(57)【要約】      （修正有）【課題】毒性作用のマーカーを提供する。【解決手段】関心対象の化合物の少なくとも1つの毒性作用を決定するためのバイオマーカーとして脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ４）を提供する。好ましくは、すくなくとも１つの毒性作用は肝毒性作用である。好ましい態様において、予測された肝毒性作用は肝臓の壊死である。化合物に暴露された組織または細胞試料中のＦＡＢＰ４遺伝子の発現レベルを測定し、対照の発現レベルと比較し、毒性作用を予測する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補化合物の少なくとも1つの毒性作用を決定するためのバイオマーカーとしてのFABP4の使用。
【請求項２】
毒性作用が肝毒性作用である、請求項1記載の使用。
【請求項３】
以下の段階を含む、候補化合物の少なくとも1つの毒性作用を予測するための方法：
a)化合物に曝露された組織または細胞試料中のFABP4遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
b)遺伝子の発現レベルを、対照の組織または細胞試料中のその発現レベルと比較する段階であって、ここで遺伝子の差示的な発現が少なくとも1つの毒性作用を示唆する、段階。
【請求項４】
対照と比較して、化合物に曝露された組織または細胞試料中の、FABP4遺伝子のより高い発現が少なくとも1つの毒性作用を示唆する、請求項3記載の方法。
【請求項５】
少なくとも1つの毒性作用が肝毒性作用である、請求項3または4記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は毒性作用のマーカーとしてのFABP4に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現パターンは細胞の発達および生理を支配し、疾患および毒性傷害への応答を含む病的状態により影響される。このことを念頭に置けば、前臨床安全性実験における遺伝子およびタンパク質発現の研究が、毒物学者が哺乳動物の生理に対する化学物質の曝露の影響をより良く理解するのに役立つことは明らかである。一方では、毒物への曝露後に調節された一定数の遺伝子および/またはタンパク質の同定が、現在使用されているものに取って代わり得る、新規の予測的およびより高感度なバイオマーカーの同定につながる。特定の毒性機構に対するマーカー遺伝子に関する知識は、ヒトゲノム構造の急速に増大する理解と共に、新規のバイオマーカーの同定の基礎を成す。これらのマーカーは、毒性傾向の予測、種特異的応答の区別、ならびに応答体および非応答体集団の同定を可能にし得る。遺伝子発現分析は、所定の毒性機構に対する新規で、特異的な、かつ高感度のマーカーの検出のための極めて強力なツールである(非特許文献1)。これらのマーカーは、追加のエンドポイントを初期の動物実験に包含させることから、開発中の化合物の潜在的な毒性の同定に必要な時間、費用、および動物の数を最小化する。
【０００３】
【非特許文献１】Fielden, M. R., and Zacharewski, T. R.(2001). Challenges and limitations of gene expression profiling in mechanistic and predictive toxicology. Toxicol Sci 60, 6-10
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は毒性作用のマーカーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、マウスにおいて予期せぬ毒性を示す、PPARα/γコアゴニストに基づく。主要な標的臓器は肝臓で、用量依存的な凝固壊死を示した。同様に、この化合物は心臓および骨格筋、ならびに褐色脂肪組織の変性をもたらした。肝臓における遺伝子発現分析から、対照では検出されなかった脂肪酸結合タンパク質4の強力な誘導を含む、脂肪分解への影響が明らかとなった。
【０００６】
