(57)【要約】      （修正有）【課題】  シマミミズが生産する新規な生デンプン分解酵素を提供する。【解決手段】  シマミミズの凍結乾燥粉末を緩衝液に懸濁し、遠心分離した後、上清を回収し、上清にプロテアーゼ阻害剤を加え超遠心分離した後得られた上清に３５％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加し、得られた沈殿を少量の緩衝液に溶解して、デンプン又は生デンプンに対する分解活性を指標とし、陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、二つの生デンプン分解酵素活性を有する画分（先に溶出する活性画分を生デンプン分解酵素Ｉ、後に溶出する活性画分を生デンプン分解酵素ＩＩと命名）を得た。これらの画分をそれぞれゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーに順にかけてその活性画分を分取することにより、シマミミズが生産する均一な生デンプン分解酵素Ｉ及び生デンプン分解酵素ＩＩを得た。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一晩絶食させたシマミミズ（Eisenia fetida）を凍結乾燥し、乳鉢で粉砕して得た粉末状シマミミズを５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）に懸濁し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）した後上清を回収し、上清にプロテアーゼ阻害剤加え、超遠心分離（１００，０００Ｇ、３０分、４℃）した後上清を回収し、この上清に３５％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加し、４℃で一晩保存し、続いて遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）した後沈殿を回収し、得られた沈殿を少量の５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）に溶解して得られた酵素液を、透析用セルロースチューブ（三光純薬株式会社）を用い、該液（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０））に対して透析し、その透析内液を、デンプン又は生デンプンに対する分解活性を指標とし、ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍによる陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて得られる二つの活性画分のうち先に溶出する活性画分を分取し、この画分を次いでＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００を用いるゲルろ過クロマトグラフィーにかけて活性画分を分取し、この活性画分をＢＵＴＹＬ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓを用いる疎水クロマトグラフィーにかけてその活性画分を分取することにより生デンプン分解酵素活性画分として得られる、シマミミズが生産する生デンプン分解酵素Ｉ。
【請求項２】
一晩絶食させたシマミミズを凍結乾燥し、乳鉢で粉砕して得た粉末状シマミミズを５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）に懸濁し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）した後上清を回収し、上清にプロテアーゼ阻害剤加え、超遠心分離（１００，０００Ｇ、３０分、４℃）した後上清を回収し、この上清に３５％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加し、４℃で一晩保存し、続いて遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）した後沈殿を回収し、得られた沈殿を少量の５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）に溶解して得られた酵素液を、透析用セルロースチューブ（三光純薬株式会社）を用い、該液（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０））に対して透析し、その透析内液を、デンプン又は生デンプンに対する分解活性を指標とし、ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍによる陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて得られる二つの活性画分のうち後に溶出する活性画分を分取し、この画分を次いでＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００を用いるゲルろ過クロマトグラフィーにかけて活性画分を分取し、この活性画分をＢＵＴＹＬ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓを用いる疎水クロマトグラフィーにかけてその活性画分を分取することにより生デンプン分解酵素活性画分として得られる、シマミミズが生産する生デンプン分解酵素ＩＩ。
