(57)【要約】      （修正有）【課題】  動脈硬化に伴う疾患の予防および／または治療を目的とした、肝ＡＢＣＡ１（ＡＴＰ結合カセット膜トランスポーターＡ１）上昇作用を有する医薬をスクリーニングする新規な方法および該方法において用いられるＤＮＡを提供する。【解決手段】  ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡを用いることを特徴とする、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法が提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡを用いることを特徴とする、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質が、動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロモーター活性を有するＤＮＡが、
（ａ）配列番号４〜６のいずれかに記載の配列を有するＤＮＡと、
（ｂ）配列番号４〜６のいずれかに記載の配列において、１もしくは数個のヌクレオチドが置換、挿入もしくは欠失された配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡと、
（ｃ）配列番号４〜６のいずれかに記載の配列と相同性が６０％以上の配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡと、
（ｄ）（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、プロモーター活性を有するＤＮＡと
からなる群から選ばれるＤＮＡの少なくとも一部である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＳＲＥ配列が、配列番号７〜１２のいずれかに記載の配列である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
被検物質を供するステップと、
前記プロモーター活性を有するＤＮＡに作動可能に連結した構造遺伝子を有するＤＮＡを有する細胞または生物の複数の群を供するステップと、
前記被検物質を前記細胞または生物の少なくとも１つの群に接触させるステップと、
前記被検物質を接触させた群と接触させなかった群とにおいて、前記遺伝子の転写量および／または発現量を測定するステップと、
前記被検物質を接触させた群と接触させなかった群の前記転写量および／または発現量を比較するステップと
を含む請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
活性型ＳＲＥＢＰの量を変化させる作用を有する物質（ピタバスタチン、シムバスタチンおよびアトルバスタチンを除く）を含有する、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写調整剤。
【請求項７】
前記活性型ＳＲＥＢＰの量を変化させる作用を有する物質が、スタチン系薬剤を除く物質である、請求項６に記載のＡＢＣＡ１遺伝子の転写調整剤。
【請求項８】
ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有する組換えＤＮＡ。
【請求項９】
ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡを有する組換えベクター。
【請求項１０】
前記プロモーター活性を有するＤＮＡに作動可能に連結した構造遺伝子をさらに有する請求項９に記載の組換えベクター。
【請求項１１】
ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有する外因性のＤＮＡに作動可能に連結した構造遺伝子を有する形質転換体。
【請求項１２】
請求項１０に記載の組換えベクターおよび／または請求項１１に記載の形質転換体を有する、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質をスクリーニングするためのキット。
【請求項１３】
前記ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質が、動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質である、請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓においてＡＢＣＡ１遺伝子の発現を制御するプロモーター領域の発見に基づき、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法ならびにそのためのＤＮＡおよびキットに関するものであり、特に、プロモーター活性の増加を指標として、肝臓におけるＡＢＣＡ１発現の増加により動脈硬化性疾患を予防または治療する作用を有する物質をスクリーニングする方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）は主に肝臓や小腸で合成、分泌され、リポ蛋白（アポＡ−ＩやアポＡ−IIなど）や脂質（リン脂質、コレステロール、トリグリセライド）から構成される複合分子である。ＨＤＬは、末梢細胞で過剰に蓄積したコレステロールを細胞膜表面から引き抜いて、胆汁酸への転換および排出が可能な肝臓へと輸送する、いわゆる「コレステロール逆輸送系」において重要な役割を担っている。血中ＨＤＬ濃度が低いほど動脈硬化性疾患の発症率が高まる疫学的知見から、ＨＤＬは善玉コレステロールと呼ばれている。
【０００３】
血中ＨＤＬ濃度の低下は、動脈硬化症や高脂血症、肥満、糖尿病などの様々な疾患で認められる。家族性ＨＤＬ欠損症であるタンジール病では、細胞内のコレステロールをアポＡ−Ｉを含むＨＤＬ粒子として放出する過程に障害を持つ。近年その原因遺伝子としてＡＴＰ結合カセット膜トランスポーターＡ１（ＡＢＣＡ１）が同定され（非特許文献１、Nat.Genet.(1999)22, 347）、ＨＤＬの形成にＡＢＣＡ１タンパク質が必須の役割を担うことが明らかになった。
【０００４】
培養細胞にＡＢＣＡ１を強制発現させるとＨＤＬ形成が増加する（非特許文献２、J.Clin.Invest.(1999)104, R25）。また、ＡＢＣＡ１過剰発現マウスでは血中ＨＤＬ濃度が上昇し、動脈硬化に抵抗性を示すことが明らかにされている（非特許文献３、J.Biol.Chem.(2001)276, 33969）。したがって、ＡＢＣＡ１発現量の増加は、ＨＤＬ濃度の上昇をもたらし、動脈硬化性疾患の予防および治療に有用であると考えられる。
【０００５】
マクロファージや繊維芽細胞など末梢細胞におけるＡＢＣＡ１遺伝子の転写は、ＡＢＣＡ１遺伝子のエクソン１上流領域により制御されており、このＡＢＣＡ１遺伝子プロモーターの活性は複数の転写因子により調節されることが明らかにされている（非特許文献４、Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)274, 794:非特許文献５、J.Biol.Chem.(2002)277, 14443:非特許文献６、J.Lipd Res(2002)43, 297:非特許文献７、Mol.Cell.Biol.(2003)23,7756）。なかでも主要なものは、核内受容体ＬＸＲであり、ＲＸＲとのヘテロダイマーがＬＸＲ応答性配列に結合しＡＢＣＡ１の転写を活性化する。細胞内コレステロール濃度を感知するＬＸＲは、ＡＢＣＡ１遺伝子の発現を促進し、ＨＤＬ新生による細胞外へのコレステロール排出を促してコレステロール恒常性を保つ（非特許文献８、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(2000)97,12097）。
【０００６】
【特許文献１】国際公開第00/078972号パンフレット
【非特許文献１】Nat.Genet.(1999)22, 347
【非特許文献２】J.Clin.Invest.(1999)104, R25
【非特許文献３】J.Biol.Chem.(2001)276, 33969
【非特許文献４】Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)274, 794
【非特許文献５】J.Biol.Chem.(2002)277, 14443
