(57)【要約】【課題】デンドロン脂質を用いた非ウィルスベクターは、細胞内へのトランスフェクション効果が高く有用であるが、安定性や特異的な吸着性がなかった。【解決手段】デンドロン脂質の末端のアミノ基にガラクトースをリガンドとして修飾し、細胞表面のレセプターに特異的に吸着する機能を付与する。また末端アミノ基をＰＥＧで修飾し、ベクターの平均粒径を小さくし、安定性と利用しやすさを向上させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式ＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ８のいずれかで表される化合物のＸＨ2の部分の少なくとも1箇所がＸＨＲ3またはＸＨＲ4のいずれかに置き換えられた化合物を含む遺伝子等運搬媒体組成物。
ＤＬ−Ｇ１：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（ＸＨ2）2
ＤＬ−Ｇ２：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（ＸＨ2）2）2
ＤＬ−Ｇ３：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2
ＤＬ−Ｇ４：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2
ＤＬ−Ｇ５：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2
ＤＬ−Ｇ６：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2）2
ＤＬ−Ｇ７：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2）2）2
ＤＬ−Ｇ８：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2）2）2）2
（式中  Ｒ1及びＲ2は、同一または異なったアルキル基、アルコキシ基、アリール基またはアラルキル基を示す。Ｘは、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ＜を示す。Ｒ3は糖類の残基を示す。Ｒ4はポリオキシエチレン基またはポリビニルアルコール基または、ポリビニルピロリドン基を示す。）
【請求項２】
前記Ｒ3は五員環構造若しくは六員環構造を含む糖類であることを特徴とする請求項１記載の遺伝子等運搬媒体組成物。
【請求項３】
さらにリン脂質を含む請求項１乃至２のいずれか１項に記載の遺伝子等運搬媒体組成物。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の遺伝子等運搬媒体組成物と遺伝子等とからなるリポプレックスまたはリポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子、薬物、生理活性物質、生理活性ペプチド類、タンパク質（本明細書を通じて「遺伝子等」という）を、目的とする細胞へ運搬するための運搬媒体と運搬媒体組成物および運搬方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は治療すべき細胞に治療用遺伝子を導入し、それを発現させることで治療を行う。細胞中に所定の遺伝子を投入するためのカプセルをベクターという。このベクターはもともと細胞に入り込む性質を持つ、ウィルスの「殻」や脂質の小胞（リポソーム）等が使われる。
【０００３】
ウィルスベクターは、ウィルスの「殻」を用いたベクターで病原性や毒性を持つ遺伝子（以下「ＤＮＡ」ともいう。）を切り取り、代わりに薬となる遺伝子をはめ込んで作成される。ウィルスベクターは、もともと細胞内に入り込む能力を有しているので、細胞内に遺伝子を持ち込む能力には優れている。しかし、切り取ったとは言え、病原性や毒性、増殖性がないとは言い切れない場合もあり、安全面では課題が残る。
【０００４】
非ウィルスベクターは、リポゾームベクターとも呼ばれ、細胞膜に良く似た構造の脂質二重膜でできたミクロの球体で、この中に遺伝子を入れ、使用する。病原性や毒性はないものを作れるが、細胞中に外来の遺伝子を導入して発現させるトランスフェクション効率には課題が残る。すなわち、安全性の観点から非ウィルスベクターのトランスフェクション効率の向上が求められる。
【０００５】
また、遺伝子はリポソームの中に封入されても、あるいはリポソームと複合体を形成していても細胞内に取り込まれることができる。リポソームとＤＮＡの複合体はリポプレックスと呼ばれる。
【０００６】
ベクターに包まれたＤＮＡは、エンドサイトーシスという過程を経て細胞内に取り込まれる。取り込まれたベクターは、エンドソームという細胞小器官に保持され、やがてリソソームによって分解されてしまう。
【０００７】
従って、トランスフェクション効率を上げるには、ベクターは分解される前に、エンドソームから脱出し、ＤＮＡを細胞質内にリリースすることが必要である。非ウィルスベクターは、プロトンスポンジ効果やベクターとエンドソームの膜が一体となる膜融合という機能を保有することによって、エンドソームからＤＮＡをリリースする。
【０００８】
本発明者はすでにデンドロンタイプの脂質が、上記のプロトンスポンジ効果と膜融合の機能を有し、効率の高いトランスフェクション効率を有する非ウィルスベクターとなりえる点を示した（特許文献１参照）。
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−１５９５０４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ベクターを遺伝子治療に用いるにはさらに標的とする細胞に特異的に吸着する能力が求められる。また、ベクター同士はお互いに凝集して大きくなる傾向があるが、一定の大きさより小さい方が投与方法の制限がなくなる点で望ましい。
本発明は上記の課題を解決するために先に示したデンドロンタイプの脂質を改良することで発想されたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
デンドロン脂質の極性基が有している多数の機能性分子導入サイトにリガンドを導入する。また、デンドロン脂質にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）等の高分子を導入する。
【発明の効果】
【００１２】
デンドロン脂質にリガンドを導入することによって、リガンドが特異的に吸着するレセプターを表面に有する細胞に対して標的指向性のあるベクターを構築することができる。これは遺伝子導入効率が高く、かつ細胞毒性の低い遺伝子運搬媒体であるから、DDS（Drug Delivery System）として用いることができる。また、デンドロン脂質にPEG等の高分子を導入することで、ベクターの大きさが一定以下の大きさになり、イン・ビボ（in vivo）での使用が容易となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
・基本となるデンドロン脂質
