(57)【要約】【課題】クロット（ｃｌｏｔ）中のフィブリンまたは他の何らかの表面のいずれかに結合したトロンビンを選択的に不活化し得るが、遊離トロンビン（すなわち液相トロンビン）に対しては最小の阻害活性しか有さない因子を投与することにより、血栓の形成および成長を改変することを実現すること。【解決手段】クロット結合トロンビンを不活化するヘパリン補因子ＩＩ特異的（ＨＣＩＩ特異的）触媒因子であって：  （ｉ）抗第ＩＩａ因子アッセイにおける約２ユニット／ｍｇ〜約５ユニット／ｍｇのヘパリン補因子ＩＩに対するヘパリン補因子ＩＩ比活性；（ｉｉ）抗第Ｘａ因子アッセイにおける約０．２ユニット／ｍｇ〜約１．５ユニット／ｍｇの第Ｘａ因子に対する抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）比活性；および（ｉｉｉ）約１５０ｍｇ／ｍｌ〜約１，０００ｍｇ／ｍｌの範囲の水性媒体への溶解度；により特徴付けられる、因子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載されるような、血栓形成を阻害するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、１９９５年３月３１日に出願した出願番号第０８／４１２，３３２号の一部継続出願である。この出願の教示は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、循環器病の処置のための組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、クロット（ｃｌｏｔ）中のフィブリンまたは他の何らかの表面のいずれかに結合したトロンビンを選択的に不活化し得るが、遊離トロンビン（すなわち液相トロンビン）に対しては最小の阻害活性しか有さない因子を投与することにより、血栓の形成および成長を改変することに関する。本発明はまた、ヘパリン補因子ＩＩ特異的（ＨＣＩＩ）触媒因子に関する。これは、とりわけ、トロンビンのＨＣＩＩに媒介される阻害を活性化する。本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子の活性は、これらが遊離トロンビンの最小の不活化を生じる濃度で、患者におけるフィブリン結合トロンビンを不活化するのを可能にし、それにより出血の危険性を減少させる。これは、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子の驚くべき特性である。なぜなら、他の抗凝血因子は、典型的には、遊離トロンビンと比較してフィブリン結合トロンビンを不活化する能力が減少している（例えば、ヘパリン、デルマタン硫酸、および低分子量ヘパリン）か、またはフィブリン結合トロンビンと遊離トロンビンとを不活化する能力が実質的に等しい（例えば、ヒルジンおよびその誘導体、ならびに活性化部位トロンビンインヒビターのインヒビター）かのいずれかであるためである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血栓症は、血管におけるクロッティング（ｃｌｏｔｔｉｎｇ）カスケードの病的症状である。クロッティングカスケードは、血小板およびフィブリンから構成されるクロットまたは血栓の形成をもたらす複雑な生物学的プロセスである。トロンビンはクロット中のフィブリンに結合する。ここでトロンビンは、触媒的に活性であり、そして周辺の血液中の凝固因子を活性化することによりその生産を１０００倍以上に増幅し得る。トロンビンを生成する血液の能力は、創傷部位での過剰な出血の防止（止血）に基づく。トロンビンは、血管が切断された場合に、血小板の凝集およびフィブリン形成を刺激するので、止血において重要である。従って、理想的な抗トロンビン（ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ）は、全身の循環におけるトロンビン形成の阻害によりもたらされる異常な出血を生じない濃度でフィブリン結合トロンビンを不活化することによりクロットを和らげ得る因子である。
【０００４】
血栓症（これは、アテローム性動脈硬化症を複雑にし得る）は、発症した血管の部分的または全体的な閉塞を生じ得、それにより多くの重要な心臓血管合併症を生じ得る。心臓血管合併症は、不安定な狭心症、急性の心筋梗塞（心発作）、脳血管偶発症候（脳卒中）、肺塞栓症、深部静脈血栓症、および動脈血栓症を包含する。このような疾患は、世界中の、しかし、特に西洋社会の障害および死亡率の主要な原因である。さらに、トロンビン、特に表面結合トロンビンは、血管形成術後、ならびに急性の心筋梗塞の血栓溶解治療の間およびその後の心臓バイパス回路において血栓の形成において役割を果たす。従って、これらの手順を受ける患者は、血栓症を防ぐために非常に高用量のヘパリンで処置されなければならない。これらの高用量のヘパリンは効果的にクロッティング（ｃｌｏｔｔｉｎｇ）を防ぐかもしれないが、これらは深刻な出血合併症を生じ得る。
【０００５】
クロットまたは血栓（クロッティングカスケードの活性化の結果として形成する）は、フィブリン、血小板、および多数の他の血液成分を含有する。フィブリン結合トロンビンは活性なままであり、そしてフィブリノーゲンの連続的な切断ならびに血小板および他の凝固因子（例えば、第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子）の活性化によりクロットの成長を生じる。さらに、天然に生じる抗トロンビン（例えば、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ））により容易に不活化される遊離トロンビンとは異なり、クロット結合トロンビンは、不活化から保護される。その結果、クロットは、クロットのさらなる成長を誘引する活性なトロンビンの貯蔵庫として作用する。さらに、トロンビンはまた、平滑細胞増殖を誘導し、従って、増殖応答（例えば、血管形成術または粥腫切除の後の移植片誘導性アテローム硬化症および再狭窄）に関与し得る。
【０００６】
トロンビンは血栓形成に必須であるため、血栓症および血栓症の合併症の処置のためのトロンビンインヒビターの使用が、長い間提案されてきた。多くの特に有効なインヒビターが何年も使用されてきた。例えば、ヘパリンは、抗凝血因子および抗トロンビン因子として、フィブリン形成、血小板凝集、および血栓形成を阻害するために使用され得る。しかし、ヘパリンは、多くの制限を有する。例えば、ＡＴＩＩＩを活性化することにより抗凝血因子として作用し、従って安全な用量ではフィブリン結合トロンビンを不活化するには比較的無効であり、それゆえ予め存在している血栓中にフィブリン結合トロンビンにより媒介される血栓の連続的な成長を可能とするために、生物物理学的制限がある。さらに、抗血栓効果を生じるために必要とされる用量は極めて予測し難く、従って用量は綿密にモニターされなければならない。低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）はまた、抗凝血因子および抗トロンビン因子として、フィブリン形成、血小板の凝集、および血栓形成を阻害するために使用され得る。ＬＭＷＨはＡＴＩＩＩを活性化することにより作用し、それゆえヘパリンと同じ生物物理学的制限を有する。しかし、ＬＭＷＨは、ヘパリンより予測可能な抗凝固効果を生じる。従って、ヘパリンおよびＬＭＷＨの両方は、表面結合トロンビンを容易に不活化できないという制限を有する。この結果は、（ａ）抗トロンビン効果を達成するためには、過剰な出血をもたらし得る高濃度が必要である、および（ｂ）一旦、この因子が循環から一掃されたら、表面結合トロンビンがクロッティングを再活性化し得るということである。
【０００７】
クロット結合トロンビンの不活化は、直接的なトロンビンインヒビターとして知られる他の一連の化合物を用いて達成され得る。このようなインヒビターは、ヒルジンおよびその誘導体、およびトロンビンの活性部位のインヒビター（例えば、アルガトロバンおよびＰＰＡＣＫ（Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロピル−Ｌ−アルギニルクロロメチルケトン））を包含する。ヒルジンは、ヒルの唾液腺から抽出された抗トロンビン物質である。関連する化合物は、ヒルログを包含する。ヒルログは、ヒルジンの小さな合成アナログである。これらの薬物はクロット結合トロンビンを阻害し得るが、これらは以下の制限を有する。第１に、これらは、典型的には、クロット結合トロンビンを選択的に不活化するのではなく、遊離トロンビンを阻害するために必要とされるのと同じ濃度で不活化する。第２に、トロンビンの不活化は、一般に化学量論的であり、従って非常に高濃度が使用されない限り、阻害効果は、表面結合トロンビンが蓄積する部位（例えば、バイパス回路上で、あるいは動脈または静脈の血栓症の部位で）で産生される大量のトロンビンにより打ち消され得る。上記の２つの制限の結果、高濃度の直接的なトロンビンインヒビター（例えば、ヒルジン）が、典型的に、クロット結合トロンビンにより産生された遊離トロンビンと相互作用するため、および遊離トロンビンを阻害するために投与されなければならない。しかし、このような高いインヒビター濃度は、望ましくない出血を生じ得る。さらに、直接的なトロンビンインヒビター（例えば、ヒルジン、そのアナログ、およびアルガトロバンのようなＬＭＷ活性部位トロンビンインヒビター）は、一般に可逆的であり、従って薬物が血液から一掃された場合には阻害効果は失われる。不幸なことに、この可逆的な阻害は、凝血の反跳する活性化をもたらし得る。
【０００８】
さらに、クロット結合トロンビンの不活化は、トロンビンの活性な（すなわち触媒的な）部位に可逆的または不可逆的に結合する第３のクラスの化合物を用いて達成され得る。ＰＰＡＣＫは、不可逆的な活性部位インヒビターの１例である。しかし、このようなインヒビターは、一般に、トロンビンに対する十分な特異性がなく、従って安全性に疑問がある。さらに、このようなインヒビターは、これらが典型的にはクロット結合トロンビンと遊離トロンビンとに対して同等の活性を有するので、ヒルジンと同じ制限を有する。これは、不可逆的な活性部位インヒビターを用いた遊離トロンビン全体の阻害が過剰な出血をもたらし得ることを示す証拠があるので問題がある。
【０００９】
先述の理由のために、例えば、循環器病に関連する血栓形成を阻害するために有用である改善された組成物および方法が必要である。特に、血管系内に存在する血栓からフィブリン結合トロンビンの活性を減少または除去し得る組成物および方法を提供することが望ましい。クロット結合トロンビンのこのような除去または減少は、処置剤の投与を止めた後にクロットの付着が実質的に再開されないように、本質的に不可逆的であるべきである。このように、遊離トロンビンをそれほど強力に不活化しない因子で、クロットまたは血栓内のトロンビンを不活化し得る組成物および方法が必要である。なぜなら、このような因子は、出血の制御（止血）に有害に作用しないからである。本発明は、これらおよび他の必要性を満たす。
【００１０】
トロンビンの活性部位のブロッキングのためのヒルジン誘導体は、米国特許第５，２４０，９１３号および同第５，１９６，４０４号に記載される。糖タンパク質のＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害ドメインおよびトロンビン阻害ドメインの両方を含む２機能性抗血栓組成物は、ＷＯ  ９２／１０５７５に記載される。血栓形成阻害のための糖タンパク質ＩＩＩａのペプチドアナログは、ＷＯ  ９０／００１７８に記載される。第Ｘ因子および／または第Ｘａ因子のインヒビターは、米国特許第５，２３９，０５８号および同第５，１８９，０１９号、ならびにＰＣＴ公開公報ＷＯ  ９３／０９８０３、ＷＯ  ９２／０４３７８、およびＷＯ  ９２／０１４６４に記載される。第ＶＩＩ因子および／または第ＶＩＩＩ因子のインヒビターは、米国特許第５，２２３，４２７号および同第５，０２３，２３６号ならびにＷＯ  ９２／０６７１１に記載される。血小板抗接着因子および関連する抗体は、ＷＯ  ９２／０８４７２に記載される。トロンビンの構造および機能の総説については、ＳｔｕｂｂｓおよびＢｏｄｅ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６９：  １−５８（１９９３）を参照のこと。ヘパリンの制限および抗血栓因子として新しい抗凝血因子の潜在的な利点の総説については、Ｈｉｒｓｈ，Ｃｉｒｃ．８８：  Ｉ−Ｃ（１９９３）を参照のこと。
【００１１】
さらに、多数の改変されたヘパリン組成物ならびに他のグリコサミノグリカンおよびそれらの誘導体が開発された。例えば、米国特許第５，２９６，４７１号、同第５，２８０，０１６号、および同第５，３１４，８７６号は、それぞれ、ヘパリンの脱硫酸化、ヘパリン／ヘパラン硫酸の過ヨウ素酸酸化およびその後の得られたアルデヒド基の還元、ならびに高分子量のＮ，Ｏ−硫酸化ヘパロサン（ｈｅｐａｒｏｓａｎ）を記載する。低分子量ヘパリン画分は、何年も使用されている（Ｂｏｎｅｕら，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０：  ８１−８９（１９８５）を参照のこと）。さらに最近では、種々のデルマタン硫酸が開発され、それらのヘパリン補因子ＩＩとの相互作用が研究された（Ｍａｓｃｅｌｌａｎｉら，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７４：  ６０５−６１５（１９９４）およびＳｈｅｅｈａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：  ３２７４７−３２７５１（１９９４））。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明によって以下が提供される：
項目１．クロット結合トロンビンを不活化するヘパリン補因子ＩＩ特異的（ＨＣＩＩ特異的）触媒因子であって：
（ｉ）抗第ＩＩａ因子アッセイにおける約２ユニット／ｍｇ〜約５ユニット／ｍｇのヘパリン補因子ＩＩに対するヘパリン補因子ＩＩ比活性；
（ｉｉ）抗第Ｘａ因子アッセイにおける約０．２ユニット／ｍｇ〜約１．５ユニット／ｍｇの第Ｘａ因子に対する抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）比活性；および
（ｉｉｉ）約１５０ｍｇ／ｍｌ〜約１，０００ｍｇ／ｍｌの範囲の水性媒体への溶解度；
により特徴付けられる、因子。
項目２．以下の特徴：
（ｉ）非分画性ヘパリンの抗トロンビンＩＩＩ親和性の約３％未満の抗トロンビンＩＩＩ親和性を有する；
（ｉｉ）約１０〜約２４の単糖単位のポリアニオン炭水化物である；
の一方または両方により特徴付けられる、項目１に記載の因子。
項目３．約３，０００ダルトンと約８，０００ダルトンとの間の分子量を有するヘパリン調製物である、項目１または２に記載の因子。
項目４．前記ヘパリン調製物が：
（ｉ）非分画性ヘパリンから単離された分子量が最も小さい第３の画分から本質的になる；または
（ｉｉ）分子量の範囲を約３，０００ダルトンと約８，０００ダルトンとの間に化学的に低下させることにより非分画性ヘパリンから製造される、
項目３に記載の因子。
項目５．前記ヘパリン調製物が：
（ｉ）約８，０００ダルトンの平均分子量を有する；
（ｉｉ）約５，０００ダルトンの平均分子量を有する；または
（ｉｉｉ）約３，０００ダルトンの平均分子量を有する、
項目３または４に記載の因子。
項目６．前記ヘパリン調製物が、分子量の範囲を約３，０００ダルトンと約８，０００ダルトンとの間に化学的に低下させることにより非分画性ヘパリンから製造され、そして該ヘパリン調製物中に存在するビシナルなアルコール基を酸化剤およびその後に還元剤で処理することにより抗トロンビン活性が減少しており、そして必要に応じて、該酸化剤は、過ヨウ素酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド、酸無水物、四酢酸鉛、およびアスコルビン酸から選択され、そして該還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、リチウムアルミニウム水素化物、金属水素化物、およびヒドラジンから選択される、項目３〜５のいずれかに記載の因子。
項目７．前記ヘパリン調製物が、ＡＴＩＩＩに対する親和性を有さない物質から本質的になり、該物質は、ＡＴＩＩＩが固定化され、そして流出物が保持される固相上でのアフィニティー精製により調製された、項目３〜６のいずれかに記載の因子。
項目８．項目１に記載の因子であって、式（ａ）：
【００１３】
【数１】
2007204500.tif 000002
【００１４】
ここで、
Ｒ１は、Ｈ、Ｄ−グルコサミン酸残基、Ｄ−グルクロン酸残基、およびＬ−イズロン酸残基からなる群より選択されるメンバーである；
Ｒ２は、Ｈ、Ｄ−グルコサミン酸残基、Ｄ−グルクロン酸残基、Ｌ−イズロン酸残基、および無水マンニトールからなる群より独立して選択されるメンバーである；
Ｒ３は、ＨおよびＳＯ３−からなる群より選択されるメンバーである；そして
Ｒ４は、Ｈ、ＳＯ３−、およびＣＨ３ＣＯ−からなる群より選択されるメンバーである；
指数ｎは独立して選択され、そして０〜約１４の範囲の値を有し得る；
ここで：
該ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、約３，０００ダルトン〜約８，０００ダルトンの範囲の分子量を有する；
を有するか、または、式（ｂ）：
【００１５】
【数２】
2007204500.tif 000003
【００１６】
ここで、
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、Ｄ−グルコサミン酸残基、Ｄ−グルクロン酸残基、およびＬ−イズロン酸残基からなる群より独立して選択されるメンバーである；
Ｒ３は、ＨおよびＳＯ３−からなる群より選択されるメンバーである；そして
Ｒ４は、Ｈ、ＳＯ３−、およびＣＨ３ＣＯ−からなる群より選択されるメンバーである；
ここで：
該ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、約３，０００ダルトン〜約８，０００ダルトンの範囲の分子量を有する、
を有する、因子。
項目９．以下の特徴：（ｉ）抗第ＩＩａ因子活性において少なくとも約３ユニット／ｍｇ〜４ユニット／ｍｇのヘパリン補因子ＩＩ比活性；（ｉｉ）抗第Ｘａ因子アッセイにおいて約１ユニット／ｍｇのＡＴＩＩＩ比活性；の一方または両方により特徴付けられる、項目１〜８のいずれかに記載の因子。
項目１０．（ｉ）前記因子がヘパリン添加剤と組み合わされるか、または
（ｉｉ）該因子が、ヘパリン添加剤と組み合わされ、そして該ＨＣＩＩ特異的触媒因子対該ヘパリン添加剤の重量比が約２対１より大きく、ここで、必要に応じて、該ヘパリン添加剤が非分画性ヘパリンであるか、または非分画性ヘパリンから単離された分子量が最も小さい第３の画分である、
項目１〜９のいずれかに記載の因子。
項目１１．患者における血栓形成を阻害するための薬学的組成物であって：
（ｉ）フィブリンに結合したトロンビンを不活化する、約９０重量％〜約９９．９重量％のＨＣＩＩ特異的触媒因子であって、ここで、該ＨＣＩＩ特異的触媒因子が抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）に対して最小の親和性しか有さない、因子；
（ｉｉ）液相トロンビンを不活化する約０．１重量％〜約１０重量％のＡＴＩＩＩ触媒因子、
を含有し、ここで；
該組成物の該ＨＣＩＩ触媒活性が約２ユニット／ｍｇ〜約５ユニット／ｍｇである、組成物。
項目１２．前記ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、
（ｉ）約１０〜約２４の単糖単位のポリアニオン炭水化物であるか；または
（ｉｉ）ポリアニオン炭水化物が、約１０〜約２４の単糖単位からなり、そして約３，０００ダルトンと約８，０００ダルトンとの間の分子量を有するヘパリン調製物である、
項目１１に記載の組成物。
項目１３．前記ヘパリン調製物が、項目４、５、６、７、８、および９の１項以上に記載される特定の特徴によりさらに規定される、項目１２に記載の組成物。
項目１４．前記ＡＴＩＩＩ触媒因子が非分画性ヘパリンであるか、または非分画性ヘパリンから単離された分子量が最も小さい第３の画分である、項目１２または１３に記載の組成物。
項目１５．（ｉ）クロットに結合したトロンビンを不活化する因子であって、該因子は、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）に対する最小の親和性、および抗第ＩＩａ因子アッセイにおいて約２ユニット／ｍｇ〜約５ユニット／ｍｇのヘパリン補因子ＩＩに対するヘパリン特異的補因子ＩＩ比活性を有する、因子；および
（ｉｉ）患者においてクロットに結合したトロンビンおよび液相トロンビンを阻害するために、同時、別々、または連続的に使用するための調製物として液相トロンビンを不活化するＡＴＩＩＩ触媒因子；
を含有する、生成物。
項目１６．前記トロンビン不活化因子が、
（ｉ）項目１〜８の１項以上に規定されるＨＣＩＩ特異的触媒因子であるか、または、
（ｉｉ）項目１２の（ｉ）または（ｉｉ）に記載される特定の特徴により規定されるポリアニオン炭水化物、およびさらに、またはあるいは抗第ＩＩａ因子活性において少なくとも約３ユニット／ｍｇ〜約４ユニット／ｍｇのヘパリン補因子ＩＩ比活性を有する、
項目１５に記載の生成物。
項目１７．前記ＡＴＩＩＩ触媒因子が非分画性ヘパリンであるか、または非分画性ヘパリンから単離された分子量が最も小さい第３の画分である、項目１５または項目１６に記載の生成物。
項目１８．（ｉ）約３，０００ダルトンと約８，０００ダルトン（±１，０００）との間の分子量；
（ｉｉ）抗第ＩＩａ因子アッセイにおける約２ユニット／ｍｇ〜約５ユニット／ｍｇのヘパリン補因子ＩＩに対するヘパリン補因子ＩＩ比活性；
（ｉｉｉ）抗第Ｘａ因子アッセイにおける約０．２ユニット／ｍｇ〜約１．５ユニット／ｍｇの第Ｘａ因子に対する抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）比活性；
（ｉｖ）約１５０ｍｇ／ｍｌ〜約１，０００ｍｇ／ｍｌの範囲の水性媒体への溶解度；および
（ｖ）一方の末端基としてのウロン酸残基または他の天然の非還元糖、および他方の末端基としての２，５−無水マンニトール非還元糖；
により特徴付けられる、低分子量ヘパリン調製物。
項目１９．遊離トロンビンの利益となるように、クロットに結合したトロンビンを選択的に不活化し得るポリアニオン炭水化物であって、ヘパリンから入手可能であり、その非硫酸化ウロン酸残基を開環形態で有し、そしてアルデヒド基を実質的に有さない、ポリアニオン炭水化物。
項目２０．一方の末端基としての天然の非還元糖、および他方の末端基としての２，５−無水マンニトール非還元糖を有し、そして／またはここで約３０％のウロン酸残基が開環形態である、項目１９に記載の炭水化物。
項目２１．項目１を特徴付ける特徴の１つ、２つ、または３つにより、および／または項目２〜９の１項以上において記載される特定の特徴によりさらに特徴付けられる、項目１８に記載の調製物あるいは項目１９または項目２０に記載の炭水化物。
項目２２．（ｉ）亜硝酸を用いて非分画性ヘパリンを脱重合する工程；
（ｉｉ）３，０００〜８，０００（±１，０００）の範囲の分子量を有する該脱重合された画分を単離およびプールし、低分子量画分を提供する工程；
（ｉｉｉ）過ヨウ素酸塩を用いて該低分子量画分を切断する工程；
（ｉｖ）該切断された画分を水素化ホウ素ナトリウムを用いて還元する工程であって、ここで、必要に応じて、抗トロンビンＩＩＩアフィニティーカラムを用いて、該脱重合したヘパリンの親和性を減少させ、そして該低分子量画分が約２抗トロンビンユニット／ｍｇ〜約５抗トロンビンユニット／ｍｇおよび約１．５抗第Ｘａ因子ユニット／ｍｇ未満の比活性を有する、工程；
により入手可能である、クロットに結合したトロンビンを選択的に阻害し得る生成物。
項目２３．（ｉ）標準的な非分画性ヘパリンを亜硝酸脱重合により脱重合する工程；
（ｉｉ）該脱重合されたヘパリンを、水性媒体中の過ヨウ素酸ナトリウムを用いて４℃にて２４時間酸化し、そして過剰なエチレングリコールを添加することにより酸化反応を停止させ、その後、５００ＭＷのカットオフを有する透析チューブを用いて蒸留水に対して十分に透析する工程；
