(57)【要約】      （修正有）【課題】誘導活性が強く、最大誘導活性までに要する時間が短く、広範な化合物により誘導され、かつグルコースにより誘導が抑制されにくい酵母プロモーターを提供する。【解決手段】Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉの一菌株のゲノムＤＮＡから、特定の塩基配列またはその相同配列を有するプロモーターを取得した。本プロモーターは広範な炭素源及び窒素源により誘導され、下流に外来遺伝子を含むベクターによって形質転換された酵母を用いることにより、培地の選択範囲が広いことから、効率のよい目的物質の大量生産が可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に示す塩基配列またはその相同配列を有するプロモーター。
【請求項２】
請求項１記載のプロモーターの下流に外来遺伝子を含むベクター。
【請求項３】
請求項２記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項４】
酵母である請求項３記載の宿主細胞。
【請求項５】
請求項３記載の細胞を培養し、培養物から外来遺伝子によりコードされた有用物質を得ることを特徴とする、有用物質の製造方法。
【請求項６】
請求項１記載のプロモーター、請求項２記載のベクター、または請求項３もしくは４記載の宿主細胞を必須成分として含む、外来遺伝子によりコードされた有用物質を製造するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規プロモーター、詳細には、誘導活性が強く、広範な化合物（Ｃ１化合物を包含）に応答する酵母プロモーター、該プロモーターの下流に外来遺伝子を含むベクター、該ベクターにより形質転換された宿主細胞、それらを用いる有用物質の製造方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物、特に微生物を用いて目的とする物質を大量生産するための種々の技術が開発されている。特に、遺伝子操作技術を用いた微生物による有用物質の大量生産について広く研究され、実施されている。なかでも酵母を用いた物質生産は、発酵食品、例えば、酒類、味噌、醤油、パン等の製造において重要である。それゆえ、種々の酵母プロモーターが開発され、報告されている。
【０００３】
例えば、Pichia pastorisのプロモーター（非特許文献１参照）、あるいは本発明とは異なるCandida boidiniiのプロモーター（非特許文献２および３参照）等が報告されているが、いずれも誘導活性が弱く、最大誘導活性までに要する時間が長い、誘導物質（特にＣ１化合物）の種類が少ない、あるいはグルコースにより誘導が抑制される等の欠点があり、酵母を用いた有用物質の大量生産には不向きであった。
【非特許文献１】Shen et al., Gene 216:93-102 (1998)
【非特許文献２】Yurimoto et al., Biochim Biophys Acta 1493:56-63 (2000)
【非特許文献３】Komeda et al., Mol. Gen. Genet. 270:273-280 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記事情に鑑みると、本発明の解決課題は、上述のような従来の酵母プロモーターの欠点が解消された新規酵母プロモーターを開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは鋭意研究を重ね、酵母カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）の一菌株から上述のような欠点が解消された新規酵母プロモーターを取得し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：１に示す塩基配列またはその相同配列を有するプロモーター；
（２）（１）記載のプロモーターの下流に外来遺伝子を含むベクター；
（３）（２）記載のベクターにより形質転換された宿主細胞；
（４）酵母である（３）記載の宿主細胞；
（５）（３）記載の細胞を培養し、培養物から外来遺伝子によりコードされた有用物質を得ることを特徴とする、有用物質の製造方法；ならびに
（６）（１）記載のプロモーター、（２）記載のベクター、または（３）もしくは（４）記載の宿主細胞を必須成分として含む、外来遺伝子によりコードされた有用物質を製造するためのキット
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、誘導活性が強く、最大誘導活性までに要する時間が短く、広範な化合物（Ｃ１化合物を包含）により誘導され、かつグルコースにより誘導が抑制されにくい新規酵母プロモーター、該プロモーターの下流に外来遺伝子を含むベクター、該ベクターにより形質転換された宿主細胞、それらを用いる有用物質の製造方法およびキットが提供され、酵母において効率のよい有用物質、例えば蛋白の大量生産が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に、本発明につきさらに詳細に説明するが、特に断らない限り、本明細書で使用する用語は当該分野にて通常に理解されている意味を有するものとする。