【非特許文献６】J.Lipd Res(2002)43, 297
【非特許文献７】Mol.Cell.Biol.(2003)23,7756
【非特許文献８】Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(2000)97,12097
【非特許文献９】Biochem.Biophys.Res.Commun.(2004)324, 835
【非特許文献１０】Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.(2004)24, 2365
【非特許文献１１】J.Clin.Invest. (2005)115, 1333
【非特許文献１２】J Biol Chem. 2005 Jun 10;280(23):22212-21
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
スタチン系薬剤は、コレステロール合成の律速酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害剤であり、血中ＬＤＬ濃度の低下薬として汎用されているが、血中ＨＤＬ濃度の上昇効果も認められる。最近、スタチン系薬剤はヒト肝がん由来細胞ＨｅｐＧ２においてＡＢＣＡ１遺伝子の発現促進作用を示すことが明らかにされた（非特許文献９、Biochem.Biophys.Res.Commun.(2004)324, 835）。一方、マクロファージ系の培養細胞ＴＨＰ−１やＲＡＷ２６４においては、ＡＢＣＡ１発現を著しく低下させる（非特許文献１０、Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.(2004)24, 2365）。これは、コレステロール合成過程で生じるＬＸＲの内因性リガンドがスタチン系薬剤の作用によって減少し、ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター活性が低下することによる。したがって、肝由来細胞のＡＢＣＡ１発現増加は、末梢細胞で機能する、上記のＬＸＲが制御するプロモーター領域（エクソン１上流領域）とは別の発現調節系により引き起こされていると推定される。
【０００８】
ＡＢＣＡ１は様々な組織に分布しているが、特に肝臓において強く発現する。マウスを用いた肝臓特異的なＡＢＣＡ１遺伝子のノックダウン解析では、血中ＨＤＬコレステロール量が２０％以下まで低下し、肝臓のＡＢＣＡ１発現量は血中ＨＤＬ量の決定に重要な役割を担うことが示されている（非特許文献１１、J.Clin.Invest. (2005)115, 1333）。
【０００９】
従って、ＨＤＬ産生の主要臓器である肝臓においてＡＢＣＡ１遺伝子発現を増加させることは、動脈硬化性疾患を予防または治療する上で極めて重要となる。このような状況から、肝臓におけるＡＢＣＡ１遺伝子発現の制御機構の解明、さらにそれを利用した制御薬剤のスクリーニング方法が望まれていた。
【００１０】
以上に鑑みて、本発明の課題は、肝臓のＡＢＣＡ１上昇作用を有し動脈硬化に伴う疾患の予防および／または治療に有用な医薬をスクリーニングする新規な方法および該方法において用いられるＤＮＡを提供することにある。
【００１１】
なお、本発明の方法において用いられるＡＢＣＡ１遺伝子は、Gene Bankデータベース上に「ＡＴＰ結合カセット輸送体Ａ１（ATP-binding cassette transporter A1）」として公開されている。また特許文献１（国際公開第00/078972号パンフレット）には「ＡＢＣ１」をコードするものとして同遺伝子が、またそれと共に上記のエクソン１上流のプロモーターが開示されている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
すなわち、本発明の一の側面によると、ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡを用いることを特徴とする、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法が提供される。
【００１３】
また、本発明の他の側面によると、活性型ＳＲＥＢＰの量を変化させる作用を有する物質（ピタバスタチン、シムバスタチンおよびアトルバスタチンを除く）を含有する、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写調整剤が提供される。
【００１４】
また、本発明の他の側面によると、ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有する組換えＤＮＡが提供される。
【００１５】
また、本発明の他の側面によると、ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡを有する組換えベクターが提供される。
【００１６】
また、本発明の他の側面によると、ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有する外因性のＤＮＡに作動可能に連結した構造遺伝子を有する形質転換体が提供される。
【００１７】
また、本発明の他の側面によると、上記組換えベクターおよび／または上記形質転換体を有する、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質をスクリーニングするためのキットが提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質、特に、動脈硬化性疾患の予防および／または治療剤を試験するための新規方法を確立する。また、本発明は、従来のＡＢＣＡ１遺伝子発現促進物質のスクリーニング方法に比べ、ＨＤＬ上昇作用により効果的な分子を検出できる可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。もっとも、本発明は、以下に説明する実施の形態によって、限定されるものではない。
【００２０】
本発明者らは、肝臓におけるＡＢＣＡ１遺伝子の発現調節に新たな制御機構が存在することを見出した。そこで、ＡＢＣＡ１遺伝子発現を調節する物質を選別または同定するための方法として、イントロン１に存在する新規肝臓型ＡＢＣＡ１プロモーター（本明細書中、肝臓型プロモーター、II型ＡＢＣＡ１プロモーター等とも記す。）を用いる方法を開発し、本発明を完成させた。
【００２１】
本発明が開示する肝臓型プロモーターは、ＡＢＣＡ１遺伝子のエクソン１上流のプロモーター（特許文献１参照）とは全く異なる領域に存在し、ＤＮＡ配列も異なる。この新規肝臓型プロモーターに関しては、ＡＢＣＡ１遺伝子転写制御、ＨＤＬ形成との関連は報告されておらず、動脈硬化性疾患の治療または予防剤の試験法としての有用性も知られていない。上記したように、ピタバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチンがＡＢＣＡ１のｍＲＮＡを増加させることが示されている（非特許文献９、Biochem.Biophys.Res.Commun.(2004)324, 835）。しかし、その作用機序に関わるデータは無く、ＬＸＲが活性化される可能性が議論されている。また、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチンが（特定の条件下で）マクロファージのＡＢＣＡ１の発現を増加させること、その機序の一つとしてＲｈｏＡのゲラニル化が関与しているという報告がある（非特許文献１２、J Biol Chem. 2005 Jun 10;280(23):22212-21）。しかし、これもＰＰＡＲ  ｇａｍｍａを介してＬＸＲを活性化する（末梢型プロモーターを活性化する）メカニズムを想定している系であり、本発明にかかる新規肝臓型ＡＢＣＡ１プロモーターおよび当該プロモーターによる発現制御については記載も示唆もしていない。
【００２２】
具体的には、本発明の一の側面によると、ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡが提供される。当該ＤＮＡは、天然のものであってもよく、また人工的なものであってもよい。すなわち、本発明の他の側面によると、ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有する組換えＤＮＡが提供される。
