(57)【要約】【課題】CK19 mRNAの新規な検出方法。【解決手段】mRNAの測定方法であって、(a) プライマーを用いてのCK19 mRNAの一部分を増幅し、そして(b) 形成された増幅物を２種類のプローブを用いて検出する、ことを含んで成り；前記プライマーが、CK19遺伝子の第１のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プライマー、及び−前記第１のエキソンの下流に位置するCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プライマー、であることを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
mRNAの測定方法であって、
(a) プライマーを用いてのCK19 mRNAの一部分を増幅し、そして
(b) 形成された増幅物を２種類のプローブを用いて検出する、
ことを含んで成り；
前記プライマーが、
−CK19遺伝子の第１のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プライマー、及び
−前記第１のエキソンの下流に位置するCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プライマー、
であり、そして前記プローブが、
−前記第１プライマーが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子のエキソンの3’−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プローブ、及び
−前記第１プローブが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流に隣接するCK19遺伝子のエキソンの5'−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プローブ、
である、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記プローブが、ドナー及びアクセプターによりラベルされる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ドナーが、FITC（fluorescein isothiocyanate）であり、そして前記アクセプターが、ローダミン色素及びシアニン色素から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１プローブがその3'−末端でドナーによりラベルされ、そして前記第２プローブがその5'−末端でアクセプターによりラベルされる請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記ドナーがFITC（fluorescein isothiocyanate）であり、そして前記アクセプターがローダミン色素である請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
CK19 mRNA及びCK20 mRNAの同時測定方法であって、
(a) CK19 mRNAのための１組のプライマー及びCK20 mRNAのための１組のプライマーを用いて前記mRNAの一部分を増幅し、そして
(b) 形成された増幅物を、CK19 mRNAのための１組のプローブ及びCK20 mRNAのための１組のプローブを用いて検出する、
ことを含んでなり；
前記CK19 mRNAのための１組のプライマーが、
−CK19遺伝子の第１のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プライマー、及び
−前記第１のエキソンの下流に位置するCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プライマー、
であり；前記CK19 mRNAのための１組のプローブが、
−前記第１プライマーが結合する領域の下流で、且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子のエキソンの3'−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プローブ、及び
−前記第１プローブが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流に隣接するCK19遺伝子のエキソンの5'−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プローブ、
であり；前記CK20 mRNAのための１組のプライマーが、
−CK20遺伝子上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第３プライマー、及び
−前記第３プライマーの下流のCK20遺伝子上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第４プライマー、
であり；そしてCK20 mRNAのための１組のプローブが、
−前記第３プライマーが結合する領域の下流で且つ前記第４プライマーが結合する領域の上流のCK20遺伝子上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第３プローブ、及び
−前記第４プライマーが結合する領域の上流で且つ前記第３プローブが結合する領域の下流のCK20遺伝子上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第４プローブ、
であることを特徴とする方法。
【請求項７】
前記CK19 mRNAの検出のためのプローブがドナー及びアクセプターによりラベルされ、そして前記CK20 mRNAの検出のためのプローブがドナー及びアクセプターによりラベルされ、ここでCK19ドナー/アクセプター対が前記CK20ドナー/アクセプター対とは異なる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記CK19 mRNAの検出のための１組のプローブ及び前記CK20 mRNAの検出のための１組のプローブが同じドナーでラベルされ、他方前記CK19 mRNAの検出のためのアクセプターは前記CK20 mRNAの検出のためのアクセプターとは異なる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記第１プローブ及び第３プローブがそれらの3'−末端でドナーによりラベルされ、そして前記第２プローブ及び第４プローブがそれらの5'−末端でアクセプターによりラベルされる、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ドナーが、FITCであり、そして前記アクセプターが、ローダミン色素及びシアニン色素から成る群から選択される、請求項７〜９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ドナーがFITCであり、そして前記アクセプターがローダミン色素である請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記CK19 mRNA及びCK20 mRNAの一部分の増幅及び前記形成される増幅物の検出が、同じ反応容器内で行われる、請求項６〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
