(57)【要約】  【課題】  培地灌流の流路閉塞または絡まりを防止することができると共に、流路の旋回スペースを最小限に制限することができる、小型化可能な培地灌流型培養装置に好適な培養モジュールを提供する。  【解決手段】    少なくとも細胞の増殖スペースである培養容器と、その培養容器に培地を供給排出するための培地灌流用流路と、これらの培養容器および培地灌流用流路を保持または固定するための部材からなる培養モジュールであって、該培養モジュールは回転軸を中心に回転または反転自在であり、かつ、該培養モジュールへの培地流入流路と培地排出流路が該回転軸上に集合配置されるように構成されてなることを特徴とする培養モジュール。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも細胞の増殖スペースである培養容器と、その培養容器に培地を供給排出するための培地灌流用流路と、これらの培養容器および培地灌流用流路を保持または固定するための部材からなる培養モジュールであって、該培養モジュールは回転軸を中心に回転または反転自在であり、かつ、該培養モジュールへの培地流入流路と培地排出流路が該回転軸上に集合配置されるように構成されてなることを特徴とする培養モジュール。
【請求項２】
培養容器が、該培養容器を保持または固定するための部材から着脱自在であることを特徴とする請求項１記載の培養モジュール。
【請求項３】
培養容器が、細胞の播種および回収のためのポートを具備するものであることを特徴とする請求項１または２記載の培養モジュール。
【請求項４】
播種および回収のためのポートの向きが変更可能に構成されていることを特徴とする請求項３記載の培養モジュール。
【請求項５】
細胞を培養するための培地灌流型培養装置に用いられる請求項１〜４のいずれかに記載の培養モジュール。
【請求項６】
播種および回収のためのポートの向きが、培地灌流型培養装置の操作側を向いていることを特徴とする請求項５記載の培養モジュール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養するための培地灌流型培養装置等の培養装置で好適に使用される培養モジュールに関するものである。詳しくは、本発明は、ヒト細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞を用いた有用物質生産あるいは有用細胞の増幅に応用可能な培養装置のための培養モジュールに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
白血病や固形癌の治療方法として、少量の造血幹細胞や自己リンパ球を生体外で増殖して患者に戻す細胞治療法が研究されている。このような分野において、生体外で閉鎖的に、低コストかつ安全性を確保した状態で、高密度に目的細胞を大量培養可能にする培養技術が望まれている。
【０００３】
また、ハイブリドーマなど有用な生理活性物質を分泌する細胞を培養し、その培養上清から有用な生理活性物質を得る方法が検討されているが、一般の培養では細胞密度が限定されるため、培養上清に分泌される有用な生理活性物質が少ないことが問題となっている。細胞が分泌する生理活性物質として抗体を作製する場合には、マウス腹腔に抗体を産生するハイブリドーマを投与し、腹水を回収して精製するという方法が一般的である。しかしながら、この方法は、マウスの飼育を始めとする煩雑な作業が伴い、また腹水からの精製により抗体を得るため、感染性物質など様々な不純物が混入してしまう恐れがあるため、安全を確保した状態で、高密度に大量にハイブリドーマなどの有用な生理活性物質を分泌する細胞を培養する技術が望まれている。
【０００４】
一般に、細胞の培養技術としては、フラスコ培養法、マイクロキャリヤー培養法、スピナーフラスコや培養タンクを用いた撹拌培養法、多孔質に細胞を接着させて培養する方法、バックを用いた培養法およびローラーボトルを用いた培養法などが挙げられる。従来法であるフラスコ培養法やバックを用いた培養法では、培養液内の栄養不足やｐＨ値の低下が生じるため、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌより高密度にすることは現状では困難である。また、スピナーフラスコや培養タンクを用いた撹拌培養法では、撹拌による細胞への物理的障害が大きく、生細胞を高密度に長時間培養するには適していない。
