(57)【要約】【課題】  タンパク質を大希釈しなくてもよく、また従来よりもリフォールディング効果の高く、かつ、高純度のタンパク質を大量に得ることができる、生産性の高いタンパク質のリフォールディング方法およびそれに使用する多孔体を提供する。【解決手段】  アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディングに使用される、一般式（１）で示される基を担持した修飾多孔体（Ａ）、該修飾多孔体を用いてリフォールディングする工程を含む、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング方法、該リフォールディング方法でリフォールディングする工程を含むタンパク質の産生方法、並びに該産生方法で得られたタンパク質である。【化５】2007204403.tif 000007【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディングに使用される、一般式（１）で示される基を担持した修飾多孔体（Ａ）。
【化１】
2007204403.tif 000006
【請求項２】
シリカ、アルミナ、チタニア、マグネシア、ジルコニア、ゼオライトおよび合成樹脂架橋体からなる群から選ばれる１種以上からなる多孔体（Ａ0）に、一般式（１）で示される基を有する化合物（ａ）を用いて、一般式（１）で示される基を化学的に担持させて得られる請求項１記載の修飾多孔体。
【請求項３】
化合物（ａ）が、多孔体（Ａ0）の表面の官能基と反応する基および一般式（１）で示される基を１分子中に有する化合物（ａ１）である請求項２記載の修飾多孔体。
【請求項４】
化合物（ａ１）が、リン原子含有チタネートカップリング剤である請求項３記載の修飾多孔体。
【請求項５】
多孔体（Ａ0）をシランカップリング剤と予め反応させた後、シランカップリング剤の残基と反応性を有し、かつ一般式（１）で示される基を有する化合物（ａ２）とを反応させて得られる請求項２記載の修飾多孔体。
【請求項６】
化合物（ａ２）が、リン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、アデノシン３リン酸、アデノシン２リン酸、アデノシン１リン酸および無水リン酸からなる群から選ばれる１種以上である請求項５記載の修飾多孔体。
【請求項７】
修飾多孔体（Ａ）が、多孔体（Ａ0）を一般式（１）で示される基を有するビニル単量体でグラフト重合することによって得られるグラフト重合体である請求項２記載の修飾多孔体。
【請求項８】
修飾多孔体（Ａ）が、一般式（１）で示される基を有するビニル単量体および架橋性ビニル単量体を必須構成単量体としてなる架橋共重合体である請求湖１記載の修飾多孔体。
【請求項９】
シリカ、アルミナ、チタニア、マグネシア、ジルコニア、ゼオライトおよび合成樹脂架橋体からなる群から選ばれる１種以上からなる多孔体（Ａ0）を、物理的に担持させて得られる請求項１記載の修飾多孔体。
【請求項１０】
１〜８，０００μｍの平均粒子径を有する粒状物である請求項１〜９のいずれか記載の修飾多孔体。
【請求項１１】
３０ｍ2／ｇ以上のＢＥＴ比表面積を有する請求項１〜１０のいずれか記載の修飾多孔体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか記載の修飾多孔体、並びに界面活性剤（Ｂ）およびｐＨ調整剤（Ｃ）、タンパク安定化剤（Ｄ）および水からなる群から選ばれる１種以上を構成材料としてなるタンパク質用のリフォールディングキット。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか記載の修飾多孔体を充填剤として充填されてなるタンパク質のリフォールディング用カラム。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか記載の修飾多孔体を用いてリフォールディングする工程を含む、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング方法。
【請求項１５】
請求項１４記載のリフォールディング方法でリフォールディングする工程を含むタンパク質の産生方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の産生方法で得られたタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質のリフォールディングに使用される修飾多孔体およびリフォールディング方法に関し、詳しくはアンフォールディングされたタンパク質を活性のあるタンパク質構造へと巻き戻すために使用される修飾多孔体、リフォールディングキットおよびリフォールディング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の機能・構造の解明・解析は、例えば、病気の治療や創薬に直結し、極めて重要である。このため、種々のタンパク質を様々な方法で合成・生産し、それらの構造を調べ、生体内における作用機構と役割を解明することが活発に行われている。そして、今や、タンパク質の機能は、それらを構成するアミノ酸の配列・鎖長のみならず、それらの取る秩序だった立体構造（高次構造）によって決まることは周知のこととなっている。
【０００３】
工業的にも、遺伝子工学の発展により、さまざまなタンパク質を組換え体として大量に調製し、医薬品製造や食品加工、臨床診断等の多岐にわたる産業に利用されてきた。ベクター技術の開発によって大腸菌や酵母の菌体内で、標的とするタンパク質を大量に産生させる技術が、少ない資源で簡単に再現性良く実行できるようになってきた。
しかし、組換え体で発現させたタンパク質の多くは立体構造に秩序が無く、高次構造が制御されておらず、不活性な封入体（インクルージョンボディ）と呼ばれる小粒子顆粒を形成することが多い。このため、大腸菌による生産プロセスでは、インクルージョンボディを解きほぐし（アンフォールディング）、高次構造を整え、秩序だった立体構造を持つ可溶性タンパク質に変換する操作、すなわち、インクルージョンボディをアンフォールディングし、さらにリフォールディング（巻き戻し）することが必要である。
【０００４】
この種のリフォールディングは、大腸菌や酵母による生産タンパク質のみならず、熱履歴等の、ある種の原因で失活したタンパク質の再生にも応用でき、極めて重要な技術である。したがって、従来から、このリフォールディングは盛んに研究され、種々の方法が提案されているが、それらのほとんどは、リフォールディング効果が低いうえに、ある限定されたタンパク質（特に、分子量の低い特定タンパク質）に対して偶発的に好ましい結果が得られたに過ぎないことが多く、現在、このリフォールディングは、種々のタンパク質に適用可能な、一般性、普遍性のある、しかも、リフォールディング効果の高い効率的で経済的な方法とはなっていない。
【０００５】