CK19 mRNAの検出のために有用な組成物であって、
−CK19遺伝子の第１のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プライマー、
−前記第１のエキソンの下流に位置するCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プライマー、
−前記第１プライマーが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子のエキソンの3'−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プローブ、及び
−前記第１プローブが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子の隣接するエキソンの5'−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プローブ、
を含んで成る組成物。
【請求項１４】
CK19遺伝子の第１のエキソンであるエキソン４上に位置する領域にハイブリダイズする、配列番号１からの10〜25個の塩基から成るプライマー。
【請求項１５】
CK19偽遺伝子に対する少なくとも２つのミスマッチを含んで成る請求項14に記載のプライマー。
【請求項１６】
前記プライマーが配列番号２の配列からなる、請求項14に記載のプライマー。
【請求項１７】
エキソン４の下流のCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域にハイブリダイズする、配列番号３からの10〜25個の塩基から成るプライマー。
【請求項１８】
前記CK19偽遺伝子に対する少なくとも２つのミスマッチを含んで成る、請求項17に記載のプライマー。
【請求項１９】
前記CK19遺伝子の第２のエキソンがエキソン６である、請求項17又は18記載のプライマー。
【請求項２０】
前記プライマーが配列番号４の配列から成る請求項19記載のプライマー。
【請求項２１】
CK19 mRNAの一部分の増幅のために有用な請求項14〜20のいずれか１項に記載の少なくとも１つのプライマーを含んで成るプライマーの組合せ。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのプライマーの配列が、その3'−末端で前記偽遺伝子に対する少なくとも１つのミスマッチを含んで成る請求項21に記載のプライマーの組合せ。
【請求項２３】
CK19遺伝子の第１のエキソンの3'−末端に位置する領域に対してハイブリダイズする、配列番号５からの10〜25個の塩基から成るプローブ。
【請求項２４】
CK19遺伝子の第１のエキソンの下流に位置するエキソンの5'−末端に位置する領域に対してハイブリダイズする、配列番号５からの10〜25個の塩基から成るプローブ。
【請求項２５】
前記プローブが、請求項21又は22に記載のプライマーの組合せを用いて得られる増幅物に対してハイブリダイズする請求項23に記載のプローブ。
【請求項２６】
前記プローブが、請求項21又は22に記載のプライマーの組合せを用いて得られる増幅物上の請求項14に記載のプライマーの下流に位置し、且つ隣接するエキソンに対してハイブリダイズする、請求項24に記載のプローブ。
【請求項２７】
前記CK19遺伝子の第１のエキソンがエキソン４である、請求項23に記載のプローブ。
【請求項２８】
前記CK19遺伝子の第１のエキソンの下流に位置するエキソンがエキソン５である、請求項24に記載のプローブ。
【請求項２９】
前記プローブが配列番号６の配列から成る請求項27に記載のプローブ。
【請求項３０】
前記プローブが配列番号７の配列から成る請求項28に記載のプローブ。
【請求項３１】
CK19 mRNAの検出のために有用な請求項23〜30のいずれか１項に記載のプローブの組合せ。
【請求項３２】
前記プローブがドナー及びアクセプターによりラベルされる、請求項23〜30のいずれか１項に記載のプローブの組合せ。
【請求項３３】
前記ドナーが、FITCであり、そして前記アクセプターが、ローダミン色素及びシアニン色素から成る群から選択される、請求項32に記載のプローブの組合せ。
【請求項３４】
前記第１プローブがその3'−末端でドナーによりラベルされ、そして前記第２プローブがその5'−末端でアクセプターによりラベルされる、請求項32に記載のプローブの組合せ。
【請求項３５】
前記ドナーがFITCであり、そして前記アクセプターがローダミン色素である請求項32に記載のプローブの組合せ。
【請求項３６】
CK19 mRNAの増幅及び検出のためのキットであって、
−CK19遺伝子の第１のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プライマー、及び
−前記第１のエキソンの下流に位置するCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プライマー、
を有する１組のプライマー；、並びに
−前記第１プライマーが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子のエキソンの3'−末端に位置する領域にハイブリダイズする第１プローブ、及び
−前記第１プローブが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子の隣接するエキソンの5'−末端に位置する領域にハイブリダイズする第２プローブ、
を有する１組のプローブ；
を少なくとも含んで成るキット。
【請求項３７】
前記プライマー対が、混合物に含まれる請求項36記載のキット。
【請求項３８】
前記プローブ対が、混合物に含まれる請求項36記載のキット。
【請求項３９】
前記プライマー対及び前記プローブ対が、混合物に含まれる請求項36記載のキット。
【請求項４０】
さらに緩衝溶液を含む請求項36〜39のいずれか１項記載のキット。
【請求項４１】
CK19 mRNA及びCK20 mRNAを同時に増幅し、そして個別に検出するためのキットであって、２対のプライマー及び２対のプローブを少なくとも含んで成り、ここで前記プローブがCK19 mRNA及びCK20 mRNAのために異なってラベルされるキット。
【請求項４２】
CK19 mRNAの増幅のための前記プライマーが、
−CK19遺伝子の第１のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プライマー、及び
−前記第１のエキソンの下流に位置するCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プライマー、
を有する１組のプライマーであり;そして
検出のための前記プローブが、
−前記第１プライマーが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子のエキソンの3'−末端に位置する領域にハイブリダイズする第１プローブ、及び
