(57)【要約】      （修正有）【課題】Glu17-オステオカルシンとオステオカルシンを識別することができる抗体を提供する。【解決手段】オステオカルシンの17位がGlu残基であるGlu17-オステオカルシンもしくは17位Glu残基を含むオステオカルシンフラグメントと特異的に結合することを特徴とする抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメント。Glu17-オステオカルシンを標識し、抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメントを用いて競合法により検出する、試料中のGlu17-オステオカルシンの測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オステオカルシンの17位がGlu残基であるGlu17-オステオカルシンもしくは17位Glu残基を含むオステオカルシンフラグメントと特異的に結合することを特徴とする抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
オステオカルシンの21位がGla残基であるGla21-オステオカルシンもしくは21位Gla残基を含むオステオカルシンフラグメントと特異的に結合することを特徴とする請求項１記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
配列番号１または２（配列中XaaはGla残基を示す）記載のペプチド断片と特異的に結合することを特徴とする請求項１または２記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
配列番号３または４（配列中XaaはGla残基を示す）記載のペプチド断片と結合しないことを特徴とする請求項１ないし３記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
配列番号５（配列中XaaはGla残基を示す）記載のペプチド断片もしくはGlu残基を含むそのフラグメントと特異的に結合する請求項１ないし４記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
配列番号５（配列中XaaはGla残基を示す）記載のペプチド断片もしくはGlu残基を含むそのフラグメントと結合し、配列番号６（配列中XaaはGla残基を示す）記載のペプチド断片と結合しないことを特徴とする請求項１ないし５記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメント。
【請求項７】
配列番号５（配列中XaaはGla残基を示す）記載のペプチド断片もしくはGlu残基を含むそのフラグメントを抗原として得られた請求項１ないし６記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメント。
【請求項８】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１ないし７記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメント。
【請求項９】
請求項１ないし８記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメントを含有するGlu17-オステオカルシン検出試薬。
【請求項１０】
Glu17-オステオカルシンを蛍光もしくは発光物質、酵素、またはラジオアイソトープで標識し、請求項１ないし８記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメントを用いて、競合法により検出することを特徴とする、試料中のGlu17-オステオカルシンの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は低カルボキシル化オステオカルシン、特にGlu17-オステオカルシン（Ｎ端より17位にグルタミン酸[Glu]残基を有するオステオカルシンを意味する。以下同じ。）の検出や測定試薬として有効な、抗Glu17-オステオカルシン抗体、およびそれを用いた試料中のGlu17-オステオカルシンの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
〔発明の背景〕
退行期女性の骨量減少に関与する因子として、閉経後の血中女性ホルモンの減少、ビタミンＤ代謝の変化、カルシウム（Ｃａ）摂取不足、運動不足、喫煙などが指摘されている（非特許文献１）。最近、骨折を併発した骨粗鬆症女性の血中ビタミンＫ1およびＫ2濃度が低下していること（非特許文献２;非特許文献３）、ビタミンＫ2の一種であるMK-4を投与することにより退行期女性の骨塩量が増加すること（非特許文献４）が報告され、ビタミンＫ代謝もまた退行期女性の骨塩量減少に関与することが明らかとなった。
【０００３】
骨代謝に対するビタミンＫの作用点に関しては各種の報告があるが、このうちでも骨基質の非コラーゲン性タンパク質のうちの主要タンパク質であるオステオカルシン中のGlu残基のγ-カルボキシル化に対し、ビタミンＫは必須であり（非特許文献５）、γ−カルボキシルグルタミン酸残基（γ-carboxyglutamic acid：Gla残基）はＣａに対する強い親和性を有し、オステオカルシンはこのγ-カルボキシル化を受けて初めて骨の成分であるハイドロキシアパタイトへの結合能を発揮することが知られている（非特許文献６）。さらに高齢者とくに骨折例では、流血中の低カルボキシル化（または非カルボキシル化）オステオカルシン［１残基以上のGla残基がGlu残基となったもの］量が増加することが報告されており（非特許文献７）、退行期骨塩量減少に、ビタミンＫ作用不全による低カルボキシル化オステオカルシンの増加が関与することが示唆されている。
