(57)【要約】【課題】  治療的およびその他の遺伝子の真核細胞中への安全かつ効果的な導入を可能にするフォーミーウイルスベクター系を得る。【解決手段】  フォーミーウイルス種由来の核酸および外因性核酸の、遺伝子工学を用いる試験管内組み換えによって作出され、そして適切な宿主細胞もしくは組み換え的に改変されたパッケージング（ゲノム詰め込み）細胞系によって作出される新規なベクター系を得た。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト  スプーマレトロウイルスｐＨＳＲＶ−１もしくはｐＨＳＲＶ−２の感染性もしくは非感染性ＤＮＡであって、ｂｅｌ−１、ｂｅｌ−２およびｂｅｌ−３遺伝子の各部位にわたる内部欠失を有するか、またはｂｅｌ−２およびｂｅｌ−３遺伝子の各部位にわたる内部欠失を有するがｂｅｌ−１遺伝子の部位には内部欠失を有さない、ことを特徴とする、ｐＦＯＶ−１、ｐＦＯＶ−２、ｐＦＯＶ−３、ｐＦＯＶ−５およびｐＦＯＶ−６を除く感染性もしくは非感染性ＤＮＡ。
【請求項２】
欠失がｂｅｌ−２およびｂｅｌ−３遺伝子の各部位にわたるが、ｂｅｌ−１遺伝子の部位には及ばない、請求項１記載の感染性もしくは非感染性ＤＮＡ。
【請求項３】
欠失がｂｅｌ−１遺伝子に隣接し、かつ、３’方向において４２０塩基対である請求項２記載の感染性もしくは非感染性ＤＮＡ。
【請求項４】
欠失がｐＨＳＲＶ−２の１０４２０〜１０８４４ヌクレオチド位にある請求項３記載の感染性もしくは非感染性ＤＮＡ。
【請求項５】
ヒト  スプーマレトロウイルスｐＨＳＲＶ−１もしくはｐＨＳＲＶ−２の感染性もしくは非感染性ＤＮＡであって、欠失中に外来性の核酸が挿入されており、かつ、該欠失がｂｅｌ−１、ｂｅｌ−２およびｂｅｌ−３遺伝子の各部位にわたるか、またはｂｅｌ−２およびｂｅｌ−３遺伝子の各部位にわたるがｂｅｌ−１遺伝子の部位には及ばない、ことを特徴とする、ｐＦＯＶ−１、ｐＦＯＶ−２、ｐＦＯＶ−３、ｐＦＯＶ−５およびｐＦＯＶ−６を除く感染性もしくは非感染性ＤＮＡ。
【請求項６】
欠失がｂｅｌ−２およびｂｅｌ−３遺伝子の各部位にわたるが、ｂｅｌ−１遺伝子の部位には及ばない、請求項５記載の感染性もしくは非感染性ＤＮＡ。
【請求項７】
外来性の核酸がポリペプチドをコードする完全な遺伝子を少なくとも１つ含んでなる請求項６記載の感染性もしくは非感染性ＤＮＡ。
【請求項８】
請求項５記載の感染性もしくは非感染性ＤＮＡ生産することを特徴とする真核細胞系もしくは組換え真核細胞系。
【請求項９】
請求項５記載の感染性もしくは非感染性ＤＮＡでトランスフェクトされ、かつ、該外来性の核酸を発現することを特徴とするヒトもしくは動物の体細胞。
【請求項１０】
欠失がｂｅｌ−１遺伝子に隣接し、かつ、３’方向において４２０塩基対である請求項６記載の感染性もしくは非感染性ＤＮＡ。
【請求項１１】
欠失がｐＨＳＲＶ−２の１０４２０〜１０８４４ヌクレオチド位にある請求項１０記載の感染性もしくは非感染性ＤＮＡ。
【請求項１２】
ポリペプチドがヒトの液性もしくは細胞性の抗原である請求項７記載の感染性もしくは非感染性ＤＮＡ。
【請求項１３】
外来性の核酸がアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡもしくはデコイＲＮＡからなる群より選ばれる請求項７記載の感染性もしくは非感染性ＤＮＡ。
【請求項１４】
ポリペプチドが腫瘍の形成を阻害できる請求項７記載の感染性もしくは非感染性ＤＮＡ。
【請求項１５】
ポリペプチドが標的生物体により生産性に欠陥を有するかまたは標的生物体により全く生産されない産物である請求項７記載の感染性もしくは非感染性ＤＮＡ。
【請求項１６】
ヒト  スプーマレトロウイルスｐＨＳＲＶ−１もしくはｐＨＳＲＶ−２の感染性もしくは非感染性ＤＮＡであって、欠失中に外来性の核酸が挿入されており、かつ、該欠失がｂｅｌ−１、ｂｅｌ−２もしくはｂｅｌ−３遺伝子内に存在する、ことを特徴とする、ｐＦＯＶ−１、ｐＦＯＶ−２、ｐＦＯＶ−３、ｐＦＯＶ−５およびｐＦＯＶ−６を除く感染性もしくは非感染性ＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項１６記載の感染性もしくは非感染性ＤＮＡ生産することを特徴とする真核細胞系もしくは組換え真核細胞系。
【請求項１８】
請求項１６記載の感染性もしくは非感染性ＤＮＡでトランスフェクトされ、かつ、該外来性の核酸を発現することを特徴とするヒトもしくは動物の体細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、フォーミーウイルス種由来の核酸および外因性核酸の、遺伝子工学を用いる試験管内組み換えによって作出され、そして適切な宿主細胞もしくは組み換え的に改変されたパッケージング（ゲノム詰め込み）細胞系によって産生される新規なベクター系の作製に関する。特に好適なパッケージング細胞系の組み換え的作製は、同様に本発明の構成をなす。本発明は、フォーミーウイルスベクターによる、治療的およびその他の遺伝子の真核細胞中への安全かつ効果的な伝達を特徴とする。
【０００２】
フォーミーウイルスベクターは、著しく広範なスペクトルの真核細胞にわたり：それらは非常に幅広い種の哺乳動物細胞を変換する；それらは、特に、ヒトにおける多くの異なる体細胞中に遺伝子を導入するために使用することができる。
【０００３】
フォーミーウイルスベクターは、外因性ＤＮＡ断片に対して大きな受容能を有することを特徴とする。
【０００４】
フォーミーウイルベクター中の外因性ＤＮＡの発現は、例えば、もし外因性のプロモーターが、そのベクター中に用いられない場合には、ウイルスのトランスアクチベーターｂｅｌ−１によって、厳格に調節することができる。
