(57)【要約】【課題】本発明は異なる組織間での目的遺伝子の発現量を比較するための基準となる遺伝子を提供すること、動物種が異なる場合であっても目的遺伝子の発現量の比較を可能にすることを目的とする。【解決手段】本発明では既知のハウスキーピング遺伝子の中から標準遺伝子として優れた特性をもつ遺伝子を同定するために、従来用いられてきたハウスキーピング遺伝子について様々な組織における発現を解析した結果、組織間で比較的一定に発現している遺伝子はａｃｉｄｉｃ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐ０（３６Ｂ４）であることを同定した。また、動物の２種以上で３６Ｂ４遺伝子の塩基配列を比較した結果、これらの種において高度に保存された塩基配列を同定した。これらの塩基配列を指標とすることにより、従来困難であった組織間及び動物種間の目的遺伝子の発現量の比較を可能にした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の動物の少なくとも２種の組織ないし臓器において目的遺伝子の発現量を評価する方法であって、３６Ｂ４遺伝子の発現量と目的遺伝子の発現量を比較することによって目的遺伝子の各組織ないし臓器における発現量の変動を評価する方法。
【請求項２】
少なくとも２種の動物の１種以上の組織ないし臓器において目的遺伝子の発現量を評価する方法であって、３６Ｂ４遺伝子の発現量と目的遺伝子の発現量を比較することによって目的遺伝子の各動物における発現量の変動を評価する方法。
【請求項３】
３６Ｂ４遺伝子の断片と目的遺伝子の断片を用いて目的遺伝子の発現量を評価することを特徴とする請求項１及び２に記載の方法。
【請求項４】
３６Ｂ４遺伝子断片を一つ以上備えたアレイであって、一つのまたは複数のアレイ間において、複数の組織もしくは臓器間及び／または複数の動物間の目的遺伝子の発現量を評価するためのアレイ。
【請求項５】
マウス、ラット、ヒトの少なくとも２種の動物の１種以上の組織ないし臓器において目的遺伝子の発現量を評価する際に基準とする３６Ｂ４遺伝子の発現量を測定するための、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の塩基配列のいずれかの領域から選ばれる２０塩基以上の配列を有する３６Ｂ４遺伝子断片；（ｉ）配列番号１の塩基配列１１〜１１９、１４２〜１９７、２０５〜２５１、（ｉｉ）配列番号２の塩基配列１１〜１１９、１４２〜１９７、２０５〜２５１、（ｉｉｉ）配列番号３の塩基配列１１〜１１９、１４２〜１９７、２０５〜２５１。
【請求項６】
請求項５に記載のいずれか一つ以上の断片と目的遺伝子の断片を用いてマウス、ラット、ヒトの少なくとも２種の動物の１種以上の組織ないし臓器における目的遺伝子の発現量を評価する方法。
【請求項７】
マウス、ラット、ヒトの少なくとも２種の動物の１種以上の組織ないし臓器において、目的遺伝子の発現量を評価する際に基準とする３６Ｂ４遺伝子の発現量を測定するための、請求項５に記載の断片の塩基配列を有するプローブ。
【請求項８】
請求項５のいずれか一つ以上の断片を備えたアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々な動物種、例えば、ヒト、げっ歯動物の組織ないし臓器、例えば、脳（大脳、小脳など）、心臓、肝臓、腎臓、骨格筋、肺、すい臓、脾臓、小腸、大腸、白色及び褐色脂肪組織における目的遺伝子の発現量を定量的に比較するための標準遺伝子の調製及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現の代表的な評価法としてノーザンブロッティング、ＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ及び定量的ＰＣＲ法が、また網羅的な解析法としてマイクロアレイ法及びＳＡＧＥ法（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）法が用いられている（遺伝子発現評価法一般に関する文献として、例えば、Raval, P. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 32: 125-127, 1994; Jung, R. et al. Clin. Chem. Lab. Med. 38: 833-836, 2000; Roth, C.M. Curr. Issues Mol. Biol. 4: 93-100, 2002; Romkes, M. and Buch, S.C. Methods Mol. Biol. 291: 387-398, 2005を参照）。
【０００３】
これら方法のうちで、ＳＡＧＥ法は、（１）ハイブリッド形成を用いないこと、ならびに、（２）得られるデータが絶対的な遺伝子発現量を反映していることの２点で他の方法よりも優れている。しかし、多くの塩基配列を決定する必要があるので、実験操作は極めて煩雑なことが問題である（例えば、Yamamoto, M. et al. J. Immunol. Methods. 250: 45-66, 2001; Tuteja, R. and Tuteja, N. Bioessays 26: 916-922, 2004を参照）。
【０００４】
一方、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ及び定量的ＰＣＲ法では、実験操作はＳＡＧＥ法に比べて簡便ではあるが、定量的な実験結果を得るためには、（１）試験管内で合成したＲＮＡを用いて検量線を描く、（２）標準になる遺伝子を選定し、その発現量を基準とすることが必要である。しかし、これらの方法では、従来、最適な標準遺伝子が知られていないことが問題であった。
【０００５】
網羅的な解析によって、ヒトの組織で発現する種々の遺伝子を、ハウスキーピング遺伝子、すなわちどの細胞にも普遍的に発現している遺伝子、あるいは組織特異的な遺伝子として分類した報告がある（特開２００４−１３５５５２）。しかし、これはハウスキーピング遺伝子と組織特異的な遺伝子に分類することに重点を置いており、個々の遺伝子の発現量の定量的な比較は詳細には行っていない。
【０００６】
また、従来からハウスキーピング遺伝子が標準遺伝子として用いられてきた例がある（Thellin, O. et al. J. Biotechnol. 75: 291-295, 1999; Sturzenbaum, S.R. and Kille, P. Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 130: 281-289, 2001）。しかし、ハウスキーピング遺伝子の発現量は同じ動物種であっても組織ないし臓器間で大きく異なるものが多く、このため、異なる組織ないし臓器間での遺伝子発現量の定量的な比較は困難である。
【０００７】
ハウスキーピング遺伝子のうちβ−アクチン、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ、ユビキチンＢ、リボゾームタンパク質Ｓ１８の各々の遺伝子の特定の塩基配列に基づく各々のオリゴヌクレオチドが、マイクロアレイ解析におけるコントロールとして有用であるとする報告もある（特開２００５−１０２５１５）。しかし、これらのオリゴヌクレオチドを使用することにより一定以上のシグナル強度が得られるものの、組織または臓器間でのシグナルのばらつきは大きい。
【０００８】
このように、ハウスキーピング遺伝子は多くの組織ないし臓器で普遍的及び恒常的に発現しているものの、その発現量は同じ動物種であっても組織ないし臓器間で大きく異なるものが多く、異なる組織ないし臓器間で目的遺伝子の発現量を定量的に比較することは困難である。さらに、異なる動物種間で目的遺伝子の発現量を定量的に比較することも困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明では、異なる組織ないし臓器間での目的遺伝子の発現量を定量的に比較するための基準となる遺伝子を提供することを目的とする。