(57)【要約】【課題】細胞またはウイルスの濃縮および破壊方法を提供する。【解決手段】細胞またはウイルスを含む溶液にビーズを注入し、ビーズ上で細胞またはウイルスを濃縮させる段階と、前記ビーズにレーザを照射して細胞またはウイルスを破壊する段階と、を含むことを特徴とする細胞またはウイルスの濃縮および破壊方法である。【選択図】図１
2007275057.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞またはウイルスを含む溶液にビーズを注入し、ビーズ上で細胞またはウイルスを濃縮する段階と、
前記ビーズにレーザを照射して細胞またはウイルスを破壊する段階と、
を含むことを特徴とする、細胞またはウイルスの濃縮および破壊方法。
【請求項２】
前記ビーズの表面は、標的細胞またはウイルスに対する親和性を有する抗体および金属酸化物の少なくとも一方で処理されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞またはウイルスを破壊する段階の後に、単離された核酸を用いてＰＣＲを行う段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞またはウイルスを濃縮する段階は、前記ビーズを振動させる段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記金属酸化物は、Ａｌ２Ｏ３、ＴｉＯ２、ＳｉＯ２、Ｔａ２Ｏ３、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、およびＨｆＯ２からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記レーザは、パルスレーザまたは連続波レーザであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記パルスレーザの出力が１ｍＪ／パルス以上１Ｊ／パルス未満であるか、または前記連続波レーザの出力が１０ｍＷ以上１０Ｗ未満であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記パルスレーザの出力が３ｍＪ／パルス以上１Ｊ／パルス未満であるか、または前記連続波レーザの出力が１００ｍＷ以上１０Ｗ未満であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記レーザは、４００ｎｍ〜１，３００ｎｍの波長帯で発生することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記レーザは、７５０ｎｍ〜１，３００ｎｍの波長帯で発生することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記レーザは、少なくとも１つの波長帯で発生することを特徴とする請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ビーズの大きさが５ｎｍ〜１，０００μｍであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ビーズの大きさが１μｍ〜５０μｍであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ビーズが少なくとも２種の大きさを有するビーズの混合物であることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ビーズが、強磁性鉄、Ｎｉ、Ｃｒ、およびこれらの酸化物からなる群より選択される少なくとも１つの物質を含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ビーズは、強磁性の金属でコートされている重合体、有機物質、ケイ素、またはガラスであることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ビーズを含む溶液のｐＨが６〜９であることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶液が唾液、小便、血液、血清、および細胞培養液からなる群より選択される少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞またはウイルスの濃縮および破壊方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、特定病原菌の分子診断は、４段階、すなわち細胞溶解、ＤＮＡ単離、ＤＮＡ増幅、およびＤＮＡ検出からなされうる。
【０００３】
細胞からのＤＮＡの効率的な抽出は、多くの適用で必要とされており、分子診断、特に、病原菌の同定および定量化に欠かせない。分子診断は、一般的に、ＤＮＡ抽出後のＤＮＡ増幅により行われる。ＤＮＡ増幅には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＬＣＲ）、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、核酸増幅、修復連鎖反応（ｒｅｐａｉｒ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ヘリカーゼ連鎖反応、ＱＢレプリカーゼ増幅、および転写活性化連結が含まれる。
【０００４】
細胞からのＤＮＡ単離方法は、ＤＮＡと結合する傾向を有する物質を用いて実施される。ＤＮＡ単離のための物質の例は、シリカ、ガラスファイバ、陰イオン交換樹脂、およびビーズである（非特許文献１および非特許文献２参照）。手作業を避け、作業者の誤りを取り除くために、いくつかの自動化された機械がハイスループットＤＮＡ抽出のために開発されている。
【０００５】
細胞溶解は、一般的に機械的方法、化学的方法、熱的方法、電気的方法、超音波法、または電磁波法で行われる（非特許文献３参照）。
【０００６】
