(57)【要約】      （修正有）【課題】ＲＨＤＶ等のカリシウイルス組換体ポックスウイルスおよびそれ由来の産物を提供する。【解決手段】ＲＨＤＶ抗原、例えば、キャプシド遺伝子のようなカリシウイルス抗原をコード化するＤＮＡを含有する弱毒化組換えウイルス、並びにウイルス、そこからの発現産生物、およびウイルスまたは発現産生物から産生された抗体を用いた方法および組成物。組換えウイルスは、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ組換えウイルスであってもよい。組換えウイルスおよびそこからの遺伝子産生物並びにウイルスおよび遺伝子産生物により産生された抗体には、いくつかの予防、治療および診断の用途がある。ウイルスからのＤＮＡは、プローブまたはプライマーに関して用いてもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変組換体ウイルスであって、該改変組換体ウイルスが、前記ウイルスが弱毒化された毒性、保持された効率を有するように内部でウイルスにコードされた遺伝子機能が不活性化されており；前記ウイルスがさらにウイルスゲノムの非必須領域中に外来性ＤＮＡを有し、該外来性ウイルスが少なくとも１つのカリシウイルスエピトープをコードしていることを特徴とする改変組換体ウイルス。
【請求項２】
前記ウイルスがポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項記載のウイルス。
【請求項３】
前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする請求の範囲第２項記載のウイルス。
【請求項４】
前記遺伝子機能が少なくとも１つのオープンリーディングフレームを欠失させることによって不活性化されていることを特徴とする請求の範囲第３項記載のウイルス。
【請求項５】
前記欠失された遺伝子機能がＣ７Ｌ−Ｋ１Ｌオープンリーディングフレーム、または宿主範囲領域を含むことを特徴とする請求の範囲第４項記載のウイルス。
【請求項６】
少なくとも１つの付加的なオープンリーディングフレームが欠失され；該付加的なオープンリーディングフレームがＪ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、およびＩ４Ｌから成る群から選択されていることを特徴とする請求の範囲第５項記載のウイルス。
【請求項７】
少なくとも１つの付加的なオープンリーディングフレームが欠失され；該付加的なオープンリーディングフレームがチミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体、血球凝集素遺伝子、およびリボヌクレオチドレダクターゼラージサブユニットから成る群から選択されていることを特徴とする請求の範囲第５項記載のウイルス。
【請求項８】
Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１ＬおよびＩ４Ｌが前記ウイルスから欠失されていることを特徴とする請求の範囲第６項記載のウイルス。
【請求項９】
チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体、血球凝集素遺伝子、宿主範囲領域およびリボヌクレオチドレダクターゼラージサブユニットが前記ウイルスから欠失されていることを特徴とする請求の範囲第７項記載のウイルス。
【請求項１０】
ＮＹＶＡＣ組換体ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第８または９項記載のウイルス。
【請求項１１】
前記外来性ＤＮＡがウサギ出血疾患ウイルスエピトープをコードしていることを特徴とする請求の範囲第１０項記載のウイルス。
【請求項１２】
前記外来性ＤＮＡがキャプシド遺伝子をコードしていることを特徴とする請求の範囲第１１項記載のウイルス。
【請求項１３】
ｖＰ１２４９であることを特徴とする請求の範囲第１項記載のウイルス。
【請求項１４】
宿主（ヒトを除く）中において弱毒化された毒性を有するように改変された改変組換体アビポックスウイルスであって、ウイルスゲノムの非必須領域中に外来ＤＮＡを有し、該外来性ウイルスが少なくとも１つのカリシウイルスエピトープをコードしていることを特徴とする改変組換体ウイルス。
【請求項１５】
前記ウイルスがカナリアポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１４項記載のウイルス。
【請求項１６】
前記カナリアポックスウイルスが、ニワトリ胚繊維芽細胞においての２００回より多くの継続的継代を通して弱毒化されたＲｅｎｔｓｃｈｌｅｒワクチン株であり、それ由来のマスターシードが４回の継続的な寒天下でのプラーク精製を経、それ由来のプラーククローンが、５回の付加的な継代を通して増幅されているものであることを特徴とする請求の範囲第１５項記載のウイルス。
【請求項１７】
ＡＬＶＡＣ組換体ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１６項記載のウイルス。
【請求項１８】
前記外来性ＤＮＡがウサギ出血疾患ウイルスエピトープをコードしていることを特徴とする請求の範囲第１８項記載のウイルス。
【請求項１９】
前記外来性ＤＮＡがキャプシド遺伝子をコードしていることを特徴とする請求の範囲第１８項記載のウイルス。
【請求項２０】
ｖＣＰ３０９であることを特徴とする請求の範囲第１９項記載のウイルス。
【請求項２１】
宿主（ヒトを除く）において免疫学的反応を誘導する方法であって、前記宿主に請求の範囲第１、８、９、１３、１４、１５、１７、１９または２０項の何れか１項記載のウイルスを好適な担体との混合物として含有する組成物を投与することを含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求の範囲第１、８、９、１３、１４、１５、１７、１９または２０項の何れか１項記載のウイルスを好適な担体との混合物として含有することを特徴とする免疫学的反応を誘導するための組成物。
【請求項２３】
インビトロで培養された細胞において遺伝子産物を発現させる方法であって、請求の範囲第１、８、９、１３、１４、１５、１７、１９または２０項の何れか１項記載のウイルスを前記細胞に導入することを含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求の範囲第１、８、９、１３、１４、１５、１７、１９または２０項の何れか１項記載のウイルスのインビトロ発現から調製されたカリシウイルス抗原。
【請求項２５】
請求の範囲第１、８、９、１３、１４、１５、１７、１９または２０項の何れか１項記載のウイルスのインビボ発現により、または前記ウイルスのインビトロ発現由来のカリシウイルス抗原の投与により誘導された抗体。
【請求項２６】
請求の範囲第１、８、９、１３、１４、１５、１７、１９または２０項の何れか１項記載のウイルス由来のＤＮＡ由来のＤＮＡプローブまたはＰＣＲプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、1991年３月７日に出願された出願番号07/666,056の一部継続出願である、1991年６月11日に出願された出願番号07/713,967の一部継続出願である、1992年３月６日に出願された出願番号07/847,951の継続出願である１９９３年８月１３日に出願された出願番号０８／１０５，４８３の一部継続出願であり、1993年３月24日に出願された出願番号08/036,217は、出願番号07/666,056の継続出願であり、米国特許第5,364,773号として1994年11月15日に発行された。上述した出願および特許の各々をここに引用する。
【０００２】
本発明は、改変ポックスウイルスおよびその製造並びに使用方法；例えば、ワクシニアウイルスまたは鳥類ポックス（例えば、カナリア痘または鶏痘）、例えば、改変組換体ポックスウイルス−カリシウイルス、例えば、弱毒化組換体、特にＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ  ＲＨＤＶ組換体のようなウサギ出血疾病ウイルス（ＲＨＤＶ）に関するものである。より詳しくは、本発明は、安全な免疫化媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）として使用するために異種遺伝子を挿入して発現させて、ＲＨＤＶのようなカリシウイルスに対する免疫応答を誘発する改良ベクターに関するものである。したがって、本発明は、そのウイルスが、カリシウイルス、例えば、ＲＨＤＶの遺伝子産生物を発現する組換えポックスウイルス、および宿主に投与されたとき、またはインビトロのカリシウイルス、例えばＲＨＤＶ感染に対して免疫応答を誘発させる免疫組成物並びにそれら自体が例えば抗体の産生等の免疫応答を誘発するポックスウイルスの発現産物であって、それらがカリシウイルス、例えば、ＲＨＤＶ感染に対して、血清陽性または血清陰性の個体のいずれにおいても有用な抗体を育成させるのに有用なものであるか、または事情に応じて動物、ヒトまたは細胞培養物から単離された、それによって誘発される抗体または発現産生物が、ウイルスの、または感染細胞の、あるいは他の系統における抗原または産生物の発現の検出のための診断キット、試験または検定を準備するのに有用なポックスウイルスの発現産物に関するものである。単離された発現産生物は、系統、宿主、血清または試料中の抗体の検出、または抗体の産生のためのキット、試験または検定において特に有用である。
【０００３】
いくつかの出版物がこの出願において参照されている。これらの参考文献については、請求の範囲の直前の明細書の終わりまたは出版物が述べられている箇所に完全に記載されている。これらの出版物の各々をここに参照文献として引用する。
【背景技術】
【０００４】
ワクシニアウイルスおよびごく最近では他のポックスウイルスが、異種遺伝子の挿入および発現に用いられている。異種遺伝子を感染性生ポックスウイルス中に挿入する基本技術は、ドナープラスミド中の異種遺伝要素に隣接するポックスＤＮＡ配列と、レスキューポックスウイルス中に存在する相同性配列との間の組換えに関するものである（Piccini他, 1987）。
【０００５】
特に、組換えポックスウイルスは、従来技術において知られており、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、および特許文献５に記載されているワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルスのようなポックスウイルスの合成組換体を形成する方法と同種の２段階で構築される。
【０００６】
第１に、ウイルスに挿入されるべきＤＮＡ遺伝子配列、特に非ポックス給源由来のオープンリーディングフレームを、内に既にポックスウイルスのＤＮＡ部分に相同的なＤＮＡが既に挿入されているＥ．コリプラスミド中に配置する。それとは別に、挿入されるべきＤＮＡはプロモーターに連結させる。プロモーター−遺伝子連結物は、プラスミド構築物中に、プロモーター−遺伝子連結物が両端で、非必須座を含むポックスＤＮＡ領域中に隣接しているＤＮＡ配列に相同的なＤＮＡに隣接しているように位置されている。その結果得られるプラスミド構築物を、続いてＥ．コリ細菌の増殖により増幅させ（Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９７２）、単離する（Ｃｌｅｗｅｌｌ  他，１９６９；Ｍａｎｉａｔｉｓ  他，１９８２）。
【０００７】
第２に、挿入されるべきＤＮＡ遺伝子を含む単離されたプラスミドは、例えばニワトリ繊維芽細胞等の細胞培養中に、ポックスウイルスとともに移入される。プラスミド中の相同ポックスＤＮＡとウイルスゲノムそれぞれとの間の組換えは、そのゲノムの非必須領域中の、外来ＤＮＡ配列の存在によって改変されたポックスウイルスを提供する。用語「外来」ＤＮＡとは、外因性ＤＮＡ、特に非ポックス給源由来のＤＮＡで、その外因性ＤＮＡが位置されているゲノムによっては本来生産されない遺伝子産物をコードしているものを意味する。
【０００８】
遺伝的組換えは一般に、ＤＮＡの２つの鎖の間での相同性部分の交換である。ある種のウイルスにおいては、ＲＮＡがＤＮＡと置き換わっていることもあり得る。核酸の相同性部分とは、ヌクレオチド塩基の同じ配列を有する核酸部分（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。
【０００９】
遺伝的組換えは、複製即ち感染された宿主細胞内部での新しいウイルスゲノムの製造の間に自然に生じ得る。このように、ウイルス遺伝子の間の遺伝的組換えが、２またはより多くの異なったウイルスまたはその他の遺伝的構築物で共感染させた宿主細胞中で行われるウイルス複製サイクルの間に起こり得る。第１のゲノム由来のＤＮＡ部分は互いに交換可能に、ＤＮＡが第１のウイルスゲノムに相同である第２の共感染ウイルスのゲノム部分構築において利用される。
【００１０】
しかしながら、組換えはまた、完全に相同ではない異なったゲノム中のＤＮＡ部分の間でも生じ得る。あるそのような部分が、第１の部分内部の存在、例えば相同性ＤＮＡの部分に挿入された遺伝子マーカーまたは抗原決定基をコードしている遺伝子等を除いて、別のゲノム部分と相同である第１のゲノム由来である場合、組換えは依然起こり得、そしてその組換え産物は、組換えウイルスゲノム中のその遺伝的マーカーまたは遺伝子の存在により検出可能である。組換えワクシニアウイルスの産生のための付加的な戦略が近年報告された。
【００１１】
改変された感染可能ウイルスによる挿入されたＤＮＡ遺伝的配列の成功した発現には、２つの状況が必要である。第１は、改変ウイルスが生育可能なままであるように、挿入はウイルスの非必須領域中でなければならない。挿入されたＤＮＡの発現のための第２の条件は、挿入されたＤＮＡと適切な関係にあるプロモーターの存在である。プロモーターは、それが発現されるべきＤＮＡ配列の上流に位置するように配置されなければならない。
【００１２】
ワクシニアウイルスは、天然痘に対する免疫化のために成功して用いられてきており、１９８０年には天然痘の全世界での撲滅を成し遂げた。その歴史において、多くのワクシニア株が生成されている。これらの異なった株は多様な免疫原性を示し、潜在的な複雑化のさまざまな度合いと関連づけられており、その最も深刻なものはワクチン後の脳炎と汎発性種痘疹である（Ｂｅｈｂｅｈａｎｉ，１９８３）。
【００１３】
天然痘の撲滅と共に、ワクシニアの新しい役割、外来遺伝子の発現のための遺伝的に操作されたベクターの役割が重要となった。数多くの異種抗原をコードしている遺伝子がワクシニア中で発現され、しばしば対応する病原体の投与に対して防御的な免疫という結果となっている（Ｔａｒｔａｇｌｉａ  他，１９９０ａにおいて概説）。
【００１４】
ワクシニアベクターの遺伝的背景が、発現された外来免疫原の防御的効率に影響することが示されている。例えば、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ３４０のワクシニアウイルスＷｙｅｔｈワクチン株においての発現では、コットントップ  タマリン（ｃｏｔｔｏｎｔｏｐ  ｔａｍａｒｉｎｓ）をＥＢＶウイルス誘導リンパ腫に対して防御しなかったが、一方で同じ遺伝子のワクシニアウイルスＷＲ実験室株においての発現では防御的であった（Ｍｏｒｇａｎ  他，１９８８）。
【００１５】
ワクシニアウイルスベースの組換えワクチン候補の、効率と安全性との微妙なバランスは非常に重要である。組換えウイルスは、ワクチン接種された動物において防御的免疫反応を誘導するような様式で免疫原を提示しなければならないが、何れの重大な病原性特性をも有してはならない。故にベクター株の弱毒化は、現在の技術の段階を超えた進歩が大いに望まれている。
【００１６】
数多くのワクシニア遺伝子で、組織培養におけるウイルスの増殖に非必須でありその欠失または不活性化が多様な動物系での毒性を減少させるものが同定されてきた。
【００１７】
ワクシニアウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子についてはマッピングが行われ（Hruby 他、1982）、また、配列決定も行われている（Hruby 他、1983；Wier他、1983）。チミジキナーゼ遺伝子が不活化または完全欠失しても、広範な組織培養中でワクシニアウイルスの増殖は妨げられない。また、ＴＫ−  ワクシニアウイルスは各種の投与法により各種の宿主における接種部位においてインビボ複製する能力を有する。
【００１８】
単純ヘルペスウイルス２型については、ＴＫ−  ウイルスをモルモットに膣内投与すると、ＴＫ＋  ウイルスの投与の場合よりも脊髄中のウイルス力価がかなり低くなることが示された（Stanberry 他、1985）。ヘルペスウイルスではインビトロでのＴＫ活性は、代謝の活発な細胞中ではウイルスの増殖に重要でないが、静止細胞中ではウイルス増殖に必須であることが示された（Jamieson他、1974）。 マウスに脳内投与および腹膜内投与することによりＴＫ−  ワクシニアが弱毒化されることが示された（Buller他、1985）。神経毒性のあるＷＲ実験室株およびWyeth ワクチン株の双方について弱毒化が認められた。皮内投与されたマウスにおいては、ＴＫ−  組換えワクシニアが、親株のＴＫ＋  ワクシニアウイルスと同等の抗ワクシニア中和抗体を産生したが、これは、この試験系では、ＴＫ機能の喪失がワクシニアウイルスベクターの免疫原性を有意に減少させないことを示唆している。ＴＫ−  およびＴＫ＋  の組換えワクシニアウイルス（ＷＲ株）をマウスに鼻内接種すると、他の部位（脳を含む）へのウイルスの伝播が顕著に減少したことが見出された（Taylor他、1991a)。
【００１９】
ヌクレオチドの代謝に関連する別の酵素は、リボヌクレオチドレダクターゼである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）内でコードされているリボヌクレオチドレダクターゼの活性が、そのラージサブユニットをコードしている遺伝子を欠失させることにより喪失しても、インビトロの分裂細胞中でのウイルス増殖やＤＮＡ合成は影響されないが、無血清細胞でのウイルスの増殖能力は極めて損なわれることが示された（Goldstein 他、1988）。眼部の急性ＨＳＶ感染および三叉神経ガングリオンにおける再活性性潜伏感染に関するマウスモデルを用いた場合、リボヌクレオチドレダクターゼのラージサブユニットを欠失したＨＳＶについては、野生型ＨＳＶに比べて毒性が減少することが示された（Jacobson他、1989）。
【００２０】
ワクシニアウイルスにおいては、リボヌクレオチドレダクターゼのスモールサブユニット（Slabaugh他、1988）およびラージサブユニット（Schmidtt他、1988）のいずれも同定されている。ワクシニアウイルスのＷＲ株において、挿入によりリボヌクレオチドレダクターゼを不活化すると、マウスの頭蓋内接種により測定され得るようなウイルスの弱毒化がもたらされる（Child 他、1990）。
【００２１】
ワクシニアウイルスの血球凝集素（ＨＡ）遺伝子についてはマッピングおよび配列決定が行われている（Shida 、1986）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子は、組織培養中の増殖にとって非必須なものである（Ichihashi 他、1971）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子を不活化すると、頭蓋内投与されたウサギにおいては神経毒性化が減少し、また、皮膚内投与部位におけるウサギの外傷は小さくなっていた（Shida 他、1988）。ＨＡの遺伝子座を利用して、ワクシニアウイルスのＷＲ株（Shida 他、1987）、Lister株の誘導体（Shida 他、1988）およびCopenhagen株（Guo 他、1989）に外来遺伝子を挿入している。外来遺伝子を発現する組換えＨＡ−  ワクシニアウイルスは、免疫原性があり（Guo 他、1989；Itamura 他、1990；Shida 他、1988；Shida 他、1987）、また、関連する病原体による免疫性テストに対して防御効果を有する（Guo 他、1989；Shida 他、1987）ことが示された。
【００２２】
牛痘ウイルス（Brighton赤色株）は、鶏卵の漿尿膜上に赤色（出血性）痘瘡を生じさせる。牛痘ゲノム内で自然欠失すると白色痘瘡を生じる変異体となる（Pichup他、1984）。出血性機能（ｕ）は、初期遺伝子によってコードされた38ｋＤａのタンパク質によることがマッピングされている（Pickup他、1986）。この遺伝子は、セリンプロテアーゼインヒビターと相同性を有し、牛痘ウイルスに対する宿主の炎症応答を阻害し（Palumbo 他、1989）、また、血液凝固のインヒビターである。
【００２３】
このｕ遺伝子は、ワクシニアウイルスのＷＲ株中に存在する（Kotwal他、1989b)。外来遺伝子を挿入することによりｕ領域が不活化されているＷＲワクシニアウイルス組換体が接種されたマウスは、ｕ遺伝子がインタクトのままである類似の組換えワクシニアウイルスが接種されたマウスよりも、該外来遺伝子に対して高い抗体レベルを産生する（Zhou他、1990）。このｕ領域は、ワクシニアウイルスのCopenhagen株内で欠陥性非機能形態として存在する（Goeberu 他による報告（1990a,b)においてＢ13およびＢ14と称されているオープンリーディングフレーム）。
【００２４】
感染細胞内において牛痘ウイルスは、細胞質Ａ型封入体（ＡＴＩ）において局在化している（Kato他、1959）。ＡＴＩの機能は、動物から動物への伝播に際して牛痘ウイルス粒子を防御することにあると考えられている（Bergoin 他、1971）。牛痘ゲノムのＡＴＩ領域は160 ｋＤａのタンパク質をコードしており、これがＡＴＩ封入体のマトリックスを形成する（Funahashi 他、1988；Patel 他、1987）。ワクシニアウイルスは、そのゲノムに相同領域を含有するが、一般にＡＴＩを産生しない。ワクシニアのＷＲ株においては、ゲノムのＡＴＩ領域は94ｋＤａのタンパク質として翻訳される（Patel 他、1988）。ワクシニアウイルスのCopenhagen株においてはＡＴＩ領域に相応するＤＮＡ配列の大部分は欠失されており、該領域の残存する３′末端はＡＴＩ領域の上流にある配列と融合して、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）Ａ26Ｌを形成する（Goebel他、1990a,b)。
【００２５】
ワクシニアウイルスの左末端近傍については、各種の自然欠失（Altenburger 他、1989；Drillien他、1981；Lai 他、1989；Moss他、1981；Paez他、1985；Panicali他、1981）や人為的欠失（Ｐｅｒｋｕｓ  他，１９９１；Ｐｅｒｋｕｓ  他，１９８９；Ｐｅｒｋｕｓ  他，１９８６）が報告されている。10kbが自然欠失したワクシニアウイルスのＷＲ株（Moss他、1981；Panicali他、1981）は、マウスに頭蓋内接種することにより弱毒化されることが示された（Buller他、1985）。後に、この欠失部は17ヶのＯＲＦを含む可能性が示された（Kotwal他、1988b)。該欠失部内にある特定の遺伝子としては、ビロカインＮ１Ｌおよび35ｋＤａタンパク質（Goebel他による1990a,b の報告でＣ３Ｌと称されたもの）が挙げられる。Ｎ１Ｌを挿入不活化すると、通常のマウスおよびヌードマウスのいずれについても、頭蓋内接種により毒性が減少する（Kotwa 他、1989a)。上記の35ｋＤａタンパク質は、ワクシニアウイルス感染細胞の培地にＮ１Ｌと同様に分泌される。このタンパク質は、補体コントロールタンパク質群、特に補体４Ｂ結合タンパク質（Ｃ４bp）に相同性である（Kotwal他、1988a)。細胞性Ｃ４bpと同様に、ワクシニアの35ｋＤａタンパク質は補体の第４成分と結合し、古典的補体カスケードを阻害する（Kotwal他、1990）。このように、ワクシニアの35ｋＤａタンパク質は、該ウイルスが宿主の防御機構を回避するのを助けることに関与しているものと考えられる。
【００２６】
ワクシニアゲノムの左末端は、宿主範囲遺伝子として同定された２つの遺伝子、Ｋ１Ｌ（Gillard 他、1986）およびＣ７Ｌ（Perkus他、1990）を含む。これらの遺伝子の双方が欠失すると、各種のヒト細胞系でワクシニアウイルスの増殖能が減少する（Perkus他、1990）。
【００２７】
本来的に宿主が制限されているポックスウイルスであるトリポックスウイルスを使用することに関する２つの付加的なワクチンベクター系がある。すなわち、家禽ポックスウイルス（ＦＰＶ：fowlpoxvirus）およびカナリアポックスウイルス（ＣＰＶ：canarypoxvirus）の両者を操作して外来遺伝子産生物を発現させてきた。家禽ポックスウイルス（ＦＰＶ）は、ポックスウイルス科のトリポックス（Avipox）属の原型ウイルスである。このウイルスは、家禽類に経済的に重要な疾病を引き起こすが、1920年代から弱毒化生ワクチンを使用することにより良好な対策が講じられてきた。トリポックスウイルスの複製は鳥類に限られ（Matthews、1982）、ヒトを含む非鳥類においてトリポックスウイルスの感染が起こったという文献の報告は存在しない。このように宿主が制限されているので、他の種にウイルスが伝染することに対する本質的な安全性が確保され、トリポックスウイルス由来のワクチンベクターは魅力ある手段として動物やヒトへ応用される。
【００２８】
ＦＰＶは、家禽類病原体由来の抗原を発現する優れたベクターとして使用されてきた。ビルレントトリインフルエンザウイルスの血球凝集素タンパク質がＦＰＶ組換体で発現された（Taylor他、1988a)。この組換体をニワトリおよび七面鳥に接種すると、同種または異種のビルレントインフルエンザウイルスのいずれの免疫性テストに対しても防御能のある免疫応答が誘起された（Taylor他、1988a)。ニューカッスル病ウイルスの表面糖タンパクを発現するＦＰＶ組換体も開発された（Taylor他、1990；Edbauer 他、1990）。
【００２９】
宿主制限によりＦＰＶおよびＣＰＶの複製はトリ系に限られているにも拘わらず、これらのウイルスから誘導された組換体は、非トリ源細胞において外来遺伝子を発現することが見出された。さらに、そのような組換体ウイルスは、該外来遺伝子産生物に対する免疫応答を引き起こし、場合によっては、相応する病原体による免疫性テストに対する防御能を有することが示された（Tartaglia 他、1993a,b ；Taylor他、1992；1991b ；1988b)。
【００３０】
カリシウイルスは、ブタ（ブタ水疱性発疹ウイルス−ＶＥＳＶ）、鰭脚類（サン  ミゲル（Ｓａｎ  Ｍｉｇｕｅｌ）アシカウイルス−ＳＭＳＶ）、ネコ（ネコカリシウイルス−ＦＣＶ）、ウサギ（ウサギ失血疾患ウイルス−ＲＨＤＶ）、ノウサギ（ヨーロッパ茶色ノウサギウイルス−ＥＢＨＶ）およびヒト（ノーウォークまたはＥ型肝炎ウイルス−ＨＥＶ）種から単離されている。それらは共通の特徴的な形態を有し、分子量約６０ｋＤａの主要なただ１つのポリペプチドを含有することにおいて哺乳類ウイルスの中で特異的である（Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ  １９７４）。それらのゲノムは約８キロベースの陽性鎖ＲＮＡ分子中にあり、キャプシドプレカーサータンパク質のコード配列はゲノムＲＮＡの３’の３番目の内部に位置している。この科の全てのメンバーは、それらが深刻な病気の原因となっているところのそれらの天然宿主範囲が顕著に制限されている（Ｓｔｕｄｄｅｒｔ  １９７８）。
