(57)【要約】【課題】ビニング動作する複数のラインセンサ、あるいは、エリアセンサを用いて画像を読み取る画像読取装置を用いて、光学顕微鏡により取得された画像情報を使用して、回折限界より小さな蛍光粒子等の位置を計算する際に、画像読取装置のフレームレートを向上させ、さらに位置の計算精度を低下させることのない解析方法を提供する。【解決手段】投影素子の複数の画素にまたがる素材の光の強度分布を所定の分布関数に基づいて一軸方向の位置を解析し、かつ、解析された一軸方向に直行する軸方向に対して、複数の画素にまたがる強度分布から理論的な複数の画素おける光強度の差分に対する光の位置の相関表を計算し、実際に投影された複数の画素おける光強度の差分から、相関表を使用して位置を計算する位置解析方法である。【選択図】  図２
2007114130.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学顕微鏡を通して、光を受光する投影素子からの信号を画像処理装置で処理して光を発光させる素材の位置を計算する位置解析方法において、
前記位置解析方法は、投影素子の複数の画素にまたがる素材の光の強度分布を所定の分布関数に基づいて一軸方向の位置を解析し、かつ、解析された一軸方向に直行する軸方向に対して、複数の画素にまたがる強度分布から理論的な複数の画素おける光強度の差分に対する光の位置の相関表を計算し、実際に投影された複数の画素おける光強度の差分から、相関表を使用して位置を計算する
ことを特徴とする位置解析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の位置解析方法において、
前記投影素子が、１もしくは２つのラインセンサ又は二次元に配置されたエリアセンサである
ことを特徴とする位置解析方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の位置解析方法において、
前記素材が、蛍光を発光する蛍光粒子あるいは蛍光色素分子であって、回折限界より小さい
ことを特徴とする位置解析方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかに記載の位置解析方法において、
前記所定の分布関数が、ガウス関数である
ことを特徴とする位置解析方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかに記載の位置解析方法において、
前記複数の画素にまたがる光強度の差分は、テーラー展開して計算する
ことを特徴とする位置解析方法。
【請求項６】
光学顕微鏡を通して、光を受光する投影素子からの信号を処理して、光を発光させる素材の位置を計算する画像処理装置を備える位置解析装置において、
前記画像処理装置は、素材の光の強度分布をガウス関数に基づいて一軸方向の位置を解析し、解析された一軸方向に直行する軸方向に対して、複数の画素にまたがる強度分布から理論的な複数の画素おける光強度の差分に対する光の位置の相関表を計算し、実際に投影された複数の画素おける光強度の差分から、相関表を使用して素材の位置を計算する
ことを特徴とする位置解析装置。
【請求項７】
請求項６に記載の位置解析装置において、
前記位置解析装置は、請求項２ないし４のいずれかに記載の位置解析方法を用いる
ことを特徴とする位置解析装置。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の位置解析装置において、
前記位置解析装置は、前記センサを備える受光面に直行する二辺に接続された二つの駆動装置と該駆動装置を制御するための制御装置とを設け、
該制御装置及び駆動装置を制御することで、移動する素材の位置を追跡し、その追跡情報を記憶する
ことを特徴とする位置解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学顕微鏡により取得された画像情報を使用して、粒子の位置を計算し、時間経過を追跡することができる位置解析方法、およびこの位置解析方法を用いることで粒子等の素材の位置を解析し、且つ、追跡する位置解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
