(57)【要約】【課題】塩基配列を解析するために従来から行われているジデオキシ法では，１回の解析作業で検出できるDNAフラグメント数や塩基長さが制限されるため，DNAフラグメントの全ての塩基配列を解析するには大量のDNAを必要とし，解析作業に多大な時間がかかり，作業効率が極めて悪かった。【解決手段】本発明では，分離したDNAのアンチセンスDNAに対するプライマーの5'末端のビオチン標識と，各塩基を個別に標識する蛍光物質により標識されたdNTP基質を用いたPCR処理と，アンチセンスDNAにおける5'末端側の塩基を酵素による順次遊離する処理と，電気泳動により移動させた遊離した塩基に対して蛍光励起検出手段により，蛍光を検出する処理を効果的に組み合わせることにより，塩基配列の解析に必要なDNAの量を少くすることができると共に，長いDNA断片のまま使用することができ，しかも塩基配列を効率的に解読することができる解析方法を提案するものである。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
解析しようとする二本鎖DNAを熱変性により一本鎖のセンスDNAとアンチセンスDNAに分離する工程と，アンチセンスDNAに対するプライマーの5'末端をビオチン標識すると共に，各塩基を個別に標識する蛍光物質により標識されたdATP，dCTP，dGTP，dTTP基質を用いてPCR処理により二本鎖DNAを所定倍数に増幅する工程と，表面にストレプトアビジンをコーティングした基板を前工程の反応液と接触させ，ストレプトアビジンをセンスDNAに標識されたビオチンに結合することにより，前工程で増幅された二本鎖DNAを基板に固定する工程と，電気泳動用電極を設置し，陽極側に蛍光励起検出手段を設置した処理槽内に前工程の基板を配置し，処理槽内の緩衝液中に添加された酵素によりアンチセンスDNAにおける5'末端側の塩基を順次遊離する工程と，電気泳動用電極に所定電圧を印加して順次遊離した塩基を陽極側に電気泳動させる工程と，順次電気泳動させた塩基に，蛍光励起検出手段において，蛍光励起光を照射し，各塩基に標識された蛍光物質からの蛍光を検出することにより，順次遊離した塩基を特定する工程とから構成されることを特徴とする生物遺伝子の塩基配列解析方法。
【請求項２】
処理槽における陽極側には，蛍光励起検出手段による検出位置との間に，遊離した塩基は通過させ，酵素を通過させないフィルター手段を設けたことを特徴とする請求項１に記載の生物遺伝子の塩基配列解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，生物遺伝子の塩基配列解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物遺伝子にあっては，その塩基配列上において，病気や人種，生活環境等の各種要素を決定する塩基変異（突然変異）やSNPs（塩基多型）が存在している。このため，これら塩基変異や塩基多型を解析することにより病気の診断，テーラーメード医療，新薬の開発，病気や機能遺伝子の特定，個人識別等の利用を可能にしている。
【０００３】
このように塩基変異や塩基多型が存在する生物遺伝子の塩基配列を解析する従来の方法としては，M-G法（Maxam-Gilbert法）や，例えば非特許文献１に示されるジデオキシ法が知られている。
【０００４】
ジデオキシ法はDNA合成酵素を利用した酵素反応を基本とした方法であり，この方法では，DNA合成酵素によりアンチセンスDNAからdNTP（デオキシトリホスフェート）が１個づつ結合するDNA合成反応を行う。このDNA合成反応には，ddNTP（ddN，ジデオキシトリホスフェート）が加えられており，伸長反応にddNが取り込まれると，３’末端がＨ基になることにより次の付加反応が停止する。その際，４種類の塩基（A，C，G，T）に結合するdCTP，dATP，dGTP，dTTPを添加して反応させると，センスDNAのT位置で，dAとddAが取り込まれ，ddAが取り込まれれば，その伸長反応が停止し，反対にdAが取り込まれれば，伸長反応が進み，次のT位置で同様の取込み反応を行う。この結果，合成されたDNAは長さを持つことになり，この反応を他の塩基であるG，T，Cに付いても行うことにより全ての塩基に相当する長さのDNAを合成することになる。こうして生成されたDNAは電気泳動法により塩基長さで分離した後，各塩基に標識された蛍光を検出して塩基を特定することにより遺伝子の塩基配列を解析している。
【０００５】
この他，参考として，従来の塩基配列解析方法には，例えば特許文献１や特許文献２に示されるような方法もある。
【非特許文献１】小池克郎  他編  「分子生物学プロトコール（改訂第２版）」，株式会社南江堂，１９９９年１２月２０日発行，２０３頁〜２１６頁
【特許文献１】特開２００４−１４７５２８号公報
【特許文献２】特開２００４−６１４２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら上記非特許文献１に記載されているようなジデオキシ法では，１回の解析作業で検出できるDNAフラグメント数や塩基長さが制限されるため，DNAフラグメントの全ての塩基配列を解析するには大量のDNAを必要とすると共に，解析作業に多大な時間がかかり，その作業効率が極めて悪かった。
