(57)【要約】【課題】  タンパク質の固定化の方向性を揃えて、タンパク質の活性・機能を保持しつつ、固相担体４に強固に固定化する、より簡易なタンパク質の固定化方法を提供する。【解決手段】  Ｎ末端又はＣ末端に、連続する複数のグリシン残基もしくはプロリン残基を介して連続する複数のリシン残基を有するペプチドタグ付きタンパク質３を調製する第一工程と、アミノ基と共有結合可能な反応基を有する固相担体４にペプチドタグ付きタンパク質３を作用させ、ペプチドタグ付きタンパク質３を固相担体４に固定化させる第二工程とを含むことを特徴とする。【選択図】    図１
2007225586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端又はＣ末端に、連続する複数のグリシン残基もしくはプロリン残基を介して連続する複数のリシン残基を有するペプチドタグ付きタンパク質を調製する第一工程と、
アミノ基と共有結合可能な反応基を有する固相担体に前記ペプチドタグ付きタンパク質を作用させ、前記ペプチドタグ付きタンパク質を前記固相担体に固定化させる第二工程とを含むことを特徴とするタンパク質の固定化方法。
【請求項２】
前記ペプチドタグ付きタンパク質は、Ｎ末端に下記式（１）に示されるペプチドタグを有することを特徴とする請求項１記載のタンパク質の固定化方法。
［数１］
Ｈ−（Ｌｙｓ）ｍ−（Ｇｌｙ）ｎ−        （１）
（ただし、ｍは、２≦ｍ≦８の整数であり、ｎは、２≦ｎ≦８の整数である。）
【請求項３】
前記ペプチドタグ付きタンパク質は、Ｎ末端に下記式（２）に示されるペプチドタグを有することを特徴とする請求項１記載のタンパク質の固定化方法。
［数２］
Ｈ−（Ｌｙｓ）ｏ−（Ｐｒｏ）ｐ−        （２）
（ただし、ｏは、２≦ｏ≦８の整数であり、ｐは、２≦ｐ≦８の整数である。）
【請求項４】
前記ペプチドタグ付きタンパク質は、Ｃ末端に下記式（３）に示されるペプチドタグを有することを特徴とする請求項１記載のタンパク質の固定化方法。
［数３］
−（Ｇｌｙ）ｊ−（Ｌｙｓ）ｋ−ＯＨ      （３）
（ただし、ｊは、２≦ｊ≦８の整数であり、ｋは、２≦ｋ≦８の整数である。）
【請求項５】
前記ペプチドタグ付きタンパク質は、Ｃ末端に下記式（４）に示されるペプチドタグを有することを特徴とする請求項１記載のタンパク質の固定化方法。
［数４］
−（Ｐｒｏ）ｈ−（Ｌｙｓ）ｉ−ＯＨ      （４）
（ただし、ｈは、２≦ｈ≦８の整数であり、ｉは、２≦ｉ≦８の整数である。）
【請求項６】
前記固相担体が、金蒸着された固体表面に前記反応基が形成されてなることを特徴とする、請求項１から５のうちいずれか一項記載のタンパク質の固定化方法。
【請求項７】
前記反応基が、スクシンイミジルオキシカルボニル基であることを特徴とする、請求項１から６のうちいずれか一項記載のタンパク質の固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を担体表面に固定化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサーチップ、プロテインチップ、アフィニティービーズ等を作製する手法として、種々のタンパク質の固定化方法が提案されている。固相担体としてのセンサーチップにタンパク質を固定化させることにより、例えば、水晶振動子マイクロバランス（Ｑｕａｒｔｚ−ｃｒｙｓｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ：ＱＣＭ）の原理を利用したセンサーチップや、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｓｅ：ＳＰＲ）の原理を利用した解析に用いるタンパク質を固定化したセンサーチップが提案されている。また、タンパク質の固定化の応用としては、いわゆるプロテインチップ（プロテインアレイ）やアフィニティービーズ（アフィニティーカラム）等も実用化されている。
【０００３】
