(57)【要約】      （修正有）【課題】光学活性体のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを選択的に合成できる、高い活性を有する、Ｌ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼを提供する。【解決手段】ストレプトマイセス属細菌から、Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを取得した。このタンパク質の特定のアミノ酸１ないし数個が付加、欠失、もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、大腸菌に導入して発現させた。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）、（２）、（３）または（４）に示す遺伝子：
（１）配列番号３、４、５または６に示す塩基配列のＤＮＡからなる遺伝子：
（２）配列番号３、４、５または６に示す塩基配列のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子：
（３）配列番号７、８、９または１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子：
（４）配列番号７に示すアミノ酸配列の８６番目のイソロイシンおよび２４１番目のシステイン、配列番号８に示すアミノ酸配列の２４番目のシステイン、配列番号９に示すアミノ酸配列の２４１番目のシステインおよび２８７番目のバリン、または配列番号１０に示すアミノ酸配列の３２１番目のシステインが保持され、当核アミノ酸配列７、８、９または１０で示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
下記の（１）または（２）に示すタンパク質：
（１）配列番号７、８、９または１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質：
（２）配列番号７に示すアミノ酸配列の８６番目のイソロイシンおよび２４１番目のシステイン、配列番号８に示すアミノ酸配列の２４番目のシステイン、配列番号９に示すアミノ酸配列の２４１番目のシステインおよび２８７番目のバリン、または配列番号１０に示すアミノ酸配列の３２１番目のシステインが保持され、当核アミノ酸配列７、８、９または１０で示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターを含む微生物。
【請求項５】
宿主が大腸菌である請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１２、ＮＩＴＥ  Ｐ−１１３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１１４およびＮＩＴＥ  Ｐ−１１５として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された微生物。
【請求項７】
請求項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドおよびグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、産業上有用な光学活性Ｌ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリン（以下、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳと略記する）を合成するのに有利なＬ−スレオ型立体選択性を有するＬ−スレオニンアルドラーゼを遺伝子工学的手法により提供するものであり、さらに、この遺伝子を導入した組換え微生物を利用した合成反応によって、産業上有用なβ−ヒドロキシアミノ酸誘導体であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの製造法を提供するものである。より具体的には、本発明は、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成に有用なＬ−スレオ型立体選択性を有するＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子およびその組換えベクターと形質転換体を提供し、この遺伝子を導入した組換え微生物による合成反応により、産業上有用なβ−ヒドロキシアミノ酸誘導体であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの製造法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の一種であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳは、体内で芳香族アミノ酸脱炭酸酵素により天然型のノルアドレナリンとなり、すくみ足や起立性低血圧に有効なノルアドレナリンの前駆物質として、年間６０億円以上の市場があるパーキンソン病の治療薬である。これらは現在、化学合成法により合成されているが、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの化学合成については多段階の面倒な保護・脱保護を必要とし、また、合成物質は４種類の異性体からなり、目的のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを得るためには繁雑な分離工程や分割工程を必要とし、非常に高価な医薬品となる。即ち、ベンズアルデヒド誘導体とグリシンを強アルカリ存在下で縮合させ、ラセミ−スレオ／エリスロ−フェニルセリン誘導体を得た後、スレオ／エリスロ体の相互分離処理を行い、エリスロ−体を除く。次に、得られたラセミ−スレオ−フェニルセリン誘導体のアミノ酸部分に置換基を導入した後、キニン、ブルシンなどの光学分割剤を用いて光学分割を行い、最後にアミノ基部分の置換基を除去しなければならないなど非常に複雑なプロセスである。
【０００３】
一方、酵素による一段階合成法は化学合成と比べ、面倒な保護・脱保護を必要としないなどメリットは大きく、さらに安価な基質を利用することにより安価で合成することができる。酵素による一段階合成法は最も簡単かつ効率的で、近年最も注目され、様々なβ−ヒドロキシアミノ酸の一段階合成に利用されている。酵素による一段階合成法でβ−ヒドロキシアミノ酸誘導体を合成できる酵素としてスレオニンアルドラーゼが知られている。スレオニンアルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．５）は、β−ヒドロキシアミノ酸を分解して、グリシンとアルデヒドを生成する反応を触媒することで知られている酵素である。この酵素は二つの不斉炭素原子を有するスレオニンを基質とした場合、α−位の立体特異性によって、Ｌ−タイプとＤ−タイプに区別される。さらに、β−位の立体特異性によりＬ−スレオニンにのみ作用するＬ−スレオニンアルドラーゼ、Ｌ−アロスレオニンにのみ作用するＬ−アロスレオニンアルドラーゼ、さらにＬ−スレオニンとＬ−アロスレオニンの両方に作用する低立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼに分類されている。Ｄ−タイプでも同様に分けられる（非特許文献１〜３）。
【０００４】
酵素による一段階合成法は、エシェリヒア属に属す微生物などにより得られるＬ−スレオニンアルドラーゼや、バチルス属に属す微生物により得られるフェニルセリンアルドラーゼに様々なアルデヒド誘導体とグリシンを作用させＬ−スレオ−フェニルセリン誘導体を得る方法が知られている。しかし、これら公知の微生物による一段階合成法に利用されているＬ−スレオニンアルドラーゼは、立体選択性であるスレオ体／エリスロ体比率に関する記載がなく、Ｌ−エリスロ−フェニルセリン誘導体の合成量は不明であったり（特許文献１〜５）、又、エシェリシア属に属する微生物由来のＬ−スレオニンアルドラーゼを用いた場合のベンズアルデヒド誘導体とグリシンからＬ−スレオ−フェニルセリン誘導体を合成する場合の選択性は−５０〜４６％ｄ．ｅ．（非特許文献１）、シュードモナス属に属する微生物により得られるＬ−スレオニンアルドラーゼにアルデヒド誘導体とグリシンを作用させてＬ−スレオ−フェニルセリン誘導体を合成する場合の選択性は５７．５〜１００％ｄ．ｅ．（非特許文献２）、アエロモナス属に属する微生物により得られるＬ−アロ−スレオニンアルドラーゼにベンズアルデヒドとグリシンを作用させてＬ−スレオ−フェニルセリンを合成する場合の選択性は７３．２％ｄ．ｅ．（非特許文献３）であることが知られているが、その他の微生物での報告はなかった。
【０００５】
特に、発明者らが目的とするＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの酵素縮合反応での立体選択性を示した例は非特許文献２のみである。尚、選択性を表わす指標（％ｄ．ｅ．）は次の計算式により算出される。選択性（％ｄ．ｅ．）＝｛（Ｌ−スレオ体−Ｌ−エリスロ体）÷（Ｌ−スレオ体＋Ｌ−エリスロ体）｝×１００
【特許文献１】特公昭５２−４６３１３号公報
【特許文献２】特公昭５１−６２３９号公報
【特許文献３】特公昭５４−３９５２号公報
【特許文献４】特公昭５４−１２５５４号公報
【特許文献５】特開平９−２３８６８０号公報
【非特許文献１】キムラ・ティー（Ｋｉｍｕｒａ，Ｔ．）他３名、ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテイー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９９７年、第１１９巻、ｐ．１１７３４−１１７４２
【非特許文献２】リウ・ジェイ・キュー（Ｌｉｕ，Ｊ．Ｑ）他５名、アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、１９９８年、第４９巻、ｐ．７０２−７０８
【非特許文献３】日本農芸化学会誌、１９９８年、第７２（５）巻、ｐ．７４６−７４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
