(57)【要約】【課題】キュウリモザイクウイルス（CMV ）による農作物の被害を軽減するため、CMV を安価かつ簡便なプロセスで高感度に検出できる方法を提供する。【解決手段】CMV の各系統に共通して保存された塩基配列から設計された、所定の塩基配列と特異的にハイブリダイズする、 LAMP プライマー又は Loop プライマーであるヌクレオチドプライマー、これらのプライマーから構成されるプライマーセット、当該プライマーセットを用いた核酸増幅法、核酸増幅の検出によるCMV 感染の有無の検出方法及び検出用キット。【選択図】図２
2007135526.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示す C7-2 系統のキュウリモザイクウイルス（ CMV：Cucumber mosaic virus ）の RNA3 の塩基配列における 1521 〜 1739 番の塩基配列（特定塩基配列）から選ばれた塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなり、RT-LAMP 法による増幅用プライマーとして用いられるものであることを特徴とするヌクレオチドプライマー。
【請求項２】
前記ヌクレオチドプライマーが、 LAMP プライマーとしてのインナープライマーＦ（IPF ）、インナープライマーＲ（IPR ）、アウタープライマーＦ（OPF ）又はアウタープライマーＲ（OPR ）として用いられるものであることを特徴とする請求項１に記載のヌクレオチドプライマー。
【請求項３】
前記ヌクレオチドプライマーが、 Loop プライマーとしてのループプライマーＦ（LPF ）又はループプライマーＲ（LPR ）として用いられるものであることを特徴とする請求項１に記載のヌクレオチドプライマー。
【請求項４】
前記ヌクレオチドプライマーが、少なくとも１５塩基を含むものであることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載のヌクレオチドプライマー。
【請求項５】
請求項１に規定する特定塩基配列において、その５’末端側から３’末端側へ向かって、互いにオーバーラップしないように６つの塩基配列領域 F3 、F2、F1、 R1c、 R2c、 R3cを順次にかつ任意に設定したもとで、これらの６つの塩基配列領域の塩基配列に対する相補的な塩基配列をそれぞれ F3c、F2c 、F1c 、R1、R2、R3としたときに、以下（１）〜（４）に列挙する各塩基配列を持つ LAMP プライマーからなることを特徴とするプライマーセット。
（１）F2より選ばれた塩基配列を３’末端側に有し、 F1cより選ばれた塩基配列を５’末端側に有するインナープライマーＦ（IPF ）。
（２）R2より選ばれた塩基配列を３’末端側に有し、 R1cより選ばれた塩基配列を５’末端側に有するインナープライマーＲ（IPR ）。
（３）F3より選ばれた塩基配列を有するアウタープライマーＦ（OPF ）。
（４）R3より選ばれた塩基配列を有するアウタープライマーＲ（OPR ）。
【請求項６】
前記６つの塩基配列領域が、請求項１に規定する特定塩基配列におけるそれぞれ次の塩基番号で示される領域であることを特徴とする請求項５に記載のプライマーセット。
F3 ：配列番号１５２１〜１５４０の領域
F2 ：配列番号１５５２〜１５７２の領域
F1 ：配列番号１５９４〜１６１４の領域
R1c：配列番号１６５５〜１６７５の領域
R2c：配列番号１６９７〜１７１７の領域
R3c：配列番号１７１９〜１７３９の領域
【請求項７】
前記 LAMP プライマーIPF 、IPR 、OPF 及びOPR がそれぞれ以下の塩基配列を有することを特徴とする請求項５又は請求項６に記載のプライマーセット。
IPF：配列番号１０に示す塩基配列
IPR：配列番号１１に示す塩基配列
OPF：配列番号４に示す塩基配列
OPR：配列番号１２に示す塩基配列
【請求項８】
前記６つの塩基配列領域の設定において、塩基配列領域 F2
と F1 との間に塩基鎖のループ構造を形成するに適当な長さの中間塩基配列領域FLP を残し、塩基配列領域 R1cと R2cとの間に塩基鎖のループ構造を形成するに適当な長さの中間塩基配列領域 RLPc を残すように設定し、かつ、これらの中間塩基配列領域 FLP、RLPcに対する相補的な塩基配列をそれぞれ FLPc 、RLP としたときに、前記プライマーセットが更に以下（５）、（６）の各塩基配列を持つ Loop プライマーを含むことを特徴とする請求項５〜請求項７のいずれかに記載のプライマーセット。
（５）FLPcより選ばれた塩基配列を有するループプライマーＦ（LPF ）。
（６）RLPcより選ばれた塩基配列を有するループプライマーＲ（LPR ）。
【請求項９】
前記中間塩基配列領域 FLP、RLPcが２０〜４０の塩基配列からなることを特徴とする請求項８に記載のプライマーセット。
【請求項１０】
前記 Loop プライマーLPF 及びLPR が、それぞれ以下の塩基配列を有することを特徴とする請求項８又は請求項９に記載のプライマーセット。
LPF：配列番号１３に示す塩基配列
LPR：配列番号９に示す塩基配列
【請求項１１】
前記 LAMP プライマー及び Loop プライマーが、少なくとも１５塩基を含むものであることを特徴とする請求項５〜請求項１０のいずれかに記載のプライマーセット。
【請求項１２】
請求項５〜請求項１１のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、RT-LAMP 法により、CMV の標的核酸領域の増幅反応を行うことを特徴とする CMVの検出方法。
【請求項１３】
前記 CMVの検出方法が、少なくとも、C7-2系統（GenBank
accession No. D42079）N 系統（GenBank accession No. D28486）、FT系統（GenBank accession No. D28487）、Pepo系統（GenBank accession No. D28488）、CS系統（GenBank accession No. D28489）並びに D8 系統（GenBank accession
