(57)【要約】【課題】有効な腫瘍マーカーを見出し、それに対する特異的なモノクローナル抗体を提供する。また、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。さらに、該モノクローナル抗体を利用した腫瘍マーカータンパク質の検出方法、延いては癌細胞の検出方法、及びそのような癌細胞の検出方法に使用するキットを提供する。【解決手段】セプチン２タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体；大腸癌細胞又は腎癌細胞由来のセプチン２タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体；上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ；上記モノクローナル抗体を用いてサンプル中のセプチン２タンパク質を検出することを特徴とする、セプチン２タンパク質の検出方法又は癌の検出方法；上記モノクローナル抗体を含む癌の検出用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セプチン２タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体。
【請求項２】
大腸癌細胞又は腎癌細胞由来のセプチン２タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体。
【請求項３】
受託番号がFERM AP-20511又はFERM AP-20512であるハイブリドーマにより産生される、セプチン２タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項５】
受託番号がFERM AP-20511又はFERM AP-20512である請求項４記載のハイブリドーマ。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載のモノクローナル抗体を用いてサンプル中のセプチン２タンパク質を検出することを特徴とする、セプチン２タンパク質の検出方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項記載のモノクローナル抗体を用いて、癌細胞に由来するセプチン２タンパク質を検出することを特徴とする、癌の検出方法。
【請求項８】
大腸癌又は腎癌の検出方法である請求項７の癌の検出方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項記載のモノクローナル抗体を含む癌の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セプチン２タンパク質、とりわけ癌細胞に由来するセプチン２タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体、及び該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。本発明はさらに、上記のモノクローナル抗体を利用するセプチン２タンパク質の検出方法、特に癌細胞の検出方法、及びそのような検出方法に使用するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞の確認・特性づけは、癌の診断及び治療において重要な項目である。近年、特異性の高いモノクローナル抗体の製造が可能となったことにより、癌の診断の領域は著しく進歩した。ここで癌検出のターゲットとして癌細胞の産生物があり、具体的に癌細胞が産生する特異的タンパク質が挙げられる。このようなターゲットは一般に腫瘍マーカーとも称される。従来、よく知られている腫瘍マーカーの例としてα-フェトプロテイン（AFP)や癌胎児性抗原（CEA)などがある。一方、腫瘍マーカーは正常時においても検出されるケースもあり、癌診断の優れた指標が求められている。
近年、癌の検出への利用の分野で、ヒト由来ブラディオンタンパク質（セプチン４タンパク質）が大腸癌や皮膚癌に関連することが報告され（特許文献１）、及びブラディオンタンパク質が大腸癌又は前立腺癌に関連することが報告され（特許文献２）、そのほか、ヒト乳癌や卵巣癌においてセプチン９遺伝子に異常が生じていることが報告されており（非特許文献１及び２参照）、セプチンタンパク質と癌との関係が注目されている。
【０００３】
セプチンは酵母からヒトまで普遍的に存在するタンパク質であり、進化的によく保存されているGTP結合ドメインをもつタンパク質ファミリーである。ヒトではセプチンファミリータンパク質は１２種類が報告されており、細胞内でフィラメント状の構造を形成する。セプチンタンパク質は細胞分裂に欠陥のある酵母の研究から発見された。セプチンタンパク質は細胞質分裂に必須であり、セプチンが発現していない変異体は細胞分裂ができず、最後には増殖を停止する。現在はその他にも多様な役割を担っていると考えられている。例えば、神経系においてセプチンファミリータンパク質が発現しており、神経網の構築と高次脳機能に重要と考えられている。GTP結合タンパク質としての正確な役割は明らかでないが、他のタンパク質との結合能が変化するような形態的な変化に関係していることが示唆されている。
近年、癌の検出方法や癌の診断薬の開発が進む中、癌の診断のより一層優れた指標が要求されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１６１３８４号公報
【特許文献２】国際公開第０３／０５２１０２号パンフレット
【非特許文献１】Russell SEら著, Cancer Research, 2000年, Vol. 60, p.4729-4734
【非特許文献２】Kalikin LMら著, Genomics, 2000年, Vol. 63, p.165-172
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、有効な腫瘍マーカーを見出し、それに対する特異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び該モノクローナル抗体を利用した腫瘍マーカータンパク質の検出方法、延いては癌細胞の検出方法、及びそのような癌細胞の検出方法に使用するキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねる中で、癌細胞のセプチンタンパク質の発現を測定したところ、大腸癌や腎癌においてセプチン２タンパク質の発現量が増加していることを見出した。さらに、セプチン２タンパク質が有効な腫瘍マーカーとなることに注目し、セプチン２タンパク質に対する抗体を用いた免疫測定系を構築することで癌の診断が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
