(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｔ細胞レセプターとＮＫレセプターの２種類のレセプターを持つリンパ球サブセットである、ＮＫＴ細胞の機能及び分化のメカニズムの解明、並びにＮＫＴ細胞の作用に関連して生じる疾患の解明、その治療方法等の研究のための実験動物の提供。【解決手段】ＮＫＴ細胞の欠損が、均一なＶα１４Ｊα２８１α鎖の欠損により、またはＮＫＴ細胞の欠損がＪα２８１遺伝子の欠損により生じている、ＮＫＴ細胞が欠損したマウス。非成熟リンパ球としてＶα１４陽性ＮＫＴ細胞のみを有する非ヒト動物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫＴ細胞が欠損したマウス。
【請求項２】
ＮＫＴ細胞の欠損が均一なＶα１４Ｊα２８１α鎖の欠損によって生じている、請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
ＮＫＴ細胞の欠損がＪα２８１遺伝子の欠損によって生じている、請求項２に記載のマウス。
【請求項４】
Ｊα２８１遺伝子のエキソンにネオマイシン耐性遺伝子が挿入されている請求項３に記載のマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＫＴ細胞欠損非ヒト動物及び成熟リンパ球としてＶα１４陽性ＮＫＴ細胞のみを有する非ヒト動物（以下、「ＮＫＴ細胞非ヒト動物」という）に関する。本発明の動物は、ＮＫＴ細胞の機能及び分化のメカニズムを明らかにするだけでなく、ＮＫＴ細胞の作用に関連して生じる疾患の解明、その治療方法等の研究のための実験動物として極めて有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＮＫ１．１抗原は従来、ナチュラルキラー細胞（以下、「ＮＫ細胞」という）に特異的なマーカーであると考えられてきたが、Ｔ細胞の中にもＮＫ１．１抗原を発現している細胞、すなわち、ＮＫ１．１陽性αβＴ細胞（以下、「ＮＫＴ細胞」という）が存在することが明らかになってきた。このＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）とＮＫレセプターの２つの抗原レセプターを有するユニークなリンパ球サブセットである。ＮＫＴ細胞は通常のＴ細胞やＮＫ細胞とは異なるレパトアを発現している。例えば、β鎖については、ＮＫＴ細胞の９０％以上は、主にＶβ８．２、他にＶβ７やＶβ２という限られたレパトアを発現し、α鎖については主として均一なＶα１４Ｊα２８１を発現しているが、Ｖα１４を細胞表面に発現しないＮＫＴ細胞も存在する。
以下、本明細書においては、Ｖα１４ＴＣＲを発現するＶα１４陽性ＮＫＴ細胞に限って、本発明を説明することとし、特に断らない限り、ＮＫＴ細胞とは、Ｖα１４陽性ＮＫＴ細胞をいうものとする。
Ｖα１４陽性ＮＫＴ細胞は、胸腺外組織において分化増殖し、均一なＴＣＲα鎖（Ｖα１４）と限られたＴＣＲβ鎖（主にＶβ８．２）を発現している。この均一なＴＣＲα鎖は、ＴＣＲ遺伝子の再構成の際に、Ｖ及びＪ遺伝子群からＶα１４遺伝子とＪα２８１遺伝子とが選ばれ、ゲノム上で再構成された結果として作成される。
【非特許文献１】（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ．Ｗ．Ｅ．ＣＤ４ｐｏｓ，ＮＫ１．１ｐｏｓＴ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｐｔｌｙ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＣＤ３．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７９：１２８５，１９９４
【非特許文献２】Ａｒａｓｅ  Ｈ，Ａｒａｓｅ  Ｎ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ  Ｔ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎγ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  （ＮＫ）ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ＮＫ１．１＋Ｔｃｅｌｌｓ  ｕｐｏｎ  ＮＫＲ−Ｐ１  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３：２３９１，１９９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＮＫＴ細胞は、Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド依存性とパーフォリン依存性の細胞傷害能と各種リンフォカイン（例えば、ＩＬ−４、γ−ＩＦＮ、ＩＬ−２）産生能を有することから、免疫統御細胞として様々な免疫反応に関与していると考えられている。特に、ＮＫＴ細胞は、パーフォリンを介すると思われる抗腫瘍細胞傷害活性を示すこと、ＴＣＲ刺激に対して非常に強くＩＬ−４やＩＦＮ−γを産生することなどが報告されている（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ．Ｗ．Ｅ．ＣＤ４ｐｏｓ，ＮＫ１．