(57)【要約】      （修正有）【課題】深刻化する環境ストレスに適応し、劣悪な環境下においてもデンプン・エネルギー集積能力の高い植物およびその製造方法を提供する。【解決手段】イネα−アミラーゼＩ−１の特定のペプチド領域及び小胞体膜透過シグナルペプチド領域を含むプラスチド輸送・局在化コンストラクトにより、機能タンパクを小胞体−ゴルジ体系を介してプラスチドへ輸送・局在化させ、プラスチドの機能改変を行うことによりデンプン集積能力の高い形質転換植物を得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）記載のアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつプラスチドへのターゲティング作用を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリペプチドをコードすることを特徴とする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ｃ）又は（ｄ）記載のアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ小胞体膜透過作用を有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項３記載のポリペプチドをコードすることを特徴とする遺伝子。
【請求項５】
請求項２記載の遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項６】
請求項２及び４記載の遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項７】
請求項２記載の遺伝子が導入されたことを特徴とする形質転換植物。
【請求項８】
請求項２及び４記載の遺伝子が導入されたことを特徴とする形質転換植物。
【請求項９】
前記形質転換植物が単子葉植物であることを特徴とする請求項７又は８記載の形質転換植物。
【請求項１０】
請求項５又は６記載のベクターを単子葉植物由来のカルスに導入し、前記カルスを増殖させた後に、前記カルスから植物体を再分化させて得られることを特徴とする形質転換植物。
【請求項１１】
請求項５又は６記載のベクターを単子葉植物由来のカルスにアグロバクテリウムを用いて導入し、前記カルスを増殖させた後に、前記カルスから植物体を再分化させることを特徴とする形質転換植物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デンプン集積能力の高い形質転換植物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化など地球規模での自然環境の悪化が大きな問題になっている。我が国においてもすでに環境ストレスがイネなどの重要作物の生長・生理、特に炭水化物代謝に大きな影響を及ぼし、減収や品質劣化を引き起こしていることが知られている。
光合成産物のデンプンへの集積は、植物のみならず地球上のすべての生命にとって最も重要なエネルギー蓄積過程である。このデンプンへの集積は、光合成機能を有する葉緑体が分化したアミロプラストにより行われていることから、環境ストレス耐性の作物を育種するためにこの葉緑体・アミロプラスト（プラスチド）の機能改変法の研究が行われている。プラスチドの分化・機能発現は、このオルガネラ自身がもつ遺伝子と細胞核のゲノムにコードされた遺伝子によって統御されている。プラスチドの機能改変法としては、これまでに大きく分けて２つの方法が知られている。１つは、プラスチドに遺伝子を直接導入する方法であり、もう１つは、トランジットペプチドと呼ばれている葉緑体移行シグナル遺伝子を葉緑体に導入したい機能タンパク質遺伝子に融合し、それを細胞核ゲノムに導入する方法である。導入された遺伝子は細胞質で翻訳され、トランジットペプチドによりプラスチドへ輸送・局在化される。しかしながら、前者の方法では植物全体のプラスチドを改変することは困難であり、また、後者の方法では細胞質で組換えタンパク質が翻訳されるため、細胞にとって負担になり得るといった問題があった。
ところで、α−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）は、デンプンの加水分解酵素であり、胚盤組織及びアリューロン層からデンプン貯蔵組織である胚乳に分泌され、そしてデンプン顆粒を分解し、発芽及び伸長生長に必要な炭素源並びにエネルギー源を供給するという重要な働きをする。イネα−アミラーゼ遺伝子は少なくとも１１種類存在していることが明らかになっているが、なかでも典型的なＮ−結合型糖鎖を有するα−アミラーゼＩ−１（ＡｍｙＩ−１）は発芽イネ種子における胚乳貯蔵デンプンの分解に重要な役割を果たしていることが報告されている（非特許文献１および２）。
【非特許文献１】Asatsuma, S., Sawada, C., Itoh, K., Okito, M., Kitajima, A., Mitsui, T. (2005): Involvement of a-amylase I-1 in starch degradation in rice chloroplasts. Plant Cell Physiol. 46: 858-869
【非特許文献２】Nanjo, Y., Asatsuma, S., Itoh, K., Hori, H. and Mitsui T. (2004) Proteomic identification of a-amylase isoforms encoded by RAmy3B/3C from germinating rice seeds. Biosci. Biotech. Biochem. 68: 112-118
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、イネα−アミラーゼの葉緑体・アミロプラスト（プラスチド）へのターゲティング機構及び遺伝的なシステムの詳細についてはほとんど知られていない。葉緑体・アミロプラストの光合成能やデンプン集積能の高い作物を育種することは、植物のみならず地球上のすべての生命にとって最も重要なエネルギー蓄積を行う上で重要な役割を果たすものとして、各方面から研究が進められ、その成果が期待されている。