本発明に用いるデンドロン脂質としては、以下に示されるＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ８の化合物である。
ＤＬ−Ｇ１：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（ＸＨ2）2
ＤＬ−Ｇ２：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（ＸＨ2）2）2
ＤＬ−Ｇ３：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2
ＤＬ−Ｇ４：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2
ＤＬ−Ｇ５：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2
ＤＬ−Ｇ６：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2）2
ＤＬ−Ｇ７：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2）2）2
ＤＬ−Ｇ８：Ｒ1Ｒ2ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ2）2）2）2）2）2）2）2）2
式中  Ｒ1及びＲ2は、同一または異なったアルキル基、アルコキシ基、アリール基またはアラルキル基を示す。Ｘは、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ−を示す。
【００１４】
上記ＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ８のいずれかのポリアミドアミンデンドロン脂質において、アルキル基としては、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、エイコサデシル、２−エチルヘキシルなどの炭素数６〜２０の直鎖または分枝を有するアルキル基が挙げられる。
【００１５】
アルコキシ基としては、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、エイコシルオキシ、２−エチルヘキシルオキシなどの炭素数６〜２０の直鎖または文枝を有するアルコキシ基が挙げられる。
【００１６】
アリール基としては、ベンジル、ナフチル、ビフェニル、アントラニル、フェナントリルなどが挙げられる。アラルキル基としては、ベンジル、フェネチルなどが挙げられる。
【００１７】
Ｘは、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2Ｎ−を表し、その末端のＮは、通常２個の水素原子を有するが、1個の水素原子がロイシン、バリン、イソロイシン、ノルロイシン、フェニルアラニン、チロシンなどの疎水性アミノ酸で置換されていてもよい。
【００１８】
本発明に用いるポリアミドアミンデンドロン脂質は、例えば以下のようにして製造することができる。
【００１９】
【化１】
2007137805.tif 000002
【００２０】
本発明に用いる好ましいポリアミドアミンデンドロン脂質を以下に示す。
【化２】
2007137805.tif 000003
【００２１】
・導入するリガンド
標的指向性を持たせるために、ポリアミドアミンデンドロン脂質の機能性分子導入サイトに付加するリガンドとしては、ガラクトース等の糖類を用いる。癌細胞の表面に比較的多く存在するレセプターのリガンドと考えられるからである。しかし、付加するリガンドは標的とする相手側のレセプターに応じて変更することができ、糖類に限定されるものではない。
【００２２】
・導入するリガンドの割合
これらのリガンドは、ポリアミドアミンデンドロン脂質のすべての導入サイトにあるのが望ましいが、すべての導入サイトになくても本件発明の効果は得ることができる。
【００２３】
・導入方法
基体となるポリアミドアミンデンドロン脂質のアミノ結合の部分が、機能性分子導入サイトとなる。従って、この部分に結合せさる方法であれば、特に限定されるものではない。例としてはリガンドの一部をエステル化したものを上記サイトと結合させたり、リガンドの糖の１部分を酸にして、ポリアミドアミンデンドロン脂質と直接結合させるなどの方法がある。
【００２４】
・ＰＥＧの修飾について
他に付加する機能性分子としてはＰＥＧなどの高分子がある。これらをポリアミドデンドロン脂質の表面に付加することで、ベクターの凝集が抑制される。その他、ポリビニルアルコールやポリビニルピロリドンなど水溶性の高分子が使用可能である。
【００２５】
これらの高分子は末端にイソシアナートやカルボキシル基、スクシミジル基、イミダゾリルカーボネート基を持つように改変した後、デンドロン脂質の末端アミノ基と反応させる。なお、付加する分子や付加方法について、特に限定されるものではない。
【００２６】
なお、リガンドまたはＰＥＧ等の高分子を結合させたポリアミドアミンデンドロン脂質を修飾デンドロン脂質と呼ぶ。
【００２７】
遺伝子等運搬媒体組成物
本発明の遺伝子等運搬媒体組成物は、修飾デンドロン脂質の他、ポリアミドアミンデンドロン脂質やリン脂質を好適に含むことができる。このようなリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスズローゲンおよびホスファチジン酸等を挙げることができ、これらは１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２８】
このうち、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンをそれぞれ単独で、または組み合わせて用いるのが好ましい。これらのリン脂質の脂肪酸残基は、特に限定されるべきものではないが、炭素数１２から１８の飽和または不飽和の脂肪酸残基をあげることができ、具体的には、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、オレオイル基、リノレイル基等をあげることができ、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）が特に好ましい。
【００２９】
・リン脂質の配合量
リン脂質の配合量は特に限定されないが、リン脂質と修飾デンドロン脂質とポリアミドアミンデンドロン脂質の合計量を１００重量部とした場合にリン脂質３０〜９０重量部、修飾デンドロン脂質とポリアミドアミンデンドロン脂質７０〜１０重量部、好ましくはリン脂質５０〜８０重量部、修飾デンドロン脂質とポリアミドアミンデンドロン脂質５０〜２０重量部、より好ましくはリン脂質６０〜７０重量部、修飾デンドロン脂質とポリアミドアミンデンドロン脂質４０〜３０重量部である。
【００３０】
・その他の添加剤
リン脂質の他に、遺伝子等運搬媒体組成物に含有され得る添加剤としては、コレステロールなどが例示される。
【００３１】
・デンドロン脂質と遺伝子の配合割合
修飾デンドロン脂質とポリアミドアミンデンドロン脂質を遺伝子等運搬媒体とした場合、遺伝子と遺伝子等運搬媒体の配合割合は、遺伝子１重量部に対して、遺伝子等運搬媒体を１〜２０重量部、好ましくは３〜１５重量部、より好ましくは５〜７重量部使用する。また、遺伝子等運搬媒体とリン脂質の混合物を用いる場合、遺伝子と遺伝子等運搬媒体導の配合割合は、遺伝子１重量部に対し、遺伝子等運搬媒体導を１〜５０重量部、好ましくは５〜３０重量部、より好ましくは１０〜１５重量部使用する。