脂肪酸結合タンパク質(FABP)は、長鎖脂肪酸および他の疎水性のリガンドに結合する、低分子の、高度に保存された、細胞質タンパク質のファミリーである。FABPの役割は、脂肪酸の取り込み、輸送、および代謝を含むと考えられている。FABP4は肝細胞では通常発現されていないが、脂肪細胞では発現され、そこで脂肪分解を増進する。
【０００７】
本発明は、候補化合物の少なくとも1つの毒性作用を決定するためのバイオマーカーとしてFABP4を提供する。好ましくは、少なくとも1つの毒性作用は肝毒性作用である。好ましい態様において、予測された肝毒性作用は肝臓の壊死である。
【０００８】
さらに、本発明は、候補化合物の少なくとも1つの毒性作用を決定するためのバイオマーカーとしてのFABP4の使用を提供する。好ましくは、毒性作用は肝毒性作用である。より好ましくは、毒性作用は肝臓の壊死である。
【０００９】
本発明は、以下の段階を含む、候補化合物の少なくとも1つの毒性作用を予測するための方法もまた提供する：
a)化合物に曝露された組織または細胞試料中のFABP4遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
b)遺伝子の発現レベルを、対照の組織または細胞試料中の該遺伝子の発現レベルと比較する段階であって、ここでこの遺伝子の差示的な発現が少なくとも1つの毒性作用を示唆する、段階。
【００１０】
好ましくは、遺伝子の差示的な発現は、発現の増加である。より好ましくは、対照試料と比較して、化合物に曝露された組織または細胞試料中の、FABP4遺伝子の発現の増加は少なくとも1つの毒性作用を示唆する。対照試料とは候補化合物に曝露されない試料である。
【００１１】
本発明(１)は、候補化合物の少なくとも1つの毒性作用を決定するためのバイオマーカーとしてのFABP4の使用である。
本発明(２)は、毒性作用が肝毒性作用である、本発明(1)の使用である。
本発明(３)は、以下の段階を含む、候補化合物の少なくとも1つの毒性作用を予測するための方法である：
a)化合物に曝露された組織または細胞試料中のFABP4遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
b)遺伝子の発現レベルを、対照の組織または細胞試料中のその発現レベルと比較する段階であって、ここで、遺伝子の差示的な発現が少なくとも1つの毒性作用を示唆する、段階。
本発明(４)は、対照と比較して、化合物に曝露された組織または細胞試料中の、FABP4遺伝子のより高い発現が少なくとも1つの毒性作用を示唆する、本発明(3)の方法である。
本発明(５)は、少なくとも1つの毒性作用が肝毒性作用である、本発明(3)または本発明(4)の方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、毒性作用のマーカーとしてのFABP4が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
「候補化合物に曝露された組織または細胞試料」という用語は、組織もしくは細胞試料、または試料が由来した動物が、候補化合物をにより処置されたことを意味する。
【００１４】
本明細書において用いられるように、「毒性作用」は、化合物の存在に起因する、生体、臓器系、各臓器、組織、細胞、または細胞内単位に対する有害作用を指す。毒性作用は、生理的もしくは物理的な症状、または細胞もしくは臓器の壊死のような攪乱であり得る。
【００１５】
本明細書において用いられるように、「候補化合物」は、その毒性について試験される任意の化合物を指す。
【００１６】
当業者はRNAまたはタンパク質レベルを測定するための種々の方法に精通している。「レベル」という用語は、個体内または個体から採取された試料中のRNAもしくはタンパク質、またはそれらの断片の、量または濃度に関連する。FAPB4 RNAまたはタンパク質の測定は、RNAもしくはタンパク質の、断片またはバリアントの測定もまた含む。
【００１７】
FABP4のRNAレベルの測定方法は、例えばノーザンブロット法、濃度測定によるバンドの定量化を含む。好ましい方法は、マイクロアレイ分析(遺伝子チップ)、ドットブロット法、または種々の定量的PCR方法論を含む。より好ましくは、マイクロアレイ分析を用いてFABP4遺伝子の発現レベルを測定する。