小さすぎて肉眼では見ることのできない蛋白質は、エバネッセント蛍光顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡などの蛍光顕微鏡を用いて、観察の対象となる蛋白質に蛍光粒子を付加し、蛍光粒子から発せられる信号から、蛍光粒子の位置、すなわち、蛋白質の位置を継時的に検出することで、前記蛋白質の挙動および状態を解析する。
この解析方法に関しては、特許文献１に開示されている。上記の方法では、蛋白質の挙動を妨害しないように、蛍光粒子は出来る限り小さな方が良い。蛋白質を蛍光標識するための物質として、蛍光色素分子を用いるのが一般的である。特に蛍光色素分子として蛍光蛋白質を用いる場合、遺伝子工学的に標的蛋白質に融合させることができる。
【０００３】
蛍光粒子あるいは蛍光色素分子の位置を計算する方法は、非特許文献１に挙げられる。非特許文献１では、光学顕微鏡下において、回折限界より直径の小さな粒子の位置は、蛍光強度分布が近似的に二次元ガウス分布に従う事を利用して、デジタル画像デ−タから、蛍光強度を重みとした重心位置として計算される。非特許文献１によると、二次元ガウス関数で近似計算する事が、前記蛍光粒子あるいは蛍光色素分子の重心位置を計算する方法として最も精度が良いとされている。
前記蛍光粒子あるいは蛍光色素分子の蛍光像を撮影するために、多くの場合において、ラインセンサ、あるいは、エリアセンサが使われる。ラインセンサとは、受光した光情報を電気信号に変換する半導体で作られた投影素子が１列だけに配置された、光学センサである。ラインセンサを用いたビデオカメラでは、像を線視野で捉え、一定ピッチ毎に平均した走査を行うことで、二次元的なビデオ信号を出力する。エリアセンサでは前記投影素子が二次元に配置されており、エリアセンサを用いたビデオカメラでは、センサを走査する必要がない。デジタルＣＣＤカメラなど、ラインセンサやエリアセンサを用いて画像を読み取る画像読取装置のフレームレートは、露光時間と読み出し時間により決定される。従って、デジタル画像デ−タの複数の画素をまとめて一つの画素（ビン）として処理（ビニング）することにより、像の解像度は低下するが、フレームレートは向上する。しかし、デジタルＣＣＤカメラではＣＣＤチップの構造上、直列レジスタ方向のビニングでは、フレームレートを向上させることはできない。
【０００４】
非特許文献１の方法で、蛍光粒子あるいは蛍光色素分子の位置を計算した場合、その位置精度は、非特許文献２に書かれている以下の式で示される。
【数１】
2007114130.tif 000003
ここで、ｓは点像分布関数の標準偏差、ａは画素の大きさ（画像上での１画素の一辺の距離）、Ｎは総フォトン数、ｂは背景光である（ただし、ｓ＞ａ）。
【０００５】
［数１］で表された数式（以下、同様に記載する。）によると、画素数の減少は精度の低下にそれほど影響を与えない。ｓ＜ａの場合、わずか数画素で蛍光粒子あるいは蛍光色素分子の像を表さなければならず、事実上、計算機による二次元ガウス関数近似は不可能である。従って、非特許文献１に記載の二次元ガウス関数近似法により、蛍光粒子あるいは蛍光色素分子の重心位置を計算する場合には、画素の大きさが、点像分布関数の標準偏差を越えない程度しかビニングを行うことはできない。
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−２９４６３１号公報
【非特許文献１】Ｃｈｅｅｚｕｍ，Ｍ．Ｋ．，  Ｗ．Ｆ．Ｗａｌｋｅｒ,  ａｎｄ  Ｗ．Ｈ．Ｇｕｉｌｆｏｒｄ．  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｂｏｉｏｐｈｙｓ．ｊ．（２００１），８１：２３７８−２３８８
