(57)【要約】      （修正有）【課題】熟練を要することなく簡便に操作可能な環境付着菌検出用デバイスを提供する。【解決手段】環境付着菌検出用デバイス１０は、環境付着菌培養用の培地を収容するための容器本体２と、該容器本体２に取り外し可能に嵌合された蓋体３とを備える。容器本体２は開口部４を有し、その周壁上面は凹部７及び凸部８を有している。蓋体３は、嵌合部外周縁に形成された鍔部５と、内表面Ａに形成された粘着層６とを有している。鍔部５は、周面Ｂから突出した凸部９を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
開口部を有し、かつ環境付着菌培養用の培地を収容するための容器本体と、
該容器本体に取り外し可能に嵌合された蓋体と
を備え、
前記容器本体の周壁上面は、凹部及び凸部を有しており、
前記蓋体は、嵌合部外周縁に形成された鍔部と、内表面に形成された粘着層とを有しており、
前記鍔部は、周面から突出した凸部を有する、
環境付着菌検出用デバイス。
【請求項２】
前記蓋体が前記容器本体周壁との接触面にパッキンを有する、請求項１記載の環境付着菌検出用デバイス。
【請求項３】
前記蓋体が内表面に溝を有する、請求項１又は２記載の環境付着菌検出用デバイス。
【請求項４】
前記容器本体が内壁面に溝を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の環境付着菌検出用デバイス。
【請求項５】
前記容器本体が基板上に形成されており、
前記鍔部の一部が突出部を有しており、
前記容器本体に隣接して立設され、かつ前記突出部を挿入し固定するための嵌挿部を基板上に有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の環境付着菌検出用デバイス。
【請求項６】
前記鍔部の一部の凸部の周端部に基板方向に延びる突出片を有しており、
前記突出片に対向して立設され、かつ前記該突出片を係合するための係合突起を基板上に有する、請求項５記載の環境付着菌検出用デバイス。
【請求項７】
前記容器本体及び前記蓋体のうちの少なくとも一方が光透過性を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の環境付着菌検出用デバイス。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の環境付着菌検出用デバイスの容器本体内に環境付着菌を培養するための培地が収容されている、環境付着菌検出用デバイス。
【請求項９】
請求項８記載の環境付着菌検出用デバイスにおける蓋体の粘着層を被験面に圧着した後剥離し、当該蓋体を容器本体に嵌合係止して環境付着菌を培養し、形成されるコロニーを検出する、環境付着菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は環境付着菌検出用デバイス及び環境付着菌の検出方法に関し、より詳細には食品、医薬品等あるいはそれらの製造過程において環境付着菌の検査に使用可能なデバイス及びこれを用いた環境付着菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
菌管理が必要とされる食品、医薬品等あるいはその製造工場においては、環境付着菌の検査が重要である。かかる環境付着菌の検査方法として、例えば、製造環境中の被験面を含水綿棒等で拭き取った液を試料とし、寒天等で賦形した固形の平板培地で至適環境下に培養することにより出現するコロニーを肉眼で観察して検査する拭き取り法や、隆起させた寒天培地を被験面に押し付けて直接菌を捕集し培養するスタンプ法が一般に用いられている（特許文献１及び２）。しかしながら、拭き取り法においては、滅菌操作等において器具の取り扱いに手間が掛かり操作も煩雑で熟練を要する、拭き取り液に含まれる緩衝成分等で被験面を汚染する虞があるなどの問題がある。また、スタンプ法においても、寒天培地を直接被験面に接触させると培養成分で被験面を汚染してしまうため付着した培地成分を拭き取る必要があり、また寒天培地の乾燥が速く長期保存に不向きであるという問題がある。
【０００３】