【０００４】
オステオカルシンは、Bone Gla Protein (BGP)又はvitamin K-dependent calcium binding proteinとも呼ばれ、骨芽細胞によって生合成される４９〜５０個のアミノ酸からなるタンパク質であり（分子量約６０００；ヒト及びウシは４９個、ラットは５０個のアミノ酸からなる）、生体のＣａの恒常性の維持に関与しているといわれている。
ヒトオステオカルシンは、配列番号４（配列中XaaはGla残基を示す。以下配列番号の記載がある場合について同じ。）に記載されるアミノ酸配列を有し、その分子中に、Ｎ末端から数えて１７位、２１位及び２４位の３つのGla残基を有する。このように３個のGla残基が存在するため、２3−１＝７通りの低カルボキシル化オステオカルシンのvariant typeが存在する。
【０００５】
〔従来の技術〕
以上のように、骨代謝のマーカーとして、流血中の低カルボキシル化（または非カルボキシル化）オステオカルシンを測定することができれば、骨脆弱症や骨粗鬆症による骨折の危険度を判断するなどの上で有用である。  そのため、例えばハイドロキシアパタイトに対して正常（カルボキシル化）オステオカルシンが親和性を持つことを利用し、これに吸着させた後、低カルボキシル化オステオカルシンを測定する方法（非特許文献７）などがとられている。
例えば、デルマスらは、特許文献１において、生体試料中の低カルボキシル化オステオカルシンの濃度を測定することにより、骨脆弱症や骨粗鬆症骨折の危険性の検査方法を開示しているが、この中の実施例で、ハイドロキシアパタイト吸着後に残ったオステオカルシンの濃度を抗体で測定している。
【特許文献１】特開平６−７８７８８号公報
【非特許文献１】Aloia J, Cohn S, Vaswani AN, Yeh JK, Yen K, Ellis K. 1985 Risk factors for postmenopausal osteoporosis. Am J Med 1985;78:95-100.
【非特許文献２】Hart JP, Shearer MJ, Klenerman L, Catterall A, Reeve J, Sambrook PN, Dodds RA, Bitensky L, Chayen J. Electrochemical detection of depressed circulating levels of vitamin K1 in osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab 1985;60:1268-1269.
【非特許文献３】Hodges SJ, Akesson K, Vergnaud P, Obrant K, Delmas PD. Circulating levels of vitamins K1 and K2 decreased in elderly women with hip fracture. J Bone Miner Res 1993;10:1241-45.
【非特許文献４】Orimo H, Fujita T, Onomura T, Inoue T, Kushida K, Shiraki M., Clinical evaluation of Ea-0167 (menatetrenone) in the treatment of osteoporosis. Phase III double-blind multi-center comparative study with alfacalcidol. Clin Eval 1992;20:45-100.
【非特許文献５】Price PA, Fraser JD, Metz VG. Molecular coning of matrix Gla protein: Implications for substrate recognition by the vitamin K-dependent gamma-carboxylase. Proc Natl Acad Sci USA, 1987;84:8335-8339.
【非特許文献６】Hauschka PV, Lian JB, Cole DE, et al. Osteocalcin and matrix Gla protein: vitamin K-dependent protein in bone. Physiol Rev, 1989;69:990-1047.
【非特許文献７】Plantalech L, Guillaumont M, Vergnaud P, Leclercq M, Delmas PD., Impairment of gamma carboxylation of circulating osteocalcin (bone Gla protein) in elderly women. J Bone Miner Res. 1991;6:1211-16.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、これらの従来技術はハイドロキシアパタイトに吸着しないオステオカルシンを間接的に測定する方法であり、低カルボキシル化オステオカルシンのみを直接測定する方法ではない。
特開平６−７８７８８号公報に開示されるような低カルボキシル化オステオカルシンに特異的なモノクローナル抗体及びモノクローナル抗体を使用した測定系の報告はあるが、１７位、２１位、２４位のどの部位の非カルボキシル化オステオカルシンを測定しているかについての記述はなく、そのためにオステオカルシンの17位、21位、24位のどの部位の非カルボキシル化が各種骨疾患の病態あるいは生理的な骨代謝に重要であるかは明らかとなっていない。
