(57)【要約】【課題】  表面プラズモン共鳴センサに照射される光束の光強度分布が一定でなかったり、一次元又は二次元に配列された各受光素子の感度のバラツキがあっても、共鳴角変化を高精度で測定できるようにする。【解決手段】  サンプル液の共鳴角近傍の測定領域内において反射光強度変化がフラットである較正溶液が表面プラズモン共鳴センサ（１０）に供給されたときに、そのセンサ部（１１）に照射した測定光の反射光強度を光学検出器（３０）で測定し、一次元又は二次元に配列された各受光素子の検出値に基づき夫々の受光素子の感度が一定になるようにキャリブレーションを実行する演算処理装置（３）を備えた。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴センサにサンプル液を供給するサンプル液供給装置と、サンプル液に接しているセンサ部に測定光を照射して、その反射光強度を一次元又は二次元に受光素子を配した光学検出器を用いて測定する光学系とを備えた表面プラズモン共鳴測定装置であって、
サンプル液の共鳴角近傍の測定領域内において反射光強度変化がフラットである較正溶液が表面プラズモン共鳴センサに供給されたときに、センサ部に照射した測定光の反射光強度を前記光学検出器で測定して、各受光素子の検出値に基づき受光素子の感度が一定になるようにキャリブレーションを実行する演算処理装置を備えたことを特徴とする表面プラズモン共鳴測定装置。
【請求項２】
前記演算処理装置は、各受光素子に共通する基準値を決定する基準値設定手段と、基準値と各受光素子の検出値との差に基づいてそれぞれの受光素子の感度を調整するキャリブレーション手段を備えた請求項１記載の表面プラズモン共鳴測定装置。
【請求項３】
前記表面プラズモン共鳴センサのセンサ部に複数の流路が平行に形成され、
表面プラズモン共鳴センサの任意の流路にサンプル液を供給したときに当該流路と直交する方向に沿って共鳴角付近の反射光強度を前記光学検出器で測定し、その反射光強度分布に基づいて流路の中心に対応する１又は複数の測定用受光素子を決定する演算処理装置を備えた請求項１記載の表面プラズモン共鳴測定装置。
【請求項４】
表面プラズモン共鳴センサにサンプル液を供給し、サンプル液に接しているセンサ部に測定光を照射して、その反射光強度変化を一次元又は二次元に受光素子を配した光学検出器を用いて測定することにより、そのサンプル液に起因する共鳴角の変化を測定する表面プラズモン共鳴測定方法であって、
サンプル液の共鳴角近傍の測定領域内において反射光強度変化がフラットである較正溶液を前記表面プラズモン共鳴センサに供給し、
前記較正溶液に接しているセンサ部に測定光を照射してその反射光強度を前記光学検出器で測定し、
各受光素子の検出値に基づき受光素子の感度が一定になるようにキャリブレーションを実行した後に、
前記表面プラズモン共鳴センサにサンプル液を供給して共鳴角の変化を測定することを特徴とする表面プラズモン共鳴測定方法。
【請求項５】
前記センサ部に複数の流路が平行に形成された表面プラズモン共鳴センサを用いて、前記各流路に較正溶液を供給して前記キャリブレーションを実行した後、
表面プラズモン共鳴センサの任意の流路にサンプル液を供給して当該流路と直交する方向に沿って共鳴角付近の反射光強度を前記光学検出器で測定し、
その反射光強度分布に基づいて流路の中心に対応する１又は複数の測定用受光素子を決定し、
該受光素子で夫々の流路を流れるサンプル液に起因する共鳴角の変化を測定する請求項４記載の表面プラズモン共鳴測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一次元又は二次元に受光素子を配した光学検出器を用いて表面プラズモン共鳴センサからの反射光強度変化を測定することにより、共鳴角の変化を測定する表面プラズモン共鳴測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子の結合の様子をセンシング装置により検出することにより、創薬の開発効率を向上させることが進められている。また、悪性の抗原抗体反応を迅速に検査することが求められている。
そして、これらの生体分子の結合および結合過程を検出する方法として、光励起による表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下、単に「ＳＰＲ」と略記する）現象を利用した表面プラズモン共鳴測定装置（以下、単に「ＳＰＲ測定装置」と略記する）が用いられる。
