(57)【要約】      （修正有）【課題】イヌＧ−ＣＳＦのシグナル配列を含む全長ｃＤＮＡ配列を解明すること、および安定なイヌＧ−ＣＳＦを簡単かつ大量に生産し得る方法を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるイヌ顆粒球コロニー刺激因子をコードするＤＮＡを組み入れた昆虫遺伝子発現ベクターを調製し、このベクターを組み込んで遺伝子組換えバキュロウイルスを作製し、それを用いてイヌ顆粒球コロニー刺激因子を生産することを特徴とするイヌ顆粒球コロニー刺激因子の製造法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるイヌ顆粒球コロニー刺激因子をコードするＤＮＡを組み入れた昆虫遺伝子発現ベクターを調製し、このベクターを組み込んで遺伝子組換えバキュロウイルスを作製し、それを用いてイヌ顆粒球コロニー刺激因子を生産することを特徴とするイヌ顆粒球コロニー刺激因子の製造法。
【請求項２】
イヌ顆粒球コロニー刺激因子が、糖鎖を有することを特徴とするイヌ顆粒球コロニー刺激因子の製造法。
【請求項３】
遺伝子組換えバキュロウイルスが組換えカイコ核多角体病ウイルスであることを特徴とする請求項１または２記載のイヌ顆粒球コロニー刺激因子の製造法。
【請求項４】
遺伝子組換えバキュロウイルスをカイコ由来細胞中またはカイコ生体中で増殖させることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のイヌ顆粒球コロニー刺激因子の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カイコを用いて、イヌ顆粒球コロニー刺激因子の製造方法に関する。さらに詳しくは、安定なイヌ顆粒球コロニー刺激因子を簡単に量産し得る製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、骨髄において血球前駆細胞に作用し、その分化・増殖を調節する働きを有している。特に顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、血球前駆細胞から好中球への分化・増殖を行う作用を有している。ヒトＧ−ＣＳＦの構造は２０４残基のアミノ酸で構成されており、その内３０残基のシグナルペプチド、成熟タンパク質としては１７４残基のアミノ酸からなり、いくつかの糖鎖修飾（グリコシレーション）を受けた糖タンパク質である。当初Ｇ−ＣＳＦは、マウスにエンドトキシンを投与し、その肺中の流出液内から分離・精製がなされた（非特許文献１）。ヒトＧ−ＣＳＦは、２つのグループからｃＤＮＡ  クローニングおよび発現の報告がなされた（非特許文献２、３）。最初の報告（非特許文献２）ではヒトＧ−ＣＳＦは成熟タンパク質が１７７残基のアミノ酸からなるとの報告がなされたが、生物活性が本来の活性の１０分の１でしかなかった。次の報告（非特許文献３）では、最初の報告よりも３残基アミノ酸が少ない１７４残基のＧ−ＣＳＦのｃＤＮＡ  クローニングがなされ、Ｇ−ＣＳＦが従来有する生物活性を保有していることが判明した。その他、マウスＧ−ＣＳＦおよびラットＧ−ＣＳＦのｃＤＮＡ  クローニングがなされた（非特許文献４、５）。
【０００３】
コンパニオンアニマルであるイヌおよびネコは感染症が多く報告され、イヌではパルボウイルスによる感染が世界で１５０万頭を超え、その内２０％が死に至ると言われている。さらにこのウイルスは、重篤な白血球減少症（ニュートロペニア）を誘発し、２次感染などによってさらに死亡するイヌが多いと報告されている。一方ネコでは、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）による感染が年あたり５０万〜１００万頭を超えると言われており、このウイルスは約３０％のネコにニュートロペニアを誘発させ、易感染症になるとされている。ＦＩＶ以外にもネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）でも同様にニュートロペニアになると言われている。また、最近ではこれらコンパニオンアニマルの腫瘍に対して、ヒトの抗腫瘍薬の投与、放射線療法などによりニュートロペニアを招き、易感染症になると言われている。
【０００４】
イヌやネコの感染症予後、抗腫瘍薬投与後の骨髄抑制などにより誘発されるニュートロペニアに対して、組換えヒトＧ−ＣＳＦが使用されている。ニュートロペニアのイヌに組換えヒトＧ−ＣＳＦを投与した場合、症状の改善があるとの報告（非特許文献６）があり、また放射線療法を施したイヌに対しても同様に改善効果があるとの報告（非特許文献７）がある。しかし、長期投与において、外因性および内因性のＧ−ＣＳＦに対する中和抗体産生がみられ、重篤なニュートロペニアに至るケースがあると報告（非特許文献８）されている。長期投与における中和抗体の発現の原因としては、種の異なるＧ−ＣＳＦの投与が原因であると推察され、イヌやネコにおける深刻な臨床治療の問題の一つであるとされている。
【０００５】
ネコＧ−ＣＳＦは、ｃＤＮＡ  クローニングがなされており、昆虫細胞での発現も確認されている（特許文献１）。本報告では、バキュロウイルスを調製し、Ｓｆ２１ＡＥ細胞を用いてネコＧ−ＣＳＦの生産に成功している。また生産されたネコＧ−ＣＳＦは、Ｇ−ＣＳＦのバイオアッセイの一つであるＮＦＳ６０細胞の増殖を促進していた。また、作製したネコＧ−ＣＳＦは、遺伝子組換え技術により、その５‘末端にタグ  を付加することにより精製の簡便化を図っている（非特許文献９）。
【０００６】
