(57)【要約】【課題】ポリマプローブを設計して、プローブ合成の統合性を照合する技術を提供する。【解決手段】同一の配列を有しながらも、少なくとも一つの異なったモノマ付加サイクルを含んで形成されるように、複数のプローブを設計する。対照標的に対するプローブの親和性に基づいて、プローブ合成の変動（例えば、エラー）を同定する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のステップを含む製造工程を照合する方法において、
前記製造工程から、第一の照合用オブジェクトを生成するための第一の複数ステップを選択する工程と、
前記製造工程から、第二の照合用オブジェクトを生成するための第二の複数ステップを選択する工程と
を備え、
前記第二の照合用オブジェクトは、前記第一の照合用オブジェクトと同一であり、前記第二の複数ステップは、前記第一の複数ステップと、少なくとも一つのステップ分異なっていることを特徴とする製造工程の照合方法。
【請求項２】
前記第一の照合用オブジェクトと前記第二の照合用オブジェクトが、同一の構造を有している、ことを特徴とする請求項１記載の照合方法。
【請求項３】
前記第一の照合用オブジェクト及び前記第二の照合用オブジェクトが、ポリマプローブ、機械デバイス、あるいは、電子回路である、ことを特徴とする請求項１または２記載の照合方法。
【請求項４】
ポリマプローブを設計する方法において、
複数のモノマから成る対照配列を準備する工程と、
複数のモノマから成る同一の配列を有し、前記対照配列に結合可能であり、かつ、ポリマプローブの統合性を照合可能なように、少なくとも一つの異なったモノマ付加サイクルを用いて形成される複数のポリマプローブを設計する工程と
を備えることを特徴とするポリマプローブ設計方法。
【請求項５】
前記ポリマプローブの各々が、モノマ付加サイクルのリストとして表わされることを特徴とする請求項４記載のポリマプローブ設計方法。
【請求項６】
請求項５記載のポリマプローブ設計方法であって、
前記ポリマプローブを設計する工程は、
重みづけされた有向非環状グラフを用いて最短経路を求め、複数のモノマからなる同一の配列を有するポリマプローブを合成するためのモノマサイクルリストを形成する工程と、
行列を用いてサイクルの相違を増大させる工程と
を備えることを特徴とする設計方法。
【請求項７】
最短経路を求めることにより形成されたモノマ付加サイクルのリストが望ましくない場合には、望ましくないモノマ付加サイクルのリストを避けるように、重みづけされた有向非環状グラフ上の重みを調整することを特徴とする請求項６記載のポリマプローブ設計方法。
【請求項８】
ポリマプローブを基板に結合させることを特徴とする請求項４ないし請求項７のいずれかに記載のポリマプローブ設計方法。
【請求項９】
ポリマプローブを設計するためのコンピュータプログラム製品において、
複数のモノマから成る対照配列を入力するコンピュータコードと、
複数のモノマから成る同一の配列を有し、前記対照配列に結合可能であり、かつ、ポリマプローブの統合性を照合可能なように、少なくとも一つの異なったモノマ付加サイクルを用いて形成される複数のポリマプローブを設計するコンピュータコードと、
上記コンピュータコードを格納するコンピュータ読み取り可能な媒体と
を備えることを特徴とするコンピュータプログラム製品。
【請求項１０】
請求項９記載のコンピュータプログラム製品であって、
前記コンピュータ読み取り可能な媒体が、フレキシブルディスク、テープ、フラッシュメモリ、システムメモリ、ハードディスクドライブ、並びに、搬送波の形態で実現されるデータ信号から選択されることを特徴とするコンピュータプログラム製品。
【請求項１１】
ポリマプローブが結合した基質において、
異種のポリマプローブが結合した基質上の複数の領域と、
同一の配列を有する複数のポリマプローブで、複数のモノマから成る対照配列に結合可能であり、かつ、ポリマプローブの統合性を照合可能なように、少なくとも一つの異なったモノマ付加サイクルを用いて形成される複数のポリマプローブが結合した基質上の複数の領域と
を備えることを特徴とする基質。
【請求項１２】
前記複数の領域が基質の中心近傍に存在することを特徴とする請求項１１記載の基質。
【請求項１３】
前記複数の領域が、基質上で市松模様に配置されることを特徴とする請求項１１または１２のいずれかに記載の基質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマプローブ等のポリマの合成の照合技術に関する。更に詳しくいえば、本発明は、同一の配列を有しながらも、プローブの統合性を照合可能なように少なくとも一つの異なったモノマ付加サイクルを用いて形成される複数のポリマプローブを設計する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
チップあるいは基質上に試料のアレイを形成し、これを利用するための装置並びにコンピュータシステムが知られている。例えば、国際公開番号ＷＯ９２／１０５８８並びに９５／１１９９５には、核酸等の試料の配列決定あるいは配列検査に用いられる技術が開示されている。このような操作を実行するためのアレイを、例えば、米国特許第５，４４５，９３４号、５，３８４、２６１号、あるいは５，５７１，６３９号に開示された先駆的技術を用いた方法に従って形成するようにしてもよい。
【０００３】
前記引例に開示された技術を用いて、核酸プローブのアレイをチップ上の特定の位置に形成する。標識された核酸をチップと反応させた後、スキャナを用いて、標識された核酸がチップ上のいずれの場所に結合したかを示す画像ファイルを生成する。この画像ファイル並びに所定の位置でのプローブの同定に基づいて、ヌクレオチドやＤＮＡあるいはＲＮＡのモノマ配列等の情報を得ることができる。このようなシステムを用いて、例えば、遺伝病、癌、感染症、エイズ等の遺伝的特性に関係する突然変異の研究・検出に利用可能なＤＮＡアレイを形成することができる。
【０００４】
また、ＶＬＳＩＰＳ（商標）技術を利用することにより、非常に小さなチップ上に非常に大きなオリゴヌクレオチドプローブのアレイを形成することができる。この方法に関しては、米国特許第５，１４３，８５４号、国際公開番号ＷＯ９０／１５０７０並びに９２／１００９２に開示ざれている。ＤＮＡプローブアレイ上のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、対象となる核酸試料（以下、「標的」核酸）に含まれる相補的核酸配列を検出することができる。
【０００５】
