(57)【要約】【課題】隣接する培養細胞からの影響が大きくならずに、最大の細胞数を確保することができる状態で継代の判断を行うことを可能とし、最適な状態で培養細胞を継代する。【解決手段】培養容器内の培養細胞の占有面積率を計測し、計測された培養細胞の占有面積率と、培養細胞の増殖状態に応じて２つの領域に分類される細胞数と占有面積率との関係とに基づいて、該２つの領域の境界Ａに位置する占有面積率を有するか否かに応じて継代の可否を判断する培養細胞の継代判断方法を提供する。【選択図】      図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器内の培養細胞の占有面積率を計測し、
計測された培養細胞の占有面積率と、培養細胞の増殖状態に応じて２つの領域に分類される細胞数と占有面積率との関係とに基づいて、該２つの領域の境界に位置する占有面積率を有するか否かに応じて継代の可否を判断する培養細胞の継代判断方法。
【請求項２】
細胞数と占有面積率との関係を２つの直線で近似することにより、培養細胞の増殖状態を分類する請求項１に記載の培養細胞の継代判断方法。
【請求項３】
培養中の培養細胞の占有面積率を計測し、
予め求められた継代に最適な細胞の占有面積率と計測された占有面積率との差を演算し、
算出された占有面積率の差に基づいて、培養細胞がコンフルエントに到達する時期を推定する請求項２に記載の培養細胞の継代判断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養細胞の継代判断方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内から採取された細胞や採取後保存されていた細胞を培養して増殖させ、再生医療や薬効試験に応用する研究が進められている。
再生医療や薬効試験に培養した細胞を使用する場合、細胞の増殖能力等の細胞特性を落とすことなく、細胞を培養して継代を続けて行く必要がある。
【０００３】
特定の培養容器で細胞培養を進めると、培養容器内の細胞数が増加して細胞密度が高くなると、個々の細胞の増殖能力が低下し始める。そして、更に細胞密度が高くなると細胞は増殖ができない状態に陥り、徐々に死滅し始める。
培養細胞の増殖能力を低下させずに培養を進めるためには、培養容器内の細胞に悪影響を与える密度に達する前に、培養細胞を新しい容器に継代を行わねばならない。
【０００４】
培養細胞の増殖能力を低下させずに継代を続けるためには、培養容器内の細胞に悪影響を与えない密度や細胞数であることを確認する必要がある。このため、培養作業者が顕微鏡等の観察手段を用いて、培養容器内の細胞の分布状態を観察し、継代時期を判断している。
【０００５】
培養細胞を新しい培養容器に継代を行うために、作業者が培養容器内の細胞を顕微鏡で観察して継代時期を判断している。このため、培養容器内の細胞数や増殖能力等は、判断する作業者の個人差に影響されることが多い。
【０００６】
この問題点を解決するために、顕微鏡による観察画像を処理し評価する方法が提案され（例えば、特許文献１参照。）、細胞の培養容器への投影面積を用いて細胞の増殖能力を評価する方法が提案されている（例えば、特許文献２参照。）。また、顕微鏡による観察画像から細胞の増殖能を評価する方法が提案されている（例えば、特許文献３参照。）。
【特許文献１】特開２００２−２１４２２８号公報
【特許文献２】特開２００４−３４４０４９号公報
【特許文献３】特開２００３−２１６２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１の方法は、画像データから評価可能な領域を抽出して、抽出された領域内の細胞の状態を解析する方法である。この手法を用いて、培養中の細胞の状態を評価すると、特定の密度に条件を設定して画像の解析を行うことになる。この場合、設定された条件以外の状態にある細胞の評価を行うことが難しく、培養容器全体に分布している細胞の状態を評価することが難しくなる。そして、正確に培養容器全体の増殖能力を評価することができなくなる。
【０００８】
特許文献３の方法は、播種後の細胞が培養容器に接着し、増殖を開始する際の細胞の接着依存性を評価する方法である。この手法を用いた場合、細胞が増殖を開始した直後の増殖能力を接着依存性として評価することはできるが、細胞が培養容器に接着し増殖を開始した後の細胞の評価に用いることが難しい、特にコンフルエントに近い状態の細胞の増殖能力を評価することができない。
【０００９】
特許文献２の方法は、特許文献３の問題点を解消して播種時の細胞を球体で近似しその投影面が円になり、細胞の接着依存性を細胞の投影円の時間変化から評価する方法である。この方法も、特許文献３の場合と同様に細胞が培養容器に接着し、増殖を開始した後の細胞の評価をすることは難しく、特に、密集した状態の細胞の評価をすることが難しくなる。
したがって、培養容器内の培養細胞の状態を作業者の個人差を無くして評価し、最適な状態で細胞を継代させることが難しいという問題がある。
