(57)【要約】      （修正有）【課題】全般的に、前立腺癌特異的な抗原であるＰＣＡ３およびその前立腺癌診断・治療への利用方法の提供。【解決手段】ＰＣＡ３タンパク質をコードする核酸分子；精製されたＰＣＡ３タンパク質とポリペプチド；組換え核酸分子を含む細胞；ＰＣＡ３タンパク質及びポリペプチドに特異的な結合親和性を有する抗体；ＰＣＡ３タンパク質をコードする核酸を検出可能な核酸プローブ；サンプル材料中のＰＣＡ３タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸を検出する方法；核酸プローブ又は抗体を包含するキット。その塩基配列、タンパク質、又は抗体を用いて、前立腺癌に罹患した哺乳類動物の診断、病態評定又は予後の判断を行なうためのバイオアッセイ；前立腺癌の治療方法；及び生体における前立腺癌の予防方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれる単離された核酸分子。
（ａ）正常ヒト組織と比べて、前立腺癌組織において過剰発現していることを特徴とする、配列番号１、３、４又は６からなる塩基配列；
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列に完全に相補的な塩基配列；及び
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列の中の少なくとも１０個の連続した塩基にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１５塩基からなる塩基配列であって、ＰＣＡ３核酸を特異的に増幅するか又は検出することのできる塩基配列。
【請求項２】
正常ヒト組織と比べて、前立腺癌組織において過剰発現している単離された核酸分子であって、次の（ａ）と（ｂ）からなる群より選ばれる単離された核酸分子。
（ａ）配列番号１、３、４又は６の塩基配列；及び
（ｂ）配列番号１、３、４又は６の塩基配列に完全に相補的な塩基配列の中の少なくとも１０個の連続した塩基にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１５塩基からなる塩基配列であって、ＰＣＡ３核酸を特異的に増幅するか又は検出することのできる塩基配列。
【請求項３】
請求項１で定義した核酸分子の部分配列からなり、該部分配列が次の（ａ）と（ｂ）からなる群より選ばれることを特徴とする単離された核酸分子。
（ａ）以下のＰＣＡ３遺伝子のエクソン又はそれらの組み合わせから選ばれる連続した１５〜５０塩基からなる塩基配列：エクソン１（配列番号１の１番〜９８番の配列又は配列番号６の１番〜１２０番の配列）、エクソン２（配列番号１の９９番〜２６３番の配列又は配列番号６の１２１番〜２８５番の配列）、エクソン３（配列番号１の２６４番〜４４６番の配列又は配列番号６の２８６番〜４６８番の配列）、エクソン４ａ（配列番号１の４４７番〜９８５番の配列又は配列番号６の４６９番〜１００７番の配列）、エクソン４ｂ（配列番号１の９８６番〜２０３７番の配列又は配列番号６の１００８番〜２０６６番の配列）、エクソン４ｃ（配列番号６の２０６７番〜２６２２番の配列）とエクソン４ｄ（配列番号６の２６２３番〜３５８２番の配列）；及び
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列に相補的な塩基配列。
【請求項４】
該ストリンジェントな条件が、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１％ ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精巣ＤＮＡを含む溶液中で６８℃のハイブリダイゼーション条件であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
該正常ヒト組織が、動脈、脳、前胸部、十二指腸、心臓、肝臓、卵巣、胎盤、精嚢、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、精巣及び前立腺からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
サンプル材料中のＰＣＡ３核酸を検出する方法にして、
ａ）ハイブリダイゼーションの起こりうる条件下において該サンプル材料と請求項１〜５のいずれかの核酸分子とを接触せしめ、
ｂ）ＰＣＡ３核酸に結合した該核酸分子の存在を検出する、
ことを包含する方法。
【請求項７】
正常ヒト組織と比べて、前立腺癌組織において過剰発現しているＰＣＡ３核酸を検出するためのキットであって、請求項１〜５のいずれかの核酸分子の入った少なくとも１つの容器手段を包含することを特徴とするキット。
【請求項８】
次の（ａ）と（ｂ）からなる群より選ばれる単離された核酸分子。
（ａ）正常ヒト組織と比べて、前立腺癌組織において過剰発現していることを特徴とする、配列番号６の４０１番〜５５３番塩基からなる塩基配列；及び
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列に完全に相補的な塩基配列。
【請求項９】
配列番号１の塩基配列からなることを特徴とする、請求項１又は２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
配列番号３の塩基配列からなることを特徴とする、請求項１又は２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
配列番号４の塩基配列からなることを特徴とする、請求項１又は２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
配列番号６の塩基配列からなることを特徴とする、請求項１又は２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
該単離された核酸分子が、ＡＬＶＡ−３１、ＪＣＡ−１、ＰＰＣ−１、ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＴＳＵ−Ｐｒ１からなる群より選ばれるヒト前立腺癌由来の細胞株と比較して、前立腺癌組織において過剰発現していることを特徴とする、請求項１〜５と８〜１２のいずれかに記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
ベクターと、請求項１〜５と８〜１３のいずれかの核酸分子とを包含することを特徴とする組換え核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４の組換え核酸分子を含む単離された細胞。
【請求項１６】
生物試料における前立腺癌細胞の存在又は癌化する素因を有する前立腺細胞の存在を検出するための方法であって、
請求項１〜５と８〜１３のいずれかの単離された核酸分子を用いて生物試料中のＰＣＡ３核酸の量を測定し、正常前立腺組織と比べて、該生物試料において該ＰＣＡ３核酸が過剰発現していることをもって、該生物試料中に前立腺癌細胞又は癌化する素因を有する前立腺細胞が存在すると判定する
ことを包含する検出方法。
【請求項１７】
該ＰＣＡ３核酸がＰＣＡ３ ｍＲＮＡであることを特徴とする、請求項１６に記載の検出方法。
【請求項１８】
５’から３’への方向に、宿主細胞において転写を開始させるのに有効なプロモーター、及び請求項１〜５と８〜１３のいずれかの核酸分子を包含することを特徴とする組換え核酸分子。
【請求項１９】
請求項１７の組換え核酸分子を含むヒト以外の生物。
【請求項２０】
該塩基配列（ｂ）が、塩基配列（ａ）に完全に相補的であることを特徴する、請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項２１】
少なくとも１５塩基からなる塩基配列が、１５〜５０塩基からなる塩基配列であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の単離された核酸分子。
【請求項２２】
患者から得たサンプル材料中のＰＣＡ３核酸を定量することによって、該患者の有する前立腺癌又は前立腺癌の素因を診断するための診断用キットであって、請求項３又は４の核酸分子の入った少なくとも１つの容器手段を包含することを特徴とするキット。
【請求項２３】
該ＰＣＡ３核酸がＰＣＡ３ ｍＲＮＡであることを特徴とする、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
該サンプル材料が、器官、組織、細胞、細胞抽出物及び体液からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項６、１６又は１７に記載の方法、あるいは請求項７、２２又は２３に記載のキット。
【請求項２５】
該体液が、血液、血清、血漿及び尿からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項２４に記載の方法又はキット。
【請求項２６】
該体液が尿であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺癌抗原ＰＣＡ３に関する。本発明は特に、以下の主題に関する：ＰＣＡ３タンパク質をコードする核酸分子；精製されたＰＣＡ３タンパク質とＰＣＡ３ポリペプチド；組換え核酸分子；該組換え核酸分子を含む細胞；ＰＣＡ３タンパク質とＰＣＡ３ポリペプチドとへの特異的結合親和性を有する抗体；該抗体を産生するハイブリドーマ；ＰＣＡ３タンパク質をコードする核酸を検出するための核酸プローブ；ＰＣＡ３タンパク質又はＰＣＡ３ポリペプチドをコードする核酸を検体から検出するための方法；核酸プローブ又は抗体を含むキット；本発明の核酸配列、タンパク質又は抗体を用いて、前立腺癌に罹患した哺乳類動物の診断、病態評定又は予後の判断を行なうためのバイオアッセイ；前立腺癌の治療方法；生体における前立腺癌の予防方法。
【背景技術】
【０００２】
西欧の男性人口において、前立腺癌は最も一般に診断される悪性腫瘍であり、がんに関連する死亡件数の第２位を占めている。この癌腫が周囲や遠隔部の組織に転移すると、有効な治療方法がない。従って、前立腺癌を抑制する（即ち、前立腺癌による死亡率を低下させる）ための努力は、この癌がまだ他の組織に転移せず（locally confined）、潜在的に治癒可能な状態にある間の発見率を高めることに集中している。前立腺癌を早期に発見するための研究によって、臓器限局的（organ-confined）で潜在的に治癒可能な前立腺癌の発見率はかなり高まっている。しかし、この発見率の増加によって前立腺癌そのものによる死亡率（prostate cancer-specific mortality rates）が減少することはまだ実証されていない。また、早期診断によって死亡率が減少するという証拠もない。そして、米国とヨーロッパの両方で、スクリーニングプログラムの有効性と許容性、過度診断（overdiagnosis）と過度治療（overtreatment）の問題、及び、早期治療が前立腺癌の罹患率と死亡率の減少につながる可能性、などについての議論がまだ続いており、前立腺癌の早期発見は論争の絶えない問題となっている［Schroder, Urology 46: 6270 (1995)］。
【０００３】
前立腺マーカー酵素の血清中濃度の測定は、前立腺癌の臨床での検出、診断及び管理に有効であることが分かっている。最も広く用いられている前立腺マーカー酵素は、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）と前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の２種類である。通常、これらの酵素はともに前立腺上皮細胞から精液中に分泌されるが、前立腺に疾患をもつ患者においては循環器系に漏出するので、免疫学的アッセイによって検出することができる［Armbruster, Clin. Che. 39: 181−95（1993）］。
【０００４】
前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）は前立腺に関する最も初期の血清中マーカーの１つであるが、機能はまだ分かっておらず、ヒト前立腺分泌物に最も多量に存在するタンパク質成分である。しかし、前立腺特異的酸性ホスファターゼと、全ての組織で産生されるリソソーム酸性ホスファターゼとの間に構造的類似性があることが報告されているので、ＰＡＰを前立腺腫瘍のマーカーとして使用することは容易ではない。また、良性前立腺肥大（benign prostatic hyperplasia）（ＢＰＨ）における場合と比較して、前立腺癌におけるＰＡＰｍＲＮＡとＰＡＰタンパク質の産生レベルは低い傾向にある。近年、前立腺癌の臨床管理において、ＰＡＰの測定は血清ＰＳＡの測定に取って替わられた。
【０００５】
前立腺特異抗原は、１９７０年代にいくつかの研究者グループによって前立腺特異的タンパク質として精液から同定された。１９７９年に、前立腺特異抗原は前立腺癌組織から抗原として単離精製された。更なる研究によって、ＰＳＡは、前立腺と尿道周囲の腺の円柱上皮細胞によってのみ産生されることがわかった。実は、正常な前立腺上皮と良性過形成組織は、ＰＳＡ ｍＲＮＡとＰＳＡタンパク質を、前立腺癌組織よりも多量に産生する。また、前立腺癌（カルシノーマ）における分化能の喪失が、前立腺内のＰＳＡレベルの減少と関連することが示された。
【０００６】
前立腺疾患の結果として生じた前立腺の構造的異常は、ＰＳＡ（とＰＡＰ）の血清中への漏出の増加につながるので、血清ＰＳＡの測定値を前立腺癌のマーカーとして使用することができる。診断用ＰＳＡ試験にはＢＰＨと前立腺癌とを区別するための特異性に欠けるという欠陥があることが初期の研究で示されたにもかかわらず、ＰＳＡ試験は１９８６年に導入され、前立腺癌患者の管理に大きな変化をもたらした。ＰＳＡの臓器特異性についての知見や、血清ＰＳＡレベルの上昇と前立腺疾患との関係についての知見の増加、更に、生検の技術と組織学的評価技術の進歩によって、ＰＳＡ試験には臨床的価値が認められるようになった［このような有用性は、他のいかなる（前立腺）腫瘍マーカーによってもまだ達成されていない］。ＰＳＡをコードする遺伝子のクローニングによって、この遺伝子がヒトカリクレイン遺伝子ファミリーの一員であることが判明し、ＰＳＡをマーカーとして使用するための新たな道筋が開発された。すなわち、非常に高感度な、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて前立腺癌患者からの血液サンプル中の極めて微量の悪性前立腺癌細胞を検出することにより、微少転移を示す前立腺癌患者を発見するための高感度な技術を提供できるかも知れない［Moreno et al., Cancer Res. 52: 6110-12 (1992)；及び Katz et al., Urology 43: 765-75 (1994)］。
【０００７】
前立腺特異的膜抗原（prostate-specific membrane antigen）（ＰＳＭ）は、もともと、ＬＮＣａＰヒト前立腺アデノカルシノーマ細胞の膜分画でマウスを免疫することによって得られる抗体を用いて発見された。ＰＡＰやＰＳＡと同様に、ＰＳＭは、正常な前立腺、ＢＰＨ及び前立腺癌のいずれにも検出されるが、他の組織には存在しない。ＰＳＭについても、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて血液循環中の前立腺癌細胞を検出する研究が行なわれているが、ＰＳＭの前立腺癌マーカーとしての有用性を確立するには更なる研究が必要である。
【０００８】
要するに、現在ＰＳＡは前立腺癌の主要なマーカーであると認識されており、前立腺癌の兆候を示す患者の検出への有用性と、治療後の患者の観察、特に前立腺の外科的切除後の患者の観察への有用性が認められている（なお、ＰＳＡが検出可能なレベルにあることは、病巣が残存するか転移していることを示し、ＰＳＡレベルの上昇は疾患の再発を示す）。ＰＳＡのマーカーとしての欠点は、（１）ＰＳＡは前立腺癌をＢＰＨから必ずしも区別できないことと、（２）前立腺癌の分化能の喪失とともにＰＳＡの発現レベルが低下すること、である。
【０００９】
進行した前立腺癌によって男性人口のかなりの割合がまだ生命を脅かされていることを考えると、（後期の）前立腺癌の新たな治療方法や診断方法を開発する必要性がある。
【００１０】
本発明は、このような必要を満足することを目的とする。
本明細書においては多くの文献に参照するが、この参照によって、これらの文献の内容を本明細書に組み入れるものである。
【００１１】
発明の開示 
本発明においては、ＰＣＡ３又はその断片をコードする単離された核酸分子が提供される。
本発明においては、また、ＰＣＡ３又はそのエピトープ含有領域であるところの精製されたポリペプチドが提供される。
本発明においては、また、ＰＣＡ３タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸が検体中に存在することを特異的に検出するための核酸が提供される。
【００１２】
本発明においては、また、ＰＣＡ３をコードする核酸を検体から検出するための方法が提供される。
本発明においては、また、ＰＣＡ３をコードする核酸の存在を検体から検出するためのキットが提供される。
本発明においては、また、５’から３’への方向に、宿主細胞において転写を開始させるのに有効なプロモーター、及び上記の単離された核酸分子を包含する組換え核酸分子が提供される。
【００１３】
本発明においては、また、ベクターと上記の単離された核酸分子を包含する組換え核酸分子が提供される。
本発明においては、また、アンチセンスＰＣＡ３核酸分子が提供される。
本発明においては、また、上記の組換え核酸分子を含有する細胞が提供される。
【００１４】
本発明においては、また、上記の組換え核酸分子を含有するヒト以外の生物が提供される。
本発明においては、また、ＰＣＡ３又はそのエピトープ含有領域への特異的結合親和性を有する抗体が提供される。
本発明においては、また、検体中のＰＣＡ３を検出する方法が提供される。
本発明においては、また、検体中のＰＣＡ３の量を測定する方法が提供される。
【００１５】
本発明においては、また、ＰＣＡ３を発現する前立腺癌細胞に対する防御を誘導するための免疫用薬剤が提供される。そのような免疫用薬剤は、好ましくは、ＰＣＡ３を包含するポリペプチド、又は、その抗原性領域、又は、ＰＣＡ３を包含する融合タンパク質、又は、ＰＣＡ３の抗原性領域を包含する融合タンパク質である。このような態様の免疫用薬剤はワクチン剤として機能することになる。
【００１６】
本発明においては、また、ＰＣＡ３への特異的結合親和性を有する抗体を検出する方法が提供される。
本発明においては、また、上記の抗体を含有する第１容器手段と、上記の抗体と結合しうる物質と標識物質とからなる検出用結合物質の入った第２容器手段を包含する診断キットが提供される。
本発明においては、また、上記のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマが提供される。
【００１７】
本発明においては、また、ヒトの疾患、特に前立腺癌のための診断方法が提供される。好ましくは、患者における前立腺癌の存在または前立腺癌の発病素因（predisposition）を診断する方法が提供される。
【００１８】
本発明においては、また、（１）ＰＣＡ３をコードする核酸配列、（２）アンチセンスＰＣＡ３核酸分子、（３）ＰＣＡ３タンパク質、及び（４）抗ＰＣＡ３抗体、からなる群から選ばれる少なくとも１種を用いる治療方法が提供される。
本発明の更なる諸目的及び諸利益は、以下の説明から明らかとなる。
【００１９】
用語の定義 
本明細書では、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術で用いられる用語が数多く使用されている。このような用語の意味のおよぶ範囲を含めて、明細書と請求の範囲の理解を明確にし、且つ、一貫させるために、以下のように定義する。
【００２０】
単離された核酸分子：「単離された核酸分子」とは、一般に理解され、また、本発明で用いられているように、ヌクレオチドの重合体を意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むが、これらに限定はされない。「単離された核酸分子」という用語のうち「単離された」とは、自然界において生体内（in vivo）に存在する状態から精製されていることである。
【００２１】
組換えＤＮＡ：各種の原料から得られたＤＮＡセグメントを結合させることによって形成されたあらゆるＤＮＡ分子であり、組換えＤＮＡ技術（遺伝子工学ともいう）を用いて産生されるものである。
【００２２】
ＤＮＡセグメント：ＤＮＡセグメントとは、一般に理解され、また、本発明で用いられているように、直鎖状に伸びたヌクレオチドを包含する分子を意味する。ここでいうヌクレオチドとは、タンパク質、タンパク質断片又はポリペプチドとよばれる、直鎖状のアミノ酸残基からなる配列を包含する分子を、遺伝暗号を介してコードする配列に存在するものである。
【００２３】
遺伝子：単鎖のポリペプチド又はタンパク質に関連するＤＮＡ配列で、本発明においては、５’及び３’の非翻訳末端を含む。このポリペプチドは、タンパク質の機能的な活性が保持される限り、全長塩基配列又はコード配列のあらゆる部分によってコードすることができる。
【００２４】
相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）：メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写によって合成される組換え核酸分子。
【００２５】
構造遺伝子：ｍＲＮＡに転写され、次に特定のポリペプチドの特性を示すアミノ酸配列に翻訳されるＤＮＡ配列。
【００２６】
