(57)【要約】【課題】蛍光強度を増加させた分析プローブを容易かつ安価に作製する方法を提供すること。【解決手段】分析対象核酸に特異的な塩基配列を有する対象核酸認識用プローブユニットと、インターナルな塩基に蛍光標識を施した複数の標識プローブユニットを、これらに相補なオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションすることによって連結し、ライゲーションして接合することにより、蛍光体の標識数を制御しつつ容易かつ安価に蛍光強度を増加させた分析プローブを作製する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象核酸に特異的な塩基配列を有する対象核酸認識用プローブユニットと、各々異なる塩基配列を有し、かつ蛍光物質で標識された複数の標識プローブユニットについて、一の前記プローブユニットの5'末端近傍の一部と他の一の前記プローブユニットの3'末端近傍の一部とに相補的な配列を各々有する複数の相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて、前記対象核酸認識用プローブユニットと前記複数の標識プローブユニットと前記複数の相補オリゴヌクレオチドからなるプローブユニット結合体を得る第1のステップと、
前記プローブユニット結合体中の隣接するプローブユニットをライゲーションにより接合して、複数の蛍光物質で標識された分析プローブを得る第2のステップとを有することを特徴とする、分析プローブ製造方法。
【請求項２】
前記ライゲーションを行う前に、前記プローブユニット結合体にDNAポリメラーゼと基質dNTPを作用させて、前記プローブユニット間のギャップを埋めるステップを有することを特徴とする、請求項１に記載の分析プローブ製造方法。
【請求項３】
前記蛍光物質は、前記標識プローブユニットの5'末端及び3'末端から5塩基以上内側に位置する塩基に結合していることを特徴とする、請求項１又は２に記載の分析プローブ製造方法。
【請求項４】
前記蛍光物質は、前記標識プローブユニットの実質的に中央に位置する塩基に結合していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分析プローブ製造方法。
【請求項５】
前記標識プローブユニットは、9塩基以上30塩基以下の長さを有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分析プローブ製造方法。
【請求項６】
前記複数の標識プローブユニットは、各々同一の前記蛍光物質で標識されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の分析プローブ製造方法。
【請求項７】
前記複数の標識プローブユニットは、各々異なる蛍光物質で標識されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の分析プローブ製造方法。
【請求項８】
分析対象核酸に特異的な塩基配列を有する対象核酸認識用プローブユニットと、各々異なる塩基配列を有する複数の標識用プローブユニットについて、一の前記プローブユニットの5'末端近傍の一部と他の一の前記プローブユニットの3'末端近傍の一部とに相補的な配列を各々有する複数の相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて、前記対象核酸認識用プローブユニットと前記複数の標識用プローブユニットと前記複数の相補オリゴヌクレオチドからなるプローブユニット結合体を得る第1のステップと、
前記プローブユニット結合体中の隣接するプローブユニットをライゲーションによって接合する第2のステップと、
前記複数の標識用プローブユニットの各々に蛍光物質を導入して、複数の蛍光物質で標識された分析プローブを得る第3のステップとを有することを特徴とする、分析プローブ製造方法。
【請求項９】
前記ライゲーションを行う前に、前記プローブユニット結合体にDNAポリメラーゼと基質dNTPを作用させて、前記プローブユニット間のギャップを埋めるステップを有することを特徴とする、請求項８に記載の分析プローブ製造方法。
【請求項１０】
前記蛍光物質は、前記標識用プローブユニットの5'末端及び3'末端から5塩基以上内側に位置する塩基に結合していることを特徴とする、請求項８又は９に記載の分析プローブ製造方法。
【請求項１１】
前記蛍光物質は、前記標識用プローブユニットの実質的に中央に位置する塩基に結合していることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の分析プローブ製造方法。
【請求項１２】
前記標識用プローブユニットは、9塩基以上30塩基以下の長さを有することを特徴とする、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の分析プローブ製造方法。
【請求項１３】
前記複数の標識用プローブユニットは、各々同一の前記蛍光物質を導入されることを特徴とする、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の分析プローブ製造方法。
【請求項１４】
前記複数の標識用プローブユニットは、各々異なる蛍光物質を導入されることを特徴とする、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の分析プローブ製造方法。
【請求項１５】
前記対象核酸認識用プローブユニットが、枝分れを有する分岐プローブであることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の分析プローブ製造方法。
【請求項１６】
各々異なる塩基配列を有する複数のプローブユニットと、一の前記プローブユニットの5'末端近傍の一部と他の一の前記プローブユニットの3'末端近傍の一部とに相補的な配列を各々有する複数の相補オリゴヌクレオチドを含む、分析プローブ製造用キット。
【請求項１７】
前記複数のプローブユニットの１つが、分析対象核酸に特異的な塩基配列を有する対象核酸認識用プローブユニットであることを特徴とする、請求項１６に記載の分析プローブ製造用キット。
【請求項１８】
前記対象核酸認識用プローブユニット以外の前記複数のプローブユニットの各々が蛍光物質で標識された標識プローブユニットであることを特徴とする、請求項１７に記載の分析プローブ製造用キット。
