(57)【要約】【課題】リコンビニアリングコンストラクト、及びジーンターゲティングコンストラクト（ベクター）を作製するためのベクター及びその作製方法を提供することである。【解決手段】２つの致死性選択マーカー遺伝子（例えば、ＳａｃＢ遺伝子）、及び該２つの致死性選択マーカー遺伝子の上流及び下流側近傍に同一の制限酵素によって認識される４つの異なる切断部位（例えば、ＳｆｉＩ切断部位）を有してなるプラスミドベクター。さらに、前記構成に加えＧＦＰｕｖ遺伝子などの選択マーカーを有するプラスミドベクターの提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの負の選択マーカー遺伝子、及び該２つの負の選択マーカー遺伝子の５’上流及び３’下流側近傍に同一の制限酵素によって認識される４つの異なる切断部位を有してなるプラスミドベクター。
【請求項２】
前記負の選択マーカー遺伝子がＳａｃＢ遺伝子である請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項３】
前記制限酵素がＳｆｉＩである請求項１又は２に記載のプラスミドベクター。
【請求項４】
さらなる選択マーカー遺伝子を有して成る請求項１乃至３のいずれかに記載のプラスミドベクター。
【請求項５】
前記さらなる選択マーカー遺伝子がＧＦＰｕｖ遺伝子である請求項１乃至４のいずれかに記載のプラスミドベクター。
【請求項６】
標的領域及び２つの相同領域を組み込んだ前記プラスミドベクターを直鎖状にするための制限酵素認識サイトをさらに有する請求項１乃至５のいずれかに記載のプラスミドベクター。
【請求項７】
前記制限酵素がＩ−ｓｃｅＩである請求項１乃至６のいずれかに記載のプラスミドベクター。
【請求項８】
ｐＡＤＹ、ｐＡＥＦ、ｐＡＤＷから選択される請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項９】
前記負の選択マーカー遺伝子を相同領域で置換した請求項１乃至８のいずれかに記載のプラスミドベクター。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれかに記載のプラスミドベクターを用いてジーンターゲティングベクターを作製する方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法により作製されたジーンターゲティングベクター。
【請求項１２】
ｐＡＧＥ、ｐＡＧＦ，ｐＡＧＩ、ｐＡＧＪ、ｐＡＨＶから選択される請求項１１に記載のジーンターゲティングベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子操作技術分野において有用なベクター及びその作製方法に関する。より詳細には、本発明はリコンビニアリングコンストラクト、及びジーンターゲティング（遺伝子標的）コンストラクト（又はベクター）を作製するためのベクター及びその作製方法、並びに該ベクターを用いて作製したジーンターゲティングベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
相同組換えによるジーンターゲティング法は、標的遺伝子を自在に修飾することができることからこれまでに広く用いられている。本技術は標的遺伝子を単にノックアウトするだけでなく、ノックインや、複雑なコンストラクトの導入などの遺伝子改変全般において極めて有効な技術である。
【０００３】
ジーンターゲティングベクターの構築は、遺伝子改変を行うにあたり多大な労力と時間を要するステップである。従来、相同組換えに必要なホモロジーアーム（homology arms）をゲノムクローンからクローニングするには、ゲノムライブラリーのスクリーニング、制限酵素地図の作成、さらに多くのクローニングステップを経る必要があった。最近では、マウスのゲノム配列が利用可能になったため、広範囲にわたるマウスゲノムの制限酵素地図を改めて作成する手間は省くことができるようになった。しかしながら、従来の方法によるジーンターゲティングコンストラクトの作製は、依然として複雑なクローニングステップを必要とするものである。特に、サイズの大きな構成要素（選択マーカー、ホモロジーアームなど）を組込むためには、適切な箇所で切断する制限酵素サイトを設定する必要があり、この制限酵素の設定が非常に煩雑で困難な作業となっていた。
【０００４】
ジーンターゲティングベクターの構築にあたり、近年開発されたＥＴリコンビネーション（ET recombination）（Zhangら, Nat Genet, 20:123-128,1998）又はリコンビニアリング（recombineering）（Copelandら, Nat Rev Genet, 2:769-779,2001）と呼ばれるリコンビノジェニック（recombinogenic）な技術は、制限酵素サイトの設定を必要としない極めて有効なＤＮＡ操作技術である。この技術はサイズの大きなＤＮＡ分子の修飾を可能とするため、本技術を用いることでＢＡＣ（細菌人工染色体）由来のインサートをジーンターゲティングベクターの調製に用いることができるようになった。リコンビノジェニックな技術によりジーンターゲティングベクターを作製するためには、標的遺伝子の一部やその相同領域（homologous reagions）など、大腸菌内での相同組換えに必要な構成要素を組込んだ直鎖状ＤＮＡ基質を調製する必要がある。
【０００５】
直鎖状ＤＮＡ基質に組込まれる相同領域のサイズが短い場合には（例えば、５０ｂｐ程度）、相同領域に相当するＤＮＡ部分をオリゴヌクレオチドとして合成することが可能で、通常は選択マーカー遺伝子などを増幅するためのＰＣＲプライマーとして付与される。この場合、直鎖状ＤＮＡ基質をＰＣＲで調製した後、リコンビノジェニックな技術を用いてＢＡＣクローン中に挿入し、大腸菌内で相同組換えを行わせることで目的のジーンターゲティングベクターを作製することができる。このような方法は比較的構成の単純なジーンターゲティングベクターの構築によく用いられている。しかし、直鎖状ＤＮＡ基質をＰＣＲ法で調製すると、ＰＣＲの過程において、比較的高頻度でＤＮＡ基質領域に変異が導入されることがある。特に、ＩＲＥＳ、ｌｏｘＰ及びレポーター遺伝子を含むような長くて複雑な構成を持つＤＮＡ基質を調製する場合には、突然変異が入りやすく望ましい基質を得ることが難しくなる。
【０００６】
Ａｎｇｒａｎｄらは、ＥＴリコンビネーション法を従来のライゲーションを用いたクローニング方法と併用することにより突然変異が生じるリスクを回避しようと試みた結果、λゲノムクローンの改変に成功した（Angrandら, Nucleic Acids Res, 27:e16,1999）。しかし、この方法は２ステップの修飾を必要とすることから多少煩雑な作業が必要となる。
Ｌｉｕら（非特許文献１、特許文献１、特許文献２及び特許文献３）及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（非特許文献２、特許文献４及び特許文献５）は、直鎖状ＤＮＡ基質に相同領域を導入するためにライゲーション法に基づいたクローニングを用いた。彼らは、ＰＣＲで増幅した２００−５００ｂｐの相同領域又はオリゴヌクレオチドとして提供される５０−２００ｂｐの相同領域を用いた。この手法の利点はＰＣＲによって生じる突然変異の可能性を回避する点と、より長い相同領域による組換え頻度の増大に伴う望ましくない組換え産物を除く点である。しかし、バックグラウンドクローンに関しては、ＰＣＲで増幅した直鎖状ＤＮＡ基質の場合、ＰＣＲテンプレートをＤｐｎＩで切断することにより、ほとんどのバックグラウンドクローンを除去できるのに対し、Ｌｉｕらの方法では、未切断ベクターによるバックグラウンドクローンを有効に除去することが困難であった。さらに、６塩基認識部位を持つ複数の制限酵素（ＥｃｏｒＩ、ＢａｍＨＩなど）をうまく設定するなどの煩雑な作業も必要であった。
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｉｕら，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，  １３：４７６−４８４，  ２００３
【非特許文献２】Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２１：６５２−６５９，  ２００３
【特許文献１】ＷＯ０２／１４４９５
【特許文献２】ＵＳ２００３／０２２４５２１
【特許文献３】ＵＳ２００４／００９２０１６
【特許文献４】ＵＳ２００２／０１０６６２８
【特許文献５】ＵＳ２００５／０１４４６５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のように、ジーンターゲティングベクターを作製する場合において、リコンビノジェニックな技術又はリコンビニアリングなどによりＢＡＣへの修飾を行う段階の作業効率は格段に改善されたが、それよりも前の段階、すなわち、リコンビノジェニックエンジニアリングにおいて用いられるコンストラクトの作製に関しては、依然として従来法による煩雑な手法を用いる必要があった。
従って、本発明の目的は、ジーンターゲティングコンストラクト（ベクター）を作製するためのベクター及びその作製方法を提供することである。
