法（特許文献２）、骨粗鬆症の素因を規定する方法として遺伝子多型を用いる方法（特許文献３）が明らかにされている。百寿者と疾患の関連では、ミトコンドリアゲノム多型を探索することにより、病変の進展を予測するための有用な情報を与える遺伝子検出方法を提供する報告がある（特許文献４、５、６）。炎症性遺伝子の遺伝子多型と長寿との関わりについては、ＩＬ−６遺伝子（非特許文献２）、ＴＮＦ遺伝子（非特許文献３）、ＩＬ−１遺伝子（非特許文献４）、ＩＬ−１０遺伝子（非特許文献５、６）、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ遺伝子（非特許文献７）、成長転換素因（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＧＦ）−β遺伝子（非特許文献８）および（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：ＭＭＰ）−３遺伝子（非特許文献９）の報告があるが、また相反するデータが、ＴＮＦ遺伝子（非特許文献１０、１１、１２）、ＩＬ−１遺伝子（非特許文献１１、１３）、ＩＬ−１０遺伝子（非特許文献１１、１２、１４）、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ遺伝子（非特許文献１２、１４）で報告されている。上記のように、これまで報告された遺伝子多型と、長寿との関係は確定的とは言えない。このことは、文化や生活スタイルの違う異なる国における研究であり、また老齢者グループと、若年者グループの区分けが充分でないためと考えられる。さらに、解析法も適切でなかったと考えられる。
【特許文献１】特開２００４−２４０３６公報
【特許文献２】特開２００４−２４２６６９公報
【特許文献３】特開２００５−６５３８公報
【特許文献４】特開２００５−４４公報
【特許文献５】特開２００４−３２１０４１公報
【特許文献６】特開２００４−２９８０８６公報
【非特許文献１】Ｄｅ  Ｂｅｎｅｄｉｃｔｉｓ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ．２００１；１２２：９０９−９２０
【非特許文献２】Ｋｒａｂｂｅ  ＫＳ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．２００４；３９：６８７−６９９
【非特許文献３】Ｌｉｏ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ．２００３；４０：２９６−２９９
【非特許文献４】Ｃｏｍｂａｒｒｏｓ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｏｕｒｏｌ．２００３；２５０：９８７−９８９
【非特許文献５】Ｌｉｏ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００２；３：３０−３３
【非特許文献６】Ｎａｕｖｏｍａ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．２００４；３９：６３７−６４４
【非特許文献７】Ｌｉｏ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．  ２００２；３７：３１５−３１９
【非特許文献８】Ｃａｒｒｉｅｒｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ．２００４；３：４４３−４４８
【非特許文献９】Ｍｅｄｌｅｙ  ＴＬ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００３；９２：１２５４−１２６１
【非特許文献１０】Ｒｏｓｓ  ＯＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ．２００３；１２４：５６３−５６７
【非特許文献１１】Ｗａｎｇ  ＸＹ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ．２００１；１２３：２９−３８
【非特許文献１２】Ｒｏｓｓ  ＯＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ．２００３；１２４：１９９−２０６
【非特許文献１３】Ｃａｖａｌｌｏｎｅ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃｈ  Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ．２００３；１２４：５３３−５３８
