(57)【要約】【課題】オーロラＡタンパク質に特異的にその活性を調節することのできる化合物を提供する。【解決手段】オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性調節剤として、オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位と相互作用する化合物を用いる。本発明者らによれば、オーロラＡタンパク質へのカルモジュリンの結合は特異的であり、カルモジュリンが結合することによりオーロラＡタンパク質のキナーゼ活性が阻害される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位と相互作用する化合物である、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性調節剤。
【請求項２】
オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を阻害又は促進可能な程度に前記カルモジュリン結合部位と相互作用する、請求項１に記載の調節剤。
【請求項３】
オーロラＡタンパク質における前記カルモジュリン結合部位は、少なくとも以下のアミノ酸残基のセットにより特定される、請求項１又は２に記載の調節剤。
アミノ酸残基のセット：
配列番号：１に記載のアミノ酸配列中の第２２２位〜第２２７位において以下の配列により特定されるアミノ酸残基のセット。
（ＦｏｒＩｏｒＬｏｒＶ）Ｑｘｘｘ（ＲｏｒＫ）
（ただし、ｘは任意のアミノ酸である。）
【請求項４】
オーロラＡタンパク質における前記カルモジュリン結合部位は、少なくとも以下のアミノ酸残基のセットにより特定される、請求項１又は２に記載の調節剤。
アミノ酸残基のセット：
配列番号：１に記載のアミノ酸配列中の第２２２位〜第２３２位において以下の配列により特定されるアミノ酸残基のセット。
（ＦｏｒＩｏｒＬｏｒＶ）Ｑｘｘｘ（ＲｏｒＫ）ｘｘｘｘ（ＲｏｒＫ）
（ただし、ｘは任意のアミノ酸である。）
【請求項５】
前記化合物は、カルモジュリン若しくはその部分ペプチド又はこれらの改変体である、請求項１〜４のいずれかに記載の調節剤。
【請求項６】
前記化合物は、オーロラＡタンパク質のＡＴＰ結合部位と相互作用する部位を有している、請求項１〜５のいずれかに記載の調節剤。
【請求項７】
オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性阻害剤である、請求項１〜６のいずれかに記載の調節剤。
【請求項８】
請求項７に記載のオーロラＡタンパク質活性調節剤を含有する、アポトーシス誘導用組成物。
【請求項９】
請求項７に記載のオーロラＡタンパク質活性調節剤を含有する、オーロラＡタンパク質に関連する疾患の予防・治療用組成物。
【請求項１０】
オーロラＡタンパク質の活性調節剤の設計方法であって、
オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位に関するカルモジュリン結合部位情報に基づいてオーロラＡタンパク質の活性調節剤又はその候補化合物を設計する工程、
を備える、設計方法。
【請求項１１】
前記カルモジュリン結合部位情報は、少なくとも以下のアミノ酸残基のセット（ａ）及び（ｂ）のいずれかのアミノ酸残基のセットの原子座標を含んでいる、請求項１０に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列中の第２２２位〜第２２７位において以下の配列により特定されるアミノ酸残基のセット。
（ＦｏｒＩｏｒＬｏｒＶ）Ｑｘｘｘ（ＲｏｒＫ）
（ただし、ｘは任意のアミノ酸である。）
（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列中の第２２２位〜第２３２位において以下の配列により特定されるアミノ酸残基のセット。
（ＦｏｒＩｏｒＬｏｒＶ）Ｑｘｘｘ（ＲｏｒＫ）ｘｘｘｘ（ＲｏｒＫ）
（ただし、ｘは任意のアミノ酸である。）
【請求項１２】
前記カルモジュリン結合部位情報は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列中の第２２２位〜第２３２位のアミノ酸配列のアミノ酸残基の原子座標を含んでいる、請求項１０に記載の設計方法。
【請求項１３】
前記カルモジュリン結合部位情報は、ＴＰＸ２とオーロラＡタンパク質との複合体の結晶構造におけるカルモジュリン結合部位情報である、請求項１０〜１２のいずれかに記載の設計方法。
【請求項１４】
オーロラＡタンパク質の活性調節剤候補化合物の製造方法であって、
オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位に関する情報に基づいてオーロラＡタンパク質の活性調節剤又はその候補化合物を設計する工程と、
前記設計された候補化合物を製造する工程と、
を備える、製造方法。
【請求項１５】
オーロラＡタンパク質の活性調節剤の探索方法であって、
オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を測定する工程を備える、探索方法。
【請求項１６】
前記被験化合物はオーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位に関するカルモジュリン結合部位情報に基づいて設計された候補化合物である、請求項１５に記載の探索方法。
【請求項１７】
オーロラＡタンパク質の活性調節剤の探索方法であって、
細胞分裂可能な状態の細胞とオーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位に関するカルモジュリン結合部位情報に基づいて設計された候補化合物とを接触させて、該候補化合物の前記細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定する工程、を備える、探索方法。
【請求項１８】
オーロラＡタンパク質の活性調節剤の製造方法であって、
オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位に関するカルモジュリン結合部位情報に基づいてオーロラＡタンパク質の活性調節剤の候補化合物を設計する工程と、
オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を測定するか又は細胞分裂可能な状態の細胞と前記候補化合物とを接触させて、該候補化合物の前記細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定する工程と、
