(57)【要約】【課題】低温ストレスから保存細胞を保護することのできる、細胞の氷冷温保存用組成物を提供する。【解決手段】式（Ｉ）：2007217385.tif 000013（式中、Ｒ１は2007217385.tif 000014であり、Ａｃはアセチルを表し、ｎは２以上の整数である）で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物を含有することを特徴とする、細胞氷冷温保存用組成物。本発明の組成物は、哺乳動物の細胞、組織または臓器のバイアビリティを低下させることなく長期に氷冷温保存するための組成物として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2007217385.tif 000008
（式中、Ｒ１は
【化２】
2007217385.tif 000009
であり、Ａｃはアセチルであり、ｎは２以上の整数である）
で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物を含有することを特徴とする、細胞氷冷温保存用組成物。
【請求項２】
ｎが２〜１０から選択される１種である式（Ｉ）で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物のみまたはｎが２〜１０から選択される２種以上である式（Ｉ）で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物の混合物のみを含有する請求項１記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ１が
【化３】
2007217385.tif 000010
（式中、Ａｃはアセチル）
である、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
細胞が、哺乳動物の細胞、または組織もしくは臓器の形態である、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の組成物を含有する細胞氷冷温保存用溶液。
【請求項６】
式（Ｉ）：
【化４】
2007217385.tif 000011
（式中、Ｒ１は
【化５】
2007217385.tif 000012
であり、Ａｃはアセチルであり、ｎは２以上の整数である）
で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物と細胞を接触させることを特徴とする、細胞の氷冷温保存方法。
【請求項７】
i）請求項５記載の溶液と細胞とを接触させる工程、および
ii)該細胞を氷点以上１０℃以下で保存する工程
を含むことを特徴とする、細胞の氷冷温保存方法。
【請求項８】
i）請求項１〜４のいずれかに記載の組成物を、１０μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する細胞氷冷温保存用溶液と細胞とを接触させる工程、および
ii)該細胞を氷点以上１０℃以下で保存する工程
を含むことを特徴とする、細胞の氷冷温保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は哺乳動物の細胞を氷冷温保存するための組成物、それを含有する溶液および保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生細胞を生きたまま半永久的に保存する凍結保存技術は、現在、輸血のための血球の保存、骨髄移植や臓器移植のための骨髄細胞や生体組織の保存、人工授精や遺伝資源の保存のための精子や受精卵の保存等に幅広く利用されつつある。しかし、解凍後の生体組織の機能回復率は高いとは言えず、より望ましい保存技術の開発が求められている。
【０００３】
細胞、組織または臓器を低温保存した場合の致死的な要因は、氷点以下に冷却することによって細胞内外に発生した氷が物理的に核やミトコンドリア等の細胞内小器官などを破壊してしまうことであると考えられている。
【０００４】
非特許文献１において血液中における巨大分子不凍化化合物が報告され、この巨大分子不凍化化合物は現在では「不凍糖タンパク質」（ＡＦＧＰ）と呼ばれている。ＡＦＧＰは以下のような機能を有している。
【０００５】
（ａ）氷結晶の形態を変化させる。
【０００６】
（ｂ）形状を保ったまま、氷結晶の成長を抑制する。
【０００７】
（ｃ）熱ヒステリシス活性を有する。すなわち、融点は純水と氷の平衡温度とほとんど変化させず、ＡＦＧＰの濃度・分子量に依存して凝固点を数度下げる。
【０００８】
（ｄ）氷結晶の再結晶化を抑制する。
【０００９】
（ｅ）細胞膜などの脂質を低温下で安定化させる。
【００１０】
好ましいＡＦＧＰの例としては、非特許文献１、特許文献１に開示されたＡＦＧＰ誘導体を挙げることができる。また特許文献２には該ＡＦＧＰ誘導体を用いた細胞、組織または臓器等の凍結保存効果について記載されている。
【００１１】
しかしながら、哺乳動物の細胞、組織または臓器の凍結保存は、上記の通り必然的に生じる氷の結晶がもたらす物理的なダメージを完全に避けることはできず、細胞等の保存において絶対的な手法であるとは言えない。
【００１２】