【請求項３】
電気泳動的に単一であり、分子量が電気泳動によれば６０ｋＤａである、請求項１又は請求項２記載の生デンプン分解酵素。
【請求項４】
エンド型のα−アミラーゼである、請求項１〜請求項３いずれか１項に記載の生デンプン分解酵素。
【請求項５】
最適作用温度が５０℃である、請求項１〜請求項４いずれか１項に記載の生デンプン分解酵素。
【請求項６】
最適作用ｐＨが５．５である、請求項１〜請求項５いずれか１項に記載の生デンプン分解酵素。
【請求項７】
４℃でのアミラーゼ活性が３７℃のアミラーゼ活性の３７％である、請求項１記載の生デンプン分解酵素Ｉ。
【請求項８】
４℃でのアミラーゼ活性が３７℃のアミラーゼ活性の２１％である、請求項２記載の生デンプン分解酵素ＩＩ。
【請求項９】
ｐＨ安定性が７〜９である、請求項１記載の生デンプン分解酵素Ｉ。
【請求項１０】
ｐＨ安定性が７〜８である、請求項２記載の生デンプン分解酵素ＩＩ。
【請求項１１】
熱安定性が１０〜６０℃である、請求項１記載の生デンプン分解酵素Ｉ。
【請求項１２】
熱安定性が１０〜５０℃である、請求項２記載の生デンプン分解酵素ＩＩ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に生デンプン分解酵素に関する。より詳しくは、本発明はミミズの生デンプン分解酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミミズは環形動物門貧毛目の生物で、地球上で３０００〜７０００種存在すると言われている。中国において、ミミズの乾燥粉末は、「地竜」と言う名で伝統的な漢方薬として知られており、解熱剤や利尿薬として長きに渡って用いられている。また、近年アカミミズ（Lumbrics rubellus）の凍結乾燥粉末から、血栓分解酵素が単離され、日本や韓国で研究が行われている（非特許文献１〜非特許文献３）。また、ミミズは重金属イオンを腸内に溜め込む習性があり、この習性を利用して汚染土壌のバイオマーカーとしても用いられている（非特許文献４、非特許文献５）。一方、日本の食品廃棄物は食品産業全体で１１３１万トン（２００２年）と世界の食糧援助総量に匹敵するところまできている。また、環境省の２０００年度の推計では、一般家庭からの食品廃棄物も１２００万トンに上り、２００１年に食品循環資源の再生利用等の促進に関する法律（食品リサイクル法）が施行され、食品廃棄物の発生抑制と再生利用などを促進することが義務づけられ、その効果的処理方法が模索されている。その方法の一つに、食品廃棄物を未利用資源としてとらえたバイオコンバージョンによるコンポスト化がある。
【０００３】
日本では微生物を用いたコンポスト化が一般的であるが、欧米諸国では実際に一般家庭でも有機ゴミを処理するのにミミズが用いられており、摂取された有機ゴミは腸内酵素と腸内微生物群によって分解され、非常に栄養価の高い糞を排泄する事が知られている（非特許文献６）。これは土壌改良剤として使用されている。コンポスト化に用いられるミミズは、ごく少数であり、中でもシマミミズ（Eisenia fetida）が最もよく用いられている（非特許文献７、非特許文献８）。しかしながら、シマミミズのどの腸内酵素、どの腸内微生物群のどの酵素がコンポスト化に寄与しているかについては充分に明らかにされているとは言えない。
【特許文献１】記載なし
【非特許文献１】ノブヨシ  ナカジマ，ヒサシ  ミハラ，ヒロユキ  スミ（1993）,「ミミズ Lumbricus rubellus の強力なフィブリン分解酵素の特性決定」, Biosci. Biotech. Biochem., 57(10): 1726-1730。
【非特許文献２】ノブヨシ  ナカジマ，マナブ  スギモト，コウジ  イシハラ，カオル  ナカムラ，ヒロキ  ハマダ（1999）,「ミミズのセリンプロテアーゼの更なる特性決定、ペプチド基質に対する及び自己消化に対する切断特異性」, Biosci. Biotech. Biochem., 63(11): 2031-2033。
【非特許文献３】ジン  チャン，リ  リ，チェン  ウ，ロン−キアオ  ヘ（2003）,「アイセニア・フェティダ由来の固定化されたミミズフィブリン分解酵素ＩＩによるフィブリノーゲン及びプラズミノーゲンの加水分解」, Int. J. Biol. Macromolecules, 32: 165-171。
【非特許文献４】Ｓ．Ａ．ライネック，Ａ．Ｊ．ライネック（2004）,「ミミズにおける重金属遺伝毒性の生体マーカーとしてのコメット検定法」, Arch. Environ. Contam. Toxicol., 46: 208-215。
【非特許文献５】ピーター  Ｋ．ハンカード，クラウス  スヴェンドセン，ジュリアン  ライト，クレール  ウィーンバーグ，サマンサ  Ｋ．フィッシュウィック，デイヴィッド  Ｊ．スパージオン，ジェイソン  Ｍ．ウィークス（2004）,「化学分析の支援としてミミズの生体マーカーを用いた汚染土壌の生物学的評価」, Sci. Total Environ., 330: 9-20。