【０００５】
近年、三次元的な空間で高密度に細胞培養を行う手段として、血液透析に利用される中空糸や多孔体を用いた培養法が提案されている（特許文献１〜３参照。）。中空糸を用いた細胞の培養法は、栄養供給と老廃物除去を目的として中空糸内腔を通る培養液と、外腔に充填された細胞とその周囲の培養液との間で物質交換が行われ、細胞を高密度に培養することができるとされている。
【特許文献１】特開平１０−３３６７１号公報
【特許文献２】特開２００４−２４８６２８号公報
【特許文献３】特開２００４−１２１１６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、これら従来の培養方法では、細胞が重力や培地灌流の流れによって培養モジュール内の一カ所に凝集魂を形成してしまい、その内部にある細胞の栄養供給と老廃物除去が困難であるため、細胞増殖が制限されたり細胞が死滅すると考えられる。そこで、本発明者らは、細胞の凝集を防止するために、培養モジュールを回転させ、攪拌しながら培養を行ったが、培養モジュールの回転培養では、次のような課題があることがわかった。
（１）培地灌流用の流路として使用するチューブや配管が、培養モジュール回転時に作業者の意図しない方向に動き、流路の閉塞や絡まりなどの培地灌流不良を起こすことがある。
（２）その流路の旋回径によって、培養モジュールのスペースを大きく取る必要があり、それによって培地灌流型培養装置全体の大きさが大きくなる。
（３）操作面では培養前の細胞の播種や培養後の培養モジュールの運搬等の取り扱いが困難である。
（４）培養装置内での細胞播種や回収の操作が困難である。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、培地灌流の流路閉塞または絡まりを防止することができると共に、流路の旋回スペースを最小限に制限することができる、小型化可能な培地灌流型培養装置に好適な培養モジュールを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の培養モジュールは、少なくとも細胞の増殖スペースである培養容器と、その培養容器に培地を供給排出するための培地灌流用流路と、これらの培養容器および培地灌流用流路を保持または固定するための部材からなる培養モジュールであって、該培養モジュールは回転軸を中心に回転または反転自在であり、かつ、該培養モジュールへの培地流入流路と培地排出流路が該回転軸上に集合配置されるように構成されてなることを特徴とする培養モジュールである。
【０００９】
本発明の培養モジュールの好ましい態様によれば、前記の培養容器は、該培養容器を保持または固定するための部材から着脱自在である。
【００１０】
本発明の培養モジュールの好ましい態様によれば、前記の培養容器は、細胞の播種および回収のためのポートを具備しており、そしてその播種および回収のためのポートの向きが変更可能に構成されている。
【００１１】
本発明の培養モジュールは、細胞を培養するための培地灌流型培養装置に好適に用いられ、本発明の培養モジュールの好ましい態様によれば、前記の播種および回収のためのポートの向きは、培地灌流型培養装置の操作側を向いている。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の培養モジュールを用いることにより、培地灌流型培養装置等の培養装置において、細胞凝集を低減させるためのモジュール回転培養時に、回転軸上に流路を集めることにより流路の動きを最小限にし、培地灌流の流路閉塞または絡まりを防止することができる。また、流路を保持しながら培養モジュールを回転させることから、モジュール内流路を最短に、かつ、流路拡がりを最小に固定できるため、流路の旋回スペースを最小限に制限することができ、それによって培養装置本体のサイズを小型化することができる。
また、培養モジュールの培養容器を保持する部材から分離することができることから、増殖後の細胞の運搬や取り扱いを容易にすることができる。また、培養容器の細胞の播種（または回収）ポートを培養装置操作面側に向けることによって培地灌流型培養装置内での培養モジュールへの細胞播種または／および回収が容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（培地灌流型培養装置）
