(57)【要約】【課題】  生体適合性に優れ、効能の異なる薬剤を所望のタイミングで徐放させることができるような薬剤送達用担体を提供する。【解決手段】  α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、カルシウム欠損型水酸アパタイト、水酸アパタイトなどを含み、中空球状粒子構造をとることを特徴とする薬剤送達用担体、及びその製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸カルシウムを含み、中空球状粒子構造をとることを特徴とする薬剤送達用担体。
【請求項２】
リン酸カルシウムが、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、カルシウム欠損型水酸アパタイト、及び水酸アパタイトからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤送達用担体。
【請求項３】
薬剤送達用担体が、血管から生体内へ投与する薬剤送達用担体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の薬剤送達用担体。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の薬剤送達用担体の内部と表面に薬剤を担持させたことを特徴とする医薬。
【請求項５】
担体の内部にゆっくりと効果を発揮させたい薬剤を担持させ、担体の表面に早く効果を発揮させたい薬剤を担持させたことを特徴とする請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
カルシウム塩とリン酸塩とを含む溶液に超音波を照射し、前記溶液の霧状の液滴を発生させる工程、前記液滴を加熱し、リン酸カルシウムを含む中空球状粒子を形成させる工程、及び前記中空球状粒子を回収する工程を含むことを特徴とする薬剤送達用担体の製造方法。
【請求項７】
超音波照射時の振動数を変化させることにより中空粒子の粒径を制御することを特徴とする請求項６に記載の薬剤送達用担体の製造方法。
【請求項８】
回収した中空球状粒子を加熱することを特徴とする請求項６又は７に記載の薬剤送達用担体の製造方法。
【請求項９】
回収した中空球状粒子を洗浄することを特徴とする請求項６又は７に記載の薬剤送達用担体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の薬剤を生体内の必要な場所に送達するための担体、及びその担体の製造方法、並びに前記担体を利用した医薬に関する。本発明の薬剤送達用担体は、生体適合性に優れ、また、効能の異なる薬剤を二段階で徐放することができ、抗癌剤や血管新生抑制剤などの送達に有用である。
【背景技術】
【０００２】
薬剤送達システム（Drug Delivery System:DDS）は必要な薬剤を必要な場所に送達する技術である。DDSは既に公知の技術であり、その担体として生分解性ポリマー（PLLA）や生体高分子（コラーゲンやゼラチン）などが利用されている。例えば、ポリマーを担体に使用する場合、薬剤をポリマー基材に練り込むことが多く、薬剤の放出はポリマーの溶解が律速となり、効能の異なる薬剤を所望のタイミングで徐放させるようなインテリジェントな薬剤徐放は難しい。また、ポリマーの生体適合性は生体が許容できるレベルであるが優れているとはいえず、生体由来材料には免疫系の問題がある。
【０００３】
ところで、リン酸三カルシウムなどのリン酸カルシウムは、生体適合性に優れていることから従来から様々な生体材料として利用されてきている。例えば、特許文献１には、噴霧熱分解法によってリン酸カルシウムの中空体を得て、これを生体材料として使用することが記載されている。また、特許文献２には、噴霧熱分解法によりリン酸カルシウムの中空状粒子を形成し、これをジルコニアを含む基材上に堆積させた生体材料について記載されている。
【０００４】
リン酸カルシウムを薬剤送達用の担体として使用することは、特許文献３に記載されている。特許文献３には、リン酸カルシウムからなるビーズやリン酸三カルシウムからなる成形多孔体をドラッグデリバリー材料として用いることが記載されている。しかし、特許文献３には、リン酸カルシウムを中空球状粒子とすることや担体を血管から投与することについては記載されていない。
【０００５】
【特許文献１】特開昭61-132555号公報
【特許文献２】特開20001-231849号公報
