(57)【要約】      （修正有）【課題】  海藻抽出物の脂溶性画分またはそれから同定された化合物を含む付着珪藻の付着防止剤を提供する。【解決手段】  アミジグサ科（Dictyotaceae）に属する褐藻、ソゾ属（Laurencia）に属する紅藻、アナメ（Agarum clathratum）、ミヤベモク（Sargassum miyabei）、およびウミトラノオ（Sargassum thunbergii）からなる群の中から選択される少なくとも一つの脂溶性画分を含む付着珪藻の付着防止剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
海藻抽出物の脂溶性画分を含む付着珪藻の付着防止剤。
【請求項２】
海藻が、アミジグサ科（Dictyotaceae）に属する褐藻、ソゾ属（Laurencia）に属する紅藻、アナメ（Agarum clathratum）、ミヤベモク（Sargassum miyabei）、およびウミトラノオ（Sargassum thunbergii）からなる群の中から選択される少なくとも一つである、請求項１に記載の付着防止剤。
【請求項３】
アミジグサ科（Dictyotaceae）に属する褐藻が、エゾヤハズ（Dictyopteris divaricata）およびシワヤハズ（Dictyopteris undulata）からなる群の中から選択される少なくとも一つであり、そしてソゾ属（Laurencia）に属する紅藻が、ミツデソゾ（Laurencia okamurae）、ウラソゾ（Laurencia nipponica）、ローレンシア  パシフィカ（Laurencia pacifica）、ローレンシア  マジュスキュラ（Laurencia majuscula）、ローレンシア  フィリホルミス（Laurencia filiformis）、ローレンシア  ジョンストニィー（Laurencia johnstonii）およびローレンシア  クラビホルミ（Laurencia claviformi）からなる群の中から選択される少なくとも一つである、請求項２に記載の付着防止剤。
【請求項４】
有効成分としてローリンテロール、イソローリンテロール、プレパシフェノール、２，１０−ジブロモ−３−クロロ−９−ヒドロキシ−α−カミグレン、キュベノールおよびクロマゾナロールからなる群の中から選択される少なくとも一つを含む、付着珪藻の付着防止剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海藻抽出物の脂溶性画分またはそれから同定された化合物を含む付着珪藻の付着防止剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
フジツボ・イガイなどの海洋付着生物は、船舶に付着して航行機能を低下させたり、漁網に付着して被害を与えたり、発電所の給排水管に付着して冷却効率を低下させて、多大な経済的損失を与えている。従来、魚網、船底などへの海洋生物の付着を防止する薬剤としては、有機スズ系化合物が広く使用されてきた。しかし、有機スズ化合物は、その強い毒性及び環境ホルモンとしての作用から使用が規制されている。代替化合物も銅や亜鉛を含むものが多く、環境に対する悪影響が懸念されており、より毒性の少ない安全な薬剤の開発が待たれている。
【０００３】
海中に構造物を投入した場合、まず高分子フィルム、次に微生物フィルムが形成され、その後付着珪藻が付着する。この微生物フィルムや付着珪藻が、大型海藻の付着、海洋無脊椎動物の付着を促進することが知られている（非特許文献１）。そこで、微生物フィルムの形成あるいは付着珪藻の付着防止が大型生物の付着を防止する手段となりうる。さらに、運動性に乏しい海洋生物は、化学防御物質を含有しており、生態系で用いられている化学防御物質は、環境に優しい化学物質と考えることができる。
【０００４】
本発明者らは、すでに、カレキグサ（Tichocarpus crinitus）の水溶性抽出物からなる海中汚損生物に対する付着防止剤を報告している（特許文献１）。しかし、当該文献には、カレキグサの水溶性抽出物以外の海藻抽出物や付着珪藻の付着防止剤については、何ら開示されていない。
【０００５】
また、化合物ローリンテロール（laurinterol）については、これまで紅藻ミツデソゾ（Laurencia okamurae）からの単離と、抗菌活性、光老化防止、抗酸化、フジツボ付着阻害、細胞毒性、Na, K-ATPase inhibitorなどの生物活性が知られている（非特許文献２、３、４）が、付着珪藻に対する付着阻害活性については知られていない。
【０００６】
また、化合物デブロモローリンテロール（Debromolaurinterol）については、これまで紅藻ミツデソゾ（Laurencia okamurae）、ローレンシア  パシフィカ（Laurencia pacifica）およびローレンシア  マジュスキュラ（Laurencia majuscula）からの単離と、光老化防止、抗酸化（ラジカル捕捉）、細胞毒性、抗菌活性、Na, K-ATPase inhibitorなどの生物活性が知られている（非特許文献２、３）が、付着珪藻に対する付着阻害活性については知られていない。
【０００７】
また、化合物イソローリンテロール（isolaurinterol）については、これまでソゾ属（Laurencia）の紅藻に広く含まれていることと、リラスズメダイやガンガゼなどの魚における摂餌阻害、抗菌活性、フジツボ付着阻害、細胞毒性などの生物活性が知られている（非特許文献３、非特許文献４）が、付着珪藻に対する付着阻害活性については知られていない。
【０００８】