また、粘着シートで表在菌を捕集し、これを寒天培地に積層して培養するための器材や、これを用いた検査方法も開発されている（特許文献３）。しかしながら、粘着シートと、寒天培地とが常時接触している場合には、製品保管時に粘着シートの粘着面に培地成分の付着防止のための剥離保護紙が必要になり、一方培養時には培地成分に汚染された剥離保護紙の廃棄が必要になる。また、剥離保護紙を使用しない場合には、表在菌を捕集する前から粘着シートが寒天培地に接触しているので、表在菌の捕集時に被験面を培地成分で汚染する可能性がある。さらに、表在菌を捕集する際に培地から分離した粘着シートを、表在菌の捕集後に所定の位置に装着する作業は熟練を要する。
【特許文献１】特開２００３−３４４２３２号公報
【特許文献２】特開平０６−１８９７３９号公報
【特許文献３】特開平０８−１０３２９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は熟練を要することなく簡便に操作可能な環境付着菌検出用デバイス及びこれを用いた環境付着菌の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するため環境付着菌検出用デバイスの構造について鋭意研究を重ねた結果、容器本体及び蓋体の嵌合位置を使用状況に応じて組み替えることができる構造を備えることで上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の特徴を有する。
（１）開口部を有し、かつ環境付着菌培養用の培地を収容するための容器本体と、該容器本体に取り外し可能に嵌合された蓋体とを備え、上記容器本体の周壁上面は凹部及び凸部を有しており、上記蓋体は嵌合部外周縁に形成された鍔部と、内表面に形成された粘着層とを有しており、上記鍔部は、周面から突出した凸部を有する、環境付着菌検出用デバイス。
（２）上記蓋体が上記容器本体周壁との接触面にパッキンを有する、上記（１）記載の環境付着菌検出用デバイス。
（３）上記蓋体が内表面に溝を有する、上記（１）又は（２）記載の環境付着菌検出用デバイス。
（４）上記容器本体が内壁面に溝を有する、上記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の環境付着菌検出用デバイス。
（５）上記容器本体が基板上に形成されており、上記鍔部の一部が突出部を有しており、上記容器本体に隣接して立設され、かつ上記突出部を挿入し固定するための嵌挿部を基板上に有する、上記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の環境付着菌検出用デバイス。
（６）上記鍔部の一部の凸部の周端部に基板方向に延びる突出片を有しており、上記凸部に対向して立設され、かつ上記該突出片を係合するための係合突起を基板上に有する、上記（５）記載の環境付着菌検出用デバイス。
（７）上記容器本体及び上記蓋体のうちの少なくとも一方が光透過性を有する、上記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の環境付着菌検出用デバイス。
（８）上記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の環境付着菌検出用デバイスの容器本体内に環境付着菌を培養するための培地が収容されている、環境付着菌検出用デバイス。
（９）上記（８）記載の環境付着菌検出用デバイスにおける蓋体の粘着層を被験面に圧着した後剥離し、当該蓋体を容器本体に嵌合係止して環境付着菌を培養し、形成されるコロニーを検出する、環境付着菌の検出方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の環境付着菌検出用デバイスによれば、未使用時（保管時）と、使用時（培養時）において容器本体及び蓋体を異なる嵌合位置に組み替えることが可能な構造を備えることで、未使用時の培地成分による蓋体の粘着層の汚染や、菌捕集時の被験面の培養成分による汚染を防止することが可能になり、また菌捕集後の蓋体を容器本体に熟練を要することなく簡便に所定の位置に装着することが可能になる。更に、上記構造を採用することにより、培地の水分蒸発を防止することができる。したがって、本発明の環境付着菌検出用デバイスを用いることで、簡便かつ確実に環境付着菌を検出することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明に係る環境付着菌検出用デバイスの好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。また、図示の便宜上、図面の寸法比率は説明のものと必ずしも一致しない。
