(57)【要約】      （修正有）【課題】中温付近で安定にポリエステル産生能を有する細菌、および該細菌から単離したポリエステル重合酵素遺伝子、該遺伝子を含む遺伝子発現システム、該遺伝子発現システムによって形質転換または形質導入された変異体および該変異体を用いて中温付近で安定でかつ幅広い基質特異性を有するポリエステル重合酵素の製造方法およびポリエステルの製造方法を提供する。【解決手段】Bacillus  sp.  INT005(FERM  P−18327)由来の下記の制限酵素開裂地図を有し、かつ塩基対が3.8kbpであって、特定の塩基配列を含む３−ケト−アシルCoA遺伝子を含むＤＮＡ断片。2007111052.tif 000007【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Bacillus  sp.  INT005(FERM  P−18327)由来の下記の制限酵素開裂地図を有し、かつ塩基対が3.8kbpであって、配列番号５に示される塩基配列を含む３−ケト−アシルCoA遺伝子を含むＤＮＡ断片。
2007111052.tif 000006
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子：
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む３−ケト−アシルCoAリダクターゼ活性もたらすポリペプチド。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列を含む３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列
（ｂ）遺伝コードの縮重により、コドン配列が（ａ）の塩基配列と異なるが同じアミノ酸配列をコードする塩基配列。
【請求項４】
以下（ａ）または（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む３−ケト−アシルCoAリダクターゼ活性をもたらすポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエステル産生能を有する細菌、ポリエステル重合酵素遺伝子、該遺伝子を含む遺伝子発現システム、該遺伝子発現システムにより形質転換または形質導入された変異体、ポリエステル重合酵素の製造方法及びポリエステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの微生物が体内にエネルギー貯蔵物質としてポリ−３−ヒドロキシアルカノエート（PHA)） を蓄積することが知られている。PHAは熱可塑性を有し、すぐれた生分解性と生体適合性を有することから生分解性プラスチック（グリーンプラ）として注目されている。PHAのモノマー組成はその物性に大きな影響を与え、モノマー組成比はポリエステル重合酵素の基質特異性と宿主のモノマー合成経路によって変化する。これまでに約30種類の微生物からPHA合成酵素遺伝子がクローニングされ、その１次構造と基質特性から3つのグループに分類されている（I〜III）。タイプIとIIIは炭素数3〜6程度の短鎖長のヒドロキシアシルCoAに、タイプIIは炭素数6〜12程度の中鎖長のヒドロキシアシルCoAに基質特異性を示す。PHAの物性はそのモノマー組成によって大きく変化し、様々な物性のPHAを製造するためには幅広い基質特性を有するポリエステル重合酵素が必要である。
【０００３】
また従来のPHA合成は微生物内（in vivo）で行う方法であり、酵素を用いた合成（in vitro合成）は工業的にはほとんど行われていない。この理由の一つとしてPHA合成酵素の不安定性が挙げられ、安定なPHA合成酵素の製造がin vitro合成には必要不可欠である。しかしこれまで報告されているポリエステル重合酵素はその基質特異性が比較的せまく、幅広い基質特性を有するポリエステル重合酵素（特開平10-108682、特開平10-276781）についても中温付近（40〜50℃）で安定でかつ高活性を有するものは報告されていなかった。
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−１０８６８２号公報
【特許文献２】特開平１０−２７６７８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の課題は、中温付近で安定にポリエステル産生能を有する細菌、および該細菌から単離したポリエステル重合酵素遺伝子、該遺伝子を含む遺伝子発現システム、該遺伝子発現システムによって形質転換または形質導入された変異体および該変異体を用いて中温付近で安定でかつ幅広い基質特異性を有するポリエステル重合酵素の製造方法およびポリエステルの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、このような課題を解決するために、中温付近（40〜50℃）で安定にポリエステルを合成し、幅広い基質特異性を有するポリエステル重合酵素を保持している細菌から、その遺伝子およびそれに付随するオープンリーディングフレームをクローニングし、遺伝的増幅、転写及び翻訳活性を高めることにより、目的の酵素生産量を高めるべく鋭意研究を行い本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、４０℃以上でポリエステル産生能を有する細菌に関する。
また、本発明は、バチルス属である、前記細菌に関する。
さらに、本発明は、細菌が、Bacillus  sp.  INT005  菌株である、前記細菌に関する。
また、本発明は、以下の制限酵素開裂地図を有し、かつ塩基対が3.8kbpであるポリエステル重合酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片に関する。  
2007111052.tif 000002
さらに、本発明は、ＤＮＡ断片が、Bacillus  sp.  INT005  菌株より単離したものである、前記ＤＮＡ断片に関する。
また、本発明は、配列番号１、配列番号３および配列番号５に示される塩基配列を含む、前記ＤＮＡ断片に関する。
【０００８】
さらに、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードするポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子に関する：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリエステル重合酵素活性を有するポリペプチド。
