(57)【要約】      （修正有）【課題】植物由来の成分を活性物質とするヒト感染性マラリア原虫類（熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫及び卵形マラリア原虫）の感染予防・治療剤の提供。【解決手段】スイレン科コウホネ（和漢生薬の川骨）より得られるセスキテルペン二量体チオアルカロイド6,6`-dihydroxythiobinupharidineを有効成分として含有するマラリア原虫類の感染予防・治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式
【化１】
2007204450.tif 000004
で示されるセスキテルペン二量体チオアルカロイド6,6'-dihydroxythiobinupharidine を有効成分として含有する、マラリア原虫類の感染予防・治療剤。
【請求項２】
マラリア原虫類の増殖を抑制することからなる請求項１記載のマラリア原虫類の感染予防・治療剤。
【請求項３】
マラリア原虫類が、ヒト感染性マラリア原虫であって、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫及び卵形マラリア原虫から選ばれた一つである請求項１ないし２項のいずれかに記載のマラリア原虫類の感染予防・治療剤。
【請求項４】
マラリア原虫類の感染予防・治療剤が、経口投与形態または注射剤、点滴剤として非経口投与形態である請求項１ないし３項のいずれかに記載のマラリア原虫類の感染予防・治療剤。
【請求項５】
マラリア原虫類の感染予防・治療剤が、薬剤耐性マラリア原虫に対して有効である請求項１ないし４項のいずれかに記載のマラリア原虫類の感染予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト感染性マラリア原虫類として、例えば熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫及び卵形マラリア原虫の増殖を既知のセスキテルペン二量体チオアルカロイド6,6'-dihyfroxythiobinupharidine で抑制することによりマラリア原虫類の感染予防・治療に有効なマラリア原虫類の感染予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関（ＷＨＯ）の熱帯病特別研究訓練計画は人類の中で制圧しなければならない８大熱帯病として、主に開発途上国での疾患であるマラリア、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、住血吸虫症、フィラリア症、ハンセン氏病、結核及びテング熱を挙げている。これらの疾患のうち、特にヒトに寄生するマラリア原虫類には、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax) 、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae)、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale) の４種類に分類される。これらの中で、最も厄介なものはマラリア感染者の８０％を占める熱帯熱マラリア原虫であり、重症の場合には脳性マラリアになって死に至る。
【０００３】
これらのマラリア原虫類に対する既存の抗マラリア剤としては、古典薬と呼ばれ、主に１９３０年〜１９６０年代に開発された化学合成医薬品であるクロロキンやファンシダール（ピリメサミンとスルファドキシンとの合剤）等、および新薬と呼ばれ１９８０年以降に開発された生薬青蒿の有効成分であるアルテミシニン等が用いられていた。しかしながら、現在クロロキンやファンシダールに対する薬剤耐性マラリア原虫がマラリア流行地域に広く蔓延し、さらに、両者の多剤耐性株も出現しており、これらの抗マラリア剤としての有用性はマラリア流行地域で著しく低下している。また、アルテミシニンは作用として速効性であり、一時治療薬として注目されたが、完治せずに再燃し易いという問題があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、既存の抗マラリア剤に対する薬剤耐性株はマラリアが再興感染症として流行している一因でもあり、薬剤耐性株に有効な抗マラリア薬の開発が地球規模で望まれている。特に熱帯熱マラリア原虫の流行地域は、熱帯・亜熱帯と多岐にわたっており、これらの地域に属する開発途上国では極めて深刻な問題であり、寄生虫感染症による死亡原因の第一位がマラリアによるとされている。さらに、最近における地球規模での温暖化によりマラリア原虫類の流行地域が開発途上国のみならず温暖地域をも含む先進国へと拡大傾向の様相を呈しているのが実情である。