【非特許文献６】ルシアノ  パスクアトロ  カネラス，ファビオ  ロペス  オリバーセ，アンナ  エル．オコロコヴァ−ファカンハ，アーノルド  ロチャ  ファカンハ（2002）,「ミミズコンポストから単離された腐植酸（Humic acids）はトウモロコシの根の伸長、横根の出現、及び細胞質膜のＨ＋−ＡＴＰアーゼ活性を増強する」, Plant Physiol. 130: 1951-1957 。
【非特許文献７】メアリー  アッペルホフ著（2002）「だれでもできるミミズで生ごみリサイクル」合同出版。
【非特許文献８】佐原  みどり著（2002）「生ごみを食べてもらうミミズ御殿の作り方」ＶＯＩＣＥ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本研究では、コンポスト化において重要な働きをするであろうシマミミズ由来の加水分解酵素群のスクリーニングを行い、特に食品廃棄物処理に有用と考えられる、これまでミミズが生産することが知られていなかった生デンプン分解酵素をシマミミズから単離精製し、その性質を明らかにすることを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、従来知られていなかった、シマミミズが生産する生デンプン分解酵素を提供する。
【０００６】
本発明の生デンプン分解酵素Ｉは、一晩絶食させたシマミミズを凍結乾燥し、乳鉢で粉砕して得た粉末状シマミミズを５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）に懸濁し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）した後上清を回収し、上清にプロテアーゼ阻害剤を加えて超遠心分離（１００，０００Ｇ、３０分、４℃）した後上清を回収し、この上清に３５％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加し、４℃で一晩保存し、続いて遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）した後沈殿を回収し、得られた沈殿を少量の５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）に溶解して透析を行った。透析膜は透析用セルロースチューブ（三光純薬株式会社）、外液は２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）を用いた。その透析内液を、デンプン又は生デンプンに対する分解活性を指標とし、ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍを用いる陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて先に溶出する活性画分を分取し、この画分を集めて次にＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００を用いるゲルろ過クロマトグラフィーにかけて活性画分を分取し、この画分をさらにＢＵＴＹＬ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓを用いる疎水クロマトグラフィーにかけて活性画分を分取することにより、生デンプン分解酵素活性画分として得られる。
【０００７】
また、本発明の生デンプン分解酵素ＩＩは、一晩絶食させたシマミミズを凍結乾燥し、乳鉢で粉砕して得た粉末状シマミミズを５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）に懸濁し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）した後、上清を回収し、上清にプロテアーゼ阻害剤を加え超遠心分離（１００，０００Ｇ、３０分、４℃）した後上清を回収し、この上清に３５％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加し、４℃で一晩保存し、続いて遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）した後沈殿を回収し、得られた沈殿を少量の５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）に溶解して透析を行った。透析膜は透析用セルロースチューブ（三光純薬株式会社）、外液は２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）を用いた。その透析内液を、デンプン又は生デンプンに対する分解活性を指標とし、ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍを用いる陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて後に溶出する活性画分を分取し、この画分を集めて次にＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００を用いるゲルろ過クロマトグラフィーにかけて活性画分を分取し、この画分をさらにＢＵＴＹＬ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓを用いる疎水クロマトグラフィーにかけて活性画分を分取することにより、生デンプン分解酵素活性画分として得られる。
