(57)【要約】【課題】フィルターを使用して細胞膜をトラップする方法の問題点を解決した、かつ高速のスクリーニング法を提供すること。【解決手段】ゲル濾過層が予め担持された容器に、ABCタンパク質を発現している膜画分又はABCタンパク質を発現している細胞及びABCタンパク質の基質を含む溶液を接触させるステップ；当該接触後の容器を遠心するステップ；及び当該容器中の溶出層中の基質量を測定するステップ；を含む、前記方法、並びに、ABC(ATP Binding Cassette)タンパク質の輸送活性の測定方法であって、ゲル濾過層が予め担持された容器に、ABCタンパク質を発現している膜画分又はABCタンパク質を発現している細胞及びABCタンパク質の基質を含む溶液を接触させるステップ；当該接触後の容器を遠心するステップ；及び当該容器中の溶出層中の基質量を測定するステップ；を含む、前記方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ABC(ATP Binding Cassette)タンパク質の基質のスクリーニング方法であって、
ゲル濾過層が予め担持された容器に、ABCタンパク質を発現している膜画分又はABCタンパク質を発現している細胞及びABCタンパク質の基質を含む溶液を接触させるステップ；
当該接触後の容器を遠心するステップ；及び
当該容器中の溶出層中の基質量を測定するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記容器が、マルチウェルプレートの各ウェルである、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記溶液が、ABCタンパク質を発現している膜画分及びABCタンパク質の基質を含む溶液である、請求項１又は２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記ABCタンパク質を発現している膜画分が、ABCタンパク質を発現している昆虫由来の細胞膜画分である、請求項１〜３のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記ABCタンパク質が、ABCGサブファミリーに属するABCタンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記基質がヘマトポルフィリンである、請求項１〜５のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記基質が標識されている、請求項１〜６のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記標識が放射性標識である、請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
ABC(ATP Binding Cassette)タンパク質の輸送活性の測定方法であって、
ゲル濾過層が予め担持された容器に、ABCタンパク質を発現している膜画分又はABCタンパク質を発現している細胞及びABCタンパク質の基質を含む溶液を接触させるステップ；
当該接触後の容器を遠心するステップ；及び
当該容器中の溶出層中の基質量を測定するステップ；
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記容器が、マルチウェルプレートの各ウェルである、請求項９記載の測定方法。
【請求項１１】
前記溶液が、ABCタンパク質を発現している膜画分及びABCタンパク質の基質を含む溶液である、請求項９又は１０記載の測定方法。
【請求項１２】
前記ABCタンパク質を発現している膜画分が、ABCタンパク質を発現している昆虫由来の細胞膜画分である、請求項９〜１１のいずれか１項記載の測定方法。
【請求項１３】
前記ABCタンパク質が、ABCGサブファミリーに属するABCタンパク質である、請求項９〜１２のいずれか１項記載の測定方法。
【請求項１４】
前記基質がヘマトポルフィリンである、請求項９〜１３のいずれか１項記載の測定方法。
【請求項１５】
前記基質が標識されている、請求項９〜１４のいずれか１項記載の測定方法。
【請求項１６】
