(57)【要約】      （修正有）【課題】モラクセラ属カタル球菌（Moraxella catarrhalis）由来の未変性のトランスフェリン受容体タンパク質の提供。【解決手段】ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したとき、約８０〜約９０ｋＤａの見かけ上分子量を有するモラクセラ属菌株、特にＭ．カタラリスの単離、精製した未変性トランスフェリン受容体タンパク質。【効果】トランスフェリン受容体タンパク質またはそのフラグメント類縁体は、診断薬および特にモラクセラ属菌株によって起こる疾病に対する防御能を賦与するために宿主にｉｎ ｖｉｖｏで投与するための免疫原性組成物として有用である。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドデシル硫酸ナトリウム  ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法によって測定した際、約８０ｋＤａ〜約９０ｋＤａに見かけ上の分子量を示す、モラクセラ属菌株由来の単離・精製された、非変性トランスフェリン受容体タンパク質であり、
タンパク質変性剤を利用することなく、該非変性トランスフェリン受容体タンパク質の単離・精製が実施されており、
前記非変性トランスフェリン受容体タンパク質は、該モラクセラ属菌株由来のＯＭＰ  Ｂ２タンパク質、ならびに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって測定した際、１０５ｋＤａに見かけ上の分子量を示す、該モラクセラ属菌株由来のトランスフェリン受容体タンパク質を実質的に含まない
ことを特徴とする、モラクセラ属菌株由来の単離・精製された、非変性トランスフェリン受容体タンパク質。
【請求項２】
該モラクセラ属菌株は、モラクセラ  カタラリスである
ことを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
該モラクセラ属菌株は、モラクセラ  カタラリス  ４２２３株、  ５１９１株、または１３５株である
ことを特徴とする、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
該タンパク質は、少なくとも純度７０重量％である
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
該タンパク質は、少なくとも純度９０重量％である
ことを特徴とする、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
ドデシル硫酸ナトリウム  ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法によって測定した際、約８０ｋＤａ〜約９０ｋＤａに見かけ上の分子量を示す、モラクセラ属菌株由来の単離・精製された、非変性トランスフェリン受容体タンパク質を含んでなる水溶液であって、
タンパク質変性剤を利用することなく、該非変性トランスフェリン受容体タンパク質の単離・精製が実施されており、
前記非変性トランスフェリン受容体タンパク質は、該モラクセラ属菌株由来のＯＭＰ  Ｂ２タンパク質、ならびに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって測定した際、１０５ｋＤａに見かけ上の分子量を示す、該モラクセラ属菌株由来のトランスフェリン受容体タンパク質を実質的に含まない
ことを特徴とする、組成物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の非変性トランスフェリン受容体タンパク質を免疫有効量含んでなる、宿主の免疫に適合する免疫原性組成物を用いて、ヒト以外の宿主を免疫して創製することが可能な、モラクセラ属菌株由来の非変性トランスフェリン受容体タンパク質に対する特異的な抗体を作製する方法であって、
前記抗体は、該モラクセラ属菌株に対する殺菌力を示す
ことを特徴とする、モラクセラ属菌株由来の非変性トランスフェリン受容体タンパク質に対する特異的な抗体を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、免疫学分野に関し、特に、モラクセラ属菌（Moraxella）由来のトランスフェリン受容体タンパク質と、その生産方法およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
中耳炎は、小児早期に最も普通に見られる疾病であり、全小児の約８０％は３才までに一度は中耳炎に罹患する（リファレンス１：本出願では、発明に関係する技術の現状を詳しく説明するために多数のリファレンスを丸括弧で囲んで示してある。丸括弧で示したリファレンスの書誌的情報の詳細は、本出願の請求の範囲の直前に列記している。これらの文献の中に開示されている事項は、本出願中において、その文献を示して参照し、本出願の開示に取り込まれる。）。小児においては、慢性中耳炎は、聴覚障害、言語障害、知覚障害に進行することがある。その原因は、約５０％が肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、約３０％が型別不能のインフルエンザ菌（non-typable Haemophilus influenzae）、約２０％がモラクセラ属カタル球菌（Moraxella (Branhamella) catarrhalis）による細菌感染である。米国だけで、中耳炎の治療には、抗生物質と、扁桃切除手術、アデノイド切除手術、鼓膜切開チューブ挿入などの外科的治療のために、年間１０〜２０億ドルの費用が掛かっている。生涯のうちでも、言語機能が急速に発達している時期に、中耳炎を発症するので、頻繁に中耳炎に罹ている子供では、特に、学習ならびに聴覚に関連した発育障害が報告されている。
【０００３】
カタル球菌（M. catarrhalis）は、主に気道でコロニーを形成し、そして、主には粘膜病原菌である。鼓室穿刺により得られた中耳液の培養物を用いた研究では、カタル球菌（M. catarrhalis）は、中耳炎の症例の約２０％を引き起こしている(リファレンス２)。
【０００４】
カタル球菌（M. catarrhalis）は、長い間。日和見感染病原菌と見做されてきたが、現在では、局所的感染、または、より稀れではあるが、全身感染の結果として、ヒトを衰弱させる多様な疾病を引き起こすことが認識されている。カタル球菌（M. catarrhalis）は、成人における下部気道感染症、特には、慢性気管支炎と気腫の発症における、主要原因である（リファレンス３、４、５、６、７、８、９）。カタル球菌（M. catarrhalis）は、小児と成人における副鼻腔炎を引き起こし(リファレンス１０、１１、１２、１３、１４)、時には、侵襲性疾患を引き起こすこともある(リファレンス１５、１６、１７、１８、１９、２０)。さらに、カタル球菌（M. catarrhalis）は、医療施設内において、院内感染の発生の原因と目されている(リファレンス２１)。
【０００５】
カタル球菌（M. catarrhalis）に起因する中耳炎の発症例は増加している。肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）と型別不能のインフルエンザ菌（non-typable Haemophilus influenzae）が原因の中耳炎を予防する方法が開発されるにつれて、中耳炎の原因として、カタル球菌（M. catarrhalis）の相対的な重要性は、更に高まるものと予想される。臨床現場では、分離カタル球菌の抗生物質耐性が一般に見られるようになっている(リファレンス２２)。このように、１９７０年以前にすでにβ−ラクタマーゼを産生するカタル球菌（M. catarrhalis）の存在が報告されていたが、その後１９７０年代の中頃には、β−ラクタマーゼを発現するカタル球菌（M. catarrhalis）が頻繁に分離されている。
【０００６】
鉄制限は、細菌病原菌に対する一般的な宿主防御機構であるが、必ずしも、全部の病原菌の成長速度を制限するものではない（リファレンス２３）。髄膜炎菌（Neisseria menigitidis）（リファレンス２４）、淋菌（N. gonorrhoeae）（リファレンス２５）、インフルエンザ菌（Haempphilus influenza）（リファレンス２６）を含む若干の細菌は、２種類の膜タンパク質を産生し、これらは特異的にヒト・トランスフェリンと結合する（リファレンス２７、２８）。これらのタンパク質の発現は、それらの菌の成長環境中に存在する鉄の量により制御を受ける。その他の細菌の受容体とは異なって、カタル球菌（M. catarrhalis）の受容体は、鉄結合トランスフェリン（すなわち、フェリトランスリン）に対して、優先的な親和性を有している（リファレンス２９）。この２つのカタル球菌（M. catarrhalis）のトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）の見かけ分子量は、１つは１１５ｋＤａ（ＴｆＲ１）であり、もう一方は８０から９０ｋＤａ（ＴｆＲ２）である（リファレンス２７）。
