(57)【要約】【課題】電気化学検出用電極を、核酸を再現性、安定性よく固定させることが可能なものとする。【解決手段】基板１上に形成された核酸を固定するための電極について、基板１の直上に相対的に結晶性が低い第一Ａｕ層２と、第一Ａｕ層２上に、相対的に結晶性が高く核酸を固定する面がＡｕ（１１１）面からなる第二Ａｕ層３との少なくとも２層からなるものとする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に形成された核酸を固定するための電極であって、該電極が、前記基板の直上に相対的に結晶性が低い第一Ａｕ層と、該第一Ａｕ層上に、相対的に結晶性が高く前記核酸を固定する面がＡｕ（１１１）面からなる第二Ａｕ層との少なくとも２層からなることを特徴とする電気化学検出用電極。
【請求項２】
前記第一Ａｕ層の（１１１）面存在率が３０％未満であって、前記第二Ａｕ層の（１１１）面存在率が３０％以上であることを特徴とする請求項１記載の電気化学検出用電極。
【請求項３】
基板上に形成された核酸を固定するための電極の製造方法であって、前記基板上にスパッタによりＡｕを堆積させて第一Ａｕ層を形成し、次いで基板を３００℃以上７００℃未満に加熱してスパッタによりＡｕを堆積させて第二Ａｕ層を形成することを特徴とする電気化学検出用電極の製造方法。
【請求項４】
前記基板を３００℃未満に加熱して前記第一Ａｕ層を形成することを特徴とする請求項３記載の電気化学検出用電極の製造方法。
【請求項５】
電極での酸化還元反応を利用して核酸のハイブリダイゼーションの有無を検出する電気化学検出チップにおいて、前記電極が基板上に形成された核酸を固定するためのものであって、前記基板の直上に相対的に結晶性が低い第一Ａｕ層と、該第一Ａｕ層上に、相対的に結晶性が高く前記核酸を固定する面がＡｕ（１１１）面からなる第二Ａｕ層との少なくとも２層からなることを特徴とする電気化学検出チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電極での酸化還元反応を利用して核酸のハイブリダイゼーションの有無を検出する電気化学検出チップに用いられる電気化学検出用電極およびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内の遺伝情報はＤＮＡ塩基配列として保存されており、遺伝子の発現を解析することは各種疾病の予防、早期診断治療、オーダーメイド医療などに有効である。生物学、医学分野での遺伝子解析においては、特定の配列を有する核酸断片を検出する方法として、ハイブリダイゼーション法が広く用いられている。ハイブリダイゼーション法は、一本鎖の核酸同士の塩基配列が相補的である場合に相補性を持つ塩基対間の水素結合により二本鎖核酸を形成することを利用するものであり、この中でも特に、目的とする遺伝子を特異的に検出することができる方法として、サザンハイブリダイゼーション法が一般的に利用されている。
【０００３】
サザンハイブリダイゼーション法では、まず試料ＤＮＡを一種類以上の制限酵素でフラグメントとし、アガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけてその分子量サイズによって分画ごとに分離し、次いで、分離した試料ＤＮＡ断片を一本鎖に変性した後、ナイロンフィルターまたはニトロセルロースペーパーに固定化する。そして、その試料ＤＮＡ断片と、この試料ＤＮＡ断片に相補性を有する放射性同位元素で標識された一本鎖ＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせた後、洗浄後のフィルターをオートラジオグラフィーにかけ現像することによって、相補性ＤＮＡとハイブリダイズする特定の塩基配列を有する試料ＤＮＡ断片を検出することができる。
【０００４】
しかし、上記のサザンハイブリダイゼーション法を含めた方法は標識として放射性同位元素を用いるため、検出に長時間を要し、バンドが不明確となりやすく、また放射性物質の取り扱いやコストの点で問題がある。