【特許文献３】特表2003-515571号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の薬剤送達用担体は、生体適合性や徐放性などについて問題があった。本発明は、これら従来の薬剤送達用担体の問題点を解決した新規な薬剤送達用担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、超音波噴霧熱分解法によって作製したリン酸カルシウムの中空球状粒子が薬剤送達用担体として優れた効果を持つことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（９）を提供するものである。
（１）リン酸カルシウムを含み、中空球状粒子構造をとることを特徴とする薬剤送達用担体。
（２）リン酸カルシウムが、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、カルシウム欠損型水酸アパタイト、及び水酸アパタイトからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする（１）に記載の薬剤送達用担体。
（３）薬剤送達用担体が、血管から生体内へ投与する薬剤送達用担体であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の薬剤送達用担体。
（４）（１）乃至（３）のいずれかに記載の薬剤送達用担体の内部と表面に薬剤を担持させたことを特徴とする医薬。
（５）担体の内部にゆっくりと効果を発揮させたい薬剤を担持させ、担体の表面に早く効果を発揮させたい薬剤を担持させたことを特徴とする（４）に記載の医薬。
（６）カルシウム塩とリン酸塩とを含む溶液に超音波を照射し、前記溶液の霧状の液滴を発生させる工程、前記液滴を加熱し、リン酸カルシウムを含む中空球状粒子を形成させる工程、及び前記中空球状粒子を回収する工程を含むことを特徴とする薬剤送達用担体の製造方法。
（７）超音波照射時の振動数を変化させることにより中空粒子の粒径を制御することを特徴とする（６）に記載の薬剤送達用担体の製造方法。
（８）回収した中空球状粒子を加熱することを特徴とする（６）又は（７）に記載の薬剤送達用担体の製造方法。
（９）回収した中空球状粒子を洗浄することを特徴とする（６）又は（７）に記載の薬剤送達用担体の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の薬剤送達用担体は、生体適合性に優れ、また、効能の異なる薬剤を二段階で徐放することができ、抗癌剤や血管新生抑制剤などの送達に有用である。また、本発明の薬剤送達用担体は、球状であることから血管の内皮を傷つけることなく、患部に送達させることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の薬剤送達用担体は、リン酸カルシウムを含み、中空球状粒子構造をとることを特徴とするものである。
【００１１】
リン酸カルシウムの種類としては、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、カルシウム欠損型水酸アパタイト、および水酸アパタイトなどを例示できる。本発明の薬剤送達用担体は、これら４種のリン酸カルシウムのいずれか１種のみを含むものであってもよく、また、２種以上を含むものであってもよい。これらのリン酸カルシウムはα−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウム、カルシウム欠損型水酸アパタイトおよび水酸アパタイトの順で生体内で吸収を受けるため、病態や加齢などを考慮してリン酸カルシウムの組成を選ぶことができるが、最も好ましい組成は生体吸収性材料として実績のあるβ−リン酸三カルシウムあるいはβ−リン酸三カルシウムとアパタイトの二相混合タイプである。なお、「カルシウム欠損型水酸アパタイト」とは、式：Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x・nH2O〔0＜x≦1、n = 0〜2.5〕で表される物質をいう。
【００１２】
中空球状粒子構造は、血管内に注入でき、薬剤を必要な場所に送達できるような構造であれば特に限定されない。球状粒子の粒径も特に限定されないが、0.1〜20 μmであることが好ましく、1〜5 μmであることが更に好ましい。
【００１３】