【００３２】
・使用する遺伝子
遺伝子としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれでもよく、特に形質転換等のイン・ビトロにおける導入用遺伝子や、イン・ビボで発現することにより作用する遺伝子、例えば、遺伝子治療用遺伝子、実験動物や家畜等の産業用動物の品種改良に用いられる遺伝子が好ましい。遺伝子治療用遺伝子としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、酵素、サイトカイン等の生理活性物質をコードする遺伝子、リポザイム、ｓｉＲＮＡなどを挙げることができる。
【００３３】
・使われる細胞
遺伝子が導入される細胞としては、ヒトなどの動物細胞、植物細胞などの真核細胞、細菌などの原核細胞が例示できる。
【００３４】
・組成物の形態
本発明の組成物の形態としては、修飾デンドロン脂質のみが存在していてもよく、ポリアミドアミンデンドロン脂質とリン脂質のどちらか若しくは両方をさらに混合物として使用していてもよく、修飾デンドロン脂質とポリアミドアミンデンドロン脂質とリン脂質が組み合わさって脂質膜構造体を形成していてもよい。この脂質膜構造体の存在形態およびその製造方法は特に限定されるべきものではないが、例えば、存在形態としては、乾燥した脂質混合物形態、水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態等を挙げることができる。
【００３５】
・乾燥した混合物
乾燥した脂質混合物は、例えば、使用する脂質成分をいったんクロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、次いでエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことで製造することができる。
【００３６】
・分散した形態
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態としては、一枚膜リポゾーム、多重層リポソーム、O/W型エマルション。Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定型の層状構造物などを挙げることができる。分散した状態の脂質膜構造体の大きさは、特に限定されるべきものではないが、例えば、リポソームやエマルションの場合には、粒子系が５０ｎｍから数μｍであり、球状ミセルの場合、粒子系が５ｎｍから５０ｎｍである。ひも状ミセルや不定型の層状構造物の場合は、その１層あたりの厚みが５ｎｍから１０ｎｍでこれらが層を形成していると考えればよい。
【００３７】
・溶媒
水系溶媒（分散媒）の組成も特に限定されるべきものではないが、水のほかに、グルコース、乳糖、ショ糖などの糖水溶液、グリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコール水溶液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。この水系溶媒に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集などの物理的安定性の面から、水系溶媒中の電解質を極力なくすことが重要である。
【００３８】
また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒中の電解質を極力なくすことが重要である。また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０から８．０）に設定したり、窒素バブリングにより溶存酸素を除去することが重要である。さらに凍結乾燥保存や噴霧乾燥保存をする場合には、糖水溶液を、凍結保存する場合には、糖水溶液や多価アルコール水溶液をそれぞれ用いると効果的な保存が可能である。
【００３９】
・濃度
これらの水系溶媒の添加物の濃度は特に限定されるべきものではないが、例えば、糖水溶液においては、２から２０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、５から１０％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。また、多価アルコール水溶液においては、１から５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、２から２．５％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。緩衝液においては、緩衝剤の濃度が１から１５０ｍＭが好ましく、１０から５０ｍＭがさらに好ましい。
【００４０】
・脂質膜構造体の濃度
水系溶媒中の脂質膜構造体の濃度は、特に限定されるべきものではないが、本発明においては脂質膜構造体として用いるリン脂質の総量の濃度は、０．００１ｍＭから１００ｍＭが好ましく、０．０１ｍＭから２０ｍＭがさらに好ましい。
【００４１】
・脂質膜構造体の水に分散したときの形態
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態は、上記の乾燥した脂質混合物を水系溶媒に添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られた方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することもでき、特に限定されるべきものではない。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルター等を用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。
【００４２】
・水系溶媒に分散した脂質膜構造体をさらに乾燥させる
また、上記の水系溶媒に分散した脂質膜構造体をさらに乾燥させる方法としては、通常の凍結乾燥や噴霧乾燥を挙げることができる。このときの水系溶媒としては、上記したように、糖水溶液、好ましくはショ糖水溶液、乳糖水溶液を用いるとよい。ここで、水系溶媒に分散した脂質膜構造体をいったん製造した上でさらに乾燥すると、脂質膜構造体の長期保存が可能となるほか、この乾燥した脂質膜構造体に遺伝子水溶液を添加すると、効率よく脂質混合物が水和されるために遺伝子自身も効率よく、脂質膜構造体に保持されることができるといったメリットがある。
【００４３】
・その他
本発明の遺伝子等運搬媒体組成物は、遺伝子だけでなく、親水性の大きい薬物、高分子量の生理活性ペプチド類、蛋白質などの細胞内に導入されにくい薬物、生理活性物質、生理活性ペプチド、蛋白質などにも適用できる。本発明の組成物を用いれば、イン・ビトロ及びイン・ビボのいずれにおいても細胞内に遺伝子等を効率良く導入、送達することができる。
【００４４】
イン・ビトロでの遺伝子等導入は、標的とする細胞を含む懸濁液に本発明の遺伝子等運搬媒体組成物を添加したり、本発明の遺伝子等運搬媒体組成物を含有する培地で標的とする細胞を培養するなどの手段により、行うことができる。