【０００４】
そこで、本発明は、以上の背景の下なされたものであって、深刻化する環境ストレスに適応し、劣悪な環境下においても効率的にデンプン・エネルギー集積能力の高い植物およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは以上の課題に鑑み、穀類細胞において核ゲノムにコードされている酵素タンパク質のプラスチドへのターゲティング機構を検討し、プラスチド構成タンパク質のターゲティング機構の存在を明らかにした（図１参照）。具体的には、イネα−アミラーゼＩ−１のプラスチドへのターゲティングは、小胞体からゴルジ体への輸送に関わるＡｔＡｒｆ１やＡｔＳａｒ１のドミナントネガティブ変異体により阻害されたことから、小胞体からゴルジ体への輸送が不可欠であることを明らかにした。すなわち、小胞体−ゴルジ体系を介したプラスチドへの輸送・局在化は、トランジットペプチド非依存性プラスチド局在であり、プラスチド包膜に存在するタンパク透過チャンネルに適合しないタンパクのプラスチド輸送・局在化を行うことができる可能性がある。また、プラスチド局在化に関わる典型的なトランジットペプチドを有しないα−アミラーゼＩ−１（ＡｍｙＩ−１）がイネ緑葉細胞の葉緑体と細胞壁区画に局在することを見出した。
【０００６】
また、イネα−アミラーゼは分泌型酵素として知られているものであったが、イネα−アミラーゼの発現抑制および過剰発現する形質転換イネ植物を解析した結果、緑葉など生細胞中のデンプン分解にα−アミラーゼが関与することを見出した。さらに、α−アミラーゼＩ−１の発現抑制および過剰発現体イネ植物を用いて、生組織細胞におけるデンプン集積に及ぼすα−アミラーゼＩ−１の役割を調べたところ、α−アミラーゼＩ−１発現抑制イネ系統においてはα−アミラーゼＩ−１発現がほぼ完全に押さえられ、野生型に比べて葉組織において顕著なデンプン蓄積の増加が見られた。
【０００７】
本発明は以上の研究成果及び知見に基づいて完成されたものであって、以下の各構成を提供する。
【０００８】
本発明における請求項１記載のポリペプチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつプラスチドへのターゲティング作用を有するポリペプチド。
【０００９】
本発明における請求項２記載の遺伝子は、請求項１記載のポリペプチドをコードすることを特徴とする。
【００１０】
本発明における請求項３記載のポリペプチドは、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする。
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ小胞体膜透過作用を有するポリペプチド。
【００１１】
本発明における請求項４記載の遺伝子は、請求項３記載のポリペプチドをコードすることを特徴とする。
【００１２】
本発明における請求項５記載のベクターは、請求項２記載の遺伝子を含むことを特徴とする。
【００１３】
本発明における請求項６記載のベクターは、請求項２及び４記載の遺伝子を含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明における請求項７記載の形質転換植物は、請求項２記載の遺伝子が導入されたことを特徴とする。
【００１５】
本発明における請求項８記載の形質転換植物は、請求項２及び４記載の遺伝子が導入されたことを特徴とする。
【００１６】
本発明における請求項９記載の形質転換植物は、請求項７又は８において、前記形質転換植物が単子葉植物であることを特徴とする。
【００１７】
本発明における請求項１０記載の形質転換植物は、請求項５又は６記載のベクターを単子葉植物由来のカルスに導入し、前記カルスを増殖させた後に、前記カルスから植物体を再分化させて得られることを特徴とする。
【００１８】
本発明における請求項１１記載の形質転換植物の製造方法は、請求項５又は６記載のベクターを単子葉植物由来のカルスにアグロバクテリウムを用いて導入し、前記カルスを増殖させた後に、前記カルスから植物体を再分化させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、今後さらに深刻化する環境ストレスに適応し、劣悪な環境下において効率的にデンプンを集積可能な形質転換植物の作出が可能となる。また、プラスチドの光合成能やデンプン集積能を高め、カーボンニュートラルな工業用素材であるデンプンの供給を増大させることができる。また、植物デンプンは人類にとって極めて重要な栄養素であり、デンプン粒の構造を改変することによってデンプン利用用途の拡大を図ることができ、生分解性樹脂など工業生産における有用素材である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（ベクター）
本発明において、遺伝子を植物へ導入する際に使用されるベクターとしては、導入遺伝子をターゲット細胞（宿主細胞）に導入することができ、且つターゲット細胞内で導入遺伝子を発現させることができるものであれば特に限定されず、目的に応じて適当なベクター（プラスミド、バクテリオファージ、ウイルスなど）が利用される。数多くのベクターが市販されており、本発明ではそれらの中から目的に応じて適切なものを選択して用いることができる。また、本発明のベクターの作成方法としては、特に限定されず、当業者に周知のいかなる方法を用いてもよい。
【００２１】
本発明において、好ましいプラスチド輸送・局在化コンストラクトの例を図２に示す。図２に記載のＡｍｙＩ−１ＳＢとは、α−アミラーゼＩ−１の３０１〜３６９のペプチド領域（配列番号１）を示し、プラスチドターゲティングに必要不可欠なものである。一般に、特定の機能を有するアミノ酸の一部に改変を施した場合においてもその機能が維持されることがある。このことを考慮して、ＡｍｙＩ−１ＳＢのポリペプチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする：（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつプラスチドへのターゲティング作用を有するポリペプチド。