制限エンドヌクレアーゼ：制限エンドヌクレアーゼ（又は、制限酵素）は、ＤＮＡ分子における特定の塩基配列（通常、４、５又は６塩基対の長さ）を認識し、この配列が現れるところであればどこでもＤＮＡ分子を開裂することができる酵素である。例えば、ＥｃｏＲＩはGAATTC/CTTAAGの塩基配列を認識する。
【００２７】
制限酵素断片：制限酵素による消化によって産生されるＤＮＡ分子を制限酵素断片という。あらゆるゲノムを、特定の制限酵素による消化によって、そのゲノム特有の制限酵素断片の集合体とすることができる。
【００２８】
アガロースゲル電気泳動：制限酵素断片の長さにおける多型性を検出するために、二本鎖ＤＮＡ分子を分子サイズによって分離する分析方法が必要とされる。このような分離を行うために最も一般的に用いられている技術が、（これが唯一の技術というわけではないが）アガロースゲル電気泳動である。この方法の原理は、ＤＮＡ分子がゲルの中を移動し、ゲルが、最も大きい分子の動きを最大限に遅らせ、最も小さい分子の動きを最小限に遅らせて、篩のようなはたらきをするというものである。尚、小さいＤＮＡ断片ほど、電気泳動中のアガロースゲルにおける移動度が大きくなる。
【００２９】
アガロースゲル電気泳動によって分離されたＤＮＡ断片は、そのパターンに含まれる断片の数が少なければ、染色操作をすることによって直接視覚化することができる。ゲノムのＤＮＡ断片は幸い視覚化することができる。しかし、ヒトゲノムを含めてほとんどのゲノムは、あまりにも多くのＤＮＡ配列を含んでいるので、制限酵素断片の単純なパターンをつくることができない。例えば、ヒトゲノムは、ＥｃｏＲＩによって約１,０００,０００の異なるＤＮＡ断片に消化される。これらの断片を小さな部分集団として視覚化するために、サザンハイブリダイゼーション法（Southern hybridization procedure）と呼ばれる方法が適用できる。
【００３０】
サザントランスファー法：サザントランスファー法（ブロッティング法とも呼ばれる）は、ニトロセルロースフィルター又は他の適当な物質の表面の上に、アガロースゲル電気泳動によって分離されたＤＮＡを物理的に、即ち、分離操作で得られたＤＮＡ断片の相対的な位置を保持しながら転写することを目的としている。アガロースゲルからニトロセルロースに転写させるために用いられる方法には、毛細管現象によってＤＮＡをゲルからニトロセルロースフィルターに吸い出す方法も含まれる。
【００３１】
核酸のハイブリダイゼーション：核酸のハイブリダイゼーションは、相補的な塩基配列を有する２つの一本鎖核酸分子を適切な条件下で混合した場合、これらの分子は熱力学的に好ましい二本鎖構造に再形成されるという原理に基いている。この二本鎖構造は、たとえ２つの相補的な一本鎖核酸のうちの片方がニトロセルロースフィルターに固定されていても、これらの間で形成されるものである。サザンハイブリダイゼーション法ではこの状況が生じる。上述したように、試験する個々のサンプルのＤＮＡを制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離する。次にＤＮＡを一本鎖型に変換し、ニトロセルロースフィルターに移行すると、ハイブリダイゼーションプローブに再アニーリングできるようになる。ハイブリダイゼーション条件の例としては、Current protocols in Molecular Biology［Ausubel, F.M.ら、John Wily and Sons社、ニューヨーク、NY (1989)］に記載されているものなどが挙げられる。ニトロセルロースフィルターは、標識プローブとともに、５０％ホルムアルデヒド、高塩濃度バッファー［5× SSC（20×：3M NaCl/0.3Mクエン酸三ナトリウム）又は5× SSPE（20×：3.6M NaCl/0.2M NaH2PO4/0.02M EDTA, pH 7.7）］、5× デンハルト溶液、１％ＳＤＳ、そして100・g/ml変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、６８℃で一晩インキュベートする。この後、０.２×ＳＳＣ／０.１％ ＳＤＳで、室温（ストリンジェンシーの低い条件）、４２℃（ストリンジェンシーが中位の条件）又は６８℃（ストリンジェンシーの高い条件）から所望のストリンジェンシーで選択した温度で数回洗浄する。この温度は、ＤＮＡハイブリッドの融点（Ｔｍ）を基準にして選択する。
【００３２】
ハイブリダイゼーションプローブ：サザンハイブリダイゼーション法においては特定のＤＮＡ配列を可視化するために、標識ＤＮＡ分子、即ち、ハイブリダイゼーションプローブを分離されたＤＮＡに反応させて、ニトロセルロースフィルターに結合させる。標識ＤＮＡプローブに相補的なＤＮＡ配列を保持するフィルター上の領域が、再アニーリング反応の結果、標識される。このような標識を示すフィルター上の領域が可視化される。ハイブリダイゼーションプローブは一般に、特定のＤＮＡ配列を分子クローニングすることによって産生される。
【００３３】
オリゴヌクレオチド、又はオリゴマー：２個以上、好ましくは３個以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドからなる分子。その正確なサイズは多くの因子に依存し、またオリゴヌクレオチドの最終的な機能や用途に依存する。オリゴヌクレオチドは合成によって又はクローニングによって作製することができる。
【００３４】
配列の増幅：標的配列を大量に発生させる方法。一般に、１個以上の増幅プライマーが核酸配列にアニールする。適切な酵素を用いて、プライマーに隣接した、又は、プライマー間にある配列が増幅される。
【００３５】
増幅用プライマー：標的配列に隣接する部分にアニールし、標的配列の相補鎖であるプライマー伸長産物の合成を開始する条件下においては、ＤＮＡ合成の開始点となることが可能なオリゴヌクレオチド。
【００３６】
アンチセンス核酸分子：本発明において「アンチセンス核酸分子」とは、標的となる塩基配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）のある部分で安定な二本鎖又は三本鎖をつくることができる分子を意味する。アンチセンス核酸分子の使用やこのような分子の設計や修飾については公知の文献、例えばＷＯ９６／３２９６６号公報、ＷＯ９６／１１２６６号公報、ＷＯ９４／１５６４６号公報、ＷＯ９３／０８８４５号公報、及び米国特許第５, ５９３, ９７４号公報等に記載されており、従来からよく知られている。本発明におけるアンチセンス核酸分子は、本発明の塩基配列を基に設計することができ、また公知の方法にしたがって修飾することができる。例えば、従来から一般に知られているように、分解に対する耐性を高める、標的となる配列に対する親和性を高める、選択した細胞や細胞内区画に輸送できるようにする、並びに／あるいは、ヌクレオチドアナログの使用及び／又は選択されたその化学的断片を置換によってそれらの脂溶性を向上させることを目的として、アンチセンス核酸分子を設計することもできる。
【００３７】
ベクター：クローン化されるようにＤＮＡを挿入することができるプラスミド又はファージＤＮＡ又はその他のＤＮＡ配列。ベクターは宿主細胞中で自律複製することができ、また、目的のＤＮＡ配列を挿入する際にベクターを切断することができる１個又は少数のエンドヌクレアーゼ認識部位によって、ベクターを更に特徴づけることができる。ベクターは、このベクターで形質転換した細胞を同定するのに適したマーカーを更に含有することができる。マーカーとしては、例えば、テトラサイクリン耐性やアンピシリン耐性などがある。「クローニングビークル」という言葉が「ベクター」として使われることもある。
【００３８】
発現：発現とは、構造遺伝子がポリペプチドを産生するプロセスのことである。発現には、遺伝子のｍＲＮＡへの転写と、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳とが含まれる。
【００３９】
発現ベクター：クローニングベクターと同義であるが、宿主に形質転換した後に、クローン化された遺伝子を発現することができるベクター又はビークル。クローン化された遺伝子は、通常プロモーター配列などのある制御配列の制御下にある（即ち、制御配列と発現可能な状態で結合している）。
【００４０】
発現制御配列は、ベクターに発現可能な状態で結合している配列を原核細胞宿主又は真核細胞宿主内のいずれかで発現するために設計されているかどうか、そして、エンハンサー、終止配列、組織特異的因子及び／又は転写開始及び終止部位などの転写要素を更に含有することができるかどうかによって変化する。
【００４１】
機能的誘導体：ある配列の「機能的誘導体」とは、タンパク質でも核酸でも、タンパク質又は核酸配列の生物学的活性と実質的に同様の（機能的又は構造的な）活性を有する分子である。タンパク質の機能的誘導体は、共有結合した炭水化物などの翻訳後修飾を、特定の機能を達成するためにこのような修飾が必要かどうかに応じて、含有することができる。「機能的誘導体」という用語には、ある分子の「断片」、「セグメント」、「変異体」、「アナログ」又は「化学的誘導体」の意味が含まれる。
【００４２】
本発明で用いられているように、ある分子が正常では分子の一部ではない付加的な化学成分を含んでいる場合、その分子を他の分子の「化学的誘導体」という。このような化学成分によって、分子の溶解性や吸収性、生物学的半減期などを改良することができる。またこの化学成分によって、分子の毒性を減少させたり、分子に望ましくない副反応を排除又は弱めることなどもできる。このような効果をもたらすことができる化学成分については、Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) に開示されている。このような化学成分を分子にカップリングする方法は従来からよく知られている。
【００４３】
変異体：タンパク質又は核酸の「変異体」とは、構造と生物学的活性においてタンパク質又は核酸と実質的に同様の分子を意味する。よって、２個の分子が共通の活性を有して互いに代替可能であれば、これらの分子の一方の組成又は二次、三次又は四次構造が他方のものと同一でなかったり、又はアミノ酸配列又はヌクレオチド配列が同一でなかったとしても、これらの分子は本発明で用いられる変異体と考える。
【００４４】
対立遺伝子：「対立遺伝子」とは、染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のもう１方の形態である。
【００４５】
変異：「変異」とは、娘細胞に遺伝し、更にその後の世代にも受け継がれて変異細胞や個々の変異体を生じさせる可能性のある遺伝物質中の検出可能な変化である。変異細胞の子孫が、多細胞生物中の体細胞のみに生じる場合には、生物体には変異細胞からなる突然変異スポット又は領域が発生する。有性生殖を行う生物体の生殖系における変異は、配偶子によって次の世代に遺伝し、体細胞と生殖細胞の両方において新たな変異条件を伴なった個体を生じることがあり得る。このような変異は、核酸分子に影響を与えるような検出可能な異常であり、その化学的又は物理的な構造、可変性、複製、表現型の機能、又は１個以上のデオキシリボヌクレオチドの組換えのいずれか（又はこれらの組み合わせ）であり得る。ヌクレオチドは付加、欠損、置換、逆位、又は逆位を伴う又は逆位を伴わない転位することができる。変異は自然に起こることもあるし、突然変異誘発物質を使用することによって実験的に誘発することもできる。核酸分子の変異体は、変異の結果として得られるものである。変異体ポリペプチドは変異核酸分子に由来する。
【００４６】
種：「種」とは、実際に交配するか又は交配可能な自然個体群の集団である。核酸分子又はタンパク質における種間の違いは、種間において生じる塩基配列又はアミノ酸配列の変化であり、その存在は、問題となっている分子のＤＮＡ配列を調べることによって決定することができる。
【００４７】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）：ポリペプチドをその分子サイズによって分離するための最も一般的な技術が（これが唯一の技術というわけではないが）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動である。この方法の原理は、ポリペプチド分子がゲルの中を移動し、ゲルが、最も大きい分子の動きを最大限に遅らせ、最も小さい分子の動きを最小限に遅らせて、篩のようなはたらきをするというものである。尚、小さいポリペプチド断片ほど、電気泳動中のポリアクリルアミドゲルにおける移動度が大きくなる。電気泳動の前も途中も、ポリペプチドは概して界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に常にさらされるという、ポリペプチドが変性される条件下にある。電気泳動を行う前のゲルはＳＤＳの非存在下で処理されている。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離されたポリペプチドは、ポリペプチド成分の数が少なければ、染色操作をすることによって直接視覚化することができる。
【００４８】
ウエスタントランスファー法： ウエスタントランスファー（ブロッテイングともいう）は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離したポリペプチドを、ポリペプチドのゲル上の位置を保持しつつ、物理的にニトロセルロースフィルターに移行するか、又はその他の適当な担体の表面にポリペプチドを移行するための方法である。その後、目的のポリペプチドに特異的に結合する抗体をプローブとして用いて、得られたブロットから目的のポリペプチドを検出することができる。
【００４９】
精製：「精製した」タンパク質又は核酸とは、それぞれ細胞由来成分から分離したタンパク質又は核酸を意味する。「精製した」タンパク質又は核酸は、自然界には存在しない純度まで精製されたものである。
【００５０】
実質的に純粋な：「実質的に純粋な」タンパク質又は核酸とは、その他の細胞由来成分を全く含まないタンパク質又は核酸である。
【００５１】
発明の概要を上述したので、次に図面に参照しながら、本発明の好ましい態様について説明する。
本発明の具体例の一部を示す添付の図面に参照しながら行う、本発明の好ましい態様の説明より、本発明のその他の目的、利点及び特徴は明らかになる。以下の説明は本発明を限定するものではない。
【００５２】
本発明の好ましい態様の説明 
本発明をより明確に記載する目的で、本発明の詳細な説明を以下の項目に分けて記載した。これらは本発明を限定するものではない。
Ｉ．ＰＣＡ３ポリペプチドをコードする単離された核酸分子
II．精製されたＰＣＡ３ポリペプチド
III．ＰＣＡ３核酸を特異的に検出するための核酸プローブ
IV．サンプル材料中のＰＣＡ３核酸を検出するための方法
Ｖ．サンプル材料中のＰＣＡ３核酸を検出するためのキット
VI．ＰＣＡ３核酸分子を包含するＤＮＡ構造体及びこのような構造体を含む細胞
VII．ＰＣＡ３ポリペプチドに対して結合親和性を有する抗体及びこの抗体を産生するハイブリドーマ
VIII．サンプル材料中のＰＣＡ３ポリペプチド又は抗体を検出するための方法
IX．ＰＣＡ３ポリペプチド又は抗体を包含する診断用キット
Ｘ．診断目的のスクリーニング
XI．治療目的の処置
XII．ヒト以外のトランスジェニックＰＣＡ３動物
【００５３】
Ｉ．ＰＣＡ３ポリペプチドをコードする単離された核酸分子 
本発明の一つの態様は、単離された（精製された）ＰＣＡ３核酸分子に関する。ＰＣＡ３核酸分子は、次の群より選ばれる塩基配列と少なくとも９０％（更に好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の相同性を有する塩基配列を包含することが好ましい。
【００５４】
（ａ）配列番号２又は配列番号７の全長アミノ酸配列を包含するＰＣＡ３ポリペプチドをコードする塩基配列；
（ｂ）Centraal voor Schimmelcultures に受託番号CBS 682.97として寄託されているポリヌクレオチドクローンがコードしている全長アミノ酸配列を包含するＰＣＡ３ポリペプチドをコードする塩基配列；
（ｃ）Centraal voor Schimmelcultures に受託番号CBS 100512として寄託されているポリヌクレオチドクローンがコードしている全長アミノ酸配列を包含するＰＣＡ３ポリペプチドをコードする塩基配列；及び
（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のいずれかの塩基配列と相補的な塩基配列。
【００５５】
ｐＭＢ９は、ＰＣＡ３遺伝子のエクソン１、２、３、４ａ及び４ｂを含むＰＣＡ３ｃＤＮＡクローンである。ｐＭＢ９は、ブタペスト条約の規定に基づき、１９９７年４月１０日に受託番号CBS 682.97として、オランダ国、３５８４  ＣＨ  ユトレヒト、パドゥアラーン ８（Padualaan 8, 3584 CH Utrecht）にあるユトレヒト大学（University of Utrecht）内のファバーヘンコレクション（Phabagen Colection）［オランダ国、３７４０ ＡＧ バールン、ポストブス ２７３、ウーストラート１（Oosterstratt 1, Postbus 273, 3740 AG Baarn）にあるセントラル ブァ シメカルチャーズ（Centraal voor Schimmelcultures）の一部］に寄託した。
【００５６】
λＤＤ３．６は、エクソン３、４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄを含むＰＣＡ３ｃＤＮＡクローンである。λＤＤ３．６は、ブタペスト条約の規定に基づき、１９９８年３月２７日に受託番号CBS 100521として、ブタペスト条約の規定に基づき、１９９７年４月１０日に受託番号CBS 682.97として、オランダ国、３５８４  ＣＨ  ユトレヒト、パドゥアラーン ８（Padualaan 8, 3584 CH Utrecht）にあるユトレヒト大学（University of Utrecht）内のファバーヘンコレクション（Phabagen Colection）［オランダ国、３７４０ ＡＧ バールン、ポストブス ２７３、ウーストラート１（Oosterstratt 1, Postbus 273, 3740 AG Baarn）にあるセントラル ブァ シメカルチャーズ（Centraal voor Schimmelcultures）の一部］に寄託した。
【００５７】
本発明の一つの好ましい態様において、単離された核酸分子は、配列番号１の塩基配列と９０％（さらに好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）を越える相同性又は類似性を有するＰＣＡ３塩基配列を包含する。他の好ましい態様においては、単離された核酸分子は、配列番号１の中のＰＣＡ３をコードする配列を包含する。さらに他の好ましい態様においては、単離された核酸分子は、配列番号２又は配列番号７のＰＣＡ３アミノ酸配列をコードする塩基配列である。さらに他の好ましい態様においては、単離された核酸分子は、配列番号６の塩基配列と９０％（さらに好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）を越える相同性又は類似性を有するＰＣＡ３塩基配列を包含する。さらに他の好ましい態様においては、本発明の単離された核酸分子は、配列番号６の塩基配列の中のＰＣＡ３をコードする配列を包含する。
【００５８】
さらに、ＰＣＡ３のスプライス変異体のｃＤＮＡを包含する塩基配列や、それと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する塩基配列も本発明に含まれる。実際、エクソンのすべての組み合わせが可能であることから、スプライス変異体の例としては、エクソン１、２、３、４ａ及び４ｂ（配列番号１）；エクソン１、３、４ａ、４ｂ及び４ｃ（配列番号３と、領域４ｂに隣接する領域４ｃ；図１を参照）；エクソン１、３、４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄ（配列番号３と、領域４ｂに隣接する領域４ｃと、領域４ｃに隣接する領域４ｄ；図１を参照）；エクソン１、３、４ａ及び４ｂ（配列番号３）；エクソン１、３及び４ａ（配列番号４）；又はエクソン１、２、３、４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄ（配列番号６）等の単離されたＰＣＡ３核酸が挙げられる。また、上記のスプライス変異体の一つと、好ましくは少なくとも９０％（さらに好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の相同性を有する塩基配列を包含するＰＣＡ３核酸分子が好ましい。
【００５９】
さらに、ここに述べた単離された核酸分子と同様の機能を有する核酸分子、及びそれらの誘導体も、本発明に含まれる。例えば、配列番号１または配列番号６に記載の塩基配列を置換、挿入又は欠損させて変化させることができる。コード領域の塩基配列には縮重があるため、配列番号２や配列番号７に記載のアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も、本発明に用いることができる。例えば、配列番号１、３ 、４又は６に記載のＰＣＡ３塩基配列に変異を誘導した配列（即ち、コドンの置換によって、この配列のコードするアミノ酸配列中のあるアミノ酸残基を同様の機能を有する他のアミノ酸に置換した配列）の全長又は1部を包含する塩基配列が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６０】
さらに、本発明の塩基配列は、配列番号１、３、４又は６に記載の塩基配列又はその誘導体の５’末端及び／又は３’末端に少なくとも一つの塩基の付加、欠損又は置換して得られる塩基配列も包含する。付加、欠損又は置換に用いられる塩基又はポリヌクレオチドについては、付加、欠損又は置換によって得られる塩基配列のコードするアミノ酸配列が、配列番号２又は７のアミノ酸配列をコードする限り特に限定はない。さらに、核酸分子は、必要に応じて、その５'末端及び／又は３'末端に制限酵素認識部位を付加しても良い。従って、遺伝暗号の縮重によって許容されるＰＣＡ３をコードする配列及びその断片のすべての変異体も、本発明に含まれる。