【非特許文献１４】Ｐｅｓ  ＧＭ  ｅｔ  ａｌ．Ａｇｉｎｇ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｅｓ．２００４；１６：２４４−２４８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＩＬ−１０遺伝子および／またはＴＮＦ−α遺伝子の遺伝子多型を検出する方法を提供すること、さらに該遺伝子多型を指標として長寿の素因の存在を判定する方法を提供することをその主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために、まず多型解析用遺伝子として、インターロイキン（ＩＬ）関連、ＴＮＦ−α関連、ＴＧＦ関連、ＭＭＰ関連などの８遺伝子を選択し、日本人の多型データベースからこれら候補遺伝子の遺伝子多型を検索し、１０の遺伝子多型候補を選択した。この８遺伝子、１０多型に関して、５００例の無関係の日本人を対象とした解析から、ＩＬ−１０遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子の中から３個の有用な多型を見出した。本発明は以上の知見に基づくものであり下記の構成を有する。
【０００６】
（１）ＩＬ−１０遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子から選ばれる１種または２種以上の遺伝子多型を検出し、これを指標として長寿の素因の存在を判定する方法。
【０００７】
（２）ＩＬ−１０遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子から選ばれる１種または２種以上の遺伝子多型の存在を指標として長寿の素因を判定するための、当該遺伝子の遺伝子多型を検出する方法。
【０００８】
（３）検出する遺伝子多型が、下記（ａ）−（ｃ）から選ばれる少なくとも１つである上記（１）または（２）に記載の方法。
（ａ）ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−８１９位の多型
（ｂ）ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−５９２位の多型
（ｃ）ＴＮＦ−α遺伝子の塩基番号−１０３１位の多型
【０００９】
（４）検出する遺伝子多型が、下記（ａ）−（ｃ）から選ばれる少なくとも１つである請求項１または２に記載の方法。
（ａ）ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−８１９位がＴ／Ｔである遺伝子多型
（ｂ）ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−５９２位がＡ／Ａである遺伝子多型
（ｃ）ＴＮＦ−α遺伝子の塩基番号−１０３１位がＴ／Ｔである遺伝子多型
【００１０】
（５）遺伝子多型の検出が、Ｔｅｔｒａ−ｐｒｉｍｅｒ  ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法から選ばれる少なくとも１つの方法により行われる上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
【００１１】
（６）上記（１）〜（５）に記載の方法において、ＩＬ−１０遺伝子および／またはＴＮＦ−α遺伝子にハイブリダイズすることができる遺伝子多型検出用プライマーまたはプローブとしてのオリゴヌクレオチドであって、下記（ａ）−（ｃ）からから選ばれるいずれか少なくとも１つを含むように設定されたＤＮＡに対応する部分オリゴヌクレオチド。
（ａ）ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−８１９位の多型
（ｂ）ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−５９２位の多型
（ｃ）ＴＮＦ−α遺伝子の塩基番号−１０３１位の多型
【００１２】
（７）ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−８１９位における多型を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１から配列番号４で示される塩基配列の少なくとも１つを有するプライマーセット。
【００１３】
（８）ＴＮＦ−α遺伝子の塩基番号−１０３１位における多型を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号５から配列番号８で示される塩基配列の少なくとも１つを有するプライマーセット。
【００１４】
（９）上記（６）に記載のオリゴヌクレオチドを、ＩＬ−１０遺伝子および／またはＴＮＦ−α遺伝子の多型検出用プライマーとして含む長寿判定用キット。
【００１５】