前記標識が放射性標識である、請求項１５記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲルろ過、特にゲル濾過プレートを用いるABCタンパク質が輸送する基質のスクリーニング方法、及びABCタンパク質の輸送活性の測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、形質膜、小胞体、ミトコンドリア等の細胞内小器官膜を介してイオンや栄養素の輸送及び老廃物や毒素の排出を行うことにより、細胞機能を維持している。これらの物質輸送は、チャネル、トランスポーターと呼ばれる膜輸送タンパク質により選択的に行われている。イオン、栄養素等の物質が細胞膜を透過するための機構の一つとしてABCタンパク質が知られている（例えば、非特許文献１参照）。ABCタンパク質は、トランスポーター、チャネル、受容体（レギュレーター）という多様な機能に分化し、それぞれの生物で重要な生理機能を果たしている。ABCタンパク質はいずれも類似の２次構造をもち、膜貫通型ドメインを含むATP結合ドメインを共通に有する膜タンパク質ファミリーであり、細胞内ATP、ADPによって駆動又は制御されている。ABCタンパク質は、細菌から酵母、植物、哺乳類に至る広い生物種に分布する最も大きい遺伝子ファミリーの一つである。ヒトでは、現在、約50以上のABCタンパク質遺伝子が同定され、これらのタンパク質の大部分が膜間の分子の能動輸送に関連していることから、ABCタンパク質はABCトランスポーターとも呼ばれている。
【０００３】
ABCタンパク質は、ATP加水分解のエネルギーをタンパク質分子の構造変化に変換し、それとカップリングすることによって薬剤を細胞の中から外へ輸送することから、薬物の体内動態プロファイル（吸収、分布、代謝、排泄、ターゲット部位での薬剤実効濃度）を規定し、ひいては薬物の全体的な薬理効果をも左右するといわれており、例えば、小腸上皮細胞や脳血管内皮細胞に発現したABCトランスポーターは、経口投与した薬物のバイオアベイラビリティー又は中枢神経系への薬物移行に大きく影響を与える。また、ABCタンパク質遺伝子の異常が病気と関連していることが知られている。特にヒトにおいては、ABCタンパク質の異常が様々な疾病を引き起こすことが明らかになり、ABCタンパク質の生体防御機構としての重要性が理解されつつある。例えば、癌の化学療法の分野では、ABCタンパク質ファミリーに属するP-糖タンパク質（MDR1）又はMRP1が過剰発現すると、多くの制癌剤を細胞外へ排出することによって癌細胞が耐性になることが知られている。
【０００４】
ABCタンパク質がトランスポーターとして細胞膜を介して薬物を輸送する機構は次のように考えられている。
（１）ABCタンパク質は細胞膜の両面（細胞の内側及び外側）にわたって膜中に存在する。
（２）このABCタンパク質に、細胞の内側から、エネルギー源としての１分子のATP及び輸送されるべき１分子の薬物が結合し、ATPはABCタンパク質のATPアーゼ活性によりADPとリン酸とに加水分解され、この際に放出されるエネルギーによるABCタンパク質の変形により薬物は細胞の内側から外側に輸送される。
（３）前記薬物は細胞の内側に放出されると共に、（２）において生成したリン酸もABCタンパク質から開放される。
（４）ABCタンパク質に、細胞の内側から、新たなATP分子が結合し、このATPがADPとリン酸とに分解し、エネルギーが開放され、このエネルギーにより前記（２）において変形したABCタンパク質の形状が復旧する。
（５）前記（４）において生成したADP及びリン酸がABCタンパク質から開放され、輸送系は前記（１）の状態に戻る。
【０００５】
ところで、現在、創薬開発の前臨床及び臨床段階での数多くの候補化合物のドロップアウトは憂慮すべき問題となっている。ドロップアウトの多くは、薬物の体内動態の不具合（低吸収率、低血中濃度、速いクリアランス等）及び毒性に起因する。そこで、創薬開発のスピードアップ化には、薬物動態のスクリーニングを薬物探索の初期段階から取り入れる必要がある。
【０００６】
一方、これまで、ABCタンパク質の輸送活性の測定方法としては、直径0.2〜0.4μmの96穴フィルターを用いて細胞膜をトラップし緩衝液で洗浄した後、基質の細胞膜内への取り込み量を測定する方法が使用されてきた（例えば非特許文献２参照）。しかしながら、細胞膜に取り込まれなかった基質がフィルター上に吸着して、バックグランドが高くなってしまうという問題がある。これでは、細胞膜に取り込まれた基質量が正確に測定できず、スクリーニング結果の再現性を低下させる。また、吸着によってフィルターの目が詰まり、スクリーニング操作自体を不可能にしてしまう場合もある。
【非特許文献１】C. F. Higgins, Ann. Rev. Cell Biol., 8, 67 (1992)