−前記第１プローブが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子の隣接するエキソンの5’−末端に位置する領域にハイブリダイズする第２プローブ、
を有する１組のプローブである請求項41に記載のキット。
【請求項４３】
前記プライマー対が、混合物に含まれる請求項41又は42に記載のキット。
【請求項４４】
前記プローブ対が、混合物に含まれる請求項41又は42に記載のキット。
【請求項４５】
前記プライマー対及び前記プローブ対が、混合物に含まれる請求項41又は42に記載のキット。
【請求項４６】
さらに緩衝溶液を含む請求項41〜45のいずれか１項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はCK19のmRNAをリアルタイムRT-PCRで迅速、且つ特異的に増幅および検出するために用いるPCRプライマー及び検出プローブの核酸配列、並びにこれらを用いた臨床検査の方法に関する技術である。
【背景技術】
【０００２】
サイトケラチンは細胞骨格を形成する中間径フィラメントと呼ばれる蛋白質の一群であり、現在までに20種類以上の亜種が報告されている。これらのサイトケラチンは主に上皮細胞に存在しているが、各亜種の分布は上皮細胞の種類によって異なっている。
【０００３】
サイトケラチン19（CK19）は、乳癌、胃癌、前立腺癌、肺癌などの癌組織において、正常組織よりも多く発現されていることが報告されており、癌診断の為の臨床マーカーとして、また、治療戦略を選択する指標として、CK19を臨床診断に応用することが検討されている。例えば、早期の乳癌や早期の胃癌においては、患者のクオリティー・オブ・ライフ（QOL）を改善するために外科手術時のリンパ節郭清範囲を縮小することの是非をリンパ節中の癌転移の有無をCK19を指標にした診断によって判断することができる可能性がある。また、腹膜洗浄液中の癌細胞の有無をCK19を指標にして調べることによって、進行胃癌患者の腹膜播種のリスクを評価することができるようになるかもしれない。
【０００４】
現在までに遺伝子を高感度に検出する方法として、LAMP法、TRC法、PCR法などが報告されている。
LAMP（loop mediated isothermal amplification）法は、増幅したい遺伝子領域の任意の６箇所の領域に対して設計された４種類のプライマーと鎖置換型DNAポリメラーゼにより、一定温度で目的遺伝子を効率よく増幅する技術である（国際公開WO00／28082号公報）。
【０００５】
TRC（transcription reverse transcription concerted reaction）法は一定温度でRNAを増幅する技術（EP 0 969 101 A1）で、シザープローブと呼ばれる標的RNA切断用DNAオリゴヌクレオチドと逆転写酵素のRNaseH活性による標的RNAのトリミング、及び逆転写反応と転写反応の繰り返しによって目的のRNA領域を増幅する。この技術は、RNAを直接増幅することができるので、PCRやLAMP法で必要となる逆転写ステップが不要である。
【０００６】
これらの核酸増幅法は、PCR法に比べると増幅過程が複雑であり、また、一つの反応チューブで複数のターゲットを同時に増幅し、個別に検出することができない。このことは、偽陰性と真の陰性を区別するための内部コントロールを反応系に組み込めないことを意味する。従って、臨床診断に応用した場合、偽陰性を区別することができなくなるなどの問題がある。
【０００７】
PCR法は任意のDNA領域を再現性よく且つ効率的に増幅することが出来る技術で、現在、医学・法医学・獣医学・農学・薬学・生物学等の各領域において基礎研究から実践産業に至るまで世界中に広く用いられている。この技術と逆転写活性をもつ酵素を組み合わせることによって、任意のmRNAの領域を増幅することも可能である（RT-PCR）。さらに、増幅した産物を検出する手段も数多く報告されており、蛍光色素をDNAオリゴヌクレオチドに結合させた蛍光プローブをPCR反応液に加えることによって、増幅反応のモニターがリアルタイムで行うことができるようになった（リアルタイムPCR）。また、複数の蛍光色素で個別にラベルした蛍光プローブを用いることによって、１個の反応容器の中で複数の標的DNA（またはRNA）を同時に増幅し、その増幅反応の様子を個別にモニターすることも可能である（マルチプレックス・リアルタイムPCR）。
【０００８】
RT-PCR法によるmRNAの増幅は、高感度である反面、測定する検体にヒトDNAが微量でも混入しているとmRNAの設計図である遺伝子（DNA）も増幅してしまうために、増幅産物がRNAに由来しているのか、それともDNAが増幅してしまったのか、判別が困難になることがある。
このことは、本来は陰性となるべき結果が陽性となる「偽陽性」が生じる可能性を意味し、臨床診断に応用する際には大きな問題となる。
このような問題を回避する策として、RT-PCRでRNAを増幅する時、そのRNA領域に相当する遺伝子の領域にはイントロンが入るようにデザインすることが行われる。
【０００９】
一般的に遺伝子はイントロンという、遺伝情報を持たない領域によって分断されている。従って、もしRT-PCRで増幅する領域にイントロンが存在するならば、DNAを増幅したPCR産物はmRNAの増幅物よりイントロンの分だけ大きなものとなる。このような場合、PCRを行う検体にDNAが混入していたとしても、増幅物のサイズの違いを検出することが出来るアガロースゲル電気泳動法などによって、mRNAが増幅したのかそれともDNAが増幅したのかが判定しうる。
【００１０】
しかし、イントロンが存在しない遺伝子領域を増幅してしまった場合には、増幅物のサイズはmRNAの場合と全く同じになるために電気泳動法では判定することが出来ない。
臨床検体にヒト遺伝子（DNA）が混入した場合、さらに問題となるのがプロセス型偽遺伝子の存在である。偽遺伝子は遺伝子として機能しないもので、プロセス型偽遺伝子の塩基配列中にはイントロンは存在しておらず、また、mRNAと高い塩基配列の相同性があるために増幅物の大きさの差で判定することはできない。
【００１１】
CK19にはプロセス型偽遺伝子の存在が報告されている。この偽遺伝子のCK19 mRNAとの相同性は90％以上である。従って、もし偽遺伝子の増幅が起こった場合には、イントロンのない遺伝子領域をPCRした場合と同じく、その増幅物がmRNAに由来したのか偽遺伝子に由来したのか判定することが出来なくなる可能性がある。
つまり、臨床検査を目的としてCK19 mRNAをRT-PCRなどの核酸増幅法で検出する場合には、検体に混入するDNAは徹底的に排除されなければならない。言い換えると、得られた陽性結果を解釈する際、その陽性結果がCK19 mRNAによる「真の陽性」なのかそれともCK19遺伝子またはCK19偽遺伝子による「偽陽性」なのかを区別できなければ臨床検査に応用することは不可能である。
【００１２】
