(57)【要約】【課題】組み換えポリペプチド細胞毒性Ｔリンパ球ワクチンの提供。【解決手段】本発明は、組み換えポリペプチド細胞毒性Ｔリンパ球ワクチンに関する。このワクチンは、１つ又はそれ以上の病原からの複数の細胞毒性Ｔリンパ球エピトープを含む少なくとも１つの組み換えタンパク質を含有し、少なくとも１つの組み換えタンパク質が、前記細胞毒性Ｔリンパ球エピトープに隣接して天然に見出される配列を実質的に含まない。さらに本発明は、１つ又はそれ以上の病原からの複数の細胞毒性Ｔリンパ球エピトープをエンコードする少なくとも１つの配列を含むポリヌクレオチドも提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の病原のそれぞれの複数のＣＴＬエピトープをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ＣＴＬエピトープをコードする各配列が連続しているか、または前記エピトープの天然に見出される隣接配列をコードしない配列を介在させることによって離れており、各病原の一つ以上のエピトープが同じＨＬＡ対立遺伝子によって制限されている、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ＣＴＬエピトープが連続している、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
複数のＣＴＬエピトープをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ＣＴＬエピトープが連続している、ポリヌクレオチド。
【請求項４】
少なくとも３つのＣＴＬエピトープをコードする、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
さらにＴヘルパー細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープをコードする核酸配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
ワクシニアベクター、アビポックス(avipox)ベクター、ラブドウイルスベクター、細菌ベクター、及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）から選択される、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む核酸ワクチン。
【請求項９】
請求項６または７に記載のベクターを含む核酸ワクチン。
【請求項１０】
複数の病原のそれぞれの複数のＣＴＬエピトープを含む組み換えポリペプチドであって、前記ＣＴＬエピトープが連続しているか、または前記エピトープの天然に見出される隣接配列を含まない配列を介在させることによって離れており、各病原の一つ以上のエピトープが同じＨＬＡ対立遺伝子によって制限されている、組み換えポリペプチド。
【請求項１１】
前記ＣＴＬエピトープが連続している、請求項１０に記載の組み換えポリペプチド。
【請求項１２】
少なくとも３つのＣＴＬエピトープを含む、請求項１０または１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
さらにＴヘルパー細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープを含む、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ポリエピトープワクチンの製造における、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドの使用。
【請求項１５】
複数の病原のそれぞれの複数のＣＴＬエピトープを含む組み換えポリペプチドを含むポリエピトープワクチンであって、前記ＣＴＬエピトープが連続しているか、または前記エピトープの天然に見出される隣接配列を含まない配列を介在させることによって離れており、各病原の一つ以上のエピトープが同じＨＬＡ対立遺伝子によって制限されている、ポリエピトープワクチン。
【請求項１６】
前記ＣＴＬエピトープが連続している、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが少なくとも３つのＣＴＬエピトープを含む、請求項１５または１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
さらにＴヘルパー細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープを含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１９】
さらにＩＳＣＯＭを含む、請求項１５から１８のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２０】
さらにアジュバントを含む、請求項１５から１９のいずれか一項に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の細胞毒性Ｔリンパ球エピトープを含むワクチン、及び複数の細胞毒性Ｔリンパ球エピトープをエンコードする配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ８＋αβ細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、クラスＩ主要組織適合性複合体1（ＭＨＣ）の特異的対立遺伝子を持つ短いペプチド（エピトープ、通常８−１０アミノ酸長）を認識する。ペプチドエピトープは、主に細胞質ゾルタンパク質からタンパク質分解によって生成され、その過程は多重触媒プロテオソーム(p roteosome)複合体を含むと考えられている２−７。適当な長さのペプチドは、特異的なエピトープがＭＨＣと結合する小胞体に運ばれる。次いで、ＭＨＣ／エピトープ複合体は、ＣＴＬに認識されるために細胞表面に運ばれる。ＣＴＬエピトープのフランキング（隣接する）配列の、これらのエピトープのタンパク質分解過程への影響は議論を残している８−１２。しかし、配列中に９個のＣＤ８ＣＴＬエピトープを含む人工的ポリペプチドタンパク質をコードする組み換えワクシニアを構成することにより、本発明者等は、ＣＴＬエピトープの天然フランキング配列はクラスＩ過程には必要でないこと、即ち、ポリエピトープタンパク質内の各エピトープは常に効率的に加工され、オートロガスなポリエピトープワクシニアに感染した標的細胞によって適当なＣＴＬクローンに提示されることを決定した。
【特許文献１】オーストラリア特許第５５８２５８号
【特許文献２】欧州特許０１９９４２号
【特許文献３】米国特許４５７８２６９号
【特許文献４】米国特許４７４４９８３号
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