【０００９】
本発明は、第１の態様において、配列番号：１（および図１）に示す塩基配列またはその相同配列を有するプロモーターを提供するものである。本発明のプロモーターの塩基配列は、カンジダ・ボイジニイＳ２株ゲノムＤＮＡ中のＦＬＤ１蛋白の構造遺伝子の上流に存在するものである。配列番号：１の塩基配列は１４６５個の塩基からなる。上述のごとく、本発明のプロモーターは配列番号：１に示す塩基配列を有するものであってもよく、その相同配列を有するものであってもよい。ここで、相同配列とは、配列番号：１の塩基配列において１個ないし数個の塩基が欠失、置換、付加、あるいはこれらの組み合わせにより変化している塩基配列をいい、数個とは１０個未満、好ましくは５個未満である。さらに、本発明においては、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において配列番号：１の塩基配列とハイブリダイゼーションしうる塩基配列も相同配列に含まれる。ここで、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例を示す：ハイブリダイゼーションの温度４２℃、ハイブリダイゼーションバッファー中のホルムアミド濃度５０％以上、洗浄の温度７０℃以上、洗浄液の塩濃度０．３Ｘ ＳＳＣ以下。本発明において、配列番号：１の相同配列を有するプロモーターは、配列番号：１の塩基配列を有するプロモーターと同等の活性を保持するものである。
【００１０】
本発明のプロモーターは、実施例１に記載のごとく、カンジダ・ボイジニイＳ２株のゲノムＤＮＡから取得することもできるが、公知の化学合成法により全合成することもできる。
【００１１】
本発明のプロモーターの下流に所望の外来遺伝子を連結して、外来遺伝子によりコードされる有用物質、例えば蛋白を高発現させることができる。ここで、「外来遺伝子」とは、本発明のプロモーターが本来制御すべきカンジダ・ボイジニイＳ２株のＦＬＤ１蛋白の遺伝子以外の遺伝子をいう。外来遺伝子はいずれの生物に由来するものであってもよく、１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。「有用物質」とは、該所望の外来遺伝子がコードしている蛋白、および該蛋白の作用により生成される種々の物質、例えば香味物質や生理活性物質等であって、製造を目的とされる物質をいう。有用物質の典型例は蛋白である。また、「高発現」とは、その外来遺伝子が本来存在する細胞内で発現されるよりも多く発現されることをいう。公知の方法を用いて、外来遺伝子を本発明のプロモーターの下流に連結することができる。外来遺伝子の高発現のためには、本発明のプロモーターの下流に外来遺伝子を連結した構築物を、遺伝子銃やエレクトロポレーション、あるいは酢酸リチウム法などの公知の方法により宿主細胞に直接導入して発現させてもよいが、一般的には、本発明のプロモーターの下流に外来遺伝子を組み込んだ構築物をベクターに組み込んで、これを宿主細胞に導入して発現させる。
【００１２】
したがって、本発明は、第２の態様において、本発明のプロモーターの下流に発現させるべき外来遺伝子を含むベクターを提供するものである。外来遺伝子はいずれのものであってもよく、目的に応じて選択することができる。具体的には、本発明のプロモーター配列は、異種蛋白質の構造遺伝子、および／またはターミネーター配列、選択マーカー遺伝子等とともに適当なベクターの中に挿入され、異種遺伝子発現ベクターとして使用される。使用されるベクターとしては、通常公知のベクターとして知られるｐＢＲ系統、ｐＵＣ系統、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系統等の大腸菌プラスミドベクターが例示されるが、これらに限定されない。ターミネーター配列、選択マーカー配列は宿主内で機能するものであれば、当業者が容易に決めることができる。
【００１３】
さらに、本発明のベクター中にマーカー遺伝子、ターミネーター、エンハンサー、本発明のプロモーター以外のプロモーター等を導入してもよい。これらのものは、宿主や発現させる有用物質の種類、宿主の培養条件等に応じて適宜選択することができ、ベクター中への導入も公知の方法にて行うことができる。
【００１４】
本発明のベクターを、種々の方法により宿主細胞に導入して、形質転換することができる。本発明のベクターによる宿主細胞の形質転換法としては、プロトプラスト法、リチウム法、エレクトロポレーション法、カルシウム法等が挙げられる。したがって、本発明は、第３の態様において、本発明のベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。本発明の形質転換宿主細胞は、所望の有用物質、例えば、所望の蛋白を高発現するものであればいずれの細胞であってもよい。宿主細胞としては酵母細胞が好ましく用いられ、特に好ましい酵母宿主細胞としては、カンジダ（Candida）属、ピヒア（Pichia）属の酵母でメタノールに生育するものであり、最も好ましい宿主細胞としてはカンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）Ｓ２株（Tani, Y., Y. Sakai, and H. Yamada. 1985. Agric. Biol. Chem. 49:2699-2706）由来の宿主細胞等が挙げられる。
