(57)【要約】【課題】簡便且つ安価な方法で、高い合成量のタンパク質を得ることができる実用性の高い無細胞タンパク質合成方法を提供する。【解決手段】ｍＲＮＡ及び生体細胞由来抽出液を含む反応液中で無細胞タンパク質合成を行う方法であって、前記反応液は、前記ｍＲＮＡの３’末端領域に存在する配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、無細胞タンパク質合成方法。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドフラグメントがＤＮＡ、ＤＮＡ類似体、ＲＮＡ、及びＲＮＡ類似体から選ばれ、前記生体細胞が昆虫細胞である、無細胞タンパク質合成方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡ及び生体細胞由来抽出液を含む反応液中で無細胞タンパク質合成を行う方法であって、前記反応液は、前記ｍＲＮＡの３’末端領域に存在する配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、無細胞タンパク質合成方法。
【請求項２】
前記反応液は、前記ｍＲＮＡの５’末端領域に存在する配列に相補的なオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＤＮＡ類似体、ＲＮＡ及びＲＮＡ類似体から選ばれる、請求項１に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【請求項４】
前記生体細胞が昆虫細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成方法に関する。より詳しくは、本発明は、単位時間当たりのタンパク質合成量を簡便な方法にて向上させることができる合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
無細胞タンパク質合成技術において、タンパク質合成量に関与する要因としては様々なものがあるが、中でもエネルギーの枯渇やｍＲＮＡの分解によることが大きい。
【０００３】
エネルギーの枯渇の問題を克服するため、例えば、Ａ．Ｓ．スピリンらは、限外濾過装置に無細胞タンパク質合成反応液を入れ、アミノ酸、ＡＴＰ及びＧＴＰを含む溶液を、ポンプを用いて反応液に連続的に供給するとともに、基質の分解物や合成されたタンパク質を含む反応産物を反応液から除去した。このことにより、十数時間にわたって無細胞タンパク質合成が持続し、従来の２０倍を超えるタンパク質合成量を達成した（A.S.Spirin et al., Science, 242, 1162-1164(1988) 、特公平７−１１０２３６号公報）。
【０００４】
一方、ｍＲＮＡの分解は、ｍＲＮＡの５’末端に存在するＣＡＰ構造のｍＲＮＡからの切断（脱ＣＡＰ反応）や、ｍＲＮＡの３’末端に存在するポリ（Ａ）構造の分解によって開始すると考えられている（Microbiol Rev. 1996 Mar;60(1):233-49.）。この文献によると、ポリ（Ａ）の分解によってｍＲＮＡがある程度の長さになると、脱ＣＡＰ反応が起き、５’エクソヌクレアーゼによって一気にｍＲＮＡの分解が進むと記載されている。
【０００５】
そこで、ｍＲＮＡの分解の問題を克服するため、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を用いることなどによって、無細胞タンパク質合成が行われている。また、無細胞タンパク質合成において、鋳型となるmRNAの3’末端にループ構造をとらせることによりタンパク質の合成量を向上させる方法が報告されている。（Biotechnol Bioeng. 1999 Jul 20;64(2):194-9.）。
【０００６】
【非特許文献１】Ａ．Ｓ．スピリン（A.S.Spirin）ら著、「サイエンス（Science）」、第２４２巻、１９８８年、ｐ．１１６２−１１６４
【非特許文献２】カポニグロ・Ｇ（Caponigro G）及びパーカー・Ｒ（Parker R）著、「マイクロバイオロジー・アンド・モレキュラー・バイオロジー・レビューズ（Microbiology and Molecular Biology Reviews）」、第６０巻、第１号、１９９６年３月ｐ．２３３−２４９
【非特許文献３】ナカノ・Ｈ（Nakano H）、シンバタ・Ｔ（Shinbata T）オクムラ・Ｒ（Okumura R）セキグチ・Ｓ（Sekiguchi S）フジシロ・Ｍ（Fujishiro M）及びヤマネ・Ｔ（Yamane T）著、「バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Biotechnology and Bioengineering）」、第６４巻、第２号、１９９９年７月２０日、ｐ．９４−９９
【特許文献１】特公平７−１１０２３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＲＮＡ分解酵素阻害剤は、例えばＲＮａｓｅＡのようなｍＲＮＡの中ほどから分解させるエンドヌクレアーゼの効果を阻害する。しかしながら、ＲＮＡ分解酵素阻害剤は、５’又は３’末端から分解を行うエキソヌクレアーゼには効果がない。