【００２３】
本発明にかかるＤＮＡは、任意の生物に由来するＤＮＡであってよく、また、人工的に設計および／または調製されたＤＮＡであってもよい。具体的には、本発明にかかるＤＮＡは、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ニワトリなどの哺乳動物その他の恒温動物に由来するＤＮＡであってよい。
【００２４】
ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１は、ＡＢＣＡ１遺伝子のエクソン１の下流かつエクソン２の上流に存在する領域である。具体的には、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のエクソン１、イントロン１およびエクソン２として、配列番号１に記載の配列の１〜２１９位、２２０〜２４３７５位および２４３７６〜２４５３５位の配列をそれぞれ有するものが見出されている。マウスＡＢＣＡ１遺伝子のエクソン１、イントロン１およびエクソン２として、配列番号２に記載の配列の１〜２１５位、２１６〜１５７９５位および１５７９６〜１５９６３位の配列をそれぞれ有するものが見出されている。ラットＡＢＣＡ１遺伝子のエクソン１、イントロン１およびエクソン２として、配列番号３に記載の配列の１〜２２０位、２２１〜１６０４８位および１６０４９〜１６２１６位の配列をそれぞれ有するものが見出されている。また、ヒト、マウスおよびラットにおける上記イントロン１の相同体、変異体および誘導体の配列、ならびに、他の任意の生物における上記イントロン１の相同体ならびにその変異体および誘導体の配列は、当業者であれば、ヒト、マウスおよび／またはラットにおける上記イントロン１および／またはエクソン１、２の配列との相同性に基づき決定することができる。
【００２５】
ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、イントロン１中のＳＲＥ配列に加えて、エクソン２の翻訳開始点付近までを含むことが好ましい。なお、ヒト、マウスおよびラットのＡＢＣＡ１のエクソン２中の翻訳開始点は、それぞれ、配列番号１に記載の配列の２４４７０位、配列番号２に記載の配列の１５８９８位、および配列番号３に記載の配列の１６１５１位である。プロモーター活性を有するのに必要な領域は、当業者であれば適宜決定することができる。プロモーター活性は、例えば、以下に詳細に説明するように、ルシフェラーゼアッセイ法、ＣＡＴ法等により測定することができる。
【００２６】
特に、ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、（ａ）配列番号４〜６のいずれかに記載の配列を有するＤＮＡの少なくとも一部とすることができる。配列番号４〜６に記載の配列を有するＤＮＡは、それぞれ、ヒト、マウスおよびラットにおいて、配列番号１の２２９６３〜２４４６９位、配列番号２の１４２９８〜１５７９７位および配列番号３の１５１０１〜１６１７３位に見出される配列に対応する。さらに、ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、以下に詳細に説明するように、（ａ）のＤＮＡと実質的に同一の配列を有するＤＮＡとすることができる。
【００２７】
具体的には、ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、（ｂ）配列番号４〜６のいずれかに記載の配列において、１もしくは数個（好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個）のヌクレオチドが置換、挿入または欠失された配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡの少なくとも一部とすることができる。当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、野生型プロモーターのヌクレオチド配列の部分的な置換、挿入または欠失などの改変により、野生型プロモーターと同等またはそれ以上のプロモーター活性を有するＤＮＡを調製することが可能である。
【００２８】
また、ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、（ｃ）配列番号４〜６のいずれかに記載の配列と相同性が６０％以上（好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）の配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡの少なくとも一部とすることができる。このようなＤＮＡには、（ａ）のＤＮＡの、自然界に存在する変異型遺伝子もしくは人為的に改変した変異型遺伝子または異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
【００２９】
相同性の比較は、通常、容易に入手できる配列比較プログラムを用いて行うことができる。商業的に入手可能なそのようなコンピュータープログラムは２以上の配列の間の％相同性を計算することができる。ほとんどの配列比較方法においては、全体としての相同性スコアに不当にペナルティを与えることなく可能な挿入および欠失を考慮に入れて、最適な整列を生じさせるよう設計される。これは、「ギャップ」を配列の整列に挿入して、局所的な相同性を最大化するよう努めることによって達成される。このような方法では、できる限り少数のギャップにおける配列の整列が、多くのギャップにおけるものより高いスコアを達成するように、各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てて、相同性を計算する。ほとんどの整列プログラムはギャップペナルティを設定することができる。しかしながら、配列比較のためのそのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。このような配列比較を実行できるソフトウェアの例として、ＢＬＡＳＴパッケージ(Ausubel et al.,1999 ibid-Chapter18参照)、ＦＡＳＴＡ(Atschul et al.,1990,J.Mol.Biol.,403-410)およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられる。
【００３０】
また、ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡは、（ｄ）（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、プロモーター活性を有するＤＮＡの少なくとも一部とすることができる。ここで、ＤＮＡは通常、互いに相補的な二本鎖ＤＮＡ構造を有している。このため、（ａ）のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとは、（ａ）のＤＮＡのいずれかの鎖とハイブリダイズする鎖を有するＤＮＡをいうことに留意すべきである。
【００３１】
なお、ストリンジェントな条件およびハイブリダイゼーションの方法は、例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 第2版, 1989に従って設定することができる。具体的には、ストリンジェントな条件は、「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」とすることができ、よりストリンジェントな条件は、「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」とすることができ、さらにストリンジェントな条件は、「０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」とすることができる（１ｘＳＳＣ：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）。ただし、これらの条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記または他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３２】