【請求項１９】
前記標識プローブユニットは9塩基以上30塩基以下の長さを有し、前記蛍光物質は前記標識プローブユニットの5'末端及び3'末端から5塩基以上内側に位置する塩基に結合していることを特徴とする、請求項１８に記載の分析プローブ製造用キット。
【請求項２０】
分析対象核酸に特異的な塩基配列を有する対象核酸認識用プローブユニットと、各々異なる塩基配列を有し、かつ蛍光物質で標識されたインターナルな塩基を含み、タンデムに連結された複数の標識プローブユニットを含む分析プローブであって、前記蛍光物質で標識されたインターナルな塩基同士が8塩基以上離れていることを特徴とする分析プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特定遺伝子を検出するためのプローブ作製に関する。より詳細には、標的遺伝子に対して蛍光標識を行い、検出するための核酸検出プローブ作製法とプローブ作製キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現量やタンパク質の存在量を高感度・高精度、かつ広範なダイナミックレンジで分析することは、遺伝子やタンパク質の機能解析、疾病の研究や診断において極めて重要な役割を果たす。例えば感染症診断では、感染拡大の回避や効果的な治療のため、初期段階で感染ウイルス遺伝子を定量する必要があり、がん診断では、がんマーカとして知られるタンパク質の血中濃度を測定して診断を行う。また製薬分野では、創薬ターゲットを同定したり、薬効を評価するため、疾病特異的に変動する遺伝子の発現量やタンパク質の存在量を定量する必要がある。
【０００３】
遺伝子発現量を調べる方法としては、リアルタイムPCR法（非特許文献1）が知られている。リアルタイムPCR法は、標準試料と検体中に存在する対象遺伝子をそれぞれ別の反応容器でPCR増幅し、それらの増幅効率を比較して間接的に対象遺伝子を定量する方法である。この方法では、二本鎖DNAに結合して蛍光を発するインターカレータを用いて増幅された対象遺伝子を標識したり、増幅の過程で対象遺伝子に特異的にハイブリダイズして蛍光を発するモレキュラービーコン（非特許文献2）やタックマンプローブ（非特許文献3）を用いて対象遺伝子を標識する。そして、反応容器中の蛍光強度の大きさを測定することで対象遺伝子を定量する。つまり、検体中に存在する対象遺伝子は、対象遺伝子1分子ずつをカウントするのでなく、増幅後に反応容器中に存在する増幅産物全体量によって定量される。なお、遺伝子増幅法としてはPCRの他にNASBA法（非特許文献4）、TMA法（特許文献1）などが挙げられる。
【０００４】
一方、タンパク質の存在量は、標識抗体を用いて標的タンパク質を捕捉し、BF分離後に標識抗体量を蛍光や化学発光などで測定して定量することが多い。この場合も対象タンパク質1分子ずつをカウントするのではなく、反応溶液中の蛍光強度や発光強度によって定量を行う。
【０００５】
遺伝子及びタンパク質検出の際に用いられるプローブとしては、上記のインターカレータやモレキュラービーコン、タックマンプローブの他に、オリゴヌクレオチドに単一の蛍光体を標識した単純なプローブがよく用いられる。モレキュラービーコンやタックマンプローブはオリゴヌクレオチド鎖に対して2つの蛍光体（もしくは1つの蛍光体と1つの消光体）が標識されたプローブである。これらのプローブでは複数の蛍光体間での蛍光エネルギートランスファーを利用して、ホモジニアス検出を可能にしている。また、多色の蛍光検出では、蛍光体の励起効率の差をなくすため蛍光エネルギートランスファーを利用したETプライマー（非特許文献5）も知られている。しかし、実質的に発光に関与する蛍光体は１つであるため、単純なプローブと比較して蛍光強度が桁違いに増加することはない。このため、これらのプローブはプローブ1分子の蛍光強度を測定して定量するといった目的では使用できず、上述のように反応容器全体の蛍光強度を測定するために使用される。
【０００６】
これに対し、プローブ1分子の蛍光強度を増加させることを目的としたプローブとして、分岐プローブ（特許文献2）も開発されている。このプローブでは、オリゴヌクレオチド鎖の途中にリンカーを挿入し、枝状や櫛状に分岐したオリゴヌクレオチドの枝部分それぞれに蛍光体や、化学発光用の酵素を標識することで、プローブ1分子から得られる蛍光強度や発光強度を増加させている。
【０００７】
上記のことから、従来の検出プローブでは、プローブ1分子を蛍光検出するためには、例えばエバネッセント照射（非特許文献6）領域だけを測定するような非常に小さな計測体積で測定する必要があった。その結果、リアルタイムPCRでの定量下限濃度（およそ10-18M）よりも10000倍程度定量下限濃度は高くならざるを得なかった。このため、実質的に遺伝子発現量を調べるには、対象遺伝子を増幅した後に増幅産物全体の量を検出プローブで測定し、増幅前の量を推定する方法が一般的であった。前述の分岐プローブを用いれば対象遺伝子を増幅せずに定量することも可能であるが、分岐プローブの合成そのものが一般的に難しいことに加え、分岐部分それぞれに蛍光体を標識することが困難なため、容易かつ安価な定量は実現できない。
【０００８】
一方、横入射法による単分子計測を用いて計測体積を増大させることにより定量下限濃度を下げて高感度化する方法（非特許文献7）も考えられる。しかし、計測体積を増大するとレーザ密度の低下やバックグラウンドの上昇が起こるため、対象遺伝子を1つの蛍光体で標識しただけでは検出ができない。
【０００９】
【特許文献１】日本国特許第3241717号
【特許文献２】米国特許第5124246号
【非特許文献１】Klein et al., Electrophoresis, 1999, 20, 291-299
【非特許文献２】S. Tyagi, F. R. Kramer, Nature Biotechnology, 1996, 14, 303-308
【非特許文献３】Pamela M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, August 1991, 88, 7276-7280
【非特許文献４】J. Compton, et.al., Nature, 1991, 350, 91-92
【非特許文献５】Jingyue Ju, et al., Nucleic Acids Res., 1996, 24, 1144-1148