タンパク質を固相担体に固定化する方法として種々の方法が知られているが、それらの多くは固定化部位がランダムになりがちでその方向性が不揃いな場合が多い。そのような場合、タンパク質の活性・機能が低下するか、又は損なわれてしまう。これに対して、タンパク質・ペプチドを、その活性・機能を保持したまま固体表面に固定化しようとする方法としは、ヒスチジンタグを有するタンパク質・ペプチドをニッケルキレートによって固定化する方法が提案されている（特許文献１等）。
【０００４】
特許文献１には、ヒスチジンタグを有するタンパク質又はペプチドを透明基板に固定化し、相互作用Ｋｉｎｅｔｉｃｓの測定方法に供する旨が記載されている。ヒスチジンタグは容易に蛋白質やペプチドに導入できるだけでなく、活性を保ったまま強固に固定化できる利点がある。
【０００５】
ヒスチジンタグは蛋白質もしくはペプチド配列のＮ末端もしくはＣ末端に導入され、他のタグと合わせて導入されることもある。ここで、通常のヒスチジンタグはヒスチジンが６つ並んだ配列であり、タンパク質若しくはペプチド配列のＮ末端若しくはＣ末端に導入される。ヒスチジンタグがニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基−ニッケルとキレート結合することにより、タンパク質又はペプチドが透明基板に固定化する。
【特許文献１】特開２００４−１５０８２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記従来技術の場合において、ヒスチジンタグを有するタンパク質又はペプチドが、基板側のニッケルとのキレート形成反応により固定化される際、ヒスチジンタグ中のヒスチジン残基のみがキレート形成反応するには問題ない。しかしながら、実際には、このときタンパク質中のヒスチジン残基もキレート形成反応してしまい、ニッケルがタンパク質及びペプチドの機能部位に配位することにより、その固定化されたタンパク質分子・ペプチド分子の活性・機能は失われてしまう。また、上記従来技術の場合、金蒸着された基板の上に自己組織化された表面を形成し、その表面にＰＥＧを固定化するという、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基導入のための多段階の反応工程が必要である。
【０００７】
そこで、本発明は上記従来技術の問題点に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、タンパク質の固定化の方向性を揃えて、タンパク質の活性・機能を保持しつつ、固相担体に強固に固定化する、より簡易な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、鋭意検討の結果、タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）又はカルボキシル末端（Ｃ末端）に、複数のグリシン残基もしくはプロリン残基を介して複数のリシン残基をペプチドタグとして導入し、タンパク質の固定化部位の確保を図ることにより、方向性を揃えてタンパク質を固定化できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明のタンパク質の固定化方法は、Ｎ末端又はＣ末端に、連続する複数のグリシン残基もしくはプロリン残基を介して連続する複数のリシン残基を有するペプチドタグ付きタンパク質を調製する第一工程と、アミノ基と共有結合可能な反応基を有する固相担体に前記ペプチドタグ付きタンパク質を作用させ、前記ペプチドタグ付きタンパク質を前記固相担体に固定化させる第二工程とを含むことを特徴とする。
【００１０】
すなわち、本発明のタンパク質の固定化方法において、ペプチドタグは連続する複数のグリシン残基もしくはプロリン残基及び連続する複数のリシン残基からなり、ペプチドタグ付きタンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端に前記ペプチドタグを有し、また、前記固相担体はアミノ基と共有結合可能な反応基を有する。
【００１１】
本発明の好ましい一の態様として、前記ペプチドタグ付きタンパク質は、Ｎ末端に下記式（１）に示されるペプチドタグを有する。
［数１］
Ｈ−（Ｌｙｓ）ｍ−（Ｇｌｙ）ｎ−        （１）
