(57)【要約】【手段】植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物を含むことを特徴とする植物ウィルス病防除剤及び該防除剤による種子、栽培土壌等の植物ウィルス病の防除方法。【効果】本発明の植物ウィルス病防除剤は、難防除植物ウィルス病汚染圃場などのウィルス病害の防除対策及び予防対策に有効に使用できるものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物を含むことを特徴とする植物ウィルス病防除剤。
【請求項２】
植物ウィルスを媒介する菌がオルピディウム菌である、請求項１記載の植物ウィルス病防除剤。
【請求項３】
植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物がBacillus（バチルス）sp.BS-05242 AVであることを特徴とする請求項１叉は２記載の植物ウィルス病防除剤。
【請求項４】
植物ウィルスがメロンえそ斑点ウィルスであり、植物ウィルス病がメロンえそ斑点病である、請求項１乃至３のいずれか記載の植物ウィルス病防除剤。
【請求項５】
植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物で栽培植物の種子、葉、根及び／又は栽培土壌を処理してなることを特徴とする植物ウィルス病の防除方法。
【請求項６】
植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物を栽培植物の種子、葉、根及び／又は栽培土壌に処理し、かつ栽培土壌に土壌消毒剤を施用してなることを特徴とする植物ウィルス病の防除方法。
【請求項７】
植物ウィルスを媒介する菌がオルピディウム菌である、請求項５叉は６記載の植物ウィルス病の防除方法。
【請求項８】
植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物がBacillus （バチルス）sp.BS-05242 AVであることを特徴とする請求項５乃至７のいずれか記載の植物ウィルス病の防除方法。
【請求項９】
植物ウィルスがメロンえそ斑点ウィルスであり、植物ウィルス病がメロンえそ斑点病である、請求項５乃至８のいずれか記載の植物ウィルス病の防除方法。
【請求項１０】
植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有するBacillus（バチルス） sp.BS-05242 AV。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物ウィルスを媒介する菌の拮抗作用を有する微生物、当該微生物を含む植物ウィルス病の防除剤及び該防除剤を使用する植物ウィルス病の防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メロンえそ斑点病やレタスビックベイン病、ビートえそ性葉脈黄化病、エンドウ茎えそ病などは土壌伝染性の植物ウィルスよってに引き起こされる病気であり、特に、メロンえそ斑点病は、土壌に普遍的に生息するオルピディウム菌によって媒介されるウィルス病であり、全国的に拡大・蔓延している。その病原ウィルスは土壌、残渣・残根、雑草、種子に存在し、定植や作業時の管理作業によって伝播する。伝播の防止には、ウィルスを媒介する菌や昆虫類を介在させないことが重要と考えられる。
【０００３】
このような土壌伝染性のウィルス病害対策として、従来は臭化メチル剤の土壌くん蒸による防除が行われてきた。しかし、本剤は国際規約によって一部の使用を除き2005年に全廃された。これに代わる技術として、蒸気・熱水による土壌消毒技術が一部地域で利用され始めたが、土壌深層に残存したウィルス保毒オルピディウム菌が上昇・蔓延し、病害を容易に発生させている。
【０００４】
このような難防除土壌伝染性ウィルス病の土壌伝染を阻止するための技術開発は必要不可欠なものとなっている。また、近年の環境問題への意識の高まりから減農薬への動きも大きくなってきている。そのような状況の中で、今後、抵抗性品種の利用や生物的な防除による環境保全型のウィルス病害防除が必要不可欠である。その他、植物ウィルスの防除剤としては、アルギン酸ナトリウム剤や、シイタケ菌糸体培養抽出物（特許文献１）があるが、いずれも土壌消毒を目的として使用するものではない。
【０００５】
【特許文献１】特公昭54-33994号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、臭化メチル代替の土壌消毒剤および土壌改良剤として、植物ウィルス病害を防除する、あるいは予防対策を目的に、有効な植物ウィルス病防除剤を提供することを課題とする。また、本植物ウィルス病防除剤を用い、減農薬による環境保全型農業が可能となるような、植物ウィルス病害の生物的防除方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行い、主たる植物ウィルス媒介菌としてオルピディウム菌があげられることに着目し、根圏土壌、有機質肥料および堆肥に存在する微生物群からオルピディウム菌に対して拮抗する微生物の検索を行い、メロンえそ斑点ウィルス（Melon necrotic spot virus：MNSV）病を媒介するオルピディウム菌に対して高い拮抗能を有する微生物を見出し、本発明を完成するに至った。特にBacillus（バチルス）属の菌株Bacillus（バチルス） sp. BS-05242 AV（受託番号：FERM  P-20743）に属する微生物が植物ウィルス媒介菌及び植物ウィルス病の防除に有効であることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有するBacillus  （バチルス）sp.BS-05242 AVである。