【０００８】
ｍＲＮＡ合成後のＣＡＰ構造の付加は無細胞タンパク質合成技術において有用であることが知られている。しかしながら、ＣＡＰ構造の付与はコストがかかる上、前処理も煩雑になるなど、現在の無細胞タンパク質合成方法では実際に使用されることは少なく、ほとんどの場合は、阻害剤のみ添加して合成が行われることが通常である。
【０００９】
また、５’末端と３’末端とをループにする方法は、そのように鋳型ＤＮＡをデザインして調製する必要があり、手間がかかる。
【００１０】
このようなｍＲＮＡの分解を抑制するための技術は、いずれも現在の一般的な無細胞タンパク質合成技術においては使われていないか、使われても実用的な技術として使われていない。
【００１１】
そこで本発明の目的は、簡便且つ安価な方法で、高い合成量のタンパク質を得ることができる実用性の高い無細胞タンパク質合成方法を提供することにある。
【００１２】
本発明には、以下の発明が含まれる。
（１）ｍＲＮＡ及び生体細胞由来抽出液を含む反応液中で無細胞タンパク質合成を行う方法であって、前記反応液は、前記ｍＲＮＡの３’末端領域に存在する配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、無細胞タンパク質合成方法。
（２）前記反応液は、前記ｍＲＮＡの５’末端領域に存在する配列に相補的なオリゴヌクレオチドをさらに含む、（１）に記載の無細胞タンパク質合成方法。
【００１３】
（３）前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＤＮＡ類似体、ＲＮＡ及びＲＮＡ類似体から選ばれる、（１）に記載の無細胞タンパク質合成方法。
前記ｍＲＮＡの３’末端領域に存在する配列がポリ（Ａ）鎖配列である、前記の無細胞タンパク質合成方法。
前記ｍＲＮＡは、前記５’末端領域の下流側に隣接する位置に翻訳増強配列を有する、前記の無細胞タンパク質合成方法。
【００１４】
前記オリゴヌクレオチドは、１５〜４０塩基長である、前記の無細胞タンパク質合成方法。
前記オリゴヌクレオチドは、前記反応液中に０．１〜２μＭの濃度で含まれる、前記の無細胞タンパク質合成方法。
【００１５】
（４）前記生体細胞が昆虫細胞である、（１）〜（３）のいずれかに記載の無細胞タンパク質合成方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、簡便且つ安価な方法で、高い合成量のタンパク質を得ることができる実用性の高い無細胞タンパク質合成方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、無細胞タンパク質合成を行う方法であって、ｍＲＮＡの末端領域に存在する配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いることによってタンパク質の合成を行う方法である。本明細書において「タンパク質」とは、オリゴペプチド、ポリペプチドをも含む意味で用いる。
【００１８】
無細胞タンパク質合成用の反応液としては、基本的には公知のものを制限なく用いることができる。通常、水中に、生体細胞由来の抽出液、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及び緩衝剤を少なくとも含むものが用いられる。
【００１９】
この中でも生体細胞由来の抽出液としては、公知のものを制限なく用いることができるが、特に、昆虫細胞由来の抽出液を用いることが好ましい。特に、タンパク質合成能が高く、また無血清培地にて培養が可能であることから、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵細胞由来の細胞であるＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）やＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｌｐｅｒｄａ卵巣細胞由来の細胞であるＳｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を昆虫細胞として用いるのが好ましい。
【００２０】
本発明の無細胞タンパク質合成系に好ましく用いられる昆虫細胞抽出液の調製方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、特開２００４−２１５６５１号公報に記載の方法、すなわち、抽出用液に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させた後に昆虫細胞を破砕し、抽出を行うという方法を用いることができる。この方法は、緩和な状態で細胞破砕を行うことから無細胞タンパク質合成に必須な成分を破壊することなく細胞外に取り出すことができる点、使用器具などからのＲＮａｓｅなどの混入を防ぐことができる点、界面活性剤などの試薬を用いた細胞破砕の場合に懸念される翻訳反応阻害物質の持込がない点などから、好ましく用いられる。
【００２１】
