(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞抽出物などから核酸を選択的にかつ効率的に吸着できる核酸吸着体、及びそれを用いた、核酸吸着・除去・解離・回収方法、使用後の再生方法を提供する。【解決手段】下記の式（I）で表される構成単位を有する重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体を用いる。2007054739.tif 000033Ｒ１は水素、フッ素またはメチル、Ｒ２及びＲ３は独立して炭素数１から６のアルキル、Ａは−ＮＨ−又は−Ｏ−、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。これを細胞抽出物に混合して核酸に吸着させた後、分離して細胞抽出物から核酸を除去し、アルカリ処理して核酸を核酸吸着体から解離させることにより、細胞抽出物から核酸を回収する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞抽出液中に含まれる核酸を吸着させるための核酸吸着体であって、
下記の式（I）で表される構成単位を有する重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体。
2007054739.tif 000018
式（I）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【請求項２】
式（I）において、Ｒ１が水素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してメチル、エチルまたはプロピルであり、Ａが−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂが炭素数２から６のアルキレンである請求項１に記載の核酸吸着体。
【請求項３】
式（I）において、Ｒ１が水素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してメチルまたはエチルであり、Ａが−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂがプロピレンである請求項１に記載の核酸吸着体。
【請求項４】
式（I）において、Ｒ１が水素であり、Ｒ２およびＲ３がメチルであり、Ａが−ＮＨ−であり、Ｂがプロピレンである請求項１に記載の核酸吸着体。
【請求項５】
式（I）において、Ｒ１がメチルであり、Ｒ２およびＲ３がメチルであり、Ａが−ＮＨ−であり、Ｂがプロピレンである請求項１に記載の核酸吸着体。
【請求項６】
細胞抽出液中に含まれる核酸を吸着させるための核酸吸着体であって、
下記の式（II）で表される１つの単量体から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体。
2007054739.tif 000019
式（II）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【請求項７】
細胞抽出液中に含まれる核酸を吸着させるための核酸吸着体であって、
下記の式（II）で表される少なくとも１つの単量体を含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体。
2007054739.tif 000020
式（II）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【請求項８】
式（II）において、Ｒ１が水素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してメチル、エチルまたはプロピルであり、Ａが−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂが炭素数２から６のアルキレンである請求項６または７に記載の核酸吸着体。
【請求項９】
式（II）において、Ｒ１が水素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３がメチルであり、Ａが−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂが炭素数２から６のアルキレンである請求項６または７に記載の核酸吸着体。
【請求項１０】
式（II）において、Ｒ１が水素であり、Ｒ２およびＲ３がメチルであり、Ａは−ＮＨ−であり、Ｂがプロピレンである請求項６または７に記載の核酸吸着体。
【請求項１１】
式（II）において、Ｒ１がメチルであり、Ｒ２およびＲ３がメチルであり、Ａは−ＮＨ−であり、Ｂがプロピレンである請求項６または７に記載の核酸吸着体。
【請求項１２】
下記の式（III）で表される少なくとも１つの単量体をさらに含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた請求項７に記載の核酸吸着体。
2007054739.tif 000021
式（III）において、Ｒ４は水素またはメチルであり、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立して炭素数１から３のアルキルであり、Ｄは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｅは炭素数２から６のアルキレンであり、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、１／２ＳＯ４、１／３ＰＯ４、１／２ＣＯ３、またはＮＯ２である。
【請求項１３】
下記の式（IV）で表される少なくとも１つの単量体をさらに含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた請求項７に記載の核酸吸着体。
2007054739.tif 000022
式（IV）において、Ｒ８は水素またはメチルであり、Ｒ９は炭素数１から３のアルキルであり、Ｇは−ＮＨ−、−ＮＲ１０−または−Ｏ−であり、Ｒ１０は炭素数１から３のアルキルである。
【請求項１４】
架橋剤によって重合体を水不溶性担体に固定化させた請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸吸着体。
【請求項１５】
架橋剤がエピクロロヒドリンである請求項１４に記載の核酸吸着体。
【請求項１６】
水不溶性担体が球状、中空糸状または膜状である請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸吸着体。
【請求項１７】
水不溶性担体がセルロースである請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸吸着体。
【請求項１８】
セルロースが球状粒子である請求項１７に記載の核酸吸着体。
【請求項１９】
前記細胞抽出液が酵母抽出液であることを特徴とする請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸吸着体。
【請求項２０】
細胞抽出液中に含まれる核酸を吸着する方法であって、
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の核酸吸着体を、核酸を含む溶液と混合することを特徴とする方法。
【請求項２１】
細胞抽出液中に含まれる核酸を除去する方法であって、
請求項２０に記載の吸着方法によって前記核酸を吸着させた前記核酸吸着体を前記細胞抽出液から分離することを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記細胞抽出液が酵母抽出液であることを特徴とする請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
溶液中で核酸を吸着した、下記の式（I）で表される構成単位を有する重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体から、前記核酸を解離させる方法であって、