（ｉｉｉ）水素化ホウ素ナトリウムの添加により、該酸化した生成物を還元し、そして反応混合物を２３℃にて２５時間静置させた後、ＨＣｌを用いて該反応混合物のｐＨを３．０に調整して過剰なホウ化水素を破壊し、次いでＮａＯＨの添加により速やかにｐＨを７．０に増大させる工程；
（ｉｖ）該得られた生成物を蒸留水に対して十分に透析する工程；および
（ｖ）該生成物を凍結乾燥により回収する工程；および必要に応じて、
（ｖｉ）該生成物を抗トロンビンＩＩＩアフィニティーカラムに通す工程、得られる該生成物は以下の特性を有する；
・３，０００〜８，０００（±１，０００）の分子量
・約２抗第ＩＩａ因子ユニット／ｍｇ〜約５抗第ＩＩａ因子ユニット／ｍｇの比活性
・約１．５抗トロンビンＩＩａユニット／ｍｇ未満の比活性；
により入手可能である、生成物。
項目２４．医薬品として使用するための、項目１〜１０のいずれかに記載の触媒因子、項目１８または項目２１に記載の調製物、項目１９〜２１のいずれかに記載の炭水化物、あるいは項目２２または項目２３に記載の生成物。
項目２５．活性因子としての項目１〜１０のいずれかに記載の触媒因子、項目１８または項目２１に記載の調製物、項目１９〜２１のいずれかに記載の炭水化物、または項目２２または項目２３に記載の生成物、および必要に応じて薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤、またはキャリアを含有する薬学的生成物であって、該薬学的生成物は、必要に応じて、該活性因子と同時、別々、または連続的に投与するための液相トロンビンのインヒビターをさらに含有する、薬学的生成物。
項目２６．一方の末端基としての天然の非還元糖および他方の末端基としての２，５−無水マンニトール非還元糖を有するＨＣＩＩ特異的触媒因子を調製するためのプロセスであって、該プロセスは：
（ｉ）非分画性ヘパリンを脱重合する工程；
（ｉｉ）得られた低分子量ヘパリンを酸化する工程；および
（ｉｉｉ）酸化された低分子量ヘパリンを還元する工程；
を包含し、
ここで、該プロセスが、必要に応じて、該ＨＣＩＩ特異的触媒因子を得るためのさらなる精製または他の手順を包含する、プロセス。
項目２７．前記非分画性ヘパリンが亜硝酸を用いて脱重合され、そして／または前記酸化された低分子量ヘパリンが水素化ホウ素ナトリウムを用いて還元される、項目２６に記載のプロセス。
項目２８．循環器病の処置のための医薬品の製造のための、項目１〜１０のいずれかに記載の触媒因子、項目１８または項目２１に記載の調製物、項目１９〜２１のいずれかに記載の炭水化物、あるいは項目２２または項目２３に記載の生成物、あるいは項目２６または項目２７のプロセスを用いて入手可能であるＨＣＩＩ特異的触媒因子の生成物の使用であって、必要に応じて、該医薬品の製造のための液相トロンビンのインヒビターの使用をさらに包含する、使用。
項目２９．非硫酸化ウロン酸残基を開環形態で有し、そして実質的にアルデヒド基を有さないヘパリン誘導体の、予防または治療により血栓症を処置するための医薬品の製造のための使用。
項目３０．臨床的に危険な全身性出血の増大を誘導することなく、患者において血栓形成を阻害するための方法であって、ここで、該方法は、クロットに結合したトロンビンを不活化する、薬理学的に受容可能な用量のヘパリン補因子ＩＩ特異的（ＨＣＩＩ特異的）触媒因子を該患者に投与する工程を包含し、該ＨＣＩＩ触媒因子は：
（ｉ）抗第ＩＩａ因子アッセイにおける約２ユニット／ｍｇ〜約５ユニット／ｍｇのヘパリン補因子ＩＩに対するヘパリン補因子ＩＩ比活性；
（ｉｉ）抗第Ｘａ因子アッセイにおける約０．２ユニット／ｍｇ〜約１．５ユニット／ｍｇの第Ｘａ因子に対する抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）比活性；および
（ｉｉｉ）約１５０ｍｇ／ｍｌ〜約１，０００ｍｇ／ｍｌの範囲の水性媒体における溶解度；
により特徴付けられる、方法。
項目３１．前記ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、非分画性ヘパリンの抗トロンビンＩＩＩ親和性の約３％未満の抗トロンビンＩＩＩ親和性を有する、項目３０に記載の方法。
項目３２．前記ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、ＨＣＩＩ媒介機構およびＡＴＩＩＩ媒介機構の両方、ならびにＨＣＩＩおよびＡＴＩＩＩの両方と関連しない機構によって寄与される、抗凝固効果を有する、項目３０に記載の方法。
項目３３．前記ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、約１０〜約２４の単糖単位のポリアニオン炭水化物である、項目３１に記載の方法。
項目３４．前記ポリアニオン炭水化物が、約３，０００ダルトンと約８，０００ダルトンとの間の分子量を有するヘパリン調製物である、項目３３に記載の方法。
項目３５．前記ヘパリン調製物が、非分画性ヘパリンから単離された分子量が最も小さい第３の画分から本質的になる、項目３４に記載の方法。
項目３６．前記ヘパリン調製物が、分子量の範囲を約３，０００ダルトンと約８，０００ダルトンとの間に化学的に低下させることにより非分画性ヘパリンから製造される、項目３４に記載の方法。
項目３７．前記ヘパリン調製物が、約８，０００ダルトンの平均分子量を有する、項目３６に記載の方法。
項目３８．前記ヘパリン調製物が、約５，０００ダルトンの平均分子量を有する、項目３６に記載の方法。
項目３９．前記ヘパリン調製物が、約３，０００ダルトンの平均分子量を有する、項目３６に記載の方法。
項目４０．前記ヘパリン調製物の抗トロンビンＩＩＩ親和性が、前記非分画性ヘパリンの抗トロンビンＩＩＩ親和性の約３％未満まで低下させられる、項目３６に記載の方法。
項目４１．前記抗トロンビンＩＩＩ親和性における低下が、前記ヘパリン調製物中に存在するビシナルなアルコール基を酸化剤およびその後に還元剤で処理することからなる、項目４０に記載の方法。
項目４２．前記酸化剤が、過ヨウ素酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド、酸無水物、四酢酸鉛、およびアスコルビン酸から選択されるメンバーであり、そして前記還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、リチウムアルミニウム水素化物、金属水素化物、およびヒドラジンから選択されるメンバーである、項目４１に記載の方法。
項目４３．前記ヘパリン調製物が、ＡＴＩＩＩに対する親和性を有さない物質から本質的になり、該物質は、ＡＴＩＩＩが固定化され、そして流出物が保持される固相上でのアフィニティー精製により調製された、項目３４に記載の方法。
項目４４．項目３０に記載の方法であって、前記ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、式：
【００１７】
【数３】
2007204500.tif 000004
【００１８】
ここで、
Ｒ１は、Ｈ、Ｄ−グルコサミン酸残基、Ｄ−グルクロン酸残基、およびＬ−イズロン酸残基からなる群より選択されるメンバーである；
Ｒ２は、Ｈ、Ｄ−グルコサミン酸残基、Ｄ−グルクロン酸残基、Ｌ−イズロン酸残基、および無水マンニトールからなる群より独立して選択されるメンバーである；
Ｒ３は、ＨおよびＳＯ３−からなる群より選択されるメンバーである；そして
Ｒ４は、Ｈ、ＳＯ３−、およびＣＨ３ＣＯ−からなる群より選択されるメンバーである；
指数ｎは独立して選択され、そして０〜約１４の範囲の値を有し得る；
ここで：
該ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、約３，０００ダルトン〜約８，０００ダルトンの範囲の分子量を有する；
を有する、方法。
項目４５．項目３０に記載の方法であって、前記ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、式：
【００１９】
【数４】
2007204500.tif 000005
【００２０】
ここで、
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、Ｄ−グルコサミン酸残基、Ｄ−グルクロン酸残基、およびＬ−イズロン酸残基からなる群より独立して選択されるメンバーである；
Ｒ３は、ＨおよびＳＯ３−からなる群より選択されるメンバーである；そして
Ｒ４は、Ｈ、ＳＯ３−、およびＣＨ３ＣＯ−からなる群より選択されるメンバーである；
ここで：
該ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、約３，０００ダルトン〜約８，０００ダルトンの範囲の分子量を有する、
を有する、方法。
項目４６．前記ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、抗第ＩＩａ因子活性において少なくとも約３ユニット／ｍｇ〜約４ユニット／ｍｇのヘパリン補因子ＩＩ比活性を有する、項目３０に記載の方法。
項目４７．前記ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、抗第Ｘａ因子アッセイにおいて約１．０ユニット／ｍｇのＡＴＩＩＩ比活性を有する、項目３０に記載の方法。
項目４８．前記ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、患者への投与の前に、ヘパリン添加剤と混合される、項目３０に記載の方法。
項目４９．前記ＨＣＩＩ特異的触媒因子対前記ヘパリン添加剤の比が、約２対１より大きい、項目４８に記載の方法。
項目５０．前記ヘパリン添加剤が、非分画性ヘパリンである、項目４８に記載の方法。
項目５１．前記ヘパリン添加剤が、非分画性ヘパリンから単離された分子量が最も小さい第３の画分である、項目４８に記載の方法。
項目５２．患者において血栓形成を阻害するための薬学的組成物であって、該組成物は：
（ｉ）フィブリンに結合したトロンビンを不活化する、約９０重量％〜約９９．９重量％のＨＣＩＩ特異的触媒因子であって、該ＨＣＩＩ特異的触媒因子は抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）に対して最小の親和性しか有さない、因子、
（ｉｉ）液相トロンビンを不活化する、約０．１重量％〜約１０重量％のＡＴＩＩＩ触媒因子
を含有し、ここで、該組成物のＨＣＩＩ触媒活性が約２ユニット／ｍｇ〜約５ユニット／ｍｇである、組成物。
項目５３．前記ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、約１０〜約２４の単糖単位のポリアニオン炭水化物である、項目５２に記載の組成物。
項目５４．前記ポリアニオン炭水化物が、約３，０００ダルトンと約８，０００ダルトンとの間の分子量を有するヘパリン調製物である、項目５３に記載の組成物。
項目５５．前記ＡＴＩＩＩ触媒因子が、非分画性ヘパリンである、項目５２に記載の組成物。
項目５６．前記ＡＴＩＩＩ触媒因子が、非分画性ヘパリンから単離された分子量が最も小さい第３の画分である、項目５２に記載の組成物。
項目５７．臨床的に危険な全身性出血の増大を誘導することなく、患者においてクロットに結合したトロンビンおよび液相トロンビンを阻害するための方法であって、該方法は：
（ｉ）クロットに結合したトロンビンを不活化するＨＣＩＩ特異的触媒因子であって、ここで、該ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）に対する最小の親和性および抗第ＩＩａ因子アッセイにおける約２ユニット／ｍｇ〜約５ユニット／ｍｇのヘパリン補因子ＩＩに対するヘパリン補因子ＩＩ比活性を有する、因子；および
（ｉｉ）液相トロンビンを不活化するＡＴＩＩＩ触媒因子；
の薬理学的に受容可能な用量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
項目５８．前記ＨＣＩＩ特異的触媒因子および前記ＡＴＩＩＩ触媒因子が、前記患者に対して同時に投与される、項目５７に記載の方法。
項目５９．前記ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、ＨＣＩＩ媒介機構およびＡＴＩＩＩ媒介機構の両方、ならびにＨＣＩＩおよびＡＴＩＩＩの両方と関連しない機構によって寄与される、抗凝固効果を有する、項目５７に記載の方法。
項目６０．前記ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、約１０〜約２４の単糖単位のポリアニオン炭水化物である、項目５７に記載の方法。
項目６１．前記ポリアニオン炭水化物が、約３，０００ダルトンと約８，０００ダルトンとの間の分子量を有するヘパリン調製物である、項目５７に記載の方法。
項目６２．項目５７に記載の方法であって、前記ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、式：
【００２１】
【数５】
2007204500.tif 000006
【００２２】
ここで、
Ｒ１は、Ｈ、Ｄ−グルコサミン酸残基、Ｄ−グルクロン酸残基、およびＬ−イズロン酸残基からなる群より選択されるメンバーである；
Ｒ２は、Ｈ、Ｄ−グルコサミン酸残基、Ｄ−グルクロン酸残基、Ｌ−イズロン酸残基、および無水マンニトールからなる群より独立して選択されるメンバーである；
Ｒ３は、ＨおよびＳＯ３−からなる群より選択されるメンバーである；そして
Ｒ４は、Ｈ、ＳＯ３−、およびＣＨ３ＣＯ−からなる群より選択されるメンバーである；
指数ｎは独立して選択され、そして０〜約１４の範囲の値を有し得る；
ここで：
該ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、約３，０００ダルトン〜約８，０００ダルトンの範囲の分子量を有する；
を有する、方法。
項目６３．項目５７に記載の方法であって、前記ＨＣＩＩと特異的触媒因子が、式：
【００２３】
【数６】
2007204500.tif 000007
【００２４】
ここで、
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、Ｄ−グルコサミン酸残基、Ｄ−グルクロン酸残基、およびＬ−イズロン酸残基からなる群より独立して選択されるメンバーである；
Ｒ３は、ＨおよびＳＯ３−からなる群より選択されるメンバーである；そして
Ｒ４は、Ｈ、ＳＯ３−、およびＣＨ３ＣＯ−からなる群より選択されるメンバーである；
ここで：
該ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、約３，０００ダルトン〜約８，０００ダルトンの範囲の分子量を有する、
を有する、方法。
項目６４．前記ＨＣＩＩ特異的触媒因子が、抗第ＩＩａ因子活性において少なくとも約３ユニット／ｍｇ〜約４ユニット／ｍｇのヘパリン補因子ＩＩ比活性を有する、項目５７に記載の方法。
項目６５．前記ＡＴＩＩＩ触媒因子が、非分画性ヘパリンである、項目５７に記載の方法。
項目６６．前記ＡＴＩＩＩ触媒因子が、非分画性ヘパリンから単離された分子量が最も小さい第３の画分である、項目５７に記載の方法。
【００２５】
発明の要旨
本発明は、循環器病の処置のための組成物および方法を提供する。本発明は、とりわけ、クロット結合トロンビンを選択的に不活化し得る因子に関する。より詳細には、１つの局面において、本発明は、クロット中のフィブリンまたは何らかの他の表面のいずれかに結合したトロンビンを選択的に不活化し得るが、遊離トロンビンに対しては最小の阻害活性しか有さない、ヘパリン補因子ＩＩ特異的（ＨＣＩＩ）触媒因子を提供する。本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子の選択的活性は、遊離トロンビンに最小の不活化を生じる濃度で患者におけるフィブリン結合トロンビンを不活化し、それにより出血の危険性を減少させることを可能にする。好ましくはフィブリン結合トロンビンまたは表面結合トロンビンの不活化は、このようなＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、フィブリン結合トロンビンのＨＣＩＩ媒介不活化を活性化、触媒、または誘導する活性化因子）が血液から一掃された後もクロットの添加が実質的に再開されないように、本質的に不可逆的である。
【００２６】
１つの実施態様では、本発明の因子は、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）調製物である。この調製物は、約５％未満、そしてより好ましくは約３％未満の抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）触媒活性、あるいは交換可能に、非改変ＬＭＷＨまたは標準的ヘパリンの活性化活性を有するが、デルマタン硫酸よりも大きなＡＴＩＩＩ活性化活性を有するように改変される。さらに、それらの鎖長は標準的なヘパリンと比較して短いために、本発明の因子は、遊離トロンビンのＨＣＩＩ媒介不活化の触媒として、標準的なヘパリンまたはデルマタン硫酸のいずれよりも大いに少ない活性を有する。このように、本発明の因子は、トロンビンクロッティング時間アッセイにおいて遊離トロンビンに対してアッセイした場合、非常に弱い活性を有するので、効果的な抗血栓因子であるとは予想されなかった。しかし、極めて驚くべきことに、本発明の因子は、表面結合トロンビン（例えば、フィブリン結合トロンビン、または交換可能に、クロット結合トロンビン）のＨＣＩＩ媒介不活化を効果的に触媒し得る。
【００２７】
表面結合トロンビンは、典型的に、共有結合した不可逆的なトロンビンＨＣＩＩ複合体の形成を通して不活化される。従って、典型的な抗トロンビンおよび他の抗凝血因子（例えば、デルマタン硫酸、ヘパリン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、ヒルジン、および他の直接的なトロンビンインヒビター）とは対照的に、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子は、液相トロンビンに対して主要な阻害効果を有さずに、選択的に、そして好ましくは不可逆的に、フィブリン結合トロンビンを不活化する能力を有する。所定の理論に束縛されることなく、この能力は、本発明の因子がＨＣＩＩにおけるコンフォメーションの変化を生じるという観察により説明される。このコンフォメーションの変化は、酵素が表面に固定化された場合にはＨＣＩＩがトロンビンに効果的に結合することを可能にするが、酵素が液相中で遊離している場合にはトロンビンに効果的に結合するにはサイズが足りない。
【００２８】
本発明の因子は、例えば、臨床的に危険な全身性の出血の増大を誘導することなく患者における血栓形成を改変するために、種々の方法において使用され得る。このような方法は、一般に、遊離トロンビンの最小限の不活化のみをともなって、クロット結合トロンビンを不活化し得る因子の薬理学的に受容可能な用量を患者に投与する工程を含む。この因子は、好ましくは、抗第ＩＩａ因子アッセイにおける約２〜約５ユニット／ｍｇのヘパリン補因子ＩＩにより媒介される特異的な抗第ＩＩａ因子活性、抗第Ｘａ因子アッセイにおける約０．２〜約１．５ユニット／ｍｇの抗トロンビンＩＩＩ触媒比活性、および約１５０〜約１，０００ｍｇ／ｍｌの範囲の水性媒体における溶解度により特徴付けられる。さらに、このような因子は、ＨＣＩＩ媒介機構およびＡＴＩＩＩ媒介機構の両方、ならびにＨＣＩＩおよびＡＴＩＩＩの両方とは独立した機構により寄与される抗凝固効果を有する。さらに、この因子は、好ましくは約２４の単糖単位未満のポリアニオン炭水化物であり、典型的には約３，０００と８，０００ダルトン（±１，０００ダルトン）との間の分子量を有するヘパリン調製物である。
【００２９】
本発明は、種々の技術を用いてヘパリンから調製され得るヘパリン調製物を含む。１つの実施態様では、ヘパリン（すなわち、標準的な非分画性のヘパリン）は、まず化学的脱重合により分子のサイズを小さくされ、そして約３，０００〜８，０００ダルトン（±１，０００ダルトン）の範囲の分子量を有する画分が単離およびプールされる。本願において好ましい実施態様では、ヘパリンは亜硝酸を用いて脱重合される。その後、得られた低分子量ヘパリンは、化学的に修飾されて抗トロンビンＩＩＩに対するその親和性を減少される。これは、化学的に、あるいは、抗トロンビンＩＩＩアフィニティーカラムの使用を介して達成され得る。現在の好ましい実施態様では、これは、酸化反応および引き続く還元反応により化学的に達成される。この好ましい実施態様では、得られた低親和性の低分子量ヘパリンは、非還元末端としての天然の糖（例えば、ウロン酸残基）および還元末端としての２，５−無水マンニトール残基を有し、そして約３，０００〜約８，０００ダルトンの範囲の分子量を有するヘパリン分子の混合物である。この実施態様では、ＡＴＩＩＩ活性化活性の減少を伴う分子サイズの減少が、遊離トロンビンの最小限の不活化のみをともなってクロット結合トロンビンを選択的に不活化する能力を本発明の因子に寄与すると考えられる。
【００３０】
ヘパリン調製物である代わりに、本発明の因子は、例えば、ヘパリン以外の負に荷電した多糖、負に荷電したポリアニオン、ＨＣＩＩに対する親和性を有する電気的に陰性な有機分子などであり得る。このような物質は、典型的には、少なくとも１０−６Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−８Ｍまたはより強い親和性でＨＣＩＩに結合するが、トロンビンに対しては弱い親和性、好ましくは約１０−６Ｍより弱い親和性を有する。
【００３１】
所望に応じて、そして用途に依存して、患者における正常な凝血を実質的に阻害することなく血栓形成を阻害するために有用な薬学的組成物が調製され得る。
この組成物は：
ｉ）クロット結合トロンビンを選択的に阻害し得る約９０〜約９９．９重量％の因子、特にＨＣＩＩ特異的触媒因子、これはＡＴＩＩＩ結合親和性に関して最小の親和性を有するかまたは親和性を本質的に有さず、そしてフィブリン結合トロンビンを置換および活化性し得る；および  
ｉｉ）液相トロンビンを不活化し得る、約０．１〜約１０重量％のＡＴＩＩＩ触媒因子または交換可能なＡＴＩＩＩ活性化因子（例えば、ヘパリンまたは低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ））；
を含有する。本願において好ましい実施態様では、必要に応じて混合される、組成物のＨＣＩＩ触媒活性または交換可能なＨＣＩＩ活性化活性は、約２〜５ユニット／ｍｇ、そしてより好ましくは約３〜４ユニット／ｍｇである。
【００３２】
別の実施態様では、本発明は、臨床的に危険な全身性出血の増大を誘導することなく患者におけるクロット結合トロンビンおよび液相トロンビンを阻害するための方法を提供する。この方法は、（ｉ）クロット結合トロンビンを不活化し得るＨＣＩＩ特異的触媒因子、このＨＣＩＩ特異的触媒因子は、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）に対して最小の親和性および抗第ＩＩａ因子アッセイにおける約２〜約５ユニット／ｍｇのヘパリン補因子ＩＩに対してヘパリン補因子ＩＩ比活性を有する；ならびに（ｉｉ）液相トロンビンを不活化し得るＡＴＩＩＩ触媒（すなわち、活性化する）因子；の薬理学的に受容可能な用量を患者に投与する工程を含む。この方法における使用に適切なＡＴＩＩＩ活性化因子は、ヘパリンおよび低分子量ヘパリンを含むが、これらに限定されない。この方法において、ＨＣＩＩ特異的触媒因子およびＡＴＩＩＩ触媒因子（すなわちＡＴＩＩＩ活性化因子）は、同時または連続的のいずれかで患者に投与され得る。患者に同時に投与する場合、ＨＣＩＩ特異的触媒因子およびＡＴＩＩＩ触媒因子は、単一の溶液または化合物、あるいは２つの異なる溶液または化合物として投与され得る。
【００３３】
別の実施態様では、本発明は、（ｉ）クロット結合トロンビンを不活化し得る本発明の因子；および（ｉｉ）液相トロンビンを不活化し得るＡＴＩＩＩ触媒因子；を含有する生成物を、患者におけるクロット結合トロンビンおよび液相のトロンビンを阻害するため（好ましくは臨床的に危険な全身性の出血の増大を誘導することなく）、同時、別々な、または連続的な使用のために組み合わされた調製物として提供する。この生成物における使用に適切なＡＴＩＩＩ触媒因子は、ヘパリンおよび低分子量ヘパリンを含むが、これらに限定されない。この生成物において、トロンビン不活化因子およびＡＴＩＩＩ触媒因子は、同時に患者に投与され得る。同時に患者に投与される場合、トロンビン不活化因子およびＡＴＩＩＩ触媒因子は、単一の溶液または化合物、あるいは２つの異なる溶液または化合物として投与され得る。
