(57)【要約】【課題】機能性食品や医薬品として利用できる低分子量で純度の高い水溶性エラスチン、及び化粧品や医療材料として利用できる高分子量で純度の高い水溶性エラスチンを提供すること。【解決手段】エラスチンを構成するアミノ酸の７９〜８４％がプロリン、グリシン、アラニン、バリンからなり、２〜３％がアスパラギン酸とグルタミン酸からなり、０．７〜１．３％がリジン、ヒスチジン、アルギニンからなり、０．２〜０．４％がデスモシンとイソデスモシンからなる、分子量が約1〜３万の低分子量水溶性エラスチンと、分子量が約３〜３０万の高分子量水溶性エラスチンであり、低分子量水溶性エラスチンは、それを含む機能性食品としてあるいはそれを有効成分とする医薬として利用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エラスチンを構成するアミノ酸の７９〜８４％がプロリン、グリシン、アラニン、バリンからなり、２〜３％がアスパラギン酸とグルタミン酸からなり、０．７〜１．３％がリジン、ヒスチジン、アルギニンからなり、０．２〜０．４％がデスモシンとイソデスモシンからなる、分子量が約1〜３万の低分子量水溶性エラスチン。
【請求項２】
エラスチンを構成するアミノ酸の７９〜８４％がプロリン、グリシン、アラニン、バリンからなり、２〜３％がアスパラギン酸とグルタミン酸からなり、０．７〜１．３％がリジン、ヒスチジン、アルギニンからなり、０．２〜０．４％がデスモシンとイソデスモシンからなる、分子量が約３〜３０万の高分子量水溶性エラスチン。
【請求項３】
エラスチンを構成するアミノ酸の７９〜８４％がプロリン、グリシン、アラニン、バリンからなり、２〜３％がアスパラギン酸とグルタミン酸からなり、０．７〜１．３％がリジン、ヒスチジン、アルギニンからなり、０．２〜０．４％がデスモシンとイソデスモシンからなる、分子量が約1〜３万の低分子量水溶性エラスチンを含む機能性食品。
【請求項４】
低分子量水溶性エラスチンの他に、生体に有用な金属を含む請求項３記載の機能性食品。
【請求項５】
エラスチンを構成するアミノ酸の７９〜８４％がプロリン、グリシン、アラニン、バリンからなり、２〜３％がアスパラギン酸とグルタミン酸からなり、０．７〜１．３％がリジン、ヒスチジン、アルギニンからなり、０．２〜０．４％がデスモシンとイソデスモシンからなる、分子量が約1〜３万の低分子量水溶性エラスチンを有効成分とする医薬。
【請求項６】
動脈硬化抑制剤である請求項５記載の医薬。
【請求項７】
脂質代謝異常改善剤である請求項５記載の医薬。
【請求項８】
血栓形成抑制剤である請求項５記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性エラスチンから得られる高純度の低分子量水溶性エラスチンと高分子量水溶性エラスチン、及び低分子量水溶性エラスチンの食品と医薬用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
エラスチンは、動物、特に哺乳動物の皮膚の真皮、靭帯、腱、血管壁等の結合組織の中に、コラーゲンと共に存在するタンパク質である。エラスチンは、通常、生体内においては、３次元の網目構造の不溶性のタンパク質として存在している。かかるエラスチンを、酸又はアルカリで加水分解したり、酵素で処理することによって、水溶性エラスチンが得られることは広く知られている。そして、水溶性エラスチンは、水分を豊富に保持する能力を有することから、化粧品、特に保湿剤として利用されている他（例えば、特許文献１〜３）、皮膚に弾力を与える等の美容効果があるとして、コラーゲン等と共に健康食品としても利用されている（例えば、特許文献４〜６）。更に、水溶性エラスチンは、人工血管等の再生医療分野においてもその利用が期待されている（例えば、特許文献７〜１０）。
【０００３】
【特許文献１】特開昭６０−２５８１０７号公報
【特許文献２】特公平５−２０４０９号公報
【特許文献３】特開２００２−２０５９１３号公報
【特許文献４】特開平６−７０９２号公報
【特許文献５】特開２００５−１３１２３号公報
【特許文献６】特開２００５−１３１２４号公報
【特許文献７】特公平６−３０６１６号公報
【特許文献８】特開平８−３３６６１号公報
【特許文献９】特開平９−１７３３６１号公報
【特許文献１０】ＷＯ２００２−９６９７８号公報
【０００４】