本発明は以上の課題を解決することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以上の課題を解決するために，本発明では，解析しようとする二本鎖DNAを熱変性により一本鎖のセンスDNAとアンチセンスDNAに分離する工程と，アンチセンスDNAに対するプライマーの5'末端をビオチン標識すると共に，各塩基を個別に標識する蛍光物質により標識されたdATP，dCTP，dGTP，dTTP基質を用いてPCR処理により二本鎖DNAを所定倍数に増幅する工程と，表面にストレプトアビジンをコーティングした基板を前工程の反応液と接触させ，ストレプトアビジンをセンスDNAに標識されたビオチンに結合することにより，前工程で増幅された二本鎖DNAを基板に固定する工程と，電気泳動用電極を設置し，陽極側に蛍光励起検出手段を設置した処理槽内に前工程の基板を配置し，処理槽内の緩衝液中に添加された酵素によりアンチセンスDNAにおける5'末端側の塩基を順次遊離する工程と，電気泳動用電極に所定電圧を印加して順次遊離した塩基を陽極側に電気泳動させる工程と，順次電気泳動させた塩基に，蛍光励起検出手段において，蛍光励起光を照射し，各塩基に標識された蛍光物質からの蛍光を検出することにより，順次遊離した塩基を特定する工程とから構成される生物遺伝子の塩基配列解析方法を提案するものである。
【０００８】
また本発明では，上記方法において，処理槽における陽極側には，蛍光励起検出手段による検出位置との間に，遊離した塩基は通過させ，酵素を通過させないフィルター手段を設けることを提案する。
【発明の効果】
【０００９】
以上の構成の本発明では，長いDNAの塩基の夫々を，１つずつ遊離させて蛍光励起検出手段を用いて順次特定することができるので，塩基配列の解析に必要なDNAの量を少なくすることができると共に，長いDNA断片のまま使用することができ，しかも塩基配列を効率的に解読することができるという効果がある。
【００１０】
蛍光励起検出手段による蛍光検出位置に電荷を持つ酵素が流出することを防止するフィルター手段を設けることにより，誤検出，酵素の流出による反応の停止を防止することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
次に本発明を実施するための最良の形態を添付図面を参照して説明する。
図１は本発明に係る塩基配列解析方法の工程の流れを示す流れ図であり，また図２〜図６は各工程における処理例を模式的に示すものである。
【００１２】
まず本発明では，工程Ｓ１において，図２に示すように，解析しようとする二本鎖DNAを，例えば94℃にて加熱処理して，熱変性により一本鎖のセンスDNA（5'……ttcgcgacgt…3'）とアンチセンスDNA(3'……aagcgctgca…5'）に分離する。
【００１３】
次いで工程Ｓ２においては，アンチセンスDNAに対するプライマーの5'末端をビオチン標識すると共に，各塩基(A，G，C，T)を個別に標識する蛍光物質，例えば４色蛍光物質（cy3，cy3.5，cy5，cy5.5）により標識されたdNTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）基質を用いてPCR処理により二本鎖DNAを所定倍数（例えば10万倍）に増幅する。即ち，PCRを行う際，dNTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）基質については，夫々異なった蛍光物質により標識されたものを用い，またアンチセンスDNAに対するプライマー，即ち図３に示すようにセンス鎖側プライマーは，その5'末端側に予めビオチンが標識されたものを用いる。この工程Ｓ２において，二本鎖DNAが増幅された状態を図３に示している。
【００１４】
次いで工程Ｓ３では，表面にストレプトアビジンをコーティングした基板を前工程の反応液と接触させ，ストレプトアビジンをセンスDNAに標識されたビオチンに結合することにより，前工程で増幅された二本鎖DNAを基板に固定する。
【００１５】
工程Ｓ３に対応する図４において，符号２は基板，例えばガラス基板であり，この基板２には予めストレプトアビジンがコーティングされている。この基板２を，例えば上記工程Ｓ２の処理槽１内に浸漬して，処理槽１内の二本鎖DNAを基板２にコーティングされているストレプトアビジンと反応させ，センスDNAに標識されたビオチンをストレプトアビジンに結合させることにより，二本鎖DNAを基板２に固定する。即ち，ストレプトアビジンはセンスDNAの5'末端に標識されたビオチンに対し，アフィニティ特性を有し，ビオチンと共有結合することにより基板２上に二本鎖DNAを固定させることができる。
【００１６】
次いで工程Ｓ４では，電気泳動用電極を設置し，陽極側に蛍光励起検出手段を設置した処理槽内に前工程の基板を配置し，処理槽内の緩衝液中に添加された酵素によりアンチセンスDNAにおける5'末端側の塩基を順次遊離する。
【００１７】