前記溶液のイオン強度を０．３以上３．０以下にすることを特徴とする方法。
2007054739.tif 000023
式（I）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【請求項２４】
溶液中で核酸を吸着した、下記の式（II）で表される１つの単量体から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体から、前記核酸を解離させる方法であって、
前記溶液のイオン強度を０．３以上３．０以下にすることを特徴とする方法。
2007054739.tif 000024
式（II）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【請求項２５】
溶液中で核酸を吸着した、下記の式（II）で表される少なくとも１つの単量体を含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体から、前記核酸を解離させる方法であって、
前記溶液のイオン強度を０．３以上３．０以下にすることを特徴とする方法。
2007054739.tif 000025
式（II）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【請求項２６】
溶液中で核酸を吸着した、下記の式（III）で表される少なくとも１つの単量体をさらに含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた請求項２５に記載の核酸吸着体から、前記核酸を解離させる方法であって、
前記溶液のイオン強度を０．３以上３．０以下にすることを特徴とする方法。
2007054739.tif 000026
式（III）において、Ｒ４は水素またはメチルであり、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立して炭素数１から３のアルキルであり、Ｄは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｅは炭素数２から６のアルキレンであり、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、１／２ＳＯ４、１／３ＰＯ４、１／２ＣＯ３、またはＮＯ２である。
【請求項２７】
溶液中で核酸を吸着した、下記の式（IV）で表される少なくとも１つの単量体をさらに含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた請求項２５に記載の核酸吸着体から、前記核酸を解離させる方法であって、
前記溶液のイオン強度を０．３以上３．０以下にすることを特徴とする方法。
2007054739.tif 000027
式（IV）において、Ｒ８は水素またはメチルであり、Ｒ９は炭素数１から３のアルキルであり、Ｇは−ＮＨ−、−ＮＲ１０−または−Ｏ−であり、Ｒ１０は炭素数１から３のアルキルである。
【請求項２８】
前記イオン強度を０．６以上１．２以下にすることを特徴とする請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記溶液が、細胞抽出液であることを特徴とする請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
細胞抽出液から核酸を回収する方法であって、
請求項２０に記載の核酸吸着方法によって、該核酸を前記核酸吸着体に吸着させ、
請求項２１に記載の核酸除去方法によって、該核酸の吸着した該核酸吸着体を該細胞抽出液から分離し、
請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の核酸解離方法によって、該核酸の吸着した該核酸吸着体から、該核酸を解離させ、
解離した該核酸吸着体を分離することを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記細胞抽出液が酵母抽出液であることを特徴とする請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
下記の式（I）で表される構成単位を有する重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体を再生する方法であって、
核酸を回収するのに用いられた前記核酸吸着体を、アルカリ溶液で洗浄することを特徴とする方法。
2007054739.tif 000028
式（I）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【請求項３３】
下記の式（II）で表される１つの単量体から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体を再生する方法であって、
核酸を回収するのに用いられた前記核酸吸着体を、アルカリ溶液で洗浄することを特徴とする方法。
2007054739.tif 000029
式（II）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【請求項３４】
下記の式（II）で表される少なくとも１つの単量体を含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体を再生する方法であって、
核酸を回収するのに用いられた前記核酸吸着体を、アルカリ溶液で洗浄することを特徴とする方法。
2007054739.tif 000030
式（II）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【請求項３５】
下記の式（III）で表される少なくとも１つの単量体をさらに含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた請求項３４に記載の核酸吸着体を再生する方法であって、
核酸を回収するのに用いられた前記核酸吸着体を、アルカリ溶液で洗浄することを特徴とする方法。
2007054739.tif 000031
式（III）において、Ｒ４は水素またはメチルであり、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立して炭素数１から３のアルキルであり、Ｄは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｅは炭素数２から６のアルキレンであり、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、１／２ＳＯ４、１／３ＰＯ４、１／２ＣＯ３、またはＮＯ２である。
【請求項３６】
下記の式（IV）で表される少なくとも１つの単量体をさらに含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた請求項３４に記載の核酸吸着体を再生する方法であって、
核酸を回収するのに用いられた前記核酸吸着体を、アルカリ溶液で洗浄することを特徴とする方法。
2007054739.tif 000032
式（IV）において、Ｒ８は水素またはメチルであり、Ｒ９は炭素数１から３のアルキルであり、Ｇは−ＮＨ−、−ＮＲ１０−または−Ｏ−であり、Ｒ１０は炭素数１から３のアルキルである。
【請求項３７】
前記アルカリ溶液のｐＨが１２以上であることを特徴とする請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
核酸吸着体を複数回使用して、細胞抽出液から複数回核酸を回収する方法であって、
該核酸吸着体が、請求項３０に記載の核酸回収方法において分離され、
請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の核酸吸着体再生方法によって、再生され、
