(57)【要約】【課題】高い検出感度で確実に生体分子間相互作用を一分子レベルで検出、定量することのできる、微小開口膜、生体分子間相互作用解析方法及びその装置を提供する。【解決手段】微小開口６が設けられた光を透過しない薄膜４と、薄膜４を支持する透明な基板５とからなり、微小開口６に透明材料10を有する微小開口膜１を用いた。励起光３の波長よりも小さい微小開口６から励起光３によるエバネッセント場７を発生させ、エバネッセント場７によって透明材料10上の第一の蛍光性生体分子２と、第一の蛍光性生体分子２と相互作用する第二の蛍光性生体分子12とを励起させ、第一の蛍光性生体分子２と第二の蛍光性生体分子12の蛍光をそれぞれ検出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小開口が設けられた光を透過しない薄膜と、前記微小開口の内部に配置された透明材料とを有することを特徴とする微小開口膜。
【請求項２】
前記薄膜を支持する透明な基板を有することを特徴とする請求項１記載の微小開口膜。
【請求項３】
微小開口が設けられた光を透過しない薄膜と、この薄膜を支持する透明な基板とからなり、前記基板に前記微小開口に対応した凹部が形成されたことを特徴とする微小開口膜。
【請求項４】
前記微小開口は複数設けられ略等間隔に配列されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の微小開口膜。
【請求項５】
前記微小開口の最大開口幅は２００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の微小開口膜。
【請求項６】
微小開口が設けられた光を透過しない薄膜と、前記微小開口の内部に配置された透明材料とを有する微小開口膜を用いた生体分子間相互作用解析方法であって、励起光の波長よりも小さい前記微小開口から前記励起光によるエバネッセント場を発生させ、このエバネッセント場によって前記透明材料上の第一の蛍光性生体分子と、前記第一の蛍光性生体分子と相互作用する第二の蛍光性生体分子とを励起し、これら第一の蛍光性生体分子と第二の蛍光性生体分子の蛍光をそれぞれ検出することを特徴とする生体分子間相互作用解析方法。
【請求項７】
前記微小開口膜が、前記薄膜を支持する透明な基板を有することを特徴とする請求項６記載の生体分子間相互作用解析方法。
【請求項８】
微小開口が設けられた光を透過しない薄膜と、この薄膜を支持する透明な基板とからなり、前記基板に前記微小開口に対応した凹部が形成された微小開口膜を用いた生体分子間相互作用解析方法であって、励起光によって前記凹部にある第一の蛍光性生体分子と、前記第一の蛍光性生体分子と相互作用する第二の蛍光性生体分子とを励起し、これら第一の蛍光性生体分子と第二の蛍光性生体分子の蛍光をそれぞれ検出することを特徴とする生体分子間相互作用解析方法。
【請求項９】
励起光を発生する励起光発生手段と、請求項１〜５のいずれか１項記載の微小開口膜と、蛍光を検出する蛍光検出手段とを備え、前記励起光発生手段から発生した励起光によって第一の蛍光性生体分子と、前記第一の蛍光性生体分子と相互作用する第二の蛍光性生体分子とを励起し、これら第一の蛍光性生体分子と第二の蛍光性生体分子の蛍光を前記蛍光検出手段によりそれぞれ検出するように構成したことを特徴とする生体分子間相互作用解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子間相互作用を１分子レベルで検出、定量するための微小開口を備えた微小開口膜、生体分子間相互作用解析方法及びその装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の生体分子間相互作用を１分子レベルで検出、定量する方法として、主として以下の２つの方法があった。
【０００３】
１つは、図８に示すように、ガラス101と水溶液102の界面103にレーザー光104を入射して全反射させ、水溶液102の界面103に発生するエバネッセント場105を利用して、蛍光性生体分子106をイメージングする方法である。エバネッセント場105は、界面103から侵入長１５０ｎｍで減衰するので局所励起が可能である。一方の蛍光性生体分子106をガラス101に固定し、他方の生体分子109を別の蛍光波長の蛍光分子で標識して水溶液102に加えると、これら生体分子同士の結合、解離（分子間相互作用）を超高感度カメラ107で撮影することが可能である。この生体分子の１分子蛍光イメージング法は、発明者らによって１９９５年に開発され（非特許文献１）、さまざまな成果を収めてきた。しかし、水溶液102中の蛍光性生体分子109の濃度を５０ｎＭ以下にしないと１分子観察が困難であること、蛍光性生体分子109がガラス101に非特異的に吸着し、分子間相互作用の検出が困難であるという問題点をかかえており、１分子計測できる生体分子間相互作用は限られていた。
【０００４】
これらの問題が発生する理由は以下のとおりである。全反射により発生するエバネッセント場105は、界面103に垂直な方向に１５０ｎｍの局所励起を実現しているが、平行な方向については局所化していない。また、蛍光性生体分子106が発した蛍光108は、超高感度カメラ107まで伝播するあいだに回折の影響を受け、試料面で直径約２５０ｎｍに相当する大きさに広がってしまう。そのため、個々の蛍光性生体分子106を識別するためには、ガラス101に固定する蛍光性生体分子106の間隔を約２５０ｎｍよりも大きくしなければならない。さらに、蛍光性生体分子106と特異的に相互作用している蛍光性生体分子109を、水溶液中の他の蛍光性生体分子と区別して識別するためには、この蛍光性生体分子の周囲約２５０ｎｍの範囲にある蛍光分子からの蛍光（背景光）が、特異的に相互作用している蛍光性生体分子109の蛍光より小さくなければならない。したがって、水溶液102に含まれる蛍光性生体分子109の濃度を５０ｎＭ以下にして背景光をできるだけ小さくする必要があった。このため、解離定数が５０ｎＭ以下の強い分子間相互作用しか１分子観察できなかった。さらに、生体分子106の周囲約２５０ｎｍの範囲に、蛍光性生体分子109が非特異的に吸着した場合、これを特異的相互作用と区別することが困難であった。これらの問題は、蛍光性生体分子106を励起する領域をさらに小さくし、それらを超高感度カメラ107に接続された光学顕微鏡の分解能よりも離れた位置に配置し、それらの間の領域に励起光が届かないようにすることによって解決できると期待される。
