(57)【要約】【課題】SLAMと呼ばれるグリコシル化された70kDaのタンパク質をコードする遺伝子を提供すること。【解決手段】実質的に純粋なSLAMタンパク質または組換えSLAMタンパク質、あるいはそのペプチドフラグメント。および、以下：ａ）鳥類およびヒトまたはマウスを含む哺乳動物からなる群より選択される、温血動物由来のタンパク質またはペプチド；ｂ）配列番号２、４、６、８、10、または12の少なくとも１つのポリペプチドセグメントを含む、タンパク質またはペプチド；ｃ）天然のSLAMとは異なる翻訳後修飾パターンを示す、タンパク質またはペプチド；ｄ）別のシグナルとともにＴ細胞を同時刺激し得る、タンパク質またはペプチドからなる群より選択されるタンパク質またはペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に純粋なSLAMタンパク質または組換えSLAMタンパク質、あるいはそのペプチドフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
休止Ｔ細胞の活性化は、大部分の免疫応答に重要であり、そしてこれらの細胞に調節能またはエフェクター能を発揮させる。非特許文献１を参照のこと。Ｔ細胞と抗原提示細胞（APC）との間の接着の増加、または他の形態の１次刺激（例えば、固定化されたモノクローナル抗体（mAb））は、Ｔ細胞レセプターシグナルを増強し得る。Ｔ細胞活性化およびＴ細胞の拡大は、Ｔ細胞レセプター（TCR）の連動および補助細胞によって提供される同時刺激シグナルに依存する。例えば、非特許文献２;非特許文献３;非特許文献４;および非特許文献５を参照のこと。主要な、そしてよく研究された、Ｔ細胞の同時刺激相互作用には、Ｔ細胞上のCD28またはCTLA-4のいずれかと、B7またはB70のいずれかとの相互作用が含まれる（非特許文献５）。CD8欠損マウス（非特許文献６;非特許文献７）およびCTLA-4免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウス（非特許文献８）における最近の研究は、これらのマウスが、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルスに対して正常な一次免疫応答および正常なCTL応答を有するが、いくらかのＴ細胞応答を欠失していることを明らかにした。結果として、これらの研究は両方とも、他の同時刺激分子がＴ細胞機能を支持しているはずであると結論づけている。しかし、異なる同時刺激シグナルを媒介するこれらの分子の同定は困難であった。
【非特許文献１】Paul（編）「Fundamental  Immunology」、第３版（1993年）、Raven  Press,  N.Y.
【非特許文献２】JenkinsおよびJohnson、Curr.  Opin.  Immunol.  (1993年)  5:ｐ．361-367
【非特許文献３】BiererおよびHahn、Semin.  Immunol.  (1993年)  5:ｐ．249-261
【非特許文献４】Juneら、Immunol.  Today  (1990年)  11:ｐ．211-216
【非特許文献５】Jenkins、Immunity  (1994年)  1:ｐ．443-446
【非特許文献６】Shahinianら、Science  (1993年)  261:ｐ．609-612
【非特許文献７】Greenら、Immunity  (1994年)  1:ｐ．501-508
【非特許文献８】Roncheseら、J.  Exp.  Med.  (1994年）  179:ｐ．809-817
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
活性化シグナルを調節し得ないことは、不適切な発生の制御または免疫系における生理学的応答を妨げる。本発明は、過剰な免疫応答の調節において有用である少なくとも１つの代替的な同時刺激分子、アンタゴニスト、およびアゴニストを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明により、以下が提供される。
（項目１）  実質的に純粋なSLAMタンパク質または組換えSLAMタンパク質、あるいはそのペプチドフラグメント。
（項目２）  以下からなる群より選択される、項目１に記載のタンパク質またはペプチド：
ａ）鳥類およびヒトまたはマウスを含む哺乳動物からなる群より選択される、温血動物由来のタンパク質またはペプチド；
ｂ）配列番号２、４、６、８、10、または12の少なくとも１つのポリペプチドセグメントを含む、タンパク質またはペプチド；
ｃ）天然のSLAMとは異なる翻訳後修飾パターンを示す、タンパク質またはペプチド；
ｄ）別のシグナルとともにＴ細胞を同時刺激し得る、タンパク質またはペプチド。
（項目３）  SLAMの細胞外部分または細胞内部分由来の配列を含む、項目１に記載のタンパク質またはペプチド。
（項目４）  項目１に記載のペプチドを含む、融合タンパク質。
（項目５）  項目１に記載のタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
（項目６）  項目１に記載のタンパク質またはペプチドに特異的に結合する、抗体。
（項目７）  項目６の抗体であって、ここで：
ａ）前記SLAMがヒトまたはマウスを含む哺乳動物のタンパク質である；
ｂ）該抗体が、配列番号２、４、６、８、10、または12の精製されたペプチド配列に対して惹起される；
ｃ）該抗体がモノクローナル抗体である；または
ｄ）該抗体が標識されている、
抗体。
（項目８）  混合物中の他の物質からSLAMタンパク質またはペプチドを精製する方法であって、該混合物を項目６に記載の抗体に接触させる工程、および結合したSLAMを他の物質から分離する工程を包含する、方法。
（項目９）  項目１に記載のタンパク質またはペプチドをコードし得る、単離された核酸または組換え核酸。
（項目１０）  項目９に記載の核酸であって、ここで該核酸は：
ａ）配列番号２、４、６、８、10、または12の配列をコードする；
ｂ）配列番号１、３、５、７、９、または11の配列を含む；あるいは
ｃ）天然のSLAMの細胞外ドメイン由来の配列をコードする；あるいは
ｄ）天然のSLAMの細胞内ドメイン由来の配列をコードする、
核酸。
（項目１１）  項目９に記載の核酸を含有する発現ベクターまたは複製ベクター。
（項目１２）  以下からなる、キット：
ａ）項目１に記載の実質的に純粋なSLAMまたはフラグメント；
ｂ）SLAMに特異的に結合する抗体またはレセプター；または
ｃ）SLAMまたはペプチドをコードする核酸。
（項目１３）  サンプル中の、核酸、タンパク質、または抗体の存在を検出するための方法であって、該サンプルを、項目１２に記載のキットを用いて試験する工程を包含する、方法。
（項目１４）  細胞の生理機能を調節する方法であって、該細胞を、以下のものと接触させる工程を包含する、方法：
ａ）項目１に記載の実質的に純粋なSLAMまたはフラグメント；
ｂ）SLAMに特異的に結合する抗体または結合パートナー；あるいは
ｃ）SLAMまたはペプチドをコードする核酸。
（項目１５）  前記細胞がＴ細胞であり、かつ前記生理機能の調節が該Ｔ細胞の活性化である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）  前記細胞が組織および/または生物内にある、項目１４に記載の方法。
（項目１７）  項目９に記載の核酸を発現させる工程を包含する、SLAMを発現させる方法。
（項目１８）  項目９に記載の核酸を含有する、細胞、組織、器官、または生物。
（項目１９）  少なくとも約30ヌクレオチドの長さにわたって、配列番号１、３、５、７、９、または11のSLAM核酸配列に少なくとも約70％同一性を有する配列を含む、組換え核酸。
（項目２０）  少なくとも約20アミノ酸の長さにわたって、配列番号２、４、６、８、10、または12のSLAM配列に少なくとも約60％同一性を有するポリペプチドをさらにコードする、項目１９に記載の核酸。
（項目２１）  免疫細胞を調節するための薬学的組成物を製造するための方法であって、SLAMタンパク質を薬学的に受容可能なキャリアと混合する工程を包含する、方法。
（項目２２）  SLAMタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、免疫細胞を調節するための薬学的組成物。
（項目２３）  免疫細胞を調節するためのSLAMタンパク質の使用。
（項目２４）  免疫細胞を調節するための薬物を製造するための、SLAMタンパク質の使用。
【０００４】
本発明は、部分的に、Ｔ細胞活性化の同時刺激物質として作用する抗原の発見に基づく。詳細には、本発明は、SLAMと呼ばれるグリコシル化された70kDaのタンパク質をコードする遺伝子を提供する。これは、CD4+、CD8+、胸腺、および末梢血のCD45ROhigh記憶Ｔ細胞において発現され、そして活性化に続いてナイーブＴ細胞において迅速に誘導される。SLAMの連動は、CD4+Ｔ細胞クローンの増殖を直接的に刺激し、そしてCD4+Ｔ細胞による抗原特異的増殖およびサイトカイン産生を増強する。特にIFN-γの産生は、Ｔヘルパー２型（Th2）CD4+Ｔ細胞クローンにおいてでさえ、強くアップレギュレートされる。一方、IL-4またはIL-5の産生の誘導はTh1クローンにおいて観察されなかった。これらのデータは、SLAMが新規のＴ細胞同時刺激分子であり、これは連動する場合、Ｔ細胞拡大を増強し、そしてTh0/Th1サイトカイン産生プロフィールを誘導することを示唆する。哺乳動物遺伝子、タンパク質、抗体、およびそれらの使用を可能にする、ヒトおよびマウスの両者の実施態様を記載する。非哺乳動物種由来の、顕著な配列相同性を示す機能的等価物が利用可能である。さらに、SLAMは、同種親和性の相互作用において、抗原を発現する他の細胞を刺激するための結合パートナーとして機能し得る。
【０００５】
より詳細には、本発明は、実質的に純粋なSLAMタンパク質、または組換えSLAMタンパク質、あるいはそのペプチドフラグメントを提供する。種々の実施態様には、鳥類および哺乳動物（ヒトまたはマウスを含む）からなる群から選択される温血動物由来のタンパク質またはペプチドから選択されるタンパク質またはペプチドが含まれる；配列番号２、４、６、８、10、または12のうちの少なくとも１つのポリペプチドセグメントを含むタンパク質またはペプチド；天然のSLAMとは異なる翻訳後修飾パターンを示すタンパク質またはペプチド；あるいは、他のシグナルとともにＴ細胞を同時刺激し得るタンパク質またはペプチド。このタンパク質またはペプチドは、SLAMの細胞外部分または細胞内部分由来の配列を含み得る；または融合タンパク質であり得る。別の実施態様は、SLAMタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含有する組成物である。
【０００６】
本発明はまた、SLAMタンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗体を包含する；例えば、ここで、SLAMはヒトまたはマウスを含む哺乳動物のタンパク質である；この抗体は、配列番号２、４、６、８、10、または12の精製されたSLAMペプチド配列に対して惹起される；この抗体はモノクローナル抗体である；あるいは、この抗体は標識される。この抗体はまた、混合物中の他の物質からSLAMタンパク質またはペプチドを精製する方法を利用可能にする。この方法は、この混合物を抗SLAM抗体に接触させ、そして結合したSLAMを他の物質から分離することを含む。
【０００７】
本発明の別の局面は、SLAMタンパク質またはペプチドをコードし得る単離された核酸または組換え核酸である。これは、配列番号２、４、６、８、10、または12の配列をコードする核酸を含む；これは、配列番号１、３、５、７、９、または11の配列を含む；これは、天然のSLAMの細胞外ドメイン由来の配列をコードする；あるいはこれは、天然のSLAMの細胞内ドメイン由来の配列をコードする。このような核酸の実施態様はまた、ベクターの発現または複製を含む。
【０００８】
本発明はまた、実質的に純粋なSLAMまたはフラグメント；SLAMに特異的に結合する抗体またはレセプター；あるいはSLAMまたはペプチドをコードする核酸、またはその相補物を含有するキットを提供する。このキットはまた、サンプル中の核酸、タンパク質、または抗体の存在を検出するための方法を提供する。この方法は、サンプルをこのようなキットで試験することを含む。
【０００９】
本発明はまた、細胞の生理機能を調節する方法を提供する。この方法は、細胞を、実質的に純粋なSLAMまたはフラグメント；SLAMに特異的に結合する抗体または結合パートナー；あるいは、SLAMペプチドをコードする核酸と接触させることを含む。一定の好ましい実施態様は、細胞がＴ細胞であり、かつ生理機能の調節がＴ細胞の活性化であるか；あるいは、細胞が組織内および/または生物内にある方法を含む。
【００１０】
SLAMポリペプチドをコードする核酸を発現することにより、SLAMペプチドを発現する方法もまた提供される。本発明はまた、SLAMペプチドをコードする核酸を含有する細胞、組織、器官、または生物を提供する。
【００１１】
本発明はまた、少なくとも約30ヌクレオチドの長さにわたって、配列番号１、３、５、７、９、または11のSLAM核酸配列に少なくとも約70％同一性を有する配列を含む組換え核酸を提供する。これは、例えば、関連した遺伝子のプローブまたはPCRプライマーとして有用である。別の実施態様は、少なくとも約20ヌクレオチドの長さにわたって、配列番号２、４、６、８、10、または12のSLAM配列に少なくとも約60％同一性を有するポリペプチドをコードする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
（I.  概略）
本発明は、Ｔ細胞活性化の初期段階において見出される抗原（例えば、Ｔ細胞を活性化し得る）である種々の哺乳動物タンパク質をコードするアミノ酸配列およびDNA配列を提供する。これらのタンパク質の中には、他の生理学的効果の間で、Ｔ細胞の増殖を誘導する抗原がある。全長の抗原およびフラグメントは両方とも、この抗原を発現する細胞の生理学的な調節に有用である。このタンパク質はまた、タンパク質上の種々のエピトープ（線状および立体配座エピトープの両方）に対する抗体を惹起することにおいて抗原（例えば、免疫原）として有用である。
【００１３】
モノクローナル抗体（mAb）を、Ｔ細胞活性化の初期相において発現される分子に対して惹起した。A12と呼ばれる１つの抗体は、Ｔ細胞クローンに対して独特のアゴニスト効果を有し、そしてSLAMと呼ばれる以前には未同定であった初期活性化分子を認識した。A12は、Th0、Th1、およびTh2様サブセットに属するCD4+Ｔ細胞クローンの増殖を、直接的に誘導した。任意の他の刺激物質の非存在下で、A12またはそのF(Ab’)2は、Ｔ細胞クローンであるB21、ChT38、HY06、およびTA23の増殖を誘導した。一方、以前の研究（Juneら、(1990)Immunol.  Today  11:211-216）と一致して、CD28の連動は、効果的でなかった。これらのデータは、SLAMがCD28とは独立に作用し、そしてそれは、Ｔ細胞活性化において新規なかつ重要な役割を果たすことを示す。
【００１４】
SLAMをコードするcDNAを、選択のためにA12を用いる発現クローニングにより、Ｔ細胞cDNAライブラリーから単離した。SLAM  cDNAは、1860bpの長さであり、そして27アミノ酸のＮ末端疎水性リーダー配列、８つの潜在的なグリコシル化部位を含有する202アミノ酸の細胞外領域、22アミノ酸の疎水性膜貫通（spanning）部分、および77アミノ酸の細胞質ドメインを有するI型膜貫通タンパク質をコードする、１つの大きなオープンリーディングフレームを含む。配列番号１を参照のこと。SLAMの細胞質ドメインの４つの潜在的なtyrリン酸化部位のうちの３つは、SH2ドメインの１つのクラスへの結合について決定されたコンセンサス配列、ホスホチロシン-疎水性-Ｘ-疎水性に適合する。Zhouら、(1993)Cell  72:767-778を参照のこと。組換えSLAMに対して惹起された抗血清は、活性化されたCD4+Ｔ細胞クローン由来の70kDの糖タンパク質を沈降させる。SLAM免疫沈降のＮグリカナーゼ処理は、40kDaのタンパク質コアを明らかにした。これは、推定された分子サイズに相当する。SLAMは、免疫グロブリン（Ig）スーパー遺伝子ファミリーのメンバーの特徴（１つの可変ドメインおよび１つの不変ドメイン）を示し、そしてCD48（26％相同性；StauntonおよびThorley-Lawson(1987)EMBO  J.  6:3695-3701を参照のこと）、LFA-3/CD58（17％相同性；Seed(1987)Nature  329:840-842を参照のこと）、およびマウスNKおよび2B4と呼ばれる細胞傷害性Ｔ細胞において発現される、最近クローン化されたシグナリング分子（28％相同性；Mathewら、(1993)J.  Immunol.  151:5328-5337を参照のこと）とある程度の相同性を示す。
【００１５】
種々の組織および細胞型における転写産物を検出するためのPCRを用いると、SLAMがリンパ球で主に発現されることが明らかである。活性化された末梢血単核球（PBMC）は、クローン化されたSLAM  cDNAのサイズに相当する1.9kbの転写産物、およびさらに４kbの転写産物を含む。４kbのmRNAは少なくとも２つの異なる転写産物からなる。これは、22アミノ酸の全膜貫通領域を含む30アミノ酸を欠失する分泌型のSLAMをコードする転写産物、および膜貫通SLAMをコードする転写産物を含む。切断された細胞質ドメインを有するSLAMの形態をコードする、代替的にスプライスされた２kbのcDNAクローンもまた、同定された。
【００１６】
SLAM  mRNAは、活性化後、２時間以内に誘導される。これは、Ｔ細胞表面上への迅速なSLAMの出現に関連する。SLAMはCD45RA+ナイーブＴ細胞上で発現されないが、インビトロ活性化の非存在下で、CD45ROhigh記憶Ｔ細胞上に低レベルで検出され得る。SLAM発現は、ナイーブCD45RA+Ｔ細胞上で迅速に誘導され（３時間以内）、そして活性化に続いてCD45ROhighＴ細胞上で増強され、そして最大発現は６〜８時間で起こる。未成熟なCD3low、CD4+、CD8+胎児胸腺細胞はSLAMを発現するが、より成熟したCD3high単純CD4+またはCD8+胸腺細胞は、ほとんど陰性である。SLAMは末梢Ｂ細胞上に非常に低レベルで発現され、そして活性化によりアップレギュレートされるが、単球においては存在しない。
【００１７】
Ｂ細胞およびCD45ROhigh記憶Ｔ細胞におけるSLAMの存在、ならびに可溶性形態のSLAMが天然に存在することは、この分子の広範な機能を示唆する。SLAMを介した同時刺激が、Th2クローンを含むＴ細胞クローンにおいて、Ag特異的増殖応答を増強し、そしてTh0/Th1サイトカイン産生プロフィールを誘導するという知見は、SLAMとそのリガンドとの間の相互作用が、Ｔ細胞拡大およびTh0またはTh1応答の発生に寄与することを示唆する。