今までにも多数のＬ−スレオニンアルドラーゼが単離され、機能解析が進められているが、一段階合成反応では、目的としているＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ以外にもＬ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ＤＯＰＳを副生してしまう欠点を有している。即ち、Ｌ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ＤＯＰＳの副生が少なく、光学活性体のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを高選択的に合成できる活性を有し、尚かつ高い生産能力を有するＬ−スレオ型のＬ−スレオニンアルドラーゼは知られていなかった。従って、本発明はＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを高選択的に合成することを目的として、これらの反応を触媒するＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を取得し、また、そのような遺伝子を導入・発現した組換え微生物の利用により、上記のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを高選択的に合成する方法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、放線菌であるストレプトマイセス属から、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを基質とし、β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の合成に関与する遺伝子を取得するべく鋭意検討を行った。その結果、ストレプトマイセス属細菌から取得したＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子がβ−ヒドロキシアミノ酸誘導体の合成に関与することを見出した。しかし、該Ｌ−スレオニンアルドラーゼを用いた合成反応により得られたβ−ヒドロキシアミノ酸誘導体はＬ−スレオ／エリスロ−フェニルセリン誘導体の混合物であったためスレオ体／エリスロ体の相互分離処理を行い、エリスロ−体を除く必要があった。そこで、本発明者らは、例えばランダム変異導入法による変異遺伝子ライブラリーを作製し、該ライブラリーからＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼを産生する変異株を取得し、さらに研究を重ねることにより本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、
［１］配列番号１１より誘導された下記の（１）、（２）、（３）または（４）に示す遺伝子：
（１）配列番号３、４、５または６に示す塩基配列のＤＮＡからなる遺伝子：
（２）配列番号３、４、５または６に示す塩基配列のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子：
（３）配列番号７、８、９または１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子：
（４）配列番号７に示すアミノ酸配列の８６番目のイソロイシンおよび２４１番目のシステイン、配列番号８に示すアミノ酸配列の２４番目のシステイン、配列番号９に示すアミノ酸配列の２４１番目のシステインおよび２８７番目のバリン、または配列番号１０に示すアミノ酸配列の３２１番目のシステインが保持され、当核アミノ酸配列７、８、９または１０で示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
［２］配列番号１２より誘導された下記の（１）または（２）に示すタンパク質：
（１）配列番号７、８、９または１０に示すアミノ酸配列からなるタンパク質：
（２）配列番号７に示すアミノ酸配列の８６番目のイソロイシンおよび２４１番目のシステイン、配列番号８に示すアミノ酸配列の２４番目のシステイン、配列番号９に示すアミノ酸配列の２４１番目のシステインおよび２８７番目のバリン、または配列番号１０に示すアミノ酸配列の３２１番目のシステインが保持され、当核アミノ酸配列７、８、９または１０で示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質、
［３］前項１に記載の遺伝子を含有する組換えベクター、
［４］前項３に記載の組換えベクターを含む微生物、
［５］宿主が大腸菌である前項４に記載の微生物、
［６］受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１２、ＮＩＴＥ  Ｐ−１１３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１１４およびＮＩＴＥ  Ｐ−１１５として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された微生物、および
［７］前項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドおよびグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから光学活性を有するＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを高い比率で合成できるＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子が提供される。そして、これらのＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を保有する菌体もしくはその調製物を用いて、高選択的にＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを合成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼは、主としてＬ−スレオニンをグリシンとアセトアルデヒドに分解する反応を触媒する酵素である。また、この酵素は分解反応以外にその逆反応としてグリシンとアセトアルデヒドからＬ−スレオニンとＬ−アロスレオニンの合成反応も触媒する酵素である。この逆（合成）反応を利用して、グリシンと３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドからＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを高選択的に合成するのが本発明の目的である。従って、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子に変異を導入して、Ｌ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子および該遺伝子を挿入した微生物を創製し、Ｌ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼが微生物で著量蓄積できれば、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの生産に有効に使用できると考えられる。
本発明のＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼとは、グリシンと３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドから通常１５％ｄ．ｅ．以上、好ましくは２０％ｄ．ｅ．以上の高い選択性でＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを製造し得るＬ−スレオニンアルドラーゼをいう。
Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子に変異を導入するとは、基礎となるＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列中の塩基が１〜数個（約２〜１０個）他の塩基に置換、または塩基が付加あるいは削除され、基礎となるＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子からＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子へと変異させることをいう。
【００１１】
上記変異操作に供される基礎となるＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子（以下、変異を導入する基となる遺伝子ともいう。）としては、Ｌ−スレオニンアルドラーゼを有する動物、植物、または微生物由来のいずれの遺伝子でも使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。前記微生物としては、例えばストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を好ましく挙げることができる。
変異を導入する基となる遺伝子としては、好ましくは、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属す微生物由来の遺伝子、さらに好ましくは、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来の遺伝子、とりわけ好ましくはストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）株（以下、親株ということもある。）由来の遺伝子が挙げられる。ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部(日本、木更津市)にストレプトマイセス・バイオラセルーバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｒｕｂｅｒ）ＮＢＲＣ１５１４６株として保存されており、誰でも入手可能である。
ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子としては、例えば配列番号１１で表される塩基配列のＤＮＡを含む遺伝子を挙げることができる。
【００１２】
ただし、変異を導入する基となる遺伝子は、上記当該の遺伝子に限定されず、例えば配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＬ−スレオニンアルドラーゼをコードするすべての遺伝子を含む。
【００１３】
また、本発明において「遺伝子」または「ＤＮＡ」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡおよびｃＤＮＡも含むものとする。したがって、本発明の遺伝子には、これらのＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡの全てが含まれる。
【００１４】
本発明において「相補的な配列」とは、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする塩基配列に対して塩基対合則（アデニン／チミン、シトシン／グアニン）に従って形成される塩基配列をいう。
【００１５】
ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）株からのＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の取得および変異の導入は、例えば以下の方法により実施することができる。
【００１６】
まず、ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）株を栄養培地で培養し菌体（微生物）を得る。栄養培地は、通常の微生物の培養に使用される培地であればいずれも好ましく用いることができる。
【００１７】
