(57)【要約】      （修正有）【課題】継代培養された間葉系幹細胞が多機能間葉系幹細胞であるか否かを識別することができる、間葉系幹細胞の均質性識別方法を提供する。またその方法を利用することにより得られる、均質間葉系幹細胞を提供する。【解決手段】間葉系幹細胞の均質性識別方法は、継代培養された間葉系幹細胞の細胞集団から二以上のクローンを作成する段階と、該クローン及びその母集団について所定の遺伝子群に関するmRNA相対強度を取得する段階と、該取得された前記クローン及びその母集団のmRNA相対強度群を前記遺伝子群に対して図式化した遺伝子発現パターンを求める段階と、該得られた遺伝子発現パターンから前記母集団の均質性を判別する段階と、からなる。【選択図】図１
2007082484.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
継代培養された間葉系幹細胞の細胞集団から複数のクローンを作製する段階と、該クローン及びその母集団について所定の遺伝子群に関するmRNA発現強度を取得する段階と、該取得された前記クローン及びその母集団のmRNA発現強度群を前記遺伝子群に対して図式化した遺伝子発現パターンを求める段階と、該得られた遺伝子発現パターンから前記母集団の均質性を判別する段階と、からなる間葉系幹細胞の均質性識別方法。
【請求項２】
継代培養された間葉系幹細胞の細胞集団の所定の遺伝子群に関するmRNA発現強度を取得する段階と、該取得されたmRNA発現強度群を前記遺伝子群に対して図式化した遺伝子発現パターンを求める段階と、該遺伝子発現パターンから前記細胞集団の均質性を判別する段階と、からなる間葉系幹細胞の均質性識別方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法により識別されて得られる均質間葉系幹細胞。
【請求項４】
脂肪分化、骨分化及び軟骨分化の３つの方向に分化する分化能を有し、分化誘導しない限りいずれの分化もしない基準間葉系幹細胞から得られる所定の遺伝子群に関する遺伝子発現パターンに類似する遺伝子発現パターンを有する均質間葉系幹細胞。
【請求項５】
所定の遺伝子群に関する各mRNA発現強度と、該遺伝子群に関し基準間葉系幹細胞から得られる各mRNA発現強度との分散和をとった場合に、その分散和が所定の範囲内にある均質間葉系幹細胞。
【請求項６】
基準間葉系幹細胞は、クローン化された細胞であることを特徴とする請求項４又は５に記載の均質間葉系幹細胞。
【請求項７】
所定の遺伝子群は、CTGF、IGFBP7、KCTD12、LAMA3、LIF、MGP、PRG1、TRIB2、IGF1、BMP4、SERPINI1、CD74、HLA-DRA、HLA-DRB、TGM2、DNCI1、MCAM、TFPI2、ARHGDIBのいずれか複数の遺伝子からなる遺伝子群であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の間葉系幹細胞の均質性識別方法又は均質間葉系幹細胞。
【請求項８】
所定の遺伝子群は、ADAMTS1、ABHD2、ADD3、ANXA10、ACLY、ATP6V1G3、BDNF、BRIP1、CDH6、CPA4、CDC25A、CHI3L1、F2R、F2RL1、CCND1、CKAP2、DNAH3、SMURF2、EFEMP1、DCBLD、ESM1、EDG2、LOC221810、GABRB1、GATA6、GMFG、HGF、HMGA2、PHLDB2、HTR7、MGC14161、DGKG、PRDM16、MCTP2、FLJ23033、FLJ35681、FLJ38725、C9orf72、LYPDC1、IF、IGFBP1、IGFBP3、IGFBP5、ITGA5、ITGB3、IFI30、IL6、KRT19、KRT23、KRTAP1-5、KRTHA4、KCTD16、KIAA1913、LXN、LEPR、Lrp2bp、MET、MICA、LF1、PR3、TN4、ASK、LAU、CTD4、4HA2、TGER1、ROS1、AB27B、AC2、GS4、ARRES1、LEKHK1、YPN、LC16A4、LC2A1、LC20A1、AMD3、UHW2、YT1、RPC4、CHL1のいずれか複数の遺伝子からなる遺伝子群であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の間葉系幹細胞の均質性識別方法又は均質間葉系幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、継代培養された間葉系幹細胞の均質性識別方法、その方法を利用して得られる均質間葉系幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は、軟骨、骨、脂肪へ容易に分化する以外に筋肉、セメント、歯周靭帯、腱、神経、肝臓実質細胞へも分化できる。