(57)【要約】【課題】グルタミン酸及び／又はその塩類から、γ−アミノ酪酸を効率よく生成し、かつγ−アミノ酪酸を高濃度で含有する組成物を製造する方法を提供することを目的とする。【解決手段】グルタミン酸及び／又はその塩類を添加した培地に、新規乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−４株又はラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−６を接種し培養し、グルタミン酸及び／又はその塩類を複数回添加すること及び／又は培地のｐＨを４．０〜６．０に調整することで、γ−アミノ酪酸を効率よく生産する。さらに、得られた発酵液をろ過、カラム精製することで、γ−アミノ酪酸を高含有する組成物を得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩を含む培地で増殖するに従い、培養液中にγ−アミノ酪酸を蓄積する能力を有する乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−４（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ＵＡＳ−４）（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７１０）。
【請求項２】
グルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩を含む培地で増殖するに従い、培養液中にγ−アミノ酪酸を蓄積する能力を有するラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−６（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ＵＡＳ−６）（ＦＥＲＭ  ＡP−２０７１１）。
【請求項３】
グルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩を含む培地で請求項１記載のラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−４又は請求項２記載のラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−６を培養し、培養液中に蓄積したγ−アミノ酪酸を回収することを特徴とするγ−アミノ酪酸の製造方法。
【請求項４】
請求項１記載のラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−４又は請求項２記載のラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−６を増殖させた培地に、培地に対して１０〜２０質量％のグルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩を一度に、又は分割して添加し、ｐHを４．０〜６．０に保持しながら２０〜３５℃で培養することを特徴とするγ−アミノ酪酸の製造方法。
【請求項５】
グルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩を含む培地で請求項１記載のラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−４又は請求項２記載のラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−６を培養し、培養液中にγ−アミノ酪酸を蓄積させた後、培養液から菌体を除去し、濃縮後乾燥してγ−アミノ酪酸を４０質量％以上にすることを特徴とするγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法。
【請求項６】
グルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩を含む培地で請求項１記載のラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−４又は請求項２記載のラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−６を培養し、培養液中にγ−アミノ酪酸を蓄積させた後、培養液から菌体を除去し、イオン交換樹脂を用いて精製を行いγ−アミノ酪酸を固形分にして９０質量％以上にすることを特徴とするγ−アミノ酪酸高含有組成物の製造方法。
【請求項７】
請求項３及び／又は４記載のγ−アミノ酪酸、請求項５記載のγ−アミノ酪酸含有組成物又は請求項６記載のγ−アミノ酪酸高含有組成物のいずれかを含有することを特徴とする飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−アミノ酪酸産生能をもつ新規乳酸菌株、その乳酸菌を用いたγ−アミノ酪酸の製造方法及びγ−アミノ酪酸高含有組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