また、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列を含むポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子に関する：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列
（ｂ）遺伝コードの縮重により、コドン配列が（ａ）の塩基配列と異なるが同じアミノ酸配列をコードする塩基配列。
さらに、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードするポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子に関する：
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリエステル重合酵素活性を有するポリペプチド。
また、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列を含むポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子に関する：
（ａ）配列番号３に示される塩基配列
（ｂ）遺伝コードの縮重により、コドン配列が（ａ）の塩基配列と異なるが同じアミノ酸配列をコードする塩基配列。
さらに、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドをコードする３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子に関する：
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む３−ケト−アシルCoAリダクターゼ活性もたらすポリペプチド。
また、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列を含む３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子に関する：
（ａ）配列番号５に示される塩基配列
（ｂ）遺伝コードの縮重により、コドン配列が（ａ）の塩基配列と異なるが同じアミノ酸配列をコードする塩基配列。
【０００９】
さらに、本発明は、前記ポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子、前記ポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子および前記３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子から成る群から選択される１または２以上の遺伝子を含む遺伝子発現カセットに関する。
また、本発明は、前記ポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子と前記ポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子とを同時に発現する遺伝子発現システムに関する。
さらに、本発明は、さらに前記３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子を含む、前記遺伝子発現システムに関する。
また、本発明は、前記遺伝子発現システムによって形質転換または形質導入された変異体に関する。
【００１０】
さらに、本発明は、以下（ａ）または（ｂ）のポリペプチドに関する：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリエステル重合酵素活性を有するポリペプチド。
また、本発明は、以下（ａ）または（ｂ）のポリペプチドに関する：
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むポリエステル重合酵素活性を有するポリペプチド。
さらに、本発明は、以下（ａ）または（ｂ）のポリペプチドに関する：
（ａ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１または２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む３−ケト−アシルCoAリダクターゼ活性もたらすポリペプチド。
【００１１】
また、本発明は、前記細菌を培養し、得られた培養物からポリエステル重合酵素を採取することを特徴とする、ポリエステル重合酵素の製造方法に関する。
さらに、本発明は、前記変異体を培養し、得られた培養物からポリエステル重合酵素を採取することを特徴とする、ポリエステル重合酵素の製造方法に関する。
また、本発明は、前記細菌を培養し、得られた培養物からポリエステルを採取することを特徴とする、ポリエステルの製造方法に関する。
さらに、本発明は、前記変異体を培養し、得られた培養物からポリエステルを採取することを特徴とする、ポリエステルの製造方法に関する。
また、本発明は、前記方法により得られたポリエステル重合酵素を用いて、ポリエステルを重合することを特徴とする、ポリエステルの製造方法に関する。
【００１２】
本発明によれば、４０℃以上でも安定にポリエステル産生能を有する細菌を培養することにより、中温付近でも安定に、熱安定性の高いポリエステル重合酵素およびポリエステルの製造を行うことができる。
上記細菌から単離したポリエステル生合成に関与する遺伝子断片を得ることで、該遺伝子を含む変異体を用いて、培養することにより、熱安定性の高いポリエステル重合酵素およびポリエステルの製造を行うことができる。
本発明によれば、熱安定性の高いポリエステル重合酵素を得ることができたため、in  vitroにおけるポリエステルの合成において、不安定性の点からこれまでにできなかった長期使用が可能となる。さらにバイオリアクター等を構築する際に、高温で反応を行わせることができることから、雑菌の混入を防ぐことができ、ポリエステル合成の応用の幅が広がる。
さらに、ポリエステルの生合成に関与する酵素である３−ケト−アシルCoAリダクターゼが得られたことから、脂肪酸からのポリエステル合成を効率的に行うことができ、基質の幅が広がる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、幅広い基質特性と安定性を有するポリエステル重合酵素関連遺伝子、該遺伝子を含む遺伝子発現カセット、該遺伝子発現カセットを含む変異体、ポリエステル重合酵素の製造方法及びポリエステルの製造方法を提供することができる。また本発明の細菌および変異体により安定で幅広い基質特性を有するポリエステル重合酵素を効率的に生産することができ、該酵素を用いて効率的にポリエステルを合成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明で重合される(R)-３-ヒドロキシブチリル-CoA（(R)-３HB-CoA）は、以下の式（Ｉ）で示されるものである。
