(57)【要約】【課題】鋭敏、迅速かつ特異的に植物の病害誘導抵抗性の検定することが出来、新規な病害抵抗性誘導化合物（病害誘導抵抗性を発現させる化合物（農薬）＝plant activator）を簡易にスクリーニングする方法等を提供すること。【解決手段】（i）試験化合物をβ−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子を有する植物体又はその一部と接触させる工程、及び（ii）該遺伝子の発現量が増加するか否かを測定する工程から成る、病害抵抗性誘導化合物のスクリーニング方法、病害誘導抵抗性の検出方法、及び、それら方法に用いられるキット等。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）試験化合物をβ−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子を有する植物体又はその一部と接触させる工程、及び（ii）該遺伝子の発現量が増加するか否かを測定する工程から成る、病害抵抗性誘導化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子がβ−シアノアラニンシンターゼ遺伝子自身である、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
β−シアノアラニンシンターゼ調節配列に機能的に結合した遺伝子が異種遺伝子である、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
異種遺伝子がレポーター遺伝子である、請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列がシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のＤＮＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
β-シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列が、シロイヌナズナエコタイプColumbiaのゲノムDNAを鋳型とし、プライマー(5’-CTTGGCAACCATCCCAATCACTG-3’及び5’-CGACTAAAACG- GAGTAACCGAAG-3’)を用いた遺伝子増幅により得られるＤＮＡである、請求項５記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
β-シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列が、請求項５又は６記載のＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列として機能するＤＮＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
植物体又はその一部が、β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子により形質転換されている、請求項３〜７のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
形質転換ベクターを用いて形質転換された植物体又はその一部を使用する、請求項８記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
形質転換ベクターがバイナリーベクターである、請求項９記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子の発現量の増加を、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡ量により測定する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子から転写されたｍＲＮＡ量を、該遺伝子の少なくとも一部と相補的に結合するハイブリダイゼーション用プローブを用いて測定する、請求項１１記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
ハイブリダイゼーション用プローブが、トマト由来のβ−シアノアラニンシンターゼ遺伝子由来のｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマー：
5’-CATGGATGAGAATCTACGTACC-3’ 及び5’-TATAACAAAACAAACTCAATAC-3’を用いてＰＣＲにより調製されたものである、請求項１２記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子から転写されたｍＲＮＡ量を、該遺伝子の少なくとも一部を増幅することにより測定する、請求項１１記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子の発現量の増加を、該遺伝子から発現される蛋白質の量により測定する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
発現される蛋白質が蛍光蛋白質である、請求項１５記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法における測定に用いられる病害抵抗性誘導化合物スクリーニング用キット。
【請求項１８】
β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子の少なくとも一部と相補的に結合するハイブリダイゼーション用プローブを含む、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子の少なくとも一部を増幅可能な増幅用プライマーを含む、請求項１７記載のキット。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のスクリーニング方法によって得られた化合物を有効成分として含有する病害抵抗性誘導剤。