また、ＳＰとは、ＥＲ膜透過シグナルペプチドを示し、例えばＡｍｙＩ−１ＳＰ（配列番号２）が挙げられるがこれに限定されるものではなく、他の植物分泌タンパク質のＳＰを用いてもよい。また、ＡｍｙＩ−１ＳＰのポリペプチドは、以下の（ｃ）又は（ｄ）記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする：（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ小胞体膜透過作用を有するポリペプチド。なお、機能タンパク質はＡｍｙＩ−１ＳＢのＮ末端側又はＣ末端側の何れに挿入してもよい。
【００２２】
（形質転換方法）
植物へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。それぞれの方法に適したベクターの調製、形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
【００２３】
（ターゲット植物）
本発明においてターゲットとする植物は、単子葉植物である。単子葉植物としては、例えばイネ科（イネ属、コムギ属、オオムギ類、ライムギ類、ハトムギ属、トウモロコシ属、サトウキビ属等）、ユリ科（ネギ属、ニンニク属等）などが挙げられる。
【００２４】
以下に本発明の実施例によって、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら制限されるものではない。
【００２５】
以下の実施例１〜３において使用される生物学的材料、試薬実験方法は次の通りである。
【００２６】
（供試植物）
形質転換に供試される植物（ターゲット植物）として、タマネギ（Allium  cepa）表皮細胞を、０．６％のゲルライトを加えた２，４−ＤフリーのＭＳ培地上にて２５℃暗所で培養後、使用した。
【００２７】
（プラスミドコンストラクト）
全ＲＮＡを、発芽６日目のイネ種子の胚盤組織から単離した。そのｃＤＮＡライブラリーをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋／−）（タカラバイオ社）を用いて製造者のプロトコールに従って作成した。ｃＤＮＡライブラリーを、α−アミラーゼＩＩ−３（ＲＡｍｙ３Ｅ），ＩＩ−５（ＲＡｍｙ３Ｂ），及びＩＩ−６（ＲＡｍｙ３Ｃ）の特定のプローブを用いて選別した（Sheu, J.-J., Yu, T.-S., Tong, W.-F., Yu, S.-M. (1996) Carbohydrate starvation stimulates differential expression of rice a-amylase genes that is modulated through complicated transcriptional and posttranscriptional processes. J. Biol. Chem. 271: 26998-27004.）。得られた完全長ｃＤＮＡ（ＡｍｙＩＩ−３，ＡｍｙＩＩ−５，及びＡｍｙＩＩ−６と称す）を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋・−）にクローニングし、ｐＡｍｙＩＩ−３，ｐＡｍｙＩＩ−５，及びｐＡｍｙＩＩ−６を作成した（図３）。ｐＡｍｙＩ−１とｐＡｍｙＩＩ−４は、Asatsuma S, Sawada C, Itoh K, Okito M, Kitajima A, Mitsui T (2005) Involvement of α-amylase I-1 in starch degradation in rice chloroplasts. Plant & Cell Physiology 46: 858-869に記載の方法に従って作成した。（図４）。
【００２８】
完全長のα−アミラーゼＩ−１ｃＤＮＡと種々のＣ末端が一部切断させたフラグメントを、鋳型ＤＮＡとしてｐＡｍｙＩ−１とプライマー配列セット（表１）を用いてＰＣＲによって増幅した。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
完全長α-アミラーゼＩＩ−３，ＩＩ−４，ＩＩ−５，ＩＩ−６ｃＤＮＡ、およびそれらのＮ−端末シグナル配列領域を、鋳型ＤＮＡとしてｐＡｍｙＩＩ−３，ｐＡｍｙＩＩ−４，ｐＡｍｙＩＩ−５及びｐＡｍｙＩＩ−６と，プライマー配列セット（表２）を用いてＰＣＲによって増幅した。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
ＢａｍＨＩ ＰＣＲ増幅フラグメントをｐＧＦＰのＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＡｍｙＩ−１−ＧＦＰ、ｐＡｍｙＩ−１（ＳＰ）−ＧＦＰ、ｐＡｍｙＩ−１（Δ１０１−４２８）−ＧＦＰ、ｐＡｍｙＩ−１（Δ２０１−４２８）−ＧＦＰ、ｐＡｍｙＩ−１（Δ３０１−４２８）−ＧＦＰ、ｐＡｍｙＩ−１（Δ３７０−４２８）−ＧＦＰ、ｐＡｍｙＩＩ−３−ＧＦＰ、ｐＡｍｙＩＩ−３（ＳＰ）−ＧＦＰ、ｐＡｍｙＩＩ−４−ＧＦＰ、ｐＡｍｙＩＩ−４（ＳＰ）−ＧＦＰ、ｐＡｍｙＩＩ−５−ＧＦＰ、及びｐＡｍｙＩＩ−６−ＧＦＰ(図５)を作成した。
【００３３】
ＰＣＲを使用して、トリプトファン３０２をアラニン３０２に置換した一つのアミノ酸を導入し、ＡｍｙＩ−１（Ｗ３０２Ａ）を作成した。変異原性のフォワードプライマー（Ｆ−ＡＴＧ＋１と、Ｆ−Ｗ３０２Ａ）及びリバースプライマー（Ｒ−ｅｎｄと、Ｒ−Ｗ３０２Ａ）を合成した（表３）。
【００３４】
【表３】
2007151435.tif 000004
【００３５】
