(57)【要約】【課題】  生体関連物質解析用試験片の製造に際して、担体表面の化学処理の結果を検査して品質良好な担体を選別でき、簡便な製造工程で得られる生体関連物質解析用試験片の品質検査方法、製造方法および製造装置ならびに該試験片を用いた生体関連物質の解析方法を提供する。【解決手段】  担体上に、生体関連物質に対する特異的結合物質を固定化する固定化物質を結合させて処理担体とする固定化物質結合工程と、前記処理担体上の固定化物質の量を測定する測定工程と、前記処理担体上の固定化物質に特異的結合物質を固定化する特異的結合物質固定化工程とを有する生体関連物質解析用試験片の製造方法および各手段を備えた製造装置。さらに特異的結合物質を固定化する前に、処理担体上に結合された固定化物質の量を測定する生体関連物質解析用試験片の品質検査方法および前記測定結果を用いて生体関連物質の定量結果を補正する生体関連物質の解析方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体上に、生体関連物質に対する特異的結合物質を固定化する固定化物質を結合させて処理担体とし、該処理担体上の固定化物質に特異的結合物質を固定化して得られる生体関連物質解析用試験片の品質検査方法であって、
特異的結合物質を固定化する前に、処理担体上に結合された固定化物質の量を測定することを特徴とする生体関連物質解析用試験片の品質検査方法。
【請求項２】
前記固定化物質の量の測定を、該固定化物質に特有の波長の光を照射した時の、光の吸収値または透過率を測定することで行うことを特徴とする請求項１に記載の生体関連物質解析用試験片の品質検査方法。
【請求項３】
前記光の照射が、赤外光の照射であることを特徴とする請求項２に記載の生体関連物質解析用試験片の品質検査方法。
【請求項４】
担体上に、生体関連物質に対する特異的結合物質を固定化する固定化物質を結合させて処理担体とする固定化物質結合工程と、前記処理担体上の固定化物質の量を測定する測定工程と、前記処理担体上の固定化物質に特異的結合物質を固定化する特異的結合物質固定化工程とを有することを特徴とする生体関連物質解析用試験片の製造方法。
【請求項５】
担体上に、生体関連物質に対する特異的結合物質を固定化する固定化物質を結合させて処理担体とし、該処理担体上の固定化物質の量を測定し、該処理担体上の固定化物質に特異的結合物質を固定化して得られる生体関連物質解析用試験片を用いた生体関連物質の解析方法であって、
前記生体関連物質解析用試験片を用いて得られた生体関連物質の定量結果を、前記測定結果を用いて補正することを特徴とする生体関連物質の解析方法。
【請求項６】
担体上に、生体関連物質に対する特異的結合物質を固定化する固定化物質を結合させて処理担体とし、該処理担体上の固定化物質に特異的結合物質を固定化して得られる生体関連物質解析用試験片の製造装置であって、
固定化物質に特有の波長の光を照射する光照射手段と、光を照射した時の光の吸収値または透過率を測定する測定手段と、処理担体上に特異的結合物質を供給する特異的結合物質供給手段と、処理担体を測定手段から供給手段へ搬送する搬送手段と、情報記録素子を処理担体に付加する付加手段と、前記測定結果の情報を情報記録素子に記録する記録手段と、を有することを特徴とする生体関連物質解析用試験片の製造装置。
【請求項７】
担体上に固定化物質を供給する固定化物質供給手段を有することを特徴とする請求項６に記載の生体関連物質解析用試験片の製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子等の生体関連物質の解析等に用いることが可能な、生体関連物質解析用試験片の品質検査方法、製造方法および製造装置ならびに該試験片を用いた生体関連物質の解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝情報の解析方法は、主として二つに分類できる。すなわち、一つは、遺伝子（ＤＮＡ）自体及び遺伝子から発現するｍＲＮＡやタンパク質が「どのようなものであるか」について解析する方法であり、もう一つは、そのｍＲＮＡやタンパク質が「如何なる条件下で発現するか」について解析する方法である。前者に属する方法としては、例えば、ウェスタン・ブロット法、ノーザン・ブロット法、サザン・ブロット法等を挙げることができ、これらはおもに、注目するタンパク質や、ＤＮＡ又はＲＮＡについての解析を行うためのものである。
一方、後者に属する方法としては、転写因子の相互作用や、シグナルトランスダクションの解析等が該当する。しかしながら、これも主に、単一の注目するＤＮＡについて解析を行うことを目的としており、ある時点で細胞内において発現している遺伝子群を一度に総合的に解析することは困難である。
【０００３】
近年、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイとよばれる、１センチ四方程度の大きさの担体表面上に、高密度に任意のオリゴＤＮＡをスポットとして固定化した生体関連物質解析用試験片に関する技術が開発されたため、前記のような、ある時点において細胞内で発現している遺伝子群を一度に総合的に解析することが可能になりつつある。
