(57)【要約】【課題】抗原抗体反応のようなタンパク質間相互作用においてその結合部位を効率的に同定する手法を提供すること。【解決手段】相互作用する第１のタンパク質と第２のタンパク質について、前記第１のタンパク質を支持体上に固定化し、前記第２のタンパク質を断片化して、前記第１のタンパク質に添加し、前記第１のタンパク質に捕捉された前記第２のタンパク質断片を分離し、分離された前記第２のタンパク質断片のアミノ酸配列を質量分析により解析して、前記第１のタンパク質に対する前記第２のタンパク質の結合部位を同定する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
相互作用するタンパク質間の結合部位を同定する方法であって、第１のタンパク質を支持体に固定化し、第２のタンパク質を断片化して、前記第１のタンパク質に添加し、前記第１のタンパク質に捕捉された前記第２のタンパク質断片を分離し、分離された前記第２のタンパク質断片のアミノ酸配列を質量分析により解析して、前記第２のタンパク質の前記第１のタンパク質への結合部位を同定することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第１のタンパク質が受容体であり、前記第２のタンパク質がそのリガンドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のタンパク質が抗体であり、前記第２のタンパク質が抗原であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原がアレルゲンであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のタンパク質がリンカーを介して支持体に固定化されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２のタンパク質の断片化が酵素処理によって行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記質量分析がＭＳ/ＭＳを用いて行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のタンパク質断片がラベルされていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２のタンパク質として２種以上のタンパク質を用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
相互作用するタンパク質間の結合部位を同定するためのシステムであって、支持体に固定化させた第１のタンパク質を収納する手段と、第２のタンパク質を断片化する手段と、前記第1のタンパク質に前記第2のタンパク質断片を捕捉させて溶出する手段と、溶出された第２のタンパク質断片のアミノ酸配列をＭＳ/ＭＳで解析する手段とを有するシステム。
【請求項１１】
前記第１のタンパク質が受容体であり、前記第２のタンパク質がそのリガンドであることを特徴とする請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記第１のタンパク質が抗体であり、前記第２のタンパク質が抗原であることを特徴とする請求項１０に記載のシステム。
【請求項１３】
前記抗原がアレルゲンであることを特徴とする請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
さらに、前記第２のタンパク質断片をラベルする手段を有することを特徴とする請求項１０に記載のシステム。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法を利用したアレルギー検査。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法を利用した薬剤スクリーニング。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原と抗体のように互いに相互作用しあうタンパク質の結合部位を同定する技術に関する。より詳細には、支持体に固定化した第1のタンパク質に、断片化した第2のタンパク質を捕捉させ、当該断片を解析することにより、結合部位を同定する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
膨大なゲノム情報の蓄積に伴い、ライフサイエンス分野の流れはゲノミクスからプロテオミクスへと移行しつつある。タンパク質は他の分子と相互作用することでその機能を発揮するため、タンパク質相互作用ネットワークの解明は生命現象を包括的に理解するために重要である。またタンパク質間相互作用の異常は種々の疾患との関連が明らかにされている。たとえば自己免疫疾患であるアレルギーは、アレルゲンに対して抗体の１つであるIgEが過剰反応して引き起こされる。従って、アレルギーの治療薬としてこのような相互作用を制御できる薬剤の開発が進められている。
【０００３】
従来のアレルギー検査では、アレルゲンに対して特異的なIgE抗体の血中濃度を測定し、IgE量が閾値以上であった場合にアレルギーと診断される。アレルギーに対する有効な治療法とされているのがワクチン、つまり弱毒化したアレルゲンをあらかじめ接種することで過剰反応を抑える手法である。
【０００４】
これらの検査や治療には天然物から抽出したアレルゲンを用いることが多い。しかし天然物由来アレルゲンは、品質が製造バッチごとに変わりやすいという問題点がある。またIgEがアレルゲン中のどの部位を認識するかは判断することができない。さらに天然物由来アレルゲンは複数のタンパク質や低分子化合物の混合物である場合がほとんどであり、どの分子に対してアレルギーを起すかは患者によって異なる。そのため、ワクチンに該当するアレルゲンが含まれていなかった場合、そのワクチンは効果を持たず、逆に関係のない分子によって別のアレルギーを生じてしまうといった副作用にもつながりうる。
【０００５】
上記のような問題を改善するため、組換えタンパク質アレルゲンの利用が提唱されている。精製した組換えタンパク質を検査に用いることで、当該タンパク質に対するアレルギーのみを検出することが可能になる。更に同タンパク質をワクチンとして用いるにあたり、欠失や変異を人工的に導入することで効果を高め、かつ副作用を低減する手法が注目されている。このためには、抗体がアレルゲン分子中のどの部位を認識しているかを予め知ることが必要となる（非特許文献１）。
【０００６】
またアレルゲン−抗体間に関わらず、重要な生体機能や疾患に関与するタンパク質間相互作用は多く存在する。これらの結合部位を同定することは、疾患メカニズムの解明や相互作用を阻害する薬剤の開発において重要となる。
【０００７】
タンパク質結合部位を同定する方法としては、ペプチドアレイを用いた結合部位マッピング法が多く報告されている。同手法では対象タンパク質のアミノ酸配列の一部を含むペプチドを人工合成し、支持体上にアレイ化したデバイスを使用する。検体をアレイ上に添加し、どのペプチドと反応するかを調べることで、認識部位を決定することができる（非特許文献２）。しかしペプチドアレイの作製には大きなコストがかかり、無数に存在する試験対象の全てに対応することは不可能である。一方、質量分析を利用した方法（特許文献１および２）も報告されているが、これらは単にリガンド探索を目的としたものであって、結合部位の配列決定を可能にするものではない。
【特許文献１】特表２００２−５０１１７６号公報
【特許文献２】特表２００４−５３４５１９号公報
【非特許文献１】Methods. 2004 Mar;32(3):313-20. Review.