【０００５】
生体分子間相互作用を１分子レベルで検出する２つめの方法は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ；Fluorescence Correlation Spectroscopy）である。これは、図９に示すように、レーザービーム111を開口数の大きい対物レンズ112で回折限界まで絞込み、その中を通過する蛍光性生体分子113の蛍光強度のゆらぎを測定することにより、個々の蛍光性生体分子113の蛍光強度と拡散定数を求める方法である（非特許文献２，特許文献１）。レーザービーム111の焦点114の蛍光115だけを検出するために、レーザービーム111の結像位置にピンホールを置く共焦点光学系が用いられている。２種類の蛍光115の相関をとれば２種類の蛍光性生体分子113の分子間相互作用を解析することも可能である。この方法は、蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ；Fluorescence Cross-correlation Spectroscopy）と呼ばれる（非特許文献３）。
【０００６】
この方法においても、照射領域が光の回折限界程度に広がるため、蛍光性生体分子113の濃度を１００ｎＭ程度までしか上げることができなかった。より高濃度で生体分子間相互作用を観察するために、光の回折限界を超える局所励起が望まれていた。
【０００７】
これらの従来の方法を解決するために、発明者らは生体分子間相互作用を観察するための微小開口膜（特許文献２）を開示している。以下、この構造を微小開口膜の「従来構造１」と称して説明する。
【０００８】
図１０，図１１に示すように、この従来構造１の微小開口膜121は、石英などで形成された透明な基板122に、金属などで形成され微小開口124が設けられた光を透過しない薄膜123が支持、結合されてなる。そして、この微小開口膜121に第一の蛍光性生体分子125を付着させ、第二の蛍光性生体分子126を含む水溶液127と微小開口膜123が接することにより、第一の蛍光性生体分子125と第二の蛍光性生体分子126との間の相互作用を観察する。蛍光性生体分子125，126を含む水溶液127と微小開口膜121は、レーザーなどの励起用光源128、超高感度カメラ、その他の解析装置（図示せず）を装備した光学顕微鏡に取り付けられる。そして、図１０に示すように、励起光129を微小開口膜121の片方から照射し、微小開口膜121に対して反対側に蛍光受光部としての対物レンズ130を配置する。
【０００９】
微小開口膜121に励起光129を照射すると、励起光129の波長よりも小さい直径の微小開口124にエバネッセント場131が発生し、この微小開口124に付着させた第一の蛍光性生体分子125と、同じエバネッセント場131の領域にあって第一の蛍光性生体分子125と相互作用する第二の蛍光性生体分子126が励起され、第一の蛍光性生体分子125と第二の蛍光性生体分子126の蛍光132がそれぞれ励起光129を照射した反対側で対物レンズ130を通して検出される。これにより、第一の蛍光性生体分子125と第二の蛍光性生体分子126との相互作用を一分子レベルで検出、定量することができる。ここでは、図１１に示すように、エバネッセント場131が発生する領域に第一の蛍光性生体分子125が配置されている。
【００１０】
一方、ＤＮＡの塩基配列の同定を目的とした類似の微小開口膜構造（特許文献３）や、同構造を用いた実施例（非特許文献４）が開示されている。以下、この構造を「従来構造２」と称して説明する。
【００１１】
図１２，図１３に示すように、この従来構造２の微小開口膜121は、石英などで形成された透明な基板122に、金属などで形成され微小開口124が設けられた光を透過しない薄膜123が支持、結合されてなる。そして、従来構造１と同様に、この微小開口膜121に第一の蛍光性生体分子125を付着させ、第二の蛍光性生体分子126を含む水溶液127と微小開口膜121が接することにより、第一の蛍光性生体分子125と第二の蛍光性生体分子126との間の相互作用を観察する。蛍光性生体分子125，126を含む水溶液127と微小開口膜121は、レーザーなどの励起用光源、超高感度カメラ、その他の解析装置（図示せず）を装備した光学顕微鏡に取り付けられる。そして、図１２に示すように、励起光129を微小開口膜121の片方から照射し、微小開口膜121に対して同じ側に蛍光受光部としての対物レンズ134を配置する。
【００１２】
微小開口膜121に対物レンズ134を通して励起光129を照射すると、励起光129の波長よりも小さい直径の微小開口124にエバネッセント場131が発生し、この微小開口124に付着させた第一の蛍光性生体分子125と、同じエバネッセント場131の領域にあって第一の蛍光性生体分子125と相互作用する第二の蛍光性生体分子126が励起され、第一の蛍光性生体分子125と第二の蛍光性生体分子126の蛍光133が受光される。そして、励起光129と蛍光133の光路をダイクロックミラー135によって分かち、抽出した蛍光を解析することで、第一の蛍光性生体分子125と第二の蛍光性生体分子126の蛍光133がそれぞれ検出される。これにより、第一の蛍光性生体分子125と第二の蛍光性生体分子126との相互作用を一分子レベルで検出、定量することができる。ここでは、図１３に示すように、微小開口124内部に露出した基板122の上に第一の蛍光性生体分子125が配置されている。