さらに、本発明の目的は、該ベクターを用いて作製したジーンターゲティングベクターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、リコンビノジェニックエンジニアリングにおいて必要となるホモロジーアーム、選択マーカー遺伝子、リコンビナーゼ認識配列を組み込んだ直鎖状ＤＮＡ基質をいかに簡便に作製するかについて、鋭意研究を重ねた結果、２つ負の選択マーカー遺伝子（例えば、ＳａｃＢ遺伝子）とこれら２つの負の選択マーカー遺伝子の上流及び下流側近傍に同一の制限酵素（例えば、ＳｆｉＩ）によって認識される４つの異なる切断部位を配置することによって、１ステップで直鎖状ＤＮＡ基質を作製することが可能となることを見いだし、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１２）である。
（１）本発明の第１の実施態様に係る発明は、「２つの負の選択マーカー遺伝子、及び該２つの負の選択マーカー遺伝子の５’上流及び３’下流側近傍に同一の制限酵素によって認識される４つの異なる切断部位を有してなるプラスミドベクター」である。
（２）本発明の第２の実施態様に係る発明は、「前記負の選択マーカー遺伝子がＳａｃＢ遺伝子である上記（１）に記載のプラスミドベクター」である。
（３）本発明の第３の実施態様に係る発明は、「前記制限酵素がＳｆｉＩである上記（１）又は（２）に記載のプラスミドベクター」である。
（４）本発明の第４の実施態様に係る発明は、「さらなる選択マーカー遺伝子を有して成る上記（１）乃至（３）のいずれかに記載のプラスミドベクター」である。
（５）本発明の第５の実施態様に係る発明は、「前記さらなる選択マーカー遺伝子がＧＦＰｕｖ遺伝子である上記（１）乃至（４）のいずれかに記載のプラスミドベクター」である。
（６）本発明の第６の実施態様に係る発明は、「標的領域及び２つの相同領域を組み込んだ前記プラスミドベクターを直鎖状にするための制限酵素認識サイトをさらに有する上記（１）乃至（５）のいずれかに記載のプラスミドベクター」である。
（７）本発明の第７の実施態様に係る発明は、「前記制限酵素がＩ−ｓｃｅＩである上記（１）乃至（６）のいずれかに記載のプラスミドベクター」である。
（８）本発明の第８の実施態様に係る発明は、「ｐＡＤＹ、ｐＡＥＦ、ｐＡＤＷから選択される上記（１）に記載のプラスミドベクター」である。
（９）本発明の第９の実施態様に係る発明は、「前記負の選択マーカー遺伝子を相同領域で置換した上記（１）乃至（８）のいずれかに記載のプラスミドベクター」である。
（１０）本発明の第１０の実施態様に係る発明は、「上記（１）乃至（９）のいずれかに記載のプラスミドベクターを用いてジーンターゲティングベクターを作製する方法」である。
（１１）本発明の第１１の実施態様に係る発明は、「上記（１０）に記載の方法により作製されたジーンターゲティングベクター」である。
（１２）本発明の第１２の実施態様に係る発明は、「ｐＡＧＥ、ｐＡＧＦ，ｐＡＧＩ、ｐＡＧＪ、ｐＡＨＶから選択される上記（１１）に記載のジーンターゲティングベクター」である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のベクターを用いることにより、ジーンターゲティングベクターの構築に必要なホモロジーアーム、選択マーカー遺伝子などの構成要素を保持した直鎖状ＤＮＡ基質を１ステップで作製することができる。
【００１２】
さらに、この１ステップのクローニング過程において、煩雑な制限酵素の設定作業を回避し、ゲル濾過などによる精製過程を経ずにバックグラウンドクローンの出現を抑えることが可能となることから、ジーンターゲティングベクターの構築に要する時間と労力の短縮を実現することができる。
【００１３】
また、本発明のベクターにGFPuv遺伝子などのさらなる選択マーカー遺伝子を保持させることで、直鎖状ＤＮＡ基質を保持するプラスミドの選択及びリコンビノジェニックエンジニアリングの過程における組換え体の選択を容易に行うことができる。
【００１４】
以上の点から、本発明のベクターを用いることで、ハイスループットな遺伝子改変を効率的かつ簡便に行うことができる。特に、複雑な構造を持つジーンターゲティングベクターの構築に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明はベクターに関するもので、本ベクターを用いるとリコンビニアリング、及びジーンターゲティングを行うのに必要な相同領域を１ステップで構築することが可能となる。具体的には、本発明のベクターは２つの負の選択マーカー遺伝子と、該２つの負の選択マーカー遺伝子を挟み込むよう位置（すなわち、該マーカー遺伝子の５’上流及び３’下流側に数ベース〜数百ベース離れた位置）に、各々２箇所、合計４箇所、同一の制限酵素で認識される異なる認識配列が配置されたものである。
ここで、「負の選択マーカー遺伝子」とは、栄養選択性であっても薬剤選択性であってもよく、特定の条件下において該マーカー遺伝子が挿入されたプラスミドを保持する宿主細胞を区別できるような遺伝子であれば如何なるものも使用することができる。該マーカー遺伝子は当業者であれば容易に選択可能であるが、例えば、ＳａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子などが好適に利用可能である。ＳａｃＢ遺伝子は大腸菌にとって致死性の代謝物をスクロースから生成するため、ＳａｃＢ遺伝子を保有する大腸菌はスクロース存在下で生育することができない。そのため、形質転換体をスクロース含有培地で培養することで、ＳａｃＢ遺伝子が相同領域と置換した目的のクローンのみを選択することができる。また、該マーカー遺伝子は本発明に係るベクター１つに少なくとも２つ存在する。該マーカー遺伝子は、２つの相同領域がクローニングされたかどうかを確認するために必要となるものである。相同領域が１箇所のみでは、所望の相同組換えを達成することができない。ここで「相同領域」とは、大腸菌内もしくはES細胞内における相同組換えに必要な領域で、組換えを起こさせたいＤＮＡ領域の一部と相同性のあるＤＮＡ配列領域のことである。
【００１６】
また、「同一の制限酵素で認識される異なる認識配列」とは、切断が行われた場合、切断部位は非同一かつ非相補的な３’又は５’オーバーハング（突出末端）を生じさせる配列のことである。このような認識配列を複数箇所で切断した場合、各切断部位同士でライゲーションを起こすことがなく、しかも切断部位にクローニングしたい相同領域ＤＮＡ断片の両末端を各切断部位と相補的になるようにデザインすれば、該ＤＮＡ断片を所定の方向に挿入することができる。従って、相同領域のクローニングを行うにあたり、ベクターのみ、インサートのみのセルフライゲーションを回避することができ、しかも１種類の酵素のみの使用で、１ステップのライゲーション反応でクローニングを達成することができる。
さらに、相同領域のクローニングを行う上で、このような異なる切断配列を認識することができる酵素は、レアカッターである方が望ましい。特に、長い相同領域のクローニングを行う場合には、相同領域自体を切断せずに切り出せるレアカッター制限酵素が好適に使用可能である。
本発明で用いられる制限酵素は上記性質を有するものであれば如何なるものも使用可能であり、特に限定はしないが、例えば、ＳｆｉＩ、ＸｃｍＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢｂｓＩ、ＢｓａＩなどが好適に利用可能である。ＳｆｉＩは、５塩基でインターラプトされたパリンドローム配列（５’−ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣＣ−３’；配列番号１）を認識し、切断後、非同一かつ非相補的な３ヌクレオチドの３’オーバーハングが生じる制限酵素である。また、ＳｆｉＩはレアカッターであるため、本発明における使用には好ましい酵素である。
【００１７】
本発明のベクターは、相同領域、選択マーカー遺伝子、及び／又はコンディショナルジーンターゲティングに必要な構成要素（例えば、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ配列などのリコンビナーゼ認識部位）などを構築した後、直鎖状にし、リコンビノジェニックエンジニアリングの過程に使用することができる。直鎖状にする場合には、前記構成要素を切断することなく直鎖状にすることが望ましい。そのため、本発明のベクターは、構成要素を構築した後に直鎖状にするための制限酵素認識サイトを有してもよい。そのような酵素としては、長い認識配列を持つレアカッターが望ましく、例えば、メガヌクレアーゼのＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、又は８−塩基認識のレアカッターであるＮｏｔＩなどが好適に利用可能である。
【００１８】
本発明のベクターには、さらなる選択マーカー遺伝子を含んでもよい。「さらなる選択マーカー遺伝子」とは、「正の選択マーカー」及び「負の選択マーカー」のいずれとしても機能し得るマーカー遺伝子を意味する。すなわち、クローニングの過程において、あるステップでは「さらなる選択マーカー遺伝子」を含むクローンを選択し、他のステップでは「さらなる選択マーカー遺伝子」を含まないクローンを選択することによって、クローニングの目的を達成せしめるような遺伝子のことである。