水溶性エラスチンを得る方法・手段は色々と提案されているが、適度の分子量を有する高純度の水溶性エラスチンを得る方法は未だ十分なものではない。エラスチンは動物の生体組織から抽出されるが、この場合、通常、不要部分の除去や脱脂操作等の前処理を施した動物性生体組織が用いられる。そして、前処理された組織を、ギ酸やシュウ酸を含む所定温度の酸性液に溶解したり、或いは、酵素で処理することによって、動物性生体組織に含まれている不溶性エラスチンを断片化し、水溶性エラスチンを溶解した可溶化液が得られる。しかしながら、かかる方法では、水溶性エラスチンが溶解した可溶化液中に、動物性生体組織に含まれるエラスチン以外のコラーゲンやその他のタンパク質も溶解し、最終的に得られる水溶性エラスチンの純度が低下するという問題があった。しかも、可溶化液に溶解した水溶性エラスチンは、可溶化液に長時間溶解していることによって、水溶性エラスチン分子が更に低分子量のポリペプチドへと細断化されてしまい、低温度帯（例えば３５〜４０℃）でのコアセルベーション能を失ってしまう。そして、コアセルベーション能を失ったエラスチンは、医用材料分野等の用途には適さなくなるという問題もあった。
【０００５】
精製したエラスチンを、熱シュウ酸を用いて抽出処理することによって、水溶性のα−エラスチンとβ−エラスチンが得られることが報告されている（非特許文献１）。しかし、非特許文献１で報告されているα−エラスチンの分子量は７０，０００で、β−エラスチンの分子量は１０，０００以下であり、以下に述べる本発明の高純度の水溶性エラスチンとは異なっている。前記特許文献１には、不溶性エラスチンをタンパク分解酵素によって分解し、分子量１５，０００〜３００，０００の可溶性エラスチンを得たことが開示されている。しかし、このエラスチンは、分子量の範囲が非常にブロードで、酵素分解の断片等を含み純度の高いものとは考えられない。前記特許文献７にも、不溶性エラスチンをペプシン分解し、分子量が８，３００〜６４０，０００の水溶性エラスチンを得たことが報告されているが、このもののアミノ酸組成（特にプロリン、グリシン、アラニン、バリン）から判断する限り、純度の高いものとは考えられない。また、前記特許文献１０にも、不溶性エラスチンを熱シュウ酸で処理し、水溶性エラスチンを得たことが報告されており、アミノ酸組成から判断すると高純度のものであることが推定されるが、この文献では、生体適合性機能性材料を得るために、得られた水溶性エラスチンを架橋させている。なお、精製した不溶性エラスチンのアミノ酸組成は、本発明の高純度の水溶性エラスチンのそれと一部重複しており、８０〜８３％がプロリン、グリシン、アラニン、バリンであり、２〜３％がアスパラギン酸とグルタミン酸であり、０．７〜１．０％がリジン、ヒスチジン、アルギニンであり、０．３〜０．４％がデスモシンとイソデスモシンからなると報告されている（例えば、非特許文献２）。
【非特許文献１】Biochimica et Biophysica Acta, 310 (1973) 481-486
【非特許文献２】Analytical Biochemistry 64, 255-259 (1975)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、機能性食品や医薬品として利用できる低分子量で純度の高い水溶性エラスチン、及び化粧品や医療材料として利用できる高分子量で純度の高い水溶性エラスチンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のうち請求項１記載の発明は、エラスチンを構成するアミノ酸の７９〜８４％がプロリン、グリシン、アラニン、バリンからなり、２〜３％がアスパラギン酸とグルタミン酸からなり、０．７〜１．３％がリジン、ヒスチジン、アルギニンからなり、０．２〜０．４％がデスモシンとイソデスモシンからなる、分子量が約1〜３万の低分子量水溶性エラスチンである。なお、本発明においてアスパラギン酸の含量にはアスパラギンも含み、グルタミン酸の含量にはグルタミンも含むものである。
【０００８】
請求項２記載の発明は、エラスチンを構成するアミノ酸の７９〜８４％がプロリン、グリシン、アラニン、バリンからなり、２〜３％がアスパラギン酸とグルタミン酸からなり、０．７〜１．３％がリジン、ヒスチジン、アルギニンからなり、０．２〜０．４％がデスモシンとイソデスモシンからなる、分子量が約３〜３０万の高分子量水溶性エラスチンである。
【０００９】
請求項３記載の発明は、エラスチンを構成するアミノ酸の７９〜８４％がプロリン、グリシン、アラニン、バリンからなり、２〜３％がアスパラギン酸とグルタミン酸からなり、０．７〜１．３％がリジン、ヒスチジン、アルギニンからなり、０．２〜０．４％がデスモシンとイソデスモシンからなる、分子量が約1〜３万の低分子量水溶性エラスチンを含む機能性食品である。
【００１０】
請求項４記載の発明は、低分子量水溶性エラスチンの他に、生体に有用な金属を含む請求項３記載の機能性食品である。
【００１１】
請求項５記載の発明は、エラスチンを構成するアミノ酸の７９〜８４％がプロリン、グリシン、アラニン、バリンからなり、２〜３％がアスパラギン酸とグルタミン酸からなり、０．７〜１．３％がリジン、ヒスチジン、アルギニンからなり、０．２〜０．４％がデスモシンとイソデスモシンからなる、分子量が約1〜３万の低分子量水溶性エラスチンを有効成分とする医薬である。
