(57)【要約】  【課題】ストレスと時計遺伝子との間の分子的反応機構を解明すること。  【解決手段】本発明者らは、末梢組織において、ストレス時にＰｅｒ１遺伝子の発現レベルが増加することを新規に見出した。また、このストレス応答において、末梢組織の概日リズムは変化しないこと、及び、Ｐｅｒ１遺伝子はそのプロモーター領域に存在するグルココルチコイド応答配列依存的に発現レベルが増加することを新規に見出した。これらの知見は、ストレス評価方法に適用できる。例えば、末梢組織中におけるＰｅｒ１遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の量の増加やＰＥＲ１（Ｐｅｒ１遺伝子がコードするタンパク質）の量の増加を検出・測定などすることにより、ストレスの有無や度合を評価することができる。  【選択図】図３Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｅｒ１遺伝子の発現レベルの増加を検出するストレス評価方法。
【請求項２】
末梢組織におけるＰｅｒ１遺伝子の発現レベルの増加を検出することを特徴とする請求項１記載のストレス評価方法。
【請求項３】
ストレス時に発現レベルが増加するＰｅｒ１遺伝子。
【請求項４】
末梢組織で発現レベルが増加することを特徴とする請求項３記載のＰｅｒ１遺伝子。
【請求項５】
グルココルチコイド応答配列依存的に発現レベルが増加することを特徴とする請求項３記載のＰｅｒ１遺伝子。
【請求項６】
請求項３記載のＰｅｒ１遺伝子の塩基配列又はその一部を有するポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項３記載のＰｅｒ１遺伝子の転写産物の、ストレス検出用マーカーとしての使用。
【請求項８】
請求項３記載のＰｅｒ１遺伝子がコードするタンパク質であるＰＥＲ１。
【請求項９】
請求項８記載のＰＥＲ１に特異的に結合する抗ＰＥＲ１抗体。
【請求項１０】
請求項８記載のＰＥＲ１の、ストレス検出用マーカーとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末梢組織におけるＰｅｒ１遺伝子の発現レベルの増加を検出するストレス評価方法、Ｐｅｒ１遺伝子、Ｐｅｒ１遺伝子がコードするタンパク質であるＰＥＲ１、Ｐｅｒ１遺伝子の転写産物又はＰＥＲ１のストレス検出用マーカーとしての使用などに関する。
【背景技術】
【０００２】
概日リズム（サーカディアンリズム）は、約２４時間を周期とする生物リズムであり、単細胞生物からヒトに至るまで、多くの生物に普遍的に見られる生体内現象である。各生物は、概日リズムの制御に関わる遺伝子を有し、概日リズム制御遺伝子が、概日リズムの調整を行っている。
【０００３】
哺乳類では、概日リズム制御遺伝子の発現量が脳視床下部の視交叉上核（ＳＣＮ）で特に高く、個体レベルでの概日リズム調整の中枢を担っている。一方、生体内のその他の組織（概日リズム末梢組織）においても、概日リズム制御遺伝子は発現しており、概日リズム中枢と同様に、概日リズム制御遺伝子による細胞・組織ごとの概日リズム調整が行われている。
【０００４】
哺乳類における概日リズム制御遺伝子としては、Ｐｅｒ遺伝子（Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｐｅｒ３）、Ｃｌｏｃｋ遺伝子、Ｂｍａｌ遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｂｍａｌ２、Ｂｍａｌ３）、Ｃｒｙ遺伝子、Ｄｅｃ遺伝子（Ｄｅｃ１、Ｄｅｃ２）、Ｄｂｐ遺伝子、Ｅ４Ｂｐ４遺伝子、Ｒｅｖ−ｅｒｂ遺伝子（Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ）などが知られている。
【０００５】
ここで、本発明に関連する先行文献として、例えば、特許文献１には、唾液中のコルチゾールを測定することによる慢性ストレス判定方法が記載されている。なお、非特許文献１は、後述の実施例において参照した文献である。
【特許文献１】特開２０００−２７５２４８号公報
【非特許文献１】Sokolove P.G. and Bushell W.N. (1978) J Theor Biol 72, 131-160
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
哺乳類などでは、ストレス応答性と概日リズム調節機構との間には関連性があると考えられているが、ストレスと時計遺伝子との間の分子的反応機構の詳細は、未解明な部分が多い。
【０００７】
そこで、本発明は、ストレスと時計遺伝子との間の分子的反応機構を解明することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、末梢組織において、ストレス時にＰｅｒ１遺伝子の発現レベルが増加することを新規に見出した。また、このストレス応答において、末梢組織の概日リズムは変化しないこと、及び、Ｐｅｒ１遺伝子はそのプロモーター領域に存在するグルココルチコイド応答配列依存的に発現レベルが増加することを新規に見出した。
