(57)【要約】【課題】肥満症、脂質代謝異常症、癌等の診断、治療及び予防のための安全かつ有効、そして高信頼度の技術の確立。脂肪細胞・軟骨・神経細胞等の分化機構の解明や制御等。【解決手段】ミトコンドリア融合タンパク質であるＭｉｔｏｇｅｎｉｎ  Ｉ（ＭＧ）、ＭＧを有効成分とするミトコンドリア活性化剤、ミトコンドリア融合試薬、抗肥満薬及び脂質代謝異常症治療薬；ＭＧ遺伝子に基づき設計・合成されるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ機能成分を含有する制癌剤；ＭＧに対する抗体を用いるミトコンドリア機能診断剤。【選択図】  図５
2007151541.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２又は４に記載の完全長アミノ酸配列又はその部分配列からなるペプチドを有効成分として薬効を奏する量、含有するミトコンドリア活性化剤、抗肥満薬、又は脂肪酸代謝異常症治療薬。
【請求項２】
請求項１記載の完全長アミノ酸配列又はその部分配列からなるペプチドをコードする遺伝子の発現べクターを含有する、ミトコンドリア活性化剤、抗肥満薬、又は脂肪酸代謝異常症治療薬。
【請求項３】
配列番号１又は３に記載の完全長ｃＤＮＡ塩基配列に基づき設計かつ合成されるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡをＲＮＡｉ機能成分として薬効を奏する量、含有する制癌剤。
【請求項４】
ｓｉＲＮＡが、配列番号７と８、９と１０、１１と１２、１３と１４、及び１５と１６に記載の各１組のＲＮＡからなる合計５種のｄｓＲＮＡ（１）〜（５）群から選ばれる少なくとも１種のｄｓＲＮＡである請求項２に記載の制癌剤。
【請求項５】
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの発現ベクターをＲＮＡｉ機能成分として薬効を奏する量、含有する制癌剤。
【請求項６】
配列番号２又は４に記載の完全長アミノ酸配列又はその部分配列からなるペプチドに対する抗体を活性成分として抗原抗体反応を呈する量、含有するミトコンドリア機能の診断剤又は検査薬。
【請求項７】
配列番号５及び６に記載のＤＮＡからなるＲＴ−ＰＣＲ用プライマー。
【請求項８】
配列番号２又は４に記載の完全長アミノ酸配列又はその部分配列からなるペプチドを作用成分として融合が生じる量、含有するミトコンドリア融合試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ミトコンドリア融合タンパク質であるミトジェニンＩ（Ｍｉｔｏｇｅｎｉｎ  Ｉ）、それをコードする遺伝子、及びこれ等の用途に関する。尚、用途としては、肥満症、癌、脂肪酸代謝異常症等に係る診断剤、治療薬、予防剤、研究用試薬等を上げることができる。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、脂肪酸代謝異常症モデルであるＪＶＳマウス（ＪＶＳ：ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）において特異的に多量発現する遺伝子をクローニングすると共に、それがコードするタンパク質が新規な機能を発揮することを発見し、「ミトジェニン  Ｉ（Ｍｉｔｏｇｅｎｉｎ  Ｉ）」と命名した。併せて、遺伝子解析及びホモロジー検索の結果、ミトジェニン  Ｉが、ＤＮＡポリメロラーゼδやＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）と相互作用することが知られているヒトＰＤＩＰ３８（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｄｅｌｔａ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ；非特許文献１）のマウスホモログであり、マウスＰＤＩＰ３８と同一であると判定した。尚、マウス及びヒトの各ＰＤＩＰ３８遺伝子のＮＣＢＩアクセッションは、それぞれＮＭ＿０２６３８９及びＮＭ＿０１５５８４である（非特許文献２及び３）。