【００１５】
本発明は、さらなる態様において、本発明のベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、培養物から外来遺伝子によりコードされた有用物質を得ることを特徴とする、有用物質、例えば、蛋白の製造方法を提供する。宿主細胞の培養条件、例えば、培地の組成、培養温度、培養時間等は、宿主細胞の種類、産生される物質、例えば蛋白の種類や性質その他の因子により、適宜選択することができる。本発明のプロモーターは、幅広い炭素源（Ｃ１化合物を包含）により活性が誘導され、しかもグルコースにより誘導が抑制されにくいという特徴を有するので、培地の選択範囲が広く、グルコース添加培地にて菌体を迅速かつ大量に増殖させて目的物質を大量に産生させることができる。得られた培養物をそのまま用いてもよいが、通常には、目的とする有用物質を培養物から単離・精製する。そのための方法も公知である。
【００１６】
本発明は、もう１つの態様において、本発明のプロモーター、本発明のベクター、または本発明の宿主細胞を必須成分として含む、外来遺伝子によりコードされた目的物質、例えば蛋白を製造するためのキットを提供する。本発明のキットは、上記必須成分に加えて培養のための装置や器具類、培地の調製のための粉末培地や試薬類、目的物質の単離・精製のための装置や器具類、その他の成分を含んでいてもよい。また、キットには取扱説明書を添付するのが一般的である。
【００１７】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００１８】
実施例１−本発明のプロモーターの取得
カンジダ・ボイジニイＳ２株（Tani, Y., Y. Sakai, and H. Yamada. 1985. Agric. Biol. Chem. 49:2699-2706）のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩにて消化し、得られたフラグメントを自己連結させた。
ＬＡＴａｑＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Takara Bio Inc., Kyoto, Japan）、ならびにプライマーＰＦＬＤ１−１−Ｆｗ（CATACTGATGCTTACACATTATCCGGTG；配列番号：２）およびＰＦＬＤ１−１−Ｒｖ（CAATGCTTAAATCTTCACCGGGCTTCC；配列番号：３）を用い、ＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、インバースＰＣＲを行った。インバースＰＣＲの条件は下記のとおりであった：９５℃１分変性、５０℃３０秒アニーリング、７２℃５分伸長からなるサイクルを２５サイクル。
増幅された２．７ｋｂのフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Promega）中にサブクローンし、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株中に形質転換した。得られた組み換えプラスミドからの１．４ｋｂのＳａｃＩ消化フラグメントまたは１．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ消化フラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（Stratagene）のＳａｃＩ部位またはＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ部位中に連結し、各形質転換体をＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株中に形質転換して組み換えプラスミドを得て、それぞれ、ｐＰＦＬＤ１ＳａｃおよびｐＰＦＬＤ１ＨＳａｌと命名した。
ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔおよびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ３７７  ＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystems, Foster, CA, USA）を用いるジデオキシサイクル配列決定法により、これらのＤＮＡフラグメントを配列決定した。
【００１９】
ＥｘＴａｑＴＭＤＮＡポリメラーゼ（Takara Shuzo Co., Ltd., Kyoto, Japan）、ならびにプライマーＰＦＬＤ１Ｎｏｔ−Ｆｗ（GCGGCCGCTCTAAGTTTTAATCTTACAAACAAACGAC；配列番号：４）およびＰＦＬＤ１Ｂｇｌ−Ｒｖ（AGATCTTTTTGTGGAATAAAAAATAGATAAATATGATTTAGTG；配列番号：５）を用い、プラスミドｐＰＦＬＤ１ＨＳａｌを鋳型として用いてＰＣＲを行って、ＰＦＬＤ１（ＦＬＤ１プロモーターを含む）をコードするＤＮＡフラグメントを得た。用いたフォワードプライマーは５’末端にさらなるＮｏｔＩ部位を有しており、リバースプライマーは３’部位にＢｇｌＩＩ部位を有し、ベクターのＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ消化部位と連結するようになっていた。ＰＣＲ反応を下記条件下で行った：９５℃１分変性、５４℃３０秒アニーリング、７２℃で１．５分伸長からなるサイクルを２５サイクル。