【００３１】
誘導される病気の深刻さに鑑み、それらの標的種でのカリシウイルス感染に対する防御免疫の基礎の理解は、獣医およびヒトの薬剤の両方に関する重要な目的を示している。この目的のために、関連した使用しうる動物モデルシステムが必要である。
【００３２】
ウサギにおいて突然かつ急激な疾患の原因となるウサギ出血疾患ウイルス（ＲＨＤＶ）（Ｍｏｒｉｓｓｅ  他  １９９０）は、その標的種におけるカリシウイルス感染に対する免疫のメカニズムに注意を向けるための固有の機会を提供する。しかしながら、このウイルスは組織培養中では効果的には繁殖しないので、その分子および生化学的分析は、最近の、そのゲノムのクローニングとヌクレオチド配列決定まで遅れていた（Ｍｅｙｅｒｓ  他  １９９１）。他のカリシウイルス［即ちＦＣＶ（Ｃａｒｔｅｒ  他  １９９２）およびＨＥＶ（Ｔａｍ  他（１９９１）］について記述されたこととは対照的に、キャプシドタンパク質アミノ末端配列分析は、ＲＨＤＶキャプシドタンパク質は８ｋｂゲノムＲＮＡからではなく２．４ｋｂのサブゲノム（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）ＲＮＡ種から翻訳されることを強力に支持していた（Ｂｏｇａ  他  １９９２、Ｐａｒｒａ  他  １９９３）。
【００３３】
適当な組換えベクターを用いた関連したＲＨＤＶタンパク質の発現が、詳細な生化学的ＲＨＤＶ分析に到達するため、および、このカリシウイルスに対する防御に関与した免疫機構を解明するために必要とされている。そのことはまた、器官から派生された不活性化ワクチンの置換を可能とする可能性もあるため（Ｙｕ  他  １９９１，ｖｏｎ  Ｈａｒａｌａｍｂｉｅｖ  他  １９９１，Ｓｍｉｄ  他  １９９１，Ｖｉｌｌａｒｅｓ  １９９１，Ｄａｖｉｄ  他  １９９１）、分子生物学的方法論を用いたワクチン候補の開発は、重要な安全性並びに飛躍的な前進をもたらし得る。
【００３４】
生ベクター、特にポックスウイルスベースの、可能性のあるワクチンとしての感染性仲介物からの関連抗原を免疫的に発現するベクターの利用が数多くの研究によって促進されてきた（Ｃｏｘ  他  １９９２を参照）。
【特許文献１】米国特許第4,769,330号公報
【特許文献２】米国特許第4,772,848号公報
【特許文献３】米国特許第4,603,112号公報
【特許文献４】米国特許第5,100,587号公報
【特許文献５】米国特許第5,179,993号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３５】
このように、ＲＨＤＶ等のカリシウイルス組換体ポックスウイルスおよびそれ由来の産物、特にＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣベースの、ＲＨＤＶ等のカリシウイルス組換体および組成物およびそれら由来の産物、特に例えばＲＨＤＶキャプシド遺伝子などの、キャプシドタンパク質の何れかまたは全てをコードしているもの（即ちキャプシド遺伝子）を有する組換体、およびそれ由来の組成物および産物を供給することは、現在の技術水準を超える高度に好ましい前進であろう。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
したがって、本発明の目的は、安全性の向上した改変組換えウイルスを提供すること、およびそのような組換えウイルスを製造する方法を提供することにある。
【００３７】
本発明のさらなる目的は、既知の組換えポックスウイルスワクチンと比較して安全性のレベルが増大した免疫組成物または組換えポックスウイルス抗原ワクチンを提供することにある。
【００３８】
本発明のさらなる目的は、ベクターが宿主中において弱毒化された毒性を有するように改変されている、宿主中において遺伝子産生物を発現する改変ベクターを提供することにある。
【００３９】
本発明の別の目的は、安全性のレベルが増大した改変組換えウイルスまたは改変ベクターを用いて、インビトロで培養された細胞中で遺伝子産生物を発現する方法を提供することにある。
【００４０】
これらの、およびその他の本発明の目的と利点は、以下の考慮の後に容易に明白となるであろう。
【００４１】
１つの側面において、本発明は、組換えウイルスが減衰された毒性と促進された安全性を有するように、ウイルスにコードされた遺伝的機能が不活性化された改変された組換えウイルスに関する。その機能とは、非必須かまたは毒性に関連したものであり得る。ウイルスは、有利には、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルスまたは家禽ポックスウイルスおよびカナリアポックスウイルス等のアビポックスウイルスである。改変された組換えウイルスは、ウイルスゲノムの非必須領域内に、ＲＨＤＶキャプシド遺伝子等のカリシウイルスキャプシド遺伝子の、ＲＨＤＶ等のカリシウイルスから派生された抗原またはエピトープをコードしている異種ＤＮＡ配列を有していても良い。
【００４２】
別の側面においては、本発明は、それが接種された宿主動物およびヒトにおいて抗原性または免疫性反応を誘導するための抗原性、免疫性またはワクチン組成物または治療組成物に関し、そこにおいて当該ワクチンは担体と組換えウイルスであって当該組換えウイルスが減衰された毒性および促進された安全性を有するように非必須ウイルスコード遺伝子領域を不活性化されているものを含有しているものに関する。本発明に従った組成物において用いられているウイルスは、有利には、ポックスウイルス、特にワクシニアウイルスまたは例えば家禽ポックスウイルスおよびカナリアポックスウイルス等のアビポックスウイルスである。改変された組換えウイルスは、ウイルスゲノムの非必須領域内に、ＲＨＤＶキャプシド遺伝子等のカリシウイルスキャプシド遺伝子の、ＲＨＤＶ等のカリシウイルスから派生された抗原タンパク質をコードしている異種ＤＮＡ配列を有していても良い。
【００４３】
さらに別の側面においては、本発明は、組換えウイルスであって当該組換えウイルスが減衰された毒性および促進された安全性を有するように非必須ウイルスコード遺伝子機能を不活性化されているものを含有している免疫原性組成物に関する。改変された組換えウイルスは、ウイルスゲノムの非必須領域内に、抗原タンパク質（ＲＨＤＶキャプシド遺伝子等のカリシウイルスキャプシド遺伝子の、ＲＨＤＶ等のカリシウイルスから派生されたもの等）をコードしている異種ＤＮＡ配列を有しており、そこにおいて組成物は、宿主に投与された場合、抗原に特異的な免疫学的反応を誘導可能である。
【００４４】
さらなる側面においては、本発明は、減衰された毒性と促進された安全性を有する改変された組換えウイルスを細胞中に導入することによりインビトロで遺伝子産物を発現させるための方法に関する。改変された組換えウイルスは、ウイルスゲノムの非必須領域内に、ＲＨＤＶキャプシド遺伝子等のカリシウイルスキャプシド遺伝子の、ＲＨＤＶ等のカリシウイルスから派生された抗原タンパク質をコードしている異種ＤＮＡ配列を有していても良い。産物は続いて、免疫反応を刺激するために動物またはヒトに投与可能である。生成された抗体はＲＨＤＶ等のカリシウイルスの防御または処理に有用であり得、そして、抗体または単離されたインビトロ発現産物は、ＲＨＤＶ等のカリシウイルスまたはそれ由来の抗原またはそれに対する抗体の、血清などの試料における存在または不在（および、それ故、ウイルスまたはその産物またはウイルスまたは抗原に対する免疫反応の存在または不在）を決定するためのウイルス診断キット、アッセイまたは試験のために利用可能である。
【００４５】
またさらなる側面においては、本発明は改変組換えウイルスに関し、該組換えウイルスは、ウイルスにコードされている非必須遺伝子機能が不活化されていることにより毒性が弱毒化されており、さらに、ウイルスゲノムの非必須領域に外来源のＤＮＡを含有している。このＤＮＡは、ＲＨＤＶ等のカリシウイルスキャプシド遺伝子で、ＲＨＤＶタンパク質等のカリシウイルスタンパク質をコードしていても良い。さらに詳述すれば、遺伝子機能は、毒性因子をコードするオープンリーディングフレームを欠失させることにより、または、自然の宿主制限ウイルスを利用することによって不活化されている。本発明に用いるウイルスは、ポックスウイルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたはトリポックスウイルス、例えば家禽ポックスウイルスまたはカナリアポックスウイルスである。オープンリーディングフレームは、Ｊ２Ｒ、Ｂ13Ｒ＋Ｂ14Ｒ、Ａ26Ｌ、Ａ56Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ、およびＩ４Ｌ（Goebel他による1990a,b の報告における名称による）から成る群、ならびにそれらの組合せにより選択されるのが好ましい。ここで、オープンリーディングフレームは、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主範囲遺伝子領域もしくはリボヌクレオチドレダクターゼのラージサブユニット、またはそれらの組合せから成る。ワクシニアウイルスの好適な改変Copenhagen株は、ＮＹＶＡＣとして同定されたものであり( Tartaglia 他、1992）、または、Ｊ２Ｒ、Ｂ13Ｒ＋Ｂ14Ｒ、Ａ26Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１ＬおよびＩ４Ｌまたはチミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主範囲領域、リボヌクレオチドレダクターゼのラージサブユニットが欠失されたワクシニアウイルスである（米国特許第5,364,773 号も参照されたい）。他の好適なポックスウイルスは、ＡＬＶＡＣであり、カナリアポックスウイルス( Rentschlerワクチン株）が、例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞による200 回以上の継代培養により弱毒化され、そのマスター種株が寒天培地下の４回の連続的なプラーク精製に供された後、５回の追加の継代培養によりプラーククローンが増幅されたものである。
【００４６】
本発明は、さらに別の態様として、本発明による組換えポックスウイルスの発現産生物およびその使用、例えば、治療、予防、診断または試験に用いられる抗原性、免疫性またはワクチン組成物を調製することに関する。組換体はまた、プローブまたはＰＣＲプライマーを生成する際に有用である。
【００４７】
これらの態様およびその他の態様は、以下の詳細な説明によって提供され、それより明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
新しいワクシニアワクチン菌株ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）を開発するために、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン菌株を、既知または潜在的な毒性要因をコード化するゲノムの６つの非必須領域の欠失により改変した。一連の欠失が以下詳細に記載されている（米国特許第5,364,773号を参照のこと、この特許をここに引用する）。ワクシニア制限断片、オープンリーディングフレームおよびヌクレオチド位置の全ての指定は、Goebel等, 1990a,bに報告されている用語法に基づいている。
【００４９】
欠失座もまた、異種遺伝子を挿入するための受容体座として設計された。
【００５０】
ＮＹＶＡＣ中で欠失された領域が以下に列記されている。欠失された領域の省略形およびオープンリーディングフレームの指定（Goebel等，1990a,b）並びに指定された欠失により全ての欠失を含有するワクシニア組換体（ｖＰ）の指定もまた列記されている：
(1)  チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖＰ４１０；
(2)  出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３；
(3)  Ａ型封入体領域（ＡＴＩ；Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８；
(4)  血球凝集素遺伝子（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）ｖＰ７２３；
(5)  宿主範囲遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）ｖＰ８０４；および
(6)  リボヌクレオチドレダクターゼラージサブユニット（Ｉ４Ｌ）ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）。
【００５１】
ＮＹＶＡＣは、毒性および宿主範囲に関連する遺伝子産生物を含む遺伝子産生物をコードする18のオープンリーディングフレームを欠失させることにより遺伝子工学的手法で得られたワクシニアウイルス株である。
【００５２】
ＮＹＶＡＣは高度に弱毒化されるが、このことは以下のような多くの特徴からも判る：i)新生マウスに脳内接種すると毒性が減少すること、ii) 遺伝学的に（nu+ / nu+ ）または化学的（シクロホスホアミド）に免疫無防備状態マウスにおける無毒性、iii)免疫無防備状態マウスにおいて、播種性感染が起こらなくなること、iv) ウサギ皮膚の硬化や潰瘍形成がなくなること、v)接種部位からの迅速なクリアランス、vi) 多くの組織培養細胞系（ヒト由来のものを含む）において複製能が激減すること。これにも拘わらず、ＮＹＶＡＣに基づくベクターは、外来性免疫原に対して優れた応答を誘起し防御免疫を提供する。
【００５３】
ＴＲＯＶＡＣとは、弱毒化家禽ポックスであって、１日齢のヒナへのワクチン接種がライセンスされている家禽ポックスウイルスＦＰ−１ワクチン株からプラークを単離して得られたものである。ＡＬＶＡＣは、弱毒化カナリアポックスを基礎とするベクターであり、ライセンスされているカナリアポックスワクチンＫａｎａｐｏｘ（Tartaglia 他、1992）からプラークをクローニングして得られたものである。ＡＬＶＡＣの一般的性質には、Ｋａｎａｐｏｘの一般的性質と同じものがある。外来性免疫原を発現するＡＬＶＡＣ系組換えウイルスは、ワクチンベクターとしても有効であることが示されている（Tartaglia 他、1993a,b)
このトリポックスベクターは、その複製がトリ類に限定されている。ヒトの培養細胞においては、ウイルスのＤＮＡ合成に先行してウイルス複製サイクルの初期にカナリアポックスウイルスの複製は中断してしまう。しかしながら、外来性免疫原を発現するように操作すれば、哺乳動物細胞中でインビトロで真正な発現とプロセシングが認められ、多くの哺乳動物種に接種すると該外来性免疫原に対する抗体および細胞性免疫応答を誘発し、同種の病原体の免疫性テストに対する防御を与える（Taylor他、1992；Taylor他、1991）。カナリアポックス／狂犬病糖タンパク質組換体（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）に関するヨーロッパおよび米国における最近のフェーズＩ臨床試験によれば、この試験ワクチンは、充分に受け入れられるものであり、防御レベルの狂犬病ウイルス中和抗体を誘起することが示された（Cadoz 他、1992；Fries 他、1992）。さらに、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ被接種者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、精製狂犬病ウイルスで刺激すると有意レベルのリンパ球増殖を示した（Fries 他、1992）。
【００５４】
また、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣは、以下の点において、あらゆるポックスウイルスの中でも独特であると考えられている。すなわち、米国公衆衛生局のＮＩＨ（National Institutes of Health)の組換えＤＮＡ勧告委員会（Recombinant DNA Advisory Committee）は、ウイルスやベクターのような遺伝子材料の物理的封じ込めに関するガイドライン、すなわち、特定のウイルスやベクターの病原性に基づくそれらのウイルスやベクターの利用における安全な取扱に関するガイドラインを出しているが、この物理的封じ込めのレベルをＢＳＬ２からＢＳＬ１に下げることを認めた。ここで、他のいずれのポックスウイルスもＢＳＬ１の物理的封じ込めレベルを認められていない。ワクシニアウイルスのCopenhagen株（最も一般的な天然痘ワクチンである）ですら、これよりも高い物理的封じ込みレベル、すなわち、ＢＳＬ２を有する。このように、当該分野においては、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣは他の何れのポックスウイルスよりも病原性が低いことが認められている。
【００５５】
ＮＹＶＡＣは、上述の通り、コペンハーゲンワクチン株から、毒性および宿主領域に関連した１８のオープンリーディングフレームを厳密に欠失させることにより派生されている。ＮＹＶＡＣの高度弱毒化表現型は、実験用および標的種の両方においてベクターとしてのその免疫化可能性を重大には減少させない（Ｔａｒｔａｇｌｉａ  他  １９９２，Ｋｏｎｉｓｈｉ  他  １９９２）。狂犬病ウイルス、日本脳炎ウイルスおよびマラリア抗原を発現するＮＹＶＡＣベースの組換体が現在、ヒト臨床評価を受けている。高度に弱毒化されたポックスウイルスのワクチンベクターとしての利用の更なる拡張とは、上記のように、アビポックスウイルス等の、自然に生じる限定された宿主領域を有するポックスウイルスを利用することである。非鳥類種においてのＡＬＶＡＣの生産的複製能力の欠如にもかかわらず、ＡＬＶＡＣは非鳥類種においていくつかのウイルス病原体に対する防御的免疫反応を誘導することが示されている（Ｔａｙｌｏｒ  他  １９９１，Ｔａｙｌｏｒ  他  １９９２，Ｔａｒｔａｇｌｉａ  他  １９９３）。このベクターはそのような種においては複製しないので、ワクチン内部での散布された感染または接触者あるいは一般環境への拡散は排除される。最近の、フェーズＩ臨床試験では、このベクターをベースとした実験用ワクチンは十分に耐性であり、外部からの免疫原に対する免疫反応を誘導することが示された（Ｃａｄｏｚ  他  １９９２；上記もまた参照されたい）。
【００５６】
ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣベクターの弱毒化特性およびそれらの示す外来免疫原に対する体液および細胞の両方の免疫学的反応を誘導する能力に明らかに基づいて（Ｔａｒｔａｇｌｉａ  他，１９９３ａ，ｂ；Ｔａｙｌｏｒ  他，１９９２；Ｋｏｎｉｓｈｉ  他，１９９２）、そのような組換えウイルスは、以前に記述されたワクシニアベースの組換えウイルスを超えためざましい利点を提供するものである。
【００５７】
本発明は、ウサギ出血疾患およびカリシウイルス一般に対する防御に関与し；ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣをベースとしたＲＨＤＶ等のカリシウイルスキャプシドタンパク質発現組換えウイルスであって、ウサギにおいてＲＨＤＶ投与曝露に対する防御的免疫を付与するもの、およびそれらのウイルス由来の発現産物の利用およびそれら由来の抗体を包含する。
【００５８】
以下に記述されるのは、実施例においては特に、カリシウイルス、特にＲＨＤＶのキャプシド遺伝子（Ｓａ  ｎｅ  ｅｔ  Ｌｏｉｒｅ株）のクローニングおよび配列決定、キャプシド遺伝子産物を発現するＮＹＶＡＣ（ワクシニアウイルス）およびＡＬＶＡＣ（カナリアポックスウイルス）組換えウイルスの派生、およびこれらの組換体の実験的投与により付与された防御の実証である。
【００５９】
カリシウイルス科の他のメンバーに関しては遺伝的変化が報告されているので（Ｈｕａｎｇ  他  １９９２；Ｎｅｉｌｌ，１９９２；Ｓｅａｌ  他  １９９３）、フレンチＲＨＤＶ単離体（Ｓａ  ｎｅ  ｅｔ  Ｌｏｉｒｅ株）のキャプシド遺伝子の配列決定分析を行い、この単離体が以前に発表されたＲＨＤＶとどの程度異なっているかを決定した（Ｍｅｙｅｒｓ  他  １９９１）。キャプシド遺伝子は１７４０ｂｐの長さのＯＲＦで、以前に発表されたＲＨＤＶジャーマン株と非常に高いヌクレオチドホモロジー（９７．３％の同一性）を有していた（Ｍｅｙｅｒｓ  他  １９９１）。ほとんどの違いが、コドンの可変の位置で生じているため、対応するアミノ酸配列は以前に報告された配列と実質的に同一である（９９．１％の同一性）。同様の高レベルのキャプシド遺伝子のホモロジーが、最近、３つの地理的なＨＥＶ単離体の間で報告された（Ｈｕａｎｇ  他  １９９２）。しかしながら、他のカリシウイルスに関しては超可変領域であることが示されている、フレンチＲＨＤＶゲノムの最初の２／３はまだ分析されていない。このフレンチ単離体と以前に記述された単離体との正確な関係は、さらに調査すべきままの状態のままである。にもかかわらず、高度に保存されたＲＨＤＶキャプシド遺伝子由来のヌクレオチド配列は、複製連鎖反応をベースとした試験またはウイルス感染を確認するためのプライマーの開発に有用である。
【００６０】
カナリアポックスウイルス（ＡＬＶＡＣ）をベースとした組換えウイルス（ｖＣＰ３０９）およびＮＹＶＡＣをベースとした組換えウイルス（ｖＰ１２４９）において、ともにＲＨＤＶキャプシド遺伝子を発現させるものを派生させるために、位置＃５３０５（Ｍｅｙｅｒｓ  他  １９９１）にあるＡＴＧが天然翻訳開始コドンとして用いられていると仮定された。この仮定は最近、選択されたＡＴＧはまさしく、そのキャプシドタンパク質を発現するためにウイルスにより用いられる開始コドンであることを示す精製ＲＨＤＶキャプシドタンパク質のアミノ酸分析によって正しいと証明された（Ｐｒｒａ  他  １９９３）。ｖＣＰ３０９およびｖＰ１２４９により発現されたポリペプチドの、ＲＨＤＶ  ＭＡｂに依存した免疫沈降によるものおよびＦＡＣＳ分析による２つの別々の確認によって、ｖＣＰ３０９およびｖＰ１２４９は天然ＲＨＤＶキャプシドタンパク質を発現していることが強く示された。最近、バキュロウイルスにより発現された組換えＲＨＤＶキャプシドタンパク質に関して示されたように（Ｌａｕｒｅｎｔ  他  １９９４）、何れか１つの特定の理論に拘束されることを必ずしも望んではいないが、組換えポリペプチドはウイルス様粒子に集合すると考えられている。
【００６１】
ｖＣＰ３０９またはｖＰ１２４９でワクチン接種されたウサギは、ワクチン接種されていない対照動物全てが殺された強力な致死ＲＨＤＶ投与を生き抜いた（以下の表を参照されたい）。これらの結果は明白に、ＲＨＤＶキャプシドタンパク質の発現が、ＲＨＤＶ投与曝露に対する防御を付与するために十分であることを示唆している。バキュロウイルス（Ｌａｕｒｅｎｔ  他  １９９４）またはＥ．コリ（Ｂｏｇａ  他  １９９４）の何れかによって発現された組換えＲＨＤＶキャプシドタンパク質調製物を用いたＲＨＤＶ投与に対するウサギの防御を記述した２つの最近の報告と一致して、本発明はＲＨＤＶに対する組換えキャプシドベースのワクチンを提供し、この戦略が一般にカリシウイルス感染に対して防御するために有用であることを示すものである。ｖＣＰ３０９およびｖＰ１２４９の性質検討に用いられた２つのＭＡｂ（３Ｈ６および１Ｈ８）が、ＥＢＨＶ抽出物とも交叉反応するという最近の実証（Ｗｉｒｂｌｉｃｈ  他  １９９４）は、ｖＣＰ３０９およびｖＰ１２４９がＥＢＨＶ投与に対する交叉防御を提供することを示している。
【００６２】
現在、組織培養においてＲＨＤＶを増殖させることは不可能であるため、ＲＨＤＶワクチン候補を開発するための組換えＤＮＡアプローチが、現在の、感染させたウサギの肝臓から派生された従来の不活性化されたＲＨＤＶワクチン調製物（Ｙｕ  他  １９９１、ｖｏｎ  Ｈａｒａｌａｍｂｉｅｖ  他  １９９１、Ｓｍｉｄ  他  １９９１、Ｖｉｌｌａｒｅｓ  １９９１、Ｄａｖｉｄ  他  １９９１）を置き換える手段を提供し、そしてこのように、重要な安全性並びに産業上の飛躍的前進をもたらしている。ヒトにおけるＥ型肝炎の原因となるカリシウイルスであるノーウォークウイルスもまた、何れの細胞培養においても増殖させることができないので（Ｋａｐｉｋｉａｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｏｃｋ、１９９０）、これらの結果はＥ型肝炎ワクチンの派生を直接的に示唆するものである。もちろん、ＲＨＤＶ発現組換体がＥ型肝炎に対して交叉反応しても良い（このように、ポックスウイルス−ＲＨＤＶ組換体はヒトにおいて有用である）。
【００６３】
さらに、ここでの結果はＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣベクターシステムの、標的種での防御的免疫反応を誘導するための用途を記述している。重要なことには、これらのベクターは鳥類種に限定された複製（ＡＬＶＡＣ）または高度に弱毒化された表現型（ＮＹＶＡＣ）の何れかによって特徴づけられているため、潜在的なワクチン誘導およびワクチン関連合併症を実質的に排除している。
【００６４】
近年、２つの報告が、バキュロウイルス（Ｌａｕｒｅｎｔ  他  １９９４）またはＥ．コリ（Ｂｏｇａ  他  １９９４）の何れかによって発現された組換えＲＨＤＶキャプシドタンパク質調製物を用いたＲＨＤＶに対するウサギの防御を記述している。両方の報告は、ウサギ体液反応と防御との間の関連を示唆している。本発明は、２つの前述のサブユニットをベースとしたアプローチとは、大きく異なっている。ｖＣＰ３０９およびｖＰ１２４９は、免疫原のデ  ノボ細胞内発現に至る生弱毒化組換えウイルスであるので、細胞媒介免疫反応のより強力な刺激が誘導される。ここにおいての結果はこの記述と一致しているが、それは、それらが血清学的力価と防御的免疫との、如何なる明白な関係をも説明していないからである。
【００６５】
ここに記載されている組換えカナリアポックスウイルスｖＣＰ３０９およびＮＹＶＡＣ  ｖＰ１２４９は、一般的なＲＨＤＶ感染およびカリシウイルス感染一般に対する防御における体液性および細胞媒介免疫反応の相対重要性の分析においての道具でもある。
【００６６】
本発明の組換えウイルスまたはその発現産生物、組成物、例えば、免疫原性、抗原性もしくはワクチン組成物または治療組成物は、非経口経路（皮内、筋肉または皮下）で投与することができる。そのような投与により全身性免疫応答が可能となる。
【００６７】