配列検査を目的とする場合には、所定の標的核酸配列をチップ上に形成する。例えば、標的配列と完全に相補的なプローブ、並びに、標的配列と一つの塩基だけ異なっているプローブをチップ上に形成する。新しい配列の決定を目的とする場合には、所定の長さの全ての可能なプローブをチップ上に形成する。この場合、セルの行列の形態でチップ上にプローブを配列し、各セルが所定のプローブの複製を複数含むようにする。更に、プローブをまったく含まない「ブランク」セルがチップ上に存在するようにしてもよい。ブランクセルにはプローブが含まれないので、標識された標的はチップのこの領域には結合しない。このため、ブランクセルを用いてバックグラウンド強度を測定することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
チップを合成する光リソグラフィ装置は非常に正確であるが、製造工程で変動が生じることがある。例えば、ある化学薬品が加えられなかったり、洗浄ステップを抜かしたり、濃度が正確でなかったり、タイミングが間違っていたり、間違ったマスクが使われたり、正しいマスクでも配置が間違っている等の場合に、エラーが起こり得る。エラーの多くは、チップ上の限られた少数のプローブにしか影響を与えないため、全てのエラーを検出することは大変困難である。厳密な品質管理のためには、例えば、チップが顧客に出荷される前に製造工程の変動を検出することが望ましい。更に、エラーの原因を探して、それを補正することが望ましい。
【０００７】
本発明は、ポリマプローブを設計して、プローブ合成の統合性を照合するための革新的な技術を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、少なくとも一つの異なったモノマ付加サイクルを利用してプローブを形成するように、同一の配列を有する複数のプローブを設計する。対照標的あるいは配列に対するプローブの親和性に基づいて、プローブ合成の変動（例えば、エラー）を同定する。本発明のいくつかの態様を以下に説明する。
【０００９】
本発明の一つの態様は、ポリマプローブを設計する方法である。複数のモノマから成る対照配列を準備して、複数のモノマからなる同一の配列を有し、対照配列と結合可能な複数のポリマプローブを設計する。ポリマプローブの統合性を照合可能なように、少なくとも一つの異なったモノマ付加サイクルを用いてプローブを形成する。望ましい例として、プローブは、基板に結合するヌクレオチド配列である。
【００１０】
本発明の別の態様は、ポリマプローブが結合した基質である。前記基質は、異種のポリマプローブ（即ち、異なった配列）を含む複数の領域を有する。前記基質は、更に、同一の配列を有するプローブが結合した複数の領域を含む。同一の配列を有するポリマプローブは、複数のモノマから成る対照配列に結合可能であり、少なくとも一つの異なったモノマ付加サイクルを用いて形成される。これにより、基質上のポリマプローブの統合性を照合することが可能になる。
【００１１】
本発明の更に別の態様は、プローブ合成を照合する方法である。複数のモノマからなる同一配列を有するポリマプローブに対して、複数のモノマから成る対照配列を結合させる場合のハイブリッド形成親和性に関する情報を入力する。ハイブリッド形成親和性に関する情報を解析して、ポリマプローブの合成に際してエラーが生じたかどうかを判定する。この場合、プローブ合成が受け入れ可能であるか、あるいは、受け入れ不能であるかを示すような判定も望ましい。
【００１２】
本発明のまた別の態様は、複数のステップを含む製造工程を照合する方法である。前記製造工程から、第一の照合用オブジェクトを生成するための第一の複数ステップを選択し、さらに、前記製造工程から、第二の照合用オブジェクトを生成するための第二の複数ステップを選択する。第二の照合用オブジェクトは、第一の照合用オブジェクトと同一であり、また、第二の複数ステップは、第一の複数ステップと、少なくとも一つのステップ分異なっている。第一の照合用オブジェクトと第二の照合用オブジェクトとが同一の構成を有し、及び／あるいは、これらの照合オブジェクトがポリマプローブ、機械デバイス、あるいは電子回路の何れかでもよい。
【００１３】
本発明の更に別の態様は、複数のステップを含む製造工程を照合する方法である。複数の照合オブジェクトに関する構造情報を入力する。ここで、各照合オブジェクトは、同一の構成を有し、照合オブジェクトを製造するために用いられる製造工程の少なくとも一つのステップ分、他の照合オブジェクトとは異なっている。構造情報を解析して、複数の照合オブジェクトの合成の際にエラーが生じたかどうかを判定する。
【００１４】
本発明の他の特徴や利点は、付帯する図面に関連する以下の詳細な説明により、明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
Ａ．概要：
以下、好適な実施例を参照して、本発明を詳述する。実施例として、ＶＬＳＩＰＳ（商標）技術を利用して、チップ上にオリゴヌクレオチドプローブの非常に大きなアレイを形成する実施形態を説明する。ただし、本発明はこの技術に限定されるものではなく、他の製造工程にも好適に適用可能である。また、以下の説明では、所定のポリマプローブを照合オブジェクトとして用いて、ポリマプローブを形成する合成工程の統合性が評価される。しかし、製造工程で生成されるオブジェクトは、ポリマプローブに限定されるものではなく、機械デバイス、電子回路等を含む他の技術分野にも好適に適用可能である。すなわち、以下の実施例の説明は、本発明を例示するものに過ぎず、何ら本発明を限定するものではない。
【００１６】
図１は、本発明の実施例のソフトウェアを実行するために利用可能なコンピュータシステムの一例を示す説明図である。図１に示すコンピュータシステム１は、ディスプレイ３と、スクリーン５と、キャビネット７と、キーボード９と、マウス１１とを備える。マウス１１は、ＧＵＩ（グラフィカルユーザインターフェース）との対話処理を可能にする一つあるいは複数のボタンを有する。キャビネット７には、ＣＤ−ＲＯＭドライブ１３と、システムメモリ並びにハードディスクドライブ（図２参照）とが収容され、これらのドライブやメモリは、本発明を実行するコンピュータコードを組み込んだソフトウェアプログラムや本発明で用いられるデータ等の格納並びに検索に用いられる。ここでは、ＣＤ−ＲＯＭ１５をコンピュータ読み取り可能な記憶媒体の例として示したが、フレキシブルディスク、テープ、フラッシュメモリ、システムメモリ、ハードディスクドライブ等、他のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を用いてもよい。さらに、（例えば、インターネット等のネットワークにおいて）搬送波の形態で実現されるデータ信号を、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体として用いることもできる。