No. AB004781）の CMVを対象とするものであることを特徴とする請求項１２に記載の CMVの検出方法。
【請求項１４】
請求項１２又は請求項１３に記載の CMVの検出方法によって植物のCMV 感染の有無を診断することを特徴とするCMV 診断方法。
【請求項１５】
請求項１〜請求項４のいずれかに記載の必要な種類のヌクレオチドプライマーを含み、又は請求項５〜請求項１１のいずれかに記載のプライマーセットを含むことを特徴とする CMV診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はキュウリモザイクウイルス（Cucumber mosaic virus ：以下において単に「CMV 」とも言う）の検出方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、CMV
遺伝子の高感度な遺伝子工学的検出法を利用したCMV 感染植物の診断法と、これに用いるヌクレオチドプライマー、プライマーセット及び CMV診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
CMV は非常に広い宿主範囲を持ち、主要な野菜や花きの殆どを含む85科365 属775 種の植物への感染が報告されている。CMV は Bromovirus 科Cucumovirus 属に分類される3 粒子性ウイルスであって、球状ウイルス粒子には3 分節の1 本鎖(+) ゲノム RNA（RNA 1 〜3 ）と、外被タンパク質をコードするサブゲノム RNA（ RNA4 ）が含まれている。CMV は、1916年に Doolittleによって初めて報告された。また、日本では1922年に笠井らによって発見されている。このウイルスは、例えば下記の非特許文献１に開示されるように、汁液伝染とともにアブラムシで伝播することが知られている。
【０００３】
【非特許文献１】Tomlinson, J. A. (1987), "Epidemiology and controlof virus diseases of vegetables" Ann. Appl. Biol., 110, 661-681.  CMV が感染すると、エンドウやソラマメなどのマメ科野菜ではモザイク症状、トマトやピーマンなどのナス科野菜ではモザイク症状やえそ症状、ウリ科野菜ではモザイク症状や奇形症状を示す。その他、アブラナ科野菜、チューリップ、スイセン・キクなどの多くの花きで、モザイク症状を中心とした病徴を示す（例えば下記の非特許文献２を参照) 。
【０００４】
【非特許文献２】都丸敬一ら編．新植物病理学．朝倉書店．202-207  農作物の栽培現場では、CMV に感染した植物体を感染源として、アブラムシによって周辺の農作物に蔓延していくため、伝染源となる罹病植物を早期に取り除くことが最も重要となる。そのために、簡易で高感度なCMV 感染植物診断技術が要求されている。
【０００５】
下記の非特許文献３に示すように、Jones とProudlove は、CMV の抗体を用いたELISA 法によって、ルピナスの種子からウイルスを検出できたことを報告している。このELISA 法を用いることにより、100 粒の種子中CMV 感染種子が1 粒でもあれば、検出可能であった。
【０００６】
【非特許文献３】Jones, R. A. C. and Proudlove, W. (1991). "Furtherstudies of cucumber mosaic virus infection of narrow-leafed lupin(Lupinas angustifolius):seed-borne infection, aphid transmission,spread and effects on grain yield" Ann. Appl. Biol., 118, 319-329.  また、下記の非特許文献４に示すように、Tsuda らは、簡易診断法としてろ紙とラテックスを用いた迅速免疫ろ紙検定法（ RIPA ）法によるCMV 検出法を開発した。そのCMV 検出法によれば、CMV の抗体をラテックスに感作させ、感作ラテックスをろ紙に塗布し乾燥させた後、ろ紙の下端をCMV が感染した植物の粗汁液に浸し、1 分後、ハサミでろ紙の下端を切除し、標識ラテックスに浸したところ、明瞭なバンドが出現した。
【０００７】
【非特許文献４】Tsuda, S., Kameya-Iwaki, M., Hanada, K., Fujisawa,I. and Tomaru, K. (1993). "Simultaneous diagnosis for plants infectedwith multiple viruses employing rapid immunofilter paper assay (RIPA)with two-step method; multi-RIPA" Ann. Phytopath. Soc. Japan, 59, 200-203.  さらにWylie らは、下記の非特許文献５に示すように、遺伝子レベルでの検出法として、CMV の RNA3 のコートタンパク質領域に設計したプライマーを利用したRT-PCR法を開発した。
【０００８】
【非特許文献５】Wylie, S., Wilson, C. R., Jones, R. A. C. andJones, G. K. (1993). "A polymerase chain reaction assay for cucumbermosaic virus in lupin seeds" Aust. J. Agric. Res., 44, 41-51.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上のように、従来は、一般的に、植物ウイルスの検定には免疫学的な手法がよく用いられている。しかしこれらの免疫学的な手法では検出感度が低いことが問題となっている。
【００１０】
一方、免疫学的な手法に変わる RT-PCR 法のような遺伝子学的な手法も提案されている。しかし RT-PCR 法のような手法では、例えばサーマルサイクラーや電気泳動槽のような高額な装置や実験設備が必要であり、農業現場での診断には不向きである。
【００１１】