【非特許文献２】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｅ．；Ｌａｒｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．；Ｗｅｂｂ，Ｗ．Ｗ．Ｐｒｅｃｉｓｅ  ｎａｎｏｍｅｔｅｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．（２００２），８２，２７７５−２７８３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明では、ビニング動作する複数のラインセンサ、あるいは、エリアセンサを用いて画像を読み取る画像読取装置を用いて、光学顕微鏡により取得された画像情報を使用して、回折限界より小さな蛍光粒子又は蛍光色素分子の重心位置を計算する際に、点像分布関数の標準偏差を越えたビニングを行い、上記画像読取装置のフレームレートを向上させ、さらに上記重心位置の計算精度を低下させることのない位置解析方法を提供すること、及び、その原理を用いて、運動する蛍光粒子又は蛍光色素分子の位置を解析し、さらに追跡する位置解析装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための手段として、本発明は以下の特徴を有している。
本発明は、本発明は、光を受光する投影素子が１列だけに配置された、ひとつ、あるいは、複数のラインセンサ、あるいは、該投影素子が二次元に配置されたエリアセンサを用いて、該撮像素子の素子数をまとめて一つの画素（ビン）として解析処理（ビニング）できる画像処理装置を装着した光学顕微鏡で、前記画像読取装置から読み込んだ画像情報から、直径が回折限界より小さな蛍光粒子あるいは蛍光色素分子の位置を計算する方法であって、前記画像情報のｙ軸のみの画素デ−タを該蛍光粒子あるいは蛍光色素分子の蛍光像が二つのビンに投影されるようにビニングを行い、直径が回折限界より小さな蛍光粒子あるいは蛍光色素分子の蛍光像の強度分布が、所定の関数、例えば、ガウス関数によるガウス分布に近似的に従うことを利用して、前記蛍光粒子の画像情報におけるｘ軸の画素デ−タ列をガウス関数で近似することでｘ軸座標位置を計算すると共に、前記蛍光像のｙ軸方向における強度分布を計算し、前記強度分布から理論的なｙ軸の二つのビンおける蛍光強度の差分に対する前記蛍光像のｙ軸座標位置の相関表を計算し、実際に投影されたｙ軸の二つのビンおける蛍光強度の差分から、前記相関表を使用して、ｙ軸座標位置を計算する位置解析方法を提供する。
【０００９】
また、二つのラインセンサと、該ラインセンサに対応する二つの出力情報を保持するためのＣＣＤレジスタと、受光面に、該ラインセンサと該ＣＣＤレジスタを配置し該受光面を二次元的に駆動させるために該受光面に直行する二辺に接続された二つの駆動装置と、該駆動装置を制御するための二つの制御装置と、ガウス関数による近似を行い、該受光面上における直径が回折限界より小さな蛍光粒子あるいは蛍光色素分子のｘ軸座標位置を計算する画像処理装置と、該ＣＣＤレジスタの値を全て加算する二つの回路と、該二つの加算回路の出力信号の差分を抽出する差分回路と、該画像処理装置からの出力信号と該差分回路からの出力信号を使用して、該受光面上における該蛍光粒子あるいは蛍光色素分子のｙ軸座標位置を計算する計算処理装置と、該ｘ軸座標位置とｙ軸座標位置と該二つの制御装置の現在位置を記録する記録装置を備え、該受光面の中心位置に該蛍光粒子あるいは蛍光色素分子のｘ軸座標位置とｙ軸座標位置が位置決めされるように、該制御装置及び駆動装置を制御することで、移動する蛍光粒子あるいは蛍光色素分子を追跡することを可能とする位置解析装置を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
上記課題を解決するための手段により、本発明の位置解析方法では、回折限界以下の大きさの蛍光粒子および蛍光色素分子の位置を解析し、さらに、時間経過を追跡する際の時間分解能を向上させることができる。また、本発明の位置解析方法では、画像処理を行うに当たり、画像情報を減らすので、計算処理時間が短縮される。また、本発明の位置解析装置では、エバネッセント蛍光顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡などの蛍光顕微鏡を用いて、ｎｍ（ナノメートル）、ｍｓ（ミリ秒）の精度で蛋白質の挙動および状態を観測、追跡して、蛋白質機能解析をすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明を実施するための最良の形態を、図面を参照しながら説明する。ただし、これらは一実施形態にすぎず、本発明の特許請求の範囲を限定するものではない。