【００１２】
そして、請求項５の医薬の特定の用途に関する発明として、請求項６記載の発明は動脈硬化抑制剤、請求項７記載の発明は脂質代謝異常改善剤、請求項８記載の発明は血栓形成抑制剤である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、分子量が約1〜３万の低分子量で純度の高い水溶性エラスチンと、分子量が約３〜３０万の高分子量で純度の高い水溶性エラスチンが得られる。そして、本発明の低分子量の水溶性エラスチンは、消化吸収性が高いので、機能性食品や医薬品として利用できる。また、高分子量の水溶性エラスチンは、化粧品や医療材料として利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の水溶性エラスチンは、エラスチンを構成するアミノ酸の７９〜８４％がプロリン、グリシン、アラニン、バリンからなり、２〜３％がアスパラギン酸とグルタミン酸からなり、０．７〜１．３％がリジン、ヒスチジン、アルギニンからなり、０．２〜０．４％がデスモシンとイソデスモシンからなる、分子量が約１〜３万の低分子量水溶性エラスチンと、分子量が約３〜３０万の高分子量水溶性エラスチンである。精製した不溶性エラスチンのアミノ酸組成は、８０〜８３％がプロリン、グリシン、アラニン、バリンであり、２〜３％がアスパラギン酸とグルタミン酸であり、０．７〜１．０％がリジン、ヒスチジン、アルギニンであり、０．３〜０．４％がデスモシンとイソデスモシンであるとされており、本発明の水溶性エラスチンのアミノ酸組成も殆どこれに近いものであるから、高純度のものであると言える。但し、エラスチンのアミノ酸分析を行うとき、通常、６Ｎ塩酸で４８時間以上加水分解するが、そのためAsnはAspに変換し、GlnはGluに変換するので、Aspの値はAsp＋Asnの合計として、また、Gluの値はGlu＋Glnの合計として表される。本発明のアミノ酸組成においても、アスパラギン酸の含量には元々のアスパラギンも含み、グルタミン酸の含量には元々のグルタミンも含むものとして定義されている。
【００１５】
かかる水溶性エラスチンは、本発明者が既に提案した、以下の様な方法によって製造することができる。先ず、第１の方法は、動物性生体組織からコラーゲンやその他の不要タンパク質の除去処理を行って不溶性エラスチンを得、次いでこの不溶性エラスチンをシュウ酸等の可溶化液に浸漬・溶解させ、水溶性エラスチンを製造する。コラーゲンやその他の不要タンパク質の除去処理は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの少なくともいずれか一つを含むアルカリ性溶液であって、このアルカリ性溶液中に添加した水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの総量を、１Ｌあたり０．０５〜０．１５molで９０〜１０５℃としたアルカリ性溶液中に、動物性生体組織を１０〜２０分間浸漬して行うのが好ましい。また、コラーゲンやその他の不要タンパク質の除去処理に際しては、アルカリ性溶液による処理の前に、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化バリウムの少なくともいずれか一つを含む塩溶液に、動物性生体組織を浸漬させる浸漬処理（前処理）を行うのも好ましい。
【００１６】
動物性生体組織としては、特に制限はないが、エラスチンの含量が多い点で、豚、馬、牛、羊などの哺乳動物から得られた項靱帯や大動脈血管を使用することが好ましい。動物性生体組織は、先ず、ホモジナイザーを用いてホモジナイズするのが良い。ホモジナイズはミキサー、ミートチョッパーなど動物性生体組織を細断できれば良く、好ましくは３ミリメートル角以下、さらに好ましくはペースト状に細断できる器具を用いると良い。細断した動物性生体組織の粒が小さいほど、コラーゲンやその他の不要なタンパク質の除去効率を上げることができるので好ましい。ホモジナイズした動物性生体組織は、例えば、熱水又は熱希薄アルカリ水溶液で煮沸するか、もしくは有機溶媒で処理することによって脱脂処理を行っても良い。
【００１７】
前記可溶化液としては、シュウ酸、蟻酸、酢酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ベタイン、ジフルオロ酢酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、スルファミン酸、過塩素酸、トリクロロ酢酸の少なくともいずれか一つを含む酸性溶液が用いられる。そして、この酸性溶液の酸の総量は、１Ｌあたり０．１〜０．５molとし、かつ、液温を９０〜１０５℃とするのが好ましい。
【００１８】