【００１７】
図２は、本発明の実施例のソフトウェアを実行するために用いられるコンピュータシステム１を示すシステムブロック図である。図１に示したように、コンピュータシステム１は、ディスプレイ３と、キーボード９と、マウス１１とを備える。コンピュータシステム１は、更に、中央処理装置５１、システムメモリ５３、固定記憶装置５５（例えば、ハードディスクドライブ）、可動記憶装置５７（例えば、ＣＤ−ＲＯＭドライブ）、ディスプレイアダプタ５９、サウンドカード６１、スピーカ６３、ネットワークインターフェース６５等のサブシステムを備える。ただし、本発明で用いられるコンピュータシステムにおいては、これらのサブシステムの内いくつかを省略してもよいし、あるいは、他のサブシステムを追加する形態でもよい。例えば、コンピュータシステムに、二つ以上の中央処理装置５１を備えた、いわゆる多重プロセッサシステムにキャッシュメモリを備えるようにしてもよい。
【００１８】
コンピュータシステム１のシステムバスアーキテクチャを矢印６７で示す。ただし、これらの矢印は、サブシステムの接続に用いられる任意の相互接続スキームを例示したものに過ぎない。例えば、ローカルバスを用いて、中央処理装置をシステムメモリやディスプレイアダプタに接続するようにしてもよい。図２に示すコンピュータシステム１は、本発明で好適に用いられるコンピュータシステムの一例を示すものに過ぎない。異なった構成のサブシステムを備える他のコンピュータアーキテクチャも同様に利用可能である。
【００１９】
以下、具体例として、チップマスクを設計し、チップ上でプローブを合成し、核酸を標識して、ハイブリッド形成された核酸プローブを走査するコンピュータシステムの一部としての本発明について説明する。このようなシステムに関しては、米国特許第５，５７１，６３９号に詳述されている。ただし、本発明を全体システムとは別個に用いて、このようなシステムによって生成されたデータを解析するようにしてもよい。
【００２０】
図３にＲＮＡやＤＮＡ等の生物学的試料のアレイを形成して、これを解析するコンピュータ化されたシステムを示す。コンピュータ１００を用いて、ＲＮＡやＤＮＡ等の生物学的ポリマのアレイを設計する。コンピュータ１００は、例えば、適切にプログラミングされたサンワークステーションでもよいし、あるいは、図１並びに図２に示したように適切なメモリやＣＰＵを備えるＩＢＭのＰＣ互換機等、他のパーソナルコンピュータやワークステーションでもよい。コンピュータ１００には、対象遺伝子の特性に関するユーザからの情報やアレイの所望の特徴に関する情報が入力される。あるいは、ＧｅｎＢａｎｋ等の外部あるいは内部データベース１０２から、対象となる所定の遺伝子配列に関する情報をコンピュータシステムに入力するようにしてもよい。コンピュータ１００は、例えば、国際公開番号ＷＯ９２／１００９２に記載されるようなスイッチマトリックスの形態のチップ設計コンピュータファイル１０４や他の関連コンピュータファイルの集合を出力する。
【００２１】
システム１０６は、このチップ設計ファイルの入力を受けて、ＤＮＡ等の分子のアレイを形成する際に用いられるリソグラフィ用マスクを設計する。システム（あるいはプロセス）１０６に、マスク１１０を製造するために必要なハードウェアや、効率よくマスク上にマスクパターンを展開するために必要なコンピュータハードウェア並びにソフトウェア１０８を備えるようにしてもよい。図３に示す他の装置に関しては、図示の都合上一緒に表示してあるが、別の物理的構成を採ってもよい。システム１０６は、マスク１１０あるいはポリマアレイの形成に用いられるクロム含有グラスマスク等の他の合成パターンを生成する。
【００２２】
マスク１１０は、コンピュータ１００から入力されたチップ設計に関する所定の情報と同様、合成システム１１２で用いられる。合成システム１１２は、基質あるいはチップ１１４上にポリマアレイを形成するために必要なハードウェア並びにソフトウェアを備える。例えば、合成システム１１２は、光源１１６と、基質あるいはチップ１１４が載置されるケミカルフローセル１１８とを備える。光源と基質あるいはチップの間にマスク１１０を置き、適当な回数、光源とチップを相対的に移動させることにより、チップの所定領域をデプロテクション処理する。所定の化学薬品をケミカルフローセル１１８に流して、デプロテクション処理した領域に結合させるとともに、洗浄等の処理を行う。これら一連の処理をすべて、適当にプログラミングされたコンピュータ１１９で制御するような構成が望ましい。この場合、コンピュータ１１９は、マスク設計およびマスク形成に用いられるコンピュータと同一のものでもよいし、異なったものでもよい。
【００２３】
合成システム１１２により形成された基質をさらに小さなチップに分割してから、標識された標的と反応させるようにしてもよい。この場合、標的が、基質上の分子の一つあるいは複数に対して相補的でもよく、非相補的でもよい。標的を、フルオレセイン等の標識物質（図３に＊で示す）で標識した後、走査システム１２０内に設置する。本実施例ではフルオレセインを標識物質として用いるが、放射線強度、光散乱、屈折率、導電率、エレクトロルミネセンス、等の高分子検出データが様々に異なっている他の標識物質を用いてもよい。従って、本発明は、ハイブリッド形成の蛍光測定値の解析に限定されるものではなく、他のハイブリッド形成の測定値の解析にも容易に適用可能である。
【００２４】
走査システム１２０が実行する処理は、適当にプログラミングされたデジタルコンピュータ１２２により制御される。この場合、デジタルコンピュータ１２２は、合成、マスク形成、およびマスク設計に用いられたコンピュータと同一のものでもよいし、異なったものでもよい。スキャナなどの走査システム１２０は、共焦点顕微鏡やＣＣＤ（電荷結合素子）等の検出装置１２４を備え、この検出装置１２４を用いて、標識された標的（＊）が基質に結合した位置を検出する。スキャナなどの走査システム１２０は画像ファイル１２４を出力する。例えば、フルオレセイン標識された標的の場合、画像ファイル１２４は、基質上の位置を示す関数として、蛍光強度（フォトン数あるいは電圧等、他の関係する測定値）を表わす。標識された標的が（基質上のＤＮＡプローブ等の）ポリマアレイとより強固に結合している部分ほど、計測されるフォトン数が高くなり、また、基質上に存在するポリマのモノマ配列が位置の関数として与えられるので、標的に対して相補的な、基質上のポリマ配列を決定することができる。
