(57)【要約】【課題】インフルエンザウイルスをはじめ、各種ウイルス性の疾患に有効な抗ウイルス剤を提供すること。  【解決手段】スルファチドを標的とした抗ウイルス剤として、抗スルファチド抗体を有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤、アリルスルファターゼＡ（ＡＳＡ）を有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤、アリルスルファターゼＡ（ＡＳＡ）遺伝子発現ベクターを有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤、スルファチド合成酵素阻害剤を有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤、スルファチド合成酵素遺伝子のアンチセンス鎖を有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤、スルファチド合成酵素のｍＲＮＡを標的にしたｓｉＲＮＡを有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤を用いる。【選択図】図１
2007099724.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルファチドを標的とした抗ウイルス剤。
【請求項２】
抗スルファチド抗体を有効成分とすることを特徴とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤。
【請求項３】
抗スルファチド抗体が、抗スルファチドモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２記載のスルファチドを標的とした抗ウイルス剤。
【請求項４】
抗スルファチドモノクローナル抗体が、マウス抗スルファチドモノクローナル抗体（ＧＳ−５、ＩｇＭ）であることを特徴とする請求項３記載のスルファチドを標的とした抗ウイルス剤。
【請求項５】
アリルスルファターゼＡ（ＡＳＡ）を有効成分とすることを特徴とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤。
【請求項６】
アリルスルファターゼＡ（ＡＳＡ）遺伝子発現ベクターを有効成分とすることを特徴とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤。
【請求項７】
スルファチド合成酵素阻害剤を有効成分とすることを特徴とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤。
【請求項８】
スルファチド合成酵素遺伝子のアンチセンス鎖を有効成分とすることを特徴とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤。
【請求項９】
スルファチド合成酵素のｍＲＮＡを標的にしたｓｉＲＮＡを有効成分とすることを特徴とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤。
【請求項１０】
スルファチド合成酵素のｍＲＮＡを標的にしたｓｉＲＮＡ発現ベクターを有効成分とすることを特徴とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤。
【請求項１１】
スルファチド合成酵素が、セレブロシドスルフォトランスフェラーゼ（ＣＳＴ）及び／又はセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）であることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか記載のスルファチドを標的とした抗ウイルス剤。
【請求項１２】
ウイルスが、インフルエンザウイルスであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか記載のスルファチドを標的とした抗ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スルファチドを標的としたインフルエンザウイルス等に有効な抗ウイルス剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスの治療薬としては、これまでに、インフルエンザＡ型ウイルスのＭ２タンパク質に結合し、抗ウイルス作用を示すアマンタジンなどのプロトンチャンネル阻害剤とＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスの表面糖タンパク質の１つであるノイラミニダーゼに結合し、シアリダーゼの活性を阻害することで抗ウイルス作用を示すシアル酸の誘導体2,3-didehydro-2,4-dideoxy-4-guanidino-N-acetylneuraminic acid（商品名ザナミビル）などが開発されている。その他、インフルエンザウイルスの治療薬として、ヤマモモの溶媒抽出物を有効成分として含有する抗インフルエンザウイルス剤（例えば、特許文献１参照）、出雲在来種の蕎麦の抽出物を有効成分とすることを特徴とする抗インフルエンザウイルス剤（例えば、特許文献２参照）、クロモグリク酸又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする抗インフルエンザウイルス剤（例えば、特許文献３参照）、カフェー酸フェネチルエステルを有効成分として含有するインフルエンザウイルスの増殖抑制剤（例えば、特許文献４参照）等が提案されている。
【０００３】
また、インフルエンザＡ型ウイルス、ＨＩＶ−１ウイルス等のウイルスに対して有効な、ガングリオシドＧＭ４、ガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ３、シアリルパラグロボンド、スルファチドを含む群から選択された、ウイルス受容体の被認識部位を含む糖鎖を持つスフィンゴ糖脂質を有効成分とする抗ウイルス剤（例えば、特許文献５参照）や、経口、非経口的に投与され、組織にインフルエンザウイルスが吸着するのを阻止し、インフルエンザウイルス感染を防御することができるスルファチドを有効成分とするインフルエンザウイルス吸着阻止剤（例えば、特許文献６参照）や、スルファチド等の生物由来の硫酸化糖脂質からなる好中球表面接着分子セレクチンの阻害物質を主成分とする、Ａ、Ｂ、Ｃ型、非ＡＢＣ型肝炎ウイルス感染による肝障害の軽減、各種レトロウイルスの感染による免疫不全、脳神経障害の抑制に有効な細胞変成抑制並びに臓器毒性軽減剤（例えば、特許文献７参照）等のスルファチド（硫酸化糖脂質）を有効成分とする抗ウイルス剤も提案されている。
【０００４】
他方、スルファチドは、様々な哺乳類の、腸や肺を含む器官において、豊富に発現している主要な硫酸化糖脂質の１つである（例えば、非特許文献１〜７参照）。またスルファチドは、インフルエンザウイルスが１次分離され、増殖する、イヌ、ウシ、サルの腎臓といった培養細胞系列にも検出される。スルファチドは、細胞外基質や、接着分子、ＨＩＶウイルス（例えば、非特許文献８，９参照）、バクテリア、マラリア原虫（例えば、非特許文献１０〜１２参照）と相互作用することが知られている。スルファチドの生合成はゴルジ体で、トランスフェラーゼ、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、セレブロシド（ガラクトシルセラミド）スルフォトランスフェラーゼ（ＣＳＴ）により行われる（例えば、非特許文献２，１３参照）。ＣＧＴはセラミドをスルファチドの前駆体であるガラクトシルセラミドへ変換する。図１に示すように、スルファチドの分解がリソソームのアリルスルファターゼＡ（ＡＳＡ）というスルファチド分子内のガラクトース残基の脱硫酸化をおこす酵素によって行われている間に、ＣＳＴによる３‘−Ｏ硫酸化に続いて、スルファチドの合成がなされている（例えば、非特許文献１４参照）。
【０００５】
本発明者らは、以前、スルファチドはインフルエンザＡ型ウイルス粒子に結合し、ウイルス感染及び、低いｐＨにおけるシアリダーゼ活性を阻害することを明らかにした（例えば、非特許文献１５，１６参照）。しかしながら、インフルエンザＡ型ウイルスの感染に関するスルファチドの役割については不明のままであった。
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−３３１６０８号公報
【特許文献２】特開２００４−２３６１号公報
【特許文献３】特開２００４−３５２７１２号公報
【特許文献４】特開２００４−９１４４６号公報
【特許文献５】特開２００１−２３３７７３号公報
【特許文献６】特開平１０−７２３５５号公報
【特許文献７】特開平８−１０９１３４号公報
【非特許文献１】J. Biochem. （Tokyo）100, 825-835 (1986)
【非特許文献２】J. Biol. Chem. 272, 4864-4868 (1997)
【非特許文献３】Eur. J. Biochem. 267, 1909-1917 (2000)
【非特許文献４】Vet. Microbiol. 36, 307-316 (1993)
【非特許文献５】J. Natl. Cancer. Inst. 63, 1153-1160 (1979)
【非特許文献６】FEMS Microbiol. Lett. 209, 183-188 (2002)
【非特許文献７】J. Biochem. (Tokyo) 130, 279-283 (2001)
【非特許文献８】Virology 246, 211-220 (1998)
【非特許文献９】AIDS 6, 1213-1214 (1992)
【非特許文献１０】Infect. Immun. 64, 624-628 (1996)
【非特許文献１１】Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996)
【非特許文献１２】J. Biol. Chem. 268, 10356-10363 (1993)
【非特許文献１３】Biochem. Biophys. Res. Commun. 32, 449-453 (1997)
【非特許文献１４】J. Biol. Chem. 264, 1252-1259 (1989)
【非特許文献１５】Biochem. J. 318, 389-393 (1996)
【非特許文献１６】FEBS Lett. 553, 355-359 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
