(57)【要約】【課題】個体内で抗原特異的な制御性Ｔ細胞の分化誘導方法、及びそれに用いられる抗原特異的制御性Ｔ細胞の分化誘導剤を提供すること。【解決手段】対象とする抗原を認識するＴ細胞に対し、その野生型抗原と強さが異なるＴ細胞活性化能を有する変異型抗原を作成し、その変異型抗原が野生型抗原より「強い」Ｔ細胞活性化能を有する場合、脊椎動物個体の胸腺に変異型抗原を投与し、その変異型抗原が野生型抗原より「弱い」Ｔ細胞活性化能を有する場合、脊椎動物個体の末梢組織に変異型抗原を投与する。また、それらの変異型抗原を含有する薬剤を作製し、抗原特異的制御性Ｔ細胞の分化誘導剤とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト以外の脊椎動物個体において、抗原に特異的な制御性Ｔ細胞の分化を誘導する方法であって、
該抗原を認識するＴ細胞に対し、該抗原より強いＴ細胞活性化能を有する、該抗原の変異型抗原を作成する工程と、
前記脊椎動物個体の胸腺に該変異型抗原を投与する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
脊椎動物個体において、抗原に特異的な制御性Ｔ細胞の分化を誘導する誘導剤であって、
該抗原を認識するＴ細胞に対し、該抗原より強いＴ細胞活性化能を有する、該抗原の変異型抗原を含有することを特徴とする誘導剤。
【請求項３】
胸腺注射剤の形状であることを特徴とする請求項５に記載の誘導剤。
【請求項４】
ヒト以外の脊椎動物個体において、抗原に特異的な制御性Ｔ細胞の分化を誘導する方法であって、
該抗原を認識するＴ細胞に対し、該抗原より弱いＴ細胞活性化能を有する、該抗原の変異型抗原を作成する工程と、
前記脊椎動物個体の末梢組織に該変異型抗原を投与する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
前記末梢組織が、皮内または皮下であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
脊椎動物個体において、抗原に特異的な制御性Ｔ細胞の分化を誘導する誘導剤であって、
該抗原を認識するＴ細胞に対し、該抗原より弱いＴ細胞活性化能を有する、該抗原の変異型抗原を含有することを特徴とする誘導剤。
【請求項７】
皮下または皮内注射剤の形状であることを特徴とする請求項６に記載の誘導剤。
【請求項８】
異常または過剰な免疫応答による疾患の治療薬の作製方法であって、
前記疾患の原因となる抗原を同定する工程と、
該抗原より強いＴ細胞活性化能を有する、該抗原の変異型抗原を同定する工程と、
前記変異型抗原を胸腺に投与できる剤形にする工程と、
を含むことを特徴とする治療薬の作製方法。
【請求項９】
異常または過剰な免疫応答による疾患の治療薬の作製方法であって、
前記疾患の原因となる抗原を同定する工程と、
該抗原より弱いＴ細胞活性化能を有する、該抗原の変異型抗原を同定する工程と、
前記変異型抗原を末梢組織に投与できる剤形にする工程と、
を含むことを特徴とする治療薬の作製方法。
【請求項１０】
前記疾患が、自己免疫疾患あるいはアレルギー疾患、または抗原に対する過剰免疫反応であることを特徴とする請求項８または９に記載の治療薬の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原特異的制御性Ｔ細胞の分化誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常な免疫系は、異常あるいは過剰な免疫応答を抑制するために、免疫応答における負の制御機構を備えている。例えば、CD25＋CD4＋制御性Ｔ細胞（以下、制御性Ｔ細胞と称する）は、全身から除去されると様々な自己免疫疾患が発症することから、常時、自己抗原を認識し、自己免疫を抑制していると考えられている。また、制御性Ｔ細胞の除去によって誘導される炎症性腸炎が、腸内細菌に対する過剰免疫応答による可能性が指摘されていることから、制御性Ｔ細胞は、慢性感染症においては病原微生物に対する免疫応答を抑制していると考えられている（例えば、非特許文献１参照）。なお、制御性Ｔ細胞の起源については、少なくとも一部は胸腺で機能的に成熟した形で産生されるが、末梢でも、ナイーブＴ細胞から制御性Ｔ細胞が分化すると考えられている（例えば、非特許文献２参照）。
