(57)【要約】【課題】複雑な構造を有する電極の内部に酵素を容易に浸透させて固定化することができることにより、電極の有効表面積を十分に利用することができ、高効率の酵素固定化電極を得ることができる製造方法を提供する。【解決手段】ポーラスカーボン電極などの複雑な構造を有する電極に酵素を固定化する場合に、この電極に酵素を固定化する際に用いる溶液にエタノールなどの有機溶媒を含ませる。こうして作製される酵素固定化電極をバイオ燃料電池のカソード電極２２などに用いる。あるいは燃料に有機溶媒を含ませる。【選択図】図４
2007280944.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極に酵素が固定化された酵素固定化電極の製造方法であって、
上記酵素を上記電極に固定化する際に用いる溶液に有機溶媒を含ませるようにした
ことを特徴とする酵素固定化電極の製造方法。
【請求項２】
上記有機溶媒がアルコールであることを特徴とする請求項１記載の酵素固定化電極の製造方法。
【請求項３】
上記電極に上記酵素に加えて電子メディエーターを固定化することを特徴とする請求項１記載の酵素固定化電極の製造方法。
【請求項４】
電極に酵素が固定化された酵素固定化電極であって、
上記酵素を上記電極に固定化する際に用いる溶液に有機溶媒を含ませたものを用いて製造される
ことを特徴とする酵素固定化電極。
【請求項５】
カソード電極とアノード電極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記カソード電極および／または上記アノード電極に酵素が固定化されている燃料電池の製造方法であって、
上記酵素を上記カソード電極および／または上記アノード電極に固定化する際に用いる溶液に有機溶媒を含ませるようにした
ことを特徴とする燃料電池の製造方法。
【請求項６】
カソード電極とアノード電極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記カソード電極および／または上記アノード電極に酵素が固定化されている燃料電池であって、
上記酵素を上記カソード電極および／または上記アノード電極に固定化する際に用いる溶液に有機溶媒を含ませたものを用いて上記カソード電極および／または上記アノード電極が製造される
ことを特徴とする燃料電池。
【請求項７】
カソード電極とアノード電極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記カソード電極および／または上記アノード電極に酵素が固定化されている燃料電池であって、
燃料に有機溶媒を含ませた
ことを特徴とする燃料電池。
【請求項８】
一つまたは複数の燃料電池を用いる電子機器において、
少なくとも一つの上記燃料電池が、
カソード電極とアノード電極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記カソード電極および／または上記アノード電極に酵素が固定化されている燃料電池であって、
上記酵素を上記カソード電極および／または上記アノード電極に固定化する際に用いる溶液に有機溶媒を含ませたものを用いて上記カソード電極および／または上記アノード電極が製造されるものである
ことを特徴とする電子機器。
【請求項９】
一つまたは複数の燃料電池を用いる電子機器において、
少なくとも一つの上記燃料電池が、
カソード電極とアノード電極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記カソード電極および／または上記アノード電極に酵素が固定化されている燃料電池であって、
燃料に有機溶媒を含ませたものである
ことを特徴とする電子機器。
【請求項１０】
電極に酵素が固定化された酵素固定化電極を有する酵素反応利用装置の製造方法であって、
上記酵素を上記電極に固定化する際に用いる溶液に有機溶媒を含ませるようにした
ことを特徴とする酵素反応利用装置の製造方法。
【請求項１１】
電極に酵素を含む凝集体が固定化されている酵素固定化電極。
【請求項１２】
上記凝集体がさらに電子メディエーターを含むことを特徴とする請求項１１記載の酵素固定化電極。
【請求項１３】
上記凝集体がさらに補酵素を含むことを特徴とする請求項１１記載の酵素固定化電極。
【請求項１４】
上記凝集体がさらにリン脂質またはその誘導体を含むことを特徴とする請求項１１記載の酵素固定化電極。
【請求項１５】
上記凝集体が略球形の微粒子からなることを特徴とする請求項１１記載の酵素固定化電極。
【請求項１６】
上記微粒子の直径が１μｍ以下であることを特徴とする請求項１５記載の酵素固定化電極。
【請求項１７】
上記微粒子がポリイオンコンプレックスにより形成されていることを特徴とする請求項１５記載の酵素固定化電極。
【請求項１８】
カソード電極とアノード電極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記カソード電極および／または上記アノード電極に酵素を含む凝集体が固定化されている燃料電池。
【請求項１９】
電極に酵素を含む層が固定され、上記層には空隙が設けられ、反応物または酸素が上記空隙を通じて上記酵素に供給される酵素固定化電極。
【請求項２０】
上記空隙は略球形であり、上記空隙の直径が１μｍ以下であることを特徴とする請求項１９記載の酵素固定化電極。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、酵素固定化電極およびその製造方法ならびに燃料電池およびその製造方法ならびに電子機器ならびに電極反応利用装置の製造方法に関し、特に、酵素を用いたバイオ燃料電池、このバイオ燃料電池を電源に用いる各種の機器、装置、システムなど、さらにはバイオセンサー、バイオリアクターなどに適用して好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
生物内で行われている生体代謝は基質選択性が高く、極めて高効率な反応機構であり、室温・中性の比較的穏やかな雰囲気下で反応が進行する特徴を持つ。ここで言う生体代謝には、酸素や糖類・脂肪・タンパク質などの種々の栄養素を、微生物や細胞の成長に必要なエネルギーに変換する呼吸や光合成などが含まれる。
【０００３】
このような生体内反応には、タンパク質からなる生体触媒、すなわち酵素が大きく関与している。この酵素の触媒作用を利用するという考え方は、人類の歴史とともに古くから実践されてきた。特に、酵素を固定化して使用するという考え方および手法は古くから検討されており、酵素を高密度で固定化することにより、少ない酵素量で高い触媒性能を示し、かつ特異性の高い酵素を一般の化学反応に用いられているような固体触媒と同様に取り扱うことができ、酵素の利用方法として非常に有用である。その応用範囲は醸造業、発酵業、繊維工業、皮革工業、食品工業、医薬品工業など多種にわたり、近年では、その触媒機能を電極系に組み込んだバイオセンサー、バイオリアクター、バイオ燃料電池など、エレクトロニクス分野への応用も検討・実用化されてきている（例えば、特許文献１〜４参照。）。
【０００４】
酵素を電極系に応用する場合にも同様なことが言え、電極上に酵素を高密度で固定化することにより、電極近傍で起こっている酵素反応現象を効率良く電気信号として捉えることが可能となる。ちなみに、電極系を検討する場合、タンパク質である酵素と電極との間では、一般的に、電子媒介が起こり難く、電子伝達媒体となる電子メディエーター（電子受容体化合物）が必要となるが、この電子メディエーターも酵素と同様に固定化されるのが望ましい。
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−１３３２９７号公報
【特許文献２】特開２００３−２８２１２４号公報
【特許文献３】特開２００４−７１５５９号公報
【特許文献４】特開２００５−１３２１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、本発明者らの検討によれば、複雑な構造を有し、有効表面積が大きい電極（例えば、ポーラスカーボン電極、カーボンペレット電極、カーボンフェルト電極、カーボンペーパー電極など）や撥水性の高い電極では、酵素や電子メディエーターが電極内部まで浸透しないためにこれらを電極内部の表面に固定化することが困難であり、電極の有効表面積を十分に利用することができなかった。そして、バイオ燃料電池においては、上記のような複雑な構造を有する電極をカソード電極またはアノード電極に用いた場合、これらの電極の有効表面積を反映する電流値を得ることが難しかった。