【００１２】
まず、非特許文献１、２に示される蛍光粒子又は蛍光色素分子のｘｙ座標系における位置を計算する方法を以下に記す。回折限界より小さな蛍光粒子又は蛍光色素分子（以下、単に蛍光粒子と記す）の像は、近似的に、以下に示す二次元ガウス分布に従う。
【数２】
2007114130.tif 000004
ここで、（ｘ０，ｙ０）は、ｘ、ｙ軸からなる座標系における蛍光粒子の重心位置、σｘｙは標準偏差、Ｉは蛍光粒子の重心位置における粒子が発する蛍光強度、Ｃは背景光を表す。
デジタル処理を行う場合、この分布は離散化される。光学顕微鏡から得られる上記蛍光粒子のデジタル画像デ−タを［数２］で近似計算することによって、ｘｙ座標系における得られる上記蛍光粒子の位置を取得することができる。
【００１３】
本実施形態では、ビニング動作する複数のラインセンサ、あるいは、エリアセンサを用いて画像を読み取る画像読取装置として、デジタルＣＣＤカメラを用いた。ここで用いた光学顕微鏡において、点像分布関数の標準偏差は２３８ｎｍ、画素（ｐｉｘｅｌ）の大きさは４９ｎｍである。また、蛍光粒子の直径は約１０ｎｍ、発するフォトンは約３５００ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍｓ、カメラのフレームレートは２ｍｓ（フレ−ム転送式）である。
図１に本実施例におけるビニング数と実際の近似計算の精度の相関を示す。ビニングは、ｘ、ｙ軸、すなわち、ＣＣＤカメラにおける並列レジスタ（ｘ）、直列レジスタ（ｙ）の両方に関して行った。図１において、例えば、ビニング数５とは、ｘ、ｙ軸のそれぞれの５つの画素を１つの画素として処理し、情報量を１／２５に減らすことを表す。図１では、横軸にビニング数、縦軸は３００枚の画像について近似計算を行った時の標準偏差を示す（［数１］におけるΔｘ）。上記標準偏差は、近似計算における位置精度を表す。ビニング数が４を超えると精度が低下する。従って、［数２］の近似による蛍光粒子の重心位置計算の計算精度を保ちつつビニングを行う場合、最大で４画素のビニングが可能であるから、ＣＣＤカメラからの読み出し時間は、ビニングを行わない場合と比べて、最大でも４倍である。
【００１４】
次に、本発明における位置解析方法を図２のフロ−チャ−トに従い説明する。
最初にデジタルＣＣＤカメラから、ビニングした画像情報を取得する。デジタルＣＣＤカメラにより画像を取得する際に、ｙ軸方向、すなわち、直列レジスタのみビニングをする。図３に本実施例におけるビニングの方法を示す。図３（ａ）は、直径１０ｎｍの蛍光粒子の蛍光像である。各画素は２５６階調である。図３（ｂ）は図３（ａ）に示す蛍光像を、画素の値をＺ軸にプロットした等高線グラフである。図３（ｂ）を二次元ガウス関数で近似する。焦点があっていれば、前記二次元ガウス関数における標準偏差は、点像分布関数の標準偏差と等しい。図３（ｂ）を二次元ガウス関数で近似した場合、標準偏差は、４．８５ｐｉｘｅｌ（２３８ｎｍ）となる。上記点像分布は、ｙ軸方向の２つのビンにのみ投影される様に、ビニング数は、ビンの大きさが、使用している光学系における点像分布関数の標準偏差の３〜４倍程度にする。図３（ｃ）に示すように、本実施例では、ｙ軸方向の１６画素をビニングした。図３（ｃ）のｙ軸上のそれぞれの画素の値を縦軸に、ｘ軸上の画素番号を横軸にプロットしたグラフが図３（ｄ）である。本実施例では、直列レジスタ方向に１６画素のビニングを行っているので、デジタルＣＣＤカメラの読み出し時間は、ビニングを行わない場合と比べて１６倍早い。本実施例におけるデジタルＣＣＤカメラでは、ＣＣＤチップが出力するアナログ信号をデジタルに変換し、コンピュ−タへとデ−タを転送する。また、本実施例で用いたデジタルＣＣＤカメラは、フレ−ム転送型であるから、露光時間は、フレームレートに加算しなくて良い。したがって、本実施例におけるデジタルＣＣＤカメラのフレームレートは、読み出し時間とコンピュ−タへのデ−タ転送時間の加算となる。本実施例においては、１６画素のビニングを行うことによって、フレームレートは６倍向上した。上記の方法で得られた画像情報から、蛍光粒子のｘ座標位置、および、ｙ座標位置をそれぞれ計算する。