１ｐｏｓＴ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｐｔｌｙ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＣＤ３．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７９：１２８５，１９９４、Ａｒａｓｅ  Ｈ，Ａｒａｓｅ  Ｎ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ  Ｔ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎγ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  （ＮＫ）ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ＮＫ１．１＋Ｔｃｅｌｌｓ  ｕｐｏｎ  ＮＫＲ−Ｐ１  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３：２３９１，１９９６）。さらに、Ｖα１４陽性ＮＫＴ細胞の減少が自己免疫病の発症に強い相関があると考えられている。したがって、ＮＫＴ細胞の機能や分化のメカニズムを解明することは自己免疫疾患やアレルギー疾患の発症機構、移植骨髄拒絶、腫瘍免疫の解明に大きく貢献することが期待される。
しかしながら、従来のＮＫＴ細胞の研究においては、ＮＫＴ細胞株は存在せず、Ｂｅｎｄｅｌａｃらによって作られたハイブリドーマ細胞はＶα１４ＴＣＲの発現が確認できないため、個体から単離したＮＫＴ細胞を用いる以外ＮＫＴ細胞の機能解析ができない状況であった。しかし、動物の末梢リンパ組織におけるＮＫＴ細胞の数がわずかであったため、ＮＫＴ細胞の豊富な系の開発が強く求められていた。
様々な免疫反応に関与するＮＫＴ細胞の機能はｉｎ  ｖｉｖｏで調べることが望ましい。生体内では、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等、ＮＫＴ細胞以外のリンパ球も相互に複雑に関与しながら作用を及ぼすので、ＮＫＴ細胞が有する機能を他のリンパ球の要因から切り離して、精密かつ明確に解析するためには、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等の他の成熟リンパ球を産生するがＮＫＴ細胞のみを産生しない動物（ＮＫＴ細胞欠損動物）とともに、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等の他の成熟リンパ球を産生せずＮＫＴ細胞のみを産生する動物（ＮＫＴ細胞動物）が、強く望まれていた。しかしながら、現在のところこのような遺伝的に安定で、かつ系統的な変異動物は知られていない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記の課題を解決すべく、本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、リンパ球系前駆細胞からＶα１４陽性ＮＫＴ細胞への分化の決定にＶα１４遺伝子及びＶβ８．２遺伝子が重要な関与をしていること、特にＮＫＴ細胞の分化にＶα１４ＴＣＲが必要であること及びＮＫ細胞とＮＫＴ細胞の共通の前駆細胞からＮＫＴ細胞への優先的な分化の決定にＶβ８．２ＴＣＲが関与していることを見出し、本発明のＮＫＴ細胞欠損動物及びＮＫＴ細胞動物を発明するに至った。
本発明は、ＮＫＴ細胞が欠損した非ヒト動物、成熟リンパ球としてＶα１４陽性ＮＫＴ細胞のみを有する非ヒト動物（免疫不全を有する非ヒト動物であって、Ｖα１４とＶβ８．２とが発現するトランスジェニック動物であることを特徴とする動物）等を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明において、「ＮＫＴ細胞が欠損した動物」又は「ＮＫＴ細胞欠損動物」とは、ＮＫＴ細胞を産生しない動物をいう。ＮＫＴ細胞の欠損は、Ｖα１４Ｊα２８１α鎖の欠損により生じていることが好ましい。
本発明において、「Ｖα１４Ｊα２８１α鎖」とは、再構成ＴＣＲ遺伝子Ｖα１４Ｊα２８１によって発現されるＴＣＲα鎖をいう。
均一なＶα１４Ｊα２８１α鎖の欠損は、上記再構成ＴＣＲ遺伝子を構成する、Ｖα１４遺伝子及びＪα２８１遺伝子の少なくとも１つを欠損させることによって生じる。Ｖα１４遺伝子はゲノムＤＮＡ上に離れて２個存在するのに対し、Ｊα２８１遺伝子はゲノムＤＮＡ上に１個のみ存在するのでＪα２８１遺伝子の欠損の方が容易に起こすことができるという観点から、ゲノム上１コピーのＪα２８１遺伝子を欠損させることが好ましい。
Ｊα２８１遺伝子を欠損させるためには、Ｊα２８１遺伝子の一部分に欠失を生じさせるか、若しくは点変異を導入してもよく、又は他の遺伝子を挿入してもよい。
挿入する他の遺伝子としては、遺伝子を挿入された細胞のポジティブ選別に用いるマーカー遺伝子、例えばネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子が好ましい。このネオマイシン耐性遺伝子は、ネオマイシン類似体であるＧ４１８を用いることにより目的遺伝子の選別を可能にする。また、目的遺伝子を選別除去するためにネガティブ選別に用いるマーカー遺伝子を上記ポジティブ選別用マーカー遺伝子とともに用いることもできる。
遺伝子の機能欠損とともにポジティブ選別の目的で用いられるマーカー遺伝子の挿入場所は特に限定されないが、通常エキソンに欠損が生じるように挿入する。
【０００６】
