(57)【要約】【課題】  粒径を調整したリポソームの製造方法を提供する。【解決手段】  内膜リン脂質を含む油性液体中に、微細毛細管により粒径を調整した水滴を導入し、Ｗ／Ｏエマルションを形成する工程と、Ｗ／Ｏエマルションを捕捉する工程と、油性液体と外膜脂質を介して油水界面を形成する水相に、捕捉されたエマルションを移行させ、Ｗ／Ｏエマルションの外側に外膜脂質を付加する工程とを有する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
内膜リン脂質を含む油性液体中に、微細毛細管により粒径を調整した水滴を導入し、Ｗ／Ｏエマルションを形成する工程と、
前記Ｗ／Ｏエマルションを捕捉する工程と、
前記油性液体と外膜脂質を介して油水界面を形成する水相に、前記捕捉されたエマルションを移行させ、前記Ｗ／Ｏエマルションの外側に前記外膜脂質を付加する工程とを有するリポソームの製造方法。
【請求項２】
水相中のリポソームを捕捉する工程と、
前記水相と外膜脂質を介して油水界面を形成する油性液体に、前記捕捉されたエマルションを移行させ、前記リポソームから前記外膜脂質が除去されたＷ／Ｏエマルションを前記油性液体中に形成する工程と、
複数の前記捕捉されたＷ／Ｏエマルションを融合し、又は前記捕捉されたＷ／Ｏエマルションの内包水滴に他の物質を導入するか若しくは該内包水滴の一部を回収する工程と、
前記融合したＷ／Ｏエマルション、又は前記他の物質が導入されたか若しくは前記内包水滴の一部が回収されたＷ／Ｏエマルションを、前記油水界面を介して前記水相に移行させ、前記Ｗ／Ｏエマルションの外側に前記外膜脂質を付加する工程とを有するリポソームの製造方法。
【請求項３】
前記リポソームの内膜リン脂質と外膜リン脂質とが同一である請求項１又は２記載のリポソームの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソームの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、リン脂質等の脂質二分子膜によって形成され、その内部に水相を閉じ込めたカプセル構造を有する。リポソームの構造は、生体膜と類似しているため、種々の研究材料や、有効成分を内包した応用（化粧料や薬物輸送システム（ＤＤＳ））が検討されている（例えば、特許文献１、２参照）。
ここで、リポソームは、リン脂質を水溶液中で懸濁させて多重層リポソーム（いわゆるリポソーム原液）を形成させた後、超音波処理を行って製造するのが通常である。
【０００３】
一方、リポソームの内膜をＷ／Ｏエマルションにより作成し、このエマルションの外膜に脂質を付加するリポソームの製造方法が提案されている（例えば、非特許文献１参照）。この方法は次のようにして行われる。
まず、油中に少量の水と脂質（リポソームの内膜となるもの）を混合し、Ｗ／Ｏエマルションを作成する。次に、水相に、外膜脂質（リポソームの外膜となるもの）を溶解した油性液体を加え、油水の分離界面に外膜脂質が並んだ分子膜を形成させる。そして、Ｗ／Ｏエマルションを前記分離界面における油相側に加え、遠心分離又は攪拌し、Ｗ／Ｏエマルションを前記分離界面における水相側に移行させて、Ｗ／Ｏエマルションの外側に外膜脂質を付加し、リポソームを製造する。
【０００４】
ところで、細胞内での生体物質の機能の研究等を行う際、細胞とほぼ同じ空間スケールや構造を持つマイクロラボ(μｍサイズの反応場)の構築が望まれる。このようなマイクロラボとしては、構造が生体膜と類似するリポソームを用いることができるが、さらに例えば、アクリル樹脂やガラスでマイクロラボを作製したものがある。又、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)等の界面活性剤でμｍサイズのＷ／Ｏエマルションを作製し、このエマルション中に反応基質を封入して反応場とする技術がある。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−２８２４号公報
