(57)【要約】      （修正有）【課題】交差感染の恐れも無く、かつ、生着率が高く、効果も長続きする形成外科や美容外科などの領域において使用されるヒト由来の１型または３型コラーゲンを提供することである。【解決手段】１型コラーゲンの抽出の例では、まずヒト脂肪組織をホモジナイズし、血液を略除去洗浄する洗浄工程と、タンパク分解酵素阻害剤を含有する酸性溶液で洗浄する洗浄工程と、脂肪分を除去する脱脂肪処理工程と、ペプシン消化を施すペプシン消化工程と、可溶上清に遠心分離操作を施す遠心分離工程と、上清に透析操作を施す透析工程と、遠心分離操作を施す遠心分離工程と、上清に緩衝液を添加すると共にアルカリを添加してｐＨが７〜８にて塩析操作を施す塩析工程と、沈殿物を洗浄し、そして遠心分離操作を施して得られた沈殿物を緩衝液で洗浄する洗浄工程と、洗浄工程後において遠心分離操作を施す遠心分離工程と、上清に透析操作を施す透析工程とを経て抽出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト脂肪組織をタンパク分解酵素で消化させる消化工程Ｃと、
消化工程Ｃ後における上清に遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｄと、
遠心分離工程Ｄ後における上清に透析操作を施す透析工程Ｅと、
透析工程Ｅ後に遠心分離操作を施して得られる沈殿物に酸を添加して遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｆと、
遠心分離工程Ｆ後における上清に対して塩析操作を施して得られた沈殿物を洗浄後に遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｇと、
遠心分離工程Ｇ後における上清に透析操作を施す透析工程Ｈ
とを具備することを特徴とするＩ型コラーゲン抽出方法。
【請求項２】
遠心分離工程Ｇは、
遠心分離工程Ｆ後における上清に緩衝液を添加すると共にアルカリを添加してｐＨが弱アルカリ状態にて塩析操作を施す塩析工程Ｇａと、
塩析工程Ｇａ後における沈殿物を洗浄し、そして遠心分離操作を施して得られた沈殿物を緩衝液で洗浄する洗浄工程Ｇｂと、
洗浄工程Ｇｂ後において遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｇｃ
とを具備することを特徴とする請求項１のＩ型コラーゲン抽出方法。
【請求項３】
消化工程Ｃの前に脱血液処理を行う脱血液工程Ａを更に具備する
ことを特徴とする請求項１又は請求項２のＩ型コラーゲン抽出方法。
【請求項４】
消化工程Ｃの前に脱血液処理を行う脱血液工程Ａと、
前記脱血液工程Ａの後で、消化工程Ｃの前に脱脂肪処理を行う脱脂肪処理工程Ｂ
とを更に具備することを特徴とする請求項１〜請求項３いずれかのＩ型コラーゲン抽出方法。
【請求項５】
ヒト脂肪組織をホモジナイズし、含まれている血液を略除去洗浄する洗浄工程Ａａと、
前記洗浄工程Ａａの後、タンパク分解酵素阻害剤を含有する酸性溶液で洗浄する洗浄工程Ａｂと、
前記洗浄工程Ａｂの後、有機溶媒を用いて含まれている脂肪分を除去する脱脂肪処理工程Ｂと、
前記脱脂肪処理工程Ｂの後、脂肪分が除去された残物にペプシンを加えてペプシン消化を施すペプシン消化工程Ｃと、
前記ペプシン消化工程Ｃ後における可溶上清に遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｄと、
前記遠心分離工程Ｄ後における上清に透析操作を施す透析工程Ｅと、
前記透析工程Ｅ後に遠心分離操作を施して得られる沈殿物に酸を添加して遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｆと、
前記遠心分離工程Ｆ後における上清に緩衝液を添加すると共にアルカリを添加してｐＨが７〜８にて塩析操作を施す塩析工程Ｇａと、
前記塩析工程Ｇａ後における沈殿物を洗浄し、そして遠心分離操作を施して得られた沈殿物を緩衝液で洗浄する洗浄工程Ｇｂと、
前記洗浄工程Ｇｂ後において遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｇｃと、
前記遠心分離工程Ｇｃ後における上清に透析操作を施す透析工程Ｈ
とを具備することを特徴とするＩ型コラーゲン抽出方法。
【請求項６】
ヒト脂肪組織をタンパク分解酵素で消化させる消化工程Ｃと、
消化工程Ｃ後における上清に遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｄと、
