(57)【要約】      （修正有）【課題】同時に多数の測定対象物質を低コスト且つ短時間で検出し定量及び同定できるようにする手段を提供する。【解決手段】測定対象物質を、蛍光寿命の異なる複数種類の蛍光分子で標識付けする。【選択図】図１
2007033159.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光寿命の異なる複数種類の蛍光分子で標識されてなることを特徴とする、測定対象物質。
【請求項２】
前記蛍光分子のうちのいずれか１種が２箇所以上に標識されている、請求項１記載の測定対象物質。
【請求項３】
前記蛍光分子のうちの少なくとも２種がそれぞれ２箇所以上に標識されている、請求項１記載の測定対象物質。
【請求項４】
前記蛍光分子の蛍光寿命が100ns以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定対象物質。
【請求項５】
前記複数種類の蛍光分子が、固有の蛍光寿命として0.01ns以上、1.0ns未満を持つグループ、1.0ns以上、2.0ns未満を持つグループ、2.0ns以上、3.0ns未満を持つグループ、3.0ns以上、4.0ns未満を持つグループ、4.0ns以上、5.0ns未満を持つグループ、5.0ns以上、6.0ns未満を持つグループ、6.0ns以上、7.0ns未満を持つグループ、7.0ns以上、10.0ns未満を持つグループ、10.0ns以上、15.0ns未満を持つグループ、15.0ns以上、20.0ns未満を持つグループ、20.0ns以上、25.0ns未満を持つグループ、25.0ns以上、30.0ns未満を持つグループ、30.0ns以上、40.0ns未満を持つグループ、及び40.0ns以上を持つグループからなる群より選ばれる２種以上のグループの各グループに属する蛍光分子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の測定対象物質。
【請求項６】
前記蛍光分子のうちの２種以上が互いに0.1ns以上異なる蛍光寿命を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の測定対象物質。
【請求項７】
前記蛍光分子のうちの２種以上が互いに1.1倍以上異なる蛍光寿命を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の測定対象物質。
【請求項８】
前記異なる蛍光寿命を有する蛍光分子の種類が３種以上である、請求項６又は７に記載の測定対象物質。
【請求項９】
前記蛍光分子のうちの少なくとも２種は、発光ピーク波長の差が互いに50nm以下である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の測定対象物質。
【請求項１０】
前記蛍光分子の組合せが互いに異なる複数種類の測定対象物質から構成される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の測定対象物質。
【請求項１１】
前記複数種類の測定対象物質は、前記蛍光分子の種類は同じであるが当該種類ごとの標識量が互いに異なる測定対象物質を含むものである、請求項１０に記載の測定対象物質。
【請求項１２】
前記蛍光分子の種類が３種以上である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の測定対象物質。
【請求項１３】
蛍光寿命の異なる３個以上の蛍光分子から選ばれる２個で標識されてなる物質から構成される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の測定対象物質。
【請求項１４】
さらに、１種の蛍光分子で標識されてなる物質を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の測定対象物質。
【請求項１５】
標識される物質１単体当たり、１個の蛍光分子で標識されてなる物質のグループ、蛍光寿命の異なる２個の蛍光分子で標識されてなる物質のグループ、蛍光寿命の異なる３個の蛍光分子で標識されてなる物質のグループ、蛍光寿命の異なる４個の蛍光分子で標識されてなる物質のグループ、及び蛍光寿命の異なる５個の蛍光分子で標識されてなる物質のグループからなる群より選ばれる２種以上のグループの各グループに属する物質を含む、請求項１４に記載の測定対象物質。
【請求項１６】
１種の蛍光分子で標識されてなる物質と、蛍光寿命の異なる２種の蛍光分子で標識されてなる物質とから構成される、請求項１４又は１５に記載の測定対象物質。
【請求項１７】
１種の蛍光分子で標識されてなる物質と、蛍光寿命の異なる２種の蛍光分子で標識されてなる物質と、蛍光寿命の異なる３種の蛍光分子で標識されてなる物質とから構成される、請求項１４又は１５に記載の測定対象物質。
【請求項１８】
前記蛍光分子による標識部位の数が、標識される物質１単体当たり３〜１００箇所である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の測定対象物質。
【請求項１９】
前記蛍光分子のうちの少なくとも１種が既知の蛍光寿命を有するものである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の測定対象物質。
【請求項２０】
前記蛍光分子で標識される物質が、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、リガンド、レセプター、ドナー、ホルモン、糖鎖、細胞及び胚からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の測定対象物質。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の測定対象物質を含むことを特徴とする、被験試料。
【請求項２２】
前記測定対象物質の少なくとも１種が既知の濃度を有するものである、請求項２１に記載の被験試料。
【請求項２３】
さらに既知の濃度を有する蛍光物質を少なくとも１種含む、請求項２１又は２２に記載の被験試料。
【請求項２４】
前記蛍光物質のうちの少なくとも１種が既知の蛍光寿命を有するものである、請求項２３に記載の被験試料。
【請求項２５】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の測定対象物質、又は請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の被験試料を含むことを特徴とする、物質検出用試薬。
【請求項２６】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の測定対象物質、又は請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の被験試料を含むことを特徴とする、物質検出用キット。