γ−アミノ酪酸（γ−ａｍｉｎｏ ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ、以下、ＧＡＢＡと略す。）は生物界に微量ながら広く存在する非タンパク質構成アミノ酸であり、ヒトにおいては脳内で神経伝達物質として働くことが知られている。食品素材としてのＧＡＢＡは血圧降下作用、精神安定作用、脳機能改善作用、更年期障害症状緩和作用、中性脂肪増加抑制作用等の健康維持意識の高い現代人にとって有効な生理作用を有している。その上、ＧＡＢＡはヒトが多量に摂取しても副作用が無いので、安全性の面でも有利であり、食事療法が効果的な生活習慣病、特に高血圧症を予防する成分として食品に付加させる開発が多くなされている。
【０００３】
そのようなものとして、米胚芽、米糠、小麦胚芽などの中に元来含まれる酵素の作用を利用してＧＡＢＡ富化穀物を製造する技術（例えば、特許文献１及び２参照）、トマト、カボチャ等の野菜などの中に含まれる酵素の作用を利用してＧＡＢＡ富化組成物を製造する技術（例えば、特許文献３〜５参照）、茶葉を嫌気処理することによってＧＡＢＡ含量の高い茶葉を製造する技術（例えば、特許文献６参照）などが報告されている。
【０００４】
また、一部の微生物がグルタミン酸からＧＡＢＡを生産する能力に優れていることが知られており、ＧＡＢＡを乳酸菌で製造する技術（例えば、特許文献７、８、１０、１１及び１２）や麹菌で製造する技術（例えば、特許文献９参照）、などが報告されている。これらの中でも乳酸菌はＧＡＢＡの生産効率が良く、例えばラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）（特許文献１１）、ラクトバチルス・ヒルガルディー（Ｌ．ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）（特許文献８）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（特許文献７、１０）、ラクトバチルス・ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）（特許文献１２）などが開示されている。
【０００５】
一方で、本発明者らは、アスパラガスは種々の野菜、果物の中においてもＧＡＢＡが著しく多く含まれており、グルタミン酸からＧＡＢＡに変換する酵素も多く持っていることを見出し既に特許出願した（特願２００４−３０１５５７号、特願２００５−１６４１０７号）。
【特許文献１】特許第２５９０４２３号公報
【特許文献２】特開２００４−１５９６１７号公報
【特許文献３】特公平７−１２２９６号公報
【特許文献４】特公平７−１４３３３号公報
【特許文献５】特開２００１−２５２０９１号公報
【特許文献６】特許第３０３８３７３号公報
【特許文献７】特開２００１−３５２９４０号公報
【特許文献８】特開２００３−７０４６２号公報
【特許文献９】特開平１１−１０３８２５号公報
【特許文献１０】特許２７０４４９３号公報
【特許文献１１】特開２００４−２１５５２９号公報
【特許文献１２】特開２００１−１２０１７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、これまで開示されていた微生物はＧＡＢＡの生産効率は低く、例えばラクトバチルス・プランタラムで最終的に培養液の２質量％以下（特許文献７、１０）、ラクトバチルス・ブレビスでは１．１質量％程度（特許文献１１）、ラクトバチルス・ラクティスでは１質量％以下であった（特許文献１２）。これまで開示されている乳酸菌で最も効率よくＧＡＢＡを生産できると考えられるラクトバチルス・ヒルガルディーでさえも４８時間後では培養液の４．８質量％、７２時間後で５．１質量％であった（特許文献８）。従来知られていた乳酸菌では純度を高くするには長時間が必要で、培地からＧＡＢＡを含有する粉末や濃縮物を製造した場合、最高でも２０質量％程度にしかならなかった。このようにＧＡＢＡ含量が少ない組成物は製造効率が悪いのみならず、飲食品に配合する際に味質や臭いの変化が問題になっていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記した課題について鋭意検討した結果、野菜より分離した乳酸菌がグルタミン酸からＧＡＢＡを効率よく生産できることを見出し、更には生産されたＧＡＢＡを簡便に高純度化できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、グルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩を含む培地で増殖するに従い、培養液中にγ−アミノ酪酸を蓄積する能力を有する乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−４（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ＵＡＳ−４）（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７１０）を要旨とするものである。また、別の本発明は、グルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩を含む培地で増殖するに従い、培養液中にγ−アミノ酪酸を蓄積する能力を有するラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−６（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ＵＡＳ−６）（ＦＥＲＭ  ＡP−２０７１１）を要旨とするものである。