【０００８】
本発明の生デンプン分解酵素Ｉ及びＩＩは、その生デンプン分解様式からいずれもエンド型のα−アミラーゼである。
【０００９】
本発明のデンプン分解酵素Ｉ及びＩＩの最適作用温度はいずれも約５０℃であったが、３０分の熱処理においては本発明のデンプン分解酵素Ｉは１０〜６０℃で安定であり、本発明のデンプン分解酵素ＩＩは１０〜５０℃である。
【００１０】
本発明のデンプン分解酵素Ｉ及びＩＩの最適作用ｐＨはいずれも５．５であり、４℃で２４時間処理後の本発明のデンプン分解酵素ＩのｐＨ安定性は７〜９であり、本発明のデンプン分解酵素ＩＩのｐＨ安定性は７〜８である。
【００１１】
本発明の生デンプン分解酵素Ｉは、４℃でのアミラーゼ活性が３７℃のアミラーゼ活性の約４０％を保持し、好ましくは３７％の活性を保持する。
【００１２】
本発明の生デンプン分解酵素ＩＩは、４℃でのアミラーゼ活性が３７℃のアミラーゼ活性の約２５％を保持し、好ましくは２１％の活性を保持する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。本発明で使用した主材料及び酵素活性測定法は以下の通りである。
【００１４】
１．実験材料
シマミミズ（Eisenia fetida）は、神奈川県伊勢原市三ノ宮１１６に住所を有する、相模浄化サービス（有）から購入した。
【００１５】
２．還元糖の測定法（ソモギーネルソン法（参考文献９））
試料、対照共に０．４％各基質を１００μｌ、緩衝液を１００μｌずつ入れて３７℃で５分プレインキュベートし、その後、試料にのみ酵素液を２０μｌ加え、１５分反応させた。反応後、試料、対照共にソモギー試薬を２００μｌずつ、対照にのみ酵素液を２０μｌ加えた後、１００℃で１０分煮沸し反応を停止させた。試料、対照共に１０分間水冷した後、ネルソン試薬を２００μｌずつ加え、２０分間放置し発色させた。２０分後、蒸留水２．０ｍｌを加えてよく混和し、６５５ｎｍの波長で吸光度を測定した。酵素活性はソモギーネルソンの検量線から得られた式を用いて求めた。なお、１単位は１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖を遊離する酵素量とした。基質には可溶化馬鈴薯デンプン、生馬鈴薯デンプン、生米デンプン、ＣＭＣ（カルボキシルメチルセルロース）、キシラン、ラミナリンを用いた。
【００１６】
３．アミラーゼ活性測定法（ヨウ素デンプン反応（参考文献１０））
試料、対照共に０．４％デンプン溶液１５０μｌ、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を２２０μｌ、０．２ＭＣａＣｌ２溶液を３０μｌずつ入れた。試料にのみ粗酵素液を２００μｌ加え、３７℃で１５分反応させた。その後、試料、対照共に１．５Ｎ酢酸溶液を２００μｌずつ入れ、反応を停止させた。対照にのみ粗酵素液を２００μｌ加えた後、試料、対照共にヨウ素ヨウ化カリウム溶液を２００μｌ加えて発色させ、２０分放置した。その後、蒸留水３．４ｍｌを加えてよく混和し、６９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。このときの対照値−試料値をアミラーゼ活性とする。なお、１単位は、澱粉を基質として、１分間でＡ６９０を０．０１低下させる酵素量と定義した。
【００１７】
４．タンパク質の定量法
精製過程におけるタンパク質は、ベックマンＤＵ７４００を用い、２８０ｎｍの吸光度を測定した。また、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質としてブラッドフォード法（参考文献１２）により測定した。
【実施例１】
【００１８】
生デンプン分解活性の測定法（参考文献９）
試料、対照共に０．４％生デンプン懸濁液を１００μｌ、緩衝液を１００μｌずつ入れて３７℃で５分プレインキュベートし、その後試料にのみ酵素液を２０μｌ加え、１５分反応させた。反応後、試料、対照共にソモギー試薬を２００μｌずつ、対照にのみ酵素液を２０μｌ加えた後、１００℃で１０分間煮沸し反応を停止させた。試料、対照共に１０分間水冷した後ネルソン試薬を２００μｌずつ加え、２０分間放置し発色させた。２０分後、蒸留水２．０ｍｌを加えてよく混和し、２５００ｒｐｍで５分遠心分離を行った後、６５５ｎｍの波長で吸光度を測定した。酵素活性はソモギーネルソンの検量線から得られた式を用いて求めた。なお、１単位は１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖を遊離する酵素量とした。
【実施例２】
【００１９】
シマミミズからの生デンプン分解酵素の単離