【０００７】
外膜タンパク質ＯＭＰ・Ｂ２（リファレンス３０、３１）の分子量は、このＴｆＲ２に近く、さらに、このＯＭＰ・Ｂ２の発現は、鉄の存在量により制御されていると報告されている(リファレンス３２)。
【０００８】
Yu と Schryvers は、カタル球菌（M. catarrhalis）由来のトランスフェリン受容体タンパク質（ＴｆＲ１とＴｆＲ２）の精製法、つまり、変性剤であるグアニジン・ＨＣＬを使用して、トランスフェリン・セファロース親和性カラムから選択的に溶出させる方法を記載している（リファレンス２９）。
【０００９】
この受容体タンパク質の生産的分離方法では、鉄欠乏カタル球菌（M. catarrhalis）の未精製細胞膜に、ＥＤＴＡを２０ｍＭ、サルコシル（Sarkosyl）を０．７５％まで添加して溶解させ、その混合物を２０、０００ｇで１５分間遠心分離して、砕片を取り除く。その上清に、２０ｍｌのＦｅ2ｈＴｆ−セファロース（すなわち、鉄飽和ヒト・トランスフェリン）を添加し、攪拌しながら室温で４５分間インキュベートした。その混合物をカラムに掛け、結合溶液を取り除いた後、樹脂を２５０ｍｌの５０ｍＭトリスＨＣＬ、１Ｍ・ＮａＣｌ、２０ｍＭ・ＥＤＴＡ、０．７５％サルコシル(Sarkosyl)、２５０ｍＭ・グアニジン・ＨＣＬを含む緩衝液（ｐＨ８）で洗浄した。１．５Ｍのグアニジン−ＨＣＬを含む緩衝液（サルコシルを含まない）使用して、ＴｆＲ２タンパク質を溶出させ、その後、ＴｆＲ１タンパク質を、４Ｍ  グアニジンを含む緩衝液を使用して溶出させた。その分画を、５０ｍＭ  トリスＨＣＬ（ｐＨ８）に対して、２４時間透析した。
【００１０】
この手順を更に改良した方法では、ＴｆＲ１と結合させるために、アポ・ｈＴｆ−セファロースを溶解膜調製物に混合し、その後、この処理を施した溶解膜調製物を、Ｆｅ2ｈＴｆ−セファロースに曝して、残っているＴｆＲ２と結合させる。その後、各アフィニティ樹脂を洗浄し、受容体タンパク質を上記ように溶出させた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
カタル球菌（M. catarrhalis）感染は重大な疾病に発展する可能性がある。従って、ワクチンを含む免疫原性調製物、その他の抗原ならびに免疫原の担体、診断試薬の生産において、抗原として使用するため、カタル球菌（M. catarrhalis）由来の未変性のトランスフェリン受容体タンパク質を提供することには利点がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明の目的は、モラクセラ属カタル球菌（Moraxella catarrhalis）およびその他のモラクセラ属（Moraxella）菌株から分離して精製した、見かけの分子量が約８０〜９０ｋＤａのトランスフェリン受容体タンパク質を提供することである。
【００１３】
本発明の態様の１つによれば、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した際、見かけの分子量が約８０〜約９０ｋＤａである、モラクセラ属（Moraxella）菌株由来の、分離精製された、未変性トランスフェリン受容体タンパク質（ＴｆＲ２）、またはそのフラグメントあるいは類似体が提供される。本発明のトランスフェリン受容体タンパク質は、（該モラクセラ属（Moraxella）菌株中のトランスフェリン受容体タンパク質の特徴的な免疫原性が実質的に保持されるように）、実質的に、その本来の立体配座で存在してもよく、また、モラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）４２２３、５１９１、１３５のような、カタル球菌（M. catarrhalis）菌株から分離できる。見かけの分子量が約８０〜約９０ｋＤａである、かかる分離・精製されたトランスフェリン受容体タンパク質は、分子量が８０〜約９０ｋＤａではない、別のモラクセラ属菌（Moraxella）タンパク質、特には、ＯＭＰ・Ｂ２タンパク質や、モラクセラ属（Moraxella）菌株の見かけの分子量約１０５ｋＤａであるトランスフェリン受容体タンパク質、モラクセラ属菌のホスホリピドやリポ多糖を、実質的に含んでいない。この約８０〜９０ｋＤａのトランスフェリン受容体タンパク質は、少なくとも、その純度が７０ｗｔ％、好ましくは、９０ｗｔ％であり、また、その水溶液の形態とすることができる。
【００１４】
さらに本発明は、薬学的に許容される担体と共に提供されている、免疫的に有効量の活性成分を、それは、トランスフェリン受容体タンパク質、あるいは、そのフラグメント、または類似体のいずれでよいが、含んでなる免疫原性組成物を提供する。この免疫原性組成物は、モラクセラ属（Moraxella）菌株、特にモラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）が原因となる疾病に対する防護を付与するために、宿主にインビボ投与するワクチンとして処方してもよい。この免疫原性組成物は、微粒子カプセル、ＩＳＣＯＭまたはリポソーム調製物として、調剤も可能である。この免疫原性組成物は、免疫システムの特定細胞または粘膜表面への薬剤デリバリーのためのターゲット分子と組み合わせて使用することも可能である。このターゲット分子には、ＷＯ９２／１７１１６７（Biotech Australia Pty. Ltd.）中に記載されているような、細菌毒素のフラグメントや菌株Ｂ１２、ならびに、米国特許５，１９４，２５４（Barber et al）中に記載されているような、モノクローナル抗体が含まれる。（ワクチンを含む）本発明の免疫原性組成物は、少なくとも１種の別の免疫原性または免疫刺激性物質を含んでもよく、そして、その免疫刺激物質は、少なくとも、１種のアジュバントでもよい。本発明で使用できる適当なアジュバントには、（ここで提示するものに限定はされないは）、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、Ｑｕｉ１  Ａ、その誘導体ならびにその構成要素、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質の類似体、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミルジペプチド、ポリ-ホスファゼン、リポタンパク質が含まれる。アジュバントの有利な組み合わせについては、本願の譲受人に対して譲受けがなされている、同時係属米国特許出願番号０８／２６１，１９４（１９９４年６月１６日）中に記載されており、それを参照することで、その開示内容は本願中に組み入れられる。本発明には、さらに、ここに提供される免疫原性組成物によって、宿主を免疫することで創製可能な、ここで提供されるトランスフェリン受容体タンパク質に対して、特異的な抗体も含まれる。
【００１５】
本発明で提供される免疫原性組成物は、パラミクソウイルス（paramuxovius）、クラミジア（Chlamydia）、ポリオウイルス（polio）、Ｂ型肝炎菌（hepatitis B）、ジフテリア・トキソイド（diphtheria toxoid）、破傷風トキソイド（tetanus toxoid）、インフルエンザ菌（influenza）、ヘモフィルス菌（haemophilus）、百日咳菌（pertussis）、肺炎球菌（pnuemococcus）、ミコバクテリア（mycobacteria）、Ａ型肝炎菌（hepatitis A）に含まれる、あるいは、それらに由来するものでもよい、少なくとも、１種の追加の免疫原をも含有するように、処方することできる。
【００１６】
本発明の別の態様によれば、ここに提供される、免疫原性組成物を投与する工程を含んでいる、宿主中において、免疫応答を創製する方法が提供される。その免疫応答は、体液性免疫応答または細胞性免疫応答のいずれでもよい。疾病に対する防御が付与される、宿主には、ヒトを含む霊長動物が含まれる。
【００１７】
本発明の付加的な態様によれば、本発明は、
ここで提供される免疫原性組成物を試験対象宿主に投与して、モラクセラ属（Moraxella）菌株が原因である疾病に対する防護を付与する上で適する、トランスフェリン受容体タンパク質の投与量とその頻度を決定する工程と、
前記の決定された投与量と投与頻度に従って、治療される宿主への投与に適する形状で、トランスフェリン受容体タンパク質を調剤する工程とを含んでいる、ワクチンの生産方法を提供する。その治療される宿主はヒトでもよい。
【００１８】
本発明のさらなる態様によれば、
（ａ）トランスフェリン受容体タンパク質と、これと特異的に反応する、試料中に存在する抗体とを含む複合体を産生させるために、本発明により提供されるトランスフェリン受容体タンパク質と試料を接触させる工程と、
（ｂ）複合体の産生の有無を決定する工程とを含んでいる、分子量が約８０〜約９０ｋＤａである、モラクセラ属（Moraxella）菌株由来のトランスフェリン受容体タンパク質と特異的に反応する試料中の抗体の存在を決定する方法を、本発明は提供する。
【００１９】