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２８０巻（第２３号）、２２３７５−２２３８４、Ｊｕｎｅ  １０、２００５．
【非特許文献２】ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、Ｅｎｔｒｅｚ、ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＮＭ＿０２６３８９．
【非特許文献３】同上、ＮＭ＿０１５５８４．  しかしながら、詳しくは後述される、本発明に係るミトジェニンＩの機能、及びその利用技術は、未だ知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
肥満症、脂肪酸代謝異常症、癌等の診断、治療及び予防のための安全かつ有効、そして高信頼度の技術の確立は、患者とその家族、そして担当臨床医のみならず、全人類にとって、解決されるべき待望の課題である。また、上記疾病の基礎研究、例えば脂肪細胞・軟骨・神経細胞等の分化機構の解明や制御等も重要な課題である。
本発明の目的は、上記の課題を解決するための診断剤、治療薬、予防剤、基礎研究用試薬等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（略語の説明）
先ず、この明細書で用いられる略語につき、略語（用語）の形で、以下に列記する：ＭＧ［ミトジェニンＩ（Ｍｉｔｏｇｅｎｉｎ  Ｉ）］、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ；ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、及びｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ）。
（配列表の説明）
配列番号１：ＭＧ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ塩基配列とそれがコードする完全長アミノ酸配列、及びマウスＰＩＤＰ３８の完全長ｃＤＮＡ塩基配列とそれがコードする完全長アミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション：ＮＭ＿００２６３８９）。
配列番号２：ＭＧの完全長アミノ酸配列、及びマウスＰＩＤＰ３８の完全長アミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション：ＮＭ＿００２６３８９）。
配列番号３：ヒトＰＩＤＰ３８の完全長ｃＤＮＡ塩基配列とそれがコードする完全長アミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション：ＮＭ＿０１５５８４）。
配列番号４：ヒトＰＩＤＰ３８の完全長アミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション：ＮＭ＿０１５５８４）。
配列番号５：ＭＧ遺伝子ｍＲＮＡ増幅用ＲＴ−ＰＣＲの上流プライマー。
配列番号６：ＭＧ遺伝子ｍＲＮＡ増幅用ＲＴ−ＰＣＲの下流プライマー。
配列番号７：ＲＮＡｉ用ｄｓＲＮＡ（１）（ｓｉＲＮＡ）のセンス鎖。
配列番号８：ＲＮＡｉ用ｄｓＲＮＡ（１）（ｓｉＲＮＡ）のアンチセンス鎖。
配列番号９：ＲＮＡｉ用ｄｓＲＮＡ（２）（ｓｉＲＮＡ）のセンス鎖。
配列番号１０：ＲＮＡｉ用ｄｓＲＮＡ（２）（ｓｉＲＮＡ）のアンチセンス鎖。
配列番号１１：ＲＮＡｉ用ｄｓＲＮＡ（３）（ｓｉＲＮＡ）のセンス鎖。
配列番号１２：ＲＮＡｉ用ｄｓＲＮＡ（３）（ｓｉＲＮＡ）のアンチセンス鎖。
配列番号１３：ＲＮＡｉ用ｄｓＲＮＡ（４）（ｓｉＲＮＡ）のセンス鎖。
配列番号１４：ＲＮＡｉ用ｄｓＲＮＡ（４）（ｓｉＲＮＡ）のアンチセンス鎖
配列番号１５：ＲＮＡｉ用ｄｓＲＮＡ（５）（ｓｉＲＮＡ）のセンス鎖。
配列番号１６：ＲＮＡｉ用ｄｓＲＮＡ（５）（ｓｉＲＮＡ）のアンチセンス鎖