イヌＧ−ＣＳＦは、ｃＤＮＡ  クローニングがなされており、大腸菌での発現も確認されている（特許文献２）。本報告では、成熟タンパク質に相当するＤＮＡ配列のみであり、動物細胞や昆虫細胞で発現させる場合に必要となるシグナル配列部の報告はされていない。また本報告では、５μｇ／ｋｇの投与量で４週間にわたって健常犬にイヌＧ−ＣＳＦを投与した場合、好中球が４．５倍になり、投与中止によりこの値は正常値にもどること、および投与期間中中和抗体の発現が見られなかったことが報告されている。しかし、Ｇ−ＣＳＦはその安定性にはＯ型糖鎖の修飾が関与しており、大腸菌生産ヒトＧ−ＣＳＦは、動物細胞で生産させたヒトＧ−ＣＳＦと比較した時、血清中での安定性が８時間後には３０％に低下することが報告されている（非特許文献１０）。活性低下はＧ−ＣＳＦに感受性のある細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの系でも同様であり、グリコシレーションを受けていないＧ−ＣＳＦ（大腸菌生産）は血清中のトリプシンなどのプロテアーゼにより分解を受けやすいと考えられる。また、ｐＨに対する感受性についても同様に、大腸菌生産ヒトＧ−ＣＳＦは、天然型Ｇ−ＣＳＦに比べてアルカリ側（ｐＨ８）での生物活性の消失を受けやすいことが判明している。
【０００７】
すなわち、大腸菌などの細菌または酵母の系では、糖鎖やリン酸化など翻訳後修飾に問題があり、タンパク質を十分機能する形で合成できないことがある。しかしその一方で動物細胞では、タンパク質の修飾が完全に行われるため、発現させたタンパク質を機能する形で合成できることが多いが、一般的に増殖させるのが困難で産生量も低く経済的ではない。
【０００８】
一方、昆虫または昆虫細胞を用いた遺伝子組み換えタンパク質の生産では、酵素や生理活性を持つ有用タンパク質等が、比較的安価に量産でき、動物に近いタンパク質の翻訳後修飾が得られることが知られている。中でも、カイコを用いた有用タンパク質の生産性については、大腸菌を用いたタンパク質生産量と比較しても同等以上である。すなわち、外来タンパク質遺伝子を組み込んだバキュロウイルスを、昆虫または昆虫細胞に感染させる方法で、外来タンパク質が比較的安価に量産が可能であり、医薬品として製品化された生理活性タンパク質も知られている（特許文献３、４）。
【非特許文献１】ニコラ（Ｎｉｃｏｌａ）ら：ジャーナル・バイオロジー・オブ・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）、２５８、９０１７（１９８３）
【非特許文献２】ナガタ（Ｎａｇａｔａ）ら：エムボ（ＥＭＢＯ）、５，５７５（１９８６）
【非特許文献３】サウザ（Ｓｏｕｚａ）ら：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３２，６１（１９８６）
【非特許文献４】ツチヤ（Ｔｈｕｃｈｉｙａ）ら：プロセジャー・ナショナル・アカデミック・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ）、８３、７６３３（１９８６）
【非特許文献５】ハン（Ｈａｎ）ら：ジーン（Ｇｅｎｅ）、１７５，１０１（１９９６）
【非特許文献６】ロスロップ（Ｌｏｔｈｒｏｐ）ら：ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、７２、１３２４（１９８８）
【非特許文献７】シェニング（Ｓｃｈｕｅｎｉｎｇ）ら：ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、７４、１３０８（１９８９）
【非特許文献８】ハモンド（Ｈａｍｍｏｎｄ）ら：ジャーナル・オブ・クリニカル・インベストメント（Ｊ．ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ）、８７，７０４（１９９１）
【非特許文献９】ヤマモトら：ベターナリーイムノロジーイムノパソロジー（Ｖｅｔ  ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ）．９０．１６９−１７７（２００２）
【非特許文献１０】オノ（Ｏｎｏ）ら：ジャーナル・オブ・ニュートリシャス・サイエンス・ビタミノール（Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ），１７１，３３７（１９９２）
【特許文献１】特開平１１−１９６８８１号公報
【特許文献２】米国特許  ５，６０６，０２４号明細書
【特許文献３】特開昭６１−９２８８号公報
【特許文献４】特開昭６１−９２９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明は、イヌＧ−ＣＳＦのシグナル配列を含む全長ｃＤＮＡ配列を解明すること、および安定なイヌＧ−ＣＳＦを簡単かつ大量に生産し得る方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、イヌＧ−ＣＳＦを組み込んだ遺伝子組換えバキュロウイルスを用いることにより、安定なイヌＧ−ＣＳＦを簡単に量産し得ることを見いだし本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるイヌ顆粒球コロニー刺激因子をコードするＤＮＡを組み入れた昆虫遺伝子発現ベクターを調製し、このベクターを組み込んで遺伝子組換えバキュロウイルスを作製し、それを用いてイヌ顆粒球コロニー刺激因子を生産することを特徴とするイヌ顆粒球コロニー刺激因子の製造法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、安定なイヌＧ−ＣＳＦを簡単かつ大量に生産し得るようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明においては、まず、イヌＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドを製造する。
【００１４】
上記イヌＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡを組み込んだ遺伝子であるプラスミドは例えば次のようにして製造することができる。すなわち、イヌのリンパ球からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、それぞれのサブユニットをコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによって、イヌＧ−ＣＳＦをコードする遺伝子を得ることができる。イヌの細胞、例えばエンドトキシンで刺激されたイヌリンパ球などによりＲＮＡを得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられる。上記イヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（文献１０）バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法、グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。