【００２５】
画像ファイル１２４は、本発明の合成統合性評価技術を組み込んだ解析システム１２６に入力される。この場合にも、解析システム１２６が種々のコンピュータシステムのいずれで構成されていてもよく、例えば、ＷＩＮＤＯＷＳ−ＮＴのワークステーション等が好適に用いられる。解析システムは、入力された画像ファイルを解析して、適当な出力１２８を実行する。例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等の標的に含まれる所定の突然変異の同定結果が出力される。
【００２６】
図４は、特定の標的ＤＮＡがＤＮＡプローブのアレイ１１４に結合する様子を示す。この簡単な例では、例えば、以下のようなプローブがアレイ中に形成されている。
３’−ＡＧＡＡＣＧＴ
ＡＧＡＣＣＧＴ
ＡＧＡＧＣＧＴ
ＡＧＡＴＣＧＴ
図示するように、フルオレセインで標識された（あるいは他の方法で標識された）標的５−ＴＣＴＴＧＣＡをアレイと反応させた場合、この標的はプローブ３’−ＡＧＡＡＣＧＴにのみ相補的であり、３’−ＡＧＡＡＣＧＴが位置するチップ表面上で主にフルオレセインが検出される。チップには、所定プローブの複製を複数有するセルが含まれるが、各セルを、例えば、チップ上の方形領域としてもよい。
【００２７】
図５は、プローブを合成する際のモノマ付加サイクルの概要を示すフローチャートである。モノマの付加は、通常複数回のステップで行われ、所望のプローブが合成されるまで何度も繰り返される。本明細書で用いられる「モノマ付加サイクル」（あるいは単に「サイクル」）という言葉は、所定のモノマを一つあるいは複数のプローブに結合させるために実行されるステップを意味する。図５は、モノマ付加サイクルの代表的なフローチャートを示すものに過ぎず、本明細書に開示される他のフローチャートと同様に、サイクルのステップを省略したり、追加したり、あるいは、別のステップを用いる等、様々な変更が可能であり、何ら本発明をこの構成に限定するものではない。
【００２８】
まず、ステップ２０１でマスクを選択する。マスクには、通常、光を選択的に透過させる光リソグラフィ用の部材が用いられる。例えば、ある領域が不透明であり、別の領域が比較的透明であるような部材を用いる。マスクを透過した光は、チップ上の所定の領域においてプローブをデプロテクト処理して、更にモノマ結合を進める。また、遮光を利用する技術にも、本発明は容易に適用可能である。
【００２９】
次に、ステップ２０３で、選択したマスクをチップ上に配置して、ステップ２０５で、チップを透過した光をチップの所定領域に照射する（デプロテクション）。
【００３０】
次のステップ２０７で、ヌクレオシドホスホルアミダイト活性化を実行することにより、モノマをチップ上の所定のプローブと化学的に結合させる。ステップ２０７が、アミダイト供給、賦活物質供給、酸化剤供給、洗浄等、多くのステップを含むようにしてもよい。
【００３１】
チップの製造工程では、モノマ付加サイクルが数十回ないし数百回繰り返される。製造工程は非常に正確に実行されるが、それでも一つあるいは複数のエラーが起こる可能性はある。エラーが生じても、そのエラーが影響を及ぼす範囲は、通常、チップ上の限られた数のプローブのみである。従って、エラーが生じたか否かを判定することは難しく、エラーの種類を特定し、将来問題を生じさせる可能性があるか否かを判定することは更に困難である。
【００３２】
Ｂ．合成統合性の評価：
チップ上に所望のプローブを形成するためには、通常、少なくとも数十回のモノマ付加サイクルが必要となる。本発明は、ポリマプローブを設計して、プローブの統合性を照合する技術を提供するものである。本明細書中で用いられる「ポリマ」という言葉は、オリゴマーを含む、複数のモノマから成る配列を意味する。少なくとも一つの異なったモノマ付加サイクルを利用してプローブが形成されるように、同一の配列を有する複数のプローブを設計することが望ましい。対照配列に対するプローブの親和性に基づいて、プローブ合成の変動（例えば、エラー）を同定する。
【００３３】
Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔのサイクルを繰り返して、所望のプローブをチップ上で合成する場合を考える。このとき、同一のプローブを形成可能なサイクルの組み合わせが、多数存在する。例えば、Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ，Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔという八回のモノマ付加サイクルでチップ上にプローブを合成し、チップ上で合成される所望のプローブを３’−ＡＣＧＴであると仮定する。この場合、以下に示すように、多数の異なったサイクルにより所望のプローブを形成可能である。
ＡＣＧＴＡＣＧＴ  （サイクル）
ＡＣＧＴ          （プローブ１）
ＡＣ        ＧＴ  （プローブ２）
ＡＣＧＴ  （プローブ３）
ＡＣＧ        Ｔ  （プローブ４）
Ａ        ＣＧＴ  （プローブ５）
（下線を引いた）最初の行は全ての利用可能なサイクルを示し、その下に、各プローブを合成するのに用いたサイクルを示す。各プローブの番号（１−５）は、単に識別を目的として割り当てられたものに過ぎない。プローブ１とプローブ３は同一の配列であるが、各々を形成するサイクルは完全に異なっている。他のプローブは共通のサイクルと少なくとも一つの異なったサイクルとから形成される。最初のＣサイクルにエラーが生じた場合、プローブ１，２，４は影響を受けるが、プローブ３，５は影響を受けないと考えられる。
【００３４】
例えば、最初のＣサイクルで生じたエラーの結果、プローブ１にＣが付加されないとすると、合成されるプローブは３’−ＡＧＴになる。標識された対照標的５’−ＴＧＣＡをプローブ１にハイブリッド形成する場合、これにより、プローブ１のハイブリッド形成親和性が低くなる。通常、エラーのないプローブ３に比べて、プローブ１のハイブリッド形成親和性は、かなり低くなる。プローブ１，２，４のハイブリッド形成親和性が、プローブ３，５のハイブリッド形成親和性に比べてかなり低い場合、最初のＣサイクルでエラーが生じたと考えられる。これは、このサイクルがプローブ１，２，４の形成には関与しているが、プローブ３，５の形成には関与していないためである。本発明の好適な実施例では、このような情報を利用して、合成エラーの検出や同定を行っている。
【００３５】