【０００７】
そこで、この発明が解決しようとする課題は、例えばポーラスカーボン電極などの複雑な構造を有する電極の内部に酵素や電子メディエーターを容易に浸透させて固定化することができ、電極の有効表面積を十分に利用することができ、高効率の酵素固定化電極の製造方法およびこの方法により製造される高効率の酵素固定化電極ならびにこの酵素固定化電極を用いた燃料電池の製造方法およびこの方法により製造される高効率の燃料電池ならびにこの酵素固定化電極を用いた高効率の電極反応利用装置の製造方法を提供することである。
上記課題および他の課題は、添付図面を参照した本明細書の以下の記述により明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ポーラスカーボン電極などの複雑な構造を有する電極に酵素を固定化する際に用いる溶液に有機溶媒を加えることにより、酵素の活性を損なうことなく、酵素を電極内部に容易に浸透させて電極内部の表面に三次元的に高密度に固定化することができることを見出した。また、燃料電池においては、燃料に有機溶媒を含ませることにより、同様な効果を得ることができることを見出した。
この発明は、本発明者らが得た上記の知見に基づいて案出されたものである。
【０００９】
すなわち、上記課題を解決するために、第１の発明は、
電極に酵素が固定化された酵素固定化電極の製造方法であって、
上記酵素を上記電極に固定化する際に用いる溶液に有機溶媒を含ませるようにした
ことを特徴とするものである。
第２の発明は、
電極に酵素が固定化された酵素固定化電極であって、
上記酵素を上記電極に固定化する際に用いる溶液に有機溶媒を含ませたものを用いて製造される
ことを特徴とするものである。
【００１０】
第１および第２の発明において、酵素固定化電極においては、例えば、ポーラスカーボン電極、カーボンペレット電極、カーボンフェルト電極、カーボンペーパー電極などのカーボン系材料からなる電極や撥水性の高い電極などに酵素が固定化され、好適には酵素に加えて電子メディエーターも固定化される。酵素は例えば分解酵素、特に燃料分解酵素であり、必要に応じてこれに加えて他の一種または二種以上の酵素を含む。
【００１１】
酵素を電極に固定化する際に用いる溶液（酵素溶液）は通常、リン酸緩衝液やトリス緩衝液などの従来公知の緩衝液に酵素を溶解させたものであり、これに有機溶媒を所要量含ませる。この酵素溶液中の有機溶媒濃度は必要に応じて選ぶことができるが、触媒電流値の増加を図るために、有機溶媒濃度は、好適には例えば５％以上６５％以下の範囲、より好適には１０％以上６０％以下、さらに好適には２０％以上４０％以下の範囲とする。有機溶媒としては各種のものを用いることができ、極性溶媒、非極性溶媒のいずれであってもよく、プロトン性溶媒、非プロトン性溶媒のいずれであってもよく、二種以上の有機溶媒を用いてもよい。有機溶媒としては、具体的には、アルコール、エーテル、ケトン（アセトンなど）、芳香族系炭化水素、塩素化炭化水素化合物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。アルコールとしては、基本的にはどのようなものを用いてもよく、一価アルコールでも多価アルコールでもよく、飽和アルコールでも不飽和アルコールでもよい。アルコールとしては、具体的には、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、１−ブタノール、２−ブタノール（ｓｅｃ−ブタノール）、２−メチル−１−プロパノール（イソブタノール）、２−メチル−２−プロパノール（ｔｅｒｔ−ブタノール）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１２】
第３の発明は、
カソード電極とアノード電極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記カソード電極および／または上記アノード電極に酵素が固定化されている燃料電池の製造方法であって、
上記酵素を上記カソード電極および／または上記アノード電極に固定化する際に用いる溶液に有機溶媒を含ませるようにした
ことを特徴とするものである。
【００１３】
第４の発明は、
カソード電極とアノード電極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記カソード電極および／または上記アノード電極に酵素が固定化されている燃料電池であって、
上記酵素を上記カソード電極および／または上記アノード電極に固定化する際に用いる溶液に有機溶媒を含ませたものを用いて上記カソード電極および／または上記アノード電極が製造される
ことを特徴とするものである。
【００１４】
酵素が固定化されるカソード電極および／またはアノード電極においては、好適には、例えば、ポーラスカーボン電極、カーボンペレット電極、カーボンフェルト電極、カーボンペーパー電極などのカーボン系材料からなる電極や撥水性の高い電極などに酵素が固定化され、好適には酵素に加えて電子メディエーターも固定化される。酵素は例えば分解酵素、特に燃料分解酵素であり、必要に応じてこれに加えて他の一種または二種以上の酵素を含む。
【００１５】
燃料としては、各種のものを用いることができ、必要に応じて選ばれるが、代表的なものを挙げると、メタノール、エタノール、単糖類、多糖類などである。単糖類、多糖類などを燃料に用いる場合、典型的には、これらをリン酸緩衝液やトリス緩衝液などの従来公知の緩衝液に溶かした燃料溶液の形で用いる。
例えば、燃料としてグルコースのような単糖類を用いる場合には、好適には、酵素として、単糖類の酸化を促進し分解する酸化酵素と、酸化酵素によって還元される補酵素を酸化体に戻す補酵素酸化酵素とが固定化される。この補酵素酸化酵素の作用により、補酵素が酸化体に戻るときに電子が生成され、補酵素酸化酵素から電子メディエーターを介して電極に電子が渡される。酸化酵素としては例えばグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が、補酵素としては例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+ ）あるいはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+ ）が、補酵素酸化酵素としては例えばジアホラーゼ（ＤＩ）が用いられる。
【００１６】
アノード電極に上記の電子メディエーター、補酵素としての還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、酸化酵素としてのグルコースデヒドロゲナーゼおよび補酵素酸化酵素としてのジアホラーゼを固定化する場合、最も好適には、これらを１．０（ｍｏｌ）：０．３３〜１．０（ｍｏｌ）：（１．８〜３．６）×１０6 （Ｕ）：（０．８５〜１．７）×１０7 （Ｕ）の比で固定化する。ただし、Ｕ（ユニット）とは、酵素活性を示す一つの指標であり、ある温度およびｐＨにおいて１分間当たり１μｍｏｌの基質が反応する度合いを示す。
【００１７】
燃料として多糖類（広義の多糖類であり、加水分解によって２分子以上の単糖を生じる全ての炭水化物を指し、二糖、三糖、四糖などのオリゴ糖を含む）を用いる場合には、好適には、上記の酸化酵素、補酵素酸化酵素、補酵素および電子メディエーターに加えて、多糖類の加水分解などの分解を促進し、グルコースなどの単糖類を生成する分解酵素も固定化される。多糖類としては、具体的には、例えば、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、マルトース、スクロース、ラクトースなどが挙げられる。これらは単糖類が二つ以上結合したものであり、いずれの多糖類においても結合単位の単糖類としてグルコースが含まれている。なお、アミロースとアミロペクチンとはデンプンに含まれる成分であり、デンプンはアミロースとアミロペクチンとの混合物である。多糖類の分解酵素としてグルコアミラーゼを用い、単糖類を分解する酸化酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを用いた場合には、グルコアミラーゼによりグルコースにまで分解することができる多糖類、例えばデンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、マルトースのいずれかを含むものであれば、これを燃料として発電することが可能となる。なお、グルコアミラーゼはデンプンなどのα−グルカンを加水分解しグルコースを生成する分解酵素であり、グルコースデヒドロゲナーゼはβ−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに酸化する酸化酵素である。