「さらなる選択マーカー遺伝子」としては、限定はしないが、例えば、ｇａｌＫ、ｌａｃＺ、ＧＦＰｕｖなどが使用可能である。特に、ＧＦＰｕｖが好ましい。ＧＦＰｕｖはＧＦＰの変異体であるが、ｕｖで励起したときに最大の蛍光を発する。ＧＦＰｕｖ遺伝子は、相同領域、標的領域などを構築した直後のプラスミドを選択する際には正の選択マーカーとして機能するが、直鎖状にした後、ＧＦＲｕｖ遺伝子が除かれるようにデザインすると、リコンビノジェニックエンジニアリングの過程において正しく相同組換えが行われたクローンを選択する際には負の選択マーカーとして利用することが可能となる。つまり、相同領域、標的領域などを構築した直後のプラスミドを選択するには、ＵＶイルミネーターなどにでＵＶを照射した際、蛍光を発するクローンを選択すればよく、また、リコンビノジェニックエンジニアリングの過程で正しく相同組換えが行われたクローンを選択する場合には、蛍光を発しないクローンを選択すれば最終的にジーンターゲティングベクターを得ることができる。ここで、「標的領域」とは、ターゲティングを行う対象ゲノム領域上に組込む構成要素（例えば、組込むべき任意の遺伝子、選択マーカー遺伝子、ホモロジーアーム、ｌｏｘＰやＦＲＴカセットなどのリコンビナーゼ認識配列など）を含んだＤＮＡのことを意味する。
【００１９】
本発明の方法により作製されたジーンターゲティングベクターも本発明の範囲に含まれる。ここで、「ジーンターゲティング」とは、当業者において最も広く認識される概念であり、特定遺伝子のノックアウトのみならず、ノックインやコンディショナルジーンターゲティングなど、遺伝子改変全般を意味する。本発明のジーンターゲティングベクターは、本発明のジーンターゲティングコンストラクト作製用ベクターを用いることで、当業者において容易に作製することができる。コンディショナルジーンターゲティング用のベクターの作製においては、導入すべきコンストラクトに含まれる構成要素の作製に市販のテンプレートを用いることもできる。
【００２０】
本発明のベクターには大腸菌において効率的に複製する上で必要な構成成分（例えば、複製起点など）、及びクローニングを効率的に行う上で必要となるマルチクローニングサイトなど、通常のクローニングを行う上で当業者が必要と認める全ての構成成分を備えているものである。本発明のベクターを作製する場合、既知のプラスミドベクターを骨格として使用することができる。既知のプラスミドベクターとしては、当該技術分野において利用可能なものであれば如何なるものでもよく、例えば、ｐＢＲ３２２系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｐｔ系プラスミド、ｐＵＣ系プラスミドなどが利用可能である。
【００２１】
次に本発明を具体例によって説明するがこれらの例によって本発明が限定されるものではない。
【実施例】
【００２２】
本実施例において用いた遺伝子操作技術は当業者が通常行っている方法に基づいている（Sambrookら, Molecular cloning: A laboratory manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, NY. 1989）。
１．本発明のベクターの説明
本発明において構築した新規クローニングベクター（図１、ｐＡＤＹ（配列番号５３），ｐＡＥＦ（配列番号５４），ｐＡＤＷ（配列番号５５））は相同領域を１ステップでクローニングできるようにデザインされている。本実施例においては、以下の２つの理由に基づいてＳｆｉＩサイト（５’−ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣＣ−３’、配列番号１）をこれらのベクターに導入した。第１の理由は、インターラプトされたパリンドローム構造をとるＳｆｉＩ認識サイトがＳｆｉＩによって切断されると、非同一かつ非相補的な３ヌクレオチドの３’オーバーハングが生じる点にある。相同領域ＤＮＡフラグメントの両末端配列を、挿入すべきＳｆｉＩ認識配列と相補的になるようにデザインすれば、該ＤＮＡフラグメントは目的の位置と方向（図１最上段及び図３を参照のこと）になるようにクローン化することができる。また、ベクター中に導入された４つのＳｆｉＩサイトの各末端は、同一のＳｆｉＩ酵素の切断により生じるが、相補的でも自己相補的でもないため、ベクターのみ又はインサートのみによるセルフライゲーションは起こらない。従って、１ステップのライゲーション反応により、２つの相同領域のクローン化を簡便かつ迅速に行うことができ、ＳｆｉＩ以外の他の酵素も必要としない。２つ目の理由は、ＳｆｉＩはレアカッター制限酵素であるため、相同性領域として機能し得る比較的長いＤＮＡフラグメントのクローニングに適していることである。本実施例では、４つのＳｆｉＩサイトをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベースのベクターに導入した。
さらに、これらのベクターは２つのＳａｃＢ遺伝子を保持しており、各々２つのＳｆｉＩサイトに挟まれている（図１）。ＳａｃＢ遺伝子産物はレバンスクラーゼと称され、スクロースを宿主細胞に毒性を有するレバンに変換する（Gayら, J Bacteriol, 164(2):918-921, 1985）。そのため、ＳａｃＢ遺伝子は負の選択マーカーとして有用である。ＳａｃＢ遺伝子はクローニング過程で容易に相同領域と置換することができる（図３）。
【００２３】
１−１．ｐＡＤＹベクター
ｐＡＤＹベクター（図１）は、リコンビノジェニッククローニング法で用いられる直鎖状ＤＮＡ基質の構築のために開発したものである。このベクターには、マルチクローニングサイト（ＡｓｃＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ及びＮｈｅＩを含む）が配置されている。ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ及びＮｈｅＩサイトは同じ粘着末端（５’−ＣＴＡＧ−３’、配列番号２）を生じさせる。相同領域及び標的フラグメントをベクター中に構築した後（例えば、図３のｐＡＦＤ）、そのまま使用可能な直鎖状ＤＮＡ基質を作製するために該プラスミドをメガヌクレアーゼのＩ−ＳｃｅＩで切断した。ＰＣＲ増幅直鎖状ＤＮＡ基質を用いた初期のリコンビノジェニックエンジニアリングでは、ＰＣＲテンプレートプラスミドのコンタミネーション由来のバックグラウンドクローンの出現をＤｎｐＩでテンプレートを切断することにより抑制することができた。しかし、本実施例では、プラスミドに由来する直鎖状ＤＮＡフラグメントを基質として使用したため、そのようなアプローチは実用的ではなかった。そこで、それに代わる手段として、本発明のベクターに、ＧＦＰｕｖ遺伝子をｐＡＤＹのｌａｃプロモーターの３’下流に導入した（図１）。ＧＦＰｕｖ遺伝子を持つｐＡＤＹ及びｐＡＥＦを保持するコロニーのみがＵＶランプ照射によって蛍光を発した（図２）。
【００２４】
１−２．ｐＡＥＦベクター
ｐＡＥＦベクター（図１）はリコンビノジェニッククローニング技術法を用いたＢＡＣクローンのサブクローニングによるジーンターゲティングベクターの構築に使用することができる。ｐＡＥＦベクター中のＳａｃＢ遺伝子を相同領域で置換して得られたベクター（例えば、図５のｐＡＦＱ）を、ＡｓｃＩで消化した後、ＢＡＣサブクローニングに使用した。ｐＡＥＦに含まれるＧＦＰｕｖカセットはＧＦＰｕｖネガティブ非組換えクローンを除去するのに使用することができる。また、ＥＳ細胞のジーンターゲティングに使用されるネガティブ選択マーカーであるジフテリアトキシンフラグメントＡ（ＤＴ−Ａ）カセットをｐＡＥＦ中に導入した。得られたジーンターゲティングベクターを直鎖状にするために、Ｉ−ＳｃｅＩ認識部位を配置した。
【００２５】
１−３．ｐＡＤＷベクター
ｐＡＤＷ（図１）は従来のＰＣＲベースの方法によるジーンターゲティングコンストラク作製用に開発したものである。ＰＣＲ増幅したホモロジーアームをｐＡＤＷ中に導入した（例えば、図５のｐＡＩＰ）。この場合、より長いホモロジーアームがＥＳ細胞における効率的な相同組換えを促進するため、ホモロジーアームの長さは十分に長い（〜１０ｋｂ）必要がある。ｐＡＤＹと同様に、ＡｓｃＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ及びＮｈｅＩ酵素サイト及びＤＴ−ＡカセットがｐＡＤＷ中に含まれている。
【００２６】
１−４．ｐＡＥＪ及びｐＡＥＫベクター
ｐＡＥＪ（配列番号５６）及びｐＡＥＫベクター（配列番号５７）（図１）は、相同領域の両末端にＳｆｉＩサイトを導入するためのプラスミドである。両末端にＡｓｃＩサイトを持つＰＣＲ増幅相同領域をＡｓｃＩ切断の後これらのベクターのＭｌｕＩサイト中にクローン化することができる。ＡｓｃＩはレアカッター制限酵素であるため、より長いＤＮＡフラグメントをこれらのベクター中にクローン化し、相同領域として使用することができる。
【００２７】