インフルエンザウイルスの治療薬として開発されているアマンタジンなどのプロトンチャンネル阻害剤は、インフルエンザＢ型及びＣ型ウイルスには有効ではなく、副作用や耐性ウイルスの出現が問題となっている。また、ノイラミニダーゼ阻害剤は、小児や高齢者に対する安全性が確立されておらず、インフルエンザＣ型ウイルスには有効ではない。一方、乳幼児にしばしば気管支炎や肺炎などの重篤な症状を引き起こすことが知られているヒトパラインフルエンザウイルス感染に有効な治療薬は全く開発されていない。本発明の課題は、インフルエンザウイルスをはじめ、各種ウイルス性の疾患に有効な抗ウイルス剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、インフルエンザＡ型ウイルスが、シアル酸含有糖鎖だけでなく、シアル酸を全く含有しないスルファチドなどの糖脂質にも強い結合性を示すことを見い出した。スルファチドは動物の組織に広く分布しており、腎臓、気管支、肺などの組織に高い発現が認められている。さらに、インフルエンザウイルスやパラインフルエンザウイルスなどの分離や培養にも広く利用されているイヌ、ウシ、サルなどの腎臓由来上皮細胞株にも存在することが知られている。そこで、抗スルファチドモノクローナル抗体を作製し、インフルエンザウイルス感染阻害効果を調べた結果、スルファチドに対するモノクローナル抗体が、インフルエンザウイルスの感染増殖を強力に阻害することを見い出した。一方、他の中性糖脂質（Ｇｂ３）に対するモノクローナル抗体には、インフルエンザウイルスの感染阻害活性が認められなかった。また、スルファチドの生合成に関与する酵素の働きをアンチセンス核酸法により抑制した場合やスルファチドを分解することが知られているアリルスルファターゼＡの遺伝子を高発現させた場合にも、インフルエンザウイルスの感染増殖が阻害されることが明らかになった。さらに、スルファチドに対するモノクローナル抗体は、ヒトパラインフルエンザウイルスやセンダイウイルスの感染も強力に阻害することを見い出した。本発明は、以上の知見により完成するに至ったものである。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）スルファチドを標的とした抗ウイルス剤や、（２）抗スルファチド抗体を有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤や、（３）抗スルファチド抗体が、抗スルファチドモノクローナル抗体であることを特徴とする上記（２）のスルファチドを標的とした抗ウイルス剤や、（４）抗スルファチドモノクローナル抗体が、マウス抗スルファチドモノクローナル抗体（ＧＳ−５、ＩｇＭ）であることを特徴とする上記（３）のスルファチドを標的とした抗ウイルス剤や、（５）アリルスルファターゼＡ（ＡＳＡ）を有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤や、（６）アリルスルファターゼＡ（ＡＳＡ）遺伝子発現ベクターを有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤や、（７）スルファチド合成酵素阻害剤を有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤や、（８）スルファチド合成酵素遺伝子のアンチセンス鎖を有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤、（９）スルファチド合成酵素のｍＲＮＡを標的にしたｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）を有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤や、（１０）スルファチド合成酵素のｍＲＮＡを標的にしたｓｉＲＮＡ発現ベクターを有効成分とすることを特徴とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤や、（１１）スルファチド合成酵素が、セレブロシドスルフォトランスフェラーゼ（ＣＳＴ）及び／又はセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）であることを特徴とする上記（７）〜（１０）のいずれかのスルファチドを標的とした抗ウイルス剤や、（１２）ウイルスが、インフルエンザウイルスであることを特徴とする上記（１）〜（１１）のいずれかのスルファチドを標的とした抗ウイルス剤に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、硫酸化糖脂質（スルファチド）を標的とした抗体や遺伝子機能阻害剤などが、インフルエンザウイルスだけでなくパラインフルエンザウイルスなどの抗ウイルス剤として有効であることを示しており、本発明によると、インフルエンザウイルスをはじめ、各種ウイルス性の疾患に有効な抗ウイルス剤を提供することができ、本発明の成果は、インフルエンザなどのウイルスによる社会的被害を回避することに貢献できると期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の抗ウイルス剤としては、スルファチドを標的とした抗ウイルス剤、すなわち、抗スルファチド抗体を有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤、アリルスルファターゼＡ（ＡＳＡ）を有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤、アリルスルファターゼＡ（ＡＳＡ）遺伝子発現ベクターを有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤、スルファチド合成酵素阻害剤を有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤、スルファチド合成酵素遺伝子のアンチセンス鎖を有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤、スルファチド合成酵素のｍＲＮＡを標的にしたｓｉＲＮＡを有効成分とするスルファチドを標的とした抗ウイルス剤であれば特に制限されるものではなく、ここで「抗ウイルス剤」とは、ウイルスの感染防除作用、ウイルス感染後のウイルス増殖の防除作用を有する組成物をいう。
【００１２】
抗ウイルス作用が期待できるウイルスの種類としては、インフルエンザウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、パラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルスやセンダイウイルスと同じパラミクソウイルス科に属する麻疹ウイルス（はしかの原因ウイルス）、ムンプスウイルス（おたふくかぜの原因ウイルス）、風疹ウイルスを挙げることができ、中でもインフルエンザウイルスを好適に例示することができる。
【００１３】
上記抗スルファチド抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらはスルファチドを抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。抗スルファチドモノクローナル抗体として、マウス抗スルファチドモノクローナル抗体（ＧＳ−５、ＩｇＭ）を具体的に例示することができる。
【００１４】
スルファチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）にスルファチド若しくはエピトープを含む断片、又は該スルファチドを膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。以下にスルファチドとして、ヒト由来のスルファチドを例に挙げてヒト由来のスルファチドに対して特異的に結合するマウスモノクローナル抗体、すなわちマウス抗ｈスルファチドモノクローナル抗体の作製方法を説明する。
【００１５】
マウス抗ｈスルファチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、ヒトから得られたスルファチドを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、免疫されたマウスの脾臓細胞とマウスＮＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１８）とを、常法により細胞融合させ、免疫蛍光染色パターンによりスクリーニングすることにより、抗ｈスルファチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作出することができる。また、かかるモノクローナル抗体の分離・精製方法としては、タンパク質の精製に一般的に用いられる方法であればどのような方法でもよく、アフィニティークロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーを具体的に例示することができる。
【００１６】
また、本発明の上記スルファチドに対する一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、スルファチドを発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでスルファチドを精製することもできる。
【００１７】
また、抗スルファチド抗体として、スルファチドに特異的に結合する上記抗体のＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片等も用いることができる。例えば、Ｆａｂ断片は抗体をパパイン等で処理することにより、またＦ（ａｂ’）２断片はペプシン等で処理することにより調製することができる。
【００１８】
また、上記抗スルファチドモノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記スルファチドの機能解析を行うことができる。また免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００１９】
上記抗スルファチドモノクローナル抗体は、抗スルファチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをインビボ又はインビトロで常法により培養することにより生産することができる。例えば、インビボ系においては、齧歯動物、好ましくはマウス又はラットの腹腔内で培養することにより、またインビトロ系においては、動物細胞培養用培地で培養することにより得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニシリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ等の細胞培養培地を例示することができる。
【００２０】