【非特許文献２】Curr Opin Biotechnol. 2001 Feb;12(1):59-64.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、抗原抗体反応のようなタンパク質間相互作用においてその結合部位を効率的に同定する手法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために鋭意検討し、一方のタンパク質を支持体に固定化し、ここに断片化したもう一方のタンパク質を捕捉させ、捕捉された断片をMS/MSで解析することにより、当該タンパク質間の結合部位を同定することに成功した。
【００１０】
すなわち、本発明は、相互作用するタンパク質間の結合部位を同定する方法であって、第１のタンパク質を支持体に固定化し、第２のタンパク質を断片化して、前記第１のタンパク質に添加し、前記第１のタンパク質に捕捉された前記第２のタンパク質断片を分離し、分離された前記第２のタンパク質断片のアミノ酸配列を質量分析により解析して、前記第２のタンパク質の前記第１のタンパク質への結合部位を同定する方法を提供する。
【００１１】
相互作用するタンパク質としては、受容体（第１のタンパク質）とそのリガンド（第２のタンパク質）、抗体（第１のタンパク質）とアレルゲンをはじめとする各種抗原（第２のタンパク質）などを挙げることができる。なお、第２のタンパク質は１種類に限定されず、２種以上であってもよい。
【００１２】
前記第１のタンパク質の固定化方法は特に限定されず、物理吸着、疎水結合、化学結合、共有結合など、タンパクの種類、目的に応じて選ぶ。
【００１３】
固定化においては、固定化における第1のタンパク質の高次構造の維持とその配向（結合部位が外側に向くようにすること）が重要である。たとえば、複数の結合部位を有するときや、結合部位が不明な場合は、ランダムな吸着が可能な物理吸着を用いることが好ましい。一方、第１のタンパク質が抗体の場合は、適当なリンカーを介して、抗体のN末端を支持体上に固定化することで、抗原結合部位を外側に向けて固定化することが望ましい。そのようなリンカーとしては、たとえば、カリックスクラウン誘導体の一種であるProLinker（登録商標）が挙げられる。なお、必要な場合には、第1のタンパク質は変性させてから用いてもよい。
【００１４】
支持体は用いるタンパク質が固定化可能な固相であれば特に限定されず、例えばニトロセルロースやPVDF等のメンブレン、ガラス、ウエハー等のシリコン、プラスチック等の樹脂、金属を用いることができる。支持体は、固定化に適した表面処理（修飾）を施したものであってもよい。そのような表面処理（修飾）としては、物理吸着によって目的分子を固定化することができるポリ-L-リジンやアミノシラン、共有結合によって目的分子を固定化することができるアルデヒド基やエポキシ基のような官能基、および目的分子との親和性を利用して固定化することができるアビジンやNi-NTAなどを用いることができる。又、ポリアクリルアミドゲルやアガロースゲルのような、親水性の多孔質マトリックスの薄層から成る固相も利用できる。
【００１５】
前記第２のタンパク質を断片化する方法としては、化学的断片化法および酵素法を挙げることができる。前者の例としては臭化シアン法、後者の例としてはトリプシン、キモトリプシン、ArgC、LysC、AspN、V8（GlcC）等による消化が挙げられる。
【００１６】
断片化には、複数種類の断片化方法を組み合わせることも有効である。組み合わせの選択方法として、例えば以下のような例が考えられる。初めに入手しやすく特異性の高いトリプシンで消化を行う。トリプシンでは消化不十分（断片が大きすぎてMS/MS解析が困難）な場合、トリプシンとは認識配列の異なるAspNやV8を併せて添加する。以上でまだ消化不十分な場合は特異性が低く比較的ランダムな消化をおこすキモトリプシンに変更する。またトリプシンで消化過剰（結合部位を消化してしまい同定できない）な場合、トリプシンよりも認識配列の少ないArgCやLysCに酵素を変更する。酵素消化を受けにくいタンパク質については化学的消化法に変更する。
【００１７】
最終的に、第２のタンパク質は分子量4000以下（アミノ酸数として40個程度）、特に2000（アミノ酸数として20個程度）以下程度に断片化されることが好ましい。断片化は、SDS−PAGE、HPLC等により確認することができる。
【００１８】