【０００９】
また、本発明は、植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物を含むことを特徴とする植物ウィルス病防除剤である。
【００１０】
また、本発明は、植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物で栽培植物の種子、葉、根及び／又は栽培土壌を処理してなることを特徴とする植物ウィルス病の防除方法である。
【００１１】
また、本発明は、植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物を栽培植物の種子、葉、根及び／又は栽培土壌に処理し、かつ栽培土壌に土壌消毒剤を施用してなることを特徴とする植物ウィルス病の防除方法である。
【００１２】
上記防除剤及び防除方法において、植物ウィルスを媒介する菌としてはオルピディウム菌が、また植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物としてはBacillus（バチルス） sp.BS-05242 AVがそれぞれ挙げられ、さらに、植物ウィルス或いは植物ウィルス病としては、メロンえそ斑点ウィルス或いはメロンえそ斑点病がそれぞれ挙げられる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の植物ウィルス病を媒介する菌の感染に対する拮抗菌は、オルピディウム菌の感染を有意に抑制し、さらには、メロンえそ斑点病の病原ウィルスの感染も有意に抑制した。また、土壌消毒剤と当該微生物との組合せ処理によって、圃場においても高いウィルス防除効果を示した。従って、本発明の植物ウィルス病防除剤は、難防除植物ウィルス病汚染圃場などのウィルス病害の防除対策及び予防対策に有効に使用できるものである。このことから、本発明により従来にない、新しい植物ウィルス防除法が確立され、ウィルス病害に対する臭化メチル代替剤としての利用が可能となり、さらに、減農薬による環境保全型農業が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の微生物としては、植物ウィルス病の媒介菌に拮抗能を有する微生物が用いられる。特に、植物ウィルス病の媒介菌の代表にあげられるオルピディウム菌に拮抗能を有する微生物が有効に用いられる。なお、上記植物ウィルス病としては、メロンえそ斑点病、レタスビックベイン病、ビートえそ性葉脈黄化病、エンドウ茎えそ病などが挙げられる。そして、上記微生物としては細菌（Pseudomonas（シュードモナス）属、Bacillus（バチルス）属、Corynebacterium（コリネバクテリウム）属）、放線菌（Streptomyces（ストレプトミセス）属、Actinomyces（アクチノミセス）属）、酵母（Saccharomyces（サッカロミセス）属）、糸状菌（Aspergillus（アスペルギルス）属、Penicillium（ペニシリュウム）属）等、植物ウィルス病の媒介菌に拮抗能を有する微生物であれば、いずれでも用いることができる。そして、Bacillus（バチルス）属の細菌としては、Bacillus（バチルス）sp. BS-05242 AV 、BS-91、BS-275が挙げられるが、特にBacillus（バチルス）sp. BS-05242 AVはオルピディウム菌への拮抗能の活性が高いことから、有効に用いられる。
BS-05242 AVの菌学的特性は表１のとおりである。
【００１５】
【表１】
2007217294.tif 000002
【００１６】
本菌株は、上記菌学的特徴において桿状のグラム染色陽性で、胞子を形成し、主として好気的条件で増殖する菌であることから、Bacillus（バチルス）属に分類される。本菌の類縁種として、バチルス・セレウス（B.cereus）、バチルス・チュウリンゲンシス（B.thuringiensis）があげられる。しかし、レシチナーゼ活性を示さない点でバチルス・セレウス（B.cereus） の典型的な性状と異なり、結晶封入体が検出されない点でバチルス・チュウリンゲンシス（B.thuringiensis） の特徴とは異なる。〔ジョン・ジ・ホルトら  ：バージーズ・マニュアル  オブ  システマティク  バクテリオロジー第2巻  (JOHN G HOLT et al.,BERGEY’S MANUAL OF Systematic Bacteriology)〕。
【００１７】
本菌株の16Sリボゾーマル（ribosomal）RNA遺伝子(16S rDNA)のうち5’末端側約500bpの領域を増幅・シーケンシングし、その配列を用いて細菌基準株データベースおよびGenBank/DDBJ/EMBLに対する相同性を検索した。その結果、本菌株の16S rDNA は部分塩基配列が、バチルス・セレウス（B.cereus）、バチルス・チュウリンゲンシス（B.thuringiensis）に99％以上の相同性を示したことから、本菌株に最も近縁な種はバチルス・セレウス（B.cereus）次いでバチルス・チュウリンゲンシス（B.thuringiensis）と考えられ、これらに近縁なBacillus（バチルス） sp.であると推定した。これらのことから、本菌株をBacillus（バチルス） sp.の新種相当と判定した。本細菌は、Bacillus（バチルス） sp.BS-05242 AVとして独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに2005年12月22日付けで受託されている（受託番号FERM  P-20743）
【００１８】
BS-05242 AV 菌の培養条件の検討
