(57)【要約】【課題】  家畜において、腸内定着性および有害微生物の増殖抑制能に優れ、しかも発酵飼料の調製および品質改善に好適である新規プロバイオティック微生物を含む、飼料調製用微生物製剤を提供すること。また、優れた発酵品質を有し、かつ、家畜において、整腸効果の高い発酵リキッドやＴＭＲ発酵飼料、サイレージ等を簡便に製造する方法を提供すること。【解決手段】  プロバイオティック微生物（ラクトバチルス・プランタルムＬＱ８０株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３）及び／又はバチルス・サブティリスＬＱ１３株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２））を含有する飼料調製用微生物製剤、有機性廃棄物に当該飼料調製用微生物製剤を加えて発酵させることを特徴とする発酵リキッドまたはＴＭＲ発酵飼料の製造方法、並びに、サイレージ原料草に当該飼料調製用微生物製剤を加えて発酵させることを特徴とするサイレージの製造方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロバイオティック微生物を含有する飼料調製用微生物製剤。
【請求項２】
プロバイオティック微生物が、ラクトバチルス・プランタルムＬＱ８０株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３）及び／又はバチルス・サブティリスＬＱ１３株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２）を含むものである請求項１記載の飼料調製用微生物製剤。
【請求項３】
ブタの飼料調製用である請求項１又は２記載の飼料調製用微生物製剤。
【請求項４】
有機性廃棄物に請求項１−３のいずれかに記載の飼料調製用微生物製剤を加えて発酵させることを特徴とする発酵リキッドの製造方法。
【請求項５】
有機性廃棄物に請求項１−３のいずれかに記載の飼料調製用微生物製剤を加えて発酵させることを特徴とするＴＭＲ発酵飼料の製造方法。
【請求項６】
サイレージ原料草に請求項１−３のいずれかに記載の飼料調製用微生物製剤を加えて発酵させることを特徴とするサイレージの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飼料調製用微生物製剤とその利用に関し、詳しくはプロバイオティック微生物を含有する発酵飼料調製用微生物製剤並びに当該微生物製剤を用いて有機性廃棄物を発酵させて発酵リキッドおよびＴＭＲ発酵飼料を製造したり、サイレージ原料草を発酵させてサイレージを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生活水準の向上やライフスタイルの多様化等に伴って、都市部においては多量の食品廃棄物などの有機性廃棄物が発生している。ここで、食品廃棄物とは、食品製造工場などから排出されるものの他、レストラン、ホテル、コンビニエンスストアなどの飲食物を製造、販売する場所から廃棄される食品残渣などを意味する。
これらの食品廃棄物の排出量は非常に多量であり、しかも排出する場所が分散しているため、これらを効率よく回収することが困難である上に、回収した食品廃棄物を効率的に利用する技術の開発が不十分である。
すなわち、年間排出量が約2,000万トンと言われる食品廃棄物のうち、約90％が焼却・埋立て処分されており、利用されるものは10％に満たない現状であり、利用分野の大半は堆肥、飼料などに限られている。
しかも、食品製造工場などから排出される食品廃棄物は、通常高水分含量の状態であるため、腐敗を防止するには、排出された後に、当該食品廃棄物を迅速に乾燥するなどの処置が必要である。
しかし、高水分含量の食品廃棄物を乾燥するためには、大型乾燥機の導入や多くの熱エネルギーを必要とする。そのため、これらを利用する場合の製造コストが必然的に上昇し、例えば家畜用飼料などとしての利用を図ることは極めて困難である。
【０００３】
一方では、このような食品廃棄物などの低・未利用資源を有効に利用することは、飼料自給率を向上するだけでなく、環境の保全や資源循環型の畜産業を振興させるためにも極めて重要なことであると考えられる。
【０００４】
畜産業界において、飼料の自給率を向上するためには、これまで以上に未利用資源に着目して飼料生産のための利用を推進することが重要であると当業者に認識されている。また、資源循環型社会の構築および環境負荷の低減などの観点から、バイオマスである食品廃棄物および農作物残渣などの低・未利用資源の有効活用が極めて重要な課題である。