【非特許文献２】Journal of Biological Chemistry, Vol. 264, No. 29, pp. 17343-17348, 1989
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明は、上記のフィルターを使用する方法の問題点を解決した、かつ高速のスクリーニング法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、斯かる現状に鑑み鋭意検討した結果、ABCタンパク質を発現している細胞膜画分とABCタンパク質の基質とを反応させ、基質に比べて十分に大きなサイズの生体膜に基質を取り込ませた後、反応物をゲル濾過手段に付したところ、ゲル粒子の孔径よりも大きなサイズである、基質が取り込まれた生体膜画分のみを選択的に溶出できることを見出した。すなわち、ABCタンパク質によって膜輸送された基質のみを正確に測定できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、ABC(ATP Binding Cassette)タンパク質の基質のスクリーニング方法であって、
ゲル濾過層が予め担持された容器に、ABCタンパク質を発現している膜画分又はABCタンパク質を発現している細胞及びABCタンパク質の基質を含む溶液を接触させるステップ；
当該接触後の容器を遠心するステップ；及び
当該容器中の溶出層中の基質量を測定するステップ；
を含む、前記方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、ABC(ATP Binding Cassette)タンパク質の輸送活性の測定方法であって、
ゲル濾過層が予め担持された容器に、ABCタンパク質を発現している膜画分又はABCタンパク質を発現している細胞及びABCタンパク質の基質を含む溶液を接触させるステップ；
当該接触後の容器を遠心するステップ；及び
当該容器中の溶出層中の基質量を測定するステップ；
を含む、前記方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、正確かつ短時間に、ABCタンパク質の基質をスクリーニングし、又はABCタンパク質の輸送活性を測定することができる。特に、容器としてマルチウェルプレートを使用することにより、一回に多数の試料を簡便にスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ABCタンパク質は、ATPの加水分解によって得られるエネルギーを駆動力として物質を輸送し、又はチャンネルを制御する。ABCタンパク質は、特徴的なATP-結合部位を持ち、その一次構造はABCタンパク質の種類を超え、また生物種を超え、進化を通してよく保持されている。特に、ABCタンパク質のATP結合部位は、膜貫通部等の部分の一次構造と比較してアミノ酸配列が保存されている。そのATP結合部位に共通のアミノ酸残基配列としては、WalkerAとWalkerBモチーフ（Walker, J. E., Saraste, M., Runswick, M.J., Gay, N. J. (1982) EMBO J 1, 945-941)及びABC signatureモチーフ(Higgins, C. F. (1992) Annu. Rev. Cell Biol. 8, 67-113)がほぼ例外なく存在する。
【００１３】
本発明におけるABCタンパク質とは、WalkerAモチーフ(Gly-X-X-Gly-X-Gly-Lys-Ser-[Ser, Thr, Gln]((1982) EMBO J 1, 945-941に記載の配列番号1)とWalkerBモチーフ([Leu, Ile, Phe]-[Ile, Leu, Val]-X-Asp-[Glu, Asp, Ser])(同文献記載の配列番号2)であり、かつ以下のABC signatureモチーフ ([Leu, Ile, Val, Met, Phe, Tyr, Cys]-[Ser, Ala]-[Ser, Ala, Pro, Gly, Leu, Val, Phe, Tyr, Lys, Gln, His]-Gly-[Asp, Glu, Asn, Gln, Met, Trp]-[Lys, Arg, Gln, Ala, Ser, Pro, Cys, Leu, Ile, Met, Phe, Trp]-[Lys, Arg, Asn, Gln, Ser, Thr, Ala, Val, Met]-[Leu, Ile, Val, Met, Phe, Tyr, Pro, Ala, Asn]-[Pro, His, Tyr]-[Leu, Ile, Val, Met, Phe, Trp]-[Ser, Ala, Gly, Cys, Leu, Ile, Val, Phe]-[Phe, Tyr, Trp, His, Pro]-[Lys, Arg, His, Pro]-[Leu, Ile, Val, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Ala]（但し、Xは不特定のアミノ酸を意味する。）