ＤＮＡチップは、シリコンチップをフォトリソグラフィー技術により多くの区画に分割し、それぞれの区画上に特定の塩基配列を持つ一本鎖ＤＮＡを直接合成したものである。一方、ＤＮＡマイクロアレイは、検出対象である生体関連物質に特異的に結合するＤＮＡを、内径約２００μｍ程度の大きさのスポットとしてスライドグラス上に固定化したものである。
【０００４】
このようなＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイは、チップやマイクロアレイ上のＤＮＡの種類や配置を適宜選択し、信号読取装置及びコンピュータシステムに接続して用いれば、これらＤＮＡがどのプローブとハイブリダイゼーションしたかを知ることができるようになっている。すなわち、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイは、遺伝子の変異解析、多形解析、塩基配列解析、発現解析等、種々の用途に用いることが可能なものである。
【０００５】
しかしながら、例えば、ＤＮＡマイクロアレイを用いた解析に関しては、マイクロアレイの作製やその検出装置の詳細な検討がなされ始めたばかりであり、まだ多くの問題点を抱えている。その問題の一つは、例えば、ＤＮＡをアレイ上に供給するためのスポッターとよばれる装置に関するものである。スポッターを用いてＤＮＡ等の特異的結合物質を担体上に供給して固定化するに際し、接触プリンティング法、又は非接触プリンティング法が採用されている。
【０００６】
接触プリンティング法においては、スライドグラス等からなる担体に対して、オリゴＤＮＡやｃＤＮＡ等を含む試料を付着させたピンを直接担体に接触させて、前記試料を担体上に供給し、オリゴＤＮＡやｃＤＮＡ等を担体上に固定化する。
一方、非接触プリンティング法においては、印刷分野等で用いられるインクジェット技術を利用して、オリゴＤＮＡやｃＤＮＡ等を含む試料を担体上に吐出して供給し、オリゴＤＮＡやｃＤＮＡ等を担体上に固定化する。
【０００７】
いずれの方法においても一般的に、オリゴＤＮＡ等の特異的結合物質を含む試料を担体上に供給して固定化する際には、固定化する担体表面に対して化学処理を行い、担体と試料との結合性をより強固にする手法が採用されている。
これは、別の面から捕らえると、この担体表面の化学処理の結果次第で、担体と特異的結合物質との結合の強さが変化することから、担体表面が高度且つ均一に化学処理されているかどうかが、マイクロアレイの品質や性能を左右する重要な要因になるということでもある。
【０００８】
しかし、これまでは、担体表面の化学処理の結果を確認する方法がなく、得られたマイクロアレイの品質や性能は、この固定化担体表面の化学処理の結果の成り行きまかせになってしまっているのが現状であり、その結果、この方法により製造されたＤＮＡマイクロアレイの品質または性能にばらつきが生じるという問題点がある。このような欠陥のあるマイクロアレイは、定量性の要求される解析に用いることは不適切であり、また、場合によっては定性的な解析においてさえも信頼性の低い結果を提供してしまう。さらに、欠陥の程度によっては、そのマイクロアレイを製品として出荷できなくなり、製造における歩留まりを悪化させるという問題を生じさせる。担体上への特異的結合物質の固定化量に関するばらつきは、現時点では、数％〜数十％程度のものは避けられないとされている。
【０００９】
このような問題点を解決するために、例えば、特異的結合物質を固定化した担体を、ロットないしバッチごとにサンプリングを行って、該特異的結合物質に相補的な塩基配列を有するオリゴＤＮＡをハイブリダイゼーションさせて、オリゴＤＮＡの定量結果から担体上への特異的結合物質の固定化量を確認する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平１１−１８７９００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
前記のように特異的結合物質を担体上にスポットとして固定化した後、さらに複数の工程を経て、製品としてのマイクロアレイを完成させるが、しかし、特許文献１に記載の方法では、固定化担体を用いて固定化後の工程を行う前に、該工程について試作を行う必要があり、この試作に投じる原材料及び工数がコストアップ要因になるとともに、製造工程が複雑化してマイクロアレイを迅速に製造できないという問題点がある。また、固定化担体の品質確認に際して、該固定化担体の表面加工が必要であり、破壊検査となるため、品質確認に供した固定化担体を製造の次工程に投入できず、コストアップ要因となる問題点がある。さらに、固定化担体のロットまたはバッチごとに、これらを代表するサンプルを抜取って検査するため、マイクロアレイ全数の品質あるいは性能を確認できない。すなわち、品質の劣る固定化担体を次工程に投入してしまい、マイクロアレイの歩留まりが悪化してコストアップしてしまう可能性があるという問題点がある。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、ＤＮＡマイクロアレイ等の生体関連物質解析用試験片の製造に際して、担体表面の化学処理の結果を検査して品質良好な担体が選別可能であり、且つ製造工程の複雑化あるいはコストアップ等の問題を生じることのない生体関連物質解析用試験片の品質検査方法、製造方法および製造装置ならびに該試験片を用いた生体関連物質の解析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、担体上に、生体関連物質に対する特異的結合物質を固定化する固定化物質を結合させて処理担体とし、該処理担体上の固定化物質に特異的結合物質を固定化して得られる生体関連物質解析用試験片の品質検査方法であって、特異的結合物質を固定化する前に、処理担体上に結合された固定化物質の量を測定することを特徴とする生体関連物質解析用試験片の品質検査方法。