【００１５】
上記RNAを用いて通常の方法、例えば塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロース法などによりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば  Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献１１）、Ｈ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（文献１２）などによりｃＤＮＡを合成することができる。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには基本的にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。このｃＤＮＡを鋳型としてイヌG-CSFをコードする遺伝子の塩基配列を基にしたプライマーを用いてＰＣＲを行うことによってイヌG-CSFをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００１６】
次に、上記で得られたＤＮＡを組み入れた昆虫遺伝子発現ベクターを調製するが、その調製方法としては、昆虫遺伝子発現ベクターにイヌＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡを連結する方法を用いることができる。そして上記調製されたイヌＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡを組み入れた昆虫遺伝子発現ベクターを相同組換えによりバキュロウィルスに組み込んで遺伝子組換えバキュロウィルスを作製する。さらに、上記遺伝子組換えバキュロウィルスを用いて宿主を形質転換し、タンパク質であるイヌＧ−ＣＳＦを生産させることができる。すなわち、遺伝子組換えバキュロウイルスは、イヌG-CSFの蛋白質をコ−ドするＤＮＡを含む昆虫遺伝子発現ベクターとバキュロウイルスＤＮＡとを、宿主にコトランスフェクションして作製することができるのである。従って、組換えバキュロウイルスは、ｉｎ  ｖｉｖｏ的な方法で作製することができる。すなわち、イヌＧ−ＣＳＦの蛋白質をコードするＤＮＡ部分を、ポリヘドリンプロモーターを有する発現用遺伝子ベクターに連結するという一般的な遺伝子操作に従って組換え体プラスミドを作製し、この組換え体プラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（文献１３）などのバキュロウィルスＤＮＡとを、文献のような方法で宿主にコトランスフェクションした後、培養を続け、培養液中に出現した非組換え体（野性型）と組換え体のウイルスの中から限界希釈法、もしくはプラーク法などの一般的な方法によって組換え体ウイルスのみをクローニングし、組換えバキュロウイルスを得る。イヌＧ−ＣＳＦの生産は、前記の遺伝子組換えバキュロウイルスを宿主中で増殖させることにより行う。
【００１７】
本発明においてはこの手段を採用することにより、糖鎖を有するイヌＧ−ＣＳＦが得られる。天然型のイヌＧ−ＣＳＦはＯ型の糖鎖の修飾を受けている。そして本発明の方法により作製したイヌＧ−ＣＳＦもカイコ由来の糖鎖付加が生じ、糖鎖付加を受けない大腸菌で作製したものに比較し、安定なイヌＧ−ＣＳＦを製造することが可能となるのである。
【００１８】
昆虫遺伝子発現ベクターとしては、ｐＢＭ０３０やｐＢＫ２８３などが使用できる。
【００１９】
本発明で用いられるバキュロウィルスとしては特に制限はないが、宿主をカイコにする場合は、組換えタンパク質生産量の点からカイコ核多角体病ウィルスなどの核多角体病ウィルスが好ましい。カイコ核多角体病ウイルスとしては、ＢｍＮＰＶ，Ｈｙｂｒｉｄ−ＮＰＶなどがあげられるが、カイコではよく知られたウイルスであり、ＢｍＮＰＶが入手容易な点から好ましく用いられる。ヨトウガを宿主とする場合はヨトウガ核多角体ウイルスが好ましい。ヨトウガ核多角体ウイルスとしては、ＡｃＮＰＶ，ＡｃＮＰＶ  Ｃ２型、ＡｃＮＰＶ  Ｅ２型、ＡｃＮＰＶ  Ｌ１型、ＡｃＮＰＶ  ＯＴ２型などが知られている。ＡｃＮＰＶが入手容易な点から好ましく用いられている。
【００２０】
宿主としては、昆虫、もしくはその細胞、特に鱗翅目の昆虫もしくはその細胞であることが好ましい。具体的には、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、キャベツルーパー（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）等の鱗翅目の幼虫、及びそれらの細胞を挙げられるが、なかでもカイコの生体、カイコ由来細胞を好ましく使用することができる。カイコ由来細胞としては、ＢｍＮ細胞が、他にカイコ細胞として類がない点から好ましい。
【００２１】
本発明における昆虫遺伝子発現ベクターによる宿主の形質転換は、当業界においてよく知られている常法により行うことができ、これらの方法は例えば、カレント  プロトコールス  イン  モレキュラー  バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン  ウィリー  アンド  サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗ−ｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）社、に記載されている。形質転換体の培養も常法に従って行うことができる。  
【００２２】