BS-05242 AV菌株、１白金耳分を各液体培地（三角フラスコ100ml）に添加し、振幅数100振幅／分、30℃の恒温器で振とう培養して、4日、8日、10日後にYPMG寒天培地を用いた希釈平板法で菌数を調査した。液体培地組成は(1)YPMG（酵母エキス0.3g、ペプトン0.5g、肉エキス0.1g、グルコース1g  蒸留水100ml、pH7.0）、(2)YPMD（酵母エキス0.3g、ペプトン0.5g、肉エキス0.1g、デキストリン1g  蒸留水100ml、pH7.0）、(3)ソイブロス（Soy broth）はDifco製のものを使用した（トリプト・ソイブロス（Tryptic Soy broth）3g、蒸留水100ml）。培養試験の結果、BS-05242 AV菌株は（2）YPMDが4日〜10日の培養で安定して1012  CFU/mlの生菌数を保っていた（表2）。
【００１９】
【表２】
2007217294.tif 000003
【００２０】
本菌株は、上記の液体培地で培養して増殖することができる。特に、YPMD液体培地では安定した菌数が保てる。用いられるYPMD培地は、寒天培地であっても、液体培地であっても使用することができる。YPMD液体培地を用いた培養は、30℃で４〜10日間行うことが好ましい。
【００２１】
本発明の微生物は、寒天培地又は液体培地を用いて、培養・増殖される。増殖された微生物は、白金耳等により採取、遠心分離等の操作により集菌して採取、あるいは培養液の状態として、植物ウィルス病の防除又は植物ウィルス病防除剤に用いることができる。
【００２２】
このように培養・増殖して得られた微生物は、単独で用いることも2種以上を組み合わせて用いることもできる。また、この微生物は、当該微生物のみで本発明の植物ウィルス病防除剤とすることもできるが、他の各種剤と組み合わせ、粒剤、粉剤、錠剤、乳剤、水和剤等の任意の形状として使用することもできる。さらには、本発明の植物ウィルス病防除剤を無機質肥料、有機質肥料、除草剤、土壌と組み合わせ、肥料、土壌改良剤、育苗培土等とすることもできる。
【００２３】
この微生物は、植物ウィルスの媒介菌に対し拮抗能を有しているので、この植物ウィルス病防除剤を栽培植物の種子、葉、根、栽培土壌等に処置して植物ウィルス病の防除効果が発揮される。この処置方法としては、土壌への施用、育苗培土への添加、作物種子にバクテリゼーション処理、葉面散布、養液栽培における養液への添加、土耕栽培における株元への添加・潅注等をあげることができる。この微生物による処理により、植物ウィルス媒介菌の防除を行うことはもとより、植物ウィルス病害汚染圃場の伝染を阻止、あるいは予防対策としても使用することができる。
【００２４】
本発明の植物ウィルス病の防除方法としては、上記のように植物ウィルス剤単独で処理することもできるが、各種土壌消毒と組み合わせて処理すると、より植物ウィルス病の防除効果は高まる。土壌消毒法としては、D‐D剤、熱水があげられるが、D-Dを用いることが好ましい。処理の時期としては、処理してガス抜き後にこの微生物により処理を行うことができ、処理の方法としては種子、葉、根、土壌等に上記微生物の処理方法と同様にして行うことができる。
【００２５】
この植物ウィルス病防除剤の使用量は、例えば栽培土壌に対しては10a当たり10kg〜500kgである。種子の処理の場合には、培養菌液に10min〜24h浸漬後風乾した種子を使用する。
【００２６】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
植物ウィルス病防除剤の製造（１）
本菌株BS-05242 AVの培養液（1×1012CFU/ml）に10％スキムミルクを添加してスプレードライヤー（ヤマトラボテック（株）製）を用いて、噴霧出口温度（100〜110℃）になるように設定した。
【００２８】
【表３】
2007217294.tif 000004
【００２９】
噴霧出口温度（100℃）の設定で、80％の回収率で1×1010CFU/gの乾燥菌体が得られた。
【実施例２】
【００３０】
植物ウィルス病防除剤の製造（２）
有機質基質（コメヌカ、フスマ）と多孔質基質（ゼオライト、バーミキュライト）の各供試資材を表10の割合で滅菌袋へ2.5kgになるように入れ、水を750mL加え混合し、封をして121℃で30分間オートクレーブ滅菌した。滅菌後、BS-05242 AV 菌株の培養液を10mLずつ添加して30℃で培養を行い、培養1ヵ月後の菌数を測定した。
結果を表４に示す。
【００３１】
【表４】
2007217294.tif 000005
【００３２】
表4の結果から、各供試資材の混合割合(3)の菌数が最大であるので、(3)を植物ウィルス防除剤とした。
【実施例３】
【００３３】
オルピディウム菌の純粋培養系での拮抗菌簡易選抜試験
本菌株BS-05242 AVを含む、土壌、堆肥から分離した当社保有のフザリウム菌に対して拮抗能を持つ当社保有の細菌（主として、バチルス菌）において、オルピディウム菌に対して拮抗作用をもつかどうかを調査した。各菌株の一白金耳分を100mlのYPMG液体培地（酵母エキス3.0ｇ、ペプトン5.0ｇ、肉エキス1.0ｇ、デキストリン10ｇ、蒸留水1.0リットル、pH7.0）を含む200ml三角フラスコ内に植菌後、振幅数100振幅／分、30℃、暗条件下で10日間培養した。その培養液を蒸留水で10倍に希釈し、その希釈液にマクワウリ種子（金太郎  タキイ種苗）を30分間浸漬し、バーミキュライト（40ｍｌ）をつめたコニカルチューブに2粒ずつ5反復で植え付け、人工気象器内で27℃、16時間日長で管理した。播種後10日目のマクワウリ子葉展開期の根に、予めオルピディウム菌の着生したマクワウリ根（100個程度／側根1cm）の粗汁液を1.0mlずつ添加した。その後、すぐに蒸留水をバーミキュライト表面から１ｃｍ程度になるように添加し、その後の水管理は地表面が覆われる程度に添加した。さらに、同様の栽培管理で3週間育成した。育成後は、根を傷めないように1株ずつ取り出し、根部を水洗し、根内に形成されているオルピディウム菌の遊走子嚢および休眠胞子数を光学顕微鏡下で計数した。なお、計数は、1株あたり地際部に近い主根から分岐した側根を任意に5本選んで、分岐部分より１ｃｍの長さに切った根の中で、着生数の多かったものについて行った。調査区は、1菌株あたり5反復設けて、計数した。