【非特許文献６】Funatsu et al., Nature., 1995, 374, 555-559
【非特許文献７】Anazawa et al., Anal. Chem, 2002, 74, 5033-5038
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、蛍光強度を増加させた分析プローブを容易かつ安価に作製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らは、1つの蛍光体で標識されたオリゴヌクレオチドをライゲーション反応でつなぎ合わせることにより、複数の蛍光体で標識されたプローブを安価かつ簡単に作製する方法を見出した。具体的には、5'末端及び3'末端以外のインターナルな塩基に蛍光標識を施したオリゴヌクレオチドを複数種用意し、相補なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせて二本鎖オリゴヌクレオチドとして、ライゲーションによりつなぎ合わせることにより、複数の蛍光体で標識された１つのプローブを作製する。この方法では、蛍光標識を施したオリゴヌクレオチドと、対象核酸を認識する配列を有するオリゴヌクレオチドをつなぎ合わせることにより、対象核酸を認識する配列と複数の蛍光標識を有するプローブが作製される。また、蛍光標識を施したオリゴヌクレオチドは対象核酸を認識する配列とは無関係な配列として設計することで、プローブは対象核酸と1:1の関係でハイブリダイズするように作製される。
【００１２】
すなわち、本発明は、分析対象核酸に特異的な塩基配列を有する対象核酸認識用プローブユニットと、各々異なる塩基配列を有し、かつ蛍光物質で標識された複数の標識プローブユニットについて、一の前記プローブユニットの5'末端近傍の一部と他の一の前記プローブユニットの3'末端近傍の一部とに相補的な配列を各々有する複数の相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて、前記対象核酸認識用プローブユニットと前記複数の標識プローブユニットと前記複数の相補オリゴヌクレオチドからなるプローブユニット結合体を得る第1のステップと、前記プローブユニット結合体中の隣接するプローブユニットをライゲーションにより接合して、複数の蛍光物質で標識された分析プローブを得る第2のステップとを有することを特徴とする、分析プローブ製造方法を提供する。
【００１３】
なお、プローブユニット結合体において、前記プローブユニット間にギャップが存在する場合は、ライゲーションを行う前にDNAポリメラーゼと基質dNTPを作用させてこれらのギャップを埋める。
【００１４】
前記方法において、ライゲーション効率をあげるため、蛍光物質は前記標識プローブユニットの5'末端及び3'末端から5塩基以上内側に位置する塩基に結合していることが望ましい。また、蛍光物質は前記標識プローブユニットの実質的に中央に位置する塩基に結合していることが望ましく、前記標識プローブユニットは9塩基以上30塩基以下の長さを有することが好ましい。
【００１５】
前記複数の標識プローブユニットは、各々同一の前記蛍光物質で標識されていてもよいし、各々異なる蛍光物質で標識されていてもよい。
【００１６】
本発明はまた、分析対象核酸に特異的な塩基配列を有する対象核酸認識用プローブユニットと、各々異なる塩基配列を有する複数の標識用プローブユニットについて、一の前記プローブユニットの5'末端近傍の一部と他の一の前記プローブユニットの3'末端近傍の一部とに相補的な配列を各々有する複数の相補オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて、前記対象核酸認識用プローブユニットと前記複数の標識用プローブユニットと前記複数の相補オリゴヌクレオチドからなるプローブユニット結合体を得る第1のステップと、前記プローブユニット結合体中の隣接するプローブユニットをライゲーションによって接合する第2のステップと、前記複数の標識用プローブユニットの各々に蛍光物質を導入して、複数の蛍光物質で標識された分析プローブを得る第3のステップとを有することを特徴とする、分析プローブ製造方法を提供する。
【００１７】
なお、プローブユニット結合体において、前記プローブユニット間にギャップが存在する場合は、ライゲーションを行う前にDNAポリメラーゼと基質dNTPを作用させてこれらのギャップを埋める。
【００１８】
前記方法において、ライゲーション効率を上げるため、蛍光物質は前記標識用プローブユニットの5'末端及び3'末端から5塩基以上内側に位置する塩基に導入されることが望ましい。また、蛍光物質は前記標識用プローブユニットの実質的に中央に位置する塩基に導入されることが望ましく、前記標識用プローブユニットは9塩基以上30塩基以下の長さを有することが好ましい。
【００１９】
前記複数の標識用プローブユニットは、各々同一の前記蛍光物質を導入されていてもよいし、各々異なる蛍光物質を導入されてもよい。
【００２０】
本発明の分析対象プローブ製造方法において、対象核酸認識用プローブユニットは、枝分れを有する分岐プローブ（米国特許第5124246号）であってもよい。
【００２１】
また、プローブに導入される蛍光物質の数を制御できるように、ライゲーション反応は所定の反応だけが進行するように配列設計し、同じ配列が繰り返しつなぎ合わさったコンカテマーを生じないようにする。
【００２２】
本発明はまた、各々異なる塩基配列を有する複数のプローブユニットと、一の前記プローブユニットの5'末端近傍の一部と他の一の前記プローブユニットの3'末端近傍の一部とに相補的な配列を各々有する複数の相補オリゴヌクレオチドを含む、分析プローブ製造用キットも提供する。
【００２３】
１つの実施形態において、前記複数のプローブユニットの１つは、分析対象核酸に特異的な塩基配列を有する対象核酸認識用プローブユニットであり、これ以外の複数のプローブユニットは分析対象核酸とは非特異的な塩基配列を有する。
【００２４】
また、前記対象核酸認識用プローブユニット以外の前記複数のプローブユニットの各々は蛍光物質で標識された標識プローブユニットであり、好ましくは9塩基以上30塩基以下の長さを有し、その5'末端及び3'末端から5塩基以上内側に位置する塩基に蛍光物質を有する。
【００２５】