さらに、動物種が異なる場合であっても目的遺伝子の発現量の定量的な比較を可能にすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明では、ノーザンブロッティング及びマイクロアレイで用いられている複数の既知のハウスキーピング遺伝子の中から標準遺伝子として優れた特性をもつ遺伝子を同定するために、従来用いられてきたハウスキーピング遺伝子について、様々な組織ないし臓器、例えば脳、心臓、肝臓、腎臓、白色及び褐色脂肪組織、骨格筋ならびに肺における発現を解析した。そして、その結果、組織ないし臓器間で比較的一定に発現している遺伝子はａｃｉｄｉｃ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐ０（３６Ｂ４）であることを同定した。
【００１１】
また、２種以上の動物で３６Ｂ４遺伝子の全塩基配列を比較した結果、これらの種において高度に保存された塩基配列を同定した。そして、これらの塩基配列を指標とすることによって、従来困難であった組織ないし臓器間及び動物種間の目的遺伝子の発現量の定量的な比較を可能にした。
【００１２】
すなわち、本発明は、
１．  １種以上の動物の少なくとも２種の組織ないし臓器において目的遺伝子の発現量を評価する方法であって、３６Ｂ４遺伝子の発現量と目的遺伝子の発現量を比較することによって目的遺伝子の各組織ないし臓器における発現量の変動を評価する方法；
２．  少なくとも２種の動物の１種以上の組織ないし臓器において目的遺伝子の発現量を評価する方法であって、３６Ｂ４遺伝子の発現量と目的遺伝子の発現量を比較することによって目的遺伝子の各動物における発現量の変動を評価する方法；
３．  ３６Ｂ４遺伝子の断片と目的遺伝子の断片を用いて目的遺伝子の発現量を評価することを特徴とする上記１及び２に記載の方法；
４．  ３６Ｂ４遺伝子断片を一つ以上備えたアレイであって、一つのまたは複数のアレイ間において、複数の組織もしくは臓器間及び／または複数の動物間の目的遺伝子の発現量を評価するためのアレイ；
５．  マウス、ラット、ヒトの少なくとも２種の動物の１種以上の組織ないし臓器において目的遺伝子の発現量を評価する際に基準とする３６Ｂ４遺伝子の発現量を測定するための、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の塩基配列のいずれかの領域から選ばれる２０塩基以上の配列を有する３６Ｂ４遺伝子断片；（ｉ）配列番号１の塩基配列１１〜１１９、１４２〜１９７、２０５〜２５１、（ｉｉ）配列番号２の塩基配列１１〜１１９、１４２〜１９７、２０５〜２５１、（ｉｉｉ）配列番号３の塩基配列１１〜１１９、１４２〜１９７、２０５〜２５１；
６．  上記５に記載のいずれか一つ以上の断片と目的遺伝子の断片を用いてマウス、ラット、ヒトの少なくとも２種の動物の１種以上の組織ないし臓器における目的遺伝子の発現量を評価する方法；
７．  マウス、ラット、ヒトの少なくとも２種の動物の１種以上の組織ないし臓器において、目的遺伝子の発現量を評価する際に基準とする３６Ｂ４遺伝子の発現量を測定するための、上記５に記載の断片の塩基配列を有するプローブ；
８．  上記５のいずれか一つ以上の断片を備えたアレイ、
を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明における動物とは、例えばマウス、ラット、イヌ、サル及びヒトなどから選択され、また、ウサギ及びニワトリなど他の動物から選択してもよい。本発明の組織ないし臓器とは、例えば脳（大脳、小脳など）、心臓、肝臓、腎臓、骨格筋、肺、すい臓、脾臓、小腸、大腸、白色及び褐色脂肪組織などから選択してもよく、また、例えば脳では大脳及び小脳などから選択してもよく、また、例えば大脳では皮質及び髄質、副腎では皮質及び髄質などから選択してもよく、さらに、他の組織ないし臓器から選択してもよい。
【００１４】
本発明の３６Ｂ４遺伝子は、１種の動物の１種または２種以上の組織ないし臓器、あるいは、２種以上の動物の１種または２種以上の組織ないし臓器における目的遺伝子の発現量を比較するための基準として使用できる。