さらに概説すれば、本発明に従う抗原性、免疫原性もしくはワクチン組成物または治療組成物（本発明のポックスウイルス組換体を含有する組成物）は、製薬または獣医の技術分野における当業者に周知の標準的な方法に従って調製することができる。それらの組成物は、特定の動物または患者の年齢、性別、体重、および症状、ならびに投与経路を考慮しながら、適当な投与量で獣医学または医学的分野の当業者に周知の方法に従って投与することができる。該組成物は、単独投与することもできるが、さらに、本発明の組成物、または他の免疫原性、抗原性もしくはワクチン組成物または治療組成物と同時に、または、それらとともに特定の順序で逐次的に、動物または患者に投与することもできる。他の組成物とは、カリシウイルス（ＲＨＤＶ等）由来の精製抗原または組換えポックスウイルスもしくは他のベクター系によって発現されたそのような抗原由来のもの、また、他のカリシウイルス（ＲＨＤＶ等）抗原を発現する組換えポックスウイルスまたは生体応答調節剤が挙げられる。これらの場合においても、特定の患者の年齢、性別、体重および症状ならびに投与経路などの因子を考慮する。
【００６８】
本発明の組成物の例には、例えば、腔部（例えば、口、鼻、肛門、膣など）投与用の液状製剤、例えば、懸濁液、シロップまたはエリキシル剤など；さらには、非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈内投与（例えば、静注）用製剤、例えば、無菌の懸濁液またはエマルジョンが含まれる。それらの組成物においては、組換えポックスウイルスに、適当なキャリア、稀釈剤、または賦形剤、例えば無菌水、生理食塩水、ブドウ糖などを混合させてもよい。
【００６９】
さらに、本発明の組換えポックスウイルスの発現産生物を直接使用して、ヒトまたは動物における免疫応答を刺激することもできる。すなわち、上述の組成物における本発明の組換えウイルスの代わりにまたはそれとともに、該発現産生物を使用して本発明に従う組成物とすることもできる。
【００７０】
また、本発明の組換えポックスウイルスおよびそれに由来する発現産生物は、ヒトおよび動物における免疫または抗体応答を刺激し、したがって該産生物は抗原となる。これらの抗体または抗原から、当該技術分野で周知の手法により、モノクローナル抗体を調製することができ、そして、周知の抗体結合分析系、診断キットまたはテスト系においてこれらのモノクローナル抗体または抗原を、特定のＲＨＤＶ等のカリシウイルス抗原の有無、したがって、（ＲＨＤＶ等のカリシウイルスまたはその他の系において）該ウイルスまた抗原の発現の有無を測定したり、または、該ウイルスまたは抗原に対する免疫応答が単に刺激されたか否かを判定するための公知の結合アッセイ、診断キットまたは試験において用いることができる。これらのモノクローナル抗体または抗原は、免疫吸着クロマトグラフィーに使用されて、ＲＨＤＶ等のカリシウイルスまたは本発明の組換えポックスウイルスの発現産生物を回収したり単離することもできる。
【００７１】
さらに、詳述すれば、本発明に従う組換体および組成物は、以下のような多くの用途を有する：
(i)   免疫応答の誘発（ワクチン接種またはワクチン接種の一部として）；および
(ii)  ウイルス感染のリスクを伴わないインビトロでのＲＨＤＶ等のカリシウイルスタンパク質の調製。
【００７２】
本発明の組換えポックスウイルスの発現産生物は、直接使用されて、血清反応陰性もしくは血清反応陽性のヒトまたは動物における免疫応答を刺激することができる。すなわち、本発明の組換えポックスウイルスに代えてまたはそれとともに、該発現産生物を使用して本発明の組成物を調製することもできる。
【００７３】
さらに、本発明の組換えポックスウイルスおよびそれに由来する発現産生物は、ヒトおよび動物における免疫または抗体応答を刺激する。これらの抗体から、当該分野で周知の手法によりモノクローナル抗体を調製することができ、そして、これらのモノクローナル抗体または本発明に従うポックスウイルスの発現産生物および組成物を周知の抗体結合分析系、診断キットまたはテスト系に使用して、特定のＲＨＤＶ等のカリシウイルス抗原または抗体の有無、したがって、該ウイルスの有無を測定したり、あるいは、該ウイルスまたは抗原に対する免疫応答が単に刺激されたか否かを判定することができる。これらのモノクローナル抗体を免疫吸着クロマトグラフィーに使用して、ＲＨＤＶ等のカリシウイルスまたは本発明の組換えポックスウイルスの発現産生物を回収、単離または検出することもできる。モノクローナル抗体を製造する方法およびモノクローナル抗体の使用方法、ならびにＲＨＤＶ等のカリシウイルス抗原（本発明のポックスウイルスの発現産生物および組成物）の使用法などは当該技術分野における当業者には周知である。それらは、診断法、キット、テストまたはアッセイなどに使用されるとともに、免疫吸着クロマトグラフィーまたは免疫沈降反応による物質回収に使用され得る。
【００７４】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞により産生される免疫グロブリンである。モノクローナル抗体は、単一の抗原決定基に反応し、通常の血清由来の抗体よりも高い特異性を与える。さらに、多数のモノクローナル抗体にスクリーニングを行うことにより、所望の特異性、アビディディ（抗原結合力）およびイソタイプを有する個々の抗体を選択することができる。ハイブリドーマ細胞系は、化学的に同一の抗体の恒常的且つ安価な供給源となり、そして、そのような抗体の調製は容易に標準化できる。
【００７５】
モノクローナル抗体を産生する方法は当該技術分野における当業者には周知であり、例えば、Koprowski,H 他による米国特許第4,196,265 号1989年４月１日査定）が参考文献としてここに取り込まれている。
【００７６】
モノクローナル抗体の用途も既知である。そのような用途の一つは診断法に利用するものであり、例えば1983年３月８日付でDavid,G.およびGreene,H. に付与された米国特許第4,376,110 号を引用しておく。モノクローナル抗体は、免疫吸着クロマトグラフィーにより物質を回収するのにも利用されており、例えば、Milstein,C. による「Scientific American 243 : 66, 70 (1980) 」を引用しておく。
【００７７】
さらに、本発明の組換えポックスウイルスまたはそれ由来のＤＮＡは、ＲＨＤＶ等のカリシウイルスの探索のために、またはＲＨＤＶ等のカリシウイルスＤＮＡの複製または検出のためのＰＣＲプライマーの生成のために用いられても良い。
【００７８】
本発明の実施態様としてはその他の用途もある。
【００７９】
本発明およびその多くの利点は、説明のために記載する以下の実施例から良好に理解されよう。
【実施例】
【００８０】
ＤＮＡクローニングおよび合成  標準的な方法により、プラスミドを構築し、スクリーニングし、成長させた（Maniatis等，1982;  Perkus等，1985;  Piccini等，1987）。制限エンドヌクレアーゼは、メリーランド州、ゲイサースブルグのベセスダリサーチラボラトリーズ；マサチューセッツ州、ビバーリーのニューイングランドバイオラド；およびインディアナ州、インディアナポリスのベーリンガーマンハイムバイオケミカルスから得た。Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノー断片は、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルスから得た。ＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼおよびファージＴ４  ＤＮＡリガーゼは、ニューイングランドバイオラボから得た。様々な供給者により指定された試薬を用いた。
【００８１】
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドは、既述のように（Perkus他、1989）Biosearch 8750またはApplied Biosystems 380B ＤＮＡ合成装置を用いて調製した。ＤＮＡ配列決定は、既述の手法に従い（Guo 他、1989）シークエナーゼ（Sequenase)を用いて（Tabor 他、1987）ジデオキシ−チェインターミネーション法により（Sanger他、1977）行った。配列確認のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅（Engelke 他、1988）は、自動式Perkin Elmer Cetus  ＤＮＡ熱サイクル装置（ＤＮＡ Thermal Cycler)によりカスタム合成オリゴヌクレオチドプライマーおよびGeneAmp ＤＮＡ増幅試薬キット（米国コネチカット州Norwalk のパーキン・エルマー・シータス（Perkin Elmer Cetus）社製）を用いて実施した。プラスミドからの過剰ＤＮＡ配列の欠失は、制限エンドヌクレアーゼ分解、その後、ＢＡＬ−３１エクソヌクレアーゼによる制限分解および合成オリゴヌクレオチドによる突然変異法（Mandecki,1986)により行った。
【００８２】
細胞、ウイルスおよびトランスフェクション  ワクシニアウイルスのコペンハーゲン（Copenhagen）株およびＮＹＶＡＣの起源および培養条件は既に明らかにされている（Guo 他、1989；Ｔａｒｔａｇｌｉａ他、１９９２）。組換えによる組換えウイルスの調製、ニトロセルロースフィルターを用いるインサイチュハイブリダイゼーションおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を利用するスクリーニングについては既に明らかにされている（Ｐａｎｉｃａｌｉ  他，１９８２；Piccini 他、1987；Ｐｅｒｋｕｓ  他，１９８９）。
【００８３】
カナリアポックスウイルスの親株（Rentschler株）はカナリアのワクシニア菌株である。このワクチン株は、野生型の単離体から得られ、ニワトリ胚繊維芽細胞を用いる200 回以上の継代培養を通して弱毒化されたものである。そのマスターウイルス種株は寒天下の４回の連続的なプラーク精製に供され、そのプラーククローンの１つが５回の追加の継代培養により増幅され、その後、このストックウイルスが親ウイルスとしてインビトロ組換え試験に使用されてきた。このプラーク精製カナリアポックス単離体がＡＬＶＡＣと命名されている。
【００８４】
ＦＰ−１と命名された家禽ポックスウイルス（ＦＰＶ）株については既に明らかにされている（Taylor他、1988a)。これは、日齢のヒナのワクチン接種に有用な弱毒化ワクチン株である。親ウイルス株Duvette は、フランスにおいてニワトリから家禽ポックス疥癬として入手された。このウイルスが胚ニワトリ卵での約50回の連続的な継代培養の後、ニワトリ胚繊維芽細胞における25回の継代培養により弱毒化された。該ウイルスは４回の連続的なプラーク精製に供された。プラークの１つが単離され、初期ＣＥＦ細胞中で増幅され、ＴＲＯＶＡＣと命名されたストックウイルスが樹立された。
【００８５】
ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣ各ウイルスベクターおよびそれらの誘導体の増殖については既に記述されている（Piccini 他、1987；Taylor他、1988a,b)。増殖にベロ（Vero）細胞やニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を使用することも既に明らかにされている（Taylor他、1988a,b)。
【００８６】
ＮＹＶＡＣおよび特に実施例１から６に関しては、米国特許第5,364,773 号を参照しており、本明細書に引用しておく。
【００８７】
実施例１  −  チミジンキナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）を欠失するための
プラスミドｐＳＤ４６０の構築                     
ここで図１を参照する。プラスミドｐＳＤ４０６は、ｐＵＣ８中にクローニングされたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊ（位置83359-88377）を含有している。ｐＳＤ４０６はＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｖｕＩＩにより切断され、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊの左側由来の1.7ｋｂの断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩにより切断されたｐＵＣ８中にクローニングし、ｐＳＤ４４７を形成した。ｐＳＤ４４７はＪ２Ｒ（位置83855-84385）の全遺伝子を含有している。開始コドンはＮｌａＩＩＩサイト内に含まれ、終止コドンはＳｓｐＩサイト内に含まれている。転写方向は、図１の矢印により示されている。
【００８８】
左側の隣接アームを得るために、ｐＳＤ４４７から0.8kb のＨｉｎｄIII ／ＥｃｏＲＩフラグメントを分離し、次いでＮｌａIII で消化して0.5kb のＨｉｎｄIII ／ＮｌａIII フラグメントを単離した。以下の配列を有するアニーニングした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４３／ＭＰＳＹＮ４４（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:1／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:2）を0.5kb のＨｉｎｄIII ／ＮｌａIII フラグメントと連結（ライゲート）し、ＨｉｎｄIII ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ１８ベクタープラスミドに導入して、プラスミドｐＳＤ４４９を得た。
【００８９】
SmaI
MPSYN43 5’     TAATTAACTAGCTACCCGGG     3’
MPSYN44 3’ GTACATTAATTGATCGATGGGCCCTTAA 5’
NlaIII                 EcoRI
ワクシニアの右側の隣接アームおよびｐＵＣベクター配列を含有する制限酵素フラグメントを得るために、ワクシニア配列内でＳｓｐＩ（部分的）を用い、またｐＵＣ／ワクシニア結合部においてＨｉｎｄIII を用いてｐＳＤ４４７を切断して、2.9kb のベクターフラグメントを分離した。このベクターフラグメントを、以下の配列を有するアニーリングした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４５／ＭＰＳＹＮ４６（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:3／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:4）と連結して、ｐＳＤ４５９を得た。
【００９０】
HindIII SmaI
MPSYN45 5’ AGCTTCCCGGGTAAGTAATACGTCAAGGAGAAAACGAA
MPSYN46 3’     AGGGCCCATTCATTATGCAGTTCCTCTTTTGCTT
NotI SspI
ACGATCTGTAGTTAGCGGCCGCCTAATTAACTAAT 3’ MPSYN45
TGCTAGACATCAATCGCCGGCGGATTAATTGATTA 5’ MPSYN46
左側隣接アームと右側隣接アームを結合させて１つのプラスミドとするために、ｐＳＤ４４９から0.5kb のＨｉｎｄIII ／ＳｍａＩフラグメントを分離し、これを、ＨｉｎｄIII ／ＳｍａＩで切断されたｐＳＤ４５９ベクタープラスミドに連結してｐＳＤ４６０を調製した。このｐＳＤ４６０をドナープラスミドとして用い、野性型親ワクシニアウイルスCopenhagen株ＶＣ−２との組換えを実施した。鋳型としてＭＰＳＹＮ４５（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:3）およびプライマーとして相補的な20マー（20mer)オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４７（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:5）（５′TTAGTTAATTAGGCGGCCGC３′）を用いるプライマー延長法により３２Ｐがラベルされたプローブを合成した。組換えウイルスｖＰ４１０の同定はプラークハイブリダイゼーションにより行った。
【００９１】
実施例２−出血性領域（Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）を欠失させたプラスミド
ｐＳＤ４８６の構築                                    
図２において、プラスミドｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８にクローニングされたワクシニアＳａｌＩ  Ｇ（位置160,744 〜173,351)を含有する。ｐＳＤ４２２は、右側に隣接するワクシニアＳａｌＩフラグメントＳａｌＩ  Ｊ（位置173,351 〜182,746)（ｐＵＣ８にクローニングされている）を含有している。出血性領域ｕ、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ（位置172,549 〜173,552)が欠失されたプラスミドを構築するため、左側隣接アーム源としてｐＳＤ４１９を用い、また、右側隣接アーム源としてｐＳＤ４２２を用いた。ｕ領域の転写方向は図２の矢印で示す。
【００９２】
ｐＳＤ４１９から非所望配列を除去するために、ＮｃｏＩ／ＳｍａＩを用いてｐＳＤ４１９を分解し、次いで大腸菌のクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結（ライゲーション）を行うことにより、ＮｃｏＩサイト（位置172,253)の左側の配列を除去してプラスミドｐＳＤ４７６を得た。Ｂ１４Ｒの終結コドンにおけるＨｐａＩでのｐＳＤ４２２の分解および0.3kb 右のＮｒｕＩによる分解によりワクシニアの右側隣接アームを得た。この0.3kb のフラグメントを単離、ｐＳＤ４７６から単離された3.4kb のＨｉｎｃIIベクターフラグメントに連結して、プラスミドｐＳＤ４７７を得た。ｐＳＤ４７７におけるワクシニアｕ領域の部分欠失位置は三角形で示している。
【００９３】
ｐＳＤ４７７における残りのＢ１３Ｒコード配列を除去するため、ＣｌａＩ／ＨｐａＩを用いる分解を行い、得られたベクターフラグメントを、以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＳＤ22mer／ＳＤ20mer（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:6／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:7）に連結して、ｐＳＤ４７９を調製した。
【００９４】
ClaI         BamHI HpaI
SD22mer 5’ CGATTACTATGAAGGATCCGTT 3’
SD20mer 3’   TAATGATACTTCCTAGGCAA 5’
ｐＳＤ４７９は、開始コドン（下線）を含有し、その後にＢａｍＨＩサイトがある。ｕプロモーターの制御下にＢ１３−Ｂ１４（ｕ）欠失座に大腸菌ベーターガラクトシダーゼを入れるために、ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira 他、1983）を含有する3.2kb のＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＤ４７９のＢａｍＨＩサイトに挿入して、ｐＳＤ４７９ＢＧを調製した。このｐＳＤ４７９ＢＧをドナープラスミドとして、ワクシニアウイルスｖＰ４１０との組換えを実施した。組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３を、発色性基質Ｘ−ｇａｌの存在下に青色のプラークとして分離した。ｖＰ５３３においては、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ領域が欠失され、ベーターガラクトシダーゼによって置換されている。
【００９５】
ｖＰ５３３からベーターガラクトシダーゼを取り除くために、ポリリンカー領域を含有するがｕ欠失結合部に開始コドンを有しないｐＳＤ４７７の派生体であるプラスミドｐＳＤ４８６を用いた。先ず、上述のｐＳＤ４７７由来のＣｌａＩ／ＨｐａＩベクターフラグメントを、以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＳＤ42mer／ＳＤ40mer（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:8／ＳＥＱＩＤ  NO:9）に連結して、プラスミドｐＳＤ４７８を調製した。
【００９６】
ClaI          SacI        XhoI        HpaI
SD42mer 5’ CGATTACTAGATCTGAGCTCCCCGGGCTCGAGGGATCCGTT 3’
SD40mer 3’   TAATGATCTAGACTCGAGGGGCCCGAGCTCCCTAGGCAA 5’
BglII        SmaI        BamHI
次に、ｐＵＣ／ワクシニア結合部におけるＥｃｏＲＩサイトを破壊するため、ＥｃｏＲＩを用いてｐＳＤ４７８を分解し、その後、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結（ライゲーション）を行うことにより、ｐＳＤ４７８Ｅ−  を得た。このｐＳＤ４７８Ｅ−  をＢａｍＨＩおよびＨｐａＩを用いて分解し、以下に示す配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５／ＨＥＭ６（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:10 ／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:11)に連結して、プラスミドｐＳＤ４８６を調製した。
【００９７】
BamHI EcoRI   HpaI
HEM5 5’ GATCCGAATTCTAGCT 3’
HEM6 3’     GCTAAGATCGA 5’
ｐＳＤ４８６をドナープラスミドとして用い、組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３との組換えを行ってｖＰ５５３を得た。このｖＰ５５３は、Ｘ−ｇａｌの存在下に透明なプラークとして単離された。
【００９８】
実施例３−ＡＴＩ領域（Ａ２６Ｌ）を欠失させたプラスミドｐＭＰ４９４Δ
の構築                                                    
図３において、ｐＳＤ４１４は、ｐＵＣ８にクローニングされたＳａｌＩ  Ｂを含有する。Ａ２６Ｌ領域の左側の非所望ＤＮＡ配列を取り除くために、ｐＳＤ４１４を、ワクシニア配列内でＸｂａＩを用いて切断し（位置１３７，０７９）、またｐＵＣ／ワクシニア結合部においてＨｉｎｄIII を用いる切断を行い、次に、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結を行うことにより、プラスミドｐＳＤ４８３を得た。Ａ２６Ｌ領域の右側の非所望ワクシニアＤＮＡ配列を除去するために、ＥｃｏＲＩを用いてｐＳＤ４８３を切断し（位置140,665 およびｐＵＣ／ワクシニア結合部）、連結処理（ライゲーション）を行ってプラスミドｐＳＤ４８４を形成した。Ａ２６Ｌコード領域を取り除くため、ＮｄｅＩ（部分的）を用いてＡ２６ＬのＯＲＦの少し上流を切断し（位置139,004)且つＨｐａＩを用いてＡ２６ＬのＯＲＦの少し下流を切断（位置137,889)した。5.2kb のベクターフラグメントを単離し、これを以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＡＴＩ３／ＡＴＩ４（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:12 ／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:13) と連結して、Ａ２６Ｌの上流領域を再構成し、下記の配列に示すようなＢｇｌII、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩの制限サイトを含有する短いポリリンカー領域とＡ２６ＬのＯＲＦを置換した。
【００９９】
NdeI
ATI3 5’ TATGAGTAACTTAACTCTTTTGTTAATTAAAAGTATATTCAAAAAATAAGT
ATI4 3’   ACTCATTGAATTGAGAAAACAATTAATTTTCATATAAGTTTTTTATTCA
BglII  EcoRI HpaI
TATATAAATAGATCTGAATTCGTT 3’ ATI3
ATATATTTATCTAGACTTAAGCAA 5’ ATI4
得られたプラスミドをｐＳＤ４８５と命名した。ｐＳＤ４８５のポリリンカー領域におけるＢｇｌIIサイトおよびＥｃｏＲＩサイトは唯一のものではないので、ＢｇｌIIを用いる分解（位置140,136)およびｐＵＣ／ワクシニア結合部におけるＥｃｏＲＩによる分解を行い、その後、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結（ライゲーション）により、プラスミド４８３（上述）から非所望のＢｇｌIIサイトおよびＥｃｏＲＩサイトを除去した。得られたプラスミドをｐＳＤ４８９と命名した。ｐＳＤ４８９由来でＡ２６ＬのＯＲＦを含有する1.8kb のＣｌａＩ（位置137,198)／ＥｃｏＲＶ（位置139,048)フラグメントを対応する0.7kb のポリリンカーを含有するｐＳＤ４８５由来のＣｌａＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントと置換することによりｐＳＤ４９２を得た。このｐＳＤ４９２のポリリンカー領域におけるＢｇｌIIサイトおよびＥｃｏＲＩサイトは唯一のものである。
【０１００】
ｐＳＤ４９２のＢｇｌIIサイトに、１１ｋＤａのワクシニアプロモーター（Bertholet 他、1985；Perkus他、1990）の制御下に大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira 他、1983）を含有する3.3kb のＢｇｌIIカセットを挿入して、ｐＳＤ４９３ＫＢＧを形成した。このプラスミドｐＳＤ４９３ＫＢＧを用いて、レスキューウイルスｖＰ５５３との組換えを行った。Ａ２６Ｌ欠失領域にベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ５８１が、Ｘ−ｇａｌの存在下に青色のプラークとして単離された。
【０１０１】
ワクシニア組換えウイルスｖＰ５８１からベーターガラクトシダーゼを欠失させるプラスミドを調製するために、以下の配列を有する合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ１７７（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:14)を用いる突然変異法（Mandeck 、1986）によりプラスミドｐＳＤ４９２のポリリンカー領域を欠失させた。