チップ上で対照プローブを合成するやり方は、合成のエラー検出には便利な方法であるが、この場合、チップ上の大きな面積を対照プローブが占めないようにすることが望ましい。従って、出来るだけ少ない数のプローブを用いて、出来るだけ多くのサイクル、可能ならば全てのサイクルの統合性を評価することが望ましい。この目的を達成するために、本発明の実施例では、以下の二つの条件を採用した。
条件１：いずれのサイクルも、少なくとも四つのプローブ形成に用いられる。
条件２：任意の二つのサイクルを取り上げた場合、一方のサイクルをその形成に用いて、他方のサイクルを用いないプローブが少なくとも二つ存在する。
ただし、これらの条件、あるいは、どのような任意の条件も本発明の必要要件ではない。従って、本発明の範囲内で、他の条件を採用することもできる。
【００３６】
上記のプローブに戻って、これらの条件を検討する。まず、最初のＡサイクルは、プローブ１，２，４，５の四つのプローブの合成に用いられているため、これらの四つのプローブに関して、条件１を満たしている。また、プローブ１並びにプローブ２は、いずれも、最初のＡサイクルを合成に用い、且つ、二番目のＣサイクルを用いていないため、最初のＡサイクルと二番目のＣサイクルに関して、条件２を満たしている。プローブ２が二番目のＣサイクルを用いて合成され、最初のＡサイクルを用いない場合にも、プローブ１およびプローブ２は、条件２を満足する。即ち、条件２を、二つのサイクルを区別可能な少なくとも二つのプローブが存在すると言いかえることができる。最初のＡサイクルと最初のＣサイクルに関しては、上述の五つのプローブは条件２を満足していない。これは、一方のサイクルが合成に関与して、他方のサイクルが関与しないプローブがプローブ５のみしか存在しないからである。
【００３７】
有向非環状グラフを用いて、二つの条件を満足するサイクルのリストを確認するようにしてもよい。有向非環状グラフでは、所望の配列のプローブを合成するために利用されるサイクルの集合として各経路を示すように、原点から下降するノードを構成することが望ましい。例えば、このグラフが、すべての可能な合成経路を含むようにしてもよい。このようなグラフは、標準データ構造並びにアルゴリズムを用いて、取得され、格納される。
【００３８】
図６は、上述した簡単なプローブ３’−ＡＣＧＴを形成するために利用可能な有向非環状グラフを示す。図６（ａ）は、上述のプローブ１の合成経路を示す有向非環状グラフである。グラフの横軸上にサイクルの種類を示し、縦軸左側に所望のプローブを示す。各ノード（斜めの矢印）は、プローブに対応するモノマを付加するために用いられるサイクルを示す。同様に、図６（ｂ）は、上述のプローブ２の合成経路を示す有向非環状グラフである。水平の矢印は、対応する四つのサイクルがプローブの合成に用いられていないことを示す。
【００３９】
あるプローブの合成に関わる合成サイクルリストを形成する場合、このグラフからその経路を求めることができる。この場合、グラフのノードに重みづけをして、重みづけされたグラフから最短の経路を合成経路として選択する構成が望ましい。
【００４０】
例えば、コンピュータプログラムに一つの有向非環状グラフを記録して、上述した二つの条件を満足するプローブのサイクルを確認するようにしてもよい。この際、ノードに重みづけを行う。あるサイクルがプローブの合成に用いられるたびに、対応するノードの重みを１ずつ増加する。図７（ａ）に、プローブ１を合成するためのサイクルを選択した後の、重みづけされた有向非環状グラフを示す。サイクルの選択前には、全てのノードの重みはゼロである（グラフを簡略化するために、重みがゼロの場合のノードは省略してある）。すなわち、プローブ１を合成するサイクルは最初はゼロである。
【００４１】
図示するように、プローブ１を合成するサイクルが選択されると、これらのサイクルに対応するノードの重みを１ずつ増加する。条件１を満足するためには、各ノードの重みが４以上になる必要がある。トータルの重みが最低の経路を見つけることにより、所望のプローブを合成するためのサイクルを選択するようにしてもよい。図７（ａ）に示した例では、プローブ１を合成するためのサイクルに対応するノードのトータルの重みは４である。
【００４２】
図７（ｂ）は、上述のプローブ５を合成するサイクルを次に選択した場合に得られる、図７（ａ）に重みづけされた有向非環状グラフである。これらのサイクルが次に選択されるのは、これらのサイクルに対応するノードのトータルの重みがこの時点で１だったためである。これらのサイクルが選択されると、最初のＡサイクルに対応するエッジの重みが２に増え、一方で、二番目のＣ，Ｇ，Ｔに対するノードの重みがゼロから１に増加する。重みが変わることにより、異なったサイクルリストが形成される。ここで、先のプローブを形成する際に用いられた合成サイクルに対応する任意のノードの重みを増やすことにより、重みを変える構成が望ましい。
【００４３】
この方法で（即ち、トータルの重みが最低となる経路を見つける方法で）、様々のサイクルを選択し、同一の配列を有する複数のプローブを合成することが可能であるが、二つ以上の経路が繰り返されて、新しい組み合わせのサイクルが見つけられないことがある。更に、あるサイクルが使われた回数に基づいてノードに重みづけをする方法では、条件１を満足することは出来るが、条件２がまったく達成されない場合が有る。
【００４４】
同じ経路が何度も最短であるとして選択される理由は、重みづけの方法にある。繰り返しを避けるために、各サイクルリストを先に選択されたリストと比較する。合致するリストが見つかった場合には、現在処理中のリストを受け入れないで、グラフの重みづけを再度行う。ここで、現在処理中のリストが受け入れられたものとして、グラフの重みづけをやり直すことが望ましい。これにより、プローブ配列に固有の不規則性を利用して、プローブ集合の決定論的な構築を可能にする。プローブ配列の不規則性が充分でない場合には、この再重みづけ作業がループに入ってしまい、同じサイクルリストを繰り返し形成することになる。ただし、これはエラーとして検出可能なため、ユーザが、例えば、より不規則な配列をプローブに与えてやればよい。このように再重みづけスキームを拡張することにより、作業がループに入ることが避けられる。例えば、ランダムな重みをノードに加えたり、あるいは、何か別の方法で、経路のつながりを破るようにしてもよい。
【００４５】
また、重みを利用して、あるサイクルリストに所定のサイクルが含まれる確率を増大させたり、逆に、あるサイクルリストが所定のサイクルを含まない確率を増大させたりすることも可能である。例えば、所望のサイクルに対応するノードの重みを第一の所定値だけ減少させる一方で、不必要なサイクルに対応するノードの重みを第二の所定値だけ増加させる。ここで、第一の所定値と第二の所定値は、異なった値であり、比較的大きな値であることが望ましい（例えば、１０００と２０００）。これらの所定値を変えることにより、「所望の」サイクルへの支持を「不必要な」サイクルへの不支持よりも大きくすることも、その逆も可能となる。