従って、関節軟骨欠損の修復以外に、骨欠損、人工関節の骨への固定、歯周病、顎骨形成、心筋梗塞、難治性皮膚潰瘍などで、間葉系幹細胞が臨床応用されている。また間葉系幹細胞は樹状細胞の分化と機能に影響するため、臓器移植での拒絶反応の抑制に対しても有効であり、臨床例もすでにある。動物モデルでは、脳梗塞、閉塞性動脈硬化症、腎臓疾患などにも有効である。
【０００３】
このように間葉系幹細胞は、非常に多くの治療対象への応用がなされ、また期待もされているが、例えば、骨髄から採取できる間葉系幹細胞の量は非常に少なく採取された骨髄細胞のわずか0.01〜0.001％といわれる。このため、社会的要請に応えるには、まず間葉系幹細胞の継代培養を行って十分な量の間葉系幹細胞を確保することであり、しかもその継代培養は未分化の状態を維持して継続して行うことができ、かつ、使用に際してはその継代培養された細胞が所用の機能を有する細胞に分化し得るものであり、分化能力のない細胞等を含まないような均質な間葉系幹細胞であることが要請される。
【０００４】
一方、多くの研究から、骨髄液中の間葉系細胞（培養皿接着細胞）は形態的にかつ機能的に不均質な細胞集団であり、多分化能を持つ間葉系幹細胞以外に、線維芽細胞や各種の前駆細胞（すでに分化が決定されているものの分化状態には至っていない細胞）も含まれていると考えられている。しかし移植用細胞に、これらの間葉系幹細胞以外の細胞が混入すると臨床効果を低下させるとともに、臨床評価の解析をも困難にする。したがって同一性が保証された均質な間葉系幹細胞のみの細胞集団を移植用細胞として用いなければならない。
【０００５】
このような社会的要請に答えるものとして、特許文献１に、骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞と、脂肪細胞に分化しやすい間葉系幹細胞とをそれぞれ得る方法が開示されている。すなわち、培養液で完全に満たした培養器中で脂肪細胞集団を培養器の天井面に接触させて培養し、当該培養器の下床面上で増殖した線維芽様の間葉系幹細胞を継代培養することによって骨芽細胞に分化しやすい間葉系幹細胞を得ることができる。また、培養液で完全に満たした培養器中で脂肪細胞集団を培養器の天井面に接触させて培養し、当該培養器の天井面で増殖した線維芽様の間葉系幹細胞を継代培養することによって脂肪細胞に分化しやすい間葉系幹細胞を得ることができることが開示されている。
【０００６】
特許文献２には、間葉系幹細胞を線維芽細胞増殖因子（FGF）を培地に添加して継代培養を行った細胞について、回数３〜１２の継代を重ねた細胞を分化誘導することにより軟骨分化、骨分化及び脂肪分化のいずれにも分化するとともに、分化誘導しない場合にはいずれの分化もしないことが開示されている。
【０００７】
また、特許文献３には、骨髄液から採取した有核細胞を培養し、ディッシュ底面に付着した接着細胞を剥離したものを初代培養し、これを１〜３回継代培養しそれぞれ軟骨分化をさせた場合に、初代培養のものは全く軟骨分化をせず、１回目継代培養したものは十分に軟骨分化せず、２及び３回目継代培養したものは十分に軟骨分化をすることが開示されている。
【０００８】
【特許文献１】特開2004-129549号公報
【特許文献２】国際公開第WO2002/22788号
【特許文献３】特開2003-289855号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような従来技術によれば、1〜3回以上継代培養された間葉系幹細胞の細胞集団は適当な培養方法を選択することにより目的とする分化能を有する間葉系幹細胞を得ることができ、あるいは、脂肪分化、骨分化又は軟骨分化のいずれの分化能をも有する間葉系幹細胞を得ることができることが推測される。