本発明の培養モジュールが好適に適用される培地灌流型培養装置は、温度制御のできるインキュベータ内に少なくとも培養モジュールと培地リザーバとポンプとで構成され、これらをつなぐ回路を有し、培地リザーバ内の培地をポンプによって培養モジュール内へと灌流させることが可能な培養装置である。培養モジュール内では、灌流された培地によって栄養物質を細胞へと供給することができ、細胞からの老廃物質は培地の流れによって排出することができるため、細胞を高密度に培養することができる。また、ハイブリドーマ等が作製する抗体は、この培養モジュールより排出される培地に含まれるため、これを精製することによって抗体を回収することができる。培養モジュールから排出された培地は培地リザーバに戻し、調整後、再度培養モジュールに供給されるような循環型の培養装置でも良い。
【００１４】
（培養モジュール）
本発明の培養モジュールは、少なくとも培養容器と培地灌流用流路およびそれらを保持する部材で構成されている。具体的には、少なくとも細胞の増殖スペースである培養容器と、その培養容器に培地を供給排出するための培地灌流用流路と、これらの培養容器および培地灌流用流路を保持または固定するための部材からなる培養モジュールであって、該培養モジュールは培養モジュールに固定された回転軸を中心に回転または反転自在であり、かつ、該培養モジュールへの培地流入流路と培地排出流路が該回転軸上に集合配置されるように構成されてなる培養モジュールである。
【００１５】
（培養モジュールの培養容器）
本発明の培養モジュールを構成する培養容器とは、培養環境を維持する細胞の増殖スペースである。細胞が増殖する空間が常に確保され、かつ灌流培地の流路内に細胞を通過せずに培地の栄養素と老廃物を通過するために、細胞培養部分と培地灌流部分が半透過膜等によって分離されていることが好ましい。
【００１６】
細胞培養部分と培地灌流部分の分離材料として使用する半透膜は、物質交換性を高めるために比表面積が大きい中空繊維状の半透過性膜を用いることが好ましい。半透膜の膜素材としては、例えば、ポリスルホン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、セルロースアセテート、ポリアクリルニトリル、フッ素系樹脂、再生セルロースおよびポリアミドなどの熱可塑性高分子化合物またはこれらの誘導体が好ましく用いられる。さらに、これらの素材にコラーゲン、フィブロネクチン等の接着因子を固定化するなど化学的に修飾を加えたものであっても良く、生体適合性に優れた膜素材が望ましい。
【００１７】
細胞に供給する必要がある栄養素は、主にタンパク質、アミノ酸、グルコース、酸素、アルブミンおよびビタミン類であり、また、主な老廃物は有機酸、尿素および二酸化炭素などの低分子物質であることから、半透過性の膜としては、物質径０．１μｍ程度の物質が透過する膜であることが好ましい。
この培養容器で使用する細胞として、通常は浮遊系細胞を培養するが、接着系細胞を培養することも可能である。この場合、好ましくはマイクロキャリヤー、不織布および極細繊維などの微粒子などに細胞を接着させた状態にして細胞培養側に細胞を供給して培養することにより、さらに高密度に培養することが可能となる。
【００１８】
本発明で用いられる培養容器の形状は、特に限定されないが、培養容器内に培地の滞留がないように円筒形であることが好ましく、細胞を播種や回収するためのポートを具備する形状構造であることが好ましい。ポートは、細胞を播種するためのポート（播種ポート）と細胞を回収するためのポート（回収ポート）の２種のポートを、別々に有する構造のものであっても良いが、同じポート（一つのポート）が、細胞の播種と回収の両方の機能を兼有するものであっても良い。
【００１９】
培養容器の材質としては、ガラスや金属等の無機材料、あるいはポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニール、ポリアクリルおよびポリカーボネート等の有機材料のいずれでも良く、好ましくは、滅菌することが可能なガラスや有機材料を用いる。また、それら材質の表面に異種の材質をコーティングして用いることも可能である。より好ましくは、容器表面への蛋白質の吸着を抑制するためのコーティングを施すことも可能である。
