(57)【要約】      （修正有）【課題】  個体発生に関連する新規タンパク質を提供する。【解決手段】  下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質を提供する。（ａ）ヒト肺由来の特定なアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）ヒト肺由来の特定なアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、個体発生に必須のタンパク質（ｃ）ヒト肺由来の特定なアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、前記（ａ）に示すタンパク質と親和性相互作用を示すタンパク質（ｄ）ヒト肺由来の特定なアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１と親和性相互作用を示すタンパク質【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、個体発生に必須のタンパク質
【請求項２】
下記（ａ）又は（ｃ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、前記（ａ）に示すタンパク質と親和性相互作用を示すタンパク質
【請求項３】
下記（ａ）又は（ｄ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１と親和性相互作用を示すタンパク質
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
下記（ｅ）又は（ｆ）に示すＤＮＡを含む請求項４記載の遺伝子。
（ｅ）配列番号１記載の塩基配列のうち１９〜１４５２番目の塩基配列からなるＤＮＡ又は配列番号３記載の塩基配列のうち４６〜１４７９番目の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）前記（ｅ）に示すＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項６】
請求項４又は５記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項７】
請求項６記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片。
【請求項９】
試験物質が、請求項２記載のタンパク質同士の親和性相互作用を抑制又は促進できる否かを判別し、前記親和性相互作用を抑制又は促進できる試験物質を個体発生に影響を与える物質としてスクリーニングする工程を含む、個体発生に影響を与える物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
試験物質が、請求項３記載のタンパク質とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を抑制又は促進できる否かを判別し、前記親和性相互作用を抑制又は促進できる試験物質を個体発生に影響を与える物質としてスクリーニングする工程を含む、個体発生に影響を与える物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規タンパク質及びそれをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者が本発明を完成した後、本発明のタンパク質と公知のタンパク質との比較を行ったところ、本発明のタンパク質のＣ末端３２６アミノ酸部分は、仮想タンパク質として、ＮＣＢＩのデータベースに公開されていることが判明した（PID g16553765）。また、本発明のタンパク質に含まれるモチーフであるＳＡＭドメインに関しては、非特許文献１〜３に総説されている。
【非特許文献１】Ponting, C.P., SAM: A novel motif in yeast sterile and Drosophila polyhomeotic proteins, Protein Sci., , 1995, 4, 1928-1930
【非特許文献２】Schultz, J., SAM as a protein interaction domain involved in developmental regulation, Protein Sci., 1997, 6, 249-253
【非特許文献３】Kim, C.A. and Bowie, J.U., SAM domains: Uniform structure, diversity of function, Trends Biochem. Sci., 2003, 28, 625-628
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、第一に、個体発生に関連する新規タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、及び上記タンパク質に対する抗体又はその断片を提供することを目的とする。また、本発明は、第二に、個体発生に影響を与える物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記目的を達成するために、本発明は、以下のタンパク質、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、抗体又はその断片、及びスクリーニング方法を提供する。
（１）下記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、個体発生に必須のタンパク質
（２）下記（ａ）又は（ｃ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、前記（ａ）に示すタンパク質と親和性相互作用を示すタンパク質
（３）下記（ａ）又は（ｄ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１と親和性相互作用を示すタンパク質
（４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（５）下記（ｅ）又は（ｆ）に示すＤＮＡを含む前記（４）記載の遺伝子。
（ｅ）配列番号１記載の塩基配列のうち１９〜１４５２番目の塩基配列からなるＤＮＡ又は配列番号３記載の塩基配列のうち４６〜１４７９番目の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）前記（ｅ）に示すＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（６）前記（４）又は（５）記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（７）前記（６）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（８）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片。
（９）試験物質が、前記（２）記載のタンパク質同士の親和性相互作用を抑制又は促進できる否かを判別し、前記親和性相互作用を抑制又は促進できる試験物質を個体発生に影響を与える物質としてスクリーニングする工程を含む、個体発生に影響を与える物質のスクリーニング方法。
（１０）試験物質が、前記（３）記載のタンパク質とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を抑制又は促進できる否かを判別し、前記親和性相互作用を抑制又は促進できる試験物質を個体発生に影響を与える物質としてスクリーニングする工程を含む、個体発生に影響を与える物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、個体発生に関連する新規タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、及び上記タンパク質に対する抗体又はその断片が提供される。また、本発明によれば、個体発生に影響を与える物質のスクリーニング方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のタンパク質は、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に示すタンパク質である。
（ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（以下「タンパク質（ａ）」という場合がある。）
（ｂ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、個体発生に必須のタンパク質（以下「タンパク質（ｂ）」という場合がある。）
（ｃ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、前記（ａ）に示すタンパク質と親和性相互作用を示すタンパク質（以下「タンパク質（ｃ）」という場合がある。）
（ｄ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１と親和性相互作用を示すタンパク質（以下「タンパク質（ｄ）」という場合がある。）
【０００７】
タンパク質（ａ）のうち、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、ヒト由来のタンパク質であり、配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、マウス由来のタンパク質である。
【０００８】
タンパク質（ａ）は、個体発生に必須のタンパク質である。タンパク質（ａ）は、特に胎生期における個体発生に必須であり、ヒトのゲノム中において、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がホモ欠損型になると、受精卵は正常な発生過程を経ることができず、ヒト胎児は致死に至る。また、マウスのゲノム中において、配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がホモ欠損型になると、受精卵は正常な発生過程を経ることができず、マウス胎児は致死に至る。なお、ヘテロ欠損型であれば、ヒト胎児及びマウス胎児は致死に至らない。
【０００９】
タンパク質（ａ）は、別のタンパク質（ａ）と親和性相互作用を示す。タンパク質（ａ）同士の親和性相互作用は、個体発生、特に胎生期における個体発生に関与しているものと考えられる。なお、「タンパク質（ａ）同士の親和性相互作用」は、タンパク質（ａ）同士の直接的な結合、及び他の物質を介したタンパク質（ａ）同士の間接的な結合のいずれをも意味するが、好ましくはタンパク質（ａ）同士の直接的な結合を意味する。
【００１０】
タンパク質（ａ）は、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１と親和性相互作用を示す。タンパク質（ａ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用は、個体発生、特に胎生期における個体発生に関与しているものと考えられる。なお、「タンパク質（ａ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用」は、タンパク質（ａ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との直接的な結合、及び他の物質を介したタンパク質（ａ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との間接的な結合のいずれをも意味するが、好ましくはタンパク質（ａ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との直接的な結合を意味する。
【００１１】
Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１は、アポトーシスを誘導する因子であるＢａｘの作用を阻害し、細胞死を抑制する。Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１と相互作用するタンパク質としては、例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ等が知られている。ヒト由来のＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１のアミノ酸配列を配列番号６に示し、それをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号５に示す。