【特許文献１】特表平１１−５０２６０８号公報
【特許文献２】特開２００４−１６３１２２号公報
【特許文献３】特表２００２−５４３８４７号公報
【非特許文献１】Funatsu, T. et al., (1995) Nature 374, 555-559
【非特許文献２】Eigen M. and Rigler, R. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5740-5747
【非特許文献３】Rigker, R., Z. et al., (1998) Fluorescence cross-correlation - a new concept for polymerase chain reaction. J. Biotechnol. 63: 97-109
【非特許文献４】M.J.Levence et al., SCIENCE 299 (2003) 682
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、従来構造１では、蛍光性生体分子125，126からの蛍光が、対物レンズまで到達するまでに微弱になってしまう場合が多いという問題が、従来構造２では、第一の蛍光性生体分子125、126からの蛍光が微弱であり、対物レンズまで到達しないという問題があった。
【００１４】
本出願の発明者が、この問題の原因を鋭意検討した結果、従来構造１では、第一の蛍光性生体分子125、第二の蛍光性生体分子126がともに微小開口124の内部に位置する場合が多いこと、従来構造２では、第一の蛍光性生体分子125、第二の蛍光性生体分子126がともに微小開口124の内部に必ず位置することとなり、蛍光性生体分子125，126が微小開口124の内部に位置した場合は、蛍光性生体分子125、126からの蛍光が微小開口124の内部に閉じ込められてしまうことが原因であることが判明した。
【００１５】
なお、従来構造１と従来構造２において、十分な蛍光量を得るために励起光の照射量を増加させると、微小開口膜121の温度が上昇して生体分子に致命的な損傷を与えてしまう。また、薄膜123は金属で作製されるが、微小開口124内部の蛍光性生体分子125，126と薄膜123との距離が近くなると、励起された蛍光性生体分子と金属との間の電子移動によって、蛍光性生体分子が蛍光を発しなくなるという問題もあった。
【００１６】
以上のように、上記従来構造１，従来構造２ではともに、励起光の照射領域を励起光の波長より小さくすることを実現するために、励起光を透過しない微小開口膜121を形成し、エバネッセント場131発生領域内に蛍光性生体分子125，126を配置することを特徴としている。しかしながら、蛍光性生体分子125，126が、微小開口膜121の内部に配置された場合は、励起した蛍光性生体分子125，126が発する蛍光132，133が微小開口124内部に閉じ込められてしまい、十分な蛍光量が検出装置に到達しないという問題を抱えていた。
【００１７】
本発明の目的は、上記の問題を解決することであり、励起した蛍光性生体分子が発する蛍光が検出に十分な強度を有し、高い検出感度で確実に生体分子間相互作用を一分子レベルで検出、定量することのできる、微小開口膜、生体分子間相互作用解析方法及びその装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の請求項１記載の微小開口膜は、微小開口が設けられた光を透過しない薄膜と、前記微小開口の内部に配置された透明材料とを有することを特徴とする。
【００１９】
本発明の請求項２記載の微小開口膜は、請求項１において、前記薄膜を支持する透明な基板を有することを特徴とする。
【００２０】
本発明の請求項３記載の微小開口膜は、微小開口が設けられた光を透過しない薄膜と、この薄膜を支持する透明な基板とからなり、前記基板に前記微小開口に対応した凹部が形成されたことを特徴とする。
【００２１】
本発明の請求項４記載の微小開口膜は、請求項１〜３のいずれか１項において、前記微小開口は複数設けられ略等間隔に配列されていることを特徴とする。
【００２２】
本発明の請求項５記載の微小開口膜は、請求項１〜４のいずれか１項において、前記微小開口の最大開口幅は２００ｎｍ以下であることを特徴とする。
【００２３】
本発明の請求項６記載の生体分子間相互作用解析方法は、微小開口が設けられた光を透過しない薄膜と、前記微小開口の内部に配置された透明材料とを有する微小開口膜を用いた生体分子間相互作用解析方法であって、励起光の波長よりも小さい前記微小開口から前記励起光によるエバネッセント場を発生させ、このエバネッセント場によって前記透明材料上の第一の蛍光性生体分子と、前記第一の蛍光性生体分子と相互作用する第二の蛍光性生体分子とを励起し、これら第一の蛍光性生体分子と第二の蛍光性生体分子の蛍光をそれぞれ検出することを特徴とする。
【００２４】
本発明の請求項７記載の生体分子間相互作用解析方法は、請求項６において、前記微小開口膜が、前記薄膜を支持する透明な基板を有することを特徴とする。
【００２５】
本発明の請求項８記載の生体分子間相互作用解析方法は、微小開口が設けられた光を透過しない薄膜と、この薄膜を支持する透明な基板とからなり、前記基板に前記微小開口に対応した凹部が形成された微小開口膜を用いた生体分子間相互作用解析方法であって、励起光によって前記凹部にある第一の蛍光性生体分子と、前記第一の蛍光性生体分子と相互作用する第二の蛍光性生体分子とを励起し、これら第一の蛍光性生体分子と第二の蛍光性生体分子の蛍光をそれぞれ検出することを特徴とする。
【００２６】
