(57)【要約】【課題】化学物質の発癌性をできるだけ正確かつ簡便に評価するための癌検定方法等を提供すること。【解決手段】  胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の検定出方法であって、（１）検体における、78-kDa glucose-regulated proteinの遺伝子の翻訳産物量を測定する第一工程、及び（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の翻訳産物量の測定値を当該遺伝子の翻訳産物量の対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における、胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の有無或いはその発生程度を評価する第二工程を有することを特徴とする方法。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の検定出方法であって、
（１）検体における、78-kDa glucose-regulated proteinの遺伝子の翻訳産物量を測定する第一工程、及び
（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の翻訳産物量の測定値を当該遺伝子の翻訳産物量の対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における、胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の有無或いはその発生程度を評価する第二工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
検体が、胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変組織を構成する肝細胞或いはその内容物が含まれる可能性のある生体試料であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
検体が、光学顕微鏡用組織標本であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
遺伝子の翻訳産物量の対照値が、当該遺伝子の正常組織又は正常細胞における翻訳産物量の値であることを特徴とする請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項５】
第二工程において、78-kDa glucose-regulated proteinの翻訳産物量の測定値が対照値よりも高いことを指標とし、当該指標に基づいて前記検体における、胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の有無或いはその発生程度を評価する工程であることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の方法。
【請求項６】
78-kDa glucose-regulated proteinの翻訳産物量の測定及びその測定値が、当該蛋白質を発現している細胞からなる細胞巣の面積又は当該細胞巣の数の測定及びその測定値であることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の方法。
【請求項７】
物質のラット肝発癌活性の検定方法であって、
（１）ラット肝細胞と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）第一工程で前記被験物質と接触させた前記肝細胞における、78-kDa glucose-regulated proteinの遺伝子の翻訳産物量を測定する第二工程、及び
（３）第二工程で得られた遺伝子の翻訳産物量の測定値を当該遺伝子の翻訳産物量の対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質のラット肝発癌活性の有無又はその量を評価する第三工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項８】
検体が、光学顕微鏡用組織標本であることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
遺伝子の翻訳産物量の対照値が、当該遺伝子の正常組織又は正常細胞における翻訳産物量の値であることを特徴とする請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
第三工程において、78-kDa glucose-regulated proteinの翻訳産物量の測定値が対照値よりも高いことを指標とし、前記被験物質のラット肝発癌活性の有無又はその量を評価することを特徴とする請求項７、８又は９記載の方法。
【請求項１１】
78-kDa glucose-regulated proteinの翻訳産物量の測定及びその測定値が、当該蛋白質を発現している細胞からなる細胞巣の面積又は当該細胞巣の数の測定及びその測定値であることを特徴とする請求項７、８、９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項７乃至１１のいずれかに記載される方法により評価されたラット肝発癌活性の有無又はその量に基づきラット肝発癌活性を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とするラット肝発癌物質の探索方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラットにおける胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の検定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌が遺伝子の関わる異常を原因とする疾病であることが次第に明らかになりつつあるが、癌に対する羅漢率、死亡率は未だ高い。このような状況において、様々な化学物質の発癌性の有無を事前に確認しておくための安全性試験は極めて重要である。従来、化学物質の発癌性を検定する代表的な方法としては、種々の脊椎動物（例えばラット）を用いた安全性試験において腫瘍マ−カ−を指標として用いることにより、発癌性の有無を評価する方法が知られている（非特許文献１及び非特許文献２参照）。
【０００３】
【非特許文献１】Ito, N., Imaida, K., Hasegawa, R., and Tsuda, H. Rapid bioassay methods for carcinogens and modifiers of hepatocarcinogenesis. CRC Crit.Rev.Toxdicol., 1989, vol.19, page 385-415.