【０００５】
放射性同位元素による標識の代わりに蛍光物質を標識として用いる方法も知られている。蛍光物質を標識として用いる方法は、安全性および迅速性において優れた方法である。例えば、スライドガラスやシリコンなどの基板上に非共有結合（静電結合）や共有結合で固定して高密度に整列化しているＤＮＡ断片に対して、蛍光物質で標識したＤＮＡ断片をハイブリダイゼーションさせ、そのハイブリダイゼーションを検出するＤＮＡチップがすでに利用されている。しかし、励起光による褪色が起こること、測定には専用の蛍光測定装置が必要であることや蛍光の内部消光および凝集等のために一定量以上の蛍光物質を導入することは困難であること等の問題がある。
【０００６】
一方、電極での酸化還元反応を利用して核酸のハイブリダイゼーションの有無を検出する電気化学検出チップによる方法も知られている。この方法は、出力端子を備えた電極にプローブＤＮＡ断片を固定し、ここに試料ＤＮＡ断片および電気化学活性縫込み型インターカレーターを接触させると、電極上に固定されているプローブＤＮＡ断片と試料ＤＮＡ断片との間に二本鎖ＤＮＡが形成され、この二本鎖ＤＮＡの内部にインターカレーターが結合するため、電極に電位を印加すると、別に設けた対極との間にインターカレーターを介して電流が流れるため、その電流量を測定することによってハイブリダイゼーションを検出することができるものである。
【０００７】
しかし、電気化学チップによる方法では電極（一般的にはＡｕ電極）へプローブＤＮＡを固定する必要があるため、固定したＤＮＡ量に関する再現性、固定されたＤＮＡの固定に対する安定性が低いため、最終的に得られた結果（データ）の信頼性が低いという問題がある。
【０００８】
Ａｕ電極上へのＤＮＡの固定方法としては、ＤＮＡの末端に修飾したチオール基とＡｕ原子の結合を利用した固定方法、Ａｕ電極上に形成したＳＡＭ（自己組織化単一分子膜）を介してＤＮＡを固定する方法等が代表的である。
【０００９】
しかしこれらの固定方法はＡｕ（１１１）面上においては再現性良く結合するが、異なる面方位や、結晶性の悪い表面では結合し難いという問題がある。また、Ａｕ（１１１）面を得るための基板はマイカ（雲母）のみで、基板として一般的なガラス等のアモルファス材料や異なる結晶構造の基板では、Ａｕ（１１１）面が得られず汎用性に乏しいという問題がある。
【００１０】
固定に関する再現性の問題を解決する方法として、例えば、特許文献１には、下地基板と上板とを組み合わせることによりマイクロ流路が形成され、下地基板上にマイクロ流路内に露出した一対の電極が形成され、既知の塩基配列を有する核酸断片および試料核酸断片を含む混合溶液をインターカレーターと共にマイクロ流路内に導入し、一対の電極間に電位を印加して電極間に流れる電流を測定することにより混合溶液内のハイブリダイゼーションの有無を検出する電気化学検出チップが開示されている。
【特許文献１】特開２００４−１０９０４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
特許文献１に記載されている電気化学検出チップは、電極へプローブＤＮＡを固定しないため、測定の再現性は向上されているものの、性能、生産性等の問題が解決されていないため、研究目的の使用にとまり汎用には至っていない。
【００１２】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、核酸を再現性、安定性よく固定させることが可能な、電気化学検出用電極およびその製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の電気化学検出用電極は、基板上に形成された核酸を固定するための電極であって、該電極が、前記基板の直上に相対的に結晶性が低い第一Ａｕ層と、該第一Ａｕ層上に、相対的に結晶性が高く前記核酸を固定する面がＡｕ（１１１）面からなる第二Ａｕ層との少なくとも２層からなることを特徴とするものである。
【００１４】