【００１５】
また、本発明の３６Ｂ４遺伝子は、試験を行う時期が異なるデータ及び試験を行う人間が異なるデータについても遺伝子の発現量を比較するための基準として使用でき、また、文献やインターネットに記載されたデータ同士、及び、これらと自分の行った試験データなどについて目的遺伝子の発現量を比較するための基準としても使用できる。目的の遺伝子は１つまたは２つ以上であってよい。
【００１６】
１種の動物の１種または２種以上の組織ないし臓器、あるいは、２種以上の動物の１種または２種以上の組織ないし臓器において、目的遺伝子の発現量を評価するための基準となる３６Ｂ４遺伝子の発現量を捉えるために使用する断片として好ましい領域は、目的遺伝子の発現量を比較しようとする動物種間で高度に保存された領域である。
【００１７】
３６Ｂ４遺伝子の断片の好ましい形態の一つの例について、本発明では図１に示すように、マウス、ラット及びヒトにおいて種を超えて保存された領域は３６Ｂ４遺伝子のｃＤＮＡの５’末端領域であることを見出した。３種の動物間で塩基配列が保存されているところにはアスタリスクを付す。さらに、マウス、ラット及びヒトの３６Ｂ４遺伝子のｃＤＮＡの翻訳開始コドンＡＴＧのＡを６１として番号付けした塩基配列で１１〜１１９、１４２〜１９７、２０５〜２５１の３つの領域から選択される塩基配列が、マウス、ラット及びヒトにおける目的遺伝子の発現量を評価するための基準となる３６Ｂ４遺伝子の断片として好ましいことを見出した。なお、マウス、ラット及びヒトの３６Ｂ４遺伝子の上記のｃＤＮＡの５’末端領域の塩基配列は、それぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示す。
【００１８】
これより、例えば、プローブを使用して３６Ｂ４遺伝子の発現量を測定する場合、使用するプローブは上記の塩基配列１１〜１１９、１４２〜１９７、２０５〜２５１の３つの領域のうち、いずれかの領域から選択される２０塩基以上、好ましくは３０塩基以上、より好ましくは４０塩基以上の配列を有することが好ましい。また、プローブの塩基配列は特に比較したい動物種または特に標的とする動物種の塩基配列に従うことが好ましく、例えば、図１の１０５番目の塩基を含むプローブを使用する場合、ラットとヒトの塩基はＴでありマウスではＣであるため１０５番目の塩基は３種間で同一ではないが、特にラットとヒトを比較したい場合には塩基Ｔを採用するプローブを、特にマウスを標的とする場合には塩基Ｃを採用するプローブを使用することが好ましい。
【００１９】
なお、プローブの塩基配列は、上記の塩基配列１１〜１１９、１４２〜１９７、２０５〜２５１の３つの領域のいずれかの領域から選択される３６Ｂ４遺伝子のｃＤＮＡ断片と全く同一の配列を有してもよく、また、３６Ｂ４遺伝子の標的部位に特異的にハイブリダイズして目的遺伝子の発現量を評価できるのであれば、３６Ｂ４遺伝子のｃＤＮＡ断片と同一の配列を有しなくてもよく、また、ミスマッチな配列を含んでもよい。
【００２０】
他の動物に関しても、上記のマウス、ラット及びヒトにおける例と同様にして、１種の動物の１種または２種以上の組織ないし臓器、あるいは、２種以上の動物の１種または２種以上の組織ないし臓器において、目的遺伝子の発現量を評価するための基準となる３６Ｂ４遺伝子の好適な断片を見出すことができる。
【００２１】
なお、本発明の断片は、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光標識剤などにより、必要に応じて標識できる。
【００２２】
３６Ｂ４遺伝子の発現量と目的遺伝子の発現量を比較することによって、１種の動物の１種または２種以上の組織ないし臓器、あるいは、２種以上の動物の１種または２種以上の組織ないし臓器における目的遺伝子の発現量を評価する方法は、例えば、マイクロアレイ、ノーザンブロッティング、定量的ＰＣＲ法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法などが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００２３】