特に、食品廃棄物については、前述のように、水分含量が高いものが多いため、長期にわたって貯蔵することはできず、そのまま放置すると、腐敗による悪臭や、蝿、蛆などの害虫の発生により、環境汚染に進展する恐れもある。そのため、排出後に早急に適切な処理を図ることが必要である。
現状においては、前記の如く、産業廃棄物として焼却、埋め立て処理するか、コンポスト原料として用いられているにすぎず、食品廃棄物などの有機性廃棄物は有効に利用されていない。しかも、これらを焼却処理することによるダイオキシン等の発生や地球温暖化ガスの排出等、環境汚染が懸念されている。
【０００５】
乳酸菌などのプロバイオティック微生物の利用が、様々な分野で進められている。
たとえば、Lactobacillus equiを含有する馬用飼料添加物（特許文献１参照）や、乳酸菌と酵母菌との混合培養物から得られる免疫促進用組成物（特許文献２参照）が提案されている。
しかし、食品残渣などの有機性廃棄物を有効利用でき、さらに豚に対する優れたプロバイオティック効果を有する発酵飼料については、これまで提供されていなかった。
【０００６】
【特許文献１】特開2003-235569号公報
【特許文献２】特開2005-068092号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、まず小規模の発酵試験で生状態の食品残渣などの有機性廃棄物を発酵させて発酵リキッドの生産を試みた。その際に、当該有機性廃棄物を発酵させて目的とする発酵リキッドの品質の改善効果を示す微生物の検索を行った。
すなわち、各種食品残渣の中から微生物を分離し、これら菌株について有機性廃棄物の発酵試験に供し、目的に適合する微生物のスクリーニングを行った。その結果、プロバイオティック機能を有する特定の乳酸菌株とバチルス属に属する菌株を選抜することに成功した。
さらに、実用化のため、選抜された当該乳酸菌とバチルス属菌株を用いて、有機性廃棄物の発酵試験を行い、良質で、かつ長期貯蔵できる発酵リキッドの製造技術を開発した。この技術を活用することにより、食品廃棄物などの未利用資源の有効利用を図れるばかりでなく、発酵リキッドの製造工場等における生産効率の向上や、有機性廃棄物の発生抑制・有効利用など、より一層の環境負荷の少ない生産システムの構築を目指すことができる。
さらに、当該プロバイオティック微生物を用いて、効率的な発酵を行い、良好な品質を有するサイレージおよびＴＭＲ発酵飼料の製造技術を開発した。
【０００８】
本発明の目的は、多種多様な有機性廃棄物の飼料化を図るために、当該有機性廃棄物の栄養価や機能性成分を有効に活用し、資源の特性に応じた飼料の製造方法や貯蔵方法などを提供することである。
そのため、発酵飼料調製用微生物の検索、選抜を行い、当該微生物を用いて有機性廃棄物の適正な製造技術を開発することをも目的とする。とりわけ、微生物としてプロバイオティック微生物を活用することによる家畜生産性の向上に寄与する飼料の製造技術を開発することを目的とするものである。
すなわち、本発明は、家畜において、腸内定着性および有害微生物の増殖抑制能に優れ、しかも発酵飼料の調製および品質改善に好適である新規プロバイオティック微生物を含む、飼料調製用微生物製剤を提供することを目的とするものである。また、本発明は、優れた発酵品質を有し、かつ、家畜において、整腸効果の高い発酵リキッドやＴＭＲ発酵飼料、サイレージ等を簡便に製造する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは各種食品残渣から分離した微生物の中から、ホモ発酵型乳酸菌で乳酸生成能、および、好気性細菌や酪酸菌などの有害微生物の増殖の抑制能が特に優れていたラクトバチルス・プランタルムＬＱ８０株と、高温耐性と動物整腸効果を有するバチルスＬＱ１３株の新規菌株の選抜に成功し、本発明を完成するに至った。さらに、当該微生物を有機性廃棄物に添加して発酵リキッドおよびＴＭＲ発酵飼料を製造する方法、並びに、当該微生物をサイレージ原料草に添加してサイレージを製造する方法の開発にも成功した。
【００１０】
すなわち、請求項１に記載の本発明は、プロバイオティック微生物を含有する飼料調製用微生物製剤である。
請求項２に記載の本発明は、プロバイオティック微生物が、ラクトバチルス・プランタルムＬＱ８０株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３）及び／又はバチルス・サブティリスＬＱ１３株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２）を含むものである請求項１記載の飼料調製用微生物製剤である。