【請求項２１】
β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子により形質転換された植物体又はその一部。
【請求項２２】
β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子が異種遺伝子である、請求項２１記載の植物体又はその一部。
【請求項２３】
β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子がレポーター遺伝子である、請求項２２記載の植物体又はその一部。
【請求項２４】
（i）試験化合物をβ−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子を有する植物体又はその一部と接触させる工程、及び（ii）該遺伝子の発現量が増加するか否かを測定する工程から成る、該植物体又はその一部における病害誘導抵抗性の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物病原体に対する誘導抵抗性の発現を迅速かつ特異的に検出できるマーカー遺伝子を利用した病害抵抗性誘導化合物のスクリーニング方法、病害誘導抵抗性の検出方法、及び、それら方法に用いられるキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
病害抵抗性誘導剤は通常病原体には直接作用せず、直物自体の防御応答機能の活性化によって植物に病害抵抗性（誘導抵抗性）を発現させるものである。このような誘導抵抗性はピシウム・オリガンドラム（Pythium oligandrum）等の菌が生産する蛋白質によって発現されることが知られている（特許文献１）。
【０００３】
病害抵抗性誘導剤は、その特異的な作用機構から耐性菌を生じる危険性も殆どないと考えられる。又、このような病害抵抗性誘導剤は環境負荷も少なく、次世代型の病害制御剤として期待されており、その代表例として、プロベナゾール、ベンゾチアゾール（ＢＴＨ）系のアシベンゾラルＳメチル、及びチアジアゾールカルボキサミド系のチアジニル等の化学合成系農薬、並びに、シュードモナス・フルオレッセンス、タラロマイセス・フラバス、非病原性フザリウム等の生物農薬を挙げることが出来る。しかしながら、これまでに利用されている病害抵抗性誘導剤は僅かであり現場への普及は未だ十分ではなく、有効な病害抵抗性誘導剤の開発が求められている。
【０００４】
従来、このような有効な病害抵抗性誘導剤を同定・スクリーニングするために、病原体接種による抵抗性検定試験（すなわち、生物検定）により植物病原体に対する誘導抵抗性の検出が行われて来た。しかしながら、従来の生物検定には、接種病原体の調整、接種試験、発病抑制効果の評価など、時間と専門的な経験が必要とされている。
【特許文献１】特開２００３−８１９９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は上記課題を解決することであり、そのために、鋭敏、迅速かつ特異的に植物の病害誘導抵抗性の検定することが出来、新規な病害抵抗性誘導化合物（病害誘導抵抗性を発現させる化合物（農薬）＝plant activator）を簡易にスクリーニングする方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究の結果、植物において誘導抵抗性の発現に応答して、鋭敏、迅速かつ特異的に発現が誘導されるマーカー遺伝子としてβ−シアノアラニンシンターゼ（CAS）遺伝子を見出し、それに基づき本発明を完成した。尚、システインシンターゼ(CS)には数〜数１０種類のアイソザイムが知られており、そのアイソザイムのひとつがβ-シアノアラニンシンターゼ(CAS)である。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の各態様に係るものである。
［１]（i）試験化合物をβ−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子を有する植物体又はその一部と接触させる工程、及び（ii）該遺伝子の発現量が増加するか否かを測定する工程から成る、病害抵抗性誘導化合物のスクリーニング方法。
［２]β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子がβ−シアノアラニンシンターゼ遺伝子自身である、上記１記載のスクリーニング方法。
［３]β−シアノアラニンシンターゼ調節配列に機能的に結合した遺伝子が異種遺伝子である、上記１記載のスクリーニング方法。
［４]異種遺伝子がレポーター遺伝子である、上記３記載のスクリーニング方法。
［５]β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列がシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のＤＮＡである、上記１〜４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
［６]β-シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列が、シロイヌナズナエコタイプColumbiaのゲノムDNAを鋳型とし、プライマー(5’-CTTGGCAACCATCCCAATCACTG-3’及び5’-CGACTAAAACG- GAGTAACCGAAG-3’)を用いた遺伝子増幅により得られるＤＮＡである、上記５記載のスクリーニング方法。
