(57)【要約】【課題】より高い精度でウィルス感染の有無を判定し得るプレート、かかるプレートを備える判定キット、およびかかる判定キットを用いた判定方法を提供すること。【解決手段】本発明の判定方法は、特定のウィルス由来の複数種の抗原１０２を、それぞれ１種類ずつ１つのウェル１０１の内面に担持したプレートの所定のウェル１０１内に、それぞれ検体液を供給し、次いで、検体液が供給された各ウェル１０１内に、それぞれ抗ＩｇＧ抗体１０４を担持した着色粒子１を含有する試薬を供給し、その後、所定数以上のウェル１０１において、抗原１０２に結合した抗体が検出されたとき、生体が前記ウィルスに感染したものと判定するものである。【選択図】図３
2007114070.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体が特定のウィルスに感染したか否かを判定するのに用いられるプレートであって、
前記生体から採取した試料を含有する検体液を供給する複数のウェルを有し、
前記ウィルス由来の複数種の抗原を、それぞれ１種類ずつ１つの前記ウェルの内面に担持したことを特徴とするプレート。
【請求項２】
同一の前記検体液を供給すべき複数の前記ウェルを一列に配置した請求項１に記載のプレート。
【請求項３】
前記ウィルスは、ＨＩＶ（Human Immunodeficiency Virus）である請求項１または２に記載のプレート。
【請求項４】
生体が特定のウィルスに感染したか否かを判定するのに用いられる判定キットであって、
請求項１ないし３のいずれかに記載のプレートと、
前記抗原に結合した抗体を検出し得る試薬とを有することを特徴とする判定キット。
【請求項５】
前記試薬は、抗ＩｇＧ抗体を担持した粒子を含有する請求項４に記載の判定キット。
【請求項６】
前記粒子は、着色されている請求項５に記載の判定キット。
【請求項７】
前記プレートは、前記ウェルの底面が収斂形状をなしている請求項５または６に記載の判定キット。
【請求項８】
請求項４ないし７のいずれかに記載の判定キットを用いて、生体が特定のウィルスに感染したか否かを判定する判定方法であって、
前記プレートの所定の前記ウェル内に、それぞれ前記検体液を供給する工程と、
前記検体液が供給された各前記ウェル内に、それぞれ前記試薬を供給する工程と、
所定数以上の前記ウェルにおいて、前記抗原に結合した前記抗体が検出されたとき、前記生体が前記ウィルスに感染したものと判定する工程とを有することを特徴とする判定方法。
【請求項９】
前記抗原の種類の数をＡとし、前記生体が前記ウィルスに感染したものと判定する際の前記ウェルの数をＢとしたとき、Ｂ／Ａが０．２以上である請求項８に記載の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プレート、判定キットおよび判定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、酵素標識免疫吸着測定法、ラジオイムノアッセイ法、粒子凝集法（例えば、特許文献１参照。）などの抗原・抗体反応を用いたイムノアッセイ法を利用した様々な診断キットが開発されている。
【０００３】
これらの診断キットに共通して求められる特性の１つに、検出精度（信頼性）がある。ウィルスの中でも、特に、ＨＩＶ感染のような人権に関わる感染症を診断する場合、極めて高い検出精度が要求される。
【０００４】
ところが、ＨＩＶに感染していない（陰性である）にも関わらず、検査結果が陽性となるヒトが通常１０００人に２〜３人程度存在する。このため、診断キットの精度は、限りなく１００％に近いものが求められるが、これを達成するのは難しいのが現状である。
【０００５】
【特許文献１】特開平７−１７４７６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、より高い精度でウィルス感染の有無を判定し得るプレート、かかるプレートを備える判定キット、および判定操作が容易な判定キットを用いた判定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような目的は、下記（１）〜（９）の本発明により達成される。
（１）  生体が特定のウィルスに感染したか否かを判定するのに用いられるプレートであって、
前記生体から採取した試料を含有する検体液を供給する複数のウェルを有し、
前記ウィルス由来の複数種の抗原を、それぞれ１種類ずつ１つの前記ウェルの内面に担持したことを特徴とするプレート。
これにより、より高い精度でウィルス感染の有無を判定し得るプレートが得られる。
【０００８】
（２）  同一の前記検体液を供給すべき複数の前記ウェルを一列に配置した上記（１）に記載のプレート。
【０００９】
これにより、各ウェル内に検体液を供給（分注）する操作が容易となる。また、各ウェル内の状態を確認し易くなり、ウィルス感染の有無の判定が行い易くなる。
【００１０】