【０１０２】
(5’ AAAATGGGCGTGGATTGTTAACTTTATATAACTTATTTTTTGAATATAC 3’)
得られたプラスミドｐＭＰ４９４Δにおいては、位置［137,889 〜138,937 ］をカバーし、Ａ２６ＬのＯＲＦ全体を含むワクシニアＤＮＡが欠失されている。このｐＭＰ４９４Δとベーターガラクトシダーゼ含有ワクシニア組換体ｖＰ５８１との間の組換えにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ６１８が得られ、Ｘ−ｇａｌの存在下に透明なプラークとして単離された。
【０１０３】
実施例４−血球凝集素遺伝子（Ａ５６Ｒ）を欠失させたプラスミドｐＳＤ４６７
の構築                                                        
図４において、ワクシニアＳａｌＩ  Ｇ制限酵素フラグメント（位置160,744 〜173,351)は、ＨｉｎｄIII Ａ／Ｂ結合部（位置162,539)を包含している。ｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８にクローニングされたワクシニアＳａｌＩ  Ｇを含有する。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写方向は図４における矢印で示されている。ＨｉｎｄIII Ｂ由来のワクシニア配列の除去には、ワクシニア配列内およびｐＵＣ／ワクシニア結合部においてＨｉｎｄIII を用いるｐＳＤ４１９の分解を行い、その後、連結処理（ライゲーション）した。得られたプラスミドｐＳＤ４５６は、左側が0.4kb のワクシニア配列および右側が0.4kb のワクシニア配列で挟まれたＨＡ遺伝子（Ａ５６Ｒ）を含有する。Ａ５６Ｒをコードする配列を除去するために、Ａ５６Ｒコード配列の上流をＲｓａＩ（部分的；位置161,090)により、また、該遺伝子の末端近傍をＥａｇＩ（位置162,054)によりｐＳＤ４５６を切断した。ｐＳＤ４５６から3.6kb のＲｓａＩ／ＥａｇＩベクターフラグメントを単離し、以下の配列を有するアニーリングした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９（ＳＥＱＩＤ  NO:15)、ＭＰＳＹＮ６２（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:16)、ＭＰＳＹＮ６０（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:17)およびＭＰＳＹＮ６１（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:18)に連結（ライゲート）して、Ａ５６ＲのＯＲＦの上流のＤＮＡ配列を再構成し、Ａ５６ＲのＯＲＦを下記に示すようなポリリンカー領域と置換した。
【０１０４】
RsaI
MPSYN59 5’ ACACGAATGATTTTCTAAAGTATTTGGAAAGTTTTATAGGT-
MPSYN62 3' TGTGCTTACTAAAAGATTTCATAAACCTTTCAAAATATCCA-
MPSYN59  AGTTGATAGAACAAAATACATAATTT 3'
MPSYN62  TCAACTATCT 5'
MPSYN60 5'                 TGTAAAAATAAATCACTTTTTATA-
MPSYN61 3' TGTTTTATGTATTAAAACATTTTTATTTAGTGAAAAATAT-
BglII SmaI  PstI  EagI
MPSYN60  CTAAGATCTCCCGGGCTGCAGC     3'
MPSYN61  GATTCTAGAGGGCCCGACGTCGCCGG 5'
得られたプラスミドがｐＳＤ４６６である。このｐＳＤ４６６におけるワクシニア欠失は位置［161,185 〜162,053 ］を包含する。ｐＳＤ４６６における欠失サイトは図４では三角形で示されている。
【０１０５】
ｐＳＤ４６６のＢｇｌIIサイトに、１１ｋＤａのワクシニアプロモーター（Bertholet 他、1985；Guo 他、1989）の制御下に大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira 他、1983）を含有する3.2kb のＢｇｌII／ＢａｍＨＩ（部分的）カセットを挿入して、ｐＳＤ４６６ＫＢＧを形成した。このプラスミドｐＳＤ４６６ＫＢＧを用いて、レスキューウイルスｖＰ６１８との組換えを行った。Ａ５６Ｒ欠失サイトにベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ７０８が、Ｘ−ｇａｌの存在下に青色プラークとして単離された。
【０１０６】
ドナープラスミドｐＳＤ４６７を用い、ｖＰ７０８からベーターガラクトシダーゼ配列を除去した。ｐＳＤ４６７はｐＳＤ４６６と同じであるが、但し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩを用いるｐＳＤ４６６の分解、それに続く大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結処理（ライゲーション）によりｐＵＣ／ワクシニア結合部からＥｃｏＲＩサイト、ＳｍａＩサイトおよびＢａｍＨＩサイトが取り除かれている。ｖＰ７０８とｐＳＤ４６７との間に組換えを行うことにより組み換えワクシニア欠失変異体ｖＰ７２３が得られ、Ｘ−ｇａｌの存在下に透明なプラークとして単離された。
【０１０７】
実施例５−オープンリーディングフレーム［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］
を欠失させたプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構築  
図５に関し、次のワクシニアクローンを利用してｐＭＰＣＳＫ１Δを構築した。ｐＳＤ４２０は、ｐＵＣ８にクローニングされたＳａｌＩ  Ｈである。ｐＳＤ４３５は、ｐＵＣ１８にクローニングされたＫｐｎＩ  Ｆである。ＳｐｈＩでｐＳＤ４３５を切断、再連結してｐＳＤ４５１を形成した。このｐＳＤ４５１においては、ＨｉｎｄIII ＭにおけるＳｐｈＩサイト（位置27,416）の左側のＤＮＡ配列が除去されている（Perkus他、1990）。ｐＳＤ４０９は、ｐＵＣ８にクローニングされたＨｉｎｄIII Ｍである。
【０１０８】
ワクシニアから［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］遺伝子クラスターを除去する基質を得るために、先ず、以下のように、ワクシニアのＭ２Ｌ欠失座に大腸菌ベーターガラクトシダーゼを挿入した（Ｇｕｏ  他，１９９０）。ｐＳＤ４０９においてＢｇｌIIサイトを取り除くために、ＢｇｌIIを用いてワクシニア配列（位置28,212）およびＢａｍＨＩを用いてｐＵＣ／ワクシニア結合部において該プラスミドを切断し、次いで連結処理（ライゲーション）を行い、プラスミドｐＭＰ４０９Ｂを形成した。唯一のＳｐｈＩサイト（位置27, 416 ）においてｐＭＰ４０９Ｂを切断した。以下の配列の合成オリゴヌクレオチドを用いる突然変異法（Guo 他、1990；Mandecki，1986）によりＭ２Ｌをコードする配列を除去した。
【０１０９】
BglII
MPSYN82  （配列番号19）5’ TTTCTGTATATTTGCACCAATTTAGATCTT-ACTCAAAATATGTAACAATA 3’
得られたプラスミドｐＭＰ４０９Ｄは、上記のようにＭ２Ｌ欠失座に挿入された唯一のＢｇｌIIサイトを含有する。ＢｇｌIIで切断されたｐＭＰ４０９Ｄに、１１ｋＤａのプロモーター（Bertholet 他、1985）の制御下に大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira 他、1983）を含有する3.2kbのＢａｍＨＩ（部分的）／ＢｇｌIIカセットを挿入した。得られたプラスミドｐＭＰ４０９ＤＢＧ (Guo 他、1990）をドナープラスミドとして用い、レスキューワクシニアウイルスｖＰ７２３との組換えを行った。Ｍ２Ｌ欠失座に挿入されたベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ７８４が、Ｘ−ｇａｌの存在下に青色プラークとして単離された。
【０１１０】
ワクシニア遺伝子［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］が欠失されたプラスミドを、ＳｍａＩ、ＨｉｎｄIII で切断され、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片で平滑末端化されたｐＵＣ８に組み込んだ。ワクシニアＨｉｎｄIII Ｃ配列から成る左側の隣接アームを得るために、ｐＳＤ４２０をＸｂａＩ（位置18,628）で分解した後、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化およびＢｇｌII（位置19,706）を用いる分解を行った。ワクシニアＨｉｎｄIII Ｋ配列から成る右側の隣接アームは、ｐＳＤ４５１をＢｇｌII（位置29,062）およびＥｃｏＲＶ（位置29,778）で分解して得られた。得られたプラスミドｐＭＰ５８１ＣＫは、ＨｉｎｄIII ＣのＢｇｌIIサイト（位置19,706）とＨｉｎｄIII ＫのＢｇｌIIサイト（位置２９０６２）との間のワクシニア配列が欠失されている。プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫにおけるワクシニア配列の欠失部位は図５に三角形で示している。
【０１１１】
ワクシニア欠失部の過剰なＤＮＡを除去するため、プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫをワクシニア配列内のＮｃｏＩサイト（位置18,811；19,655）において切断し、Ｂａｌ−３１エクソヌクレアーゼを用いて処理し、さらに、以下の配列を有する合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２３３（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:20)を用いる突然変異法（Mandecki，1986）に供した。
【０１１２】
5’-TGTCATTTAACACTATACTCATATTAATAAAAATAATATTTATT-3’
得られたプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δは、12のワクシニアオープンリーデンフレーム[ Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を包含する18,805〜29,108位置のワクシニア配列が欠失されている。ｐＭＰＣＳＫ１Δとベーターガラクトシダーゼ含有ワクシニアウイルスｖＰ７８４との間に組換えを行わせることにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８０４が得られ、Ｘ−ｇａｌの存在下に透明なプラークとして単離された。
【０１１３】
実施例６−リボヌクレオチドレダクターゼラージサブユニットを欠失させた
プラスミドｐＳＤ５４８の構築                              
図６において、プラスミドｐＳＤ４０５は、ｐＵＣ８にクローニングされたワクシニアＨｉｎｄIII Ｉ（位置63,875〜70,367）を含有する。このｐＳＤ４０５をワクシニア配列内でＥｃｏＲＶにより、また、ｐＵＣ／ワクシニア結合部においてはＳｍａＩにより消化分解し、連結処理（ライゲーション）することによりプラスミドｐＳＤ５１８を形成した。ｐＳＤ５４８の構築に用いたワクシニア制限フラグメントは、全て、このｐＳＤ５１８由来のものである。
【０１１４】
ワクシニアのＩ４Ｌ遺伝子は、67,371〜65,059の位置に延在している。Ｉ４Ｌの転写方向は、図６において矢印で示されている。Ｉ４Ｌのコード配列の一部が欠失したベクタープラスミドを得るために、ｐＳＤ５１８をＢａｍＨＩ（位置65, 381 ）およびＨｐａＩ（位置67,001）を用いて分解し、且つ、大腸菌のクレノウ断片を用いて平滑末端化した。この4.8kb のベクターフラグメントを、ワクシニアの１１ｋＤａのプロモーター（Bertholet 他、1985；Perkus他、1990）の制御下に大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira 他、1983）を含有する3.2kb のＳｍａＩカセットに連結して、プラスミドｐＳＤ５２４ＫＢＧを得た。このｐＳＤ５２４ＫＢＧをドナープラスミドとして、ワクシニアウイルスｖＰ８０４との組換えを行った。Ｉ４Ｌ遺伝子の部分欠失位置にベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ８５５が、Ｘ−ｇａｌの存在下に青色プラークとして単離された。
【０１１５】
ベーターガラクトシダーゼおよび残存するＩ４ＬのＯＲＦをｖＰ８５５から欠失させるために、欠失プラスミドｐＳＤ５４８を構築した。以下に詳述し且つ図６に示すように、左側および右側のワクシニア隣接アームをそれぞれ別個にｐＵＣ８に組み込んだ。
【０１１６】
左側のワクシニア隣接アームを受け入れるベクタープラスミドを構築するため、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチド５１８Ａ１／５１８Ａ２（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:21 ／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:22)に連結して、プラスミドｐＳＤ５３１を形成した。
【０１１７】
BamHI    RsaI
518A1 5’ GATCCTGAGTACTTTGTAATATAATGATATATATTTTCACTTTATCTCAT
518A2 3’     GACTCATGAAACATTATATTACTATATATAAAAGTGAAATAGAGTA
BglII    EcoRI
TTGAGAATAAAAAGATCTTAGG     3’ 518A1
AACTCTTATTTTTCTAGAATCCTTAA 5’ 518A2
ＲｓａＩ（部分的）およびＢａｍＨＩでｐＳＤ５３１を切断し、2.7kb のベクターフラグメントを単離した。ＢｇｌII（位置64,459）／ＲｓａＩ（位置６４９９４）でｐＳＤ５１８を切断して0.5kb のフラグメントを単離した。これらの２つのフラグメントを互いに連結して、Ｉ４Ｌのコード配列の左側の完全なワクシニア隣接アームを含有するｐＳＤ５３７を形成した。
【０１１８】
右側のワクシニア隣接アームを受け入れるベクタープラスミドを構築するため、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩでｐＵＣ８を切断し、以下に示す配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチド５１８Ｂ１／５１８Ｂ２（ＳＥＱＩＤ  NO:23 ／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:24)に連結して、プラスミドｐＳＤ５３２を形成した。
【０１１９】
BamHI BglII SmaI
518B1 5’ GATCCAGATCTCCCGGGAAAAAAATTATTTAACTTTTCATTAATAG-
518B2 3’     GTCTAGAGGGCCCTTTTTTTAATAAATTGAAAAGTAATTATC-
RsaI   EcoRI
GGATTTGACGTATGTAGCGTACTAGG     3’ 518B1
CCTAAACTGCATACTACGCATGATCCTTAA 5’ 518B2
このｐＳＤ５３２をＲｓａＩ（部分的）／ＥｃｏＲＩで切断して2.7kb のベクターフラグメントを単離した。ｐＳＤ５１８を、ワクシニア配列内をＲｓａＩ( 位置67,436）により、また、ワクシニア／ｐＵＣ結合部をＥｃｏＲＩによって切断して0.6kb のフラグメントを単離した。２つの断片を互いに連結し、Ｉ４Ｌをコードする配列の右側の完全なワクシニア隣接アームを含有するｐＳＤ５３８を調製した。
【０１２０】
右側のワクシニア隣接アームは、ｐＳＤ５３８から0.6kb のＥｃｏＲＩ／ＢｇｌIIフラグメントとして単離し、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌIIで切断されたｐＳＤ５３７内に連結した。得られたプラスミドｐＳＤ５３９においては、Ｉ４ＬのＯＲＦ（位置65,047〜67,836）がポリリンカー領域によって置換されており、該領域は左側を0.6kb のワクシニアＤＮＡにより、また右側を0.6kb のワクシニアＤＮＡにより挟まれており（フランキングされており）、これらは全てｐＵＣバックグランド内にある。ワクシニア配列内の欠失部は、図６において三角形で示している。ｐＳＤ５３９のｐＵＣ派生部分のベーターガラクトシダーゼが、組換えワクシニアウイルスｖＰ８５５内のベーターガラクトシダーゼと組換えを行う可能性を回避するため、ｐＳＤ５３９からワクシニアＩ４Ｌ欠失カセットを取り除いてｐＲＣ１１とした。このｐＲＣ１１は、すべてのベーターガラクトシダーゼが除去され、ポリリンカー領域で置換されたｐＵＣ派生体である（Ｃｏｌｉｎａｓ他、1990）。ｐＳＤ５３９をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断して1.2kb のフラグメントを単離した。このフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断したｐＲＣ１１（2.35kb）に連結して、ｐＳＤ５４８を形成した。ｐＳＤ５４８とベーターガラクトシダーゼ含有ワクシニア組換体ｖＰ８５５との間に組換えを行わせることにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８６６が得られ、Ｘ−ｇａｌの存在下に透明なプラークとして単離された。
【０１２１】
組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６由来のＤＮＡの分析は、制限酵素分解、次にアガロースゲル上の電気泳動法により行った。制限パターンは予測どおりであった。鋳型としてｖＰ８６６および上で詳述した６つの欠失遺伝子座を挟むプライマーを用いた複製連鎖反応（ＰＣＲ）（Engelke 他、1988）により予測された大きさのＤＮＡフラグメントが得られた。ＰＣＲで得られたフラグメントの欠失接合領域近傍の配列分析により、接合が期待どおりであることが確認された。上述したような６つの欠失部を有するように工夫した組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６をワクシニアウイルス株「ＮＹＶＡＣ」と命名した。
【０１２２】
実施例７−ＮＹＶＡＣへの狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子の挿入
ワクシニアＨ６プロモーター（Taylor他、1988a,b)の制御下に狂犬病（ウイルス）糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子をＴＫ欠失プラスミドｐＳＤ５１３に挿入した。ｐＳＤ５１３は、ポリリンカーが存在している点を除いては、ｐＳＤ４６０（図１）と同一である。
【０１２３】
図７に示すように、ｐＳＤ４６０をＳｍａＩで切断し、以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＶＱ１Ａ／ＶＱ１Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:25 ／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:26)に連結することにより該ポリリンカーを挿入することにより、ベクタープラスミドｐＳＤ５１３を形成した。
【０１２４】
SmaI BglII XhoI PstI NarI BamHI
VQ1A 5’ GGGAGATCTCTCGAGCTGCAGGGCGCCGGATCCTTTTTCT 3’
VQ1B 3’ CCCTCTAGAGAGCTCGACGTCCCGCGGCCTAGGAAAAAGA 5’
このｐＳＤ５１３をＳｍａＩで切断し、ワクシニアＨ６プロモーター（Taylor他、1988a,b)の制御下に狂犬病糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子を含有し、ＳｍａＩ末端から成る1.8kb のカセットに連結した。得られたプラスミドをｐＲＷ８４２と命名した。このｐＲＷ８４２をドナープラスミドとして用い、ＮＹＶＡＣレスキューウイルス（ｖＰ８６６）と組換えを行った。狂犬病糖タンパク質Ｇをコードする配列に対する３２Ｐラベル化プローブを用いるプラークハイブリダイゼーションにより組換えワクシニアウイルスｖＰ８７９を同定した。
【０１２５】
本発明の改変組換えウイルスは、組換えワクチンベクターとして幾つかの利点を有する。すなわち、ベクターの毒性が弱毒化されているので、ワクチン接種による被接種者が無制御（ランナウェー）感染する可能性が減少し、さらに、感染者から非感染者への伝染や環境の汚染も少なくするという利点を有する。
【０１２６】
さらに、本発明の改変組換えウイルスは、インビトロ培養される細胞内で遺伝子産物を発現させるのに用いることもでき、このためには、該細胞内で遺伝子産物をコードし発現する外来遺伝子を有する本発明の改変組換えウイルスを該細胞に導入すればよい。
【０１２７】
実施例８−狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇを発現するＡＬＶＡＣ組換体の構築
この実施例は、カナリアポックスウイルスベクターＡＬＶＡＣおよびカナリアポックス−狂犬病ウイルス組換体ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の調製ならびにその安全性と効力について記述するものである。
【０１２８】
細胞およびウイルス  親カナリアポックスウイルス（Rentschler株）はカナリア用ワクチン株の１つである。このワクチン株は野性型の単離体から入手され、ニワトリ胚繊維芽細胞による200 回以上の連続的な継代培養により弱毒化されたものである。マスターウイルスシードは、寒天下の４回の連続的なプラーク精製に供され、さらに、プラーククローンの１つが５回の追加の継代培養により増殖された後、該ストックウイルスが親ウイルスとしてインビトロ組換え試験に用いられた。プラーク精製されたカナリアポックス単離体は、ＡＬＶＡＣと命名されている。
【０１２９】
カナリアポックス挿入ベクターの構築  880bp のカナリアポックスＰｖｕIIフラグメントを、ＰＵＣ９のＰｖｕIIサイト間にクローニングしてｐＲＷ764.5 を調製した。このフラグメントの配列は、図８（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:27)において1372〜2251位置に示されている。Ｃ５として称されているオープンリーディングフレームの範囲を確認した。このオープンリーディングフレームは、該フラグメント内の位置１６６で開始され且つ位置４８７で終結されていることが明らかにされた。オープンリーディングフレームを阻害することなくＣ５の欠失を行った。位置１６７から位置４５５までの塩基を、配列（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:28)GCTTCCCGGGAATTCTAGCTAGCTAGTTT と置換した。この置換配列は、ＨｉｎｄIII 、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ挿入サイトと、それに後続しワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼにより認識される翻訳停止シグナルおよび転写終結シグナルを含有している（Yuen他、1987）。Ｃ５オープンリーディングフレームの欠失は以下のように行った。プラスミドｐＲＷ764.5 をＲｓａＩで部分的に切断して線状の生成物を単離した。このＲｓａＩ線状フラグメントをＢｇｌIIで再切断し、かくして、位置１５６から位置４６２までのＲｓａＩからＢｇｌIIまでが欠失したｐＲＷ764.5 フラグメントを単離し、以下の合成オリゴヌクレオチド用ベクターとして使用した。
【０１３０】
RW145（配列番号２９）
ACTCTCAAAAGCTTCCCGGGAATTCTAGCTAGCTAGTTTTTATAAA
RW146（配列番号３０）
GATCTTTATAAAAACTAGCTAGCTAGAATTCCCGGGAAGCTTTTGAGAGT
オリゴヌクレオチドＲＷ１４５およびＲＷ１４６をアニーリングし、上述のｐＲＷ764.5 ＲｓａＩおよびＢｇｌIIベクターに挿入した。得られたプラスミドをｐＲＷ８３１と命名した。
【０１３１】
狂犬病Ｇ遺伝子を含有する挿入ベクターの構築  以下にｐＲＷ８３８の構築について説明する。ＡからＥのオリゴヌクレオチド（狂犬病ウイルスＧのＨ６プロモーターの開始コドンと重なっている）をｐＵＣ９にクローニングしてｐＲＷ７３７とした。オリゴヌクレオチドＡからＥはＨ６プロモーターを含有し、ＮｒｕＩで始まり、狂犬病ウイルスＧのＨｉｎｄIII に到り、その後にＢｇｌIIがある。オリゴヌクレオチドＡからＥ（（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:31)から（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:35 ) ）の配列は以下のとおりである。
【０１３２】
A(配列番号31):CTGAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGTTCCTCAGGCTCTCCTGTTTGT
B(配列番号32):CATTACGATACAAACTTAACGGATATCGCGATAATGAAATAATTTCAG
C(配列番号33):ACCCCTTCTGGTTTTTCCGTTGTGTTTTGGGAAATTCCCTATTTACACGATCCCAGACAAGCTTAGATCTCAG
D(配列番号34):CTGAGATCTAAGCTTGTCTGGGATCGTGTAAATAGGGAATTTCCCAAAACA
E(配列番号35):CAACGGAAAAACCAGAAGGGGTACAAACAGGAGAGCCTGAGGAAC
また、アニーリングされたオリゴヌクレオチドＡからＥを図解すると次のようになる。
【０１３３】
A                   C
-------------------------|---------------------------