遠心分離工程Ｄ後における上清に透析操作を施す透析工程Ｅと、
透析工程Ｅ後に遠心分離操作を施して得られる沈殿物に酸を添加して遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｆと、
遠心分離工程Ｆ後における上清に対して塩析操作を施して得られた沈殿物を洗浄後に遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｇと、
遠心分離工程Ｇ後における沈殿物を洗浄後、遠心分離操作を施し、そして上清に透析操作を施す透析工程Ｉ
とを具備することを特徴とするＩＩＩ型コラーゲン抽出方法。
【請求項７】
遠心分離工程Ｇは、
遠心分離工程Ｆ後における上清に緩衝液を添加すると共にアルカリを添加してｐＨが弱アルカリ状態にて塩析操作を施す塩析工程Ｇａと、
塩析工程Ｇａ後における沈殿物を洗浄し、そして遠心分離操作を施して得られた沈殿物を緩衝液で洗浄する洗浄工程Ｇｂと、
洗浄工程Ｇｂ後において遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｇｃ
とを具備することを特徴とする請求項６のＩＩＩ型コラーゲン抽出方法。
【請求項８】
消化工程Ｃの前に脱血液処理を行う脱血液工程Ａを更に具備する
ことを特徴とする請求項６又は請求項７のＩＩＩ型コラーゲン抽出方法。
【請求項９】
消化工程Ｃの前に脱血液処理を行う脱血液工程Ａと、
前記脱血液工程Ａの後で、消化工程Ｃの前に脱脂肪処理を行う脱脂肪処理工程Ｂ
とを更に具備することを特徴とする請求項６〜請求項８いずれかのＩＩＩ型コラーゲン抽出方法。
【請求項１０】
ヒト脂肪組織をホモジナイズし、含まれている血液を略除去洗浄する洗浄工程Ａａと、
前記洗浄工程Ａａの後、タンパク分解酵素阻害剤を含有する酸性溶液で洗浄する洗浄工程Ａｂと、
前記洗浄工程Ａｂの後、有機溶媒を用いて含まれている脂肪分を除去する脱脂肪処理工程Ｂと、
前記脱脂肪処理工程Ｂの後、脂肪分が除去された残物にペプシンを加えてペプシン消化を施すペプシン消化工程Ｃと、
前記ペプシン消化工程Ｃ後における可溶上清に遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｄと、
前記遠心分離工程Ｄ後における上清に透析操作を施す透析工程Ｅと、
前記透析工程Ｅ後に遠心分離操作を施して得られる沈殿物に酸を添加して遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｆと、
前記遠心分離工程Ｆ後における上清に緩衝液を添加すると共にアルカリを添加してｐＨが７〜８にて塩析操作を施す塩析工程Ｇａと、
前記塩析工程Ｇａ後における沈殿物を洗浄し、そして遠心分離操作を施して得られた沈殿物を緩衝液で洗浄する洗浄工程Ｇｂと、
前記洗浄工程Ｇｂ後において遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｇｃと、
前記遠心分離工程Ｇｃ後における沈殿物を洗浄後、遠心分離操作を施し、そして上清に透析操作を施す透析工程Ｉ
とを具備することを特徴とするＩＩＩ型コラーゲン抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形成外科や美容外科などの領域において用いられるＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンの抽出方法に関する。特に、人体に安心して使用できるようにする為、人体より採取した脂肪組織からＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンを抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚を構成しているコラーゲンは、主に、Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンである。
現在、形成外科や美容外科などの領域において、顔面の皺や瘢痕の修正にＺｙｄｅｒｍ（米国コラーゲン社製のコラーゲン注入剤）等の皮膚修正用皮下注入型コラーゲン製剤が広く用いられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
さて、前記皮膚修正用皮下注入型コラーゲン製剤（Ｚｙｄｅｒｍ）は、牛皮由来のコラーゲンをペプシンで処理し、コラーゲンの大部分の抗原性を有しているテロペプチド部分を除去した抗原性の弱いアテロコラーゲンである。そして、このコラーゲンをリン酸緩衝生理食塩水に分散し、無痛化剤としてリドカインを０．３％の割合で添加した粘性を有する乳白色のゲル状物質である。