従って本発明は、セプチン２タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体である。本発明の上記モノクローナル抗体は具体的に、大腸癌細胞又は腎癌細胞由来のセプチン２タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体である。
本発明はまた、受託番号がFERM AP-20511又はFERM AP-20512であるハイブリドーマにより産生される、セプチン２タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体である。
本発明はさらに、上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであり、その具体例として受託番号がFERM AP-20511又はFERM AP-20512であるハイブリドーマがある。
本発明はさらに、上記モノクローナル抗体を用いてサンプル中のセプチン２タンパク質を検出することを特徴とする、セプチン２タンパク質の検出方法に向けられている。本発明はまた、上記のモノクローナル抗体を用いて、癌細胞に由来するセプチン２タンパク質を検出することを特徴とする、癌の検出方法に向けられている。本発明の癌の検出方法は具体的に大腸癌又は腎癌の検出方法として用いられる。
本発明はさらに、上記のモノクローナル抗体を含む癌の検出用キット、具体的には大腸癌又は腎癌の検出用キットに向けられている。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、癌の診断に有用なモノクローナル抗体が提供され、また該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが提供される。本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫測定系により、簡便かつ迅速に癌を検出、診断することが可能となり、癌の早期発見・予後の診断に大いに寄与すると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のモノクローナル抗体は、セプチン２タンパク質、具体的には大腸癌細胞又は腎癌細胞に由来するセプチン２タンパク質と特異的に反応するものである。本発明のモノクローナル抗体のグロブリンタイプは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよい。特にＩｇＧタイプが挙げられる。
［免疫原の調製］
本発明のモノクローナル抗体を作製するにあたり、免疫原（抗原）とするタンパク質を用意する。免疫原としてはヒトセプチン２タンパク質を用いる。
セプチン２タンパク質は、１２種類あるセプチンファミリータンパク質のうちの一つである。セプチン２タンパク質は361個の完全長のアミノ酸配列からなる（配列番号１）。ヒトセプチン２タンパク質のアミノ酸配列及び当該タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２）は、GenBankにおいて公開されている。GenBankにおける番号はNM_004404である。従って、このようなアミノ酸配列を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法などによる合成法により、免疫原とするヒトセプチン２タンパク質を得ることができる。
あるいは、公知の遺伝子組換え手法を用いて、ヒトセプチン２タンパク質をコードするｃＤＮＡの情報を用いてヒトセプチン２タンパク質を生産することができる。
【０００９】
以下に、遺伝子組換え手法を用いたヒトセプチン２タンパク質の一般的な生産方法について説明する。
セプチン２タンパク質生産用組換えベクターは、公開されているｃＤＮＡ配列を適当な発現ベクターに連結することにより得ることができる。さらに形質転換体は、セプチン２タンパク質生産用組換えベクターを、セプチン２タンパク質が発現し得るように適当な宿主中に導入することにより得られる。
発現ベクターとしては、宿主微生物で自立的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド（例えばpET15b、pET21a、pGEX4T、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19など）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5など）、酵母由来のプラスミド（例えば例えばYEp13、YEp24、YCp50など）などが挙げられる。ファージＤＮＡとしてλファージ（λgt11、λZAPなど）が挙げられる。さらに、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００１０】
発現ベクターにヒトセプチン２タンパク質ｃＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
また、セプチン２タンパク質生産用組換えベクターには、プロモーター、ヒトセプチン２タンパク質ｃＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）などが連結されていてもよい。
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、セプチン２タンパク質生産用組換えベクターを作製する。
【００１１】