前記可溶化液は、また、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの少なくともいずれか一つを含むアルカリ性溶液であっても良い。このアルカリ性溶液中に添加した水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの総量を、１Ｌあたり０．０５〜０．５molとし、かつ、液温が９０〜１０５℃のアルカリ性溶液とするのが好ましい。
【００１９】
本発明の水溶性エラスチンを製造する第２の方法は、動物性生体組織の不要部分の除去処理、動物性生体組織の脱脂処理、動物性生体組織の細断処理の少なくともいずれか一つを含む前処理工程と、前処理された動物性生体組織をアルカリ性溶液に浸漬して濾別するアルカリ溶解工程と、アルカリ溶解工程を所定回数繰り返し、濾別により水溶性エラスチンを含む濾液を得る濾液回収工程と、濾液から水溶性エラスチンを生成する水溶性エラスチン生成工程とを順次行って水溶性エラスチンを製造する方法である。前記アルカリ溶解工程で用いるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムのいずれか一つ又は混合物が好ましい。
【００２０】
この操作は、前記の、組織からコラーゲンやその他の不要タンパク質を除去して不溶性エラスチンを得て、次いで、この不溶性エラスチンを可溶化して水溶性エラスチンを得る第１の方法とは異なり、組織から不溶性エラスチンを得ることなく、直接水溶性エラスチンを得る方法である。即ち、１Ｌあたり０．０５〜０．１５molで９０〜１０５℃としたアルカリ性溶液中に、脱脂、細断処理した動物性生体組織を１０〜２０分間浸漬し、エラスチン以外のコラーゲンや不要タンパク質を除去した処理組織を得、次いで、この処理組織を１Ｌあたり０．０５〜０．５mol（アルカリ液の濃度がより高濃度）で９０〜１０５℃のアルカリ性溶液中に６０〜２４０分間（時間がより長い）浸漬して溶解し、水溶性エラスチンを得る方法である。
【００２１】
なお、前記第１の方法では、不溶性エラスチンを反応系から実際に取出すので、取出した不溶性エラスチンのアミノ酸組成等を解析し、その純度を検証できるというメリットがある。また、不溶性エラスチンは安定であり長期間の保存が可能であるし、可溶化方法は酸処理でもアルカリ処理でも選択できるという利点がある。一方、第２の方法は、不溶性エラスチンを取出すことがないので、工程が簡便で、アルカリ液の濃度と反応時間を調節するだけで、高純度の水溶性エラスチンを得ることができる。そのため、後者の方が高収率で水溶性エラスチンが得られるという特徴がある。
【００２２】
前記のごとく第１又は第２の方法で得られた水溶性エラスチンは、次いで、それを相分離によって低分子量（分子量約１〜３万）水溶性エラスチンと高分子量（分子量約３〜３０万）水溶性エラスチンに分画する操作を行なう。即ち、水溶性エラスチンを３０〜５０℃に加熱すると相分離して白濁し、そのまま放置すると2層に分離する。この上層画分の平衡液相から低分子量水溶性エラスチンを回収し、下層画分のコアセルベート相から高分子量水溶性エラスチンを回収する。それらの分子量測定の結果と、アミノ酸組成の測定結果から、本発明の低分子量水溶性エラスチンと高分子量水溶性エラスチンはいずれも高純度であることが評価できる。
【００２３】
また、低分子量水溶性エラスチンと高分子量水溶性エラスチンのコアセルベーション特性即ち、温度上昇で濁度が上昇し、温度降下で濁度がもとに戻る可逆的な性質の検討の結果、高分子量水溶性エラスチンは加熱すると白濁することが確認できた。従って、その濁度曲線が可逆的であるので、高分子量水溶性エラスチンは、化粧品や医用材料に応用できることが期待される。一方、低分子量水溶性エラスチンは、加熱しても白濁しないので化粧品や医用材料に用いるのは困難である。しかしながら、低分子量水溶性エラスチンは、分子量サイズが小さいので消化吸収の面で利点になるので、食品素材や医薬品に適していると考えられる。
【００２４】
コラーゲンの溶液は加熱すると白濁するが、温度を下げても白濁したままで、元の透明な状態には戻らない（非可逆性）。しかし、水溶性エラスチンの溶液は、加熱すると白濁し、温度を下げると元の透明な状態に戻る（可逆性）という違いがある。かかる特性を利用して、コラーゲンとエラスチンをそれぞれ適当な医用材料に応用することができる。また、製造された水溶性エラスチンの濁度曲線が、可逆的であるかどうかによって、コラーゲンの混入の有無を検証するのにも利用できる。
【００２５】