【０００４】
ところで、上記のコラーゲン製剤は、牛などの動物由来のものであることから、免疫原性や交差感染の危険性を有している。
【０００５】
そこで、ヒト由来の皮膚を一部採取し、培養操作によって皮膚由来の細胞を増殖し、注入剤として用いることが提案されている。
【０００６】
しかしながら、この提案の技術は、患者の健常部の皮膚への浸襲を伴い、かつ、培養操作を必要とすることから、時間やコストが掛かる問題点が有る。
【０００７】
さて、形成外科や美容外科などの領域において、組織増大術の一手法として、遊離脂肪移植手術や吸引脂肪注入術が提案されている。
【０００８】
これは、自家移植であり、交差感染などの危険性が無い。しかしながら、生着率が低く、効果も長続きしないと指摘されている。
【０００９】
従って、本発明が解決しようとする課題は、上記の問題点を解決することである。すなわち、交差感染の恐れも無く、かつ、生着率が高く、効果も長続きする形成外科や美容外科などの領域において使用されるヒト由来のＩ型またはＩＩＩ型コラーゲンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記の課題は、ヒト脂肪組織をタンパク分解酵素で消化させる消化工程Ｃと、
消化工程Ｃ後における上清に遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｄと、
遠心分離工程Ｄ後における上清に透析操作を施す透析工程Ｅと、
透析工程Ｅ後に遠心分離操作を施して得られる沈殿物に酸を添加して遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｆと、
遠心分離工程Ｆ後における上清に対して塩析操作を施して得られた沈殿物を洗浄後に遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｇと、
遠心分離工程Ｇ後における上清に透析操作を施す透析工程Ｈ
とを具備することを特徴とするＩ型コラーゲン抽出方法によって解決される。
【００１１】
特に、前記Ｉ型コラーゲン抽出方法であって、前記遠心分離工程Ｇは、
遠心分離工程Ｆ後における上清に緩衝液を添加すると共にアルカリを添加してｐＨが弱アルカリ状態にて塩析操作を施す塩析工程Ｇａと、
塩析工程Ｇａ後における沈殿物を洗浄し、そして遠心分離操作を施して得られた沈殿物を緩衝液で洗浄する洗浄工程Ｇｂと、
洗浄工程Ｇｂ後において遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｇｃ
とを具備することを特徴とするＩ型コラーゲン抽出方法によって解決される。
【００１２】
又、前記Ｉ型コラーゲン抽出方法であって、
消化工程Ｃの前に脱血液処理を行う脱血液工程Ａを更に具備する
ことを特徴とするＩ型コラーゲン抽出方法によって解決される。
【００１３】
又、前記Ｉ型コラーゲン抽出方法であって、
消化工程Ｃの前に脱血液処理を行う脱血液工程Ａと、
前記脱血液工程Ａの後で、消化工程Ｃの前に脱脂肪処理を行う脱脂肪処理工程Ｂ
とを更に具備することを特徴とするＩ型コラーゲン抽出方法によって解決される。
【００１４】
中でも、ヒト脂肪組織をホモジナイズし、含まれている血液を略除去洗浄する洗浄工程Ａａと、
前記洗浄工程Ａａの後、タンパク分解酵素阻害剤を含有する酸性溶液で洗浄する洗浄工程Ａｂと、
前記洗浄工程Ａｂの後、有機溶媒を用いて含まれている脂肪分を除去する脱脂肪処理工程Ｂと、
前記脱脂肪処理工程Ｂの後、脂肪分が除去された残物にペプシンを加えてペプシン消化を施すペプシン消化工程Ｃと、
前記ペプシン消化工程Ｃ後における可溶上清に遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｄと、
前記遠心分離工程Ｄ後における上清に透析操作を施す透析工程Ｅと、
前記透析工程Ｅ後に遠心分離操作を施して得られる沈殿物に酸を添加して遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｆと、
前記遠心分離工程Ｆ後における上清に緩衝液を添加すると共にアルカリを添加してｐＨが７〜８にて塩析操作を施す塩析工程Ｇａと、
前記塩析工程Ｇａ後における沈殿物を洗浄し、そして遠心分離操作を施して得られた沈殿物を緩衝液で洗浄する洗浄工程Ｇｂと、
前記洗浄工程Ｇｂ後において遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｇｃと、