【００１３】
請求項２に記載の発明は、前記固定化物質の量の測定を、該固定化物質に特有の波長の光を照射した時の、光の吸収値または透過率を測定することで行うことを特徴とする請求項１に記載の生体関連物質解析用試験片の品質検査方法である。
【００１４】
請求項３に記載の発明は、前記光の照射が、赤外光の照射であることを特徴とする請求項２に記載の生体関連物質解析用試験片の品質検査方法である。
【００１５】
請求項４に記載の発明は、担体上に、生体関連物質に対する特異的結合物質を固定化する固定化物質を結合させて処理担体とする固定化物質結合工程と、前記処理担体上の固定化物質の量を測定する測定工程と、前記処理担体上の固定化物質に特異的結合物質を固定化する特異的結合物質固定化工程とを有することを特徴とする生体関連物質解析用試験片の製造方法である。
【００１６】
請求項５に記載の発明は、担体上に、生体関連物質に対する特異的結合物質を固定化する固定化物質を結合させて処理担体とし、該処理担体上の固定化物質の量を測定し、該処理担体上の固定化物質に特異的結合物質を固定化して得られる生体関連物質解析用試験片を用いた生体関連物質の解析方法であって、前記生体関連物質解析用試験片を用いて得られた生体関連物質の定量結果を、前記測定結果を用いて補正することを特徴とする生体関連物質の解析方法である。
【００１７】
請求項６に記載の発明は、担体上に、生体関連物質に対する特異的結合物質を固定化する固定化物質を結合させて処理担体とし、該処理担体上の固定化物質に特異的結合物質を固定化して得られる生体関連物質解析用試験片の製造装置であって、固定化物質に特有の波長の光を照射する光照射手段と、光を照射した時の光の吸収値または透過率を測定する測定手段と、処理担体上に特異的結合物質を供給する特異的結合物質供給手段と、処理担体を測定手段から供給手段へ搬送する搬送手段と、情報記録素子を処理担体に付加する付加手段と、前記測定結果の情報を情報記録素子に記録する記録手段と、を有することを特徴とする生体関連物質解析用試験片の製造装置である。
【００１８】
請求項７に記載の発明は、担体上に固定化物質を供給する固定化物質供給手段を有することを特徴とする請求項６に記載の生体関連物質解析用試験片の製造装置である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、処理担体上の固定化物質を定量することで、生体関連物質に対する特異的結合物質の固定化量が少ない担体を製造工程から除くことができ、安定した品質の生体関連物質解析用試験片が製造できる。また、前記固定化物質の定量結果に基づいて、生体関連物質の定量結果を補正することで、特異的結合物質の固定化量が少ない担体も生体関連物質解析用試験片の製造に用いることができる。これによって、生体関連物質解析用試験片の製造工程を簡略化できるとともに、歩留まりを向上できるので、低コストでの生体関連物質解析用試験片の製造が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明について、詳しく説明する。
本発明における生体関連物質とは、動物、植物、微生物等の細胞のみならず、これらに寄生しなければ自ら増殖できないウイルス等に由来する物質のことであり、具体的にはタンパク質、核酸等を挙げることができる。また、これら生体より直接抽出あるいは単離された天然由来のもののみならず、遺伝子工学的手法を用いて生産されたもの、あるいは化学的に修飾されたものや化学的に合成されたものをも含む。より具体的には、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、あるいはＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、その他の核酸等を挙げることができ、さらにこれらを化学修飾したもの等を挙げることができる。
また、本発明においては、生体関連物質として、蛍光物質等の標識物質により標識化されたものも用いるが、標識物質および標識方法に関しては、当該技術分野で公知のものであれば特に限定されず、生体関連物質の検出法および装置とを考慮して適宜選定すればよい。
【００２１】
本発明で用いる特異的結合物質とは、前記生体関連物質に対して特異的に結合する物質のことであり、特異的結合物質と生体関連物質との組み合わせとしては、例えば、ホルモン等のリガンドとその受容体、酵素とその基質、腫瘍マーカー等の抗原とそれに対する抗体、特定配列を有する核酸とこれに相補的な配列を有する核酸等を挙げることができる。
【００２２】