増幅されたフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターに挿入してｐＰＦＬＤ１を得て、塩基配列を決定した。配列番号：１および図１に示すように、本発明のＦＬＤ１プロモーターの１４６５ｂｐからなる塩基配列が決定された。
【実施例２】
【００２０】
実施例２−本発明のプロモーターの評価系の確立
ｐＰＦＬＤ１をＮｏｔＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ＦＬＤ１プロモーターを含むフラグメントをアガロースゲルにて精製した。
ｐＰＡＴ（ＳｃＰＨＯ５遺伝子の１．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩフラグメントおよびＡＯＤ１ターミネーターの０．５ｋｂのＳｐｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋中に含む）（Yurimoto et al., Biochim. Biophys. Acta. 1493:56-63 (2000)）をＸｈｏＩで消化し、平滑末端化し、ＣｂＵＲＡ３遺伝子の１．９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ平滑末端化フラグメント（Sakai et al., J. Bacteriol. 173:7458-7463 (1991)）と連結して、ｐＰＡＴＵ１を得た。
ｐＰＡＴＵ１をＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られた６．８ｋｂのフラグメントを精製した。ＦＬＤ１プロモーターを含むＮｏｔＩ−ＢｇｌＩ消化フラグメントを、ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩで消化されたｐＰＡＴＵ１と連結して、ｐＦＬＰＵを得た。
ＮｃｏＩを用いてｐＦＬＰＵを直鎖状にし、カンジダ・ボイジニイＴＫ６２株（ｕｒａ３）およびａｏｄＩΔｕｒａ３株の染色体ＤＮＡのｕｒａ３遺伝子座中に移し、Ｕｒａ＋形質転換体を単離した。
形質転換体の試験は、カンジダ・ボイジニイＵＲＡ３遺伝子をプローブとして用いて、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化された染色体ＤＮＡに関してサザン分析を行った。
ＣｂＵＲＡ３の１．９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントをプローブとして用いたＨｉｎｄＩＩＩにより消化された染色体ＤＮＡに関するサザン分析により、染色体ＤＮＡのｕｒａ３遺伝子座にプラスミドがシングルコピーで組み込まれたことが示された形質転換体（ＦＬＰ株）を単離した。
【００２１】
上記のごとく得られたカンジダ・ボイジニイ形質転換体をＹＰＤ培地で８〜１０時間前培養し、その後、氷冷した蒸留水で２回洗浄し、炭素源および窒素源、および／またはホルムアミド（誘導物質として）、および必要ならば０．５％酵母エキスを含有するＢＭ培地にて、６１０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６１０）が０．０５または１．０から培養を開始した。
ＢＭ培地は２．８１ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５９ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５５ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、３７．５ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．４５ｇのＥＤＴＡ・２Ｎａ、１０ｍｌの金属溶液および１ｍｌのビタミン溶液を、１０００ｍｌの蒸留水に溶解したものであった。金属溶液は０．８５ｇのＭｎＳＯ４・３Ｈ２Ｏ、１．１ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１４ｇのＣｏＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＨ３ＢＯ４、０．０３ｇのＫＩを５００ｍｌの蒸留水に溶解したものであった。ビタミン溶液は５ｍｇのビオチンおよび５００ｍｇのチアミンを１００ｍｌの蒸留水に溶解したものであった。
下記の化合物をＢＭ培地中の窒素源および炭素源として、あるいはプロモーターの誘導物質として用いた：０．７％（ｖ／ｖ）メタノール、３％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）グルコース、０．７６％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウム、０．５％（ｗ／ｖ）塩酸メチルアミン、０．５％（ｗ／ｖ）塩化コリン、および／または１ｍＭ ホルムアミド。ＢＭ培地の初期ｐＨを６．０に調節した。