【特許文献２】特開２００５−１６２７１２号公報
【非特許文献１】Langmuir 19 (2003) 2870-2879
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来のリポソームの製造方法の場合、リポソームのサイズを制御することが困難であり、得られたリポソームの粒径が不均一になったり、所望の粒径のリポソームが得られないという問題があった。又、従来の技術の場合、懸濁により一度に多数のリポソームを作製するため、Ｗ／Ｏエマルションが水相へ移行する状態を観察することができないことから、個々のＷ／Ｏエマルションとリポソームとを対応させて実験を行うマイクロラボに適用することは困難である。
【０００７】
さらに、上記非特許文献１記載の技術の場合、粒径５μｍ以上のリポソームを製造することが困難である。これは、リポソームが非常に不安定な構造であり、５μm以上に大きくなると、遠心分離等により油水界面でリポソームが壊れてしまうためと考えられる。
【０００８】
又、従来、複数、リポソームを融合させたり、リポソームの内包水滴に試薬を導入することは困難であった。リポソームの融合が可能になれば、内包水滴同士を混合させたり、内包水滴に試薬を導入してリポソーム内の反応開始を制御し、マイクロラボとしての活用が期待できる。
【０００９】
従って、本発明の目的は、粒径を調整したリポソームの製造方法を提供することにある。又、本発明の目的は、複数のリポソームを融合し、又はリポソームの内包水滴に他の物質を導入するか若しくは該内包水滴の一部を回収することが可能なリポソームの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち本発明のリポソームの製造方法は、内膜リン脂質を含む油性液体中に、微細毛細管により粒径を調整した水滴を導入し、Ｗ／Ｏエマルションを形成する工程と、前記Ｗ／Ｏエマルションを捕捉する工程と、前記油性液体と外膜脂質を介して油水界面を形成する水相に、前記捕捉されたエマルションを移行させ、前記Ｗ／Ｏエマルションの外側に前記外膜脂質を付加する工程とを有する。
【００１１】
本発明のリポソームの製造方法は、水相中のリポソームを捕捉する工程と、前記水相と外膜脂質を介して油水界面を形成する油性液体に、前記捕捉されたエマルションを移行させ、前記リポソームから前記外膜脂質が除去されたＷ／Ｏエマルションを前記油性液体中に形成する工程と、複数の前記捕捉されたＷ／Ｏエマルションを融合し、又は前記捕捉されたＷ／Ｏエマルションの内包水滴に他の物質を導入するか若しくは該内包水滴の一部を回収する工程と、前記融合したＷ／Ｏエマルション、又は前記他の物質が導入されたか若しくは前記内包水滴の一部が回収されたＷ／Ｏエマルションを、前記油水界面を介して前記水相に移行させ、前記Ｗ／Ｏエマルションの外側に前記外膜脂質を付加する工程とを有する。
【００１２】
前記リポソームの内膜リン脂質と外膜リン脂質とが同一であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、粒径を調整したリポソームを製造することができる。又、本発明によれば、複数のリポソームを融合し、又はリポソームの内包水滴に他の物質を導入するか若しくは該内包水滴の一部を回収することが可能なリポソームを製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について図１〜図４を参照して説明する。
図１は、本発明の製造方法の実施形態に用いる装置の構成例を示す。この図において、図示しないマイクロインジェクタ、マイクロマニピュレータ、及び光ピンセット用装置が設けられている。
【００１５】
マイクロインジェクタは微細毛細管が取付けられ、窒素ガス等によって微細毛細管の内圧を調整し、管内に溶液を吸い込んだり、吐き出したりすることができる装置である。例えば、Narishige社製のマイクロインジェクタIM-300が市販されている。