【００１２】
配列番号２又は４記載のアミノ酸配列のうち、第７３アミノ酸から第１４０アミノ酸部分は、ＳＡＭ（Sterile Alpha Motif）ドメインと称されるシグナル伝達因子に特徴的なペプチドモチーフを含む。第５２アミノ酸のＳｅｒ残基は、ＭＡＰキナーゼ基質に特徴的なモチーフに含まれ、第２４７から第２５０アミノ酸までの部位（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ）は、ＳＨ３結合領域モチーフである。
【００１３】
ＳＡＭドメインは、約７０アミノ酸のペプチドドメイン構造であり、酵母からヒトに至る真核生物の遺伝子産物中に見出されており、タンパク質−タンパク質間の相互作用を仲介していると考えられている。また、一部のＳＡＭドメインでは、ＲＮＡ結合能、脂質結合能等も報告されている。ＭＡＰキナーゼは、真核生物に普遍的に存在するセリンスレオニンキナーゼであり、細胞増殖、分化、アポトーシス、形態形成等に重要な役割を果たしている。ＭＡＰキナーゼ基質は、ＭＡＰキナーゼによりリン酸化されて活性化又は不活性化するタンパク質であり、Ｅｌｋ−１、ｃ−Ｍｙｃ等の転写因子、ＲＳＫ、ＭＡＰＫＡＰＫ−２等のキナーゼ等が知られている。ＳＨ３（Ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ３）結合領域ドメインは、発がんチロシンキナーゼ遺伝子産物Ｓｒｃ中に存在する機能ドメインであるＳＨ３ドメインと結合するドメインで、共通アミノ酸配列として、Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｐｒｏ（Ｘａａ２は通常、疎水的アミノ酸）を有する。Ｓｒｃ遺伝子産物は、胎生期発生、細胞増殖に重要な役割を果たしていると考えられている。
【００１４】
タンパク質（ｂ）において、配列番号２又は４記載のアミノ酸配列に対して欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数及び位置は、個体発生に必須であるというタンパク質（ａ）の機能が保持される限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個、好ましくは１又は数個である。欠失に関する具体的な範囲は通常１〜４０個、好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個であり、置換に関する具体的な範囲は通常１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個であり、付加に関する具体的な範囲は通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。タンパク質（ｂ）のアミノ酸配列は、タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と通常７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する。
【００１５】
タンパク質（ｂ）には、タンパク質（ａ）に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質の他、欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質や、それに対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質も含まれる。欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質としては、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等）由来のタンパク質（これらの哺乳動物において多型によって生じ得るタンパク質を含む。）が挙げられる。
【００１６】
タンパク質（ｃ）において、配列番号２又は４記載のアミノ酸配列に対して欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数及び位置は、他のタンパク質（ａ）と親和性相互作用を示すというタンパク質（ａ）の機能が保持される限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個、好ましくは１又は数個である。欠失に関する具体的な範囲は通常１〜４０個、好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個であり、置換に関する具体的な範囲は通常１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個であり、付加に関する具体的な範囲は通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。タンパク質（ｃ）のアミノ酸配列は、タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と通常７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する。
【００１７】
配列番号２又は４記載のアミノ酸配列のうち、１〜６２番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列部分、又は１５９〜４７８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列部分において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されても、他のタンパク質（ａ）と親和性相互作用を示すというタンパク質（ａ）の機能が保持される。なお、１〜６２番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列部分は、ＳＡＭドメインよりもＮ末側に存在し、ＭＡＰキナーゼ基質モチーフを含み、ヒトとマウス間で比較的相違の大きい部分であり、１５９〜４７８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列部分は、ＳＡＭドメインよりもＣ末側に存在し、ＳＨ３結合領域ドメインを含み、ヒトとマウス間で比較的相同性の高い部分である。
【００１８】
タンパク質（ｃ）には、タンパク質（ａ）に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質の他、欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質や、それに対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質も含まれる。欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質としては、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等）由来のタンパク質（これらの哺乳動物において多型によって生じ得るタンパク質を含む。）が挙げられる。
【００１９】
タンパク質（ｄ）において、配列番号２又は４記載のアミノ酸配列に対して欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数及び位置は、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１と親和性相互作用を示すというタンパク質（ａ）の機能が保持される限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個、好ましくは１又は数個である。欠失に関する具体的な範囲は通常１〜４０個、好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個であり、置換に関する具体的な範囲は通常１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個であり、付加に関する具体的な範囲は通常１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。タンパク質（ｄ）のアミノ酸配列は、タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と通常７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する。
【００２０】
配列番号２又は４記載のアミノ酸配列のうち、１〜２３２番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列部分、又は２６４〜４７８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列部分において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されても、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１と親和性相互作用を示すというタンパク質（ａ）の機能が保持される。１〜２３２番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列部分は、ＳＡＭドメイン及びＭＡＰキナーゼ基質モチーフを含み、比較的親水性アミノ酸の多く含まれる部分であり、２６４〜４７８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列部分は、ＳＨ３結合領域ドメインを含み、疎水性アミノ酸の比較的多く含まれる部分である。
【００２１】
タンパク質（ｄ）には、タンパク質（ａ）に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質の他、欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質や、それに対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質も含まれる。欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質としては、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等）由来のタンパク質（これらの哺乳動物において多型によって生じ得るタンパク質を含む。）が挙げられる。
【００２２】
タンパク質（ｄ）が親和性相互作用を示すＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１の由来動物は特に限定されるものではないが、タンパク質（ｄ）が天然に存在するタンパク質である場合、タンパク質（ｄ）の由来動物とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１の由来動物とが同種であると、タンパク質（ｄ）はＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１と高い親和性相互作用を示すと考えられる。
【００２３】
タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）には、糖鎖が付加されたタンパク質及び糖鎖が付加されていないタンパク質のいずれもが含まれる。タンパク質に付加される糖鎖の種類、位置等は、タンパク質の製造の際に使用される宿主細胞の種類によって異なるが、糖鎖が付加されたタンパク質には、いずれの宿主細胞を用いて得られるタンパク質も含まれる。また、タンパク質（ａ）、（ｂ）又は（ｄ）には、その医薬的に許容される塩も含まれる。
【００２４】
タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子は、例えば、哺乳動物の脳、腎臓、肺、筋肉、胎盤、小腸、精巣、副腎、唾液腺、脾臓、胃等の組織から抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、それぞれ配列番号１又は３記載の塩基配列に基づいて合成したプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすることにより得られる。以下、ｃＤＮＡライブラリーの作製、及び目的のＤＮＡを含むクローンのスクリーニングの各工程について説明する。
【００２５】
〔ｃＤＮＡライブラリーの作製〕
ｃＤＮＡライブラリーを作製する際には、例えば、哺乳動物の脳、腎臓、肺、筋肉、胎盤、小腸、精巣、副腎、唾液腺、脾臓、胃等の組織から全ＲＮＡを得た後、オリゴｄＴ−セルロースやポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、バッチ法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。この際、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分画してもよい。次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製し、該組換えベクターを用いて大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーが得られる。ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターは、宿主細胞中で自立複製できるものであればよく、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター等を使用できる。宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等を使用できる。
【００２６】
大腸菌等の宿主細胞の形質転換は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム又は塩化ルビジウムを共存させて調製したコンピテント細胞に、組換えベクターを加える方法等により行うことができる。ベクターとしてプラスミドを用いる場合は、テトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を含有させておくことが好ましい。
【００２７】
ｃＤＮＡライブラリーの作製にあたっては、市販のキット、例えば、SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（Gibco BRL社製）、ZAP-cDNA Synthesis Kit（ストラタジーン社製）等を使用できる。
【００２８】
〔目的のＤＮＡを含むクローンのスクリーニング〕
ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングする際には、配列番号１又は３記載の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ＰＣＲ増幅断片を得る。ＰＣＲ増幅断片は、適当なプラスミドベクターを用いてサブクローニングしてもよい。ＰＣＲに使用するプライマーセットは特に限定されるものではなく、配列番号１又は３記載の塩基配列に基づいて設計できる。
【００２９】
ｃＤＮＡライブラリーに対して、ＰＣＲ増幅断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、目的のＤＮＡが得られる。プローブとしては、ＰＣＲ増幅断片をアイソトープ（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ）、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ等で標識したものを使用できる。目的のＤＮＡを含むクローンは、抗体を用いたイムノスクリーニング等の発現スクリーニングによっても得ることができる。
【００３０】
取得されたＤＮＡの塩基配列は、該ＤＮＡ断片をそのまま、又は適当な制限酵素等で切断した後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法を用いて決定できる。塩基配列解析の際には、通常、３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（Perkin Elmer社製）等の塩基配列分析装置が用いられる。
【００３１】
タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子は、オープンリーディングフレームとその３'末端に位置する終止コドンとを含む。また、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子は、オープンリーディングフレームの５'末端及び／又は３'末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことができる。
【００３２】
配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１記載の塩基配列のうち１９〜１４５２番目の塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。ここで、配列番号１記載の塩基配列のうち、オープンリーディングフレームは１９〜１４５２番目の塩基配列に位置し、翻訳開始コドンは１９〜２１番目の塩基配列に位置し、終止コドンは１４５３〜１４５５番目の塩基配列に位置する。配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、当該タンパク質をコードする限り特に限定されるものではなく、オープンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号１記載の塩基配列のうち１９〜１４５２番目の塩基配列に限定されるものではない。
【００３３】
配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号３記載の塩基配列のうち４６〜１４７９番目の塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。ここで、配列番号４記載の塩基配列のうち、オープンリーディングフレームは４６〜１４７９番目の塩基配列に位置し、翻訳開始コドンは４６〜４８番目の塩基配列に位置し、終止コドンは１４８０〜１４８２番目の塩基配列に位置する。配列番号４記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、当該タンパク質をコードする限り特に限定されるものではなく、オープンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号４記載の塩基配列のうち４６〜１４７９番目の塩基配列に限定されるものではない。
【００３４】
タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子は、その塩基配列に従って化学合成により得ることもできる。ＤＮＡの化学合成は、市販のＤＮＡ合成機、例えば、チオホスファイト法を利用したＤＮＡ合成機（島津製作所社製）、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機（パーキン・エルマー社製）を用いて行うことができる。
【００３５】
タンパク質（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１記載の塩基配列のうち１９〜１４５２番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子、又は配列番号３記載の塩基配列のうち４６〜１４７９番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。
【００３６】
「ストリンジェントな条件」としては、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件が挙げられる。
【００３７】
配列番号１記載の塩基配列のうち１９〜１４５２番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号１記載の塩基配列のうち１９〜１４５２番目の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、配列番号３記載の塩基配列のうち４６〜１４７９番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号３記載の塩基配列のうち４６〜１４７９番目の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００３８】
タンパク質（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子は、タンパク質（ａ）をコードする遺伝子に、部位特異的変異誘発法等の公知の方法を用いて人為的に変異を導入することにより得ることもできる。変異の導入は、例えば、変異導入用キット、例えば、Mutant-K（TAKARA社製）、Mutant-G（TAKARA社製）、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて行うことができる。また、塩基配列が既に決定されている遺伝子については、その塩基配列に従って化学合成することにより得ることができる。
【００３９】
タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）は、例えば、以下の工程に従って、それぞれのタンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることにより製造できる。
〔組換えベクター及び形質転換体の作製〕
組換えベクターを作製する際には、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、目的とするタンパク質のコード領域の塩基配列を、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換したＤＮＡを調製する。
【００４０】
このＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより組換えベクターを作製し、該組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することにより、目的とするタンパク質を生産し得る形質転換体が得られる。上記ＤＮＡ断片は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であり、ベクターは、プロモーターの他、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含有できる。
【００４１】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用できる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pRSET、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13、YEp24、YCp50）が挙げられ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）が挙げられ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスが挙げられる。
【００４２】
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現し得る限り、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれを使用してもよい。また、動物個体、植物個体、カイコ虫体等を使用してもよい。
【００４３】