【０００９】
（第１実施形態）
図１は、第１実施形態に係る環境付着菌検出用デバイスの断面図である。図１（ａ）は未使用時（保管時）の環境付着菌検出用デバイスを示し、図１（ｂ）は使用時（培養時）の環境付着菌検出用デバイスを示す。図２は本実施形態に係る容器本体の正面図であり、図３は蓋体の正面図である。本実施形態に係る環境付着菌検出用デバイス１０は、環境付着菌を培養するための培地１と、容器本体２と、蓋体３とを備えている。容器本体２は開口部４を有しており、その内部に培地１が収容されている。蓋体３は鍔部５を有しており、容器本体２に嵌合されている。また、蓋体３の内表面Ａには、環境付着菌を捕集するための粘着層６が形成されている。なお、蓋体３は、取り外し可能である。容器本体２の周壁上面には凹部７と、凸部８とが交互に設けられている。また、鍔部５には、その周面Ｂから突出した凸部９が設けられている。
【００１０】
保管時には、容器本体２の凸部８が蓋体３の鍔部５の非凸部と当接し、蓋体３は培地１に接触しない高い位置で容器本体２と嵌合する。これにより、培地１の開放面Ｃと、蓋体３の粘着層６との接触が防止できるので、培地成分による粘着層６の汚染が防止され、また粘着層６を剥離保護紙等で保護することが不要になる。また、環境付着菌の捕集時において、被験面の培地成分による汚染や、培地１の乾燥が防止される。
培養時には、容器本体２の凸部８が蓋体３の鍔部５の凸部９と当接し、蓋体３は、培地１に接触する低い位置で容器本体２と嵌合する。これにより、培地１の開放面Ｃと、蓋体３の粘着層６とが確実に接触するので、環境付着菌の培養や、その検出が簡便にできる。
【００１１】
容器本体２の凹部７及び凸部８の幅は、蓋体３と充分に嵌合できれば特に限定されるものではなく、例えば等間隔とすることができる。また、凹部７が凸部８よりも短くてもよく、その逆であってもよい。また、容器本体２の凹部７及び凸部８の高さは、蓋体３と嵌合可能であり、かつ保管時において開放面Ｃと粘着層６と接触せず、培養時において開放面Ｃと粘着層６とが接触可能であれば特に限定されるものではない。さらに、容器本体２の厚みは強度的に十分であれば特に限定されるものではないが、培養後のコロニーの観察に鑑みると可及的に薄い方が望ましい。また、容器本体２の平面形状は特に限定されるものではないが、例えば、円形、略円形、方形、略方形等が挙げられる。更に、容器本体２の大きさも環境付着菌を簡便に検出できれば特に限定されるものではない。
【００１２】
蓋体３は、環境中の雑菌汚染から培地１を保護する機能を有する。かかる観点から、図３（ｂ）に示すように、蓋体３は容器本体２の周壁との接触面Ｄにパッキン１１を備えることが好ましい。これにより、培地１の水分蒸発を防止できるため、より確実に長期間保管することが可能になる。なお、パッキン１１としては、公知のパッキンを使用することができる。また、環境付着菌を捕集する際に被験面が平面状であると、蓋体３の粘着層６を被験面に圧着した後に剥がし難いことがあるので、図３（ｃ）に示すように蓋体３の内表面Ａを突出させてもよい。
また、蓋体３の鍔部５の大きさは、凸部９を形成できる大きさであれば特に限定されるものではない。蓋体３の厚みは強度的に十分であれば特に限定されるものではないが、培養後のコロニーの観察に鑑みると可及的に薄い方が望ましい。なお、蓋体３の平面形状は特に限定されるものではないが、容器本体２と同様の平面形状とすることが望ましい。また、蓋体３の大きさは、環境中の雑菌汚染から培地１を保護するために十分な大きさとすることが望ましい。保管状態において、培地１の開放面Ｃから蓋体３の粘着面までの距離は、通常０．２〜１０ｍｍ以下、好ましくは１〜５ｍｍである。なお、かかる距離は、容器本体２又は蓋体３の厚みや、培地１の高さで調整することが可能である。