本発明で用いる担体とは、特異的結合物質を固定化するものであり、該特異的結合物質を安定に結合あるいは点着できるものであれば特に制限はなく、例えば、多孔質体、メンブレンフィルターあるいはスライドグラス板等を挙げることができる。
【００２３】
本発明において、担体上への特異的結合物質の固定化は、特異的結合物質の種類と、固定化を行う担体表面の性質に応じて、本発明の関連する技術分野における従来公知の方法を採用することができる。例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．[１]（１９７８）１−６、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．[１６]（１９８８）１０８６１−１０８８０等の文献に記載されている方法を採用することができる。
【００２４】
具体的には、本発明において特異的結合物質の担体への固定化は、担体表面を化学処理することにより担体表面に固定化物質を導入し、該固定化物質に特異的結合物質を結合させることで行う。すなわち、固定化物質とは、処理担体表面に存在し、特異的結合物質を供給結合を介して固定化できる官能基を有する物質のことである。
【００２５】
本発明において、処理担体とは、前記のように担体表面に固定化物質を結合させたものを指し、特異的結合物質を含む溶液を供給することで、特異的結合物質を担体上に決められた配置にしたがって固定化できるものを指す。
さらに、本発明において、生体関連物質解析用試験片とは、前記処理担体に特異的結合物質を固定化したものを指し、該特異的結合物質に生体関連物質を結合させることで、該生体関連物質を検出および定量できるものを指す。具体的には、例えば、ＤＮＡチップあるいはＤＮＡマイクロアレイ等を挙げることができる。さらに、特異的結合物質を適宜変更することにより、ＤＮＡ以外の核酸や、その他の生体関連物質、例えばタンパク質の検出および定量にも応用することが可能である。
【００２６】
本発明の生体関連物質解析用試験片の品質検査方法は、特異的結合物質を処理担体上の固定化物質に固定化する前に、処理担体上の固定化物質の量を測定することを特徴とする。固定化物質の量は、該固定化物質中の官能基あるいは化学結合に由来するシグナルを計測することで測定できる。
前記固定化物質の定量は、例えば、固定化物質に特有の波長の光を照射して、その時の光の吸収値あるいは透過率を測定することで行うことが好ましい。また、この時の光としては、赤外線を用いることが好ましい。すなわち、照射する光の波長は、固定化物質の種類により異なるが、例えば、カルボジイミド基を有する固定化物質であれば、カルボジイミド基に由来する２１３５ｃｍ−１付近の波長の赤外線を用いることが好ましく、マレイミド基を有する固定化物質であれば、マレイミド基中のエステル基に由来する１７００ｃｍ−１の波長の赤外線を用いることが好ましい。一方、固定化物質の定量は、これらに代わってラマンスペクトル等を測定することでも行うことができる。
【００２７】
前記固定化物質の定量結果から、生体関連物質解析用試験片の品質を判断する。すなわち、処理担体上の固定化物質の量が十分であるか判断するための基準値を設け、基準値を満たしている処理担体から製造された生体関連物質解析用試験片については、そのまま生体関連物質の定量に供し、基準値を満たしていない処理担体から製造された生体関連物質解析用試験片については、生体関連物質定量結果を、前記固定化物質の定量結果に基づいて補正する。この時の基準値とは、例えば、光の吸収値あるいは透過率を測定した場合であれば、処理担体によらず該測定値がほぼ一定となっている値のことである。光の吸収値を測定した場合は、基準値よりも小さい測定値の処理担体から製造された生体関連物質解析用試験片について前記補正を行い、光の透過率を測定した場合は、基準値よりも大きい測定値の処理担体から製造された生体関連物質解析用試験片について前記補正を行えばよい。なお、固定化物質の量が不十分であると判断された処理担体については、生体関連物質解析用試験片の製造に用いないようにしてもよい。
【００２８】
本発明の生体関連物質の解析方法は、前記のように、処理担体上の固定化物質の定量値が基準値を満たさなかった場合、このような処理担体から製造された生体関連物質解析用試験片を用いて生体関連物質を定量した際に、該定量結果を、前記固定化物質の定量結果に基づいて補正することを特徴とする。その補正方法としては、例えば、固定化物質定量値の前記基準値に対する比を求めて補正値とし、生体関連物質定量値をこの補正値で割ることにより行う方法を挙げることができる。このような補正を行うことで、固定化物質の定量値が基準値を満たしている処理担体から製造された生体関連物質解析用試験片を用いた場合と比較して何ら遜色ない精度で、生体関連物質の定量を行うことができる。
【００２９】
本発明の生体関連物質解析用試験片の製造方法は、担体上に、生体関連物質に対する特異的結合物質を固定化する固定化物質を結合させて処理担体とする固定化物質結合工程と、前記処理担体上の固定化物質の量を測定する測定工程と、前記処理担体上の固定化物質に特異的結合物質を固定化する特異的結合物質固定化工程とを有することを特徴とする。
【００３０】