以下本発明で好ましく用いられるバキュロウィルスであるカイコに感染する組換えカイコバキュロウイルスを作製することによって、カイコ発現系を用いて生産する場合を例にとって以下説明する。
【００２３】
カイコ樹立細胞を用いる場合は、前記組換え体ウイルスを含む培養液により、ＢＭ−Ｎ細胞を感染させ、平面培養または浮遊培養により培養する。ＢＭ−Ｎ細胞を培養する培地としては、例えば牛血清を添加したＴＣ−１０培地（文献１３）やＴＣ−１００培地（日本農産工業（株）製）を使用することができる。培養温度は２５〜２８℃が適当である。培養後、培養液を遠心分離しその上清からイヌＧ−ＣＳＦを回収する。
【００２４】
カイコ生体を用いる場合は、５令２日目のカイコ幼虫に、組換えウイルスを接種後、２５℃条件下４〜５日飼育を継続し、カイコの腹部分を切開し、得られるカイコ体液を約１〜２０倍量、好ましくは約５〜１５倍量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）内に回収する。産生されたイヌＧ−ＣＳＦは非還元下、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定すると、見かけの分子量が約２０ｋＤである。
【００２５】
イヌＧ−ＣＳＦは、以下の実施例  で示すようにｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＦＳ−６０による細胞増殖活性により主に特性化される。
【実施例】
【００２６】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１  カイコ生産イヌG-CSFの調製
（１）イヌG-CSF遺伝子の取得
イヌ末梢血リンパ球をエンドトキシンで４時間、３７℃下で刺激後、アイソジェン（ニッポンジーン社）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）を含む１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。０．５Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥにて洗浄後、０．０１％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ  ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２ を２μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰを１μｌおよび０．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を２μｌそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニットの“スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）  ＩＩ  ＲＴ”（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ社製）を１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００２８】
イヌＧ−ＣＳＦのＮ末端およびＣ末端の塩基配列（特許文献２）をもとに、配列番号２と配列番号３の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記のイヌ末梢血リンパ球より得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに２μｌ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２ 、２５ｍＭ  ＫＣｌ、１００μｇ／ｍｌ  ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でパーキン−エルマーシータス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約500ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献１４）に従って調製した。
【００２９】
このＤＮＡ断片をＴ−ベクター“Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ”（ノバジェン社製）の“ＤＮＡ  ライゲーションキット（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１”を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認後、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片がイヌＧ−ＣＳＦをコードする配列であることを確認した（配列番号４）。
【００３０】
イヌＧ−ＣＳＦ遺伝子５’末端のクローニングは５’レース（ＲＡＣＥ）法により行った。すなわち、上記で得られたイヌＧ−ＣＳＦの部分塩基配列をもとに、配列番号５と配列番号６と配列番号７の３種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のイヌ末梢血リンパ球メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を0.５ｍＬのマイクロチューブに２μLを入れ、“５’ＲＡＣＥ  ｋｉｔ”(ギブコ(ＧＩＢＣＯ)社製)を用いてイヌＧ−ＣＳＦの５’側末端を含むＤＮＡを調製した。すなわち、イヌ末梢血リンパ球ｍＲＮＡおよびＲｎａｓｅを不活化するためのジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）水、プライマー２５ｐｍｏｌ（配列番号５）を加え、７０℃１０分間処理した。次に氷上で１分間おき、１０×ＰＣＲ  緩衝液、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．１Ｍ  ＤＴＴをそれぞれ添加し４２℃で１分加温した。