なお、（ｂ）〜（ｄ）のＤＮＡのプロモーター活性は、例えば、以下に詳細に説明するように、ルシフェラーゼアッセイ法、ＣＡＴ法等により測定することができる。また、（ｂ）〜（ｄ）のＤＮＡは、（ａ）のＤＮＡと「同様」のプロモーター活性を有することが好ましい。ここで、「同様」のプロモーター活性を有するとは、質的に類似のプロモーター活性を有することをいい、例えば、（ｂ）〜（ｄ）のＤＮＡが、（ａ）のＤＮＡと少なくとも１つの因子（活性型ＳＲＥＢＰ２等の転写因子等）について同一の制御を受ける場合が含まれる。一方で、「同様」のプロモーター活性を有するとは、量的に同程度のプロモーター活性を有することを意図するものではない。また、当業者には明らかなように、プロモーター活性を発揮するために、ＤＮＡは、配列番号４〜６のいずれかに記載の配列（またはこれと実質的に同一の配列）の全てを有する必要はなく、その一部であってもよい。上記したように、プロモーター活性を有するのに必要な領域は、当業者であれば、ルシフェラーゼアッセイ法、ＣＡＴ法等により適宜決定することができる。
【００３３】
ＳＲＥ配列は、ＳＲＥＢＰが特異的に結合する能力を有するいかなる配列でもよく、例えば、配列番号７〜１０に記載のコンセンサス配列を有することが好ましい。また、ＳＲＥ配列は、配列番号１１、１２に記載の、ラット肝臓型ＡＢＣＡ１プロモーター領域中のＳＲＥと相同なＳＲＥコンセンサス配列を有することが好ましい。換言すると、ＳＲＥ配列は、配列番号７〜１２に記載のコンセンサス配列を有し、ＳＲＥＢＰが特異的に結合できる配列であることが好ましい。なお、配列番号１１、１２に記載のＳＲＥコンセンサス配列は、後述する配列番号１４に記載のＳＲＥ配列に相補的な配列に相同な配列である。
【００３４】
なお、配列番号７〜１２に記載のＳＲＥコンセンサス配列を一塩基または多塩基置換することにより、ＳＲＥ配列を不活化させることができる。(J Biol Chem. 1999 Feb 26;274(9):5285-91., PNAS. 2004 Aug 3;101(31):11245-50)変異の導入はクイックチェンジ（ストラタジェン）やオルタドサイトズ（プロメガ）やジーンエディター（プロメガ）などのキットを用いて行うことができる。また、制限酵素を用いてコンセンサス配列そのものを除去することで、ＳＲＥを不活性化させるのと同様の効果を得ることもできる。
【００３５】
ＳＲＥＢＰが特異的に結合する能力の有無は、例えば、以下に詳細に説明するように、ゲルシフトアッセイ、DNase Iフットプリンティング法、クロマチン免疫沈降法（ＣｈｉＰアッセイ）等により測定することができる。なお、「特異的に結合する」とは、好ましくは生理的条件下（好ましくは天然の細胞、組織または生物内と同等の条件下）で、当該タンパク質の目的のＤＮＡ配列への結合能が、当該タンパク質の他の無作為なＤＮＡ配列への結合能と比べて、有意に大きいことをいう。
【００３６】
［ゲルシフトアッセイ］
ゲルシフトアッセイは、ＤＮＡとタンパク質との相互作用を検出する方法である。一般的には、32Ｐで標識したＤＮＡ断片と目的のタンパク質とを混合し低塩濃度の未変性ゲルで電気泳動しＤＮＡをオートラジオグラフィーで検出する。タンパク質と結合したＤＮＡは遊離ＤＮＡと比べゲル中で移動度が遅れるため検出が可能となる。
【００３７】
［DNase Iフットプリンティング法］
DNase Iフットプリンティング法は、塩基配列特異的ＤＮＡ分解酵素であるDNase IでＤＮＡを部分的に消化する際、ＤＮＡに結合しているタンパク質は、結合部位のホスホジエステル結合をDNase Iによる攻撃から保護することを利用し、ＤＮＡとタンパク質との相互作用を検出する方法である。ＤＮＡ断片の一端を放射性同位元素で標識しておき、DNase I反応後の生成物を高分解能ゲル電気泳動で分離した後、ゲルのオートラジオグラムを得ると、タンパク質結合部位のバンドが消失することになる。同じＤＮＡ断片をタンパク質非存在下においてDNase I処理したものとMaxam-Gilbertシークエンス反応(Maxam, A. & Gilbert, W., Methods Enzymol., 65, 499, 1980)したものを同時に電気泳動することにより、タンパク質の結合部位が同定できる。
【００３８】
［クロマチン免疫沈降法（ＣｈｉＰアッセイ）］
クロマチン免疫沈降法は、ホルムアルデヒド等を用いて細胞内でＤＮＡとタンパク質を架橋し、目的のタンパク質に対する特異的な抗体を使った免疫沈降法と組み合わせることで、細胞内に実際に存在するクロマチンＤＮＡ上でのＤＮＡとタンパク質の相互作用を検出する方法である。ホルムアルデヒド等によりＤＮＡと目的のタンパク質の架橋を行い、目的のタンパク質に対する抗体で免疫沈降を行った後、可逆反応により架橋を外し、タンパク質を除き、ＤＮＡ断片を回収する。回収されたＤＮＡを鋳型にして、目的のＤＮＡ配列の特異的プライマーを用いてＰＣＲまたはＰＣＲ／サザンブロットで解析を行う。
【００３９】
具体的には、ヒトＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１におけるＳＲＥ配列として、TCTCAGCTGAG（配列番号１３、配列番号１の２４２８５〜２４２９５位に対応）が見出されている。また、マウスおよびラットＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１におけるＳＲＥ配列として、GTCTGGTGAGA（配列番号１４、配列番号２の１５６６６〜１５６７６位および配列番号３の１５９５４〜１５９６４位に対応）が見出されている。通常、ＳＲＥ配列は、配列番号１３または１４に記載の野生型配列と５０％以上の相同性を有し、好ましくは６０％以上の相同性、さらに好ましくは８０％以上の相同性を有する。
【００４０】
また、上記したように、本発明の他の側面によると、ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有する組換えＤＮＡが提供される。本発明にかかる組換えＤＮＡは、転写最小プロモーターをさらに有することが好ましい。最小プロモーターの例として、ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のプロモーター、ＣＭＶ初期プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明にかかる組換えＤＮＡは、協調因子の結合配列をさらに有することが好ましい。このような協調因子の例として、ＮＦ−ＹやＳＰ１などが挙げられる。また、協調因子の結合配列とＳＲＥ配列との距離は、５０塩基以内であることが好ましい。
【００４１】
本発明にかかるＤＮＡは、ゲノムライブラリーからの選別や、ゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により取得できる。ゲノムライブラリーからの選別は、適当なベクターに組み込んだゲノムＤＮＡと、目的のＤＮＡの一部の配列を有する標識ＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって行うことができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 第2版, 1989に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。また、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲは、目的のＤＮＡの一部の配列を有するプライマーを用いて行うことができる。ヌクレオチド配列の改変は、例えば、制限酵素またはＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法による改変、合成変異ＤＮＡの直接導入などの方法により行うことができる。
【００４２】
本発明の他の側面によると、ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡを有する組換えベクターが提供される。組換えベクターは、当該プロモーター活性を有するＤＮＡに作動可能に連結した構造遺伝子をさらに有してもよい。以下に詳細に説明するように、構造遺伝子は、例えば、組換えベクターをスクリーニングに用いる場合、その転写量および／または発現量を測定できるものであれば、任意の遺伝子でよい。
【００４３】