本発明でいう、「成熟リンパ球としてＶα１４陽性ＮＫＴ細胞のみを有する動物」とは、成熟リンパ球として、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を有さず、Ｖα１４陽性ＮＫＴ細胞のみを有する動物をいう。このような動物は、免疫不全を有する動物、例えば、ＲＡＧ−１欠損、ＲＡＧ−２欠損、ＳＣＩＤ動物にトランスジェニックＶβ８．２遺伝子とトランスジェニックＶα１４遺伝子とを発現させたトランスジェニック動物として作成することができる。
本明細書において、「Ｖα１４ｔｇ」とは、トランスジェニックＶα１４遺伝子を発現させたことを表わし、「Ｖβ８．２ｔｇ」は、トランスジェニックＶβ８．２遺伝子を発現させたことを表わす。
「免疫不全」とは、本明細書においては、Ｂ細胞及びＴ細胞の全部、又は、Ｔ細胞のみを欠く表現型をいう。例えば、マウスを例にとれば、ＳＣＩＤマウス、ＲＡＧ−１欠損（ＲＡＧ−１−／−）マウス、ＲＡＧ−２欠損（ＲＡＧ−２−／−）マウス、ＴＣＲα欠損（ＴＣＲα−／−）等が挙げられる。
ＳＣＩＤマウスは、成熟Ｔ細胞及びＢ細胞を欠く重症複合免疫不全症マウスである。このマウスは、１６番染色体上に存在する、ＴＣＲ遺伝子および免疫グロブリン遺伝子（Ｂ細胞レセプター遺伝子）のＶＤＪ再構成に関与するＳＣＩＤ遺伝子の欠損により生じる。
ＲＡＧ−１−／−マウス及びＲＡＧ−２−／−マウスは、成熟Ｂ細胞およびＴ細胞を欠くマウスである。これらのマウスは、マウス２番染色体上に存在する、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）及びＢ細胞レセプター遺伝子のＶ（Ｄ）Ｊ再構成を誘導するＲＡＧ−１遺伝子及びＲＡＧ−２遺伝子の欠損により生じる。
ＴＣＲα−／−マウスは成熟Ｔ細胞のみを欠く免疫不全マウスである。このマウスはマウス１４染色体上に存在するＴＣＲα鎖定常部遺伝子の欠損により生じる。
ＴＣＲ遺伝子は、遺伝子再構成によって特定のＴＣＲ蛋白をコードするが、この時、通常、対立遺伝子排除（ａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）という現象が生じている。ＴＣＲβ鎖遺伝子については、トランスジェニックＶβ８．２遺伝子が存在していれば、それは内在性ＴＣＲが遺伝子再構成を起こす前に既に再構成が完了している遺伝子なので、対立遺伝子排除が働いて内在性ＴＣＲβ鎖遺伝子再構成は抑制されてしまう。しかし、ＴＣＲα鎖遺伝子については、トランスジェニックＶα１４遺伝子が存在していても、対立遺伝子排除が不完全であるため、内在性のＴＣＲα鎖遺伝子が再構成を起こして発現されてしまう。このような内在性ＴＣＲα鎖遺伝子の影響を除くために、上述のような免疫不全を有する動物のトランスジェニック体を作成する。
本発明でいう「非ヒト動物」とはヒトを除く全ての動物をいい、好ましくは哺乳動物、より好ましくは齧歯動物、さらに好ましくはマウスである。
以下マウスを例にして本発明を説明するが、本発明は何らこの例によって限定されない。
【実施例】
【０００７】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
例１ ＮＫＴ細胞マウスの作成
（Ａ）  ＮＫＴ細胞の分化に必要な遺伝子の解明
ＮＫＴ細胞は、均一なＴＣＲα鎖（Ｖα１４Ｊα２８１）と限られたβ鎖（主にＶβ８．２）を発現していることから、ＮＫＴ細胞の分化におけるこれらのＴＣＲの役割について、各種のＴＣＲトランスジェニック（ｔｇ）マウスを用いて検討した。
（方法）ＴＣＲαｔｇ（Ｖα１４、Ｖα１、Ｖα１１）マウスおよびこれらのマウスとＴＣＲα欠損（ＴＣＲα−／−マウス（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓ，Ｐ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ａ．Ｒ．，Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，Ｍ．Ａ．，Ｉａｃｏｍｉｎｉ，Ｊ．，Ｉｔｏｈａｒａ，Ｓ．，Ｌａｆａｉｌｌｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｙ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．，Ｈｏｐｐｅｒ，Ｍ．Ｌ．  ＆  Ｔｏｎｅｇａｗａ，Ｓ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３６０，２２５−２３１）とかけあわせたマウス（ＴＣＲα−／−／Ｖα１４、ＴＣＲα−／−／Ｖα１）、ＴＣＲβｔｇ（Ｖβ８．２、Ｖβ３）マウスおよびＴＣＲαβｔｇ（Ｖα１４／Ｖβ８．２、Ｖα１１／Ｖβ３）マウスにおけるＮＫＴ細胞の発現をＦＡＣＳおよびＲＮａｓｅプロテクション解析により測定した。
上記Ｖα１４ｔｇマウスについては、以下の方法によって作成した。
ＫＬＨ−特異的抑制Ｔ細胞ハイブリドーマ３４Ｓ−２８１のｃＤＮＡライブラリーよりクローン化したＴ細胞レセプターＶα１４Ｊα２８１Ｃα  ｃＤＮＡ（ｐＴｓα１０４／４６）１．０ｋｂを、４．３ｋｂのヒトβ−アクチンプロモーター（Ｌｅａｖｉｔｔ，Ｊ．，Ｇｕｎｎｉｎｇ，Ｐ．，Ｐｏｒｒｅｃａ，Ｐ．，Ｎｇ，Ｓ．−Ｙ．，Ｌｉｎ，Ｃ．−Ｓ．  ＆  Ｋｅｄｅｓ，Ｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１９６１−１９６９）をもつｐＨβＡＰｒ−３−ｎｅｏのＳａｌＩ制限酵素部位に導入し、発現ベクターであるｐＨβＡＰｒ−Ｔｓα２−ｎｅｏを作成した（図１）。このｐＨβＡＰｒ−Ｔｓα２−ｎｅｏから得られる１１．０ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＰｖｕＩ断片をＣ５７ＢＬ／６マウス由来の受精卵にマイクロインジェクションし、仮親の卵管にもどした。生まれたマウスの尾よりＤＮＡを抽出し、サザンプロット解析にてＶα１４ＴＣＲ遺伝子のインテグレーションを確認し、Ｖα１４ＴＣＲ遺伝子トランスジェニックマウス（Ｖα１４ｔｇマウス）を作成した。