【請求項２７】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の測定対象物質に標識された蛍光分子の蛍光寿命に基づいて、当該測定対象物質の構造及び／又は存在比を解析する方法。
【請求項２８】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の測定対象物質に標識された蛍光分子の蛍光寿命に基づいて、当該測定対象物質の種類及び／又は存在量を特定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数種類の蛍光分子で標識された測定対象物質、これを含む被験試料、及びこれを用いた物質検出用試薬、物質検出用キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
被験試料中に存在する蛍光を標識した物質の濃度や混合比の測定は、近年主に蛍光分子の蛍光強度を計測することによって行われてきている。すなわち、濃度既知の蛍光分子（以下「参照蛍光分子」という）を被験試料中に入れ、検出の対象となる蛍光分子と参照蛍光分子との蛍光強度を比較することにより、濃度や混合比が未知の蛍光分子を定量することができる。こうした蛍光強度を利用する方法を適用すると、蛍光分子をプローブやターゲットとなる分子に標識し、その強度を比較することにより、ターゲットとなる遺伝子の発現量や一塩基多型（SNP: Single Nucleotide Polymorphism）のタイプを判別することが可能であるため、DNAマイクロアレイ、タックマン(TaqMan)法、インベーダー法として工業的に応用され、現在広く使われている。例えば、２種類の蛍光分子を用い、その蛍光強度を比較することによって、PCRにより増幅された核酸の量をモニターする検出方法が開示されている（特許文献１）。
【０００３】
一方、蛍光分子に固有の蛍光寿命は、蛍光分子の周囲の環境や化学反応の度合いにあまり影響を受けないと考えられていたことから、これまで利用されることが少なかったが、近年可視光領域において高出力のレーザーやレーザーダイオードが開発され、また電子回路の処理速度が高速化し測定精度が向上したことから、バイオ分野にも積極的に使われるようになってきた。例えば、光ルミネセンスエネルギーの移転がみかけの蛍光寿命に現れることを利用した、免疫反応の反応生成物の存在量の定量法が知られている（特許文献２）。また、「生物学的系についての蛍光分析法」として、供与体と受容体との間に起こる蛍光共鳴エネルギー転移によって蛍光の調節寿命及び相寿命が変化することにより、受容体の内部成長度をモニターすることができる測定方法が開示されている（特許文献３）。
【特許文献１】特表平８−５１０５６２号公報
【特許文献２】特開平６−６６８０２号公報
【特許文献３】特表２００２−５４２４５３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在普及している被験試料、特に核酸の定量あるいは同定は、PCR法、LAMP法、ICAN法などによって増幅された試料を、蛍光分子で標識し、その蛍光強度を検出することによって実施されている。しかしながら、同定できる被験試料の種類はこれまで蛍光波長が分離可能な蛍光分子の数に制限されていたため、３種類程度の蛍光分子を用いて標識された数種類の測定対象物質の同時検出、及び定量・同定が限界であった。
【０００５】
そこで本発明は、同時に多数の測定対象物質を低コスト且つ短時間で検出し定量及び同定できるようにする手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、異なる蛍光寿命を有する蛍光分子を複数種類用いて標識した測定対象物質、これを含む被験試料、及びこれを用いた試薬、キット等を用いれば、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００８】
(1) 蛍光寿命の異なる複数種類の蛍光分子で標識されてなることを特徴とする、測定対象物質。
【０００９】
本発明の測定対象物質においては、例えば、前記蛍光分子のうちのいずれか１種が２箇所以上に標識されるようにすることができる。また、前記蛍光分子のうちの少なくとも２種がそれぞれ２箇所以上に標識されるようにすることができる。
【００１０】
前記蛍光分子の蛍光寿命は、例えば、100ns以下とすることができる。
【００１１】
前記複数種類の蛍光分子は、例えば、固有の蛍光寿命として0.01ns以上、1.0ns未満を持つグループ、1.0ns以上、2.0ns未満を持つグループ、2.0ns以上、3.0ns未満を持つグループ、3.0ns以上、4.0ns未満を持つグループ、4.0ns以上、5.0ns未満を持つグループ、5.0ns以上、6.0ns未満を持つグループ、6.0ns以上、7.0ns未満を持つグループ、7.0ns以上、10.0ns未満を持つグループ、10.0ns以上、15.0ns未満を持つグループ、15.0ns以上、20.0ns未満を持つグループ、20.0ns以上、25.0ns未満を持つグループ、25.0ns以上、30.0ns未満を持つグループ、30.0ns以上、40.0ns未満を持つグループ、及び40.0ns以上を持つグループからなる群より選ばれる２種以上のグループの各グループに属する蛍光分子を含むことができる。
【００１２】
前記蛍光分子のうちの２種以上が、例えば、互いに0.1ns以上異なる蛍光寿命を有することができ、また、互いに1.1倍以上異なる蛍光寿命を有することができる。ここで、当該異なる蛍光寿命を有する蛍光分子の種類は、例えば、３種以上とすることができる。
【００１３】
前記蛍光分子のうちの少なくとも２種は、例えば、発光ピーク波長の差が互いに50nm以下とすることができる。
【００１４】
また本発明の測定対象物質においては、例えば、前記蛍光分子の組合せが互いに異なる複数種類の測定対象物質から構成されるものとすることができる。ここで、当該複数種類の測定対象物質は、例えば、前記蛍光分子の種類は同じであるが当該種類ごとの標識量が互いに異なる測定対象物質を含むものとすることができる。
【００１５】
また本発明の測定対象物質においては、例えば、前記蛍光分子の種類を３種以上とすることができる。
【００１６】
また本発明の測定対象物質においては、例えば、蛍光寿命の異なる３個以上の蛍光分子から選ばれる２個で標識されてなる物質から構成されるものとすることができる。
【００１７】