アリルスルファターゼＡ（セレブロシドスルファターゼ）は、スルファチドを基質とし、その硫酸基を分解する酵素で、調べられているすべての生物種がもっており、リソゾームに局在する酵素として知られている。アリルスルファターゼＡとしては、動植物細胞や微生物から抽出・精製してもよいが、アリルスルファターゼＡ遺伝子を用いて、遺伝子組換え技術により作製することもできる。酵素の精製は、アフィニティークロマト、イオン交換クロマト、疎水クロマトにより行うことができる。アリルスルファターゼＡの活性測定法としては、一般に動物組織由来の酵素については、［３５Ｓ］スルファチドやｐ−ニトロカテコールサルフェートを、微生物由来の酵素については、ｐ−ニトロカテコールサルフェートを、用いることができるが、基質としてスルファチドを用い、酵素反応によって生成した硫酸をイオンクロマトグラフィーにより活性測定を行うこともできる。また、細胞内にアリルスルファターゼＡを導入する方法としては、巨大分子と非共有結合体を形成し、タンパク質等の巨大分子の構造を変化させ、タンパク質等の巨大分子を細胞内にデリバリーすることができるChariot（Active Motif社製）等の細胞毒性のない薬剤を用いることができる。
【００２１】
また、アリルスルファターゼＡを発現しうるアリルスルファターゼＡ遺伝子発現ベクターとしては、例えば、非分列細胞を含む全ての細胞（血球系以外）での一過性発現に用いられるアデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991）や、分裂細胞での長期発現に用いられるレトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology, 158, 1-23, 1992）や、非病原性、非分裂細胞にも導入可能で、長期発現に用いられるアデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992）や、リポソーム等を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これらの中でも、経口により細胞株を樹立することなく直接的に遺伝子を生体に発現させることができ、高い効率で細胞系や生体の臓器における遺伝子発現が可能なアデノウイルスベクターが特に好ましい。また、これらの発現ベクターへのアリルスルファターゼＡ遺伝子の導入は常法によって行うことができ、例えばこれら発現ベクター中の適当なプロモーターの下流にアリルスルファターゼＡ遺伝子（NC_000022等）を挿入することにより発現ベクターを構築することができる。これらウイルスにアリルスルファターゼＡ遺伝子を組み込んだ発現ベクターは、標的細胞に感染させることにより、局所的に発現させることができる。
【００２２】
本発明の抗ウイルス剤としては、セレブロシドスルフォトランスフェラーゼ（ＣＳＴ）、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）等のスルファチド合成酵素の発現や作用を阻害するものを挙げることができ、スルファチド合成酵素の作用を阻害する抗ＣＳＴモノクローナル抗体や抗ＣＧＴモノクローナル抗体等のスルファチド合成酵素阻害剤や、スルファチド合成酵素の発現を阻害するスルファチド合成酵素遺伝子のアンチセンス鎖やスルファチド合成酵素のｍＲＮＡを標的にしたｓｉＲＮＡ等を例示することができる。
【００２３】
上記スルファチド合成酵素の発現を阻害するスルファチド合成酵素遺伝子のアンチセンス鎖は、スルファチド合成酵素をコードするＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスポリヌクレオチド、好ましくはアンチセンスＤＮＡを挙げることができる。スルファチド合成酵素をコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、スルファチド合成酵素遺伝子ＤＮＡのセンス鎖に相補的な塩基配列の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などを挙げることができる。アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成され、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、スルファチド合成酵素遺伝子ＤＮＡの塩基配列情報に基づき、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【００２４】
本発明のスルファチド合成酵素遺伝子のアンチセンス鎖は、変化・修飾された糖、塩基、結合を含有していてもよく、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で投与することができる。かかる付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものを挙げることができる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）を挙げることができ、これらは核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることもできる。また、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するため、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で修飾することもできる。かかるキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基を挙げることができる。また、アンチセンス鎖の阻害活性は、形質転換体、生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはスルファチド合成酵素の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。
【００２５】
スルファチド合成酵素のｍＲＮＡを標的にしたｓｉＲＮＡとしては、スルファチド合成酵素遺伝子の発現を抑制することができ、スルファチド合成酵素 ｍＲＮＡの標的となる特定配列に相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡであれば特に制限されるものではなく、上記スルファチド合成酵素遺伝子の由来としては特に限定されないがヒト由来のスルファチド合成酵素遺伝子が好ましい。上記スルファチド合成酵素ｍＲＮＡの標的となる特定配列とは、スルファチド合成酵素 ｍＲＮＡの特定の領域の部分配列、好ましくは１９〜２１ｂｐの塩基長の部分配列をいい、かかるスルファチド合成酵素ｍＲＮＡの標的配列としては、スルファチド合成酵素 ｍＲＮＡに特異的配列が好ましい。
【００２６】
かかるｓｉＲＮＡの塩基配列は、スルファチド合成酵素遺伝子の配列情報に基づいて設計することができる。ｓｉＲＮＡの設計の指針については既に多数の文献や成書において公表されており、これらの指針にしたがってスルファチド合成酵素特異的ｓｉＲＮＡを設計することができる。例えば、ｓｉＲＮＡの作製は、合成による方法及び遺伝子組換え技術を用いる方法等、公知の方法を適宜用いることができる。
【００２７】
合成による方法では、配列情報に基づき、常法により二本鎖ＲＮＡを合成することができる。すなわち、２本鎖のオリゴリボヌクレオチドであるｓｉＲＮＡを合成するには、先ずセンス鎖オリゴリボヌクレオチドおよびアンチセンス鎖オリゴリボヌクレオチドをそれぞれ合成する。一般的に、保護基のついた４種類のリボヌクレオチドを用い、合成機を使用した有機合成で合成する。ＲＮＡは、４種類のヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）がホスホジエステル結合によって連なったポリマー分子で、合成はアミダイドに、バックボーンを形成する糖の２’末端に２’−ビス（アセトキシエトキシ）−メチルエーテル（２’−ＡＣＥ）保護基をつけ、１塩基ずつリン酸結合（カップリング）させる。生成された一本鎖ＲＮＡは、１００ｍＭ ＴＥＭＥＤ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ３．８）バッファーで、６０℃、３０分反応させることにより脱保護を行い、ＨＰＬＣを用いて品質チェックを行う。高い純度のＲＮＡを必要とする場合は、さらに変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲルからＲＮＡを精製したり、ＨＰＬＣで精製を行う。次に両鎖をアニーリングさせる。濃度約５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）の両鎖の水溶液を調製し、各々の水溶液と５ｘアニーリング用緩衝液（５００ｍＭ 酢酸カリウム，１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ ７．４，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム）を混合した溶液を９０℃で１分間加熱し、その後、３７℃６０分間保温する。このことにより、センスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドは互いにアニーリングし２本鎖となる。
【００２８】
また、遺伝子組換え技術を用いる方法では、センス鎖ＤＮＡやアンチセンス鎖ＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入後、転写により生成されたセンス鎖ＲＮＡやアンチセンス鎖ＲＮＡをそれぞれ取得することによって作製することもできるが、スルファチド合成酵素遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセットを構築し、該二本鎖ＲＮＡ発現カセットを発現ベクターのプロモーターの下流に連結し、インビボでの発現・構築により所望の二本鎖ＲＮＡを作製することが好ましい。
【００２９】
ｓｉＲＮＡは、リポフェクション法等により直接細胞内に導入することができる。通常陰電荷を有するホスファチジルセリン（ＰＳ）からなるリポソームを用いることができるが、より安定したリポソームを形成する陽イオン性脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ、商品名：トランスフェクタム、リポフェクトアミン）を用いることもできる。これら陽イオン脂質と陰電荷をもつｓｉＲＮＡとの複合体を形成させると、正に荷電しているリポソームが、負に荷電している細胞の表面に吸着し、細胞膜と融合することでｓｉＲＮＡを細胞内に導入することができる。実際の治療にあたっては患部またはその周辺組織にｓｉＲＮＡとリポソームの複合体を直接注入する。
【００３０】