レーザは、細胞の破壊に関して多くの長所を有し、ＬＯＣ（Ｌａｂ−Ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ）に容易に適用されうる（非特許文献４参照）。
【０００７】
特許文献１には、レーザ誘起細胞溶解システムが開示されている。しかし、前記特許文献１には、レーザのみを用いる細胞溶解システムを開示しているが、本発明に関するビーズおよびレーザを用いて細胞溶解が行われることについては言及されていない。
【０００８】
一般的に、市販の抗体がコートされたビーズを用いた標的細胞分離の方法は、全血などの複雑な流体から標的細胞を分離することができる。しかし、その後の工程で、核酸を溶解する方法が複雑であり、時間が長くかかり、さまざまな種類の緩衝液を必要とすることなど、ＬＯＣには好適ではない。
【０００９】
最近、本発明者らは、新しい細胞溶解方法である、レーザ照射されたビーズシステム（ＬＩＢＳ：Ｌａｓｅｒ−Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｂｅａｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を報告した（非特許文献５参照）。病原菌含有溶液への磁性ビーズの添加は、加熱速度を加速させた。したがって、グラム陰性バクテリアおよびグラム陽性バクテリアの両者、ならびにＢ型肝炎ウイルスを含む多様な類型の病原菌からのＤＮＡは、単に４０秒レーザ（８０８ｎｍ、１．０Ｗ）を照射することにより、効果的に抽出された。しかし、全血などの実際の試料からのＤＮＡ抽出および細胞またはＤＮＡの濃縮はできなかった。
【特許文献１】米国特許出願公開２００３／９６４２９号明細書
【非特許文献１】Ｒｕｄｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｒｅｓ  ２２，ｐｐ．５０６−５１１  （１９７７）
【非特許文献２】Ｄｅｇｇｅｒｄａｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｒｅｓ  ２２，５５４−５５７  （１９９７）
【非特許文献３】Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｔ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７３，４９２−４９６  （２００１）
【非特許文献４】Ｈｕａｉｎａ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７３，４６２５−４６３１（２００１）
【非特許文献５】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，６，ｐｐ．８８６−８９５（２００６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、標的細胞の分離／濃縮および核酸の分離を速やかに行うことができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記従来技術の問題点を解決するために、鋭意研究を積み重ねた結果、抗体結合ビーズまたはアフィニティー結合ビーズを用いて標的細胞を分離／濃縮した後、ビーズ−細胞複合体溶液にレーザを直接照射して核酸を分離することにより、標的細胞の分離／濃縮および核酸の分離が速やかに行われることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、細胞またはウイルスを含む溶液にビーズを注入し、ビーズ上で細胞またはウイルスを濃縮する段階と、前記ビーズにレーザを照射して細胞またはウイルスを破壊する段階と、を含むことを特徴とする、細胞またはウイルスの濃縮および破壊方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、標的細胞の分離／濃縮および核酸の分離が速やかに行われうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、細胞またはウイルスを含む溶液にビーズを注入し、ビーズ上で細胞またはウイルスを濃縮する段階と、前記ビーズにレーザを照射して細胞またはウイルスを破壊する段階と、を含むことを特徴とする細胞またはウイルスの濃縮および破壊方法である。
【００１６】
本発明の一実施形態における方法において、標的細胞の分離を改良する抗体コートビーズを用いて、全血、唾液、小便などの複雑な流体から標的細胞またはウイルスなどを分離して濃縮し、これにレーザを直接照射して核酸を速やかに単離するものであり、ＬＯＣの一体化を可能にする。例えば、ビオチンを有する抗体と、ストレプトアビジンが付着したビーズとを反応させると、ストレプトアビジンとビオチンとの間の特異的なアフィニティー結合により、抗体はビーズと結合する。ここに、細胞またはウイルスを含む試料を接触させると、細胞またはウイルスに特異的に結合できる抗体は、前記細胞または前記ウイルスに結合し、前記細胞または前記ウイルスは濃縮される。したがって、様々な種類の抗体が用いられると、所望の細胞またはウイルスが濃縮されうる。従来、濃縮された細胞またはウイルスの細胞溶解は、Ｂｏｏｍ法などを利用して行われていたが、この方法は段階が複雑であり、かつ、時間が長くかかるという問題がある。しかし、本発明の方法は、細胞またはウイルスの分離に用いられたビーズが細胞破壊にも用いられるので、迅速であり、かつ、経済的に核酸が単離されうる。具体的には、ビーズが結合した細胞またはウイルスにレーザを照射すると、レーザアブレーション現象により、速やかに細胞またはウイルスが破壊されうる。図１は、本発明の一実施形態による細胞またはウイルスの濃縮および破壊方法の原理を示す模式図である。図１から分かるように、標的特異的抗体１と接合されたビーズ２は、試料溶液と混合される。標的病原菌３は、ビーズ２上に選択的に捕獲され、血漿残留物のような不要な物質は洗浄して除去される。３０秒間の簡単なレーザ（８０８ｎｍ、１．５Ｗ）照射は、捕獲された標的病原菌からＰＣＲ用ＤＮＡ  ５を効果的に抽出しうる。