以上の問題点を解決するために、本発明者らは抗低カルボキシル化オステオカルシン抗体について鋭意研究した結果、17位のγ-カルボキシル化グルタミン酸残基の非カルボキシル化が他の部位の非カルボキシル化に比し生理的な条件下で容易に起こることを明らかにし、低カルボキシル化オステオカルシンの７つのvariant typeの中でも、特に17位にGlu残基を有するオステオカルシンが低カルボキシル化オステオカルシンの本態として重要であることを示した（Nakao M, Nishiguchi Y, Nakata M, Kimura T, Sakakibara S. Synthesis of human osteocalcins: g-carboxyglutamic acid at position 17 is essential for a calcium-dependent conformational transition., Peptide Res 1994;7:171-174.）。このような知見の下、配列番号５記載のペプチド断片を抗原として得られた抗Glu17-オステオカルシン抗体が、Glu17-オステオカルシンとGla17-オステオカルシンに対し優れた選択結合性を有することを見いだし、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち本発明は、1)オステオカルシンの17位がGlu残基であるGlu17-オステオカルシンもしくは17位Glu残基を含むオステオカルシンフラグメントと特異的に結合することを特徴とする抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメントであり、2)オステオカルシンの21位がGla残基であるGla21-オステオカルシンもしくは21位Gla残基を含むオステオカルシンフラグメントと特異的に結合することを特徴とする前記1)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメントであり、3)配列番号１または２記載のペプチド断片と特異的に結合することを特徴とする前記1)または2)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメント、詳細に述べればTyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val（配列番号１または２）のペプチド断片と特異的に結合することを特徴とする前記1)または2)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメントであり、4)配列番号３または４記載のペプチド断片と結合しないことを特徴とする前記1)ないし3)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメント、詳細に述べれば、Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val（配列番号３または４）のペプチド断片と結合しないことを特徴とする前記1)ないし3)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメントであり、5)配列番号５記載のペプチド断片もしくはGlu残基を含むそのフラグメントと特異的に結合する前記1)ないし4)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメント、詳細に述べれば、Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val（配列番号５）のペプチド断片もしくはGlu残基を含むそのフラグメントと特異的に結合する前記1)ないし4)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメントであり、6)配列番号５記載のペプチド断片もしくはGlu残基を含むそのフラグメントと結合し、配列番号６記載のペプチド断片と結合しないことを特徴とする前記1)ないし5)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメント、詳細に述べれば、Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val（配列番号５）のペプチド断片もしくはGlu残基を含むそのフラグメントと結合し、Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro Arg Arg Gla Val（配列番号６）のペプチド断片と結合しないことを特徴とする前記1)ないし5)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメントであり、7)配列番号５記載のペプチド断片もしくはGlu残基を含むそのフラグメントを抗原として得られた前記1)ないし6)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメント、詳細に述べれば、Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val（配列番号５）のペプチド断片もしくはGlu残基を含むそのフラグメントを抗原として得られた前記1)ないし6)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメントであり、8)抗体がモノクローナル抗体である前記1)ないし7)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメントであり、9)前記1)ないし8)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメントを含有するGlu17-オステオカルシン検出試薬であり、10)Glu17-オステオカルシンを蛍光もしくは発光物質、酵素、またはラジオアイソトープで標識（ラベル）し、前記1)ないし8)記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体またはそのフラグメントを用いて、競合法により検出することを特徴とする、試料中のGlu17-オステオカルシンの測定方法に関する。