このＳＰＲ現象によれば、例えば、金属薄膜上に抗体などを固定化した状態で、抗原を含んだサンプル液を金属薄膜上に供給し、抗原抗体反応による抗体の屈折率変化に起因する共鳴角度変化が検出され、これにより、特定物質の定量を行うことができる。
【０００３】
ＳＰＲ測定装置４１は、ＳＰＲセンサ４２にサンプル液を供給するサンプル液供給装置４３と、サンプル液に接しているセンサ部４４における反射光強度を測定する光学系４５とを備えている。
ＳＰＲセンサ４２は、半円形プリズム４６の平面部分に金属薄膜を蒸着したセンサ部４４が形成され、底面側に溝状の流路４７が形成されたセル４８を前記センサ部４４に密着させた状態で、前記流路４７にサンプル液を供給して測定を行う。
【０００４】
光学系４５は、半円形プリズム４６の円弧面側から中心に向かう照射光軸ＺＬに沿ってＰ偏光の測定光を照射する光源装置４９と、この測定光を所定の中心角度範囲（入射角７５°±５°）で入射させるレンズ系５０と、その反射光軸ＺＲ上に二次元マトリクス状に受光素子を配したＣＣＤ素子などの光学検出器５１が配されている。
これにより、受光素子の位置と入射角が対応し、光源装置４９及び光学検出器５１を移動させることなく、各入射角度に対応した反射光強度変化が測定できる。
【特許文献１】特開平７−１５９３１９号公報
【０００５】
しかしながら、受光素子を１次元又は２次元に配した光学検出器５１を用いた場合、一般的な点での受光素子を用いた測定とは異なり、光源装置４９からＳＰＲセンサ４２に照射される光束の光強度分布が一定でなかったり、受光素子の感度のバラツキがあったりすると、測定精度に悪影響を及ぼすという問題があった。
また、流路が形成されたセルを用いる場合、セルをセットするたびに、その流路の位置に対応する受光素子の位置を決定しなければならずその作業が面倒であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、第一に、センサに照射される光束の光強度分布が一定でなかったり、受光素子の感度のバラツキがあったりしても、高精度で測定することができ、第二に、流路が形成されたセルの流路に対応する受光素子の位置を自動的に決定することができるようにすることを技術的課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この課題を解決するために、請求項１の発明は、表面プラズモン共鳴センサにサンプル液を供給するサンプル液供給装置と、サンプル液に接しているセンサ部に測定光を照射して、その反射光強度を一次元又は二次元に受光素子を配した光学検出器を用いて測定する光学系とを備えた表面プラズモン共鳴測定装置であって、サンプル液の共鳴角近傍の測定領域内において反射光強度変化がフラットである較正溶液が表面プラズモン共鳴センサに供給されたときに、センサ部に照射した測定光の反射光強度を前記光学検出器で測定して、各受光素子の検出値に基づき受光素子の感度が一定になるようにキャリブレーションを実行する演算処理装置を備えたことを特徴としている。
請求項２の発明は、演算処理装置が、各受光素子に共通する基準値を決定する基準値設定手段と、基準値と各受光素子の検出値との差に基づいてそれぞれの受光素子の感度を調整するキャリブレーション手段を備えている。
請求項３の発明は、表面プラズモン共鳴センサのセンサ部に複数の流路が平行に形成され、表面プラズモン共鳴センサの任意の流路にサンプル液を供給したときに当該流路と直交する方向に沿って共鳴角付近の反射光強度を前記光学検出器で測定し、その反射光強度分布に基づいて流路の中心に対応する１又は複数の測定用受光素子を決定する演算処理装置を備えている。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、較正溶液を前記表面プラズモン共鳴センサに供給した状態で、そのセンサ部に測定光を照射してその反射光強度を光学検出器で測定すると、較正溶液は、サンプル液の共鳴角近傍の測定領域内において反射光強度変化がフラットであるので、反射率が一定のセンサ部からの反射光強度が光学検出器の夫々の各受光素子で測定される。
このとき、測定光の光束の光強度分布が一定でなかったり、受光素子の感度のバラツキがあったりすると、そのような誤差を含んだまま各受光素子で光強度が測定される。