さらに本発明は、上記した方法で得られる分析プローブを提供する。本発明のプローブは、分析対象核酸に特異的な塩基配列を有する対象核酸認識用プローブユニットと、各々異なる塩基配列を有し、かつ蛍光物質で標識されたインターナルな塩基を含み、タンデムに連結された複数の標識プローブユニットを含む分析プローブであって、前記蛍光物質で標識されたインターナルな塩基同士が8塩基以上離れていることを特徴とする。
【００２６】
本発明では、蛍光標識を施す標識プローブユニットあるいは標識用プローブユニットの配列は任意に設計でき、分析対象核酸が変化しても共通に使用することができる。よって、対象核酸認識用プローブユニットと、これを標識プローブユニットあるいは標識用プローブユニットに連結するための相補オリゴヌクレオチドの配列を設計しなおすだけでさまざまな対象核酸に対する分析プローブを作製できる。
【００２７】
本発明のプローブを予め作製しておくことで、RCR産物（Lizardi et al., Nature Genetics, 1998, 19, 225-232）を合成することなく短時間で、対象核酸に複数の蛍光標識を施すことができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、インターナルな塩基に蛍光標識したオリゴヌクレオチドをライゲーションによってつなぎ合わせることで複数の蛍光体で標識したプローブを簡便かつ安価に作製することができる。これにより、種々の蛍光検出に用いるプローブの性能を向上させ検出下限を向上させることができる。また、横入射法によりレーザの照射体積を拡大し計測体積を大きく保った状態において、十分な感度で単分子計測することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明を図面に基づいて詳細に説明する。
図1は本発明により蛍光標識プローブを作製し、標的分子に対してハイブリダイズさせ、検出する手順を示した図である。1は対象分子（分析対象核酸）であり、2は対象分子にハイブリダイズするように設計したオリゴヌクレオチド（対象核酸認識用プローブユニット）である。3、4、5、6は5'末端及び3'末端以外のインターナルな塩基に蛍光標識を施したオリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）である。2、3、4、5、6の各オリゴヌクレオチドをそれぞれライゲーションで連結し、複数の蛍光標識を施したオリゴヌクレオチドプローブ7を得る。オリゴヌクレオチドプローブ7を対象分子にハイブリダイズさせて、検出を行う。
【００３０】
オリゴヌクレオチドの配列中で対象分子にハイブリダイズする部分の長さは、特に限定されないが、好ましくは18〜25塩基長程度とする。これはヒトゲノムと同程度の長さをもつランダムな塩基配列に対しては、20塩基弱の長さの配列は存在確率が1回以下となり、対象分子を特異的に認識できるためである。また、蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、特に限定されないが、好ましくは9〜30塩基程度とする。
【００３１】
図2は、ライゲーション反応を具体的に示した模式図である。対象分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（対象核酸認識用プローブユニット）と蛍光標識を施したオリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）に、それぞれに相補な配列をもつオリゴヌクレオチド（相補オリゴヌクレオチド）をハイブリダイズさせて二本鎖を形成させ、ライゲーションにより、対象分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと隣接する蛍光標識を施したオリゴヌクレオチド間、及び隣接した蛍光標識を施したオリゴヌクレオチド間をつなぎ合わせ、複数の蛍光標識を施したオリゴヌクレオチドプローブを作成する。2は対象分子にハイブリダイズするように設計したオリゴヌクレオチド（対象核酸認識用プローブユニット）であり、3、4、5、6は5'末端及び3'末端以外のインターナルな塩基に蛍光標識を施したオリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）である。また、11は2と3の配列の一部と、12は3と4の配列の一部と、13は4と5の配列の一部と、14は5と6の配列の一部それぞれに相補な配列をもつオリゴヌクレオチド（相補オリゴヌクレオチド）である。ライゲーションによって2と3、及び3と4、及び4と5、及び5と6をつなぎ合わせて複数の蛍光標識を施したオリゴヌクレオチドプローブ7を作成する。
【００３２】
蛍光標識オリゴヌクレオチド3、4、5、6と、相補なオリゴヌクレオチド鎖11、12、13、14はそれぞれ想定する配列とだけハイブリダイズし、ミスハイブリダイゼーションが起こらないように、又はハイブリダイゼーションの安定性の指標となるTm値をなるべく揃えるように設計する。ライゲーションは2と3をつなぎ合わせた後に、4をつなぎ、さらに5をつないでいくというように順次行っても良いし、一度に行ってもよい。また、図2(a)に示すように蛍光標識を施したオリゴヌクレオチド鎖だけをつなぎ合わせても良いし、図2(b)に示すように蛍光標識を施したオリゴヌクレオチド鎖と相補鎖両方をつなぎ合わせても良い。
【００３３】
蛍光標識オリゴヌクレオチド3、4、5、6の蛍光標識の位置は、5'末端もしくは3'末端から2〜4塩基目ではライゲーション効率が低くなるため、両末端から5塩基目以降の塩基とする。これは蛍光体及びリンカーの立体障害によって酵素反応に影響が及んでいるためと考えられる。5'末端、3'末端どちらについても同じ傾向があるため、蛍光標識の位置は両末端から4塩基目までを除くインターナルな塩基とする。このため、ライゲーション後に得られる蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブの蛍光体間の距離は、少なくとも8塩基以上離れることとなる。
【００３４】