【００１８】
Ｔ細胞クローンに対する直接的な刺激効果に加えて、SLAMは、Ｔ細胞活性化に対する同時刺激分子として作用する。破傷風毒素（TT）または精製されたタンパク質誘導体（PPD）を用いて免疫化したドナーの末梢血Ｔ細胞の最適な抗原特異的増殖応答は、A12  F(ab’)2の添加により、用量依存的な様式でさらに増強された。このことは、SLAMの特異的な連動が、増強されたＴ細胞応答を担うことを示す。一般的に、増殖において２〜３倍の増加が観察された。同様に、CD4+Ｔ細胞クローンの最適な抗原特異的増殖は、A12またはA12  F(ab’)2の存在下で、用量依存的な様式で増強された。この増強は、Th2、Th0、およびTh1サブセットに属するCD4+Ｔ細胞クローンで観察された。抗CD3  mAbによって誘導されるＴ細胞増殖がまたA12によっても増強されたように、Ｔ細胞においてSLAMにより媒介される同時刺激効果は、Ag特異的刺激に制限されなかった。最適な抗CD3濃度でさえ、増殖のさらなる２〜３倍の増加が、A12によるSLAMの連動において観察された。
【００１９】
それぞれの抗原によって刺激された異なるサブセットに属するCD4+Ｔ細胞クローンのパネルによるサイトカイン産生は、A12によるSLAMの連動に続いてアップレギュレートされた。詳細には、IFN-γ産生が、A12およびA12  F(Ab’)2によって強く増強された。
【００２０】
A12またはそのF(Ab’)2でのTh2クローンの同時刺激は、IFN-γ産生を強くアップレギュレートした（５〜17倍）が、一方、試験した４クローンによるIL-4産生に対しては、ほとんど（２倍未満）または全く増強効果がなかった。A12の存在下で誘導されるTh2クローンによるIFN-γ産生のレベルは、Th1およびTh0クローンにおいて抗体により誘導されるIFN-γの量に匹敵した。A12同時刺激はまた、Th0およびTh1クローンによるIFN-γ産生を優先的に増強した。Th2クローンにおける強いIFN-γ誘導効果と比較して、SLAMを介した同時刺激は、Th1クローンによるIL-4またはIL-5産生を誘導しなかった。
【００２１】
これらの結果は、SLAMを介するＴ細胞同時刺激が、Th2サブセットのアレルゲン特異的CD4+Ｔ細胞クローンにおいてでさえ、IFN-γ産生の優先的な誘導をもたらし、それによってこれらの細胞の表現型を、明らかなTh0サイトカイン産生プロフィールに転換することを示す。しかし、樹立されたTh1クローンを定義するサイトカイン産生パターンは、SLAMを介する同時刺激により変化されない。
【００２２】
５日間のPHAにより活性化された末梢血Ｔ細胞（PHA-芽球（blast））は、抗SLAM  mAbでの刺激に応答して直接的に増殖する。このことは、一旦Ｔ細胞がＴ細胞レセプターを介して活性化されると、SLAMの直接的な連結がＴ細胞拡大をもたらすことを示す。さらに、24時間の抗SLAM  F(ab’)2フラグメントによるこれらのPHA芽球の活性化は、高レベルのIFN-γ産生をもたらすが、一方、IL-4は検出不可能であった。このことは、SLAMの連結が、Th1サイトカイン産生プロフィールをもたらすことを示す。
【００２３】
抗SLAM  mAbは、PHAの存在下で、高度に精製されたCD4+末梢血Ｔ細胞の長期拡大を誘導し得る。Ｔ細胞は、PHA（１μg/ml）および抗SLAM  mAb（10μg/ml）での毎週の再刺激に応答して、16時間の推定倍加時間で９週間（これは、分析される最大期間である）増殖を続ける。これらの結果は、ヒトTh2クローンにおいて抗SLAM  F(ab’)2によるSLAMの連動が、高レベルのIFN-γ産生（従って、Th0、Th1様サイトカイン産生プロフィール）を誘導するという観察とともに、F(ab’)2抗SLAM  mAb、またはヒト化された抗SLAM  F(ab’)2フラグメントでの処理が、いくつかの疾患状態において潜在的な臨床的有用性を有し得ることを示す。
【００２４】
抗SLAM  F(ab’)2または同様の結合組成物は、例えば、ヘルペスウイルス感染（例えば、サイトメガロウイルス感染）において観察されるような、欠損した抗原特異的Ｔ細胞増殖によって特徴付けられる後天性Ｔ細胞免疫不全を処置するために有用である。ガン患者における化学療法および/または放射線療法に続く、または骨髄移植に先立つ免疫抑制治療の後のＴ細胞区画の回復の促進は、上記の治療法が利益をもたらす別の状態である。
【００２５】
SLAM抗体または結合組成物は、例えば、ワクチン接種のためのアジュバントとして、またはAIDS患者におけるHIV媒介性のＴ細胞の涸渇を代償するために用いられ得る。この治療法はまた、Th2応答を引き起こす疾患（例えば、食物および薬物アレルギー；鼻炎；アトピー性皮膚炎；喘息；高IgE症候群および過好酸球増加症；および伝染性疾患（例えば、らい腫（Lepromatous  Leprae）、Yamamuraら、(1991)Science  254:277-279参照のこと;リーシュマニア症;チャガス病（Chagas  disease）;住血吸虫症（Schistomiasis）;およびトリパノソーマ症（Trypanosmiasis）de  Vriesら、（編）(1995)Interleukin-10  R.G.  Landes  Company,  Austin,  Texas,70-91頁を参照のこと））をTh0の回復、またはIFN-γ産生によって特徴付けられるTh1応答（IL-4およびIL-5の高生産レベルによって特徴付けられる）に再指向し得る。
【００２６】
いくつかの研究により、Ｔ細胞サイトカイン産生パターンの変化では、AIDS病原の進行に関係することが示されている。感染初期のHIV-1感染個体から得られる末梢血単核細胞（PBMC）は、リコール抗原（recall  antigen）に応答するサイトカイン産生プロフィールに関して比較的正常である。この無症候性段階において、これらの活性化されたPBMCは、IL-2を優勢に産生し、そして非常に低レベルのIl-4およびIL-10のみを産生する。HIV拒絶（rejection）の後期に、このプロフィールは、IL-2産生レベルの減少、ならびにIL-4およびIL-10産生レベルの増大に変化する。Clericiら、(1993)J.Clin.Invest.  91:759-765、およびClericiら、(1994)J.  Clin.  Invest.  93:768-775を参照のこと。さらに、Th2細胞は、HIV感染に対してより感受性であるように思われる。SLAM抗体または結合組成物は、Th2応答（抗体産生を促進する）を、Th1応答（細胞媒介性応答を指示する）に向け直すために有用であり得る。この治療法はまた、免疫複合体によって引き起こされる疾患（例えば、糸球体腎炎（glomerunephritis）および若年性関節炎）において有益であり得る。
【００２７】
SLAMに対する天然のリガンドを同定するために、SLAM-免疫グロブリン融合タンパク質（SLAM-Ig）を作製した。SLAM-IgのSLAM部分は、SLAMで安定にトランスフェクトされたＬ細胞に特異的に結合した。さらに、SLAM-Igは、溶液中で同種親和的に相互作用し、このことは、SLAMが自己リガンドとして働き得ることを証明する。種々の細胞型へのSLAM-Ig結合はまた、それらのSLAM発現に相関した。Ｔ細胞に対する他の記載されたリガンドとは異なり、Ｌ細胞で発現されたSLAMは、任意の他の刺激物質の非存在下で、ヒトＴ細胞クローンに対して直接的な増殖シグナルを与えた。SLAMの同種親和性相互作用によって提供されるこの新規の刺激活性は、サイクロスポリンに対して抵抗性であった。
【００２８】
（ヒトSLAM配列）
ヒトSLAM1（pSURslam1）のヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸配列を、配列番号１および２に示す。予測されるリーダー配列および膜貫通配列は、アミノ酸１〜27、237〜258であるが、天然の境界は異なり得、これは細胞型にも依存している。ヒトSLAM3（pSECslam）には存在しない膜貫通ドメインをコードするエキソンは、ヌクレオチド761〜780を含む。システインが、53、57、102、125、150、155、189、および217番目のアミノ酸で見出される。システインおよび／またはＮ結合グリコシル化部位の間のフラグメントは、抗体を作製するにおいて特に有用である。
【００２９】
ヒトSLAM2（pSURslam2）のヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸配列を、配列番号３および４に示す。ヒトSLAM2は、ヌクレオチド924で始まる異なるＣ末端配列を生じる特異的スプライシング事象により、ヒトSLAM1とは明らかに異なる。
【００３０】
ヒトSLAM3（pSECslam）のヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸配列を、配列番号５および６に示す。SLAM1の膜貫通ドメイン配列が欠失されたスプライス接合点は、ヌクレオチド761である。SLAM3は、pSECslamでトランスフェクトされたCOS細胞により分泌され、このことは、SLAM3が可溶性形態のSLAMをコードすることを確認する。RT-PCRに対して、この可溶性形態のSLAMに特異的なプライマーを用いると、SLAM3転写産物が、異なる細胞型において見出された。このことは、その転写産物が真正のmRNAであることを確認する。配列番号５および６。
【００３１】
ヒトSLAM4（pCYTslam）のヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸配列を、配列番号７および８に示す。SLAM4の配列がSLAM1と異なる位置は、ヌクレオチド145以前である。この５’末端にこの代わりのエキソンが存在することにより、SLAM4がリーダー配列を欠損していることが予測される。このSLAM4分子は、COS細胞で発現される場合、細胞表面に効率よく移動されず、そしておそらく細胞質にある。RT-PCRに対して、SLAM4の非翻訳５’エキソンに特異的な５’プライマーおよびSLAMコード領域に特異的な３’プライマーを用いると、この転写産物は、異なる細胞型において見出された。このことは、この転写産物が真正のmRNAであることを確認する。
【００３２】
マウスSLAMのヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸配列を、配列番号９、10、11、および12に示す。マウスSLAMの１つの型（version）は、９つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位を含有するI型膜貫通タンパク質である。予測される非グリコシル化分子量は、40,000である。示された配列は、マウスSLAM1（プラスミドpMSLAM1中）に関し、これは最も豊富な1.8kbのSLAM  cDNAであるが、別の1.8kbのcDNA  SLAM2（pMSLAM2）（約25%のcDNAを示す）もまた単離された。SLAM2は、SLAM1配列と配列の初めの約1kbを共有するが、その３’末端で異なる配列を有する。pMSLAM2におけるこのSLAM2  cDNAは、異なる細胞質ドメインを有するSLAMタンパク質をコードする。表１は、選択されたヒトおよびマウスSLAMタンパク質配列のアラインメントを示す。ヒトSLAMに関する場合のように、マウスSLAMは、典型的に１つのＶおよび１つのＣ免疫グロブリンドメインを有し、全体の分子にわたってヒトSLAMと広範なアミノ酸相同性を共有する。この相同性は、保存的置換を考慮すると88%である。ヌクレオチドレベルでの相同性は約70%である。このマウスタンパク質は、ヒトSLAMに比べて８つの別々のアミノ酸挿入を含む。細胞外ドメインのシステインは、すべて保存されており、そして細胞質ドメインの３つのチロシンの前後関係（context）は完全に保持されている。細胞質ドメインの２つの遠位のチロシンは、pSLAM2（配列番号11および12）によりコードされる代替的にスプライスされたマウスSLAM2において存在せず、およびこの細胞質ドメインの独特の部分は、ヒトSLAMと高い相同性を共有しない。異なる細胞質テールを有する、代替的にスプライスされた形態のヒトSLAMが存在する。pMSLAM2における代替の配列は、ヒトSLAM2（pSURslam2）の独特の配列に相同ではないが、代替のエキソンがスプライスされるヌクレオチド配列の位置は、両方の配列において同一である。
【００３３】
（マウスSLAM配列）
マウスSLAM1（pMSLAM1）のヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸配列を、配列番号９および10に示す。予測されるリーダー配列および膜貫通配列は、アミノ酸１〜28および242〜267であるが、天然の境界は異なり得、これは細胞型にも依存する。システインが、32、133、161、167、212、232、276、および310番目のアミノ酸残基で見出される。潜在的なＮ結合グリコシル化部位が、54、58、103、126、151、158、192、210、および226番目の残基で見出される。システインおよび／またはＮ結合グリコシル化部位の間のフラグメントは、抗体を作製するにおいて特に有用である。
【００３４】
マウスSLAM2（pMSLAM2）のヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸配列を、配列番号11および12に示す。マウスSLAM2の配列がマウスSLAM1と異なる位置は、ヌクレオチド944以降で始まる。
【００３５】
【表１】
2007008958.tif 000002
ヒトSLAMの細胞外ドメインにおいて、マウス2B4、ヒトCD48、およびヒトLFA-3（CD58）タンパク質配列とのいくつかの相同性が明白に存在する。配列のアラインメントにより、共有される相同性、共有されない相同性、共通のモチーフ、および部分的に共有される特徴の部分が示される。
【００３６】
天然の抗原は、標的細胞において生物学的応答または生理学的応答に導く種々の生物化学的応答を介在し得る。最も良く特徴付けられた実施態様を、最初にヒトにおいて記載するが、ヒトおよびマウス改変体をまた、本明細書中に記載する。他の哺乳動物種（例えば、霊長類および齧歯類）におけるタンパク質のさらなる配列もまた、利用可能であるはずである。以下を参照のこと。以下の記載は、例示の目的のために、ヒトSLAMに関するが、他の種からの関連の実施態様に対して同じように適用可能である。
【００３７】
単離されたヒトSLAMタンパク質は、細胞表面抗原に特徴的な構造特徴を示すタンパク質である。このタンパク質は、特定の細胞型において容易に検出され、他の細胞型はほとんど発現しない。表２を参照のこと。SLAMは、抗体または他の未だ同定されていないリガンドの結合に対する生物化学的応答を介在し、シグナル伝達および細胞性応答に導く。特に、SLAM抗原は特異的抗体を用いる発現クローニングにより単離された。SLAM抗原は、約70kDのタンパク質の移動度特徴を有してポリアクリルアミドゲル電気泳動上を移動するタンパク質として単離および特徴付けられた。Ｎ-グリカナーゼでの処理後、コアタンパク質は、約40kDタンパク質の移動度を有する。
【００３８】
【表２−１】
2007008958.tif 000003
【００３９】
【表２−２】
2007008958.tif 000004
SLAM抗原は、同定された組織型において存在するはずであり、そして抗原とその結合パートナーとの相互作用は、細胞生理学または細胞発生の種々の局面を介在するために重要であるはずである。
【００４０】
（II.  精製SLAM）
ヒトSLAMおよびマウスSLAMのアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、10、および12に示される。アミノからカルボキシに与えられるこれらのアミノ酸配列は、他のタンパク質からこのタンパク質を識別させ得る抗原における配列情報を提供し、かつ非常に多くの変種を例示することにおいて重要である。さらに、このペプチド配列は、このようなセグメントを認識する抗体を生成するためのペプチドを調製させ得、そしてオリゴヌクレオチドプローブを調製させ得る。これは両方とも検出または単離のストラテジー（例えば、このような配列をコードする遺伝子のクローニング）である。
【００４１】
本明細書において使用される場合、用語「ヒトSLAM」は、タンパク質について使用される場合には、配列番号２、４、６、または８に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、またはこのようなタンパク質の重要なフラグメント、あるいはヒト由来の他の相同性が高いタンパク質を包含する。明らかに、スプライシング変種を示すmRNA種がある。これはまた、同様な生物学的機能を示すか、またはSLAM特異的結合成分と相互作用するヒト由来ポリペプチドをもいう。これらの結合成分(例えば、抗体)は、代表的にはSLAMと高い親和性、例えば、少なくとも約100nM、通常約30nMより良く、好ましくは約10nMより良く、そしてさらに好ましくは約３nMより良い親和性で結合する。相同なタンパク質は、ヒト以外の哺乳類種(例えば、霊長類または齧歯類)で見出される。非哺乳類種もまた、構造的または機能的に関連する遺伝子およびタンパク質を有する（例えば、鳥類または両生類）。
【００４２】
本明細書中で使用されるように用語「ポリペプチド」は、重要なフラグメントまたはセグメントを包含し、そして少なくとも約８アミノ酸、一般的には少なくとも約12アミノ酸、代表的には少なくとも約16アミノ酸、好ましくは少なくとも約20アミノ酸、そして特に好ましい実施態様においては少なくとも約30またはそれ以上のアミノ酸のアミノ酸残基のストレッチを包含する。
【００４３】
用語「結合組成物」は、SLAMに特異的に(例えば、細胞接着ペアリング型様式、または抗体-抗原相互作用で)結合する分子をいう。それはまた化合物、例えば、SLAMと特異的に結合するタンパク質(天然の生理学的に関係するタンパク質-タンパク質相互作用(共有結合または非共有結合のいずれか)で)を含む。この分子はポリマー、または化学試薬であり得る。機能的アナログは、構造的な改変を伴う抗原であり得るか、または適切な結合決定基と相互作用する分子形状を有する分子であり得る。この化合物は結合相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストとして働き得る（例えば、Goodmanら(編)(1990)Goodman  &  Gilman’s：The  Pharmacological  Bases  of  Therapeutics(第８版)、Pergamon  Pressを参照のこと）。
【００４４】