（結果）
Ｖα１４ｔｇ、Ｖβ８．２ｔｇおよびＶα１４／Ｖβ８．２ｔｇについてのみＮＫＴ細胞が出現し、他のｔｇでは認められなかった。
Ｖβ８．２ｔｇにおいて、ＮＫ細胞が消失し、すべてがＮＫ１．１＋Ｖβ８．２Ｔ細胞へ分化したことにより、共通の前駆細胞からＮＫ細胞とＮＫＴ細胞への分化の決定におけるＶβ８．２ＴＣＲの重要性が明らかとなった。
ＴＣＲα−／−／Ｖα１４ｔｇにおいて、通常のＴ細胞が出現せずすべてがＮＫ１．１＋Ｖα１４＋Ｔ細胞になったことにより、ＮＫＴ細胞の分化における、Ｖα１４ＴＣＲの必要性が確認された。
以上のことより、ＮＫＴ細胞のみを分化させるためには、Ｖα１４遺伝子とＶβ８．２遺伝子との組み合わせが必要であると考えられた。
【０００８】
（Ｂ）
（１）  上記（Ａ）の方法に従って得られたＶα１４ｔｇマウスをＲＡＧ−１遺伝子ノックアウトマウス（ＲＡＧ−１−／−マウス）（Ｄｒ．Ｍｏｍｂａｅｔｓより供与、Ｍｏｎｂａｅｔｓ  Ｐ，Ｉａｃｏｍｉｎｉ  Ｊ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＲＳ，ｅｔ  ａｌ．ＲＡＧ−１  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ，ｍｉｃｅ  ｈａｖｅ  ｎｏ  ｍａｔｕｒｅ  Ｂ  ａｎｄ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｃｅｌｌ  ６８：８６９，１９９２）と交配した。図２は、ＲＡＧ−１−／−マウスを作製するためにＲＡＧ−１遺伝子を欠失させるための手法を示す。まず、ＲＡＧ−１遺伝子の中にｎｅｏ遺伝子を挿入することによって、図２（１）のようなＲＡＧ−１遺伝子を破壊したノックアウトコンストラクトを作製した。このノックアウトコンストラクトを、図２（２）の制限酵素地図で表されるＲＡＧ−１遺伝子含有ゲノムを有する１２９ＳＶマウス由来のＥＳ細胞に注入して、ノックアウトコンストラクトと１２９ＳＶマウスゲノムとの間で、図２（１）と（２）のＸの部位で調製組み換えを起こさせた。この相同組み換えの結果として、図２（３）に示すように、ＥＳ細胞のＲＡＧ−１遺伝子が欠失されたことになり、ＲＡＧ−１欠失対立遺伝子が形成された。このような手法によって得られる（ＲＡＧ−１＋／−ＸＶα１４ｔｇ）Ｆ１マウス同士を交配して得られた仔マウスについて耳ＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法にてＲＡＧ−１−／−／Ｖα１４ｔｇマウスを選択した。
（２）  一方、Ｖβ８．２ＴＣＲ遺伝子トランスジェニックマウス（Ｖβ８．２ｔｇマウス）を作るためのコンストラクトを図３に示す。コスミドベクターｐＴＣＦを用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスからコスミドライブラリーを作製した。再構成されたＶβ８．２ＤβＪβ２．４遺伝子をもつ長さ３５ｋｂのゲノムＤＮＡコンストラクトを、Ｖβ８．２ｔｇマウスを作るためのコンストラクトとして用いた。再構成されたＶβ８．２ＤβＪβおよびＣβ部分は図３中に拡大して示す。このＶβ８．２ｔｇマウス（Ｄｒ．Ｂｏｅｈｍｅｒより供与、Ｕｅｍａｔｓｕ  Ｙ，Ｒｙｓｅｒ  Ｓ，Ｄｅｍｂｉｃ  Ｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  β  ｇｅｎｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  β  ｇｅｎｅｓ．Ｃｅｌｌ  ５２：８３１，１９８８）についてもＲＡＧ−１−／−マウスと交配し、上記と同様にして、ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇマウスを作成した。
（３）  上記で得られたＲＡＧ−１−／−／Ｖα１４ｔｇマウスとＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇマウスとを交配し、得られたマウスについて耳ＤＮＡを調製し、ＰＣＲ法にてＲＡＧ−１遺伝子の欠失とＶβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇの共発現を確認し、ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウスを選択した。上記各ＰＣＲに用いたプライマーを示す。
【化１】
2007054073.tif 000002
【０００９】
（Ｃ）  作成したＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウスの脾臓単核球を用いて、既に報告されているＮＫＴ細胞と比較検討して、表面形質上及び機能的に同等のものであるか以下のように評価した。
脾臓細胞の調製