一晩絶食させたシマミミズ（Eisenia fetida）を凍結乾燥した後、１０ｇを乳鉢で破砕した。粉末状にしたミミズを５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）に懸濁し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）した後上清を回収した。上清にプロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテクス）を２％（ｖ／ｖ）になるように加えた。そして、超遠心（１００，０００Ｇ、３０分、４℃）後、上清を回収した。上清に３５％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加し、４℃で一晩保存した。続いて遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）し、沈殿を回収した。回収した沈殿を少量の５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）に溶解して得られた酵素液を透析した。透析膜は透析用セルロースチューブ（三光純薬株式会社）、外液は２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）を用いた。その透析内液を、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ）、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００）、疎水クロマトグラフィー（ＢＵＴＹＬ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓ）の順で精製を行った（図１）。
【００２０】
結果：イオン交換クロマトグラフィー
シマミミズ乾燥重量１０ｇから得られた粗酵素液を超遠心により、不溶性の物質を取り除いた後、３５％硫安塩析により、目的とするアミラーゼのほとんどは沈殿した。この沈殿を少量の２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）に溶解したものを透析した。透析膜は透析用セルロースチューブ（三光純薬株式会社）、外液は２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）を用いた。その透析内液を、ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍを用いる陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた。透析内液を２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（２．５×２１ｃｍ、１０３ｍｌ）に負荷し、同緩衝液で洗浄後、０から０．５Ｍの濃度勾配をつけたＮａＣｌを含む同緩衝液で溶出を行った。その結果は図２に示すように、生デンプン分解活性のピークが２箇所見られた。このうち画分Ｎｏ．５４〜６１を生デンプン分解酵素Ｉ、画分Ｎｏ．６６〜７３を生デンプン分解酵素ＩＩとして回収した。
【００２１】
結果：ゲルろ過クロマトグラフィー
次いで、得られた生デンプン分解酵素Ｉの画分、及び生デンプン分解酵素ＩＩの画分に、それぞれ８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃で一晩放置した。続いて遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）で得られた沈殿を８ｍｌの２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）に溶解し、透析を行った。透析膜は透析用セルロースチューブ（三光純薬株式会社）、外液は２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）を用いた。その透析内液を、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００（２．５×９０ｃｍ、４４２ｍｌ）に負荷し、同緩衝液で溶出を行った。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、図３及び図４に示すような結果を得た。このうち生デンプン分解酵素Ｉでは画分Ｎｏ．８６〜１００を、生デンプン分解酵素ＩＩでは画分Ｎｏ．６４〜８０を活性画分として回収した。
【００２２】
結果：疎水クロマトグラフィー
次いで、ゲルろ過クロマトグラフィー後の生デンプン分解酵素Ｉの活性画分、及び生デンプン分解酵素ＩＩの活性画分にそれぞれ、０．５Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加したものを、０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）で平衡化したＢＵＴＹＬ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓ（３．０×７．０ｃｍ、５０ｍｌ）に負荷し、０．５から０Ｍの濃度勾配をつけた硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）で溶出を行った。その結果を図４〜図６に示す。このうち生デンプン分解酵素Ｉでは画分Ｎｏ．３０〜３５を、生デンプン分解酵素ＩＩでは画分Ｎｏ．４０〜４４を回収し、精製を終了した。以上の精製ステップを表１にまとめた。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