【０００５】
フォーミーウイルスから誘導されるフォーミーウイルスベクターは、ヒトには病原性はなく、それゆえに使用上安全である。ヒトのフォーミーウイルスが人間に対して病理学的作用を引き起こすという証拠はない。ヒトのフォーミーウイルスが、神経学的疾病、グレーヴス病、その他の自己免疫症状、カーベーンの甲状腺炎もしくは筋委縮性側索硬化症に関与していることを推論するこれまでの報告は、現在では、そのような臨床例のおけるフォーミーウイルスに関する徹底的解析を基に、明白に否定することができる。フォーミーウイルスの使用に関する安全性は、また、フォーミーウイルスベクターと細胞ＤＮＡの相同組み換えを起こし得る相同なＤＮＡ配列が、ヒト染色体ＤＮＡには存在しないという事実に由来する。フォーミーウイルスは、他のレトロウイルスとは系統発生的に区別されるものである。
【０００６】
フォーミーウイルス、およびそれからのベクターは、発癌性をもたないことが知られている。
【０００７】
中でも、複製能のあるフォーミーウイルスベクターは、ウイルス遺伝子ｂｅｌ−２およびｂｅｌ−３を欠失させることによって作製される。
【０００８】
例えば、フォーミーウイルスベクターｐＦＯＶ−１、ｐＦＯＶ−２およびｐＦＯＶ−３は、通常、ｂｅｌ−１遺伝子に隣接する３’方向に約４２０塩基対の欠失を有する。
【０００９】
さらに、遺伝子工学によって同様に作製されるパッケージング細胞系において生産することができるところの、例えば、ｐＦＯＶ−４のような複製不能のフォーミーウイルスベクターが作製された。
【００１０】
フォーミーウイルスベクターは、治療学的に活性なタンパク質もしくはアンチセンスＲＮＡもしくはデコイ（ｄｅｃｏｙ）ＲＮＡを形成するために、ヒトもしくは動物細胞において外因性ＤＮＡを発現させるのに適している。フォーミーウイルスベクターは、体液性免疫および／または細胞性免疫をつくるために、ヒトもしくは動物において外因性ＤＮＡを発現させるのに適している。
【００１１】
そのベクターの外因性核酸を選択することにより、フォーミーウイルスベクターは、相同組み換えによって、ヒトもしくは動物における標的細胞の染色体ＤＮＡにおける望ましくない遺伝子を不活化するために、または遺伝子欠損を相補するために適切に使用することができる。
【００１２】
標的組織のレポーター遺伝子の発現を調節することによって、またはその他の遺伝子構築によって、フォーミーウイルスベクターは、診断薬として使用するために適切である。
【００１３】
ヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）は、レトロウイルスのスプーマウイルス・ファミリーに属している。レトロウイルスのスプーマウイルスファミリーは、他のレトロウイルスとは明らかに異なる［R.M. Fuegel et al., EMBO J. 6, 2077-2084 (1987); B. Maurer etal., J. Virol, 62, 1590-1597 (1988); A. Rethwilm et al., Nucleic AcidSRes. 18, 733-738 (1990) ］。
【００１４】
ＨＦＶ分離株が、これまでヒトにおいて病原性が見出されていないことは、本発明のために特に重要なことである。さらにまた、ＨＦＶは、ヒト組織に各種型の多重性を導入するので、ベクターは、“遺伝子送達系”として開発されたものであって、それは感染性分子クローンｐＨＳＲＶ［A. Rethwilm et al., Nucleic Acid Research 18, 733-738 1990)］から得られ、そして本発明の主題である。“遺伝子送達”のためのベクターとしてのその使用において、フォーミーウイルスは新規である。
【００１５】
ＨＦＶベクターは、例えば、ＭｏＭＬＶ（モロニー・マウス白血症ウイルス）、それからは広く普及されたＮ２ベクター［A.D. Miller et al., Biotechniques 7, 980-990 (1989)］が得られるが、ＨＦＶはいかなる発癌性ももたず、ＨＦＶベクターは使用上安全であると考えられる点で、そのような他のレトロウイルスベクターとは根本的に異なる。そのうえ、フォーミーウイルスは、繊維芽様細胞、上皮様細胞およびリンパ細胞を含む非常に広範な宿主スペクトルに感染する。さらに、もしフォーミーウイルスのＬＴＲ（ロング・ターミナル・リピート）が転写活性をもつならば、ウイルスのトランスアクチベーターｂｅｌ−１の存在が、命令となるという事実のゆえに、ＨＦＶ誘導体は安全なベクターを代表するものとなる。しかしながら、もしそのベクターが、ｂｅｌ−１トランスアクチベーターに関する遺伝情報を有していなければ、移動可能な複製能のある、例えば発癌性をもつＨＦＶベクターは、ＬＴＲ塩基配列が、トランスアクチベーターｂｅｌ−１遺伝子なしでは転写を活性化しないので、その細胞内に産生することはできない。挿入変異誘発による細胞のがん遺伝子の活性化は、同様にありそうにもない。ベクターとしてＨＦＶ誘導体を使用することについて、さらに安全なファクターは、フォーミーウイルスの内因的相同性が知られておらず、それゆえ、内因性レトロウイルスとのいかなる組み換えの問題も起き得ないことである。この考察は、また、使用にさいしてフォーミーウイルスベクターの遺伝的安定性を特に高度にするためにも重要である。
【００１６】
例えば、以下に示すｐＦＯＶ−１ないしｐＦＯＶ−４に関する構築実施例において記載するように、組み換えフォーミーウイルスは、遺伝子材料を、永久的な動物もしくはヒトの細胞系に、またはヒトもしくは動物の体細胞に伝達するために好適である。それらは、代々遺伝する情報を真核細胞中に導入するためのベクターを表していて、可能な応用範囲、標的細胞への遺伝子導入の効率性および操作上の安全性において、通常の遺伝子伝達系（ＭｏＭＬＶ、アデノ随伴ウイルスもしくはシンビスウイルス、またはアデノウイルス粒子、界面活性剤およびその他の添加剤、または物理的方法を用いるＤＮＡの形成）よりも優位性をもっている。