【００１８】
分解酵素としてセルラーゼを用い、酸化酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを用いた燃料電池では、セルラーゼによりグルコースにまで分解することができるセルロースを燃料とすることができる。セルラーゼは、より詳しくはセルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）、エキソセロビオヒドラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）などのいずれか少なくとも一種である。なお、分解酵素としてグルコアミラーゼとセルラーゼとを混合して用いてもよく、この場合には、自然界で生産される多糖類の大半を分解することができるため、これらを多く含むもの、例えば生ごみなどを燃料とすることが可能となる。
【００１９】
また、分解酵素としてα−グルコシダーゼを用い、酸化酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを用いた燃料電池では、α−グルコシダーゼによりグルコースに分解されるマルトースを燃料とすることができる。
また、分解酵素としてスクラーゼを用い、酸化酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを用いた燃料電池では、スクラーゼによりグルコースとフルクトースとに分解されるスクロースを燃料とすることができる。スクラーゼは、より詳しくはα−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０）、スクロース−α−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４８）、β−フルクトフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２６）などの少なくともいずれか一種である。
また、分解酵素としてβ−ガラクトシダーゼを用い、酸化酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを用いた燃料電池では、β−ガラクトシダーゼによりグルコースとガラクトースとに分解されるラクトースを燃料とすることができる。
必要に応じて、これらの燃料となる多糖類もアノード電極上に固定化してもよい。
【００２０】
特に、デンプンを燃料とする燃料電池では、デンプンを糊化してゲル状の固形化燃料としたものを用いることもできる。この場合、糊化したデンプンを酵素などが固定化されたアノード電極に接触させるか、あるいはアノード電極上に酵素などとともに固定化する方法をとることができる。このような電極を用いると、アノード電極表面のデンプン濃度を、溶液中に溶解したデンプンを用いた場合よりも高い状態に保持することができ、酵素による分解反応がより速くなり、出力が向上するとともに、燃料の取り扱いが溶液の場合よりも容易で、燃料供給システムを簡素化することができ、しかも燃料電池を天地無用とする必要がないため、モバイル機器に用いたときに非常に有利である。
【００２１】
カソード電極に酵素が固定化される場合、この酵素は、典型的には酸素を還元する酵素を含む。この酸素を還元する酵素としては、例えば、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどを用いることができる。この場合、カソード電極には、好適には、酵素に加えて電子メディエーターも固定化される。電子メディエーターとしては、例えば、ヘキサシアノ鉄酸カリウム、フェリシアン化カリウム、オクタシアノタングステン酸カリウムなどを用いる。電子メディエーターは、好適には、十分に高濃度、例えば、平均値で０．６４×１０-6ｍｏｌ／ｍｍ2 以上固定化する。
【００２２】
アノード電極またはカソード電極としては、上述の電極を用いることができるほか、多孔体材料からなる骨格と、この骨格の少なくとも一部の表面を被覆する、カーボン系材料を主成分とする材料とを含む多孔体導電材料を用いることができる。この多孔体導電材料は、多孔体材料からなる骨格の少なくとも一部の表面に、カーボン系材料を主成分とする材料をコーティングすることにより得ることができる。この多孔体導電材料の骨格を構成する多孔体材料は、多孔率が高くても骨格を安定に維持することができるものであれば、基本的にはどのようなものであってもよく、導電性の有無も問わない。多孔体材料としては、好適には、高多孔率および高導電性を有する材料が用いられる。このような高多孔率および高導電性を有する多孔体材料としては、具体的には、金属材料（金属または合金）や、骨格を強固にした（もろさを改善した）カーボン系材料などを用いることができる。多孔体材料として金属材料を用いる場合、金属材料は溶液のｐＨや電位などの使用環境との兼ね合いにより状態安定性が異なることから様々な選択肢が考えられるが、例えば、ニッケル、銅、銀、金、ニッケル−クロム合金、ステンレス鋼などの発泡金属あるいは発泡合金は入手しやすい材料の一つである。多孔体材料としては、上記の金属材料やカーボン系材料以外に樹脂材料（例えば、スポンジ状のもの）を用いることもできる。この多孔体材料の多孔率および孔径（孔の最小径）は、この多孔体材料からなる骨格の表面にコーティングする、カーボン系材料を主成分とする材料の厚さとの兼ね合いで、多孔体導電材料に要求される多孔率および孔径に応じて決められる。この多孔体材料の孔径は一般的には１０ｎｍ〜１ｍｍ、典型的には１０ｎｍ〜６００μｍである。一方、骨格の表面を被覆する材料は、導電性を有し、想定される作動電位において安定なものを用いる必要がある。ここでは、このような材料としてカーボン系材料を主成分とする材料を用いる。カーボン系材料は一般に電位窓が広く、しかも化学的に安定なものが多い。このカーボン系材料を主成分とする材料は、具体的には、カーボン系材料のみからなるものと、カーボン系材料を主成分とし、多孔体導電材料に要求される特性などに応じて選ばれる副材料を微量含む材料とがある。後者の材料の具体例を挙げると、カーボン系材料に金属などの高導電性材料を添加することにより電気伝導性を向上させた材料や、カーボン系材料にポリテトラフルオロエチレン系材料などを添加することにより表面撥水性を付与するなど、導電性以外の機能を付与した材料である。カーボン系材料にも様々な種類が存在するが、いかなるカーボン系材料であってもよく、カーボン単体のほか、カーボンに他の元素を添加したものであってもよい。このカーボン系材料は、特に、高導電性・高表面積を有する微細粉末カーボン材料が好ましい。このカーボン系材料としては、具体的には、例えば、ＫＢ（ケッチェンブラック）などの高導電性を付与したものや、カーボンナノチューブ、フラーレンなどの機能性カーボン材料などを用いることができる。このカーボン系材料を主成分とする材料のコーティング方法は、必要に応じて適当な結着剤を用いるなどして多孔体材料からなる骨格の���面にコーティング可能であれば、いかなるコーティング方法を用いてもよい。この多孔体導電材料の孔径は、その孔を通して基質などを含む溶液が容易に出入り可能な程度の大きさに選ばれ、一般的には９ｎｍ〜１ｍｍ、より一般的には１μｍ〜１ｍｍ、さらに一般的には１〜６００μｍである。多孔体材料からなる骨格の少なくとも一部の表面がカーボン系材料を主成分とする材料により被覆された状態、あるいは、多孔質材料からなる骨格の少なくとも一部の表面をカーボン系材料を主成分とする材料によりコーティングした状態では、孔が全て互いに連通し、あるいは、カーボン系材料を主成分とする材料による目詰まりが発生しないようにするのが望ましい。
【００２３】