古くから良く用いられているリフォールディング操作は透析法と希釈法である。  透析法は、透析に供することで予め添加されたタンパク質変性剤（アンフォールディング剤：例えば塩酸グアニジンおよび／または尿素など）を徐々に希釈して緩衝液等に置き換え、機能のある蛋白質立体構造へとリフォールディングする方法である。本方法の応用例として、タンパク質変性剤濃度を、さらにゆっくりと減少させることで、機能のあるタンパク質立体構造へのリフォールディングの収率を上げる段階的希釈法が知られている
（例えば、非特許文献１）。
しかし、透析法は、外液にタンパク質溶液の百倍以上の容積が通常必要になり、また数日の時間を必要とするので、産業上実用的ではない。
【０００６】
希釈法は、透析法と比べて比較的短時間で終わり、容積も比較的少なくて済むので広く用いられている。希釈法は、タンパク質変性剤（アンフォールディング剤）を加えたアンフォールディングされたタンパク質溶液を、緩衝液などで過剰に希釈することで、アンフォールディング状態から機能のあるタンパク質立体構造へとタンパク質をリフォールディングする方法である。希釈法は簡便で低コストの方法であるが、リフォールディングの収率が悪く（例えば、非特許文献２）、大希釈をするので収量が少ないのが現状である。
【０００７】
透析法と希釈法以外では、リフォールディングに吸着分離カラムを用いることも試されている。尿素・塩酸グアニジンでアンフォールディングさせたタンパク質やチオレドキシンをゲル濾過にかけると、ゲル濾過中にそのリフォールディングが起こる（非特許文献３）。しかし、この方法では、リフォールディング率は必ずしも十分ではなく、しかも他のタンパク質でも満足できる結果が得られない。構造が壊れたタンパク質のリフォールディングを促進するタンパク質の一種である分子シャペロンＧｒｏＥＬを固定したカラムに、８Ｍの尿素で可溶化したタンパク質を吸着させ、塩化カリウムと尿素をそれぞれ２Ｍ含む溶液で溶離すると、溶離タンパク質のリフォールディングが起こることも報告されている（非特許文献４）。しかし、これらは、Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  Ａ等、極めて限られたタンパク質で認められているに過ぎない。分子シャぺロンを用いる場合は、それがある種の鋳型であるために、その鋳型の形に適合しないものではまったく役に立たないというのが実情である。
【０００８】
カラム上の固定物質として、リフォールディングを促進するタンパク質の代わりに金属キレートを用いる場合もある。ニッケルキレートを固定した樹脂に、塩酸グアニジンと尿素を含む水溶液でアンフォールディングしたＨｉｓ６−タグ融合タンパク質を吸着させ、アンフォールディング剤を含まない緩衝溶液で洗うと、該融合タンパク質のリフォールディングが起こる（非特許文献５）。しかし、この方法はＨｉｓ６−タグタンパク質に限られることと、樹脂の調製が煩雑でコスト高となるという問題点がある。
【０００９】
人工の分子シャペロンとして、β−シクロデキストリンやシクロアミロースを用い、このシャペロン溶液に界面活性剤でアンフォールディングしたタンパク質を混ぜると、界面活性剤のシャペロンによる取り込み除去が生じ、この過程でタンパク質がリフォールディングするとの報告（非特許文献６〜８）もある。しかし、この方法は、特定のタンパク質（ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ  Ｂ  等）で成功しているに過ぎない。しかも、繰り返し行える方法ではなく、高コストである。
【非特許文献１】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ｍａｒ  １４；２７８（１１）：８９７９−８９８７．
【非特許文献２】Ｊ  ＩｍＭｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９８  Ｏｃｔ  １；２１９（１−２）：１１９−１２９．
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６（１９８７）３１３５−３１４１
【非特許文献４】Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９４（１９９７）３５７６−３５７８
【非特許文献５】Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｎｅｗｓ（Ｊａｐａｎ  Ｅｄ．）Ｖｏｌ．３（２００１）６−７
【非特許文献６】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  Ｖｏｌ．１１７（１９９５）２３７３−２３７４
【非特許文献７】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．２７１（１９９６）３４７８−３４８７
【非特許文献８】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  Ｖｏｌ．４８６（２０００）１３１−１３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上のように、さまざまなリフォールディング方法が提案されてきているが、アンフォールディングされたタンパク質をリフォールディングする際に、依然としてタンパク質を大希釈することによる収量の低下や、純度が低いといった課題、さらには適用できるタンパク質の種類が限定されるという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは以上の問題点を解決するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明はアンフォールディングされたタンパク質のリフォールディングに使用される、一般式（１）で示される基を担持した修飾多孔体（Ａ）；該修飾多孔体を必須構成材料としてなるリフォールディングキット；該修飾多孔体を充填剤として充填されてなるリフォールディング用カラム；該修飾多孔体、該リフォールディングキットまたは該リフォールディング用カラムを用いてリフォールディングする工程を含むリフォールディング方法；該リフォールディング方法でリフォールディングする工程を含むタンパク質の産生方法；および該産生方法で得られたタンパク質である。
【００１２】
【化２】
2007204403.tif 000002
【発明の効果】
【００１３】
本発明の修飾多孔体（Ａ）を用いるリフォールディング方法は、タンパク質を大希釈しなくてもよいので従来よりも生産性が飛躍的に向上する。、また従来よりもリフォールディング効果が高いため、高純度のタンパク質を大量に得ることができる。さらに形態が固体であることから分離精製が容易になるといった効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の修飾多孔体（Ａ）はアンフォールディングされたタンパク質のリフォールディングに使用されるものであり、一般式（１）で示される基を担持した修飾多孔体（Ａ）である。
【００１５】
【化３】
2007204403.tif 000003
【００１６】
一般式（１）におけるＰ＝Ｏはリン酸、ポリリン酸およびその誘導体などに含まれるリン原子と酸素原子の結合である。