前記第１のタンパク質に捕捉された第２のタンパク質断片は、適当な溶媒を用いて溶出することにより分離される。溶出には、タンパク質の解離に一般的に用いられる方法を使用する。例えば0.1Mグリシンバッファー（pH 2）等の酸や8M尿素、6Mグアニジン、3％SDSなどの変性剤、4.5M MgCl2等のカオトロピックイオン、50％エチレングリコールなどの非極性溶媒を用いて溶出すればよい。
【００１９】
溶出された断片を含む試料は、質量分析にかける前に脱塩する必要がある。脱塩用デバイスとしては、C18等の逆相レジンを充填したカラム（PIERCE社、PepClean等）、カートリッジ（3M社、Empore抽出ディスク等）、ピペットチップ（Millipore社、ZipTip等）、マルチ−ウェルフィルタープレート(Millipore社、ZipPlatemaikuro-SPEプレート等)等が用いられる。
【００２０】
脱塩した試料は、MS/MS等の質量分析装置にかけて、その一次構造を決定する。この場合、あらかじめ測定対象である断片をラベルしておくことにより、定量的な解析が可能となる。ラベリングは第２のタンパク質を断片化するときでも、第１のタンパク質から分離（溶出）した後であってもよい。また、ラベリングに用いられる標識物質は、蛍光物質、放射性物質など当該分野で公知のいずれの標識物質を用いてもよい。なお、定量のみが目的の場合は、ラベルした断片を単に質量分析にかけ、一次構造解析はしなくてもよい。
【００２１】
本発明はまた、相互作用するタンパク質間の結合部位を同定するためのシステムであって、支持体に固定化させた第１のタンパク質を収納する手段と、第２のタンパク質を断片化する手段と、前記第1のタンパク質に前記第2のタンパク質断片を捕捉させて溶出する手段と、溶出された第２のタンパク質断片のアミノ酸配列をMS/MSで解析する手段とを有するシステムも提供する。
【００２２】
本発明の方法やシステムにより、被験者体内の抗体が反応する特定のアレルゲンやエピトープ部位を特定するアレルギー検査を行うことができる。あるいは自己免疫疾患（関節リウマチ、膠原病、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性の糖尿病や甲状腺炎等）において、疾患の原因である自己抗体生成を引き起こす自己抗原を検出・同定することができる。自己抗体の抗原認識能は疾患の進行に伴って変化し、これらの変化は発症の前兆として現れる場合が多いことから、本システムは特に疾患の早期診断に有効であることが期待される。また、本発明の方法やシステムを用いて、抗体等の標的タンパク質あるいは標的受容体に特異的に結合するエピトープ配列を特定し、当該配列に基づいて薬剤設計や候補物質の探索を行う、薬剤スクリーニングを行うこともできる。さらにこれらエピトープ配列の、疾患のステージや個人差に基づく違いを明らかにすることで、各患者に適したオーダーメードの投薬・治療を行なうことが可能となる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、抗原抗体反応をはじめとするタンパク質間相互作用において、その結合部位を簡便かつ効率的に同定（一次構造決定）することができる。本発明の方法は、微量なサンプル（数μl程度）について、定量的解析が可能なうえ、１つのタンパク質と相互作用する２種以上のタンパク質の同時解析も可能である。
【００２４】
成人後に発症するアレルギーの多くは小児期の生活習慣に依存すると考えられており、従って、乳幼児期にアレルギー検査を行ってアレルゲンを特定し、早くから食事等の生活習慣に注意を払えば、成人後のアレルギーの発症を防ぐことが可能となる。しかしながら、乳幼児の検査では大量の検体採取が困難であるため、微量検体による同定が可能な本発明の方法は、非常に有効な手段となる。さらに、本発明は、抗原-抗体反応以外のタンパク質間相互作用においても、迅速且つ簡便に結合部位の同定を可能とする。したがって、本発明によれば、効果が高く副作用の少ない医薬の開発やオーダーメードの医療が促進される。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
〔実施例１〕
図１〜図３はプロテインマイクロアレイを用いたタンパク質間結合部位の同定工程を示す。ここでは、(1)解析対象となるタンパク質Aの支持体への固定化、(2)解析対象となるタンパク質Bの断片化、(3)固定化したタンパク質Aによるタンパク質B断片の捕捉、(4)捕捉したタンパク質B断片の溶出、(5)脱塩およびMS/MS測定、の順番で実験操作を進めているが、本発明は必ずしもここに示した方法に限定されるものではない。