蛍光体をオリゴヌクレオチドに標識するタイミングは、ライゲーションの前後どちらでも良い。図1及び図2に示すように蛍光標識を施したオリゴヌクレオチドをつなぎ合わせて複数の蛍光標識を施したオリゴヌクレオチドプローブを作製しても良いし、図3に示すように蛍光体を導入するためのリンカー21を有するオリゴヌクレオチド23、24、25、26（標識用プローブユニット）をつなぎ合わせて、オリゴヌクレオチド27を作製した後に、蛍光体28をリンカー部分に導入してプローブ29を作製してもよい。蛍光体を導入するためのリンカーとして、ビオチン、アミノ基、チオール基、などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。リンカーの位置は上述の蛍光体の場合と同様に両末端から4塩基目までを除くインターナルな塩基とする。
【００３５】
また、蛍光標識を施したオリゴヌクレオチドは、相補なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした時に1塩基以上のギャップが生じるように設計し、DNAポリメラーゼでギャップを埋めてからライゲーションを行ってミスハイブリダイゼーションによる想定外のライゲーション産物を防止できるようにしても良い。図4に示すように対象分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド2（対象核酸認識用プローブユニット）、蛍光標識を施したオリゴヌクレオチド33、34、35、36（標識プローブユニット）をそれぞれに相補なオリゴヌクレオチド11、12、13、14（相補オリゴヌクレオチド）とハイブリダイズさせる。オリゴヌクレオチド33、34、35、36の配列は、それぞれに相補なオリゴヌクレオチド11、12、13、14とハイブリダイズした時に1塩基以上のギャップが生じるように設計しておく。次にDNAポリメラーゼにより蛍光標識を施したオリゴヌクレオチド33、34、35、36を伸長させ、ギャップを埋めて、オリゴヌクレオチド43、44、45、46とする。その後、ライゲーションを行い複数の蛍光標識が施されたオリゴヌクレオチドプローブ7を得る。この場合においても、ライゲーションの後に蛍光体をリンカーに導入してもよい。
【００３６】
また、図5(a)と(b)に示すように様々な蛍光体51、52、53、54でそれぞれ標識されているオリゴヌクレオチド56、57、58、59（標識プローブユニット）とそれぞれ異なる対象分子を認識するオリゴヌクレオチド60、61（対象核酸認識用プローブユニット）を用意し、それらをつなぎ合わせて複数種類の蛍光体が複数個導入されたプローブ62、63を取得できる。蛍光体の種類を変化させることでプローブ全体の蛍光波長をコントロールできる。
【００３７】
また、量子ドットは幅広い波長領域で励起できるため、蛍光体として量子ドットを利用すると、さまざまな蛍光波長をもつプローブを簡単に作製できる。対象分子を認識する配列を変化させ、それに応じて利用する蛍光体（量子ドット）の組み合わせを変化させると、複数の対象分子を蛍光波長で識別しつつ、一度の測定で検査することが可能になる。n種類の蛍光体からm種類を選択して利用する場合、nCm種類の蛍光プローブが作成可能である。
【００３８】
分岐プローブに対しても、枝部分のプローブに相補なオリゴヌクレオチド（相補オリゴヌクレオチド）を用意し、ライゲーションを行うことで、枝部分それぞれに複数の蛍光体が導入されたオリゴヌクレオチドを得ることができる。図6に示すように対象分子にハイブリダイズする分岐オリゴヌクレオチド47（対象核酸認識用プローブユニット）に5'末端及び3'末端以外のインターナルな塩基に蛍光標識を施したオリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）3、4、5、6をつなぎ合わせることで、枝部分それぞれに複数の蛍光体を導入できる。これにより、標識数を制御しつつ、複数の蛍光体が導入された分岐プローブ48を作製することができる。
【００３９】
上記の通り、対象分子の配列を認識する配列を持つオリゴヌクレオチド（対象核酸認識用プローブ）と、蛍光標識を施したオリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）をライゲーションによりつなぎ合わせることで、蛍光体の数を制御しつつ、複数の蛍光体で標識されたプローブを作製することが可能となる。別の対象分子を検出する場合には、対象分子を認識する配列だけを変更すれば良く、蛍光標識部分は、対象分子によらずユニバーサルに使用できる。すなわち、本発明はこれらユニバーサルに利用できる蛍光標識プローブを作製するためのキットも提供する。本発明のキットはある特定の対象分子解析用のものであっても良いし、対象分子を認識する配列を持つオリゴヌクレオチドをユーザが用意し、様々な対象分子に対して容易に蛍光標識プローブを作製できる形態であっても良い。キットの必須構成要素である、蛍光体標識オリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）や、蛍光体、オリゴヌクレオチドに蛍光体を導入するためのリンカーは上記の通りである。本発明により、直鎖状オリゴヌクレオチドもしくは分岐状オリゴヌクレオチド鎖に複数の蛍光体が導入されたプローブが得られるが、各蛍光体は8塩基以上離れた塩基に標識される。
【００４０】
本発明のキットは、必須構成要素である前記蛍光体標識オリゴヌクレオチドや、蛍光体とオリゴヌクレオチドに蛍光体を導入するためのリンカーのほか、プローブ作製に必要な他の試薬等を含んでいてもよい。そのようなものとしては、例えば、酵素、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、酵素反応に必要な基質などの試薬類を挙げることができる。さらに、該キットは、１回の反応に必要な試薬を反応容器に分注した状態で供給するものであってもよい。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明について実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４２】
〔実施例1〕複数の蛍光標識を有するオリゴヌクレオチドプローブのライゲーションによる作製方法