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇマウス、ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウスの３種類、全て６−８週齢のメスマウスを用いた。各マウスの脾臓を摘出した後、スライドガラスを用いてホモジェナイズし、ＡＣＫ溶解緩衝液（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１．０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２−７．４）を用いて溶血処理を行い、脾臓単核球とした。後述する細胞増殖試験、細胞傷害性試験においては、脾臓単核球を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ１６４０にて２ｘ１０６／ｍｌに調製し以後の実験に供した。
【００１０】
ＦＡＣＳ解析
それぞれのマウスより調製した脾臓単核球（５−１０ｘ１０５個）を１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３２／１６（２．４Ｇ２）抗体でインキュベーションし、Ｆｃ介在性の非特異的抗体結合を阻害し、各種細胞染色を行った。細胞染色には、以下のモノクローナル抗体を用いた３カラー染色を用いた。
サイクローム・アビジン、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）結合抗ＴＣＲβ（Ｈ５７−５９７）、ＦＩＴＣ結合ＣＤ３−ε（１４５−２Ｃ１１）、ＦＩＴＣ結合ＣＤ４５ＲＢ（１６Ａ）、ＦＩＴＣ結合ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、ＦＩＴＣ結合ＣＤ４（ＲＭ４−５）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）結合抗Ｖα１４（ＣＭＳ−１）、ＰＥ結合ＣＤ８（５３−６．７）、ビチオン結合抗ＮＫ１．１（ＰＫ１３６）
Ｖα１４染色の特異性の証明のために、細胞を過剰量の無標識抗Ｖα１４にて前処理したのちＰＥ結合抗Ｖα１４を反応させた（Ｃｏｌｄ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ）。ＦＡＣＳ解析には、ＥＰＩＣＳ−ＸＬ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）を用いた。その結果を図４に示す。解析図は、いずれもＣＤ３／ＮＫ１．１にて展開したが、これは、ＣＤ３分子が、ＴＣＲと複合体を形成し、Ｔ細胞のシグナル伝達に必須の構造であるためであり、すなわち、機能性Ｔリンパ球の証明ともなりうるからである。
ＦＡＣＳ解析図から、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（図４上段）においては、ＣＤ３陽性ＮＫＴ細胞のなかにＶα１４ＮＫＴ細胞が存在しているのがわかる。
ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇマウス（図４中段）においては、ＣＤ３陽性細胞は出現しなかった。このマウスのＣＤ３陰性ＮＫ１．１陽性細胞はＴＣＲβ陽性であることから、ＮＫ細胞ではなく、ＮＫＴ細胞の前駆細胞であることがわかった。
ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウス（図４下段）では、ＮＫ１．１陽性のＣＤ３陽性細胞が出現し、また、同細胞はＶα１４陽性であった。すなわち、ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウス中に見いだしうる成熟Ｔ細胞はＶα１４陽性ＮＫＴ細胞のみであった。また、このマウスのＣＤ３陰性ＮＫ１．１陽性細胞も、ＴＣＲβ陽性であることから、ＮＫ細胞ではなく、ＮＫＴ細胞の前駆細胞であることがわかった。
従って、表面形質上では、ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウスは、目的とするＮＫＴ細胞であると考えられた。
次に、ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウスのＶα１４陽性ＮＫＴ細胞が機能的に従来のＮＫＴ細胞と同等のものであるか否かを、以下に検討した。
【００１１】
細胞増殖能およびＩＬ−４、ＩＦＮ−γ産性能
ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウスにおける成熟リンパ球、すなわち、ＣＤ３陽性細胞は上記のようにＶα１４陽性ＮＫＴ細胞のみである。
そこで、この細胞が実際にＣＤ３を介する刺激によって細胞増殖しうるのかを検討した。
一方、従来のＮＫＴ細胞は、代表的なＩＬ−４供給細胞であるとともに、ＩＦＮ−γをも産生している。そこで、ＣＤ３を介する刺激下にＩＬ−４及びＩＦＮ−γを産生しうるのかについて検討した。
抗ＣＤ３ε抗体（１４５−２Ｃ１１）をＰＢＳにて、１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌに調製し、それぞれの抗ＣＤ３ε抗体溶液３０μｌの９６穴丸底細胞培養プレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に添加し、３７℃にて９０分間インキュベーションしたのち冷ＰＢＳにて２回洗浄し、抗ＣＤ３ε抗体固相化プレートとした。このプレート上に２ｘ１０６／ｍｌに調製したＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウス脾臓細胞浮遊液を１００μｌ（２ｘ１０５個）ずつ各ウエルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２の環境にて３日間培養した。培養後半の６時間に１００μＣｉ／ウエルの３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加し、液体シンチレーションカウンターにて３Ｈ−チミジンの取り込みを測定し細胞増殖試験を行った。結果を図５に示す。
