(57)【要約】【課題】細胞または細胞由来成分、または血液や血液由来成分から高い免疫活性増強作用を有する細胞や細胞由来成分などを製造する方法、前記製造法により得られた免疫活性増強作用を有する細胞または細胞由来成分、並びに免疫増強材料、免疫活性増強器具を提供する。【解決手段】細胞または細胞由来成分と、免疫活性増強材料とを接触させることを特徴とし、前記免疫活性増強材料は、免疫活性誘導物質と、免疫活性誘導物質における免疫活性誘導作用を増強させる免疫活性誘導増強作用を有しかつ水に不溶性の誘導増強物質とを含む、免疫活性増強された細胞または細胞由来成分の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞または細胞由来成分と、免疫活性増強材料とを接触させることを特徴とし、前記免疫活性増強材料は、免疫活性誘導物質と、免疫活性誘導物質における免疫活性誘導作用を増強させる免疫活性誘導増強作用を有しかつ水に不溶性の誘導増強物質とを含むことを特徴とする、免疫活性増強された細胞または細胞由来成分の製造方法。
【請求項２】
前記細胞または細胞由来成分が、血液細胞または血液由来成分である、請求項１に記載の免疫活性増強された細胞または細胞由来成分の製造方法。
【請求項３】
前記免疫活性誘導物質が、細胞性免疫活性増強を誘導させる物質である、請求項１または２に記載の細胞または細胞由来成分の製造方法。
【請求項４】
前記細胞性免疫活性増強がＴヘルパー１型活性増強である、請求項１または２に記載の細胞または細胞由来成分の製造方法。
【請求項５】
前記細胞性免疫活性増強がナチュラルキラー活性増強である、請求項１または２に記載の細胞または細胞由来成分の製造方法。
【請求項６】
前記細胞性免疫活性増強が細胞傷害性Ｔリンパ球活性増強である、請求項１または２に記載の細胞または細胞由来成分の製造方法。
【請求項７】
前記免疫活性増強がサイトカイン誘導活性増強である、請求項１または２に記載の細胞または細胞由来成分の製造方法。
【請求項８】
前記サイトカイン誘導活性増強がインターフェロンγ誘導活性増強である、請求項１または２に記載の細胞または細胞由来成分の製造方法。
【請求項９】
前記免疫活性増強が自然免疫活性増強である、請求項１または２に記載の細胞または細胞由来成分の製造方法。
【請求項１０】
前記自然免疫活性増強がマクロファージ活性増強である、請求項１または２に記載の細胞または細胞由来成分の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫活性増強された細胞または細胞由来成分の製造方法により得られた細胞または細胞由来成分。
【請求項１２】
請求項１〜１０に記載の免疫活性増強された細胞または細胞由来成分の製造方法に用いられる免疫活性増強材料であって、免疫活性誘導物質と、前記免疫活性誘導物質の免疫活性誘導作用を増強する水に不溶性の誘導増強物質とを含む、免疫活性増強材料。
【請求項１３】
前記水に不溶性の誘導増強物質が巨大網目構造を有する多孔性材料である請求項１２に記載の免疫活性増強材料。
【請求項１４】
前記巨大網目構造を有する多孔性材料が、細孔分布が２〜２０００Åであることを特徴とする請求項１２または１３に記載の免疫活性増強材料。
【請求項１５】
前記水に不溶性の誘導増強物質が中心線平均粗さ０．１〜１０μｍである表面粗さを有することを特徴とする請求項１２〜１４に記載の免疫活性増強材料。
【請求項１６】
前記水に不溶性の誘導増強物質が高分子材料から成る請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の免疫活性増強材料。
【請求項１７】
前記高分子材料は、ポリスチレン系高分子材料、アクリルエステル系高分子材料、ポリエチレンテレフタレート系高分子材料、ナイロン系高分子材料、セルロース系高分子材料の少なくとも１種の高分子材料から成ることを特徴とする請求項１６に記載の免疫活性増強材料。
【請求項１８】
前記水に不溶性の誘導増強物質が活性炭から成る材料であることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の免疫活性増強材料。
【請求項１９】
免疫活性誘導物質は、菌体及び／または菌体由来成分であることを特徴とする請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の免疫活性増強材料。
【請求項２０】
免疫活性誘導物質は、抗酸菌及び／または抗酸菌由来成分であることを特徴とする請求項１９に記載の免疫活性増強材料。
【請求項２１】
免疫活性誘導物質は、溶連菌及び／または溶連菌由来成分であることを特徴とする請求項１９に記載の免疫活性増強材料。
【請求項２２】
請求項１〜１０に記載の免疫活性増強された細胞または細胞由来成分の製造方法に用いられる免疫活性増強器具であって、免疫活性誘導物質と、前記免疫活性誘導物質の免疫活性誘導作用を増強する作用を有し、水に不溶性の誘導増強物質とを含む免疫活性増強材料と、該免疫活性増強材料を収納してなる容器とを備えることを特徴とする免疫活性増強器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫活性増強された細胞または細胞由来成分の製造方法、及び該製造方法により得られた免疫活性増強材料並びに免疫活性増強器具に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫活性を増強して癌や感染症などの免疫疾患を治療するさまざまな方法が試みられている。免疫賦活薬として、結核菌製剤であるＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕeｒｉｎ）や溶連菌製剤であるＯＫ−４３２（ピシバニール）、レンチナン、シゾフィラン、クレスチンなどが知られている。
【０００３】
また、免疫に関与するサイトカインであるインターロイキン２やインターフェロン類なども免疫活性を増強させる作用が期待され、一部の疾患の治療に用いられている。
【０００４】
一方、細胞などを体外で処理することによる細胞の腫瘍細胞傷害活性を高める方法やサイトカインを誘導する方法も知られている。（特許文献１、特許文献２）
【特許文献１】特開昭６１−２７７６２８号公報
【特許文献２】特開２００３−２０１２５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記免疫賦活薬による治療では、体内に投与しても十分な免疫活性増強作用が発揮されず、期待される治療効果が得られないなどの課題があり、また効果を高めようと投与量を増加させると重篤な副作用が発現されるなどの問題点があった。
【０００６】
精製または遺伝子組換えにより製造されたサイトカインによる癌の治療なども期待されたが、体内で作用する濃度を考えると非常に過剰量のサイトカインを投与するにも関わらず期待された免疫活性増強作用は得られていない。
【０００７】
また、細胞などを体外に取り出し、体外で細胞の抗腫瘍性活性を増強させようとする細胞療法方法では、細胞の培養や活性化処理に非常に手間がかかり、また培養中の異物や微生物などが混入する可能性も大きく、安全で有効な治療が行い得ないなどの問題がある。また、使用している刺激剤や培地成分などの完全な除去が難しいなど、体内に安全に細胞や細胞由来成分を投与できないという問題もあった。
【０００８】
このように、体内において、あるいは体外の血液や細胞の由来成分において、免疫活性を増強させる方法が知られているが、安全に、かつ簡便に、高い免疫活性増強作用を発揮する方法や高い免疫活性増強作用を有する血液や細胞の由来成分を得る方法などが望まれている。
【０００９】
体外に取り出した細胞を、生理活性物質が固定化された不溶性担体と接触させて細胞を刺激して腫瘍細胞傷害活性を有する細胞を得る方法などが知られている。
【００１０】
これらは上記のように体内に投与すると副作用を発現する生理活性物質を不溶性の担体に固定化することで、体外で細胞などに作用させることを目的としている。これらの担体は生理活性物質が反応溶液や培地中、あるいは細胞に混入しないための用途に用いられているに過ぎない。また、ＬＰＳなどを固定化する不溶性担体においても腫瘍細胞傷害活性を誘導する作用に担体は何ら積極的な関与をしない。実際にこれらの細胞や血液と接触するような医用材料では生体適合性材料が用いられており、これらの材料は白血球などの細胞と反応しない性質が求められてきた。  
