(57)【要約】【課題】  大腸菌溶菌作用を有するポリペプチドを提供し、遺伝子工学的手法における工程の簡略化を可能とする。【解決手段】  本発明のポリペプチドは大腸菌に対して溶菌作用を有するので、当該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ及び有用産物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入した発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養すると、有用産物と共に上記の大腸菌溶菌性ポリペプチドが産生され、大腸菌が溶菌するので、従来の遺伝子工学的手法で必要となっていた大腸菌の分解工程を省略することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、大腸菌に対して溶菌作用を有するポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載されるアミノ酸配列をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載される遺伝子を挿入した発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養し、大腸菌を溶菌することからなる大腸菌の溶菌方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリペプチド、それをコードする遺伝子及び大腸菌の溶菌方法に関する。より詳細には、大腸菌の溶菌作用を有し、遺伝子工学などの分野で有用なポリペプチド及びそれをコードする遺伝子並びに当該遺伝子を利用した大腸菌の溶菌方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子工学的手法により、有用産物（組換蛋白質）が工業的に産生されるようになっている。このような手法において、宿主細胞（ホストセル）としては、大腸菌が繁用されている。即ち、有用産物をコードするＤＮＡを挿入した発現ベクターで基質転換した大腸菌を培養し、大腸菌が産生した有用産物を回収・精製することにより、有用産物の大量生産が行われている。
当該方法において、大腸菌により産生された有用産物は、大腸菌の菌体外に放出される場合もあるが、通常は菌体内に蓄積されるので、所定の培養後、大腸菌を集菌し、菌体をソニケーターなどにより機械的に粉砕するか、リゾチームなどの酵素を用いて分解し、有用産物を菌体から放出させ、その後、分離・精製工程に付すことが行われている。
従来の遺伝子工学的方法では、上記のように、菌体を分解する一工程が必要となり、更に分解した菌体の残骸により溶液の粘度が上昇し、有用産物を含んだ上清を分離することが困難になる場合がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上述のように、従来の遺伝子工学的方法では、培養した大腸菌を分解する工程が必要であり、この操作をすることなく、産生された有用産物を分離・精製し得る方法が望まれている。
ところで、本願発明者らは、ダイコンにおけるオグラ型細胞質雄性不稔の研究を永年に亘り行ってきた。その後、ミトコンドリアのorf138遺伝子が雄性不稔の原因遺伝子であると特定された（非特許文献１及び２）。
更に、orf138遺伝子が我が国の海岸に自生するハマダイコンに広く存在することが見出された（非特許文献３）。
【非特許文献１】Mol Gen Genet. 235: 340-348 (1992)
【非特許文献２】Curr Genet. 24: 156-163 (1993)
【非特許文献３】Theor. Appl. Genet. 93: 325-332 (1996)
【０００４】
本願発明者らは、遺伝子工学的手法でorf138遺伝子を大腸菌内で発現させ、その産物（蛋白質）を大量に調製することを検討したところ、当該形質転換大腸菌の培養が進行し、orf138遺伝子産物が産生されると、大腸菌が溶菌されるという現象を見出した。即ち、orf138遺伝子産物には大腸菌に対して溶菌作用を有するペプチドが存在することが示唆された。本願発明者らは、この作用を有するペプチドについて検討した結果、当該ペプチドを分離・同定することに成功し、本発明を完成した。
本発明は係る知見に基づくものであり、大腸菌に対して溶菌作用を有するポリペプチド及びそれをコードする遺伝子並びに当該遺伝子を利用した大腸菌の溶菌方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の課題を解決するためになされた本願発明は、後記配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
当該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、大腸菌に対して溶菌作用を有するポリペプチド；
上記のアミノ酸配列をコードする遺伝子；及び
上記の遺伝子を挿入した発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養し、大腸菌を溶菌することからなる大腸菌の溶菌方法；
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のポリペプチドは大腸菌に対して溶菌作用を有するので、当該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）及び有用産物のアミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養すると、有用産物と共に上記の大腸菌溶菌性ポリペプチドが産生され、大腸菌が溶菌するので、従来の遺伝子工学的手法で必要となっていた大腸菌の分解工程を省略することが可能となり、工程の簡略化を図ることができるという格別の効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の大腸菌溶菌作用を有するポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、また大腸菌に対して溶菌作用を有する限り、配列番号１に示されるアミノ酸配列に、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
係るポリペプチドは、化学的に合成することもできるが、慣用の遺伝子工学的手法によるのが簡便である。
【０００８】
本発明の遺伝子（ＤＮＡ）は、上述した配列番号１に示されるアミノ酸配列又は大腸菌に対して溶菌作用を有し、当該アミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（以下、便宜上、これらを本発明のＤＮＡという）である。係るＤＮＡは、上記のアミノ酸配列に基づいて、当業者であれば容易に演繹可能であるが、例として、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一例を配列番号２に示す。
【０００９】