【００１７】
したがって、実施例実験において述べられる、そしてｂｅｌ−１もしくはｂｅｌ−２遺伝子の領域に、外因性核酸を挿入するための多重クローニング配列を有しているフォーミーウイルスベクターは、以下に述べる目的のために使用することができる。しかしながら、多重クローニング配列を挿入し、それによって別のフォーミーウイルスベクターを構築するために、ｐＨＦＶのプロウイルスＤＮＡもしくはその他のフォーミーウイルス分離株において他の欠失をつくることもまた可能である。
【００１８】
そのような組み換えフォーミーウイルスベクターは、長さで１７００塩基対を容易に越えるところの外因性核酸（ＤＮＡ断片）を受け入れることができるので、そのようなフォーミーウイルスベクターは、可能な多数の応用のための発現可能な外因性ＤＮＡを、生産目的のための細胞系に、または医薬的もしくは診断的目的のための体細胞に導入され得る：
【００１９】
Ｉ．  予防接種のためのフォーミーウイルスベクター
組み換えフォーミーウイルスベクター中の外因性核酸は、１種もしくはそれ以上のポリペプチドを発現するために１種もしくはそれ以上の完全な遺伝子を含有することができる。そのようなペプチドは、ヒトもしくは動物において液性および／または細胞性免疫を引き出すために、好適であり、導入された標的細胞中のこのフォーミーウイルスベクターによってそれらの発現を継続して起こすことができる。細胞内で形成されたペプチドは、特殊なポリペプチドであり、細胞性免疫を引き出すために重要なものであることが、既に分かっている（J.B. Ulmer et al., Science 259, 1745-1749 (1993)）。
【００２０】
外因性核酸を運び、そして導入された標的体細胞において、ＨＩＶ，ＨＴＬＶ，Ｂ型肝炎，Ｃ型肝炎，ヒトパピローマウイルス、シトメガロウイルス、ＨＳＶもしくはインフルエンザウイルス、または、例えば、ＰＲＶ，ＢＨＶもしくはＥＨＶのような動物ヘルペスウイルス等のウイルスタンパク質を発現するフォーミーウイルスベクターは、予防的に、または病原性ウイルスによるヒトもしくは動物の継続する感染の治療手段として使用される強力なワクチンを代表するものである。
【００２１】
さらにまた、フォーミーウイルスベクターは、バクテリア感染に対して、マイコプラズマ感染に対して、またはプラズモジウムもしくは他の内部寄生虫による感染に対して、同じ原理による予防接種のために使用することができる。そのような予防接種のためには、複製不能であるが、感染性のフォーミーウイルスベクター粒子、バッファー溶液ｍｌ当たり１０３〜１０７タイターもしくはそれ以上の粒子が、生体内での細胞導入のために皮下もしくは筋肉内に注射される。さもなくば、繊維芽細胞、筋芽細胞もしくはその他の体細胞が、そのような細胞とフォーミーウイルスを産生している細胞とを混合培養することによって、または目的の体細胞を、ｍｌ当たり１０３〜１０７タイターのフォーミーウイルスベクターもしくはそれ以上の粒子を含有するバッファー水懸濁液とともに培養することによって、生体外で導入される。
【００２２】
ＩＩ．  特にウイルス性疾患およびがん性疾患の治療に関して、治療用ＲＮＡを発現するためのフォーミーウイルスベクター
組み換えフォーミーウイルスベクターにおける外因性核酸は、標的細胞で望ましくないＲＮＡ分子の配列と相補的な（アンチセンス）ヌクレオチド塩基配列を保持するか、またはほかにヌクレアーゼ活性のあるリボザイムＲＮＡを保持するＲＮＡを、導入細胞中で発現する１個ないしそれ以上の遺伝子を包含している。
【００２３】
これらの望ましくないＲＮＡ分子は、レンチウイルスもしくはその他のＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡであり得る。それらはまた、レンチウイルス（中でも、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、シトメガロウイルス、エプスタイン・バールウイルス、単純ヘルペスウイルス、動物のヘルペスウイルス（例えばＰＲＶ，ＢＨＶおよびＥＨＶ）、またはその他の病原ウイルスもしくはマイコプラズマ、または細胞内で複製する原核生物、のような細胞内病原体のメッセンジャーＲＮＡ分子でもあり得る。
【００２４】
しかしながら、望ましくないＲＮＡ分子は、また、体細胞の悪性増殖の原因となるがん遺伝子もしくはその他の遺伝子のｍＲＮＡ転写物でもあり得る。したがって、ｃ−ｍｙｃＲＮＡ転写物に対するアンチセンスＲＮＡを発現するフォーミーウイルスベクターは、例えば、バーキットリンパ腫のような悪性障害の場合に使用されるであろう。望ましくないＲＮＡ分子はまた、自己免疫障害もしくは代謝障害の遺伝もしくは発現に、原因として関与しているタンパク質をコードしていることもある。組み換えフォーミーウイルスベクターによってコードされ得る相補的アンチセンスＲＮＡを用いて、そのような望ましくないＲＮＡ分子は、導入細胞において、ワトソン−クリック塩基対による配列選択的方法で不活化することができる。フォーミーウイルスベクターは、それゆえ、感染されたもしくは病理学的に変性した細胞において、アンチセンスＲＮＡ発現を用いて、細菌、ウイルスおよびその他の生物による感染病、およびがん性もしくは自己免疫疾患の治療のために使用することができる。
【００２５】