（１０）上記（７）および／または（８）に記載のプライマーを含む上記（９）に記載の長寿判定用キット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ＩＬ−１０遺伝子および／またはＴＮＦ−α遺伝子の多型を検出することができ、これによって長寿素因の存在を判定することができる。さらに本発明により被験者の長寿素因の存在を判定して、被験者へ有用な情報を与えることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の方法は、被験者のヒトゲノムＤＮＡを含む試料において、ＩＬ−１０遺伝子および／またはＴＮＦ−α遺伝子の遺伝子多型を検出することにより、被験者が長寿素因の存在を有するかどうかを判定する方法である。
【００１８】
各遺伝子における塩基番号は公共のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋに登録されている公知の配列を基準として表される。ＩＬ−１０遺伝子はアクセッション番号：Ｕ０６８４４、ＴＮＦ−α遺伝子はアクセッション番号：ＡＢ０４８８１８として登録されている。
【００１９】
ＩＬ−１０は、Ｔ細胞の分化に深く関わるサイトカインの一つである。ＩＬ−１０はマウスではヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）２、樹状細胞、マクロファージ等により、ヒトではＴｈ２細胞、活性化Ｂ細胞等によって産生され、Ｔｈ１細胞によるＩＦＮ−γ等の産生を抑制する。ＩＬ−１０は、Ｔｈ１サイトカイン産生抑制能を有することから、アレルギー、リウマチや多発性硬化症といった自己免疫疾患の治療、さらには臓器移植時の拒絶反応の制御に使用しうることが示唆されている。
【００２０】
ＴＮＦ−αは、マクロファージで産生され、好中球や血管内皮細胞に働いて、炎症の初発から進展をもたらす。その後、線維芽細胞や肝細胞に働くことにより、その炎症は終息、修復へ向かう。炎症反応は、多くの細胞とメディエーターが相互に関連しつつ進行し、通常は一定の速度で消失するが、抗原となるべき物質が存在し、その量が一定以上であれば、その情報は免疫系へと受け渡される。炎症反応と免疫反応は、相補的な一連の流れの中で起こるものであるが、ＴＮＦ−αはこの両者の橋渡しも担っていることになる。
【００２１】
長寿者におけるこれらの炎症関連遺伝子、ＩＬ−１０遺伝子および／またはＴＮＦ−α遺伝子の、特定部位における変異を含む多型を検出し、解析することにより、長寿の素因の存在を判定するものである。これらの遺伝子における遺伝子多型の検出は、以下のように行うことができる。
【００２２】
１．ヒトゲノムＤＮＡを含む試料の調製
被験者より得られた材料から、常法に従ってｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを抽出する。定法のＮａＩを用いたＷａｎｇ  Ｌ．らの方法（Ｗａｎｇ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９９４；２２：１７７４−１７７５）が好ましい。あるいは市販のＤＮＡ抽出キット等を利用して行ってもよい。
【００２３】
上記において、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む材料としては、具体的に、血清、血漿などの血液、唾液、リンパ液、気道粘液、尿、精液などの体液を例示することができる。
【００２４】
２．遺伝子多型の検出
得られたヒトゲノムＤＮＡを含む試料から、本発明者らによって解明された、長寿と極めて関連の深い遺伝子多型を検出するのに好ましいのは、末梢血であり、抗凝固剤を含む採血管で採取する。遺伝子多型の検出方法としては、Ｔｅｔｒａ−ｐｒｉｍｅｒ  ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法やＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法を用いることができる。
【００２５】
（１）Ｔｅｔｒａ−ｐｒｉｍｅｒ  ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法
対立遺伝子特異ＰＣＲ（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）は、塩基配列の違いをプライマーの３’側の１塩基で認識し、ＤＮＡが合成されるかどうかにより遺伝子型を決定する。適切なａｎｎｅａｌｉｎｇ温度を設定すると、３’側の１塩基が違うだけでもＤＮＡが合成されず、完全マッチのプライマーでのみＤＮＡが合成される。この対立遺伝子特異ＰＣＲを５’側および３’側の両方向から同時に行う。遺伝子多型の２つの対立遺伝子アレルについて、それぞれアレル特異的なプライマーペアを設定する。ペアのうち１つをｏｕｔｅｒプライマーとして利用する。これら２セット計４プライマーを１本のチューブ内でＤＮＡを増幅する。この時遺伝子多型からそれぞれのｏｕｔｅｒプライマーまでの距離に差をつけて設定することで、増幅産物の長さの違いを電気泳動で検出できる。