また本発明の測定対象物質においては、例えば、さらに、１種の蛍光分子で標識されてなる物質を含むことができる。ここで、標識される物質１単体当たり、１個の蛍光分子で標識されてなる物質のグループ、蛍光寿命の異なる２個の蛍光分子で標識されてなる物質のグループ、蛍光寿命の異なる３個の蛍光分子で標識されてなる物質のグループ、蛍光寿命の異なる４個の蛍光分子で標識されてなる物質のグループ、及び蛍光寿命の異なる５個の蛍光分子で標識されてなる物質のグループからなる群より選ばれる２種以上のグループの各グループに属する物質を含むものとすることができる。また、１種の蛍光分子で標識されてなる物質と、蛍光寿命の異なる２種の蛍光分子で標識されてなる物質とから構成されるものとすることができる。あるいは、１種の蛍光分子で標識されてなる物質と、蛍光寿命の異なる２種の蛍光分子で標識されてなる物質と、蛍光寿命の異なる３種の蛍光分子で標識されてなる物質とから構成されるものとすることができる。
【００１８】
また本発明の測定対象物質においては、例えば、前記蛍光分子による標識部位の数が、標識される物質１単体当たり３〜１００箇所とすることができる。また、例えば、前記蛍光分子のうちの少なくとも１種が既知の蛍光寿命を有するものとすることができる。
【００１９】
前記蛍光分子で標識される物質として、例えば、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、リガンド、レセプター、ドナー、ホルモン、糖鎖、細胞及び胚からなる群より選ばれる少なくとも１種を挙げることができる。
【００２０】
(2) 上記本発明の測定対象物質を含むことを特徴とする、被験試料。
【００２１】
本発明の被験試料においては、例えば、前記測定対象物質の少なくとも１種が既知の濃度を有するものとすることができる。
【００２２】
また本発明の被験試料においては、例えば、さらに既知の濃度を有する蛍光物質を少なくとも１種含むことができる。ここで、当該蛍光物質のうちの少なくとも１種は、例えば、既知の蛍光寿命を有するものとすることができる。
【００２３】
(3) 上記本発明の測定対象物質、又は上記本発明の被験試料を含むことを特徴とする、物質検出用試薬。
【００２４】
(4) 上記本発明の測定対象物質、又は上記本発明の被験試料を含むことを特徴とする、物質検出用キット。
【００２５】
(5) 上記本発明の測定対象物質に標識された蛍光分子の蛍光寿命に基づいて、当該測定対象物質の構造及び／又は存在比を解析する方法。
【００２６】
(6) 上記本発明の測定対象物質に標識された蛍光分子の蛍光寿命に基づいて、当該測定対象物質の種類及び／又は存在量を特定する方法。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、異なる蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子で標識された測定対象物質、これを含む被験試料、これを用いた物質検出用試薬、物質検出用キット、測定対象物質の構造及び／又は存在比の解析方法、並びに測定対象物質の種類及び／又は存在量の特定方法を提供することができる。本発明は、低濃度の測定対象物質であっても高感度に検出等を行うことができる点で、極めて有用であると言える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
１．概要
本発明者は、蛍光分子から発せられる蛍光強度が時間の経過により減衰する点に着目し、当該蛍光強度の減衰を時間依存的に測定することを考えた。そして、異なる蛍光寿命を有する蛍光分子を含有する被験試料の蛍光強度の蛍光減衰曲線（試料から発せられる蛍光強度の時間依存性）を単一光子計数法（「蛍光測定」木下一彦・御橋廣眞編、学会出版センター）により測定した。
【００２９】
なお、本発明の説明において例示されている蛍光寿命の測定は、単一光子計数法を用いることに限定される必要はなく、蛍光寿命を測定できる方法であれば、位相変調法、パルスサンプリング法、励起プローブ法など、他の公知のいずれの方法を用いても構わない。これら他の方法を用いて蛍光寿命の値や強度比を求めた場合でも、以下に説明する単一光子計数法を用いる場合と同様に、測定対象物質の識別と定量が可能である。
【００３０】
本発明において、蛍光寿命とは、パルス励起光による蛍光強度I0が1/e（ｅは自然対数の底を表す。）となるまでの時間を意味し、蛍光分子が固有に有する値である。例えば、FAM（米国インビトロジェン社製）は4.0ナノ秒 (nsec)、PyMPO（米国インビトロジェン社製）は1.8nsec、5-カルボキシナフトフルオレセインは0.65nsec、フルオレセインは4.04 nsecである。
【００３１】
単一光子計数法は、光の最低単位である光子を１個１個検出する方法であるため、あらゆる光検出法の中で最も感度が高く、一般的に用いられる蛍光強度や吸光度に比較し、極微量の試料の蛍光寿命を、濃度に依存することなく安定的に測定するのに適している。例えば、本発明者が出願した国際出願（WO2004/090517 (以下「特許文献4」と称する)）での開示と同様に、図１に、単一光子計数法を用いた蛍光寿命の測定方法や微小な蛍光寿命の差を持つ物質の定量法・同定法を示す。詳しくは、セル、チューブ、マイクロプレート等に入れた被験試料１（被験試料1中に測定対象物質が含まれている）にパルス光源２からパルス光３を照射し、被験試料１から発せられる蛍光４を光電子増倍管（PMT: photomultiplier tube）５で検出する。光源２の波長及び光電子増倍管５で検出する光の波長は、フィルターまたは分光器により選択する。パルス光源２からの信号をスタート信号とし、光電子増倍管５からの信号をストップ信号としてアンプ６、定フラクションデスクリミネータ（CFD: constant fraction discriminator）７を経由して時間-電圧変換器（TAC: Time to Amplitude Converter）8に入力すると、光電子増倍管５で検出されるタイミングによって、TAC８の出力信号に差が出るため、これをマルチチャンネルアナライザ（MCA： Multi Channel Analyzer）９に取り込むことにより、蛍光寿命を測定することが可能である。出力信号は、パーソナルコンピュータ（PC）10のハードディスク等に保存される。
【００３２】
本発明においては、異なる蛍光寿命を有するｉ種類の蛍光分子「F1（蛍光寿命τ1）、F2（蛍光寿命τ2）、F3（蛍光寿命τ3）、F4（蛍光寿命τ4）、・・・、Fi（蛍光寿命τi）」により標識されたDNAプローブ（測定対象物質）の濃度を測定する場合を例に挙げて説明するが、測定対象物質はこれには限定されない。
【００３３】