［７]β-シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列が、上記５又は６記載のＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列として機能するＤＮＡである、上記１〜４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
［８]植物体又はその一部が、β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子により形質転換されている、上記３〜７のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
［９]形質転換ベクターを用いて形質転換された植物体又はその一部を使用する、上記８記載のスクリーニング方法。
［１０]形質転換ベクターがバイナリーベクターである、上記９記載のスクリーニング方法。
［１１]β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子の発現量の増加を、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡ量により測定する、上記１〜１０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
［１２]β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子から転写されたｍＲＮＡ量を、該遺伝子の少なくとも一部と相補的に結合するハイブリダイゼーション用プローブを用いて測定する、上記１１記載のスクリーニング方法。
［１３]ハイブリダイゼーション用プローブが、トマト由来のβ−シアノアラニンシンターゼ遺伝子由来のｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマー：
5’-CATGGATGAGAATCTACGTACC-3’及び5’-TATAACAAAACAAACTCAATAC-3’を用いてＰＣＲにより調製されたものである、上記１２記載のスクリーニング方法。
［１４]β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子から転写されたｍＲＮＡ量を、該遺伝子の少なくとも一部を増幅することにより測定する、上記１１記載のスクリーニング方法。
［１５]β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子の発現量の増加を、該遺伝子から発現される蛋白質の量により測定する、上記１〜１０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
［１６]発現される蛋白質が蛍光蛋白質である、上記１５記載のスクリーニング方法。
［１７]上記１〜１６のいずれか一項に記載の方法における測定に用いられる病害抵抗性誘導化合物スクリーニング用キット。
［１８]β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子の少なくとも一部と相補的に結合するハイブリダイゼーション用プローブを含む、上記１７記載のキット。
［１９]β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子の少なくとも一部を増幅可能な増幅用プライマーを含む、上記１７記載のキット。
［２０]上記１〜１６のいずれか一項に記載のスクリーニング方法によって得られた化合物を有効成分として含有する病害抵抗性誘導剤。
［２１]β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子により形質転換された植物体又はその一部。
［２２]β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子が異種遺伝子である、上記２１記載の植物体又はその一部。
［２３]β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子がレポーター遺伝子である、上記２２記載の植物体又はその一部。
［２４]（i）試験化合物をβ−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子を有する植物体又はその一部と接触させる工程、及び（ii）該遺伝子の発現量が増加するか否かを測定する工程から成る、該植物体又はその一部における病害誘導抵抗性の検出方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、誘導抵抗性を簡便に検出することにより、病害抵抗性誘導化合物を網羅的、迅速かつ特異的にスクリーニングすることが出来る。従って、本発明のスクリーニング方法の工程を用いて、該植物体又はその一部における病害誘導抵抗性を検出することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のスクリーニング方法において、β−シアノアラニンシンターゼ（CAS）遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子は、その発現量を測定することが可能なものである限り、その種類・特性・由来等に特に制限はない。例えば、それはCAS遺伝子自身でも良く、この場合には該遺伝子を天然に有する植物体又はその一部をそのままで使用することが出来る。
【００１０】
或いは、CAS遺伝子調節配列に機能的に結合した異種遺伝子を使用することも可能である。ここで、「CAS遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子」とは、適当な細胞中でCAS遺伝子調節配列の制御下に該遺伝子が発現されるように、CAS遺伝子調節配列の下流に結合した遺伝子を意味する。このような、CAS遺伝子調節配列と異種遺伝子との機能的な結合は、当業者に公知の遺伝子工学的手法により、容易に実施することが出来る。