【非特許文献２】Ito, N., Shirai, T., and Fukushima, S. Medium-term bioassay for carcinogens using multiorgan models. Prog.Exp.Tumor Res., 1991, vol.33, page 41-57.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、実験動物としてラットを使用する場合において、例えば、化学物質の発癌標的となる割合の最も高い器官若しくは組織の一つである肝臓の場合には、最も頻繁に用いられるラット肝臓腫瘍マ−カ−の一つである胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼの場合には、肝細胞中のペルオキシソ−ム数を増大させるペルオキシソ−ム増生剤により誘発される腫瘍性病変又は前腫瘍性病変を検出することはできない等の欠点があり、場合によっては必ずしも十分に満足のゆくものではなかった。
そこで、化学物質の発癌性をできるだけ正確かつ簡便に評価するためのラットにおける癌検定方法の開発が切望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
かかる状況の下、本発明者らは鋭意検討した結果、胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変組織を構成する肝細胞において、特定の遺伝子の翻訳産物量が隣接する正常組織での肝細胞における当該遺伝子の翻訳産物量に比べ増大していることを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変（以下、本病変と記すこともある。）の検定出方法であって、
（１）検体における、78-kDa glucose-regulated proteinの遺伝子の翻訳産物量を測定する第一工程、及び
（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の翻訳産物量の測定値を当該遺伝子の翻訳産物量の対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における、胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の有無或いはその発生程度を評価する第二工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明方法と記すこともある。）
２．検体が、胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変組織を構成する肝細胞或いはその内容物が含まれる可能性のある生体試料であることを特徴とする前項１記載の方法；
３．検体が、光学顕微鏡用組織標本であることを特徴とする前項１又は２記載の方法；
４．遺伝子の翻訳産物量の対照値が、当該遺伝子の正常組織又は正常細胞における翻訳産物量の値であることを特徴とする前項１、２又は３記載の方法；
５．第二工程において、78-kDa glucose-regulated proteinの翻訳産物量の測定値が対照値よりも高いことを指標とし、当該指標に基づいて前記検体における、胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の有無或いはその発生程度を評価する工程であることを特徴とする前項１、２、３又は４記載の方法；
６．78-kDa glucose-regulated proteinの翻訳産物量の測定及びその測定値が、当該蛋白質を発現している細胞からなる細胞巣の面積又は当該細胞巣の数の測定及びその測定値であることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の方法。
７．物質のラット肝発癌活性の検定方法であって、
（１）ラット肝細胞と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）第一工程で前記被験物質と接触させた前記肝細胞における、78-kDa glucose-regulated proteinの遺伝子の翻訳産物量を測定する第二工程、及び
（３）第二工程で得られた遺伝子の翻訳産物量の測定値を当該遺伝子の翻訳産物量の対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質のラット肝発癌活性の有無又はその量を評価する第三工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明肝発癌活性検定方法と記すこともある。）
８．検体が、光学顕微鏡用組織標本であることを特徴とする前項７記載の方法；
９．遺伝子の翻訳産物量の対照値が、当該遺伝子の正常組織又は正常細胞における翻訳産物量の値であることを特徴とする前項７又は８記載の方法；
１０．第三工程において、78-kDa glucose-regulated proteinの翻訳産物量の測定値が対照値よりも高いことを指標とし、前記被験物質のラット肝発癌活性の有無又はその量を評価することを特徴とする前項７、８又は９記載の方法；
１１．78-kDa glucose-regulated proteinの翻訳産物量の測定及びその測定値が、当該蛋白質を発現している細胞からなる細胞巣の面積又は当該細胞巣の数の測定及びその測定値であることを特徴とする請求項７、８、９又は１０記載の方法。