また、化合物デブロモイソローリンテロール（Debromoisolaurinterol）については、紅藻ミツデソゾ（Laurencia okamurae）からの単離が（非特許文献３）、また、プレパシフェノール（Prepacifenol）については、ウラソゾ（Laurencia nipponica)、ローレンシア  フィリホルミス（Laurencia filiformis）、ローレンシア  ジョンストニィー（Laurencia johnstonii）、ローレンシア  パシフィカ（Laurencia pacifica）、ローレニシア  マジュスキュラ（Laurencia majuscula）およびローレンシア  クラビホルミ（Laurencia claviformi）からの単離が（非特許文献５）、また、２，１０−ジブロモ−３−クロロ−９−ヒドロキシ−α−カミグレン（2,10-dibromo-3-chloro-9-hydroxy-α-chamigrene）については、ウラソゾ（Laurencia nipponica) からの単離が（非特許文献６）知られている。しかし、これら化合物の生物活性については知られていない。
また、キュベノール（Cubenol）については、これまでアミジグサ科（Dictyotaceae）に属する海藻（非特許文献７）とサルビア属（Salvia）やピヌス属（Pinus）に属する植物に一般的に含まれていることが知られており、また、抗菌・抗カビ活性が知られているが（非特許文献１０, 非特許文献１１、非特許文献１２）、付着珪藻に対する付着阻害活性については知られていない。
【０００９】
また、化合物クロマゾナロール（Chromazonarol）については、これまでエゾヤハズ（Dictyopteris divaricata）またはシワヤハズ（Dictyopteris undulata）からの単離と、キタムラサキウニやエゾアワビなどに対する摂食阻害活性が知られているが（非特許文献８、９）、付着珪藻に対する付着阻害活性については知られていない。
【特許文献１】国際公開第２００４／０６７５０１号パンフレット
【非特許文献１】Stephen C. Dexter, Biofouling, vol. 7, pp.97-127 (1993) Role of microfouling organisms in marine corrosion.
【非特許文献２】Irie,T.,Suzuki,M., Laurinterol and debromolaurinterol, constituents from Laurencia intermedia; Tetrahedron Lett. 1966: (No. 17) 1837-1840.
【非特許文献３】T. Irie, M. Suzuki, E. Kurosawa and T. Masamune: Laurinterol, debromolaurinterol and isolaurinterol, constituents of Laurencia intermedia YAMADA. Tetrahedron, vol 26, pp.3271-3277 (1970)）.
【非特許文献４】Han’guk Hwankyong Uisaeng Hakhoechi (2003) 29 (3) 1-8
【非特許文献５】Abe, Tsuyoshi; Masuda, Michio; Suzuki, Teruaki; Suzuki, Minoru. Chemical races in the red alga Laurencia nipponica (Rhodomelaceae, Ceramiales)
【非特許文献６】Suzuki, Minoru; Kawamoto, Tomotake; Vairappan, Charles Santhanaraju; Ishii, Takahiro; Abe, Tsuyoshi; Masuda, Michio.  Halogenated metabolites from Japanese Laurencia spp. Phytochemistry (Elsevier) (2005), 66(23), 2787-2793.
【非特許文献７】Suzuki,M.1981.Epicubenol and related sesquiterpenoids from the brown algae Dictyopteris divaricata ; Bull. Chem. Soc. Jpn. 54: (No.8) 2366-2368.
【非特許文献８】Suzuki,M.1991.褐藻エゾヤハズのメタノール抽出物によるキタムラサキウニとエゾアワビに対する摂食阻害作用
【非特許文献９】Nippon Suisan Gakkaishi 57(10), 1945-1948、Fenical, W.; McConnell, O.  Chromazonarol and isochromazonarol, new chromanols from the brown seaweed Dictyopteris undulata (zonarioides). Experientia (1975), 31(9), 1004-5.
【非特許文献１０】Pitarokili, D., Tzakou, O., Couladis, M., Verykokidou, E.; J. Essential Oil Res. (1999) 11 (5) 655-659.
【非特許文献１１】Krauze-Baranowska, M., Mardarowicz, M., Wilwart, M., Poblocka, L., Dynowska, M.; Zeitschrift fuer Naturforschung, C (2002) 57 (5/6) 478-482.