また、スルファチド合成酵素のｍＲＮＡを標的にしたｓｉＲＮＡ発現ベクターは、ｓｉＲＮＡを直接細胞内に導入した場合より、ｓｉＲＮＡが細胞内に存在できる期間が長くなり、遺伝子発現抑制の効率が高くなるという利点を有する。かかるスルファチド合成酵素のｍＲＮＡを標的にしたｓｉＲＮＡ発現ベクターは、上記スルファチド合成酵素遺伝子の特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセットをプロモーターの下流に挿入することにより有利に作製することができる。また、ｓｉＲＮＡ発現用のベクターは市販品を含め公知のものを用いることができるが、哺乳動物に導入する場合にはウイルスベクターであることが好ましい。ウイルスベクターとしては、例えば、マウス白血病レトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology, 158, 1-23, 1992）や、アデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992）や、アデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991）や、リポソーム等を具体的に挙げることができるが、ＨＩＶレンチウイルスベクターは、非分裂細胞にも効率よく長期発現が可能であるという特徴を有する点で好ましい。また、これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。これらの発現ベクターへの二本鎖ＲＮＡ発現カセットの導入は常法によって行うことができ、例えばこれら発現ベクター中の適当なプロモーターの下流に二本鎖ＲＮＡ発現カセットを挿入することによりｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築することができる。
【００３１】
本発明の抗ウイルス剤は、ウイルス性疾患の予防・治療薬として用いることができる。治療薬として哺乳動物の生体、組織、細胞等に投与又は導入するに際しては、この分野で通常用いられる薬学的に許容される担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分とともに用いることができる。該薬学的に許容される担体とともに用いる薬学的組成物は、その投与形態、例えば経口（口腔内又は舌下を含む）投与、或いは非経口投与（注射剤等）等に合わせて、薬学の分野ではそれ自体周知の製剤形態で製剤化することができる。具体的な製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、シロップ剤、坐薬、軟膏剤、注射剤などをあげることができる。製剤の担体として具体的には、たとえば結晶性セルロース、ゼラチン、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物性及び動物性脂肪ならびに油、ガム、ポリアルキレングリコールとなどをあげることができる。本発明の抗ウイルス剤は製剤中に０．００１〜１００％含ませることができる。例えば、抗スルファチド抗体（ＧＳ−５）については０．３％、プラスミドベクターは０．００１％で用いることができる。
【００３２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
［抗スルファチド抗体によるインフルエンザＡ型ウイルスの増殖抑制］
１．抗スルファチド抗体（ＧＳ−５）はインフルエンザＡ型ウイルスが感染した細胞に作用してウイルスの増殖を抑制する。
インフルエンザＡ型ウイルス株：Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）を用いた。ウイルスＨＡを開裂させウイルス増殖を促進するアセチルトリプシン(ＡＴ)の存在下又は非存在下で感染１５時間後の細胞をメタノールで室温、３０秒間固定化し、マウス抗インフルエンザＡ型ウイルスヌクレオプロテイン(ＮＰ)モノクローナル抗体(４Ｅ６)を室温、３０分間反応させた。西洋ワサビperoxidase (ＨＲＰ)標識anti-mouse ＩｇＧ＋Ｍで室温、３０分間反応させた。結果を図２に示す。
Before: ウイルスに感染していないイヌ腎臓由来 (ＭＤＣＫ)細胞と抗スルファチドモノクローナル抗体ＧＳ−５(３００μｇ／ｍｌ)を３７℃で３０分間インキュベート後、３４℃、１時間感染。
During: 抗スルファチドモノクローナル抗体ＧＳ−５(３００μｇ／ｍｌ)
と混合したウイルスでＭＤＣＫ細胞に３４℃、１時間感染。
After: ウイルスをＭＤＣＫ細胞に３４℃で１時間感染させた後、抗スルファチドモノクローナル抗体ＧＳ−５(３００μｇ／ｍｌ)を継続的にインキュベート。
【００３４】
図２ (ａ)は、１００ｍＭクエン酸緩衝液 (ｐＨ６．０) １０ｍｌに対して、３０％過酸化水素 1 μｌ、６０ｍＭ N,N-Diethyl-p-phenylenediamine (ＤＥＰＤＡ) ２００μｌ、１００ ｍＭ 4-chloro-naphtol (４−ＣＮ) ２００μｌ混合後、ろ過した発色液を加え、室温で１０〜３０分間発色させた（ＤＥＰＤＡ発色、ウイルス感染細胞は青く染色）結果を示し、図２ (ｂ) は、単位面積当たりのウイルス感染細胞数を示す。これら結果から、抗スルファチド抗体（ＧＳ−５）はインフルエンザＡ型ウイルスが感染した細胞に作用してウイルスの増殖を抑制することがわかる。
【００３５】
２．抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)はインフルエンザＡ型ウイルス感染後４時間以降の感染細胞に効果を示し、感染細胞から産生される感染性子孫ウイルス量を減少させる。
インフルエンザＡ型ウイルス株：Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）をＭＤＣＫ細胞へ３４℃で１時間感染させ、その後、図３に示した時間で抗スルファチドモノクローナル抗体ＧＳ−５(３００μｇ／ｍｌ)で処理した。ＧＳ−５で処理していないものをコントロールとした(Ｃｏｎ)。感染２４時間後の上清中ウイルス感染価を測定した。Ｃｏｎを１００％としたときの相対感染価％で示した結果を図３に示す。図３から、抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)はインフルエンザＡ型ウイルス感染後４時間以降の感染細胞に効果を示し、感染細胞から産生される感染性子孫ウイルス量を減少させることがわかった。
【００３６】
３．抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)はインフルエンザＡ型ウイルスの増殖を抑制する。
インフルエンザＡ型ウイルス株：Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）をＭＤＣＫ細胞へ３４℃で１時間感染させ、抗スルファチドモノクローナル抗体ＧＳ−５(３００μｇ／ｍｌ)又はマウス抗糖脂質Ｇｂ３Ｃｅｒモノクローナル抗体(ＴＵ−１；サブクラスＩｇＭ) (５００μｇ／ｍｌ)を含む無血清培地(２．５μｇ／ｍｌ アセチルトリプシン含有)で培養した。抗体を含まない培地をコントロールとした(Ｃｏｎ)。感染２６時間後の細胞をメタノールで室温で３０秒間固定化し、マウス抗インフルエンザＡ型ウイルスＮＰモノクローナル抗体(４Ｅ６)を室温で３０分間反応させた。ＨＲＰ標識anti-mouse ＩｇＧ＋Ｍで室温で３０分間反応させた。図４(ａ)は感染細胞をＤＥＰＤＡ発色させた結果を示し、図４(Ｂ)は上清中のウイルス感染価(plaque forming unit; ｐｆｕ／ｍｌ)の測定結果を示す。これらの結果から、抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)はインフルエンザＡ型ウイルスの増殖を抑制するが、抗糖脂質Ｇｂ３Ｃｅｒ抗体（ＴＵ−１）はインフルエンザＡ型ウイルスの増殖を抑制しないことがわかった。
【００３７】
４．抗スルファチド抗体（ＧＳ−５）はＷＳＮ株以外のインフルエンザＡ型ウイルスの増殖も抑制する。
インフルエンザＡ型ウイルス株：Ａ／Memphis／１／７１（Ｈ３Ｎ２）又はＡ／duck／３１３／４／７８（Ｈ５Ｎ３）をＭＤＣＫ細胞へ３４℃で1時間感染させ、抗スルファチドモノクローナル抗体ＧＳ−５(３００μｇ／ｍｌ)又はマウス抗糖脂質Ｇｂ３Ｃｅｒモノクローナル抗体(ＴＵ−１；サブクラスＩｇＭ) (５００μｇ／ｍｌ)を含む無血清培地(２．５μｇ／ｍｌ アセチルトリプシン含有)で培養した。抗体を含まない培地をコントロールとした(Ｃｏｎ)。感染２４時間後の細胞をメタノールで室温で３０秒間固定化し、マウス抗インフルエンザＡ型ウイルスＮＰモノクローナル抗体(４Ｅ６)を室温で３０分間反応させた。ＨＲＰ標識anti-mouseＩｇＧ＋Ｍで室温、３０分間反応させ、感染細胞をＤＥＰＤＡ発色させた。結果を図５に示す。図５から、抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)はインフルエンザＡ型ウイルス株：Ａ／Memphis／１／７１（Ｈ３Ｎ２）やＡ／duck／３１３／４／７８（Ｈ５Ｎ３）の増殖を抑制するが、抗糖脂質Ｇｂ３Ｃｅｒ抗体（ＴＵ−１）はこれらインフルエンザＡ型ウイルスの増殖を抑制しないことがわかった。
【００３８】
５．抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)はインフルエンザＡ型ウイルスの増殖を抑制する。
ＭＤＣＫ細胞へインフルエンザＡ型ウイルス株：Ａ／Memphis／１／７１（Ｈ３Ｎ２）を３４℃で１時間感染させ、抗スルファチドモノクローナル抗体ＧＳ−５(３００ μｇ／ｍｌ)を含む無血清培地(アセチルトリプシン(ＡＴ)含有（ＧＳ−５／ＡＴ;●）又は不含（ＧＳ−５;■）)で０、２、６、１８、３０、４５時間培養した。コントロールとして無血清培地（ＡＴ含有（Ｃｏｎ／ＡＴ；○）又は不含（Ｃｏｎ；□））を用いた。細胞をメタノールで室温、３０秒間固定化し、マウス抗インフルエンザＡ型ウイルスＮＰモノクローナル抗体（４Ｅ６）を室温、３０分間反応させた後、ＨＲＰ標識anti-mouse ＩｇＧ＋Ｍで室温、３０分間反応させ、感染細胞をＤＥＰＤＡ（N,N-Diethyl-p-phenylenediamine）発色させ、４５時間培養上清のウイルスによる赤血球凝集価(hemagglutination unit; ＨＡＵ)を測定した結果を図６（Ａ）に示す。また、各時間の単位面積当たりの感染細胞数をカウントした結果を図６(Ｂ)に、培養３０時間後の感染細胞写真 (１００倍率)を図６(Ｃ)に示す。これらの結果から、抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)は、ウイルス増殖を促進するアセチルトリプシン(ＡＴ)の存在下においても、インフルエンザＡ型ウイルスの増殖を抑制することがわかった。
【実施例２】
【００３９】
［抗スルファチド抗体によるパラインフルエンザＡ型ウイルスの増殖抑制］
１．抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)はパラインフルエンザウイルス(ｈＰＩＶ１, ｈＰＩＶ３,  ＳＶ, ＮＤＶ)の増殖を抑制する。
