(57)【要約】【課題】高倍率又はＮＡが大きく作動距離が短い対物レンズでも量子ドットの観察を可能とする蛍光顕微鏡用標準プレパラートを実現する。【解決手段】  液体を封入し、この液体中に量子ドットを分散させた液体封入層を、基板部材とカバーガラスの間に挟み込んだ構造。【選択図】                    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体を封入し、この液体中に量子ドットを分散させた液体封入層を、基板部材とカバーガラスの間に挟み込んだことを特徴とする蛍光顕微鏡用標準プレパラート。
【請求項２】
前記液体封入層に蛍光ビーズを混合させたことを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡用標準プレパラート。
【請求項３】
前記液体封入層の厚さを前記蛍光ビーズの直径と同一にしたことにより、前記蛍光ビーズを前記液体封入層のスペーサとすることを特徴とする請求項２に記載の蛍光顕微鏡用標準プレパラート。
【請求項４】
前記蛍光ビーズは、励起用の第１光源の波長のみにより励起され、前記量子ドットは、フォトアクチベーション用の第２光源の波長のみにより励起されることを特徴とする請求項２又は３に記載の蛍光顕微鏡用標準プレパラート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光顕微鏡のキャリブレーションに用いる標準プレパラートの構造に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ニポウディスク方式の蛍光顕微鏡の詳細に関しては、特許文献１に開示されている。フォトアクチベーション用の第２光源を有する蛍光顕微鏡に関しては特許文献２に開示されている。図７は、フォトアクチベーション用の第２光源を有する蛍光顕微鏡の構成を示す要部の斜視図である。
【０００３】
励起用の第１光源１０からのレーザ光の第１ビーム（波長λ１）Ｌ１は、回転軸１１を中心に回転するマイクロレンズディスク１２のマイクロレンズ１３により個別の光束に集光され、ダイクロイックミラー１４を透過後、前記マイクロレンズディスク１２と同軸に回転するピンホールディスク（ニポウディスク）１５の個々のピンホール１６を通過し、顕微鏡ユニットの対物レンズ１７を介して、ステージ上の試料１８上に集光される。
【０００４】
この第１ビームＬ１の照射により試料１８が励起されて蛍光する。試料１８から出た戻り蛍光は、再び対物レンズ１７を通り、ニポウディスク１５の個々のピンホール１６上に集光される。個々のピンホールを通過した戻り蛍光は、ダイクロイックミラー１４で反射され、リレーレンズ１９を介してイメージセンサ２０に結像される。
【０００５】
２１は、フォトアクチベーション用の第２光源であり、試料１８の励起に刺激を与えるスポットを前記試料１８上に結像させるために、波長λ２の第２ビームＬ２を出力する。第２ビームＬ２は、第１ビームＬ１によりもたらされる戻り蛍光には影響しない波長、具体的には蛍光試料の吸収(励起)が少ない波長λ２が選定される。尚、フォトアクチベーションに関する詳細は、特許文献２に開示されている。
【０００６】
２２は、ニポウディスク１５と対物レンズ１７間において第１ビームＬ１の光軸に挿入されたダイクロイックミラーであり、第１ビームＬ１及びこの第１ビームによる戻り蛍光を透過させると共に、第１ビームＬ１の光軸に直交して入力される第２ビームＬ２を試料方向に反射させ、対物レンズ１７を介して試料１８上に第２ビームＬ２のスポットを形成させる。
【０００７】
このような基本構成を有する蛍光顕微鏡では、試料からの戻り蛍光が正常に観察できることを確認するためのキャリブレーションを前もって実施し、正常動作確認後に観察対象試料１８をステージ上に搭載する。キャリブレーションを実施するためのダミーの試料は、一般の顕微鏡用の標準プレパラートとして市販されているスライドを使用することができる。プレパラートの詳細に関しては、特許文献３に開示されている。
【０００８】
図５及び図６により、市販されているスライドの構造を説明する。図５（Ａ）及び（Ｂ）は、Ｍ社から市販されているスライドの構造を示す平面図及び断面図である。基板部材１と極めて薄い（約0.17mm）カバーガラス２との間に有機物より構成された蛍光ビーズ（又は蛍光染色された細胞）３の液層を挟み込んで、カバーガラス２の周端部を光学的な特殊溶着で封入している。基板部材１は、標準的なスライドグラス等の顕微鏡に固定が容易なガラス部材である。
【０００９】
図６（Ａ）及び（Ｂ）は、Ｅ社から市販されているスライドの構造を示す平面図及び断面図である。基板部材１の上面に形成された凹部１ａに、量子ドットを液体に分散させた液層を入れ、比較的厚い（約1mm）スライドガラス４で覆って封入している。量子ドットの詳細に関しては、特許文献４に開示されている。
【００１０】
【特許文献１】特開平５−６０９８０号公報
【００１１】
【特許文献２】特開平１０−２０６７４２号公報
【００１２】