すなわち、昆虫細胞抽出液としては、タンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ含有するとともに、１０ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは５０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、１μＭ〜５０ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦ、及び、５ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ４〜１０、好ましくは６．５〜８．５）を含有する水溶液として調製され、好ましくはヌクレアーゼ処理を施されたものを用いると良い。
【００２２】
そして、無細胞タンパク質合成用反応液は、このような昆虫細胞抽出液が１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有されるように調製されるのが好ましい。すなわち、上記反応液の全体において、昆虫細胞由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、目的のタンパク質の合成速度が低下する虞があるためである。
【００２３】
上記抽出液を除く成分として反応液中に用いられる、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、外来ｍＲＮＡ、緩衝剤については、当業者が適宜決定することができる。例えば、反応液を、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．０５ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、２０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を含有する水溶液として実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに０．１ｍＭ〜１０ｍＭのＥＧＴＡを含有するように実現されるのがより好ましい。
【００２４】
本発明においては、一定の条件を満たすオリゴヌクレオチドを前記反応液中に含ませて用いる。
一定の条件を満たすオリゴヌクレオチドとは、無細胞タンパク質合成用の反応液中に含まれるｍＲＮＡの末端領域に存在する配列について相補的なオリゴヌクレオチドである。より具体的には、ｍＲＮＡの３’末端領域に存在する配列に相補的なオリゴヌクレオチドを少なくとも反応液中に含ませる。また、ｍＲＮＡの５’末端領域に存在する配列に相補的なオリゴヌクレオチドをさらに反応液中に含ませてることもできる。
【００２５】
本発明において末端領域とは、タンパク質合成に影響のない領域をいい、すなわち、ｍＲＮＡにおける非翻訳領域のうちタンパク質合成に関わる領域（以下、「タンパク質合成に関わる領域」を「翻訳関連領域」と記載することがある。）以外の領域をいう。このような末端領域は翻訳関連領域の上流側と下流側とに存在し、上流側に存在する領域を５’末端領域、下流側に存在する領域を３’末端領域と表記する。以下に、これら末端領域に関してさらに詳しく述べる。
【００２６】
上記の翻訳関連領域には、開始コドンから終結コドンまでのコード領域が含まれ、さらにリボソームの結合に関与する配列や翻訳増強配列などから構成される非翻訳領域が含まれることがある。リボソームの結合に関与する配列としては、コザックコンセンサス配列やシャイン・ダルガーノ配列などが挙げられる。翻訳増強配列としては、Ω配列などが挙げられる。本発明においては、ｍＲＮＡの翻訳関連領域に翻訳増強配列が含まれていることが好ましい。
【００２７】
従って、本発明において５’末端領域とは、ｍＲＮＡにおいて、５’末端塩基から上記の翻訳関連領域の上流側に隣接する塩基までの（連続する塩基からなる）領域をいう。すなわち５’末端領域とは、ｍＲＮＡの５’末端塩基から開始コドンの上流側に隣接する塩基までの領域；ｍＲＮＡの５’末端塩基からリボソーム結合配列の上流側に隣接する塩基までの領域；又は、ｍＲＮＡの５’末端塩基から翻訳増強配列の上流側に隣接する塩基までの領域である。本発明は、ｍＲＮＡにキャップ構造を付与しなくとも高いタンパク質合成量を確保することができるが、ｍＲＮＡがキャップ構造（m7G-(5’)pppX(m)pY(m)p-）又は（m7G-(5’)pppX-）を有する場合は、キャップ構造中の塩基Ｘが５’末端塩基となる。
【００２８】
そして、５’末端領域に存在する配列とは、５’末端領域の塩基配列そのもの（すなわち、ｍＲＮＡの５’末端塩基から開始コドンの上流側に隣接する塩基までの配列；ｍＲＮＡの５’末端塩基からリボソーム結合配列の上流側に隣接する塩基までの配列；又は、ｍＲＮＡの５’末端塩基から翻訳増強配列の上流側に隣接する塩基までの配列）、或いはその５’末端領域の塩基配列から任意の長さで選択される部分配列である。
【００２９】
