(57)【要約】【課題】反応プレートの外部からの異物の進入や、外部への環境汚染を防ぐ。【解決手段】反応プレート５の表面側に、サンプル注入部１１２、タイピング試薬収容部１１４、ミネラルオイル収容部１１６、遺伝子増幅試薬収容部１３０、ＰＣＲ終了液注入部１３１及び複数のプローブ配置部１１８が凹部として形成されており、増幅反応部１３２の出入口となるポート１３４ａ，１３４ｂが開口として形成されている。反応プレート５の表面側に配置された分注チップ２０と、反応プレート５上の表面側の空間を覆うとともに、分注チップ２０をその先端部が内側、基端部が外側になるようにして移動可能に支持しているカバー２４と、カバー２４の一部に密閉可能に設けられた開口３１を介してカバー２４で覆われた空間内に外部からサンプルを注入するサンプル容器３２とを備えている。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面側に、複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容しフィルムで封止されたタイピング試薬収容部、反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容しフィルムで封止された不揮発性液体収容部、及び前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部を少なくとも備えた反応プレートと、
前記反応プレートの表面側の上方に配置された分注チップと、
前記反応プレート上の表面側の上部空間を覆うとともに、前記分注チップをその先端部が前記空間の内側、基端部が外側になるようにして移動可能に支持しているカバーと、
を備えた遺伝子多型解析用反応容器。
【請求項２】
前記試薬収容部として複数の多型部位それぞれを挟んで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容しフィルムで封止された遺伝子増幅試薬収容部をさらに含み、
前記遺伝子増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部をさらに含んでいる請求項１に記載の遺伝子多型解析用反応容器。
【請求項３】
前記増幅反応部の液分注用ポートは分注チップの先端形状に対応した開口形状をもち、分注チップの先端に密着できる素材で構成されている請求項２に記載の遺伝子多型解析用反応容器。
【請求項４】
前記増幅反応部は反応液を収容する流路をもち、その流路は前記反応プレートの裏面側に突出して外部の熱源により温度制御されるようになっている請求項２又は３に記載の遺伝子多型解析用反応容器。
【請求項５】
前記フィルムはノズルで貫通可能なものである請求項１から４のいずれかに記載の遺伝子多型解析用反応容器。
【請求項６】
前記反応プレートの表面側に凹部として形成され、サンプルを注入するためのサンプル注入部をさらに備えている請求項１から５のいずれかに記載の遺伝子多型解析用反応容器。
【請求項７】
前記不揮発性液体はミネラルオイル、植物油、動物油、シリコーンオイル及びジフェニルエーテルからなる群から選ばれた液体である請求項１から６のいずれかに記載の遺伝子多型解析用反応容器。
【請求項８】
対象とする多型が一塩基多型である請求項１から７のいずれかに記載の遺伝子多型解析用反応容器。
【請求項９】
前記サンプルは核酸抽出操作を施していない生体サンプルである請求項２から８のいずれかに記載の遺伝子多型解析用反応容器。
【請求項１０】
前記遺伝子増幅試薬はＰＣＲ反応試薬である請求項２から９のいずれかに記載の遺伝子多型解析用反応容器。
【請求項１１】
前記タイピング試薬はインベーダ試薬又はタックマンＰＣＲ試薬である請求項１から１０のいずれかに記載の遺伝子多型解析用反応容器。
【請求項１２】
前記カバーの一部に密閉可能に設けられた開口を介して外部から前記空間内にサンプルを注入するサンプル導入部をさらに備えた請求項１から１１のいずれかに記載の遺伝子多型解析用反応容器。
【請求項１３】
前記分注チップは前記カバーの外側から操作するシリンジを備えており、そのシリンジの操作により分注動作を行なうものである請求項１から１２のいずれかに記載の遺伝子多型解析用反応容器。
【請求項１４】
前記分注チップは先端部の内部にフィルタを備えている請求項１から１３のいずれかに記載の遺伝子多型解析用反応容器。
【請求項１５】
前記プローブ配置部は底部から光学的に測定が可能なように光透過性の材質にて構成されている請求項１から１４のいずれかに記載の遺伝子多型解析用反応容器。
【請求項１６】
前記カバーは気密性をもち柔軟性のある素材によって前記分注チップを保持し移動可能に支持している請求項１から１５のいずれかに記載の遺伝子多型解析用反応容器。
【請求項１７】
請求項１に記載の遺伝子多型解析用反応容器を装着する反応容器装着部と、
前記反応容器に取りつけられた分注チップによる吸引及び吐出のための機構を備えて液を移送して分注する分注部と、
前記反応容器のプローブ配置部の温度をサンプルとタイピング試薬との反応液をプローブと反応させる温度に制御するタイピング反応温度調節部を少なくとも含む温度調節部と、
前記プローブ配置部に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出部と、
前記分注部の分注動作、前記タイピング反応温度調節部の温度制御及び前記蛍光検出部の検出動作を少なくとも制御する制御部と、
を備えた反応容器処理装置。
【請求項１８】
前記反応容器は複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部と、前記遺伝子増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部をさらに含んだものであり、
前記温度調節部は前記増幅反応部の温度をサンプルと遺伝子増幅試薬との反応液内でＤＮＡを増幅させる遺伝子増幅のための温度に制御する増幅反応温度調節部をさらに含み、
前記制御部は前記増幅反応温度調節部の温度制御も行なう請求項１７に記載の反応容器処理装置。
【請求項１９】
前記反応容器は液体の収容部がフィルムで封止されており、そのフィルムで封止された状態で該反応容器処理装置に装着され、前記分注チップによりそのフィルムを貫通して液の吸入を行なう請求項１７又は１８に記載の反応容器処理装置。
【請求項２０】
請求項１７から１９のいずれかに記載の反応容器処理装置と、
特定の多型又は複数の多型の組合せについての診断値を記憶したデータベースと、
表示装置と、
前記反応容器処理装置により検出された多型解析結果に基づいて前記データベースから診断値を読み出して前記表示装置に表示する診断処理装置と、を備えた診断装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は化学反応を初め、現場において各種自動解析、例えば遺伝子解析の研究や臨床を行なうのに適する反応容器と、それを用いて人間を初めとする動物や植物のゲノムＤＮＡの多型、例えばＳＮＰ（一塩基多型）を検出するための反応容器処理装置、並びにその遺伝子多型検出結果を用いて病気罹患率の診断や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係などの診断を行なう装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子多型を利用して病気の罹りやすさなどを予測する方法又は装置として、下記のようなものが提案されている。
患者が敗血症に罹りやすいか否か及び／又は敗血症に急速に進行しやすいか否かを決定するために、患者から核酸サンプルを採取し、該サンプル中におけるパターン２対立遺伝子、又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子を検出し、パターン２対立遺伝子又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子が検出されれば該患者が敗血症に罹りやすいと判定する（特許文献１参照。）。