【００３４】
本発明の好ましい因子は、ヘパリンから入手可能である。本発明に含まれる１つのクラスの生成物は、このような好ましい因子および別のサブクラスとして本発明のヘパリン調製物を含有する。両方のサブクラスのこの生成物は、開環形態の非硫酸化ウロン酸残基を有し、そして実質的にアルデヒド基を有さない。このクラスのメンバーの代表例は、それらのウロン酸残基の約３０％を開環形態で有する。別のクラスのこのような好ましい因子およびヘパリン調製物は、非還元末端としての天然の糖（例えば、ウロン酸残基）および還元末端としての２，５−無水マンニトール残基を有する生成物を含有する。いくつかの特に好ましい生成物は、上述のクラスの両方に属する。
【００３５】
本発明の別の局面は、ヘパリンから入手可能な遊離トロンビンの利益になるように、クロット結合トロンビンを選択的に不活化し得、その非硫酸化ウロン酸残基を開環形態で有し、そして実質的にアルデヒド基を有さないポリアニオン炭水化物にある。
【００３６】
本発明はまた、クロット結合トロンビンを選択的に阻害し得る生成物であるＨＣＩＩ特異的触媒因子を提供する。ＨＣＩＩ特異的触媒因子は：
（ｉ）標準的な非分画性ヘパリンを亜硝酸脱重合により脱重合する工程；
（ｉｉ）脱重合されたヘパリンを、水性媒体中の過ヨウ素酸ナトリウムを用いて４℃にて２４時間酸化し、そして過剰なエチレングリコールを添加することにより酸化反応を停止させ、その後、５００ＭＷのカットオフを有する透析チューブを用いて蒸留水に対して十分に透析する工程；
（ｉｉｉ）水素化ホウ素ナトリウムの添加により、酸化した生成物を還元し、そして反応混合物を２３℃にて２５時間静置した後、ＨＣｌを用いて反応混合物のｐＨを３．０に調整して過剰なホウ化水素を破壊し、次いでＮａＯＨの添加により速やかにｐＨを７．０に増大させる工程；
（ｉｖ）得られた生成物を蒸留水に対して十分に透析する工程；および
（ｖ）生成物を凍結乾燥により回収する工程；ならびに必要に応じて、
（ｖｉ）生成物を抗トロンビンＩＩＩアフィニティーカラムに通す工程により入手可能であり、得られる生成物は以下の特性を有する；
・３，０００〜８，０００（±１，０００）の分子量
・約２〜約５抗第ＩＩａ因子ユニット／ｍｇの比活性
・約１．５抗トロンビンＩＩａユニット／ｍｇ未満の非活性。
【００３７】
さらなる局面において、一方の末端基としての天然の非還元糖および他方の末端基としての２，５−無水マンニトール非還元糖を有するＨＣＩＩ特異的触媒因子を調製するためのプロセスが提供される。このプロセスは：
（ｉ）非分画性ヘパリンを脱重合する工程；
（ｉｉ）得られた低分子量ヘパリンを酸化する工程；および
（ｉｉｉ）酸化された低分子量ヘパリンを還元する工程；
を包含し、ここで、このプロセスは、必要に応じて、このＨＣＩＩ特異的触媒因子を得るためのさらなる精製または他の手順を含む。
【００３８】
本発明の生成物および因子は、薬学的用途に好ましい。それゆえ、本発明は、心臓血管疾患の処置のための薬物を製造するための、本発明の任意の生成物または因子（例えば、トロンビンのＨＣＩＩ媒介性阻害を活性化してトロンビンの重大なＡＴＩＩＩ媒介性阻害を排除するための因子）の使用を包含する。このように使用され得る本発明の他の生成物および因子は、ＨＣＩＩ特異的触媒因子、ＬＭＷＨ調製物、ポリアニオン炭水化物、および前述のように得ることが可能な生成物、および実施例に記載の生成物Ｖ１８（またはＶ１８に実質的に類似の生成物）、ならびに前述の生成物および因子と実質的に同じ特徴あるいは阻害特性または薬理学的特性を有する物質を包含する。
【００３９】
本発明は、予防または治療による血栓症の処置のための薬物の製造のための、開環形態中に非硫酸化ウロン酸残基を有し、かつ実質的にアルデヒド基を有しないヘパリン誘導体の使用をさらに包含する。
【００４０】
前述のものに加えて、ＨＣＩＩに結合し、そしてトロンビン上の非フィブリン結合部位との相互作用を可能にする因子または生成物を含有する薬学的組成物が提供される。本発明は、ＨＣＩＩ特異的触媒因子およびＡＴＩＩＩ触媒因子（すなわち、ＡＴＩＩＩ活性化因子）を含有する薬学的組成物、ならびに表面結合されたトロンビンまたはクロット結合されたトロンビンを選択的に不活性化する因子およびトロンビンのインヒビターを液相中に含有する組成物をさらに提供する。このような薬学的組成物は、混合物の形態であり得、非常に多くの心臓血管症状を処置するために有用である。さらに、このような組成物は従来の血栓溶解の処置（例えば、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔｐＡ）、ストレプトキナーゼなどの投与）、ならびに血管内介入（例えば、血管形成、アテレクトミーなど）と組み合わせて有用である。
【００４１】
本発明の性質および利点のさらなる理解は、明細書の残りの部分および図面を参照にすることにより明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
発明の詳細な説明および好ましい実施態様
本発明は、血栓またはクロット内でフィブリンに結合するトロンビンを不活性化し、それによりクロット結合トロンビンがクロット付着成長をさらに触媒的に促進する能力を実質的に減少するかまたは排除する、組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、心臓バイパス装置の回路および腎臓透析を受ける患者における血栓症を防止するために、および血栓関連性心臓血管症状（例えば、不安定性狭心症、急性心筋梗塞（心臓発作）、脳血管障害（発作）、肺塞栓症、深静脈血栓症、動脈性血栓症など）を被る、または被る可能性のある患者を処置するために特に有用である。しかし、本発明は、そのような用途に限定されず、そして本明細書中に記載の組成物および方法は、クロットあるいは血栓付着成長を阻害すること、またはクロットまたは血栓の可溶化を促進することが望ましい場合はいつでも、他のインビトロおよびインビボの状態においての用途が見出され得る。例えば、本発明の組成物は、種々のインビトロでの研究、アッセイなどにおけるトロンビン誘導性のクロッティングを阻害するための抗凝固因子として使用され得る。
【００４３】
本明細書中で使用される「プロテオグリカン」は、１つ以上のグリコサミノグリカン鎖が付着したタンパク質をという意味を含む。プロテオグリカンは、タンパク質およびグリコサミノグリカン鎖の両方を反映する特性を有するポリアニオン化合物である。
【００４４】
本明細書中で使用される「グリコサミノグリカン」は、反復二糖単位からなる多糖という意味を含む。二糖単位は常に、アミノ糖（すなわち、グルコサミンまたはガラクトサミン）およびもう１つの別の単糖を含む。別の単糖は、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、またはデルマタン硫酸におけるようなウロン酸（すなわち、グルクロン酸またはイズロン酸）であり得、またはケラタン硫酸におけるようなガラクトースであり得る。グリコサミノグリカン鎖は、反復二糖のどちらかの部分において硫酸化され得る。ヒアルロン酸での例外を除いて、全てのグリコサミノグリカンは、「コアタンパク質」に共有結合する。すなわちそれらはプロテオグリカンとして生じる。
【００４５】
本明細書中で使用する「ヘパリン」（または相互変換可能に「標準ヘパリン」（ＳＨ）または「非修飾ヘパリン」）は、ウロン酸残基（Ｄ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸）およびＤ−グルコサミンおよび残基からなる反復二糖からなる多糖鎖の混合物という意味を含む。これらの二糖の多くは、ウロン酸残基および／またはグルコサミン残基上で硫酸化される。一般に、ヘパリンは、ヘパリンの供給源およびその単離に使用される方法に依存して、約６，０００ダルトン〜２０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する。ヘパリンの反復二糖単位の構造式は、一般に以下のようである：
2007204500.tif 000008
【００４６】
上記の式において、ウロン酸Ｃ５−Ｃ６での「波線」の結合は、ウロン酸が、Ｄ−グルクロン酸（カルボキシル基が上）またはＬ−イズロン酸（カルボキシル基が下）のいずれかであり得ることを示す。さらに、Ｒ１は、ＨまたはＳＯ３のいずれかであり得、そしてＲ２は、Ｈ、Ａｃ（アセチル）、またはＳＯ３であり得る。
【００４７】
本明細書中で使用する「低分子量ヘパリン」（ＬＭＷＨ）は、約３，０００ダルトン〜約８，０００ダルトンの分子量を有するヘパリン調製物という意味を含む。
【００４８】
本明細書中で使用する「低親和性ヘパリン」（ＬＡＨ）（または相互交換可能に、「低親和性標準ヘパリン」（ＬＡＳＨ））は、約１０−６Ｍ、好ましくは約１０−５Ｍよりも弱い親和性で抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）に結合するヘパリン調製物という意味を含む。
【００４９】
本明細書中で使用する「低親和性低分子量ヘパリン」（ＬＡ−ＬＭＷＨ）は、約３，０００ダルトン〜約８，０００ダルトンの分子量を有し、約１０−６Ｍ、好ましくは約１０−５Ｍよりも弱い親和性でＡＴＩＩＩに結合するヘパリン調製物という意味を含む。ＬＡ−ＬＭＷＨ調製物は、３，０００〜８，０００ダルトン（±１，０００ダルトン）の範囲の分子量を有するヘパリン分子の混合物であり得る。このＬＡ−ＬＭＷＨ分子の混合物は、一般に、Ｖ１８、または相互交換可能に、Ｌ１８として、本明細書中で呼ばれる。あるいは、ヘパリン分子の混合物は、例えば、ゲル排除クロマトグラフィーを用いて、その種々の成分に分離され得る。ＬＡ−ＬＭＷＨ混合物は、ゲル排除クロマトグラフィーによって、３つのＬＡ−ＬＭＷＨ画分に任意に分離され得る。画分１は、約８，０００ダルトンの平均分子量を有し、画分２は、約５，０００ダルトンの平均分子量を有し、そして画分３は、約３，０００ダルトンの平均分子量を有する。
【００５０】
本明細書中で使用される「ヘパリン調製物」は、標準の非分画性ヘパリンから調製される調製物という意味を含む。好ましい実施態様において、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子は、以下の化学反応を用いて標準の、非分画性ヘパリンから調製された修飾ヘパリンである：（１）分画化していないヘパリンを亜硝酸脱重合化して、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）を得る；（２）得られたＬＭＷＨを、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化して、環構造の硫酸化されていないウロン酸部分を開環する；および（３）酸化ＬＭＷＨを、例えば、ホウ水素化ナトリウムを用いて還元し、脱重合化および酸化工程の間に形成されたアルデヒドを（アルコール）に還元する。
【００５１】
本明細書中で使用される「ヘパラン硫酸」（ＨＳ）は、ヘパリンの二糖反復単位に類似するが、より多くのＮ−アセチル基、より少ないＮ−硫酸基、およびより低い程度のＯ−硫酸基を有する二糖反復単位を含むグリコサミノグリカンという意味を含む。
【００５２】
本明細書中で使用される「デルマタン硫酸」（ＤＳ）は、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンおよびＤ−グルクロン酸からなる二糖反復単位、およびＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンおよびＬ−イズロン酸からなる二糖反復単位を含む不均一なグリコサミノグリカンという意味を含む。種々の硫酸化の程度のウロン酸が存在する。
【００５３】
本明細書中で使用される「ヒルジン」は、ヒルの唾液腺から抽出された抗トロンビン物質という意味を含む。本明細書中で使用される「ヒルログ」は、ヒルジンの小さな合成アナログという意味を含む。
【００５４】
本明細書中で使用される「単糖」は、アルデヒド基またはケトン基のいずれかを含むポリヒドロキシアルコール（すなわち、単純糖）をいう。単糖は、天然に存在する単純糖、ならびに化学修飾された単純糖という意味を含む。修飾された単糖としては、増加したかあるいは減少した硫酸化、または修飾されたカルボキシル基、アミノ基、あるいはヒドロキシル基を有する単糖が挙げられるが、これらに限定されない。単糖は、Ｎ−脱硫酸化（例えば、Ｉｎｏｕｅ．Ｙ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ＲＥＳ．、４６、８７−９５（１９７６）を参照）；Ｎ−再硫酸化（ｒｅｓｕｌｆａｔｉｏｎ）（例えば、Ｌｌｏｙｄ，Ａ．Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０  ６３７−６４８（１９７１）を参照）；Ｎ−アセチル化（例えば、Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，Ｉ．ら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．９０，１１４−１２１（１９７０）を参照）；Ｎ−スクシニル化（例えば、Ｎａｇａｓａｗａ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１、９８９−９９３（１９７７）を参照）；Ｎ−脱アセチル化（例えば、Ｄｉｍｉｔｒｉｅｖ，Ｂ．Ａ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．４０，３６５−３７２（１９７５）を参照）；Ｏ−脱硫酸化（例えば、Ｊａｃｏｂｓｏｎ．Ｉ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２５，５０８４−５１００（１９８０）を参照）；カルボキシ還元；遊離ヒドロキシル基またはアミノ基のメチル化などにより化学修飾され得る。
【００５５】
本明細書中で使用される「多糖」は、グリコシド結合により連結された１０個を超える単糖の直鎖状ポリマーまたは分岐ポリマーをいう。
【００５６】
本明細書中で使用される「ポリアニオン」は、多数の負電荷を有する分子をいう。本明細書中で使用される「ポリアニオン炭水化物」は、多数の負電荷を有する炭水化物という意味を含む。
【００５７】
本明細書中で使用される「ヘパリン添加物」は、患者への投与の前に本発明の因子と混合されるヘパリンまたはヘパリン様化合物という意味を含む。現在好ましい実施態様において、ヘパリン添加物は、非分画性ヘパリン、または非分画性ヘパリンから単離された最も低い第３の分子量の画分のいずれかである。
【００５８】
本明細書中で使用される「ビシナルアルコール基」は、隣接した炭素原子上の２つのヒドロキシル基という意味を含む。より詳細には、本明細書中で使用される「ビシナルアルコール基」は、本発明のヘパリン調製物のＣ２およびＣ３炭素原子上の２つのヒドロキシル基のことをいうために使用される。
【００５９】
本明細書中で使用される「酸化剤」（または相互交換可能に「オキシダント」）は、（１）容易に酸素を生じ、（２）化合物から水素を除去し、あるいは（３）陰性電子を求引する物質という意味を含む。適切な酸化試薬としては、過ヨウ素酸ナトリウムおよび当業者に公知の反応条件下での四酢酸鉛が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
本明細書中で使用される「還元剤」または相互交換可能に「還元剤（ｒｅｄｕｃｅｒ）」は、別の物質を還元することにより、容易に酸化される物質という意味を含む。適切な還元剤としては、ホウ水素化ナトリウム、他の金属水素化物、および当業者に公知の反応条件下での水素化アルミニウムリチウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
本明細書中で使用される「親和性」は、解離定数（Ｋｄ）に関して表現される。そのため、親和性が言及される場合はいつでも、Ｋｄのことであり、Ｋａではない。
【００６２】
本明細書中で使用される「全身性出血において、臨床的に危険な増加」とは、好ましい実施態様において、最も高い有効濃度で因子が使用された場合でも、４００秒未満の活性化されたクロッティング時間および１００秒間未満のトロンビンクロッティング時間という意味を含む。
【００６３】
本明細書中で使用される「抗第ＩＩａ因子アッセイ」は、以下のように行われるＨＣＩＩ触媒アッセイである：ヒトトロンビンの一定量を色素生産性合成トロンビン基質を含有する血漿に添加する。目的の化合物とインキュベーションした後、残余のトロンビンの量を４０５ｎｍでの吸光度を測定することにより決定する。
【００６４】
本明細書中で使用される「抗第Ｘａ因子アッセイ」は、以下のようにして行われるＡＴＩＩＩ触媒アッセイである：一定量の第Ｘａ因子を、色素生産性合成第Ｘａ因子基質を含有する血漿に添加する。目的の化合物とのインキュベーション後、残余の第Ｘａ因子活性の量を４０５ｎｍでの吸光度を測定することにより決定する。
【００６５】
本明細書中で使用される「ハンギングクロットアッセイは、液相およびクロット結合トロンビン活性に対する因子の阻害効果を試験するために使用されるアッセイという意味を含む。一般に、液相トロンビン活性に対する阻害効果を決定するために、クエン酸を加えた（ｃｉｔｒａｔｅｄ）血漿と共に、示した濃度のヘパリンの存在下または非存在下、６０分間、３７℃でα−トロンビン（０．２〜４．０ｎＭ）をインキュベートする。インキュベーション期間の終わりに、フィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ）の血漿レベルを決定し、次いでＦＰＡ生成の阻害パーセントを、各インヒビター濃度について算定する。クロット結合トロンビン活性に対する阻害効果を決定するために、洗浄したフィブリンクロットをクエン酸を加えた血漿中、様々な濃度のヘパリンの存在下または非存在下、６０分間、３７℃でインキュベートする。インキュベーション期間の終わりに、ＦＰＡの血漿レベルを決定し、次いでクロット誘導性ＦＰＡ生成の阻害パーセントを各インヒビター濃度について算定する。
【００６６】
本明細書中で使用される「フィルター含有プレートアッセイ」（または相互交換可能に「濾過ベースのアッセイ」）は、フィブリン結合トロンビンを置き換えて不活性化する化合物の能力を試験するために使用されるアッセイという意味を含む。このアッセイは、実施例において記載するプロトコールを用いて行われる。
【００６７】
トロンビン上のフィブリン結合部位（アニオン結合外部位（ｅｘｏｓｉｔｅ）２）が、トロンビン上のフィブリノゲン結合部位（アニオン結合外部位１）とは異なることが示された。すなわち、トロンビンがフィブリンに結合する場合、クロットまたは血栓マトリクスにおける場合のように、フィブリン結合部位は占有されるが、一方、フィブリノゲン結合部位は、フィブリノゲンを結合し、そして結合したフィブリノゲンを、フィブリノゲンのフィブリンへの転換を促進するトロンビン触媒部位との相互作用のために配向させるために立体的に利用可能なままである。酵素の活性部位および外部位１は、その上、他の物質（第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子および血小板上のトロンビンレセプターを包含する）を結合して切断するためにも利用可能である。
【００６８】
従って、周囲の水性環境中（通常、血管環境中の血液中）に、クロットまたは血栓からのトロンビンを放出するために、トロンビン上のフィブリン結合部位および／またはフィブリン上のトロンビン結合部位の間の結合を分裂または妨害し得る。クロットまたは血栓中のフィブリン結合トロンビンが、ヘパリンおよび内因性抗プロテイナーゼによって不活化から保護される一方で、クロットまたは血栓から放出されるトロンビンは、内因性抗プロテイナーゼおよび／または適切な薬物療法による不活化に対して感受性になる。
【００６９】
遊離トロンビン（すなわち、液相トロンビン）は、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）
を第一のインヒビターとして、２つの血漿インヒビター（ＡＴＩＩＩおよびヘパリン補因子ＩＩ（ＨＣＩＩ））によって不可逆的に活性化される。これらのインヒビターのは両方とも、特定のクラスの硫酸化多糖の存在下で、著しく増加した活性を示す。ＡＴＩＩＩの活性は、ヘパリンによって、および低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）によって触媒されるのに対して、ＨＣＩＩの活性は、高濃度のヘパリンによって、およびデルマタン硫酸によって触媒される。しかし、ヘパリン（しかし、ＬＭＷＨではない）はＨＣＩＩの強力な触媒であるが、治療的濃度でのヘパリンの優先的な効果はＡＴＩＩＩの触媒としてである。なぜなら、ヘパリンは、このような濃度でＨＣＩＩよりもＡＴＩＩＩに対して高い親和性を有するからである。さらに、ＡＴＩＩＩの血漿濃度は、ＨＣＩＩの血漿濃度の２倍よりも高く（それぞれ、２．４μＭおよび１μＭ）、従って、ヘパリンは、非常に高濃度で投与される場合にのみ、ＡＴＩＩＩおよびＨＣＩＩＩの両方を触媒する。
【００７０】
ＨＣＩＩは、酵素の疑似基質として作用することによってトロンビンを不活化する。トロンビンはＨＣＩＩを切断し、その結果、共有結合酵素インヒビター複合体の形態となる。この複合体の形成は、触媒の非存在下では非常に遅い。しかし、デルマタン硫酸またはヘパリンの存在下では、トロンビンのＨＣＩＩ媒介性阻害の速度を約２，０００倍に増加する（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１４：２１−３１（１９９４）を参照のこと）。
【００７１】
デルマタン硫酸またはヘパリンによって触媒されるＨＣＩＩについてのモデルは、二段階のプロセスを包含する。最初に、硫酸化多糖は、ＨＣＩＩ上の正に荷電した領域に結合し、そしてＮ末端（ＨＣＩＩ分子の負に荷電したセグメント）の展開（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）を引き起こす（図１）。次いで、この負に帯電したＮ末端セグメントは、エキソサイト１として公知のトロンビン上の正に荷電した領域と相互作用する。
【００７２】
立体的に改変されたＨＣＩＩとトロンビンとの相互作用は、約５０倍まで阻害の速度を増加する。硫酸化多糖鎖が十分に長い場合、トロンビンのＨＣＩＩ媒介性不活化の速度を著しく増加させる第２段階が生じる。この第２段階において、硫酸化多糖は、エキソサイト２として公知のトロンビン上の正に荷電した領域に結合する。インヒビターおよび効果的にＨＣＩＩに隣接した酵素ならびにトロンビンの両方に結合し得る硫酸化多糖は、それにより、約２，０００倍までのトロンビンのＨＣＩＩ媒介性不活化の速度を増加する。
【００７３】
本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子の活性は、置換を必要とせずにフィブリン結合トロンビンを不活化することに一部に基づいている。より詳細には、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子の活性の仮定される様式は、以下の観察に一部基づいている。第１に、エキソサイト１は、立体的に改変されたＨＣＩＩとの相互作用に利用可能である。なぜなら、トロンビンはエキソサイト２を介してフィブリンに結合するからである。結果として、立体的に改変されたＨＣＩＩは、その置換を必要とせずにフィブリン結合トロンビンを不活化し得る。第２に、ＨＣＩＩおよびトロンビンの両方に結合するのに不十分な鎖長であるために、溶液中でトロンビンのＨＣＩＩ媒介性不活化の不十分な触媒である特定の硫酸化多糖が、ＨＣＩＩによるフィブリン結合トロンビンの不活化をさらに効果的に触媒し得ることが発見されている。従って、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子は、それらが顕著な全身性抗凝固状態を包含することなくフィブリン結合トロンビンを不活化するので、インビボにおけるクロット結合トロンビンの選択的なインヒビターとして有用である。
【００７４】