担体上へ固定化物質を結合させる方法としては、例えば、担体を洗浄した後、固定化物質を含有する液体中に前記担体を浸漬するか、固定化物質を含有する液体を前記担体に刷毛塗りまたは吹付け等によって塗布する方法を挙げることができる。
【００３１】
より具体的には、例えば、洗浄後の担体にポリカルボジイミド樹脂等を反応させる方法、または、洗浄後の担体をシランカップリング剤で処理した後、二官能性架橋剤を反応させる方法等が挙げられる。
シランカップリング剤としては、例えば、チオールシランカップリング剤およびアミノシランカップリング剤等を挙げることが出来る。
【００３２】
二官能性架橋剤は、従来公知のものを用いることができ、シランカップリング剤と、固定化する特異的結合物質との組み合わせを考慮して、適宜選択すればよい。例えば、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシニミド、スクシニミジル−４−（マレイミドフェニル）ブチレート、ビス[２−（スクシニミドオキシカルボニロキシ）エチル]スルフォン、ビス（スルフォスクシニミジル）スベレート、酒石酸ジスクシニミジル、３，３’−ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）、３，３’−ジチオビス（スルフォスクシニミジルプロピオネート）、エチレングリコールビス（スクシニミジルスクシネート）、エチレングリコールビス（スルフォスクシニミジルスクシネート）、ビス[２−（スルフォスクシニミドオキシカルボニロキシ）エチル]スルフォン、酒石酸ジスルフォスクシニミジル、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−ジスルフォン酸スチルベン、ビスマレイミドヘキサン、ジスクシニミジルスベレート、Ｎ，Ｎ’−１，２−フェニレンジマレイミド、Ｎ，Ｎ’−１，４−フェニレンジマレイミド、ジメチルアジピミデート二塩酸塩、ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオニミデート二塩酸塩、ジメチルピメリミデート二塩酸塩、ジメチルスベリミデート二塩酸塩、２−イミノチオラン塩酸塩、ビス−（マレイミド）メチルエーテル、Ｎ−（３−マレイミドプロピオニロキシ）スクシニミド、Ｎ−（γ−マレイミドブチリロキシ）スクシニミド、３−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、スクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル−４−アジドベンゾエート、ｍ−マレイミドベンゾイルスルフォスクシニミドエステル、Ｎ−スクシニミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート、スルフォスクシニミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、スルフォスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルフォスクシニミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル−４−アジドサリチル酸、メチル−４−アジドベンゾイミデート塩酸塩、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイロキシスクシニミド、ｐ−アジドフェナシルブロミド、ｐ−アジドフェニルグリオキサール、Ｎ−（４−アジドフェニルチオ）−フタリミド、４，４’−ジチオビスフェニルアジド、エチル４−アジドフェニル−１，４−ジチオブチリミデート塩酸塩、ｐ−ニトロフェニル−２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオネート、Ｎ−スクシニミジルー６（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート、Ｎ−スクシニミジル（４−アジドフェニル）１，３’−ジチオプロピオネート、スルフォスクシニミジル２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンザミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート、スルフォスクシニミジル（４−アジドフェニルジチオ）プロピオネート、スルフォスクシニミジル６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート、スルフォスクシニミジル２−（ｐ−アジド−サリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート等を挙げることができる。
【００３３】
担体上の固定化物質の量は、該固定化物質中の官能基あるいは化学結合に由来するシグナルを計測することで測定できる。例えば、固定化物質に特有の波長の光を照射して、その時の光の吸収値あるいは透過率を測定することで行うことが好ましい。また、この時の光としては、赤外線を用いることが好ましい。照射する光の波長は、固定化物質の種類により異なるが、例えば、カルボジイミド基を有する固定化物質であれば、カルボジイミド基に由来する２１３５ｃｍ−１付近の波長の赤外線を用いることが好ましく、マレイミド基を有する固定化物質であれば、マレイミド基中のエステル基に由来する１７００ｃｍ−１の波長の赤外線を用いることが好ましい。一方、固定化物質の定量は、これらに代わってラマンスペクトル等を測定することでも行うことができる。