【００４６】
行列を用いることにより、重みづけされたサイクルの選択が容易になる。図８に、経路の繰り返しを避けて、上述した条件２を満足させるように用いられる行列の例を示す。この例では、８個のサイクルＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔ，Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔが示されている。これらのサイクルに１から８までの番号をつけて、選択されるサイクルの多様性が増大するように図８に示す行列を作成する。行列の横軸の上と縦軸の左側の番号は、サイクルの番号を示す。行列の各要素となる値は、対応するサイクルに関して条件２を満足するプローブの数を示す。図示するように、行列は、（ｎ，ｎ）（ただし、ｎ＝１〜８）によって規定される対角線を挟んで対称である。
【００４７】
図７（ｂ）に示す重みづけされた有向非環状グラフに応じて、行列を作成した（すなわち、プローブ１およびプローブ５を合成する経路が一度ずつ選択されている）。行列の要素（１，２）の値は１であり、これは、最初のＡサイクルが用いられる一方、最初のＣサイクルが用いられないという条件、あるいは、その逆の条件を満足するプローブが一つ存在することを示している。簡単に言えば、図８の行列は、任意の二つのサイクルに関して条件２を満足するプローブの数を示していることになる。
【００４８】
条件２を満足するためには、行列の要素が、２以上の値でなければならない。ある経路を選択する際に、対照プローブを設計するコンピュータシステムが、重みづけされた有向非環状グラフの重みを減少／増加させることにより、所望の経路を「強制する」場合がある。例えば、３番目のサイクルと８番目のサイクルを用いるプローブが存在しない場合、システムは、この経路の重みを減少させることにより（及び／あるいは、他の経路の重みを増大させることにより）、３番目のサイクルを用いる一方、８番目のサイクルを用いないでプローブを合成する（即ち、条件２を満足する）経路を選択する。重みづけされた有向非環状グラフと行列を組み合せて用いることにより、あるプローブを合成するために異なったサイクルリストを選択することが可能になる。
【００４９】
以上、説明を簡略化するために、簡単な対照プローブを例にとって説明した。上述した簡単な例からわかるように、（対照プローブが３’−ＡＣＧＴであれば）、最初のＡサイクルを用いることなく最初のＣサイクルを用いることは、一般に不可能であることがわかる。対照標的のいずれかの一部に相補的な四つの異なった対照プローブを合成することが望ましい。例えば、対照標的が５'−ＧＡＣＴＴＧＣＣＡＴＣＧＴＡＧＡＡＣＴＧの場合、以下に示すような対照プローブを用いることができる。
３’−ＣＴＧＡＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴＣＴＴ  (Ｃプローブ：配列ＩＤ番号１)
３’−ＴＧＡＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴＣＴＴＧ  (Ｔプローブ：配列ＩＤ番号２)
３’−ＧＡＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴＣＴＴＧＡ  (Ｇプローブ：配列ＩＤ番号３)
３’−ＡＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴＣＴＴＧＡＣ  (Ａプローブ：配列ＩＤ番号４)
これらの四つの対照プローブは、すべて、異なった位置において、対照標的に相補的であり、また、上に示すように、対照プローブは、それぞれ、異なったヌクレオチドで始まり、異なったヌクレオチドで終わっている。このような対照プローブの各々を異なったサイクルで合成することにより、プローブ合成の統合性をより総合的に評価することが可能になる。
【００５０】
次に、本発明の実施例を詳述する。図９は、プローブ合成の統合性を評価するために対照プローブを合成する工程の概要を示すフローチャートである。ステップ３０１で、複数のモノマから成る対照配列を準備する。複数のモノマから成る対照配列としては、通常、チップのハイブリッド形成の際に加えられる対照標的が用いられる。合成エラーの検出が可能なように、対照配列を設計するようにしてもよい。
【００５１】
ステップ３０３で、同一のモノマ配列を有し、少なくとも一つの異なったサイクルを用いて形成される複数の対照プローブを設計する。これらの対照プローブは、同一の配列を有しているが、この配列は、対照標的に対する所望の結合に基づいて選択されている。対照プローブを設計する際には、まず、各プローブを合成するために利用可能なサイクルを選択する。望ましい例としては、コンピュータシステムが、上述した条件、有向非環状グラフ、並びに、行列を利用して、対照プローブを設計する。ただし、本発明の要旨の範囲内で、他の手法を用いて、対照プローブを形成することも可能である。
【００５２】
対照プローブの設計後、ステップ３０５で、対照プローブを合成する。対照プローブは、各プローブに対して選択されたサイクルに従って合成される。
【００５３】
図１０は、図９のステップ３０３で実行される対照プローブの設計工程の詳細を示すフローチャートである。ステップ３５１で、重みづけされた有向非環状グラフから最短の経路を求める。この場合、最低のコストで実現される経路が、最短の経路であると定義してもよい。ただし、重みが大きいほど好ましい経路を示している場合には、最高のコストで実現される経路が最短の経路であると定義する等、状況に応じて最短の経路を定義すればよい。選択された経路は、モノマ付加サイクルのリストを示す。
【００５４】
次のステップ３５３で、サイクルリストが望ましくないものかどうかの判定を行う。既に選択されたサイクルリストや、合成が難しいといったその他の理由のために望ましくないとして予め用意されたサイクルリストが、望ましくないサイクルリストとして判定される。最短経路を形成するサイクルリストが望ましくないと判定された場合には、ステップ３５５で、望ましくないサイクルリストを避けるように、有向非環状グラフ上の重みを調整する。一つの重みが増加すると、他の重みが減少するように、重みの調整を行うことが望ましい。この手法により、望ましくないサイクルリストを避けるという所望の結果を達成することができる。