本発明の薬剤送達用担体は、超音波噴霧熱分解法（例えば、M. Aizawa, T. Hanazawa, K. Itatani, F. S. Howell and A. Kishioka, "Characterization of hydroxyapatite powders prepared by ultrasonic spray-pyrolysis technique", J. Mater. Sci., 34, 2865-2873 (1999).や板谷清司, 相澤守, “噴霧熱分解法を利用した多機能セラミックスの作製”, J. Soc. Inorg. Mater. Jpn., 10, 285-292(2003).など）によって作製することができる。即ち、カルシウム塩とリン酸塩とを含む溶液に超音波を照射し、前記溶液の霧状の液滴を発生させ、次いで、前記液滴を加熱し、リン酸カルシウムを含む中空球状粒子を形成させ、更に、前記中空球状粒子を回収することによって、本発明の薬剤送達用担体を作製できる。
【００１４】
カルシウム塩とリン酸塩とを含む溶液は、通常の超音波噴霧熱分解法に用いられるものでよく、例えば、Ca / P比が1.50前後となるように調製された硝酸カルシウム、リン酸水素二アンモニウム、及び硝酸を含む溶液を使用できる。溶液中のカルシウム塩及びリン酸塩の濃度により、リン酸カルシウムの組成比が変わるので、カルシウム塩及びリン酸塩の濃度によって、粒子のリン酸カルシウムの組成を調整できる。
【００１５】
超音波の周波数は、通常の超音波噴霧熱分解法に用いられるものでよく、例えば、0.5 〜 3.0 MHzとすることができる。超音波の周波数により、粒子の粒径を変えることができる。例えば、粒径2.5 μm程度のものを得たい場合には、超音波の周波数を0.5 MHz程度とすればよく、粒径1 μm程度のものを得たい場合には、超音波の周波数を3.0 MHz程度とすればよい。
液滴の加熱は、通常、低温と高温の二段階で行う。低温加熱の温度は300 〜 500 ℃とするのが好ましく、高温加熱の温度は800 〜1100 ℃とするのが好ましい。加熱時の温度により、リン酸カルシウムの組成比が変わるので、加熱温度によって、粒子のリン酸カルシウムの組成を調整できる。
【００１６】
上記方法によって得られる中空球状粒子に対して洗浄処理を行ってもよい。この洗浄処理によって、硝酸イオンが除去され、粒子の表面積が増大し、より好適な薬剤送達用担体となる。
また、上記方法によって得られる中空球状粒子に対して加熱処理を行ってもよい。洗浄処理と同様、加熱処理によっても硝酸イオンを除去できる。また、加熱処理によって、リン酸カルシウムの組成を調整することもできる。例えば、Ca/P比1.50の溶液から中空微小球を合成した場合、1000 ℃で加熱するとβ-リン酸三カルシウム相が、1200 ℃で加熱するとα-リン酸三カルシウム相が得られる。
【００１７】
本発明の薬剤送達用担体に薬剤を担持させたものは医薬として利用することができる。担持させる薬剤としては、例えば、抗がん剤のプラチナ製剤（シスプラチン、カルボプラチン）、パクリタキセル、メドロキシプロゲステロン（ホルモン剤）、5-フルオロウラシル（5-FU）、血管新生抑制剤のサリドマイドやBevacizumabを例示できる。これらの薬剤を本発明の薬剤送達用担体に担持させるには、薬剤を含む溶液中に本発明の薬剤送達用担体を浸漬して凍結乾燥すればよい。薬剤溶液中に浸漬する時間は特に制限はなく、合目的的な任意の時間でよい。通常、数分〜48時間、好ましくは、1〜30 時間である。
【００１８】
本発明の薬剤送達用担体は、担体の表面と内部（空隙部分）に異なる薬剤を担持させることができる。このような二種類の薬剤の担持は、例えば、以下のようにして行うことができる。まず、担体を内部に充填したい薬剤Aに浸漬したのち、十分に真空脱気して薬剤を内部に充填させる。その後、微小球表面に担時させたい薬剤Bを含む溶液中に担体を浸漬して凍結乾燥すればよい。このとき、ゼラチンなどを用いて薬剤Bを含む溶液の粘性を増加させて担体表面にコーティングする方法を採用してもよい。
【００１９】
担体の内部に担持させた薬剤は生体内へゆっくりと拡散していき、一方、担体の表面に担持された薬剤は直ちに生体内へ拡散していく。従って、担体の内部にゆっくりと効果を発揮させたい薬剤を担持させ、担体の表面に早く効果を発揮させたい薬剤を担持させることが好ましい。ゆっくりと効果を発揮させたい薬剤としては、血中半減期の長い薬剤を例示でき、例えば、Bevacizumab（血中半減期：17-21日）、サリドマイド（血中半減期：9.4時間）、パクリタキセル（血中半減期：9.9-16時間）、メドロキシプロゲステロン（血中半減期：16日）などを挙げることができ、早く効果を発揮させたい薬剤としては、血中半減期の短い薬剤を例示でき、例えば、シスプラチン（血中半減期：約40分）、カルボプラチン（血中半減期：2-3時間）、5-FU（血中半減期：24分）などを挙げることができる。
