(57)【要約】【課題】妊娠高血圧症の患者の母体や胎児に悪影響を及ぼすことがなく、症例の内容に拘わらず有効で実用的な治療薬を提供する。【解決手段】Ｎ末端から７１番目までのアミノ酸配列を、ヒトトリプシンII、ヒトＡ−ＬＡＰのシグナルペプチドに置換することにより得られる分泌型ＡＰＡを、昆虫細胞を利用して培養することによって、ヒトＡＰＡタンパク質を製造した。そして、得られたヒトＡＰＡタンパク質を高血圧症自然発症ラットに経口投与し、その後の平均血圧の変化を調べたところ、ＡＰＡタンパク質の単独投与、連続投与により、短時間の内に血圧が効果的に低下すること、また、長時間に亘って低い血圧が維持されることが分かった。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノペプチダーゼＡを有効成分とする治療薬。
【請求項２】
高血圧症に効能を有することを特徴とする請求項１に記載の治療薬。
【請求項３】
前記高血圧症が、妊娠高血圧症、急性高血圧性脳症、脳出血、急性心不全、急性大動脈解離の内のいずれかであることを特徴とする請求項２に記載の治療薬。
【請求項４】
抗腫瘍薬であることを特徴とする請求項１に記載の治療薬。
【請求項５】
胎盤を通過しないタンパク質を有効成分とする妊娠高血圧症治療薬。
【請求項６】
前記タンパク質がアミノペプチダーゼＡであることを特徴とする請求項５に記載の妊娠高血圧症治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、各種の疾病に対する治療薬に関するものであり、特に高血圧症、その中でも妊娠高血圧症（妊娠性高血圧症）に対して効能を有する治療薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
日本の出生数は近年減少傾向にあるが、その中にあって体重２，５００ｇ以下の未熟児（低出生体重児）の出生数は増加している。その原因として、妊婦の高齢化や社会構造の変化による妊娠高血圧症や切迫早産症例の増加が挙げられる。そのような妊娠高血圧症の治療薬としては、降圧剤のヒドラジン（たとえば、アプレゾリン）、メチルドパ（たとえば、アルドメット）が従来用いられている（特許文献１）。また、妊娠高血圧症が悪化して起こる子癇補発作を抑制するために、硫酸マグネシウムが利用されることもある。
【０００３】
【特許文献１】特開２０００−１７８２４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ヒドラジンやメチルドパ等の降圧剤は、重症妊娠中毒症に対しては必ずしも有効とは言えない。また、妊娠高血圧症の病態においては、胎児がストレスに耐えるべく、血管収縮ペプチドであるアンジオテンシンの分泌を亢進させて自らの血圧を上げようとしている。母体の血圧を下げる目的でヒドラジンやメチルドパ等の血圧降下剤を投与することは、これらの薬剤が胎盤を通過するので、胎児のストレスへの適用に悪影響を及ぼす可能性がある。一方、硫酸マグネシウムは、母体に対して毒性があるばかりでなく、胎盤を通過してしまうため、胎児への副作用が懸念される。
【０００５】
本発明の目的は、上記従来の高血圧症治療薬、特に妊娠高血圧症治療薬の有する問題点を解消し、症例の内容に拘わらず有効であり、妊娠高血圧症の患者に投与した場合に、母体や胎児に悪影響を及ぼすことのない実用的な治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明の内、請求項１に記載された発明は、アミノペプチダーゼＡを有効成分とする治療薬であることを特徴とする。また、請求項２に記載された発明は、請求項１に記載された発明において、高血圧症に効能を有することを特徴とするものであり、請求項３に記載された発明は、請求項２に記載された発明において、前記高血圧症が、妊娠高血圧症、急性高血圧性脳症、脳出血、急性心不全、急性大動脈解離の内のいずれかであることを特徴とするものであり、請求項４に記載された発明は、請求項１に記載された発明において、抗腫瘍薬であることを特徴とするものである。さらに、請求項５に記載された発明は、胎盤を通過しないタンパク質を有効成分とする妊娠高血圧症治療薬であることを特徴とするものであり、請求項６に記載された発明は、請求項５に記載された発明において、前記タンパク質がアミノペプチダーゼＡであることを特徴とするものである。
【０００７】