請求項３に記載の本発明は、ブタの飼料調製用である請求項１又は２記載の飼料調製用微生物製剤である。
請求項４に記載の本発明は、有機性廃棄物に請求項１−３のいずれかに記載の飼料調製用微生物製剤を加えて発酵させることを特徴とする発酵リキッドの製造方法である。
請求項５に記載の本発明は、有機性廃棄物に請求項１−３のいずれかに記載の飼料調製用微生物製剤を加えて発酵させることを特徴とするＴＭＲ発酵飼料の製造方法である。
請求項６に記載の本発明は、サイレージ原料草に請求項１−３のいずれかに記載の飼料調製用微生物製剤を加えて発酵させることを特徴とするサイレージの製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、家畜において、腸内定着性および有害微生物の増殖抑制能に優れ、しかも発酵飼料の調製および品質改善に好適である新規プロバイオティック微生物である上記ＬＱ８０株及び／又はＬＱ１３株を含む、飼料調製用微生物製剤が提供される。
さらに、本発明によれば、優れた発酵品質を有し、かつ、家畜において、整腸効果の高い発酵リキッドやＴＭＲ発酵飼料、サイレージ等を簡便に製造することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、本発明について詳しく説明する。
本発明においてプロバイオティック微生物とは、宿主である家畜において、腸内定着性および有害微生物の増殖抑制能に優れた微生物を指称し、しかも発酵飼料などの調製および品質改善に好適な微生物である。このような微生物としては、例えばラクトバチルス（Lactobacillus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属などに属する乳酸菌やバチルス（Bacillus）属に属する枯草菌などが挙げられ、具体的にはラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）などがある。これらの微生物は、単独で用いる他、２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００１３】
本発明において用いるプロバイオティック微生物は、以下に示した方法で取得することができる。
一般的には、各種食品残渣、当該食品残渣の発酵産物、例えば発酵リキッド、ブタ等の家畜の腸管などを分離源として、常法によりスクリーニングする方法が適用される。
具体的には、供試試料を乳酸菌やバチルス属微生物の分離用培地にて培養し、培養物から分離した菌株について、有機性廃棄物を用いた小規模の発酵リキッド調製試験を行い、目的とする菌株を選抜する。
次いで、選抜した乳酸菌株およびバチルス属菌株について、菌学的諸性質や生理的・生化学的性質等を調べる。さらに、必要に応じて選抜した微生物を用いて発酵リキッド飼料やサイレージ等の調製適性試験を実施する。
このようにして、ラクトバチルス・プランタルムＬＱ８０株とバチルス・サブティリスＬＱ１３株を選抜した。
【００１４】
ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＬＱ８０株は、ホモ発酵型乳酸菌で低ｐＨ耐性と乳酸生成能が特に優れ、好気性細菌や大腸菌群などの有害微生物の増殖を抑制する乳酸菌株である。
一方、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）ＬＱ１３株は、高温耐性や耐酸性を有し、動物腸内定着性や整腸効果に優れた有胞子菌株である。
ラクトバチルス・プランタルムＬＱ８０株はLactobacillus plantarumの基準株と最も近縁な系統関係にあるが、糖類発酵特性等において基準株と異なることから、本発明者らは新規菌株であると判定し、上記の如く命名した。また、バチルス・サブティリスＬＱ１３株はBacillus subtilisの基準株と最も近縁な系統関係にあるが、糖類発酵特性等において基準株と異なることから、本発明者らは新規菌株であると判定し、上記の如く命名した。これら菌株は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はラクトバチルス・プランタルムＬＱ８０株がＮＩＴＥ  Ｐ−１３３であり、バチルス・サブティリスＬＱ１３株がＮＩＴＥ  Ｐ−１３２である。
【００１５】
本発明に係る飼料調製用微生物製剤は、プロバイオティック微生物を含有するものであり、好ましくは上記のＬＱ８０株とＬＱ１３株を単独で、もしくは組み合わせて含有する飼料調製用微生物製剤である。なお、この微生物製剤は、当然のことであるが、当該微生物の生菌を含有するものである。