従って、第１の態様において、本発明は、１つ又はそれ以上の病原からの複数の細胞毒性Ｔリンパ球エピトープを含む少なくとも１つの組み換えタンパク質を含有する、組み換えポリペプチド細胞毒性Ｔリンパ球ワクチンであり、少なくとも１つの組み換えタンパク質が、前記細胞毒性Ｔリンパ球エピトープに隣接して (flank)天然に見出される配列を実質的に含まないことを特徴とするワクチンである。
【０００４】
好ましくは、少なくとも１つの組み換えタンパク質が、細胞毒性Ｔリンパ球エピトープに隣接して天然に見出される配列を含まない。しかし、細胞毒性Ｔリンパ球エピトープに隣接して天然に見出される長さの短い配列（例えば、１−５アミノ酸）は含まれていてもよい。「細胞毒性Ｔリンパ球エピトープに隣接して天然に見出される配列を実質的に含まない」という表現は、そのような長さの短いフランキング配列は含むものと解される。
【０００５】
第２の態様では、本発明は、１つ又はそれ以上の病原からの複数の細胞毒性Ｔリンパ球エピトープをエンコードする少なくとも１つの配列を含むポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの配列が、前記細胞毒性Ｔリンパ球エピトープに隣接して天然に見出されるペプチド配列をエンコードする配列を実質的に含まないことを特徴とするポリヌクレオチドである。
【０００６】
ここでも、「細胞毒性Ｔリンパ球エピトープに隣接して天然に見出される配列を実質的に含まない」という表現は、細胞毒性Ｔリンパ球エピトープに隣接して天然に見出される長さの短い配列（例えば、１−５アミノ酸）を含む可能性があると解される。
【０００７】
第３の態様では、本発明は核酸ワクチンであり、このワクチンは、本発明の第２の態様のポリヌクレオチドと、許容されうるキャリアとからなる。 第４の態様では、本発明はワクチン製剤であり、このワクチンは、本発明の第１の態様の組み換えタンパク質と、許容されうるキャリア及び／またはアジュバントを含む。
【０００８】
本発明の好ましい実施態様では、少なくとも１つの組み換えタンパク質が、少なくとも３つの細胞毒性Ｔリンパ球エピトープを含み、少なくとも１つの配列が少なくとも３つの細胞毒性Ｔリンパ球エピトープをエンコードする。
【０００９】
さらに好ましい実施態様では、エピトープが、多重病原(multiple pathogen) からのものである。
【００１０】
また、本発明のワクチンは、（シトキンなどの）イムノドゥレートリ(immunod ulatory)化合物、他のタンパク質／化合物（メリチンまたは調節タンパク質）及び／またはアジュバントを含んでも良いとされる。このワクチンは、ヘルパーエピトープ／ＣＤ４エピトープ及びタンパク質、Ｂ細胞エピトープまたは例えば破傷風毒素などのそのようなエピトープを含むタンパク質を含んでも良い。本発明のワクチンの他の例は、組み換えワクチン構造体からなり、ＣＴＬエピトープを含むポリペプチドは、細胞外糖タンパク質、または、Ｂ細胞及び／またはＣＤ４エピトープ含有糖タンパク質に結合している。
【００１１】
本発明のワクチンは、例えば、ワクシニアベクター、アビポックス(avipox)ウイルスベクター、細菌ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、及びラブドウイルスといった種々のベクターによって、または、核酸ワクチン化技術によって誘導してよい。ポリとーぷタンパク質は、製造及び／または漿液注入中にタンパク質分解を受けやすいので、我々は、そのようなワクチンを誘導する最善の方法は、核酸ワクチン化技術１２、ベクター系またはポリトープタンパク質をタンパク質分解から保護するアジュバント系を用いることであると考える。ベクターに関するさらなる情報は、Chatfield，等，Vaccine，7，495-498，1989; Taylor，等，Va ccine，13，539-549，1995; Hodson 農業におけるワクチン(Vaccines in Aglicu lture)の中の、「細菌ワクチンベクター(Bacterial Vaccine Vectors)」に見られる。
【００１２】
本発明のポリトープワクチンは、標的集団のＨＬＡ多様性をカバーするように、一つの病原からの多数のエピトープ（例えば１０以上）を含んでもよい。例えば、ＨＬＡ Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ１１、及びＡ２４に制限されたエピトープを含むワクチンは、コーカサス集団の約９０％をカバーする。
【００１３】
本発明のポリトープワクチンは、多数のエピトープが単一のＨＬＡ対立遺伝子によって制限されるように構成されてもよい。
【００１４】
本発明の第四の態様の好ましい実施態様では、ワクチン製剤はＩＳＣＯＭを含んでいる。ＩＳＣＯＭに関する情報は、オーストラリア特許第５５８２５８号、欧州特許尾０１９９４２号、米国特許４５７８２６９号、及び米国特許４７４４９８３号に見られ、これらの開示を参考として取り入れる。
【００１５】
本発明の性質をさらに明瞭に理解するために、ここで、図面を添付して、以下の実施例を参照しながら好ましい形態を説明する。 
【実施例】
【００１６】
実施例１
９個の、クラスＩ制限された、数種のエプスタイン・バールウイルス各抗原（ＥＢＮＡ）からのＣＴＬエピトープを、ＣＴＬクローンを用いて予め決定した１０、１８−２０。クローンは、通常の健常エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）セロポジティブなドナーから単離し、異なるＨＬＡ対立遺伝子で制限した（表１）。これらのＣＴＬエピトープの９個全てを含む単一の人工タンパク質をコードする組み換えポリペプチドワクシニア（ポリトープワクシニア）を構成した（図１）。このタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、オーバーラップ延長によるスプライシング（ＳＯＥｉｎｇ）、及び、６個のオーバーラップしたオリゴヌクレオチドを結合するポリメラゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて製造した。挿入断片は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩにクローンされ、配列をチェックされ、ｐＳＴＰＴ１を生成するワクシニアプロモーターの後ろで、ｐＢＣＢＯ７１５に移入された。このプラスミドは、次いで、マーカー救援組み換え１６によって、ポリトープワクシニアウイルスを生成させるために用いた。このワクシニアに表現された人工ポリトープタンパク質は、従って、その起源のタンパク質のＣＴＬエピトープに隣接して天然に見いだされる配列を含んでいない（図１）。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
ポリトープのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、ほ乳類で最もしばしば用いられるコドンで設計され、コザック(Kozac)配列１３及び開始コドンの上流側のＢａｍＨＩ部位を組み込んだ。６個の７０ｍｅｒの２０塩基対がオーバーラップしたオリゴヌクレオチドは、ともにオーバーラップ延長によるスプライシング（ＳＯＥｉｎｇ）１４を用いてスプライシングした。これは、標準ＰＣＲバッファー、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１．５ＵのＴａｑ ポリメラーゼ（９４℃で加熱開始）を含む２０μｌ反応で、以下の温度プログラムに従って行なわれた。９４℃で１０秒、４５℃で２０秒、及び７２℃で２０秒（４０サイクル）。各ゲル精製ダイマーサンプルの半分を、さらに０．５μｌのα32ｐ ｄＣＴＰを添加した第２のＰＣＲ反応（１２サイクル）に結び付けた。反応は、６％アクリルアミドゲル上で行い、ヘキサマー生成物に相当する位置のスライスを単離した。２つの２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドは、温度５６℃での２５サイクルのアニーリングを用いたヘキサマーのＰＣＲ増幅に用いられる。ゲル精製されたフラグメントはｐＢｌｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−のＥｃｏＲＶ部位にクローンされ、配列をチェックされ、ｐＳＴＰＴ１を生成するためにワクシニアプラスミドベクターｐＢＣＢ０７１５のＢａｍＨｉ／ＳａＩＩ部位を用いて、ワクシニアｐ７．５早期／晩期プロモーターの後ろにクローンされた。ＴＫ−組み換えウイルスの構成は、ｐＳＴＰＴ１とＶＶ−ＷＲ−Ｌ９２９との間の前記マーカー救済結合を用いて行われた１６。プラーク精製ウイルスは、ＴＫ表現型及び適当なゲノム配列に対して、細菌ＤＮＡのサザンブロットによって試験した１６。
【００１９】
各エピトープがポリトープタンパク質から効率的に加工されるか否かを確認するために、ポリトープワクシニアを、各エピトープを制限するＨＬＡ対立遺伝子を表現した標的細胞のパネルの感染に使用した。対で、各エピトープに特異的なオートロガスＣＴＬクローンを、標準クロム放出アッセイにおけるエフェクター細胞として使用した。試験した全てのケースで、ＣＴＬクローンは、ポリトープワクシニア及び適当な（表１）ＥＢＮＡワクシニア（正の対照）で感染したＨＬＡ適合標的細胞を認識して殺傷したが、ＴＫ−ワクシニア（負の対照）はしなかった（図２）。
【００２０】
図２は、ポリトープワクシニア構造体に表現された各エピトープのＣＴＬ認識を示す。エフェクターＣＴＬは、表１に挙げた（Ｅ：Ｔ比５：１）。標的細胞（下記）は、（ｉ）ＣＴＬクローンで認識されるＥＰＶ核光源（ＥＢＮＡ）（表１参照）（正の対照）、または（ｉｉ）ポリトープ構造体（例えば、ポリトープワクシニア）を発現する組み換えワクシニアで感染させた。標的細胞のワクシニア感染は、５：１の多重感染においておこない、次いで３７℃で１４−１６時間インキュベーションし、その後、５時間、標準51Ｃｒ放出アッセイを用いた。クローンＬＸ１は、アッセイの時点で得られなかった。標的細胞；２タイプのＥＢＶ、Ａ及びＢ−タイプがあり、これらのＥＢＮＡタンパク質配列はかなり個となっている。ＣＴＬクローンＬＣ１３、ＬＣ１５、ＣＭ４、ＮＢ２６、ＪＳＡ２、及びＣＭ９は、Ａ−タイプＥＢＶで形質転換した細胞は認識するが、Ｂ−タイプＥＢＶでは認識せず、ＣＴＬクローンＣＳ３１及びＹＷ２２は、Ａ−タイプＥＢＶ及びＥＢＶで形質転換された細胞を認識する10、18-20。Ａ−タイプ特異的ＣＴＬに対して用いる標的細胞は、従って、Ｂ−タイプウイルスで形質転換したオートロガスなリンパ芽球細胞系（Ｂ−タイプＬＣＬ）である。ＣＳ３１及びＹＷ２２に対する標的細胞は、抗−ＣＤ４０抗体及びｒＩＬ−４で確立されたＥＢＶネガティブなＢ細胞芽球である２１。
【００２１】
さらなる一連の実験は、ポリトープワクシニアを、インビトロでの、健常ＥＢＶセロポジティブドナーから得た抹消血液単核細胞（ＰＢＭＣ）からの二次的ＣＴＬ反応の刺激に用いた。その結果得られたバルクＣＴＬ培地は、次いで、標準的なクロム放出アッセイにおける、オートロガスＰＨＡ芽球に過敏化されたペプチドエピトープに対するエフェクターとして用いられる。このポリトープワクシニアは、各ドナーによって発現されたＨＬＡ対立遺伝子に制限されたエピトープに特異的なＣＴＬ反応をリコールすることができる。
【００２２】
図３は、エピトープ特異的反応をリコールできるポリトープワクシニアを示す。ドナー（Ａ）ＣＭ−Ａ２４、Ａ１１、Ｂ７、Ｂ４４；（Ｂ）ＹＷ−Ａ２、Ｂ８、Ｂ３８、及び、（Ｃ）ＮＢ−Ａ２、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ３５からのバルクエフェクターは、ポリトープワクシニアを持つ末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）で、０．０１のＭＯＩで２時間感染させ、次いで２回洗浄することによって生成された。１０％ＦＣＳ／１６４０ＲＰＭＩでの１０日培養の後、バルクエフェクターは、標準的な５時間クロム放出アッセイ１９において、示したペプチド（１０μＭ）で過敏化したオートロガスなフィトヘマグルチニンＴ細胞芽球標的細胞（Ｅ：Ｔ ２０：１）に対して使用された。照射したオートロガスＡタイプＬＣＬ１９（ＬＣＬのＰＢＭＣに対する比 １：５０）の添加によって生成したバルクエフェクターは、上記と同様の結果を与えた。
【００２３】
モノクローナル抗体（８Ｇ１０／４８２２及び８Ｅ７／５５２３）に認識された２つの線形Ｂ細胞エピトープ（ＳＴＮＳ及びＮＮＬＶＳＧＰＥＨ）は、ポリトープタンパク質の発現に従うために、各ポリトープ構造体の各末端に組み込まれた。これらの抗体を用いたウェスタンブロット及びリンパ芽球細胞系（ＬＣＬｓ）で感染したポリトープワクシニアの間接的免疫蛍光抗体染色、及び検出できるＴ２細胞列の加工６、７は、ポリトープタンパク質精製物を検出しなかった（データは示さず）。同じｐ７．５プロモーターを用いたワクシニアによって発現された組み換えタンパク質は、通常は容易に検出でき２４、このポリトープタンパク質がほ乳類細胞の細胞質中で容易に分解されることを意味している。Ｔ２細胞系はこれらのプロテオース様(proteosome)をともなうエンドペプチダーゼを発現しないので６、７、この分解は、ＬＭＰ２及び７には依存しない。この現象は、ほ乳類細胞における端を切り取ったタンパク質またはペプチドを説明する他の研究25と一致し、個のようなタンパク質が二次または三次構造に保持される可能性が無いことを反映していると思われる。
【００２４】
ヒトのポリトープを含むグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ・フュージョンベクターを構成した。ヒトポリトープをコードするＤＮＡフラグメントは、ｐＢＳポリトープから、ＢａｍＨＩＩ／ＨｉｎｃＩＩを用いて励起され、ｐＦｕｓｐｏｌｙを製造するためにｐＧｅｘ−３ｘ（ＧＳＴ遺伝子フュージョンシステムファーマシア(Pharmacia)）のＢａｍＨＩ／ＡｍａＩ制限部位にクローンされた。このプラスミドは、標準的な誘発プロトコールを用いて、細菌のポリトープフュージョンの発現に用いられた。細菌のアリコートは、ローディング・バッファー中に溶解し、寸法標識を備えた２０％ＳＤＳ ＰＡＧＥ下る上を走らせた。このゲルは、発現された約３８ｋＤ（ヒトポリトープ プラス ＧＳＴドメイン（２６ｋＤ））のタンパク質が、プラスミドを含む細菌内で発現されたことを示した。２つのモノクローナル抗体８Ｇ１０／４８及びＥ７／５５のウェスタンブロットは、検出されたフュージョンが、ポリトープ構造体の各末端に組み込まれた２つの線形Ｂ細胞エピトープ（各々、ＳＴＮＳ及びＮＮＬＶＳＧＰＥＨ）を有するヒトポリトープを含んでいることを示した。このタンパク質は、リポソームまたはＩＳＣＯＭｓに組み込まれてもよい。