【０００３】
ヒトのｆｌｔ−１遺伝子中の１又はそれ以上の単一ヌクレオチド多型性の診断のために、ヒトの核酸の１又はそれ以上の位置：１９５３、３４５３、３８８８（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｘ５１６０２中の位置に従う）、５１９、７８６、１４２２、１４２９（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｄ６４０１６中の位置に従う）、４５４（配列番号３に従う）及び６９６（配列番号５に従う）の配列を決定し、ｆｌｔ−１遺伝子中の多型性を参照することにより、そのヒトの体質を決定する（特許文献２参照。）。
【０００４】
ＳＮＰ部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告されている。そのうちの代表的なものは次の方法である。
比較的に少量のゲノムＤＮＡを用いて数十万箇所に及ぶＳＮＰ部位についてタイピングを行なうために、少なくとも一つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅し、増幅した複数の塩基配列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基をタイピング工程により判別する。そのタイピング工程として、インベーダ法又はタックマンＰＣＲ法を用いる（特許文献３参照。）。
【０００５】
生化学的分析や通常の化学分析に使用する小型の反応装置としては、マイクロマルチチャンバ装置が使用されている。そのような装置としては、例えば平板状の基板表面に複数のウエルを形成したマイクロタイタープレートなどのマイクロウエル反応プレートが用いられている。
核酸検出用容器としては、同一容器内に、特定の核酸を増幅させる核酸増幅部位と、予め該核酸の検出用プローブが固定化された核酸検出部位を備えた容器が提案されている（特許文献５,６参照）。
【特許文献１】特表２００２−５３３０９６号公報
【特許文献２】特開２００１−２９９３６６号公報
【特許文献３】特開２００２−３００８９４号公報
【特許文献４】特許第３４５２７１７号公報
【特許文献５】特開２００５−３１８８２２号公報
【特許文献６】特開２００５−３３３８８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来のマイクロウエル反応プレートや核酸検出用容器は、使用時には反応プレートの上面は大気に開放された状態となる。そのため、サンプルに外部から異物が進入する虞があるし、逆に反応生成物が外部の環境を汚染することもありうる。
【０００７】
本発明の第１の目的は、遺伝子多型検出を自動化するのに適し、反応プレートの外部からの異物の進入や、外部への環境汚染を防ぐことができる反応容器を提供することを目的とするものである。
本発明の第２の目的は、本発明の反応容器を用いて遺伝子多型検出を自動化する装置を提供することである。
本発明の第３の目的は、本発明による遺伝子多型検出結果を用いて病気罹患率の診断や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係などの診断を自動的に行なうための装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の遺伝子多型解析用反応容器は、表面側に、複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容しフィルムで封止されたタイピング試薬収容部、反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容しフィルムで封止された不揮発性液体収容部、及び前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部を少なくとも備えた反応プレートと、反応プレートの表面側の上方に配置された分注チップと、反応プレート上の表面側の上部空間を覆うとともに、前記分注チップをその先端部が前記空間の内側、基端部が外側になるようにして移動可能に支持しているカバーと、を備えている。
【０００９】
反応プレート上の表面側の空間はカバーで覆われて外部と遮断されており、サンプルに対する反応はその空間内で行なわれる。反応後の反応生成物の検知も反応生成物をそのカバーの外に出すことなく、反応生成物がカバー内にある状態で行なわれる。検知後は反応生成物がカバー内にある状態のままでこの反応容器が廃棄処理される。すなわち、この反応容器は使い捨て可能である。
【００１０】
この反応容器の使用に際し、何らかの方法によりサンプルをカバーで覆われた空間内に導入しなければならない。その導入方法は特に限定されるものではないが、例えば、カバーの一部に密閉可能に設けられた開口を介して外部からその空間内にサンプルを注入するサンプル導入部をさらに設けておいてもよい。
【００１１】
サンプルの反応に使用される試薬も何らかの方法によりカバーで覆われた空間内に導入しなければならず、その方法も特に限定されるものではないが、例えばサンプルとともにサンプル導入部から導入するようにしてもよく、別の容器に入れて導入するようにしてもよく、又は予め反応プレートに収容しておいてもよい。反応プレートに試薬を予め収容しておく形態では、反応プレートはその表面側に試薬を収容しフィルムで封止された試薬収容部も備えているものとなる。試薬収容部を被って試薬を封止しているフィルムは分注チップで貫通可能なものである。
【００１２】
フィルムで封止された試薬や不揮発性液体は、本発明の遺伝子多型解析用反応容器処理装置内においてそのフィルムを貫通して分注チップを挿入することにより分注チップに吸入し、反応部などの他の場所に移送することができる。
【００１３】
この遺伝子多型解析用反応容器の第１の形態は、生体サンプルとして遺伝子増幅反応がなされたものをこの反応容器に注入して遺伝子多型を検出する反応容器である。その第１の形態の反応容器は、試薬収容部として複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部を含み、複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部を含んで遺伝子多型解析用試薬キットを構成しているものである。
プローブ配置部も分注チップで貫通可能なフィルムで封止されていることが好ましい。
【００１４】
遺伝子多型検出用反応容器の第２の形態は、上記の第１の形態の反応用試薬キットに、試薬収容部として複数の多型部位それぞれを挟んで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部をさらに含み、遺伝子増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部をさらに含んだものである。
【００１５】
第２の形態の遺伝子多型解析用反応容器において、増幅反応部の形状の一例として従来のようなウエル形状のものとすることができる。また、増幅反応部の他の形状として、液分注用ポートは分注チップの先端形状に対応した開口形状をもち、分注チップの先端に密着できる素材で構成されているものとすることもできる。分注チップの先端に密着できるそのような素材の典型的なものは弾性素材であるが、それに限らない。増幅反応部は温度を変化させるサイクルを繰り返すことから基板の熱伝導性が高い方が好ましい。そのために、増幅反応部の基板肉厚が他の部分よりも薄くなっていることが好ましい。
また、増幅反応部は反応液を収容する流路をもち、その流路は反応プレートの裏面側に突出して外部の熱源により温度制御されるようになっているものであってもよい。
【００１６】