【非特許文献１】Koh WP, Chan E, Scott K, McCaughan G, France M, Fazekas de St Groth B. Journal of Immunology, Jun 15;162(12):7208-16(1999)
【非特許文献２】S. Sakaguchi, Annual Review of Immunology, 22:531-62 (2004), S. Liang, P. Alard, Y. Zhao, S. Parnell, S. Clark, M. Kosiewicz, et al. Journal of Experimental Medicine, vol. 201, no.1, pp127-137 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
異常あるいは過剰な免疫応答による疾患（例えば、自己免疫疾患やアレルギー性疾患、過剰免疫応答によるショック等）の治療には、副腎皮質ステロイドのような免疫抑制剤が用いられているが、その場合の免疫抑制は全身性で、非特異的である。
【０００４】
そこで、本発明は、個体内で抗原特異的な制御性Ｔ細胞の分化誘導方法、及びそれに用いられる抗原特異的制御性Ｔ細胞の分化誘導剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的に鑑み、発明者らは、個体内で抗原特異的な制御性Ｔ細胞の分化を誘導するために、その抗原をそのままの形で個体内に投与したが、制御性Ｔ細胞の分化を効率的に誘導できなかった。そこで、鋭意努力の結果、野生型抗原のアミノ酸配列を変えたペプチドを合成し、そのＴ細胞活性化能をin vitroで測定することによって、もとの野生型抗原と異なるＴ細胞活性化能を有する変異型抗原を作成し、制御性Ｔ細胞の分化誘導をアッセイしたところ、変異型抗原によって適切な場所に投与することにより、その抗原特異的に制御性Ｔ細胞の分化を誘導できることが明らかになり、本発明の完成に至った。
【０００６】
このように、本発明の抗原特異的制御性Ｔ細胞の分化誘導方法は、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物個体において、抗原に特異的な制御性Ｔ細胞の分化を誘導する方法であって、該抗原を認識するＴ細胞に対し、該抗原より「強い」Ｔ細胞活性化能を有する、該抗原の変異型抗原を作成する工程と、前記脊椎動物個体の胸腺に該変異型抗原を投与する工程と、を含むことを特徴とする。
【０００７】
また、該抗原を認識するＴ細胞に対し、該抗原より「弱い」Ｔ細胞活性化能を有する、該抗原の変異型抗原を作成する工程と、前記脊椎動物個体の末梢組織に該変異型抗原を投与する工程と、を含んでもよい。
【０００８】
本発明の抗原特異的制御性Ｔ細胞の分化誘導剤は、脊椎動物個体において、抗原に特異的な制御性Ｔ細胞の分化を誘導する誘導剤であって、該抗原を認識するＴ細胞に対し、該抗原より強いまたは弱いＴ細胞活性化能を有する、該抗原の変異型抗原を含有することを特徴とする。前記誘導剤が該抗原より強いＴ細胞活性化能を有する場合、胸腺注射剤の形状であることが好ましく、前記誘導剤が該抗原より弱いＴ細胞活性化能を有する場合、皮下または皮内注射剤の形状であることが好ましい。
【０００９】
さらに、本発明にかかる、異常または過剰な免疫応答による疾患の治療薬の作製方法は、前記疾患の原因となる抗原を同定する工程と、該抗原より強いＴ細胞活性化能を有する、該抗原の変異型抗原を同定する工程と、該変異型抗原を胸腺に投与できる剤形にする工程と、を含むことを特徴とする。あるいは、前記疾患の原因となる抗原を同定する工程と、該抗原より弱いＴ細胞活性化能を有する、該抗原の変異型抗原を同定する工程と、前記変異型抗原を末梢組織に投与できる剤形にする工程と、を含んでもよい。