【００２０】
本発明の薬剤送達用担体は、通常、カテーテルなどにより血管に注入して使用するが、これ以外の使い方をしてもよい。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００２２】
〔実施例１〕  生体吸収性微小球の合成
〔超音波噴霧熱分解装置〕
本実験で用いた超音波噴霧熱分解装置の概略図を図１に示す。本装置は、噴霧部、加熱部、粉体捕集部および制御部から構成される。各部の詳細を以下に示す。
【００２３】
i）  噴霧部
試料溶液を霧状にするための噴霧器として超音波発振器（本多電子製 HM-303N）を用いた。その概略図を図２に示す。超音波発振器からの振動を、水を媒体としてラップ膜に伝え、試料溶液を振動させることで液滴を発生させた。発振器の周波数は2.4 MHz であった。
【００２４】
ii）  加熱部
加熱部は小型電気炉（アサヒ理化製作所 ARF-30 M：最高使用温度 1200 ℃）を上下二つに重ねて使用した。下部電気炉は低温（300〜500 ℃）に設定し、液滴の乾燥および溶媒の除去、上部電気炉は高温（850〜1000 ℃）に設定し熱分解に用いた。この二つの電気炉により反応管（ムライト製；長さ1 m，内径3 cm）を加熱した。
【００２５】
iii）  粉体捕集部
粉体を捕集するフィルターとして、ガラス繊維製試験管型ろ紙（東洋ろ紙社製 THIMBLE FILTER 86R 22 mmφ×90 mm）を用いた。また、溶媒である水が捕集した粉体中に混入しないよう捕集部の周りをマントルヒーターを用いて約120 ℃に保持し、水蒸気の凝縮を防いだ。
【００２６】
iv）  制御部
上部および下部の電気炉の温度はそれぞれクロメル／アルメルの熱電対を用いて測定し、シマデン製SR-22温度調節計およびPAC15Z電力調節器を用いて制御した。
【００２７】
〔試料溶液の調製および合成〕
リン酸カルシウム粉体を合成するための試料溶液を、Ca / P比が1.50となるように硝酸カルシウム（Ca(NO3)2），リン酸水素二アンモニウム（(NH4)2HPO4）および硝酸（HNO3）を用いて調製した。本実験で用いた試料溶液の調製条件および熱分解条件を表１に示す。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
噴霧用試料溶液を超音波噴霧熱分解装置の下部に設置した超音波発振器を用いて微細な液滴とし、加熱部に空気流量1.5 dm3・min-1導入した。導入された液滴は溶媒の除去および析出物の熱分解を経て粉体となった。粉体の収量は溶液の濃度に依存したが、1 時間あたり約0.2〜0.5 gの範囲であり、収率は約70〜80 ％の範囲であった。
【００３０】
合成粉体の結晶相の同定を粉末X線回折法(XRD)と赤外吸収スペクトル法(FT-IR)によって行い、各粉体中の水酸アパタイト（HAp）、β−リン酸三カルシウム（β-TCP）、及びα−リン酸三カルシウム（α-TCP）の比を求めた。結果を図３に示す。図３に示すように、熱分解温度の低い場合には、結晶相は水酸アパタイトの単一相（Sample No.1）、又は水酸アパタイトとβ−リン酸三カルシウムとの混合相（Sample No.2-5）となった。一方、熱分解温度の高い場合には、結晶相はα−リン酸三カルシウムとβ−リン酸三カルシウムの混合相（Sample No.6-9）となることが多かったが、溶質濃度の高いSample No.10では、水酸アパタイトも存在した。
【００３１】
また、粉体（Sample No.1-5）の形態観察を走査型電子顕微鏡(SEM)によって観察した。各粉体のSEM写真を図４に示す。SEM写真から各粉体粒子の平均粒径を求めたところ、0.85-1.4μmであった。
【００３２】
〔超音波振動数による粒径制御〕
超音波発振器(明治大学 物理学科 崔 博抻 教授作製)の振動数は岩通製ファンクション・ジェネレーターSG-4105を用いて調節し、エヌエフ回路設計ブロック株式会社製HSA41010 10 MHzスーパーボイラー電源を用いて超音波を伝送させた。なお、実験に適用した振動数は 0.5, 1.0, 1.5, 2.5, 3.0 MHzとし、試料溶液および電気炉条件は表１のSample No. 4で行った。各粉体のSEM写真を図５に示す。図５に示すように、振動数を大きくするに従い粉体の粒径が小さくなる傾向がみられた。振動数を0.5〜3.0 MHzに調整することで、粉体の平均粒径を1〜2.5μmに制御することができた。