実質的に純粋は、代表的に、タンパク質に他の混入するタンパク質、核酸、または生物起源由来の他の生物製剤がないことを意味する。純度は、標準的な方法（代表的には重量）によりアッセイされ得、そして通常は少なくとも約40％純粋、一般的には少なくとも約50％純粋、しばしば少なくとも約60％純粋、代表的には少なくとも約80％純粋、好ましくは少なくとも約90％純粋、そして最も好ましい実施態様においては、少なくとも約95％純粋である。キャリアまたは賦形剤がしばしば添加される。
【００４５】
ポリペプチドまたはフラグメントの溶解性は、環境およびそのポリペプチドに依存する。温度、電解質環境、ポリペプチドのサイズおよび分子特性、ならびに溶媒の性質を包含する多くのパラメーターがポリペプチドの溶解性に影響を与える。代表的には、ポリペプチドが使用される温度は約４℃〜約65℃の範囲である。通常、使用温度は約18℃より高い。診断目的の場合、温度は、通常、室温付近またはそれより暖かいが、アッセイにおける成分の変性温度より低い。治療目的の場合、温度は通常、体温(代表的にはヒトおよびマウスについては約37℃)であるが、一定の状況下では、温度はインサイチュまたはインビトロで上昇または低下され得る。
【００４６】
ポリペプチドのサイズおよび構造は、一般的には、実質的に安定な状態にあるべきであり、そして通常は、変性状態にあるべきではない。このポリペプチドは、４次構造で他のポリペプチドと結合し得、例えば、溶解性を与えるか、あるいは天然の脂質二重層相互作用に近い様式で、脂質または界面活性剤と結合し得る。
【００４７】
溶媒および電解質は通常、生物学的活性の保護のために使用されるタイプの生物学的に適合する緩衝液であり、そして通常、生理学的水性溶媒に近い。通常、溶媒は中性のpH、代表的には約５と10との間のpH、そして好ましくは約7.5のpHを有する。いくつかの場合、代表的にはマイルドな非変性界面活性剤(例えば、CHS（コレステリルヘミスクシネート）またはCHAPS（3-[3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート）)か、またはタンパク質の構造的または生理学的特性の顕著な崩壊を避けるのに十分に低い濃度で、１つ以上の界面活性剤が添加される。
【００４８】
（III.  物理的変種）
本発明はまた、SLAMのアミノ酸配列と実質的にアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはペプチドを包含する。変種には、種変種または対立遺伝子変種が含まれる。
【００４９】
アミノ酸配列相同性、または配列同一性は、残基適合を最適化することにより(必要ならば、必要とされるギャップを導入することにより)決定される。また、Needlehamら(1970)J.Mol.Biol.  48:443-453；Sankoffら(1983)Time  Warps,String  Edits,and  Macromolecules:The  Theory  and  Practice  of  Sequence  Comparisonの第１章、Addison-Wesley、Reading、MA；ならびにIntelliGenetics、Mountain  View、CA；およびthe  University  of  Wisconsin  Genetics  Computer  Group、Madison、WIからのソフトウェアパッケージを参照のこと。配列の同一性は、保存的置換を適合と考える場合、変化する。保存的置換は、代表的には、以下の群内での置換を包含する：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。相同なアミノ酸配列は、代表的には各個のタンパク質配列における天然の対立遺伝子変異物(variation)および種間変異物を包含することが意図される。代表的な相同タンパク質またはペプチドは、SLAMのアミノ酸配列と、25〜100％の同一性(ギャップが導入され得る場合)から50〜100％の同一性(保存的置換が含まれる場合)を有する。同一性の尺度は少なくとも約35％、一般的には少なくとも約40％、しばしば少なくとも約50％、代表的には少なくとも約60％、通常少なくとも約70％、好ましくは少なくとも約80％、そしてより好ましくは少なくとも約90％である。
【００５０】
単離されたSLAM  DNAは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、およびヌクレオチドストレッチの反転(inversion)により容易に改変され得る。これらの改変は、これらの抗原、それらの誘導体、あるいは類似の生理学的活性、免疫原性活性、抗原性活性、または他の機能的活性を有するタンパク質をコードする新規のDNA配列を生じる。これらの改変された配列は変異抗原を生成するため、または発現を増強するために用いられ得る。増強された発現は、遺伝子増幅、転写の増加、翻訳の増加、および他の機構を包含し得る。「変異SLAM」は、他の点では上記のSLAMの配列同一性の定義に該当するが、欠失、置換、または挿入のいずれによるかにかかわらず、天然において通常見出されるSLAMのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。これは一般的に、配列番号２、４、６、８、10、または12の配列を有するタンパク質と顕著な同一性を有し、かつこれらの配列と種々の生物学的な活性(例えば、抗原性活性または免疫原性活性)を共有するタンパク質を包含し、そして好ましい実施態様においては、全長を開示された配列のほとんどを含む。端が切断されたものもまた有用であるが、代表的には全長配列が好ましい。同様の概念が、異なるSLAMタンパク質、特に種々の温血動物(例えば、哺乳動物および鳥類)に見出されるSLAMタンパク質に適用される。これらの記載は、一般的には、すべてのSLAMタンパク質を包含することを意味し、詳細に論じられる特定のヒトまたはマウスの実施態様に限定されない。
【００５１】
SLAM変異誘発はまた、アミノ酸挿入または欠失を作成することにより行われ得る。置換、欠失、挿入、または任意の組み合わせが作成されて、最終構築物に到達し得る。挿入には、アミノ末端またはカルボキシ末端の融合が含まれる。ランダムな変異誘発を標的コドンで行い得、次いで発現された変異体を所望の活性についてスクリーニングし得る。公知の配列を有するDNA中の予め決定された部位に置換変異を作成するための方法（例えば、M13プライマー変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術による）は、当該分野において周知である。例えば、Sambrookら(1989)；Ausubelら(1987および増刊)；およびKunkelら(1987)Methods  in  Enzymol.154:367-382を参照のこと。
【００５２】
本発明はまた、組換えタンパク質、例えば、これらのタンパク質由来のセグメントを使用する異種融合タンパク質を提供する。異種融合タンパク質は、天然には同じ様式で通常融合されないタンパク質またはセグメントの融合物である。同様の概念が異種核酸配列に適用される。
【００５３】
さらに、新たな構築物が、他のタンパク質由来の類似の機能的ドメインを組み合わせることにより作成され得る。例えば、標的結合セグメントまたは他のセグメントは、異なる新たな融合ポリペプチドまたはフラグメントの間で「交換」され得る。例えば、Cunninghamら(1989)Science  243:1330-1336；およびO’Dowdら(1988)J.Biol.Chem.  263:15985-15992を参照のこと。
【００５４】
BeaucageおよびCarruthers(1981)Tetra.Letts.22:1859-1862により記載されるホスホルアミダイト(phosphoramidite)法は、適切な合成DNAフラグメントを生成する。相補鎖を合成し、そして適切な条件下で鎖を一緒にアニーリングするか、または適切なプライマー配列とともにDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を付加するか(例えばPCR技術)のいずれかにより、二本鎖フラグメントがしばしば得られる。
【００５５】
（IV.  機能的変種）
SLAMに対する生理学的応答のブロッキングは、その結合パートナーに対するこの抗原の結合阻害(例えば、それ自身とは別の、おそらく競合的阻害を介して)から生じ得る。従って、本発明のインビトロアッセイは、単離されたタンパク質、組換え膜結合SLAMを発現する細胞由来の膜、これらのタンパク質の抗原結合セグメントを含有する可溶性フラグメント、または固相基質に接着するフラグメントをしばしば使用する。これらのアッセイはまた、結合セグメントの変異および改変、または抗原の変異および改変(例えば、SLAMアナログ)のいずれかの効果の診断的測定を可能にする。
【００５６】
本発明はまた、競合的薬物スクリーニングアッセイの使用を意図し、例えばここで、抗原または結合フラグメントに対する中和抗体が、タンパク質の結合に関して試験化合物と競合する。
【００５７】
SLAM抗原の「誘導体」には、アミノ酸配列変異体、グリコシル化変種、および他の化学的部分との共有結合体または凝集結合体が含まれる。共有結合誘導体は、例えば、標準的な手段によって、SLAMアミノ酸側鎖において、あるいはＮ末端またはＣ末端で見出される基に官能性を結合することにより調製され得る。例えば、LundbladおよびNoyes(1988)Chemical  Reagents  for  Protein  Modification,1-2巻,CRC  Press,Inc.、Boca  Raton,  FL;Hugli（編）(1989)Techniques  in  Protein  Chemistry,  Academic  Press,  San  Diego,  CA;およびWong(1991)Chemistry  of  Protein  Conjugation  and  Cross  Linking,  CRC  Press,  Boca  Raton,FLを参照のこと。
【００５８】
詳細には、例えば合成およびプロセシングの間、またはさらなるプロセシング工程での、ポリペプチドのグリコシル化パターンを改変することによってなされるグリコシル化の変化が含まれる。例えば、Elbein(1987)Ann.  Rev.  Biochem.56:497-534を参照のこと。リン酸化されたアミノ酸残基(例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニン)を含む、他の小さな改変を有する同じ一次アミノ酸配列を有するペプチドの変形体(version)もまた含まれる。
【００５９】
SLAMと他の相同タンパク質または異種タンパク質との間の融合ポリペプチドもまた提供される。多くのサイトカインレセプターまたは他の表面タンパク質は、多量体（例えば、ホモ二量体の存在）であり、そして反復構築物は、タンパク質加水分解切断に対する感受性の減少を含む種々の利点を有し得る。代表的な例は、融合されたリガンドの存在または位置が容易に決定され得るような、レポーターポリペプチド(例えば、ルシフェラーゼ)とタンパク質のセグメントまたはドメイン(例えば、レセプター結合セグメント)との融合体である。例えば、Dullら、米国特許第4,859,609号を参照のこと。他の遺伝子融合パートナーには、細菌のβガラクトシダーゼ、trpE、プロテインＡ、βラクタマーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、酵母α接合因子、および検出タグまたは精製タグ（例えば、His6配列のFLAG配列）が含まれる。例えば、Godowskiら、(1988)Science  241:812-816を参照のこと。
【００６０】
融合タンパク質は、代表的には、組換え核酸法、または合成ポリペプチド法のいずれかにより作製される。核酸操作および発現の技術は、一般には、例えば、Sambrookら(1989)Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual(第２版),1-3巻,Cold  Spring  Harbor  Laboratory；およびAusubelら（編）(1993)Current  Protocols  in  Molecular  Biology,Greene  and  Wiley,NYに記載される。ポリペプチド合成の技術は、例えば、Merrifield(1963)J.Amer.Chem.Soc.85:2149-2156;Merrifield(1986)Science  232:341-347;Athertonら(1989)Solid  Phase  Peptide  Synthesis:A  Practical  Approach,  IRL  Press,  Oxford；およびGrant  (1992)  Synthetic  Peptides:  A  User’s  Guide,  W.  H.  Freeman,  NYに記載される。
【００６１】
本発明はまた、アミノ酸配列またはグリコシル化における変異物以外のSLAMの誘導体の使用を意図する。このような誘導体は、化学部分との共有結合または凝集結合を含み得る。共有結合誘導体または凝集誘導体は免疫原として、イムノアッセイにおける試薬として、または、例えば、結合パートナー（例えば、他の抗原）のアフィニティー精製のための精製方法における試薬として有用である。抗SLAM抗体または代替的な結合組成物のアッセイまたは精製において使用するために、SLAMは、当該分野で周知の方法によって、臭化シアン活性化SEPHAROSEなどの固体支持体に共有結合させることにより固定化され得るか、あるいはグルタルアルデヒド架橋を用いて、またはそれを用いずにポリオレフィン表面上へ吸着され得る。SLAMはまた、例えば、診断アッセイに使用するために検出可能な基で標識され得る。SLAMの精製は、固定化された抗体または相補的な結合パートナーにより達成され得る。
【００６２】
本発明の可溶化SLAMまたはフラグメントは、抗原またはそのフラグメントに対する結合に特異的な抗血清または抗体の生成のための免疫原として使用され得る。精製された抗原は、天然の抗体の抗体結合フラグメントを含むモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントをスクリーニングするために使用され得る。精製されたSLAMはまた、抗原または抗原を含む細胞フラグメントの上昇レベルの存在(これらの両方が、異常な状態または特定の生理学的状態または疾患状態の診断症状であり得る)に応答して産生される抗体を検出するための試薬として、使用され得る。本発明は、配列番号１、３、５、７、９、または11に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、またはこれらを含むタンパク質のフラグメントに対して惹起される抗体を意図する。詳細には、本発明は、脂質二重層の外部（細胞外または細胞内の両方）に位置すると予測される特定のフラグメントに結合親和性を有するか、あるいはこのフラグメントに対して惹起される抗体を意図する。
【００６３】
本発明は、さらなる近密に関連した種の変種の単離を意図する。サザンブロット分析およびノーザンブロット分析により、類似の遺伝実体(entity)が他の哺乳動物に存在することが立証されるはずである。SLAMは、種の変種(例えば、齧歯類、ウサギ目動物、肉食動物、偶蹄目動物、奇蹄目動物、および霊長類)において広範囲に存在するようである。
【００６４】
本発明はまた、構造、発現、および機能における相違性および類似性の両方を示す一群の関連する抗原を単離する手段を提供する。この分子の多くの生理学的効果の解明は、それらのさらなる別個の種変種の単離および特徴付けによって、大きく加速される。詳細には、本発明は、異なる種においてさらなる相同な遺伝実体を同定するために有用なプローブを提供する。
【００６５】
単離された遺伝子は、対応するSLAMの発現を欠く細胞(例えば、対応する抗原を欠き、そしてネガティブバックグランド活性を示す種タイプまたは細胞のいずれか)の形質転換を可能にする。これは、形質転換されないコントロール細胞に比較してSLAMの機能の分析を可能にするはずである。
【００６６】
これらの抗原によって媒介される種々の活性化機能または分化機能をもたらす重要な構造エレメントの詳細な分析は、特に関連したクラスのメンバーの比較において、現代の分子生物学の標準的な技術を使用して可能である。例えば、Cunninghamら(1989)  Science  243:1339-1336に記載のホモローグスキャニング変異誘発技術(homolog-scanning  mutagenesis  technique)；およびO’Dowdら(1988)J.Biol.Chem.  263:15985-15992において使用されるアプローチ；およびLechleiterら(1990)EMBO  J.  9:4381-4390を参照のこと。
【００６７】
細胞内機能は、おそらく通常サイトゾルに接近し易い抗原のセグメントを包含する。しかし、タンパク質インターナリゼーションは、一定の環境下で生じ得、そして細胞内成分と「細胞外」セグメントの間の相互作用が存在し得る。SLAMと他の細胞内成分との相互作用の特異的セグメントは、変異誘発または直接的な生化学的手段（例えば、架橋法またはアフィニティー法）により同定され得る。結晶学的方法または他の物理的方法による構造解析もまた適用可能である。シグナル伝達の機能のさらなる研究には、アフィニティー方法により、または遺伝子的手段（例えば、変異体の相補性分析）により単離可能であり得る、結合される成分の研究が含まれる。
【００６８】
SLAMの発現および制御のさらなる研究が遂行される。抗原に付随する制御エレメントは、ディファレンシャルな（differential）発現パターン、生理学的発現パターン、発生的発現パターン、組織特異的発現パターン、または他の発現パターンを示すべきである。上流または下流の遺伝子領域(例えば、制御エレメント)は重要である。特に、生理学的変異体または発生的変異体（例えば、抗原の複数のオルタナティブにプロセシングされた形態）が見出されている。例えば、配列番号１または３参照。したがって、メッセージのディファレンシャルなスプライシングは、抗原の膜結合形態、可溶性形態、および抗原の改変型の組合せを導き得る。
【００６９】
抗原の構造的研究は、新しい抗原、特に分子上にアゴニスト特性またはアンタゴニスト特性を示すアナログの設計を導く。これは、所望の範囲の活性を示す抗原を単離するための、以前に記載のスクリーニング法と組み合わされ得る。
【００７０】
（V.  抗体）
抗体は、天然に存在する形態および組換え形態の両方の、種々のSLAM(種変異体または対立遺伝子変異体を含む)およびそのフラグメントに対して惹起され得る。さらに、抗体は、活性形態または不活性形態（天然型または変性型を含む）のいずれかのSLAMに対して惹起され得る。抗-イディオタイプ抗体もまた意図される。