【００１１】
一方、体外でサイトカイン誘導物質のサイトカイン誘導作用を増強させる材料や用具の開示がなされている（特許文献２）。これらは血液などとサイトカイン誘導物質とサイトカイン誘導増強作用を有する不溶性材料から構成され、インターフェロンγなどのサイトカインを誘導増強させることができる。しかしながら、サイトカインを誘導増強させる方法などが開示されているが、これらの誘導されたサイトカインが従来の精製あるいは遺伝子組み換えにより得られたサイトカインと比較してどのような作用を示すのかは一切開示されていない。また、このような誘導増強されたサイトカインがどのような生物活性を発揮するのか示されてはいない。
【００１２】
また、材料に特異的な官能基を付与したり、表面粗さを付与することによって血液からサイトカインを誘導する材料などが知られている。しかしながら腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）などの限定されたサイトカインを誘導することが開示されているこれらの材料では、誘導されたサイトカインを含む血液などの組成物の生理活性や作用については何も開示されていない。
【００１３】
このように、細胞や血液から免疫活性増強作用を引き出すための、簡便で安全な方法は知られていない。
【００１４】
本発明の目的は、細胞または細胞由来成分、または血液や血液由来成分から高い免疫活性増強作用を有する細胞や細胞由来成分などを製造する方法、前記製造法により得られた免疫活性増強作用を有する細胞または細胞由来成分、並びに免疫活性増強材料、免疫活性増強器具を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の免疫活性増強された細胞または細胞由来成分の製造方法は、細胞または細胞由来成分と、免疫活性増強材料とを接触させることを特徴とし、前記免疫活性増強材料は、免疫活性誘導物質と、免疫活性誘導物質における免疫活性誘導作用を増強させる免疫活性誘導増強作用を有しかつ水に不溶性の誘導増強物質とを含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明により得られる免疫活性増強された細胞または細胞由来成分は、それを新たに白血球などのような免疫細胞に作用させることにより白血球などの免疫細胞の免疫活性を著しく増強させる作用を有する。このように、本発明で製造される細胞または細胞由来成分は、白血球などの免疫細胞などの免疫細胞の免疫活性を増強する作用を示すことが特徴である。
【００１７】
本発明は、免疫活性誘導物質の免疫活性誘導作用を増強させる免疫活性誘導増強作用を有する、水に不溶性の誘導増強物質を用いる免疫活性増強された細胞または細胞由来成分の製造方法に関するものである。
【００１８】
なお、本発明においては、免疫活性増強材料と接触されることにより、免疫活性増強された細胞または細胞由来成分が得られるが、この場合、細胞または細胞由来成分を独立に取り出す必要は必ずしもなく、例えば、細胞または細胞由来成分を含む血液、血漿、血漿成分、血清、血清成分、生体由来成分または緩衝液などの液体成分などを免疫活性増強材料と接触させることにより得られた血液、血漿、血漿成分、血清、血清成分、生体由来成分または緩衝液などの液体成分なども、本発明の実施態様として含まれるものである。
【００１９】
また、本発明他の態様としては、血液、血漿、血漿成分、血清、血清成分、生体由来成分または緩衝液などの液体成分などと、免疫活性増強材料とを接触させることを特徴とし、上記免疫活性増強材料が、免疫活性誘導物質と、免疫活性誘導物質における免疫活性誘導作用を増強させる免疫活性誘導作用を有し、かつ水に不溶性の免疫活性誘導物質とを含むことを特徴とする、血液、血漿、血漿成分、血清、血清成分、生体由来成分または緩衝液などの液体成分などの製造方法が挙げられる。
【００２０】
免疫活性誘導物質としては特に限定はされないが、菌体および／または菌体由来成分から成ることが好ましい。
【００２１】
また、菌体および／または菌体由来成分としては、抗酸菌および／または抗酸菌由来成分が特に好ましい。抗酸菌としては、結核菌、とくにウシ型結核菌弱毒株であるＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕeｒｉｎ）が特に好ましく、ＢＣＧの細胞壁成分であるＢＣＧ−ＣＷＳや核酸成分であるＣｐＧモチーフやポリＩ：Ｃ、ポリＡ：Ｕなど、脂質多である糖リポアラビノマンナン、構成成分であるＭｕｒａｍｙｌ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅなども特に好ましい。ヒト型結核菌由来成分であるＰＰＤ（結核菌精製物），ＳＳＭ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｏｆ  Ｍａｒｕｙａｍａ）なども用いることができる。
【００２２】
菌体由来成分としては、溶連菌および／または溶連菌由来成分も特に好ましく、ストレプトコックス・ピオゲネス（Ａ群３型）Ｓｕ株ペニシリン処理凍結乾燥品の溶連菌製剤であるＯＫ−４３２やＯＫ−４３２由来成分であるリポタイコ酸も特に好ましい。
【００２３】
また、免疫活性誘導物質としては、担子菌および／または担子菌由来成分（担子菌とは菌界に属するものでいわゆるキノコとして知られている生物を含むグループである）が好ましい。
【００２４】
また、免疫活性誘導物質としては、レンチナン、シゾフィラン、クレスチンなども好ましい。
【００２５】
また、上記免疫活性誘導物質としては、例えば、放線菌及び放線菌由来成分や菌体由来成分のＮｏｃａｒｄｉａ−ＣＷＳやＬｅｖａｍｉｓｏｌｅ、ＤＮＣＢ、Ａｚｉｍｅｘｏｎ、Ｔｉｌｏｒｏｎｅ、Ｂｅｓｔａｔｉｎ等の化学物質も挙げられる。
【００２６】
水に不溶性の誘導増強物質としては特に限定されないが、上記誘導増強物質としては水に不溶性であればよく、例えば、金属、有機物又は無機物等により構成され、好ましくは有機物材料、より好ましくは高分子材料からなる。
【００２７】
上記金属としては、例えば、金若しくは金合金、銀若しくは銀合金、チタン若しくはチタン合金、又は、ステンレス等が挙げられる。上記無機物としては、例えば、ガラス又はガラスの誘導体、シリカ系組成物、アルミナ、ヒドロキシアパタイト、活性炭等が挙げられる。
【００２８】
上記有機物材料又は高分子材料としては、例えば、セルロース系、アガロース系、デキストラン系、ポリスチレン系、アクリルエステル系、ポリエチレンテレフタレート系、ナイロン系、ポリビニルアルコール系、ポリスルホン系、ポリアミド系、ポリアクリロニトリル系、ポリエチレン系、ポリウレタン系、ポリプロピレン系、ポリエステル系等の材料が挙げられる。
【００２９】
上記ポリスチレン系の材料としては、例えば、ジビニルベンゼン−スチレン共重合体等が挙げられ、アクリルエステル系の材料としては、例えば、ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート等が挙げられる。
【００３０】
上記高分子材料としては、なかでも、ポリスチレン系、アクリルエステル系、ナイロン系、ポリエステル系、セルロース系、ポリビニルアルコール系高分子材料からなるものが好ましい。
【００３１】
また上記誘導増強物質としては活性炭から成る材料が好ましい。
【００３２】
上記高分子材料は無極性であり、かつ、疎水性であってもよく、この場合、ポリスチレン系高分子材料等を用いることができる。また、これらの高分子材料には、必要に応じて、表面修飾や表面コーティング等により、表面に極性や親水性を付与することもできる。
【００３３】