形質転換体とする宿主としては、ヒトセプチン２タンパク質を発現できるものであればよく、限定されるものではない。例えば細菌（大腸菌、枯草菌など）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞などが挙げられる。例えば細菌を宿主とする場合は、セプチン２タンパク質が該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、ヒトセプチン２タンパク質ＤＮＡ，転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌として例えばエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）JM109などが挙げられ、枯草菌としては例えばバチルス・ズブチリス（Bacilllus subtilis）などが挙げられる。中でも大腸菌が好ましく使用される。プロモーターは、大腸菌などの宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。
細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばリン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）などが挙げられる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞などを宿主とする場合には、同様に、当技術分野で公知の手法に従って、ヒトセプチン２タンパク質を生産することができる。
【００１２】
本発明において免疫原として使用するヒトセプチン２タンパク質は、上記のように作製した形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。この培養物は培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞もしくは菌体の破砕物のいずれか適当なものを意味する。形質転換体を培地で培養する方法や条件は、宿主によって適宜選択して行うことができる。
大腸菌や酵母などの微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
培養は通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間程度行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機酸、有機酸又はそれらの塩類、アルカリ溶液などを用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
【００１３】
培養後、ヒトセプチン２タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、ヒトセプチン２タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離などにより菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物からヒトセプチン２タンパク質を単離精製することができる。
ヒトセプチン２タンパク質が得られたことを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（略称：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などにより確認することができる。
【００１４】
こうして得られたセプチン２タンパク質を適当な緩衝液に溶解して免疫原を調製する。必要に応じて、免疫を効果的に行うためにアジュバントを添加してもよい。アジュバントとしては、例えば市販のフロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ＢＣＧ、水酸化アルミニウム、百日咳加熱死菌ワクチンなどが挙げられ、これらの混合物を使用してもよい。
【００１５】
［免疫及び抗体産生細胞の採取］
上述の免疫原を、哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのBALB/c）、ウサギなどに投与する。特にマウスが使用される。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり一般的に約１０〜５００μｇである。免疫は主として静脈内、皮下、腹腔内に免疫原を注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１週間から４週間間隔で、２〜６回、好ましくは３〜４回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中で抗体価の測定をELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay、酵素標識イムノメトリックアッセイの一種）法などにより繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したときに、免疫原を静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。最終免疫の日から２〜５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。
抗体産生細胞としては脾臓細胞、リンパ節細胞、抹消血細胞、胸腺細胞などが挙げられるが、脾臓細胞を用いるのが一般的である。かかる抗体産生細胞は、免疫動物から脾臓、リンパ節、抹消血、胸腺などを摘出又は採取し、これら組織を破砕し、得られる破砕物をPBS、DMEM、RPMI1640、E-RDFなどの培地又は緩衝液に懸濁し、任意に200〜250μmのステンレスメッシュなどでろ過後、遠心分離を行うことなどに調製する。
【００１６】
［細胞融合］
ハイブリドーマを得るため、上述のように免疫動物から得た抗体産生細胞とミエローマ（骨髄腫）細胞との細胞融合を行う。
抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、マウスなどの動物の一般に市場で入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。一般的に8-アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチン-グアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼを欠損し（HGPRT-)、HAT培地に生育できない。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、BALB/cマウス由来のヒポキサンチン-グアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)欠損細胞株である、P3X63-Ag.8株（ATCC TIB9)、P3X63-Ag.8.U1株（癌研究リサーチソースバンク(JCRB)9085)、P3/NSI/1-Ag4-1株（JCRB 0009)、P3x63Ag8.653株（JCRB 0028)、又はSp2/0-Ag14株（JCRB 0029)などが挙げられる。