【００２６】
（２）ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法
ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）とＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲを利用した方法である〔Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．，１４，１４３−１４９（１９９９），Ｊ．ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３４，２９３３−２９３６（１９９６）〕。目的の配列を含む領域にプライマーを設計し、ＴａｑＭａｎプローブをその間に設定する。このプローブの５’末端側にリポーター蛍光色素（Ｒ）を３’末端側にクレンチャー蛍光色素（Ｑ）をラベルする。プローブのＴｍ値プライマーのＴｍ値より１０℃くらい高めに設計することで、プローブが先にハイブリする。そしてプライマーがハイブリし、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって、ＴａｑＭａｎプローブが一塩基ずつ加水分解され、レポーター蛍光色素を遊離する。この遊離したリポーター色素の強度が、ＰＣＲ産物に比例することを利用している。
【００２７】
その他の遺伝子多型の検出方法としては、次のような方法がある。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）法、ＡＳＯ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ハイブリダイゼーション法、ダイレクトシークエンス法、ＤＧＧＥ（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）法、ＲＮａｓｅＡ切断法、化学切断法、ＤＯＬ（Ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ）法、インベーダー法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ／Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）法、ＴＤＩ（Ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法などをあげることができる。これらの遺伝子多型検出方法も、本発明の判定方法のために利用することができる。また、本発明の方法においては、これらの遺伝子多型検出方法を単独で用いても、二つ以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２８】
３．プライマーおよびプローブ
以上の方法では、各方法に応じたプライマーやプローブ等のオリゴヌクレオチドが使用される。多型解析用オリゴヌクレオチドの例としては、Ｔｅｔｒａ−ｐｒｉｍｅｒ  ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法で解析する場合には、遺伝子多型の２つの対立遺伝子アレルについて、３’側の１塩基が違った、それぞれアレル特異的なプライマーペアを設定する。
【００２９】
例えば、ＩＬ−１０遺伝子の−８１９位の多型解析用のオリゴヌクレオチドセットとしては、
フォワード・アウタープライマー（ＦＯ）５‘−ａｃａｃｔａｃｔａａｇｇｃｔｔｃｃｔｔｇｇｇａ−３'（配列番号１）
リバース・アウタープライマー（ＲＯ）５’−ｔｇｃａｃｔｔｇｃｔｇａａａｇｃｔｔｃｔｔａｔ−３'（配列番号２）
フォワード・インナープライマー（ＦＩ）５’−ｔｇｔａｃｃｃｔｔｇｔａｃａｇｇｔｇａｔｇｔｃａＴ−３'（配列番号３）
リバース・インナープライマー（ＲＩ）５’−ｇａｇｃａａａｃｔｇａｇｇｃａｃａｇａｇｇｔＧ−３'（配列番号４）
があげられる。ただし、配列番号３および４の３'末端に記載しているＴ（チミン）とＧ（グアニン）は、多型の位置に相当する。
【００３０】
例えば、ＴＮＦ−α遺伝子の−１０３１位の多型解析用のオリゴヌクレオチドセットとしては、
フォワード・アウタープライマー（ＦＯ）５’−ｇｃｔｇｔｇｇｇｇａｇａａｃａａａａｇｇａｔａａ−３'（配列番号５）
リバース・アウタープライマー（ＲＯ）５’−ｇｇｔｃｃｃｃａｔａｃｔｃｇａｃｔｔｃｃａｔａ−３'（配列番号６）
フォワード・インナープライマー（ＦＩ）５’−ｇａａｇｃａａａｇｇａｇａａｇｃｔｇａｇａａｃａＴ−３'（配列番号７）
リバース・インナープライマー（ＲＩ）５’−ｔｃｃａｇａｃｃｃｔｇａｃｔｔｔｔｃｃｔｇｃＧ−３'（配列番号８）