このような「偽陽性」の発生を防ぐために有効な手段は、検体中のヒトDNAを徹底的に排除することであり、そのための検体調製方法も報告されている。しかし、このような検体調製方法は精製度を重視するあまり、検体調整にかかる時間が長くなり、特殊な装置が必要であり、また処理できる検体の数に制限があるなど、迅速性と簡便性が求められる臨床の場では必ずしも有効ではない。
CK19mRNAをRT-PCRによって増幅・検出するためのPCRプライマーや検出プローブを報告する文献は多数あり、特にCK19偽遺伝子を増幅あるいは検出しないように工夫したことを記述した報告例もある（後記、非特許文献１〜５）。しかし、そのどれもが現在、臨床の場で要求されている迅速性を満たすものではなかった。
【００１３】
例えば、後記の非特許文献１はnested PCRを行っているが、この方法ではPCRだけでも５時間以上かかる。特に後記の非特許文献１と非特許文献４は増幅物の検出にアガロースゲル電気泳動法を用いており、PCRの結果判定にはさらに時間がかかる。また、PCRを行う試料の調製にあたっては、後記の非特許文献１〜５のどれもがmRNAの逆転写反応とPCRを別々の反応容器内で行っており（２ステップ RT-PCR）、逆転写ステップだけで一時間前後の時間がかかる。
【００１４】
また後記非特許文献２及び非特許文献５は、精製したRNAサンプルをさらにDNase処理する必要があることを述べている。核酸増幅法を臨床診断に用いる医療現場では、ヌクレアーセの汚染を嫌う。もし作業室内や実験器具にDNaseやRNaseなどの汚染が生じると、遺伝子検査の結果に影響が出る可能性があるからである。従って、一般的に臨床検査を目的とした核酸増幅用試料の調製法にはヌクレアーゼを使わない方法が望ましい。
【００１５】
【特許文献１】WO 00/28082
【特許文献２】EP 0 969 101 A1
【非特許文献１】Yuan, CC., et. al. Gynecol Oncol. 85: (1) 148-153, 2002
【非特許文献２】Dimmler, A., et. al. Laboratory Investigation 81: (10) 1351-1361, 2001
【非特許文献３】Gazzaniga, P., et. al. Clin. Cancer Res., 7: 577-583, 2001
【非特許文献４】Stathopoulou, A., et. al. Clin. Cancer Res. 9: 5145-5151, 2003
【非特許文献５】Fellowes, V., et. al. Int. J. Oncol. 24: 861-867, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
癌の外科手術においては、原発性癌のほか、リンパ節など、癌の転移先の器官や組織も切除する必要がある。しかしながら、上に説明したごとく、癌に関連する特定の遺伝子の発現（mRNA）を正確に検出するためには、混在するDNAなどを完全に除去し、目的とするmRNAを高度に精製する必要があり、このためにmRNAの存否の判定には長時間を要する。他方、外科手術に許容される時間には限界がある。このため、従来、ある手術中に採取した組織や器官に癌特有のmRNAが存在するか否かを、その手術中に判定することができなかった。このため、手術後の移転癌の再発を防止するためには、癌細胞が実際に転移しているか否かを判定することなく、リンパ節など、転移の可能性のある組織や器官を広範に切除する必要があった。
【００１７】
これに対して、ある外科手術において採取した組織や器官のサンプル中に特定の癌関連遺伝子のmRNAが存在するか否かを短時間に判定することができれば、その外科手術内で、癌関連遺伝子のmRNAが検出された組織や器官のみを切除すればよく、患者の負担が著しく軽減される。
本発明は、ある外科手術において採取した組織や器官のサンプル中にCK19遺伝子のmRNAが存在するか否か、当該組織や器官を切除する必要か否かを、その手術中に判断することができるほど短時間に知ることが出来る手段を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、プライマーとプローブの選択により上記の課題を達成する。即ち、本発明では、PCRプライマーの選択性によって偽遺伝子の増幅を防ぎ、且つ、検出プローブの位置選択によって遺伝子の検出をしないようなPCRプライマーと検出プローブの組み合わせを開示する。本発明のプライマーとプローブを用いることによって、PCRを行う試料をDNase処理する必要が無くなる。また、実施例に示すように、逆転写能をもつ核酸合成酵素を用いることによって、逆転写ステップとPCRステップを同一反応容器で行い、且つ、リアルタイムPCRを行うことによってCK19 mRNAの増幅・検出にかかる時間は40分前後にまで短縮することができる。
【００１９】
従って、本発明は、mRNAの測定方法であって、
(a) プライマーを用いてのCK19 mRNAの一部分を増幅し、そして
(b) 形成された増幅物を２種類のプローブを用いて検出する、
ことを含んで成り；
前記プライマーが、
−CK19遺伝子の第１のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プライマー、及び
−前記第１のエキソンの下流に位置するCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プライマー、
であり、そして前記プローブが、
−前記第１プライマーが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子のエキソンの3’−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プローブ、及び
−前記第１プローブが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子の隣接するエキソンの5'−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プローブ、
である、ことを特徴とする方法を提供する。
【００２０】
上記の方法において、上記のプローブは、ドナー及びアクセプターによりラベルされている。例えば、前記ドナーは、FITCであり、そして前記アクセプターは、ローダミン色素及びシアニン色素から成る群から選択される。前記第１プローブはその3'−末端でドナーによりラベルされ、そして前記第２プローブはその5'−末端でアクセプターによりラベルされる。具体的な例として、前記ドナーはFITCであり、そして前記アクセプターはローダミン色素であるLC-Red 640である。
【００２１】
ローダミン色素は、無水フタル酸とｍ−ジアルキルアミノフェノールとの縮合に由来する。このような色素は例えばEP 567622に開示されており、ピラノ[3,2-g:5,6-g']ジグアノリン-13イルム,6-(2-カルボキシ-3,4,5,6-テトラクロロフェニル)-1,11-ジエチル-1,2,3,4,8,9,10,11-オクタヒドロ-2,2,4,8,10,10-ヘキサメチル-,パークロレートの誘導体がローダミン色素として使用されることが示されている。
【００２２】