次に“スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＩＩＲＴ”を添加し、さらに４２℃で３０分処理し続けて７０℃１５分処理して、ｃＤＮＡへの逆転写を行った。最後にＲｎａｓｅＭｉｘを加え３７℃で２０分処理を行ってＲＮＡを分解した。こうして得られたサンプルを用いて、スピンカートリッジにより逆転写されたｃＤＮＡの精製を行った。すなわち、結合溶液（Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（６Ｍ  ＮａＩ）をサンプルに添加し、スピンカートリッジにセットした後１３，０００Ｇ、２０秒遠心を行った。４００μＬ  洗浄緩衝液（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄を繰り返し、さらに７０％エタノールで洗浄を加えた後、予め６５℃に熱しておいた滅菌水を加えて１３，０００Ｇ、２０秒遠心を加えた。溶出したサンプル１０μＬ、ＤＥＰＣ処理水６．５μＬ、ｔａｉｌｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ５μＬ、２ｍＭｄＣＴＰ２．５μＬを混合し、９４℃、３分処理した後、氷上で１分静置した。次に５’ＲＡＣＥ  ｋｉｔ（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）のターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）１μＬを加え、３７℃１０分処理し、さらに６５℃、１０分処理して、後述のアダプタープライマーと塩基配列が相補的な塩基配列を前記ｃＤＮＡ５’末端に付加させた。得られたサンプルを用いて、プライマー２０ｐｍｏｌ（配列番号６）およびアダプタープライマー２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２５ｍＭ  ＫＣｌ、５０μＭ各ｄＮＴＰ、ＫＯＤを添加し、全量５０μＬとした。ＤＮＡの変性条件９４℃、３０秒、プライマーのアニーリング条件を６２〜５０℃，３０秒、プライマーの伸張条件を６８℃，１分の各条件でＢｉｏ−ＲＡＤ社製ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、３５サイクル反応させた。得られたＰＣＲ産物を用いてプライマー２０ｐｍｏｌ（配列番号７）およびアダプタープライマー２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２５ｍＭ  ＫＣｌ、５０μＭ各ｄＮＴＰ、ＫＯＤ（ＤＮＡポリメラーゼ）を添加し、全量５０μＬとした。ＤＮＡの変性条件９４℃，３０秒、プライマーのアニーリング条件を６２〜５０℃，３０秒、プライマーの伸張条件を６８℃，１分の���条件でＢｉｏ−ＲＡＤ社製ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約４００ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００３１】
このDNA断片をｐＵＣ１０８（アマシャム社製）に“ＤＮＡ  ライゲーションキット（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）Ｖｅｒ．２”を用いて連結した。これを用いて常法に従って大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同条件のＰＣＲにより確認し、ＡＢＩプリズム（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ）３７７ＸＬ（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社）により、ビッグダイ  ターミネーター  サイクルシーケンシング（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法で５’末端を含むイヌＧ−ＣＳＦのＤＮＡの一部と推定される塩基配列を決定した（配列番号８）。最後に、得られたＤＮＡサンプル（配列番号４および８）をそれぞれ１ｎｇを用いて、プライマー２０ｐｍｏｌ（配列番号９および１０）、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２５ｍＭ  ＫＣｌ、５０μＭ各ｄＮＴＰ、ＫＯＤを添加し、全量５０μＬとした。ＤＮＡの変性条件９４℃、３０秒、プライマーのアニーリング条件を６２〜５０℃、３０秒、プライマーの伸張条件を６８℃、１分の各条件でＢｉｏ−ラッド（ＲＡＤ）社製ＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約４００ｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って調製した。
【００３２】
このＤＮＡ断片をｐＵＣ１０８（アマシャム社製）に“ＤＮＡ  ライゲーションキット（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）  Ｖｅｒ．２”を用いて連結した。これを用いて常法に従って大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同条件のＰＣＲにより確認し、ＡＢＩプリズム（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ）３７７ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、ビッグダイ  ターミネーター  サイクルシーケンシング（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法でイヌＧ−ＣＳＦの全ＤＮＡの塩基配列を決定した（配列番号１）。
【００３３】
（２）組換え体ウイルス液の調製