【００７１】
抗原の予め決定されたフラグメントに対する抗体(結合フラグメントおよび単鎖型を含む)は、このフラグメントと免疫原性タンパク質との結合体で動物を免疫することによって惹起され得る。モノクローナル抗体は、所望の抗体を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、正常SLAMまたは欠損SLAMへの結合についてスクリーニングされ得るか、またはアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性(例えば、抗原またはその結合パートナーにより媒介される)についてスクリーニングされ得る。これらのモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約1mM、より通常には少なくとも約300μM、代表的には少なくとも約100μM、より代表的には少なくとも約30μM、好ましくは少なくとも約10μM、そしてより好ましくは少なくとも約3μMまたはより良好なKDで結合する。
【００７２】
本発明の抗体はまた、診断適用に有用であり得る。捕獲または非中和抗体として、これらの抗体は、パートナーによる結合を阻害することなく、抗原に結合する能力についてスクリーニングされ得る。中和抗体として、これらの抗体は、競合的結合アッセイにおいて有用であり得る。これらの抗体は、SLAMタンパク質またはその結合パートナーを検出または定量することにおいてもまた有用である。例えば、Chan(編)(1987)Immunology:A  Practical  Guide  Academic  Press,Orlando,FLA；PriceおよびNewman(編)(1991)  Principles  and  Practice  of  Immunoassay  Stockton  Press,NY；ならびにNgo(編)(1988)Nonisotopic  Immunoassay  Plenum  Press,NYを参照のこと。交差吸収または他の試験は、種々の範囲の特異性（例えば、独特のまたは共有される種特異性）を示す抗体を同定する。
【００７３】
さらに、本発明の抗体（抗原結合フラグメントを含む）は、抗原に結合し、そして機能的結合を阻害するかまたは結合パートナーの生物学的応答を誘起する能力を阻害する、強力なアンタゴニストであり得る。それらはまた、非中和抗体として有用であり得、そして毒素または放射性核種と結合され得、その結果抗体が抗原に結合した場合に、（例えば、その表面上で）それを発現する細胞が傷害される。さらに、これらの抗体は、リンカーにより直接的または間接的にのいずれかで、薬物またはその他の治療的物質に結合され得、そして薬物標的化をもたらし得る。
【００７４】
抗原フラグメントは、免疫原として使用されるべきポリぺプチドに融合または共有結合されて、他の物質、特にポリペプチドに結合され得る。抗原およびそのフラグメントは、キーホールリンペットのヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、破傷風トキソイドなどの様々な免疫原に融合されるかまたは共有結合され得る。ポリクローナル抗血清の調製方法の記載については、Microbiology,  Hoeber  Medical  Division,  HarperおよびRow,  1969；Landsteiner  (1962)Specificity  of  Serological  Reactions,  Dover  Publications,  New  York；Williamsら  (1967)Methods  in  Immunology  and  Immunochemistry,第１巻,Academic  Press,  New  York；ならびに、HarlowおよびLane(1988)Antibodies;A  Laboratory  Manual,CSH  Press,  NYを参照のこと。
【００７５】
いくつかの例において、マウス、ゲッ歯類、霊長類、ヒトなどの種々の哺乳動物宿主由来のモノクローナル抗体を調製することが望ましい。このようなモノクロール抗体を調製するための技術の記載は、例えば、Stitesら(編)、Basic  and  Clinical  Immunology（第４版）,  Lange  Medical  Publications,  Los  Altos,  CA,およびそこで引用される参考文献；HarlowおよびLane  (1988)  Antibodies:  A  Laboratory  Manual,  CSH  Press；Goding  (1986)  Monoclonal  Antibodies:  Principles  and  Practice(第２版)  ,  Academic  Press,  New  York；  ならびに特にKohlerおよびMilstein  (1975)  Nature  256:495-497  (これは、モノクローナル抗体を生成する１つの方法を考察する)に見い出され得る。
【００７６】
他の適切な技術は、リンパ球を抗原性ポリペプチドに対してインビトロで曝露すること、あるいはファージまたは同様なベクター中の抗体ライブラリーの選択を包含する。Huseら(1989)「λファージ中の免疫グロブリンレパートリーの大組み合わせライブラリーの生成」Science  246:1275-1281；およびWardら(1989)  Nature  341:544-546を参照のこと。本発明のポリペプチドおよび抗体は、改変を有してまたは有さないで使用され得、改変はキメラ抗体またはヒト化抗体を含む。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、共有結合または非共有結合のいずれかで、検出可能なシグナルを提供する物質と結合することにより標識される。広範な標識および結合技術が公知であり、科学文献および特許文献の両方において広く報告されている。適切な標識は、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子などを含む。このような標識の使用を教示する特許は、米国特許第3,817,837号；第3,850,752号；第3,939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号；第4,275,149号；および第4,366,241号を含む。また、組換え免疫グロブリンが産生され得る(Cabilly、米国特許第4,816,567号；Mooreら、米国特許第4,642,334号；およびQueenら、(1989)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA  86:10029-10033を参照のこと)。
【００７７】
本発明の抗体はまた、タンパク質を単離することにおいて、アフィニティークロマトグラフィーのために使用され得る。抗体が固体支持体に結合されているカラムが調製され得る。例えば、Wilchekら(1984)Meth.Enzymol.104:3-55を参照のこと。
【００７８】
各SLAMに対して惹起される抗体はまた、抗イディオタイプ抗体を惹起するために有用である。これらは、それぞれの抗原の発現に関連する種々の免疫学的症状を検出または診断することにおいて有用である。
【００７９】
（VI.核酸）
記載されたペプチド配列および関連試薬は、例えば天然供給源由来のSLAMをコードするDNAクローンを検出、単離、または同定するのに有用である。代表的には、それは、哺乳動物由来の遺伝子を単離するのに有用であり、そして同様の手順が、他の種（例えば、鳥類および哺乳動物のような温血動物）由来の遺伝子を単離するために適用される。クロスハイブリダイゼーションは、他の種由来のSLAMの単離を可能にする。多くの異なるアプローチが、適切な核酸クローンをうまく単離するのに利用可能であるはずである。
【００８０】
精製タンパク質または規定されたペプチドは、上記のように、標準方法により抗体を生成するために有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク質は、免疫系に提供され、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を生成し得る。例えば、Coligan(1991)Current  Protocols  in  Immunology  Wiley/Greene；ならびにHarlowおよびLane(1989)Antibodies:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Pressを参照のこと。あるいは、SLAMは、特異的結合試薬として用いられ得、そして抗体が用いられる場合と全く同様に、その結合特異性が利用され得る。
【００８１】
例えば、特異的結合組成物は、SLAMを発現する細胞株から作製される発現ライブラリーのスクリーニングのために用いられ得る。スクリーニングは、表面に発現される抗原の標準的染色であり得、またはパンニングにより得る。細胞内発現のスクリーニングはまた、種々の染色または免疫蛍光法手順により行われ得る。結合組成物は、このタンパク質を発現する細胞をアフィニティー精製または選別（sort  out）するために用いられ得る。
【００８２】
ペプチドセグメントはまた、ライブラリーをスクリーンする適切なオリゴヌクレオチドを予測するのに用いられ得る。遺伝子コードは、スクリーニングのためのプローブとして有用な適切なオリゴヌクレオチドを選択するのに用いられ得る。例えば、配列番号１または３を参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術と組み合わせて、合成オリゴヌクレオチドは、ライブラリーからの正しいクローンを選択するのに有用である。相補的配列もまた、プローブ、プライマー、またはアンチセンス鎖として用いられる。予想される(likely)細胞外ドメインの同定に基づいて、種々のフラグメントは、例えば、アンカーされたベクターまたはポリ-A相補的PCR技術あるいは他のペプチドの相補的DNAと合わせて、特に有用であるはずである。
【００８３】
本発明は、生物学的に活性な対応するSLAMポリペプチドをコードする単離されたDNAまたはフラグメントの使用を意図している。さらに、本発明は、適切な条件下で本明細書中に記載されるDNA配列とハイブリダイズし得る、生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドをコードする単離されたDNAまたは組換えDNAをカバーする。この生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドは、インタクトな抗原、またはフラグメントであり得、そして、例えば、配列番号１または３に開示されるアミノ酸配列を有する。さらに、本発明は、単離されたDNAまたは組換えDNA、あるいはそのフラグメントの使用をカバーする。ここで、これらのDNAは、SLAMに相同なタンパク質をコードするか、またはSLAMをコードするcDNAをプローブとして用いて単離された。単離されたDNAは、５’および３’に隣接してそれぞれ調節配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナルおよびその他)を有し得る。
【００８４】
「単離された」核酸は、本来(native)の配列に天然に付随する他の成分(例えば、起源の種由来のリボソーム、ポリメラーゼ、および／または隣接するゲノム配列)から実質的に分離された核酸(例えば、RNA、DNA、または混合ポリマー)である。この用語は、その天然に生じる環境から取り出された核酸配列を包含し、そして組換えまたはクローン化DNA単離物、および化学的に合成されるアナログまたは異種系により生物学的に合成されるアナログを包含する。実質的に純粋な分子は、単離された形態の分子を包含する。一般に、核酸は、ベクター中に存在するか、または約50kb未満、通常約30kb未満、代表的には約10kb、そして好ましくは約６kb未満のフラグメントである。
【００８５】
単離された核酸は、一般に、分子の均質な組成物であるが、しかしいくつかの実施態様においては、少しの不均質性を含む。代表的には、この不均質性は、ポリマー末端、または所望の生物学的な機能または活性に重要ではない部分に見出される。
【００８６】
「組換え」核酸は、その生成方法またはその構造のいずれかにより定義される。その生成方法については（例えば、あるプロセスにより作製された産物）、そのプロセスは、組換え核酸技術(例えば、ヌクレオチド配列におけるヒトの介入（代表的には、選択または生成）を含む)の使用である。あるいは、組換え核酸は、天然には互いに隣接していない２つのフラグメントの融合を含む配列を生成することにより作製される核酸であり得るが、しかし天然の産物(例えば、天然に生じる変異体)を除外することを意味する。したがって、任意の合成オリゴヌクレオチドプロセスを使用して誘導される配列を含む核酸のように、例えば、任意の天然に生じないベクターで細胞を形質転換することにより作製された産物が包含される。このようなことは、代表的には、配列認識部位を導入または除去して、コドンを、同じアミノ酸または保存アミノ酸をコードする縮重（redundant）コドンで置換するためにしばしば行われる。
【００８７】
あるいは、所望の機能の核酸セグメントどうしを結合し、一般的に入手可能な天然形態では見出されない、機能の所望の組み合わせを含む単一の遺伝子物質(entity)を生成することが行われる。制限酵素認識部位は、しばしばこのような人工的な操作の標的であるが、しかし他の部位特異的標的(例えば、プロモーター、DNA複製部位、調節配列、制御配列または他の有用な特徴)が設計により取り込まれ得る。同様の概念が、組換え(例えば、融合)ポリペプチドについて意図される。これらの抗原のフラグメントに類似するポリペプチドを、遺伝コードの縮重によりコードする合成核酸、および種々の異なる種変異体に由来する配列の融合物が、特に包含される。
【００８８】
核酸の記載において重要な「フラグメント」（significant  fragment）は、少なくとも約17ヌクレオチド、一般的には少なくとも22ヌクレオチド、普通少なくとも約29ヌクレオチド、さらにしばしば少なくとも約35ヌクレオチド、代表的には少なくとも約41ヌクレオチド、通常は少なくとも約47ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約55ヌクレオチド、そして特に好ましい実施態様においては少なくとも約60以上のヌクレオチドの連続セグメントである。
【００８９】
SLAMタンパク質をコードするDNAは、関連するかまたは相同なタンパク質をコードする遺伝子、mRNA、およびcDNA種、ならびに異なる種由来の相同なタンパク質をコードするDNAを同定するのに特に有用である。霊長類、齧歯類、および鳥類を含む他の種においてホモログが存在すると思われる。種々のSLAMタンパク質が相同であるはずであり、本明細書中に包含される。しかし、この抗原とより遠い進化的関係を有するタンパク質でさえ、これらが十分に相同である場合には、これらの配列を用いて適切な条件下で容易に単離され得る。霊長類SLAMタンパク質を特に目的とする。
【００９０】
ゲノム配列(例えば、イントロンを含む)由来の組換えクローンは、トランスジェニック研究(例えば、トランスジェニック細胞および生物を包含する)ならびに遺伝子治療に有用である。例えば、Goodnow(1992)「Transgenic  Animals」  Roitt(編)Encyclopedia  of  Immunology,  Academic  Press、San  Diego、pp.1502-1504；Travis(1992)Science  256:1392-1394；Kuhnら(1991)Science  254:707-710；Capecchi(1989)Science  244:1288；Robertson(1987)(編)Teratocarcinomas  and  Embryonic  Stem  Cells:A  Practical  Approach,IRL  Press、Oxford；およびRosenberg(1992)J.Clinical  Oncology  10:180-199を参照のこと。
【００９１】
核酸配列比較についての実質的な相同性は、比較した場合に、セグメントまたはそれらの相補鎖が、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って最適にアラインされる場合、少なくとも約50%のヌクレオチド、一般には少なくとも約58%、普通少なくとも約65%、しばしば少なくとも約71%、代表的には少なくとも約77%、通常少なくとも約85%、好ましくは少なくとも約95〜約98%またはそれ以上、そして特定の実施態様においては、約99%またはそれ以上のヌクレオチドで同一であることを意味する。あるいは、セグメントが、選択的なハイブリダイゼーション条件下で、鎖またはその相補物に、代表的には、配列番号１、３、５、７、９、または11のSLAMの配列を使用して、ハイブリダイズする場合、実質的な相同性が存在する。代表的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約30ヌクレオチドの領域(stretch)にわたって少なくとも約55%、好ましくは約25ヌクレオチドの領域にわたって少なくとも約75%、そして最も好ましくは約20ヌクレオチドにわたって少なくとも約90%の相同性が存在する場合に起こる。Kanehisa(1984)Nuc.Acids  Res.12:203-213を参照のこと。相同性比較の長さは、記載されるように、より長い領域にわたり得、そして特定の実施態様においては、少なくとも約17ヌクレオチド、通常少なくとも約28ヌクレオチド、代表的には少なくとも約40ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも約75〜100またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたる。
【００９２】
ハイブリダイゼーションについての相同性を言う場合、ストリンジェントな条件は、塩、温度、有機溶媒、および他のパラメーター(代表的にはハイブリダイゼーション反応において制御される)のストリンジェントな組合わされた条件である。ストリンジェントな温度条件は、約30℃を超過する、通常は約37℃を超過する、代表的には約55℃を超過する、好ましくは約70℃を超過する温度を通常包含する。ストリジェントな塩条件は、普通約1000mM未満、通常約400mM未満、代表的には約250mM未満、好ましくは約150mM未満である。しかし、パラメーターの組合わせは、どの一つのパラメーターの度合よりもはるかに重要である。例えば、WetmurおよびDavidson(1968)J.Mol.Biol.31:349-370を参照のこと。