前記活性に基づいてオーロラＡタンパク質の活性調節剤を選択する工程と、
前記選択された活性調節剤を製造する工程と、
を備える、方法。
【請求項１９】
オーロラＡタンパク質とカルシウム結合型カルモジュリンとの結合を促進又は阻害することにより、オーロラＡタンパク質の活性を調節する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オーロラＡタンパク質の活性を調節（促進又は阻害）できる化合物及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
オーロラキナーゼファミリーは、酵母からヒトまで保存されている細胞周期依存的なセリン−スレオニンキナーゼである。例えば、ヒトにおいては、３種類のオーロラＡ、オーロラＢ及びオーロラＣの３種類のアイソフォームが知られている。
【０００３】
これら３種類のアイソフォームはそれぞれ異なる細胞内局在性を有している。すなわち、オーロラＡタンパク質は、中心体、紡錘体及び紡錘体極に存在し、中心体の分離成熟や紡錘体ダイナミクスを制御していることが知られている。オーロラＢタンパク質は、オーロラＡタンパク質とは異なり、分裂中期までは染色体上に存在し、染色体分配が始まる分裂後期からその局在を紡錘体へと移動させ、最終的にはミッドボディーに集積する。すなわち、細胞周期に依存して異なる局在性を示している。さらに、オーロラＣタンパク質は、その局在性においてオーロラＢタンパク質と挙動を共にすることが報告されている。
【０００４】
図１に示すように、これらのオーロラキナーゼファミリーのタンパク質は、高度に保存されたセリン／スレオニンキナーゼ領域でほとんどが占められており、ヒトにおけるオーロラキナーゼファミリー間での相同性は８４％以上である。オーロラＡタンパク質についてはその結晶構造も解析され、ＡＴＰが結合するキナーゼ活性部位に関する情報も提供されている（特許文献１、非特許文献１）。オーロラＢタンパク質については、アミノ酸配列ではオーロラＡタンパク質と８４％の高い相同性を示す他、ＡＴＰ結合部位（アミノ酸２６残基）においては３つのアミノ酸残基が異なっているに過ぎない。さらに、オーロラＣタンパク質も、オーロラＢタンパク質と同一のＡＴＰ結合部位を備えている。
【０００５】
これらのオーロラキナーゼファミリーのなかでもオーロラＡタンパク質については、ヒトの乳癌において高頻度に遺伝子増幅が起こっている（非特許文献２）ほか、大腸癌等の他の細胞株でも確認されている。さらに、繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３やＲａｔ−１においてオーロラＡのｍＲＮＡを過剰発現させるとこれらの細胞が癌細胞としての特徴を示すようにトランスフォームすることから、オーロラＡは癌遺伝子として位置付けられている（非特許文献３）。オーロラＡ蛋白質の発現量を細胞周期の点から見た場合、オーロラＡ蛋白質の発現量はＧ２／Ｍ期に上昇し、Ｇ１期になると急速に分解される（非特許文献２）。それに伴い、オーロラＡのキナーゼ活性もまたＧ２／Ｍ期に上昇し、Ｇ１期になると急速に低下することが知られている。
【０００６】
こうしたことから、オーロラＡタンパク質をターゲットとした抗腫瘍剤が種々試みられている。なかでも、オーロラＡタンパク質のＡＴＰ結合部位に結合してオーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を阻害するＡＴＰアナログの開発が試みられている。
【特許文献１】特開２００５−５０４５４８
【非特許文献１】Ｃｈｅｅｔｈａｍ，  Ｇ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＢＣ  ２７７：  ４２４１９−４２４２２，  ２００２
【非特許文献２】Ｓｅｎ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １４：２１９５−２２００（１９９７）
【非特許文献３】Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，  Ｊ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．：ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １７：３０５２−３０６５（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、既に述べたように、これらのアイソフォームのＡＴＰ結合部位のアミノ酸配列は３つしか異なっていない。したがって、オーロラＡタンパク質のＡＴＰ結合部位をオーロラＡタンパク質に関する疾患のための医薬化合物の分子標的部位とする場合、オーロラＡタンパク質に対して特異性の高い医薬を得ることは容易ではない。
【０００８】
そこで、本発明は、オーロラＡタンパク質に特異的にその活性を調節することのできる化合物やその設計方法、探索方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性部位のＸ線構造解析情報（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ ｂａｎｋ（ＰＤＢ），Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．１ＭＵＯ）とオーロラＡタンパク質のリン酸化促進タンパク質であるＴＰＸ２との複合体のＸ線構造解析情報（ＰＤＢ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．１ｏｌ５）等により、オーロラＡタンパク質にカルモジュリンが結合する部位があることを見出し、該結合部位を同定するとともに、該カルモジュリン結合部位へのカルモジュリンの結合によりオーロラＡタンパク質のキナーゼ活性が阻害され、活性化タンパク質であるＴＰＸ２が結合した状態でもカルモジュリンの結合によってキナーゼ活性が阻害されることを見出した。さらに、オーロラＡタンパク質におけるカルモジュリン結合部位は、他のオーロラファミリーのタンパク質には存在せずカルモジュリンによる上記キナーゼ活性阻害作用が生じないことを見出した。すなわち、本発明者らは、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性の新たな調節部位を見出し、該調節部位を利用することで、オーロラＡタンパク質に特異性の高い調節剤、特に、阻害剤が得られることを見出し、本発明を完成した。本発明によれば以下の手段が提供される。