特定の理論に制限されることを意図しないが、遊離トロンビンのＨＣＩＩ媒介性不活化の触媒（つまり活性化）の必要性は、フィブリン結合トロンビンのＨＣＩＩ媒介性不活化の活性化に必要とされるものと異なるので、この選択的阻害が起こると考えられる。従って、本発明により、ポリアニオンは、遊離トロンビンよりもフィブリン結合トロンビンを不活化する際により有効であることが同定された。ポリアニオンが不十分な鎖長であるかまたはＨＣＩＩおよびトロンビンの両方に結合するための必要な負電荷を欠くかのいずれかのために、これらのポリアニオンは、遊離トロンビンのＨＣＩＩ媒介性不活化を十分に触媒し得ない。しかし、このような因子は、フィブリン結合トロンビンを不活化し得ない。なぜなら、理論によると、酵素がフィブリン表面に固定化される場合、架橋（すなわち、ＨＣＩＩおよびトロンビンの両方への結合）は、トロンビンの有効なＨＣＩＩ媒介性不活化の必要条件ではないからである。代わりに、例えば、硫酸化ポリアニオンによるＨＣＩＩの立体的改変は不活化を促進するのに十分である。
【００７５】
ＨＣＩＩおよびトロンビンの両方に結合する硫酸化多糖の能力は、大きさに依存する。従って、約２４個未満の単糖単位を含む硫酸化多糖は、代表的には、トロンビンに結合するには不十分な長さであり、そしてＨＣＩＩ媒介性トロンビン阻害の速度を劇的には増加しない。しかし、これらの因子がさらにＨＣＩＩに結合し得、そして立体的な変化を誘導するので、因子は、程度な範囲にトロンビン阻害の速度を増加する。さらに、トロンビンがエキソサイト２でフィブリンに結合され、そして固定される場合、多糖はトロンビンの結合に必要とされず、従って、クロット結合トロンビンは、低分子量の多糖によって改変されたインヒビターを提供するＨＣＩＩによって容易に不活化され得る（図２および３）。これは、クロット結合トロンビンに対する本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子の選択性についての考えられ得る機械作用的説明であると考えられる。
【００７６】
本発明の組成物および方法は、クロット結合トロンビンまたは血栓結合トロンビンの完全な不活化またはほぼ完全な不活化を提供し得、それにより、凝固のトロンビン媒介性増幅が実質的に阻害または防止される。通常、クロット結合トロンビンまたは血栓結合トロンビンの少なくとも約６０％の阻害、好ましくは少なくとも約９０％の阻害、そしてより好ましくは少なくとも約９５％の阻害で達成され得る（この情況において、「阻害」により、トロンビン活性が、実質的に、不可逆的に不活化され、その結果トロンビン分子が、クロットまたは血栓の形成または癒着を促進し得ないことを意味する；より通常には、阻害は活性の減少をいう）。
【００７７】
いくつかのＨＣＩＩ触媒アッセイまたは、相互交換可能に、ＨＣＩＩ活性化アッセイは、当業者に周知である。このようなＨＣＩＩ活性化アッセイの例は、抗第ＩＩａ因子アッセイである（Ｏｆｏｓｏ、Ｂｌｏｏｄ  ６４：７４２−７４７（１９８４）を参照のこと）。他のＨＣＩＩ活性化アッセイは、米国特許出願第０８／１７５，２２１号（１９９３年１２月２７日出願）に記載されたアッセイを包含する。同様に、いくつかのＡＴＩＩＩ触媒アッセイまたは、相互交換可能に、ＡＴＩＩＩ活性化アッセイは、当業者に周知である。このようなＡＴＩＩＩ活性化アッセイの例は、抗第Ｘａ因子アッセイである（Ｔｅｉｅｎら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．８：４１３−４１６（１９７６）を参照のこと）。さらに、いくつかの抗凝固アッセイは、当業者に公知であり、例えば、トロンビンクロッティング時間、第Ｘａ因子クロッティング時間、部分的なトロンボプラスチン時間、および活性化クロッティング時間である。前述のアッセイは、一般に、例えば、Ｌｏｗ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｗｅｉｇｈｔ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ｉｎ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ｈ．Ｂｏｕｎａｍｅａｕｘ（編）；Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４））に記載され、その教示は、全ての目的のために本明細書中で参考として援用される。
【００７８】
本発明の生成物および因子は、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子を例示的な参考として例示するために、より詳細に記載されるのみである。このようなＨＣＩＩ特異的触媒因子に関する以下に記載の好適な特性はまた、本発明の他の局面の因子および生成物に適用可能である。
【００７９】
本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子は、好ましくは１つ以上の以下の特徴を示す：
ｉ）色素生産性抗第ＩＩａ因子アッセイにおいて、約２〜５ユニット／ｍｇ、およびより好ましくは、約３〜４ユニット／ｍｇのＨＣＩＩ触媒比活性または、相互交換可能に、ＨＣＩＩ活性化比活性；
ｉｉ）色素生産性抗第Ｘａ因子アッセイにおいて、約０．２〜１．５ユニット／ｍｇ、好ましくは、約０．５〜１．３ユニット／ｍｇ、およびより好ましくは、約１ユニット／ｍｇのＡＴＩＩＩ触媒比活性または、相互交換可能に、ＡＴＩＩＩ活性化比活性；
ｉｉｉ）約１５０〜約１，０００ｍｇ／ｍｌの範囲、好ましくは、約２００〜約７５０ｍｇ／ｍｌの範囲、およびより好ましくは、約４００〜約５００ｍｇ／ｍｌの範囲の、水性媒体中の溶解性；
ｉｖ）インビボでの抗トロンビン効果を用いる濃度、２０〜８０秒（２０秒のコントロールを有する）、好ましくは、２５〜４５秒、およびより好ましくは３０秒のトロンビンクロッティング時間により測定される、血漿中の抗凝固活性；および
ｖ）ＨＣＩＩ媒介性機構およびＡＴＩＩＩ媒介性機構の両方により、ならびにＨＣＩＩおよびＡＴＩＩＩ両方に独立的である機構によって寄与される抗凝固効果。
【００８０】
本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子は、好ましくは、グリコサミノグリカンである。より詳細には、ＨＣＩＩ特異的触媒因子は、好ましくは約１０〜約２４個の単糖単位、そしてより好ましくは、約１４〜約２０個の単糖単位のポリアニオン炭水化物である。代表的には、ＨＣＩＩ特異的触媒因子は、約３，０００〜８，０００ダルトン（±１，０００ダルトン）の範囲の分子量を有するヘパリン調製物である。このように、１つの実施態様において、ヘパリンは、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子の好適な供給源である。前述で説明したヘパリンは、Ｄ−グルコサミン残基およびＤ−グルクロン酸残基、またはＬ−イズロン酸（ｉｄｕｒｏｎｉｃ）残基からなる高度に硫酸化された右旋性のムコ多糖である。一般に、ヘパリンは、ヘパリンの供給源およびヘパリンを単離するために使用する方法に依存して、約６，０００ダルトン〜２０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する。好適な実施態様において、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子は、以下の化学反応を用いてヘパリンから調製されたヘパリン調製物である：（１）非分画化ヘパリンの脱重合によりＬＭＷＨを得る工程；（２）得られたＬＭＷＨの酸化；および（３）酸化ＬＭＷＨの還元。これらの工程の順序が最終工程が還元工程であること以外は、変更され得ることは当業者には直ちに明白であり、例えば、非分画化ヘパリンは、酸化、脱重合、および還元され得るか、あるいは酸化、還元、脱重合、および還元され得る。
【００８１】
しかし、ヘパリン調製物であることに加えて、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子は、例えば、ヘパリン以外の負に荷電した多糖、負に荷電したポリアニオン、ＨＣＩＩに親和性を有する負に荷電した有機分子などであり得る。このような物質は、代表的には、少なくとも１０−６Ｍ、好ましくは約１０−８Ｍ以上の強い親和性でＨＣＩＩに結合するが、トロンビンに対して、好ましくは約１０−６Ｍよりも弱い親和性でＨＣＩＩに結合する。
【００８２】
１つの実施態様において、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子は、以下の式を有し得る：
2007204500.tif 000009
【００８３】
上記の式において、Ｒ１は、Ｈ、Ｄ−グルコサミン酸残基、Ｄ−グルクロン酸残基、およびＬ−イズロン酸残基からなる群より選択されるメンバーである。Ｒ２は、Ｈ、Ｄ−グルコサミン酸残基、Ｄ−グルクロン酸残基、Ｌ−イズロン酸残基、および無水マンニトールからなる群より選択されるメンバーである。上記の式において、Ｒ３は、ＨおよびＳＯ３−からなる群より選択されるメンバーである。最後に、Ｒ４は、Ｈ、ＳＯ３−、およびＣＨ３ＣＯ−からなる群より選択されるメンバーである。上記の式において、添え字「ｎ」は、独立的に選択され、そして０〜約１４の範囲の値を有し得る。「ｎ」の値は、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子が、約３，０００ダルトン〜約８，０００ダルトン（±１，０００ダルトン）の範囲の分子量を有するように選択される。
【００８４】
別の実施態様において、本発明のヘパリン由来のＨＣＩＩ触媒因子は、以下の式を有し得る：
2007204500.tif 000010
【００８５】
上記の式において、Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、Ｄ−グルコサミン酸残基、Ｄ−グルクロン酸残基、およびＬ−イズロン酸残基からなる群より独立的に選択されるメンバーである。上記の式において、Ｒ３は、ＨおよびＳＯ３−からなる群より選択されるメンバーである。最後に、Ｒ４は、Ｈ、ＳＯ３−、およびＣＨ３ＣＯ−からなる群より選択されるメンバーである。上記の構造において、ＡＴＩＩＩのヘパリン５糖配列を有する配列は、ＡＴＩＩＩアフィニティークロマトグラフィーにより実質的に除去される。記載のように、本発明のＨＣＩＩ触媒因子は、代表的には、約３，０００ダルトン〜約８，０００ダルトン（±１，０００ダルトン）の範囲の分子量を有する。
【００８６】
ヘパリン調製物から得られるＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、フィブリン結合トロンビンのＨＣＩＩ媒介性不活化を選択的に触媒する触媒因子）は、多数の異なる方法を用いて調製され得る。上述したように、好適な実施態様において、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子は、以下の化学反応を用いてヘパリンから調製されたヘパリン調製物である：（１）非画分化ヘパリンを脱重合して、ＬＭＷＨを得る工程；（２）得られたＬＭＷＨの非硫酸化ウロン酸部分を酸化して、環構造を開環する工程；および（３）酸化されたＬＭＷＨを還元して、脱重合工程および酸化工程中に形成されたアルデヒドをＬＭＷＨを（アルコールに）還元する工程。さらに好適な実施態様において、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子は、以下の化学反応を用いてヘパリンから調製される：（１）亜硝酸を用いて非分画化ヘパリンを脱重合して、ＬＭＷＨを得る工程；（２）過ヨウ素酸ナトリウムを用いて得られたＬＭＷＨを酸化する工程；および（３）ホウ化水素ナトリウムを用いて酸化されたＬＭＷＨを還元する工程。この好適な実施態様において、得られた低親和性で、低分子量のヘパリンは、非還元末端として負の糖（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｕｇａｒ）（例えば、ウロン酸残基）および還元末端として２，５−無水マンニトール残基を有するヘパリン分子の混合物であり、そして約３，０００〜約８，０００ダルトンの範囲の分子量を有する。
【００８７】
より詳細には、ＡＴＩＩＩに対して低い親和性を有するヘパリンは、標準的な非分画化ヘパリン（１５０〜１６０の抗第Ｘａ因子および抗第ＩＩａ因子ユニット／ｍｇの比活性）から、または化学的に酸化反応およびその後の還元反応、あるいは、ＡＴＩＩＩアフィニティークロマトグラフィーのいずれかにより、低分子量のヘパリンから調製される。好適な実施態様において、ＡＴＩＩＩに対して低い親和性を有するヘパリンは、化学的に調製される。このような化学的修飾は、実施例の節に記載のプロトコールに従う酸化剤およびその後の還元剤を用いるヘパリン調製物中に存在するビシナルアルコール処理する工程を包含する。適切な酸化剤としては、過ヨウ素酸ナトリウム、および当業者に公知の特定の反応条件下での四酢酸鉛が挙げられるが、これらに限定されない。適切な還元剤としては、ホウ化水素ナトリウム、他の金属水酸化物、当業者に公知の特定の反応条件下での、水酸化アルミニウムリチウムをが挙げられるがこれらに限定されない。これらの反応は、ビシナル（すなわち、ＡＴＩＩＩのヘパリン五糖配列内に見出される重要な非硫酸化グルクロン酸残基のＣ２−Ｃ３結合）を切断する。この結合の切断は、ＡＴＩＩＩに対するヘパリンの親和性を著しく減少させる。あるいは、ＡＴＩＩＩアフィニティークロマトグラフィーが、ＡＴＩＩＩに対してほとんどまたは全く親和性を有さないこれらのヘパリン鎖を選択するために使用され得る。いずれかの技術により調製された場合、得られた低親和性ヘパリン（ＬＡＨ）は、以下の特徴を有する：
ａ）ＡＴＩＩＩ触媒化（すなわち、ＡＴＩＩＩ活性化活性（１．５の抗第Ｘａ因子ユニット／ｍｇ以下を有する））が本質的に欠損するが、触媒する（すなわち、ＨＣＩＩを活性化する）その能力のために抗第ＩＩａ因子活性が（約２〜約５ユニット／ｍｇ）残存する。
【００８８】
ｂ）開始物質（ＬＡＨまたはＬＡ−ＬＭＷＨ）を比較すると、血漿中に減少した抗凝固活性（活性化された部分トロンボプラスチン時間またはトロンビンクロッティング時間のいずれかにより測定される）を有するが、生理学的濃度のＨＣＩＩを含有する緩衝液中のトロンビンの不活化を触媒するその能力は残存する（表１を参照のこと）。
【００８９】
2007204500.tif 000011
【００９０】
ｃ）フィルター含有プレートアッセイにおいて、ＬＡＨは、フィブリン結合トロンビンのＨＣＩＩ媒介性置換（図４）およびＨＣＩＩ媒介性不活化（図５）を促進する際の標準ヘパリンとして有効である。標準ヘパリンおよびＬＡＨは両方とも、ＬＡＨがフィブリン結合トロンビンを置換するよりも優れた範囲でフィブリン結合トロンビンを阻害し、このことは、ＨＣＩＩがエキソサイト２を介するフィブリンへの結合を残存するトロンビンを結合および不活化し得るという概念に矛盾しない。
【００９１】
ｄ）標準ヘパリンまたはＬＡＨのいずれかにより置換されたトロンビンのほとんどは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定されるように、ＨＣＩＩに共有結合的に複合体化された（データは示さず）。
ｅ）血漿中のクロット誘導フィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ）生成の阻害の範囲に基づいて、ＬＡＨは標準として有効であり、フィブリン結合トロンビン不活化における非分画化ヘパリンである（図６Ａおよび６Ｂ）。懸クロットアッセイ（ｈａｎｇｉｎｇ  ｃｌｏｔ  ａｓａｙ）において、両方の因子は、最小のトロンビン置換のみを生成する。なぜなら、トロンビンは、エキソサイト２を介するフィブリンに結合し、エキソサイト１を放出し、そしてＨＣＩＩと相互作用する活性部位は解放されている（ｆｒｅｅ  ｔｏ）からである。
【００９２】
低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）画分は、種々の技術を用いて調製され得、亜硝酸を用いる化学的脱重合、ヘパリナーゼを用いる酵素分解、およびゲル濾過を包含する。好適な実施態様において、ＬＷＭＨは、亜硝酸脱重合を用いる標準的な非画分化ヘパリンから調製される。代表的には、得られたＬＭＷＨは約３，０００ダルトン〜約８，０００ダルトン（±１，０００ダルトン）の範囲の分子量を有するヘパリン分子の混合物である。この物質の混合物は、直接使用され得るか、あるいは、例えば、ゲル排除クロマトグラフィーを用いて種々の成分に分離され得る。例えば、ＬＭＷＨ混合物は、ゲル排除クロマトグラフィーによって３つの画分に任意に分離され得る。画分１は、約８，０００ダルトンの平均分子量を有し、画分２は、約５，０００ダルトンの平均分子量を有し、そして画分３は、約３，０００ダルトンの平均分子量を有する。本明細書中に記載の実施例により例示されるのように、これらの３つの画分は、互いにならびに物質の混合物（すなわち、約３，０００ダルトン〜約８，０００ダルトンの範囲の分子量を有するヘパリ分子の混合物）とは異なる性質を有する。従って、物質の混合物、画分１、画分２、画分３、またはこれらの物質の種々の組み合わせのいずれが使用されるかに依存して、異なる特性を利用し得る。
【００９３】
ＬＡ−ＬＭＷＨ（例えば、Ｖ１８）は、トロンビンをフィブリン被覆フィルター（ｆｉｂｒｉｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｆｉｌｔｅｒ）から置換する際、標準ヘパリンよりも有効ではないが（図４）、結合トロンビンを有効に阻害する（図５）。例えば、４μＭのＶ１８（約３，０００ダルトン〜約８，０００ダルトンの範囲の分子量を有するＬＡ−ＬＭＷＨ分子の混合物であるＨＣＩＩ特異的触媒因子）は、わずか６０％の結合トロンビンを置換したが、結合酵素の活性の８５％よりも高い阻害を生成する。しかし、Ｖ１８は、液相トロンビンの阻害をほとんど引き起こさない。なぜなら、４μＭのＶ１８は、わずか５０秒のトロンビンクロッティング時間を生成するが、４μＭの標準ヘパリンのトロンビンクロッティング時間は測定不可能である。
【００９４】
本発明のＬＡ−ＬＭＷＨは、以下の特徴を有する：
ａ）その比活性が、約０．２〜約１．５の抗第Ｘａ因子ユニット／ｍｇおよび約２〜約５の抗第ＩＩａ因子ユニット／ｍｇである；
ｂ）標準非分画化標準ヘパリンおよびＬＡＨの両方と比較すると、ＬＡ−ＬＭＷＨは、血漿中の抗凝固活性を減少させ（トロンビンクロッティング時間により測定された）、そして生理学的濃度のＨＣＩＩを含有する緩衝液中のＨＣＩＩ媒介性トロンビン不活化のより少ない触媒（すなわち、活性化）を生じる（表１、前出を参照のこと）。
【００９５】
ｃ）フィルター含有プレートアッセイにおいて、ＬＡ−ＬＭＷＨは、フィブリン結合トロンビンのＨＣＩＩ媒介性置換を促進する際、標準ヘパリンまたはＬＡＨよりも有効ではないが、同様の範囲まで結合トロンビンの不活化を促進し得る（図５および６）。
【００９６】
ｄ）血漿中のクロット誘導性フィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ）生成を阻害するその能力（図６Ａおよび６Ｂ）に基づいて、ＬＡ−ＬＭＷＨは、フィブリン結合トロンビンを不活化する際、標準、非分画化ヘパリン、およびＬＡＨと実質的に同様に有効である。これに対して、ＬＡ−ＬＭＷＨは、トロンビンクロッティング時間アッセイにおいて遊離トロンビンを不活化する際、ヘパリンおよびＬＡＨの約１０分の１未満有効である。従って、標準、非分画化ヘパリン、およびＬＡＨと比較して、ＬＡ−ＬＭＷＨは、フィブリン結合トロンビンの不活化を選択的に促進する。
【００９７】
ｅ）本発明のＬＡ−ＬＭＷＨは、ＨＣＩＩ媒介性機構およびＡＴＩＩＩ媒介性機構の両方により、ならびにＨＣＩＩおよびＡＴＩＩＩの両方に独立する機構により寄与される抗凝固効果を有する。
【００９８】
従って、本発明の生成物およびＨＣＩＩ特異的触媒因子は、好ましくは１つ以上の以下の特徴を有する。１つの実施態様において、本発明は、好ましくは、２つの方法で化学修飾されたヘパリン調製物を提供する。第１に、それらは、例えば、亜硝酸を用いて化学的に脱重合され、従って、ヘパリン親分子の大きさの約３分の１に大きさが減少し、従って、それらは、代表的には、約３，０００ダルトン〜約８，０００ダルトン（±１，０００ダルトン）の範囲の分子量を有する。この改変は、遊離トロンビンに対するヘパリン補因子ＩＩ（ＨＣＩＩ）の活性を触媒する能力の著しい損失を生じるが、表面結合トロンビンに対するＨＣＩＩの活性を触媒するそれらの能力は残存する。第２に、それらは、約９５％〜約９９％のそれらの抗トロンビンＩＩＩ結合活性の損失を生じる酸化反応および還元反応に供される。より詳細には、それらは、弱いＡＴＩＩＩ触媒活性を有するか、または相互交換可能に、約０．２〜約１．５ユニット／ｍｌの抗第Ｘａ因子レベルによって証明されるＡＴＩＩＩ活性化活性を有し、これは、非修飾の低分子量ヘパリンと比較して約９５％〜約９９％の活性の減少を示す。従って、本発明の得られたＨＣＩＩ特異的触媒因子は、表面結合トロンビンを効率良く不活化する濃度で５倍も長いトロンビンクロッティング時間にそれらが延長できないことにより証明されるように、遊離トロンビンに対して弱い活性を有する。これらの２つの特性、すなわち、他のＨＣＩＩ触媒、または交換可能に、ＨＣＩＩアクチベーター（例えば、デルマタン硫酸）の、遊離トロンビンよりも表面結合を不活性化する相対的に優れた能力、および、（たとえ著しく減少しても）、ある程度のＡＴＩＩＩ依存性抗第Ｘａ因子活性は、トロンビンクロッティング時間の延長によって測定される遊離トロンビンの不活化に対してこれらの他の抗凝固因子より低い効果を有する濃度で、表面結合トロンビンの測定器具であるバイパス回路において、ヘパリン、デルマタン硫酸、およびヒルジンと比較して、改善された抗トロンビン効果を担う。さらに、非常に驚くことに、このような因子は、ＨＣＩＩ媒介性機構およびＡＴＩＩＩ媒介性機構の両方により、ならびにＨＣＩＩおよびＡＴＩＩＩの両方に独立する機構により寄与される抗凝固効果を有する。
【００９９】
前述の特性の結果として、本発明の生成物およびＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、クロット結合トロンビンを置換および／または不活化し得る触媒）は、過剰な出血を生じることなく（すなわち、全身性出血における臨床的に危険な増加を生じることなく）患者において血栓形成を防止および／または血栓成長をブロッキングするために使用され得る。より詳細には、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子は、表面結合トロンビンを不活化する用量であるが、遊離トロンビンを阻害する際にごくわずかな少しの効果を有する用量を投与され得る。このように、別の実施態様において、本発明は、好ましくは、全身性出血における臨床的に危険な増加を誘導することなく、患者における血栓形成を阻害する方法、クロット結合トロンビンを不活化し得るヘパリン補因子ＩＩ特異的触媒因子の薬理学的に受容可能な用量を患者に投与する工程を包含する方法を包含し、ＨＣＩＩ特異的触媒因子は、以下のように特徴づけられる：（ｉ）抗第ＩＩａ因子アッセイにおいて、約２〜約５ユニット／ｍｇのヘパリン補因子ＩＩに対するヘパリン補因子ＩＩの比活性；（ｉｉ）抗第Ｘａ因子アッセイにおいて約０．２〜約１．５ユニット／ｍｇの第Ｘａ因子に対する抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）の比活性；および（ｉｉｉ）約１５０〜約１，０００ｍｇ／ｍｌの範囲の水性媒体における可溶性。
【０１００】
単独で用いる場合、あるいは、遊離トロンビンを不活化するのに必要である低容量のヘパリンまたは低分子量のヘパリンとともに用いる場合、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子（および他のトロンビンインアクチベーター）は有効である。ヘパリン抵抗性条件（すなわち、非常に高用量のヘパリンを必要とする疾患）において、例えば、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子は、ヘパリン節約剤（ｈｅｐａｒｉｎ−ｓｐａｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）として使用され得る。このように、別の実施態様において、本発明は、ＨＣＩＩ特異的触媒因子およびＡＴＩＩＩ触媒因子（すなわち、ＡＴＩＩＩ活性化因子）の組み合わせ、および、好ましくは、混合物を提供する。このような混合物は、正常な凝固を実質的に阻害することなく、患者における血栓形成を阻害するために有用である。従って、本発明の組成物または混合物は、全身性出血において臨床的に危険な増加を誘導することなく、患者において血栓形成を阻害するために有用である。さらに、このような組成物または混合物は、静脈血栓症または動脈血栓症の予防、処置、および体外循環におけるクロッティングの防止に有用である。