従って、CMV に対して高い検出感度を持ち、しかも簡易かつ安価に実行できる診断法を開発することが要求されている。そこで本発明は、CMV 遺伝子の高感度な遺伝子工学的検出法を利用した、簡易かつ安価に実行できるCMV 感染植物の診断法を開発することを、解決すべき技術的課題とする。
〔着眼点〕
本発明者は、免疫学的な方法やRT-PCR法よりも高感度で特異的な検出方法である LAMP （Loop-mediated isothermal amplification）法に着眼した。但し診断対象が RNAであるから、実際には逆転写過程を伴う RT-LAMP法となる。この高感度な検出法を利用することで、検体に対する特別な抽出法や押潰し等の物理的な操作も不要となり、高額な装置や実験設備を必要とすることなく、例えば、葉を突いた爪楊枝を反応液に浸漬することで、ウイルス感染の有無を調べることができる。
【００１２】
また、本発明者は、CMV には各系統間で塩基配列の差異が多い点に鑑み、CMV
の各系統に共通して適用できる検出法を確立するため、多系統のCMV の塩基配列の比較検討を通じて、CMV に特異的な塩基配列であって、しかも各系統で共通に保存されている塩基配列の領域を割出した。そして、これらのCMV に特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするヌクレオチドプライマーを LAMP プライマーとして作製し、更にはプロセスの迅速化のためにLoopプライマーも作製し、これらのプライマーからなるプライマーセットを用いて、RT-LAMP 法により各系統のCMV に特異的な塩基配列を増幅することで、多様な系統のCMV のいずれであっても高感度に検出できることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（第１発明）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、配列番号１に示す C7-2 系統のキュウリモザイクウイルス（ CMV）の RNA3 の塩基配列における、 1521 〜 1739 番の塩基配列（以下、これを「特定塩基配列」とも言う）から選ばれた塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなり、RT-LAMP 法による増幅用プライマーとして用いられるものである、ヌクレオチドプライマーである。
【００１４】
（第２発明）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に係るヌクレオチドプライマーが、 LAMP プライマーとしてのインナープライマーＦ（IPF ）、インナープライマーＲ（IPR ）、アウタープライマーＦ（OPF ）又はアウタープライマーＲ（OPR ）として用いられるものである、ヌクレオチドプライマーである。
【００１５】
（第３発明）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第１発明に係るヌクレオチドプライマーが、 Loop プライマーとしてのループプライマーＦ（LPF ）又はループプライマーＲ（LPR ）として用いられるものである、ヌクレオチドプライマーである。
【００１６】
（第４発明）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、前記第１発明〜第３発明のいずれかに係るヌクレオチドプライマーが、少なくとも１５塩基を含むものである、ヌクレオチドプライマーである。
【００１７】
（第５発明）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、第１発明に規定する特定塩基配列において、その５’末端側から３’末端側へ向かって、互いにオーバーラップしないように６つの塩基配列領域 F3 、 F2 、 F1 、R1c 、R2c 、R3c を順次にかつ任意に設定したもとで、これらの６つの塩基配列領域の塩基配列に対する相補的な塩基配列をそれぞれ F3c、F2c 、F1c 、R1、R2、R3としたとき、以下の（１）〜（４）に列挙する各塩基配列を持つ LAMP プライマーからなる、プライマーセットである。
（１）F2より選ばれた塩基配列を３’末端側に有し、 F1cより選ばれた塩基配列を５’末端側に有するインナープライマーＦ（IPF ）。
（２）R2より選ばれた塩基配列を３’末端側に有し、 R1cより選ばれた塩基配列を５’末端側に有するインナープライマーＲ（IPR ）。
（３）F3より選ばれた塩基配列を有するアウタープライマーＦ（OPF ）。
（４）R3より選ばれた塩基配列を有するアウタープライマーＲ（OPR ）。
【００１８】
（第６発明）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、前記第５発明に係る６つの塩基配列領域が、第１発明に規定する特定塩基配列におけるそれぞれ次の塩基番号で示される領域である、プライマーセットである。
F3 ：配列番号１５２１〜１５４０の領域
F2 ：配列番号１５５２〜１５７２の領域
F1 ：配列番号１５９４〜１６１４の領域
R1c：配列番号１６５５〜１６７５の領域
R2c：配列番号１６９７〜１７１７の領域
R3c：配列番号１７１９〜１７３９の領域
（第７発明）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、前記第５発明又は第６発明に係る LAMP プライマーIPF 、IPR 、OPF 及びOPR がそれぞれ以下の塩基配列を有する、プライマーセットである。
IPF：配列番号１０に示す塩基配列
IPR：配列番号１１に示す塩基配列
OPF：配列番号４に示す塩基配列
OPR：配列番号１２に示す塩基配列
（第８発明）
上記課題を解決するための本願第８発明の構成は、前記第５発明〜第７発明のいずれかに係る６つの塩基配列領域の設定において、塩基配列領域 F2 と F1 との間に塩基鎖のループ構造を形成するに適当な長さの中間塩基配列領域 FLPを残し、塩基配列領域 R1cと R2cとの間に塩基鎖のループ構造を形成するに適当な長さの中間塩基配列領域 RLPc を残すように設定し、かつこれらの中間塩基配列領域 FLP、RLPcに対する相補的な塩基配列をそれぞれ FLPc 、RLP としたときに、前記プライマーセットが更に以下（５）、（６）の各塩基配列を持つ Loop プライマーを含む、プライマーセットである。