フォーミーウイルスベクターを用いて発現されたアンチセンスＲＮＡもしくはリボザイムＲＮＡはまた、代謝障害もしくは神経変性障害に関与しているその他の遺伝子に対しても使用することができる。したがって、フォーミーウイルスベクターによって発現されたアンチセンスＲＮＡもしくはリボザイムＲＮＡを用いて、アルツハイマーβ−アミロイドタンパク質前駆体もしくは神経組織のアセチルコリンエステラーゼをコードしているｍＲＮＡを不活化することは、また治療上価値をもつものである。
【００２６】
アンチセンスＲＮＡをコードしている外因性核酸の代わりに、デコイＲＮＡをコードする外因性核酸が、治療的に使用される組み換えフォーミーウイルスベクター中に挿入されることもある。
【００２７】
デコイＲＮＡは、強力な抗ウイルス作用を示すことができ、例えば、ウイルス感染の治療のために使用される。
【００２８】
この目的のために、そのデコイＲＮＡは、病原ウイルスの複製に不可欠なウイルスタンパク質を、それらの部分に対して、結合する特殊なヌクレオチド塩基配列を有する。したがって、デコイＲＮＡ配列は、例えば、ＴＡＲヌクレオチド塩基配列およびＨＩＶ由来のＲＥＶ応答要素ヌクレオチド塩基配列（ＲＲＥ）の多重コピーを含有し、ＨＩＶのｔａｔおよびｒｅｖ調節タンパク質と拮抗的に結合し、それによって感染細胞中でのＨＩＶの複製速度を低下させる。これは、治療的抗ウイルス作用を表している。
【００２９】
しかしながら、そのデコイＲＮＡはまた、ＨＩＶに関して記載したようにレンチウイルス由来のパッケージング配列を、例えば、５’−ＬＴＲおよびｇａｇ配列中への伸長との間のゲノムＲＮＡ中に含有している。
【００３０】
目的の体細胞中への治療的核酸の送達のためにフォーミーウイルスベクターを用いることは、生体外もしくは生体内フォーミーウイルスの応用に関して２種の異なる方法が、適用できる、一般に：
導入されるべき細胞を含む体細胞のあるサンプルの生体外導入のためには、これらの細胞は、適切な細胞培養培地中で、一定培養時間、フォーミーウイルスベクター産生細胞系とともに混合培養される。通常、生体外導入に対する培養時間は、４〜３６時間である。混合培養の条件は、標的細胞の効率的導入を許し、また導入される体細胞に再注射するかまたは再注入するために、培養後、標的細胞とフォーミーウイルスベクター産生細胞系の分別ができるように選択される。臨床適用のための体細胞の生体外導入の技術は、レトロウイルス遺伝子伝達の場合に、十分確立されている。科学文献に詳細に報告されているそのような技術は、また、フォーミーウイルスベクターによる細胞の形質導入にも応用することができる（概観のために以下を参照、Richard C. Mulligan:“遺伝子治療の基礎科学”，Science. Vol. 260, 926-932,1993; W. Frech Anderson:“ヒトの遺伝子治療”, Science、 Vol. 256, 808-813, 1992; A.Dusty Miller:“ヒトの遺伝子治療の到来”, Nature, Vol. 357, 455-460, 1992）。
【００３１】
フォーミーウイルスベクターを用いる体細胞の生体内導入のために、ｍｌ当たり１０３〜１０７もしくはそれ以上のフォーミーウイルスベクター粒子を含むバッファー水懸濁液が、導入されるべき標的細胞を有する組織に注射される。容量１μｌ〜１ｍｌもしくはそれ以上の懸濁液からなるフォーミーウイルスベクターが、生体内で種々の組織に注射することができる。中でも、それは、骨髄、肝臓、血液、リンパ節、骨格筋、皮膚表皮組織、皮膚繊維芽組織、脳、胸腺、もしくはその他の器官である。生体内導入は、ペースト剤もしくはクリーム剤の製剤を含有するフォーミーウイルスベクターの局所投与のような非侵入性フォーミーウイルスベクターによって、または吸入用の、エアゾル、泡沫もしくは粉末製剤によって実施されてもよい。
【００３２】
生体外および生体内適用に対するフォーミーウイルスベクターの産出のために、これらのベクター粒子のいわゆる偽性タイプが使用できることも、また述べる必要がある。偽性フォーミーウイルスベクターは、遺伝的に改変されたパッケージング細胞系によるか、あるいは水泡性口内炎ウイルスに似たウイルスまたはエンベロープ糖タンパク質様タンパク質を発現している複製不能ＨＩＶもしくはその他のウイルスによって意図的に感染された生産細胞系を用いることによって、産生される。これらの外来のウイルスタンパク質は、そのベクターの異種構成分をもつエンベロープを形成するように、フォーミーウイルスベクタータンパク質コート中に取り入れられる。そのような偽性タイプベクターは、ある種の応用に対して優位性を発揮する。それらは、パッケージング細胞の上澄液中のフォーミーウイルスベクター粒子濃度を増加させるために使用できる。それらは、またフォーミーウイルスベクター粒子の宿主範囲を拡大するためにも使用できる。特に、ＨＩＶエンベロープタンパク質を保持する偽性フォーミーウイルスベクターは、そのベクターをＣＤ４受容体を発現する標的細胞に特異的に指向させるために、興味が深い。同様に、異種エンベロープタンパク質によって、例えば、標的とするＩＣＡＭ−１発現細胞に対する肝炎ウイルスタンパク質もしくはライノウイルスタンパク質を用いる肝細胞類似の他の細胞に、優先的に向けられた偽性フォーミーウイルスベクターは、興味が深い。
【００３３】
この優位性に加えて、偽性フォーミーウイルスベクター中のＨＩＶエンベロープタンパク質類似の異種タンパク質は、望ましい免疫応答を発揮する。
【００３４】
ＩＩＩ．  ウイルス性、がん性および自己免疫性疾患の治療に関する発現ポリペプチドのためのフォーミーウイルスベクター