本発明にあっては、ベクターは、任意のベクター、例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどであってよい。より具体的には、本発明に用いることができるベクターの例として、動物細胞用のベクターであるｐＣＤベクター、ｃＤＭ８ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノアソシエイトウイルスベクターなどや、細菌用のベクターであるｐＵＣなどを挙げることができる。構造遺伝子をベクター内に組み込むためには、構造遺伝子が正しく転写される方向に、さらにプロモーターが構造遺伝子に対して適正に機能する位置関係になる様に、プロモーター領域の下流に構造遺伝子を連結すればよい。プロモーターと構造遺伝子との連結は、制限酵素切断部位を利用して行うことができ、また、適当な制限酵素部位がなくてもリガーゼ反応を用いて行うことができる。本発明にかかる組換えベクターは、プロモーター活性を促進するエンハンサー領域等の転写調節領域、転写停止部位などその他の要素を有してもよい。
【００４４】
なお、「作動可能に連結」とは、一の遺伝子要素が、他の遺伝子要素に対して予測されるように機能できるように配置されていることをいう。例えば、プロモーターが、構造遺伝子の転写の開始を助ける場合には、プロモーターは構造遺伝子に作動可能に結合している。この機能的な関係が維持される限り、プロモーターと構造遺伝子との間に残基が介在してもよい。
【００４５】
本発明の他の側面によると、ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有する外因性のＤＮＡに作動可能に連結した構造遺伝子を有する形質転換体が提供される。本明細書において、形質転換体は、広く、外部からＤＮＡが導入された結果、新しい形質を獲得した生物をいう。形質転換体は、任意の生物であってよく、また、任意の生物に由来する任意の細胞または組織であってよい。特に、本発明にかかる形質転換体は、上記組換えベクターで形質転換された形質転換体を含む。
【００４６】
組換えベクターにより形質転換することができる宿主の例として、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などを挙げることができる。これらの宿主への形質転換の方法の例として、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターによる遺伝子導入法、マイクロインジェクション法などを挙げることができる。
【００４７】
本発明の他の側面によると、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質をスクリーニングするためのキットが提供される。本発明にかかるキットは、動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質をスクリーニングするために用いることができる。以下に詳細に説明するように、ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡを用いることで、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質をスクリーニングすることができる。すなわち、本発明にかかるキットは、上記組換えベクターおよび／または上記形質転換体を有する。
【００４８】
本発明にかかるキットには、スクリーニングの方法に応じて、酵素、酵素基質、緩衝液等の試薬、培地、道具等を組み合せることができる。酵素基質の例として、ルシフェリン、ＡＴＰ、［14Ｃ］クロラムフェニコール、アセチルＣｏＡを挙げることができる。緩衝液として、解析に用いる酵素の活性の維持に好適な緩衝液を適宜選択することができる。道具の例として、ＴＬＣ用展開シート、メンブレン等を挙げることができる。
【００４９】
本発明の他の側面によると、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質、特に、肝臓においてＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質のスクリーニング方法が提供される。特に、本発明にかかるスクリーニング方法によると、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を促進する物質をスクリーニングすることができる。本発明にかかるスクリーニング方法は、動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質をスクリーニングするために用いることができる。本発明にかかるスクリーニング方法は、ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡを用いることを特徴とする。当該ＤＮＡを用いることにより、本発明にかかるスクリーニング方法によると、例えば活性型ＳＲＥＢＰ量を増加させる作用を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００５０】
具体的には、本発明にかかるスクリーニング方法は、
被検物質を供するステップと、
ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡに作動可能に連結した構造遺伝子を有するＤＮＡを有する細胞または生物の複数の群を供するステップと、
前記被検物質を前記細胞または生物の少なくとも１つの群に接触させるステップと、
前記被検物質を接触させた群と接触させなかった群とにおいて、前記遺伝子の転写量および／または発現量を測定するステップと、
前記被検物質を接触させた群と接触させなかった群の前記転写量および／または発現量を比較するステップと
を含むことが好ましい。
【００５１】
被検物質として、単一の化合物または組成物、天然または合成化合物、有機または無機化合物、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、細胞抽出物、細胞培養上清、その他の任意の物質を供することができる。
【００５２】
スクリーニングは、インビトロおよびインビボのいずれでも行うことができる。本発明にかかるスクリーニング方法において用いられる細胞または生物として、細菌等の原核生物（大腸菌等）、酵母（サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライヴェロマイセス(Kluyveromyces)属等）、昆虫、植物もしくは動物またはこれらに由来する細胞が挙げられる。動物の例として、恒温動物、特にヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ等の哺乳動物を挙げることができる。本発明で用いられる細胞は、実験室で培養することのできる培養細胞であることが好ましく、初代培養肝細胞であることがさらに好ましい。細胞は、恒温動物、特にヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ等の哺乳動物に由来することができ、ヒトに由来することが好ましい。また、細胞は、肝臓に由来することが好ましい。
【００５３】
本発明に用いられる細胞または生物は、ＡＢＣＡ１遺伝子のイントロン１中のＳＲＥ配列を含み、プロモーター活性を有するＤＮＡに作動可能に連結した構造遺伝子を有するＤＮＡを有することが好ましい。当該ＤＮＡは、内因性であっても、または外因性であってもよい。外因性である場合、当該ＤＮＡは、任意の手段により細胞または生物に導入されてもよい。例えば、スクリーニングに培養細胞を用いる場合、培養細胞への当該ＤＮＡの導入方法として、本発明の属する技術分野において汎用される任意の方法を採用することができる。例えば、ＤＮＡの導入方法の例として、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気パルス穿孔法等が挙げられるが、これらに限定されない。いずれの方法においても、用いる細胞に応じて至適化されたトランスフェクション条件を用いることが好ましい。
【００５４】