変異原性のプライマーセットと、鋳型ＤＮＡとしてｐＡｍｙＩ−１を使用して第一のＰＣＲを行った。Ｆ−ＡＴＧ＋１とＲ−ｅｎｄのプライマーと、鋳型ＤＮＡとして第一のＰＣＲ産物を使用して第二のＰＣＲを行った。第二のＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで切断し、ｐＧＦＰのＢａｍＨＩ部位にクローニング、ｐＡｍｙＩ−１（Ｗ３０２Ａ）（図６）を作成した。
【００３６】
タマネギ表皮細胞におけるＤｓＲｅｄ２発現において、ｐＤｓＲｅｄ２（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）からのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩのＰＣＲ増幅フラグメントを、ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ消化ｐＧＦＰのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ消化部位にクローニングし、ｐＤｓＲｅｄ（図７）を産生した。イネwaxy遺伝子（Itoh, K., Ozaki, H., Okada, K., Hori, H., Takeda, Y., Mitsui, T. (2003) Introduction of Wx transgene into rice wx mutants leads to both high- and low-amylose rice. Plant Cell Physiol., 44: 473-480）からトランジットペプチド配列の始めの１−１１１のアミノ酸を、２つのプライマー5'-ctggatccatgtcggctctcaccacg-3'と5'-tatggatccggcaggggggaggccaccgag-3'を用いてＰＣＲ増幅し、その後ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化してｐＷｘＴＰ−ＤｓＲｅｄを作成した。ＢａｍＨＩ消化フラグメントをｐＤｓＲｅｄのＢａｍＨＩ消化部位に挿入した（図８）。さらに、ＢａｍＨＩ ＰＣＲの増幅ＷｘＴＰフラグメントを、ｐＧＦＰのＢａｍＨＩ消化部位にクローニングし、ｐＷｘＴＰ−ＧＦＰを構築した（図９）。
【００３７】
ペルオキシソームとミトコンドリアにそれぞれｐＰＴＳ２−ＧＦＰ（Mano, S., Nakamori, C., Hayashi, M., Kato, A., Kondo, M., Nishimura, M. (2002) Distribution and characterization of peroxisomes in Arabidopsis by visualization with GFP: dynamic morphology and actin-dependent movement. Plant Cell Physiol. 43: 331-41.）とｐｍｔ−ＧＦＰ（Niwa, Y., Hirano, T., Yoshimoto, K., Shimizu, M., Kobayashi, H. (1999) Non-invasive quantitative detection and applications of non-toxic, S65T-type green fluorescent protein in living plants. Plant J. 18, 455-463.）を用いて、他の細胞小器官を可視化した（図１０）。
【００３８】
（遺伝子導入方法）
プラスミドＤＮＡを、パーティクルデリバリーシステム（ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いてタマネギ表皮細胞へ導入した。具体的には、１０μｌの滅菌水に溶解させた３μｇのプラスミドＤＮＡに、１０μｌの金粒子懸濁液（直径１．０μｍの金粒子６０ｍｇ／ｍｌ）と、１０μｌの２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２と、４μｌの０．１Ｍ  スペルミジンを加えて懸濁し、室温で３０分間静置した。プラスミドＤＮＡで被覆された金粒子を冷エタノールで洗浄した後、１０μｌのエタノールで緩やかに懸濁した。１１００ｐｓiのラプチャーディスクを使用し、一サンプルあたり２回ずつ導入を行った。
【００３９】
（観察方法）
ＧＦＰ，ＤｓＲｅｄおよびｍＲＦＰ蛍光画像は、電動蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ−６１）と、ＣＣＤカメラ（Ｃｏｏｌ  ＳＮＡＰ  ｆｘ、Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて観察・撮影し、画像解析ソフト（Ｌｕｍｉｎａ  Ｖｉｓｉｏｎ、三谷商事（株））を用いて解析した。ＧＦＰは４７０〜４９０ｎｍで励起し、５１０〜５５０ｎｍを検出した。ＤｓＲｅｄおよびｍＲＦＰは、５２０〜５５０ｎｍで励起し、≧５８０ｎｍを検出した。一細胞につき、１０μｍ間隔で２０〜３０枚の画像を撮り、デコンボリューション処理した後、一つの画像にした。
【実施例１】
【００４０】
イネα−アミラーゼ遺伝子と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を融合し、この融合物をタマネギ細胞に導入させ、ＧＦＰの輸送・局在化を調べた。
【００４１】
タマネギ表皮細胞にパーティクルガンでＡｍｙＩ−１−ＧＦＰおよびＷｘＴＰ−ＤｓＲｅｄを同時に導入し、一過的に発現させた（図１１）。ＷｘＴＰ−ＤｓＲｅｄは、プラスチドへの局在を示すマーカーである。図１１のＡ，Ｄに示すようにように、ＡｍｙＩ−１−ＧＦＰの蛍光は細胞表面だけでなく、細胞内で何らかのオルガネラに局在していた。Ｂ，Ｅでは、ＷｘＴＰ−ＤｓＲｅｄの蛍光はプラスチドを示し、プラスチド特有の構造であるストロミュールも確認された（図１１Ｅ）。ＣはＡとＢを、ＦはＤとＥを重ね合わせた画像で、部分的にＡｍｙＩ−１−ＧＦＰの蛍光がＷｘＴＰ−ＤｓＲｅｄの蛍光と局在が一致し、ＡｍｙＩ−１がプラスチドに局在することを示した。この結果から、イネα−アミラーゼ遺伝子と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を融合し、この融合物をタマネギ細胞に導入することによって、タマネギ細胞のプラスチドにＧＦＰを輸送・局在化させることが示された。また、α−アミラーゼＩ−１においてはイネおよびタマネギの両細胞に共通するプラスチド局在化シグナルが含まれることが明らかになった。