また、一般式（１）において、リン原子のＰ＝Ｏ以外の残りの３価のそれぞれが結合する原子は特に限定されず、本発明のリフォールディング効果を発揮できる。
一般式（１）の基は、残りの３価のそれぞれが結合する原子まで記載すると、例えば下記一般式の基が挙げられる。
【００１７】
【化４】
2007204403.tif 000004
【００１８】
本発明の修飾多孔体（Ａ）は、多孔体（Ａ0）の微細孔の表面に、一般式（１）で示される基を直接またはその他の基を介在して化学的または物理的に担持している。
なお、以下において、一般式（１）で示される基を担持する前の多孔体を単に「多孔体（Ａ0）」と表現し、担持した後の多孔体を単に「修飾多孔体（Ａ）」と表現する。
【００１９】
多孔体（Ａ0）としては、無機多孔体および有機多孔体が挙げられる。
無機多孔体としては、通常の無機多孔体が使用でき、無機多孔体を構成する無機成分としては、シリカ、アルミナ、チタニア、マグネシア、ジルコニア、窒化珪素、炭化珪素およびゼオライトからなる群から選ばれる１種以上が挙げられ、好ましくはシリカ、アルミナ、チタニア、マグネシアおよびジルコニアからなる群から選ばれる１種以上である。
シリカからなる無機多孔体としてはシリカゲル；アルミナからなる無機多孔体としてはアルミナゲルなど；シリカおよびアルミナからなる無機多孔体としてはゼオライトなど；その他の無機多孔体としては吸着剤として市販されている「キョーワード」（協和化学（株）製）、ベントナイト、ヒドロキシアパタイトリン酸カルシウムゲルおよび珪藻土など；が挙げられ、リフォールディング効果の観点から好ましいものは、シリカゲル、アルミナゲル、ゼオライトおよび「キョーワード」である。
【００２０】
有機多孔体としては、合成樹脂から構成される通常の有機多孔体が使用できる。
有機多孔体を構成する合成樹脂としては、ビニル樹脂、フェノール樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリアミド樹脂およびシリコン樹脂など、多孔質にできる樹脂であれば特に限定されない。好ましいのは、多孔体が合成しやすく、かつ表面が修飾しやすいという観点から、ビニル樹脂である。
ビニル樹脂の合成に使用できるビニル単量体としては、芳香族単量体（スチレン、ヒドロキシスチレン、安息香酸ビニル、ビニルトルエンおよびジビニルベンゼンなど）、（メタ）アクリル酸エステル（メタクリル酸、アクリル酸、メタクリル酸ヒドロキシアルキルエステル、アクリル酸ヒドロキシアルキルエステル、メタクリル酸アルキルエステルおよびアクリル酸アルキルエステルなど）およびアクリロニトリルなどの他に、特開２００４−１２４０８０号公報のｐ５〜ｐ１０に記載のビニル単量体が使用できる。
【００２１】
ビニル樹脂のうち好ましいのは、表面が修飾しやすいという観点から、ヒドロキシスチレン、メタクリル酸、アクリル酸、メタクリル酸ヒドロキシアルキルエステルおよびアクリル酸ヒドロキシエステルなど、官能基を有する単量体を構成単量体の少なくとも一部に含むビニル樹脂であり、さらに好ましいのは、不溶性の樹脂にするために、架橋性ビニル単量体、たとえばジビニルベンゼン、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレートおよびジペンタエリスリトールペンタもしくはヘキサ（メタ）アクリレートなどを少量使用して製造された架橋ビニル樹脂である。
【００２２】
多孔体（Ａ0）のうち、リフォールディング効果の観点から好ましいのは、シリカ、アルミナ、チタニア、マグネシア、ジルコニアおよびビニル樹脂からなる群から選ばれる１種以上からなる多孔体である。
【００２３】
多孔体（Ａ0）は通常は粒状物であり、その形状としては、不定形粒子、球状粒子またはペレット状などが挙げられる。
これらのうち球状粒子およびペレット状、特に球状粒子が、取り扱いが簡単な点で好ましい。
【００２４】
多孔体（Ａ0）の粒径は、平均粒子径（ｄ５０：メディアン径）として、好ましくは１〜８,０００μｍ、さらに好ましくは１０〜６，０００μｍ、特に好ましくは４０〜５００μｍである。１μｍ以上にすることで取り扱いが容易になり、８,０００μｍ以下がリフォールディング効果の面で好ましい。本発明におけるｄ５０はＪＩＳ Ｋ１１５０に規定される粒度分布測定法において測定できる。
【００２５】
多孔体（Ａ0）の比表面積は、ＢＥＴ比表面積として、好ましくは３０ｍ2／ｇ以上、さらに好ましくは５０〜１，５００ｍ2／ｇ、特に好ましくは１００〜８００ｍ2／ｇである。３０ｍ2／ｇ以上であることが、リフォールディング効果が高いという観点で好ましい。本発明におけるＢＥＴ比表面積はＪＩＳ Ｋ１１５０に規定される比表面積測定法により測定できる。
【００２６】
多孔体（Ａ0）に、一般式（１）で示される基を担持させる方法としては、化学的方法と物理的方法の２種の方法がある。
【００２７】
これらのうちで、一般式（１）で示される基がリフォールディング工程で脱離しにくいという観点から、好ましいのは化学的方法である。
化学的方法には以下の方法が挙げられる。
【００２８】
（ｉ）：多孔体（Ａ0）の表面の官能基と反応する基および一般式（１）で示される基を１分子中に有する化合物（ａ１）で、多孔体（Ａ0）を化学的に修飾する。
【００２９】
（ｉｉ）：多孔体（Ａ0）を、一般式（１）で示される基を有しないカップリング剤（好ましくはシランカップリング剤）と予め反応させた後、カップリング剤の残基と反応性を有し、かつ一般式（１）で示される基を有する化合物（ａ２）と反応させて、多孔体（Ａ0）を化学的に修飾する。
【００３０】
（ｉｉｉ）：多孔体（Ａ0）を一般式（１）で示される基を有するビニル単量体（ａ３）
でグラフト重合する。
【００３１】
（ｉｖ）：一般式（１）で示される基を有するビニル単量体（ａ３）および架橋性ビニル単量体を必須構成単量体としてなる架橋共重合体を製造する。
【００３２】
以下に、（ｉ）〜（ｉｖ）を順に説明する。
【００３３】
（ｉ）の方法における化合物（ａ１）としては、多孔体（Ａ0）の表面の水酸基またはカルボキシル基などと反応する基と一般式（１）で示される基を１分子中に有するカップリング剤、例えばリン原子含有チタネートカップリング剤が挙げられる。
リン原子含有チタネートカップリング剤としては、例えば、モノアルコキシ・ピロフォスフェートタイプ［例えば、イソプロピル・トリ（ジオクチルフォスフェート）チタネート：Ｋｅｎｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ社「ＫＲ−３８Ｓ」など］；配位タイプ［例えば、テトライソプロピル・ジ（ジオクチルピロフォスファイト）チタネート：Ｋｅｎｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ社「ＫＲ−４１Ｂ」など］；およびキレート１００−オキシアセテート−２官能タイプ［例えば、チタニウム・ジ（ジオクチルピロフォスフェート）オキシアセテートなど］が挙げられる。
これらのリン原子含有チタネートカップリング剤と多孔体（Ａ0）との反応は、通常、温度３０〜８０℃、反応時間２〜２０時間で反応させて進行させることができる。
