(57)【要約】【課題】  細胞が物質を取り込む状況を微視的に観察し評価する方法及びその装置を提供する。【解決手段】  原子間力顕微鏡のカンチレバーの自由端に設けたコロイドプローブの表面に評価対象物質を付着させて、その評価対象物質を標的細胞表面に接触させ、前記標的細胞が評価対象物質を取り込む様子を光学顕微鏡で観察するようにした。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
原子間力顕微鏡と、少なくとも前記原子間力顕微鏡の試料設置場所をその内部に包含するインキュベーターと、光学顕微鏡とを備えており、
前記原子間力顕微鏡のカンチレバーの自由端にコロイドプローブが設けてあり、そのコロイドプローブ表面に付着させた評価対象物質を標的細胞表面に接触させ、前記標的細胞が前記評価対象物質を取り込む様子を前記光学顕微鏡により観察するように構成してあることを特徴とする細胞の物質取り込み評価装置。
【請求項２】
前記コロイドプローブが、架橋された高分子化合物又は多孔質体からなる請求項１記載の細胞の物質取り込み評価装置。
【請求項３】
前記カンチレバーと前記コロイドプローブとが一体として形成してある請求項１又は２記載の細胞の物質取り込み評価装置。
【請求項４】
請求項１、２又は３記載の装置を用いて細胞の物質取り込みを評価する方法であって、
前記コロイドプローブの表面に評価対象物質を付着させて、
その評価対象物質を標的細胞表面に接触させ、
前記標的細胞が前記評価対象物質を取り込む様子を前記光学顕微鏡で観察することを特徴とする細胞の物質取り込み評価方法。
【請求項５】
前記評価対象物質が、蛍光標識してある請求項４記載の細胞の物質取り込み評価方法。
【請求項６】
前記評価対象物質が、ナノサイズの粒径の薬剤担体粒子、ナノサイズの粒径のミセル、ナノサイズの粒径のリポソーム、ナノサイズの粒径のエマルション粒子、又は、ナノサイズの粒径の薬剤粒子である請求項４又は５記載の細胞の物質取り込み評価方法。
【請求項７】
前記薬剤担体粒子が、薬剤を担持している請求項６記載の細胞の物質取り込み評価方法。
【請求項８】
前記ミセル、前記リポソーム、又は、前記エマルション粒子が、薬剤を内包している請求項６記載の細胞の物質取り込み評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、細胞が物質を取り込む状況を観察し評価する方法及びその装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近時、薬物を標的細胞へ選択的に送達するドラックデリバリーシステム（Drug Delivery System、以下ＤＤＳとも言う）の開発が精力的に行われている（例えば特許文献１参照）。ＤＤＳ用担体微粒子としては一般的に標的細胞へ特異的に吸着する表面や官能基を有するエマルション粒子やカプセル粒子や磁性粒子が用いられるが、これらの性能テストは主にラットやマウス等の実験動物に投与することにより行われ、マクロな収支バランスと、解剖後の各組織への吸収・蓄積率等により評価される。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−０６０２２１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
こうした組織レベルでの評価により様々な知見が得られてきたが、更に高効率の標的細胞指向性を有するＤＤＳ用担体微粒子を設計するためには、細胞レベルでの微視的な理解が必須であり、従来の組織レベルでの評価のみでは、今後ＤＤＳの飛躍的発展を図ることは難しいと思われる。
【０００５】
そこで本発明は、特定の細胞が物質を取り込む状況を微視的に観察し評価する方法及びその装置を提供すべく図ったものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち本発明に係る細胞の物質取り込み評価方法は、原子間力顕微鏡のカンチレバーの自由端に設けたコロイドプローブの表面に評価対象物質を付着させて、その評価対象物質を標的細胞表面に接触させ、前記標的細胞が前記評価対象物質を取り込む様子を光学顕微鏡で観察することを特徴とする。
【０００７】
このようなものであれば、個々の標的細胞毎に薬剤担体粒子や薬剤の細胞内への取り込み確率、細胞内での代謝過程、細胞の死滅薬剤濃度等を視覚的に評価することができる。また、得られた情報に基づいて、個々の標的細胞特性に応じた薬剤担体粒子や薬剤の設計（好適なサイズの特定も含む）や、取り込み部位の特定が可能となる。このため、本評価方法を用いることにより、動物実験を行うよりも迅速に、詳細な情報を細胞レベルで得ることができる。