（(1992) Annu. Rev. Cell Biol. 8, 67-113記載の配列番号3）を有するタンパク質及びそれに類似するタンパク質をいい、その由来は細菌、酵母、植物及び動物など、特に制限されない。
【００１４】
かかるABCタンパク質としては、ABCA1(別名ABC1、TGD、HDLDT1)、ABCA2(別名ABC2)、ABCA3(別名ABC3、ABC-C、EST111653)、ABCA4(別名STGD1、RP19、FFM、STGD)、ABCA5(別名EST90625)、ABCA6(別名EST155051)、ABCA7、ABCA8、ABCA9、ABCA10(別名EST698739)、ABCA11(別名EST1133530)、ABCA12(DKFZP434G232)等のABCAサブファミリー（別名ABC1サブファミリー）に属するヒトABCタンパク質；ABCB1(別名MDR1、P-gp、PGY1)、TAP1(別名PSF1、RING4、D6S114E)、TAP2(別名PSF2、RING11、D6S217E)、ABCB4(別名MDR2/3、PFIC-3、PGY3)、ABCB5(別名EST422562)、ABCB6(別名EST45597、umat、Hs.107911)、ABCB7(別名EST140535、Atmlp、ABC7)、ABCB8(別名EST328128、M-ABC1)、ABCB9(別名EST122234)、ABCB10(別名EST20237)、ABCB10P(別名M-ABC2、MABC2)、ABCB11(別名SPGP、PFIC-2、BSEP、PGY4)等のABCBサブファミリー(別名MDR/TAPサブファミリー)に属するヒトABCタンパク質；ABCC1(別名MRP1、MRP、GS-X pump)、ABCC2(別名MRP2、cMOAT、cMRP)、ABCC3(別名MRP3、cMOAT2、EST90757、MLP2、MOAT-D)、ABCC4(別名MRP4、EST170205、MOAT-B)、ABCC5(別名MRP5、SMRP、EST277145、MOAT-C)、ABCC6（別名MRP6、EST349056、MLP1、ARA)、CFTR(別名CF、MRP7、ABCC7)、ABCC8(別名SUR1、MRP8、PHHI、HI、HRINS)、ABCC9(別名SUR2)、ABCC10(別名EST182763)、ABCC11、ABCC12(別名MRP9)、ABCC13(別名PRED6、C21orf73)等のABCCサブファミリー（別名CFTR/MRPサブファミリー）に属するヒトABCタンパク質；ABCD1(別名ALDP、ALD、AMN)、ABCD1P1、ABCD1P2、ABCD1P3、ABCD1P4、ABCD2(別名ALDR、ALDRP、ALDL1)、ABCD3(別名PMP70、PXMP1)、ABCD4(別名P70R、EST352188、PXMP1L、PMP69)等のABCDサブファミリー(別名ALDサブファミリー)に属するABCタンパク質、ABCE1(別名RNS4I、RL1、OABP、RNASELI)等のABCEサブファミリー(別名OABPサブファミリー)に属するABCタンパク質、ABCF1(別名EST123147、ABC50)、ABCF2(別名EST133090、Hs.153612)、ABCF3(別名EST201864)等のABCFサブファミリー(別名GCN20サブファミリー)に属するヒトABCタンパク質；ABCG1(別名WHITE、ABC8)、ABCG2（別名EST157481、MXR、BCRP、ABCP)、ABCG3(別名Abcp2、Mxr2)、ABCG4(別名WHITE2)、ABCG5、ABCG8等のABCGサブファミリー（別名WHITEサブファミリー）に属するヒトABCタンパク質又は昆虫ABCタンパク質などを挙げることができるが、これらの中で、ABCG2、P糖タンパク質(P-gp)、MRP1、MRP2、CFTR、SUR1、ABC1、TAP1が好ましく、特にABCG2が好ましい。
【００１５】