又、マイクロマニピュレータは、上記した微細毛細管を３次元的に精度良く移動（操作）ことができる装置であり、マイクロマニピュレータに取り付けられた微細毛細管は、マイクロインジェクタへと接続されている。マイクロマニピュレータは多数市販されている。
光ピンセットとは、レーザー光を集光照射して生じる光放射圧を利用して水中の微細物を捕捉するものである。この光ピンセットは、レーザー光を水等の媒質を通して微細物に照射した場合に、媒質と微細物の屈折率の違いからレーザー光が屈折し、それに伴う光運動量変化に対する反作用によって微細物を焦点にトラップするものである。そして、微細物を捕捉した状態で、微細物を含む試料ステージ側を相対移動させることにより、微細物を移動・搬送することができる。このような光ピンセットを用いて微細物を操作・採取する技術としては、例えば、特開２００１−７１３００号公報、特開２００１−２１１８７５号公報に記載の技術がある。
本発明においてはこれらの装置を適宜用いることができる。
【００１６】
図１において、上記したマイクロインジェクタ及びマイクロマニピュレータが微細毛細管（マイクロキャピラリー）５０に取付けられている。微細毛細管５０は図示しない試料ステージ上の疎水性カバーガラス２００内に載置されている。試料ステージの下方には微細毛細管５０の動きを観察しながら操作するための対物レンズ（顕微鏡レンズ）１００が上方に向けて設置されいる。
疎水性カバーガラス２００の上には中央部が開口する矩形状の枠体２１０が載置され、枠体２１０の開口部と疎水性カバーガラス２００の上面とによって形成される空間に、油性液体１０及び水相３０を収容することができる。ここで、枠体２１０の開口は矩形状をなすが、各長辺（図１の左右方向）の中点付近から開口中心に向かって先細りの突起が延び、各突起は開口中心近傍で僅かに離間している。そして、各突起で分割された図１の左側空間に油性液体１０が収容され、図１の右側空間に水相３０が収容され、各突起の間の離間部に油水界面が形成されている。枠体２１０は、例えばシリコーンゴムで形成することができ、その厚みは例えば２ｍｍとすることができる。
油性液体１０及び水相３０に分散しているＷ／Ｏエマルション及びリポソームは、微細毛細管５０により捕捉することができる。  
【００１７】
図２は、枠体２１０の拡大図である。図２において、枠体２１０の開口の長辺の中点から開口中心に向かって各突起２１２が延び、各突起２１２で分割された開口のうち、左側空間は略Ｄ字形をなし、右側空間は左側空間を短辺周り（図２の上下方向の辺）に対称とした形状をなしている。この実施形態では、枠体２１０の長辺及び短辺は１．５ｃｍ、開口の長辺及び短辺は１．０ｃｍ、各突起２１２の間隔は１．２ｍｍである。各突起２１２の間隔が小さいので、この間に油水界面となる脂質膜の層を確実に形成することができる。
【００１８】
<本発明の第１の発明に係るリポソームの製造方法>
次に、本発明の第１の発明の実施形態に係るリポソームの製造方法について説明する。この実施形態に係る製造方法は、Ｗ／Ｏエマルションを形成する工程と、該エマルションを捕捉する工程と、前記Ｗ／Ｏエマルションの外側に前記外膜脂質を付加する工程とを有する。
【００１９】
（Ｗ／Ｏエマルションの形成）
図１において、油性液体１０中に微細毛細管５０を挿入し、マイクロインジェクタによって毛細管５０内部に圧力を掛け、毛細管５０内の水を押出すことによって水滴を生成する。
油性液体１０には内膜リン脂質が含まれており、内膜リン脂質は疎水基と親水基を有するため、油性液体中で内膜リン脂質が水滴の周囲に自発的に並び、図３に示すようにＷ／Ｏエマルション２が得られる。
内膜リン脂質としては特に制限されないが、例えばホスファチジルコリン（以下、「ＰＣ」と表示する）又はその誘導体、ホスファチジルセリン（以下、「ＰＳ」と表示する）又はその誘導体、ホスファチジルエタノールアミン（以下、「ＰＥ」と表示する）又はその誘導体、SM（スフィンゴミエリンなど）及びその誘導体等を用いることができる。上記誘導体としては、ジオレイル（ＤＯ）が挙げられる。