そこで、各受光素子の検出値に基づき、例えば、各受光素子で検出された反射光強度の平均値を基準値とし、この基準値に対する各受光素子の検出値の差に基づいて、受光素子の感度が一定になるようにキャリブレーションする。
これにより、同一条件で測定すれば、測定光の光束の光強度分布や、受光素子の感度のバラツキは相殺されるので、これらの誤差を排除して、高精度で表面プラズモン共鳴の測定を行うことができる。
【０００９】
また、センサ部に複数の流路が平行に形成されている場合は、前記キャリブレーションを実行した後、表面プラズモン共鳴センサの任意の流路にサンプル液を供給して当該流路と直交する方向に沿って共鳴角付近の反射光強度を前記光学検出器で測定する。
こ共鳴角付近では、反射光強度が低下するため、サンプル液が流れている流路の部分は暗く、流路が形成されていない部分は明るくなる。
すなわち、流路と直交する方向に反射光強度を測定すれば、極小値を示す部分が流路の位置に対応するので、その極小値が測定された受光素子を通り、流路と平行な方向に配列された受光素子が流路の中心に対応することとなる。
したがって、この状態で、任意の入射角に対応する位置にある１又は所要数の受光素子を選定すれば、センサ部に形成された流路における共鳴角の変化を正確に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本例では、センサに照射される光束の光強度分布が一定でなかったり、受光素子の感度のバラツキがあったりしても高精度で測定できるようにするという目的を達成するために、サンプル液の共鳴角近傍の測定領域内において反射光強度変化がフラットである較正溶液を前記表面プラズモン共鳴センサに供給し、較正溶液に接しているセンサ部に測定光を照射してその反射光強度を前記光学検出器で測定し、各受光素子の検出値に基づき受光素子の感度が一定になるようにキャリブレーションを実行した後に、前記表面プラズモン共鳴センサにサンプル液を供給して共鳴角の変化を測定するようにした。
【００１１】
図１は本発明に係る表面プラズモン共鳴測定装置の一例を示す説明図、図２は表面プラズモン共鳴センサを示す説明図、図３は光学系とセンサの関係を示す説明図、図４（ａ）及び（ｂ）は較正溶液及びサンプル液を供給したときの反射光強度分布を示す説明図、図５は流路に直交する受光素子列の検出結果を示すグラフ、図６はキャリブレーションプログラムを示すフローチャート、図７は流路位置決定プログラムを示すフローチャート、図８（ａ）及び（ｂ）は較正前後のデータに基づく反射光強度の測定結果、図９は共鳴角の変化の測定結果を示すグラフである。
【００１２】
本例の表面プラズモン共鳴測定装置１は、光励起による表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下、単に「ＳＰＲ」と略記する）現象により生ずる共鳴角の変化を測定するものである。
ＳＰＲ測定装置１は、ＳＰＲセンサ１０にサンプル液を供給するサンプル液供給装置２と、サンプル液に接しているセンサ部１１における反射光強度を測定する光学系２０とを備えている。
【００１３】
ＳＰＲセンサ１０は、半円形プリズム１２とサンプル液が流れるセル１３からなる。
プリズム１２は、その平面部分に金属薄膜を蒸着したセンサ部１１が形成されている。
セル１３は、エアシリンダ１４のピストン１５に取り付けられてプリズム１２のセンサ部１１に対して昇降可能に配されている。そして、底面側に溝状の流路１６…が平行に形成され、夫々の流路１６の流入口１６inに任意のサンプル液を供給するサンプル供給装置２が接続されると共に、流出口１６outがドレイン（図示せず）に接続されている。
これにより、セル１３をセンサ部１１に密着させ、サンプル液供給装置２からサンプル液を供給すると、溝状の流路１６…をセンサ部１１に接して流れていき、ドレインに排出される。
【００１４】
光学系２０は、半円形プリズム１２の円弧面側から中心に向かう照射光軸ＺＬに沿って中心波長７２０ｎｍの光を照射する発光ダイオード２１と、直径２００μｍのピンホール２２と、光束径を広げて平行化するビームエクスパンダレンズ２３及び２４と、干渉フィルタ（中心波長７２０ｎｍ、半値幅１０ｎｍ）２５と、センサ部１１に対してＰ偏光を照射させる偏光プリズム（消光比１０−６）２６と、半円形プリズム１２の中心に対して共鳴角近傍の入射角度（中心入射角７５°±５°）で照射されるように集光する円筒面レンズ２７が配されている。