（ただし、ｍは、２≦ｍ≦８の整数であり、ｎは、２≦ｎ≦８の整数である。）
また、本発明の好ましい他の態様として、前記ペプチドタグ付きタンパク質は、Ｎ末端に下記式（２）に示されるペプチドタグを有する。
［数２］
Ｈ−（Ｌｙｓ）ｏ−（Ｐｒｏ）ｐ−        （２）
（ただし、ｍは、２≦ｏ≦８の整数であり、ｎは、２≦ｐ≦８の整数である。）
【００１２】
また、本発明の好ましい他の態様として、前記ペプチドタグ付きタンパク質は、Ｃ末端に下記式（３）に示されるペプチドタグを有する。
［数３］
−（Ｇｌｙ）ｊ−（Ｌｙｓ）ｋ−ＯＨ      （３）
（ただし、ｊは、２≦ｊ≦８の整数であり、ｋは、２≦ｋ≦８の整数である。）
また、本発明の好ましい他の態様として、前記ペプチドタグ付きタンパク質は、Ｃ末端に下記式（４）に示されるペプチドタグを有する。
［数４］
−（Ｐｒｏ）ｈ−（Ｌｙｓ）ｉ−ＯＨ      （４）
（ただし、ｈは、２≦ｈ≦８の整数であり、ｉは、２≦ｉ≦８の整数である。）
【発明の効果】
【００１３】
本発明のタンパク質の固定化方法によれば、タンパク質のＮ末端又はＣ末端に、連続する複数のグリシン残基もしくはプロリン残基を介して連続する複数のリシン残基が導入されおり、これら複数のリシン残基及び複数のグリシン残基もしくはプロリン残基からなるペプチドタグを介して、タンパク質が前記固相担体に固定化するので、タンパク質の固定化部位をＮ末端又はＣ末端の近傍に確保をすることができ、タンパク質の固定化の方向性を揃えて、タンパク質の高次構造及びその活性・機能を保持しつつ、固定化することができる。なお、グリシン残基及びプロリン残基は単なるスペーサーとしての役割だけではなく、タンパク質の２次構造を破壊するアミノ酸残基として、導入したポリリシンのタンパク質Ｎ末端又はＣ末端への影響を効果的に削減する役割も有する。タンパク質の側の固定化部位は、アミノ基を有するペプチドタグが担っているので、固相担体側と強固に共有結合することが可能であり、充分な量の安定的な固定化を実現することができる。更に、このアミノ基と共有結合可能な反応基を固相担体側に導入する際にも、複雑な反応工程の必要性を避けることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のタンパク質の固定化方法は、Ｎ末端又はＣ末端に、連続する複数のグリシン残基もしくはプロリン残基を介して連続する複数のリシン残基を有するペプチドタグ付きタンパク質３を調製する第一工程と、アミノ基と共有結合可能な反応基を有する固相担体４にペプチドタグ付きタンパク質３を作用させ、ペプチドタグ付きタンパク質３を固相担体４に固定化させる第二工程とを含むことを特徴とする。
【００１５】
図１は、本発明のタンパク質の固定化方法を模式的に示したものである。本発明のタンパク質の固定化方法において、ペプチドタグ付きタンパク質３は、Ｎ末端又はＣ末端にペプチドタグ１を有し、固相担体４はアミノ基と共有結合可能な反応基を有しており、図１に示されるように、本発明のタンパク質の固定化方法によって、タンパク質２はペプチドタグ１を介して固相担体４に固定化される。
【００１６】
本発明のタンパク質の固定化方法において、ペプチドタグ１中のリシン残基は側鎖にアミノ基を有する。したがって、第二工程では、アミノ基と共有結合可能な反応基を有する固相担体４にペプチドタグ付きタンパク質３を作用させるので、ペプチドタグ１を介して、ペプチドタグ付きタンパク質３を固相担体４に固定化させることができる。Ｎ末端又はＣ末端のペプチドタグ１は複数のリシン残基すなわち複数のアミノ基を有するので、これらのアミノ基との反応の確率が高められて、Ｎ末端又はＣ末端の近傍で固相担体４と共有結合することにより、タンパク質２の固定化の方向性を揃えることができる。
【００１７】
仮にタンパク質２を直接ポリリシンと結合させた場合には、このポリリシンの電荷とタンパク質２の電荷とが相互作用して、タンパク質２の機能と構造に悪影響を及ぼすおそれがあるのに対して、本発明のタンパク質の固定化方法においては、Ｎ末端又はＣ末端の複数のリシン残基（ポリリシン）は複数のグリシン残基もしくはプロリン残基を介して導入されているので、リシン残基をタンパク質２の構造と断絶させることができ、タンパク質２の機能部位と、Ｎ末端又はＣ末端のポリリシンとの相互作用を防ぎ、タンパク質２の活性・機能を保持することができる。