【００１１】
このような異種遺伝子の例としては、一般に「レポーター遺伝子」と呼ばれる各種の標識蛋白質をコードする遺伝子を挙げることが出来る。この標識蛋白質としては、発現した蛋白質の検出に使用する物質として当業者に公知の任意の蛋白質を使用することが出来る。このような物質の代表例として、オワンクラゲ由来のＧＦＰ（Green fluorescent protein）、ＹＦＰ（Yellow fluorescent protein）、ＲＦＰ（Red fluorescent protein）及びＢＦＰ（Blue fluorescent protein）のような緑、黄色、赤、青等の可視光域の多彩な色彩で自家蛍光を発する蛋白質、又は、経時に色彩が変化する蛋白質を挙げること出来る。更には、赤外光域や紫外光域の蛍光を発する蛋白質を使用することも可能である。
【００１２】
また、標識蛋白質として特定の抗原性を持つ蛋白質を用い、その抗原性を認識する蛍光抗体を用いれば、核に蛍光を持たせることが可能となる。更に、標識蛋白質としてルシフェラーゼのような酵素蛋白質を用い、その酵素蛋白質の働きにより、蛍光を発する物質が産生されるような基質を用いることも出来る。
【００１３】
CAS遺伝子調節配列の種類に特に制限はなく、任意の植物に由来するものを使用することが出来る。本明細書において、「調節配列」とは、制御配列とも呼ばれるＤＮＡ上の配列であり、プロモーター近位配列、プロモーター遠位配列、エンハンサー、サプレッサー、その他の転写因子結合配列等の遺伝子転写効率を調節するＤＮＡ配列の少なくとも一つの要素を含む配列を意味する。該CAS遺伝子調節配列の長さ（塩基数）に特に制限はなく、通常、数百〜数千塩基対である。
【００１４】
CAS遺伝子調節配列の一例として、例えば、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のCAS遺伝子調節配列を使用することが出来る。シロイヌナズナ由来のCAS遺伝子調節配列は、例えば、シロイヌナズナゲノムＤＮＡを鋳型とし、当業者に公知のシロイヌナズナに関するＤＮＡ配列情報（GenBank accession no. AB024282.1）に基づき適宜設計したプライマーを使用するPCR（Polymerase Chain Reaction）法等の当業者に公知の任意の遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００１５】
具体的には、本明細書中の実施例に示されるように、例えば、シロイヌナズナエコタイプColumbiaのゲノムDNAを鋳型とし、プライマー：5’-CTTGGCAACCATCCCAATCACTG-3’（配列番号２１）及び5’-CGACTAAAACG GAGTAACCGAAG-3’（配列番号２２）を用いた遺伝子増幅（ＰＣＲ）によりCAS遺伝子調節配列を容易に調製することが出来る。
【００１６】
更に、上記のCAS遺伝子調節配列の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、CAS遺伝子調節配列として機能するＤＮＡも、本発明におけるCAS遺伝子調節配列として使用することが出来る。又は、上記のCAS遺伝子調節配列の塩基配列と８０％、好ましくは９０％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列からなるＤＮＡも本発明においてCAS遺伝子調節配列として使用することが出来る。
【００１７】
本明細書において、ハイブリダイズにおける「ストリンジェント（stringent）な条件」は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。更に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。従って、ストリンジェントな条件の好適な一具体例としては、5 x SSC (750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウム)、0.1% SDS、5 x デンハルト溶液、50%ホルムアミド、及び42℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、0.1 x SSC (15 mM NaCl、1.5 mM クエン酸三ナトリウム)、0.1% SDS、及び55℃の条件で洗浄を行うものである。
【００１８】
又、本発明のCAS遺伝子調節配列は、任意の植物に由来する各種のCAS遺伝子のＤＮＡ配列情報に基づき、当業者に公知の方法（例えば、Carruthers（1982）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams（1983）J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov（1997）Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel（1995）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380;Blommers（1994）Biochemistry 33:7886-7896; Narang（1979）Meth. Enzymol. 68:90;Brown（1979）Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage（1981）Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号）に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することもできる。
【００１９】