【００６１】
さらに、ある塩基配列の一つ又は二つ以上のコドンの欠損や、異なるアミノ酸をコードするコドンに置換することによって変異体塩基配列を作製し、変異体ポリペプチドを製造することもできる。この場合、変異体ポリペプチドの構造は、変異を誘発する前の核酸分子から製造されるポリペプチドと異なるが、通常のポリペプチドと実質的に同じ用途又は活性を有する。本技術分野においては明らかなように、２つのポリペプチドは同様の機能を有するものであり、それらをコードする核酸分子と同様に、２つのポリペプチドの差が遺伝暗号の縮重と関係がない場合にも同様である。
【００６２】
Ａ．核酸分子の単離 
本発明の一態様においては、ＰＣＡ３に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。特に、このような核酸分子は、ＰＣＡ３ＲＮＡ又はＤＮＡを含む生物試料から単離することができる。
【００６３】
本発明の核酸分子は、ｃＤＮＡクローニング及びサブトラクティブ・ハイブリダイゼイション（subtractive hybridization）の手法を用いて、ＰＣＡ３ＲＮＡを含む生物試料から単離することができる。また、本発明の核酸分子との相同性を有するプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから単離することもできる。
【００６４】
本発明の核酸分子は、ゲノムＤＮＡを含む生物試料又は、ゲノムライブラリーから単離することができる。適切な生物試料は、生物体、器官、組織、血液及び細胞などであるがこれらに限定されるものではない。生物試料の採取方法は、試料の性質によって異なる。
【００６５】
当業者は、個体間におけるゲノム中の微少な対立変異の存在を認識すると思われる。本発明の核酸分子には、ＰＣＡ３コード配列の機能的誘導体である限り、すべての対立遺伝子変異体が含まれる。ＰＣＡ３対立遺伝子が配列番号１又は６の塩基配列と同じ配列をコードしていない場合には、その遺伝子を単離してＰＣＡ３と同定することが可能である。この場合、本明細書の記載と同様の方法、特に、本発明に開示されている配列に基づくプライマーを用いたＰＣＲ法によって適当な遺伝子を増幅することが可能である。
【００６６】
当業者は、ヒト以外の生物（例えば、真核生物、具体的には哺乳類、鳥類、魚類及び植物、より具体的にはゴリラ、アカゲザル及びチンパンジー）もＰＣＡ３遺伝子を有することに気がつくだろう。本発明には、上記した生物から単離されたＰＣＡ３核酸分子も含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
Ｂ．核酸分子の合成
本発明の単離された核酸分子には、化学的に合成された核酸分子も含まれる。例えば、ＰＣＡ３遺伝子の発現産物をコードする塩基配列を有する核酸分子を設計し、必要であれば、それを適当な、更に小さい断片にすることもできる。そして、核酸分子又はそれぞれの断片に対応するオリゴマーを合成することができる。このような合成オリゴヌクレオチドは、たとえば、Matteucciらのトリエステル法［J. Am. Chem. Soc. Vol.103, pp.3185-3191 (1981)］や自動ＤＮＡ合成機を用いて製造することができる。
【００６８】
オリゴヌクレオチドは、化学合成又はクローニングにより製造することができる。必要ならば、オリゴマーの５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化することができる。過剰な酵素を用いることにより、アニーリング又はラベリングを行う前の１本鎖核酸分子をキナーゼで処理することもできる。プローブをラベルするためにキナーゼで処理する場合には、高い比活性を有する放射性同位元素を含むＡＴＰを用いることができる。その後、得られたＤＮＡオリゴマーをアニーリング及びＴ４リガーゼによるライゲーションなどに付すことができる。
【００６９】
II．精製されたＰＣＡ３ポリペプチド
本発明の他の１つの態様は、ＰＣＡ３に対応するアミノ酸配列を有する精製された（好ましくは実質的に純粋な）ポリペプチド、又はその機能的誘導体に関する。好ましい態様である本発明のポリペプチドの有するアミノ酸配列としては、配列番号２又は７のアミノ酸配列、或いはその突然変異体又は種間変異体のアミノ酸配列、或いは少なくとも８０％の相同性又は少なくとも９０％の類似性（好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性、或いはそのポリペプチドと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の類似性）を有するアミノ酸配列、或いはそのポリペプチドの中の少なくとも６個（好ましくは少なくとも１０、１５、２０、２５又は５０個の隣接するアミノ酸残基）からなるアミノ酸配列が挙げられる。
【００７０】
本発明の好ましい態様は、ＰＣＡ３のエピトープに関する。上記したポリペプチドのエピトープは、免疫原エピトープ又は抗原エピトープである。免疫原エピトープとは、免疫原である全長タンパク質の中の、抗体産生応答を引き起こす部分である。抗原エピトープとは、抗体産生応答を引き起こすことが可能なタンパク質の断片である。抗原エピトープ断片の選択方法は当業界では良く知られており、Sutcliffe et al., Science 219:660-666 (1983)を参照することができる。本発明の、抗原エピトープ含有ペプチド及びポリペプチドは、ポリペプチドを特異的に認識する免疫応答を高めるのに有用である。本発明の抗原エピトープ含有ペプチド及びポリペプチドは、本発明のタンパク質の中から選ばれる少なくとも７つのアミノ酸残基（好ましくは９、１０、１２、１５又は２０のアミノ酸残基）を包含する。例えば、抗原性を有するペプチドとして、ＨＴＱＥＡＱＫＥＡＱＲ（配列番号５）が挙げられる。
【００７１】
ＰＣＡ３のアミノ酸配列の変異体は、ＤＮＡに突然変異を誘発することにより調製することができる。このような変異体には、配列番号２又は７のアミノ酸配列内にアミノ酸残基の欠損、挿入又は置換を誘発することにより調製することができる。最終的に得られる変異体が所望の活性を有するならば、欠損、挿入と置換をどのように組み合わせてもかまわない。
【００７２】
アミノ酸配列の変異を導入する部位は前もって決めておいても、そこに誘発する変異を前もって決める必要はない。例えば、ある部位に誘発する突然変異を最適に行うためには、ランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で行い、発現されたＰＣＡ３変異体の中から所望の活性の最適な組み合わせを示す変異体をスクリーニングすることが可能である。塩基配列のわかっている配列の中の任意の部位に置換による突然変異を誘発するための技術は良く知られている。例えば、部位特異的突然変異誘発を行うことができる。
【００７３】
本発明で行うＰＣＡ３変異体の調製は、初期段階で作製した変異体（earlier prepared variant）又は変異を有さないタンパク質をコードするＤＮＡに部位特異的突然変異を誘発をすることが好ましい。部位特異的突然変異誘発においては、目的の変異をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列を用いて、ＰＣＡ３変異体を作製することができる。部位特異的突然変異誘発の方法は当業界では一般的に良く知られており、例えば、Adelman et al., DNA 2:183 (1983) や Ausubel et al.,“Current Protocols in Molecular Biology”, J. Wiley and Sons, NY,  1996 などの刊行物に記載されている。
【００７４】
アミノ酸配列の欠損は、通常、約１〜３０アミノ酸残基、好ましくは１〜１０アミノ酸残基であり、典型的な欠損変異においては、隣接したアミノ酸が欠損している。
【００７５】
アミノ酸配列の挿入には、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端への、１アミノ酸残基から実質的には無制限の長さのポリペプチドの融合や、配列内における単数又は複数のアミノ酸残基の挿入が挙げられる。配列内への挿入（すなわち、全長ＰＣＡ３配列内への挿入）は、通常、約１〜１０アミノ酸残基、好ましくは１〜５アミノ酸残基である。
【００７６】
変異体の第３のグループは、ＰＣＡ３分子内の少なくとも１アミノ酸残基、好ましくは１アミノ酸残基のみ、を欠損し、それとは異なる残基をその位置に挿入したものである。ＰＣＡ３の特性を微細に調節しようと望む場合には、下記の表１に従った置換を行うことが好ましい。
【００７７】
【表１】
2007275069.tif 000002
【００７８】
機能的又は免疫学的な特性に実質的な変化を誘発する場合には、表１に示した置換よりも保存性の低い置換、即ち、以下の（ａ）〜（ｃ）により顕著な影響を与えるアミノ酸残基を選択すればよい：（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、即ち、シートやへリックスなどの立体構造；（ｂ）標的部位におけるの分子の電荷又は疎水性；又は（ｃ）アミノ酸の側鎖の大きさ。通常、行なわれる置換は、（ａ）グリシン及び／又はプロリンを他のアミノ酸残基に置換するか、或いは欠損又は挿入する；（ｂ）親水性のアミノ酸残基、例えばセリン残基やスレオニン残基を疎水性のアミノ酸残基、例えばロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン残基、バリン残基又はアラニン残基に置換するか、或いは疎水性のアミノ酸残基を親水性のアミノ酸残基に置換する；（ｃ）システイン残基を他のアミノ酸残基に置換するか、又は他のアミノ酸残基をシステイン残基に置換する；（ｄ）陽電荷の側鎖を有するアミノ酸残基、例えばリシン残基、アルギニン残基又はヒスチジン残基を、負電荷の側鎖を有するアミノ酸残基、例えばグルタミン酸残基又はアスパラギン酸残基に置換する、又は負電荷の側鎖を有するアミノ酸残基を陽電荷の側鎖を有するアミノ酸残基に置換する；或いは（ｅ）大きな側鎖を有するアミノ酸残基、例えばフェニルアラニン残基を、そのような側鎖をもたないアミノ酸残基、例えばグリシン残基に置換するか、又は、小さな側鎖を有するアミノ酸残基を大きな側鎖を有するアミノ酸残基に置換する。
【００７９】
一部の欠損、挿入及び置換はＰＣＡ３の特徴に根本的な変化をもたらすと考えられない。しかしながら、変異の誘発前に置換、欠損又は挿入によって生じる効果を正確に予測できない場合には、当業者にとっては、変異の誘発後に慣例的なスクリーニングアッセイの手順に従って、効果的な変異体を選択することが好ましい。例えば、典型的には変異体は、ＰＣＡ３をコードする本来の核酸分子に部位特異的突然変異を誘発し、組換え細胞の培養によって変異体核酸を発現し、場合によっては、培養細胞から変異体を精製する。精製はカラムを用いたイムノアフィニティー吸着（変異体に残っている少なくとも１つの免疫エピトープにリガンドを結合させることにより、変異体をカラムに吸着する）などにより行うことができる。その後、細胞溶解液又は精製ＰＣＡ３変異体に対して、適当なスクリーニングアッセイを用いて目的の活性を測定する。例えば、任意の抗体に対する親和性などのＰＣＡ３分子の免疫学的特質の変化は、競合イムノアッセイにより測定する。免疫調節活性の変化は適宜なアッセイで測定する。酸化還元又は熱安定性、疎水性、タンパク質分解に対する感受性、或いは坦体との凝集形成又は多量体形成の傾向などのタンパク質特性の変化は、一般的に当業者によく知られた方法でアッセイする。
【００８０】
本発明のペプチドを得る方法として様々な公知の方法を用いることができる。１つの態様においては、自然界において本発明のペプチドを生成している組織や細胞から精製する。それに替わる方法としては、上記の単離された核酸断片を用い、任意の生物にＰＣＡ３タンパク質を発現させることができる。本発明のペプチドを含む試料としては、細胞、細胞のタンパク質抽出物や細胞膜抽出物、又は体液が挙げられる。このような試料は、アッセイの形態、検出方法及び試料として用いられる組織、細胞又は抽出物の性質により異なる。
【００８１】
本発明のペプチドを天然に有する生物であれば、どのような生物でも本発明のペプチドの原料として用いることができる。本明細書において“原料生物”とは、サブユニットのアミノ酸配列が由来する元の生物を意味し、サブユニットを発現し、最終的にサブユニットを単離した生物とは関係ない。
【００８２】
公知のタンパク質単離の方法に従い、天然の異物を含まないペプチドを得ることは、当業者には容易である。タンパク質単離の方法としては、免疫クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、及び免疫アフィニティークロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８３】
好ましい態様においては、ペプチドの精製はイオン交換クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーで行なわれる。数多い公知のイオン交換樹脂の内のどれもが使用できるが、例えば、mono Q、sepharose Q、marco-prep Q、AG1-X2やHGが使用できる。また、サイズ排除樹脂の例としては、Superdex 200、Superose 12やSephycryl 200が挙げられ、これらに限定されるものではない。樹脂からの溶出には、０．０１Ｍから２．０Ｍの塩化カリウム又は塩化ナトリウム水溶液を用いることができる。
【００８４】
III．ＰＣＡ３核酸を特異的に検出するための核酸プローブ 
更に他の１つの態様においては、本発明は、ストリンジェントな条件において、サンプル材料中のＰＣＡ３核酸の存在を特異的に検出するための、ＰＣＡ３核酸と結合する上記核酸分子又はその断片を包含する核酸プローブに関する。
【００８５】
好ましい態様としては、本発明は、ＰＣＡ３をコードするＲＮＡ又はＤＮＡ、又はＰＣＡ３遺伝子に選択的にハイブリダイズし、ＰＣＡ３に関連しないＲＮＡ又はＤＮＡとは選択的にハイブリダイズしない１０〜１０００塩基（好ましくは、１０〜５００、１０〜１００、１０〜５０、１０〜３５、２０〜１０００、２０〜５００、２０〜１００、２０〜５０、又は２０〜３５塩基）からなる単離された核酸プローブであって、以下の（ａ）〜（ｈ）よりなる群から選ばれる配列と少なくとも９０％の相同性を有するポリヌクレオチドを含む核酸分子中の少なくとも１０個（好ましくは、１５、１８、２０、２５、又は３０個）の連続した塩基からなる塩基配列と相補的な核酸プローブに関する。
【００８６】
（ａ）  配列番号２又は７の全長アミノ酸配列を包含するＰＣＡ３ポリペプチドをコードする塩基配列； 
【００８７】
（ｂ） Centraal voor Shmmelculturesに受託番号CBS 682.97として寄託されているポリヌクレオチドクローンがコードしている全長アミノ酸配列を包含するＰＣＡ３ポリペプチドをコードする塩基配列；
（ｃ） Centraal voor Schemmelculturesに受託番号 CBS 100521として寄託されているポリヌクレオチドクローンがコードしている全長アミノ酸配列を包含するＰＣＡ３ポリペプチドをコードする塩基配列；
【００８８】
（ｄ） 配列番号１、３、４、又は６の塩基配列を包含するＰＣＡ３遺伝子をコードする塩基配列；  
（ｅ）配列番号１の１番〜９８番、９９番〜２６３番、２６４番〜４４６番、４４７番〜９８５番又は９８６番〜２０３７番の配列を包含するＰＣＡ３遺伝子のエクソンをコードする塩基配列；
【００８９】
（ｆ）配列番号６の１番〜１２０番、１２１番〜２８５番、 ２８６番〜４６８番、４６９番〜１００７番、１００８番〜２０６６番、２０６７番〜２６２２番又は２６２３番〜３５８２番の配列を包含するＰＣＡ３遺伝子のエクソンをコードする塩基配列；
【００９０】
（ｇ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）の塩基配列のいずれかに相補的な塩基配列；及び
（ｈ）既に上記した塩基配列。
【００９１】
本発明の核酸プローブは、配列番号１の５１１番〜９８５番の配列、配列番号１の５６７番〜９６１番の配列、配列番号６の５３３番〜１００７番の配列又は配列番号６の５８９番〜９８３番の配列には特異的にハイブリダイズしないことが好ましい。
【００９２】
相補的配列は、コード領域に対して相補的な配列を包含する場合には、アンチセンス核酸とも呼ばれる。
【００９３】
本発明で用いることが出来る特定の核酸プローブの例を下記の表２に示す。
【００９４】
【表２】
2007275069.tif 000003
【００９５】
勿論、当業者には明らかように、配列番号１と配列番号６の配列、及び本発明のその他の配列に存在する、上記と同様の又は異なった領域から、上記以外の様々なプローブを設計することができる。
【００９６】
本発明の核酸プローブを用いた通常のハイブリダイゼーション法により、適当な染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーから本発明の他の核酸分子を得ることができる。 染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーは、当業界において一般に用いられる方法によって適当な細胞から調製することができる（Molecular Cloning： A Laboratory Manual, second edition, Sambrooks, Fritsh and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory編, 1989参照）。
【００９７】
また、化学合成によって、ＰＣＡ３アミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端部分に対応する塩基配列を有する核酸プローブを得ることもできる。このようにして合成された核酸プローブをプライマーとして用いて、一般的に行われているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術に従って（実質的に、ＰＣＲ protocols, A Guide to Methods and Applications, Michael et al., Academic Press編、1990に従って)ＰＣＲを行い、適当な染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は細胞株ライブラリーから本発明の断片を得ることが出来る。
【００９８】
当業者であれば、当技術分野において知られているコンピューターによるホモロジーの検索 (sequence alignment) 及び配列分析法を用いて、本明細書に記載の配列から上記のようなプローブを設計することができる（Molecular Cloning： A Laboratory Manual, second edition, Sambrooks, Fritsh, and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory編, 1989参照）。
【００９９】
本発明のハイブリダイゼーションプローブは、放射線標識、酵素標識、蛍光標識、アビジン−ビオチン標識、化学発色等の標準的な標識技術によって標識することができる。ハイブリダイゼーションの後、プローブは公知の方法で視覚化することができる。
【０１００】
本発明の核酸プローブは、ＤＮＡプローブのみならずＲＮＡを含み、これらは当業界で知られている技術を用いて製造することができる。
【０１０１】
上記の方法の１つの態様においては、核酸プローブは固形担体上に固定化される。そのような固形担体の例としては、ポリカーボネート等のプラスチック、アガロース及びセファロース等の複合炭水化物、及びポリアクリルアミド及びラテックスビーズ等のアクリル樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。 核酸プローブを上記のような固形担体へ固定化する技術は、当業界でよく知られている。
【０１０２】
本発明の核酸プローブを用いた検出方法に適した試験サンプルとしては、例えば、細胞又は細胞の核酸抽出物、又は体液が挙げられる。上記方法において用いられるサンプル材料は、アッセイの形式、検出方法、検定される組織、細胞、抽出物の性質によって異なる。細胞から核酸抽出物を調製する方法は良く知られており、そのような公知の方法を用いて、アッセイの方法に応じた適切なサンプルを容易に得ることができる。
【０１０３】
IV．サンプル材料中のＰＣＡ３核酸を検出するための方法 
更に他の1つの態様においては、本発明は、サンプル材料中のＰＣＡ３核酸を検出する方法であって、ａ）ハイブリダイゼーションの起こりうる特定のハイブリダイゼーション条件下においてサンプル材料と上記の核酸プローブとを接触せしめ、そしてｂ）核酸分子に結合したプローブの存在を検出する、ことを包含する方法に関する。当業者であれば、上記したような公知の技術に従い核酸プローブを適宜選択することができる。 用いるサンプル材料の例としては、ヒト組織由来のＲＮＡ又はＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０４】
V．サンプル材料中のＰＣＡ３核酸を検出するためのキット 
更に他の１つの態様においては、本発明は、上記の核酸プローブの入った少なくとも１つの容器手段を包含することを特徴とする、サンプル材料中のＰＣＡ３核酸を検出するためのキットに関する。好ましい態様においては、上記のキットは更に洗浄用試薬、及び結合した核酸プローブの検出を可能にする試薬からなる群より選ばれる少なくとも１つを包含する他の容器を包含する。 検出用試薬の例としては、放射線標識プローブ、酵素標識プローブ（西洋わさびペルオキシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ等）、アフィニティー標識プローブ（ビオチン、アビジン、又はストレプトアビジン等）が挙げられるが、これ等に限定されない。