【０００５】
本発明者らは、上述の課題と現状に鑑み、長年にわたる深い洞察と試行錯誤の結果、ＭＧ遺伝子とＭＧがもたらす次（１）〜（５）に示す実に驚くべき現象を発見した：
（１）ＭＧ遺伝子発現は、健常マウスに比べ、脂肪酸代謝異常症モデルＪＶＳマウスで増強される。
（２）ＭＧ遺伝子の過剰発現は、ミトコンドリアを長いチューブ状に形態変化させる。、細胞内脂肪滴の蓄積を抑制する。
（３）ＲＮＡｉによるＭＧ遺伝子発現のノックダウンは、ミトコンドリアの断片化及び死細胞の増加をもたらす。
（４）ＭＧは、ミトコンドリアタンパク質である。
（５）ＭＧは、ミトコンドリア融合を促進ないしは刺激する。
この発明は、前述課題の解決に寄与するため、上記（１）〜（５）の基礎的知見に基づき着想かつ創作され、絶え間ない創意工夫の投入と勤勉により完成された。
【０００６】
この発明によれば、前述の課題を解決するための手段として、次の（１）〜（８）がそれぞれ提供される：
（１）配列番号２又は４に記載の完全長アミノ酸配列又はその部分配列からなるペプチドを有効成分として薬効を奏する量、含有するミトコンドリア活性化剤、抗肥満薬、又は脂肪酸代謝異常症治療薬。
（２）上記（１）記載の完全長アミノ酸配列又はその部分配列からなるペプチドをコードする遺伝子の発現べクターを含有する、ミトコンドリア活性化剤、抗肥満薬、又は脂肪酸代謝異常症治療薬。
（３）配列番号１又は３に記載の完全長ｃＤＮＡ塩基配列に基づき設計かつ合成されるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡをＲＮＡｉ機能成分として薬効を奏する量、含有する制癌剤。
（４）ｓｉＲＮＡが、配列番号７と８、９と１０、１１と１２、１３と１４、及び１５と１６に記載の各１組のＲＮＡからなる合計５種のｄｓＲＮＡ（１）〜（５）群から選ばれる少なくとも１種のｄｓＲＮＡである請求項２に記載の制癌剤。
（５）ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの発現ベクターをＲＮＡｉ機能成分として薬効を奏する量、含有する制癌剤。
（６）配列番号２又は４に記載の完全長アミノ酸配列又はその部分配列からなるペプチドに対する抗体を活性成分として抗原抗体反応を呈する量、含有するミトコンドリア機能の診断剤又は検査薬。
（７）配列番号５及び６に記載のＤＮＡからなるＲＴ−ＰＣＲ用プライマー。
（８）配列番号２又は４に記載の完全長アミノ酸配列又はその部分配列からなるペプチドを作用成分として融合が生じる量、含有するミトコンドリア融合試薬。
【発明の効果】
【０００７】
この発明は、肥満症、脂肪酸代謝異常症、癌等の診断、臨床検査、治療及び予防の技術を高め、併せて、上記疾病の基礎研究、例えば脂肪細胞・軟骨・神経細胞等の分化機構の解明や制御技術の開発等を可能にする。更に、この発明は、世界の保健と医療行政に寄与するだけではなく、今日の深刻な課題である肥満症、脂肪酸代謝異常症癌の制圧に多大に貢献すると共に、長寿と延命という福音を全ての人類にもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
この発明の実施の形態に関し、次の通り詳述する：
（１）ＭＧ遺伝子
配列番号１及び３に記載のｃＤＮＡの完全長塩基配列及びその部分配列を、前述した肥満症、脂肪酸代謝異常症、癌等の診断、臨床検査、治療及び予防、あるいは上記した疾病の基礎研究、例えば脂肪細胞・軟骨・神経細胞等の分化機構の解明や制御技術の開発等に用いることができる。尚、部分配列の利用の具体例は、実験例３に記載の通り、ＭＧ遺伝子増幅用のＰＣＲ用プライマーである配列番号５と６に記載のＤＮＡを上げることができる。
（２）ＭＧ遺伝子がコードするアミノ酸配列
配列番号２及び４に記載の完全長アミノ酸配列及びその部分配列を、前述した肥満症、脂肪酸代謝異常症、癌等の診断、臨床検査、治療及び予防、あるいは上記した疾病の基礎研究、例えば脂肪細胞・軟骨・神経細胞等の分化機構の解明や制御技術の開発等に用いることができる。尚、配列番号２の第１番アミノ酸Ｍ〜第３０番Ｌはミトコンドリア移行シグナルの領域、また、第２４３番Ｖ〜第３５３番Ｌはタンパク質−タンパク質相互作用に関わるモチーフであり、薬剤や試薬への部分配列の利用や設計において有用かつ活用可能である。