シアニン色素は、一般式 R2N[CH=CH]nCH=N+R2＜-＞R2N+=CH[CH=CH]nNR2（ｎは小さい数値である）を有する合成色素であり、この式中、窒素及び共役鎖系の部分が通常、複素還系、例えばイミダゾール、ピリジン、ピロール、キノリン及びチアゾールの部分を構成する。このような色素は、例えば米国特許5,268,486、5,569,587、5,556,959及び5,808,044の明細書に開示されている。Cy3.5ホスホラミダイトとして知られる1-[3-(4-モノメトキシトリチルオキシ)プロピル]-1'-[3-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)ホスホラミジチル]プロピル]-3,3,3',3'-テトラメチル-4,5-ベンズインドカルボシアニンをシアニン色素として使用することができる。
【００２３】
本発明はまた、CK19 mRNA及びCK20 mRNAの同時測定方法であって、
(a) CK19 mRNAのための１組のプライマー及びCK20 mRNAのための１組のプライマーを用いて前記mRNAの一部分を増幅し、そして
(b) 形成された増幅物を、CK19 mRNAのための１組のプローブ及びCK20 mRNAのための１組のプローブを用いて検出する、
ことを含んでなり；
前記CK19 mRNAのための１組のプライマーが、
−CK19遺伝子の第１のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プライマー、及び
−前記第１のエキソンの下流に位置するCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プライマー、
であり；前記CK19 mRNAのための１組のプローブが、
−前記第１プライマーが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子のエキソンの3'−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プローブ、及び
−前記第１プローブが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流に隣接するCK19遺伝子のエキソンの5'−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プローブ、
であり；前記CK20 mRNAのための１組のプライマーが、
−CK20遺伝子上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第３プライマー、及び
−前記第３プライマーの下流のCK20遺伝子上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第４プライマー、
であり；そしてCK20 mRNAのための１組のプローブが、
−前記第３プライマーが結合する領域の下流で且つ前記第４プライマーが結合する領域の上流のCK20遺伝子上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第３プローブ、及び
−前記第４プライマーが結合する領域の上流で且つ前記第３プローブが結合する領域の下流のCK20遺伝子上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第４プローブ、
であることを特徴とする方法を提供する。
【００２４】
上記の方法において、前記CK19 mRNAの検出のためのプローブはドナー及びアクセプターによりラベルされ、そして前記CK20 mRNAの検出のためのプローブはドナー及びアクセプターによりラベルされ、ここでCK19ドナー/アクセプター対が前記CK20ドナー/アクセプター対とは異なり、前記CK19 mRNAの検出のための１組のプローブ及び前記CK20 mRNAの検出のための１組のプローブが同じドナーでラブルされ、他方前記CK19 mRNAの検出のためのアクセプターは前記CK20 mRNAの検出のためのアクセプターとは異なる。
【００２５】
前記第１プローブ及び第３プローブはそれらの3'−末端でドナーによりラベルされ、そして前記第２プローブ及び第４プローブはそれらの5'−末端でアクセプターによりラベルされる。例えば、前記ドナーは、FITCであり、そして前記アクセプターは、ローダミン色素及びシアニン色素から成る群から選択される。具体例として、前記ドナーはFITCであり、そして前記アクセプターはローダミン色素であるLC-Red 640及びLC-Red 610である。
好ましい態様においては、前記CK19 mRNA及びCK20 mRNAの一部分の増幅及び前記形成される増幅物の検出は、同じ反応容器内で行われる。
【００２６】
本発明は更に、CK19 mRNAの検出のために有用な組成物であって、
−CK19遺伝子の第１のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プライマー、
−前記第１のエキソンの下流に位置するCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プライマー、
−前記第１プライマーが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子のエキソンの3'−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プローブ、及び
−前記第１プローブが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流に隣接するCK19遺伝子のエキソンの5'−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プローブ、
を含んで成る組成物を提供する。
【００２７】
本発明は更に、CK19遺伝子のエキソン４上に位置する領域にハイブリダイズする、配列番号１からの10〜25個の塩基から成るプライマーを提供し、ここで、
当該プライマーはCK19偽遺伝子に対する少なくとも２つのミスマッチを含んで成る部分から選択されることを特徴とする。
好ましくは、前記プライマーは配列番号２の配列から成る。
【００２８】
本発明はまた、エキソン４の下流のCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域にハイブリダイズする、配列番号３中の10〜25個の塩基から成るプライマーを提供する。
上記プライマーは、前記CK19偽遺伝子に対する少なくとも２つのミスマッチを含んで成る。前記CK19遺伝子の第２のエキソンはエキソン６である。好ましくは、前記プライマーは配列番号４のの配列から成る。
【００２９】
本発明はまた、CK19 mRNAの一部分の増幅のために有用な上記いずれかの少なくとも１つのプライマーを含んで成るプライマーの組合せを提供する。前記少なくとも１つのプライマーの配列は、その3'−末端で偽遺伝子に対する少なくとも１つのミスマッチを含んで成る。
【００３０】
本発明はまた、
CK19遺伝子の第１のエキソンの3'−末端に位置する領域に対してハイブリダイズする、完全なCK19 mRNAの配列である配列番号５からの10〜25個の塩基から成るプローブ；及び