菌体（微生物）からのゲノムＤＮＡの抽出は公知の方法で行なうことができ、また市販のＤＮＡ抽出キットを用いて簡便に行なうことができる。市販のＤＮＡ抽出キットとしては、例えばＰｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ社製）、ＧＦＸ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス製）、ＭａｇＰｒｅｐ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
次に、ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）株の全塩基配列はデータベース上で公開されているので、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の配列も閲覧することができる（例えばＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ６４５８８２）。このＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ６４５８８２に示されるＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＮ末端およびＣ末端配列の塩基配列をもとにオリゴヌクレオチドを設計する。設計したオリゴヌクレオチドをプライマーとして、上記で抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡを得る。このようなプライマーとして例えば配列番号１または２の塩基配列で示されるプライマーが挙げられる。配列番号１の塩基配列で示されるプライマーはＬ−スレオニンアルドラーゼのＮ末端配列の上流に制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を、配列番号２の塩基配列で示されるプライマーはＬ−スレオニンアルドラーゼのＣ末端配列の下流に制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列をそれぞれ追加したものである。なお、前記認識配列は前記に限定されず、後記するベクターが有する制限酵素部位に含まれる制限酵素の認識配列との関係から適宜選択するのが好ましい。ＰＣＲ反応は公知のＰＣＲ増幅装置、例えばサーマルサイクラーなどを利用し得る。ＰＣＲのサイクルは、公知技術に従って行なわれてよく、例えばデナチュレーション→アニーリング→エクステンションを１サイクルとして、約１０〜１００サイクル、好ましくは約２０〜５０サイクル程度増幅するのが好ましい。
【００１９】
ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片を制限酵素、例えばＥｃｏＲＩと制限酵素ＢａｍＨＩなどで処理し、同じく両制限酵素で処理した発現ベクターと連結させることにより発現ベクターを得ることができる。該発現ベクターを公知の方法で例えば大腸菌などの微生物に挿入し上記遺伝子のクローニングを行ない得る。
【００２０】
大腸菌などの微生物への遺伝子の導入および該遺伝子の発現は遺伝子工学実験の常法に基づいて行うことができる。大腸菌や放線菌などの種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入・発現法は、多くの実験書に記載されているので（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．，Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．，Ｂｒｕｔｏｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｋｉｅｓｅｒ，Ｈ．Ｍ．，Ｌｙｄｉａｔｅ，Ｄ．  Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｐ．，Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｈｒｅｍｐｆ，Ｈ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫ，１９８５）、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
【００２１】
クローニングされたストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子への変異の導入は、市販の変異導入用キットなどを用いることにより簡便に行なうことができる。すなわち、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子が挿入されたベクターを用いて、変異導入用キットを該キットのプロトコールなどに従い実施することにより、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子に非常に高い頻度でランダムに変異が導入され、同時に該変異した遺伝子（以下、変異遺伝子という。）がＰＣＲにより増幅され得る。このような変異導入用キットとしては、例えばＭｕｔａｚｙｍｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含むＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ（登録商標）  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（タカラバイオ株式会社製）またはＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲランダム突然変異誘発キット（ＢＤバイオサイエンス社製）などが挙げられるがこれに限定されない。変異導入用キットによりＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子に変異が導入され増幅された、変異遺伝子のＰＣＲ産物を、ＤＮＡ精製用キットを用いて精製するのが好ましい。該精製用キットとしては、例えばＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ社製）、ＳｐｉｎＣｌｅａｎ（登録商標）  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）  ＰＣＲ産物クリーンアップキット（パーキンエルマー社製）、ＪＥＴＦＬＥＸ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｍｅｄ社製）、ＧＦＸ  ９６  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ＡｕｔｏＳｅｑ  Ｇ−５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などが挙げられるがこれに限定されない。精製した変異遺伝子のＰＣＲ産物を前述した二種類の制限酵素、例えばＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩなどで切断した後、アガロースゲル電気泳動にかけて、約１ｋｂｐに相当するバンドをゲルから切り出して、更にアガロースゲルからＤＮＡの精製を行うのが好ましい。該精製は、市販キットを使用することができ、例えばＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ社製）またはＳ．Ｎ．Ａ．Ｐ．ＵＶ−Ｆｒｅｅ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などを使用し得るが、これらに限定されない。精製された変異遺伝子のＰＣＲ産物は、適当な発現用ベクターに挿入され、次いで変異遺伝子が挿入された発現ベクターを、宿主（菌株）に挿入し、宿主を形質転換し、変異遺伝子ライブラリーを構築し得る。
【００２２】
発現用ベクターとしては、例えば細菌プラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ  １６ｂ、ｐＥＴ  ３２ａ（＋）、ｐＣＩＴＥ  ４ａ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＭＡＬ−ｃ２、ｐＢｒｉｄｇｅ  Ｖｅｃｔｏ、ｐＫＦ１８ｋ  ＤＮＡ、ｐＫＦ１９ｋ  ＤＮＡ、ｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス製）、ｐＳＰＯＲＴ  １、Ｃｈａｒｍｏｍｉｄ  ９−３６  ＤＮＡ、ｐＥＵ−ＤＦＲ、ｐＩＶＥＸ  ２．３−ＭＣＳ、ｐＩＶＥＸ  ２．４ｃ、ｐＩＶＥＸ  ２．３、ｐＩＶＥＸ  ２．４ｂ  Ｎｄｅ、ｐＩＶＥＸ  ２．４ａなど）、ファージＤＮＡ（ラムダファージなど）、酵母プラスミド（ｐＧ−１など）、哺乳類細胞用のベクターとしてのバキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどのウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体などが挙げられ、宿主において複製可能である限り他のいかなるベクターも用いることができる。
【００２３】
ベクターは例えば複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナルなどを含んでいてもよい。ベクターは、種々の制限酵素部位をその内部にもつポリリンカーを含んでいるか、または単一の制限酵素部位を含んでいることが望ましい。制限酵素部位としては、例えばＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩサイト、ＮｏｔＩサイト、ＳａｌＩサイト、ＫｐｎＩサイトまたはＨｉｎｄＩＩＩサイトなどが挙げられる。これら制限酵素サイトは、各々制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｌＩ、ＫｐｎＩまたはＨｉｎｄＩＩＩなどで切断され得る。
ベクターへの遺伝子導入は、公知の手段で行なうことができる。具体的には、ベクター中の特定の制限酵素部位（例えばＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩなど）を特定の制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩなど）によって切断し、その切断部位に本発明の遺伝子を挿入するのが好ましい。このようにして、本発明の遺伝子を含む組換えベクターを調製できる。
【００２４】
宿主としては、例えば細菌、例えば大腸菌（例えば、エシェリヒア・コリＪＭ１０９菌株など）、コリネバクテリウム属菌、バチルス属菌、ストレプトミセス、枯草菌など；真菌細胞、例えばアスペルギルス属菌株など；酵母細胞、例えばパン酵母、メタノール資化性酵母など；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９など；ヒト培養細胞を含む哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７など；あるいはこれらのコンピテントセルなどが挙げられ、好ましくは大腸菌のコンピテントセルである。