本発明の更なる態様によれば、
（ａ）対象をここで提供される免疫原性組成物で免疫して、トランスフェリン受容体タンパク質に対する特異的は抗体を生産させる工程と、
（ｂ）試料を該抗体に接触させて、試料中に存在する該外膜タンパク質と、前記外膜タンパク質の特異的抗体とからなる複合体を産生させる工程と、
（ｃ）複合体の産生の有無を決定する工程とを含んでいる、
試料中のモラクセラ属（Moraxella）菌株由来の分子量が約８０〜約９０ｋＤａのトランスフェリン受容体タンパク質の存在を決定する方法を本発明は提供する。そのトランスフェリン受容体タンパク質は、モラクセラ属カタル球菌（Moraxella catarrhalis）菌株の一部であってもかまわない。
【００２０】
本発明の更なる態様によれば、
分子量が約８０〜約９０ｋＤａである、モラクセラ属（Moraxella）菌株由来のトランスフェリン受容体タンパク質に対する特異的な反応性を有する抗体の、試料中での存在を決定するための、診断キットであって、
（ａ）ここで提供されるトランスフェリン受容体タンパク質と、
（ｂ）試料中に存在する前記抗体とトランスフェリン受容体タンパク質とからなる複合体を産生させるため、トランスフェリン受容体タンパク質を試料に接触させる手段と、
（ｃ）複合体の産生の有無を決定する手段とを含んでいるキットを提供する。
【００２１】
また、本発明は、
（ａ）ここで提供される分子量が約８０〜約９０ｋＤａであるトランスフェリン受容体タンパク質に対する特異的な抗体と、
（ｂ）トランスフェリン受容体タンパク質とトランスフェリン受容体タンパク質に特異的抗体とからなる複合体を産生させるために、抗体を試料に接触させる手段と、
（ｃ）複合体の産生の有無を決定する手段とを含んでいる、
分子量が約８０〜約９０ｋＤａである、モラクセラ属（Moraxella）菌株由来のトランスフェリン受容体タンパク質の、試料内における存在を検出するための診断キットを提供する。
【００２２】
さらに別の態様によれば、本発明は、
ここで提供される免疫原性組成物を試験宿主に投与して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）により分析した際、見かけの分子量が約８０〜約９０ｋＤａであるトランスフェリン受容体タンパク質、あるいは、試験宿主中において、トランスフェリン・タンパク質に対して、特異的な反応性を有する抗体を誘発する能力のあるタンパク質を産生する、モラクセラ属（Moraxella）菌株が原因である疾病に対する防護を付与する上で、適する投与量と投与頻度を決定する工程と、
前記の決定された投与量と投与頻度に従って、ヒトを含む、治療される宿主への投与に適する形状で、該免疫原性組成物を調剤する工程とを含んでいる、ワクチンの生産方法を提供する。
【００２３】
本発明の付加的な態様によれば、
（ａ）ここに提供されるトランスフェリン受容体タンパク質を、少なくとも１匹のマウスに投与して、免疫されたマウスを作る工程、
（ｂ）少なくとも１匹の免疫されたマウスからＢ−リンパ球を取り出す工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（myeloma cells）と、少なくとも１匹の免疫されたマウス由来のＢ−リンパ球とを溶融させ、ハイブリドーマを作製する工程、
（ｄ）ハイブリドーマをクローン化する工程、
（ｅ）抗−トランスフェリン受容体タンパク質抗体を産生するクローンを選択する工程、
（ｆ）抗−トランスフェリン受容体タンパク質抗体を産生するクローンを培養する工程  、
（ｇ）その培養物から、抗−トランスフェリン受容体タンパク質抗体を単離する工程
とを含んでいる、
見かけの分子量約８０〜約９０ｋＤａである、モラクセラ属（Moraxella）菌株由来のトランスフェリン受容体タンパク質に対して、特異的なモノクローナル抗体を製造する方法が提供される。
【００２４】
さらに本発明の別の態様によれば、
（ａ）モラクセラ属（Moraxella）菌株の細胞塊を供給する工程、
（ｂ）細胞塊から選択的に水溶性タンパク質を抽出して、第１の上清と第１のペレットを提供する工程、
（ｃ）第１のペレットから第１の上清を分離する工程、
（ｄ）第１のペレットから分子量約８０〜約９０ｋＤａであるトランスフェリン受容体を選択的に溶解させ、第２のペレットと第２の上清を提供する工程、
（ｅ）第２のペレットから第２の上清から分離する工程、
（ｆ）選択的な溶解工程において、第１のペレットから溶解した別の種類のモラクセラ属菌のタンパク質が混入していない、第２の上清中の、分子量が約８０〜９０ｋＤａである、トランスフェリン受容体タンパク質を精製する工程とを含んでいる、
モラクセラ属カタル球菌（Moraxella catarrhalis）のような、モラクセラ属（Moraxella）菌株由来の分子量約８０〜９０ｋＤａである、分離・精製された非変性のトランスフェリン受容体タンパク質を生産する方法を提供する。
【００２５】
約５０ｍＭ〜約１ＭのトリスＨＣＬを含んでいる、ｐＨ：約７〜約８．５の緩衝水溶液に細胞塊を接触させ、細胞塊を破壊するための超音波処理し、そして、遠心分離を行って、第１のペレットと第１の上清を作製することにより、水溶性タンパク質を、選択的にその細胞塊から抽出することができる。
【００２６】
約０．２−約２ｗｔ・％のトリトン・Ｘ−１００(TRITON X-100)(非イオン性洗浄剤オクタデシルフェノール（エチレン・グリコール）１０の商標である)のような、洗浄剤と、約２〜約２０ｍＭのＥＤＴＡのような、可溶化剤を含んでいる、約２０ｍＭ〜約１Ｍのトリス・ＨＣＬなどの、緩衝水溶液に、第１のペレットを少なくとも１回接触させ、破壊するため、第１のペレットを超音波処理し、その後、遠心分離を行って、第２のペレットと第２の上清を作製することによって、選択的な溶解工程を実施することができる。このような緩衝水溶液との接触、超音波処理、遠心分離、音波処理のステップは、少なくとも２回行うことができ、その際、各ステップで得られる上清は、プールして、第２の上清を提供する。
【００２７】
精製ステップは、下記する操作を含むような、多重クロマトグラフィ・コラム操作によって実施することができる。
【００２８】
（ａ）約１０ｍＭ〜約１Ｍのトリス−ＨＣＬを含むｐＨ約７−約８．５の緩衝液の使用によって、トランスフェリン受容体は選択的に通過するが、夾雑蛋白質はその上に結合する、ＤＥＡＥ−セファセル(Sephacel)カラムのような、第１のクロマトグラフィ・コラム上での第一のクロマトグラフィ操作、
（ｂ）約１０ｍＭ〜約１Ｍのトリス−ＨＣＬを含むｐＨ約７−約８．５の緩衝液の使用によって、トランスフェリン受容体は選択的に通過するが、夾雑蛋白質はその上に結合する、ＳＥ−セルロース／Ｄ５２９のような、陽イオン交換マトリックスを含んでなる、第２のクロマトグラフィ・コラム上での第二のクロマトグラフィ操作、
（ｃ）ｐＨ約７〜約８．５でカラムの載せることによって、ＯＭＰ・Ｂ２タンパク質と比較して、トランスフェリン受容体タンパク質が選択的にその上に結合する、ヒドロキシアパタイトのような、第３のクロマトグラフィ・コラム上での第三のクロマトグラフィ操作、
（ｄ）約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4を含むｐＨ約７〜約８．５の緩衝液の使用などにより、第３クロマトグラフィからトランスフェリン受容体タンパク質を溶離させる。
【００２９】
ここで提供される、調製手法によって、精製された、非変性の形状のトランスフェリン受容体タンパク質の分離が可能となる。本願の中で、「見かけの分子量が約８０〜約９０ｋＤａである、モラクセラ属（Moraxella）菌株由来のトランスフェリン受容体タンパク質（Ｔｆｒ２）」という言葉は、分子量が約８０〜約９０ｋＤａである、モラクセラ属カタル球菌（Moraxella catarrhalis）のトランスフェリン受容体タンパク質のファミリーを定義するために使用され、モラクセラ属（Moraxella）の種々の菌株中に天然に存在しているものを含め、そのアミノ酸配列中に変異を有するタンパク質が含まれる。本願においては、仮に、第１のタンパク質が第２のタンパク質と免疫学的に関係しているか、または第２のタンパク質と同じ機能を有する場合、第１のタンパク質は、第２のタンパク質の「機能的な類似体」と定義している。そのような機能的な類似体は、例えば、タンパク質のフラグメント、または置換、付加、あるいは、欠失型の変異体であってもよい。
【００３０】
本発明の長所には、以下のものが含まれる。
−モラクセラ属カタル球菌（Moraxella catarrhalis）を含む、トランスフェリン受容体タンパク質を産生する、モラクセラ属（Moraxella）菌株から、見かけの分子量が約８０〜約９０ｋＤａである、精製トランスフェリン受容体タンパク質を分離する方法；
−モラクセラ属（Moraxella）菌株から分離・精製される、見かけの分子量が約８０〜約９０ｋＤａである非変性トランスフェリン受容体タンパク質；
−モラクセラ属（Moraxella）菌、ならびに、それに感染している宿主を特異的に特定するための診断キットと免疫学的試薬。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