【０００９】
また、別の本発明は、グルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩を含む培地で前記のラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−４又は前記の請求項２記載のラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−６を培養し、培養液中に蓄積したγ−アミノ酪酸を回収することを特徴とするγ−アミノ酪酸の製造方法を要旨とするものである。また、別の本発明は、前記のラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−４又は前記のラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−６を増殖させた培地に、培地に対して１０〜２０質量％のグルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩を一度に、又は分割して添加し、ｐHを４．０〜６．０に保持しながら２０〜３５℃で培養することを特徴とするγ−アミノ酪酸の製造方法を要旨とするものである。
【００１０】
また、別の本発明は、グルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩を含む培地で前記のラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−４又は前記のラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−６を培養し、培養液中にγ−アミノ酪酸を蓄積させた後、培養液から菌体を除去し、濃縮後乾燥してγ−アミノ酪酸を４０質量％以上にすることを特徴とするγ−アミノ酪酸含有組成物の製造方法を要旨とするものである。さらに、別の本発明は、グルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩を含む培地で前記のラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−４又は前記のラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−６を培養し、培養液中にγ−アミノ酪酸を蓄積させた後、培養液から菌体を除去し、イオン交換樹脂を用いて精製を行いγ−アミノ酪酸を固形分にして９０質量％以上にすることを特徴とするγ−アミノ酪酸高含有組成物の製造方法を要旨とするものである。
【００１１】
さらに、別の本発明は、前記したγ−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸含有組成物又はγ−アミノ酪酸高含有組成物のいずれかを含有することを特徴とする飲食品を要旨とするものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、高濃度のＧＡＢＡ含有組成物を安全な微生物を用いて短時間に容易に得ることができる。また、本発明のＧＡＢＡ含有組成物は高濃度であるために飲食品に配合する場合も少量で効果が期待でき、飲食品の味に悪影響を及ぼすことがない。また、ＧＡＢＡの作用により、血圧降下、リラックス、ストレス緩和、更年期障害症状改善、不眠改善、利尿、腎機能改善、肝機能改善等の効果が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−４及びラクトバチルス・ブレビスＵＡＳ−６は、以下の表1の様な性質を有する。
【００１４】
【表１】
2007135416.tif 000002
また、ＵＡＳ−４及びＵＡＳ−６の１６Ｓ  ｒＲＮＡのうち５’−末端側の約５００塩基についてＤＮＡシーケンサーを用いて特定した結果、いずれも全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ）の保有するラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）の１６S  ｒＲＮＡ配列と９９％以上の相同性を有していた。
【００１５】
ＵＡＳ−６株については、Ｌ−アラビノースの資化性が陰性であり、一般的なＬ．ｂｒｅｖｉｓがＬ−アラビノースを良好に資化することから鑑みると、この株に特徴的な性質である。また、ＵＡＳ−４株及びＵＡＳ−６株のいずれも、後述するようにグルタミン酸又はグルタミン酸塩からγ−アミノ酪酸の産生能が従来公知のラクトバチルス・ブレビスと比較して顕著に高いことから、新規な乳酸菌であると判断し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託手続を行い、ＵＡＳ−４株は、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７１０として、またＵＡＳ−６株は、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７１１として、平成１７年１１月１１日に受領された。
【００１６】
次に、本発明のγ−アミノ酪酸の製造方法について説明する。
【００１７】