本発明の、水溶性エラスチンのうち、エラスチンを構成するアミノ酸の７９〜８４％がプロリン、グリシン、アラニン、バリンからなり、２〜３％がアスパラギン酸とグルタミン酸からなり、０．７〜１．３％がリジン、ヒスチジン、アルギニンからなり、０．２〜０．４％がデスモシンとイソデスモシンからなる、分子量が約1〜３万の低分子量水溶性エラスチンは、消化吸収性に優れているので、機能性食品として利用できる。現在、健康食品市場が急拡大しているが、高コレステロール、高中性脂肪あるいは高血圧などの症状に個別的に対応する機能性食品はあっても、動脈硬化を総合的に予防し、抑制する万能対応型機能性食品はこれまで皆無である。血管を構成する主成分はエラスチン（約３０％）で、次いでコラーゲン（約１８％）であるが、コラーゲンは美肌効果を有する食品素材として広く普及してきたものの、エラスチンを素材とした動脈硬化予防・抑制対応型機能性食品は未だ開発されていない。
【００２６】
なお、食品産業センター技術研究報告書No.27, 2001, 21-26頁には、エラスターゼ活性を持つ酵素処理によって製造した水溶性エラスチン(分子量は不明)を、高脂肪食負荷ラット及び健常者に投与したところ、血中の総コレステロール、中性脂肪等が低下し、血中脂質代謝異常が改善されたことが報告されている。しかし、この報告で用いた水溶性エラスチンは、これまで高純度と評価されている水溶性エラスチンとはアミノ酸組成がかなり異なっている（プロリン、グリシン、アラニン、バリンが６８％に過ぎない）ばかりでなく、エラスチンに特有のアミノ酸であるデスモシン及びイソデスモシンも検出されていないことから、極度に低純度のもの、あるいはエラスチンとは異なるものではないかと推定される。
【００２７】
本発明の低分子量水溶性エラスチンは、後述のごとく、コレステロールの上昇抑制、中性脂肪の上昇抑制、LDL-コレステロール（悪玉コレステロール）の上昇抑制
、HDL-コレステロール（善玉コレステロール）の低下抑制、過酸化脂質の上昇抑制などの血中脂質代謝異常の改善作用、及び血管内腔表面の硬化病変抑制作用や、血管弾性機能の低下抑制作用を持つことが証明できたので、動脈硬化予防・抑制万能対応型機能性食品として開発されることが期待できる。
【００２８】
また、本発明の低分子量水溶性エラスチンは、後述のごとく、コレステロールの上昇抑制、中性脂肪の上昇抑制、LDL-コレステロール（悪玉コレステロール）の上昇抑制
、HDL-コレステロール（善玉コレステロール）の低下抑制、過酸化脂質の上昇抑制、酸化LDLの上昇抑制などの血中脂質代謝異常の改善作用、血栓形成の抑制作用、及び血管内腔表面の硬化病変（硬化プラーク）抑制作用や血管弾性機能の低下抑制作用等の生理作用を有する。従って、本発明の低分子量水溶性エラスチンは、それを有効成分とする色々な治療又は予防用医薬、例えば、動脈硬化抑制剤、脂質代謝異常改善剤、血栓形成抑制剤等の医薬としても開発が期待できる。
【００２９】
本発明の低分子量水溶性エラスチンを食品又は医薬として用いる場合には、それを有効成分として含むものであれば良く、生体に有用な金属、例えば、マグネシウム、カルシウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、アルミニウム、亜鉛などのアルカリ土類金属や遷移金属を併用しても良い。用いる金属によっては、相乗的に効果が得られる。
【００３０】
本発明において機能性食品は、その形態は特に限定されるものではなく、分子量が約1〜３万の低分子量水溶性エラスチンをそのまま飲食品として調製したもの、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類等を更に配合したもの、液状、半液体状若しくは固体状にしたもの、一般の飲食品へ添加したものであってもよい。また、食品とは、健康食品、健康補助食品、特定保健用食品等を広く含む意味で用いられる。そして、本発明の機能性食品は、血中脂質代謝異常の改善や血管内腔表面の硬化抑制効果、血管弾性機能の低下抑制効果が期待できるので、動脈硬化予防・抑制万能対応型の機能性食品として提供することができる。
【００３１】
本発明において医薬は、有効成分である分子量が約1〜３万の低分子量水溶性エラスチンと、薬学上許容される添加物とを混合することにより製造できる。本発明の医薬は、経口投与または非経口投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、注射剤や点滴剤が挙げられる。これらの製剤は、製剤分野で通常行われている手段・方法により、薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。
【００３２】
本発明の機能性食品の摂取量は、成人１人１日当たり、エラスチン換算で３０〜６０００ｍｇ、好ましくは６０〜３０００ｍｇが適当である。また、医薬として投与する場合は、被投与者の年齢、体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存するが、例えば、本発明の有効成分を医薬として経口投与する場合は、成人１人当たり０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【実施例１】