【化１】
2007111052.tif 000003
【００１５】
なお、本発明で重合される化合物は(R)-３HB-CoAのみならず、(R)-３-ヒドロキシアシル-CoA（(R)-３HA-CoA）も含まれる。(R)-３HA-CoAの例としては、式（ＩＩ）に示した。
【化２】
2007111052.tif 000004
（式中のＲはエチル基、プロピル基、ペンチル基又はヘプチル基をしめす）
【００１６】
本発明に係る４０℃以上でポリエステルを生産する細菌としては、４０℃以上で安定に生育でき、かつポリエステルを菌体内に蓄積することができるものであればいずれの細菌でもよいが、例えば、Thermus属、Cyanobacterium属、Bacillus属等を挙げることができる。中でも、安定な生育およびポリエステル産生の点から、４５℃以上でも安定に生育できるものが好ましく、本発明者らが分離した新種の菌株である、Bacillus sp. INT005菌株（以下、「本菌株」または「INT005」と略すことがある）が好ましい。この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所に平成１３年５月９日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２７として寄託されている。
【００１７】
１．Bacillus sp. INT005菌株の単離・同定
INT005株は、本発明者らにより北海道内天然ガス田採掘土壌より分離した。
その菌学的性状は次の通りである。
（１）形態学的性状
−普通寒天培地上、37℃
コロニーの特徴
1） 外形        ：  円形
2） 表面の隆起  ：  低凸状
3） 表面の形状  ：  円形
4） 周縁        ：  巻き毛状
5） 光沢        ：  無
6） 色調        ：  クリーム色
−普通寒天培地上、37℃
形態的性質
1） 細胞形態    ：  桿状
2） 運動性      ：  あり
3） 胞子形状    ：  円形
4） グラム染色  ：  陽性
【００１８】
（２）生理学的性状
1） 嫌気条件下での生育          ：  陽性
2） カタラーゼ                  ：  陽性
3） オキシダーゼ                ：  陽性
4） OＦテスト                   ：  −
5） カゼイン加水分解            ：  陽性
6） でん粉加水分解              ：  陰性
7） 硝酸塩還元                  ：  陰性
8） ＶＰテスト                  ：  陰性
9） インドロール産生            ：  陰性
10） 硫化水素産生             ：  陰性
11） クエン酸の利用性         ：  陰性
12） ウレアーゼ               ：  陰性
13） １０％ＮａＣｌでの生育   ：  陰性
14） 生育温度上限             ：  45℃
15） アルギニンの加水分解     ：  陰性
16） チロシン分解性           ：  陰性
17） 炭素源からの酸の生成
【００１９】
１  グリセロール  −
２  エリスリトール  −
３  Ｄ−アラビノース  −
４  Ｌ−アラビノース  −
５  リボース  ＋
６  Ｄ−キシロース  −
７  Ｌ−キシロース  −
８  アドニトール  −
９  β−メチルーＤ−キシロース  −
１０  ガラクトース  −
１１  グルコース  ＋
１２  フラクトース  ＋
１３  マンノース  −
１４  マルトース  ＋
１５  トレハロース  ＋
１６  マンニトール  −
１７  イノシトール  −
１８  グリセロール  −
１９  スクロース  ＋
２０  グルコネート  ＋
【００２０】
（３）分類学的考察
−属レベルの同定
本菌株（INT005）は、１）グラム陽性桿菌である、２）運動性を有する、３）芽胞を形成する、４）グルコースから好気的に酸を生成するなどの特徴を示す。これらの特徴から、本菌株は、Bergey’s Mannual of Dterminative Bacteriology 第９巻に記載されている、Endo-spore-forming Gram-Positive Rods and Cocci群のBacillus属菌に帰属することが判明した。
−種レベルの同定
Bacillus属には、現在５０種近い菌が含まれている。16SRNA遺伝子の部分塩基配列を解析し、データーベース検索を行った結果Bacillus  cereusと最も高い相同性を有していた。しかしサリシンからの酸産生、ＶＰテスト、硝酸塩還元能、でん粉の加水分解の結果はいずれもBacillus  cereusと異なりこれらの結果から本菌株をBacillus sp.と同定した。
（４）ポリエステル産生能
３７℃および４５℃におけるＰＨＡ産生能は、以下の通りである。
37℃  (++>+>+->-)
Ralstnia eutropha     ++
Bacillus megaterium     ++   
Bacillus sp.INT005     ++
45℃ 
Ralstnia eutropha     -
Bacillus megaterium    -  
Bacillus sp.INT005     +
Bacillus sp.INT005は、４５℃においてもポリエステル産生能を有するものであった。
【００２１】
さらに、本発明では、Bacillus sp. INT005菌株の４０℃以上でのポリエステル産生能に着目し、該菌株より、４０℃以上でも安定でかつ幅広い基質特異性を有するポリエステル重合関連遺伝子を切り出し、これを適当なベクターを用いて適当な宿主に形質転換または形質導入し、変異体を作製し、該変異体を用いてポリエステル重合酵素およびポリエステルを製造することもできる。
【００２２】
２．繊維対の作製
（１）遺伝子のクローニング
遺伝子のクローニングは、公知の方法を用いることができる。例えば、カレントプロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）、ユニット２・４の方法等により染色体ＤＮＡを調製する。