ここで、多型部位とプライマーの関係を示すと、１つの多型部位を増幅するためにはその多型部位をはさんで結合する一対のプライマーが必要になる。対象となる生体サンプルには複数種類の多型部位が存在するので、それらの多型部位が互いに離れた位置に存在する場合には多型部位の種類の数の２倍の種類のプライマーが必要になる。しかし、２つの多型部位が接近している場合には、それらの多型部位それぞれをはさんでプライマーを結合させて増幅することも、またそれらの２つの多型部位の間にはプライマーを結合させず、２つの多型部位の配列の両側にのみプライマーを結合させて増幅することもできる。したがって、必要なプライマーの種類は必ずしも多型部位の種類の数の２倍になるわけではない。本発明における「複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマー」とは一対のプライマーが１つの多型部位をはさんで結合する場合だけでなく、２又はそれ以上の多型部位をはさんで結合する場合も含めて、複数の多型部位を増幅するのに必要な種類のプライマーという意味で使用している。
【００１７】
本発明による多型検出の対象は特に限定されないが、例えばｃＤＮＡ、ヒトを含む様々な生物の遺伝子、ウイルス及び細菌を含む様々な微生物の遺伝子などが挙げられる。したがって、これら核酸の配列をもつものを核酸増幅のための鋳型核酸とすることができる。また、これら多型検出の対象となる遺伝子としては、ＤＮＡの遺伝子であるかＲＮＡの遺伝子であるかを問わない。
【００１８】
これらの遺伝子を含むサンプルも特に限定されない。すなわち、生体試料、生体由来試料、抽出核酸試料などに対して多型検出を行なうことができる。ここで、生体試料や生体由来試料は、核酸の抽出操作を行なわず、核酸包含体（例えば細胞、真菌、細菌、ウイルスなど、核酸を内部に含有する膜構造体）を維持した形態の試料である。生体試料の例としては、臓器、組織、体液、排泄物などが挙げられる。体液には、血液試料、髄液、唾液、乳などが含まれる。血液試料には、全血、血漿、血清などが含まれる。排泄物には、尿、便などが含まれる。生体由来試料は、生体試料から回収した核酸包含体である。核酸包含体の回収方法は特に限定されないが、遠心・超遠心操作、ポリエチレングリコールなどの共沈剤、吸着担体などを用いた方法が挙げられる。抽出核酸試料は、核酸の抽出操作を行なった試料であり、抽出後さらに核酸を精製した試料であってもよい。抽出方法としては、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤などを用いた方法が挙げられる。精製方法としては、フェノール／クロロホルム、イオン交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズ、磁気ビーズ、タンパク凝集作用を有する試薬などを用いた方法が挙げられる。
【００１９】
本発明で検出できる多型は、特に限定されず、ＳＮＰ及び複数ヌクレオチドからなる配列にわたる多型の両方を含む。本発明においては、多型にはさらに変異も含む。具体的には、本発明で検出できる多型の例としては、ＳＮＰ、挿入多型、欠失多型、反復配列多型などが挙げられる。
【００２０】
ＳＮＰのタイピングには増幅工程に入る段階でゲノムＤＮＡの調整が必須であり、そこに手間とコストがかかる。ＤＮＡを増幅するＰＣＲ法だけに着目すれば、前処理なしで血液などのサンプルから直接ＰＣＲ反応を行なわせる方法も提案されている。そこでは、遺伝子を含むサンプル中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法において、遺伝子を含むサンプル中の遺伝子包含体もしくは遺伝子を含むサンプルそのものを遺伝子増幅反応液に添加して、添加後の該反応液のｐＨが８.５−９.５（２５℃）で遺伝子を含むサンプル中の目的とする遺伝子を増幅する（特許文献４参照。）。
【００２１】
既に構築されているタイピングシステムは、タイピングしようとする複数のＳＮＰ領域をＰＣＲ法で増幅するために、最初に採取するＤＮＡ量は少なくてすむが、ＰＣＲ法で増幅する前に予め生体サンプルからＤＮＡを抽出しておくという前処理が必要である。そのためにその前処理に時間と手間がかかる。
【００２２】
直接ＰＣＲ法とタイピング方法を結びつけたときに、タイピングを目的とする複数のＳＮＰ部位について同時に増幅を行なうような自動化システムはこれまで構築されていなかった。
タイピング工程はインベーダ法やタックマンＰＣＲ法を使用することができる。その場合、タイピング試薬はインベーダ試薬又はタックマンＰＣＲ試薬である。
【００２３】
図１５は本発明の反応容器を遺伝子多型解析用試薬キットとして使用して遺伝子多型を検出する際の検出方法を概略的に示したものである。ここでは、増幅工程にはＰＣＲ法、タイピング工程にはインベーダ法を使用するものとして説明する。
ＰＣＲ工程では血液などの生体サンプル２にＰＣＲ反応試薬４を添加するか、逆にＰＣＲ反応試薬４に生体サンプル２を添加する。
【００２４】
ＰＣＲ反応試薬４は予め調整されたものであり、測定しようとするＳＮＰ部位のための複数のプライマーを含み、それにｐＨを調整するためのｐＨ緩衝液、４種類のデオキシリボヌクレオチド類、熱安定性合成酵素、及びＭｇＣｌ2、ＫＣｌ等の塩類などの必要な試薬が添加されている。その他に、界面活性剤や蛋白などの物質を必要に応じて添加することができる。本発明で用いることのある増幅工程のＰＣＲ法は、目的とする複数のＳＮＰ部位を同時に増幅させるものである。生体サンプルは核酸抽出操作を施しているものであってもよく、核酸抽出操作を施していないものであってもよい。核酸抽出操作を施していない生体サンプルから直接ＰＣＲ法によりそれらのＳＮＰ部位を含む複数のゲノムＤＮＡを増幅させる場合には、それらのＳＮＰ部位のための複数のプライマーを含む遺伝子増幅反応試薬を生体サンプルに作用させ、サンプル２と混合したときに２５℃でのｐＨが８.５−９.５となる条件下でＰＣＲ反応を起こさせる。
【００２５】
ｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せのほか、種々のｐＨ緩衝液を使用することができる。ｐＨ調整された緩衝液は、ＰＣＲ反応試薬の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用するのが好ましい。
プライマーはＰＣＲ反応によるＤＮＡ合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは合成したものであってもよく、生物界から単離したものであってもよい。
【００２６】
合成酵素はプライマー付加によるＤＮＡ合成用の酵素であり、化学合成系も含む。適切な合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ．litoralis ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、Hot Start Taq ポリメラーゼ、KOD ＤＮＡポリメラーゼ、EX TaqＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などがあるが、これらに限定されるものではない。「熱安定性」は、高温下、好ましくは６５−９５℃でもその活性を保持する化合物の性質を意味する。
【００２７】
ＰＣＲ工程では、生体サンプル２とＰＣＲ反応試薬４との混合液を所定の温度サイクルに従ってＰＣＲ反応を行なわせる。ＰＣＲ温度サイクルは、変性、プライマー付着（アニーリング）及びプライマー伸長の３工程を含み、そのサイクルを繰り返すことによりＤＮＡを増幅させる。各工程の一例は、変性工程が９４℃で１分間、プライマー付着工程が５５℃で１分間、プライマー伸長が７２℃で１分間である。生体サンプルはゲノム抽出操作を施したものであってもよいが、ここではゲノム抽出操作を施していないものを使用する。ゲノム抽出操作を施していない生体サンプルであっても、ＰＣＲ温度サイクルの高温下でＤＮＡが血球や細胞から遊離し、ＰＣＲ反応に必要な試薬がＤＮＡに接触して反応が進む。