【０００９】
これらの新知見は、次のようなストレス応答機構の存在を示唆する。個体にストレスが負荷されると、副腎皮質よりグルココルチコイドが分泌され、全身に運ばれる。それに対し、Ｐｅｒ１遺伝子の発現レベルが、そのプロモーター領域に存在するグルココルチコイド応答配列依存的に増加する。即ち、ストレス負荷によるＰｅｒ１遺伝子の発現レベルの上昇は、他の時計遺伝子の発現や概日リズムとは別の反応機構により行われる。
【００１０】
前記各知見は、ストレス評価方法に適用できる。例えば、末梢組織中におけるＰｅｒ１遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の量の増加やＰＥＲ１（Ｐｅｒ１遺伝子がコードするタンパク質）の量の増加を検出・測定などすることにより、ストレスの有無や度合を評価することができる。
【００１１】
なお、Ｐｅｒ１遺伝子の転写産物の検出は、例えば、末梢組織からｔｏｔａｌＲＮＡなどを抽出・合成した後、Ｐｅｒ１の塩基配列又はその一部を有するポリヌクレオチド（検出用プローブ）と抽出・合成した核酸とのハイブリダイゼーション反応により行うことができる。また、ＰＥＲ１（タンパク質）の検出は、例えば、ＰＥＲ１に特異的に結合する抗ＰＥＲ１抗体を用いた抗原抗体反応により行うことができる。
【００１２】
Ｐｅｒ１遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の遺伝子データベースなどで取得できる。例として、ヒトのＰｅｒ１遺伝子のホモログの塩基配列を配列番号１に、マウスのＰｅｒ１遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す。なお、本発明におけるＰｅｒ１遺伝子には、各動物種におけるＰｅｒ１遺伝子ホモログの配列のほか、それらの配列の一部に置換、欠損、挿入、付加部分が含まれるものも包含される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、より客観的かつ高精度にストレス状態を評価できる。
【実施例１】
【００１４】
実施例１では、赤外線運動記録装置（Ｂｉｏｔｅｘ社製）を用いてマウスの運動を記録し、ストレスを負荷した場合におけるマウスの運動の概日変化を調べた。
【００１５】
赤外線運動記録装置を備えたケージ内に、ＢＡＬＢ／ｃ系統のマウスを一匹ずつ入れ、２週間、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返し（明条件は８時から２０時とした。）概日リズムを同調させた後、２４時間暗条件でフリーラン（自由継続）させ、アクトグラムを記録した。また、フリーランさせている途中で、２日間連続で、所定時刻に１時間のストレスをマウスに負荷した。ここで、アクトグラムとは、マウスの運動を連続的に記録したものである。記録したアクトグラムは、「ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ  ｐｅｒｉｏｄｇｒａｍ」法による解析を行った（非特許文献１参照）。
【００１６】
図１Ａは、ストレスを負荷した場合におけるマウスの運動の概日変化を示すアクトグラムである。図の一番上の段に示された数値は時刻を、そのすぐ下の黒色部分はフリーランさせる前において暗条件にした時刻を、灰色部分は同じく明条件にした時刻を、それぞれ表す。図中の以下の各段は２日ごとのアクトグラムであり、各点は運動の検出回数を表す。
【００１７】
図中、「ＣＴ２」は、概日時間（Ｃｉｒｃａｄｉａｎ  Ｔｉｍｅ）の２時を、「ＣＴ５」は同じく５時を、「ＣＴ１５」は同じく１５時を、それぞれ表す。ここで、概日時間は、マウスが主観的な時刻を表す。即ち、マウスは夜行性であるため、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返される条件の場合は、明条件の開始時刻を概日時間の０時に、２４時間暗条件の場合は、日周リズムにより運動が減る時刻（睡眠状態になる時刻）を０時に、それぞれ設定する。
【００１８】
アクトグラム中の黒く塗りつぶされた部分は、ストレスを負荷した時間帯を表す。即ち、「ＣＴ２」のアクトグラムの場合、２４時間暗条件にしてから２０日目と２１日目の概日時間１〜２時にストレスを負荷した。同様に、「ＣＴ５」のアクトグラムの場合、２４時間暗条件にしてから２０日目と２１日目の概日時間４〜５時に、同様に、「ＣＴ１５」のアクトグラムの場合、２４時間暗条件にしてから２０日目と２１日目の概日時間１４〜１５時に、それぞれストレスを負荷した。
【００１９】
その結果、図１Ａに示す通り、ストレスを負荷した場合も、概日リズムの変化は観察されなかった。
【００２０】
図１Ｂは、図１Ａのアクトグラムにおけるマウスの概日周期を平均値化したグラフである。図中、縦軸の「ｐｅｒｉｏｄ（ｈｒ）」は、マウスの概日周期（主観的な１日の長さ）を表す。「ＰｒＳ」はストレス負荷前（ｐｒｅ  ｓｔｒｅｓｓ）における概日周期であることを、「ＰｏＳ」はストレス負荷後（ｐｏｓｔ  ｓｔｒｅｓｓ）における概日周期であることを、それぞれ表す。図中、「ｓｔｒｅｓｓ」の項目は、ストレス負荷の有無を表す。その他、「ＣＴ２」、「ＣＴ５」、「ＣＴ１５」は前記と同様である。