【００１５】
まず、蛍光粒子のｘ座標における位置を求める。図３（ｃ）の画像をｙ軸方向に加算し、一次元のデ−タ列にする。これは、図３ｂに示すガウス分布をｘ軸方向に投影するのと等価である。上記デ−タ列を以下に示す一次元ガウス関数により近似する。
【数３】
2007114130.tif 000005
ここで、ｘ０は、蛍光粒子のｘ軸上の重心位置、σは標準偏差、Ｉは蛍光粒子の重心位置における粒子が発する蛍光強度、Ｃは背景光を表す。これにより、蛍光粒子のｘ軸上の重心位置が求まる。
【００１６】
次に、蛍光粒子のｙ座標における位置を求める。本実施例では、図３（ｄ）に示すように、二つのビンに投影された蛍光粒子の画像は、各ビンにおいて、一次元ガウス分布で表される。上記の二つのビンに投影された蛍光粒子の画像について、それぞれ［数３］の一次元ガウス関数で近似し、近似パラメータのＩをＩＡ、ＩＢとして記録しておく。上記近似計算の際、ＩＡ、ＩＢ以外の近似パラメータは、ｘ座標における位置を求める際に行った近似解の値を代入し固定値とすることにより、反復計算処理の速度が向上する。蛍光粒子の蛍光像は、ｙ軸の二つの画素に投影されるので、理論上、ＩＡ、ＩＢは、下式に従う。
【数４】
2007114130.tif 000006
ここで、ｙ０は、蛍光のｙ軸上の重心位置、σは標準偏差、ｂiｎはビニング数を表す。また、ｂiｎがσに比べ十分大きい場合は、ｂiｎ＝∞としてもよい。
【００１７】
Ｉ＝ＩＡ＋ＩＢであるから、ＩＡ、ＩＢの差分ｄｉｆｆ（ｙ０）を、
【数５】
2007114130.tif 000007
と定義する。
【００１８】
その逆関数は、
【数６】
2007114130.tif 000008
となり、ＩＡ、ＩＢから、蛍光粒子のｙ軸上の重心位置が計算できる。
焦点の多少のずれにより、σの値が変化し、点像分布関数の標準偏差から離れる。図４に、σを変化させたときの、（ＩＡ−ＩＢ）／（ＩＡ＋ＩＢ）とｙ０の理論上の相関である［数４］をプロットしたグラフを示す。図４のグラフをキャリブレ−ションテ−ブルとして用いて、ＩＡ、ＩＢから、蛍光粒子のｙ軸上の重心位置ｙ０を求めることができる。
【００１９】
しかしながら、［数５］、［数６］を、解析的に求めることは非常に困難である。そこで、式を簡略化するため、また、計算処理を高速化するため、［数６］を予め数値計算により求め、５次関数で近似した式を用いる。この作業は、［数６］をテイラ−展開したことと等価である。また、［数６］は点対称であるから、偶数項は省き、［数７］を［数６］の近似式とする。
【数７】
2007114130.tif 000009
［数７］では、簡単の為、−８〜８ｐｉｘｅｌを０〜１と線形変換している。ｇ１、ｇ２、ｇ３はそれぞれ、σの関数である。図５はｇ１、ｇ２、ｇ３はとσの相関を表した各グラフである。ｇ１、ｇ２、ｇ３もまた５次関数として近似することができる。
【００２０】
本実施例における、ｇ１、ｇ２、ｇ３は、以下に示す［数８］とした。
【数８】
2007114130.tif 000010
ただし、ξ＝σ／１６ｐｉｘｅｌｓであり、有効桁数は５桁までしか表記していない。図５におけるプロットは、理論値であり、実線は、［数８］で表される関数を示している。図５の理論値に対する［数８］の近似曲線のＲ−２乗値は、１．０（少数点以下７桁繰上げ）であり、［数８］は丸め誤差範囲以内で理論値にほぼ一致する。以上により、［数６］は、［数７］、［数８］で示す、σと（ＩＡ−ＩＢ）／（ＩＡ＋ＩＢ）の高次多項式として近似できる。図６は、σを変化させたときの、（ＩＡ−ＩＢ）／（ＩＡ＋ＩＢ）とｙ０の関係の理論値と、［数７］、［数８］を用いて計算した値を示した図である。図６中の○△□は、図４を離散化したプロットであり、三つの線は、σを変化させ［数７］、［数８］を用いて計算した値である。近似曲線のＲ−２乗値は、０．９９９６〜１．０（少数点以下７桁繰上げ）であるから、［数７］、［数８］は、［数６］にほぼ等しいと言える。
【００２１】