昆虫発現用遺伝子ベクターｐＢＫ  ｂｌｕｅ（日本農産工業（株）社製）及びイヌＧ−ＣＳＦ遺伝子をケイピーエヌ（ｋｐｎ）Ｉ、エックスビーエー（Ｘｂａ）Ｉ処理する。次に１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、常法により目的の遺伝子の切り出しを行う。得られた遺伝子断片を“ジーンクリーンIIキット（ｇｅｎｅｃｌｅａｎ  II  ｋｉｔ）”（フナコシ社製）により抽出し、“ＤＮＡ  ライゲーションキット（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）  ｖｅｒII”（宝酒造（株）社製）により１６℃、３０分の条件下ｐＢＫ  ｂｌｕｅとイヌＧ−ＣＳＦ遺伝子の連結を行った。次に連結した遺伝子をＸＬ−１０  Ｇｏｌｄ  コンピテントセル（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製）に常法により形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりイヌＧ−ＣＳＦ遺伝子断片を含む発現用遺伝子ベクターＤＮＡを調製する。
【００３４】
文献８の方法で組換えウイルスを作製した。すなわち、５０ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）バッファー（ｐＨ７．１）、０．２８Ｍ  ＮａＣｌ、０．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．７ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４からなる２．５ｍｌの溶液に、２．５ｍｌのＤＮＡ混合液（０．２５ＭＣａＣｌ２、カイコ核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶ  Ｔ３株（文献１３）のＤＮＡ１０μｇ、カイコ発現用組換えベクター６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを５ｍｌの１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ギブコ社製）を添加したＴＣ−１０培地（文献１３）中、２５ｃｍ２のフラスコで平面培養した約３×１０５個のＢｍＮ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さらに２７℃下、５日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添加し１時間培養後、最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬＸ−ガル（ｇａｌ）（シグマ社製）を含む１％アガロースゲルを添加し、さらに２７℃下、５日間培養を行った。次に最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ  Ｘ−ｇａｌを含む１％アガロースゲルを重層し、２７℃下、５日間培養を行った。組換えウイルスである青色のプラークを拾い、ＴＣ−１０培地１ｍＬに終夜処理した（プラークアッセイ法）。再度その上清を希釈して平面に培養したＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添加し１時間培養後、最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ  Ｘ−ｇａｌを含む１％アガロースゲルを添加し、さらに２７℃下、５日間培養を行い、プラークアッセイを３回繰りかえし、組換えウイルスの純化を行った。
【００３５】
ここで作製したイヌＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ（配列番号１）を含む組換えウイルスをｒＢＮＶＣａＧ−ＣＳＦとした。
【００３６】
さらに、７５ｃｍ2のフラスコ底面で、１５ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０6個のＢｍＮ細胞に、前記（２）でクローニングした組換え体ウイルスを含む培養液それぞれ５０μｌづつをＢＭ−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、遠心上清を組換え体ウイルス液として得た。それぞれのウイルス液を１０7倍希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添加して２７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によって培養基のＢＭ−Ｎ細胞にそれぞれウイルス感染が認められた。
【００３７】
（３）カイコでのイヌＧ−ＣＳＦの生産
５令２日目のカイコ幼虫に、（２）で得た組換えウイルスのウイルス液を５０μＬ／頭投与し、２５℃で４日間市販の人工飼料（カネボウシルクエレガンス社製）を与えて飼育後、カイコの腹部を切開し、体液を体液の１０倍量の氷冷した２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に採取し、遠心分離後の上清を得、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌し回収した。得られたカイコ体液を用いて、イヌＧ−ＣＳＦをウエスタンブロッティング法によって検出した。カイコ体液をアトー（株）製のパジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー（株）製のクリアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング後、メンブランを、抗ヒトＧ−ＣＳＦポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロックエース（大日本製薬（株）製）溶液に６時間反応させ、０．０２％ポリオキシエチレンソルビタンモノローレート（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット（株）製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ（株）製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、約２０ｋＤのバンドを検出した。