【００３４】
次式、感染率（％）＝（BS-05242 AV処理区のオルピディウム菌着生数／無処理のオルピディウム菌着生数）×100
により感染率を算出したところ、供試した菌の中でBS91、BS-05242 AV、BS275の感染率が無処理区に比べて低く、特にBS-05242 AV処理区では３％の感染率であった。結果を表5に示した。
【００３５】
この試験結果から、拮抗菌の中で、BS-05242 AV菌処理を行うことにより、オルピディウム菌の感染を有意に抑制できる拮抗菌であることが分かった。
【００３６】
【表５】
2007217294.tif 000006
【実施例４】
【００３７】
BS-05242 AV菌を利用したメロンえそ斑点ウィルス感染抑制ポット試験
拮抗菌処理方法  播種時と植付時との2回処理
播種時処理：  BS-05242 AV菌体濃縮液（2.0×1010 CFU/ml）にメロン種子（品種  アールス雅春秋系）を2時間浸漬後、セルトレイ（1穴容量：約30ml）に播種し、その後菌液の100倍希釈液（蒸留水）を1セル当たり20mlずつかん注した。
植付時処理：  供試土壌をつめたビニールポットにメロン苗を植え付け後、培養菌液（1.6×1011 CFU/ml）を株元に50mlずつかん注した。
供試土壌：半促成栽培で本病が多発した土壌を用いて、供試土壌の汚染度をオートクレイブ滅菌（120℃、1.2気圧、30分）した同一土壌で3段階に希釈（原土区、1/4原土区、1/8原土区）設定し、本土壌４に対して1の割合でオートクレイブ滅菌した牛糞もみがら堆肥を混入して用いた。また、対照となる健全植物の育成には、同一土壌をオートクレイブして使用した。なお、汚染土壌のウィルス系統は、MNSV-NHであった。
検定方法：メロンを播種して人工気象器（25℃定温）内で管理し、播種後10日目の本葉1葉期に供試土壌をつめたビニールポット（径9cm）に1ポット当たり1株ずつ植付け、25℃定温の人工気象器内で3週間育成後、根部を水洗して土壌を良く落とし、地際直下の根部を採取して、100倍の粗汁液をDAS-ELISA検定した。
【００３８】
次式、陽性株率（％）＝（処理区の陽性株数／供試株数）×100により陽性株率を算出したところ、処理区では1/4原土区では25％、1/8原土区では0％の陽性株率であり、無処理区と比較すると有意な差で、処理区では感染が抑えられていた。また、平均吸光度は各株のDAS-ELISA値の平均であり、平均したウィルス濃度で、原土区でも処理区の半分以下であった。結果を表6に示した。
【００３９】
この試験結果から、BS-05242 AV菌処理を行うことで、メロンえそ斑点病多発土壌の原土区でもウィルス濃度をある程度低下させることができ、予め汚染程度を抑えることによって、メロンえそ斑点ウィルスの感染を有意に抑制した。
【００４０】
【表６】
2007217294.tif 000007
【実施例５】
【００４１】
BS-05242 AV菌を利用したメロンえそ斑点病防除圃場試験（メロンえそ斑点病発生温室  実施時期2005年3月〜7月）
本菌株の濃縮菌体液（1×1010 CFU/ml）にメロン種子（アールス雅春秋系）を2時間浸漬した。育苗用土を16穴連結ポット（5×5×5cm）に詰め、浸漬した種子を播種した。さらに、濃縮菌体液の100倍希釈液（蒸留水）を1ポット当たり20mlずつかん注した。その後、発芽室（30℃）で3日間催芽させた後、育苗温室で本葉3葉期まで育苗した。定植時に植え穴と定植後の株元へ菌液（2×109 CFU/ml）を1株当たり50mlずつかん注した。耕種概要は、畝間200cm（ベット130cm、通路50cm）、株間36cm、条間60cmの2条植えで、栽植株数260株/aとし、地床栽培を行った。施肥及びその他栽培管理は慣行法に準じた。その他、土壌消毒については、サブソイラーによる温室内圃場の硬盤破砕後、D-D-92（30L/10a）相当量を処理し、ビニールで8日間被覆して、その後3回ガス抜きを行った。ガス抜き後はネコブセンチュウ防除を目的に、ネマトリン20g/m2を管理機により土壌混和した。熱水消毒方法については、圃場の硬盤破砕後、移動散布式熱水消毒機により300L/m2の熱水を処理し、処理後8日目に被覆剤をはがして、さらに5日間置いた後に管理機によって耕運を行った。各処理区は、14株 / 区の3反復行った。調査方法は、収穫直前に葉の病斑（小病斑及び大病斑）を目視により下の基準に従って発病程度を調査し、発病度を算出した。また、判別が困難な病斑については、DAS-ELISA法によりウィルスの検定を行った。
【００４２】
［発病程度別指数］
0：発病が認められない
1：発病葉枚数1〜4枚
2：発病葉枚数5〜9枚
3：発病葉枚数10枚以上
4：枯死
【００４３】
次式、発病度＝[｛Σ（発病程度別株数×指数）｝／（調査株数×4）]×100により発病度を算出したところ、微生物＋土壌消毒剤区では8.9と土壌消毒剤単独区の16.1に比べて低く、さらには熱水消毒区25.6よりも低かった。結果を表7 に示した。
【００４４】
また、発病株率でも微生物＋土壌消毒剤区は他の区に比べて低かった。
この試験結果から、BS-05242 AV菌処理を行うことで、圃場においても効果を確認することができた。さらには、土壌消毒等の組み合わせにより有意な差があることが実証できた。