【００２８】
ＰＣＲ反応終了後、タイピング試薬としてインベーダ試薬６が添加される。インベーダ試薬６には蛍光を発するフレット（FRET）プローブ及びクリベース（Cleavase：構造特異的ＤＮＡ分解酵素）が含まれている。フレットプローブはゲノムＤＮＡと全く無関係な配列をもつ蛍光標識オリゴであり、ＳＮＰの種類によらず配列は共通であることが多い。
【００２９】
次に、インベーダ試薬６が添加された反応液を複数のプローブ配置部８に添加して反応をさせる。各プローブ配置部８には、複数のＳＮＰ部位のそれぞれに対応してインベーダプローブとレポータープローブが個別に保持されており、反応液がインベーダプローブと反応し、そのレポータープローブに対応するＳＮＰが存在すれば蛍光を発する。
【００３０】
インベーダ法については、特許文献３の段落［0032］から［0034］に詳しく記載されている。
各レポータープローブはそれに対応したＳＮＰの塩基に応じて２種類のものを用意すれば、そのＳＮＰがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判別することができる。
【００３１】
タイピング工程で使用するインベーダ法は、アレル特異的オリゴとタイピング対象のＳＮＰを含むＤＮＡとをハイブリダイゼーションすることによりＳＮＰ部位をタイピングする方法であり、タイピング対象のＳＮＰを含むＤＮＡと、タイピング対象のＳＮＰのそれぞれのアレルに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダプローブと、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とを用いる方法である（特許文献３参照。）。
【００３２】
本発明の遺伝子多型解析用反応容器において、前記フィルムはノズルで貫通可能なものであることが好ましい。
プローブ配置部は不揮発性液体を保持できる凹部となっていることが好ましい。
同じ基板に凹部として形成され、サンプルを注入するためのサンプル注入部をさらに備えていてもよい。
プローブ配置部は使用前は剥離可能なシール材で被われていることが好ましい。
タイピング試薬はインベーダ試薬又はタックマンＰＣＲ試薬である。
【００３３】
分注チップはシリンジを備えずに分注ノズルの先端に取り付けられるものであってもよい。その場合には分注動作のためにはノズル機構が別途必要になる。そこで、そのようなノズル機構を不要にすることを目的として、本発明の好ましい形態では、分注チップはカバーの外側から操作するシリンジを備えており、そのシリンジの操作により分注動作を行なうものとすることができる。分注チップがシリンジを備えている場合にはシリンジが分注チップの通路を封止しているので、カバーで覆われた空間の内外が分注チップの通路を介して通じることがない。
【００３４】
分注チップがシリンジを備えていないものである場合には、分注動作時にはノズル機構により密閉状態とすることができるが、反応時や検出時など、分注チップが使用されていないときは分注チップを介して外部空間と連通する。そのような場合でも外部から異物が侵入したり、サンプルやその反応生成物が外部に出るのを阻止できるようにするための好ましい形態として、分注チップが先端部の内部にフィルタを備えているものとすることができる。
【００３５】
反応プレートのプローブ配置部は底部から光学的に測定が可能なように光透過性の材質にて構成されていることが好ましい。
分注チップを保持し移動可能に支持する構造の一例は、ダイアフラムやフィルムのように、気密性をもち柔軟性のある素材によって分注チップを保持し移動可能に支持する構造である。
【００３６】
分注チップを保持し移動可能に支持する構造の他の例は、カバーが反応プレートと一体化されたカバー本体と、反応プレートの表面側の上部に配置されカバー本体に対してシール材により気密を保って水平面内で摺動可能に保持されたカバープレートとからなるものとし、分注チップがそのカバープレートに他のシール材により気密を保って垂直方向に摺動可能に保持されている構造である。
本発明の遺伝子多型解析用反応容器を用いて測定されるサンプルは、生体試料、生体由来試料など種々のものを挙げることができ、特に限定されない。
【００３７】
第２の目的を達成するための本発明の反応容器処理装置は、本発明の遺伝子多型解析用反応容器を装着する反応容器装着部と、図１４に示されるように、その反応容器に取りつけられた分注チップ２０による吸引及び吐出のための機構を備えて液を移送して分注する分注部３６と、反応容器のプローブ配置部の温度をサンプルとタイピング試薬との反応液をプローブと反応させる温度に制御するタイピング反応温度調節部８３ａを少なくとも含む温度調節部と、プローブ配置部に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出部３８と、分注部３６の分注動作、タイピング反応温度調節部８３ａの温度制御及び蛍光検出部３８の検出動作を少なくとも制御する制御部８４と、を備えている。
タイピング反応としてインベーダ反応を使用する場合は、タイピング反応温度調節部３８ａはインベーダ反応のための温度調節部となる。
【００３８】
この反応容器処理装置の他の形態は、反応容器として複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部と、遺伝子増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部をさらに含んだものを使用する。そして、図１４に示されるように、温度調節部として増幅反応部の温度をサンプルと遺伝子増幅試薬との反応液内でＤＮＡを増幅させる遺伝子増幅のための温度に制御する増幅反応温度調節部８３ｂをさらに含み、制御部８４は増幅反応温度調節部８３ｂの温度制御も行なうものとなる。
【００３９】
遺伝子増幅反応としてＰＣＲ反応を使用する場合は、増幅反応温度調節部８３ｂはＰＣＲ反応のための温度サイクル用の温度調節部となる。
制御部８４を外部から操作したり検査結果を表示したりするために、制御部８４にパーソナルコンピュータ（ＰＣ）８６を接続してもよい。
反応容器の液体収容部がフィルムで封止されている場合、そのフィルムで封止された状態で反応容器処理装置に装着されるときには、分注チップによりそのフィルムを貫通して液の吸入を行なうものとなる。
【００４０】
第３の目的を達成するための本発明の診断装置は、本発明の反応容器のうちの遺伝子多型解析用反応容器を処理する本発明の反応容器処理装置と、特定の多型又は複数の多型の組合せについての診断値を記憶したデータベースと、表示装置と、反応容器処理装置により検出された多型解析結果に基づいてデータベースから診断値を読み出して表示装置に表示する診断処理装置とを備えている。
【発明の効果】
【００４１】
本発明の遺伝子多型解析用反応容器は、反応プレートの表面側の空間がカバーで覆われた状態で使用されるので、外部からサンプルに異物が侵入するのを阻止することができるとともに、反応生成物が外部環境を汚染するのも阻止することができるとともに、反応プレートに反応部と反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容しているので、反応部で反応液の表面を不揮発性液体で被うことにより、反応液が反応部で加熱されても反応液が蒸発してしまう事態をさけることができる。
【００４２】
また、タイピング試薬収容部、不揮発性液体収容部及びプローブ配置部を一体的に備えているので、複数の多型部位が増幅されたＤＮＡサンプルについてそれらの多型部位を同時にタイピングすることができ、多型のタイピングを簡単な工程で短時間に行なうことができる。プローブ配置部が分注チップで貫通可能なフィルムで封止されておれば、分注チップによりそのフィルムを貫通して反応液をプローブ配置部に分注することができる。