前記遠心分離工程Ｇｃ後における上清に透析操作を施す透析工程Ｈ
とを具備することを特徴とするＩ型コラーゲン抽出方法によって解決される。
【００１５】
又、前記の課題は、ヒト脂肪組織をタンパク分解酵素で消化させる消化工程Ｃと、
消化工程Ｃ後における上清に遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｄと、
遠心分離工程Ｄ後における上清に透析操作を施す透析工程Ｅと、
透析工程Ｅ後に遠心分離操作を施して得られる沈殿物に酸を添加して遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｆと、
遠心分離工程Ｆ後における上清に対して塩析操作を施して得られた沈殿物を洗浄後に遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｇと、
遠心分離工程Ｇ後における沈殿物を洗浄後、遠心分離操作を施し、そして上清に透析操作を施す透析工程Ｉ
とを具備することを特徴とするＩＩＩ型コラーゲン抽出方法によって解決される。
【００１６】
特に、前記ＩＩＩ型コラーゲン抽出方法であって、前記遠心分離工程Ｇは、
遠心分離工程Ｆ後における上清に緩衝液を添加すると共にアルカリを添加してｐＨが弱アルカリ状態にて塩析操作を施す塩析工程Ｇａと、
塩析工程Ｇａ後における沈殿物を洗浄し、そして遠心分離操作を施して得られた沈殿物を緩衝液で洗浄する洗浄工程Ｇｂと、
洗浄工程Ｇｂ後において遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｇｃ
とを具備することを特徴とするＩＩＩ型コラーゲン抽出方法によって解決される。
【００１７】
又、前記ＩＩＩ型コラーゲン抽出方法であって、
消化工程Ｃの前に脱血液処理を行う脱血液工程Ａを更に具備する
ことを特徴とするＩＩＩ型コラーゲン抽出方法によって解決される。
【００１８】
又、前記ＩＩＩ型コラーゲン抽出方法であって、
消化工程Ｃの前に脱血液処理を行う脱血液工程Ａと、
前記脱血液工程Ａの後で、消化工程Ｃの前に脱脂肪処理を行う脱脂肪処理工程Ｂ
とを更に具備することを特徴とするＩＩＩ型コラーゲン抽出方法によって解決される。
【００１９】
中でも、ヒト脂肪組織をホモジナイズし、含まれている血液を略除去洗浄する洗浄工程Ａａと、
前記洗浄工程Ａａの後、タンパク分解酵素阻害剤を含有する酸性溶液で洗浄する洗浄工程Ａｂと、
前記洗浄工程Ａｂの後、有機溶媒を用いて含まれている脂肪分を除去する脱脂肪処理工程Ｂと、
前記脱脂肪処理工程Ｂの後、脂肪分が除去された残物にペプシンを加えてペプシン消化を施すペプシン消化工程Ｃと、
前記ペプシン消化工程Ｃ後における可溶上清に遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｄと、
前記遠心分離工程Ｄ後における上清に透析操作を施す透析工程Ｅと、
前記透析工程Ｅ後に遠心分離操作を施して得られる沈殿物に酸を添加して遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｆと、
前記遠心分離工程Ｆ後における上清に緩衝液を添加すると共にアルカリを添加してｐＨが７〜８にて塩析操作を施す塩析工程Ｇａと、
前記塩析工程Ｇａ後における沈殿物を洗浄し、そして遠心分離操作を施して得られた沈殿物を緩衝液で洗浄する洗浄工程Ｇｂと、
前記洗浄工程Ｇｂ後において遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｇｃと、
前記遠心分離工程Ｇｃ後における沈殿物を洗浄後、遠心分離操作を施し、そして上清に透析操作を施す透析工程Ｉ
とを具備することを特徴とするＩＩＩ型コラーゲン抽出方法によって解決される。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ヒト由来のＩ型コラーゲン或いはＩＩＩ型コラーゲンを低廉なコストで得ることが出来る。
【００２１】
しかも、自己の体から脂肪吸引などの手段で採取した脂肪組織を原料とした場合、交差感染の恐れも無く、それだけ安全性が高いと考えられる。
【００２２】
更には、ヒト由来のＩ型コラーゲン或いはＩＩＩ型コラーゲンであるから、特に、自己の生体からのＩ型コラーゲン或いはＩＩＩ型コラーゲンであるから、注入した場合の生着率は高く、効果も長続きすると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明になるＩ型コラーゲン抽出方法は、ヒト脂肪組織をタンパク分解酵素で消化させる消化工程Ｃと、消化工程Ｃ後における上清に遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｄと、遠心分離工程Ｄ後における上清に透析操作を施す透析工程Ｅと、