本発明の大腸菌の溶菌方法は、上述した本発明のＤＮＡを挿入した発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養し、大腸菌を溶菌することからなる大腸菌の溶菌方法である。
即ち、当該形質転換大腸菌は、培養が進行するにつれ、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが産生され、係るポリペプドは大腸菌溶菌作用を有するので大腸菌は溶菌される。
上記の発現ベクターとしては、大腸菌内で発現し得るベクターであれば特に限定はされず、例えばプラスミドベクターpRSET-A(Invitrogen社)などが挙げられる。係る発現ベクターは、周知のとおり、発現に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、各種マーカーなどを必要に応じて有している。また発現ベクターによる大腸菌の形質転換方法は既に周知である。
形質転換大腸菌の培養は、常法に準じて行うことができ、例えばＬＢ培地などの適当な培地を用い、３７℃程度で震とう培養することにより行うことができる。
【００１０】
上記の本発明のＤＮＡを含有する発現ベクターには、更に有用産物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入してもよい。係る発現ベクターで形質転換した大腸菌を培養すると、培養の進行に伴い、当該有用産物が産生され、それと共に本発明の溶菌作用を有するポリペプチドも産生されるので、大腸菌は溶菌されて当該有用産物が菌体外に放出されることになる。
【００１１】
また、本発明のＤＮＡが挿入された発現ベクターとは別に有用産物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入した発現ベクターを調製し、係る２種の発現ベクターを用いて、大腸菌を同時又は前後して形質転換し、形質転換大腸菌を調製してもよい。
上述のように、本発明の方法を利用すれば、形質転換大腸菌の増殖に伴い、大腸菌が溶菌され、目的とする有用産物は菌体外に放出されるので、従来の遺伝子工学的手法で必要とされていた菌体の分解という操作を省略することが可能となる。
【実施例】
【００１２】
以下、比較例及び実施例に基づいて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１３】
実施例１
(1)orf138遺伝子の部分配列を含むDNA断片
雄性不稔ダイコン（MS-源助）の全DNAを鋳型に、下記F09とR02のプライマーペアを用いたPCRで、orf138遺伝子の部分配列を含む187bpのＤＮＡ断片を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号３に示す。なお、当該配列において、開始コドンATGのAは開始コドンに対応させるために付したもので、実際の発現ベクターにおいてはベクター配列に由来する。
F09: TGTCAAATGTACCTAACGATGAAG（配列番号８）
R02: AATTTTCTCGGTCCATTTTCC（配列番号９）
【００１４】
(2)発現ベクターの調製と形質転換
プラスミドベクターpRSET-A(Invitrogen社)を制限酵素NdeIで消化後、平滑末端化し、上記増幅断片を挿入した。
増幅断片が正しくクローニングされているか、塩基配列の決定により確認した。確認された塩基配列をd231と称し、その配列が演繹するアミノ酸配列を配列番号４に示す。なお、配列番号４において、orf138遺伝子に由来する部分は下線を付した（以下同様）。d231は、開始コドンとして導入したメチオニンに続いて、orf138遺伝子に由来する61個のアミノ酸、pRSET-Aに由来する6Xヒスチジンタグ及びAnti-Xpress抗体のエピトープを持つ全長134個のアミノ酸から成る蛋白質をコードしていることが判明した。
その後、当該コンストラクトを、常法に準じて大腸菌ホストE. coli BL21(DE3)pLysS株へ導入し、形質転換大腸菌を調製した。
【００１５】
(3) 蛋白質の発現実験
ベクターであるpRSET-Aのみを持つクローンと、ｄ231を持つクローンを、それぞれアンピシリン（50μg/ml）とクロラムフェニコール（30μg/ml）を含む1.5mlのLB培地で１終夜、37℃で震とう培養した。
次いで、それぞれのクローンの培養液（100μl）をアンピシリンとクロラムフェニコールを含む新しい5mlのLB培地へ加え、37℃で震とう培養を開始した。1時間ごとに吸光度（OD660）を測定して大腸菌の増殖を測定した。なお、各クローンについて6本の試験管を使用した。
培養開始3時間後、吸光度が0.4を越えたところで6本の試験管のうちの3本にIPTG（Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside、蛋白質発現誘導剤、終濃度1mM）を加え、蛋白質の発現を誘導した。
それぞれに試験官の震とう培養を継続し、1時間ごとに吸光度を測定して大腸菌の増殖を測定した。その結果を表１に示す。
【００１６】
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【００１７】
IPTGによる蛋白質発現誘導後、pRSET-Aのみを持つクローンは吸光度0.5弱で増殖を停止するのに対し、d231をもつクローンでは誘導後1時間を待たずに吸光度が低下しはじめ、誘導後2時間で0.1前後になり、培養液はほぼ透明になり、大腸菌の溶菌が認められた。なお、発現誘導をかけない場合は、いずれのクローンも吸光度0.9弱まで増殖を続けた。
【００１８】
実施例２
作用発現蛋白質の同定
大腸菌溶解性を示すペプチドの最小単位を絞り込むため、適当なプライマーを合成し、実施例１(1)と同様にして、当該プライマーを用いたPCRで、配列番号３に示される塩基配列よりも短い配列を含むＤＮＡ断片を増幅した。係るＤＮＡを用いて、様々なプラスミドコンストラクトを作製し、実施例１と同様にして大腸菌内での発現・溶菌実験を行い、吸光度（ＯＤ）を測定した。
試験したコンストラクから演繹されるアミノ酸配列を、配列番号５、６及び７に示した。また、発現・溶菌試験の結果を表２、３及び４に示す。なお、当該表において、IPTGを添加した時間は太文字で示した。
表２〜４に示されるように、配列番号５、６及び７に示される配列を有するポリペプチドは大腸菌に対して溶菌作用を示した。これらの表の結果を勘案し、各アミノ酸配列を比較すると、溶菌性を示すポリペプチドの最小単位は配列番号１に示されるアミノ酸配列であると推察された。
【００１９】
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【００２０】
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【００２１】
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【配列表】
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