【００１０】
本発明の一つの形態によれば、オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位と相互作用する化合物である、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性調節剤が提供される。
【００１１】
この形態においては、前記活性調節剤は、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を阻害又は促進可能な程度に前記カルモジュリン結合部位と相互作用するものとすることができる。
【００１２】
また、オーロラＡタンパク質における前記カルモジュリン結合部位は、少なくとも以下のアミノ酸残基のセットにより特定されることが好ましい態様である。
アミノ酸残基のセット：
配列番号：１に記載のアミノ酸配列中の第２２２位〜第２２７位において以下の配列により特定されるアミノ酸残基のセット。
（ＦｏｒＩｏｒＬｏｒＶ）Ｑｘｘｘ（ＲｏｒＫ）
（ただし、ｘは任意のアミノ酸である。）
【００１３】
また、オーロラＡタンパク質における前記カルモジュリン結合部位は、少なくとも以下のアミノ酸残基のセットにより特定されることも好ましい態様である。
アミノ酸残基のセット：
配列番号：１に記載のアミノ酸配列中の第２２２位〜第２３２位において以下の配列により特定されるアミノ酸残基のセット。
（ＦｏｒＩｏｒＬｏｒＶ）Ｑｘｘｘ（ＲｏｒＫ）ｘｘｘｘ（ＲｏｒＫ）
（ただし、ｘは任意のアミノ酸である。）
【００１４】
さらに、この形態においては、前記化合物は、カルモジュリン若しくはその部分ペプチド又はこれらの改変体であることが好ましい態様である。
【００１５】
さらにまた、この形態においては、前記化合物は、オーロラＡタンパク質のＡＴＰ結合部位と相互作用する部位を有していることも好ましい態様である。
【００１６】
この形態においては、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性阻害剤であることが好ましい態様である。
【００１７】
本発明の他の一つの形態によれば、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性阻害剤を含有する、アポトーシス誘導用組成物も提供される。さらに、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性阻害剤を含有するオーロラＡタンパク質に関連する疾患の予防・治療用組成物も提供される。
【００１８】
本発明の他の一つの形態によれば、オーロラＡタンパク質の活性調節剤の設計方法であって、オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位に関するカルモジュリン結合部位情報に基づいてオーロラＡタンパク質の活性調節剤又はその候補化合物を設計する工程、を備える、設計方法が提供される。
【００１９】
この形態においては、前記カルモジュリン結合部位情報は、少なくとも以下のアミノ酸残基のセット（ａ）及び（ｂ）のいずれかのアミノ酸残基のセットの原子座標を含んでいることが好ましい態様である。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列中の第２２２位〜第２２７位において以下の配列により特定されるアミノ酸残基のセット。
（ＦｏｒＩｏｒＬｏｒＶ）Ｑｘｘｘ（ＲｏｒＫ）
（ただし、ｘは任意のアミノ酸である。）
（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列中の第２２２位〜第２３２位において以下の配列により特定されるアミノ酸残基のセット。
（ＦｏｒＩｏｒＬｏｒＶ）Ｑｘｘｘ（ＲｏｒＫ）ｘｘｘｘ（ＲｏｒＫ）
（ただし、ｘは任意のアミノ酸である。）
【００２０】
また、この形態においては、前記カルモジュリン結合部位情報は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列中の第２２２位〜第２３２位のアミノ酸配列のアミノ酸残基の原子座標を含んでいることも好ましい態様である。
【００２１】
さらにまた、この形態においては、前記カルモジュリン結合部位情報は、ＴＰＸ２とオーロラＡタンパク質との複合体の結晶構造におけるカルモジュリン結合部位情報であることも好ましい態様である。
【００２２】
本発明の他の一つの形態によれば、オーロラＡタンパク質の活性調節剤候補化合物の製造方法であって、オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位に関する情報に基づいてオーロラＡタンパク質の活性調節剤又はその候補化合物を設計する工程と、前記設計された候補化合物を製造する工程と、を備える、製造方法も提供される。
【００２３】
本発明の他の一つの形態によれば、オーロラＡタンパク質の活性調節剤の探索方法であって、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を測定する工程を備える、探索方法も提供される。
【００２４】
この形態においては、前記被験化合物はオーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位に関するカルモジュリン結合部位情報に基づいて設計された候補化合物であることが好ましい態様である。
【００２５】
本発明の他の一つの形態によれば、オーロラＡタンパク質の活性調節剤の探索方法であって、細胞分裂可能な状態の細胞とオーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位に関するカルモジュリン結合部位情報に基づいて設計された候補化合物とを接触させて、該候補化合物の前記細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定する工程、を備える、探索方法も提供される。
【００２６】