本発明のγ−アミノ酪酸の製造方法は、上記したＵＡＳ−４株又はＵＡＳ−６株を用いるところに特徴を有する。ＵＡＳ−４株、ＵＡＳ−６株を増殖させる培地には本発明の効果を損なわない限り、従来公知のあらゆる培地を使用することができる。かかる培地としては、乳酸菌の培養に一般的なＧＹＰ培地（Ｄ−グルコース１質量％、ペプトン０．５質量％、酵母エキス１質量％、酢酸ナトリウム３水和物０．２質量％、ツイン８０  ０．０５質量％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２質量％、硫酸マンガン４水和物１０ｐｐｍ、硫酸鉄７水和物１０ｐｐｍ、塩化ナトリウム１０ｐｐｍ）、ＦＹＰ培地（ＧＹＰ培地の糖がＤ−フルクトースになったもの）の他、市販のＧＡＭ培地（日水製薬社製）、ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）等を使用することもできるし、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、魚肉エキス、大豆分解物、ペプトン、ポリペプトン、ポテト浸出液等を単独で又は２種以上を水に溶解させた培地を使用することもできる。また、ＵＡＳ−４株及びＵＡＳ−６株は野菜から分離された株であり、野菜ジュース等を培地として用いたり、添加することでも良好に増殖させることができる。
【００１８】
本発明で用いられる培地中の糖としては、上記した市販培地に含まれるＤ−グルコース、Ｄ−フルクトースなどのほかに、ＵＡＳ−４株又はＵＡＳ−６株が資化性を有するものであればいかなる物も使用できる。かかる糖としては例えば、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−アラビノース（ＵＡＳ−４株のみ）、Ｄ−キシロース、マルトース、スクロース、Ｄ−リボース、メリビオース等であり、好ましくはＤ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、マルトースであり、さらに好ましくはＤ−グルコース、Ｄ−フルクトース、マルトースである。
【００１９】
本発明の製造方法では、上記した培地にグルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩を含ませることが必要である。ここで用いられるグルタミン酸塩としてはいかなるものでもよいが、食品添加物となっており、水への溶解性に優れるグルタミン酸ナトリウムが好ましい。グルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩の含有量は培地中に通常０．１質量％〜４０質量％であればよく、０．２質量％〜２５質量％が好ましく、３質量％〜２０質量％がさらに好ましい。０．１質量％より少なければ得られるＧＡＢＡの量が少なくなり、４０質量％より多ければグルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩が残存してしまうか、全量ＧＡＢＡに変換されたとしても長時間かかるので好ましくない。
【００２０】
培地中に含ませるグルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩は、乳酸菌を植菌して培養する培養開始時に上記した量が含まれていてもよく、また培養開始後に１回で全量添加する、あるいは培養の途中で複数回に分けて添加してもよい。作業性の面では１回で全量添加することが好ましいが、急激なｐＨの上昇を引き起こすため、これを防ぐためには少量ずつ添加することが好ましく、その場合は２回〜１０回、さらに好ましくは２回〜５回に分けて添加するのがよい。
【００２１】
本発明の製造方法においては、上記した培地にＵＡＳ−４株又はＵＡＳ−６株を接種して培養を開始する。この際、少量の菌体を接種することで増殖させることができるが、短期間で菌体濃度を上昇させる為には、前培養した菌液を接種することが好ましい。かかる前培養した菌液を接種する量としては、本培養の培地量の１００００分の１〜２分の１であり、１０００分の１〜１０分の１が好ましく、２００分の１〜３０分の１がさらに好ましい。この範囲より接種量が少なければ、菌体濃度の増加に時間がかかる問題があり、この範囲より多ければもはや前培養の時点で大きなスケールになっており、本培養を行う必要性がないということである。
【００２２】
本発明における培養条件としては、嫌気条件下でも好気条件下でもよいが、増殖の際には若干好気条件にした方がよい。そのためには、例えばバブリングや速い攪拌等を行う必要は無く、緩やかに攪拌する程度でよい。
【００２３】
培養温度としては、本発明の効果を損なわない限り限定されないが、通常５℃〜４５℃であり、好ましくは１５℃〜４０℃であり、さらに好ましくは２０℃〜３５℃である。培養温度がこの温度範囲より高くても低くても著しく増殖速度が劣る傾向にある。
【００２４】