【０００８】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明は、Glu17-オステオカルシンに選択的に結合し、Gla17-オステオカルシンとは結合しない抗体を提供するものである。
【０００９】
本発明抗体は、オステオカルシンのＮ端より17位にGlu残基を有するGlu17-オステオカルシンもしくは17位Glu残基を含むオステオカルシンフラグメントと特異的に結合する。
17位Glu残基を含むオステオカルシンフラグメントとは、17位Glu残基を含み、全体として６残基以上のアミノ酸を含むペプチドフラグメントであることが望ましい。より好ましくは21位のGla残基を含むペプチドフラグメントである。さらに、Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val（配列番号１または２）のペプチド断片と結合性を有し、Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val（配列番号３または４）のペプチド断片と結合しないことが好ましい。
【００１０】
本発明にかかる抗Glu17-オステオカルシン抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、さらにはその反応性を有する限り、抗体のフラグメントであっても良い。
この抗体のフラグメントとは、Ｆｃ’あるいはＦｃ領域を除去したＦ(ab')2、Ｆａｂ’あるいはＦａｂ画分、あるいはその重合体であってもよく、また、そのキメラ抗体であってもよい。
【００１１】
本発明抗体は、配列番号５記載のペプチド断片もしくはGlu残基を含むそのフラグメントを抗原ペプチド（またはエピトープ）として用いることにより作成することができる。
ここで、配列番号５に記載されたペプチド断片（Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val）とは、オステオカルシンの10位から22位にわたるペプチドフラグメントのうち、17位のGla残基がGlu残基に置換された１３個のアミノ酸からなるポリペプチドである。Glu残基を含むそのフラグメントとは、配列番号５記載のペプチド断片中、Glu残基を含むその一部のフラグメントをいう。
また、エピトープとは構造既知の抗原決定基を意味し、タンパク質（ポリペプチド）においては、一般に少なくとも６個のアミノ酸で構成される（６個のアミノ酸で構成されるポリペプチドが抗体と結合することは特表昭60-500684号公報に開示されている）。そのため、本願における抗Glu17-オステオカルシン抗体の作成にあたっては、配列番号５記載のペプチド断片をエピトープとして用いるだけでなく、Glu残基を含むそのフラグメントをエピトープとして調製することも可能であり、好ましくは少なくとも６以上の連続したペプチド断片が選択される。
【００１２】
このように調製された抗体の中から、特に好ましくは配列番号３または４記載のペプチド断片（Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla/Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val）および／または配列番号６記載のペプチド断片（Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Gla Pro Arg Arg Gla Val）と結合しないものが選択される。
【００１３】
本発明にかかる抗体は、低カルボキシル化オステオカルシン検出用試薬、特にGlu17-オステオカルシンの検出に利用することができ、近年問題となっている骨脆弱症や骨粗鬆症による骨折の危険性の判断にも有用である。
本発明にかかるGlu17-オステオカルシンの検出試薬は、本発明抗体を含むことにより調製することができ、例えば標準抗原、抗原希釈用溶液、発色剤、基質溶解液、洗浄液、反応停止液などの他、一般に検出試薬の原料として用いられる成分を配合して目的とするキットとすることができる。
血液、血漿、血清、尿などの試料中のGlu17-オステオカルシン量を測定するには、蛍光もしくは発光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、または125Ｉなどのラジオアイソトープで標識（ラベル）したGlu17-オステオカルシンを、試料中の抗原と本発明抗体に対して競合させることにより、試料中のGlu17-オステオカルシンを測定することができる。
【００１４】
本発明抗体は、以上のような性質を有するものであるが、その中でも特に好ましい抗体を挙げると、1)Glu17-オステオカルシンに特異的に結合する、2)Glu17,Gla21-オステオカルシンに特異的に結合する、3)配列番号１または２記載のペプチド断片と特異的に結合し、配列番号３または４記載のペプチド断片と結合しない、4)配列番号５記載のペプチド断片と特異的に結合し、配列番号６記載のペプチド断片と結合しない、または5)[配列番号１または２]および[配列番号５]記載のペプチド断片と特異的に結合し、[配列番号３または４]および[配列番号６]記載のペプチド断片と結合しないなどの性質を有する抗体が挙げられる。