本発明の方法を用いて、複数の蛍光標識を有するオリゴヌクレオチドプローブを作製した実施例を示す。18塩基の配列からなり、10塩基目のインターナルなT（チミジン）を蛍光体FITCで標識したオリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）70、71、72、73、74、75、76、77、78、79を10種類用意した（配列番号1〜10）。この10種類のオリゴヌクレオチドと粘着末端を生じるようにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（相補オリゴヌクレオチド）80、81、82、83、84、85、86、87、88、89を10種類用意した（配列番号11〜20）。また、対象分子と、先に用意したオリゴヌクレオチド80の両方にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（対象核酸認識用プローブユニット）90（配列番号21）を用意した。なお、各オリゴヌクレオチドは図7に示すように二本鎖を形成するように配列設計しておく。
【００４３】
各オリゴヌクレオチドを50 pmolずつ混ぜ合わせ、invitrogen社のT4 ligaseを用いて37℃で60分間反応させてライゲーションを行い、10種類の蛍光標識オリゴヌクレオチドと対象分子を認識するオリゴヌクレオチドがつなぎ合わされたプローブ91を得た。塩基長が18塩基の蛍光標識オリゴヌクレオチドの蛍光標識された塩基は10塩基目であるため、5'末端側には9塩基、3'末端側には8塩基の蛍光標識されていない塩基が存在する。従ってライゲーション後に得られたプローブでは18塩基ごとに蛍光体で標識された塩基が存在することになる。
【００４４】
反応終了後にライゲースを失活させ、得られた溶液の蛍光強度を測定した。反応前の蛍光標識オリゴヌクレオチド70と反応により得られたプローブ91の蛍光強度測定結果を図8に示す。蛍光体がプローブ1分子に複数導入されているため、単位濃度あたりの蛍光強度が10倍以上に増加していることが確認できた。
【００４５】
FITC標識オリゴヌクレオチド70：5'-aagtgacctttaaacatg-3'（配列番号1）
FITC標識オリゴヌクレオチド71：5'-aagtgagctttaaaccag-3'（配列番号2）
FITC標識オリゴヌクレオチド72：5'-aagtggtctttaaacgcg-3'（配列番号3）
FITC標識オリゴヌクレオチド73：5'-aagtgtactttaaactgg-3'（配列番号4）
FITC標識オリゴヌクレオチド74：5'-aagtgatctttaaacacg-3'（配列番号5）
FITC標識オリゴヌクレオチド75：5'-acttgacctttccacatg-3'（配列番号6）
FITC標識オリゴヌクレオチド76：5'-acttgagctttccaccag-3'（配列番号7）
FITC標識オリゴヌクレオチド77：5'-acttggtctttccacgcg-3'（配列番号8）
FITC標識オリゴヌクレオチド78：5'-acttgtactttccactgg-3'（配列番号9）
FITC標識オリゴヌクレオチド79：5'-acttgatctttccacacg-3'（配列番号10）
オリゴヌクレオチド80：5'-ggtcacttgcacattt-3'（配列番号11）
オリゴヌクレオチド81：5'-gctcacttcatgtttaa-3'（配列番号12）
オリゴヌクレオチド82：5'-gaccacttctggtttaa-3'（配列番号13）
オリゴヌクレオチド83：5'-gtacacttcgcgtttaa-3'（配列番号14）
オリゴヌクレオチド84：5'-gatcacttccagtttaa-3'（配列番号15）
オリゴヌクレオチド85：5'-ggtcaagtcgtgtttaa-3'（配列番号16）
オリゴヌクレオチド86：5'-gctcaagtcatgtggaa-3'（配列番号17）
オリゴヌクレオチド87：5'-gaccaagtctggtggaa-3'（配列番号18）
オリゴヌクレオチド88：5'-gtacaagtcgcgtggaa-3'（配列番号19）
オリゴヌクレオチド89：5'-gatcaagtccagtggaa-3'（配列番号20）
オリゴヌクレオチド90：5'-ctagccgagtagtgttgggttttaaatgtgc-3'（配列番号21）
【００４６】
〔実施例2〕蛍光標識位置の違いによるライゲーション効率の違い
実施例1と同様にライゲーションにより蛍光標識オリゴヌクレオチド同士をつなぎ合わせ、複数の蛍光体で標識されたプローブの作製を試みた。
【００４７】
図9(a)に示すように、つなぎ合わせる2つの蛍光標識オリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）95、96のうち、一方のオリゴヌクレオチド96の蛍光体の標識位置を変化させてライゲーションを行い、反応産物を電気泳動してライゲーション産物97と未反応物98の量をデンシトメータで測定し、ライゲーション効率を算出した。その結果、図9(b)に示すように、オリゴヌクレオチド96の蛍光体の標識位置が5'末端から4塩基目までの場合にはライゲーション効率が低くプローブ作製に向かないことが確認された。3'末端側も同様の傾向がみられたことから、蛍光体の標識位置が両末端から4塩基以内にあると酵素の働きが阻害されてライゲーション効率が低下するものと考えられた。このため、以降の実施例では蛍光標識の導入位置をオリゴヌクレオチドの5'末端及び3'末端から5塩基以上内側の塩基とすることとした。
【００４８】
〔実施例3〕ライゲーション前に、DNAポリメラーゼによりギャップを埋めるステップを有するプローブの作製方法
本発明の方法を用いて、複数の蛍光標識を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、DNAポリメラーゼにより伸長反応を行った後にライゲーションを行いプローブを作製した実施例を示す。
【００４９】
16塩基の配列からなり、9塩基目のインターナルなT（チミジン）をビオチン標識した5種類のオリゴヌクレオチド100、101、102、103、104（標識プローブユニット）を用意した（配列番号22〜26）。用意した5種類のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする5種類のオリゴヌクレオチド110、111、112、113、114（相補オリゴヌクレオチド）を用意した（配列番号27〜31）。また、対象分子とオリゴヌクレオチド110を認識してハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（対象核酸認識用プローブユニット）105（配列番号32）を用意した。各オリゴヌクレオチドは図10に示すように二本鎖を形成するが、少なくとも1塩基以上のギャップが生じるように配列設計しておく。塩基長が16塩基の蛍光標識オリゴヌクレオチドの蛍光標識された塩基は9塩基目であるため、5'末端側には8塩基、3'末端側には7塩基の蛍光標識されていない塩基が存在する。2塩基のギャップを埋め、ライゲーション後に得られたプローブでは18塩基ごとに蛍光体で標識された塩基が存在することになる。
