(57)【要約】      （修正有）【課題】持続性と動物愛護の精神で、動物起源の血清に匹敵し、合成的に植物性または海産の出発物資を用いて、ウシ胎児血清用代替物製造を無用にし、培養物中で十分に溶解する、数多くの細胞株のための培地を提供する。【解決手段】共役リノール酸および／又はオメガ脂肪酸のエステルのような、不飽和な生理活性脂肪酸エステルおよび／又はステロールエステルの、細胞培養用培地として、とりわけウシ胎児血清用代替物として使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不飽和な生理活性脂肪酸エステルの、細胞培養用培地としての使用。
【請求項２】
ウシ胎児血清用代替物としての、不飽和な生理活性脂肪酸エステルの使用。
【請求項３】
16〜24個の炭素原子と2〜5個の二重結合を含有する脂肪酸のエステルを用いることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
共役リノール酸(CLA)及び／又はオメガ脂肪酸(oF)のエステルを用いることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
脂肪酸をその脂肪族C1-4アルコールエステルの形態で用いることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
エチルエステルを用いることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
脂肪酸をそのステロールエステルの形態で用いることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
天然または合成の油または油混合物と、高含量の不飽和な生理活性脂肪酸と低級C1-4アルコールまたはステロールのエステル交換生成物を用いることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
植物油、魚油または微生物油もしくは油混合物をベースとするエステル交換生成物を用いることを特徴とする、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
エステルをステロール、リン脂質及び／又は植物性タンパク質と共に用いることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には細胞培養に関し、とりわけ、特定の脂肪酸低級アルキルエステルの、細胞培養用培地としての、とりわけ、ウシ胎児血清用代替物(FBS)としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシ胎児血清は、その用途が広範にわたることから、工業並びに医薬および科学のいずれにおいても、細胞、組織および臓器のインビトロ培養法のために最も広く使用されている血清である。ほぼウシ胎仔血清のみでカバーされる世界的需要は、１年当たり凡そ500,000リットルの量となる。
【０００３】
FBS製造のために用いられる動物胎児由来の血液は、敗血の理由で心臓を穿刺するのが好適ではあるが、通常は臍帯または頸静脈に穴を開けることによって得られる。専門家の間で広く行き渡った見方では胎児は母動物とほぼ同時に死ぬということであるが、胎児と新生児は酸素の欠乏を比較的うまく処理する能力を有することが科学的研究によって示されたことから、母動物の心臓が鼓動を停止した時の後しばらくの間、胎児は生き延び得るということを排除することはできない。FBSを得るプロセスを倫理的に問題のある営みであるとする苦痛を胎児が感じることも、排除し得ない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明によって取り組むべき課題は−持続性と動物愛護との関連で−その特性が動物起源の血清に匹敵するが、合成的に、好ましくは植物性または海産の出発物質を用いて得ることができ、および、従って培地期間でのFBSの製造を無用にする、培養物中で十分な溶解性を有する数多くの全く異なる細胞株のための培地を提供することであった。
【０００５】
US-A 4,762,792には、水系の動物性リポタンパク質濃縮物が開示されている。
【０００６】
【特許文献１】US-A 4,762,792号公報
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、不飽和な生理活性脂肪酸エステルの、細胞培養用培地としての、とりわけウシ胎児血清用代替物としての使用に関する。
【０００８】
驚くべきことに、本発明に従って用いるべきエステルは、例えば、「BHK」型(ハムスター腎臓の線維芽細胞)、「Vero」型(ミドリザル腎臓の線維芽細胞)、または「MRC 5」型(ヒト肺組織からの線維芽細胞)の細胞株についての試験において実証されたように、優れた培地特性を有しており、この点でFBSと同等であるか、若しくは優れてすらあることが判明した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
不飽和の生理活性脂肪酸エステル
本発明に従って用いるべき生理活性脂肪酸エステルの一般基準は、十分に長い脂質残基と十分な数の二重結合を有すべきことである。従って、16〜26個の炭素原子と2〜6個の二重結合を含有する脂肪酸のエステルは、この目的にとって特に適当である。
【００１０】