この氷の結晶がもたらす物理的なダメージを避けるためには、氷点以上であって微生物等の増殖や細胞内の各種成分の代謝、分解が事実上抑制される温度（以下、氷冷温ということとする）、好ましくは氷点以上〜１０℃で細胞等を保存することが考えられる。
【００１３】
しかし、かかる氷冷温での細胞等の保存には、氷の結晶がもたらす物理的なダメージとは全く別の問題による細胞等のバイアビリティの低下という問題が指摘されている。例えば、氷冷温に長時間置かれた細胞において、低温ストレス時の細胞膜リン脂質二重層の相転移反応による不可逆的な変化が細胞膜機能の障害をもたらすことが報告されている（非特許文献２）。
【００１４】
【非特許文献１】アンジュヴァンテ  ケミー  インターナショナル  エディション（Angewandte Chemie / International edition）、第４３巻、ｐ．８５６−８６２、２００４年
【非特許文献２】ルビンスキー（Boris Rubinsky）、ハート  フェイルアー  レビュー（Heart Failure Reviews）、第８巻、ｐ．２７７−２８４、２００３年
【特許文献１】国際公開ＷＯ００／０９５４６号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ０５／９５５８６号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
以上のように、細胞等を長期に氷冷温で保存するためには、氷冷温保存に特有の細胞等のバイアビリティの低下を防止する技術が必要とされている。本発明は、かかるバイオアビリティの低下を防止した細胞等の新たな氷冷温保存方法を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、
（１）式（Ｉ）：
【化６】
2007217385.tif 000002
【００１７】
（式中、Ｒ１は
【化７】
2007217385.tif 000003
【００１８】
であり、Ａｃはアセチルであり、ｎは２以上の整数である）
で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物（以下、化合物（Ｉ）とする）を含有することを特徴とする、細胞氷冷温保存用組成物に関する。
【００１９】
詳しくは、以下の（２）〜（８）に関する。
【００２０】
（２）ｎが２〜１０から選択される１種である式（Ｉ）で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物のみまたはｎが２〜１０から選択される２種以上である式（Ｉ）で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物の混合物のみを含有する（１）記載の組成物。
【００２１】
ここで、ｎが２〜１０から選択される１種である式（Ｉ）で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物のみを含有する組成物とは、実質的に不純物を含まないことを意味する。ここで、不純物とは、魚類等からＡＦＧＰを抽出する際に混入するＡＦＧＰ以外の成分を包含する。
【００２２】
ｎが２〜１０から選択される２種以上である式（Ｉ）で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物の混合物のみを含有する組成物とは、ｎが２〜１０から選択される式（Ｉ）で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物、および前記のｎとは異なる２〜１０から選択される１または２以上の式（Ｉ）で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物の混合物を含み、実質的に不純物を含まない組成物を意味する。ここで、不純物とは、魚類等からＡＦＧＰを抽出する際に混入するＡＦＧＰ以外の成分を包含する。
【００２３】
（３）Ｒ１が
【化８】
2007217385.tif 000004
【００２４】
（式中、Ａｃはアセチルを表す）
である、（１）記載の組成物。
【００２５】
（４）細胞が、哺乳動物の細胞、または組織もしくは臓器の形態である、（１）記載の組成物。
【００２６】
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物を含有する細胞氷冷温保存用溶液。
【００２７】
（６）式（Ｉ）：
【化９】
2007217385.tif 000005
【００２８】
（式中、Ｒ１は
【化１０】
2007217385.tif 000006
【００２９】
であり、Ａｃはアセチルであり、ｎは２以上の整数である）
で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物と細胞を接触させることを特徴とする、細胞の氷冷温保存方法。
【００３０】
（７）i）（５）記載の溶液と細胞とを接触させる工程、および
ii)該細胞を氷点以上１０℃以下で保存する工程
を含むことを特徴とする、細胞の氷冷温保存方法、および
（８）i）（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物を、１０μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する細胞氷冷温保存用溶液と細胞とを接触させる工程、および