CK19遺伝子の第１のエキソンの下流に位置するエキソンの5'−末端に位置する領域に対してハイブリダイズする、完全なCK19 mRNAである配列番号５からの10〜25個の塩基から成るプローブ；
を提供する。
【００３１】
前記第１プローブは、上記のプライマーの組合せを用いて得られる増幅物に対してハイブリダイズする。前記第２プローブは、上記のプライマーの組合せを用いて得られる増幅物上の、上記の第１プローブの下流に位置し、且つ隣接するエキソンに対してハイブリダイズする。前記CK19遺伝子の第１のエキソンはエキソン４であり、前記CK19遺伝子に隣接するエキソンはエキソン５である。例えば、前記第１プローブの正確な配列は配列番号６であり、前記第２プローブの正確な配列は配列番号７である。
【００３２】
本発明はまた、CK19 mRNA増幅物の検出のために有用な、上記のプローブの組合せに関する。このプローブはドナー及びアクセプターによりラベルされている。前記ドナーは、FITCであり、そして前記アクセプターは、ローダミン色素及びシアニン色素から成る群から選択される。前記第１プローブはその3'−末端でドナーによりラベルされ、そして前記第１プローブの下流で隣接して結合する第２プローブがその5'−末端でアクセプターによりラベルされる。この場合、例えば、前記ドナーはFITCであり、そして前記アクセプターはLC-Red 640である。
【００３３】
本発明は更に、CK19 mRNAの増幅及び検出のためのキットであって、
−CK19遺伝子の第１のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プライマー、及び
−前記第１のエキソンの下流に位置するCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プライマー、
を有する１組のプライマー；、並びに
−前記第１プライマーが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子のエキソンの3'−末端に位置する領域にハイブリダイズする第１プローブ、及び
−前記第１プローブが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流に隣接するCK19遺伝子のエキソンの5'−末端に位置する領域にハイブリダイズする第２プローブ、
を有する１組のプローブ；
を少なくとも含んで成るキット、を提供する。
【００３４】
例えば、前記プライマー対は混合物として存在し、又は前記プローブ対は混合物として、あるいは前記プライマー対及び前記プローブ対の両者が混合物として存在する。前記キットは更に、緩衝溶液を含んでもよい。
【００３５】
本発明は更に、CK19 mRNA及びCK20 mRNAの組合された増幅及び検出のためのキットであって、少なくとも、２対のプライマー及び２対のプローブを含んで成り、ここで前記プローブがCK19 mRNA及びCK20 mRNAのために異なってラベルされるキットを提供する。
【００３６】
上記のキットにおいては、例えば、
CK19 mRNAの増幅のための前記プライマーが、
−CK19遺伝子の第１のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プライマー、及び
−前記第１のエキソンの下流に位置するCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プライマー、
を有する１対のプライマーであり;そして
検出のための前記プローブが、
−前記第１プライマーが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子のエキソンの3'−末端に位置する領域にハイブリダイズする第１プローブ、及び
−前記第１プローブが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流に隣接するCK19遺伝子のエキソンの5’−末端に位置する領域にハイブリダイズする第２プローブ、
を有する１対のプローブである。
【００３７】
上記のキットにおいては、前記プライマー対が混合物として存在し、又は前記プローブ対が混合物として存在し、あるいは前記プライマー対及び前記プローブ対の両方が混合物として存在する。前記のキットは、さらに緩衝溶液を含んでいてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明は、臨床検査を目的として、CK19 mRNAをリアルタイムRT-PCR技術とハイブリダイゼーションプローブ技術にて特異的に増幅・検出するために用いる新規のPCRプライマーと検出用プローブ及びその反応条件を提供する。
ヒトDNAが検体に混入していても、CK19 mRNAに特異性の高いRT-PCRを実現するために、以下のようなデザインを基礎にしてRT-PCRの領域、PCRプライマーと検出プローブの位置を決定した。
【００３９】
１）RT-PCRの際、２本のPCRプライマーの３'−末端がCK19の偽遺伝子とCK19 mRNAのミスマッチ部位になるようにデザインすることにより、mRNAの増幅はできても偽遺伝子の増幅ができないようにする。
２）遺伝子増幅する領域は上記の条件を満たし、かつ、CK19遺伝子の少なくとも１つ以上のエクソン−イントロンの境界を含むような部分を選択する。
３）ハイブリダイゼーションプローブ技術に基づき２本の検出用プローブがターゲット配列にハイブリダイゼーションする際、先に述べたエクソン−イントロンの境界が２本の検出用プローブの間にハイブリダイゼーションするようにデザインするか、もしくは２本の検出用プローブのどちらかがエクソン−イントロンの境界上にハイブリダイゼーションするようにデザインすることにより、CK19遺伝子に由来する増幅物は検出しないようにする。
【００４０】
１）PCRプライマーの設計
本発明で提供されるPCRプライマーは、CK19 mRNAと相補的にハイブリダイズするが、CK19偽遺伝子に対してハイブリダイズする際は、そのPCRプライマーの３'−末端が少なくとも１塩基、望ましくは２塩基が相補的ではない塩基領域に設定する。
本発明は臨床診断に応用することから、リアルタイムPCRが可能となるようにPCRプライマーを設計する。具体的には、PCRプライマーのサイズは10〜25塩基、望ましくは17〜18塩基とする。GC％は45％〜55％が望ましい。Tmは45℃〜55℃、望ましくは52℃付近とする。
【００４１】
また、PCRによる増幅時間の短縮のため、PCRにより増幅されるサイズは150〜250塩基対が望ましい。また、PCRにより増幅される領域内に遺伝子のエクソン−イントロンの境界が１つ以上存在するようにする。
PCRにより増幅される領域内に検出プローブがハイブリダイズする部位を設ける。
【００４２】
２）検出プローブの設計
本発明で提供される２種類の検出プローブは、それぞれPCRにより増幅されるCK19 mRNAと相補的にハイブリダイズする。
２種類の検出プローブは異なる蛍光色素で標識されたDNAオリゴヌクレオチドであり、一方をドナープローブ、他方をアクセプタープローブと呼ぶ。ドナープローブは５'−末端に蛍光色素が標識されており、アクセプタープローブは３'−末端が蛍光標識されている。
【００４３】