一つの例として、マイクロアレイでは、例えば上記の塩基配列１１〜１１９、１４２〜１９７、２０５〜２５１の３つの領域のうち、いずれかの領域から選択される２０塩基以上、好ましくは３０塩基以上、より好ましくは４０塩基以上の配列を有する断片を一つ以上備えていればよい。また、該断片と共に、各々の組織ないし臓器において特異的に発現する遺伝子の断片を備えてもよく、また、特定の組織ないし臓器でのみ多量に発現する遺伝子の断片を備えてもよい。さらに、一般的なマイクロアレイの実験では、このようにして作成されたアレイに対し、特定の組織や細胞から調製したＲＮＡを色素などで標識したものを添加してハイブリダイゼーションさせた後に、それぞれのＤＮＡ断片のスポットにおいて観察されるシグナル強度を比較する。一般に、異なる実験で得られたマイクロアレイ解析の生データを比較することは困難であるが、本発明で見出された３６Ｂ４遺伝子断片で観察されるシグナル強度は組織ないし臓器及び動物種の違いを超えてほぼ一定の値を示すことから、その強度を指標にして他のシグナルを補正することによって、異なる実験結果の間においても遺伝子発現の定量的な比較が可能になる。
【００２４】
１種の動物の１種または２種以上の組織ないし臓器、あるいは、２種以上の動物の１種または２種以上の組織ないし臓器において比較的一定に発現している３６Ｂ４遺伝子を標準として目的遺伝子の発現量を評価する一つの形態として、例えば、３６Ｂ４遺伝子の発現量を１として新規の遺伝子の発現量を数値化して表すことにより、様々な組織ないし臓器及び動物種間における該新規遺伝子の発現量について定量的に議論することが可能となる。
【００２５】
また、例えば、複数の医薬品候補物質について種々の組織ないし臓器に対する副作用を調べる場合、目的遺伝子の発現量を評価する基準として３６Ｂ４遺伝子を使用することにより、各候補物質を投与した検体の様々な組織ないし臓器における目的遺伝子の発現量を比較できる。そしてこれにより、各候補物質の生体への影響を把握でき、より効果的な医薬品を選択することができる。また、このとき、動物種間で比較的一定に発現している３６Ｂ４遺伝子を基準として評価することにより、複数の動物種間においても目的遺伝子の発現量を比較でき、動物種間における候補化合物の影響の差異についても知ることが可能となる。
【００２６】
３６Ｂ４遺伝子を標準として使用する方法は上記の例に制限されるもではない。また、３６Ｂ４遺伝子は、組織ないし臓器及び動物種の種類が異なる試料において目的遺伝子の発現量を評価できるだけでなく、癌、糖尿病、肥満などの何らかの疾患または複数の疾患を有する検体、成長段階が異なる検体など、様々な条件の異なる検体間における目的遺伝子の発現量を評価するための有用なツールとして使用できる。
【００２７】
また、３６Ｂ４遺伝子から発現するタンパク質を基準として、組織間ないし臓器間及び動物種間の目的遺伝子の発現量を比較してもよい。
【実施例】
【００２８】
（１）異なる組織ないし臓器で一定に発現している遺伝子を同定するにあたり、遺伝子発現の標準として一般的に用いられている４つのハウスキーピング遺伝子、すなわち、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、Ｇ３ＰＧＨ（ＥＣ  １．２．１．１２）以下、Ｇ３ＰＧＨと示す）、３６Ｂ４、β−アクチン、シクロフィリン（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）について、ラットの脳、心臓、肝臓、腎臓、白色及び褐色脂肪組織、骨格筋ならびに肺における発現量を比較した。
【００２９】
１．プローブの調製