【００９３】
他の哺乳動物種由来のSLAMは、近縁の種の種間ハイブリダイゼーション(cross-species  hybridization)によりクローン化および単離され得る。遠縁の種間では、相同性は比較的低くあり得、したがって比較的近縁の種のハイブリダイゼーションが得策である(advisable)。あるいは、より低い種特異性を示す抗体調製物の調製が、発現クローニングアプローチにおいて有用であり得る。
【００９４】
（VII．SLAM；模擬体の作製）
SLAMまたはそのフラグメントをコードするDNAは、化学的合成、cDNAライブラリーのスクリーニング、または広範な種々の細胞株または組織サンプルから調製されたゲノムライブラリーのスクリーニングにより得られ得る。OkayamaおよびBerg(1982)Mol.Cell.Biol.2:161-170；GublerおよびHoffman(1983)Gene25:263-269；およびGlover（編）(1984)DNA  Cloning:A  Practical  Approach,IRL  Press,Oxfordを参照のこと。あるいは、本明細書中に提供される配列は、有用なPCRプライマーを提供するか、またはSLAMをコードする適切な遺伝子の合成または他の調製を可能にする。
【００９５】
このDNAは、次に例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作成するために使用され得る完全長のSLAMまたはフラグメントの合成のために；結合研究のために；改変分子の構築および発現のために；および構造/機能研究のために広範な種々の宿主細胞で発現され得る。
【００９６】
本明細書で使用されるベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組み込み可能DNAフラグメント、およびDNAフラグメントの宿主ゲノムへの組み込みを可能にする他のビヒクルを包含する。例えば、Pouwelsら、(1985および補遺)Cloning  Vectors:A  Laboratory  Manual、Elsevier、N.Y.；およびRodriquezら、(1988)(編)Vectors:A  Survey  of  Molecular  Cloning  Vectors  and  Their  Uses、Buttersworth、Boston、MAを参照のこと。
【００９７】
本発明の目的のために、DNA配列は、それらが互いに機能的に関連する場合、作動可能に連結される。例えば、プレ配列(presequence)または分泌リーダーのDNAは、それがプレタンパク質として発現されるか、あるいはポリペプチドを細胞膜に指向させることまたはポリペプチドの分泌に関与する場合には、そのペプチドに作動可能に連結される。プロモーターは、それがポリペプチドの転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結される；リボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするように置かれる場合、コード配列に作動可能に連結される。通常、作動可能に連結されるとは、隣接し、そしてリーディングフレーム内にあることを意味する。しかし、リプレッサー遺伝子のような特定の遺伝子エレメントは、隣接して連結しないが、それでもやはりオペレーター配列(これは、次には発現を制御する)に結合する。例えば、Rodriguezら,第10章,205-236ページ；BalbasおよびBolivar(1990)Methods  in  Enzymology  185:14-37；ならびにAusubelら(1993)Current  Protocols  in  Molecular  Biology,GreeneおよびWiley,NY参照。
【００９８】
適切な発現ベクターの代表的な例は、pCDNA1；pCD(Okayamaら、(1985)Mol.Cell  Biol.  5:1136-1142参照)；pMC1neo  Poly-A(Thomasら、(1987)Cell  51:503-512参照)；およびpAC373またはpAC  610のようなバキュロウイルスベクターを包含する。例えば、Miller(1988)Ann.Rev.Microbiol.42:177-199参照。
【００９９】
特定のまたは規定されたグリコシル化パターンを提供するシステムにおいてSLAMポリペプチドを発現することがしばしば望ましい。例えば、LuckowおよびSummers(1988)Bio/Technology6:47-55；およびKaufman(1990)Meth.Enzymol.185:487-511参照。
【０１００】
SLAMまたはそのフラグメントは、細胞膜にホスファチジルイノシトール(PI)結合するように操作され得るが、ホスファチジルイノシトール切断酵素(例えば、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ)を用いる処理により膜から除去され得る。これは抗原を生物学的に活性な形態で放出し、そしてタンパク質化学の標準的な手順による精製を可能にする。例えば、Low(1989)Biochim.Biophys.Acta  988:427-454；Tseら、(1985)Science  230:1003-1008；およびBrunnerら、(1991)J.Cell  Biol.114:1275-1283を参照のこと。
【０１０１】
SLAMが特徴づけられたため、そのフラグメントまたは誘導体はペプチド合成のための従来のプロセスにより調製され得る。これらは、StewartおよびYoung(1984)Solid  Phase  Peptide  Synthesis、Pierce  Chemical  Co.、Rockford、IL；BodanszkyおよびBodanszky(1984)The  Practice  of  Peptide  Synthesis、Springer-Verlag、New  York；Bodanszky(1984)The  Principles  of  Peptide  Synthesis、Springer-Verlag、New  York；ならびにVillafranca（編）(1991)Techniques  in  Protein  Chemistry  II,Academic  Press,San  Diego,CAに記載されるようなプロセスを包含する。
【０１０２】
（VIII．用途）
本発明は、本明細書の別の場所(例えば、Ｔ細胞媒介状態に関する一般的な記載において、または下記の診断のためのキットの記載において)に記載されるような診断適用において用途を見い出す試薬を提供する。
【０１０３】
本発明はまた、重要な治療価値を有する試薬を提供する。SLAM（天然に存在するSLAM、または組換えSLAM）、そのフラグメント、およびそれらに対する抗体、さらにSLAMに対して結合親和性を有すると同定される化合物は、異常な増殖(例えば、ガン状態)、または変性(degenerative)状態を含む異常な生理状態または発生状態に関連する状態の処置において有用であるべきである。特に、リンパ球の発生の調整は、本明細書が提供する組成物を使用する適切な治療処置によって達成され得る。例えば、SLAMによる異常な発現または異常なシグナル伝達に関連する疾患または異常は、その抗原のアゴニストまたはアンタゴニストの有望な標的であるはずである。抗原は、造血細胞（例えば、リンパ球）の調節または発生において役割を果たし、その造血細胞は、免疫応答（自己免疫障害）に影響を与える。
【０１０４】
特に、抗原は、同時刺激シグナルをＴ細胞活性化に提供することが証明されている。したがって、SLAMは、Ｔ細胞-Ｔ細胞の相互作用において役割を有する。これらの相互作用は、特別な状況において、細胞増殖、その細胞による増大されたサイトカイン合成、およびその結果としてＴ細胞増殖の増幅を導く。
【０１０５】
さらに、インターフェロン−γのSLAM誘導産生は、SLAMに対する特定のアゴニストが、Th0/Th1経路にＴ細胞応答を指向し得、したがってTh2型応答を抑制することを示唆する。これらのアゴニストの間には、適切なエピトープ（例えば、SLAMのそのリガンドへの結合を模倣する）を認識する種々の抗体が、存在すべきである。
【０１０６】
逆に、SLAMのアンタゴニスト（例えば、SLAMの天然に存在する分泌型またはブロッキング抗体）は、異常な状況（例えば、自己免疫障害：リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス（erythematois)(SLE）、Hashimoto自己免疫甲状腺炎、ならびにＴ細胞活性化、拡大、および／または免疫学的なＴ細胞記憶が重要な役割を果たす、急性または慢性の炎症反応を含む）において、免疫応答をブロックする選択的および強力な方法を提供する。Samterら（編）Immunological  Disease  第１巻および第２巻、Little、Brown  and  Co.もまた参照のこと。組換え法または抗体をブロックすることより多量に生産され得る天然に存在するSLAMの分泌型による、Ｔ細胞活性化、拡大、および／またはサイトカイン放出の抑制は、異常なＴ細胞応答が重要である多くの障害に効果的であるはずである。
【０１０７】
SLAMは、CD45RO（これは、初回刺激されたＴ細胞または記憶Ｔ細胞に関するマーカーである）と同時発現されるようである。SLAMはまた、CD45RA細胞（これは、ナイーブＴ細胞サブセットを表す）中には存在しない。このように、SLAMはまた、記憶Ｔ細胞のための診断マーカーとして働き得る。
【０１０８】
種々の異常な状態が、ノザンブロット分析によってSLAM  mRNAを有することが示された細胞タイプで知られている。Berkow（編）The  Merck  Manual  of  Diagnosis  and  Therapy,  Merck  &  Co.,Rahway,N.J.；Thornら、Harrison’s  Principles  of  Internal  Medicine,McGraw-Hill,N.Y.；ならびにWeatherallら（編）Oxford  Textbook  of  Medicine,  Oxford  University  Press,  Oxfordを参照のこと。多くの他の症状および疾患は、Ｔ細胞に関するか、またはＴ細胞に媒介され、そして、これらの多くは、本明細書中で提供されるアゴニストまたはアンタゴニストによる処置に応答する。例えば、SitesおよびTerr（編；1991）Basic  and  Clinical  Immunology  AppletonおよびLange,  Norwalk,  Connecticut；ならびにSamterら（編）Immunological  Diseases  Little,  Brown  and  Co.参照。これらの問題は、本明細書で提供される組成物を使用する予防または処置の対象となり得る。
【０１０９】
SLAM抗体は、精製され得、次いで（動物またはヒトの）患者に投与され得る。これらの試薬は、治療的使用のために別の活性な成分または不活性な成分、例えば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物(例えば、免疫原性アジュバント)ならびに生理学的に無毒な安定剤、賦形剤、または防腐剤中で組み合され得る。これらの組合わせは、滅菌濾過され、そして凍結乾燥により投薬形態にして投薬バイアル中に入れ得るか、または安定化された水性調製物として保管され得る。本発明はまた、抗体またはその結合フラグメント(補体結合していない形態を含む)の使用を意図する。
【０１１０】
SLAMまたはそのフラグメントを用いた薬物スクリーニングは、SLAMへの結合親和性またはSLAMの機能において他の関連した生物学的効果を有する化合物を同定するため（会合した成分の単離を含む）に行われ得る。次いで、その化合物が内因性刺激活性を有し、そしてそれゆえに抗原の活性をブロックするブロッカーまたはアンタゴニストであるかどうかを決定するために、引き続く生物学的アッセイが利用され得る。同様に、内因性の刺激活性を有する化合物は、シグナル経路を活性化し得、したがってSLAM活性を刺激するアゴニストである。本発明はさらに、アンタゴニストとしてのSLAMに対するブロック抗体、および刺激抗体（例えば、アゴニストとしてのA12）の治療的用途を意図する。このアプローチは、他のSLAM種変異体にも特に有用であるはずである。
【０１１１】
効果的な治療に必要な試薬の量は、多くの異なる因子(投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、および他の投与される薬剤(medicant)を含む)に依存する。したがって、処置用量は、安全性および効果を最適化にするように滴定されるべきである。代表的に、インビトロで使用される用量は、これらの試薬のインサイチュ投与に有用な量の有用な指標を提供し得る。特定の異常の処置に効果的な用量の動物試験は、ヒト投薬量の予測的指示をさらに提供し得る。種々の考察が、例えば、Gilmanら編(1990)Goodman  and  Gilman’s:  The  Pharmacological  Bases  of  Therapeutics、第８版、Pergamon  Press；およびRemington’s  Pharmaceutical  Sciences、第17版(1990)、Mack  Publishing  Co.,Easton,Pennに記載されている。投与の方法(例えば、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、または筋肉内投与、経皮的拡散など)は、それらの中でまたは下記に論じられる。薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理食塩水、緩衝液、および例えば、Merck  Index,Merck  &  Co.,Rahway,New  Jerseyに記載される他の化合物を含む。用量の範囲は、適切なキャリアを伴って、通常１mMより低い濃度、代表的には約10μMより低い濃度、通常約100nMより低く、そして好ましくは約10pM(ピコモル)より低く、そして最も好ましくは約1fM(フェントモル)より低い濃度の用量であると通常予想される。徐放性処方物(slow  release  formulation)、または徐放装置は、しばしば連続投与または長期投与に利用される。例えば、Langer(1990)Science  249:1527-1533を参照のこと。
【０１１２】
SLAM、そのフラグメント、およびそれに対する抗体またはそのフラグメント、アンタゴニストおよびアゴニストは、処置されるべき宿主に直接投与され得るか、または化合物のサイズに依存して、それらの投与の前にオボアルブミンまたは血清アルブミンなどのキャリアタンパク質と結合させることが望ましい。治療処方物は、任意の従来の投与処方物で投与され得る。活性成分が単独で投与されることも可能であるが、薬学的処方物として存在することが好ましい。代表的に処方物は、上記に規定されるような少なくとも１つの活性成分を、１つ以上のそれらの受容可能なキャリアと共に含有する。各キャリアは、他の成分と適合性がある点、および患者に対して傷害性でない点で、薬学的にも生理学的にも受容可能であるべきである。処方物は、経口投与、直腸投与、鼻腔内投与、局所投与、または非経口投与(皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、および皮内投与を含む)に適切なキャリアを含む。処方物は、都合の良いように単位用量形態であり得、そして薬学分野において周知の任意の方法によって調製され得る。例えば、Gilmanら編(1990)Goodman  and  Gilman’s:The  Pharmacological  Bases  of  Therapeutics,第８版,Pergamon  Press；およびRemington’s  Pharmaceutical  Sciences,第17版(1990),Mack  Publishing  Co.,Easton,Penn.;Avisら編(1993)Pharmaceutical  Dosage  Forms:  Parenteral  Medications,Dekker,New  York；Liebermanら編(1990)  Pharmaceutical  Dosage  Forms：Tablets,第２版  Dekker,New  York；およびLiebermanら編(1990)  Pharmaceutical  Dosage  Forms:  Disperse  Systems,  Dekker,New  Yorkを参照のこと。本発明の治療は、他の薬剤と組み合わせて、あるいは関連して用いられ得る。
【０１１３】
本発明の天然に存在するSLAMおよび組換え形態のSLAMの両方は、タンパク質に対する結合活性について化合物をスクリーニングし得るキットおよびアッセイ方法において特に有用である。近年自動化アッセイのいくつかの方法が開発され、短期間で何万もの化合物をスクリーニングすることが可能になった。例えば、Fodorら(1991)Science  251:767-773(固体支持体上で合成された複数の規定されたポリマーによって結合親和性を試験する方法を記載している)を参照のこと。適切なアッセイの開発は、本発明によって提供される大量の精製された可溶性SLAMタンパク質の利用可能性によって非常に容易にされ得る。
【０１１４】
他の方法は、SLAM-SLAM相互作用における決定的な残基を決定するのに用いられ得る。変異分析は、相互作用および／またはシグナル伝達において決定的な特異的残基を決定するために行われ得る。例えば、Somozaら(1993)J.Exptl.Med.178:549-558を参照のこと。両方の細胞外ドメイン（同種親和性相互作用に関与する）または細胞内ドメイン（細胞内伝達において重要な相互作用を提供する）。
【０１１５】
例えば、一旦、抗原が構造的に規定されれば（例えば３次元構造データにより）、アンタゴニストは通常見出され得る。潜在的な相互作用アナログの試験が、精製SLAMを用いて、高度に自動化されたアッセイ法の発達により今や可能である。特に、新規のアゴニストおよびアンタゴニストは、本明細書中に記載のスクリーニング技術を用いることにより発見される。種々のSLAM分子（SLAMの種変異体に対するアンタゴニストとして役に立つ化合物）に対して組合された結合親和性を有することが見出だされる化合物は、特に重要である。
【０１１６】
薬物スクリーニングの１つの方法は、SLAMを発現する組換えDNA分子によって安定に形質転換される真核または原核宿主細胞を利用する。他の分子からの単離において、SLAMを発現する細胞が単離され得る。このような細胞は、生存形態または固定化形態のいずれかで、標準的な結合パートナー結合アッセイに使用され得る。Parceら(1989)Science  246:243-247；およびOwickiら(1990)Proc.Nat’l  Acad.  Sci.  USA  87:4007-4011もまた参照のこと。これらは細胞応答を検出する感度の高い方法を記載している。