２．本発明のベクターの構築
本発明の実施おいて用いた制限酵素は、全てＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ(ＮＥＢ社)から購入した。ｐＡＥＪとｐＡＥＫを構築するためにｐＵＣ１１９のマルチクローニングサイトをＳｆｉＩとＭｌｕＩサイトで置き換えた。各ＳｆｉＩサイトは非同一の粘着末端を生じるようにデザインした。ｐＡＤＹ、ｐＡＤＷ及びｐＡＥＦは、複数のステップにより構築した。これらのベクターのバックボーンはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔであるが、ＫｐｎＩサイト以外のマルチクローニングサイトは除かれている。マルチクローニングサイト（ＡｓｃＩ，ＸｂａＩ，ＳｐｅＩ及びＮｈｅＩ）はオリゴヌクレオチドリンカー（配列番号３及び配列番号４）として提供される。用いたＳａｃＢ遺伝子はｐＤＮＲ−Ｄｕａｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に由来するものである。両側にＳｆｉＩサイトを持つＳａｃＢ遺伝子は、ｐＤＮＲ−Ｄｕａｌテンプレートとして、以下のプライマーによりＰＣＲ増幅させ、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ切断後、ｐＵＣ１１９ベクターに導入した。次にＳａｃＢカセットを、ＢｂｓＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ及びＸｈｏＩを用いてｐＡＤＹ、ｐＡＤＷ及びｐＡＥＦ中に構築に使用した。
ｐＡＤＹ用
ＧＥ−Ｆ２                                                （配列番号５）
ＧＥ−Ｒ３                                                （配列番号６）
ｐＡＥＦ用
ＧＥ−Ｆ４                                                （配列番号７）
ＧＥ−Ｒ２                                                （配列番号８）
ｐＡＤＷ用
ＧＥ−Ｆ１                                                （配列番号９）
ＧＥ−Ｒ１−２                                            （配列番号１０）
【００２８】
ｐＡＥＦ中のＧＦＰｕｖ遺伝子は、ｐＧＦＰｕｖ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）をから以下のプライマーセットを用いて増幅し、ＡｓｃＩ切断の後、ベクター中に導入した。
ＧＥ−Ｆ３                                                （配列番号１１）
ＧＥ−Ｒ５                                                （配列番号１２）
ｐＡＤＹ中のＧＦＰｕｖ遺伝子は、ｐＧＦＰｕｖ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）をから以下のプライマーセットを用いて増幅し、ＰＣＲ増幅産物をＢｓｔＩで切断後、ベクターのＫｐｎＩサイトに導入した。
Ｆ                                                        （配列番号１３）
Ｒ                                                        （配列番号１４）
ｐＡＤＹ中のＧＦＰｕｖ遺伝子は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのｌａｃオペレーター配列のコントロール下、読み枠が合うにように配置されている。ｐＡＤＷ及びｐＡＥＦ中のＤＴ−Ａ遺伝子は、ｐＭＣ１ＤＴｐＡベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントに由来する（１２）。
【００２９】
３．相同領域の１ステップクローニング
３−１．結果
本発明によって開示されるベクターを用いた相同領域の１ステップクローニング手順を図３に示した。相同領域をまずｐＡＥＪとｐＡＥＫに挿入する（図３−ａ）。相同領域は、二重鎖オリゴ（図３―ｂ）又はベクターのＳｆｉＩサイトに相補的な粘着末端を持つＰＣＲ増幅フラグメント（図３−ｃ）としても提供される。ＳｆｉＩ切断ベクター（図３中のｐＡＥＹ）はＳｆｉＩ切断ＨＲ１（相同領域１）とＨＲ２（相同領域２）の両方と一度の反応で直接ライゲーションさせることができる。非同一なＳｆｉＩ切断によって生じた粘着末端を用いると、ｐＡＦＤ（図３）などの正しくライゲートしたクローンが得られる。
【００３０】
本発明のベクター中に存在するＳａｃＢ遺伝子及びＳｆｉＩサイトが相同領域のクローニングにおいて効率的に機能するかどうか評価するためにクローニング効率を調べた（表１）。この実験において、５０ｂｐ−二重鎖オリゴとして供給された異なる濃度の相同領域（ＨＲ）を、標的フラグメントを含むＳｆｉＩ切断ｐＡＥＹベクターとのライゲーションに用いた（図３）。オリゴの配列は、非古典的クラスＩ ＭＨＣ分子の一つであるＨ２−Ｍ５遺伝子座位の配列と相同である。相同領域のクローニング効率を、ゲル濾過を行ったベクターと行わなかったベクター、及びスクロースを含むＬＢプレートとスクロース含まないＬＢプレートとの間で比較した（表１）。より高い濃度のオリゴを相同領域として用いた場合、生じたクローンのほとんどは、スクロースを含まない場合であっても、相同領域を保持した正しいクローンであった。多くのバックグラウンドクローンは、より低い濃度のオリゴを非ゲル濾過ベクターとライゲーションし、形質転換体をスクロース非存在下で培養した場合に生じたが、スクロースの存在下で培養することで顕著に減少した。この条件では、選択した全ての組換体クローンが両方の相同領域を正しい位置及び正しい方向で含んでいた（表1、kan/amp/suc）。また、４００−６００ｂｐのＰＣＲ増幅フラグメントを相同領域の入手源として用いた場合でも（図３−ｃ）良い結果が得られた。
【００３１】
【表１】
2007124915.tif 000002
【００３２】
相同領域を供給するＤＡＮフラグメントがｐＡＥＪ及びｐＡＥＫ（図１）のインサートから供給される場合、ｐＡＤＹ及びｐＡＥＦに含まれる変異型緑色蛍光タンパク質をコードするＧＦＰｕｖ遺伝子がポジティブ選択マーカーとして有効に機能した。表２はポジティブセレクションとしてのＧＦＰｕｖ遺伝子の利用効果を示している。本実験において、ｐＡＥＪ及びｐＡＥＫ中にＨ２−Ｍ５遺伝子座位（Takadaら, Genome Res, 13(4):589-600, 2003）のＨＲ１及びＨＲ２を各々保持するｐＡＦＥ及びｐＡＦＦを用いた（表３を参照）。ｐＡＦＥ及びｐＡＦＦをＳｆｉＩで切断することによって調製した相同領域に対して、ゲル濾過を行わなかった。これらのフラグメントは、ゲル濾過も脱リン酸化も行っていないＳｆｉＩ切断ベクターｐＡＥＦ（図１）又はｐＡＥＹ（図３）とライゲーションさせた。そのため、多くのバックグラウンドクローンを出現させ得るｐＡＦＥ及びｐＡＦＦに由来するベクター骨格もライゲーションミックスに含まれていた。ｐＡＤＹ由来のｐＡＥＹは、大腸菌にカナマイシン耐性を付与するｎｅｏを含む複雑なインサートを含んでいる（図３）。形質転換体をアンピシリンとスクロースの存在化において選択した場合、未切断及び／又はセルフライゲートしたｐＡＦＥ及びｐＡＦＦベクターに由来する多くのバックグラウンドクローンが生じた。これらのバックグラウンドクローンは、ｐＡＥＪ及びｐＡＥＫにβ−ラクタマーゼ遺伝子を使用する代わりにｚｅｏｃｉｎ（ゼオシン）などの他の選択マーカーを導入することによって回避することができる。あるいは、本発明のベクターに含まれるＧＦＰｕｖ遺伝子が発する緑色蛍光の有無によってもバックグラウンドクローンから正しいクローンを効率よく選別することが可能である。本実験において、ＧＦＰ蛍光選択の後、１／２以上のクローン（ＧＦＰ＋）が正しいクローンとして見いだされた（表２）。この結果は、ＧＦＰｕｖ遺伝子が相同領域のクローニングにおいてポジティブ選択マーカーとして有用であることを示す。特に、カナマイシンによる選択により、ｐＡＥＹベクターに由来するバックグラウンドクローンを完全に除去することができた。
【００３３】
【表２】
2007124915.tif 000003
【００３４】
また、本発明のベクターは、５ｋｂ以上の長い相同領域をクローニングするためにも有効に利用することができた（図４及び図５）。従って、本発明のベクターは、ＥＳ細胞における相同組換えに直接使用することができる長い相同領域の組込みにも利用することができることを示す。本方法により、ジーンターゲティングベクターを１週間以内で構築することが可能となる。
【００３５】
３−２．方法