まず、測定対象物質を、蛍光寿命の異なる蛍光分子「F1、F2、F3、F4、・・・」を用いて図２A、Ｂの(1)〜(8)のDNAプローブのように標識化する。具体的には、任意の塩基配列からなるDNAプローブの5'末端、3'末端及び非末端部分の塩基のうちの、任意の１箇所又は２箇所以上に、１種又は２種以上の蛍光分子を結合させて標識化する。例えば、(1)のDNAプローブでは3'末端の塩基に蛍光分子F1が結合され、(2)のDNAプローブでは非末端部分の塩基に蛍光分子F2が結合されている。また、(6)のDNAプローブでは非末端部分の２箇所の塩基に蛍光分子F2及びF3がそれぞれ結合され、(7)のDNAプローブでは5'末端、3'末端及び非末端部分の塩基にそれぞれ順にF1、F3及びF2が結合されている。他のDNAプローブでも、これらと同様に蛍光分子が結合されている。
【００３４】
なお、測定対象物質としてのDNAプローブは、図２Ａ、Ｂに示す塩基配列を有するものに限定されるわけではない。
【００３５】
次に、標識化した上記(1)〜(8)のDNAプローブの蛍光強度を測定すると、図３A、Ｂに示す減衰曲線(1)〜(3)を得ることができる。
【００３６】
詳しくは、測定対象物質に対し、１種の蛍光分子のみで標識した場合は、図３Ａに示す態様の減衰曲線(1)が得られる。この場合は、各々の蛍光分子が有する固有の蛍光寿命のみ基づく減衰曲線が得られる。
【００３７】
同様に、２種の蛍光分子で標識した場合は、図３Ａに示す態様の減衰曲線(2)が得られる。この場合は、まず、ある時点までは、２種の蛍光分子のうち蛍光寿命の短い方の固有の蛍光寿命に基づく減衰曲線が得られ、その後は、もう一方（蛍光寿命が長い方）の固有の蛍光寿命に基づく減衰曲線が得られることになる。つまり、全体としては、２種の蛍光分子の固有の減衰曲線をそれぞれ一部ずつ組合せたような減衰曲線が得られ、２種の蛍光分子の組合せが同一でない限り、得られる減衰曲線は当該組合せに固有の互いに異なるものとなる。
【００３８】
同様に、３種の蛍光分子で標識した場合は、図３Ｂに示す態様の減衰曲線(3)が得られる。この場合も、２種の蛍光分子で標識した場合と同様に考えることができる。まず、ある時点までは、３種の蛍光分子のうち蛍光寿命が最も短いものの固有の蛍光寿命に基づく減衰曲線が得られ、その後、さらにある時点までは、蛍光寿命が次に短いものの固有の蛍光寿命に基づく減衰曲線が得られ、その後は、蛍光寿命が最も長いものの固有の蛍光寿命に基づく減衰曲線が得られることになる。つまり、全体としては、３種の蛍光分子の固有の減衰曲線をそれぞれ一部ずつ組合せたような減衰曲線が得られ、３種の蛍光分子の組合せが同一でない限り、得られる減衰曲線は当該組合せに固有の互いに異なるものとなる。
【００３９】
なお、以上のことは、４種、５種、・・・、ｉ種の蛍光分子で標識した場合も、同様に考えることができる。
【００４０】
すなわち、ｉ種類の蛍光分子により標識した場合、各種蛍光分子が重複して標識される場合を除いて考えると、（２i−１）種の異なる減衰曲線が得られることになる。この蛍光減衰曲線は、励起波長と蛍光波長が決まれば蛍光分子の組合せと種類に固有のものであるため、その減衰曲線の形状パターンから、蛍光分子が標識された測定対象物質が同定できる。
【００４１】
また、被験試料に含まれる蛍光分子（標識には関与せずに含まれている蛍光分子）のうちの一つを参照蛍光分子（内部標準）として、濃度が常に一定になるように被験試料に加えることにすれば、蛍光強度を比較することによって、濃度が未知の他の蛍光分子の濃度（すなわち、それら蛍光分子で標識された測定対象物質の濃度）を求めることができる。
【００４２】
このことは、言い換えれば、蛍光減衰曲線を測定すれば、蛍光分子で標識された（２i−１）種類の測定対象物質の識別が可能になることを意味する。また、その定量は、前記「特許文献４」に開示されているように、蛍光減衰曲線をデコンボリューションして求めた蛍光寿命と係数Aを、参照蛍光分子と比較することによって求めることができ、具体的には以下の通りである。
【００４３】
すなわち、一般に、異なる固有の蛍光寿命を有するｉ種類の蛍光分子を用いたときの蛍光減衰曲線を求める場合は、蛍光寿命関数f(t)は下記式(I)のように表される。
【００４４】
【数１】
2007033159.tif 000003
〔式(I)中、Aiは係数、tは時刻、τiは蛍光寿命を表す。〕
上記蛍光寿命関数f(t)は、必要に応じて、測定時のバックグラウンド(background)を加えた下記式(II)で表すことができる。
【００４５】
【数２】
2007033159.tif 000004
〔式(II)中、Aiは係数、tは時刻、τiは蛍光寿命を表す。〕
被験試料に含まれる蛍光分子の蛍光寿命とその強度は、測定された蛍光減衰曲線をデコンボリューションすることによって求められる。なお、デコンボリューションは、当業者において明らかである。その結果得られる係数Aと蛍光寿命τの値から、各蛍光分子の蛍光強度の割合が （Ai×τi）（ここで i = 1, 2, 3,・・・）に比例するため、その混合比を、（A1×τ1）:（A2×τ2）:（A3×τ3）: ・・・・・という方法で見積ることが可能である。そして被験試料に含まれる蛍光分子のうちの一つを参照蛍光分子とすれば、蛍光強度を比較することによって、前述したように、濃度が未知の他の蛍光分子の濃度を求めることができる。
【００４６】
例えば、異なる蛍光寿命τ1と蛍光寿命τ2を有する２種の蛍光分子を用いた場合は、被験試料の蛍光減衰曲線を測定すると、後述の実施例において示す図６のようなデータが観察される。そして、装置の応答関数g(t)と蛍光分子の持つ本質的な蛍光寿命関数 f(t)との畳み込み積分である蛍光強度の減衰をデコンボリューションすることにより、係数Aと被験試料に含まれる蛍光分子の蛍光寿命とを求める。その結果得られる係数Aと蛍光寿命τの値から、その混合比は（A1×τ1）:（A2×τ2）により算出される。そして被験試料に含まれる蛍光分子のうちの一つを参照蛍光分子とすれば、蛍光強度を比較することによって、濃度が未知の他の蛍光分子の濃度を求めることができる。
【００４７】
以上の例では、ｉ種類の蛍光分子をそれぞれ測定物質単体あたり１個ずつしか同時に標識しない場合（すなわち、各種蛍光分子が重複して標識されない場合）を示したが、同じ測定対象物質に対して同一種類の蛍光分子を重複可能なように（すなわち２個以上）標識させることも考慮すれば、例えば図２Ｂの(9)〜(11)に示すDNAプローブように、さらに多くの標識パターンができる。なお、(9)〜(11)に示すDNAプローブも、前述した(1)〜(8)のDNAプローブと同様に、任意の塩基配列からなるDNAプローブの5'末端、3'末端及び非末端部分の塩基のうちの、任意の１箇所又は２箇所以上に、１種又は２種以上の蛍光分子を結合させて標識化することができ、また、測定対象物質としてのDNAプローブは、図２Ｂに示す塩基配列を有するものに限定されるわけではない。
【００４８】