【００２１】
その結果、図１Ｂに示す通り、ストレス負荷前とストレス負荷後とで、概日周期の変化はほとんど見られなかった。
【００２２】
図１Ｃは、ストレス負荷前と負荷後の運動率の変化を表すグラフである。図中、縦軸の「Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒａｔｉｏ（％）」は、ストレス負荷後の３日間における運動値を、ストレス負荷前の１０日間における運動値で除した値（％）である。図中、「ｓｔｒｅｓｓ」の項目は、前記と同様、ストレス負荷の有無を表す。その他、「ＣＴ２」、「ＣＴ５」、「ＣＴ１５」は前記と同様である。
【００２３】
その結果、図１Ｃに示す通り、ストレスを負荷しなかった群（コントロール）とストレスを負荷した群との間で、運動率の変化はほとんど観察されなかった。
【００２４】
図１Ｄは、ストレスを負荷した場合における再同調までの日数を表すグラフである。この実験では、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した（明条件は８時から２０時とした。）後、ストレスを負荷した日から、明条件開始時刻を６時間早くした（明条件は２時から１４時）場合、概日リズムが何日間で再同調するかを調べた。
【００２５】
図中、縦軸の「Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｄａｙｓ  ｕｎｔｉｌ  Ｒｅｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ」は、明条件開始時刻の変更後再同調するまでの日数を表す。図中、「ＺＴ２」は、明暗周期（Ｚｅｉｔｇｅｂｅｒ  ｔｉｍｅ）１〜２時の間ストレスを負荷したことを、「ＺＴ１５」は同じく１４〜１５時の間ストレスを負荷したことを、「ｃｔｒｌ」はストレスを負荷しなかったこと（コントロール）を、それぞれ表す。ここで、明暗周期（Ｚｅｉｔｇｅｂｅｒ  ｔｉｍｅ）は、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返す条件下において、明条件の開始時刻を０時にした場合の時刻を表す。
【００２６】
その結果、図１Ｄに示す通り、ＺＴ２の場合では、ばらつきが見られたが、ＺＴ１５の場合では、概日リズムが再同調するまでの日数は、ストレスを負荷しなかった場合（コントロール）とほとんど同じだった。
【００２７】
以上、実施例１の結果は、個体の行動レベルにおいて、ストレス負荷によっては、概日リズムはほとんど変化しないことを示す。
【実施例２】
【００２８】
実施例２では、ストレスを負荷した場合における各時計遺伝子の発現量の概日変化を調べた。
【００２９】
まず、所定時刻に１時間のストレスをマウスに負荷した後、そのマウスから肝臓、心臓、腎臓の各臓器を採取した。臓器の採取時刻は、ストレス負荷の１２時間後から４時間ごとに設定した。次に、それらの臓器をホモジナイズ後、Ｐｒｏｍｅｇａ  ｔｏｔａｌ  ＳＶ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、各臓器からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、ｍＰｅｒ１、ｍＰｅｒ２、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現量を測定した。
【００３０】
次に、測定した発現量の経時的データについて、「数１」に示す数式を用いて、「Ｃｏｓｉｎｅ  ｆｉｔｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ」法により、フィッティングを行った。
【００３１】
【数１】
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【００３２】
結果を図２Ａ〜２Ｃに示す。
【００３３】
図２Ａは肝臓における各時計遺伝子の発現量の概日変化を示すグラフ、図２Ｂは心臓における各時計遺伝子の発現量の概日変化を示すグラフ、図２Ｃは腎臓における各時計遺伝子の発現量の概日変化を示すグラフである。
【００３４】
各図中、「ｍＰｅｒ１」はｍＰｅｒ１の発現量の概日変化を示すグラフであることを、「ｍＰｅｒ２」はｍＰｅｒ２の発現量の概日変化を示すグラフであることを、「ｍＢａｌ１」はｍＢａｌ１の発現量の概日変化を示すグラフであることを、それぞれ表す。なお、各遺伝子の名称に付された「ｍ」は、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）を表す。各図中、「ｃｔｒｌ」はストレスを負荷しなかったこと（コントロール）を、「ＺＴ２」は、明暗周期（Ｚｅｉｔｇｅｂｅｒ  ｔｉｍｅ）１〜２時の間ストレスを負荷したことを、「ＺＴ１５」は同じく１４〜１５時の間ストレスを負荷したことを、それぞれ表す。各図中の数値は、臓器の採取時刻を表す。
【００３５】