【０００８】
また、最終的な薬理効果の評価は実験動物を用いた生体投与実験で行う場合であっても、複数種類ある候補から薬剤を絞り込むためのスクリーニングとしても利用できる。これにより、動物実験の回数を格段に減らすことができ、経費面からも動物愛護の観点からも、有意義である。
【０００９】
前記評価対象物質は、用いる光学顕微鏡の種類によっては、蛍光標識してあってもよい。
【００１０】
前記評価対象物質は、例えばナノサイズの粒径の薬剤担体粒子、ナノサイズの粒径のミセル、ナノサイズの粒径のリポソーム、ナノサイズの粒径のエマルション粒子、又は、ナノサイズの粒径の薬剤粒子等である。なお、本発明において、エマルション粒子とは水相中に分散している油滴をいい、油滴の表面が界面活性剤等の両親媒性物質で覆われていてもよい。
【００１１】
前記薬剤担体粒子には薬剤が担持されていてもよく、前記ミセルや前記リポソームや前記エマルション粒子には薬剤が内包されていてもよい。
【００１２】
本発明に係る細胞の物質取り込み評価方法に用いる評価装置としては、例えば、原子間力顕微鏡と、少なくとも前記原子間力顕微鏡の試料設置場所をその内部に包含するインキュベーターと、光学顕微鏡とを備えており、前記原子間力顕微鏡のカンチレバーの自由端にコロイドプローブが設けてあり、そのコロイドプローブ表面に付着させた評価対象物質を標的細胞表面に接触させ、前記標的細胞が前記評価対象物質を取り込む様子を前記光学顕微鏡により観察するように構成してあることを特徴とするものを使用することができる。このような細胞の物質取り込み評価装置も、本発明の１つである。
【００１３】
前記コロイドプローブとしては、例えば、シリカ、石英、ガラス、酸化チタン等の金属酸化物、金属、イオン結晶、カーボン、ダイヤモンド等を含む無機物質や、天然ゴム、ポリスチレンやポリメチルメタクリレート等の合成ゴム等を含む有機物質からなる粒子や、これらの無機物質と有機物質からなり、コアシェル型、母粒子・子粒子型等の形態を有する複合粒子を用いることができる。また、前記コロイドプローブは、非多孔質体からなるものであってもよく、架橋された高分子化合物や多孔質体からなるものであってもよい。更に、前記カンチレバーと前記コロイドプローブは分離可能なものであってもよいが一体として形成してあってもよい。
【発明の効果】
【００１４】
このように本発明によれば、薬剤担体粒子や薬剤の細胞内への取り込み確率、細胞内での代謝過程、細胞の死滅薬剤濃度等を細胞レベルで、かつ視覚的に評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の一実施形態を図面を参照して説明する。
【００１６】
本実施形態に係る細胞の物質取り込み評価装置１は、図１に示すように、原子間力顕微鏡２と、原子間力顕微鏡２の試料（細胞）設置場所をその内部に配置するインキュベーター３と、蛍光顕微鏡4とを備えている。
【００１７】
原子間力顕微鏡２は、その自由端にコロイドプローブ２２を有するカンチレバー２１と、カンチレバー２１の変位を検出する光学式変位センサーと、コロイドプローブ２２と細胞Ｃとを相対的に走査する走査機構を備えている。更に原子間力顕微鏡２は、ＣＰＵ、内部メモリ、ＨＤＤ等の外部記憶装置、モデム等の通信インタフェース、モニタ、マウスやキーボードといった入力手段等を有する情報処理装置２０を備えている。
【００１８】
カンチレバー２１は、単結晶シリコンや窒化シリコン等からなるものであり、一端が固定され他端が自由端となっており、自由端にはコロイドプローブ２２が設けてある。カンチレバー２１の自由端に設けられたコロイドプローブ２２は、略球状をなすものであり、例えば樹脂や、膨潤ゲル等の多孔質体等から構成される。カンチレバー２１とコロイドプローブ２２とは分離可能なものであってもよいが、同じ材料から一体として形成されていてもよい。
【００１９】
光学式変位センサーは、半導体レーザー２３と、４分割フォトダイオード検出器２４からなる光てこ式の光学式変位センサーである。半導体レーザー２３から射出されたレーザー光Ｌが、カンチレバー２１の背面で反射し、カンチレバー２１の反りに応じた反射光の反射方向の変化を４分割フォトダイオード検出器２４で検知して、カンチレバー２１の自由端にあるコロイドプローブ２２の動きを反映した電気信号をＺ駆動部２５に向けて出力する。
【００２０】