前記第一Ａｕ層の（１１１）面存在率は３０％未満であって、前記第二Ａｕ層の（１１１）面存在率は３０％以上であることが好ましい。
【００１５】
本発明の電気化学検出用電極の製造方法は、基板上に形成された核酸を固定するための電極の製造方法であって、前記基板上にスパッタによりＡｕを堆積させて第一Ａｕ層を形成し、次いで基板を３００℃以上７００℃未満に加熱してスパッタによりＡｕを堆積させて第二Ａｕ層を形成することを特徴とするものである。
【００１６】
前記第一Ａｕ層の形成は、前記基板を３００℃未満で加熱することが好ましく、より好ましくは５０℃以上２００℃未満、さらには５０℃以上１００℃以下に加熱することが好ましい。
【００１７】
本発明の電気化学検出チップは、電極での酸化還元反応を利用して核酸のハイブリダイゼーションの有無を検出する電気化学検出チップにおいて、前記電極が基板上に形成された核酸を固定するためのものであって、前記基板の直上に相対的に結晶性が低い第一Ａｕ層と、該第一Ａｕ層上に、相対的に結晶性が高く前記核酸を固定する面がＡｕ（１１１）面からなる第二Ａｕ層との少なくとも２層からなることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の電気化学検出用電極は、基板上に形成された核酸を固定するための電極であって、この電極が、基板の直上に相対的に結晶性が低い第一Ａｕ層と、この第一Ａｕ層上に、相対的に結晶性が高く核酸を固定する面がＡｕ（１１１）面からなる第二Ａｕ層との少なくとも２層からなるので、核酸を固定する面はＡｕ（１１１）面上となり、４個のＡｕ原子によって規則正しい隙間が形成され、ここに核酸の末端に形成されるチオール基（ＳＨ基）が入るため、Ａｕ−Ｓの配位結合によりその結合を強固なものとすることができ、安定性よく核酸を固定することが可能である。
【００１９】
また、一般的にＡｕは酸化されやすく、他の物質との接触による影響を受けやすいため、チオール基の固定能の低下を生じやすいが、本発明の電気化学検出用電極は、核酸を固定する面がＡｕ（１１１）面からなりＡｕ原子が規則正しく配列しているので、安定して固定することが可能であり、また、Ａｕ原子が規則正しく配列しているのでＣ軸方向の剥離を抑制することができる。
【００２０】
また、本発明の電気化学検出用電極の製造方法は、基板上にスパッタによりＡｕを堆積させて第一Ａｕ層を形成し、次いで基板を３００℃以上７００℃未満に加熱してスパッタによりＡｕを堆積させて第二Ａｕ層を形成するので、第一Ａｕ層の形成時には基板の凹凸を緩衝するように、基板近傍においてはＡｕ（１１１）面の存在率が３０％未満である相対的に結晶性の低いＡｕ層が得られ、第二Ａｕ層の形成時には、基板の凹凸を緩衝した第一Ａｕ層上に、基板を３００℃以上７００℃未満に加熱することによって高いエネルギー状態でスパッタするので、Ａｕが自己結晶化して、Ａｕ（１１１）面の存在率が３０％以上である相対的に結晶性の高い第二Ａｕ層を形成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明の電気化学検出用電極について図面を用いて説明する。図１は本発明の電気化学検出用電極の概略断面図である。図１に示すように、本発明の電気化学検出用電極１０は、基板１の直上に相対的に結晶性が低い第一Ａｕ層２と、この第一Ａｕ層２上に、相対的に結晶性が高く核酸を固定する面がＡｕ（１１１）面からなる第二Ａｕ層３との少なくとも２層からなることを特徴とする。
【００２２】
ここで、上記核酸とは、塩基、リン酸および糖からなるヌクレオチドを基本単位とし、このリン酸が各ヌクレオチド間で糖の３’と５’位炭素の間にジエステル結合を作ることにより重合した長い鎖状のポリヌクレオチドである。糖部分がリボースかデオキシリボースかによってＲＮＡとＤＮＡがある。核酸は電極に固定されるためにその末端にチオール基が形成されたものである。
【００２３】
上記基板としては、特に限定されるものではなく、汎用性の高いガラス等のアモルファス材料やＳｉ等の半導体材料、セラミックスやアルミナ等の絶縁材料等があげられる。