【００１５】
また、その反射光軸ＺＲ上に沿って、センサ部１１で反射してプリズム１２から広がって出射してくる光束を平行化する円筒面レンズ２８と、その光を結像させる結像レンズ２９と、その結像面に受光素子をｉ×ｊの二次元マトリクス状に配して成るＣＣＤ素子などの光学検出器３０が配され、その光学検出器３０が演算処理装置３に接続されている。
【００１６】
サンプル供給装置２は、ＳＰＲセンサ１０に形成された流路１６…に対応したチャンネル数の供給系を有すると共に、全ての流路１６…に対して、サンプル液（例えば水）の共鳴角近傍の測定領域（７５±５°）内において反射光強度変化がフラットである較正溶液（例えばクロロホルム）を供給できるように供給液切換装置が配されている。
これにより、光学検出器３０の受光素子の較正を行うときは、ＳＰＲセンサ１０のすべての流路１６…に較正溶液を供給することができ、ＳＰＲ測定を行うときは、ＳＰＲセンサ１０のすべての流路１６…に同一又は異なる種類の任意のサンプルを混合したサンプル液を供給したり、任意に選択した流路１６…にサンプル液を供給すると同時に、選択されなかった流路１６…に較正溶液を供給することもできる。
【００１７】
演算処理装置３は、光学検出器３０の各受光素子の検出値に基づき受光素子の感度が一定になるようにキャリブレーション実行プラグラムＰＲＧ１と、流路１６…に対応する受光素子を決定する流路位置決定プログラムＰＲＧ２を備えている。
【００１８】
図６はキャリブレーション実行プログラムＰＲＧ１を示すフローチャートで、まず、プリズム１２、ＳＰＲセンサ１０が定位置にセットされると、サンプル液供給装置２からＳＰＲセンサ１０の全流路１６…に較正溶液としてクロロホルムが供給される。
クロロホルムを供給した場合、７５±５°の範囲内に共鳴角は存在せず、反射率が一定であるので、光学検出器３０で撮像された画像は、図４（ａ）に示すように同色／同輝度の画面となるので、全ての受光素子で検出された反射光強度は一定になる筈であるが、実際には、発光ダイオード２１の照射光の光強度分布や、各受光素子の感度のバラツキにより、検出値は一定ではなく誤差を含むこととなる。
【００１９】
そこで、ステップＳＴＰ１で、発光ダイオード２１からＳＰＲセンサ１０に照射されたＰ偏光の反射光強度に応じた検出値Ｅijを光学検出器３０の各受光素子から出力させ、ステップＳＴＰ２で全受光素子の検出値Ｅijの平均値を求め、これを基準値Ａｖとして設定する。
次いで、ステップＳＴＰ３に移行して、基準値Ａｖに対する各受光素子の検出値Ｅijの差ΔＥijを、
ΔＥij＝Ｅij／Ａｖ
で算出し、ステップＳＴＰ４で、各受光素子の任意の検出値Ｅijに対し較正値Ｋijを求める較正式を、
Ｋij＝Ｅij／ΔＥij
と設定し、キャリブレーションプログラムＰＲＧ１を終了する。
これによれば、較正溶液を供給したときの各受光素子の検出値Ｅijを較正すると、較正出力Ｋijは、
Ｋij＝Ｅij／ΔＥij＝Ａｖ
となるので、発光ダイオード２１の照射光の光強度分布や、各受光素子の感度のバラツキに拘わらず、どの受光素子からも同じ検出値が得られることがわかる。
【００２０】
図７は、キャリブレーションプログラムＰＲＧ１終了後に実行される流路位置決定プログラムＰＲＧ２を示すフローチャートである。
サンプル液供給装置２からＳＰＲセンサ１０の全流路１６…に、サンプルが混入されていないサンプル液（例えば水）のみを供給した場合、７５±５°の範囲内に共鳴角が存在し、その部分の反射光強度が低下するので、光学検出器３０で撮像された画像は、図４（ｂ）に示すように、流路１６…に対応し、且つ、共鳴角付近が暗色を呈する。
【００２１】
そこで、ステップＳＴＰ１１で、発光ダイオード２１からＳＰＲセンサ１０に照射されたＰ偏光の反射光強度を光学検出器３０の各受光素子で検出し、ステップＳＴＰ１２で共鳴角付近において流路１６…に直交する方向Ｘに配列された受光素子の検出値を抽出し、ステップＳＴＰ１３で夫々の検出値の較正値を算出する。
図５は較正値のグラフであって、一定間隔で極小値が存在し、この極小値の観察された部分が流路１６…の中央に対応する部分である。
したがって、ステップＳＴＰ１４で、極小値が観察された受光素子抽出し、この受光素子を通り前記方向Ｘに対して直交する方向Ｙに配列された夫々の受光素子列により反射光強度を測定することにより、夫々の流路１６を流れるサンプル液について入射角度に対応した反射光強度の測定が可能となる。