【００１７】
次に、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないMEM、DMEM、RPMI-1640、E-RDFなどの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合比１：１〜２０：１（細胞数）で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量1,000〜6,000のポリエチレングリコール、ポリビニールアルコール、センダイウイルスなどの融合促進剤や融合ウイルスを約10〜80％の濃度で使用することができる。また、場合によっては、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００１８】
［ハイブリドーマの選別及びクローニング］
細胞融合処理後の細胞から、目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有 RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マクロタイタープレート上に１×105〜１×106個/ウェル程度まき、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は、２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ミエローマ細胞が HGPRT欠損株又はチミジンキナーゼ(TK)欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（HAT培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞のハイブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始後、約１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採取し、酵素標識イムノアッセイ（ELISA やEIA: Enzyme Immuno Assay, エンザイムイムノアッセイ）、ラジオイムノアッセイ（RIA: RadioImmuno Assay）などによって行うことができる。
【００１９】
融合細胞のクローニングは、限界希釈法などにより行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。本発明のハイブリドーマは、大腸癌細胞又は腎癌細胞に由来するセプチン２タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体を産生、分泌するものである。
本発明者は、抗セプチン２モノクローナル抗体の産生が認められたハイブリドーマ６種に201E2、201H4、201G9、201C12、201A2、及び201E8と名称を付けた。そのうち201E2、及び201H4は、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、2005年４月16日に、それぞれFERM AP-20511、及びFERM AP-20512として寄託されている。これらのハイブリドーマは、ハイブリドーマ 201E2 がサブクラス IgG2a(κ）のモノクローナル抗体を産生するもので、その他の５種はサブクラスIgG1(κ）のモノクローナル抗体を産生するものである。
ハイブリドーマ201E2が産生するモノクローナル抗体201E2（以下、簡単に抗体201E2とも称し、他の抗体も同様に称する。）は、セプチン２タンパク質のアミノ酸No.267-334の位置に結合することができる。ハイブリドーマ201H4が産生するモノクローナル抗体201H4は、セプチン２タンパク質のアミノ酸No.200-267の位置に結合することができる。その他の抗体201G9、201C12、201A2、及び201E8は、セプチン２タンパク質のアミノ酸No.200-267の位置に結合することができる。
本発明のハイブリドーマは、上述した手法に従って作製し、スクリーニングしたものであれば上記したものに限定されるものでない。
【００２０】
［モノクローナル抗体の採取］
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法などを採用することができる。
細胞培養法においては、ハイブリドーマを10％ウシ胎児血清含有 RPMI-1640 培地、MEM 培地又は無血清培地などの動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％CO2濃度）で２〜１０日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×106〜１×107個程度投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして１〜２週間後に腹水又は血清を採取する。
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製されたモノクローナル抗体を得ることができる。
【００２１】
［セプチン２タンパク質の検出方法、癌の検出方法］
上記のようにして得られたモノクローナル抗体を、適当なサンプル中にセプチン２タンパク質が存在するか否かの確認に、すなわちセプチン２タンパク質の検出方法に利用することができる。
本発明のセプチン２タンパク質の検出方法の実施態様として、上記のモノクローナル抗体を用いて、癌細胞に由来するセプチン２タンパク質を検出することが可能である。セプチン２タンパク質は大腸癌細胞あるいは腎癌細胞で発現することが判明し、よって、具体的に上記のモノクローナル抗体を用いて、大腸癌又は腎癌の検出方法を実施することができる。