【００１７】
本発明の一実施形態による方法において、前記ビーズの表面は、標的細胞またはウイルスに親和性を有する抗体および金属酸化物の少なくとも一方で処理されることが好ましい。前記ビーズの表面は、細胞またはウイルスに特異的に結合できる抗体で処理されることがより好ましい。所望の特異的細胞またはウイルスは、抗体により選択的に濃縮されるため、非常に低い濃度の細胞またはウイルスを検出する場合に有用である。細胞またはウイルスに特異的に結合できる抗体が結合されたビーズは、公知の方法で製造してもよく、または、インビトロジェン社、キアゲン社などから市販されているものを入手しても良い。市販されているものの例としては、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ（インビトロジェン社製、米国）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  ａｎｔｉ−Ｅ．ｃｏｌｉ  ０１５７（インビトロジェン社製、米国）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｍ−２７０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  ＭｙＯｎｅ（商標）  カルボン酸（インビトロジェン社製、米国）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  ＭｙＯｎｅ（商標）  Ｓｔｒｅｐｔｖｉｄｉｎ  Ｃ１（インビトロジェン社製、米国）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  ＭｙＯｎｅ（商標）  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｔ１（インビトロジェン社製、米国）、ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ（商標）  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｉｎｄｅｒ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製、米国）、ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ  Ｖｉｒｕｓ  Ｍｉｎ  Ｍ４８  Ｋｉｔ（キアゲン社製、米国）などがある。特異的抗体が結合されたビーズを用いて、ジフテリア毒素、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、インフルエンザ（Ｉｎｆｕｌｅｎｚａ）Ａ、インフルエンザＢ、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｍｉａｅ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、ルベラウイルス（Ｒｕｂｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）などが分離されうる。
【００１８】
本発明の一実施形態による方法は、細胞またはウイルスを破壊する段階の後に、単離された核酸を用いてＰＣＲを行う段階をさらに含むことができる。「ＰＣＲ」とは、ポリメラーゼ連鎖反応を意味し、ポリメラーゼを用いて、標的核酸に特異的に結合するプライマー対から標的核酸を増幅する方法である。かかるＰＣＲ法は、当業者には周知であり、市販のキットを用いて行うこともできる。前記ＰＣＲ法は、リアルタイムＰＣＲを含む。標的核酸の増幅は、前記ＰＣＲ法以外にも、リガーゼ連鎖反応、核酸配列増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、転写増幅システム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、またはＱβＲＮＡ複製酵素（ｒｅｐｌｉｃａｓｅ）などの、当業者に周知である適当な方法を用いて行われうるが。これらの方法のうち、好ましくは、リアルタイムＰＣＲである。
【００１９】
本発明の一実施形態による方法において、細胞またはウイルスの濃縮段階で、前記ビーズを振動させる段階をさらに含むことができる。前記ビーズを振動させると、ビーズを振動させないときと比べて、ビーズは細胞またはウイルスとより接触しやすくなり、細胞またはウイルスは、さらに効果的にビーズ上で濃縮されうる。前記ビーズは、超音波洗浄器、磁場を利用した振動器、電場を利用した振動器、ボルテックスなどの機械的振動器、または圧電物質などの振動器を介して振動されうる。
【００２０】
本発明の一実施形態による方法において、前記金属酸化物の例としては、Ａｌ２Ｏ３、ＴｉＯ２、ＳｉＯ２、Ｔａ２Ｏ３、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、またはＨｆＯ２など好ましく挙げられるが、これらに制限されるものではない。前記金属酸化物は、より好ましくは、Ａｌ２Ｏ３またはＴｉＯ２であり、さらに好ましくは、Ａｌ２Ｏ３である。前記金属酸化物の蒸着は、物理気相成長（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｖａｐｏｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：ＰＶＤ）法、原子層堆積（ａｔｏｍｉｃ  ｌａｙｅｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：ＡＬＤ）法、ゾル・ゲル法などにより行われうる。ビーズの表面に金属酸化物を蒸着する方法は公知の技術であり、一般的には、ＰＶＤ法、ＡＬＤ法、ゾル・ゲル法などにより行われる。
【００２１】