再生された該核酸吸着体を再使用することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸吸着体、それを用いた核酸吸着・除去・解離・回収方法、及びその再生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオテクノロジーを利用した医薬品の開発が盛んになり、組み替え遺伝子により有用な生体関連物質が量産されるようになった。組み替え遺伝子技術を利用して生産された医薬品が、核酸を不純物として含むことがある。この核酸が生体に及ぼす影響は十分に解明されていない。そのためＦＤＡおよびＷＨＯから、生物学的製剤に残存する核酸に関するガイドラインが発表されている。ＷＨＯのガイドラインによれば、成人一回の薬剤投与量において、残存する核酸の量は１０ｎｇ以下であることが望ましい（非特許文献１参照。）。
【０００３】
核酸を除去する方法は知られている。例えば、水溶性の核酸吸着剤を使用して核酸を凝集沈殿させ除去する方法である。核酸吸着剤は、プロタミン硫酸やストレプトマイシン（非特許文献２参照。）である。核酸吸着剤は、また、カチオン性ヒドロキシアルキルセルロース（特許文献１参照。）である。しかし、この方法は、水溶性の吸着剤を凝集処理するとき、遠心分離によって凝集物を除去する操作が必要になり、そして過剰に加えた溶解性の凝集剤を除去する操作が必要となる。
【０００４】
イオン交換、ゲルろ過、アフィニティーなどのクロマトグラフィー法も検討されている。この方法には、核酸の除去率が高くない、目的の生体関連物質の回収率が高くない、除去条件の設定が複雑である、クロマト剤の機械的強度が十分ではない、などの課題がある。これらの課題は、工業的な用途には好ましくない。例えば、キトサンによる核酸を吸着除去する方法では、核酸を含む溶液のｐＨが塩基性であるとき、核酸を除去する能力が低下する（特許文献２、特許文献３参照。）。
【特許文献１】特開平１−２５７９１号公報
【特許文献２】特開平３−１０９３９７号公報
【特許文献３】特開平３−１０９９４０号公報
【非特許文献１】ＷＥＥＫＬＹ  ＥＰIＤＥＭIＯＬＯＧIＣＡＬ  ＲＥＣＯＲＤ，Ｎｏ．２０，１６，ＭＡＹ，１９９７
【非特許文献２】生化学実験講座５、ｐ２０１、日本生化学会編、東京化学同人
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、核酸を選択的にかつ効率的に吸着できる核酸吸着体、それを用いた核酸吸着・除去・解離・回収方法、及び使用後の再生方法、特に、細胞抽出物などの複雑な混合物から核酸を選択的にかつ効率的に吸着できる核酸吸着体、それを用いた、細胞抽出物などの複雑な混合物からの核酸吸着・除去・解離・回収方法、及び細胞抽出物などの複雑な混合物に対する使用後の再生方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記した課題の解決するために検討を重ねた結果、下記に示す吸着体が核酸を選択的に吸着する能力を有することを見いだし、下記の項を含む本発明を完成するに至った。
【０００７】
（１）細胞抽出液中に含まれる核酸を吸着させるための核酸吸着体であって、下記の式（I）で表される構成単位を有する重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体。  
2007054739.tif 000002
式（I）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【０００８】
（２）式（I）において、Ｒ１が水素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してメチル、エチルまたはプロピルであり、Ａが−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂが炭素数２から６のアルキレンである（１）項に記載の核酸吸着体。
【０００９】
（３）式（I）において、Ｒ１が水素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してメチルまたはエチルであり、Ａが−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂがプロピレンである（１）に記載の核酸吸着体。
【００１０】
（４）式（I）において、Ｒ１が水素であり、Ｒ２およびＲ３がメチルであり、Ａが−ＮＨ−であり、Ｂがプロピレンである（１）項に記載の核酸吸着体。
【００１１】
（５）式（I）において、Ｒ１がメチルであり、Ｒ２およびＲ３がメチルであり、Ａが−ＮＨ−であり、Ｂがプロピレンである（１）項に記載の核酸吸着体。
【００１２】
（６）細胞抽出液中に含まれる核酸を吸着させるための核酸吸着体であって、下記の式（II）で表される１つの単量体から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体。  
2007054739.tif 000003
式（II）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【００１３】
（７）細胞抽出液中に含まれる核酸を吸着させるための核酸吸着体であって、下記の式（II）で表される少なくとも１つの単量体を含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体。  
2007054739.tif 000004
式（II）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【００１４】
（８）式（II）において、Ｒ１が水素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３が独立してメチル、エチルまたはプロピルであり、Ａが−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂが炭素数２から６のアルキレンである（６）項または（７）項に記載の核酸吸着体。
【００１５】
（９）式（II）において、Ｒ１が水素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３がメチルであり、Ａが−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂが炭素数２から６のアルキレンである（６）項または（７）項に記載の核酸吸着体。
【００１６】
（１０）式（II）において、Ｒ１が水素であり、Ｒ２およびＲ３がメチルであり、Ａは−ＮＨ−であり、Ｂがプロピレンである（６）項または（７）項に記載の核酸吸着体。
【００１７】
（１１）式（II）において、Ｒ１がメチルであり、Ｒ２およびＲ３がメチルであり、Ａは−ＮＨ−であり、Ｂがプロピレンである（６）項または（７）項に記載の核酸吸着体。
【００１８】
（１２）下記の式（III）で表される少なくとも１つの単量体をさらに含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた（７）項に記載の核酸吸着体。  
2007054739.tif 000005
式（III）において、Ｒ４は水素またはメチルであり、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立して炭素数１から３のアルキルであり、Ｄは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｅは炭素数２から６のアルキレンであり、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、１／２ＳＯ４、１／３ＰＯ４、１／２ＣＯ３、またはＮＯ２である。
【００１９】
（１３）下記の式（IV）で表される少なくとも１つの単量体をさらに含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた（７）項に記載の核酸吸着体。  
2007054739.tif 000006
式（IV）において、Ｒ８は水素またはメチルであり、Ｒ９は炭素数１から３のアルキルであり、Ｇは−ＮＨ−、−ＮＲ１０−または−Ｏ−であり、Ｒ１０は炭素数１から３のアルキルである。
【００２０】