（３）脂肪酸代謝異常症モデル動物
ＪＶＳマウスは、未熟内臓脂肪酸代謝異常症あるいは全身性カルニチン欠乏疾患のモデル動物であり、脂肪肝、心肥大、成長障害等の多彩な症状を示す。そのため、ＪＶＳマウスは、健常マウスとの比較による遺伝子の異常発現の検出が容易であるので、実験例３において後述される通り、ＭＧ遺伝子のクローニングに推奨される。
【０００９】
（４）ＲＮＡｉ用薬剤
ＭＧ遺伝子ＤＮＡ塩基配列に基づくＲＮＡｉ用薬剤としてのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの合成では、ノックダウン率を考慮し、標的ｍＲＮＡが高次構造をとらない部分に対するよう事前に設計することが重要である。具体的には実施例１で後述される通り、配列番号７と８に記載の両ＲＮＡからなるｄｓＲＮＡを上げることができる。
（５）発現ベクターを用いた薬剤
配列番号２及び４に記載の完全長アミノ酸配列及びその部分配列からなるペプチドをコードする遺伝子の発現ベクターを、ミトコンドリア活性剤、抗肥満剤又は脂肪酸代謝異常症治療薬等の薬剤として利用することができる。
前記配列番号２及び４に記載の完全長アミノ酸配列及びその部分配列からなるペプチドをコードする遺伝子としては、例えば配列番号１及び３に記載のｃＤＮＡの完全長塩基配列或いはその部分配列からなるＤＮＡが上げられる。これらのＤＮＡ以外でも、配列番号２及び４に記載のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、或いは付加されたアミノ酸配列であって、ミトジェニンＩと同様の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
発現ベクターは、上記の遺伝子ＤＮＡを、原核細胞ベクター、真核細胞ベクター、ウイルスベクター等の公知のベクターに挿入・連携することにより構築できる。その具体的手順については、例えば、常用のテキストＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら著，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１年発行（ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ｃｏｍ）に記載されている。
発現ベクターは、そのままの形態で、或いは常法に従い、公知の担体を用いて製剤化した後、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。
【００１０】
この発明に係る薬剤、診断剤、試薬等は、アンプルやバイアル瓶等に分注され、液状又は乾燥のかたちで密封された状態で提供かつ使用に供される。
【００１１】
以下、実験例及び実施例を上げ、本発明の構成と効果を具体的に説明する。但し、この発明は、これ等の実験例及び実施例だけに限定されるわけではない。
（実験例１）
【００１２】
ＪＶＳマウスと健常マウスとの間で発現量が違うｍＲＮＡの同定
ＪＶＳマウスと健常マウスの各心臓細胞から常法によりｍＲＮＡを抽出・精製し、得られたｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅することによりｃＤＮＡを調製した。次いで、ｃＤＮＡ解析キットを用い、ｍＲＮＡの同定を行った。上記の解析キットには、ＧｅｎｅＣｈｉｐ［Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社（米国）製］、蛍光Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ［タカラバイオ社（日本）製］及びＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（米国）製］を用いた。その結果、健常マウスに比べＪＶＳマウスでの発現量増加が検出された遺伝子数は、ＧｅｎｅＣｈｉｐでは１７６、蛍光Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙは９、及びＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎは６７であった。上記の通り同定された合計２５０遺伝子ｃＤＮＡは、機能解析のため、それぞれ−２０℃以下に保存した。