ＰＶＤ法は、薄膜形成に用いられる方法であり、他の方法では行えない低温処理によって比較的簡単に薄膜を得ることができるために、最近、表面硬化の一手段として注目を集めている。ＰＶＤ法の例としては、イオンを利用しない真空蒸着、イオンを利用するスパッタリング、イオンプレーティング、イオン注入、イオンビームミキシングなどが挙げられる。ＡＬＤ法では、化学的に付着する特性を利用して、ウェハ表面に分子を吸着された後で置換される。吸着と置換とは交互に行われるため、超微細層同士の蒸着が可能であり、酸化物および金属薄膜ができるだけ薄く積層されうる。ゾル・ゲル法は、金属ハロゲン化物またはアルコキシドの加水分解反応を介して、コロイド状の金属酸化物を調製する方法であり、二酸化チタンのコーティング液を調製する、代表的な方法である。
【００２２】
標的細胞またはウイルスがビーズに結合され、ビーズを含む溶液にレーザが照射されると、ビーズがレーザによりアブレーション現象を起こし、衝撃波、蒸気圧、および熱が細胞表面に伝達される。このとき、物理的衝撃も細胞表面に加えられる。レーザにより加熱されたビーズは、水溶液の温度を上昇させ、細胞を直接破壊する。水溶液中のビーズは、単なる熱伝導体としての役割を果たすではなく、熱的、機械的、および物理的衝撃を細胞表面に伝達し、これにより細胞表面を効果的に破壊する。レーザだけを用いると、効果的な細胞溶解は起こらない。透明度の高い溶液に加えられた大腸菌を用いて実験した結果、レーザだけを照射した場合、低い細胞溶解効率が得られるということが確認される。１５０秒間レーザを照射した後に測定したＤＮＡ濃度は、３．７７ｎｇ／μｌであるが、９５℃で５分間煮沸した後のＤＮＡ濃度は、６．１５ｎｇ／μｌである。これは、レーザエネルギーが効果的に細胞に伝達されていないためである。
【００２３】
レーザおよびビーズを用いた迅速な細胞溶解は、液体培地で加熱およびレーザアブレーションにより行われる。マイクロビーズととともにレーザは、熱源を高熱のビーズの物理的および機械的衝撃に転換させることにより、細胞溶解を改良する。最近、小型の高出力のレーザダイオードが急速に開発されており、これを利用した非常に小さな細胞溶解装置が、ＬＯＣ上に装着されうる。その上、レーザは、直接か、または光ファイバ、ミラー、もしくはレンズなどの手段によって、出力およびエネルギーをチップ上の特異的な領域に集中させることができる。
【００２４】
ビーズの一番の利点は、ＤＮＡ単離段階を減らすことであるが、これは、レーザおよびマイクロビーズによる細胞溶解が蛋白質変性を招くためである。変性された蛋白質および細胞残屑は、重力または磁力により除去されうるビーズに付着する。その結果、検出限界を低くし、ＤＮＡ抽出時間は、ＤＮＡ抽出段階が一段階減ることにより、大幅に短縮され、信号振幅の増加により、ＰＣＲ分析結果が顕著に改善される。マイクロビーズおよびレーザを利用して細胞を破壊するために必要な時間は、たった４０秒である。
【００２５】
レーザアブレーションとは、レーザビームに露出された物質に発生する現象を意味する。レーザアブレーションは、素材表面の温度を、数百℃から数千℃にまで急速に上昇させる。素材表面の温度がその物質の蒸発点以上に上昇すれば、液体状態の材料の蒸発と共に、表面での飽和蒸気圧も急速に上昇する。飽和蒸気圧は、クラジウス−クラペイロン（Ｃｌａｕｓｉｕｓ−Ｃｌａｐｅｙｒｏｎ）の式により温度の関数として表され、高出力パルスレーザ加工の場合、一般的に、数十気圧以上まで上昇する。蒸気により素材表面に作用する圧力を「反発圧」といい、反発圧の大きさは、蒸気圧をＰｓａｔとするとき、約０．５６Ｐｓａｔになる。
【００２６】
衝撃波は、パルスレーザなどの、瞬間強度が非常に大きいレーザ加工で発生する。温度が蒸発点以上に加熱された材料表面から発生した蒸気は、数ｎｓから数十ｎｓまでの短時間で、圧力が数気圧から数十気圧まで上昇し、周辺の大気中に膨脹しながら、衝撃波を形成する。非常に高い圧力により、膨脹する蒸気は、物質にも約０．５６Ｐｓ（ここで、Ｐｓは、表面での飽和蒸気圧を表す）の圧力が作用する。
【００２７】
本発明の一実施形態による方法において、前記レーザは、パルスレーザまたは連続波レーザであることが好ましい。レーザ出力があまりにも低い場合、効果的にレーザアブレーションが起こらない場合がある。レーザ出力は、連続波（ＣＷ）レーザの場合、１０ｍＷ以上１０Ｗ未満であることが好ましく、パルスレーザの場合、１ｍＪ／パルス以上１Ｊ／パルス未満であることが好ましい。連続波（ＣＷ）レーザの場合、１００ｍＷ以上１０Ｗ未満であることがより好ましく、パルスレーザの場合、３ｍＪ／パルス以上１Ｊ／パルス未満であることがより好ましい。連続波レーザの出力が１０ｍＷ未満であり、パルスレーザの出力が１ｍＪ／パルス未満であるならば、細胞を破壊するために十分なエネルギーが伝達されない場合がある。連続波レーザの出力が１０Ｗ以上の場合、またはパルスレーザの出力が１Ｊ／パルス以上の場合、エネルギーが高すぎてレーザの制御が困難となる場合がある。
【００２８】
本発明の一実施形態の方法において、前記レーザは、ビーズがレーザのエネルギーを吸収する特定波長帯で発生するものでなければならない。前記レーザは、４００ｎｍ以上の波長帯で発生することが好ましく、前記レーザは、７５０ｎｍ〜１，３００ｎｍの波長帯で発生することがより好ましい。４００ｎｍ未満の波長では、ＤＮＡの変性または損傷が起こる場合があり、１３００ｎｍを超える波長では、ビーズのレーザ吸収効率が低下する場合がある。また、前記レーザは、少なくとも１つの波長帯で発生することが好ましい。すなわち、レーザは、１つの波長を有してもよいし、前記範囲内で互いに異なる少なくとも２つの波長であってもよい。
【００２９】
本発明の一実施形態による方法において、前記ビーズの大きさは５ｎｍ〜１，０００μｍであることが好ましく、より好ましくは１μｍ〜５０μｍである。ビーズの大きさが５ｎｍ未満の場合、物理的および機械的衝撃が細胞溶解に対して不十分となる場合がある。ビーズの大きさが１，０００μｍを超えると、ＬＯＣに好適ではない場合がある。また、前記ビーズは、少なくとも２種の大きさを有するビーズの混合物であることが好ましい。すなわち、前記ビーズは、すべて同じ大きさであってもよいし、互いに異なる大きさを有するビーズの混合物であってもよい。