（３）  前記ウィルスは、ＨＩＶ（Human Immunodeficiency Virus）である上記（１）または（２）に記載のプレート。
【００１１】
誤判定は、ＨＩＶ感染のような人権に関わるウィルス感染の有無を判定する場合、極力少ないことが望ましい。したがって、本発明のウィルス感染の有無をより高い精度で判定し得るプレートは、特に、ＨＩＶ感染の有無を判定する場合への適用に適する。
【００１２】
（４）  生体が特定のウィルスに感染したか否かを判定するのに用いられる判定キットであって、
上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のプレートと、
前記抗原に結合した抗体を検出し得る試薬とを有することを特徴とする判定キット。
これにより、より高い精度でウィルス感染の有無を判定し得る判定キットが得られる。
【００１３】
（５）  前記試薬は、抗ＩｇＧ抗体を担持した粒子を含有する上記（４）に記載の判定キット。
【００１４】
かかる方法、すなわち、粒子凝集法は、手順が少なく、短時間で判定できるという簡便な方法でありながら、感度が高く、また、特殊な機器や設備を必要としないという利点がある。
【００１５】
（６）  前記粒子は、着色されている上記（５）に記載の判定キット。
これにより、可視光下での判定が可能となるという利点がある。
【００１６】
（７）  前記プレートは、前記ウェルの底面が収斂形状をなしている上記（５）または（６）に記載の判定キット。
【００１７】
これにより、沈降した粒子は、ウェルの中央部に向かって転がり、集合して凝集する。その結果、粒子として着色粒子を用いる場合には、ウェルの中央部で、着色粒子の色相が濃い色で（濃く着色して）視認されるので、ウェル内での着色粒子の沈降・凝集（挙動）を容易に確認することができる。
【００１８】
（８）  上記（４）ないし（７）のいずれかに記載の判定キットを用いて、生体が特定のウィルスに感染したか否かを判定する判定方法であって、
前記プレートの所定の前記ウェル内に、それぞれ前記検体液を供給する工程と、
前記検体液が供給された各前記ウェル内に、それぞれ前記試薬を供給する工程と、
所定数以上の前記ウェルにおいて、前記抗原に結合した前記抗体が検出されたとき、前記生体が前記ウィルスに感染したものと判定する工程とを有することを特徴とする判定方法。
これにより、より高い精度でウィルス感染の有無を判定し得る。
【００１９】
（９）  前記抗原の種類の数をＡとし、前記生体が前記ウィルスに感染したものと判定する際の前記ウェルの数をＢとしたとき、Ｂ／Ａが０．２以上である上記（８）に記載の判定方法。
【００２０】
これにより、生体のウィルス感染の有無の判定結果の正確性（判定精度）をより向上させることができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、ウィルスの感染がない（陰性である）にも関わらず、陽性と判定することを防止し得る。すなわち、より高い精度でウィルス感染の有無を判定し得る。
【００２２】
したがって、本発明は、ウィルス感染のスクリーニングのみならず、確定診断への利用も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明のプレート、判定キットおよび判定方法を、添付図面に示す好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
【００２４】
図１は、本発明の判定キットが備えるプレートを模式的に示す斜視図、図２〜図４は、それぞれ、本発明の判定方法を説明するための模式図である。
【００２５】
まず、本発明の判定キットについて説明する。
本発明の判定キットは、生体から採取した試料中に特定のウィルスに対する抗体（抗ウィルス抗体）が存在するか否かを検出し、これにより、生体が特定のウィルスに感染したか否かを判定する際に用いられるものである。
【００２６】
ここで、抗体を検出する方法としては、例えば、粒子凝集法（ＰＡ法）、酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）等が挙げられるが、粒子凝集法を用いるのが好ましい。粒子凝集法は、手順が少なく、短時間で判定できるという簡便は方法でありながら、感度が高く、また、特殊な機器や設備を必要としないという利点がある。
【００２７】
以下では、粒子凝集法を用いる場合を一例に説明する。
粒子凝集法による抗体の検出（生体が特定のウィルスに感染したか否かの判定）は、例えば、次のようにして行われる。
【００２８】
まず、内面に目的とするウィルス由来の抗原を担持したウェル内に、生体から採取した試料を含有する検体液を供給し、次いで、ウェル内に、抗ＩｇＧ抗体を担持した着色粒子を含有する試薬を供給し、そして、検体液（試料）中に抗ウィルス抗体が存在する（陽性）か否（陰性）かを判定する。
【００２９】