【００１８】
FABP4タンパク質レベルの測定方法は、例えば、沈降法(特に免疫沈降法)、電気化学発光法(電気生成化学発光法)、RIA(radioimmunoassay)、ELISA(enzyme-linked immunoabsorbent assay)、サンドイッチ酵素免疫試験、電気化学発光サンドイッチ免疫測定法(ECLIA)、解離増強ランタノイド蛍光免疫測定法(DELFIA)、シンチレーション近接検定(SPA)、濁度測定法、比濁分析法、ラテックス増強濁度測定法または比濁分析法、固相免疫試験、およびSELDI-TOF、MALDI-TOF、またはキャピラリー電気泳動-質量分析法(CEMS)のような質量分析法を含む。
【００１９】
当技術分野において公知のさらなる方法(例えば、ゲル電気泳動法、2Dゲル電気泳動法、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)、ウェスタンブロット法)を、単独で、または標識もしくは他の検出法と組み合わせて用いることができる。
【００２０】
FABP4は、ヒト、ラット、マウス、またはサルのような任意の哺乳動物において、マーカーとして用いられ得る(ヒトFABP4：SEQ. ID NO:1、ラットFABP4：SEQ. ID NO:2、マウスFABP4：SEQ. ID NO:3)。好ましくは、FABP4は、マウスまたはラットにおいてマーカーとして用いられる。
【００２１】
この文脈において、RNAの「バリアント」という用語は、該RNAに実質的に類似したヌクレオチドに関連する。「実質的に類似した」という用語は、当業者により十分理解される。具体的には、バリアントは各々の集団中で最も優勢なRNAアイソフォームのヌクレオチド配列と比較してヌクレオチド変化を示すアイソフォームまたはアレルであり得る。好ましくは、そのような実質的に類似したRNAは、最も優勢なRNAアイソフォームに、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有する。診断的手段または各々の全長RNAに対するリガンドにより依然認識される分解産物、例えば、ヌクレアーゼ分解産物もまた実質的に類似している。
【００２２】
この文脈において、タンパク質の「バリアント」という用語は、該タンパク質に実質的に類似したタンパク質またはペプチドに関連する。「実質的に類似した」という用語は、当業者により十分理解される。具体的には、バリアントは各々の集団中で最も優勢なペプチドアイソフォームのアミノ酸配列と比較してアミノ酸変化を示すアイソフォームまたはアレルであり得る。好ましくは、そのような実質的に類似したペプチドは、最も優勢なタンパク質またはペプチドアイソフォームに、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有する。診断的手段または各々の全長タンパク質またはペプチドに対するリガンドにより依然認識される分解産物、例えば、タンパク質分解産物もまた実質的に類似している。「バリアント」という用語はまたスプライスバリアントに関連することを意図される。
【００２３】
「バリアント」という用語は、グリコシル化されたタンパク質のような、翻訳後に修飾されたタンパク質にもまた関連する。「バリアント」は、試料回収後に例えば、タンパク質に、標識、特に放射性または蛍光標識を共有または非共有結合させることにより、修飾されたペプチドでもある。
【００２４】
一般的に本発明について記載したところで、以下の図を伴い、説明の目的のためだけに本明細書に含まれ、他に特に明記されない限り限定する意図のない、特定の実施例への参照により、本発明への理解がさらに深まると考える。
【実施例】
【００２５】
実施例において言及される市販されている試薬は、他に特に示されていない限り、製造者の使用説明書に従って使用された。
【００２６】
実施例1
動物および用量：
CD-1マウス(Charles River Laboratories, UK)：
・1日間の3-{1-[2-(2-クロロ-フェニル)-5-メチル-オキサゾル-4-イルメチル]-1H-インドール-5-イル}-2-エトキシ-プロピオン酸による処置；用量は0、0.2、および3mg/kgであった。