【００３３】
［水溶性エラスチンの製造］
動物性生体組織として牛の項靱帯を用い、付着している脂肪や筋肉などエラスチン含量の低い部分を刃物などを用いて削ぎ落とし、動物性生体組織をホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ホモジナイズした動物性生体組織を、沸騰水中で１時間、脱脂のための煮沸を行い、その後水切りした。なお、この脱脂工程は複数回行っても良く、また脱脂効率を良くするためには、希薄アルカリ溶液処理あるいは有機溶媒処理を行っても良い。
【００３４】
容器にホモジナイズして脱脂した動物性生体組織を入れ、その動物性生体組織の重量に対して１０倍容量（重量１ｇ当たり１０ｍｌ）の１Ｍ塩化ナトリウム水溶液を加えて浸漬し、４℃で２４時間攪拌した。なお、この不要なタンパク質を除去するための浸漬処理は、必ずしも必要ではなく、また、必要によっては複数回行っても良い。
【００３５】
浸漬処理を経た動物性生体組織を１０倍容量の０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液に入れ、１００℃で１５分間攪拌し、コラーゲン除去処理を行った。次いで、動物性生体組織とアルカリ性溶液とを分離し、純粋な不溶性エラスチンを得た。なお、分離したアルカリ性溶液を、例えば、ビューレット法にて総タンパク質の定量を行い、アルカリ性溶液中に含まれる総タンパク質量が０．１ｍｇ/ｍＬ以下であれば、コラーゲンは除かれたと判断した。コラーゲンが除かれていない場合は、この操作を複数回行なえば良い。
【００３６】
次に、不溶性エラスチンの重量に対して１０倍容量の０．２５Ｍのシュウ酸（可溶化液）を加え、１００℃で６０分間攪拌することで不溶性エラスチンを断片化し、可溶化液に水溶性エラスチンを遊離・溶解させた。その後、不溶性エラスチンと可溶化液とを分離し、分離した可溶化液を２５℃以下に冷却した。かかる操作によって、可溶化液の反応性を低下させ、可溶化液中に遊離して溶解した水溶性エラスチンの細断化を防ぐことができる。不溶性エラスチンが残存している場合には、この操作を繰り返すことによって、不溶性エラスチンの可溶化を行うことができる。
【００３７】
［高分子量エラスチンと低分子量エラスチンの製造］
次に、水溶性エラスチンが溶解している可溶化液のｐＨを６〜７に調整して、４〜１０℃で９６時間（２４時間ごとに透析膜外の水を入れ替えて）以上水に対して透析を行い、水溶性エラスチンの精製を行った。その後、透析した水溶性エラスチンは、水溶液の温度を３０〜５０℃とすることによって、相分離を行い、２層に分離した。上層画分からは低分子量（分子量約１〜３万）水溶性エラスチンを回収し、下層画分からは高分子量（分子量約３〜３０万）水溶性エラスチンを回収した。水溶液の温度を３０〜４０℃に設定すれば、低分子量水溶性エラスチンの回収率を高めることができ、水溶液の温度を４０〜５０℃に設定すれば、高分子量水溶性エラスチンの回収率を高めることができる。また、水溶性エラスチンの等電点付近のｐＨであるｐＨ３〜ｐＨ７、望ましくは、ｐＨ４〜ｐＨ６に調整して行えば、高分子量の水溶性エラスチンの回収率を高めることができる。かかる相分離の操作で、水溶性エラスチンを基準として、低分子量画分が２０〜５０％、高分子量画分が１０〜３０％回収できる。そして、牛の項靱帯を基準にすると、低分子量水溶性エラスチンの収率は２〜４％で、高分子量水溶性エラスチンの収率は１〜２％である。
【００３８】
相分離後の上層画分と下層画分は非還元条件下でSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)-PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行い、泳動後のゲルを染色して、その染色バンドから、上層画分は分子量約１〜３万の低分子量水溶性エラスチンであることが確認され、下層画分は分子量約３〜３０万の高分子量水溶性エラスチンであることが確認された。
【００３９】
低分子量水溶性エラスチンと高分子量水溶性エラスチンのアミノ酸組成は、表１に示した通りであった。表１のアミノ酸組成は、総アミノ酸数を１０００としたときのアミノ酸組成を示す。また、低分子量とは、分子量約１〜３万の低分子量水溶性エラスチンを、高分子量とは、分子量約３〜３０万の高分子量水溶性エラスチンを示す。なお、ヒスチジンの含量は、本発明では、アミノ酸１０００残基当たり０．４〜０．５程度であるが、表１では四捨五入により０とされている。
【００４０】
【表１】
2007045722.tif 000002
【実施例２】
【００４１】
［水溶性エラスチンの製造］