【００３４】
前記固定化物質の定量は、該固定化物質に特異的結合物質を固定化する直前に行うことが好ましい。固定化物質の量の測定から特異的結合物質の固定化までに長時間が経過すると、固定化物質が経時的並びに外的要因によって変化することがある。例えば、マレイミド基を有する固定化物質の場合、マレイミド基が開環等を起こすことがある。このような場合、測定結果が生体関連物質解析用試験片の品質を正しく示さない可能性がある。
【００３５】
固定化物質への特異的結合物質の固定化は、例えば、特異的結合物質を含む溶液を担体に供給することで行うことができる。前記溶液の担体への供給は、スポット機器を用いる従来公知の方法を適用できる。例えば、ピンを用いて、前記溶液を担体上に直接接触させて特異的結合物質を固定化する接触プリンティング法や、インクジェット技術を用いて、担体上に前記溶液を吐出して特異的結合物質を固定化する非接触プリンティング法等を挙げることができる。
【００３６】
また本発明の生体関連物質解析用試験片の製造方法においては、処理担体に情報記録素子を設け、前記固定化物質の定量結果を、該情報記録素子に記録できるようにしておくことが好ましい。
【００３７】
本発明の生体関連物質解析用試験片の製造装置は、固定化物質に特有の波長の光を照射する光照射手段と、光を照射した時の光の吸収値または透過率を測定する測定手段と、処理担体上に特異的結合物質を供給する特異的結合物質供給手段と、処理担体を測定手段から供給手段へ搬送する搬送手段と、情報記録素子を処理担体に付加する付加手段と、前記測定結果の情報を情報記録素子に記録する記録手段と、を有する。
また、該製造装置は、上記各手段に加え、担体上に固定化物質を供給する固定化物質供給手段を有することが好ましい。
【００３８】
光照射手段としては、例えば、近赤外領域の測定には、ＣａＦ２（フッ化カルシウム）ビームスプリッタ、ＩｎＧａＡｓ（インジウム・ガリウム・ヒ素）検出器、タングステンヨウ素ランプ光源等を挙げることができ、これらを用いて、固定化物質に特有の波長の光を照射することができる。
測定手段としては、例えば、分光光度計、赤外線分光光度計等を挙げることができ、特異的結合物質供給手段としては、例えば、接触あるいは非接触式スポット機器等を挙げることができる。
また、情報記録素子としては、例えば、バーコード、ＩＣチップおよびＩＣタグ等を挙げることができる。
一方、搬送手段としては、例えば、自動ライン式搬送機等を挙げることができ、記録手段としては、例えば、バーコードラベラーやＩＣタグへの書き込み装置等を挙げることができ、付加手段としては、例えば、前記記録手段を自動的に接着する接着装置または印刷する印刷機等を挙げることができる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を具体的実施例により、さらに詳細に説明する。なお本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例におけるプローブとは、特異的結合物質のことである。
＜第一の実施形態＞
（実施例１）
図１は、本発明のＤＮＡマイクロアレイの製造装置の概略平面図を示すものである。符号１は赤外線（ＩＲ）測定機器であり、測定用ステージ４上に設置された処理担体７上の固定化物質のＩＲを測定できるようにされている。ＩＲ測定済みの処理担体７は、測定情報付加機器２により、その測定結果が付加される。そして、情報付加済みの処理担体７は、スポット用ステージ５上に設置され、スポット機器３により、プローブ溶液が処理担体７上に吐出されて、プローブが固定化されたスポットを有する処理担体７すなわちＤＮＡマイクロアレイが作製されるようになっている。
また、処理担体７は、ＩＲ測定機器１、測定情報付加機器２およびスポット機器３の間を、処理担体自動搬送ライン６で搬送され、処理担体７に測定情報が付加された後、その情報に基いて、固定化物質の量が基準値以上の処理担体７を、スポット用ステージ５へ選別して設置できるようにされている。
以下、各工程について詳しく述べる。
【００４０】
◎担体の洗浄
担体として、７６mm×２６ｍｍ×１ｍｍのスライドグラスを用意し、蒸留水１００ｍｌに浸漬させた後、さらに１N水酸化ナトリウム水溶液１００ｍｌに８０℃にて１０分間浸漬させて洗浄を行い、最後に蒸留水にて十分に洗浄した。
◎シランカップリング処理
前記洗浄済み担体を、シランカップリング剤（商品名：ＫＢＭ６０３、信越化学工業株式会社製）１００ｍｌに２５℃にて浸漬させて反応させ、乾燥後、さらに１２０℃のオーブン中へ1時間入れて、担体表面のシランカップリング処理を行った。
◎マレイミド基の導入