図面の簡単な説明
本発明は、以下の図面を参照するとともに、後述する記述によって、さらに詳しく理解できる。
【００３２】
図１は、本発明の１つの実施態様による、モラクセラ属カタル球菌（Moraxella catarrhalis）由来のトランスフェリン受容体タンパク質を精製する方法のフロー・ダイアグラムである；
図２は、見かけの分子量が約８０〜約９０ｋＤａである、分離・精製されたトランスフェリン受容体タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示している。
【００３３】
図３は、精製されたトランスフェリン受容体のヒト・トランスフェリンを結合する能力を示している；
図４（ａ）、４（ｂ）、４（ｃ）は、精製されたトランスフェリン受容体タンパク質のイムノブロット分析を示している；そして、
図５（ａ）と５（ｂ）は、中耳炎の原因となる、モラクセラ属カタル球菌（Moraxella catarrhalis）とその他の細菌病原体を特異的に区別するため、分離・精製されたトランスフェリン受容体タンパク質を使用した免疫により生産された、モルモットの抗−Ｔｆｒ抗血清の能力を検証するイムノブロットである。
発明の一般的説明
本発明は、モラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）由来の精製トランスフェリン受容体タンパク質Ｔｆｒ２を調製するために採用できる、新規な手法を提供する。Ｔｆｒ２を産生するモラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）の菌株は、いずれも、ここで提供される、分離・精製されたＴｆｒ２を提供するために、好適に利用できる。そのような菌株は、臨床的ソース（clinical source）や、細菌培養コレクション（bacterial culture collection）から一般的に入手できる。モラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）の適する菌株には、モラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）  ５１９１、１３５、４２２３が含まれる。
図１を参照して、発明の１つの態様による、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）により分析した際、見かけの分子量約８０〜９０ｋＤａを示すモラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）由来のトランスフェリン・タンパク質を精製する方法のフロー・ダイアグラムを説明する。下記で述べる種々の操作は、一般的に、約４℃〜約３０℃までの周辺温度で実施可能である。全細胞は、約１０ｍＭ〜約１Ｍのトリス−ＨＣＬを含む、ｐＨが約７〜約８．５の緩衝水溶液に接触させ、超音波処理により細胞を破壊し、引き続き、遠心分離を行って、第１の上清（Ｓ１）と第１の上清（ＰＰＴ１）を作製する。該上清（Ｓ１）には、該細胞ペレットに由来する、実質的な可溶性タンパク質画分が含まれており、これは廃棄する。残ったペレット（ＰＰＴ１）に、選択的な洗浄剤抽出を行って、残留する可溶性タンパク質を取り除き、また、該ペレットから、ＴｆＲ２タンパク質を含む膜タンパク質の可溶化を行う。この選択的抽出は、適宜、実施できる。その手法の一つには、ペレットの多段洗浄剤抽出が含まれる。特には、第１の洗浄剤抽出をトリトンＸ−１００とＥＤＴＡを使用して実施し、引き続き、遠心分離を行って、第２のペレット（ＰＰＴ２）と第２の上清（Ｓ２）を作製し、第２の上清を、保管する。第２の上清（Ｓ２）の分離の後、残っているペレットＰＰＴ２を、再度トリトンＸ−１００とＥＤＴＡを使用して洗浄剤抽出し、その後、遠心分離を行う。得られる第３の上清（Ｓ３）を、残留している第３ペレット（ＰＰＴ３）から分離した後（この第３のペレットは廃棄する）、第１の抽出で得られる、第２の上清（Ｓ２）と組み合わせることで、プールされた上清（ＴｆＲ２−１）が提供される。約１０ｍＭ〜約１Ｍのトリスを用いて、ｐＨ約７〜約８．５に緩衝された条件下の、濃度約０．２〜約２ｗｔ％のトリトンＸ−１００と、濃度約２〜２０ｍＭのＥＤＴＡの溶液を使用して、このトリトン・Ｘ−１００による抽出を実施してもよい。このプールされた上清（ＴｆＲ２−１）は、ＴｆＲ２タンパク質、ならびに、このＴｆＲ２タンパク質と同等の分子量を有するＯＭＰ・Ｂ２タンパク質を含む、モラクセラ属カタル球菌の夾雑タンパク質を含んでいる（図２の３、５レーンを参照）。このプールされた上清（ＴｆＲ２−１）を一連のカラム・クロマトグラフィ操作において処理して、それら不純物を取り除く。
【００３４】
最初のカラム・クロマトグラフィ操作において、約１０ｍＭ〜約１Ｍのトリス・ＨＣＬを用いて、ｐＨ約７〜約８．５とするような、適正に緩衝されている、ＤＥＡＥ−セファセル(Sephacel)カラム、またはその他の適当なカラムに、プールされた上清（ＴｆＲ２−１）を載せて、ＴｆＲ２タンパク質はカラムを通過し、一方、不純物はカラムに結合するすることができる。なお、更なるフロー・スルーの処理を行う前に、該ＤＥＡＥ−セファセル(Sephacel)カラムを洗浄してもよい。
【００３５】
約１０ｍＭ〜約１Ｍのトリス・ＨＣＬを用いて、ｐＨ約７〜約８．５とするような、適正に緩衝されている、陽イオン交換カラム、例えば、ＳＥ−セルロース／Ｄ５２９またはエプシロン・セファロースに、ＤＥＡＥ−セファセル(Sephacel)カラムから流出液と洗浄液（ＴｆＲ２ー２）を載せて、ＴｆＲ２タンパク質はカラムを通過し、一方、不純物はカラムに結合することができる。なお、更なるフロー・スルーの処理を行う前に、該陽イオン交換カラムを洗浄してもよい (図２の４レーンを参照)。
【００３６】
ＯＭＰＢ２タンパク質、ならびに、少量の残留タンパク質性夾雑物をなお含んでいる、陽イオン交換カラム（ＴｆＲ２−３）からの流出液と洗浄液を、ＯＭＰ・Ｂ２タンパク質やその他の夾雑タンパク質に対して、優先的に、ＴｆＲ２タンパク質はカラムに結合でき、それらは、該カラムを通過するように、緩衝条件下で、ヒドロキシアパタイト・カラムに載せる。かかる条件は、ｐＨ約６〜ｐＨ約８．５の、約５〜約５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液を用いることで提供される。該カラムからの流出液は夾雑タンパク質を含んでいる（図２、５レーンを参照）。
【００３７】
該緩衝液によって、繰り返し洗浄し、カラムに残った夾雑物を取り除いた後、ｐＨ約７〜約８．５の、約１５０〜約２５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液のような、適当な緩衝液を使用して、ＴｆＲ２タンパク質を、該ヒドロキシアパタイトカラムから溶出させる。溶出画分を分取し、各アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ＴｆＲ２タンパク質を含有する画分をプールする。プールした画分を濃縮することで、ＴｆＲ２タンパク質を含有する溶液が提供できる（図２、レーン６を参照）。この手順によって、単離・精製された、非変性のＴｆＲ２タンパク質の水溶液が提供される。該ＴｆＲ２タンパク質水溶液は、該物質の目的とする用途に適合する濃度、一般に、約１００〜約２００μｇ／ｍｌで、提供することもできる。
図２を参照して、図１中に模式的に示す手順で代表される、ここに記載される方法で精製された、トランスフェリン受容体タンパク質の純度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法による分析結果を示す。図２中、レーン１は、モラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）の細胞溶解物を示す。レーン２は、プールされた上清（ＴｆＲ２−１）を示す。レーン３は、ＤＥＡＥ−セファセル(Sephacel)カラム・クロマトグラフィにおける、流過（run-through）画分（ＴｆＲ２−２）を示し、レーン４は、ＳＥ−セルロース／Ｄ５２９コラム・クロマトグラフィにおける、流過（run-through）画分（ＴｆＲ２−３）を示している。レーン５は、ＨＴＰの流過（run-through）画分を示し、ＯＭＰＢ２タンパク質を含んでいる。レーン６は、ＴｆＲ２を含有しているＨＴＰ結合画分を示す。レーン７は、リファレンス２９に記載されているように、本質的にアフィニティ・クロマトグラフィにより単離された、トランスフェリン受容体タンパク質ＴｆＲ２を示す。ここで提供される、ＴｆＲ２タンパク質の精製方法によって、少なくとも純度７０％のＴｆＲ２タンパク質調製物が生産できる。図２中のレーン６に示されている、調製物は、デンシトメータ・スキャンニングにより決定した際、少なくとも純度９５％である。
【００３８】