【０１０１】
本発明の混合物は、代表的には、ＨＣＩＩ特異的触媒因子の約９０重量％〜約９９．９重量％であり、より好ましくは、約９５重量％〜９８．５重量％であり；ＡＴＩＩＩ触媒因子（すなわち、ＡＴＩＩＩ活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ））の約０．１重量％〜約１０重量％であり、より好ましくは、約０．５重量％〜約５重量％である。代表的には、混合物の全体のＨＣＩＩ触媒活性は、約２〜約５ユニット／ｍｇであり、より好ましくは、約２〜約４ユニット／ｍｇである。本発明の混合物における使用に適切なＡＴＩＩＩ触媒因子またはＡＴＩＩＩ活性化因子は、ヘパリンおよびＬＭＷＨを包含するが、これらに限定されない。さらに、他の因子が、所望により混合物を改変するために添加され得、例えば、ＬＭＷＨ（０．１〜５重量％）、ヘパリン（０．１〜５重量％）、ダイレクトトロンビンインヒビター、活性化された第Ｘ因子のダイレクトインヒビターなどが挙げられる。
【０１０２】
別の実施態様において、本発明は、好ましくは、全身性出血における臨床的に危険な増加を誘導することなく、患者におけるクロット結合トロンビンおよび液相トロンビンを阻害する方法を提供する。この方法は、以下の薬理学的に受容可能な用量を患者に投与する工程を包含する：（ｉ）クロット結合トロンビンを不活化し得るＨＣＩＩ特異的触媒因子、このＨＣＩＩ特異的触媒因子は、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）に対する最小の親和性、および抗第ＩＩａ因子アッセイにおいて約２〜約５ユニット／ｍｇのヘパリン補因子ＩＩ比活性を有する；および（ｉｉ）液相トロンビンを不活化し得るＡＴＩＩＩ触媒因子。適切なＡＴＩＩＩ触媒因子（すなわち、ＡＴＩＩＩ活性化因子）は、ヘパリン、低分子量ヘパリン、トロンビンダイレクトインヒビターおよび活性化された第Ｘ因子のダイレクトインヒビターが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、本方法において、ＨＣＩＩ特異的触媒因子およびＡＴＩＩＩ触媒因子（すなわち、ＡＴＩＩＩ活性化因子））は、同時に、別々に、または連続的に患者に投与され得る。患者に同時に投与される場合、ＨＣＩＩ特異的触媒因子およびＡＴＩＩＩ触媒因子は、単一の溶液あるいは化合物としてともに投与され得るか、または、それらは２つの異なる溶液または化合物として別々に投与され得る。
【０１０３】
本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子および混合物は、上記の心血管疾患症状を処置するために有用である薬学的組成物中の化合物として組み込まれ得る。このような組成物はまた、従来の血栓崩壊処置物（例えば、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔｐＡ）、ストレプトキナーゼの投与など）、ならびに血管内介入（例えば、血管形成、アテレクトミーなど）と組み合わせて有用である。
【０１０４】
適切な薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に、本発明の１つ以上の活性生成物（例えば、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子）の治療有効量を含有する。他の適切な薬学的組成物は、本発明の活性生成物（例えば、ＨＣＩＩ特異的触媒因子）およびＡＴＩＩＩ特異的触媒因子の混合物の薬学的有効量を含有する。「治療有効量」、または、相互変換可能に「薬学的に受容可能な用量」によって、生成物またはＨＣＩＩ特異的触媒因子、あるいは、例えば、ＨＣＩＩ特異的触媒因子およびＡＴＩＩＩ特異的触媒因子の組合せまたは混合物の十分な量は、血栓関連性心血管症状を処置する場合、上記のようにクロット結合トロンビンを不活化するためにおよび／または血栓付着成長を阻害するために存在することが意味される。
【０１０５】
代表的には、活性生成物またはＨＣＩＩ特異的触媒因子は、約２００ｍｇ／用量〜２ｇ／用量の濃度範囲で、より好ましくは、５００ｍｇ／用量〜１ｇ／用量の範囲の濃度で薬学的組成物中に存在する。毎日の投薬量は、用いられる特定のＨＣＩＩ特異的触媒因子の活性に依存して、非常に広範であり得るが、通常、約３０μｇ／ｋｇ重／日〜約５００μｇ／ｋｇ重／日の濃度範囲で、より好ましくは約５０μｇ／ｋｇ重／日〜約２００μｇ／ｋｇ重／日の濃度範囲で存在する。
【０１０６】
組み合わせた薬学的組成物または混合物した薬学的組成物に関して、活性生成物またはＨＣＩＩ特異的触媒因子は、約３ｍｇ／ｋｇ／用量〜約３０ｍｇ／ｋｇ／用量の濃度範囲で、より好ましくは、約３ｍｇ／ｋｇ／用量〜約１０ｍｇ／ｋｇ／用量の濃度範囲で存在し、そしてＡＴＩＩＩ触媒因子（すなわち、ＡＴＩＩＩ活性化因子）は、約１０Ｕ／ｋｇ／用量〜約５００Ｕ／ｋｇ／用量の濃度範囲で、より好ましくは、約１５Ｕ／ｋｇ／用量〜約１００Ｕ／ｋｇ／用量の濃度範囲で存在する。毎日の投薬量は非常に広範であり得、用いられる特定のＨＣＩＩ特異的触媒因子およびＡＴＩＩＩ触媒因子（あるいは、ＡＴＩＩＩ活性化因子）の活性に依存する。代表的には、ＨＣＩＩ特異的触媒因子は、通常、約３ｍｇ／ｋｇ重／日〜約３０ｍｇ／ｋｇ重／日の濃度範囲で、より好ましくは、約３ｍｇ／ｋｇ重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ重／日の濃度範囲で存在し、一方、ＡＴＩＩＩ触媒因子は、通常、約１０Ｕ／ｋｇ重／日〜約５００Ｕ／ｋｇ重／日の濃度範囲で、より好ましくは、約１５Ｕ／ｋｇ重／日〜約１００Ｕ／ｋｇ重／日の濃度範囲で存在する。
【０１０７】
薬学的に受容可能なキャリアは、ＨＣＩＩ触媒因子またはＨＣＩＩ特異的触媒因子とＡＴＩＩＩ特異的触媒因子との混合物を患者に送達するのに適切な、任意の適合性で非毒性の物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂肪、ワックス、および不活性の固体がキャリアとして使用され得る。薬学的に受容可能なアジュバント、緩衝化剤、分散剤などはまた、薬学的組成物中に組み込まれ得る。このような組成物は、経口投与、鼻腔内投与、呼吸（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ）投与または非経口投与に適切であり、好ましくは、非経口投与（すなわち、皮下投与、血管投与、および静脈内投与）に適切である。経皮投与を介する本発明によって提供される物質を送達することもまた好ましくあり得る。
【０１０８】
前述を考慮すると、ＨＣＩＩ特異的触媒因子または本発明の活性生成物は、全身性出血における臨床的に危険な増加を誘導することなく、クロット結合トロンビンまたはフィブリン結合トロンビンを選択的に阻害するために有効に使用され得ることは当業者には直ちに明らかである。さらに、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子は、他のＡＴＩＩＩ触媒、すなわち、ＡＴＩＩＩ活性化因子（例えば、ヘパリンまたはＬＭＷＨ）と組み合わせて有効に使用され得、全身性出血における臨床的に危険な増加を誘導することなく、クロット結合トロンビンおよび液相トロンビンの両方を阻害する。このように、不安定狭心症、急性心筋梗塞（心臓発作）、脳血管障害（発作）、肺塞栓症、深静脈血栓症、動脈性血栓症などを含む、多くの重要な心血管合併症を処置するために、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子は、単独でまたは他のＡＴＩＩＩ触媒因子（すなわち、活性化因子）と組み合わせで使用され得る。
【０１０９】
上記の心血管症状の処置のための薬学的組成物に有用であることに加えて、本発明の活性生成物またはＨＣＩＩ特異的触媒因子および組み合わせは、インビトロにおける血液凝固機構を解明するための試薬として使用され得ることは、当業者には直ちに明らかである。
【０１１０】
上記の所望の特性を有するヘパリン画分またはその誘導体が生成されると、類似の触媒特異性および／または親和性を有する他のトロンビンインアクチベーターまたはＨＣＩＩ特異的触媒因子は、当業者に周知の種々の方法によって産生され得る。例えば、Ｆｏｄｏｒらの米国特許第５，１４３，８５４号は、「ＶＬＳＩＰＳ」と呼ばれる技術を記載しており、そこには、短いペプチドの多様な収集が、固体基質上の選択された位置で形成される。次いで、このようなペプチドは、立体的にＨＣＩＩを改変する能力についてスクリーニングされ、必要に応じてヘパリン画分と競合してスクリーニングする。短いペプチドのライブラリーはまた、ファージディスプレイ技術を用いて生成およびスクリーニングされ得る（例えば、Ｄｅｖｌｉｎ、ＷＯ  ９１／１８９８０を参照のこと）。必要に応じて、これらのポリペプチドまたは他の方法によって産生された改変物は、ＨＣＩＩに対して改善された結合親和性を達成するために多彩であり得る（例えば、Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９、これは全ての目的のためにその全体が参考として援用される、を参照のこと）。
【０１１１】
ＨＣＩＩアクチベーターのペプチドアナログは、従来の固相合成または組換え技術（これらの両方は、当該分野において十分に記載されている）によって調製され得る。適切な固相合成技術は、最初にＭｅｒｒｉｅｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６（１９６３）に記載されたように、固相基質上で増加する鎖へのアミノ酸の連続的付加に基づく。自動化固相合成のための市販のシステムは、現在、供給者（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．、Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から広範に入手可能である。さらに、組換えポリペプチド産生技術は、技術論文および科学論文に広範に記載される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、１〜３巻を参照のこと。
【０１１２】
本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子の小分子模倣物は、薬物設計の領域で研究する当業者に公知の技術を使用することにより達成され得る。このような方法は、つじつまの合う場（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ｆｉｅｌｄ）（ＳＥＦ）分析、立体配座相互作用（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）（ＣＩ）分析、および通常様式の力学的コンピュータープログラム（これらの全ては現在容易に入手可能である）を包含するが、これらに限定されない。Ｒｅｉｎら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、Ａｌａｎ  Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）およびＮａｖｉａおよびＭａｒｃｋｏ、「薬物設計における構造的情報の使用」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、Ｎｏ．２、２０２−２１０頁、（１９９２）を参照のこと。これらの技術によって同定された化合物の調製は、それらの構造および他の特徴に依存し、そして入手可能なテキスト（例えば、Ｆｕｒｎｉｓｓら、Ｖｏｇｅｌ’ｓ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．、Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９２  およびＬａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９）に記載の標準的な化学合成法によって通常達成され得る。
【０１１３】
本発明は、特定の実施例により、より詳細に記載される。以下の実施例は、例示の目的ために提供され、そしていかなる様式においても本発明を限定も規定もすることを意図しない。実施例において、トロンビンインアクチベーターは、ヘパリン由来のＨＣＩＩ特異的触媒因子によって例示されるが、本発明はこのような因子に限定されない。
【０１１４】
実施例
Ａ．材料の調製
ヘパリンは、天然供給源（通常、ブタの胴粘膜）から単離されるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）である。本発明の１つの局面は、本質的に抗トロンビンＩＩＩ活性化活性を欠くが、ヘパリン補因子ＩＩを触媒する能力を保持する低分子量ヘパリン画分を調製することである。ヘパリン補因子ＩＩを触媒するその能力の結果として、この修飾ＧＡＧはフィブリン結合トロンビンを不活化し得る。
【０１１５】
一般に、低分子量ヘパリンは、標準的な非分画ヘパリンから、ベンジル化およびそれに続くアルカリ脱重合；亜硝酸脱重合；ヘパリナーゼを用いる酵素的脱重合；または過酸化脱重合により調製される。本発明の好ましい実施態様において、低分子量ヘパリンを、亜硝酸脱重合を用いて、標準的ヘパリンから調製する。次いで、この低分子量ヘパリンを、抗トロンビンＩＩＩに対するその親和性を減少させるようにさらに改変する。これは、化学的に、あるいは抗トロンビンＩＩＩアフィニティーカラムの使用を介して達成され得る。本発明の好ましい実施態様において、これは酸化反応およびそれに続く還元反応により、化学的に達成される。得られる低親和性、低分子量ヘパリン（ｌｏｗ  ａｆｆｉｎｉｔｙ，ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｈｅｐａｒｉｎ）は、代表的には、約３，０００〜約８，０００ダルトンの範囲の分子量を有するヘパリン分子の混合物である。この範囲は、約１０〜約２４単糖単位に相当する。この材料の比活性は、約２〜約５抗トロンビン単位／ｍｇおよび約１．５（開始、１００抗Ｘａ）抗Ｘａ単位／ｍｇ未満である。
【０１１６】
材料のＬＡ−ＬＭＷＨ混合物を直接に使用し得る。あるいは、例えば、ゲル排除クロマトグラフィーを用いて、ＬＡ−ＬＭＷＨ混合物をその種々の成分に分離し得る。ゲル排除クロマトグラフィーにより分離した場合、ＬＡ−ＬＭＷＨ画分は一般に３つのＬＡ−ＬＷＭＨ画分を生じる。画分１は約８，０００ダルトンの平均分子量を有し、画分２は約５，０００ダルトンの平均分子量を有し、そして画分３は約３，０００ダルトンの平均分子量を有する。図７は、Ｇ−５０  ＳＥＰＨＡＤＥＸカラムおよび種々の濃度のグルクロノラクトンを用いる材料のＬＡ−ＬＭＷＨ混合物の溶出プロフィールを示す。材料のＬＡ−ＬＭＷＨ混合物と同様に、これら３つのＬＡ−ＬＭＷＨ画分の各々の比活性は、約２〜約５抗トロンビン単位／ｍｇおよび約１．５（開始、１００抗Ｘａ）抗Ｘａ単位／ｍｇ未満である。
【０１１７】
以下の実施例は、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子を調製するために用いられ得る実験プロトコルを示す。上記のように、本発明の好ましい実施態様において、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子の調製に導く化学反応は以下のとおりである：（１）低分子量ヘパリンを得るためのヘパリンの亜硝酸脱重合；（２）不飽和ウロン酸部分の環構造を開裂するための低分子量ヘパリンの過ヨウ素酸塩での酸化；および（３）亜硝酸および過ヨウ素酸塩工程の間に形成されるアルデヒドの（アルコールへの）水素化ホウ素還元（ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）。
【０１１８】
１．実施例１：Ｖ−１８、ロット＃７−１の調製
ａ．工程１：ＬＭＷヘパリン、ロット＃７の単離
ブタ腸ヘパリン（２５０グラム）を、５リットルの精製水に溶解した（５％溶液）。硝酸ナトリウム（３．４５グラム）を、この溶液に添加しそして溶解して１０  ｍＭの濃度とした。溶液の温度は１８℃と２４℃との間であった。約２分にわたって、３０  ｍｌの３７％ＨＣｌを添加し、そしてｐＨを６．３２の開始値から３．００の最終ｐＨに調整した。次いで、得られた溶液を、２時間雰囲気温度で撹拌して脱重合を生じさせた。２時間のインキュベーションの終了時に、ｐＨを上方に６．７５の値に、約１８  ｍｌの５０％ＮａＯＨ溶液の緩やかな添加により調整した。
【０１１９】
次いでこのサンプルを１２．５リットルの容量まで希釈し、そして１０容量の精製水に対して１０，０００分子量カットオフメンブレン（１．５  ｍ２）を装着したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過デバイスを用いて限外濾過した。次いで限外濾過からの透過液を濃縮し、そして３，０００分子量カットオフメンブレン（１．５  ｍ２）を装着したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて透析した。一旦１２５リットルの透過液が約６リットルに濃縮されると、次いでこれを３容量の精製水に対して透析した。次いで濃縮液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を凍結乾燥して、ＬＭＷ−ヘパリン、ロット＃７を得た。収量＝１０６グラム（４２％）。
【０１２０】
ＬＭＷ−ヘパリン中間体＃７（上記）の分子量特性を、多角レーザー光散乱に連結した高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉａｎｇｌｅ  ｌａｓｅｒ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）（ＨＰＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）により測定した。それを表２にまとめる。
【０１２１】
2007204500.tif 000012
【０１２２】
ｂ．工程２および３：ＬＭＷ−ヘパリン、ロット＃７の酸化および還元
ＬＭＷ−ヘパリン、ロット＃７（１００グラム）を４〜１０℃で１リットルの精製水に溶解した。１リットルの２００  ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を、溶解したサンプルに添加した。２リットルの２００  ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムを、緩衝化ＬＭＷ−ヘパリン溶液に添加した。得られた溶液を、暗中で、４〜１０℃で、４８時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。
【０１２３】
４８時間後、過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを、グリセロール（７０  ｍｌ）の添加により破壊した。得られた反応混合物のｐＨを、約１０  ｍｌの５０％ＮａＯＨ溶液を用いて中性に上昇させ、そして得られた溶液を約５．５リットルに希釈した。次いでこの溶液を、３，０００  ＭＷＣＯメンブレンを装着したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎシステムを用いて（上記工程１におけるように）透析（限外濾過）した。約７容量の透過液を採集した後、酸化ＬＭＷ−ヘパリン中間体溶液を約３リットルの容量まで濃縮した。
【０１２４】
酸化中間体の還元を以下の様に実施した：重炭酸ナトリウム（６３グラム）を上記の３リットルの溶液に添加しそして混合して、約０．２５  Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を得た。この溶液を低温（４〜１０℃）に維持し、その間２２．８グラムのＮａＢＨ４を含有する溶液（１．２リットル）（これもまた４〜１０℃）を撹拌しながら緩やかに添加した。一旦全てのＮａＢＨ４溶液を添加すると、この反応物を４〜１０℃に３．５時間維持した。次いで、反応ｐＨを６Ｍ  ＨＣｌ（約２３０  ｍｌ）を用いて４．０に調整し、約３０分間混合し、次いでｐＨを上方に６．２まで、５０％ＮａＯＨの添加により調整した。次いでこのサンプルを再度３，０００  ＭＷＣＯメンブレンに対してＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎシステムを用いて限外濾過し（７容量）、そして最後に０．２μＳｔｅｒｉｖｅｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターを通して濾過滅菌した。得られた溶液を凍結乾燥して、Ｖ−１８、ロット＃７１を得た。収量＝７６．６グラム。
【０１２５】
産物の分子量特性をＨＰＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにより測定した。それを前記表２にまとめる。
【０１２６】
２．実施例２：Ｖ−１８、ロット＃９−１および９−２の調製
ａ．工程１：ＬＭＷ−ヘパリン、ロット＃９の単離
ブタ腸ヘパリン（２５０グラム）を５リットルの精製水に溶解した（５％溶液）。硝酸ナトリウム（８．６２グラム）をこの溶液に添加しそして溶解して、２５  ｍＭの濃度とした。溶液の温度は、１８℃と２４℃との間であった。約２分にわたって、３３  ｍｌの３７％ＨＣｌを添加し、そしてｐＨを６．３２の開始値から３．０１の最終ｐＨまで調整した。次いで、得られた溶液を、２時間雰囲気温度で撹拌して脱重合を生じさせた。２時間のインキュベーションの終了時に、ｐＨを上方に６．２８の値まで、５０％ＮａＯＨ溶液の緩やかな添加により調整した。
【０１２７】
次いでこのサンプルを１０リットルの容量まで希釈し、そして７容量の精製水に対して３，０００  ＭＷＣＯメンブレン（１．５  ｍ２）を装着したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過デバイスを用いて限外濾過した。次いで、このサンプルを約３．５リットルに濃縮し、そして凍結乾燥して、ＬＭＷ−ヘパリン、ロット＃９を得た。収量＝１２０．４グラム（４８％）。
【０１２８】
ＬＭＷ−ヘパリン中間体＃９の分子量特性を、ＨＰＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにより測定した。それを前記表２にまとめる。
【０１２９】
ｂ．工程２および３：Ｖ−１８、ロット９−１および９−２の酸化および還元
ＬＭＷ−ヘパリン、ロット＃９の２つの同一の、しかし別々の５０グラム（５０ｇ）サンプルを以下の様に処理した：ＬＭＷ−ヘパリン（５０  ｇ）を５００  ｍｌの精製水（４〜１０℃）に溶解した。酢酸ナトリウム緩衝液（５００  ｍｌの２００  ｍＭ（ｐＨ５．０））を各々の同一のサンプルに添加した。次いで、過ヨウ素酸ナトリウム（１，０００  ｍｌの２００  ｍＭ溶液）を各々の反応物に添加し、そして得られた溶液を各々暗中で冷却して７２時間インキュベートした。７２時間のインキュベーションの後、各々のサンプルにグリセロール（４０  ｍｌ）を添加して、過剰の過ヨウ素酸塩を破壊した。次いで、反応ｐＨを各々のサンプルについて約６．５に上昇させ、そして各々を、３，０００  ＭＷＣＯメンブレンを装着したＰｅｌｌｉｃｏｎシステムを用いて７容量の精製水に対して限外濾過した。
【０１３０】
各々の得られた酸化ＬＭＷ−中間体の還元および全ての他の検査（ｗｏｒｋｕｐ）における工程は、正確に実施例１（上記）においてサンプル７−１について示したとおりであった。Ｖ−１８、ロット＃９−１および９−２の収量はそれぞれ：３７．４  ｇおよび３６．７  ｇであった。
【０１３１】
Ｖ−１８、ロット＃９−１および９−２の分子量特性をＨＰＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにより測定した。それを表２にまとめる。
【０１３２】