２．７ｇのN−マレイミドカプロイロキシスクシニミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、Ｄｏｊｉｎ社製）をジメチルスルホキシド／エタノール（１／１、ｖ／ｖ）の混合液に溶解させ、上記工程で得たシランカップリング処理済みの担体を２５℃にて２時間浸漬させて反応を行い、N−マレイミドカプロイロキシスクシニミドを担体表面に結合させて、生体関連物質に対する特異的結合物質を固定化するためのマレイミド基を導入した処理担体７を得た。
【００４１】
◎ＤＮＡプローブの準備
生体関連物質に対する特異的結合物質としてＤＮＡオリゴマーを用い、常法に従って、このＤＮＡオリゴマーの末端にチオール基を導入し、保護基を除去してＤＮＡプローブを得た。さらに得られたＤＮＡプローブの最終濃度が４００ｍｇ／ｍｌとなるように、トリスバッファーに溶解して、前記処理担体７に吐出するためのプローブ溶液を調製した。
【００４２】
◎赤外線値の測定
前記マレイミド基を導入した処理担体７を５０枚、図１に示す製造装置の測定用ステージ４上に設置して、処理担体７上のマレイミド基中のエステル基に由来する１７００ｃｍ−１の波長の赤外線透過率を赤外分光光度計により測定した。
◎測定値の情報付加
測定の終わった前記処理担体７を、図１に示す製造装置の処理担体自動搬送ライン６上に移し、測定情報付加機器２に移送して、前記透過率データを記録した情報記録素子を付加した。
【００４３】
◎スポット
前記測定値情報を付加した処理担体７を、処理担体自動搬送ライン６で、吐出手段を有するスポット機器３へと移送して、測定値情報を付加した処理担体７に前記ＤＮＡプローブ溶液を、ひとつのスポットにつき３５０ｐｌ吐出して、ＤＮＡプローブを含むスポットを該処理担体７上に作製し、ＤＮＡマイクロアレイを得た。
◎ハイブリダイゼーション
ＤＮＡマイクロアレイ７上のＤＮＡプローブに対して、該プローブと相補的な塩基配列を有する、蛍光標識されたカウンターオリゴＤＮＡを、常法に従ってハイブリダイゼーションさせて、各スポットの蛍光輝度を測定した。その結果を図２に示す。
【００４４】
赤外線透過率が７０％以下の場合は、各スポットの蛍光輝度が一定となっており、これは、該スポット上に固定化されているＤＮＡプローブの量が最大であることを示している。
また、透過率が７０％以上の場合は、透過率の上昇に伴いスポットの蛍光輝度が減少しており、赤外線透過率と蛍光輝度との間に相関が見られる。
この時、透過率が７０％以下のものを選別することで、ＤＮＡプローブが一定の高い効率で固定化された処理担体、すなわちＤＮＡマイクロアレイを得ることができ、高品質で高性能のＤＮＡマイクロアレイを安定して製造できることが確認された。
なお、この結果から、透過率が７０％以下である処理担体は、スポット用ステージ５に自動的に搬送されるように設定しておけば、高品質のＤＮＡマイクロアレイを効率的に製造することができる。
【００４５】
（実施例２）
図１に示す製造装置を用いて、実施例１のマレイミド基が導入された処理担体に代わって、カルボジイミド基が導入された処理担体を用いて、ＤＮＡマイクロアレイの製造を行った。なお、本実施例においては、カルボジイミド基の導入に際し、単体表面のシランカップリング処理は不要であるため、実施例１よりも短工程でＤＮＡマイクロアレイを得ることができた。また、カルボジイミド基の検出および定量は、赤外線吸収値を測定することで行った。以下、各工程について詳しく述べる。
【００４６】
◎担体の洗浄
担体として、７６mm×２６ｍｍ×１ｍｍのスライドグラスを用意し、蒸留水１００ｍｌに浸漬させた後、さらに１N水酸化ナトリウム水溶液１００ｍｌに８０℃にて１０分間浸漬させて洗浄を行い、最後に蒸留水にて十分に洗浄した。
◎カルボジイミド基の導入
前記洗浄済み担体に、日清紡績株式会社製カルボジイミド樹脂溶液（ポリマー濃度１０重量％）をコーティングし、６０℃で１時間インキュベートして、担体表面にカルボジイミド基を導入して、処理担体を得た。
【００４７】
◎赤外線値の測定〜ハイブリダイゼーション
前記カルボジイミド基を導入した処理担体に対して、実施例１と同様に、カルボジイミド基に由来する２１３５ｃｍ−１付近の波長の赤外線吸収値を測定した。
続いて、その結果を処理担体に付加した後、処理担体にＤＮＡプローブ溶液を吐出して、ＤＮＡプローブを含むスポットを処理担体上に作製し、ＤＮＡマイクロアレイを得た。続いて、カウンターオリゴＤＮＡを常法に従ってハイブリダイゼーションさせて、各スポットの蛍光輝度を測定した。
【００４８】
赤外線吸収値と各スポットの蛍光輝度との間には、実施例１における赤外線透過率と蛍光輝度との関係と、同様の関係がある（図示略）ことが確認され、赤外線吸収値で処理担体上の固定化物質の量を定量する、本発明の生体関連物質解析用試験片の品質検査方法および製造方法が有効であることが確認された。
【００４９】
なお、実施例１および２においては、処理担体上の固定化物質の定量を、赤外線透過率あるいは赤外線吸収値を測定することで行ったが、これらに代わって、ラマンスペクトル等を測定することによっても、測定することが可能である。
【００５０】
＜第二の実施形態＞
（実施例３）
（補正の方法）
実施例１で作製したＤＮＡマイクロアレイのうち、赤外線透過率が７０％以上の処理担体から製造したものに対し、透過率の標準値を７０%として、各ＤＮＡマイクロアレイの標準値に対する透過率の比（以降、補正値と呼ぶ）を算出した。