ここで、前記疾患が、自己免疫疾患、アレルギー疾患、または抗原に対する過剰免疫反応であってもよい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、個体内で抗原特異的な制御性Ｔ細胞の分化誘導方法、及びそれに用いられる抗原特異的制御性Ｔ細胞の分化誘導剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、 J. Sambrook, E. F. FriＴsch & Ｔ. ManiaＴis (Ed.), Molecular Cloning, A LaboraＴory Manual (3rd ediＴion), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) や、 F. M. Ausubel, R. BrenＴ, R. E. KingsＴon, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. SmiＴh, K. SＴruhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons LＴd.や、 Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons LＴd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれらを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１２】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１３】
＝＝抗原特異的制御性Ｔ細胞誘導方法Ｉ＝＝
本実施の形態では、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物個体において、抗原を認識するＴ細胞に対し、その野生型抗原より「強い」Ｔ細胞活性化能を有する、その抗原を由来とする変異型抗原を作成し、個体の胸腺に変異型抗原を投与する。これにより、注入した個体において、抗原特異的な制御性Ｔ細胞の分化を誘導することができる。
【００１４】
この方法において、対象となる抗原は、例えば、糖、タンパク質、ペプチド、それらの複合体、またはウイルスや細胞など、特に限定されない。また、抗原提示細胞に取り込まれた抗原がプロセシングにより断片化され、細胞膜上に提示される抗原ペプチドが明らかになっている場合、その抗原ペプチド自体を抗原として用いてもよい。その抗原より強いＴ細胞活性化能を有する変異型抗原を作製するには、例えば以下のようなスクリーニングを行う。
【００１５】
まず、抗原のアミノ酸配列に１個または数個またはそれ以上のアミノ酸を置換した変異型抗原ライブラリーを作製する。これは、様々に変異を導入したアミノ酸配列を有する抗原ペプチドを化学合成によって合成してもよく、また、抗原をコードずるＤＮＡに対し、ランダムに変異を導入した変異ＤＮＡを発現させて得られる蛋白質またはペプチドをライブラリーとしてもよい。この変異型抗原ライブラリーを用いて、野生型抗原より強いＴ細胞活性化能を有する変異型抗原をスクリーニングする。このスクリーニングには、通常のＴ細胞の細胞分裂増殖をみる方法、例えば細胞数計測、3H-thymidineや、Ｔ細胞の蛍光標識ラベルを用いたproliferation assay、またはインターフェロンgやIL-2などのサイトカイン産生の評価、またはＴ細胞表面のCD69、CD44、CD25などの活性化マーカーの発現量を指標として、各変異型抗原をアッセイすることにより、野生型抗原より強いＴ細胞活性化能を有する変異型抗原を得ることができるが、スクリーニング方法としては特定のアッセイ系に限定されない。ここで、CD4+CD25+制御性Ｔ細胞のマーカーとしては、特異性の面から、Foxp3の発現を指標とするのが好ましい。
【００１６】
なお、野生型抗原より強いＴ細胞活性化能を有する変異型抗原とは、例えば、上記のin vitroアッセイにおいて、同じ量でより多くのＴ細胞を分裂増殖、またはより多くのサイトカイン産生、またはより高いＴ細胞表面活性化マーカーの発現をさせるような抗原のことである。この変異型抗原を用いて、もとの野生型抗原に特異的な制御性Ｔ細胞を分化誘導させるためには、変異型抗原由来の抗原ペプチドと主要組織適合抗原の複合体が、親和性の強弱に拘らず、目的のＴ細胞受容体に認識されることが可能な変異でなければならない。
【００１７】
こうして得られた変異型抗原を、生理食塩水またはリン酸緩衝液など適切な溶媒に溶解し、脊椎動物個体の胸腺に投与する。投与方法は特に限定されないが、注射などによる注入であることが好ましい。投与時に、何らかの免疫活性物質、アジュバント等とともに投与しても良い。投与量及び投与回数などは、目的により適宜選択可能である。
【００１８】
＝＝抗原特異的制御性Ｔ細胞誘導方法ＩＩ＝＝