【００１３】
容器本体２及び蓋体３としては光透過性を有するものが好ましく、その材質としては、具体的には、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレン、ガラス等が挙げられる。培養後のコロニーを観察しやすくするために、容器本体２及び蓋体３のうちの少なくとも一方は透明であることが望ましい。
【００１４】
粘着層６は、被験面に圧着し剥離して環境付着菌を捕集し、かつ培地１の開放面Ｃに密着させるのに十分な粘着性を有するものであれば特に限定されるものではない。粘着層６は、例えば、蓋体３の内表面Ａに粘着剤を直接塗布し、乾燥して形成するか、あるいは両面テープを貼付することで形成することができる。粘着剤としては、アクリル系、ゴム系、シリコーン系、ウレタン系の粘着剤を用いることができ、両面テープの場合には各面に異種の粘着層が形成されていてもよい。この場合、粘着層６は、アルコールその他有機溶剤や防腐抗菌剤を含まないものが望ましい。また、両面テープが基材を有する場合には、その基材としてポリプロピレン、ポリエステル、ポリカーボネート、トリアセチルセルロースのプラスチックフィルムや不織布を好適に用いることができる。
【００１５】
培地１としては、液体の場合には微小なコロニーを形成することが難しいので、例えば、寒天平板の形態で用いることが好ましい。寒天以外のゲル化剤としてカラギーナン、アルギル酸、ザンサンガム、ローカストビーンガム等の天然多糖類を用いることができる。ゲルの形成方法は、使用する天然多糖類の種類に応じてそれぞれに公知の方法を用いればよく、例えば、寒天の場合には所定濃度の寒天含有溶液を加熱後、放冷することによりゲルを得ることができる。また、培地成分としては、検出すべき環境付着菌に適したものであれば特に限定されるものではなく、例えば、一般細菌を検出する場合にはソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地を選択することができる。培地１の厚みは通常１０ｍｍ以下、好ましくは３ｍｍ以下である。
【００１６】
以上説明したように、本実施形態の環境付着菌検出用デバイスにおいては、使用状況に応じて容器本体及び蓋体の嵌合位置を組み替えるだけで、容器本体と蓋体との嵌合高さを簡便に調整することができる。これにより、保管時には培地成分による蓋体の粘着層の汚染を防止することができる。また、培養時には、熟練を要することなく、環境付着菌の捕集後の蓋体を所定の位置に装着することが可能になるので、簡便に菌を培養し検出することができる。
【００１７】
（第２実施形態）
次に、本発明の第２実施形態に係る環境付着菌検出用デバイスについて説明する。図４は、本実施形態に係る環境付着菌検出用デバイスの容器本体の正面図である。図５は、本実施形態に係る環境付着菌検出用デバイスの蓋体の平面図である。本実施形態に係る環境付着菌検出用デバイスは、培地１と、容器本体２と、蓋体３とから構成されており、蓋体３の内表面Ａには粘着層６が形成されている点において第１実施形態の環境付着菌検出用デバイスと同様であるが、以下の点で相違する。すなわち、容器本体２の凸部８の内壁面には、溝１２が形成されている点で相違する。これにより、酸素が要求される菌の培養時において、通気性が確保される。さらに、蓋体３の内表面Ａには、図５（ａ）に示されるように溝１３が碁盤目状に形成されている点で相違する。これにより、溝１２と溝１３とが連続した通気溝を形成することが可能になるので、通気性がより高められる。なお、培地１、容器本体２、蓋体３及び粘着層６の構成は、第１実施形態において説明した通りである。また、本実施形態においても、培地１の水分蒸発防止の観点から、蓋体３は容器本体２の周壁との接触面Ｄにパッキン１１を有することが望ましい。
【００１８】
また、溝１２及び溝１３は、両者が連続した通気溝を形成するように配置されることが望ましい。また、溝１２及び１３の深さ及び形状は通気性を確保でき、容器本体２及び蓋体３の強度を損なわなければ特に限定されるものではない。