上記誘導増強物質の形状としては特に限定されず、例えば、繊維状、不織布状、スポンジ状、粒子状、膜状、中空糸状等の公知の形状を用いることができる。上記誘導増強物質の大きさとしては、粒子状では好ましい下限は５０μｍ、好ましい上限は１０ｍｍであり、より好ましくは、２ｍｍであり、繊維状では繊維径が１０μｍ以下であることが好ましく、５μｍ以下であることがより好ましい。上記誘導増強物質が繊維状である場合は不織布からなることが好ましく、繊維径は３μｍ以下であることが好ましい。
【００３４】
上記誘導増強物質は、白血球を吸着する材料からなることが好ましく、白血球を吸着する材料としては、例えば、ポリスチレン系、アクリルエステル系、ポリエステル系、ナイロン系、ポリビニルアルコール系または酢酸セルロース等のセルロース系材料からなる高分子材料やガラス系の材料等や活性炭から成る材料が挙げられる。
【００３５】
また上記誘導増強物質としては、巨大網目構造を有する多孔性材料からなるものが好ましい。特に巨大網目構造からなる細孔を有する多孔性高分子材料であることが好ましい。
【００３６】
上記多孔性材料は、細孔分布が２〜２０００Åであることが好ましい。この細孔分布は通常に使用されている細孔の測定方法を用いて算出することができ、市販の多孔性材料において品質表示されているものと同様の方法で算出することができる。（三菱化学社ダイヤイオン、ロームアンドハース・ジャパン社アンバーライトなどの資料による。）
【００３７】
上記巨大網目構造を有する多孔性材料の細孔分布としては、下限が２Å、上限が２０００Åであることが好ましい。また、細孔分布としては、下限が２０Å、上限が８００Åであることが特に好ましい。細孔分布としては細孔容積の５〜９５％を占める細孔径で示されても良い。
【００３８】
また、上記多孔性高分子材料の表面積としては、４００ｍ２／ｇ以上であることが好ましく、細孔容積としては、０．５ｍＬ／ｇであることが好ましい。
【００３９】
上記多孔性高分子材料を大別すると標準的なゲル構造をもつゲル型と、巨大網目構造（Ｍａｃｒｏ  ｒｅｔｉｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）をもつＭＲ型とに分けられる。また、単にスチレンとジビニルベンゼンのような架橋剤を用いて重合して得られた多孔性樹脂等は透明に近く、ゲル構造を呈するのでゲル型多孔性樹脂と呼ばれる。一方、特殊な重合法によると物理的に多孔性の樹脂等を製造することができ、このような樹脂はＭＲ型又はポーラス型多孔性樹脂と呼ばれる。更に、懸濁重合の際において水に不溶でモノマーだけを溶かすことのできる特殊な有機溶剤を使用することにより、粒子の内部奥にまで大きな孔（マクロポア）をもったＭＲ型又はポーラス型の粒子を作製することができる。
【００４０】
粒子状の多孔性高分子材料としては、例えば、強酸性陽イオン交換樹脂、弱酸性陽イオン交換樹脂、強塩基性陰イオン交換樹脂、弱塩基性陰イオン交換樹脂、合成吸着剤の他、キレート樹脂等からなるものが挙げられる。これらの多孔性粒子は公知の方法によって得ることができ、例えば、原料モノマーをゼラチン等の適当な懸濁安定剤を用いて水中で懸濁重合することにより球状の重合体として製造される。上記原料モノマーとしては、スチレン、ビニルトルエン、アクリル酸エチル、メタクリル酸メチル、アクリロニトリル等のエチレン性二重結合を有する化合物が用いられ、これにジビニルベンゼン、エチレンジメタクリレート等の多官能性モノマーである架橋剤を加え、多孔化剤の存在下過酸化ベンゾイル、アゾビスイソブチルニトリル等の重合開始剤を用いて架橋重合体を得る。上記多孔性粒子のうち市販されているものとしては、例えば、三菱化学社製ダイヤイオン、ロームアンドハース社製アンバーライト等、ダウケミカル製ダウエックス等が挙げられる。
【００４１】
例えば、架橋結合をもった球状樹脂はスチレンとジビニルベンゼン（架橋剤）のモノマーを水に懸濁し、重合して作ることができるが、この時にモノマーを溶解するような適当な溶媒を加えると、重合の過程で相分離が誘発されて、その結果、下記の細孔分布測定法によって測定できる範囲の多孔度を有する高分子材料が作製される。
【００４２】
細孔分布は従来より用いられている一般的な試験方法にて測定することができる。このような試験方法としては、例えば、水銀圧入法とガス吸着法そしてバブルポイント法等が挙げられる。水銀圧入法では、一般的に水銀圧入式ポロシメーターといわれている測定装置が用いられる。この原理は試料を真空処理できる容器に入れ、微細な孔に入っている水分や様々なガスを取り除く前処理をした後に、試料を水銀で覆うようにする。そして、水銀全体に圧力をかけていくと、水銀は逃げ場がなくなり、試料の表面にあいている微細な孔に入り出すことにある。圧力を上げれば上げるだけ、水銀は小さな孔に入っていくので、（つまり圧力と孔の大きさは反比例しているので）かけた圧力と水銀の変化量を調べると、孔の大きさ（横軸）と孔の容積（縦軸）の関係のグラフ（細孔分布曲線）を得ることができる。
【００４３】
また、ガス吸着法では、一般的には窒素・ヘリウム・クリプトンなどのガスを用いて、先のポロシメーター同様、試料を真空装置で脱気させた後一定圧または一定量のガスを試料容器に加えると、ガスの分子は試料の表面に吸着していく。水銀圧入法の場合は、大きな孔から水銀が入っていくが、ガス吸着法の場合は、小さな孔にガスが吸着されていくことから始まる。数十回に分けて試料にガスを加えていくと、吸着の飽和をそれぞれに繰り返し、それ以上与えても全く吸着しない状態になる。そして、比較的小さな細孔までの細孔分布を計ることができる。
【００４４】
バブルポイント法は一般的には貫通した孔の細孔分布を計る方法で、フィルター・不織布などに適している。フロンで濡らした試料を固定し、窒素ガスを加圧していくと、ある圧力で大きな孔に着いていたフロン液が飛ばされ泡となって飛んでいく。すると、突然ガスはその孔から上に流れ出す。さらガスを多く試料に当てると再び１回目より高い圧力で、もう少し小さい孔よりフロン液が泡となって飛びそこからガスが流れ出す。この時のガスの圧力と流れたガスの量を計るとポロシメーターと同様の細孔分布測定ができる。
【００４５】
上記誘導増強物質の表面にＲａ値が０．１μｍ以上の粗さを付与することにより、著しく免疫活性の誘導が増強される。また、この表面粗さの増強作用は、白血球の大きさが１０〜２０μｍであることを考えると、白血球に比べて上記Ｒａ値が非常に小さいため、単なる接触表面積の増大によるものでないと考えられる。
【００４６】
ここで、上記Ｒａ値とはＪＩＳ  Ｂ０６０１−１９８２における中心線平均粗さである。
【００４７】
上記誘導増強物質の表面粗さとして、凸凹平均間隔Ｓｍ値は、以下のようにして定義される値である。
【００４８】
まず、図１に示す粗さ曲線Ａの中心線Ｂに対して、それぞれ、一定の高さ及び深さの位置に上側カウントレベルＣ及び下側カウントレベルＤを引く。次に、下側のカウントレベルＤと粗さ曲線Ａとが交差する２点間において、上側カウントレベルと粗さ曲線とが交差する点が一回以上存在するときに、一つの山として「山」を定義する。そして、凹凸平均間隔Ｓｍ値は、図２に示すように、基準長さＬの間にある山の間隔をＳｍｉとしたときに、下記の式（１）で定義される値である。
【００４９】
【数１】
2007217360.tif 000002
【００５０】
すなわち、凹凸平均間隔Ｓｍ値とは、基準長さＬの間にある山同士の間隔の平均値を示す。このようにして、凹凸の平均間隔Ｓｍ値により、凸凹の面方向の条件が定義される。
【００５１】
上記誘導増強物質は、表面粗さを付与された材料からなることが好ましく、その中心線平均粗さＲａ値は、下限が０．１μｍ、上限が１０μｍであることが好ましい。
【００５２】
上記誘導増強物質の表面粗さは材料の多孔性等に由来するものであっても良い。上記表面粗さ付与材料に用いられる多孔性高分子材料としては、例えば、ポリスチレン系、アクリルエステル系、ポリエステル系、ナイロン系、セルロース系等の材料が挙げられる。また活性炭から成る材料も用いることができる。
【００５３】
上記誘導増強物質の表面粗さは誘導増強物質の繊維形状に由来するものであっても良く、その場合、上記誘導増強物質としては、繊維状材料又は不織布状材料からなるものが好ましい。上記繊維状材料又は不織布状材料としては、例えば、ポリスチレン系、アクリルエステル系、ポリエステル系、ナイロン系、セルロース系、活性炭等の高分子材料からなるものが挙げられる。また、上記表面粗さは適度な粒子径を有する微粒子の不溶性材料への固定化などによっても付与することができる。