透析工程Ｅ後に遠心分離操作を施して得られる沈殿物に酸を添加して遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｆと、遠心分離工程Ｆ後における上清に対して塩析操作を施して得られた沈殿物を洗浄後に遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｇと、遠心分離工程Ｇ後における上清に透析操作を施す透析工程Ｈとを具備する。前記遠心分離工程Ｇは、特に、遠心分離工程Ｆ後における上清に緩衝液を添加すると共にアルカリを添加してｐＨが弱アルカリ状態にて塩析操作を施す塩析工程Ｇａと、塩析工程Ｇａ後における沈殿物を洗浄し、そして遠心分離操作を施して得られた沈殿物を緩衝液で洗浄する洗浄工程Ｇｂと、洗浄工程Ｇｂ後において遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｇｃとを具備する。前記消化工程Ｃの前に、特に、脱血液処理を行う脱血液工程Ａを更に具備する。又、前記脱血液工程Ａの後で、前記消化工程Ｃの前に、脱脂肪処理を行う脱脂肪処理工程Ｂを更に具備する。そして、特に、ヒト脂肪組織をホモジナイズし、含まれている血液を略除去洗浄する洗浄工程Ａａと、前記洗浄工程Ａａの後、タンパク分解酵素阻害剤を含有する酸性溶液で洗浄する洗浄工程Ａｂと、前記洗浄工程Ａｂの後、有機溶媒を用いて含まれている脂肪分を除去する脱脂肪処理工程Ｂと、前記脱脂肪処理工程Ｂの後、脂肪分が除去された残物にペプシンを加えてペプシン消化を施すペプシン消化工程Ｃと、前記ペプシン消化工程Ｃ後における可溶上清に遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｄと、前記遠心分離工程Ｄ後における上清に透析操作を施す透析工程Ｅと、前記透析工程Ｅ後に遠心分離操作を施して得られる沈殿物に酸を添加して遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｆと、前記遠心分離工程Ｆ後における上清に緩衝液を添加すると共にアルカリを添加してｐＨが７〜８にて塩析操作を施す塩析工程Ｇａと、前記塩析工程Ｇａ後における沈殿物を洗浄し、そして遠心分離操作を施して得られた沈殿物を緩衝液で洗浄する洗浄工程Ｇｂと、前記洗浄工程Ｇｂ後において遠心分離操作を施す遠心分離工程Ｇｃと、前記遠心分離工程Ｇｃ後における上清に透析操作を施す透析工程Ｈとを具備する。
【００２４】
本発明になるＩＩＩ型コラーゲン抽出方法は、本発明になるＩ型コラーゲン抽出方法の工程の大部分を共通にする。すなわち、最終工程に近い工程までは、同一に行うことが出来る。すなわち、Ｉ型コラーゲン抽出方法にあっては、遠心分離工程Ｇ後における上清に透析操作を施すのであるが、遠心分離工程Ｇ後における沈殿物を洗浄後、遠心分離操作を施し、そして上清に透析操作を施すことによって、ＩＩＩ型コラーゲンが得られる。
【００２５】
以下、具体的な実施例を挙げて説明する。
【００２６】
先ず、脂肪吸引技術により採取したヒト大腿部脂肪組織３００ｇをホモジナイズし、精製水にて血液を大まかに除去した。この後、精製水で２４時間掛けて洗浄した。
【００２７】
次に、１ＭのＮａＣｌを含む０．０５ＭのTris−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で４日間掛けて洗浄した。この後、更に、精製水で２４時間掛けて洗浄した。
【００２８】
この後、血清成分を除去する為、タンパク分解酵素阻害剤として４ｍＭのＥＤＴＡ，２ｍＭのα−トルエンスルホニルフロライド，１０ｍＭのＮ−エチルマレイミド，１μｇ／ｍｌのPepstatin Aを含む０．５Ｍ酢酸溶液で３日間掛けて洗浄した。この後、精製水で２４時間掛けて洗浄した。
【００２９】
次いで、上記洗浄した脂肪組織（組織や水分を含めて約１０８ｍＬ）を分液ロートに入れ、そして２７０ｍＬのメタノールと１３５ｍＬのクロロホルムを加えて混合した。この後、ロート内の液は二層に分離した。そこで、更に、１３５ｍＬのクロロホルムを加え、次いで１３５ｍＬの精製水を加えて混合した。この後、ロート内の液は三層に分離した。三層に分離後、下層を取り除いた。そして、フラッフ層のみを分取した。分取したフラッフ層から溶媒を飛ばし、２５０ｍｇのペプシンを含む０．５Ｍの酢酸溶液５００ｍＬを加え、２４時間掛けてペプシン消化を行わしめた。