走査機構は、Ｚ駆動部２５と、Ｚピエゾスキャナー２６と、Ｘ、Ｙ駆動部２７と、Ｘ−Ｙピエゾスキャナー２８とからなり、Ｘ、Ｙ駆動部２７はＸ−Ｙピエゾスキャナー２８を駆動してコロイドプローブ２２をＸＹ方向に相対的に走査し、Ｚ駆動部２５は光学式変位センサーの出力を一定に保つようにＺピエゾスキャナー２６を駆動してコロイドプローブ２２のＺ方向位置を制御する。これにより、試料表面の凹凸の状態をマッピングして、得られた結果を情報処理装置２０のモニタ上に表示する。これら走査機構の制御は情報処理装置２０の内部メモリや外部記憶装置等の所定領域に設定したプログラムにしたがってＣＰＵやその周辺機器を作動させることにより行われる。
【００２１】
Ｘ−Ｙピエゾスキャナー２８は観察対象の細胞Ｃを設置する試料台を兼ねており、蛍光顕微鏡４による観察のために貫通孔Ｏが設けてある。また、Ｘ−Ｙピエゾスキャナー２８の上には、細胞Ｃの温度を所定の温度に制御する透明サーモプレート２９が備えてある。透明サーモプレート２９は、温度制御を行う温度制御部と、硬質ガラスからなる透明発熱体である発熱プレート部と、温度センサを有する測温部を備えている（いずれも図示しない）。
【００２２】
インキュベーター３は、観察対象である細胞Ｃを包含するように配置されており、細胞Ｃを培養しつつｉｎ−ｓｉｔｕで観察するために、細胞Ｃの生存環境を一定温度かつ一定ＣＯ２濃度に制御するものである。
【００２３】
蛍光顕微鏡4は、励起用の光源４１と励起光Ｅと蛍光Ｆを分離するフィルタブロックからなる光学系と、対物レンズ４５と、細胞Ｃの蛍光画像を撮影するＣＣＤカメラ４６と、その蛍光画像をモニタ上に表示する情報処理装置４７を備えている。
【００２４】
光源４１は、水銀ランプ等からなるものであり、蛍光物質を励起するための光を射出するものである。なお、蛍光物質は、特定波長の光（励起光Ｅ）を吸収し、それにより励起された状態（励起状態）から元の状態（基底状態）に戻る際に光（蛍光Ｆ）としてエネルギーを放出する特性を有する。
【００２５】
フィルタブロックは、励起フィルタ４２と吸収フィルタ４４の２種のフィルタ、及び、ダイクロイックミラー４３から構成されている。
【００２６】
励起フィルタ４２は、蛍光物質の励起に必要な波長の光を光源４１から抽出するための光学素子あり、特定の波長の光のみを透過し、それ以外の光を通さないバンドパスフィルタ等からなるものである。
【００２７】
ダイクロイックミラー４３は、励起光Ｅと蛍光Ｆを分離するための光学素子であり、特定の波長の光のみを反射し、それ以外の波長の光を透過するという特徴をもつ。ダイクロイックミラー４３は入射光に対して４５°の角度で配置されることにより反射帯域と透過帯域をもち、励起フィルタ４２を透過した励起光Ｅはダイクロイックミラー４３により反射されて９０°折り曲げられ対物レンズ４５及び観察試料（細胞Ｃ）の方向へ導かれ、一方試料から発せられた蛍光Ｆはダイクロイックミラー４３を透過し、ＣＣＤカメラ４６方向へ進む。なお、対物レンズ４５に対物ヒーターを設置して、試料設置場所（約３７℃）と対物レンズ（対物ヒーターがない場合、室温約２５℃）の温度差により生じるドリフトを抑えるようにしてもよい。
【００２８】
吸収フィルタ４４は、試料から発せられた蛍光Ｆとその他の不要な散乱光等を分離する光学素子であり、ダイクロイックミラー４３を透過した長波長の蛍光Ｆを透過し、その他の励起の漏れ光（試料や光学系からの散乱光）等は透過しないものである。吸収フィルタ４４は蛍光画像の画質向上のため若干傾けて設置してある。
【００２９】
ＣＣＤカメラ４６は、細胞Ｃの蛍光画像を動画として撮影可能なものであり、得られた画像は情報処理装置４７に向けて出力され、そのモニタ上に表示する。
【００３０】
情報処理装置４７は、ＣＰＵ、内部メモリ、ＨＤＤ等の外部記憶装置、モデム等の通信インタフェース、モニタ、マウスやキーボードといった入力手段等を有するものであり、汎用のコンピュータであってもよく、専用のものであってもよい。
【００３１】
次に、このように構成した細胞の物質取り込み評価装置１を用いた細胞の物質取り込み評価方法について、図２とともに説明する。
【００３２】
まず、原子間力顕微鏡２のカンチレバー２１の自由端に適当なコロイドプローブ２２を設置して、コンタクトモードやタッピングモードを用いて、細胞Ｃの形状、高さイメージ像、粘弾性マッピング、摩擦力マッピング、吸着力マッピング、位相イメージ像等を得る。この際、細胞Ｃは培養液に浸漬した状態であってもよい。
【００３３】
次いで、表面特性の異なるコロイドプローブ２２を複数種類用意して、それらをカンチレバー２１の自由端に設置して、コロイドプローブ２２の表面と細胞Ｃの表面との親和性を評価する。
【００３４】