----------------|------------------|-----------------
B                 E                 D
オリゴヌクレオチドＡからＥをキナーゼ処理し、アニーリングし（95℃で５分間、その後、室温に冷却）、ｐＵＣ９のＰｒｕIIサイト間に挿入した。得られたプラスミドｐＲＷ７３７をＨｉｎｄIII およびＢｇｌIIで切断し、ｐｔｇ１５５ＰＲＯ(Kieny他、1984）のＨｉｎｄIII −ＢｇｌIIの1.6kbpフラグメント用ベクターとして使用しｐＲＷ７３９を調製した。ｐｔｇ１５５ＰＲＯＨｉｎｄIII サイトは、狂犬病Ｇの翻訳開始コドンの86bp下流にある。また、ｐｔｇ１５５ＰＲＯにおいて、ＢｇｌIIは狂犬病Ｇ翻訳停止コドンの下流にある。ｐＲＷ７３９をＮｒｕＩ用いて部分切断し、さらにＢｇｌIIを用いて完全切断し、かくして、既知のＨ６プロモーター（Taylor他、1988a,b ；Guo他、1989；Perkus他、1989）の３′末端から狂犬病Ｇの全遺伝子までを含有する1.7kbpのＮｒｕＩ−ＢｇｌIIフラグメントをｐＲＷ８２４のＮｒｕＩサイトとＢａｍＨＩサイトとの間に挿入した。得られたプラスミドをｐＲＷ８３２と命名する。ｐＲＷ８２４に挿入することにより、ＮｒｕＩのＨ６プロモーターの５′が付加された。ＳｍａＩが後に続いているＢａｍＨＩのｐＲＷ８２４の配列は、GGATCCCCGGG （ＳＥＱ  ＩＤ  NO:36)である。ｐＲＷ８２４は、ワクシニアウイルスのＨ６プロモーターに非関連遺伝子が正確に結合されたプラスミドである。ＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩでの分解によりこの非関連遺伝子を切除した。このｐＲＷ８３２のＳｍａＩの1.8kbpフラグメント（Ｈ６をプロモーターとする狂犬病Ｇを含有している）をｐＲＷ８３１のＳｍａＩに挿入して、プラスミドｐＲＷ８３８を調製した。
【０１３４】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧの調製  既知のリン酸カルシウム沈降法を用いて（Panicali他、1982；Piccini 他、1987）、ＡＬＶＡＣ感染初期ＣＥＦ細胞にｐＲＷ８３８を移入させた。特定の狂犬病Ｇプローブに対するハイブリダイゼーションにより陽性クローンを選択し、純粋な集団が得られるまで６回の連続的なプラーク精製に供した。次に、１つの代表プラークを増殖して、得られたＡＬＶＡＣ組換体をＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）と命名した（図９Ａおよび図９Ｂ参照）。配列分析により、狂犬病Ｇ遺伝子がＡＬＶＡＣゲノム内に正しく挿入され、その後の変異が生じていないことを確認した。
【０１３５】
免疫蛍光  成熟狂犬病ウイルス粒子が形成される最終段階においては、糖タンパク質成分はゴルジ体から形質膜に移送され、そこで、細胞膜質および細胞膜の外表面にあるタンパク質本体にカルボキシ末端を延ばしながら蓄積する。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ内で発現された狂犬病糖タンパク質が正しく存在していることを確認するために、ＡＬＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ−ＲＧで感染された初期ＣＥＦ細胞上で免疫蛍光測定法を実施した。この免疫蛍光法は、既知の手法（Taylor他、1990）に従い、狂犬病Ｇのモノクローナル抗体を用いて行った。ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させたＣＥＦ細胞においては強い表面蛍光が検出されたが、親のＡＬＶＡＣには蛍光は認められなかった。
【０１３６】
免疫沈降  初期ＣＥＦ細胞、ベロ（Vero）細胞（アフリカミドリザルの腎臓細胞由来の細胞系、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ81）、およびＭＲＣ−５細胞（正常なヒト胎児肺組織から派生された繊維芽細胞類似の細胞系、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ171)から予め形成した単層に、既知の手法（Taylor他、1990）に従い、放射ラベルした３５Ｓ−メチオニンの存在下に、１０pfu ／細胞で、親ウイルスＡＬＶＡＣおよび組換えウイルスＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した。免疫沈降反応は、狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いて行った。組換えＡＬＶＡＣ−ＲＧの場合は、分子量がおよそ67kDa の狂犬病特異的糖タンパク質が効率的に発現していることが検出された。非感染細胞または親ウイルスであるＡＬＶＡＣが感染された細胞においては、狂犬病特異的生成物の検出は認められなかった。
【０１３７】
連続継代培養実験  ＡＬＶＡＣを広範囲の非トリ種に適用した研究では、感染の増幅や明白な病気は認められていない（Taylou他、1991b)。しかしながら、親ウイルスおよび組換えウイルスのいずれも非トリ細胞では増殖できないことを確認するため、連続的な継代培養実験を行った。
【０１３８】
以下の細胞基質に２種類のウイルス、すなわち、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種して10代の連続的な盲検（ブラインド）継代培養を行った。
【０１３９】
(1) 11日齢の白色レグホーン胚由来の初期ニワトリ繊維芽（ＣＥＦ）細胞；
(2) ベロ（Vero）細胞−アフリカミドリザルの腎臓細胞由来の無限増殖性細胞
（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ81）；および
(3) ＭＲＣ−５細胞−ヒト胎児の胚組織由来の二倍体細胞系（ＡＴＣＣ＃ＣＣ
Ｌ171)。
【０１４０】
各細胞につき３ヶの60mm培養皿を用い各皿に２×10６  個の細胞が含有されるようにして、0.1pfu／細胞のm.o.i.で最初の接種を行った。培養皿の１つは、ＤＮＡ複製の阻害剤であるシトシンアラビノシド（Ara Ｃ）40μg/mlの存在下に接種を行った。37℃で１時間の吸着期間の後、接種物を除去し、単層を洗浄して非吸着ウイルスを取り除いた。この時点で、培地の置換を行い、２つの培養皿（試料ｔ０および試料ｔ７）には５mlのＥＭＥＭ＋２％ＮＢＣＳを入れ、また、第３番目の培養皿（試料ｔ７Ａ）には40μg/mlのAra Ｃを含有する５mlのＥＭＥＭ＋２％ＮＢＣＳを入れた。試料ｔ０は−70℃で凍結して残存する導入ウイルスの指標とした。試料ｔ７および試料ｔ７Ａは37℃で７日間培養し、その後、内容物を回収し、間接音波処理により細胞を破砕した。
【０１４１】
各細胞基質の試料ｔ７の１mlを同じ細胞基質の３つの培養皿に稀釈せずに接種し（試料ｔ０、ｔ７およびｔ７Ａとする）、さらに、初期ＣＥＦ細胞の１つの培養皿に接種した。試料ｔ０、試料ｔ７および試料ｔ７Ａは第１代継代のために処理した。ＣＥＦ細胞への追加接種は、非トリ細胞中に存在し得るようなウイルスに対する高感度検出用の増殖工程に供した。
【０１４２】
この操作を繰り返して、10代の連続ブラインド継代培養（ＣＥＦおよびＭＲＣ−５）または８代（ベロ）の連続ブラインド継代培養を行った。試料を凍結し、３回解凍して初期ＣＥＦ単層上で滴定を行うことにより分析した。
【０１４３】
次に、寒天下にＣＥＦ単層上でプラーク滴定を行うことによりウイルス収量を測定した。実験結果をまとめて表１および表２に示す。
【０１４４】
この結果から、親のＡＬＶＡＣおよび組換体のＡＬＶＡＣ−ＲＧの両方とも、ＣＥＦ単層上で複製を持続する能力を有し力価の損失はないことが示されている。ベロ（Vero）細胞においては、ＡＬＶＡＣについては第２代後、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧについては第１代後にウイルスのレベルは検出レベル以下に低下した。ＭＲＣ−５においても同様の結果が示され、第１代後にはウイルスが検出されなかった。表１および表２には第４代までの結果しか示していないが継代培養を第８代（Vero）および第10代（ＭＲＣ−５）まで行ったところ、これらの非トリ細胞においてはいずれのウイルスも検知可能となるように成長適応化していなかった。
【０１４５】
第１代においては、ＭＲＣ−５細胞およびVero細胞のｔ７試料には比較的高レベルのウイルスが存在した。しかしながら、このレベルは、ｔ０試料およびウイルスの複製が起こり得ないようにシトシンアラビノシドの存在下に接種を行ったｔ７Ａ試料において見られるレベルに等しかった。このことは、非トリ細胞において７日目に認められたウイルスレベルは、残存ウイルスを表し新たに複製されたウイルスではないことを示している。
【０１４６】
分析をさらに高感度にするため、各細胞基質から７日目に回収したものの一部を、任意のＣＥＦ単層に接種し、細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められた時に回収するか、またはＣＰＥが見られない場合は７日目に回収した。この実験結果を表３に示す。任意の細胞基質による増殖後においも、ＭＲＣ−５細胞およびVero細胞においては、更に２代の継代でウイルスが検出されるだけであった。これらの結果から、採用した条件下では、Vero細胞またはＭＲＣ−５細胞においてはいずれのウイルスも増殖できるように適応化できないことが明らかである。
【０１４７】
アカゲザルへの接種  ＨＩＶに関して血清反応陽性の４匹のアカゲザルに先ずＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した（表４）。100 日後、該動物に再接種して追加免疫効果を調べ、さらに、追加の７匹のアカゲザルにいろいろな投与量で接種を行った。適当な間隔で血液を抜き出し、56℃において30分間の加熱不活性化後、高速蛍光焦点阻害（Rapid Fluorescent Focus Inhibition：ＲＦＦＩ）分析法（Smith 他、1973）により狂犬病ウイルス抗体の存在を血清分析した。
【０１４８】
チンパンジーへの接種  オトナのオスのチンパンジー２匹（体重範囲50〜65kg）に、ｖＣＰ６５を１×10７  pfu で筋肉内また皮下接種した。該動物の反応を観察し、また、規則的な間隔で採血を行いＲＦＦＩテスト（Smith 他、1973）により抗狂犬病ウイルス抗体の存在を分析した。最初の接種から13週間後、同じ投与量で該動物に再接種した。
【０１４９】
マウスへの接種  グループ分けしたマウスに、異なるバッチ由来のｖＣＰ６５をいろいろな希釈度で50〜100 μｌ接種した。マウスへの接種は足蹠に接種した。14日目に、狂犬病ウイルスの毒性ＣＶＳ株を15〜43マウスＬＤ５０で頭蓋内接種することによりマウスの免疫性テストを行った。マウスの生存率を監視し、接種から28日目における50％防御投与量（ＰＤ５０）を求めた。
【０１５０】
イヌおよびネコへの接種  10匹のビーグル犬（５ヶ月齢）および10匹のネコ（４ヶ月齢）に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを6.7 または7.7log１０ＴＣＩＤ５０で皮下接種した。４匹のイヌおよび４匹のネコには接種を行わなかった。接種後14日および28日後にそれらの動物の採血を行い、ＲＦＦＩテストにより抗狂犬病ウイルス抗体を分析した。6.7log１０ＴＣＩＤ５０のＡＬＶＡＣ−ＲＧが投与された動物については、接種後29日目に、ＮＹＧＳ狂犬病ウイルス免疫性テスト株の3.7log１０（マウスＬＤ５０）（ビーグル犬）または4.3log１０（マウスＬＤ５０）（ネコ）を用いて免疫性テストを行った。
【０１５１】
リスザルへの接種  各グループが４匹のリスザル（Saimiri Sciureus）から成る３グループのリスザルに、３種類のウイルスの１つ、すなわち、(a) ＡＬＶＡＣ（カナリアポックス親ウイルス）、(b) ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（狂犬病Ｇ糖タンパク質を発現する組換体、または(c) ｖＣＰ３７（ネコ白血病ウイルスのエンベロープ糖タンパク質を発現するカナリアポックス組換体）を接種した。接種はケタミン麻酔下に実施した。各動物は以下を同時に投与された：(1) 乱刺を行わずに右目の表面に滴注された20μｌ、(2) 口中に数滴として100 μｌ、(3) 右腕の外表面の毛をそった皮膚内の２つの注射部位にそれぞれ100 μｌ；および(4) 右大腿の前部筋肉に100 μｌ。
【０１５２】
４匹のサルに各ウイルスを接種し、２匹についてはlog１０pfuとして全量5.0 とし、また、他の２匹についてはlog１０pfuとして7.0 とした。規則的な間隔で該動物の採血を行い、血清を分析してＲＦＦＩテスト（Smith 他、1973）により抗狂犬病ウイルス抗体を調べた。接種に対する該動物の反応を毎日観察した。最初の接種から６ヶ月後、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを投与された４匹のリスザル、ｖＣＰ３７をはじめに投与された２匹のリスザルに加えて非投与のリスザル１匹に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを6.5log１０pfu で皮下接種した。血清を分析して、ＲＦＦＩテスト（Smith 他、1973）により狂犬病ウイルス中和抗体の存在を調べた。
【０１５３】
ヒト細胞系へのＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種  当該ウイルスが複製しない非トリ細胞内で外来遺伝子が効率的に発現されるか否かを判定するため、５種類の細胞系、すなわち、１種類のトリ系および４種類の非トリ系について分析を行い、ウイルス収量、外来狂犬病Ｇ遺伝子の発現およびウイルス特異的ＤＮＡ蓄積を調べた。接種した細胞は次のとおりである。
【０１５４】
(a) Vero細胞。アフリカミドリザル腎臓細胞。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ81。
【０１５５】
(b) ＭＲＣ−５細胞。ヒト胎児肺細胞。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ171 。
【０１５６】
(c) ＷＩＳＨ細胞。ヒト羊膜由来。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ25。
【０１５７】
(d) Detroit-532 細胞。ヒト包皮由来。ダウン症候群。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ54。
【０１５８】
(e) 初期ＣＥＦ細胞。
【０１５９】
11日齢白色レグホーン胚由来のニワトリ胚繊維芽細胞を陽性対照として用いた。接種は全て、下記のように予め調製した２×10６  細胞から成る単層に実施した。
【０１６０】
Ａ．ＤＮＡ分析法。
【０１６１】
各細胞系について３ヶの培養皿を用い、被試験ウイルスを５pfu ／細胞で接種し、さらに、各細胞系について１ヶの培養皿を追加し非接種用とした。培養皿の１つについては、40μg/mlのシトシンアラビノシド（Ａｒａ  Ｃ）の存在下に培養を行った。37℃において60分間の吸着期間の後、接種物を除き、単層を２回洗浄して非吸着ウイルスを除去した。次いで、培地（Ａｒａ  Ｃを含有するもの、または含有しないもの）の交換を行った。培養皿の１つ（Ａｒａ  Ｃを含有しないもの）からは、時間ゼロにおける試料として細胞を回収した。残りの皿は、37℃で72時間保持した後、細胞を回収してＤＮＡ蓄積の分析に用いた。２×10６  細胞から成る各試料を40ｍＭのＥＤＴＡを含有する0.5ml のリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）に再懸濁して37℃で５分間保温した。42℃で予め加温し120 ｍＭのＥＤＴＡを含有する等体積の1.5 ％アガロースを細胞懸濁液に添加してゆっくり混合した。該懸濁液をアガロースプラグモールドに移し、少なくとも15分間放置して硬化させた。次いで、アガロースプラグを取り除き、該プラグを完全に覆うような体積の溶解緩衝液（１％のサルコシル、100 μg/mlのプロティナーゼＫ、10ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ7.5 、200ｍＭのＥＤＴＡ）内で50℃において12〜16時間インキュベートした。次に、該溶解緩衝液を5.0ml の無菌0.5 ×ＴＢＥ（44.5ｍＭのトリス−ホウ酸、44.5ｍＭのホウ酸、0.5 ｍＭのＥＤＴＡ）と置換して、ＴＢＥ緩衝液を３回変えながら４℃において６時間平衡化した。パルスフィールド電気泳動装置を用いて細胞ＲＮＡおよびＤＮＡからプラグ内にあるウイルスＤＮＡを分別した。電気泳動は、50〜90秒の傾きで0.5 ×ＴＢＥ内で15℃において、180Ｖで20時間実施した。ラムダＤＮＡを分子量標準としてＤＮＡを泳動させた。電気泳動後、エチジウムブロミドで染色することによりウイルスＤＮＡのバンドを可視化した。次にＤＮＡをニトロセルロース膜に移し、精製ＡＬＶＡＣゲノムＤＮＡから調製した放射ラベル化プローブを用いて分析した。
【０１６２】
Ｂ．ウイルス収量の推定
培養皿への接種は上記と同じように行った。但し、感染多重度は0.1pfu／細胞とした。感染72時間後、凍結および解凍サイクルを３回連続的に実施することにより細胞を溶解した。ＣＥＦ単層上でプラーク滴定を行うことによりウイルス収量を調べた。
【０１６３】
Ｃ．狂犬病Ｇ遺伝子の発現の分析
組換えウイルスまたは親ウイルスを10pfu ／細胞の多重度で培養皿に接種するとともに、追加の皿を非感染ウイルス対照用とした。１時間の吸着期間の後、培地を除去し、無メチオニン培地と置換した。30分後、この培地を、25μCi/ml の３５Ｓ−メチオニンを含有する無メチオニン培地と置換した。感染細胞を一晩かけて（約16時間）ラベル化し、次に、バッファーＡ溶解バッファーを添加することにより溶解した。狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用い既知の手法に従い（Taylor他、1990）、免疫沈降を実施した。
【０１６４】
結果：ウイルス収量の推定
細胞当たり0.1pfuで接種し72時間後に行ったウイルス収量を求める滴定分析の結果を表５に示す。この結果が示すように、トリ細胞においては強い感染が生じ得るが、４種類の非トリ細胞系においてはこの方法ではウイルス収量の増加は検知されない。
【０１６５】
ウイルスＤＮＡの蓄積の分析  ＤＮＡ複製の前または後に非トリ細胞におけるウイルス複製の阻害が生じたか否かということを判定するために、細胞破砕物からのＤＮＡを電気泳動法により分画し、ニトロセルロースに移し、ウイルス特異的ＤＮＡを探査した。非感染ＣＥＦ細胞、時間ゼロにおけるＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞、接種72時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞および接種72時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞（40μg/mlのシトシンアラビノシド存在下）由来のＤＮＡはいずれもある程度のバックグランド活性を示したが、これは、おそらく、放射ラベル化ＡＬＶＡＣ  ＤＮＡプローブの調製に際して混入したＣＥＦ細胞ＤＮＡに因るものと思われる。しかしながら、接種72時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞は、約350kbpの領域にＡＬＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡの蓄積を表す強いバンドを示した。ＤＮＡ合成阻害剤であるシトシンアラビノシドの存在下に培養物をインキュベートしてもそのようなバンドは検出されなかった。Vero細胞で得られた相応する試料については、時間ゼロにおけるＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染Vero細胞において約350kbpにおいて非常に弱いバンドが示された。このレベルは残存ウイルスを表すものであった。接種72時間後にはバンド強さが増加されており、このことは、Vero細胞においてはある程度のレベルのウイルス特異的ＤＮＡ複製が起こったが、ウイルス子孫の増加を生じさせはしなかったということを示唆している。ＭＲＣ−５細胞で得られた相応する試料においては、これらの条件下でウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は検出されなかった。この実験を広げ、追加のヒト細胞系、すなわちＷＩＳＨ細胞およびDetroit-532 細胞についても実施した。ＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞を陽性対照とした。ＡＬＶＡＣ−ＲＧが接種されたＷＩＳＨ細胞およびDetroit 細胞のいずれにおいてもウイルス特異的ＤＮＡ蓄積は検出されなかった。なお、この方法の検出限界は完全には確認されておらず、ウイルスＤＮＡ蓄積は起こっているのかも知れないが、該方法の感度よりも低いレベルであろう。  ３Ｈ−チミジンの取り込みによりウイルスＤＮＡ複製が測定された他の実験は、Vero細胞およびＭＲＣ−５細胞に関して得られた上記の結果を支持している。
【０１６６】
狂犬病遺伝子の発現分析  ウイルス遺伝子、特に挿入された外来遺伝子の発現が、ウイルスＤＮＡ複製の非存在下においてもヒト細胞系で起こっているか否かを判定するために、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させたトリ系細胞および非トリ系細胞由来の３５Ｓ−メチオニンラベル化破砕物について免疫沈降実験を実施した。狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いる免疫沈降実験の結果、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させたＣＥＦ、Vero、ＭＲＣ−５、ＷＩＳＨおよびDetroit の各細胞において67ｋＤａの糖タンパク質から成る特異的免疫沈降が認められた。非感染細胞および親ウイルスを感染させた細胞の破砕物のいずれにおいても、そのような特異的狂犬病遺伝子産物は検出されなかった。
【０１６７】
この実験結果が示唆することは、分析したヒト細胞系においては、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ組換体はＨ６初期／後期ワクシニアウイルスプロモータの転写制限下に感染を開始し外来遺伝子産物を発現させることはできるが、ＤＮＡ複製を介する複製は進行せず、また、検知され得るようなウイルス子孫は産生しなかったということである。Vero細胞においては、ある程度のレベルのＡＬＶＡＣ−ＲＧ特異的ＤＮＡ複製は認められたが、この方法ではウイルス子孫は検出されなかった。これらの結果は、分析したヒト細胞系においてはウイルス複製の阻止はＤＮＡ複製の開始前に起こるが、Vero細胞においてはウイルスＤＮＡ複製の開始後に該阻止が起こることを示している。
【０１６８】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧ内で発現された狂犬病糖タンパク質が免疫原性を有するか否かを判定するために、多くの動物種に該組換体を接種してテストした。現行の狂犬病ワクチンの効力はマウスモデル系で評価されている。そこで、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを用いて同様のテストを行った。感染力価が6.7 から8.4 （log１０ （ＴＣＩＤ５０/ml)）の範囲にある９種類の異なったウイルス調製物（種ウイルスを10回組織培養による継代培養して得られたワクチンバッチ(J) を含む）を連続的に稀釈し、50〜100 μｌの稀釈液を４週齢から６週齢のマウスの足蹠に接種した。14日後に、マウスＬＤ５０（対照用マウスグループにおける致死滴定量から求めた）が15から43の狂犬病ウイルスＣＶＳ株300 μｌを頭蓋内投与してマウスを免疫性テストした。ＰＤ５０（50％防御投与量）として表す効力を免疫性テストから14日目に計算した。実験結果を表６に示す。この結果から、ＡＬＶＡＣ−ＲＧは狂犬病ウイルスの免疫性テストに対して恒常的にマウスを防御することができ、ＰＤ５０値は、3.33から4.56の範囲にあり平均値3.73（ＳＴＤ0.48）であることが示されている。追加実験として、6.0log１０ＴＣＩＤ５０のＡＬＶＡＣ−ＲＧを含有するウイルス50μｌまたは等体積の非感染細胞懸濁液をオスのマウスに頭蓋内接種した。接種から１日、３日および６日目にマウスを殺し、その脳を取り出し、固定化し薄片に切断した。組織病理学検査によれば、マウス内にＡＬＶＡＣ−ＲＧの神経毒性の証拠は認められなかった。
【０１６９】
イヌおよびネコに対するＡＬＶＡＣ−ＲＧの安全性および効力を評価するため、14匹の５ヶ月齢のビーグル犬、ならびに14匹の４ヶ月齢のネコから成るグループの分析を行った。該イヌおよびネコのそれぞれについて４匹にはワクチン接種を行わなかった。該動物の５匹には6.7 log１０ ＴＣＩＤ５０で皮下投与した。動物の採血を行い、抗狂犬病抗体の分析を行った。非投与または6.7log１０ＴＣＩＤ５０のＡＬＶＡＣ−ＲＧを投与した動物に対しては、接種から29日目に、ＮＹＧＳ狂犬病ウイルス免疫性テスト株の3.7log１０（マウスＬＤ５０）（ビーグル犬、側部筋に）または4.3log１０（マウスＬＤ５０）（ネコ、頸部に）を用いて免疫性テストを行った。実験結果を表７に示す。
【０１７０】
ネコおよびイヌのいずれにおいても且ついずれの接種ウイルス投与量においても接種に対する副作用は認められなかった。6.7log１０ＴＣＩＤ５０で免疫された５匹のイヌのうち４匹は、ワクチン接種14日目に抗体力価を示し、29日目には全てのイヌが抗体力価を有した。４匹の対照用イヌのうち３匹を死なせるような免疫性テストに対して全てのイヌが防御された。ネコの場合、6.7log１０ＴＣＩＤ５０で投与された５匹のネコのうち、３匹が14日目に特異的抗体力価を有し、そして、29日目には全てが陽性となったが、平均抗体力価は低く2.9 ＩＵであった。対照用ネコの全てを死なせるような免疫性テストにおいて、５匹のネコのうち３匹が生存した。7.7log１０ＴＣＩＤ５０で免疫したネコは全て14日目に抗体力価を示し、29日目には幾何平均力価は8.1 国際単位（ＩＵ）であった。
【０１７１】
ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ−ＲＧおよび非関連カナリアポックスウイルス組換体の接種に対するリスザル（Saimiri   Sciureus）の免疫応答を試験した。幾つかのグループに分けたリスザルに上述したように接種を行い、血清を分析して狂犬病特異的抗体の有無を調べた。皮内投与に対する軽い典型的な皮膚反応を除いては、いずれのサルにおいても副作用は認められなかった。投与から２日目および４日目だけは、皮内接種後の皮膚外傷部から少量の残留ウイルスを単離した。７日目以降は全ての検体が陰性であった。筋注に対する局部反応は認められなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧが接種された４匹のサルは全て、ＲＦＦＩテストで測定すると、抗狂犬病血清中和抗体を産生していた。最初の接種から約６ヶ月後、全てのサルおよび追加の非接種サル１匹に、左側大腿部の外表面に6.5log１０ＴＣＩＤ５０のＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下経路で再接種した。血清を分析して抗狂犬病抗体の存在を調べた。結果を表８に示す。
【０１７２】
狂犬病ウイルス未感染の５匹のサルのうち４匹は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種７日後に血清学的応答を示した。接種11日後までには５匹のサル全てが検出可能な抗体を有した。予め狂犬病糖タンパク質に感染された４匹のサルについては、ワクチン接種から３日から７日の間に血清中和力価に有意の増加が認められた。この結果から、リスザルにＡＬＶＡＣ−ＲＧをワクチン接種すると副作用は生じず、一次中和抗体応答が誘起され得ることが示された。再接種により既往反応もまた誘導された。ＡＬＶＡＣに、または非関連外来遺伝子を発現するカナリアポックス組換体に予め感染していても、再ワクチン接種に際して、抗狂犬病免疫反応の誘発を妨げない。
【０１７３】
ＨＩＶ−２に関して血清反応陽性のアカゲザルにおいてＡＬＶＡＣ−ＲＧ接種に対する免疫応答を調べた。該動物に上述のように接種を行い、ＲＦＦＩテストにより抗狂犬病血清中和抗体の有無を分析した。表９に結果を示すように、皮下接種されたＨＩＶ−２陽性アカゲザルは、１回の接種から11日目までに抗狂犬病抗体を産生した。最初の接種から約３ヶ月後に与えた追加免疫接種後に既往応答が検出された。該組換体が経口投与された動物には何らの応答も検出されなかった。更に、一連の６匹のアカゲザルに投与量を減少させながらＡＬＶＡＣ−ＲＧを筋肉内または皮下投与した。接種された６匹のうち５匹がワクチン接種から14日目までに応答を示したが抗体力価に有意の差は無かった。
【０１７４】
以前にＨＩＶ感染した２匹のチンパンジーに7.0log１０pfu のＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下または筋肉内接種した。該接種から３ヶ月後に両チンパンジーに同じ方法で再ワクチン接種した。結果を表10に示す。
【０１７５】
筋肉内または皮下接種のいずれにおいても接種に対する副作用は見られなかった。いずれのチンパンジーも初回接種から14日目までに応答し、そして、再接種後に強く上昇している応答が検出された。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【０１７６】
実施例９−狂犬病糖タンパク質を発現するカナリアポックス
（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ；ｖＣＰ６５）を用いるヒトの免疫化
実施例９および図９Ａおよび図９Ｂで記述したようにＡＬＢＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を調製した。スケールアップおよびワクチン生産のため、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）卵由来の初期ＣＥＦにおいてＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を増殖させた。細胞を0.1 の多重度で感染させ、37℃において３日間インキュベートした。
【０１７７】
該感染細胞から成る無血清培地中で超音波破砕することによりワクチンウイルスの懸濁液を得た。次に、細胞破片を遠心分離とろ過により取り除いた。得られた清澄な懸濁液に凍結乾燥安定剤（アミノ酸の混合物）を加え、単一投与用バイアル内に分散させ、凍結乾燥した。凍結乾燥の前に、無血清培地および凍結乾燥剤の混合物に入れたウイルス懸濁液を連続的に10倍稀釈することにより力価が徐々に低下した３種類のバッチを調製した。
【０１７８】
細胞基質、培地およびウイルス種株ならびに最終生成物に対しては、外来物質の探索および実験用げっ歯類動物に対する接種性に特に注意して品質管理試験を行った。望ましくない特徴は見出されなかった。
【０１７９】
前臨床データ  インビトロ試験によれば、ＶＥＲＯ細胞またはＭＲＣ−５細胞はＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の増殖を支持せず、８回の連続継代培養（ＶＥＲＯの場合）および10回の連続継代培養（ＭＲＣの場合）によって、これらの非トリ細胞系において当該ウイルスが検出され得るように増殖適応化されないことが示された。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）が感染または接種されたヒト細胞系（ＭＲＣ−５、ＷＩＳＨ、Detroit-532 、ＨＥＬ、ＨＮＫまたはＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞）の分析では、ウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は認められず、これらの細胞においてはＤＮＡ合成の前に複製の阻害が起こることが示唆された。しかしながら、重要なことは、試験された全ての細胞系での狂犬病ウイルス糖タンパク質の発現から、カナリアポックス複製サイクルにおける不稔過程はウイルスＤＮＡ複製に先行して起こることが示唆されたことである。
【０１８０】
一連の動物実験においてＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の安全性と効力が明らかにされた。多数の動物種、例えばカナリア、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、実験用げっ歯類（マウスの乳獣および成獣）、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、リスザル、アカゲザルおよびチンパンジーに、10５  から10８  pfu の投与量範囲で接種が行われた。各種の投与経路を検討し、最も一般的には皮下、筋肉内および皮下投与であったが、経口（サル類およびマウス）や頭蓋内投与（マウス）も採用した。
【０１８１】
カナリアにおいては、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）は、乱刺部位に「癒着」外傷を引き起こしたが、疾病や死亡の徴候はなかった。ウサギへの皮内接種は典型的なポックスウイルス接種反応を示したが、この反応が拡がることはなく、７日から10日で治癒した。いずれの動物においてもカナリアポックスに因る副作用は無かった。げっ歯類、イヌ、ネコおよび霊長動物にＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ）を接種した後、高速蛍光焦点阻害テスト（ＲＦＦＩＴ）によって測定すると、抗狂犬病抗体が産生していることにより免疫原性があることが明らかにされた。また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）で免疫したマウス、イヌ、およびネコに狂犬病ウイルスを免疫性テストすることにより防御機能が発現することも明らかにされた。
【０１８２】
ボランティア  狂犬病免疫化の前歴のない年齢20〜45才の25人の健康な成人を登録した。病歴調査、身体検査および血液の化学分析を行うことにより、これらのボランティアの健康状態を調べた。妊娠、アレルギー症、あらゆる種類の免疫低下症、慢性的な衰弱症、がん、過去３ヶ月以内の免疫グロブリンの投与、およびヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）またはＢ型肝炎表面抗原に対する血清反応陽性を有する者は排除した。
【０１８３】
試験計画  標準的なヒトジプロイド細胞狂犬病ワクチン（ＨＤＣ）（フランスLyonのPasteur Merieux Serums & Vaccine製）または対象ワクチンＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）のいずれかが投与されるようにボランティアを無作為に振り分けた。
【０１８４】
この試験は投与量（用量）漸増試験とした。３つのバッチ由来の試験対象ワクチンＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を３グループのボランティア（グループＡ，ＢおよびＣ）に２週間間隔で逐次的に使用した。それらの３つのバッチの濃度は、それぞれ、１回の投与当たり、10３．５  、10４．５  および10５．５  ＴＣＩＤ５０（Tissue Culture Infectious Dose : 50 ％組織培養感染量）とした。
【０１８５】
各ボランティアには、２週間間隔で三角筋域に同一のワクチンを２回皮下投与（注射）した。最初の投与時にはボランティアには投与ワクチンの種類を知らせないが、研究者には分かるようにした。
【０１８６】
第２回目の投与時に即時過敏症を可及的に少なくするため、実験対象ワクチンの中間用量が投与されるように割り当てられたグループＢのボランティアには、１時間前に低用量を投与し、また、高用量グループ（グループＣ）のボランティアには１時間間隔で低用量および中間用量を逐次投与した。
【０１８７】
６ヶ月後、最も高用量のＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の被投与者（グループＣ）およびＨＤＣワクチンの被投与者に第３回目のワクチン投与を行った。次に、該被投与者を無作為に分けて以前と同一のワクチンまたは別のもう一方のワクチンを投与した。このようにして、以下の免疫化スケジュールに対応する４つのグループを構成した：１．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＨＤＣ；２．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）；３．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＨＤＣ；４．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）。
【０１８８】
副作用の観察  すべての被験者を投与１時間後に観察し、さらに次の５日間にわたり毎日検査した。次の３週間、局部反応および全身反応について尋ね、１週間に２度、電話により質問した。
【０１８９】
実験室における分析  登録前、ならびに各投与後２日目、４日目および６日目に血液標本を採取した。実施した分析には、血球数、肝臓酵素およびクレアチンキナーゼの分析が含まれていた。
【０１９０】
抗体分析  最初の投与の７日前ならびに実験開始から７日、28日、35日、56日、173 日、187 日および208 日目に抗体分析を行った。
【０１９１】
中和抗体のレベルの測定には、高速蛍光焦点阻害テスト（ＲＦＩＩＴ）（Smith 他、1973）を採用した。カナリアポックス抗体は、直接ＥＬＩＳＡにより測定した。これには、抗原、すなわち、0.1 ％Triton×100 で破砕した精製カナリアポックスウイルスの懸濁液をマイクロプレートに被覆した。血清の固定化稀釈液を室温下で２時間反応させ、ペルオキシダーゼでラベルした抗ヒトＩｇＧヤギ抗体を用いて反応性抗体を出現させた。結果を490nm における吸光度として表した。
【０１９２】
分析  25名を被験者として登録し試験を行った。男性が10名、女性が15名であり、平均年齢は31.9才（21才〜48才）であった。３名を除く全てが、以前に種痘のワクチン接種を受けていた。残りの３名の被験者は瘢痕およびワクチン接種の前歴がなかった。３名の被験者に試験対象ワクチンの低用量のそれぞれ（10３．５  および10４．５  ＴＣＩＤ５０）を投与し、９名の被験者には10５．５  ＴＣＩＤ５０を投与し、さらに10名の被験者にＨＤＣワクチンを投与した。
【０１９３】
安全性（表11）  初回免疫に際して、投与から24時間以内に37.7℃より高い熱を示したのは、ＨＤＣを投与された者の１名（37.8℃）および10５．５  ＴＣＩＤ５０のｖＣＰ６５を投与された者の１名（38℃）であった。ワクチン接種によるその他の全身性反応はいずれの被投与者にも見られなかった。
【０１９４】
皮下接種によるＨＤＣワクチンの被投与者の9/10に、また、10３．５  、10４．５  および10５．５  ＴＣＩＤ５０のｖＣＰ６５被投与者には、それぞれ0/3 、1/3 および9/9 に局部的反応が見られた。
【０１９５】
痛覚が最も一般的な症状であったが、常に軽いものであった。他の局所的症状として発赤および硬化があったが、これらも軽く且つ一過性のものであった。すべての症状は一般に24時間以内におさまり、72時間以上持続することはなかった。
【０１９６】
血球数、肝臓酵素またはクレアチンキナーゼの値に有意の変化はなかった。
【０１９７】
免疫応答：狂犬病に対する中和抗体（表12）  最初の投与から28日後、ＨＤＣ被投与者のすべてが（感染）防御力価（＞0.5IU/ml）を有していた。これに対して、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の被投与者においては、この防御力価に達したのは、グループＡおよびＢ（10３．５  および10４．５  ＴＣＩＤ５０）の被投与者にはなく、またグループＣ（10５．５  ＴＣＩＤ５０）では2/9 のみであった。
【０１９８】
56日目（すなわち、２回目接種（二次接種）から28日目）に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ワクチン被投与者においては、グループＡでは0/3 、グループＢでは2/3 およびグループＣでは9/9 が防御力価を得、また、ＨＤＣ被投与者においては10名の全てにおいて、この防御力価が持続されていた。
【０１９９】
56日目における幾何平均力価は、グループＡ、Ｂ、ＣおよびＨＤＣにおいて、それぞれ、0.05、0.47、4.4 および11.5IU/ml であった。
【０２００】
180 日目には、すべての被験者において狂犬病抗体力価はかなり低下したが、ＨＣＤ被投与者のうち5/10、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）被投与者のうち5/9 においては、最低防御力価0.5IU/ml以上に持続されていた。ＨＣＤグループおよびグループＣにおける幾何平均力価は、それぞれ、0.51および0.45IU/ mlであった。
【０２０１】
カナリアポックスウイルスに対する抗体（表13）  高力価被験者にカナリアとの接触の前歴が無いにも拘わらず、0.22から1.23O.D.の広範囲にわたる前免疫（pre-immune）力価が認められた。前免疫力価とその後の第２回目の投与による力価との差の２倍以上増加した場合に血清変換（seroconversion）が起こったと定義すれば、グループＢの被験者の1/3 、グループＣの被験者の9/9 に血清変換が起こったが、グループＡまたはＨＤＣの被験者には血清変換はなかった。
【０２０２】
追加免疫投与  ６ヶ月後の追加免疫投与（追加接種）時にはワクチンは充分に許容できるものとなった。ＨＤＣ追加免疫被投与者の2/9 、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加免疫被投与者の1/10に発熱が見られた。局部反応は、ＨＤＣ追加免疫被投与者の5/9 、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加免疫被投与者の6/10に認められた。
【０２０３】
観察結果  図11Ａ〜図11Ｄは、狂犬病中和抗体力価（高速蛍光焦点阻害試験、ＲＦＦＩＴによる。単位IU/ml)を示すグラフであり、ボランティアに対するＨＤＣまたはｖＣＰ６５（10５．５  ＴＣＩＤ５０）の追加免疫効果を示している（該ボランティアには以前に同一のワクチンまたはもう一方のワクチンを接種）。ワクチン接種は０日、28日および180 日目に実施した。抗体力価の測定は、０日、７日、28日、35日、56日、173 日、187 日および208 日目に行った。
【０２０４】
図11Ａ〜図11Ｂに示すように、追加免疫投与するとどの免疫スケジュールでも全ての被験者に狂犬病抗体力価の上昇をもたらした。しかしながら、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加免疫は、全体的に、ＨＤＣ追加免疫よりも低い免疫応答を誘発しており、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の順序から成るグループは、他の３つのグループよりも顕著に力価が低くなっていた。同様に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を追加免疫投与すると、以前にＨＤＣワクチンが投与された被験者の3/5 に、また、以前にＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）で免疫化された被験者の全てに、カナリアポックス抗体力価の上昇をもたらした。
【０２０５】
一般的に、ｖＣＰ６５の投与による局所的副作用からウイルスの局所的複製が起こっていることは示されなかった。特に、ワクチン接種後に見られるような外傷はなかった。このように見かけ上はウイルスの複製が無いにも拘わらず、該投与により、カナリアポックスベクターおよび発現された狂犬病糖タンパク質の双方に対する有意量の抗体がボランティアに産生された。
【０２０６】
狂犬病中和抗体の分析は、高速蛍光焦点阻害テスト（ＲＦＦＩＴ）により実施したが、この方法は、マウスにおける血清中和テストと良好に相関性を有することで知られている。10５．５  ＴＣＩＤ５０の被投与者９名のうち５名は、初回投与後の応答レベルが低かった。最も用量（投与量）の高い被投与者全員、また、中間用量の被投与者も３名のうち２名において、２回目の投与後に防御力価を有する狂犬病抗体が得られた。この試験においては、両ワクチンとも、生ワクチンについては、一般的に推奨されているが不活性ＨＤＣワクチンには勧められていない皮下投与により接種した。この投与経路を選択したのは、投入部位（注射部位）を入念に調べることができる点において最良であるからであるが、このために、ＨＤＣ被投与者における抗体の出現が遅くなったことも考えられる：事実、ＨＤＣ被投与者のいずれも７日目には抗体上昇を示さず、一方、ＨＤＣワクチン筋肉内投与する多くの試験においては、被験者の大部分に抗体上昇が認められている（Klietmann 他、国際緑十字（ジュネーブ）、1981；Kuwert他、国際緑十字（ジュネーブ）、1981）。しかしながら、本発明は必ずしも皮下投与に限定されるものではない。
【０２０７】
被験ワクチンにおける狂犬病中和抗体のＧＭＴ（幾何平均力価：geometric mean fiters)は、ＨＤＣ対照ワクチンよりも低かったが、防御に必要な最低力価を充分に上まわるものであった。３種類の投与量を採用した本試験において得られた明瞭な用量依存性応答は、より高い投与量により、より強い応答を誘発される可能性があることを示している。当業者であれば本明細書の開示から、所与の患者に至適な投与量を選択できることは明らかであろう。
【０２０８】
本実施例の他の重要な結果は、抗体応答を増強（ブースト）する能力である。免疫スケジュールの如何に拘わらず６ヶ月目の投与後には全ての被験者に狂犬病抗体力価の上昇が見られており、このことは、カナリアポックスウイルスまたは狂犬病糖タンパク質により誘発された既存の免疫は、当該組換えワクチン候補または従来からのＨＤＣ狂犬病ワクチンによる追加接種に対する阻害作用を有しないということを示している。このことは、ワクシニア組換体をヒトに用いた場合、既存の免疫によって免疫応答が阻害されるという従来の知見（Cooney他，１９９１；Etinger 他）とは対照的である。
【０２０９】
かくして、本実施例が明示するように、非複製性ポックスウイルスはヒトにおいて免疫化ベクターとして機能することができ、その際、複製性の作用物質が免疫応答に与えるような全ての利点を有しながら、完全に許容性のウイルスが引き起こすような安全上の問題はない。そして、本実施例および他の実施例の教示から、狂犬病ウイルスまたはその他のコードもしくは発現産物を含有する組換体を投与または免疫接種するに際して、至適な投与量（用量）または投与方式や投与経路を選択することは、インビトロ発現法とともに当業者には明らかであろう。
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【０２１０】
実施例10−ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣと各種のワクシニアウイルス株
とのＬＤ５０の比較                                      
マウス  異系交配したオスのスイス・ウェブスター（Swiss Webster)マウスをTaconic Farms （米国ニューヨーク州Germantown）から購入し、３週齢（「標準」マウス）になって使用に供されるまで、マウス飼料と水を任意に（ad  libitum)に与えて飼育した。異系交配したオスとメスのスイス・ウェブスター新生マウスはTaconic Faums によって実施された計画妊娠に従って入手した。使用された新生マウスは全て出産から２日以内に引き渡されたものである。
【０２１１】
ウイルス  ＡＬＶＡＣは、カナリアポックスウイルスの集団をプラーク精製し、初期ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）内で調製されたものである。ショ糖密度勾配遠心法により精製した後、ＣＥＦ細胞内のＡＬＶＡＣのプラーク形成単位を測定した。ワクシニアウイルスのＷＲ（Ｌ）変異株はＷＲの大プラーク表現型を選択することによって得られたものである（Panicali他、1981）。ワクシニアウイルスのWyeth ワクチン株（New York State Board of Health）はPharmaceuticals Calf Lymph Type vaccine Dryvaxから管理番号302001B として入手したものである。ワクシニアウイルスのCopenhagen株ＶＣ−２はフランスのInstitut Merieuxから入手した。ワクシニアウイルスのＮＹＶＡＣ株はCopenhagen株ＶＣ−２から誘導されたものである。Wyeth株をのぞき、これらの株は全て、アフリカミドリザルの腎臓由来のVero細胞で培養し、ショ糖密度勾配遠心法により精製し、そしてVero細胞上のプラーク形成単位を測定した。Wyeth 株はＣＥＦ細胞内で増殖し、ＣＥＦ細胞内のプラーク形成単位を測定した。
【０２１２】
接種  各グループ10匹から成る標準マウスにウイルス稀釈液の１つ0.05mlを頭蓋内（ic）接種した。ウイルス稀釈液は保存ウイルス液を連続的に10倍稀釈することによって調製した。場合によっては、滅菌リン酸緩衝食塩水中の保存ウイルス液を稀釈せずに接種した。
【０２１３】
各グループ10匹から成る新生マウス（１日齢または２日齢）にも標準マウスと同様にic接種した。但し、接種量は0.03mlとして使用した。
【０２１４】
すべてのマウスについて、毎日、接種から14日間（新生マウスの場合）または21日間（標準マウスの場合）にわたって死亡率を観察した。接種の翌朝に死亡したマウスは、トラウマによる死亡の可能性があるので排除した。
【０２１５】
被験個体数の50％を死亡させるのに要する致死量（ＬＤ５０）は、ReedおよびMuenchの比例法に従って求めた。
【０２１６】
若い異系交配標準マウスにおけるic経路によるＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣと各種のワクシニアウイルス株とのＬＤ５０の比較  若い標準マウスにおいては、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの毒性は、試験した他のワクシニアウイルス株よりも数桁低かった（表14）。ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣは、Wyeth 株よりも3,000 倍以上平常マウスにおける毒性が低く；親株であるＶＣ−２株よりも12,500倍以上毒性が低く；そして、ＷＲ（Ｌ）変異株よりも63,000,000倍以上毒性が低いことが見出された。これらの結果から、ＮＹＶＡＣは他のワクシニアウイルスよりも高度に弱毒化されており、また、ＡＬＶＡＣは頭蓋内投与された場合、若いマウスには一般に非毒性性であると考えられる。但し、両者ともきわめて高投与量の場合（ＡＬＶＡＣを3.85×10８  PFU 、ＮＹＶＡＣを３×10８  PFU ）、未だ不明の機序により、この投与経路によりマウスの死亡をもたらすことがある。
【０２１７】
異系交配新生マウスにおけるic投与によるＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣと各種のワクシニア株とのＬＤ５０の比較  標準新生マウスにおける５種類のポックスウイルス株の相対的毒性を頭蓋内（ic）免疫性テストモデル系における滴定によって調べた（表15）。終点としての死亡と共に、ＬＤ５０の値が示したところによれば、ＡＬＶＡＣは、ワクシニアウイルスのWyeth 株よりも100,000 倍以上毒性が低く；ワクシニアウイルスのCopenhagenＶＣ−２株よりも200,000 倍以上毒性が低く；そして、ワクシニアウイルスのＷＲ（Ｌ）変異株よりも25,000,000倍以上毒性が低い。但し、試験した最高投与量（6.3 ×10７  PFU ）においては、100 ％死亡率となった。6.3 ×10６  PFU では33.3％の死亡率が認められた。最高投与量グループ（約6.3 ＬＤ５０）の平均生存時間（ＭＳＴ）が6.7 ±1.5 日であることから、死因は（未だはっきりしないが）おそらく毒性または外傷性によるものではないであろう。免疫性テスト投与量５ＬＤ５０におけるＷＲ（Ｌ）のＭＳＴは４．８±０．６日であったが、それと比較すると、ＡＬＶＡＣが免疫性テストされたマウスのＭＳＴは有意に長いものであった（Ｐ＝0.001)。
【０２１８】
ＮＹＶＡＣと比較すると、Wyeth は15,000倍以上毒性が高く；ＶＣ−２は35,000倍以上毒性が高く；そして、ＷＲ（Ｌ）は3,000,000 倍以上毒性が高いことが見出された。ＡＬＶＡＣの場合と同様に、ＮＹＶＡＣの投与量が高くなる（６×10８  PFU および６×10７  PFU ）と、100 ％死亡率となった。しかしながら、そのような最高用量（380 ＬＤ５０に相応）で免疫性テストされたマウスのＭＳＴは僅か２日（２日目に９匹死亡、４日目に１匹死亡）であった。これに対して、最高用量（500 ＬＤ５０に等しい）のＷＲ（Ｌ）で免疫性テストされたマウスは全て４日目まで生存した。