【００２７】
本実施例では、試料や試薬を支持体上にスポットするためのスポット用シール302、マイクロピペッター303、密封容器306、気相インキュベーター307、洗浄容器308を用いる。
【００２８】
スポット用シール302は直径2 mmのスポット用孔を縦4列に5 mm間隔、横12列に4.5 mm間隔で配置した縦25 mm x 横55 mmの疎水性シートである。裏面は粘着性になっており、支持体に予め貼付することで、試料や試薬を支持体上の同じ位置に同じ大きさでスポットすることができる。マイクロピペッター303は、支持体上に試料や試薬304を任意の分量でスポットするためのものである。密封容器306は、支持体を少量の水滴305と共に密封することにより、容器の内部の湿度を長時間保ち、支持体上の試料や試薬の蒸発を防ぐためのものである。気相インキュベーター307は試料や試薬の結合反応に適した温度を保持するためのものである。洗浄容器308は支持体を洗浄溶液とともに振とうすることで、支持体に結合しなかった分子を除去する目的で用いる。
【００２９】
(1)解析対象となるタンパク質Aの支持体への固定化では、スポット用シール302を支持体301に貼付し、マイクロピペッター303を使用して解析対象となるタンパク質Aを手動で滴下する。支持体を水滴305とともに密封容器306中に設置し、インキュベーター307内で保温してタンパク質Aの支持体上への結合反応を行う。洗浄操作によって未結合のタンパク質Aを取り除く。
【００３０】
(2)解析対象となるタンパク質Bの断片化では、解析対象であるタンパク質Bを化学的あるいは酵素的な処理により断片化する。
【００３１】
(3)固定化したタンパク質Aによるタンパク質B断片の捕捉では、(2)で断片化したタンパク質B試料を(1)で支持体に固定化したタンパク質Aに添加し、一定時間インキュベートする。認識部位に相当する配列を持つペプチド断片のみがタンパク質Aによって捕捉され、それ以外の断片は洗浄操作によって除去される。
【００３２】
(4)捕捉したタンパク質B断片の溶出では、溶出試薬をタンパク質固定化スポットへと添加し、一定時間インキュベートした後、支持体表面から溶出試薬中へと溶離されたペプチド断片を回収する。
【００３３】
(5)脱塩およびMS/MS測定では、市販の脱塩用デバイス（Millipore社のZip-Tip等）312を用いて溶出試薬中の塩を除去した後、質量分析計313によって測定する。MS解析で得られたペプチドピークはMS/MS解析によりそのアミノ酸配列を解析する。
【００３４】
〔実施例２〕
本実施例では、ヒスチジン6つから成るポリペプチド鎖を認識する抗(His)6抗体を支持体に固定化し、(His)6配列を保持した抗原のプロテアーゼ消化物を添加して(His)6配列部位を抗体により捕捉させた後、支持体より溶出してMS/MS測定により配列を決定した実験について記載する。
【００３５】
１．抗体の支持体への固定化
本実施例では、支持体としてProteoChip (TypeA、Proteogen Inc.)を用いた。ProteoChipはカリックスクラウン誘導体の一種であるタンパク質結合試薬‘ProLinker’をスライドグラス（縦26 mm x 横76 mm）上にコーティングしたプロテインチップであり、ProLinkerとの相互作用によってタンパク質を表面に固定化することができる。
【００３６】
ProteoChip表面には試料や試薬を同じ位置に同じ大きさでスポットするためのスポット用シール（意匠1213441号開示）302を予め貼付した。抗(His)6抗体(MAB050、R&D Systems Inc.)を、30％Glycerolを含んだPBS(pH 7.4)を用いて100 μg/mlに希釈し、マイクロピペッター303を用いて支持体301に対して1.5 μlずつ滴下した。
【００３７】
支持体を隅に水滴305をいれた密閉容器306に設置し、37℃で一晩インキュベートして抗(His)6抗体を支持体に固定化した。固定化後、支持体を50 mlの洗浄溶液（0.5％ Tween20を含むPBS、 pH 7.8）中に浸漬し、10分間振とうして未結合の抗体を取り除いた。洗浄後、濾紙により余分な水分を取り除いた。
【００３８】
２．解析対象となる抗原のプロテアーゼによる断片化