【００１８】
本発明の好ましい一の態様のタンパク質の固定化方法においては、Ｎ末端に下記式（１）に示されるペプチドタグを有するタンパク質（ペプチドタグ付きタンパク質３）を調製する第一工程を含む。
［数１］
Ｈ−（Ｌｙｓ）ｍ−（Ｇｌｙ）ｎ−        （１）
（ただし、ｍは、２≦ｍ≦８の整数であり、ｎは、２≦ｎ≦８の整数である。）
また、本発明の好ましい他の態様のタンパク質の固定化方法においては、Ｎ末端に下記式（２）に示されるペプチドタグを有するタンパク質（ペプチドタグ付きタンパク質３）を調製する第一工程を含む。
［数２］
Ｈ−（Ｌｙｓ）ｏ−（Ｐｒｏ）ｐ−        （２）
（ただし、ｏは、２≦ｏ≦８の整数であり、ｐは、２≦ｐ≦８の整数である。）
【００１９】
タンパク質工学において有用なタンパク質の対象が、分子量１０万以下程度であることを考慮すると、ｍは、２≦ｍ≦５の整数であることがより好ましく、ｎは、３≦ｎ≦５の整数であることがより好ましい。また、ｏは、２≦ｏ≦５の整数であることがより好ましくｐは、３≦ｐ≦５の整数であることがより好ましい。
【００２０】
本発明の好ましい他の態様のタンパク質の固定化方法においては、Ｃ末端に下記式（３）に示されるペプチドタグを有するタンパク質（ペプチドタグ付きタンパク質３）を調製する第一工程を含む。
［数３］
−（Ｇｌｙ）ｊ−（Ｌｙｓ）ｋ−ＯＨ      （３）
（ただし、ｊは、２≦ｊ≦８の整数であり、ｋは、２≦ｋ≦８の整数である。）
また、本発明の好ましい他の態様のタンパク質の固定化方法においては、Ｃ末端に下記式（４）に示されるペプチドタグを有するタンパク質（ペプチドタグ付きタンパク質３）を調製する第一工程を含む。
［数４］
−（Ｐｒｏ）ｈ−（Ｌｙｓ）ｉ−ＯＨ      （４）
（ただし、ｈは、２≦ｈ≦８の整数であり、ｉは、２≦ｉ≦８の整数である。）
【００２１】
タンパク質工学において有用なタンパク質の対象が、分子量１０万以下程度であることを考慮すると、ｊは、２≦ｊ≦５の整数であることがより好ましく、ｋは、３≦ｋ≦５の整数であることがより好ましい。また、ｈは、２≦ｈ≦５の整数であることがより好ましく、ｉは、３≦ｉ≦５の整数であることがより好ましい。
【００２２】
なお、タンパク質化学又はペプチド化学の通常の表記方法に従って、上記（１）式及び（２）式中の左側のＨ−はこれがＮ末端であることを表し、上記（３）式及び（４）式中の右側の−ＯＨはこれがＣ末端であることを表している。
【００２３】
本発明のタンパク質の固定化方法の第一工程においては、タンパク質のＮ末端に上記（１）式または（２）式に示されるペプチドタグを伸長させても良く、Ｃ末端に上記（３）式または（４）に示されるペプチドタグを伸長させても良い。タンパク質のＮ末端に上記（１）式に示されるペプチドタグを伸長させた場合には、Ｎ末端に、ｎ個のグリシン残基を介して、ｍ個のリシン残基、が導入されたことになる。同様に、タンパク質のＮ末端に上記（２）式に示されるペプチドタグを伸長させた場合には、Ｎ末端に、ｏ個のプロリン残基を介して、ｐ個のリシン残基、が導入されたことになる。また、タンパク質のＣ末端に上記（３）に示されるペプチドタグを伸長させた場合には、Ｃ末端に、ｋ個のグリシン残基を介して、ｊ個のリシン残基が導入されたことになる。同様に、タンパク質のＣ末端に上記（４）に示されるペプチドタグを伸長させた場合には、Ｃ末端に、ｈのプロリン残基を介して、ｉ個のリシン残基が導入されたことになる。
【００２４】
いずれの場合も、第一工程で、タンパク質の末端に複数のグリシン残基もしくはプロリン残基を介して複数のリシン残基が導入される。そして、第二工程では、当該ペプチドタグが末端に導入されたペプチドタグ付きタンパク質３を固相担体４に固定化させる。Ｎ末端にｍ個のリシン残基が導入される上記一の態様においては、ｍ個のリシン残基中のｍ個のアミノ基又はＮ末端のアミノ基（ｍ＋１個のアミノ基）が固定化に関与することができ、Ｃ末端に複数のリシン残基が導入される上記他の態様においては、ｋ個のリシン残基中のｋ個のアミノ基が固定化に関与することができる。