【００２４】
第一Ａｕ層の（１１１）面存在率は３０％未満であって、第二Ａｕ層の（１１１）面存在率は３０％以上であることが好ましく、より望ましくは第一Ａｕ層の（１１１）面存在率は５０％未満であって、第二Ａｕ層の（１１１）面存在率は５０％以上であることが好ましい。ここで、Ａｕ層の（１１１）面存在率は、任意の点でＴＥＭ像を撮影し、目視により結晶配列のそろっている領域をＡｕ（１１１）面とみなし、ＴＥＭ像で目視によりＡｕ（１１１）面を測定することにより求めるものである。
【００２５】
上記のような電極を製造するためには、基板上にスパッタによりＡｕを堆積させて第一Ａｕ層を形成し、次いで基板を３００℃以上７００℃未満に加熱してスパッタによりＡｕを堆積させて第二Ａｕ層を形成する。
【００２６】
スパッタとしては、直流スパッタ（ＤＣ）、高周波（ＲＦ）スパッタ、マグネトロンスパッタ、イオンビームスパッタ等いずれでもよいが、電極膜の品質や汎用性の観点から高周波スパッタが好ましい。
【００２７】
スパッタ時の加熱温度は、第一Ａｕ層の形成時にあっては、基板を３００℃未満で加熱することが好ましく、より好ましくは５０℃以上２００℃未満、さらには５０℃以上１００℃以下に加熱することが好ましい。第二Ａｕ層の形成時にあっては、基板を３００℃以上７００℃未満、より好ましくは５００℃以上６００℃以下で加熱することが好ましい。
【００２８】
第一Ａｕ層および第二Ａｕ層の層厚は、スパッタ方法、スパッタ条件によるため一概には言えないが、第一Ａｕ層は３０〜７０ｎｍが好ましく、第二Ａｕ層は１００ｎｍ以上が好ましい。
【００２９】
なお、ここでは、スパッタによりＡｕを堆積させて第一Ａｕ層を形成し、次いで基板を３００℃以上７００℃未満に加熱してスパッタによりＡｕを堆積させて第二Ａｕ層を形成する場合について説明したが、基板上にＡｕ層を形成する際に、最初に室温〜２００℃未満でＡｕのスパッタを開始し、その後、徐々に加熱温度を上昇させて、最終的に３００℃以上７００℃未満でスパッタを行うこととしてもよい。
【００３０】
図２は、第二Ａｕ層３の核酸が固定される最上層のＡｕ（１１１）面の拡大模式図である。図２に示すように、第二Ａｕ層３の核酸が固定される最上層のＡｕ（１１１）面は、４個のＡｕ原子によって規則正しい隙間が形成され、ここに核酸の末端に形成されるチオール基が入るため、その結合を強固なものとすることができ、安定性よく核酸を固定することが可能である。
【００３１】
本発明の電気化学検出用電極は、酸化還元反応を利用して核酸のハイブリダイゼーションの有無を検出する電気化学検出チップに利用することができる。この電気化学検出チップは、一本鎖の核酸（例えばＤＮＡプローブ）を電極表面に固定化し、溶液系でインターカレータの存在下、被験ＤＮＡとプローブＤＮＡとの相補的二本鎖ＤＮＡを形成させ、形成された二本鎖ＤＮＡの検出を、電極の電流変化を電気化学的シグナルとして検出するものである。
【００３２】
図３に作用極（ＷＥ）、対極（ＣＥ）、および参照極（ＲＥ）からなる三電極方式を用いて電気化学検出法を実施する電気化学測定の概念図を示す。出力端子を備えた作用極にプローブＤＮＡを固定し、ここに被験ＤＮＡ断片および電気化学活性縫込み型インターカレーターを接触させると、電極上に固定されているプローブＤＮＡ断片と被験ＤＮＡ断片との間に二本鎖ＤＮＡが形成され、この二本鎖ＤＮＡの内部にインターカレーターが結合するため、電極に電位を印加すると、別に設けた対極との間にインターカレーターを介して電流が流れるため、その電流量を測定することによってハイブリダイゼーションを検出することができる。なお、参照極は作用極の電位を測定するためのものであり、参照極には事実上電流は流れない。
【００３３】
以下、本発明の電気化学検出用電極およびその製造方法を実施例によりさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００３４】
（実施例１）