その結果、図２Ａ〜２Ｃにに示す通り、各時計遺伝子の発現量にはばらつきがみられたが、ストレスを負荷した場合（「ＺＴ２」、「ＺＴ１５」のグラフ参照）と、ストレスを負荷しなかった場合（コントロール）との間で、概日リズムの位相の移動は、ほとんどなかった。
【００３６】
従って、実施例２の結果は、時計遺伝子の発現レベルにおいて、ストレス負荷によっては、概日リズムの位相はほとんど変化しないことを示す。
【実施例３】
【００３７】
実施例３では、ストレスを負荷した場合において、各臓器における時計遺伝子の発現量が変化するかどうか調べた。
【００３８】
まず、所定時刻に１時間のストレスをマウスに負荷した後、そのマウスから肝臓、心臓、肺、腎臓の各臓器を採取した。臓器の採取時刻は、ストレス負荷の１２時間後から４時間ごとに設定した。次に、それらの臓器をホモジナイズ後、Ｐｒｏｍｅｇａ  ｔｏｔａｌ  ＳＶ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、各臓器からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、各時計遺伝子の発現量を測定した。
【００３９】
結果を図３Ａ〜３Ｄに示す。
【００４０】
図３Ａは肝臓における各時計遺伝子の発現量を示すグラフ、図３Ｂは心臓における各時計遺伝子の発現量を示すグラフ、図３Ｃは肺における各時計遺伝子の発現量を示すグラフ、図３Ｄは腎臓における各時計遺伝子の発現量を示すグラフである。
【００４１】
各図中、「Ｐｅｒ１」、「Ｐｅｒ２」、「Ｐｅｒ３」、「Ｂｍａｌ１」、「Ｎｐａｓ２」、「Ｃｒｙ１」、「Ｃｒｙ２」、「Ｄｅｃ１」、「Ｄｅｃ２」、「Ｄｂｐ」、「Ｅ４ｂｐ４」は各時計遺伝子の発現量を示すグラフであることを表す。各グラフ中、黒色のバーは、ストレスを負荷しなかった場合（ｃｏｎｔｒｏｌ）における各時計遺伝子の発現量を、白色のバーはストレスを負荷した場合における各時計遺伝子の発現量を、それぞれ表す。各グラフ中、横軸の数値は臓器の採取時刻を、縦軸の数値は発現量（相対値）を、それぞれ表す。
【００４２】
図３Ａ〜３Ｄに示す通り、各臓器において、ストレス負荷により、Ｐｅｒ１遺伝子の発現量は増大したのに対し、その他の各時計遺伝子は、ストレスを負荷しても、発現量は増大しなかった。
【００４３】
以上、実施例１〜実施例３を総合すると、本実験結果は、ストレスを負荷した場合、個体レベルでの行動リズムや時計遺伝子の発現レベルでは、概日リズムが安定しているのに対し、ストレスを負荷した直後の末梢組織では、Ｐｅｒ１遺伝子の発現レベルが上昇することを示唆する。
【００４４】
従って、例えば、末梢組織におけるＰｅｒ１遺伝子の発現レベルを指標とすることにより、ストレスを客観的に評価できる可能性がある。
【００４５】
また、それらの実験結果は、ストレス負荷によるＰｅｒ１の発現レベルの上昇が、既知のプロモーター（Ｅ−ｂｏｘ、ＣＲＥなど）を介した経路、例えば、Ｂｍａｌ／Ｃｌｏｃｋ−Ｅ−ｂｏｘ経路、ＣＲＥ−ＣＲＥＢ経路などとは異なる新規の転写制御機構によるものである可能性を示唆する。
【実施例４】
【００４６】
実施例４では、ストレス応答に関わるＰｅｒ１遺伝子のプロモーターについて、検討した。
【００４７】
はじめに、ゲノム情報に基づき、Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域の配列について、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏの解析を行った。その結果、プロモーター領域の配列中に、ヒト、ラット、マウスに共通して、４つのＥ−ｂｏｘと２つのＤＢＰＥ（Ｄｂｐ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を見つけた。また、ＧＲＥ（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）に近似する配列を２つ見つけた（以下、「ＧＲＥ近似配列」とする）。
【００４８】
なお、Ｅ−ｂｏｘは、Ｐｅｒ１遺伝子の他、Ｐｅｒ２遺伝子、Ｄｂｐ遺伝子のプロモーター領域などにも存在する。また、ＤＢＰＥは、Ｐｅｒ３遺伝子のプロモーター領域にも存在する。
【００４９】
図４ＡはＧＲＥ近似配列及びその近傍の配列を示す図、図４Ｂは各プロモーターの配列上の位置を示す模式図である。
【００５０】
図中、「Ｄｉｓｔａｌ  ＧＲＥ」は、２つのＧＲＥ近似配列のうち上流側の配列であることを、「Ｐｒｏｘｉｍａｌ  ＧＲＥ」は、同じくＧＲＥ近似配列のうち下流側の配列であることを、それぞれ表す。図中、それぞれ、「Ｈ」はヒトの、「Ｒ」はラットの、「Ｍ」はマウスの配列であることを示す。図中、下線のある配列がＧＲＥに近似する配列である。図中、「Ｅｘ１」はエクソン１を、「Ｅｘ２」はエクソン２を表す。
【００５１】
図４Ｂ中、「Ｅ−ｂｏｘ」は、Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域のうち、Ｅ−ｂｏｘの存在する位置を、「ＧＲＥ」は、同じくＧＲＥ近似配列の存在する位置を、「ＣＲＥ」は、同じくＣＲＥの存在する位置を、それぞれ表す。