本発明方法における植物体に特に制限はないが、病害駆除の必要性が高い、イネ及び小麦等の穀物類、ダイズ及びエンドウなどの豆類、ジャガイモなどのイモ類、トマト、キュウリ、ナス、及びキャベツ等の野菜類、リンゴ及びナシ等の果物類、ワタ、ヒマワリ、並びにタバコ等の農作物を挙げることが出来る。試験化合物と接触させる対象としては、このような植物体そのものに加えて、その任意の一部であっても良い。このような直物体の一部としては、例えば、病害虫が感染し易いような部位である、葉、根、及び、それらに由来する組織の一部、更には、カルス等の培養組織を挙げることが出来る。
【００２０】
又、このような植物体又はその一部は、CAS遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子により形質転換されているものであっても良い。このような形質転換（遺伝子導入）の手段としては、植物等の種類・形態、遺伝子の種類等に応じて当業者に公知の任意の方法を使用することが出来る。その代表例として、CASプロモーターに機能的に結合した遺伝子が挿入された各種の形質転換ベクターを用いた導入法を挙げることが出来る。
【００２１】
各種の形質転換ベクターは当業者に公知の任意の方法で作製することが出来、CAS遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子以外に、ポリＡ付加配列 (たとえばNOSターミナーター)、 T-DNAのright border配列およびleft border配列、形質転換体選抜のための薬剤耐性遺伝子(たとえばカナマイシン分解酵素遺伝子NPTII)等の発現ベクターの要素として当業者に公知の任意の要素を適宜含むことが出来る。
【００２２】
特に、アグロバクテリウムのTiプラスミドを利用したバイナリーベクターを使用すると効率よく植物体にCAS遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子を導入することが可能となる。
【００２３】
従って、試験化合物とCAS遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子を有する植物体又はその一部との接触は、試験化合物の種類・形態及び状態（例えば、溶液状又は粉末形態）、植物体又はその一部の種類及び形態等に応じて、インビトロ、インビボ等を含む、当業者に公知の様々な態様及び条件を適宜選択して実施することが出来る。
【００２４】
本発明方法において、CAS遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子の発現量の増加は、当業者に公知の任意の方法・手段で測定することが出来る。例えば、該遺伝子から転写されたｍＲＮＡ量により測定したり、又は、レポーター遺伝子から発現される蛋白質の量により測定することが出来る
【００２５】
例えば、発現されたｍＲＮＡ量の測定としては、ノーザンブロッティング（ノーザンハイブリダイゼーション）等の各種ハイブリダイゼーションを利用する方法、RNA分解酵素プロテクションアッセイ、並びに逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）及びリアルタイム定量PCR等の該遺伝子の少なくとも一部を増幅する方法を用いることが出来る。
【００２６】
例えば、各種のハイブリダイゼーションにおいては、CAS遺伝子の少なくとも一部と相補的に結合するハイブリダイゼーション用プローブを用いて測定することが出来る。このようなプローブの具体的としては、実施例に示したように、トマト由来のβ−シアノアラニンシンターゼ遺伝子由来のｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマー：５’−CATGGATGAGAATCTACGTACC-3’（配列番号３）及び  5’-TATAACAAAACAAACTCAATAC-3’（配列番号４）を用いてＰＣＲにより調製されたものを挙げることが出来る。
【００２７】
又、CAS遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子の少なくとも一部を増幅することにより測定する方法においては、該遺伝子の少なくとも一部を増幅可能なポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの増幅用プライマーを使用することが出来る。
【００２８】
CAS遺伝子調節配列に機能的に結合したレポーター遺伝子から発現される蛋白質量の測定としては、ウェスタンブロッティング、ELISAアッセイ、タンパク質アレイ（プロテインチップ）、免疫組織染色、及び二次元電気泳動等の当業者に公知の任意の方法を挙げることができる。
【００２９】
尚、このような蛋白質として、既に記載した蛍光蛋白質、特定の抗原性を持つ蛋白質、又は、ルシフェラーゼのような酵素蛋白質を用いた場合には、適当な測定装置又は目視により蛍光を検出することによって、極めて容易に該蛋白質の発現を測定することが出来る。
【００３０】
従って、本発明のスクリーニング方法における測定に用いられる病害抵抗性誘導化合物スクリーニング用キット（装置又はシステム）には、上記遺伝子の発現量を測定するための具体的な方法・手段に応じて、適当な構成をとることが出来る。該システムは、例えば、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドから成る本発明の遺伝子増幅用プライマー及びハイブリダイゼーション用のプローブを含むことが出来る。これらは、その用途に応じて、適当な長さ、例えば、３０〜５００個の連続した塩基配列から成る。
【００３１】
以上のキットに構成要素として含まれる、各種のプライマー、プローブ、又は、抗体は、当業者に公知の任意の放射性物質、蛍光物質、色素等の適当な標識物質によって標識されていても良い。更に、上記システムには、その構成・使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート（容器）等が含まれる。