【０００５】
本発明の解決しようとする問題点は、薬剤耐性のＫ１株と薬剤感受性のＦＣＲ３株の両株に対して抗マラリア活性を示すマラリア原虫類の感染予防・治療剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の如く課題を解決すべく、薬用植物などより該活性を示す生物活性物質を広範囲に探索した結果、和漢生薬の川骨（スイレン科コウホネNuphar japonicum DC.およびネムロコウホネNaphar pumilum DC.の根茎）よりセスキテルペン二量体チオアルカロイドの6,6'-dihydroxythiobinupharidine を抗マラリア活性物質として見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、請求項１に記載のように、下記式
【０００８】
【化２】
2007204450.tif 000002
で示されるセスキテルペン二量体チオアルカロイド6,6'-dihydroxythiobinupharidine を有効成分として含有する、マラリア原虫類の感染予防・治療剤とするものである。
【０００９】
本発明は、請求項２に記載のように、マラリア原虫類の増殖を抑制することからなる請求項１記載のマラリア原虫類の感染予防・治療剤とするものである。
【００１０】
本発明は、請求項３に記載のように、マラリア原虫類が、ヒト感染性マラリア原虫であって、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫及び卵形マラリア原虫から選ばれた一つである請求項１ないし２項のいずれかに記載のマラリア原虫類の感染予防・治療剤とするものである。
【００１１】
本発明は、請求項４に記載のように、マラリア原虫類の感染予防・治療剤が、経口投与形態または注射剤、点滴剤として非経口投与形態である請求項１ないし３項のいずれかに記載のマラリア原虫類の感染予防・治療剤とするものである。
【００１２】
本発明は、請求項５に記載のように、マラリア原虫類の感染予防・治療剤が、薬剤耐性マラリア原虫に対して有効である請求項１ないし４項のいずれかに記載のマラリア原虫類の感染予防・治療剤とするものである。
【００１３】
セスキテルペン二量体チオアルカロイド6,6'-dihydroxythiobinupharidine は川骨などのスイレン科植物等に含有されるアルカロイドとして既に文献等にて知られている。例えば［Lalonde RT., Wong CF., and Cullen WP., Tetrahedron letters, 11: 4477〜4480 (1970) 、Yamahara J., Shimoda H., Matsuda H. and Yoshikawa M., Biological Pharmaceutical Bulletin, 19: 1241〜1243 (1996) 、Matsuda H., Shimoda H. and Yoshikawa M., Bioorganic Medicinal Chemistry, 9: 1031〜1035 (2001) 、Matsuda H., Morikawa T., Oda M., Asao Y. and Yoshikawa M., Bioorganic Medicinal Chemistry Letters, 13:4445〜4449 (2003) ］に記載されている。そして、それの製造法および性状に関しては、公開特許公報２００２−０４７１４６号に抗体産生抑制作用、免疫抑制作用、癌細胞の転移抑制作用および発毛作用等に対して効力を示すことが開示されていたが、抗マラリア剤としての有効性の開示はなされていなかった。
【００１４】
前記の式で表されたセスキテルペン二量体チオアルカロイド6,6'-dihydroxythiobinupharidine の精製方法およびＮＭＲによる構造解析法は［Lalonde RT., Wong CF., and Cullen WP., Tetrahedron letters, 11: 4477〜4480 (1970) 、Yamahara J., Shimoda H., Matsuda H. and Yoshikawa M., Biological Pharmaceutical Bulletin, 19: 1241〜1243 (1996) 、Matsuda H., Shimoda H. and Yoshikawa M., Bioorganic Medicinal Chemistry,9:1031〜1035 (2001) 、Matsuda H., Morikawa T., Oda M., Asao Y. and Yoshikawa M.,Bioorganic Medicinal Chemistry Letters, 13: 4445〜4449 (2003) ］および公開特許公報２００２−０４７１４６号に詳細に記載されている。