【００１０】
本発明は、この問題を解決し、最適な状態で細胞を継代することができる培養細胞の継代判断方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、培養容器内の培養細胞の占有面積率を計測し、計測された培養細胞の占有面積率と、培養細胞の増殖状態に応じて２つの領域に分類される細胞数と占有面積率との関係とに基づいて、該２つの領域の境界に位置する占有面積率を有するか否かに応じて継代の可否を判断する培養細胞の継代判断方法を提供する。
【００１２】
一般には、細胞数と培養細胞の総面積とは比例関係にあると考えられている。このことからすれば、観察範囲に対する培養細胞の占有する面積は細胞数に比例することになり、細胞数と占有面積率との間にも比例関係が存在することになる。しかし、実際に、培養容器内の培養細胞の細胞数と占有面積率との関係を調べてみると、細胞数と占有面積率との間には必ずしも比例関係が存在しないことがわかった。
【００１３】
培養容器内で培養細胞が増殖する場合、培養細胞の密度が低いときには培養細胞の周りに十分な空間があり、培養細胞が近傍の培養細胞と接触することはなく、培養細胞１個の形状や大きさに変化は生じず、細胞数と占有面積率は比例関係になる。
しかし、培養細胞の増殖が進むと、培養容器によって培養細胞の移動が制限されるために、隣接する培養細胞との空間が狭まり始める。そして、隣接する培養細胞と接触することになり、培養細胞１個の形状や大きさに変化が生じ始める。これにより、培養細胞１個が培養容器を占有する面積が小さくなり、細胞数と占有面積率との間の比例関係が崩れ始める。
【００１４】
すなわち、培養細胞の占有面積率と細胞数との関係は、培養細胞の増殖状態に応じて２つの領域に分類される。
第１の領域は、占有面積率が低いときの細胞数と占有面積率の関係を示す領域であり、隣接する培養細胞間に十分な空間が存在するときの細胞数と占有面積率の関係を表している。この領域においては、培養細胞が隣接する培養細胞からの影響を受けずに理想的な状態で増殖を続けることが示されている。
【００１５】
第２の領域は、占有面積率が大きいときの細胞数と占有面積率の関係を示す領域であり、培養容器内の細胞密度が非常に高くなり、隣接する培養細胞どうしの影響が最も大きくなる。そして、培養細胞の増殖能力に最も悪影響を与える状態でもある。
【００１６】
第１の領域では、培養容器内の培養細胞には十分な増殖空間が存在し、隣接する培養細胞どうしの影響が少なくなっていると考えられる。そして、培養細胞には本来の増殖能力が十分残っていると考えられる。
【００１７】
第２の領域では、培養容器内の培養細胞には増殖のための空間がなく、隣接する培養細胞からの影響も多く、培養細胞の増殖が阻害される状態にあると考えられる。この状態では、培養細胞どうしが与え合うストレスも大きく、培養細胞の増殖能力を低下させていることが考えられる。
したがって、占有面積率が第２の領域になる前に継代を行うことが望ましい。
【００１８】
培養細胞を継代する場合には、細胞数が多い方がより多くの培養容器に分配することが可能になるが、上述したように、細胞数が多くなると、培養細胞の密度が高い状態が長く続いていることになり、培養細胞どうしの接触等によって、各培養細胞に供給される養分等の不足等の悪影響が現れ、培養細胞の増殖能力を低下させる可能性がある。
【００１９】
したがって、培養細胞の増殖能力を低下させずに継代を行うためには、培養容器内の培養細胞の密度を隣接する培養細胞どうしで影響し合わない状態にする必要がある。
そこで、占有面積率を評価関数に取った場合に、隣接する培養細胞間の影響が現れない時期を考える。
【００２０】
上述したように、第１の領域と第２の領域との境界における占有面積率を境に、培養細胞の周りに十分な増殖空間が存在する状態から隣接する培養細胞からの影響が大きくなる状態へ変わることが考えられる。
したがって、本発明によれば、培養容器内の培養細胞が２つの領域の境界における占有面積率に到達した時点が、隣接する培養細胞からの影響が大きくならずに、最大の細胞数を確保することができる状態であり、この占有面積率に達した時点で継代するという判断を行うことにより、最適な状態で培養細胞を継代することができる。
【００２１】
ここで、培養容器内の培養細胞の占有面積率を計測する方法は、例えば、特開平７−２２５３４１号公報あるいは特開平９−１５５０４号公報に示された方法による。これらの公報に示される方法は、培養細胞などの位相物体を位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡で観察する際に、位相差量やリターデーション量を変化させて像コントラストが反転している２つの観察画像を取り込み、その差画像を形成することにより、観察物体の位相分布のみを抽出するものである。抽出された位相分布に閾値を設定することで、培養細胞が存在する部分と存在しない部分を示す２値化画像を形成することができる。