３．実施例３：Ｖ−１８、ロット＃２０−１の調製
ａ．工程１：ＬＭＷ−ヘパリン、ロット＃２０の単離
ブタ腸ヘパリン（５００グラム）を１０リットルの精製水に溶解した（５％溶液）。硝酸ナトリウム（９．０グラム）をこの溶液に添加しそして溶解して、１２．８  ｍＭの濃度とした。溶液の温度は１８℃と２４℃との間であった。約２分にわたって、５９  ｍｌの３７％ＨＣｌを添加し、そしてｐＨを６．２７の開始値から３．００の最終ｐＨに調整した。次いで、得られた溶液を、２時間雰囲気温度で撹拌して脱重合を生じさせた。２時間のインキュベーションの終了時に、ｐＨを上方に６．５７の値に、約３８  ｍｌの５０％ＮａＯＨ溶液の緩やかな添加により調整した。
【０１３３】
次いで、このサンプルを１７リットルの容量まで希釈し、そして１０容量の精製水に対して８，０００分子量カットオフメンブレン（１．５  ｍ２）を装着したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＩＩ限外濾過デバイスを用いて限外濾過した。次いで、限外濾過からの透過液を濃縮し、そして３，０００  分子量カットオフメンブレン（１．５  ｍ２）を装着したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＩＩ限外濾過ユニットを用いて透析した。一旦１７０リットルの透過液を約８．５リットルまで濃縮したら、次いでこれを７容量の精製水に対して透析した。次いで濃縮液を凍結乾燥して、ＬＭＷ−ヘパリン、ロット＃２０を得た。収量１７１．３グラム（３４％）。
【０１３４】
ＬＭＷ−ヘパリン中間体＃２０（上記）の分子量特性を、ＨＰＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにより測定した。それを前記表２にまとめる。
【０１３５】
ｂ．工程２および３：Ｖ−１８、ロット２０−１の酸化および還元
ＬＭＷ−ヘパリン（１７０ｇ、ロット＃２０）を１７００  ｍｌの精製水（４〜１０℃）に溶解した。酢酸ナトリウム緩衝液（１７００  ｍｌの２００  ｍＭ（ｐＨ５．０））を添加し、そしてサンプルと混合した。次いで過ヨウ素酸ナトリウム（３，４００  ｍｌの２００  ｍＭ溶液）を混合物に添加して反応を開始し、そして得られた溶液を暗中で冷却して７２時間インキュベートした。７２時間のインキュベーションの後、グリセロール（１１５  ｍｌ）を添加して、過剰の過ヨウ素酸塩を破壊した。次いで、反応ｐＨを約６．５に上昇させ、そして酸化ＬＭＷ−ヘパリンを３，０００  ＭＷＣＯメンブレンを装着したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎシステムを用いて７容量の精製水に対して限外濾過した。
【０１３６】
得られた酸化ＬＭＷ−中間体の還元および全ての他の検査における工程は、正確に実施例（上記）においてサンプル７−１について示したとおりであった。Ｖ−１８、ロット＃２０−１の収量は１３１  ｇであった。
【０１３７】
Ｖ−１８、ロット＃２０−１の分子量特性をＨＰＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにより測定した。これは前記表２に含まれる。
【０１３８】
Ｂ．濾過に基づくアッセイ
種々のヘパリン誘導体が液相トロンビンのＨＣＩＩ媒介性不活化を触媒する能力を検討することに加えて、フィブリン結合トロンビンを置換し、そして不活化するそれらの能力もまた研究した。この系において、８μＭフィブリノーゲン、８ｍＭ  ＣａＣｌ２および８ｎＭ  １２５Ｉ−標識トロンビンを含有する２５μｌの緩衝液を各ウェルに添加することにより、９６ウェルプレートのフィルターで覆ったウェル上でフィブリンクロットを形成した。室温での３０分間のインキュベーションの後、得られたクロットを１５０μｌの緩衝液で２回洗浄し、そして結合したトロンビンを放射能を計数することにより定量した。ヘパリン由来の変化する濃度の異なる材料を、ＨＣＩＩを伴ってまたは伴わないで添加した。各々の場合において、これらの成分を２０μｌ容量で添加し、２０分間インキュベートし、次いでフィルタープレートを通して吸引した。この工程を繰り返し、次いでクロットを５０μｌの緩衝液で２回洗浄した。クロットから置換されたトロンビンの量を、洗浄緩衝液を計数することにより測定し、フィブリンに結合したままのトロンビンの量をフィルターを計数することにより定量した。残存結合トロンビンの酵素活性を、合成トロンビン基質を添加し、そして反応に起因する蛍光シグナルの変化を３分間にわたってモニターすることにより測定した。最後に、洗浄緩衝液を採集し、フィルターをパンチ（ｐｕｎｃｈ  ｏｕｔ）し、そして、ＳＤＳ含有緩衝液中で煮沸した後、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびそれに続くオートラジオグラフィーに供して、トロンビンがＨＣＩＩに複合体化された程度を測定した。
【０１３９】
図４に示すように、１μＭ  ＨＣＩＩ（これは、生理的ＨＣＩＩ濃度である）は、少量のトロンビンのみを置換する。ＳＨ、ＬＡＳＨ、ＬＭＷＨおよび３，０００ダルトンの分子量を有するヘパリン画分は、ＨＣＩＩなしではトロンビンを置換しない。しかし、１μＭ  ＨＣＩＩとともに使用する場合、これらの物質は全てトロンビンを置換する（図４）。ここでＳＨおよびＬＡＳＨは、ＬＭＷＨ（これは、約５，５００ダルトンの平均分子量を有する）より多くの置換を生じる。しかし、全ての因子はフィブリンに結合したままのトロンビンを阻害する（図５）。ここでＳＨおよびＬＡＳＨは高濃度でほぼ完全な阻害を生じ、そしてＬＡ−ＬＭＷＨ（すなわち、Ｖ１８）は、幾分より少ない阻害を生じる。フィルターに結合したままの物質のゲル電気泳動分析により、大部分のトロンビンがＨＣＩＩに複合体化されていることが示され、その結果その色素生産性活性の欠如を説明する。これらの知見は、フィブリンに結合したままのトロンビンがエキソサイト（ｅｘｏｓｉｔｅ）２を介して結合しており、その結果エキソサイト１および活性部位をＨＣＩＩと相互作用するために利用可能なままとする。
【０１４０】
Ｃ．ハンギングクロットアッセイ（Ｈａｎｇｉｎｇ  Ｃｌｏｔ  Ａｓｓａｙ）
ハンギングクロットアッセイを、液相およびクロット結合トロンビン活性に対する因子の阻害効果を検討するために使用する。液相トロンビンに対する阻害効果を測定するために、α−トロンビン（０．２〜４．０  ｎＭ）を、クエン酸添加血漿と６０分間３７℃で示される濃度のヘパリンの存在下または非存在下でインキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、フィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ）の血漿レベルを測定し、次いでＦＰＡ生成の阻害百分率を各々のインヒビター濃度について算出した。クロット結合トロンビン活性に対する阻害効果を測定するために、洗浄したフィブリンクロットを、クエン酸添加血漿中６０分間３７℃で変化する濃度のヘパリンの存在下または非存在下でインキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、ＦＰＡの血漿レベルを測定し、次いでクロット誘導性ＦＰＡ生成の阻害百分率を各々のインヒビター濃度について算出した。各々の棒は３つの別々の実験の平均を表し（各々２連で実施した）、棒の上の線はＳＤを表す。
【０１４１】
図６Ａおよび図６Ｂは、デルマタン硫酸（ＨＣＩＩアクチベータのプロトタイプ）および本発明のＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒の１つ（すなわち、Ｖ１８）が遊離およびフィブリン結合トロンビンを不活化する相対的な能力を、ハンギングクロットアッセイを用いて比較する研究を示す。５μｇ／ｍｌにおいて、ＬＡ−ＬＭＷＨは、デルマタン硫酸よりずっと選択的であった（デルマタン硫酸は、フィブリン結合トロンビンを不活化することにおいて半分しか有効ではなかったが、ＬＭＷＨはフィブリン結合および遊離トロンビンを不活化することにおいてほぼ同様に有効であった）。２０μｇ／ｍｌにおいて、ＬＡ−ＬＭＷＨの有利性は、たとえ幾分か明白ではなかったとしてもなお明らかであった。より高い濃度において、両者はフィブリン結合および遊離トロンビンを不活化することにおいてほぼ９０％有効である。
【０１４２】
ハンギングクロットアッセイからの他の結果により、本発明のＬＡ−ＬＭＷ  ＨＣＩＩアクチベータは、クロット結合トロンビンまたは血栓結合トロンビンに結合しそしてこれを不活化することもまた示される。これらの実験において、２５０μｌの標識トロンビンを含有するクロットを、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌまたは２Ｍ  ＮａＣｌのいずれかを含有する溶液１０  ｍｌ中に懸濁した。以下の１つを等張緩衝液に添加した：ＨＣＩＩ  ０．２５または０．５μＭ、１００μｇのＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子、あるいはＨＣＩＩとＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子との組み合わせ。以下の測定を行った：（１）クロットからのトロンビンの拡散；（２）クロットに対するトロンビンの触媒活性（これは、クロットを取り出しそしてそれをフィブリノーゲン溶液に添加した後のフィブリノペプチドＡ生成を測定することにより評価した）；および（３）トロンビン／ＨＣＩＩ複合体形成の程度（これは、クロットを可溶化し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーを実施することにより評価した）。
【０１４３】
図８は、フィブリンクロットからの標識トロンビンの拡散速度を示す。５時間後、約４０％のトロンビンが１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ中に懸濁したクロット中に残存した。ＨＣＩＩ単独の添加も、ＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、Ｖ１８）との組み合わせも拡散速度に影響しなかった。事実、ＨＣＩＩとＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子との組み合わせは、実際小さな程度で拡散速度を減少させた。対照的に、トロンビンの拡散速度は、クロットを２  Ｍ  ＮａＣｌ中に懸濁した場合に顕著に増加した。
【０１４４】
図９は、開始溶液との５時間のインキュベーション後にクロットを取り出し、そしてこれをフィブリノーゲン溶液中に懸濁することにより測定したクロット結合トロンビンの触媒活性を比較する。ＨＣＩＩまたはＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、Ｖ１８）単独の存在下または非存在下で１５０  ｎＭ  ＮａＣｌ中に懸濁したクロットは、約６０００  ｎＭのＦＰＡを生成した。対照的に、ＨＣＩＩとＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子との組み合わせを含有する１５０  ｍＭ中に懸濁したクロットによるＦＰＡ生成は、約９５％抑制された。２Ｍ  ＮａＣｌ中に懸濁したクロットは、約４０００  ｎＭのＦＰＡを生成し、これは、これらがＨＣＩＩを含むまたは含まない低塩緩衝液中でインキュベートしたクロットにおいて見出されたトロンビンの約半分のトロンビンを含有するという事実と一致する。これらの知見は、本発明のＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、Ｖ１８）が、ＨＣＩＩの存在下でクロット結合トロンビンを不活化するが、図８に示すように、トロンビンをクロットから置換することなくこれを行うことを示す。このことは、トロンビンがフィブリンにエキソサイト２を介して結合し、エキソサイト１をＨＣＩＩとの相互作用のために利用可能なままにするという概念を支持する（米国特許出願第０８／１７５，２１１号（１９９３年１２月２７日出願）（その教示は本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。
【０１４５】
ゲルの分析により、ＨＣＩＩとＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、Ｖ１８）との組み合わせを含有する緩衝液中に懸濁したクロットから回収したトロンビンの大きな割合が、ＨＣＩＩに複合体化されたことが示される。対照的に、優勢に複合体化されないトロンビンが、ＨＣＩＩ単独またはＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子単独を含有する緩衝液中に懸濁したクロットから回収された。これらの知見は、ＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、Ｖ１８）が、トロンビンとＨＣＩＩとの間の共有結合複合体形成を触媒することにより、クロット結合トロンビンの永続的な不活化を生成することを示す。
【０１４６】
Ｄ．体外再循環回路
フィブリン結合トロンビンを不活化する選択的能力を、ヒト血液を含有する体外閉鎖回路を用いて、種々の抗凝固因子が表面結合トロンビンを不活化する能力を測定することにより実証し、トロンビンクロッティング時間を用いて、種々の抗凝固因子が液相トロンビンを不活化する能力を測定した。本発明のＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、Ｖ１８）を、以下の抗凝固因子と比較した：デルマタン硫酸、低分子量ヘパリン、非分画ヘパリン、およびヒルジン。
【０１４７】
１．体外閉鎖回路
体外閉鎖回路の図解を図１０に示す。この回路は、４０ミクロン輸血フィルター（Ｐａｌｌ  ＳＱ４０Ｓ）に連結したＴｙｇｏｎチューブ（３／１６”×１／１６”）からなる。このシステムは、血液サンプリングのための三方ストップコックを有する。圧力レコーダーに連結された外科手術用圧力トランスデューサ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）を、フィルターに直結させて、フィルターのクロッティングが圧力の定常的な増加を生じるようにする。正常、健常ボランティアから得たクエン酸添加全血を使用する。回路をリザーバー中に入れた５０  ｍｌの全血で満たし、そして３７℃に維持した水浴中に保持する。試験されるべき抗凝固因子を回路に添加し、クロットを再カルシウム添加（０．８  ｍｌの１．０  Ｍ  ＣａＣｌ２）により開始し、そして血液をローラーヘッドポンプ（大きいＦ／６ロールヘッドカートリッジを有するＣｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ  ＭＦＬＸモデュラードライブ）を用いて、トロンボゲン表面を通して一定の流速で再循環する。フィルターの血栓形成を、フィルターに近接して循環に挿入したゲージ中の圧を変化させることによりモニターする。流れの進行性の閉塞が、フィルターの表面上にフィブリンが形成されるにつれて、そしてさらに、クロットまたは血栓に結合したトロンビンがさらなるクロッティングを促進するにつれて生じる。
【０１４８】
表面結合トロンビンおよび液相トロンビンの不活化は、この系を用いて、同時に測定され得る。より詳細には、表面結合トロンビンの不活化は、この回路のクロッティングにおける遅延を記録することによって定量される。この遅延は、液相トロンビンにおける抗凝固効果を不活化することにより、小さな程度ではあるが、寄与される。その液相トロンビンの産生は、クロット結合トロンビンによって強力にされる。液相トロンビンの不活化は、再カルシウム添加の直前にこの回路から取り出された血液から調製された血漿のトロンビンクロッティング時間を記録することによって定量される。
【０１４９】
２．結果
以下の点は、以下の実験の結果を要約する：ａ）２つのＨＣＩＩアクチベーターの１つ（すなわち、ＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（Ｖ１８）またはデルマタン硫酸）を血液単独に添加した（図１１）；ｂ）ＨＣＩＩアクチベーターを、低濃度（２重量％未満）の非修飾低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）と組み合わせて添加した（図１２）；ｃ）非修飾ＬＭＷＨを単独で添加した（図１３）；ｄ）デルマタン硫酸を単独で添加した（図１４）；ｅ）ＬＡ−ＬＭＷＨを単独で添加した（図１５）；およびｆ）ヒルジンを単独で添加した（図１６）。
【０１５０】
図１４および１５は、デルマタン硫酸および本発明のＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、Ｖ１８）が１２０μｇ／ｍｌ〜９６０μｇ／ｍｌの濃度範囲にわたってこの回路におけるクロッティングについて比較的な効果を有することを説明する。図８に示されるように、ＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、Ｖ１８）は、この回路におけるクロッティングの用量依存性阻害を生じる。より詳細には、この回路においてクロッティングは、２４０μｇ／ｍｌのＬＡ−ＬＭＷＨ用量で約２０分経って生じ、そして９６０μｇ／ｍｌのＬＡ−ＬＭＷＨ用量で廃止される。対応するトロンビンクロッティング時間は、表１（前出）に示される。表３（下記）は、種々の濃度のＬＭＷＨあるいはＬＡ−ＬＭＷＨとＬＭＷＨまたはデルマタン硫酸との混合物の比較的な効果を示す。トロンビンクロッティング時間は、２４０μｇ／ｍｌのＬＡ−ＬＭＷＨ濃度で２６秒であり、９６０μｇ／ｍｌのＬＡ−ＬＭＷＨ濃度については４３．６秒であった。対照的に、図１５に示されるように、対応トロンビンクロッティング時間は５００秒以上であったとしても（上述の表１を参照のこと）、この回路におけるクロッティングは、２４０μｇ／ｍｌのデルマタン硫酸用量で１０分よりも短い間に生じた。さらに、対応トロンビンクロッティング時間は８４１秒であったとしても（表１、上述を参照のこと）、この回路におけるクロッティングは、９６０μｇ／ｍｌのデルマタン硫酸用量で２０分より短い間に生じた。
【０１５１】
2007204500.tif 000013
【０１５２】
さらに、同一のヒト血液サンプルのアリコートをモデルにおいて試験した場合のＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、Ｖ１８）およびデルマタン硫酸の相対的な効果を比較した（図１１）。重量に基づいて、ＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子は、この回路の血栓症を予防することにおいてデルマタン硫酸よりも効果的である。従って、４８０μｇ／ｍｌのＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子は、９０分間クロッティングを完全に防止し得たが、デルマタン硫酸の量における８倍の増加は、この回路におけるクロッティングを全体には防止し得なかった。対照的に、デルマタン硫酸は、液相トロンビンの非常により効果的なインヒビターである（上述の表１を参照のこと）。例えば、この実験において２４０μｇ／ｍｌでは、ＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子に関するトロンビンクロッティング時間は、デルマタン硫酸に関しては５００秒よりも長いのに対して、約２６秒である（コントロールは２１秒）。
【０１５３】
図１３は、フィルターのクロッティングおよびトロンビンクロッティング時間についての１抗Ｘａ単位／ｍｌおよび２抗Ｘａ単位／ｍｌの非修飾ＬＭＷＨの効果を説明する。これらの濃度では、ＬＭＷＨは、たとえトロンビンクロッティング時間がそれぞれ３７秒および６４秒に延長されたとしても（表３、上述を参照のこと）、短絡血栓症を防止することにおいて最小の効果を有する。
【０１５４】
図１２は、ＨＣＩＩ特異的触媒（すなわち、Ｖ１８）と効率的なＡＴＩＩＩ触媒（例えば、ＬＭＷＨ）との混合物を用いた場合の結果を説明する。０．５抗第Ｘａ因子単位／ｍｌの濃度のＬＭＷＨ（これは、２０秒のトロンビンクロッティング時間を生じた）では、非修飾ＬＭＷＨは、フィルターのクロッティングを防止することにおいて無効であったが、同一量のＬＭＷＨが２４０μｇ／ｍｌのＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、Ｖ１８）と組み合わせて用いた場合、この混合物は、フィルターのクロッティングを阻害することにおいて高度に効果的であった。ＬＭＷＨとデルマタン硫酸の混合物もまた非常に効果的であった。しかし、ＬＭＷＨ／デルマタン硫酸の組み合わせに対して対応するトロンビンクロッティング時間は、５００秒よりも長く、一方、ＬＭＷＨ／ＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子の混合物に対して対応するトロンビンクロッティング時間は、わずか２０秒であった（表３を参照のこと）。
【０１５５】
これらの知見は、デルマタン硫酸と比較して、本発明のＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、Ｖ１８）が、フィブリン結合トロンビンに対して選択的な活性を有することを明らかに示す。従って、これはフィルタークロッティングを防止することにおいてデルマタン硫酸よりも効果的であるが、それはトロンビンクロッティング時間の非常に少ない延長を生じる。なぜなら、それは液相トロンビンに対する阻害活性が小さいからである。
【０１５６】
ＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子とは対照的に、ヒルジンは、トロンビンクロッティング時間を５００秒よりも長く延長する濃度、トロンビンクロッティング時間を５００秒未満に延長する濃度（図１６および表１を参照のこと）、およびＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子とＬＭＷＨとの組み合わせが、３０秒よりも短い時間までトロンビンクロッティング時間を延長するのに用いられる場合（図１３および表１を参照のこと）には、この回路において血栓症を防止することにおいて非常に効果が小さい。
【０１５７】
図１７は、バイパスシミュレーションモデルにおける、ヘパリンまたはＶ１８と組み合わせたヘパリンの効果を説明する。さらに、表４は、バイパスフィルターにおけるＡＣＴとフィブリノーゲン沈着との間の関係を示す。表４では、ヘパリン単独と、Ｖ１８と組み合わせたヘパリンとを比較している。
【０１５８】
2007204500.tif 000014
【０１５９】
Ｅ．静脈血栓症防止の動物疾患モデル
実施例１
１．外科手順
３キログラム〜４キログラムの体重の雄ニュージーランド白ウサギで研究を行った。頸部における腹側切開を介して、右および左の頸静脈を曝した。各頸静脈の２ｃｍのセグメントを同定し、そして側枝を結紮した。静脈血サンプルを凝固研究のために回収した後、動物を無作為化して、低親和性標準ヘパリン、低親和性低分子量ヘパリン、または生理食塩水のいずれかの静脈内ボーラスを与えた。この処置の４分後、第２の血液サンプルを凝固研究のために回収した。次いで、４フレンチバルーンカテーテルを右頸静脈に導入し、バルーンを膨張させ、そして２ｃｍ頸静脈セグメント内の内皮を、膨張したバルーンを１５回通すことにより傷つけた。次いで、血液に充満したセグメントのまわりに約２ｃｍ離して２つの止血帯を配置することによって、鬱血を２ｃｍセグメント内に誘導した。これを行ってすぐに、トロンボプラスチンの静脈内ボーラス（７ｍｇ／ｋｇ）を左頸静脈に注射し、血液が充満したセグメントのまわりに約２ｃｍ離して２つの止血帯を配置することによって、鬱血をこの静脈において誘導した。静脈閉塞の１５分後、血液サンプルを、凝固研究のために採取し、次いで静脈セグメントを外植し、そしてそこに含有されているクロットを秤量した。
【０１６０】
２．結果