【００３０】
ペプシン消化後の可溶上清に１０００００ｇ×１時間の超遠心分離操作を施した。この後、上清を０．５Ｍ酢酸（０．７ＭのＮａＣｌを含む）で透析し、この後１０００００ｇ×１時間の超遠心分離操作を施した。
【００３１】
超遠心分離操作の後、沈殿物（Ｉ，ＩＩＩ型コラーゲンが含まれる）を０．５Ｍの酢酸に溶解し、この後、再度、１０００００ｇ×１時間の超遠心分離操作を施した。
【００３２】
そして、得られた上清が０．０５Ｍとなるように０．５ＭのTris−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、緩衝能を持たせた上でｐＨを測定しながら５ＭのＮａＯＨを加え、ｐＨが７．４のものにした。
【００３３】
このようにして得られた液に対して４．４Ｍとなるように塩析（２４時間攪拌）を行って得た沈殿物を、０．０５ＭのTris−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５：４．４ＭのＮａＣｌを含む）で２４時間掛けて洗浄した。
【００３４】
この洗浄後、１０００００ｇ×１時間の超遠心分離操作を施した。そして、得られた沈殿物を０．０５ＭのTris−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５：４．４ＭのＮａＣｌを含む）で４８時間掛けて洗浄した。
【００３５】
この洗浄後、１０００００ｇ×１時間の超遠心分離操作を施した。そして、得られた沈殿物を０．０５ＭのTris−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５：２．４ＭのＮａＣｌを含む）で４８時間掛けて洗浄した。
【００３６】
この洗浄後、１０００００ｇ×１時間の超遠心分離操作を施した。そして、得られた沈殿物を０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５：１．７ＭのＮａＣｌを含む）で４８時間洗浄した。そして、洗浄後、１０００００ｇ×１時間の超遠心分離操作を施した。そして、得られた上清を０．１Ｍの酢酸で透析した。次いで、凍結乾燥を行い、２５．５ｍｇの試料（Ｉ型コラーゲン）を得た。
【００３７】
前記超遠心分離操作で得られた沈殿物を０．０５ＭのTris−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５：１．０ＭのＮａＣｌを含む）で４８時間掛けて洗浄した。
【００３８】
この洗浄後、１０００００ｇ×１時間の超遠心分離操作を施した。そして、得られた上清を０．１Ｍの酢酸で透析した。次いで、凍結乾燥を行い、３０．４ｍｇの試料（ＩＩＩ型コラーゲン）を得た。
【００３９】
尚、上記工程の概略を図１に示した。
【００４０】
上記のようにして得られたコラーゲンについて、アミノ酸分析計（日立製８３５型）でアミノ酸の分析を行った。すなわち、上記試料０．８３ｍｇに６Ｎの塩酸３００μＬを添加し、１１０℃で２２時間掛けて加水分解し、次いで減圧乾固した。残渣を純水５００μＬに溶解させ、０．２２μｍのフィルターで濾過し、濾液を１０倍希釈し、アミノ酸分析に供した。その結果を表−１に示す。
【００４１】
表−１
2007124901.tif 000002
この表−１におけるハイドロキシプロリンはコラーゲンのみに存在するものであるから、抽出された試料はコラーゲンであることが判る。又、ハイドロキシプロリンは、コラーゲンに存在するアミノ酸の約１０％であり、表−１も約１０％である。
【００４２】
次に、上記のようにして得られたＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンを、各々、電気泳動試料用緩衝液（非還元）及び電気泳動試料用緩衝液（還元）で１０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、ＳＤＳ化する為、９５℃で５分間加温し、非還元型および還元型の電気泳動試料を作成した。そして、電気泳動用ゲル板を開封し、電気泳動装置を組み立て、１０％ＳＤＳゲルのレーンに試料１５μＬと分子量マーカー５μＬをスポットし、ゲル１枚について２０ｍＡで約２時間電気泳動を行った。
【００４３】