この２つの検出プローブは１〜５塩基離れただけの非常に近い領域にハイブリダイズするように設計する。これにより、２つのプローブに標識された蛍光色素間で、いわゆる蛍光共鳴エネルギー移動：FRET（fluorescence resonance energy transfer）が起こる。より具体的には、ドナープローブの蛍光色素を励起する光を照射すると、励起されたエネルギーが隣のアクセプタープローブ上の蛍光色素に転移し、蛍光が発生する。この現象は、２つのプローブが正しく近接した場所にハイブリダイズした場合にのみ起こる。
検出プローブのサイズは10〜25塩基、望ましくは18〜22塩基とする。GC％は45％〜55％が望ましい。Tmは50℃〜65℃、とするが、プライマーより５℃高くなるように設定し、且つ、アクセプタープローブのTmはドナープローブのTmより２〜３℃高くなるように設定する。
【００４４】
３）RT-PCR法と反応プロトコル
本発明で提供されるPCRプライマーと検出プローブを用いたPCRは、全てのリアルタイムPCRが可能なサーマルサイクラーで行うことができる。その際、各機械の温度管理の性能や対応する蛍光フィルターが異なるために必要に応じてPCR条件の最適化及び蛍光色素の選択が必要である。ここでは、ライトサイクラー（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を使用した場合のPCR条件について、実施例で示す。
【００４５】
RT-PCRを行うには、まず、標的であるmRNAを逆転写してcDNAを合成し、その後PCRを行う。本発明で提供されるPCRプライマーと検出プローブを用いたPCRは、逆転写ステップとPCRステップを分けた場合（２ステップRT-PCR）でも使用することができるが、１個の反応容器で逆転写ステップとPCRステップを行う場合（１ステップRT-PCR）でも使用することができる。ここでは、より迅速な１ステップRT-PCRの結果を実施例で示す。
【００４６】
４）PCR増幅物の検出方法
本発明で提供される検出プローブを用いるためには、ドナープローブの蛍光色素を励起することのできる波長を発する光源、且つ、アクセプタープローブの蛍光色素の蛍光を測定できる検出器を備えているサーマルサイクラーが必要である。
ここでは、ライトサイクラー（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を使用した場合のPCR条件について、実施例で示す。
【００４７】
５）試薬・試薬キット
本発明のPCRプライマーと検出プローブは標的であるCK19 mRNAの増幅・検出のために必要な試薬類と併せてキット化することが可能である。
【実施例】
【００４８】
本発明の実施例を以下に示すが、本発明はこの実施例のみに限定されるものではない。
実施例１. PCRプライマーのデザイン
前述したとおり、CK19にはプロセス型の偽遺伝子が報告されている。この偽遺伝子が検体に混入した場合でも影響を受けないPCRプライマーを作成する必要がある。
この目的のために、３種のフォワードプライマー（F1〜F3）と２種のリバースプライマー（R1〜R2）を試作した。F1〜F3とR1はその３'−末端がCK19の偽遺伝子とCK19 mRNAのミスマッチ部位になるようにデザインした。R2はその塩基配列中にイントロン−エクソンの境界が存在するようにデザインした。F1及びR1はCK19偽遺伝子に対して２個のミスマッチを有し、そしてF2、F3及びR2はCK19偽遺伝子との間に１個のミスマッチを有する。
【００４９】
F1：TGAGTGACATGCGAAGC（配列番号：５の塩基799〜815）（配列番号：２）
F2：CGCCAAGATCCTGAGTG（配列番号：５の塩基788〜804）（配列番号：８）
F3：GACATGCGAAGCCAATAT（配列番号：５の塩基804〜821）（配列番号：９）
R1：TGTGTCTTCCAAGGCA（配列番号：５の塩基1007〜1022）（配列番号：４）
R2：CCAAGGCAGCTTTCAT（配列番号：５の塩基999〜1014）（配列番号：10）
F1/R1、F1/R2、F2/R2、F3/R2の各プライマーの組み合わせで以下の条件にてPCRを行った。
【００５０】
反応に用いる酵素（Th DNA polymerase）は市販のキット（LightCycler RNA Master Hybridization Probes、販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いた。
50mＭ  酢酸マンガン                3.25ｍM
PCRプライマー                      各0.25μM
Tth DNA polymerase                 7.5μL/反応
CK19 mRNAまたはCK19偽遺伝子        105コピー/PCR
以上の成分が入った20μLの反応液をガラスキャピラリーに入れ、ライトサイクラーで表１に示す条件で１ステップRT-PCRを行ない、反応産物5μLを3％アガロースゲル電気泳動にて分析した。
【００５１】
【表１】
2007275016.tif 000002
【００５２】
F1/R1（F1、R1ともCK19偽遺伝子とのミスマッチは２個）ではCK19遺伝子からの増幅物と考えられるバンドが若干見られたものの、CK19偽遺伝子からの増幅物はまったく認められなかった。
F1/R2、F2/R2、F3/R2（R2、F2、F3ともにCK19偽遺伝子とのミスマッチは１個）ではCK19遺伝子からの増幅物と考えられるバンドは認められなかったが、CK19偽遺伝子からの増幅物は僅かに認められた。
検出プローブの工夫によって、CK19偽遺伝子からの増幅物を検出しないようにする事は難しいと判断して、CK19偽遺伝子からの増幅物はまったく認められなかったF1/R1を採用することにした。
【００５３】
実施例２. 検出プローブのデザイン
検出プローブは２セット試作して比較した。ドナープローブ（P1とP1b）はその３'−末端をFITCで標識し、アクセプタープローブはその５'−末端をLC-Red 640（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で標識した。
セット１
P1：GTCATGGCCGAGCAGAACC（配列番号：５の塩基825〜843）（配列番号：11）
P2：AAGGATGCTGAAGCCTGGT（配列番号：５の塩基846〜864）（配列番号：12）
セット２
P1b：AAGCCTGGTTCACCAGCCG（配列番号：５の塩基856〜874）（配列番号：６）
P2c：CTGAAGAATTGAACCGGGAGG（配列番号：５の塩基877〜897）（配列番号：７）
セット2はエクソン‐イントロンの境界が2本の検出用プローブの間にハイブリダイズするようにデザインされているが、セット1はそのようなデザインはされていない。
【００５４】
プローブセットの評価のため、以下の成分が入った20μLの反応液をガラスキャピラリーに入れ、ライトサイクラーで表１に示す条件で１ステップRT-PCRを行った。
50mＭ  酢酸マンガン                      3.25ｍM
PCRプライマー  F1及びR1                  各0.25μM
ドナープローブ（P1またはP1b）            25nM