同様に、本発明において３’末端領域とは、ｍＲＮＡにおいて、上記の翻訳関連領域の下流側に隣接する塩基から３’末端塩基までの（連続する塩基からなる）領域をいう。すなわち３’末端領域とは、終結コドンの下流側に隣接する塩基からｍＲＮＡの３’末端塩基までの領域である。このような領域には、ポリ（Ａ）シグナル配列やポリ（Ａ）鎖配列が含まれることがある。ここで、ポリ（Ａ）とはポリアデニル酸又はアデニル酸オリゴマーをいう。
【００３０】
そして、３’末端領域に存在する配列とは、３’末端領域の塩基配列そのもの（すなわち、終結コドンの下流側に隣接する塩基からｍＲＮＡの３’末端塩基までの配列）又は、その３’末端領域の塩基配列から任意の長さで選択される部分配列である。本発明においては、３’末端領域に存在する配列としてポリ（Ａ）鎖配列が選択されることが好ましい。
【００３１】
５’末端領域に存在する配列及び３’末端領域に存在する配列（以下、「末端領域に存在する配列」を「末端側配列」と記載することがある。）は、１５〜４０塩基長であることが好ましく、２０〜３０塩基長であることがより好ましい。末端領域が上記好ましい塩基長よりも長い場合は、末端領域から上述の好ましい塩基長を有する部分配列を末端側配列として選択すると良い。なお、一方の末端領域から複数種の塩基長を有する部分配列を末端側配列として選択することもできる。
【００３２】
本発明におけるオリゴヌクレオチド、すなわち上述の末端側配列に相補的なオリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＤＮＡ類似体、ＲＮＡ及びＲＮＡ類似体から少なくとも１種が選ばれる。（以下、ＤＮＡ類似体及びＲＮＡ類似体を核酸類似体と表記することがある。）
ＤＮＡ類似体としては、末端側配列に相補的に結合しうるものであれば特に限定されない。すなわち、ＤＮＡのリン酸エステル主鎖、デオキシリボース、及び/又は、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンから選ばれる塩基が改変されたものであって、且つ塩基は前記の末端側配列の塩基に相補的に結合しうるものであれば制限なく用いることができる。
同様に、ＲＮＡ類似体としては、末端側配列に相補的に結合しうるものであれば特に限定されない。すなわち、ＲＮＡのリン酸エステル主鎖、リボース、及び/又は、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルから選ばれる塩基が改変されたものであって、且つ塩基は前記の末端側配列の塩基に相補的に結合しうるものであれば制限なく用いることができる。
【００３３】
例えば、リン酸エステル主鎖の改変としては、ホスホチオエート化などの化学修飾が挙げられる。デオキシリボースやリボース（以下、総称して五単糖と表記することがある。）の改変としては、Ｏ−メチル化などの化学修飾が挙げられる。リン酸エステル主鎖及び五単糖が改変された核酸類似体としてはペプチド核酸などが挙げられる。
【００３４】
これらオリゴヌクレオチドは、設定された末端側配列の長さと同じ塩基長を有する。すなわち、オリゴヌクレオチドは、１５〜４０塩基長であることが好ましく、２０〜３０塩基長であることがより好ましい。上記の塩基長より短いと、ｍＲＮＡとアニーリングしないことがある。また、上記の塩基長より長くても効果は変わらないが、コストの観点から塩基長の上限は上記長さ程度でよい。
なお、すでに述べたように一方の末端領域から複数の塩基長を有する末端側配列を選択することができるため、一方の末端領域につき複数種の塩基長を有するオリゴヌクレオチドを用いることもできる。
【００３５】
特に、本発明においては、末端側配列としてポリ（Ａ）鎖配列又はその部分配列を選択した場合、それに対するオリゴヌクレオチドとしてはチミジル酸オリゴマーやウリジル酸オリゴマーなどの単純な配列のものを用いることができる。ｍＲＮＡはポリ（Ａ）鎖配列を有することが多いため、これらは汎用性の高いオリゴヌクレオチドとして用いることができる。
【００３６】
本発明において用いるオリゴヌクレオチドは、例えばＰＣＲのプライマー合成において用いられる方法などを特に制限なく用いることによって調製することができる。
【００３７】
オリゴヌクレオチドは、反応液中に０．１〜５μＭ、好ましくは０．５〜１．５μＭの濃度で含まれるように用いることができる。上記濃度より少ないと、オリゴヌクレオチド添加の効果が出にくい。また、上記濃度より多いと、かえって合成量が下がる恐れがある。
【００３８】
本発明においては、このようにオリゴヌクレオチドを用いるだけでタンパク質の合成量を向上させることができる。このため、ｍＲＮＡの末端からの分解を抑制するために行われた方法、たとえばキャップ構造の付与やループ状ｍＲＮＡの調製などの方法を行うことなく、高いタンパク質合成量を実現することができる。タンパク質の合成量向上のメカニズムは定かではないが、このようなオリゴヌクレオチドがｍＲＮＡの末端側配列にアニーニングすることによって、末端からのｍＲＮＡ分解を抑制している可能性が考えられる。  
【００３９】
なお反応温度としては、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは１５℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を越えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。