【００４５】
【表７】
2007217294.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成18年2月22日(2006.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物を含むことを特徴とする植物ウィルス病防除剤。
【請求項２】
植物ウィルスを媒介する菌がオルピディウム菌である、請求項１記載の植物ウィルス病防除剤。
【請求項３】
植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物がBacillus（バチルス）sp.BS-05242 AVであることを特徴とする請求項１又は２記載の植物ウィルス病防除剤。
【請求項４】
植物ウィルスがメロンえそ斑点ウィルスであり、植物ウィルス病がメロンえそ斑点病である、請求項１乃至３のいずれか記載の植物ウィルス病防除剤。
【請求項５】
植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物で栽培植物の種子、葉、根及び／又は栽培土壌を処理してなることを特徴とする植物ウィルス病の防除方法。
【請求項６】
植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物を栽培植物の種子、葉、根及び／又は栽培土壌に処理し、かつ栽培土壌に土壌消毒剤を施用してなることを特徴とする植物ウィルス病の防除方法。
【請求項７】
植物ウィルスを媒介する菌がオルピディウム菌である、請求項５又は６記載の植物ウィルス病の防除方法。
【請求項８】
植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物がBacillus （バチルス）sp.BS-05242 AVであることを特徴とする請求項５乃至７のいずれか記載の植物ウィルス病の
防除方法。
【請求項９】
植物ウィルスがメロンえそ斑点ウィルスであり、植物ウィルス病がメロンえそ斑点病である、請求項５乃至８のいずれか記載の植物ウィルス病の防除方法。
【請求項１０】
植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有するBacillus（バチルス） sp.BS-05242
AV。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物ウィルスを媒介する菌の拮抗作用を有する微生物、当該微生物を含む植物ウィルス病の防除剤及び該防除剤を使用する植物ウィルス病の防除方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メロンえそ斑点病やレタスビックベイン病、ビートえそ性葉脈黄化病、エンドウ茎えそ病などは土壌伝染性の植物ウィルスよってに引き起こされる病気であり、特に、メロンえそ斑点病は、土壌に普遍的に生息するオルピディウム菌によって媒介されるウィルス病であり、全国的に拡大・蔓延している。その病原ウィルスは土壌、残渣・残根、雑草、種子に存在し、定植や作業時の管理作業によって伝播する。伝播の防止には、ウィルスを媒介する菌や昆虫類を介在させないことが重要と考えられる。
【０００３】
このような土壌伝染性のウィルス病害対策として、従来は臭化メチル剤の土壌くん蒸による防除が行われてきた。しかし、本剤は国際規約によって一部の使用を除き2005年に全廃された。これに代わる技術として、蒸気・熱水による土壌消毒技術が一部地域で利用され始めたが、土壌深層に残存したウィルス保毒オルピディウム菌が上昇・蔓延し、病害を容易に発生させている。
【０００４】
このような難防除土壌伝染性ウィルス病の土壌伝染を阻止するための技術開発は必要不可欠なものとなっている。また、近年の環境問題への意識の高まりから減農薬への動きも大きくなってきている。そのような状況の中で、今後、抵抗性品種の利用や生物的な防除による環境保全型のウィルス病害防除が必要不可欠である。その他、植物ウィルスの防除剤としては、アルギン酸ナトリウム剤や、シイタケ菌糸体培養抽出物（特許文献１）があるが、いずれも土壌消毒を目的として使用するものではない。
【０００５】
【特許文献１】特公昭54-33994号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、臭化メチル代替の土壌消毒剤および土壌改良剤として、植物ウィルス病害を防除する、あるいは予防対策を目的に、有効な植物ウィルス病防除剤を提供することを課題とする。また、本植物ウィルス病防除剤を用い、減農薬による環境保全型農業が可能となるような、植物ウィルス病害の生物的防除方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行い、主たる植物ウィルス媒介菌としてオルピディウム菌があげられることに着目し、根圏土壌、有機質肥料および堆肥に存在する微生物群からオルピディウム菌に対して拮抗する微生物の検索を行い、メロンえそ斑点ウィルス（Melon necrotic spot virus：MNSV）病を媒介するオルピディウム菌に対
して高い拮抗能を有する微生物を見出し、本発明を完成するに至った。特にBacillus（バチルス）属の菌株Bacillus（バチルス） sp. BS-05242 AV（受託番号：FERM  P-20743）
に属する微生物が植物ウィルス媒介菌及び植物ウィルス病の防除に有効であることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有するBacillus  （バチルス）sp.BS-05242 AVである。
【０００９】