本発明の他の一つの形態によれば、オーロラＡタンパク質の活性調節剤の製造方法であって、オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位に関するカルモジュリン結合部位情報に基づいてオーロラＡタンパク質の活性調節剤の候補化合物を設計する工程と、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を測定するか又は細胞分裂可能な状態の細胞と前記候補化合物とを接触させて、該候補化合物の前記細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定する工程と、前記活性に基づいてオーロラＡタンパク質の活性調節剤を選択する工程と、前記選択された活性調節剤を製造する工程と、を備える、方法も提供される。
【００２７】
本発明の他の一つの形態によれば、オーロラＡタンパク質とカルシウム結合型カルモジュリンとの結合を促進又は阻害することにより、オーロラＡタンパク質の活性を調節する方法も提供される。
【００２８】
本発明の他の一つの形態によれば、オーロラＡタンパク質とカルシウム結合型カルモジュリンとの結合を促進又は阻害することにより、細胞周期を調節する方法も提供される。
【００２９】
なお、本明細書においてアミノ酸表記は、一文字表記を用いるものとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位と相互作用する化合物であるオーロラＡタンパク質の活性調節剤、カルモジュリン結合部位に関するカルモジュリン結合部位情報に基づいてオーロラＡタンパク質の活性調節剤又はその候補化合物を設計する方法及びオーロラＡタンパク質とカルモジュリンとカルシウムイオンと被験化合物とを接触させてオーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を測定するオーロラＡタンパク質の活性調節剤の探索方法等に関している。以下、本発明の各種の実施形態について詳細に説明する。
【００３１】
（オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位）
オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位は、配列番号：１の第２２２位〜第２２７位であるアミノ酸配列中の少なくとも一部のアミノ酸残基を含んでいる。すなわち、配列番号：１中第２２２位、第２２３位及び第２２７位のアミノ酸残基がカルモジュリン結合部位を構成している。これらの３つのアミノ酸残基は、６個のアミノ酸残基からなる配列「（ＦｏｒＩｏｒＬｏｒＶ）Ｑｘｘｘ（ＲｏｒＫ）」（以下、第１のモチーフという。）中で特定される３つのアミノ酸残基に対応している（ただし、アミノ酸は１文字表記によるものとし、ｘは任意のアミノ酸を意味している。）。なお、ｘはＬ−アミノ酸であることが好ましい。また、このモチーフは、一般にＩＱ様モチーフ（’ＩＱ−ｌｉｋｅ’ｍｏｔｉｆ）と称され、カルモジュリンの結合部位であることが確立されている。
【００３２】
オーロラＡタンパク質の第２２２位及び第２２７位のアミノ酸残基は、上記第１のモチーフにおいて置換可能とされる他のアミノ酸残基（すなわち、第２２２位においては、Ｌ以外にＩ，Ｆ及びＶのいずれかであってもよいし、第２２７位においてはＫ以外にＲであってもよい。）とすることができる。
【００３３】
また、ＩＱ−様モチーフは、「（ＦｏｒＩｏｒＬｏｒＶ）Ｑｘｘｘ（ＲｏｒＫ）ｘｘｘｘ（ＲｏｒＫ）」（以下、第２のモチーフという。）として特定される場合もある。したがって、配列番号：１のアミノ酸配列の第２３２位は、配列番号：１において特定されるＲ以外にＫであってもよい。
【００３４】
さらに、配列番号：１における第２２２位〜第２３２位の配列において、上記第１のモチーフ又は上記第２のモチーフにおいてＸ（任意のアミノ酸）として表記される部位のアミノ酸残基は、いずれのアミノ酸で置換されていてもよい。
【００３５】
以上のことから、配列番号：１に記載のオーロラＡタンパク質の第２２２位〜第２３２位のＩＱ−様モチーフ相当配列中、少なくとも第２２２位、第２２３位、第２２７及び第２３２において以下の表１に示す各種の態様を採ることができる。すなわち、オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位は、少なくとも表１に示す第２２２位〜第２２７位さらには第２３２位のアミノ酸残基のセットにより特定されるのである。こうしたアミノ酸残基のセットには、配列番号：１に記載のオーロラＡタンパク質の第２２２位〜第２３２位の配列も含まれる。
【表１】
2007137856.tif 000002
【００３６】
また、オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位は、表１に示すアミノ酸残基のセットのほか、さらに、そのＮ末端側及びＣ末端側のアミノ酸配列を含むことができる。例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列中、上記した各種態様のＩＱ様モチーフを少なくとも含む第２１５位〜第２３６位のアミノ酸配列を好ましいカルモジュリン結合部位として用いることができる。
【００３７】
さらに、本発明において、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性の調節剤を設計し、探索するのにあたっては、カルモジュリン結合部位は、上記ＩＱ様モチーフ内の特定部位以外のアミノ酸残基や上記ＩＱ様モチーフ近傍のアミノ酸残基を適宜、置換、欠損及び挿入のいずれかあるいは２種以上の修飾を加えた相同的結合部位であってもよい。
【００３８】
（オーロラＡタンパク質の活性調節剤）
オーロラＡタンパク質の活性調節剤としては、カルモジュリンに作用してオーロラＡタンパク質とカルモジュリンとの結合（複合体の形成）を促進し又は阻害する化合物が挙げられる。カルモジュリンに作用してオーロラＡタンパク質との結合を促進する化合物は、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を阻害剤として利用できる。また、カルモジュリンに作用してオーロラＡタンパク質との結合を阻害する（促進しない）化合物は、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性の活性化剤（維持剤）として利用できる。オーロラＡタンパク質にはカルシウム結合型カルモジュリンが結合し、カルシウム非結合型カルモジュリンは結合しないため、カルシウムイオンあるいはカルシウムイオンのキレート剤は、オーロラＡタンパク質の活性調節剤として利用可能である。
【００３９】
オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位と作用する化合物も利用できる。カルモジュリン結合部位に作用してカルモジュリンと同様にキナーゼ活性を阻害する化合物は、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性阻害剤として利用でき、カルモジュリン結合部位に作用して、カルモジュリンの結合をブロックすることでキナーゼ活性を促進する化合物は、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性促進剤として利用できる。こうしたキナーゼ活性阻害剤としては、カルモジュリンあるいは当該カルモジュリン結合部位に結合活性を有するカルモジュリンの部分ペプチドや改変体が挙げられる。こうした部分ペプチドや改変体は、カルシウム依存的にカルモジュリン結合部位と相互作用するものであってもよいし、カルシウム非依存的にカルモジュリン結合部位と相互作用可能であってもよい。
【００４０】
また、こうした化合物は、オーロラＡタンパク質のＡＴＰ結合部位と作用する部位を有していてもよい。具体的には、オーロラＡタンパク質のＡＴＰ結合部位に結合するＡＴＰアナログ等の分子構造を化合物の一部に備えることができる。こうしたＡＴＰアナログとしては、例えば、特表２００５−５０４５４８等に記載されている。こうしたＡＴＰ結合部位と作用する部位は、オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位と作用する構造部分がカルモジュリン結合部位に作用するときに同様にＡＴＰ結合部位に作用するように連結されていることが好ましい。これらの部位は、適当なリンカーを介して共有結合により連結されていてもよい。
【００４１】
こうしたオーロラＡタンパク質活性調節剤、特に、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性阻害剤を含む組成物は、細胞にアポトーシス誘導するアポトーシス誘導用組成物として利用できる。また、同様に、オーロラＡタンパク質活性調節剤、特に、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性阻害剤を含有する組成物は、オーロラＡタンパク質に関連する疾患の予防・治療用組成物として利用できる。こうした疾患としては悪性腫瘍（癌）が挙げられ、例えば、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎盂・尿管癌、腎細胞癌、精巣（睾丸）腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、乳癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、悪性黒色腫、菌状息肉症、皮膚癌、軟部肉腫、悪性リンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、慢性骨髄増殖性疾患及び膵内分泌腫瘍等が挙げられる。なお、予防・治療用組成物としては、本発明の活性化調節剤を有効成分とし、投与経路や剤型に応じて薬学的に許容される担体を適宜選択することにより製剤化することができる。
【００４２】
こうした化合物は、カルモジュリンの改変体や部分ペプチドなどを適宜合成し、後述する探索方法によって目的とする調節剤を選択してもよいが、カルモジュリン結合部位に関するカルモジュリン結合部位情報を利用して調節剤の候補化合物を設計した上、後述する探索方法を用いて選択することもできる。
【００４３】
（オーロラＡタンパク質の活性調節剤候補の設計方法）
本発明のオーロラＡタンパク質の活性調節剤の設計方法は、オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位に関するカルモジュリン結合部位情報に基づいてオーロラＡタンパク質の活性調節剤又はその候補化合物を設計する工程、を備えている。本設計方法によれば、上記したオーロラＡタンパク質の活性調節剤又はその候補化合物を容易に設計でき、さらに、後述する探索方法等を実施することでは、オーロラＡタンパク質の活性調節剤を得ることができる。
【００４４】
カルモジュリン結合部位情報としては、上述のカルモジュリン結合部位のアミノ酸配列やＩＱ様モチーフに含まれる特定のアミノ酸残基のセット（組み合わせ）を利用することができる。好ましくは、カルモジュリン結合部位情報は、カルモジュリン結合部位のアミノ酸配列による二次構造又は三次構造に関する情報を含み、こうした立体構造情報に基づいてカルモジュリン結合部位に作用する化合物を設計する。カルモジュリン結合部位の立体構造や原子座標を利用することで該結合部位に作用させるのに好ましい候補化合物に予測できるため探索作業等を効率的に行うことができる。より好ましくは、カルモジュリン結合部位情報は、カルモジュリン結合部位のアミノ酸配列を構成するアミノ残基の全てあるいは一部の原子座標に関する情報を含み、こうした原子座標情報を用いてカルモジュリン結合部位に作用する化合物を設計する。なお、こうしたカルモジュリン結合部位情報を用いて、カルモジュリン結合部位を有するオーロラＡタンパク質を模倣した相同体（アミノ酸配列などを変化させたものが含まれる）などを設計することができる。さらに、こうしたカルモジュリン結合部位情報を用いてオーロラＡタンパク質の活性調節剤やオーロラＡタンパク質相同体を設計するプログラムも提供される。
【００４５】
こうしたカルモジュリン結合部位情報としては、例えば、表１において特定された配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるオーロラＡタンパク質のＩＱ−様モチーフ相当部位において特定されるアミノ酸残基を含む原子座標のセットが挙げられる。例えば、第２２２位のＬ、第２３２位のＱ、第２２７位のＫ及び第２３２位のＲからなるアミノ酸残基の原子座標のセットが挙げられる。さらにまた、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の２２２位〜２３２位のアミノ酸残基の原子座標のセットが挙げられる。さらに、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第２１５位〜第２３６位のアミノ酸残基の原子座標のセットが挙げられる。なお、既に説明したように、カルモジュリン結合部位情報に含まれるカルモジュリン結合部位は、こうしたアミノ酸残基の原子座標のセットによって特定されるカルモジュリン結合部位の相同なカルモジュリン結合部位であってもよい。