【００１０】
しかしながら、このような方法で継代培養された間葉系幹細胞は、脂肪分化能を有するのか、骨分化能を有するのか、軟骨分化能を有するのか、あるいはいずれか２つ又は３つの方向に分化する分化能を有するのかが明確でなく、実際に分化誘導を行って確認しなければならないという問題がある。このため、望ましくは３つの分化能を有し分化誘導しない限りいずれの分化もしない間葉系幹細胞が得られることであるが、そのような性質を有する間葉系幹細胞を予め取得することが困難であるという問題がある。また、従来方法により得られる細胞集団の均質性は不明である。
【００１１】
本発明は、係る従来技術の問題点に鑑み、継代培養された間葉系幹細胞が脂肪分化、骨分化及び軟骨分化の３つの方向に分化する分化能を有し、分化誘導しない限りいずれの分化もしない細胞（以下多機能間葉系幹細胞という）であるか否かを識別することができる間葉系幹細胞の均質性識別方法を提供することを目的とする。また、その方法を利用して得られる均質間葉系幹細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、骨髄液を培養皿中で培養したときに培養皿に接着し増殖した培養皿接着細胞は、一般にはその培養中に行われた１〜３回の培地交換で造血系細胞は除かれているが、多機能間葉系幹細胞以外に、分化能力のない線維芽細胞様の細胞（CFU-Fの一部）、骨／軟骨／脂肪への一方向だけの分化能をもつ前駆細胞、造血支持能のある間質細胞など、多様な細胞が存在する可能性があるという事実に注目した。そして、使用される間葉系幹細胞がどのような異質の細胞を含むか、あるいはどの程度の均質性を有するかについて判別するには遺伝子分析が有力であり、特に多機能間葉系幹細胞と形態においてほとんど識別できず、しかも培養細胞中に混入のおそれがある線維芽細胞様の細胞（以下線維芽細胞という）の遺伝子発現レベル基準とし、それより高い発現レベルを示す遺伝子の遺伝子発現状況からその細胞集団の識別又は均質性を判別することができるという知見に基づいて本発明を完成した。
【００１３】
本発明に係る間葉系幹細胞の均質性識別方法は、継代培養された間葉系幹細胞の細胞集団から複数のクローンを作製する段階と、該クローン及びその母集団について所定の遺伝子群に関するmRNA発現強度を取得する段階と、該取得された前記クローン及びその母集団のmRNA発現強度群を前記遺伝子群に対して図式化した遺伝子発現パターンを求める段階と、該得られた遺伝子発現パターンから前記母集団の均質性を判別する段階と、からなる。
【００１４】
また、本発明に係る間葉系幹細胞の均質性識別方法は、継代培養された間葉系幹細胞の細胞集団の所定の遺伝子群に関するmRNA発現強度を取得する段階と、該取得されたmRNA発現強度群を前記遺伝子群に対して図式化した遺伝子発現パターンを求める段階と、該遺伝子発現パターンから前記細胞集団の均質性を判別する段階と、からなる。
【００１５】
このような間葉系幹細胞の均質性識別方法を使用することによって均質な多機能間葉系幹細胞を得ることができる。
【００１６】
本発明に係る均質間葉系幹細胞は、脂肪分化、骨分化及び軟骨分化の３つの方向に分化する分化能を有し、分化誘導しない限りいずれの分化もしない基準間葉系幹細胞から得られる所定の遺伝子群に関する遺伝子発現パターンに類似する遺伝子発現パターンを有するものである。
【００１７】
また、本発明に係る均質間葉系幹細胞は、所定の遺伝子群に関する各mRNA発現強度と、該遺伝子群に関し基準間葉系幹細胞から得られる各mRNA発現強度との分散和をとった場合に、その分散和が所定の範囲内にあるものである。
【００１８】
上記発明において、基準間葉系幹細胞は、クローン化された細胞であるのがよい。また、所定の遺伝子群は、CTGF、IGFBP7、KCTD12、LAMA3、LIF、MGP、PRG1、TRIB2、IGF1、BMP4、SERPINI1、CD74、HLA-DRA、HLA-DRB、TGM2、DNCI1、MCAM、TFPI2、ARHGDIBのいずれか複数の遺伝子からなる遺伝子群であるのがよい。