本発明のＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（例えば、Ｖ１８）を、高度に危険な状態において予防をシミュレートするウサギモデルにおいて研究した。用量応答関係を確立した。８ｍｇ／ｋｇ（約１００μｇ／ｍｌ、これはバイパス回路において血栓症を防止するのに必要とされるよりも約５倍少ない）で、血栓症の完全な阻害が生じた（図１８を参照のこと）。本発明のＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、Ｖ１８）とＡＴＩＩＩ触媒との組み合わせの相乗的な効果を試験するために、１０Ｕ／ｋｇの濃度（血栓形成において効果を有さない濃度（図１９を参照のこと））のヘパリンと２ｍｇ／ｋｇおよび４ｍｇ／ｋｇの濃度のＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、Ｖ１８）との組み合わせを研究した。２ｍｇ／ｋｇ（単独で用いた場合、実際に全く効果を有さない用量）のＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子を用いた場合、血栓症の６０％よりも多い阻害が見られ、４ｍｇ／ｋｇ（単独で用いた場合、４０％未満の阻害を生じる用量）のＬＡ−ＭＬＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子を用いた場合、血栓症の１００％阻害が見られた（図２０を参照のこと）。トロンビンクロッティング時間は、８ｍｇ／ｋｇのＬＡ−ＬＭＷＨを単独で使用した場合、またはそれを１０Ｕ／ｋｇのヘパリンと組合わせて使用した場合、増加しなかった。このことは、有効性が、遊離トロンビンに対する最少阻害効果より明らかであることを示す。
【０１６１】
ＡＴＩＩＩに対して低い親和性を有するＳＨおよびＬＭＷＨ（それぞれ、ＬＡＳＨおよびＬＡ−ＬＭＷＨ）を、それぞれ、ＳＨ（比活性、１６０抗Ｘａおよび抗ＩＩａ単位／ｍｇ）およびＬＭＷＨ（比活性、１００抗Ｘａ  Ｕ／ｍｇ）から、Ｃａｓｕ，Ｂ．ら、「過ヨウ素酸酸化された非抗凝固ヘパリンによる抗脂血症活性の保持」、Ａｒｚｈｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．３６：６３７−４２（１９８６）に記載の過ヨウ素酸酸化およびその後の還元により調製した。次に、低親和性誘導体の抗凝固活性を、出発物質およびデルマタン硫酸（ＤＳ）の抗凝固活性と比較した。表５に示すように、重量等量で比較すると、ＬＡＳＨおよびＬＡ−ＬＭＷＨ（すなわち、Ｖ１８）は、本質的に、抗Ｘａ活性を全く有しない。このことは、それらが、第Ｘａ因子の抗トロンビンＩＩＩ媒介不活性化をもはや増強し得ないことを示す。さらに、これらの低い親和性誘導体は、もとの化合物よりも、トロンビンクロッティング時間（ＴＣＴ）に対する効果をほとんど有しない。従って、ＡＴＩＩＩを触媒する能力を損なうことにより、抗凝固活性を減少させた。
【０１６２】
2007204500.tif 000015
【０１６３】
異なる分子量のヘパリン画分の活性を比較すると、９，０００ダルトン画分はＳＨの活性に近い活性を有した。一方、５，０００ダルトン画分はＬＭＷＨの活性により近い活性を有した。対照的に、３，０００ダルトン画分は、ほとんど活性を有していなかった（図５および６）。さらに、これらの知見は、ＨＣＩＩの最大の活性化が、８，０００ダルトン以上の分子量に相当する、２０以上のモノサッカライド単位を含むヘパリン鎖とともに生じるという考えと一致する。
【０１６４】
実施例ＩＩ
１．麻酔
特定の病原体を有しない雄のＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギを、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射により麻酔した。麻酔後、腹側頸部領域の毛を剃り、そしてアルコールおよびヨウ素溶液を準備した。２２ゲージのカテーテル（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎｄｙ，ＵＴ）を、それぞれ、血液サンプル採取ならびに液体および抗凝固因子の静脈内投与のために、左中心耳介動脈および辺縁耳介静脈内に挿入した。これらの手順を行った後、ウサギを手術室に移した。イソフルラン（１〜４％）、酸素（１Ｌ／分）、および亜酸化窒素（０．５Ｌ／分）の混合物を顔面マスクにより短時間曝した後、ウサギにＮｏ．２Ｆｒ内皮チューブを挿管し、そして手順の終了まで吸入麻酔の同じ混合物で保持した。
【０１６５】
２．クロット生成
右外頸静脈および顔面静脈を腹側頸部皮膚切開により曝露した。顔面静脈の１つのセグメントを、０．５ｃｍ離れて、２本のＮｏ．４−０の絹縫合糸で閉塞した。頸静脈のすべての側枝を、２ｃｍの長さにわたって結紮した。Ｎｏ．３Ｆｒ  Ｆｏｇａｒｔｙ血栓摘出カテーテルを、顔面静脈の閉塞セグメントを通る頸静脈内に導入した後、バルーンを膨張させ、そして頸静脈の２ｃｍのセグメントを裏打ちする内皮を、カテーテルを１５回通すことにより傷つけた。２つのＮｏ．４０絹縫合糸を、１．５ｃｍ離れて傷つけた静脈の周りに置いた。Ｆｏｇａｒｔｙカテーテルを取り出し、そして隔離された頸静脈セグメントに通した＃６０ポリエチレンチューブと置き換えた。血液を傷つけた静脈セグメントから抜き取り、そしてセグメントを縫合糸で閉塞した。その静脈セグメントを０．５ｍｌの生理食塩水に希釈した５００Ｕのウシトロンビンで５分間洗い流した。その際、静脈セグメントを完全に閉塞することに注意し、それによってトロンビンの全身送達を防止した。トロンビン溶液を抜き取り、次いでセグメントを生理食塩水で洗い流した。
【０１６６】
約１ｍｌの動脈血液を、素早く、１ｍｌシリンジ内に吸い取り、そして約１μＣｉの１２５Ｉ−標識フィブリノーゲンと混合した。０．２ｍｌのこの混合液を、閉塞した頸静脈セグメント内に注入した。次いで、カテーテルを取り出し、顔面静脈を結紮し、そして血栓を３０分間成長させた。それと同時に、２つの０．２ｍｌアリコートの同じ血液を、試験管内で、３０分間３７℃で凝固させた。予備研究は、エクスビボで形成された血栓は、頸静脈内でインサイチュウで形成された血栓に対して、重量および放射能が等しいことを示していたので、エクスビボのクロットの平均の重量および放射能を、インサイチュウのクロットの重量および放射能の指標として用いた。
【０１６７】
頸静脈セグメント内へのトロンビン注射の２０分後、動物に、以下のいずれかを与えた：（ａ）ヘパリン、７０Ｕ／ｋｇ静脈内ボーラスおよび２８０Ｕ／ｋｇ皮下９６時間×２、（ｂ）デルマタン硫酸、２ｍｇ／ｋｇ静脈内ボーラスおよび８ｍｇ／ｋｇ皮下９６時間×２、（ｃ）Ｖ−１８、２ｍｇ／ｋｇ静脈内ボーラスおよび８ｍｇ／ｋｇ皮下９６時間×２、（ｄ）同じ用量のヘパリンとデルマタン硫酸との組合せ、または（ｅ）同じ用量のヘパリンとＶ−１８との組合せ。対照動物には、同じ間隔で等量の生理食塩水を与えた。トロンビン成長の３０分後、止血帯を除き、そして２つの４−０絹縫合糸を、血栓の移動を防ぐために、頸静脈壁を介して血栓内に置いた。次いで、閉塞用止血帯を除き、そして頸静脈セグメントを通る血流をもとに戻した。頸部切開を、０．５ｍｌのペニシリンで洗い流し、そして皮膚を日常的な方法で閉じた。ウサギを、１００％酸素の呼吸を回復するまで放置した。ウサギが咽頭反射を取り戻したときに、気管内チューブを取り出し、そして動物を回復室に移した。
【０１６８】
３．終了
血栓生成の２４時間後、動物を安楽死させ、そして頸静脈セグメントを開き、そして残存するクロットを秤量し、そして放射能を計測した。これらの結果をエクスビボで形成したクロットの重量および放射能と比較することにより、クロット重量（クロット増大）および放射能（クロット溶解）の割合の変化を算出した（図２１および２２参照）。
【０１６９】
Ｆ．正常血漿ならびにＡＴＩＩＩおよびＨＣＩＩ欠損血漿における、低分子量ヘパリンおよびデルマタン硫酸と比較されるＶ１８およびその画分の凝固プロフィール
凝固研究を、Ｖ１８および３つのＶ１８画分の抗凝固プロフィールを特徴付けるために行った。３つのＶ１８画分は、ゲル排除クロマトグラフィーによる分離により、画分１（平均分子量８，０００）、画分２（平均分子量５，０００）、および画分３（平均分子量３，０００）を生じた。さらに、Ｖ１８は、デルマタン硫酸（ＤＳ）の特徴をいくらか有する改変されたＬＭＷＨであるので、Ｖ１８の抗凝固プロフィールを、これらの２つの硫酸化多糖と比較した。このような比較を、トロンビンクロッティング時間（ＴＣＴ）アッセイ、活性化部分トロンボプラスチン（ＡＰＴＴ）アッセイ、および第Ｘａ因子クロッティング時間（Ｘａ時間）アッセイを用いて行った。これらの３つのアッセイを、正常血漿、ＡＴＩＩＩ欠損血漿、およびＨＣＩＩ欠損血漿で行った。
【０１７０】
図２３は、正常血漿、ＡＴＩＩＩ欠損血漿、およびＨＣＩＩ欠損血漿におけるＡＰＴＴ（Ａ）、ＴＣＴ（Ｂ）、および第Ｘａ因子クロッティング時間（Ｘａクロット時間）（Ｃ）についてのＶ１８の効果を示す。図２３Ａから、ＡＴＩＩＩおよびＨＣＩＩの両方に依存的であるＡＰＴＴにおいて、用量依存的に増加することが明らかである。なぜなら、同様の用量依存的な延長が、正常血漿で、ＡＴＩＩＩ枯渇血漿およびＨＣＩＩ枯渇血漿で認められるからである。図２３Ｂは、約１２０μｇ／ｍｌの濃度までのＴＣＴが最も小さく延長されることを示す。その後、正常血漿、およびＡＴＩＩＩ枯渇血漿でＴＣＴが急激に増加する。しかし、ＨＣＩＩ枯渇血漿では、若干増加するのみである。このような知見は、Ｖ１８が遊離トロンビンに対して弱い活性を有すること、そしてこの活性がＨＣＩＩに大きく依存していることを示す。図２３Ｃは、ＨＣＩＩおよびＡＴＩＩＩの両方に依存的であるＸａクロット時間の用量依存的延長を示す。これらの知見は、クロット結合トロンビンに対するその活性に加えて、Ｖ１８が、液相トロンビン（ＨＣＩＩ依存的である）に対して弱い活性を有し、かつＡＴＩＩＩに依存的であるさらなる抗Ｘａ活性を有することを示す。
【０１７１】
比較の目的のために、図２４および２５に、ＬＭＷＨの抗凝固プロフィール（図２４）およびＤＳの抗凝固プロフィール（図２５）を示す。Ｖ１８と対照的に、ＬＭＷＨのＴＣＴについての阻害効果（図２４Ａ）、ＡＰＴＴについての阻害効果（図２４Ｂ）、およびＸａ時間についての阻害効果（図２４Ｃ）は、ＴＣＴおよびＸａ時間の延長に対するＨＣＩＩの小さな寄与を有するとともに、主としてＡＴＩＩＩ依存的ある。さらに、Ｖ１８と対照的に、ＴＣＴについてのＤＳの阻害効果（図２５Ａ）、ＡＰＴＴの阻害効果（図２５Ｂ）、およびＸａ時間の阻害効果（図２５Ｃ）は、完全にＨＣＩＩに依存的である。
【０１７２】
図２６、２７および２８は、ゲル排除クロマトグラフィーを用いてサイズ分離されたＶ１８の３つの画分の抗凝固プロフィールを示す。画分１は、約８，０００の平均分子量を有し、画分２は、約５，０００の平均分子量を有し、そして画分３は、約３，０００の平均分子量を有する。画分１のＴＣＴについての阻害効果（図２６Ａ）は、主としてＨＣＩＩ依存的であり、ＡＰＴＴについての阻害効果（図２６Ｂ）はＨＣＩＩおよびＡＴＩＩＩの両方に依存的であり、そしてＸａ時間についての阻害効果（図２６Ｃ）は、主としてＡＴＩＩＩ依存的である。画分２のＴＣＴについての阻害効果（図２７Ａ）は、ＨＣＩＩ依存的であり、ＡＰＴＴについての阻害効果（図２７Ｂ）はＨＣＩＩおよびＡＴＩＩＩの両方に依存的であり、そしてＸａ時間についての阻害効果（図２７Ｃ）は、主としてＡＴＩＩＩ依存的である。画分１と対照的に、画分２は、液相トロンビンに対してほとんど効かず、そしてＡＰＴＴアッセイおよびＸａ時間アッセイにおいてほとんど効かない。画分３は、ＴＣＴアッセイ（図２８Ａ）において最小活性を有し、そしてＡＰＴＴアッセイ（図２８Ｂ）およびＸａ時間アッセイ（図２８Ｃ）において弱い活性を有する。
【０１７３】
表６は、ＡＰＴＴおよびＴＣＴを２倍にするに必要な種々のグリコサミノグリカン（ＧＡＧＳ）の濃度を示す要約した表である。
【０１７４】
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【０１７５】
重量に基づき、ＤＳは、Ｖ１８よりもずっと強力であり、そしてＤＳは、画分１と同様の効力を有する。Ｖ１８の画分は、分子量の減少とともに効力を失う。図２９は、ＤＳおよびＶ１８によって生じるトロンビン時間の延長についてのヘパリン（０．１Ｕ／ｍＬ）の匹敵し得るさらなる効果を示す。
【０１７６】
Ｇ．遊離およびクロット結合トロンビンの阻害を試験するための改変された全血クロッティング時間（ＷＢＣＴ）アッセイ
改変された全血クロッティング時間アッセイにおける液相トロンビンおよびクロット結合トロンビンに対する種々のＧＡＧＳの効果を比較するために研究を行った。クロットを、２５０μｌのＣａＣｌ２を１０ｍｌの血小板欠乏血漿に添加する（最終濃度０．０２５Ｍ）ことにより、ポリスチレンフックの周りに調製した。クロットを、１時間３７℃で放置した。次いで、クロットを取り出し、フックに付着させ、そして３０分間４回洗浄した。ＰＰＡＣＫ不活化クロット結合トロンビンを有するコントロールクロットを、凝固物を１０μＭ  ＰＰＡＣＫで最初の３０分インキュベーション間インキュベーションすることにより調製した。全血凝固時間は、９５０μｌの正常ドナーから得られたヒト血液を５０μｌの抗凝固因子（または緩衝液コントロール）に添加することにより行った。クロット（クロット結合トロンビン）またはＰＰＡＣＫクロット（不活化クロット結合トロンビン）（これらはポリスチレンフックに付着している）、あるいはクロット結合トロンビンにより得られる凝固時間に対して、基準の凝固時間を減少させるに充分な濃度の遊離トロンビン（遊離トロンビン）を、３７℃でインキュベートしている血液のチューブに添加し、そしてクロット時間を傾斜（ｔｉｌｔ）管法を用いて記録した。
【０１７７】
図３０は、トロンビン（Ａ）、ＰＰＡＣＫクロット（Ｂ）およびクロット結合トロンビン（Ｃ）が添加されたヘパリンの漸増投与量の全血クロッティング時間に対する影響を示す。ＩＣ５０は、遊離トロンビン、ＰＰＡＣＫクロット、およびクロット結合トロンビンについてそれぞれ、０．３ユニット／ｍｌ、０．６ユニット／ｍｌおよび０．９ユニット／ｍｌであった。従って、遊離トロンビン（Ａ）の影響のクロット結合トロンビン（Ｃ）の影響に対するこの全血系の相対感受性についての割合は、約３であり、そしてＰＰＡＣＫ不活化クロット（Ｂ）の影響のクロット結合トロンビン（Ｃ）の影響に対する全血系の相対感受性についての割合は、約１．５である。
【０１７８】
図３１は、トロンビン（Ａ）、ＰＰＡＣＫクロット（Ｂ）およびクロット結合トロンビン（Ｃ）が添加されたＤＳの漸増投与量の全血クロッティング時間に対する影響を示す。ＩＣ５０は、遊離トロンビンについて４８０μｇ／ｍｌであり、ＰＰＡＣＫクロットおよびクロット結合トロンビンの両方について＞１４４０であった。従って、遊離トロンビン（Ａ）の影響のクロット結合トロンビン（Ｃ）の影響に対するこの全血系の相対感受性についての割合は、＞３であり、そしてＰＰＡＣＫ不活化クロット（Ｂ）の影響のクロット結合トロンビン（Ｃ）の影響に対するこの全血系の相対感受性についての割合は、＞３．０である。
【０１７９】
図３２は、トロンビン（Ａ）、ＰＰＡＣＫクロット（Ｂ）およびクロット結合トロンビン（Ｃ）が添加されたＶ１８の漸増投与量の全血クロッティング時間に対する影響を示す。ＩＣ５０は、遊離トロンビン、ＰＰＡＣＫクロット、およびクロット結合トロンビンについてそれぞれ、９０μｇ／ｍｌ、１８０μｇ／ｍｌおよび２５０μｇ／ｍｌであった。従って、遊離トロンビン（Ａ）の影響のクロット結合トロンビン（Ｃ）の影響に対するこの全血系の相対感受性についての割合は、約３であり、そしてＰＰＡＣＫ不活化クロットの影響のクロット結合トロンビンの影響に対するこの全血系の相対感受性についての割合は、約１．５である。
【０１８０】
図３３、３４および３５は、それぞれトロンビン（Ａ）、ＰＰＡＣＫクロット（Ｂ）およびクロット結合トロンビン（Ｃ）が添加されたＶ１８の画分１、２、および３の漸増投与量の全血クロッティング時間に対する影響を示す。画分１について、ＩＣ５０は、遊離トロンビン、ＰＰＡＣＫクロット、およびクロット結合トロンビンについてそれぞれ、２２μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌおよび３７μｇ／ｍｌであった。従って、遊離トロンビン（Ａ）の影響のクロット結合トロンビン（Ｃ）の影響に対するこの全血系の相対感受性についての割合は、約１．７であり、そしてＰＰＡＣＫ不活化クロット（Ｂ）の影響のクロット結合トロンビン（Ｃ）の影響に対するこの全血系の相対感受性についての割合は、約１．６である。
【０１８１】
画分２について、ＩＣ５０は、遊離トロンビン、ＰＰＡＣＫクロット、およびクロット結合トロンビンについてそれぞれ、９０μｇ／ｍｌ、２４０μｇ／ｍｌおよび２５０μｇ／ｍｌであった。従って、遊離トロンビン（Ａ）の影響のクロット結合トロンビン（Ｃ）の影響に対するこの全血系の相対感受性についての割合は、約２．７であり、そしてＰＰＡＣＫ不活化クロット（Ｂ）の影響のクロット結合トロンビン（Ｃ）の影響に対する全血系の相対感受性についての割合は、約１．０である。画分３について、ＩＣ５０は、遊離トロンビン、ＰＰＡＣＫクロット、およびクロット結合トロンビンについてそれぞれ、１５０μｇ／ｍｌ、３２０μｇ／ｍｌおよび約６００μｇ／ｍｌであった。従って、遊離トロンビン（Ａ）の影響のクロット結合トロンビン（Ｃ）の影響に対するこの全血系の相対感受性についての割合は、約４．０であり、そしてＰＰＡＣＫ不活化クロット（Ｂ）の影響のクロット結合トロンビン（Ｃ）の影響に対するこの全血系の相対感受性についての割合は、約１．９である。
【０１８２】
図３６は、ＷＢＣＴに対するヘパリン（図３６Ａ、上パネル）、画分１（図３６Ｂ、中パネル）およびヘパリンと１０μｇ／ｍｌの画分１との組合せ（図３６Ｃ、下パネル）の影響を比較する。ヘパリンおよび画分１についての結果は上述され、そしてヘパリンと画分１との組合せと比較する目的のために図３６に示されている。遊離トロンビンについての組合せ（図３６Ｃ、下パネル）のＩＣ５０は、０．３ユニット／ｍｌ（すなわち、ヘパリン（図３６Ａ、上パネル）についてと同じ値）であった。同様に、ＰＰＡＣＫクロットについてのＩＣ５０は、ヘパリンについてと同じ値、すなわち約０．５５ユニット／ｍｌである。対照的に、クロット結合トロンビンについてのＩＣ５０は、ＰＰＡＣＫクロットについてと同じ、すなわち約０．５５ユニット／ｍｌである。従って、ヘパリンとは対照的に、遊離トロンビン（Ａ）の影響のクロット結合トロンビン（Ｃ）の影響に対するこの全血系の相対感受性についての割合は、約２．０であり、そしてＰＰＡＣＫ不活化クロット（Ｂ）の影響のクロット結合トロンビン（Ａ）の影響に対するこの全血系の相対感受性についての割合は、約１．０である。
【０１８３】
図３７は、ＷＢＣＴに対するヘパリンとＤＳとの組合せの影響を示す。Ｖ１８とは対照的に、１２０μｇ／ｍｌのＤＳは、ＰＰＡＣＫクロットまたはクロット結合トロンビンの存在下においてクロッティング時間に影響しなかった。しかし、漸増濃度のＤＳを０．５ユニット／ｍｌのヘパリンに添加した場合（図３８）、相対ＩＣ５０値について割合を計算することは可能であった。遊離トロンビン（Ａ）の影響のクロット結合トロンビン（Ｃ）の影響に対するこの全血系の相対感受性についての割合は、約５．０であり、そしてＰＰＡＣＫ不活化クロット（Ｂ）の影響のクロット結合トロンビン（Ｃ）の影響に対するこの全血系の相対感受性についての割合は、約２．０である。従って、遊離トロンビン（Ａ）の影響のクロット結合トロンビン（Ｃ）の影響に対するこの全血系の相対感受性についての割合は、１．１であり、そしてＰＰＡＣＫ不活化クロットの影響のクロット結合トロンビンの影響に対する全血系の相対感受性についての割合は、約１．０である。
【０１８４】
図３９は、トロンビン（Ａ）、ＰＰＡＣＫクロット（Ｂ）およびクロット結合トロンビン（Ｃ）が添加されたヘパリンとＶ１８との組合せの全血クロッティング時間、ＷＢＣＴ、に対する影響を示す。ＩＣ５０は、遊離トロンビン、ＰＰＡＣＫクロット、およびクロット結合トロンビンについてそれぞれ、５０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌおよび４５μｇ／ｍｌであった。従って、遊離トロンビン（Ａ）の影響のクロット結合トロンビン（Ｃ）の影響に対するこの全血系の相対感受性についての割合は、約３であり、そしてＰＰＡＣＫ不活化クロット（Ｂ）の影響のクロット結合トロンビン（Ｃ）の影響に対するこの全血系の相対感受性についての割合は、約１である。
【０１８５】
トロンビン、ＰＰＡＣＫクロットおよびクロット結合トロンビンの存在下におけるＷＢＣＴに対する種々のＧＡＧＳの影響、およびそれに加えて対応するＩＣ５０の割合の概要を表７に示す。
【０１８６】
2007204500.tif 000017
【０１８７】
さらに、フィブリン結合トロンビンに対するＶ１８とヘパリンとの間の相乗作用の概要を表８に示す。
【０１８８】
2007204500.tif 000018
【０１８９】
Ｈ．バイパス回路を用いるクロッティング阻止研究
図４０は、バイパス回路におけるクロッティング阻止に対するヘパリンの影響を示す。クロッティングは、８４％フィブリノーゲン消費を伴って、１．５ユニット／ｍｌのヘパリン濃度で生じた。クロッティングは、２．０ユニット／ｍｌの濃度により部分的に妨げられたが、この濃度でさえ３６％のフィブリノーゲン消費がなお存在していた。Ｖ１８は、単独で使用された場合９６０μｇ／ｍｌの濃度で、そして１．５ユニット／ｍｌのヘパリンと組合わせて使用された場合１２０〜２４０μｇ／ｍｌの濃度でこの回路におけるクロッティングを妨げた。画分１は、約１２０μｇ／ｍｌの濃度でこの回路におけるクロッティングを阻止した。
【０１９０】
図４１は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｇ５０カラムからの画分１、２および３の溶出パターンを示す。さらに、図４２は、１．５ユニット／ｍｌのヘパリンと組合わせた場合の画分１、２および３の有効性を比較する。画分１は、約６０μｇ／ｍｌの濃度でこの回路におけるクロッティングを妨げたが、画分２は、約６０μｇ／ｍｌの濃度で部分的に有効であり、そして画分３は、有効でなかった。この実験は、３つの画分のうち画分１がバイパス回路において最も有効であり、そして画分３は最も有効でないことを実証する。単独、あるいは１．５ユニット／ｍｌのヘパリンと組合わせて用いた場合の、ＧＡＧＳの最小有効濃度を表９および１０に示す。
【０１９１】
2007204500.tif 000019
【０１９２】
2007204500.tif 000020
【０１９３】
ＡＰＴＴおよびＴＣＴを延長するために、クロットの存在下で全血のクロッティングを妨げるために、そしてこのバイパスにおけるクロッティングを妨げるために必要とされるＧＡＧＳの相対濃度を表１１に示す。
【０１９４】
2007204500.tif 000021
【０１９５】
この回路におけるクロッティングを妨げるために必要とされるＴＣＴについてのＩＣ５０および対応する投与量ならびに相対的割合を表１２に示す。
【０１９６】
2007204500.tif 000022
【０１９７】
Ｉ．二次速度定数の測定
６、６０および３００μｇ／ｍｌの濃度でのＡＴＩＩＩ媒介第Ｘａ因子触媒作用およびトロンビン阻害、ならびにＨＣＩＩ媒介トロンビン阻害についての二次速度定数（ｓｅｃｏｎｄ  ｏｒｄｅｒ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）（Ｋ２）の増加倍数の概要を表１３に示す。
【０１９８】
2007204500.tif 000023
【０１９９】
これらのＧＡＧＳの治療濃度でのＫ２の増加倍数を表１４に示す。
【０２００】
2007204500.tif 000024
【０２０１】
治療濃度（すなわち、約６μｇ／ｍｌ）で、ヘパリン（ＳＨ）およびＬＭＷＨは、ＨＣＩＩの触媒作用からの弱い寄与のみを有して、ＡＴＩＩＩを活性化することにより、それらの抗凝固効果を生じる。対照的に、治療濃度（すなわち、約６０〜３００μｇ／ｍｌ）で、Ｖ１８は、ＡＴＩＩＩおよびＨＣＩＩの両方を活性化することにより、その抗凝固効果を生じる。さらに、治療濃度（約３００μｇ／ｍｌ）で、ＤＳは、ＨＣＩＩを活性化することにより、その抗凝固効果を生じる。クロッティングがフィブリン結合トロンビンにより媒介される両方のアッセイ（すなわち、血漿クロットおよびバイパス回路を用いた全血クロッティング時間）において、Ｖ１８より非常に高い濃度のＤＳがより少ないクロッティングを妨げるために必要とされるが、Ｖ１８は、ＨＣＩＩ媒介トロンビン阻害についてほぼ５０倍より少ない速度の増加を有することは興味深い。トロンビン（ＩＩａ）、第Ｘａ因子、およびＡＴＩＩＩについての種々のＧＡＧＳの結合親和性（Ｋｄ）を表１５に示す。