【００３０】
本発明の一実施形態による方法において、前記ビーズは、強磁性鉄、Ｎｉ、Ｃｒ、およびこれらの酸化物からなる群より選択される少なくとも１つの物質を含むことが好ましい。
【００３１】
本発明の一実施形態による方法において、前記ビーズは、強磁性の金属でコートされている重合体、有機物質、ケイ素、またはガラスであることが好ましい。
【００３２】
本発明の一実施形態による方法において、前記ビーズを含む溶液のｐＨは、６〜９であることが好ましい。前記溶液のｐＨが前記範囲を外れると、細胞溶解後にＤＮＡの増幅効率が低下する場合がある。
【００３３】
本発明の一実施形態による方法において、前記溶液は、唾液、小便、血液、血清、および細胞培養液からなる群より選択されることが好ましい。前記溶液は、動物細胞、植物細胞、バクテリア、ウイルス、ファージなどの核酸を有するいかなる溶液であってもよい。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を介して本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例により限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は「質量％」を意味するものとする。
【００３５】
（実施例１：本発明の方法を用いた大腸菌細胞の溶解）
（１）大腸菌細胞の準備
バクテリア細胞として大腸菌Ｋ１２（ＡＴＣＣ  ２５４０４）を、ＡＴＣＣ培地２９４で培養させた後、遠心分離により収穫し、３ｍｌのリン酸塩緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）で２回洗浄した。次に、細胞をＰＢＳ（細胞濃度：１×１０９細胞／ｍｌ）に再懸濁させた。得られた細胞はＰＢＳで希釈し、最終細胞濃度が１×１０７細胞／ｍｌになるようにした。
【００３６】
（２）ビーズ洗浄
直径が２．８μｍであり、ストレプトアビジンが付着したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎをビーズとして用い、ビーズ溶液を混合して均一な溶液を調製した。調製された溶液１００μｌをチューブに入れ、磁石の中に２分間放置した。ピペットで上澄み液を除去した。チューブを磁石から取り出し、緩衝液１（０．１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）を１００μｌ添加して混合した。再び磁石に置いて２分間放置した。ピペットで上澄み液を除去した。チューブを磁石から取り出し、緩衝液１（０．１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）を１００μｍ添加して混合した。
【００３７】
（３）抗体を用いたビーズの予備コーティング
前記で調製したビーズ溶液に大腸菌抗体（ｖｉｒｏｓｔａｔ：１００７ビオチン接合、４〜５ｍｇ／ｍｌ）１０μｍを入れて混合した。数回ひっくり返しながら混合しつつ、室温で３０分間培養した。磁石を用いてビーズを１分間集め、上澄み液を除去した。洗浄緩衝液（１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）１ｍｌを添加して数回ひっくり返しながら混合した。磁石を用いてビーズを１分間集め、上澄み液を除去した。緩衝液１（０．１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）１００μｍを添加した。
【００３８】
（４）大腸菌細胞の分離
前記（１）で製造した大腸菌Ｋ１２細胞１００μｍに、前記（３）で製造した大腸菌抗体が結合されたビーズの溶液１００μｍを混合した。数回ひっくり返しながら混合しつつ、常温で２０分間培養した。磁石を用いてビーズを１分間集め、上澄み液を除去した。洗浄緩衝液１００μｍを添加し、数回ひっくり返しながら混合した。磁石を用いてビーズを集め、上澄み液を除去した。緩衝液１（０．１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）４μｌを添加した。
【００３９】
（５）細胞溶解
前記（４）で分離された大腸菌細胞４μｌを、バイアル・ガイド（ＡＭＩＴＥＣＨ社製、韓国）内に配置したバイアルに注入した（図２参照）。バイアルをボルテックスにより撹拌しつつ、それぞれの実験で指定された時間の間細胞を破壊するために、８０８ｎｍ、１Ｗ（ＨＬＵ２５Ｆ１００−８０８、ＬＩＭＯ社製、ドイツ）のレーザビームを３０秒間照射した（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，６，ｐｐ．８８６−８９５（２００６）参照）。
【００４０】
実施例２：バクテリア細胞捕獲効率
最近、Ｌｅｅらは、レーザ照射されたビーズシステム（ｌａｓｅｒ−ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｂｅａｄ  ｓｙｓｔｅｍ：ＬＩＢＳ）を用いる迅速なＤＮＡ抽出方法を報告した（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，６，ｐｐ．８８６−８９５（２００６）参照）。ビーズを細胞溶液に添加し、４０秒のレーザ（８０８ｎｍ、１．０Ｗ）を照射することにより、グラム陰性およびグラム陽性のバクテリア、ならびにＢ型肝炎ウイルスからのＤＮＡ抽出が示された。ビーズのカルボキシル化された表面が、ＰＣＲの下記のような段階において阻害剤でありうる蛋白質を吸着するのに効果的であると立証されたが、全血などの実際の試料は、直接利用されなかった。さらに、希釈試料の濃縮は、可能ではなかった。
【００４１】