【非特許文献１２】Solis, C., Becerra, J., Flores, C., Robledo, J., Silvia, M.: J. Chilean Chem. Soc. (2004) 49 (2) 157-161.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、海藻由来の付着珪藻の付着防止剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究の結果、海藻の抽出物およびそれから単離同定された化合物が付着珪藻の付着防止効果を有することを見出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は、下記：
１．海藻抽出物の脂溶性画分を含む、付着珪藻の付着防止剤、
２．海藻が、アミジグサ科（Dictyotaceae）に属する褐藻、ソゾ属（Laurencia）に属する紅藻、アナメ（Agarum clathratum）、ミヤベモク（Sargassum miyabei）、およびウミトラノオ（Sargassum thunbergii）からなる群の中から選択される少なくとも一つである、上記１に記載の付着防止剤、
３．アミジグサ科（Dictyotaceae）に属する褐藻が、エゾヤハズ（Dictyopteris divaricata）およびシワヤハズ（Dictyopteris undulata）からなる群の中から選択される少なくとも一つであり、そしてソゾ属（Laurencia）に属する紅藻が、ミツデソゾ（Laurencia okamurae）、ウラソゾ（Laurencia nipponica）、ローレンシア  パシフィカ（Laurencia pacifica）、ローレンシア  マジュスキュラ（Laurencia majuscula）、ローレンシア  フィリホルミス（Laurencia filiformis）、ローレンシア  ジョンストニィー（Laurencia johnstonii）およびローレンシア  クラビホルミ（Laurencia claviformi）からなる群の中から選択される少なくとも一つである、上記２に記載の付着防止剤、
４．有効成分としてローリンテロール、イソローリンテロール、プレパシフェノール、２，１０−ジブロモ−３−クロロ−９−ヒドロキシ−α−カミグレン、キュベノールおよびクロマゾナロールからなる群の中から選択される少なくとも一つを含む、付着珪藻の付着防止剤、
である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の海藻抽出物の脂溶性画分または同定された化合物は、例えば、これらを船底塗料に含有させることにより、付着防汚剤として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
上記のように、本発明は、海藻抽出物の脂溶性画分または同定された化合物を含む付着珪藻の付着防止剤に関する。
本発明で、海藻とは、藻類のうち、クロレラなどの単細胞藻類を含まない海産の大形藻類を意味し、光合成色素としてクロロフィル a と bを有する緑藻、光合成色素としてクロロフィル aを有する紅藻、光合成色素としてクロロフィル a と cを有する褐藻が含まれる。海藻には、例えば、ウラソゾ（Laurencia nipponica）、ミツデソゾ（L. okamurae）、ハネソゾ（L. pinnata）、クロソゾ（L. intermedia）、ヒメソゾ(L. venusta)、マギレソゾ（L. saitoi）、コブソゾ（L. undulata）、ローレンシア  パシフィカ（Laurencia pacifica）、ローレンシア  マジュスキュラ（Laurencia majuscula）、ローレンシア  フィリホルミス（Laurencia filiformis）、ローレンシア  ジョンストニィー（Laurencia johnstonii）、ローレンシア  ヨナグニエンシス（Laurencia yonaguniensis）、ローレンシア  クラビホルミ（Laurencia claviformi）などのソゾ属（Laurencia）に属する紅藻；エゾヤハズ（Dictyopteris divaricata）、シワヤハズ（Dictyopteris undulata）、アミジグサ（Dictyota dichotoma）、イトアミジ（Dictyota linearis）、フクリンアミジ（Dilophus okamurae）、コモングサ（Spatoglossum pacificum）、サナダグサ（Pachydictyon coriaceum (Holmes) Okamura）、ウミウチワ（Padina arborescens Holmes）、ウスユキウチワ（Padina minor）、コナウミウチワ（Padina crassa）などのアミジグサ科（Dictyotaceae）に属する褐藻；アナメ（Agarum clathratum）、スジメ（Costraia costata）、ツルアラメ（Ecklonia stolonifera）などのコンブ科（Laminariaceae）に属する褐藻；ウミトラノオ（Sargassum thunbergii）、ミヤベモク（Sargassum miyabei）、ウガノモク（Cystoseira hakodatensis ）、ジョロモク（Myagropsis myagroides）、フシスジモク（Sargassum confusum ）、エゾノネジモク（Sargassum yezoense）などのホンダワラ科（Sargassaceae）に属する褐藻などが挙げられる。