本発明の判定キットは、このような判定を行う際に用いられるものであり、ウィルス由来の抗原１０２を担持したウェル１０１が複数設けられたプレート（本発明のプレート）１０と、抗ＩｇＧ抗体１０４を担持した着色粒子１を含有する試薬（判定試薬）とを有している。
【００３０】
図１に示すように、プレート１０は、平板状をなす部材で構成され、一方の面に複数のウェル１０１が、行列状に配列して設けられている。
【００３１】
プレート１０の構成材料としては、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレンのような樹脂材料等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３２】
ウェル１０１は、その内面に抗原１０２を担持し、検体液および試薬を収納（貯留）するための空間である。
【００３３】
図１に示すように、ウェル１０１は、その底面が収斂形状（本実施形態では、深さが中央部に向かって深くなる形状）をなしている。これにより、沈降した着色粒子１は、ウェル１０１の中央部に向かって転がり、集合して凝集する。その結果、ウェル１０１の中央部で、着色粒子１の色相が濃い色で（濃く着色して）視認されるので、ウェル１０１内での着色粒子１の沈降・凝集（挙動）を容易に確認することができる。
【００３４】
なお、ウェル１０１は、その底面が収斂形状をなすのが好ましいが、最も深くなる箇所は、図示と異なり中央部（中心部）からズレていてもよい。
【００３５】
ウェル１０１の容量は、特に限定されないが、０．０３〜０．５ｍＬ程度であるのが好ましく、０．０５〜０．３ｍＬ程度であるのがより好ましい。ウェル１０１の容量を前記範囲とすることにより、プレート１０の大型化を招くことなく、判定に必要かつ十分な量の液体（検体液や試薬）を収納することができる。
【００３６】
このウェル１０１の内面には、例えば疎水結合によって、抗原１０２が担持されている。
【００３７】
本発明では、各ウェル１０１の内面に、ウィルス由来の複数種（本実施形態では、８種）の抗原１０２を、それぞれ１種類毎に担持してある。
【００３８】
例えば、図２に示すプレート１０では、第１の抗原１０２ａを第１のウェル１０１ａの内面に担持し、第２の抗原１０２ｂを第２のウェル１０１ｂの内面に担持し、同様に、第３〜第８の抗原１０２ｃ〜１０２ｈを、それぞれ第３〜第８のウェル１０１ｃ〜１０１ｈの内面に担持してある。
【００３９】
これにより、生体が特定のウィルスに感染したか否かの判定を正確に行うことができるようになる。これについては、後の判定方法において詳述する。
【００４０】
また、図２に示すプレート１０では、同一の検体液を供給すべきウェル１０１ａ〜１０１ｈが一列に配置されている。これにより、各ウェル１０１ａ〜１０１ｈ内に検体液を供給（分注）する操作が容易となる。また、各ウェル１０１ａ〜１０１ｈにおける着色粒子１の状態を視認し易くなり、ウィルス感染の有無の判定が行い易くなる。
【００４１】
抗原としては、目的とするウィルスに応じて選択されるものであり、特に限定されないが、例えば、目的とするウィルスがＨＩＶ（Human Immunodeficiency Virus）である場合には、例えば、ＨＩＶ−１  ｐ１８、ＨＩＶ−１  ｐ２４、ＨＩＶ−１  ｐ５５、ＨＩＶ−１  ｐ３１、ＨＩＶ−１  ｐ５１、ＨＩＶ−１  ｐ６６、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０、ＨＩＶ−２  ｐ１６、ＨＩＶ−２  ｐ２６、ＨＩＶ−２  ｐ５６、ＨＩＶ−２  ｐ３４、ＨＩＶ−２  ｐ５３、ＨＩＶ−２  ｐ６８、ＨＩＶ−２  ｇｐ３６、ＨＩＶ−２  ｇｐ１０５、ＨＩＶ−２  ｇｐ１４０等が挙げられ、これらの中から複数種を選択するようにすればよい。
【００４２】
ウェル１０１の内面に担持する抗原１０２の量は、０．０１μｇ以上であるのが好ましく、０．０５〜１μｇ程度であるのがより好ましい。抗原１０２の量を前記範囲とすることにより、抗ウィルス抗体１０３が試料（検体液）中に存在する場合には、十分な量の抗ウィルス抗体１０３を抗原１０２に結合させることができ、より正確な検出を行うことができる。なお、抗原１０２の量を前記上限値を超えて多くしても、それ以上の検出結果の精度の向上は期待できない。
【００４３】
本実施形態では、試薬には、抗ＩｇＧ抗体１０４が担持された着色粒子１を含有する懸濁液が用いられる。
【００４４】
この試薬を用いると、図３（ａ）に示すように、抗原１０２に抗ウィルス抗体１０３（一次抗体）が結合している場合、この抗ウィルス抗体１０３に、着色粒子１に担持された抗ＩｇＧ抗体（標識二次抗体）１０４が結合する。これにより、着色粒子１が、ウェル１０１内においてウェル内面に吸着し分散した状態となる。
【００４５】
一方、図３（ｂ）に示すように、抗原１０２に抗ウィルス抗体１０３が結合していない場合、ウェル１０１内において着色粒子１が沈降・凝集した状態となる。
【００４６】