【００５４】
また、上記免疫活性誘導物質を上記誘導増強物質に固定化して用いることもできる。上記免疫活性誘導物質を誘導増強物質の表面に固定化する方法としては特に限定されず、例えば、物理吸着、共有結合、イオン結合等の公知の方法を用いることができる。また、共有結合等により上記免疫活性誘導物質を誘導増強物質の表面に固定化する場合には、必要に応じて、免疫活性誘導物質と誘導増強物質との結合部に任意の長さをもつスペーサーを導入することが好ましい。
【００５５】
上記免疫活性誘導物質が菌体等である場合は、必要に応じて、固定化する前に菌体の洗浄操作や破砕操作、成分分画操作等のさまざまな前処理を施してもよい。また、上記免疫活性誘導物質が生菌等である場合は、より安全性を高めるために、必要に応じて、固定化する前、固定化と同時、固定化の後のいずれの時点でも、加熱処理・薬品処理・放射線処理・ガス滅菌処理等のさまざまな方法により死菌化させてもよい。上記加熱処理としては、例えば、オートクレーブ処理が挙げられ、上記薬品処理としては、例えば、グルタルアルデヒド処理、ホルマリン処理、又は、エタノール処理が挙げられ、上記放射線処理としては、例えば、γ線処理が挙げられ、上記ガス滅菌処理としては、例えば、エチレンオキサイドガス処理等が挙げられる。
【００５６】
上記免疫活性誘導物質としては、蛋白質変性剤で変性されているものが好適に用いられる。上記蛋白質変性剤としては、例えば、グルタルアルデヒド、ホルマリン、エタノール等の各種溶剤や界面活性剤等が挙げられる。また、加熱処理等も蛋白質変作用を発揮するので、水溶液中での加熱処理等も上記蛋白質変性剤に含まれる。なかでも、ホルマリンにより変性された免疫活性誘導物質がより好ましい。
【００５７】
また、ＢＣＧのような微生物からなる免疫活性誘導物質を誘導増強物質に固定化する場合には、菌体表面外壁成分のアミノ酸や糖成分等を介して、誘導増強物質のカルボキシル基、アミノ基及び／又はエポキシ基等の官能基に結合させることができる。このとき、必要に応じてさまざまな鎖長や構造のスペーサーを導入することもできる。
【００５８】
ＢＣＧのような微生物の菌体外層が脂質等により覆われている場合には、必要に応じて脂質を洗浄除去した後、結合することもできる。また、固定化法としては、物理吸着法が好ましい。免疫活性誘導物質を物理吸着法によって誘導増強物質に固定化することもできる。特に疎水性表面を有する誘導増強物質にＢＣＧのような免疫活性誘導物質を物理吸着作用によって固定化することができる。また、免疫活性誘導物質が微生物やその成分からなる場合等は、その表面が電荷を帯びている場合にも、その対極電荷を表面に有する誘導増強物質に物理吸着作用によって固定化することができる。
【００５９】
上記免疫活性増強材料の使用割合としては特に限定されないが、粒子状の材料として用いる場合には、細胞または細胞由来成分の浮遊溶液や懸濁溶液などの容積に対する材料のかさ体積量として、下限は０．０２％、上限は８０％程度であり、好ましい下限は０．１％、好ましい上限は５０％程度である。
【００６０】
上記免疫活性誘導物質の使用割合としては特に限定されないが、例えば、ＢＣＧである場合は、細胞または細胞由来成分の浮遊溶液や懸濁溶液などに添加される濃度として、乾燥重量で下限は０．０００１ｍｇ／ｍＬ、上限は１０ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。また、上記免疫活性物質がＯＫ−４３２である場合は、細胞または細胞由来成分の浮遊溶液や懸濁溶液などに添加される濃度として、下限は０．００００１ＫＥ／ｍＬ、上限は１０ＫＥ／ｍＬであることが好ましい。
【００６１】
本発明の免疫活性増強器具は、誘導増強物質に固定化された免疫活性誘導物質と、それを収容する容器とからなることが好ましい。これにより、容器内にて、上記の誘導増強物質に固定化された免疫活性誘導物質が、細胞または細胞由来成分などに接触される。この場合、接触温度を下限は１５℃、上限は４２℃の範囲とすることが好ましく、それによって、免疫活性増強作用を有する細胞または細胞由来成分をより効果的に製造することができる。
【００６２】
上記容器の構造としては特に限定されないが、図３に模式的に示すように、細胞または細胞由来成分等の導入部１と、免疫活性誘導物質と接触した細胞または細胞由来成分４等を容器外に導く導出部２とが備えられている容器３が好ましい。上記容器としては、血液バッグ状の容器等がより好ましい。
【００６３】
また、上記容器としては、体外循環システム等に用いられるカラム状の容器も用いることができる。しかしながら、上記容器としてこれらの体外循環システム等を用いた場合には、上記誘導増強物質に固定化された免疫活性誘導物質が、容器内にて細胞または細胞由来成分等と接触する時間が限定される。
【００６４】
本発明の製造方法においては、上記免疫活性増強材料と接触させた細胞または細胞由来成分等を容器外に導く場合に、免疫活性増強材料または免疫活性誘導物質が容器外に導出した細胞または細胞由来成分等に混入しないように流出防止機構が備えられていることがより好ましい。
【００６５】
図３に模式的に示すように、流出防止機構５としては、上記免疫活性増強材料が容器３内部に固定化されていることであっても良く、また、例えば、流出防止用の分離膜や分離フィルター等が設けられていても良い。
【００６６】
ひとつの実施態様としては、例えば、導入部と導出部とを有する血液バッグに、粒子状、繊維状、不織布状等の免疫活性増強材料を充填し、ここに例えば血液などの細胞または細胞由来成分などを導入する。その後、所定温度で所定時間インキュベートをし、その後に細胞や細胞由来成分、または血液や血液成分等を導出部から取り出し、免疫増強作用を有する細胞、細胞由来成分、血液、または血液成分などの組成物を得ることができる。これらの免疫活性増強器具の容量としては下限は１０ｍＬ、上限は１０００ｍＬであることが好ましく、より好ましい下限は５０ｍＬ、より好ましい上限は４００ｍＬである。
【００６７】
本発明の細胞または細胞由来成分は、骨髄系細胞、血液幹細胞などに限らず、白血球の株化細胞や表皮細胞、繊維芽細胞、肝細胞、骨芽細胞、胚性幹細胞等の組織から採取した細胞や培養細胞、株化細胞等の様々な細胞やその細胞由来成分、細胞培養液や血液、血液由来成分、白血球、単球（マクロファージ）、樹状細胞、リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、好塩基球、好酸球、血小板、血漿、血漿成分、血清、血清成分などを用いることができる。また、好ましくは、血液、希釈血液、血液からの血液由来成分、白血球、単球（マクロファージ）、樹状細胞、リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、好塩基球、好酸球、血小板、血漿、血漿成分、血清、血清成分などの成分を用いることができる。
【００６８】
本発明の免疫活性とは、細胞性免疫活性、サイトカイン誘導活性、自然免疫活性であることが好ましい。
【００６９】
免疫活性にはリンパ球の中のＴ細胞を中心とする細胞性免疫があり、癌に対する免疫反応に大きく関与している。本発明の免疫活性ではこの細胞性免疫活性であることが好ましい。
【００７０】
細胞性免疫活性は、特にＴヘルパー１型活性であることが好ましい。免疫調節には２種類のヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１型・Ｔｈ２型）が関与しており、このＴヘルパー１型活性を高めることが好ましい。
【００７１】
細胞免疫活性は、特にナチュラルキラー（ＮＫ）活性であることが好ましい。ナチュラルキラー活性とは抗原非特異的に標的細胞を傷害できる活性である。ＮＫ細胞はリンパ球のＴ細胞やＢ細胞とは異なり、抗原非特異的に標的細胞を傷害できる。また、ナチュラルキラー活性を示す細胞としてはＮＫＴ細胞もあり、これらの細胞を活性化させることが好ましい。
【００７２】
細胞免疫活性は、特に細胞傷害性Ｔリンパ球活性であることが好ましい。
【００７３】