（１４）架橋剤によって重合体を水不溶性担体に固定化させた（１）項〜（１３）項のいずれか１項に記載の核酸吸着体。
【００２１】
（１５）架橋剤がエピクロロヒドリンである（１４）項に記載の核酸吸着体。
【００２２】
（１６）水不溶性担体が球状、中空糸状または膜状である（１）項〜（１５）項のいずれか１項に記載の核酸吸着体。
【００２３】
（１７）水不溶性担体がセルロースである（１）項〜（１６）項のいずれか１項に記載の核酸吸着体。
【００２４】
（１８）セルロースが球状粒子である（１７）項に記載の核酸吸着体。
【００２５】
（１９）前記細胞抽出液が酵母抽出液であることを特徴とする（１）項〜（１８）項のいずれか１項に記載の核酸吸着体。
【００２６】
（２０）細胞抽出液中に含まれる核酸を吸着する方法であって、（１）項〜（１９）項のいずれか１項に記載の核酸吸着体を、核酸を含む溶液と混合することを特徴とする方法。
【００２７】
（２１）細胞抽出液中に含まれる核酸を除去する方法であって、（２０）項に記載の吸着方法によって前記核酸を吸着させた前記核酸吸着体を前記細胞抽出液から分離することを特徴とする方法。
【００２８】
（２２）前記細胞抽出液が酵母抽出液であることを特徴とする（２０）項または（２１）項に記載の方法。
【００２９】
（２３）溶液中で核酸を吸着した、下記の式（I）で表される構成単位を有する重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体から、前記核酸を解離させる方法であって、前記溶液のイオン強度を０．３以上３．０以下にすることを特徴とする方法。  
2007054739.tif 000007
式（I）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【００３０】
（２４）溶液中で核酸を吸着した、下記の式（II）で表される１つの単量体から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体から、前記核酸を解離させる方法であって、前記溶液のイオン強度を０．３以上３．０以下にすることを特徴とする方法。  
2007054739.tif 000008
式（II）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【００３１】
（２５）溶液中で核酸を吸着した、下記の式（II）で表される少なくとも１つの単量体を含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体から、前記核酸を解離させる方法であって、前記溶液のイオン強度を０．３以上３．０以下にすることを特徴とする方法。  
2007054739.tif 000009
式（II）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【００３２】
（２６）溶液中で核酸を吸着した、下記の式（III）で表される少なくとも１つの単量体をさらに含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた（２５に記載の核酸吸着体から、前記核酸を解離させる方法であって、前記溶液のイオン強度を０．３以上３．０以下にすることを特徴とする方法。  
2007054739.tif 000010
式（III）において、Ｒ４は水素またはメチルであり、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立して炭素数１から３のアルキルであり、Ｄは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｅは炭素数２から６のアルキレンであり、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、１／２ＳＯ４、１／３ＰＯ４、１／２ＣＯ３、またはＮＯ２である。
【００３３】
（２７）溶液中で核酸を吸着した、下記の式（IV）で表される少なくとも１つの単量体をさらに含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた（２５）項に記載の核酸吸着体から、前記核酸を解離させる方法であって、前記溶液のイオン強度を０．３以上３．０以下にすることを特徴とする方法。  
2007054739.tif 000011
式（IV）において、Ｒ８は水素またはメチルであり、Ｒ９は炭素数１から３のアルキルであり、Ｇは−ＮＨ−、−ＮＲ１０−または−Ｏ−であり、Ｒ１０は炭素数１から３のアルキルである。
【００３４】
（２８）前記イオン強度を０．６以上１．２以下にすることを特徴とする（２３）項〜（２７）項のいずれか１項に記載の方法。
【００３５】
（２９）前記溶液が、細胞抽出液であることを特徴とする（２３）項〜（２８）項のいずれか１項に記載の方法。
【００３６】
（３０）細胞抽出液から核酸を回収する方法であって、（２０）項に記載の核酸吸着方法によって、該核酸を前記核酸吸着体に吸着させ、（２１）項に記載の核酸除去方法によって、該核酸の吸着した該核酸吸着体を該細胞抽出液から分離し、（２３）項〜（２８）項のいずれか１項に記載の核酸解離方法によって、該核酸の吸着した該核酸吸着体から、該核酸を解離させ、解離した該核酸吸着体を分離することを特徴とする方法。
【００３７】
（３１）前記細胞抽出液が酵母抽出液であることを特徴とする（２９）項または（３０）項に記載の方法。
【００３８】
（３２）下記の式（I）で表される構成単位を有する重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体を再生する方法であって、核酸を回収するのに用いられた前記核酸吸着体を、アルカリ溶液で洗浄することを特徴とする方法。  
2007054739.tif 000012
式（I）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【００３９】
（３３）下記の式（II）で表される１つの単量体から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体を再生する方法であって、核酸を回収するのに用いられた前記核酸吸着体を、アルカリ溶液で洗浄することを特徴とする方法。  
2007054739.tif 000013
式（II）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【００４０】
（３４）下記の式（II）で表される少なくとも１つの単量体を含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた核酸吸着体を再生する方法であって、核酸を回収するのに用いられた前記核酸吸着体を、アルカリ溶液で洗浄することを特徴とする方法。  
2007054739.tif 000014
式（II）において、Ｒ１は水素、フッ素またはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は独立して炭素数１から６のアルキルであり、Ａは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｂは炭素数２から１８のアルキレンである。
【００４１】
（３５）下記の式（III）で表される少なくとも１つの単量体をさらに含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた（３４）項に記載の核酸吸着体を再生する方法であって、核酸を回収するのに用いられた前記核酸吸着体を、アルカリ溶液で洗浄することを特徴とする方法。  
2007054739.tif 000015
式（III）において、Ｒ４は水素またはメチルであり、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立して炭素数１から３のアルキルであり、Ｄは−ＮＨ−または−Ｏ−であり、Ｅは炭素数２から６のアルキレンであり、Ｘはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、１／２ＳＯ４、１／３ＰＯ４、１／２ＣＯ３、またはＮＯ２である。