【００４５】
イン・ビボでの遺伝子等の導入は、本発明の含有組成物を宿主に投与すればよい。宿主への投与手段としては、経口投与でもよく、非経口投与でもよいが、非経口投与が好ましい。剤形としては、通常知られたものでよく、経口投与の剤形としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などを上げることができる。
【００４６】
また、非経口投与の剤形としては、例えば注射剤、点眼剤、軟膏剤、坐剤等を挙げることができる。中でも注射剤が好ましく、投与方法としては、静脈注射、標的とする細胞や臓器に対しての局所注射が好ましい。
【実施例】
【００４７】
実施例１
本実施例では、ＤＬ−Ｇ３にラクトビオン酸を結合させることで、ＤＬ−Ｇ３の末端をガラクトースで修飾する。
【００４８】
１．ＤＬ−Ｇ３の合成
本実施例に用いるＤＬ−Ｇ３は以下の手順で作成する。なお反応式は化１を参照のこと。
１−１．ＤＬ−Ｇ―０．５の合成
蒸留したアクリル酸メチル（１４ｍｌ、０．１５６ｍｏｌ）にジーｎ−ドデシルアミン（２．００ｇ、５．６６ｍｍｏｌ）を溶かし、窒素雰囲気において８０℃で１８時間還流した。その後、未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル（展開溶媒は、石油エーテル：ジエチルエーテル＝２：１）で精製した。基本となるデンドロン脂質のＲ１Ｒ２がジドデシルタイプのデンドロン脂質であるので、「−２Ｃ１２」と付記する
【００４９】
１−２．ＤＬ−Ｇ０−２Ｃ１２の合成
ＤＬ−Ｇ−０．５−２Ｃ１２（２．１６２ｇ、４．９２ｍｍｏｌ）をメタノール（５０ｍｌ、１．２３ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（０．０４８ｇ、０．９７９ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（１００ｍｌ、１．５０ｍｏｌ）に徐徐（以下「徐々」と記す。）に加え、窒素雰囲気において４５℃で５０時間攪拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄａｘ  ＬＨ−２０カラム（溶離液としてメタノール）によって精製した。
【００５０】
１−３．ＤＬ−Ｇ０．５−２Ｃ１２の合成
ＤＬ−Ｇ０−２Ｃ１２（２．２５６ｇ。４．８２ｍｍｏｌ）をメタノール（１７．５ｍｌ、０．４３１ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル（４３．５ｍｌ。０．４３１ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において３５℃で５０時間攪拌した。その後メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル（展開溶液として石油エーテル：ジエチルエーテル＝２：１  のち  ジクロロメタン：メタノール＝９：１）で精製した。
【００５１】
１―４．ＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１２の合成
ＤＬ−Ｇ０．５−２Ｃ１２（０．７１４ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）をメタノール（２０．５ｍｌ、０．５０５ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（０．０１１ｇ、０．２２４ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（３７．５ｍｌ、０．５６２ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において４５℃で５０時間攪拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄａｘ  ＬＨ−２０カラム（溶離液としてメタノール）によって精製した。
【００５２】
１―５．ＤＬ−Ｇ１．５−２Ｃ１２の合成
ＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１２（１．５３９ｇ。２．２１ｍｍｏｌ）をメタノール（８６．５ｍｌ、２．１３ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル（１５２ｍｌ。１．６９ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において３５℃で５０時間攪拌した。その後メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル（展開溶液としてジクロロメタン：メタノール＝９：１）で精製した。
【００５３】
１−６．ＤＬ−Ｇ２−２Ｃ１２の合成
ＤＬ−Ｇ１．５−２Ｃ１２（１．７０３ｇ、１．６４ｍｍｏｌ）をメタノール（４６ｍｌ、１．１３ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（０．０３２ｇ、０．６５５ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（１３４ｍｌ、２．００ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において４５℃で５０時間攪拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄａｘ  ＬＨ−２０カラム（溶離液としてメタノール）によって精製した。
【００５４】
１−７．ＤＬ−Ｇ２．５−２Ｃ１２の合成
ＤＬ−Ｇ２−２Ｃ１２（１．７１３ｇ。１．４９ｍｍｏｌ）をメタノール（１２０ｍｌ、２．９６ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル（１００ｍｌ。１．１２ｍｏｌ）に徐々に加え、３０℃で２５時間攪拌した。その後メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル（展開溶液としてジクロロメタン：メタノール＝８５：１５）で精製した。
【００５５】
１−８．ＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１２の合成
ＤＬ−Ｇ２．５−２Ｃ１２（０．１１５ｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）をメタノール（２．５３ｍｌ、０．６２５ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（０．００１２ｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（５．００ｍｌ、０．０７５ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において４５℃で５０時間攪拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄａｘ  ＬＨ−２０カラム（溶離液としてメタノール）によって精製した。以上の工程を繰り返して所定量のＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１２を得た。