【００１６】
上記微生物製剤は、主として家畜、具体的にはブタ、ウシなどの家畜用飼料の調製に用いられるが、ニワトリなどの家禽用飼料の調製にも用いることができる。とりわけ、ブタ用飼料の調製に好適である。
本発明において飼料とは、当該微生物製剤を使用して食品残渣などの有機性廃棄物あるいはサイレージ原料草を発酵させて得られるもの、すなわち発酵リキッド（液体発酵産物）、ＴＭＲ発酵飼料、サイレージ等を主成分として含有するものを指称し、具体的には当該発酵産物自体の他、これらを含むＴＭＲ発酵飼料や、当該主成分である発酵産物と市販飼料成分を配合したものなどが挙げられる。飼料の形状は問わないが、発酵リキッドを含有する場合は、液状や懸濁状の飼料が好ましい。
本発明により得られる発酵飼料には、上記したプロバイオティック微生物が多く含まれているため、これを摂取させることにより、家畜の腸内フローラを改善することができる。かかる効果を得るためには、家畜に与える飼料１ｇ当たりに存在する当該微生物菌体数が、ＬＱ１３株では１０２〜１０６個、好ましくは１０５〜１０６個、ＬＱ８０株では１０４〜１０９個、好ましくは１０６〜１０８個となるようにすればよい。
【００１７】
次に、本発明に係る発酵リキッドの製造方法について、以下に説明する。
発酵原料である有機性廃棄物としては、たとえば野菜類、果物類、ご飯類、麺類、パン・ケーキ類、乳・肉類などの各種食品残渣等を用いることができる。
当該原料としては含水率が６０％〜８０％のもの好ましいので、この範囲外の場合は、発酵させるにあたり、あらかじめ含水率を当該範囲内となるように調整することが望ましい。
【００１８】
これら発酵原料は、まず粉砕機などを用いてよく粉砕する。なお、家畜給与に支障を来たすような物質、例えば塩化ビニルフィルムなどの合成樹脂製フィルム、シートや金属片、その他の異物が存在する場合は、これらを取り除く。
次いで、当該原料の水分含量を６０％〜８０％に調整した後、滅菌処理を行う。ここで、滅菌方法としては、８０−１００℃スチーム処理、加熱処理など通常の方法を採用することができる。なお、加熱殺菌を行わない場合、原料に有機酸を添加することにより不良菌の増殖を抑制することができる。
その後、当該発酵原料の温度を上記プロバイオティック微生物が生育可能な温度、通常は１５〜４５℃、好ましくは20〜35℃程度まで冷やしてから、本発明の飼料調製用微生物製剤を添加し、よく混合させた後、１〜５日間、好ましくは２日間発酵させる。微生物製剤の添加量は、発酵原料１ｋｇ（乾物重）当たりの菌体数が、ＬＱ１３株では１０６〜１０９個、好ましくは１０７〜１０８個、ＬＱ８０株では１０７〜１０１０個、好ましくは１０７〜１０８個となるようにすればよい。発酵は、タンクなどの通常用いられる貯蔵用容器内で実施する。
【００１９】
発酵を行うに際して、本発明の飼料調製用微生物製剤以外にも、必要に応じて他の微生物も適宜添加することができる。なお、培養条件としては、嫌気発酵が行われる条件であれば特に制限はない。
発酵終了後、得られた発酵産物（発酵リキッド）はそのまま、あるいは既知の飼料成分と混合して家畜へ給与することができる。また、この発酵リキッドを発酵スターターとして使用し、食品残渣など既知の飼料成分などを必要に応じて添加し、改めて飼料を調製することができる。
上記のようにして製造した発酵リキッドにおける微生物菌相や発酵品質等について調べた結果、上記ＬＱ８０株およびＬＱ１３株は、飼料中の大腸菌などの不良菌、有害菌などを排除したり、発酵品質の改善効果を有していることから、特に発酵リキッドの調製に適した微生物であることを明らかとなった。
【００２０】
次に、本発明に係るＴＭＲ発酵飼料の製造方法について、以下に説明する。
ＴＭＲ発酵飼料とは、食品・作物残渣などの有機性廃棄物を主原料として発酵させて得られる混合飼料である。
発酵原料である有機性廃棄物としては、たとえば茶殻、野菜類、果物類、ご飯類、麺類、パン・ケーキ類、乳・肉類などの各種食品残渣や、イネ、トウモロコシ、ビートなどの作物残渣を用いることができ、特に脂肪（油）と塩が少ないものが好ましい。これらの有機性廃棄物の混合物を用いることができる。
当該原料としては含水率が６０〜７０％のものが好ましいので、この範囲外の場合は、発酵させるにあたり、あらかじめ含水率を当該範囲内となるように調整することが望ましい。
また、これらの有機性廃棄物に、必要に応じて既知の飼料成分や牧草類、飼料用サプリメントなどを添加することもできる。
【００２１】
これら発酵原料は、発酵や家畜給与に支障を来たすような物質、例えば塩化ビニルフィルムなどの合成樹脂製フィルム、シートや金属片、その他の異物が存在する場合は、これらを取り除く。当該原料の水分含量を４０〜７０％に調整する。