本発明のセプチン２タンパク質の検出方法あるいは癌の検出方法においては、抗体を用いる免疫学的測定法であればいずれの手法を採用してもよく、その測定で使用する抗体として本発明のモノクローナル抗体を用いることができる。そのような測定法としては、酵素標識イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡやＥＩＡなど）、蛍光標識イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、発光イムノアッセイ、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応、ウェスタンブロット法などが挙げられる。中でも、ＥＬＩＳＡ法やウェスタンブロット法がよく使用される。
本発明の検出方法において被検対象となるサンプルとしては、癌細胞、特に大腸癌細胞や腎癌細胞に由来するセプチン２タンパク質が含まれる可能性のある生体サンプルであれば、特に限定されるものではない。例えば血液、血清、血漿、リンパ球培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹水などが挙げられ、細胞又は臓器の抽出液なども使用することができる。特に尿、血液、組織や細胞の抽出液のようなサンプルにおいて、本発明のモノクローナル抗体を用いて得られたセプチン２タンパク質の測定値は、大腸癌や腎癌の指標として有用である。
【００２２】
本発明の検出方法を、酵素標識イムノアッセイ、蛍光標識イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、又は発光イムノアッセイなどの標識を用いた免疫測定法により実施する場合には、本発明のモノクローナル抗体を固相化するか、又はサンプル中の成分を固相化して、それらの免疫学的反応を行うことが好ましい。
固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体などの材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片などの形状の不溶性担体を用いることができる。固相化は、固相担体と本発明のモノクローナル抗体又はサンプル成分とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用などの公知の方法に従って、結合させることにより行うことができる。
【００２３】
上述のような標識を用いた免疫測定法では、本発明のモノクローナル抗体と、サンプル中のセプチン２タンパク質との反応を容易に検出するために、本発明のモノクローナル抗体を標識することにより該反応を直接検出するか、又は標識二次抗体を用いることにより間接的に検出する。本発明の検出方法においては、感度の点で、後者の間接的検出（例えばサンドイッチ法など）を利用することが好ましい。
標識物質としては、酵素標識イムノアッセイの場合には、パーオキシダーゼ（POD)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼ又はビオチン-アビジン複合体などが挙げられ、蛍光標識イムノアッセイの場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリアジンイソチオシアネート、Alexa480又はAlexaFluor488などが挙げられ、またラジオイムノアッセイの場合にはトリチウム、ヨウ素125又はヨウ素131などを用いることができる。また、発光イムノアッセイでは、NADH-FMNH2-ルシフェラーゼ系、ルミノール-過酸化水素-POD系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系などを用いることができる。
標識物質と抗体との結合法は、酵素標識イムノアッセイの場合にはグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又は過ヨウ素酸化法などの公知の方法を、ラジオイムノアッセイの場合にはクロラミンＴ法、ボルトンハンター法などの公知の方法を用いることができる。
【００２４】
測定の操作法は、公知の方法、例えば日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」、臨床病理刊行会、１９８３年；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」、第３版、医学書院、１９８７年；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定法」、共立出版、１９８７年；入江實編「ラジオイムノアッセイ」、講談社サイエンティフィック、１９７４年；入江實編「続ラジオイムノアッセイ」、講談社サイエンティフィック、１９７９年などにある方法を採用することができる。
【００２５】
本発明のモノクローナル抗体を直接標識する場合には、サンプル中の成分を固相化し、標識した本発明のモノクローナル抗体と接触させて、セプチン２タンパク質−本発明のモノクローナル抗体の複合体を形成させる。そして未結合の標識モノクローナル抗体を洗浄分離して、結合標識モノクローナル抗体量又は未結合標識モノクローナル抗体量よりサンプル中のセプチン２タンパク質量を測定することができる。
また、標識二次抗体を用いる場合には、本発明のモノクローナル抗体とサンプルとを反応させ（一次反応）、さらに標識二次抗体を反応させる（二次反応）。一次反応と二次反応は逆の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいし、又は時間をずらして行ってもよい。一次反応及び二次反応により、固相化したセプチン２タンパク質−本発明のモノクローナル抗体−標識二次抗体の複合体、又は固相化した本発明のモノクローナル抗体−セプチン２タンパク質−標識二次抗体の複合体が形成する。そして未結合の標識二次抗体を洗浄分離して、結合標識二次抗体量又は未結合標識二次抗体量よりサンプル中のセプチン２タンパク質量を測定することができる。
具体的に、酵素標識イムノアッセイの場合は酵素標識にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成物の量を光学的方法などにより測定する。蛍光標識イムノアッセイの場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、ラジオイムノアッセイの場合には放射性物質標識による放射能量を測定する。発光イムノアッセイの場合は発光反応系による発光量を測定する。
【００２６】