細胞免疫活性は、特にサイトカイン誘導活性であることが好ましい。これらのサイトカインは細胞性免疫に関与するサイトカインであればいずれでも、または複数でも良い。好ましくは、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターフェロンα／β／γなどが挙げられる。
【００７４】
また、上記サイトカイン誘導活性ではインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）誘導活性であることがより好ましい。
【００７５】
免疫活性は自然免疫活性であることが好ましい。また自然免疫活性ではマクロファージ活性であることが特に好ましい。
【００７６】
本発明の実施例と比較例によれば、本発明により得られた血液から分離された血液成分である血漿などは高い免疫増強作用を示した。本発明では、たとえ細胞または細胞由来成分である血漿中のＩＦＮ−γ含有量が小さく、そのためＩＦＮ−γの培養前の含有量が小さい血漿であっても、非常に高い免疫増強作用を示すことができる。特許文献２の先行技術においては、菌体を固定化した高分子材料などにより血液からサイトカインを誘導する方法や用具が開示されているが、このようにサイトカインを誘導することを見出したとしても、それらがどのような生理活性作用を発揮するかは何も述べられていない。ましてや血液成分が免疫増強活性を有するかどうかについては何も開示されていない。
【００７７】
また、サイトカインを直接作用させるサイトカイン療法と同じように細胞または細胞由来成分である血漿にＩＦＮ−γを直接加えた場合にも本発明で示しているような免疫活性増強作用は何ら見られなかった。本発明によって得られる高い免疫活性増強作用を有する細胞または細胞由来成分は単にサイトカインを含有するからといって考えられるものではない。
【発明の効果】
【００７８】
本発明により、非常に簡便に、また閉鎖系の容器などにより、安全で作用の高い免疫活性増強された細胞または細胞由来成分を製造することができる。また高い免疫活性増強作用を有する細胞や細胞由来成分を簡単に、効率的に、また安全なものを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７９】
（実施例）
各実施例及び比較例において記載されている中心線平均粗さＲａ値及びでこぼこ平均間隔Ｓｍ値は、表面粗さ測定装置（小坂研究所製、商品名；サーフコーダＳＥ−３０Ｄ）により測定、または走査型レーザー顕微鏡（レーザーテック社性、商品名；１ＭＬ２１Ｗ）により観察した表面画像を画像解析システム（三谷商事社製、商品名；ＳＵＰＥＲ  ＡＳＰＥＣＴ）にて処理して測定した。
【００８０】
（実施例１）
材料１（オルガノ社製、商品名：アンバーライトＸＡＤ４、多孔性ポリスチレン粒子、ＭＲ型、細孔分布２〜１５０Å、表面積７００ｍ２／ｇ以上、細孔容積０．５ｍＬ／ｇ以上、平均細孔径約１２０Å）を精製水（大塚製薬社製）にてデカンテーションにより洗浄し、しかる後メタノール（和光純薬社製、ＨＰＬＣ用）にてデカンテーションすることにより洗浄した。次に、注射用生理食塩水（大塚製薬社製）にて材料１をデカンテーションにより洗浄した。
【００８１】
洗浄済み材料１のかさ体積１００μＬを滅菌済みチューブ（エッペンドルフ社製、１．５ｍＬ用）に入れ、そこに健常人Ａから得たヘパリン加血液を１．４ｍＬ添加した。この血液にＢＣＧ（日本ビーシージー製造社）生理食塩水懸濁液を最終濃度が０．１（ｍｇ／ｍＬ）になるように添加し、ロータリーミキサー（ＴＡＩＴＥＣ社製）に取り付け、６ｒｐｍで転倒混和させつつ、３７℃にて２４時間インキュベートした。インキュベート後の血液を４℃で１５００ｇ（トミー精工社製、微量高速遠心機ＭＲＸ−１５０）で１５分間遠心し、しかる後血漿を採取し、再び３０００ｇで１５分間遠心して血小板を含有しない血漿を得た。−７０℃で該血漿を凍結保存した。次に、保存された血漿を、融解し、１５００ｇで５分間遠心後に０．２２μｍフィルター（日本ミリポア社製）にてろ過した血漿を得た。
【００８２】
同一の健常人から採血した末梢血液から単核球を採取し、５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ培地に懸濁した。１×１０５個／ウェルになるように９６ウェル細胞培養プレートに単核球を添加した。ここに先の血漿を最終濃度が１０％になるように添加した。５％二酸化炭素下で３７℃にて７２時間培養し、細胞の培養上清を採取した。免疫活性増強作用を評価するため、ＥＬＩＳＡキット（ＪＩＭＲＯ社製）にて上清のＩＦＮ−γ誘導量を測定した。また、培養前の血漿を添加した細胞懸濁液中のＩＦＮ−γ濃度を培養前の値とした。結果を表１に示した。
【００８３】
（比較例１）
何ら処理されていない血漿を用意し、該血漿を実施例１の培養試験と同様にして培養試験に供し、評価した。結果を下記の表１に示す。
【００８４】
（比較例２）
健常人Ａから得たヘパリン添加血液を実施例１と同様にしてインキュベートし、濾過された血漿を用いたことを除いては、実施例１と同様にして評価した。すなわち、上記材料１と接触させていないことを除いては、実施例１と同様にして用意された血漿を用いた。
【００８５】
（比較例３）
菌体が固定されていないＸＡＤ４粒子を用いたことを除いては、実施例１と同様にして、血漿を用意し、評価した。
【００８６】
（比較例４）
実施例１において、滅菌済チューブに洗浄済み材料１を投入しなかったことを除いては、実施例１と同様にして血漿を用意し、評価した。
【００８７】
【表１】
2007217360.tif 000003
【００８８】
（実施例２）
材料１（オルガノ社製、商品名：アンバーライトＸＡＤ４、多孔性ポリスチレン粒子、ＭＲ型、細孔分布２〜１５０Å、表面積７００ｍ２／ｇ以上、細孔容積０．５ｍＬ／ｇ以上、平均細孔径約１２０Å）を精製水（大塚製薬社製）にてデカンテーションにより洗浄し、しかる後メタノール（和光純薬社製、ＨＰＬＣ用）にてデカンテーションすることにより洗浄した。次に、注射用生理食塩水（大塚製薬社製）にて材料１をデカンテーションにより洗浄した。
【００８９】
洗浄済み材料１のかさ体積１ｍＬを滅菌済みチューブ（エッペンドルフ社製、２．０ｍＬ用）に入れ、そこにＢＣＧ（日本ビーシージー製造社）の２％ホルマリン含有生理食塩水懸濁液（１０ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを添加し、３７℃にて２０時間混和し、ＢＣＧを材料１の粒子表面に物理吸着させた。混和後、生理食塩水にて充分洗浄し、再び生理食塩水に懸濁した。このようにして得られた材料１のかさ体積８００μＬを５ｍＬ用塩化ビニル製バッグに収納させた。ここに健常人から採血したヘパリン加血液（Ａ・Ｂ）を５．０ｍＬ添加した。
【００９０】
次に、バッグを転倒混和して血液を撹拌し、ロータリーミキサー（ＴＡＩＴＥＣ社製）に取り付け、６ｒｐｍで転倒混和させつつ、３７℃にて６時間恒温槽中でインキュベートした。インキュベート後の血液を４℃で１５００ｇ（トミー精工社製、微量高速遠心機ＭＲＸ−１５０）で１５分間遠心し、しかる後血漿を採取し、再び３０００ｇで１５分間遠心して血小板を含有しない血漿を得た。−７０℃で該血漿を凍結保存した。次に、保存された血漿を、融解し、１５００ｇで５分間遠心後に０．２２μｍフィルター（日本ミリポア社製）にてろ過した血漿を得た。
【００９１】
同一の健常人から採血した末梢血液から単核球を採取し、５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ培地に懸濁した。１×１０５個／ウェルになるように９６ウェル細胞培養プレートに単核球を添加した。ここに先の血漿を最終濃度が１０％になるように添加した。５％二酸化炭素下で３７℃にて７２時間培養し、細胞の培養上清を採取した。免疫活性増強作用を評価するため、ＥＬＩＳＡキット（ＪＩＭＲＯ社製）にて上清のＩＦＮ−γ誘導量を測定した。また、培養前の血漿を添加した細胞懸濁液中のＩＦＮ−γ濃度を培養前の値とした。結果を表１に示した。
【００９２】
（実施例３）
実施例２と同様にして、但し、血液処理時間を３７℃及び６時間のインキュベーションから３７℃及び１８時間のインキュベーションに変更したことを除いては、実施例２と同様にして血漿を用意し、評価した。