また、同様の系にて、培養開始後７時間、２４時間、４８時間で培養上清を採取し、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γ産生能を検討した。結果を図６に示す。
図に示すように、ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウスの脾臓細胞では、抗ＣＤ３ε抗体による刺激によって明らかに細胞増殖反応が誘導され、また、顕著なＩＬ−４及びＩＦＮ−γ産生がみられた。すなわち、ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウスにおいて、Ｖα１４ＮＫＴ細胞のみに発現するＣＤ３複合体が有効なシグナル伝達分子として機能していることが判明した。
【００１２】
細胞傷害性試験
ＮＫＴ細胞はパーフォリンシステムやＦａｓ−Ｆａｓリガンドシステムによる細胞傷害機能を有することが報告されている。ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウスの脾臓細胞をエフェクター細胞として腫瘍細胞株に対する細胞傷害活性を以下のように測定した。
１５０ｍｇ／マウスのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）をＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウスに腹くう内投与し、１８時間後に同マウスの脾臓を摘出し、ホモジェナイズした後、ＡＣＫ溶解緩衝液（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１．０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２−７．４）を用いて溶血処理を行い、エフェクター細胞とした。ターゲット細胞には、ＮＫ感受性のＹＡＣ−１細胞を選択し、５ｘ１０６個あたり１００μＣｉの５１Ｃ−クロミウムを３７℃で１時間反応させてラベリングを行い、ＲＰＭＩ１６４０にて３回洗浄したのち、ターゲット細胞として用いた。反応は、９６穴丸底細胞培養プレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）にて行い、１ｘ１０４個／ウエルのＹＡＣ−１細胞に対して、エフェクター細胞数とターゲット細胞数の比（Ｅ／Ｔ比）６、１２．５、２５でＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウス脾臓単核球を添加して、３７℃、５％ＣＯ２において４時間反応させ、放出された５１Ｃ−クロミウムをγカウンターにて測定した。ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のコントロール実験としてはＰＢＳ１００μｌを腹くう内投与したマウスの脾臓単核球を用いた。結果を図７に示す。
ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウスの脾臓単核球は、ナイーブの状態からＮＫ活性を有していた。さらに、そのＮＫ活性は、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の投与によって増強された。ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウスの脾臓細胞のうちＮＫ活性を有すると考えられる細胞は、ＮＫ１．１陽性細胞、即ち、ＮＫＴ細胞のみと考えられる。従って、ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウスのＶα１４ＮＫＴ細胞は、従来のＮＫＴ細胞と同様に細胞傷害活性を有することが判明した。
【００１３】
例２  ＮＫＴ細胞欠損マウスの作成
１２９ＳＶマウスのゲノムＤＮＡライブラリーによりＪα２８１遺伝子断片を含むＤＮＡクローンをスクリーニングした。遺伝子欠損マウス作成用ベクター（以下ターゲッティングベクターという）は、短腕にＪα２８１遺伝子断片の５’側に存在する１．２ｋｂのＳａｌＩ／ＣｌａＩ断片、長腕にＪα２８１遺伝子断片の３’側に存在する１２ｋｂのＣｌａＩ／ＳａｌＩ断片を含むようにして（ただし、ＳａｌＩはＮｏｔＩに置き換えた）、Ｊα２８１遺伝子のエクソン部分は逆向きのＰＧＫ−ｎｅｏ−ｐｏｌｙＡのカセット（京都大学糸原重美博士より供与を受けた）におきかえて完全に欠失させることによって作成した（図８（１））。なお、隣接する他のＪα遺伝子断片はこの欠失により影響を受けない。ターゲッティングベクターのランダムなゲノムＤＮＡへの挿入を減らす目的で、短腕の５’側にＤＴＡカセット（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を導入した。