【００５２】
続いて、Ｐｅｒ１のプロモーター領域のうち、どの部分がストレス応答に関与しているか、ルシフェラーゼアッセイにより調べた。
【００５３】
ルシフェラーゼは、生物発光を触媒する酵素タンパク質である。例えば、所定の遺伝子のプロモーター領域とルシフェラーゼをコードする遺伝子とを連結させた組換え遺伝子を作製し、その組換え遺伝子を培養細胞に組み込んだ場合、その遺伝子の発現が誘導されると、ルシフェラーゼが発現する。従って、ルシフェラーゼによる生物発光を測定し、ルシフェラーゼの発現レベルを取得することにより、その遺伝子の発現誘導レベルを推定することができる。
【００５４】
そこで、本実験では、Ｐｅｒ１のプロモーター領域の長さの異なるＤＮＡを調製し、デキサメサゾン存在下でＰｅｒ１の発現レベルを取得することにより、Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域のどの部分がストレス応答に関与しているか、調べた。ここで、デキサメサゾンは、合成グルココルチコイドである。グルココルチコイドは、生体がストレス状態になると血中量が増加することが知られている。
【００５５】
実験手順の概要を以下に示す。
【００５６】
（１）まず、Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域のうち全長を有するＤＮＡ（Ｐ１Ｆ）、及び、上流側を切断・除去したＤＮＡ（Ｐ１Ｋ、Ｐ１Ｓ）を調製した。なお、切断部位は、図４Ｂに示す通り、「Ｐ１Ｆ」ではＰｅｒ１遺伝子の転写開始領域から６３０１塩基上流、「Ｐ１Ｋ」では同じく３８０６塩基上流、「Ｐ１Ｓ」では同じく２３６９塩基上流である。（２）次に、ルシフェラーゼ発光ベクターｐＧＬ３  ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、それらのＤＮＡを組み込んで、組換えベクターを作製した。この組換えベクターは、所定長のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子をコードする領域を有する。（３）次に、（２）で作製した組換えベクターを、培養細胞ＮＩＨ３Ｔ３にトランスフェクションし、０．１μＭのデキサメサゾンを添加した。次に、トランスフェクションした培養細胞を、単離・継代し、ルシフェラーゼを発現させた。そして、トランスフェクションの３６時間後に、継代した細胞を集め、溶解させた。（４）次に、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、溶解させた細胞溶液を調製した後、発光強度を測定し、デキサメサゾンによるＰｅｒ１遺伝子の発現誘導レベルを取得した。
【００５７】
結果を図４Ｃに示す。
【００５８】
図４Ｃは、ルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフである。グラフの横軸の「ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｕｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」は、発光強度を表す。この値は、Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域の全長を培養細胞に組み込んだ場合の発光強度を「１００」とした場合の相対値（％）である。
【００５９】
「Ｐ１Ｆ」はＰｅｒ１遺伝子のプロモーター領域の全長を培養細胞に組み込んだ場合の発光強度であることを、「Ｐ１Ｋ」はＰｅｒ１遺伝子の転写開始領域から３８０６塩基上流までを培養細胞に組み込んだ場合の発光強度であることを、「Ｐ１Ｓ」はＰｅｒ１遺伝子の転写開始領域から２３６９塩基上流までを培養細胞に組み込んだ場合の発光強度であることを、「ｖｅｃｔｏｒ」は空ベクターを培養細胞に組み込んだ場合（コントロール）の発光強度であることを、それぞれ表す。また、図４Ｃ中の右側の模式図は組み込んだＤＮＡを模式的に表したものである。「ＤＥＸ」はデキサメサゾンを添加した場合の発光強度であることを、「ＥｔＯＨ」はエタノールを添加した場合（コントロール）の発光強度であることを、それぞれ表す。
【００６０】
その結果、図４Ｃに示す通り、デキサメサゾンを添加した場合、「Ｐ１Ｋ」の群では高い発光強度を取得し、また、「Ｐ１Ｓ」の群でも一定量の発光強度を取得した。
【００６１】
「Ｐ１Ｋ」の群で用いたプロモーター配列の場合、ＧＲＥ近似配列を２つとも有する。一方、「Ｐ１Ｓ」の群で用いたプロモーター配列の場合、ＧＲＥ近似配列を１つ有する。従って、本実験結果は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏの解析で見つけたＧＲＥ近似配列が、Ｐｅｒ１遺伝子のストレス応答に関与する可能性を示唆する。
【００６２】
続いて、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏの解析で見つけた２つのＧＲＥ近似配列のいずれか又は両方の配列を変異させた場合に、図４Ｃと同様の発現誘導が起きるかどうか調べた。