図３を参照して、ここで提供される、モラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）の精製ＴｆＲ２の、ヒト・トランスフェリンに対する特異的な結合能を示す。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分離し、本質的にリファレンス２７に記載されるようにして、インビトロのトランスフェリン結合で評価を行った。レーン１は、レファレンス２９中に記載されるように、本質的にアフィニティ・クロマトグラフィにより単離された、モラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）のＴｆＲ２を含む。レーン２は、ここで記載されている、精製されたモラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）由来のＴｆＲ２を含む。レーン３は、モラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）のＯＭＰＢ２タンパク質を含む。図３から判るように、トランスフェリン結合性タンパク質調製物はトランスフェリンを特異的に結合している。これらの結果は、ここで提供される方法によって、モラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）由来のＴｆＲ２が単離されていることを検証している。
【００３９】
（ワクチンを含む）免疫原性組成物の成分、あるいは、診断における抗原として有用であるためには、ここに記載する、精製されたトランスフェリン受容体タンパク質は、好ましくは、複数種を含む、モラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）菌株を認識する、あるいは、中和する抗体を創製できなければならない。
【００４０】
図４（ａ）、４（ｂ）、４（ｃ）を参照して、ここで提供される、ＴｆＲ２のイムノブロット分析の結果を示し、それは、ＯＭＰ・Ｂ２タンパク質からＴｆＲ２の特異的な分離を示している。各図中において、試料１は、ＯＭＰＢ２タンパク質を含んでおり、試料２はＴｆＲ２タンパク質を含んでいる。モラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）菌株は、（ａ）は、５１９１株、（ｂ）は、１３５株、（ｃ）は、４２２３株である。試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されている。試料３は、精製されたＴｆＲ２である。図４（ａ）は、クーマシーブルー染色ゲルを示す。図４（ｂ）は、抗−ＴｆＲ２・抗血清を使用したイムノブロットを示す。図４（ｃ）は、抗−ＯＭＰ・Ｂ２・抗血清を使用したイムノブロットを示す。図４の結果から、特に、実質的にＯＭＢＰ２タンパク質を含有していない、ここに提供される方法による、モラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）由来のトランスフェリン受容体タンパク質ＴｆＲ２の特異的な精製が検証される。
【００４１】
図５（ｂ）を参照して、ここで提供される、精製したＴｆＲタンパク質でモルモットを免疫することにより作製されたモルモット・抗−ＴｆＲ・抗血清の、種々の入手源（source）から分離したモラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）に由来するＴｆＲタンパク質を認識する能力を示すイムノブロット結果を示し。試験した試料は下記の通りである。
【００４２】
【表１】
2007291128.tif 000002
【００４３】
本発明の１つの態様によれば、ここで提供される、分離・精製されたＴｆＲ２タンパク質は、モラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）を他の中耳炎の原因菌である細菌病原体から特異的に区別するために使用できる抗体を創製する上で有用である。すなわち、図５（ａ）と５（ｂ）を参照して、ここで提供されるＴｆＲ２タンパク質により、モルモットを免疫することにより作製されたモルモット・抗−ＴｆＲ２抗血清の特異的反応性をそれぞれ示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびにイムノブロットを示す。分析した試料は以下の通りである。
【００４４】
【表２】
2007291128.tif 000003
【００４５】
図５（ｂ）に示された結果は、ここで提供される、ＴｆＲ２特異的抗血清が、同じような臨床徴候のある疾病を引き起こす細菌病原体間の区別する上での有用性を明確に示している。
【００４６】
下の表１に示される結果は、ここで提供されるＴｆＲ２タンパク質による免疫によって、作製されたモルモット・抗−ＴｆＲ２抗血清の、モラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）を殺生する能力を示している。この結果は、４２２３株から単離したＴｆＲ２タンパク質にとる免疫によって作製された抗血清は、４２２３株から誘導された、同原の非凝集型のモラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）ＲＨ４０８株に対して、殺菌性である。ここで提供される、分離・精製されたＴｆＲ２タンパク質の有する、殺菌力のある抗体を創製する能力は、モラクセラ属カタル球菌（M. catarrhalis）が引き起こす疾病に対する防御のためのワクチンとしての、ここで提供される、ＴｆＲ２タンパク質の効用のインビボの証拠である。
【００４７】
すなわち、本発明の別の態様によれば、ここで提供される、ＴｆＲ２タンパク質の免疫的な有効量と、生理学的に許容されるその担体とを含んでなる、ＴｆＲ２タンパク質を産生するか、または、ＴｆＲ２を特異的に認識する抗体を誘導する能力のあるタンパク質を産生する、モラクセラ属（Moraxella）菌株やその他の細菌性病原体に対するワクチンが提供される。ＴｆＲ２と関係のない、抗原決定基に対する抱合体ワクチンを作製するため、ここで提供されるＴｆＲ２タンパク質を、ハプテン、ポリ多糖、またはペプチドに対するの担体タンパク質として利用することもできる。
【００４８】
ここで提供される、ＴｆＲ２タンパク質は、診断試薬、抗ＴｆＲ２抗体産生のための抗原、あるいは、モラクセラ属（Moraxella）菌株が原因である疾病に対するワクチン用の抗原として有用である。
【００４９】
本発明の追加の態様として、ここで提供されるＴｆＲ２タンパク質は、被包性細菌を含む病原細菌に対する抱合体ワクチンやキメラ分子（糖質抱合体を含む）を調製するための担体分子として使用することもできる。すなわち、本発明の糖質抱合体は、リポオリゴ糖ＬＯＳとＰＲＰを含む、糖鎖抗原を有している細菌が原因となる疾病と感染に対する防御を付与するために使用できる。かかる細菌病原菌には、例えば、インフルンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、大腸菌（Escherichia coli）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、チフス菌（Salmonella typhi）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutants）、クリプトコックス・ネオファルマンス（Cryptococcus neoformans）、クレブシェラ属菌（Klebsiella）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）がある。ＴｆＲ２タンパク質と結合される特定の抗原と、かかる結合を達成する方法は、本願の譲受人に譲渡されている、公開されたＰＣＴ出願  ＷＯ９４／１２６４１に記載されており、それを参照することで、その開示は、本願に組み入れられる。
【００５０】
別の実施態様では、例えば、腫瘍細胞の異常多糖に対する免疫を誘導するためや化学療法剤または生理活性剤と結合できる抗腫瘍抗体を産生するために、ＴｆＲ２タンパク質の担体機能が利用できる。
【００５１】
本発明は、製剤原料として、特には、モラクセラ属（Moraxella）菌株による感染が原因となる疾病に対するワクチン中で、有効成分としての用途のＴｆＲタンパク質にも及ぶ。
【００５２】
さらに別の形態によれば、本発明は、モラクセラ属（Moraxella）菌株による感染が原因となる疾病に対する免疫用の医薬の調製のための、ＴｆＲ２タンパク質の使用をも提供する。
【００５３】
本発明の種々の態様は、ワクチン生産、診断、モラクセラ属（Moraxella）菌株感染の治療の分野、および免疫学的試薬の創製において、多様な応用を有することは当業者には明かである。そのような用途に関しての非限定的な論議を下記に示す。
【００５４】
１．ワクチン製剤とその使用