【００４２】
（３６）下記の式（IV）で表される少なくとも１つの単量体をさらに含有する混合物から得られた重合体を水不溶性担体に固定化させた（３４）項に記載の核酸吸着体を再生する方法であって、核酸を回収するのに用いられた前記核酸吸着体を、アルカリ溶液で洗浄することを特徴とする方法。  
2007054739.tif 000016
式（IV）において、Ｒ８は水素またはメチルであり、Ｒ９は炭素数１から３のアルキルであり、Ｇは−ＮＨ−、−ＮＲ１０−または−Ｏ−であり、Ｒ１０は炭素数１から３のアルキルである。
【００４３】
（３７）前記アルカリ溶液のｐＨが１２以上であることを特徴とする（３４）項〜（３６）項のいずれか１項に記載の方法。
【００４４】
（３８）核酸吸着体を複数回使用して、細胞抽出液から複数回核酸を回収する方法であって、該核酸吸着体が、（３０）項に記載の核酸回収方法において分離され、（３４）項〜（３７）項のいずれか１項に記載の核酸吸着体再生方法によって、再生され、再生された該核酸吸着体を再使用することを特徴とする方法。
【発明の効果】
【００４５】
本発明によって、核酸を選択的にかつ効率的に吸着できる核酸吸着体、それを用いた核酸吸着・除去・解離・回収方法、及び使用後の再生方法、特に、細胞抽出物などの複雑な混合物から核酸を選択的にかつ効率的に吸着できる核酸吸着体、それを用いた、細胞抽出物などの複雑な混合物からの核酸吸着・除去・解離・回収方法、及び細胞抽出物などの複雑な混合物に対する使用後の再生方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００４７】
＝＝核酸吸着体＝＝
「式（I）で表される構成単位を有する重合体」を「重合体（I）」と記載することがある。「式（II）で表される単量体」などを「単量体（II）」などのように記載することがある。（メタ）アクリルアミドは、アクリルアミドまたはメタアクリルアミドを意味する。（メタ）アクリル酸エステルなども同様な意味を有する。
【００４８】
本発明の核酸吸着体は、ジアルキルアミノを有する構成単位を含有する重合体（I）を、水に不溶な担体に固定化させた吸着体である。固定化には架橋剤などを用いる。重合体（I）は、単量体（II）の単独重合体、単量体（II）の共重合体、単量体（II）と他の単量体との共重合体などである。他の単量体の例は、単量体（III）、単量体（IV）などである。単独重合体の出発物は、１つの単量体（II）である。共重合体の出発物は、複数の単量体の混合物である。単量体の重合には重合開始剤や溶媒を用いてもよい。以下に、具体的な単量体、重合体の種類、単量体の重合条件、重合開始剤、重合に用いられる溶媒、水不溶性担体、重合体の固定（架橋剤）、重合体の分子量とｐＫａ、などを順に説明する。
【００４９】
単量体（II）は（メタ）アクリルアミドまたは（メタ）アクリル酸エステルである。これらの単量体はジアルキルアミノを有する。ジメチルアミノを有する単量体の例は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノブチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノペンチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノヘキシル（メタ）アクリルアミドなどである。
【００５０】
ジエチルアミノを有する単量体の例は、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノブチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノペンチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノヘキシル（メタ）アクリルアミドなどである。
【００５１】
その他のアミノを有する単量体の例は、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノブチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノペンチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノヘキシル（メタ）アクリルアミドなどである。
【００５２】
（メタ）アクリル酸エステルの例は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノブチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノペンチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノヘキシル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレートなどである。好ましい単量体（II）はＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミドである。
【００５３】
単量体（III）は、（メタ）アクリルアミドまたは（メタ）アクリル酸エステルの４級アンモニウム塩である。アミドの塩の例は、２−（メタ）アクリルアミドエチルトリメチルアンモニウム塩化物、３−（メタ）アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウム塩化物、４−（メタ）アクリルアミドブチルトリメチルアンモニウム塩化物、５−（メタ）アクリルアミドペンチルトリメチルアンモニウム塩化物、６−（メタ）アクリルアミドヘキシルトリメチルアンモニウム塩化物などである。
【００５４】
エステルの塩の例は、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウム塩化物、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウム塩化物、４−（メタ）アクリロイルオキシブチルトリメチルアンモニウム塩化物、５−（メタ）アクリロイルオキシペンチルトリメチルアンモニウム塩化物、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルトリメチルアンモニウム塩化物などである。
【００５５】
単量体（IV）は、その他の（メタ）アクリルアミドまたは（メタ）アクリル酸エステルである。このようなアミドの例は、（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミドなどである。このようなエステルの例は、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピルなどである。
【００５６】
単独重合体は、１つの単量体（II）から調製される。共重合体は、少なくとも２つの単量体（II）の混合物から調製される。共重合体は、また、少なくとも１つの単量体（II）の混合物から調製される。この混合物における他の単量体は、単量体（II）とは異なる単量体である。他の単量体の例は、単量体（III）、単量体（IV）などである。混合物は、単量体（III）および単量体（IV）の一方または両方を含んでもよい。混合物は、単量体（III）および単量体（IV）には該当しない単量体を含んでもよい。これらの混合物における単量体（II）の好ましい割合は、１０モル％以上である。好ましくは５０モル％以上である。この混合物は複数の単量体（II）だけであってもよい。１つの単量体（II）またはこれを含有する混合物を重合するとき、必要に応じて重合開始剤や溶媒などを添加してもよい。
【００５７】
重合反応には、公知の水溶液重合、懸濁重合、乳化重合などがある。工業的観点から好ましい反応は水溶液重合である。好ましい反応温度は、０℃から８０℃である。さらに好ましい反応温度は１０℃から５０℃である。反応は室温（２０℃から３０℃）で通常は行なわれる。好ましい反応時間は３から１０時間程度である。
【００５８】