即ち，工程Ｓ４に対応する図５において，符号３は上記基板２をセット可能な処理槽であり，この処理槽３の図中右側には電気泳動用の陽極５を設けると共に，図中左側には陰極４を設けている。また陽極５側には絞った経路６を形成しており，その外側に，蛍光励起光源８と蛍光検出手段９とから成る蛍光励起検出手段７を構成している。また，処理槽３における陽極５側には，蛍光励起検出手段７による検出位置，この場合，経路６との間に，遊離した塩基１１は通過させ，酵素を通過させないフィルター手段１０を設けている。このフィルター手段１０は，例えばメンブレンにより構成することができる。
【００１８】
以上の構成において，処理槽３内に充填した緩衝液に添加した酵素は，触媒反応によりアンチセンスDNAにおける5'末端側の塩基を所定時間（例えば30〜60秒）毎に順次遊離（切断）させる。図５中，符号１１は遊離した塩基を示すものである。
【００１９】
次いで，図６に示すように，工程Ｓ５においては，上記酵素による塩基の遊離（切断）のタイミングにほぼ同期させて，陰極４及び陽極５間に所定の電圧（例えば2000V）を印加することにより，遊離した塩基１１を陽極５方向に電気泳動させて，フィルター手段１０を通して経路６に至らせ，次いで工程Ｓ６において，遊離した塩基１１に蛍光励起光源８から励起光を照射し，これにより塩基に標識された蛍光物質に特有な蛍光を蛍光検出手段９により検出し，蛍光から塩基を特定する。
【００２０】
次いで工程Ｓ７においては，全ての塩基についての解析が完了したか否かを判定し，完了していない場合には工程４に移行して，上述した工程４〜工程６の処理を行い，このようにして工程４〜工程６の処理を繰り返して行って，全ての塩基についての解析が完了した場合には，処理を終了する。
【００２１】
このように，本発明では，解析しようとする長いDNAの塩基を，アンチセンスDNAの5'末端側から１つずつ遊離させて順次特定することができるので，使用するDNAの量を少なくすることができ，しかも塩基配列を効率的に解読することができるという効果がある。
【実施例１】
【００２２】
次に本発明を実施した実験例を説明する。
１．処理槽３の緩衝液に添加する酵素
酵  素    EC.No.:3.1.11.3，Lambda  Exonuclease，MKFRLGGFEAIKSAYMAQVQYSMWVTRKDAWYFANYDPRMKREGLHYVVIERNEKYMASFDEMVPEFIEKMDEALAEIGFVFGEQWRを，カルバモイルリン酸のリン酸基と総合作用しているArg52を側鎖のないGlyに変換して改変した酵素を使用する。このGly52変異体は原型と比較して活性が低下した特性を有しているが，オルニチン及びカルバモイルリン酸に対してアロステリック効果を示す特質を有している。
２．処理槽３の緩衝液の組成
10×buffer：0.67M glysine-KOH(pH9.3) and
25mM MgCl2
３．処理槽３内の反応液
ゲノムDNA PCR product(0.1ug/uL)        15μL
10×反応Buffer                          5μL          1×
dH2O                                 28.5μL
酵素（Exonuclease）(10U/μL)          1.5μL        0.4U/uL
全量                                   50μL
３．処理条件
上記処理槽３内の反応液を37℃に維持して反応を行わせると共に，30〜60秒毎に陰極，陽極５間に2000Vの電圧を印加して電気泳動を行い，酵素により遊離された塩基を電気泳動によって切り離して陽極側へ流して，蛍光励起検出手段により蛍光を検出し，遊離した塩基を順に特定してDNAの塩基配列を解読する。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明は以上のとおりであるので，長いDNAの塩基の夫々を，１つずつ遊離させて蛍光励起検出手段を用いて順次特定することができるので，塩基配列の解析に必要なDNAの量を少なくすることができると共に，長いDNA断片のまま使用することができ，しかも塩基配列を効率的に解読することができるという効果があり，産業上の利用可能性が大である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明に係る塩基配列解析方法の工程の流れを示す流れ図である。
【図２】本発明の工程における処理例を模式的に示すものである。
【図３】他の工程における処理例を模式的に示すものである。
【図４】更に，他の工程における処理例を模式的に示すものである。
【図５】更に，他の工程における処理例を模式的に示すものである。
【図６】更に，他の工程における処理例を模式的に示すものである。
【符号の説明】
【００２５】
１        処理槽
２        基板（ガラス基板）
３        反応処理槽
４        陰極
５        陽極
６        経路
７        蛍光励起検出手段
８        蛍光励起手段
９        蛍光検出手段
１０      フィルター手段
１１      遊離した塩基
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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