本発明で用いる海藻は、１種だけでなく、２種以上を組合せても良い。また、本発明で、付着珪藻とは、水中の構造物、例えば、岩、杭、船底などの表面に着生して生育している珪藻類をいう。そして、付着珪藻には、例えば、Nitzchia sp.、Cylindrotheca closterium、Navicula sp.、Amphora sp.、Achnanthes sp.などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１４】
本発明に用いる海藻は、採集した海藻を水切りしたもの又は採集した海藻を乾燥したものやこれを粉末にしたものを用いることができる。この海藻を、例えばメタノールに浸漬して抽出する。抽出温度は、好ましくは室温（約２０℃）であり、抽出時間は、１時間〜１週間、好ましくは２４時間である。抽出操作は、１回でもよいが、２回以上とするとより多くの抽出物を得ることができる。メタノール抽出物の濃縮は、湯浴の温度を２０〜２５℃に設定し、減圧下で行うことができる。抽出物を減圧濃縮後、残渣を例えばジエチルエーテル／水で分配して得られた脂溶性画分から本発明の有効成分を分離・精製することができる。
【００１５】
本発明に用いる化合物ローリンテロール（laurinterol）は、下記：
【００１６】
【化１】
2007045811.tif 000002
【００１７】
の構造式を有し、例えば、従来公知の方法（非特許文献２，３，４）を用いてソゾ属（Laurencia）に属する紅藻、好ましくはミツデソゾ（Laurencia okamurae）から抽出することができるが、ローリンテロールを含有する生物であれば抽出のための生物は特に限定されない。また、ローリンテロールを、化学合成しても、市場より入手しても良い。付着珪藻防止剤として好ましいローリンテロールの濃度は、１．５μg/cm2以上、より好ましくは２．０μg/cm2以上、さらに好ましいのは３．０μg/cm2以上である。
【００１８】
本発明に用いる化合物デブロモローリンテロール（Debromolaurinterol）は、下記：
【００１９】
【化２】
2007045811.tif 000003
【００２０】
の構造式を有し、例えば、従来公知の方法（非特許文献２，３）を用いてソゾ属（Laurencia）に属する紅藻、好ましくはミツデソゾ（Laurencia okamurae）、ローレンシア  パシフィカ（Laurencia pacifica）またはローレンシア  マジュスキュラ（Laurencia majuscula）から抽出することができるが、デブロモローリンテロールを含有する生物であれば抽出のための生物は特に限定されない。また、デブロモローリンテロールを、化学合成しても、市場より入手しても良い。付着珪藻防止剤として好ましいデブロモローリンテロールの濃度は、５．０μg/cm2以上、より好ましくは１０．０μg/cm2以上、さらに好ましいのは２０．０μg/cm2以上である。
【００２１】
本発明に用いる化合物イソローリンテロール（isolaurinterol）は、下記：
【００２２】
【化３】
2007045811.tif 000004
【００２３】
の構造式を有し、例えば、従来公知の方法（非特許文献３）を用いてソゾ属（Laurencia）に属する紅藻、好ましくはミツデソゾ（Laurencia okamurae）から抽出することができるが、イソローリンテロールを含有する生物であれば抽出のための生物は特に限定されない。また、イソローリンテロールを、化学合成しても、市場より入手しても良い。付着珪藻防止剤として好ましいイソローリンテロールの濃度は、０．２μg/cm2以上、より好ましくは０．５μg/cm2以上、さらに好ましいのは１．０μg/cm2以上である。
【００２４】
本発明に用いる化合物デブロモイソローリンテロール（Debromoisolaurinterol）は、下記：
【化４】
2007045811.tif 000005
【００２５】
の構造式を有し、例えば、従来公知の方法（非特許文献３）を用いてソゾ（Laurencia）属に属する紅藻、好ましくはミツデソゾ（Laurencia okamurae））から抽出することができるが、デブロモイソローリンテロールを含有する生物であれば抽出のための生物は特に限定されない。また、デブロモイソローリンテロールを、化学合成しても、市場より入手しても良い。付着珪藻防止剤として好ましいデブロモイソローリンテロールの濃度は、５．０μg/cm2以上、より好ましくは１０．０μg/cm2以上、さらに好ましいのは２０．０μg/cm2以上である。
【００２６】
本発明に用いる化合物プレパシフェノール（Prepacifenol）は、下記：
【００２７】
【化５】
2007045811.tif 000006
【００２８】