組み換えフォーミーウイルスベクター中の外因性核酸は、発現ポリペプチドのための１個ないしそれ以上の遺伝子を包含することができる。もしこれらのポリペプチドが、そのベクターを導入された標的細胞中で発現されるならば、それらは、トランスドミナントに負に働き、病原ウイルスの複製速度を減退させ、それ故、抗ウイルス作用を有する調節タンパク質となることができる。トランスドミナントに負に働く調節タンパク質は、例えば、ウイルス粒子の構築を妨害するか、またはＨＩＶの改変されたｔａｔタンパク質もしくはｒｅｖタンパク質を表すタンパク質である。
【００３５】
これらの改変されたタンパク質は、ＨＩＶ  ＲＮＡのＴＡＲもしくはＲＲＥ配列になお結合するので、それらの生物学的機能、すなわち抗転写終結（ｔａｔ機能）またはｒｅｖのＲＮＡプロセシング機能は、そのタンパク質の非結合部分における変異によってもはや発現されない。
【００３６】
ウイルス性疾患に治療効果を有するその他の抗ウイルスポリペプチドは、ウイルス結合部位において病原ウイルスを取り込むための受容体に類似しているものである。ウイルスが細胞の受容体に結合するために重要な病原ウイルスの結合部位に結合するポリペプチドが、フォーミーウイルスベクターを用いて、生物体において発現され、分泌され、その結果、細胞中へのウイルスの取り込みを妨げる。この関係において、ＨＩＶ  ｇｐ１２０への結合によって、ＨＩＶによるヒト細胞の新規な感染を防ぐＣＤ４ポリペプチド断片を発現するフォーミーウイルスベクターは、治療上有効なものとなろう。
【００３７】
同様にして、組み換えフォーミーウイルスベクターの力を借りて形成されたそのペプチドは、増殖因子受容体の可溶性部分であってもよく、そして悪性の細胞増殖へ導きつつある発現された増殖因子を捕捉することにもなる。これらの意味によって、フォーミーウイルスベクターは、抗腫瘍性を発現することになる。
【００３８】
この原理は、また自己免疫病を治療するために使用することもできるであろう。２つの例が、この関連で述べられる：
１．  免疫抑制の目的で、そして臓器移植拒絶を防ぐために、外因性核酸によって標的組織中に分泌される抗インターロイキン２抗体を発現するフォーミーウイルスベクターが、使用される。
【００３９】
２．  そのフォーミーウイルスベクターは、標的組織に分泌されるポリペプチドを発現し、そのポリペプチドは、アセチルコリン受容体のα−サブユニットのペプチド断片を有し、そして重症性筋無力症にかかっている患者において抗体を結合し、不活化することができる。
【００４０】
組み換えフォーミーウイルスベクターを用いて発現されるその他のポリペプチドは、がん免疫療法のために、新生物性に形質転換されるが、化学的もしくは物理的手段によって増殖を妨げられる細胞中の、例えば、インターロイキン２のようなリンホカインであってもよい。この場合には、免疫療法のために使用されるその細胞は、フォーミーウイルスベクターを用いて生体外で導入される。同様に、がんの免疫療法は、実施例ＩＩに概説したようなフォーミーウイルスベクターによる腫瘍細胞の生体内形質導入によって実施することもできる。
【００４１】
フォーミーウイルスベクターの仲介により、標的組織での１種以上のインターフェロンの発現は、また抗ウイルス治療および／またはがん治療の手段として考えられる。
【００４２】
さらにまた、新生物性に転換された細胞、またはレンチウイルスもしくは肝炎ウイルスに感染した細胞は、標的組織において、そのベクターが毒素もしくは細胞内の病原体によるか、または新生物性に転換された細胞の特別な代謝により細胞毒性のポリペプチドに変換されるその他のポリペプチドを発現させることによって、組み換えフォーミーウイルスベクターを用いて治療的に処置することができる。フォーミーウイルスベクターは、リシンＡもしくはジフテリア毒素もしくはスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）  エンテロトキシンＢもしくはコリシンＥ、またはその他の毒素を発現するために構築されてもよい。細胞もしくは器官に特異的なそのような生産物の発現を確実にするために、細胞特異性もしくは器官特異性であるプロモーターの調節下の細胞毒ポリペプチドを形成するフォーミーウイルスベクターが、構築されることもある。
【００４３】
フォーミーウイルスベクターによって標的細胞中に内生的に発現され得るその他の治療用タンパク質は、例えば、病原性レンチウイルスもしくは肝炎ウイルスのウイルスプロテアーゼに対するプロテアーゼ阻害剤である。それらはまた、エラスターゼおよび／またはトリプシン、およびその他のプロテアーゼに対するプロテアーゼ阻害剤でもあり、それは、成人呼吸困難症候群および気腫、およびその他の病状を防ぐことになる。それらはまた、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなタンパク質でもよく、それは、フォーミーウイルスベクターを用いてがん治療のために使用される。さらに、腫瘍抑制遺伝子を見落とすことが、フォーミーウイルスベクターの力で発現させることもできる。
【００４４】
フォーミーウイルスベクターの重要な応用のさらなる例は、細胞静止性の化学療法剤、又は骨髄を損なうようなその他の薬剤を用いる腫瘍治療の間に、骨髄細胞（骨髄幹細胞、ＣＤ３４−始原細胞およびその他の造血細胞）を保護する目的で、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）を造血細胞に伝達するために、このベクターを使用することである。
【００４５】
ＩＶ．  細胞染色体ＤＮＡとの相同組み換えのためのフォーミーウイルスベクター