Ｈ２−Ｔ３ＴＶ（Ｈ２−Ｈ３ジーンターゲティングベクター）構築のためのＨＲ１（相同領域１），ＨＲ２（相同領域２），ＨＲ３（相同領域３）及びＨＲ４（相同領域４）は、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、ＢＡＣクローン（ｃｉｔｂ５８５ｃ７［ＡＦ５３２１１６］(Takadaら, Genome Res, 13(4):589-600, 2003)）をテンプレートとして以下のプライマーによりＰＣＲ増幅した。
【００３６】
ＨＲ１用
Ｔ３−ｕＨＯＭ−Ｆ                                          （配列番号１５）
Ｔ３−ｕＨＯＭ−Ｒ                                          （配列番号１６）
ＨＲ２用
Ｔ３−ｄＨＯＭ−Ｆ                                          （配列番号１７）
Ｔ３−ｄＨＯＭ−Ｒ                                          （配列番号１８）
ＨＲ３用
Ｔ３−ｕＨＯＭ−ＴＶＥＴ−Ｆ                                （配列番号１９）
Ｔ３−ｕＨＯＭ−ＴＶＥＴ−Ｒ                                （配列番号２０）
ＨＲ４用
Ｔ３−ｄＨＯＭ−ＴＶＥＴ−Ｆ                                （配列番号２１）
Ｔ３−ｄＨＯＭ−ＴＶＥＴ−Ｒ２                              （配列番号２２）
【００３７】
増幅したフラグメントは、ｐＡＦＢ（ＨＲ１）、ｐＡＦＣ（ＨＲ２）、ｐＡＦＩ（ＨＲ３）、ｐＡＦＯ（ＨＲ４）を作製するために、ｐＡＥＪ（ＨＲ１及びＨＲ３）又はｐＡＥＫ（ＨＲ２及びＨＲ４）のＭｌｕＩサイト（脱リン酸化済み）にＡｓｃＩを用いて挿入した。ｐＡＥＹとｐＡＥＦを保持するＤＨ５α株（TAKARA社）は、アンピシリンを添加したＬＢ培地中で一晩培養した。プラスミドは４ｍｌの培養液からアルカリ法により単離し、最終的に、５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解させた。この溶解液の３μｌを１００μｌの反応液中で、４０ＵのＳｆｉＩを用いて５０℃、３時間反応させた。反応後、ＳｆｉＩで切断したｐＡＥＹとｐＡＥＦをフェノール抽出し、エタノール沈殿で回収し、２μｌの水に溶解させた。ｐＡＦＢ、ｐＡＦＣ、ｐＡＦＩ及びｐＡＦＯに関しては、ＳｆｉＩ切断サンプルをゲル電気泳動し、インサートを切り出し、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ社)で抽出し、最終的に２μｌの水に溶解させた。ｐＡＦＤを作製するために、ＳｆｉＩで切断した０．１５μｌのｐＡＥＹサンプルと、ＳｆｉＩで切断したｐＡＦＢ及びｐＡＦＣ由来のインサートを含むサンプル各０．１５μｌを、５％ＰＥＧ８０００の存在下、３６ＵのＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅを用いて、総体積０．９μｌ中にてライゲーションさせた（図３）。１６℃、３０分間反応させた後、ライゲーションしたサンプルの１０μｌを用いてＤＨ５αを形質転換した。ＳＯＣ培地中、３７℃で１時間反応させた後、サンプルの１／２を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、２５μｇ／ｍｌのカナマイシン、７％のスクロースを添加したＬＢプレート上にプレートし、３７℃で一晩インキュベートした。
【００３８】
翌日、ＧＦＰｕｖによる蛍光を発している（＞９８％）コロニーが数多く（＞３００）出現した。これらのコロニーから８コロニーを選択し、正しいインサートが挿入されていることをＰＣＲ及び配列決定により確認した。その結果、チェックした全てのコロニーは正しいコロニーで、それらの１つ（ｐＡＦＤ）を次のリコンビニアリングに用いた。サブクローニングコンストラクトであるｐＡＦＱは、アンピシリンとスクロースが存在すること以外はｐＡＦＤを作製したときと同じ手順により、ＳｆｉＩで切断したｐＡＥＦとＳｆｉＩで切断したｐＡＦＩ及びｐＡＦＯのインサートをライゲーションさせた。ｐＡＦＱのクローニング効率は、ｐＡＦＤとほぼ同程度であった。ｐＡＦＤとｐＡＦＱはＨ２−Ｔ３ＴＶ（ｐＡＦＰ）の作製に用いた（図５−ａ）。
【００３９】
他のＨ２−Ｔ３ＴＶ（ｐＡＩＰ）もｐＡＥＸを用いて標準的なライゲーションベースのクローニングにより作製した。ロング及びショートホモロジーアーム（図５−ｃ）は、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）により、以下のプライマーを用いてＢＡＣクローンからＰＣＲ増幅した。
【００４０】
ロングアーム用
Ｔ３−ｕＨＯＭ−ＡＤＷ−Ｆ２                                  （配列番号２３）
Ｔ３−ｕＨＯＭ−ＡＤＷ−Ｒ２                                  （配列番号２４）
ショートアーム用
Ｔ３−ｄＨＯＭ−ＡＤＷ−Ｆ２                                  （配列番号２５）
Ｔ３−ｄＨＯＭ−ＡＤＷ−Ｒ２                                  （配列番号２６）
【００４１】
増幅したフラグメントは、ＡｓｃＩを用いて切断し、ｐＡＥＪとｐＡＥＫにクローン化し、ｐＡＩＨとｐＡＩＧとした。これらのプラスミドから、ホモロジーアーム領域をＳｆｉＩで切り出し、アガロースゲルで精製した。両方のホモロジーアームは、ＳｆｉＩで切断ｐＡＥＸ（ゲル濾過及び脱リン酸化を行っていない）と１ステップでライゲーションさせ、ｐＡＩＰを得た（図５−ｂ）。
【００４２】
表１に示した実験の手順を以下に示す。
相同領域の入手源としてＨ２−Ｍ５遺伝子座と相同な１５ｂｐのオリゴを用いた。オリゴの配列は以下の通りである。
ＨＲ１用
Ｍ５−ｕ−１                                                （配列番号２７）
Ｍ５−ｕ−２                                                （配列番号２８）
ＨＲ２用
Ｍ５−ｄ−１                                                （配列番号２９）
Ｍ５−ｄ−２                                                （配列番号３０）
【００４３】
各オリゴは、濃度が３００μＭとなるようにＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解させた。８μｌのＭ５−ｕ−１及びＭ５−ｕ−２（ＨＲ１）又はＭ５−ｄ−１及びＭ５−ｄ−２（ＨＲ２）は２μｌの水、２μｌの１０ｘＴ４ポリヌクレオチドキナーゼバッファー（ＮＥＢ社）と混合し、総体積２０μｌとした。これらのオリゴ溶液は９６℃で５分間変性させた後室温まで冷却し、水で希釈した（１：１００、１：１０００、１：１００００）。２ｍｌの一晩培養したサンプルから単離したｐＡＥＹの３／５０に相当する２サンプル（各々約１００ｎｇ）を総体積１００μｌとして、４０ＵのＳｆｉＩで５０℃３時間切断した。フェノール抽出及びエタノール沈殿の後、１サンプルを２μｌの水に溶解させ、ライゲーションに用いた（表１の「ゲル濾過なし」を参照）。これに対して、他のサンプルは、１ｘＴＡＥを用いて低温度溶解アガロースゲルで電気泳動した。ベクター配列と４．３ｋｂ領域を有するＳｆｉＩフラグメントをゲルから切り出し、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ社）で精製した。ＳａｃＢ遺伝子を含んだＳｆｉＩフラグメント（１．９ｋｂ）は、ゲルから切り出さなかった。精製したＤＮＡはエタノール沈殿を行い、２μｌの水に溶解し、ライゲーションに用いた（表１のゲル濾過）。
【００４４】
ＳｆｉＩで切断したベクター（０．３μｌ）は、０．３μｌの希釈したＨＲ１と０．３μｌの希釈したＨＲ２と５％ＰＥＧ８０００の存在下、７２ＵのＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅを用いて、総体積１．８μｌ中にてライゲーションさせた。ライゲーション混合液中のＨＲ（オリゴ）の濃度は、各々、２００、２０、２ｎＭであった。相同領域のフラグメントを加えないベクターのみのサンプルもネガティブコントロールとして反応を行った。ライゲーションは１６℃で３０分間行った。各ライゲーション後のサンプルで、２０μｌのＤＨ５α（ＴａＫａＲａ社）を形質転換させた。ＬＢ倍中、３７℃でインキュベートした後、１／５のサンプルをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）及びスクロース（７％）を含んだＬＢプレート上にプレートした。コロニーの数を数えたのち、各プレートから８個のコロニーを選択してＰＣＲ解析を行った。
【００４５】
正しく挿入された相同領域は、以下のプライマーを用いてＰＣＲにより確認した。
Ｍ５−ｄＨＯＭ−Ｆ                                          （配列番号３１）
Ｍ１３Ｆ                                                    （配列番号３２）