【００４０】
本発明における無細胞タンパク質合成は、バッチ法によって行うことができる。反応時間としては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。例えば、６時間程度を目安にすると良い。
【００４１】
本発明の無細胞系タンパク質合成方法にて合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。
【００４２】
本発明の無細胞系のタンパク質合成方法にて合成できるタンパク質に特に制限はない。
【００４３】
以上に述べたように、本発明の方法は、オリゴヌクレオチドを用いるだけでタンパク質合成量を向上させることができる。本発明で用いるオリゴヌクレオチドは、その調製方法自体は種々確立され実用化されているものとして用いることができるため、本発明の方法は良い簡便かつ且つ安価な方法であり、従ってより実用的な方法であるといえる。また、本発明において用いることができるオリゴヌクレオチドの一つは、ポリ（Ａ）鎖配列に相補的なオリゴヌクレオチド（例えばチミジル酸オリゴマーやウリジル酸オリゴマー）であり、その調製は他のオリゴヌクレオチドに比べても簡便である。さらに、ｍＲＮＡは３’末端にポリ（Ａ）鎖配列を有することが多いため、オリゴヌクレオチドとしてポリグアニル酸を用いる本発明の方法は、より汎用性の高い方法といえる。
【００４４】
また、本発明は、ｍＲＮＡの末端からの分解を抑制するために行われた方法、たとえばキャップ構造の付与やループ状ｍＲＮＡの調製などの方法を行うことなく、高いタンパク質合成量を実現することができるため、この観点からも、本発明はより簡便かつより安価な方法であり、従ってより実用的な方法であるといえる。
【実施例】
【００４５】
昆虫細胞としてＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）由来の抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系にて、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を合成した。
実施例１、２、及び比較例１では以下のオリゴヌクレオチドを用いた。すなわち、５’末端側配列に相補的なオリゴヌクレオチドとして、Ω配列上流の非翻訳領域に存在する配列（３０塩基長）に相補的なオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ１）を用い、３’末端側配列に相補的なオリゴヌクレオチドとして、ポリ（Ａ）鎖配列の部分配列（３０塩基長）に相補的なオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ２）を用いた。それぞれの塩基配列は、以下のとおりである。
(i)ＡＳＯ１
5’-AATTAAAAATAAAAACGCGAATTCCGTGTA-3’（配列番号１）
(ii)ＡＳＯ２
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’（配列番号２）
【００４６】
［実施例１］
昆虫細胞抽出液を、以下の方法で調製した。この方法は、特開２００４−２１５６５１号公報に記載された実施例１の方法に基づく。
＜昆虫細胞の培養＞
細胞数２．１×１０７個の昆虫細胞Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、Ｌ−グルタミンを添加したＥｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を入れた培養フラスコ（６００ｃｍ２）内で２７℃で６日間培養した。結果、細胞数１．０×１０８個、湿重量１．２１ｇとなった。
【００４７】
＜昆虫細胞抽出液の調製＞
まず、上記培養した昆虫細胞を集菌し、下記組成の抽出用液で３回洗浄（７００×ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心分離）した後、１ｍＬの抽出用液中に懸濁した。
〔抽出用液の組成〕
・６０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・２００ｍＭ 酢酸カリウム
・４ｍＭ 酢酸マグネシウム
・４ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
この懸濁液を液体窒素中にて急速（１０秒以内）に凍結させた。充分に凍結させた後、約１０℃の水浴中で解凍した。完全に解凍した後、１５０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）し、上清を回収した。回収した上清１．５ｍＬを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャム バイオサイエンス社製）にアプライした。
【００４８】
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ 酢酸カリウム
