(57)【要約】【課題】短時間で大量の塩基配列を決定することを可能とする、Ｓａｎｇｅｒ法とは異なる塩基配列決定方法を提供することを目的とする。【解決手段】チップを用いて標的核酸の塩基配列を決定する方法であって、（ａ）任意の塩基数の核酸鎖が取り得る塩基配列の全種類について、それぞれの種類の塩基配列を有する核酸鎖をプローブ核酸として調製する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）で調製されたプローブ核酸の全種類をチップ上に固定する工程と、（ｃ）該チップ上に固定されたプローブ核酸と、標的核酸とをハイブリダイゼーションさせる工程と、（ｄ）該チップ上で標的核酸がハイブリダイズしたプローブ核酸を検出する工程とを具備する塩基配列決定方法を提供する。【選択図】      図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チップを用いて標的核酸の塩基配列を決定する方法であって、
（ａ）任意の塩基数の核酸鎖が取り得る塩基配列の全種類について、それぞれの種類の塩基配列を有する核酸鎖をプローブ核酸として調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）で調製されたプローブ核酸の全種類をチップ上に固定する工程と、
（ｃ）該チップ上に固定されたプローブ核酸と、標的核酸とをハイブリダイゼーションさせる工程と、
（ｄ）該チップ上で標的核酸がハイブリダイズしたプローブ核酸を検出する工程と、
（ｅ）新たなチップに第２のプローブ核酸を固定する工程、ここで、該第２のプローブ核酸は、前記検出工程で検出されたプローブ核酸の塩基配列に加えて、さらに任意の塩基数の核酸鎖が取り得る塩基配列の全種類について、それぞれの種類の塩基配列を有する核酸鎖である、及び、
（ｆ）前記工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返し、標的核酸の全塩基配列を決定する工程、
を具備する、塩基配列決定方法。
【請求項２】
チップを用いて標的核酸の塩基配列を決定する方法であって、
（ａ）任意の塩基数の核酸鎖が取り得る塩基配列の全種類について、それぞれの種類の塩基配列を有する核酸鎖をプローブ核酸として調製する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）で調製されたプローブ核酸の全種類をチップ上に固定する工程と、
（ｃ）該チップ上に固定されたプローブ核酸と、標的核酸とをハイブリダイゼーションさせる工程と、
（ｄ）該チップ上で標的核酸がハイブリダイズしたプローブ核酸を検出する工程と、
を具備し、検出されたプローブ核酸から標的核酸の塩基配列を決定することを特徴とする、塩基配列決定方法。
【請求項３】
前記標的核酸の塩基数が、２０〜８０塩基である、請求項１又は２に記載の塩基配列決定方法。
【請求項４】
前記プローブ核酸のための任意の塩基数は５塩基である、請求項１〜３の何れか一項に記載の塩基配列決定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チップを用いて塩基配列を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、一般的に行われている塩基配列決定方法は、ジデオキシヌクレオチドによる特異的な塩基でのＤＮＡ複製反応の停止を利用するＳａｎｇｅｒ法である（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、この方法では、ＧＣリッチな特殊な配列における複製反応の乱れによって部分的に塩基配列の決定が困難になることがある。また、電気泳動を用いて検出するため、時間がかかり、また、大量に処理するためには多数の装置を用いて同時平行的に処理を行う必要があるなどの問題があった。
【特許文献１】特開２００２−３６０２９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記問題に鑑み、本発明は、短時間で大量の塩基配列を決定することを可能とする、Ｓａｎｇｅｒ法とは異なる塩基配列決定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記目的を達成するため、本発明は、チップを用いて標的核酸の塩基配列を決定する方法であって、（ａ）任意の塩基数の核酸鎖が取り得る塩基配列の全種類について、それぞれの種類の塩基配列を有する核酸鎖をプローブ核酸として調製する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）で調製されたプローブ核酸の全種類をチップ上に固定する工程と、（ｃ）該チップ上に固定されたプローブ核酸と、標的核酸とをハイブリダイゼーションさせる工程と、（ｄ）該チップ上で標的核酸がハイブリダイズしたプローブ核酸を検出する工程と、（ｅ）新たなチップに第２のプローブ核酸を固定する工程、ここで、該第２のプローブ核酸は、前記検出工程で検出されたプローブ核酸の塩基配列に加えて、さらに任意の塩基数の核酸鎖が取り得る塩基配列の全種類について、それぞれの種類の塩基配列を有する核酸鎖である、及び、（ｆ）前記工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返し、標的核酸の全塩基配列を決定する工程、を具備する塩基配列決定方法を提供する。