【００２５】
グルタチオン寒天ビーズを使用したＧＳＴ精製を用いたフュージョンタンパク質の精製の試みは、細菌抽出物の上澄み中にフュージョンタンパク質が無いので失敗した。全てのフュージョンタンパク質は、細胞の破片とともに沈澱した。異なる細菌においてそれ自体発現されたＧＳＴは、細胞抽出物の上澄み中にあり、容易に精製できるので、プロトコールは誤っていなかった。これらのデータは、フュージョンタンパク質が、細菌封入体に隔離することなく細菌中で即座に分解されること、従って、ＧＳＴ系を用いた精製が困難なことを示している。
【００２６】
実施例２
材料及び方法
マウスのポリトープタンパク質を発現する組み換えワクシニアの構成。種々の疾患からのクラスＩマウスＣＴＬエピトープは、マウスの３つの株で表現されるＨ−２Ｄｂ、Ｈ−２Ｋｂ、Ｈ−２Ｋｄ、Ｈ−２Ｋｋ及びＨ−２Ｌｄの各々に対して２つのエピトープが存在するように選択された（表２参照）。これらのアミノ酸配列は、各々の最初の５エピトープが異なるＨＬＡ対立遺伝子に制限され、続いて第２のグループ６−１０に制限されるように配列した。エピトープの２つのグループは、母集団コドン利用データを用いてＤＮＡ配列に変換された。これら２つのＤＮＡ配列は、ＳｐｅＩによって分離され、５’末端のＸｂａｌ制限部位及び３’末端のＡｖｒＩＩ部位によってフランクされた。また、５’末端に組み込まれたのは、ＢａｍＨＩ制限部位、Ｋｏｚａｃ配列１３、及びメチオニン開始コドンである。３’末端に形質胞体ファルシファルム(falciparum)からのＢ細胞エピトープはあるが、停止コドン及びＳａＩＩ制限部位は図４及び５に見られる。５個の７５ｍｅｒのオリゴヌクレオチド及び２０塩基対がオーバーラップした７６ｍｅｒのオリゴヌクレオチドで、この３４１塩基対配列を表現するものは、オーバーラップ延長によるスプライシング（ＳＯＥｉｎｇ）１４及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてともにスプライシングした。プライマーダイマーは、プライマー１及び２、３及び４、５及び６（各０．４μｇ）から、標準１ｘＰｆｕ ＰＣＲバッファー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ及び１ＵのクローンしたＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを含む４０μｌの反応中（９４℃で加熱開始）で、下記の温度プログラムでプログラムされたパーキン・エルマー９６００ＰＣＲ装置を用いて製造した。９４℃で１０秒間、４２℃で２０秒間、及び、７２℃で２０秒間を５サイクル。ＰＣＲプログラムの５サイクルの最後に、７２℃で休止し、反応２及び３のアリコートを混合し（反応１はＰＣＲ装置に残す）、さらに５サイクルを行った。サイクル１０において、プログラムを再度停止し、２０μｌの反応１を、混合した反応２及び３に添加し、さらに５サイクルを完了した。混合した４０μｌサンプルを、４％のＮｕｓｉｅｖｅ寒天ゲル（ＦＭＣ）上でゲル精製し、集めた寸法のフラグメントに対応するゲルスライスを取り出し、Ｗｈａｔｍａｎｎ３ＭＭペーパーを通してスピンした。２つの２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを、全長生成物の、上記標準反応混合物及び５０℃のアニール温度及び２５サイクルを使用したＰＣＲ増幅に用いた。全長ＰＣＲフラグメントは、４％Ｎｕｓｉｅｖｅ寒天ゲル上でゲル精製し、ｐＢＳＭＰを製造するためにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＫＳ-のＥｃｏＲＶ部位にクローンし、配列によって突然変異をチェックした。正しい配列を含むＤＮＡ挿入片は、ＢａｍＨＩ／ＳａＩＩ制限酵素を用いて励起し、ｐＳＴＭＯＵＳＥＰＯＬＹを生成するために、同じ酵素を用いて、プラスミドシャトルベクターｐＢＣＢ０７１５内のワクシニアｐ７．５早期／晩期プロモーターの後ろにクローンした。ＴＫ−組み換えウイルスの構成は、ｐＳＴＭＯＵＳＥＰＯＬＹ及びＶＶ−ＷＲ−Ｌ９２９の間の上述した１６マーカー救済組み換えを用いて行った。プラーク精製ウイルスは、ＴＫ表現型、及び細菌��ＮＡ17のサザンブロットによる適当なゲノム配列に対して試験した。
【００２７】
マウスの組み換えマウスポリトープワクシニアでのワクチン化。組み換えワクシニアは、各々がマウスの３つの株、Ｂａｌｂ／ｃｖ、Ｃ５７ＢＬ／６、及びＣＢＡの、３匹のマウスのワクチン化に用いた。ワクチン化は、５ｘ１０７のワクシニアｐｆｕを含む５０μｌＩ．Ｖ．であり、マウスは３週間回復させた。この実験では、ＴＫ−ワクシニアは、マウスの各株に対する負の対照として用いた。
【００２８】
細胞毒性Ｔ細胞アッセイ。脾臓細胞は、ワクチン化３週間後のワクチン化マウスから取り出し、適当なペプチド（１μｇ／ｍｌ）で、印日吐露で再刺激した16 。再刺激について、負の対照として用いたペプチドは無い。７日の培養の後、再刺激したバルクエフェクターを取り出し、５時間、５１Ｃｒ−放出アッセイに用いた。これらのアッセイで用いた標的は、その株によって表現されたペプチドの１つで被覆された各株からのＣｏｎＡ芽球である。３種の標的対エフェクター比、５０：１、１０：１、及び２：１を用い、結果を図６に示した。
【００２９】
結果
マウス組み換えポリトープワクシニアの構成、マウスのポリトープに含まれるエピトープのリストを表２に挙げた。ポリトープＤＮＡ挿入片の構成を、図４にまとめた。ポリトープ配列は図５に示した。 
【００３０】
【表２】
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【００３１】
ＣＴＬアッセイ
ポリトープ内の各エピトープは、適当なＭＨＣ対立遺伝子で、マウスに主要なＣＴＬ反応を誘発した。同じ対立遺伝子に制限された２つのエピトープ間の競合は観察されなかった。（ＴＫ−対照を与えたＣＢＡマウスにおける高いｆｌｕ ＮＰ反応は、天然に獲得したインフルエンザによると思われる）。
【００３２】