【００３４】
（ｉｉ）の方法におけるカップリング剤としては、多孔体（Ａ0）の表面の官能基である水酸基またはカルボキシル基などと反応性の高い官能基（ｂ’）を一端に有し、他端には前記一般式（１）で示される基をその後の工程で導入することができる官能基（ｂ’’）を有する構造のカップリング剤が使用できる。
【００３５】
官能基（ｂ’）としては、多孔体（Ａ０）の表面の官能基が水酸基またはアミノ基の場合はトリアルコキシシリル基、グリシジル基およびカルボキシル基などが挙げられ、多孔体（Ａ0）の表面の官能基がカルボキシル基の場合はトリアルコキシシリル基、グリシジル基およびアミノ基などが挙げられる。
官能基（ｂ’’）としては、グリシジル基、水酸基、アミノ基、メルカプト基およびビニル基などが挙げられる。これらのうち反応性の観点から好ましいのはアミノ基およびグリシジル基である。
カップリング剤の具体例としては；グリシジル基を有するシランカップリング剤、例えばγ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランなど；アミノ基を有するシランカップリング剤、例えばγ−（２−アミノエチル）アミノプロピルトリメトキシシラン、アミノプロピルトリメトキシシランおよびアミノプロピルトリエトキシシランなど；メルカプト基を有するシランカップリング剤、例えばγ−メルカプトプロピルトリメトキシシランなど；並びに、ビニル基を有するシランカップリング剤、例えばγ−メタクリロキシプロピルトリメトキシシランなど；が挙げられる。
カップリング剤のうち、好ましいのは、多孔体（Ａ0）との反応性の観点からトリアルコキシ基を有する、いわゆるシランカップリング剤、特にγ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランおよびγ−（２−アミノエチル）アミノプロピルトリメトキシシランである。
【００３６】
シランカップリング剤と多孔体（Ａ0）との反応は、種々の反応条件で行うことができる。例えば、シランカップリング剤を多孔体（Ａ0）の重量に基づいて３０〜６０重量％の割合で仕込み、溶剤の存在下に加熱撹拌し、シランカップリング剤中のトリアルコキシシリル基と多孔体（Ａ0）の表面の官能基（水酸基など）を反応させた後、精製して得ることができる。
反応溶剤としては有機溶剤（トルエン、ヘキサン、キシレン、酢酸エチル、メチルエチルケトン、アセトンおよび／または低級アルコール等）を使用することができ、水とこれらの有機溶剤との混合溶剤でもよい。水は多孔体表面の官能基およびシランカップリング剤の活性を促進させるため少量使用する方が好ましく、水の割合はシランカップリング剤のトリアルコキシシリル基に対して３倍モル以下が特に好ましい。また反応溶剤の使用量は多孔体の重量に基づいて、通常８０〜３００％（以下において、％は特に限定しない限り重量％を表す）、好ましくは１００〜２５０％である。
【００３７】
反応温度は通常６０〜１５０℃であり、生成するアルコキシ基由来物質（例えばメタノール、エタノール等の低級アルコール）を除去しながら反応してもよい。
反応後は粒状物をろ過もしくは遠心分離機等を用いて分離・回収し、未反応物質（未反応シランカップリング剤など）除去のために、上記の有機溶剤で数回洗浄した後、減圧乾燥（通常１００〜１２０℃、１０〜２０ｍｍＨｇで３〜５時間）させる。
【００３８】
（ｉｉ）の方法における化合物（ａ２）は、前記の官能基（ｂ’’）と反応性の化合物であり、かつ一般式（１）で示される基を有する化合物であれば特に限定されない。
化合物（ａ２）としては、リン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、アデノシン３リン酸、アデノシン２リン酸、アデノシン１リン酸および無水リン酸などが挙げられる。
【００３９】
官能基（ｂ’’）がアミノ基の場合は、例えばリン酸を加えて中和塩を形成することができ、さらに高温（例えば８０〜１８０℃）で加熱してリン酸アミドにすることもできる。
官能基（ｂ’’）がグリシジル基の場合は、例えばリン酸を反応させてβ−ヒドロキシプロピルリン酸エステルが得られ、官能基（ｂ’’）が水酸基またはメルカプト基の場合は、例えば無水リン酸を反応させてリン酸エステルまたはチオリン酸エステルが得られる。さらに官能基（ｂ’’）がビニル基の場合は、一般式（１）で示される基を有するビニル単量体（ａ３）をグラフト重合することで目的の修飾多孔体（Ａ）が得られる。
（ａ３）としては、モノ（２−メタクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、ジ（２−メタクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、モノ（２−アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェートおよびジ（２−アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェートなどが挙げられる。
【００４０】
（ｉｉ）の製造方法のうち好ましいのは、多孔体（Ａ0）を、グリシジル基を有するシランカップリング剤と反応させた後、リン酸でグリシジル基を開環反応させる方法、並びに、多孔体（Ａ0）を、アミノ基を有するシランカップリング剤と反応させた後、リン酸と中和反応またはアミド化反応させる方法である。
【００４１】
（ｉｉｉ）の製造方法におけるビニルモノマー（ａ３）としては、前述のモノ（２−メタクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、ジ（２−メタクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、モノ（２−アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェートおよびジ（２−アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェートなどが挙げられる。
また、グラフト重合において（ａ３）以外の他のビニル単量体を併用してもよく、他のビニル単量体としては、前述のビニル樹脂の合成に使用できるビニル単量体が使用できる。
多孔体（Ａ0）のうち、（ｉｉｉ）の製造方法に好ましい多孔体は、グラフト重合のためのラジカルが発生しやすいという観点から、合成樹脂架橋体、シリカおよびゼオライトなどであり、特に、カルボキシル基または水酸基などを有する合成樹脂架橋体が好ましい。
グラフト重合は、多孔体（Ａ0）とビニル単量体（必要によりラジカル重合開始剤）の共存下に、加熱もしくは電磁放射線（特に電子線）により、表面にラジカルを発生させてグラフト重合させる方法などが挙げられ、例えば特開平１１−１７１９４７号公報に記載の方法などが挙げられる。
【００４２】
（ｉｖ）の方法は、多孔体の製造と同時に、多孔体に一般式（１）で示される基を担持させる方法である。