本発明の請求項９記載の生体分子間相互作用解析装置は、励起光を発生する励起光発生手段と、請求項１〜５のいずれか１項記載の微小開口膜と、蛍光を検出する蛍光検出手段とを備え、前記励起光発生手段から発生した励起光によって第一の蛍光性生体分子と、前記第一の蛍光性生体分子と相互作用する第二の蛍光性生体分子とを励起し、これら第一の蛍光性生体分子と第二の蛍光性生体分子の蛍光を前記蛍光検出手段によりそれぞれ検出するように構成したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の微小開口膜、生体分子間相互作用解析方法及びその装置によれば、励起した蛍光性生体分子が発する蛍光が検出に充分な強度を有し、高い検出感度で確実に生体分子間相互作用を一分子レベルで検出、定量することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明の微小開口膜、生体分子間相互作用解析方法及びその装置について詳細に説明する。
【実施例１】
【００２９】
図１〜図４に基づき、本発明の実施例１について説明する。１は微小開口膜であり、この微小開口膜１は、解析対象となる蛍光色素で標識した第一の蛍光性生体分子２を励起する励起光３を透過しない薄膜４と、薄膜４に前後左右方向にそれぞれ間隔ｄを隔てて等間隔に整然と配列した複数の微小開口６と、微小開口６の内部に配置された透明材料10とからなる。本実施例では、薄膜４は基板５によって支持されている。そして、透明材料10は、微小開口６の内部に充填された状態で配置されており、透明材料10の上面は薄膜４の上面と略面一に形成され、透明材料10と薄膜４の厚さは略同一に形成されている。
【００３０】
薄膜４と透明材料10は、石英やガラスなどの透明な基板５に結合されており、例えば、蒸着などの手段によって、アルミニウム，タングステン、クロム，金，銀，ゲルマニウムなどの金属薄膜４を基板５上に形成したものである。
【００３１】
微小開口６は直径φの円形に形成されている。なお、微小開口６は、必ずしも円形である必要はなく、微小開口６が円形でない場合は、開口部中の最長の直線の長さを微小開口６の最大開口幅とする。
【００３２】
そして、微小開口６の直径φは、励起光３の波長λexよりも小さくなっている。なお、この直径φはできる限り小さいほうが好ましい。すなわち、直径φが小さいほど、後述するエバネッセント場７の領域が小さくなり、１分子レベルで蛍光性生体分子２を励起させるためには好都合であるため、好ましくは、直径φを２００ｎｍ以下とし、さらに好ましくは１００ｎｍ以下とする。
【００３３】
また、１分子レベルで蛍光性生体分子２が発する蛍光を検出するために、微小開口６の間隔ｄは、蛍光性生体分子２の蛍光８を検出する蛍光検出手段を構成する光学顕微鏡の対物レンズ９の分解能と同じかそれよりも大きくなっている。すなわち、検出する光がコヒーレントでない場合、対物レンズ９の開口数ＮＡに対し、蛍光８の波長をλemとすると、その対物レンズ９の分解能は式０．６１λem／ＮＡで表されるので、微小開口６の間隔ｄは、ｄ≧０．６１λem／ＮＡの式を満足する値になっている。例えば、蛍光８の波長λemが５００ｎｍの場合、対物レンズ９の開口数ＮＡが１．２として、対物レンズ９の分解能は０．６１λem／ＮＡ≒２５０ｎｍとなる。したがって、開口数ＮＡが１．２の対物レンズ９を用いる場合は、微小開口６の間隔ｄを２５０ｎｍ以上とすれば、１分子レベルで第一の蛍光性生体分子２が発する蛍光を検出することができることになる。
【００３４】
透明材料10は、基板５の一部として予め形成されたものであってもよく、あるいは、基板５上に薄膜４を形成した後に充填されたものであってもよい。また、透明材料10は、基板５とは異なる材料であっても同じ材料であってもよいし、あるいは、薄膜４を局所的に改質して透明化したものでもよい。薄膜４の表面と透明材料10の表面との高さに差があってもよいが、第一の蛍光性生体分子２からの蛍光をより確実に観測するため、その差は５０ｎｍ以下とするのが好ましい。なお、11は励起光３を発する励起光発生手段としてのレーザーである。
【００３５】
つぎに、作用について説明する。図１〜図３に示すように、微小開口膜１の透明材料10上に第一の蛍光性生体分子２を配置する。そして、第一の蛍光性生体分子２が配置した微小開口膜１の上面を第二の蛍光性生体分子12を含む水溶液13に浸漬し、第一の蛍光性生体分子２と第二の蛍光性生体分子12との間の相互作用を観察する。なお、水溶液13は、微小開口膜１とカバーガラスとしての透明基板14との間に挟まれている。
【００３６】
そして、基板５の薄膜４の結合していない側、すなわち、微小開口膜１の水溶液13と接していない側である下面から励起光３を入射すると、微小開口６で励起光３の染み出し、すなわちエバネッセント場７が発生する。このエバネッセント場７の大きさは、微小開口６の大きさと同程度であるが、第一の蛍光性生体分子２は微小開口６を穴埋めした透明材料10上に配置されているので、第一の蛍光性生体分子２は微小開口６からわずかに染み出したエバネッセント場７の内部に含まれている。したがって、微小開口６に近接した励起光３の波長λexよりも小さい領域にある第一の蛍光性生体分子２が局所的に励起され、蛍光８を発する。エバネッセント場７内で励起された第一の蛍光性生体分子２が発する蛍光８は、水溶液13と透明基板14を通過して、対物レンズ９に到達する。したがって、第一の蛍光性生体分子２が発する蛍光８を検出することができる。
【００３７】
また、多数の微小開口６が、光学顕微鏡の対物レンズ９の分解能よりも離れて配置しているため、微小開口６あたりに１個ずつ第一の蛍光性生体分子２を配置して、励起された個々の蛍光性生体分子２の蛍光８を分離して１分子計測することが可能である。
【００３８】
また、このエバネッセント場７は、微小開口６の直径φに応じて僅かに微小開口６の表面から水溶液13側に染み出す。しかしながら、エバネッセント場７は染み出すだけであるので、微小開口６を含めて微小開口膜１は光を全く透過させない。したがって、ほとんどの場合、水溶液13中に無数に存在する第二の蛍光性生体分子12が励起されることはない。