【０１０５】
詳細には、複数の容器を有する区分けされたキットとしては、試薬が別々の容器に入っているキットであればどのようなキットであっても良い。容器の例としては、小型のガラス容器、プラスチック容器、又はプラスチック片又は紙片製の容器が挙げられる。また、そのような容器としては、１つの容器から他の容器に試薬を効率よく移動できるもの、即ち、サンプル材料と試薬とが互いに混合することを防ぎ、且つそれぞれの容器の薬品や溶液を他の容器に定量的に加えることができるものを用いる。容器の用途に関しては、例えば、試験サンプルを受け入れる容器、アッセイに用いるプローブやプライマーを含有する容器、洗浄用試薬（リン酸緩衝化生理食塩水、トリス−緩衝液等）を含有する容器、ハイブリダイズしたプローブ、結合抗体及び増幅された物質を検出するために用いる試薬を含有する容器として用いることができる。
【０１０６】
当業者には明らかなように、本発明の核酸プローブは当業界でよく知られている確立したキット形式に容易に組み入れることができる。
【０１０７】
VI．ＰＣＡ３核酸分子を包含するＤＮＡ構造体及びこのような構造体を含む細胞 
本発明の他の態様によれば、宿主細胞において５’から３’への転写を開始するのに有効なプロモーター及び上述した核酸分子を包含する組換えＤＮＡ分子が提供される。本発明の更に他の態様によれば、ベクター及び上述した核酸分子を包含する組換えＤＮＡ分子が提供される。
【０１０８】
本発明の更に他の態様によれば、細胞中で機能しうる転写制御領域、上述したポリペプチドに対応するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列に対して相補的な配列、及び細胞中で機能しうる転写終止領域を包含する核酸分子が提供される。
【０１０９】
上述した各分子は単離及び／又は精製されたＤＮＡ分子である。
【０１１０】
本発明の更に他の態様によれば、上述した核酸分子を含む細胞又はヒト以外の生物体が提供される。
【０１１１】
本発明の更に他の態様によれば、本発明のペプチドは、それを発現するように形質転換された細胞から精製される。
【０１１２】
ここでは、通常はタンパク質を全く生成しないか、あるいは低レベルでしか生成しない細胞に遺伝学的な操作を加えることにより、タンパク質を生成するように形質転換された細胞を、「所望のペプチドを発現するように形質転換された」細胞という。当業者であれば、真核生物あるいは原核生物のいずれに対しても、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、あるいは合成配列のいずれをも導入し発現させるようにすることができる。
【０１１３】
ＤＮＡのような核酸分子が転写及び翻訳の調節情報を含む塩基配列を包含しており、そしてそのような配列がポリペプチドをコードする塩基配列に「発現可能に結合している」場合に、そのような核酸分子を「発現することが可能である」という。「発現可能に結合している」とは、調節ＤＮＡ配列及び発現させるべきＤＮＡ配列が、遺伝子配列発現が可能なように結合されていることをいう。遺伝子配列発現のために必要な調節領域は、正確には、生物体によって変わるが、一般に、原核生物においては、ＲＮＡに転写したときに合成を開始するシグナルを発するＤＮＡ配列、及び、プロモーター（それはＲＮＡへの転写を起こさせる）の両方を含むプロモーター領域を包含する。そのような領域は、通常、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等のような、転写及び翻訳の開始配列を伴う５’−非コード配列を包含する。
【０１１４】
もし望まれれば、３’の非コード領域からＰＣＡ３コード配列は上述の方法により得ることができる。この領域には、終止及びポリアデニル化のような転写終止調節配列を保持することができる。従って、本来、ＰＣＡ３遺伝子をコードするＤＮＡ配列に隣り合う３’−領域を保持することにより、転写終止シグナルが発せられるようになる。発現宿主細胞中において転写終止シグナルが充分に機能しない場合には、宿主細胞中で機能する３’−領域に置き換えることができる。
【０１１５】
（プロモーター領域配列及びＰＣＡ３コード配列のような）二つのＤＮＡ配列は、これら二つのＤＮＡ配列間の結合が、それにより（１）フレームシフト変異が起こらないか、（２）ＰＣＡ３コード配列の転写を起こさせるプロモーター領域配列の能力に干渉しないか、又は、（３）プロモーター領域配列によりＰＣＡ３コード配列が転写される能力に干渉しないときには、発現可能に結合しているという。従って、プロモーターがＤＮＡ配列の転写を起こすことができる場合に、プロモーター領域はＤＮＡ配列に発現可能に結合しているといえる。
【０１１６】
本発明は、原核生物又は真核生物における、ＰＣＡ３コード配列（又はその機能的誘導体）の発現を含む。原核生物宿主細胞は、一般に、組換えタンパク質の生成に最も有効かつ適切なものであり、従って、ＰＣＡ３コード配列の発現に用いるのに好適である。
【０１１７】
原核生物は、しばしば種々の大腸菌株に代表される。しかしながら、他の細菌株などの他の微生物株も用いることができる。原核生物系においては、宿主細胞と親和性を有する種から誘導された複製部位及び制御配列を含むプラスミド ベクターを用いることができる。好適なプラスミド ベクターの例としてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等を、好適なファージ、即ち、バクテリオファージベクターの例としてはλｇｔ１０、λｇｔ１１等を、好適なウイルスベクターの例としてはｐＭＡＭ−ｎｅｏ、ｐＫＲＣ等を挙げることができる。本発明で選択されるベクターは、選択された宿主細胞において複製可能であることが必要である。
【０１１８】
原核生物系宿主として認識されているものの例としては、大腸菌、バチルス、ストレプトミセス、シュードモナス、サルモネラ、セラシア等の細菌類を挙げることができる。しかしながら、そのような条件下では、ペプチドはグリコシル化されない。原核生物系宿主は、発現プラスミドにおけるレプリコン及び制御配列に対して親和性がなければならない。
【０１１９】
原核細胞中でＰＣＡ３を発現するためには、ＰＣＡ３をコードする配列を機能的原核生物系プロモーターに発現可能に結合することが必要である。そのようなプロモーターは、構成要素を成しているか、又は、更に好ましくは、調節可能なものである（すなわち、誘導又は抑制解除可能である）ことがより好ましい。構成要素を成しているプロモーターの例としてはバクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２配列のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、及びｐＢＲ３２５配列のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーター等を挙げることができる。誘導可能な原核生物系プロモーターの例としてはバクテリオファージλの左右の主要なプロモーター（L及びＰR）、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｃｌ、及びｇａｌプロモーター、α−アミラーゼ［Ulmanenら、J. Bacteriol. 162: 176-182頁（1985年）］及び枯草菌（Bacillus subtilis）のσ−２８に特異的なプロモーター［Gilmanら、Gene sequence 32: 11-20頁（1984年）]、バシラス属のバクテリオファージのプロモーター［Gryczan, In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY（1982年）］、及びストレプトマイシス属プロモーター［Wardら、 Mol. Gen. Genet. 203: 468-478頁（1986年）]。原核生物系プロモーターはGlick[J. Ind. Microbiol. 1: 277-282頁（1987年）]、Cenatiempo［Biochimie 68: 505-516頁（1986年）]、及びGottesman［Ann. Rev. Genet. 18: 415-442頁（1984年）]らによって概説されている。
【０１２０】
原核生物系細胞における適切な発現のためには、また、遺伝子配列をコードする配列の上流のリボソーム結合部位の存在が必要である。このようなリボソーム結合部位は、例えば、Goldらによって開示されている［Ann. Rev. Microbiol. 35: 365-404頁（1981年）]。
【０１２１】
制御配列、発現ベクター、形質転換方法等の選択は、遺伝子の発現に用いられる宿主細胞のタイプに依存する。ここで、「細胞（cell）」、「細胞株（cell line）」及び「培養細胞（cell culture）」とは互換可能な用語であり、また、これらの称呼はその継代物を包含する。従って「形質転換体」又は「形質転換細胞」なる用語は、継代の回数にかかわらず、初代細胞及びそれから誘導される培養細胞を包含する。また、意図的変異か或いは突然変異かにかかわらず、変異によって、全ての継代細胞はＤＮＡ成分において正確には同一ではない。しかしながら、変異継代細胞は元の形質転換細胞と同一の機能を有する。
【０１２２】
本発明の発現システムで用いられる宿主細胞は、ＰＣＡ３ペプチドの発現に適していれば厳格には限定されない。適当な宿主細胞としては真核細胞を挙げることができる。
【０１２３】
好ましい真核生物系宿主の例としては、酵母、真菌、昆虫細胞、in vivo、又は組織培養された哺乳類動物細胞を挙げることができる。好ましい哺乳類動物細胞としては、ＨｅＬａ細胞、線維芽細胞に由来するＶＥＲＯ又はＣＨＯ−Ｋ１のような細胞、又はリンパ球由来の細胞及びそこから誘導した細胞を挙げることができる。
【０１２４】
これらに加えて、例えば植物細胞も宿主として用いることができ、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ及び１９Ｓ、ノパリン合成酵素プロモーター及びポリアデニル化シグナル配列のような、植物細胞に適した制御配列を用いることができる。
【０１２５】
他の好ましい宿主である昆虫細胞の例としては、ショウジョウバエの幼虫を挙げることができる。昆虫細胞を宿主として用いる際には、ショウジョウバエのアルコール脱水素酵素プロモーターが用いられる［Rubin, Science 240: 1453-1459頁（1998年）]。代わりに、昆虫細胞中に多量のＰＣＡ３を発現するように処理したバクロウイルスベクターを用いることもできる（Jasny, Science 238: 1653頁（1987年）；Millerら, Genetic Engineering（1986年）; Setlow, J.K.ら編, Plenum, Vol.8: 277-297頁）。
【０１２６】
異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳、及び翻訳後のプロセシング及び修飾（例えば、グリコシル化、分裂）に関し特徴的かつ特定のメカニズムを有している。適切な細胞株又は宿主システムを、外来遺伝子の発現したタンパク質の所望の変異及びプロセシングを確実にするために選択することができる。
【０１２７】
一連の酵母遺伝子配列発現システムのいずれも、解糖系の酵素をコードする発現遺伝子配列からプロモーター及び終止要素を組み込んだものを利用することができる。これらの酵素はグルコースに富んだ培地中で酵母を培養させた場合に多量に製造することができる。公知の解糖系の遺伝子配列類も極めて効率的な転写制御シグナルを与えることができる。
【０１２８】
酵母は、翻訳後のペプチドの修飾をも遂行し得るという実質的な利点を有する。酵母中で所望のタンパク質を製造するために、強力なプロモーター配列及び高コピー数のプラスミドを用いる多くのＤＮＡ組換え法が存在する。酵母は、複製された哺乳類動物遺伝子配列製造物のリーダー配列を認識し、リーダー配列を有するペプチド（すなわち、ペプチド前駆体）を分泌することが知られている。哺乳類動物宿主によるＰＣＡ３の発現に役立つ、いくつかの可能なベクターシステムが存在する。
【０１２９】
宿主の性質に応じて、多くの種類の転写及び翻訳調節配列を用いることができる。転写及び翻訳調節シグナルは、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サルウイルス等のウイルス源由来のものを用いることができる。そして、これらの調節シグナルは高発現レベルを有する特定の遺伝子配列と結合させて用いる。これらの代わりに、アクチン、コラーゲン、ミオシン等の哺乳類動物発現産物からのプロモーターを用いることもできる。転写開始調節シグナルは、転写を抑制するか、あるいは活性化するかを選択することができるので、遺伝子配列の発現を調節することができる。興味深いのは、調節シグナルは温度感受性であり、温度を変えることによって発現が抑制されたり開始されたりし、また或いは、メタボライトのような化学的調節に付される。
【０１３０】
上述したように、真核生物宿主におけるＰＣＡ３の発現には、真核生物調節領域を用いることが必要である。一般に、そのような領域は、ＲＮＡ合成を開始するのに充分なプロモーター領域を含んでいる。好ましい真核生物系プロモーター領域の例としてはネズミメタロチオネインＩ（mouse metallothionein I）遺伝子配列（Hamerら, J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288頁（1982年））；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（McKnight, Cell 31: 355-365頁（1982年））；ＳＶ４０初期プロモーター（Benoistら, Nature（ロンドン） 290: 304-310頁（1981年））；酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Johnstonら, Proc. Natl. Acad. Sci.（ＵＳＡ）79: 6971-6975頁（1982年）; Silverら, Proc. Nati. Acad. Sci.（ＵＳＡ）81: 5951-5955頁（1984年））及びＣＭＶ前初期遺伝子プロモーター（Thomseonら, Proc. Natl. Acad. Sci.（ＵＳＡ）81: 659-663頁（1984年））を挙げることができる。
【０１３１】
広く知られているように、真核生物系ｍＲＮＡの翻訳は最初のメチオニンをコードするコドンで開始される。そのため、真核生物系プロモーターとＰＣＡ３コード配列との結合に、メチオニン（すなわちＡＵＧ）をコードするコドンが介在しないことを確認することが好ましい。このようなコドンが存在することにより、ＡＵＧコドンがＰＣＡ３コード配列と同一のリーディングフレームに存在する場合には融合タンパク質を形成し、あるいは、ＡＵＧコドンがＰＣＡ３コード配列と同一のリーディングフレームに存在しない場合にはフレームシフト変異をもたらす。
【０１３２】
ＰＣＡ３核酸分子及び発現可能に結合したプロモーターは、原核生物又は真核生物中に非複製ＤＮＡ（又はＲＮＡ）分子として導入することができる。該非複製分子は、直鎖形分子又はより好ましくは閉環状分子（closed covalent circular molecule）のいずれでもよい。これらの分子は自律的な複製ができないため、遺伝子の発現は導入された配列の一時的な発現を通じて起こる。あるいは、恒常的な発現は、導入されたＤＮＡ配列の宿主染色体への組込みを通じて起こる。
【０１３３】
１つの態様においては、所望の遺伝子配列を宿主細胞の染色体に導入可能なベクターを用いることができる。所望のＤＮＡが染色体中に安定に組み込まれた細胞を選択できるようにするために、このような発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１つ又はそれ以上のマーカーをベクターに導入しておくことができる。このマーカーとしては、例えば、栄養要求性の宿主に原栄養性を賦与するものや、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質や、銅などの重金属への耐性）を賦与するものが挙げられる。選択可能なマーカー遺伝子配列は、発現されるべきＤＮＡ遺伝子配列に直接に連結してもよいし、コトランスフェクションによって同じ宿主細胞に導入してもよい。１本鎖結合タンパク質ｍＲＮＡの合成を最適に行なうためには、更なる遺伝子要素が必要である。この更なる遺伝子要素の例としては、スプライスシグナルや、転写プロモーター、エンハンサーシグナル配列、終止シグナルが挙げられる。これらの遺伝子要素が組み込まれたｃＤＮＡ発現ベクターの例としては、Okayama, Molec. Cell. Biol. 3:280 (1983)に記載のものが挙げられる。
【０１３４】
好ましい態様においては、導入される核酸分子は、宿主内で自立的に複製可能なプラスミドベクター又はウイルスベクターに組み込まれる。多岐にわたるベクターのうちのいずれもこの目的に使用できる。特定のプラスミドベクターやウイルスベクターを選択する上で重要なポイントとしては、以下の点を挙げることができる：  ベクターを含む宿主細胞を、ベクターを含まない宿主細胞から識別及び単離する際の容易性；特定の宿主内で求められるベクターのコピー数；及び、生物種の異なる宿主間を移動することができるベクター（シャトルベクター）の使用が望ましいか否か。原核細胞用ベクターの好ましい例としては、大腸菌中で複製可能なプラスミド（例えば、pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, ΠVX）が挙げられる。このようなプラスミドは、例えば、Sambrookによって開示されている（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, edited by Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989を参照）。バシルス用プラスミドの例としては、pC194、pC221、pT127等が挙げられる。このようなプラスミドは、Gryczanによって開示されている［The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), pp.307−329を参照］。ストレプトミセス用プラスミドの好適な例としては、pIJ101［Kendall et al., J. Bacteriol. 169:4177−4183 (1987)］や、φC31などのストレプトミセスのバクテリオファージ［Chater et al., Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pp.45−54］が挙げられる。シュードモナス用プラスミドは、John et al.［Rev. Infect. Dis. 8:693−704 (1986)］や Izaki［Jpn. J. Bacteriol. 33:729−742 (1978)］によって開示されている。
【０１３５】
真核細胞用プラスミドの好適な例としては、ＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０、２ミクロン サークル（2-micron circle）などと、その誘導体が挙げられる。これらのプラスミドは当業界では周知である［Botstein et al., Miami Wntr. Symp. 19:265−274 (1982); Broach, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, p.445−470 (1981); Broach, Cell 28:203−204 (1982); Bollon et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39−48 (1980); Maniatis, Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, p.563−608 (1980)］。
【０１３６】
所望のＤＮＡ構築体を発現可能な状態で含むベクター又は核酸分子を作製した後、種々の好適な導入手段のいずれかを用いて、ＤＮＡ構築体を適当な宿主細胞に導入することができる。この導入手段の例としては、トランスフォーメーション、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション、パーティクルガン法（particle gun technology）、リン酸カルシウム法、直接マイクロインジェクション、などが挙げられる。ベクターを導入した宿主細胞を選択培地で培養することによって、ベクターを含む細胞を選択的に増殖させる。クローニングされた遺伝子分子が発現することによって、ＰＣＡ３が産生される。遺伝子の発現は形質転換細胞のそのままの状態で起きるか、又は、形質転換細胞の分化を誘導してから起きる（分化は、例えば、神経芽細胞腫細胞などにブロモデオキシウラシルを投与することによってその分化を誘導できる）。
【０１３７】
VII．ＰＣＡ３ポリペプチドに対する結合親和性を有する抗体及びこの抗体を含むハイブリドーマ 
更に他の1つの態様においては、本発明は上記したようなＰＣＡ３ポリペプチド又はそのＰＣＡ３ポリペプチド結合断片に対して特異的な結合親和性を有する抗体に関する。もし、抗体がＰＣＡ３ポリペプチド以外のポリペプチドに結合しないのであれば、その抗体はＰＣＡ３ポリペプチドと特異的に結合する。ＰＣＡ３に選択的に結合する抗体を選択して、例えば、ＰＣＡ３を含有する組織における様々なＰＣＡ３発現の分析等の方法に用いることができる。しかし、上記の抗体の利用分野はこの方法に限定されない。