本発明の検出方法を、免疫比濁法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応などの免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、目視的に測る測定法により実施する場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液などを用いることができ、更にポリエチレングリコールなどの反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませもよい。
本発明の検出方法の一実施態様として、本発明のモノクローナル抗体を一次モノクローナル抗体として使用する方法の例を挙げる。先ず本発明のモノクローナル抗体を一次モノクローナル抗体として不溶性担体に固定する。そして好ましくは、抗原が吸着していない固相表面を、抗原とは無関係のタンパク質（仔ウシ血清、ウシ血清アルブミン、ゼラチンなど）によりブロッキングする。続いて、固定化された一次モノクローナル抗体と被検サンプルとを接触させる。次いで、上記一次モノクローナル抗体と異なる部位で、セプチン２タンパク質と反応する標識二次抗体とを接触させ、該標識からの信号を検出する。
ここで用いる「一次モノクローナル抗体と異なる部位で、セプチン２タンパク質と反応する二次抗体」は、一次モノクローナル抗体とセプチン２タンパク質との結合部位以外の部位を認識する抗体であれば特に制限はなく、免疫原の種類を問わず、ポリクローナル抗体、抗血清、モノクローナル抗体のいずれでもよく、またこれらの抗体のフラグメント（Fab、F(ab')2、Fab' など）を用いることもできる。更に、二次抗体として複数種のモノクローナル抗体を用いてもよい。
またこれとは逆に、本発明のモノクローナル抗体に標識を付して二次抗体とし、本発明のモノクローナル抗体と異なる部位で、セプチン２タンパク質と反応する抗体を一次抗体として不溶性担体に固定し、この固定化された一次抗体と被検サンプルとを接触させ、次いで、二次抗体として標識を付した本発明のモノクローナル抗体とを接触させ、前記標識から信号を検出してもよい。
【００２７】
本発明の検出方法の好ましい実施態様として、ウェスタンブロット法を採用した検出方法がある。ウェスタンブロット法による具体的な操作法は、公知の方法を使用することができる。以下にウェスタンブロット法の操作の例を挙げる。
細胞抽出液、細胞破砕液、組織ホモジネートなどのサンプルをスラブ型のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって分離し、ゲル中に泳動分離されたタンパク質バンドを電気的にろ紙やフィルター（例えばニトロセルロースフィルター、ＰＶＤＦ膜（ポリビニリデンフルオリド膜）、ナイロンメンブレンなど）へ転写する。この操作を一般的にブロッティングと呼んでいる。ブロッティングにはろ紙やフィルターなど全体を緩衝液中に浸漬して通電するウェット法と、ろ紙やフィルターなど必要な部分だけに緩衝液を浸み込ませて通電するセミドライ法とがある。本発明の検出方法ではいずれの方法も採用できる。こうしてタンパク質をブロットしたフィルターは、ウシ血清アルブミン、脱脂粉乳溶液、ゼラチン又はカゼインなどでブロックした後、本発明のモノクローナル抗体（一次抗体）と反応させ、セプチン２タンパク質の存在を検出する。この検出には一次抗体に適当な標識をつけて検出する直接法が可能であるが、以下の間接法を用いることが多い。
一次抗体を作用させた後、その一次抗体を認識する二次抗体（例えば一次抗体がマウス由来であるときは抗マウスＩｇ抗体などを用いる）を作用させ、二次抗体を種々の方法で検出する方法を間接法と称する。このような二次抗体の検出法には、二次抗体を、上記のラジオイムノアッセイで挙げた標識、例えばヨウ素125又はヨウ素131などで標識しオートラジオグラフィーを行う方法や、二次抗体を上述の酵素標識イムノアッセイで挙げた標識、例えばパーオキシダーゼなどの酵素で標識し、基質を発色させる方法などが用いられる。
こうしてサンプル中のセプチン２タンパク質の存在を検出することができる。
【００２８】
本発明のモノクローナル抗体は、癌細胞に由来するセプチン２タンパク質と特異的に反応するので、上記のモノクローナル抗体を含む癌の検出用キット、具体的には大腸癌又は腎癌の検出用キットが提案できる。
本発明の癌の検出用キットは、本発明のモノクローナル抗体を含むものであり、その他に、該モノクローナル抗体を用いる免疫学的手法の実施に使用する材料を収容することができる。例えばＥＬＩＳＡ法の手法を利用する検出用キットであれば、捕捉抗体固相化プレート、ブロッキング剤、希釈液、緩衝液、検出用一次抗体、検出用二次抗体、発色液、発色停止剤などを収容する。またウェスタンブロット法を利用する検出用キットであれば、ブロッキング剤、緩衝液、検出用一次抗体、検出用二次抗体、発色液、希釈液などを収容する。
上記のキットにおいて、本発明のモノクローナル抗体は凍結品、安定剤入液状、抗菌剤入液状、凍結乾燥品などの態様で収容されてよい。
また、本発明の癌の検出用キットは、本発明のモノクローナル抗体を使用して免疫クロマト法を実施するためのキットであってもよい。このようなキットは例えば免疫クロマト用テストストリップを含んでもよい。免疫クロマト用テストストリップは、例えばサンプルを吸収しやすい材料からなるサンプル受容部、試薬（本発明のモノクローナル抗体）を含有する試薬部、サンプルと試薬との反応物が移動する展開部、展開してきた反応物を呈色する標識部、呈色された反応物が展開してくる提示部などから構成されるものである。サンプル受容部にサンプルを与えることで、サンプル受容部はサンプルを吸収してサンプルを試薬部にまで到達させ、試薬部においてサンプル中のセプチン２タンパク質と本発明のモノクローナル抗体との反応が起こり、反応した複合体のみが展開部を移動して標識部に到達する。標識部においては、上記反応複合体と標識二次抗体との反応が起こって、その標識二次抗体との反応物が提示部にまで展開すると呈色が認められることになる。
【００２９】
以下に実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。本発明はこれらの記載に限定されるものではない。
［実施例１］
組換えセプチン２タンパク質の作製
セプチン２遺伝子を発現用プラスミドベクターに組み込み、組換えセプチン２タンパク質を作製した。