本発明によると、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物個体において、抗原を認識するＴ細胞に対し、その野生型抗原より「弱い」Ｔ細胞活性化能を有する、その抗原を由来とする変異型抗原を作成し、個体の末梢組織、例えば皮内または皮下に変異型抗原を投与する。これにより、注入した個体内で、抗原特異的な制御性Ｔ細胞の分化を誘導することができる。
【００１９】
なお、変異型抗原の作成方法、及び野生型抗原より弱いＴ細胞活性化能を有する変異型抗原の選択方法は、Ｉと同様に行うことができる。
【００２０】
ここで、野生型抗原より弱いＴ細胞分化誘導能を有する変異型抗原とは、例えば、Iに記したin vitroアッセイにおいて、同じ量でより少ないＴ細胞を分裂増殖、またはより少ないサイトカイン産生、またはより低いＴ細胞表面活性化マーカーの発現をさせるような抗原のことである。この変異型抗原を用いて、もとの野生型抗原に特異的な制御性Ｔ細胞を分化誘導させるためには、変異型抗原由来のペプチドと主要組織適合抗原による複合体が、親和性の強弱に拘らず、目的のＴ細胞受容体に認識される範囲の変異でなければならない。
【００２１】
得られた変異型抗原は、生理食塩水またはリン酸緩衝液など適切な溶媒に溶解し、末梢組織に投与する。末梢組織としては、皮内または皮下が好ましいが、特に限定されない。投与方法も特に限定されないが、注射による注入であることが好ましい。投与時に、何らかの免疫活性物質、アジュバント等とともに投与しても良い。投与量及び投与回数などは、目的により適宜選択可能である。
【００２２】
＝＝抗原特異的な制御性Ｔ細胞の誘導剤＝＝
本発明にかかる抗原特異的な制御性Ｔ細胞の誘導剤は、上記変異型抗原を含有する。
【００２３】
この誘導剤には、製剤設計上必要な添加剤として、防腐剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、吸収促進剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の各種の公知物質を適宜配合してもよい。添加剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、パラベン類（メチルパラベン、エチルパラベン等）、チメロサール等の真菌及び細菌に有効な防腐剤、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−キシリトール、グリセリン、ブドウ糖、マルトース、ショ糖、プロピレングリコール等の多価アルコール類や塩化ナトリウム等の等張化剤、トコフェロール、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、システイン等の安定化剤が挙げられる。
【００２４】
剤型としては、特に限定されないが、注射剤が好ましく、例えば、溶液性注射剤、乳濁性注射剤、又は固形注射剤等が挙げられる。
【００２５】
また、本剤は、剤形化のため、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤等を含んでいてもよい。例えば液剤の場合、担体としては、精製水（滅菌水）又は生理学的緩衝液、等張液等が挙げられるが、グリコール、グリセロール、オリーブ油のような有機エステル等を使用してもよい。
【００２６】
将来的にはDNA製剤として、DNA製剤をそのまま、または電気的な組織内導入法、リポソームを用いた注射、または金粒子にcoatingしてGene gunを用い、皮膚や筋肉、内臓に投与する方法も考えられる。
【００２７】
＝＝異常または過剰な免疫応答による疾患の治療薬＝＝
例えば、膠原病、慢性関節リウマチ、バセドー氏病などの自己免疫疾患やアレルギー疾患などは、特定の抗原に対する異常または過剰な免疫応答が原因となる。従って、その抗原を同定し、上記の方法でその抗原に対する特異的な制御性Ｔ細胞を誘導することにより、異常または過剰な免疫応答による疾患に罹患している患者に対して、疾患の原因となる異常または過剰な免疫応答を抑制し、その疾患を治療することができる。
【００２８】
また、同定した抗原に対して、上記の方法で抗原特異的な制御性Ｔ細胞の誘導剤を作製すると、その誘導剤は、その抗原に対する異常または過剰な免疫応答による疾患の治療薬として用いることができる。すなわち、対象とする疾患の原因となる抗原を同定し、その抗原より強いまたは弱いＴ細胞活性化能を有する変異型抗原を同定し、変異型抗原をそれぞれ胸腺または末梢組織に投与できる剤形にすることにより、その疾患の治療薬を作製することができる。