及び、
ＰＫＧ−Ｒ２                                                （配列番号３３）
Ｍ１３Ｒ                                                    （配列番号３４）
及び、
Ｇｌｏｂｉｎ−Ｆ２                                          （配列番号３５）
Ｍ１３Ｆ                                                    （配列番号３２）
【００４６】
表２に示した実験の手順は以下に示す。
Ｈ２−Ｍ５遺伝子座のＨＲ１とＨＲ２（各々ｐＡＦＥとｐＡＦＦに相当）を用いた。これらの相同領域を作製するために、テンプレートとしてＢＡＣクローン（ｃｉｔｂ５４４ｅ１４［ＡＦ５３２１１４］）を用い、以下のプライマーでＫＯＤ−ｐｌｕｓＰＣＲを行った。
ｐＡＦＥ用
Ｍ５−ｕＨＯＭ−Ｆ                                          （配列番号３６）
Ｍ５−ｕＨＯＭ−Ｒ                                          （配列番号３７）
ｐＡＦＦ用
Ｍ５−ｄＨＯＭ−Ｆ                                          （配列番号３１）
Ｍ５−ｄＨＯＭ−Ｒ                                          （配列番号３８）
【００４７】
増幅させたフラグメントをＡｓｃＩで切断し、エタノール沈殿後、ゲル濾過を行い、ｐＡＥＪ又はｐＡＥＫとライゲーションさせて、最終的に、ｐＡＦＥとｐＡＦＦを作製した。各４ｍｌの一晩培養物から得たプラスミドＤＮＡ（ｐＡＥＦ、ｐＡＥＹ、ｐＡＦＦ及びｐＡＦＦ）の１／２５量を、総体積１００μｌとして、４０ＵのＳｆｉＩで５０℃、３時間切断した。エタノール沈殿後、全てのサンプルを２μｌの水に溶解させた。ライゲーションの前に、全てのサンプルについて、ゲル濾過及び脱リン酸化を行わなかった。ＳｆｉＩで切断したｐＡＥＦ又はｐＡＥＹ（各０．１５μｌ）は、０．１５μｌのＳｆｉＩ切断したｐＡＥＦ及び０．１５μｌのＳｆｉＩ切断したｐＡＦＦと５％ＰＥＧ８０００の存在下、３６ＵのＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅを用いて、総体積０．９μｌ中にてライゲーションさせた。
【００４８】
１６℃で３０分間ライゲーション行った後、各ライゲーション後のサンプルで、１０μｌのＤＨ５α（ＴａＫａＲａ社）を形質転換させた。各サンプルはＳＯＣ培地で希釈後それらの一部を表２に示す抗生物質を含むＬＢプレート上にプレートした。コロニーの数を数えたのち、形質転換したサンプルの総量から得られる、予想コロニー数を計算し、表２に示した。ＧＦＰｕｖの蛍光を長波長ＵＶランプを用いて確認し、正しく挿入された相同領域を以下のプライマーを用いてコロニーＰＣＲ法により確かめた。
Ｇｌｏｂｉｎ−Ｆ２                                          （配列番号３５）
Ｍ１３Ｆ                                                    （配列番号３２）
及び、
ＧＦＰｕｖ−Ｆ                                              （配列番号３９）
Ｍ５−ｕＨＯＭ−Ｒ                                          （配列番号３７）
及び、
ＤＴ−ｓｅｑ                                                （配列番号４０）
Ｍ１３Ｒ                                                    （配列番号３４）
【００４９】
４．ジーンターゲティングベクター構築のための本発明ベクターの適用例
４−１．結果
ホモロジーアームをジーンターゲティングベクターに導入する最も簡便な方法の一つとして、ゲノムＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅フラグメントをクローニングする方法がある。ｐＡＤＷはこのような方法のためにデザインされたベクターである。ｐＡＤＷから作製されたｐＡＥＸ（図５−ｂ）を用いて、Ｈ２−Ｔ３遺伝子座に対応するホモロジーアームを具備したジーンターゲティングベクターを構築した（図４、５−ｂ、ｃ）。この方法が、ＳｆｉＩサイトを用いると６．５ｋｂの長いアームと１．４ｋｂの短いアームを含む、より長い相同領域のクローニングに有用であることが確認された。しかし、ＰＣＲによって得られるホモロジーアームは、しばしば突然変異を有し、生じたノックアウトマウスにおいて予期せぬ表現型を引き起こすことも皆無ではない。また、ゲノムＤＮＡに対して高い正確性を持つロングＰＣＲを行う場合、しばしば５ｋｂ以上の標的領域の増幅ができないという問題もある。そこで、以下の実験では、変異のないホモロジーアームの取得ができるマウスのＢＡＣクローンを用いた。
【００５０】
ＰＣＲ法を利用せずに制限酵素を用いてジーンターゲティングベクターを構築する従来の方法は、ゲノムＤＮＡ上に適当な制限酵素サイトが存在するか否かに依存するところが大きかった。これに対し、リコンビノジェニックエンジニアリングは大腸菌における相同組換えに基づき、簡便で迅速なＢＡＣの修飾を効率的に可能ならしめる。ゲノムＤＮＡ上の適当な制限酵素サイトを調べる必要がないため、ジーンターゲティングベクターの構築にあたり有効な方法になると思われる。本発明のベクターであるｐＡＤＹ及びｐＡＥＦを組み合わせてリコンビノジェニックエンジニアリングシステムにおいて使用することにより、迅速かつ簡便なジーンターゲティングベクターの構築を実現することができた（図５）。
【００５１】
本実験においては、まず、４．３ｋｂコンストラクト（選択マーカーであるＥＣＦＰと幾つかのサイト特異的な変異ｌｏｘＰサイトのようなリコンビナーゼ認識サイトを含んでいる）をｐＡＤＹのクローニングサイトに導入し、ｐＡＥＹを作製した（図３）。ｐＡＥＹは、Ｈ２−Ｔ３ゲノム領域中に対して、ノックアウトのみならず、大きな欠失又は挿入変異を誘導するために作製した。
リコンビノジェニックエンジニアリング法においては、宿主としてＤＹ３８０大腸菌株を使用し、ジーンターゲティングベクターの構築にｐＡＦＤ及びｐＡＦＱを用いた。本実験においては、図５−ａに示すような２ステップのリコンビニアリングが必要である。２つのステップはどちらを先に行っても良いが、本実施例で行ったようにステップ１を先に行うと、ゲノムサザンのパターンを野生型及び修飾ＢＡＣを用いて実験の初期の段階でチェックすることができるという利点を有し、ＢＡＣクローンの完全配列が未知の場合には極めて有効である。
【００５２】
本方法においては、ジーンターゲティングベクターを構築するにあたり、直鎖状ＤＮＡ基質が由来するベクターによるバックグラウンドを除くために、ＧＦＰｕｖ遺伝子を負の選択マーカーとして使用した（図５−ａ及びｃ）。得られた組換体クローン及びＨ２−Ｔ３ＴＶが目的のものであるかどうか、ＰＣＲ法、配列決定（シークエンシング）及び制限酵素解析によって確認した（図６）。
本発明のベクターを利用することにより、相同領域の１ステップクローニング及びジーンターゲティングベクターの構築を含む全ての方法工程を約２週間で完了することができた。
【００５３】
４−２．方法
Ｈ２−Ｔ３遺伝子座に導入された３つ部位特異的組換え部位、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、ＩＲＥＳ及びＥＣＦＰを含む４．３−ｋｂフラグメントは、複数のステップを経るライゲーションに基づくクローニングにより作製した。３つの部位特異的組換え部位、ＦＲＴ，変異ｌｏｘ（ｍｌｏｘ：ＪＴ１５（Thomsonら, Genesis, 36(3):162-167, 2003）），及びｌｏｘ２２７２はオリゴを用いたライゲーションに基づくクローニングにより作製した。作製されたフラグメントはｐＵＣ１１９中にクローン化し、カセットとして用いた。ＰＧＫプロモーターにより発現されるネオマイシン耐性遺伝子は、ｐＰＧＫ−ｎｅｏ−ｌｏｘＰ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ社）に由来する。ｐＣＡＧＧＳ−ＦＬＰｅ、ＩＲＥＳ配列は、Ｄ１Ｆプライマー（配列番号４１）とＤ１Ｒプライマー（配列番号４２）のペアーにより増幅され、ｐＵＣ１１９ベクター中にクローン化され、ＩＲＥＳカセットとして用いた。ＥＣＦＰカセットはｐＥＣＦＰ−ｎｕｃベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から、Ｂ１Ｆプライマー（配列番号４３）とＥＹＦＰ−Ｎｕｃ−Ｒ１プライマー（配列番号４４）のペアーにより増幅されたＰＣＲフラグメントをクローニングすることにより調製した。ポリＡ配列（ラビットβグロビンンポリＡ）は、ｐＣＧＮ２Δ２ベクターからＧｌｏｂｉｎ−Ｆプライマー（配列番号４５）とＧｌｏｂｉｎ−Ｒプライマー（配列番号４６）のペアーにより増幅され、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ+）に導入され、ポリＡカセットとして用いた。全てのヌクレオチドカセットはシークエンスにより配列を確認した。これらのクローニングカセットはｐＡＥＹに含まれる複雑な４．３ｋｂコンストラクトに用いた（図２）。また、４．３ｋｂフラグメントは、ｐＡＤＷにも挿入された；作製したプラスミドはｐＡＥＸと呼ぶ。