【００１５】
したがってこれらの性質を有する抗体を使用すれば、17位にGlu残基を有する４つの低カルボキシル化オステオカルシンのvariant typeを識別することができ、さらに、その中で17位にGlu残基および21位にGla残基を有する２つの低カルボキシル化オステオカルシンのvariant type（17位Glu残基、21位Gla残基、24位GlaまたはGlu残基）を識別することが可能となる。
【００１６】
〔発明の実施の形態〕
本発明抗体の調製は配列番号５記載のGlu17-オステオカルシンのペプチドフラグメントを抗原とし、必要に応じてキャリアータンパク質（ＢＳＡ[bovine serum albumin]やＯＶＡ[ovalbumin]など）との複合体を作り、これを動物に接種して免疫する。また、Tam JPによって開発されたＭＡＰ系（Maltiple antigen peptide system）を使用して免役することもできる（Tam JP,Synthetic Peptide:Approaches to Biological Problems,p3-18,1989;Tam JP,PNAS USA,85,5409,1988;Tam et al.,J.Exp.Med.,171,299,1990;Tam and Lu.,PNAS USA,86,9084,1989）。  上記免疫動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合し、配列番号５記載のペプチド断片および低カルボキシル化オステオカルシン（Glu17-オステオカルシン）に強い特異性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより調製される。その操作は従来既知の方法に準ずればよい。
【００１７】
免疫抗原としては天然もしくはワーファリンによって誘発されたGlu17-オステオカルシンのフラグメント、遺伝子組換手法により得られたGlu17-オステオカルシンのフラグメント、天然もしくは遺伝子組換えによりえられたオステオカルシンを熱的もしくは化学的に脱カルボキシル化の操作をしたもののフラグメント、または化学合成手法により生産したものなどいずれも使用できる。
【００１８】
しかし、天然物のGlu17-オステオカルシンを免疫用抗原とするために分離・精製することは、その生体試料中濃度がとても低いことから実用的ではない（例えば血中の含量はpg/mlのオーダーであり、免疫に供する量を確保するには数トンの血液が必要である）。もし大量に試料を使うことができるのであれば、公知の分離・精製法を適宜組み合わせて実施することができる。これらの公知の方法としては塩析、溶媒沈殿法、透析ゲルろ過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００１９】
従って実用的には、免疫抗原用Glu17-オステオカルシンのフラグメントペプチドの調製は化学合成法、上記遺伝子組換法あるいは天然物を分解する方法などが用いられるが、簡便には、常法によりペプチドシンセサイザーを用いて行うことができる。
【００２０】
抗原とキャリアタンパク質の複合体の調製は種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、マレイミド活性エステル等が使用できる。
キャリアタンパク質は牛血清アルブミン、サイログロブリン、ヘモシアニン等の常用されているものでよく、通常１〜５倍量の割合でカップリングさせる方法が用いられる。
【００２１】
免疫される動物としてはマウス、ラット、ウサギ、モルモットなどがあげられ、接種方法は皮下、筋肉あるいは腹腔内に投与される。投与に際しては完全フロイントアジュバンド（ＦＣＡ：Freund's complete adjuvant）や不完全フロイントアジュバンド（ＦＩＡ：Freund's incomplete adjuvant）と混和して投与してもよく、投与は通常２〜５週毎に１回ずつ行われる。免疫された動物より血液を採取し、血清を分離し、血清より抗体を硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなど常用されている方法で精製してポリクローナル抗体とする。また、免疫された動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合させられハイブリドーマとして単離される。骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のものであることが好ましいが、異種間においても可能な場合もある。
【００２２】
細胞融合の操作は既知の方法、たとえばケーラーとミルスタインの方法（Nature, 256, 495, 1975）に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコールやセンダイウイルスなどが挙げられるが、通常20〜50％程度の濃度のポリエチレングリコール（平均分子量1000〜4000）を用いて20〜40℃、好ましくは30〜37℃の温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常１：１〜１０：１程度、約１〜10分間程度反応させることにより細胞融合を実施することができる。  抗Glu17-オステオカルシン抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の免疫化学的方法が使用できる。たとえば、Glu17-オステオカルシンをコートしたマイクロプレートを用いるＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay ）法、抗免疫グロブリン抗体をコートしたマイクロプレートを用いるＥＩＡ（enzyme immunoassay）法、Glu17-オステオカルシンを含むサンプルを電気泳動後ニトロセルロース転写膜を用いるウエスタンブロット法などがあげられる。