【００５０】
各オリゴヌクレオチドを50 pmolずつ混ぜ合わせ、dNTPとDNAポリメラーゼを含む緩衝溶液中で37℃、10分間反応させて、オリゴヌクレオチドを伸長させて2塩基のギャップを埋める反応を行った。この伸長反応の後にライゲーションを行い、ビオチン標識オリゴヌクレオチドと対象分子を認識するオリゴヌクレオチドがつなぎ合わされたプローブ106を得た。この際、プローブの相補鎖107もライゲーションでつなぎ合わされる。プローブ106とストレプトアビジン標識した量子ドット108を混ぜ合わせて、複数の量子ドットで標識されたプローブ109を得た。得られたプローブを蛍光顕微鏡にて測定した結果を図11に示す。プローブ109を測定した画像110では蛍光を発するプローブが観測されているのに対し、1つの量子ドットを導入したプローブを測定した画像111では、明確な蛍光像が観測されておらず、本発明によりプローブの蛍光強度を容易に増加できることが確認された。
【００５１】
ビオチン標識オリゴヌクレオチド100：5'- gatgagctttggacca-3'（配列番号22）
ビオチン標識オリゴヌクレオチド101：5'- gatggtctttggacgc-3'（配列番号23）
ビオチン標識オリゴヌクレオチド102：5'- gatgtactttggactg-3'（配列番号24）
ビオチン標識オリゴヌクレオチド103：5'- gatgatctttggacac-3'（配列番号25）
ビオチン標識オリゴヌクレオチド104：5'- tctgacctttttacat-3'（配列番号26）
オリゴヌクレオチド110：5'- gctcatctcatgtcca-3'（配列番号27）
オリゴヌクレオチド111：5'- gaccatctctggtcca-3'（配列番号28）
オリゴヌクレオチド112：5'- gtacatctcgcgtcca-3'（配列番号29）
オリゴヌクレオチド113：5'- gatcatctccagtcca-3'（配列番号30）
オリゴヌクレオチド114：5'- ggtcagatcgtgtcca-3'（配列番号31）
オリゴヌクレオチド105：5'- ctagccgagtagtgttgggttttatggacat-3'（配列番号32）
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明によれば、インターナルな塩基に蛍光標識したオリゴヌクレオチドをライゲーションによってつなぎ合わせることで複数の蛍光体で標識したプローブを簡便で安価に作製することができる。これにより、種々の蛍光検出に用いるプローブの性能を向上させ検出下限を向上させることができ、十分な感度で単分子計測することが可能となる。したがって、本発明は微量核酸の定量やこれを利用した疾病の診断など、基礎研究から臨床に至る幅広い分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図1は、ライゲーションにより複数の蛍光物質で標識されたプローブを作製し、標的分子に対してハイブリダイズさせ、検出する手順を示した図である。
【図２】図2は、オリゴヌクレオチド（プローブユニット）同士をハイブリダイズさせ、その後ライゲーションにより複数のプローブを作製する手順を示した図である。
【図３】図3は、蛍光体を標識していないオリゴヌクレオチド（標識用プローブユニット）同士をハイブリダイズさせ、ライゲーションによりオリゴヌクレオチドをつなぎ合わせた後に蛍光体を標識することで複数の蛍光体で標識されたプローブを作製する手順を示した図である。
【図４】図4は、蛍光体が標識されたオリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）同士をハイブリダイズさせ、DNAポリメラーゼによりギャップを埋めた後にライゲーションを行い、複数の蛍光体が標識されたプローブを作製する手順を示した図である。
【図５】図5は、様々な蛍光体で標識されているオリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）をつなぎ合わせて複数種類の蛍光体が複数個導入されたプローブを作製する手順を示した図である。
【図６】図6は、分岐プローブの枝部分にオリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）をライゲーションさせ、複数の蛍光標識が施された分岐プローブを作製する手順を示した図である。
【図７】図7は、蛍光標識されたオリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）同士をハイブリダイズさせ、その後ライゲーションにより複数の蛍光体が標識されたプローブを作製する手順を示した図である。
【図８】図8は、単一の蛍光体が標識されたプローブと、複数の蛍光体で標識されたプローブの蛍光強度を比較したグラフである。
【図９】図9は、インターナルな塩基に蛍光体が標識されたオリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）をライゲーションする際に、蛍光体が標識された塩基の位置とライゲーション効率の関係を示したグラフである。
【図１０】図10は、ビオチンが標識されたオリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）同士をハイブリダイズさせ、DNAポリメラーゼによりギャップを埋めた後にライゲーションを行い、その後蛍光体を標識して、複数の蛍光体が標識されたプローブを作製する手順を示した図である。
【図１１】図11は、１つの量子ドットが標識されたプローブと、複数の量子ドットが標識されたプローブを蛍光顕微鏡にて計測した画像である。
【符号の説明】
【００５４】
1…対象分子
2…対象分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（対象核酸認識用プローブユニット）