の構造式を有し、例えば、従来公知の方法（非特許文献５.）を用いてソゾ（Laurencia）属に属する紅藻、好ましくはウラソゾ（Laurencia nipponica)、ローレンシア  フィリホルミス（Laurencia filiformis）、ローレンシア  ジョンストニィー（Laurencia johnstonii）、ローレンシア  パシフィカ（Laurencia pacifica）、ローレンシア  マジュスキュラ（Laurencia majuscula）、ローレンシア  クラビホルミ（Laurencia claviformi）から抽出することができるが、プレパシフェノールを含有する生物であれば抽出のための生物は特に限定されない。また、プレパシフェノールを、化学合成しても、市場より入手しても良い。付着珪藻防止剤として好ましいプレパシフェノールの濃度は、４．０μg/cm2以上、より好ましくは８．０μg/cm2以上、さらに好ましいのは１０．０μg/cm2以上である。
【００２９】
本発明に用いる化合物２，１０−ジブロモ−３−クロロ−９−ヒドロキシ−α−カミグレン（2,10-dibromo-3-chloro-9-hydroxy-α-chamigrene）は、下記：
【００３０】
【化６】
2007045811.tif 000007
【００３１】
の構造式を有し、例えば、従来公知の方法（非特許文献６）を用いてソゾ（Laurencia）属に属する紅藻、好ましくはウラソゾ（Laurencia nipponica）から抽出することができるが、２，１０−ジブロモ−３−クロロ−９−ヒドロキシ−α−カミグレンを含有する生物であれば抽出のための生物は特に限定されない。また、２，１０−ジブロモ−３−クロロ−９−ヒドロキシ−α−カミグレンを、化学合成しても、市場より入手しても良い。付着珪藻防止剤として好ましい２，１０−ジブロモ−３−クロロ−９−ヒドロキシ−α−カミグレンの濃度は、４．０μg/cm2以上、より好ましくは８．０μg/cm2以上、さらに好ましいのは１０．０μg/cm2以上である。
【００３２】
本発明に用いる化合物キュベノール（Cubenol）は、下記：
【００３３】
【化７】
2007045811.tif 000008
【００３４】
の構造式を有し、例えば、従来公知の方法（非特許文献７）を用いてアミジグサ科（Dictyotaceae）に属する褐藻、好ましくはエゾヤハズ（Dictyopteris divaricata）またはシワヤハズ（Dictyopteris undulata）、あるいはサルビア属（Salvia）やピヌス属（Pinus）に属する植物から抽出することができるが、キュベノールを含有する生物であれば抽出のための生物は特に限定されない。また、キュベノールを、化学合成しても、市場より入手しても良い。付着珪藻防止剤として好ましいキュベノールの濃度は、４．０μg/cm2以上、より好ましくは８．０μg/cm2以上、さらに好ましいのは１０．０μg/cm2以上である。
【００３５】
本発明に用いる化合物クロマゾナロール（Chromazonarol）は、下記：
【００３６】
【化８】
2007045811.tif 000009
【００３７】
の構造式を有し、例えば、従来公知の方法（非特許文献８、９）を用いてアミジグサ科（Dictyotaceae）に属する褐藻、好ましくはエゾヤハズ（Dictyopteris divaricata）またはシワヤハズ（Dictyopteris undulata）から抽出することができるが、クロマゾナロールを含有する生物であれば抽出のための生物は特に限定されない。また、クロマゾナロールを、化学合成しても、市場より入手しても良い。付着珪藻防止剤として好ましいクロマゾナロールの濃度は、２．０μg/cm2以上、より好ましくは３．０μg/cm2以上、さらに好ましいのは１０ ．０μg/cm2以上である。
【００３８】
本発明に用いる化合物ローリンテロール、イソローリンテロール、プレパシフェノール、２，１０−ジブロモ−３−クロロ−９−ヒドロキシ−α−カミグレン、キュベノールまたはクロマゾナロールは、付着珪藻の付着防止剤として１種類だけで用いても、２種類以上を組合せて用いても良い。
【００３９】
本発明の海中汚損生物に対する付着防止剤は、そのまま使用する形態、あるいは、ハイドロゲルのようなゲル、塗料、溶液、乳剤などの形に調製することができる。また、本発明の付着珪藻の付着防止剤には、必要に応じ、増粘剤、可塑剤、着色料等を配合することができる。
【実施例１】
【００４０】
ミツデソゾの付着阻害物質であるローリンテロール
小樽市で採集した紅藻ミツデソゾ（２３２ｇ、湿重量）をメタノール１．２Ｌで２４時間浸漬抽出した。抽出液をエバポレーターを用いて減圧濃縮後、水とジエチルエーテル（各１２５mL）で３回２層分配し、得られた脂溶性画分に硫酸ナトリウムを加えて脱水し、減圧濃縮した。ろ過処理後、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（２．５×３８cm）でヘキサン／酢酸エチル（９５：５）で溶出後、さらにヘキサン／酢酸エチル（９：１）で溶出した。後者の画分を、シリカゲルの大量分取用薄層クロマトグラフィーにより、トルエンで展開し、ローリンテロール１６．７mgを単離した。１Ｈ  ＮＭＲデータは文献値と一致した（非特許文献２、３）。