・10日間の3-{1-[2-(2-クロロ-フェニル)-5-メチル-オキサゾル-4-イルメチル]-1H-インドール-5-イル}-2-エトキシ-プロピオン酸による処置；用量は0、0.2、および3mg/kgであった。
・14日間の3-{1-[2-(2-クロロ-フェニル)-5-メチル-オキサゾル-4-イルメチル]-1H-インドール-5-イル}-2-エトキシ-プロピオン酸による処置；用量は0、0.6、および15mg/kgであった。
【００２７】
C57BL6マウス(RCC Ltd., Fullinsdorf)：
・1日間の3-{1-[2-(2-クロロ-フェニル)-5-メチル-オキサゾル-4-イルメチル]-1H-インドール-5-イル}-2-エトキシ-プロピオン酸による処置；用量は0、0.2、および3mg/kgであった。
・10日間の3-{1-[2-(2-クロロ-フェニル)-5-メチル-オキサゾル-4-イルメチル]-1H-インドール-5-イル}-2-エトキシ-プロピオン酸による処置；用量は0、0.2、および3mg/kgであった。
ウィスターラット(RCC Ltd., Fullinsdorf)：
・14日間の3-{1-[2-(2-クロロ-フェニル)-5-メチル-オキサゾル-4-イルメチル]-1H-インドール-5-イル}-2-エトキシ-プロピオン酸による処置；用量は0、0.3、および1.2mg/kgであった。
・28日間の3-{1-[2-(2-クロロ-フェニル)-5-メチル-オキサゾル-4-イルメチル]-1H-インドール-5-イル}-2-エトキシ-プロピオン酸による処置；用量は0、0.1、および2.5mg/kgであった。
【００２８】
カニクイザル(macaca fascicularis)：
・28日間の3-{1-[2-(2-クロロ-フェニル)-5-メチル-オキサゾル-4-イルメチル]-1H-インドール-5-イル}-2-エトキシ-プロピオン酸による処置；用量は0、0.015、0.09、および0.31mg/kgであった。
・16週間の3-{1-[2-(2-クロロ-フェニル)-5-メチル-オキサゾル-4-イルメチル]-1H-インドール-5-イル}-2-エトキシ-プロピオン酸による処置；用量は0、0.15、0.1、0.3、および1mg/kgであった。
【００２９】
3-{1-[2-(2-クロロ-フェニル)-5-メチル-オキサゾル-4-イルメチル]-1H-インドール-5-イル}-2-エトキシ-プロピオン酸を20%プロピレングリコール/リン酸緩衝液、pH8に溶解した。処置された動物には経口で投与された。
【００３０】
マウスのFABP4(SEQ. ID NO:3)の発現レベルをAffymetrixマイクロアレイ(MEA 230 plus、プローブセット：1417023_a_at、1424155_at、1425809_at、1451263_a_at)、またはApplied Biosystemsのアッセイオンデマンド(Assays on Demand)(アッセイID：Mm00445880_m1)を用いて測定した。ラットのFABP4(SEQ. ID NO:2)の発現レベルはAffymetrixマイクロアレイ(RG U34A、プローブセット：rc_AI169612_at)、またはApplied Biosystemsのアッセイオンデマンド(アッセイID：Rn00670361_m1)を用いて測定した。サルのFABP4の発現レベルは測定しなかった。
【００３１】
結果：
予期されたヒトの曝露量の≧約50×において、用量依存的な強度の毒性を、3-{1-[2-(2-クロロ-フェニル)-5-メチル-オキサゾル-4-イルメチル]-1H-インドール-5-イル}-2-エトキシ-プロピオン酸(PPAR α,γコアゴニスト)を用いたマウスにおいて見いだした。主要な標的臓器は肝臓で、用量依存的な凝固壊死を示した。同様に、この化合物は心臓および骨格筋、ならびに褐色脂肪組織の変性をもたらした。マウスの死亡は≧0.6mg/kg/日において見られた。
【００３２】
ラットおよびサルの組織(肝臓、心臓、骨格筋、褐色脂肪組織)においては、類似の曝露レベルでそのような毒性は観察されなかった。
【００３３】