詳しくは、図２Ｂの(9)〜(11)に示すDNAプローブは、いずれも、標識として用いる蛍光分子の種類がF1及びF2の２種である点で同じであるが、これら蛍光分子のいずれか一方又は両方の標識量に違いを設けて標識化し（例えば図２Ｂの(9)と(10)に示すDNAプローブではF1の個数が１つ異なる。）、その蛍光強度を測定すると、図３Ｂに示すような減衰曲線(4)が得られる。上記いずれのDNAプローブも、２種の蛍光分子で標識したものであるので、前述したように、得られる減衰曲線は、全体としては、２種の蛍光分子の固有の減衰曲線をそれぞれ一部ずつ組合せた形となる。しかしながら、一方の蛍光分子に固有の減衰曲線から他方のそれに切り変わるまでの時間が、当該２種それぞれの標識量（存在量）及び標識割合（存在比）に依存して変化するため、得られる減衰曲線のパターンは、減衰曲線(4)にみるように、上記標識量及び標識割合に固有の互いに異なるものとなる。本発明におけるこのような態様は、少ない種類の標識で多くの物質を個別に標識化することができ測定が容易となるほか、測定装置等も含めたコスト面においても、極めて有効である。なお、以上のことは、３種、４種、５種、・・・、ｉ種の蛍光分子で標識した場合も、同様に考えることができる。
【００４９】
２．測定対象物質
本発明の測定対象物質は、前述したように、蛍光寿命の異なる複数種類の蛍光分子で標識されてなることを特徴とするものである。上記「複数種類（２種類以上）の蛍光分子で標識された」とは、例えば図２Ａ、Ｂの(4)〜(11)のDNAプローブのように、蛍光寿命の異なる複数種類の蛍光分子「F1、F2、F3、F4、・・・」のうちの２種以上を用いて標識化されている場合を意味するが、本発明はこれらに限定はされるものではない。
【００５０】
ここで、上記測定対象物質は、「この蛍光分子の種類が３種以上である」ことが好ましく、例えば図２Ｂの(7)〜(8)のような場合を意味する。また、「この蛍光分子のうちのいずれか１種の蛍光分子が２箇所以上に標識されている」ことや「標識された複数種類の蛍光分子のうちの少なくとも２種の蛍光分子がそれぞれ２箇所以上に標識されている」ことも好ましい態様であり、それぞれ順に、例えば図２Ｂの(9)〜(11)のような場合、及び図２Ｂの(11)のような場合を意味する。
【００５１】
本発明の測定対象物質は、標識となる複数種類の蛍光分子の組合せが互いに異なる複数種類の測定対象物質から構成される、いわゆる測定対象物質の一群（測定対象物質群）であることも好ましい態様として挙げられる。そして、上記「蛍光分子の組合せが互いに異なる複数種類の測定対象物質から構成される」とは、例えば図２Ａ、Ｂの(4)〜(11)の標識化DNAプローブのうちの２種以上から構成されるような場合を意味する。
【００５２】
ここで、上記測定対象物質（測定対象物質群）における「複数種類の測定対象物質」とは、標識として用いる蛍光分子の種類は同じであるが当該種類ごとの標識量が異なる測定対象物質を含むもの」であってもよいことを意味し、好ましい態様の一つである。例えば図２Ａ、Ｂの(4)、(9)〜(11)のうちの２種以上を含む場合は、この態様の一例となる。これにおいては、さらに「蛍光分子の種類が３種以上である」ことも好ましい態様であるが、例えば図２Ｂの(7)〜(8)を含むような場合を意味する。
【００５３】
また上記測定対象物質（測定対象物質群）は、「蛍光寿命の異なる３個以上の蛍光分子から選ばれる２個で標識されてなる物質から構成される」ものであることも好ましい態様であるが、例えば図２Ａの(4)〜(6)のうちの２種以上を含むような場合を意味する。
【００５４】
また上記測定対象物質（測定対象物質群）は、「１種の蛍光分子で標識されてなる物質をさらに含む」ものであることも好ましい態様であるが、例えば図２Ａ、Ｂの(4)〜(11)のうちの少なくとも１種の他に、さらに図２Ａの(1)〜(3)のうちの少なくとも１種を測定対象物質として含むような場合を意味する。これにおいては、さらに「１種の蛍光分子で標識されてなる物質と、蛍光寿命の異なる２種の蛍光分子で標識されてなる物質とから構成される」ことも好ましい態様であるが、例えば図２Ａの(1)〜(3)のうちの少なくとも１種と、図２Ａの(4)〜(6)及び図２Ｂの(9)〜(11)のうちの少なくとも１種とを共に含むような場合を意味する。同様に、「１種の蛍光分子で標識されてなる物質と、蛍光寿命の異なる２種の蛍光分子で標識されてなる物質と、蛍光寿命の異なる３種の蛍光分子で標識されてなる物質とから構成される」ことも好ましい態様であるが、例えば図２Ａの(1)〜(3)のうちの少なくとも１種と、図２Ａの(4)〜(6)及び図２Ｂの(9)〜(11)のうちの少なくとも１種と、図２Ｂの(7)〜(8)のうちの少なくとも１種とを共に含むような場合を意味する。
【００５５】
さらに上記測定対象物質（測定対象物質群）としては、好ましい態様として以下のものを挙げることもできる。すなわち、標識される物質１単体当たり、１個の蛍光分子のみで標識されてなる物質のグループ（例えば図２Ａの(1)〜(3)）、蛍光寿命の異なる２個の蛍光分子のみで標識されてなる物質のグループ（例えば図２Ａの(4)〜(6)）、蛍光寿命の異なる３個の蛍光分子のみで標識されてなる物質のグループ（例えば図２Ｂの(7)〜(9)）、蛍光寿命の異なる４個の蛍光分子のみで標識されてなる物質のグループ、及び蛍光寿命の異な５個の蛍光分子のみで標識されてなる物質のグループからなる群より選ばれる２種以上のグループの各グループに属する物質を含むものを好ましく挙げることができる。
【００５６】
なお、上記説明における図２Ａ、Ｂの(1)〜(11)のDNAプローブは、それぞれ順に、配列番号１〜１１に示される。
【００５７】
本発明の測定対象物質においては、複数種類の蛍光分子による標識部位の数は、少なすぎると、識別可能な測定対象物質の数が制限されるが、多すぎると、蛍光分子のコストが大きくなる。従って、上記標識部位数は、標識される物質１単体当たり、例えば３〜１００箇所であることが好ましく、より好ましくは４〜５０箇所、さらに好ましくは５〜３０箇所である。
【００５８】
本発明の測定対象物質であれば、これまで蛍光スペクトルの重なりが大きいために同じ溶液中で同時に使用できなかった標識用の複数の蛍光分子でも、それぞれの蛍光寿命が互いに1.1倍以上異なれば、その蛍光スペクトルに関係なく有効に利用できることになり、より一層、検出・測定を多重化（マルチプレックス）し且つハイスループットで行うことができるという、これまでにないメリットがある。すなわち、これまで蛍光強度を比較することによって解析していた多くのアプリケーションに対し、本発明で示されているような蛍光分子の組合せを適用し、生産性を向上することが可能である。このことは具体的には、蛍光側波長フィルターとしてバンドパスフィルターを使用すると、蛍光強度の時間依存性だけでなく、波長依存性も利用することができ、検出しようとする対象物質の数を飛躍的に増大させることが可能になり、アッセイの高効率化とコスト削減を実現することができることを意味する。
【００５９】