【実施例２】
【００４２】
α−アミラーゼＩ−１のプラスチドターゲティングに必要不可欠な領域を決定するために、Ｃ端末の端部が一部欠けているα−アミラーゼＩ−1とＧＦＰの融合タンパク質を一過的に発現させその局在を調べた。
【００４３】
図１２に、Ｃ末端が一部切断されたα−アミラーゼＩ−１（ＡｍｙＩ−1Δ３４−４２８、ＡｍｙＩ−1Δ１０１−４２８、ＡｍｙＩ−1Δ２０１−４２８、ＡｍｙＩ−１Δ３０１−４２８、ＡｍｙＩ−１Δ３７０−４２８）を示す。ＡｍｙＩ−１Δ３４−４２８は、α−アミラーゼＩ−１のＮ末端シグナルペプチドのみを含んでいた。予測されたシグナルペプチダーゼ開裂部位はＧｌｎ２６のＮ末端側である。ＡｍｙＩ−１Δ３０１−４２８は、Ｎ結合型糖鎖結合部位（Ａｓｎ２６５、−Ｇｌｙ２６６、−Ｔｈｒ２６７）を含んでいる。ＡｍｙＩ−１Δ３７０−４２８は、推定のデンプン結合部位（３０１Ｔｙｐ−３０２Ｔｙｐ）を含む完全なＡドメインとＢドメインを有する（Robert, X., Haser, R., Mori, H., Svensson, B., Aghajari, N. (2005) Oligosaccharide binding to barley a-amylase 1. J. Biol. Chem. 280: 32968-32978）。３７０〜４２８残基のアミノ酸配列は、５つの逆平行β-シートを構成したＣ-ドメインに対応している。図１２と表４に示されるように、多くのＣ末端が欠失したＡｍｙＩ−１−ＧＦＰ融合タンパク質は小胞体（ＥＲ）様網目状構造に局在し、プラスチドにはほとんど局在しなかったが、ＡｍｙＩ−１Δ３７０−４２８−ＧＦＰ融合タンパク質は完全長ＡｍｙＩ−１−ＧＦＰと同様に遺伝子導入されたタマネギ細胞におけるプラスチドに局在した。これらの結果から、３０１〜３６９のアミノ酸残基のペプチド領域（α−ＡｍｙＩ−１ＳＢ（配列番号１））がタマネギ表皮細胞におけるα−アミラーゼＩ−１のプラスチドターゲッティングに必要不可欠であることが明らかとなった。
【００４４】
【表４】
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【実施例３】
【００４５】
α−アミラーゼのアイソフォーム（ＡｍｙＩＩ−３、ＡｍｙＩＩ−４、ＡｍｙＩＩ−５およびＡｍｙＩＩ−６）が、タマネギ表皮細胞のプラスチドに局在するか否かをα−アミラーゼのアイソフォームとＧＦＰの融合タンパク質（ＡｍｙＩＩ−３−ＧＦＰ、ＡｍｙＩＩ−４−ＧＦＰ、ＡｍｙＩＩ−５−ＧＦＰおよびＡｍｙＩＩ−６−ＧＦＰ）を用いて調べた。
【００４６】
イネα−アミラーゼには多くのアイソフォームが存在し、これらのアイソフォームは多くの遺伝子によってコードされていることが知られている（O'Neill, S.D., Kumagai, M.H., Majumdar, A., Huang, N., Sutliff, T.D. and Rodriguez, R.L. (1990) The alpha-amylase genes in Oryza sativa: characterization of cDNAclones and mRNA expression during seed germination. Mol. Gen. Genet. 221: 235-244；Huang, N., Koizumi, N., Reinl, S., Rodriguez, R.L. (1990a) Structural organization and differential expression of rice a-amylase genes. Nucl. Acid Res. 18: 7007-7013；Huang, N., Sutliff, T.D., Litts, J.C., Rodriguez, R.L. (1990b) Classification and characterization of the rice a-amylase multigene family. Plant Mol. Biol. 14: 655-668；Kim, J.-K. and Wu, R. (1992) Nucleotide sequence of a high-pI rice (Oryza sativa) a-amylase gene. Plant Mol. Biol. 18: 399-402）。また、本発明者らは以前の研究において、ＲＡｍｙ１Ａ、ＲＡｍｙ３Ｂ、ＲＡｍｙ３Ｃ、ＲＡｍｙ３Ｄ、及びＲＡｍｙ３Ｅの天然の発現産物がイネ植物と組織培養で検出されたことを報告している（Mitsui, T., Yamaguchi, J. and Akazawa, T. (1996) Physicochemical and serological characterization of rice a-amylase isoforms and identification of their corresponding genes. Plant Physiol. 110: 1395-1404；Nanjo, Y., Asatsuma, S., Itoh, K., Hori, H. and Mitsui T. (2004) Proteomic identification of a-amylase isoforms encoded by RAmy3B/3C from germinating rice seeds. Biosci. Biotech. Biochem. 68: 112-118）。
【００４７】
ＡｍｙＩ−１−ＧＦＰのプラスチドにおける局在化と比較して、ＡｍｙＩＩ−３−ＧＦＰ、ＡｍｙＩＩ−４−ＧＦＰ、ＡｍｙＩＩ−５−ＧＦＰ、及びＡｍｙＩＩ−６−ＧＦＰはプラスチド内でほとんど局在していなかった（表４）。