得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばPstI、EcoRI等により完全分解する。得られるＤＮＡ断片を、制限酵素（例えばPstI、EcoRI等）で切断してフォスファターゼ処理したベクターとライゲーションを行う。
【００２３】
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。ファージベクターとしては、例えばEMBL3、M13、λgt11等が挙げられ、プラスミドベクターとしては、例えばpBR322、pUC18、pBluescript II（STRATAGENE社製）等が挙げられる。さらに、大腸菌やバチルス属菌などの２種以上の宿主微生物で自律的増殖が可能なベクターのほか、各種のシャトルベクターを使用することもできる。このようなベクターについても、前記制限酵素で切断し、その断片を得ることができる。
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、組換えベクターを作製する。
【００２４】
宿主微生物に組換えベクターを導入するには、公知の方法により行うことができる。例えば、宿主微生物が大腸菌の場合は塩化カルシウム法（カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラーバイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）ユニット１・４、Lederberg, E.M. et al., J. Bacteriol. 119, 1072 (1974)）やエレクトロポレーション法（Current Protocols in Molecular Biology, 1巻，1.8.4 頁, 1994年）を採用することができ、宿主微生物がファージＤＮＡの場合はインビトロ・パッケージング法（Current Protocols in Molecular Biology, 1巻，5.7.1 頁, 1994年）等を採用することができる。本発明では、インビトロ・パッケージング用キット（Gigapack II； STRATAGENE 社製等）を用いてもよい。
【００２５】
次に、本発明のポリエステル重合酵素ＩおよびＩＩ遺伝子並びに３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得るためのプローブを調製する。
ポリエステル重合酵素のアミノ酸配列については、既に何種類かのものが知られている（Gabriel J. McCool and Maura C. Cannon, J. Bacteriol., 181,585(1999); Liebergesell, M. and Steinbuchel, Eur. J. Biochem.,  209, 135(1992);Kaneko, T., et al., DNA Res., 3, 109(1996);  Liebergesell, M. and Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol.,  38, 493(1993) 他）。そこで、これらのアミノ酸配列のうち、よく保存されている領域を選択し、それをコードする塩基配列を推定してオリゴヌクレオチドを設計する。これらオリゴヌクレオチドとしてはPrimer1：GCAGTGAAAAAAGTAATGCGAACTGCAAGA、Primer2： CCGCTGTTCCACCGTAAACAATCGCATATG挙げられるが、これに限定されない。
【００２６】
次に、この合成オリゴヌクレオチドを適当な試薬を用いて標識し、前記染色体ＤＮＡライブラリーから上述のPrimer1・２を用いたPCR法（ライブラリーをいくつかのグループに分け、それぞれのグループからプラスミドを調製した。このプラスミドをテンプレートとしてPCRを行い、断片増幅が行ったグループを更に細分化し最終的に目的遺伝子を含む大腸菌を分離した）によってスクリーニングを行った。
【００２７】
スクリーニングされた大腸菌からアルカリ法（Currnt Protocols in Molecular Biology,1巻,1.6.1頁, 1994年) によってプラスミドを回収することにより、ポリエステル重合酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片が得られる。
上記ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、公知方法、例えばサンガー法（Molecular Cloning,2巻, 13.3頁, 1989年）等によって行うことができ、塩基配列自動分析装置、例えば種々の合成ＤＮＡをプライマーとして、ダイエナミック・ET・ターミナル・サイクル・シークエンシング・キット（アマシャム・ファルマシア）およびＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー・アプライド・バイオシステムズ）（ABI社）を用いて、常法に従って行うことができる。
【００２８】
なお、上記手法により塩基配列が決定された後は、化学合成によって、又は染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００２９】
Bacillus sp. INT 005株由来のポリエステル重合酵素遺伝子を含む3.8kbpのＤＮＡ断片の全塩基配列を解析したところ、複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が確認された。今回確認された３つのＯＲＦをプロモーターから順方向にＯＲＦ１〜３とする。ＯＲＦ２は、744塩基で構成され、Bacillus megaterium由来３−ケト−アシルCoAリダクターゼをコードする遺伝子（J. Bacteliol., 181, 585-592 (1999)）とアミノ酸配列レベルで約72.5％の相同性（FASTAプログラム）を持つことが確認された。ＯＲＦ３は、1086塩基で構成され、Bacillus megaterium由来ポリエステル重合酵素をコードする遺伝子（J. Bacteliol., 181, 585-592 (1999)）とアミノ酸配列レベルで約71.5％の相同性（FASTAプログラム）を持つことが確認された。３−ケト−アシルCoAリダクターゼはポリエステル生合成に関与する酵素であり、脂肪酸からのポリエステル合成を効率的に行うことができ、ポリエステル重合における幅広い基質特性を得ることができる。また、ＯＲＦ２およびＯＲＦ３の上流に位置するＯＲＦ１は、ポリエステル産生に関与する遺伝子と考えられ、ＯＲＦ３と同時に発現することで、ポリエステル重合酵素活性が得られ、ＯＲＦ１およびＯＲＦ３の同時の発現が、必須であることが確認された。