【０１３８】
本発明のＰＣＡ３タンパク質は、例えば、抗体の産生、医薬組成物の同定、ＤＮＡとタンパク質との間の相互作用の研究等の様々な操作や方法において用いることができる。
【０１３９】
本発明のＰＣＡ３ペプチドは抗体やハイブリドーマを製造するのに用いることができる。当業者には明らかなように、抗体を製造する際には、本明細書に記載の方法で製造したペプチドを免疫原として用いることができる。
【０１４０】
本発明の抗体は、モノクローナル及びポリクローナル抗体、及びこれらの抗体の断片を含む。また、本発明の抗体は更に１本鎖抗体も含む。分子のイディオタイプを含有する抗体断片は公知の方法で製造することができる。このような断片の例として、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片及びＦｖ断片等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４１】
本発明において特に有用なのは、人体にて産生されるＰＣＡ３抗体、又は組換え技術等によって「ヒューマナイズした（humanized）」（即ち、ヒトにおいて免疫原性を示さない）ＰＣＡ３抗体である。ヒューマナイズした抗体は、例えば、抗体の免疫原性を有する部位を、これと対応するが免疫原性を有しない部位で置換することによって製造することができる（即ち、キメラ抗体の製造）［Robinson. R.R. et al.、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；Akira, K, et al., 欧州特許出願第１８４，１８７号；Taniguchi, Ｍ．、欧州特許出願弟１７１，４９６号；Morrison, S．L. et al et al., 欧州特許出願第１７３，４９４号；Neuberger M.S. et al., 国際出願公開第WO ８６／０１５３３号；Cabilly, Ｓ. et al．, 欧州特許願弟１２５，０２３号；Better, M．et al., Science 240：1041-1043（1988）；Liu, A．Y．et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 米国 84：3439-3443（1987）； Liu, A．Y．et al., J.Immunol．139：3521-3526（1987）； Sun．L.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 米国84：214-218（1987）； Nishimura, Y．et al, Canc．Res．47：999-1005（1987）；Wood, C．R．et al., Nature 314：446-449（1985）；及び Shaw et al., Ｊ. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559（1988）］。「ヒューマナイズされた（humanized）」キメラ抗体に関する一般的な考察はMorrison, S．L．［Science, 229：1202〜1207（1985）］及び Oi, V．T．et al［Bio techniques 4：214（1986）］が行っている。適切な「ヒューマナイズされた」抗体は、ＣＤＲ置換又はＣＥＡ置換によって製造することができる［Jones, P．T．et al., Nature 321：552-525（1986）； Verhoeyan et al., Science 239：1534（1988）；及びBeidler, C．B．et al., J．Immunol. 141:4053-4060（1988）］。
【０１４２】
更に他の１つの態様においては、本発明は上記したモノクローナル抗体を製造するハイブリドーマに関する。ハイブリドーマは、特定のモノクローナル抗体を分泌することができる不死化した細胞株である。
【０１４３】
モノクローナル抗体及びハイブリドーマを調製する技術は一般に当業界でよく知られている［Campbell,“Monoclonal Antibody Technology： Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”, Elsevier Science Publishers, オランダ国、アムステルダム（1984）；及び St. Groth et al., J．Immunol．Methods 35:1-21（1980）］。
【０１４４】
抗体を製造することが知られている動物（マウス、ウサギ等）であれば、適切なポリペプチドを用いて免疫することができる。免疫する方法は当業界でよく知られている。そのような方法の例としては、ポリペプチドの皮下又は腹膜間注射が挙げられる。当業者には明らかなように、免疫に用いるポリペプチドの量は免疫する動物の種類、ポリペプチドの抗原性及び注射の場所によって異なる。
【０１４５】
ポリペプチドは、修飾したりアジュバントと混合して投与することでペプチド抗原性を高めることができる。ポリペプチドの抗原性を高める方法は当業界でよく知られており、例えば、抗原を異種タンパク（グロブリンやβ−ガラクトシダーゼ等）とカップリングするか、又は免疫時にアジュバントを加えることなどによって行うことができる。
【０１４６】
モノクローナル抗体に関しては、免疫した動物から取り出した脾臓細胞をミエローマ細胞と融合し、モノクローナル抗体を製造するハイブリドーマ細胞を得ることができる。
【０１４７】
所望の性質を有する抗体を製造するハイブリドーマ細胞の同定は、様々な公知の方法を用いて行うことができる。このような公知の方法の例としては、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット分析又はラジオイムノアッセイ［Lutz et al., Exp．Cell Res．175：109〜124（1988）］を用いたハイブリドーマのスクリーニングを挙げることができる。
【０１４８】
所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、公知の方法を用いて、クローンのクラス及びサブクラスを決定することができる［Campbell, Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, supra (1984）］。
【０１４９】
ポリクローナル抗体を得る際には、免疫した動物から抗体含有抗血清を採取し、上記したスクリーニング法のいずれかを用いて所望の特異性を有する抗体の存在を検出することができる。
【０１５０】
本発明の更に他の１つの態様においては、上述した抗体を検出可能なように標識する。抗体を検出可能なように標識することは、放射性同位体、アフィニティー標識（ビオチン及びアビジン等）、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリフォスファターゼ等）、蛍光標識（ＦＩＴＣ及びローダミン等）、及び常磁性原子等を用いて行うことができる。上記のような標識を行う方法は当業界でよく知られており、例えば、Sternberger et al., J．Histochem．Cytochem．18：315 (1970)；Bayer et al., Meth. Enzym．62：308 (1979)；Engval et al., Immunol. 109：129 (1972)；及び Goding, J. Immunol. Meth. 13：215 (1976) を参照することができる。標識した本発明の抗体をin vitro、in vivo又はin situでのアッセイに用いることにより、特定のペプチドを発現する細胞又は組織を同定することができる。
【０１５１】
本発明の更に他の1つの態様においては、上記した抗体を固形担体に固定する。固形担体の例としては、ポリカーボネート等のプラスチック；アガロース及びセファロース等の複合炭水化物；ポリアクリルアミド及びラテックスビーズ等のアクリル樹脂が挙げられる。抗体を上記のような固形担体に固定化する方法は当業界でよく知られている［Weir et al.,“Handbook of Experimental Immunology”4th Ed., Blackwell Scientific Publications, 英国、オックスフォード、第１０章（1986）；及びJacoby et al., Meth．Enzym. 34 Academic Press, N.Y.（1974）］。固定化された本発明の抗体は免疫クロマトグラフィー及びin vitro、in vivo又はin situでのアッセイに用いることができる。
【０１５２】
更に、当業者であれば、抗体に関する上記の技術、方法及びキットのみならず、現在知られている操作を用いて、特定のペプチド配列に結合可能なペプチドを製造し、合理的に設計された抗ペプチドペプチドを容易に製造することができる［例えば、Hurby et al, “Application of Synthetic Peptide：Antisence Peptides”, In Synthetic Peptides, A User's Guide, W.H. Freeman, NY, pp．289-307（1992）、及び Kaspczak et al., Biochemistry 28：9230-8（1989）を参照］。
【０１５３】
抗ペプチドペプチドを製造する方法には２通りある。第１の方法においては、疎水性で非荷電の極性基を維持しながら、ＰＣＡ３ペプチド配列における塩基性アミノ酸残基を酸性残基で置換することによって製造することができる。例えば、リジン残基、アルギニン残基、及び／又はヒスチジン残基をアスパラギン酸又はグルタミン酸で置換し、 グルタミン酸残基をリジン残基、アルギニン残基又はヒスチジン残基で置換する。
【０１５４】
VIII．サンプル材料中のＰＣＡ３ポリペプチド又は抗体を検出するための方法 
更に他の１つの態様においては、本発明はサンプル材料中のＰＣＡ３ポリペプチドを検出するための方法に関する。この方法は、ａ）免疫複合体が形成され得る条件下において、サンプル材料と上記の抗体（タンパク質）とを接触せしめ、そして、ｂ）ＰＣＡ３ポリペプチドに結合した該抗体の存在を検出することを包含する。詳細には、サンプル材料を少なくとも１種の本発明の抗体と共にインキュベートし、抗体がサンプル材料に結合したかどうかを分析することによってサンプル材料中のＰＣＡ３ポリペプチドを検出することができる。サンプル材料中のＰＣＡ３のレベルが通常のＰＣＡ３のレベルと異なることは、特定の疾患（例えば、前立腺癌）であることを示す。
【０１５５】
本発明の更に他の１つの態様においては、本発明はサンプル材料中のＰＣＡ３抗体を検出するための方法に関する。この方法は、ａ）免疫複合体が形成され得る条件下において、サンプル材料と上記のＰＣＡ３タンパク質とを接触せしめ、そして、ｂ）抗体に結合したＰＣＡ３タンパク質又はＰＣＡ３タンパク質に結合した抗体の存在を検出することを包含する。詳細には、サンプル材料を少なくとも１種の本発明のＰＣＡ３タンパク質と共にインキュベートし、抗体がサンプル材料に結合したかどうかを分析することによってサンプル材料中のＰＣＡ３抗体を検出することができる。
【０１５６】
抗体をサンプル材料と共にインキュベートする際の条件は、分析の形式、検出方法、分析に用いる抗体の種類や性質等によって異なる。当業者には明らかなように、一般に知られている形式の免疫アッセイ［例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、オクタロニー拡散法（diffusion based Ouchterlony）及びロケット免疫蛍光アッセイ（rocket immunofluorescent assays）等］を、本発明の抗体を用いて行うことは容易である。上記のような免疫アッセイの例としては、Chard, An Introduction to Raedioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, オランダ国、アムステルダム (1986)；Bullock et al., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, FL Vol.1 (1982), Vol.２（1983）Vol.3 (1985)；Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Imunoassays；及びLaboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, オランダ国、アムステルダム (1985)に記載のものを挙げることができる。
【０１５７】
本発明において、免疫アッセイに用いるサンプル材料としては、細胞、タンパク質や細胞の膜抽出物、又は血液、血清、血漿及び尿等の体液等を用いることができる。上記の方法において用いるサンプル材料はアッセイの形式、検出方法及びサンプル材料として用いる組織、細胞又は抽出物の性質によって異なる。タンパク質抽出物又は細胞膜抽出物の調製方法は公知であり、これらの公知の方法を用いて、アッセイに用いるシステムに適合したサンプル材料を容易に得ることができる。
【０１５８】
IX．ＰＣＡ３タンパク質又は抗ＰＣＡ３抗体を用いる診断キット 
本発明の更に他の１つの態様によると、上記の検出方法を実施するために必要な試薬の全てを備えたキットが提供される。
【０１５９】
このキットは、ｉ）上記の抗体の入った第１容器手段、及びii）上記の抗体に結合しうる物質（binding partner）と標識物質とからなる検出用結合物質（conjugate）の入った第２容器手段を包含することができる。
【０１６０】
又は、このキットは、ｉ）上記のタンパク質の入った第１容器手段と、好ましくは更に、ii）上記のタンパク質と結合しうる物質と標識物質とからなる検出用結合物質の入った第２容器手段を包含することができる。より具体的には、このキットは、例えば、上記のＰＣＡ３タンパク質を包含し、疾病を有する可能性のある動物又はヒトの血清中の抗体検出に用いることができる。
【０１６１】
他の好ましい態様においては、このキットは、洗浄用試薬と、抗原と結合した抗体の存在を検出できる試薬からなる群から選ばれる少なくとも１種の試薬を更に包含する。検出用試薬の例としては、標識された２次抗体等が挙げられる。また、標識された１次抗体を用いる場合の検出用試薬の例としては、標識された１次抗体と反応可能な発色性結合試薬、酵素型結合試薬、または抗体型結合試薬等が挙げられる。しかし、検出用試薬はこれらに限定されるものではない。この場合のコンパートメント化されたキットの構造や材料などは、核酸プローブキットに関連して前記で説明したものと同様のものでよい。
【０１６２】
当業者には明らかなように、当業界で広く用いられている公知のキットの形式に本発明における抗体を容易に組み入れることができる。
【０１６３】
Ｘ. 診断的スクリーニング 
以下の議論は特にヒト患者について述べるが、その教示はＰＣＡ３を発現するいかなる動物にも適用可能である。
【０１６４】
本発明の診断方法及びスクリーニング方法は、家族歴に基づき、ＰＣＡ３の発現レベルの変化に関連した疾患を発病する危険があると疑いのもたれる患者、またはＰＣＡ３に関連した疾患（例えば前立腺癌）を診断することが望ましい患者に特に有用である。
【０１６５】
本発明によれば、ＰＣＡ３タンパク質をコードするＤＮＡ、即ち本発明のＰＣＡ３遺伝子、またはその断片を用いることによって、スクリーニングを必要とする患者について前兆のスクリーニング（presymptomatic screening）をすることが今や可能である。本発明のスクリーニング方法によると、患者にＰＣＡ３遺伝子の欠損または異常があるかどうかを出生前の診断を含む前兆診断（presymptomatic disagnosis）を行うことができ、従って、その患者がＰＣＡ３関連疾患を将来発症するかまたは現在すでに発症しているかどうかの可能性に関する所見を下すことができる。これは、例えばＰＣＡ３関連疾患の病歴のある家族をもつ人々などから、ＰＣＡ３遺伝子の変異や欠損の保有者を発見するのに特に有用である。また、最適な時期に疾患へ医療上の介入を行なうためには、早期診断が望ましい。
【０１６６】
スクリーニング方法の好ましい１つの態様においては、組織検体を個体から採取して、(１)「正常な」ＰＣＡ３遺伝子の存在、(２）ＰＣＡ３ｍＲＮＡの存在、及び（３）ＰＣＡ３タンパク質の存在、からなる群から選ばれる少なくとも１種についてスクリーニングする。正常なヒトＰＣＡ３遺伝子の同定は、例えば、本発明で教示するＰＣＡ３配列（またはその機能的断片）に対して調製されたＤＮＡプローブを用い、ＲＦＬＰ分析を含む手法によって「正常な」ＤＮＡの制限酵素による消化のパターンを検出し、これを患者のＤＮＡの制限酵素消化パターンと対比することによって、行なうことができる。同様にして、患者のＰＣＡ３ｍＲＮＡの分析データを、ＰＣＡ３関連疾患を発症する危険性のないヒトの個体群から同様のプローブを用いて見出される正常なＰＣＡ３ｍＲＮＡの(ａ)レベル及び／又は(ｂ)サイズと比較することができる。また、ＰＣＡ３活性についての生物学的なアッセイを行なうか、または抗ＰＣＡ３抗体を用いる免疫学的なアッセイを行なって、ＰＣＡ３タンパク質を(ａ)検出及び／又は(ｂ)定量することができる。ＰＣＡ３タンパク質のアッセイを行なう場合、スピードの点で免疫学的アッセイが好ましい。(１)異常なＰＣＡ３ＤＮＡサイズのパターン、及び／又は(２)異常なＰＣＡ３ｍＲＮＡサイズまたはレベル、及び／又は(３)異常なＰＣＡ３タンパク質のレベルは、患者がＰＣＡ３に関連した疾患を発症する危険性のあることを示唆している。
【０１６７】
より詳しくは、本発明においては、患者の有する前立腺癌または前立腺癌の素因を診断する方法が提供される。
【０１６８】
本発明のスクリーニング方法及び診断方法において、全長ＰＣＡ３ＤＮＡコード配列をプローブとして使用する必要はない。むしろ、正常なもしくは罹患した個体から採取したＤＮＡサンプル中のＰＣＡ３遺伝子の存在、または該遺伝子の欠損、または該遺伝子の物理的特性の異常（電気泳動移動パターンの変化等）を検出すのるに十分な長さの核酸断片を使用することだけが必要である。恐らく、上記したプローブのいずれも使用可能であろう。
【０１６９】
所望ならば、羊水穿刺、絨毛穿刺及び胎児内視鏡検査等、胎児細胞を採取する公知の方法を用いて、出生前の診断を実施することができる。出生前の染色体分析を行なうことにより、染色体において正常なＰＣＡ３遺伝子を保有する部分がヘテロ接合状態にあるかどうかを調べることができる。
【０１７０】
XI. 治療的処置
Ａ. 治療用核酸
治療剤としての治療用核酸の治療効果は特に限定されるものではないが、例えば、標的細胞に対して以下の治療効果のうちの少なくとも１種の効果を有することができる：  ＤＮＡ配列の転写に対する阻害；ＲＮＡ配列の翻訳に対する阻害；ＲＮＡまたはＤＮＡ配列の逆転写に対する阻害；タンパク質の翻訳後修飾に対する阻害；ＤＮＡ配列の転写の誘導；ＲＮＡ配列の翻訳の誘導；ＲＮＡまたはＤＮＡ配列の逆転写の誘導；タンパク質の翻訳後修飾の誘導；治療用核酸のＲＮＡへの転写；治療用核酸のタンパク質または酵素への翻訳；及び、治療用核酸を標的細胞の染色体へ組み込むことによる、標的細胞での構成的または一時的な発現。
【０１７１】
治療用核酸の具体的な治療効果の例としては、以下のものを挙げることができる：  アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ等を利用して、欠陥遺伝子の不活性化（turning off）またはその発現の調節；ウイルスの複製または合成に対する阻害；治療用タンパク質をコードするかまたは欠陥タンパク質を修正する外来核酸を発現させることによる遺伝子治療；ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡの欠陥または発現量の低下の修復（modifying）；薬剤もしくはプロドラッグをコードすること、または特定のキメラ状受容体を発現する疾患細胞または正常細胞中で薬剤もしくはプロドラッグとして機能する化合物を生成させる酵素をコードすること；及びその他公知のあらゆる治療効果を挙げることができる。しかし、治療効果の例はこれらに限定されるものではない。
【０１７２】
ＰＣＡ３に関連した疾患（好ましくは前立腺癌）の治療を必要とする患者に実施される治療方法においては、疾患の原因となる兆候のないＰＣＡ３遺伝子を適切な方法と量で患者の細胞に与えることによって、その患者を治療するに十分な時間と量でＰＣＡ３タンパク質を発現させることができる。好ましくは、遺伝子置換（「ノックアウト」）技術を利用して、疾患（具体的には前立腺癌）を引き起こすＰＣＡ３遺伝子を、疾患を引き起こさないＰＣＡ３遺伝子で置換する。
【０１７３】
また、本発明においては、少なくとも１種のＰＣＡ３アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量と薬学的に許容し得る担体とからなる医薬組成物も提供される。上記アンチセンスオリゴ体の例としては、ＰＣＡ３エクソン１、２、３、４ａ〜４ｄに相補的で長さが１２〜５００塩基の少なくとも１種のヌクレオチド配列；配列番号１、３、４もしくは６のＤＮＡ配列；及び、配列番号２もしくは配列番号７から選ばれる少なくとも４個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１７４】
あるいは、ＰＣＡ３核酸は、コレステロール、コール酸塩、デオキシコール酸等の多くのステロール類から選ばれる脂肪親和性の担体と組み合わせることができる。好ましいステロールはコレステロールである。
【０１７５】
本発明のＰＣＡ３遺伝子治療用核酸及び医薬組成物は、所期の目的が達成されるものであればどのような手段で投与してもよい。例えば、非経口、皮下、静脈内、筋肉内, 腹腔内または経皮などの種々のルートにより投与することができる。投与量は、年齢、健康状態、体重、並行して行われる治療がある場合はその種類と治療の回数、及び所望する効き目などを考慮して選択される。
