(57)【要約】    【課題】  新規な感染症治療剤又は感染症予防剤を提供する。    【解決手段】  抗NKR-P1抗体をリステリア菌、サルモネラ菌、大腸菌、緑濃菌又は黄色ブドウ球菌などによる感染症の予防剤又は治療剤の有効成分とする。    【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗NKR-P1抗体を有効成分とする、感染症治療剤又は感染症予防剤。
【請求項２】
感染症が細菌による感染症である、請求項１に記載の感染症治療剤又は感染症予防剤。
【請求項３】
細菌による感染症が、リステリア菌、サルモネラ菌、大腸菌、緑濃菌又は黄色ブドウ球菌による感染症である、請求項２に記載の感染症治療剤又は感染症予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、NKR-P1タンパク質に対する抗体を利用した細菌・ウィルスなどの各種病原微生物に対する抗感染症薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
これまで、種々の感染症に対する予防策としてワクチンが広く用いられてきた。ワクチンは、目的とする病原微生物に対する特異的免疫応答が長期間持続することを利用しているが、対象となる病原微生物によって効果の持続期間が大きく異なること、並びに個体差を生じる場合があることから、必ずしも有効な予防策とはいえない。また、生ワクチンでは使用する弱毒株が変異する可能性があり、安全面において問題がある。
現在、感染症に罹患した場合の治療薬として、抗菌薬、抗真菌薬、抗ウィルス薬などの抗生物質が使用されている。抗生物質はヒトの細胞を破壊することなく体内の微生物を減少（あるいは死滅）させると共に、生体の免疫応答によって残存する病原微生物を殺傷・排除させるために投与される。しかし、近年、抗生物質の多用によって多剤耐性菌が出現し、院内感染・日和見感染など、社会的問題となっていることから、緊急な対策が必要とされる。このように、感染症に対する既存の予防法・治療法の限界に加えて、再興感染症並びに新興感染症への罹患数が世界的に増加していることから、安全、確実かつ簡便に提供できる新規予防法・治療法の開発が急務である。
【０００３】
これまで、結核菌、リステリア菌、サルモネラ菌といった細胞内寄生細菌感染に対する防御にはインターフェロン（IFN）-γ産生を中心とする細胞性免疫が重要であると考えられてきた。NKR-P1はナチュラルキラー（NK）細胞の膜表面に発現し、NK細胞の活性化に働く受容体である（非特許文献１）。これまで、NKR-P1を発現する細胞は感染後速やかにIFN-γを産生することから、細胞内寄生細菌に対する防御に中心的役割を演じていると考えられてきた。
【非特許文献１】Science. 1990 Sep 14;249(4974):1298-300
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、安全で安価な感染症治療剤又は感染症予防剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記のような感染防御的役割とは逆に、NKR-P1に対する抗体を投与することにより、NKR-P1を発現する細胞が消失し、細胞内寄生細菌に対する感染抵抗性が著しく亢進すること、ならびに感染による臓器障害が抑制されることを見出した。このことから、NKR-P1に対する抗体を用いてNKR-P1を発現する細胞の数を調節することにより、感染症の軽減が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）抗NKR-P1抗体を有効成分とする、感染症治療剤又は感染症予防剤。
（２）感染症が細菌による感染症である、（１）の感染症治療剤又は感染症予防剤。