【００３２】
本発明は、更に、以上のスクリーニング方法によって得られた化合物を有効成分として含有する病害抵抗性誘導剤にも係るものである。このような病害抵抗性誘導剤は当業者に公知の任意の製剤学的方法により調製することが可能である。又、例えば、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、徐放剤等の当業者に公知の任意の補助剤と適宜組み合わせて製剤化して適用することが考えられる。該病害抵抗性誘導剤は、液体、粉体、及び顆粒など様々な形態であり得る。本発明化合物の含有率、並びに、該病害抵抗性誘導剤の適用量、時期、経路及び方法等は、適用対象植物、有効成分の種類等に応じて、当業者が適宜決定することが出来る。
【００３３】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。又、特に記載のない場合には、以下の実施例は、例えば、Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている、当業者に公知の標準的な遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い、実施することが出来る。又、本明細書中に引用された文献の記載内容は本明細書の開示内容の一部を構成するものである。
【実施例】
【００３４】
Pythium oligandrum (PO)菌が生産するエリシター(CWP)をトマト根に処理することにより誘導される病害抵抗性において、発現が変動する遺伝子を、cDNAアレイを用いて網羅的に解析した。発現変動が認められた遺伝子の中で、特にコントロールと比較して7倍以上の顕著な発現上昇が認められた9遺伝子の中で、安定して発現が上昇するβ-シアノアラニンシンターゼ(CAS)遺伝子を見出した。このCAS遺伝子は、病害抵抗性の誘導剤として実用化されている３種類のPlant activatorの処理に対しても顕著な発現上昇を示し、他の環境ストレスでは誘導されないかった。更に、CWP処理によるCAS遺伝子の発現上昇の経時変動、及びCWP処理によるCAS遺伝子の組織特異性などについて検討を行い、CAS遺伝子が病害抵抗性誘導におけるマーカー遺伝子として利用できることを明らかにした。以下に、実験の詳細を記す。
【００３５】
実施例１：
（１）植物材料とPO菌エリシターおよびPlant activator処理
トマト品種マイクロトム(Lycopersicon esculentum cultivar Micro-Tom)を, 石英砂に播種し、24℃、連続光 (7,000 lux)照射下のグロスチャンバー内で約2週間栽培した。根を傷つけないように注意しながら石英砂を洗い流し、12穴プレート(Nunc co, USA)に置床し、0.35mlの2mg/ml CWP、0.1μg/ml Plant activator、又はコントロール（蒸留水：DW）を加え、24℃、連続光照射下で４時間インキュベートした。
【００３６】
CWPは、Pythium oligandrum isolate MMR2の細胞壁タンパク質画分を0.5M CaCl2で可溶化後、透析処理することにより調整した。Plant activatorとしては、3-allyloxy-1,2-benzisothiazole-1,1-dioxide (プロベナゾール)、benzo(1,2,3)thiadiazole-7- carbothioic acid S-methyl ester (ベンゾチアゾール (BTH)) 及びvalidamycin A (バリダマイシンA (VMA))の３剤を用いた。
【００３７】
（２）トマトcDNAアレイメンブレンの調整
（財）かずさＤＮＡ研究所（千葉県木更津市かずさ鎌足2-6-7）が所有するトマトESTクローンを用い、Japanese Solanaceae Genomics Project (J-SOL)コンソーシアムに参加して作成されたcDNAアレイメンブレンを用いた（ESTクローンリストはhttp://www.kazusa.or.jp/jsol/microtom/indexj.htmlを参照）。かずさＤＮＡ研究所で単離された11,520のトマトESTクローン（由来組織は果実と葉）は、pBluescript II SK(-)のEcoRIサイトとXhoIサイトで切断した部位に組み込まれている。各プラスミドDNAを鋳型とし、プライマー(XhoI側 5’-TCATTAGGCACCCCAGGCTTTACAC-3’（配列番号１）とEcoRI側 5’-gtaatacgactcactatagggc-3’（配列番号２）)を用いて、PCRで各ESTインサートを増幅した。増幅したインサートDNA 500ngを10μlのWell spot buffer (80%ホルムアミド、0.025%キシレンシアノール、20mM EDTA pH8.0)に溶かし、MICROGRID II Robotic Workstation (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA, U.S.A.)を用いて、ナイロンメンブレン(8x12 cm, バイオダインPAL)にスポッティングした。メンブレンを、0.2N NaOH, 1.5M NaClを含ませた3MM濾紙上に置き、2分間変性処理したのち、0.2M Tris-HCl(pH7.0)を含ませた3MM濾紙上に移し、2分間中和処理を行った。メンブレンを2xSSCで洗浄したのち、表面が光らなくなる程度に自然乾燥させ、UV-cross linker (120,000 Joules/cm2)で変性DNAをメンブレン上に固定した。
【００３８】
（３）アレイプローブの作成とアレイメンブレンのハイブリダイゼーション