有機洗浄（アセトン及び超純水にて、５分間／２回超音波洗浄）を施したガラス基板上に、成膜速度１００ｎｍ／ｍｉｎ、パワー２００Ｗの条件で高周波スパッタを行い、約５０ｎｍの膜厚の第一Ａｕ層を形成させた。次に、ガラス基板を５００℃に加熱しながら、成膜速度１００ｎｍ／ｍｉｎ、パワー２００Ｗの条件で高周波スパッタを行い、約１５０ｎｍの膜厚の第二Ａｕ層を形成して電極を製造した。
【００３５】
得られた電極表面をＴＥＭ像撮影したところ、実施例１の電極の第二Ａｕ層では、Ａｕ（１１１）面存在率が５０％以上である、相対的に結晶性の高い表面が得られており、一方第二Ａｕ層を削り取り、さらに第一Ａｕ層の表層を削り取って基板近傍について再度ＴＥＭ像撮影をしたところ、Ａｕ（１１１）面存在率が２５％である、相対的に結晶性の低い面が得られていた。
【００３６】
（比較例１）
実施例１と同様に下処理したガラス基板上に、１０−３Ｐａ以下の真空度中で、蒸着により２００ｎｍの厚みでＡｕを堆積させて電極を製造した。
【００３７】
（比較例２）
実施例１と同様に下処理したガラス基板上に、１００ｎｍ／ｍｉｎの成膜速度で２００Ｗのパワーで２５０ｎｍの膜厚のＡｕを堆積させて電極を製造した。
【００３８】
（比較例３）
比較例２で得られた電極を電気炉に入れ、空気中５３０℃で７時間アニールして電極を製造した。
【００３９】
図４〜図７に実施例１、比較例１〜３で得られた電極のＲＨＥＥＤ（反射高速電子線回折）のパターンを示す。ＲＨＥＥＤのパターンから明らかなように、実施例１で製造した電極のみでＡｕ（１１１）面が得られていた。
【００４０】
また、実施例１および比較例１〜３で得られたＡｕ電極に、末端をチオール基で修飾したＤＮＡプローブを固定し、応答曲線（ＤＰＶ）を調べた結果を図８〜図１１に示す。ＤＰＶグラフは、ＤＮＡを固定した場合の応答曲線を丸繋線で、何も固定していない場合の応答曲線を四角繋線で示した。実施例１の電極の場合には固定されたＤＮＡ量が比較例１〜３の電極に比べて大幅に向上していることがわかる。これは、比較例１〜３で製造された電極の場合には、Ａｕ層が非晶質で単結晶化されていない状態であるために、ＤＮＡ末端のチオール基との結合が充分に得られないが、実施例１で製造した電極は表面がＡｕ（１１１）面となっており、この（１１１）面上の４個のＡｕ原子の間にチオール基が確実に結合されたためと考えられる。このように確実に結合される部分が形成されているために、再現性が向上できるものと考えられる。
【００４１】
以上のように、本発明の電気化学検出用電極は、基板の直上に相対的に結晶性が低い第一Ａｕ層と、この第一Ａｕ層上に、相対的に結晶性が高く核酸を固定する面がＡｕ（１１１）面からなる第二Ａｕ層との少なくとも２層からなるので、核酸を固定する面はＡｕ（１１１）面上となり、４個のＡｕ原子によって規則正しい隙間が形成され、ここに核酸の末端に形成されるチオール基が入るため、Ａｕ−Ｓの配位結合によりその結合を強固なものとすることができ、安定性よく核酸を固定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の電気化学検出用電極の概略断面図
【図２】核酸が固定される最上層のＡｕ（１１１）面の拡大模式図
【図３】電気化学測定の概念図
【図４】実施例１で得られた電極のＲＨＥＥＤのパターン
【図５】比較例１で得られた電極のＲＨＥＥＤのパターン
【図６】比較例２で得られた電極のＲＨＥＥＤのパターン
【図７】比較例３で得られた電極のＲＨＥＥＤのパターン
【図８】実施例１で得られた電極にＤＮＡを固定した場合の応答曲線
【図９】比較例１で得られた電極にＤＮＡを固定した場合の応答曲線
【図１０】比較例２で得られた電極にＤＮＡを固定した場合の応答曲線
【図１１】比較例３で得られた電極にＤＮＡを固定した場合の応答曲線
【符号の説明】
【００４３】
１    基板
２    第一Ａｕ層
３    第二Ａｕ層
１０  電極
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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