【０００５】
また、本発明の他の態様として、チップを用いて標的核酸の塩基配列を決定する方法であって、（ａ）任意の塩基数の核酸鎖が取り得る塩基配列の全種類について、それぞれの種類の塩基配列を有する核酸鎖をプローブ核酸として調製する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）で調製されたプローブ核酸の全種類をチップ上に固定する工程と、（ｃ）該チップ上に固定されたプローブ核酸と、標的核酸とをハイブリダイゼーションさせる工程と、（ｄ）該チップ上で標的核酸がハイブリダイズしたプローブ核酸を検出する工程と、を具備し、検出されたプローブ核酸から標的核酸の塩基配列を決定することを特徴とする、塩基配列決定方法が提供される。
【０００６】
上記塩基配列決定方法において、前記標的核酸の塩基数は２０〜８０塩基であることが好ましく、また、前記プローブ核酸のための任意の塩基数は５塩基であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、インクジェット合成によりチップにプローブ核酸を固定し、該チップ上で標的核酸をハイブリダイゼーションさせることによって、短時間で簡便に塩基配列を決定することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、ＤＮＡチップを用いて塩基配列を決定することを特徴とする。本発明において、標的核酸とは、塩基配列を決定されるべき核酸鎖であって、ゲノムＤＮＡやその他任意の核酸鎖であってよい。標的核酸鎖を含む試料は、血液を含む体液や細胞などの任意の試料であってよく、当該分野で周知の方法によって核酸を抽出処理すればよい。標的核酸の塩基数は任意に決定することができ、例えば約８０塩基とすることができる。より好ましい標的核酸の塩基数は、約５０塩基数であり、最も好ましくは約２０塩基数である。
【０００９】
以下、本発明の方法を順に説明する。まず、（ａ）任意の塩基数の核酸鎖が取り得る塩基配列の全種類について、それぞれの種類の塩基配列を有する核酸鎖をプローブ核酸として調製する。即ち、プローブ核酸は、その塩基数において存在し得る塩基配列の種類数だけ調製される。例えば図１に例示するように、５塩基からなる核酸が取り得る塩基配列の種類は、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇの４種類の塩基を５個並べた重複組合せであるから１０２４となる。この１０２４種類の全ての塩基配列のそれぞれを有するプローブ核酸を調製する。プローブ核酸の塩基数は、例えば約２０塩基であってよく、好ましくは約１０塩基であり、最も好ましくは約５塩基である。以下、５塩基数のプローブ核酸を用いる場合を例に説明する。
【００１０】
次に、（ｂ）前記工程（ａ）で調製されたプローブ核酸の全種類をチップ上に固定し、ＤＮＡチップを作製する。チップは、通常用いられている任意のチップであってよいが、電気化学検出チップが好適である。チップは何れの大きさのものであってよく、例えばスポット数が１Ｋのチップを用いる。
【００１１】
チップ上にプローブ核酸を固定する方法は、任意の方法を用いてよいが、予め調製した核酸をインクジェットにより固定する方法が好適に用いられる。上記で調製したプローブ核酸を、例えば一つのチップの各スポットに１種類ずつ固定し、１０２４の全種類のプローブ核酸を一つのチップ上に固定する。このようにすることによって、５塩基から成る核酸の塩基配列をチップ上に網羅することができる。或いは１種類のプローブ核酸に複数のスポットを用いてもよく、複数枚のチップを使用して全種類のプローブ核酸を固定してもよい。
【００１２】
次に、プローブ核酸が固定されたチップ上で、（ｃ）該チップ上に固定されたプローブ核酸と、標的核酸とをハイブリダイゼーションさせる（図２）。図２の場合、標的核酸がハイブリダイズしたプローブ核酸の配列はＴＡＡＡＧである。ハイブリダイゼーションは、周知の方法に従って行い、種々の反応条件等は適宜選択できる。ハイブリダイゼーション反応の後、チップを洗浄し、未反応の標的核酸を除去する。
【００１３】
次に、（ｄ）該チップ上で標的核酸がハイブリダイズしたプローブ核酸を検出する。検出は、任意の方法により行うことができる。例えば、標的核酸を蛍光標識しておき、チップ上で蛍光を測定することによって検出してもよい。又或いは、二本鎖に特異的に結合する挿入剤等を用い、電気化学的に検出してもよい。チップ上のアドレスと固定されたプローブ核酸の配列が記録されているため、検出されたプローブ核酸の位置から、プローブ核酸の塩基配列が判明する。
【００１４】
ここで標的核酸がハイブリダイズしたプローブ核酸の塩基配列から、標的核酸の配列が決定される。即ち、標的核酸の塩基配列は、該プローブ核酸と相補的な配列である。従って、第一回目のハイブリダイゼーションにおいて、標的核酸の５塩基分の配列が決定されたことになる。
【００１５】