【００２３】
このようなウエルから更に例えば限界希釈法によってクローニングを行いクローンを得る。ハイブリドーマの選別、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、10〜20％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ1640）で行われる。このようにして得られたクローンはあらかじめブリスタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内へ移植し、10〜14日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。また、該クローンを培養し、その培養物を抗体精製の原料とすることもできる。モノクローナル抗体の回収は免疫グロブリンの精製法として既知の方法を用いればよく、たとえば、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利用、さらにアフィニティクロマトグラフィなどの手段により容易に達成することができる。
【００２４】
本発明によって得られた抗Glu17-オステオカルシン抗体を用いる免疫学的方法により生体試料中のGlu17-オステオカルシン（正常オステオカルシンが有する17位のGla残基が脱カルボキシル化してGlu残基になったものや、ビタミンＫの代謝異常等により生じたオステオカルシンの17位のＰＩＶＫＡ体(Protein Induced by Vitamin K Absence or Antagonist)などの17位非カルボキシル化オステオカルシンなどが含まれる）の定性、定量を行うことができる。
免疫学的方法としては、生体試料を必要に応じて適切に処理、たとえば血液、血漿、血清、尿などを試料とすることができる。また、細胞の分離、抽出操作などした試料についても試料とすることができる。これらの試料について、免疫組織染色法、ＥＬＩＳＡ法やＲＩＡ（radioimmunoassay）法などの免疫測定法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。免疫組織染色法あるいは免疫測定法は、例えば標識化抗体を用いる直接法、該抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行いうる。標識化剤としては螢光物質・発光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質はいずれも使用できる。
【実施例】
【００２５】
以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例１．抗原ペプチドの合成
抗原とする配列番号５記載のペプチドを米国Applied Biosystems社製のペプチド自動合成機で合成した。合成法としては、高分子樹脂担体を用いる固相合成法によりＣ端より逐次合成を行い、相当する保護ペプチド樹脂を合成した。保護ペプチド樹脂から酸処理にて目的とする粗ペプチドは逆相高速液体クロマトグラフィーで精製を行い目的とする抗原用のペプチドを得た。
このペプチドは、Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Valの１３残基で、正常なオステオカルシンの10位から22位にわたるペプチドフラグメントのうち、17位のGla残基がGlu残基に置換されたものである。Ｎ末端にコンジュゲーションのためにシステイン残基を付加した。
【００２７】
実施例２．抗体の調製
このように合成したペプチドをＢＳＡ、ＯＶＡなどに結合させて高分子とし、これを免疫原としてマウスに免疫した。具体的には、前記のペプチド断片を、まず０日目に免疫前血清の力価測定用血液をサンプリングした後、マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）２匹にＦＣＡとエマルジョンを作り、５０μg／匹を腹腔に２〜３ヶ月間定期的に投与して免疫した。
その後脾臓細胞を採取し、Myeloma細胞P3U1と融合した。これを培養し、HAT培地で選択した。このうち、配列番号５に記載のペプチド断片および配列番号１または２記載の低カルボキシル化オステオカルシン（Glu17-オステオカルシン）と反応し、配列番号３または４記載のオステオカルシンおよび配列番号６に記載のペプチド断片と反応しない融合細胞をクローニングした。ＩｇＧを分泌する細胞のみを選択し、培養上清中のＩｇＧをprotein Aまたはprotein Gで精製して精製モノクローナル抗体を得た。
【００２８】
実施例３．力価検定など
抗体の性質や力価の検定はＥＬＩＳＡ法で検討した。
ＥＬＩＳＡは、マイクロプレート（住友ベークライト社製；Ｈタイプ、Ａタイプ）を用い、まず、抗原ペプチドをコーティングした。カゼイン溶液でブロッキングした後、培養上清あるいは精製モノクローナル抗体を適当に段階的に希釈して加え、固相上で抗原抗体反応を行わせて、免疫複合体を形成させ、さらに酵素標識第２抗体（抗マウスＩｇＧ抗体）を反応させた。洗浄後、固相上に結合した酵素活性を測定することで抗体の産生の有無、力価変動、特異性を検討した。