【０１７６】
少なくとも１種のＰＣＡ３遺伝子の発現を低減するのに有効な量のＰＣＡ３アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する全ての組成物は本発明の範囲に包含される。各成分の有効量は個体により異なるが、有効量の最適な範囲の決定は当業者の技術で行なうことができる。代表的な例を挙げると、例えばヒト等の哺乳類にＰＣＡ３核酸を0.005〜１mg/kg/日（治療を施す哺乳類の体重１kg及び１日当たり）の量で投与するか、またはこれと当量の薬学的に許容し得る塩の形態で投与することができる。
【０１７７】
非経口投与のための好適な剤形としては、例えば、水溶性の塩などの水溶性形態のＰＣＡ３核酸を水溶液としたものが挙げられる。更に、適当な油性の注射用懸濁液の形で、有効成分の懸濁液を投与することができる。好適な親油性溶媒またはビヒクルの例としては、ゴマ油等の脂肪油や、オレイン酸エチルやトリグリセライド等の合成脂肪酸エステルが挙げられる。注射用水性懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩, ソルビトール及び／又はデキストラン等、懸濁液の粘度を高める物質を含有してもよい。場合によっては、懸濁液は安定剤を含有してもよい。
【０１７８】
細胞から遺伝子またはタンパク質が欠失したヒト患者の細胞へ必要な遺伝子を送達するための数多くのベクター系が当業界において知られている。例えば、レトロウイルス系、特に修飾レトロウイルス系や単純ヘルペススウイルス系（Gage et al., 米国特許第 5,082,670号）を利用することができる。これらを用いる方法は、例えば Breakefield, X.A. et al., The New Biologist 3:203-218 (1991)；Huang, Q. et al., Experimental Neurology 115:303-316 (1992)；ＷＯ93/03743；ＷＯ90/0944；Taylor, ＷＯ92/06693；Mulligan, R.C., Science 260:926-932 (1993)；及びBrown et al.,“Retroviral Vectors,”in DNA Cloning：A Practical Approach, Volume 3, IRL Press, Washington, D.C. (1987) に教示されている。正常に発現されるＰＣＡ３タンパク質をコードするＤＮＡ配列を送達すると、病態（例えば前立腺癌）の原因となるＰＣＡ３遺伝子を効果的に置換するであろう。
【０１７９】
核酸を運ぶベクターの細胞への導入を可能にする手段としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、ＤＥＡＥ-デキストランを用いるトランスフェクション、リポフェクション、リン酸カルシウム法、または当業者にとって公知の他の方法が挙げられる［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York (1989)］。しかし、導入手段はこれらに限定されるものではない。
【０１８０】
本発明の他の１つの態様においては、正常なＰＣＡ３遺伝子を細胞内で組換え遺伝子として発現し、該細胞を遺伝子治療が必要とされる哺乳類、好ましくはヒトに移植することができる。遺伝子治療を個体に施すためには、ＰＣＡ３遺伝子の全部または一部に相当する遺伝子配列をベクターに挿入し、宿主細胞に導入する。
【０１８１】
更に、患者の細胞に核酸を導入するために利用できる遺伝子治療方法は、Chatterjee and Wong, Current Topics in Microbiol. and Immuno., 218:61-73 (1996)；Zhang, J. Mol. Med., 74:191-204 (1996)；Schmidt-Wolf and Schmidt-Wolf, J. of Hematotherapy 4:551-561 (1995)；Shaughnessy et al., Seminars in Oncology, 23(1):159-171 (1996)；及びDunbar Annu. Rev. Med., 47:11-20 (1996)に記載されている。
【０１８２】
前立腺癌細胞における遺伝子の特異的発現は、細胞特異的エンハンサーや細胞特異的プロモーター等の適切な細胞特異的調節配列を用いることにより達成することができる。
【０１８３】
このように、特定の形態にあるＰＣＡ３の不適切な発現を阻害することによって、ＰＣＡ３に関連した病状の緩和に遺伝子治療を利用することができる。しかも、特定の形態にあるＰＣＡ３を適切なレベルで発現させることによって、上記病状の緩和に遺伝子治療を利用することもできる。この場合、前述のように、ウイルスの形態で投与されるＤＮＡまたはＲＮＡ構築体として、特定のＰＣＡ３核酸配列を導入することができる。
【０１８４】
Ｂ. ＰＣＡ３のアンタゴニストとアゴニスト
ＰＣＡ３のアンタゴニストとアゴニストがＰＣＡ３の活性をそれぞれ阻害及び亢進する能力は、ＰＣＡ３を含む細胞を用いて評価することができる。アンタゴニストやアゴニストとして挙動する作用物質（agent）の存在下でのＰＣＡ３タンパク質の機能を測定するための、細胞内のＰＣＡ３活性のアッセイを行なうことができ、こうして、ＰＣＡ３の活性を阻害する作用物質と亢進する作用物質を同定することができる。
【０１８５】
上記のアッセイでスクリーニングされる作用物質としては、抗体、ペプチド、炭水化物、ビタミン誘導体または他の薬剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。スクリーニングにかけるべき作用物質の選択は、１）ランダムに、または２）理論的根拠に基づく（rational）選択方法により、または３）例えばタンパク質モデリングやリガンドモデリング技術（好ましくは、コンピュータによるモデリング）を用いる方法によって行なうことができる。
【０１８６】
ランダムスクリーニングにおいては、抗体、ペプチド、炭水化物または薬剤等の作用物質がランダムに選択され、ＰＣＡ３タンパク質に結合する能力やＰＣＡ３タンパク質の活性を刺激または阻害する能力が評価される。
【０１８７】
あるいは、理論的根拠に基づき作用物質を選択または設計してもよい。本明細書において、「理論的根拠に基づき作用物質を選択または設計」するとは、ＰＣＡ３タンパク質の立体配置に基づいて作用物質を選択することを意味する。
【０１８８】
１つの態様において、本発明は、下記の工程(ａ)及び工程(ｂ)からなる、ＰＣＡ３の活性を刺激または阻害するアンタゴニストまたはアゴニストのスクリーニング方法に関する：
(ａ)ＰＣＡ３を発現する細胞を、試験に供される作用物質と共にインキュベートし；そして
(ｂ)ＰＣＡ３のＡＴＰへの結合に及ぼす作用物質の効果を測定して、細胞におけるＰＣＡ３タンパク質の活性を評価する。
【０１８９】
上記の方法において使用可能な細胞としては、ＰＣＡ３を機能可能な形態で発現する細胞であり、且つ、そのＰＣＡ３活性が測定可能な細胞である限り、いかなる細胞でも用いることができる。好ましい発現細胞は真核細胞または真核生物である。このような細胞には、当業界で周知の通常の方法により、ＰＣＡ３をコードするＤＮＡ配列を含ませることができる。あるいは、当業者は、ＰＣＡ３タンパク質をコードするｍＲＮＡを細胞に直接導入することができる。
【０１９０】
本発明は更に、ＰＣＡ３リガンド（前述のアンタゴニスト及びアゴニストなど）を用いることにより、細胞内のＰＣＡ３タンパク質の活性を調整する方法を提供する。一般に、ＰＣＡ３活性を阻害または刺激することが確認されたリガンド（アンタゴニスト及びアゴニスト）は、ＰＣＡ３タンパク質を発現する細胞と該リガンドとが生体内（in vivo）で接触することが可能となるように製剤化することができる。上記細胞とリガンドとが接触することにより、ＰＣＡ３タンパク質の活性の調整が生体内（in vivo）で行われる。製剤化への障害や毒性の問題がない限り、上記の方法で発見されたリガンドは生体内での使用に有効である。
【０１９１】
他の１つの態様において、本発明は、動物［好ましくは哺乳類（具体的にはヒト）］内のＰＣＡ３レベルを変化させるのに十分な量のＰＣＡ３またはＰＣＡ３リガンド（ＰＣＡ３アンタゴニスト及びアゴニストなど）を動物に投与する方法に関する。投与されたＰＣＡ３またはＰＣＡ３リガンドは、ＰＣＡ３に関連する機能を特異的に発揮することができるであろう。また、ＰＣＡ３は前立腺癌細胞に発現されるので、ＰＣＡ３またはＰＣＡ３リガンドを投与することによって、そうした細胞内のＰＣＡ３レベルを変化させることができる。
【０１９２】
当業者は、個々のいかなる治療プロトコールのための投与量でも容易に定め得ることが理解できるであろう。投与量は、望ましくない交叉反応、アナフィラキシー反応等の副作用を引き起こすほど大きすぎてはならない。一般に、投与量は、患者の年齢、症状、性別、疾患の程度、もしあれば拒絶反応（counter indications）、及びその他の可変要素に応じて変りうるものであり、個々の医師によって調整される。ＰＣＡ３またはＰＣＡ３リガンドの投与量は、１日当たり0.001 mg/kg〜50 mg/kgの範囲とすることができ、この量を１日に１回投与するかまたは複数回に分けて投与し、これを１日から数日間行なうことができる。ＰＣＡ３またはＰＣＡ３リガンドの非経口的な投与は、注射によって行なうか、または時間をかけて徐々に灌流させることによって行なうことができる。また、ＰＣＡ３またはＰＣＡ３リガンドは、静脈内、腹腔内、筋肉内または皮下などのいずれの経路で投与してもよい。
【０１９３】
非経口的投与用の剤形の例としては、滅菌済の水性溶液または非水性溶液、懸濁液及びエマルジョン等が挙げられる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルが挙げられる。水性溶媒の例としては、水、アルコール水溶液（alcoholic/aqueous solutions）、エマルジョンまたは懸濁液等が挙げられ、生理食塩水や緩衝液等も含まれる。非経口用ビヒクルの例としては、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖と塩化ナトリウムを加えたリンゲル液（Ringer's dextrose and sodium chloride）、加乳したリンゲル液（lactated Ringer's）、及び不揮発性油等が挙げられる。静脈内投与用ビヒクルの例としては、体液・栄養補給剤や電解質補給剤［例えば、ブドウ糖を加えたリンゲル液（Ringer's dextrose）をベースにしたもの］などが挙げられる。また、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガス等の保存剤やその他の添加剤を含有させてもよい。これらの点の全般ついて、Remington's Pharmaceutical Science, 16th Ed., Mack Eds. (1980)を参照のこと。
【０１９４】
他の１つの態様において、本発明は、ＰＣＡ３に関連する活性を変化させるのに十分な量のＰＣＡ３またはＰＣＡ３リガンドと、薬学的に許容し得る希釈剤、担体または賦形剤とを包含する医薬組成物に関する。当業者は、適切な濃度や投与単位サイズを容易に決定することができる［例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (16th ed., Osol, A., Ed., Mack, Easton PA (1980) 及びＷＯ 91/19008を参照］。
【０１９５】
Ｃ．免疫療法
本発明はまた、in vivoにおいてＰＣＡ３の生物活性を阻害又は中和し、且つＰＣＡ３に特異的な、上記したＰＣＡ３抗体（好ましくはマウス抗ＰＣＡ３抗体及びマウス−ヒト抗ＰＣＡ３キメラ抗体、並びにその断片及び領域）を提供する。これらの抗体は、ＰＣＡ３の異常な発現に伴う病態（pathologies and conditions）を示す患者の治療を目的として使用することができる。本発明の抗体並びにその断片、領域及び誘導体は、in vivoにおいて上記ＰＣＡ３の生物活性を阻害及び／または中和することができる、ＰＣＡ３のエピトープを認識する領域を少なくとも１つ含むことが好ましい。
【０１９６】
治療に際しては、抗体、その断片または誘導体を、１回以上非経口的に投与する。本発明のマウス抗体及びマウス−ヒトキメラ抗体、並びにそれらの断片及び領域は、上記ＰＣＡ３に対する親和性が高く、また上記ＰＣＡ３の生物活性を阻害及び／または中和する作用が強いので、ヒトの医薬品として好ましく用いることができる。
【０１９７】
本発明のモノクローナル抗体の投与方法は、哺乳類の体内の作用すべき部位に抗体が到達できるような方法であれば、どのような方法でもよい。タンパク質は経口投与すると消化されやすいので、抗体の吸収を最適化するため、通常注射による非経口投与、即ち静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射などが行われる。
【０１９８】
本発明のモノクローナル抗体は、単独で治療薬として投与しても、他の治療薬と組み合わせて投与してもよい。また本発明のモノクローナル抗体は、それ自体だけで投与してもよいが、一般的には、投与経路や、医薬品に関する標準的な慣例などに基づき選択された、医薬品用担体と共に投与する。
【０１９９】
当然のことながら、投与量は公知の種々の要因、例えばその薬物の薬力学的特性、投与法及び投与経路、投与を受ける者の年齢、健康状態及び体重、病状の性質及び程度、併用する処置の種類、薬物投与の頻度、所望する効果などにより異なるが、通常、有効成分の１日当りの投与量は、体重１ｋｇ当り約０．１〜１００ｍｇである。通常、所望の結果を得るためには、１日に、体重１ｋｇ当り有効成分０．５〜５０ｍｇ、好ましくは１〜１０ｍｇを、１日１〜６回に分けて、または徐放性製剤として投与すればよい。
【０２００】
一般に、内服に適する製剤（組成物）は、１投与単位当り約１〜５００ｍｇの有効成分を含む。これらの医薬品組成物には、通常その医薬品組成物の重量に対し約０．５〜９５重量％の有効成分が含まれる。
【０２０１】
非経口投与（注射）を行う場合、上記の抗体は、溶液、懸濁液、乳液、薬学的に許容される非経口投与（注射）用賦形剤を添付した凍結乾燥粉末などの形態で処方することができる。非経口投与（注射）用賦形剤の例としては、水、食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液、５％ヒト血清アルブミン溶液などを挙げることができる。リポソームや、不揮発性油などの非水性賦形剤を用いてもよい。この非経口投与（注射）用賦形剤や凍結乾燥粉末は、等張性を維持するための添加剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトールなど）や、化学的安定性を維持するための添加剤（例えば、緩衝化剤、保存剤など）を含んでいてもよい。また、上記の製剤は、通常用いられる方法により滅菌する。
【０２０２】
適切な医薬品用担体に関しては、当該分野において標準的な参考文献である、Remington's Pharmaceutical Sciences （A. Osol著）の最新版に記載がある。
【０２０３】
本発明のマウス抗体及びマウス−ヒトキメラ抗体、並びにそれらの断片及び領域は、イムノコンジュゲート（immunoconjugates）として治療に用いることができる［Ann. Int. Med., 111: 592-603(1989)に記載の、R.O. Dillmanによる総説を参照]。本発明のマウス抗体及びマウス−ヒトキメラ抗体、並びにそれらの断片及び領域は、細胞毒性を有するタンパク質［例えばリシン−Ａ（Risin-A）、シュードモナス毒素、ジフテリア毒素など；但しこれらに限定されるものではない］と結合させることができる。抗体またはその他のリガンドと結合した毒素は、当該技術分野において公知である［例えば、S. Olsnesら、Immunol. Today, 10: 291-295(1989)を参照］。植物及び細菌の毒素は、典型的にはタンパク質合成系を崩壊させることによって殺細胞作用を示す。
【０２０４】
本発明の抗体には、上記以外の治療効果を有する部位を結合させることができる。治療効果を有する部位の例としては、放射性核種（radionuclide）、細胞毒性物質、医薬品などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。抗体に結合させ、in vivoにおいて抗原上の部位に送達することができる放射性核種の例としては、212Ｂｉ、131Ｉ、186Ｒｅ、90Ｙなどを挙げることができるが、これら以外の放射性核種の使用を否定するものではない。放射性核種は、放射線療法の分野において知られている通り、局所的に細胞に放射線を照射して、細胞内に種々の障害を引き起こすことにより、細胞毒性作用を示す。
【０２０５】
抗体に結合させた後、in vivoでの治療に用いることのできる、細胞毒性を示す医薬品の例としては、ダウノルビシン、ドキソルビシン、メトトレキセート、マイトマイシンＣなどを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。細胞毒性を示す医薬品は、ＤＮＡ合成、ＲＮＡ合成、タンパク質合成などの重要な細胞のプロセスに干渉する。当該分野において知られている、この種の医薬品に関する詳細な説明、及びその作用機序については、Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 第７版 (1985) (A.G. Goodmanら著、Macmillan Publishing Co.より発行) を参照することができる。
【０２０６】
本発明の抗体は、他のモノクローナル抗体や、他のマウス抗体及びマウス−ヒトキメラ抗体、並びにそれらの断片及び領域や、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数や活性を増すのに役立つ、リンホカイン類や造血細胞成長因子類などと組み合わせても有利に用いることができる。
【０２０７】
XII．ヒト以外のトランスジェニックＰＣＡ３動物 
ヒト以外のトランスジェニックＰＣＡ３動物の作成方法
本発明における、ヒト以外の動物は、形質転換により内因性遺伝子が分断または改変されている動物（ノックアウト動物）、及び／またはヒトＰＣＡ３の発現に繋がる１種以上の導入遺伝子（transgenes）がそのゲノムに導入されている動物を包含する。アンチセンスＰＣＡ３核酸を導入されている動物もまた好ましい。
【０２０８】
そのようなヒト以外の動物には、げっ歯目、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、両生類、爬虫類などの脊椎動物が含まれる。このヒト以外の動物は、ヒト以外の哺乳動物から選ばれることが好ましく、ラットやマウスを含むげっ歯目から選ばれる動物、特にマウスが好ましい。
【０２０９】
本発明でいうトランスジェニック動物とは、動物の体内に、遺伝子が天然には起こらない導入方法（即ち人為的な操作）により、その動物の体内に自然に生じることのない遺伝子（例えば、外来遺伝子や、遺伝子操作を受けた内因性遺伝子）を１種以上導入することにより得られる動物を意味する。天然には起こらない遺伝子導入方法により導入された遺伝子、即ち導入遺伝子は、遺伝子を導入する動物の遺伝情報の構成（configuration）に含まれる遺伝子及び／または導入遺伝子が組込まれる染色体上の座に自然界で見出される遺伝子でない限り、その動物と同一種から得られるものであっても、別の種から得られるものであってもよい。導入遺伝子は、外来性ＤＮＡ配列、即ち宿主動物のゲノム中に通常見出されることのない配列を含んでいてもよい。あるいは、または更に導入遺伝子は、天然のものとは異なっている（abnormal）内因性ＤＮＡ配列、即ち、遺伝子のin vivoにおける通常の発現様式の改変、または遺伝子によってコードされた内因性遺伝子産物の生物活性の改変又は削除を目的として、配列が再編成または変異を受けている配列を包含してもよい［Reconbimant DNA 第２版｛J.D. Watsonら著、W.H. Freeman and Co. (ニューヨーク)より発行 (1992)｝、第255-272頁、J.W.Gordon, Intl. Rev. Cytol., 115:171-229 (1989)、R. Jaenisch, Science, 240:1468-1474 (1989)、J. Rossant, Neuron, 2:323-334 (1990)］。
【０２１０】
本発明のヒト以外のトランスジェニック動物は、ヒト以外の動物の生殖細胞系（germline）に導入遺伝子を導入することによって作製される。本発明の導入遺伝子の導入には、種々の発生段階にある胚性標的細胞（embryonic target cell）が用いられる。導入遺伝子の導入は、胚性標的細胞の発生段階に応じて、種々の方法により行われる。
【０２１１】
１．接合体へのマイクロインジェクションは、本発明の実施に際して、動物のゲノムに導入遺伝子を組み込むための好ましい方法である。接合体とは、前核の融合やそれに続く細胞分裂を起こしていない受精卵であって、導入遺伝子のＤＮＡ配列をマイクロインジェクションにより導入する場合、その標的細胞として好ましい細胞である。マウス接合体中の雄性前核の直径が約２０μｍになると、導入用のＤＮＡ配列を含む溶液１〜２ピコリットルを繰り返して注入することができる。接合体を用いて導入遺伝子を導入する場合、次のような利点がある。注入された導入遺伝子のＤＮＡ配列は、１回目の細胞分裂の前に、宿主動物のゲノム中に組み込まれることが多い［Brinsterら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82: 4438-4442 (1985)］。その結果、得られたトランスジェニック動物［創始動物（founder animals）］の全ての細胞は、組み込まれた導入遺伝子を特定の遺伝子座に安定に保持しており、このような導入遺伝子はトランスジェニック対立遺伝子（transgenic allele）と呼ばれる。トランスジェニック対立遺伝子はメンデルの法則に従う遺伝様式を示す。トランスジェニック動物と非トランスジェニック動物との交雑により生まれた子孫の半数は、メンデルの独立の法則に従いトランスジェニック対立遺伝子を持つことになる。