【００５６】
２．DL-G3−２Ｃ１２とラクトビオン酸とからGal-DL-G3-2C12の合成
Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（０．２４ｇ、２．０９ｍｍｏｌ）とジシクロヘキシカルボジイミド（ＤＣＣ）０．４７ｇ（２．２６ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド（ＤＦＭ）５ｍｌに溶かしたＬａｃｔｏｂｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ラクトビオン酸（０．６２ｇ、１．７３ｍｍｏｌ）に加え、氷冷下で５時間攪拌しＡ液とした。
ＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１２（０．２８ｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．３６２ｍｌ、２．６１ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）５ｍｌに溶かし、これをＡ液に加えて室温で７日間攪拌した。その後反応液をろ過し、ろ液をエーテルで２回再沈殿させ、沈殿物を透析（Ｍｗ  ｃｕｔｏｆｆ  １０００）により精製した（３日間）。
以下に反応式を示す。
【００５７】
【化３】
2007137805.tif 000004
【００５８】
図１および図２には、採取物のＮＭＲ分析結果を示す。図１は、（Ａ）ラクトビオン酸、（Ｂ）ＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１２単体、（Ｃ）上記採取物のプロトンＮＭＲ（以下「1ＨＮＭＲ」と記す。）の結果を示す。またそれぞれのピーク位置を示す構造も記した。ＮＭＲのチャート上のアラビア数字は、構造式の水素番号と対応している。周波数は４００ＭＨｚである。
【００５９】
図１を参照して、領域IIの部分を（Ｂ）ＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１２単体と（Ｃ）上記採取物
で比較するとアミノ基に結合している６番目の水素が低磁場側へシフトしているのがわかる。この領域IIの部分の積分値を（Ｂ）と（Ｃ）で比較すると、（Ｃ）の方が減少してい
た。この減少分は６番目の水素のシフトを考慮した全末端が置換された場合の理論値と非常によい一致を見た。この結果から、デンドロン脂質の全末端のプロトンが糖で修飾されたことがわかる。
【００６０】
図２は同じ採取物の13ＣのＮＭＲ（以下「13ＣＮＭＲ」と記す。）の結果を示す。（Ａ）、(Ｂ)、(Ｃ)と構造およびチャート上のアラビア数字については図１と同じである。図２ではさらに２２番および２３番目のカーボン部分の拡大図も同時に示した。図２より、２２番および２３番目のカーボンが高磁場側へシフトしており、このことも全末端が糖で修飾されていることを示している。以上の結果より全末端にガラクトースを修飾したデンドロン脂質を合成したと確認した。
【００６１】
なお図１および図２のデータを示す。括弧中の番号はそれぞれの図に示した構造の番号に対応する。
1HNMR (DMSO): δ 0.85 (1), δ 1.23 and 1.42 (alkyl protons), δ 2.20-2.67 (dendron protons), δ 3.11-5.20 (2-6 and protons of galactosyl residue), δ 7.81 and 7.92 (protons of dendron amide and lactobionamide);
13CNMR (DMSO): δ 14.0 (1), δ 22.1, 26.5, 28.8, 29.0, 29.1 and 31.3 (2), δ 33.1 (5, 10, 15 and 20), δ 36.4 and 36.9 (7, 12 and 17), δ 38.3 and 38.4 (22 and 23), δ 49.5 (4, 9, 14 and 19), δ 52.2 and 52.6 (8, 13 and 18), δ 60.7 (35), δ 62.3 (29), δ 68.3-75.7 (25, 26, 28, 31-34), δ 104.6 (30), δ 171.4, 171.7 and 172.7 (6, 11, 16, 21 and 24).
【００６２】
３．リポプレックスの調製
上記のＧａｌ−ＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１２のＤＭＦ溶液からロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して、一晩真空乾燥した。その後、この薄膜にＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１２のクロロホルム溶液（６６．６μｌ）とＤＯＰＥのクロロホルム溶液（２４０μｌ）を加え、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して、脂質薄膜を形成させた。これにＰＢＳ（０．５ｍｌ）を加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を２分間照射し、脂質分散液を調製した。この分散液を数種々の脂質濃度に調製し、次に、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液のプラスミドＤＮＡ溶液（１μｇ／５０μｌ）をこれらの脂質分散液に加えて混合し、室温で３０分インキュベートして種々のＮ／Ｐ比のＧａｌ−ＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１２リポプレックスを調整した。なお、ここでＮ／Ｐ比は、ＤＮＡと脂質膜との比率である。
【００６３】
４．遺伝子導入
ヒト肝ガン由来のＨｅｐＧ２細胞を２４穴ディッシュ１穴当たり５．０ｘ１０4個になるように撒き、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ（ダルコット改変イーグル培地）０．５ｍｌ中、３７℃で２日間培養した。
その後、０．３６ｍＭＣａＣｌ2と０．４２ｍＭＭｇＣｌ2を含むＰＢＳ（ＰＢＳ（＋））で２回洗浄した後、ＦＣＳ非含有ＤＭＥＭ１ｍｌを加え、１穴当たり１μｇのプラスミドＤＮＡを含むリポプレックスを細胞に加えたのち４時間インキュベーションした。その後ＰＢＳ（＋）で３回洗浄して細胞に取り込まれていないリポプレックスを除去し、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ１ｍｌを加えた。４０時間培養後、ルシフェラーゼアッセイにて遺伝子導入活性を評価した。
【００６４】
５．ルシフェラーゼアッセイによる遺伝子導入の評価