【特許文献３】特開２００４−２２９５４８号公報
【００１３】
【特許文献４】ＵＳＰ  ６，３２２，９０１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
スライドの形態で市販されている従来の標準プレパラートでは、次のような問題点がある。
（１）図５に示した、蛍光ビーズや蛍光染料で染色した細胞を用いたスライドでは、量子ドットと比較すると、有機物により構成された蛍光ビーズや蛍光染料で染色した細胞が励起用の第１ビームにより褪色し易く、不安定であるという問題がある。
【００１５】
（２）図６に示した量子ドットを液体に分散させたスライドでは、量子ドットが励起用の第１ビーにより褪色しにくく、安定した強度の蛍光を発生するという利点があるが、市販されているスライドは、高解像度を必要とする生物を対象とする蛍光顕微鏡専用の設計ではなく、比較的厚いスライドガラスを使用しているために、ＮＡが大きく作動距離が短い対物レンズでは量子ドットを封入している部分に焦点を合わせることができないという問題がある。
【００１６】
（３）第２光源を追加してフォトアクチベーションを行なう、図７に示した形態の蛍光顕微鏡では、キャリブレーション時に、フォトアクチベーションを起こさせる試料上の特定部位に第２ビームのスポットを照射するための位置を、試料からの蛍光を見ながら調整する必要がある。しかしながら、ダイクロイックミラー２２の光学的な特性上、第２ビームによる蛍光を透過しないので、観察側から見ることができないという問題がある。
【００１７】
そこで、標準プレパラートが、励起用の第１光源の波長のみにより励起される第１蛍光を発生し、更にフォトアクチベーション用の第２光源の波長のみにより励起されて前記第１蛍光とは波長の異なる第２蛍光を発生する両方の特性を備えれば、これらの蛍光を同時に観察することで第２光源の位置調整が可能である。しかしながら、このような特性を備えた標準プレパラートは、市販のスライドでは提供されていない。
【００１８】
本発明は上述した問題点を解決するためになされたものであり、以下を実現する蛍光顕微鏡用標準プレパラートを提供することにある。
（１）高倍率又はＮＡが大きく作動距離が短い対物レンズでも量子ドットの観察を可能とする。
（２）励起用の第１光源の波長のみにより励起される第１蛍光と、フォトアクチベーション用の第２光源の波長のみにより励起され、第１蛍光とは波長の異なる第２蛍光を発生する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
このような課題を達成するために、本発明は次の通りの構成になっている。
（１）液体を封入し、この液体中に量子ドットを分散させた液体封入層を、基板部材とカバーガラスの間に挟み込んだことを特徴とする蛍光顕微鏡用標準プレパラート。
【００２０】
（２）前記液体封入層に蛍光ビーズを混合させたことを特徴とする（１）に記載の蛍光顕微鏡用標準プレパラート。
【００２１】
（３）前記液体封入層の厚さを前記蛍光ビーズの直径と同一にしたことにより、前記蛍光ビーズを前記液体封入層のスペーサとすることを特徴とする（２）に記載の蛍光顕微鏡用標準プレパラート。
【００２２】
（４）前記蛍光ビーズは、励起用の第１光源の波長のみにより励起され、前記量子ドットは、フォトアクチベーション用の第２光源の波長のみにより励起されることを特徴とする（２）又は（３）に記載の蛍光顕微鏡用標準プレパラート。
【発明の効果】
【００２３】
以上説明したことから明らかなように、本発明によれば次のような効果がある。
（１）均一に分散された量子ドットを測定対象としたため、有機物より構成された蛍光色素に比べ、退色が大幅に低減できる。
（２）量子ドットを分散させた液層をカバーする部材として、薄いカバーガラスを採用することで高倍率又はＮＡが大きく作動距離が短い対物レンズでも量子ドットの観察が可能となる。
（３）量子ドットのみを分散封入したことでは実現困難な液体層の厚さ制御を、大きさ既知の蛍光ビーズをスペーサとして利用することで、目的とする任意の試料厚さを実現することができる。
（４）蛍光ビーズと量子ドットを混在させることにより、励起用の第１光源の波長のみにより蛍光ビーズが励起され、フォトアクチベーション用の第２光源の波長のみにより量子ドットが励起されることで、励起された波長の異なる蛍光を同時に観察して第２光源の位置調整が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を図面により詳細に説明する。図１は本発明を適用した蛍光顕微鏡用標準プレパラートの一実施形態を示す構成図である。図５及び図６で説明した従来の標準プレパラートと同一要素には同一符号を付して説明を省略する。以下、本発明の特徴部につき説明する。
【００２５】
図１（Ａ）は、模式的に示した斜視図、（Ｂ）は断面図である。本発明の構成上の特徴は、液体中に量子ドットを分散させた液体封入層を、基板部材とカバーガラスの間に挟み込んだ点にある。
【００２６】