得られた結果より、細胞Ｃの表面に対して高い親和性を有する表面をもつコロイドプローブ２２を選び出し、同じ材料で粒径がナノサイズの薬剤担体粒子５を製作する。その際、薬剤担体粒子５には、常法に従い蛍光物質を付着、結合又は含有させて、蛍光標識する。薬剤担体粒子には、薬剤を付着又は含有させてもよく、その場合は、蛍光標識は薬剤に対して行ってもよい。なお、薬剤には、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の生体高分子も含まれる。
【００３５】
蛍光標識された薬剤担体粒子５は、静電気力、磁気力、ファンデルワールス力等の物理的相互作用や、化学的・生化学的相互作用を利用して、コロイドプローブ２２表面に付着させてから、細胞Ｃ表面に接触させることにより、細胞Ｃに取り込ませる。コロイドプローブ２２が膨潤ゲル等の架橋された高分子化合物からなる場合は、架橋構造中に薬剤担体粒子５を含有させてもよい。
【００３６】
次いで、蛍光顕微鏡４により、細胞Ｃが薬剤担体粒子５を取り込む様子を観察し、取り込み位置を同定する。また、細胞Ｃの増殖過程も併せて観察する。
【００３７】
図２は、細胞Ｃが核Ｎ近傍において薬剤担体粒子５を取り込む様子を経時的に示す図であり、（ａ）はコロイドプローブ２２が非多孔質体からなる場合を示し、（ｂ）はコロイドプローブ２２が多孔質体からなる場合を示す。
【００３８】
様々な焦点深度における蛍光画像の経時的変化を記録し、薬剤担体粒子５取り込み後の細胞Ｃの挙動、細胞Ｃ内に取り込まれた薬剤担体粒子５の状態等を観察し、薬剤の細胞内代謝過程の計測・分析を行う。
【００３９】
このように構成した本実施形態による細胞の物質取り込み評価方法によれば、個々の標的細胞毎に薬剤担体粒子や薬剤の細胞内への取り込み確率、細胞内での代謝過程、細胞の死滅薬剤濃度等を視覚的に評価することができる。また、得られた情報に基づいて、個々の標的細胞特性に応じた薬剤担体粒子や薬剤の設計が可能となる。このため、本評価方法を用いることにより、動物実験を行うよりも迅速に、詳細な情報を細胞レベルで得ることができる。
【００４０】
また、最終的な薬理効果の評価は実験動物を用いた生体投与実験で行う場合であっても、複数種類ある候補から薬剤を絞り込むためのスクリーニングとしても利用できる。これにより、動物実験の回数を格段に減らすことができ、経費面からも動物愛護の観点からも、有意義である。
【００４１】
なお、本発明は前記実施形態に限られるものではない。原子間力顕微鏡２のＺピエゾスキャナー２６とＸ−Ｙピエゾスキャナー２８は独立していなくてもよく、一体となったＸ−Ｙ−Ｚピエゾスキャナーであってもよい。また、変位センサーは、光てこ式の光学的変位センサーに限定されず、例えば、光学系が不要な自己検知式カンチレバーシステムを用いたものであってもよい。
【００４２】
蛍光顕微鏡４の代わりに、種々の光学顕微鏡を用いることができ、例えば、偏光顕微鏡、ブリュースター角顕微鏡、レーザー顕微鏡等の他の光学顕微鏡を用いてもよい。
【００４３】
ナノサイズの粒径の薬剤担体粒子５は、界面活性剤からなるミセルや脂質からなるリポソームや油滴からなるエマルション粒子であってもよく、その場合、薬剤はミセルやリポソームやエマルション粒子の内部に包含される。いかなる界面活性剤や脂質や油を用いるかは標的細胞Ｃに対する親和性を評価して決定する。
【００４４】
また、薬剤担体粒子を用いずに、直接コロイドプローブ２２に薬剤からなるナノ粒子を付着させてもよい。
【００４５】
更に本発明は、その趣旨を逸脱しない範囲で種々の変形が可能であることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明によれば、個々の標的細胞の特質に応じて、薬剤担体粒子や薬剤を設計することができ、例えば標的細胞がガン細胞である場合、ガン細胞の発生場所及び個体ごとに薬剤担体粒子や薬剤を設計する、いわゆるオーダーメード医療を提供することができる。また、実験動物を使用せずに迅速に薬剤のスクリーニングを行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞の物質取り込み評価装置の模式的機器構成図。
【図２】同実施形態における細胞の物質取り込みの様子を示す模式図。
【符号の説明】
【００４８】
２・・・原子間力顕微鏡
３・・・インキュベーター
４・・・光学顕微鏡
２１・・・カンチレバー
２２・・・コロイドプローブ
Ｃ・・・標的細胞
【図１】
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【図２】
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