前処理工程として、動物性生体組織は牛の項靱帯を用い、付着している脂肪や筋肉などエラスチン含量の低い部分を、刃物などを用いて削ぎ落とすことで不要部分の除去処理を行い、次いで、動物性生体組織をホモジナイザーを用いてホモジナイズすることで細断処理を行った。ホモジナイズした動物性生体組織を、沸騰水中で１時間、脱脂のための煮沸を行い、その後水切りした。
【００４２】
ホモジナイズして脱脂した動物性生体組織の重量に対して１０倍容量（重量１ｇ当たり１０ｍｌ）の０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加え、１００℃で１５分間攪拌し、エラスチン以外のコラーゲンや不要タンパク質を除去する工程を行った。そして、動物性生体組織とアルカリ性溶液とを分離した。分離したアルカリ性溶液を、例えば、ビューレット法にて総タンパク質の定量を行い、アルカリ性溶液中に含まれる総タンパク質量が０．１ｍｇ/ｍＬ以下であれば、コラーゲン及び不要タンパク質は除かれたと判断した。コラーゲン及び不要タンパク質が除かれていない場合はこの操作を複数回行えば良い。
【００４３】
次いで、上記で得られた動物性生体組織の重量に対して１０倍容量（重量１ｇ当たり１０ｍｌ）の０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（可溶化液）を加え、１００℃で６０分間アルカリ溶解工程を行った。その後、動物性生体組織とアルカリ性溶液との分離操作を行い、水溶性エラスチンの可溶化溶液を得た（濾液回収工程）。この際、動物性生体組織が残存している場合には、この濾液回収工程は複数回行っても良い。
【００４４】
［高分子量エラスチンと低分子量エラスチンの製造］
次に、水溶性エラスチンを含む可溶化液を、中性付近のｐＨ６〜７で、４〜１０℃の温度で９６時間（２４時間ごとに透析膜外の水を入れ替えて）以上水に対して透析した。その後、透析して得られた液は、水溶液の温度を３０〜５０℃とすることによって、相分離を行い、２層に分離した。上層画分からは低分子量（分子量１〜３万）水溶性エラスチンを回収し、下層画分からは高分子量（分子量３〜３０万）水溶性エラスチンを回収した。水溶液の温度を３０〜４０℃に設定すれば、低分子量水溶性エラスチンの回収率を高めることができ、水溶液の温度を４０〜５０℃に設定すれば、高分子量水溶性エラスチンの回収率を高めることができる。また、水溶性エラスチンの等電点付近のｐＨであるｐＨ３〜ｐＨ７、望ましくは、ｐＨ４〜ｐＨ６に調整して行えば、高分子量の水溶性エラスチンの回収率を高めることができる。かかる相分離の操作で、水溶性エラスチンを基準にして、低分子量画分が５０〜７０％、高分子量画分が２０〜３０％回収できる。これは、牛の項靱帯を基準にすると、低分子量水溶性エラスチンの収率は４〜１２％で、高分子量水溶性エラスチンの収率は２〜５％である。得られた水溶性エラスチンを、再生医療用の組織培養基材等として利用する場合は、組織培養は３５℃〜４０℃で行うことが多いので、４０℃以下でコアセルベーションを起こす高分子量水溶性エラスチンを効率良く回収するのが望ましい。
【００４５】
相分離後の上層画分と下層画分は非還元条件下でSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)-PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行い、泳動後のゲルを染色して、その染色バンドから、上層画分は分子量約１〜３万の低分子量水溶性エラスチンであることが確認され、下層画分は分子量約３〜３０万の高分子量水溶性エラスチンであることが確認された。
【００４６】
低分子量水溶性エラスチンと高分子量水溶性エラスチンのアミノ酸組成は、表２に示した通りであった。表２のアミノ酸組成は、総アミノ酸数を１０００としたときのアミノ酸組成を示す。また、低分子量とは、分子量約１〜３万の低分子量水溶性エラスチンを、高分子量とは、分子量約３〜３０万の高分子量水溶性エラスチンを示す。なお、ヒスチジンの含量は、本発明では、アミノ酸１０００残基当たり０．４〜０．５程度であるが、表２では四捨五入により０とされている。
【００４７】
【表２】
2007045722.tif 000003
【実施例３】
【００４８】
本実施例では、実施例１及び２で得られた低分子量水溶性エラスチンの生理作用について説明する。
［血中脂質代謝異常の改善作用］
０．５％コレステロールを負荷して実験的に動脈硬化モデル家兎を作成し、これに低分子量水溶性エラスチンを経口投与して、動脈硬化抑制効果と血中脂質代謝異常の改善効果を検証した。ニュージーランドホワイト雄性家兎（体重約２ｋｇ）１２羽を、４羽ずつコントロール群、コレステロール群、コレステロール群+エラスチン併用群の3群に分け、コントロール群には普通食（ORC4：オリエンタル酵母社製）を９０ｇ／日与え、コレステロール群にはコレステロール食（ORC4＋０．５％コレステロール）を９０ｇ／日与え、コレステロール群+エラスチン併用群にはコレステロール+エラスチン併用食（ORC4＋０．５％コレステロール＋０．１〜０．５％エラスチン）を９０ｇ／日与えた。所定期間後に採血し各種の検査を行った。エラスチンは本発明の低分子量水溶性エラスチンを用いた。