その後、当該発酵原料の温度を上記プロバイオティック微生物が生育可能な温度、通常は１５〜４５℃、好ましくは20〜35℃程度に調整し、本発明の飼料調製用微生物製剤を添加し、室外温度（１０−３０℃）で概ね３週間以上保存する。微生物製剤の添加量は、発酵原料１ｋｇ（乾物重）当たりの菌体数が、ＬＱ１３株では１０６〜１０９個、好ましくは１０７〜１０８個、ＬＱ８０株では１０７〜１０１０個、好ましくは１０７〜１０８個となるようにすればよい。
【００２２】
発酵を行うに際して、本発明の微生物製剤以外にも、必要に応じて他の微生物も適宜添加することができる。
上記のようにして製造したＴＭＲ発酵飼料における微生物菌相や発酵品質等について調べた結果、上記ＬＱ８０株およびＬＱ１３株は、飼料中の大腸菌などの不良菌、有害菌などを排除し、発酵品質の改善効果を有していることから、特にＴＭＲ発酵飼料の調製に適した微生物であることが明らかとなった。
【００２３】
次に、本発明に係るサイレージの製造方法について説明する。
サイレージは、空気を遮断した状態で飼料作物を原料草として一定期間貯蔵し、嫌気発酵させたものである。
まず、原料草としては、通常に使用されるものであればよく、例えばトウモロコシ、ソルゴー、イタリアングラス、オーチャード、リードカナリー、オオムギ、コムギ、エンバク、アルファルファなどが挙げられる。これらは単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いることもできる。これらの原料草は、予乾して水分含量を低く（５０〜６０％程度）して用いるのが好ましい。
上記の原料草に、本発明の飼料調製用微生物製剤を添加し、３０〜３００日間嫌気発酵させる。微生物製剤の添加量は、サイレージ原料草１ｋｇ（乾物重）当たりの菌体数が、ＬＱ１３株では１０６〜１０９個、好ましくは１０７〜１０８個、ＬＱ８０株では１０７〜１０１０個、好ましくは１０７〜１０８個となるようにすればよい。発酵は、各種サイロなどで行う。なお、発酵条件は、材料草をサイロに詰め込み、嫌気発酵が行われれば良い。
このようにして得られたサイレージは、乳酸菌などの微生物菌叢のバランスが良く、優れた発酵を示す良質のものである。このサイレージを家畜に給与することによって、飼料の摂取量が多くなり、腸内フローラの改善作用などが期待される。
【実施例】
【００２４】
実施例１（乳酸菌ＬＱ８０株とバチルス属菌ＬＱ１３株の取得）
乳酸菌ＬＱ８０株とバチルス属菌ＬＱ１３株は、以下に示した方法で取得した。
食品残渣、発酵リキッドおよびブタ腸管を分離源（試料）とし、これらから乳酸菌やバチルス属菌の分離を行った。なお、発酵リキッドは、野菜類などの各種食品残渣を発酵原料として含水状態で嫌気的に発酵させることにより得たものである。また、ブタ腸管は、屠殺したブタから採取したものを用いた。
上記の新鮮試料１０gを、それぞれストマッカ−用ビニール袋（「飛竜KN208」、旭化成（株）製）に採取し、滅菌した生理食塩水９０mlを加えて１０倍希釈液とした後、この液をさらに1０８倍まで希釈した。
この希釈液を乳酸菌用培地であるLactobacilli MRS寒天培地（DIFCO Laboratories, Detroit, USA）、普通寒天培地（日水製薬（株）、日本）及びGYP白亜寒天培地（小崎ら、乳酸菌実験マニュアル、1992）に塗布して、乳酸菌については、乳酸菌用嫌気培養装置（ヒラサワ（株）製）を用いて37℃で2日間培養した。一方、バチルス属菌については、恒温培養装置を使って30℃で2日間培養した。
【００２５】
上記の培養物から分離した乳酸菌およびバチルス属菌について、菌学的諸性質や生理的・生化学的性質等を調べ、さらに発酵リキッド、サイレージ及びＴＭＲ発酵飼料の調製適性試験を実施し、耐酸性や胆汁耐性が強く、厳しい環境で生育できる優良株など、目的とする菌株の選抜を行った。
このようにして、発酵リキッド由来の菌株の中から、特に低ｐＨ下で生育可能であり、DL型乳酸を高生産し、かつ発酵リキッド等の調製に適した乳酸菌株を選抜し、本菌株をラクトバチルス・プランタルムＬＱ８０株と命名した。また、豚腸管由来の菌株からは、低ｐＨ下で生育可能であり、高温耐性を持ち、かつ発酵リキッド等の調製に適した枯草菌株を選抜し、本菌株をバチルス・サブティリスＬＱ１３株と命名した。これら菌株の性質等を表１に示す。
【００２６】
【表１】
2007082468.tif 000002
【００２７】
両菌株の電子顕微鏡写真を図１に示す。