【００４６】
カルモジュリン結合部位の三次元構造や原子座標は、オーロラＡタンパク質のＸ線結晶構造解析等により得ることができる。カルモジュリン結合部位の結晶構造解析のためには、オーロラＡタンパク質単独の結晶、オーロラＡタンパク質とＴＰＸ２との複合体の結晶及びオーロラＡタンパク質とカルモジュリンとの複合体の結晶、ＴＰＸ２とオーロラＡタンパク質とカルモジュリンとの複合体の結晶構造を利用できる。なお、ＴＰＸ２は、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を活性化する物質として知られるタンパク質である。そのアミノ酸配列の一例を配列番号：２に示す。
【００４７】
（活性調節剤候補化合物の製造方法）
本発明のオーロラＡタンパク質の活性調節剤候補化合物の製造方法は、オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位に関する情報に基づいてオーロラＡタンパク質の活性調節剤又はその候補化合物を設計し、設計された候補化合物を製造することを特徴としている。この製造方法によれば、オーロラＡタンパク質の活性調節剤の候補化合物を効率的に製造することができる。こうした製造方法によって得られた候補化合物のセットは、オーロラＡタンパク質の活性調節剤のための有用な化合物セットとなる。なお、候補化合物の製造は、特に限定しないで、全合成、半合成、あるいは天然物からの抽出等いずれの方法であってもこれらの方法を組み合わせたものであってもよい。
【００４８】
（活性調節剤の探索方法）
本発明のオーロラＡタンパク質の活性調節剤の探索方法は、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を測定することを特徴としている。オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を測定することにより、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性の阻害剤や促進剤を選択することができる。キナーゼ活性の測定は、例えば、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を直接的に測定することもできるし、キナーゼ活性を有するオーロラＡタンパク質を測定することによってもよい。
【００４９】
キナーゼ活性を直接的に測定するには、オーロラＡタンパク質とオーロラＡタンパク質のキナーゼ活性の測定に必要な基質やＡＴＰのほか、カルモジュリンとカルシウムイオンとを含む反応系に被験化合物を接触させ、これにより生成するリン酸化された基質量又は該リン酸化物の生成に付随する他の化合物の量を測定すればよい。キナーゼ活性の測定にあたっては、リン酸化のための基質やＡＴＰなどのオーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を測定するために必要な化合物が適宜添加される。こうした化合物は、予め、オーロラＡタンパク質を含む系に含めておいてもよい。また、キナーゼ活性の測定方法は適宜選択されるが、リン酸化された基質量を直接的に検出してもよい、リン酸化された基質に特異的な抗体を用いてもよい。
【００５０】
また、キナーゼ活性を有するオーロラＡタンパク質を測定するには、例えば、２８８位のトレオニンがリン酸化されたオーロラＡタンパク質の量を測定すればよい。こうしたリン酸化オーロラＡタンパク質の測定には当該タンパク質に対して特異的な抗体を用いることができる。こうした抗体は、特開２００５−６５３２に開示されており、このような抗体を産生するハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に平成１４年１１月１４日付けで受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１０５として、また、同所に平成１５年３月５日付けで受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２４３として寄託されている。
【００５１】
本探索方法においては、被験化合物としては、オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位に関するカルモジュリン結合部位情報に基づいて設計された候補化合物を用いることが好ましい。また、こうしたオーロラＡタンパク質のキナーゼ活性の測定にあたっては、オーロラＡタンパク質の活性化タンパク質であるＴＰＸ２を有する系で行うこともできる。
【００５２】
なお、オーロラＡタンパク質の活性調節剤の探索の指標としてオーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を用いることとしたが、他の現象を指標として用いてもよい。例えば、細胞分裂可能な状態の細胞と被験化合物とを接触させ、被験化合物の前記細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定してもよい。この他、オーロラＡタンパク質の活性と関係のある現象であれば、オーロラＡタンパク質の活性調節剤あるいはそうした現象の抑制剤又は促進剤としての探索が可能である。
【００５３】
（活性調節剤の製造方法）
本発明のオーロラＡタンパク質の活性調節剤の製造方法は、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を測定するか又は細胞分裂可能な状態の細胞と前記候補化合物とを接触させて、該候補化合物の前記細胞に対するアポトーシス誘導活性を測定し、前記活性に基づいてオーロラＡタンパク質の活性調節剤を選択し、選択された活性調節剤を製造することを特徴としている。こうした方法によれば、抗腫瘍剤等として使用可能なオーロラＡタンパク質の活性調節剤を容易に取得することができる。さらにこの製造方法においては、オーロラＡタンパク質のカルモジュリン結合部位に関するカルモジュリン結合部位情報に基づいてオーロラＡタンパク質の活性調節剤の候補化合物を設計し、こうした候補化合物を被験化合物として用いることもできる。
【００５４】
（細胞周期の調節方法）
また、本発明によれば、オーロラＡタンパク質とカルモジュリンとの結合を促進又は阻害することにより、細胞周期を調節する方法も提供される。この方法によれば、医薬開発や治療方法の開発のために必要なツールを提供することができる。この方法においては、上記したオーロラＡタンパク質の活性調節剤を用いることができる。