重合開始剤は、アゾ化合物、過酸化物などである。過酸化物と還元剤との組合せたレドツクス系の化合物を用いてもよい。アゾ化合物の例は、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）、２，２’−アゾビスイソ酪酸ジメチルなどである。過酸化物の例は、過酸化水素、ラウロイルペルオキシド、ベンゾイルペルオキシド、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、塩素酸ソーダなどである。好ましい重合開始剤は過硫酸カリウムまたは過硫酸アンモニウムである
重合の溶媒は、水、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどである。好ましい溶媒は水である。単量体の好ましい濃度は０．１重量％から５０重量％の範囲である。さらに好ましい濃度は１重量％から２０重量％の範囲である。
【００５９】
水不溶性担体の例は、セルロース、アガロース、キチン、でんぷんなどの水不溶性の多糖類である。他の例は、アクリルアミド類、メタクリルアミド類、アクリル類、メタクリル類、ビニル類、アリル類、など単量体から得られる単独重合体や共重合体である。セルロース、アガロース、キチン、キトサン、でんぷんなどの多糖類が水溶性であるときは、架橋反応などの処理によって水不溶性にしてもよい。架橋反応などの処理は、物理的強度を大きくする目的で行なってもよい。好ましい担体の例はセルロースなどである。
【００６０】
水不溶性担体の形態は、特に限定されないが、粒子、糸、膜などである。好ましい形状は球状、中空糸状、膜状などである。粒子の好ましい形状は球状である。球状粒子は製造や、取り扱いが容易である。糸の好ましい形状は中空糸状である。中空糸状は、内部に連続または不連続の空洞を持つ繊維状を意味する。空洞は、紡糸液に発泡剤を添加する、または特殊な口金などを用いることによって形成される。膜の好ましい形状は多孔状である。市販のメンブランフィルターのような多孔状の膜は、一定の範囲の排除限界分子量を持っている。これらのうち好ましい担体はセルロースの球状粒子である。この粒子は、安価であり、生体適合性が高く、強度が大きく、カラム耐圧性が良好である。
【００６１】
重合体（I）を水不溶性担体に固定化するときは、重合体（I）のジアルキルアミノの求核性が利用される。このアミノに対して反応性を有するように、水不溶性担体には前処理をする。この前処理には架橋剤などを用いる。架橋剤は、複数の反応性官能基を有する化合物などである。二官能性化合物は、ジハロゲン化アルキル化合物、ジエポキシ化合物、アルカンジオールジグリシジルエーテル化合物、ハロゲン化アルキルエポキシド化合物などである。三官能性化合物は、トリハロゲン化アルカン化合物、アルカントリオールトリグリシジルエーテル化合物などである。
【００６２】
ジハロゲン化アルキル化合物の例は、１，３−ジクロロプロパン、１，４−ジクロロブタン、１，５−ジクロロペンタン、１，６−ジクロロヘキサン、１，７−ジクロロヘプタン、１，８−ジクロロオクタンなどである。ジエポキシ化合物の例は、１，２，３，４−ジエポキシブタン、１，２，４，５−ジエポキシペンタン、１，２，５，６−ジエポキシヘキサン、１，２，６，７−ジエポキシヘプタン、１，２，７，８−ジエポキシオクタン、１，２，８，９−ジエポキシノナン、１，２，９，１０−ジエポキシデカンなどである。
【００６３】
アルカンジオールジグリシジルエーテル化合物の例は、エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，３−プロパンジオールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、１，５−ペンタンジオールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテルなどである。ハロゲン化アルキルエポキシド化合物の例は、エピクロロヒドロリン、１−クロロ−３，４−エポキシブタン、１−クロロ−４，５−エポキシペンタン、１−クロロ−５，６−エポキシヘキサンなどである。
【００６４】
トリハロゲン化アルカン化合物の例は、２−クロロメチル−１，３−ジクロロプロパン、２−クロロエチル−１，３−ジクロロプロパンなどである。アルカントリオールトリグリシジルエーテルの例は、グリコールトリグリシジルエーテル、トリメチロールエタントリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパントリグリシジルエーテルなどである。
【００６５】
これらの多官能性化合物のうち好ましい架橋剤は、エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，３−プロパンジオールジグリシジルエーテルまたはエピクロロヒドロリンである。さらに好ましい架橋剤はエピクロロヒドロリンである。この化合物は固定化を制御するのに適しているので、核酸吸着体の調製が容易になる。
【００６６】
本発明の核酸吸着体は核酸を選択的に吸着する。この高い選択性は、重合体（I）の分子量やｐＫａなどの因子に基づいている。この因子を適切に設定することにより、核酸吸着体の表面における親水性や疎水性を制御することが可能になる。この制御によって、蛋白質などの生体物質と核酸吸着体との相互作用を低下させることができる。
【００６７】
重合体（I）の分子量はＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレンオキシド換算の重量平均分子量である。重合体（I）の分子量は、通常は１０００から５００万である。好ましい分子量は５０００から３００万である。さらに好ましい分子量は１万から１００万である。さらに好ましい分子量はまた１０万から２００万でもある。
【００６８】
重合体（I）は窒素を含んでいるので塩基性である。重合体（I）のｐＫａは、通常７．２から１０．４である。好ましいｐＫａは７．４から９．５である。さらに好ましいｐＫａは７．５から９．０である。
【００６９】
ここで、本発明の核酸吸着体の吸着対象となる核酸は何でもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またそれらの混合物、など、核酸の構成や長さなどに限定されない。
【００７０】
＝＝核酸の吸着・除去・吸着体からの解離・回収＝＝
本発明の核酸吸着体を用いることによって、核酸を選択的に吸着することができる。核酸を吸着した核酸吸着体は、系外に容易に取り出すことができる。核酸吸着体は、水不溶性担体に固定化された重合体（I）であるからである。また、核酸を吸着した核酸吸着体から、核酸を解離することができる。解離した核酸は、核酸吸着体から容易に分離し、回収することができる。したがって、この方法は蛋白質、酵素、生理活性物質などのような医薬品として有用な生体物質に含まれる核酸や、細胞抽出物などの複雑な混合物に含まれる核酸を除去したり、回収したりするのに有効である。
【００７１】
以下、このような核酸吸着体を用いて、核酸を含む溶液に対し、核酸の吸着・除去・吸着体からの解離・回収をおこなう方法について、具体的に述べる。
【００７２】
核酸吸着体は、吸着処理の前に適当な緩衝液で洗浄しておく。核酸吸着体は、核酸を含む溶液と混合したとき、核酸を吸着する。このように核酸を吸着した核酸吸着体を溶液から除去することにより、核酸自体を溶液から除去することができる。例えば、バッチ法では、チューブや試験管内で、緩衝液で洗浄した核酸吸着体を、核酸を含む溶液中に添加して混合したあと、核酸吸着体を分離する。この分離はろ過などの方法によって行なう。また、カラム法では、核酸吸着体を充填したカラムを緩衝液で洗浄したあと、核酸を含む溶液を通液させる。この方法によって核酸がカラムに吸着するので、核酸が除去された溶出液を得ることができる。ここで、緩衝液として、リン酸緩衝液、トリス緩衝液などを用いることができる。
【００７３】