Ｒ１  ＥＳ細胞（Ｍｏｕｎｔｓｉｎａｉ病院Ａ．Ｎａｇｙ博士より供与を受けた、図８（２））にターゲッティングベクターを電気穿孔法（５５０μＦ，２７０ｍＶ，Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩＴＭ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて遺伝子導入した。
２００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を加えたＲ１培地（Ｄａｌｌｂｅｃｏ  ＭＥＭ，２ｍＭ１−グルタミン，５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌペニシリン、１０μＭβＭＥ、２００００Ｕ／ｍｌＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、２０％牛胎児血清（ＦＣＳ））により選別を行い、培養開始後８−１０日目に、４５個のＧ４１８耐性ＥＳ細胞コロニ−を単離した。
Ｇ４１８耐性ＥＳ細胞よりＤＮＡを抽出し、次のようなＰＣＲ法及びＤＮＡブロット法により、Ｊα２８１遺伝子座において相同組み換えが起こったＥＳ細胞、５クローンを選別した。
ＰＣＲ法は、図８（３）に示した、
【化２】
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を各１０μＭの濃度で、０．１μｇのＤＮＡを鋳型として、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ、５％ＤＭＳＯの条件で５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を加え、総量５０μｌでＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  ＰＪ２０００、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、９４℃で５分間反応させたのち、９４℃１分、６２℃１分、７４℃２分のサイクルを３０回繰り返した。反応後のＰＣＲ産物は、１０μｌを０．８％アガロースゲル上で電気泳動（１００Ｖ、２５分間）を行い、１．８ｋｂのバンドを０．５μｇ／ｍｌのｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅで染色して検出した（図９参照）。
ＤＮＡブロット法は、ＤＮＡ２０μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで１６時間反応させて切断したものを、０．８％アガロースゲル上で電気泳動（３０Ｖ、１６時間）を行い、ゲルからナイロン膜にＤＮＡ断片をうつしとり、放射線同位元素Ｐ３２で標識したＤＮＡプローブ（プローブＡとプローブＢ（図８（２）、（３）に示したように、プローブＡはＳａｌ１／Ｓａｌ１断片、プローブＢはＳａｌ１／Ｃｌａ１断片である）と特異的に結合させ、バイオイメージアナライザー（ＢＡＳｔａｔｉｏｎ、富士フィルム株式会社、東京、日本）を用いることで、特定の長さのＤＮＡ断片（変異したＪα２８１遺伝子座は３．６ｋｂのバンドになる）として検出できる（図１０参照）。
上記で得られた５個のＥＳ細胞クローンを用いて、ＢＤＦ２マウスをホストにして凝集キメラ法により次のようにキメラマウスを作成した。１０−２０個のＥＳ細胞塊と透明帯を取り除いたＢＤＦ２マウス８細胞期胚をＭ１６培地（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）内で一晩培養してキメラ桑実胚へと分化させ、それを偽妊娠状態のＩＣＲマウス雌の子宮内へ戻すことで、９８種類のキメラマウスが得られ、そのうち２０種類が生殖細胞キメラであった。
キメラマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスとの交配により対立遺伝子のうちの一方のＪα２８１遺伝子を欠いたマウス（ヘテロ接合体；＋／−と表示）を得て、これを交配することで両方のＪα２８１遺伝子を欠いたマウス（ホモ接合体；−／−と表示）を得た。
生まれたマウスの尾の一部よりＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法およびＤＮＡブロット法により遺伝子型を確認した。
ＰＣＲ法は、上記と同じ条件で、プライマー１とプライマー３で１．８ｋｂの変異したＪα２８１遺伝子座を検出し、プライマー１とプライマー２
【化３】
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で１．５ｋｂの野生型のＪα２８１遺伝子座を検出した（図９）。ＤＮＡブロット法も上記と同じ条件で、変異したＪα２８１遺伝子座は３．６ｋｂのバンド、野生型のＪα２８１遺伝子座は７．２ｋｂのバンドとして検出した（図１０）。
【００１４】
作成したＪα２８１遺伝子欠損マウス（−／−）について、単核細胞浮遊液を用いて、同腹のコントロールマウス（＋／＋）に対して、表面形質及び機能を以下のように比較検討した。
ＦＡＣＳ解析
Ｊα２８１遺伝子欠損マウス（−／−）及び同腹のコントロールマウス（＋／＋）の胸腺、脾臓、骨髄および肝臓より単核細胞浮遊液を次のように調製した。胸腺および脾臓は、少量のメディウム（１０％ＦＣＳ添加ＰＢＳ）の入ったシャーレの中でハサミで細切したのち、スライドガラスの間で押しつぶした。
骨髄は、マウスの後肢より大腿骨および脛骨を取りだし上端と下端を切り、２３Ｇ針をつけた注射筒に上記メディウムをいれ、シャーレの中で一方の断端に針を入れて骨髄を押し出した。