本発明のアミノペプチダーゼＡ（aminopeptidase A （EC3.4.11.7）；アンジオテンシナーゼともいい、以下、ＡＰＡタンパク質という）としては、人体から採取したもの（精製したものを含む）、あるいは人工的に製造したものを好適に用いることができる。また、ＡＰＡタンパク質を製造する方法としては、Ｎ末端から７１個のアミノ酸を、後述する配列番号１または配列番号２に示されるようなＤＮＡから転写・翻訳される配列番号３（配列番号１に対応）または配列番号４（配列番号２に対応）のシグナルペプチド（すなわち、ヒトトリプシンIIやヒトＡ−ＬＡＰのシグナルペプチド）に置換することにより、本来の細胞膜結合型から細胞外分泌型へと変化させる方法を採用することができる。このような製造方法により、きわめて純度の高いＡＰＡタンパク質を製造することが可能となる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の治療薬によれば、有効成分であるＡＰＡタンパク質が血管収縮ペプチドであるアンジオテンシンIIをアンジオテンシンIIIに代謝分解するため、平均血圧を効果的に降下させることができる。したがって、妊娠高血圧症をはじめとする各種の高血圧症、および急性高血圧性脳症、脳出血、急性心不全、急性大動脈解離等の高血圧性緊急症の治療薬として好適に用いることができる。また、本発明の高血圧症治療薬は、ヒトの血中や臓器内に多く存在するＡＰＡタンパク質を有効成分とするものであり、ヒトに投与しても抗体を産生する可能性がほとんどないため、人体への副作用がきわめて小さい。また、有効成分であるＡＰＡタンパク質の分子量が大きく、胎盤を通過することがないため、妊娠高血圧症の治療の際に、胎児の血圧を低下させることにより胎児に悪影響が及んだり、胎児へ副作用が及んだりする心配がない。
【０００９】
また、アンジオテンシンIIが、腫瘍細胞の血管新生等を介して腫瘍発生や増殖、進展に関与することが明らかになっているが、本発明の治療薬は、アンジオテンシンIIを分解する機能を有するので、各種の癌、たとえば、子宮頸がん、絨毛癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、繊維肉腫、腎臓癌、胃癌、肝癌、大腸癌、肺癌、グリオーム、黒色腫等に対しても効能を発現する。なお、ＡＰＡタンパク質の遺伝子が抗腫瘍作用を有することはすでに知られている（Laboratory Investigation (2004)84,639-648参照）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の治療薬の一実施形態について、図面等に基づいて詳細に説明する。
【００１１】
［ヒトＡＰＡタンパク質の製造方法］
本実施形態においては、Ｎ末端から７１番目までのアミノ酸配列を、配列番号３に示すヒトトリプシンIIや配列番号４に示すヒトＡ−ＬＡＰのシグナルペプチドに置換することにより得られる分泌型ＡＰＡを、昆虫細胞（たとえば、蚕細胞）を利用して培養することによって、ヒトＡＰＡタンパク質を製造した。以下に、その製造方法について詳述する。
【００１２】
（ａ）分泌型ＡＰＡをコードするｃＤＮＡ（配列番号１，２に示すＤＮＡ）の増幅、及びトランスファーベクターの構築
分泌型ＡＰＡをコードするｃＤＮＡの構築は、天然に存在するヒトＡＰＡタンパク質をコードするｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法にて行った。ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）とは、DNA Polymeraseの反応を連続的かつ連鎖的に実行することにより、１セットのprimerの間に挟まれるＤＮＡ断片を特異的に増幅する反応である。
【００１３】
ここでは、ロブスターのトロポミオシンの前駆配列（AACTCCTAAAAAACCGCCACC）からヒトトリプシンIIのシグナル配列（MNLLLILTFVAAAVAA）へと続き、さらにヒトＡＰＡのAla72-Asp76をコードするセンス鎖プライマーからヒトＡＰＡのLeu953-Gly957、そして６個のヒスチジン残基、終止コドンとなるようにコードすべく設計したアンチセンス鎖プライマーを用いた。そして、そのアンチセンス鎖プライマーを、９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で３分を１サイクルとした過程を３０サイクル繰り返して、目的とするＤＮＡ断片を増幅した。増幅後のＤＮＡ断片は、アガロースゲルを用いた電気泳動にて分離し、目的のＤＮＡ断片を、ゲルから従来の方法により回収・精製した。