構造遺伝子は、その転写量および／または発現量を測定できるものであれば、任意の遺伝子でよい。当業者に明らかなように、上記構造遺伝子は、その転写量および／または発現量の測定方法に応じて、適宜選択することができる。上記構造遺伝子の例として、ＡＢＣＡ１、所定の活性を有するタンパク質（ルシフェラーゼ等）、所定の抗体が結合できるタンパク質、所定の物質が特異的に結合できるタンパク質（ＧＳＴ等）等をコードする遺伝子を挙げることができ、特に、ホタルルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、分泌型アルカリホスファターゼおよび緑色蛍光蛋白質からなる群より選択されるタンパク質をコードする遺伝子（いわゆるレポーター遺伝子）を挙げることができる。
【００５５】
被検物質を細胞または生物に接触させることは、当業者に明らかなように、任意の方法により行うことができる。例えば、培養細胞を用いる場合、被検物質を培地中に添加することで、接触させることができる。すなわち、培養細胞を用いる場合、細胞を、被検物質の存在下または非存在下で培養することが好ましい。また、動物を用いる場合は、任意の手段による投与により、例えば、任意の経路からの注射により、接触させることができる。被検物質を細胞または生物へ接触させる時間は、被験物質の効果、濃度、細胞または生物の種類および技術的考慮に応じて、適宜設定することができる。また、被験物質の濃度は、その毒性、透過性、細胞数、処理時間等に応じて、適宜設定することができ、通常１ｎＭ〜１ｍＭであることが好ましい。培養細胞を用いる場合、一般的にこのような処理は、多くの試験を同時に実施できるマルチウェルプレートで実施することが好ましい。培養細胞を用いる場合、被験化合物の処理によるレポーター遺伝子の発現が測定可能な条件は、細胞が生存してレポーター遺伝子の発現産物が生産可能な条件であれば良い。特に好ましい条件にあっては、好ましくは使用される細胞株に適した培地を使用し、４〜６％の炭酸ガス存在下、３６〜３８℃で５〜７２時間培養する。
【００５６】
被検物質を接触させた群と接触させなかった群とにおいて、上記構造遺伝子の転写量および／または発現量を測定し、これらの転写量および／または発現量を比較することで、当該被検物質を、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質の候補物質とすることができるか否か判断することができる。具体的には、ある被検物質を接触させた群で、接触させなかった群と比べて、上記遺伝子の転写量および／または発現量が変化した場合、特に増加した場合、当該被検物質を候補物質とすることができる。
【００５７】
被検物質を接触させた群と接触させなかった群とにおいて、上記構造遺伝子の転写量および／または発現量を測定するステップと、被検物質を接触させた群と接触させなかった群の転写量および／または発現量を比較するステップは、当業者に明らかなように、任意の方法により行うことができる。具体的には、ノーザンブロッティング法、ＤＮＡアレイ法等により、上記遺伝子の転写量を測定することができる。また、ルシフェラーゼアッセイ法やＣＡＴ法等により、上記遺伝子の発現量を測定することができる。さらに、上記所定の遺伝子に対する抗体が入手可能な場合は、ＥＬＩＳＡ法、免疫沈降法、ウエスタンブロッティング法により、当該遺伝子の発現量を測定することができる。また、上記所定の遺伝子として、ＧＳＴ等の所定の物質に特異的に結合するタンパク質の遺伝子を用いる場合は、当該タンパク質を沈降させ、沈降したタンパク質の量を測定することで、上記遺伝子の発現量を測定することができる。
【００５８】
［ノーザンブロッティング法］
ノーザンブロッティング法は、変性したＲＮＡを変性条件下のアガロース電気泳動で分離し、ニトロセルロースフィルターに移して、標識した特異的なプローブで検出するものである。ＲＮＡを変性させるのは、ＲＮＡは分子内に二次構造を持つため、そのままではサイズに従った正確な分離ができず、さらに、フィルターは一本鎖の核酸しか結合できないためである。
【００５９】
［ルシフェラーゼアッセイ法、ＣＡＴ法］
ルシフェラーゼアッセイ法およびＣＡＴ法は、目的とする遺伝子の転写調節領域の下流にレポーターとしてＬＵＣ（ルシフェラーゼ）またはＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子を組み込んだプラスミドを作成し、そのプラスミドを導入した細胞の酵素活性を測定するものである。具体的には、ルシフェラーゼアッセイ法は、マグネシウム存在下、ルシフェラーゼがルシフェリンとＡＴＰから酸化ルシフェリンとＡＭＰを作る反応を触媒する際に発する波長５６０ｎｍの光を、ルミノメーターを使って検出するものである。ＣＡＴ法の場合、基質の［14Ｃ］クロラムフェニコールが、ＣＡＴによりアセチル化されて、［14Ｃ］アセチルクロラムフェニコールが産生される。このサンプルを酢酸エチルで抽出し、薄層のシリカゲルプレート上に展開後、移動度の異なるスポットの放射活性を測定する。
【００６０】
本発明の他の側面によると、上記スクリーニング方法によりスクリーニングされた、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質、特に、肝臓においてＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整する作用を有する物質が提供される。特に、上記したように、本発明にかかるスクリーニング方法によると、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を促進する物質をスクリーニングすることができる。このため、本発明の他の側面によると、上記スクリーニング方法によりスクリーニングされた、動脈硬化性疾患の予防または治療に有用な物質が提供される。
【００６１】
本発明の他の側面によると、活性型ＳＲＥＢＰの量を変化させる作用を有する物質を含有する、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写調整剤が提供される。特に、活性型ＳＲＥＢＰの量を変化させる作用を有する物質が、活性型ＳＲＥＢＰの量を増加させる作用を有することが好ましい。ＡＢＣＡ１遺伝子の転写調整剤は、活性型ＳＲＥＢＰの量を変化させる作用を有する物質を、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調整するのに有効な量含有する。有効な量は、当業者であれば、転写調整剤を用いる目的、条件等に応じて、適宜設定することができる。なお、活性型ＳＲＥＢＰはステロール応答性配列（ＳＲＥ配列）を標的とする転写因子で、活性型ＳＲＥＢＰを過剰発現させることでＳＲＥ配列下の転写が活性化されることが知られている。より具体的には、活性型ＳＲＥＢＰは、以下のように制御されることが知られている。一般に、ＳＲＥＢＰは小胞体膜に結合した形で存在している。細胞内コレステロール量が減少すると、ＳＲＥＢＰはプロセシングを受けて膜から切り離され活性型ＳＲＥＢＰ（Ｎ末端４８０アミノ酸）として核内に移行し、標的遺伝子の転写を活性化あるいは抑制する。切断が行われるゴルジ体への輸送は、ステロールの低下により行われる。ＳＲＥＢＰはＳＣＡＰ(SREBP cleavage activating protein)と結合しＩＮＳＩＧ−１によって小胞体に留められているが、コレステロール量が減少するとＩＮＳＩＧ−１が解離し、ＳＲＥＢＰ−ＳＣＡＰ複合体がゴルジ体に移行する。
【００６２】
また、活性型ＳＲＥＢＰの量を変化させる作用を有する物質が、ピタバスタチン、シムバスタチンおよびアトルバスタチンを除く物質であることが好ましく、スタチン系薬剤を除く物質であることがさらに好ましい。活性型ＳＲＥＢＰの量を変化させる作用を有する物質は、不活性型ＳＲＥＢＰを活性型ＳＲＥＢＰに（または活性型を不活性型に）変換する作用を有する物質であってもよく、また、例えば、活性型ＳＲＥＢＰを発現させることで、活性型ＳＲＥＢＰの量を直接変化させる作用を有する物質であってもよい。具体的には、活性型ＳＲＥＢＰの量を変化させる作用を有する物質が、活性型ＳＲＥＢＰ発現ベクター、細胞内コレステロール量を減少させる作用を有する物質、ＳＲＥＢＰの前駆体（不活性型ＳＲＥＢＰ）から核内移行型（活性型ＳＲＥＢＰ）へのプロセシングを促進する作用を有する物質、活性型ＳＲＥＢＰの分解を抑制する作用を有する物質からなる群から選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。より具体的には、細胞内コレステロール量を減少させる作用を有する物質の例として、コレステロール合成阻害剤、ＬＤＬ受容体阻害剤、胆汁酸吸着樹脂が挙げられる。また、ＳＲＥＢＰの前駆体から核内移行型へのプロセシングを促進する作用を有する物質の例として、インシュリンが挙げられる。その他、活性型ＳＲＥＢＰの量を変化させる作用を有する物質の例として、ＡＴＰやインポーチンβ、ＡＬＬＮなどのプロテアソーム阻害剤が挙げられる。