これらの菌株は、いずれも胆汁酸や胃酸に対する耐性を有し、ｐＨ３．５まで生育できる短桿菌であった。また、ＬＱ１３株は、高温耐性を有し（４５℃まで生育可）、芽胞を形成した。一方、ＬＱ８０株は、グラム陽性菌で、ＤＬ型乳酸生成能に優れていた。
なお、胆汁酸耐性試験では、胆汁酸0.5％添加した増殖培地で３０℃で５日間培養し、菌生育可能かどうか（生残菌数）を調べた。
【００２８】
次に、両菌株について16S  rRNAの全領域塩基配列を決定して分子系統を解析した。その結果、バチルス・サブティリスＬＱ１３株の分子系統位置は、Bacillus属のクラスターにあり、Bacillus subtilisの基準株と最も近縁な系統関係を示した。また、ラクトバチルス・プランタルムＬＱ８０株の分子系統位置は、Lactobacillus属のクラスターにあり、Lactobacillus plantarumの基準株と最も近縁な系統関係を示した。
また、上記基準株とのDNA-DNA相同性試験の結果では、バチルス・サブティリスＬＱ１３株がBacillus subtilisと同定されたが、糖類発酵特性などにおいて基準株と異なることから、本菌株は新規菌株種と判定し、バチルス・サブティリスＬＱ１３株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１３２）と命名した。また、上記基準株とのDNA-DNA相同性試験の結果では、ラクトバチルス・プランタルムＬＱ８０株がLactobacillus plantarumと同定されたが、糖類発酵特性などにおいて基準株と異なることから、本菌株は新規菌株種と判定し、ラクトバチルス・プランタルムＬＱ８０株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１３３）と命名した。
【００２９】
実施例２（発酵リキッドの調製と発酵品質）
ＬＱ８０株及びＬＱ１３株を単独で、又はこれらを組み合わせて用いて発酵リキッドの調製を行った。
食品製造工場、レストラン、ホテル、コンビニエンスストアなどから排出された各種食品残渣を回収したものを原料として用いた。発酵リキッド飼料生産工場において、これらの原料をよく粉砕したのち、異物などを取り除いた。
次に、当該原料２００ｋｇに原料中の水分含量を８１％に調整し、100℃スチームで３分間滅菌処理を行った。滅菌後、放置することにより、原料の温度を３０℃まで冷やしてから貯蔵タンクに入れ、これに上記２種類の菌株を単独で、又はこれらを組み合わせて添加し、2日間培養（発酵）した。
なお、各菌株の添加量は、ＬＱ１３株が１０４〜１０５個／ｇ原料、ＬＱ８０株が１０４〜１０５個／ｇ原料となるように調整した。得られた発酵物をそのまま発酵リキッド（本発明品）とした。
【００３０】
このようにして得られた発酵リキッドについて、存在する微生物菌相や当該飼料の発酵品質等について調べた。発酵品質試験は、液体クロマトグラフィー（日本分光製）を用いて乳酸、酢酸および酪酸を分析し、また、ケルティック窒素分析器（フォスジャパン製）でアンモニア態窒素を分析した。なお、上記２種類の菌株を添加することなく同様にして発酵を行って得た発酵リキッド（無添加品）を対照として供試した。
無添加の対照品と、両菌株を併用して得られた本発明品、並びに、各菌株を単独で用いて製造した本発明品の分析結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
2007082468.tif 000003
*発酵リキッドは貯蔵後３日目に分析。
nd, 検出されない; +-, 弱陽性反応; FM, 新鮮物
【００３２】
表から明らかなように、本発明に係る菌株を添加しないで製造した発酵リキッド（対照品）に比べ、ＬＱ８０株又はＬＱ１３株を添加して製造した発酵リキッド（本発明品）では、乳酸が多く作られており、またｐＨが対照品より顕著に低下した。
さらに、本発明品においては、原料の発酵過程において乳酸菌が旺盛に増殖するため、大腸菌や糸状菌などの有害微生物の増殖が効果的に抑制され、発酵リキッドの品質が改善された。なお、本発明品における上記の効果は、両菌株を併用した場合に顕著であった。
特に、ＬＱ８０株の添加により、乳酸発酵が促進され、乳酸が多く作られ、発酵リキッドのｐＨ値とアンモニア態窒素含量が低下した。また、不良菌である好気性細菌の増殖も抑えられた。
一方、ＬＱ１３株の添加により、バチルス属菌の増殖が促進され、これに伴い発酵リキッド中の乳酸含量が高く、不良菌の生成量が低い傾向が示された。
以上の結果、本発明に係るＬＱ８０株とＬＱ１３株は、単独で用いても、組み合わせて用いても、発酵リキッドの調製において、有害微生物や不良菌の増殖を抑制する作用があり、かつ発酵品質の向上に有効な菌株であることが示された。
【００３３】