（３）細菌による感染症が、リステリア菌、サルモネラ菌、大腸菌、緑濃菌又は黄色ブドウ球菌による感染症である、（２）の感染症治療剤又は感染症予防剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の感染症予防剤又は治療剤を用いることにより、効果的に、感染症を予防又は治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に本発明を詳しく説明する。
本発明の感染症予防剤又は治療剤（以下、これらをまとめて抗感染症剤と呼ぶこともある）は、抗NKR-P1抗体を有効成分とする。抗NKR-P1抗体はNKR-P1を認識し、感染症の治療又は予防効果を有するものであればよいが、NK細胞及びNKT細胞のいずれか又は両方の細胞数を減少させるものが好ましい。
【０００９】
抗NKR-P1抗体は、哺乳動物のNKR-P1を抗原として得られる抗体が好ましく、マウスまたはヒトのNKR-P1を抗原として得られる抗体がより好ましく、ヒトのNKR-P1を抗原として得られる抗体が特に好ましい。ヒトのNKR-P1としては配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられ、マウスのNKR-P1としては配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。なお、NKR-P1は、NK1.1とも呼ばれる。
本発明の感染症予防剤又は治療剤に含まれる抗体は、NKR-P1を特異的に認識し、感染症の予防又は治療効果を発揮できる抗体である限り、エピトープがどの部分にあってもよい。
【００１０】
このような抗体は、例えば、以下のようにして作製することができる。すなわち、まずNKR-P1タンパク質を大腸菌や哺乳動物細胞などを用いて作製する。具体的には、NKR-P1の塩基配列に基いて設計したオリゴヌクレオチドを用いたPCRによりNKR-P1をコードするDNAを増幅する。ヒトNKR-P1をコードするDNAとしては配列番号１の塩基配列を有するDNAが挙げられ、マウスNKR-P1をコードするDNAとしては、配列番号３の塩基配列を有するDNAが挙げられる。これらのDNAを適当なプラスミドに挿入して得られたプラスミドを宿主細胞に導入して、細胞内又は培地中にNKR-P1タンパク質を発現させる。この細胞又は培地からNKR-P1タンパク質を単離、精製することによってNKR-P1タンパク質を得ることができる。大腸菌でタンパク質を発現させるためのプラスミドとしては、pETベクター（Novagen社）やpGEXベクター（Amersham Pharmacia社）などが、哺乳動物細胞でタンパク質を発現させるためのプラスミドとしては、pcDNAベクター（Invitrogen社）などが挙げられる。また、発現させるNKR-P1タンパク質は、精製のための配列などを含む融合タンパク質であってもよい。得られたNKR-P1タンパク質で宿主動物を免疫することによって抗NKR-P1抗体を得ることができる。なお、免疫に使用するためのNKR-P1タンパク質は、その一部であってもよい。
【００１１】
本発明の抗感染症剤に包含させる抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体がより好ましい。モノクローナル抗体は、例えば、上記のようにして得られたNKR-P1タンパク質でマウスなどの非ヒト哺乳動物を免疫し、非ヒト哺乳動物から単離したリンパ球を同種ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、得られたハイブリドーマが産生する抗体の中から、NKR-P1を認識し、かつ、感染症の治療又は予防効果を有する抗体を選択することによって得ることができる。抗体がNKR-P1を認識するかどうかは、ウエスタンブロットやELISAなどによって確認することができる。また、抗NKR-P1抗体の感染症治療又は予防効果は、感染菌数の減少、感染動物の生存率の改善、感染動物の臓器障害の改善、NK細胞またはNKT細胞数の減少などによって確認することができる。
【００１２】