プロトン伝導体として緩衝物質（緩衝液）を含む電解質を用いる場合には、高出力動作時に十分な緩衝能を得ることができ、酵素が本来持っている能力を十分に発揮することができるようにするために、電解質に含まれる緩衝物質の濃度を０．２Ｍ以上２．５Ｍ以下にすることが有効であり、好適には０．２Ｍ以上２Ｍ以下、より好適には０．４Ｍ以上２Ｍ以下、さらに好適には０．８Ｍ以上１．２Ｍ以下とする。緩衝物質は、一般的には、ｐＫa が６以上９以下のものであれば、どのようなものを用いてもよいが、具体例を挙げると、リン酸二水素イオン（Ｈ2 ＰＯ4 - ）、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（略称トリス）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、カコジル酸、炭酸（Ｈ2 ＣＯ3 ）、クエン酸水素イオン、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（略称トリシン）、グリシルグリシン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（略称ビシン）などである。リン酸二水素イオン（Ｈ2 ＰＯ4 - ）を生成する物質は、例えば、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2 ＰＯ4 ）やリン酸二水素カリウム（ＫＨ2 ＰＯ4 ）などである。緩衝物質を含む電解質のｐＨは、好適には７付近であるが、一般的には１〜１４のいずれであってもよい。
【００２４】
この燃料電池は、およそ電力が必要なもの全てに用いることができ、大きさも問わないが、例えば、電子機器、移動体（自動車、二輪車、航空機、ロケット、宇宙船など）、動力装置、建設機械、工作機械、発電システム、コージェネレーションシステムなどに用いることができ、用途などによって出力、大きさ、形状、燃料の種類などが決められる。
第３および第４の発明においては、上記以外のことについては、その性質に反しない限り、第１および第２の発明に関連して説明したことが成立する。
【００２５】
第５の発明は、
カソード電極とアノード電極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記カソード電極および／または上記アノード電極に酵素が固定化されている燃料電池であって、
燃料に有機溶媒を含ませた
ことを特徴とするものである。
【００２６】
燃料に単糖類、多糖類などを用いる場合、典型的には、これらをリン酸緩衝液やトリス緩衝液などの従来公知の緩衝液に溶かした燃料溶液の形で用いる。この燃料溶液中の緩衝液に対する有機溶媒の体積比は必要に応じて選ぶことができるが、一般的には０％より大きく５０％以下であり、好適には５％以上３０％以下、より好適には５％以上１５％以下である。
第５の発明においては、上記以外のことについては、その性質に反しない限り、第１〜第４の発明に関連して説明したことが成立する。
【００２７】
第６の発明は、
一つまたは複数の燃料電池を用いる電子機器において、
少なくとも一つの上記燃料電池が、
カソード電極とアノード電極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記カソード電極および／または上記アノード電極に酵素が固定化されている燃料電池であって、
上記酵素を上記カソード電極および／または上記アノード電極に固定化する際に用いる溶液に有機溶媒を含ませたものを用いて上記カソード電極および／または上記アノード電極が製造されるものである
ことを特徴とするものである。
【００２８】
第６の発明による電子機器は、基本的にはどのようなものであってもよく、携帯型のものと据え置き型のものとの双方を含むが、具体例を挙げると、携帯電話、モバイル機器（携帯情報端末機（ＰＤＡ）など）、ロボット、パーソナルコンピュータ（デスクトップ型、ノート型の双方を含む）、ゲーム機器、カメラ一体型ＶＴＲ（ビデオテープレコーダ）、車載機器、家庭電気製品、工業製品などである。
第６の発明においては、その性質に反しない限り、第１〜第４の発明に関連して説明したことが成立する。
【００２９】
第７の発明は、
一つまたは複数の燃料電池を用いる電子機器において、
少なくとも一つの上記燃料電池が、
カソード電極とアノード電極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記カソード電極および／または上記アノード電極に酵素が固定化されている燃料電池であって、
燃料に有機溶媒を含ませた
ことを特徴とするものである。
第７の発明においては、上記以外のことについては、その性質に反しない限り、第１〜第６の発明に関連して説明したことが成立する。
【００３０】
第８の発明は、
電極に酵素が固定化された酵素固定化電極を有する酵素反応利用装置の製造方法であって、
上記酵素を上記電極に固定化する際に用いる溶液に有機溶媒を含ませるようにした
ことを特徴とするものである。
【００３１】
第８の発明において、電極反応利用装置には、上記の燃料電池、すなわちバイオ燃料電池のほか、バイオセンサー（グルコースセンサーなど）、バイオリアクターなどが含まれ、酵素としては個々の目的に応じたものが用いられる。
第８の発明においては、上記以外のことについては、その性質に反しない限り、第１〜第７の発明に関連して説明したことが成立する。
第９の発明は、
電極に酵素を含む凝集体が固定化されている酵素固定化電極である。
この酵素固定化電極においては、好適には、凝集体はさらに電子メディエーター、あるいは補酵素、あるいはリン脂質またはその誘導体、あるいはこれらの二以上を含む。リン脂質としては基本的にはどのようなものを用いてもよく、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質のいずれを用いてもよい。グリセロリン脂質としては、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール（カルジオリピン）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。スフィンゴリン脂質としては、スフィンゴミエリンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。ホスファチジルコリンの代表例はジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）である。凝集体は、典型的には、微粒子からなる。この微粒子は、例えば、ポリイオンコンプレックスなどにより形成されるが、これに限定されるものではない。この微粒子は、典型的には略球形であり、その直径は必要に応じて選ばれるが、例えば１μｍ以下である。
第１０の発明は、
カソード電極とアノード電極とがプロトン伝導体を介して対向した構造を有し、上記カソード電極および／または上記アノード電極に酵素を含む凝集体が固定化されている燃料電池である。
第９および第１０の発明においては、上記以外のことについては、その性質に反しない限り、第１〜第７の発明に関連して説明したことが成立する。
第１１の発明は、
電極に酵素を含む層が固定され、上記層には空隙が設けられ、反応物または酸素が上記空隙を通じて上記酵素に供給される酵素固定化電極である。
この酵素固定化電極においては、酵素を含む層は、例えば、電極上に一様に存在する。この層に設けられた空隙は典型的には略球形であり、この空隙の直径が１μｍ以下であるが、これに限定されるものではない。また、この層は、好適には、さらに電子メディエーター、あるいは補酵素、あるいはリン脂質またはその誘導体、あるいはこれらの二以上を含む。
第１１の発明においては、上記以外のことについては、その性質に反しない限り、第１〜第１０の発明に関連して説明したことが成立する。
【００３２】
上述のように構成されたこの発明においては、酵素を電極に固定化する際に用いる溶液あるいは燃料に含まれる有機溶媒の作用により、例えばポーラスカーボン電極などのように電極が複雑な構造を有する場合や電極の撥水性が高い場合でも、電極内部に酵素が容易に浸透するようになる。
また、電極に酵素を含む凝集体が固定化されている酵素固定化電極または電極に酵素を含む層が固定され、この層に空隙が設けられた酵素固定化電極では、凝集体の空隙を通して反応物の供給および生成物の排出を容易かつ円滑に行うことができる。