【０１１７】
薬物スクリーニングの別の技術は、SLAMに適切な結合親和性を有する化合物の高処理量スクリーニングを提供するアプローチを包含し、Geysen、欧州特許出願第84/03564号、1984年９月13日公開に詳細に記載されている。始めに多数の異なる小ペプチド試験化合物を固体支持体(例えば、プラスチックピンまたは他の適切な表面、Fodorら(1991)を参照のこと)上で合成する。次いで、全てのピンを、可溶化された未精製SLAM、または可溶化された精製SLAMと反応させ、そして洗浄する。次の工程は、結合したSLAMの検出を包含する。
【０１１８】
合理的な薬物設計はまた、SLAMおよび他のエフェクターまたはアナログの分子形状の構造研究に基づき得る。エフェクターは、結合に応じて他の機能を媒介する他のタンパク質、またはSLAMと正常に相互作用する他のタンパク質であり得る。特定の他のタンパク質と相互作用する部位を決定する１つの手段は、物理的な構造決定(例えば、Ｘ線結晶学、または２次元NMR技術)である。これらは、どのアミノ酸残基が分子接触領域を形成するかについて指標を提供する。タンパク質の構造決定の詳細な説明については、例えば、BlundellおよびJohnson(1976)Protein  Crystallography,Academic  Press,New  Yorkを参照のこと。
【０１１９】
（IX.  キット）
本発明はまた、別のSLAMまたは結合パートナーの存在を検出する種々の診断キットおよび方法における、SLAMタンパク質、そのフラグメント、ペプチド、およびそれらの融合産物の使用を意図する。代表的に、キットは規定のSLAMペプチドまたは遺伝子セグメント、またはあるものか別のものか(例えば、SLAMフラグメントまたは抗体)を認識する試薬のいずれかを有する区画を有する。
【０１２０】
試験化合物のSLAMに対する結合親和性を測定するためのキットは、代表的に以下の試験化合物を含む；標識化合物(例えば、SLAMに対する公知の結合親和性を有する結合パートナーまたは抗体)；SLAMの供給源(天然に存在するか、または組換え)；および、分子を固定化する固相のように遊離標識化合物から結合標識化合物を分離する手段。一旦、化合物がスクリーニングされると、抗原に対して適切な結合親和性を有する化合物は、当該分野において周知のように適切な生物学的アッセイにおいて評価され得、それらがSLAMシグナル伝達経路に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するかどうかを決定し得る。組換えSLAMポリペプチドの有用性はまた、そのようなアッセイを較正するための十分に規定された標準を提供する。
【０１２１】
例えば、サンプル中のSLAMの濃度を測定するための好ましいキットは、代表的に、標識化合物(例えば、抗原に対して公知の結合親和性を有する結合パートナーまたは抗体)、抗原供給源(天然に存在するか、または組換え)および遊離標識化合物から結合標識化合物を分離する手段(例えば、SLAMを固定化する固相)を含む。試薬を含む区画、および説明書が、通常提供される。
【０１２２】
SLAMまたはフラグメントに特異的な抗体(抗原結合フラグメントを含む)は、増加したレベルのSLAMおよび／またはそのフラグメントの存在を検出する診断適用において有用である。このような診断アッセイは、溶解物、生細胞、固定化細胞、免疫蛍光、細胞培養物、体液を使用し得、さらに血清中の抗原などに関連する抗原の検出を包含し得る。診断アッセイは、同種(遊離試薬と抗原−結合パートナー複合体との間の分離工程を有さない)または異種(分離工程を有する)であり得る。ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素免疫吸着測定法(ELISA)、酵素免疫測定法(EIA)、酵素増加(enzyme-multiplied)イムノアッセイ技法(EMIT)、基質標識蛍光イムノアッセイ(SLFIA)などの種々の市販のアッセイが存在する。例えば、Van  Vunakisら、(1980)Meth  Enzymol.70:1-525；HarlowおよびLane(1980)Antibodies:A  Laboratory  Manual、CSH  Press、NY；およびColiganら、(編)(1993)Current  Protocols  in  Immunology、GreeneおよびWiley、NYを参照のこと。
【０１２３】
抗イディオタイプ抗体は、SLAMに対する抗体の存在を診断するための同様の使用を有し得、それ自体種々の異常な状態の診断であり得る。例えば、SLAMの過剰生成は、種々の免疫学的反応の生成となり得る。それは特に、ガンあるいは異常な活性化または分化のような増殖細胞状態において、異常な生理学的状態の診断となり得る。
【０１２４】
しばしば、診断アッセイのための試薬がキット中に供給され、アッセイの感度を最適化する。本発明のためには、アッセイの性質に依存して、プロトコル、および標識、標識抗体または標識結合パートナーあるいは非標識抗体または非標識結合パートナーのいずれか、または標識SLAMが提供される。これは通常、他の付加物(例えば、緩衝液、安定剤、酵素の基質などのシグナル生成に必要な物質)などとの組み合わせである。好ましくは、キットはまた、正しい利用のための説明書および使用後の内容物のディスポーザーを包含する。代表的には、キットはそれぞれの有用な試薬についての区画を有する。望ましくは、試薬は凍結乾燥粉末として提供される。この試薬は水性媒介物中で再構成され、アッセイを行うために適切な濃度の試薬を提供し得る。
【０１２５】
薬物スクリーニングおよび診断アッセイの任意の前記構成要素が改変せずに使用され得るか、または種々の方法で改変され得る。例えば標識化は、共有結合的にまたは非共有結合的に直接的または非直接的に検出可能なシグナルを提供する部分を結合することにより達成され得る。任意のこれらのアッセイにおいて、結合パートナー、試験化合物、SLAM、またはそれらに対する抗体が、直接的または間接的のいずれかで標識され得る。直接標識の可能性は、標識群を含む：125Iのような放射標識、パーオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素(米国特許第3,645,090号)、および蛍光強度、波長シフト、または蛍光偏光における変化をモニターし得る蛍光標識(米国特許第3,940,475号)。間接標識の可能性は１つの成分をビオチンで標識した後、上記の標識群の１つにカップリングさせたアビジンに結合させることを包含する。
【０１２６】
また、遊離SLAMから結合SLAMを分離するか、あるいは遊離試験化合物から結合化合物を分離する、非常に多くの方法がある。SLAMは種々のマトリックス上で固定化され得、次いで洗浄される。適切なマトリックスは、ELISAプレート、フィルター、およびビーズのようなプラスチックを含む。例えば、Coliganら（編）(1993)Current  Protocols  in  Immunology、第１巻、第２章、GreeneおよびWiley、NYを参照のこと。他の適切な分離技術は、Rattleら(1984)Clin.Chem.30:1457-1461に記載される蛍光抗体磁化粒子法、および米国特許第4,659,678号に記載されるような二重抗体磁化粒子分離を含むが、これらに限定されない。
【０１２７】
種々の標識にタンパク質またはそれらのフラグメントを結合する方法は、広範囲にわたって文献中に報告されており、本明細書中での詳細な考察は必要としない。多くの技術が、ペプチド結合を形成するためにカルボジイミドまたは活性エステルのいずれかの使用を介して活性化されたカルボキル基の使用、結合のためにクロロアセチルなどの活性化ハロゲンまたはマレイミドなどの活性化オレフィンとメルカプト基を反応させることによるチオエーテルの形成などを包含する。融合タンパク質もまた、これらの適用における使用が見出される。
【０１２８】
本発明の別の診断的局面は、SLAMの配列から得られるオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の使用を包含する。これらの配列は異常な状態(例えば、ガンまたは発生の問題)を有する疑いのある患者由来のサンプルにおけるSLAMメッセージのレベルを検出するためのプローブとして使用され得る。RNAヌクレオチド配列およびDNAヌクレオチド配列の両方の調製、配列の標識、および配列の好ましいサイズは、文献中で十分に記載され、そして考察されてきた。例えば、Langer-Saferら(1982)Proc.  Nat’l.  Acad.  Sci.  79:4381-4385；Caskey(1987)Science  236:962-967；およびWilchekら(1988)Anal.  Biochem.  171:1-32を参照のこと。
【０１２９】
他のマーカーの定性的または定量的存在についても試験する診断キットもまた、意図される。診断または予後は、マーカーとして使用される複数の指標の組み合わせに依存し得る。従って、キットはマーカーの組み合わせについて試験し得る。例えば、Vialletら(1989)Progress  in  Growth  Factor  Res.  1:89-97を参照のこと。
【０１３０】
SLAM-IgのSLAMトランスフェクトＬ細胞への結合は、SLAMがリガンドとしてそれ自体と相互作用し得ることを示す。高分子量形態の存在する精製SLAM-Igのネイティブゲル電気泳動は、SLAM-Ig分子もまた溶液中で同種親和性相互作用し得たことを直接示した。モノマーおよびダイマー形態のSLAM-Igは、ネイティブゲル上で優勢であるが、それらは別のバンドではなく、電気泳動の間の解離しやすい敏感なかなり弱い分子相互作用を示した。実際、Ｌ細胞を発現するSLAMへのSLAM-Ig結合のレベルは、等濃度のモノクローナル抗体を用いて観察されたレベルよりも低く、これはSLAM-SLAM相互作用がmAb  A12とSLAMとの相互作用よりも弱いことを示す。他のIgスーパーファミリーメンバー間の相互作用は、抗体の相互作用（van  der  MerweおよびBarclay(1994)  TIBS  19:354-358）よりも本質的に弱い。SLAMがそれ自体に対するリガンドであることと一致して、SLAM-Ig結合は、Ｔ細胞クローンおよびEBV形質転換Ｂ細胞上で観察された。両方の細胞型とも有意なレベルのSLAMを発現する。PBMC由来のCD45RO+Ｔ細胞上でのSLAMレベルは、活性化後のSLAM-Ig結合レベルと相関した。これらのデータは、SLAMに対する別のリガンドが存在し得ることを排斥しないが、別のリガンドの証拠はない。なぜなら、これまで試験されたSLAM陰性細胞型は、SLAM-Ig結合を示さず、そしてSLAM-Ig結合が観察された場合、それはSLAM発現レベルに比例したからである。
【０１３１】
SLAMがそれ自体に対する天然のリガンドであるという生化学的証拠と一致して、SLAMでトランスフェクトされたＬ細胞は、CD4+Ｔ細胞クローンに対する直接的同時刺激性シグナルを提供し得た。SLAMのmAb  A12との結合は、Ｔ細胞活性化の顕著な同時刺激シグナルを提供する。アゴニストmAb  A12で観察されるように、Ｌ細胞上で発現されたSLAMと抗CD3との組み合わせによるCD4+Ｔ細胞クローンの活性化により、増殖が大きく増大する。抗CD3の次善の用量を用いる増殖の同時刺激が、SLAMトランスフェクタントで観察された。SLAMトランスフェクトＬ細胞により提供される刺激は、他の刺激の非存在下でＴ細胞増殖を直接導くに実質的に十分であった。この点に関して、Ｌ細胞上で発現されたSLAMにより提供される直接刺激シグナルは独特のものであり、そして古典的同時刺激分子B7（JenkinsおよびJohnson(1993)Curr.  Opin.  Immunol.  5:361-367）およびB70（Azumaら(1993)Nature  366:76-79）でさえ観察されない。
【０１３２】
B7に対するリガンドはCD28であり、そして抗CD28  mAbはＴ細胞クローンの増殖を直接刺激しない。しかし、抗SLAM  mAb  A12、またはそのF(ab)2フラグメントは、Ｔ細胞増殖を直接誘導し得る。Ｔ細胞クローン上のSLAMの、トランスフェクトＬ細胞上のSLAM、またはmAb  A12もしくはそのF(ab)2フラグメントによる結合の結果は一致する。従って、SLAMの直接結合は、相互作用に他の分子を含むことなく、観察される機能効果を誘導するに十分である。これは、SLAM結合の最も強力な機能効果（例えば、抗原特異的な様式で刺激されたＴ細胞上のSLAMによる非常に大きな同時刺激効果）を達成することにおいて、SLAMとシグナル伝達分子との相互作用の可能性を除外しないか、または他の細胞表面分子の相互作用の重要性を低下させる。
【０１３３】
SLAM遺伝子は、ヒト染色体１上のバンドq21.3とq22との境界面に位置した。染色体１のこの領域は、細胞−細胞相互作用に関与する遺伝子にとって重要な座であるようである。白血球接着およびトラフィッキング（trafficking）に関与する分子である、セレクチンの遺伝子（Watsonら(1990)J.  Exp.  Med.  172:263-272）もまた、1q22-23に位置する。この座（1q21.3-23）での別の遺伝子は、ミエリン（Filbinら(1990)Nature  344:871-872）中の最も豊富なタンパク質である、ミエリンPo（Pham-Dinhら(1993)Hum.  Mol.  Genet.  2:2051-2054）である。SLAMと同様に、ミエリンPoは、Igスーパーファミリーのメンバーであり（WilliamsおよびBarclay(1988)Annu.  Rev.  Immunol.  6:381-405）、そしてまた同種親和的に相互作用する。正常なミエリン構造は、ミエリンPoの自己相互作用に依存し、そしてミエリンPoにおける変異は、1b型のCharcot-Marie-Toothニューロパシーに起因する（Kulkensら(1993)Nat.  Genet.  5:35-39；Hayasakaら(1993)Nat.  Genet.  5:31-34）。Igスーパーファミリーの多くのメンバーは、関連するファミリーのメンバーと異種親和的に相互作用し、重要な例は、LFA-3を有するCD2（Selvarajら(1987)Nature  326:400-403）またはCD48（van  der  Merweら(1993)EMBO  J.  12:4945-4954）；B7-1を有するCD28（Linsleyら(1990)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  87:5031-5035）またはB7-2を有するCD28（Freemanら(1993)Science  262:909-911；Azumaら(1993)Nature  366:76-79）；およびMHCクラスIIを有するTCR（Matsuiら(1991)Science  254:1788-1791）である。多くのIgスーパーファミリーのメンバーがこのように相互作用し得ることは、同種親和的に相互作用する前駆体の遺伝子複製後の進化の結果であり得る（WilliamsおよびBarclay(1988)Annu.  Rev.  Immunol.  6:381-405）。SLAMおよびミエリンPoは、Igスーパーファミリーのメンバーの原始的な機能を保持し、同種親和的に相互作用し得る。
【０１３４】
CD48の遺伝子は、染色体１の、SLAMと同一部分の1q21-23に位置する（Stauntonら(1989)J.  Exp.  Med.  169:1087-1099）。CD2に対する弱いリガンドであると報告されているCD48（van  der  Merweら(1993)EMBO  J.  12:4945-4954）、ならびにマウスNK細胞および細胞傷害性Ｔ細胞上で発現されるシグナル伝達分子である2B4（これに対するリガンドは報告されていない）（Mathewら(1993)J.  Immunol.  151:5328-5337）は、SLAMに最も密接に関連した分子である。興味深いことに、SLAM、CD48、および2B4は全て、１つのＶドメインおよび１つのＣドメインを有し、そして配列CXLXLXCの保存によりIgスーパーファミリーの他のメンバーと区別され得る。第２のシステインはＣドメインに対するつなぎ鎖（tether）であり、そして第１のシステインはおそらくＶドメインとＣドメインとの間に保存された残基である。CD48および2B4は、それらの同種親和的に相互作用する能力についてまだ直接評価されていないが、組換え可溶性形態のCD48が、溶液中で凝集する傾向があることが報告されている。CD48とSLAMとの関係および染色体での同配置は、遺伝子複製後の進化の分岐を示す。
【０１３５】
複数のドメインを有する他の大きなIgスーパーファミリーのメンバーは、同種親和的に相互作用することが報告されており、そしてこれらとしては、血小板内皮細胞接着分子（CD31）(Wattら(1993)Blood  82:2649-2663）、神経膠腫細胞接着分子（GrumetおよびEdelman(1988)J.  Cell  Biol.  106:487-503）、神経膠腫関連細胞接着分子（Mauroら(1992)J.  Cell  Biol.  119:191-202）、神経細胞接着分子またはCD56（Raoら(1992)J.  Cell  Biol.  118:937-949）、およびガン胚抗原（Zhouら(1993)J.  Cell  Biol.  122:951-960）が挙げられる。
【０１３６】
90bpのエクソンを欠失し、SLAMの膜貫通領域に対応し、かつ正確に含む、SLAMの別にスプライスされた形態は、SLAMの分泌形態をコードする。活性化Ｔ細胞により発現されたこの天然に産生した分子は、Ｔ細胞機能を抑制し得、そして細胞−細胞相互作用においてSLAM媒介活性化を弱めるか、または局所的に制限するネガティブフィードバックループの一部であり得る。SLAM媒介Ｔ細胞活性化は、抗IL-2抗体がSLAM誘導Ｔ細胞クローン増殖の阻害に対して無力であることと一致して、シクロスポリンに対して耐性である。Ｔ細胞増殖およびTh1サイトカイン産生に対するSLAM結合の強力な同時刺激効果が得られれば、可溶性SLAMの潜在的免疫抑制活性は、同種移植片拒絶（Pereiraら(1990)J.  Immunol.  144:2109-2116；Zeeviら(1988)Hum.  Immunol.  21:143-153）において見られるように、シクロスポリンに対して比較的耐性の進行する免疫応答の阻害に有効な付加物となる。
【０１３７】