【００１９】
さらに、所定の遺伝子群として、ADAMTS1、ABHD2、ADD3、ANXA10、ACLY、ATP6V1G3、BDNF、BRIP1、CDH6、CPA4、CDC25A、CHI3L1、F2R、F2RL1、CCND1、CKAP2、DNAH3、SMURF2、EFEMP1、DCBLD、ESM1、EDG2、LOC221810、GABRB1、GATA6、GMFG、HGF、HMGA2、PHLDB2、HTR7、MGC14161、DGKG、PRDM16、MCTP2、FLJ23033、FLJ35681、FLJ38725、C9orf72、LYPDC1、IF、IGFBP1、IGFBP3、IGFBP5、ITGA5、ITGB3、IFI30、IL6、KRT19、KRT23、KRTAP1-5、KRTHA4、KCTD16、KIAA1913、LXN、LEPR、Lrp2bp、MET、MICA、LF1、PR3、TN4、ASK、LAU、CTD4、4HA2、TGER1、ROS1、AB27B、AC2、GS4、ARRES1、LEKHK1、YPN、LC16A4、LC2A1、LC20A1、AMD3、UHW2、YT1、RPC4、CHL1のいずれか複数の遺伝子からなる遺伝子群を選択することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係る間葉系幹細胞の均質性識別方法は、継代培養された間葉系幹細胞を分化誘導しないで予めその細胞集団が多機能間葉系幹細胞であるか否かを識別することができる。そして、この方法を利用することにより均質な特性を有する多機能間葉系幹細胞特性を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下本発明に係る間葉系幹細胞の均質性識別方法の実施形態について説明する。本発明に係る間葉系幹細胞の均質性識別方法は、継代培養された間葉系幹細胞の細胞集団から複数のクローンを作製する段階と、該クローン及びその母集団について所定の遺伝子群に関するmRNA発現強度を取得する段階と、該取得された前記クローン及びその母集団のmRNA発現強度群を前記遺伝子群に対して図式化した遺伝子発現パターンを求める段階と、該得られた遺伝子発現パターンから前記母集団の均質性を判別する段階と、からなる。
【００２２】
本発明において、間葉系幹細胞は、大腿骨、脛骨、腸骨等いずれに由来するものであってもよい。間葉系幹細胞とは、それらのいずれかから採取し培養を行ったとき、培養皿に接着する性質を有し、線維芽細胞様の形態を有する細胞をいう。このようにして得られた間葉系幹細胞は継代培養される。なお、継代培養とは、取得した細胞を所定の稠密状態になるまで培養し、その後その培養環境から一旦取り出し、他の培養環境に移し換えて培養することをいう。初代培養から１回目の継代培養 、１回目から２回目移行の継代培養はそれぞれ同一の培養条件としてもよく、異なる培養条件としてもよい。すなわち、培地組成、培養温度等が異なる培養条件で培養するものであってもよい。
【００２３】
所定の遺伝子群とは、間葉系幹細胞が有する遺伝子のうち所定のものをいう。この所定の遺伝子は、線維芽細胞よりも高い遺伝子発現を示す遺伝子を選択するのがよい。すなわち、線維芽細胞は、繊維芽様の形態を有し、上記の間葉系幹細胞とは形態的にはほとんど区別ができず、脂肪分化能、骨分化能又は軟骨分化能のいずれの機能をも有しない。しかも、間葉系幹細胞の初代培養時又は継代培養時に混入のおそれがある細胞である。従って、まず、線維芽細胞は間葉系幹細胞集団から排除する必要があり、均質な多機能間葉系幹細胞であるというには、線維芽細胞を含まない細胞集団であることが証明されたものでなければならない。
【００２４】
このため、本発明においては、線維芽細胞よりも高い遺伝子発現を示す、例えば、以下に説明する遺伝子略名でCTGF、IGFBP7、KCTD12、LAMA3、LIF、MGP、PRG1、TRIB2、IGF1、BMP4、SERPINI1、CD74、HLA-DRA、HLA-DRB、TGM2、DNCI1、MCAM、TFPI2、ARHGDIBの遺伝子（図２）が選ばれる。対象とされる遺伝子は必ずしもこれらのすべてを含めることを要しない。以下に説明する遺伝子発現パターンが認識できる程度の数の遺伝子が対象にされればよく、少なくとも複数の遺伝子が対象とされる。なお、遺伝子略名TRIB2は、TRB2と表記される場合もある。