・２ｍＭ 酢酸マグネシウム
・１ｍＭ ＤＴＴ
・０．５ｍＭ ＰＭＳＦ
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液４ｍＬにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分を回収した。回収した濾液をさらに４５，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、その上清を昆虫細胞抽出液とした。
【００４９】
＜外来ｍＲＮＡの作製＞
ＰＲＯＴＥＩＯＳ（東洋紡）のプロトコルに従い、ベクターｐＥＵ（東洋紡製）のΩ配列下流に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を挿入したプラスミドｐＥＵ−ＧＦＰを構築し、環状ＤＮＡを用いてｍＲＮＡを合成した。（なお、ｍＲＮＡ合成においては、環状ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物を用いることにより行うこともできる。）ＲｉｂｏＭＡＸ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）のプロトコルに従い、ｍＲＮＡを合成後、エタノール沈殿及びゲル濾過を行い、紫外吸収法にて定量し、無細胞タンパク質合成に用いた。
【００５０】
＜無細胞タンパク質合成＞
〔反応液の組成〕
・４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ  酢酸カリウム
・２ｍＭ  酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ  ＡＴＰ
・０．２５ｍＭ  ＧＴＰ
・２０ｍＭ  クレアチンリン酸
・２００μｇ/ｍｌ  クレアチンキナーゼ
・２ｍＭ  ＤＴＴ
・８０μＭ  アミノ酸（２０種類）
・０．２５ｍＭ  ＥＧＴＡ
・２００μｇ/ｍｌ  ｔＲＮＡ（ビール酵母由来）
・２Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅインヒビター
・５０％（ｖ/ｖ）抽出液
・３２０μｇ/ｍｌ  ｍＲＮＡ
・１．２５μＭ  オリゴヌクレオチド（上記ＡＳＯ２）
上記組成を有する反応液の全量を４０μｌ（すなわちｍＲＮＡ含有量は１２．８μｇ）とし、この反応液中にて、２５℃、６時間でタンパク質合成を実施した。
【００５１】
［実施例２］
オリゴヌクレオチドとして、ＡＳＯ２の代わりにＡＳＯ１とＡＳＯ２との１：１（重量比）混合物が反応液中に１．２５μＭ含まれるように用いたこと以外は実施例１と同様にしてタンパク質合成を実施した。
【００５２】
［比較例１］
オリゴヌクレオチドとして、ＡＳＯ２の代わりに上記のＡＳＯ１を用いたこと以外は実施例１と同様にしてタンパク質合成を実施した。
【００５３】
［比較例２］
オリゴヌクレオチドを用いなかったこと以外は実施例１と同様にしてタンパク質合成を実施した。
【００５４】
実施例１、２、及び比較例１、２で合成されたＧＦＰは、マイクロプレートリーダーＧＥＮｉｏｓ（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて蛍光強度を測定した。別途既知濃度のＧＦＰ希釈系列を調製し蛍光強度を測定することによって作成したＧＦＰ濃度−蛍光強度の検量線から、合成されたＧＦＰ濃度を求めた。本発明の方法（実施例１及び２）と参考用の方法（比較例１）とによるＧＦＰ合成量と、従来法（比較例２）によるＧＦＰ合成量とを比較したものを図１に示す。図１においては、縦軸にＧＦＰの相対合成量（％）を表す。また、従来法（比較例２）による結果を「コントロール」の棒グラフで示し、本発明の方法のうち、オリゴヌクレオチドＡＳＯ２を用いた方法（実施例１）による結果を「ＡＳＯ２」の棒グラフで、オリゴヌクレオチドＡＳＯ１及びＡＳＯ２を用いた方法（実施例２）による結果を「ＡＳＯ１＋ＡＳＯ２」の棒グラフで示し、参考用にオリゴヌクレオチドＡＳＯ１を用いた方法（比較例１）による結果を「ＡＳＯ１」の棒グラフで、図１が示すように、本発明の方法によるといずれもＧＦＰ合成量の向上が確認され、比較例１ ＜ コントロール（比較例２） ＜ 実施例２ ＜ 実施例１の順で合成量が向上し、最大で従来法（比較例１）の約1.7倍の合成量を達成した。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】従来法（「コントロール」）によるタンパク質合成の結果と、参考用の方法（「ＡＳＯ１」）によるタンパク質合成の結果と、本発明の方法（「ＡＳＯ２」及び「ＡＳＯ１＋ＡＳＯ２」）によるタンパク質合成の結果とを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号１は、合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号２は、合成オリゴヌクレオチドである。
【図１】
2007151482.tif 000003
【配列表】
2007151482000001.app