細菌を宿主細胞とする場合、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌を宿主細胞として使用できる。具体的には、Escherichia coli BL21、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli K12、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101等の大腸菌や、Bacillus subtilis MI 114、Bacillus subtilis 207-21等の枯草菌を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、大腸菌等の細菌中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターを使用できる。また、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも使用できる。
【００４４】
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を使用できる。
【００４５】
酵母を宿主細胞とする場合、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomycescerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を使用できる。
【００４６】
酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用できる。
【００４７】
動物細胞を宿主細胞とする場合、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、動物細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTR(Long Terminal Repeat)プロモーター、CMVプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を使用できる。
【００４８】
動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を使用できる。
【００４９】
昆虫細胞を宿主とする場合には、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞、Trichoplusia niの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を宿主細胞として使用できる。Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞としてはSf9、Sf21等、Trichoplusia niの卵巣細胞としてはHigh 5、BTI-TN-5B1-4（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはBombyx mori N4等が挙げられる。
【００５０】
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入し得る限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用できる。
【００５１】
〔形質転換体の培養〕
目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを導入した形質転換体を通常の培養方法に従って培養する。形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００５２】
大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを使用してもよい。
【００５３】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を使用できる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物等を使用できる。無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用できる。
【００５４】
大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体の培養は、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は通常２５〜３７℃、培養時間は通常１６〜２４時間であり、培養期間中はｐＨを６．０〜８．０に保持する。ｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。また、培養の際、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５５】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００５６】
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、EagleのMEM培地、DMEM培地、Ham F12培地、Ham F12K培地又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用できる。形質転換体の培養は、通常５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３日間行う。また、培養の際、必要に応じてカナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５７】
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地（ファーミンジェン社製）、Sf-900 II SFM培地（Gibco BRL社製）、ExCell400、ExCell405（JRHバイオサイエンシーズ社製）等を使用できる。形質転換体の培養は、通常２０〜２８℃で２〜４日間行う。また、培養の際、必要に応じてゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５８】
目的とするタンパク質は、分泌タンパク質又は融合タンパク質として発現させることもできる。融合させるタンパク質としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（His-tag）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）等が挙げられる。
【００５９】
〔タンパク質の単離・精製〕
形質転換体の培養物より目的とするタンパク質を採取することにより、目的とするタンパク質が得られる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。
目的とするタンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、目的とするタンパク質を抽出する。目的とするタンパク質が形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養上清をそのまま使用するか、遠心分離等により培養上清から細胞又は菌体を除去する。
【００６０】
こうして得られるタンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）は、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法等により精製できる。
【００６１】
タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）は、そのアミノ酸配列に基づいて、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造できる。この際、市販のペプチド合成機を使用できる。
【００６２】
本発明の抗体又はその断片は、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に反応し得る抗体又はその断片である。ここで、「抗体」には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれ、「モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体」には全てのクラスのモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。また、「抗体」には、ウサギ、マウス等の免疫動物にタンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）を免疫して得られる抗血清、ヒト抗体、遺伝子組換えによって得られるヒト型化抗体も含まれる。また、「抗体の断片」には、Fab断片、F(ab)'2断片、単鎖抗体(scFv)等が含まれる。
【００６３】
本発明の抗体又はその断片は、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）を免疫用抗原として利用することより作製できる。免疫用抗原としては、例えば、(i) タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）を発現している細胞又は組織の破砕物又はその精製物、(ii) 遺伝子組換え技術を用いて、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）をコードする遺伝子を大腸菌、昆虫細胞又は動物細胞等の宿主に導入して発現させた組換えタンパク質、(iii) 化学合成したペプチド等を使用できる。
【００６４】
ポリクローナル抗体の作製にあたっては、免疫用抗原を用いて、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の哺乳動物を免疫する。免疫動物は、抗体を容易に作製できることからウサギを利用することが好ましい。免疫の際には、抗体産生誘導する為に、フロイント完全アジュバント等の免疫助剤を用いてエマルジョン化した後、複数回の免疫することが好ましい。免疫助剤としては、フロイント完全アジュバント(FCA)の他、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムゲル等を利用できる。哺乳動物１匹当たりの抗原の投与量は、哺乳動物の種類に応じて適宜設定できるが、ウサギの場合には通常１０〜１０００μｇである。投与部位は、例えば、静脈内、皮内、皮下、腹腔内等である。免疫の間隔は、通常、数日から数週間間隔、好ましくは５日〜３週間間隔で、合計３〜８回、好ましくは４〜６回免疫を行う。そして、最終免疫日から１０〜１４日後に、タンパク質（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に対する抗体力価を測定し、抗体力価が上昇した後に採血し、抗血清を得る。抗体力価の測定は、酵素免疫測定法(ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)等により行うことができる。
【００６５】
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用できる。
【００６６】
モノクローナル抗体の作製にあたっては、ポリクローナル抗体の場合と同様に免疫用抗原を用いて哺乳動物を免疫し、最終免疫日から３〜４日後に抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が一般的に利用される。
【００６７】
次いで、ハイブリドーマを得るために、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、ヒト、マウス等の哺乳動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を利用できる。利用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態では選択培地(例えばHAT培地)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、P3X63-Ag.8.U1（P3U1）、P3/NSI/1-Ag4-1、Sp2/0-Ag14等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００６８】