したがって、この試薬をウェル１０１内に供給したときに、着色粒子１がウェル１０１内でウェル内面に吸着し分散した状態で観察された場合には、このウェル１０１の内面に担持した抗原１０２に結合する抗ウィルス抗体１０３が存在することが判り、着色粒子１がウェル１０１内で沈降した状態で観察された場合には、このウェル１０１の内面に担持した抗原１０２に対する抗ウィルス抗体１０３が存在しないことが判る。
【００４７】
なお、本実施形態では、粒子として、着色粒子１を用いる場合について説明するが、本発明では、その他、例えば、蛍光物質等を担持した粒子を用いることもできる。ただし、粒子として着色粒子１を用いることにより、可視光下での判定が可能となるという利点がある。
【００４８】
このような粒子（着色粒子１）には、樹脂材料やセラミックス材料で構成された粒子や、樹脂材料とセラミックス材料とで構成された複合粒子（例えば、樹脂粒子の表面をセラミックス材料で被覆した粒子）等を用いることができる。
【００４９】
樹脂材料としては、例えば、ポリアミド（例えば、ナイロン６、ナイロン６・６、ナイロン６・１０、ナイロン１２）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリイミド、メタクリル樹脂、アクリル樹脂、熱可塑性ポリウレタンのような熱可塑性樹脂、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル、アルキド樹脂、熱硬化性ポリウレタン、エボナイドのような熱硬化性樹脂等が挙げられる。
【００５０】
また、セラミックス材料としては、例えば、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｃｌ２、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（ＰＯ３）２、ＣａＨＰＯ４のようなリン酸カルシウム系化合物、アルミナ、シリカ等が挙げられる。
【００５１】
また、前述した複合粒子は、例えば、樹脂粒子の表面に、市販のハイブリダイゼーション装置やメカノフュージョン装置等を用いて、セラミックス材料の多孔質粒子を衝突させることにより製造することができる。
【００５２】
粒子の比重は、後述する工程［５］において、ウェル１０１内に存在する液体の比重より大きいものが好ましく、具体的には、１．０５〜１．３ｇ／ｃｍ３程度であるのが好ましい。これにより、必要な時（陰性と判定すべき時）に、ウェル１０１内において、粒子を迅速かつ確実に沈降・凝集させることができる。
【００５３】
また、粒子の平均粒径は、３０μｍ以下であるのが好ましく、１〜２０μｍ程度であるのがより好ましい。
【００５４】
粒子を着色粒子１とする場合には、例えば、直接染料、酸性染料、塩基性染料、媒染染料、酸性媒染染料、硫化染料、硫化建染染料、建染染料、可溶性建染染料、アゾイック染料、分散染料、反応染料、酸化染料、合成繊維用染料、蛍光増白染料のような各種染料や、各種顔料を用いて染色すればよい。
【００５５】
この着色粒子１（粒子）の表面には、例えば直接、または固定化剤により、抗ＩｇＧ抗体１０４が固定（担持）されている。
【００５６】
固定化剤としては、グルタールアルデヒド、ホルムアルデヒド、カップリング、四塩化オスミウム等を用いることができる。このうち、カップリング剤としては、例えば、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−チオプロピルトリメトキシシラン、２−（３−トリメトキシシリルプロピルジチオ）−５−ニトロピリジン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−クロロプロピルジメトキシメチルシラン等が挙げられる。
【００５７】
また、着色粒子（着色ビーズ）１の少なくとも表面付近がリン酸カルシウム系化合物で構成される場合、抗ＩｇＧ抗体１０４を着色粒子１の表面に固定した後、着色粒子１の抗ＩｇＧ抗体１０４から露出する部分を、ブロッキング剤でブロック（被覆）するのが好ましい。このブロッキング剤としては、抗原・抗体反応に影響を与えないもの、例えば、カゼイン、アルブミン等が好適に用いられる。
【００５８】
試薬中の着色粒子１の含有量は、特に限定されないが、０．０５〜０．２ｗｔ％程度であるのが好ましく、０．０８〜０．１２ｗｔ％程度であるのがより好ましい。着色粒子１の含有量を前記範囲とすることにより、ウェル１０１内での着色粒子１の挙動を確実に視認することができるようになる。なお、着色粒子１の含有量が多過ぎると、試薬をウェル１０１内に供給（分注）する際の操作において、ピペットの先端が詰まる等の不都合が生じるおそれがある。
【００５９】