遺伝子発現の比較に供したラットの４種の遺伝子をコードするプローブはすべてＲＴ−ＰＣＲ法によって調製した。遺伝子Ｇ３ＰＤＨのｃＤＮＡはＭＢ４７６（５’−ＣＴＣＡＴＡＧＡＣＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡＡＧ）とＭＢ４７７（５’−ＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＣ）、遺伝子３６Ｂ４のｃＤＮＡはＭＢ１２１７（５’−ＣＣＣＡＴＡＴＧＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＡＣＡＧ）とＭＢ１２１８（５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＣＧＡＡＧＡＧＡＣＣＧＡＡＴＣ）、遺伝子β−アクチンのｃＤＮＡはＨＴ１１９（５’−ＡＴＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣＧＣＴＧＣＧ）とＨＴ１２０（５’−ＧＴＧＣＣＴＡＧＧＧＣＧＧＣＣＣＡＣＧＡＴ）、また遺伝子シクロフィリンのｃＤＮＡはＨＴ４６２（５’−ＡＴＧＧＴＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣ）とＨＴ４６３（５’−ＣＴＣＣＴＧＡＧＣＴＡＣＡＧＡＡＧＧＡＡＴ）をアンプライマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）として用いて増幅した。それぞれのｃＤＮＡを増幅するための鋳型は、遺伝子ＡＨ１３０のｃＤＮＡライブラリー、あるいはラットの心臓から調製した総ＲＮＡの逆転写産物を用いた。
【００３０】
なお、これらの遺伝子でコードされるタンパク質の生理機能は以下の通りである。
【００３１】
Ｇ３ＰＤＨ：解糖系においてグリセルアルデヒド−３−リン酸（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）をリン酸化し、１，３−ビスホスホグリセリン酸（１，３−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ）に変換する酵素で、Ｇ３ＰＤＨまたはＧＡＰＤＨと略して表記される。
【００３２】
３６Ｂ４：３６Ｂ４タンパク質は、もともとはエストラジオールで処理したＭＣＦ−７細胞と処理していない細胞間でのディファレンシャルｃＤＮＡライブラリー（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ）において、エストラジオールによる変動のないクローン３６Ｂ４として同定され、その後の塩基配列の解析によって３６Ｂ４であることが明らかにされた。３６Ｂ４はリボソーム中に含まれるリン酸化された酸性タンパク質群の１つで、ポリペプチド鎖の伸長において機能する。
【００３３】
β−アクチン：細胞骨格を形作るミクロフィラメントの成分であり、ほとんど全ての真核細胞において発現していると考えられている。組織間における遺伝子発現量の比較の際に、コントロールとして最も一般的に用いられてきた。
【００３４】
シクロフィリン：最初は免疫抑制剤として知られるシクロスポリンＡ（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ）に結合するタンパク質として単離された。タンパク質の本来の機能はペプチジル−プロリル  シス−トランス  イソメラーゼ（ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  （ＥＣ  ５．２．１．８））という酵素の１つであり、新たに合成されたタンパク質のホールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）に関与しているとされている。ほとんどの真核生物に高レベルに発現しており、細胞質の全タンパク質の０．１〜０．４％を占める。
【００３５】
２．動物組織からのＲＮＡ試料の調製
雄性のＷｉｓｔａｒラット（４週齢、７匹）の脳、心臓、肝臓、腎臓、白色脂肪組織、褐色脂肪組織、骨格筋及び肺の各組織を摘出し、グアニジンチオシアネート溶液中でホモジナイズ後、ゲノムＤＮＡをシーリングによって細かく分断し、塩化セシウム溶液中での超遠心によって総ＲＮＡを単離した。