実施例３（発酵リキッド飼料のブタへの給与効果）
実施例２において、ＬＱ８０株とＬＱ１３株を併用して製造した発酵リキッドをブタ（LWD三元交雑種、雌・雄去勢）に摂取させ、その効果を以下のようにして確認した。
ブタへの給与試験については、トウモロコシと大豆粕を主体とする配合飼料を給与した対照区と、多様な食品残渣を原料としてＬＱ８０株とＬＱ１３株を併用して調製した発酵リキッド（本発明品）給与区（それぞれ６頭ずつ）を設け、６週間各飼料の給与を継続した。
各飼料の給与開始から６週間後、ブタ各部消化管における供試菌株の腸内定着性および腸内フローラを分析した。
【００３４】
腸内フローラの分析は、給与開始から６週間後のブタの胃、小腸、大腸の各部から採取した内容物１０ｇを滅菌生理食塩水で１０５倍まで希釈したものをＭＲＳ、普通寒天培地ＰＤＡなどの培地に接種して、３０℃の条件下で培養した。添加菌の同定および定着性の確認は１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基配列の解析結果に基づき行った。
【００３５】
次に、トウモロコシと大豆粕を主体とする配合飼料を原料として上記と同様に調製した発酵リキッドを２週間継続給与した３頭のブタに、続いて上記の対照区と同じ配合飼料を２週間継続して給与した。給与停止時並びに停止後５、１０、１４日目において、このブタの糞中の微生物菌叢を分析することで添加菌の腸内定着性の経時的な変化を検討した。
なお、糞中の微生物菌叢の分析は、糞を１０ｇ採って滅菌食塩水で１０５倍希釈したものをＭＲＳ、普通寒天培地ＰＤＡなどの培地に接種して、３０℃の条件下で培養することにより行った。
【００３６】
図２に、ブタ消化管内容物の菌種構成を、図３にブタ消化管における添加菌の定着性を、図４に添加菌の定着性の経時的変化を示した。
図２から、配合飼料給与区（対照、黒棒で示す。）に比べ、発酵リキッド飼料供与区（白棒で示す。）のブタ各部消化管における大腸菌数が減少し、乳酸菌、バチルス及び酵母菌数が増加して、腸内フローラの改善効果が示された。
また、図３に示したように、胃、小腸、大腸などの各部消化管において、添加したＬＱ８０株とＬＱ１３株は発酵リキッド飼料の給与期間中、腸内容物１ｇ当たり１０５−１０６個と高い菌数レベルを維持し、ＲＯ５０株とＬＱ７８株に比べ良好な定着性を示した。さらに図４に示したように、発酵リキッド飼料の給与停止後に配合飼料に切り替えて２週間経過した後も、豚フン中にＬＱ８０株とＬＱ１３株が確認された。このように、ＬＱ８０株とＬＱ１３株は、良好な腸内定着性をもつプロバイオティック効果を示した。
【００３７】
図５に給与試験中の体重変化を、図６に給与試験終了後の発酵リキッド飼料給与区（左３頭）および配合飼料給与区（対照、右３頭）のブタ枝肉の写真をそれぞれ示す。各試験区のブタ枝肉の重量、歩留り、背脂肪厚に有意差（p>0.10）は見られなかった。また、発酵リキッド飼料給与区におけるＤＧ（１日当たりの増体重）は870ｇであり、ブタにおける日本飼養標準の目標ＤＧ（850ｇ／日）を上回っていた。
このように、本発明により得られた発酵リキッド飼料によるブタ増体重と肉質は、市販配合飼料に比べても遜色のない品質であることが認められた。
【００３８】
実施例４（ＴＭＲ発酵飼料の調製と発酵品質）
ＬＱ８０株及びＬＱ１３株を単独で、又はこれらを組み合わせて用いてＴＭＲ発酵飼料の調製を行った。
発酵原料としては、飲料工場から排出直後の新鮮な緑茶飲料残渣を供試した。これらの飲料残渣を原料全体の乾物重量に対して10％、配合飼料３５％、乾草30.5％、アルファルファ乾草１２％、ビートパルプ11％、およびサプリメント1.5％の割合で混合し、またＬＱ１３株とＬＱ８０株を原料1ｇ当たりそれぞれ１０４〜１０５個添加した。原料を十分に混合してから小規模発酵試験法により試料100gをストマッカ−用積層フィルム袋（飛竜KN208、旭化成ポリフレックス株式会社、東京）に採取し、真空密封器で調製し、室温で貯蔵した。得られた発酵物をＴＭＲ発酵飼料（本発明品）とした。
【００３９】
このようにして得られたＴＭＲ発酵飼料について、存在する微生物菌相や当該飼料の発酵品質等について調べた。発酵品質は、実施例２と同様の方法で測定した。なお、上記２種類の菌株を添加することなく同様にして発酵を行って得たＴＭＲ発酵飼料（対照品）を対照として供試した。
無添加の対照品と、両菌株を併用して得られた本発明品、並びに、各菌株を単独で用いて製造した本発明品の分析結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
2007082468.tif 000004