従って、ＯＲＦ３を、ポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子、ＯＲＦ１をポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子、およびＯＲＦ２を３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子とした。
【００３０】
本発明のポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子の全塩基配列を配列番号１に、次いでこの塩基配列によって翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２に、ポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子の全塩基配列を配列番号３に、次いでこの塩基配列によって翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４に、３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子の全塩基配列を配列番号５に、次いでこの塩基配列によって翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号６に記載する。
なお、配列番号２、４および６に示されるアミノ酸配列において、１または２以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつポリエステル重合酵素活性および３−ケト−アシルCoAリダクターゼ活性をもたらすポリペプチドをコードする遺伝子は、全て本発明に含まれる。
【００３１】
そして、配列番号２、４および６に示されるアミノ酸配列において、１または２以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつポリエステル重合酵素活性をもたらすポリエステル重合酵素をコードする遺伝子を得るには如何なる方法でもよく、例えば、遺伝子に点変異又は欠失変異を生じさせるための周知の技術である部位特定変異誘導法；遺伝子を選択的に開裂し、次いで選択されたヌクレオチドを除去または付加し、遺伝子を連結する方法；オリゴヌクレオチド変異誘導法などがある。
また、本発明のポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子、ポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子および３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子は、配列番号１、３および５に示される塩基配列を含むものに限定されず、これらの塩基配列で、遺伝コードの縮重のために、アミノ酸に対するコドンが等価の他のコドンに置き換えられた塩基配列であってもよい。等価の他のコドンで置き換えるとは、例えば、セリン残基の場合は、コドンＴＣＡ、ＴＣＧ、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＡＧＴまたはＡＧＣの６つのコドンでコードされるが、これらは、セリン残基をコードする目的では等価であるため、これらのコドンであれば、他のコドンで置き換えてもよいことをいう。他のそれぞれのアミノ酸残基についても同様に、他の等価のコドンで置き換えられてよく、同じアミノ酸配列をコードするものであれば、本発明の塩基配列に含まれる。
【００３２】
(2) 変異体の作製
本発明の遺伝子発現カセットは、プロモーターと、ポリエステル重合酵素活性および３−ケト−アシルCoAリダクターゼ活性を有する遺伝子、例えば上述のポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子、ポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子および３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子から選択される１または２以上のＤＮＡを含み、上記プロモーターに対応するターミネーターを含むもので、これらが５’末端方向から３’末端方向に連結されたものである。この遺伝子発現カセットを１または２以上の組換えベクターに組み込む本発明の遺伝子発現システムにより、宿主に導入することで、本発明の変異体を得ることができる。さらには、該変異体において発現を調節することができる。
【００３３】
本発明の遺伝子発現システムは、効率よくポリエステル重合酵素およびポリエステルを生産したい場合には、ポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子およびポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子を同時に発現できることが好ましく、この場合、同一宿主内で同時に発現するのであれば、必ずしもポリエステル重合酵素ＩＩ遺伝子は、ポリエステル重合酵素Ｉ遺伝子の上流に存在する必要はなく、さらには、該遺伝子を同一ＤＮＡ断片上に存在させる１の組換えベクターであっても、または異なるＤＮＡ断片上に存在させる２以上の組換えベクターを用いて分けて同一宿主内に導入することもできる。
さらに、幅広い基質特異性をもつポリエステル重合酵素を生産したい場合には３−ケト−アシルCoAリダクターゼ活性を有する遺伝子を上記の遺伝子発現システムに含ませることができる。
【００３４】
本発明の変異体は、本発明の遺伝子発現システムによる組換えベクターを宿主中に形質転換および形質導入することにより得られる。宿主としては、目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、アルカリゲネス属に属する微生物、シュードモナス属に属する微生物、バチルス属に属する微生物、大腸菌等の細菌、サッカロミセス属、カンジダ属等の酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞などが挙げられる。
【００３５】
大腸菌等を宿主として用いる場合は、本発明の組換え体ＤＮＡが該宿主中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、本発明のＤＮＡ、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。発現ベクターとしては、広範囲の宿主において複製・保持されるRK2複製起点を有するpLA2917 (ATCC 37355)やRSF1010複製起点を有するpJRD215 (ATCC 37533)等が挙げられる。
