(57)【要約】【課題】濃縮プロセスの間の蛋白、特にＩＬ−１１の安定性を改善する方法、並びに例えば皮下注射、静脈注射を包含する種々の投与経路用の蛋白が十分に高濃度である組成物において他の担体蛋白が不存在の場合でも高い安定性を提供する。【解決手段】ＩＬ−１１およびグリシンを含むことを特徴とする組成物であって、中性のｐＨを有する組成物。詳細には、ＩＬ−１１およびグリシン、所望によりヒスチジンおよびリン酸塩のごとき緩衝剤を含むことを特徴とする組成物であって、グリシンが１００ｍＭから３００ｍＭであり、中性のｐＨを有する組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１１およびグリシンを含むことを特徴とする組成物であって、グリシンが１００ｍＭから３００ｍＭであり、中性のｐＨを有する組成物。
【請求項２】
該グリシンが１５０ｍＭから３００ｍＭまでの範囲である請求項１の組成物。
【請求項３】
該グリシンが３００ｍＭである請求項１の組成物。
【請求項４】
該グリシンが１５０ｍＭである請求項１の組成物。
【請求項５】
該ＩＬ−１１が０.１ないし２０ｍｇ／ｍＬである請求項１の組成物。
【請求項６】
該ＩＬ−１１が５.０ｍｇ／ｍＬである請求項１の組成物。
【請求項７】
該ＩＬ−１１が５.０ｍｇ／ｍＬであり、該グリシンが３００ｍＭである請求項１の組成物。
【請求項８】
ＩＬ−１１、グリシン、および緩衝剤を含むことを特徴とする組成物であって、グリシンが１００ｍＭないし３００ｍＭであり、中性のｐＨを有する組成物。
【請求項９】
該緩衝剤がヒスチジンおよびリン酸塩からなる群より選択されるメンバーである請求項８の組成物。
【請求項１０】
該緩衝剤がリン酸ナトリウムである請求項９の組成物。
【請求項１１】
該リン酸塩が５ｍＭから４０ｍＭまでの範囲である請求項９の組成物。
【請求項１２】
該リン酸ナトリウムが１０ｍＭである請求項１０の組成物。
【請求項１３】
該ヒスチジンが５ｍＭから４０ｍＭまでの範囲である請求項９の組成物。
【請求項１４】
該ヒスチジンが２０ｍＭである請求項１１の組成物。
【請求項１５】
５.０ｍｇ／ｍＬのＩＬ−１１、３００ｍＭのグリシン、および１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１６】
５.０ｍｇ／ｍＬのＩＬ−１１、３００ｍＭのグリシン、および２０ｍＭのヒスチジンを含むことを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１１新規処方に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインとして知られる、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）を包含する種々の調節分子が同定されている。ＩＬ−１１は種々の造血および免疫機能を刺激する。ＩＬ−１１の種々の蛋白形態およびＩＬ−１１活性の種々の形態をコードしているＤＮＡは、特許文献１〜３に記載されており、これらを参照により本明細書に記載されているものとみなす。よって、用語「ＩＬ−１１」は、組み換え遺伝子操作法により生産された蛋白、本来的にもしくは他の因子での誘導によりＩＬ−１１を産生する細胞ソースから精製された蛋白、または化学的方法により合成された蛋白、または上記の組み合わせにより得られる蛋白を包含する。
【０００３】
蛋白の薬理学的利益を最大にするためには、安定で、容易かつ再生産可能に製造でき、投与の標準的経路用に設計された最終投与形態を有することが必須である。特別には、バルク蛋白、例えばＩＬ−１１の安定かつ濃縮された形態を有し、蛋白の最終投与形態のさらなる製造に適し、その後、例えば皮下注射のごとき経路で投与できることが望ましい。
【０００４】
バルク蛋白および最終投与形態の両方において、蛋白安定性は、イオン強度、ｐＨ、温度、凍結／融解の繰り返しサイクル、および剪断力のごとき因子により影響される。変性および凝集をはじめとする物理的不安定状態、並びに例えば、加水分解、脱アミド化および酸化をはじめとする化学的不安定状態の結果として活性蛋白が消失する。蛋白医薬の安定性のレビューについては、例えば、非特許文献１参照。さらに、担体蛋白の不存在下において安定性を維持することが望ましい。
【０００５】
これらの蛋白の不安定性が生じうることが広く認識されているが、蛋白についての研究が行われるまでは特定の蛋白が有しうる特定の不安定性の問題を予想することは不可能である。これらの不安定性はいずれも、低下した活性、増加した毒性、および／または増加した免疫原性を有する蛋白または蛋白副産物もしくは誘導体の生成を引き起こしうる。実際に、蛋白沈殿は血栓症、剤型および免疫反応の不均一性を引き起こしうる。よって、すべての蛋白医薬処方の安定性および効能は、その安定性に直接関連している。