【００２５】
上記に示す遺伝子は、一般に高い遺伝子発現強度を示すので有用であるが、以下の遺伝子を対象にすることもできる。すなわち、ADAMTS1、ABHD2、ADD3、ANXA10、ACLY、ATP6V1G3、BDNF、BRIP1、CDH6、CPA4、CDC25A、CHI3L1、F2R、F2RL1、CCND1、CKAP2、DNAH3、SMURF2、EFEMP1、DCBLD、ESM1、EDG2、LOC221810、GABRB1、GATA6、GMFG、HGF、HMGA2、PHLDB2、HTR7、MGC14161、DGKG、PRDM16、MCTP2、FLJ23033、FLJ35681、FLJ38725、C9orf72、LYPDC1、IF、IGFBP1、IGFBP3、IGFBP5、ITGA5、ITGB3、IFI30、IL6、KRT19、KRT23、KRTAP1-5、KRTHA4、KCTD16、KIAA1913、LXN、LEPR、Lrp2bp、MET、MICA、LF1、PR3、TN4、ASK、LAU、CTD4、4HA2、TGER1、ROS1、AB27B、AC2、GS4、ARRES1、LEKHK1、YPN、LC16A4、LC2A1、LC20A1、AMD3、UHW2、YT1、RPC4、CHL1の遺伝子（図３、４）のうちいずれか複数の遺伝子を選択することもできる。
【００２６】
なお、識別をしようとする間葉系幹細胞と線維芽細胞であることが明確な細胞集団について同時に遺伝子発現を調べることによってその間葉系幹細胞が線維芽細胞を含まない細胞集団であることを証明することができる。また、上記のように線維芽細胞よりも高い遺伝子発現を示す遺伝子についての遺伝子発現に限定することは、初代培養の間葉系幹細胞のようにmRNA発現強度を測定することが不可能なほどに均質性を有しない細胞を除外できるという意義を有する。
【００２７】
遺伝子群に関するmRNA発現強度とは、公知のPCR法、サザンブロッティング法あるいは、DNAマイクロアレイ法等によって求められる遺伝子発現状態の相対的な大きさの程度をいう。遺伝子群に関するmRNA発現強度は、上記のいずれの方法により求められるものであってもよい。
【００２８】
図式化とは、遺伝子群によって発現されたmRNA発現強度について全体として視覚的にみればどのような形態（遺伝子発現パターン）を有するか判断するための基礎になるグラフ又は図面をいう。遺伝子の類似度は系統や個体間の類似度を反映しているといわれるように、本発明は、間葉系幹細胞の遺伝子が類似であれば均質であるということに基礎をおいている。すなわち、複数の遺伝子から形成される図式化された遺伝子発現パターンが類似であれば間葉系幹細胞は均質であると判断される。
【００２９】
この類似性を判断するには基準の間葉系幹細胞との比較により判別するのがよい。そして、その基準となる基準間葉系幹細胞は、クローンであるのが好ましい。すなわち、多機能間葉系幹細胞であることが明らかな基準となるクローンから求めた遺伝子群についてのmRNA発現強度に関する遺伝子パターンと類似な遺伝子パターンを示す間葉系幹細胞はそのクローンと同質であると判断されるからである。なお、クローンとは、一個の細胞から無性生殖的に増殖した細胞をいう。
【００３０】
以下に、本発明に係る間葉系幹細胞の均質性識別方法の一実施例について説明する。図１は、上記の方法により得られた遺伝子発現パターンの一例を示す。図１は、各遺伝子を横軸に表し、縦軸にそのmRNA発現強度を表したグラフである。横軸の遺伝子番号は、図２に示す遺伝子に対応している。例えば、遺伝子番号２の遺伝子は、遺伝子略名がIGFBP7であり、遺伝子名称がinsulin-like growth factor binding protein 7を示す。図中のパラメータにおいて、C1〜C8はクローン番号を示し、massは前記クローンがクローン化される母胎となった母集団を示す。F1〜F4は、上記間葉系幹細胞を採取した人を含め異なる4人から採取したそれぞれの線維芽細胞を示す。なお、クローンC1〜C8は継代3回の細胞集団からクローン化した細胞、母集団はさらに継代した継代4回の細胞集団である。線維芽細胞は、継代回数が6から11の細胞である。