本発明の抗感染症剤の有効成分とする抗NKR-P1モノクローナル抗体として具体的には、例えば、実施例で使用した、Koo GC, Peppard JR. 「Establishment of monoclonal anti-Nk-1.1 antibody.」 Hybridoma. vol. 3: p301-303, 1984に開示されたモノクローナル抗体が挙げられるが、これらには限定されない。
なお、本発明において、モノクローナル抗体とは、モノクローナル抗体、モノクローナ
ル抗体のフラグメント、F(ab')2化抗体、F（ab'）化抗体、短鎖抗体（scFv）、ダイアボディ（Diabodies）およびミニボディ（Minibodies）を含むものとする。本発明の感染症治療剤または予防剤がヒトに使用するものである場合は、マウスミエローマ細胞によって得られた抗体を、キメラ化又はヒト化することが好ましい。具体的には、遺伝子組み換えによって抗体の定常領域をヒト由来のものとするキメラ抗体作成技術や、超可変領域以外をヒト由来とするヒト化抗体作成技術などを用いて、モノクローナル抗体をキメラ化又はヒト化することが好ましい。
【００１３】
本発明の抗感染症剤は、NKR-P1を認識する抗体をそのまま用いてもよいが、好ましくはNKR-P1を認識する抗体を薬学的に許容されうる担体と配合することによって製造することができる。「薬学的に許容され得る担体」としては、希釈剤、安定剤、保存剤、緩衝剤等が挙げられる。また、その他の抗感染症剤と併用してもよい。
本発明の抗感染症剤の剤型は特に制限されないが、注射剤が好ましい。注射剤は、抗体を希釈剤などに溶解し、必要に応じて安定剤、保存剤、緩衝剤等を添加することによって製造することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。
本発明の抗感染症剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、投与方法、あるいは抗感染症剤に含有される抗体の割合などにより異なるが、１回の投与において体重１ｋｇあたり、１μg〜100mgが好ましく、体重１ｋｇあたり、50μg〜50mgがより好ましい。投与回数は特に制限されず、１日あたり１回〜数回投与することができる。
【００１４】
抗NKR-P1抗体は、感染した細菌、ウィルス、または寄生虫などを排除する効果を有する。したがって、細菌、ウィルス、または寄生虫などによる感染症の治療剤として有効に用いることができる。また、あらかじめ生体のNK細胞やNKT細胞を減少させて感染に対して防御することもできるため、感染症の予防剤としても有効に用いることができる。
この中では、細菌による感染症の予防剤又は治療剤として特に好ましく用いられる。細菌による感染症としては、例えば、リステリア（リステリア・モノサイトゲネス）菌、サルモネラ菌、（病原性）大腸菌、緑濃菌、黄色ブドウ球菌などによる感染症が挙げられるが、リステリア又はサルモネラ菌による感染症が好ましい。
【００１５】
抗NKR-P1抗体は、NK細胞やNKT細胞表面のNKR-P1に結合し、これらの細胞を消失させることにより抗感染症効果を発揮すると考えられる。また、NKR-P1を発現するNKT細胞を欠損するJα281遺伝子欠損マウスでも抗感染症効果が確認できたことから、NKR-P1の機能を抑制する薬剤、NKR-P1の発現を抑制する薬剤、NKR-P1の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉなども、抗NKR-P1抗体と同様に、抗感染症剤として使用できると考えられる。さらに、NK細胞やNKT細胞の数を減少させる薬剤も抗感染症剤として使用できると考えられる。
【実施例】
【００１６】
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。抗NKR-P1モノクローナル抗体（抗NK1.1 mAb）は、BD Pharｍingen社製（クローン名PK136）を用いた。
【００１７】