基板部材１００の上面部に量子ドット４００を分散させた液体封入層５００を載せ、カバーガラス２００で覆い、液体封入層を基板部材とカバーガラスで挟み込み、カバーガラス２００の周辺を光学的に特殊溶着したスライドの形態としている。
【００２７】
カバーガラス２００は、一般的な生物用顕微鏡が設計値として想定している厚さ約0.17mmの薄いガラスである。基板部材１００は、標準的なスライドグラス等の顕微鏡に固定が容易な厚さ約1mmのガラスである。
【００２８】
このように、褪色が従来の蛍光ビーズ等の試薬に比べて大幅に少ない特性を持つ量子ドットを均一に分散させた液体層５００と、標準的なスライドグラスよりも薄いカバーガラス２００の組み合わせた構成によれば、高倍率又はＮＡが大きく作動距離が短い対物レンズの蛍光顕微鏡が使用できる、高品質の標準プレパラートを実現することができる。
【００２９】
図２は、本発明の他の実施形態を示す蛍光顕微鏡用標準プレパラートの構成図である。図２（Ａ）は、模式的に示した斜視図、（Ｂ）は断面図、（Ｃ）は平面図である。この実施形態の特徴は、基本構成は図１で示したものと同一であるが、液体中に量子ドット４００を分散させた液体封入層５００内に、蛍光ビーズ３００を追加添加させた点にある。
【００３０】
蛍光ビーズ３００は、量子ドット４００の励起波長(例えば405nm)とは励起波長が異なる(例えば568nm)蛍光色素により染色されたビーズであり、視野内にシェーディングが確認できる程度の個数を液体中に分散させる。
【００３１】
このような構成によれば、第１光源の励起波長を切り換えることで、量子ドットの観測と蛍光ビーズの観測によるキャリブレーションを選択的に実施することができ、標準プレパラートの汎用性が向上する。
【００３２】
図３は、本発明の更に他の実施形態を示す蛍光顕微鏡用標準プレパラートの断面構成図である。基本構成は図２で示したものと同一であるが、量子ドット４００とは励起波長が異なる蛍光色素により染色された蛍光ビーズ３００を、液体層５００の厚さ調整用のスペーサとして用いた構造を特徴としている。尚、量子ドットは大きさが規制されており、それ自身では液体層５００の厚さ調整機能をもたない。
【００３３】
液体層５００の厚さは、蛍光ビーズ３００の直径（例えば6μm）選択により任意の値に設計することができるので、標準プレパラートを製造する場合の液体層の厚さ管理を標準化でき、品質の高い標準プレパラートを実現できる。このような蛍光ビーズをスペーサとする標準プレパラートでは、平面内だけでなく厚さ方向の焦点ずれも観測することができる。
【００３４】
更に他の実施形態につき説明する。図２及び図３で示した、液体層５００中に量子ドット４００と蛍光ビーズ３００を分散させた構成において、次の条件を設定する。
（１）励起用の第１光源１０の波長λ１のみにより蛍光ビーズ３００が励起され、フォトアクチベーション用の第２光源２１の波長λ２のみにより量子ドット４００が励起されるように波長λ１及びλ２を選択する。
【００３５】
（２）これら波長のλ１及びλ２励起によって発生する、第１蛍光及び第２蛍光の波長が異なる（色が異なる）ように選択する。
（３）第２光源の波長λ２による量子ドット４００への励起で発生する第２蛍光の波長
を、ダイクロイックミラー２２は透過し、ダイクロイックミラー１４で反射してセンサ２０で観察可能なスペクトルに選択する。
【００３６】
図４は、第１蛍光と第２蛍光のスペクトルの例を示す特性図である。Ｓ１は、第１光源波長λ１による可視光領域の第１蛍光（蛍光ビーズの蛍光スペクトル）、Ｓ２は、第２光源波長λ２による第２蛍光（量子ドットの蛍光スペクトル）を示し、両スペクトルは波長的にずれており、異なった色として観察可能である。
【００３７】
前記（１）乃至（３）の条件設定により、第１光源の焦点位置と第２光源の焦点位置を異なった蛍光色で同時に観察することが可能となり、キャリブレーション時に第２光源の焦点位置を第１光源の焦点位置に合わせる位置調整が容易に実施可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明を適用した蛍光顕微鏡用標準プレパラートの一実施形態を示す構成図である。
【図２】本発明の他の実施形態を示す蛍光顕微鏡用標準プレパラートの構成図である。
【図３】本発明の更に他の実施形態を示す蛍光顕微鏡用標準プレパラートの構成図である。
【図４】第１蛍光と第２蛍光のスペクトルの例を示す特性図である。
【図５】Ｍ社から市販されているスライドの構造を示す平面図及び断面図である。
【図６】Ｅ社から市販されているスライドの構造を示す平面図及び断面図である。
【図７】フォトアクチベーション用の第２光源を有する蛍光顕微鏡の構成を示す要部の斜視図である。
【符号の説明】
【００３９】
１００  基板部材
２００  カバーガラス
４００  量子ドット
５００  液体封入層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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