ｈＰＩＶ１: ヒトパラインフルエンザ１型、ｈＰＩＶ３:ヒトパラインフルエンザ３型、ＳＶ:センダイウイルス及びＮＤＶ: ニューキャッスル病ウイルスを供試した。サル腎臓由来ＬＬＣＭＫ２細胞へ各ウイルスを３４℃で１時間感染させ、抗スルファチドモノクローナル抗体ＧＳ−５(３００μｇ／ｍｌ)又は抗糖脂質Ｇｂ３Ｃｅｒモノクローナル抗体ＴＵ−１ (５００μｇ／ｍｌ)を含む無血清培地(１μｇ／ｍｌ ＡＴ含有)で３７℃、４８時間培養した。抗体を含まない培地をコントロール(Ｃｏｎ)とした。細胞をメタノールで室温、３０秒間固定化し、各ウイルスに対してのウサギポリクローナル抗体を室温、３０分間反応させた。西洋ワサビperoxidase (ＨＲＰ)標識Protein Aで室温、３０分間反応させた。１００ｍＭ クエン酸緩衝液 (ｐＨ  ６．０) １０ｍｌに対して、３０％過酸化水素１μｌ、６０ｍＭのＤＥＰＤＡ２００μｌ、１００ｍＭ ４−ＣＮ (4-chloro-naphtol)２００μｌ混合後、ろ過した発色液を加え、室温で１０〜３０分間発色させた。結果を図７に示す（ＤＥＰＤＡ発色、ウイルス感染細胞は青く染色）。これらの結果から、抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)はパラインフルエンザウイルスの増殖を抑制するが、抗糖脂質Ｇｂ３Ｃｅｒ抗体（ＴＵ−１）はパラインフルエンザウイルスの増殖を抑制しないことがわかった。
【００４０】
また、サル腎臓由来ＬＬＣＭＫ２細胞へ各ウイルスを３４℃で１時間感染させ、ＧＳ−５又はＴＵ−１を含む無血清培地(１μｇ／ｍｌ  ＡＴ含有)で３７℃、４８時間培養した。抗体を含まない培地をコントロール(Ｃｏｎ)とした。４８時間後の培養上清の感染性子孫ウイルス価を測定した。結果を図８に示す。培養上清のウイルス価測定においても、抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)はパラインフルエンザウイルスの増殖を抑制するが、抗糖脂質Ｇｂ３Ｃｅｒ抗体（ＴＵ−１）はパラインフルエンザウイルスの増殖を抑制しないことがわかった。
【００４１】
２．抗スルファチド抗体（ＧＳ−５）は濃度依存的にパラインフルエンザウイルス(ｈＰＩＶ１, ｈＰＩＶ３,  ＳＶ, ＮＤＶ)の増殖を抑制する。
サル腎臓由来ＬＬＣＭＫ２細胞へ、ｈＰＩＶ１、ｈＰＩＶ３、ＳＶ及びＮＤＶの各ウイルスを３４℃で１時間感染させ、１〜８倍段階希尺した抗スルファチドモノクローナル抗体ＧＳ−５(３００μｇ／ｍｌ)を含む無血清培地(１μｇ／ｍｌ  ＡＴ含有)で３７℃、４８時間培養した。抗体を含まない培地をコントロール(Ｎｏ  ＧＳ−５)とした。細胞をメタノールで室温、３０秒間固定化し、各ウイルスに対してのウサギポリクローナル抗体を室温、３０分間反応させた。西洋ワサビperoxidase (ＨＲＰ)標識Protein Aで室温、３０分間反応させた。１００ｍＭ クエン酸緩衝液 (ｐＨ  ６．０) １０ｍｌに対して、３０％過酸化水素１μｌ、６０ｍＭのＤＥＰＤＡ２００μｌ、１００ｍＭ ４−ＣＮ (4-chloro-naphtol)２００μｌ混合後、ろ過した発色液を加え、室温で１０〜３０分間発色させた。結果を図９に示す（ＤＥＰＤＡ発色、ウイルス感染細胞は青く染色）。これらの結果から、抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)は濃度依存的にパラインフルエンザウイルスの増殖を抑制することがわかった。
【００４２】
３．抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)はパラインフルエンザウイルスの初期感染を阻害しないが、感染細胞から産生される感染性子孫ウイルス量を減少させる。
ｈＰＩＶ１、ｈＰＩＶ３、ＳＶ及びＮＤＶの各ウイルス感染前３０分間及びウイルス感染の間（３４℃、１時間）、抗スルファチドモノクローナル抗体ＧＳ−５(３００μｇ／ｍｌ)又は抗糖脂質Ｇｂ３Ｃｅｒモノクローナル抗体ＴＵ−１ (５００μｇ／ｍｌ)でサル腎臓由来ＬＬＣＭＫ２細胞を処理した。抗体未処理をコントロール（Ｃｏｎ）とした。細胞を無血清培地で１６時間培養した。細胞をメタノールで室温、３０秒間固定化し、各ウイルスに対してのウサギポリクローナル抗体を室温、３０分間反応させた。ＨＲＰ標識Protein Aで室温、３０分間反応させ、ＤＥＰＤＡ発色させた。Ｃｏｎを１００％としたときの相対感染細胞数として示した結果を図１０（Ａ）に示す。また、各ウイルスでＬＬＣＭＫ２細胞がすべて感染する条件で、３４℃、１時間感染させた。ＧＳ−５又はＴＵ−１を含む無血清培地で２４時間培養し、上清中の感染性ウイルス感染価(ＴＣＩＤ５０／０．１ｍｌ)を測定した結果を図１０（Ｂ）に示す。これらの結果から、抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)はパラインフルエンザウイルスの初期感染を阻害しないが、感染細胞から産生される感染性子孫ウイルス量を減少させることがわかった。
【実施例３】
【００４３】
［スルファチド分解酵素によるウイルスの増殖抑制］
１．イヌ腎臓由来ＭＤＣＫ細胞におけるスルファチド分解酵素（アリルスルファターゼＡ；ＡＳＡ）発現はスルファチド量を減少させ、インフルエンザＡ型ウイルスの増殖も減少させる。
ヒトＡＳＡ遺伝子（NC_000022）を組み込んだpTriEx3-neoベクター（ＡＳＡ）又はベクターのみ（Vector）をＭＤＣＫ細胞へ遺伝子導入し、ネオマイシンＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）下で２週間以上培養した。細胞をメタノールで固定化後、マウス抗スルファチドモノクローナル抗体（ＧＳ−５）を氷上１時間反応させた。ＦＩＴＣ標識anti-mouse ＩｇＭ−ＰＢＳ  １００倍希尺液を氷上、１時間反応させ、フローサイトメーターで各細胞のスルファチド量を測定し、スルファチド量を比較した結果を図１１（ａ）に示す。また、細胞をメタノールで固定化後、上記（ａ）と同様に行った。共焦点レーザー顕微鏡で観察し、スルファチド量を比較した結果を図１１（ｂ）に示す（スルファチド；緑、核；ＤＡＰＩ染色、青）。
【００４４】
インフルエンザＡ型ウイルス株：Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）を低感染価で３４℃，１時間感染させ、２．５μｇ／ｍｌアセチルトリプシン（ＡＴ）含有無血清培地で２６時間培養した。上清のウイルス感染価（plaque forming unit；ｐｆｕ／ｍｌ）を測定し、ウイルスの増殖性を比較した結果を図１１（ｃ）に示す。感染細胞をインフルエンザウイルスシアリダーゼ阻害剤ザナミビル（１μＭ）含有無血清培地で１６時間培養した。細胞をメタノールで室温、３０秒間固定化し、マウス抗インフルエンザＡ型ウイルスヌクレオプロテイン（ＮＰ）モノクローナル抗体（４Ｅ６）を室温、３０分間反応させた。西洋ワサビＨＲＰ標識anti-mouse ＩｇＧ＋Ｍ  ３０００倍希尺液で室温、３０分間反応させた。１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１０ｍｌに対して、３０％過酸化水素１μｌ、６０ｍＭ  ＤＥＰＤＡ（N,N-Diethyl-p-phenylenediamine）２００μｌ、１００ｍＭ  ４−ＣＮ（4-chloro-naphtol）２００μｌ混合後、ろ過した発色液を加え、室温で１０〜３０分間発色させた（ＤＥＰＤＡ発色、ウイルス感染細胞は青く染色）。単位面積当たりの感染細胞数をカウントし、初期感染細胞数を比較した結果を図１１（ｄ）に示す。上記（ｃ）の結果を（ｄ）と同様に感染細胞の染色を行い、４０倍率顕微鏡視野で観察し、ウイルス増殖を比較した結果を図１１（ｅ）に示す。
【実施例４】
【００４５】
［ＲＮＡｉによるウイルスの増殖抑制］
１．ＭＤＣＫ細胞におけるスルファチド合成酵素（ＣＳＴ）のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、スルファチド量を減少させ、インフルエンザＡ型ウイルスの増殖を減少させる。
ＲＮＡｉ用ベクターpSilencer3.1-H1 neoへＣＳＴ遺伝子の４０１−４１９番目、３３７−３５７番目、ＧＦＰの２９−４７番目を組み込み、ＭＤＣＫ細胞へ遺伝子導入した。２週間以上のＧ４１８薬剤選択及びクローニングを行った。細胞内のＣＳＴｍＲＮＡ量をグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ量を基準として、リアルタイムＰＣＲにより定量した。リアルタイムＰＣＲで使用したプライマー対は、親ＭＤＣＫ株のｍＲＮＡ量の相対値（％）として示し、ＣＳＴｍＲＮＡに対してのＲＮＡｉ効果を比較した。結果を図１２（ａ）に示す。また、細胞をメタノールで固定化後、ＧＳ−５を氷上１時間反応させた。ＦＩＴＣ標識anti-mouse ＩｇＭ−ＰＢＳ  １００倍希尺液を氷上、１時間反応させ、フローサイトメーターで各細胞のスルファチド量を測定し、比較した。結果を図１２（ｂ）に示す。また、ウイルスを低感染価で３４℃，１時間感染させ、２．５μｇ／ｍｌ  ＡＴ含有無血清培地で２６時間培養した。上清のウイルス感染価（ｐｆｕ／ｍｌ）を測定し、ウイルスの増殖性を比較した。結果を図１２（ｃ）に示す。そしてまた、上記（ｃ）の細胞をメタノールで室温、３０秒間固定化し、４Ｅ６を室温、３０分間反応させた。ＨＲＰ標識anti-mouse ＩｇＧ＋Ｍ  ３０００倍希尺液で室温、３０分間反応させた。室温で１０〜３０分間ＤＥＰＤＡ発色させた。４０倍率顕微鏡視野で観察し、ウイルス増殖を比較した。結果を図１２（ｄ）に示す。
【実施例５】
【００４６】
［スルファチド高発現ＣＯＳ７細胞］
１．２つのイヌ由来スルファチド合成酵素を遺伝子導入したサル腎臓由来ＣＯＳ７細胞は、親ＣＯＳ７細胞に比較して、インフルエンザＡ型ウイルスの増殖性が大きく増加する。
スルファチド発現が非常に少ないＣＯＳ７細胞へスルファチド合成酵素ＣＳＴ及びＣＧＴを組み込んだpIRES-neoベクターを遺伝子導入し、Ｇ４１８薬剤選択とクローニングを行い、スルファチド高発現ＣＯＳ７細胞を２クローン、すなわち、ＳｕｌＣＯＳ１：スルファチド高発現ＣＯＳ７細胞クローン１（ＣＳＴの開始コドンから１３２番目に３塩基ＣＡＧが挿入）及びＳｕｌＣＯＳ２：スルファチド高発現ＣＯＳ７細胞クローン２、を得た。細胞をメタノールで固定化後、抗スルファチド抗体（ＧＳ−５）を氷上１時間反応させた。ＦＩＴＣ標識anti-mouse ＩｇＭ−ＰＢＳ  １００倍希尺液を氷上で１時間反応させ、フローサイトメーターで各細胞のスルファチド量を測定し、比較した。結果を図１３（ａ）に示す。また、細胞をメタノールで固定化後、上記（ａ）と同様に行った。共焦点レーザー顕微鏡で観察し、スルファチド量を比較した。結果を図１３（ｂ）に示す（スルファチド；緑、核；ＤＡＰＩ染色、青）。また、ウイルスを低感染価で３４℃，１時間感染させ、２．５μｇ／ｍｌアセチルトリプシン（ＡＴ）含有無血清培地で２４時間培養した。上清のウイルス感染価（ｐｆｕ／ｍｌ）を測定し、ウイルスの増殖性を比較した。結果を図１３（ｃ）に示す。また、感染細胞をインフルエンザウイルスシアリダーゼ阻害剤ザナミビル（１μＭ）含有無血清培地で１５時間培養した。細胞をメタノールで室温、３０秒間固定化し、４Ｅ６を室温、３０分間反応させた。ＨＲＰ標識anti-mouse ＩｇＧ＋Ｍ  ３０００倍希尺液で室温、３０分間反応させた。室温で１０〜３０分間ＤＥＰＤＡ発色させた単位面積当たりの感染細胞数をカウントし、初期感染細胞数を比較した。結果を図１３（ｄ）に示す。そしてまた、上記（ｃ）の結果を（ｄ）と同様に感染細胞の染色を行い、４０倍率顕微鏡視野で観察し、ウイルス増殖を比較した。結果を図１３（ｅ）に示す。