次に、（ｅ）新たなチップに第２のプローブ核酸を固定する。ここで、該第２のプローブ核酸は、前記検出工程で検出されたプローブ核酸の塩基配列に加えて、さらに任意の塩基数の核酸鎖が取り得る塩基配列の全種類について、それぞれの種類の塩基配列を有する核酸鎖である。即ち、標的核酸と相補的であると判明したプローブ核酸の配列に加えて、さらに５塩基分の長さを加えた第２のプローブ核酸をチップに固定する。このとき、第２のプローブ核酸において、チップ側の５塩基は上記で決定した配列であるが、それに続く５塩基の配列は、上記工程（ａ）で調製したプローブ核酸を用いる。即ち、上記のように１０２４種類のプローブ核酸を用いる。
【００１６】
この第２のプローブ核酸の固定は、上記で決定された５塩基の配列を有する核酸を予め調製してインクジェットにより固定し（図３）、さらに、上記工程（ａ）で調製した各種の核酸をインクジェット合成による方法（特表２０００−５１４８０２を参照）で結合させてもよい。或いは、インクジェット合成法により、チップ上で最初からプローブ核酸を合成及び固定してもよい。
【００１７】
このようにして作製された第２のプローブ核酸が固定されたチップを用い、再び標的核酸とのハイブリダイゼーションを行う（図４）。図４の例では、標的核酸がハイブリダイズしたプローブ核酸の塩基配列は、ＴＡＡＡＧＣＣＴＴＧである。ハイブリダイゼーション後にチップを洗浄し、上記と同様に標的核酸がハイブリダイズしたプローブ核酸を検出する。これによって、標的核酸の１０塩基の塩基配列が決定される。
【００１８】
（ｆ）このような工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返し、標的核酸の全塩基配列を決定する。ここでは、プローブ核酸を５塩基として説明したが、これは任意の塩基数であってよい。例えば、標的核酸を８０塩基とし、プローブ核酸の長さを５塩基ずつ伸長させる場合、以上のハイブリダイゼーションを１６回繰り返す。また、このとき、プローブ核酸をチップ上で５塩基ずつ伸長させて合成する場合、インクジェット合成は１３６回となる。仮にそれぞれのインクジェット合成が各１秒、ハイブリ検出が各２秒とすると、１３６×１＋１６×２＝１６８秒＝２．８分であり、８０塩基の未知のＤＮＡ配列を２．８分で解析することが可能である。例えば、ヒトゲノムを４０億とすると、140,000,000分＝2,333,333時間＝97,222日であり、１,０００台の分析装置で並列処理をすると、３ヶ月強でヒトゲノムの解析を完了することもできる。
【００１９】
なお、ハイブリダイゼーション及びその後の洗浄において、塩基配列の長さ、決定された塩基配列のＧＣ含量等により、反応条件、洗浄の際の温度及びアルカリ強度条件などを適宜変更することが好ましい。
【００２０】
また、本発明の他の実施形態として、プローブ核酸と標的核酸のハイブリダイゼーションを１回だけ行い、これによって配列を決定することもできる。例えば２０塩基或いは１０塩基程度のプローブ核酸を用い、その塩基配列を網羅的にチップに固定する。このチップを用いて上記と同様にハイブリダイゼーションを行い、標的核酸がハイブリダイズしたプローブ核酸を検出して塩基配列を決定することもできる。
【００２１】
さらに、本発明の他の実施形態として、ＤＮＡチップによる塩基配列決定を行うためのシステムが提供される。該システムの概要図を図５に示す。塩基配列決定システム１００は、採取されたサンプルから標的核酸を含む試料を調製する手段、例えば抽出処理及び増幅処理などを行う試料調製手段１と、調製された標的核酸を貯蔵するＤＮＡタンク３を具備する。また、プローブ核酸のために用いられる核酸鎖を貯蔵する試薬ライブラリ５を備え、該試薬ライブラリを用いてＤＮＡチップ９を自動的に合成し、ハイブリダイゼーション、洗浄、及び検出を自動的に行う反応装置７、検出されたプローブ核酸のチップ上のアドレスを記憶する記憶装置１１、プローブ核酸の配列から相補的な標的核酸の配列に変換する出力装置１３を具備する。これらの装置は、一部を手動で行ってもよいが、全て自動で実行されるシステムであることが望ましい。また、システムの構成を適宜変更又は追加することは、当業者には容易に実施できるであろう。
【００２２】
以上述べたように本発明の方法によれば、標的核酸の塩基配列を短時間で且つ簡便に解析することができ、例えばヒトゲノム配列の解析等も従来の方法に比べて画期的に早く処理することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】プローブ核酸の調製を表す概念図。
【図２】第１回目のハイブリダイゼーションを表す概念図。
【図３】第２回目のＤＮＡチップの合成を表す概念図。
【図４】第２回目のハイブリダイゼーションを表す概念図。
【図５】塩基配列決定システムの概要図。
【符号の説明】
【００２４】
１…試料調製手段、３…ＤＮＡタンク、５…試薬ライブラリ、７…反応装置、９…ＤＮＡチップ、１１…記憶装置、１３…出力装置、１００…塩基配列決定システム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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