近交系マウス（C57BL/6）に、500μgの抗NK1.1 mAb あるいは生理食塩水（PBS）を腹腔内投与し、3日後に肝臓中のNK細胞並びにNKT細胞の数をフローサイトメーターにより解析した。結果を図１に示す。抗NK1.1 mAbの投与により、NK（CD3-NK1.1+）細胞は検出できなくなり、また、NKT（CD3+NK1.1+或いはα-ガラクトシルセラミド（GalCer）/CD1dテトラマー反応性CD3+）細胞のうち、NK1.1を発現する細胞が検出できなくなった。一方、アイソタイプの一致したイムノグロブリン（マウスIgG2a）を投与した場合には両細胞共全
く影響を受けなかった（データは示さず）。
2次抗体（蛍光標識抗マウスIgG2a mAb）を用いた染色ではNK細胞、NKT細胞共に検出出来なかった。このことから、抗NK1.1 mAb はこれらの細胞に結合しただけではなく、これらの細胞を消失させたと考えられる。
【００１８】
NKT細胞欠損マウス（Jα281遺伝子欠損マウス：Science. 1997, 278(5343):1623-6.）に500μgの抗NK1.1 mAb 或いはPBSを腹腔内投与した後、3日目の肝臓内に存在するNK細胞並びにNKT細胞をフローサイトメーターにより解析した。結果を図２に示す。Jα281遺伝子欠損マウスにはα-GalCer/CD1dテトラマー反応性CD3+細胞は検出されなかった。CD3+NK1+細胞は検出されたが、本細胞はテトラマーに結合しないことから、通常のNKT細胞とは違うものであることが明らかとなった。一方、Jα281遺伝子欠損マウスには、通常のマウスと同様、NK（CD3-NK1.1+）細胞が存在し、それは抗NK1.1 mAb 投与により検出できなくなった。また、通常のNKT細胞とは異なるNKT細胞も抗NK1.1 mAb 投与により消失した。なお、この現象はアイソタイプの一致したmAb（マウスIgG2a）を投与した場合には認められなかった（データは示さず）。
2次抗体（蛍光標識抗マウスIgG2a mAb）を用いた染色ではNK細胞、NKT細胞共に検出出来なかった。このことは、抗NK1.1 mAb はこれらの細胞に結合しただけではなく、これらの細胞を消失させたことを示唆している。
【００１９】
近交系マウス（C57BL/6）に、500μgの抗NKR-P1 mAb、アイソタイプの一致したイムノグロブリン（マウスIgG2a）、あるいはPBSを腹腔内投与し、3日後にリステリアを尾静脈より1 x 104 CFU感染させ、その後の生存率を比較した。結果を図３に示す。非投与群並びにアイソタイプの一致したイムノグロブリン投与群では感染後４日目より、死亡が認められ、１週間以内に全例死亡したが、抗NKR-P1 mAb 投与群においては感染後20日においても生存率は100%であった。このことは抗NK1.1 mAb が病原微生物の排除を促進していることを示唆している。
以上のデータから、抗NK1.1 mAb を用いてNKR-P1を発現する細胞(NK/NKT細胞）を消失させることにより、病原微生物感染に対する抵抗性を亢進できることが明らかとなった。
【００２０】
近交系マウス（C57BL/6）に、500μgの抗NKR-P1 mAb あるいは PBS を腹腔内投与し、3日後にリステリアを尾静脈より2 x 103CFU感染させ、感染4日目の肝臓並びに脾臓内の菌数を比較した。結果を図４に示す。非投与群並びに PBS 投与群に比較して、抗NKR-P1 mAb 投与群では両臓器共有意な菌数の減少が認められた（肝臓：p<0.05、脾臓：p<0.01）。これにより、抗NK1.1 mAbを用いてNKR-P1を発現する細胞(NK/NKT細胞）を消失させることにより、病原微生物感染に対する抵抗性を亢進することの出来ることが明らかとなった。
【００２１】
リステリア菌は結核等のマイコバクテリアと同様、細胞内に寄生する細菌であり、臓器障害を惹起することが知られているため、上記感染実験における臓器障害への影響について調べた。C57BL/6マウスに予め500μgの抗NK1.1 mAb、アイソタイプの一致したイムノグロブリン（マウスIgG2a）、あるいはPBSを投与した後、3日目にリステリアを尾静脈より2
x 103 CFU 感染し、感染４日目に、マウスを開腹し、脾臓を肉眼的に観察した。結果を図５に示す。非処理群並びにアイソタイプの一致したイムノグロブリン投与群における脾臓はサラミ状になっていたが、抗NKR-P1 mAb 投与群では全く変化は認められなかった。