（５）FLPcより選ばれた塩基配列を有するループプライマーＦ（LPF ）。
（６）RLPcより選ばれた塩基配列を有するループプライマーＲ（LPR ）。
【００１９】
（第９発明）
上記課題を解決するための本願第９発明の構成は、前記第８発明に係る中間塩基配列領域 FLP、RLPcが２０〜４０の塩基配列からなる、プライマーセットである。
【００２０】
（第１０発明）
上記課題を解決するための本願第１０発明の構成は、前記第８発明又は第９発明に係る Loop プライマーLPF 及びLPR が、それぞれ以下の塩基配列を有する、プライマーセットである。
LPF：配列番号１３に示す塩基配列
LPR：配列番号９に示す塩基配列
（第１１発明）
上記課題を解決するための本願第１１発明の構成は、前記第５発明〜第１０発明のいずれかに係る LAMP プライマー及び Loop プライマーが、少なくとも１５塩基を含むものである、プライマーセットである。
【００２１】
（第１２発明）
上記課題を解決するための本願第１２発明の構成は、第５発明〜第１１発明のいずれかに係るプライマーセットを用いて、RT-LAMP 法により、CMV の標的核酸領域の増幅反応を行う、 CMVの検出方法である。
【００２２】
（第１３発明）
上記課題を解決するための本願第１３発明の構成は、前記した第１２発明に係る CMVの検出方法が、少なくとも、C7-2系統（GenBank accession No. D42079）N 系統（GenBank accession No. D28486）、FT系統（GenBank accession No. D28487）、Pepo系統（GenBank accession No. D28488）、CS系統（GenBank accession No. D28489）並びに D8 系統（GenBank accession No. AB004781）の CMVを対象とするものである、 CMVの検出方法である。
【００２３】
（第１４発明）
上記課題を解決するための本願第１４発明の構成は、前記第１２発明又は第１３発明に係る CMVの検出方法によって植物のCMV 感染の有無を診断する、CMV 診断方法である。
【００２４】
（第１５発明）
上記課題を解決するための本願第１５発明の構成は、第１発明〜第４発明のいずれかに係る必要な種類のヌクレオチドプライマーを含み、又は第５発明〜第１１発明のいずれかに係るプライマーセットを含む、 CMV診断用キットである。
【発明の効果】
【００２５】
以上の本願第１発明〜第１５発明からなる本発明によれば、以下の種々の効果が得られる。
【００２６】
（第１発明〜第４発明の効果）
第１発明〜第４発明に係るヌクレオチドプライマーは、前記した特定塩基配列から選ばれた塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなる。
【００２７】
この特定塩基配列は C7-2 系統の CMVの RNA3 の塩基配列における1495〜1739番の塩基配列であるが、同時に、C7-2系統（GenBank accession No. D42079）N
系統（GenBank accession No. D28486）、FT系統（GenBank accession No. D28487）、Pepo系統（GenBank accession No. D28488）、CS系統（GenBank accession No. D28489）並びに D8 系統（GenBank accession No. AB004781）の CMVの塩基配列の比較検討を通じて、「CMV に特異的な塩基配列であって、しかも各系統で共通に保存されている塩基配列が集中している領域」として割り出したものでもある。従ってこれらのヌクレオチドプライマーを適正に組み合わせてRT-LAMP
法による増幅用プライマーとして用いると、各系統間で塩基配列の差異が多い各系統のCMV に対し、共通して信頼性の高いRT-LAMP 法によるCMV 診断を行うことができる。
【００２８】
RT-LAMP 法を行うに当たり、第２発明のように LAMP プライマーとしてのインナープライマーＦ（IPF ）、インナープライマーＲ（IPR ）、アウタープライマーＦ（OPF ）及びアウタープライマーＲ（OPR ）を設定することもでき、更に、RT-LAMP 法の効率を向上させるために、第３発明のように Loop プライマーとしてのループプライマーＦ（LPF ）及びループプライマーＲ（LPR ）を追加して設定することもできる。
【００２９】
上記の各種のヌクレオチドプライマーの長さ（塩基数）は必ずしも限定されないが、第４発明のように少なくとも１５塩基を含むものが特に好ましい。
【００３０】
（第５発明〜第１１発明の効果）
第５発明〜第１１発明に係るプライマーセットは、第１発明〜第１１発明に係るヌクレオチドプライマーと同様、前記した特定塩基配列から選ばれた塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなるプライマーであって、RT-LAMP 法用の１セットのプライマーとして構成されたものである。従って、これらのプライマーセットをRT-LAMP 法による増幅用プライマーとして用いると、各系統間で塩基配列の差異が多い各系統のCMV に対し、共通して信頼性の高いRT-LAMP 法によるCMV
診断を行うことができる。
【００３１】
プライマーセットとしては、第５発明のように１セットの LAMP プライマーからなるプライマーセットも利用できるし、第８発明のように更に Loop プライマーを追加した高効率なプライマーセットも利用できる。
【００３２】
周知のように、LAMP法においては、標的核酸上において、その３’末端側から５’末端側へ向かって、互いにオーバーラップしないように６つの塩基配列領域を順次に設定し、ここから、第５発明のように、IPF 、IPR 、OPF 、OPR の４つの LAMP プライマーを設定する。
【００３３】