さらに、この２値化画像から観察範囲で細胞が占有する面積を計算することができ、占有面積率を求めることができる。
【００２２】
この方法で、占有面積率を求めることにより、細胞の形状や大きさに影響されること無く、培養用容器内に存在する細胞が占有する面積率を計測することができる。
上述した占有面積率を求める方法は、位相差顕微鏡と微分干渉顕微鏡に限定されるものではなく、特開２００５−１７３２８８号公報に示されるように、焦点位置を前後に移動させることによっても像コントラストを反転させ、位相分布を抽出する方法を採用してもよい。
【００２３】
上記発明においては、細胞数と占有面積率との関係を２つの直線で近似することにより、培養細胞の増殖状態を分類することとしてもよい。
上述したように、第１、第２の領域における培養細胞の細胞数と占有面積率との関係をそれぞれ直線で近似することにより、２つの直線の交点位置を２つの領域の境界位置として簡易に検出することができる。したがって、計測された占有面積率が、２つの直線の交点位置における占有面積率に達した時点で継代を行うことにより、最適な状態で培養細胞を継代することができる。
【００２４】
また、上記発明においては、培養中の培養細胞の占有面積率を計測し、予め求められた継代に最適な細胞の占有面積率と計測された占有面積率との差を演算し、算出された占有面積率の差に基づいて、培養細胞がコンフルエントに到達する時期を推定することとしてもよい。
【００２５】
培養容器内の培養細胞が、この隣接する培養細胞どうしが影響し合わない細胞密度に達したときをコンフルエントと考えた。
培養容器の面積は細胞が増殖している間に変化することはなく、細胞数は培養容器内の平均密度を表していることになる。よって、占有面積率から培養容器内の培養細胞の平均密度を評価することができる。
【００２６】
コンフルエントになる培養細胞の占有面積率を実験的に求めることができると、培養中の培養細胞の占有面積率を計測し、コンフルエントとの差を求め、培養細胞の占有面積率の時間変化を予め求めておくことにより、コンフルエントに達するまでの培養日数を求めることができ、コンフルエントに達する時期を予測することができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、隣接する培養細胞からの影響が大きくならずに、最大の細胞数を確保することができる状態で継代の判断を行うことを可能とし、最適な状態で培養細胞を継代することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の一実施形態に係る培養細胞の継代判断方法について、図１〜図３を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る継代判断方法を実施する細胞数計測装置１は、図１に示されるように、培養細胞を観察する装置として、倒立顕微鏡２を用いている。これにより、培養容器３ごと培養中の培養細胞を観察することができるようになっている。
【００２９】
倒立顕微鏡２は、顕微鏡コントローラ４および電動ステージコントローラ５のようなコントロールボックスを介してコンピュータ（ＰＣ）６に接続され、照明光の強度、倍率、焦点位置の調整をＰＣ６から行えるようになっている。倒立顕微鏡２にはＣＣＤカメラ７が取り付けられている。ＣＣＤカメラ７は、ＰＣ６に接続され、培養細胞の観察画像をＰＣ６に取り込むことやＰＣ６のモニタ８に表示することが可能になっている。倒立顕微鏡２のステージ９は電動化され、ＰＣ６によって制御可能になっている。これにより、ＰＣ６の制御で培養容器３の任意の位置で観察することができるようになっている。図１中、符号１０は照明光学系である。
【００３０】
ＰＣ６は、倒立顕微鏡２を制御して、ステージ９を駆動することにより、予めプログラムされた観察位置に培養容器３を移動させ、所望の観察位置で培養容器３内の培養細胞の観察および観察画像の取得を行うことができるようになっている。
ＰＣ６は、所望の観察位置に培養容器３を位置決めし、倒立顕微鏡２を制御して、（例えば、先開２００５−１７３２８８の方法により、）焦点位置を前後に変化させた２つの観察画像を取得させ、取得された２つの観察画像を演算することにより、培養容器３内の培養細胞の位相分布を抽出するようになっている。また、ＰＣ６は抽出された位相分布に基づいて、培養細胞の存在する部分と存在しない部分とを２値化して区別し、観察範囲内の培養細胞の占有面積率を演算するようになっている。
【００３１】
特に、ＰＣ６に培養容器３内で培養細胞の占有面積率を計測する位置をプログラミングすることにより、培養容器３内の複数の位置で観察画像を取り込み、演算処理を行い、培養細胞の存在部分を抽出した２値化画像を形成し、複数の位置における培養細胞の占有面積率を算出する。そして、算出された複数の位置での占有面積率を平均することにより、培養容器３内の培養細胞の平均占有面積率を求めることができる。
【００３２】
次に、培養細胞の平均占有面積率と、細胞数との関係を示す。