【０２１２】
２．動物に本発明の導入遺伝子を導入する方法として、ウイルスによる組み込みを行うことも可能である。発生途中の胚を胚盤胞の段階までin vitroで培養する。この段階になると、割球はウイルス感染を受けることがある［R. Jaenisch, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 73: 1260-1264 (1976)］。酵素処理によって透明帯を除去すると、割球の（ウイルス）感染が促進される［Manipulating the Mouse Embryo、Hoganら著、 Cold Spring Harbor Press (ニューヨーク州、Cold Spring Harbor)より発行 (1986)］。典型的なものとしては、複製能が欠損しているが、ウイルスの有するＤＮＡ配列を宿主の遺伝子中に組み込む機能は保持されているようなウイルスベクターを介して、導入遺伝子を導入する［Jahnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82: 6927-6931 (1985)及びVan der Puttenら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82: 6148-6152 (1985)］。導入遺伝子を含むウイルスベクターを産生する細胞の単層上の割球の培養により、形質転換体（transfection）が容易且つ効率よく得られる[Van der Puttenら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82: 6148-6152 (1985) 及びStewartら、EMBO Journal, 6: 383-388 (1987)]。或いは、もっと後の発生段階、例えば胞胚腔の段階でウイルスに感染させてもよい［D. Jahnerら、Nature, 298: 623-628 (1982)］。いずれの場合においても、ウイルスによる組み込みで作製したトランスジェニック創始動物は、トランスジェニック対立遺伝子に関してのモザイクである。即ちこの場合、導入遺伝子はトランスジェニック創始動物を構成している細胞の１つのサブセット（subset）にしか導入されていない。その上、１つの創始動物において、複数のウイルスによる組み込みが起こり、その結果複数のトランスジェニック対立遺伝子が生じる場合があり、更にその複数のトランスジェニック対立遺伝子が後の世代の子孫において分離されることもありうる。また、この方法によって生殖細胞系に導入遺伝子を導入することも可能ではあるが、実際に導入遺伝子の導入が起こる頻度は低いと考えられる［D. Jahnerら、Nature, 298: 623-628 (1982)］。しかしながら、この方法によって動物の生殖細胞系に導入遺伝子が導入できれば、全ての細胞（即ち体細胞と生殖細胞の両方）にトランスジェニック対立遺伝子が導入されている子孫を作成することができる。
【０２１３】
３．胚幹細胞（以降「ＥＳ細胞」と称する）もまた、導入遺伝子を導入する場合の標的細胞として有用な細胞である。ＥＳ細胞は、in vitroで培養された着床前の胚から得られる細胞である［M.J. Evansら、Nature, 292:154-156 (1981); M.O. Bradleyら、Nature, 309:255-258 (1984); Gosslerら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 83:9065-9069 (1986); Robertsonら、Nature, 322:445-448 (1986); E.J. Robertson、｛E.J. Robertson編、Teratocarcinoma and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, ILI Press. (オックスフォード)より発行 (1987), 第７１〜１１２頁｝］。ＥＳ細胞は市販されており（例えば、ミズーリ州セントルイス、Genome Systems, Inc. などより入手可能）、確立された方法［R.H. Lovell-Badge、Teratocarcinoma and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson編、ILI Press. (オックスフォード)より発行 (1987), 第１５３〜１８３頁］により、１つ以上の導入遺伝子を用いて形質転換することができる。形質転換されたＥＳ細胞を、動物の胚盤胞に組み込むことができる。すると、ＥＳ細胞は胚に定着（colonize）し、その一部はこの動物［この動物はキメラ（２種以上の動物に由来する細胞によって構成されている）である］[R. Jaenisch, Science, 240: 1468-1474 (1989)]の生殖細胞系となる。この場合も、この方法によって動物の生殖細胞系に導入遺伝子が導入できれば、全ての細胞（即ち体細胞と生殖細胞の両方）にトランスジェニック対立遺伝子が導入されている子孫を作成することができる。
【０２１４】
導入遺伝子の導入は、初期段階においてはラマルク説に従うような（Lamarckian）[メンデル的でない（non-Mendelian）]挙動を示す場合もある。しかし、本発明の導入遺伝子は、生殖細胞系に安定に導入され、メンデルの法則に従う遺伝子座（Mendelian loci）に位置してトランスジェニック動物の子孫に移行する。この他の形質転換法では、モザイクのトランスジェニック動物が得られ、導入遺伝子を有する細胞と有さない細胞が生じる。モザイクのトランスジェニック動物において、生殖細胞が導入遺伝子を有さない場合、導入遺伝子は子孫に移行しない。それでも、モザイクのトランスジェニック動物は導入遺伝子に基づく表現型を示すことができる。
【０２１５】
ヒトの疾病の動物モデルを提供することを目的として、ヒト以外の動物に導入遺伝子を導入することができる。このような動物モデルの作製に用いられる導入遺伝子としては、ヒトの遺伝病における先天的代謝異常に関連する変異遺伝子産物をコードする導入遺伝子や、ヒトが病原体（即ち、細菌、ウイルス、その他の病原性微生物）に対して感受性を示すのに必須のヒトの因子をコードする導入遺伝子［Lederら、米国特許第5,175,383号（１９９２年１２月２９日）、Kindtら、米国特許第5,183,949号（１９９３年２月２日）、Smallら、 Cell, 46:13-18 (1986)、Hooperら、 Nature, 326:292-295 (1987)、Staceyら、 Nature, 332:131-136 (1988)、Windleら、 Nature, 343:665-669 (1990)、Katzら、 Cell, 74:1089-1100 (1993)］を挙げることができる。遺伝子の導入によってもたらされる変異は、通常は内因性の遺伝子配列を、選択及び／または検出を可能とするマーカーをコードするＤＮＡ配列に置換した、ヌル（いわゆる「ノックアウト」）対立遺伝子を含む。得られたヒト以外のトランスジェニック動物は、疾患にかかりやすいか、或いは導入遺伝子により疾患にかかるので、この動物には色々な用途がある。例えば、疾患を引き起こす組成物の同定や、疾患を引き起こすか、その疑いのある組成物の病原性の高さ（pathogenic potential）の評価［A.J.M. Berns、米国特許第5,174,986号（１９９２年１２月２９日）］、又、疾患の治療や症状の改善に用いることが考えられる組成物の評価に使用することができる｛Scottら、WO 94/12627（１９９４年）｝。
【０２１６】
子孫から得た遺伝物質を分析し、本発明の導入遺伝子の配列に対応する、または本発明の導入遺伝子によってコードされる特有の配列を有する生体分子の有無を調べることにより、本発明の導入遺伝子を受け継いでいる子孫と、導入遺伝子を受け継いでいない同腹子（littermate）とを区別することができる。例えば、本発明の導入遺伝子の選択的マーカーによってコードされたポリペプチドを含む体液をイムノアッセイにより分析し、上記のようなポリペプチドの有無を調べればよい。導入遺伝子を受け継いでいる子孫を同定するためのより単純で信頼性の高い手段としては、以下のような方法を挙げることができる。動物の末端部（extremity）、例えば尾から組織検体を取り、この検体に関して、本発明の導入遺伝子に特有の部位のＤＮＡ配列（例えば、選択的マーカー）に対応する核酸配列の有無を調べる。このような核酸配列の有無は、例えば、導入遺伝子に特有の部位に対応するＤＮＡ配列を用いたハイブリダイゼーション（いわゆるサザンハイブリダイゼイション）や、検体中のＤＮＡ配列を基質とし、導入遺伝子のＤＮＡ配列に由来するオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲの増幅産物の分析などによって調べることができる。
【０２１７】
以下に、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これは本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０２１８】
ＰＣＡ３ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの単離及び特徴付け 
前立腺癌の新しいマーカーを同定するために、differential display analysis （Liang et al., Science 257: 967-971, 1992）を用いて、正常な前立腺と比較して、前立腺癌で過剰発現している遺伝子を同定した。具体的には、同一患者の正常な前立腺組織、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）組織及び悪性前立腺組織のそれぞれから全ＲＮＡを抽出して解析を行った。４つのアンカープライマーと５つの任意のプライマーによる２０種類の異なるプライマーセットを用いて、両者で見かけ上異なった発現をする１１種のｍＲＮＡ（即ち、調べた全ての癌組織においては一貫して過剰発現しているが、正常組織或いはＢＰＨ組織においては発現していないｍＲＮＡ）を同定した。これらのｍＲＮＡの相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）断片をノーザンブロット解析にプローブとして用いて、differential display法で調べた前立腺腫瘍における一貫した過剰発現を確認した。こうしたプローブの１つであるＤＤ３（４８６ｂｐのｃＤＮＡプローブ）によって、調べたヒト前立腺腫瘍５０例中４７例において高度に過剰発現している２．３ｋｂ並びに４．０ｋｂの2つの主要な転写物を検出した。一方、同一患者の正常組織またはＢＰＨ組織においては、これらの転写物の発現は全くみられなかった（又は非常に低レベルであった）。
【０２１９】
全長のｃＤＮＡクローンを得るために、ヒト前立腺腫瘍の初代培養組織から単離したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを構築した。このライブラリーのスクリーニングによって２５０個のＤＤ３関連陽性クローンを得た。このうち８０クローンを精製し、自動シークエンス解析によってその塩基配列を決定した。
【０２２０】
λＦＩＸ２に組込んだヒト胎盤ゲノムＤＮＡで構築されたゲノムライブラリーについて、ＤＤ３をプローブとして用いてスクリーニングし、４つの異なるクローンを得た。このうち２つのクローン（λＦＩＸ−ＭＥ３及び−ＭＥ４）は遺伝子の５’末端側に位置し、残りの２つのクローン（λＦＩＸ−ＭＥ１及び−ＭＥ２）は遺伝子の３’末端側に位置する断片であった。λＦＩＸ−ＭＥ４の５’末端をサブクローニングし、ゲノムライブラリーのスクリーニングにプライマーとして用いた。そして３つの新規且つ固有のクローンを単離した（λＦＩＸ−ＩＨ１、−ＩＨ２及び−ＩＨ６）。
【０２２１】
分析した８０個のｃＤＮＡクローンから、選択的スプライシング或いは選択的ポリアデニル化によって少なくとも４つの異なる転写物が存在することが示された。ｃＤＮＡクローンと比較したゲノムクローンの塩基配列の解析によりＰＣＡ３遺伝子のゲノム構造が示された。３つのイントロンと４つのエクソンが存在しており、最初のイントロンの長さはおよそ２０ｋｂである。
【０２２２】
１つめのｃＤＮＡ種は、ｃＤＮＡクローンのおよそ５％にみられ、エクソン１、２、３、４ａ及び４ｂを含んでいる（真に保存されたポリＡ付加シグナルは、４ｂの下流に起こるポリアデニル化の上流に存在する）（図１参照）。
【０２２３】
２つめのｃＤＮＡ種は、ｃＤＮＡクローンのおよそ１５％にみられ、エクソン１、３、４ａ、４ｂ及び４ｃを含み、第２エクソンの選択的スプライシングによって生じ（即ち、このｃＤＮＡには第２エクソンが存在していない）、上記とは異なる（真に保存された）ポリＡ付加シグナルで終結している（図１参照）。
【０２２４】
３つめのｃＤＮＡ種は、エクソン１、３、４ａ及び４ｂを含み、最も一般的にみられるものである（８０クローンのうちのおよそ６５％に相当）（図１参照）。このｃＤＮＡはノーザンブロット解析でみられる最も顕著な転写物（２ｋｂ）に対応するものであると考えられる。
【０２２５】
４つめのｃＤＮＡ種は、エクソン１、３及び４ａを含み、全クローンの約１５％にみられ、元のＤＤ３クローンの終結部位にあたる４ａの下流で終結している（図１参照）。ここに存在するポリＡ付加シグナルは保存配列に近い。
【０２２６】
ＰＣＡ３は、ノーザンブロットで異なるサイズの転写物が観察されること、及び異なる種類のクローンが同定されていることから明らかなように、この遺伝子では顕著な選択的スプライシングが（選択的ポリアデニル化と共に）起こる。前述したように、エクソンの全ての組合せが実質的に可能なので、他のスプライシング変異体も同定することができる。例えば、エクソン２、３、４ａ、４ｂ及び４ｃを有するｃＤＮＡクローンが最近同定されている。実際に、実質的に全ての可能なエクソンの組合わせで表されるクローンが同定されていると考えられる。
【０２２７】
λＤＤ３．６というクローンのシークエンシングにより、このようなスプライシング変異体の１つが同定された。λＤＤ３．６は、２５歳の男性の前立腺ＲＮＡから構築したｃＤＮＡライブラリー（CLONTECH社より購入）をＰＣＡ３プローブを用いてスクリーニングすることによって同定、単離したλｇｔ１１クローンである。λＤＤ３．６はエクソン３、４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄを含んでいる。しかしながら、このｃＤＮＡクローンはイントロン配列（イントロン２の一部とイントロン３）も含んでいる。
【０２２８】
２つの寄託したクローンｐＭＢ９及びλＤＤ３．６の比較を図３に示す。
【０２２９】
異なる組合せのエクソンについてコンピュータ解析で調べてオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定し、タンパク質のコード領域を予測した。最長のＯＲＦがタンパク質のコード領域である可能性の最も高いで領域であった。１５３塩基の最長のＯＲＦが５１アミノ酸残基からなる小さなペプチドＰＣＡ３をコードしている。ＰＣＡ３はエクソン３の一部とエクソン４ａによってコードされている。小さなサイズのタンパク質は、そのタンパク質がメッセンジャー分子として最もよく機能し、細胞から分泌される可能性を有することを示唆している。エクソン１、２、３及び４ａから４ｄの塩基配列並びにＰＣＡ３のアミノ酸配列を図２と図５（それぞれ、配列番号１及び６と２及び７に相当）に示す。
【０２３０】
通常の技術を有する者が、上記した方法に従ってｃＤＮＡクローンの単離及び特徴付けを行えば、配列番号６及び図５に示す塩基配列を有するｃＤＮＡクローンを得ることができると認識するだろう。例えば、従来技術でよく知られているように、エクソン１、２、３、４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄの少なくとも１つの５’末端に特異的なプローブを更に用いて、全長ＰＣＡ３ｃＤＮＡを有するクローンを得る確率を上昇させることができる。例えば、９６穴プレートを用いて、上記のプローブで多数のＰＣＡ３陽性ｃＤＮＡクローンをスクリーニングすることができる。よく知られているように、又ここに記載するように、所望のｃＤＮＡクローンを得るまでＰＣＡ３陽性クローンの塩基配列を決定を行うことも、当然のことながら可能である。
【０２３１】
その上、ＰＣＡ３特異的プライマーとＰＣＲのような増殖法を用いて、配列番号６及び図５に示す配列を有するｃＤＮＡクローンを得ることも可能である。例えば、ＰＣＡ３ｃＤＮＡの最端の５’末端並びに３’末端に特異的なプライマーを用いたＰＣＲ技術によって、例えば前立腺腫瘍から単離したＲＮＡから所望の産物（ほぼ４ｋｂ）を増幅し、そのＰＣＲ産物をクローニングすることができる。しかしながら、ＰＣＲ増幅は間違った塩基を取り込む可能性があるので、完全なｃＤＮＡのシークエンシングがほとんどの場合必要である。
【０２３２】
通常の技術を有する者にはよく知られているように、配列番号６及び図５に示す配列を有するｃＤＮＡクローンは、ここに記載したクローン（或いは新たに単離されたクローン）と従来の遺伝子工学的手法を用いて構築することもできる。
【０２３３】
例えば、寄託したクローンであるｐＭＢ９やλＤＤ３．６を用いてそのような全長のｃＤＮＡクローンを構築することができる。配列番号６及び図５に示す塩基配列を有するこのようなｃＤＮＡクローンを構築するための方法の例を以下に示すが、本願を限定するものではない。
【０２３４】
λＤＤ３．６ファージＤＮＡをＮｄｅＩで完全に消化し、およそ２ｋｂのＮｄｅＩ断片をアガロースゲルから単離する。この断片は、ＰＣＡ３のエクソン４ｂの一部、エクソン４ｃと４、ｄ及び約５０塩基のファージＤＮＡを含んでいる。次に、この２ｋｂ断片の末端をＤＮＡポリメラーゼのKlenow断片とｄＮＴＰｓで平滑末端化し、この平滑末端化断片を更にBluescript SKのＨｉｎｃII／ＳｍａＩ切断部位に連結する。ＨｉｎｃIIとＳｍａＩの消化によるBluescriptのＨｉｎｄIII認識部位の欠失は、以下に示すこの特定の方法における更なるクローニングステップには重要なことである。複数のＮｄｅＩ認識部位がλｇｔ１１ファージにも存在するため、ＮｄｅＩで消化するといくつかの付加的な断片を生じ、そのうちのいくつかは２ｋｂに近い（具体的には、１．８ｋｂと２．５ｋｂ）ことに注目されたい。しかしながら、これらの異なるバンドはアガロースゲル上で即座に分離される。λＤＤ３．６の平滑末端化した２ｋｂのＮｄｅＩ断片のBluescriptへの挿入（この構築物をＰＣＡ３−Ｘという）における正しい方向性は、ＳａｃＩ単一で消化することによって証明することができる。その際、アガロースゲルをエチヂウムブロマイド染色した時に、約０．４５ｋｂ断片と約４．５ｋｂの断片を生ずる。また、塩基配列の解析を行ってＰＣＡ３挿入断片の確認することもできる。
【０２３５】
次に、ＰＣＡ３−Ｘ構築物をＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩで完全に消化し、４．８ｋｂのベクター挿入物断片をアガロースゲルゲルから単離する。この結果、挿入物から約０．２ｋｂのＤＮＡが除去される。同時にｐＭＢ９をＢａｍＨＩとＨｉｎｄIIIで完全に消化すると、１．９ｋｂの挿入物（ＰＣＡ３のエクソン１、２、３、４ａ及び４ｂの大部分を含む）をアガロースゲルから単離することができる。ｐＭＢ９由来の挿入物をＰＣＡ３−Ｘ構築物のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII切断部位に連結する。連結した構築物ＰＣＡ３−Ｙは、エクソン１の最初の２２塩基を除きＰＣＡ３の完全なｃＤＮＡを含んでいる（以下の記載及び図４参照）。ＰＣＡ３−Ｙ構築物とオリゴマー（７４ｂｐ：配列番号８）を共にＢａｍＨＩとＰｓｔＩで完全に切断し、切断したオリゴマーをＰＣＡ３−Ｙ構築物に連結することによってこの最初の２２塩基をＰＣＡ３ｃＤＮＡに付加することができる。この構築物をＰＣＡ３−Ｚという。塩基配列の解析を行い、オリゴマーが正しく連結されたことを証明することができる（即ち、複数のオリゴマーが並んだものではなく、単一のオリゴマーが連結されたことを確認する）。当然、ＰＣＡ３−Ｚ内に形成されたｃＤＮＡのシークエンシングを行って、核酸配列の完全性を証明することもできる。
【０２３６】
体細胞のハイブリッドパネル（hybrid panel）のスクリーニングによって、ＰＣＡ３をコードする遺伝子がヒト９番染色体上に局在することが明らかとなった。プローブとして４つのＰＣＡ３関連ゲノムクローンの混合物を用い、ヒトリンパ球の細胞分裂中期の染色体にハイブリダイズさせたところ、ＰＣＡ３は９ｑ２１〜２２にマップされた（図１も参照）。
【０２３７】
進化の過程におけるＰＣＡ３遺伝子の保存をサザンブロット解析で研究したところ、この遺伝子の相同遺伝子がサル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ及びブタにも存在することが示された。この遺伝子はイヌやネコにも存在している。一方、ＰＳＡをコードする遺伝子は霊長類のみにみられる。
【実施例２】
【０２３８】
ＰＣＡ３の前立腺特異的な発現 