本発明では、抗体が接合されたビーズを用い、標的特異的な分離および濃縮が可能であるということが分かった。したがって、ビーズは、２つの目的に利用される。第一に、ビーズは病原菌特異的抗体に変形されるので、病原菌特異的な細胞の分離および濃縮に対する媒介としての機能を果たす。第二に、ビーズは、迅速な熱伝達のためのマイクロヒータとしての機能を果たす。８０８ｎｍレーザは、水分子により吸収されないが、溶液中に分散されたビーズにより効果的に吸収される。その結果、加熱速度は非常に速く、細胞溶解段階は急激に短縮されうる。さらに、大体積の溶解緩衝液が不要であり、これは、小型化のための他の好ましい特徴である。
【００４２】
前記実施例１の（３）で製造した大腸菌抗体（ｖｉｒｏｓｔａｔ：１００７ビオチン接合、４−５ｍｇ／ｍｌ）が結合されたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎについての、大腸菌Ｋ１２細胞の捕獲効率を調べた。大腸菌細胞数は、３Ｍコロニーカウントペーパーを用いてカウントした。大腸菌Ｋ１２細胞の濃度は、１．０×１０５細胞／μｌ、１．０×１０４細胞／μｌ、および１．０×１０３細胞／μｌの３種類を利用した。ビーズに結合された大腸菌Ｋ１２細胞の捕獲効率を下記表１に示す。
【００４３】
【表１】
2007275057.tif 000003
【００４４】
表１で、Ｉは、添加した溶液の大腸菌濃度を表し、Ｂは、結合緩衝液に残っている大腸菌の濃度を表し、Ｗは、洗浄緩衝液に残っている大腸菌濃度を表す。また、ＣＶは変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を表す。捕獲効率は、添加した溶液に存在する大腸菌の濃度に対して、添加した溶液に存在する大腸菌の濃度細胞数から結合緩衝液に残っている大腸菌細胞数および洗浄緩衝液に残っている大腸菌細胞数を除いた大腸菌細胞数がどのくらいあるかという割合で表した。表１から分かるように、捕獲効率は、９０％程度で非常に高いということが分かる。したがって、本発明の方法を利用すれば、大腸菌細胞を非常に高い効率で捕獲できるため、細胞の濃度が非常に低い試料に対して、本発明の方法が非常に有用であろう。
【００４５】
実施例３：ビーズによるＰＣＲ阻害の効果
本発明の一実施形態による、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎビーズを２５０ｍｇ／ｍｌを利用したとき、捕獲効率が約９０％となった（実施例２参照）。ビーズを用いた細胞捕獲実験において、濃度１０ｍｇ／ｍｌのビーズを１００μｌ用い、大腸菌１００μｌと反応させて、生成物を洗浄した。その後、４μｌの溶出溶液で溶出させた。その結果、ビーズの濃度は、２５０ｍｇ／ｍｌとなった。これは、従来の細胞の濃縮機能なしに細胞溶解を起こす物質として用いられるビーズである、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  ＭｙＯｎｅ（商標）  カルボン酸（インビトロジェン社製、米国）（１０ｍｇ／ｍｌ）を利用した場合（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，６，ｐｐ．８８６−８９５（２００６）参照）よりも、ビーズの濃度が２５倍高い。よって、ビーズ量が増加した場合にも、ＰＣＲ阻害が起こるか否かを調べた。
【００４６】
実施例２と同様に、それぞれ６×１０９細胞／ｍｌ、６×１０８細胞／ｍｌ、および６×１０７細胞／ｍｌを、大腸菌Ｋ１２の濃度として用いた。ビーズ１０％と細胞溶液９０％とを含む細胞およびビーズの溶液中の細胞を、レーザを用いて溶解した後、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＧｅｎｅＳｐｅｃｔｏｒ（登録商標）  Ｍｉｃｒｏ  ＰＣＲ（ＳＡＩＴ社製、韓国）を用い、ＰＣＲ混合物（７５ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ９．０）、１５ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２５０μＭ  ｄＮＴＰミックスチャ、１μＭ  ＰＣＲプライマー（配列番号１および配列番号２））、および０．４μＭ  ＴａｑＭａｎプローブ（ＦＡＭ−５’−ＴＧＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＧＣＧＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＴＡＡＡＧＴＴＡＡＴＡＣＣＴＴＴ−３’−ＴＡＭＲＡ：配列番号３）で、９５℃で１分間、ＤＮＡを完全に変性した後、４０サイクル（９５℃で１０秒、５０℃で１０秒、および７２℃で１０秒）を行った。ＰＣＲ産物のＣｐ（Ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）を測定した結果を下記表２に表した。Ｃｐは、リアルタイムＰＣＲで検出可能な蛍光信号が現れるサイクル数をいう。すなわち、初期ＤＮＡ濃度が高いほど、低いＣｐで蛍光信号が検出可能であり、初期ＤＮＡ濃度が低いほどＣｐが大きい。Ｃｐは、また、ＤＮＡ精製とも関連があり、ＤＮＡの純度が高いほどＣｐは低く、ＤＮＡの純度が低いほどＣｐは高い。したがって、Ｃｐが低いほど、溶液中のＤＮＡは、より精製されている形態であることを示す。
【００４７】
【表２】
2007275057.tif 000004
【００４８】
表２から分かるように、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  ＭｙＯｎｅ（商標）カルボン酸（インビトロジェン社製、米国）ビーズよりも、２５倍多いビーズ量であるビーズ溶液を用いた本発明の場合でも、ＰＣＲに対する影響がほとんどない。したがって、本発明の方法を用いた場合、細胞の捕獲効率が約９０％と非常に高く、捕獲された細胞から放出されたＤＮＡの核酸増幅に対し、核酸の結合および溶解に用いられたビーズはほとんど影響を与えないため、本発明の方法は、細胞の捕獲および核酸の分離に非常に有用である。