また、培養液のｐＨは通常４．０〜６．０に調整することが好ましく、４．５〜５．５に調整することがより好ましい。ｐＨがこの範囲を外れると、乳酸菌が有するグルタミン酸脱炭酸酵素の活性が低下し、ＧＡＢＡの産生速度が低下する傾向がある。ｐＨ調整に用いる薬品はいかなるものも使用でき、例えば塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、酢酸、酪酸、乳酸、蟻酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、クエン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア水等が挙げられる。本発明ではＧＡＢＡの産生に応じてｐＨは上昇する傾向になり調整は主に酸を添加して行うため、これらの中で好ましくは、塩酸、リン酸、酢酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸であり、さらに好ましくは塩酸、乳酸、酢酸である。
【００２５】
上記のようにしてＵＡＳ−４株又はＵＡＳ−６株の培養を行えば、通常５時間〜５日間、好ましくは７時間〜２４時間で菌体濃度が増加してくる。菌体濃度が増加したことを知る方法としては、菌液の濁度を測定することが好ましい。菌液の濁度は、５００ｎｍ〜７２０ｎｍ、好ましくは６００ｎｍ〜６６０ｎｍの吸光度を測定して評価する方法であり、菌体濃度が増加した状態とは、菌体が入っていない培地のこの波長での吸光度を０とした場合に、菌液の濁度が１．０以上となっている状態である。
【００２６】
本発明の製造方法においては、グルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩を添加して２日以内に、好ましくは２４時間以内に、さらに好ましくは１０時間以内に、グルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩の９０％以上がＧＡＢＡに変換されることになる。ＧＡＢＡへの変換率は添加したグルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩の量に依存するものであり、グルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩の添加量が少なければ短時間で全量をＧＡＢＡに変換することができる。
【００２７】
本発明の製造方法によって培養液中に蓄積したＧＡＢＡは、その培養液そのままでも種々の用途に用いることができるが、菌体を除去して培養上清を用いるか培養上清を濃縮、乾燥してＧＡＢＡ含有組成物として用いることが好ましい。また、培養上清に晶析、イオン交換等の処理を施してＧＡＢＡの純度を向上させてＧＡＢＡ高含有組成物として用いることもできる。
【００２８】
培養液から菌体を除去するには、従来公知の方法で行えばよく、例えばフィルタープレス、ブフナー漏斗、遠心ろ過器、遠心分離機、デカンタ等を使用することができる。
【００２９】
ＧＡＢＡが蓄積した培養液を濃縮するには、従来公知の濃縮装置を使用することができ、例えばエバポレーター、濃縮缶の他、エバポール（大河原製作所）、ウォールウェッター（関西化学機械製作）等が挙げられる。
【００３０】
ＧＡＢＡが蓄積した培養液を乾燥するには、従来公知の乾燥装置を使用することができ、例えば真空凍結乾燥機、真空棚式乾燥機、温風乾燥機、真空ニーダー、リボコーン乾燥機、ドラムドライヤー、振動流動乾燥機、スプレードライヤー等が挙げられる。乾燥させる液は培養液そのままでも良いし、濃縮した物でも良いが、固形分濃度５〜７０質量％、好ましくは５〜５０質量％、さらに好ましくは１０〜４０質量％まで濃縮したものを使用することが好ましい。
【００３１】
上記のように乾燥させたものは粉砕して粉末状にすることもできる。粉砕には従来公知の粉砕機が使用でき、例えば乳鉢、ブレンダーミキサー、カッターミル、ハンマーミル、ジェットミル、フェザーミル等が挙げられる。
【００３２】
乾燥したもののＧＡＢＡ濃度は、産生したＧＡＢＡの量、添加したグルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩の量にもよるが、通常４０質量％以上となり、多いときでは４５質量％以上となる。
【００３３】
ＧＡＢＡ含有組成物中のＧＡＢＡの濃度をさらに向上させるために、さらなる精製を行ってもよく、かかる精製方法としては、晶析、限外ろ過、イオン交換、活性炭処理、クロマト分離等が挙げられる。これらの中で、限外ろ過、イオン交換樹脂、活性炭処理が好ましい。
【００３４】
晶析による精製は、従来公知の方法を用いることができ、例えば濃縮した後に冷却して結晶を析出させる方法や、有機溶媒を加えて結晶を析出させる方法などが挙げられる。中でもＧＡＢＡは水への溶解度が非常に高いことから、固形分濃度５０〜９０質量％、好ましくは６０〜９０質量％、さらに好ましくは６５〜８５質量％まで濃縮した水溶液に、有機溶媒を水溶液に対して１０００分の１等量〜２等量、好ましくは１００分の１等量〜１等量、さらに好ましくは１０分の１等量〜２分の１等量導入して、結晶を析出させることができる。かかる有機溶媒のうち好ましい例としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、アセトン、ヘキサン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド等が挙げられ、さらに好ましい例としてはエタノールである。析出した結晶は従来公知の方法で分離すれば良く、例えば遠心ろ過機、ブフナー漏斗、フィルタープレス等を使用することができる。
【００３５】
限外ろ過による精製は、高分子量の成分を除去することができるものであり、目的とするＧＡＢＡ純度になるように分画分子量を選定することができる。限外ろ過膜の分画分子量は好ましくは１０００〜２０００００であり、さらに好ましくは３０００〜１００００である。この範囲より低ければ精製に時間がかかる問題があり、この範囲より高ければＧＡＢＡ純度が向上しない問題がある。