形質転換は、例えば塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などの公知の方法で行うことができる。
具体的には、例えば上述の変異遺伝子が挿入された発現ベクターとエシェリヒア・コリＪＭ１０９（以下、大腸菌ＪＭ１０９ともいう。）のコンピテントセルと混合することにより、形質転換された微生物を得ることができる。
【００２５】
上述の変異遺伝子が挿入された発現ベクターにて形質転換された微生物（以下、単に形質転換された微生物または形質転換微生物という。）は下記する微生物培養培地などで、培養温度約２０〜４０℃、培養時間約１〜７日間、培地のｐＨ約５．０〜８．０程度で培養されることが好ましい。
【００２６】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼの活性は、例えば以下の様にしてＬ−スレオニンアルドラーゼのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの分解活性を測定することにより確認することができる。即ち分解活性は、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを含む反応液（以下、分解反応液ともいう。）に、形質転換微生物から調製した無細胞抽出液を添加し、約２０〜６０℃、好ましくは約４０〜５０℃、約１〜３０分間、好ましくは約１０〜１５分間反応を行い、生成したグリシンを高速液体クロマトグラフ法（以下、ＨＰＬＣという。）により定量することにより測定することができる。無細胞抽出液としては、形質転換微生物を例えば水媒体中で超音波やガラスビーズなどで破砕した後のＬ−スレオニンアルドラーゼを含む遠心分離上清などが挙げられる。
Ｌ−スレオニンアルドラーゼのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ合成活性は、形質転換微生物をグリシンと３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドを含む反応液（以下、合成反応液ともいう。）中で、約５〜５０℃、好ましくは約１０〜２０℃、約１〜２４時間、好ましくは約４〜６時間反応させ、生成したＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを例えばＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣ法などにより定量することができる。
【００２７】
分解反応液および合成反応液の基礎となる溶液としては、形質転換された微生物の生育やＬ−スレオニンアルドラーゼの働きを阻害しない溶液であれば特に制限はなく、例えば微生物培養培地または緩衝液、あるいは水（例えば精製水、蒸留水、イオン交換水等）などが好ましく挙げられる。
【００２８】
微生物培養培地は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば好ましく用いることができ、例えば炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質などを含有する天然培地または合成培地などが用いられる。
炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、シュークロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトールまたはグリセリンなどの糖質および糖アルコール、酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸またはグルコン酸などの有機酸、エタノールまたはプロパノールなどのアルコールなどが挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィンなどの炭化水素なども用いることができる。炭素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
これら炭素源の培地における濃度は通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
窒素源としては、窒素化合物、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの無機もしくは有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウムまたは硝酸カリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、ＮＺ−アミン、蛋白質加水分解物またはアミノ酸などの含窒素有機化合物なども使用可能である。窒素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
窒素源の培地濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルトまたは炭酸カルシウムなどが挙げられる。これら無機塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
無機塩類の培地濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常約０．０１〜１．０％（ｗｔ）程度である。
栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物または動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物などが挙げられる。
栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
培地のｐＨは約５．０〜８．０程度が好ましい。
【００２９】
好ましい微生物培養培地としては、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地；トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、食塩１０ｇ／Ｌ）、ＮＺＹＭ培地、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ、ＳＯＢ培地、２ｘＹＴ培地、ＡＨＣ培地、χ１７７６培地、Ｍ９培地、ＹＰＤ培地、ＳＤ培地、ＹＰＡＤ培地またはＳｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈ培地などが挙げられる。
【００３０】
緩衝液としては、例えばリン酸バッファー、トリスバッファー、リン酸緩衝食塩水、酢酸緩衝液などが挙げられる。緩衝液のｐＨは、通常約５〜１０、さらに約６．５〜８．５が好ましい。
【００３１】
また、Ｌ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼを産生する変異株を上述の遺伝子ライブラリーから選択するためのスクリーニングは、例えば９６穴あるいは２４穴のディープウェルプレートなどを用いて、少量の培養で迅速に行なうことができる。即ち、前述の変異遺伝子ライブラリーのコロニーを、例えばコロニーピッカーなどにより選抜し、該コロニーの菌体（微生物）を、例えば９６穴のプレートを用いて約５０〜２００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む微生物培養培地（例えばＬＢ培地）約０．１〜０．５ｍＬ、好ましくは約０．２５ｍＬの培養液量で約２０〜４０℃、好ましくは約３０℃、一晩培養を行ない約２０００〜３０００ｒｐｍ、約５〜２０分間の遠心分離により菌体を得る。この菌体と約０．１〜０．５ｍＬ、好ましくは約０．２５ｍＬのＬ−スレオニン（約１〜５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約２ｍｇ／ｍＬ）を含む反応液を約３０〜５０℃、約１０〜６０分、好ましくは約３０分間反応後、生成したアセトアルデヒドを発色剤（例えば、約１５Ｗ／Ｖ％酢酸アンモニウム、約０．５Ｖ／Ｖ％酢酸、約２０Ｖ／Ｖ％アセチルアセトン）と約３０〜５０℃、約１０〜６０分、好ましくは約３０分間反応させ黄色の発色により、Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性の確認を行なう。この一次スクリーニングで活性の確認されたコロニーの菌体（微生物）のみを次の二次スクリーニングに供する。
【００３２】
二次スクリーニングは、例えば２４穴のディープウェルプレートを用いて、一次スクリーニングで活性が確認されたコロニーの菌体（微生物）を、約１〜３ｍＬ、好ましくは約２ｍＬの約５０〜２００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む微生物培養培地（例えばＬＢ培地）で約２０〜４０℃、好ましくは約３０℃、約１〜４８時間培養を行なう。遠心分離により得られた菌体と約５０〜５００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約２００ｍｇ／ｍＬのグリシンと約５〜５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約２０ｍｇ／ｍＬの３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドを含む約０．１〜０．５ｍＬ、好ましくは約０．２ｍＬの反応液中（ｐＨ約５〜１０、特に好ましくは約６．５〜８．５）で、温度約５〜６０℃、好ましくは約２０〜４０℃で約１時間〜４８時間、静置若しくは攪拌下に反応させＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成反応を進行せしめるのが好ましい。生成したＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳはＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣ法により分析し、スレオ体とエリスロ体の割合を測定することができる。選択性の計算は以下の計算式で計算できる。
【００３３】
【数１】
2007054012.tif 000002
【００３４】
親株の場合の上記立体選択性はおおよそ１５％ｄ．ｅ．であるが、前述のスクリーニングにより立体選択性が親株より５％ｄ．ｅ．以上向上したＬ−スレオ高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼを産生する形質転換微生物を得ることができる。この形質転換微生物を約５０〜２００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１００μｇ／ｍＬのアンビシリンを含む微生物培養培地（例えばＬＢ培地）で、約２０〜４０℃、好ましくは約３０℃約１時間〜４８時間培養し、その培養液から遠心分離により菌体を回収する。回収された菌体からプラスミドＤＮＡを抽出する。プラスミドＤＮＡの抽出は、公知の方法で行なうことができ、また市販のＤＮＡ抽出キットを用いてプラスミドＤＮＡを簡便に抽出できる。市販のプラスミドＤＮＡ抽出キットとしては、例えば例えばＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）などが挙げられる。この抽出されたプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定することにより、本発明のＬ−スレオ高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする全ＤＮＡを決定することができる。