このように分離した、核酸を吸着した核酸吸着体を、適当な緩衝液で洗浄する。核酸を回収するためには、核酸を核酸吸着体に吸着させたまま洗浄する必要がある。そのためには、０．９以下、より好ましくは０．４以下のイオン強度を有する水溶液を用いればよい。その際、核酸吸着体に付着した核酸以外の挟雑物を除去するために、０．２以上のイオン強度を有する塩溶液を用いることが好ましい。その後、０．３以上３．０以下、より好ましくは、０．６以上１．２以下のイオン強度を有する塩溶液で、核酸吸着体を処理することにより、核酸を核酸吸着体より解離させる。例えば、バッチ法では、０．２以上０．４以下のイオン強度を有する塩溶液を用いて、核酸を吸着した核酸吸着体を洗浄後、０．６以上１．２以下のイオン強度を有する塩溶液で、核酸を吸着した核酸吸着体を懸濁して核酸を核酸吸着体より分離し、遠心して上清を回収することにより核酸を回収することができる。また、カラム法では、核酸が吸着したカラムに、０．２以上０．４以下のイオン強度を有する塩溶液を適当量通液してカラムを洗浄し、０．６以上１．２以下のイオン強度を有する塩溶液で核酸を溶出させることにより、核酸を分離・回収できる。ここで、塩溶液としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸ナリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウムなどを用いることができ、その種類は特に限定されない。
【００７４】
このようにして使用した後の核酸吸着体を、アルカリ溶液を用いて洗浄することにより、残存した核酸を除去後、緩衝液で洗浄することにより再生させることができる。このアルカリ溶液は、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどを用いることができ、その種類は特に限定されない。また、水酸化ナトリウムに関し、０．２Ｍ，０．０５Ｍ，０．０１ＭのｐＨはそれぞれ１３．０，１２．６，１１．８であるので、ここでは、ｐＨ１２以上のアルカリを用いることが好ましく、ｐＨ１３．０以上のアルカリを用いることがより好ましい。こうして再生した核酸吸着体を、再び核酸の回収に用いることができる。この再生―回収は、少なくとも５回繰り返すことが可能である。
【実施例】
【００７５】
以下、本発明について実施例及び比較例を用いて詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されない。実験に用いたリン酸緩衝液のｐＨ及び濃度は、特に記載が無い場合、それぞれ、７及び０．０２Ｍであり、イオン強度は０．２である。ここで、イオン強度の調製は、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）に所定のイオン強度になるように塩化ナトリウムを加えて行った。
【００７６】
＜実施例１＞
＝＝Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体の調製＝＝
反応は窒素雰囲気下で行なった。攪拌機、温度計、窒素導入管を取り付けた１Ｌの３口フラスコに、イオン交換水（３２８ｇ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（１８．０ｇ）を入れて混合した。これに、５．０％過硫酸アンモニウム水溶液（１４．４ｇ）を滴下したあと、室温で１６時間撹拌して、重合体の水溶液を得た。この重合体の重量平均分子量は、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー；ポリエチレンオキシド換算）によって測定したところ、３００，０００であった。
【００７７】
＜実施例２＞
＝＝核酸吸着体Ａの調製＝＝
ポリエチレンオキシドを標準物質として測定した排除限界分子量が２００万の平均粒径８０μｍのセルロース微粒子（３００ｇ；水分９０重量％、乾燥重量３０．５ｇ）とイオン交換水（４１０ｇ）の混合物を３０℃に加温し、これに２０％水酸化ナトリウム水溶液（２２７ｇ）を加え、１時間撹拌した。次いでエピクロロヒドリン（１３１ｇ）を加え、２時間反応させた。反応混合物をろ過したあと、得られたエポキシ活性化セルロース粒子が中性になるまで水洗した。次に、エポキシ活性化セルロース粒子（１００ｇ；湿重量）と実施例１で調製したＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体の水溶液（１５０ｇ）を混合し、４５℃で１６時間反応させた。得られた反応混合物をろ過し、吸着体が中性になるまで水洗した。こうして得られた吸着体を吸着体Ａという。
【００７８】
＜実施例３＞
＝＝バッチ法による核酸の吸着体Ａへの吸着及び核酸溶液からの除去＝＝
吸着体Ａ（０．５０ｇ）およびリン酸緩衝液１０ｍLの混合物を室温で１０分間攪拌した。このようにして平衡化させたあと、ろ過によって、緩衝液と平衡化させた吸着体Ａを得た。この吸着体Ａと鮭精巣由来の核酸（ＤＮＡ；５０μｇ）および牛血清のアルブミン（ＢＳＡ；５０００μｇ）のリン酸緩衝液（５ｍＬ）溶液を混合し、２５℃で２時間撹拌した。撹拌したあと、上澄み液のＤＮＡの濃度を測定したところ、濃度は５０ｎｇ／ｍＬ以下（ＤＮＡ吸着率９９．５％以上）であった。上澄み液のＢＳＡの濃度を測定したところ、濃度は８３０μｇ／ｍＬ（ＢＳＡ回収率８３％）であった。
【００７９】
＜実施例４＞
＝＝クロマト法による核酸の吸着体Ａへの吸着及び核酸溶液からの除去＝＝
吸着体Ａ（１．６７ｍＬ）を充填したカラム（直径４．６ｍｍ、長さ１００ｍｍ）に、リン酸緩衝液を通液して、平衡化させた。次いで、鮭精巣由来の核酸（ＤＮＡ；１ｍｇ）および牛血清のアルブミン（ＢＳＡ；１００ｍｇ）のリン酸緩衝液（１００ｍＬ）溶液を流し、溶出液１００ｍＬを得た。溶出液のＤＮＡ濃度は０．３μｇ／ｍＬ以下（ＤＮＡ吸着率９７％以上）であり、ＢＡＳ濃度は９６０μｇ／ｍＬ（ＢＳＡ回収率９６％）であった。
【００８０】
＜実施例５＞
＝＝核酸吸着体Ｂの調製＝＝
ポリエチレンオキシドを標準物質として測定した排除限界分子量が１，０００の平均粒径８０μｍのセルロース微粒子（２５０ｇ；水分４６重量％、乾燥重量１３４ｇ）とイオン交換水（５０８ｇ）の混合物を３０℃に加温した。この混合物に２０％水酸化ナトリウム水溶液（２０７ｇ）を加え、１時間撹拌した。次いでエピクロロヒドリン（１３１ｇ）を加え、２時間反応させた。得られた反応混合物をろ過し、エポキシ活性化セルロース粒子が中性になるまで水洗した。次に、エポキシ活性化セルロース粒子（１００ｇ；湿重量）と実施例１で調製したＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体の水溶液（１５０ｇ）を混合し、４５℃で１６時間反応させた。得られた反応混合物をろ過し、吸着体が中性になるまで水洗した。こうして得られた吸着体をＢという。
【００８１】
＜実施例６＞
＝＝バッチ法による核酸の吸着体Ｂへの吸着及び核酸溶液からの除去＝＝
吸着体Ｂ（０．５０ｇ）およびリン酸緩衝液１０ｍLの混合物を室温で１０分間攪拌した。このようにして平衡化させたあと、ろ過によって緩衝液と平衡化させた吸着体Ｂを得た。この吸着体Ｂ、鮭精巣由来の核酸（ＤＮＡ；５０μｇ）および牛血清のアルブミン（ＢＳＡ；５０００μｇ）のリン酸緩衝液（５ｍＬ）溶液を混合し、２５℃で２時間撹拌した。撹拌したあと、上澄み液のＤＮＡ濃度を測定したところ、濃度は０．１μｇ／ｍＬ以下（ＤＮＡ吸着率９９％以上）であった。上澄み液のＢＳＡの濃度を測定したところ、濃度は９７０μｇ／ｍＬ（ＢＳＡ回収率９７％）であった。
【００８２】
＝＝比較例＝＝
ＤＥＡＥ−セファロース・ＣＬ−６Ｂ（アマシャム・バイオサイエンス社製のイオン交換担体）を用い、バッチ法による核酸の除去を行った。ＤＥＡＥ−セファロース・ＣＬ−６Ｂ（０．５０ｇ）はリン酸緩衝液１０ｍLと混合し、室温で１０分間攪拌した。このようにして平衡化させたあと、ろ過によって回収した。このＤＥＡＥ−セファロース・ＣＬ−６Ｂ、核酸（ＤＮＡ；５０μｇ）および牛血清のアルブミン（ＢＳＡ；２５００μｇ）のリン酸緩衝液の溶液（５ｍＬ）を混合し、２５℃で２時間撹拌した。撹拌したあと、上澄み液のＤＮＡの濃度を測定したところ、濃度は２μｇ／ｍＬであった。上澄み液のＢＳＡ濃度を測定したところ、濃度は４７０μｇ／ｍＬ（回収率９４％）であった。