【００４９】
実施例４：本発明の一実施形態による方法を用いた細胞濃縮の効果
マイクロビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  ＭｙＯｎｅ（商標）カルボン酸、インビトロジェン社製、米国）を混合した従来の方法と比較して、本発明の方法を用いた細胞捕獲効率について調べた。前記の実施例１と同様に実験を行った。リアルタイムＰＣＲ産物のＣｐ値とＲｎ値とを測定した結果を図３Ａ、図３Ｂ、および表３に示す。図３Ａは、細胞濃縮機能がないＬＩＢＳ法と、細胞濃縮機能を含む本発明の一実施形態である標的分離およびレーザ照射されたビーズシステム法（Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｓｅｒ−Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  Ｂｅａｄ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＴＳ−ＬＩＢＳ）とを用いてリアルタイムＰＣＲを行った結果である。図３Ａで、右側に「Ａ６」、「Ａ５」、および「Ａ４」と表示されているのは、細胞濃縮機能のある本発明のＴＳ−ＬＩＢＳ法を利用し、大腸菌濃度がそれぞれ１．０×１０９細胞／ｍｌ、１．０×１０８細胞／ｍｌ、および１．０×１０７細胞／ｍｌである溶液を用いたものである。「Ｂ６」、「Ｂ５」、および「Ｂ４」と表示されているのは、細胞濃縮機能のないＬＩＢＳ法を利用し、大腸菌濃度がそれぞれ１．０×１０９細胞／ｍｌ、１．０×１０８細胞／ｍｌ、および１．０×１０７細胞／ｍｌである溶液をもの用いたである。「Ｎ」と表示されているのは、陰性対照群を表す。図３Ｂは、図３ＡのリアルタイムＰＣＲ結果をＲｎ値で表したものである。図３Ｂにおいて、Ａは、細胞濃縮機能のある本発明の一実施形態によるＴＳ−ＬＩＢＳ法を用いたＰＣＲの結果を示し、Ｂは、細胞濃縮機能のないＬＩＢＳ法を用いたＰＣＲの結果を示す。Ｃｐ値は、初期のＰＣＲテンプレート濃度と関連し、Ｃｐ値が低いほど初期濃度が高いということを意味する。ＰＣＲ効率が１００％である場合、△Ｃｐ＝３．３は、初期濃度に１０倍の差があるということを意味する。Ｒｎ値は、ＰＣＲ産物の濃度と関連し、Ｒｎ値が大きいほど、ＰＣＲ産物の濃度が高いということを意味する。図３Ａおよび図３Ｂの結果を下記表３にまとめた。
【００５０】
【表３】
2007275057.tif 000005
【００５１】
図３Ａ、図３Ｂ、および表３から分かるように、従来のマイクロビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  ＭｙＯｎｅ（商標）  カルボン酸、インビトロジェン社製、米国）を混合した方法と比較して、本発明の方法を用いたときの細胞捕獲効率は、約２〜７倍高いということが分かる。
【００５２】
したがって、本発明の方法を用いると、細胞濃縮効率が従来の方法に比べて非常に高い。
【００５３】
実施例５：本発明の一実施形態による方法を用いた全血からの細胞濃縮の効果
リン酸塩緩衝液ではなく、ヒト全血にスパイクされた大腸菌から、大腸菌を選択的に分離／濃縮するために、実施例１の方法を行った。細胞濃縮機能のないＬＩＢＳ法および細胞濃縮機能のあるＴＳ−ＬＩＢＳ法を用い、リン酸塩緩衝液および全血にスパイクされた大腸菌を分離／濃縮し、リアルタイムＰＣＲを行った結果を下記表４に示す。下記表４で、×は、ＰＣＲ産物が生成されていないことを表す。
【００５４】
【表４】
2007275057.tif 000006
【００５５】
表４から分かるように、全血を用いた場合、リン酸塩緩衝液を用いた場合と同様の細胞捕獲効率およびＰＣＲの結果を示すということが分かった。試料がリン酸塩緩衝液である場合、ＴＳ−ＬＩＢＳ法でのＣｐ値は、ＬＩＢＳ法でのＣｐ値より１．６５低いということが分かる。較正曲線を用いて計算された初期のＨＢＶ濃度は、本発明の方法による標的分離および濃縮さらに追加したときのＤＮＡ濃度が、約３．４倍増加するということを示した（データは提示していない）。
【００５６】
また、ＬＩＢＳを用いた場合は、ＴＳ−ＬＩＢＳを用いた場合とは異なり、ＰＢＳ緩衝液中の大腸菌に対しては、ＰＣＲが効率的に行われるが、全血にスパイクされた大腸菌のＰＣＲ産物は得られない。
【００５７】
したがって、直接ＰＣＲに用いられなかった血液、唾液、小便などの実際の試料を用いた場合でも、本発明の方法によるＴＳ−ＬＩＢＳ法を用いることにより、細胞捕獲およびＰＣＲが効果的に行われうる。
【００５８】
実施例６：本発明の方法を用いたウイルス濃縮およびレーザ照射を用いたＤＮＡ抽出
ＨＢＶでスパイクされた全血からのＤＮＡ分離をＴＳ−ＬＩＢＳ法を用いて行った。ＴＳ−ＬＩＢＳ法の最適条件を探し出すために、ビーズの粒径、表面特性およびビーズの濃度、結合時間、洗浄緩衝液の体積、および洗浄段階の数を調べた。
【００５９】
図４Ａに示すように、Ｃ１型のビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  ＭｙＯｎｅ（商標）  Ｓｔｒｅｐｔｖｉｄｉｎ  Ｃ１、直径：１μｍ、ビオチン化されたＩｇの結合能：１５〜２０μｇ／ｍｇ、親水性、カルボン酸ビーズ）は、さらに大きいサイズの他種のビーズ、例えば、Ｍ−２８０（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、直径：２．８μｍ、ビオチン化されたＩｇの結合能：５〜１０μｇ／ｍｇ、疎水性、トシル活性化されたビーズ）、およびＭ−２７０（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｍ−２７０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、直径：２．８μｍ、ビオチン化されたＩｇの結合能：５〜１０μｇ／ｍｇ、親水性、カルボン酸ビーズ）、または疎水性およびトシル活性化されたビーズ、例えば、Ｔ１（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  ＭｙＯｎｅ（商標）  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｔ１、直径：１μｍ、ビオチン化されたＩｇの結合能：４０〜５０μｇ／ｍｇ、疎水性、トシル活性化されたビーズ）と比較して、いちばん良い結果を示した。