ここで得られた抗体は、配列番号５記載のペプチドとは反応したが、配列番号６記載のペプチドとは交差反応を示さなかった。
【００２９】
実施例４．Glu17-オステオカルシン のラジオイムノアッセイ
Glu17-オステオカルシンを酵素法にて125Iで標識し標識物質とした後、Glu17-オステオカルシンのラジオイムノアッセイを、抗Glu17-オステオカルシン抗体、標準物質としてGlu17-オステオカルシン(1-49)あるいはGla17-オステオカルシン(1-49)を用い、さらに0.5％ウシ血清アルブミン、5 mM Tris-塩酸緩衝液(pH 7.4)を緩衝液として用いることにより行った。
また各ラジオイムノアッセイ系における緩衝液中カルシウム濃度依存性を検討するため、塩化カルシウムを0.03〜10 mM の濃度にて添加した。さらに緩衝液中カルシウム濃度 0 mM の条件にはEGTA 1 mM を添加した。Ｂ/F 分離は二抗体法にて行った。
ラジオイムノアッセイ系におけるGlu17-オステオカルシン(1-49)およびGla17-オステオカルシン(1-49)の標準曲線の緩衝液中カルシウム濃度依存性を検討した結果を図１に示す。
いずれのラジオイムノアッセイ系においても各２種の標準曲線は緩衝液中カルシウム濃度依存性を示した。抗体として実施例２で得られた抗Glu17-オステオカルシン抗体を用いたラジオイムノアッセイ系では緩衝液中カルシウム濃度が０ mM あるいは0.03 mM のときに標準物質Glu17-オステオカルシン(1-49)では良好な標準曲線が得られた。さらに、同抗体はGla17-オステオカルシン(1-49)を高濃度まで認識せず、Glu17-オステオカルシン(1-49)とGla17-オステオカルシン(1-49)を分離識別することが可能であった。
【００３０】
実施例５．ヒト血漿Glu17-オステオカルシン濃度の測定
ヒト血漿Glu17-オステオカルシン濃度のラジオイムノアッセイに、抗Glu17-オステオカルシン抗体を用い、測定緩衝液としては0.5％ウシ血清アルブミン、1 mM EGTA、5 mM Tris-塩酸緩衝液 (pH 7.4)を用いた。
いずれの血漿の希釈曲線もGlu17-オステオカルシン (1-49）の標準曲線と良好な平行関係を示した。
この結果よりヒト血中にもGlu17-オステオカルシン免疫活性が存在することを示すとともに、ヒトの体内におけるGlu17-オステオカルシンの測定に本ラジオイムノアッセイ系が有効であることが示された。
以下のヒト血漿Glu17-オステオカルシン濃度測定時には全ての血漿検体につき希釈曲線を作成し標準曲線の上下端20％に入る測定値は除外し、標準曲線の中央80％に位置する希釈の血漿検体の値のみを採用した。
【００３１】
実施例６．女性における血漿Glu17-オステオカルシン濃度の加齢変化
健常女性322例における血漿Glu17-オステオカルシン濃度の平均値の加齢変化を図２に示した。
肥満度BMI (body mass index) が正常範囲 (18〜26）を示す健常かつ歩行可能な16歳〜93歳の女性322例を対象とし、早朝空腹時にEGTAチューブに採血し直ちに血漿を分離したものを、-20℃にて保存した後測定に供した。
血漿Glu17-オステオカルシン濃度は加齢とともに上昇し、特に閉経前後および高齢者での上昇率が高いことが窺えた。この血漿Glu17-オステオカルシン濃度の加齢による上昇はPlantalechらの報告（Plantalech L, Guillaumont M, Vergnaud P, Leclercq M, Delmas PD., Impairment of gamma carboxylation of circulating osteocalcin (bone Gla protein) in elderly women. J Bone Miner Res. 1991;6:1211-16.）と類似するものである。
【００３２】
実施例７．健常女性における血漿Glu17-オステオカルシン濃度と腰椎骨塩量との関係
女性における血漿Glu17-オステオカルシン 濃度と、二重Ｘ線吸収骨量測定（Lunar社製DPXを使用）にて測定した第二〜第四腰椎骨塩量との相関を検討した。
その結果として、対象とした全322例の女性の血漿Glu17-オステオカルシン濃度と、各年齢における日本人の腰椎骨塩量の平均値を０とし標準偏差を１として各個人の骨塩量が各年齢の日本人平均値よりどのくらい解離しているかを示す値であるZ score との相関を図３に示した。全女性においては血漿Glu17-オステオカルシン 濃度が高値を示す例ほどこの腰椎骨塩量 Z score は低下しており、両値の間には p<0.001 の負の相関関係を認めた。
さらに、図４にはこれらの女性を16歳〜29歳の若年群、30歳〜49歳の壮年群、50〜69歳の閉経後群、70〜93歳の高齢群の４群に分け、それぞれの年代での血漿Glu17-オステオカルシン 濃度と腰椎骨塩量の絶対値との相関を検討した結果を示す。各年代群の中では50歳〜69歳の閉経後群において血漿Glu17-オステオカルシン 濃度と腰椎骨塩量絶対値との間に負の相関を認めた。
上記のように、健常女性の血漿Glu17-オステオカルシン濃度と腰椎骨塩量Z scoreの間に p<0.001 の有意の負の相関関係を認め、全年齢を通じて年齢相応よりも骨塩量が低下している例において血漿Glu17-オステオカルシン 濃度は高値を呈することが示された。また女性における年代別での血漿Glu17-オステオカルシン 濃度と腰椎骨塩量の絶対値との相関の検討では各50歳〜69歳の閉経後群において血漿Glu17-オステオカルシン 濃度と腰椎骨塩量絶対値との間に負の相関を認め、この時期の女性の著しい骨量減少、すなわち閉経後骨粗鬆症に血漿Glu17-オステオカルシン 濃度高値が関与することが推察された。今回の検討においては健常女性を対象としたが、罹患頻度が極めて高い骨粗鬆症以外にも、多種の骨疾患における低カルボキシル化オステオカルシンの病態生理的意義の解明およびビタミンＫ作用の解明に本測定系が有用であると考えられる。