【００４１】
珪藻付着試験
本試験は、ウニおよびアワビの摂食阻害試験方法（月刊海洋vol27 (1) 13-21 (1995) 鈴木稔、藻類の生理活性物質の多様性）として用いられたものを、独自に付着珪藻の試験のために改変したものである。
用いた珪藻はCylindrotheca closteriumおよびNitzchia sp.である。ろ過天然海水を用いて、ヨーガンソン培地を作製し、１２１℃、２０分間オートクレーブした。浅型滅菌シャーレ（９０×１５mm）に培養液を２５mL加えた。５．９cm角に切断したセルロースのＴＬＣアルミシート上の直径１．５cmの円内に試験する物質あるいは抽出物を吸着させた後、シャーレに静置した。珪藻を植え継ぎ、目視観察により評価した。
ローリンテロールをセルロースのＴＬＣアルミシートに１８０μg/cm2吸着させて、水槽内に静置し、ろ過天然海水（独立行政法人水産総合研究センター北海道区水産研究所の施設内のポンプで直接くみ上げた天然海水を砂ろ過した。１２月〜３月に実施した。）を流したところ、２週間後吸着部分には珪藻の付着は認められなかったが、非吸着部分には珪藻の付着が認められた。さらに、ローリンテロールは、付着珪藻Nitzchia sp.に対して３μg/cm2で強力な付着阻害活性を示し、試験区の円内に珪藻が付着している面積は１％以下であった。また、付着珪藻Cylindrotheca closteriumに対して３μg/cm2で強力な付着阻害活性を示し、試験区の円内に珪藻が付着している面積は１％以下であった。
【実施例２】
【００４２】
アナメの付着阻害活性
根室市で採集した褐藻アナメ（５８ｇ、湿重）をメタノール３００mLで３回抽出した。抽出液を減圧濃縮後、水とジエチルエーテル（各５０mL）で３回分配し、得られた脂溶性画分をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーでヘキサン／酢酸エチル９５：５、ヘキサン／酢酸エチル９：１で溶出後、さらにヘキサン／酢酸エチル４：１（２１ＬＣ）で溶出した。最後の画分４７mg（乾燥重量）を、ＯＤＳのフラッシュクロマトグラフィーで分離した。８０％メタノール、９０％メタノール、１００％メタノールで溶出後、１００％クロロホルムで溶出した画分（２１ＬＣ−Ｄ）を１１mg（乾燥重量）得た。
【００４３】
画分２１ＬＣ（エタノールで１０mg/mLに濃度調製したもの）をセルロースのＴＬＣアルミシートに１４０μg/cm2吸着させて、水槽内に静置し、上記のろ過天然海水を流したところ、１２日後吸着部分には珪藻の付着はなく、非吸着部分には珪藻の付着がみられた。画分２１ＬＣ−Ｄ（エタノールで１０mg/mLに濃度調製したもの）をセルロースのＴＬＣアルミシートに１４０μg/cm2吸着させて、珪藻Cylindrotheca closteriumを培養したシャーレ内に静置したところ、２週間後吸着部分には珪藻の付着は認められなかったが、非吸着部分には珪藻の付着が認められた。画分２１ＬＣ−Ｄの１Ｈ  ＮＭＲの結果により、グリセロ糖脂質が主成分であることが推定された。
【実施例３】
【００４４】
ミヤベモクの付着阻害活性
小樽市で採集した褐藻ミヤベモク（３６５ｇ、湿重）をメタノール１．５Ｌで３回抽出した。抽出液を減圧濃縮後、水とジエチルエーテル（各２５０mL）で３回分配し、得られた脂溶性画分をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーでヘキサン／酢酸エチル９５：５、ヘキサン／酢酸エチル９：１、ヘキサン／酢酸エチル４：１、ヘキサン／酢酸エチル１：１、酢酸エチル１００％、酢酸エチル／メタノール９：１、酢酸エチル／メタノール４：１、酢酸エチル／メタノール１：１で溶出後、さらに、酢酸エチル／メタノール１：３で溶出した。ヘキサン／酢酸エチル４：１画分（４７３mgの乾燥物をエタノールで１０mg/mLに濃度調製したもの）および酢酸エチル／メタノール１：３画分（１０．８mgの乾燥物をエタノールで１０mg/mLに濃度調製したもの）をセルロースのＴＬＣアルミシートに１４０μg/cm2吸着させて、珪藻Cylindrotheca closteriumを培養したシャーレ内に静置したところ、２週間後吸着部分には珪藻の付着は認められなかったが、非吸着部分には珪藻の付着が認められた。
【実施例４】
【００４５】
ウミトラノオの付着阻害活性
室蘭市で採集した褐藻ウミトラノオ（１０ｇ、湿重）をメタノールで３回抽出した。抽出液を減圧濃縮後、水とジエチルエーテル（各２５mL）で３回分配し、得られた脂溶性画分（乾燥物をエタノールで１０mg/mL濃度調製したもの）をセルロースのＴＬＣアルミシートに１４０μg/cm2吸着させて、珪藻Cylindrotheca closteriumを培養したシャーレ内に静置したところ、２週間後吸着部分には珪藻の付着は認められなかったが、非吸着部分には珪藻の付着が認められた。
【実施例５】
【００４６】
ウラソゾの付着阻害活性