【００３８】
（４）カイコでのイヌＧ−ＣＳＦの生産量について
上記カイコ体液を用いて、ＮＦＳ−６０細胞によるイヌＧ−ＣＳＦの生産性について検討した。すなわち、ＮＦＳ−６０をＲＰＭＩ１６４０（ギブコ社製）／１０％ＦＢＳ培地に懸濁し、２．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、９６穴マイクロプレートに１００μＬ添加した。さらにカイコ体液および対照としてヒトＧ−ＣＳＦ１０μＬをそれぞれ添加し、５％ＣＯ２、３７℃条件下、２４時間培養し、セルカウンティングキット“ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８”（和光純薬社製）を用いて細胞増殖の程度を測定した。すなわち、キットのＷＳＴ−８を各穴１０μＬずつ添加し、２．５時間培養後、エライザプレートリーダー（ＥＬＩＳＡ  Ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）（ファルマシア社製）によりＡ４５０を測定した。その結果、カイコあたりのイヌＧ−ＣＳＦの生産量は８００−１０００μｇ／頭であった。
【００３９】
比較例１  大腸菌によるイヌＧ−ＣＳＦの調製
（１）発現用遺伝子ベクターへのイヌＧ−ＣＳＦ遺伝子の組込み
配列番号１に示したイヌＧ−ＣＳＦのＮ末側およびＣ末端の塩基配列をもとに、配列番号９  と配列番号１０の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。実施例１（２）で得られたイヌＧ−ＣＳＦｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲによるイヌＧ−ＣＳＦ  成熟タンパク質に相当する遺伝子の増幅を行った。すなわち、０．５ｍｌのミクロ遠心チューブにイヌＧ−ＣＳＦ２μｌ添加し、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、２５ｍＭ  ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ  ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でパーキン−エルマーシータス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約５００ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献１４）に従って調製した。
【００４０】
大腸菌発現用遺伝子ベクターペット（ｐＥＴ）２０ｂ（＋）（ノバジェン社製）及び上記で調製したイヌＧ−ＣＳＦ遺伝子をＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ処理する。次に１％アガロースゲルにより電気泳動を行い、常法により目的の遺伝子の切り出しを行う。得られた遺伝子断片を“ジーンクリーン（ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）  II  ｋｉｔ”（フナコシ社製）により抽出し、“DNA ライゲーションキット（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）  ｖｅｒII”（宝酒造（株）社製）により１６℃、３０分の条件下ｐＥＴ２１ｂ（＋）とイヌＧ−ＣＳＦ遺伝子の連結を行った。次に連結した遺伝子をＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡社製）に常法により形質転換を行った。得られた形質転換体から、アルカリ法によりイヌＧ−ＣＳＦ遺伝子断片を含む大腸菌発現用遺伝子ベクターＤＮＡを調製する。
【００４１】
（２）大腸菌でのイヌＧ−ＣＳＦの生産
大腸菌ＢＬ２１株を抗生物質非存在下３７℃でＯＤ＝０．７になるまで培養を行った。上記（１）で調製したイヌＧ−ＣＳＦ遺伝子断片を含む大腸菌発現用遺伝子ベクターＤＮＡをエレクトロペレーション（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法によりＢＬ２１に形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を行った。すなわち、０．２ｃｍキュベットにＢＬ２１およびイヌＧ−ＣＳＦ遺伝子断片を含む大腸菌発現用遺伝子ベクターＤＮＡを入れ、氷冷下１０分間処理した。次にエレクトロポレーション（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にそのキュベットをセットし、２５μＦ、２．５ｋＶで電気穿孔を行った。キュベット内の培養液を回収し、ＬＢ培地にて１時間培養後、アンピシリンを含むＬＢ  プレートに培養液を塗布し、１日３７℃で培養を行った。得られた形質転換体をＯＤ＝０．７になるまで培養し、最終濃度１ｍＭイソプロピルベータディーチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（アマシャム社製）を添加し、さらに３時間培養を行った。遠心操作により沈殿画分を得た後、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７）で懸濁した。超音波破砕操作を行い、再度遠心を行った。得られた沈殿画分を最終濃度５％ＳＤＳを含む２０ｍＭトリス緩衝液に溶解した。
【００４２】
（３）大腸菌生産イヌＧ−ＣＳＦの精製