この方法における架橋性ビニル単量体としては、前述のビニル樹脂の合成に使用できる架橋性ビニル単量体が使用できる。なお、（ａ３）以外の他のビニル単量体を併用してもよく、他のビニル単量体としては、前述のビニル樹脂の合成に使用できるビニル単量体が使用できる。重合の方法は、縣濁重合およびパール重合などが挙げられる。
【００４３】
多孔体（Ａ0）に、一般式（１）で示される基を担持させる方法のうち物理的に担持させる方法としては以下の方法が挙げられる。
【００４４】
（ｉ）一般式（１）で示される基をもつ化合物（ａ）を含む溶液もしくは分散液と多孔体
（Ａ0）を攪拌混合する。
（ｉｉ）一般式（１）で示される基をもつ化合物（ａ）を含む溶液もしくは分散液を多孔
体（Ａ0）を充填したカラムを通す。
【００４５】
（ｉ）の方法における攪拌混合する方法としては、一般式（１）で示される基をもつ化合
物（ａ）を水もしくは有機溶剤に溶解または分散させ、さらに多孔体（Ａ0）を加えて攪拌する方法があげられる。溶解または分散状態の一般式（１）で示される基をもつ化合物（ａ）は、攪拌により多孔体（Ａ0）の空孔部分に捕捉される。
具体例としては、５００ｍＬコルベンに０．５モル／Ｌのトリポリリン酸ナトリウム水溶液１００ｍｌとシリカ２０ｇを加え、２時間攪拌し上澄みを除去することで修飾多孔体（Ａ）を得ることができる。
【００４６】
（ｉｉ）の方法としては、一般式（１）で示される基をもつ化合物（ａ）を水もしくは有
機溶剤に溶解または分散させ、多孔体（Ａ0）を充填したカラムを通す方法があげられる。溶解または分散状態の一般式（１）で示される基をもつ化合物（ａ）は、カラムを通すことにより多孔体（Ａ0）の空孔部分に捕捉される。
【００４７】
（Ａ）は、一般式（１）で示される基を担持する前の多孔体（Ａ0）と実質的に同じ形状であり、その平均粒子径（ｄ５０）およびＢＥＴ比表面積の好ましい範囲も同様である。
【００４８】
（Ａ）は、好ましくは１〜８,０００μｍ、さらに好ましくは１０〜６，０００μｍ、特に好ましくは４０〜５００μｍの平均粒子径（ｄ５０）を有する。１μｍ以上であることで取り扱いが容易になり、８,０００μｍ以下であることが取り扱いが容易であるという観点で好ましい。
【００４９】
（Ａ）は、好ましくは３０ｍ2／ｇ以上、さらに好ましくは５０〜１，５００ｍ2／ｇ、特に好ましくは１００〜８００ｍ2／ｇのＢＥＴ比表面積を有する。３０ｍ2／ｇ以上であることが、リフォールディング効果が高いという観点で好ましい。
【００５０】
本発明の他の実施態様は、上記の修飾多孔体（Ａ）、並びに界面活性剤（Ｂ）およびｐＨ調整剤（Ｃ）、タンパク安定化剤（Ｄ）および水からなる群から選ばれる１種以上を構成材料としてなるタンパク質用のリフォールディングキットである。
本発明のリフォールディングキットは、修飾多孔体以外の各構成材料を、修飾多孔体と混合して使用してもよく、また、それぞれの材料を別々に使用してもよい。
【００５１】
本発明のリフォールディングキットには、リフォールディング効果の観点から界面活性剤（Ｂ）を併用することが好ましい。界面活性剤としては、リフォールディング効果を妨げないものであれば特に限定するものではなく、非イオン性界面活性剤（Ｂ１）、カチオン性界面活性剤（Ｂ２）、アニオン性界面活性剤（Ｂ３）または両性界面活性剤（Ｂ４）が挙げられる。
【００５２】
非イオン性界面活性剤（Ｂ１）としては、高級アルコールアルキレンオキサイド（以下、ＡＯと略記）付加物［炭素数８〜２４の高級アルコール（デシルアルコール、ドデシルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール、オクタデシルアルコールおよびオレイルアルコールなど）のエチレンオキサイド（以下、ＥＯと略記）１〜２０モル付加物など］、炭素数６〜２４のアルキルを有するアルキルフェノールのＡＯ付加物、ポリプロピレングリコールＥＯ付加物およびポリエチレングリコールＰＯ付加物、プルロニック型界面活性剤、および脂肪酸ＡＯ付加物、多価アルコール型非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮなど）などが挙げられる。
カチオン性界面活性剤（Ｂ２）としては、第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤
およびアミン塩型カチオンカチオン性界面活性剤（セチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドなど）などが挙げられる。
アニオン性界面活性剤（Ｂ３）としては、炭素数８〜２４の炭化水素基を有する、エーテルカルボン酸またはその塩、硫酸エステルもしくはエーテル硫酸エステルおよびそれらの塩、スルホン酸塩、スルホコハク酸塩、脂肪酸塩、アシル化アミノ酸塩、並びに天然由来のカルボン酸およびその塩（たとえばケノデオキシコール酸、コール酸、デオキシコール酸など）が挙げられる。
両性界面活性剤（Ｂ４）としては、ベタイン型両性界面活性剤およびアミノ酸型両性界面活性剤が挙げられる。
（Ｂ）としては、上記の他に特公昭５７−３９６７８号公報記載の界面活性剤が挙げられる。
【００５３】
ｐＨ調整剤（Ｃ）としては、Ｔｒｉｓ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノエタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、およびリン酸緩衝剤（例えば、リン酸１水素２ナトリウム＋塩酸水溶液、またはリン酸２水素１ナトリウム＋水酸化ナトリウム水溶液）などが挙げられる。
【００５４】
さらにリフォールディング効果を失わない範囲でタンパク安定化剤（Ｄ）を加えても良い。タンパク安定化剤（Ｄ）としては還元剤、ポリオール類、金属イオン、キレート試薬などが挙げられる。
還元剤としては２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、アスコルビン酸、還元型グルタチオンおよびシステインなどが挙げられる。
ポリオール類としてグリセリン、ブドウ糖、ショ糖、エチレングリコール、ソルビトールおよびマンニトールなどが挙げられる。
金属イオンとしてマグネシウムイオン、マンガンイオンおよびカルシウムイオンなどの２価金属イオンが挙げらる。
キレート試薬としてはエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）およびグリコールエーテルジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸（ＥＧＴＡ）などが挙げられる。
【００５５】
（Ｂ）の添加量は、修飾多孔体（Ａ）の添加量に対し、リフォールディング効果の観点から０．００１〜２０％が好ましく、０．０１〜５％がさらに好ましい。
（Ｃ）の添加量は、（Ａ）の添加量に対しリフォールディング効果の観点から０．０１〜１００％が好ましく、０．１〜３０重量％がさらに好ましい。
（Ｄ）の添加量は、（Ａ）の添加量に対しリフォールディング効果の観点から０．００１〜１０％が好ましく、０．０１〜１％がさらに好ましい。
【００５６】
本発明の他の実施態様は、上記の修飾多孔体（Ａ）を充填剤として充填されてなるタンパク質のリフォールディング用カラムである。