【００４７】
２．抗スルファチド抗体（ＧＳ−５）はスルファチド高発現ＣＯＳ７細胞におけるインフルエンザＡ型ウイルスの増殖を抑制する。
スルファチド高発現ＣＯＳ７細胞（ＳｕｌＣＯ１，ＳｕｌＣＯＳ２）へウイルスを３４℃で１時間感染させ、抗スルファチドモノクローナル抗体ＧＳ−５又は抗糖脂質Ｇｂ３Ｃｅｒモノクローナル抗体ＴＵ−１を含む無血清培地（ＡＴ  ２．５μｇ／ｍｌ含有）で２０時間培養した。コントロールとして、無血清培地（ＡＴ  ２．５μｇ／ｍｌ含有）のみを用いた（Ｃｏｎ）。上清のウイルス感染価（ｐｆｕ／ｍｌ）を測定し、抗体のウイルス増殖抑制効果を比較した結果を図１４（ａ）に示す。また、細胞をメタノールで室温、３０秒間固定化し、ＮＰモノクローナル抗体（４Ｅ６）を室温、３０分間反応させた。ＨＲＰ標識anti-mouse ＩｇＧ＋Ｍで室温、３０分間反応させ、感染細胞をＤＥＰＤＡ発色させ、抗体のウイルス増殖抑制効果を比較した。結果を図１４（ｂ）に示す。
【００４８】
３．ＷＳＮ株以外のインフルエンザＡ型ウイルスもスルファチド高発現ＣＯＳ７細胞で増殖する。
インフルエンザＡ型ウイルス株：Ａ／Memphis／１／７１（Ｈ３Ｎ２）又はＡ／duck／３１３／４／７８（Ｈ５Ｎ３）をＳｕｌＣＯＳ１細胞へ３４℃で１時間感染させ、無血清培地（２．５μｇ／ｍｌ  ＡＴ含有）で培養した。感染２４時間後の細胞をメタノールで室温、３０秒間固定化し、ＮＰモノクローナル抗体（４Ｅ６）を室温、３０分間反応させた。ＨＲＰ標識anti-mouse ＩｇＧ＋Ｍで室温、３０分間反応させ、感染細胞をＤＥＰＤＡ発色させた。結果を図１５に示す。
【実施例６】
【００４９】
［スルファチドによるアポトーシス誘導促進］
１．スルファチドはインフルエンザＡ型ウイルスのアポトーシス誘導を促進する。
細胞に高感染価のウイルスを３４℃で１時間感染させ、抗スルファチドモノクローナル抗体ＧＳ−５又は抗糖脂質Ｇｂ３Ｃｅｒモノクローナル抗体ＴＵ−１を含む２％ＦＢＳ含有培地でＣＯＳ７細胞は１６時間、ＭＤＣＫ細胞は２４時間培養した。０．１２５％トリプシンで細胞をはがし、ＦＩＴＣ標識アネキシンＶ（アポトーシス初期に起こる細胞膜内側の脂質フォスファチジルセリンの膜外側への転移を認識し結合する、アポトーシスの指標）、及び死細胞を染色するプロピジウムイオダイド（ＰＩ）で室温１５分間染色した。抗体を含まない２％ＦＢＳ含有培地をコントロールとした（Ｃｏｎ）。染色細胞は、フローサイトメーターにより解析した。どの細胞でもＰＩ染色にはほとんど差が見られなかった。スルファチド高発現ＳｕｌＣＯＳ１細胞におけるウイルス誘導性アポトーシスと抗スルファチド抗体（ＧＳ−５）のアポトーシス抑制効果の結果を図１６（ａ）に示す。また、ＣＯＳ７細胞におけるウイルス誘導性アポトーシスとＧＳ−５の効果の結果を図１６（ｂ）に示す。また、ＡＳＡ発現ＭＤＣＫ細胞とＭＤＣＫ細胞のウイルス誘導性アポトーシス比較結果を図１６（ｃ）に示す。
【実施例７】
【００５０】
［抗スルファチド抗体（ＧＳ−５）等によるＮＰの輸送抑制］
１．スルファチド高発現ＳｕｌＣＯＳ１細胞内の新生ウイルス膜タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）の細胞膜輸送は正常だが、新生ウイルスヌクレオプロテイン（ＮＰ）の核から細胞質への輸送が、親ＣＯＳ７細胞と比較して促進される。さらに、抗スルファチド抗体（ＧＳ−５）は、ＮＰの輸送を抑制する。
スルファチド高発現ＳｕｌＣＯＳ１細胞と親ＣＯＳ７細胞へ高感染価のインフルエンザＡ型ウイルス株：Ａ／Memphis／１／７１（Ｈ３Ｎ２）を３４℃で１時間感染させた。細胞を１％ＦＢＳ含有培地で３７℃７時間培養し、メタノールで３０秒間固定化した。抗インフルエンザＡ型ウイルスＨ３ＨＡモノクローナル抗体（２Ｅ１０）、Ｎ２ＮＡモノクローナル抗体（ＳＩ−４）又はＮＰモノクローナル抗体（４Ｅ６）で４℃、一晩反応させた。ＴＲＩＴＣ標識goat anti-mouse ＩｇＧ  １００倍希尺液を４℃２時間反応させ、退色防止剤を添加した。核はＤＡＰＩ染色を行った。共焦点レーザー顕微鏡下で新生ウイルスタンパク質を観察した。結果を図１７に示す。図１７中、（ａ）−（ｃ）及び（ｇ）−（ｈ）はＳｕｌＣＯＳ１細胞（ＳｕｌＣＯＳ１）、（ｄ）−（ｆ）及び（ｉ）−（ｊ）はＣＯＳ７細胞（Parent）であり、（ａ），（ｄ），（ｇ），（ｈ）はＨＡ染色を、（ｂ），（ｅ）はＮＡ染色を、（ｃ），（ｆ），（ｉ），（ｊ）はＮＰ染色であり、（ｇ）−（ｈ）はウイルス感染後、ＧＳ−５又はＴＵ−１を含む１％ＦＢＳ含有培地で３７℃７時間培養した結果を表し、（ｇ），（ｉ）はＧＳ−５処理を、（ｈ），（ｊ）はＴＵ−１処理を示す。なお、（ａ）の白線は５０μｍを示す。
【００５１】
２．ＭＤＣＫ細胞内の新生ウイルス膜タンパク質ＨＡの細胞膜輸送は正常だが、新生ＮＰの核から細胞質への輸送が、ＡＳＡ発現ＭＤＣＫ細胞では抑制される。さらに、抗スルファチド抗体（ＧＳ−５）は、ＭＤＣＫ細胞内の新生ウイルスＨＡとＮＡの細胞膜輸送には影響を与えないが、新生ウイルスＮＰの細胞質への輸送を抑制する。
ＭＤＣＫ細胞へ高感染価のインフルエンザＡ型ウイルス株：Ａ／Memphis／１／７１（Ｈ３Ｎ２）を３４℃で１時間感染させた。細胞を１％ＦＢＳ含有培地で３７℃、７時間培養し、メタノールで３０秒間固定化した。Ｈ３ＨＡモノクローナル抗体（２Ｅ１０）、Ｎ２ＮＡモノクローナル抗体（ＳＩ−４）又はＮＰモノクローナル抗体（４Ｅ６）で４℃、一晩反応させた。ＴＲＩＴＣ標識goat anti-mouse ＩｇＧ  １００倍希尺液を４℃２時間反応させ、退色防止剤を添加した。核はＤＡＰＩ染色を行った。共焦点レーザー顕微鏡下で新生ウイルスタンパク質を観察した。結果を図１８に示す。図１８中、（ａ），（ｄ），（ｇ）−（ｏ）はＭＤＣＫ細胞（Parent）を、（ｂ），（ｅ）はVectorのみ遺伝子導入したＭＤＣＫ細胞（Vector）を、（ｃ），（ｆ）はＡＳＡ発現ＭＤＣＫ細胞（ＡＳＡ）であり、（ａ）−（ｃ）及び（ｇ）−（ｉ）はＨＡ染色を、（ｊ）−（ｌ）はＮＡ染色を、（ｄ）−（ｆ）及び（ｍ）−（ｏ）はＮＰ染色を表し、（ｇ）−（ｏ）はウイルス感染後、ＧＳ−５又はＴＵ−１を含む１％ＦＢＳ含有培地で３７℃、７時間培養した結果を示す。（ｇ），（ｉ）はＧＳ−５処理を、（ｈ），（ｊ）はＴＵ−１処理を表す。なお、（ａ）の白線は５０μｍを示す。
【実施例８】
【００５２】
［各ウイルス感染細胞又はＧＳ−５処理下の子孫ウイルス産生量比較］
各細胞へ高感染価のインフルエンザＡ型ウイルス株：Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）を３４℃、１時間感染させた。ウイルスの多段階感染を防ぐためにＡＴ非存在下の無血清培地で培養した。回収した上清は、子孫ウイルスに感染性を与えるためにＡＴ（１０μｌ／ｍｌ）で３７℃、３０分間処理し、感染価（ｐｆｕ／ｍｌ）を測定した。スルファチド高発現ＣＯＳ７細胞（ＳｕｌＣＯＳ１、ＳｕｌＣＯＳ２）と親ＣＯＳ７細胞（Parent）における感染後２０時間の上清中子孫ウイルス感染価の測定結果を図１９（ａ）に示す。また、スルファチド高発現ＳｕｌＣＯＳ１細胞における感染後１６時間後のＧＳ−５又はＴＵ−１を含む無血清培地上清中の子孫ウイルス感染価の測定結果を図１９（ｂ）に示す。なお、抗体を含まない無血清培地をコントロールとした（Ｃｏｎ）。また、ＡＳＡ発現ＭＤＣＫ細胞（ＡＳＡ）、Vectorのみを導入したＭＤＣＫ細胞（Vector）、親ＭＤＣＫ細胞（Parent）における感染後１６時間の上清中子孫ウイルス感染価の測定結果を図１９（ｃ）に示す。そしてまた、ＭＤＣＫ細胞における感染後１６時間後のＧＳ−５又はＴＵ−１を含む無血清培地上清中の子孫ウイルス感染価の測定結果を図１９（ｄ）に示す。なお、抗体を含まない無血清培地をコントロールとした（Ｃｏｎ）。
【実施例９】
【００５３】
［方法］
１．細胞とウイルス
ＭＤＣＫ（Madin-Dearby canine kidney）細胞及びプラスミドが導入されたＭＤＣＫ細胞は、ＦＢＳ（Fetal bovine serum）を５％加えたＥＭＥＭ（Eagle‘s minimum essential medium）培地にて培養した。ＣＯＳ−７細胞及びプラスミドが導入されたＣＯＳ−７細胞は、ＦＢＳを１０％加えたＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）にて培養した。数種類のインフルエンザＡ型ウイルス（Influenza Ａ virus）［Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Menphis／１／７１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／duck／３１３／４／７８（Ｈ５Ｎ３）］は、生後１０日の孵化鶏卵において３４℃で２日間増殖させ、引用文献７（Takahashi,T.et al. J.Biochem.(Tokyo) 130,279-283(2001)）記載の方法に準じてシュークロース密度勾配遠心法により分離した。
【００５４】
２．抗体
マウス抗スルファチドモノクローナル抗体（ＧＳ−５、ＩｇＭ）とマウス抗スフィンゴ糖脂質（Ｇｂ３Ｃｅｒ）抗体（ＴＵ−１、ＩｇＭ）は、文献［Konno,A et al. Int.Immunol.8,1905-1913(1996)，Ding, Z.et al. FEBS Lett.418, 310-314(1997)，Shikata,K.et al. J. Pathol. 188,93-99(1999)，Miyamoto,D.et al. Glycoconj.J.14,379-388(1997)］に記載のものを用いた。ウイルス感染及び複製に関する実験では、無血清培地ハイブリドーマ−ＳＦＭ(Invitrogen Corp., Carlsbad,CA,USA) で培養されたマウスのハイブリドーマ細胞の上清中、ＧＳ−５（３００μｇ／ｍｌ）と、ＴＵ−１（５００μｇ／ｍｌ）の濃度で使用した。マウス抗ＮＰ（４Ｅ６）、ＨＡ（２Ｅ１０）、ＮＡ（ＳＩ−４）モノクローナル抗体（ＩｇＧ）はインフルエンザウイルスであるＡ／Menphis／１／７１（Ｈ３Ｎ２）を使用し、文献（Miyamoto,D.et al. Glycoconj.J.14,379-388(1997)）記載の方法にて作製した。