【００２０】
（培養モジュールの培地灌流用流路）
本発明における培養用モジュールを構成する培地灌流用流路は、培地リザーバから培養容器へと培地を供給および排出するための部品である。
【００２１】
培地灌流用流路の材質としては、シリコン、ガラスおよび金属等の無機材料あるいはポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニール、ポリアクリルおよびポリカーボネート等の有機材料のいずれでも良い。また、この培地灌流用の流路は、培養モジュールから外す必要がないため、保持部品をポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニール、ポリアクリルおよびポリカーボネート等で作製する場合には、それと同じ材質で一体化されていても良い。
【００２２】
（培養モジュールの保持部材）
本発明における培養モジュールを構成する保持部材は、培養モジュールの骨格部品であり、培養容器や培地灌流用流路を保持または固定する機能を有する。培地灌流型培養装置への取付が容易になるように培養装置への取付機構を具備するものであることが好ましい。
【００２３】
保持部材は、培地灌流用流路をガイド等で固定できる構造を具備し、この構造によって、培養容器の直近で直角方向に流路を転換し固定することができるため、培養モジュールのサイズを最小限にすることができ、これによって培養モジュールの旋回径を小さくすることができる。このことによって、回転モジュールを使用した培地灌流型培養装置のサイズを小さくすることができる。
【００２４】
また、培養モジュールの培地灌流用流路から延びる培地流入のための培地流入流路と培地排出のための培地排出流路は、培養モジュール内で培養モジュール回転軸上に集合配置させるように構成されていることが重要である。培地流入流路と培地排出流路をこのように構成することによって、モジュール回転時に動く流路の移動距離を小さくすることができ、流路の閉塞や絡まりを防ぐことができる。培養モジュール回転軸上とは、例えば、培養モジュールの一端側に回転軸が嵌合されており、培養モジュールの反対側に向かってその回転軸が延びた方向を想定したものであり、好ましくはその延長線上を中心に半径１０ｍｍ以下に収まっていることが好ましく、培養モジュール長の５０％以内となっていても良い。
【００２５】
保持部材の材質は、金属等の無機材料あるいはポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニール、ポリアクリルおよびポリカーボネート等の有機材料のいずれでも良い。
【００２６】
（培地モジュールの回転機構）
増殖した細胞は、培養容器内で重力による沈降や培地の流れによって凝集魂となる。その凝集魂内部の細胞へは栄養物質が行き渡らないために、増殖を阻害する。そこで、培地灌流型培養装置に水平方向の駆動回転軸を設け、培養モジュールの中心付近を培養装置の回転軸（培養モジュール回転軸）に接続し、回転させることにより、培養容器内で凝集した細胞を攪拌し、凝集魂の形成を防ぐことができる。培養モジュールの回転は、一方向で回転してもかまわないが、培地灌流用流路を回転式のコネクタで接続する必要がある。このため、３６０°以内の角度で往復回転することで、回転式コネクタを必要とせずに３６０°回転と同様の効果を得ることができる。この際の回転角は、細胞の攪拌効率の面で、９０°〜２７０°の間で往復回転させることが好ましい。また、回転速度は、細胞へのストレスを少なくするために、１〜２０ｒｐｍ以内であることが好ましく、より好ましくは４〜１０ｒｐｍである。
【００２７】
（培地リザーバー）
本発明における培地リザーバーは、培養モジュールに供給する培地を一時的に蓄え、培地性状を調整する部分である。培地リザーバーの材質は、ガラスや金属等の無機材料あるいはポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニール、ポリアクリルおよびポリカーボネート等の有機材料のいずれでも良く、好ましくは、滅菌することが可能なガラスや有機材料を用い、またそれら材質の表面に異種の材質をコーティングして用いることも可能であるが、より好ましくは、リザーバー表面への蛋白質の吸着を抑制するために表面の平滑化や親水性の処理を施した材質を使用する。培地リザーバーの容量は、特に限定されない。