【００６０】
同じ質量濃度のビーズを用いたため、小さいサイズのビーズの表面積は、より大きいため、ビオチン標識された抗体の結合能は大きかった。さらに、以前に報告した通り、カルボキシル化されたビーズは、その他のアミン改質されたビーズ、またはポリスチレンビーズと比較して、優れた蛋白質除去機能を示した。
【００６１】
図４Ｂに示すように、さらに高濃度のビーズは、１００μｇ／μｌまで、より良好なＰＣＲ産物が得られた。Ｃ１ビーズ（１０ｍｇ／ｍｌ）の１００μｌが用いられ、最終溶解チャンバ体積が１０μｌであったため、溶解チャンバ内のビーズ濃度は１００μｇ／μｌであった。
【００６２】
ビーズを用いた市販の試料調製キットは、通常、ビーズ表面上に抗体の結合に対し、２０分の培養時間を推薦する。しかし、図４Ｃに示すように、結合時間を３分から２０分に変えた場合、溶解効率はほとんど影響を受けていないので、３分の結合時間をその後利用した。
【００６３】
ウイルス培養が可能ではないため、捕獲効率の測定は、ウイルス試料に対して簡単ではなかった。その代わり、ウイルス溶液に抗体接合されたビーズを２回添加し、各段階からＤＮＡを増幅した。図４Ｄに示すように、ウイルスのほとんどは、１回目の結合段階で捕獲され、２回目の結合段階では、いかなるＰＣＲアンプリコンも得られなかった。
【００６４】
ＴＳ−ＬＩＢＳ法のＤＮＡ単離効率を、市販のキット（キアゲン社製、米国、ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｕｍ  ｋｉｔ、５７７１４）と比較した。ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｕｍ  ｋｉｔは、５００μｌの血清または血漿を必要とし、多種の緩衝液に加えて、多くの段階の手作業を必要とし、１時間以上かかる。本発明によるＴＳ−ＬＩＢＳ法は、３０μｌだけの血清または血漿を必要とし、血液を注入する一段階だけで、１２分かかるだけである。
【００６５】
初期の試料体積の条件が異なるが、比較のために、同じ濃度因子、すなわち、ＤＮＡ溶液の最終体積に対する初期の血漿試料の体積の比率を用いた。キアゲン社製の調製キットに対し、１００μｌの血漿試料を４００μｌのＰＢＳ緩衝液と混合したところ、最終溶出体積は３３μｌであった。ＴＳ−ＬＩＢＳ法では、３０μｌの血漿が用いられ、最終体積が１０μｌであったので、濃度因子は同様であった。
【００６６】
図４Ｅに示すように、ＴＳ−ＬＩＢＳ法によるリアルタイムＰＣＲの結果は、市販のキット（キアゲン社製、米国、ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｕｍ  ｋｉｔ、５７７１４）と同じぐらい良好であった。検出限界は、両方の方法について１０コピー／μｌであった。現在の臨床診断では、ＨＢＶ  ＤＮＡ試験に対するカットオフ値が１００コピー／μｌであるということは、注目に値する。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の細胞またはウイルスの濃縮および破壊方法は、例えば、病原菌診断関連の技術分野に好適に用いられうる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の細胞またはウイルスの濃縮および破壊方法の原理を示す模式図である。
【図２】マイクロチップ上でのレーザおよびマイクロビーズを用いた細胞溶解のシステムの一例を示す模式図である。
【図３Ａ】細胞濃縮機能がないＬＩＢＳ法と、細胞濃縮機能がある本発明によるＴＳ−ＬＩＢＳ法とを用いて、リアルタイムＰＣＲを行った結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３ＡのリアルタイムＰＣＲの結果をＲｎで示したグラフである。
【図４Ａ】リアルタイムＰＣＲの結果について、ビーズの型による効果を示すグラフである。
【図４Ｂ】リアルタイムＰＣＲの結果について、ビーズの濃度による効果を示すグラフである。
【図４Ｃ】リアルタイムＰＣＲの結果について、結合時間による効果を示すグラフである。
【図４Ｄ】ウイルスの結合回数による抗体接合されたビーズのウイルス捕獲効率を示すグラフである。
【図４Ｅ】本発明によるＴＳ−ＬＩＢＳ法を用いた場合と、市販のキット（キアゲン社製、米国、ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｕｍ  ｋｉｔ、５７７１４）を用いた場合との、ＤＮＡウイルスの単離効率を比較したグラフである。
【符号の説明】
【００６９】
１    抗体、
２    ビーズ、
３    標的病原菌、
４    レーザ、
５    ＤＮＡ、
６    出口、
７    細胞、
８    レーザビーム、
９    光ファイバ、
１０    マイクロ磁性ビーズ、
１１    導入口、
１２    マイクロチップ、
１３    振動方向（垂直）、
１４    振動器。
【図４Ａ】
2007275057.tif 000007
【図４Ｂ】
2007275057.tif 000008
【図４Ｃ】
2007275057.tif 000009
【図４Ｄ】
2007275057.tif 000010
【図４Ｅ】
2007275057.tif 000011
【図１】
2007275057.tif 000012
【図２】
2007275057.tif 000013
【図３Ａ】
2007275057.tif 000014
【図３Ｂ】
2007275057.tif 000015
【配列表】
2007275057000001.app