アクセプタープローブ（P2またはP2c）      100nM
Tth DNA polymerase                       7.5μL/反応
CK19 mRNAまたはCK19偽遺伝子              105コピー/PCR
【００５５】
その結果、セット1ではCK19遺伝子の増幅に伴う蛍光シグナルが見られたが、セット2では全く蛍光シグナルは検出されなかった。
以上の検討から、PCRプライマーでCK19偽遺伝子の増幅を排除し、検出プローブでCK19遺伝子の増幅シグナルを排除するプライマー（F1とR1）とプローブ（P1bとP2c）の組み合わせが確立された。
【００５６】
実施例３. CK19mRNAのリアルタイムRT-PCR
陽性コントロールであるCK19 mRNAと、ヒトDNA及びCK19偽遺伝子のリアルタイムRT-PCRの実施例を示す。
CK19 mRNAを段階的に10倍希釈し、105〜102コピーをライトサイクラーにて１ステップRT-PCR増幅にかけた。反応液の組成（20μL/PCR）は以下の通り。同様に、ヒトDNA 500ng、あるいはCK19偽遺伝子105コピーをRT-PCRにて増幅・検出した（所要時間は約40分）。
50mＭ  酢酸マンガン                  3.25ｍM
PCRプライマー  F1及びR1              各0.25μM
ドナープローブ  P1b                  25nM
アクセプタープローブ  P2c            100nM
Tth DNA polymerase                   7.5μL/反応
【００５７】
結果を図１と図２に示す。これらの図において、縦軸が蛍光の強度を示し、横軸がPCRのサイクル数を示す。
CK19 mRNAをRT-PCRにより増幅した場合は、その初期量に依存したPCRサイクル数で蛍光シグナルが発生するが（図１）、ヒトDNA又はCK19偽遺伝子を同様にしてPCRにかけた場合はそのような蛍光シグナルは見られない（図２）。
【００５８】
実施例４. ヒトリンパ節中のCK19 mRNAの検出
臨床検体を用いたCK19 mRNAのリアルタイムRT-PCRの実施例を示す。cT1N0の胃癌患者から摘出されたリンパ節のうち、病理診断で癌転移が認められたリンパ節と癌の転移が認められなかったリンパ節を選び、グアニジンチオシアネートが入った緩衝液中(600μL)にホモゲナイズした。ホモゲナイズはMagNA Lyser（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で行った。ホモジネート450μLに蒸留水を500μL加え、これを14500x Gで遠心して上清（900μL）を新しいチューブに移した。これに5μMのビオチンラベルしたオリゴヌクレオチド（Biotin-5’-gcttcacatccctccgctgattctcttga）を2μL加えた後、37℃で10分間放置してオリゴヌクレオチドとCK19 mRNAをハイブリダイズさせた。
【００５９】
ついでアビジンでコートした磁性粒子を加えてさらに37℃10分放置してmRNA-オリゴヌクレオチド複合体を磁性粒子上にトラップした。この磁性粒子を界面活性剤入りの緩衝液で2回洗浄して余分な成分を除去した後、TE緩衝液を50μL加えて良く磁性粒子を懸濁し、磁性粒子上のCK19mRNAを熱で抽出した（所要時間は約45分）。
この抽出検体、2μLを１ステップRT-PCRにかけるが、その具体的な条件は実施例３と同じである（所要時間は約40分）。
結果を図３に示す。病理診断で癌転移が陽性であったリンパ節（#1-2）はRT-PCRで陽性であり、病理診断で癌転移が陰性であったリンパ節（#3）はRT-PCRで陰性であった。
【００６０】
実施例５. マルチプレックス・リアルタイムRT-PCRの一例
臨床検査において、一回の測定で複数の検査項目を同時に行うことがあり、コストや労力の削減に重要である。特に、癌細胞の有無や転移の診断を行う場合、単一のマーカーの結果のみで判断することは、誤診の危険が伴う可能性がある。従って、CK19m RNAに加えて他のマーカーを同時にリアルタイムRT-PCRすることができれば、臨床診断に応用する場合にその有用性が高くなる。
【００６１】
そこで、CK19と同じサイトケラチンの一種であるCK20のmRNAをCK19と同時に増幅し、個別に検出するプロトコルを確立した。RT-PCRの条件は先の実施例３と同じであるが、CK20のPCRプライマー（CK20F及びCK20R）と検出プローブ（CK20P1及びCK20P2）を反応液に添加した。この検出プローブでは、CK19の検出波長と区別するために、ドナープローブはその３'−末端をFITCで標識し、アクセプタープローブはその５'−末端をLC-Red610（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で標識した。
CK20F  ATCAAGCAGTGGTACGAAAC  （配列番号：13）
CK20R  AGGACACACCGAGCATTT  （配列番号：14）
CK20P1  ATTACAGACAAATTGAAGAGCTGCC  （配列番号：15）
CK20P2  AGTCAGATTAAGGATGCTCAACTGC  （配列番号：16）
【００６２】
50mＭ  酢酸マンガン                       3.25ｍM
CK19 PCRプライマー  F1及びR1            各0.25μM
CK19ドナープローブ  P1b                     25nM
CK19アクセプタープローブ  P2c              100nM
CK20 PCRプライマー  CK20F及びCK20R         各0.25μM
CK20ドナープローブ  CK20P1                  25nM
CK20アクセプタープローブ  CK20P2           100nM
Tth DNA polymerase                       7.5μL/反応
陽性コントロール CK19 mRNA
陽性コントロール CK20 mRNA
CK19とCK20のそれぞれのmRNAは同じ反応容器の中で増幅され、異なる検出波長（CK19については640nm、CK20については610nm）でその増幅を個別にモニターすることができた。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、段階的に希釈したCK19 mRNAを、本発明の１ステップRT-PCRにかけた結果を示すグラフである。
【図２】図２は、ヒトDNA及びCK19偽遺伝子を、図１の場合と同様の１ステップRT-PCRにかけた結果を示すグラフである。
【図３】図３は、病理診断で癌転移が陽性であったリンパ節（#1-2）、及び病理診断で癌転移が陰性であったリンパ節（#3）を、本発明の１ステップRT-PCRにかけた結果を示すグラフである。
【図１】
2007275016.tif 000003
【図２】
2007275016.tif 000004
【図３】
2007275016.tif 000005
【配列表】
2007275016000001.app