【００１４】
その後、インビトロジェン社のpENTR-/D-TOPOクローニングキットにて、精製されたＤＮＡ断片をpENTRプラスミドへと組み込んだ。さらに、インビトロジェン社Geteway LRクロナーゼによって、分泌型ＡＰＡのｃＤＮＡをバキュロウイルスへのトランスファーベクターであるpDEST8（インビトロジェン社）へと組み込むことによって、トランスファーベクターを構築した。
【００１５】
（ｂ）分泌型ＡＰＡ発現バキュロウイルスの作製
大腸菌は原核生物であるため、動物等の真核生物由来の発現系を用いてタンパク質（たとえば、ヒトＡＰＡタンパク質）を発現させると、正しいフォールディングをとれないといった事態が多々発生する。そこで、真核細胞を用いた大量発現系として、バキュロウイルス−昆虫細胞系に注目した。バキュロウイルス発現系は、哺乳動物細胞系と比べると非常に安価である上、培養に係る作業等も煩わしくなく、使い勝手が非常に良い。また、目的とするタンパク質を大量に且つ本来の生物学的性質を保持した状態で発現させることができるといった特性を備えている。
【００１６】
そのようなバキュロウイルス発現系において、たとえば、リコンビナントタンパク質の分野でバキュロウイルといえば、核多角体病ウイルス（Nuclear Polyhedorosis Virus : NPV）と呼ばれる昆虫の二本鎖ＤＮＡウイルスのことである。そして、このグループのウイルスは、感染細胞の核内にポリヘドリンと呼ばれるタンパク質からなる多角体と呼ばれる封入体を大量に作るという特徴を備えている。そこで、このポリヘドン遺伝子の非常に強力なプロモーターを利用して昆虫細胞内でリコンビナントタンパク質の合成を行わせるのが、バキュロウイルス発現系である。
【００１７】
このようなバキュロウイルス発現系として、現在一般的に用いられているものは、ベクターとして夜蛾科のバキュロウイルスAutographa californica NPV（AcNPV）を、感染細胞として同じく夜蛾科のSpodoptera Frugiperdaの幼虫由来のSf9を用いたシステムである。他にも、カイコ(Bombix mori）の核多角体病ウイルスBmNPVを用いたシステムも日本で開発されている。後者のカイコを利用したシステムは、高価な血清を含む培地を使用した大容量の培養を行わなくても、組換え体ウイルスをカイコの幼虫に直接接種することによって大量に産物を得ることができるという利点がある。なお、本発明のＡＰＡタンパク質の製造にあたっては、どちらのシステムも適用可能である。
【００１８】
さらに、組換え型ウイルスの作製について説明する。バキュロウイルスの遺伝子は１３０ｋｂもあるため、発現させたい遺伝子をポリヘドリンプロモーターの下流に直接挿入することは、一般的な試験管内で行うＤＮＡ操作では不可能である。しかしながら、インビトロジェン社のBac-to-Bacシステムを利用することで簡便かつ迅速に組換えウィルスを作製することが可能である。それゆえ、上述の如く、目的のＤＮＡ断片を一旦トランスファーベクターと称されるプラスミドに組み込んだ後、大腸菌DH10Bac（インビトロジェン社）へと導入し、分泌型ＡＰＡのｃＤＮＡを含むバクミドＤＮＡを作製した。
【００１９】
Bac-to-Bacシステムでは、まず発現させたい遺伝子を大腸菌のトランスポゾン Tn7の両末端の配列を持つドナープラスミドに組み込み、これをTn7のターゲットサイトと大腸菌での複製起点を組み込んだバキュロウイルスＤＮＡ(バキュロウイルスシャ トルベクター=バクミド)を持つ大腸菌DH10Bacに導入した。この菌にはトランスポザーゼを発現するヘルパープラスミドも導入してあり、菌体内でドナープラスミドの目的遺伝子を含む領域がトランスポザーゼの働きによってバクミドへと転移し、組換え型バクミドを得ることができる。バクミドは、大腸菌から精製して昆虫細胞にトランスフェクションすれば、昆虫細胞内でウイルスが作製される。この方法では、ウイルスＤＮＡへの外来遺伝子の挿入を大腸菌内で行なうため、時間が短縮できることと、この段階でウイルスのクローン化されていることになり非組換え型ウイルスを除き目的のウイルスのみにする操作（純化）が必要ない、といった利点を有している。