【００５４】
主にLiuらの方法（Liuら, Genome Res, 13(3):476-484, 2003）に基づくリコンビニアリング法をＨ２−Ｔ３  ＴＶを構築するために適用した。
まず、ｃｉｔｂ５８５ｃ  Ｂａｃクローン（１２９／ＳＶマウス系に由来するＣＩＴＢライブラリー、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）をＤＹ３８０大腸菌宿主株（Ｎｅａｌ  Ｇ．Ｃｏｐｅｌａｎｄ博士より分譲を受けた）にエレクトロポレーション法により導入し、形質転換されたＢＡＣが正しいインサートを持っているか制限酵素分析により確認した。
ｃｉｔｂ５８５ｃ  Ｂａｃを含むＤＹ３８０細胞を５ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３０℃で一晩培養した。翌日、一晩培養物から１ｍｌを分取し２０ｍｌのＳＯＢに添加し、ＯＤ６００の値が０．６になるまで振とう培養を行った。次に、細胞の１０ｍｌを新しいチューブに移し、４２℃で１５分間振とう後氷水中で１５分間冷却した。細胞を０℃、２５００ｒｐｍで１０分間遠心した。得られた細胞の沈殿を８８８μｌの氷冷した１０％グリセロールに懸濁し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。１０％グリセロールで３回洗浄後、沈殿を１００μｌの氷冷した１０％グリセロールに再度懸濁し、直鎖状ＤＮＡ基質のエレクトロポレーションに使用した。直鎖状ＤＮＡ基質を作製するために、４ｍｌの一晩培養物から得たｐＡＦＤ又はｐＡＦＱの３／５０量をＩ−ＳｃｅＩ又はＡｓｃＩで切断し、アガロースゲルで抽出後、最終的に２μｌの水に溶解させた。水に溶解させたサンプルから１μｌを５０μｌのコンピテント細胞と混合し、エレクトロポレーション法（ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ；ＢｉｏＲａｄ社、１．７５ｋＶ，２５μＦ，２００Ωのコントローラーを使用）により形質転換を行った。その後、１．０ｍｌのＳＯＢを各キュベットに加え、３０℃にて１時間インキュベートした。細胞は、適当な抗生物質の存在下でプレート上に広げた。
【００５５】
正しく組換えられたクローンは以下のプライマーを用いてＰＣＲによりスクリーニングを行った。
ステップ１
Ｔ３−ｕＨＯＭ−ｃｈｅｃｋ−Ｆ                              （配列番号４７）
ＰＫＧ−Ｒ２                                                （配列番号３３）
及び、
Ｔ３−ｄＨＯＭ−ｃｈｅｃｋ−Ｒ２                            （配列番号４８）
Ｇｌｏｂｉｎ−Ｆ２                                          （配列番号３５）
ステップ２
ＤＴ−ｓｅｑ                                                （配列番号４０）
Ｇｌｏｂｉｎ−Ｆ２                                          （配列番号３５）
及び
Ｍ１３Ｒ                                                    （配列番号３４）
Ｔ３−ｄＨＯＭ−ｃｈｅｃｋ−Ｒ                              （配列番号４９）
【００５６】
ステップ１で作製される修飾したＢＡＣクローンに関して、正しい組換えが行われたことをＢｇｌＩの切断パターン、及び後述のＥＳ標的クローンの検出に用いたプローブによるサザンブロット分析によって確認した。得られたジーンターゲティングベクター（ｐＡＦＰ）は、配列決定（シークエンシング）により確認した。
【００５７】
５．マウスＥＳ細胞におけるジーンターゲティング
５−１．結果
得られたＨ２−Ｔ３ＴＶを、ユニークなサイトであるＩ−ＳｃｅＩサイトで切断し、Ｅ１４．１及びＥ１４ｔｇ２ａＥＳ細胞中にエレクトロポレートした。７つの相同組換クローンが、２７８個のＧ４１８耐性コロニーからＰＣＲ法によってスクリーニングされた。さらに、得られたクローンが目的の組換体であるかどうか、ゲノムサザンハイブリダイゼーション分析によって確認した（図６）。これらのクローンを用いてキメラマウスを作製し、生殖系列への伝播を確認している。
【００５８】
５−２．方法
リコンビノジェニックエンジニアリングによって調製したＨ２−Ｔ３ＴＶであるｐＡＦＰをＩ−ＳｃｅＩにより直鎖状にした。２０μｇの直鎖状ジーンターゲティングベクターを１×１０７のＥ１４．１(Kuhnら, Science, 254(5032):707-710, 1991)及び１×１０７のＥ１４ｔｇ２ａ(Hooperら, Nature, 326(6110):292-295, 1987)ＥＳ細胞にエレクトロポレーション法により導入した。まず最初に、Ｇ４１８耐性ＥＳ細胞を以下のプライマーを用いてＰＣＲ法によりスクリーニングした。
【００５９】
Ｇｌｏｂｉｎ−Ｆ２                                          （配列番号３５）
Ｔ３−ｄＨＯＭ−ＴＶＥＴ−Ｒ                                （配列番号５０）
正しくターゲティングされたクローンは、以下のプライマーを用いてＢＡＣ  ＤＮＡから増幅された断片を、ランダムプライミング法により３２Ｐ標識化して作製したプローブにより、サザンブロット分析にて確認を行った。
Ｔ３−ｓｈｏｒｔ−ｐｒｏｂｅ−Ｆ                            （配列番号５１）
Ｔ３−ｓｈｏｒｔ−ｐｒｏｂｅ−Ｒ                            （配列番号５２）
【００６０】
Ｅ１４ｔｇ２ａＥＳ細胞由来の２つのクローンを（Ｃ５７ＢＬ／６ＪｘＢＤＦ１）Ｆ１マウス胚盤胞にマイクロインジェクションした。生殖細胞キメラが標的化されたＥＳクローンの１つから得られた（３Ｄ２、 図６）。
【００６１】
６．通常のジーンターゲティング及びコンディショナルジーンターゲティングに有用なベクター
６−１．本発明のジーンターゲティングベクター
以上詳細に示した結果より、本発明のベクターであるｐＡＤＹ及びｐＡＤＷはジーンターゲティングベクターの構築を行うにあたり、有用なプラスミドであることが明らかとなった。
なお、上記のＨ２−Ｔ３ＴＶは、ｎｅｏ、ＥＣＦＰ遺伝子及び３つのサイト特異的な組換えサイトを含んでおり、ある特定の目的のためにデザインされたものである。従って、より一般的な目的、例えば、通常のノックアウトマウスの作製又はコンディショナルノックアウトマウスの作製など、より一般的な目的には他のジーンターゲティングベクターを用いることができる。他のベクターの作製も本発明のベクターを用いることで、簡便かつ迅速に実施することが可能である。一般的なジーンターゲティングベクターの構築に有用なｐＡＤＹ由来のベクターを表３に示した（ｐＡＧＥ（配列番号５８）、ｐＡＧＦ（配列番号５９）、ｐＡＧＩ（配列番号６０）、ｐＡＧＪ（配列番号６１）、ｐＡＨＶ（配列番号６２））。これらのベクターは通常のジーンターゲティング又はコンディショナルジーンターゲティングに使用することが可能である。
【００６２】
６−２．本発明のジーンターゲティングベクターの作製
６−２−１．ｐＡＦＺの作製
ｐＡＧＥ、ｐＡＧＦ、ｐＡＧＩ、ｐＡＧＪ、ｐＡＨＶを作製するにあたり、以下のプライマーを用いてＰＧＫ−ｎｅｏ−ｌｏｘＰ（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ社）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、得られた増幅産物をＸｂａＩとＥｃｏＲＩ切断してｐＡＣＳ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒで、ＫｐｎＩ以外のＭＣＳが除かれており、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＳｆｉＩ、ＮｈｅＩ、ＳｔｙＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ等の制限酵素サイトを含んだリンカーが導入されているもの）のＸｂａＩとＮｈｅＩサイトに挿入した（ｐＡＦＺ）。
ＰＧＫ−ｎｅｏ−Ｆ                                    （配列番号６３）
ＰＧＫ−ｎｅｏ−Ｒ                                    （配列番号６４）
【００６３】
６−２−２．ｌｏｘＰカセット（ｐＡＦＹ）の作製
ｌｏｘＰ−Ｆ１                                 （配列番号６５）