遺伝子導入した４０時間後、ＰＢＳ（＋）で３回洗浄し、さらにＰＢＳで１回洗浄した後、細胞を１穴当たり５０μｌの細胞溶解剤に溶かし、エッペンドルフチューブに回収して１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、その上澄みを回収した。まず、発光基質液を用いて、ルシフェラーゼ活性の定量を行った。ルシフェラーゼ活性の定量は細胞溶解液２０μｌを１３．５μｇのルシフェリンを含んだ発光基質液９５μｌ、アルブミン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）５μｌと混合し、ルミノメーターＬｕｍａｔ  ＬＢ９５０７（ベルトールドジャパン）を使って２０秒間の発光量を測定した。次に細胞溶解液５μｌｘ３を用いて、細胞内のタンパク質の定量をＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて行った。定量は細胞溶解液５μｌに対してＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｒｅａｇｅｎｔを２５０μｌずつ加え、波長５９５ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定することによってタンパク質濃度を求めた。そして、細胞のタンパク質当たりのルシフェラーゼ活性を求めた。図３にその結果を示す。
【００６５】
図３は、リガンド（本実施例の場合はガラクトース）を修飾したデンドロン脂質である、Ｇａｌ−ＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１２と修飾していないデンドロン脂質であるＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１２と溶媒のＤＯＰＥの混合比をＸ／１／１０とし、Ｎ／Ｐ比（脂質膜とＤＮＡ（遺伝子）の比）毎にＸの値を変えながら、遺伝子導入活性を測定した結果である。横軸はＮ／Ｐ比を、縦軸は遺伝子導入活性を示す。
【００６６】
遺伝子導入活性は、Ｎ／Ｐ比が２の時に最大値を有した。Ｎ／Ｐ比をそれ以上にすると、未修飾のリポプレックスよりも遺伝子活性が低下した。また、Ｎ／Ｐ比を２より小さくすると、遺伝子導入活性の絶対値は低下した。
【００６７】
しかし、Ｎ／Ｐ比が２の場合は、Ｇａｌ−ＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１２を０．１含んでいる場合と含んでいない場合の比率が２：１程度であるのに対して、Ｎ／Ｐ比が１の場合は１０：１程度になっている。
すなわち、Ｇａｌ−ＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１２／ＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１２／ＤＯＰＥの混合比が０．１／１／１０の時の遺伝子導入の効率は、Ｇａｌ−ＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１２を含んでいない場合より高くなった。
【００６８】
これは、Ｎ／Ｐ比が小さくなることで、リポプレックスの静電相互作用による非特異的な取り込みが抑えられ、リガンドの存在による細胞吸着の効果の違いが表れたためと考えられる。すなわち、Ｎ／Ｐ比が１という静電相互作用のない状態では、リガンドのついていないリポプレックスの細胞吸着力は低く、一方リガンドのついているデンドロン脂質を含むリポプレックスは細胞に特異的に吸着することができる。
【００６９】
なおここでは、リポプレックスを調製し遺伝子を細胞に導入することについて実施例を示したが、リポソームを作成し、比較的小さな薬物や生理活性物質を細胞へ送達し、また細胞内に導入することもできる。例えば、具体的なリポソームの調製方法は、以下のようである。
【００７０】
卵黄レシチンのクロロホルム溶液（10mg/ml）５００μlをＧａｌ−ＤＬ−Ｇ０−２Ｃ１２のクロロホルム溶液（0.5mg/ml）１０３μlと２０６μlにそれぞれ加えた。また同じく卵黄レシチンのクロロホルム溶液（10mg/ml）５００μlをGal-DL-G3-2C12のDMF溶液（2mg/ml）２９．９μl、７５．２μl、１３７．３μlにそれぞれ加えた。これら５種類の溶液のそれぞれをロータリーエバポレーターで溶媒を除去し薄膜を形成させ、2時間真空乾燥させた。その後、63mMカルセイン水溶液 (pH7.4）500μlを加え、2分間超音波照射し、凍結融解を5回繰り返した後、エクストルーダーを用いて孔径100nmのフィルターを通すことによってリポソ―ム分散液を調製した。さらにセファロース4Bカラムに通すことによってリポソ―ムを精製した。このようにしてデンドロン脂質の異なる５種類のリポソームを実際に作成することができた。
【００７１】
実施例２
ラクトビオン酸（４ｇ、１．１８Ｘ１０-2ｍｏｌ）をメタノールに溶解し、５０℃にてメタノールの減圧留去を４回繰り返し、ラクトビオンラクトンを得た。これをＤＭＳＯ５ｍｌに溶解し、４ｍｌのＤＭＳＯに溶解したＤＬ−Ｇ０−２Ｃ１２（０．４５ｇ、９．５３Ｘ１０-4ｍｏｌ）に滴下して加え、４０℃で１０時間反応させた。その後、透析（Ｍｗ  ｃｕｔｏｆｆ２０００）を２日間行い精製した。さらに、ＬＨ−２０により精製した。次にシリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水＝６０／３５／５）による精製を行った。そして、透析（Ｍｗ  ｃｕｔｏｆｆ２０００）を２日間行い、再度ＬＨ−２０により精製することによりＧａｌ−ＤＬ−Ｇ０−２Ｃ１２を得た。以下に反応式を示す。
【００７２】
【化４】
2007137805.tif 000005
【００７３】
図４には、上記で得たＧａｌ−ＤＬ−Ｇ０−２Ｃ１２の1ＨＮＭＲの結果と構造を示す。Ｇａｌ−ＤＬ−Ｇ０−２Ｃ１２とＤＬ−Ｇ０−２Ｃ１２のピークの違い、特に４．２〜４．６ｐｐｍ付近のシグナルの有無からガラクトース修飾ができており、積分値を理論値と比較することで、ほぼ１００％のＤＬ−Ｇ０が修飾されたことがわかる。図５は、同じく13ＣＮＭＲの結果であるが、やはり７と８のシグナルの変化より、糖での修飾がされていることを示している。このようにして作成したデンドロン脂質も実施例１のデンドロン脂質の代わりに利用することができる。図４および図５のデータを示す。括弧中の番号はそれぞれの図に示した構造の番号に対応する。
【００７４】
1HNMR (CD3OD): δ 0.90 (1), δ 1.30 (2), δ 1.49 (3), δ 2.37 (6), δ 2.49 (4), δ 2.81 (5), δ 3.30-3.94 (7-19);
13CNMR (CD3OD): δ 14.5 (1), δ 23.8, 27.4, 28.6, 30.5, 30.7, 30.8, 31.0 and 33.1 (2), δ 33.7 (5), δ 39.6 and 39.9 (7 and 8), δ 51.0 (4), δ 54.6 (3), δ 62.7 (20), δ 63.8 (14), δ 70.4-77.2 (10, 11, 13, 16-19), δ 83.3 (12), δ 105.7 (15), δ 175.2 (6), δ 175.5 (9).