上記のABCタンパク質を発現している膜画分としては、ABCタンパク質遺伝子が導入され、ABCタンパク質を発現している生体膜の画分であれば如何なるものでもよく、かかる生体膜としては細胞膜、小胞体、ミトコンドリア等の細胞内小器官膜を挙げることができる。これら生体膜の由来としては特に制限されるものではないが、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞；酵母、アスペルギルス等の真核細胞；ドロソフィラS2、スポドプテラSf9等の昆虫細胞；L細胞、CHO細胞、LLC-PK1細胞、MDCK細胞、COS細胞、HeLa細胞、C127細胞、BALB/c3T3細胞、BHK21細胞、HEK293細胞、VERO細胞、CV-1細胞、MDCK細胞、Bowesメラノーマ細胞、アフリカツメガエル等の卵母細胞等の動植物細胞などを挙げることができるが、これらの中で、特にドロソフィラS2、スポドプテラSf9等の昆虫細胞が好ましい。
【００１６】
ABCタンパク質を発現している膜画分の調製方法としては、ABCタンパク質を発現している細胞を作製し、当該細胞から膜画分を得る方法が挙げられる。上記ABCタンパク質を発現している細胞の作製方法としては、例えば、ABCタンパク質をコードするcDNAを、選択マーカーを有する発現ベクターに組み込み、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母、細菌等の培養細胞にトランスフェクションする方法を挙げることができる。選択マーカーを有する発現ベクターとして、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン等の特定の抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子を持つベクターを使用し、トランスフェクションした細胞を抗生物質の存在下で培養することによって、ABCタンパク質の発現ベクターを持つ細胞のみを選択することができる。ABCタンパク質の発現は、RT-PCR又は特異的抗体によって確認することが好ましい。このようにして得られたABCタンパク質発現細胞を大量に培養する。ABCタンパク質を発現している細胞からの膜画分の調製方法としては、例えば、上記ABCタンパク質発現細胞の培養物を遠心分離し、ABCタンパク質を発現する細胞を集め、細胞を超音波、浸透圧処理等によって破砕して、遠心によって膜画分を採取し、採取した膜画分を緩衝液中に懸濁して、ショ糖濃度勾配遠心によって細胞膜画分を単離精製する方法を挙げることができる。調製後の細胞膜画分は、そのタンパク質濃度を測定した後、液体窒素温度で瞬時凍結して−80℃で保存することが好ましい。
【００１７】
上記のABCタンパク質を発現している膜画分の他に、ABCタンパク質を発現している細胞そのものを使用することもできる。細胞そのものを使用することは、薬剤の生理活性及び薬剤とABCタンパク質との相互作用の相関についての解析を行う際に有効である。薬剤とABCタンパク質との相互作用を定量的に評価できる点から、ABCタンパク質を発現している膜画分を使用することが好ましい。
【００１８】
本発明で使用するABCタンパク質の基質としては、特に制限されないが、ABCタンパク質がABCG2タンパク質である場合には、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、ウロポルフィリン、コプロポルフィリン等のポルフィリン類等が挙げられる。ABCタンパク質がP糖タンパク質の場合には、ベラパミル（ワソラン）、キニジン、ローダミン123、ドキソルビシン、ジゴキシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、フォレート、コルチゾール、アルドステロン等の一部のステロイド等を挙げることができる。ABCタンパク質がMRP2の場合には、β-エストラジオール-17-(β-D-グルクロニド）、スルフォブロモフタレイン等を挙げることができる。これらの中で、ABCG2タンパク質の基質であるポルフィリン類が好ましく、特にヘマトポルフィリンが好ましい。
【００１９】
上記基質の標識としては、検出可能なものであれば特に限定されないが、32P、33P、35S、14C、3H等の放射性同位体を用いる放射性標識；フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート等を用いる蛍光標識；アジド基、ベンゾフェノン等を用いる光親和基標識；ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等を用いる酵素標識などを挙げることができ、この中でも特に放射性標識が好ましい。