【００４３】
また、この遺伝子多型解析用反応容器の他の形態は、さらに遺伝子増幅試薬収容部と増幅反応部まで一体的に備えているので、生体サンプルから目的とする複数の多型部位を同時に増幅させた後に、それらの多型部位を同時にタイピングすることができ、多型のタイピングを簡単な工程で短時間に行なうことができる。
【００４４】
試薬や不揮発性液体を封止しているフィルムを分注チップで貫通可能なものとしておけば、反応容器処理装置内での液の移送が容易になる。
プローブ配置部が凹部となっていて不揮発性液体を保持できるようになっておれば、プローブ配置部での反応液の蒸発をより効果的に防ぐことができる。
【００４５】
増幅反応部を備えている遺伝子多型解析用反応容器においては、増幅反応部の液分注用ポートを分注ノズルの先端形状に対応した開口形状にして分注ノズルの先端に密着できる素材で構成しておけば、増幅反応部への混合液の注入動作、及び増幅反応部からの反応液の回収を容易に行なうことができるようになる。
サンプル導入部をさらに備えている場合には、カバーで覆われた空間内へのサンプルの導入操作が容易になる。
【００４６】
試薬を予め反応プレートに収容しておくので、この反応容器を処理する装置の側に試薬を用意する必要がなくなるため、処理装置が簡便なものですむようになる。
分注チップがカバーの外側から操作するシリンジを備えているものとすれば、ノズル機構を別途設ける必要がなくなる。
反応プレートが遺伝子増幅部をさらに備えている場合には、測定対象の遺伝子を微量にしか含んでいないサンプルでもＰＣＲ法やＬＡＭＰ法など遺伝子増幅反応によって遺伝子を増幅して分析精度を高めることができるようになる。
【００４７】
分注チップが先端部の内部にフィルタを備えているものとすれば、分注チップがシリンジを備えていない場合でも、分注チップを通して外部から異物が侵入するのを阻止することができるとともに、分注チップを通して反応生成物が外部環境を汚染するのも阻止することができる。
【００４８】
反応プレートの表面側の空間がカバーで覆われていない場合には、外部からサンプルに他のＤＮＡなどが侵入したり、他のサンプルを汚染したりする問題が生じる。特にＰＣＲ反応などの遺伝子増幅反応を伴なう場合には、外部から侵入した他のＤＮＡも増幅されてしまい、また増幅されて高濃度になった増幅反応産物により他のサンプルを汚染する程度も大きくなるために、汚染による問題がより顕著になる。しかし、本発明により、反応プレートの表面側の空間がカバーで覆われていることにより、遺伝子増幅反応も閉じた空間内で行ない、分析終了後はその空間に閉じたまま廃棄処理するので、遺伝子増幅反応を伴なう場合であっても、外部からの汚染を阻止することができるとともに、他のサンプルを汚染する虞もなくなる。
分注チップを保持し移動可能に支持する構造を、気密性をもち柔軟性のある素材によって実現すれば、分注チップを保持し移動可能に支持する構造を簡単な構成で実現することができる。
【００４９】
本発明の反応容器処理装置では、分注チップにより液の移送を行なうので、簡単な機構で分注動作を行なうことができる。
本発明の診断装置では、多型のタイピングからそれに基づいた診断値の表示までを自動的に実行することができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
図１は一実施例の反応容器を表わしたものであり、（Ａ）は垂直断面図、（Ｂ）は反応プレート５と分注チップ２０を示す平面図、（Ｃ）は内部にフィルタを備えた分注チップ２０ａを示す断面図である。図２は同実施例の外観斜視図であり、（Ａ）は反応容器１を示す斜視図であり、（Ｂ）は未使用状態の反応容器が包装部材３で包装された状態を示している。包装部材３はアルミニウム箔、アルミニウムとＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）フィルムなどの樹脂フィルムとの積層膜などであり、手で引っ張って容易に切り裂いて開放できるように、包装部材３の一部には切裂き片３ａが設けられている。
【００５１】
この反応容器は生体サンプルを注入し、ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅と、インベーダ反応によるＳＮＰ検出を行なうものである。図１に示されるように、平板状の基板１１０の表面側に、サンプル注入部１１２、タイピング試薬収容部１１４、ミネラルオイル収容部１１６、遺伝子増幅試薬収容部１３０、ＰＣＲ終了液注入部１３１及び複数のプローブ配置部１１８が凹部として形成されており、増幅反応部１３２の出入口となるポート１３４ａ，１３４ｂが開口として形成されている。
【００５２】
反応液よりも比重の低い不揮発性液体としては、ミネラルオイル（鉱油）、植物油、動物油、シリコーンオイル又はジフェニルエーテルなどを用いることができる。ミネラルオイルはペトロラタムから蒸留により得られる液体の炭化水素混合物であり、流動パラフィン、流動ペトロラタム、ホワイト油などとも呼ばれ、低比重の軽油も含む。動物油としてはタラの肝油、オヒョウ油、ニシン油、オレンジラフィー油又はサメの肝油などを用いることができる。また、植物油としてはカノーラ油、扁桃油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ピーナツ油、ベニバナ油、ゴマ油、大豆油などを用いることができる。実施例では、不揮発性液体としてミネラルオイルを使用する。そのため、不揮発性液体収容部をミネラルオイル収容部と称す。
【００５３】
サンプル注入部１１２は生体サンプルが注入されるものであり、ＰＣＲ終了液注入部１３１は増幅反応部１３２でのＰＣＲ反応終了液が注入されるものである。サンプル注入部１１２とＰＣＲ終了液注入部１３１は使用前の状態では空の状態で提供される。
タイピング試薬収容部１１４は複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を１０〜３００μＬ収容しており、ミネラルオイル収容部１１６は反応液の蒸発を防ぐためのミネラルオイルを２０〜３００μＬ収容している。遺伝子増幅試薬収容部１３０は複数の多型部位それぞれを挟んで結合する複数のプライマーを含むＰＣＲ反応試薬を２〜３００μＬ収容している。
【００５４】
サンプル注入部１１２、タイピング試薬収容部１１４、ミネラルオイル収容部１１６、遺伝子増幅試薬収容部１３０及びＰＣＲ終了液注入部１３１は、分注チップ２０で貫通可能なフィルム１２０で封止されている。そのようなフィルム１２０は、例えばアルミニウム箔、アルミニウムとＰＥＴフィルムなどの樹脂フィルムとの積層膜などであり、容易に剥がれないようにヒートシールや接着により貼りつけられている。
【００５５】
プローブ配置部１１８は複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持しており、ミネラルオイル収容部１１６からのミネラルオイルが分注されたときにそのミネラルオイルを保持できる凹部となっている。各プローブ配置部１１８の凹部の大きさは、例えば直径が１００μｍ〜５ｍｍ、深さが５０μｍ〜５ｍｍの円形である。プローブ配置部１１８も分注チップ２０で貫通可能なフィルム１２０で封止されている。
【００５６】
基板１１０はプローブ配置部１１８において底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性（それ自身からの蛍光発生が少ない性質のこと）で光透過性の樹脂、例えばポリカーボネートやポリプロピレンなどの素材で形成されている。基板１１０の厚さは０.３〜４ｍｍ、好ましくは１〜２ｍｍである。低自蛍光性の観点から基板１１０の厚さは薄い方が好ましい。
【００５７】