なお、試薬の調製に用いる分散媒としては、例えば、トリエタノールアミン塩酸−水酸化ナトリウム緩衝液、ベロナ−ル（５，５−ジエチルバルビツル酸ナトリウム）−塩酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール−塩酸緩衝液、ジエタノールアミン−塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ホウ酸ナトリウム−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液、ホウ酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸二水素カリウム−リン酸水素ニナトリウム緩衝液、リン酸二ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、ブリトン−ロビンソン緩衝液、ＧＴＡ緩衝液等の各種緩衝液またはこれらに生理食塩を加えたもの等が挙げられる。
【００６０】
次に、このような判定キットの使用方法、すなわち、生体が特定のウィルスに感染したか否かを判定する判定方法（本発明の判定方法）について説明する。
【００６１】
［１］  まず、判定に供する検体液を調製する。
この検体液は、生体から採取した試料をそのまま、または、必要に応じて容量を調製（例えば希釈）することにより得られる。
【００６２】
この容量調製用の液体には、例えば、前記試薬の調製で挙げた緩衝液と同様のものを用いることができる。
【００６３】
また、試料としては、例えば、血清（血液）、精液、膣分泌液、母乳、唾液、尿、髄液、リンパ液のような液体や、細胞（組織）のような固体（固形物）を用いることができる。なお、細胞のような固体の試料を用いる場合には、例えば、これを粉砕し、前記緩衝液に懸濁することにより、検体液とすることができる。
【００６４】
試料として血清を用いる場合、検体液は、血清を２〜１０００倍程度（特に、５〜１００倍程度）に希釈して用いるのが好ましい。
【００６５】
［２］  次に、各ウェル１０１（１０１ａ〜１０１ｈ）の内面に、それぞれ抗原１０２（１０２ａ〜１０２ｈ）１種類ずつ担持したプレート１０を用意し、各ウェル１０１内を洗浄液で洗浄する。
【００６６】
この洗浄液には、例えば、前記試薬の調製で挙げた緩衝液と同様のものを用いることができる。
【００６７】
［３］  次に、一列に配置された各ウェル１０１（１０１ａ〜１０１ｈ）内に、それぞれ同一の検体液を分注（供給）する。
【００６８】
各ウェル１０１内に検体液を供給すると、図３（ａ）に示すように、検体液中に抗ウィルス抗体１０３が含まれている場合、この抗ウィルス抗体１０３が、ウェル１０１に担持された抗原１０２に結合する（捕捉される）。
【００６９】
なお、検体液のウェル１０１内への供給量は、特に限定されないが、０．０２〜０．２５ｍＬ程度であるのが好ましく、０．０４〜０．０６ｍＬ程度であるのがより好ましい。
【００７０】
［４］  次に、各ウェル１０１内からそれぞれ検体液を除去し、前記と同様の洗浄液により各ウェル１０１内を洗浄する。
【００７１】
これにより、抗ウィルス抗体１０３の検出に際して、検出を妨害する妨害物質等を除去することができ、抗ウィルス抗体１０３の検出をより正確に行うことができる。
【００７２】
［５］  次に、各ウェル１０１内にそれぞれ試薬を供給する。
ウェル１０１内に試薬を供給すると、図３（ａ）に示すように、抗原１０２に抗ウィルス抗体１０３が結合している場合、この抗ウィルス抗体１０３に、着色粒子１に担持された抗ＩｇＧ抗体１０４が結合する。これにより、着色粒子１が、ウェル１０１内（試薬中）でウェル内面に吸着し分散した状態となり、ウェル１０１内の液体は薄く着色する程度である。この場合、このウェル１０１の内面に担持された抗原１０２に結合する抗ウィルス抗体１０３が存在することが判る。
【００７３】
一方、図３（ｂ）に示すように、抗原１０２に抗ウィルス抗体１０３が結合していない場合、抗ＩｇＧ抗体１０４を担持した着色粒子１は、沈降・凝集した状態となり、ウェル１０１の底に、濃く着色した部分（本実施形態では、スポット）が形成される。この場合、このウェル１０１の内面に担持された抗原１０２に結合する抗ウィルス抗体１０３が存在しないことが判る。
【００７４】
ところが、生体は、多種多様の抗原に対する複数種の抗体を持っており、その中には、本来第１〜第８の抗原１０２ａ〜１０２ｈに対応して産生されたものでない抗体でありながら、第１〜第８の抗原１０２ａ〜１０２ｈにたまたま結合（交叉反応）するものが存在する。かかる抗体が、第１〜第８の抗原１０２ａ〜１０２ｈに結合すると、やはり、着色粒子１がウェル１０１ａ〜１０１ｈ内においてウェル内面に吸着し分散した状態となり、それに対応する抗ウィルス抗体１０３が存在するものと誤認される。
【００７５】
しかしながら、一般に存在する抗体であって、特殊な抗原である第１〜第８抗原１０２ａ〜１０２ｈに交叉反応（cross reaction）を示す抗体は、それ程多く存在しない。
【００７６】