【００２０】
本発明で用いる容器は、特に制限されないが、例えばマルチウェルプレートの各ウェル、栓付きカラム管又は栓付きカラム管に類似した筒状の容器、試験管、バイアル瓶、フラスコ等の任意の既知の形状ものが挙げられるが、一回に多数の基質のスクリーニングが行える点、簡便性の点などから、特にマルチウェルプレートを使用することが好ましい。マルチウェルプレートは、例えばPET（ポリエチレンテレフタレート）樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリビニル樹脂、ポリスチレン樹脂製等の96ウェルのマルチウェルプレート、384ウェルのマルチウェルプレートなどが好ましい。更に、マルチウェルプレートは、細胞膜の回収率を向上できる点から、各ウェルの深さが通常のマルチウェルプレートのウェルの深さよりも深めであるものが好ましい。
【００２１】
本発明で用いる容器中には、生体膜に取り込まれた基質と取り込まれなかった基質とを分離するためのゲル濾過層が予め担持されている。基質分子が取り込まれた生体膜のサイズはゲル粒子の孔径よりも大きいため、ゲル粒子の外側をたどるように進むが、取り込まれなかった基質はゲル粒子の細孔を満たすように進む。そのため、基質分子が取り込まれた生体膜画分は、取り込まれなかった基質に比べて速く溶出する。従って、このゲル濾過層により、基質分子が取り込まれた細胞膜画分と、取り込まれなかった基質との分離が可能になる。このゲル濾過層を形成するゲル濾過剤としては、乾燥粒子直径が13μm〜650μm程度のゲル濾過担体であって後記の遠心条件に適用できるものであれば特に制限されず、例えばファルアシア社製のセファデックスG-25（乾燥粒子直径が20〜80μm）、セファデックスG-50（乾燥粒子直径が20〜80μm）等を挙げることができる。ゲル濾過層が予め担持されたマルチウェルプレートは、米国Edge Biosystems社より市販されており、容易に入手することができる。尚、必要に応じて、当該Edge Biosystems社製のプレートに、各ウェルを深めにする等の変更を加えたプレートを使用することができる。
【００２２】
次に、本発明のABCタンパク質の基質のスクリーニング方法又は輸送活性の測定方法について説明する。ABCタンパク質が発現している膜画分と、放射性標識された基質とをTris-HEPES、Tris-HCl、リン酸緩衝液等の反応緩衝液中で反応させる。反応緩衝液はpH６〜８、特にpH７〜7.5が好ましい。反応時間は10秒間〜３時間、例えば１分間〜30分間程度が好ましい。反応は、例えば０℃に冷却した上記緩衝液を反応液とほぼ同量加えることにより停止させることができる。次いで、反応終了後の反応液を、ゲル濾過層が予め担持された容器に添加する。当該ゲルは、反応液の添加前に、反応緩衝液で平衡化しておくこと好ましい。次いで、反応液が添加された容器を850×g〜2,000×gで、3分〜5分程度遠心する。遠心後、生体膜に取り込まれなかった基質を含むゲル層（容器の上層）を吸引洗浄により除去し、生体膜に取り込まれた基質を含む溶液層（容器の下層）について液体シンチレーション、ベーターカウンター等を用いて放射性標識量を測定する。基質が非標識の場合には、当該溶液層の蛍光強度を測定してもよい。
【００２３】
従って、上記の標識量値と基質未添加の場合の標識量値とを比較し、ABCタンパク質の輸送活性が高い場合には、当該ABCタンパク質の基質であると判断できる。また、本発明のスクリーニング方法又は輸送活性の測定法により、例えば、ある薬剤がABCタンパク質の基質として輸送される速度を定量的に評価することにより、動物実験を行う前に当該薬剤の薬物動態を予測することが可能となり、また、ABCタンパク質による食品添加物の輸送を定量的に評価することができ、より安全な食品を提供することができる。更に、複数の薬剤を反応系に添加することにより、これらの薬剤同士の相互作用をABCタンパク質との相互作用の点から定量的に評価することができる。すなわち、薬剤X及びYを反応系に添加した場合に、薬剤XとABCタンパク質との相互作用に対する薬剤Yの影響を試験することができる。
【００２４】
本発明の具体的方法を後記実施例に示す。本発明で具体的に用いるポルフィリン類は本来、速やかに尿又は便の中に排泄されて体の中には残らないものであるが、ヘム合成酵素の異常により体内、特に皮膚に蓄積し、光と反応して皮膚アレルギー症状(porphyria)を起こす。従って、ABCタンパク質のポルフィリンの輸送活性を測定することにより、ポルフィリンの体内蓄積度を評価することができる。