【０００６】
したがって、濃縮プロセスの間の蛋白安定性を改善する方法、並びに例えば皮下注射、静脈注射を包含する種々の投与経路用の、十分に高濃度である場合であって他の担体蛋白の不存在下における安定性を提供する方法に対する必要性が当該分野において存在し続けている。
【特許文献１】ベネット（Bennett）ら、米国特許第５,２１５,８９５号
【特許文献２】マッコイ（McCoy）ら、米国特許第５,２７０,１８１号
【特許文献３】マッコイら、米国特許第５,２９２,６４６号
【非特許文献１】マンニング（Manning）ら、ファーマシューティカル・リサーチ（Pharmaceutical Research）第６巻：９０３〜９１８頁（１９８９年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
濃縮プロセスの間の蛋白、特にＩＬ−１１の安定性を改善する方法、並びに例えば皮下注射、静脈注射を包含する種々の投与経路用の蛋白が十分に高濃度である組成物において他の担体蛋白が不存在の場合でも高い安定性を提供することが本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、ＩＬ−１１およびグリシンからなる（comprise）組成物であって、中性のｐＨを有する組成物を用いた場合に上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明の１の態様は、バルク薬剤製品として有用なＩＬ−１１の濃縮調製物を提供する。
【００１０】
本発明のもう１つの態様は、最終剤型での投与に有用な濃縮ＩＬ−１１処方からなる組成物を提供する。
【００１１】
好ましい組成物は、ＩＬ−１１およびグリシンを含有し、所望により緩衝剤を含有していてもよい。好ましいグリシン濃度は１００ｍＭから３００ｍＭまでの範囲であり、３００ｍＭが最も好ましい。ＩＬ−１１濃度は、０.１ｍｇ／ｍＬから２０.０ｍｇ／ｍＬまでの範囲であり、５.０ｍｇ／ｍＬが最も好ましい。適当な緩衝剤は、ヒスチジンおよびリン酸ナトリウムを包含し、５ｍＭから４０ｍＭまでの範囲であり、リン酸ナトリウムについては１０ｍＭが好ましく、ヒスチジンについては２０ｍＭが好ましく、リン酸ナトリウムが好ましい緩衝剤である。
【００１２】
本発明組成物は凍結物、液体、または凍結乾燥物のいずれかであってもよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、濃縮プロセスの間の蛋白、特にＩＬ−１１の安定性が改善され、例えば皮下注射、静脈注射を包含する種々の投与経路用の蛋白が十分に高濃度である組成物において他の担体蛋白が不存在の場合でも高い安定性が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
適切な薬剤投与処方の開発において、特定の蛋白の溶解度、その安定性、および蛋白に関する特別な取り扱い条件を包含する種々の因子が考慮される。すべての蛋白が取り扱いに対して感受性があるというわけではないが、出願人は、ＩＬ−１１は実際には取り扱いに対して感受性があり、可溶性凝集物および沈殿の形成が蛋白取り扱い後に観察されることを見いだしている。かかる取り扱いは、例えば、医療現場への輸送および包装操作に関連する通常の剪断力を包含する。さらに、時々、蛋白処方は、製造中にステンレス鋼または他の管中をポンプ輸送され、あるいは蛋白を剪断力にさらす可能性のある送達システムによりストレスを受ける。蛋白を種々の凍結／融解サイクルに供することも時々必要であり、それによっても蛋白は潜在的な変性にさらされる。
【００１５】
対象蛋白を凍結乾燥すること、および蛋白を凍結乾燥形態で輸送することにより、いくつかの努力が行われてきたが、いったん蛋白がその状態になると、ヘルスケア従事者または患者のいずれかにより復元されなければならない。正当な復元は、滅菌条件下で手順が行われることを必要とし、温和に行われることを必要とし、さらに復元溶液の完全性に関する評価を行う必要がある。凍結乾燥剤型の使用に関する潜在的な不便さのため、可能であれば液体剤型がより望ましい。安定な液体剤型の蛋白医薬の開発は１つの挑戦である。なぜなら、一般的には、液体形態は凍結乾燥形態よりも不安定だからである。しかしながら、液体剤型の安定性の問題が克服されたならば、液体形態を使用することができる。
【００１６】
出願人は、ＩＬ−１１のいくつかの化学的不安定性はＡｓｐ１３３とＰｒｏ１３４との間の加水分解の結果であることを見いだしている。また、Ａｓｎ４９のＡｓｐ４９への脱アミド化も検出されている。さらに、Ｍｅｔ５８の酸化も観察されている。これらの化学反応のすべてがＩＬ−１１蛋白の化学的不安定性の証拠である。さらにＩＬ−１１は、ダイマー化プロセス（実際には、ＩＬ−１１のモノマー形態とダイマー形態との間の平衡をシフトさせる）、並びに凝集体形成を包含するある種の物理的不安定状態にもさらされる。