SLAM結合は、Th0/Th1サブタイプに対するサイトカイン産生プロフィールを調節するその能力、および特定の環境下で、Ｔ細胞増殖を直接誘導するその能力に関する、Ｔ細胞活性化について独特の重要性を有する。TCR、CD28、CTLA-4、CD4、およびCD2に加えて、新たに記載されたSLAMは、Igスーパーファミリーのメンバーであるようであり、そしてその結合はＴ細胞応答を調節する。リンパ球上のSLAMの存在は、活性化リンパ球自体が、顕著な同時刺激を提供し得ることを示す。これは、リンパ系器官中の最も優勢な細胞型がリンパ球であるので、予想されないことではなく、リンパ球は統計学的に常に存在する協調因子（collaborator）であり、かつIL-2のようなオートクリンＴ細胞増殖因子の主要な供給源である。SLAMは、強力な同時刺激シグナルを提供し得、かつリンパ系器官内での相対的分離およびリンパ球蓄積の維持に関与し得る。Ｔ細胞同時刺激に関する大部分の研究は、異なる抗原提示細胞およびそれらが発現する分子（特に、CD28およびCTLA-4に対するリガンドであるB7およびB70）に集中している（Jenkins(1994)Immunity  1:443-446）。Ｂ細胞は、活性化されるとSLAMを発現する抗原提示細胞であり、これはIg産生を導くB-T細胞協調を支持する。SLAMに関して本明細書中に記載した同時刺激機能と一致して、CD28欠乏マウスに関する最近の研究は、Ｔ細胞活性化における他の同時刺激分子の役割を引用し（Greenら(1994)Immunity  1:501-508；Shahinianら(1993)Science  261:609-612）、そして他のＴ細胞により提供される同時刺激がＴ細胞活性化に寄与し得ることを示した（Greenら(19994)Immunity  1:501-508；Jenkins(1994)Immunity  1:443-446）。SLAMに加えて、活性化ヒトＴ細胞はMHCクラスIIおよびB7を発現し、そして抗原を提示し得ることが示され（Azumaら(1993)J.  Exp.  Med.  177:845-850）、Ｔ細胞間の相互作用の潜在能力を強調する。これらは、Ｔ細胞のクローン拡大の間に、抗原提示細胞の一定の存在の要求を軽減し得る。天然に産生された可溶性SLAMは、有用なアンタゴニストを提供し、ヒト免疫応答の発生におけるSLAM-SLAM相互作用の重要性をさらに評価する。
【０１３８】
抗SLAMモノクローナル抗体は、IgE合成を誘導（indued）するIg-4を阻害する。これは、Ｔヘルパー細胞レベルまたはＢ細胞レベルのいずれかでのSLAMによるシグナル伝達が、産生T-B細胞相互作用を阻害し、IL-4によるIgEスイッチングおよびIgE産生を生じることを示す。この効果は、直接的（例えば、Ｔ細胞上のSLAMとＢ細胞上のSLAMとの間の相互作用による）、または間接的（例えば、IL-4によるIgE合成を阻害する、Ｔヘルパー細胞によるサイトカイン産生を誘導することによる）のいずれかであり得る。インターフェロン−γは、このようなサイトカインの主要な例である。
【０１３９】
これらの結果はまた、アゴニスト活性を有するSLAMの可溶性形態が、アトピー性患者におけるIL-4および／またはIL-13によるIgE合成を防止し得、それによりIgE媒介アレルギー性疾患をダウンレギュレートする治療有用性を有することを示唆する。SLAMの結合が、優先的にTh1サイトカイン産生を誘導するという事実に加えて、SLAMアゴニストは、明白なTh2プロフィールが含まれる疾患（例えば、アレルギー、特定の自己免疫疾患、または特定の炎症性疾患）におけるTh1応答に対するTh2応答を再指向する一般的な臨床的有用性を有し得る。これは、Hashimotoの甲状腺炎を含む。
【０１４０】
一方、SLAMアンタゴニストは、反対の効果、すなわち、Th1細胞およびTh1細胞由来サイトカインにより生じる疾患状態（例えば、結核およびらい病を含む感染性疾患、または自己免疫疾患（例えば、慢性関節リュウマチおよび自己免疫ブドウ膜炎））におけるTh1応答のブロッキング、を有する。
【０１４１】
これらの治療剤は、寄生虫感染について、ワクチン反応を調節するこのような応答の調節においても有用である。
【０１４２】
本発明の多くの改変および変形は、当業者に明らかであるように、その精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書中に記載される特定の実施態様は、実施例のみにより提供され、そして本発明は、このような請求の範囲が権利を有する等価物の十分な範囲と共に、添付の請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１４３】
（一般的方法）
いくつかの標準的な方法は、例えば、Maniatisら(1982)Molecular  Cloning,A  Laboratory  Manual,Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  Cold  Spring  Harbor  Press；Sambrookら(1989)Molecular  Cloning,A  Laboratory  Manual,(第二版)第１〜３巻,CSH  Press,NY；Ausubelら、Biology,Greene  Publishing  Associates,Brooklyn,NY；またはAusubelら(1987および増刊)Current  Protocols  in  Molecular  Biology,GreeneおよびWiley,New  York；Innisら(編)(1990)  PCR  Protocols:A  Guide  to  Methods  and  Applications  Academic  Press,N.Yに記載され、または述べられている。タンパク質の精製方法は、硫酸アンモニウム沈澱、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化などの方法を包含する。例えば、Ausubelら(1987および定期増刊)；Deutscher(1990)Methods  in  Enzymologyの「Guide  to  Protein  Purification」第182巻、およびこのシリーズの他の巻；および、例えば、Pharmacia  Piscataway,N.J.またはBio-Rad,Richmond,CAのタンパク質精製製品の使用に関する製造業者の使用説明書を参照のこと。組換え技術との組合わせにより適切なセグメント(例えば、FLAG配列またはプロテアーゼによって除去可能な配列を介して融合され得る等価物)への融合が可能になる。例えば、Hochuli(1989)Chemische  Industrie  12:69-70;Setlow(編)のGenetic  Engineering,Principle  and  Methods  12:87-98  Plenum  Press,N.Y.中のHochuli(1990)「Purification  of  Recombinant  Proteins  with  Metal  Chelate  Absorbent」；およびCroweら(1992)OIAexpress:The  High  Level  Expression  &  Protein  Purification  System  QUIAGEN,Inc.,Chatsworth,CAに記載されている。細胞培養技術は、Doyleら（編）（1994）Cell  and  Tissue  Culture:Laboratory  Procedures、John  Wiley  and  Sons、NYに記載されている。
【０１４４】
FACS解析は、Melamedら(1990)Flow  Cytometry  and  Sorting  Wiley-Liss,Inc.,New  York,NY;Shapiro(1988)  Practical  Flow  Cytometry  Liss,New  York,NY；およびRobinsonら(1993)  Handbook  of  Flow  Cytometry  Methods  Wiley-Liss,New  York,NYに記載されている。適切な試薬による蛍光標識は、標準的方法により行った。
【０１４５】
（実施例1：mAbの調製）
抗SLAMモノクローナル抗体A12（IgG1）を、12-0-テトラデカノイル-13アセテート（TPA）（1ng/ml）とCa2+イオノフォアA23187（500ng/ml）（Calbiochem-Behring  Corporation）で5時間活性化した末梢血液単核細胞で免疫感作したBALB/cマウス由来の脾細胞の融合体中で作成した。
【０１４６】
標準的な手法を用いて適切な産生クローンをスクリーニングし、A12ハイブリドーマをクローンとして単離し、通常の分析（例えば産生能力および免疫グロブリンタイプの決定）にかけた。このA12ハイブリドーマ細胞系は1994年11月10日にATCCに寄託され、ATCC受託番号HB11760を与えられている。
【０１４７】
（実施例2：ヒトSLAMのクローニング）
Cocksら（1993）Int.  Immunol.  5:657-663に記載のエレクトロポレーション（電気穿孔法）によって、COS-7細胞を、McKinneyおよびParkinson（1987）J.  Immunol.  Methods  96:271-278の記述に従って調製したA10  CD８+Ｔ細胞ライブラリーDNAでトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞をFITC結合抗SLAM  mAb  A12で染色し、そしてFACStarプラス（Becton  Dickinson）細胞選別装置で選別した。選別した細胞からWizardミニプレップキット（Promega  Corporation）を用いてプラスミドDNAを単離した。増幅のため、プラスミドDNAをエレクトロポレーションによってEscherichia  coli（ElectroMAX,  BRL）に形質転換し、次いでCOS-7細胞に導入した。2回の選別を行った後に、SLAM  cDNAクローンが全cDNAクローンの45％まで濃縮された。これらクローンの1つ（pSURslam1）中の1.8kb挿入物の両鎖を、ジデオキシ鎖終結法を用いて配列決定した。このプラスミドは1994年11月10日にATCCに寄託され、ATCC受託番号69713を与えられている。SLAM変種をコードする他のcDNAクローンも単離し、そして標準的な方法で特徴づけた。具体的には、pSURslam1を鋳型とし、適切なPCRプライマーを用いて、SLAMの細胞外部分または細胞内部分をコードする構築物を調製した。
【０１４８】
（実施例3：マウスSLAMのクローニング）
ヒトSLAMの細胞外ドメインに相当するDNAをハイブリッド形成プローブとして用いることにより、初期胸腺細胞cDNAライブラリー（すなわちαβ,CD4−,CD8−胸腺細胞）からマウスSLAM  cDNAをクローン化した。
【０１４９】
胸腺細胞を単離し、一次抗体を用いて4℃で30分間染色し、2回洗浄した後、FITC結合二次抗体と共に4℃で30分間インキュベートし、3回洗浄した。新たに単離した胸腺細胞を抗SLAMモノクローナル抗体またはIgGで染色した後、FITC結合ヒツジ抗マウス抗体で染色した。FACScan（Becton-Dickinson）装置を用いて、細胞を染色について評価した。
【０１５０】
（実施例4：ヒトSLAMに対する抗体の調製）
C3Hマウスを、pSURslam1で安定にトランスフェクションされたL-細胞で免疫感作した。脾細胞をNJ1骨髄腫系と融合することによってハイブリドーマを作成した。ヒトSLAMに対する適切なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の検出は、間接的免疫蛍光とフローサイトメトリーによった。ハイブリドーマ上清液を、トランスフェクションされていないＬ細胞をコントロールとして、pSURslam1トランスフェクションＬ細胞との反応性についてスクリーニングした。
【０１５１】
（実施例5：マウスSLAMに対する抗体の調製）
ラットをpMSLAM1でトランスフェクションされた107  COS細胞で免疫感作した。ラット膝窩リンパ節細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させることによって、ハイブリドーマを調製した。ポリクローナル血清もまたラットから単離した。
【０１５２】
（実施例6：ヒトSLAMの免疫沈降）
Th0  T-細胞クローンB21の細胞表面タンパク質を、ラクトペルオキシダーゼ触媒反応によって、125I-Na（Amersham）で放射線標識した。ウサギ抗マウスIgと抗SLAM抗血清でコーティングしたPansorbinTM（Calbiochem）を用いて、SLAMを免疫沈降させた。この免疫沈降物を、還元条件下で10%アクリルアミドミニゲル（ISS）にかけ、乾燥したゲルをPhosphorimager（Molecular  Dynamics）で走査、および分析した。
【０１５３】
天然のSLAMは、糖タンパク質に特徴的な拡散様式で、約70kdの移動度特性で移動した。SLAMを1.2μlのN-グリカナーゼ（Genzyme）で終夜処理すると、このタンパク質は約40kdの移動特性で移動した。
【０１５４】
（実施例7：ヒトPBMC上でのSLAM発現）
細胞を抗CD3抗体に様々な時間暴露することによって、ヒトPBMC上でのSLAM発現を誘導する。末梢血液リンパ球を抗CD3抗体（1μg/ml）と共に0、1、2、4、8または24時間培養した。RNAを抽出し、SLAMおよびアクチンプローブを逐次使用するノーザン分析にかけた。PCR分析のため、適切なプライマーをSLAM用とHPRT用に選択した。5ngのcDNAプライマーを30サイクルのPCRにかけた。アクチンシグナルは標準化因子として機能する。
【０１５５】
4kb種は2時間および4時間の時点でははっきりとしているが、0、1、8および24時間の時点でははるかに少ない。2kb種は0および1時間の時点でより検出しにくく、2時間の時点では高く、4時間で減少し、8および24時間の時点で安定化する。
【０１５６】
（実施例8：単核細胞および胎生胸腺細胞上のSLAMの表面発現）
FACS分析のため、健康な提供者から得た末梢血液単核細胞を、TPAおよびA23187Ca２＋イオノフォアと共に（またはこれらを含まずに）6時間インキュベートし、抗CD3チクローム（cychrome）複合体（Pharmingen）、PE結合A12  mAbおよびFITC標識CD45R0（Pharmingen）で染色した。さらに、胎生胸腺細胞をPE結合A12およびFITC結合抗CD3（Becton  Dickinson）で30分間染色し、FACScan（Becton  Dickinson）で分析した。
【０１５７】
刺激されていない末梢血液Ｔ細胞と活性化したＴ細胞（CD3＋細胞）を、CD45R0およびA12に対するmAbで染色した。同様に、胎生胸腺細胞を抗CD3およびA12で染色した。
【０１５８】
非刺激Ｔ細胞には２つの有意な亜集団が存在した：1つはCD45R0を伴わずSLAMをほとんどまたは全く伴わない亜集団で、これは細胞の約49％を占める；もう1つは低SLAMと高CD45R0を伴う亜集団で、この亜集団は細胞の約51%を占める。CD45R0は記憶Ｔ細胞のマーカーであり、SLAMはその発現と正に相関しているように見える。CD45R0−である天然型Ｔ細胞もまたSLAMを欠く。SLAMは記憶Ｔ細胞表現型の有用なマーカーであるようである。
【０１５９】
活性化されたＴ細胞には２つの主要な亜集団が存在した。これらは共に高SLAMであるが、1つは低濃度のCD45R0を有し、これは細胞の約46%を占め、もう1つは高濃度のCD45R0を持っていた。細胞の約4%を占める小さい亜集団は、CD45R0もSLAMも発現しなかった。
【０１６０】
胎生胸腺細胞は、発生の進行を示唆すると思われるパターンを持っていた。SLAMもCD3も示さない小さな細胞亜集団が約2%ある。細胞の約13%はおそらく初期の発生細胞であり、低濃度のCD3と高濃度のSLAMを示す。細胞の約80%はおそらく発生中期にあり、CD3とSLAMの両方を示す。細胞の約5%を占める小さい亜集団は、低濃度のSLAMと高濃度のCD3を示す成熟胸腺細胞である。これはおそらく胸腺の成熟に伴うSLAM発現の進行を反映する。最も初期の成熟段階ではSLAMが高度に発現されるが、最終的には消失する。
【０１６１】
（実施例9：ヒトSLAMの細胞発現）
種々の細胞および組織から得たRNAを、SLAM特異的プライマーによる逆転写とPCRにかけた。ヒトSLAMの組織分布については表2を参照のこと。
【０１６２】
（実施例10：マウスSLAM1の細胞発現）
マウスSLAM1の細胞外ドメインの一部をコードするDNAに特異的なプローブを用いて、この抗原の組織分布の決定した。ネズミSLAM用の600bpプローブDNAを、プラスミドpMSLAM1（マウスSLAM  DNAを含有する）のXhoI/PstI制限消化によって生成し、ゲル電気泳動の後、Promega（Madison,  WI）DNA  Clean  Upシステムを用いて精製した。すべてのプローブをランダムプライミングで標識した。多組織ノーザンブロットをClontechから購入し、Quick  Hyb（Stratagene,  La  Jolla  CA）を用いてプローブした。
【０１６３】
その結果は、SLAMが、心臓、脳、肺、肝臓、骨格筋、腎臓または精巣よりも脾臓においてはるかに多量に発現されることを示した。精巣では他の組織よりも多量に発現するが、胸腺ほどではないようであった。胸腺はノーザンブロット上の組織の一つではなかったが、SLAMはそこで発現されるはずである。マウスSLAM  cDNAはαβ,CD4−,CD8−胸腺細胞からクローン化され、そして、さらに、マウスSLAMを認識するモノクローナル抗体は新たに単離した胸腺細胞の90%に特異的に結合した。胸腺細胞ライブラリーにおけるSLAMクローンの頻度は5000の中で約1であった。
【０１６４】
（実施例11：SLAM相同体の種分布）
様々な種からDNAを得て、EcoRIで消化し、電気泳動し、ブロッティングし、そして転移した後、32Pで標識したヒトSLAMプローブ（ヌクレオチド291-901を含む）と68℃でハイブリダイズさせた。このブロットを60℃の0.2×SSCで洗浄した。様々な種から得たゲノムDNAのサザン分析により、SLAM遺伝子が哺乳類（例えば、ヒト、サル、マウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ウサギ）間ではよく保存されているが、ニワトリと酵母では検出されないことが示された。ラットでも検出されなかったが、陽性コントロールが得られなかった。
【０１６５】
（実施例12：抗SLAM抗体A12で刺激されたＴ細胞クローンによる抗原誘発性サイトカイン生産の増強）