【００７５】
なお、実施例１および２ではラクトビオン酸を用いて修飾デンドロンの末端がガラクトース残基で修飾されるようにしたが、五員環構造若しくは六員環構造を持つ糖類であれば、ラクトビオン酸以外でも容易に置き換えることができる。
【００７６】
実施例３
１．DL-G2-2C18とM-PEG５５０からPEG５５０−DL-G2-2C18を合成する。
リポプレックスのｉｎ  ｖｉｖｏにおける使用には、血清タンパク質との相互作用が重要な問題である。これは、正に帯電したリポプレックスと負に帯電した血清タンパク質の静電相互作用が原因である。このことによってリポプレックスが崩壊したり、凝集が起こる。発明者がすでに開示したDL-G3-DOPE（特開２００４−１５９５０４号）は、血清中での遺伝子導入が可能である。
【００７７】
しかし、その粒径は約８００ｎｍとｉｎ  vivoで使用するには若干大きく、表面は正電荷で覆われている。そこで、ポリエチレングリコール（PEG）を結合させた脂質をリポプレックスに導入することによって、リポプレックスを安定化させた。このPEG脂質は主にPEの末端にPEGを結合させたPEG結合デンドロン脂質を合成することで得る。これにより、リポプレックスの安定化およびさらなる血清耐性の向上が期待できる。
【００７８】
実施例１および２では、ジドデシルジアミンを用いてデンドロン脂質のアルキル鎖の部分は炭素１２個のジドデシルタイプのデンドロン脂質を用いたが、ここでは炭素が１８個のジオクタデシルタイプのデンドロン脂質を用いる。以後このタイプのデンドロン脂質に「−２Ｃ１８」をつけて呼ぶ。
【００７９】
本実施例に用いるＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１８は以下の手順で作成する。なお反応式は実施例１，２と同じく化１に従う。
１−１．ＤＬ−Ｇ―０．５−２Ｃ１８の合成
蒸留したアクリル酸メチル（３５ｍｌ、０．３９ｍｏｌ）にジオクタデシルアミン（２．００ｇ、３．８ｍｍｏｌ）を溶かし、窒素雰囲気において８０℃で１８時間還流した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル（展開溶媒は、石油エーテル：ジエチルエーテル＝２：１）で精製した。
【００８０】
１−２．ＤＬ−Ｇ０−２Ｃ１８の合成
ＤＬ−Ｇ−０．５（２．０ｇ、３．４ｍｍｏｌ）をメタノール（４０ｍｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（３３ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（７０ｍｌ、１．０５ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において５０℃で７日間攪拌した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカ（展開溶媒：クロロホルム／メタノール／水＝６０／３５／５）により精製した。
【００８１】
１−３．ＤＬ−Ｇ０．５−２Ｃ１８の合成
ＤＬ−Ｇ０（１．２ｇ、１．９ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍｌ）に溶かした。この溶液を、アクリル酸メチル（３４ｍｌ、０．３８ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において３５℃で５０時間攪拌した。その後メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル（展開溶液として石油エーテル：ジエチルエーテル＝２：１  のち  ジクロロメタン：メタノール＝９：１）で精製した。
【００８２】
１―４．ＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８の合成
ＤＬ−Ｇ０．５（１．５ｇ、１．８ｍｍｏｌ）をメタノール（５０ｍｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（１８ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（６５ｍｌ、０．９２ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において４５℃で６０時間攪拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄａｘ  ＬＨ−２０カラム（溶離液としてクロロホルム）によって精製した。
【００８３】
１―５．ＤＬ−Ｇ１．５−２Ｃ１８の合成
ＤＬ−Ｇ１（１．３ｇ、１．５ｍｍｏｌ）をメタノール（６０ｍｌ）に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル（１１０ｍｌ、１．２３ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において３５℃で５２時間攪拌した。その後メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル（展開溶液としてクロロホルム、後にクロロホルム：メタノール＝９：１）で精製した。
【００８４】
１−６．ＤＬ−Ｇ２−２Ｃ１８の合成
ＤＬ−Ｇ１．５（１．３ｇ、１．１ｍｍｏｌ）をメタノール（３０ｍｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（２１ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（９５ｍｌ、１．４２ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において４５℃で５０時間攪拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄａｘ  ＬＨ−２０カラム（溶離液としてメタノール）によって精製した。
【００８５】
１−７．ＤＬ−Ｇ２．５−２Ｃ１８の合成
ＤＬ−Ｇ２（０．９４ｇ、０．７１ｍｍｏｌ）をメタノール（６０ｍｌ）に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル（５５ｍｌ、０．６１ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気中、３０℃で５０時間攪拌した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル（展開溶液としてクロロホルム：メタノール＝９５：５のち、クロロホルム：メタノール＝８０：２０）で精製した。
【００８６】
１−８．ＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１８の合成