【００２８】
（培養容器の脱着分離機構）
本発明で用いられる培養容器の脱着分離機構とは、細胞を培養後に回収する際に、培地灌流型培養装置を無菌化することにより、そのまま装置内で細胞を回収することも可能であるが、本発明のように、培養容器を保持または固定するための部材から着脱自在にし、培養容器を培養モジュールから分離できる機構にすることにより、培養終了後に培養モジュールから培養容器を取り外して、広いスペースの確保できるクリーンベンチ内などの細胞を操作するスペースに運搬し、細胞を回収することが可能になる。
【００２９】
また、細胞の操作として、培養容器をボルテックスミキサー等で振盪してから回収することによって培養容器内からより多くの細胞を回収することが可能になる。
【００３０】
（細胞の播種および回収のためのポート）
本発明における細胞の播種および回収のためのポートは、培養容器内の細胞増殖スペースに細胞を出し入れするためのコネクタである。培養容器内は、細胞培養部分と培地灌流部分とに分離されているが、この播種およびポートまたは回収のためのポートは、細胞培養部分に接続されるため、分離されている培地灌流部分へは細胞を漏らすことなく播種や回収を行うことができる。無菌化された培地灌流型培養装置内では、培養容器の播種および回収のためのポートは、培地灌流型培養装置の操作側（または開口部方向）に向くように設定させることが好ましく、これにより、細胞を播種や回収を培養装置内で行うことが容易になる。
【００３１】
ポートは、上記のように、細胞を播種するための播種ポートと細胞を回収するための回収ポートの２種のポートを、別々に具備するものでよい。また、一つのポートが、細胞の播種と回収の両方の機能を兼有するものであっても良い。すなわち、同一のポートを細胞の播種と回収の両方に使い分けすることができる。
【００３２】
また、ポート部の形状は、注射等で使用するシリンジから細胞を入れる場合にはシリンジの注射針挿入部に合うコネクタを使用しても良いが、さらに無菌的に操作するために注射針を直接刺すことのできる栓を使用することが好ましい態様である。
【００３３】
（培養される細胞の種類）
本発明において、培養モジュールで培養される細胞は、接着性細胞および浮遊性細胞のいずれもが使用可能であり、例えば、動物細胞としては、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｌ９２９細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＫＧ−１ａ細胞などの株化細胞、各種ハイブリドーマ細胞株あるいは動物由来の血液細胞や神経細胞、肝細胞、角質化細胞、繊維芽細胞、上皮細胞、肝細胞等の初代培養細胞、あるいは昆虫細胞等が挙げられる。さらに、ＥＳ細胞、造血幹細胞、肝幹細胞および間葉系幹細胞などの幹細胞や前駆細胞でもよい。また、これらの細胞は、培養前に外来遺伝子を導入した細胞であってもよいし、抗体やリガンドなどの刺激因子などで予め刺激、加工されている細胞であっても良い。
【００３４】
（培養用の培地の条件）
本発明の培養モジュールを用いて細胞培養する培地としては、用いられる細胞の種類によって適宜利用されるが、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、α−ＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＳｔｅｍＳｐａｎ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ培地、ＨｙｂｒｉｄｏｍａＳＦＭ培地、およびこれらの混合物等が挙げられるが、これらの培地に限定されない。また、培養の際は添加物として、例えば、ウシ血清、ウシ胎児血清、ウマ血清、ヒト血清など血清やインターロイキン、インターフェロン、インシュリン、トランスフェリンおよびセレンなどのサイトカインや増殖因子などを添加することができる。また、細胞から分泌される有用物質を製造する用途に使用する場合には、これら添加物は不純物となるためなるべく添加しないことが好ましい。