【００４８】
さらに、タマネギ細胞におけるデンプン結合部位を変異させたα−アミラーゼＩ−１−ＧＦＰ融合タンパク質のターゲティング特性を調べて比較した。
【００４９】
図１３に、イネα−アミラーゼのアイソフォーム（アミラーゼＩ−１（Ｍ２４２８６）；アミラーゼＩＩ−３（Ｍ５９３５２）；アミラーゼＩＩ−４（Ｍ２４２８７）；アミラーゼＩＩ−５（Ｘ５６３３７）；アミラーゼＩＩ−６（Ｘ５６３３８））のアミノ酸配列の配列比較を示す。図１３に示されるα−アミラーゼＩ−１（ＲＡｍｙ１Ａ）、ＩＩ−３（ＲＡｍｙ３Ｅ）、ＩＩ−４（ＲＡｍｙ３Ｄ）とＩＩ−５／６（ＲＡｍｙ３Ｂ／３Ｃ）間のアミノ酸配列は約８３〜９０％の相同性を有する。
【００５０】
３０１Ｔｙｐ−３０２Ｔｙｐは、α−アミラーゼＩ−１のポリペプチドにおける特有のアミノ酸残基であった。その他のα−アミラーゼのアイソフォーム（α−アミラーゼＩＩ−３、ＩＩ−４、ＩＩ−５およびＩＩ−６）は、ペプチド領域３０１〜３６９のアミノ酸残基においてトリプトファンジペプチドを有していなかった（図１３）。リプトファン３０２をアラニン３０２に置換した場合、プラスチドへのＡｍｙＩ−１−ＧＦＰのターゲティングを強く阻害し、ＡｍｙＩ−１（Ｗ３０２Ａ）−ＧＦＰはＥＲ様網目状に保持されていた（図１４、表４）。これらの結果から、３０２Ｔｙｐ残基はタマネギ表皮細胞においてα−アミラーゼＩ−１のプラスチドターゲティングに必須であることが明らかになった。図１５に、プラスチドターゲティングのためのα−アミラーゼＩ−１のシグナル領域を示す。図１５に示される「ＳＰ」とはＥＲ（小胞体）膜透過シグナルペプチドを意味し、「ＴＳＲ」とはプラスチドターゲティングのためのシグナル領域（すなわち、α−アミラーゼＩ−１の３０１〜３６９ペプチド領域（デンプン結合領域））を意味する。なお、α−アミラーゼは、３つのドメインからなり、ドメインＡは、(β／α)８バレルに折り重なり、酵素の触媒残基を含み、ドメインＢは、ドメインＡの３番目のβ鎖と３番目のαへリックスの間から突き出している大きなループであり、ドメインＣは、(β／α)8バレルのＣ末端に位置し、β鎖からなっている。
【００５１】
以下の実施例４において使用される生物学的材料、試薬、実験方法等は次の通りである。尚、特に説明のない材料等については上記実施例で使用したものと同様である。
【００５２】
（供試植物）
供試植物として、イネ品種「日本晴」（Oryza sativa L. cv. Nipponbare）を用いた。そのイネの種子は、新潟農業研究所より提供されたものである。
【００５３】
（分析法）
デンプンの含量は、Matsukura C, Saitoh T, Hirose T, Ohsugi R, Perata P, Yamaguchi J (2000) Sugar uptake and transport in rice embryo. Expression of companion cell-specific sucrose transporter (OsSUT1) induced by sugar and light. Plant Physiology 124: 85-93、及びBradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. . Anal. Biochem. 72: 248-254に記載の方法に従って決定した。α−アミラーゼの分析法は、Mitsui T, Yamaguchi J, Akazawa T (1996) Physicochemical and serological characterization of rice α-amylase isoforms and identification of their corresponding genes. Plant Physiology 110: 1395-1404に記載の方法に従って行った。
【００５４】
（ベクターの構築）
ｐＺＨ２Ｂ−３５Ｓ−ＡｍｙＩ−１及びｐＴＮ１−３５Ｓ−ＡｍｙＩＩ−４の構築は、Asatsuma S, Sawada C, Itoh K, Okito M, Kitajima A, Mitsui T (2005) Involvement of α-amylase I-1 in starch degradation in rice chloroplasts. Plant & Cell Physiology 46: 858-869及びHajdukiewicz P, Svab Z, Maliga P (1994) The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology 25: 989-994に記載の方法に従って行った（図１６）。ｐＡｍｙＩＩ−４をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで消化して得られたフラグメントを、ｐＴＮ１−３５Ｓ−ＡｍｙＩ−１をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで消化した対応する制限部位にクローニングし、ｐＴＮ１−３５Ｓ−ＡｍｙＩＩ−４を作成した（図１７）。
【００５５】
（α−アミラーゼ過剰発現植物体の作成）
上述のようにして作成されたベクターを、２０ｍＭのＣaＣｌ２で処理されたアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）ＥＨＡ１０１株のコンピテント細胞へ導入し、暗所でプレート培養して導入されたアグロバクテリウムを選抜した。プラスミドが導入されたアグロバクテリウムをアセトシリンゴン存在下でイネの胚組織から誘導したカルスに感染させた。感染後、抗生物質を含んだプレート培地上でプラスミドが誘導されたカルスを選抜し、植物ホルモン（ＮＡＡ）により植物体に再分化させた（Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T (1994) Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal 6: 271-282及びAsatsuma S, Sawada C, Itoh K, Okito M, Kitajima A, Mitsui T (2005) Involvement of α-amylase I-1 in starch degradation in rice chloroplasts. Plant & Cell Physiology 46: 858-869）。