精製したアミラーゼの比活性は生デンプン分解酵素Ｉでは約８５倍、生デンプン分解酵素ＩＩでは約２６０倍に上昇し、回収率はおのおの３．６％、５．９％であった。上記の精製過程において、各画分のタンパク質量はベックマンＤＵ７４００を用い、２８０ｎｍの吸光度を測定し、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質としてブラッドフォード法（参考文献１２）により定量した。
【００２５】
結果：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性分析
上記の精製により得られた本発明の生デンプン分解酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動を行なった。レムリーの方法（参考文献１３）に従い、分離ゲルを１０％、濃縮５％で行った。泳動はゲル１枚あたり２０ｍＡで行った。その結果は、図７に示すとおり電気泳動的に均一であり、生デンプン分解酵素Ｉ及びＩＩの分子量は共に約６０ｋＤａと推測された。
【実施例３】
【００２６】
本発明の生デンプン分解酵素のデンプン分解様式
本発明の生デンプン分解酵素による生デンプン分解産物を、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）により経時的に分析した。生米デンプンを精製したシマミミズ由来生デンプン分解酵素で、３７℃の条件下で３時間、１２時間、７２時間反応させ、各時間の生成糖を薄層クロマトグラフィーにより分析した。薄層クロマトグラフィーはＴＬＣプレートシリカゲル６（ＭＥＲＣＫ）に各時間の反応液をスポットし、常温で、クロロホルム：酢酸：水＝５：７：１の展開溶媒で展開を行った後、ドラフト内で乾燥させ、２０％硫酸エタノールを噴霧し、１２０℃で３０分間放置し、糖検出を行った。
【００２７】
結果
図８から明らかなように、３時間後の分解産物はＧ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５そしてそれ以上のオリゴ糖が多く、Ｇ１はほとんど観測されなかった。１２時間後では主にＧ２、Ｇ３が生成し、７２時間後ではＧ１、Ｇ２が主要産物となっている。つまり、反応初期では重合度の大きなオリゴ糖が見られ、時間の経過に伴い重合度の小さなオリゴ糖が得られることより、これら２つの酵素はエンド型のα−アミラーゼであると決定した。
【実施例４】
【００２８】
本発明のデンプン分解酵素活性に対する温度の影響
１．最適作用温度
０．１Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＯＯＮａ緩衝液（ｐＨ５．５）中で、３０℃〜８０℃の各温度で可溶化馬鈴薯デンプンを基質としてアミラーゼ活性を測定した。
【００２９】
２．熱安定性
酵素液を１０℃〜８０℃の各温度で３０分間インキュベートした後、直ちに氷冷し、０．１Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＯＯＮａ緩衝液（ｐＨ５．５）中、３７℃で可溶化馬鈴薯デンプンを基質として残存活性を測定した。
【００３０】
結果
可溶化した馬鈴薯デンプンに対する最適作用温度は、生デンプン分解酵素Ｉ及び生デンプン分解酵素ＩＩ共に５０℃であった（図９Ａ）。熱安定性に関しては、生デンプン分解酵素Ｉは１０〜６０℃まで、生デンプン分解酵素ＩＩは１０〜５０℃まで安定であった（図９Ｂ）。
【実施例５】
【００３１】
本発明の生デンプン分解酵素活性に対するｐＨの影響
１．最適作用ｐＨ
３７℃で、ｐＨ３．０〜９．０までの各緩衝液を用いて、可溶化馬鈴薯デンプンを基質としてアミラーゼ活性を測定した。用いた緩衝液は以下に示すとおりである。０．１Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＨ／ＨＣｌ（ｐＨ３．０）、０．１Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ４．０〜６．０）、０．１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４／ＮａＯＨ（ｐＨ７．０〜８．０）、０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．０）。
【００３２】
２．ｐＨ安定性
ｐＨ４．０〜１０．０までの各緩衝液に酵素液を加え、４℃で２４時間放置した後、ｐＨを５．５に戻し、３７℃で可溶化馬鈴薯デンプンを基質として残存活性を測定した。用いた緩衝液は以下に示すとおりである。０．１Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＯＯＮａ（ｐＨ４．０〜６．０）、０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．０〜９．０）、０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ１０．０）。
【００３３】
結果
可溶化馬鈴薯デンプンに対する最適作用ｐＨは生デンプン分解酵素Ｉ及び生デンプン分解酵素ＩＩ共に５．５であった（図１０Ａ）。ｐＨ安定性に関しては、生デンプン分解酵素ＩはｐＨ７〜９まで、生デンプン分解酵素ＩＩは７〜８まで安定であった（図１０Ｂ）。