本実施例で用いた光学顕微鏡において、上記の方法を用いて、図３の蛍光粒子の位置を計測した位置精度は、ｘ軸方向で３ｎｍ、ｙ軸方向で３ｎｍであった。従来の方法（二次元ガウス関数による近似）で、同様の輝点の位置を計測した位置精度は、ｘ軸方向、ｙ軸方向共に３ｎｍであった。本発明では、ｙ座標の位置を計算するために、蛍光粒子が発する蛍光強度を用いるため、蛍光粒子の明滅や異方性が、ｙ軸方向の位置精度を低下させてしまう。しかしながら、本発明では、［数５］に示すように、差分（ＩＡ−ＩＢ）を加算（ＩＡ＋ＩＢ）で割ることにより蛍光強度の項を除去するため、蛍光粒子の明滅や異方性のｙ軸方向の位置精度への影響はなく、従来の方法に比べて、ｙ軸方向の情報が１６分の１に低下しているにも係わらず、位置精度は、低下していない。時空間分解能は、デジタルＣＣＤカメラの画像取得時間は、本実施例においては６倍向上しているので、ｘ、ｙ軸両方向で、３ｎｍ／ｍｓ→１．２ｎｍ／ｍｓ（従来法→本発明）と向上している。
【００２２】
本手法の位置精度もまた、従来法と同様に、蛍光粒子の発する総フォトン数に依存する。総フォトン数が十分に大きい場合（回折限界より小さなポリエステルビ−ズの暗視野像等）で、本手法の位置精度は、ｘ軸方向、ｙ軸方向共に０．６ｎｍであった。従来の方法で、同様の輝点の位置を計測した位置精度は、ｘ軸方向、ｙ軸方向共に０．６ｎｍであった。このように、本発明によれば、ビニングによるデジタルＣＣＤカメラの取得する画像情報の低下に係わらず、蛍光粒子の位置計測の計算精度を低下させることはない。
以上に記した計算方法を用いて、フレ−ム毎に蛍光粒子のｘｙ座標における位置を計算することで、その動きを追跡することができる。図７は、本実施例で用いた光学顕微鏡において、１０ｎｍ毎に階段状に駆動する直径が約１０ｎｍの蛍光粒子を本手法により追跡したグラフである。上記蛍光粒子の発するフォトン数は、５０００ｐｈｏｔｏｎｍｓであり、この条件での位置精度は、ｘ軸方向で１．９ｎｍ、ｙ軸方向で２．０ｎｍであった。図７ａは、ｘ軸に沿って駆動した蛍光粒子を追跡、図７ｂはｙ軸に沿って駆動した蛍光粒子を追跡した時間経過を表すグラフである。図７のグラフによれば、本実施例において、ビニングなしの状態でフレームレートが最速２ｍｓのＣＣＤカメラを用いて、蛍光粒子の運動を、３３０μｓのフレームレートで、数ｎｍの精度で取得できる。
【００２３】
次に、本発明における解析方法を用いて、蛍光粒子を追跡する位置解析装置を、図８を用いて説明する。二つのラインセンサ８０１、８０２および、対応するＣＣＤレジスタ８０３、８０４を１つのステ−ジ８０５上に配置する。受光面であるステ−ジは、二つの駆動装置８０６、８０７によってＸ、Ｙ軸に沿って二次元的に駆動可能である。ラインセンサ８０１はＣＣＤレジスタ８０３に、ラインセンサ８０２はＣＣＤレジスタ８０４にそれぞれ信号を送る。ＣＣＤレジスタ８０３、８０４からの信号は、画像処理装置８０８にて、それぞれの画素が加算処理され、ガウス関数［数３］によって近似される。
【００２４】
画像処理装置８０８によって、ステ−ジ８０５上における蛍光粒子のｘ座標上の位置（Ｘ）が計算される。加算回路８０９、８１０は、ＣＣＤレジスタ８０３、８０４の信号をそれぞれ加算して電圧信号を差分回路８１１に渡す。差分回路８１１は、加算回路８０９、８１０から渡された電圧信号を差分した電圧信号を計算装置８１２に渡す。計算装置８１２には、画像処理装置８０８からガウス関数近似の結果から得られるパラメータを受け取り、［数６］，［数７］を用いて、差分回路８１１により渡された差分電圧から、ステ−ジ８０５上における蛍光粒子のｙ座標上の位置（Ｙ）を計算する。Ｘ、Ｙは、記録装置８１３によって記録される。駆動装置８０６、８０７を制御する制御装置８１４、８１５は現在のステ−ジの位置を記録装置８１３に送る。その後、駆動装置８０６を制御する制御装置８１４は、Ｘを受け取り、ステ−ジの中心が輝点の中心に来るように駆動装置８０６を制御する（フィ−ドバック回路を用いても良い）。
同様に、駆動装置８０７を制御する制御装置８１５は、Ｙを受け取り、ステ−ジの中心が輝点の中心に来るように駆動装置８０６を制御する。記録装置８１３には、上記のル−プの度に、ステ−ジの現在の位置と蛍光輝点のステ−ジ上における位置が記録される事になる。以上の装置を用いることで、運動する蛍光輝点の中心位置を、追跡し続けることが可能である。駆動装置８０６、８０７は、ステ−ジ８０５すなわち受光面を移動させるが、顕微鏡ステ−ジを移動させるなどして、顕微観察する標本を移動させても良い。