カラムは市販されているカラムを使用することができ、特に限定されるものではない。
例えば、直径１ｃｍ×長さ２０ｃｍ（内容量約１５ｍｌ）のガラス製カラムに、本発明の修飾多孔体５〜１０ｇを最密充填したカラムなどが挙げられる。これらのカラムは、後述の本発明のリフォールディング方法において効率よくリフォールディングするのに適している。
【００５７】
本発明のさらに他の実施態様は、上記の修飾多孔体（Ａ）を用いて（または修飾多孔体を含むリフォールディングキットを用いて）リフォールディングする工程を含む、アンフォールディングされたタンパク質のリフォールディング方法である。
本発明のリフォールディング方法は、修飾多孔体（Ａ）が固体であるために分離精製が非常に容易になり、かつ再利用が可能といったメリットを有する。
【００５８】
本発明の修飾多孔体（Ａ）は固体であるため、リフォールディング方法には以下の２つの方法が挙げられる。
（ｉ）修飾多孔体（Ａ）を、アンフォールディングされたタンパク質の溶液に加えて、攪拌する方法。
（ｉｉ）修飾多孔体（Ａ）を充填したリフォールディング用カラムに、アンフォールディングされたタンパク質の溶液を流下させる方法。
【００５９】
上記の（ｉ）および（ｉｉ）のリフォールディング方法において、修飾多孔体に担持されている一般式（１）で示される基の（ｉ）における系中または（ｉｉ）におけるカラム中の濃度はリン原子濃度で０．０１〜６ミリモル／ｍＬが好ましい。ここで系中のリン原子濃度とは、アンフォールディングされたタンパク質溶液（ｍＬ）に対する、加えた多孔体中に含まれるリン原子のモル数を表し、カラム中のリン原子濃度とは、アンフォールディングされたタンパク質溶液（ｍＬ）に対する、カラム内の多孔体中に含まれるリン原子のモル数を表す。
系中またはカラム中のリン原子濃度を０．０１〜６ミリモル／ｍＬにすることでより高いリフォールディング効果（アンフォールディングされたタンパク質をリフォールディングすることができる割合）と高純度のタンパク質を得ることができる。
リン原子濃度が０．０１ミリモル／ｍＬになると、タンパク質の特異的な３次元構造が形成されやすくなるための平衡濃度に達するものと推定される。
また、リン原子濃度が６ミリモル／ｍＬを超える濃度になると、流動性の観点から好ましくない。
【００６０】
本発明のリフォールディング方法において、リフォールディング工程のタンパク質の系中の濃度は、好ましくは０．１〜３０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．２〜２０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．２５〜２０ｍｇ／ｍＬである。０．１ｍｇ／ｍＬ以上であればタンパク質の生産効率の観点から好ましく、３０ｍｇ／ｍＬ以下であれば系内の粘度が高くなりすぎることが少ないため生産効率が低下しないので好ましい。
また、修飾多孔体（Ａ）の、タンパク質の重量に対する添加量（重量）は、タンパク質１００部に対して好ましくは１０〜３００，０００部、リフォールディング効果の観点からさらに好ましくは５０〜１００，０００部である。
【００６１】
本発明の他の実施態様は上記いずれか記載のリフォールディング方法でリフォールディングする工程を含むタンパク質の産生方法である。本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質は、上記のリフォールディング方法で得られるため、従来よりも純度が高く、また大希釈を行う必要がないため高い収量を得ることができる。
本発明のタンパク質の産生方法としては、例えば、以下のような順序の工程による産生方法が挙げられる。
（１）タンパク質の培養工程：大腸菌などのタンパク質生産体に酵素または組み換えタンパク質を培養させる。
（２）溶菌工程：溶菌剤などの使用によってでタンパク質生産体内のインクルージョンボディを取り出す。
（３）アンフォールディング工程；インクルージョンボディ懸濁液（例えば１０ｍｇタンパク質／ｍＬ）に０．５モル／Ｌ以上のアンフォールディング剤および２０ミリモル／Ｌ以下の還元剤を加え軽くかきまぜ室温で数時間放置する。
（４）リフォールディング工程：アンフォールディングされたタンパク質懸濁液に、０．０１〜６ミリモル／ｍＬのリン原子濃度になるように修飾多孔体（Ａ）を加えて軽くかき混ぜ、室温で１晩放置しリフォールディングを行う、または修飾多孔体（Ａ）を充填したカラムにアンフォールディングされたタンパク質縣濁液をゆっくり加えてリフォールディングを行う。
（５）分離・取り出し工程：上澄みから目的とする正常なタンパク質をとりだす、又はカラムを使用した場合には流下した液から正常なタンパク質を取り出す。
【００６２】
上記の（１）のタンパク質の培養工程におけるタンパク質生産体としては、以下の細菌細胞、エシェリヒア属菌およびバチルス属菌などが挙げられる。
細菌細胞としては、連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミセス属菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、真菌細胞：例えば酵母細胞およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞、昆虫細胞：例えばドロソフィラＳ２（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２）、スポドプテラＳf９（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９）細胞、動物細胞：例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Ｂｏｗｓ）メラノーマ細胞、ならびに植物細胞等が挙げられる。
エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１〔プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）６０巻、１６０頁（１９６８年）を参照〕、ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９巻、３０９頁（１９８１年）を参照〕、ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）１２０巻、５１７頁（１９７８年）を参照〕、ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）４１巻、４５９頁（１９６９年）を参照〕、Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）３９巻、４４０頁（１９５４年）を参照〕、ＭＭ２９４〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２１７巻、１１１０頁（１９６８年）を参照〕などが挙げられる。
バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン、２４巻、２５５頁（１９８３年）を参照〕、２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５巻、８７頁（１９８４年）を参照〕などが挙げられる。
【００６３】
組み換えタンパク質の培養方法として、目的タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターは、
（ｉ）目的タンパク産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込む。
（ｉｉ）得られた組み換えファージまたはプラスミドで宿主を形質転換し、培養後、目的タンパクの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、あるいは抗体を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージあるいはプラスミドを単離する。
（ｉｉｉ）その組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切りだし、該クローン化ＤＮＡまたはその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。
その後、適当な方法により、宿主を発現ベクターで形質転換し培養する。培養は通常１５〜４３℃で３〜２４時間行い、必要により通気、攪拌を加えることもできる。
【００６４】
溶菌工程における溶菌方法としては、超音波による物理的破砕、リゾチーム等の溶菌酵素による処理、界面活性剤等の溶菌剤による処理などのいずれもが使用でき、生産性の観点から溶菌剤による処理が好ましく、有用タンパクを変性させないといった観点から特に特願２００５−１１９１３３記載の溶菌剤による処理が好ましい。
【００６５】
アンフォールディング工程において使用されるアンフォールディング剤としては、塩酸グアニジン、尿素およびこれらの併用などが挙げられる。
なお、タンパク質が、分子内にＳ−Ｓ結合を含むタンパク質である場合には、還元剤として塩酸グアニジンおよび／または尿素以外に、さらに２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、シスチンまたはチオフェノールなどを加えてもよい。
【００６６】
本発明のタンパク質は、上記のタンパク質産生方法で得られたタンパク質である。本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質は、上記のリフォールディング方法で得られるため、従来よりも純度が高く、また大希釈を行う必要がないため高い収量を得ることができる。本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質としては、酵素、組み換えタンパク質および抗体などが挙げられる。
【００６７】
酵素としては、加水分解酵素、異性化酵素、酸化還元酵素、転移酵素、合成酵素および脱離酵素などが挙げられる。加水分解酵素としては、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、グルコアミラーゼなどが挙げられる。異性化酵素としては、グルコースイソメラーゼが挙げられる。酸化還元酵素としては、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。転移酵素としては、アシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼなどが挙げられる。合成酵素としては、脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ、クエン酸シンターゼなどが挙げられる。脱離酵素としては、ペクチンリアーゼなどが挙げられる。
【００６８】
組み換えタンパク質としては、タンパク製剤、ワクチン等が挙げられる。
タンパク製剤としては、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第２因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン、カ
ルシトニン等が挙げられる。ワクチンとしては、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン等が挙げられる。抗体としては、特に限定はないが、医療用抗体が挙げられる。
【００６９】
＜実施例＞
以下の製造例および実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
下記の実施例１〜６および比較例１〜４の方法でリフォールディングを行いタンパク質を得て、得られたタンパク質の酵素活性を測定した。
【００７０】
製造例１〜６（修飾多孔体の製造）
製造例１
１Lコルベンに多孔体シリカ（協和化学製「キョーワード３００」）１０ｇを入れ、室温で激しく攪拌しながら、ヘキサン２０ｇに溶解させたシランカップリング剤［アミノプロピルトリメトキシシラン（東京化成製）］４ｇを少しずつ加えた。その後、窒素雰囲気下で、ヘキサンを蒸発させながら昇温し、１２０℃で２時間加熱することで、多孔体シリカとトリメトキシシリル基を反応させ、シランカップリング剤の残基としてのアミノ基を有する多孔体シリカを得た。このアミノ基と反応性を有し一般式（１）で示される基を１分子中に有する化合物（ａ２）としてのピロリン酸（アルドリッチ社製）の９０重量％水溶液４ｇを加えて１時間１２０℃で攪拌し、脱水しながら反応させた。室温まで冷却後、イオン交換水５０ｍｌを加えて攪拌洗浄し、静置して上清を除き、乾燥することによってピロリン酸基担持多孔体シリカを得た。
【００７１】
製造例２
１Lコルベンに多孔体アルミナ（電気化学工業（株）製）１０ｇを入れ、室温で激しく攪拌しながら、ヘキサン２０ｇに溶解させたシランカップリング剤［アミノプロピルトリエトキシシラン（信越化学（株）製）］５．０ｇを少しずつ加えた。その後、窒素雰囲気下で、ヘキサンを蒸発させながら昇温し、１２０℃で２時間加熱することで、アミノ基を有する多孔体アルミナを得た。この多孔体アルミナにリン酸（アルドリッチ社製）の９０重量％水溶液２．２２ｇを加えてさらに１時間１２０℃で攪拌し、脱水しながら反応させた。室温まで冷却後、イオン交換水５０ｍｌを加えて攪拌洗浄し、静置して上清を除き、乾燥することによってリン酸基担持多孔体アルミナを得た。
【００７２】
製造例３
１Lコルベンに多孔体チタニア（堺化学工業（株）製）１０ｇを入れ、室温で激しく攪拌しながら、ヘキサン１０ｇに溶解させたリン原子含有チタネートカップリング剤［イソプロピル・トリ（ジオクチルフォスフェート）チタネート：Ｋｅｎｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ社「ＫＲ−３８Ｓ」］５．０ｇを少しずつ加えた。その後、窒素雰囲気下で、１２０℃で２時間加熱することでリン酸エステル基担持多孔体チタニアを得た。
【００７３】
製造例４