ｌｏｘＰ−Ｒ１                                 （配列番号６６）
ｌｏｘＰ−Ｆ２                                 （配列番号６７）
ｌｏｘＰ−Ｒ２                                 （配列番号６８）
ｌｏｘＰ−Ｆ１及びＲ１、ｌｏｘＰ−Ｆ２及びＲ２を用いてテンプレートなしでＰＣＲを行ってプライマーダイマーを作る。その結果、各々以下の配列のＤＮＡフラグメントが作製された。
ｌｏｘＰ−１                                          （配列番号６９）
ｌｏｘＰ−２                                          （配列番号７０）
【００６４】
次に、ｌｏｘＰ−１をＸｂａＩとＢｂｓＩ切断、ｌｏｘＰ−２をＥｃｏＲＩとＢｂｓＩ切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩサイトに３−フラグメントライゲーションで導入した。作製されたインサートの配列は、ＸｂａＩ＿ｌｏｘＰ＿ＳｔｙＩ＿ｌｏｘＰ＿ＮｈｅＩ＿ＥｃｏＲＩ（配列番号７１）で、得られたベクターをｐＡＦＹと称する。
【００６５】
６−２−３．ＦＲＴカセット（ｐＡ１６６）の作製
２種類の二重鎖オリゴヌクレオチドを以下の２組のプライマーセットを用いてＰＣＲ法（テンプレートなし；プライマーダイマーを作らせる）で作製後、各々制限酵素で切断し、３−フラグメントライゲーション一度にベクターに導入する。
０８２−ＦＲＴ                                    （配列番号７２）
０８３−ＦＲＴ                                    （配列番号７３）
及び、
０８４−ＦＲＴ                                    （配列番号７２）
０８５−ＦＲＴ                                    （配列番号７３）
【００６６】
まず、０８２−ＦＲＴ及び０８３−ＦＲＴ、０８４−ＦＲＴ及び０８５−ＦＲＴを用いてテンプレートなしでＰＣＲを行った結果、各々以下の配列のＤＮＡフラグメントが作製された。
ＦＲＴ１                                          （配列番号７６）
ＦＲＴ２                                          （配列番号７７）
次にＦＲＴ１をＢａｍＨＩとＢｂｓＩ切断、ＦＲＴ２をＥｃｏＲＩとＢｂｓＩ切断し、ｐＵＣ１１９ベクターのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに３−フラグメントライゲーションで導入した。作製されたインサートの配列は、ＢａｍＨＩ＿ＳｐｅＩ＿ＦＲＴ＿ＳｔｙＩ＿ＦＲＴ＿ＮｈｅＩ＿ＥｃｏＲＩ（配列番号７８）で、得られたベクターをｐＡ１６６と称する。
【００６７】
６−２−４．ｐＡＧＥとｐＡＧＦの作製
ｐＡＦＺをＸｂａＩ／ＮｈｅＩ切断し、１７７６ｂｐのｎｅｏ耐性遺伝子の入った断片を回収した後、ｐＡＦＹをＳｔｙＩで切断し、切断部位に回収した断片を導入した。その結果、方向性の異なるｐＡＧＢ及びｐＡＧＤが作製された。次に、ｐＡＧＢ又はｐＡＧＤをＸｂａＩ／ＮｈｅＩ切断して得られたｎｅｏ耐性遺伝子を含む断片を、ｐＡＤＹ  （図１）のＸｂａＩ切断部位に挿入した。得られたベクターが、各々、ｐＡＧＥ（配列番号５８）及びｐＡＧＦ（配列番号５９）である。
【００６８】
６−２−５．ｐＡＧＩ、ｐＡＧＪ及びｐＡＨＶの作製
ｐＡＦＺをＸｂａＩ／ＮｈｅＩ切断して得られた１７７６ｂｐの断片をｐＡ１６６のＳｔｙＩ切断部位に挿入した。得られたベクターをｐＡＧＧと称する。
一方、ｐＡＧＦをＥＬ３５０大腸菌（Ｎｅａｌ  Ｇ．Ｃｏｐｅｌａｎｄ博士より分譲：Genome Res, 13: 476-484, 2003）に導入した。ＥＬ３５０は、ＤＹ３８０と同様にリコンビニアリングを可能とする大腸菌宿主であるが、アラビノースを培地に加えることによってＣｒｅタンパク質が発現し、その結果、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ部位特異的組換えを誘導することができる。ｐＡＧＦを導入したＥＬ３５０の培養液にアラビノースを加え、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換えを誘導し、ｐＡＧＦ内の２つのｌｏｘＰに挟まれたｎｅｏ耐性遺伝子領域を欠失させた。得られたプラスミドをｐＡＧＨと称する。
次に、ｐＡＧＧをＮｈｅＩ／ＳｐｅＩで切断した。この時、ＳｐｅＩは部分分解とした。得られた１８６０ｂｐの断片を、ｐＡＧＨのＸｂａＩ切断部位に挿入してｐＡＧＩ（配列番号６０）を、ｐＡＧＨのＮｈｅＩ切断部位に挿入してｐＡＧＪ（配列番号６１）及びｐＡＨＶ（配列番号６２）を作製した（ｐＡＧＪとｐＡＨＶはＦＲＴ−ｎｅｏ−ＦＲＴの向きが逆となっている）。
【００６９】
【表３】
2007124915.tif 000004
【００７０】
プラスミド名       受領番号                     寄託日
ｐＡＤＹ           ＦＥＲＭ ＡＰ−２０７０１      ２００５年１０月２８日
ｐＡＤＷ           ＦＥＲＭ ＡＰ−２０７０２      ２００５年１０月２８日
ｐＡＥＦ           ＦＥＲＭ ＡＰ−２０７０３      ２００５年１０月２８日
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明により開発されたクローニングベクターの模式図を示す。各ベクターの模式図には、必要な構成要素及び制限酵素サイトが示されている。ＳｆｉＩの切断部位は全て異なる配列に設定されている。また、相同領域を供給するためのｐＡＥＪ及びｐＡＥＫのＳｆｉＩサイトも全て異なる配列を示している（最上段）。ｐＡＤＹはリコンビニアリングにおいて使用する直鎖状ＤＮＡ基質の構築するためのベクターである。ｐＡＥＦは、ＢＡＣクローンのサブクローニングを行うことによって、ジーンターゲティングコンストラクトの構築ために開発されたものである。ｐＡＤＷは、従来法によって、ジーンターゲティングコンストラクトの構築ために開発されたものである。ＳａｃＢはＳａｃＢ遺伝子を、ＤＴ−ＡはジフテリアトキシンフラグメントＡ発現カセットを、ＧＦＰｕｖはＧＦＰｕｖ遺伝子を示す。
【図２】ＧＦＰｕｖ由来緑色蛍光を発するｐＡＤＹ及びｐＡＥＦを保持する大腸菌のコロニーを示す。左の図は、図１に示すベクターを保持する大腸菌をアンピシリンを添加したプレート上にて培養した結果得られたコロニーを示す。右の図は、長波長ＵＶランプによって蛍光が確認されたコロニーを示す。
【図３】１ステップによりＨ２−Ｔ３  ＴＶに使用可能な直鎖状ＤＮＡ基質を調製するクローニング手順を示す。相同領域は、クローン化したフラグメント（ａ）、二重鎖オリゴ（ｂ）、ＰＣＲ増幅フラグメント（ｃ）等により供給することができる。ＨＲは相同領域を意味する。
【図４】ＳｆｉＩで切断した相同領域、クローニングベクター及びその誘導ベクターの電気泳動写真を示す。
【図５】本発明のベクターを用いてジーンターゲティングベクターを作製する手順を示す。（ａ）は、リコンビニアリング法によるジーンターゲティングベクターの作製手順を示す。（ｂ）は、ＰＣＲ増幅によって得られたホモロジーアームを用いて、ｐＡＤＷ由来のｐＡＥＸからジーンターゲティングコンストラクトを作製する手順を示す。（ｃ）は、（ａ）又は（ｂ）の手順により作製したＨ２−Ｔ３  ＴＶを用いてＥＳ細胞中にて相同組換えを行う手順を示す。
【図６】ＢＡＣクローン及びターゲティングされたＥＳ細胞の制限酵素分析及びサザンブロット分析の結果を示す。野生型（レーン１）及びリコンビノジェニックエンジニアリング法により修飾したＢＡＣ（レーン２）（図５−ａのステップ１）をＢｇｌＩで切断し（左図）、メンブレンに転写後プローブでハイブリダイゼーションを行った（真中の図）。ハイブリダイズしたフラグメントは、野生型については９．４ｋｂで、ターゲティングしたアリルは４．３ｋｂである（矢印）。サザンブロット分析の結果、Ｅ１４．１由来の野生型からは９．４ｋｂのバンドが、ターゲティングしたＥＳ細胞クローン（３Ｄ２及び４Ａ２）（右図）からは９．４ｋｂと４．３ｋｂのバンドが確認された。
【図１】
2007124915.tif 000005
【図２】
2007124915.tif 000006
【図３】
2007124915.tif 000007
【図４】
2007124915.tif 000008
【図５】
2007124915.tif 000009
【図６】
2007124915.tif 000010
【配列表】
2007124915000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月25日(2005.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
プラスミド名       受託番号                     寄託日
ｐＡＥＦ           ＦＥＲＭ Ｐ−２０７０３      ２００５年１０月２８日