細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地等の動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを所定の割合（例えば３：１〜１．５：１）で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤の存在下で、又は電気パルス処理(例えばエレクトロポレーション)により融合反応を行う。
【００６９】
細胞融合処理後、選択培地を用いて培養し、目的とするハイブリドーマを選別する。次いで、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法 (ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)等によってスクリーニングできる。
【００７０】
ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行うことができ、最終的にモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得する。
【００７１】
取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法等を利用することができる。細胞培養法においては、例えばハイブリドーマを１０〜２０％牛胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地等の動物細胞培養培地中、通常の培養条件(例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度)で３〜１４日間培養することにより、その培養上清からモノクローナル抗体を取得することができる。また、ハイブリドーマをマウス等の腹腔内に移植し、１０〜２０日後に腹水を採取し、当該腹水からモノクローナル抗体を取得することもできる。
【００７２】
モノクローナル抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用できる。
【００７３】
モノクローナル抗体をヒトに投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体又はヒト型化抗体を使用することが好ましい。ヒト抗体又はヒト型化抗体は、例えば、免疫動物としてヒト抗体遺伝子を導入したマウス等を用いてハイブリドーマを作製することにより、また、ファージ上に抗体を提示したライブラリーを用いることにより取得できる。具体的には、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に、抗原となるタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いて目的のタンパク質に対するヒト抗体を取得できる（国際公開番号WO92-03918、WO93-2227、WO94-02602、WO96-33735及びWO96-34096参照）。また、複数の異なるヒトscFvをファージ上に提示させた抗体ライブラリーから、抗原となるタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物に結合する抗体を提示しているファージを選り分けることで、目的のタンパク質に結合するscFvを選択できる（Griffiths.等, EMBO J. 12, 725-734, 1993）。
【００７４】
本発明の第１のスクリーニング方法は、試験物質が、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の親和性相互作用を抑制又は促進できる否かを判別し、当該親和性相互作用を抑制又は促進できる試験物質を個体発生に影響を与える物質としてスクリーニングする工程を含む。
【００７５】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の親和性相互作用は、個体発生、特に胎生期における個体発生に関与していると考えられるので、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の親和性相互作用を抑制又は促進できる物質を選択することにより、個体発生、特に胎生期における個体発生に影響を与える可能性がある物質をスクリーニングできる。
【００７６】
試験物質が、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の親和性相互作用を抑制又は促進できる否かは、例えば、次のようにして判別できるが、判別方法はこれに限定されるものではない。
【００７７】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）と別のタンパク質（ａ）又は（ｃ）とを試験物質の存在下又は不存在下で接触させた後、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合量を測定し、試験物質の存在下における結合量と試験物質の不存在下における結合量とを比較する。その結果、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも少なければ、試験物質が、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合を抑制できると判別できる。一方、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも多ければ、試験物質が、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合を促進できると判別できる。
【００７８】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合を抑制又は促進できる物質は、一方のタンパク質（ａ）又は（ｃ）に作用する物質であってもよいし、両方のタンパク質（ａ）又は（ｃ）に作用する物質であってもよい。また、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合を抑制できる物質は、解離状態にあるタンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合を抑制できる物質であってもよいし、結合状態にあるタンパク質（ａ）又は（ｃ）同士を解離させることができる物質であってもよい。
【００７９】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）と別のタンパク質（ａ）又は（ｃ）とは、in vitroで接触させてもよいし、in vivoで接触させてもよい。
【００８０】
in vitroで接触させる場合、タンパク質（ａ）又は（ｃ）として、（i）目的とするタンパク質を発現している細胞又は組織から抽出した内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、当該形質転換体の培養物から抽出した組換えタンパク質、（iii）化学合成したペプチド等を使用できる。
【００８１】
in vivoで接触させる場合、タンパク質（ａ）又は（ｃ）として、（i）細胞内に存在する内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製された形質転換体内に存在する組換えタンパク質等を使用できる。
【００８２】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士を接触させる際、タンパク質（ａ）又は（ｃ）として、野生型、変異型、野生型又は変異型の誘導体、野生型又は変異型と他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質等を使用できる。
【００８３】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士を接触させる際、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合に影響を与える条件を調節し、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合が試験物質の有無に依存するようにする。
【００８４】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合に影響を与える条件としては、例えば、温度、溶媒の種類、タンパク質（ａ）又は（ｃ）の濃度、攪拌強度、共存時間、重力、磁場等が挙げられる。
【００８５】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士を接触させる際の温度は、例えば、２〜６５℃に設定できる。タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士を接触させる際の溶媒としては、例えば、ＰＢＳ、ＴＢＳ、Ｈｅｐｅｓバッファー等を使用できる。タンパク質（ａ）又は（ｃ）の濃度は、例えば１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌに設定できる。
【００８６】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合量は、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合体量、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合によって生じるシグナル量等を指標として測定できる。
【００８７】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合体量は、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｃ）に標識物質を付加しておき、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士を接触させた後、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合体を分離し、当該結合体が有する標識物質量を指標として測定できる。具体的には、ＧＳＴ ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ法等の公知の方法を利用して測定できる。
【００８８】
また、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合体量は、公知のタンパク質解析技術、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合体に反応できる抗体又はその断片を使用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、組織免疫染色法等によって測定できる。なお、「抗体」には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれ、「モノクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体」には全てのクラスのモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。また、「抗体の断片」には、Fab断片、F(ab)'2断片、単鎖抗体(scFv)等が含まれる。
【００８９】
タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合によって生じるシグナルの種類は特に限定されるものではないが、例えば、レポーター遺伝子の発現、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又は水晶振動子の振動数移動による局所密度変化の検出等が挙げられる。
【００９０】
レポーター遺伝子としては、例えば、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等が挙げられ、レポーター活性としては、例えば、βガラクトシダーゼ活性、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性、ルシフェラーゼ活性、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性等が挙げられる。