【表１４】
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【表１５】
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【０２１９】
実施例11−ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）およびＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）
の評価                                                      
免疫沈降  トリ細胞または非トリ細胞の予め形成した単層に、親ウイルスであるＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）ウイルスまたはＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）ウイルスを10pfu ／細胞接種した。この接種は２％の透析したウシ胎児血清を添加した無メチオニンＥＭＥＭ内に行った。１時間インキュベートした後、接種物を除き、培地を20μCi/ml の３５Ｓ−メチオニンを含有するＥＭＥＭ（無メチオニン）と置換した。一晩、約16時間インキュベートした後、緩衝液Ａ（１％のNonidet P-40、10mMトリス（ｐＨ7.4)、150mM のＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、0.01％のアジ化ナトリウム、アプロチニン500 単位／ml、および0.02％のフェニル・メチル・スルホニル・フルオリド）を添加して細胞を溶解した。免疫沈降には、狂犬病糖タンパク質特異的モノクローナル抗体24−3F10（入手先：米国ニューヨーク州AlbanyのGriffith Laboratories, New York State Department of HealthのC. Trinarchi博士）およびラットの抗マウスコンジュゲート（入手先：Boehringer Mannheim Corporation,カタログ番号605-500)を使用した。支持マトリックスとしてプロテインＡセファロースＣＬ−４８（入手先：米国ニュージャージー州PiscatawayのPharmacia LKB Biotechnology 社）を用いた。10％ポリアクリルアミドゲル上で免疫沈降物を分画した(Dreyfuss 他、1984）。ゲルを固定化し、蛍光写真に供するため１Ｍのサリチル酸ナトリウム塩で１時間処理し、Kodak のＸＡＲ−２フィルムに露光して免疫沈降したタンパク質種を現像した。
【０２２０】
動物源  ニュージーランド（New zealand)白色ウサギをHare-Marland（米国ニュージャージー州Hewitt）から入手した。３週齢のオスの異系交配スイス・ウェブスター（Swiss Webster)マウス、計画妊娠しているメスの異系交配スイス・ウェブスターマウス、および４週齢のスイス・ウェブスターヌードマウス（ｎｕ＋  ｎｕ＋  ) をTaconic Farms 社（米国ニューヨーク州Germantown）から入手した。これらの動物は全てＮＩＨのガイドラインに従って飼育した。動物のプロトコールは全てＩＡＣＵＣによって承認されたものである。必要と考えられた場合には、明らかに致命的な疾病を有しているマウスは安楽死させた。
【０２２１】
ウサギにおける外傷評価  ２匹のウサギのそれぞれに、10４  、 10５  、 10６  、 10７  もしくは10８  pfu の各被験ウイルスを含有するＰＢＳまたはＰＢＳのみを0.1ml 複数部位に皮内接種した。４日目から外傷が消散するまでウサギを毎日観察した。硬化および潰瘍形成を測定し記録した。
【０２２２】
接種部位からのウイルス回収  １匹のウサギに、10６  、 10７  もしくは10８  pfu の各試験ウイルスを含有するＰＢＳまたはＰＢＳのみの0.1ml を複数の部位に皮内接種した。11日目に、ウサギを安楽死させ、各接種部位から採取した皮膚のバイオプシー標本を機械的破砕および間接音波処理により無菌的に調製してウイルスを回収した。ＣＥＦ単層上のプラーク滴定により感染ウイルスを分析した。
【０２２３】
マウス内の毒性  各グループ10匹から成るマウス、または５匹から成るヌードマウスに、0.5ml の無菌ＰＢＳに溶かしたウイルスのいくつかの稀釈液の１つをip接種した。実施例11も参照。
【０２２４】
シクロホスホアミド（ＣＹ）処理  −２日目に４mg（0.02ml）のＣＹ（ＳＩＧＭＡ製）をマウスにip注入した後、０日目にウイルス注入を行った。ウイルス注入後、次のようにマウスにＣＹをip注入した：１日目に４mg；４日、７日および11日目に２mg；14日、18日、21日、25日および28日目に３mg。Coulter 計数装置を用い11日目に白血球を計数することにより免疫抑制を間接観察した。平均白血球数は、非処理マウス（ｎ＝４）については13,500白血球／μｌ、また、ＣＹ処理した対照マウスについては4,220 白血球／μｌであった（ｎ＝５）。
【０２２５】
ＬＤ５０の計算  ReedおよびMuenchによる比例法（ReedおよびMuench, 1938）により、50％死亡率をもたらすのに要する致死量（ＬＤ５０）を求めた。
【０２２６】
マウスにおけるＮＹＶＡＣ−ＲＧの効力試験  ４週齢から６週齢のマウスの足蹠に、ＶＶ−ＲＧ（Kieny 他、1984）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（Taylor他、1991b)、またはＮＹＶＡＣ−ＲＧのいずれかの一定範囲稀釈液（50％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）として2.8 〜8.0log １０)の50〜100 μｌを接種した。各グループは８匹のマウスから構成した。ワクチン接種後14日目において、狂犬病ウイルスＣＶＳ株（0.03ml）の15ＬＤ５０を頭蓋内接種することによりマウスへの免疫性テストを行った。28日目に生存マウスを数え、50％防御投与量（ＰＤ５０）を求めた。
【０２２７】
ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）の誘導  ワクシニアウイルスのＮＹＶＡＣ株は、Copenhagenワクチン株をプラーククローニングして得られたＶＣ−２から調製されたものである。ＶＣ−２からＮＹＶＡＣを調製するためには、本明細書において既述したような一連の操作を行って、18ヶのワクシニアのＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）（毒性に関連する多数のウイルスの機能を含む）を正確に欠失させた。これらの欠失を行うに当たっては、非所望の新規なオープンリーディングフレームが出現しないように設計した。図10は、ＮＹＶＡＣを調製するのに欠失させたＯＲＦを図示する。図10の上部には、ワクシニアウイルスゲノム（ＶＣ−２プラーク単離体、Copenhagen株）のＨｉｎｄIII 制限マップを示す。ＮＹＶＡＣを調製するのに逐次欠失させたＶＣ−２の６つの領域を拡大して示している。これらの欠失については本明細書において既述した（実施例１から実施例６）。そのような欠失位置の下に、該位置から欠失させたＯＲＦを、その遺伝子産物の機能ないしはホモロジーおよび分子量とともに掲記している。
【０２２８】
ヒト組織細胞系におけるＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの複製試験  ヒト由来の細胞におけるワクシニアウイルスのＮＹＶＡＣ株（ｖＰ８６６）の複製レベルを調べるため、液体培養条件下、導入多重度0.1pfu／細胞で６種類の細胞系に接種し、72時間インキュベートした。親株のCopenhagenクローン（ＶＣ−２）の接種も併せて行った。初期ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）（10〜11日齢のＳＰＦ起源の胚卵。米国コネチカット州StorrsのSpafas社製）を使用して全てのウイルスに対する許容細胞基質とした。２つの基準、すなわち、産生的なウイルス複製が生じているかということ、および、外来抗原が発現しているかということに基づいて培養物の分析を行った。
【０２２９】
ヒト由来のいろいろな細胞におけるＮＹＶＡＣの複製能を表16に示す。ＶＣ−２およびＮＹＶＡＣのいずれもＣＥＦ細胞内で複製する能力を有するが、ＮＹＶＡＣの方が幾分収量（産生量）が低い。ＶＣ−２も、ＥＢＶ形質転換リンパ球芽細胞系ＪＴ−１（エプステインバーウイルスで形質転換されたヒトリンパ球芽細胞系。Rickinson 他(1984)を参照）を除き、試験した６種類のヒト由来細胞系で産生的複製能力を有している。これに対して、ＮＹＶＡＣは、試験したヒト由来細胞系のいずれにおいてもその複製能力が高度に減弱されている。ＮＹＶＡＣを感染させたＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ171 、ヒト胎児肺由来）、ＤＥＴＲＯＩＴ５３２（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ54。ヒト包皮、ダウン症候群）、ＨＥＬ２９９（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ137 、ヒト胎児肺細胞）、およびＨＮＫ（ヒト新生児腎臓細胞。米国メリーランド州Wakersville のWhittiker Bioproducts 社製、カタログ＃70-151）細胞から、残存ウイルスレベルを超える感染ウイルスの僅かな増加が見られている。これらの細胞系における複製は、ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞または親株のＶＣ−２から得られたウイルス収量（産生量）に比較すると有意に減少していた（表16）。注目すべきことには、ＮＹＶＡＣおよびＶＣ−２のいずれについても、24時間におけるウイルス収量は72時間の収量に等しい。したがって、該ヒト由来細胞系培養物を更に48時間（ウイルス生成サイクルの２回分）培養させると、相対的なウイルス収量を上昇させたかも知れない。
【０２３０】
上記のヒト由来細胞系においては、ウイルス収量が低かったことに一致して、ＭＲＣ−５およびＤＥＴＲＯＩＴ５３２においてもＮＹＶＡＣ特異的ＤＮＡの複製は、検出可能ではあったが、そのレベルは低かった。ＮＹＶＡＣを感染させたＭＲＣ−５およびＤＥＴＲＯＩＴ５３２細胞系におけるＤＮＡ複製レベルは、ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞で見出されたレベルと比較すると、ウイルス収量において近似していた。その他のヒト由来細胞のいずれにおいてもＮＹＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ複製は見出されなかった。
【０２３１】
トリポックスウイルスであるＡＬＶＡＣを用いても同様の実験を行った。このウイルス複製の結果も表16に示す。いずれのヒト細胞系においても子孫ウイルス（子ウイルス）は検出されず、カナリアポックスウイルスの宿主範囲によりトリ種に制限されていることに相反しない。さらに、いずれのヒト由来細胞系においてもＡＬＶＡＣ特異的なＤＮＡ蓄積は検出されなかったという事実も、それらのヒト由来細胞のおいてＡＬＶＡＣの産生的複製が起こらないということに矛盾していない。
【０２３２】
ヒト細胞におけるＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）による狂犬病糖タンパク質の発現  産生的ウイルス複製が実質的に起こらない場合においても外来遺伝子の効率的な発現が得られるかということを判定するために、上記と同じ細胞系に、３５Ｓ−メチオニンの存在下に、狂犬病ウイルス糖タンパク質発現性のＮＹＶＡＣ組換体（ｖＰ８７９、実施例７）を接種した。該狂犬病糖タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用い、放射ラベルした培養破砕物から狂犬病糖タンパク質を免疫沈降させた。６７ｋＤａのタンパク質の免疫沈降物が得られたが、これは狂犬病糖タンパク質が完全にグリコシル化された形態に一致する。非感染細胞破砕物または親のＮＹＶＡＣが感染した細胞破砕物において血清学的に交差性の生成物は検出されなかった。分析した他の細胞においても同様の結果が得られた。
【０２３３】
ウサギ皮膚への接種  ワクシニアウイルス株の病原性の尺度として、皮内（id）接種後のウサギの皮膚外傷およびその特徴が利用されている（Buller他、1988；Child 他、1990；Fenner他、1958；Flexner 他、1987；Ghendon およびChernos 1964）。そこで、ワクシニア株ＷＲ（ＣＶ−１細胞ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ70でプラーク精製したＡＴＣＣ＃ＶＲ119 からのＬ変異体と命名されたプラーク単離体から、Panicali他(1981)の記述に従って選択されたＡＴＣＣ＃ＶＲ2035。）、ＷＹＥＴＨ（ＡＴＣＣ＃ＶＲ325 。米国ペンシルバニア州MariettaのWyeth Laboratories社からＤＲＹＶＡＣとして市販）、COPENHAGEN（ＶＣ−２）およびＮＹＶＡＣを２匹のウサギ（Ａ０６９およびＡ１２８）にid接種した場合の外傷の特徴を調べた。これらの２匹のウサギはウイルスに対する全体的な感度が異なっており、ウサギＡ１２８の方がウサギＡ０６９よりも応答性が低かった。ウサギＡ１２８においては外傷は比較的軽くて、接種後27日目までに消散した。ウサギＡ０６９においては、外傷程度は強く（特にＷＲ接種部位）、49日経過後ようやく消散した。また、外傷の強さは、リンパ液排出網状組織に対する接種部位の相対的な位置に依存していた。特に脊椎上に位置する部位の外傷が強く、脾腹にある外傷が消散するのに長い時間を要した。４日目から最後の外傷が消えるまで全ての外傷を毎日調べ、外傷の最大サイズの平均値および消散までの日を求めた（表17）。対照であるＰＢＳの注入部位には局部反応は見られなかった。ＷＲ、ＶＣ−２およびＷＹＥＴＨワクシニアウイルス株の注入部位には潰瘍性外傷が見られた。重要なことは、ＮＹＶＡＣの接種部位には硬化または潰瘍性外傷が観察されなかったということである。
【０２３４】
接種部位における感染性ウイルスの残存  接種部位における各ウイルスの相対的な残存性を調べるため、10６  、 10７  、または10８  pfu のＶＣ−２、ＷＲ、ＷＹＥＴＨまたはＮＹＶＡＣを含有する0.1ml のＰＢＳをウサギの複数部位に皮内接種した。各ウイルスについて、10７  pfu を脊椎上に投与し、その両側に10６  および10８  を投与した。接種部位を11日間にわたって毎日観察した。ＷＲが最も強い反応を誘導し、次いで、ＶＣ−２およびＷＹＥＴＨとなった（表18）。潰瘍が最初に見出されたのは、ＷＲおよびＷＹＥＴＨについては９日目、ＶＣ−２については10日目であった。ＮＹＶＡＣまたは対照用ＰＢＳが接種された部位は硬化または潰瘍形成を示さなかった。接種後11日目に、接種部位から皮膚試料を切除し、機械的に破砕し、ＣＥＦ細胞上でウイルスを滴定した。結果を表18に示す。いずれの場合においても、この時点では投与量よりも多量のウイルスは回収されなかった。ワクシニア株ＷＲの回収量は、ウイルス投与量とは無関係に約10６  pfu であった。ワクシニア株ＷＹＥＴＨおよびＶＣ−２の回収量は投与量と関係なく10３  から10４  pfu であった。ＮＹＶＡＣを接種した部位からは感染性ウイルスは回収されなかった。
【０２３５】
遺伝的または化学的に免疫不全性のマウスへの接種  ヌードマウスに高投与量のＮＹＶＡＣ（５×10８  pfu ）またはＡＬＶＡＣ（10９  pfu ）を腹腔内投与したが、10日間の観察期間を通じ、死亡、外傷および明らかな疾病を引き起こすことはなかった。これに対して、ＷＲ（10３  から10４  pfu ）、ＷＹＥＴＨ（５×10７  または10８  pfu ）またはＶＣ−２（10４  から10９  pfu ）を接種されたマウスは、先ず趾部に、次いで尾部にポックスウイルスに典型的な播種性外傷を示し、その後、幾つかのマウスにおいては深刻な睾丸炎が見られた。ＷＲまたはＷＹＥＴＨを感染させたマウスは播種性外傷が出現すると、一般的に、最終的には死亡したが、ＶＣ−２を感染させたマウスは多くの場合、最終的には回復した。ＬＤ５０計算値を表19に示す。
【０２３６】
さらに詳述すると、ＶＣ−２を接種されたマウスは先ず趾部に、そして、それより１〜２日後には尾部に外傷（赤色丘疹）を示す。これらの外傷は、高投与量（10９  、10８  、10７  および10６  pfu ）を投与されたマウスについては接種後から11〜13日目、10５  pfu を投与されたマウスにおいては接種後16日目、また、10４  pfu を投与されたマウスにおいては接種後21日目に出現した。10３  および10２  を投与されたマウスにおいては100 日間の観察期間中外傷は見出されなかった。10９  および10８  pfu を投与されたマウスにおいては接種後23日目に、また、他のグループのマウス（10７  から10４  pfu ）においては、それより約７日後に睾丸炎が認められた。睾丸炎は10９  および10８  投与グループにおいて特に強く、次第に後退してはゆくが、100 日間の観察期間の終わりまで認められた。数匹のマウスの皮膚には、接種後30〜35日目に幾つかのポックス性の外傷が認められた。これらのポックス外傷の多くは、一般に接種後60〜90日目に治癒した。10９  pfu を接種されたグループのマウスのうち１匹のみが死亡し（接種後34日）、また、10８  pfu を投与されたグループのマウスの１匹が死亡（接種後94日）した。ＶＣ−２が接種されたマウスにその他の死亡は見られなかった。
【０２３７】
10４  pfu のＷＲワクシア株を接種されたマウスは、接種後17日目にポックス性外傷を示し始めた。これらの外傷は、ＶＣ−２接種マウスに見られた外傷と同じであった（趾部、尾部の腫脹）。10３  pfu のＷＲ株を接種されたマウスでは接種後34日目まで外傷は出現しなかった。睾丸炎が認められたのは高用量のＷＲ（10４  pfu ）が接種されたマウスのみであった。観察期間の後期に口の周りに外傷が現れマウスは食餌を止めた。10４  pfu のＷＲを接種したマウスは全て、接種後21日から31日目に死亡するか、必要に応じて安楽死させた。10３  pfu のＷＲを投与した５匹のうち４匹は、接種後35日から57日目に死亡するか、必要と考えられた場合は安楽死させた。低投与量のＷＲ（１から100pfu）が接種されたマウスには死亡は認められなかった。
【０２３８】
高投与量（５×10７  および５×10８  pfu ）のワクシニアＷＹＥＴＨ株を投与したマウスは、趾部および尾部に外傷を示し、睾丸炎が発生し、そして死亡した。５×10６  pfu またはそれ以下のＷＹＥＴＨを投与したマウスは疾病や外傷の症状を示さなかった。
【０２３９】
表19に示すように、ＣＹ処理されたマウスは、ポックスウイルスの毒性を分析するのにヌードマウスの場合よりも高感度のモデル系を与える。ＷＲ、ＷＹＥＴＨ、およびＶＣ−２に関するＬＤ５０値は、このモデル系においてはヌードマウスモデルの場合よりも有意に低くなっていた。さらに、ＷＹＥＴＨ、ＷＲおよびＶＣ−Ｒワクシニアウイルスをマウスに投与した場合、以下に記すように、各ウイルスをさらに高い用量で投与することにより外傷が出現し、この結果、外傷の形成がさらに迅速になっている。ヌードマウスにおいて見られたように、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを注入されたＣＹ処理マウスは外傷を示さなかった。しかしながら、ヌードマウスの場合とは異なり、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを用いて免疫性テストされたＣＹ処理マウスにおいては、投与量とは無関係に、死亡が見られたものもあった。これらの無作為の出来事が死因と関係しているかも知れない。
【０２４０】
ＷＹＥＴＨが投与されたマウスはいずれの投与量においても（9.5 ×10４  から9.5 ×10８  pfu ）、接種後７日目から15日目の間に尾部および／または趾部にポックス性外傷を示した。さらに、尾部および趾部は腫脹した。尾部での外傷の出現は、ポックス性外傷の典型的なものであり、丘疹の形成、潰瘍形成、そして最後には痂皮の形成を伴う。ＶＣ−２が投与されたマウスも、すべての投与量において（1.65×10５  から1.65×10９  pfu ）、ＷＹＥＴＨ投与マウスの場合に類似した尾部および／または趾部にポックス性外傷を示した。これらの外傷は、接種後７−１２日の間に観察された。これより低用量のＷＲウイルスを投与したマウスには外傷は見られなかったが、これらのグループで死亡は生じた。
【０２４１】
ＮＹＶＡＣ−ＲＧの効力試験  ワクシニアウイルスのCOPENHAGEN株を弱毒化すすることにより、それから得られるＮＹＶＡＣ株のベクターとしての有用性を実質的に変化させていないことを明らかにするため、比較効力試験を行った。該ウイルスを弱毒化するのに行われた一連の遺伝子操作中の該ベクターの免疫原性能を調べるため、リポーター外来抗原として狂犬病ウイルスの糖タンパク質を利用した。該狂犬病糖タンパク質を発現するベクターの感染防御効力の評価は狂犬病に関する標準的なＮＩＨマウス効力試験によった（Seligmann 、1973）。表20に示しているように、高度に弱毒化したＮＹＶＡＣベクターについて得られるＰＤ５０値は、ｔｋ遺伝子座に狂犬病遺伝子を含有するCOPENHAGEN由来組換体を用いて得られた値（Kieny 他、1984）と同じであり、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（トリ種に複製が制限されているカナリアポックス由来ベクター）について得られたＰＤ５０に近似している。
【０２４２】
考察  よく知られた毒性遺伝子が欠失され且つ限定されたインビトロ増殖特性を有するＮＹＶＡＣを動物モデル系で分析して、その弱毒化特性を調べた。これらの試験に当たって、神経毒性のあるワクシニアウイルスの実験室株、ＷＲ、２種類のワクシニアウイルスワクチン株、ＷＹＥＴＨ（New York City Board of Health)およびCOPENHAGEN株（ＶＣ−２）、さらには、カナリアポックスウイルス株であるＡＬＶＡＣとの比較を行った（実施例11も参照）。さらに、これらのウイルスについてマウス免疫性テストモデルおよびウサギ皮膚モデルにおける相対的な病原性の可能性のスペクトルが調べられた。すなわち、ＷＲが最も毒性の高い株であり、ＷＹＥＴＨおよびCOPENHAGEN（ＶＣ−２）は弱毒化ワクチン株として既に利用されているような立証された特徴を有し、そして、ＡＬＶＡＣは複製がトリ種に制限されるようなポックスウイルスの１例であることが理解された。これらのインビボ分析は、ワクシニアウイルス株ＷＲ、ＷＹＥＴＨおよびCOPENHAGEN（ＶＣ−２）に比べるとＮＹＶＡＣが高度に弱毒化された特性を有するものであることを明示している（実施例14〜20）。重要なことは、ＮＹＶＡＣにおけるＬＤ５０値は、トリ宿主制限トリポックスウイルスであるＡＬＶＡＣにおいて見出された値に匹敵したということである。ＮＹＶＡＣに因る死亡は、ＡＬＶＡＣと同様に、きわめて高用量のウイルスが頭蓋投与された場合のみ見出された（実施例11、表14、15、19）。この死亡が多量のタンパク質を接種した非特異性に因るものであるか否かは未だ明らかでない。免疫無防備状態マウスモデル（ヌードマウスおよびＣＹ処理マウス）における分析からも、ＷＲ、ＷＹＥＴＨおよびCOPENHAGEN株に比べてＮＹＶＡＣが高度に弱毒化された特徴を有することが明らかにされた（表１７および１８）。重要なことは、ＮＹＶＡＣ接種動物またはＡＬＶＡＣ接種モデルにおいては、観察期間を通して、ワクシニア感染の播種やワクシニア性疾病の形跡が見出されなかったということである。ＮＹＶＡＣにおいて複数の毒性関連遺伝子を欠失させると、病原性に関する相乗効果が示された。ＮＹＶＡＣの接種特性を知る別の手段としてウサギ皮膚への皮内投与を行った（表17および18）。非トリ種において複製能力を有しないウイルスであるＡＬＶＡＣに関する結果を考察すると、接種部位における複製能力のみが反応性に相関しているのではない。ＡＬＶＡＣの皮内接種は投与量に依存して硬化域をもたらしたからである。すなわち、ウイルスの複製能力以外の因子が外傷の形成に寄与しているものと推測される。ＮＹＶＡＣにおいて毒性に関連する特定の遺伝子を欠失させると外傷の発生が防止される。
【０２４３】
さらに、本実施例および既述の実施例（実施例１０を含む）の結果から、ＷＲ、ならびに既に利用されているワクシニアウイルスワクチン株であるＷＹＥＴＨおよびCOPENHAGENに比べてＮＹＶＡＣが高度に弱毒化された特性を有することが明らかである。事実、試験した動物モデル系におけるＮＹＶＡＣの病原性プロフィルは、トリ種においてのみ産生的複製を行うことで知られたポックスウイルスであるＡＬＶＡＣのプロフィルに類似していた。ＮＹＶＡＣの産生的複製能がヒト（表16）およびその他の動物（マウス、ブタ、イヌおよびウマを含む）由来の細胞において見かけ上制限されていることが重要な障壁となって、ワクチン接種されたヒトの中で播種する可能性の低いベクターを提供できることに加えて、ワクチン接種者内部または一般的な環境への伝染を制限したり防止することになる。
【０２４４】
重要なことは、ＮＹＶＡＣ系ワクチンが効力を有することが示されたことである。各種の病原体由来の外来遺伝子産物を発現するＮＹＶＡＣ組換体は、霊長類を含む幾つかの動物種において該外来遺伝子産物に対する免疫応答を引き起こした。特に、狂犬病糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣを基礎とする組換体は致死的な狂犬病ウイルスの免疫性テストに対してマウスを防御する能力を有した。該ＮＹＶＡＣ由来狂犬病糖タンパク質組換体の効力は、ｔｋ遺伝子座に狂犬病糖タンパク質を含有するCOPENHAGEN由来組み換え体のＰＤ５０に匹敵するものであった（表20）。また、ＮＹＶＡＣを基礎とする組換体は、ウサギにおいて麻疹ウイルス中和抗体を誘起し、ブタにおける擬狂犬病ウイルスおよび日本脳炎ウイルスの免疫性テストに対して防御機能を有した。高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣ株は、ヒト、動物、医学および獣医学の分野での利用において安全であるという利点を有する（Tartaglia 他、1992）。さらに、一般の実験的発現ベクター系としてＮＹＶＡＣを使用すれば、ワクシニアウイルスに関連する生物学的危険性（ハザード）が激減する。
【０２４５】
本実施例およびその他の実施例（実施例10を含む）の結果が示すように、次のような基準によりＮＹＶＡＣが高度に弱毒化されたものであることを明らかにした：ａ）接種部位に硬化または潰瘍化が検出されないこと（ウサギ皮膚）；ｂ）皮内接種部位から感染ウイルスが迅速に存在しなくなること（ウサギ皮膚）；ｃ）睾丸炎症がないこと（ヌードマウス）；ｄ）毒性が激減していること（３週齢マウスおよび新生マウスの両方における頭蓋内免疫性テスト）；ｅ）免疫不全被験体において病原性が激減しており播種しないこと（ヌードおよびシクロホスホアミド処理マウス）；およびｆ）各種のヒト組織培養細胞において複製能が著しく減少していること。そして、高度に弱毒化されているのにも拘わらず、ＮＹＶＡＣは、ベクターとして、外来抗原に対する強力な免疫応答を保有している。