【００２０】
油性液体は、内膜リン脂質を安定に分散させるものであれば特に制限されないが、例えば、鉱物油（ミネラルオイル）を用いることができる。水性液体は特に制限されず、又、最終的に得られるリポソームに内包する有効成分等を水性液体に含有させてもよい。
（リポソームは二分子膜です。また、本手法（マイクロインジェクタを用いる手法）では、粒径は内包する水性液体によらず制御できます。ただ、リポソームの内外の浸透圧が異なると、純粋な二分子膜のリポソームでは、変形、あるいは壊れてしまう恐れはあります。）
又、油性液体中の内膜リン脂質の濃度は、例えば１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０μｍｏｌ／Ｌ程度とすることができる。ここで、後述するように、内膜リン脂質と外膜リン脂質とを同一とする場合、油性液体中の内膜リン脂質及び外膜リン脂質の合計濃度を上記範囲とすればよい。
【００２１】
本発明においては、水滴の粒径を微細毛細管により調整することにより、最終的に得られるリポソームの粒径を調整することができる。水滴の粒径は、キャピラリの内径、押圧力、押圧時間等を適宜変化させることによって調整することができる。
水滴の粒径は、例えば光学顕微鏡により測定することができる。上記したマイクロキャピラリにより得られる水滴の粒径は、例えば数μｍ〜数百μｍ程度である。
【００２２】
（Ｗ／Ｏエマルションの捕捉）
Ｗ／Ｏエマルションの捕捉は、上記したＷ／Ｏエマルションを微細毛細管に吸着させて行う。上記した方法で水滴の粒径を調整してＷ／Ｏエマルションを一旦形成すれば、それによってリポソームの粒径も決まるので、微細毛細管による捕捉過程でＷ／Ｏエマルションの粒径が変化することはない。
【００２３】
（外膜脂質の付加）
次に、マイクロマニピュレータを操作して、捕捉したＷ／Ｏエマルション２を油性液体１０から水相３０に移行させることにより、Ｗ／Ｏエマルション２の外側に外膜脂質４を付加してリポソーム６を製造する。
ここで、図３に示すように、油性液体１０と水相３０との油水界面には外膜脂質４が単層に並んでおり、Ｗ／Ｏエマルション２がこの外膜脂質４層を通過して水相へ移行する際に、Ｗ／Ｏエマルション２の外側に外膜脂質４が付加される。
外膜脂質４を油水界面に整列させる方法としては、例えば、上記油性液体中に脂質を溶かしておき、この油性液体を水と接しさせればよく、これにより、油性液体中の脂質の一部が油水界面に自発的に単層で並ぶ。なお、この場合、Ｗ／Ｏエマルションを構成する内膜脂質と外膜脂質として同一のものを用いる。
【００２４】
以上のように、本発明の第１の発明の実施形態に係るリポソームの製造方法によれば、リポソームの粒径（内包水滴の粒径）を所望の値に調整することができるので、例えばリポソーム内をマイクロラボの反応系に用いる際の試料や反応試薬等が極微量で済むという利点がある。又、個々の水滴を作成してからリポソームが形成されるまでの過程を対応付けることができるので、マイクロラボとして適している。
例えば、医薬、生物系の研究、生化学反応等の検査に本発明を適用することができる。
【００２５】
<本発明の第２の発明に係るリポソームの製造方法>
次に、本発明の第２の発明の実施形態に係るリポソームの製造方法について説明する。この実施形態に係る製造方法は、水相中のリポソームを捕捉する工程と、捕捉されたリポソームを油性液体に移行させる工程と、得られたＷ／Ｏエマルションを融合し、又はＷ／Ｏエマルションの内包水滴に他の物質を導入するか若しくは該内包水滴の一部を回収する工程と、これらのＷ／Ｏエマルションを水相に移行させる工程とを有する。
第２の発明の実施形態に用いる装置としては、第１の発明の場合と同様、上記図１、図２に示したものを用いることができる。
【００２６】
（水相中のリポソームの捕捉）
第２の発明は、予め所定のリポソームを用いることを前提とし、このリポソームの外側脂質を除去したＷ／Ｏエマルションの状態で種々の操作を行った後、再びリポソームに戻すことを特徴としている。