ワクチンとしての使用に適している免疫原性組成物を、ここで記載されている免疫原性トランスフェリン受容体タンパク質、またはその類似体から調製できる。抗原材料を、好ましくない小さな分子量の分子を除去するために十分に透析すること、および／または、より製剤しやすい形に調製することが望ましい。免疫原性組成物は、抗トランスフェリン受容体抗体ならびにオプソニン作用と殺菌力のある抗体を含む、抗体を産生する、免疫応答を誘導する。ワクチンを投与した対象にモラクセラ属（Moraxella）菌株やトランスフェリン受容体を産生するような他の細菌が侵入した場合、その抗体がトランスフェリン受容体と結合して、生存に必要な鉄源に細菌が接近するのを阻止する。さらに、オプソニン作用があるかまたは殺菌力のある抗ＴｆＲ抗体も別の代替メカニズムにより細菌の予防が可能である。
【００５５】
ワクチンを含む免疫成分は、注射できるように液体にしたりエマルジョンの形にして使用することができる。トランスフェリン受容体タンパク質は、これと適合性のある、薬学的に受け入れられる医薬品添加物と混合できる。そのような添加物として、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびこれらを組み合わせものがある。この免疫原性組成物とワクチンには浸潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバントなどの補助剤を、効果の強化のために一緒に使用することが可能である。免疫原性組成物とワクチンを、非経口、皮下、筋肉内投与することもできる。
【００５６】
また、本発明にかかる免疫原性組成物を粘膜表面での免疫応答を誘発するために調製・注入することができる。免疫原性を粘膜表面に、例えば、経鼻または経口（胃内）で投与できる。その他の投与法として座剤の使用と経口調剤が望ましい。
【００５７】
座剤用の結合剤と担体にはポリアルカリングリコールまたはトリグリセリドが含まれる。このような座剤は、有効成分を０．５〜１０％、望ましくは１〜２％含む混合物質から調製する。経口用の調剤としては、通常、糖類で製剤的に使えるもの、セルロース、炭酸マグネシウムのような補助剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放剤、粉末の形状をよることでき、約１〜９５％、好ましくは、約２０〜約７５％のトランスフェリン受容体タンパク質を含む。
【００５８】
免疫原性調製物およびワクチンは、投与製剤に適合するような方法で、かつ治療的に有効、防御性かつ免疫原性であるような量を投与する。投与すべき量は、処理する被験者に依存し、例えば、抗体を合成する個体の免疫系の能力、希望する防御の程度および、必要ならば細胞媒介性免疫反応の生成を含む。投与すべき有効成分の正確な量は、実施者の判断による。しかし、好適な投与範囲は、この分野の専門家には容易に決定でき、接種当たりにマイクログラム程度のトランスフェリン受容体タンパク質でよい。初回投与およびブースター投与の適当な割合も変化してもよいが、初回投与に続く投与を行うとよい。この投与は、投与経路にも関係し、宿主の大きさによっても変化する。
【００５９】
本発明による免疫原性組成物中のトランスフェリン受容体タンパク質の濃度は、一般に約１〜約９５％である。ただ一種類の病原の抗原物質を含むワクチンは、単価ワクチンである。数種類の病原の抗原物質を含むワクチンは、混合ワクチンであり、これも本発明に属する。このような混合ワクチンは、例えば、種々の病原から、または同じ病原の種々の菌株から、または種々の病原の混合からの物質を含む。
【００６０】
免疫原性は、リン酸緩衝生理食塩水中に０．０５〜０．１％溶液として通常用いられるアジュバントと同時に抗原が投与された場合に、著しく強化できる。アジュバントは抗原の免疫原性を強化するが、それ自体は必ずしも免疫原性ではない。アジュバントは、投与位置の近くの局部に抗原を保持して、免疫系の細胞への遅く、継続した抗原の放出を容易にするデポー効果を発生するように作用する。アジュバントは、また、免疫系の細胞を抗原デポーに誘引し、かかる細胞に免疫反応を誘発するように刺激することもできる。
【００６１】
免疫刺激剤またはアジュバントは、例えばワクチンへの宿主免疫反応を強化するために、多年にわたって使用されている。内因性アジュバント、例えばリポ多糖類は、通常、ワクチンとして使用される死んだ菌または弱毒菌の成分である。
【００６２】
外因性アジュバントは、代表的には抗原に非共有結合的に結合しており、かつ宿主の免疫反応を強化するように配合される免疫調整剤である。このように、アジュバントは、非経口投与された抗原に対する免疫反応を強化すると認められる。しかし、これらのアジュバントの一部は毒性であり、かつ望ましくない副作用を起こし、ヒトや多くの動物への使用が不適当である。実際には、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（両者を一緒にしてアルム（Ａｌｕｍ）と呼ぶ）のみがヒトおよび獣医学的ワクチン中のアジュバントとして日常的に用いられている。
【００６３】
ジフテリア菌および破傷風菌トキソイドに対する抗体反応を強化するアルム（Ａｌｕｍ）の効力は、明らかに確立されており、ＨＢｓＡｇワクチンにはアルム（Ａｌｕｍ）が添加されている。アルム（Ａｌｕｍ）の有用性は、一部の用途には十分に確立されているが、これには限界がある。例えば、アルム（Ａｌｕｍ）は、インフルエンザワクチンに対しては効力がなく、細胞媒介性免疫反応の誘発は不規則である。アルム（Ａｌｕｍ）をアジュバントとした抗原により誘発される抗体は、マウスにおいては主としてＩｇＧ１アイソタイプであり、これは一部のワクチン剤による防御のためには最適ではない。
【００６４】
広範囲の外因性アジュバントが、抗原に対して強い免疫反応を引き出すことができる。これらには、膜タンパク質抗原に複合したサポニン(免疫刺激性複合体)、鉱油と混合したプルロニック(Pluronic)ポリマー、鉱油中の死んだミコバクテリア、フロイント完全アジュバント、菌生成物、例えばムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）、ならびに脂質Ａおよびリポソームを含む。
【００６５】
効率的に体液性免疫反応（ＨＩＲ）および細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）を誘発するために、免疫原はしばしばアジュバント中で乳化される。多くのアジュバントは、毒性で、肉芽腫、急性および慢性炎症(フロイント完全アジュバント、ＦＣＡ)、細胞溶解（サポニンおよびプルロニックポリマー）および発熱性、関節炎および前部ブドウ膜炎（ＬＰＳおよびＭＤＰ）を誘発する。ＦＣＡは優れたアジュバントであり。研究に広く使用されているが、その毒性のためにヒトおよび獣医学的ワクチンへの使用に関しては認可されていない。
【００６６】
理想的なアジュバントの望ましい特性は下記である。
【００６７】
（１）無毒性；
（２）長期持続性免疫反応を刺激する能力；
（３）製造が簡単で長期の貯蔵でも安定；
（４）必要ならば、各種の経路で投与された抗原に対し、ＣＭＩおよびＨＩＲの両者を誘発する能力；
（５）他のアジュバントとの相乗効果；
（６）抗原提供細胞（ＡＰＣ）の集団との選択的交互作用の能力；
（７）適当なＴH１またはＴH２細胞特異性免疫反応を特異的に誘発する能力；および
（８）抗原に対して、適当な抗体アイソタイプレベル（例えばＩｇＡ）を選択的に増加する能力。
【００６８】
本発明に引用して含まれる、１９８９年８月８日にロックホッフら(Ｌockhoff et al.)に許可された米国特許第４８５５２８３号は、いずれも糖残基をアミノ酸により置換されているＮ−グリコシルアミド、Ｎ−グリコシルウレアーゼおよびＮ−グリコシルカルバメートを含む糖脂質類縁体を、免疫媒介体またはアジュバントとして教示している。このように、ロックホッフら（米国特許第４８５５２８３号およびリファレンス３３）は、天然に存在する糖脂質、例えばグリコスフィンゴリピドおよびグリセロ糖脂質に対して構造的な類似性を示すＮ−糖脂質類縁体が、単純性ヘルペスウイルスワクチンと仮性狂犬病ウイルスワクチンの両者の中で強い免疫反応を誘発できることを報告している。天然に存在する脂質残基の機能を模倣するために、一部の糖脂質が、長鎖アルキルアミンと脂肪酸から合成されており、これはアノマー炭素原子を介して糖と直接リンクしている。
【００６９】
モロニー(Moloney)に許可され、その譲渡人に譲渡され、本発明に引用して含まれる米国特許第４２５８０２９号は、オクタデシルチロシン塩酸塩（ＯＴＨ）が、破傷風菌トキソイドおよびホルマリンで不活性化されたタイプＩ、ＩＩおよびＩＩＩポリオウイルスワクチンと複合された場合に、アジュバントとして機能することを教示している。また、ニクソン−ジョージら(Nixon-George et al.)（リファレンス３４）は、組換え型Ｂ形肝炎表面抗原と複合化された芳香族アミノ酸のオクタデシルエステルが、Ｂ形肝炎ウイルスに対する宿主の免疫反応を強化することを報告している。
２．免疫検定