肝臓は、ＰＢＳ１５ｍｌを入れたシャーレの中で細切りしたのち、４００Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼを加えて３７℃２０分反応させた後、＃２００メッシュを張ったステンレスメッシュの上で押しつぶしてペレットにし、５０Ｕ／ｍｌヘパリンを加えた３３％Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）＋ＰＢＳ１５ｍｌによく懸濁したのち、２０００ｒｐｍ１０分の遠心により得た。なお、混在する赤血球は、ＡＣＫ溶解緩衝液（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）により除去した。
１〜２ｘ１０６細胞をはじめにＦｃγＩＩ／ＩＩＩレセプターに対するモノクローナル抗体（２．４Ｇ２；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を反応させて非特異的な抗体の結合をブロックした後、蛍光色素Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）標識の抗Ｔ細胞レセプターβ鎖抗体（Ｈ５７−５９７；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）およびＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）標識の抗ＮＫ１．１抗体（ＰＫ１３６；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）の二重染色を行い、ＥＰＩＣＳ−ＸＬ（Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）により解析を行った。その結果を図１１に示す。
Ｊα２８１遺伝子を欠損したマウスにおいては、胸腺および末梢組織（脾臓、骨髄および肝臓）のいずれにおいても、ＮＫ細胞やＴ細胞は認められるが、ＮＫＴ細胞のみが欠損していた。
【００１５】
ＩＬ−４産生
例１で述べたように、ＮＫＴ細胞は、生体におけるＩＬ−４の主な産生細胞であることが報告されている。従って、上記で作成したＮＫＴ細胞欠損マウスのＩＬ−４産生能を調べた。抗ＣＤ３ε抗体（２Ｃ１１：１．５μｇ）をマウスに静注し、９０分後に脾臓を取り出してＲＮＡを抽出し、ＲＮＡａｓｅプロテクション法およびＲＴ−ＰＣＲ法により、ｍＲＮＡレベルでのＩＬ−４の発現を調べた。さらに、脾臓細胞を固相化した抗ＣＤ３抗体上で４８時間培養し、上清中のＩＬ−４をＥＬＩＳＡ法により測定した。
その結果、ＮＫＴ細胞欠損マウスはＩＬ−４を産生しなかった。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｖα１４ＴＣＲコンストラクト：ｐＨβＡＰｒ−Ｔｓα２−ｎｅｏの模式図。各記号が示す制限部位に関与する制限酵素は以下の通りである。Ｂ：ＢｇｌＩＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｓ：ＳａｌＩ、Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐ：ＰｖｕＩ。
【図２】ＲＡＧ−１遺伝子を破壊するための手法を示す図。（１）はノックアウトコンストラクトを表す。（２）はＲＡＧ−１遺伝子を含むＥＳ細胞ゲノムを表す。（３）はＲＡＧ−１欠失対立遺伝子を表す。（１）と（２）との間のＸは相同組換えが起こる位置を示す。
【図３】Ｖβ８．２ｔｇマウスを作るためのコンストラクト。
【図４】各マウスの脾臓単核球のＦＡＣＳ解析図。上段：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、中段：ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇマウス、下段：ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウス。
【図５】ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウスの細胞増殖能を示すグラフ。
【図６】ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウスのＩＬ−４及びＩＦＮ−γ産生能を示すグラフ。
【図７】ＲＡＧ−１−／−／Ｖβ８．２ｔｇ／Ｖα１４ｔｇマウスの細胞傷害活性を示すグラフ。
【図８】Ｊα２８１遺伝子の破壊のための相同組み換え用ＤＮＡコンストラクト、ゲノムマップ模式図。（１）は、相同組み換え用ＤＮＡコンストラクト制限酵素地図を表す。（２）は、Ｊα２８１遺伝子を含む遺伝子破壊をうける側のゲノムマップと制限酵素地図を表す。（３）は、Ｊα２８１遺伝子欠失対立遺伝子のゲノムマップと制限酵素地図を表す。各記号が示す制限部位に関与する制限酵素は以下の通りである。Ｃ：ＣｌａＩ、Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓ：ＳａｌＩ、Ｎ：ＮｏｔＩ、Ｘ：ＸｈｏｌＩ。
【図９】ＰＣＲ法によって得られたＤＮＡを電気泳動したゲルの写真。
【図１０】ＤＮＡブロット法による電気泳動を示すゲルの写真。
【図１１】Ｊα２８１遺伝子欠損マウス（−／−）の胸腺、脾臓、骨髄および肝臓の単核細胞のＦＡＣＳ解析図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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