【００３６】
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、tac プロモーター、trc プロモーター、lac プロモーター、ＰL プロモーター、ＰR プロモーター、T7プロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられ得る。細菌への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Current Protocols in Molecular Biology, 1巻, 1.8.1頁，1994年）やエレクトロポレーション法（Current Protocols in Molecular Biology, 1巻，1.8.4 頁, 1994年）等が挙げられる。
【００３７】
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばYEp13、YCp50等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばgal 1 プロモーター、gal 10プロモーター等が挙げられる。酵母への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法（Methods Enzymol.,194,182-187(1990))、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929-1933 (1978))、酢酸リチウム法（J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)）等が挙げられる。
【００３８】
動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばpcDNAI、pcDNAI/Amp（インビトロジェン社）等が用いられる。動物細胞への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
【００３９】
３．ポリエステル重合酵素およびポリエステルの製造
本発明のポリエステル重合酵素は、本発明の細菌または変異体を培養し、培養物（培養菌体又は培養上清）中に本発明のポリエステル重合酵素を生成蓄積させ、該培養物からポリエステル重合酵素を採取することにより行われる。本発明の細菌および変異体を培養する方法は、通常の方法に従って行われる。
さらに、ポリエステルの製造は、本発明の細菌または変異体を培養し、培養物又は培養菌体中に本発明のポリエステルを生成蓄積させ、該培養菌体又は培養物からポリエステルを採取することにより行われる。本発明の細菌および変異体を培養する方法は、通常の方法に従って行われる。
【００４０】
細菌および変異体を培養する培地としては、完全培地又は合成培地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、pH7〜９、培養温度は30〜37℃の範囲で好気的に4〜24時間培養することによりポリエステル重合酵素およびポリエステルを菌体内に蓄積させ、回収する。
なお、Bacillus sp. INT005菌株を用いた場合には、30〜45℃の範囲でも培養可能である。
本発明の炭素源は微生物の増殖に必要であり、かつポリエステル合成の原料となるものであり、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、マルトース等の炭水化物が挙げられる。
また、３−ケト−アシルCoAリダクターゼ遺伝子を用いることで、ポリエステル合成の原料に脂肪酸を用いることもできる。脂肪酸としては、酪酸、ヒドロキシ酪酸、吉草酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸等が挙げられる。  
【００４１】
窒素源としては例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。
無機物としては例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸マンガン等が挙げられる。
【００４２】
培養は、通常振盪培養などの好気的条件下、25〜37℃で発現誘導後２時間以上行う。培養中は、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４３】
誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インデューサーを培地に添加することもできる。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG) 、インドールアクリル酸(IAA) 等を培地に添加することができる。
【００４４】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えばRPMI-1640 、DMEM培地又はこれらの培地にウシ胎児血清を添加した培地が用いられる。培養は、通常５％ＣＯ2存在下、30〜37℃で１〜７日間行う。培養中はカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４５】
ポリエステル重合酵素の精製は、培養終了後、該培養物から採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を超音波破砕処理等で等で破砕するか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて菌体を溶菌して酵素を抽出する。そして、得られる粗酵素をイオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過による各種クロマトグラフィーを用いて精製する。
菌体および変異体から得られたポリエステルの精製は例えば以下のように行うことができる。培養液から遠心分離によって菌体および変異体を集め、蒸留水で洗浄した後、乾燥させる。その後、クロロホルムに乾燥した菌体および変異体を懸濁し、加熱することによってポリエステルを抽出する。なお、濾過によって残渣を取り除く。このクロロホルム溶液にメタノールを加えてポリエステルを沈殿させる。濾過や遠心分離によって上澄み液を除去した後、乾燥して精製ポリエステルを得る。