増幅反応部１３２はＰＣＲ反応試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせるものであり、この実施例では２つが用意されている。増幅反応部１３２は、図３に示されるように、反応液を収容する流路１３３をもち、その流路１３３は反応プレート５の基板１１０の裏面側に突出して、反応容器処理装置に設けられた温度調節部のヒータユニット８３ｂ１，８３ｂ２により温度制御されるようになっている。増幅反応部１３２の液分注用ポート１３４ａ，１３４ｂは分注チップ２０の先端形状に対応した形状の開口１３６ａ，１３６ｂをもち、分注チップ２０の先端に密着できるようになっている。より好ましくは、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）やシリコーンゴムなどの弾性素材で構成されている。
【００５８】
増幅反応部１３２で基板１１０の裏面側に突出した部分の下面には、流路１３３部分の熱伝導性を高めるためにアルミニウムフィルム又はアルミニウムプレート１３５が貼りつけられている。ヒータユニット８３ｂ１，８３ｂ２はペルチェ素子とそれにより加熱制御されるヒータプロックとからなり、増幅反応部１３２の流路１３３部分を両側面と下面から挟み込んで加熱する。
【００５９】
プローブ配置部１１８はＰＣＲ反応終了液とタイピング試薬（インベーダ試薬）との反応液がプローブと反応して蛍光を発するようにするための所定の反応温度に加熱される。そのために、図４に示されるように、反応プレート５の基板１１０の裏面側から反応容器処理装置に設けられた温度調節部のヒータユニット８３ａにより温度制御されるようになっている。プローブ配置部１１８は表面側の凹部に対応して基板１１０の裏面側に凹凸が形成されており、その凹凸に嵌めあうようにヒータユニット８３ａが凹凸形状に形成されており、そのヒータユニット８３ａの凹凸によりプローブ配置部１１８の各凹部の裏面側が覆われて加熱されることにより熱効率の向上が図られている。
【００６０】
反応プレート５の表面側の上部には分注チップ２０が配置されている。分注チップ２０はサンプル、試薬及び反応後の反応液を所定の部分に分注するものである。分注チップ２０はシリンジ２２を備えており、カバー２４の外部からこのシリンジ２２を駆動することによって分注動作を行なう。
【００６１】
分注チップとしては、図１（Ｃ）に示されるように、シリンジ２２の代わりに内部にフィルタ２３を備えている分注チップ２０ａでもよい。分注チップ２０ａの場合、フィルタ２３は外部から侵入する異物を吸着してカバー２４で覆われた空間に外部から異物が侵入するのを阻止し、またカバー２４で覆われた空間から反応物や反応生成物が外部に放出されるのを阻止する上でより有効である。
【００６２】
カバー２４は反応プレート５の表面側の上部空間を覆うように設けられている。カバー２４は周辺部を覆うカバー本体２６と、上部を覆うベローズフィルム２８とからなっており、反応プレート５の表面側の空間を外部から遮断している。カバー本体２６は下端部が反応プレート５に固着されているか、又はシール材を介して反応プレート５と一体として組み立てられており、剛性をもってカバー２４の形状を維持している。ベローズフィルム２８は柔軟性のあるダイアフラムや柔軟性のあるフィルムからなり、分注チップ２０をその先端部がカバー２４で覆われた空間の内側、基端部がカバー２４で覆われた空間の外側になるようにして移動可能に保持している。
【００６３】
カバー２４の素材も特に限定されるものではなく、反応プレート５の表面側の上部空間を気密を保って覆うことができるものであればよいが、この反応容器が使い捨て可能であることから、安価に入手可能な素材があることが好ましい。そのような素材として、カバー本体２６には例えばポリプロピレン、ポリカーボネートなどの樹脂素材、ベローズフィルム２８にはナイロン（登録商標）、ポリ塩化ビニール、シリコーンゴムその他のゴム素材などが好ましい。
【００６４】
カバー本体２６の一部又は基板１１０には使用前及び使用後の分注チップ２０を保持するための保持部材３０が設けられており、分注チップ２０は分注時には保持部材３０から取り外されて反応プレート５の表面側の上部を自由に移動できるようになる。
【００６５】
カバー２４の外部から反応プレート５にサンプルを導入するためにカバー本体２６の一部に開口３１が設けられ、その開口３１にはサンプル容器３２が開閉可能に取りつけられている。サンプル容器３２にはサンプルを注入するために上に開いた凹部が形成されている。その凹部にサンプルを注入し、カバー２４の内部に位置決めすると、サンプル容器３２を保持しているプレート３４がカバー本体２６に密着して開口３１を密閉するように、プレート３４の内側に粘着剤が塗布されているか、又はシール材を介してカバー本体２６に挟み込まれるようになっている。したがって、開口３１は密閉可能な開口となっている。
この反応容器は使い捨て可能なものであり、１つのサンプルについて分析を行なった後は反応プレート５がカバー２４で覆われた状態のままでこの反応容器全体を破棄する。
【００６６】
反応プレート５における増幅反応部の形状が従来のようなウエル形状のものであってもよい。図５はそのような増幅反応部を備えた実施例を示したものである。
図５の実施例では、反応プレート５における増幅反応部１３２ａがウエル形状をしている点で図１の実施例のものと異なるが、他の構成は同じである
【００６７】
増幅反応部１３２ａがＰＣＲ反応試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせるものであることに変りはない。この実施例でも増幅反応部１３２ａは２つが用意されている。増幅反応部１３２ａは反応プレート５の基板１１０の表面側に開口をもつウエル形状をなし、基板１１０の裏面側に突出している。増幅反応を行なうときは、図６に示されるように、基板１１０の裏面側に突出している部分が反応容器処理装置に設けられた温度調節部のヒータユニット８３ｃにより温度制御されるようになっている。
【００６８】
次に、図１の実施例の反応容器によりサンプルを分析する動作を説明する。
分析に先立ち、サンプルは開口３１からサンプル容器３２に注入され、その後サンプル容器３２により開口３１が閉じられることによってカバー本体２６にサンプル容器３２が固着されて、サンプルがこの反応容器のカバー２４で覆われた空間内に導入された状態で外部と遮断される。
【００６９】
図７はサンプルが導入された状態で、分注部３６が分注チップ２０とシリンジ２２との係合を開始する状態を示している。
まず、図８に示されるように、シリンジ駆動部であるプランジャホルダ３６ｂが下降してシリンジ２２のプランジャと係合する。
続いて、図９に示されるように、チップホルダ３６ａも下降して分注チップ２０に圧入されて分注チップ２０を保持する。
【００７０】
次に、図１０に示されるように、分注チップ２０が保持部３０から取り外される。これで分注チップ２０はベローズフィルム２８によって外部と遮断された状態で自由に移動できるようになる。
【００７１】
図１（Ｂ）に戻って、この反応容器を用いた分析動作を説明する。
サンプル容器３２によりこの反応容器内に導入されるサンプルは核酸抽出操作を施していない生体サンプル、例えば血液である。サンプルは核酸抽出操作を施した生体サンプルであってもよい。
【００７２】
分注チップ２０はサンプル容器３２へ移動させられてサンプルを吸入し、その後、サンプル注入部１１２へ移動してサンプルを０.５〜２μＬ注入する。
次に、分注チップ２０は遺伝子増幅試薬収容部１３０へ移動し、フィルム１２０を貫通して挿入されてＰＣＲ反応試薬を吸入し、その後、サンプル注入部１２へ移動して５〜２０μL注入する。サンプル注入部１１２では分注チップ２０による吸入と吐出が繰り返されることにより、サンプル液とＰＣＲ反応試薬が混合されてＰＣＲ反応液となる。
【００７３】