【実施例】
【００６３】
本発明は以下の実施例においてより具体的に説明される。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
【００６４】
［実施例１：スタチン系薬剤のＡＢＣＡ１遺伝子発現に対する影響］
スタチン系薬剤がＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現に及ぼす影響を、以下の方法で調べた。ヒト肝ガン由来培養細胞ＨｅｐＧ２およびラット繊維芽細胞Ｒａｔ２を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で、マウス単球由来細胞Ｒａｗ２６４を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地でそれぞれ培養し、被験化合物を含む無血清培地（０．２％ＢＳＡ）で２４時間処理した。ＨｅｐＧ２細胞およびＲａｗ２６４細胞には、被験化合物として、コンパクチンを最終濃度５０μＭで添加した。Ｒａｔ２細胞には、被験化合物として、プラバスタチンを、最終濃度５０μＭで添加した。それぞれ、溶剤のみを添加したものを対照とした。また、雄性ラットに被験化合物を経口投与し、その後該動物個体から肝臓を摘出した。被験化合物として、プラバスタチンを０．１％の濃度で飲料水に添加して１週間投与した。培養細胞およびラット組織からRNeasy（QIAGEN社製）を用いてＲＮＡを調製した。7700 Sequence Detector（ＡＢＩ社製）システムを用いたTaqManリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲにより、調製したＲＮＡ中におけるＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ量を測定した。各試料中のｍＲＮＡ量は、それぞれ１８ＳＲＮＡまたはＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対して正規化を行った。
【００６５】
ヒト肝ガン由来培養細胞ＨｅｐＧ２を５０μＭのコンパクチンで処理すると、ＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ量の増加が認められた（図１Ａ）。また、雄性ラットにプラバスタチンを０．１％飲料水に添加して１週間投与した場合にも、肝臓のＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ量の増加が認められた（図１Ｂ）。しかし、ラット繊維芽細胞Ｒａｔ２やマウス単球由来細胞ＲＡＷ２６４のような末梢系細胞ではＡＢＣＡ１遺伝子の発現量は低下した（図１Ｃ，Ｄ）。したがって、肝臓のＡＢＣＡ１遺伝子は末梢組織とは異なる機構で発現制御されていると考えられる。
【００６６】
［実施例２：ヒト、マウスおよびラット肝臓で発現するＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ］
５’−ＲＡＣＥ法により、ヒト、マウスおよびラット肝臓で発現しているＡＢＣＡ１のｍＲＮＡの５’末端領域を解析した。プライマーはＡＢＣＡ１のｍＲＮＡエクソン４および５の配列を基に設計した。配列番号１５〜２０に、ヒト、マウスおよびラット肝臓のそれぞれに対して用いた遺伝子特異的プライマーの配列を示す。これらのプライマーを用い、GeneRacerキット（Invitrogen社製）の添付プロトコールに従い、ヒト肝臓由来総ＲＮＡ（Human Liver Total RNA；クロンテック社製）、マウス肝臓由来総ＲＮＡ（Mouse Liver Total RNA；クロンテック社製）および雄性ウィスター系ラット肝臓より抽出した総ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを増幅した。
【００６７】
ヒト、マウスおよびラット肝臓において、２または３種類の異なる転写開始点を持つＡＢＣＡ１のｍＲＮＡを検出した。配列番号２１〜２３にヒトＩ型〜III型のＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡを、配列番号２４，２５にマウスＩ型、II型のものを、配列番号２６〜２８にラットＩ型、II型、II’型のものの配列をそれぞれ示す。図２は、検出したＡＢＣＡ１のｍＲＮＡの５’末端の模式図である。ここでＩ型と仮称したｍＲＮＡは、これまで５’−ＲＡＣＥ法を用いてヒト繊維芽細胞やヒト単球由来ＴＨＰ−１細胞から同定されたＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ［NM_005502］に相同する配列（ラット［NW_178095］およびマウス［NM_013454］）であり、既報のプロモーター領域（エクソン１上流、Proc.Natl.Acad.Sci.(2000)97, 7987）により転写制御を受けると考えられる。他の２種類はＩ型とは異なる新規なＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡであった。特に、II型と命名したｍＲＮＡは、ヒト、マウス、ラットに共通に発現しており、Ｉ型が持つエクソン１領域を欠損しており、エクソン２から転写が開始されるｍＲＮＡである。ラット肝臓のII’型ｍＲＮＡはII型の５’側が６８塩基短縮されたｍＲＮＡに相当し、転写制御はII型と同一であると予測される。
【００６８】
［実施例３：ラット組織におけるＡＢＣＡ１のｍＲＮＡ発現分布］
ラットの各組織（肝臓、脳、心臓、腎臓、肺、筋肉、脾臓および精巣）から得られたｍＲＮＡ（ラットＭＴＣパネルＩ；クロンテック社製）を用い、各組織におけるＩ型およびII型ＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡの分布を調べた。ラットＩ型ＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡ量はエクソン１領域（Ｉ型特有の非翻訳領域）を認識するプライマー・プローブ、また総ＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡ量はタンパク質をコードする領域の配列を基に作成したプライマー・プローブを用いて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量した。以下に、Ｉ型ＡＢＣＡ１検出用プローブおよび総ＡＢＣＡ１検出用プローブの配列を示す。
【００６９】
・ラットＩ型ＡＢＣＡ１検出用標識プローブ（配列番号２９）
FAM-ccctactttt ttctcccggt ttctgg-TAMRA
・ラットＩ型ＡＢＣＡ１検出用フォワードプライマー（配列番号３０）
tctgctccct gtccccac
・ラットＩ型ＡＢＣＡ１検出用リバースプライマー（配列番号３１）
ccaaccccta cacaaaccct
・ラット総ＡＢＣＡ１検出用標識プローブ（配列番号３２）
FAM-tctttgctca gattgtcctg ccggc-TAMRA
・ラット総ＡＢＣＡ１検出用フォワードプライマー（配列番号３３）
cccggcggag tagaaagg
・ラット総ＡＢＣＡ１検出用リバースプライマー（配列番号３４）
agggcgatgc aaacaaagac
【００７０】
上記の方法で、各組織についてＩ型と総ＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡの発現量を測定すると、Ｉ型とII型の発現は組織間で異なり、II型は主に肝臓および腎で発現していることが判明した（図３）。そこでII型を肝臓型、これに対しＩ型を末梢型と呼ぶことにした。
【００７１】
［実施例４：コンパクチンによる新規な肝臓型ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーターの活性化］