【００３１】
図１によると、クローンC1〜C8の遺伝子のmRNA発現強度とF1〜F4のmRNA発現強度とは強度レベルが異なり、それぞれ明確に区別されていることが分かる。また、クローンC1〜C8は個々の遺伝子をみると遺伝子の種類によってはmRNA発現強度のばらつきはあるが、全体としてみればそれぞれのクローンのmRNA発現強度を折れ線で示す図形（遺伝子パターン）は類似していることが分かる。また、母集団の遺伝子発現パターンをみると、クローンC1〜C8の遺伝子発現パターンに類似していることが分かる。
【００３２】
このような遺伝子発現パターンの類似性は、他の図形化によっても確認することができる。図５は、図１のクローンC1〜C8の遺伝子のmRNA発現強度について最も高い強度を示す直線を連結した上限線と、最も低い強度を示す直線を連結した下限線とで囲まれる範囲を斜線部で表し、母集団の遺伝子発現パターンを太い破線で示したグラフである。細い破線は、母集団の発現パターンを示す太い破線を上方に平行移動した折れ線である。図３によると、細い破線部のほとんどが斜線部分に含まれ、しかも、その細い破線部は、上限線と下限線のいずれかによく一致することが分かる。すなわち、クローンC1〜C8の遺伝子発現パターンと母集団の遺伝子発現パターンは近似しているということができる。
【００３３】
図６〜図９は、上記の遺伝子発現パターンを示すクローンの母集団（図１、５の太い破線で表される遺伝子発現を示す細胞集団）及び上記の継代培養で得た他の細胞集団について分化能を調べた試験結果を示す。これらの図から各細胞集団は多機能間葉系幹細胞であることが分かり、細胞集団は、脂肪分化、骨分化及び軟骨分化の３つの方向に分化する分化能を有し、分化誘導しない限りいずれの分化もしない細胞であることが分かる。以下に個々の試験結果について具体的に説明する。図６は、骨分化を行った結果、図７及び８は軟骨分化を行った結果、図９は脂肪分化を行った結果を示す。各図において横軸に示す記号は、細胞集団の番号を示し、パラメータの＋は分化誘導を行った細胞集団を示し、−は分化誘導を行わなかった細胞集団を示す。なお、M1〜M8は数人から得た間葉系幹細胞（母集団）の細胞集団記号を示す。
【００３４】
図６によると、骨分化誘導を行った細胞集団は骨分化誘導を行わなかった細胞集団よりも1μgDNA当たりのカルシウム量μgがいずれも10倍以上多く、各細胞集団は骨分化したことが分かる。さらに、アリザリン赤による染色試験においても、すべての細胞集団が十分に染色されており、骨分化されていることを確認した。すなわち、各細胞集団は骨分化能を有し、骨分化誘導を行わないと骨分化しないことが分かる。
【００３５】
また、図７に示すように、アルカリフォスファターゼ活性についても同様に、骨分化誘導を行った細胞集団の1min、1μgDNA当たりのアルカリフォスファターゼ活性は骨分化誘導を行わなかった細胞集団の数倍以上になっており、この結果から、各細胞集団は骨分化能を有し、骨分化誘導を行わないと骨分化しないことが分かる。
【００３６】
図８によると、軟骨分化誘導を行った細胞集団は軟骨分化誘導を行わなかった細胞集団よりも1μgDNA当たりのグリコサミノグルカン量μgがいずれも数倍以上多く、各細胞集団は軟骨分可能を有し、軟骨分化誘導を行わない限り軟骨分化をしないことが分かる。
【００３７】
また、図９によると、脂肪分化誘導を行った細胞集団は脂肪分化誘導を行わなかった細胞集団よりもOil-red-O（オイルレッドＯ）の吸光度540nmによる分光分析の強度は数倍以上になっており、各細胞集団は脂肪分化したことが分かる。そして、各細胞集団は脂肪分化能を有し、脂肪分化誘導を行わないと脂肪分化しないことが分かる。
【００３８】
なお、図１の遺伝子発現データは、腸骨由来の骨髄から採取した間葉系幹細胞を用いて以下に示す方法により求めた。まず、骨髄の採取方法は、シリンジとニードルを用いて骨髄を吸引・採取し、等量の200U/mLのヘパリンナトリウムを含む基本培地に添加し、転倒混和し、これを骨髄細胞液として常温にて保管した。基本培地は、DMEM（Sigma D6046相当品）、10%FBS、Penicillin-Streptomycin（Sigma P0781相当品）を用いた。