【００５５】
（オーロラＡタンパク質が関連する疾患の予防又は治療方法）
さらに、本発明によれば、本発明に係るオーロラＡタンパク質の活性調節剤を用いる、オーロラＡタンパク質が関連する疾患の予防方法及び治療方法も提供される。例えば、オーロラＡタンパク質の活性を阻害する調節剤を適切な方法で投与することで、腫瘍組織の発現や腫瘍組織の増殖を抑制することができる。オーロラＡタンパク質は、腫瘍細胞において高発現されているタンパク質であり、オーロラＡタンパク質の活性阻害は、腫瘍細胞の発現や増殖等を抑制するのに有用である。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例においてオーロラＡタンパク質は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、ＴＰＸ２は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００５７】
（実施例１）
本実施例では、オーロラＡタンパク質とカルモジュリンとの結合性を確認した。ｇｌｕタグ付きオーロラＡタンパク質をｐＭＴにより発現させたサルＣＯＳ細胞の溶解物とカルモジュリンを担持させたビーズとを混合し、これらの混合物を５ｍＭ  ＥＧＴＡ及び１ｍＭ  ＣａＣｌ２のそれぞれで洗浄後、その後、ビーズを分離しビーズに結合したタンパク質（アフィニティー沈降産物，ＡＰ）についてイムノブロットを行った。結果を図２に示す。図２に示すように、オーロラＡタンパク質は、Ｃａ２＋存在下ではカルモジュリン担持ビーズと結合したが、キレート剤であるＥＧＴＡの存在下及びＭｇ２＋のみの存在下（データ示さず）では結合しなかった。以上のことから、オーロラＡタンパク質とカルモジュリンとの結合は、Ｃａ２＋特異的であることがわかった。
【００５８】
（実施例２）
ＧＦＰ−オーロラＡタンパク質を発現するヒトＭＤＡ細胞をＭ期に同調させ（ダブルチミジン法によりＧ１／Ｓ期に同調後薬剤をｗａｓｈｏｕｔ後１４時間後に回収）、回収したＭ期のＭＤＡ細胞内のタンパク質をホルムアルデヒドによりクロスリンクさせた後、抗体により免疫沈降（ＩＰ）を行い、さらにイムノブロットを行った。結果を図３に示す。図３に示すように、オーロラＡタンパク質と結合してカルモジュリン（ＣａＭ）が免疫沈降していることがわかった。以上のことから、オーロラＡタンパク質とカルモジュリンとが細胞内において結合していることがわかった。一方、コントロールの抗体（ＩｇＧ）ではカルモジュリン（ＣａＭ）が免疫沈降してこないことから、両者の結合は特異的であることがわかった。
【００５９】
（実施例３）
大腸菌で発現精製したオーロラＡタンパク質及び２２７位をＫ→Ｔとした修飾オーロラＡタンパク質のそれぞれダンジル化した精製カルモジュリンを反応させたところ、図４に示すように、対照に対して精製オーロラＡタンパク質の蛍光強度（５００−５１０ｎｍ）が約１．５倍に上昇した（図４中、最上方のスペクトルが精製オーロラＡタンパク質の蛍光スペクトルである）。また、修飾オーロラＡタンパク質の蛍光強度は元の精製タンパク質の蛍光強度に比べて顕著に低下した（図４中、上方から２番目のスペクトルが修飾オーロラＡタンパク質の蛍光スペクトルである）。精製タンパク質を用いた反応であるためカルモジュリンとオーロラＡタンパク質との結合は直接的であり、さらに蛍光強度が上述のように上昇したことから、カルモジュリンとオーロラＡタンパク質とが試験官内で結合していることがわかった。また、ＩＱ−様モチーフに変異を導入した修飾オーロラＡタンパク質では蛍光強度が低いことから、ＩＱ−様モチーフを介して両者が結合していることがわかった。
【００６０】
オーロラＡタンパク質とダンシル化カルモジュリンとの結合は、Ｓｈｉｍａｄｕ  ＲＦ−５３００ＲＣスペクトロフルオロメーターにおいて１ｃｍの石英製キュベットを用いて、Ｍａｔｓｕｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２ ２３０５０−２３０５６，１９９７に記載のように測定した。励起波長を３４０ｎｍにセットし、オーロラＡタンパク質の存在下及び非存在下で、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ７．４，１００ｍＭ ＮａＣｌ（１  ｍＭ  ＣａＣｌ２．含有）中でのダンシル化カルモジュリン（５０ｎＭ）の放射スペクトルを測定した。カルモジュリンに対するタンパク質の結合は、４９０ｎｍの励起蛍光として測定した。
【００６１】
（実施例４）
表面プラズモン共鳴法（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ：ＳＰＲ）を用いて精製タンパク質同士の結合を解析した。ＩＱ−様モチーフ領域のペプチド（オーロラＡタンパク質の２１５−２３６位）を用いて阻害実験をおこなった。結果は図５に示すように、このペプチドは、その濃度に応じてオーロラＡタンパク質とカルモジュリンとの結合を阻害した。この結果は、ＩＱ−様モチーフ領域を介してオーロラＡタンパク質とカルモジュリンとが結合していることを支持しているといえる。
【００６２】
なお、ＳＰＲ法は、ＣＭ５センサーチップを装備したＢＩＡｃｏｒｅ ３０００ （Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）を用いて行った。全ての実験は、２５℃で行い、製造者による取り扱い説明書に基づいて、カルボキシメチル化デキストランマトリックスは０．２Ｍ Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド及び０．０５Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシイミドの水溶液８０μｌを注入して活性化した。組換えオーロラＡタンパク質を１０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．０）で希釈してＣＭ５センサーチップに結合させた後、１Ｍ  エタノールアミン（ｐＨ８．５）でブロッキングし、２０００以下程度のレゾナンス単位とした。センサーチップのパラレルチャンネルをオーロラＡタンパク質が結合されていないときと同一の状態としてコントロールとした。オーロラＡタンパク質とペプチドとの相互作用は、ランニングバッファとして使用する０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＣａＣｌ２，０．００５％ポリソルベート２０％（ｖ／ｖ）中で実施した。ペプチドを各種濃度で注入して、それぞれの定常レートを決定した。各分析後のセンサーチップの再生は、５０μＭ水酸化ナトリウム２０ｌを注入して行った。各分析で得られた生のセンサーグラムを整形し、コントロールのフローセルへの結合によるシグナルを除し、１：１ラングミュア結合モデル（Ａ＋Ｂ→ＡＢ）に適合させた。結果として得られた分離定数は、複数の結果の平均値とした。