【実施例６】
【００３４】
本発明の生デンプン分解酵素活性に対する金属イオンの影響
０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）８０μｌに、１０Ｕ／ｍｌ酵素液１０μｌ、１０ｍＭ金属イオン溶液１０μｌを加え、４℃で２４時間放置した後、これを酵素液として、ｐＨ５．５、３７℃で、可溶化馬鈴薯デンプンを基質としてアミラーゼ活性を測定し、金属イオンに対する影響を調べた。
【００３５】
結果
１ｍＭの金属イオンの存在下で、４℃で２４時間インキュベートした後の残存活性を調べたところ、表２に示すような結果が得られた。Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｈｇ２＋によって生デンプン分解酵素Ｉ、生デンプン分解酵素ＩＩの活性は阻害を受けることが分かる。また、一般的にアミラーゼの安定化に関与すると言われているＣａ２＋の存在下では、両者の活性はコントロールに比べてわずかであるが、上昇した。また生デンプン分解酵素ＩはＡｌ３＋、Ｍｇ２＋の存在によって活性化もしくは安定化されたことが分かる。
【００３６】
【表２】
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【実施例７】
【００３７】
低温条件下での生デンプン加水分解率の測定
基質である米デンプンは、３度水で洗浄し、遠心分離後、凍結乾燥したものを使用した。０．４％生米デンプン１．０ｍｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）９８０μｌ、酵素液２００μｌ、２％アジ化ナトリウム２０μｌを含む反応液を３７℃でインキュベートし、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間の各時間で測定を行った。酵素は、シマミミズ由来生デンプン分解酵素（生デンプン分解酵素Ｉ、生デンプン分解酵素ＩＩ）、Ａ．ｏｒｙｚａｅ由来α−アミラーゼ（ＳＩＧＭＡ）、ブタ膵臓由来α−アミラーゼ（ＳＩＧＭＡ）をそれぞれ２Ｕ／ｍｌ（基質・可溶化馬鈴薯デンプン）に調製して用いた。
【００３８】
加水分解率（Ｒｄ）は以下の式により定義した。
Ｒｄ（％）  ＝  （Ａ１／Ａ０）×１００
ここで、Ａ１は反応後の遊離糖のモル濃度であり、Ａ０は反応前の生デンプンのモル濃度である。
【００３９】
結果
本発明の生デンプン分解酵素Ｉ及び生デンプン分解酵素ＩＩの生米デンプンに対する加水分解率を生デンプン分解能を有するブタ膵臓由来α−アミラーゼ（ＰＰＡ）（参考文献１４、１９）と、タカアミラーゼ（ＴＡＡ）を用いて比較した。（図１１）。本発明の生デンプン分解酵素Ｉは４日で３７％、生デンプン分解酵素ＩＩは４３．５％であった。これは一般的に生デンプンを分解するＰＰＡよりは若干劣っているが、同程度の加水分解能を有していると考えられる。本酵素は４℃でも、３７℃の３７％（生デンプン分解酵素Ｉ）、２０％（生デンプン分解酵素ＩＩ）の活性が維持されることから、低温条件下での利用が可能であると考えられる。
【実施例８】
【００４０】
低温条件下でのアミラーゼ活性
０．１ＭＣＨ３ＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＯＯＮａ緩衝液（ｐＨ６．０）中で、４℃と３７℃での可溶化馬鈴薯デンプンを基質としてアミラーゼ活性を比較した。
【００４１】
結果
４℃と３７℃での可溶化馬鈴薯デンプンに対する本発明の酵素のアミラーゼ活性の比較を行ったところ、生デンプン分解酵素Ｉでは４℃で３７℃の３６．８％、生デンプン分解酵素ＩＩでは２０．７％の活性が維持されていた（図１２Ａ、１２Ｂ）。
【００４２】
参考文献
（１）  ルシアノ  パスクアトロ  カネラス，ファビオ  ロペス  オリバーセ，アンナ  エル．オコロコヴァ−ファカンハ，アーノルド  ロチャ  ファカンハ（2002）,「ミミズコンポストから単離された腐植酸（Humic acids）はトウモロコシの根の伸長、横根の出現、及び細胞質膜のＨ＋−ＡＴＰアーゼ活性を増強する」, Plant Physiol. 130: 1951-1957 。
（２）  ノブヨシ  ナカジマ，ヒサシ  ミハラ，ヒロユキ  スミ（1993）,「ミミズ Lumbricus rubellus の強力なフィブリン分解酵素の特性決定」, Biosci. Biotech. Biochem., 57(10): 1726-1730。
（３）  ノブヨシ  ナカジマ，マナブ  スギモト，コウジ  イシハラ，カオル  ナカムラ，ヒロキ  ハマダ（1999）,「ミミズのセリンプロテアーゼの更なる特性決定、ペプチド基質に対する及び自己消化に対する切断特異性」, Biosci. Biotech. Biochem., 63(11): 2031-2033。
（４）  ジン  チャン，リ  リ，チェン  ウ，ロン−キアオ  ヘ（2003）,「アイセニア・フェティダ由来の固定化されたミミズフィブリン分解酵素ＩＩによるフィブリノーゲン及びプラズミノーゲンの加水分解」, Int. J. Biol. Macromolecules, 32: 165-171。