【００１５】
本発明において、川骨より見出された当該活性物質はこれらのスペクトルデータの比較から6,6'-dihydroxythiobinupharidine と一致する化合物であると同定された。
【００１６】
セスキテルペン二量体チオアルカロイド6,6'-dihydroxythiobinupharidine の製造方法について説明すると、和漢生薬の川骨にメタノールを加え室温で抽出後、減圧下で溶媒を留去し、メタノール抽出エキスを得る。次いで本エキスを３０％メタノール水溶液に懸濁し、酢酸エチルを加えて分配抽出し、酢酸エチル層を除去する。３０％メタノール水溶液移行部をアンモニアアルカリ性（ｐＨ１０）とした後、クロロホルムを加えて分配抽出し、クロロホルム画分を得る。本クロロホルム画分を常法によりシリカゲルカラムクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーを用いて分離精製することにより本発明で用いられる6,6'-dihydroxythiobinupharidine が得られる。
【００１７】
本発明のセスキテルペン二量体チオアルカロイド6,6'-dihydroxythiobinupharidine を得る方法は、上記方法のみに限らない。例えば抽出溶媒は上記の、メタノール以外の有機溶媒もしくは水を用いてもよい。使用し得る有機溶媒の例としては、ケトン類（アセトンなど）、アルコール類（エタノール、ブタノールなど）およびエステル類（酢酸エチルなど）等が挙げられる。また、アルコール類は水分を含むものを用いてもよい。カラムクロマトグラフィーでは順相系の担体（シリカゲル、アルミナ）や逆相系の担体（ＯＤＳなど）および多孔性ビーズなどを用いることができる。また、再結晶法によっても本発明の化合物を得ることができる。
【発明の効果】
【００１８】
下記式
【００１９】
【化３】
2007204450.tif 000003
で表されるセスキテルペン二量体チオアルカロイド6,6'-dihydroxythiobinupharidine は、ヒト感染性熱帯熱マラリア原虫類に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗マラリア活性を示し、マラリア原虫感染ネズミモデルに対してｉｎ  ｖｉｖｏで治療効果を示し、抗マラリア剤として臨床応用できることが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
6,6'-dihydroxythiobinupharidine の調製法
セスキテルペン二量体チオアルカロイド6,6'-dihydroxythiobinupharidine は河原らの方法（公開特許公報２００２−０４７１４６号）を改良して調製した。
【００２２】
すなわち、川骨（２ｋｇ）にメタノール（１０Ｌ）を加え室温で３日間抽出後、抽出液をろ取した。残渣にメタノール（１０Ｌ）を加えて同様の抽出操作を計３回行った。この抽出液を合わせて減圧下で溶媒留去し抽出液量を３００ｍｌとし、この抽出液に水７００ｍＬを加え３０％メタノール水溶液とした。この溶液に酢酸エチル（０．５Ｌ）を加えて分配抽出し、酢酸エチル層を除去した。３０％メタノール水溶液移行部に２５％アンモニア水溶液を加えて、弱アルカリ性（ｐＨ１０）とした後、クロロホルム（０．５Ｌ）を加えて合計３回分配抽出し、得られたクロロホルム層を減圧下で溶媒留去してクロロホルム画分（１００ｇ、収率０．５％）を得た。
【００２３】
このクロロホルム画分を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１／アンモニアアルカリ性）で１０画分（画分１〜１０）に分画し、このうち、6,6'-dihydroxythiobinupharidine を含有する画分６（４．４ｇ、０．２２％）を逆相ＨＰＬＣ［カプセルパック  Ｃ１８−ＡＱ、内径２０×２５０ｍｍ、アセトニトリル：水：２５％アンモニア水溶液＝９００：１００：０．５（５分）、９００：１００：０．５→１０００：０：０．５（２０分）］で分離精製することで6,6'-dihydroxythiobinupharidine （２．１ｇ、０．１１％、保持時間１７．５分）が得られた。
【実施例２】
【００２４】
6,6'-dihydroxythiobinupharidine の抗マラリア活性
熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum)の薬剤耐性株のＫ１株（東京大学大学院医学系研究科より分与可能）および薬剤感受性のＦＣＲ３株（東京大学大学院医学系研究科より分与可能）に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗マラリア活性の測定は、乙黒らの方法［Otoguro,K., Kohana,A., Manabe,C., Ishiyama,A., Ui,H., Shiomi,K., Yamada,H. and Omura,S., J. Antibiotics, 54: 658-663 (2001) ］に従って行った。
【００２５】
即ち、試験原虫としては、TRAGERとJENSENの方法［Trager,W and Jensen,J., Science,193: 673-677 (1976) ］を若干改変し、維持、継代を行ったものを用いた。すなわち、培養シャーレ内で、１０％ヒト血漿を添加したＲＰＭＩ１６４０培地と新鮮なヒト赤血球を用いて継代した原虫感染赤血球を希釈し（ヘマトクリット値：２〜５％、原虫感染赤血球率：０．２５〜１％）、３７℃にて３％Ｏ2 −４％ＣＯ2 −９３％Ｎ2 の混合ガス下で培養を行い、２〜３日毎に培地交換と新鮮な赤血球を添加して連続培養を行った。
【００２６】
薬剤感受性試験は、DESJARDINSらの方法［Desjardines,R.E., Canfield,C.J., Haynes,D.E. and Chulay,J.D., Antimicrob. Agents Chemother.,16: 710-718 (1979)］を改変し、９６ well plate の各 well に前培養された原虫浮遊液（ヘマトクリット値：２％、原虫感染赤血球率：０．５または１％、１９０μl ）と化合物の溶液（５０％メタノール溶液１０μl ）を添加し、混和後、前述の混合ガス下で７２時間培養を行った。
【００２７】
原虫増殖の測定は、MAKLERらの方法［Makler,M.T., Rise,J.M., Wiliams,J.A., Bancroft,J.E., Piper,R.C., Gibbins,B.L. and Hinrichs,D.J., Am. J.Med. Hyg, 48: 739-741(1993)］を改変し、Malstat 試薬（Ｆｌｏｗ社製、米国）にて原虫の乳酸脱水素酵素（ｐ−ＬＤＨ）を比色定量する方法で行った。
【００２８】
すなわち、７２時間の培養を終了した９６ well plate を直接−２０℃下で１８時間凍結後、３７℃下で融解することにより、原虫感染赤血球を溶血および原虫を破壊させ粗酵素液を調製した。新たな９６ well plate の各 well にMalstat 試薬（Ｆｌｏｗ社製、米国）１００μl と粗酵素液２０μl を添加、混和し、１５分間室温にて反応後、ニトロブルーテトラゾリウム（nitroblue tetrazolium)（２ｍｇ／ｍｌ）とフェナジンエトサルフェート（phenazine ethosulfate)（０．１ｍｇ／ｍｌ）の混合溶液２０μl を各 well に添加し、遮光条件下、室温にて２時間反応させた。
【００２９】
生じたブルーフォルマザン（blue formazan)生成物をマイクロプレートリーダーにて測定波長６５５ｎｍでの吸光度を測定することにより、原虫の増殖の有無を比色定量した。化合物の５０％原虫増殖阻止濃度（ＩＣ50値）は化合物濃度作用曲線より求めた。本発明の6,6'-dihydroxythiobinupharidine と既知の抗マラリア剤の培養熱帯熱マラリア原虫に対する抗マラリア活性は下記に示す通りであった。
【００３０】
培養熱帯熱マラリア原虫に対する既知の抗マラリア剤としては、アルテメーター（Cerbios Pharma社製、スイス国）、アルテスネート（Cerbios Pharma社製、スイス国）、アルテミシニン（Aldrich 社製、米国）、クロロキン（Sigma 社製、米国）、ピリメサミン（Sigma 社製、米国）を用いた。また、試験原虫としては薬剤耐性のＫ１株および薬剤感受性のＦＣＲ３株を用いた。
【００３１】
───────────────────────────────────────
ＩＣ50値（ｎＭ）
───────────────────
化合物                                Ｋ１株        ＦＣＲ３株
──────────────────────────────────────
6,6'-dihydroxythiobinupharidine        988.6           1064.6  
アルテメーター                          7.6              2.2