【００２９】
ここで、患者において、疾患の原因となる抗原を同定するのは、例えば、病変部位に浸潤しているリンパ球の認識抗原の解析、患者血中に増加が認められる抗体の認識抗原の解析、または病変部位や血液中で異常に増加している抗原を特定することなどにより可能になる。
【実施例】
【００３０】
＝＝野生型抗原及び変異型抗原＝＝
本実施例では、野生型抗原（アゴニスト）として、ＰＣＣ（pigeon cytochrome c、ハト・チトクロームＣ８８番残基〜１０４番残基）に対応する配列を有するペプチドを用いた。変異型抗原としては、野生型抗原より強いＴ細胞活性化能を有する変異型抗原として、ＭＣＣ(moth cytochrome c 、蛾・チトクロームＣ８８番残基〜１０３番残基)、ＭＣＣ／９７Ｆ（ＭＣＣの９７番アミノ酸置換体、スーパーアゴニスト）、野生型抗原より弱いＴ細胞活性化能を有する変異型抗原（以下、部分的アゴニストと称する）として、ＭＣＣ／Ｓ１０２及び自己由来の配列を持つ、ＭＯＣＣ(mouse cytochrome c、マウス・チトクロームＣ８８番残基〜１０４番残基)を用いた。更に、ＴＣＲに負のシグナルを送るとされる、更に弱い活性化能を有するペプチドである、ＭＣＣ／Ｇ１０２（ＭＣＣの１０２番アミノ酸置換体、アンタゴニスト）も用いた。各ペプチドの配列を以下に示す。  
ＭＣＣ／９７Ｆ：  ＡＮＥＲＡＤＬＩＡＦＬＫＱＡＴＫ  （配列番号１）
ＭＣＣ：          ＡＮＥＲＡＤＬＩＡＹＬＫＱＡＴＫ  （配列番号２）
ＰＣＣ：          ＫＡＥＲＡＤＬＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ（配列番号３）
ＭＣＣ／Ｓ１０２：ＡＮＥＲＡＤＬＩＡＹＬＫＱＡＳＫ  （配列番号４）
ＭＯＣＣ：        ＫＧＥＲＡＤＬＩＡＹＬＫＫＡＴＮＥ（配列番号５）
ＭＣＣ／Ｇ１０２：ＡＮＥＲＡＤＬＩＡＹＬＫＱＡＧＫ  （配列番号６）
【００３１】
各ペプチドのＴ細胞活性化能の強弱に関しては、以下のようにして確認した。  
PCC88-104に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を遺伝子導入した、5C.C7 TCRトランスジェニック（Ｔｇ）マウス（Seder, R.A., Paul, W.E., Davis, M.M. & Fazekas de St. Groth, B. J Exp Med 176, 1091-8 (1992)）由来のＴ細胞を、抗原提示細胞であるDCEKhi7(Ding, L., Linsley, P.S., Huang, L.-Y., Germain, R.N. & Shevach, E.M. J Immunol 151, 1224-34 (1993))の存在下に、野生型ペプチドまたは各変異型ペプチドを用いてin vitroで16時間刺激し、Ｔ細胞表面の活性化マーカーである、ＣＤ６９を抗体で染色し、フローサイトメトリーを用いてＣＤ６９を発現しているＴ細胞の割合を解析した。
【００３２】
図１に示すように、ＭＣＣ／９７Ｆ＞ＭＣＣ＞ＰＣＣ＞ＭＣＣ／Ｓ１０２＞ＭＯＣＣの順で、Ｔ細胞活性化能は弱くなった。一方、アンタゴニストと知られるＭＣＣ／Ｇ１０２においては、Ｔ細胞の活性化は殆ど認められなかった（Stefanova I, Dorfman JR, Germain RN. Nature. 2002 Nov 28;420(6914):429-34なども参照のこと）。
【００３３】
＝＝マウス＝＝
マウスは、5C.C7 TCRトランスジェニックマウス（Seder, R.A., Paul, W.E., Davis, M.M. & Fazekas de St. Groth, B. J Exp Med 176, 1091-8 (1992)）とＲＡＧ−２ノックアウトマウス (Shinkai, Y. et al. Science 259, 822-5 (1993))を交配させて、5C.C7 TCRのトランスジーンを有するＲＡＧ−２欠損マウス（以下、5C.C7 Tg x RAG2-/- マウスと表記する。）を作製した。5C.C7 Tg x RAG2-/- マウスは、遺伝子再構成活性化遺伝子（ＲＡＧ遺伝子）を完全に欠損しているため、本来有しているはずの成熟Ｔ細胞を欠くが、Ｔ細胞受容体のうち、ＰＣＣに対する特異的受容体である5C.C7 TCRのみが発現しているので、5C.C7 TCRが発現しているＴ細胞のみが存在する。