【００６３】
まず、Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域のうち全長を有するＤＮＡ（Ｐ１Ｆ）、Ｐ１Ｆのうち上流側のＧＲＥ近似配列を変異させたＤＮＡ（Ｐ１ＦｄＭ）、同じく下流側のＧＲＥ近似配列を変異させたＤＮＡ（Ｐ１ＦｐＭ）、両方のＧＲＥ近似配列を変異させたＤＮＡ（Ｐ１Ｆｄ／ｐＭ）の４種類を調製した。次に、上述の手順と同様に、ルシフェラーゼ発光ベクターにそれらのＤＮＡを組み込み、培養細胞ＮＩＨ３Ｔ３にトランスフェクションした後、０．１μＭのデキサメサゾンを添加し、トランスフェクションの３６時間後に、継代した細胞を集め、溶解させた。そして、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、溶解させた細胞溶液を調製した後、発光強度を測定し、デキサメサゾンによるＰｅｒ１遺伝子の発現誘導レベルを取得した。
【００６４】
結果を図４Ｄに示す。
【００６５】
図中、それぞれ、「Ｐ１Ｆ」はＰｅｒ１遺伝子のプロモーター領域の全長を培養細胞に組み込んだ場合の、「Ｐ１ＦｄＭ」はＰ１Ｆのうち上流側のＧＲＥ近似配列を変異させたものを培養細胞に組み込んだ場合の、「Ｐ１ＦｐＭ」はＰ１Ｆのうち下流側のＧＲＥ近似配列を変異させたものを培養細胞に組み込んだ場合の、「Ｐ１Ｆｄ／ｐＭ」は両方のＧＲＥ近似配列を変異させたものを培養細胞に組み込んだ場合の発光強度であることを表す。その他は、図４Ｃと同様である。
【００６６】
その結果、図４Ｄに示す通り、デキサメサゾンを添加した場合、「Ｐ１ＦｐＭ」の群では高い発光強度を取得したのに対し、「Ｐ１ＦｄＭ」の群では、発光強度があまり高くなかった。この実験結果は、Ｐｅｒ１のプロモーター領域に存在するＧＲＥ近似配列のうち、特に、下流側の配列が、ストレス応答に強く関与していることを示唆する。
【実施例５】
【００６７】
実施例５では、ＮＩＨ３Ｔ細胞を用いて、Ｐｅｒ１遺伝子配列のＧＲＥ近似配列とグルココルチコイド受容体（以下、「ＧＲ」とする）とが結合するかどうかを、ＣｈＩＰ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）法により調べた。
【００６８】
まず、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をデキサメサゾン処理し、ｍＰｅｒ１遺伝子を発現誘導した。次に、その細胞へホルムアルデヒドを加え、タンパク質とクロマチンＤＮＡとの結合を固定した。次に、クロマチンＤＮＡをソニケーションにより断片化した後、抗ＧＲ抗体を用いて免疫沈降を行い、免疫沈降物（抗ＧＲ抗体、ＧＲ、ＧＲと結合したクロマチンＤＮＡ、以上３者の複合体）を回収した。次に、その免疫沈降物を加熱してＤＮＡ−タンパク質間のクロスリンクを解除させた後、ＰＣＲを行って目的の配列を増幅し、電気泳動により、ＰＣＲ産物を確認した。
【００６９】
図５Ａは、Ｐｅｒ１遺伝子の配列を模式的に示した図である。
【００７０】
図中、「ｄＧＲＥ」及び「ｐＧＲＥ」の上に付された三角は、ＰＣＲに用いたプライマーに対応する配列部位を示す。即ち、プライマーは、２つのＧＲＥ近似配列の近傍の部位をそれぞれ特異的に増幅させるように設計した。
【００７１】
図５Ｂは、ＣｈＩＰ法により免疫沈降物を得た後、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより目的の配列を検出した場合における電気泳動写真である。
【００７２】
図中、「ＩＰ：α−ＧＲ」は、抗ＧＲ抗体を用いて免疫沈降物を得た後、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより目的の配列を検出した場合の結果であることを、「ＩＰ：α−ｎｏｒｍａｌ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ」は、ウサギのＩｇＧを用いて免疫沈降物を得た場合の結果（コントロール）であることを、「ｉｎｐｕｔ」は、免疫沈降を行わずに半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより目的の配列を検出した場合（コントロール）の結果であることを、それぞれ表す。図中、「ＣｈＩＰ  ｐｒｉｍｅｒ」の段は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマー、即ち、増幅した目的の配列を表す。ここで、「ｄＧＲＥ」は、Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域に存在する２つのＧＲＥ近似配列のうち、上流側の配列を増幅させたことを、「ｐＧＲＥ」は、同じく下流側の配列を増幅させたことを、「ｍＰｅｒ２」は、ｍＰｅｒ２遺伝子を増幅させた（コントロール）ことを、それぞれ表す。図中、「０ｈｒ」は、デキサメサゾン処理を行わずに、すぐにホルムアルデヒドを加えた場合の結果であることを、「１ｈｒ（Ｄｅｘ）」は、デキサメサゾン処理の１時間後にホルムアルデヒドを加えた場合の結果であることを、「１ｈｒ（ＥｔＯＨ）」は、コントロールとしてエタノール処理の１時間後にホルムアルデヒドを加えた場合の結果であることを、それぞれ表す。