上記の６つの塩基配列領域は、CMV の各系統で共通に保存されている塩基配列領域である限りにおいて、限定されない。但し、特に好ましい６つの塩基配列領域が、前記第６発明に規定する F3 、 F2 、 F1 、 R1c、 R2c、 R3cの各領域である。この場合、上記のIPF 、IPR 、OPF 、OPR の４つの LAMP プライマーは、前記第７発明で規定するそれぞれの塩基配列を有することになる。
【００３４】
LAMP プライマー及び Loop プライマーからなるプライマーセットを構成する場合には、前記第８発明及び第９発明のようにして、６つの塩基配列領域の他に２つの中間塩基配列領域 FLP、RLPcを設定し、この中間塩基配列領域に基づいて、第８発明の（５）として前記したループプライマーＦ（LPF ）と、第８発明の（６）として前記したループプライマーＲ（LPR ）とを更に設定する。 LAMP プライマーがそれぞれ第７発明で規定する塩基配列を有する場合においては、これらの Loop プライマー LPF及び LPRはそれぞれ第１０発明に規定する塩基配列を有することが、特に好ましい。
【００３５】
上記の各種のプライマーセットを構成する LAMP プライマーや Loop プライマーの長さ（塩基数）は必ずしも限定されないが、第１１発明のように少なくとも１５塩基を含むものが特に好ましい。
【００３６】
（第１２発明及び第１３発明の効果）
第１２発明及び第１３発明によれば、各系統間で塩基配列の差異が多い各系統のCMV に対し、特に、少なくともC7-2系統、N 系統、、FT系統、Pepo系統、CS系統並びに D8 系統の CMVに対し、共通して信頼性の高いRT-LAMP 法によるCMV の検出を行うことができる。
【００３７】
しかもこれらの CMVの検出方法は、免疫学的な方法やRT-PCR法よりも高感度で、特異的な検出が可能である。更に、これらの従来法のような面倒な抽出法や物理的な操作も不要となり、高額な装置や実験設備を必要とせず、例えば、葉を突いた爪楊枝を反応液に浸漬することで、ウイルス感染の有無を調べることができる。
【００３８】
（第１４発明の効果）
第１４発明によって、植物のCMV 感染の有無を診断する高感度で特異的なCMV
診断方法が提供される。
【００３９】
（第１５発明の効果）
第１５発明によって、前記第１４発明のCMV 診断方法を実行するに好適な CMV診断用キットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明の主要な実施形態は、その最良の形態を含めて、前記した「課題を解決するための手段」の項における本願第１発明〜第１５発明の構成の説明において述べられている。本発明の実施形態におけるその他の点を、以下に述べる。
【００４１】
本発明において使用される試料としては、植物由来の葉、枝、果実等を適当な大きさの切片としたもの等が挙げられる。そして、この切片試料はCMV の感染の有無を問わず、肉眼的に無病徴であっても、あるいは明らかにモザイク症状を呈しているものであってもよい。植物検体から増幅に用いられる核酸は、この切片をそのまま増幅に使用される緩衝液に浸漬して遊離させるか、あるいは爪楊枝などで突くことによって付着した試料を用いるか、また別にトリス緩衝液やリン酸緩衝液等の緩衝液からなる抽出液と共に試料を磨砕等してから、抽出・精製等の公知の技術より精製させたものを用いることができる。
【００４２】
このように植物検体から得られたCMV 由来の核酸の増幅は、近年、納富らが開発した、温度制御が不要な新しい核酸増幅法である上記 LAMP 法（ループ媒介等温増幅法：WO  00/28028）で達成される。この方法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の３’末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。
【００４３】
また、LAMP法では、プライマー３’末端が常に試料に由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能する。そしてその結果として、高感度にかつ特異性の高い核酸増幅反応を可能としている。
【００４４】
さらに、CMV の核酸のように鋳型がRNA である場合は、RNA を鋳型としてDNA
を合成する逆転写反応と上記のLAMP反応を組み合わせたRT-LAMP 法によって核酸を増幅することができる。
【００４５】
RT-LAMP 反応で使用されるヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列における前記した６つの塩基配列領域を認識する少なくとも４種類の前記 LAMP プライマー、更には前記した２つの中間配列領域を認識する２種類の前記 Loop プライマーから構成される。
【００４６】
これらの６種類のプライマーは、通常、各々インナープライマーＦ及びＲと、アウタープライマーＦ及びＲ、更にループプライマーＦ及びＲと呼ぶ。インナープライマーとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３’末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’末端に有するヌクレオチド（好ましくは、オリゴヌクレオチド）である。一方、アウタープライマーとは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」の３’末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するヌクレオチド（好ましくは、オリゴヌクレオチド）である。さらに、ループプライマーとは、第８発明で前記したような中間塩基配列領域を認識し、かつ合成基点を与える塩基配列を有するヌクレオチド（好ましくは、オリゴヌクレオチド）である。
【００４７】
ここで、各プライマーにおける「Ｆ」とは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示であり、一方「Ｒ」とは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマー表示である。プライマーとして用いられるヌクレオチドの長さは、10塩基以上、好ましくは15塩基以上で、化学合成物あるいは天然物のどちらでも良く、各プライマーは単一の特定された塩基配列に係るヌクレオチドでもよく、部分的に同じ塩基配列を持つ複数種類のヌクレオチドの混合物でもよい。