【００９３】
（実施例４）
実施例２と同様にして、但し、血液処理時間を３７℃及び６時間のインキュベーションから３７℃及び２４時間のインキュベーションに変更したことを除いては、実施例２と同様にして血漿を用意し、評価した。
【００９４】
（比較例５）
実施例２において用意したヘパリン添加血液（Ａ・Ｂ）から何も処理せずに血漿を分離し、このようにして分離された血漿を用い、実施例２と同様にして評価した。
【００９５】
（比較例６）
菌体が固定化されていないＸＡＤ４粒子を用い、処理時間を６時間としたことを除いては、実施例２と同様にして血漿を用意し、評価した。
【００９６】
（比較例７）
菌体が固定化されていないＸＡＤ４粒子を用い、処理時間を１８時間としたことを除いては、実施例３と同様にして血漿を用意し、評価した。
【００９７】
（比較例８）
菌体が固定化されていないＸＡＤ４粒子を用い、処理時間を２４時間としたことを除いては、実施例４と同様にして血漿を用意し、評価した。
【００９８】
（比較例９）
組み換えＩＦＮ−γ製剤（塩野義製薬社製、商品名：イムノマックス−γ）を健常人から採取した正常血漿に８（ＪＲＵ／ｍＬ）濃度になるように添加して得られた血漿を用い、比較例５と同様にして評価した。
【００９９】
（比較例１０）
組み換えＩＦＮ−γ製剤（塩野義製薬社製、商品名：イムノマックス−γ）を健常人から採取した正常血漿に１６（ＪＲＵ／ｍＬ）濃度になるように添加して得られた血漿を用い、比較例５と同様にして評価した。
【０１００】
（比較例１１）
組み換えＩＦＮ−γ製剤（塩野義製薬社製、商品名：イムノマックス−γ）を健常人から採取した正常血漿に３２（ＪＲＵ／ｍＬ）濃度になるように添加して得られた血漿を用い、比較例５と同様にして評価した。
【０１０１】
【表２】
2007217360.tif 000004
【０１０２】
（実施例５）
ヘパリン添加血液（Ａ・Ｂ）をヘパリン添加血液（Ｃ・Ｄ）に変更したことを除いては、実施例２と同様にして血漿を用意し、評価した。
【０１０３】
（実施例６）
血液に対する処理時間を１８時間に変更したことを除いては、実施例５と同様にして血漿を用意し、評価した。
【０１０４】
（実施例７）
血液に対する処理時間を２４時間に変更したことを除いては、実施例５と同様にして血漿を用意し、評価した。
【０１０５】
（比較例１２）
健常人から得られたヘパリン添加血液に何も処理せずに用意した血漿を用いたことを除いては、実施例５と同様にして評価した。
【０１０６】
（比較例１３）
菌体が固定化されていないことを除いては、実施例５と同様にして評価した。
【０１０７】
（比較例１４）
菌体が固定化されていないことを除いては、実施例６と同様にして評価した。
【０１０８】
（比較例１５）
菌体が固定化されていないことを除いては、実施例７と同様にして血漿を用意し、評価した。
【０１０９】
（比較例１６）
組み換えＩＦＮ−γ製剤、塩野義製薬社製、商品名：イムノマックス−γ）を健常人から採血した正常血漿に５０（ＪＲＵ／ｍＬ）濃度となるように添加して得られた血漿を用い、比較例１２と同様にして評価した。
【０１１０】
（比較例１７）
組み換えＩＦＮ−γ製剤、塩野義製薬社製、商品名：イムノマックス−γ）を健常人から採血した正常血漿に５００（ＪＲＵ／ｍＬ）濃度となるように添加して得られた血漿を用い、比較例１２と同様にして評価した。
【０１１１】
【表３】
2007217360.tif 000005
【０１１２】
（実施例８）
材料２（エアウォター・ベルパール社製、商品名：ベルファインＢＧ、フェノール樹脂系円柱状造粒活性炭、比表面積１３５０〜１８００ｍ２／ｇ、ピーク細孔径約８Å、径１０００〜４０００μｍ）を５０ｍＬチューブにかさ体積で２５ｍＬ入れ、そこにポリヒドロキシエチルメタクリレート（平均分子量３０万、ＳＩＧＭＡ社製）を２％（ｖ／ｖ）溶解させた９５％エタノール溶液（ナカライテスク社製）２５ｍＬを入れ、３０分浸漬後、ステンレス製のかごに移し、余分なエタノールを除去した後、８０℃で２０時間乾燥させて、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）が表面にコーティングされた材料２を作製した。その後、この材料２をかさ体積で１ｍＬと、５ＫＥ／ｍＬのＯＫ−４３２（中外製薬社製、商品名：ピシバニール）懸濁生理食塩水１ｍＬとを混合し、３７℃にて２０時間、回転混和させてＯＫ−４３２を材料２の粒子表面に物理吸着させた。この後、この粒子を生理食塩水にて充分洗浄し、再び生理食塩水に懸濁した。このようにして得られた材料２のかさ体積４００μＬを５ｍＬ用塩化ビニル製バッグに収納させた。ここに健常人から採血したヘパリン加血液（Ｅ）を５．０ｍＬ添加した。
【０１１３】
次に、バッグを転倒混和して血液を撹拌し、ロータリーミキサー（ＴＡＩＴＥＣ社製）に取り付け、６ｒｐｍで転倒混和させつつ、３７℃にて６時間恒温槽中でインキュベートした。インキュベート後の血液を４℃で１５００ｇ（トミー精工社製、微量高速遠心機ＭＲＸ−１５０）で１５分間遠心し、しかる後血漿を採取し、再び３０００ｇで１５分間遠心して血小板を含有しない血漿を得た。−７０℃で該血漿を凍結保存した。次に、保存された血漿を、融解し、１５００ｇで５分間遠心後に０．２２μｍフィルター（日本ミリポア社製）にてろ過した血漿を得た。
【０１１４】
同一の健常人から採血した末梢血液から単核球を採取し、５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ培地に懸濁した。１×１０５個／ウェルになるように９６ウェル細胞培養プレートに単核球を添加した。ここに先の血漿を最終濃度が１０％になるように添加した。５％二酸化炭素下で３７℃にて７２時間培養し、細胞の培養上清を採取した。免疫活性増強作用を評価するため、ＥＬＩＳＡキット（ＪＩＭＲＯ社製）にて上清のＩＦＮ−γ誘導量を測定した。また、培養前の血漿を添加した細胞懸濁液中のＩＦＮ−γ濃度を培養前の値とした。結果を表４に示した。
【０１１５】
（実施例９）
実施例８と同様に血液を１８時間処理して得られた血漿を用いたことを除いては、実施例８と同様にして血漿を用意し、評価した。
【０１１６】
（比較例１８）
実施例８で用意したヘパリン添加血液（Ｅ）から何ら処理を施さずに分離した血漿を用い、実施例８と同様にして評価した。
【０１１７】
（比較例１９）
ＯＫ−４３２が固定化されていないベルファインＢＧ粒子を用いたことを除いては、実施例８と同様にして血漿を用意し評価した。
【０１１８】
（比較例２０）
ＯＫ−４３２が固定化されていないベルファインＢＧ粒子を用いたことを除いては、実施例９と同様にして血漿を用意し、評価した。
【０１１９】
（比較例２１）
組み換えＩＦＮ−γ製剤（製剤塩野義製薬社製、商品名：イムノマックス−γ）を健常人から採取した正常血漿に４（ＪＲＵ／ｍＬ）濃度となるように添加した以外は、比較例１８と同様にして評価した。
【０１２０】
（比較例２２）
組み換えＩＦＮ−γ製剤（製剤塩野義製薬社製、商品名：イムノマックス−γ）を健常人から採取した正常血漿に８（ＪＲＵ／ｍＬ）濃度となるように添加した以外は、比較例１８と同様にして評価した。
【０１２１】
【表４】
2007217360.tif 000006
【０１２２】
（実施例１０）
実施例３と同様にして得られたＡからの１８時間処理の血漿を同様にして同一の健常人から得られた単核球に添加し培養した。免疫活性増強作用を評価するため細胞性免疫活性増強作用としてＴヘルパー１型活性増強作用を以下のように算出した。ＥＬＩＳＡキットにて単核球培養上清のＩＦＮ−γ誘導量（ＪＩＭＲＯ社製キット使用）とＩＬ−４誘導量（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を測定し、培養後前後のその比率を算出した。結果を表５に示した。
【０１２３】
（比較例２３）
何ら処理されていない血漿を用いたことを除いては実施例１０と同様にして評価した。
【０１２４】
（比較例２４）
菌体が固定化されていないＸＡＤ４粒子を用いたことを除いては、実施例１０と同様にして血漿を用意し評価した。