このことは、NKR-P1を発現する細胞（NK/NKT細胞）が臓器障害の誘発に中心的役割を演じていると共に、抗NK1.1 mAb が感染により誘発される臓器障害を著しく抑制することを示唆している。
【００２２】
NKT細胞欠損マウス（Jα281遺伝子欠損マウス；Science. 1997 Nov 28;278(5343):1623-6.）並びにHeterozygous littermatesにリステリアを尾静脈より2 x 103 CFU感染し、感染4日目の肝臓並びに脾臓における菌数を比較した。結果を図６に示す。Heterozygous li
ttermates に比してNKT細胞を欠損したマウスでは両臓器における菌の排除が有意に亢進していた（肝臓：p<0.05、脾臓：p<0.01）。一方、C57BL/6マウスの感染抵抗性はHeterozygous littermatesとほぼ同じであった（データは示さず）。このことは、NKT 細胞がリステリア感染に対して増悪的に働いていることを示唆している。
【００２３】
NKT細胞欠損（Jα281遺伝子欠損）マウスに、500μgの抗NKR-P1 mAb あるいはPBSを腹腔内投与し、3 日後にリステリアを尾静脈より2 x 103 CFU感染させ、感染4日目の肝臓並びに脾臓内の菌数を比較した。結果を図７に示す。PBS投与群に比較して、抗NKR-P1 mAb 投与群では両臓器共有意な菌数の減少が認められた（p<0.01）。このことは、NKT細胞に加えて、NK細胞、通常とは異なるNKT細胞、或いは両細胞が病原微生物感染に対して悪影響を及ぼしていることを示唆している。
【００２４】
RAG-2遺伝子欠損マウス（Cell. 1992 Mar 6;68(5):869-77.）に500μgの抗NKR-P1 mAb あるいはPBSを腹腔内投与し、3 日後にリステリアを尾静脈より3 x 102 CFU感染させ、感染4日目の肝臓並びに脾臓における菌数を比較した。結果を図８に示す。PBS投与群に比較して、抗NKR-P1 mAb投与群では有意な菌数の減少が認められた（p<0.01）。RAG-2遺伝子欠損マウスはT、B、NKT細胞共欠損しているが、NK細胞は通常のマウスより多いことから、本結果は、NK細胞が病原微生物感染に対して悪影響を及ぼしていることを示唆している。
【００２５】
IFN-γ遺伝子欠損マウスに予め500μgの抗NK1.1 mAb 或いはPBSを腹腔内投与した後、リステリアを3 x102 CFU感染し、感染4日目の肝臓並びに脾臓の菌数を比較した。結果を図９に示す。抗NK1.1 mAbを投与することにより、肝臓・脾臓内における菌の排除が有意に亢進されていた（p<0.01）。このことは、IFN-γ非存在下においても、NKR-P1を発現する細胞（NK/NKT細胞）が病原微生物感染に対して悪影響を及ぼしていることを示唆している。
【００２６】
C57BL/6マウスに予め500μgの抗NK1.1 mAb 或いはPBSを腹腔内投与した後、リステリアを尾静脈より2 x 103 CFU感染し、感染前、並びに感染4日目の肝臓内のNK細胞、NKT細胞をフローサイトメーターにより解析した。結果を図１０に示す。抗NK1.1 mAbを投与した群では、感染前後共、NK/NKT細胞は検出出来なかった。PBS投与群においても、感染後、NKT細胞の数は減少していたが、NK細胞の数は逆に増加していた。
【００２７】
C57BL/6マウスに予め500μgの抗NK1.1 mAb 或いはPBSを腹腔内投与した後、リステリアを尾静脈より2 x 103 CFU感染し、感染1日目の血清中のインターロイキン（IL）-12の量をELISAにより比較した。結果を図１１に示す。PBS投与群では、感染1日目より血清中のIL-12の量は有意に増加した（p<0.05）。抗NK1.1 mAb を投与することにより、感染前後共、若干IL-12のレベルは低下したが、PBS投与群と比較して有意な差は認められなかった。
【００２８】