したがって、ウェル１０１ａ〜１０１ｈのうちの所定数（カットライン）以上のウェルにおいて、抗原１０２（１０２ａ〜１０２ｈ）に結合した抗体が検出された場合、検体液が陽性、すなわち、生体がウィルスに感染したものと判定するようにする。
【００７７】
このようにすれば、陰性の検体液であるにも関わらず、陽性と誤って判定されるのを確実に防止することができ、生体のウィルス感染の有無の判定を正確に行うことができる。
【００７８】
ここで、用いる抗原１０２の種類の数をＡとし、生体がウィルスに感染したものと判定する際のウェル１０１の数をＢとしたとき、Ｂ／Ａが０．２以上であるのが好ましく、０．３以上であるのがより好ましい。このようにカットラインを設定することにより、生体のウィルス感染の有無の判定結果の正確性（判定精度）をより向上させることができる。
【００７９】
例えば、２以上のウェル１０１（１０１ａ〜１０１ｈ）において、抗原１０２（１０２ａ〜１０２ｈ）に結合した抗体が検出された場合を陽性とし、ウェル１０１ａ〜１０１ｈのうちの任意の１つのウェルにおいて、抗原１０２（１０２ａ〜１０２ｈ）に結合した抗体が検出された場合、または抗原１０２に結合した抗体が検出されない場合を陰性とするものとすると、図４に示す例では、検体液１〜３が陰性、検体液４、５が陽性とされる。したがって、検体液４、５に用いた試料を提供した生体は、ウィルスに感染したものと判定される。
【００８０】
なお、仮に、第１〜第８の抗原１０２ａ〜１０２ｈを、１つのウェルの内面に担持した構成の従来のプレートを用いて、前述したような交叉反応を示す抗体を含む検体液について、ウィルス感染の有無の判定を行うと、陰性であるにも関わらず、ほぼ１００％の確率で陽性となってしまう。
【００８１】
このような誤判定は、ＨＩＶ感染のような人権に関わるウィルス感染の有無を判定する場合、極力少ないことが望ましい。したがって、本発明は、特に、ＨＩＶ感染の有無を判定する場合への適用に適する。
【００８２】
以上のように、本発明によれば、ウィルス感染の有無のより高い精度での判定を、容易かつ簡便に行うことができる。
【００８３】
また、ＨＩＶ感染の有無を判定する場合、すなわち、抗原１０２としてＨＩＶ抗原１０２’を用い、抗ウィルス抗体１０３として抗ＨＩＶ抗体を検出する場合、前述した判定キットには、例えば、以下に示すような拮抗剤、すなわち、着色粒子１の沈降を阻害する阻害物質１０５がＨＩＶ抗原１０２’へ結合するのを阻止するタンパク質１０６を含有する拮抗剤を追加することができる。
【００８４】
ここで、生体から採取した試料（特に、血清）には、ＨＩＶ抗原１０２’および抗ＩｇＧ抗体１０４’に対して結合して、着色粒子１の沈降を阻害する阻害物質１０５が多数含まれている。
【００８５】
図５に示すように、ウェル１０１内のＨＩＶ抗原１０２’に、このような阻害物質１０５が結合すると、ウェル１０１内に試薬を供給した際に、この阻害物質１０５にさらに抗ＩｇＧ抗体１０４’が結合し、着色粒子１がウェル内面に吸着し分散した状態となる。これにより、本来、ＨＩＶ抗原１０２’に結合した抗ＨＩＶ抗体が存在しないにも関わらず存在するもの誤認される。
【００８６】
そこで、検体液をウェル１０１内に供給するのに先立って、検体液中に阻害物質１０５に対する親和力が、ＨＩＶ抗原１０２’より高いタンパク質１０６を含有する拮抗剤を添加するようにする。これにより、タンパク質１０６が、検体液（試料）中に含まれる阻害物質１０５に選択的（特異的）に結合する。この状態で、検体液をウェル１０１内に供給すると、図６に示すように、阻害物質１０５のＨＩＶ抗原１０２’との結合サイトが、タンパク質１０６によりブロックされているため、阻害物質１０５がＨＩＶ抗原１０２’に結合することが妨げられる（阻止される）。
【００８７】
このため、ＨＩＶ抗原１０２’に結合した阻害物質１０５に、抗ＩｇＧ抗体１０４’がさらに結合し、着色粒子１がウェル１０１内でウェル内面に吸着し分散した状態（陽性）となる現象を回避すること、すなわち、着色粒子１を確実に沈降・凝集させることができる。その結果、抗ＨＩＶ抗体が存在しないにも関わらず存在するものと誤認されるのを確実に防止することができる。
【００８８】
このタンパク質１０６には、阻害物質１０５に対する親和力がＨＩＶ抗原１０２’より高く、かつＨＩＶ抗原１０２’への結合性を実質的に有さないものであれば、いかなるものを用いてもよいが、カゼイン（リンタンパク質）、オボアルブミン（糖タンパク質）、アルブミン、ラクトフェリン（糖タンパク質）およびキモトリプシノーゲンのうちの少なくとも１種を用いるのが好ましく、特に、カゼイン、オボアルブミンおよびラクトフェリンのうちの少なくとも１種がより好ましい。これらのタンパク質は、いずれも、阻害物質１０５に対する親和力がＨＩＶ抗原１０２’より特に高いものであることから好ましい。
【００８９】