【００９１】
本発明の第２のスクリーニング方法は、試験物質が、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を抑制又は促進できる否かを判別し、当該親和性相互作用を抑制又は促進できる試験物質を個体発生に影響を与える物質としてスクリーニングする工程を含む。
【００９２】
タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用は、個体発生、特に胎生期における個体発生に関与していると考えられるので、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を抑制又は促進できる物質を選択することにより、個体発生、特に胎生期における個体発生に影響を与える可能性がある物質をスクリーニングできる。
【００９３】
試験物質が、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を抑制又は促進できる否かは、例えば、次のようにして判別できるが、判別方法はこれに限定されるものではない。
【００９４】
タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１とを試験物質の存在下又は不存在下で接触させた後、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との結合量を測定し、試験物質の存在下における結合量と試験物質の不存在下における結合量とを比較する。その結果、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも少なければ、試験物質が、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を抑制できると判別できる。一方、試験物質の存在下における結合量が試験物質の不存在下における結合量よりも多ければ、試験物質が、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を促進できると判別できる。
【００９５】
タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を抑制又は促進できる物質は、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１のうちの一方に作用する物質であってもよいし、両方に作用する物質であってもよい。また、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との親和性相互作用を抑制できる物質は、解離状態にあるタンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との結合を抑制できる物質であってもよいし、結合状態にあるタンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１とを解離させることができる物質であってもよい。
【００９６】
タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１とは、in vitroで接触させてもよいし、in vivoで接触させてもよい。
【００９７】
in vitroで接触させる場合、タンパク質（ａ）又は（ｄ）として、（i）目的とするタンパク質を発現している細胞又は組織から抽出した内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、当該形質転換体の培養物から抽出した組換えタンパク質、（iii）化学合成したペプチド等を使用できる。Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１についても同様である。
【００９８】
in vivoで接触させる場合、タンパク質（ａ）又は（ｄ）として、（i）細胞内に存在する内因性タンパク質、（ii）目的とするタンパク質を発現できる組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製された形質転換体内に存在する組換えタンパク質等を使用できる。Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１についても同様である。
【００９９】
タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１とを接触させる際、タンパク質（ａ）又は（ｄ）として、野生型、変異型、野生型又は変異型の誘導体、野生型又は変異型と他のタンパク質又はペプチドとの融合タンパク質等を使用できる。Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１についても同様である。
【０１００】
タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１とを接触させる際、両者の結合に影響を与える条件を調節し、両者の結合が試験物質の有無に依存するようにする。両者の結合に影響を与える条件としては、例えば、温度、溶媒の種類、タンパク質（ａ）又は（ｄ）の濃度、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１の濃度、攪拌強度、共存時間、重力、磁場等が挙げられる。
【０１０１】
温度は、例えば、２〜６５℃に設定できる。溶媒としては、例えば、ＰＢＳ、ＴＢＳ、Ｈｅｐｅｓバッファー等を使用できる。タンパク質（ａ）又は（ｄ）の濃度は、例えば、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌに設定できる。Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１の濃度は、例えば、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌに設定できる。
【０１０２】
タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との結合量は、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｃ）同士の結合量と同様に、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との結合体量、タンパク質（ａ）又は（ｄ）とＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１との結合によって生じるシグナル量等を指標として測定できる。
【実施例】
【０１０３】
〔実施例１〕ヒト遺伝子１及びマウス遺伝子１の単離及び同定
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりヒト肺由来ｃＤＮＡの中からヒト遺伝子１を単離した。ＰＣＲは、変性工程、プライマーのアニーリング工程及びＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程からなるＤＮＡ増幅サイクルを繰り返して行う反応であり、例えば、Saiki等，Science，第230巻，第1350頁（1985年）、Williams等，Nucleic Acid Research，第18巻，第22号，第6531頁〜第6535頁（1991年）等に記載されている常法に従って行った。
【０１０４】
具体的には、5'-aagcagttccggttcggctccgagcagctgccg-3'を５'プライマーとして用い、5'-ggcatctaagacacctagggggaacgc-3'を３'プライマーとして用い、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Expand Long Template PCR System, Roche社製）５ユニット、２００μＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ）、ヒト肺組織由来ｃＤＮＡ ０．５ｎｇ、及び１．７５ｍＭ 塩化マグネシウムを含有する増幅用バッファー中で、９４℃で１０分間処理の後、９４℃で３０秒、６２℃で４５秒、６８℃で５分の処理を３５サイクル繰り返し、さらに６８℃１０分の処理を行った。
【０１０５】
プライマーは次のように設計した。ショウジョウバエにおいて、発生分化に関わるレセプター（エクダイソンレセプター）と相互作用するタンパク質（ＧＨ２４６２７ｐ）をコードするＤＮＡ配列に基づいて、その相同ｃＤＮＡをヒトＥＳＴから検索し、このｃＤＮＡ配列に基づいて、ヒト精巣由来ｃＤＮＡを鋳型として５'−ＲＡＣＥを行い、得られた配列に基づいて５'プライマーを設計した。３'プライマーは、ヒトゲノム配列から想定して設計した。
【０１０６】
反応終了後、反応液を、１％アガロースゲル（ＴＢＥバッファー）を用いた電気泳動に供した後、ゲルをエチジウムブロマイド染色し、トランスイルミネーターにより観察することにより、増幅されたＤＮＡ断片を検出した。さらにこのＤＮＡ断片を、QUIAquick Gel Extraction Kit（QUIAGEN社製）を用いてアガロースゲルから回収し、ｐＧＥＭＴＥ等のクローニング用ベクタープラスミドのマルチクローニングサイトに挿入した後、大腸菌を宿主として増幅し、配列を決定した。クローニング用ベクターのクローニングサイトへの挿入は、ＴＡクローニングにより行った。すなわち、ＥｃｏＲＶ消化により平滑末端化したベクターの３’末端にＴ（チミジン）を付加し、３’末端にＡ（アデニン）が付加されたＰＣＲ産物をライゲートした。これを電気穿孔法により、大腸菌内に遺伝子導入し、ポジティブクローンを選抜した後、ＬＢ液体培地中、３７℃で１６〜２０時間攪拌培養した。培養後の大腸菌を、遠心により回収し、ＱＩＡＧＥＮミニプレップキット（キアゲン社製）を用いてプラスミドの精製を行った。挿入配列の決定は、Dye Terminator法により、蛍光シークエンサーを用いて行った。
【０１０７】
さらにヒト遺伝子１を基にマウスｃＤＮＡからマウス遺伝子１を単離した。ヒト遺伝子１の部分ｃＤＮＡと相同性を示すマウスｃＤＮＡを公開データベースから探索し、この配列を基に５'-ＲＡＣＥプライマー(5'-cttcggtcatggagaaggcccacgggatcct-3')を設計し、マウス精子由来ｃＤＮＡを鋳型として５'-ＲＡＣＥを行い、得られた配列より５'プライマー(5'-ccaaaggggccggagcgatgcccgctggtagccg-3')を設計した。５'プライマー及び３'プライマー(5'-ctcattacagagagagagtcttcatcc-3')各１５ｐｍｏｌｅ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Expand Long Template PCR System, Roche社製）５ユニット、２００μＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ）、マウス精子由来ｃＤＮＡ ０．５ｎｇ及び１．７５ｍＭ 塩化マグネシウムを含有する増幅用バッファー中、９４℃で１０分間処理の後、９４℃で３０秒、６２℃で４５秒、６８℃で５分の処理を３５サイクル繰り返し、さらに６８℃１０分の処理を行った。反応終了後、反応液を、１％アガロースゲル（ＴＢＥバッファー）を用いた電気泳動に供した後、ゲルをエチジウムブロマイド染色し、トランスイルミネーターにより観察することにより、増幅されたＤＮＡ断片を検出した。さらにこのＤＮＡ断片を、QUIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いてアガロースゲルから回収し、ｐＧＥＭＴＥ等のクローニング用ベクタープラスミドのマルチクローニングサイトに挿入した後、大腸菌を宿主として増幅し、配列を決定した。クローニング用ベクターのクローニングサイトへの挿入は、ＴＡクローニングにより行った。すなわち、ＥｃｏＲＶ消化により、平滑末端化したベクターの３’末端にＴ（チミジン）を付加し、３’末端にＡ（アデニン）が付加されたＰＣＲ産物をライゲートした。これを電気穿孔法により、大腸菌内に遺伝子導入し、ＬＢ液体培地中で、３７℃下で１６〜２０時間攪拌培養した。培養後の大腸菌を、遠心により回収し、ＱＩＡＧＥＮミニプレップキット（キアゲン社製）を用いてプラスミドの精製を行った。挿入配列の決定は、Dye Terminator法により、蛍光シークエンサーを用いて行った。