【００３６】
３．ノーザンブロッティング
それぞれの組織におけるそれぞれの遺伝子の発現量を解析するために、上記の要領で精製した各組織または臓器の総ＲＮＡ  １０μｇを変性アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写した。同じ要領で、複数枚の均質なフィルターを調製し、１枚のフィルターはメチレンブルー染色し、等量のＲＮＡが電気泳動に供されていることの確認を行った。残りのフィルターを放射標識したそれぞれの遺伝子のプローブとハイブリダイズさせ、それぞれの遺伝子の発現量を検討した。
【００３７】
発現量を比較した結果、図２に示すように遺伝子Ｇ３ＰＤＨや遺伝子β−アクチンの発現量は組織または臓器間で大きな差があり、これらの遺伝子を組織ないし臓器間の発現量を比較するための標準として用いることは妥当ではないことが認められた。また、シクロフィリン遺伝子の発現レベルについても、遺伝子Ｇ３ＰＤＨや遺伝子β−アクチンほどではないものの、組織ないし臓器間で顕著な差異が認められた。一方、遺伝子３６Ｂ４の発現は組織ないし臓器間での差が極めて少なく、組織ないし臓器間でのスタンダード遺伝子として有用であることが結論された。
【００３８】
（２）次に、異なる動物種間で遺伝子３６Ｂ４の発現を比較する方法を調べた。一般に実験によく用いられるマウス、ラット及びヒトの遺伝子３６Ｂ４のｃＤＮＡの塩基配列を比較したところ、９０〜９２％同一であった。そこで、マウス、ラット及びヒトの３６Ｂ４をコードするｍＲＮＡを試験管内で合成し、ラットのｃＤＮＡを用いて、ノーザンブロッティングにより定量した。
【００３９】
１．マウス、ラット及びヒトの３６Ｂ４をコードするｍＲＮＡの試験管内合成
ラットの遺伝子３６Ｂ４の発現ベクターは、上記のプローブ調製の要領で調製したｃＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化後、ｐＥＴ−３ａベクターにサブクローニングすることによって調製した。マウス及びヒトの遺伝子３６Ｂ４の発現ベクターも同じ要領で調製した。なお、ＲＴ−ＰＣＲのプライマーは上記のアンプライマー、ＭＢ１２１７とＭＢ１２１８を用い、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型としては、マウス及びヒトの心臓のＲＮＡの逆転写産物を用いた。なお、それぞれの発現ベクターが適切に構築されていることを検証するために、塩基配列の確認を行った。このようにして調製したマウス、ラット及びヒトの遺伝子３６Ｂ４の発現ベクターを、ｃＤＮＡの３’末端に位置する制限酵素ＢａｍＨＩのサイトで消化して１本鎖とした後、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを加えることによりＲＮＡへと転写させ、それぞれの種の遺伝子３６Ｂ４をコードするｍＲＮＡを調製した。
【００４０】
２．ノーザンブロッティング
試験管内で合成したマウス、ラット及びヒトのそれぞれのｍＲＮＡ  ２．５μｇを変性アガロースゲル電気泳動に供し、ニトロセルロース膜に転写後、メチレンブルー染色し、合成されたＲＮＡの量と質の検定を行った。その結果を図３の（Ａ）に示す。また、合成されたそれぞれの種のＲＮＡの０．１ｎｇ及び１．０ｎｇを変性アガロースゲル電気泳動に供し、これをラットのｃＤＮＡで検出した。その結果を図３の（Ｂ）に示す。それぞれのＲＮＡ試料で観察されたハイブリダイゼーションシグナルをＢＡＳイメージアナライザーで定量し、ラットについて得られた値を１．００とした場合の値を図３の（Ｂ）に示す写真の下に付記した。
【００４１】
その結果、図３に示すように、ラットのｃＤＮＡを用いても、マウス及びヒトの遺伝子３６Ｂ４のｍＲＮＡを検出することができた。しかし、マウス及びヒトのｍＲＮＡではラットのｍＲＮＡに比べて、その塩基配列に１０％程度のミスマッチがあるため、同一の動物種間でのシグナル強度に対して、３０％程度に低下してしまうことが明らかになった。なお、ＲＮＡは化学的に極めて不安定で、周囲環境中に存在するＲＮＡ分解酵素によって容易に分解されることがよく知られている。図３に示されているように、合成されたＲＮＡが先鋭な１本のバンドとして検出されたことは、本実施例において良質なＲＮＡが調製されたことを意味する。