トマト根からの全RNA抽出は、RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Chatsworth, CA, U.S.A.)を用いて行った。20μgの全RNAを9 μlの蒸留水に懸濁し、50μM oligo(dT)20を1 μl加え、65°C で 5 分間インキュベートした。室温に戻した後、5×cDNA synthesis buffer (Invitrogen, CA, U.S.A.)を 5 μl、0.1 M DTTを2 μl、dNTP mixture (20 mM dGTP, 20 mM dATP, 20 mM dTTP and 0.125 mM dCTP each)を1 μl、 [α33P]dCTP (Amersham Pharmacia Biotech, U.S.A.)を5μl、40 U μl-1 RNaseOUT (Invitrogen, CA, U.S.A.)を1 μl、15 Uμl-1 Thermoscript RT (Invitrogen, CA, U.S.A.)を1 μl加え、50°Cで60分間インキュベートした。 85°Cで5分間インキュベートすることにより酵素を不活性かさせた後、 RNase Hを2ユニット加え、37°Cで20分間インキュベートした。合成されたcDNAをProbeQuant G-50 Micro column (Amersham Pharmacia Biotech, U.S.A.) を用いてゲル濾過により精製し、33PラベルcDNAプローブとした。
【００３９】
マクロアレイメンブレン１枚あたり 12 ml の0.5 M Church phosphate buffer [1 mM EDTA, 7% SDS と 12 μg/ml oligo(dA)18 を含む]を加え、55℃で6時間プレハイブリダイゼーションを行った。熱変性した33PラベルcDNAプローブを1 ml の0.5M Church phosphate buffer[1 mM EDTA, 7% SDS と 12 μg/ml oligo(dA)18 を含む]に懸濁し、新しいバッグに移したアレイメンブレンに加え、55℃で20時間ハイブリダイゼーションを行った。アレイメンブレンを、200mlの2xSSC (0.1% SDSを含む)に移し、25℃で5分間洗浄した。次に、200mlの1xSSC (0.1% SDSを含む)で65℃、15分間洗浄を1回、200mlの0.1xSSC (0.1% SDSを含む)で65℃、15分間洗浄を2回行った。アレイメンブレンをラップフィルムに包み、IP イメージプレート (Fuji Photo Film, Tokyo, Japan) に3日間露光させた。
【００４０】
（４）アレイデータの解析
IPイメージプレートをFX (Bio-Rad, U.S.A.) でスキャンし、シグナルの検出を行った。得られたシグナル像を、Array Vision 5.1 software (IMAGING Research Inc., Ontario, Canada)を用いて定量化した。３回の反復実験を行い、得られた各シグナル値について標準化処理後、CWP処理区とコントロール（蒸留水：DW）区の間で分散分析による有意差検定を行った。その結果、DW処理に対してCWP処理において142遺伝子で発現が3倍以上増加し、99遺伝子で発現が1/3以下に減少していた（図１）。    
【００４１】
実施例２：
ノーザンハイブリダイゼーションによる遺伝子発現の検出
ノザンハイブリダイゼーションに用いるプローブは、DW処理に対してCWP処理において発現が3倍以上増加した142遺伝子の中でも、特に5倍以上の顕著な発現上昇が認められた9遺伝子(CUG1〜CUG8 ：TC116638, TC125475, TC116923, TC117846, TC124613, TC116192, TC116283, 及びTC126254とBasic PR-2遺伝子）の各DNA断片を、pBluescript SK+ (Stratagene, CA, U.S.A.)のEcoRVサイトにクローニングすることにより調製した。各DNA断片は、トマト根のmRNAから逆転写した１本鎖cDNAを鋳型とし、以下のプライマーを用いてPCRにより増幅した。尚、得られた各プローブは約５００bp程度のDNA断片であった。
【００４２】
TC116638:  5’-CATGGATGAGAATCTACGTACC-3’  （配列番号３）及び 
5’-TATAACAAAACAAACTCAATAC-3’ （配列番号４）
TC125475:  5’-GGAGGGTGAAGCAATGAGGA-3’  （配列番号５）及び
5’-CAAACCTTCTCTCCCATGAC-3’ （配列番号６）
TC116923:  5’-GGAAACCAAAGTTATTTCTA-3’  （配列番号７）及び
5’-TAGTTCTTGAAAAGTTCCAA-3’ （配列番号８）
TC116192:  5’-GGCAAATTTGTTCATTAAGC-3’  （配列番号９）及び 
5’-CAATCCAAATTTCCAACTTT-3’ （配列番号１０）
TC124613:  5’-GGCTGATCTGAAGAAGAAAT-3’  （配列番号１１）及び
5’-TACTTCTGCCTCTTATAAAT-3’ （配列番号１２）
TC117846:  5’-GGCCAGGAAGAAGATCAGAG-3’  （配列番号１３）及び
5’- TATGCAGCTGCACTGATGCA-3’  （配列番号１４）
TC126254:  5’-CCATGGGAGCTGGTGGAAATATG-3（配列番号１５）及び
5’-CTTTCAAAGCTTGTTTTTATACC-3’ （配列番号１６）
TC116283:  5’-CATGGATGAGAATCTACGTACC-3’  （配列番号１７）及び
5’-TATAACAAAACAAACTCAATAC-3’ （配列番号１８）