図４に示すように、まず、所定のリポソーム６を水相３０に分散させ、微細毛細管にリポソーム６を吸着させて捕捉する。
【００２７】
（リポソームの油性液体への移行）
次に、マイクロマニピュレータを操作して、捕捉したリポソーム６を水相３０から油性液体１０に移行させると、リポソーム６の外膜脂質４が油水界面で除去され、Ｗ／Ｏエマルション２が得られる。
【００２８】
（Ｗ／Ｏエマルションの操作）
次に、油性液体１０で得られたＷ／Ｏエマルション２に種々の操作を行う。Ｗ／Ｏエマルション２の操作としては、複数のＷ／Ｏエマルションの融合、Ｗ／Ｏエマルションの内包水滴に他の物質の導入、及び内包水滴の一部を回収（水滴の採取、分析等）することが挙げられる。
通常、リポソームは外膜脂質があるために複数のリポソームの融合や、リポソームの内包水滴に他の物質を導入することが難しいが、外膜脂質を除去して油性液体中にＷ／Ｏエマルションとして存在させることにより、これらの操作が容易となる。なお、油相中の融合は、上記したようにマイクロインジェクタ、マイクロマニピュレータを取付けた微細毛細管によって行う他、光ピンセット、電場などによって水滴同士を接触させて誘起することもできる。
【００２９】
Ｗ／Ｏエマルション内に導入する他の物質としては、例えばＷ／Ｏエマルションに含まれている反応基質と反応する反応剤が挙げられる。例えば反応基質がタンパク質の場合、それと特異的に反応する酵素が反応剤となる。他の物質を導入する方法としては、マイクロマニピュレータによってＷ／Ｏエマルション内にマイクロピペットを挿入し、ピペット内の物質を導入する方法が挙げられる。
反応基質としては、生体物質である各種タンパク質やＤＮＡ等を合成するための生体物質を好適に用いることができる。生体物質は周囲の環境に非常に左右されやすく、従来のマイクロメートルサイズの微小空間では、生体物質の反応を制御することは困難である。本発明の実施形態によれば、細胞膜の主成分と同様なリン脂質で生体物質を囲むことができ、内部が細胞内環境に類似した微小反応空間を作製して、生体物質が失活せずに反応を制御することができる。
【００３０】
又、反応基質が封入されたＷ／Ｏエマルションに反応剤を導入する代わりに、反応基質が封入された第１のＷ／Ｏエマルションと、反応剤が封入された第２のＷ／Ｏエマルションとを融合させれば、融合を開始時間として反応を進行させることができる。
又、反応基質が封入されたＷ／Ｏエマルションに、反応基質と反応する波長光又は電磁波を照射して反応を開始させることもできる。
いずれの場合も、反応開始後、以下のように外膜脂質を付加させることにより、リポソーム類似環境下で反応を進行させることができる。
【００３１】
（外膜脂質の付加）
次に、図３に示す第１の発明の場合と同様にして、上記Ｗ／Ｏエマルションを捕捉して水相に移行させることにより、Ｗ／Ｏエマルション２の外側に外膜脂質４を付加し、リポソーム６を得ることができる。
このように、第２の発明の場合、リポソームの内包水滴の融合や物質導入が容易に行えるので、例えばリポソームの内包水滴の反応を精度よく制御することができ、反応開始をリアルタイムで制御でき、マイクロラボとして適している。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の製造方法の実施形態に用いる装置の構成例を示す斜視図である。
【図２】枠体２１０の上面拡大図である。
【図３】本発明の第１の発明の実施形態を示す図である。
【図４】本発明の第２の発明の実施形態を示す図である。
【符号の説明】
【００３３】
４      外膜脂質
１０    油性液体
３０    水相
５０    微細毛細管
１００  対物レンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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