（実験例２）
【００１３】
ＪＶＳマウスにおける特異的に発現が増加するｃＤＮＡのクローニングと遺伝子解析
実験例１で得た合計２５０遺伝子ｃＤＮＡのうち、前記の３つの方法で共通して発現量増加が認められた合計７遺伝子につき、各発現ベクターを構築の後、これ等の発現ベクターをそれぞれ細胞に移入し得られる形質転換体を検鏡することにより、各遺伝子の機能解析を行った。その結果、ミトコンドリア融合を促進ないしは刺激する遺伝子を検出し、「Ｍｉｔｏｇｅｎｉｎ  Ｉ遺伝子」と命名した。該ＭＧ遺伝子のＤＮＡ塩基配列は、ＤＮＡ解析装置により決定した。ＤＮＡ塩基配列のホモロジー検索は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴを用いて行った。その結果、発見したＭＧ遺伝子は、ヒトＰＤＩＰ３８（ＮＣＢＩアクセッションＮＭ＿０１５５８４）のマウスホモログであり、マウスＰＤＩＰ３８（ＮＣＢＩアクセッションＮＭ＿０２６３８９）と同一であるが、機能の相違することが確認された。
（実験例３）
【００１４】
ＭＧタンパク質の細胞内（ミトコンドリア）局在
ＪＶＳマウス心臓から精製したｍＲＮＡを使用し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＭＧ遺伝子を増幅の後、これをＣＴ−ＧＦＰ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＴＯＰＯベクター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社［カナダ］製］にサブクローニングした。尚、ＭＧ遺伝子の増幅には、次のプライマーを用いた：
上流ブライマー：５‘−ＴＴＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧＧＴＧＴＧＧ−３’
下流プライマー：５‘−ＣＴＧＧＴＧＧＧＴＡＡＴＣＣＧＴＧＴＣＴＡＴ−３’
次いで、ＦｕＧＥＮＥ  ６  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬［Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（米国）製］を用い、ＭＧ−ＧＦＰ融合遺伝子をマウス筋芽細胞にトランスフェクションした。比較対照として、同時に、ＭｉｔｏＤｓＲｅｄＩを発現させることにより、ミトコンドリアを赤色標識した。トランスフェクション４８時間後、共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析した。
その結果を図１に示す。ＧＦＰ−Ｍｉｔｏｇｅｎｉｎ  ＩとＭｉｔｏＤｓＲｅｄ１の両画像の重ね併せ（ｍｅｒｇｅ）による画像一致に基づき、ＭＧはミトコンドリアタンパク質であることが確認された。
（実験例４）
【００１５】
ＭＧタンパク質によるミトコンドリア融合の促進
（ａ）ＭＧ遺伝子をｐＣＭＳ−ＥＧＦＰベクターにサブクローニングした後、これをマウス筋芽細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、ミトコンドリアをＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで染色し、蛍光顕微鏡を用いてミトコンドリアの形態を解析した。解析には、約５０個の細胞を選択し、ミトコンドリアの形態変化に基づき、断片化された状態（ｆｒａｇｍｅｎｔ）、チューブ状（ｔｕｂｅ）、及び断片化とチューブ状の混在状態（ｍｉｘｔｕｒｅ）に分類し、各分類形態のミトコンドリアを持つ細胞を数えた。