【００３５】
得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、例えばジデオキシヌクレオチド酵素法など、公知の方法により決定することができる。また、キャピラリー電気泳動システムを用い、検出には多色蛍光技術を使用して塩基配列を決定することもできる。また、ＤＮＡシークエンサー、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  ＡＮＡＬＹＺＥＲ（アプライドバイオシステム社製）などを使用して自動的に分析して塩基配列を決定することもできる。
【００３６】
上記のようにして、Ｌ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、本発明に用いられる遺伝子として、例えば、配列番号３〜６に示す塩基配列を決定し得る。該遺配列番号３で示される遺伝子は、変異が導入される基となる配列番号１１に示される塩基配列の１１７番目のシトシンがチミンに、２５６番目のグアニンがアデニンに、７２１番目のシトシンがチミンに、配列番号４で示される遺伝子は、同配列番号１１で示される塩基配列の７１番目のアデニンがグアニンに、配列番号５で示される遺伝子は、同配列番号１１で示される塩基配列の５２５番目のシトシンがチミンに、７２１番目のシトシンがチミンに、８６０番目のシトシンがチミンに、配列番号６で示される遺伝子は、同配列番号１１で示される塩基配列の４２９番目のシトシンがチミンに、９６２番目のアデニンがグアニンにそれぞれ変化したものである。
【００３７】
なお、前記配列番号３〜６で示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子も、本発明に用いられる遺伝子である。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、例えば配列番号４に示す塩基配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法またはプラーク・ハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡを意味する。なお、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、例えば相同性が高いＤＮＡ同士、少なくとも配列番号４で示される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）、温度約６５℃程度でのハイブリダイズ条件をいう。なお、相同性は塩基配列解析ソフト、例えばＥＭＢＯＳＳなどにより計算され得る。
【００３８】
次いで前記配列番号３〜６で示される塩基配列をアミノ酸配列に翻訳して解析し、例えば、配列番号７〜１０に示すＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼの全アミノ酸配列を決定することができる。該配列番号７で示されるアミノ酸配列は、変異が導入される基となる配列番号１２に示されるアミン酸配列の８６番目のバリンがイソロイシンに、２４１番目のアルギニンがシステインに変化したものであり、配列番号８で示されるアミノ酸配列は、同配列番号１２に示されるアミン酸配列の２４番目のチロシンがシステインに変化したものであり、配列番号９で示されるアミノ酸配列は、同配列番号１２に示されるアミン酸配列の２４１番目のアルギニンがシステインに、２８７番目のアラニンがバリンに変化したものであり、配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、同配列番号１２に示されるアミン酸配列の３２１番目のチロシンがシステインに変化したものである。
【００３９】
本発明のＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼとしては、例えば配列番号７〜１０に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が好ましく挙げられる。また、本発明のＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼには、配列番号７に示すアミノ酸配列の８６番目のイソロイシンおよび２４１番目のシステイン、配列番号８に示すアミノ酸配列の２４番目のシステイン、配列番号９に示すアミノ酸配列の２４１番目のシステインおよび２８７番目のバリン、配列番号１０に示すアミノ酸配列の３２１番目のシステインが保持され、当核アミノ酸配列７、８、９または１０で示されるアミノ酸配列において１乃至数個（約２〜２０個、好ましくは約２〜１０個程度）のアミノ酸が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質が含まれる。
【００４０】
上述のＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターにて形質転換された微生物（以下、変異遺伝子導入微生物という。）を培養し、得られる変異遺伝子導入微生物を下記する反応に用いるのが好ましい。培養は、上記形質転換微生物の培養条件と同様に行うことができる。例えば好気条件下で約１２〜２４時間程度実施するのが好ましい。また培養温度は例えばエシェリキア・コリＪＭ１０９株形質転換体の場合、ポリペプトンや酵母エキス等の炭素源や窒素源、食塩等の無機物を含む培地を用いて、好ましくは約２０〜４０℃、より好ましくは３０〜３７℃である。
【００４１】
得られた変異遺伝子導入微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する液（合成反応液）と接触させ、目的のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ一段階合成反応を行い生成蓄積せしめる。該合成反応液の基礎となる溶液は、上記した分解反応液および合成反応液の基礎となる溶液と同様のものを用いることができる。
すなわち、本発明のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの製造方法において、変異遺伝子導入微生物またはその調製物を用いて、グリシンと３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドから一段階で収率よくＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを得ることができる。
【００４２】
変異遺伝子導入微生物は、培養液中に存在する状態や培養液から該微生物を分離・濃縮などして使用することもできる。また、変異遺伝子導入微生物の調製物としては、例えばアクリルアミドやカラギーナンなどの担体上に変異遺伝子導入微生物を固定化した固定化微生物、あるいは、凍結乾燥やアセトン処理などによる乾燥微生物などの調製物などが挙げられる。また、前記調製物には変異遺伝子導入微生物に生成蓄積した酵素を抽出し、好ましくは精製などして樹脂担体などに固定化した固定化酵素も含まれる。酵素の精製法は、微生物を超音波やガラスビーズで破砕した後、硫安沈殿、イオン交換およびゲルろ過カラムクロマトといった通常酵素精製に用いられる精製法を組み合わせて行なうことができる。
【００４３】
又、変異遺伝子導入微生物は、紫外線、エックス線または薬品などを用いる人工的な変異手段でさらに変異しうるが、このように得られるどのような変異株であっても本発明の対象とするＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼ生産能を有するかぎり、本発明の変異遺伝子導入微生物として使用することができる。
【００４４】
合成反応液中に含まれる３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドは、Ｌ−スレオニンアルドラーゼの酵素活性を阻害しない程度の濃度で用いられ、通常、合成反応液の約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。またその供給方法としては分割添加や連続的に添加する方法などで行うことが出来る。
合成反応液中に含まれる他方の反応基質であるグリシンは、通常約０．１〜３０％（ｗｔ）程度を反応系に存在せしめて使用されるが、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドに対しては等モル以上で使用することが好ましい。グリシンは、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドと同様に合成反応液に添加できる。
【００４５】
合成反応液と変異遺伝子導入微生物またはその調製物との接触は、例えば培養した変異遺伝子導入微生物を遠心分離機やろ過などで集め、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する合成反応液に加えて接触せしめてもよく、また集めた変異遺伝子導入微生物を例えば水媒体中で超音波やガラスビーズなどで破砕した後のＬ−スレオニンアルドラーゼを含む遠心分離上清または該上清から精製したＬ−スレオニンアルドラーゼを合成反応液に加える方法であってもよい。また、固定化微生物や固定化酵素を合成反応液と接触させても良い。
合成反応液と変異遺伝子導入微生物またはその調製物との接触方法は、公知の方法、例えばバッチ方式または連続方式（例えば、カラム法、固定化微生物、固定化酵素法等）など、いずれの方法も用いることができる。
また、合成反応液と変異遺伝子導入微生物をフィルターなどにより分離し、変異遺伝子導入微生物を連続的に回収し、繰り返し再使用することもできる。
【００４６】
本発明の反応は、ｐＨ約５〜１０、特に好ましくは約６．５〜８．５において、温度約５〜６０℃、特に約１０〜５０℃で静置若しくは攪拌下に反応を進行せしめるのが好ましい。反応時間としては、通常約１時間〜４８時間の範囲が好ましい。
また、本発明の反応は、好気、嫌気いずれの条件でも行なうことができる。また、合成反応液と変異遺伝子導入微生物の反応は、変異遺伝子導入微生物が生存できる条件、例えば上記微生物の培養における条件と同様の条件で実施することが好ましい。
【００４７】
本酵素系には補酵素としてビタミンＢ６が要求されるため、合成反応液には、例えばピリドキシン、ピリドキサールまたはピリドキサール−５’−リン酸などを添加することが好ましい。該補酵素を添加することにより反応が高められ得る。
また。合成反応液には、所望により例えば２−メルカプトエタノールのような還元剤を添加することもできる。