【００１７】
本発明によれば、適切なｐＨにおけるグリシンの添加は、ＩＬ−１１の凝集を防止し、ＩＬ−１１を有害な剪断効果から防御する作用をする。次いで、これにより蛋白の取り扱いの可能性が増加し、ＩＬ−１１製品の貯蔵期間が延長される。また本発明は、皮下注射に適するグリシン含有ＩＬ−１１処方を提供する。ＩＬ−１１濃度は０.５から２０.０ｍｇ／ｍＬまでの範囲である。ＩＬ−１１処方は液体または凍結乾燥剤型いずれであってもよい。そのうえ、適当な緩衝剤の添加により加水分解、脱アミノ化、および酸化の速度が低下する。中性ｐＨにおいて十分に緩衝作用を有する、当該分野において知られている適当なバッファーまたはいずれかの緩衝剤を用いて緩衝化が行われる。ヒスチジンが好ましく、リン酸ナトリウムが最も好ましい。
【００１８】
以下の実施例は、本発明の実施を説明する。これらの実施例は単に説明を目的とするものであって、権利請求されている本発明の範囲を何ら限定するものではない。実施例１はＩＬ−１１に対する剪断力に対する種々の賦形剤の影響を記載する。実施例２は濃縮ＩＬ−１１溶液に関する。実施例３はＩＬ−１１含有溶液の熱安定性を記載する。実施例４は長期間のＩＬ−１１安定性に関する。
【実施例１】
【００１９】
剪断効果に対する抵抗性
ＩＬ−１１の剪断に対する種々の賦形剤の剪断防御効果を試験するために、表Ｉに示す種々のバッファーを含有する溶液にＩＬ−１１を添加する。詳細には、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０.１５Ｍ  ＮａＣｌ,ｐＨ７.０中の２ｍｇ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−１１を種々のバッファーを含有する溶液に添加し、トライアンギュラー・リアクティーバイアル（triangular reacti-vial）を用いて約１００ｒｐｍで２０分間、体積１ｍＬ中の０.１ｍｇ／ｍＬの溶液を激しく撹拌する。すべての試料を３系で調製する。試料を遠心分離し、サイズ排除高品質液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により上清を蛋白濃度に関して試験する。表ＩはｒｈＩＬ−１１の回収に対する賦形剤の影響を示す。
【００２０】
撹拌前後の試料を試験することにより回収率パーセントを決定する。１００μＬの部分試料をトーソーハース（TosoHass）  ＴＳＫ２０００ＳＷＸＬ  ＨＰＬＣカラム（カタログ番号０８５４０）に注入し、５０ｍＭ  ＭＥＳ、０.５  ＮａＣｌ,ｐＨ６.０のバッファーを用い、流速１ｍＬ／分とする。吸光度を２８０ｎｍにおいてモニターする。ウォーターズ（Waters）ＨＰＬＣシステムを用いる（ウォーターズ６００マルチソルベントデリバリーシステム、ウォーターズ６００Ｅシステムコントローラー、ウォーターズＷＩＳＰ７１２オートインジェクター、ウォーターズ４９０Ｅプログラム可能多波長検出器、およびウォーターズＥｘｐｅｒｔＨＰＬＣソフトウェアパッケージ）。撹拌された試料中のｒｈＩＬ−１１ピーク吸光面積を対照試料の吸光面積で割ることにより回収率パーセントを決定する。３つの試料の回収率を平均する。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
最大の剪断防御効果は、グリシン、エチルグリシン、塩化カルシウム、およびε−アミノ−ｎ−カプロン酸に関して観察される。
【実施例２】
【００２３】
ＩＬ−１１溶液の濃縮
この実施例はグリシンの可溶化効果を示す。ＩＬ−１１溶液の濃縮効果を試験するために試料を調製する。出願人は、グリシン不存在下でのＩＬ−１１の撹拌セル濃縮は低い回収率（８５〜９０％）となり、多量体ＩＬ−１１のレベルの上昇を導く可能性があることを見いだしている。サイズ排除高品質液体クロマトグラフィーを用いて決定したこれらの種の見かけの分子量は、ダイマーおよびトライマー形態に対応する。
【００２４】
２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、０.２５Ｍ  ＮａＣｌ,ｐＨ７.０中のＩＬ−１１含有溶液（０.４ｍｇ／ｍＬ、５００ｍＬ）を、１００ｍＬ撹拌セルを用いて６０ｐｓｉにおいて５ｍｇ／ｍＬ（４０ｍＬ）にまで濃縮する。限界濾過中、体積が減少するにつれ蛋白濃度が上昇し、ＹＭ１０（１０ｋＤ）膜を通過する溶液の流速が減少する。この流速の減少は膜表面上への蛋白層の沈着による。透析濾過工程が開始し、グリシン含有バッファー（２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、０.３Ｍグリシン,ｐＨ７.０）が導入されると、流速が増加する。この流速の増加は膜表面上に沈着した蛋白層の可溶化を示すものである。かくして、グリシンを用いるとＩＬ−１１回収率が８５〜９０％から９８〜１００％に上昇する。