以上のように、本発明抗体を用いることにより、Glu17-オステオカルシンを容易に検出・測定することができ、それが関連する骨疾患の診断などに非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】抗Glu17-オステオカルシン抗体を用いたGlu17-オステオカルシンのラジオイムノアッセイの標準曲線の緩衝液中カルシウム濃度依存性を示す図である。標準物質としてはGlu17-オステオカルシン(1-49) 「○」（丸）あるいはGla17-オステオカルシン(1-49) 「◇」（四角）を用いた。
【図２】健常女性322例における血漿Glu17-オステオカルシン濃度の加齢変化を示す図である。
【図３】健常女性322例における血漿Glu17-オステオカルシン濃度と腰椎骨塩量Z scoreの相関を示す図である。
【図４】各年代女性における血漿Glu17-オステオカルシン濃度と腰椎骨塩量の絶対値との相関を示す図である。
【図１】
2007045834.tif 000002
【図２】
2007045834.tif 000003
【図３】
2007045834.tif 000004
【図４】
2007045834.tif 000005
【配列表】
2007045834000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年10月27日(2006.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または２（配列中XaaはGla残基を示す）記載のオステオカルシンと特異的に結合することを特徴とする抗Glu17-オステオカルシン抗体の製造方法であって、配列番号５記載のペプチド断片を抗原エピトープとして含む抗原を用いて非ヒト動物を免疫する段階を含むことを特徴とする抗Glu17-オステオカルシン抗体の製造方法。
【請求項２】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする、請求項１に記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体の製造方法 。
【請求項３】
配列番号１または２（配列中XaaはGla残基を示す）記載のオステオカルシンと特異的に結合し、配列番号３または４（配列中XaaはGla残基を示す）記載のオステオカルシンとは結合しないことを特徴とする抗Glu17-オステオカルシン抗体の製造方法であって、配列番号５記載のペプチド断片を抗原エピトープとして含む抗原を用いて非ヒト動物を免疫する段階、ならびに、配列番号３または４（配列中XaaはGla残基を示す）記載のオステオカルシンとは結合しない抗体を選択する段階を含むことを特徴とする抗Glu17-オステオカルシン抗体の製造方法。
【請求項４】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする、請求項３に記載の抗Glu17-オステオカルシン抗体の製造方法。
【請求項５】
配列番号１または２（配列中XaaはGla残基を示す）記載のオステオカルシンと特異的に結合することを特徴とする抗Glu17-オステオカルシンモノクローナル抗体の製造方法であって、
１）配列番号５記載のペプチド断片を抗原エピトープとして用いて非ヒト動物を免疫する段階、
２）前記動物の脾臓細胞を採取し、ハイブリドーマを作製する段階、
３）配列番号１または２（配列中XaaはGla残基を示す）記載のオステオカルシンと特異的に反応する抗体を分泌する細胞を選択する段階、
４）分泌された抗体を精製する段階、
を含むことを特徴とする抗Glu17-オステオカルシンモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項６】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする、請求項５に記載の抗Glu17-オステオカルシンモノクローナル抗体の製造方法 。
【請求項７】
配列番号１または２（配列中XaaはGla残基を示す）記載のオステオカルシンと特異的に結合し、配列番号３または４（配列中XaaはGla残基を示す）記載のオステオカルシンとは結合しないことを特徴とする抗Glu17-オステオカルシンモノクローナル抗体の製造方法であって、
１）配列番号５記載のペプチド断片を抗原エピトープとして用いて非ヒト動物を免疫する段階、
２）前記動物の脾臓細胞を採取し、ハイブリドーマを作製する段階、
３）配列番号１または２（配列中XaaはGla残基を示す）記載のオステオカルシンと特異的に反応する抗体を分泌する細胞を選択する段階、
４）配列番号３または４（配列中XaaはGla残基を示す）記載のオステオカルシンとは結合しない抗体を分泌する細胞を選択する段階
５）分泌された抗体を精製する段階、
を含むことを特徴とする抗Glu17-オステオカルシンモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項８】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする、請求項７に記載の抗Glu17-オステオカルシンモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項９】
配列番号５記載のペプチド断片。