次に、そのＰＣＲ反応液が分注チップ２０により増幅反応部１３２へ注入される。このとき、分注チップ２０によりミネラルオイル、ＰＣＲ反応液、ミネラルオイルの順に吸引し、分注チップ２０内では上層にミネラルオイル、中間層にＰＣＲ反応液、下層にミネラルオイルの３層になる状態にする。その後、増幅反応部１３２へ３層の液をそのまま注入する。増幅反応部１３２ではＰＣＲ反応液の両端の表面がミネラルオイルで被われた状態となり、ＰＣＲ反応中の反応液の蒸発を防ぐことができる。
【００７４】
増幅反応部１３２でのＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応終了液がポート１３４ａ又は１３４ａから分注チップ２０により回収される。このとき、ミネラルオイル／ＰＣＲ反応終了液／ミネラルオイルの３層のまま、又はミネラルオイル／ＰＣＲ反応終了液の２層で回収される。ここで、回収を容易にするために、増幅反応部１３２の一方のポート、例えばポート１３４ａからミネラルオイルが注入されてもよい。ＰＣＲ反応終了液は他方のポート１３４ｂに押しやられる。そこで、そのポート１３４ｂに分注チップ２０が挿入され、ＰＣＲ反応終了液が分注チップ２０に吸入される。ＰＣＲ反応終了液の回収に際しては、分注チップ２０にはミネラルオイル／ＰＣＲ反応終了液／ミネラルオイルの３層を吸入してもよく、又はミネラルオイル／ＰＣＲ反応終了液の２層を吸入してもよい。ポート１３４ａ，１３４ｂはその開口１３６ａ，１３６ｂの形状が分注チップ２０の形状に合わせて形成されているので、分注チップ２０がポート１３４ａ，１３４ｂに密着して液漏れを防ぎ、ＰＣＲ反応液の注入と回収の操作が容易である。より好ましくは、ポート１３４ａ，１３４ｂが弾性素材で形成されていることである。
【００７５】
ここで、ポート１３４ａ又は１３４ｂから注入する液体はミネラルオイルに限らず、他の液体であってもよく、好ましくは比重が反応液と同じか反応液よりも低い液体である。
分注チップ２０により増幅反応部１３２から回収された反応終了後のＰＣＲ反応終了液はＰＣＲ終了液注入部１３１に移送されて注入される。
【００７６】
次に、分注チップ２０がタイピング試薬収容部１１４に移送され、フィルム１２０を貫通して挿入されてタイピング試薬を吸入し、タイピング試薬はＰＣＲ終了液注入部１３１に移送されて注入される。ＰＣＲ終了液注入部１３１では分注チップ２０による吸入と吐出が繰り返されることにより、ＰＣＲ反応終了液とタイピング試薬が混合される。
【００７７】
その後、ＰＣＲ反応終了液とタイピング試薬との反応液が分注チップ２０に吸入され、分注チップ２０がフィルム１２０を貫通して各プローブ配置部１１８へその反応液を０.５〜４μＬずつ分注する。各プローブ配置部１１８には、また、分注チップ２０によりミネラルオイル収容部１１６からミネラルオイルも分注される。プローブ配置部１１８へのミネラルオイルの分注は、プローブ配置部１１８への反応液の分注の前後のいずれであってもよい。各プローブ配置部１１８ではミネラルオイルが反応液の表面を被い、タイピング反応温度調節部での加熱を伴なうタイピング反応時間中の反応液の蒸発を防止する。
各プローブ配置部１１８では反応液がプローブと反応して所定のＳＮＰがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板１１０の裏面側から励起光を照射することにより検出する。
【００７８】
図５の実施例の動作は、増幅反応部１３２ａへのＰＣＲ反応液の分注と増幅反応部１３２ａからのＰＣＲ反応終了液の回収の仕方において図１の実施例の動作と違いがあるが、他の動作は同じである。
図５の実施例においてもＰＣＲ反応液は分注チップ２０により増幅反応部１３２ａへ注入される。このとき、ＰＣＲ反応中の反応液の蒸発を防ぐために、増幅反応部１３２ａではＰＣＲ反応液の表面をミネラルオイルの層が被うように、分注チップ２０によりミネラルオイルとＰＣＲ反応液を分注する。増幅反応部１３２でのＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応終了液が分注チップ２０により回収される。ＰＣＲ反応終了液のみを回収してもよく、ＰＣＲ反応終了液をミネラルオイルとともに回収してもよい。増幅反応部１３２ａはウエル形状で上方に向かって開口しているので、分注チップ２０による増幅反応部１３２ａへのＰＣＲ反応液の分注も、増幅反応部１３２ａからのＰＣＲ反応終了液の回収も、図１の実施例のものよりも容易である。増幅反応部１３２ａからＰＣＲ反応終了液を回収した後の動作は図１の実施例と同じである。
【００７９】
以下、各反応試薬の組成を示して、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
ＰＣＲ反応試薬は既知のものであり、例えば特許文献３の段落［００４６］に記載されているような、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及びTaqStart （CLONTECH Laboratories社製）を含む反応試薬を使用することができる。また、ＰＣＲ反応試薬にはAmpDirect（島津製作所製）が混入されていてもよい。プライマーは、例えば、特許文献３の表１に記載されているＳＮＰ  ＩＤ１〜２０、配列番号を１〜４０などを使用することができる。
【００８０】
タイピング試薬としてインベーダ試薬を使用する。そのインベーダ試薬としては、インベーダーアッセイキット（Third Wave Technology社製）を使用する。例えば、シグナルバッファー、フレットプローブ、構造特異的ＤＮＡ分解酵素及びアレル特異的プローブを特許文献３の段落［００４６］に記載されているような濃度に調製されたものである。
【００８１】
上記の実施例では反応プレート５は試薬収容部１１４や１３０を備えているが、反応プレート５は試薬収容部１１４や１３０を備えないものとすることもできる。その場合、試薬はサンプルとともにサンプル容器３２に注入してこの反応容器内に導入したり、又は図示していない別の容器に入れてこの反応容器内に導入したりするように使用することができる。
【００８２】
図１１はカバーの構造が異なる他の実施例を表わしたものである。分注チップ２０を移動可能に支持し、反応プレート５の上部を覆うためのカバーの一部が、図１や図５の実施例ではベローズフィルム２８であったのに対し、図１１の実施例では柔軟に変形するフィルム状の素材２８ａになっている点で異なる。フィルム状の素材２８ａとしては、ベローズフィルム２８と同様に、ナイロン（登録商標）、ポリ塩化ビニール、シリコーンゴムその他のゴム素材などが好ましい。
【００８３】
また、サンプル容器として図１や図５の実施例ではその一辺がカバー本体２６に回動可能に支持されているのに対し、図１１の実施例におけるサンプル容器３２ａは、カバー本体２６に対しスライド可能に取りつけられている点で異なる。このようなサンプル容器３２ａにおいても、サンプル容器３２ａはカバー本体２６から外部に引き出すことによりサンプル容器３２ａに試料を分注することができる。また、サンプル容器３２ａのプレート３４の内側に粘着剤が塗布されており、サンプル容器３２ａをカバー本体２６の内部に押し込むことによりプレート３４の内側で開口３１を密閉したり、シール材により開口３１を密閉したりすることができる点は図１や図５の実施例のものと同じである。
【００８４】
図１２は本発明による反応容器を処理する処理装置の一例の内部を概略的に示した斜視図である。
８０は上記の実施例に示される反応容器を表わしている。反応容器８０は反応容器装着部であるテーブル８２上に装着される。テーブル８２は反応容器８０の下面側に開口をもち、テーブル８２の下部には反応容器８２のプローブ配置部１１８での反応生成物を光学的に検出する検出部３８が配置されている。反応容器８２の温度制御を行なう温調（温度調節）ユニット８３が概略的に示されている。ここでは反応容器８０の側方に配置されているように描かれているが、実際には温調ユニット８３は図３に示されているような増幅反応部１３２の流路１３３部分を両側面と下面から挟み込んで加熱するヒータユニット８３ｂ１，８３ｂ２又は図６に示されているような増幅反応部１３２ａの底部を包み込んで加熱するヒータユニット８３ｃと、図４に示されるようなプローブ配置部１１８を加熱するヒータユニット８３ａを含んでおり、これらは反応容器の下面側に配置されるものである。