【００２５】
本発明の応用は、顕微鏡下における直径が回折限界より小さな蛍光粒子、あるいは、蛍光色素分子の追跡に限らない。例えば、天体観測における、星の輝点の重心位置計算にも用いることができる。ビニングすることにより、計算処理が早くなるとともに、見かけ上画素が大きくなるので、より多くのフォトンを集めることができ背景光の軽減になる。さらに、本実施例では、蛍光粒子は、光学系の回折限界よりも小さいとしている。そのため、得られる蛍光像が近似的にガウス分布に従うとしている。
本発明は、光学系の回折限界よりも小さい蛍光粒子の場合に限らない。得られる像が点対称かつ線対称であれば、像を近似するための理論式さえ用意しておけば、本発明における計算アルゴリズムを使用することが可能である。従って、本発明は、粒子の重心を計算する為のデジタル計算処理を行う全てに利用可能である。
特に、粒子の流れを計測する流体力学の分野や、蛍光体を関節に取り付け、動きをキャプチャ−する（野球の投球モ−ションをキャプチャ−する場合に用いられる技術で、肘や手首などに蛍光体を取り付け、その動きを見る）バイオメカニクスやコンピュ−タシミュレ−ションなど、粒子あるいは蛍光体が運動する場合に有効である。
その他、様々な用途に応用できるが、一部を以下に記す。医療においては、血液中の血球の動き、細胞、最近の運動、ＤＮＡチップなどの分析等、製造・検査分野では、傷や汚れ、変色、気泡、その他の異物の検査等、鉱物における化石・鉱石、研磨形状や気泡などの検出等である。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明によって開発された蛍光粒子あるいは蛍光色素分子の重心位置計算方法は、微小空間像を含む全ての動画像内を移動する移動粒子を追跡する動画像デ−タに基づく移動物体を追跡する方法として用いることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】従来の手法による、ビニング数と計算位置精度の相関を示すグラフである。
【図２】本発明の実施形態に係る計算処理の流れ図である。
【図３】（ａ）は、本発明の実施形態に係る蛍光粒子の蛍光像である。（ｂ）は、本発明の実施形態に係る蛍光粒子の蛍光像の蛍光強度をｚ軸にプロットした等高線グラフである。（ｃ）は、本発明の実施形態に係る蛍光粒子のビニング後の蛍光像である。（ｄ）は、本発明の実施形態に係る蛍光粒子のビニング後の蛍光像の各ビンにおける蛍光強度分布を示すグラフである。
【図４】本発明の実施形態に係る、ビンにおける蛍光強度の差分に対する蛍光粒子のｙ座標における位置の理論値を示すグラフである。
【図５】本発明の実施形態に係る、［数６］におけるσに対するｇ１、ｇ２、ｇ３はの理論値と、［数７］を示すグラフである。
【図６】本発明の実施形態に係る、ｙ軸方向のビンにおける蛍光強度の差分に対する蛍光粒子のｙ座標における位置の理論値と、本手法における近似曲線を示すグラフである。
【図７】本発明の実施形態に係る解析手法を用いて、１０ｎｍ毎に階段状に動く直径１０ｎｍの蛍光粒子の運動を追跡したグラフである。
【図８】本発明の実施形態に係る解析手法を用いて、粒子位置追跡装置のブロック図である。
【符号の説明】
【００２８】
８０１  ラインセンサ
８０２  ラインセンサ
８０３  ラインセンサ８０１に対応したＣＣＤレジスタ
８０４  ラインセンサ８０２に対応したＣＣＤレジスタ
８０５  ステ−ジ
８０６  駆動装置（Ｘ軸用）
８０７  駆動装置（Ｙ軸用）
８０８  画像処理装置
８０９  加算回路
８１０  加算回路
８１１  差分回路
８１２  計算装置
８１３  記録装置
８１４  駆動装置８０６を制御する制御装置（Ｘ軸用）
８１５  駆動装置８０７を制御する制御装置（Ｙ軸用）
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図３】
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