種々のＭＨＣ対立遺伝子に制限された種々の疾患からの多重ＣＴＬエピトープを含むポリトープ構造体は、ポリトープワクチン内の各エピトープに対して主要なＣＴＬ反応を生じうる。これは、予防のためにＣＴＬ反応が必要なすべてのワクチンにおいて明かな応用を有する。例えば、多重ＨＩＶ ＣＴＬエピトープは治療ワクチンと組み合わせることができ、突然変異を避けることによって表現される予示エピトープとすることができ、それによって疾患の進行を防止する。マウスのポリペプチドマウスは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＴＬを有し、インビトロ及びインビボでオボアルブミン移入細胞系ＥＧ７を殺傷することができる。インビトロで示されたＥＧ７腫瘍細胞を殺傷するＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＴＬ マウスワクシニアで免疫化したマウスからの脾臓細胞を、ワクチン化４週間後に収集し、インビトロで、１０μｇ／ｍｌのＳＩＩＮＦＥＫＬで７日間再刺激した。エフェクターは、移入していない親系列ＥＬ４は溶解できないが、ＥＧ７腫瘍細胞及びＳＩＩＮＦＥＫＬで過敏化したＥＬ４細胞は溶解した。
【００３３】
マウスのポリトーアで補助されたインビボでのＥＧ７腫瘍細胞に対する保護
マウス（Ｃ５７Ｂ６）が、ヒトポリトープワクシニア（Thomsom,ら，1995）またはマウスポリトープワクシニア（１０７ｐｆｕ／マウス／ｉｐ）のいずれかに与えられ、４週間後に１０７ＥＬ４またはＥＧ７腫瘍細胞（Moore，ら，1988，Ce ll，54，777）を連続的（グループ当り１０−１１マウス）に受けた。
【００３４】
９日目における、目に見える腫瘍（いずれも＞直径１ｃｍ）を持つマウスの数を与える。  
【００３５】
【表３】
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【００３６】
ＭＣＭＶに対する保護
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ポリトープワクシニアでのワクチン化の５週間後に、ＭＣＭＶ（Ｋ１８１株、８ｘ１０３ＰＦＵ、１００μｌ 腹腔内）でチャレンジした。チャレンジの４日後、脾臓グラム当りの細菌タイターを決定し、結果を図７に示した（Scalzo，らの方法）。
【００３７】
ＤＮＡプラスミドに誘導されたポリトープワクチンの評価
上記のポリトープタンパク質は、モノクローナル抗体に認識される線形抗体エピトープを含む。しかし上述のように、ポリトープタンパク質は、保持構造を持たない配列のようにきわめて不安定なポリトープワクシニアで感染された細胞内では検出されない。従って、ポリトープワクチンの輸送は、拡散ワクチン化技術またはタンパク質分解から保護するアジュバントシステム（例えば、リポソームまたはＩＳＣＯＭ）を用いるのが最善である。
【００３８】
ｐＣＩＳ２．ＣＸＸＮＨからのＣＭＶプロモーターカセット（Easonら,（1986 ）Bioochemistry，25(26)，p8343）は、プラスミドｐＤＮＡＶａｃｃを製造するために、ｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ部位に、Ｌａｃｚ遺伝子と同じ方向でクローンされる（ＤＮＡワクチン化実験における対照プラスミドとして用いられる）。次いで、このプラスミドは（ｐＢＳＭＰからの）マウスのポリトープを持ち、多重クローニング部位のＸｈｏｌ部位に挿入されてｐＳＴＭＰＤＶを形成する。このプラスミドｐＲＳＶＧＭ／ＣＭＶＭＰは、多くの異なるプラスミドを起源とするフラグメントをもつ。ＲＳＶプロモーターは、ｐＲＳＶＨｙｇｒｏ（Long，ら,（1 991）Hum．Immunol.，31，229-235）、ｐＭＰＺｅｎからのマウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Johnson，ら,（1989）EMBO，8，441-448）及びｐＣＳからのＣＭＶプロモーターカセット（Kienzie，ら,（1992）Arch．Virol.，124，p123- 132）から励起される。ＣＭＶカセットの中に、マウスポリトープは多重クローニング部位のＳｍａＩ部位にクローンされる。両方の遺伝子、マウスＧＭ−ＣＳＦ及びマウスポリトープは、ＳＶ４０からの２方向ｐｏｌｙＡを用いる。
【００３９】
９個の６週齢雌Ｂａｌｂ／ｃマウスは、５０μｌのＰＢＳ中のｐＤＮＡＶａｃｃ（プラスミド対照）、ｐＳＴＭＰＤＶ（マウスプラスミドのみ）、またはｐＲＳＶＧＭ／ＣＭＶＭＰ（マウスＧＭ−ＣＳＦ及びマウスポリトープ）のいずれか５０μｇをＩ．Ｍ．注入された（次図参照）。これらは、３週間において、他の同じプラスミドにブースターを与えた。ワクチン化から８週目に、これらのマウスを殺傷し、脾臓を取り出した。脾臓細胞は分離され、ワクシニアでのワクチン化ほ乳類について既に述べたペプチドとともに培養した。これらのバルクエフェクターは、Ｂａｌｂ／ｃに発現されたマウスポリトープのエピトープに対応するペプチドで被覆されたｐ８１５細胞に対する５１Ｃｒアッセイに用いられた。このアッセイは、Ｅ：Ｔ比２：１、１０：１、及び５０：１で６時間行った。
【００４０】
これらの実験の結果は図８に示す。
【００４１】
マウスポリトープワクシニアに誘発されたペプチド被覆または感染した標的に対する特異的ＣＴＬ活性
方法
１．ワクチン化及びエフェクター細胞の調製。マウス（グループ当り３）は、５ｘ１０７ＰＦＵのワクシニアで、腹腔内（ＩＰ）ワクチン化された。マウスは、同じ量のワクシニア３週で、同じ経路でブースト(boost)された。最初のワクチン化後６週に脾臓を取り出し、脾臓細胞はＡＣＫバッファー（０．１５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭＫ ＨＣＯ３、０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ）での白血球溶解の後に単離した（「免疫学に於ける現在のプロトコール(Current Protocols in Immuno logy)」， Ed JE Coligan，AM Kruisbeek，DH Margulies，EM Shevach，W Strob er，1994， John Wiley and Sons Inc．USA.）。ウェル当り５ｘ１０６の脾臓細胞は、バルクＴ細胞媒質（ＲＰＭＩ／１０％ ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭグルタミン、５ｘ１０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール）中で７日間ペプチド再刺激（１μｇ／ｍｌ）された後、５１クロム（５１Ｃｒ）ラベルされた標的細胞上で細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイされた１７。再刺激に用いたペプチドは、上記ＡからＪに与えた。エフェクターは、ペプチド被覆標的Ａ−Ｊ、細菌感染標的（Ａ’−Ｊ ’）、または標的を発現する移入抗源（Ｉ’）のいずれかに対して用いた。
【００４２】