示したＴ細胞クローン（破傷風トキソイドに特異的なCD4+Ｔ細胞クローンMoT72（Th2）およびMoT81（Th0）を含む）を増殖アッセイに対する条件と類似の条件で次の変更を加えて培養した：106Ｔ細胞を、106照射オートロガスEBV-形質転換B細胞、抗原および増殖アッセイについて記述するmAbと共に、24ウェルプレート上のアイセル(Yssel)培地1ml中で培養した。上清液を24時間後に収集し、Chretienら（1989）J.  Immunol.  Methods  117:67-81またはFavreら（1989）Mol.  Immunol.  26:17-25に記載のELISAによってサイトカイン含量を決定した。CD4+Ｔ細胞クローンMoT72（Th2）とMoT81（Th0）は破傷風トキソイドに特異的であり、記述されているように培養した。表3を参照のこと。この研究と同時刺激機能研究に使用したmAbは、カプリン酸(caprilic  acid)分画法（McKinneyおよびParkinson（1987）J.  Immunol.  Methods  96:271-278を参照）とそれに続く硫酸アンモニウム沈殿によって腹水から精製した。mAbをペプシンで消化する標準的な方法でF（Ab’）2を製造した。使用したコントロールmAbはMOPC-21から得たIgG1とIgG1コントロールmAb（Pharmingen）である。
【０１６６】
【表３−１】
2007008958.tif 000005
【０１６７】
【表３−２】
2007008958.tif 000006
（実施例13：Ｔ細胞活性化に対する同時刺激活性）
最近追加投与した提供者から得た末梢血液単核細胞（105/ウェル）を、平底96ウェルプレート上の200μlアイスル培地中で、3ウェルづつ、1μg/mlの破傷風トキソイドまたは精製タンパク質誘導体（PPD）で刺激した。5日後に培養を回収した。培養の最後の16時間、1μCiの3H-Tdrを各ウェルに加え、3H-Tdrの取り込みをβカウンターを用いることによって増殖を測定した。
【０１６８】
次のCD4+Ｔ細胞クローンを使用した：Th0：B21（Bacchettaら（1990）J.  Immunol.  144:902-908）；破傷風トキソイドフラグメント947-960に特異的なMoT72および破傷風トキソイドフラグメント16-35に特異的なChT38（Carballidoら（1993）J.  Immunol.  150:3582-3591に従って調製した）。Th1：熱ショックタンパク質に特異的なHY-06（Haanenら（1991）J.  Exp.  Med.  174:583-592）；精製タンパク質誘導体（PPD）に特異的なTA20とTA23。Th2：Der-p1に特異的なNP44（Th2）とNP12（Ysselら（1992）J.  Immunol.  148:738-745）。供給細胞としての照射PBMCとPHAによる再刺激の5〜7日後にすべてのＴ細胞クローンを回収し、アイセル培地中、特異的抗原（1μg/ml）または破傷風ペプチド（100ng/ml）、および2.5×105オートロガス照射（5000rad）EBV-形質転換B細胞および示したmAbの存在下または非存在下で培養した（5×104/ウェル）。3日後に増殖を測定した。
【０１６９】
抗SLAM  mAb  A12によるＴ細胞クローン増殖の直接的誘導：Ｔ細胞クローンB21とChT38を、mAbとそれらのF（Ab’）2との存在下または非存在下、アイセル培地中で培養した。3日後に増殖を測定した。これら2つの細胞系の投与量依存的増殖が観測された。
【０１７０】
末梢血液リンパ球の抗原特異的Ｔ細胞増殖は、抗SLAM抗体A12によって増強される：A12のFabフラグメントは投与量依存的な増殖を誘導した。免疫感作した提供者から得たPBMCを、mAbフラグメントの存在下または非存在下、破傷風トキソイドまたは精製タンパク質誘導体で刺激した。
【０１７１】
A12抗体によって抗原誘導されたＴ細胞クローン増殖の同時刺激：Ｔ細胞クローンNP12、AR142、ChT38またはHY06を、mAbの存在下または非存在下、それらの特異的抗原で刺激した。すべての結果は、A12またはFabフラグメントのいずれかが投与量依存的に増殖を誘導しうるという解釈に一致した。
【０１７２】
A12抗体によって抗CD3誘導されたＴ細胞クローン増殖の同時刺激：Ｔ細胞クローンB21またはTA20を、A12mAbまたはコントロールIgG1  mAbの存在下または非存在下、抗CD3  mAbで刺激した。いずれの場合も、A12による投与量依存的な増殖が認められたが、コントロール抗体による増殖は認められなかった。増殖は抗CD3量にも依存した。
【０１７３】
（実施例14：SLAM-Ig融合体の調製）
Ｔ細胞同時刺激分子SLAMの潜在的リガンドを同定するため、ヒトIgGのFc部分に融合したSLAMの全細胞外ドメインを含む組換えタンパク質（SLAM-Ig）を生成した。SLAMをコードするDNAを、IgGのFc部分をコードするDNAに融合することによって、SLAM-Igを作成した。SLAMの細胞外ドメインをコードするDNAは、プラスミドpSURslam1を鋳型とし、適切なプライマーを用いるPCRによって生成した。XhoIで消化した後、そのフラグメントをIgG1重鎖のFc部分をコードするcDNAに融合した。SLAM-Ig発現ベクターをCOS細胞中にトランスフェクションし、SLAM-Igをその上清液からプロテインG-セファロース（Sigma）を用いてアフィニティー精製した。
【０１７４】
（実施例15：SLAM-Igは細胞表面上に発現したSLAMに結合する）
組換えSLAM-Igは、SLAM特異的モノクローナル抗体A12の中和に有効であった。このことはSLAM-Igが貫膜SLAMに類似する天然のコンフォメーションを保持していたことを示している。フルオレセイン結合SLAM-Igを種々の細胞タイプの蛍光サイトメトリー分析に用いたところ、試験した多くの細胞タイプに結合しなかった。しかし、SLAM-Igは、SLAMを発現することが示されている細胞タイプには結合した。
【０１７５】
（実施例16：SLAM-Igの分子内相互作用）
Ｔ細胞クローンB21（Bacchettaら（1990）J.  Immunol.  144:902-908）およびHY06（Haanenら（1991）J.  Exp.  Med.  174:583-592）は既に記述されている。胸腺上皮細胞系を、GalyおよびSpits（1991）J.  Immunol.  147:3823-3830に記載のごとく、胎生胸腺由来の培養によって作成した。TEC、TEC、U937系はGalyおよびSpits（1991）にも記述されている。RPMIに保持されるＬ細胞はpSURslam1で安定にトランスフェクションされた。単球をネガティブデプリーションによって精製した。CD32Ｌ細胞はK.  Moore博士（DNAX,  Palo  Alto）から提供された。フィコール（Histopaque-1077,Sigma）上で遠心分離することにより、末梢血液からPBMCを新たに単離した。
【０１７６】
SLAM-IgはSLAMでトランスフェクションしたＬ細胞（SLAM/Ｌ細胞）に結合したが、トランスフェクションしていないＬ細胞には結合しなかった。このことはSLAMが自己親和的に相互作用することを示している。30％ヒト血清に添加した過剰のIgGの存在下で染色を行なったところ、SLAMトランスフェクタントに対するSLAM-Igの結合は、Ig部分ではなくこの分子のSLAM部分に特異的である。さらに、SLAMトランスフェクタントは他のFc含有分子（CD40-Igなど）では染色されなかった。SLAM-Igの結合は、相当する濃度のmAb  A12で観察されたSLAM/Ｌ細胞への結合より約5倍低かった。SLAM-Igの細胞表面SLAMとの相互作用は、SLAMに対する過剰量のモノクローナル抗体によって特異的に阻害することができた。トランスフェクションされた細胞に対するSLAM-Igの結合はEDTAでは阻害されなかった。
【０１７７】
A12抗SLAM  mAbは既に記述されている。フィコエリトリン結合CD45R0およびCD3  mAbはBecton-Dickinsonから購入した。mAb、SLAM-IgまたはCD40-Igで染色した細胞をPBS、2%FCSで3回洗浄し、FACScan（Becton-Dickinson）を用いて分析した。
【０１７８】
フルオレセイン結合SLAM-Igを種々の細胞タイプの蛍光サイトメトリー分析に用いたところ、単球や胸腺上皮細胞系を含めて試験した多くの細胞タイプに結合しなかった。しかし、SLAM-Igは、EBV形質転換B細胞系およびCD4+Ｔ細胞クローンには結合した。本発明者らはこの両方の細胞タイプが共にSLAMを発現することを示している。試験した細胞タイプでは、SLAMを発現しない細胞へはSLAM-Igが結合しなかった。さらにSLAM-Ig結合のレベルは、抗CD3による活性化後、CD45R0＋Ｔ細胞上でのSLAM発現と同時に調節された。異なる細胞タイプに対するA12染色と比較したSLAM-Ig染色のレベルは、Ｌ細胞トランスフェクタントに関して観察されるレベルと一致して、5倍低く、Ca++非依存的だった。
【０１７９】
（実施例17：SLAM-Igの分子間相互作用）
Integrated  Separation  Systemsから購入したゲルとBioRadマルチゲル装置とを用いてゲル電気泳動を行なった。SDS-電気泳動は、10%ゲルを用いて記述した条件下で行い、未変性ゲル電気泳動は2-25%勾配ゲルを用いて製造者の指示に従った。ゲルをクマシーブルーで染色した。MW標準はSigmaから購入した。
【０１８０】
可溶型のSLAM（SLAM-Ig）は細胞表面SLAMと相互作用できるので、SLAM-Igが溶液中で自己親和的に相互作用（例えば自己認識）するかどうかを試験した。精製SLAM-IgはSDS-ゲル電気泳動下でそのサイズに合致する位置に移動し、還元または非還元条件下で1つの分離したバンドを形成する。しかしSLAM-Igは未変性ゲル電気泳動では異常に大きく泳動され、溶液中におけるSLAM-Ig分子の凝集を示唆した。CD40-Igと他のタンパク質バンドは鮮明で、それらのサイズに従うが、同じ条件下でSLAM-Igは、凝集していない場合の予想サイズ160,000に始まり500,000以上までのスミアーを形成する。この分子量範囲には、さらに2つの主要バンドが存在する。１つは〜160,000でもう1つは〜300,000である。これらはそれぞれ1および2分子のSLAM-Igに相当する。SLAM-Igのゲルろ過によって、SLAM-Ig凝集体の存在が確認された。これらの条件下では、単量体の方が優勢ではあるが、SLAM二量体に対応するピークも高分子量物質の中では優勢である。
【０１８１】
（実施例18：SLAMの自己親和的相互作用はＴ細胞の活性化をもたらす）
活性化Ｔ細胞上で発現したSLAMが重要な同時刺激分子であることもまた示された。mAb  A12によるSLAMの結合はＴ細胞増殖とサイトカイン産生の増大を引き起こす。SLAMに対する天然のリガンドもこのような同時刺激シグナルを提供するはずである。これらの結果は、SLAMに対する天然のリガンドがSLAM自身であることを示唆している。したがって、Ｔ細胞に刺激シグナルを与える表面SLAMの能力を試験した。至適投与量以下の抗CD3で、SLAMを発現するＬ細胞はＴ細胞を増殖させる直接的同時刺激シグナルを提供したが、トランスフェクションされていないＬ細胞は無効であった。SLAM/Ｌ細胞はまた、抗CD3または他の刺激シグナルの非存在下で、Ｔ細胞の増殖を直接的に支持し得た。SLAMは、他の刺激物質の非存在下でＴ細胞を直接的に刺激するこの能力によって、LFA-3（BiererおよびHahn（1993）Semin.  Immunol.  5:249-261）、B7（JenkinsおよびJohnson（1993）Curr.  Opin.  Immunol.  5:361-367）およびB70（Azumaら（1993）Nature  366:76-79）を含む他の同時刺激分子（これらはＴ細胞増殖を誘導するために別のシグナルが必要である）とは区別される。
【０１８２】
Ｌ細胞とＴ細胞の間のSLAM-SLAM相互作用は明確な機能的効果を持つので、SLAMでトランスフェクションされたＬ細胞を、少なくとも3つの基準によって、トランスフェクションされていないＬ細胞と識別できたことは驚くにあたらない。第1に、SLAM+Ｌ細胞は、EDTAによる脱離に対して抵抗性で、正常なＬ細胞や他のＬ細胞トランスフェクタントが5分以内に脱離されるのに対して、37℃で30分以上を要する。第2に、トランスフェクションされていないＬ細胞は、接触阻害されるけれども、コンフルエントに達した後も同じ程度に増殖を続けるのに対して、SLAMトランスフェクタントは厳密に接触阻害される。第3に、SLAMトランスフェクタントは、より玉石状の外見を持つ正常Ｌ細胞とはコントロール的に、より細長い形態を持つことが、細胞が絡み合っているコンフルエント単層培養で明白である。脱離したSLAM/Ｌ細胞が懸濁状態でより容易に接着するようには見えなかった。
【０１８３】
（実施例19：SLAM-SLAM相互作用によって誘導されるＴ細胞増殖はシクロスポリンに対して耐性である）
TCRによって媒介されるＴ細胞の活性化は、シクロスポリンによって阻害される。SLAMが媒介するＴ細胞の活性化がシクロスポリン感受性であるかどうかを試験するため、様々な濃度のシクロスポリンの存在下で、Ｔ細胞クローンB21をSLAM/Ｌ細胞で直接的に活性化した。SLAM/Ｌ細胞は、1μgシクロスポリンの存在下でさえ、Ｔ細胞増殖を直接的に支持することができた。興味深いことに、シクロスポリンは、SLAMの自己親和的相互作用によって誘導されたＴ細胞増殖を、100ng/mlを超える濃度で実際に促進した。2μg/mlでは、シクロスポリンはSLAM/Ｌ細胞によって誘導されたＴ細胞増殖を2倍に増強した。
【０１８４】
（実施例20：染色体局在化）
プローブ（pSURslam1）を、ビオチン-14  dATPを用いてニックトランスーションし、2人の正常な男性から得た中期染色体に5ng/μlの最終濃度でインサイチュハイブリダイズさせた。Callenら（1990）Ann.  Genet.  33:219-221に記載の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（FISH）法に変更を加え、分析前に染色体をヨウ化プロジジウム（対比染色として）とDAPI（染色体同定用）の両方で染色した。中期調製物の画像をCCDカメラで取り込み、コンピューターで増強した。
【０１８５】
第1の正常男性から得た20の中期染色体を蛍光シグナルについて調べた。これらの中期染色体のうち19が、第１染色体の1つのまたは両染色分体上の1q21.2-1q23領域にシグナルを示し、このシグナルの34%は1q21.3に、59%はlq22にあった。このことは、これら2つのバンドの境界に近接する位置である可能性を示した。これら20の中期染色体には全部で4つの非特異的バックグランドドットが観察された。第2の正常男性から得た20の中期染色体に対するプローブのハイブリダイゼーションについても同様の結果が得られた。
【０１８６】
この遺伝子は、エリテマトーデス感受性と相関する遺伝子と同じ領域にマップされる。これら2つの遺伝子は同一であり得る。例えばSLAM試薬はこの症状の直接治療物質として有用であり得、あるいはこの遺伝子はそのような遺伝子のマッピングに有用な遺伝子マーカーであり得る。
【０１８７】
（実施例21：SLAM-SLAM相互作用のKd）
BIAcoreTM（Pharmacia）装置を用いて、表面プラスモン共鳴によってSLAM/SLAM相互作用の平衡定数を分析した。抗SLAM  Ab  7D4を用いた。
【０１８８】
Ab  7D4/SLAM-IgとSLAM-Ig/SLAM-Igとの結合動力学および親和性を測定した。製造者のプロトコル（BIAcoreTMマニュアル,Pharmacia  Biosensor）に従って、約8000共鳴単位（RU）のSLAM-Igを、そのリジンを介してセンサーチップ中のデキストランマトリックスに共有結合した。解離しうるタンパク質のすべてが除去され、ベースラインが安定に維持されるまで、フローセルに緩衝液（リン酸緩衝液生理食塩水,PBS,pH7.0）を流した。次に、様々な濃度（10nM〜500nM）の抗体7D4をPBS中に含む溶液をフローセルに通した。結合したタンパク質の質量の増大を観察し、次いでタンパク質溶液を緩衝液に置換した時に減少を観察した。非線型データ分析法（O’Shannessyら（1993）Anal.  Biochem.  212:457-468）を用いてデータを分析することにより、会合速度定数（ka）と解離速度定数（kd）を決定した。表4を参照のこと。次に、kd/ka比から平衡解離定数Kdを計算した。
【０１８９】
SLAM-Ig/SLAM-Ig結合動力学を同様の方法で測定した。SLAM-Igをチップに固定化した後、100nM〜1500nMの範囲のSLAM-Igを5μl/分の流速でフローセルに通した。会合相と解離相から対応する速度定数を求めることにより、平衡結合定数を得た。
【０１９０】
kon速度とkoff速度は共に他の細胞-細胞接着相互作用より遅かった。Kdは他の細胞-細胞接着相互作用（例えば、CD48とのCD2相互作用（約60〜80μM））より数十〜100倍高かった。
【０１９１】
【表４】
2007008958.tif 000007
（配列表）
【０１９２】
【表５】
2007008958.tif 000008
【０１９３】
【表６】
2007008958.tif 000009
【０１９４】
【表７】
2007008958.tif 000010
【０１９５】
【表８】
2007008958.tif 000011
【０１９６】
【表９】
2007008958.tif 000012
【０１９７】
【表１０】
2007008958.tif 000013
【０１９８】
【表１１】
2007008958.tif 000014
【０１９９】
【表１２】
2007008958.tif 000015
【０２００】
【表１３】
2007008958.tif 000016
【０２０１】
【表１４】
2007008958.tif 000017
【０２０２】
【表１５】
2007008958.tif 000018
【０２０３】
【表１６】
2007008958.tif 000019
【０２０４】
【表１７】
2007008958.tif 000020
【０２０５】
【表１８】
2007008958.tif 000021
【０２０６】
【表１９】
2007008958.tif 000022
【０２０７】
【表２０】
2007008958.tif 000023
【０２０８】
【表２１】
2007008958.tif 000024
【０２０９】
【表２２】
2007008958.tif 000025
【０２１０】
【表２３】
2007008958.tif 000026
【０２１１】
【表２４】
2007008958.tif 000027
【０２１２】
【表２５】
2007008958.tif 000028
【０２１３】
【表２６】
2007008958.tif 000029