【００３９】
第二の蛍光性生体分子12が、微小開口６から水溶液13側に染み出したエバネッセント場の中に存在する場合には、第二の蛍光性生体分子12も励起されることになる。しかしながら、第二の蛍光性生体分子12は、水溶液13中でブラウン運動などにより拡散してしまうため、励起された第二の蛍光性生体分子12が発する蛍光は微弱な背景光としてしか検出されない。一方、第二の蛍光性生体分子12が第一の蛍光性生体分子２との特異的な相互作用により、第一の蛍光性生体分子２と同じエバネッセント場の領域にある場合には、第二の蛍光性生体分子12が発する蛍光を強い輝点として観測することができる。
【００４０】
このように、本実施例によれば、対物レンズ９側から観察すると、第一の蛍光性生体分子２及び第二の蛍光性生体分子12がともに、光を遮断する微小開口膜１より手前に配置されている。したがって、第一の蛍光性生体分子２及び第二の蛍光性生体分子12が発する蛍光８が微小開口内部に閉じ込められることなく、対物レンズ９に達する。したがって、透明材料10上に配置した第一の蛍光性生体分子２と、同じエバネッセント場７の領域にあって第一の蛍光性生体分子２と相互作用する第二の蛍光性生体分子12とを励起させ、第一の蛍光性生体分子２と第二の蛍光性生体分子12の蛍光８をそれぞれ検出することによって、第一の蛍光性生体分子２と第二の蛍光性生体分子12との相互作用を一分子レベルで検出、定量することができる。
【００４１】
なお、水溶液13中にある第二の蛍光性生体分子12の濃度を、微小開口６の大きさに応じて調整することによって、第二の蛍光性生体分子12が同一時間帯に同一のエバネッセント場７の領域に存在できる確率を１個程度に制御することが可能である。
【００４２】
また、エバネッセント場７は、開口部６の半径（φ/2）程度の侵入長で減衰するので、エバネッセント場７の領域は微小開口６の面積に応じて縮小する。従来の微小開口膜１を通さないで界面での全反射によるエバネッセント場を用いて蛍光性生体分子を励起する場合に、蛍光性生体分子を１分子レベルで検出するためには、対物レンズの分解能である直径２５０ｎｍの範囲内にある分子からの背景光を小さくするために、蛍光性生体分子の濃度を５０ｎＭ以下にする必要があった。しかし、本実施例の微小開口膜１を用いれば、微小開口６の直径が１５０ｎｍのときは蛍光性生体分子の濃度を１μＭ程度まで、さらに、微小開口６の直径が１００ｎｍのときは蛍光性生体分子の濃度を１０μＭ程度、すなわち、従来の２０〜２００倍程度にまで増加させることができる。したがって、解離定数の大きな弱い生体分子間相互作用をも一分子観察することができるようになると同時に、生体分子がガラス面などに非特異的に吸着することによる悪影響を従来の１／１００程度まで飛躍的に減少させることができる。
【００４３】
以上のように、本実施例の微小開口膜は、微小開口６が設けられた光を透過しない薄膜４と、前記微小開口６の内部に配置された透明材料10とを有する。微小開口６の最大開口幅φを励起光３の波長λexよりも小さくし、この微小開口６に励起光３を照射すれば、この微小開口６からエバネッセント場７が生じ、このエバネッセント場７を用いることで、励起光３の波長λexより小さい領域で励起光３を第一の蛍光性生体分子２、第二の蛍光性生体分子12に照射することが可能になる。そして、微小開口６に透明材料10が存在するので、第一の蛍光性生体分子２、第二の蛍光性生体分子12は微小開口６の外側に配置されることとなり、第一の蛍光性生体分子２、第二の蛍光性生体分子12が発する蛍光８が微小開口内部に閉じ込められることなく、検出に充分な強度で対物レンズ９に達する。したがって、透明材料10上に配置された第一の蛍光性生体分子２、第二の蛍光性生体分子12の蛍光８をそれぞれ検出することによって、高い検出感度で確実に、第一の蛍光性生体分子２と第二の蛍光性生体分子12の相互作用を一分子レベルで検出、定量することができる。また、本実施例１では、薄膜４を支持する透明な基板５を備えているので、微小開口膜１の生産性と取り扱い性を向上させることができる。また、基板５は透明なので励起光３の透過を妨げることがない。
【００４４】
また、前記微小開口６は複数設けられ略等間隔に配列されている。複数の微小開口６のうちの任意の微小開口６において蛍光性生体分子２の蛍光８を観察することができるので、対物レンズ９の位置合わせが容易になる。また、微小開口６の間隔ｄを対物レンズ９の分解能と同じか又は対物レンズ９の分解能よりも大きくすれば、それぞれの微小開口６によって励起された個々の蛍光性生体分子２の蛍光８を分離して、１分子レベルで生体分子間相互作用を検出することができる。
【００４５】
さらに、前記微小開口６の最大開口幅たる直径φは２００ｎｍ以下であるので、微小開口６の直径φを励起光３の波長λexより小さくすることができる。
【００４６】
本実施例の生体分子間相互作用解析方法は、微小開口６が設けられた光を透過しない薄膜４と、前記微小開口６の内部に配置された透明材料10とを有する微小開口膜１を用いた生体分子間相互作用解析方法であって、励起光３の波長よりも小さい前記微小開口６から前記励起光３によるエバネッセント場７を発生させ、このエバネッセント場７によって前記透明材料10上の第一の蛍光性生体分子２と、前記第一の蛍光性生体分子２と相互作用する第二の蛍光性生体分子12とを励起して、これら第一の蛍光性生体分子２と第二の蛍光性生体分子12の蛍光をそれぞれ検出する。透明材料10上の第一の蛍光性生体分子２、第二の蛍光性生体分子12の蛍光８をそれぞれ検出することによって、第一の蛍光性生体分子２、第二の蛍光性生体分子12が発する蛍光８が微小開口内部に閉じ込められることなく、高い検出感度で確実に、第一の蛍光性生体分子２と第二の蛍光性生体分子12の相互作用を一分子レベルで検出、定量することができる。