約５４００ｍｍ２の底面積を有する複数の培養容器３に同数のヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を播種し、同一培養装置（図示略）内で同一条件のもとで培養を行い、培養日数が経過するごとに培養容器３を培養装置から取り出す。そして、図１に示す倒立顕微鏡２で培養容器３内に存在する培養細胞の平均占有面積率を計測し、計測した培養容器３内の培養細胞をトリプシン処理して剥離し、従来方法である血球計測板を用いて細胞数の計測を行った。
【００３３】
その結果、培養細胞の占有面積率と細胞数との間には、図２に示すグラフの関係が得られる。
図２には、計測結果および計測結果を近似する曲線が示されている。
【００３４】
本実施形態に係る培養細胞の継代判断方法は、図３に示されるように、図２の近似曲線（グラフ１）に対して、占有面積率が５０％以下の領域を直線で近似し、グラフ２を設定する。グラフ１の占有面積率が８０％以上の領域も直線で近似できると考え、グラフ３を設定する。
【００３５】
グラフ２は占有面積率が５０％以下の密度状態で培養細胞が増殖を続けていると考えられ、隣接する培養細胞との間に十分な空間が存在し、培養細胞間で増殖に与える影響はほとんど無いと考えられる。グラフ３は占有面積率が８０％以上の密度状態で増殖が進んだ場合と考えられ、隣接する培養細胞は密集し、培養細胞は閉塞状態に陥っていると考えられる。この閉塞状態が長く続くと、培養細胞は増殖ができなくなるだけでなく、代謝も難しくなり、死滅し始める。
【００３６】
実際の培養細胞は、培養容器内でグラフ２の状態から次第にグラフ３の状態に移行しながら、グラフ１の曲線に従って密度状態を変化させていく。すなわち、グラフ２とグラフ３が交差する交点Ａでグラフ２の状態からグラフ３の状態に移行すると考えられる。
【００３７】
したがって、交点Ａにおいて占有面積率が大きくなり始めると、培養細胞の密度が高くなり、培養細胞の増殖に悪影響が発生する状態になると考えられる。
その結果、交点Ａの占有面積率を超えて培養を進めると、細胞数は多くなるが、培養細胞が密集することによって悪影響を受けた培養細胞も多くなり、継代した後に増殖能が低下する可能性が大きくなる。
【００３８】
本実施系に係る培養細胞の継代判断方法は、グラフ２とグラフ３が交差する交点Ａの占有面積率に到達したときに、培養細胞を継代するという判断を行うものであり、これによれば、隣接する培養細胞から受ける悪影響が小さい状態で細胞数を最大にするような最適な状態で継代することが可能となる。
【００３９】
培養容器で間葉系幹細胞を培養した場合には、上記に示したように交点Ａの占有面積率である約７０％で継代を行うことにより、間葉系幹細胞の増殖能力を阻害することなく継代が続けられる。
継代に最適な占有面積率は、培養する培養細胞ごとに、図３に示す方法で予め実験的に求めることができる。同一の培養条件で同種の培養細胞を培養する場合には、継代に最適な占有面積率は予め求めておいた値を用いればよく、培養細胞と培養条件に対応したデーターベースを構築しておけば、常に培養細胞間の影響が小さい状態で培養細胞を継代し続けることができる。
【００４０】
また、本実施形態に係る培養細胞の継代判断方法によれば、継代に最適な占有面積率が実験的に求められ、占有面積率が自動計測できることにより、継代を判断する作業者の個人差に影響されることも無くなるという利点がある。
【００４１】
さらに、占有面積率の計測値と継代に最適な占有面積率との比較機能を占有面積率計測装置に組み込むことにより、継代時期の自動判定が可能である。
すなわち、培養中の間葉系幹細胞の平均占有面積率を計測し、計測結果と交点Ａの占有面積率との差を演算することにより、継代時期を推定することができる。したがって、推定した培養日数が経過した後に占有面積率の計測を行い、交点Ａの占有面積率と比較することにより、最適な状態で継代を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の一実施形態に係る培養細胞の継代判断方法に用いる細胞数計測装置を示す全体構成図である。
【図２】間葉系幹細胞の細胞数と占有面積率との関係を示すグラフである。
【図３】図１の継代判断方法に使用する近似直線を、図２のグラフに重ねて示すグラフである。
【符号の説明】
【００４３】
Ａ  交点（境界）
１  細胞数計測装置
２  倒立顕微鏡
３  培養容器
４  顕微鏡コントローラ
５  電動ステージコントローラ
６  コンピュータ（ＰＣ）
７  ＣＣＤカメラ
８  モニタ
９  ステージ
１０  照明光学系
【図１】
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【図２】
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【図３】
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