拮抗剤の添加量は、特に限定されないが、タンパク質１０６の量としてＨＩＶ抗原１０２’の量１μｇに対して、０．１〜１０ｍｇ程度とするのが好ましく、０．３〜８ｍｇ程度とするのがより好ましい。タンパク質１０６の添加量を前記範囲とすることにより、タンパク質１０６と未結合の阻害物質１０５の量を確実に少なくすることができ、阻害物質１０５の着色粒子１の沈降を阻害する作用（沈降阻害作用）を確実に妨げることができる。なお、タンパク質１０６の添加量を前記上限値を超えて多くしても、それ以上のタンパク質１０６による効果の増大は期待できない。
【００９０】
拮抗剤としては、タンパク質１０６をそのまま用いることもできるが、適当な溶媒に溶解して用いるのが好ましい。これにより、タンパク質１０６の添加量の調製が容易となる。
【００９１】
この溶媒には、例えば、前記試薬の調製で挙げた緩衝液と同様のものを用いることができる。
【００９２】
拮抗阻害剤は、さらに非イオン性界面活性剤を含有するのが好ましい。これにより、ＨＩＶ抗原１０２’または抗ＩｇＧ抗体１０４’に阻害物質１０５が結合するのをより効果的に妨げることができる。
【００９３】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、オクトフェノール−ポリ（エチレングリコエーテル）、ポリ（オキシエチレン）−ソルビタン−モノラウレート、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ｎ−ノナノニル−Ｎ−メチルグルカミド等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００９４】
このような判定キットを用いれば、阻害物質１０５のＨＩＶ抗原１０２’への結合が、タンパク質１０６により阻止することができるので、抗ＨＩＶ抗体が存在しない検体液では、確実に着色粒子１を沈降・凝集させることができる。
【００９５】
また、タンパク質１０６により阻害物質１０５の沈降阻害作用を阻止するので、この阻害物質１０５をウェル１０１内から除去するための洗浄操作が不要である。したがって、作業効率がよく、また、洗浄操作を行っている際に検体液等が周囲に飛散し、作業者が、ＨＩＶに感染する危険を回避することができ、安全性が高い。
【００９６】
また、この場合、検体液としては、試料の希釈倍率の比較的低いものを用いることも可能である。
【００９７】
具体的には、試料として血清を用いる場合、検体液は、血清を２〜１０００倍程度（特に、５〜１００程度）に希釈して用いるのが好ましい。拮抗剤を用いれば、このように低い希釈倍率でも（すなわち、検体液中に比較的多くの阻害物質１０５が存在していても）、確実に着色粒子１に沈降・凝集を生じさせることが可能である。また、この程度の希釈倍率であれば、その操作を比較的容易かつ短時間に行うことができるため、判定操作（作業）に要する時間の短縮を図ることができる。
【００９８】
以上、本発明のプレート、判定キットおよび判定方法について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００９９】
例えば、本発明の判定方法は、必要に応じて任意の１または２以上の工程が追加されてもよい。
【０１００】
また、前記実施形態では、抗体を検出する方法として粒子凝集法を用いる場合を代表にして説明したが、他の検出方法を用いる場合、試薬は、例えば、酵素、放射性物質、蛍光物質等の標識を抗ＩｇＧ抗体に結合した標識二次抗体を含有する液体を用いることができる。
【実施例】
【０１０１】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
（実施例）
＜１＞  まず、Ｖ底のウェル（容量：０．３ｍＬ）が９６個設けられたマイクロプレートを用意した。このマイクロプレートには、１ウェル内に、それぞれ、以下の６種類Ａｇ１〜６（ＨＩＶ抗原）溶液を５０μＬを供給し、各ウェルの内面に、Ａｇ１〜６のうちの１種類を担持させた。また、Ａｇ１〜６は、１列の配置されたウェルの内面に、順に担持させた。
【０１０２】
・Ａｇ１；組み換えHIV-1 IIIB gag p24（ImmunoDiagnostics社製）
：１μｇ／ｍＬ
・Ａｇ２；組み換えウィルス蛋白HIV-1 gp120（Advanced Biotechnologies社製）
：０．５μｇ／ｍＬ
・Ａｇ３；組み換えHIV-2 env(gp36)（Virogen社製）
：１μｇ／ｍＬ
・Ａｇ４；組み換えHIV-1 env(gp41-gp120)（Virogen社製）
：１μｇ／ｍＬ
・Ａｇ５；組み換えHIV-1 p17/24/gp120・gp41（Virogen社製）
：１μｇ／ｍＬ
・Ａｇ６；組み換えHIV-1/-2 env（Virogen社製）
：１μｇ／ｍＬ
【０１０３】
＜２＞  次に、タンパク質としてカゼインを３．４ｍｇ／ｍＬ、非イオン性界面活性剤としてポリ（オキシエチレン）−ソルビタン−モノラウレート（和光純薬工業株式会社社製、「Ｔｗｅｅｎ２０」）を０．２４ｖｏｌ％となるように、それぞれリン酸二水素カリウム−リン酸水素ニナトリウム緩衝生理食塩液に溶解して拮抗剤を調製した。