望ましくない遺伝子、例えば、レンチウイルスのプロウイルスＤＮＡ、増幅されたがん遺伝子、遺伝病を引き起こす遺伝子、およびその他の遺伝子は、望ましくない遺伝子に相同であるＤＮＡ配列を有する外因性核酸を保持しているフォーミーウイルスベクターによって不活化することができる。この目的のために、フォーミーウイルスベクターの外因性核酸が、高頻度で、適切な方法で、相同組み換えによる対応する細胞遺伝子の破壊へ導くような方向において選択される。しかしながら、欠陥遺伝子は、フォーミーウイルスベクターの外因性核酸の、完全な遺伝子との組み換えによって、遺伝子座においてこの手段で修正されることもあり得る。
【００４６】
Ｖ．  遺伝病の体細胞遺伝子療法のためのフォーミーウイルスベクター
例えば、血液凝固因子ＶＩＩＩもしくはＩＸにおける欠損、アデノシンデアミナーゼ欠損、ヘモグロビン異常症、嚢胞性繊維症、家族性高ステロール血症、デュシェン・筋ジストロフィー、もしくはその他の遺伝病のような遺伝病は、フォーミーウイルスベクターを用いて、体細胞中へ適切な修正遺伝子を導入することによって治療することができる。
【００４７】
ＶＩ．  心臓血管疾患治療のためのフォーミーウイルスベクター
組み換えフォーミーウイルスベクターは、その外因性核酸が、血圧調節効果をもつポリペプチドを発現させるための１個以上の遺伝子を保持するように構築され得る。したがって、そのポリペプチドは、例えば、トランスドミナントに負に作用する調節心房性ナトリウム利尿ペプチドであってもよい。それらは、循環するＡＮＰ（心房性ナトリウム利尿ペプチド）もしくはＡＮＦ（心房性ナトリウム利尿因子）に結合し、不活化するためのポリペプチドである。これらのポリペプチドは、例えば、抗体類似タンパク質であるか、または、例えば、ＡＮＰもしくはＡＮＦ結合受容体の可溶性受容体誘導体である。それらは、数種の例を挙げると、レニンの阻害剤、またはアンジオテンシン変換酵素の阻害剤であってもよい。
【００４８】
フォーミーウイルスベクターにおける外因性核酸の遺伝子は、また、動脈硬化もしくはその他の心臓血管疾患の進展を阻止する生産物をコードすることもできる。これらの生産物は、内皮細胞もしくは平滑筋細胞の増殖を阻止する物質、例を挙げると、ｃ−ｍｙｂのｍＲＮＡもしくはＴＧＦ−βのｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡである。
【００４９】
これに関連して、フォーミーウイルスベクターにより生成される治療用生産物は、また、ＬＤＬ受容体であってもよい。
【００５０】
フォーミーウイルスベクターは、例えば、ＥセレクチンもしくはＰセレクチンのような粘着タンパク質に対するアンチセンスＲＮＡもしくはリボザイムＲＮＡを発現するように構築することができる。相補性ＲＮＡによって、選択された粘着タンパク質のｍＲＮＡの翻訳を阻害するほかに、そのフォーミーウイルスベクターは、また、血液循環中に分泌され、血液細胞間の（例えば、血小板凝集）、または血液細胞と内皮細胞との相互作用を、例えば、ＥセレクチンもしくはＰセレクチンのような粘着タンパク質に選択的に結合することによって阻止するポリペプチドを発現する外因性核酸を保持することもできる。
【００５１】
血液中および内皮細胞上での粘着タンパク質の阻止は、血管の病理学的変化および炎症疾患に関しての治療原理として重要である。
【００５２】
ＶＩＩ．  診断上の応用のためのフォーミーウイルスベクター
組み換えフォーミーウイルスベクターの外因性核酸は、検出されるべきある物質によって細胞内で活性化され、そしてそのために、特異的に、しかも増幅可能なシグナルを用いて、その物質を高い感度で検出可能にする遺伝子もしくは遺伝子断片を保持することもできる。
【００５３】
細胞内のウイルス性もしくは細菌性トランスアクチベータータンパク質を、生検材料、体液、細胞系、生産細胞系もしくはその他の細胞から検出することは、例を挙げて本明細書で述べることができる。トランス活性可能な遺伝子配列を、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼもしくはペルオキシダーゼのような下流のレポーター遺伝子に共役させることによって、感染の存在を確認できるそのようなトランスアクチベータータンパク質が、検査下の細胞内のフォーミーウイルスベクターによって、感度よく検出できる。
【実施例】
【００５４】
ＶＩＩＩ．  核酸の試験管内組み換えによるフォーミーウイルスベクターの構築
感染性分子クローンｐＨＳＲＶ−２（図１および２）は、ｐＨＳＲＶ−１の誘導体である。ｐＨＳＲＶ−１は、ヒト・フォーミーウイルスベクターのｃＤＮＡクローニングおよび組み込まれていないウイルスＤＮＡのクローニングによって得られた（A. Rethwilm et al., Gene 59, 19-28 (1987), A. Rethwilm etal., Nucleic acids Res. 18, 733-738 (1990)）。ｐＨＳＲＶ−１においては、約５００塩基対が、５’ＬＴＲのＵ３領域から欠失し、約３５０塩基対が、３’ＬＴＲのＵ３領域から欠失している（A.Rethwilm et al., 未発表）。ｐＨＳＲＶ−２においては、５００塩基対が、両ＬＴＲで欠失している。このことは、ｐＨＳＲＶ−１の３’ＬＴＲにおけるＡｆｌＩＩ／ＸｂａＩ断片を、５’ＬＴＲの対応する断片により置換することによって容易になされた。両プラスミドは、感受性細胞へのトランスフェクションの後、感染性ウイルスを誘発する。図３−８に描かれたｐＦＯＶベクターを得るために、ｂｅｌ−２／ｂｅｌ−３における欠失が、制限エンドヌクレアーゼＡｃｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって、ｐＨＳＲＶ−２の、それぞれヌクレオチド位置１０４２０および１０８４４の間に導入された。ＥｃｏＲＶ、ＳｍａＩおよびＮｒｕＩに対する切断部位を有する多重クローニング配列が、ｐＦＯＶ−１におけるこの欠失中に挿入された。