かくして反応せしめた反応混合物中には、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから両化合物の反応生成物であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳが高選択的にかつ高収率（反応条件により一概にはいえないが、約１５％ｄ．ｅ．以上、好ましくは約２０％ｄ．ｅ．以上、より好ましくは約２０〜８０％ｄ．ｅ．程度である。）に生成し得る。
【００４８】
合成されたＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの精製は、公知の方法、例えばイオン交換樹脂、吸着樹脂やシリカゲルなどのクロマト分離、酢酸エチルやトルエンなどの有機溶媒を用いた溶媒抽出、溶解度の差を利用した分別結晶化などを組み合わせて行なうことができる。
【００４９】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、本発明において配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示す。本明細書において％は特に断らない限り質量％を意味する。
【実施例１】
【００５０】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼ産生株ＤＮＡの取得
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）からのゲノムＤＮＡ抽出には、ＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ社製）を用いた。まず、斜面培養したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）のコロニーから白金耳を用いて採取した菌体を、ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．２％および硫酸マグネシウム０．１％を含む液体培地１０ｍＬ（ｐＨ７．０）に植菌し、３０℃、２日間振騰培養した。この５ｍＬの培養液を１５ｍＬのファルコンチューブへ移し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を捨て、得られたペレットをキットに添付のＣｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ３ｍＬに懸濁した。８０℃、５分間の熱処理により細胞を溶菌させた。その後、１５μＬのＲＮａｓｅ  Ａ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、溶液を良く混合の後、３７℃、３０分間処理を行なった。次に１ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、溶液を激しく混合した後、１５，０００×ｇ、３分間の遠心分離によりゲノムＤＮＡを含む溶液を上清として回収した。更に、回収した溶液に３ｍＬのＩｓｏｐｒｏｐａｎｏｌを添加し混合の後、１５，０００×ｇ、１分間の遠心分離によりゲノムＤＮＡを白いペレットとして回収した。得られたＤＮＡは、ＤＮＡ  Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５００μＬに溶解し、１μＬをアガロース電気泳動してＤＮＡの存在を確認後、４℃または−２０℃で保存した。
【実施例２】
【００５１】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の増幅
実施例１で取得したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）のゲノムＤＮＡよりＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子をＰＣＲ反応より増幅するためのプライマーを合成した。即ち、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）のゲノム解析の結果得られたＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子塩基配列はすでに公開されている（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＬ６４５８８２）。この遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＮ末端およびＣ末端部分の塩基配列を利用し制限酵素の認識配列として、Ｎ末端の前にＥｃｏＲＩ認識配列を追加したＤＮＡプライマー配列；
５’プライマー：5’-ATATACCATGGAATTCAACCCTCCTAAGACCGACG-3’（配列番号１）
とＣ末端の後にＢａｍＨＩ認識配列を追加したＤＮＡプライマー配列；
３’プライマー：5’-ATCTAGAGGATCCTCAGCGCGCCATCTCTTCCTTG-3’（配列番号２）
を合成した。
【００５２】
これらのＤＮＡプライマー（配列番号１と配列番号２）を用いて実施例１で得たゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅を行なった。ＰＣＲには、Ｔａｋａｒａ社のＬＡ−ＰＣＲキットを用い、２種類のＨｉｇｈ  ＧＣバッファーで反応を行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである。
ＰＣＲ条件：１μＬ鋳型ゲノムＤＮＡ（３８７．５ｎｇ／μＬ）、０．５μＬ（５Ｕ／μＬ）ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２５μＬ  ＬＡ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付のＨｉｇｈ  ＧＣバッファー（Ｉ）（１Ｘ）、８μＬｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）、０．５μＬ  ５’プライマー（配列番号１）２５ｐｍｏｌ／ｍＬおよび０．５μＬ  ３’プライマー（配列番号２）２５ｐｍｏｌ／ｍＬの混合物に水を加え、総量５０μＬの溶液を作製し、９４℃で２分間熱処理後、９４℃で４０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分の条件で３０サイクルのプログラムで増幅を行い、その後７２℃で５分間処理した。また、増幅の確認は１％のアガロース電気泳動を行った。その結果、制限酵素部位を含む１種類のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子が増幅された（１０９７ｂｐ）。
【実施例３】
【００５３】
組換えＬ−スレオニンアルドラーゼ発現ベクターの作製
ＰＣＲにより増幅されたＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断して分離し、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス製）に挿入することにより発現させた。即ち、実施例２におけるＰＣＲにより増幅されたＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子断片を含むＰＣＲ溶液をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）にて精製し、各々１０Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて３７℃で３時間切断反応を行った。反応後の溶液を１％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロースゲル電気泳動より分離し、１０８１ｂｐに相当するバンドをゲルより切り出してＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製した。
【００５４】
次に１μｇのｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス製）を各１０Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて３７℃で一晩静置し、ｐＴｒｃ９９Ａの制限酵素部位の切断反応を行った。反応後の溶液を０．７％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロースゲル電気泳動より切断を確認し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製し、３０μＬのトリス−塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）により溶解した。
【００５５】
制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断して得た１０８１ｂｐのＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子断片を含む溶液８μＬとＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断して得たｐＴｒｃ９９Ａの溶液８μＬをＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）と混合し、１６℃で５時間連結反応を行った。反応後の溶液５μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を含む溶液を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧおよび０．００４％のＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３７℃で一晩培養してコロニーを形成させた。それぞれについて白色の陽性コロニーを選択し、３ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含んだＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。培養液を遠心分離して集菌後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により約２μｇのプラスミドＤＮＡを精製した。そのうち約０．５μｇのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、１％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロースゲル電気泳動より１０８１ｂｐに相当する挿入断片の存在を確認した。さらに挿入断片の塩基配列をシークエンス反応により確認したところ、変異は認められなかった。この発現プラスミドをｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）とした。
【実施例４】
【００５６】
組換えＬ−スレオニンアルドラーゼの大腸菌での発現および活性測定