上記（２）で得られた上清を１日間、２０ｍＭリン酸緩衝液にて透析し、予め用意したＮｉ  キレートカラムに供した。Ｎｉ  キレート精製キット“Ｎｉ  ｃｈｅｌａｔｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ｋｉｔ”（ノバジェン社製）を用いて精製を行い、得られた溶出液を再度１日間、２０ｍＭリン酸緩衝液にて透析した。イヌＧ−ＣＳＦをウエスタンブロッティング法によって検出した。精製液をアトー（株）製のパジェル中、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その後、アトー（株）製のクリアブロットメンブランに常法に従ってブロッティング後、メンブランを、抗ヒトＧ−ＣＳＦポリクローナル抗体を含むウサギ血清を含むブロックエース（大日本製薬（株）製）溶液に６時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて３回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（バイオラット（株）製）を含むブロックエース溶液に６時間反応させ、同様に洗浄した後、コニカ（株）製のコニカイムノステインＨＲＰ１０００にて発色を行った。その結果、約２０ｋＤのバンドを検出した。さらに、精製液中のイヌＧ−ＣＳＦの活性測定を以下のようにして行った。ＮＦＳ−６０をＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ培地に懸濁し、２．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、９６穴マイクロプレートに１００μＬ添加した。さらにイヌＧ−ＣＳＦサンプル１０μＬを添加し、５％ＣＯ２、３７℃条件下、２４時間培養し、“セルカウンティングキット（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ）−８”を用いて細胞増殖の程度を測定した。すなわち、キットのＷＳＴ−８を各穴１０μＬずつ添加し、２．５時間培養後、エライザプレートリーダー（ＥＬＩＳＡ  Ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）（ファルマシア社製）によりＡ４５０を測定した。その結果、ＮＦＳ−６０の増殖活性がみられた。
【００４３】
実施例２、比較例２  カイコ生産イヌＧ−ＣＳＦおよび大腸菌生産イヌＧ−ＣＳＦの安定性検討
上記のカイコ生産イヌＧ−ＣＳＦ（実施例２）および大腸菌生産イヌＧ−ＣＳＦ（比較例２）をそれぞれ、１、１０，１００、１０００ｐｇ／ｍＬの濃度となるようにイヌ血清中に入れ、３７℃下処理し、ＮＦＳ−６０細胞を用いた残存活性を測定した。すなわち、健常犬より全血を得、フィコールグラジエント（Ｆｉｃｏｌｌ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）操作により血清画分を回収した。次にカイコおよび大腸菌生産イヌＧ−ＣＳＦをイヌ血清に添加し、さらに３７℃下０時間または８時間処理したものを、予め９６穴マイクロプレートにＮＦＳ−６０細胞を２．２×１０４ｃｅｌｌｓ／穴調製したものに添加した。５％ＣＯ２、３７℃条件下、２４時間培養し、セルカウンティングキット“ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８”を用いて細胞増殖の程度を測定した。すなわち、キットのＷＳＴ−８を各穴１０μＬずつ添加し、２．５時間培養後、エライザ  プレートリーダー（アマシャム社製）により吸光度Ａ４５０を測定した。イヌ血清を加えて０時間ではカイコ生産イヌＧ−ＣＳＦおよび大腸菌生産イヌＧ−ＣＳＦ間で差が見られなかった。イヌ血清を加えて８時間後の結果を図１（ａ）、（ｂ）に示す。すなわち図１（ａ）は比較例２で評価した大腸菌生産イヌＧ−ＣＳＦに対する血清中残存活性を示したグラフであり、図１（ｂ）は実施例２で評価したカイコ生産イヌＧ−ＣＳＦに対する血清中残存活性を示したグラフである。図１のグラフに示されるとおり、８時間処理後のサンプルでは、大腸菌生産イヌＧ−ＣＳＦは、カイコ生産イヌＧ−ＣＳＦに比べ、８時間処理では有意に残存活性が低下していた。すなわち、糖鎖が欠損している大腸菌生産イヌＧ−ＣＳＦは、血清中のプロテアーゼにより分解を受けやすいと考えられ、その結果残存活性の低下が生じたものと考えられる（図１（ａ）、（ｂ））。
【００４４】
［参考文献］
１０．チーゥイン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）ら：バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１８、５２９４（１９７９）．
１１．ガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）ら：ジーン（Ｇｅｅｎ）．２５，２３６−２６９（１９８３）．
１２．オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）ら：モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ）．，２，１６１，（１９８２）＆３，２８０，（１９８３）．
１３．ティーホリウチ（Ｔ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉ）ら：アグリカルチャル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５１，１５７３−
１５８０，（１９８７）．
１４．モレキュラー・クローニング・コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・ニューヨーク（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）．１９８２．
【産業上の利用可能性】
【００４５】
イヌＧ−ＣＳＦの未知配列部分を明らかにすることにより、昆虫中でも組換えタンパク質の生産性の高いカイコでの生産を可能にすることにより、犬のニュートロペニアや抗癌剤による白血球減少症治療薬を提供できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１（ａ）は比較例２で評価した大腸菌生産イヌＧ−ＣＳＦに対する血清中残存活性を示したグラフであり、図１（ｂ）は実施例２で評価したカイコ生産イヌＧ−ＣＳＦに対する血清中残存活性を示したグラフである。
【図１】
2007151401.tif 000002
【配列表】
2007151401000001.app