アルテスネート                         11.0              2.7
アルテミシニン                         24.0             18.0
クロロキン                            357.0             29.0  
ピリメサミン                     >100,000,0              7.8  
───────────────────────────────────────
【００３２】
本発明に用いた6,6'-dihydroxythiobinupharidine は熱帯熱マラリア原虫（Plasmodiumfalciparum) の薬剤耐性のＫ１株に対して有効な抗マラリア活性を示した。さらに、薬剤感受性のＦＣＲ３株に対しても同等な抗マラリア活性を示した。このことから、6,6'-dihydroxythiobinupharidine は薬剤耐性のＫ１株と薬剤感受性のＦＣＲ３株に対して同程度の活性があり、6,6'-dihydroxythiobinupharidine は薬剤耐性マラリア原虫におけるクロロキンやピリメサミン等の作用メカニズムと異なる作用メカニズムでＫ１株およびＦＣＲ３株の両株に対し抗マラリア活性を示すものである。
【実施例３】
【００３３】
6,6'-dihydroxythiobinupharidine のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗マラリア活性
本発明に用いた6,6'-dihydroxythiobinupharidine のネズミマラリア原虫類Plasmodiumberghei Ｎ株（薬剤感受性株）の感染実験モデルに対するｉｎ  ｖｉｖｏでの治療効果の測定は乙黒らの方法［Otoguro,K., Kohana,A., Manabe,C., Ishiyama,A., Ui,H., Shiomi,K., Yamada,H. and Omura,S., J. Antibiotics, 54: 658-663 (2001) ］及びPETERSらの方法［Peters,W., Portus,J.H. and Robinson,B.L., Ann. Trop. Med. Parasitol. 69: 155-171 (1975) ］の一部を若干改変して行った。
【００３４】
すなわち、供試動物としては雄性ＩＣＲマウス（体重１８〜２０ｇ、一群５匹）を用い、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐａｓｓａｇｅにて維持・継代した原虫を２×１０6 個の寄生虫感染赤血球に調整し、尾静脈接種にて感染させた。治療実験は４ days suppressive testで行った。感染日をday 0 とすると、感染２時間後に化合物の溶液（１０％ジメチルスルホキサイド溶液−Tween 80) を皮下（ｓ．ｃ．）で投与し、以後１日１回３日間連続投与し（days 1〜3)、day 4 で尾静脈より血液塗抹標本を作成し、原虫感染赤血球率（parasitaemia) を観察し、化合物非投与群の感染率より治療効果を判定した。
【００３５】
化合物の５０％有効濃度（ＥＤ50値）および９０％有効濃度（ＥＤ90値）は化合物濃度作用曲線より求めた。その結果は下記の通りであった。
ネズミマラリア原虫感染モデルに対する6,6'-dihydroxythiobinupharidine の皮下投与による治療効果
【００３６】
───────────────────────────────────────
マラリア種            化合物                  ED50値（mg/kg)  ED90値（mg/kg)
───────────────────────────────────────
P. berghei N株  6,6'-dihydroxythiobinupharidine     20.2        38.7  
アルテメーター                       0.95        3.8  
アルテスネート                       1.7        10.0  
クロロキン                           1.5         2.5
───────────────────────────────────────
【００３７】
本発明の6,6'-dihydroxythiobinupharidine を皮下投与した場合、ネズミマラリア原虫感染モデルにおいて薬剤感受性のP. berghei N株に対して、6,6'-dihydroxythiobinupharidine は有効である。