テーブル８２は前後方向（Ｘ方向）に移動し、一方、検出部３８はそれに直交する横方向（Ｙ方向）に移動するように支持されている。
【００８５】
テーブル８２の近くには分注チップ２０を駆動する分注部３６がＹ方向とＺ方向に移動可能に取りつけられている。分注部３６は、図４に示されているように、分注チップ２０の基端部と係合して分注チップ２０を保持するチップ保持部３６ａと、分注チップ２０に設けられたシリンジ２２のプランジャと係合してシリンジを駆動するシリンジ駆動部３６ｂを同軸上に備えており、分注チップ２０の移動とシリンジ２２の駆動の両方を行なうことができるものである。
【００８６】
図１３は検出部３８を詳細に示したものである。検出部３８は励起光源として４７３ｎｍのレーザ光を発するレーザダイオード（ＬＤ）や発光ダイオード（ＬＥＤ）９２を備え、そのレーザ光を反応容器の反応プレート５のプローブ配置部１１８の底面に集光して照射する一対のレンズ９４，９６を備えている。レンズ９４はレーザダイオード９２からのレーザ光を集光して平行光にするものであり、レンズ９６は平行にされたレーザ光を反応プレート５の底面に収束させて照射する対物レンズである。対物レンズ９６はまた、反応プレート５のプローブ配置部１１８から発生する蛍光を集光するレンズとしても作用する。一対のレンズ９４，９６の間にはダイクロイックミラー９８が設けられており、ダイクロイックミラー９８は励起光を透過させ、蛍光を反射させるように波長特性が設定されている。ダイクロイックミラー９８の反射光（蛍光）の光路上にはさらにダイクロイックミラー１００が配置されている。ダイクロイックミラー１００は５２５ｎｍの光を反射し６０５ｎｍの光を透過するように波長特性が設定されている。ダイクロイックミラー１００による反射光の光路上には５２５ｎｍの蛍光を検出するようにレンズ１０２と光検出器１０４が配置され、ダイクロイックミラー１００による透過光の光路上には６０５ｎｍの蛍光を検出するようにレンズ１０６と光検出器１０８が配置されている。この２つの検出器１０４，１０８による２種類の蛍光検出により、各プローブ配置位置に固定されたインベーダプローブに対応したＳＮＰの有無と、そのＳＮＰがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかが検知される。標識蛍光体としては、例えばＦＡＭ、ＲＯＸ、ＶＩＣ、ＴＡＭＲＡ、Redmond Redなどを使用することができる。
【００８７】
図１３の検出部３８は１光源による励起光で励起し、２波長の蛍光を測定するように構成されているが、検出部３８としては２波長の蛍光測定のために異なる励起波長で励起できるように２光源を使用するように構成してもよい。
【００８８】
この反応容器処理装置の制御系は図１４に示されたものである。テーブル８２に装着された反応容器８０に対する処理動作を制御するために、専用のコンピュータ（ＣＰＵ）又は汎用のパーソナルコンピュータからなる制御部８４が設けられている。制御部８４は分注チップ２０の基端部と係合した分注部３６による分注チップ２０の移動と分注動作、温調ユニット８３ａ，８３ｂ１，８３ｂ２，８３ｃによる温度調節、及び検出部３８による検出動作を制御する。
【００８９】
制御部８４を外部から操作する入力部として使用したり、検査結果を表示するモニターとして使用したりするために、制御部８４に外部コンピュータとして、例えばパーソナルコンピュータ（ＰＣ）８６を接続してもよい。
【００９０】
本発明の診断装置は、図１６に示されるように、本発明の反応容器のうちの遺伝子多型解析用反応容器を処理する反応容器処理装置２００と、ディスク装置やドラム装置などの記憶装置からなり、特定の多型又は複数の多型の組合せについての診断値を記憶したデータベース２０２と、液晶ディスプレーやＣＲＴなどの表示装置２０４と、反応容器処理装置２００により検出された多型解析結果に基づいてデータベース２０２から診断値を読み出して表示装置２０４に表示するコンピュータからなる診断処理装置２０６とを備えている。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明は遺伝子解析の研究や臨床分野において、種々の自動分析に利用することができ、例えば、人間を初めとして、動物や植物のゲノムＤＮＡの多型、特にＳＮＰ（一塩基多型）を検出することができ、さらにその結果を用いて病気罹患率の診断や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係などの診断のほか、動物や植物の品種判定、感染症診断（感染菌の型判定）などを行なうのにも利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】反応容器の一実施例を表わしたものであり、（Ａ）は垂直断面図、（Ｂ）は反応プレートと分注チップを示す平面図、（Ｃ）は分注チップの他の例を示す概略断面図である。
【図２】同実施例の外観斜視図である。
【図３】同実施例における増幅反応部を示す図であり、（Ａ）はヒータユニットとともに示す正面断面図、（Ｂ）は側面図である。
【図４】同実施例におけるプローブ配置部を示す正面断面図である。
【図５】反応容器の他の実施例を表わしたものであり、（Ａ）は垂直断面図、（Ｂ）は反応プレートと分注チップを示す平面図である。
【図６】同実施例における増幅反応部をヒータユニットとともに示す正面断面図である。
【図７】同実施例においてサンプルが導入された状態を示す垂直断面図である。
【図８】同実施例において分注部のシリンジ駆動部がシリンジのプランジャと係合した状態を示す垂直断面図である。
【図９】同実施例において分注部のチップ保持部が分注チップと係合した状態を示す垂直断面図である。
【図１０】同実施例において分注チップが保持部から取り外された状態を示す垂直断面図である。
【図１１】反応容器の他の実施例を表わす垂直断面図である。
【図１２】反応容器処理装置の一例を示す内部の概略斜視図である。
【図１３】同検出装置における検出部を示す概略構成図である。
【図１４】反応容器処理装置の実施例おける制御系を概略的に示すブロック図である。
【図１５】本発明が関係することのあるＳＮＰ検出方法を概略的に示すフローチャート図である。
【図１６】本発明の診断装置を概略的に示すブロック図である。
【符号の説明】
【００９３】
５      反応プレート
２０      分注チップ
２２      シリンジのプランジャ
２３      フィルタ
２４      カバー
２６      カバー本体
２８      ベローズフィルム
３２，３２ａ      サンプル容器
６４，６４ａ，７１      カバープレート
６６，６８，７２      シール材
８３      反応温度調節部
１１０      基板
１１２      サンプル注入部
１１４      タイピング試薬収容部
１１６      ミネラルオイル収容部
１１８      プローブ配置部
１２０      フィルム
１３０      遺伝子増幅試薬収容部
１３１      ＰＣＲ終了液注入部
１３２，１３２ａ      増幅反応部
１３４ａ，３４ｂ      増幅反応部のポート
１３６ａ，３６ｂ      ポートの開口
２００      反応容器処理装置
２０２      データベース
２０４      表示装置
２０６      診断処理装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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