２．標的細胞の調製。これらのアッセイで用いた細胞系は、Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ−２ｄ）、Ｃ５７ＢＬ／６に対するＥＬ−４及びＥＧ７（Ｈ−２ｂ）、ＣＢＡに対するＬ９２９（Ｈ−２ｋ）、または、各々Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６またはＣＢＡマウスから調製したｃｏｎＡ芽球であった１。ＣＴＬ殺傷に必要なエピトープを発現するために、標的細胞は、（ｉ）ペプチド（Ａ−Ｊ）、（ｉｉ）ワクシニア（Ｂ’−Ｄ’、Ｆ’−Ｊ’）、または（ｉｉｉ）インフルエンザ（Ａ’、Ｅ ’）で前インキュベートするか、（ｉｖ）ＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープシステム（Ｉ’）の場合は、Ｅ１−４（ＥＧ７）のプラスミド移入物を発現するオボアルブミンとして維持した。
【００４３】
（ｉ）ペプチド被覆標的（Ａ−Ｊ）：標的細胞は、１０００ｒｐｍ／５分で遠心分離した。上澄みを約２００μｇ／ｍｌまで廃棄し、１０−２０ＰＲＭＩ（ペプチド無し）またはＲＰＭＩ（ペプチド被覆）中２００μｍｇ／ｍｌストック溶液（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）のいずれかを細胞ペレットに添加した。１００マイクロリットルの５１Ｃｒを細胞ペレットに添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ＦＣＳ下層を通してＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで細胞を２回洗浄し、ＣＴＬアッセイの標的細胞用に１０５／ｍｌで再懸濁した。
【００４４】
（ｉｉ）ワクシニア（Ｖａｃｃ）感染標的（Ｂ’−Ｄ’、Ｆ’−Ｊ’）：ワクシウイルス感染標的に用いたワクシニアはマウスポリトープ（Ｖａｃｃ Ｍｕ ＰＴ）、及び、負の対照としてのヒトポリトープ（Ｖａｃｃ Ｈｕ ＰＴ）である。ワクシニア感染された細胞系は、ｐ８１５（Ｂ’−Ｄ’）、Ｌ９２９（Ｆ’）、及びＥＬ−４（Ｇ’−Ｌ’）である。標的細胞は、１０００ｒｐｍ／５分で遠心分離した。上澄みを約２００μｌまで廃棄し、細胞（約１０６細胞）を、２０μ ｌワクシニア（１０９ｐｆｕ／ｍｌ）を添加し、続いて３７℃で１時間インキュベーションすることによる１０：１の感染多重性(multiplicity of infection) （ＭＯＩ）においてワクシニアで感染させた。次いで、５ミリリットルのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳを添加し、細胞を混合して３７℃で一昼夜インキュベートした。これらの細胞を、引き続いて遠心分離し、上澄みをカムディン(camdyne)に廃棄した。１００マイクロリットルの５１Ｃｒを細胞ペレットに加え、細胞を３７℃ で１時間インキュベートした。次いで、ＦＣＳ下層を通してＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで細胞を２回洗浄し、ＣＴＬアッセイの標的細胞用に１０５／ｍｌで再懸濁した。
【００４５】
（ｉｉｉ）インフルエンザ感染標的（Ａ’、Ｅ’）：インフルエンザウイルスのＡ／ＰＲ／８／３４株を、Ｂａｌｂ／ｃ標的（Ａ’）に、再組合せ(reassortant )Ａ／タイワン(Taiwan)／１／８６（ＩＶＲ−４０）をＣＢＡ標的（Ｅ’）にもちいた。負の対照として尿膜液を用いた。インフルエンザで感染させた細胞系は、ｐ８１５（Ａ’）及びＬ９２９（Ｅ’）である。標的細胞は、１０００ｒｐｍ／５分で遠心分離し、上澄みを廃棄した。５００ミリリットル：インフルエンザウイルス（１０８ｍｌ ＥＩＤ）または尿膜液、５０μｌの５１Ｃｒ、４００μｌのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳを細胞ペレットに加え、３７℃で１時間インキュベートした。１０ミリリットルのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳを添加し、混合して、３７ ℃でさらに２時間インキュベートした。次いで、ＦＣＳ下層を通してＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで細胞を２回洗浄し、ＣＴＬアッセイの標的細胞用に１０５／ｍｌで再懸濁した。
【００４６】
（ｉｖ）標的を発現するオボアルブミン（Ｉ’）：ＥＧ７細胞は、チキンのオボアルブミンｃＤＮＡで形質転換したＥＬ−４細胞である（Moore MW，Carbone FR 及び Bevan BJ（1988）「抗原加工及び表現のクラス１経路への可溶性タンパク質の導入(Intruduction of soluble protein into Class 1 pathway of antigen processing and presentation)」，Cell，54: 777-785）。これらの細胞は、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ、２０ｍＭ ヘペス、２ｍＭ グルタチオン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、１００１Ｕ／ｍｌ ペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン中に維持した。プラスミドを選択し、１ヶ月に１回５００μ ｇ／ｍｌで、ケネチシン(Geneticin)（Ｇ−４１８）中で維持した。ペプチド無しのＥＬ−４細胞（ＥＬ４ ｎｏ ｐｅｐ）は、負の対照として用いた。細胞は、１０００ｒｐｍ／５分で遠心分離し、上澄みは約２００μｌまで廃棄した。１００マイクロリットルの５１Ｃｒを細胞ペレットに加え、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ＦＣＳ下層を通してＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで細胞を２回洗浄し、ＣＴＬアッセイの標的細胞用に１０５／ｍｌで再懸濁した。
【００４７】
３．ＣＴＬアッセイ。 再刺激した脾臓細胞（５ｘ１０６／ｍｌ）を、ＣＴＬアッセイ用に、３種のエフェクター：標的比（５０、１０、２ｘ１０４エフェクター細胞：１ｘ１０４標的細胞）で、３つ（１００μｌ）に分けた。標的細胞（１０５／ｍｌ）の１００マイクロリットルを、全てのエフェクター及び対照ウェル（自発放出＝１００、１μｌ媒質；最大放出＝１００μｌ ０．５％ＳＤＳ／ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ）に添加した。マイクロタイタープレートを、５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、３７℃で６時間インキュベートした。プレートは５００ｒｐｍ／５分で再度遠心分離し、２５μｌの上澄みの５１Ｃｒ放出を計数した。特異的溶解の比率（％）は、３回の計数の平均を表す：１００ｘ（試験ｃｐｍ−自発ｃｐｍ）／（最大ｃｐｍ−自発ｃｐｍ）。 
【００４８】
結果を図９に示す。
【００４９】
ＤＮＡワクチン化実験
最初のＤＮＡワクチン化実験は、ポリペプチドがＤＮＡワクチン化を用いて誘導されることを示す。さらに、ワクチン化はシトキン遺伝子（ＧＭ−ＣＦＳ）とともに誘導することによって促進されるが、この実験においては、この促進は満足できるほど有意ではない。