【０２０２】
2007204500.tif 000025
【０２０３】
Ｊ．Ｖ１８がＨＣＩＩまたはＡＴＩＩＩに非依存性である抗凝固効果を有するか否かを決定するための実験
Ｖ１８がＡＴＩＩＩまたはＨＣＩＩに非依存性である凝固に対する効果を有するか否かを決定するために、実験を行った。これらの実験を：１）Ｖ１８がＡＴＩＩＩ非依存的に第Ｘａ因子を阻害するかどうか；２）Ｖ１８がフィブリン重合を減じるかどうか；３）Ｖ１８がＡＴＩＩＩ非依存的に第ＩＸａ因子または第ＸＩａ因子を不活化するかどうか；および４）Ｖ１８が血小板欠乏（ｐｏｏｒ）系と同様に血小板リッチ系において有効であるかどうかを決定するために設計した。
【０２０４】
１．第Ｘａ因子のＡＴＩＩＩ非依存性阻害
緩衝液系において、Ｖ１８の抗第Ｘａ因子活性を、ＡＴＩＩＩの存在下および非存在下で測定した。Ｖ１８はＡＴＩＩＩの非存在下で第Ｘａ因子を不活化しなかった（図４３）。
【０２０５】
２．フィブリン重合の阻害
Ｖ１８がフィブリン重合を妨げるかどうか決定するために、フィブリノーゲンを含む緩衝液系におけるトロンビンクロッティング時間の延長をＡＴＩＩＩまたはＨＣＩＩの存在下および非存在下で測定した。比較のために、ヘパリン（ＳＨ）およびＤＳを用いて実験を行った。これらのＧＡＧＳのいずれもが、ＡＴＩＩＩまたはＨＣＩＩの非存在下においてトロンビンクロッティング時間を延長しなかった。Ｖ１８の効果は、ＤＳの効果と同様にＨＣＩＩ依存性であった。重量基準で、ＤＳはＶ１８より約２０倍強力であった。トロンビンによるフィブリノーゲンクロッティングを阻害するためにＨＣＩＩを必要とするがＡＴＩＩＩを必要としないＶ１８およびＤＳとは対照的に、ヘパリンは両方の補因子を介して作用したが、ＡＴＩＩＩはより効果的な補因子であった（図４４）。
【０２０６】
３．ＩＸａおよびＸＩａの不活化
Ｖ１８またはＶ１８の画分１が、ＡＴＩＩＩまたはＨＣＩＩに非依存性の機構によりＩＸａまたはＸＩａを不活化することにより、ＡＰＴＴを延長するか否かを決定するために、これらの実験を行った。Ｘａ、ＩＸａおよびＸＩａを不活化することに対するヘパリン、ＬＭＷＨ、Ｖ１８およびＶ１８の画分１の相対効果を、これらの凝固酵素のそれぞれが添加された血漿系において研究した（図４４）。凝固酵素のそれぞれを、４０秒と５０秒との間のクロッティング時間を生じた濃度で添加した。ヘパリン（図４４Ａ）はＸａクロッティング時間よりＩＸａクロッティング時間を延長し、そしてＸＩａクロッティング時間に対して相対的に少ししか効果を有さなかった。対照的に、Ｖ１８およびＶ１８の画分１を含む全ての他のＧＡＧＳは、ＩＸａおよびＸａクロッティング時間について類似の効果を有した。これらの結果は、ＡＴＩＩＩまたはＨＣＩＩに非依存性であるＩＸａまたはＸＩａに対する効果を、Ｖ１８（図４４Ｃ）およびＶ１８の画分１（図４４Ｄ）が有さないことを示す。
【０２０７】
Ｋ．Ｖ１８および画分１の抗凝固活性に対する血小板の効果
第Ｘａ因子クロッティング時間を、ヘパリン、Ｖ１８、ＬＭＷＨおよびＶ１８の画分１の存在下で、血小板リッチ血漿、血小板欠乏血漿、および無血小板血漿に対して行った。全ての場合において、クロッティング時間は血小板リッチ血漿においてより短かく、このことは第Ｘａ因子が、Ｖ１８および画分１を含むこれらのＧＡＧＳによる不活化から保護されることを示す（図４５）。しかし、Ｖ１８の抗凝固効果は、ヘパリンまたはＬＭＷＨより血小板に対してより耐性であるようである。これらのＧＡＧＳの全てについてのカルシウム再添加時間の結果は、血小板欠乏血漿より血小板リッチ血漿において非常に短く、このことはテナーゼ（ｔｅｎａｓｅ）複合体中の第ＩＸａ因子がこれらのＧＡＧＳによる不活化から保護されることを示す（図４６）。
【０２０８】
ｌ．Ｖ１８はＨＣＩＩまたはＡＴＩＩＩに非依存性である抗凝固効果を有する
Ｖ１８は、標準的色素生産性第Ｘａ因子アッセイにおいてインビトロで試験した場合、最小の抗第Ｘａ因子活性を有するが、ＨＣＩＩ枯渇血漿において試験した場合、認識可能な抗凝固活性を有する。これを、カルシウム再添加クロッティング時間（カルシウムおよびリン脂質（セファリン）の添加によるクエン酸添加血小板枯渇血漿のクロッティング）に対するＶ１８およびヘパリンの効果を記載する表１６に要約する。正常な血漿において、５００μｇ／ｍｌの濃度のＶ１８は、カルシウム再添加時間を９．６倍増加させた。この濃度のＶ１８の添加は、カルシウム再添加時間をＡＴＩＩＩ枯渇血漿において３．６倍（「ＨＣＩＩ効果」）およびＨＣＩＩ枯渇血漿において４．１倍（「ＡＴＩＩＩ効果」）増加させた。さらに、Ｖ１８は、カルシウム再添加時間をＨＣＩＩおよびＡＴＩＩＩの両方を枯渇させた血漿（２重枯渇血漿）において２．９倍増加させた。対照的に、カルシウム再添加時間の延長におけるヘパリンの効果は、実質的に完全にＡＴＩＩＩ依存性であった。従って、ヘパリンを用いてのカルシウム再添加の時間の増加倍数は、正常血漿において９．５倍、ＡＴＩＩＩ枯渇血漿において１．２倍（「ＨＣＩＩ効果」）、ＨＣＩＩ枯渇血漿において６．０倍（「ＡＴＩＩＩ効果」）ならびにＨＣＩＩおよびＡＴＩＩＩの両方を枯渇させた血漿において１．３倍のみであった。これらの知見は、Ｖ１８の抗凝固効果がＨＣＩＩ媒介機構およびＡＴＩＩＩ媒介機構の両方により、ならびにＡＴＩＩＩおよびＨＣＩＩの両方に非依存性である機構により寄与されることを示す。対照的に、ヘパリンの抗凝固効果のほとんど全てがＡＴＩＩＩにより媒介される。
【０２０９】
特定の理論に限定されることを意図することなく、２つの相互関係を有する機構がＶ１８のＨＣＩＩ非依存性活性を担うと考えられる。両者は、Ｖ１８が血小板表面上の第Ｘａ因子の集合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）を妨げるという事実に関連する。血液凝固のプロセスは、血小板表面上での多数の凝固因子の集合の結果として、血小板表面上で起こる。従って、第ＩＸａ因子は第ＶＩＩＩａ因子と複合体化して、第Ｘ因子を第Ｘａに活性化するテナーゼ複合体を形成し、次に第Ｘａ因子は、血小板上で第Ｖａ因子と共に、プロトロンビンをトロンビンに変換する複合体（「プロトロンビナーゼ複合体」）を形成する。第Ｖａ因子は、血小板上の第Ｘａ因子のレセプターである。第Ｖ因子から第Ｖａ因子への活性化はトロンビン表面により媒介される。フィブリン網目構造における血小板凝集からなる血栓において、第Ｖ因子の活性化は、血小板に近接してフィブリンに結合したトロンビンにより媒介される（図４７）。第Ｘａ因子は、このクロッティング酵素が血小板表面上で第Ｖａ因子に結合すると、その天然のインヒビターであるＡＴＩＩＩによる不活化から保護される（図４８）。従って、血小板表面への第Ｘａ因子結合を妨げる因子は、ＡＴＩＩＩによる第Ｘａ因子の活性化速度を顕著に増加させる（図４９）。
【０２１０】
Ｖ１８は、２つの異なるが相互作用する機構により血小板表面への第Ｘａ因子の結合を妨げる（図５０）。第１に、ＨＣＩＩ媒介機構を介してフィブリン結合トロンビンを不活化することにより、Ｖ１８は第Ｖ因子から第Ｖａ因子への活性化を妨げ、これにより血小板表面上の第Ｘａ因子レセプターの密度を減少させる。第２に、示したように、Ｖ１８は、リン脂質表面（「血小板」表面）への第Ｘａ因子結合と競合する。これらの機構は両方とも、血小板表面への第Ｘａ因子の結合を阻害するように作用し、これにより第Ｘａ因子を、Ｖ１８のような比較的弱いＡＴＩＩＩ触媒によってさえ不活化を受けやすくする（図４９）。
【０２１１】
Ｖ１８によって示される集合の阻害は新規である。このプロセスは、Ｘａを標的化するだけでなく、図４９に示されるように他のクロッティング酵素も標的化する。他の発見は、不活性なタンパク質アナログを用いることによりＸａおよびＩＸａの結合に競合させることを試みた。しかし、Ｖ１８について上記した抗血栓機構は独特である。なぜなら、これは、ＡＴＩＩＩによる不活化に対して保護されていない第Ｘａ因子を曝露する、血小板表面上の第Ｘａ因子の集合を妨げるための独特のプロセスと、フィブリン結合トロンビンに対する選択性を有するＨＣＩＩアクチベーターとを併用するからである。トロンビン生成のＡＴＩＩＩ媒介阻害（第Ｘａ因子の不活化を介しての）と、フィブリン結合トロンビンのＨＣＩＩ媒介不活化を併用することにより、Ｖ１８は２つの重要な経路を阻害することにより血栓形成を調節する（図５０）。
【０２１２】
2007204500.tif 000026
【０２１３】
Ｍ．シミュレートされた心肺バイパス回路におけるＶ１８（ＭＷ３，０００〜８，０００）とＳＰＬ（ＭＷ１，０００〜３，０００）との比較
この実施例は、シミュレートされた心肺バイパス回路におけるＶ１８の活性と、１，０００〜３，０００  Ｄａの分子量を有するＶ１８様物質であるＳＰＬの活性とを比較する。下記の表１７に示すように、Ｖ１８とは対照的に、ＳＰＬは実質的に不活性である。
【０２１４】
１．１，０００〜３，０００ダルトンの分子量を有するＶ１８様物質であるＳＰＬの調製
２ｇのＳＰＬ（１，０００〜３，０００  Ｄａ）生成物を５０ｍＬの蒸留水に溶解した。等容量の０．２Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウム（新たに作製した）を添加した。溶液を混合し、そして２４時間４℃に保った。５．０ｍＬのエチレングリコールを添加し、そして溶液を透析チューブ（ＭＷＣＯ５００）中に入れ、そして２４時間蒸留水を数回取り替えて透析した。溶液をビーカーに戻し、そして８００ｍｇの水酸化ホウ素カリウムを一定に撹拌しながら添加した。溶液を室温で２．５時間、暗所で保った。ｐＨを１Ｎ  ＨＣｌで３．０に調整し、そしてすばやく１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ７．４に再調整した。溶液を上記のように再度透析し、そして凍結乾燥して最終生成物を得た。
【０２１５】
２．シミュレートされた心肺バイパス回路におけるＶ１８とＳＰＬとの比較
Ｖ１８とＳＰＬとの比較を、上記のシミュレートされた心肺バイパス回路において行った。得られた結果は、Ｖ１８とは対照的に、ＳＰＬは実質的に不活性であることを立証する（表１７、下記を参照のこと）。３，０００  Ｄａ未満の分子量を有するヘパリン分子の画分がＶ１８から取り除かれるのは、この理由のためである。Ｖ１８からこのような分子を取り除くことにより、Ｖ１８の能力は実質的に増加する。
【０２１６】
2007204500.tif 000027
【０２１７】
Ｎ．シミュレートされた心肺バイパス回路におけるＶ１８とヘパリンとの組み合わせとヒルジンとの効力および安全性の比較
この実施例は、上記のシミュレートされた心肺バイパス回路におけるＶ１８とヘパリンとの組み合わせとヒルジンとの効力および安全性を比較する。得られた結果は、ヒルジンとは対照的に、Ｖ１８が出血問題を有さない濃度において非常に良好なＡＰＴＴを有することを明らかに立証する（表１８を参照のこと）。
【０２１８】
2007204500.tif 000028
【０２１９】
Ｏ．液相トロンビンおよびクロット結合トロンビンに対するＶ１８＋デスミンの比較効果
本実施例は、上記のハンギングクロットアッセイを使用しての、液相トロンビンおよびクロット結合トロンビンに対するＶ１８およびデスミン（すなわち、低分子量デルマタン硫酸）の効果を比較する。以下の表１９に示す結果は、デスミンがＶ１８より選択が低く、さらに、約４の係数でＶ１８より効力が低いことを明らかに立証する。
【０２２０】
2007204500.tif 000029
【０２２１】
上記の記載は、例示的であり、かつ限定的でないことが意図されることを理解するべきである。多くの実施態様は、上記の記載を読めば当業者には明らかである。従って、本発明の範囲は、上記の記載を参考にして決定されるべきでなく、添付の請求の範囲を参考にしてこのような請求の範囲が権利を与えられる等価物の完全な範囲と共に決定されるべきである。特許出願および刊行物を含む全ての記事および参考文献の開示は、全ての目的のために本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】図１は、ヘパリンがＨＣＩＩに結合し、そしてＨＣＩＩとトロンビンとの間の接近を促進して、それゆえ不可逆的な共有結合がトロンビンの触媒中心とＨＣＩＩ上のＬｅｕ−Ｓｅｒ結合との間で形成され得る、提唱メカニズムを示す。
【図２】図２および図３は、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子が、表面結合されたトロンビンに対して選択的な活性を有し得る、提唱メカニズムを示す。
【図３】図２および図３は、本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子が、表面結合されたトロンビンに対して選択的な活性を有し得る、提唱メカニズムを示す。
【図４】図４および図５は、種々のヘパリンおよびＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、Ｖ１８）が、フィブリンからトロンビンを阻害して置き換える（ｄｉｓｐｌａｃｅ）相対的な能力をフィルター含有プレートアッセイを用いて比較した一連の実験の平均結果を示す。置き換えおよび阻害の両方について用量応答性であり、４μＭで８５％の不活性化および約６０％の置き換えであった。置き換えられたトロンビンおよび残余の不活性化されたフィブリン結合トロンビンに対して行ったゲルの分析により、ＨＣＩＩはトロンビンに共有結合することが示された。このことは、トロンビンが永久に不活性化されることを示している。
【図５】図４および図５は、種々のヘパリンおよびＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、Ｖ１８）が、フィブリンからトロンビンを阻害して置き換える（ｄｉｓｐｌａｃｅ）相対的な能力をフィルター含有プレートアッセイを用いて比較した一連の実験の平均結果を示す。置き換えおよび阻害の両方について用量応答性であり、４μＭで８５％の不活性化および約６０％の置き換えであった。置き換えられたトロンビンおよび残余の不活性化されたフィブリン結合トロンビンに対して行ったゲルの分析により、ＨＣＩＩはトロンビンに共有結合することが示された。このことは、トロンビンが永久に不活性化されることを示している。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、「ハンギングクロット（ｈａｎｇｉｎｇ  ｃｌｏｔ）アッセイを用いて、デルマタン硫酸および本発明のＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒（すなわち、Ｖ１８）それぞれが、遊離トロンビンおよびフィブリン結合トロンビンを不活性化する能力を示す。
【図７】図７は、Ｇ−５０  ＳｅｐｈａｄｅｘカラムでのＶ１８の溶出プロフィールを示す。
【図８】図８は、フィブリンクロットからの標識トロンビンの拡散速度を示す。
【図９】図９は、６０μｇ／ｍｌの本発明のＨＣＩＩ特異的触媒因子のうちの１つの存在下または非存在下で、精製フィブリノゲン中のフィブリン結合トロンビンの活性に対する０．２５μＭ  ＨＣＩＩの効果を示す。
【図１０】図１０は、ヒトの全血系において因子がクロッティングを阻害する能力を試験するために使用された生体外再循環（ｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）回路を示す。
【図１１】図１１は、同じヒト血液サンプルのアリコートを生体外再循環回路において試験した場合の、デルマタン硫酸および本発明のＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、Ｖ１８）の１つが有する効果の比較を示す。
【図１２】図１２は、ＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子（すなわち、Ｖ１８）とＡＴＩＩＩ触媒因子（例えば、ヘパリン）との混合物を用いた結果を示す。
【図１３】図１３は、１抗Ｘａユニット／ｍｌおよび２抗Ｘａユニット／ｍｌの非修飾ＬＭＷＨの、フィルターのクロッティングおよびトロンビンクロッティング時間（ＴＣＴ）に対する効果を示す。
【図１４】図１４および図１５は、デルマタン硫酸および本発明のＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子の１つ（すなわち、Ｖ１８）が、生体外再循環回路におけるクロッティングに対して有する効果の比較を１２０μｇ／ｍｌ〜９６０μｇ／ｍｌの濃度範囲にわたり示す。
【図１５】図１４および図１５は、デルマタン硫酸および本発明のＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子の１つ（すなわち、Ｖ１８）が、生体外再循環回路におけるクロッティングに対して有する効果の比較を１２０μｇ／ｍｌ〜９６０μｇ／ｍｌの濃度範囲にわたり示す。
【図１６】図１６は、ヒルジンが生体外再循環回路におけるクロッティングに対して有する効果を１０Ｕ／ｍｌ〜２０Ｕ／ｍｌの濃度範囲にわたり示す。
【図１７】図１７は、バイパスシュミレーションモデルにおけるヘパリンまたはＶ１８と組み合わせたヘパリンの効果を示す。
【図１８】図１８は、本発明のＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子の１つ（すなわち、Ｖ１８）の、バルーン傷害後のクロット重量に対する効果を示す。
【図１９】図１９は、標準ヘパリンの、バルーン傷害後のクロット重量に対する効果を示す。
【図２０】図２０は、標準ヘパリンと本発明のＬＡ−ＬＭＷＨ  ＨＣＩＩ特異的触媒因子の１つ（すなわち、Ｖ１８）との、バルーン傷害後のクロット重量に対する効果を示す。
【図２１】図２１は、ウサギ静脈血栓症処置モデル（Ｒａｂｂｉｔ  Ｖｅｎｏｕｓ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ）を用いたクロット溶解に対する種々の抗凝固因子の効果を示す。
【図２２】図２２は、ウサギ静脈血栓症処置モデルを用いたクロット付着成長（ａｃｃｒｅｔｉｏｎ）に対する種々の抗凝固因子の効果を示す。
【図２３】図２３は、正常な血漿（＋＋）、ＡＴＩＩＩ欠損血漿（−■−）、およびＨＣＩＩ欠損血漿（−□−）における、ＴＣＴ（Ａ）、ＡＰＴＴ（Ｂ）、および第Ｘａ因子クロッティング時間（Ｘａクロット時間）（Ｃ）に対するＶ１８の効果を示す。
【図２４】図２４は、正常な血漿（＋＋）、ＡＴＩＩＩ欠損血漿（−■−）、およびＨＣＩＩ欠損血漿（−□−）における、ＴＣＴ（Ａ）、ＡＰＴＴ（Ｂ）、および第Ｘａ因子クロッティング時間（Ｘａクロット時間）（Ｃ）に対するＬＭＷＨの効果を示す。
【図２５】図２５は、正常な血漿（＋＋）、ＡＴＩＩＩ欠損血漿（−□−）、およびＨＣＩＩ欠損血漿（−■−）における、ＴＣＴ（Ａ）、ＡＰＴＴ（Ｂ）、および第Ｘａ因子クロッティング時間（Ｘａクロット時間）（Ｃ）に対するデルマタン硫酸の効果を示す。
【図２６】図２６は、正常な血漿（＋＋）、ＡＴＩＩＩ欠損血漿（−□−）、およびＨＣＩＩ欠損血漿（−■−）における、ＴＣＴ（Ａ）、ＡＰＴＴ（Ｂ）、および第Ｘａ因子クロッティング時間（Ｘａクロット時間）（Ｃ）に対する画分１の効果を示す。
【図２７】図２７は、正常な血漿（＋＋）、ＡＴＩＩＩ欠損血漿（−□−）、およびＨＣＩＩ欠損血漿（−■−）における、ＴＣＴ（Ａ）、ＡＰＴＴ（Ｂ）、および第Ｘａ因子クロッティング時間（Ｘａクロット時間）（Ｃ）に対する画分２の効果を示す。
【図２８】図２８は、正常な血漿（＋＋）、ＡＴＩＩＩ欠損血漿（−□−）、およびＨＣＩＩ欠損血漿（−■−）における、ＴＣＴ（Ａ）、ＡＰＴＴ（Ｂ）、および第Ｘａ因子クロッティング時間（Ｘａクロット時間）（Ｃ）に対する画分３の効果を示す。
【図２９】図２９は、ＤＳおよびＶ１８により生じるトロンビン時間の延長に対するヘパリン（０．１Ｕ／ｍＬ）の添加効果の比較を示す。
【図３０】図３０は、トロンビン（Ａ）（−■−）、ＰＰＡＣＫクロット（Ｂ）（−□−）、およびクロット結合トロンビン（Ｃ）（＋＋）が添加された全血のクロッティング時間に対する、漸増用量のヘパリンの効果を示す図である。
【図３１】図３１は、トロンビン（Ａ）（−■−）、ＰＰＡＣＫクロット（Ｂ）（−□−）、およびクロット結合トロンビン（Ｃ）（＋＋）が添加された全血のクロッティング時間に対する、漸増用量のデルマタン硫酸の効果を示す図である。
【図３２】図３２は、トロンビン（Ａ）（−■−）、ＰＰＡＣＫクロット（Ｂ）（−□−）、およびクロット結合トロンビン（Ｃ）（＋＋）が添加された全血の液クロッティング時間に対する、漸増用量のＶ１８の効果を示す図である。
【図３３】図３３は、トロンビン（Ａ）（−■−）、ＰＰＡＣＫクロット（Ｂ）（−□−）、およびクロット結合トロンビン（Ｃ）（＋＋）が添加された全血のクロッティング時間に対する、漸増用量の画分１の効果を示す図である。
【図３４】図３４は、トロンビン（Ａ）（−■−）、ＰＰＡＣＫクロット（Ｂ）（−□−）、およびクロット結合トロンビン（Ｃ）（＋＋）が添加された全血のクロッティング時間に対する、漸増用量の画分２の効果を示す図である。
【図３５】図３５は、トロンビン（Ａ）（−■−）、ＰＰＡＣＫクロット（Ｂ）（−□−）、およびクロット結合トロンビン（Ｃ）（＋＋）が添加された全血のクロッティング時間に対する、漸増用量の画分３の効果を示す図である。
【図３６】図３６は、ヘパリン（（Ａ）、上部パネル）、画分１（（Ｂ）、中部パネル）、およびヘパリンと１０μｇ／ｍｌの画分１との組合せ（（Ｃ）、下部パネル）の、トロンビン（−■−）、ＰＰＡＣＫクロット（−□−）、およびクロット結合トロンビン（＋＋）が添加された全血のクロッティング時間に対する効果を示す。
【図３７】図３７は、標準ヘパリンとデルマタン硫酸（１２０μｇ）との組み合わせの漸増用量の、トロンビン（Ａ）（−■−）、ＰＰＡＣＫクロット（Ｂ）（−□−）、およびクロット結合トロンビン（Ｃ）（＋＋）が添加された全血のクロッティング時間に対する効果を示す。
【図３８】図３８は、デルマタン硫酸と標準ヘパリン（０．５Ｕ／ｍＬ）との組み合わせの漸増用量の、トロンビン（Ａ）（−■−）、ＰＰＡＣＫクロット（Ｂ）（−□−）、およびクロット結合トロンビン（Ｃ）（＋＋）が添加された全血のクロッティング時間に対する効果を示す。
【図３９】図３９は、Ｖ１８と標準ヘパリン（ＳＨ）（０．５Ｕ／ｍＬ）との組み合わせの漸増用量の、トロンビン（Ａ）（−■−）、ＰＰＡＣＫクロット（Ｂ）（−□−）、およびクロット結合トロンビン（Ｃ）（＋＋）が添加された全血のクロッティング時間に対する効果を示す。
【図４０】図４０は、バイパス回路におけるクロッティングの阻害に対するヘパリンの効果を示す。
【図４１】図４１は、バイパス回路において１．５ユニット／ｍｌのヘパリンと組み合わせた場合の画分１、２、および３の有効性を比較する。
【図４２】図４２は、ＡＴＩＩＩの存在下または非存在下での緩衝液系におけるインヒビターの抗Ｘａ活性のまとめを記載する。
【図４３】図４３は、種々のＧＡＧについてＡＴＩＩＩまたはＨＣＩＩの存在下または非存在下で測定した、フィブリノゲンを含有する緩衝液系におけるトロンビンクロッティング時間の延長を示す。
【図４４−１】図４４は、標準ヘパリン（Ａ）、ＬＭＷＨ（Ｂ）、Ｖ１８（Ｃ）およびＶ１８の画分１（Ｄ）の、これらの凝固酵素それぞれが添加された血漿系におけるＸａ、ＩＸａ、およびＸＩａの不活性化に対する効果を示す。
【図４４−２】図４４は、標準ヘパリン（Ａ）、ＬＭＷＨ（Ｂ）、Ｖ１８（Ｃ）およびＶ１８の画分１（Ｄ）の、これらの凝固酵素それぞれが添加された血漿系におけるＸａ、ＩＸａ、およびＸＩａの不活性化に対する効果を示す。
【図４５】図４５は、Ｖ１８（Ａ）、Ｖ１８の画分１（Ｂ）、ＬＭＷＨ（Ｃ）、およびＳＨ（Ｄ）の抗凝固活性に対する血小板の効果を示す。
【図４６】図４６は、血小板が豊富な血漿（ＰＲＰ）、血小板に乏しい血漿（ＰＰＰ）、および血小板が存在しない血漿（Ｐｉｔ−Ｆｒｅｅ）における、種々のＧＡＧＳを用いたカルシウム再沈着時間の結果を示す。
【図４７】図４７は、欠陥（ｉｍｐａｉｒｅｄ）アセンブリの機構を示す。
【図４８】図４８は、リン脂質表面上での第Ｘａ因子のアセンブリを示す。
【図４９】図４９は、欠陥アセンブリの結果を示す。
【図５０】図５０は、欠陥アセンブリの機構を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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