本発明の第一の態様では、共役リノール酸(CLA)のエステル、好ましくは1〜4個の炭素原子を含有する低級脂肪族アルコールとのエステル、より好ましくはそのエチルエステルが、この目的で用いられる。これらのエステルは、例えば、アザミ油または対応するアルキルエステルの塩基触媒異性化、その後の酵素加水分解およびエステル化によって製造することのできる既知の物質である。CLA成分は特定仕様を満たすと有利であることが判明しており、これによると、アシル基は少なくとも30重量％のt10,c12-異性体、少なくとも30重量％のc9,t11異性体、および、合計で、1重量％未満の8,10-、11,13-およびt,t-異性体を含有する。相当する出発の酸は、例えば、Tonalin（登録商標） CLA-80 (Cognis)の名称で市販されている。
【００１１】
第二の別の態様では、他の適当なエステルは、所謂オメガ脂肪酸、および特に、典型的には18〜26個、とりわけ20〜22個の炭素原子と少なくとも4〜6個の二重結合を含有するオメガ-3 脂肪酸のエステルである。これらのエステルは、有機化学の標準的方法、例えば、ドイツ特許 DE 3926658 C2 (Norsk Hydro)に記載されたように、魚油のエステル交換、尿素によって得られたC1-4アルキルエステルの析出、およびその後の非極性溶媒による抽出によって得ることもできる。オメガ-3 (全て-Z)-5,8,11,14,17-エイコサペンタエン酸(EPA) C20:5 および (全て-Z)-4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサエン酸(DHA) C22:6 において豊富な脂肪酸エステルの混合物が、このような方法で得られる。これらのような出発の脂肪酸は、例えば、Omacor（登録商標） (Pronova)の名称で市販されている。または、等しく高いEPAおよびDHA含有量の油も、例えばEP 0515460 B1 (Martek)またはWO 98/003671 A1 (Santory)に記載されているように、微生物技術、即ち特定の菌類または微細藻類の発酵によって得ることもできる。
【００１２】
しかし、生理活性成分は、それらの低級アルキルエステル形態でのみならず、ステロールとのエステル形態でも使用することができる。ステロールエステルは、それらが容易に吸収され、また生理学的条件下で容易に開裂する点で有利である。また、別の生理活性成分がステロールによって放出される。用語「ステロール」、「スタノール」および「ステリン」は同義であって、C-3にヒドロキシル基のみを有するが、他の機能を有さないステロイドを意味する。更に、27〜30個の炭素原子を含有するステロールは、二重結合を、好ましくは5/6位に含有してよい。その代表例は、β-シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール、アヴィーナステロールおよびスチグマステロールとのエステルである。本発明の目的にとって好適な化合物は、CLAまたはオメガ脂肪酸のβ-シトステロールまたはその水素化生成物であるβ-シトスタノールによるエステルである。
【００１３】
ある好適な態様では、高含量の、好ましくは、アシル基を基準に、50モル％より多い、とりわけ、75モル％より多い、不飽和な生理活性脂肪酸を有する天然または合成の油または油混合物と、低級C1-4アルコール、好ましくはエタノール、またはステロールとのエステル交換生成物が、生理活性成分として用いられる。出発の油または油混合物は、好ましくは植物性、海産性または微生物性のものであり、そのような物質の混合物でさえあってよい。その代表例は、アザミ油、ひまわり油、菜種油、オリーブ油、アマニ油、綿実油、米油、鯖油、鰯油、ニシン油および最初に述べた海洋微生物の発酵に由来する微生物油である。これらの油のエステル交換は、既知の方法で、即ち、専門家を発明活動に関与させることなく、必要に応じてアルカリ触媒の存在下で、実施し得る。
【００１４】
別の好適な態様では、不飽和な生理活性脂肪酸のエステルをステロールと混合してよい。ここでも、また、適当なステロールの典型例はカンペステロール、ブラシカステロール、アヴィーナステロール、スチグマステロールおよび、とりわけ、β-シトステロールである。混合比は、99:1〜50:50であってよく、好ましくは98:2〜75:25、とりわけ95:5〜90:10重量部である。CLAエチルエステルとβ-シトステロールの混合物、とりわけ重量比が99:1〜96:4のものは、特に好適である。これらの混合物を使用するのが有利な点は、特別な細胞株、例えばハムスター卵巣(CHO)の上皮細胞によって得られるより良い培養結果にある。
【００１５】
本発明に従って使用されるべき脂肪酸エステルの溶解性を向上させるためには、リン脂質を使用すると有利であることが判明した。このために、脂肪酸エステルを、好ましくは同じアシル基を有するリン脂質と20:80〜80:20、好ましくは40:60〜60:40の重量比で混合するか、または、既知の方法でリポソームによりカプセル化することもできる。リポソームを用いる場合には、これは、例えば、膜中に組み込まれた大豆または小麦に由来する植物性タンパク質を更に含有してよい。
【実施例】
【００１６】
〔実施例１〕
不飽和脂肪酸エチルエステルの製造
パーム油20重量％、菜種油(古い植物からのもの)5重量％、高エルカの菜種油50重量％、ひまわり油20重量％およびアマニ油5重量％から構成される混合物を、エタノールによって既知の方法でエステル交換に付した。得られたエチルエステル混合物は、以下の脂肪酸分布を示した。
【００１７】
【表１】
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【外国語明細書】
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