【００３５】
（細胞製剤の製造方法）
本発明の培養モジュールを用いた培養装置は、外部からの異物の混入の可能性は極めて低く、細胞培養が安価に行える。そのため、医療用の細胞を培養することに対して有利であり、疾病や疾患に対して有効な細胞を培養することにより、細胞製剤を製造することも可能である。細胞製剤とは、組織や細胞を加工した医薬品や医療用具を指し、細胞製剤の製造方法とは、細胞の分離、細胞の増殖、細胞への刺激、細胞への分化誘導および細胞のアポトーシス誘導など細胞を細胞製剤として疾病や疾患に対して有効な形態に加工するためのあらゆる工程を含んでいる。
【００３６】
細胞製剤を製造するには、まず、細胞群の供給源となる組織や体液などを採取する必要がある。これら細胞群の供給源は、ヒト由来のものが好ましいが、これに限定されない。また、幹細胞や免疫細胞を含む細胞群が供給源として好ましく、このような細胞群の供給源として臍帯血、骨髄液、羊膜組織、胎盤組織、生殖巣、胎児組織、末梢血およびＧ−ＣＳＦ動員末梢血などが挙げられるが、これらに限定されない。供給源として、特に体液などを使用するときは、予め培養前に遠心法、単位重力沈降法および遠心選別法などで細胞培養に余分な成分を排除した均一な細胞群を得ることが一般的である。また、さらに培養前にフローサイトメトリー、磁気ビーズ法およびアフィニティーカラム法など細胞分離の方法を用いて純度の高い幹細胞やある種の免疫細胞のサブセットにしておくことが好ましい。
【００３７】
このような様々な加工を行った後、本発明の培養用モジュールを用いて細胞培養を行うことにより、細胞製剤として必要な細胞を純度高く得ることができる。  
【００３８】
（生理活性物質の製造方法）
本発明の培養モジュールを用いた培養装置は、疾病や疾患に対して有用な生理活性物質を分泌する細胞を培養することにより有用な生理活性物質を製造することも可能である。生理活性物質とは、わずかな量で生物の生理や行動に何らかの特有な作用を示す化学物質であり、細胞から分泌されるような生理活性物質としては、抗体、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦなどのサイトカイン、およびＦＧＦやＥＧＦなどの増殖因子などがある。
【００３９】
これらの生理活性物質は、本発明の培養用モジュールを用いて疾病や疾患に対して有用な生理活性物質を分泌する細胞を培養し、その培養上清から細胞から分泌された生理活性物質を精製することで製造することができる。このような有用な生理活性物質を分泌する細胞として、繊維芽細胞、神経細胞および肝細胞などの初代培養細胞や癌細胞を特定の分化形質を持つ細胞に融合させて得られるハイブリドーマなどが挙げられる。特に、モノクローナル抗体を産生するＢ細胞ハイブリドーマは、好適に用いることができる。
【００４０】
本発明の培養用モジュールを用いて上記のような細胞を培養することにより、細胞から分泌された有用な生理活性物質が培養上清に蓄積される。この培養の際に、細胞からの有用な生理活性物質の分泌を促進するような物質を培養液中に添加しても良い。培養後、この培養上清を硫安塩析、透析、限外濾過、あるいはイオン交換クロマト、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどクロマトグラフィーによる手法などを用いて生理活性物質を精製することにより有用な生理活性物質を製造することができる。また、分泌される生理活性物質が抗体などの場合はプロテインＡやプロテインＧなど抗体のＦｃ部位に親和性のあるアフィニティー担体を用いた方法で精製することも可能である。
【実施例】
【００４１】
以下、図面を用い実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。図１は、本発明の培養モジュールを例示する概略斜視図であり、図２は、本発明の実施例に基づく培地灌流型培養装置を例示する全体概略斜視図である。図２では、培地灌流型培養装置前面の扉は省略した。
【００４２】
（培養容器）