１Lコルベンに多孔体ゼオライト（東ソー（株）製）１０ｇを入れ、室温で激しく攪拌しながら、ヘキサン１０ｇに溶解させたシランカップリング剤［アミノプロピルトリメトキシシラン（東京化成製）］４ｇを少しずつ加えた。その後、ヘキサンを蒸発させ、窒素雰囲気下で、１２０℃で２時間加熱することでアミノ基を有する多孔体ゼオライトを得た。この多孔体ゼオライトにピロリン酸（アルドリッチ社製）の９０重量％水溶液４ｇを加えて１２０℃で１時間攪拌し、脱水しながら反応させた。室温まで冷却後、イオン交換水５０ｍｌを加えて攪拌洗浄し、静置して上清を除き、乾燥することによってピロリン酸基担持多孔体ゼオライトを得た。
【００７４】
製造例５
メタクリル酸／ジビニルベンゼン共重合（モル比９５／５）体１０ｇに 放射線照射することにより反応活性点を生成させた。放射線照射は、電子線を用いて窒素雰囲気下でトータル線量が２００ｋＧｙになる条件で行った。放射線照射した共重合体１０ｇを１Ｌのコルベンに入れ、激しく攪拌しながら、モノ（２−メタクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート３０ｇをメタノールと純水の混合溶媒（メタノール２５重量％）１００ｇ中で１２時間、４０〜６０℃で反応させ、リン原子含有ビニル単量体をグラフト重合したビニル樹脂多孔体を得た。
【００７５】
製造例６
３００ｍＬコルベンに多孔体シリカ（協和化学製「キョーワード３００」）３０ｇを入れ、０．５モル／Ｌのトリポリリン酸ナトリウム（東京化成製）水溶液２００ｍｌ、ソルビタントリオレート（三洋化成工業（株）製）を１ｍＬ加えた。２時間室温で攪拌後、上清を除き、乾燥することによってリン酸基を物理的に担持した多孔体シリカを得た。
【００７６】
以上の多孔体の平均粒子径をＪＩＳ Ｋ１１５０に規定される粒度分布測定法において測定し、ＢＥＴ比表面積をＪＩＳ Ｋ１１５０に規定される比表面積測定法により測定した。
【００７７】
多孔体中のリン原子濃度（ミリモル／ｇ）を、多孔体の製造に用いたリン原子含有化合物のリン原子濃度（ＣP0）（ミリモル／ｇ）と、製造後の上清中に含まれるリン原子濃度（ＣP1）（ミリモル／ｇ）から次の式で計算した。それぞれのリン原子濃度はＩＣＰ法により測した。結果を表１に示す。
【００７８】
多孔体中のリン原子濃度（ミリモル／ｇ）
＝｛ＣP0×リン原子化合物の使用量（ｇ）−ＣP1×上清の量（ｇ）｝／多孔体Ａの重量（ｇ）
【００７９】
カラム内のリン原子濃度（ミリモル／ｍＬ）は、多孔体中のリン原子濃度（ミリモル／ｇ）とカラム充填量（ｇ）およびカラムに流すタンパク溶液量（ｍＬ）から下式で計算した。
【００８０】
カラム内のリン原子濃度（ミリモル／ｍＬ）
＝多孔体中のリン原子濃度（ミリモル／ｇ）×カラム充填量（ｇ）／カラムに流すタンパク溶液量（ｍＬ）
【００８１】
実施例１〜６
１０ｍｌ容の滅菌済み試験管に、３０ｍｇのリパーゼ（「リリパーゼ」ナガセケムテックス社製：以下、同様のものを使用）および６モル／Ｌ塩酸グアニジン（和光純薬製：以下、同様のものを使用）水溶液を３ｍｌ加えて、室温で１晩放置しリパーゼをアンフォールディングさせた。
このアンフォールディングされたタンパク質溶液３ｍｌを、上記の修飾多孔体１０ｇを充填したガラス製カラム（直径１ｃｍ×長さ２０ｃｍ）にゆっくり流した。
（リフォールディング工程のタンパク質濃度＝１０ｍｇ／ｍＬ）
【００８２】
比較例１
［稀釈法によるリフォールディング−１］
実施例１〜６と同様にしてリパーゼをアンフォールディングさせた。２１０ｍｌ容の滅菌瓶に上記酵素溶液１ｍｌと、０．１モル／Ｌ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ＝７）２００ｍｌを入れ軽くかき混ぜ室温で１晩放置した。（リフォールディング工程のタンパク質濃度＝０．０５ｍｇ／ｍＬ）
【００８３】
比較例２
［稀釈法によるリフォールディング−２］
実施例１〜６と同様にしてリパーゼをアンフォールディングさせた。１４０ｍｌ容の滅菌瓶に、上記酵素溶液１ｍｌおよび０．０５％セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）（東京化成製）溶液７０ｍｌを加えて、室温で１時間放置し、２％シクロアミロース（江崎グリコ製）溶液を３０ｍｌ加え１晩放置した。（リフォールディング工程のタンパク質濃度＝０．１ｍｇ／ｍＬ）
【００８４】
比較例３
［透析法によるリフォールディング］
実施例１〜６と同様にしてリパーゼをアンフォールディングさせた。上記酵素溶液１ｍｌを透析装置に入れ、０．１モル／Ｌ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ＝７）を徐々に加え、徐々に希釈していきリフォールディングをおこなった。２００ｍｌのＴｒｉｓバッファーを加えたところで終了した。（リフォールディング工程のタンパク質濃度＝０．０５ｍｇ／ｍＬ）
【００８５】
比較例４
［スルホン酸基含有イオン交換樹脂によるリフォールディング］
実施例１〜６と同様にしてリパーゼをアンフォールディングさせた。
このアンフォールディングされたタンパク質溶液３ｍｌを、スルホン酸基含有陽イオン交換樹脂アンバーライトＩＲ１２０Ｂ（ローム・アンド・ハース社製）を１０ｇ充填したガラス製カラム（直径１ｃｍ×長さ２０ｃｍ）にゆっくり流下した。
（リフォールディング工程のタンパク質濃度＝１０ｍｇ／ｍＬ）
【００８６】
＜酵素活性の測定＞
１０ｍｌ容の滅菌済み試験管に、０．１モル／Ｌ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ＝７）２ｍｌと実施例１〜６または比較例１〜４で得られたタンパク質溶液を５μｌマイクロピペットで加えて軽くかき混ぜた。さらに３．５ミリモル／Ｌｐ−ニトロフェニル酢酸塩溶液を１ｍｌ加え、加水分解生成物であるｐ−ニトロフェノールの吸光度（４００ｎｍ）を紫外可視分光光度計（島津製作所製、ＵＶ−２５５０）で３分毎に１２分間測定し、時間に対する吸光度の増加割合から加水分解反応の初速度を算出した。
また実施例１〜６または比較例１〜４のそれぞれのタンパク質濃度と同濃度の天然リパーゼ水溶液を調製し、それらを用いて上記と同様にｐ−ニトロフェニル酢酸塩の加水分解反応の初速度を算出した。
【００８７】
実施例１〜６および比較例１〜４の酵素活性（％）を以下の式で算出した。結果を表１に示す。
酵素活性（％）＝［実施例または比較例で得られたタンパク質を使用した場合の初速度／天然リパーゼを使用した場合の初速度］×１００
【００８８】
＜タンパク質の生産性の評価＞
タンパク質の生産性を以下の指標で定義し、評価した。結果を表１に示す。
生産性指標＝リフォールディング工程のタンパク質の系中濃度（ｍｇ／ｍＬ）×酵素活性（％）
【００８９】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明のリフォールディング用の修飾多孔体を用いると、有用な各種のタンパク質を、高純度で、かつ効率よく産生することができる。本発明のタンパク質産生方法で得られるタンパク質としては、酵素、組み換えタンパク質および抗体などが挙げられる。