挿入断片が確認されたｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）を挿入した大腸菌ＪＭ１０９株（この形質転換体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。寄託番号：受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１１）を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ培地に植菌し、一晩３７℃で培養した。この培養液のうち、０．１ｍＬを１０ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に接種した。約３時間後、培地のＯＤ６００が０．４〜０．７に上昇したことを確認後、最終濃度で２ｍＭになるように１ＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を培地に添加し組換えＬ−スレオニンアルドラーゼの大腸菌での発現を誘導させた。その培養液をさらに、一晩３７℃で培養し、培養液を１００００×ｇ、５分間の遠心操作により細胞を沈殿させ、上清を除いた後、０．８５％のＮａＣｌで１回洗浄した。遠心操作により細胞を沈殿させた後、ビーズ衝撃法細胞破砕装置Ｂｅａｄｓ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ＢＣ−２０（４℃、３分、セントラル科学貿易製）でその菌体を２回破壊した。２００００×ｇで１０分間遠心した後、その上清を粗酵素液としてＬ−スレオニンアルドラーゼの分解活性を調べた。反応液の組成は１００μＬのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ）、２５μＬのピリドキサール−５’−リン酸（０．６μｇ／ｍＬ）および１μＬのメルカプトエタノール（２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を水で１５０μＬとし、この反応液に５０μＬの粗酵素液（多段階希釈により許容範囲に合わせた）を加え５０℃で１０分間酵素反応を行い、３倍量のメタノールを加えることにより反応を停止させた。Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの分解産物であるグリシンの生成量はＨＰＬＣ（日立Ｌ２０００シリーズ、日立製作所製）でポストカラム分析法を用いて定量した。ＨＰＬＣ分析は、ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＭＳ（Φ４．６×１５０ｍｍ）カラム、カラムおよび反応コイル温度２０℃、移動相は０．１％  １−ヘプタンスルポン酸Ｎａ／メタノール［１０：１（Ｖ／Ｖ）］、ポスト反応液組成は、ミリ−Ｑ水１Ｌに対しホウ酸２１．６４ｇ、水酸化ナトリウム１２ｇ、２−メルカプトエタノール  ２ｍＬ、ＯＰＡ（オルトフタルアルデヒド；８００ｍｇ／１５ｍＬエタノール）、Ｂｒｉｊｉ−３５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル；０．２５ｇ／２ｍＬエタノール）を添加し行った。ＨＰＬＣの流速は移動相および反応液共に０．７５ｍＬ／分で、分離産物の検出はλｅｘ／ｅｍ＝３４０／４５０ｎｍの蛍光で分析した。このＨＰＬＣによるグリシンの分析範囲は０．１μｇ／ｍＬ以下である。酵素活性は５０℃における１分間あたり１μｍｏｌのグリシンの生成量を１単位とした。その結果、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）のゲノムＤＮＡよりクローニングしたＬ−スレオニンアルドラーゼは、粗酵素１ｍｇあたり１５４単位のＬ−スレオニンアルドラーゼ分解活性を示すことがわかった。
【００５７】
また、分解活性が確認されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）由来のＬ−スレオニンアルドラーゼによる合成反応の目的物質であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成活性を調べた。即ち、ｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）を含む大腸菌ＪＭ１０９株を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、一晩３７℃で培養した。この培養液のうち、０．５ｍＬを５０ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に接種した。約３時間後、培地のＯＤ６００が０．４〜０．７に上昇したことを確認後、最終濃度で２ｍＭになるように１ＭのＩＰＴＧを添加し組換えＬ−スレオニンアルドラーゼの大腸菌での発現を誘導させた。その培養液をさらに、一晩３７℃で培養し、培養液を１００００×ｇ、１０分間の遠心操作により細胞を沈殿させ、上清を除いた後、０．８５％のＮａＣｌ水溶液で１回洗浄した。遠心操作により細胞を沈殿させた後、その菌体を用い合成反応を行った。反応液の組成は１ｇのグリシン、１００ｍｇの３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、１０μＬのメルカプトエタノール（２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、２５０μＬのピリドキシサール−５’−リン酸（ＰＬＰ、０．６ｍｇ／ｍＬ）、４．７４ｍＬ  ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０１５８ｇの亜硫酸ナトリウム、０．０３７５ｇのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に溶解し、１Ｎ塩酸で最終ｐＨを６．５にした。この反応液に−８０℃で凍結保存しておいた上記遠心分離操作により得た菌体を加え１５℃で５時間酵素反応を開始させ、３倍量のメタノールを加えることにより反応を停止させた。合成産物であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成量はＨＰＬＣ（日立Ｌ２０００シリーズ、日立製作所製）で測定した。ＨＰＬＣ分析は、ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＭＳ（Φ４．６×１５０ｍｍ）カラム、カラム温度３０℃、移動相は０．１％  １−ヘプタンスルホン酸（ｐＨ２．５）／メタノール／１，４−ジオキサン＝［５００：５０：１５（Ｖ／Ｖ／Ｖ）］で行った。ＨＰＬＣの移動相流速は０．７５ｍＬ／分で、分離産物の検出はＵＶ＝２２０ｎｍの吸光で分析した。その結果、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）のゲノムＤＮＡよりクローニングしたＬ−スレオニンアルドラーゼは、菌体培養液１Ｌあたり０．４ｇのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成活性能を有することがわかった。なお反応液１Ｌあたりの合成量は４ｇであった。
【実施例５】
【００５８】
ランダム変異導入法による変異遺伝子ライブラリーの作製
作製したｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）を用いてＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）のプロトコールに従いランダムに変異を導入することにより変異遺伝子ライブラリーを構築した。このＫｉｔに含まれているＭｕｔａｚｙｍｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは従来のＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅと比べ非常に高い頻度で変異を導入することができ、さらに初期のベクターの濃度を制御することにより導入される変異の頻度を制御できる。そこで、実施例３で作製したｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）を鋳型としてＰＣＲを行うことにより導入される変異を制御した。このときｐｌｔｈ−ＳＣＡ３（２）の濃度を５０ｎｇ／μＬ、２５０ｎｇ／μＬ、さらに５００ｎｇ／μＬの三つの濃度でＰＣＲを行なった。プライマーはクローニングの時と同様にＮ末端の前にＥｃｏＲＩ認識配列を追加した５’プライマー（配列番号１）とＣ末端の後にＢａｍＨＩ認識配列を追加した３’プライマー（配列番号２）を用いて行った。変異ＰＣＲの条件は以下の通りである。
変異ＰＣＲ条件：１μＬ鋳型ＤＮＡ  ５０ｎｇ／μＬ（２５０ｎｇ／μＬ、５００ｎｇ／μＬ）、１μＬＭｕｔａｚｙｍｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μＬ）、２５μＬ  ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔに添付の反応バッファー（１Ｘ）、８μＬ  ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ、０．５μＬ  ５’プライマー（配列番号１）２５ｐｍｏｌ／ｍＬおよび０．５μＬ  ３’プライマー（配列番号２）２５ｐｍｏｌ／ｍＬの混合物に水を加え、総量５０μＬの溶液を作製し、９６℃で３０秒間熱処理後、９６℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分１５秒、３０サイクルのプログラムで増幅を行い、その後７２℃で１０分間処理した。増幅反応後の溶液１０μＬを１％濃度のアガロースゲル電気泳動を行った結果、目的とした約１ｋｂｐの変異型Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した。
【００５９】
次に、ランダム変異導入法により増幅した変異ＰＣＲ産物を大腸菌ＪＭ１０９に挿入し、変異遺伝子ライブラリーを構築した。即ち、変異型Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を含むＰＣＲ溶液をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにより精製（Ｑｉａｇｅｎ社製）し、精製した変異ＰＣＲ産物全量を各々２０Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて３７℃で一晩切断反応を行った後、１％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロースゲル電気泳動により分離し、約１ｋｂｐに相当するバンドをゲルより切り出してＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により該バンド部分のＤＮＡを精製後、３０μＬのトリス−塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）に溶解した。次に１μｇのｐＴｒｃ９９Ａを各１０Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて３７℃で一晩静置し、ｐＴｒｃ９９Ａの制限酵素部位の切断反応を行い、反応後の溶液をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにより精製（Ｑｉａｇｅｎ社製）し、３０μＬのトリス−塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．５）により溶解した。精製したＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断した約１ｋｂｐに相当するバンド部分のＤＮＡ溶液８μＬと２μＬの  ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断したベクターｐＴｒｃ９９Ａを５μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ製）と混合し、１６℃で一晩連結反応を行った。連結反応後の溶液５μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ変異遺伝子ライブラリー作製した。