【００３９】
初代培養方法は、以下のように行った。すなわち、まず、骨髄細胞液に、クリーンベンチ内で適量の培地を加え、白血球数(WBC)と赤球数(RBC)を測定した。本例のように、腸骨由来の骨髄を用いる場合は、WBC/RBCの百分率が0.5%以上で、1mLの骨髄液当たりWBCが1000万個含まれていることが望ましい。つぎに、遠心し、遠心沈査に適量の培地を加えて培養皿(CORNING)に、WBCが1x105cells/cm2以上となるように播種し、37℃、5%CO2条件下で培養した。播種した3日後に浮遊細胞を除去し、新鮮な基本培地に交換した。その後、接着した細胞に1ng/mLのFGF-2を添加した。FGF-2は１日おきに添加した。
【００４０】
継代培養方法は、0.25% Trypsin、1mM EDTA・4Na (Gibco 25200-56  相当品)を用いて上記のように培養した細胞を培養皿から剥離させ、これに基本培地を適量添加した後、その細胞液を遠心力300gで遠心した。その後、遠心沈査に適量の基本培地を添加し、攪拌し、5000 個の細胞を100-mm培養皿(CORNING 430167相当品)に播種し、1ng/mLのFGF-2を含む10mLの基本培地で培養した。
【００４１】
遺伝子の複製方法は、以下のように行った。すなわち、First-strand cDNAは、1μgの全RNAからReverTra Ace-alpha(Toyobo)を用いて合成した。合成したcDNAを鋳型として、ABI Prism 7700 Sequence Detection System instrument and software(PE Applied Biosystems Inc., Foster City CA)を用いてReal time PCRを行った。解析に用いた遺伝子のプライマーとプローブとしては、PE Applied Biosystemsから購入したTaqMan Gene Expression AssaysまたはGene Expression Micro Fluidic Cardを用いた。
【００４２】
mRNA発現強度の測定は、各遺伝子について、ベータアクチンの遺伝子発現量で補正し、Comparative Ct法を用いて相対的なmRNAレベルを計算した。なお、統計解析は、Student's t-test を用いておこなった。
【００４３】
図６〜９のデータは以下の方法により求めた。すなわち、カルシウム量は、Gitelmanらの方法(Anal Biochem 18:521-531 1967)に準じた方法を用いて測定した。グリコサミノグルカン量は、sulfated GAG assay kit(Biocolor)を用い、Farndale らの方法(Connect Tissue Res 9:247-248 1982)に準じた方法を用いて測定した。アルカリフォスファターゼ活性は、Besseyらの方法(J Biol Chem 164:321-329 1946)に準じた方法を用いて測定した。オイルレッドOの相対強度の測定は、12wellプレートで培養した細胞に1well当たり1mLの0.3%オイルレッドO（WAKO154-02072）:水＝6：4に混合した溶液を添加し、37℃で15 分間染色した後、1well当たり4mLの水で3回洗浄し、これを1well当たり1mLのイソプロパノールを加えて30分間色素を溶出させ、その溶出液を分光光度計で波長540nmについて測定した。DNA量は、PicoGreen dsDNA Quantitation kit(Molecular Probes)を用いて測定した。
【００４４】
以上本発明に係る間葉系幹細胞の均質性識別方法について説明した。しかしながら、均質性識別の基準となる基準間葉系幹細胞は必ずしもクローン、あるいはクローンと同等な均質性を有する細胞集団でなくても良い。例えば、複数の異なる他人から得た間葉系幹細胞であっても良い。
【００４５】