【００３６】
イオン交換樹脂により精製は、従来公知の方法を用いることができるが、好ましくはイオン交換樹脂塔を用いた精製である。イオン交換樹脂としては陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂いずれも使用することができる。例えば陽イオン交換樹脂を用いる時には酸でＨ型に変換したところに培養液を通液してＧＡＢＡを樹脂に吸着させ、アルカリを通液してＧＡＢＡを溶離させる方法が好適に使われる。また陰イオン交換樹脂を用いる時にはアルカリでＯＨ型に変換したところに培養液を通液してＧＡＢＡを樹脂に吸着させ、酸を通液してＧＡＢＡを溶離させる方法が好適に使われる。イオン交換樹脂としては陽イオン交換樹脂が好ましく、特に強酸性陽イオン交換樹脂が好ましい。
【００３７】
イオン交換樹脂の好ましい例としては、三菱化学「ダイヤイオン」シリーズのＳＫ１Ｂ、ＳＫ１０２、ＳＫ１０４、ＳＫ１０６、ＳＫ１１０、ＳＫ１１２、ＳＫ１１６、ＰＫ２０８、ＰＫ２１２、ＰＫ２１６、ＰＫ２２０、ＰＫ２２８、室町ケミカル「ダウエックス」シリーズの５０Ｗ×２、５０Ｗ×４、５０Ｗ×８、５０Ｗ×１２、マラソンＣ、マラソンＨＳＣ、モスフィアー６５０Ｃ、ＨＣＲ−Ｗ２、ＨＧＲ−Ｗ２、８８、ＭＡＣ−３、ＨＣＲ−Ｓ、ムロマックＣ１０２Ｎａ、オルガノ「アンバーライト」シリーズのＩＲ１２０Ｂ、ＩＲ１２、２００ＣＴなどが挙げられ、これらの中でも特にダイヤイオンＳＫ１Ｂ、ＳＫ１０４、ＰＫ２０８、ダウエックス５０Ｗ×８、ムロマックＣ１０２Ｎａ、アンバーライトＩＲ１２０Ｂが好ましい。
【００３８】
本発明において好適に使用できる強酸性陽イオン交換樹脂の使用量は、添加したグルタミン酸及び／又はグルタミン酸塩に対して２倍量〜２０倍量、好ましくは３倍量〜１５倍量、さらに好ましくは５倍量〜１０倍量である。この範囲より少なければ吸着されずにＧＡＢＡが流出する問題があり、この範囲より多ければ再生、溶出に多量の溶液が必要となる問題がある。
【００３９】
陽イオン交換樹脂を使用する場合は例えば以下の様な方法で精製することができる。まず、従来公知の方法でH型に再生したイオン交換樹脂に、ＧＡＢＡを産生させた培養液をＳＶ＝０．０１〜５、好ましくはＳＶ＝０．１〜４、さらに好ましくはＳＶ＝１〜３の速度で通液してＧＡＢＡを吸着させる。その後、カラム容量の０．２〜２０倍量、好ましくは０．５〜１０倍量、さらに好ましくは１〜５倍量の脱イオン水を上記と同様の速度で通液して洗浄する。その後、０．０１規定〜２規定、好ましくは０．０１規定〜１規定、さらに好ましくは０．１規定〜０．５規定のアルカリ水溶液を上記と同様の速度で通液してＧＡＢＡを溶出させ、回収する。ここでＧＡＢＡの溶出に使用するアルカリとしては特に限定されないが、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、アンモニア水、炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、酢酸ナトリウム水溶液等が使用でき、これらの中でも水酸化ナトリウム水溶液、アンモニア水が好ましく、アンモニア水がより好ましい。
【００４０】
陰イオン交換樹脂を使用する場合は、例えば以下の様な方法で精製することができる。まず、従来公知の方法でOH型に再生したイオン交換樹脂に、ＧＡＢＡを産生させた培養液をＳＶ＝０．０１〜５、好ましくはＳＶ＝０．１〜４、さらに好ましくはＳＶ＝１〜３の速度で通液してＧＡＢＡを吸着させる。その後、カラム容量の０．２〜２０倍量、好ましくは０．５〜１０倍量、さらに好ましくは１〜５倍量の脱イオン水を上記と同様の速度で通液して洗浄する。その後、０．０１規定〜２規定、好ましくは０．０１規定〜１規定、さらに好ましくは０．１規定〜０．５規定の酸性水溶液を上記と同様の速度で通液してＧＡＢＡを溶出させ、回収する。ここでＧＡＢＡの溶出に使用する酸としては特に限定されないが、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、酢酸、シュウ酸等が使用でき、これらの中でも塩酸、硫酸、酢酸が好ましく、塩酸、酢酸がより好ましい。
【００４１】
活性炭処理による精製は、従来公知の方法を使用でき、活性炭をＧＡＢＡを含む培養液の中に投入して攪拌するバッチ法、活性炭をカラムに充填してその中に培養液を通液するカラム法のいずれの方法でもよい。
【００４２】
例えばバッチ法で活性炭処理を行う場合は、活性炭は表面積が大きいものの方が効率が良く、例えば二村化学工業（株）製の太閤ＳＡ１０００、太閤ＫＳ、太閤Ａ、武田薬品（株）製のカルボラフィン、強力白鷺、精製白鷺、特製白鷺、白鷺Ａ、白鷺Ｍ、三菱化学（株）製のダイヤソーブＦ、三井製薬工業（株）製の三井ＰＭ−ＫＩ、三井ＰＭ−ＫＯ、三井ＰＭ−ＳＸ、三井ＰＭ−ＦＺ、三井ＰＭ−ＳＡＹ、クラレケミカル（株）製のクラレコールＰＫ等が挙げられ、これらの中で太閤ＳＡ１０００、カルボラフィン、精製白鷺、三井ＰＭ−ＳＸ、三井ＰＭ−ＦＺが好ましく、太閤ＳＡ１０００、カルボラフィンがより好ましい。活性炭処理後には活性炭を分離するが、この分離にはフィルタープレス、ブフナー漏斗を用いたろ過等従来公知のろ過技術を用いることができる。
【００４３】