があげられる。ただし、配列番号７および８の３'末端に記載しているＴ（チミン）とＧ（グアニン）は、多型の位置に相当する。
【００３１】
さらに、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法で解析する場合には、プライマーとプローブの具体的なヌクレオチド配列は、適宜決定することができる。５’末端側のリポーター蛍光色素と３’末端側にクレンチャー蛍光色素の２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれ当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはＦＡＭ（登録商標）、ＶＩＣ（登録商標）、およびＴＥＴ（登録商標）のいずれかの組合せを用いる。
【００３２】
以上のプライマーおよびプローブは、単なる一例であって、オリゴヌクレオチドプライマーであれば目的の増幅反応を支障なく行える限度において、他方オリゴヌクレオチドプローブであれば目的のハイブリダイゼーション反応を支障なく行える限度において、一部の塩基配列に欠失、置換、挿入及び／又は付加等の改変がされていても良い。改変にかかる塩基数は、例えば１〜５個、好ましくは、１〜３個である。なお、このような改変は、原則として多型部位に対応する塩基以外の部分において行われる。
【００３３】
多型解析用オリゴヌクレオチド（プローブ、プライマー）には、解析方法に応じて適宜ＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片が用いられる。多型解析用オリゴヌクレオチドの塩基長はそれぞれの機能が発揮される長さであればよく、プライマーとして用いられる場合の塩基長の例としては、１５〜３０塩基長、好ましくは１８〜２５塩基長程度である。
【００３４】
増幅するポリヌクレオチドの長さは、用いられる検出方法に応じて適宜設定されるが、一般的には２０〜５００塩基長、好ましくは２０〜２００塩基長である。
【００３５】
本発明のプライマーおよびプローブには、その配列の末端に、検出のための適当な標識が
付加されたものも含むものとする。標識としては、例えば、ＲＯＸ（登録商標）、ＦＩＴＣ（登録商標；フルオレセイン）、ＴＥＴ（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、ＨＥＸ（登録商標）、ＮＥＤ（（登録商標））、６−ＦＡＭ（登録商標）、ＲＯＸ（登録商標）、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎ）またはその誘導体等などの蛍光色素、酵素、タンパク、放射性物質、ビオチン、チオール等を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素で塩基を標識する方法は、公知の方法を用いることができる。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる。
【００３６】
多型解析用オリゴヌクレオチド（プライマー、プローブ）の合成は、具体的には通常のホスホルアミダイト法、リン酸トリエステル法などの化学合成法によることもでき、また市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置、例えば（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｐｌｕｓ：ファルマシア社製）などを使用して合成することもできる。あるいは、ｃｕｓｔｏｍ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄされたものを用いることもできる。
【００３７】
４．統計的解析
年令と遺伝子多型を変数とする二変量解析、あるいは、年令と遺伝子多型数個を変数とした多変量解析により長寿の素因の存在を判定することができる。二変量解析はカイ（χ）二乗検定で行うことが好ましい。カイ二乗検定とは、２つのカテゴリー変数の間の独立性（関連がまったく無いと言えるかどうか＝関連があるか）を検定する。２つのカテゴリー変数によるクロス表を想定し、「本当に互いの変数が独立だった場合、このような分布になるはずだ」という分布を計算する。この分布を期待値と呼ぶ。独立ならそのような分布が期待される、という思いからである。この期待値と実際の分布がどの程度はなれているかを算出する。この値が、カイ二乗値である。
【００３８】
多変量解析は、回帰分析、重回帰分析、素因分析、多素因ロジスティック回帰分析などがあるが、オッズ比（ＯＲ）や９５％信頼区間（ＣＩ）を算出して統計解析する、多素因ロジスティック回帰分析が好ましい。オッズ比とは、ある事象の起こる確率と起こらない確立の比と定義されている。オッズ比は、ブラウン法（Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｃ．，Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．，１１３：４７４−４８０（１９８１））に従い、オッズ比の９５%信頼区間はＷｏｏｌｆの方法を用いて算出する。