【００３４】
5C.C7 Tg x RAG2-/- マウスにおいては、5C.C7 TCRが発現しているＴ細胞以外のＴ細胞は存在せず、CD25＋CD4＋制御性Ｔ細胞が存在しないため、胸腺および末梢リンパ組織において、CD25＋CD4＋制御性Ｔ細胞由来のFoxp3の発現は検出されないことを、以下のＲＴ−ＰＣＲによって確認した（図２） 。
【００３５】
まず、5C.C7 Tg x RAG2-/- マウスから胸腺または末梢リンパ組織（リンパ節および脾臓）を単離し、細胞レベルに粉砕する。得られた細胞を、Miltenyi Biotec社のCD25＋CD4＋ regulatory T cell isolation kitを用いて、胸腺の場合はCD4＋細胞を、末梢リンパ組織の場合はCD25＋CD4＋細胞を単離した。こうして得られた細胞からIsogen reagent（ニッポンジーン社）を用いて全RNAを抽出し、SuperscriptII及びoligo(dT)12-18（InVitrogen社）を用いて、逆転写した。得られたｃDNAを鋳型とし、Taq DNA polymerase（Promega社）を用いて、以下の条件でPCRを行った。
【００３６】
まず、２．５分９４℃で変性後、その後９４℃  ３０秒−６１℃  ３０秒−７４℃  ３０秒のサイクルを３５回行ったなお、プライマーは、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。  
Foxp3-1：  ＣＡＧＣＴＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＣＣＣＣＴＡＧ  （配列番号７）
Foxp3-2：  ＣＡＴＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＴＡＧ      （配列番号８）
ポジティブコントロールとしては、以下のプライマーを用い、HPRT遺伝子断片を増幅させた。  
HPRT-1：ＧＴＴＧＧＡＴＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＴＴＧ（配列番号９）
HPRT-2：ＧＡＡＧＧＧＴＡＧＧＣＴＧＧＣＣＴＡＴＡＧＧＣＴ（配列番号１０）
【００３７】
図２に示したように、5C.C7 Tg x RAG2-/- マウスにおいては、胸腺（図２A）および末梢リンパ組織（図２B）において、CD25＋CD4＋制御性Ｔ細胞由来のFoxp3の発現は検出されなかった。なお、図２A及び図２Bのポジティブコントロール（PC）としては、野生型マウスを用いた。
【００３８】
なお、5C.C7 Tg x RAG2-/- マウスにおいて、抗マウスCD4、抗マウスCD25、抗マウスTCRb（以上、BD Pharmingen社）、抗マウスFoxp3抗体（eBioscience社）の各蛍光標識抗体を用い、CD25＋CD4＋制御性Ｔ細胞を105細胞あたり抗体0.1mg用いて染色し、Foxp3の発現が検出されないことを確認した。
【００３９】
＝＝ペプチドの胸腺への注入＝＝
上記配列番号１〜５を有するペプチド13.3 nmolを30 mlのPBSに混和し、麻酔した5C.C7 Tg x RAG2-/- マウスの胸骨上端を切開し、胸腺を目視できるようにした後、注射器を用いてペプチドを胸腺内に注射した後、切開部を閉じた。一週間後、末梢リンパ球を採取し、抗マウスCD4、抗マウスCD25、抗マウスTCRb（以上、BD Pharmingen社）、抗マウスFoxp3（eBioscience社）の各蛍光標識抗体を用いて染色し、FACSで解析した。なお、ポジティブコントロールとしては、野生型マウス（Ｂ１０．Ａ）、ネガティブコントロールとしては、5C.C7 Tgマウスを、未処理で用いた。
【００４０】
その結果、野生型ＰＣＣペプチドの胸腺注射では、CD25＋CD4＋Ｔ細胞の発生が殆ど  検出されず（図３Ｂ）、図３Ａに示すように、変異型ペプチドのＴ細胞活性化能が野生型より強くなると（ＭＣＣ及びＭＣＣ／９７Ｆの場合）、CD25＋CD4＋Ｔ細胞が野生型マウス（Ｂ１０．Ａ）より高頻度に発生した。また、図３Ｂに示すように、制御性Ｔ細胞特異的な蛋白質であるFoxp3も、ＭＣＣペプチドの胸腺内投与において誘導されたが、野生型ＰＣＣペプチドにおいては誘導を殆ど認めなかった。なお、図に示していないが、免疫染色により、ＭＯＣＣペプチドを用いた胸腺注射においても、制御性Ｔ細胞の発生は認められないことが確認された。