本発明のトランスフェリン受容体タンパク質は、抗トランスフェリン受容体タンパク質抗体の生成のための免疫原として、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)、ＲＩＡおよび抗菌性、抗モラクセラ、および抗ＴｆＲ抗体の検出のための従来から公知のその他の非−酵素リンク抗体結合検定または手順を含む免疫検定法における抗原として有用である。ＥＬＩＳＡ検定において、トランスフェリン受容体タンパク質は、選定された表面、例えばタンパク質を結合できる表面、例えばポリスチレンマイクロタイタープレート上で固定化される。不完全に吸着されたトランスフェリン受容体タンパク質を除くために洗浄した後に、供試試料に関して抗原的に中性であることが知られている非特異性タンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液を選定された表面上に結合させてもよい。これは固定面上の非特異性吸着サイトのブロッキングを許し、従って、表面への抗血清の非特異性結合により起きるバックグラウンドを減少させる。
【００７０】
次いで、免疫複合体（抗原／抗体）形成に導くように、固定化面を試験すべき試料、例えば臨床または生物学的物質と接触させる。これには、希釈媒体、例えばＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）および／またはリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎの溶液を用いる試料の希釈を含んでいてもよい。次いで、この試料を２〜４時間、温度約２５〜３７℃の程度でインキュベーションする。インキュベーションに続いて、非免疫複合物質を除くために、試料接触面を洗浄する。洗浄手順には、溶液、例えばＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎまたはホウ酸塩緩衝液を用いる洗浄を含んでいてもよい。供試試料と結合トランスフェリン受容体タンパク質との間に特異性免疫複合体が形成され、引き続き洗浄した後に、免疫複合体形成の発生およびその量も、第一抗体に特異性を有する第二抗体に対して免疫複合体を作用させて測定してもよい。供試試料がヒト由来の場合には、第二抗体は、ヒト免疫グロブリン、一般にはＩｇＧに対して特異性を有する抗体である。検出手段を提供するために、第二抗体は、同伴活性、例えば適当な発色物質を用いてインキュベーションして発色する酵素活性を有していてもよい。次いで、定量は、例えば分光光度計を用いて発色の程度を測定して得られる。
【実施例】
【００７１】
実施例
以上の開示は、本発明を一般的に記載したものである。さらに完全な理解は、下記の特定の実施例を参照して得ることができる。これらの実施例は、説明のみを目的として記載されており、本発明の範囲の限定を意図するものではない。相当する物との変形また置換は、環境から要求されるかまたは便宜的なものである。この中に特定の用語が使用されているが、その用語は、内容を説明するためであり、限定を目的としたものではない。
【００７２】
使用されているが、本開示および実施例中に明らかには記載されていない分子遺伝学、タンパク質生化学、および免疫学的方法は、科学文献中に広く記載されており、十分にこの分野の専門家の能力の範囲内にある。
【００７３】
実施例１
本実施例は、Ｍ．カタラリス（M. catarrhalis）の増殖を説明する。
【００７４】
使用したＭ．カタラリス（M. catarrhalis）菌株は、１３５、４２２３（リファレンス３５）、５１９１（リファレンス３５）(いずれも、中耳からの単離株)、ＡＴＣＣ２５２４０、Ｑ８（咯出物からの単離株）およびＲＨ４０８であった。
【００７５】
ＴｆＲ２の単離のための細胞を提供するために、Ｍ．カタラリス（M. catarrhalis）菌株をチョコレート・アガー・プレート（ＢＢＬ）上で定法によって維持した。
【００７６】
Ｍ．カタラリス（M. catarrhalis）菌株４２２３を脳−心臓インフュージョン（ＢＨＩ）培地２０ｍＬ中に接種した。該培養物を一晩、通気しながら３７℃でインキュベーションした。鉄制限条件下での増殖のために、該一晩培養物１ｍＬを、２５μＭ  ＥＤＤＡを含むＢＨＩ培地２０ｍＬ中に接種し、該培養物を３７℃において約３〜４時間増殖させた。対数増殖中間期まで増殖した細胞（Ａ578＞０．５）を、２０分間、１０，０００ｘｇの遠心分離により採取した。下記の実施例３に記載するように、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ２）タンパク質の抽出のためのこのペレットを用いた。
【００７７】
実施例２
本実施例は、Ｍ．カタラリス（M. catarrhalis）の非凝集菌株（ＲＨ４０８）の創製を説明する。
【００７８】
Ｍ．カタラリス（M. catarrhalis）菌株４２２３を、ＢＨＩ培地２０ｍＬを入れた数個のフラスコ中に接種し、各培養物を、一晩、３７℃で振とう（１７０ｒｐｍ）しながらインキュベーションした。各一晩培養物の５ｍＬを、個別に１ｍＬ試験管に分注し、室温で３〜８時間静置し、菌を沈降させた。各培地の上清１００μＬを用いて、ＢＨＩ培地ス２５ｍＬに接種し、そして、各培養物を上記のように、３７℃において一晩インキュベーションした。この処理手順を６回反復し、それぞれの一晩培養カルチャーに対して、ＢＨＩ２５ｍＬに接種するために透明な培地２５μＬを用いた。処理した菌株と、最初のＭ．カタラリス（M. catarrhalis）菌株４２２３カルチャーとの沈降速度を比較するために、非凝集菌カルチャーは、３時間間隔でＡ578を測定して決定した。Ｍ．カタラリス（M. catarrhalis）ＲＨ４０８を含む非凝集変異菌株は、３時間の期間中、凝集しなかった。ＲＨＩアガープレート上で、ＲＨ４０８菌株は、すべての非凝集菌株に一般的なコロニー形態を有していた。ＲＨ４０８菌株は、１９９４年１２月１３日のブタペスト条約の規定に従って、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド、２０８５２、米国にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、受託番号：ＡＴＣＣ  Ａｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ５５６３７（ATCC 55637）が付与されている。
【００７９】
実施例３
本実施例は、アフィニティ精製によるトランスフェリン受容体タンパク質ＴｆＲ２の抽出を説明する。
【００８０】
アフィニティ精製ＴｆＲ２は、リファレンス２９に記載されてるトータル膜から、セファロース４Ｂ(Pharmacia)結合ヒトトランスフェリン(Sigma)を用いて調製した。アフィニティマトリックスに結合している細菌受容体タンパク質は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ラウリルサルコシン酸ナトリウム、２Ｍグアニジンの緩衝液を用いて選択的に溶出した。溶出したタンパク質は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０に対して透析した。
【００８１】
実施例４
本実施例は、トランスフェリン受容体タンパク質ＴｆＲ２の抽出と精製を説明する。
【００８２】
トランスフェリン受容体タンパク質は、図１に一般的に説明されている手順によりＭ．カタラリス（M. catarrhalis）から単離したものである。
【００８３】
Ｍ．カタラリス（M. catarrhalis）の鉄欠乏一晩培養カルチャーからの細胞ペレットを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０中に再懸濁し、音波破砕により破壊した。音波破砕物を３０分間、２０，０００ｘｇで遠心分離し、可溶性タンパク質を含む得られた上清（Ｓ１）を廃棄した。ペレット（ＰＰＴ１）を０．５％トライトンＸ−１００および１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０中に懸濁した。この抽出工程はＴｆＲ２を可溶化した。懸濁液を２０分間、２０，０００ｘｇで遠心分離して不溶性物質を除去し、上清を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０中で平衡化したＤＥＡＥ セファセル(Pharmacia)カラムに負荷した。ＴｆＲ２を流出画分中で回収し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０中で平衡化したＳＥ−セルロースＤ５２９カラムを用いてさらに精製した。ＴｒＦ２を含む流出画分を次いで１０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ８．０中で平衡化したヒドロキシアパタイト（ＨＰＴ）カラム上に負荷した。この工程は、ＨＴＰと結合して残っているＴｆＲ２からＯＭＰ Ｂ２(ＨＴＰ流出画分中に存在する)を、分離した。５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０を用いてＨＴＰカラムを十分に洗浄した後に、２００ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ８．０を用いてマトリックスからＴｆＲ２を溶出させた。ＴｆＲ２の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。