【００４８】
本発明者は、配列番号1 で示される塩基配列から、各系統のCMV に共通する特異的な塩基配列を迅速に増幅できるRT-LAMP 法のプライマーの塩基配列とその組み合わせを鋭意研究した結果、以下のプライマーセットを選定した。
IPF：5'-TAACTCGAATTTGAATGCGCGTATTACCTGATTCAGTCACGG -3' （配列番号10）
OPF：5'-GACCGTGGGTCTTATTATGG-3'                        （配列番号4 ）
IPR：5'-CCGTAAAGTTCCTGCCTCCTCCCGTCCGCAAACATAGCAGAG-3'  （配列番号11）
OPR：5'-ATTAACCAGTACCGGTGAGGC-3'                       （配列番号12）
LPF：5'-AACAAGTTTCTTATC-3'                             （配列番号13）
LPR：5'-ACTTATCCGTTGCCGCCA-3'                          （配列番号9 ）
核酸合成で使用する酵素は、RNA からDNA を合成する逆転写酵素および鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。逆転写酵素としてはAMV 逆転写酵素、M-MLV 逆転写酵素、また、DNA 合成酵素としては、Bst
DNAポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Bca (exo-) DNAポリメラーゼ、大腸菌DNA ポリメラーゼI のクレノウフラグメント等が挙げられ、好ましくはAMV 逆転写酵素とBst DNA ポリメラーゼ（ラージフラグメント）の組み合わせが挙げられる。AMV 逆転写酵素とBst DNA ポリメラーゼを用いる場合は、その反応至適温度である６５°Ｃ付近で反応を行うのが望ましい。
【００４９】
RT-LAMP 反応後の核酸増幅産物の検出には、公知の技術を適用できる。例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドや蛍光性インターカレーター法（特開2001-242169 ）を用いたり、あるいは反応終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかけても容易に検出できる。電気泳動においては、RT-LAMP 増幅産物が、塩基長の異なる多数のバンドがはしご状に検出される。
【００５０】
また、RT-LAMP 法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副生物であるピロリン酸が、共存するマグネシウムイオンと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼でも確認できる程に白濁する。従って、この白濁を、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に観察できる測定機器を用いて、例えば400nm の吸光度変化を通常の分光光度計を用いて、確認することも可能である（W001/83817）。
【実施例】
【００５１】
以下に本発明の実施例を具体的に説明する。本発明の技術的範囲は、以下の実施例によって限定されるものではない。
【００５２】
（実施例１：検出限界の確認）
以下のようにして、RT-LAMP 法と、代表的な核酸増幅法であるRT-PCR法との検出感度の比較を行った。
１．試料及び試薬の調整
１）核酸抽出
CMV に感染した植物（キクの葉）を、200 倍容の100mM Tris-HCl (pH 8.0) で磨砕したものを10０  倍とし、さらに段階的に１０倍ずつの希釈操作を繰り返し、10６  倍までの希釈液を作製し、これらを核酸抽出試料とした。
【００５３】
２）RT-PCR法
RT-PCR反応は、ReverTra Dash Kit (Toyobo)を用い、添付されたプロトコールに従って行った。CMV 検出用プライマーとして、CMV ゲノムの約 250bpを増幅する配列番号４及び１２の塩基配列からなる２種類のプライマーを使用した。
【００５４】
３）RT-LAMP 法
RT-LAMP 法での最終反応溶液 25 μL 中の各試薬濃度が下記になるように調整した。
【００５５】
・20 mM Tris-HCl (pH 8.8)
・10 mM KCl
・10mM (NH４)２SO４
・8mM MgSO４  
・0.1% Tween 20
・0.8M betaine (Sigma-Aldrich)
・1.4 mM dNTPs
・5mM DTT
・8 ユニットの RNase Inhibitor (Promega)
・16ユニットの Bst DNA polymerase (New England Biolabs)
・1.25ユニットの AMV reverse transcriptase (Invitrogen)
・1.6 μM IPF （配列番号１０）及びIPR （配列番号１１）
・0.2 μM OPF （配列番号４）及びOPR （配列番号１２）
・0.8 μM LPF （配列番号１３）及びLPR （配列番号９）
（実施例２：核酸増幅法による反応）
１）RT-PCR法による反応
10０  〜10６  倍まで希釈した、実施例１に係る各核酸抽出試料１μL を用い、上記の RT-PCR キットを利用してCMV の検出を行った。反応終了後の液５μL について２％アガロースゲルで電気泳動行った。
【００５６】
２）RT-LAMP 法による反応
10０  〜10６  倍まで希釈した各核酸抽出試料１μL を用い、６３°Ｃで６０分のRT-LAMP 反応を行った。反応液の濁度をリアルタイム濁度測定装置 LA-200 （テラメックス）で測定した。
【００５７】
（実施例３：各増幅反応の検出限界の比較結果）