【００３９】
５．キット
長寿に関連した遺伝子多型を検出するためには、検出すべき遺伝子多型が存在する部位またはその近傍の配列を検出するためのプローブまたは該配列を特異的に増幅するためのプライマーが用いられる。これらのプローブやプライマーは、本発明の判定方法を実施するための試薬、またはキットとして有用である。本発明のキットは上記した構成要素のほか、必要に応じて、化学修飾物質である放射性同位元素、発光物質、蛍光物質などの標識剤、ＰＣＲ法に必須な試薬、本発明の判定方法に必要な試薬、器具等を適宜含んでいてもよい。
【００４０】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００４１】
＜被験者＞
被験者は、男性（Ｍ）２５２名、女性（Ｆ）２４８名で、年齢は１９歳から１００歳まで（平均年齢５６．７歳）の５００名とした。年代別の人数は、カッコ内に（男／女）数を示すと、１０歳代５名（０／５）、２０歳代１３３名（７０／６３）、３０歳代３９名（２３／１６）、４０歳代４３名（２２／２１）、５０歳代３０名（１１／１９）、６０歳代２８名（２２／６）、７０歳代７９名（５７／２２）、８０歳代１００名（３５／６５）、９０歳代４２名（１２／３０）、１００歳代１名（０／１）であった。これらの被験者のうち、３３７名は健康人であり、男性１８７名、女性１５０名で、年齢は１９歳から９８歳まで（平均年齢４４．３歳）である。また、１６３名の被験者は、２００１年１月から、２００４年１０月までの間に大学病院で検査を受けた患者であり、虚血性心疾患、高血圧症、糖尿病、消化性潰瘍、肝臓疾患等の慢性疾患を有し、男性６５名、女性９８名で、年齢は６４歳から１００歳まで（平均年齢８２．３歳）である。慢性疾患を有する患者については、悪性腫瘍や重篤な組織疾患を有しない患者を被験者とした。被験者へは、遺伝子解析による研究目的を説明し、被験者からは文書で協力の同意が得られた。被験者は日本人で、同様な居住環境や社会環境を有している人とした。
【００４２】
＜ゲノムＤＮＡの調製＞
被験者の末梢血を材料とし、ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出にあたっては、ＥＤＴＡ・２Ｎａ入り採血菅（ベノジェクト）に採血し、ヨウ化ナトリウム法を用いた。得られた各試料の２６０ｎｍの吸光度を測定し、各試料のＤＮＡ濃度を算出した。その後、調製したＤＮＡは、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、使用するまで、４℃で保存した。
【００４３】
＜解析対象遺伝子＞
サイトカイン関連のＩＬ−１０遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子を選択した。
【００４４】
＜解析手法＞
遺伝子多型の解析は、Ｔｅｔｒａ−ｐｒｉｍｅｒ  ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法、ＴａｑＭａｎ法を用いて実施した。
【実施例２】
【００４５】
ＩＬ−１０  −８１９の遺伝子多型の解析はＴｅｔｒａ−ｐｒｉｍｅｒ  ＡＲＭＳ  ＰＣＲにより行った。ゲノムＤＮＡ８０ｎｇ，２００μｌ  ｄＮＴＰ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１００ｍＭ  ＫＣｌ，ｉ  Ｕ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ，ＴａＫａＲａ社製）と下記４種のプライマー各１０ｐｍｏｌ／μｌを混合し、全量を１０μｌとした。
フォワード・アウタープライマー（ＦＯ）５‘−ａｃａｃｔａｃｔａａｇｇｃｔｔｃｃｔｔｇｇｇａ−３'（配列番号１）
リバース・アウタープライマー（ＲＯ）５’−ｔｇｃａｃｔｔｇｃｔｇａａａｇｃｔｔｃｔｔａｔ−３'（配列番号２）
フォワード・インナープライマー（ＦＩ）５’−ｔｇｔａｃｃｃｔｔｇｔａｃａｇｇｔｇａｔｇｔｃａＴ−３'（配列番号３）
リバース・インナープライマー（ＲＩ）５’−ｇａｇｃａａａｃｔｇａｇｇｃａｃａｇａｇｇｔＧ−３'（配列番号４）
９５℃２分間のインキュベーション後、ＰＣＲサイクルは３１回で、１サイクルあたり９４℃３０秒、５９℃２０秒、７２℃３０秒で行った。
【実施例３】
【００４６】
ＴＮＦ−α  −１０３１の遺伝子多型の解析はＴｅｔｒａ−ｐｒｉｍｅｒ  ＡＲＭＳ  ＰＣＲにより行った。ゲノムＤＮＡ８０ｎｇ，２００μｌ  ｄＮＴＰ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１００ｍＭ  ＫＣｌ，ｉ  Ｕ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ，ＴａＫａＲａ社製）と下記４種のプライマーを混合し全量を１０μｌとした。