C57BL/6マウスに予め500μgの抗NK1.1 mAb 或いはPBSを腹腔内投与した後、リステリアを尾静脈より2 x 103 CFU感染し、感染1日目の血清中のIFN-γの量をELISAにより比較した。結果を図１２に示す。PBS投与群では、感染1日目より血清中のIFN-γの量は有意に増加した（p<0.01）。抗NK1.1 mAb を投与することにより、感染後、IFN-γのレベルは有意に低下した。このことは、IFN-γの産生はNKR-P1を発現する細胞（NK/NKT細胞）を消失することにより著しく抑制されることを示唆している。NK/NKT細胞は感染後多量のIFN-γを産生するにもかかわらず、これらの細胞を消失することにより感染抵抗性が亢進することから、両細胞はIFN-γの影響を完全に相殺するほど、強い免疫抑制効果を有していることを示唆している。
【００２９】
NKT 細胞欠損（Jα281 遺伝子欠損）マウス並びにHeterozygous littermatesに、500μ
gの抗NKR-P1 mAb あるいはPBSを腹腔内投与し、3 日後にリステリアを尾静脈より2 x 103
CFU感染させ、感染1日目の肝臓並びに脾臓におけるIL-12（図１３）並びにIFN−γ（図１４）産生細胞数を比較した。なお、これらの細胞数は、各臓器より分離した白血球をリステリア加熱死菌と共にELISPOTプレート中で18h培養した後に計測した。
IL-12産生細胞数は両群において有意な差は認められなかったが、IFN-γ産生細胞数はPBS投与群に比して、抗NKR-P1 mAb 投与群において有意な低下が認められた（p<0.01）。このことは、感染後両臓器において産生されるIFN-γの殆どはNKR-P1を発現する細胞（NK/NKT細胞）から産生されていることを示唆している。NK/NKT細胞は感染後多量のIFN-γを産生するにもかかわらず、これらの細胞を消失することにより感染抵抗性が亢進することから、両細胞はIFN-γの影響を完全に相殺するほど、強い免疫抑制効果を有していることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】C57BL/6マウスの肝臓内に存在するNKR-P1を発現する細胞に及ぼす抗NK1.1 mAbの影響を示す図。
【図２】Jα281遺伝子欠損マウスの肝臓内に存在するNKR-P1を発現する細胞に及ぼす抗NK1.1 mAbの影響を示す図。
【図３】C57BL/6マウスのリステリア感染後における生存率に及ぼす抗NK1.1 mAb の影響を示す図。
【図４】C57BL/6マウスにリステリアを感染した際の肝臓並びに脾臓における菌数に及ぼす抗NK1.1 mAb の影響を示す図。
【図５】リステリア感染後の臓器障害に及ぼす抗NK1.1 mAb の影響を示す図（写真）。
【図６】Jα281遺伝子欠損マウスにリステリアを感染した際の肝臓並びに脾臓における菌数を示す図。
【図７】Jα281遺伝子欠損マウスのリステリア感染抵抗性に及ぼす抗NK1.1 mAb の影響を示す図。
【図８】RAG-2遺伝子欠損マウスのリステリア感染抵抗性に及ぼす抗NK1.1 mAb の影響を示す図。
【図９】IFN-γ遺伝子欠損マウスのリステリア感染抵抗性に及ぼす抗NK1.1 mAb の影響を示す図。
【図１０】リステリア感染前後のC57BL/6マウスの肝臓内に存在するNKR-P1を発現する細胞に及ぼす抗NK1.1 mAb の影響を示す図。
【図１１】リステリア感染前後の血中IL-12レベルに及ぼす抗NK1.1 mAb の影響を示す図。
【図１２】リステリア感染前後の血中IFN-γレベルに及ぼす抗NK1.1 mAb の影響を示す図。
【図１３】リステリア感染後の肝臓並びに脾臓内のIL-12産生細胞数に及ぼす抗NK1.1 mAbの影響を示す図。
【図１４】リステリア感染後の肝臓並びに脾臓内のIFN-γ産生細胞数に及ぼす抗NK1.1 mAbの影響を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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