【００１９】
なお、本実施形態においては、蓋体３の内表面Ａの溝１３が碁盤目状に形成されている場合について説明したが、通気性が確保できれば溝１３の配置は特に限定されず、例えば、図５（ｂ）に示されるような同心円状や、放射状であってもよい。
【００２０】
（第３実施形態）
次に、本発明の第３実施形態に係る環境付着菌検出用デバイスについて説明する。図６は、本実施形態に係る環境付着菌検出用デバイスの斜視図である。図７は、本実施形態に係る環境付着菌検出用デバイスの正面図であり、図７（ａ）は保管時の環境付着菌検出用デバイスを示し、図７（ｂ）は培養時の環境付着菌検出用デバイスを示す。環境付着菌検出用デバイス３０は、培地１と、容器本体２と、蓋体３とから構成されている。蓋体３の内表面Ａには、粘着層６と碁盤目状の溝１３が形成されている。容器本体２の内壁面にも上記実施形態と同様の溝１２が形成され、容器本体２の周壁にはパッキン１１が装着されている。また、容器本体２は基板１４上に形成されており、この基板１４上には嵌挿部１５が容器本体２に隣接して立設されている。蓋体３の鍔部５には突出部１６が形成されており、この突出部１６を挿入するための嵌挿口１７が嵌挿部１５に形成されている。さらに、突出部１６に対向する鍔部５の凸部９には平板状の突出片１８が形成されており、この突起片１８に対向して平板状の係合突起１９が基板１４上に立設されている。なお、培地１、容器本体２、蓋体３、粘着層６、及び溝１２、１３の構成は、上記実施形態において説明した通りである。
【００２１】
本実施形態に係る環境付着菌検出用デバイス３０は、培養時においては、図７（ｂ）に示すように、突出部１６の先端が嵌挿口１７に挿入され、嵌挿部１５に固定される。また、突出片１８と、係合突起１９とが係合される。この場合、上記実施形態と同様に容器本体２の凸部８が蓋体３の鍔部５の凸部９と当接し、蓋体３は培地１に接触する低い位置で容器本体２と嵌合される。これにより、粘着層６を培地１の開放面Ｃにより確実に密着させることが可能になり、また錯誤により環境付着菌検出用デバイス３０を落下したとしても蓋体３が外れるおそれがない。なお、保存時には、上記実施形態と同様に容器本体２の凸部８が蓋体３の鍔部５の非凸部と当接し、蓋体３は培地１に接触しない高い位置で容器本体２と嵌合される。
【００２２】
突出部１６の形状は、嵌挿部１５に突出部１６を嵌挿できれば特に限定されるものではなく、方形、略方形等が挙げられる。また、嵌挿口１７の形状も突出部１６の先端が挿入できれば特に限定されるものではなく、円形、略円形、方形、略方形等が挙げられる。さらに、係合突起１９の形状は、突出片１８を固定できるものであれば特に限定されるものではなく、円形、略円形、方形、略方形等が挙げられる。
【００２３】
次に、本発明の環境付着菌検出用デバイスの製造方法について説明する。本発明の環境付着菌検出用デバイスは、容器本体及び蓋体をエチレンオキサイドガス（ＥＯＧ）、又は電子線若しくはγ線等の電磁放射線で予め滅菌した後、この容器本体に、オートクレーブで滅菌した固化前の培地を無菌環境で充填することで作製できる。
【００２４】
次に、本発明の環境付着菌の検出方法について説明する。検出対象である環境付着菌としては、細菌や放線菌等の原核生物、酵母等の真核生物等が含まれる。検出方法としては、例えば、上記実施形態において説明したデバイスを用いて、通常の微生物の培養と同様の方法で行うことができる。具体的には、固形培地が収容された容器本体から蓋体を取り外し、蓋体の粘着面を環境の被験面に圧着し、剥離して環境付着菌を捕集する。次いで、図８（ａ）に示すように、突出部１６の先端を嵌挿口１７に挿入し嵌挿部１５に嵌挿した後、突出片１８を、係合突起１９と容器本体２の外壁面と間に挿入し係合する。このようにして、図８（ｂ）に示すように、容器本体２と、蓋体３とを嵌合係止した後、至適環境下で培養する。そして、培養終了後又は培養途中に、目視や顕微鏡等を用いてコロニーを観察する。なお、コロニーの観察は、蓋体３越し、あるいは容器本体２の底部から行なうことができる。また、観察終了後にはそのまま滅菌可能であるので、環境汚染や感染を防止することができる。
【実施例】