【０１２５】
【表５】
2007217360.tif 000007
【０１２６】
（実施例１１）
実施例３と同様にして得られたＡからの１８時間処理の血漿を同様にして同一の健常人から血液に１０％（ｖ／ｖ）となるように添加し、５ｍＬ血液バッグにて培養した。バッグを転倒混和して血液を撹拌し、ロータリーミキサー（ＴＡＩＴＥＣ社製）に取り付け、６ｒｐｍで転倒混和させつつ、３７℃にて２４時間恒温槽中でインキュベートした。この血液の免疫活性増強作用を評価するため細胞性免疫活性増強作用としてナチュラルキラー活性を測定した。
【０１２７】
（比較例２５）
何ら処理されていない血漿を用いたことを除いては、実施例１１と同様にして評価した。
【０１２８】
（比較例２６）
菌体が固定化されていないＸＡＤ４粒子を用いたことを除いては、実施例１１と同様にして評価した。
【０１２９】
【表６】
2007217360.tif 000008
【０１３０】
（実施例１２）
実施例３と同様にして得られたＡからの１８時間処理の血漿を同様にして同一の健常人から得られた単核球に添加し培養した。この単核球を２４時間３７℃にて培養後、リンパ球を回収し、免疫活性増強作用を評価するため細胞性免疫活性増強作用として細胞傷害性Ｔリンパ球活性を測定した。マイトジェンとしてコンカナバリンＡを用いてヒトＣＭＬ細胞株Ｋ５６２細胞を標的細胞として標的細胞傷害反応で評価した。
【０１３１】
（比較例２７）
何ら処理されていない血漿を用いたことを除いては、実施例１２と同様にして評価した。
【０１３２】
（比較例２８）
菌体が固定化されていないＸＡＤ４粒子を用いたことを除いては、実施例１２と同様にして評価した。
【０１３３】
【表７】
2007217360.tif 000009
【０１３４】
（実施例１３）
実施例２と同様にして得られたＡからの１８時間処理の血漿を同様にして同一の健常人から得られた単核球に添加し培養した。この単核球を２４時間３７℃にて培養後、付着細胞を回収し、免疫活性増強作用を評価するため自然免疫活性増強作用としてマクロファージ活性増強作用を評価するためフローサイトメーターにて細胞内ＴＮＦ−αの量を測定した。マクロファージの同定にはＣＤ１４の発現で解析した。結果を表８に示した。
【０１３５】
（比較例２９）
何ら処理されていない血漿を用いたことを除いては、実施例１３と同様にして評価した。
【０１３６】
（比較例３０）
菌体が固定化されていないＸＡＤ４粒子を用いたことを除いては、実施例１３と同様にして評価した。
【０１３７】
【表８】
2007217360.tif 000010
【０１３８】
（実施例１４〜１７）
材料３：ＣＡフィルム（アートプラス社製、酢酸セルロースフィルム、商品名：アセチフィルムＶＲ−Ｒ）を用い、フィルム表面をメチルアルコールで２４時間、ソックスレー抽出を行って可塑剤を抽出し、フィルムを取り出した後、１５時間風乾後、さらに８０℃で５時間乾燥した。その後、ストルアス社（デンマーク）製自動研磨機（商品名：プラノボールペデマックス）に、２２０、５００及び１２００メッシュのサンドペーパーを取り付けたものを用いて、上記ＣＡフィルムを研磨し、両側の表面に表面粗さを持つ研磨済みＣＡフィルムを作製した。このフィルムをメチルアルコールで洗浄後、２．５ｍｍ×２．５ｍｍの大きさに細片化し、かさ体積で約２００μＬとなるようにはかり取った。これらの細片を注射用生理食塩水で洗浄後、１．５ｍＬ用滅菌済みチューブに充填した。
【０１３９】
健常人から採血し、ヘパリン１５ＩＵ／ｍＬ含有静脈血を得た。血液に０．１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、ＢＣＧ（日本ビーシージー製造社製）を添加し、血液約１．３ｍＬを前記充填チューブに添加し、次に、ロータリーミキサー（ＴＡＩＴＥＣ社製）に取り付け、６ｒｐｍで転倒混和させつつ、３７℃にて２４時間恒温槽中でインキュベートした。インキュベート後の血液を４℃で１５００ｇ（トミー精工社製、微量高速遠心機ＭＲＸ−１５０）で１５分間遠心し、しかる後血漿を採取し、再び３０００ｇで１５分間遠心して血小板を含有しない血漿を得た。−７０℃で該血漿を凍結保存した。次に、保存された血漿を、融解し、１５００ｇで５分間遠心後に０．２２μｍフィルター（日本ミリポア社製）にてろ過した血漿を得た。
【０１４０】
同一の健常人から採血した末梢血液から単核球を採取し、５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ培地に懸濁した。１×１０５個／ウェルになるように９６ウェル細胞培養プレートに単核球を添加した。ここに先の血漿を最終濃度が１０％になるように添加した。５％二酸化炭素下で３７℃にて７２時間培養し、細胞の培養上清を採取した。免疫活性増強作用を評価するため、ＥＬＩＳＡキット（ＪＩＭＲＯ社製）にて上清のＩＦＮ−γ誘導量を測定した。また、培養前の血漿を添加した細胞懸濁液中のＩＦＮ−γ濃度を培養前の値とした。結果を表９に示した。
【０１４１】
また実施例１４〜１７で使用した各ＣＡフィルムのみを用いて上記と同様に血液と接触させ、血漿を採取して同様の方法にて免疫活性増強作用を評価したところ、培養前後の単核球培養上清中のＩＦＮ−γはいずれも検出限界以下（４ｐｇ／ｍＬ以下）であった。
【０１４２】
（比較例３１）
材料３を添加しなかったことを除いては、実施例１４と同様にして血漿を得て、同様にして単核球からのＩＦＮ−γ誘導量を評価した。結果を下記の表９に示す。
【０１４３】
【表９】
2007217360.tif 000011
【０１４４】
（実施例１８〜２３）
材料４：ＰＥＴフィルム（ユニチカ社製、ポリエチレンテレフタレートフィルム、商品名：エンブレットＳ−７５）を用い、フィルム表面をメチルアルコールで洗浄した。しかる後、ストルアス社（デンマーク）製自動研磨機（商品名：プラノボールペデマックス）に、２２０、５００，１２００、２４００，及び４０００メッシュのサンドペーパーを取り付けたものを用いて、ＰＥＴフィルムを研磨し、両側の表面に表面粗さを持つ研磨ずみＰＥＴフィルムを作製した。このフィルムをメチルアルコールで洗浄後、２．５ｍｍ×２．５ｍｍの大きさに細片化し、かさ体積で約２００μＬとなるようにはかり取った。これらの細片を注射用生理食塩水で洗浄後、１．５ｍＬ用滅菌済みチューブに充填した。健常人から採血し、ヘパリン１５ＩＵ／ｍＬ含有静脈血を得た。血液に０．１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、ＢＣＧ（日本ビーシージー製造社製）を添加し、血液約１．３ｍＬを前記充填チューブに添加し、実施例１４と同様にして血漿を得た。単核球を用いて実施例１４と同様にして、免疫活性増強作用を評価するためＥＬＩＳＡキット（ＪＩＭＲＯ社製）にて上清のＩＦＮ−γ誘導量を測定した。また、培養前の血漿を添加した細胞懸濁液中のＩＦＮ−γ濃度を培養前の値とした。結果を表１０に示した。
【０１４５】
また実施例１８〜２３で使用した各ＰＥＴフィルムのみを用いて上記と同様に血液と接触させ、血漿を採取して同様の方法にて免疫活性増強作用を評価したところ、培養前後の単核球培養上清中のＩＦＮ−γはいずれも検出限界以下（４ｐｇ／ｍＬ以下）であった。
【０１４６】
（比較例３２）
材料４を添加しないで、実施例１８と同様にして血漿を得て、同様にして単核球からのＩＦＮ−γ誘導量を評価した。結果を表１０に示す。
【０１４７】
【表１０】
2007217360.tif 000012
【０１４８】
（実施例２４〜２８）