室蘭市で採集した紅藻ウラソゾ（４０ｇ、湿重）をメタノールで３回抽出した。抽出液を減圧濃縮後、水とジエチルエーテル（各２５mL）で３回分配し、得られた脂溶性画分（３４０mgの乾燥物をエタノールで１０mg/mLに濃度調製したもの）をセルロースのＴＬＣアルミシートに１４０μg/cm2吸着させて、珪藻Cylindrotheca closteriumを培養したシャーレ内に静置したところ、２週間後吸着部分には珪藻の付着はなく、非吸着部分には珪藻の付着がみられた。珪藻Nitzchia sp.についても同様に付着阻害効果が認められた。
【実施例６】
【００４７】
ウラソゾの付着阻害物質であるプレパシフェノール（Prepacifenol）および２，１０−ジブロモ−３−クロロ−９−ヒドロキシ−α−カミグレン（2,10-dibromo-3-chloro-9-hydroxy-α-chamigrene）
実施例５に記載と同様に、室蘭で採集されたイギス目・フジマツモ科ウラソゾ400 ｇ（冷凍湿重量）をメタノール５００mlで３回抽出した。抽出物を濃縮後、水とジエチルエーテルで２層分配を行った。１２．５μg/cm2で活性が見られたジエチルエーテル層をｎ−ヘキサンと酢酸エチルを用いたシリカゲルカラムフラッシュクロマトグラフィーにより分画を行った。分画後、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝４：１およびｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１：１の画分をＰＴＬＣ行った。溶媒は１００％ベンゼンおよびクロロホルム：メタノール＝９７：３を使用し、付着珪藻阻害活性を示す化合物２種類を得た。２種類の化合物はそれぞれＰＴＬＣにより再精製し、化合物Ａ（２．８mg）および化合物Ｂ（４mg）を得た。
ＮＭＲの測定から、化合物ＡはＮＭＲの測定から、プレパシフェノール（非特許文献５）Phycological Research  (1999), 47(2), 87-95.）であることが分かった。また、化合物Ｂは２，１０−ジブロモ−３−クロロ−９−ヒドロキシ−α−カミグレン（非特許文献６.）であることが分かった。
【００４８】
付着珪藻に対する付着阻害活性試験は、実施例１に記載したように、ＴＬＣセルロースシートを用いて実施した。２５℃のインキュベーター内で飼育した付着珪藻Nitzchia sp.またはCylindrotheca closteriumを用いて、単離同定したプレパシフェノールおよび２，１０−ジブロモ−３−クロロ−９−ヒドロキシ−α−カミグレンの付着阻害活性を試験した。阻害活性試験にはMERCK社製ＴＬＣアルミシートを用い、これらの化合物をエタノールに溶かした溶液を各試験区に１０μl注ぎ、乾燥させた後、円形シャーレに静置し、ヨーガンスン改変培地を２５ml注入した。試験区の大きさは直径１．６cmである。試験する化合物の濃度は１０μg/cm2であった。シャーレ内に珪藻を植え継ぎ、７日後の付着状況を肉眼で観察した。
【００４９】
プレパシフェノールおよび２，１０−ジブロモ−３−クロロ−９−ヒドロキシ−α−カミグレンはともに、付着珪藻Nitzchia sp. に対して１０μg/cm2で強力な付着阻害活性を示し、試験区の円内に珪藻が付着している面積は１％以下であった。また、Cylindrotheca closteriumに対して１０μg/cm2で強力な付着阻害活性を示し、試験区の円内に珪藻が付着している面積は１％以下であった。
【実施例７】
【００５０】
ミツデソゾの付着阻害活性およびその付着阻害物質であるデブロモローリンテロール（Debromolaurinterol）、イソローリンテロール（Isolaurinterol）、デブロモイソローリンテロール（Debromoisolaurinterol）
実施例１のローリンテロールとは異なる付着阻害物質をミツデソゾからさらに単離同定するため、小樽市忍路で採集されたイギス目・フジマツモ科ミツデソゾ３００ｇ（冷凍湿重量）をメタノール５００mlで３回抽出した。抽出物を濃縮後、水とジエチルエーテルで２層分配を行った。５０μg/cm2活性が見られたジエチルエーテル層をｎ−ヘキサンと酢酸エチルを用いたシリカゲルカラムフラッシュクロマトグラフィーにより分画を行った。分画後、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝９：１の画分をＰＴＬＣ行った。溶媒は１００  ％トルエンおよびヘキサン：ベンゼン＝１：１を使用し、付着珪藻阻害活性を示す化合物４種類を得た。４種類の化合物はそれぞれＰＴＬＣにより再精製し、化合物Ａ（１１．６mg）（収率約１３％）化合物Ｂ（３．８mg）および化合物ＣとＤの混合物（０．５mg）を得た。
ＮＭＲの測定から、化合物Ａは実施例１に記載のローリンテロール（Laurinterol）であることが分かった。化合物Ｂはデブロモローリンテロール（Debromolaurinterol）であることが分かった。化合物ＣとＤの混合物はイソローリンテロール（Isolaurinterol）とデブロモイソローリンテロール（Debromoisolaurinterol）の混合物（１：１）であることが分かった（非特許文献２、３) 。
付着珪藻に対する付着阻害活性試験は、実施例１に記載したように、ＴＬＣセルロースシートを用いて実施した。