【発明の効果】
【００３３】
この発明によれば、電極内部への酵素の浸透が容易になるため、複雑な構造を有する電極の内部の表面全体に酵素を固定化することができる。このため、複雑な構造を有する電極の有効表面積を十分に利用して酵素を三次元的に高密度に固定化することができる。このため、電極上での酵素代謝反応を高効率に行わせることができ、高効率の酵素固定化電極を得ることができる。この酵素固定化電極を用いることにより、高効率の燃料電池あるいは電極反応利用装置を実現することができる。そして、このように高効率の燃料電池を用いることにより、高性能の電子機器などを実現することができる。
また、電極に酵素を含む凝集体が固定化されている酵素固定化電極または電極に酵素を含む層が固定され、この層に空隙が設けられた酵素固定化電極により、高効率の酵素固定化電極を得ることができ、この酵素固定化電極を用いることにより、高効率の燃料電池あるいは電極反応利用装置を実現することができる。そして、このように高効率の燃料電池を用いることにより、高性能の電子機器などを実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、この発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。なお、実施形態の全図において、同一または対応する部分には同一の符号を付す。
この第１の実施形態においては、複雑な構造を有する電極などに酵素あるいは酵素および電子メディエーターを固定化して酵素固定化電極を製造する場合について説明する。
酵素固定化電極は次のようにして製造される。
酵素あるいは酵素および電子メディエーターを固定化する電極としては、例えば、ポーラスカーボン電極、カーボンペレット電極、カーボンフェルト電極、カーボンペーパー電極など、あるいは撥水性の高い電極などを用いる。ただし、電極はこれらのものに限定されるものではない。
【００３５】
上記電極に固定化しようとする酵素を含む酵素溶液に上記のアルコールなどの有機溶媒を酵素溶液中の有機溶媒濃度が体積濃度で例えば５％以上６５％以下、好適には１０％以上６０％以下、より好適には２０％以上４０％以下になるように含ませる。そして、上記電極をこの溶液中に浸けた後、水で洗浄し、酵素固定化電極を作製する。上記電極に酵素に加えて電子メディエーターも固定化する場合には、電子メディエーターを同じく有機溶媒に溶解させた溶液を用いる。
この第１の実施形態によれば、複雑な構造を有する電極でも、有機溶媒の作用により酵素溶液中の酵素の電極内部への浸透が容易になり、結果として電極内部の表面の全体に酵素を固定化することができ、酵素を三次元的に高密度に固定化することができる。このため、この酵素固定化電極は高効率であり、大きな触媒電流値を得ることができる。
【００３６】
〔実施例１〕
酵素を固定化する電極を次のようにして作製した。市販のケッチェンブラックとポリフッ化ビニリデン（ＰＶｄＦ）とを７：３の分量比（ケッチェンブラック２０ｍｇ、ＰＶｄＦ１０ｍｇ）でＮＭＰ（Ｎ−メチル−２−ピロリドン）（１．２ｍｌ）中にて良く分散させた。一方、図１Ａに示すように、市販のグラッシーカーボン電極１１（電極直径３ｍｍ）を用意する。そして、図１Ｂに示すように、このグラッシーカーボン電極１１にマイクロシリンジ１２により上記の分散溶液１３を１０μｌ（ケッチェンブラック０．１７ｍｇ）滴下し、１００℃で十分乾燥させた。こうして、図１Ｃに示すように、酵素を固定化する電極１４を作製した。
【００３７】
この電極１４をリン酸緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨ2 ＰＯ4 、イオン強度＝０．３、ｐＨ＝７）中にて、参照電極にＡｇ｜ＡｇＣｌを用い、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を行った。その結果を図２Ａの曲線１に示す。また、この電極１４をエタノール中で洗浄し、完全に乾燥させた後に同じくＣＶ測定を行った。その結果を図２ＡおよびＢの曲線２に示す。さらに、この電極１４をエタノールに浸した後、水で洗浄し、ＣＶ測定を行った。その結果を図２Ｂの曲線３に示す。図２ＡおよびＢから分かるように、電極１４をエタノールにて洗浄後乾燥させることにより、エタノールで洗浄を行わない場合に比べて、バックグラウンド電流が１０倍程度になった。また、電極１４をエタノール中で洗浄した後に乾燥させない場合には、エタノールで洗浄を行わない場合に比べて、さらに５０倍のバックグラウンド電流が得られた。これはエタノールにより、電極１４の内部までリン酸緩衝液が染み込むことで電極１４の反応面積が大きくなっていることを示している。
【００３８】
次に、基質としての酸素を還元する酵素としてビリルビンオキシダーゼをリン酸緩衝液０．９ｍｌに対し１ｍｇの割合で溶解させた酵素溶液にエタノールを０．１ｍｌ添加した溶液（エタノール濃度１０％）を調製する。そして、この溶液中に電極１４を浸した後、すぐに洗浄し、ＣＶ測定を行った。その結果を図３ＡおよびＢの曲線１に示す。比較のために、エタノールを含まない酵素溶液に電極１４を浸した後、すぐに洗浄し、ＣＶ測定を行った。その結果を図３ＡおよびＢの曲線２に示す。ただし、図３Ａは緩衝液中の溶存酸素のみが基質となる時（除酸素時）、図３Ｂは緩衝液を攪拌して酸素を飽和量含ませた時（酸素飽和攪拌時）の測定結果である。図３ＡおよびＢから分かるように、エタノールを含む酵素溶液に電極１４を浸した場合には、エタノールを含まない酵素溶液に電極１４を浸した場合に比べて、極めて大きな触媒電流値が得られている。
図４に酵素溶液中のエタノール濃度を変化させた時の触媒電流値（酸素飽和攪拌条件下の触媒限界電流（電位は０Ｖ））の変化を示す。図４から分かるように、エタノール濃度が５％以上６５％以下の範囲で触媒電流値の増加が明確に観測され、特に１０％以上６０％以下の範囲では触媒電流値の顕著な増加が観測され、取り分け２０％以上４０％以下の範囲では触媒電流値の著しい増加が観測される。
【００３９】
次に、この発明の第２の実施形態について説明する。この第２の実施形態においては、バイオ燃料電池のカソード電極に酵素を固定化する場合に第１の実施形態と同様な方法を用いる。
図５はこの第１の実施形態によるバイオ燃料電池を模式的に示す。このバイオ燃料電池では、燃料としてグルコースを用いるものとする。図６は、このバイオ燃料電池のアノード電極の構成の詳細ならびにこのアノード電極に固定化された酵素群の一例およびこの酵素群による電子の受け渡し反応を模式的に示す。
図５に示すように、このバイオ燃料電池は、アノード電極２１とカソード電極２２とがプロトン伝導体２３を介して対向した構造を有する。アノード電極２１は、燃料として供給されたグルコースを酵素により分解し電子を取り出すとともにプロトン（Ｈ+ ）を発生する。カソード電極２２は、アノード電極２１からプロトン伝導体２３を通って輸送されたプロトンとアノード電極２１から外部回路を通って送られた電子と例えば空気中の酸素とにより水を生成する。
【００４０】
アノード電極２１は、例えばポーラスカーボンなどからなる電極２１ａ（図６参照）上に、グルコースの分解に関与する酵素と、グルコースの分解プロセスにおける酸化反応に伴って還元体が生成される補酵素（例えば、ＮＡＤ+ ）と、補酵素の還元体（例えば、ＮＡＤＨ）を酸化する補酵素酸化酵素（例えば、ジアホラーゼ）と、補酵素酸化酵素から補酵素の酸化に伴って生じる電子を受け取って電極２１ａに渡す電子メディエーター（例えば、ＶＫ３）とが固定化材（図示せず）（例えば、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）のようなポリカチオンとポリアクリル酸ナトリウム（ＰＡＡｃＮａ））のようなポリアニオンとを用いて形成されたポリイオンコンプレックス）により固定化されて構成されている。
【００４１】
グルコースの分解に関与する酵素としては、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、好適にはＮＡＤ依存型グルコースデヒドロゲナーゼを用いることができる。この酸化酵素を存在させることにより、例えば、β−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに酸化することができる。