【００７３】
図５Ｃは、ＣｈＩＰ法により免疫沈降物を得た後、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより目的の配列を検出した場合における結果を示すグラフである。
【００７４】
グラフの縦軸「％ｉｎｐｕｔ」は、増幅した目的のＤＮＡの、ＰＣＲ産物中における量を示す。グラフ中の他の記載は、図５Ｂと同様である。
【００７５】
その結果、図５Ｂに示す通り、デキサメサゾン処理し、抗αＧＲ抗体を用いて免疫沈降物を得た後、ＰＣＲにより、「ｄＧＲＥ」及び「ｐＧＲＥ」で示す配列を増幅させた場合、目的のバンドが検出された（図５Ｂ中の上段の電気泳動写真を参照）。
【００７６】
また、図５Ｃに示す通り、デキサメサゾン処理し、抗αＧＲ抗体を用いて免疫沈降物を得た後、ＰＣＲにより、「ｄＧＲＥ」及び「ｐＧＲＥ」で示す配列を増幅させた場合、それらの配列を含むＤＮＡが大幅に増幅した。
【００７７】
従って、これらの結果は、Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域のうち、２つのＧＲＥ近似配列に、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）が結合することを示唆する。
【実施例６】
【００７８】
実施例６では、実際にストレスを負荷したマウスから採取した肝臓を用いて、実施例５と同様、Ｐｅｒ１遺伝子配列のＧＲＥ近似配列とグルココルチコイド受容体（ＧＲ）とが結合するかどうかを、ＣｈＩＰ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）法により調べた。
【００７９】
まず、１時間のストレスをマウスに負荷した１時間後に、そのマウスから肝臓を採取した。そして、実施例５と同様の方法により、目的の遺伝子配列を有するＰＣＲ産物を得た。
【００８０】
図６Ａは、ＣｈＩＰ法により免疫沈降物を得た後、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより目的の配列を検出した場合における電気泳動写真である。図中の各項目は、図５Ｂと同様である。
【００８１】
図６Ｂは、ＣｈＩＰ法により免疫沈降物を得た後、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより目的の配列を検出した場合における結果を示すグラフである。図中の各項目は、図５Ｃと同様である。
【００８２】
図６Ａ及び図６Ｂの結果は、個体レベルで実際にストレスが負荷された場合においても、Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域のうち、２つのＧＲＥ近似配列に、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）が結合することを示す。
【００８３】
なお、図６Ａ及び図６Ｂの結果では、Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域に存在する２つのＧＲＥ近似配列のうち、上流側の配列のほうが、ＧＲの結合量が多かった。
【実施例７】
【００８４】
実施例７では、マウスにコルチコステロンを投与した場合におけるＰｅｒ１の発現量を調べた。
【００８５】
まず、マウスにコルチコステロンを所定量投与し、その１時間後に肝臓を採取した。次に、採取した肝臓をホモジナイズ後、実施例２などと同様の方法により、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、各時計遺伝子の発現量を測定した。
【００８６】
図７Ａは、コルチコステロンの投与量とＰｅｒ１遺伝子の発現量との相関性を示すグラフである。
【００８７】
グラフの横軸は、マウスの体重１ｋｇ当たりに換算したコルチコステロンの投与量（ｍｇ／ｋｇ）を表す。「ＰＢＳ」はコルチコステロンの代わりにリン酸緩衝液を投与した場合（コントロール）であることを表す。グラフの縦軸「ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ」は、Ｐｅｒ１遺伝子の発現量を表す。なお、この値は、ＰＢＳを投与した場合の発現量を１とした場合の相対値である。
【００８８】
図７Ａの結果は、コルチコステロンの投与量を増加させると、Ｐｅｒ１遺伝子の発現量も増加することを示す。
【００８９】
図７Ｂは、コルチコステロンを１０ｍｇ／ｋｇ投与した場合における各時計遺伝子の発現量を示すグラフである。
【００９０】
グラフの横軸は各時計遺伝子を表す。グラフの縦軸「ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ」は、各時計遺伝子の発現量を表す。なお、この値は、ＰＢＳを投与した場合におけるＰｅｒ１遺伝子の発現量を１とした場合の相対値である。
【００９１】