図１に示されるように、RT-PCR反応では CMV由来の約 250bpのバンドが10０  、10１  倍希釈まで明瞭に観察されたが、10２  倍希釈ではやや薄く、10３  倍希釈以上の希釈液からは検出されなかった。図１は、CMV ポジティブコントロールを10０  〜10６  倍希釈したサンプルおよびウイルスフリーサンプルを用いたRT-PCR産物の電気泳動像である。M は100bp ラダーである。RT-PCRの結果、CMV が検出されたサンプルでは約 250bpのDNA が増幅される（図の右側の矢印）。
【００５８】
一方、図２に示されるように、RT-LAMP 反応では、反応開始から約２０分後に10０  と10１  倍希釈サンプルで濁度が上昇し始め、その後、２３分後に10２  、２５分後に10３  、２９分後に10４  倍希釈のサンプルの濁度の上昇が認められた。図２は、CMV ポジティブコントロールを10０  〜10６  倍希釈したサンプルおよびウイルスフリーサンプルを用いたRT-LAMP 反応液の濁度の変化を示す。図２中、「■」のプロットは10０  倍希釈を、「□」のプロットは10１  倍希釈を、「◆」のプロットは10２  倍希釈を、「◇」のプロットは10３  倍希釈を、「▲」のプロットは10４  倍希釈を、「△」のプロットは10５  倍希釈を、「●」のプロットは10６  倍希釈を、「○」のプロットはウイルスフリーをそれぞれ示している。RT-LAMP 反応は、６３°Ｃ、１時間で行った。
【００５９】
以上の結果から、実施例に係るプライマーを用いた RT-LAMP法は RT-PCR 法よりも検出感度が約１００倍高いことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、CMV に特異的な塩基配列と選択的にハイブリダイズするヌクレオチドプライマーを作製し、RT-LAMP 法によりCMV を高感度に検出することができる。
〔配列表〕
ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＩＳＴＩＮＧ
<110> Aichi Prefecture
<120> キュウリモザイクウイルスの診断法
<130> POK-05-024
<160> 13
<210> 1
<211> 2238
<212> RNA
<213> Cucumber mosaic virus
<400> 1
gtaatctaca ctgtgtgtgt gcgtgtgtgt gtgtgtgtgt cgcgtcgtgt cgagtcgtgt   60
tgtccgcaca tttgagtcgt gctgtccgca cattttatct attagtgtgg tgtgttagat  120
ttgccgaggc atggctttcc aaggtaccag taggacttta actcaacagt cctcagcggc  180
tacgtccgac gaacttcaaa agatattatt tagccctgat gccattaaga aaatggctac  240
tgagtgtgac ctaggccggc atcactggat gcgcgccgat aacgctattt cagtccgacc  300
cctcgttccc gaagtaaccc atggaagtat tgcatccttc tttaagtctg gatatgatgc  360
tggtgaatta cgctctaaag gatatatgag cgtccctcaa gtgttgtgtg ctgttactcg  420
aacagtttcc accgatgctg aaggatcttt gagaatttac ctagctgatt taggtgataa  480
ggagttatct cctatagatg ggcaatgcgt ttcattacat aaccatgatc ttcccgcttt  540
ggtgtctttc caaccgacgt atgattgtcc tatggagacg attgggaatc gtaagcggtg  600
tttcgctgtt gttatcgaaa gacatggtta tattgggtat accggcacca cagctagcgt  660
gtgtagtaat tggcaagcac ggttttcttc taagaataac aactacactc atatcgcagc  720
tgggaagact ctagtactac ctttcaacag attagctgag caaacaaaac cgtcggctgt  780
cgctcgcctg ttgaagtcgc agcttaacaa tattgaatct tcgcagtacg tcctatcaaa  840
agcgaagatt aatcagaatg cgcgtagtga gtccgaggaa ttgaatgttg agagcccttc  900
cttcgcaatc gggagttctt ccgcgtcccg ctccgaagcc tttagaccgc aggtggttaa  960
cggtctttag cactttagtg ctttcgttgc gtattagtgt atatatctac ttatgagtct 1020
acatagtatg tatataccta tagtgtcctg tgtgagttga tacagttgac aactgtgacg 1080
cgatgccgtg ttgagaagag aacacatctg gttttagtaa gtccacatca taactttgag 1140
gttcaattcc tctcgttccc tgttgggctc cttacttttt catggatgct tctccacgag 1200
attgcgtttc gtctactgat tatctataga gtctgtgtgt gctgtgtttt ctcttttgtg 1260
tcgtagaatt gagtcgagtc atggacaaat ctgaatcaac cagtgctggt cgtaaccgtc 1320
gacgtcgtcc gcgtcgtggt tcccgctccg ccccctcctc cgcggatgct aactttagag 1380
tcttgtcgca gcaactttcg cgactaaaca agacgttagc agctggtcgt ccaaccatta 1440