ｐＦＯＶ−１において、外来のＤＮＡ配列は、Ｃ−末端を切り取られたＢｅｔタンパク質の融合タンパク質として発現される。ｐＦＯＶ−２においては、内部リボソームランディングパッド（ｌａｎｄｉｎｇ  ｐａｄ）が、ＡｃｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ欠失中に挿入された。その上、２個の終止コドンが、ｂｅｌ−２の読み枠中に導入された（G.Baunach et al., J. Virol. 67, 5411-5418,(1993)）。ｐＦＯＶ−３、ｐＦＯＶ−５およびｐＦＯＶ−６は、ｐＦＯＶ−２の誘導体であり、そこには、ｂｅｌ−１読み枠中のスプライス供与部位（ｐＦＯＶ−３）、ｂｅｌ−２読み枠のスプライス受容部位（ｐＦＯＶ−５）、または両方（ｐＦＯＶ−６）が、変異を受けている。ｐＦＯＶ−２，ｐＦＯＶ−３，ｐＦＯＶ−５およびｐＦＯＶ−６は、これらのベクター中に挿入された外来ＤＮＡによってコードされた真のタンパク質を生じる。
【００５５】
これらのベクターは、複製能があり、外因性核酸を発現するために（例えば、ＣＡＴ遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を発現するために）引き続いて使用された。
【００５６】
ベクターｐＦＯＶ−４（図１，２および６）は、ＥｃｏＲＩ（ヌクレオチド位置９５２９）およびＨｉｎｄＩＩＩ（ヌクレオチド位置１０８４４）制限部位の間でプロウイルスＤＮＡを欠失させることにより作製された。このフォーミーウイルスベクターは、複製能をもたない。
【００５７】
ＩＸ．  フォーミーウイルスベクターの生産
複製能のあるフォーミーウイルスベクター、例えば、ｐＦＯＶ−１ないしｐＦＯＶ−３は、細胞系、例えばＨＥＬ２９９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１３７）ヒト胎児性肺繊維芽細胞、ＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）ハムスター腎細胞、ＣＦ２ＴＨ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４３０）イヌ胸腺細胞系、ＭＲＣ５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）ヒト肺細胞系、ＣＨＯチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞系、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８１）アフリカミドリザル腎細胞系、３ＴＳ−ＴＫ−（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９２）マウス繊維芽細胞系、およびその他の細胞系、または一次組織培養もしくは感染動物において増殖させられる。感染性フォーミーウイルスベクター粒子を含む細胞培養上澄液もしくは感染動物からの液は、感染させる標的細胞に対して使用できる。
【００５８】
複製能をもたないフォーミーウイルスベクターは、組み換え的に改変されたパッケージング細胞系を用いて生産される。その複製能のないフォーミーウイルスベクターは、複製能のあるフォーミーウイルスによって感染されない体細胞において、そのベクターの複製を排除する遺伝子欠失をもっている。ｂｅｌ遺伝子に加えて、これらの遺伝子欠失は、ｇａｇ遺伝子領域および／またはｐｏｌ遺伝子領域および／またはｅｎｖ遺伝子領域を含むことができる。
【００５９】
欠失遺伝子のタンパク質は、例えば通常の伝達（例えば、エレクトロポレーションもしくはＣａＰＯ４沈殿）によってパッケージング細胞系中にトランスフェクションされた１個もしくはそれ以上のフォーミーウイルス遺伝子によって産生される。パッケージング細胞系の特徴は、それが、外因性核酸を包含するベクターのゲノムＲＮＡを、感染性フォーミーウイルス粒子中に詰め込むことを可能とするｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖタンパク質のような１個もしくはそれ以上のフォーミーウイルスタンパク質を発現することである、何故ならば、これらのタンパク質は、パッケージング細胞系においてトランスに供給されるからである。
【００６０】
感染性であるが複製能のないフォーミーウイルスベクター粒子は、安全性の理由からこの方法で生産される。パッケージング細胞系は、前記細胞系もしくはその他の適切な細胞系のひとつであり得る。
【００６１】
Ｘ．  生物学的、薬理学的、および医学的研究に関して特別な生理学的性質を有する組織培養および動物（細胞および動物モデル）を作出するためのフォーミーウイルスベクター
組織培養（生体外）の細胞、または動物における組織細胞（生体内）は、そのベクターを用いて、これらの細胞に特殊な遺伝子の発現を起こさせるために、フォーミーウイルスベクターによって形質導入される。これらの方法によって、特殊な生理学的状態、特殊な代謝効果、または細胞の特殊な生化学的性質が、生体外もしくは生体内で作り出される。この方法で改変されたこれらの細胞は、生理学的、薬理学的、または医学的研究のために大きな価値をもつことができる。例えば、それらは、生体外もしくは生体内で、遺伝子の機能を決定するため、または研究中の活性化合物もしくは薬物の効果を決定するために試験される。さらに、そのような導入細胞（そのベクターによって遺伝的に改変された細胞）は、生体外細胞試験もしくは生体内動物実験によって、薬物としてさらに開発するために適切な活性化合物（化学合成的もしくは生物学的に作製された物質）に関する研究（活性化合物のスクリーニング）において、非常に価値ある助けとなり得る。具体的な例は、遺伝的に改変された細胞中のがん遺伝子のがん遺伝子的能力を研究するため、がん遺伝子依存性の腫瘍発生を研究するため、そして腫瘍発生を阻害するための活性に関して生体内で活性化合物を試験するために、選ばれた動物器官中にｃ−ｍｙｃ、ｒａｓ，ｂｃｒ−ａｂｌ，もしくはＨＩＶ−ｔａｔのようながん遺伝子を伝達すべきそのベクターの使用によって提供される。