ヒト癌細胞株（腎癌細胞 Caki-2）より調製したcDNAを鋳型としてPCR反応によりセプチン２遺伝子DNA断片を得た。このDNA断片を制限酵素で消化した発現ベクターpET15bに、フレームを合わせて連結させ、pET15b＋セプチン２ベクターを得た。pET15b＋セプチン２ベクターを大腸菌BL21に形質転換し形質転換菌を得た。この大腸菌をLB培地中で対数増殖期まで増殖させた後、IPTGを添加し（終濃度0.2mM）、37℃でさらに3時間培養を続け、セプチン２タンパク質の発現誘導を行なった。遠心分離により培養液から集菌し、緩衝液に懸濁し、超音波破砕機により細胞を破砕した。細胞破砕液にSDS含有緩衝液を加え、SDS-PAGEにより分離することで組換えセプチン２タンパク質を精製した。この組換えセプチン２タンパク質を免疫原として免疫に用いた。
【００３０】
［実施例２］
マウスの免疫とハイブリドーマの作製
実施例１で得られた組換えセプチン２タンパク質を0.5mg/mlに調製し、等量のフロイント完全アジュバントと混合し乳化した。この乳化液400μlをマウス腹腔内に注射した。その後10日毎に等量のタンパク質を３回追加免疫し、最終免疫の３日後にマウスの脾臓を摘出した。
脾臓をRPMI1640培地中で断片化し、ピンセットで細胞を押し出し、遠心分離（1,000rpm、５分）した後、上清を捨てた。ペレットを0.17M塩化アンモニウム液で10分処理し赤血球を破壊し、RPMI1640培地で遠心洗浄して融合用脾細胞とした。
上記脾細胞とあらかじめ培養していたマウス骨髄腫細胞（sp2/0-Ag14）を細胞数が脾細胞：骨髄腫細胞＝５：１になるように混合し、遠心分離（1,000rpm、５分）した。上清を取り除きペレットをよく解きほぐした後、37℃で50％ポリエチレングリコール1500溶液を1ml滴下し、チューブを１分間回転させることで混合した。次に、37℃に加温しておいたRPMI1640培地を１分毎に１mlずつ数回加えた後、RPMI1640培地を加えて全量を10mlとした。遠心分離（1,000rpm、５分）後、上清を捨てペレットをよく解きほぐし、HAT培地を加えて全量を100mlとした。この懸濁液を96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルずつ分注し、CO2インキュベーター（CO2濃度５％）中、37℃で約10日間培養した。
【００３１】
［実施例３］
ハイブリドーマの確立
抗セプチン２抗体を産生しているハイブリドーマを選択するために、ハイブリドーマ培養上清中に産生された抗体の有無を酵素免疫測定法（ELISA法）で測定し調べた。
96穴ELISAプレートの各ウェルに、組換えセプチン２タンパク質溶液（1μg/ml PBS）を100μlずつ分注し、４℃で一夜放置した。0.1％ Tween20/PBS（PBS-T）で３回洗浄した後、５％スキムミルク/PBSを100μl/ウェル分注し、室温で1時間放置した。
次に、ウェルに培養上清を100μlずつ加え、室温で１時間反応させた。
PBS-Tで３回洗浄した後、５％スキムミルク/PBS-Tで1,000倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体を100μlずつ加え、室温で１時間反応させた。
反応終了後、各ウェルを PBS-T で３回洗浄し、0.006％過酸化水素及び0.96mg/mlテトラメチルベンジジンを含む溶液100μlを各ウェルに加え、室温で30分間反応させた。反応後、各ウェルの655nmにおける吸光度を測定した。
【００３２】
その結果、1,500ウェル中９ウェルに抗セプチン２・モノクローナル抗体の産生が認められた。その９ウェル中の各ハイブリドーマを24穴プレートに移し、HT培地で培養した後、限界希釈法によりクローニングを行なった。
こうして得たクローンの中から、増殖が良好で抗体産生能が高いクローンを選択し、抗セプチン２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（６種類）を確立した。
得られたモノクローナル抗体のサブクラス決定は、マウス・モノクローナル・アイソタイピング・キット（大日本製薬）を用いて、その説明書に従って行なった。下記表１に、ハイブリドーマの性質をまとめた。
なお、これらのハイブリドーマの内２種類は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、2005年４月16日に、それぞれFERM AP-20511、及びFERM AP-20512として寄託されている。
【００３３】
【表１】
2007008844.tif 000002
【００３４】
［実施例４］
モノクローナル抗体の調製
13週齢のBALB/c系マウスにプリスタン0.5mlを腹腔内注射し、１週間飼育した。上記実施例３で得られた各種のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５×106個を腹腔内移植した。１〜２週間後、マウスから腹水を採取し、遠心分離で固形物を除去後、50%硫安で塩析した。
沈澱を0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）に溶解し、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）に対して透析した。この液を、あらかじめ0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）で平衡化したプロテインG-アガロースカラムに通した。モノクローナル抗体はカラム内に保持されるので、カラムを0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）で洗浄しその他の成分を除いた。モノクローナル抗体の溶出は、0.2Mグリシン（pH2.85）により行なった。溶出されたモノクローナル抗体は、PBSに対して透析して精製抗体液を得た。
【００３５】
［実施例５］
モノクローナル抗体の特異性測定
組換えセプチン２タンパク質のほかに、組換えセプチン１、セプチン４およびセプチン５タンパク質を調製した。モノクローナル抗体とこれら組換えタンパク質との反応をウェスタンブロット法で調べた。
ポリアクリルアミドゲルのウェルに組換えタンパク質溶液をアプライしSDS-PAGEを行ない、分離したタンパク質をゲルからPVDF膜に転写した。
PVDF膜を５％スキムミルク/PBSに浸し、４℃で一夜放置しブロッキングした。