【実施例６】
【００６０】
Ｌ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼのハイスループットスクリーニング
変異遺伝子ライブラリーのコロニーをコロニーピッカー（ＧＥＮＥＴＩＸ、ビーエム機械社製）によりランダムに約１２５９２株を選抜し、一次スクリーニングへ供した。一次スクリーニングは２ｍＬ容量の９６穴の角型ディープウエルプレート（Ｗｈａｔｍａｎ製）を用い、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２５０μＬのＬＢ液体培地に植菌し、９６穴の角型プレート振動機（Ｔｉｔｒａｍａｘ  １０００、ＨＥＩＤＯＬＰＨ社製）で一晩培養した（３０℃、６００ｒｐｍ）。９６穴の角型ディープウェルプレートを２５００ｒｐｍで１０分間遠心することにより菌体を分離し、−８０℃の冷凍庫で１時間保存した。菌体を用いての酵素反応は、凍結菌体を冷凍庫から取り出し、その凍結菌体に２５０μＬのＬ−スレオニン（２ｍｇ／ｍＬ）を添加し５０℃で３０分間振動させながら反応を行った。この菌体反応によりＬ−スレオニンはグリシンとアセトアルデヒドに分解される。活性を有する変異酵素の選別は反応後の液と同量の発色剤（Ｎａｓｈ’ｓ試薬：１５％（Ｗ／Ｖ）酢酸アンモニウム、０．５％（Ｖ／Ｖ）酢酸および２０％（Ｖ／Ｖ）アセチルアセトン）を添加し５０℃で３０分間振動させながら行った。酵素活性を有するコロニーはＬ−スレオニンの分解によりアセトアルデヒドが生成する。発色剤はそのアセトアルデヒドと反応し黄色に発色する。発色反応の結果、２７６９のコロニーについて黄色（吸光度：３８８ｎｍ）の発色が観察された。
【００６１】
一次スクリーニングの結果、活性を示した２７６９株を対象に、グリシンと３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとの合成反応（２次スクリーニング）へ供した。ＨＰＬＣにより、合成された立体異性体の割合の変化をＤｉａｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ（％ｄ．ｅ．で表わす）として算出し％ｄ．ｅ．が向上しているコロニーを選択した。即ち、一次スクリーニングの結果、Ｌ−スレオニン分解活性を示している２７６９株を２４穴の角型ディープウエルプレート（Ｗｈａｔｍａｎ製）の１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２０００μＬのＬＢ液体培地に植菌し、２４穴の角型プレート振動機（Ｔｉｔｒａｍａｘ  １０００、ＨＥＩＤＯＬＰＨ社製）で一晩培養した（３０℃、６００ｒｐｍ）。２４穴の角型ディープウェルプレートを２５００ｒｐｍで１０分間遠心することにより菌体を分離した。その菌体を−８０℃の冷凍庫で３０分間凍結処理した後、冷凍庫から取り出し培養液量の１０％となる２００μＬの反応液を添加し３０℃で３時間振動させながら合成反応を行った。反応液は１ｇのグリシン、１００ｍｇの３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、１０μＬのメルカプトエタノール（２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、２５０μＬのピリドキシサール−５’−リン酸（ＰＬＰ、０．６ｍｇ／ｍＬ）、４．７４ｍＬ  ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０１５８ｇの亜硫酸ナトリウムおよび０．０３７５ｇのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を混合溶解し、１Ｎ塩酸で最終ｐＨを６．５にした。合成活性の測定および％ｄ．ｅ．の算出はすべて３回行いその平均値で示した。その結果、４種のコロニーについて％ｄ．ｅ．が向上していることが観察された。表１で明らかなように、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）のＬ−スレオニンアルドラーゼが、同じ反応条件で平均１５％ｄ．ｅ．の選択性しか示さないのに対し、本発明の変異酵素（ｍｕｔ２−２、ｍｕｔ２−４、ｍｕｔ３−２およびｍｕｔ３−３）は、それぞれ２０．５％ｄ．ｅ．、２６．２％ｄ．ｅ．、２１％ｄ．ｅ．および４０％ｄ．ｅ．のＬ−スレオ型選択性を示した。これらの結果を表１に示した。
【００６２】
【表１】
2007054012.tif 000003
【００６３】
これら変異遺伝子およびその発現変異酵素を有する大腸菌形質転換体はそれぞれ独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。寄託番号：受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１２、ＮＩＴＥ  Ｐ−１１３、ＮＩＴＥ  Ｐ−１１４およびＮＩＴＥ  Ｐ−１１５）
【実施例７】
【００６４】
Ｌ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の単離および塩基配列の解析
２次スクリーニングの結果高いＬ−スレオ型選択性活性を示したＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子をもつ大腸菌ＪＭ１０９をＬＢ液体培地３ｍＬで培養し、プラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン製）で抽出した。シークエンス反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライドバイオシステム社製）、Ｄｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （アプライドバイオシステム社製）を用い、９６℃  １０秒、５０℃  ５秒、６０℃  ４分、２５サイクルで行った。反応生成物のシークエンスは全自動シークエンサー  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステム社製）にて解析することにより決定した。
【００６５】
その結果高い立体選択性を示したＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子は、配列番号１１で示される親株のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子に比べ、ｍｕｔ２−２では配列番号１１の塩基配列の１１７番目のシトシンがチミンに（アミノ酸配列変化なし）、配列番号１１の塩基配列の２５６番目のグアニンがアデニンに（アミノ酸配列：配列番号１２のアミノ酸配列の８６番目のバリンがイソロイシンに変化）、配列番号１１の塩基配列の７２１番目のシトシンがチミンに（アミノ酸配列：配列番号１２のアミノ酸配列の２４１番目のアルギニンがシステインに変化）、ｍｕｔ２−４では配列番号１１の塩基配列の７１番目のアデニンがグアニンに（アミノ酸配列：配列番号１２のアミノ酸配列の２４番目のチロシンがシステインに変化）、ｍｕｔ３−２では配列番号１１の塩基配列の５２５番目のシトシンがチミンに（アミノ酸配列変化なし）、配列番号１１の塩基配列の７２１番目のシトシンがチミンに（アミノ酸配列：配列番号１２のアミノ酸配列の２４１番目のアルギニンがシステインに変化）、配列番号１１の塩基配列の８６０番目のシトシンがチミンに（アミノ酸配列：配列番号１２のアミノ酸配列の２８７番目のアラニンがバリンに変化）、ｍｕｔ３−３では配列番号１１の塩基配列の４２９番目のシトシンがチミンに（アミノ酸配列変化なし）、配列番号１１の塩基配列の９６２番目のアデニンがグアニンに（アミノ酸配列：配列番号１２のアミノ酸配列の３２１番目のチロシンがシステインに変化）それぞれ変化していた。この高い立体選択性を示したＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の配列を配列番号３〜６に示す。
（配列番号３はＭｕｔ２−２、配列番号４はＭｕｔ２−４、配列番号５はＭｕｔ３−２そして配列番号６はＭｕｔ３−３にそれぞれ対応している。）
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の遺伝子は、Ｌ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子として有用である。該遺伝子を挿入した微生物を用いる本発明のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの製造法は、医薬品として有用なＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを煩雑な分離精製工程を行うこともなく工業的に有利に製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】親株のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子導入微生物を用いて合成したＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳのＨＰＬＣの結果を示す図である。（ａ）はＬ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ＤＯＰＳを、（ｂ）はＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを示す。
【図２】高い立体選択性を示したＬ−スレオ型高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子（ｍｕｔ３−３）導入微生物を用いて合成したＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳのＨＰＬＣの結果を示す図である。（ａ）はＬ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ＤＯＰＳを、（ｂ）はＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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