【００５６】
（植物体の生育）
再生した植物体をポットに移し、明所１２時間、暗所８時間、２７℃のグロスチャンバー内で２０ｃｍ程度になるまで生育させた。その後、温室に移し種子を採取するまで約６ヶ月間生育させた。開花後、４０日ほどで種子を刈り取った。
【００５７】
（サザンブロット解析、ノーザンブロット解析、ウエスタンブロット解析）
野生型および形質転換イネの若葉より単離したゲノムＤＮＡ（５μｇ）をＥｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動で分画した後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロン膜（Amersham）に転写・固定した。ノーザンブロット解析は、Mitsui T, Loboda T, Kamimura I, Hori H, Itoh K, Mitsunaga S, (1999) Sucrose-controlled transport and turnover of α-amylase in rice (Oryza sativa L.) cells. . Plant Cell Physiol. 40 884-893およびKashem MA, Itoh K, Iwabuchi S, Hori H, Mitsui T (2000) Possible involvement of phosphoinositide-Ca2+ signaling in the regulation of alpha-amylase expression and germination of rice seed (Oryza sativa L.). Plant & Cell Physiology 41: 399-407に記載の手順に従って行った。サザンブロット解析に関し、α−アミラーゼＩ−１遺伝子およびα−アミラーゼＩＩ−４遺伝子の特異的ＤＮＡ（前出のKashem et al. 2000）を放射性プローブとして使用した。オートラジオグラフィーは、画像解析装置ＢＡＳ５０００（フジフィルム）を用いて行った。ウエスタンブロット解析、抗α−アミラーゼＩ−１抗体及び抗α−アミラーゼＩＩ−４抗体の調製法等は、Mitsui T, Yamaguchi J, Akazawa T (1996) Physicochemical and serological characterization of rice α-amylase isoforms and identification of their corresponding genes. Plant Physiology 110: 1395-1404に記載の方法に従って行った。２次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を使用した。そのタンパク質バンドをＥＣＬ（化学発光、Amersham）を用いて可視化し、ＬＡＳ３０００（フジフィルム）を用いて定量化した。野生型イネ植物において発現するα−アミラーゼＩ−１およびＩＩ−４の各タンパク質の量を１ユニットとした。
【実施例４】
【００５８】
特異的抗体（例えば抗α−アミラーゼＩ−１，ＩＩ−３，ＩＩ−４，ＩＩ−５およびＩＩ−６）を用いてウエスタンブロット解析を行い、登熟期間中のイネ登熟種子におけるα−アミラーゼのアイソフォームの発現を調べた。出穂後１０日目の登熟種子において、α−アミラーゼＩ−１およびＩＩ−４の発現を検出した（図１８）。興味深いことに、α−アミラーゼＩＩ−４が登熟種子において最も多量に存在するアイソフォームであることが示唆された。
【００５９】
カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターの制御下それぞれα−アミラーゼＩ−１（ＡｍｙＩ−１）とα−アミラーゼＩＩ−４ｃＤＮＡ（ＡｍｙＩＩ−４）を含むｐＺＨ２Ｂ−３５Ｓ−ＡｍｙＩ−１とｐＴＮ１−３５Ｓ−ＡｍｙＩＩ−４を用いて、アグロバクテリウムを介した形質転換によって、遺伝組換えイネ植物を産出した。ＡｍｙＩ−１およびＡｍｙＩＩ−４の存在を、サザンハイブリダイゼーションを用いて再生された形質転換植物中において確認した。得られた形質転換イネ植物は１〜８コピーの導入遺伝子を有していた（図示せず）。また、ｐＺＨ２Ｂ−３５Ｓ−ＡｍｙＩ−１とｐＴＮ１−３５Ｓ−ＡｍｙＩＩ−４で形質転換されたこれらの遺伝子導入系統におけるα−アミラーゼ遺伝子発現を、ノーザンおよびウエスタンブロット解析を用いて調べた。結果を図１９に示す。図１９に示されるように、これらの形質転換イネ系統の双方が、成葉およびＴ１世代のシュート組織においてα−アミラーゼのｍＲＮＡおよびタンパク質の著しい増加を示した。また、α−アミラーゼＩ−１（Ａ３−１）を過剰発現した葉におけるデンプン含有量は、野生型（ＷＴ）のものと比較して著しく減少し、そのデンプン含有量は野生型の約４２％であった。（図２０）。一方、α−アミラーゼＩＩ−４（Ｄ１−４）を過剰発現した葉におけるデンプン含有量はわずかに減少し、野生型のデンプン含有量の約８２％であった。
【００６０】
Ａ３−１およびＤ１−４のＴ３世代の登熟期において、野生型と比較しα−アミラーゼのより高い活性はα−アミラーゼＩ−１およびＩＩ−４を発現する形質転換植物の両方の登熟種子で検出された（図２１）。図２１の縦軸はα−アミラーゼ活性（unit／seed）を示し、横軸は出穂後の日数（daf：days  after  heading）を示す。Ｄ１−４系統の登熟種子に含まれるα−アミラーゼ活性のレベルは、Ａ３−１系統の約２倍の活性を示した。
【００６１】