【００２５】
本発明のタンパク質の固定化方法において、固定化されるタンパク質２の対象としては、何ら限定されず、如何なる特性、性質のタンパク質をも適用することができる。タンパク質２の対象としては、塩基性タンパク質であっても酸性タンパク質であってもよく、また、疎水性タンパク質であっても親水性タンパク質であっても良い。また、対象とするタンパク質２の機能部位がＣ末端の近傍にあるときは、第一工程において、Ｎ末端にペプチドタグを導入する上記一もしくは他の態様が好ましく、対象とするタンパク質２の機能部位がＮ末端の近傍にあるときは、第一工程において、Ｃ末端にペプチドタグを導入する上記他の態様が好ましい。
【００２６】
本発明のタンパク質の固定化方法の第一工程において、タンパク質のＮ末端又はＣ末端に、上記（１）式、（２）式、（３）式、又は（４）式に示されるペプチドタグを導入する手法としては、何ら限定はされないが、上記（１）式、（２）式、（３）式、又は（４）式に示されるペプチドタグ部を有するタンパク質（ペプチドタグ付きタンパク質３）は、例えば、遺伝子的にタンパク質工学用いて、当該ペプチドタグ部をコードする遺伝子と、タンパク質をコードする遺伝子とをフレームが一致した状態で有する発現ベクターを用いて形質転換し、形質転換細胞中で当該ペプチドタグ部とタンパク質との融合タンパク質として発現させ、当該融合タンパク質を回収することで調製できる。
【００２７】
本発明において、アミノ基と共有結合可能な反応基としては、何ら限定はされない。アミノ基と共有結合可能な反応基としてエステル基を選択することにより、ペプチドタグ中のアミノ基はそのエステル基と酸アミド結合することにより、タンパク質の固定化に寄与することができ、アミノ基と共有結合可能な反応基としてイソシアネート基を選択することにより、ペプチドタグ中のアミノ基はそのイソシアネート基とウレア結合することにより、タンパク質の固定化に寄与することができる。アミノ基と共有結合可能な反応基としては、反応活性が高く、かつ、調製が容易な点から、後述するスクシンイミジルオキシカルボニルエチルチオ基、すなわちスクシンイミジルオキシカルボニル基が好ましい。
【００２８】
本発明のタンパク質の固定化方法の第二工程において、ペプチドタグ付きタンパク質３を固相担体４に固定化させる手法としては、固相担体４にペプチドタグ付きタンパク質３を作用させ、ペプチドタグ１を介して、ペプチドタグ付きタンパク質３を固相担体４に固定化させるのであれば、何ら限定はされないが、例えば、スクシンイミジルオキシカルボニル基をペプチドタグのアミノ基とカップリング反応させて共有結合させる反応を用いることができる。
【００２９】
本発明において用いる固相担体の基材としては、シリコン、透明なガラス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートなどのポリマー類を等挙げることができる。上記の基材に対して、アミノ基と共有結合可能な反応基を結合させることにより、固相担体４とすることができる。アミノ基と共有結合可能な反応基を結合させる手法は何ら限定されないが、上記の基材に対して金蒸着処理した後、ＤＳＰ（３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル））を作用させることにより、スクシンイミジルオキシカルボニルエチルチオ基、すなわち、スクシンイミジルオキシカルボニル基を付加させて固相担体４とすることができる。このように、基材を選ばずに、容易に、アミノ基と共有結合可能な反応基を導入できる点で、固相担体４は、金蒸着された固体表面に前記反応基が形成されてなることが好ましい。固相担体の基材がガラスである場合には、このガラス基材に対してシランカップリング処理した後、ＤＳＳ（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｓｕｂｅｒａｔｅ）、ＳＭＣＣ（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−［Ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ  ｍｅｔｈｙｌ］−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）等の架橋剤を作用させることにより、アミノ基と共有結合可能なスクシンイミジルオキシカルボニル基を付加反応させて固相担体４とすることもできる。