(His)6融合組換えモデルタンパク質（東北大学多元物質科学研究所にて発現・精製済の試料を入手）を150 mM NaCl、2.5 mM CaCl2を含んだ50 mM Tris-HCl (pH 8.0)に0.5 mg/mlとなるように希釈し、30 Uのスロンビン（27-0846-01、Amercham Bioscience）を添加して室温で一晩インキュベートした。消化の確認のため、消化物の一部を採取しNi-NTA担体（30210、QIAGEN）を添加した。モデルタンパク質が補因子として保持する色素が担体に結合しなくなることを指標に、(His)6配列の離脱を確認した。
【００３９】
３．固定化抗体による抗原断片の捕捉
スロンビン消化済み(His)6融合組換えモデルタンパク質を、マイクロピペッター303を用いて支持体に対して1.5 μlずつ滴下した。支持体を隅に水滴305をいれた密閉容器306に設置し、37℃で一晩インキュベートして、抗(His)6抗体により(His)6配列を保持したペプチドを補足させた。支持体を50 mlの洗浄溶液（0.5％ Tween20を含むPBS、 pH 7.8）中に浸漬し、10分間振とうして未結合のペプチドを取り除いた。洗浄後、濾紙により余分な水分を取り除いた。
【００４０】
４．捕捉した抗原断片の溶出
溶出試薬310として6M塩酸グアニジンを、マイクロピペッター303を用いて支持体に対して1.5 μlずつ滴下した。支持体を隅に水滴305をいれた密閉容器306に設置し、室温で10分間インキュベートして、抗(His)6抗体に結合したペプチドを解離させた。6M塩酸グアニジンを、マイクロピペッターを用いて回収した。再度1.5 μlの6M塩酸グアニジンを支持体に添加し、同様の回収操作を繰り返した。
【００４１】
５．脱塩およびMS/MS測定
脱塩は市販の脱塩用デバイスZip-Tip C18 （ZTC1 8S0 08、Millipore）312を用いて行った。脱塩済み試料は遠心濃縮を行い、脱塩時に用いた有機溶媒（アセトニトリル）を除去した。脱塩後の試料は液体クロマトグラフ質量分析計NanoFrontier（日立ハイテクノロジーズ）313により測定した。検出されたペプチドイオンはMS/MS測定によりその配列を決定した。
【００４２】
６．実験結果
図４にMS/MS測定を行った質量分析の結果を示す。横軸がm/z比、縦軸がイオン強度である。この結果“GSSHHHHHHSSGLVPR（配列番号１）”というペプチドが同定された。これは塩基配列から予測される(His)6配列を含んだペプチドのアミノ酸配列と完全に一致した。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、創薬、治療、診断をはじめとする医療の分野において有用である。特にアレルゲンと体内IgEの結合部位を特定することで、より効果が高く副作用の少ないアレルギー治療薬の開発を可能とする。また診断において患者に固有のアレルゲン（エピトープ部位）を解析することで、個人の体質にあった治療を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、タンパク質結合部位同定のための実験フローを示す。
【図２】図２は、タンパク質結合部位同定の原理を示す。
【図３】図３は、プロテインマイクロアレイを用いた実験操作を示す。
【図４】図４は、MS/MS測定の結果を示す（横軸：m/z比、縦軸：イオン強度）。
【符号の説明】
【００４５】
201：タンパク質A
202：タンパク質B
203：断片化したタンパク質B
204：タンパク質溶出試薬
301：支持体
302：スポット用シール
303：マイクロピペッター
304：タンパク質A
305：水滴
306：密封容器
307：インキュベーター
308：洗浄容器
309：断片化済みタンパク質B
310：タンパク質溶出試薬
311：溶出済みタンパク質B断片
312：脱塩用デバイス
313：質量分析装置
【配列表フリーテキスト】
【００４６】
配列番号１：抗(His)6抗体に結合した断片
【図１】
2007309689.tif 000003
【図２】
2007309689.tif 000004
【図３】
2007309689.tif 000005
【図４】
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【配列表】
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