電気泳動終了後、電気泳動装置からゲルを取り出し、下からフィルターペーパー、ＰＶＤＦ膜、ゲル、フィルターペーパーの順に重ねて転写装置を組み立て、１５Ｖで３０分間の転写を行った。転写後、ＰＶＤＦ膜を精製水でリンスしてからブロッキング液に浸し、室温で１時間シェイキングしてブロッキングした。この後、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１０分間シェイキングして洗浄し、各レーン毎に切り分け、各型の一次抗体をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２５００倍に希釈した液に切り分けたＰＶＤＦ膜を浸し、４℃で一晩シェイキングした。
【００４４】
翌日、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎでシェイキングしながら１０分間ずつ２回洗浄した。この後、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで二次抗体を３００倍に希釈した液に浸し、室温で２時間シェイキングした。この後、ＰＶＤＦ膜を再びＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎでシェイキングしながら１０分間ずつ２回洗浄した。この洗浄したＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−ＴｗｅｅｎでＳＴＡＶ−ＡＰｃｏｍｐｌｅｘを３０００倍に希釈した液（streptavidin 10μＬ及びbiotinylated Alkaline Phosphatase
10μＬをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ３０ｍＬに加える）に浸し、室温で２時間シェイキングした。この後、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎでシェイキングしながら１０分間ずつ２回洗浄した。洗浄後、発色液に浸し、発色するまでシェイキングした。発色後、発色液を捨て、精製水でシェイキングしながら１０分間ずつ３回洗浄した。
【００４５】
そして、Ｉ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンに対する一次抗体を反応させたものを図２に示す。
【００４６】
この結果、Ｉ型コラーゲンに対する一次抗体を反応させたものでは、４個のバンドが確認できた。コラーゲンを変性状態（分子の３本鎖ヘリックス構造が壊れた状態）で泳動すると、α鎖間に架橋結合が有るβ，γ鎖は移動度が小さく、鎖間に架橋が無いα鎖は移動が大きいので、両者は簡単に識別できる。Ｉ型コラーゲン分子の鎖組成は、α１鎖（Ｉ型）２本とα2鎖（Ｉ型）１本で形成されており、泳動のバンドパターン及びバンドの強度比から判断して、最も移動度が大きい１番下に現れているバンドがα2鎖（Ｉ型）で、下から２番目の最も強いバンドがα１鎖（Ｉ型）であると同定した。
【００４７】
ＩＩＩ型コラーゲンに対する一次抗体を反応させたものでは、還元型は１個、非還元型は３個のバンドが確認できた。ＩＩＩ型コラーゲン分子｛α１鎖（ＩＩＩ型）｝３では、α鎖間にジスルフィド架橋結合が有るので、変性のみでは余り泳動しないが、ＩＩＩ型はＳ−Ｓ結合が分子内に存在する為、還元剤でジスルフィド結合を遮断すると、α１鎖（ＩＩＩ型）はα１鎖（Ｉ型）と同じ移動度を示し、α鎖やβ鎖が生じて来ると考えられる。この結果からも、上記のようにして抽出されたものがＩ型コラーゲンやＩＩＩ型コラーゲンであることが判る。
【００４８】
更に、ＨＰＬＣ法によっても調べた。すなわち、Ｉ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンの標準品を用意し、液体クロマトグラムに掛けた。又、上記のようにして抽出されたＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンを液体クロマトグラムに掛けた。その結果、上記のようにして抽出されたものがＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンであることが判った。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明になる抽出方法のフロー図
【図２】本発明方法により地湧出されたコラーゲンのＨＰＬＣ及び電気泳動図                                             代  理  人  宇  高    克  己
【図１】
2007124901.tif 000003
【図２】
2007124901.tif 000004