【００３３】
〔洗浄粉体の調製〕
合成した粉体（Sample No.1-5）約2 gに対し、50 cm3の純水中で超音波洗浄を1分間行った。この洗浄操作を2回行った後、アセトン20 cm3で置換し、液体窒素で急速冷凍後、凍結乾燥を24 時間行い洗浄粉体とした。
【００３４】
洗浄粉体と非洗浄粉体の赤外吸収スペクトル及び比表面積をそれぞれ図６及び図７に示す。なお、粉体の比表面積はBET法により測定し、粉体の粒度分布はSEM写真からサンプル数200-400個の粒子径を計測して求めた。
図６に示すように、非洗浄粉体において観察される硝酸イオンの吸収ピークが洗浄粉体では消失している。従って、粉体を洗浄することによって粉体から硝酸イオンを除去できると考えられる。
【００３５】
図７に示すように、洗浄粉体の比表面積は、非洗浄粉体の表面積の1.5-2倍に上昇しており、洗浄処理により粉体の表面積を増大できると考えられる。
【００３６】
〔加熱粉体の調製〕
合成した粉体（Sample No.4）を示差熱重量分析の結果から以下の条件で加熱した。
加熱温度： 600 ℃, 800 ℃, 1000 ℃, 1200 ℃
昇温速度： 10 ℃・min-1
保持時間： なし
加熱した粉体と加熱していない粉体のSEM写真、粉末X線回折(XRD)、赤外吸収スペクトル、及び比表面積をそれぞれ図８、図９左、図９右、及び図１０に示す。
【００３７】
図１０に示すように、800℃以上の加熱により粉体の比表面積が減少した。また、図９左に示すように、800℃以上の加熱により、結晶相がα−リン酸三カルシウムとβ−リン酸三カルシウムの混合相となった（但し、1000℃の加熱ではβ−リン酸三カルシウムの単一相）。更に、洗浄の場合と同様、加熱により粉体から硝酸イオンが除去された（図９右）。
【００３８】
〔実施例２〕  薬剤徐放実験モデル
〔ウシ血清由来アルブミン（BSA）の吸着実験〕
PBS(-)溶液を用いてBSAの2000 ppm溶液を調製した。合成した粉体（Sample No. 4）0.1 g に調製した溶液5 cm3を加え、恒温振とう槽（37 ℃, 100 回・min-1）中でBSAを吸着させた。BSAの吸着量は、以下に示す時間でBSAを吸着していたサンプルを、遠心分離し、上清を取り出し、吸光光度計で残ったBSAの量を測定した。
【００３９】
吸着時間： 30 min, 1, 3, 5, 10, 24, 48, 72 h
吸収波長： 280 nm
BSAの吸着時間と吸着量の関係を図１１に示す。図１１に示すように、BSAの吸着量は24時間でほぼ一定になった。
【００４０】
〔BSAの徐放実験〕
合成粉体1.0 gに、PBS(-)溶液を用いて2000 ppmに調製したBSA溶液50 cm3を加え、恒温振とう槽（37 ℃, 100 回・min-1）中でBSAを24 時間吸着させた。遠心分離で上清を取り除いた後、BSAを吸着させた粉体を真空脱気によって乾燥した。乾燥後、粉体はBSAの徐放評価に用いた。
【００４１】
乾燥した粉体にPBS(-)20 cm3を加え、恒温振とう槽（37 ℃, 100 回・min-1）中でBSAの徐放挙動を調べた。以下の設定時間ごとに、遠心分離をし、上清を新しいPBS(-)と交換し、徐放評価終了後、上清のBSAの量を吸光光度計で測定した。
徐放時間： 30 min, 1, 3, 5, 10, 24, 48, 72, 120, 168 h
BSAの除放時間と総計除放量の関係を図１２に示す。図１２に示すように、48時間までに急激な一段階目の除放が、48時間以降ゆっくりな二段階目の除放が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】実験に使用した超音波噴霧熱分解装置の概略図。
【図２】実験に使用した超音波噴霧熱分解装置の噴霧部の概略図。
【図３】粉体結晶中のHAp、β-TCP、α-TCPの存在比を示す図。
【図４】粉体粒子のSEM写真。
【図５】超音波の振動数の異なる粉体粒子のSEM写真。
【図６】粉体の赤外吸収スペクトル。
【図７】粉体の比表面積を示す図。
【図８】加熱粉体粒子のSEM写真。
【図９】加熱粉体の粉末X線回折図（左）及び加熱粉体の赤外吸収スペクトル（右）。
【図１０】加熱粉体の比表面積を示す図。
【図１１】BSAの吸着時間と吸着量の関係を示す図。
【図１２】BSAの徐放時間と徐放量の関係を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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