【００３０】
本発明において用いる固相担体の基材としては、あらかじめ、金属、特に金がコーティングされた水晶振動子や、金蒸着された基板、あるいは、シランカップリング処理されたガラス等を用いることもできる。
【００３１】
また、固相担体の基材として、金蒸着された水晶発振子を用いることができ、これにＤＳＰ（３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル））を作用させ、スクシンイミジルオキシカルボニル基を付加させて固相担体４とすることもできる。図２は、更にこれにペプチドタグ付きタンパク質３を作用させて、タンパク質を固定化する様子を模式的に示したものである。
【００３２】
金蒸着された固体表面にＤＳＰ（３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル））を作用させることにより、スクシンイミジルオキシカルボニル基を有する固相担体４を調製する際の反応式を図３の（５）式に示す。また、これにペプチドタグ付きタンパク質３を作用させて、ペプチドタグを介して、ペプチドタグ付きタンパク質３を固相担体４に固定化させる際の反応式を図３の（６）式に示す。
【実施例】
【００３３】
（１）  電極直径５ｍｍの表面を金蒸着された水晶振動子（セイコー・イージーアンドジー株式会社製、商品名ＱＡ２０−Ｂ９Ｍ−ＡＵ）をＤＳＰ（３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル））のアセトニトリル溶液（濃度４ｍｇ／ｍＬ）に室温で２時間浸漬し、スクシンイミジルオキシカルボニルエチルチオ基を金表面に付加反応させて、反応基としてのスクシンイミジルオキシカルボニル基を形成させた（図３の（３）式）。更に、金表面に非特異的に吸着しているＤＳＰ、及び３−メルカプトプロピオン酸スクシンイミジル（ｍｅｒｃａｐｔ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）をアセトニトリルで３回洗浄除去した。
【００３４】
（２）  タンパク質工学の技法により、ウサギのチトクロムＣのＮ末端側にＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−の構造を有するペプチド成分を伸長させたＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｎ末端修飾チトクロムＣを作製し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に、濃度０．５ｍｇ／ｍＬで溶解させた。これに、（１）で調製した、スクシンイミジルオキシカルボニル基が形成された水晶振動子を室温で３０分間浸漬することにより、スクシンイミジルオキシカルボニル基と上記Ｎ末端修飾チトクロムＣ（ペプチドタグ付きタンパク質３）を反応させた（図３の（４）式）。リン酸緩衝液で３回洗浄し、更に、未反応のＤＮＰ及び３−メルカプトプロピオン酸スクシンイミジルをブロックするために、エタノールアミン水溶液（１０ｍＭ）と反応させた。
【００３５】
これらの過程中、水晶振動子の周波数変化をモニターしたところ、水晶振動子（ＱＡ２０−Ｂ９Ｍ−ＡＵ）にＤＳＰを反応させ、アセトニトリル洗浄、リン酸緩衝液平衡後の共振周波数２６９８５５Ｈｚ（３次オーバートーンモードでの測定値）を基準として、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｎ末端修飾チトクロムＣを反応させ、エタノールアミンでブロック後の周波数変化は−６０２Ｈｚであり、上記の操作により得たＮ末端修飾チトクロムＣ（ペプチドタグ付きタンパク質３）が水晶振動子に固定化されたことを確認した（図２）。
【００３６】