【００２２】
図８は、任意の一の流路１６を流れるサンプル液について入射角度に対応した反射光強度を測定したもので、図８（ａ）が較正前のデータでプロットしたもの、図８（ｂ）が較正後のデータでプロットしたものである。
このように、発光ダイオード２１の照射光の光強度分布や、各受光素子の感度のバラツキにより、受光素子の検出値に誤差を含む場合も、キャリブレーションを実行することにより、その誤差を無くして高精度で測定することが可能となる。
【００２３】
以上が本発明の一構成例であって、次にその作用について説明する。
まず、センサ部１１に定量しようとする特定物質(サンプル)に適した反応物質を固定したプリズム１２にセル１３を密着させてＳＰＲセンサ１０を所定位置にセットする。
そして、各流路１６…に較正溶液としてクロロホルムを供給してキャリブレーションプログラムＰＲＧ１を実行した後、特定物質を含んでいないサンプル液（水）を供給して流路位置決定プログラムＰＲＧ２を実行し、各流路１６に対応する受光素子列で入射角に応じた反射光強度を測定する。
得られたデータに基づいてフィッティング処理を施してスムージングすると、図９に示すような共鳴カーブＣ１が得られるので、その極小値を基準共鳴角θ０として記録する。
【００２４】
次いで、特定物質が混入したサンプル液（水）を各流路１６…に供給し、同様にして、各流路１６に対応する受光素子列で入射角に応じた反射光強度を測定する。
得られたデータに基づいてフィッティング処理を施してスムージングすると、図９に示すような共鳴カーブＣ２が得られるので、その極小値を共鳴角θＲとして記録する。
このとき、各受光素子の検出値は較正されているので、高精度で基準共鳴角θ０及び共鳴角θＲを求めて、その変化を算出することができ、これに基づき特定物質を定量することが可能となる。
【００２５】
なお、隣り合う二つの流路１６を一対とし、一方の流路１６にサンプル液を流し、他方の流路１６に較正溶液を流しながらＳＰＲ測定を行えば、較正溶液が流れる流路に対応する受光素子で照射光の強度変化をモニタすることができ、外気温の変化などにより測定装置の状態が変化するようなことがあっても、その影響による測定誤差を軽減することができる。
また、ＳＰＲセンサ１０として流路１６…が複数形成されたものについて説明したが、流路は一つであってもよい。
さらに、受光素子を二次元に配した光学検出器３０を用いた場合についてのみ説明したが、共鳴カーブが既知の場合に受光素子を一次元に配した光学検出器を共鳴角近傍に配したり、ＳＰＲセンサ１０に流路１６が一本しか形成されていない場合に受光素子を一次元に配した光学検出器をその流路方向に沿って配したＳＰＲ測定装置にも適用し得る。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
以上述べたように、本発明は、一次元又は二次元に受光素子を配した光学検出器を用いて、表面プラズモン共鳴センサからの反射光強度変化を測定し、共鳴角の変化を検出し、生体分子の結合および結合過程を検出する用途に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明に係る表面プラズモン共鳴測定装置の一例を示す説明図。
【図２】表面プラズモン共鳴センサを示す説明図。
【図３】光学系とセンサの関係を示す説明図。
【図４】（ａ）及び（ｂ）は較正溶液及びサンプル液を供給したときの反射光強度分布を示す説明図。
【図５】流路に直交する受光素子列の検出結果を示すグラフ。
【図６】キャリブレーションプログラムを示すフローチャート。
【図７】流路位置決定プログラムを示すフローチャート。
【図８】（ａ）及び（ｂ）は較正前後のデータに基づく反射光強度の測定結果。
【図９】共鳴角の変化の測定結果を示すグラフ。
【図１０】従来装置を示す説明図。
【符号の説明】
【００２８】
１  表面プラズモン共鳴測定装置
２  サンプル液供給装置
３  演算処理装置
１０  表面プラズモン共鳴センサ
１１  センサ部
１２  半円形プリズム
２０  光学系
３０  光学検出器
【図１】
2007225389.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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