２５℃のインキュベーター内で飼育した付着珪藻Nitzchia sp.およびCylindrotheca closteriumを用いて、単離したローリンテロール、デブロモローリンテロール、イソローリンテロールとデブロモイソローリンテロールの混合物（１：１）の阻害活性を試験した。阻害活性試験にはMERCK社製ＴＬＣアルミシートを用い、これらの化合物をエタノールに溶かした溶液を各試験区に１０μl注ぎ、乾燥させた後、円形シャーレに静置し、ヨーガンスン改変培地を２５ml注入した。試験区の大きさは直径１．６cmである。試験する化合物の濃度は３μg/cm2であった。シャーレ内に珪藻を植え継ぎ、７日後の付着状況を肉眼で観察した。
デブロモローリンテロールは付着珪藻Nitzchia sp.に対して１０μg/cm2で弱い付着阻害活性を示した。一方、Cylindrotheca closteriumに対して１０μg/cm2では活性を示さなかった。これは、濃度が低くすぎたためと考えられた。
イソローリンテロールとデブロモイソローリンテロールの混合物（１：１）は、付着珪藻Nitzchia sp.に対して１μg/cm2で強力な付着阻害活性を示し、試験区の円内に珪藻が付着している面積は１％以下であった。また、付着珪藻Cylindrotheca closteriumに対して１μg/cm2で強力な付着阻害活を示し、試験区の円内に珪藻が付着している面積は１％以下であった。
イソローリンテロールとデブロモイソローリンテロールのそれぞれの純品を分離できなかったが、ローリンテロールの活性が強いのに対して、デブロモローリンテロールの活性は弱いことから、化合物における臭素原子の有無が活性に大きく影響していると推測された。これよりイソローリンテロールとデブロモイソローリンテロールの混合物（１：１）の活性はイソローリンテロールにそのほとんどがあり、デブロモイソローリンテロールにはあまりないものと推測された。よって、イソローリンテロールは、０．５μg/cm2程度で付着阻害活性を示すものと推測された。
【実施例８】
【００５１】
エゾヤハズの付着阻害活性およびその付着阻害物質であるキュベノール（Cubenol）およびクロマゾナロール（Chromazonarol）
室蘭で採集されたアミジグサ目・アミジグサ科エゾヤハズ４５０g（冷凍湿重量）をメタノール５００mlで３回抽出した。抽出物を濃縮後、水とジエチルエーテルで２層分配を行った。１２．５μg/cm2で活性が見られたジエチルエーテル層をｎ−ヘキサンと酢酸エチルを用いたシリカゲルカラムフラッシュクロマトグラフィーにより分画を行った。分画後、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝９：１およびｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝９：３の画分についてＰＴＬＣを２回繰り返した。ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝９：１の画分から、溶媒としてベンゼン１００％を使用したところ、化合物Ａ（乾燥重量で１０mg）を得た。ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝９：３の画分から、溶媒としてクロロホルム：メタノール＝9９：１を使用したところ、化合物Ｂ（乾燥重量で１mg）を得た。
ＮＭＲおよびＭＳの測定から、化合物Ａはキュベノール（非特許文献７）であることが分かった。また、ＮＭＲおよびＭＳの測定から、化合物Ｂはクロマゾナロール（非特許文献８、９）であることが分かった。
【００５２】
付着珪藻に対する付着阻害活性試験は、実施例１に記載したように、ＴＬＣセルロースシートを用いて実施した。２５℃のインキュベーター内で飼育した付着珪藻Nitzchia sp.およびCylindrotheca closteriumを用いて、単離同定したキュベノールおよびクロマゾナロールの阻害活性を試験した。阻害活性試験にはMERCK社製ＴＬＣアルミシートを用い、これらの化合物をエタノールに溶かした溶液を各試験区に１０μl注ぎ、乾燥させた後、円形シャーレに静置し、ヨーガンスン改変培地を２５ml注入した。試験区の大きさは直径１．６cmである。試験する化合物の濃度は１０μg/cm2であった。シャーレ内に珪藻を植え継ぎ、７日後の付着状況を肉眼で観察した。
【００５３】
キュベノールは、付着珪藻Nitzchia sp.に対して１０μg/cm2で強力な付着珪藻阻害活性を示し、試験区の円内に珪藻が付着している面積は１％以下であった。また、付着珪藻Cylindrotheca closteriumに対して１０μg/cm2で強力な付着珪藻阻害活性を示し、試験区の円内に珪藻が付着している面積は１％以下であった。
クロマゾナロールは、付着珪藻Nitzchia sp.に対して１０μg/cm2で強力な付着阻害活性を示し、試験区の円内に珪藻が付着している面積は１％以下であった。また、付着珪藻Cylindrotheca closteriumに対して３μg/cm2で強力な付着阻害活性を示し、試験区の円内に珪藻が付着している面積は１％以下であった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、魚介類や人体に対する安全性が高い、海藻抽出物の脂溶性画分、またはそれより単離された化合物を含む付着珪藻の付着防止剤を提供する。