【実施例】
【００２５】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２６】
実施例１  ABCG2を発現する昆虫細胞膜の調製
まず、pFastBaclベクター（米国Invitrogen社から入手）に、ABCG2のcDNAを組み込んだ。このpFastBaclベクターをDH10Bacコンピテントセルに形質転換し、ABCG2のcDNAをバクミドに組み換えた。その後、Cellfectin試薬（Invitrogen社）を用いて、組み換えバクミドをSf9昆虫細胞に遺伝子導入することにより、ABCG2のcDNAをゲノム中に有する遺伝子改変ウイルスを得た。Sf9昆虫細胞にこの遺伝子改変ウイルスを感染させ、ABCG2タンパク質を発現させた。
【００２７】
このABCG2タンパク質の発現は、ABCG2特異的モノクローナル抗体BXP-21（SIGNET社）を用いるウェスタンブロッティングにより確認した。すなわち、タンパク質を転写したニトロセルロース膜を0.5%(w/v)スキムミルク含有TTBS（0.05% Tween20含有TBS（20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCl））でブロッキングした後、0.5%(w/v)スキムミルク含有TTBSで500倍に希釈したBXP-21に室温で1.5時間浸漬して抗原抗体反応を行った。ニトロセルロース膜をTTBSで十分に洗浄し、0.5%(w/v)スキムミルク含有TTBSで3,000倍に希釈した抗マウスIgG抗体溶液に室温で1時間浸漬して二次抗体反応を行った。ニトロセルロース膜をTTBSで十分に洗浄した後、Western Lightning（商標）Chemiluminescence Reagent Plus（PerkinElmer社製）に浸し、その化学発光をLumino Imaging Analyzer FAS-1000（TOYOBO社製）で検出した（データ非表示）。
以上のようにして、Sf9昆虫細胞においてABCG2タンパク質の発現を確認できたので、当該昆虫細胞から形質膜を調製した。
【００２８】
実施例２  輸送活性の測定
ABCG2の基質であるヘマトポルフィリンについて輸送活性を測定した。
まず、0.25 M ショ糖/10 mM Tris-HEPES(pH 7.4) 49.73μL；3.33 mM ATP/33.3 mM クレアチンリン酸/33.3 mM MgCl2 30μL；2 mg/ml クレアチンキナーゼ 5μL；Sf9細胞膜溶液(9.49μg ABCG2タンパク質/μL) 5.27μL；及び、ヘマトポルフィリン(0, 0.05, 1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10 mM) 10μLを氷上で混合した（全量で100μL）。尚、ABCG2タンパク質の最終量が50μg、及びヘマトポルフィリンの最終濃度が0、50、100、250、500、750、1000μMとなるようにSf9細胞膜溶液の濃度を調整した。
次いで、当該混合溶液を37℃で20分間インキュベーションした後、停止溶液（0.25 M ショ糖/10 mM Tris-HEPES（pH 7.4）/20 mM EDTA）を100μL添加し、反応を停止させた。
【００２９】
0.25M ショ糖/10 mM Tris-HEPES（pH 7.4）で平衡化したGel Filtration Coloum(Edge BioSystems社製)に、上記溶液20μLを添加し、850×gで30分間遠心した。溶出してきた20μLの溶液に、10 mM NaOH 980μLを加え、総量1 mLとした。この溶液の蛍光強度をF-2000型分光蛍光光度計（日立（株）製）により測定した。結果を図１に示す。
【００３０】
図１から明らかなように、ヘマトポルフィリンの各濃度において、ATP(+)がATP(-)を有意に上回り、かつ反応系に使用したヘマトポルフィリンの濃度に依存して、ヘマトポルフィリンの取り込み量が増加した。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、反応液中のヘマトポルフィリン濃度と、生体膜画分へのヘマトポルフィリンの取り込み量との関係を示すグラフである。
【図１】
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