（５）  Ｓ．Ａ．ライネック，Ａ．Ｊ．ライネック（2004）,「ミミズにおける重金属遺伝毒性の生体マーカーとしてのコメット検定法」, Arch. Environ. Contam. Toxicol., 46: 208-215。
（６）  ピーター  Ｋ．ハンカード，クラウス  スヴェンドセン，ジュリアン  ライト，クレール  ウィーンバーグ，サマンサ  Ｋ．フィッシュウィック，デイヴィッド  Ｊ．スパージオン，ジェイソン  Ｍ．ウィークス（2004）,「化学分析の支援としてミミズの生体マーカーを用いた汚染土壌の生物学的評価」, Sci. Total Environ., 330: 9-20。
（７）  メアリー  アッペルホフ著（2002）,「だれでもできるミミズで生ごみリサイクル」合同出版。
（８）  佐原  みどり著（2002）,「生ごみを食べてもらうミミズ御殿の作り方」ＶＯＩＣＥ。
（９）  ミハエル  ソモギー (1952),「糖量測定について」, J.Biol.Chem., 195:19-23。
（１０）サイトウ  Ｎ (1973),「Bacillus Iicheniformis由来の好熱性細胞外α-アミラーゼについて」, Arch.Biochem.Biophys., 155:290-298。
（１１）日本生化学会編 (1992),「微生物実験法17」, 東京化学同人:36-37。
（１２）ブラッドフォード ＭＭ (1976),「タンパク質の色素結合原理を用いた迅速かつ高感度のタンパク定量方法」, Anal.Biochem., 72:248-254。
（１３）レムリー  U.K. (1980),「バクテリオファージT4の上部集合の際の構造タンパク質の分裂」, Nature(London) ,  227: 680-68。
（１４）ハルユキ  イエフジ，マリコ  チノ，ミヨシ  カトウ，ユズル  イイムラ(1996), 「酵母Criptococcus S-2株由来の生デンプン分解し熱に安定なα-アミラーゼの精製、特性決定、クローニングおよび配列決定」, Biochem.J., 318:989-996。
（１５）シンサク  ハヤシバ，ユウジ  テラモト，タケヒロ  イノウエ(1988),「Bacillus subtilis 65由来の生ポテトデンプン分解α-アミラーゼの生産と特性決定」, Apple.Environ.Microbiol., 
54(6): 1516-1522。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
シマミミズが生産する本発明の生デンプン分解酵素は生デンプンを含む廃棄物の処理に、特に低温での処理に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、シマミミズ由来の生デンプン分解酵素の精製スキームである。
【図２】図２は、ＤＥＡＥ  ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍによるシマミミズの生デンプン分解酵素の陰イオンクロマトグラフィーの結果である。
【図３】図３は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００による生デンプン分解酵素Ｉのゲルろ過クロマトグラフィーの結果である。
【図４】図４は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００による生デンプン分解酵素ＩＩのゲルろ過クロマトグラフィーの結果である。
【図５】図５は、ＢＵＴＹＬ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓによる生デンプン分解酵素Ｉの疎水クロマトグラフィーの結果である。
【図６】図６は、ＢＵＴＹＬ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓによる生デンプン分解酵素ＩＩの疎水クロマトグラフィーの結果である。
【図７】図７は、本発明の生デンプン分解酵素Ｉ及びＩＩのゲル電気泳動図である。
【図８】図８は、本発明の生デンプン分解酵素Ｉ及びＩＩによる生デンプンの分解産物のＴＬＣによる経時的分析の結果である。
【図９】図９は、本発明の生デンプン分解酵素Ｉ及びＩＩの酵素活性と安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明の生デンプン分解酵素Ｉ及びＩＩの酵素活性と安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明の生デンプン分解酵素Ｉ及びＩＩによる生デンプンに対する加水分解率を示す図である。
【図１２】図１２は、低温条件下における本発明の生デンプン分解酵素Ｉ及びＩＩの生デンプン加水分解率を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図７】
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【図８】
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【図１２】
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