１２．前項７乃至１１のいずれかに記載される方法により評価されたラット肝発癌活性の有無又はその量に基づきラット肝発癌活性を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする肝発癌物質の探索方法等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によって、遺伝子の翻訳産物量の異常を指標としたラットにおける胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の検定方法等が提供可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において検体とは、例えば、胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変を構成する肝細胞或いはその内容物が含まれる可能性のある生体試料（例えば、光学顕微鏡用組織標本等）をあげることができ、具体的には、例えば、ラットから採取された肝臓組織等の組織或いはこれら組織から分離された細胞、又はその培養細胞等をあげることができる。これらの試料はそのまま検体として用いてもよく、また、かかる試料から分離、分画、固定化等の種々の操作により調製された試料を検体として用いてもよい。
本発明において利用される78-kDa glucose-regulated protein（以下、本蛋白質と記すこともある。）は、ヒートショック蛋白質７０（HSP70）ファミリーの一つに分類され、小胞体ストレスの際に細胞内に誘導されることが知られている蛋白質である。例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列等の公知のアミノ酸配列を有しており、当該蛋白は動植物に広く存在し、その分子量は約７８，０００で６５４アミノ酸残基からなる。
本発明において翻訳産物量が測定される78-kDa glucose-regulated proteinの遺伝子（以下、本遺伝子と記すこともある。）には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列と併記されている塩基配列等の公知の塩基配列と全く同一の塩基配列を有する遺伝子のほか、前記の遺伝子の塩基配列に、生物の種差（具体的には、ラットの系統差）、個体差若しくは器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が生じた塩基配列を有する遺伝子も含まれる。本遺伝子の翻訳産物量には、これらの遺伝子の翻訳産物量も含まれる。
【０００８】
本遺伝子の翻訳産物量の測定は、例えば、単位量の検体当たりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができる。
本遺伝子の翻訳産物量を測定するには、例えば、本蛋白質を発現している細胞からなる細胞巣の面積又は当該細胞巣の数を測定する。当該測定としては、例えば、免疫組織化学的検査法等を挙げることができる。
また、例えば、本遺伝子の塩基配列にコ−ドされるアミノ酸配列を有する蛋白質の量を測定する。特定の蛋白質の量の測定は、具体的には、例えば、当該蛋白質に対する特異抗体を用いた免疫学的測定法（例えば、ELISA、ウェスタンブロット、RIA、免疫組織化学的検査法等）、二次元電気泳動法、高速液体クロマトグラフィ−等により実施することができる。本遺伝子の塩基配列にコ−ドされるアミノ酸配列を有する蛋白質に対する特異抗体は、常法に準じて、本遺伝子の塩基配列にコ−ドされるアミノ酸配列を有する蛋白質を免疫抗原として調製することができる。
【０００９】
本発明検出方法において、免疫組織化学的検査法を用いて本遺伝子の検体における翻訳産物量を測定する方法についてさらに説明する。
まず、胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変組織を構成する肝細胞或いはその内容物が含まれる可能性のある生体試料であるラット肝臓組織を、例えば、４％パラホルムアルデヒドで４℃、一晩固定する。固定後、適当な大きさに当該組織を切り出す。切り出された組織をアルコール脱水、パラフィン包埋した後、これをミクロスライサーを用いて約４μmの厚さで薄切し、薄切された組織切片をスライドグラスに載せる。
次いで、当該組織切片からキシレンを用いてパラフィンを除去した後、必要に応じて抗原の賦活化処理を行う。賦活化処理としては、例えば、以下のように行う。0.01Mクエン酸緩衝液（pH6.0）にスライドグラスに載せた組織切片を浸漬し、これをオートクレーブで１２１℃、５分間処理する。その後、これを適当な温度まで冷却する。賦活化後、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻止するために、例えば、組織切片を３％過酸化水素水に５分間、室温で浸漬する。次いで、例えば、PBS buffer（組成：10mM リン酸ナトリウム ［pH7.4］, 100mM NaCl）で洗浄した後、当該組織切片に、必要に応じて一次抗体反応前の前処理を行う。当該前処理としては、例えば、二次抗体作製に用いた動物と同種の動物から調製された正常血清を当該組織切片にかけ、これを完全に覆った状態で室温、３０分間反応させればよい。当該前処理後、例えば、当該組織切片をPBS bufferで５分間×３回洗浄した後、当該組織切片に抗ラット本蛋白質抗体をかけ、これを完全に覆った状態で、例えば、室温、１時間反応させる。反応後、例えば、当該組織切片をPBS bufferで５分間×３回洗浄した後、二次抗体による反応を行う。例えば、当該組織切片に一次抗体の起源と同種の動物から調製されたビオチン化されたイムノグロブリンをかけ、これを完全に覆った状態で、例えば、室温、３０分間反応させる。更に、例えば、PBS bufferで５分間×３回洗浄した後、当該組織切片に３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ナカライ製）を用いて発色させる。その後、当該組織切片を蒸留水で洗浄し、脱水、透徹、封入等の各種処理を行う。本蛋白質の発現量の指標となる染色性が低い場合には、必要に応じて、例えば、Tyramideを用いた抗原増感法を用いることで染色性を高めることもできる。