【００５０】
現在のシステムは、明らかに最適に次ぐものである。同様の促進は、潜在的によりよいプラスミドベクター、例えばＶｉｃａｌ、サンディエゴからのプラスミドの使用（Sedegah M，R Hendestrom，P Hobart，SL Hoffman，1994，「サーカムスポロゾイテタンパク質をエンコードするプラスミドＤＮＡでの免疫化によるマラリアに対する保護(Protection against malaria by immunisation with pla smid DNA encoding circumsporozoite protein)」，PNAS，91，9866-9870）、及び、遺伝子銃を用いた（ＩＭ注入に対して）よりよい誘導システム（SUn WH.，B urkholder JK.，Sun J.，Culp J.，Lu XG.，Pugh TO.，Ershler WB，Yang NS.，「遺伝子銃によるインビボのシトキン遺伝子輸送がマウスにおける腫瘍成長を低減させる(IN VIVO CYTOKINE GENE TRANSFER BY GENE GUN REDUCES TURMOUR GROW TH IN MICE)」，Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America)，92: 2889-2893，1995）。さらに、ＣＴＬエピトープに対するプライミングはＣＤ４Ｔ細胞の助けを必要とし17、よって、構造体にヘルパーエピトープまたはタンパク質を含むことは、マウスＤＮＡワクチンポリトープによるＣＴＬプライミングのレベル及び信頼性を向上させる。
【００５１】
「最初の抗原シン(sin)」の欠如、即ち、個体が既にエピトープの中の１つに反応を得ていたときの、ポリトープがポリトープ中の全てのエピトープの免疫反応を向上させる可能性。
導入
最初の抗原シンとは、抗原に基づく現象に与えられた用語であり、その現象によって、エピトープに対して存在する抗体反応が、第２のエピトープに対する免疫反応の発生を、そのエピトープがダイ１のエピトープと雄ねじタンパク質上に存在する場合に防止する（Benjamini E.，Andria M.L.，Estin C.D.，Notron，F ．L．& Leung C.Y.（1988）「タンパク質抗原にエピトープに対する反応のクローン性に関する研究。エピトープ認識クローン活性のランダム性及びクローナル優勢の開発(Stdies on the clonality of the response to an epitope of a pr otein antigen．Randomness of activation of epitope-recognizing clones an d the development of clonal dominance.)」，J．Immunol.，141，55）。この現象の原因は、第１のエピトープに特異的なプライムしたＢ細胞の大集団が、第２の抗体に特異的な無垢のＢ細胞が、抗原と結合し、それを加工し、そしてそれをＴヘルパー細胞に提示する機会を持つ以前に、全ての抗原に結合して拭き取ってしまうことである。同様の状況は、個体が、彼／彼女がポリトープ中のエピトープの１つに対する反応を既に有している場合に、ポリトープでワクチン化されるときにも起こりうる。存在するＣＴＬは、他のエピトープが向くのＴ細胞に提示される前に、ポリトープ発現細胞の全てを殺傷するだろう。
【００５２】
方法
この可能性を試験するために、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）を１０４ｐｆｕのマウスのシトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）（Ｋ１８１株 − Scalzo．等，1995）で感染させ、５週間放置し、その時点で、ＭＣＭＶエピトープ、ＹＰＨＦＭＰＴＮＬに特異的な強いＣＴＬ反応を起こした（Scalzo，等，1995 − 図２Ａ）。これらのマウスは、次いで、マウスポリトープワクシニアを与えられ、脾臓細胞は、１０日後に、マウスのこの株のポリトープによって発現される他の３つのエピトープ（ＲＰＱＡＳＧＶＹＭ、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス核タンパク質、Ｈ−２Ｌｄ；ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ、インフルエンザ核タンパク質、Ｈ−２Ｋｄ、及び、ＳＹＩＰＳＡＥＫＩ、Ｐ．ベルグハイ(P．Berghei)サーカムスポロゾイテ、Ｈ−２Ｋｄ）に特異的なＣＴＬに対して試験された。
【００５３】
結果
３つの新しいエピトープの各々に対する反応は、以下のポリトープワクチン化に見られ、ＹＰＨＦＭＰＴＮＬ特異的ＣＴＬは、ＲＰＱＡＳＧＶＹＭ、ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ及びＳＹＩＰＳＡＥＩに特異的なＣＴＬのプライミングを、これら４つのエピトープがポリトープ中にともに存在する場合は阻害しないことが示された。（マウスポリトープワクシニアではなくヒトポリトープワクシニアを受けた対照動物は、ＹＰＨＦＭＰＴＮＬ特異的ＣＴＬのみを示した。）
【００５４】
この一連の実験は、例えば、ポリトープが種々の異なる疾患をカバーするように設計されれば、そのようなポリトープワクチンを受けた個体は、標的とする疾患の１つに既に罹患していなければ、ポリトープ中の残ったＣＴＬエピトープに対して免疫化されることを示している。
【００５５】
当業者には明らかなように、本発明者等は、クラスＩ加工にはＣＴＬエピトープのフランキング配列は必要ないこと、即ち、ポリトープタンパク質内の各エピトープは常に効率的に加工され、オートロガスなポリエピトープワクシニア感染した標的細胞によって適当なＣＴＬクローンに提示されることを示した。ポリトープが、エピトープに隣接して天然には見いだせない配列を含んでも良いことは当業者にとって明白である。
【００５６】
上で議論したように、本発明はエピトープの範囲で使用できる。エピトープの範囲は、Brusic，等，Nucleic Acids Research，1994，22; 3663-5 に記載されたインターネットのアドレスから知ることができる。
【００５７】
特別な実施態様として示した本発明を、広く記載した精神または範囲から離れることなく種々の変形及び／または修飾を施すことは当業者には容易である。これらの実施態様は、全ての点において例示的であり、何ら制限するものではない。
【００５８】
（参考文献）
2007135598.tif 000006
2007135598.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】配列中に９個のＣＴＬエピトープを含有するポリトープタンパク質をコードする合成ＤＮＡ挿入断片を発現する組み換えワクシニアの構造。ボックスで囲った配列は、線形Ｂ細胞エピトープを発現する。
【図２】組み換えポリトープワクシニア構造体で発現された各エピトープのＣＴＬ認識。