図７Ｂの結果は、コルチコステロンを投与した場合、時計遺伝子のうち、Ｐｅｒ１遺伝子の発現量だけが増加することを示す。即ち、本実験結果は、ストレス負荷によるＰｅｒ１遺伝子の発現誘導が、概日リズムの調節とは全く別の機構により行われていることを示唆する。
【００９２】
以上、実施例１〜実施例７の実験結果は、図８に示すストレス応答機構の存在を示唆する。
【００９３】
図８に示す通り、Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域には、Ｅ−ｂｏｘ、ＣＲＥなどのほか、ＧＲＥ近似配列が存在する。
【００９４】
まず、個体にストレスが負荷されると、副腎皮質よりグルココルチコイドが分泌され、全身に運ばれる。次に、末梢組織に存在するＧＲとグルココルチコイドが結合する。次に、Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域に存在するＧＲＥ近似配列とその結合体とが結合し、Ｐｅｒ１遺伝子の発現が誘導される。
【００９５】
なお、Ｅ−ｂｏｘ、ＣＲＥなどの配列は、このストレス応答機構には関与しない。従って、それらの配列を有する他の時計遺伝子の発現誘導も起こらない。そのため、ストレスが負荷された場合でも、概日リズム（体内時計）はほとんど変化しない。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明に係るストレス評価方法は、既知のストレス応答機構とは全く異なる新規な機構を用いて、ストレスを検出できる点で有用である。また、本発明に係る遺伝子の転写産物及びタンパク質は、ストレス検出用マーカーとしての使用できる点で有用である。その他、本発明に係るポリヌクレオチド及び抗体は、ＤＮＡチップ、プロテインチップ、ストレス評価用キットなどに適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１Ａ】実施例１において、ストレスを負荷した場合におけるマウスの運動の概日変化を示すアクトグラム。
【図１Ｂ】実施例１において、図１Ａのアクトグラムにおけるマウスの概日周期を平均値化したグラフ。
【図１Ｃ】実施例１において、ストレス負荷前と負荷後の運動率の変化を表すグラフ。
【図１Ｄ】実施例１において、ストレスを負荷した場合における再同調までの日数を表すグラフ。
【図２Ａ】実施例２において、肝臓における各時計遺伝子の発現量の概日変化を示すグラフ。
【図２Ｂ】実施例２において、心臓における各時計遺伝子の発現量の概日変化を示すグラフ。
【図２Ｃ】実施例２において、腎臓における各時計遺伝子の発現量の概日変化を示すグラフ。
【図３Ａ】実施例３において、肝臓における各時計遺伝子の発現量を示すグラフ。
【図３Ｂ】実施例３において、心臓における各時計遺伝子の発現量を示すグラフ。
【図３Ｃ】実施例３において、肺における各時計遺伝子の発現量を示すグラフ。
【図３Ｄ】実施例３において、腎臓における各時計遺伝子の発現量を示すグラフ。
【図４Ａ】実施例４において、ＧＲＥ近似配列及びその近傍の配列を示す図。
【図４Ｂ】実施例４において、各プロモーターの配列上の位置を示す模式図。
【図４Ｃ】実施例４において、ルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。
【図４Ｄ】実施例４において、ＧＲＥ近似配列を変異させた場合におけるルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。
【図５Ａ】実施例５において、Ｐｅｒ１遺伝子の配列を模式的に示した図。
【図５Ｂ】実施例５において、ＣｈＩＰ法により免疫沈降物を得た後、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより目的の配列を検出した場合における電気泳動写真。
【図５Ｃ】実施例５において、ＣｈＩＰ法により免疫沈降物を得た後、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより目的の配列を検出した場合における結果を示すグラフ。
【図６Ａ】実施例６において、ＣｈＩＰ法により免疫沈降物を得た後、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより目的の配列を検出した場合における電気泳動写真。
【図６Ｂ】実施例６において、ＣｈＩＰ法により免疫沈降物を得た後、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより目的の配列を検出した場合における結果を示すグラフ。
【図７Ａ】実施例７において、コルチコステロンの投与量とＰｅｒ１遺伝子の発現量との相関性を示すグラフ。
【図７Ｂ】実施例７において、コルチコステロンを１０ｍｇ／ｋｇ投与した場合における各時計遺伝子の発現量を示すグラフ。
【図８】本発明に係るストレス応答機構を示す模式図。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【配列表】
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