さらに、このＤ−グルコノ−δ−ラクトンは、グルコノキナーゼとフォスフォグルコネートデヒドロゲナーゼ（ＰｈＧＤＨ）との二つの酵素を存在させることにより、２−ケト−６−フォスフォ−Ｄ−グルコネートに分解することができる。すなわち、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンは、加水分解によりＤ−グルコネートになり、Ｄ−グルコネートは、グルコノキナーゼの存在下、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とリン酸とに加水分解することでリン酸化されて、６−フォスフォ−Ｄ−グルコネートになる。この６−フォスフォ−Ｄ−グルコネートは、酸化酵素ＰｈＧＤＨの作用により、２−ケト−６−フォスフォ−Ｄ−グルコネートに酸化される。
【００４２】
また、グルコースは上記分解プロセスのほかに、糖代謝を利用してＣＯ2 まで分解することもできる。この糖代謝を利用した分解プロセスは、解糖系によるグルコースの分解およびピルビン酸の生成ならびにＴＣＡ回路に大別されるが、これらは広く知られた反応系である。
単糖類の分解プロセスにおける酸化反応は、補酵素の還元反応を伴って行われる。この補酵素は作用する酵素によってほぼ定まっており、ＧＤＨの場合、補酵素にはＮＡＤ+ が用いられる。すなわち、ＧＤＨの作用によりβ−Ｄ−グルコースがＤ−グルコノ−δ−ラクトンに酸化されると、ＮＡＤ+ がＮＡＤＨに還元され、Ｈ+ を発生する。
【００４３】
生成されたＮＡＤＨは、ジアホラーゼ（ＤＩ）の存在下で直ちにＮＡＤ+ に酸化され、二つの電子とＨ+ とを発生する。したがって、グルコース１分子につき１段階の酸化反応で二つの電子と二つのＨ+ とが生成されることになる。２段階の酸化反応では、合計四つの電子と四つのＨ+ とが生成される。
上記プロセスで生成された電子はジアホラーゼから電子メディエーターを介して電極２１ａに渡され、Ｈ+ はプロトン伝導体２３を通ってカソード電極２２へ輸送される。
【００４４】
上記の酵素、補酵素および電子メディエーターは、電極反応が効率よく定常的に行われるようにするために、プロトン伝導体２３に含まれるリン酸緩衝液やトリス緩衝液などの緩衝液によって、酵素にとって最適なｐＨ、例えばｐＨ７付近に維持されていることが好ましい。リン酸緩衝液としては、例えばＮａＨ2 ＰＯ4 やＫＨ2 ＰＯ4 が用いられる。さらに、イオン強度（Ｉ．Ｓ．）は、あまり大きすぎても小さすぎても酵素活性に悪影響を与えるが、電気化学応答性も考慮すると、適度なイオン強度、例えば０．３程度であることが好ましい。ただし、ｐＨおよびイオン強度は、用いる酵素それぞれに最適値が存在し、上述した値に限定されない。
【００４５】
図６には、一例として、グルコースの分解に関与する酵素がグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、グルコースの分解プロセスにおける酸化反応に伴って還元体が生成される補酵素がＮＡＤ+ 、補酵素の還元体であるＮＡＤＨを酸化する補酵素酸化酵素がジアホラーゼ（ＤＩ）、補酵素酸化酵素から補酵素の酸化に伴って生じる電子を受け取って電極２１ａに渡す電子メディエーターがＶＫ３である場合が図示されている。
【００４６】
カソード電極２２は、ポーラスカーボン電極、カーボンペレット電極、カーボンフェルト電極、カーボンペーパー電極など、あるいは撥水性の高い電極などに、第１の実施形態と同様に有機溶媒を用いた酵素固定化処理を行うことにより例えばビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどの酸素を分解する酵素を固定化したものである。このカソード電極２２の外側の部分（プロトン伝導体２３と反対側の部分）は通常、ポーラスカーボンよりなるガス拡散層により形成される。カソード電極２２には、好適には、酵素に加えて、このカソード電極２２との間で電子の受け渡しを行う電子メディエーターも固定化される。
このカソード電極２２においては、上記の酸素を分解する酵素の存在下で、プロトン伝導体２３からのＨ+ とアノード電極２１からの電子とにより空気中の酸素を還元し水を生成する。
【００４７】
プロトン伝導体２３はアノード電極２１において発生したＨ+ をカソード電極２２に輸送するためのもので、電子伝導性を持たず、Ｈ+ を輸送することが可能な材料により構成されている。プロトン伝導体２３としては、具体的には、例えば、パーフルオロカーボンスルホン酸（ＰＦＳ）系の樹脂膜、トリフルオロスチレン誘導体の共重合膜、リン酸を含浸させたポリベンズイミダゾール膜、芳香族ポリエーテルケトンスルホン酸膜、ＰＳＳＡ−ＰＶＡ（ポリスチレンスルホン酸ポリビニルアルコール共重合体）や、ＰＳＳＡ−ＥＶＯＨ（ポリスチレンスルホン酸エチレンビニルアルコール共重合体）などからなるものが挙げられる。なかでも、含フッ素カーボンスルホン酸基を有するイオン交換樹脂からなるものが好ましく、具体的には、ナフィオン（商品名、米国デュポン社）が用いられる。
【００４８】
以上のように構成されたバイオ燃料電池において、アノード電極２１側にグルコースが供給されると、このグルコースが酸化酵素を含む分解酵素により分解される。この単糖類の分解プロセスで酸化酵素が関与することで、アノード電極２１側で電子とＨ+ とを生成することができ、アノード電極２１とカソード電極２２との間で電流を発生させることができる。
【００４９】
次に、バイオ燃料電池の具体的な構造例について説明する。
図７ＡおよびＢに示すように、このバイオ燃料電池は、例えばカーボンフェルト（例えば、面積０．２５ｃｍ2 ）に酵素、補酵素および電子メディエータを固定化材で固定化した酵素／補酵素／電子メディエーター固定化カーボン電極からなるアノード電極２１と、例えばカーボンフェルト（例えば、面積０．２５ｃｍ2 ）の上に酵素や電子メディエーターを固定化材で固定化した酵素／電子メディエーター固定化カーボン電極からなるカソード電極２２とが、プロトン伝導体２３を介して対向した構成を有している。この場合、カソード電極２２の下およびアノード電極２１の上にそれぞれＴｉ集電体３１、３２が置かれ、集電を容易に行うことができるようになっている。符号３３、３４は固定板を示す。これらの固定板３３、３４はねじ３５により相互に締結され、それらの間に、カソード電極２２、アノード電極２１、プロトン伝導体２３およびＴｉ集電体３３、３４の全体が挟み込まれている。固定板３３の一方の面（外側の面）には空気取り込み用の円形の凹部３３ａが設けられ、この凹部３３ａの底面に他方の面まで貫通した多数の穴３３ｂが設けられている。これらの穴３３ｂはカソード電極２２への空気の供給路となる。一方、固定板３４の一方の面（外側の面）には燃料装填用の円形の凹部３４ａが設けられ、この凹部３４ａの底面に他方の面まで貫通した多数の穴３４ｂが設けられている。これらの穴３４ｂはアノード電極２１への燃料の供給路となる。この固定板３４の他方の面の周辺部にはスペーサー３６が設けられており、固定板３３、３４をねじ３５により相互に締結したときにそれらの間隔が所定の間隔になるようになっている。
図７Ｂに示すように、Ｔｉ集電体３１、３２の間に負荷３７を接続し、固定板３４の凹部３４ａに燃料として例えばリン酸緩衝液にグルコースを溶かしたグルコース溶液を入れて発電を行う。
【００５０】
次に、この発明の第３の実施形態によるバイオ燃料電池について説明する。
この第３の実施形態によるバイオ燃料電池は、第２の実施形態によるバイオ燃料電池と同様な構成を有するが、単糖類、多糖類などの燃料をリン酸緩衝液やトリス緩衝液などの緩衝液に溶かした燃料溶液に有機溶媒を含ませることが異なる。燃料溶液中の緩衝液に対する有機溶媒の体積比は、一般的には０％より大きく５０％以下、好適には５％以上３０％以下、より好適には５％以上１５％以下である。
このバイオ燃料電池においては、カソード電極２２およびアノード電極２１に酵素を固定化した直後にはそれらの内部に酵素があまり浸透していない場合でも、これらのカソード電極２２およびアノード電極２１が緩衝液および有機溶媒を含む燃料溶液と接触することにより、有機溶媒の作用で緩衝液がカソード電極２２およびアノード電極２１の内部に容易に浸透し、これに促される形で酵素が内部に容易に浸透して内部の表面に三次元的に高密度に固定化される。このため、第２の実施形態と同様に、高効率のバイオ燃料電池を実現することができる。