【図３】ポリトープワクシニアは、エピトープ特異的反応をリコール(recall)する。ドナー（Ａ）ＣＭ−Ａ２４、Ａ１１、Ｂ７、Ｂ４４；（Ｂ）ＹＷ−Ａ２、Ｂ８、Ｂ３８、及び、（Ｃ）ＮＢ−Ａ２、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ３５からのバルクエフェクターは、ポリトープワクシニアを持つ末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）で、０．０１のＭＯＩで２時間感染させ、次いで２回洗浄することによって生成された。１０％ＦＣＳ／１６４０ＲＰＭＩでの１０日培養の後、バルクエフェクターは、標準的な５時間クロム放出アッセイ１４において、示したペプチド（１０μＭ）で過敏化したオートロガスなフィトヘマグルチニンＴ細胞芽球標的細胞（Ｅ：Ｔ ２０：１）に対して使用された。照射したオートロガスＡタイプＬＣＬ１４の添加によって生成したバルクエフェクターは、上記と同様の結果を与えた。
【図４】１０個のマウスＣＴＬエピトープを含むポリトープＤＮＡ挿入断片(i nsert)の構造を示す。
【図５】図１のポリトープＤＮＡ挿入断片の配列を示す。
【図６−１】図３のＤＮＡ挿入断片を含む組み換えワクシニアでワクチン化されたマウスから取り出した脾臓細胞に行ったＣＴＬアッセイの結果を与える。
【図６−２】図３のＤＮＡ挿入断片を含む組み換えワクシニアでワクチン化されたマウスから取り出した脾臓細胞に行ったＣＴＬアッセイの結果を与える。
【図６−３】図３のＤＮＡ挿入断片を含む組み換えワクシニアでワクチン化されたマウスから取り出した脾臓細胞に行ったＣＴＬアッセイの結果を与える。
【図７】ポリトープワクシニアワクチン化の５週間後、及び、ＭＣＭＶチャレンジの４日後の脾臓ＭＣＭＶタイター（±標準誤差）の比較を示す。Ｐ値−非対スチューデントｔ−テスト。
【図８】Ｂａｌｂ／ｃマウス中の異なるプラスミドでのＤＮＡワクチン化。
【図９−１】これらの株（Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＢＡ、Ｃ５６ＢＬ／６）からのマウスのポリトープワクシニア免疫化（ＩＰ）マウスは、移植された脾臓を持ち、脾臓細胞は、ペプチド（例えば、Ａ’に対してＡ）で再刺激された。エフェクターは、インフルエンザＮＰペプチド”ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ”での刺激によって生成された。エフェクターは、次いで、ペプチド被覆標的（Ａ−Ｊ）、ウイルス感染標的（Ａ’−Ｊ’）、及び、腫瘍標的（Ｉ’）に用いられた。ウイルス感染標的は、負の対照としての尿膜液(allantoic fluid)（Ａ’、Ｆ’）、または、マウスポリトープワクシニア（Ｖａｃｃ Ｍｕ ＰＴ）（Ｂ’−Ｄ’、Ｆ’−Ｊ’）のいずれかで、負の対照としてヒトポリトープワクシニア（Ｖａｃｃ Ｈｕ ＰＴ）で感染した。
【図９−２】これらの株（Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＢＡ、Ｃ５６ＢＬ／６）からのマウスのポリトープワクシニア免疫化（ＩＰ）マウスは、移植された脾臓を持ち、脾臓細胞は、ペプチド（例えば、Ａ’に対してＡ）で再刺激された。エフェクターは、インフルエンザＮＰペプチド”ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ”での刺激によって生成された。エフェクターは、次いで、ペプチド被覆標的（Ａ−Ｊ）、ウイルス感染標的（Ａ’−Ｊ’）、及び、腫瘍標的（Ｉ’）に用いられた。ウイルス感染標的は、負の対照としての尿膜液(allantoic fluid)（Ａ’、Ｆ’）、または、マウスポリトープワクシニア（Ｖａｃｃ Ｍｕ ＰＴ）（Ｂ’−Ｄ’、Ｆ’−Ｊ’）のいずれかで、負の対照としてヒトポリトープワクシニア（Ｖａｃｃ Ｈｕ ＰＴ）で感染した。
【図９−３】これらの株（Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＢＡ、Ｃ５６ＢＬ／６）からのマウスのポリトープワクシニア免疫化（ＩＰ）マウスは、移植された脾臓を持ち、脾臓細胞は、ペプチド（例えば、Ａ’に対してＡ）で再刺激された。エフェクターは、インフルエンザＮＰペプチド”ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ”での刺激によって生成された。エフェクターは、次いで、ペプチド被覆標的（Ａ−Ｊ）、ウイルス感染標的（Ａ’−Ｊ’）、及び、腫瘍標的（Ｉ’）に用いられた。ウイルス感染標的は、負の対照としての尿膜液(allantoic fluid)（Ａ’、Ｆ’）、または、マウスポリトープワクシニア（Ｖａｃｃ Ｍｕ ＰＴ）（Ｂ’−Ｄ’、Ｆ’−Ｊ’）のいずれかで、負の対照としてヒトポリトープワクシニア（Ｖａｃｃ Ｈｕ ＰＴ）で感染した。
【図９−４】これらの株（Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＢＡ、Ｃ５６ＢＬ／６）からのマウスのポリトープワクシニア免疫化（ＩＰ）マウスは、移植された脾臓を持ち、脾臓細胞は、ペプチド（例えば、Ａ’に対してＡ）で再刺激された。エフェクターは、インフルエンザＮＰペプチド”ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ”での刺激によって生成された。エフェクターは、次いで、ペプチド被覆標的（Ａ−Ｊ）、ウイルス感染標的（Ａ’−Ｊ’）、及び、腫瘍標的（Ｉ’）に用いられた。ウイルス感染標的は、負の対照としての尿膜液(allantoic fluid)（Ａ’、Ｆ’）、または、マウスポリトープワクシニア（Ｖａｃｃ Ｍｕ ＰＴ）（Ｂ’−Ｄ’、Ｆ’−Ｊ’）のいずれかで、負の対照としてヒトポリトープワクシニア（Ｖａｃｃ Ｈｕ ＰＴ）で感染した。
【図９−５】これらの株（Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＢＡ、Ｃ５６ＢＬ／６）からのマウスのポリトープワクシニア免疫化（ＩＰ）マウスは、移植された脾臓を持ち、脾臓細胞は、ペプチド（例えば、Ａ’に対してＡ）で再刺激された。エフェクターは、インフルエンザＮＰペプチド”ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ”での刺激によって生成された。エフェクターは、次いで、ペプチド被覆標的（Ａ−Ｊ）、ウイルス感染標的（Ａ’−Ｊ’）、及び、腫瘍標的（Ｉ’）に用いられた。ウイルス感染標的は、負の対照としての尿膜液(allantoic fluid)（Ａ’、Ｆ’）、または、マウスポリトープワクシニア（Ｖａｃｃ Ｍｕ ＰＴ）（Ｂ’−Ｄ’、Ｆ’−Ｊ’）のいずれかで、負の対照としてヒトポリトープワクシニア（Ｖａｃｃ Ｈｕ ＰＴ）で感染した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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