【００６２】
ｂｅｌ−１を発現するパッケージング細胞系は、ＨＩＶ−ＬＴＲ−レポーター遺伝子構成物を保持するｐＦＯＶ−４−ベクターを作製するために使用される。このベクターは、ヒト一次マクロファージ、神経細胞およびその他の体細胞に感染する。そのような導入マクロファージもしくは他の一次細胞は、実施例ＶＩＩに概説したように、ＨＩＶ汚染に関して分析されるべきサンプルとの混合培養によって、感受性のＨＩＶ検出ための診断目的に対して使用することができる。何故ならば、狭い宿主領域に限定され、それゆえ、抹消の血液リンパ球サンプルで培養できない臨床関連ＨＩＶ分離株があるからである。
【００６３】
そのようなｐＶＯＦ−４を導入されたマクロファージもしくはその他の細胞は、また、ＨＩＶの阻害物である。さらに、もしｐＶＯＦ−４のレポーター遺伝子が、ブドウ球菌エンテロトキシンＢもしくはリシンＡのような潜在的ｓｕｉｚｉｄｅ遺伝子、または細胞毒性産物をコードしているその他の遺伝子によって置換されるならば、ｐＶＯＦ−４は、そのような一次体細胞のＨＩＶ感染において活性化されるｓｕｉｚｉｄｅ遺伝子のスクリーニングに使用される。
【００６４】
さらに、ヒトの細胞粘着タンパク質（セレクチン）は、フォーミーウイルスベクターを用いて種々の動物の体細胞において発現され、それによって、動物（例えば、マウス）において抗炎症性、セレクチン結合性の、活性化合物のスクリーニングを可能とする。これらには、動物においてヒトのタンパク質を用いて、フォーミーウイルスベクターの力で実現されつつある“分子薬理学”に関する２例の試験モデルがある。
【００６５】
本発明の特徴および態様は以下のとおりである。
１．  治療的、免疫的もしくは診断的効果を有する１個ないしそれ以上の遺伝子産物を発現するための外因性核酸を含むフォーミーウイルスベクター。
２．  上記１記載のフォーミーウイルスベクターであって、そのフォーミーウイルスベクターは、外因性核酸を挿入するためのｂｅｌ−１、ｂｅｌ−２および／またはｂｅｌ−３遺伝子の領域に欠失を有するヒト・フォーミーウイルス（ヒト・スプーマレトロウイルスＨＳＲＶ−１もしくはＨＳＲＶ−２の感染性もしくは非感染性ＤＮＡ）の誘導体であることを特徴とする。
３．  上記１ないし２記載のフォーミーウイルスベクターであって、その外因性核酸は、液性および／または細胞性免疫化に関するポリペプチドを発現するための１個の完全な遺伝子、または数個の完全な遺伝子を含むことを特徴とする。
４．  上記１ないし２記載のフォーミーウイルスベクターであって、その外因性核酸は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡもしくはデコイＲＮＡを発現するための遺伝子を含むことを特徴とする。
５．  上記１ないし２記載のフォーミーウイルスベクターであって、その外因性核酸は、腫瘍形成を阻害するための遺伝子産物を発現することを特徴とする。
６．  上記１ないし２記載のフォーミーウイルスベクターであって、その外因性核酸は、標的生物において遺伝子欠損を償う遺伝子産物を発現することを特徴とする。
７．  自己免疫疾患、心臓血管疾患、腫瘍、ウイルス性疾患もしくは遺伝子欠損を治療するための上記１ないし６記載のフォーミーウイルスベクター。
８．  上記１ないし６記載のフォーミーウイルスベクターであって、それは、診断的使用のための産物を発現する外因性核酸配列を含んでいる。
９．  上記１ないし７記載のフォーミーウイルスベクターを含有する医薬品。
１０．上記１ないし９記載のフォーミーウイルスベクターを産生するための、真核生物細胞系もしくは組み換え真核生物細胞系。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ｐＨＦＶ（ヒト・スプーマレトロウイルスｐＨＳＲＶ−２の感染性プロウイルスＤＮＡ）、およびＡｃｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断部位（それぞれ、ヌクレオチド位置１０４２０および１０８４４）における欠失によって、それから作出されるフォーミーウイルスベクターｐＦＯＶ−１、ｐＦＯＶ−２およびｐＦＯＶ−３のゲノム構造の図式表示。複製不能ベクターｐＦＯＶ−４は、ＥｃｏＲＩ（ヌクレオチド位置９５２９）およびＨｉｎｄＩＩＩ（ヌクレオチド位置１０８４４）の間に、より大きい欠失を有する。多重クローニング部位、例えば、ここに示されたＥｃｏＲＶ、ＳｍａＩおよびＮｒｕＩ切断部位は、その欠失の場所に挿入された。
【図２】図１と一緒になって、上述のベクターを構成する一方の部分を示す図である。
【図３】フォーミーウイルスベクターｐＦＯＶ−１の制限酵素切断地図。
【図４】フォーミーウイルスベクターｐＦＯＶ−２の制限酵素切断地図。
【図５】フォーミーウイルスベクターｐＦＯＶ−３の制限酵素切断地図。
【図６】フォーミーウイルスベクターｐＦＯＶ−４の制限酵素切断地図。
【図７】フォーミーウイルスベクターｐＦＯＶ−５の制限酵素切断地図。
【図８】フォーミーウイルスベクターｐＦＯＶ−６の制限酵素切断地図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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