ＰＣＡ３に特異的なプライマーを開発する際に、いくつかの正常ヒト組織から抽出したＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。４０サイクルのＰＣＲで、正常前立腺組織及びＢＰＨ組織におけるＰＣＡ３関連産物が増幅された。ＰＣＡ３の発現は、非常に前立腺特異的である。何故なら、以下の正常ヒト組織においては、同様の条件下でＰＣＡ３産物を全く増幅することができなかったからである。調べた組織は、動脈、脳、前胸部、膀胱、大腸、十二指腸、心臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胎盤、精嚢、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓並びに精巣である。ヒト前立腺癌由来の細胞株であるＡＬＶＡ−３１、ＤＵ１４５、ＪＣＡ−１、ＰＰＣ−１、ＰＣ３並びにＴＳＵ−Ｐｒ１においても、ＰＣＡ３関連ＰＣＲ産物は全く検出できなかった。ヒト前立腺アデノカルシノーマ細胞株ＬＮＣａＰでは、４０サイクルのＰＣＲで産物を得ることができる（一方、同じ条件下で、前立腺腫瘍では２０サイクル以内で産物を得ることができる）。前立腺に特異的なＰＣＡ３の発現の評価に用いた技術は、前立腺癌の診断試験に適応することができる。その上、前立腺を原発巣とする転移巣の同定に適応することもできる。
【０２３９】
更に、半定量的なＲＴ−ＰＣＲ解析を行って、ＰＣＡ３の発現をＰＳＡ（前立腺特異抗原）並びにＰＳＭ（前立腺特異的膜抗原）の発現と比較し、ＰＣＡ３−ＲＴ−ＰＣＲ解析を悪性前立腺標本と良性前立腺標本との区別に用いることができるかどうかを確認した。ＲＴ反応を定量化した後、１０ｎｇのｃＤＮＡをＰＣＲ反応に用いた。対照として、β2−ミクログロブリンについても調べた。調べた２５例中２３例において、検出されたＰＣＡ３産物によって悪性の標本と良性の標本とを明確に区別することができた。一方、ＰＳＡ及びＰＳＭではこの区別をすることができなかった。即ち、正常サンプルと腫瘍サンプルにおいてほぼ等量の産物が認められた。ＰＳＡとＰＣＡ３の発現をノーザンブロット解析でも比較した。その結果は、ＰＣＡ３の高い腫瘍特異性を明確に示している。正常組織或いはＢＰＨ組織と比較して、前立腺癌では少なくとも２０倍のＰＣＡ３の過剰発現が観察される。この結果は、良性組織と比較して、悪性組織で減少しているＰＳＭ並びにＰＳＡの発現とは顕著に異なっている。よって、ＰＣＡ３は前立腺癌を診断するのための優れたマーカーとなることは明らかである。
【０２４０】
前立腺癌の理想的な腫瘍マーカーは、良性組織と悪性組織とを明確に区別できるだけでなく、この疾患に苦しむ患者の臨床的成果（即ち、治療効果や腫瘍の進行度）についても予測できなければならない。データは、実際にＰＣＡ３の発現レベルが腫瘍の悪性度（tumor grade）と明確に相関する傾向にあることを示している。
【０２４１】
ＲＩＳＨ（即ち、免疫組織化学）を用いて、ＰＣＡ３の過剰発現、腫瘍の悪性度、進行度（stage）及び臨床的成果のあいだに相関関係があるかどうかを確認することができる。パラフィン包埋標本及び氷結標本を用いれば、長期の臨床的継続管理が可能となる。コンピュータ画像解析を用いて、ＲＩＳＨで検出したようなＰＣＡ３の発現レベルの定量化を行い、これを外部基準に対して標準化する（Tamimi et al., Cancer Res. 53: 5512-5516, 1993; Tamimi et al., B. J. Cancer, 1996）。腫瘍の悪性度、病理学的な腫瘍の進行度、臨床学的な腫瘍の進行度、ＰＳＡレベル並びにＰＣＡ３の発現を変量とした多変量の回帰分析（Gleasonを含む）を用いると、ＰＣＡ３が進行を正確に予知するかどうか並びに（付加的な）予後価値を有するかどうかが確認される。
【０２４２】
現在有効な進行度分類様式では検出されない極微量の造血性微小癌組織の転移細胞を検出するために、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイが開発されている。このＲＴ−ＰＣＲアッセイは、前立腺癌や他の悪性腫瘍を患う患者に対して既に行われている。高感度の（nested）ＲＴ−ＰＣＲアッセイ［或いは、ＮＡＳＢＡ、ＰＣＲ、ＱＢ ｒｅｐ．、ＳＯＡ、ＴＭＡ並びにＬＣＲ（Winn-Deen, J. Clin., Liquid Assay 19: 21-26, 1996）に限定されない他の種類の増幅アッセイ］を用いて、前立腺の循環血中に存在する前立腺癌細胞を検出することができる。即ち、転移を有する危険性又は転移が進行する危険性にあるとみなされる癌患者を検出することができる。実験には適正な対照（例えばβ2−ミクログロブリン）が含まれ、半定量的な方法で行われる（即ち、ｃＤＮＡ合成量を定量化し、ＰＣＲ解析に等量のｃＤＮＡを投入する）。
【０２４３】
分子レベルでの進行度分類研究が大容量のＢＩＯＭＥＤ IIプログラム（「前立腺癌のマーカー」という研究）で行われる。この広範囲な協力的研究においては、ＰＳＡとＰＳＭが、前立腺癌に対する他の潜在的に興味深いマーカーと共に研究される。関連する研究施設においては、前立腺疾患と診断されている患者から既に血液サンプルが回収されている。循環している腫瘍細胞の検出に用いるための患者の血液サンプルについても、その回収及び処理法の適正化が始まっている。例えば、血液を回収し、末梢血白血球を精製するためにvacutainerTM CPT-tubes（BecktonDickinson社製）をTrizolTM RNA−抽出法（チオシアン酸グアニジン法に基づく）と共に用いると、ＰＣＲ解析に適当な高純度且つ高濃度のＲＮＡを調製することができる。ＰＣＡ３特異的プライマーを用いて前立腺癌患者の血液から抽出したＲＮＡ中のＰＣＡ３転写物を増幅したところ、転移が立証されている患者だけでなく、限局的な疾患であると想定される患者の循環血液中にさえ、前立腺癌細胞の存在を検出できることが示された。個別の前立腺癌患者に対するＰＣＡ３の予後価値を決定するために、より多数の患者人口を対象とした研究、及び臨床データと継続管理との相関性に対する研究が広範囲に行われる。
【０２４４】
Nested ＲＴ−ＰＣＲ解析（或いは同様の増幅法）は、ＰＣＡ３を発現する臓器が他に（未だに調べられていない臓器の中に）あるかどうかを決定する手段を提供すると考えられる。例えば、クーパー腺（前立腺と同様の胚由来）及びスキーン腺（女性における前立腺「相同物」）についても、ＰＣＡ３を調べることができる。
【０２４５】
１０％の腫瘍細胞を含む「正常な」前立腺組織標本の１つにおいてＰＣＡ３の発現が検出され、腫瘍マーカーとしてのＰＣＡ３の高い感受性を示した。この方法で、２、３例のＢＰＨサンプルにおいてもＰＣＡ３の発現も検出し、その結果、これらのサンプルが小さな腫瘍細胞領域を含むことを見出した。前立腺癌におけるＰＣＡ３の発現レベルは腫瘍の悪性度と明確に相関する傾向を示している。これらのデータは、ノーザンブロットハイブリダイゼーションの結果であるオートラジオグラフィーの解析に基づいている。
【０２４６】
ＰＣＡ３の発現が分化能の欠失と共に上昇しているという観察結果は、ＰＳＡに対して報告されているものとは異なっている。何故なら、ＰＳＡの発現レベルは、分化能の欠失と共に減少している（Hakalahti et al., Int. J. Cancer 55: 590-597, 1993）からである。正常組織又はＢＰＨ組織と比較して、前立腺癌においては少なくとも２０倍のＰＣＡ３の過剰発現が認められる。これは、良性組織に対して悪性組織では減少すると報告されているＰＳＡの発現とは顕著に異なっている。ＰＣＡ３の発現は転移研究４例中４例において検出された。
【実施例３】
【０２４７】
ＰＣＡ３の転写開始部位の同定 
ＰＣＡ３の転写開始部位を決定するために、プライマー・エクステンション法、ヌクレアーゼＳ1マッピング、５’ＲＡＣＥ（急速ｃＤＮＡ末端増幅法）を行った。その結果、主要な転写開始部位が４塩基の範囲内に局在することが見出された（図４参照）。
【０２４８】
これらの実験結果は、ｐＭＢ９のｃＤＮＡ配列（配列番号１及び図２参照）に関して、ｃＤＮＡのサイズを５’方向に更に２２塩基延ばした。この付加的な５’ポリヌクレオチド配列は配列番号６及び図５にも示している。
【０２４９】
参考文献として上記した刊行物の内容は、全て本明細書に組み込まれたものとする。
【０２５０】
本発明を明確にし、その理解を容易にする目的で本発明を詳細に記載したが、本明細書を読む当業者においては、本発明の実際の範囲及び添付の請求の範囲から逸脱することなく、本発明の形態及びその細部に変更を加えることが可能である点をご理解頂きたい。
本発明の好ましい態様について説明したが、本明細書に添付のクレームによって定義された本発明の本質及びその性質から逸脱することなく本発明の説明を改変することは可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２５１】
【図１】図１に、ＰＣＡ３遺伝子のゲノム構造を示す。
【図２】図２Ａは、ＰＣＡ３ｃＤＮＡの構造を示し、図２Ｂは、ＰＣＡ３ｃＤＮＡの塩基配列とそのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１と２に示した）である。
【図３】図３ＡとＢは、ｃＤＮＡクローンであるｐＭＢ９及びλＤＤ３．６を比較した模式図である。
【図４】図４に、ＰＣＡ３の転写開始部位（ＴＳＳ）を示す。転写開始部位は、プライマー伸張反応（ＰＥ）、ヌクレアーゼＳ1マッピング（Ｓ１）及び５’ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）法で決定した。
【図５】図５Ａは、ＰＣＡ３ｃＤＮＡの構造を示し、図５Ｂは、ＰＣＡ３ｃＤＮＡの塩基配列とそのアミノ酸配列（それぞれ配列番号６と７に示した）であり、推定されるポリアデニル化シグナルを下線で示した。
【図１】
2007275069.tif 000004
【図２Ａ】
2007275069.tif 000005
【図２Ｂ】
2007275069.tif 000006
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
2007275069.tif 000011
【図２Ｈ】
2007275069.tif 000012
【図２Ｉ】
2007275069.tif 000013
【図２Ｊ】
2007275069.tif 000014
【図３】
2007275069.tif 000015
【図４】
2007275069.tif 000016
【図５Ａ】
2007275069.tif 000017
【図５Ｂ】
2007275069.tif 000018
【図５Ｃ】
2007275069.tif 000019
【図５Ｄ】
2007275069.tif 000020
【図５Ｅ】
2007275069.tif 000021
【図５Ｆ】
2007275069.tif 000022
【配列表】
2007275069000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月10日(2007.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５１】
【図１】ＰＣＡ３遺伝子のゲノム構造を示す。
【図２Ａ】ＰＣＡ３ｃＤＮＡの構造を示す。
【図２Ｂ】ＰＣＡ３ｃＤＮＡの塩基配列とそのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１と２に示した）を図２Ｂ〜図２Ｊに示し、５’末端からの配列を図２Ｂに示す。
【図２Ｃ】ＰＣＡ３ｃＤＮＡの塩基配列とそのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１と２に示した）を図２Ｂ〜図２Ｊに示し、図２Ｂの続きを図２Ｃに示す。
【図２Ｄ】ＰＣＡ３ｃＤＮＡの塩基配列とそのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１と２に示した）を図２Ｂ〜図２Ｊに示し、図２Ｃの続きを図２Ｄに示す。
【図２Ｅ】ＰＣＡ３ｃＤＮＡの塩基配列とそのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１と２に示した）を図２Ｂ〜図２Ｊに示し、図２Ｄの続きを図２Ｅに示す。
【図２Ｆ】ＰＣＡ３ｃＤＮＡの塩基配列とそのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１と２に示した）を図２Ｂ〜図２Ｊに示し、図２Ｅの続きを図２Ｆに示す。
【図２Ｇ】ＰＣＡ３ｃＤＮＡの塩基配列とそのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１と２に示した）を図２Ｂ〜図２Ｊに示し、図２Ｆの続きを図２Ｇに示す。
【図２Ｈ】ＰＣＡ３ｃＤＮＡの塩基配列とそのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１と２に示した）を図２Ｂ〜図２Ｊに示し、図２Ｇの続きを図２Ｈに示す。
【図２Ｉ】ＰＣＡ３ｃＤＮＡの塩基配列とそのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１と２に示した）を図２Ｂ〜図２Ｊに示し、図２Ｈの続きを図２Ｉに示す。
【図２Ｊ】ＰＣＡ３ｃＤＮＡの塩基配列とそのアミノ酸配列（それぞれ配列番号１と２に示した）を図２Ｂ〜図２Ｊに示し、図２Ｉの続きを図２Ｊに示す。
【図３】ｃＤＮＡクローンであるｐＭＢ９とλＤＤ３．６を比較した模式図である。
【図４】ＰＣＡ３の転写開始部位（ＴＳＳ）を示す。転写開始部位は、プライマー伸張反応（ＰＥ）、ヌクレアーゼＳ1マッピング（Ｓ１）及び５’ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）法で決定した。
【図５Ａ】ＰＣＡ３ｃＤＮＡの構造を示す。
【図５Ｂ】ＰＣＡ３ｃＤＮＡの塩基配列とそのアミノ酸配列（それぞれ配列番号６と７に示した）を図５Ｂ〜図５Ｆに示し、５’末端からの配列を図５Ｂに示す。
【図５Ｃ】ＰＣＡ３ｃＤＮＡの塩基配列とそのアミノ酸配列（それぞれ配列番号６と７に示した）を図５Ｂ〜図５Ｆに示し、図５Ｂの続きを図５Ｃに示し、推定されるポリアデニル化シグナルを下線で示した。
【図５Ｄ】ＰＣＡ３ｃＤＮＡの塩基配列とそのアミノ酸配列（それぞれ配列番号６と７に示した）を図５Ｂ〜図５Ｆに示し、図５Ｃの続きを図５Ｄに示した。
【図５Ｅ】ＰＣＡ３ｃＤＮＡの塩基配列とそのアミノ酸配列（それぞれ配列番号６と７に示した）を図５Ｂ〜図５Ｆに示し、図５Ｄの続きを図５Ｅに示し、推定されるポリアデニル化シグナルを下線で示した。
【図５Ｆ】ＰＣＡ３ｃＤＮＡの塩基配列とそのアミノ酸配列（それぞれ配列番号６と７に示した）を図５Ｂ〜図５Ｆに示し、図５Ｅの続きを図５Ｆに示し、推定されるポリアデニル化シグナルを下線で示した。
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月20日(2007.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）と（ｂ）からなる群より選ばれる単離された核酸分子。
（ａ）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１％ ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精巣ＤＮＡを含む溶液中で６８℃のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、配列番号１、３、４又は６からなる塩基配列又はそれに完全に相補的な塩基配列のいずれかの中の少なくとも１５個の連続した塩基にハイブリダイズする１５〜５０塩基からなる塩基配列であって、ＰＣＡ３核酸を特異的に増幅するか又は検出することのできる塩基配列；及び 
（ｂ）配列番号１、３、４又は６からなる塩基配列又はそれに完全に相補的な塩基配列のいずれかに全体が含まれている、１５〜５０塩基からなる塩基配列。
【請求項２】
正常ヒト組織と比べて、前立腺癌組織において過剰発現している単離された核酸分子であって、次の（ａ）と（ｂ）からなる群より選ばれる単離された核酸分子。
（ａ）５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１％ ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精巣ＤＮＡを含む溶液中で６８℃のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、配列番号１、３、４又は６の塩基配列に完全に相補的な塩基配列の中の少なくとも１５個の連続した塩基にハイブリダイズする１５〜５０塩基からなる塩基配列であって、ＰＣＡ３核酸を特異的に増幅するか又は検出することのできる塩基配列；及び 
（ｂ）配列番号１、３、４又は６からなる塩基配列に全体が含まれている、１５〜５０塩基からなる塩基配列。
【請求項３】
請求項１又は２で定義した核酸分子の部分配列からなり、該部分配列が次の（ａ）と（ｂ）からなる群より選ばれることを特徴とする単離された核酸分子。
（ａ）以下のＰＣＡ３遺伝子のエクソン又はそれらの組み合わせから選ばれる連続した１５〜５０塩基からなる塩基配列：エクソン１（配列番号１の１番〜９８番の配列又は配列番号６の１番〜１２０番の配列）、エクソン２（配列番号１の９９番〜２６３番の配列又は配列番号６の１２１番〜２８５番の配列）、エクソン３（配列番号１の２６４番〜４４６番の配列又は配列番号６の２８６番〜４６８番の配列）、エクソン４ａ（配列番号１の４４７番〜９８５番の配列又は配列番号６の４６９番〜１００７番の配列）、エクソン４ｂ（配列番号１の９８６番〜２０３７番の配列又は配列番号６の１００８番〜２０６６番の配列）、エクソン４ｃ（配列番号６の２０６７番〜２６２２番の配列）とエクソン４ｄ（配列番号６の２６２３番〜３５８２番の配列）；及び
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列に完全に相補的な塩基配列。
【請求項４】
請求項１又は２で定義した核酸分子の部分配列からなり、該部分配列が次の（ａ）と（ｂ）からなる群より選ばれることを特徴とする単離された核酸分子。 
（ａ）配列番号４の塩基配列中の連続した１５〜５０塩基からなる塩基配列；及び 
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列に完全に相補的な塩基配列。
【請求項５】
該正常ヒト組織が、動脈、脳、前胸部、十二指腸、心臓、肝臓、卵巣、胎盤、精嚢、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、精巣及び前立腺からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
生物試料中のＰＣＡ３核酸を検出する方法にして、
ａ）ハイブリダイゼーションの起こりうる条件下において該生物試料と請求項１〜５のいずれかの核酸分子とを接触せしめ、
ｂ）ＰＣＡ３核酸に結合した該核酸分子の存在を検出する、
ことを包含する方法。
【請求項７】
正常ヒト組織と比べて、前立腺癌組織において過剰発現しているＰＣＡ３核酸の存在を生物試料から検出するためのキットであって、請求項１〜５のいずれかの核酸分子の入った少なくとも１つの容器手段を包含することを特徴とするキット。
【請求項８】
該単離された核酸分子が、ＡＬＶＡ−３１、ＪＣＡ−１、ＰＰＣ−１、ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＴＳＵ−Ｐｒ１からなる群より選ばれるヒト前立腺癌由来の細胞株と比較して、前立腺癌組織において過剰発現していることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
ベクターと、請求項１〜５と８のいずれかの核酸分子とを包含することを特徴とする組換え核酸分子。
【請求項１０】
請求項９の組換え核酸分子を含む単離された細胞。
【請求項１１】
生物試料における前立腺癌細胞の存在又は癌化する素因を有する前立腺細胞の存在を検出するための方法であって、
請求項１〜５と８のいずれかの単離された核酸分子を用いて生物試料中のＰＣＡ３核酸の量を測定し、正常前立腺組織と比べて、該生物試料において該ＰＣＡ３核酸が過剰発現していることをもって、該生物試料中に前立腺癌細胞又は癌化する素因を有する前立腺細胞が存在すると判定する
ことを包含する検出方法。
【請求項１２】
該ＰＣＡ３核酸がＰＣＡ３ ｍＲＮＡであることを特徴とする、請求項１１に記載の検出方法。
【請求項１３】
５’から３’への方向に、宿主細胞において転写を開始させるのに有効なプロモーター、及び請求項１〜５と８のいずれかの核酸分子を包含することを特徴とする組換え核酸分子。
【請求項１４】
請求項１３の組換え核酸分子を含むヒト以外の生物。
【請求項１５】
塩基配列（ａ）に完全に相補的な塩基配列であることを特徴する、請求項３又は４に記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
生物試料中のＰＣＡ３核酸を定量することによって、該生物試料における前立腺癌細胞の存在又は癌化する素因を有する前立腺細胞の存在を検出するためのキットであって、請求項３又は４の核酸分子の入った少なくとも１つの容器手段を包含することを特徴とするキット。
【請求項１７】
該ＰＣＡ３核酸がＰＣＡ３ ｍＲＮＡであることを特徴とする、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
該生物試料が、器官、組織、細胞、細胞抽出物及び体液からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項６、１１又は１２に記載の方法、あるいは請求項７、１６又は１７に記載のキット。
【請求項１９】
該体液が、血液、血清、血漿及び尿からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１８に記載の方法又はキット。
【請求項２０】
該体液が尿であることを特徴とする、請求項１９に記載の方法又はキット。