また、本発明は、植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物を含むことを特徴とする植物ウィルス病防除剤である。
【００１０】
また、本発明は、植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物で栽培植物の種子、葉、根及び／又は栽培土壌を処理してなることを特徴とする植物ウィルス病の防除方法である。
【００１１】
また、本発明は、植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物を栽培植物の種子、葉、根及び／又は栽培土壌に処理し、かつ栽培土壌に土壌消毒剤を施用してなることを特徴とする植物ウィルス病の防除方法である。
【００１２】
上記防除剤及び防除方法において、植物ウィルスを媒介する菌としてはオルピディウム菌が、また植物ウィルスを媒介する菌に対し拮抗作用を有する微生物としてはBacillus（バチルス） sp.BS-05242 AVがそれぞれ挙げられ、さらに、植物ウィルス或いは植物ウィルス病としては、メロンえそ斑点ウィルス或いはメロンえそ斑点病がそれぞれ挙げられる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の植物ウィルス病を媒介する菌の感染に対する拮抗菌は、オルピディウム菌の感染を有意に抑制し、さらには、メロンえそ斑点病の病原ウィルスの感染も有意に抑制した。また、土壌消毒剤と当該微生物との組合せ処理によって、圃場においても高いウィルス防除効果を示した。従って、本発明の植物ウィルス病防除剤は、難防除植物ウィルス病汚染圃場などのウィルス病害の防除対策及び予防対策に有効に使用できるものである。このことから、本発明により従来にない、新しい植物ウィルス防除法が確立され、ウィルス病害に対する臭化メチル代替剤としての利用が可能となり、さらに、減農薬による環境保全型農業が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の微生物としては、植物ウィルス病の媒介菌に拮抗能を有する微生物が用いられる。特に、植物ウィルス病の媒介菌の代表にあげられるオルピディウム菌に拮抗能を有する微生物が有効に用いられる。なお、上記植物ウィルス病としては、メロンえそ斑点病、レタスビックベイン病、ビートえそ性葉脈黄化病、エンドウ茎えそ病などが挙げられる。そして、上記微生物としては細菌（Pseudomonas（シュードモナス）属、Bacillus（バチ
ルス）属、Corynebacterium（コリネバクテリウム）属）、放線菌（Streptomyces（スト
レプトミセス）属、Actinomyces（アクチノミセス）属）、酵母（Saccharomyces（サッカロミセス）属）、糸状菌（Aspergillus（アスペルギルス）属、Penicillium（ペニシリュウム）属）等、植物ウィルス病の媒介菌に拮抗能を有する微生物であれば、いずれでも用いることができる。そして、Bacillus（バチルス）属の細菌としては、Bacillus（バチルス）sp. BS-05242 AV 、BS-91、BS-275が挙げられるが、特にBacillus（バチルス）sp. BS-05242 AVはオルピディウム菌への拮抗能の活性が高いことから、有効に用いられる。
BS-05242 AVの菌学的特性は表１のとおりである。
【００１５】
【表１】
2007217294.tif 000009
【００１６】
本菌株は、上記菌学的特徴において桿状のグラム染色陽性で、胞子を形成し、主として好気的条件で増殖する菌であることから、Bacillus（バチルス）属に分類される。本菌の類縁種として、バチルス・セレウス（B.cereus）、バチルス・チュウリンゲンシス（B.thuringiensis）があげられる。しかし、レシチナーゼ活性を示さない点でバチルス・セレウス（B.cereus） の典型的な性状と異なり、結晶封入体が検出されない点でバチルス・チュウリンゲンシス（B.thuringiensis） の特徴とは異なる〔ジョン・ジ・ホルトら  ：バージーズ・マニュアル  オブ  システマティク  バクテリオロジー第2巻  (JOHN G HOLT et al.,BERGEY’S MANUAL OF Systematic Bacteriology)〕。
【００１７】
本菌株の16Sリボゾーマル（ribosomal）RNA遺伝子(16S rDNA)のうち5’末端側約500bp
の領域を増幅・シーケンシングし、その配列を用いて細菌基準株データベースおよびGenBank/DDBJ/EMBLに対する相同性を検索した。その結果、本菌株の16S rDNA は部分塩基配列が、バチルス・セレウス（B.cereus）、バチルス・チュウリンゲンシス（B.thuringiensis）に99％以上の相同性を示したことから、本菌株に最も近縁な種はバチルス・セレウス（B.cereus）次いでバチルス・チュウリンゲンシス（B.thuringiensis）と考えられ、これらに近縁なBacillus（バチルス） sp.であると推定した。これらのことから、本菌株をBacillus（バチルス） sp.の新種相当と判定した。本細菌は、Bacillus（バチルス） sp.BS-05242 AVとして独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに2005年12月22日付けで受託されている（受託番号FERM  P-20743）。
【００１８】
BS-05242 AV 菌の培養条件の検討