また、上述の方法によって得られたポリエステル重合酵素を用いて、(R)-３HB-CoAを添加すれば、酵素反応によりポリエステル（ポリ−3−ヒドロキシブチレート（P3HB））を得ることができる。  
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、これらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
（１）Bacillus sp. INT 005株の染色体ＤＮＡの調製
Bacillus sp. INT 005株を2mlの滅菌したLB培養液［LB Broth Base (GIBCO BRL)］からなる液体培地（蒸留水使用、pH7.4）において37℃で一晩培養した。培養液全量を100mlのLB培養液に入れ、培養液の濁度（600nmの吸光度）が0.7になるまで37℃で振とう培養した。培養終了後、培養液から7000rpm、10分間の遠心分離処理により菌体を分離し、該菌体からカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラーバイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）ユニット２・４に記載の方法に従って、染色体ＤＮＡを得た。
【００４７】
次にこの染色体ＤＮＡ0.05mgを制限酵素PstI（宝酒造）500ユニットと供に、50mMトリス−塩酸緩衝液（100mMNaCl、10mMMgSO4、1mMジチオスレイトール含有）（pH7.5）に混合し、37℃で8時間反応させて、ＤＮＡの完全消化を行った。反応終了後、反応液を0.7%アガロース電気泳動にかけ、約8kbp付近のＤＮＡのバンドを切り出した。ゲルの中に含まれているＤＮＡをQIAEX II Gel Extraction Kit（Qiagen製）を使用して抽出、精製し、１μgの染色体ＤＮＡ断片を得た。
【００４８】
（２）プラスミドベクターpUC19を用いたBacillus sp. INT 005株の染色体ＤＮＡライブラリーの作成及びポリエステル重合酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片の検索
プラスミドベクターpUC19  ２μg及び制限酵素PstI（宝酒造）1ユニットを50mMトリス−塩酸緩衝液（100mMNaCl、10mMMgSO4、1mMジチオスレイトール含有）（pH7.5）に混合し、37℃で3時間反応させて消化し、さらにフォスファターゼ処理を行った。反応後常法により、フェノール抽出処理し、エタノール沈殿処理して、PstIで消化されたプラスミドベクターpUC19を得た。
【００４９】
次いで、このPstIで消化されたプラスミドベクターpUC19のＤＮＡ断片100ngと、上記項目（１）で得られたPstIで完全消化された染色体ＤＮＡ断片200ngを混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造）を用いて、常法に従ってＤＮＡを連結させた。このようにして得た組換え体プラスミドＤＮＡ含有液をカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラーバイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）ユニット１・４に記載の方法に従って、大腸菌JM109に塩化カルシウム法によって導入した。形質転換液をLB培地に塗布し、37℃で24時間静置培養した。生じたコロニー2000個を100クローンずつ20グループに分割した。それぞれのグループからカレントプロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー・ユニット１・６の方法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。ポリエステル重合酵素遺伝子特異的に結合するオリゴＤＮＡを用い、TaqDNAポリメラーゼ（シグマ）によって当該遺伝子の部分的増幅を行った。断片増幅が起こったグループについてさらに分割を行い最終的に断片増幅が起こる形質転換体1株を得た。
【００５０】
（３）ポリエステル重合酵素遺伝子の塩基配列の解析及びポリエステル重合酵素遺伝子の検索
上記項目（２）で得られた形質転換体を培養し、プラスミドをカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラーバイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）ユニット1.6に記載された方法によって調製した結果、約8.0キロ塩基の大きさの挿入ＤＮＡ部分を持つプラスミドが得られた。このプラスミドをpNAと命名した。プラスミドpNAを種々の制限酵素で消化することにより、得られた挿入ＤＮＡ部分の制限酵素地図を作製した。解析の結果をもとにして、pNAを制限酵素DraIで消化し、その結果生じた約3.8キロ塩基のＤＮＡ断片をSmaIで消化、フォスファターゼ処理したプラスミドベクターpUC19にサブクローニングした（pNAD38、独立行政法人産業技術総合研究所に平成１３年５月９日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３２６として寄託）。サブクローニングして得られたプラスミドを鋳型にして、それぞれのＤＮＡ断片の塩基配列決定を行った。塩基配列の決定は種々の合成ＤＮＡをプライマーとして、ダイエナミック・ET・ターミナル・サイクル・シークエンシング・キット（アマシャム・ファルマシア）およびＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー・アプライド・バイオシステムズ）（ABI社）を用いて、常法に従って行った。
サブクローニングされた挿入ＤＮＡ部分を、種々の合成ＤＮＡをプライマーとして用いて、ジデオキシ法によって塩基配列を決定した。            
【００５１】
Bacillus sp. INT 005株由来のポリエステル重合酵素遺伝子を含む3.8kbのＤＮＡ断片の全塩基配列を解析したところ、３つのオープンリーディングフレームが確認された。その内の１つで、1086塩基で構成されたオープンリーディングフレーム（ORF3）は、Bacillus megaterium由来ポリエステル重合酵素をコードする遺伝子（J. Bacteliol., 181, 585-592 (1999)）とアミノ酸配列レベルで約71.5％の相同性（FASTAプログラム）を、また744塩基で構成されたオープンリーディングフレーム（ORF2）は、Bacillus megaterium由来３−ケト−アシルCoAリダクターゼをコードする遺伝子（J. Bacteliol., 181, 585-592 (1999)）とアミノ酸配列レベルで約72.5％の相同性（FASTAプログラム）を持つことが確認された。