【００４２】
（３）次に、異なる動物種間で遺伝子３６Ｂ４の発現レベルを定量的に比較するために、マウス、ラット及びヒトで高度に保存されている領域を探索したところ、マウス、ラット及びヒトの３６Ｂ４をコードするｃＤＮＡの塩基配列は全長では９０〜９２％保存されていたが、そのｃＤＮＡの５’末端領域に高度に保存された領域が存在することを見出した。図１では、保存された５’末端領域を中心に塩基配列を示す。なお、塩基配列は、翻訳開始コドンＡＴＧのＡを６１として番号を付した。また、３種の動物間で塩基配列が保存されているところにはアスタリスクを付した。
【００４３】
（４）図１に示す、ｃＤＮＡの５’末端領域に見出された種を超えて保存された領域を用いれば、マウス、ラット及びヒトの３６Ｂ４の発現強度を定量的に比較できる可能性がある。この可能性を実証するために、高度に保存された領域のアンチセンスＤＮＡ鎖をプローブとして、既知量の合成されたマウス、ラット及びヒトのｍＲＮＡを検出した。
【００４４】
ここでは、図３の試験管内で合成したＲＮＡ  ０．１ｎｇ及び１．０ｎｇを電気泳動に供し、ニトロセルロース膜に転写後、５’末端を放射標識したプローブ（高度に保存された塩基配列（６１〜１１９）のアンチセンス鎖に相当する合成オリゴヌクレオチドＭＢ１２１９を放射標識したプローブ）との反応性を検討した。それぞれのＲＮＡ試料で観察されたハイブリダイゼーションシグナルをＢＡＳイメージアナライザーで解析し、ラットのＲＮＡについて得られたシグナル強度を１．００とした場合の相対値を図４の写真の下に記した。その結果、図４に示すように、ヒトのｍＲＮＡにおけるシグナル強度は０．９９、マウスのｍＲＮＡにおけるシグナル強度は０．９６であり、それぞれの種のｍＲＮＡを同じように検出できた。
【００４５】
（５）上記の実施例で使用した３６Ｂ４遺伝子の発現量を測定するためのプローブは、遺伝子３６Ｂ４のｃＤＮＡの翻訳開始コドンＡＴＧのＡを６１として番号付けした塩基配列で６１〜１１９の５９塩基からなる。３６Ｂ４遺伝子の発現量を測定するための断片として特に好ましい領域を「４０塩基以上連続し、このうちに２塩基以上のミスマッチのない領域」と規定すると、図１の塩基配列１１〜１１９、１４２〜１９７、２０５〜２５１の３つの領域がこの規定に該当する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ヒト、マウス及びラットの３６Ｂ４をコードするｃＤＮＡの５’末端領域の塩基配列の比較結果。
【図２】ラットの種々の組織ないし臓器における４つのハウスキーピング遺伝子の発現プロフィール。
【図３】ラットのｃＤＮＡをプローブに用いた場合のマウス、ラット及びヒトにおけるハイブリダイゼーションシグナル強度の差。
【図４】ヒト、マウス及びラットにおいて高度に保存された領域のｃＤＮＡをプローブに用いた場合のマウス、ラット及びヒトにおけるハイブリダイゼーションシグナル強度の差。
【配列表フリーテキスト】
【００４７】
配列番号４はＭＢ４７６プライマーの塩基配列を示す。
【００４８】
配列番号５はＭＢ４７７プライマーの塩基配列を示す。
【００４９】
配列番号６はＭＢ１２１７プライマーの塩基配列を示す。
【００５０】
配列番号７はＭＢ１２１８プライマーの塩基配列を示す。
【００５１】
配列番号８はＨＴ１１９プライマーの塩基配列を示す。
【００５２】
配列番号９はＨＴ１２０プライマーの塩基配列を示す。
【００５３】
配列番号１０はＨＴ４６２プライマーの塩基配列を示す。
【００５４】
配列番号１１はＨＴ４６３プライマーの塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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