ここで、標識となる複数種類の蛍光分子の有する蛍光寿命は、そのうちの２種以上（さらには３種以上）が、上述のごとく、互いに1.1倍以上異なることが、定量・定性分析を安定的に行うことができる点で好ましいが、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上、特に好ましくは5倍以上互いに異なることである。
【００６０】
また、標識となる複数種類の蛍光分子の有する蛍光寿命は、その種類ごとに（全ての種類間で）、又はそのうちの２種以上（さらには３種以上）が、互いに0.1ns以上異なることが、定量・定性分析を安定的に行うことができる点で好ましいが、より好ましくは0.3ns以上、さらに好ましくは0.5ns以上、特に好ましくは1.0ns以上互いに異なることである。なお、標識となる蛍光分子の蛍光寿命は、すべて100ns以下であることが好ましい。
【００６１】
さらに、標識となる複数種類の蛍光分子のうちの少なくとも２種が、蛍光ピーク波長及び／又は吸収ピーク波長の差が、50nm以下であることが、定量・定性を工業的に実現することができる点で好ましく、より好ましくは30nm以下、さらに好ましくは10nm以下の差である。使用する複数種類の蛍光分子は、互いに吸収や蛍光のピーク波長が離れていてももちろん使用できるが、吸収や波長のピークが近ければ、同じ光源を使ったり、同じ蛍光波長フィルターを利用したりすることができるため、ハイスループットや低コスト化等の効果の点で好適となる。ここで、標識となる複数種類の蛍光分子は、その種類ごとに互いに0.1ns以上異なる蛍光寿命を有し、かつ、そのうちの少なくとも２種が発光ピーク波長の差が互いに50nm以下であることが、上記効果の点で、特に好ましい態様として挙げることができる。
【００６２】
また本発明の測定対象物質の好ましい態様としては、以下のものを挙げることができる。すなわち、標識となる複数種類の蛍光分子が、固有の蛍光寿命として0.01ns以上、1.0ns未満を持つグループ、1.0ns以上、2.0ns未満を持つグループ、2.0ns以上、3.0ns未満を持つグループ、3.0ns以上、4.0ns未満を持つグループ、4.0ns以上、5.0ns未満を持つグループ、5.0ns以上、6.0ns未満を持つグループ、6.0ns以上、7.0ns未満を持つグループ、7.0ns以上、10.0ns未満を持つグループ、10.0ns以上、15.0ns未満を持つグループ、15.0ns以上、20.0ns未満を持つグループ、20.0ns以上、25.0ns未満を持つグループ、25.0ns以上、30.0ns未満を持つグループ、30.0ns以上、40.0ns未満を持つグループ、及び40.0ns以上を持つグループからなる群より選ばれる２種以上のグループの各グループに属する蛍光分子を（測定対象物質１単体中に）含むものを好ましく挙げることができる。
【００６３】
本発明の測定対象物質においては、標識として使用する蛍光分子のうちの少なくとも１種は蛍光寿命が既知であることが好ましく、全てが既知であることが当然により好ましい。
【００６４】
本発明の測定対象物質において、標識として使用可能な蛍光分子としては、限定はされないが、例えば以下の色素等が挙げられる：Cascade Yellow, Dapoxyl carboxylic acid, Pacific Blue, 7-Hydroxycourmarin-3-carboxylic acid, FAM（米国インビトロジェン社製）, 5-carboxynaphthofluorescein, Dabcyl LysoSensor, Lucifer Yellow, Alexa Flour, PyMPO（米国インビトロジェン社製）, NBD-X, DCCH, HEX, JOE, ROX, Texas Red, TET, TAMRA, AMC, Ant, Mant, DAN（米国インビトロジェン社製）, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7（アマシャムバイオサイエンス社製）, Qdot（米国Quantum Dot社製）, FITC, GFP。
【００６５】
本発明の測定対象物質に関しては、蛍光分子によって標識される物質が、プローブ又はターゲットであることが好ましい。当該プローブ又はターゲットとしては、例えば、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、リガンド、レセプター、ドナー、ホルモン、糖鎖、細胞及び胚などからなる群より選ばれる少なくとも１種を好ましく使用することができ、濃度同定や蛍光を発する微量物質の同定・検出を目的とする場合に好適である。また、種類の異なる測定物質（例えば遺伝子）の判別をすることも可能である。その手段・方法の例としては、DNAマイクロアレイ、タックマン(TaqMan)法、インベーダー法、in situハイブリダイゼーション、フローサイトメトリー、各種シーケンサー、蛍光顕微鏡などが挙げられ、これらの使用又は実施の際に使用される測定対象物質を、本発明のごとく、蛍光寿命の異なる複数の蛍光分子で標識したものに置き換えることによって、より一層マルチプレックス化し且つハイスループットで遺伝子等の測定対象物質を解析することを可能にし得る。
【００６６】
３．被験試料
本発明の被験試料は、上述した本発明の測定対象物質を含むことを特徴とする。
【００６７】
上記被験試料においては、含有する測定対象物質の少なくとも１種が既知の濃度を有するものであることが好ましい。
【００６８】
また上記被験試料は、測定対象物質のほかに、さらに既知の濃度を有する蛍光物質を少なくとも１種含むものであることが好ましい。ここで、当該蛍光物質のうちの少なくとも１種が既知の蛍光寿命を有するものであることが好ましい。
【００６９】
上記被験試料は、本発明の効果を損なわない範囲で、適宜その他の成分を含むことができる。その他の成分としては、例えば、緩衝液及びBSA等のブロッキング液、並びにRNaseやDNaseフリーの水などが挙げられる。
【００７０】
４．物質検出用試薬、物質検出用キット
(1) 本発明の物質検出用試薬は、上記本発明の測定対象物質、又は上記本発明の被験試料を含むことを特徴とする。上記試薬は、本発明の効果を損なわない範囲で、適宜その他の成分を含むことができる。その他の成分としては、例えば、緩衝液及びBSA等のブロッキング液、並びにRNaseやDNaseフリーの水などが挙げられる。
【００７１】
(2) 本発明の物質検出用キットは、上記本発明の測定対象物質、又は上記本発明の被験試料を含むことを特徴とする。キットには、上記測定対象物質又は被験試料のほか、緩衝液、使用説明書、及び各種部品などを含むことができ、好ましくは、上記本発明の物質検出用試薬を含むものである。また、本発明の効果を損なわない範囲で、適宜その他の構成要素を含むことができる。その他の構成要素としては、例えば、プラスチック製及びガラス製等の検出用チップ、検出用マイクロチューブ、検出用マイクロタイタープレート並びにカラムなどが挙げられる。