【００６３】
（実施例５）
本実施例では、精製したオーロラＡタンパク質を用いてインビトロでのキナーゼ活性を測定した。キナーゼ活性の測定は、以下のようにして行った。すなわち、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．５ｍＭジチオスレイトール，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に、カルモジュリン及びＣａ２＋を含む又はこれらのいずれかを含むとともに、基質（ＧＳＴ−Ｈ３（５−１５）ヒストンＨ３の５位〜１５位までのアミノ酸のＧＳＴタグ化ペプチド）、酵素（オーロラＡタンパク質）、５０μＭ  ＡＴＰ及び３μＣｉのγ−３２ＡＴＰを含む反応混合液（３０μｌ）を３０℃で２０分インキュベートし、反応生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離してクマシブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。また、ゲルを乾燥後、ＭａｃＢＡＳ−１５００イメージングアナライザー（富士フィルム株式会社製）を用いて３２Ｐを検出した。結果を図６に示す。
【００６４】
図６に示すように、Ｃａ２＋存在下でのみカルモジュリンはオーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を阻害した。すなわち、カルモジュリンとＣａ２＋との存在下において、強く、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性が阻害されたが、いずれか一方のみが存在するときには、ほとんど影響されなかった。
【００６５】
（実施例６）
本実施例では、カルモジュリンの濃度を変えてオーロラＡタンパク質のキナーゼ活性の測定を行った。カルモジュリンの濃度を変えるとともにＡＴＰ濃度を２５μＭとする以外は、実施例５と同様にキナーゼ活性の測定を行った。図７に示すように、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性は、カルモジュリンにより濃度依存的に阻害されることがわかった。
【００６６】
（実施例７）
本実施例では、オーロラＡタンパク質の活性化タンパク質であることが知られているＴＰＸ２により活性化したオーロラＡタンパク質のキナーゼ活性の測定を行った。ＧＳＴ又はＧＳＴ−ＴＰＸ２（１−４３）（ＴＰＸ２タンパク質のアミノ酸配列中１位〜４３位のアミノ酸のＧＳＴタグ化ペプチド）を追加的に用いる以外は、実施例５と同様にしてキナーゼ活性を測定した。なお、カルモジュリンとＧＳＴ−ＴＰＸ２（１−４３）は、オーロラＡタンパク質に対して添加する順序を前後させた。結果は、図８に示すように、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性は、ＴＰＸ２の存在下であっても、カルモジュリンにより阻害されることがわかった。
【００６７】
（実施例８）
本実施例では、細胞内におけるオーロラＡタンパク質のキナーゼ活性を測定した。カルモジュリンＧＦＰ融合タンパク質を強制発現させたヒトＨｅＬａ細胞につき、抗オーロラＡタンパク質抗体、抗オーロラＡタンパク質ｐＴ２８８（２８８位のトレオニンのリン酸化したオーロラＡタンパク質）抗体を用いて、免疫沈降法を行った。なお、２８８位のトレオニンのリン酸化は、オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性の指標である。結果は、図９に示すように、カルモジュリンＧＦＰ融合タンパク質を発現させたヒトＨｅＬａ細胞においては、オーロラＡタンパク質ｐＴ２８８の沈降が抑制されていることがわかった。すなわち、カルモジュリンが過剰発現されたヒトＨｅＬａ細胞内では、オーロラＡタンパク質の活性の指標であるオーロラＡタンパク質ｐＴ２８８量が低下しオーロラＡタンパク質のキナーゼ活性が低下していることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】酵母ｉｐｌ１ｐ，ヒトＡｕｒｏｒａ−Ａ，ヒトＡｕｒｏｒａ−ＢおよびヒトＡｕｒｏｒａ−ＣのＡｕｒｏｒａファミリーの一次構造（アミノ酸配列）を比較した図。数値はアミノ酸配列を基にした相同性を示す。
【図２】ｇｌｕタグ付きオーロラＡタンパク質とカルモジュリンのＣａ２＋存在下及び非存在下における結合性を示す図。ＡＰはアフィニティー沈降の略であり、ＩＢはイムノブロッティングの略（以下同様）である。なお、イムノブロッティングは抗ｇｌｕ抗体で行った。
【図３】オーロラＡタンパク質ＧＦＰ融合タンパク質を発現するヒトＭＤＡ細胞における免疫沈降結果を示す図。ＩＰは免疫沈降の略である。イムノブロットは、抗ＧＦＰ抗体及び抗カルモジュリン抗体で行った。
【図４】精製オーロラＡタンパク質と精製カルモジュリンとの結合による蛍光強度を示すグラフ図。
【図５】オーロラＡタンパク質とカルモジュリンとの結合に対するオーロラＡタンパク質の部分ペプチドによる阻害実験結果を示す図。
【図６】精製オーロラＡタンパク質を用いたＣａ２＋存在下及び非存在下並びにカルモジュリンの存在下及び非存在下におけるキナーゼ活性の試験結果を示す図。クマジー染色とオートラジオグラフィーとによって検出した。
【図７】カルモジュリン濃度と精製オーロラＡタンパク質のキナーゼ活性との関係を示す図。クマジー染色とオートラジオグラフィーとによって検出した。
【図８】精製オーロラＡタンパク質を用いたＴＰＸ２の存在下及び非存在下並びにカルモジュリンの存在下及び非存在下におけるキナーゼ活性の試験結果を示す図。クマジー染色とオートラジオグラフィーとによって検出した。
【図９】細胞内に過剰発現させたカルモジュリンＧＦＰ融合タンパク質によるオーロラＡタンパク質のキナーゼ活性の影響について示す免疫沈降の結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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