【００４７】
本実施例の生体分子間相互作用解析装置は、励起光を発生する励起光発生手段としてのレーザー11と、微小開口６が設けられた光を透過しない薄膜４と前記微小開口６の内部に配置された透明材料10とを有する微小開口膜１と、蛍光を検出する蛍光検出手段としての対物レンズ９とを備え、前記レーザー11から発生した励起光によって第一の蛍光性生体分子２と、前記第一の蛍光性生体分子２と相互作用する第二の蛍光性生体分子12とを励起し、これら第一の蛍光性生体分子２と第二の蛍光性生体分子12の蛍光８を前記対物レンズ９によりそれぞれ検出するように構成したものである。この生体分子間相互作用解析装置によれば、励起光３の波長よりも小さい前記微小開口６から前記励起光３によるエバネッセント場７を発生させ、このエバネッセント場７によって前記透明材料10上の第一の蛍光性生体分子２と、前記第一の蛍光性生体分子２と相互作用する第二の蛍光性生体分子12とを励起し、これら第一の蛍光性生体分子２と第二の蛍光性生体分子12の蛍光をそれぞれ検出する。透明材料10上の第一の蛍光性生体分子２、第二の蛍光性生体分子12の蛍光８をそれぞれ検出することによって、第一の蛍光性生体分子２、第二の蛍光性生体分子12が発する蛍光８が微小開口内部に閉じ込められることなく、高い検出感度で確実に、第一の蛍光性生体分子２と第二の蛍光性生体分子12の相互作用を一分子レベルで検出、定量することができる。
【実施例２】
【００４８】
図５〜図７に基づき、本発明の実施例２について説明する。21は微小開口膜であり、微小開口膜21は、解析対象となる蛍光色素で標識した第一の蛍光性生体分子22を励起する励起光23を透過しない薄膜24と、薄膜24に前後左右方向にそれぞれ間隔ｄを隔てて等間隔に整然と配列した複数の微小開口26とからなる。薄膜24は、基板25によって支持されている。
【００４９】
薄膜24は、石英やガラスなどの透明な基板25に結合されており、例えば、蒸着などの手段によって、アルミニウム，タングステン、クロム，金，銀，ゲルマニウムなどの金属薄膜24を基板25上に形成したものである。
【００５０】
微小開口26は直径φの円形に形成されている。なお、微小開口26は、必ずしも円形である必要はなく、微小開口26が円形でない場合は、開口部中の最長の直線の長さを微小開口６の最大開口幅とする。
【００５１】
そして、微小開口26の直径φは、励起光23の波長λexよりも小さくなっている。なお、この直径φはできる限り小さいほうが好ましい。すなわち、直径φが小さいほど、後述するエバネッセント場27の領域が小さくなり、１分子レベルで蛍光性生体分子22を励起させるためには好都合であるため、好ましくは、直径φを２００ｎｍ以下とし、さらに好ましくは１００ｎｍ以下とする。
【００５２】
また、１分子レベルで蛍光性生体分子22が発する蛍光を検出するために、微小開口26の間隔ｄは、蛍光性生体分子22の蛍光28を検出する蛍光検出手段を構成する光学顕微鏡の対物レンズ29の分解能と同じかそれよりも大きくなっている。すなわち、検出する光がコヒーレントでない場合、対物レンズ29の開口数ＮＡに対し、蛍光28の波長をλemとすると、その対物レンズ29の分解能は式０．６１λem／ＮＡで表されるので、微小開口26の間隔ｄは、ｄ≧０．６１λem／ＮＡの式を満足する値になっている。例えば、蛍光28の波長λemが５００ｎｍの場合、対物レンズ29の開口数ＮＡが１．２として、対物レンズ29の分解能は０．６１λem／ＮＡ≒２５０ｎｍとなる。したがって、開口数ＮＡが１．２の対物レンズ29を用いる場合は、微小開口26の間隔ｄを２５０ｎｍ以上とすれば、１分子レベルで第一の蛍光性生体分子22が発する蛍光を検出することができることになる。
【００５３】
さらに、基板25には微小開口26に対応した凹部30が形成されており、凹部30は微小開口26の底に露出した基板25を微小開口26の形状に合わせて掘り下げた形状となっている。なお、この凹部30は、基板25に予め形成されたものであってもよく、あるいは、基板25上に薄膜24を形成した後に形成されたものであってもよい。凹部30は必ずしも微小開口26の形状に合わせた円形である必要はなく、微小開口26と異なった形状であってもよい。凹部30が円形でない場合は、最大開口幅をその凹部30中の最長の直線の長さとする。また、凹部30の深さは１００ｎｍ以下とするのが好ましく、凹部30の直径は、微小開口26の直径φと異なってもよいが、２００ｎｍ以下とするのが好ましい。蛍光性生体分子22を１分子レベルで確実に識別するため、凹部30の深さは１００ｎｍ以下、凹部30の直径は２００ｎｍ以下が好ましい。なお、31は励起光23を発する励起用光源としてのレーザーであり、35は励起光23を反射し蛍光28を透過するダイクロイックミラーである。
【００５４】
つぎに、作用について説明する。図５〜図７に示すように、微小開口膜21の凹部30に第一の蛍光性生体分子22を配置する。そして、第一の蛍光性生体分子22が配置された微小開口膜21の上面を第二の蛍光性生体分子32を含む水溶液33に浸漬し、第一の蛍光性生体分子22と第二の蛍光性生体分子32との間の相互作用を観察する。なお、水溶液33は、微小開口膜21とカバーガラスとしての透明基板34との間に挟まれている。
【００５５】
そして、基板25の薄膜24の結合していない側、すなわち、微小開口膜21の水溶液33と接していない側である下面から励起光23を入射すると、微小開口26で励起光33の染み出し、すなわちエバネッセント場27が発生する。このエバネッセント場27の大きさは、微小開口26の大きさと同程度である。一方、第一の蛍光性生体分子22は凹部30に配置されているので、第一の蛍光性生体分子22は微小開口26の外部に位置している。したがって、第一の蛍光性生体分子22はエバネッセント場27ではなく励起光23により直接励起され、蛍光を発する。励起光23により直接励起された第一の蛍光性生体分子22が発する蛍光は、基板25を通過して、直接対物レンズ29に到達する。したがって、第一の蛍光性生体分子22が発する蛍光28を検出することができる。