細胞をＢＭ培地で培養し、対数増殖期の中期（ＯＤ６１０が０．３ないし０．５）あるいは４時間または８時間培養後に細胞を収集し、５０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ４．０）で洗浄し、次いで、適当量の５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）に懸濁した。
以下の実験において、細胞の酸性ホスファターゼ活性を指標に、本発明のプロモーターの活性を調べた。酸性ホスファターゼ活性の測定は、Torrianiらの方法（Torriani et al., Biochim. Biophys. Acta. 38:460-479）によった。酸性ホスファターゼ活性１ユニット（Ｕ）は、１分間に１ナノモルのｐ−ニトロフェノールを遊離する酵素量とした。
【実施例３】
【００２２】
実施例３−本発明のプロモーターの評価
（ａ）本発明のプロモーター活性の経時変化
炭素源として０．７％メタノールを添加したＢＭ培地で培養した場合の酸性ホスファターゼ活性の経時変化を、本発明のＦＬＤ１プロモーターを有するＦＬＰ株、およびＡＯＤ１プロモーターを有するＡＰ株（Yurimoto et al., Biochim Biophys Acta 1493:56-63 (2000)）に関して調べ、比較した。結果を図２に示す。本発明のＦＬＤ１プロモーターはＡＯＤ１と比較して１．５〜２倍強力であり、最大活性に至るまでの時間も短く（ＦＬＤ１の場合約１０時間であるのに対し、ＡＯＤ１の場合２４時間またはそれ以上）、メタノール応答性に優れていることが示された。
【００２３】
（ｂ）各種炭素源、窒素源の本発明のプロモーター活性に対する影響
上記の各種炭素源、窒素源をＢＭ培地に添加して対数増殖期の中期（ＯＤ６１０が０．３ないし０．５）まで培養し、酸性ホスファターゼ活性を、本発明のＦＬＤ１プロモーターを有するＦＬＰ株、およびＤＡＳ１プロモーターを有するＤＰ株（Yurimoto et al., Biochim Biophys Acta 1493:56-63 (2000)）に関して調べ、比較することにより、プロモーター活性の強さを比較した。結果を図３に示す。本発明のＦＬＤ１プロモーターは、広範な炭素源（Ｃ１化合物を包含）および窒素源により誘導された。本発明のＦＬＤ１プロモーターは、炭素源としてメタノールを用いた場合に活性の上昇が顕著で、次いで、炭素源としてグリセロールを用いた場合に活性が高い傾向を示した。これに対し、ＤＡＳ１プロモーターはメタノール／塩化アンモニウム、グリセロール／メチルアミンおよびグリセロール／コリンの３種を培地に添加した場合にのみ活性が見られた。しかも、グリセロール／メチルアミンおよびグリセロール／コリンを培地に添加した場合の活性は非常に低かった。さらに、本発明のＦＬＤ１プロモーターは、グルコースを培地に添加した場合にも活性が見られた（特にグルコース／コリンを添加した場合）。一方、ＤＡＳ１プロモーターはグルコース添加系では活性が全く見られなかった。このことは、本発明のプロモーターはグルコースにより誘導が抑制されにくいという特徴を有するので、培地の選択範囲が広く、グルコース添加培地にて菌体を迅速かつ大量に増殖させて目的物質の大量生産が可能であることを示す。
【００２４】
配列表フリーテキスト
配列番号：１は本発明のＦＬＤ１プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号：２は本発明のＦＬＤ１プロモーターを得るためのインバースＰＣＲ用プライマーＰＦＬＤ１−１−Ｆｗの塩基配列を示す。
配列番号：３は本発明のＦＬＤ１プロモーターを得るためのインバースＰＣＲ用プライマーＰＦＬＤ１−１−Ｒｖの塩基配列を示す。
配列番号：４は本発明のＦＬＤ１プロモーターを得るためのＰＣＲ用プライマーＰＦＬＤ１Ｎｏｔ−Ｆｗの塩基配列を示す。
配列番号：５は本発明のＦＬＤ１プロモーターを得るためのＰＣＲ用プライマーＰＦＬＤ１Ｂｇｌ−Ｒｖの塩基配列を示す。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明によれば、新規酵母プロモーターが提供され、酵母を用いて効率よく蛋白を大量生産することができるので、本発明は、食品や医薬品等の分野において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は本発明の新規酵母プロモーターの塩基配列を示す。
【図２】図２は本発明の新規酵母プロモーター活性の経時変化を示す図である。
【図３】図３は各種炭素源、窒素源の本発明の新規酵母プロモーター活性に対する影響を示す図である。ＭｅＯＨはメタノール、Ｇｌｕｃはグルコース、Ｇｌｙはグリセロール、ＮＨ４Ｃｌは塩化アンモニウム、Ｃｈｏｌはコリン、ＭＡはメチルアミン、ＦＡはホルムアミドを示す。
【図１】
2007049963.tif 000002
【図２】
2007049963.tif 000003
【図３】
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【配列表】
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