【００８４】
実施例５
本実施例は、Ｍ．カタラリス（M. catarrhalis）外膜タンパク質Ｂ２ ＯＭＰ Ｂ２の精製を記載する。
【００８５】
ＨＴＰカラムの流出フラクションを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。電気泳動の後に、ＯＭＰ Ｂ２タンパク質バンドに相当するゲルスライスをゲルから切り取った。溶出緩衝液（１５ｍＭ  ＮＨ4ＣＯ3／０．１％ＳＤＳ）中、１００ボルトで１２時間、電気溶出によりゲルスライスからタンパク質を回収した。
【００８６】
実施例６
本実施例は、モルモットの免疫を説明する。
【００８７】
モルモット（チャールズリバー、ケベック）を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に乳化したＴｆＲ２またはＯＭＰ Ｂ２のいずれかのタンパク質の５μｇを用いて１日目に筋肉内免疫（ｉ．ｍ.）した。１４日目および２８日目に、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中に乳化した同じ投与量を用いて動物をブーストした。血液試料は、４２日目に採取した。得られた結果は表１に記載してある。
【００８８】
実施例７
本実施例は、精製したＴｆＲ２およびＯＭＰ  Ｂ２タンパク質の分析を記載する。
【００８９】
分離ゲル中の１１．５％または１２．５％（ｗ／ｖ）アクリルアミド（ＢＲＬ）を用いて、ルンテンベルグら（Ｌｕｎｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．）（リファレンス３６）に記載のようにしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離した。クーマッシー・ブリリアントブルー（ＢｉｏＲａｄ）を用いてゲルを着色して、タンパク質を目に見えるようにした。タンパク質標準分子量マーカーは、ＢｉｏＲａｄおよびＰｈａｒｍａｃｉａから入手した。
【００９０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したタンパク質は、ポリ二フッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にタウビンら（Ｔｏｗｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）の方法（リファレンス３７）により電気ブロットした。免疫ブロットに対して、希釈度１：１０００で抗血清を用いた。組換え型タンパク質Ｇホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体（Ｚｙｍｅｄ）を希釈度１：４０００でレポーターとして用いた。比色反応（４ＣＮ／ＤＡＢ；Ｐｉｅｒｃｅ）または化学蛍光反応（ＬｕｍｉＧｌｏ；  Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ）のいずれかを用いて、ブロットを現像した。メーカーの推奨する手順を両方の検出法に用いた。予備着色分子量マーカーは、ＢｉｏＲａｄから購入した。
【００９１】
精製タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェリン−結合活性は、シュリベルスとリー（Ｓｃｈｒｙｖｅｒｓ  ａｎｄ  Ｌｅｅ）（リファレンス２７）が記載した方法をいくらか変更して用いて評価した。簡単に記載すると、タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、次いでＰＣＤＦ膜に塩基泳動により移行させた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合ヒトトランスフェリン（１：５０希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、一晩、４℃で膜をインキュベーションした。上記のようにＬｕｍｉＧｌｏ化学蛍光反応を用いてブロットを現像した。
【００９２】
実施例８
本実施例は、Ｂ．カタラリスに対する殺菌性検定を説明する。
【００９３】
抗血清試料（２５μＬ）を５６℃に３０分間加熱して、補体活性を除き、０．１％ＢＳＡを含むベロナール緩衝液（ＮａＣｌ  ８．０ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ3  ０．２５ｇ／Ｌ、バルビツール酸ナトリウム０．３０ｇ／Ｌ、バルビツール酸０．４５ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ  ０．１ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ  ０．０５ｇ／Ｌ）（ＶＢＳ）中で１：８に希釈し、次いで９６ウエルＮｕｎｃマイクロタイタープレートの最初のウエルを加えた。ＶＢＳ中の抗血清の２倍段階希釈物を、残ったウエルに加えた。ＯＤ578＞０．５まで増殖した菌細胞をＶＢＳ中で１：２００，０００に希釈し、菌懸濁液の２５μＬ部分をそれぞれのウエルに加えた。モルモット補体（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）をＶＢＳ中で１：１０に希釈し、溶液２５μＬをそれぞれのウエルに加えて反応を開始させた。３７℃で６０分間プレートをインキュベーションし、次いで、それぞれの反応混合物５０μＬを、２．２％ミュラー−ヒントン−ブロスおよび１．５％アガーを含むミュラー−ヒントンアガープレート上に置いた。３７℃で４５分間インキュベーションした後、コロニーを計数して、殺菌力価を決定した（５０％以上の菌を殺菌できる抗血清の最高希釈度の逆数を免疫前血清を含む対照と比較した）。結果は表１に記載してある。
開示の要約
開示を要約すると、本発明は、約８０ｋＤａ〜約９０ｋＤａ見かけ上分子量を有し、Ｍ．カタラリス（M. catarrhalis）から単離したトランスフェリン受容体タンパク質、これを製造する方法、免疫原性組成物としてのこの利用および診断体系を提供する。本発明の範囲内で、変更はできる。
【００９４】
表１
【００９５】
【表３】
2007291128.tif 000004
【００９６】
参考文献
【００９７】
【表４】
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【００９８】
【表５】
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【００９９】
【表６】
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【０１００】
【表７】
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【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１−１】図１は、本発明の１つの実施態様による、モラクセラ属カタル球菌（Moraxella catarrhalis）由来のトランスフェリン受容体タンパク質を精製する方法のフロー・ダイアグラムである。
【図１−２】図１は、本発明の１つの実施態様による、モラクセラ属カタル球菌（Moraxella catarrhalis）由来のトランスフェリン受容体タンパク質を精製する方法のフロー・ダイアグラムである。
【図１−３】図１は、本発明の１つの実施態様による、モラクセラ属カタル球菌（Moraxella catarrhalis）由来のトランスフェリン受容体タンパク質を精製する方法のフロー・ダイアグラムである。
【図１−４】図１は、本発明の１つの実施態様による、モラクセラ属カタル球菌（Moraxella catarrhalis）由来のトランスフェリン受容体タンパク質を精製する方法のフロー・ダイアグラムである。
【図２】図２は、見かけの分子量が約８０〜約９０ｋＤａである、分離・精製されたトランスフェリン受容体タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示している。
【図３】図３は、精製されたトランスフェリン受容体のヒト・トランスフェリンを結合する能力を示している。
【図４】図４（ａ）、４（ｂ）、４（ｃ）は、精製されたトランスフェリン受容体タンパク質のイムノブロット分析を示している。
【図５】図５（ａ）と５（ｂ）は、中耳炎の原因となる、モラクセラ属カタル球菌（Moraxella catarrhalis）とその他の細菌病原体を特異的に区別するため、分離・精製されたトランスフェリン受容体タンパク質を使用した免疫により生産された、モルモットの抗−Ｔｆｒ抗血清の能力を検証するイムノブロットである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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