【００２０】
このようにして得られたヒト分泌型ＡＰＡのバクミドＤＮＡを、Cellfection試薬試薬（インビトロジェン社）にてSf9細胞へと導入した後、同細胞を２７℃、３日間培養を行ってウイルスの作製を行った。その後、培養上清中に分泌されたウイルスの回収を行い、２度の増幅を行って、高力価のウイルス液を作製した。
【００２１】
（ｃ）ヒトＡＰＡタンパク質の発現
上述の如く得られた組換え型ウイルスをスケールアップして増大させ、高タイターのウイルスストックを得た。なお、スケールアップの際、あまり継代数を多くすると変異株が出現して発現効率が低下するため、６代以上は継代しない方が好ましい。また、得たウイルスストックは−８０℃で半永久的に保存可能であるが、凍結融解によりタイターが下がる。したがって、４℃でも２年程度であれば保存可能であるため、使用分にあたっては凍結しない方が好ましい。
【００２２】
効率の良くタンパク質を発現させるためには、１細胞あたりに出来るだけ多くのウイルスを感染させることが必要である。そこで、ＭＯＩ（Multiphcity of Infection）を５〜１０程度とする。また、細胞の密度が非常に高くなってから感染させるよりも、対数増殖機にある状態で感染させるようにした。分泌ＡＰＡの発現は、感染後４８〜７２時間でピークになるのが一般的であるが、一応タイムコースをとって観察した。
【００２３】
本実施形態では、Sf9細胞を、酵素濃度８ｐｐｍとなるように制御可能な３リットルのスピナーフラスコを用いて無血清培地SFM900II（インビトロジェン社）中、２７℃の条件のもとで培養した。そして、細胞濃度が１．５×１０６細胞／ｍＬまで達した後、上述の如く作製した高力価ウイルス液をウイルスと細胞との比が略１０：１（ＭＯＩ＝１０）となるように添加してウイルス感染を行った。さらに、ウイルス感染後３日間培養を続け、タンパク質の発現を行った。
【００２４】
（ｄ）ヒトＡＰＡタンパク質の精製
上記３リットルの培養液を回収し、遠心分離機によって細胞と培養上清とを分離した。また、分離されたヒトＡＰＡタンパク質を含む細胞培養上清を、４℃、３６時間、５０ｍＭの条件のもとTris-HCL溶液（pH8.0）にて透析した。なお、透析方法としては、affinity chromatographyを用いた。
【００２５】
そして、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥ  トーヨーパール：東ソー社）により精製した後、コバルトイオンを用いた金属キレートカラムクロマトグラフィー（キレーティングセファロース：アマシャムバイオサイエンス社）によって精製することによって、ヒトＡＰＡタンパク質を得た。
【００２６】
［投与実験１］
得られたＡＰＡタンパク質を２匹の高血圧症自然発症ラット（１０週齢のＳＨＲ：ラット１，２とも体重は約３００ｇ）に投与し、その後の平均血圧の変化を調べた。ラット１の当初の血圧は、１５５ｍｍＨｇであり、ラット２の当初の血圧は、１６７ｍｍＨｇであった。ＡＰＡタンパク質の投与は、１日当たり１．６ｍｇ／ｋｇをＰＢＳ（phosphate-buffered salt saline）に混ぜてラットの静脈に注射することによって行い、血圧の測定は、Ｔａｉｌ−Ｃｕｆｆ法により行った。ＡＰＡタンパク質を投与した後の経過時間に対する血圧の変化を図１に示す。図１より、ラット１、ラット２のいずれについても、ＡＰＡタンパク質の投与により、短時間（３時間）の内に血圧が効果的に低下すること、また、長時間（４８時間以上）に亘って低い血圧が維持されることが分かる。
【００２７】
［投与実験２］
ＡＰＡタンパク質のラットへの投与量を１日当たり０．８ｍｇ／ｋｇに変更した以外は投与実験１と同様にして投与実験２を行った。投与実験２においてＡＰＡタンパク質を投与したラット３の当初の血圧は、１６１ｍｍＨｇであり、ラット４の当初の血圧は、１６３ｍｍＨｇであった。また、ラット３，４とも体重は約３００ｇであった。ＡＰＡタンパク質を投与した後の経過時間に対する血圧の変化を図２に示す。図２より、投与実験１と同様に、ＡＰＡタンパク質の投与により、短時間の内に血圧が効果的に低下すること、また、長時間（３６時間以上）に亘って低い血圧が維持されることが分かる。
【００２８】
［投与実験３］