その結果を図２（Ｂ）と（Ｃ）に示す。ベクターだけをトランスフェクションした比較対照（ｍｏｃｋ）に比べ、ＭＧの過剰発現により、ミトコンドリア融合による長いチューブ状のミトコンドリアを持つ細胞の増加が確認された。
（ｂ）また、ＭＧを過剰発現させ、そのミトコンドリアをＤＡＳＰＥＩ（ミトコンドリアの染色試薬）で染色の後、フローサイトメーターでミトコンドリア量を解析した。
その結果を図２（Ａ）に示す。ＭＧの過剰発現はミトコンドリア量の増加をもたらさないことが確認された。
（ｃ）更に、ベクターだけをトランスフェクションした比較対照（ｍｏｃｋ）細胞と、ＭＧをトランスフェクションした細胞の両者からＲＮＡを抽出調製の後、ＲＴ−ＰＣＲで増幅、次いでアガロースゲル電気泳動にかけ、ＭＧ発現量を解析した。その結果を図２（Ａ）左上の小枠に示す。ＭＧトランスフェクション細胞ではＭＧの過剰発現が確認された。
【実施例１】
【００１６】
ｄｓＲＮＡによるＭＧ遺伝子発現ノックダウンによるミトコンドリアの形態変化
（ａ）ＲＮＡｉ法によりＭＧ遺伝子をノックダウンするため、配列表１のＤＮＡ塩基配列に基づき、ＭＧ遺伝子特異的な次のｄｓＲＮＡを設計した（上段はセンス鎖、下段はアンチセンス鎖）：
５‘−ＣＵＡＡＧＧＡＧＧＵＧＡＡＡＧＧＣＡＡＡＡＣＵＣＡＡＧ−３’
３‘−ＵＡＧＡＵＵＣＣＵＣＣＡＣＵＵＵＣＣＧＵＵＵＵＧＡＧＵ−５’
尚、合成は［北海道システムサイエンス社（日本）］に委託した。上記の塩基配列からなるｄｓＲＮＡをＣ２Ｃ１２細胞にトランスフェクションし、その４８時間後にミトコンドリアの形態を解析した。
その結果を図３（Ｂ）と（Ｃ）に示す。ｄｓＲＮＡをトランスフェクションしない比較対照（ｍｏｃｋ）に比べ、ｄｓＲＮＡトランスフェクションにより、ＭＧ遺伝子発現のノックダウン、及び断片化ミトコンドリアの増加が併せて確認された。
（ｂ）また、ｄｓＲＮＡによりＭＧ発現をノックダウンし、そのミトコンドリアをＤＡＳＰＥＩ（ミトコンドリアの染色試薬）で染色の後、フローサイトメーターでミトコンドリア量を解析した。
その結果を図３（Ａ）に示す。ＭＧ発現のノックダウンはミトコンドリア量の増加を生じないことが確認された。
（ｃ）更に、ｄｓＲＮＡをトランスフェクションしない比較対照（ｍｏｃｋ）細胞と、ｄｓＲＮＡをトランスフェクションした細胞の両者からＲＮＡを抽出調製の後、ＲＴ−ＰＣＲで増幅、次いでアガロースゲル電気泳動にかけ、ＭＧ発現量を解析した。
その結果を図３（Ａ）左上の小枠に示す。比較対照（ｍｏｃｋ）に比べ、ｄｓＲＮＡトランスフェクション細胞ではＭＧ遺伝子発現のノックダウンが確認された。
【実施例２】
【００１７】
ＭＧ遺伝子発現ノックダウンによる細胞の生存率
実施例１の記載と同様にしてｄｓＲＮＡを用いるＲＮＡｉ法により、ＭＧ遺伝子発現をノックダウンした後、その細胞をトリパンブルー（以下「ＴＢ」と略記する）で染色し、細胞の生存率を解析した。即ち、生細胞率（＝ＴＢ染色陰性・生細胞数／総細胞数）、及び死細胞率（＝ＴＢ染色陽性・死細胞数／総細胞数）をそれぞれ計数・算出した。
その結果を図４に示す。比較対照（ｍｏｃｋ）では生細胞率（ＴＢ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）がほぼ１００％であるのに対し、ＭＧ遺伝子発現ノックダウン（ｄｓＲＮＡ）では、死細胞率（ＴＢ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）が約６０％に達した。また、死細胞の細胞内にはオートファジー様の小胞の形成が多数、確認された。尚、かかる小胞形成は、アポトーシス以外のメカニズムによる細胞死の誘導を示唆する。
【実施例３】
【００１８】
ＭＧタンパク質によるミトコンドリア融合の促進と細胞内脂肪滴の蓄積抑制