【００７２】
５．物質検出方法など各種方法
(1) 本発明においては、上記本発明の測定対象物質に標識された蛍光分子の蛍光寿命に基づいて、当該測定対象物質における各蛍光分子の標識量の割合及び／又は蛍光強度比を解析する方法を含むことができる。
【００７３】
(2) 測定対象物質の構造等の解析方法
本発明の解析方法は、上記本発明の測定対象物質に標識された蛍光分子の蛍光寿命に基づいて、当該測定対象物質の構造及び／又は存在比を解析する方法である。
【００７４】
具体的には、例えば、アミノ酸配列の異なるペプチドに、異なる蛍光寿命を持つ複数の蛍光分子を標識し、それぞれのペプチドが蛍光寿命によって明確に区別されるように標識した上で、特定のタンパク質に結合させ、BF(Binding/Free)分離の操作の後、どのペプチドがその特定のタンパク質と結合しているのかを、蛍光寿命を測定することにより、定量的に見積もることができる。特定のタンパク質に結合しているペプチドのアミノ酸配列が分かれば、タンパク質の活性部位を構成しているアミノ酸の種類や３次元的な構造等を知ることができる。また、別の例として、DNAやRNAの複数の部位に、異なる蛍光寿命を持つ複数の蛍光分子と、１個のダーククエンチャー（消光分子）を標識する。DNAやRNAが３次元構造を構成した後、蛍光寿命の蛍光強度が低下する蛍光分子を、蛍光寿命のデータから特定することにより、クエンチャーが標識された部位と、その蛍光強度が低下した蛍光分子が標識された部位とが、３次元構造を形成した場合に近接していることを確認することができる。
【００７５】
(3) 測定対象物質の種類等の特定方法
本発明の特定方法は、上記本発明の測定対象物質に標識された蛍光分子の蛍光寿命に基づいて、当該測定対象物質の種類及び／又は存在量を特定する方法である。なお、ここでいう測定対象物質の種類及び／又は存在量とは、測定対象物質と反応した官能基の種類及び／又は存在量や、測定対象物質と結合又は会合した物質の種類及び／又は存在量なども含むものとする。
【００７６】
本発明の特定方法に関しては、具体的には、例えば、タンパク質はアミノ基やチオール基等の官能基を持っていることが知られているが、それら官能基と反応し得るサクシニミジルエステルやマレイミド等の状態の蛍光分子をタンパク質と反応させることで標識し、その蛍光寿命から得られる蛍光分子の存在比を分析すれば、タンパク質にアミノ基とチオール基がそれぞれどのくらいの割合で含まれているかを同定することが可能となる。また、DNAマイクロアレイを用いた解析においては、異なる蛍光寿命を持つ複数の蛍光分子を標識したDNAプローブを複数種類用意し、これらを基板上に固定されたターゲットDNAとハイブリダイゼーションさせ、BF(Binding/Free)分離した後、基板上に残されたプローブの蛍光寿命を測定すれば、どのプローブがどの特定のターゲットと結合又は会合しているかを定量的に確認することが可能となる。
【００７７】
(4) 本発明においては、上記本発明の測定対象物質に標識された蛍光分子の蛍光寿命を、単一光子計数法、位相変調法、パルスサンプリング法、又は励起プローブ法などの公知の蛍光測定方法により測定することを特徴とする、物質の検出方法を含むことができる。
【００７８】
上記検出方法においては、蛍光寿命を複数の励起波長及び／又は複数の蛍光波長で測定することができる。詳しくは、複数種類の光源を用いて２種以上の波長で励起することや、複数種類のバンドパスフィルターなど各種フィルターを使用して２種以上の蛍光波長を検出することができる。
【００７９】
(5) 本発明においては、被験試料中の検出物質として上記本発明の測定対象物質を用いることを特徴とする、フローサイトメトリーによる物質の検出方法を含むことができる。フローサイトメトリーでは、通常、測定対象とする細胞・染色体等をその種類ごとに１種類の蛍光分子で標識した上で、水流とともに流す際にレーザー光を当て、放出される蛍光のスペクトルとその強度に応じて、細胞等の種類が判別される。すなわち、判別する測定対象の種類が増えればその分蛍光分子の種類も必要となる。これに対し、本発明を適用して、蛍光寿命の異なる複数の蛍光分子を標識するようにすれば、判別する測定対象の種類が増えた場合であっても、その種類ごとに、標識する蛍光分子の組合わせや標識量に違いを設けることで、より少ない種類の蛍光分子の使用で多くの種類の測定対象を判別し分離することが可能となる。
【００８０】
(6) 本発明においては、被験試料中の検出物質として上記本発明の測定対象物質を用いることを特徴とする、シークエンス方法を含むことができる。また、本発明においては、被験試料中の検出物質として上記本発明の測定対象物質を用いることを特徴とする、遺伝子のタイプを判別する方法を含むこともできる。
【００８１】
シーケンサーでは、１種類の蛍光分子で標識されたDNAがゲルに乗って流れる際にレーザー光を当て、放出される蛍光のスペクトルとその強度に応じて、標識されたDNAの種類が判別される。従来の技術では1000塩基程度しか配列を読み取れないシークエンサーにおいても、本発明を適用し、FAMやVIC等の蛍光強度の強い複数種類の蛍光分子をそれらの標識量の割合を変えて標識するようにすれば、高感度に、かつ長い配列を判別することが可能となる。シークエンサーを使った遺伝子のタイプの判別（一塩基多型の検出など）に関しても、同様の方法を適用することができる。
【００８２】
(7) 本発明においては、被験試料中の検出物質として上記本発明の測定対象物質を用いることを特徴とする、in situ ハイブリダイゼーション法を含むことができる。また、本発明においては、被験試料中の検出物質として上記本発明の測定対象物質を用いることを特徴とする、蛍光顕微鏡を用いた物質の検出方法を含むことができる。
【００８３】
蛍光を使ったin situ ハイブリダイゼーション法（FISH法）では、DNAやRNA等に蛍光分子を標識し、蛍光顕微鏡で標識した測定対象物質を観察するのが一般的である。これにおいても、本発明を適用し、蛍光寿命の異なる複数の蛍光分子をDNAやRNAに標識するようにすれば、より多くの遺伝子やRNAを、蛍光寿命に基づきin situで同時に判別し、定量化することが可能となる。
【００８４】
なお、上記(1)〜(7)の各種方法においては、光源としてレーザーダイオード（LD）やレーザーを使用してもよいが、それ以外にフラッシュランプや発光ダイオード（LED）を使ってももちろん構わない。また、本発明においては、パルス周波数、パルス強度、パルス径は、測定対象によって適宜選択することができる。例えば、パルス周波数は1kHz〜1GHzであり、パルス強度は数μW〜数百Wである。また、パルス径は数十μm〜数十mmである。
【００８５】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００８６】