【表１６】
2007082551.tif 000017
【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【０２４６】
実施例１２  ＲＨＤＶキャプシドを発現するＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの生成
細胞系統およびウイルス株                                    
ＮＹＶＡＣ組換体ｖＰ１２４９およびカナリアポックスウイルス組換体ｖＣＰ３０９の生成に用いられたレスキューウイルスは、それぞれＮＹＶＡＣウイルスｖＰ８６６（Ｔａｒｔａｇｌｉａ  他  １９９２）およびカナリアポックスＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）（Ｔａｙｌｏｒ  他  １９９１）であった。ＲＨＤＶ（Ｓａ  ｎｅ  ｅｔ  Ｌｏｉｒｅ単離体）を、フランスにおいて感染したウサギより得た。ウイルスを増殖させ、力価はＶｅｒｏまたはＣＥＦ細胞炭層の何れかにおいて測定した。
【０２４７】
ウイルス増殖およびＲＮＡ調製
ＲＨＤＶ（Ｓａ  ｎｅ  ｅｔ  Ｌｏｉｒｅ単離体）はウサギにおいて、濾過された肝臓ホモジネートの筋内注入後に増殖させた。ＲＨＤＶ感染により死亡した動物由来の肝臓は−７０℃で凍結させた。全ＲＮＡ調製を、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｈｉ（１９８７）の方法に基づく手順を用いて行った。この報告に記載されている全ての酵素は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｇｍｂｈ（Ｇｅｒｍａｎｙ）より購入した。
【０２４８】
簡潔には、２．０ｇの感染ウサギ肝臓組織を、乳棒およびモーターを用いて液体窒素の存在下で破砕し、続いて０．１ｍｌ酢酸ナトリウム（２Ｍ、ｐＨ４．０）、１．０ｍｌＨ２  Ｏ飽和フェノール、および０．２ｍｌクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）により連続的に抽出した。最終エマルジョンを強力に混合し、１５分間氷上に放置した後、１３ｋｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離した。核酸を、イソプロパノールの添加および１３ｋｒｐｍで、２０分間、４℃で遠心分離することにより得た。沈殿を、６５℃で５分間、２０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび０．３７％サルコシルおよび使用される当日に調製された０．５Ｍ  ２−メルカプトエタノールを含む、０．２ｍｌの３Ｍグアニジンチオシアネート溶液中加熱することにより溶解させた。ＲＮＡ沈殿を、１３ｋｒｐｍ、４℃での遠心分離により回収し、冷７５％エタノールで２回洗浄した後、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理された５０μｌの水に再懸濁させた。全ての溶液はＤＥＰＣ処理された水を用いて調製された。
【０２４９】
ＲＨＤＶキャプシド遺伝子のｃＤＮＡクローニング
全ＲＮＡを、以前に記述されたように（Ｔａｙｌｏｒ  他  １９９０）第１鎖ｃＤＮＡを生成するために用いた。１本鎖ｃＤＮＡを続いて、９５℃で５分間加熱し、氷上で冷却した後、５μｌの１０ｘＰＣＲバッファー、３．７５μｌの２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、５μｌの５μＭ  ５’末端プライマー（配列番号４０）
5’ CTGGAATTCTATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGAGGGCAAAGCCCGT 3’
５μｌの５μＭ  ３’末端プライマー（配列番号４１）
5’ GTAAGCTTATCAGACATAAGAAAAGCC 3’
２６μｌのＨ２  Ｏおよび０．２５μｌのＴａｑポリメラーゼ（５．０ｕ／μｌ）と混合した。３０サイクルのＰＣＲ増幅を、４０μｌの鉱物油を含む０．５ｍｌチューブ中で以下の概要で実行した：９４℃１分、６０℃１分、および７２℃１分。ＰＣＲ水層反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させ、続いてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化した。増幅された１．８ｂｐＤＮＡ断片を、１％アガロースゲル上で精製し、Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ手順を、製造者（Ｂｉｏ  １０１，Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の指定に従って用いて単離し、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の対応するサイトにクローン化し、プラスミドｐＬＦ１１を生成した。
【０２５０】
変異実験
第１の潜在初期転写終結シグナル（５ＴＡＴ  位置＃１６００、図１ａ）（Ｙｕｅｎ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，１９８７）を除去するために、プライマーＬＦ０９３（配列番号４２）
5’-TGGCAGTTAACCTTTGCATCTGGTTTCATGGAGATCGGTTTAAGTGTGGACGGGTACTTCTATGC A-3’
およびＬＦ０９４（配列番号４３）
5’-TATAAGCTTTCAGACATAAGAAAAGCC-3’
を用いたｐＬＦ１１ＤＮＡのＰＣＲ増幅に基づいて二重変異を行った。
【０２５１】
その結果得られた１９０ｂｐの断片をＨｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、続いて精製し、４．５ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｐａＩ断片にライゲーションさせ、ｐＬＦ１１ａを生成した。第２の潜在初期転写終結シグナル（５ＴＡＴ  位置＃２１３、図１ａ）を除去するために、ｐＬＦ１１ａＤＮＡにおける二重ラウンドのＰＣＲ増幅により第２の二重変異を操作した。ｐＬＦ１１ａＤＮＡに関しての第１のＰＣＲラウンドは、以下のプライマーの組、［ＬＦ０７０（配列番号４４）（5’-TCATTCGAATTCTATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATG-3’）
／ＬＦ０９５（5’-ATTGTAATAGAAGTTTGTTCT-3’）
および［ＬＦ０９６（配列番号４５）（5’-AGAACAAACTTCTATTACAAT-3’）
／ＬＦ０９７（5’-GCGAAACTGCATGCCACCAGC-3’）
を用いて実行され、それぞれ２５０ｂｐと１４０ｂｐの、２つの部分的にオーバーラップしているＤＮＡ断片を生成した。ＰＣＲ増幅の第２のラウンドは、両方の部分的にオーバーラップしている精製された２５０ｂｐおよび１４０ｂｐのＤＮＡ断片および外部プライマーＬＦ０７０およびＬＦ０９７の存在下で行った。その結果得られた３８０ｂｐＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩで消化した後精製し、ｐＬＦ１１ａのＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ  ４．３ｋｂｐＤＮＡ断片とライゲーションさせ、ｐＬＦ１１ｂを生成した。全てのＰＣＲ増幅は以前に記述された条件を用いて行った。
【０２５２】
ドナープラスミドｐＬＦ１４の構築
ｐＬＦ１１ｂの１．８ｂｐ  ＮｒｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片を精製し、カナリアポックスＣ６座左（３７７ｂｐ）および右（１１５５ｂｐ）アーム（Ｇｏｅｂｅｌ  他  １９９５）の間にクローン化されたワクシニア初期／後期Ｈ６プロモーター（Ｐｅｒｋｕｓ  他  １９８９）の１００ｂｐのＮｒｕＩ／ＨｉｎｆＩＤＮＡ断片を含んでいる改変ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋プラスミドの４．５ｂｐ  ＮｒｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片とライゲーションし、ｐＬＦ１４を生成した。
【０２５３】
ドナープラスミドｐＬＦ１２の構築
ｐＬＦ１１ｂの１．８ｂｐ  ＮｒｕＩ／ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片を精製し、ｐＳＤ５５０ＶＣの３．６ｂｐ  ＮｒｕＩ／ＢａｍＨＩ断片とライゲーションし、ｐＬＦ１２を生成した。ｐＳＤ５５０ＶＣを派生させるために、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ制限サイトを有するポリリンカーを、ｐＳＤ５４８（Ｔａｒｔａｇｌｉａ  他，１９９２）のＢｇｌＩＩおよびＳｍａＩサイトの間にクローン化し、ワクシニア初期／後期Ｈ６プロモーターを、続いてＢｇｌＩＩサイト中に導入した。
【０２５４】
ヌクレオチド配列決定および配列分析
プラスミドＤＮＡをＳｅｑｕｅｎａｓｅ２．０キットの指示（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）に従って配列決定し、配列分析をＰＣ  Ｇｅｎｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて行った。
【０２５５】
ＮＹＶＡＣ組換体ｖＰ１２４９およびカナリアポックス組換体ｖＣＰ３０９のインビボ組換え、精製、増幅、および濃縮
組換え実験を、以前に記述されたように（Ｐｅｒｋｕｓ  他  １９９３）、ｐＬＦ１４およびｐＬＦ１２をドナーＤＮＡとして、ＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）およびＮＹＶＡＣをレスキューウイルスとしてそれぞれ用いて行った。ウイルスは、アガロースの下のＣＥＦ単層上にプレートし、組換えプラークを、全ＲＨＤＶキャプシド遺伝子に特異的な放射性標識プローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションにより、Ｐｅｒｋｕｓ  他，１９９３に記載されているとおりに同定した。各々の組換え実験について、陽性プラークを精製し組換えウイルスを、Ｔａｙｌｏｒ  他  （１９９１）に従って増幅し、濃縮した。
【０２５６】
放射性免疫沈降およびポリアクリルアミドゲル電気泳動
放射性免疫沈降分析を、以前に記述されたとおりに（Ｐｉｎｃｕｓ  他  １９９２）、ｖＣＰ３０９またはｖＰ１２４９に感染させたＶｅｒｏ細胞から派生された［３５Ｓ］メチオニン標識溶解物およびＲＨＤＶモノクローナル抗体調製物（３Ｈ６および１Ｈ８）（Ｗｉｒｂｌｉｃｈ  他  １９９４）を用いて行った。イムノ沈殿物を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分画した。沈殿されたポリペプチドを、サリチル酸ナトリウムを用いた標準的な蛍光法で可視化した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  他  １９８９）。
【０２５７】
ｖＣＰ３０９感染細胞のＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳｃａｎ分析を、Ｔｉｎｅ  他  （１９９０）に記載されているとおりに、ＲＨＤＶモノクローナル抗体３Ｈ６および１Ｈ８を用いて行った。
【０２５８】
ウサギＶＨＤ投与研究
生後４、５または９週のＳＰＦウサギ群を、皮下または皮内経路の何れかで、ｖＣＰ３０９でワクチン接種した（０．２ｍｌ）。ワクチン接種群に、１０５  または１０７  の何れかのプラーク形成単位（pfu ）のｖＣＰ３０９を第０日に接種した。４匹のＳＰＦウサギの群には、１０７  のプラーク形成単位（pfu ）のｖＰ１２４９を第０日に接種した。第２８日に追加免疫注入を受けた群に関しては（表２１）、第２の注入を同じ接種物により行った。生ＲＨＤＶ免疫性テスト曝露を、第４２日に１０２  ＬＤ５０のＬＳＴ  Ｌ４／９０．１０  ＲＨＤＶ株を用いて行った。動物は、生存した動物を剖検しＲＨＤＶ誘導された外傷について調査する前の８日間の期間にわたって観察した。血液試料を第２８日および第４２日に回収した。抗ＲＨＤＶ抗体を、ＥＬＩＳＡおよび血球凝集阻害アッセイ（ＨＩＡ）の両方で滴定した。
【０２５９】
キャプシド遺伝子の配列分析
他のＲＨＤＶ単離体のヌクレオチド配列（Ｍｅｙｅｒｓ  他  １９９１）を、続いて実行するＲＨＤＶ（Ｓａ  ｎｅ  ｅｔ  Ｌｏｉｒｅ株）の推定キャプシド遺伝子領域のＰＣＲ増幅のための、ゲノムＲＨＤＶ  ＲＮＡのゲノム部分の３’に相同性であるプライマーを設計するために用いた。派生された１７４０ｂｐのＲＨＤＶキャプシド遺伝子のＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸は図１２Ａに示されている。別の単離体のＲＨＤＶゲノム配列（Ｍｅｙｅｒｓ  他  １９９１）とのヌクレオチド配列の比較により、完全キャプシド配列に関して９７．３％の配列の同一性が示された。アミノ酸レベルでの同じ分析はより高いホモロジーすら示している（９９．１％）。Ａｓｎ＃４５、２８１、３０８、３６９、３９３、４３０、４７４、４８１、および５０２に集められた９つの推定Ｎ−グリコシル化サイトが推定アミノ酸配列から予測可能である。興味深いことには、これらの８つはキャプシド遺伝子１次配列のカルボキシハーフ（ｃａｒｂｏｘｙ  ｈａｌｆ）に位置していた。
【０２６０】
ＡＬＶＡＣベースの組換えウイルスｖＣＰ３０９およびＮＹＶＡＣベースの組換えウイルスｖＰ１２４９の構築
ＡＬＶＡＣ  ｖＣＰ３０９およびＮＹＶＡＣ  ｖＰ１２４９組換えウイルスは、ＲＨＤＶ推定キャプシド遺伝子を発現するものであるが、以前に記述されたもの（Ｐｅｒｋｕｓ  他  １９９３）と類似の戦略を用いて開発された。図１３は、ｖＣＰ３０９およびｖＰ１２４９をそれぞれ得るために用いられた、ドナープラスミドｐＬＦ１４およびｐＬＦ１２の操作を、ｐＬＦ１４（１１６２ｂｐ  ＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩおよび３８６ｂｐＨｉｎｆＩ／ＳａｃＩ配列、それぞれ右および左隣接アームに相当）カナリアポックスＣ６座隣接アームを示している図１２Ｂと共に示している。ＲＨＤＶキャプシド遺伝子のＮＨ２末端のアミノ酸分析は、本発明以前には入手可能ではなかった。しかしながら、カリシウイルス科のメンバーはそれらのキャプシドポリペプチドを、それらのゲノムの３’末端から発現し、そして、Ｍｅｙｅｒ  他  （１９９１）におけるＭｅｔ＃１７６６から始まるＯＲＦによってコードされたポリペプチドの計算上の分子量（６０．２５７Ｄａ）が、精製されたウイルス調製物（Ｐｒｉｅｔｏ  他  １９９０）において検出されたポリペプチドのサイズと良く一致するため、ＲＨＤＶキャプシド遺伝子ＮＨ２末端は、Ｍｅｙｅｒｓ  他  １９９１に記載された配列におけるＭｅｔ＃１７６６に相当するものと推定されている。
【０２６１】
ｖＣＰ３０９およびｖＰ１２４９によって発現されたＲＨＤＶキャプシドの免疫沈降分析
ｖＣＰ３０９およびｖＰ１２４９の両方が、真正のキャプシドタンパク質を発現することを示すために、免疫沈降実験を、モノクローナル抗体調製物、３Ｈ６および１Ｈ８を用いて行った。簡潔には、ベロ細胞単層を、１０pfu ／細胞で親株または適切な組換えウイルスの何れかに、［３５Ｓ］の存在下で感染させた。組換えＲＨＤＶキャプシドタンパク質は、記述されたように感染させた溶解物から免疫沈降された。感染させていないベロ細胞溶解物（図４、レーン１および６）または親株ＡＬＶＡＣまたはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞溶解物（図１４、レーン２−３および７−８）からは放射性標識された産物は検出されなかった。重要なことには、見かけの分子量が６０ｋＤａのポリペプチドが、ｖＣＰ３０９ベロ細胞溶解物からモノクローナル抗体１Ｈ８および３Ｈ６によって沈殿された（図１４、それぞれレーン４および９）。同様に、同じ見かけの分子量のポリペプチドが、ｖＰ１２４９ベロ細胞溶解物からモノクローナル抗体１Ｈ８および３Ｈ６によって沈殿された（図１４、それぞれレーン５および１０）。６０ｋＤａの評価された分子量は、推定されるＲＨＤＶキャプシド配列から予見される分子量および精製されたウイルスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（Ｐｒｉｅｔｏ  ａｎｄ  Ｐａｒｒａ，１９９０）の両方に一致している。さらに、このことは、上記の開始コドン（ＡＴＧ）が真正翻訳開始コドンに一致していることを示している。精製されたＲＨＤＶ試料（Ｍｅｙｅｒ  他  １９９１；Ｒｏｄａｋ  他  １９９０）において、およびバキュロウイルスＲＨＤＶキャプシド組換えウイルスから派生された溶解物（Ｌａｕｒｅｎｔ  他  １９９４）において以前に記述された２６−および３６−ｋＤａポリペプチドは、ｖＣＰ３０９またはｖＰ１２４９細胞溶解物の何れにおいても検出されなかった。
【０２６２】
同じＭＡｂｓおよびｖＣＰ３０９またはｖＰ１２４９感染ベロ細胞について行ったＦＡＣＳｃａｎ分析により、ｖＣＰ３０９またはｖＰ１２４９感染細胞中におけるＲＨＤＶ発現が確認された。さらに、このような分析の結果は、内部でのキャプシド発現を示したが、感染細胞の表面での発現は示さなかった。
【０２６３】
ＡＬＶＡＣ組換体ｖＣＰ３０９およびＮＹＶＡＣ組換体ウイルスｖＰ１２４９によってウサギにおいて誘導された防御的免疫
投与経路の効果、初期ワクチン接種時の動物の年齢、追加免疫注入の存在およびｖＣＰ３０９の量といった組み合わている要因マトリックスを用いて、ＡＬＶＡＣ組換体ｖＣＰ３０９によるウサギにおいての防御免疫を分析した。１０７  pfu のｖＣＰ３０９の１または２用量で免疫化されたウサギは、ワクチン接種されていない動物の１００％が死んだ強力致死ＲＨＤＶ免疫性テストに生き残った（表２１、レーン１−５）。これらの１６のウサギのうち１４を投与後１週間で剖検したが、何れのＲＨＤＶ誘導外傷も検出されなかった。ウサギが１０５  pfu のｖＣＰ３０９でワクチン接種された場合には、１６のうち４（２５％）が死亡し、ＲＨＤＶ誘導外傷が３の生存動物において明白であった（表２１、レーン６−９）。これらの結果はワクチン用量の明白な効果（スチューデントｔ＝１．９）と、投与ルートのより弱い効果（スチューデントｔ＝１．２）を示している。血清学的分析により、主要な効果はｖＣＰ３０９投与量に関していることが示されたが、防御と抗体価との明確な相関を立証はできなかった。
【０２６４】
ＮＹＶＡＣ組換体ｖＰ１２４９によりウサギにおいて誘導された防御免疫を、１０７  pfu のｖＰ１２４９の２度の皮内接種により免疫化されたウサギの１群において分析した。４匹全てのウサギが免疫性テストで生き残ったが、１つの生存動物においてＲＨＤＶ誘導外傷が明白であった（表２１、レーン１０）。
【表２１】
2007082551.tif 000022
【０２６５】
ここに表示された結果は、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−カリシウイルス（ＲＨＤＶ等）組換体およびそれ由来の産物の、組成物中で用いられるための能力、および前述の、例えば免疫学的、抗原的またはワクチン組成物等の用途、またはアッセイ、キットまたは試験のための、ワクチンまたは免疫化戦略において好適である抗原もしくは抗体の調製においての利用；および、プローブのためのＤＮＡを提供することまたはカリシウイルス（ＲＨＤＶ等）ＤＮＡの検出または増幅のためのＤＮＡプライマーを生成させることを示している。
【０２６６】
このように、本発明の好ましい実施態様を詳細に記述してきたが、添付されたクレームによって定義される本発明は、上の記述において示された特定の細目に限定されるものではなく、その精神または範囲から離れることなく、それらの数多くの明らかな変化型が可能である。
【参考文献】
【０２６７】
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【図面の簡単な説明】
【０２６８】
【図１】図１は、チミジンキナーゼ遺伝子の欠失および組換えワクシニアウイルスｖＰ４１０の産生のためのプラスミドｐＳＤ４６０を構築する方法を示している
【図２】図２は、出血領域の欠失および組換えワクシニアウイルスｖＰ５５３の産生のためのプラスミドｐＳＤ４８６を構築する方法を示している
【図３】図３は、ＡＴＩ領域の欠失および組換えワクシニアウイルスｖＰ６１８の産生のためのプラスミドｐＭＰ４９４Δを構築する方法を示している
【図４】図４は、血球凝集素遺伝子の欠失および組換えワクシニアウイルスｖＰ７２３の産生のためのプラスミドｐＳＤ４６７を構築する方法を示している
【図５】図５は、遺伝子クラスター［Ｃ７Ｌ  −  Ｋ１Ｌ］の欠失および組換えワクシニアウイルスｖＰ８０４の産生のためのプラスミドｐＭＰＣＫ１Δを構築する方法を示している
【図６】図６は、リボヌクレオチドレダクターゼラージサブユニットの欠失および組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）の生成のためのプラスミドｐＳＤ５４８の構築方法を模式的に示している
【図７】図７は、ＴＫ欠失遺伝子座に狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子を挿入し組換えワクシニアウイルスｖＰ879 を形成するためのプラスミドｐＲＷ842 を構築する方法を図示する
【図８】図８は、Ｃ５  ＯＲＦを含有するカナリアポックスのＰｖｕＩＩフラグメントのＤＮＡ配列（配列番号２７）を示す
【図９Ａ】図９Ａは、組換えカナリアポックスウイルスｖＣＰ65（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）を構築する方法を図示する
【図９Ｂ】図９Ｂは、組換えカナリアポックスウイルスｖＣＰ65（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）を構築する方法を図示する
【図１０】図１０は、ＮＹＶＡＣを形成するために欠失させるＯＲＦｓ（オープンリーディングフレーム）を図示する
【図１１−１】図１１−１は、予め同一のワクチンを接種するかまたはワクチンを変えて免疫化したボランティアにおける狂犬病中和抗体力価（ＲＦＦＩＴ、IU／ml）、ＨＤＣおよびｖＣＰ65（10５．５  ＴＣＩＤ５０）の追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ）効果を示すグラフである（なお、ワクチン接種は、０日、28日および180 日目に行い、抗体力価の測定は０日、７日、28日、35日、56日、173 日、187 日および208 日目に行った）
【図１１−２】図１１−２は、図１１−１の続きを示す
【図１２Ａ−１】図１２Ａ−１は、ＲＨＤＶ（Ｓａ  ｎｅ  ｅｔ  Ｌｏｉｒｅ株）キャプシド遺伝子のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列（配列番号３７、３８）を示す（上および下のケースの左端のナンバリングは、核酸配列およびアミノ酸配列にそれぞれ付属している；２つのワクシニア初期転写終結シグナルはアンダーラインされている）
【図１２Ａ−２】図１２Ａ−２は、図１２Ａ−１の続きを示す
【図１２Ａ−３】図１２Ａ−３は、図１２Ａ−２の続きを示す
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ドナープラスミドｐＬＦ１４中のカナポックスＣ６座隣接アームのヌクレオチド配列を示している（配列番号３９）（１１６２ｂｐＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩおよび３８６ｂｐＨｉｎｆＩ／ＳａｃＩ配列はそれぞれ、ｐＬＦ１４中の右および左隣接アームに対応している）
【図１３】図１３はドナープラスミドｐＬＦ１４およびｐＬＦ１２の構築を模式的に示している（ｐＬＦ１１ｂ由来の１．８ｋｂｐ  ＮｒｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩおよび１．８ｋｂｐ  ＮｒｕＩ／ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片で、両方ともＲＨＤＶキャプシドコード配列およびワクシニアＨ６プロモーターの最初の３０ｂｐを有しているものが、カナリアポックスＣ６座右および左隣接アームの間にクローン化された残りのＨ６プロモーターを含有している改変ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋プラスミドの４．５ｋｂｐ  ＮｒｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片またはｐＳＤ５５０ＶＣの３．７ｋｂｐ  ＮｒｕＩ／ＢａｍＨＩ断片の何れかと連結された；その結果得られたプラスミドはｐＬＦ１４およびｐＬＦ１２は、インビトロ組換え実験で用いられ、それぞれ、ＡＬＶＡＣ  ｖＣＰ３０９およびＮＹＶＡＣ  ｖＰ１２４９を生成した）
【図１４】図１４はｖＣＰ３０９およびｖＰ１２４９感染ベロ細胞からのＲＨＤＶ組換えキャプシドタンパク質の免疫沈降を示す（免疫沈降は、ＲＨＤＶ  ＭＡｂ群１Ｈ８（レーン１−５）および３Ｈ６（レーン６−１０）をそれぞれ用いて実施例に記載されたとおりに実行した；レーン１および６は感染されていないベロ細胞；レーン２および７は親カナリアポックスＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）で感染されたベロ細胞；レーン３および８は親ＮＹＶＡＣで感染されたベロ細胞；レーン４および９は組換えｖＣＰ３０９で感染されたベロ細胞；レーン５および１０は組換えｖＰ１２４９で感染されたベロ細胞；左端の数字は標準分子量マーカーの移動に対応している
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２Ａ−１】
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【図１２Ａ−２】
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【図１２Ａ−３】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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