【００５５】
ステップ３５６で、行列（図８参照）を用いて、サイクルの相違を増大させる。具体的には、行列を走査して、形成されるプローブ間に充分な相違が得られないサイクル対を同定する。行列の要素の値が小さい場合に、充分な相違が得られないと考えてもよい。相違がより大きなプローブを形成可能なサイクル対を選択した後、一つのサイクルの重みを増大させ、一方で、別のサイクルの重みを減少させるようにしてもよい。通常、重みは１ずつ増減させるが、必要に応じて、もっと大きな値や異なった値で増減させるようにしてもよい。一つのサイクルの重みを増大させる一方で、別のサイクルの重みを減少させるため、最短経路に前者が含まれ後者が含まれない可能性が高くなる。
【００５６】
ステップ３５７で、所望の数の、および／あるいは、所望の変動を有する対照プローブが得られたと判定されると、対照プローブを設計する工程を終了する。そうでない場合には、ステップ３５１に戻り、上述の処理を繰り返す。
【００５７】
以上、対照プローブを設計する方法を詳述した。図１１は、チップ上のどこで対照プローブが実際に合成されるのかを示す説明図である。図示するように、チップ４０１は、プローブを結合させるための比較的大きな領域を有する。チップの中心である対照プローブ領域４０３で対照プローブを合成することが望ましい。チップの中心に対照プローブを配置することにより、チップ上の全てのプローブ合成に関する情報を、対照プローブが容易に提供できるようになる。
【００５８】
図１２（ａ）は、ハイブリッド形成並びに走査後における、図１１の対照プローブ領域の画像を示す説明図である。画像４０５は、合成の際のエッジ効果を減らすように、対照プローブがチップ上のセルに市松模様で配置されている様子を示す（即ち、対照プローブが、水平方向にも鉛直方向にも一つおきのセルに配置されている）。エッジ効果に関する詳細は、１９９８年４月１３日出願の米国特許出願第０９／０５９，７７９号に記載されている。図では、比較的明るい領域が、対照プローブを含むセルに対応する。図示されているように、対照プローブを含むセルの強度は、ほぼ等しい。これは、プローブ合成の際にエラーが生じないと仮定した場合、各対照プローブと対照標的との間のハイブリッド形成親和性がほぼ等しいと考えられることを示している。
【００５９】
図１２（ｂ）は、ハイブリッド形成並びに走査後における、図１１の対照プローブ領域の他の画像を示す説明図である。ただし、画像４０７では、対照プローブを含むセルの強度は等しくない。これは、視覚的に、プローブ合成の過程で何らかのエラーが生じたことを示している。エラーによって影響を受けたプローブ（並びに、そのサイクル）を解析することにより、いずれのサイクルでエラーが生じたのかを判定することができる。図１３は、３つの対照プローブ領域を示す画面である。左側と中央の画像は、合成の過程でエラーが生じたことを示し、一方、右側の画像は、認識可能なエラーが生じなかったことを示す。
【００６０】
画像、影響を受けたプローブ、並びに、そのサイクルを解析することにより、サイクルと生じたエラーを判定することができる。一方、間違ったマスクの選択等、他のエラーを判定することはほとんど不可能である。これは、いずれのプローブが影響を受けるかが予想不能だからである。ただし、プロセス制御を目的とする場合には、チップが受け入れ可能か不能かを単純に示すだけでも利点がある。
【００６１】
図１４は、品質管理を目的として、ハイブリッド形成親和性に関する情報を解析することにより、チップが受け入れ可能か不能かを判定する工程を示すフローチャートである。この工程は、複数の対照プローブ配列を用いて処理を行うように設計されている（すなわち、異なったグループの対照プローブが存在し、各グループの対照プローブが同一の配列を有する一方、各グループのプローブが、各々、少なくとも一つの異なったサイクルを利用して形成される）。ただし、この工程は、単一の対照プローブ配列を用いるような場合にも好適に適用される。
【００６２】
ステップ４８１で、全ての対照プローブ強度の平均を算出する。ここで、強度は、対照プローブのハイブリッド形成親和性測定値を示す。ステップ４８１では、さらに、サイクル強度差（ＣＩＤ）も算出される。サイクル強度差は、あるサイクルを用いることなく形成された全てのプローブ強度の中央値と、同じサイクルを用いることによって形成された全てのプローブ強度の中央値との差を示す。ハイブリッド形成親和性を（例えば、フォトン数由来の）強度として測定することが望ましい。ただし、本明細書で記載したものも含めて、他の様々な情報を利用して、ハイブリッド形成親和性を測定するようにしてもよい。
【００６３】
ステップ４８３で、ＣＩＤが全ての対照プローブ強度の平均の４０％より大きいと判定された場合には、ステップ４８５で、プローブ合成が受け入れ不能であると判定される。そうでない場合には、処理がステップ４８７に進み、各対照プローブのグループに関する％ＣＶを算出する。対照プローブのグループには、同一の配列を有する全ての対照プローブが含まれる。％ＣＶは、変動係数で、対照プローブのグループに関する強度の標準偏差を１００倍して、対照プローブの全ての強度の平均で割ることにより求められる。
【００６４】
次に、ステップ４８９で、最大％ＣＶが３０％よりも大きいかどうかを判定する。最大％ＣＶが３０％よりも大きい場合には、ステップ４８５で、プローブ合成が受け入れ不能であると判定される。そうでない場合には、処理がステップ５１１に進み、プローブ合成が受け入れ可能であると判定される。
【００６５】
図１５は、品質管理を目的として、ハイブリッド形成親和性の情報を解析して、チップが受け入れ可能、受け入れ不能、あるいは、限界点上にある、のいずれであるかを判定する他の工程を示すフローチャートである。上述したように、この工程も、複数の対照プローブ配列を用いて処理を行うように設計されている。ただし、この工程も、単一の対照プローブ配列を用いるような場合にも好適に適用される。
【００６６】
ステップ５０１で、サイクル強度差を算出する。各サイクルに関して、そのサイクル強度差を、４分位範囲（ＩＱＲ）と対照プローブに関する強度の全体中央値の両方と比較する。ＩＱＲは、７５％値と２５％値の差を示す周知の統計学的計算値である。
【００６７】
サイクル強度差の絶対値が、対照プローブの全強度のＩＱＲの３．５倍よりも大きいか、あるいは、対照プローブ強度の全体中央値の５０％よりも大きい場合には、プローブ合成には疑問が残り、エラーが生じる可能性がある（ステップ５０３）。この場合には、ステップ５０５で、プローブ合成は受け入れ不能であると判定される。そうでない場合には、処理がステップ５０７に進み、各対照プローブのグループに関する％ＣＶを算出する。対照プローブのグループには、同一の配列を有する全ての対照プローブが含まれる。％ＣＶは、変動係数で、対照プローブのグループに関する強度の標準偏差を１００倍して、対照プローブの全ての強度の平均で割ることにより求められる。