【０１０８】
ヒト遺伝子１の塩基配列を配列番号１に示す。ヒト遺伝子１は、４７８アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含む。ヒト遺伝子１にコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２のうち、第７３アミノ酸から第１４０アミノ酸部分は、ＳＡＭ（Sterile Alpha Motif）ドメインと称されるシグナル伝達因子に特徴的なペプチドモチーフを含む。第５２アミノ酸のＳｅｒ残基は、ＭＡＰキナーゼ基質に特徴的なモチーフに含まれ、第２４７から第２５０アミノ酸までの部位（ＰＰＬＰ：Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ）は、ＳＨ３結合領域モチーフである。
【０１０９】
マウス遺伝子１の塩基配列を配列番号３に示す。マウス遺伝子１は、４７８アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含む。マウス遺伝子１にコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。配列番号４のうち、第７３アミノ酸から第１４０アミノ酸部分は、ＳＡＭ（Sterile Alpha Motif）ドメインと称されるシグナル伝達因子に特徴的なペプチドモチーフを含む。第５２アミノ酸のＳｅｒ残基は、ＭＡＰキナーゼ基質に特徴的なモチーフに含まれ、第２４７から第２５０アミノ酸までの部位（ＰＰＬＰ：Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ）は、ＳＨ３結合領域モチーフである。
【０１１０】
オープンリーディングフレーム領域について、ヒト遺伝子１及びマウス遺伝子１は、ＤＮＡレベルで８９．５％、タンパク質レベルで９０．２％の相同性を示した。
【０１１１】
〔実施例２〕ヒト遺伝子１及びマウス遺伝子１のゲノム構造
ヒト遺伝子１のｃＤＮＡ配列を公開済ヒトゲノム配列に対して相同検索することにより、ヒト遺伝子１のゲノム構造を決定した。マウス遺伝子１のｃＤＮＡ配列を公開済マウスゲノム配列に対して相同検索することにより、マウス遺伝子１のゲノム構造を決定した。
【０１１２】
ヒト遺伝子１及びマウス遺伝子１のゲノム構造を図１に示す。図１に示すように、ヒト遺伝子１及びマウス遺伝子１のゲノム構造は極めて類似していた。特に相同なエクソン領域は全て同一の塩基数であった。イントロンの長さは、ヒト遺伝子１及びマウス遺伝子１間で相違が認められた。
【０１１３】
〔実施例３〕ヒト遺伝子１の発現組織
ヒト各組織から調製したｐｏｌｙＡ ＲＮＡをブロットしたナイロンメンブレンに対し、32Ｐ標識ヒト遺伝子１をプローブとして用い、ハイブリダイゼーションバッファー（ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer, Ambion社製）中で、４２℃、２２時間ハイブリダイズさせた後、ＬＳバッファー（組成：２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）又はＨＳバッファー（組成：０．１％ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ）を用いて洗浄した。ハイブリダイズ像の検出は、イメージアナライザー（Fuji社製）を用いて行った。
【０１１４】
その結果、図２に示すように、脳、腎臓、肺、筋肉、胎盤、小腸、精巣、副腎、唾液腺、脾臓、胃等の組織でヒト遺伝子１の発現が確認された。
【０１１５】
〔実施例４〕ＧＦＰ融合ヒト遺伝子１産物の細胞内での存在状態の観察
哺乳動物細胞内でＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）のＣ末端にヒト遺伝子１産物が融合したタンパク質が産生されるように設計した遺伝子発現ベクター１を構築した（図８）。すなわち、ＧＦＰコード領域ｃＤＮＡの３’末端部位にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位を付加し、ＣＭＶプロモーターにより哺乳動物細胞内でＧＦＰ融合タンパク質の発現が誘導されるように設計した基本ＧＦＰベクターを、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで制限消化した。ヒト遺伝子１ｃＤＮＡの５’末端にＥｃｏＲＩ部位、３’末端にＮｏｔＩ部位を導入し、両酵素で切断した遺伝子断片をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化した前述の基本ＧＦＰベクターにライゲートし、大腸菌に遺伝子導入し、遺伝子発現ベクター１をクローニングした。
【０１１６】
Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、遺伝子ベクター１をＣＯＳ−７細胞内に遺伝子導入した。すなわち、１μｇの遺伝子ベクター１と３μｌのＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）を含む無血清培地１００μｌを混和し、室温下で１５分間静置した後、ＣＯＳ−７を２４時間前にハーベストした細胞培養シャーレに滴下、混和することにより遺伝子導入した。遺伝子導入されたＣＯＳ−７細胞を３７℃、５％ＣＯ２存在下で、２４時間培養した。細胞核を染色するため、培地中に１．５μｇ／ｍｌ濃度となるようにＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を加え、１０分間３７℃でインキュベートした後、ＰＢＳで４回洗浄した。蛍光顕微鏡によりＣＯＳ−７細胞内でのＧＦＰ融合ヒト遺伝子１産物の局在を観察した。その結果、図３に示すように、ＧＦＰ融合ヒト遺伝子１産物は、ＣＯＳ−７細胞内で繊維状又は小胞状の構造を呈することが判明した。
【０１１７】
〔実施例５〕免疫共沈法によるヒト遺伝子１産物同士の相互作用の検出
ヒト遺伝子１産物のＮ末端にＦＬＡＧタグ又はＨＡタグが融合したタンパク質を哺乳動物細胞内で発現できる遺伝子発現ベクターを構築した（図９，図１０）。すなわち、ＦＬＡＧタグｃＤＮＡの３’末端部位にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位を付加し、ＣＭＶプロモーターにより哺乳動物細胞内でＧＦＰ融合タンパク質の発現が誘導されるように設計した基本ＦＬＡＧタグベクターを、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで制限消化した。ヒト遺伝子１ｃＤＮＡの５’末端にＥｃｏＲＩ部位、３’末端にＮｏｔＩ部位を導入した遺伝子断片をＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ消化した基本ＧＦＰベクターにライゲートし、大腸菌に遺伝子導入し、ＦＬＡＧ−ヒト遺伝子１ベクターをクローニングした。ＨＡタグベクターも同様に作製した。
【０１１８】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、遺伝子導入した。２日間培養後、細胞溶解液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，２２５ｍＭ ＮａＣｌ，０．２％ＮＰ−４０，ｐＨ７．４）を培養プレートに加え、細胞抽出液を調製した。抗ＦＬＡＧ抗体を加え、４℃で６０分間反転混和し、さらにプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを細胞抽出液に加え、４℃で６０分間反転混和し、遠心分離後、細胞溶解液でペレットを３回洗浄し、２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４）で１回洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、タンパク質を分離した。泳動終了後、ニトロセルロースメンブレンにタンパク質を転写し、マウス抗ＨＡ（ヘマグルチニン）抗体（Ｒｏｃｈｅ社）を一次抗体、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（アマーシャム―ファルマシア社）を２次抗体として用いて、ＨＡタグタンパク質の存在を検出した。
【０１１９】
その結果、図４に示すように、ＦＬＡＧタグ−ヒト遺伝子１産物（レーン１）又はＨＡタグ−ヒト遺伝子１産物（レーン３）を単独で発現させた場合、ＨＡ−ヒト遺伝子１産物は検出されなかった。しかし、ＦＬＡＧタグ−ヒト遺伝子１産物及びＨＡタグ−ヒト遺伝子１産物（レーン２）を同時に発現させた場合、ＨＡタグ−ヒト遺伝子１産物が検出された。このことは、ＦＬＡＧタグ−ヒト遺伝子１産物及びＨＡタグ−ヒト遺伝子１産物が親和性を持ち、ＦＬＡＧ抗体による免疫沈降複合体にＨＡタグ−ヒト遺伝子１産物が含まれることを示している。
【０１２０】
〔実施例６〕哺乳動物細胞ツーハイブリッド法によるヒト遺伝子１産物同士の相互作用の検出
ヒト遺伝子１産物が酵母由来ＧＡＬ４ＤＮＡ結合タンパク質のＣ末領域に融合して発現できるように設計した哺乳動物細胞用遺伝子発現ベクター（ｐＧＡＬ４−ヒト遺伝子１ベクター，図１１）、及びヒト遺伝子１産物がＨｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ由来ＶＰ１６遺伝子発現活性化タンパク質のＣ末領域に融合して発現できるように設計した哺乳動物細胞用遺伝子発現ベクター（ｐＶＰ１６−ヒト遺伝子１ベクター，図１２）を構築した。すなわち、ｐＧＡＬ４−ヒト遺伝子１ベクターは、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合結合領域ｃＤＮＡの３’末端部位にＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位を付加し、Ｅａｒｌｙ ＳＶ４０プロモーターにより哺乳動物細胞内でＧＡＬ４ＤＮＡ結合領域融合タンパク質の発現が誘導されるように設計した基本ＧＡＬ４ベクターを、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで制限消化した。ヒト遺伝子１ｃＤＮＡの５’末端にＥｃｏＲＩ部位、３’末端にＸｈｏＩ部位を導入し両酵素で切断した遺伝子断片をＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ消化した基本ＧＡＬ４ベクターにライゲートし、大腸菌に遺伝子導入し、ｐＧＡＬ４−ヒト遺伝子１ベクターをクローニングした。ｐＶＰ１６−ヒト遺伝子１ベクターは、ＶＰ１６転写活性化領域ｃＤＮＡの３’末端部位にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位を付加し、ＣＭＶプロモーターにより哺乳動物細胞内でＶＰ１６転写活性化領域融合タンパク質の発現が誘導されるように設計した基本ＶＰ１６ベクターを、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで制限消化した。ヒト遺伝子１ｃＤＮＡの５’末端にＥｃｏＲＩ部位、３’末端にＮｏｔＩ部位を導入し両酵素で切断した遺伝子断片をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化した基本ＶＰ１６ベクターにライゲートし、大腸菌に遺伝子導入し、ｐＶＰ１６−ヒト遺伝子１ベクターをクローニングした。これらのベクターをＣＯＳ−７細胞に遺伝子導入した。３７℃、５％ＣＯ２存在下で、２４時間培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ルシフェラーゼ活性測定用細胞溶解液（２５ｍＭ ＴＡＥ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２ｍＭ ＤＴＴ）を加え、ルシフェリン、ＡＴＰ存在下でルミノメーターにより、細胞抽出液中のルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１２１】