肝臓型（II型）ＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡの発現調節領域の解析を行った。まず、ラット尾ゲノムＤＮＡから末梢型（Ｉ型）および肝臓型（II型）ＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡの転写開始点上流領域約１０００塩基をクローニングした。配列番号３５に、ラット末梢型ＡＢＣＡ１転写開始点上流領域の配列を示す。配列番号６に、ラット肝臓型ＡＢＣＡ１転写開始点上流領域の配列を示す。得られた転写開始点上流領域を、ホタルルシフェラーゼベクターｐＧＬ３（プロメガ社製）に組み込み、レポータープラスミドを構築した。ＭｃＡＲＨ７７７７細胞への一過性トランスフェクションにより、レポータープラスミドおよび遺伝子導入効率補正用のウミシイタケルシフェラーゼレポータープラスミドｐｈＲＬ−ＴＫ（プロメガ社製）を形質導入し、５０μＭプラバスタチンを含む１０％脱脂血清培地で１６時間処理した。その後、細胞を回収し、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社製）により細胞内ルシフェラーゼ活性を測定した。なお、転写活性は次のように定義して評価した。
（転写活性）＝（ホタルルシフェラーゼ活性測定値）／（ウミシイタケルシフェラーゼ活性測定値）
【００７２】
細胞をプラバスタチン処理することにより、末梢型転写開始点上流領域を組み込んだレポータープラスミドの転写活性は低下した（図４）。逆に、肝臓型転写開始点上流領域を組み込んだレポータープラスミドの転写活性は増大した。この結果は、スタチン系薬剤によるＡＢＣＡ１遺伝子発現の肝臓と末梢における応答性の違い（実施例１、図１）とよく一致した。従って、該肝臓型転写開始点上流領域が肝臓でのＡＢＣＡ１遺伝子発現を制御していることが示唆された。
【００７３】
［実施例５：肝臓型ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーター活性を調節するＳＲＥ配列］
スタチン系薬剤はステロール合成を阻害することにより、転写因子として機能する活性型（核内移行型）ＳＲＥＢＰを二次的に増加させることが知られている。上記したように、活性型ＳＲＥＢＰ２はステロール応答性配列（ＳＲＥ配列）を標的とする転写因子で、活性型ＳＲＥＢＰ２を過剰発現することでＳＲＥ配列下の転写が活性化されることが知られている。上記したように、ＳＲＥ配列は、配列番号７〜１２に記載のコンセンサス配列を有し、ラットの肝臓型ＡＢＣＡ１プロモーター領域に見出された（配列番号１４）。
【００７４】
そこで、肝臓型ＡＢＣＡ１プロモーター配列内に存在するＳＲＥ配列の変異解析を行った。実施例４で得られたラット肝臓型ＡＢＣＡ１プロモーターのＳＲＥ配列を、変異型ＳＲＥ配列を含む合成オリゴヌクレオチドおよびクイックチェンジ（ストラタジェン社製）を用いて機能的に不活性化した。配列番号３６に、変異型ＳＲＥ配列の配列を示す。なお、この変異型ＳＲＥ配列(GTGCGGCCGC）は、配列番号１４に記載のＳＲＥ配列(GTCTGGTGAGA)にＮｏｔＩの認識配列を導入したものであり、ＳＲＥとして機能しないことが報告されている(J Biol Chem. 2003 Sep 19;278(38):36176-82.)。
【００７５】
上述した方法（実施例４）に従い、野生型あるいは変異型ＳＲＥを有する肝臓型ＡＢＣＡ１レポータープラスミドをＭｃＡＲＨ７７７７細胞に形質導入した。実施例５にあっては、５０μＭプラスバスタチンの代わりに、５０μＭコンパクチンで処理し、転写活性を測定した。
【００７６】
さらに、スタチン系薬剤で処理する代わりに、活性型ＳＲＥＢＰ２の過剰発現させた際の転写活性も測定した。活性型ＳＲＥＢＰ２の過剰発現実験においては、野生型あるいは変異型ＳＲＥを有する肝臓型ＡＢＣＡ１レポータープラスミドに加えて、さらにｐＭＥ−ＳＲＥＢＰ２（１−４８０）あるいはｐＭＥ−１８Ｓプラスミド（非特許文献１３、J.Biol.Chem. (2003)36176）を共導入した。ｐＭＥ−ＳＲＥＢＰ２（１−４８０）プラスミドは、活性型ＳＲＥＢＰ２であるＳＲＥＢＰ２のアミノ酸残基１〜４８０を発現することができるベクターであり、ｐＭＥ−１８Ｓプラスミドは、その空ベクターである。
【００７７】
コンパクチンによるラット肝臓型プロモーター転写活性促進作用は、配列中のＳＲＥの変異により消失した（図５）。活性型ＳＲＥＢＰ２を過剰発現した場合にも転写が活性化されるが、これもＳＲＥ変異により消失した（図５）。したがって、プロモーター内に存在するＳＲＥ配列が肝臓のＡＢＣＡ１遺伝子の転写調節に機能していることが判明した。
【００７８】
［実施例６：ヒト肝臓型ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーターのＳＲＥＢＰ２による活性化］
ヒトゲノムＤＮＡ（Human Genomic DNA；クロンテック社製）から、ヒト肝臓型ＡＢＣＡ１プロモーターをクローニングした。配列番号４に、ヒト肝臓型ＡＢＣＡ１転写開始点上流領域の配列を示す。得られた転写開始点上流領域を、ホタルルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ３（プロメガ社製）に組み込んだ。ヒト肝臓型ＡＢＣＡ１レポータープラスミドおよびウミシイタケルシフェラーゼレポータープラスミドｐｈＲＬ−ＳＶ４０（プロメガ社製）を、ｐＭＥ−１８ＳまたはｐＭＥ−ＳＲＥＢＰ２プラスミドと共に、ＨｅｐＧ２細胞へ形質導入し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で１６時間培養した。その後、細胞を回収し細胞内ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００７９】
ヒト肝臓型ＡＢＣＡ１プロモーターの活性は、活性型ＳＲＥＢＰ２の過剰発現により増大した（図６）。したがって、ヒト肝臓のＡＢＣＡ１遺伝子もラット肝臓と同様の転写制御を受けていると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１Ａは、コンパクチンで処理したヒト肝臓由来培養細胞ＨｅｐＧ２におけるＡＢＣＡ１遺伝子の発現量変化を示すグラフである。図１Ｂは、プラバスタチンを投与したラットの肝臓におけるＡＢＣＡ１遺伝子の発現量変化を示すグラフである。図１Ｃは、プラバスタチンで処理したラット繊維芽細胞Ｒａｔ２におけるＡＢＣＡ１遺伝子の発現量変化を示すグラフである。図１Ｄは、コンパクチンで処理したマウス単球由来細胞ＲＡＷ２６４におけるＡＢＣＡ１遺伝子の発現量変化を示すグラフである。
【図２】図２は、５’−ＲＡＣＥ法により解析したラット、マウスおよびヒト肝臓で発現するＡＢＣＡ１のｍＲＮＡの５’末端の模式図である。
【図３】図３は、ラット各組織（肝臓、脳、心臓、腎臓、肺、筋肉、脾臓および精巣）で発現する総ＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡ量および末梢型（Ｉ型）ＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡ量を示したグラフである。
【図４】図４Ａは、プラバスタチンによるラット末梢型（Ｉ型）ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーターの活性化を示したグラフである。図４Ｂは、プラバスタチンによるラット肝臓型（II型）ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーターの活性化を示したグラフである。
【図５】図５は、ラット肝臓型（II型）ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーターの活性がＳＲＥ配列の変異により消失したことを示すグラフである。
【図６】図６は、ヒト肝臓型（II型）ＡＢＣＡ１遺伝子プロモーターの活性がＳＲＥＢＰ２の発現増加により活性化されることを示すグラフである。
【図１】
2007082445.tif 000002
【図２】
2007082445.tif 000003
【図３】
2007082445.tif 000004
【図４】
2007082445.tif 000005
【図５】
2007082445.tif 000006
【図６】
2007082445.tif 000007
【配列表】
2007082445000001.app