ＡＰＡタンパク質のラットへの投与量を１日当たり０．１６ｍｇ／ｋｇに変更した以外は投与実験１，２と同様にして投与実験３を行った。投与実験３においてＡＰＡタンパク質を投与したラット５の当初の血圧は、１８５ｍｍＨｇであり、ラット６の当初の血圧は、１６４ｍｍＨｇであった。また、ラット５，６とも体重は約３００ｇであった。ＡＰＡタンパク質を投与した後の経過時間に対する血圧の変化を図３に示す。図３より、投与実験１，２と同様に、ＡＰＡタンパク質の投与により、短時間の内に血圧が効果的に低下すること、また、長時間（３６時間以上）に亘って低い血圧が維持されることが分かる。
【００２９】
［投与実験４］
得られたＡＰＡタンパク質を高血圧症自然発症ラット（１０週齢のＳＨＲ：体重約３２０ｇ）に断続的に投与し、その後の平均血圧の変化を調べた。ラットの当初の血圧は、１８２ｍｍＨｇであった。ＡＰＡタンパク質の投与は、最初の投与については、１日当たり０．１６ｍｇ／ｋｇをＰＢＳに混ぜてラットの静脈に注射することによって行い、最初の投与から２４毎に、１日当たり０．３２ｍｇ／ｋｇの投与を同様の方法により４回繰り返した。また、血圧の測定は、投与実験１〜３と同様に行った。ＡＰＡタンパク質を投与した後の経過時間に対する血圧の変化を図４に示す。図４より、ＡＰＡタンパク質の投与により、短時間（３時間）の内に血圧が効果的に低下すること、また、その後、血圧が上昇するものの、長時間（１２０時間以上）に亘って血圧が投与前より低い値に維持されることが分かる。
【００３０】
［投与実験５］
得られたＡＰＡタンパク質を高血圧症自然発症ラット（１０週齢のＳＨＲ：体重約３８０ｇ）に断続的に投与し、その後の平均血圧の変化を調べた。ラットの当初の血圧は、１９１ｍｍＨｇであった。ＡＰＡタンパク質の投与は、１日当たり０．１６ｍｇ／ｋｇをＰＢＳに混ぜてラットの静脈に注射することによって行い、２４毎に同様な投与を４回繰り返した。また、血圧の測定は、投与実験１〜４と同様に行った。ＡＰＡタンパク質を投与した後の経過時間に対する血圧の変化を図５に示す。図５より、ＡＰＡタンパク質の投与により、短時間（３時間）の内に血圧が効果的に低下すること、また、その後、血圧が上昇するものの、長時間（１４４時間以上）に亘って血圧が投与前の血圧に対して非常に低いレベルに維持されることが分かる。
【００３１】
［投与実験６］
得られたＡＰＡタンパク質を３匹の高血圧症自然発症ラット（１２週齢のＳＨＲ：ラット７〜９の体重は、いずれも約３００ｇ）に断続的に投与し、その後の平均血圧の変化を調べた。ラット７の当初の血圧は、１９８ｍｍＨｇであり、ラット８の当初の血圧は、１９９ｍｍＨｇであり、ラット９の当初の血圧は、１８２ｍｍＨｇであった。ＡＰＡタンパク質の投与は、１日当たり０．０１６ｍｇ／ｋｇをＰＢＳに混ぜてラットの静脈に注射することによって行い、２４毎に同様な投与を３回繰り返した。また、血圧の測定は、投与実験１〜５と同様に行った。ＡＰＡタンパク質を投与した後の経過時間に対する血圧の変化を図６に示す。図６より、ＡＰＡタンパク質の初回の投与により血圧が効果的に低下すること、また、その後、血圧が次第に上昇するものの、長時間（１２０時間以上）に亘って血圧が投与前より低い値に維持されることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明の治療薬は、上記の如く優れた血圧降下作用を有するものであるので、妊娠高血圧症をはじめとする各種の高血圧症の治療薬として好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＡＰＡタンパク質を１回投与した後の経過時間に対する血圧の変化をプロットしたものである。
【図２】ＡＰＡタンパク質を１回投与した後の経過時間に対する血圧の変化をプロットしたものである。
【図３】ＡＰＡタンパク質を１回投与した後の経過時間に対する血圧の変化をプロットしたものである。
【図４】ＡＰＡタンパク質を連続投与したときの経過時間に対する血圧の変化をプロットしたものである。
【図５】ＡＰＡタンパク質を連続投与したときの経過時間に対する血圧の変化をプロットしたものである。
【図６】ＡＰＡタンパク質を連続投与したときの経過時間に対する血圧の変化をプロットしたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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