【００５６】
また、多数の微小開口26が、光学顕微鏡の対物レンズ29の分解能よりも離れて配置しているため、微小開口26あたりに１個ずつ第一の蛍光性生体分子22を配置して、励起された個々の蛍光性生体分子22の蛍光28を分離して１分子計測することが可能である。
【００５７】
また、このエバネッセント場27は、微小開口26の直径φに応じて僅かに微小開口26の表面から水溶液33側に染み出す。しかしながら、エバネッセント場27は染み出すだけであるので、微小開口26を含めて微小開口膜21は光を全く透過させない。したがって、ほとんどの場合、水溶液33中に無数に存在する第二の蛍光性生体分子32が励起されることはない。
【００５８】
第二の蛍光性生体分子32が、微小開口26の内部のエバネッセント場の中に存在する場合には、第二の蛍光性生体分子32も励起されることになる。しかしながら、第二の蛍光性生体分子32が発する蛍光は微小開口26内部に閉じ込められる上、第二の蛍光性生体分子32は水溶液33中でブラウン運動などにより拡散してしまうため、励起された第二の蛍光性生体分子32が発する蛍光は微弱な背景光としてしか検出されない。一方、第二の蛍光性生体分子32が第一の蛍光性生体分子22との特異的な相互作用により、第一の蛍光性生体分子22と同じ凹部30の中にある場合には、第二の蛍光性生体分子32が発する蛍光を強い輝点として観測することができる。
【００５９】
このように、本実施例によれば、対物レンズ29側から観察すると、第一の蛍光性生体分子22及び第二の蛍光性生体分子32がともに、光を遮断する微小開口膜21より手前に配置されている。したがって、第一の蛍光性生体分子22及び第二の蛍光性生体分子32が発する蛍光28が微小開口内部に閉じ込められることなく、対物レンズ29に達する。したがって、凹部30に配置させた第一の蛍光性生体分子22と、同じ凹部30にあって第一の蛍光性生体分子22と相互作用する第二の蛍光性生体分子32とを励起し、第一の蛍光性生体分子22と第二の蛍光性生体分子32の蛍光28をそれぞれ検出することによって、第一の蛍光性生体分子22と第二の蛍光性生体分子32との相互作用を一分子レベルで検出、定量することができる。
【００６０】
なお、水溶液33中にある第二の蛍光性生体分子32の濃度を、微小開口26の大きさと凹部30の大きさに応じて調整することによって、第二の蛍光性生体分子32が同一時間帯に同一の凹部30に存在する確率を１個程度に制御することが可能である。
【００６１】
また、従来の界面の全反射によるエバネッセント場を用いて蛍光性生体分子を励起する場合に、蛍光性生体分子を１分子レベルで検出するためには、対物レンズの分解能である直径２５０ｎｍの範囲内に１分子のみが存在するように、蛍光性生体分子の濃度を５０ｎＭ以下にする必要があった。しかし、本実施例の微小開口膜21を用いれば、凹部30の直径が１５０ｎｍのときは蛍光性生体分子の濃度を１μＭ程度まで、さらに、微小開口26の直径が１００ｎｍのときは蛍光性生体分子の濃度を１０μＭ程度、すなわち、従来の２０〜２００倍程度にまで増加させることができる。したがって、解離定数の大きな弱い生体分子間相互作用をも一分子観察することができるようになると同時に、生体分子がガラス面などに非特異的に吸着することによる悪影響を従来の１／１００程度まで飛躍的に減少させることができる。
【００６２】
以上のように、本実施例の微小開口膜21は、微小開口が設けられた光を透過しない薄膜24と、この薄膜24を支持する透明な基板25とからなり、前記基板25に前記微小開口26に対応した凹部30が形成されたことを特徴とする。凹部30に第一の蛍光性生体分子22を配置することによって、第一の蛍光性生体分子22と、この第一の蛍光性生体分子22と相互作用する第二の蛍光性生体分子32は微小開口26の外側に配置されることとなり、第一の蛍光性生体分子22、第二の蛍光性生体分子32が発する蛍光28が微小開口内部に閉じ込められることなく、検出に充分な強度で対物レンズ29に達する。したがって、凹部30に配置した第一の蛍光性生体分子22、第二の蛍光性生体分子32の蛍光28をそれぞれ検出することによって、高い検出感度で確実に、第一の蛍光性生体分子22と第二の蛍光性生体分子32の相互作用を一分子レベルで検出、定量することができる。また、薄膜24を支持する透明な基板25を備えているので、微小開口膜21の生産性と取り扱い性を向上させることができる。また、基板25は透明なので励起光23、蛍光28の透過を妨げることがない。
【００６３】
また、前記微小開口26は複数設けられ略等間隔に配列されている。複数の微小開口26のうちの任意の微小開口26において蛍光性生体分子22の蛍光28を観察することができるので、対物レンズ29の位置合わせが容易になる。また、微小開口26の間隔ｄを対物レンズ29の分解能と同じか又は対物レンズ29の分解能よりも大きくすれば、それぞれの微小開口26によって励起された個々の蛍光性生体分子22の蛍光28を分離して、１分子レベルで生体分子間相互作用を検出することができる。
【００６４】
さらに、前記微小開口26の最大開口幅たる直径φは２００ｎｍ以下であるので、微小開口26の直径φを励起光23の波長λexより小さくすることができる。
【００６５】
本実施例の生体分子間相互作用解析方法は、微小開口26が設けられた光を透過しない薄膜24と、この薄膜24を支持する透明な基板25からなり、前記基板25に前記微小開口26に対応した凹部30が形成された微小開口膜21を用いた生体分子間相互作用解析方法であって、励起光23によって前記凹部30にある第一の蛍光性生体分子22と、前記第一の蛍光性生体分子22と相互作用する第二の蛍光性生体分子32とを励起し、これら第一の蛍光性生体分子22と第二の蛍光性生体分子32の蛍光28をそれぞれ検出する。凹部30に配置した第一の蛍光性生体分子22、第二の蛍光性生体分子32の蛍光28をそれぞれ検出することによって、第一の蛍光性生体分子22、第二の蛍光性生体分子32が発する蛍光28が微小開口内部に閉じ込められることなく、高い検出感度で確実に、第一の蛍光性生体分子22と第二の蛍光性生体分子32の相互作用を一分子レベルで検出、定量することができる。