【００６８】
次に、ステップ５０９で、最大％ＣＶが２５％よりも小さいかどうかを判定する。最大％ＣＶが２５％よりも小さい場合には、ステップ５１１で、プローブ合成が受け入れ可能であると判定される。そうでない場合には、処理がステップ５１３に進み、最大％ＣＶが３５％よりも小さいかどうかを判定する。最大％ＣＶが３５％以上であれば、ステップ５０５で、プローブ合成が受け入れ不能であると判定される。
【００６９】
処理はステップ５５１に進んで、各対照プローブのグループに関して、暗プローブ差（ＤＰＤ）を算出する。ＤＰＤは、あるグループに含まれる対照プローブに関する強度平均とそのグループに含まれる４つの最暗（即ち、最弱強度を有する）対照プローブの強度平均との間の差を示す。差が大きい場合には、通常、プローブ強度の変動性が高いことを示し、一方、差が小さい場合には、プローブ強度が比較的均一であることを示す。ステップ５５３で、ある対照プローブのグループに関するＤＰＤが全ての対照プローブの強度平均の５０％よりも大きい場合には、ステップ５０５で、プローブ合成が受け入れ不能であると判定される。そうでない場合には、処理がステップ５５９に進み、プローブ合成が限界点上にある、と判定される。
【００７０】
例えば、検査対象となっているチップに関して、受け入れ可能、受け入れ不能、あるいは、限界点上を示す定格、並びに、図１５のフローチャート中でなされる判定についての指標といった内容を、数値的な符号を用いるといった方法により与えるようにしてもよい。更に、判定が限界点上あるいは受け入れ不能である場合に、いずれの対照プローブのグループにエラーを生じたか（例えば、塩基が対照プローブのグループにおける最初の塩基を示す場合のＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔ）、あるいは、生じる可能性があるかを規定する指標を与えるようにしてもよい。
【００７１】
上述の好適な実施例で、よい結果が得られた特定の式や値（例えば、パーセント）を示したが、これらの式や値は、特定の実験やシステムに適するように様々に変更可能である。即ち、本発明は、何ら、上述した実施例に限定されるものではない。
【００７２】
以上、本発明の好適な実施例を説明したが、本発明は、様々に変更・変形可能である。上述した実施例に適切な変形を加えた構成にも、本発明は同様に適用可能である。例えば、チップ上で合成される核酸プローブを参照して本発明を説明したが、アミノ酸やサッカライド等の他のモノマにも好適に適用可能であるし、また、プローブを基板に結合させない手法を初めとする他のハイブリッド形成手法にも好適に適用可能である。従って、上述の説明は、本発明の範囲を何ら限定するものではなく、本発明は、特許請求の範囲により規定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明の実施例のソフトウェアを実行するために利用可能なコンピュータシステムの一例を示す説明図である。
【図２】図１のコンピュータシステムを示すシステムブロック図である。
【図３】ＤＮＡやＲＮＡ等の生物学的試料のアレイを形成して、解析するための全体システムを示す説明図である。
【図４】チップ上にプローブが結合する様子を示す概念図である。
【図５】実施例で、プローブを合成する際のモノマ付加サイクルの概要を示すフローチャートである。
【図６】対象となるサイクルの同定に利用可能な有向非環状グラフを示す説明図である。
【図７】対象となるサイクルの同定に利用可能な、重みづけされた有向非環状グラフを示す説明図である。
【図８】サイクルリストの繰り返しを避けるために利用可能な行列を示す説明図である。
【図９】対照プローブを合成する工程の概要を示すフローチャートである。
【図１０】対照プローブを設計する工程を示すフローチャートである。
【図１１】チップ上で対照プローブが実際に合成される位置を示す説明図である。
【図１２】ハイブリッド形成並びに走査後における、対照プローブ領域の画像を示す説明図である。
【図１３】３つの対照プローブ領域の画面を示す説明図である。
【図１４】ハイブリッド形成親和性の情報を利用して、チップが受け入れ可能であるかどうかを判定する工程を示すフローチャートである。
【図１５】ハイブリッド形成親和性の情報を解析して、チップが受け入れ可能であるかどうかを判定する他の工程を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００７４】
１…コンピュータシステム
３…ディスプレイ
５…スクリーン
７…キャビネット
９…キーボード
１１…マウス
１３…ＲＯＭドライブ
１５…ＲＯＭ
５１…中央処理装置
５３…システムメモリ
５５…固定記憶装置
５７…可動記憶装置
５９…ディスプレイアダプタ
６１…サウンドカード
６３…スピーカ
６５…ネットワークインターフェース
６７…矢印
１００…コンピュータ
１０２…内部データベース
１０４…チップ設計コンピュータファイル
１０６…システム
１０８…ソフトウェア
１１０…マスク
１１２…合成システム
１１４…アレイ
１１６…光源
１１８…ケミカルフローセル
１１９…コンピュータ
１２０…走査システム
１２２…デジタルコンピュータ
１２４…検出装置
１２６…解析システム
１２８…出力
４０１…チップ
４０３…対照プローブ領域
４０５…画像
４０７…画像
【図１】
2007054070.tif 000003
【図２】
2007054070.tif 000004
【図３】
2007054070.tif 000005
【図４】
2007054070.tif 000006
【図５】
2007054070.tif 000007
【図６】
2007054070.tif 000008
【図７】
2007054070.tif 000009
【図８】
2007054070.tif 000010
【図９】
2007054070.tif 000011
【図１０】
2007054070.tif 000012
【図１１】
2007054070.tif 000013
【図１２】
2007054070.tif 000014
【図１３】
2007054070.tif 000015
【図１４】
2007054070.tif 000016
【図１５】
2007054070.tif 000017