ＤＬ−Ｇ２．５（０．９２ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）をメタノール（４０ｍｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（８．９ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（６０ｍｌ、０．９ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において４５℃で５５時間攪拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄａｘ  ＬＨ−２０カラム（溶離液としてメタノール）によって精製した。以上の工程を繰り返して所定量のＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１８を得た。
【００８７】
Ｍ−ＰＥＧ550４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＮＰＣ）の合成
ポリエチレングリコール（平均分子量５５０）の一方の末端をメチル基と置換したＭ−ＰＥＧ550を用意する。M-PEG550を０．５ｇ（０．９１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン０．２５２ｍｌ（１．８２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフタン（ＴＨＦ）１０ｍｌに溶解し、これにニトロフェニルクロロホルメイト（４−ｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｙｌｃｈｒｏｌｏｆｏｒｍａｔｅ）０．３６７ｇ（１．８２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１５ｍｌ）を氷冷下で加え２時間攪拌した。その後、室温で２２時間攪拌した。得られた反応液をろ過し、ろ液を減圧留去後、ＬＨ−２０（溶離液：メタノール）により精製した。これにより得た物質をＭ−ＰＥＧ550−ＮＰＣと記す。以下に反応式を示す。
【００８８】
【化５】
2007137805.tif 000006
【００８９】
Ｍ−ＰＥＧ550−ＤＬ−Ｇ２−２Ｃ１８の合成
ＤＬ−Ｇ２−２Ｃ１８（０．１ｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５ｍｌ）に溶解し、これにＭ−ＰＥＧ550−ＮＰＣ（０．４５ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液（７ｍｌ）を加え、室温で５日間攪拌した。その後、２４時間透析（Ｍｗ  Ｃｕｔｏｆｆ  １０００）を行い、凍結乾燥したのち、ＬＨ−２０（溶離液：メタノール）により精製した。
【００９０】
図６および図７に1ＨＮＭＲと13ＣＮＭＲの結果を示す。図６にはＮＭＲのチャートと構造式を示し、図７には、構造式とＰＥＧで修飾する前（Ａ）と修飾後（Ｂ）のチャートを示す。また図７では、３０から５０ｐｐｍまでの拡大図も記載した。拡大図では図面上が（Ａ）に対応し、図面下が（Ｂ）に対応する。図６および図７のデータを示す。括弧中の番号はそれぞれの図に示した構造の番号に対応する。
【００９１】
1HNMR (CDCl3): δ 0.88 (1), δ 1.25 (2) and 1.53 (3), δ 2.35 (4, 6, 11 and 16), δ 2.53 (9 and 14), δ 2.72 (5, 10 and 15), δ 3.28 and 3.33 (8, 13, 18 and 19), δ 3.38 (23), δ 3.64 (22), δ 4.18 (21), δ 6.19 (20), δ 7.66 (7, 12 and 17);
13C NMR (CDCl3): δ 14.1 (1), δ 22.7, 27.3, 29.3, 29.4, 29.6, 29.7 and 31.9 (2 and 3), δ 34.1 (6, 11 and 16), δ 37.5 and 37.7 (8 and 13), δ 39.5 (19), δ 40.8 (18), δ 50.1 and 50.4 (9, 10, 14 and 15), δ 52.6 and 52.9 (4 and 5), δ 59.0 (23), δ 61.6, 63.8, 69.6, 70.4, 70.5, 70.8 and 71.9 (21 and 22), δ 156.9 (20), δ 172.7 and 173.3 (7, 12 and 17).
【００９２】
図６の1ＨＮＭＲより、ジオクタデシル基末端のメチルに由来する０．８８ｐｐｍのピークの積分値を基準として、３．４ｐｐｍＰＥＧ末端（２３）のＯＣＨ3の積分値が理論値とほぼ一致したこと、さらに図７の13ＣＮＭＲより、デンドロン末端のメチレンプロトン１８，１９が高磁場シフトしたことから、ＤＬ−Ｇ２の全末端にＰＥＧが結合していると判断できる。また、ニンヒドリン反応が陰性であったことからも一級アミノ基は存在しないことがわかった。すなわち、ＰＥＧ550−を４本結合したＭ―ＰＥＧ−ＤＬ−Ｇ２が合成できた。
【００９３】
図８にはＭ―ＰＥＧ−ＤＬ−Ｇ２単体であるリポソームと、DNAを加えたリポプレックスにした場合での粒径とPEG含有量の関係を示す。粒径は動的光散乱によって３回測定の平均値をプロットし、測定幅を縦線でしめした。縦軸は平均粒径、横軸はＰＥＧの割合を示す。黒四角はリポプレックスを示し、白丸はリポソームを示す。リポプレックスはＮ／Ｐ比が４であり、ＤＬ−Ｇ３−２Ｃ１２とＤＯＰＥとＰＥＧ550−ＤＬ−Ｇ２−２Ｃ１８を用いたものである。またDNAはホタルのルシファーゼ遺伝子を含むｐＣＭＶＬｕｃを用いた。
【００９４】
図８より、リポソームの状態であるとPEGの含有量は、平均粒径に影響を与えないが、リポプレックスになると、ＰＥＧ含有量が１．０ｍｏｌ％以上で粒径はほぼ２００ｎｍ〜２５０ｎｍに小さくなっていることがわかる。このようにPEGで修飾したデンドロン脂質を含有させることによって、リポプレックスにしたときの凝集を抑え、安定化させることができる。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明は、遺伝子治療において治療用のＤＮＡを細胞内に送り込むベクターとして利用でき、特に末端にリガンドを付加するなどによって標的細胞に対する特異性を持たせることができるため、ＤＤＳ（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ＤＬ−Ｇ３の末端がガラクトースで修飾されたことを示す1ＨＮＭＲ分析チャートと構造を示す図。
【図２】図１の13ＣＮＭＲ分析チャートと構造を示す図。
【図３】遺伝子導入効果を示すグラフ。
【図４】ＤＬ−Ｇ０の末端がガラクトースで修飾されたことを示す1ＨＮＭＲ分析チャートと構造を示す図。
【図５】図４の13ＣＮＭＲ分析チャートと構造を示す図。
【図６】Ｍ−ＰＥＧ５５０−ＤＬ−２Ｃ１８の1ＨＮＭＲ分析チャートと構造を示す図。
【図７】図６の13ＣＮＭＲ分析チャートと構造を示す図。
【図８】デンドロン脂質のＰＥＧの修飾割合とそれを用いたリポプレックスの平均距離を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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