図１０は、異なる４人P1〜P4から得た腸骨由来の間葉系幹細胞の1〜4回の継代培養された細胞集団に関し、図１と同様な方法で求めた遺伝子発現パターンである。図１１は、図１０のP1〜P4についての遺伝子のmRNA発現強度について最も高い強度を示す直線を連結した上限線と、最も低い強度を示す直線を連結した下限線とで囲まれる範囲を斜線部で表し、図１の母集団の遺伝子発現パターンを破線で併記したグラフである。
【００４６】
図１０において、横軸は遺伝子番号を示し、縦軸はmRNA発現強度を示す。遺伝子番号は、図２に示す遺伝子を示す。パラメータP1〜P4は異なる4人の骨髄間葉系幹細胞（母集団）のそれぞれの遺伝子発現パターンを示し、F1〜F4は図１の線維芽細胞の遺伝子発現パターンを併記したものである。図１０によると、全体的に見ればP1〜P4の遺伝子発現パターンは図１のクローンC1〜C8の遺伝子発現パターンとよく類似していることが分かる。また、P1〜P4の各遺伝子のmRNA発現強度は、線維芽細胞のmRNA発現強度とは強度レベルが異なり明確に区別されていることが分かる。
【００４７】
さらに、図１１によると、図１０と図１は類似度が高いことが分かる。すなわち、図１１と図５は類似しており、しかも、図１１において破線で示される図１の母集団の遺伝子パターンがP1〜P4の遺伝子発現の上限線と下限線に囲まれる斜線部によく含まれていることが分かる。さらに、図５の場合と同様に、図１１において破線を上方に移動すればその大部分が斜線部に含まれるようになることも分かる。
【００４８】
このように、判別を行おうとする間葉系幹細胞においてその均質性を判断するための基準となる多機能間葉系幹細胞は、クローンに限らずその母集団あるいは異なる人から採取された多機能間葉系幹細胞であっても良いことが分かる。
【００４９】
以上説明したように、図式化された遺伝子発現パターンの類似性を判断することにより、間葉系幹細胞の同質性又は均質性を判別することができる。この遺伝子発現パターンの類似性を判別するために他の図式化を用いることができる。例えば、図１２に示す棒グラフ表示を用いることができる。図１２は、図１０に示すP1〜P4ついてのmRNA発現強度を遺伝子ごとに棒グラフで表したものである。
【００５０】
図１２によると、各遺伝子についてのmRNA発現強度にばらつきが見られるが、そのばらつきは大きくなく、そのバラツキの平均値からみれば小さいことが分かる。すなわち、例えば、予め均一な細胞集団から求められた遺伝子発現強度の平均値を基準とし、その平均値と判別しようとする間葉系幹細胞の遺伝子のmRNA発現強度との分散和が、所定の範囲内にあるならば、その判別しようとする間葉系幹細胞は、均質な多機能間葉系幹細胞であるとすることができる。なお、上記において、平均値として単純平均値を用いることができるが、必ずしも単純平均値でなくてもよい。所定の加重平均値を用いることができ、また、クローンの遺伝子が発現するmRNA発現強度を基準とすることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】継代培養された間葉系幹細胞の遺伝子群に関するmRNA発現強度を図式化したグラフである。
【図２】図１に遺伝子番号で示す記号の遺伝子略称、名称及びGenBank 登録番号を示す説明図である。
【図３】図２の遺伝子に準ずる遺伝子に関する遺伝子略称、名称及びGenBank 登録番号を示す説明図である。
【図４】図２の遺伝子に準ずる遺伝子に関する遺伝子略称、名称及びGenBank 登録番号を示す説明図である。
【図５】図１のグラフを加工した図である。
【図６】数人の間葉系幹細胞（母集団）の骨分化能を示すグラフである。
【図７】数人の間葉系幹細胞（母集団）の骨分化能を示すグラフである。
【図８】数人の間葉系幹細胞（母集団）の軟骨分化能を示すグラフである。
【図９】数人の間葉系幹細胞（母集団）の脂肪分化能を示すグラフである。
【図１０】異なる4人から得た間葉系幹細胞を継代培養し、その細胞集団の遺伝子群に関するmRNA発現強度を図式化したグラフである。
【図１１】図１０グラフを加工した図である。
【図１２】図１０の４人に関するmRNA発現強度を棒グラフ表示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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