さらにミトコンドリアの形態変化と脂肪滴の蓄積との関係に注目して検討するため、ＭＧ遺伝子をＦｕＧＥＮＥ  ６  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬［Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（米国）製］を用いて未分化３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を分化誘導した脂肪細胞に発現させ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで染色してミトコンドリアの形態を蛍光顕微鏡にて観察した（図５：Ａ）。また、細胞内脂肪滴（図５：Ｂ）についても観察し、上述の解析方法に従い、細胞内脂肪滴及びｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌを算出し、統計学的な解析を行った（図５：Ｂ）。
【００１９】
［解析方法１：細胞内脂肪滴の細胞内レベルの算出］
脂肪細胞を顕微鏡（オリンパス社製、ＯＬＹＭＰＵＳ  ＩＸ７０）の４０倍の対物レンズで観察し、最も細胞内脂肪滴レベルが（トリアシルグリセロールレベル：ＴＧレベル）高くなる１０ケ所を写真にとる（１０枚の写真の総面積は１５４０ｍｍ2）。油滴が目で確認できるので、そのサイズから以下のように分類した。大：直径３μｍ以上、中：１−３μｍ、小：１μｍ以下。１０枚の写真全ての大、中の油滴を数え、大の場合は係数１か２を掛け、中の場合は０．５か１を掛けてＴＧレベルを算出した。脂肪細胞への誘導率が実験によって異なるため、係数を掛けてコントロールのスコアが５５〜６５付近になるようにして算出した。
【００２０】
［解析方法２：ミトコンドリアチューブのｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌの算出］
細胞全体のミトコンドリアの形態について、蛍光顕微鏡で観察し（１００倍の対物レンズを使用し、油浸で観察する）、表１に示すように場合によって該当する係数を掛け算し、カウントした細胞数に占める割合（％）としてスコアー化した。また、その合計を、ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌとした。
【００２１】
【表１】
2007151541.tif 000003
【００２２】
その結果、ＭＧ遺伝子の過剰発現によりミトコンドリアの融合が促進され、細胞内への脂肪滴の蓄積が抑制された。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
肥満症、脂肪酸代謝異常症、癌等に係る診断剤・臨床検査薬・治療薬・予防剤等、また、上記疾病等の基礎研究用試薬の製造・販売の分野で利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】細胞質（ミトコンドリア）におけるＭＧ遺伝子発現の局在を示す検鏡写真。
【図２】（Ａ）ＭＧ遺伝子の過剰発現がミトコンドリア量の増加をもたらさないことを示すフローサイトメーター計測値であり、図中の左上小枠はＭＧ遺伝子の過剰発現を示す電気泳動像。（Ｂ）及び（Ｃ）は、ＭＧ遺伝子の過剰発現による、長いチューブ状のミトコンドリアの増加をそれぞれ示す。
【図３】（Ａ）ｄｓＲＮＡによるＭＧ遺伝子発現ノックダウンがミトコンドリア量の増加をもたらさないことを示すフローサイトメーター計測値であり、図中の左上小枠はＭＧ遺伝子発現のノックダウンを示す電気泳動像。（Ｂ）及び（Ｃ）は、ｄｓＲＮＡによるＭＧ遺伝子発現ノックダウンによる、断片化ミトコンドリア量の増加をそれぞれ示す。
【図４】ｄｓＲＮＡによるＭＧ遺伝子発現のノックダウンが死細胞数の増加をもたらすことを示す。
【図５】脂肪細胞にＭＧ遺伝子を発現させ、ミトコンドリアの形態及び細胞内脂肪滴を解析した結果を示す図である。（Ａ）は蛍光顕微鏡観察の結果、（Ｂ）は統計的に解析した結果を示す。
【図４】
2007151541.tif 000004
【図１】
2007151541.tif 000005
【図２】
2007151541.tif 000006
【図３】
2007151541.tif 000007
【図５】
2007151541.tif 000008
【配列表】
2007151541000001.app