【００５１】
〔実施例２〕
実施例１と同様な方法で酵素を固定化する電極１４を作製した。そして、実施例１と同様なリン酸緩衝液中にビリルビンオキシダーゼをリン酸緩衝液１ｍｌに対し１ｍｇの割合で加え、電極１４にてＣＶ測定を行った。その結果を図８Ａに示す。次に、このリン酸緩衝液中にエタノールを体積比１０％になるように加えた後に同様のＣＶ測定を行った。その結果を図８Ｂに示す。図８ＡおよびＢから分かるように、リン酸緩衝液にエタノールを加えた場合においては、リン酸緩衝液にエタノールを加えない場合に比べて、１００倍程度の極めて大きな触媒電流値が得られている。これはリン酸緩衝液中のエタノールの作用により、電極１４の内部へのリン酸緩衝液の浸透が容易になり、これに促される形でリン酸緩衝液中のビリルビンオキシダーゼの電極１４の内部への浸透が容易になった結果であると考えられる。
【００５２】
次に、この発明の第４の実施形態によるバイオ燃料電池について説明する。
この第４の実施形態によるバイオ燃料電池は、アノード電極２１の電極２１ａの材料に図９に示すような多孔体導電材料を用いることを除いて、第２の実施形態によるバイオ燃料電池と同様な構成を有する。
図９Ａはこの多孔体導電材料の構造を模式的に示し、図９Ｂはこの多孔体導電材料の骨格部の断面図である。図９ＡおよびＢに示すように、この多孔体導電材料は、三次元網目状構造の多孔体材料からなる骨格４１と、この骨格４１の表面を被覆するカーボン系材料４２とからなる。この多孔体導電材料は、カーボン系材料４２に囲まれた多数の孔４３が網目に相当する三次元網目状構造を有する。この場合、これらの孔４３同士は互いに連通している。カーボン系材料４２の形態は問わず、繊維状（針状）、粒状などのいずれであってもよい。
【００５３】
多孔体材料からなる骨格４１としては、発泡金属あるいは発泡合金、例えば発泡ニッケルが用いられる。この骨格４１の多孔率は一般的には８５％以上、より一般的には９０％以上であり、その孔径は、一般的には例えば１０ｎｍ〜１ｍｍ、より一般的には１０ｎｍ〜６００μｍ、さらに一般的には１〜６００μｍ、典型的には５０〜３００μｍ、より典型的には１００〜２５０μｍである。カーボン系材料４２としては、例えばケッチェンブラックなどの高導電性のものが好ましいが、カーボンナノチューブやフラーレンなどの機能性カーボン材料を用いてもよい。
この多孔体導電材料の多孔率は一般的には８０％以上、より一般的には９０％以上であり、孔４３の径は、一般的には例えば９ｎｍ〜１ｍｍ、より一般的には９ｎｍ〜６００μｍ、さらに一般的には１〜６００μｍ、典型的には３０〜４００μｍ、より典型的には８０〜２３０μｍである。
【００５４】
次に、この多孔体導電材料の製造方法について説明する。
図１０Ａに示すように、まず、発泡金属あるいは発泡合金（例えば、発泡ニッケル）からなる骨格４１を用意する。
次に、図１０Ｂに示すように、この発泡金属あるいは発泡合金からなる骨格４１の表面にカーボン系材料４２をコーティングする。このコーティング方法としては従来公知の方法を用いることができる。一例を挙げると、カーボン粉末や適当な結着剤などを含むエマルションをスプレーにより骨格４１の表面に噴射することによりカーボン系材料４２をコーティングする。このカーボン系材料４２のコーティング厚さは、発泡金属あるいは発泡合金からなる骨格４１の多孔率および孔径との兼ね合いで、多孔体導電材料に要求される多孔率および孔径に応じて決められる。このコーティングの際には、カーボン系材料４２に囲まれた多数の孔４３同士が互いに連通するようにする。
こうして、目的とする多孔体導電材料が製造される。
【００５５】
この第４の実施形態によれば、第２の実施形態と同様な利点に加えて次のような利点を得ることができる。すなわち、発泡金属あるいは発泡合金からなる骨格４１の表面をカーボン系材料４２により被覆した多孔体導電材料は、孔４３の径が十分に大きく、粗な三次元網目状構造を有しながら、高強度でしかも高い導電性を有し、必要十分な表面積を得ることもできる。このため、この多孔体導電材料を用いてアノード電極２１の電極２１ａを形成し、これに酵素、補酵素および電子メディエーターを固定化することで得られる酵素／補酵素／電子メディエーター固定化電極からなるアノード電極２１は、その上での酵素代謝反応を高効率に行わせることができ、あるいは、電極２１ａの近傍で起こっている酵素反応現象を効率よく電気信号として捉えることが可能であり、しかも使用環境によらずに安定であり、高性能のバイオ燃料電池を実現することが可能である。
【００５６】
次に、この発明の第５の実施形態によるバイオ燃料電池について説明する。
この第５の実施形態によるバイオ燃料電池は、プロトン伝導体２３がリン酸緩衝液やトリス緩衝液などの緩衝液を含む電解質層からなり、少なくとも、アノード電極２１および／またはカソード電極２２に固定化された酵素の周囲の電解質層には緩衝液が０．２Ｍ以上２．５Ｍ以下、好適には０．２Ｍ以上２Ｍ以下、より好適には０．４Ｍ以上２Ｍ以下、さらに好適には０．８Ｍ以上１．２Ｍ以下の濃度含まれている。こうすることで高い緩衝能を得ることができ、バイオ燃料電池の高出力動作時においても、酵素にとって最適なｐＨ、例えばｐＨ７付近に維持することができるので、酵素本来の能力を十分に発揮することができる。リン酸緩衝液としては、例えば、ＮａＨ2 ＰＯ4 やＫＨ2 ＰＯ4 が用いられる。
上記以外のことは第２の実施形態と同様である。
【００５７】
以上のように、この第５の実施形態によれば、プロトン伝導体２３を構成する電解質層に含まれる緩衝物質（緩衝液）の濃度が０．２Ｍ以上２．５Ｍ以下であることにより、十分な緩衝能を得ることができ、このためバイオ燃料電池の高出力動作時においても、カソード電極２２および／またはアノード電極２１に固定化された酵素の周囲の電解質層のｐＨを至適ｐＨ付近に維持することができ、酵素が本来持っている能力を十分に発揮させることができる。これによって、高出力動作が可能な高性能のバイオ燃料電池を実現することができる。
【００５８】
次に、この発明の第６の実施形態によるバイオ燃料電池について説明する。
このバイオ燃料電池においては、燃料として、多糖類であるデンプンを用いる。また、デンプンを燃料に用いることに伴い、アノード電極２１にデンプンをグルコースに分解する分解酵素であるグルコアミラーゼも固定化する。
このバイオ燃料電池においては、アノード電極２１側に燃料としてデンプンが供給されると、このデンプンがグルコアミラーゼによりグルコースに加水分解され、さらにこのグルコースがグルコースデヒドロゲナーゼにより分解され、この分解プロセスにおける酸化反応に伴ってＮＡＤ+ が還元されてＮＡＤＨが生成され、このＮＡＤＨがジアホラーゼにより酸化されて２個の電子とＮＡＤ+ とＨ+ とに分離する。したがって、グルコース１分子につき１段階の酸化反応で２個の電子と２個のＨ+ とが生成される。２段階の酸化反応では合計４個の電子と４個のＨ+ とが生成される。こうして発生する電子はアノード電極２１の電極２１ａに渡され、Ｈ+ はプロトン伝導体２３を通ってカソード電極２２まで移動する。カソード電極２２では、このＨ+ が、外部から供給された酸素およびアノード電極２１から外部回路を通って送られた電子と反応してＨ2 Ｏを生成する。
上記以外のことは第２の実施形態によるバイオ燃料電池と同様である。
この第６の実施形態によれば、第２の実施形態と同様な利点を得ることができるほか、デンプンを燃料に用いていることにより、グルコースを燃料に用いる場合に比べて発電量を増加させることができるという利点を得ることができる。
【００５９】
次に、この発明の第７の実施形態による酵素固定化電極について説明する。