Basic PR2:  5’-GTGCTTCTAGGATTACTTGTCGCCACC-3’（配列番号１９）及び
5’-CTCACTAGTGAGTGAAGAAGCAGTGC-3’（配列番号２０） 
【００４３】
実施例１（１）の記載されたように品種マイクロトムを処理し、そのトマト根からの全RNA抽出は、RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Chatsworth, CA, U.S.A.)を用いて行った。CWPまたは蒸留水を処理したトマト根より抽出した10 μgの全RNAを1.2%アガロースゲルで電気泳動後、ナイロンメンブレンにブロットした。メンブレンにプレハイブリダイゼーション液(5xSSPE, 50%ホルムアミド, 0.1%SDS, 5xDenhart’s solution, 100μg/mlキャリアーDNA)10mを加え、42℃で6時間インキュベートした。MegaprimeTM DNA labeling systems (Amersham-Pharmacia, NJ, U.S.A.)により[32P]dCTP で各DNA断片をラベル後、熱変性してプローブとした。プレハイブリダイゼーション液に浸積しているメンブレンにプローブを加え、さらに20時間、42℃でインキュベートした。メンブレンを、2xSSC (0.1% SDSを含む)に移し、25℃で5分間洗浄したのち、0.1xSSC (0.1% SDSを含む)で55℃、20分間洗浄を2回行った。アレイメンブレンをラップフィルムに包み、X-rayフィルムで3日間露光後に現像しバンドを検出した。その結果、CUG1〜CUG5, CUG7, CUG8及びBasic PR-2で発現上昇が確認された（図２）。さらに、それらの遺伝子が、Plant activatorのひとつである3-allyloxy-1,2-benzisothiazole-1,1-dioxide (PBZ)によっても誘導されるかどうか調べたところ、CUG1〜CUG3でCWP処理と同様に発現誘導が認められた（図２）。
【００４４】
次に、CUG1〜CUG3について、３種類のPlant activator: PBZ、benzo(1,2,3)thiadiazole-7- carbothioic acid S-methyl ester (BTH) 、validamycin A (VMA)を用いた実施例１と同様な処理に対する応答をさらに調べたところ、特にCUG1が、すべてのPlant activatorに対し安定して高い発現誘導を示すことが明らかになった（図３Ａ）。一方、誘導抵抗性に関する基礎研究で用いられている化合物INA処理では、同遺伝子の発現は上昇しなかった(図３Ａ)。
【００４５】
このCUG1は、β−シアノアラニンシンターゼ（CAS）の遺伝子をコードしていた（http://www.kazusa.or.jp/jsol/microtom/indexj.htmlを参照）。また、以下の表１に示すような各種環境ストレスに対するCASの発現について検討したところ、それらストレスでは顕著な発現誘導は認められなかった(図３Ｂ)。従って、エリシタータンパク質やplant activatorによるCASの発現上昇は、単なるストレス応答ではなく、誘導抵抗性と相関する特異性の高い現象であると考えられた。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
実施例３：
形質転換ベクターの構築
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のβ-シアノアラニンシンターゼ遺伝子プロモーター(約1.2 kbp、CAS-pro)は、シロイヌナズナエコタイプColumbiaのゲノムDNAを鋳型とし、プライマー(5’-CTTGGCAACCATCCCAATCACTG-3’（配列番号２１）)及び 5’-CGACTAAAACGGAGTAACCGAAG-3’（配列番号２２）)を用いてPCR増幅した。CAS-pro、pEGFP (BD Biosciences, CA, U.S.A.)のGFPオープンリーディングフレーム領域、NOSターミネーター(NOS-Term.)を連結してpUC18にクローニングし、pCAS-pro:GFPを作成した。得られたCAS-pro:GFP:NOS-T断片を植物形質転換用バイナリーpGA482 (Pharmacia, NJ, U.S.A.)のright borderとleft borderの間にクローニングし、形質転換ベクターpGA.CAS-pro:GFPを作出した（図４）。pGA.CAS-pro:GFPを形質転換したAgrobacterium tumefaciens LBA4404を用いて、リーフディスク法によりトマト、タバコ、シロイヌナズナに形質転換を行った。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
β−シアノアラニンシンターゼ遺伝子調節配列に機能的に結合した遺伝子により形質転換されている植物体又はその一部は、誘導抵抗性活性を有する化合物の選抜に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】アレイメンブレンにより得られたアレイ解析データのScattered plotを示す。
【図２】CWP及びPBZ処理によるCUG1〜8遺伝子及びBasic PR-2遺伝子のノーザンハイブリダイゼーションによる遺伝子発現の解析結果を示す。
【図３】各種ストレスに対するβ−シアノアラニンシンターゼ（CAS）遺伝子のノーザンハイブリダイゼーションによる遺伝子発現の解析結果を示す。
【図４】形質転換ベクターpGA.CAS-pro:GFPの構造を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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