【実施例３】
【００２５】
ＩＬ−１１の熱安定性
この実施例は、グリシンの添加により、ＩＬ−１１が可溶性のままである温度を上昇させ得ることを示す。
【００２６】
ＩＬ−１１含有溶液の熱変性を、ＳＬＭ／アミコン（SLM/Amicon）８０００Ｃ蛍光分光測定器を用いて行う。溶液中でＩＬ−１１が変性するにつれ、それが沈殿する。この観察結果に基づいて、試料を３２０ｎｍにおいて励起し、エミッションも３２０ｎｍにおいてモニターすることにより蛍光分光測定器を用いて直角光散乱をモニターする。キュベット温度を１分間に１℃上昇させながらエミッションシグナルを連続的にモニターする。ネスラブ（Neslab）１１０Ｃグラジエントコントロールドウォーターバスを用いて温度を調節する。５０％の蛋白が沈殿する温度を沈殿温度（Ｔｐ）と記載する。
【００２７】
種々の量のＩＬ−１１を含有する溶液を熱変性させた。蛋白濃度が上昇するにつれ、沈殿の生成は蛋白濃度依存性であるため一般的にはＴｐが低下する。２種のＩＬ−１１溶液を試験する：ＰＢＳ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ,ｐＨ７.０）および２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、３００ｍＭグリシン,ｐＨ７.０のグリシン含有溶液。表IIは、蛋白濃度が上昇するにつれ、ＰＢＳ溶液中におけるＴｐは劇的に低下するが、グリシン含有溶液中では低下しないことを示す。該データは、グリシンが溶液中のＩＬ−１１を安定化することを示す。
【００２８】
【表２】
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【実施例４】
【００２９】
長期間のＩＬ−１１安定性
ＩＬ−１１安定性に対する長期間の効果を評価するために、異なる温度において、１５０ｍＭまたは３００ｍＭいずれかのグリシンを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウムの存在下でＩＬ−１１を１２カ月までインキュベーションする。データは、より多くのグリシンの添加は、温度を上昇した場合の液体状態のこの蛋白の貯蔵期間の安定性の増加を助けることを明確に示す。さらに、グリシンの不存在は、温度を上昇させた場合のｒｈＩＬ−１１の劇的な損失を総体的に導く。
【００３０】
５.０ｍｇ／ｍＬの２種の処方にｒｈＩＬ−１１を調製する：１０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭグリシン,ｐＨ７.０、および１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭグリシン,ｐＨ７.０。１ｍＬの試料を２ｍＬのモールデッドバイアル（molded vials）（キンブル（Kimble））中に調製し、栓をして固定して１２カ月まで６種の温度においてインキュベーションする（−８０℃、−２０℃、２〜８℃、３０℃、４０℃、５０℃）。逆相ＨＰＬＣ法により蛋白回収率を決定し、結果を表IIIに示す。
【００３１】
【表３】
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【００３２】
もう１つのセットの試料を、１０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭグリシン,ｐＨ７.０の処方に調製する。これらの試料は液体であり、２〜８℃で１８カ月まで貯蔵する。該試料はＩＬ−１１活性を保持する。
【００３３】
もう１つのセットの試料を、２０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、３００ｍＭグリシン,ｐＨ７.０の処方に調製する。これらの試料を凍結乾燥し、２〜８℃で１８カ月まで貯蔵する。該試料はＩＬ−１１活性を保持する。
【００３４】
本発明は、特定の方法および組成物に関して説明されたが、当業者が本発明を考慮して変更および改変を行うであろうということが理解される。
【００３５】
上記説明的な実施例に記載された本発明における多くの改変および変更が当業者により行われると考えられ、したがって、添付された請求の範囲にあるような限定は本発明の範囲内のはずである。したがって、権利請求された本発明の範囲内にあるすべてのかかる均等なバリエーションをカバーすることが添付された請求の範囲において意図される。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、安定性の高い高濃度蛋白処方を提供することができるので、医薬品、研究試薬等の分野において利用することができる。