【００４１】
このことから、Ｔ細胞の活性化能が野生型抗原よりも「強い」変異型抗原を胸腺に投与することにより、その抗原特異的なCD25＋CD4＋制御性Ｔ細胞の分化を誘導できることが明らかになった。
【００４２】
＝＝ペプチドの皮下への注入＝＝
上記配列番号３〜６を有するペプチド50 nmolをPBS 250 mlに加え、 Incomplete Freunds adjuvant (IFA) 250 mlと十分に混和した後、この計500 mlを 5C.C7 Tg x RAG2-/- マウス一匹分として、四肢足底、尾根部、背部皮下に注射した。上と同様に、蛍光標識された各抗体を用い、CD25＋CD4＋制御性Ｔ細胞の発生をFACSで調べた。なお、ポジティブコントロールとしては、野生型マウス（Ｂ１０．Ａ）、ネガティブコントロールとしては、5C.C7 Tg x RAG2-/- マウスを、未処理で用いた。
【００４３】
図４に示すように、野生型ＰＣＣペプチドでは、CD25＋CD4＋Ｔ細胞の発生が殆ど検出されず（図４Ａ）、弱いＴ細胞活性化能をもつ変異型ペプチドであるＭＣＣ／Ｓ１０２（図４Ｃ）、ＭＯＣＣ（図４Ａ、Ｂ）の投与において、CD25＋CD4＋Ｔ細胞の発生が認められた。また、図４Ｂに示すように、ＭＯＣＣペプチドにより誘導されたCD25＋CD4＋Ｔ細胞において、制御性Ｔ細胞特異的蛋白質であるFoxp3の発現が認められた。一方、Ｔ細胞活性化能力が殆どない、アンタゴニストペプチドであるＭＣＣ／Ｇ１０２の投与においては、CD25＋CD4＋Ｔ細胞の発生は認めなかった（図４Ｃ）。
【００４４】
このことから、部分的アゴニストのような、野生型抗原より弱いＴ細胞の活性化能を有する変異型抗原を、皮下のような末梢組織に投与することにより、その野生型抗原特異的なCD25＋CD4＋制御性Ｔ細胞の分化を誘導できることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の実施例において、ＭＣＣ／９７Ｆ、ＭＣＣ、ＰＣＣ、ＭＣＣ／Ｓ１０２、ＭＯＣＣの各ペプチドのT細胞活性化の強さを示すグラフである。
【図２】本発明の実施例において、未処理の5C.C7 Tg x RAG2-/- マウスの胸腺（図２Ａ）のCD4＋細胞、および末梢リンパ組織（図２Ｂ）のCD25＋CD4＋Ｔ細胞におけるFoxp3の発現をRT-PCRで調べた図である。
【図３Ａ】本発明の実施例において、ＭＣＣ／９７Ｆ、ＭＣＣ、ＭＣＣ／Ｓ１０２の各ペプチドを5C.C7 Tg x RAG2-/- マウスの胸腺に注射したときの、CD25＋CD4＋制御性Ｔ細胞の発生を調べた図である。
【図３Ｂ】本発明の実施例において、ＭＣＣ及びＰＣＣの各ペプチドを5C.C7 Tg x RAG2-/- マウスの胸腺に注射したときの、CD25＋CD4＋Ｔ細胞の発生、およびCD4+T細胞におけるFoxp3の発現誘導を調べた図である。
【図４Ａ】本発明の実施例において、ＰＣＣ、ＭＯＣＣの各ペプチドを5C.C7 Tg x RAG2-/- マウスの皮下に注射したときの、CD25＋CD4＋制御性Ｔ細胞の発生を調べた図である。
【図４Ｂ】本発明の実施例において、ＭＯＣＣペプチドを5C.C7 Tg x RAG2-/- マウスの皮下に注射したときの、CD25＋CD4＋Ｔ細胞の発生、およびCD4+T細胞におけるFoxp3の発現誘導を調べた図である。
【図４Ｃ】本発明の実施例において、ＭＣＣ／Ｓ１０２、ＭＣＣ／Ｇ１０２の各ペプチドを5C.C7 Tg x RAG2-/- マウスの皮下に注射したときの、CD25＋CD4＋制御性Ｔ細胞の発生を調べた図である。
【図１】
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【図３Ａ】
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【図２】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【配列表】
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