直径１０ｍｍ、長さ１２０ｍｍの円筒状のポリカーボネート製培養容器ケース内に、ポリスルホン中空糸（直径４６０μｍ、膜厚８０μｍ、孔径０．１μｍ）を２０％の充填率になるように９５本充填した後、ポリスルホン中空糸の中空部を閉塞しないようにポリウレタン系ポッティング剤で両末端を培養容器ケースに固定し、上部側に播種ポート５ａを下部側に回収ポート５ｂを具備する、図１に示すような形状の、培養容器１を作製した。
【００４３】
（培養容器固定部）
培養容器１を収納するためのＳＵＳ３０４で作製した培養モジュールフレーム２に、培養容器固定ホルダー３をボルトで固定し、培地流路留め金４を溶接で固定し培養容器固定部を作製した。また、図１に示すように、培養モジュールフレーム２の一辺中程に培養モジュール回転軸８を取り付け、培養モジュールの回転軸８が取り付けられた反対側の開口部側フレーム６ａに、直径８ｍｍの培養モジュールフレーム開口部６ｂを設けた。この培養モジュールフレーム開口部６ｂは、培養モジュールの回転軸８延長上に形成されている。
【００４４】
（培養モジュール）
図１に示すように、上記で作製した培養容器１に培地灌流用の流路７として内径２ｍｍ外径４ｍｍのシリコン製チューブを取付けた後、培養容器１の播種ポート５ａと回収ポート５ｂの向きを、培養モジュールフレーム２の開口部側フレーム６ａから角度θが１０°〜５５となるように角度変更可能に取り付け、培養容器１を培養容器固定ホルダー３に挟み込んで固定した。また、培地灌流用の流路７は培地流路留め金４で固定され、培地灌流用の流路７から延びる培地流入流路７ａと培地排出流路７ｂを、培養モジュール回転軸８延長上の反対側の培養モジュールフレーム開口部６ｂから培養モジュールフレーム２外に取り出した。その結果、培地流入流路７ａと培地排出流路７ｂは、培養モジュールの回転軸８上に集合し配置された。
【００４５】
（培養回路）
図２に示すように、上記で作製した培養モジュールの培地流入流路７ａと培地排出流路７ｂを培地リザーバ９に接続し、使用前にオートクレーブにて滅菌を行った。
【００４６】
（培養前の準備）
培地灌流型培養装置１０には、上記の培養容器１を備えた培養モジュールと培地リザーバ９とポンプ１１が収納されている。無菌化した培地灌流型培養装置１０の培養モジュール回転機構に培養モジュール回転軸８を接続し、培地灌流型培養装置１０のポンプ１１に培地流入流路７ａを接続した。
【００４７】
（培養方法）
培地灌流型培養装置１０の温度を３７℃に設定し、牛胎児血清１０％のＲＰＭＩ−１６４０を培地リザーバ９に１００ｍＬ入れ、培養容器１の播種ポート５ａから１×１０６個／ｍＬに懸濁したハイブリドーマを１０ｍＬ播種し７日間培養した。培養モジュールの回転は、５分おきに９０°ずつ回転させ、２７０°回転したら回転方向を逆転させることを繰り返した。
【００４８】
培養開始から３日後、５日後および６日後に培地リザーバ９内の培地を交換し、７日後に培養モジュールから培養容器１を取り外し、クリーンベンチ内で回収ポート５ｂと細胞を回収したところ、１×１０８個／ｍＬの細胞密度まで細胞を増殖させることができた。また、生存率も８０％以上と良好な結果を出すことができた。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の培養モジュールは、培地灌流型培養装置等の培養装置において好適に用いられ、流路の動きを最小限にし、培地灌流の流路閉塞または絡まりを防止することができ、また、流路の旋回スペースを最小限に制限することができ、それによって培養装置本体のサイズを小型化することができ、細胞培養に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、本発明の培養モジュールを例示する概略斜視図である。
【図２】図２は、本発明の実施例に基づく培地灌流型培養装置を例示する全体概略斜視図である。
【符号の説明】
【００５１】
１     培養容器
２     培養モジュールフレーム
３     培養容器固定ホルダー
４     培地流路留め金
５ａ   播種ポート
５ｂ   回収ポート
６ａ   開口部側フレーム
６ｂ   培養モジュールフレーム開口部
７     培地灌流用流路
７ａ   培地流入流路
７ｂ   培地排出流路
８     培養モジュールの回転軸
９     培地リザーバ
１０   培地灌流型培養装置
１１   ポンプ
【図１】
2007110923.tif 000002
【図２】
2007110923.tif 000003