次いで、染色された組織切片を用いて、本蛋白質を発現している細胞からなる細胞巣のの面積又は細胞巣の数を測定する。当該測定では、例えば、画像解析装置IPAP（住化テクノサービス製）を用いて染色性が確認された細胞巣の面積及び組織切片全体の面積をそれぞれ測定し、下記式により単位面積当たりの検出された細胞巣の面積を算出する。また、染色性が確認された細胞巣の数をカウントし、下記式により単位面積当たりの検出された細胞巣の数を算出する。
【００１０】
＜単位面積当たりの検出された細胞巣の面積＞
（染色性が認められた細胞巣の面積）/（組織切片全体の面積）
【００１１】
＜単位面積当たりの検出された細胞巣の数＞
（染色性が認められた細胞巣の数）/（組織切片全体の面積）
【００１２】
本遺伝子の翻訳産物量の測定は、上述のようにして、単位量の検体当たりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができる。
【００１３】
上記のようにして得られた前記検体における本遺伝子の翻訳産物量の測定値を、当該遺伝子の翻訳産物量の対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における、胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の有無或いはその発生程度を評価する。
当該評価において、第二工程で得られた遺伝子の翻訳産物量の測定値を当該遺伝子の翻訳産物量の対照値と比較すればよいが、この場合、例えば、上述のような免疫組織化学的検査法等によって本蛋白質を発現している細胞からなる細胞巣の面積又は当該細胞巣の数を測定する場合には、（１）前記検体において差異が認められる細胞からなる細胞巣を検出し、単位面積当たりの検出された細胞巣の面積又は検出された細胞巣の数と、（２）前記被験物質と接触させていないラット肝細胞における細胞からなる細胞巣を検出し、単位面積当たりの検出された細胞巣の面積又は検出された細胞巣の数とを比較し、その差異に基づいて前記被験物質の肝発癌活性の有無又はその量を評価してもよい。
本遺伝子の翻訳産物量の対照値としては、例えば、正常組織での細胞における当該遺伝子の翻訳産物量の値をあげることができる。ここで、正常組織とは、例えば、病理組織学的検査において異常の認められない組織を意味し、特に、翻訳産物量の測定をする方法として免疫組織化学的検査方法等を用いる場合には、翻訳産物量のシグナルが肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変を有する組織より明らかに弱い組織を示す。
かかる対照値は、正常組織での細胞における本遺伝子の翻訳産物量を、検体における当該遺伝子の翻訳産物量と併行して測定して求めてもよいし、別途測定して求めてもよい。また、複数の正常組織での細胞における本遺伝子の翻訳産物量を測定してその平均値を対照値としてもよい。
例えば、正常組織での細胞における本遺伝子の翻訳産物量の値を対照値として、検体における、本蛋白質の翻訳産物量の測定値が対照値よりも高ければ、検体中に胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変を有すると評価することができる。
【００１４】
本発明肝発癌活性検定方法においては、まず、ラット肝細胞と被験物質とを接触させる。用いられるラット肝細胞としては、ラットから採取された肝臓組織内に存在している状態にある肝細胞、或いは、当該組織から分離された細胞又はその培養細胞等があげられる。
【００１５】
本発明肝発癌活性検定方法において、肝細胞と被験物質との接触は、例えば、ラットに被験物質を投与することにより行ってもよい。ラットは、天然の動物のほか、トランスジェニック動物、遺伝子ノックアウト動物等であってもよい。ラットへの被験物質の投与方法としては、例えば、経口（強制又は飲料水や餌に混じ）、筋肉内、静脈内、皮下、腹腔内、経気道等により行うことができる。投与量、投与回数及び投与期間は、例えば、全身状態、全身諸器官組織等に重篤な影響を及ぼさない範囲内（例えば投与量は、最大耐量）とすればよい。
【００１６】
次に、上記のようにして被験物質と接触させたラット肝細胞における、78-kDa glucose-regulated proteinの遺伝子の翻訳産物量を、上述のようにして測定する。
本遺伝子の翻訳産物量の測定は、上述のようにして、単位量の検体当たりの本遺伝子の転写物量を測定する方法、単位量の検体当たりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができ、本遺伝子の転写物量を測定する方法を好ましくあげることができる。
【００１７】
上記のようにして被験物質と接触させた又はラット肝細胞から得られた本遺伝子の翻訳産物量の測定値を、当該遺伝子の翻訳産物量の対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質のラット肝発癌活性の有無又はその量を評価する。