モノクローナル抗体：５％スキムミルク/PBS＝1：1,000（w/v）の溶液をつくり、室温で１時間反応させ、PBS-Tで洗浄した（10分、３回）。
パーオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体を５％スキムミルク/PBSで1,000倍に希釈し、室温で１時間反応させた後、PBS-Tで洗浄した（10分、３回）。
ECL Western Blotting Detection System（アマシャム・バイオサイエンス社）を用い、プロトコールに従い化学発光法で検出した。
図１に、上記のウェスタンブロット法による抗セプチン２モノクローナル抗体と組換えセプチンタンパク質との反応を示す。作製したモノクローナル抗体は、組換えセプチン２タンパク質（分子量約45kDa）とのみ反応しており、他の３つの組換えタンパク質とは反応していない。作製した抗体がセプチン２タンパク質に特異的に反応する性質をもつことがわかる。なお、ここで使用した組換えセプチンタンパク質はタグを付加しているため分子量が理論値より若干大きくなっている。
【００３６】
［実施例６］
モノクローナル抗体の活性測定
上記のように調製した抗セプチン２モノクローナル抗体と大腸癌細胞株HT-29のセプチン２タンパク質、及び腎癌細胞株Caki-2のセプチン２タンパク質との反応をウェスタンブロット法で調べた。
培養フラスコでコンフルエントまで培養した大腸癌細胞株HT-29細胞を回収し、PBSで３回洗浄した。遠心分離で得られた細胞ペレットをPBSに懸濁しSDS溶液を添加し溶解させることで、タンパク質溶液を得た。大腸癌細胞株HT-29細胞と同様にして、腎癌細胞株Caki-2を培養し洗浄し、及び処理してタンパク質溶液を得た。
ポリアクリルアミドゲルのウェルに各タンパク質溶液をアプライしSDS-PAGEを行ない、分離したタンパク質をゲルからPVDF膜に転写した。
PVDF膜を5％スキムミルク/PBSに浸し、４℃で一夜放置しブロッキングした。
モノクローナル抗体：５％スキムミルク/PBS＝1：1,000（w/v）の溶液をつくり、室温で１時間反応させ、PBS-Tで洗浄した（10分、３回）。
パーオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体を５％スキムミルク/PBSで1,000倍に希釈し、室温で１時間反応させた後、PBS-Tで洗浄した（10分、３回）。次いで、ECL Western Blotting Detection System（アマシャム・バイオサイエンス社）を用い、プロトコールに従い化学発光法で検出した。
図２に、上記のウェスタンブロット法によるモノクローナル抗体と大腸癌細胞株HT-29及び腎癌細胞株Caki-2のタンパク質との反応を示す。抗体201E2と201H4は両細胞のセプチン２タンパク質（分子量約41kDa）と強く反応したが、その他の４抗体は比較的弱い反応を示した。
【００３７】
［実施例７］
腎癌検体からの検出
抗セプチン２モノクローナル抗体 201E2を用いて、ウェスタンブロット法により腎癌検体からセプチン２タンパク質の検出を行なった。
腎癌患者２名（Ａ、Ｂ）から摘出した組織のうち、癌部位とその周辺の正常部位から、TRIzol reagent（インビトロジェン社）を用いプロトコールに従いタンパク質溶液を調製した。１レーン当たり全タンパク質量として30μgをアプライし、SDS-PAGEを行なった。泳動後、分離したタンパク質をゲルからPVDF膜に転写した。
PVDF膜を５％スキムミルク/PBSに浸し、４℃で一夜放置しブロッキングした。
モノクローナル抗体201E2：５％スキムミルク/PBS＝1：1,000（w/v）の溶液をつくり、室温で1時間反応させ、PBS-Tで洗浄した（10分、３回）。
パーオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体を５％スキムミルク/PBSで1,000倍に希釈し、室温で1時間反応させた後、PBS-Tで洗浄した（10分、３回）。
ECL Western Blotting Detection System（アマシャム・バイオサイエンス社）を用い、プロトコールに従い化学発光法で検出した。
図３に、上記のウェスタンブロット法によるモノクローナル抗体201E2と腎癌患者２名より摘出した組織のうち癌部位とその周辺の正常部位のタンパク質との反応を示す。患者Ａ及びＢとも、癌部位のタンパク質のセプチン２タンパク質と反応したが、正常部位のタンパク質とは反応しなかった。
【００３８】
［実施例８］
細胞の免疫蛍光染色
大腸癌細胞株HT-29の懸濁液をスライドグラス上に塗抹し乾燥させた。10％ホルマリンで室温にて５分間処理することにより固定し、PBSで洗浄した。１％Triton X-100/PBSで処理し、PBSで洗浄した。３％BSA/PBSでブロッキングしPBSで洗浄した。一次抗体として上記実施例４で得られたモノクローナル抗体201E2の精製品（20μg/ml）を室温で１時間反応させた。これをPBSで洗浄後、二次抗体としてFITC標識抗マウスIgG抗体（ケミコン社）を20μl/mlで添加して、室温で1時間反応させた。PBSで洗浄後、封入して蛍光顕微鏡にて観察した。
その結果、癌細胞に蛍光が認められ、本発明のモノクローナル抗体によって癌細胞を陽性に染色することができることが判った（図４）。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ウェスタンブロット法による本発明のモノクローナル抗体と組換えセプチンタンパク質との反応を示す写真である。
【図２】ウェスタンブロット法による本発明のモノクローナル抗体と大腸癌細胞株HT-29のタンパク質、及び腎癌細胞株Caki-2のタンパク質との反応を示す写真である。
【図３】ウェスタンブロット法による、本発明モノクローナル抗体201E2と腎癌患者２名より摘出した組織のうち癌部とその周辺の正常部のタンパク質との反応を示す写真である。
【図４】本発明のモノクローナル抗体201E2を用い、免疫蛍光染色法により大腸癌細胞HT-29に存在するセプチン２タンパク質を染色して確認した写真である。
【図１】
2007008844.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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