材料５：ポリスチレンフィルム（三菱モンサント社製、商品名：サントクリア）を用い、フィルム表面を精製水で洗浄した。しかる後、ストルアス社（デンマーク）製自動研磨機（商品名：プラノボールペデマックス）に、２２０、５００，１２００、及び２４００メッシュのサンドペーパーを取り付けたものを用いて、ポリスチレンフィルムを研磨し、両側の表面に表面粗さを持つ研磨ずみポリスチレンフィルムを作製した。このフィルムを精製水で洗浄後、２．５ｍｍ×２．５ｍｍの大きさに細片化し、かさ体積で約２００μＬとなるようにはかり取った。これらの細片を注射用生理食塩水で洗浄後、１．５ｍＬ用滅菌済みチューブに充填した。実施例１４と同様に健常人から採血し、ヘパリン１５ＩＵ／ｍＬ含有静脈血を得た。血液に０．１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、ＢＣＧ（日本ビーシージー製造社製）を添加し、血液約１．３ｍＬを前記充填チューブに添加し、実施例１４と同様にして血漿を得た。単核球を用いて実施例１４と同様にして、免疫活性増強作用を評価するためＥＬＩＳＡキット（ＪＩＭＲＯ社製）にて上清のＩＦＮ−γ誘導量を測定した。また、培養前の血漿を添加した細胞懸濁液中のＩＦＮ−γ濃度を培養前の値とした。結果を表１１に示した。
【０１４９】
また実施例２４〜２８で使用した各ポリスチレンフィルムのみを用いて上記と同様に血液と接触させ、血漿を採取して同様の方法にて免疫活性増強作用を評価したところ、培養前後の単核球培養上清中のＩＦＮ−γはいずれも検出限界以下（４ｐｇ／ｍＬ以下）であった。
【０１５０】
（比較例３３）
材料５を添加しないで、実施例２４と同様にして血漿を得て、実施例２４と同様にして単核球からのＩＦＮ−γ誘導量を評価した。結果を表１１に示す。
【０１５１】
【表１１】
2007217360.tif 000013
【０１５２】
（実施例２９）
材料６；ナイロン６６ペレット（宇部興産社製、商品名；ウベ６６  ２０２０Ｂ）を射出成形し、直径２．５ｍｍの球状ビーズを作製した。ポットミル（東洋エンジニアリング社製、商品名；５ｌ−セラミックポットミルＢＰ−５）に、上記ビーズ２００ｍｌ及び同容量の研磨材；ＷＨＩＴＥ  ＡＢＲＡＸ（ＷＡ）＃３４（日本研磨材工業社製）を投入し、さらにセラミックポットミル用ボール（東洋エンジニアリング社製、商品名；ＢＢ−１３）数個を投入し、ボール研磨機（日陶科学社製ポットミル、商品名；ＡＮ−３Ｓ）により５時間研磨した。
【０１５３】
上記のようにして、Ｒａ値９．１μｍ及びＳｍ値１２３．５μｍのビーズを得た。このビーズをメタノールで３回洗浄して、注射用生理食塩水（大塚製薬社製）で５回洗浄した。その後、同じく注射用生理食塩水で洗浄した２ｍｌ用チューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  社）に充填した。充填量はビーズ７０個とした。
【０１５４】
実施例１４と同様にして採血した血液に０．１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、ＢＣＧ（日本ビーシージー製造社製）を添加し、血液約１．３ｍＬを前記充填チューブに添加し、次に、ロータリーミキサー（ＴＡＩＴＥＣ社製）に取り付け、６ｒｐｍで転倒混和させつつ、３７℃にて２４時間恒温槽中でインキュベートした。インキュベート後の血液を４℃で１５００ｇ（トミー精工社製、微量高速遠心機ＭＲＸ−１５０）で１５分間遠心し、しかる後血漿を採取し、再び３０００ｇで１５分間遠心して血小板を含有しない血漿を得た。−７０℃で該血漿を凍結保存した。次に、保存された血漿を、融解し、１５００ｇで５分間遠心後に０．２２μｍフィルター（日本ミリポア社製）にてろ過した血漿を得た。
【０１５５】
実施例１４と同様に、同一の健常人から採血した末梢血液から単核球を採取し、５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ培地に懸濁した。１×１０５個／ウェルになるように９６ウェル細胞培養プレートに単核球を添加した。ここに先の血漿を最終濃度が１０％になるように添加した。５％二酸化炭素下で３７℃にて７２時間培養し、細胞の培養上清を採取した。免疫増強作用を評価するため、ＥＬＩＳＡキット（ＪＩＭＲＯ社製）にて上清のＩＦＮ−γ誘導量を測定した。また、培養前の血漿を添加した細胞懸濁液中のＩＦＮ−γ濃度を培養前の値とした。結果を表１２に示した。
【０１５６】
また実施例２９で使用した研磨ビーズのみを用いて上記と同様に血液と接触させ、血漿を採取して同様の方法にて免疫活性増強作用を評価したところ、培養前後の単核球培養上清中のＩＦＮ−γはいずれも検出限界以下（４ｐｇ／ｍＬ以下）であった。
【０１５７】
【表１２】
2007217360.tif 000014
【０１５８】
（実施例３０）
材料７（オルガノ社製、商品名：アンバーライトＸＡＤ１６ＨＰ、ポリスチレン多孔性粒子、ＭＲ型、細孔分布２〜３００Å、表面積８００ｍ２／ｇ以上、細孔容積０．５８〜０．６５ｍＬ／ｇ、平均細孔径約１５０Å）に変更したことを除いては実施例１と同様にして血漿を得て、実施例１と同様にして単核球からのＩＦＮ−γ誘導量を測定した。結果を表１３に示す。
【０１５９】
（比較例３４）
ＢＣＧを血液に添加しなかったことを除いては、実施例３０と同様にしてＩＦＮ−γ誘導量を測定した。結果を表１３に示す。
【０１６０】
（実施例３１）
材料を材料８（オルガノ社製、商品名：アンバーライトＸＡＤ２０００、ポリスチレン多孔性粒子、ＭＲ型、細孔分布２〜８０Å、表面積約６２０ｍ２／ｇ、細孔容積約０．７ｍＬ／ｇ、平均細孔径約４０〜５０Å）に変更したことを除いては実施例３０と同様にした。結果を表１３に示す。
【０１６１】
（比較例３５）
ＢＣＧを血液に添加しなかったことを除いては、実施例３１と同様にしてＩＦＮ−γ誘導量を測定した。結果を表１３に示す。
【０１６２】
（実施例３２）
材料を材料９（オルガノ社製、商品名：アンバーライトＸＡＤ７ＨＰ、アクリル酸系多孔性粒子、ＭＲ型、細孔分布２〜２０００Å、表面積４００ｍ２／ｇ以上、細孔容積０．５ｍＬ／ｇ以上、平均細孔径約４００〜５００Å）に変更したことを除いては実施例３０と同様にした。結果を表１３に示す。
【０１６３】
（比較例３６）
ＢＣＧを血液に添加しなかったことを除いては、実施例３２と同様にしてＩＦＮ−γ誘導量を測定した。結果を表１３に示す。
【０１６４】
（比較例３７）
材料として何も用いずＢＣＧのみを血液に添加したことを除いては、実施例３０と同様にした。結果を表１３に示す。
【０１６５】
【表１３】
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【０１６６】
（実施例３３）
健常人血液から実施例１に記載の方法で単核球を採取し、２％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ培地に懸濁した。１×１０５個／ｍＬの細胞数に調製し、５００μＬを２４ウェル細胞培養プレートに添加した。ここにあらかじめ実施例２と同様に作製した誘導増強材料をかさ体積で１００μＬ添加しておき、５％二酸化炭素下３７℃で２４時間培養した。この培養上清を３０００ｇで１５分間遠心して上清を−７０℃で凍結保存した。次に、保存された上清を、融解し０．２２μｍフィルター（日本ミリポア社製）にてろ過した上清を得た。
【０１６７】
実施例２と同様に、同一健常人から得た単核球に、先の上清を最終濃度が１０％になるように添加した。５％二酸化炭素下で３７℃にて７２時間培養し、細胞の培養上清を採取した。免疫増強作用を評価するため、ＥＬＩＳＡキット（ＪＩＭＲＯ社製）にて上清のＩＦＮ−γ誘導量を測定した。また、培養前の血漿を添加した細胞懸濁液中のＩＦＮ−γ濃度を培養前の値とした。結果を表１４に示した。
【０１６８】
【表１４】
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【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】表面粗さを説明するための模式図であり、でこぼこの「山」を説明するための図。
【図２】表面粗さにおけるでこぼこ平均間隔Ｓｍ値を説明するための図。
【図３】本発明の免疫活性増強器具の一例を示す模式図。
【符号の説明】
【０１７０】
１…導入部
２…導出部
３…容器
４…血液
５…流出防止機構
【図１】
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【図２】
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【図３】
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