＜異なる蛍光寿命を有する蛍光分子を標識したDNAの同定及び定量測定＞
本実施例では、4.0ns（τ1）の蛍光寿命を持つFAMをF1とし、1.8ns（τ2）の蛍光寿命を持つPyMPO をF2とし、両蛍光分子が標識された測定対象物質を含む被験試料の蛍光減衰曲線を図２Ａの(1)、(2)、(4)のDNAプローブ（順に、配列番号１、２、４）を使って測定し、観察した。FAMの吸収スペクトルと蛍光スペクトルのピーク波長は、それぞれ415 nmと570nmである。また、PyMPOの吸収スペクトルと蛍光スペクトルのピーク波長は、それぞれ495nmと516nmである。
【００８７】
操作として蛍光分子であるFAM及びPyMPOが標識された図４(1)〜(3)記載のDNAプローブ（順に、配列番号１２、１３、１４）が含まれる溶液を調製し、その蛍光減衰曲線を測定した。被験試料を波長408nmのLD光源で励起し、蛍光波長570nmで測定したところ、図５のような結果が得られた。図５は、図４の(1)と(2)のDNAプローブが入っている別々の溶液（pH=8.5、濃度1.0μM）を測定したデータである。図５から得られる図４(1)と(2)のDNAプローブの入った溶液の蛍光寿命は、DNAに標識していないFAM単体あるいはPyMPO単体の蛍光寿命と同じで、それぞれ4.0nsと1.8nsであった。次に、図４(3)に記載されたFAMとPyMPOが同時に標識されたDNAプローブを同じく408nmで励起し、515nmと570nmで蛍光の減衰曲線を測定したところ、図６のような結果が得られた。図６から明らかなように、FAMとPyMPOを同時に標識したDNAプローブの蛍光減衰曲線は、PyMPOの蛍光寿命とFAMの蛍光寿命が足し合わさった形状になっており、515nmで得られた減衰曲線は、570nmでの減衰曲線に比較しPyMPOの割合が高くなっている。これは、515nmという波長が、PyMPOの蛍光ピーク波長に近いためと考えられる。515nmと570nmにおけるFAMとPyMPOの蛍光強度比（A1×τ1：A2×τ2）は、それぞれ42：58と21：79であった。ここでは、「特許文献４」に記載の指数関数（前述）の係数Ai（ここで i = 1, 2）を、蛍光減衰曲線に適用して計算した。この図６のように、減衰曲線をモニターする波長を変えると、FAMとPyMPOから得られる蛍光の成分比が変化することから、いくつかの波長で減衰曲線を測定することにより、各蛍光分子の存在比を高精度で測定することが可能になる。
【００８８】
図７には、FAMとPyMPOが同時に標識されたDNAを、測定時間を一定にして、異なる濃度（0.33μMと1.00μM）で測定した際の結果を示す。ここで、濃度以外のパラメーター（励起波長、蛍光波長、スリット幅、光源強度など）は全く同じである。この図７から明らかなように、濃度が３分の１になると、カウント（蛍光強度）も約３分の１になるが、FAMの蛍光寿命の成分と、PyMPOの成分の比は濃度に依存せずに一定である。すなわち、FAMとPyMPOの蛍光強度比（A1×τ1：A2×τ2）は、いずれの濃度でも21：79であった。このことから、２つの異なる蛍光分子に同時に標識されたDNAは、蛍光寿命を測定することによって、容易に識別が可能であること、また蛍光寿命の強度を比較することによって、簡単に定量することが可能であることを示している。
【００８９】
本実施例から明らかなように、FAMとPyMPOの蛍光寿命の比が２倍以上あるため、FAMとPyMPOに由来する蛍光寿命の成分を分離することは容易であり、FAMとPyMPOが同時に標識されたDNAの濃度を変えると、それに応じて、FAMとPyMPOの割合は変化しないが、蛍光減衰曲線の強度（カウント）が変化することが認められる。このとき、FAMが標識されたDNAを濃度既知の参照分子として利用すると、濃度未知のPyMPOが標識されたDNA、及び、FAMとPyMPOが同時に標識されたDNAの蛍光減衰曲線から、参照蛍光分子に対するそれぞれのDNAの濃度を求めることが可能である。また、濃度既知の２種類以上の参照蛍光分子を溶液中に混合することによって、濃度検出範囲（ダイナミックレンジ）をさらに広げることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本発明で利用し得る単一光子計数法の測定原理及び測定装置を表す。
【図２Ａ】本発明の例として、蛍光分子が標識されたDNAの配列を示す図である。
【図２Ｂ】本発明の例として、蛍光分子が標識されたDNAの配列を示す図である。
【図３Ａ】本発明の蛍光分子を標識したDNAの減衰曲線が、組合せに固有のものであることを示す蛍光減衰曲線の模式図を示す。
【図３Ｂ】本発明の蛍光分子を標識したDNAの減衰曲線が、組合せに固有のものであることを示す蛍光減衰曲線の模式図を示す。
【図４】本実施例で用いられた蛍光分子が標識されたDNAの配列を示す図である。
【図５】本実施例の蛍光分子を標識したDNAの減衰曲線が、蛍光分子に固有のものであることを示すプロット。
【図６】本実施例の蛍光分子を同時に標識したDNAの減衰曲線が、モニターする蛍光波長によって形状を変化させることを示すプロット。
【図７】本実施例の蛍光分子を同時に標識したDNAの減衰曲線が、濃度に比例して、その蛍光強度を変化させるが、蛍光分子の成分割合は変化しないことを示すプロット。
【符号の説明】
【００９１】
１    被験試料
２    パルス光源
３    パルス光
４    蛍光
５    光電子増倍管
６    アンプ
７    定フラクションデスクリミネータ
８    時間-電圧変換器
９    マルチチャンネルアナライザ
１０  パーソナルコンピュータ
１１  励起側波長フィルター
１２  蛍光側波長フィルター
【配列表フリーテキスト】
【００９２】
配列番号１：DNAプローブ
配列番号２：DNAプローブ
配列番号３：DNAプローブ
配列番号４：DNAプローブ
配列番号５：DNAプローブ
配列番号６：DNAプローブ
配列番号７：DNAプローブ
配列番号８：DNAプローブ
配列番号９：DNAプローブ
配列番号１０：DNAプローブ
配列番号１１：DNAプローブ
配列番号１２：DNAプローブ
配列番号１３：DNAプローブ
配列番号１４：DNAプローブ
【図１】
2007033159.tif 000005
【図２Ａ】
2007033159.tif 000006
【図２Ｂ】
2007033159.tif 000007
【図３Ａ】
2007033159.tif 000008
【図３Ｂ】
2007033159.tif 000009
【図４】
2007033159.tif 000010
【図５】
2007033159.tif 000011
【図６】
2007033159.tif 000012
【図７】
2007033159.tif 000013
【配列表】
2007033159000001.app