【００８３】
＜実施例７＞
＝＝クロマト法による核酸の吸着体Ａへの吸着及び核酸溶液からの除去＝＝
吸着体Ｂ（１．６７ｍＬ）を充填したカラム（直径４．６ｍｍ、長さ１００ｍｍ）に、リン酸緩衝液を通液して平衡化した。次いで核酸（ＤＮＡ；１ｍｇ）および牛血清のアルブミン（ＢＳＡ；１００ｍｇ）のリン酸緩衝液（１００ｍＬ）を流し、溶出液１００ｍＬを得た。溶出液のＤＮＡ濃度は０．１μｇ／ｍＬ以下（ＤＮＡ吸着率９９％以上）であり、ＢＳＡ濃度は９５０μｇ／ｍＬ（回収率９５％）であった。
【００８４】
＜実施例８＞
＝＝吸着体に対するＤＮＡ吸着のイオン強度依存性＝＝
各イオン強度（０．１、０．２、０．４、０．６、０．８）のリン酸緩衝液と平衡化させた吸着体Ｂ０．４ｍＬと試料溶液（ＢＳＡ ５００μｇ／ｍＬとＤＮＡ １０μｇ／ｍＬを含有）４．０ｍＬをチューブ内で混合し、２５℃で２時間撹拌した後、遠心して得られた上清のＤＮＡ及びＢＳＡ濃度を測定した。  
図１に示した結果より、イオン強度が０．４以下のとき、ＤＮＡの吸着体への吸着はほぼ１００％であり、イオン強度が０．２以上のとき、ＢＳＡの吸着体への吸着率はほぼ０％であった。従って、吸着体に核酸を吸着させたまま、吸着体を洗浄するためのイオン強度は０．２−０．４が好ましい。
【００８５】
＝＝比較例＝＝
ＤＥＡＥ−セファロース・ＣＬ−６Ｂ（アマシャム・バイオサイエンス社製のイオン交換担体）を用い、バッチ法による核酸の除去を行った。ＤＥＡＥ−セファロース・ＣＬ−６Ｂ（０．５０ｇ）は各イオン強度（０．１、０．２、０．４、０．６、０．８）のリン酸緩衝液１０ｍLと混合し、室温で１０分間攪拌した。このようにして平衡化させたあと、ろ過によって回収した。このＤＥＡＥ−セファロース・ＣＬ−６Ｂ、核酸（ＤＮＡ；５０μｇ）のリン酸緩衝液（５ｍＬ）、および牛血清のアルブミン（ＢＳＡ；２５００μｇ）の各イオン強度と同じイオン強度のリン酸緩衝液の溶液（５ｍＬ）を混合し、２５℃で２時間撹拌した。撹拌したあと、上澄み液のＤＮＡの濃度を測定した。  
図１に示した結果から、ＤＥＡＥ−セファロース・ＣＬ−６Ｂは、いずれのイオン強度においても、ＤＮＡに対する吸着容量が低く、選択的吸着能力も低く、吸着体ＢのＤＥＡＥ−セファロース・ＣＬ−６Ｂに対する優位性が示された。
【００８６】
＜実施例９＞
＝＝吸着体からのＤＮＡの回収＝＝
実施例４と同様に、吸着体Ａ（１．６６ｍＬ）を充填したカラム（直径４．６ｍｍ、長さ１００ｍｍ）に、リン酸緩衝液（イオン強度０．２、ｐＨ７．０）を通液して平衡化させた。ＤＮＡ（１００μｇ／ｍＬ）とＢＳＡ（１，０００μｇ／ｍＬ）の混合溶液６０ｍＬ、リン酸緩衝液６０ｍＬ、２Ｍ塩化ナトリウム水溶液６０ｍＬを添加し、５ｍＬずつ溶出液を分画して回収し、各分画におけるＢＳＡ濃度とＤＮＡ濃度を測定し、グラフにプロットした。図２にその結果を示す。  
まず、ＤＮＡとＢＳＡの混合溶液を流したところ、約２０ｍＬ以降は、ＢＳＡの添加濃度と溶出濃度が平衡化した。一方、ＤＮＡに関しては、添加したＤＮＡはほぼ１００％吸着された。  
次に、リン酸緩衝液６０ｍＬを流したところ、ＢＳＡのみが溶出し、約４０ｍＬ添加したあたりで、ＢＳＡは溶出しなくなった（ＢＳＡ回収率９０％）。  
次に、２Ｍ塩化ナトリウム水溶液を流したところ、ＤＮＡのみが溶出した（回収率４９％）。このように吸着体を用いることで、ＤＮＡが効率よく回収されることが明らかになり、本発明の吸着体がＤＮＡの回収に有用であることがわかる。
【００８７】
＜実施例１０＞
＝＝ＤＮＡ回収の際のイオン強度依存性＝＝
吸着体Ａ（６．３６ｍＬ）を充填したカラム（直径９．０ｍｍ、長さ１００ｍｍ）に、リン酸緩衝液（イオン強度０．２、ｐＨ７．０）を通液して平衡化させた。ＤＮＡ（１００μｇ／ｍＬ）の溶液２５０ｍＬ、リン酸緩衝液２５０ｍＬを流した。ついでイオン強度が０．２から３．２になるように流速１．０ｍＬ／ｍIｎで溶出液を６００ｍL流した。この時の溶出液の体積、ＤＮＡ濃度及びイオン強度を測定し、グラフにプロットした。図３にイオン強度を高くしてからの結果を示す。尚、イオン強度は電気伝導度を測定し算出した。  
ＤＮＡの溶出は、イオン強度が約０．３から始まり、約０．６から急激に増大し、約０．９で最大になり、約１．２で急減に減少し、約３．０で終了した。このようにイオン強度を０．３以上３．０以下にすることによって、より好ましくは、０．６以上１．２以下にすることによって、ＤＮＡの回収が可能になる。
【００８８】
＜実施例１１＞
＝＝核酸吸着体の再生と再利用＝＝
実施例９と同様に、吸着体Ａ（１．６６ｍＬ）を充填したカラム（直径４．６ｍｍ、長さ１００ｍｍ）をリン酸緩衝液で平衡化し、濃度５０μｇ／ｍＬのＤＮＡリン酸緩衝液溶液を１８０ｍＬ流してＤＮＡを吸着させ、リン酸緩衝液を６０ｍＬ流してカラムを洗浄し、２Ｍ  ＮａＣｌ水溶液６０ｍＬを流してＤＮＡを溶出させた（ＤＮＡ回収率４９％）。  
その後、０．２Ｍ  ＮａＯＨ（ｐＨ１３）を５０ｍＬ流して残存するＤＮＡを吸着体から解離させ、リン酸緩衝液で平衡化してカラムを再生した。再度、同様にＤＮＡの吸着・回収を行った。  
このようなＤＮＡの再吸着操作を５回繰り返したが、図４に示すように、５回目のＤＮＡの吸着特性は１回目と変化は無かった（５回目のＤＮＡ回収率５３％）。このように、本発明の核酸吸着体は再生することができ、少なくとも５回は再利用することが可能である。
【００８９】
＜実施例１２＞
＝＝酵母菌破砕抽出液からのＤＮＡ除去＝＝
本発明の吸着体が、細胞抽出物などの複雑な混合物から、選択的に核酸を吸着できるかどうか調べるため、実施例９と同様に、各吸着体を１ｍＬカラム（直径９ｍｍ、長さ１６ｍｍ）に充填し、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、イオン強度μ＝０．１７）で平衡化後、酵母菌破砕抽出液２０ｍＬ（総タンパク質２．２  ｍｇ／ｍＬ、ＤＮＡ  １６０  μｇ／ｍＬ、  ０．０２Ｍリン酸緩衝液溶液）を流し（２５℃、流速：０．１  ｍＬ／分）、２０ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、イオン強度μ＝０．１７）で洗浄した。この時の全溶出液中のタンパク質及びＤＮＡの濃度を測ることにより、タンパク質の回収率及びＤＮＡの吸着率を調べた。この結果を表１に示す。なお、酵母菌破砕抽出は、超音波破砕抽出法(H. Maemura, S. MorImura, K. KIda, J. Inst. Brew, 104, 207-211, 1998.)を用いた。また、比較実験として、吸着体の代わりに、ＤＥＡＥ−セファロース・ＣＬ−６Ｂ（カラム体積１ｍL、乾燥重量０．０５g）及び架橋ＰＡＡ粒子（ＰＡＡ−Ｂ）（カラム体積１ｍL、乾燥重量０．５g）を用いた実験を行った。
【００９０】
［表１］
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【００９１】
このように、本発明の吸着体は、細胞抽出物などの複雑な混合物から、効率よく選択的に核酸を吸着できることが明らかになった。従って、本発明の吸着体は、細胞抽出物などの複雑な混合物から、核酸を回収するのにも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】本発明にかかる一実施例において、吸着体Ｂに対するＤＮＡ吸着のイオン強度依存性を調べた結果を示すグラフである。
【図２】本発明にかかる一実施例において、吸着体ＡにＤＮＡを吸着させて回収する際、カラムからの溶出液を５ｍＬずつ分画して回収し、各分画において測定したＢＳＡ濃度とＤＮＡ濃度を示したグラフである。
【図３】本発明にかかる一実施例において、吸着体ＡからＤＮＡを遊離させる際の、ＤＮＡ遊離のイオン強度依存性を示したグラフである。
【図４】本発明にかかる一実施例において、吸着体Ａに対し、ＤＮＡの再吸着操作を５回繰り返した時の、１回目と５回目のＤＮＡの吸着特性を比較した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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