この補正値を用いて、ハイブリダイゼーションしたカウンターオリゴＤＮＡの蛍光輝度（以降、生データの輝度と呼ぶ）に対して、以下の式を用いて補正を行い、補正データの輝度を算出した。各ＤＮＡマイクロアレイの生データの輝度を図３に、補正データの輝度を、図４に示す。
補正データの輝度：生データの輝度／補正値
【００５１】
上記のように、透過率の測定結果から生データの輝度を補正したところ、補正データの輝度はすべて、透過率７０％以下の処理担体を用いたＤＮＡマイクロアレイの輝度と同等になることが確認された。
これはすなわち、実施例１においては、透過率が７０％以上の処理担体は、以降のマイクロアレイの製造に用いなかったのに対して、本実施例のようにデータの補正を行うことで、透過率が７０％以上の処理担体を用いたマイクロアレイによっても、生体関連物質の検出および定量が正確に行えることを示すものである。
したがって、ＤＮＡマイクロアレイの製造に際して、本来不良品として用いることができなかった処理担体も、そのまま製造に用いることができるため、歩留まりを向上させることができる。
【００５２】
（実施例４）
実施例１と同様の方法で、ＤＮＡマイクロアレイを５０枚作製した。さらに、全てのマイクロアレイには、それぞれの１７００ｃｍ−１の赤外線透過率の値を入力したバーコードを取り付けた。
次に、全てのマイクロアレイを実施例１と同様にプローブオリゴＤＮＡとハイブリダイゼーションさせて、図５に示す解析装置を用いて、マイクロアレイ上の蛍光輝度を補正して出力した。
すなわち、マイクロアレイ８上のスポットに対し、光源１１から発した光を蛍光観察用ミラーユニット１２を介して照射して、この時の画像をＣＣＤカメラ１３で撮影して制御装置１４へ送り、スポットの蛍光輝度を算出した。また、マイクロアレイ８に取り付けられたバーコード９をバーコードリーダー１５で読み取って、固定化物質の赤外線透過率の値を制御装置１４へ送った。以上の操作をマイクロアレイ５０枚すべてに対して行い、制御装置１４内には、すべてのマイクロアレイに関する生データの輝度および透過率の値が蓄積された。これら蓄積されたデータから、制御装置１４で補正データの輝度を算出し、出力した。出力された補正データの輝度を図６に示す。
【００５３】
この結果から、すべてのマイクロアレイについて、各スポットは、ほぼ同じ蛍光輝度を示すことが確認された。
なお、本実施例では、赤外線透過率の値をバーコード９を用いて入力したが、バーコード以外にもＩＣチップやＩＣタグ等の情報記録素子を用いることも可能である。
また、本実施例では、透過率の値をマイクロアレイ８に付加したが、制御装置１４に直接入力してもよい。
【００５４】
以上のように、本発明の生体関連物質解析用試験片の品質検査方法を採用することで、固定化物質の結合量が不足した処理担体を除き、良好な品質の処理担体を選別して用いることで、高品質の生体関連物質解析用試験片を製造できることが確認された。
また、固定化物質の結合量が不足した処理担体も、本発明の生体関連物質の解析方法を採用することで、生体関連物質解析用試験片の製造に用いることができることが確認された。加えて、ロットあるいはバッチごとの抜き取り検査が不要になり、品質保証の精度を向上できることが確認された。
さらに、本発明の生体関連物質解析用試験片の製造方法により、処理担体を用いた試作あるいは破壊検査等が不要となり、複雑な製造工程を経ることなく、低コストで生体関連物質解析用試験片を製造できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明により、生体関連物質を高感度で検出できる安定した品質の生体関連物質解析用試験片を、複雑な工程を経ることなく製造できるとともに、その製造に際して、歩留まりを向上できるため、高品質な生体関連物質解析用試験片を、低コストで広範に各産業界に提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の実施例１におけるＤＮＡマイクロアレイ製造装置の概略図である。
【図２】本発明の実施例１におけるハイブリダイゼーションの結果を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例３におけるハイブリダイゼーションの結果を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例３におけるハイブリダイゼーションの補正結果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例４におけるＤＮＡマイクロアレイ解析装置の概略図である。
【図６】本発明の実施例４におけるハイブリダイゼーションの補正結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００５７】
１・・・ＩＲ測定機器、２・・・測定情報付加機器、３・・・スポット機器、４・・・測定用ステージ、５・・・スポット用ステージ、６・・・処理担体自動搬送ライン、７・・・処理担体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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