【００４９】
血清中の総コレステロールの変化を図１に、ＬＤＬ−コレステロールの変化を図２に、ＨＤＬ−コレステロールの変化を図３に、トリグリセレドの変化を図４に、過酸化脂質の変化を図５に示した。これらの結果から、コレステロール群で認められる血中脂質代謝異常は、コレステロール群+エラスチン併用群では改善されていることが分かる。即ち、本発明の低分子量水溶性エラスチンは、血中の総コレステロールを減少させる効果があるが、その内容をみると、いわゆる悪玉のＬＤＬ−コレステロールは減少させる一方、いわゆる善玉のＨＤＬ−コレステロールは増加させていることが分かる。また、トリグリセリドや過酸化脂質も減少させる効果があることが分かる。
【００５０】
この結果、本発明の低分子量水溶性エラスチンは、血中脂質代謝異常の改善作用、ひいては、動脈硬化抑制作用のある機能性食品素材として、また血中脂質代謝異常の改善、ひいては、動脈硬化抑制作用のある医薬としての可能性があることが分かる。
【００５１】
[動脈硬化あるいは血管弾性機能低下の改善]
実験に用いた家兎の大動脈の近位部（心臓側）を５ｍｍの幅で切断し、その試験片の両端を挟んで一定速度V=０．０１ｍｍ／ｓで伸展させ、ひずみ０から０．１の範囲での平均の縦弾性係数を求め、それをElastic Modulusとして、普通食を投与したコントロール群、コレステロール食を投与したコレステロール群、コレステロール食と同時に水溶性エラスチンを投与したコレステロール+エラスチン併用群で比較検討した。その結果は図６に示した通りであり、水溶性エラスチンの投与により血管の弾性機能の低下が回復していることが分かる。
【００５２】
［アテローム性プラークの血管病変の抑制作用］
図７には、血管の血流側の内膜表面の写真を示した。コレステロール食を投与したコレステロール群ではアテローム性プラーク（血管内膜が肥厚し脂質（コレステロールなど）が沈着して粥状物を生じ、線維性の被膜で内膜表面が覆われた隆起状態。この状態が進行すると増々大きな隆起状態になって血液の流れが妨げられるようになり、冠動脈などの非常に細い血管では血管の閉塞がみられ、心筋梗塞を発症する）が内膜表面全体（隆起して白くみえる）に認められる。コレステロール食と同時に水溶性エラスチンを投与したコレステロール+エラスチン併用群ではアテローム性プラークが内膜表面にまばらにわずかに認められる。即ち、水溶性エラスチンを投与するとアテローム性プラーク等の血管病変が抑制されることがこの3枚の写真から分かる。
【００５３】
［血栓形成抑制作用］
血中では血小板が凝集すると血栓が形成される。そこで試験管内で、水溶性エラスチンによる血小板凝集阻害実験を行った。低分子量水溶性エラスチンはADP（アデノシン-5´-ニリン酸）、トロンビン、コラーゲンによる血小板凝集を阻害したが、なかでもコラーゲンによる血小板凝集を最も強く阻害した。結果は図８に示した。
【００５４】
［血液の粘性］
血液中でコレステロール等の脂質濃度が高くなったり、血小板が粘着・凝集したりすると、血液粘性が増し、ドロドロになるので、血液中の粘性(Viscosity)を測定した。結果は図９に示した。コレステロールの投与で上昇する血液粘性が水溶性エラスチン投与により改善していることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明によると、低分子量で純度の高い水溶性エラスチンと、高分子量で純度の高い水溶性エラスチンが得られる。そして、本発明の低分子量の水溶性エラスチンは、消化吸収性が高いので、機能性食品や各種医薬品として利用できる。また、高分子量のエラスチンは、再生医療のための組織工学用足場への応用や、高分子量水溶性エラスチンのコアセルベートは６０〜７０％の水分を含むので、保湿性のための化粧品基材への応用が考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】血清中の総コレステロールの変化を示す図。
【図２】ＬＤＬ−コレステロールの変化を示す図。
【図３】ＨＤＬ−コレステロールの変化を示す図。
【図４】トリグリセレドの変化を示す図。
【図５】過酸化脂質の変化を示す図。
【図６】血管の弾性係数の変化を示す図。
【図７】血管の血流側の内膜表面の状態を示す図。
【図８】血小板凝集抑制作用を示す図。
【図９】血液中の粘性を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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