その結果、図５に示すように、ｐＧＡＬ４−ヒト遺伝子１及びｐＶＰ１６−ヒト遺伝子１を同時に遺伝子導入した場合には、ｐＧＡＬ４−ヒト遺伝子１及び遺伝子１領域をもたないｐＶＰ１６を同時に遺伝子導入させた場合に比べて、９．３倍のルシフェラーゼ活性が検出された。この結果から、ヒト遺伝子１産物同士の親和性相互作用が示唆された。
【０１２２】
〔実施例７〕哺乳動物細胞ツーハイブリッド法によるヒト遺伝子１産物及びヒトＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１遺伝子産物間の相互作用の検出
ヒト遺伝子１産物が酵母由来ＧＡＬ４ＤＮＡ結合タンパク質のＣ末領域に融合して発現できるように設計した哺乳動物細胞用遺伝子発現ベクター（ｐＧＡＬ４−ヒト遺伝子１，図１１）、及びヒトＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１遺伝子産物がＨｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ由来ＶＰ１６遺伝子発現活性化タンパク質のＣ末領域に融合して発現できるように設計した哺乳動物細胞用遺伝子発現ベクター（ｐＶＰ１６−Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１，１３）を構築した。すなわち、ｐＶＰ１６−Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１ベクターは、ＶＰ１６転写活性化領域ｃＤＮＡの３’末端部位にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位を付加し、ＣＭＶプロモーターにより哺乳動物細胞内でＶＰ１６転写活性化領域融合タンパク質の発現が誘導されるように設計した基本ＶＰ１６ベクターを、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで制限消化した。ヒトＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１ｃＤＮＡの５’末端にＥｃｏＲＩ部位、３’末端にＮｏｔＩ部位を導入し両酵素で切断した遺伝子断片をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化した基本ＶＰ１６ベクターにライゲートし、大腸菌に遺伝子導入し、ｐＶＰ１６−ヒトＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１ベクターをクローニングした。なお、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１遺伝子の塩基配列を配列番号５に、Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１遺伝子産物のアミノ酸配列を配列番号６に示す。これらのベクターを、ＣＯＳ−７細胞に遺伝子導入した。３７℃、５％ＣＯ２存在下で、２４時間培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ルシフェラーゼ活性測定用細胞溶解液（２５ｍＭ ＴＡＥ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２ｍＭ ＤＴＴ）を加え、ルシフェリン、ＡＴＰ存在下でルミノメーターにより、細胞抽出液中のルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１２３】
その結果、図６に示すように、ｐＧＡＬ４−ヒト遺伝子１及びｐＶＰ１６−Ｂａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１を同時に遺伝子導入した場合、ｐＧＡＬ４及びｐＶＰ１６を同時に遺伝子導入させた場合に比べて、１１．３倍のルシフェラーゼ活性が検出された。この結果から、ヒト遺伝子１産物及びＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１遺伝子産物の親和性相互作用が示唆される。
【０１２４】
〔実施例８〕抗遺伝子１抗体を用いたウェスタンブロッティングによるヒト遺伝子１産物の検出
ヒト遺伝子１産物のうち第３０から４９アミノ酸部分（ＮＨ２−ＧＥＡＧＲＡＰＤＳＤＧＧＳＤＡＤＳＥＶＧ−ＣＯＯＨ）をペプチド合成し、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）をキャリアーとし、アジュバンドとともにウサギ（２羽）に筋肉及び皮下注射した。さらに２週後、５週後、１１週後、１７週後にもペプチド、アジュバンド混合液を注射し、抗血清を最初の抗原注射から２５週後に調製した。ＦＬＡＧタグ−ヒト遺伝子１産物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過的に発現させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動でタンパク質を分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンをブロッキングバッファー（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０及び５％脱脂粉乳含有ＰＢＳ）で室温下１時間ブロックし、１０００倍希釈した抗血清を含む新たなブロッキングバッファー中で、４℃、２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回メンブレンを洗浄した後、ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を含む、ブロッキングバッファー中で室温下１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で３回メンブレンを洗浄した後、ケミルミネッセンス法（例えば、ＷｅｓｔＰｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて、抗体特異的バンドを検出した。
【０１２５】
その結果、図７に示すように、ヒト遺伝子１を強制発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞抽出タンパク質レーンに抗原特異的バンドが検出された。
【０１２６】
〔実施例９〕
（１）マウス遺伝子１ジーンターゲッティングベクターの構築
マウス遺伝子１の第１エクソン及び第２エクソンの一部を含む５'側のゲノムＤＮＡと、第２エクソンの一部、第３及び第４エクソンを含む３'側のゲノムＤＮＡとを、末端に制限酵素部位を付加した形で、ＰＣＲ増幅した。すなわち、第１エクソン及び第２エクソンの一部を含む５'側のゲノムＤＮＡは、５’プライマー（5'-gactcgtcctcttcagtgctggatgtaggcgtg-3’）と、SalI部位を付加して設計した３'プライマー（5'-tcgtcgacacagccacatgcttggtagtccagcggc-3'）各１５ｐｍｏｌｅ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Expand Long Template PCR System, Roche社製）５ユニット、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ）、マウス精子由来ｃＤＮＡ０．５ｎｇ及び１．７５ｍＭ 塩化マグネシウムを含有する増幅用バッファー中で、９４℃で１０分間処理の後、９４℃で３０秒、６５℃で４５秒、６８℃で１５分の処理を２６サイクル繰り返し、さらに６８℃１５分の処理を子なった。第２エクソンの一部、第３及び第４エクソンを含む３'側のゲノムＤＮＡは、ClaI部位を付加して設計した５'プライマー（5'-catcgatttaggttattgttcatgagcgagtgcctg-3'）と、３'プライマー（5'-caggtgctgtcctggcacggagagggaggtc-3’）各１５ｐｍｏｌｅ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Expand Long Template PCR System, Roche社製）５ユニット、２００μＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ）、マウス精子由来ｃＤＮＡ ０．５ｎｇ及び１．７５ｍＭ 塩化マグネシウムを含有する増幅用バッファー中で、９４℃で１０分間処理の後、９４℃で３０秒、６２℃で４５秒、６８℃で２０分の処理を２６サイクル繰り返し、さらに６８℃２０分の処理を行った。ＧＦＰ−Ｎｅｏ遺伝子をＧＦＰｃＤＮＡとマウス遺伝子１の第２エクソンのタンパク質コード領域とインフレームになるよう接続し、Ｎｅｏ遺伝子の３’側には、ストップコドンを導入したマウス遺伝子１ジーンターゲッティングベクターを構築した（図１４）。
【０１２７】
（２）遺伝子１ノックアウトマウスの作製
マウス遺伝子１ジーンターゲッティングベクターを制限酵素ＮｏｔＩ消化により、２本鎖状にし、電気穿孔法によりマウスＥＳ細胞に導入した。同細胞を３７℃、５％ＣＯ２で選択薬剤であるＧ４１８及びガンシクロビル存在下で培養した。耐性細胞コロニーからゲノミックＤＮＡを調製し、ＰＣＲ及びサザンハイブリダイゼーションにより相同組み換え陽性ＥＳ細胞を選抜した。陽性ＥＳ細胞を胚盤胞にマイクロインジェクション法により導入後、偽妊娠雌マウスに移植した。産生したキメラマウスを野生型マウスと交配し、アグーチ毛色をマーカーとして、得られた産児のゲノタイピングを行い、ヘテロに遺伝子１を欠損したマウスを作出した。
【０１２８】
（３）遺伝子１ヘテロ欠損マウス間交配より得られた産児及び胎児のゲノタイプ解析
遺伝子１のヘテロ欠損雌マウスと遺伝子１のヘテロ欠損雄マウスを交配し、得られた産児のゲノタイピングを行った。また、遺伝子１のヘテロ欠損雌マウスと遺伝子１のヘテロ欠損雄マウスを交配し、一定時期経過後、妊娠雌マウスを解剖し、胎児又は羊膜よりゲノムＤＮＡを調製し、ゲノタイピングを行った。
その結果、表１に示すように、遺伝子１ヘテロ欠損マウス間交配により産生した産児のゲノタイプは、野生型又はヘテロ欠損型で、ホモ欠損型は得られなかった。また、表２に示すように、遺伝子１ヘテロ欠損マウス間交配により得られた受精１２．５日後、９．５日後、８．５日後の各胎児のゲノタイプは、野生型又はヘテロ欠損型で、ホモ欠損型は得られなかった。これらの結果から、遺伝子１ホモ欠損型の胎児は受精８．５日後以前の発生段階で致死していると考えられる。
【０１２９】
【表１】
2007135441.tif 000002
【０１３０】
【表２】
2007135441.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】ヒト遺伝子１及びマウス遺伝子１のゲノム構造を示す図である。
【図２】脳、腎臓、肺、筋肉、胎盤、小腸、精巣、副腎、唾液腺、脾臓、胃等の組織でヒト遺伝子１の発現を示す図である。
【図３】蛍光顕微鏡によってＣＯＳ−７細胞内でのＧＦＰ融合ヒト遺伝子１産物の局在を観察した結果を示す図である。
【図４】免疫共沈法によるヒト遺伝子１産物同士の相互作用の検出結果を示す図である。
【図５】哺乳動物細胞ツーハイブリッド法によるヒト遺伝子１産物同士の相互作用の検出結果を示す図である。
【図６】哺乳動物細胞ツーハイブリッド法によるヒト遺伝子１産物及びヒトＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１遺伝子産物間の相互作用の検出結果を示す図である。
【図７】抗遺伝子１抗体を用いたウェスタンブロッティングによるヒト遺伝子１産物の検出結果を示す図である。
【図８】ＧＦＰ−ヒト遺伝子１ベクターの構成図である。
【図９】ＦＬＡＧ−ヒト遺伝子１ベクターの構成図である。
【図１０】ＨＡ−ヒト遺伝子１ベクターの構成図である。
【図１１】ＧＡＬ４−ヒト遺伝子１ベクターの構成図である。
【図１２】ＶＰ１６−ヒト遺伝子１ベクターの構成図である。
【図１３】ＶＰ１６−ヒトＢａｘ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１遺伝子ベクターの構成図である。
【図１４】マウス遺伝子１ジーンターゲッティングベクターの構成図である。
【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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