accacccaac ctttgtgggg agtgaacgct gtaaacctgg gtacacgttc tcatctatta 1500
ccctgaagcc accgaaaata gaccgtgggt cttattatgg taaaaggttg ttattacctg 1560
attcagtcac ggagttcgat aagaaacttg tttcgcgcat tcaaattcga gttaatcctt 1620
tgccgaaatt tgattctacc gtgtgggtta cggtccgtaa agttcctgcc tcctcggacc 1680
tatccgtcgc cgccatctct gctatgtttg cggacggagc ctcaccggta ctggttaatc 1740
agtatgctgc atccggcgtc caagccaaca acaagttgtt gtatgatctt tcagcgatgc 1800
gagctgatat tggcgacatg agaaagtacg ccgtcctcgt gtattcaaaa gacgatgcgc 1860
tcgagacgga tgaactggta cttcatgtcg acattgagca ccaacgcatt cccacgtctg 1920
gagtgctccc agtgtgaatc cgtgttttcc cagaacctcc ctccgatttc tgtggcggga 1980
gctgagttgg cagttctgct ataaactgtc tgaagtcact aaacgtttta cggtgaacgg 2040
gttgtccatc cagcttacgg ctaaaatggt cagtcgtgga gaaatctacg ccagcagatt 2100
tacaaatctc tgagacgcct ttgaaaccat ctcctaggtt tcttcggaag gacttcggtc 2160
cgtgtacttc tagcacaaga tgctagtttc agggtacagg tgccccccca ctctcgtggg 2220
ggcctccaaa ggagacca                                               2238
<210> 2
<211〉21
<212〉DNA
<213〉Artificial Sequence
<400〉2
CGCGCATTCA AATTCGAGTT A                                             21
<210> 3
<211〉21
<212〉DNA
<213〉Artificial Sequence
<400> 3
TATTACCTGA TTCAGTCACG G                                             21
<210> 4
<211〉20
<212〉DNA
<213〉Artificial Sequence
<400> 4
GACCGTGGGT CTTATTATGG                                               20
<210> 5
<211〉21
<212〉DNA
<213〉Artificial Sequence
<400> 5
CCGTAAAGTT CCTGCCTCCT C                                             21
<210> 6
<211〉21
<212〉DNA
<213〉Artificial Sequence
<400> 6
CTCTGCTATG TTTGCGGACG G                                             21
<210> 7
<211〉21
<212〉DNA
<213〉Artificial Sequence
<400> 7
GCCTCACCGG TACTGGTTAA T                                             21
<210> 8
<211〉15
<212〉DNA
<213〉Artificial Sequence
<400> 8
GATAAGAAAC TTGTT                                                    15
<210> 9
<211〉18
<212〉DNA
<213〉Artificial Sequence
<400> 9
ACTTATCCGT TGCCGCCA                                                 18
<210> 10
<211〉42
<212〉DNA
<213〉Artificial Sequence
<400> 10
TAACTCGAAT TTGAATGCGC GTATTACCTG ATTCAGTCAC GG                      42
<210> 11
<211〉42
<212〉DNA
<213〉Artificial Sequence
<400> 11
CCGTAAAGTT CCTGCCTCCT CCCGTCCGCA AACATAGCAG AG                      42
<210> 12
<211〉21
<212〉DNA
<213〉Artificial Sequence
<400> 12
ATTAACCAGT ACCGGTGAGG C                                             21
<210> 13
<211〉15
<212〉DNA
<213〉Artificial Sequence
<400> 13
AACAAGTTTC TTATC                                                    13
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】RT-PCR法によるCMV の検出限界を示す図である。
【００６２】
【図２】RT-LAMP 法によるCMV の検出限界を示す図である。
【図１】
2007135526.tif 000003
【図２】
2007135526.tif 000004