【００５２】
得られたBacillus sp. INT 005株由来のＯＲＦ３の塩基配列を配列番号１に、また塩基配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸一次配列を配列番号２に、ＯＲＦ２の塩基配列を配列番号５に、また塩基配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸一次配列を配列番号６に、ＯＲＦ１の塩基配列を配列番号３に、また塩基配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸一次配列を配列番号４にそれぞれ示した。得られた塩基配列を基にして、pNAD38にクローニングされたBacillus sp. INT 005株由来の3.8kbpのＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成した。この制限酵素地図のとおりである。
【００５３】
2007111052.tif 000005
【００５４】
この制限酵素地図上でORF3は約1.6〜2.7kbpの間に左から右の方向に存在する。
プラスミドpNAD38で大腸菌JM109を形質転換し、アンピシリン耐性を指標にして形質転換体を得た。pNAD38にはベクター上のlacプロモーターと順方向にORF1〜3が存在しており、培養液にイソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（IPTG）を加えることによって ORF1〜3の発現を誘導することができる。形質転換によって得られた大腸菌JM109（pNAD38）をLB培養液5ml中で培養液の600nmでの吸光度が0.6（初期対数増殖期）になるまで振とう培養した（37℃）。この時点で培養液に終濃度0.2mMになるようにIPTGを加え、さらに3時間振とう培養を続けた。培養後、遠心分離により菌体を回収し、菌体を1mlの25mMトリス塩酸バッファー（pH7.5）で洗浄後、5％グリセロールを含む25mMトリス塩酸バッファー（pH7.5）に懸濁し、超音波破砕により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心し、その上清をポリエステル重合酵素を含む粗抽出液とした。この粗抽出液を1mM(R)-３HB-CoAを含む25mMトリス塩酸バッファー（pH7.5）に10分の1量加え、ポリエステル重合酵素活性測定反応液とした。この反応液を30℃で保温、一定時間ごとにサンプリングし、2倍量の5%TCAをサンプルに加えて反応を停止させたあと、遠心して変性したタンパク質を沈殿させた。遠心後の上清に500mMリン酸バッファーとDTNB（発色液）を添加し、30℃で10分間インキュベートした。ポリエステルの重合反応にともなって遊離するCoAとDTNBが反応し412nmの吸収を呈することを利用し、吸光度変化から反応量を定量した。ポリエステル重合活性試験の結果を図１に示した。ベクターＤＮＡ（pUC19）のみを含んだ大腸菌の抽出液を添加した反応液では吸光度がほとんど変化しないのに対し、pNAD38を含んだ大腸菌の抽出液を添加した反応液では時間とともに吸光度が増加した。
【００５５】
次にORFのコードするポリペプチドの活性を確認するために、ORF1、ORF1・2をベクターDNA［pSTV28（宝酒造）］にORF3をベクターDNA［pQE30（キアゲン）］に組み込んだ。このプラスミドを大腸菌JM109に導入し、以下の6つの菌株を作成した（JM109（pSTV28、pQE30）、JM109（pSTV-ORF1、pQE30）、JM109（pSTV-ORF1・2、pQE30）、JM109（pSTV28、pQE-ORF3）、JM109（pSTV-ORF1、pQE-ORF3）、JM109（pSTV-ORF1・2、pQE-ORF3））。同様に粗酵素溶液を調製し、ポリエステル重合酵素活性を測定した（図２）。これらの結果より、ORF1と3の発現がポリエステル重合酵素活性に必須であることが確認された。
【００５６】
JM109（pSTV28）、JM109（pSTV-ORF1）、JM109（pSTV-ORF1・2）を用いて同様に粗酵素溶液を調製した。この粗抽出液を0.125mM、NADPH、0.025mMアセトアセチルを含む125mMトリス塩酸バッファー（pH8.0）に80分の1量加え、３−ケト−アシルCoAリダクターゼ活性測定反応液とした。この反応液を30℃で保温、340nmの吸光度変化（NADPHの吸収）を測定した（図３）。この結果、ORF2が３−ケト−アシルCoAリダクターゼをコードしていることがわかった。
【００５７】
JM109（pSTV-ORF1、pQE-ORF3）を用いて同様に粗酵素溶液を調製した。この粗抽出液を1mM(R)-３HB-CoAを含む25mMトリス塩酸バッファー（pH7.5）に10分の1量加え、ポリエステル重合酵素活性測定反応液とした。この反応液を25、30、37、40、42、45、50℃で保温、一定時間ごとにサンプリングした。この結果、45℃という比較的高い温度で最も高い活性を有していることがわかった（図４）。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】pNAD38を用いてORF1・2・3を発現させた大腸菌粗抽出液による(R)-３HB-CoAの重合反応の経時変化（反応の進行によって遊離するCoAをDTNB試薬によって定量）を示す。
【図２】ORF1・2・３を種々の組み合わせで発現させた大腸菌粗抽出液による(R)-３HB-CoAの重合反応の経時変化（反応の進行によって遊離するCoAをDTNB試薬によって定量）を示す。
【図３】ORF1およびORF1・2を発現させた大腸菌粗抽出液による３−ケト−アシルCoA還元反応の経時変化（反応の進行によって減少するNADPH量を340nmの吸光度変化によって定量）を示す。
【図４】ORF1・3を発現させた大腸菌粗抽出液による(R)-３HB-CoAの重合反応の至適温度を（30℃の活性を100とした相対活性として表示）示す。
【図１】
2007111052.tif 000008
【図２】
2007111052.tif 000009
【図３】
2007111052.tif 000010
【図４】
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【配列表】
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