【００６６】
本実施例の生体分子間相互作用解析装置は、励起光23を発生する励起光発生手段（図示せず）と、微小開口26が設けられた光を透過しない薄膜24とこの薄膜24を支持する透明な基板25とからなり前記基板25に前記微小開口26に対応した凹部30が形成された微小開口膜21と、蛍光を検出する蛍光検出手段としての対物レンズ29とを備え、励起光23によって前記凹部30にある第一の蛍光性生体分子22と、前記第一の蛍光性生体分子22と相互作用する第二の蛍光性生体分子32とを励起し、これら第一の蛍光性生体分子22と第二の蛍光性生体分子32の蛍光28をそれぞれ検出するように構成したものである。凹部30に配置した第一の蛍光性生体分子22、第二の蛍光性生体分子32の蛍光28をそれぞれ検出することによって、第一の蛍光性生体分子22、第二の蛍光性生体分子32が発する蛍光28が微小開口内部に閉じ込められることなく、高い検出感度で確実に、第一の蛍光性生体分子22と第二の蛍光性生体分子32の相互作用を一分子レベルで検出、定量することができる。
【００６７】
上記各実施例で詳細に説明したように、本発明では、微小開口の外側に蛍光性生体分子を配置するものである。すなわち、本発明では、実施例１においては、微小開口の外側に染み出したわずかなエバネッセント場の領域に、または実施例２においては、微小開口、及びその内部に形成されるエバネッセント場の完全に外側の領域に、蛍光性生体分子を配置することを特徴とする。このように蛍光性生体分子を配置することで、従来構造１、従来構造２での問題点、すなわち、蛍光性生体分子が微小開口の内部に位置した場合に、蛍光性生体分子からの蛍光が微小開口の内部に閉じ込められてしまい、観測できる蛍光量が微弱になってしまうこと、を完全に対策することができる。
【００６８】
また、薄膜が、金属で作製された場合、微小開口内部に蛍光性生体分子が位置すると薄膜と接触する確率が高くなり、励起された蛍光性生体分子と金属の間で電子移動が起こり、蛍光性生体分子が蛍光を発しなくなるという従来構造１、従来構造２の問題点に対しても、本発明の構造とすることで、蛍光性生体分子が薄膜に接触する確率を著しく低減できるので対策が可能である。
【００６９】
そして、本発明は、微小開口からのエバネッセント場の生成，１分子蛍光イメージング法，ＦＣＳ，ＦＣＣＳなどの既知の方法を巧みに組み合わせ、改良することにより、従来の原理的な問題を解決して水溶液中に従来の限界濃度の２０〜２００倍もの高濃度の分子を加えることを可能にしたほか、ガラス面などへの非特異的吸着の影響を従来の１／１００程度にまで抑えることを可能にしている。
【００７０】
そして、本発明は、励起した蛍光性生体分子が発する蛍光を十分な強度で検出することを可能にし、高い検出感度で確実に生体分子間相互作用を１分子レベルで定量することを可能とするものであって、生物学、医学、薬学などの広範な分野で利用可能である。特に、ポストゲノム研究として、タンパク質間相互作用の研究が重要になっているが、本発明により、生体分子間相互作用、特に、タンパク質間相互作用を１分子レベルで高感度に検出し、機能解析を行ことが可能になる。そして、本発明によれば、従来は不可能であった解離定数が１μＭよりも大きな弱い相互作用を検出することができる。本発明は、ＤＮＡチップやタンパク質チップに直ちに応用可能であり、タンパク質間相互作用の解析や病理検査などに大きな威力を発揮することが期待される。
【００７１】
なお、本発明は上記の実施例に限定されるものでなく、本発明の要旨の範囲内において種々の変形実施が可能である。例えば、基板を有し、微小開口が多数ある微小開口膜を例にとって説明したが、基板を有さない微小開口膜又は微小開口が１つの微小開口膜であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の微小開口膜の実施例１を示す拡大部分断面図である。
【図２】同上部分断面図である。
【図３】同上断面図である。
【図４】同上平面図である。
【図５】本発明の微小開口膜の実施例２を示す拡大部分断面図である。
【図６】同上部分断面図である。
【図７】同上断面図である。
【図８】従来例を示す模式図である。
【図９】別の従来例を示す模式図である。
【図１０】従来構造１を示す断面図である。
【図１１】同上拡大部分断面図である。
【図１２】従来構造２を示す断面図である。
【図１３】同上拡大部分断面図である。
【符号の説明】
【００７３】
１，21  微小開口膜
２，22  第一の蛍光性生体分子
３，23  励起光
４，24  薄膜
５，25  基板
６，26  微小開口
７  エバネッセント場
９,29  対物レンズ(蛍光検出手段)
10  透明材料
11  レーザー(励起光発生手段)
12，32  第二の蛍光性生体分子
30  凹部
φ  直径(最大開口幅)
【図１】
2007198801.tif 000003
【図２】
2007198801.tif 000004
【図３】
2007198801.tif 000005
【図４】
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【図５】
2007198801.tif 000007
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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