市販されているウサギのチトクロムＣを抗原とする抗体をリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解（濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）し、上記の操作により得たＮ末端修飾チトクロムＣ固定化水晶振動子を室温で３０分間浸漬した。その浸漬後の水晶振動子の周波数変化は−５０３２Ｈｚ（−６０２−４４３０Ｈｚ）であり、チトクロムＣ抗体が上記修飾チトクロムＣと結合して水晶振動子に固定化されたことを確認した。
【００３７】
（比較例）
一方、実施例１のうちＮ末端修飾チトクロムＣに代えて未修飾のチトクロムＣを用いた以外は実施例１と同様にした対照実験を行ったところ、未修飾のチトクロムＣを結合させエタノールアミンでブロック後の周波数変化は−４５２Ｈｚであり、また、チトクロムＣ抗体を結合させた後の周波数変化は−３４２８Ｈｚ（−４５２−２９７６Ｈｚ）であった。実施例１と同様に、チトクロムＣ抗体は水晶振動子表面に固定化されることをこの周波数変化から確認した。しかし、その変化量は、Ｎ末端修飾チトクロムＣ固定化水晶振動子の場合よりも小さく、未修飾のチトクロムＣの結合分子数は少ないことがわかった。
【００３８】
Ｎ末端修飾チトクロムＣは、未修飾のチトクロムＣ（分子量約１２４００）より分子量がおよそ５６０大きくなっている。分子量で約５％増の影響を考慮しても、Ｎ末端修飾チトクロムＣ結合後の周波数変化量（−６０２Ｈｚ）は、−４７５Ｈｚ（４５２×１．０５）よりも大きいので、Ｎ末端修飾チトクロムＣの結合分子数の方が未修飾のチトクロムＣの場合よりも多かったと云える。
【００３９】
同様に、Ｎ末端修飾チトクロムＣへのチトクロムＣ抗体の結合量は、未修飾のチトクロムＣへのチトクロムＣ抗体の結合量よりも多かったと云える。したがって、この結果は、本発明のタンパク質の固定化法においては、チトクロムＣのＮ末端にＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ペプチドを伸長させ、そのＮ末端の連続するリシン残基において頻度高く固定化させることにより、チトクロムＣの活性・機能を保持しつつ固相担体４に強固に安定的に固定化し、かつ、チトクロムＣの固定化の配向性が高まったことを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明のタンパク質の固定化方法は、水晶振動子マイクロバランス（Ｑｕａｒｔｚ−ｃｒｙｓｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ：ＱＣＭ）の原理を用いたセンサーチップや、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｓｅ：ＳＰＲ）の原理を利用した解析に用いるタンパク質を固定化したセンサーチップを作製する際にも適用することができ、また、いわゆるプロテインチップ（プロテインアレイ）やアフィニティービーズ（アフィニティーカラム）を作製する際にも適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、本発明のタンパク質の固定化方法を模式的に示したものである。
【図２】図２は、スクシンイミジルオキシカルボニル基を有する金蒸着された水晶発振子にペプチドタグ付きタンパク質３を作用させて、タンパク質を固定化する様子を模式的に示したものである。
【図３】図３は、金蒸着された固体表面にＤＳＰ（３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル））を作用させて、スクシンイミジルオキシカルボニル基を有する固相担体４を調製する際の反応式（３）、及び、ペプチドタグ付きタンパク質３をこの固相担体４に固定化させる際の反応式（４）を示したものである。
【符号の説明】
【００４２】
１：ペプチドタグ、２：タンパク質、３：ペプチドタグ付きタンパク質、４：固相担体
【図１】
2007225586.tif 000003
【図２】
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【図３】
2007225586.tif 000005