BS-05242 AV菌株、１白金耳分を各液体培地（三角フラスコ100ml）に添加し、振幅数100振幅／分、30℃の恒温器で振とう培養して、4日、7日、10日後にYPMG寒天培地を用いた希釈平板法で菌数を調査した。液体培地組成は(1)YPMG（酵母エキス0.3g、ペプトン0.5g、肉エキス0.1g、グルコース1g  蒸留水100ml、pH7.0）、(2)YPMD（酵母エキス0.3g、ペプトン0.5g、肉エキス0.1g、デキストリン1g  蒸留水100ml、pH7.0）、(3)ソイブロス(ソイブロス（Soy broth）はDifco製のものを使用した（トリプト・ソイブロス（Tryptic Soy broth）3g、蒸留水100ml）。培養試験の結果、BS-05242 AV菌株は（2）YPMDが4日〜10日の培養で安定して1012  CFU/mlの生菌数を保っていた（表2）。
【００１９】
【表２】
2007217294.tif 000010
【００２０】
本菌株は、上記の液体培地で培養して増殖することができる。特に、YPMD液体培地では安定した菌数が保てる。用いられるYPMD培地は、寒天培地であっても、液体培地であっても使用することができる。YPMD液体培地を用いた培養は、30℃で4〜10日間行うことが好ましい。
【００２１】
本発明の微生物は、寒天培地又は液体培地を用いて、培養・増殖される。増殖された微生物は、白金耳等により採取、遠心分離等の操作により集菌して採取、あるいは培養液の状態として、植物ウィルス病の防除又は植物ウィルス病防除剤に用いることができる。
【００２２】
このように培養・増殖して得られた微生物は、単独で用いることも2種以上を組み合わ
せて用いることもできる。また、この微生物は、当該微生物のみで本発明の植物ウィルス病防除剤とすることもできるが、他の各種剤と組み合わせ、粒剤、粉剤、錠剤、乳剤、水和剤等の任意の形状として使用することもできる。さらには、本発明の植物ウィルス病防除剤を無機質肥料、有機質肥料、除草剤、土壌と組み合わせ、肥料、土壌改良剤、育苗培土等とすることもできる。
【００２３】
この微生物は、植物ウィルスの媒介菌に対し拮抗能を有しているので、この植物ウィルス病防除剤を栽培植物の種子、葉、根、栽培土壌等に処置して植物ウィルス病の防除効果が発揮される。この処置方法としては、土壌への施用、育苗培土への添加、作物種子にバクテリゼーション処理、葉面散布、養液栽培における養液への添加、土耕栽培における株元への添加・潅注等をあげることができる。この微生物による処理により、植物ウィルス媒介菌の防除を行うことはもとより、植物ウィルス病害汚染圃場の伝染を阻止、あるいは予防対策としても使用することができる。
【００２４】
本発明の植物ウィルス病の防除方法としては、上記のように植物ウィルス剤単独で処理
することもできるが、各種土壌消毒と組み合わせて処理すると、より植物ウィルス病の防除効果は高まる。土壌消毒法としては、D‐D剤、熱水があげられるが、D-D剤を用いることが好ましい。処理の時期としては、処理してガス抜き後にこの微生物により処理を行うことができ、処理の方法としては種子、葉、根、土壌等に上記微生物の処理方法と同様にして行うことができる。
【００２５】
この植物ウィルス病防除剤の使用量は、例えば栽培土壌に対しては10a当たり10kg〜500kgである。種子の処理の場合には、培養菌液に10min〜24h浸漬後、風乾した種子を使用する。
【００２６】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
植物ウィルス病防除剤の製造（１）
本菌株BS-05242 AVの培養液（1×1012CFU/ml）に10％スキムミルクを添加してスプレードライヤー（ヤマトラボテック（株）製）を用いて、噴霧出口温度が100〜110℃となるように設定した。
【００２８】
【表３】
2007217294.tif 000011
【００２９】
噴霧出口温度（100℃）の設定で、80％の回収率で1×1010CFU/gの乾燥菌体が得られた
。
【実施例２】
【００３０】
植物ウィルス病防除剤の製造（２）
有機質基質（コメヌカ、フスマ）と多孔質基質（ゼオライト、バーミキュライト）の各供試資材を表4の割合で滅菌袋へ2.5kgになるように入れ、水を750mL加え混合し、封をして121℃で30分間オートクレーブ滅菌した。滅菌後、BS-05242 AV 菌株の培養液を10mLず
つ添加して30℃で培養を行い、培養1ヵ月後の菌数を測定した。
結果を表４に示す。
【００３１】
【表４】
2007217294.tif 000012
【００３２】
表4の結果から、各供試資材の混合割合(3)の菌数が最大であるので、(3)を植物ウィル
ス防除剤とした。
【実施例３】
【００３３】
オルピディウム菌の純粋培養系での拮抗菌簡易選抜試験
本菌株BS-05242 AVを含む、土壌、堆肥から分離した当社保有のフザリウム菌に対して
拮抗能を持つ当社保有の細菌（主として、バチルス菌）において、オルピディウム菌に対して拮抗作用をもつかどうかを調査した。各菌株の一白金耳分を100mlのYPMG液体培地（
酵母エキス3.0ｇ、ペプトン5.0ｇ、肉エキス1.0ｇ、デキストリン10ｇ、蒸留水1.0リットル、pH7.0）を含む200ml三角フラスコ内に植菌後、振幅数100振幅／分、30℃、暗条件下
で10日間培養した。その培養液を蒸留水で10倍に希釈し、その希釈液にマクワウリ種子（金太郎  タキイ種苗）を30分間浸漬し、バーミキュライト（40ｍｌ）をつめたコニカルチューブに2粒ずつ5反復で植え付け、人工気象器内で27℃、16時間日長で管理した。播種後10日目のマクワウリ子葉展開期の根に、予めオルピディウム菌の着生したマクワウリ根（100個程度／側根1cm）の粗汁液を1.0mlずつ添加した。その後、すぐに蒸留水をバーミキュライト表面から１ｃｍ程度になるように添加し、その後の水管理は地表面が覆われる程度に添加した。さらに、同様の栽培管理で3週間育成した。育成後は、根を傷めないように1株ずつ取り出し、根部を水洗し、根内に形成されているオルピディウム菌の遊走子嚢および休眠胞子数を光学顕微鏡下で計数した。なお、計数は、1株あたり地際部に近い主根から分岐した側根を任意に5本選んで、分岐部分より１ｃｍの長さに切った根の中で、着生数の多かったものについて行った。調査区は、1菌株あたり5反復設けて、計数した。