3-{1-[2-(2-クロロ-フェニル)-5-メチル-オキサゾル-4-イルメチル]-1H-インドール-5-イル}-2-エトキシ-プロピオン酸の投与後の肝臓における遺伝子発現をラットとマウスの間で比較した。この比較から、マウスにおける、脂肪酸結合タンパク質4の強力な発現誘導が明らかとなった(図1を参照されたい)。FABP4はラットにおいては誘導されなかった。
【００３４】
ラットにおいて肝臓毒性を誘発する他の化合物(インドメタシン(実施例2を参照されたい)、リポ多糖(LPS)、四塩化炭素(CCl4))に関しては、ラットの肝臓組織においてもまたFABP4の発現誘導が見いだされた。
【００３５】
実施例2
動物および用量：
ウィスターラット(RCC Ltd., Fullinsdorf)：
・インドメタシン(1-(4-クロロベンゾイル)-5-メトキシ-2-メチル-3-インドール酢酸、Sigma I7378)による処置、経口単回投与；用量は0、2、10、および20mg/kgであった。
・7日間のインドメタシン(1-(4-クロロベンゾイル)-5-メトキシ-2-メチル-3-インドール酢酸、Sigma I7378)による処置；用量は0、2、および5mg/kg/日であった。
【００３６】
インドメタシンをコーン油に溶解した。処置された動物には経口で投与された。
【００３７】
ラットのFABP4(SEQ. ID NO:2)の発現レベルをAffymetrixマイクロアレイ(RG U34A、プローブセット：rc_AI169612_at)、またはApplied Biosystemsのアッセイオンデマンド(アッセイID：Rn00670361_m1)を用いて測定した。
【００３８】
結果：
インドメタシン処置した肝臓において、用量依存的に、軽微な病理組織学的変化(肝細胞性肥大)が観察された。試験品により処置した動物における肝細胞性グリコーゲン沈着の減少を、10もしくは20mg/kgの単回投与、または連続した7日間の5mg/kg/日の複数回投与後に観察した。これらの結果に付随して、特にインドメタシン単回投与後の10および20mg/kg用量群、ならびに反復処置後の5mg/kg/日用量群において、肝臓の変化を示唆する種々の臨床生化学的パラメーターの変化が起こった。
【００３９】
インドメタシンの投与後の肝臓における遺伝子発現をAffymetrix遺伝子アレイを用いて測定し、10または20mg/kgのインドメタシンによる単回投与処置から24時間後のラット、および連続した7日間、5mg/kg/日のインドメタシンにより処置したラットの肝臓において、脂肪酸結合タンパク質4の強力な発現誘導(表1を参照されたい)を観察した。最も高度な誘導を示した処置群(20mg/kgで24時間および5mg/kg/日で7日間)について、このFABP4 mRNAの誘導をPCRにより確認した。(表1を参照されたい)
【００４０】
【表１】
2007082546.tif 000002
表1：Affymetrixマイクロアレイ(RG U34A)またはPCR(Applied Biosystemsのアッセイオンデマンド；アッセイID：Rn00670361_m1)により測定された、単回または連続した7日間のいずれか、異なるインドメタシン用量で処置されたウィスターラットの肝臓における、ラットFABP4(SEQ. ID NO:2)の相対発現量の平均値。発現量は、溶媒のみで処置された、各々の時間適合対照動物における発現量に対して与えられる。(n.d.＝測定せず)
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】異なる用量のPPAR α/γコアゴニストの3-{1-[2-(2-クロロ-フェニル)-5-メチル-オキサゾル-4-イルメチル]-1H-インドール-5-イル}-2-エトキシ-プロピオン酸(試験された用量で動物に反復投与の後に肝臓の壊死を引き起こすことが公知である)により処置された、CD-1およびC57Bl/6マウスの肝臓における、Affymetrixマイクロアレイ(MEA 230 plus)を用いて測定された、マウスFABP4(SEQ. ID NO:3)の発現レベルの概略図を示す図である。A：初回処置から24時間後、B：初回処置から10日後(連日投与)。
【符号の説明】
【００４２】
１  対照(0mg/kg)、２  0.2mg/kg、３  3mg/kg
【図１】
2007082546.tif 000003
【配列表】
2007082546000001.app