さらに、Ａ３−１系統およびＤ１−４系統の登熟種子表現型の特性を分析した。α−アミラーゼＩ−１とα−アミラーゼＩＩ−４に対する特異的抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った場合、野生型の種子と比較し、Ａ３−１系統の登熟種子においてα−アミラーゼＩ−１分子は３６倍もの増加を示し、Ｄ１−４系統の登熟種子においてα−アミラーゼＩＩ−４分子は４４倍もの増加を示した（図２２−Ａ）。酵素活性の増加はＡ３−１及びＤ１−４系統の登熟種子の両方で示されたが、Ｄ１−４系統ではより顕著な増加が示された（図２２−Ｂ）。Ａ３−１及びＤ１−４系統の登熟種子の乾燥重量は、野生型の種子と比較し、Ａ３−１系統で４％、Ｄ１−４系統で１１％の減少が見られた（図２２−Ｃ）。
【００６２】
また、α−アミラーゼＩ−１とα−アミラーゼＩＩ−４を過剰発現した形質転換体イネ系統（Ａ３−１及びＤ１−４系統）の完熟種子の品質を反射光画像と透過光画像の双方によって評価した（図２３）。表５に示すように、形質転換体イネ系統から得られた種子においては、ともにデンプン蓄積異常が見られ、野生型，Ａ３−１系統及びＤ１−４系統の正常な穀粒のパーセンテージはそれぞれ９０％，５４．４％，３６．５％であった。Ａ３−１系統及びＤ１−４系統の異常な種子の特徴的な形態学的表現型はそれぞれ心白（white core）と全乳白（whole opaque white）であった（図２３、表５）。これらの結果から、α−アミラーゼ活性の異常な発現はデンプンの集積およびイネ粒構造に影響することが示された。また、α−アミラーゼＩ−１とα−アミラーゼＩＩ−４は、登熟種子の胚乳におけるアミロプラストに局在する能力を有し、デンプン集積（分解）調節機能を有すると考えられる。
【００６３】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】高等植物細胞におけるα−アミラーゼＩ−１のプラスチドターゲティング機構を示す図である。
【図２】プラスチドコンストラクトを構築した例を示す図である。
【図３】ｐＡｍｙＩＩ−３，ｐＡｍｙＩＩ−５及びｐＡｍｙＩＩ−６の作成過程を示す図である。
【図４】ｐＡｍｙＩ−１及びｐＡｍｙＩＩ−４のマップである。
【図５】種々のｐＡｍｙ−ＧＦＰの作成過程を示す図である。
【図６】ｐＡｍｙＩ−１（Ｗ３０２Ａ）−ＧＦＰの作成過程を示す図である。
【図７】ｐＤｓＲｅｄの作成過程を示す図である。
【図８】ｐＷｘＴＰ−ＤｓＲｅｄの作成過程を示す図である。
【図９】ｐＷｘＴＰ−ＧＦＰの作成過程を示す図である。
【図１０】ｐＰＴＳ２−ＧＦＰおよびｐｍｔ−ＧＦＰを構築した例を示す図である。
【図１１】ＡｍｙＩ−１−ＧＦＰとＷｘＴＰ−ＤｓＲｅｄのタマネギ表皮細胞での同時発現の結果を示す図である。Ａ，ＤはＡｍｙＩ−１−ＧＦＰの蛍光像を示し、Ｂ，ＥはＷｘＴＰ−ＤｓＲｅｄの蛍光像を示し、Ｃ，ＦはＧＦＰとＤｓＲｅｄの重ね合わせ像を示す。下図（Ｄ，Ｅ，Ｆ）は、上図（Ａ，Ｂ，Ｃ）の拡大図である。
【図１２】遺伝子導入されたタマネギ表皮細胞における一部切断されたα−アミラーゼＩ−１−ＧＦＰの局在を示す図である。Ａ〜Ｅの左側、中央、右側はそれぞれＷｘＴＰ−ＤｓＲｅｄ画像、ＡｍｙＩ−１−ＧＦＰ画像、ＷｘＴＰ−ＤｓＲｅｄとＡｍｙＩ−１−ＧＦＰの重ね合わせ画像を示す。
【図１３】イネα−アミラーゼのアイソフォーム（アミラーゼＩ−１（Ｍ２４２８６）；アミラーゼＩＩ−３（Ｍ５９３５２）；アミラーゼＩＩ−４（Ｍ２４２８７）；アミラーゼＩＩ−５（Ｘ５６３３７）；アミラーゼＩＩ−６（Ｘ５６３３８））のアミノ酸配列の配列比較を示す図である。矢頭は、Ｎ末端シグナルペプチドの開裂部位を示す。＊＊（アスタリスク２）印の個所は、推定デンプン結合部位を示す。下線個所は、グリコシル化部位を示す。
【図１４】ＡｍｙＩ−１（Ｗ３０２Ａ）−ＧＦＰとＷｘＴＰ−ＤｓＲｅｄのタマネギ表皮細胞での同時発現を示す図である。
【図１５】プラスチドへのターゲティングに関するα−アミラーゼＩ−１のシグナル領域を示す図である。
【図１６】ｐＺＨ２Ｂ−３５Ｓ−ＡｍｙＩ−１の作成過程を示す図である。
【図１７】ｐＴＮ１−３５Ｓ−ＡｍｙＩＩ−４の作成過程を示す図である。
【図１８】抗α−アミラーゼＩ−１，ＩＩ−３，ＩＩ−４，ＩＩ−５およびＩＩ−６を用いてウエスタンブロット解析を行った結果を示す図である。
【図１９】α−アミラーゼＩ−１（Ａ）及びα−アミラーゼＩＩ−４（Ｂ）を過剰発現したイネ植物のノーザンブロット解析およびウエスタンブロット解析を行った結果を示す図である。
【図２０】（Ａ）は、野生型（ＷＴ）、α−アミラーゼＩ−１（Ａ３−１）およびα−アミラーゼＩＩ−４（Ｄ１−４）を過剰発現した葉におけるデンプン含有量の結果を示し、（Ｂ）はα−アミラーゼの発現の結果を示すグラフである。
【図２１】形質転換植物（Ａ３−１およびＤ１−４）及び野生型（ＷＴ）の登熟種子におけるα−アミラーゼ活性の変化を示す図である。
【図２２】（Ａ）は、野生型（ＷＴ）、α−アミラーゼＩ−１（Ａ３−１）およびα−アミラーゼＩＩ−４（Ｄ１−４）を過剰発現した完熟種子のα−アミラーゼ発現の結果を示し、（Ｂ）は、α−アミラーゼ活性の結果を示し、（Ｃ）は完熟種子の乾燥重量の結果を示すグラフである。
【図２３】（Ａ）は、野生型（ＷＴ）、α−アミラーゼＩ−１及びα−アミラーゼＩＩ−４を過剰発現した形質転換体イネ系統（Ａ３−１及びＤ１−４系統）の完熟種子の反射光画像を示し、（Ｂ）は透過光画像を示す図である。
【図２】
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【図１３】
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【図２１】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
2007151435.tif 000028
【図２３】
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【配列表】
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