【００３４】
次式、感染率（％）＝（BS-05242 AV処理区のオルピディウム菌着生数／無処理のオル
ピディウム菌着生数）×100
により感染率を算出したところ、供試した菌の中でBS-91、BS-05242 AV、BS-275の感染率が無処理区に比べて低く、特にBS-05242 AV処理区では３％の感染率であった。結果を表5に示した。
【００３５】
この試験結果から、拮抗菌の中で、BS-05242 AV菌処理を行うことにより、オルピディ
ウム菌の感染を有意に抑制できる拮抗菌であることが分かった。
【００３６】
【表５】
2007217294.tif 000013
【実施例４】
【００３７】
BS-05242 AV菌を利用したメロンえそ斑点ウィルス感染抑制ポット試験
拮抗菌処理方法：播種時と植付時との2回処理
播種時処理：  BS-05242 AV菌体濃縮液（2.0×1010 CFU/ml）にメロン種子（品種  アー
ルス雅春秋系）を2時間浸漬後、セルトレイ（1穴容量：約30ml）に播種し、その後菌液の100倍希釈液（蒸留水）を1セル当たり20mlずつかん注した。
植付時処理：  供試土壌をつめたビニールポットにメロン苗を植え付け後、培養菌液（1.6×1011 CFU/ml）を株元に50mlずつかん注した。
供試土壌：半促成栽培で本病が多発した土壌を用いて、供試土壌の汚染度をオートクレイブ滅菌（120℃、1.2気圧、30分）した同一土壌で3段階に希釈（原土区、1/4原土区、1/8
原土区）設定し、本土壌４に対して1の割合でオートクレイブ滅菌した牛糞もみがら堆肥
を混入して用いた。また、対照となる健全植物の育成には、同一土壌をオートクレイブして使用した。なお、汚染土壌のウィルス系統は、MNSV-NHであった。
検定方法：メロンを播種して人工気象器（25℃定温）内で管理し、播種後10日目の本葉1
葉期に供試土壌をつめたビニールポット（径9cm）に1ポット当たり1株ずつ植付け、25℃
定温の人工気象器内で3週間育成後、根部を水洗して土壌を良く落とし、地際直下の根部
を採取して、100倍の粗汁液をDAS-ELISA検定した。
【００３８】
次式、陽性株率（％）＝（処理区の陽性株数／供試株数）×100
により陽性株率を算出したところ、処理区では1/4原土区では25％、1/8原土区では0％の陽性株率であり、無処理区と比較すると有意な差で、処理区では感染が抑えられていた。また、平均吸光度は各株のDAS-ELISA値の平均であり、平均したウィルス濃度で、原土区でも処理区の半分以下であった。結果を表6に示した。
【００３９】
この試験結果から、BS-05242 AV菌処理を行うことで、メロンえそ斑点病多発土壌の原
土区でもウィルス濃度をある程度低下させることができ、予め汚染程度を抑えることによって、メロンえそ斑点ウィルスの感染を有意に抑制した。
【００４０】
【表６】
2007217294.tif 000014
【実施例５】
【００４１】
BS-05242 AV菌を利用したメロンえそ斑点病防除圃場試験（メロンえそ斑点病発生温室  
実施時期2005年3月〜7月）
本菌株の濃縮菌体液（1×1010 CFU/ml）にメロン種子（アールス雅春秋系）を2時間浸
漬した。育苗用土を16穴連結ポット（5×5×5cm）に詰め、浸漬した種子を播種した。さ
らに、濃縮菌体液の100倍希釈液（蒸留水）を1ポット当たり20mlずつかん注した。その後、発芽室（30℃）で3日間催芽させた後、育苗温室で本葉3葉期まで育苗した。定植時に植え穴と定植後の株元へ菌液（2×109 CFU/ml）を1株当たり50mlずつかん注した。耕種概要は、畝間200cm（ベット130cm、通路50cm）、株間36cm、条間60cmの2条植えで、栽植株数260株/aとし、地床栽培を行った。施肥及びその他栽培管理は慣行法に準じた。その他、土壌消毒については、サブソイラーによる温室内圃場の硬盤破砕後、D-D-92（30L/10a）相当量を処理し、ビニールで8日間被覆して、その後3回ガス抜きを行った。ガス抜き後はネコブセンチュウ防除を目的に、ネマトリン20g/m2を管理機により土壌混和した。熱水消毒方法については、圃場の硬盤破砕後、移動散布式熱水消毒機により300L/m2の熱水を処理し、処理後8日目に被覆剤をはがして、さらに5日間置いた後に管理機によって耕運を行った。各処理区は、14株 / 区の3反復行った。調査方法は、収穫直前に葉の病斑（小病斑及び大病斑）を目視により下の基準に従って発病程度を調査し、発病度を算出した。また、判別が困難な病斑については、DAS-ELISA法によりウィルスの検定を行った。
【００４２】
［発病程度別指数］
0：発病が認められない
1：発病葉枚数1〜4枚
2：発病葉枚数5〜9枚
3：発病葉枚数10枚以上
4：枯死
【００４３】
次式、発病度＝[｛Σ（発病程度別株数×指数）｝／（調査株数×4）]×100
により発病度を算出したところ、微生物＋土壌消毒剤区では8.9と土壌消毒剤単独区の16.1に比べて低く、さらには熱水消毒区25.6よりも低かった。結果を表7 に示した。
【００４４】
また、発病株率でも微生物＋土壌消毒剤区は他の区に比べて低かった。
この試験結果から、BS-05242 AV菌処理を行うことで、圃場においても効果を確認する
ことができた。さらには、土壌消毒等の組み合わせにより有意な差があることが実証できた。
【００４５】
【表７】
2007217294.tif 000015