【０１０４】
＜３＞  そして、予め調製しておいた抗ＨＩＶ抗体陰性の陰性血清（試料）および抗ＨＩＶ抗体陽性の陽性血清（試料）に、それぞれ拮抗剤を添加して１００倍に希釈することにより陰性検体液および陽性検体液を調製した。
【０１０５】
なお、陰性血清および陽性血清には、それぞれＥＬＩＳＡ法により、抗ＨＩＶ抗体陰性および抗ＨＩＶ抗体陽性と判定されたものを用いた。
【０１０６】
＜４＞  次に、陰性検体液および陽性検体液を、それぞれウェル内に０．０５ｍＬずつ供給した。すなわち、カゼインは、Ａｇ１、Ａｇ３〜６（ＨＩＶ抗原）１μｇに対して３．４ｍｇ添加され、Ａｇ２（ＨＩＶ抗原）１μｇに対して６．８ｍｇ添加されたこととなる。
【０１０７】
なお、例えば、Ａｇ１（ＨＩＶ抗原）１μｇに対するカゼインの添加量は、具体的には以下のようにして求められる。
【０１０８】
・１ウェル当たりに供給したカゼイン量
＝３．４ｍｇ／ｍＬ×０．０５ｍＬ＝０．１７ｍｇ
・１ウェル当たりに供給したＡｇ１（ＨＩＶ抗原）溶液の濃度
＝１μｇ／ｍＬ
・１ウェル当たりのＡｇ１（ＨＩＶ抗原）の担持量
＝１μｇ／ｍＬ×５０μＬ＝０．０５μｇ
・１ウェルにおけるＡｇ１（ＨＩＶ抗原）１μｇ当たりのカゼイン量
＝０．１７ｍｇ÷０．０５μｇ＝３．４ｍｇ
【０１０９】
また、ＨＩＶ抗原１μｇ当たりのカゼインの添加量は、Ａｇ３〜６については、Ａｇ１と同様であり、Ａｇ２については、Ａｇ１の２倍量となる。
【０１１０】
そして、各ウェル内に、抗ＨＩＶ抗体に結合する抗体（抗ＩｇＧ抗体）を担持したハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズ（赤色着色粒子）を含有する試薬を供給した。
【０１１１】
なお、試薬中のハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズの含有量は、０．１ｗｔ％とした。また、ハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズは、平均粒径５．８μｍ、比重１．１３ｇ／ｃｍ３であった。
【０１１２】
＜５＞  次に、各ウェル内におけるハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズの挙動を観察した。
【０１１３】
そして、６つのウェルのうち、ハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズの沈降・凝集が認められないウェルが２つ以上の場合を陽性、１以下の場合を陰性とした。
【０１１４】
（比較例）
前記工程＜１＞において、１つのウェル内に、Ａｇ１〜６（ＨＩＶ抗原）溶液を混合した混合液５０μＬを供給し、ウェルの内面に、Ａｇ１〜６の全てを担持させたプレートを用意した以外は、前記実施例と同様にして、ハイドロキシアパタイトコートナイロンビーズの挙動を観察した。
【０１１５】
なお、実施例と同様に計算すると、カゼインは、ＨＩＶ抗原（Ａｇ１〜６の合計）１μｇに対して０．６１８ｍｇ添加されたこととなる。
これらの結果を、図７に示す。
【０１１６】
図７に示すように、実施例では、陰性検体液は、いずれも陰性と判定すべき結果であり、陽性検体液は、陽性と判定するべき結果であった。
【０１１７】
これに対して、比較例では、陰性検体液のうち１つが陽性と判定すべき結果となった。
これは、陰性検体液３中に、抗ＨＩＶ抗体ではないが、Ａｇ６に結合する抗体が存在したためである。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】本発明の判定キットが備えるプレートを模式的に示す斜視図である。
【図２】図１に示すプレートの平面図である。
【図３】本発明の判定方法を説明するための模式図である。
【図４】本発明の判定方法による判定結果を示す図である。
【図５】本発明の判定方法を説明するための模式図である。
【図６】本発明の判定方法を説明するための模式図である。
【図７】実施例および比較例における判定結果を示す写真である。
【符号の説明】
【０１１９】
１            着色粒子
１０          プレート
１０１、１０１ａ〜１０１ｈ  ウェル
１０２、１０２ａ〜１０２ｈ  抗原
１０２’      ＨＩＶ抗原
１０３        抗ウィルス抗体
１０４        抗ＩｇＧ抗体
１０４’      抗ＩｇＧ抗体
１０５        阻害物質
１０６        タンパク質
【図１】
2007114070.tif 000003
【図２】
2007114070.tif 000004
【図３】
2007114070.tif 000005
【図４】
2007114070.tif 000006
【図５】
2007114070.tif 000007
【図６】
2007114070.tif 000008
【図７】
2007114070.tif 000009