3、4、5、6…5'末端及び3'末端以外のインターナルな塩基に蛍光標識を施したオリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）
7…複数の蛍光標識を施したオリゴヌクレオチドプローブ
11、12、13、14…非標識オリゴヌクレオチド（相補オリゴヌクレオチド）
21…蛍光体を導入するためのリンカー
23、24、25、26…蛍光体を導入するためのリンカーを有するオリゴヌクレオチド（標識用プローブユニット）
27…オリゴヌクレオチド（プローブユニット結合体）
28…蛍光体
29…プローブ
33、34、35、36…5'末端及び3'末端以外のインターナルな塩基に蛍光標識を施し、ギャップが生じるようにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）
43、44、45、46…オリゴヌクレオチド33、34、35、36がそれぞれギャップを埋めるように伸長したオリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）
47…分岐オリゴヌクレオチド（対象核酸認識用プローブユニット）
48…複数の蛍光体が導入された分岐プローブ
51、52、53、54…蛍光体
56、57、58、59…蛍光体で標識されているオリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）
60、61…対象分子を認識するオリゴヌクレオチド（対象核酸認識用プローブユニット）
62、63…複数種類の蛍光体が複数個導入されたプローブ
70、71、72、73、74、75、76、77、78、79…FITCで標識したオリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）
80、81、82、83、84、85、86、87、88、89…オリゴヌクレオチド（相補オリゴヌクレオチド）
90…対象分子とオリゴヌクレオチド80の両方にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（対象核酸認識用プローブユニット）
91…プローブ
95、96…蛍光標識オリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）
97…ライゲーション産物
98…未反応物
100、101、102、103、104…ビオチン標識オリゴヌクレオチド（標識プローブユニット）
110、111、112、113、114…オリゴヌクレオチド（相補オリゴヌクレオチド）
105…対象分子とオリゴヌクレオチド110を認識してハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（対象核酸認識用プローブユニット）
106…ビオチン標識オリゴヌクレオチドと対象分子を認識するオリゴヌクレオチドがつなぎ合わされたプローブ
107…プローブの相補鎖
108…量子ドット
109…プローブ
110、111…画像
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号1−人工配列の説明：FITC標識プローブユニット
配列番号2−人工配列の説明：FITC標識プローブユニット
配列番号3−人工配列の説明：FITC標識プローブユニット
配列番号4−人工配列の説明：FITC標識プローブユニット
配列番号5−人工配列の説明：FITC標識プローブユニット
配列番号6−人工配列の説明：FITC標識プローブユニット
配列番号7−人工配列の説明：FITC標識プローブユニット
配列番号8−人工配列の説明：FITC標識プローブユニット
配列番号9−人工配列の説明：FITC標識プローブユニット
配列番号10−人工配列の説明：FITC標識プローブユニット
配列番号11−人工配列の説明：プローブユニットに相補なオリゴヌクレオチド
配列番号12−人工配列の説明：プローブユニットに相補なオリゴヌクレオチド
配列番号13−人工配列の説明：プローブユニットに相補なオリゴヌクレオチド
配列番号14−人工配列の説明：プローブユニットに相補なオリゴヌクレオチド
配列番号15−人工配列の説明：プローブユニットに相補なオリゴヌクレオチド
配列番号16−人工配列の説明：プローブユニットに相補なオリゴヌクレオチド
配列番号17−人工配列の説明：プローブユニットに相補なオリゴヌクレオチド
配列番号18−人工配列の説明：プローブユニットに相補なオリゴヌクレオチド
配列番号19−人工配列の説明：プローブユニットに相補なオリゴヌクレオチド
配列番号20−人工配列の説明：プローブユニットに相補なオリゴヌクレオチド
配列番号21−人工配列の説明：対象分子にハイブリダイズするプローブユニット
配列番号22−人工配列の説明：ビオチン標識プローブユニット
配列番号23−人工配列の説明：ビオチン標識プローブユニット
配列番号24−人工配列の説明：ビオチン標識プローブユニット
配列番号25−人工配列の説明：ビオチン標識プローブユニット
配列番号26−人工配列の説明：ビオチン標識プローブユニット
配列番号27−人工配列の説明：プローブユニットに相補なオリゴヌクレオチド
配列番号28−人工配列の説明：プローブユニットに相補なオリゴヌクレオチド
配列番号29−人工配列の説明：プローブユニットに相補なオリゴヌクレオチド
配列番号30−人工配列の説明：プローブユニットに相補なオリゴヌクレオチド
配列番号31−人工配列の説明：プローブユニットに相補なオリゴヌクレオチド
配列番号32−人工配列の説明：対象分子にハイブリダイズするプローブユニット
【図１】
2007275006.tif 000003
【図２】
2007275006.tif 000004
【図３】
2007275006.tif 000005
【図４】
2007275006.tif 000006
【図５】
2007275006.tif 000007
【図６】
2007275006.tif 000008
【図７】
2007275006.tif 000009
【図８】
2007275006.tif 000010
【図９】
2007275006.tif 000011
【図１０】
2007275006.tif 000012
【図１１】
2007275006.tif 000013
【配列表】
2007275006000001.app