*貯蔵後３０日目に発酵品質を分析。
nd, 検出されない; +-, 弱陽性反応; FM, 新鮮物
【００４１】
表から明らかなように、本発明に係る菌株を添加しないで製造したＴＭＲ発酵飼料（対照品）に比べ、ＬＱ８０株及び／又はＬＱ１３株を添加して製造した発酵リキッド飼料（本発明品）では、ｐＨが低く、乳酸含量が高く、発酵品質が良好であった。
特に、両菌株を混合して添加した場合、乳酸菌が旺盛に増殖するため、好気性不良菌の抑制等の良好な品質改善効果を示した。
ＬＱ８０株の添加により、乳酸発酵が促進され、乳酸が多く作られ、飼料のｐＨ値とアンモニア態窒素含量が低下した。また、不良菌である好気性細菌の増殖も抑えられた。
一方、ＬＱ１３株の添加により、バチルス属菌の増殖が促進され、これに伴い飼料中の乳酸含量が高く、不良菌の生成量が低い傾向が示された。
以上の結果、本発明に係るＬＱ８０株とＬＱ１３株は、単独で用いても、組み合わせて用いても、ＴＭＲ発酵飼料の調製において、有害微生物や不良菌の増殖を抑制する作用があり、かつ発酵品質の向上に有効な菌株であることが示された。
【００４２】
実施例５（サイレージの調製と発酵品質）
ＬＱ８０株とＬＱ１３株をそれぞれ単独で、又は組み合わせて用い、以下のようにしてサイレージを調製した。
すなわち、サイロに収容したイタリアングラス（水分７４％）１ｋｇ当たりＬＱ８０株及び／又はＬＱ１３株をそれぞれ培養液１ｍｌ（菌数１０４〜１０５個程度）添加し、十分に混合した後、サイロに密封して室温で貯蔵した。９５日間発酵させ、サイレージ（本発明品）を得た。
また、対照として、ＬＱ８０株とＬＱ１３株を添加せず、上記と同様にしてサイレージ（対照品）を製造した。
このようにして得られたサイレージ中の有機酸、アンモニア態窒素および微生物菌相を分析し、サイレージ発酵品質および菌種構成を調べた。分析結果を表４に示す。
【００４３】
【表４】
2007082468.tif 000005
*イタリアンライグラスサイレージは貯蔵後95日目に分析。
nd, 検出されない; +-, 弱陽性反応; FM, 新鮮物
【００４４】
表から明らかなように、本発明に係る菌株を添加しないで製造したサイレージ（対照品）に比べ、ＬＱ８０株及び／又はＬＱ１３株を添加して製造した発酵リキッド飼料（本発明品）では、乳酸が多く作られており、またｐＨが対照品より顕著に低下した。
さらに、本発明品においては、原料の発酵過程において乳酸菌が旺盛に増殖するため、大腸菌や糸状菌などの有害微生物の増殖が効果的に抑制され、サイレージの品質が改善された。なお、本発明品における上記の効果は、両菌株を併用した場合に顕著であった。
特に、ＬＱ８０株の添加により、乳酸発酵が促進され、乳酸が多く作られ、サイレージのｐＨ値とアンモニア態窒素含量が低下した。また、不良菌である好気性細菌の増殖も抑えられた。
一方、ＬＱ１３株の添加により、バチルス属菌の増殖が促進され、これに伴いサイレージ中の乳酸含量が高く、不良菌の生成量が低い傾向が示された。
以上の結果、本発明に係るＬＱ８０株とＬＱ１３株は、単独で用いても、組み合わせて用いても、サイレージの調製において、有害微生物や不良菌の増殖を抑制する作用があり、かつ発酵品質の向上に有効な菌株であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明により、有機性廃棄物や牧草類を原料として良質かつ長期貯蔵可能な発酵飼料の製造方法が提供される。本発明によれば、食品残渣などの未利用資源の有効利用を図れるばかりでなく、発酵飼料の生産効率や、家畜・家禽の生産性の向上にも貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ＬＱ８０株（ａ）およびＬＱ１３株（ｂ）の電子顕微鏡写真である。
【図２】実施例３において、６週間の給与試験終了後のブタの各部消化管から採取した内容物１ｇ中の菌種構成を示すグラフである。
【図３】実施例３において、６週間の給与試験終了後のブタの各部消化管から採取した内容物１ｇ中における各種菌の存在数を示すグラフである。
【図４】実施例３において、本発明の発酵リキッド飼料を２週間給与し、その後市販の配合飼料を給与したブタのフン中の微生物菌叢の変化を経時的に示すグラフである。
【図５】実施例３における６週間の給与試験中のブタ体重の経時的変化を示す。
【図６】実施例３における６週間の給与試験終了後のブタ枝肉の写真である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図６】
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