この第７の実施形態においては、図１１に示すように、例えばポーラスカーボンなどからなる電極５１上に、グルコースの分解に関与する酵素と、グルコースの分解プロセスにおける酸化反応に伴って還元体が生成される補酵素と、補酵素の還元体を酸化する補酵素酸化酵素と、補酵素酸化酵素から補酵素の酸化に伴って生じる電子を受け取って電極５１に渡す電子メディエーターとが固定化材により固定化された微粒子５２が多数凝集した凝集体５３が固定されている。この固定化材は、典型的には、例えば、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）のようなポリカチオンとポリアクリル酸ナトリウム（ＰＡＡｃＮａ））のようなポリアニオンとを用いて形成されたポリイオンコンプレックスからなるが、これに限定されるものではない。この微粒子５２をポリイオンコンプレックスにより形成する場合、この微粒子５２の直径は、このポリイオンコンプレックスの形成に用いるポリカチオンおよびポリアニオンの分子量、ポリイオンコンプレックスを形成する際の乾燥温度などの乾燥条件、このポリイオンコンプレックスを形成するポリカチオンおよびポリアニオンの組成などを選択することにより制御することができる。この微粒子５２は、例えば略球状で、その直径が１μｍ以下であるのが望ましいが、これに限定されるものではない。
【００６０】
図１１に示すように、この酵素固定化電極においては、凝集体５３を構成する微粒子５２の表面および内部が酵素の反応場となる。この場合、凝集体５３は多くの空隙を含むため、この空隙を通して反応物（例えば、燃料）の反応場の酵素への供給および反応物の反応により得られる生成物の排出を容易かつ円滑に行うことができるだけでなく、この凝集体５３は表面積が多く、凝集体５３の内部への反応物の供給も容易であるため、全体として反応速度の向上を図ることができる。電子は凝集体５３に固定化された電子メディエーターを介して、あるいは電子メディエーター間を介して電極５１とやりとりすることができる。
【００６１】
〔実施例３〕
酵素固定化電極を次のようにして作製した。
溶液調製
まず、以下のようにして各種の溶液を調製した。緩衝溶液としては、０．１Ｍ  ＮａＨ2 ＰＯ4 −ＮａＯＨ−ＮａＣｌ（Ｉ．Ｓ．＝０．３、ｐＨ７）を用いた。
・ＧＤＨ／ＤＩ／ＮＡＤＨ酵素・補酵素緩衝溶液（（１））
ジアホラーゼ（ＤＩ）（ＥＣ  １．６．９９．−、天野エンザイム製、ＤＨ”Amano ”３）を１０ｍｇ秤量し、緩衝溶液２００μｌに溶解させた（（１）´）。酵素を溶解させる緩衝溶液は直前まで８℃以下で冷蔵されていたものが好ましく、酵素緩衝溶液もできるだけ８℃以下で冷蔵保存しておくことが好ましい。
グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）（ＮＡＤ依存型、ＥＣ  １．１．１．４７、天野エンザイム製、ＧＤＨ−２）を１３．８ｍｇ秤量し、緩衝溶液１８０μｌに溶解させた。これに上記の溶液（１）´を２０μｌ加えてよく混合し、最終的にＧＤＨ／ＤＩ＝４．２／２０Ｕ／μｌ溶液２００μｌとした。
・ＮＡＤＨ緩衝溶液（（２））
ＮＡＤＨ（シグマアルドリッチ製、Ｎ−８１２９）を６４ｍｇ秤量し、緩衝溶液０．１ｍｌに溶解させた（６４０μｇ／μｌ）。
・ＰＬＬ水溶液（（３））
ポリ−Ｌ−リシン臭化水素酸塩（ＰＬＬ）（シグマアルドリッチ製、Ｐ−２１７４）を適量秤量し、２ｗｔ％となるように脱イオン水に溶解させた。
・ＡＮＱアセトン溶液（（４））
２−アミノ−１，４−ナフトキノン（ＡＮＱ）を１０ｍｇ秤量し、アセトン溶液９６４μｌに溶解させ６０ｍＭとした。
・ＰＡＡｃＮａ水溶液（（５））
ポリアクリル酸ナトリウム（ＰＡＡｃＮａ）（シグマアルドリッチ製、４１，６０４−５）を適量秤量し、０．０２２ｗｔ％となるように脱イオン水を加えて調製した。
固定化膜作製
上記のようにして調製した各種の溶液を下記に示す量だけ、下記の順序で、それぞれマイクロピペッターなどでグラッシーカーボンディスク電極（ＢＡＳ製、００２０１２、３ｍｍφ、０．０７１ｃｍ2 ）表面上に滴下・混合した後、適宜室温もしくは４０℃以下で乾燥を行い、酵素固定化電極を作製した。
ＧＤＨ／ＤＩ酵素緩衝溶液（（１））：８μｌ
ＮＡＤＨ緩衝溶液（２）：２μｌ
ＰＬＬ水溶液（（３））：１０μｌ
ＡＮＱアセトン溶液（（４））：１８．７μｌ
ＰＡＡｃＮａ水溶液（（５））：１２μｌ
図１２はこうして作製された酵素固定化電極の表面を共焦点顕微鏡（オリンパス製Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＶ１０００×１００レンズ  ズーム×１）により観察した結果を示す。図１２より、直径約１μｍの酵素を含む微粒子が電極表面に凝集して凝集体を形成している様子が観察される。
【００６２】
〔実施例４〕
酵素固定化電極を次のようにして作製した。
溶液調製
以下のようにして各種の溶液を調製した。緩衝溶液としては、実施例３と同じものを用いた。
・ＤＭＰＣエタノール溶液（６）
ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）（和光純薬工業製、１６３−１２７７１）１ｍｇを１ｍｌのエタノールに溶解し、０．１％（ｗ／ｖ）エタノール溶液とした。
ＧＤＨ／ＤＩ酵素緩衝溶液（（１））、ＮＡＤＨ緩衝溶液（（２））、ＰＬＬ水溶液（（３））、ＡＮＱアセトン溶液（４）およびＰＡＡｃＮａ水溶液（（５））は実施例３と同様に調製した。
固定化膜作製
上記のようにして調製した各種の溶液を下記に示す量だけ、下記の順序で、それぞれマイクロピペッターなどでグラッシーカーボンディスク電極（ＢＡＳ製、００２０１２、３ｍｍφ、０．０７１ｃｍ2 ）表面上に滴下・混合した後、適宜室温もしくは４０℃以下で乾燥を行い、酵素固定化電極を作製した。
ＧＤＨ／ＤＩ酵素緩衝溶液（（１））：８μｌ
ＮＡＤＨ緩衝溶液（（２））：２μｌ
ＰＬＬ水溶液（（３））：１０μｌ
ＡＮＱアセトン溶液（（４））：１８．７μｌ
ＰＡＡｃＮａ水溶液（（５））：１２μｌ
ＤＭＰＣエタノール溶液（６）：１０μｌ
こうして作製された酵素固定化電極の表面を実施例３と同様に共焦点顕微鏡により観察したところ、実施例３と同様な結果が得られた。
この第７の実施形態によれば、高効率な酵素固定化電極を実現することができる。そして、この酵素固定化電極をバイオ燃料電池のカソード電極またはアノード電極に用いることにより、高効率なバイオ燃料電池を実現することができる。
【００６３】
以上、この発明の実施形態について具体的に説明したが、この発明は、上述の実施形態に限定されるものではなく、この発明の技術的思想に基づく各種の変形が可能である。
例えば、上述の実施形態において挙げた数値、構造、構成、形状、材料などはあくまでも例に過ぎず、必要に応じてこれらと異なる数値、構造、構成、形状、材料などを用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】この発明の第１の実施形態による酵素固定化電極の評価用の酵素を固定化する電極の作製方法を説明するための略線図である。
【図２】図１に示す電極のサイクリックボルタモグラムを示す略線図である。
【図３】図１に示す電極に酵素を固定化した酵素固定化電極のサイクリックボルタモグラムを示す略線図である。
【図４】酵素溶液中のエタノール濃度を変化させた時の触媒電流値の変化を示す略線図である。
【図５】この発明の第２の実施形態によるバイオ燃料電池を示す略線図である。
【図６】この発明の第２の実施形態によるバイオ燃料電池のアノード電極の構成の詳細ならびにこのアノード電極に固定化された酵素群の一例およびこの酵素群による電子の受け渡し反応を模式的に示す略線図である。
【図７】この発明の第２の実施形態によるバイオ燃料電池の具体的な構成例を示す略線図である。
【図８】この発明の第３の実施形態によるバイオ燃料電池の評価用の酵素固定化電極のサイクリックボルタモグラムを示す略線図である。
【図９】この発明の第４の実施形態によるバイオ燃料電池においてアノード電極の電極材料に用いる多孔体導電材料の構造を説明するための略線図および断面図である。
【図１０】この発明の第４の実施形態によるバイオ燃料電池においてアノード電極の電極材料に用いる多孔体導電材料の製造方法を説明するための略線図である。
【図１１】この発明の第７の実施形態による酵素固定化電極を示す略線図である。
【図１２】この発明の実施例３により作製された酵素固定化電極の表面の共焦点顕微鏡像である。
【符号の説明】
【００６５】
２１…アノード電極、２１ａ…電極、２２…カソード電極、２３…プロトン伝導体、３１、３２…Ｔｉ集電体、３３、３４…固定板、３７…負荷、４１…骨格、４２…カーボン系材料、４３…孔、５１…電極、５２…微粒子、５３…凝集体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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