【００５５】
３．クローニング及びプラスミド導入
細胞の全ＲＮＡはTRIzol reagent(Invitrogen Corp., Carlsbad,CA,USA)にて抽出し、Takara RNA ＰＣＲTM Kit(AMV)ver.3.0(Takara Bio Inc., Shiga. Japan)を使ってｃＤＮＡに変換した。ＭＤＣＫ細胞由来のＣＧＴ遺伝子とＣＳＴ遺伝子は、3’-full RACE Core set(Takara Bio Inc., Shiga. Japan)と5’-full RACE Core set(Takara Bio Inc., Shiga. Japan)を使って決定した。ＣＳＴのｍＲＮＡから２種類のＯＲＦ(Open reading frame)シークエンスを得た。一つはヒトＣＳＴのＯＲＦと同一であったが、もう一方は開始コドンから数えて１３１番目と１３２番目の塩基の間に３塩基挿入されていた。ＣＳＴ遺伝子は５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＡＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣ−３’［配列番号１］と、５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＴＣＡＣＣＡＣＣＴＣＡＧＡＡＡＧＴＣＣＣＧＧＡＴＧＡ−３’［配列番号２］というEcoRI酵素切断部位を含む配列のプライマーを用いてpfu Ultra high fidelity DNA polymerase(stratagene,CA,USA)を使用し、ＰＣＲにより増幅させた。３塩基挿入されたＣＳＴ遺伝子及び挿入のないＣＳＴ遺伝子のＰＣＴ断片をEcoRIで処理し、pGEM-T easy ベクター(Promega,Madison,WI,USA)のEcoRI酵素切断部位を利用してそれぞれ組み込むことにより、２つのpGEM-CSTベクターを作製した。そのpGEM-CSTベクターからさらにEcoRIを用いて切り出されたＣＳＴ遺伝子のＯＲＦ部分断片は、pIRES-neoベクター（BD Biosciences,CA,USA）に組み込んだ。
【００５６】
ＣＧＴ遺伝子は５’−ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＴＣＴＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＣＴＴＡＣＡＣＴＣＣＧＴＡＴＴＣＡＴＧＣ−３’ ［配列番号３］及び５’−ＣＧＧＣＧＧＣＧＴＣＴＣＧＡＡＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＡＴＧＴＴＴＡＡＴＡＴＧＧＣ−３’ ［配列番号４］という配列のプライマーを用いて、Tbr EXT DNA polymerase（Finnzymes Oy,Finland）を使いＰＣＲにて増幅させた。pTRAGET-CGTベクターは、この増幅させた遺伝子断片をＴＡクローニングによってpTRAGET vector(Promega,Madison,WI,USA)に組み込むことによって作製した。pTRAGET-CGT ベクターをテンプレートとして、５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＡＣＴＡＴＡＴＧＡＡＧＴＣＴＴＡＣＡＣＴＣＣＧＴＡＴＴＴＣＡＴＧＣＴＣＣＴＧ−３’［配列番号５］及び５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＡＣＴＡＴＴＣＡＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＡＴＧＴＴＴＡＡ−３’［配列番号６］といった配列のプライマーを用いてＰＣＲを行った結果、２つのNot I切断部位をもつ断片が得られた。Not I処理したＣＧＴのＯＲＦのＰＣＲ断片を、ＣＳＴのＯＲＦがすでに組み込まれているpIRES-neoベクターのNot I切断部位を使って組み込んだ。２つの２シストロン性のpIRES-CST-CGT発現ベクター（ＣＳＴ遺伝子の中に何も挿入されていないもの、あるいは３塩基挿入が見られるもの）という、同一のｍＲＮＡからＣＳＴとＣＧＴタンパク質を同時に発現するベクターを作製した。
【００５７】
ＡＳＡ遺伝子はＨｅｌａ細胞から、５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＧＧＧＣＡＣＣＧＣＧＧＴ−３’［配列番号７］及び５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＴＣＡＧＧＣＡＴＧＧＧＧＡＴＣＴＧＧＧＣ−３’［配列番号８］という配列の、EcoRI切断部位をもつプライマーをpfu Ultra high fidelity DNA polymerase(stratagene,CA,USA)を使用し、ＰＣＲにより増幅させた。ｐGEM−ASAベクターはpGEM-T easyベクターにEcoRI部位を利用して組み込まれた。ＡＳＡのＯＲＦはpGEM‐ASAを利用して、５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＧＧＣＡＣＣＧＣＧＧＴＣ−３’［配列番号９］（Nco I制限酵素部位）と、５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＧＣＡＴＧＧＧＧＡＴＣＴＧＧＧＣＡ−３’ ［配列番号１０］（EcoRI制限酵素部位とヒスチジンタグをつけるために終止コドンをはずしたもの）の配列をもちいて増幅させ、pTriEx3-neo ベクター(Novagen,Darmstad, Germany)のNco IとEcoRI切断部位間に挿入した。このようにして、ＡＳＡとネオマイシン燐酸転移酵素タンパク質を、同一のｍＲＮＡから発現することができる、２シストロン性のpTriEx3-ASAベクターが構築された。プラスミドに挿入された遺伝子断片の全配列は、ABI PRISM 310NT Genetic Analyzer(Applied Biosystems,CA,USA)により確認した。
【００５８】
ＣＯＳ−７細胞には、Trans IT-293(Panvera,Madison,WI,USA)試薬を用いて、pIRES-CST-CGTベクター（３塩基挿入のあるＣＳＴ遺伝子、あるいは無いＣＳＴ遺伝子の両方）を導入した。クローニングの後、遺伝子導入された細胞は、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Promega, Madison,WI,USA）の存在下で３週間以上培養することにより選択した。硫脂質が豊富な細胞かどうかの選択は、１次抗体としてＧＳ−５抗体及びFluorescein isothiocyanate(FITC)-conjugated抗マウスＩｇＧヤギ抗体(Sigma-Aldrich Corp.,Missouri,USA)を２次抗体として使用し、蛍光顕微鏡(OLYMPUS IX70, Olympus,Tokyo, Japan)観察により確認した。２つのスルファチドが豊富な細胞クローン（１つは３塩基挿入があるＣＳＴ遺伝子を持つ）を得ることが出来、それぞれの細胞においてpIRES-CST-CGTからＣＳＴ遺伝子のｍＲＮＡが定常的に発現しているかどうか、５’−ＡＧＴＡＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’［配列番号１１］（Ｔ７プロモーターのプライマー）及び５’−ＡＣＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣ−３’［配列番号１２］（ＣＳＴのアンチセンスプライマー）といった配列のプライマーを使用して、ＰＣＲ法により確認した。その際、コントロールとしてはハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)のｍＲＮＡの発現を用いた。
【００５９】
ＭＤＣＫ細胞には、Trans IT-293試薬を用いてpTriEx3-ASAを導入した。クローニングの後、遺伝子導入された細胞は、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で３週間以上培養することにより選択した。遺伝子導入がなされた細胞は、ＡＳＡ活性及び硫脂質の枯渇の確認によってスクリーニングされた。遺伝子導入細胞の１２０−１５０μｇにおけるスルファターゼ活性は、4-methylumbelliferyl sulfate(Reserch Organics, Ohio,USA)を用いた、文献（Yaghootfam,A. et al. J. Biol. Chem.278,32653-32661(2003)）に記載の方法で測定した。
【００６０】
遺伝子導入された細胞における硫脂質の枯渇の確認は、１次抗体としてＧＳ−５抗体及びＦＩＴＣ(Fluorescein isothiocyanate)-conjugated抗マウスＩｇＧヤギ抗体(Sigma-Aldrich Corp.,Missouri,USA)を２次抗体として使用し、蛍光顕微鏡(OLYMPUS IX70, Olympus,Tokyo, Japan)観察することにより行ったpTriEx3-ASAベクターからＡＳＡ遺伝子のｍＲＮＡが定常的に発現しているかどうかについては、５’−ＡＧＴＡＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’ ［配列番号１１］（Ｔ７プロモーターのプライマー）と、５’−ＡＧＣＣＡＧＧＡＣＴＴＣＧＧＣ−３’［配列番号１３］（ＡＳＡアンチセンスプライマー）といった配列のプライマーを用いてＰＣＲを行い確認した。その際のコントロールとしてはＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現を使用した。
【００６１】
４．ウイルスの感染と複製