本遺伝子の翻訳産物量の対照値としては、例えば、前記被験物質と接触させていないラット肝細胞における翻訳産物量の値をあげることができる。ラット肝細胞は、正常組織でのラット肝細胞における当該遺伝子の翻訳産物量の値を好ましくあげることができる。ここで正常組織とは、例えば、被験物質と接触していない肝臓組織で病理組織学的検査において異常の認められない組織を意味し、特に、翻訳産物量で測定する方法として免疫組織化学的検査方法を用いる場合には、被験物質と接触した肝臓組織であっても翻訳産物量のシグナルが、胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変組織よりも明らかに弱い組織を示す。
かかる対照値は、正常組織での細胞における本遺伝子の翻訳産物量を、被験物質と接触させた肝臓組織での細胞における当該遺伝子の翻訳産物量と併行して測定して求めてもよいし、別途測定して求めてもよい。例えば、被験物質と接触させる前の肝臓組織の一部を採取して本遺伝子の翻訳産物量を測定し、得られた値を対照値とすることもできる。また、複数の正常組織での細胞における本遺伝子の翻訳産物量を測定してその平均値を対照値としてもよい。
例えば、被験物質と接触させた肝細胞における本遺伝子の翻訳産物量の測定値が、正常組織での細胞における本遺伝子の翻訳産物量の値よりも高ければ、前記被験物質との接触によるラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変組織を構成する肝細胞の発生を意味し、当該被験物質はラット肝発癌活性を有すると評価することができる。
【００１８】
さらに、上記のような本発明肝発癌活性検定方法は、ラット肝発癌活性を有する物質の探索等に利用することができる。具体的には、本発明肝発癌活性検定方法により評価されたラット肝発癌活性の有無又はその量に基づきラット肝発癌活性を有する物質を選抜することによって、ラット肝発癌活性物質を探索することができる。選抜されたラット肝発癌活性物質は、例えば、肝癌モデル哺乳動物の作製等に利用することもできる。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２０】
実施例１  （免疫組織化学的検査を用いたラット肝発癌活性検定方法）
（１）ラットへの被験物質の投与
肝中期発癌性試験モデル(Ito, N., et al. CRC Crit Rev Toxicol, 19: 385−415, 1989.)を用いた。具体的には、被験物質が変異原性物質の場合には、雄F344系ラット（投与開始時６週齢）に、Ｎ−ジエチルニトロサミン（以下、DENと記す。）200mg/kg体重を腹腔内に単回投与した群を設け、対照として被験物質の溶媒を単回投与した群をさらに設けた。被験物質が非変異原性の場合には、同じ雄F344系ラットに上記と同用量のDENを単回投与した後２週目から被験物質として、クロフィブレ−ト（3000ppm）又はＷＹ−14,643（1000ppm）を混餌投与した群をそれぞれ設け、対照として基礎飼料のみを混餌投与した群をさらに設けた。被験物質の変異原性に関わらず、試験開始から３週目に2/3部分肝切除術を全例に施し、８週目に各群動物の肝臓を摘出した。
【００２１】
（２）肝臓組織の固定、包埋及び薄切切片の作製
摘出された肝臓を、固定液（4％パラホルムアルデヒド＋0.5％グルタールアルデヒド／0.075Mリン酸緩衝液、pH7.2〜7.4）を用いて４℃、一晩浸漬固定した。固定後、適当な大きさに当該組織を切り出した。切り出された組織をアルコール脱水、パラフィン包埋した後、これをミクロスライサーを用いて２〜１０μｍの厚さで薄切し、薄切された組織切片をスライドグラスに載せることにより、光学顕微鏡用組織標本を作製した。
【００２２】
免疫組織化学的染色法はCSAIIキット（ダコサイトメーション製）を用いて実施した。
上記で作製された組織切片を1×Target Retrieval Solution (pH6.1)（ダコサイトメーション製）に浸漬し、１２１℃、１５分間オートクレーブした後、６０℃まで室温下冷却することにより抗原の賦活化処理を行った。その後、組織切片をCSAIIキット添付のプロトコールに従い染色した。ラット本蛋白質の特異抗体（Santacruz）としては1000倍稀釈したものを使用し、immunoglobulins/HRPとしては抗ヤギ（ダコサイトメーション製）のものを200倍希釈したものを使用した。発色反応後、当該組織切片を蒸留水で洗浄し、脱水、透徹、封入を行った。
【００２３】
（４）遺伝子翻訳産物の発現解析
画像解析装置IPAP（住化テクノサービス製）を用いて染色性が確認された細胞巣の面積及び組織切片全体の面積をそれぞれ測定し、単位面積当たりの検出された細胞巣の面積[＝（染色性が認められた細胞巣の面積）/（組織切片全体の面積）]を算出した。また染色性が確認された細胞巣の数をカウントし、単位面積当たりの検出された細胞巣の数[＝（染色性が認められた細胞巣の数）/（組織切片全体の面積）]を算出した。各種の検定手法を用いて統計学的解析を行い、被験物質投与群における値が基礎飼料投与群における当該値よりも有意な増加を示した場合には、被験物質はラット肝発癌性を有すると評価した。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明によって、遺伝子の翻訳産物量の異常を指標としたラットにおける胎盤型グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ酵素を認識する抗体に対して陰性を示すラット肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の検定方法等が提供可能となる。
【配列表】
2007033041000001.app