例えばカラム法で活性炭処理を行う場合は、通液時に圧力がかかる為ある程度粒度が大きい活性炭を使用することが好ましく、例えば、二村化学工業(株)製の太閤ＦＣ、太閤ＦＣＳ、武田薬品(株)製の粒状白鷺ＬＨｃ、粒状白鷺ＫＬ、三菱化学(株)製のダイアホープＳ６０、ダイアホープＳ７０、ダイアソーブＷ、三井製薬工業(株)製の三井ＭＭ−ＣＢＳ、三井ＢＭ−ＷＡ、クラレケミカル(株)製のクラレコールＧＬＣ等が挙げられ、これらの中で太閤ＦＣＳ、粒状白鷺ＫＬ、三井ＢＭ−ＷＡ、クラレコールＧＬＣが好ましく、粒状白鷺ＫＬ、三井ＢＭ−ＷＡがより好ましい。
【００４４】
活性炭の使用量は本発明の効果を損なわない限り限定されないが、バッチ法で活性炭処理を行う場合には、培養液の固形分に対して、１質量％〜５０質量％であり、５質量％〜３０質量％が好ましく、１０質量％〜２５質量％がさらに好ましい。この範囲より活性炭量が少なければ十分に脱色効果が得られない可能性があり、この範囲より活性炭量が多くてももはや脱色効果が向上するものではなく、攪拌が難しくなり、ろ過時にロスが出る可能性がある。
【００４５】
カラム法で活性炭処理を行う場合には、培養液の固形分に対して２０質量％〜５００質量％であり、５０質量％〜４００質量％が好ましく、１００質量％〜３００質量％がさらに好ましい。この範囲より活性炭量が少なければ十分に脱色効果が得られない可能性があり、この範囲より活性炭量が多くてももはや脱色効果が向上するものではなく、水押し量が多くなったりロスが出る可能性がある。
【００４６】
活性炭処理の時間は本発明の効果を損なわない限り限定されないが、バッチ法では攪拌しながら１０分〜２４時間であり、２０分〜５時間が好ましく、３０分〜２時間がさらに好ましい。活性炭処理の時間がこの範囲より短いと十分に脱色されない可能性が有り、この範囲より長くてももはや脱色効率が向上するものではない。カラム法での培養液の流速はＳＶ＝０．１〜１０であり、ＳＶ＝０．３〜５が好ましく、ＳＶ＝１〜３がさらに好ましい。培養液の流速がこの範囲より大きければ十分に脱色されない可能性が有り、この範囲より小さくとももはや脱色効率が向上するものではなく、いたずらに処理時間がかかるだけである。
【００４７】
次に、本発明の飲食品について説明する。
【００４８】
本発明の飲食品は、上記した本発明により得られたＧＡＢＡ及び／又はＧＡＢＡ含有組成物又はＧＡＢＡ高含有組成物それ自体あるいは既存の飲料又は食品にこれらを含ませることにより得ることができる。また、味質の改善等のために、本発明の効果を損なわない範囲で糖類、糖アルコール類、塩類、油脂類、アミノ酸類、有機酸類、果汁、野菜汁、香料、アルコール類、グリセリン等を添加することができる。
【００４９】
本発明の飲食品のベースとなる飲料又は食品としては、特に限定されず例えば飲料は清涼飲料水、アルコール類、果汁飲料、野菜汁飲料、乳飲料、炭酸飲料、コーヒー飲料、アルコール類等であることが好ましく、また食品はカプセル、グミ、キャンデー、錠剤、顆粒、ドリンク等の形状をしたサプリメントであってもよいし、通常の食事として摂る食品であってもよい。
【００５０】
本発明の飲食品に含ませるＧＡＢＡ含有組成物又はＧＡＢＡ高含有組成物の量としては、特に限定されないが、１日当たりに摂取する量がＧＡＢＡとして１０〜５００ｍｇになるように配合することが好ましい。この範囲より少ない場合は効果が望めない可能性があり、この範囲より多い場合はもはや効果の増大は見込めない可能性がある。本発明の飲食品に含ませるＧＡＢＡ含有組成物の形態は特に限定されず、飲料、グミ、キャンデーなどにおいては液体状の物を、錠剤、顆粒、カプセルなどにおいては粉末状の物を使用するなどすればよい。
【００５１】
本発明において、ＧＡＢＡ、アミノ酸の含有量は、以下の方法により求められた値である。すなわち、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）により以下の条件で測定し、蛍光検出器を用いて検出した。
ＨＰＬＣ：島津製作所（株）製ＬＣ−９Ａ
カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＩＳＣ−０７／Ｓ１５０４
移動相：０．２規定クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．２）
流速：０．３ｍｌ／分
温度：５５℃
反応液：オルト−フタルアルデヒド
検出波長：励起波長３４８ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本実施例中のＧＡＢＡ、アミノ酸の含有量は前記した方法で測定した。
【００５３】
実施例１
１．０重量％のグルタミン酸ナトリウムを含有するＧＹＰ培地５Ｌに、前培養したラクトバチルス  ブレビス  ＵＡＳ−４の菌体懸濁液１００ｍＬを添加して３０℃、２０ｒｐｍ、通気無しの条件で培養を開始した。培養開始から１日後に、４０質量％グルタミン酸ナトリウム水溶液を２．５Ｌ添加し、同時に２倍濃度のＧＹＰ培地２．５Ｌを追加して総量を１０Ｌとし、その後は６Ｎ塩酸を適時添加してｐＨを４．８±０．５に維持しながら同条件で培養を続けた。培養液量を１０Ｌとしてから４０時間経過した後の培養液を遠心し、上清をＨＰＬＣ分析してグルタミン酸ナトリウム、ＧＡＢＡの量を測定した結果、４．４０質量％のＧＡＢＡ濃度であり、９６％の変換率でＧＡＢＡが生成していた。この培養液上清を凍結乾燥、粉砕したところＧＡＢＡを５５％含有する淡褐色の粉末が９６０ｇ得られた。