インフルエンザＡ型ウイルス株：Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）を感染させた細胞を血清が入っていない培地で３４℃、１時間放置する。インフルエンザＡ型ウイルスの初感染を確認するため、多重複製を防ぐためにインフルエンザＡ型ウイルス特異的なシアリダーゼ阻害薬であるザナミビル（１μＭ）を加えた血清なしの培地で細胞を培養した。ウイルスの多重複製を確認するため、感染させた細胞を、ＧＳ−５抗体、ＴＵ−１抗体、あるいは抗体なしで、３４℃、多重複製に必要とされるウイルスの融合活性を活性化させるため、ＨＡ，ＨＡ１，ＨＡ２サブユニットを乖離させるアセチルトリプシン（２．５μｇ／ｍｌ）を加えた血清の入っていない培地で培養した。感染した細胞は冷メタノールで３０秒間固定し、抗ＮＰモノクローナル抗体（４Ｅ６）と３０分間反応させ、その後ＨＲＰ(Hourse radish peroxidase)-conjugated ヤギ抗マウスＩｇＧ+Ｍ抗体（Jackson Immuno research, West Grove,PA）と３０分間室温で反応させた。感染した細胞内のウイルスのＮＰは、文献（Suzuki,T. et al.Biochem.J.318,389-393(1996)）に記載の方法に従い、過酸化水素、N,N-diethyl-p-phenylendiamin dihydrocholoride、4-chloro-1-naphtolを加えることで成熟させた。感染させた細胞の上清中の子孫ウイルス力価は、プラークアッセイによって測定した。
【００６２】
５．プラークアッセイとウイルス滴定
ウイルスの力価を測定するため、単一の層に密集しているＭＤＣＫ細胞を、ウイルスを血清無しの液体培地で対数希釈したものと３４℃で１時間反応させた。感染した単一層の細胞に、さらにアセチルトリプシン（２．５μｇ／ｍｌ）を含む血清を含まない液体培地と、０．８％アガロースを加えた。単一層の細胞は３４℃で２−３日、プラークが目に見えるようになるまで培養した。
【００６３】
６．ウイルス誘導型アポトーシスの蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）解析
ＣＯＳ−７細胞とＭＤＣＫ細胞は、インフルエンザＡ型ウイルス株：Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）を、ＭＯＩが１あるいは２ｐｆｕ／ｃｅｌｌで、３４℃１時間、それぞれ感染させた。ＣＯＳ−７細胞とＭＤＣＫ細胞は３４℃で、ＧＳ−５あるいはＴＵ−１を含む、ＦＢＳを加えた液体培地で培養し、感染後１６、２４時間後に０．１２５％トリプシンで培養皿からはがして回収した。コントロールとして、２％ＦＢＳを加えた、抗体を含まない液体培地を使用した。ウイルス誘導型アポトーシスの結果おこるフォスファチヂルセリンの細胞表面への表出を、製造業者のマニュアルに従って、プロピジウムアイオダイドが結合したＦＩＴＣ−conjugated アネキシンＶの２色解析により検討した。細胞への蛍光は、EPICS XL flow cytometer(Beckman Coulter Inc., Fullerton,CA)の４８８ｎｍ波長のアルゴンレーザーで励起した。それぞれのサンプルにつき、最低でも１０，０００個の細胞を調べた。
【００６４】
７．蛍光顕微鏡観察
細胞内での硫脂質の発現を視覚化するため、細胞をカバースリップ(Teflon printed glass slides,Erie Scientific Company,Portsmouth,NH)上に培養し、冷メタノールを用いて３０秒間で固定、パーミアビライズし、ＧＳ−５抗体と反応させ、その後ＦＩＴＣ-conjugated ヤギ抗マウスＩｇＭ二次抗体と反応させた。ウイルス感染した細胞における、ウイルスのＮＰ、ＨＡ、ＮＡを視覚化するため、細胞にインフルエンザＡ型ウイルスのＡ／Memphis／１／７１(Ｈ３Ｎ２)という種を、ＭＯＩが５ｐｆｕ／ｃｅｌｌで３４℃１時間感染させ、３７℃で１％ＦＢＳを加えた液体培地中で培養した。感染後７時間で、感染した細胞は冷メタノール３０秒で固定、パーミアビライズした。感染した細胞はマウス抗ＮＰ（４Ｅ６）、ＨＡ（２Ｅ１０）、あるいはＮＡ（ＳＩ−４）モノクローナル抗体と反応させ、その後tetramethyl rhodamin(ＴＲＩＴＣ)-conjugated ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Sigma-Aldrich Corp., Missouri,USA）と反応させた。核はＤＡＰＩ (4’6-diamino-2-phenylindole dihydrochloride)(Dojindo Labratories,Kumamoto,Japan)で染色した。細胞はＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡(Carl Zeiss Inc., Thornwood,N.Y.)下で観察した。
【００６５】
８．ＲＮＡｉ
図２０に示すように、ＲＮＡｉ用ベクターpSilencer3.1-H1 neoへＣＳＴ遺伝子の４０１−４１９番目（開始コドンからの番号）５’−ＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣＴＧＣＡ−３’［配列番号１４］、３３７−３５７番目（開始コドンからの番号）５’−ＣＧＡＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＣＣＧＧＣＣ−３’［配列番号１５］、ＧＦＰ（Green fluorescence protein）の２９−４７番目（開始コドンからの番号）５’−ＣＴＧＧＡＧＴＴＧＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴ−３’［配列番号１６］をそれぞれ組み込み、ＭＤＣＫ細胞へ遺伝子導入した。遺伝子導入されたＭＤＣＫ細胞は、２週間以上の期間Ｇ４１８による薬剤選択を行った。
【００６６】
選択されたＭＤＣＫ細胞を用い、細胞内のＣＳＴのｍＲＮＡ量をグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ量を基準として、リアルタイムＰＣＲにより定量した。リアルタイムＰＣＲのプライマー対として、ＣＳＴ：forward，５’−ＡＧＣＡＣＧＧＧＣＴＣＡＡＧＴＴＣ−３’［配列番号１７］（ＣＳＴ３０２−３１８）／reverse，５’−ＡＣＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣ−３’［配列番号１２］（ＣＳＴ４６９−４８５）と、ＧＦＰ：forward，５’−ＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＣＣＧＴＡＴＴＧＧ−３’［配列番号１８］（ＧＡＰＤＨ１７−３８）／reverse，５’−ＴＧＡＡＧＧＧＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＣＧ−３’［配列番号１９］（ＧＡＰＤＨ９７−１０６）を使用した。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】硫酸化糖脂質（スルファチド）の合成・分解代謝経路を示す図である。
【図２】本発明の抗スルファチド抗体（ＧＳ−５）が、インフルエンザＡ型ウイルス感染細胞に作用してウイルスの増殖を抑制する結果を示す図である。
【図３】本発明の抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)が、インフルエンザＡ型ウイルス感染後４時間以降の感染細胞に効果を示し、感染細胞から産生される感染性子孫ウイルス量を減少させる結果を示す図である。
【図４】本発明の抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)が、インフルエンザＡ型ウイルスの増殖を抑制することを示す図である。
【図５】本発明の抗スルファチド抗体（ＧＳ−５）はＷＳＮ株以外のインフルエンザＡ型ウイルスの増殖も抑制することを示す図である。
【図６】本発明の抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)は、ウイルス増殖を促進するアセチルトリプシン(ＡＴ)の存在下においても、インフルエンザＡ型ウイルスの増殖を抑制することを示す図である。
【図７】本発明の抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)が、パラインフルエンザウイルスの増殖を抑制することを示す図である。
【図８】本発明の本発明の抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)が、パラインフルエンザウイルスの増殖を抑制すること（培養上清ウイルス価測定）を示す図である。
【図９】本発明の抗スルファチド抗体（ＧＳ−５）は濃度依存的にパラインフルエンザウイルスの増殖を抑制することを示す図である。
【図１０】本発明の抗スルファチド抗体(ＧＳ−５)は、パラインフルエンザウイルスの初期感染を阻害しないが、感染細胞から産生される感染性子孫ウイルス量を減少させることを示す図である。
【図１１】イヌ腎臓由来ＭＤＣＫ細胞におけるスルファチド分解酵素（アリルスルファターゼＡ；ＡＳＡ）発現は、スルファチド量を減少させ、インフルエンザＡ型ウイルスの増殖も減少させることを示す図である。
【図１２】ＭＤＣＫ細胞におけるスルファチド合成酵素（ＣＳＴ）のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が、スルファチド量を減少させ、インフルエンザＡ型ウイルスの増殖を減少させることを示す図である。
【図１３】２つのイヌ由来スルファチド合成酵素を遺伝子導入したサル腎臓由来ＣＯＳ７細胞が、親ＣＯＳ７細胞に比較して、インフルエンザＡ型ウイルスの増殖性が大きく増加することを示す図である。
【図１４】本発明の抗スルファチド抗体（ＧＳ−５）が、スルファチド高発現ＣＯＳ７細胞におけるインフルエンザＡ型ウイルスの増殖を抑制することを示す図である。
【図１５】ＷＳＮ株以外のインフルエンザＡ型ウイルスも、スルファチド高発現ＣＯＳ７細胞で増殖することを示す図である。
【図１６】スルファチドが、インフルエンザＡ型ウイルスのアポトーシス誘導を促進することを示す図である。
【図１７】スルファチド高発現ＳｕｌＣＯＳ１細胞内の新生ウイルス膜タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）の細胞膜輸送は正常だが、新生ウイルスヌクレオプロテイン（ＮＰ）の核から細胞質への輸送が、親ＣＯＳ７細胞と比較して促進され、さらに、抗スルファチド抗体（ＧＳ−５）は、ＮＰの輸送を抑制することを示す図である。
【図１８】ＭＤＣＫ細胞内の新生ウイルス膜タンパク質ＨＡの細胞膜輸送は正常だが、新生ＮＰの核から細胞質への輸送が、ＡＳＡ発現ＭＤＣＫ細胞では抑制され、さらに、抗スルファチド抗体（ＧＳ−５）は、ＭＤＣＫ細胞内の新生ウイルスＨＡとＮＡの細胞膜輸送には影響を与えないが、新生ウイルスＮＰの細胞質への輸送を抑制することを示す図である。
【図１９】各ウイルス感染細胞又はＧＳ−５処理下の子孫ウイルス産生量の比較結果を示す図である。
【図２０】ＲＮＡｉ用ベクターpSilencer3.1-H1 neoを用いたｓｉＲＮＡ作製の概要を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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