【００２５】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００２６】
（実施例１）
環境付着菌検出用デバイスの作製
トリプトソーヤ寒天培地顆粒（ペプトン１５ｇ、ダイズペプトン５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ）４０ｇを１Ｌの蒸留水に溶かしオートクレーブ滅菌した培地を、γ線により滅菌処理したポリスチレン製容器本体に無菌環境下で厚み２ｍｍになるように注ぎ、次いでこれを冷却して固化させた。次いで、ポリプロピレンフィルムの両面にアクリル系粘着剤を積層した、厚み７０μｍの透明な粘着シート（２５ｃｍ２）を、１．３ｍｍ径のエチレン酢酸ビニル共重合体製パッキンを装着した蓋の内表面に貼付した後、γ線により滅菌した。そして、蓋の内表面の粘着層が培地に接触しない位置で容器本体と蓋とを嵌合させて、図６に示す環境付着菌検出用デバイスを作製した。
【００２７】
（環境菌の捕集性試験）
実施例１で得られた環境付着菌検出用デバイスの蓋を取り外し、その粘着面を表１に示す環境被験面に圧着して剥がし、粘着面が培地に接触するように容器本体と、蓋とを嵌合させた。嵌合させた状態で３５℃、４８時間培養し出現するコロニー数を計数した。
【００２８】
スタンプアガー（商品名：ぺたんチェック２５、栄研器材（株）製）を用いて表１に示す環境被験面における環境付着菌を採取し、同様の条件で培養して出現するコロニー数を計数した。測定結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
2007135542.tif 000003
【００３０】
表１の結果から、実施例１のデバイスを用いた検出方法は、スタンプアガー法と同等の菌捕集性を有することが確認された。
【００３１】
（保管性試験）
実施例１の環境付着菌検出用デバイスと、スタンプアガー（商品名：ぺたんチェック２５、栄研器材（株）製）とを室温下に７〜２８日間放置し、初期重量からの重量変化を測定した。測定結果を表２に示す。
【００３２】
【表２】
2007135542.tif 000004
【００３３】
表２の結果から、実施例１の環境付着菌検出用デバイスの重量減少は小さく、長期間保存しても寒天培地の保水量は充分に保持されており、培養能力に優れることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の環境付着菌検出用デバイスの一実施形態を示す断面図である。
【図２】本発明の環境付着菌検出用デバイスの容器本体の一実施形態を示す正面図である。
【図３】本発明の環境付着菌検出用デバイスの蓋体の一実施形態を示す正面図である。
【図４】本発明の環境付着菌検出用デバイスの容器本体の他の実施形態を示す正面図である。
【図５】本発明の環境付着菌検出用デバイスの蓋体の他の実施形態を示す平面図である。
【図６】本発明の環境付着菌検出用デバイスの他の実施形態を示す斜視図である。
【図７】本発明の環境付着菌検出用デバイスの他の実施形態を示す正面図である。
【図８】本発明の環境付着菌検出用デバイスの使用方法の一例を説明する模式図である。
【符号の説明】
【００３５】
１…培地、２…容器本体、３…蓋体、４…開口部、５…鍔部、６…粘着層、７…容器本体の凹部、８…容器本体の凸部、９…鍔部の凸部、１０…環境付着菌検出用デバイス、１１…パッキン、１２…容器本体の溝、１３…蓋体の溝、１４…基板、１５…嵌挿部、１６…蓋体の突出部、１７…嵌挿口、１８…突出片、１９…係合突起、３０…環境付着菌検出用デバイス、Ａ…蓋体の内表面、Ｂ…蓋体の周面、Ｃ…培地の開放面、Ｄ…蓋体の容器本体周壁との接触面。
【図１】
2007135542.tif 000005
【図２】
2007135542.tif 000006
【図３】
2007135542.tif 000007
【図４】
2007135542.tif 000008
【図５】
2007135542.tif 000009
【図６】
2007135542.tif 000010
【図７】
2007135542.tif 000011
【図８】
2007135542.tif 000012