【００５４】
実施例２
実施例１において、ラクトバチルス  ブレビス  ＵＡＳ−４に代えてラクトバチルス  ブレビス  ＵＡＳ−６を使用した以外は同様にして、ＧＡＢＡを製造した。４０時間経過した後の培養液上清の分析を行った結果、４．４０質量％のＧＡＢＡ濃度であり、９６％の変換率でＧＡＢＡが生成していた。この培養液上清を凍結乾燥、粉砕したところＧＡＢＡを５４％含有する淡褐色の粉末が９７８ｇ得られた。
【００５５】
実施例３
１．０重量％のグルタミン酸ナトリウムを含有するＧＹＰ培地５Ｌに、前培養したラクトバチルス  ブレビス  ＵＡＳ−４の菌体懸濁液１００ｍＬを添加して３０℃、２０ｒｐｍ、通気無しの条件で培養を開始した。培養開始から１日後に、３９質量％のグルタミン酸ナトリウムを溶解した２倍濃度のＧＹＰ培地５Ｌを追加して総量を１０Ｌとし、その後は６Ｎ塩酸を適時添加してｐＨを４．８±０．５に維持しながら同条件で培養を続けた。培養液量を１０Ｌとしてから４８時間経過した後の培養液を遠心し、上清をＨＰＬＣ分析してグルタミン酸ナトリウム、ＧＡＢＡの量を測定した結果、７．７５質量％のＧＡＢＡ濃度であり、９１％の変換率でＧＡＢＡが生成していた。この培養液上清を凍結乾燥、粉砕したところＧＡＢＡを６２％含有する淡褐色の粉末が１６１５ｇ得られた。
【００５６】
実施例４
実施例３において、ラクトバチルス  ブレビス  ＵＡＳ−４に代えてラクトバチルス  ブレビス  ＵＡＳ−６を使用した以外は同様にして、ＧＡＢＡを製造した。４８時間経過した後の培養液上清の分析を行った結果、７．８８質量％のＧＡＢＡ濃度であり、９３％の変換率でＧＡＢＡが生成していた。この培養液上清を凍結乾燥、粉砕したところＧＡＢＡを６３％含有する淡褐色の粉末が１６２４ｇ得られた。
【００５７】
実施例５
実施例３において、４８時間以降も引き続き培養を続けた場合、６０時間後にはグルタミン酸ナトリウムが完全に消費され、８．４６質量％のＧＡＢＡ濃度であり、ＧＡＢＡへの変換率が１００％となった。この培養液上清を凍結乾燥、粉砕したところ、ＧＡＢＡを７０％含有する淡褐色の粉末が１５７２ｇ得られた。
【００５８】
比較例１
実施例３において、ラクトバチルス  ブレビス  ＵＡＳ−４に代えてラクトバチルス  ブレビス  ＮＢＲＣ１２００５株を使用した以外は同様にして、ＧＡＢＡを製造した。４８時間経過した後の培養液上清の分析を行った結果、６．６０質量％のＧＡＢＡ濃度であり、グルタミン酸ナトリウムのＧＡＢＡへの変換率は７８％と低いものであった。この時点で培養上清を凍結乾燥、粉砕したところ、ＧＡＢＡを４４％しか含有しない淡褐色の粉末が１９５０ｇ得られた。
【００５９】
実施例６
実施例３で得られた培養液を遠心し、培養液上清をＨ型に再生したイオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ（三菱化学製）７ＬにＳＶ＝２の流速で通液した。その後イオン交換水２１Ｌを通液し、０．５規定アンモニア水６０ＬをＳＶ＝２の流速で通液してＧＡＢＡを溶離した。アンモニア水流出液を回収し、エバポレーターで固形分濃度３０％まで濃縮し、これを凍結乾燥、粉砕した結果、ＧＡＢＡを９８％含有する乳白色の粉末が１００１ｇ得られた。
【００６０】
実施例７
実施例３で得られた培養液を遠心し、培養液上清に太閤活性炭ＳＡ１０００を３５０ｇ導入し、１時間攪拌した。その後活性炭はブフナー漏斗にＡＤＶＡＮＴＥＣ東洋製Ｎｏ．５Ｃのろ紙を敷き、珪藻土でプレコートしてろ過した。得られた活性炭処理液を、エバポレーターで固形分濃度３０％まで濃縮し、これを凍結乾燥、粉砕した結果、ＧＡＢＡを７１％含有する淡黄色の粉末が１４２８ｇ得られた。
【００６１】
実施例８
実施例７において、活性炭処理後濃縮した液を、７ＬのダイヤイオンＳＫ−１ＢにＳＶ＝１で通液した。その後イオン交換水２１Ｌを通液し、０．５規定アンモニア水６０ＬをＳＶ＝２の流速で通液してＧＡＢＡを溶離した。アンモニア水流出液を回収し、エバポレーターで固形分濃度３０％まで濃縮し、これを凍結乾燥、粉砕した結果、ＧＡＢＡを９９％含有する白色の粉末が９８３ｇ得られた。
【００６２】
実施例９
実施例８において、ダイヤイオンＳＫ−１Ｂに代えて、強酸性陽イオン交換樹脂ムロマックＣ１０２Ｎａ（室町ケミカル製）を使用した以外は同様にして、ＧＡＢＡの精製を行い、ＧＡＢＡを９９％含有する白色の粉末を９７０ｇ得た。
【００６３】
実施例１０
緑茶１５０ｍｌに実施例３で得られたＧＡＢＡ含有粉末１００ｍｇを添加したところ、室温においても速やかに溶けた。このように作ったＧＡＢＡ含有緑茶の色、臭い、味質は全く変わらず、美味しく飲める飲料であった。
【００６４】
実施例１１
実施例１０において、実施例３で得られたＧＡＢＡ含有粉末の代わりに実施例４、６、７、８で得られたＧＡＢＡ含有粉末をそれぞれ添加したが、いずれも実施例１０と同様に、室温で速やかに溶け、色、臭い、味質に全く影響を及ぼさず、美味しく飲める飲料であった。
【００６５】
実施例１２
実施例８で得られた高純度のＧＡＢＡ粉末を２００μｍ以下に粉砕した微粉末２００ｇ、乳糖１００ｇ、デキストリン１００ｇ、ナタネ硬化油３０ｇ、ステアリン酸マグネシウム２ｇ、水７０ｇを混合し、打錠機で２５０ｍｇ／個で打錠し、ＧＡＢＡ含有錠剤を１７００個作った。錠剤は雑味が無く飲みやすいものであった。