フォワード・アウタープライマー（ＦＯ）５’−ｇｃｔｇｔｇｇｇｇａｇａａｃａａａａｇｇａｔａａ−３'（配列番号５）
リバース・アウタープライマー（ＲＯ）５’−ｇｇｔｃｃｃｃａｔａｃｔｃｇａｃｔｔｃｃａｔａ−３'（配列番号６）
フォワード・インナープライマー（ＦＩ）５’−ｇａａｇｃａａａｇｇａｇａａｇｃｔｇａｇａａｃａＴ−３'（配列番号７）
リバース・インナープライマー（ＲＩ）５’−ｔｃｃａｇａｃｃｃｔｇａｃｔｔｔｔｃｃｔｇｃＧ−３'（配列番号８）
各々のプライマー濃度は、ＦＯが４ｐｍｏｌ／μｌ、ＲＯが２ｐｍｏｌ／μｌ、ＦＩが８ｐｍｏｌ／μｌ、ＲＩが２０ｐｍｏｌ／μｌとした。９５℃２分間のインキュベーション後、ＰＣＲサイクルは１０回で（１サイクルあたり９４℃３０秒、５９℃２０秒、７２℃３０秒）、続いて２５サイクル（１サイクルあたり９４℃３０秒、５６℃２０秒、７２℃３０秒）で行った。
【実施例４】
【００４７】
ＩＬ−１０  −５９２の遺伝子多型解析はＴａｑＭａｎ法により行った。ゲノムＤＮＡ５ｎｇにＴａｑＭａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）２．５μｌ、２０ｘ  ａｓｓａｙ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）０．２５μｌ、精製水２．２５μｌを加えて全量５μｌとし、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９５℃１０分間のインキュベーションの後、ＰＣＲを４０サイクル（１サイクルあたり９５℃１５秒、６０℃６０秒）行い、ＰＣＲ産物の蛍光を測定した。
【実施例５】
【００４８】
＜遺伝子型判定法＞
遺伝子型は、Ｔｅｔｒａ−ｐｒｉｍｅｒ  ＡＲＭＳ  ＰＣＲの場合、電気泳動により検出されるＰＣＲ増幅産物の長さによって判定した。ＴａｑＭａｎ法の場合、本反応の結果、検出される２色の蛍光強度により判定した。
【００４９】
＜統計的分析方法＞
実施例１から実施例３により得られた定性的データはカイ二乗テストで検定した。アリル頻度を実測し、ハーディ−ワインバーグ平衡（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）から逸脱していないかどうかをカイ二乗テストによって検定した。また、危険素因を補正した多素因ロジスティック回帰分析を行った。すなわち、遺伝子型を従属素因とし、年齢、性を独立変数としてし、相対危険度（Ｐ）、オッズ比（ＯＲ）、９５％信頼区間（ＣＩ）を算出した。この解析は、Ｔｈｅ  ｓｔａｔＶｉｅｗ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ５；ＳＡＳ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）で行った。
【００５０】
＜結果＞
被験者のＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−８１９位、ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−５９２位、ＴＮＦ−α遺伝子の塩基番号−１０３１位について、年代別、性別に分けて、それぞれの塩基を表１に示した（但し、Ｔ；チミン、Ｃ；シトシン、Ａ；アデニンを表す）。
【００５１】
【表１】
2007110991.tif 000002
【００５２】
１歳刻みのデータを基に、ロジスティック回帰分析により、算出した遺伝子型による長寿のオッズ比（ＯＲ）、９５％信頼区間（ＣＩ）、危険率（Ｐ）を表２に示す。ＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−８１９位のＴ／Ｔおよび−５９２位のＡ／Ａ、ＴＮＦ−α遺伝子の塩基番号−１０３１位のＴ／Ｔの出現する相対危険度が、性別とは無関係に、年齢が１歳上がる毎に、統計学的有意差をもって１．００９倍上昇することが分かった。すなわちＩＬ−１０遺伝子の塩基番号−８１９位および−５９２位の多型、ＴＮＦ−α遺伝子の塩基番号−１０３１位の多型は長寿と強く関連していることが示唆された。
【００５３】
【表２】
2007110991.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００５４】
ＩＬ−１０遺伝子および／またはＴＮＦ−α遺伝子の多型を検出することにより、長寿素因の存在の有無を判定できることから、被験者における長寿の判定が可能になり、被験者の将来設計計画などに有用な情報を与えることが可能になる。
【配列表】
2007110991000001.app