ii)該細胞を氷点以上１０℃以下で保存する工程
を含むことを特徴とする、細胞の氷冷温保存方法。
【発明の効果】
【００３１】
本発明組成物の使用により、細胞を長期に氷冷温保存することが可能となる。保存された細胞は、氷冷温保存時に生じ得る細胞障害等が最小限に抑えられ、その機能を高度に維持している。従って、本発明組成物を用いて保存された細胞、組織または臓器は長期保存後においても移植等に好適に用いることができ、移植後の組織障害、臓器障害等を予防または改善することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本明細書中において、「細胞」とは動物細胞および植物細胞を包含し、好ましくは哺乳動物の細胞である。ここで「哺乳動物」とはヒト、ブタおよびウシ等を含む温血哺乳動物を意味する。
【００３３】
本明細書中における「細胞」は複数個が集合することにより、組織または臓器の形態をとっていてもよい。哺乳動物の「細胞」としては、例えば膵島、肝細胞、白血球、赤血球、血小板、卵母細胞および胚等の細胞、皮膚組織、骨髄組織および角膜組織等の組織、並びに膵臓、肝臓、脳、肺、心臓、胃、腎臓、脾臓、卵巣および精巣等の臓器を包含するものである。
【００３４】
「氷冷温保存」とは、細胞、臓器または組織を凍結することなく、氷冷温下で保存することを包含する。氷冷温とは氷点以上であって微生物の増殖や細胞内の各種成分の代謝、分解が事実上抑制される温度を意味し、具体的には氷点以上１０℃以下、より狭義には氷点以上５℃以下である。
【００３５】
化合物（Ｉ）はその製薬上許容される塩を包含し、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、臭化水素酸等の鉱酸の塩；ギ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマール酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、カンファースルホン酸等の有機酸の塩；アンモニウム、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム等の有機塩基の塩；ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の塩またはカルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の塩等を挙げることができる
化合物（Ｉ）はその溶媒和物も包含し、化合物（Ｉ）１分子に対し、任意の数の溶媒分子と配位していてもよい。
【００３６】
化合物（Ｉ）中のｎは２以上の整数であれば本発明に好適に用いることができるが、好ましくは４以上、さらに好ましくは５以上である。上限は特に限定されないが、好ましくは５０以下、さらに好ましくは１５以下、さらに好ましくは１０以下、最も好ましくは８以下である。
【００３７】
重量平均分子量は好ましくは１．２ｋＤａ以上、より好ましくは２ｋＤａ以上、さらに好ましくは３ｋＤａ以上である。上限は特に限定されないが、好ましくは４０ｋＤａ以下、さらに好ましくは１５ｋＤａ以下、より好ましくは７ｋＤａ以下、最も好ましくは５ｋＤａ以下である。
【００３８】
数平均分子量の下限は好ましくは１．５ｋＤａ以上、より好ましくは２．８ｋＤａ以上であり、上限は好ましくは５ｋＤａ以下、より好ましくは４ｋＤａ、さらに好ましくは３．５ｋＤａである。
【００３９】
化合物（Ｉ）の好ましい具体例として、下記化合物ａ〜ｃが挙げられる。
【化１１】
2007217385.tif 000007
【００４０】
（式中、Ａｃはアセチルを表す）
化合物ａは式（Ｉ）のＲ１がＮアセチルガラクトサミンである化合物であり、化合物ｂは式（Ｉ）のＲ１がＮアセチルグルコサミンである化合物であり、化合物ｃは式（Ｉ）のＲ１がガラクトシルＮアセチルガラクトサミンである化合物である。
【００４１】
本発明組成物は化合物（Ｉ）を含むものであれば、特にその組成および形状等は限定されない。化合物（Ｉ）はいずれか１種単独で用いてもよく、Ｒ１および／またはｎが異なる２種以上を混合して用いてもよい。当該組成物の形状は粉末、顆粒、または溶液等のいずれであってもよい。化合物（Ｉ）以外に氷冷温保存で通常使用される各種添加剤や溶媒と混合して組成物とすることも可能である。
【００４２】
本発明溶液は本発明組成物を含むものであれば特に限定されないが、好ましくは、組織や臓器の保存に臨床上使用されている保存液または還流液に本発明組成物を添加することにより得られる。
【００４３】
臨床上使用されている保存液または還流液としては、生理食塩水、リンゲル液、コリンズ液、ユーロコリンズ液、ＵＷ液、ＰＦＣ（パーフルオロカーボン）乳剤、ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）溶液、グリセリン溶液等が挙げられる。特に好ましくはユーロコリンズ液またはＵＷ液である。
【００４４】
上記保存液または還流液に本発明組成物を添加すれば本発明溶液が得られる。
【００４５】
本発明溶液中の化合物（Ｉ）の濃度は細胞、臓器または組織の種類、保存条件、保存液または還流液の種類、並びにその他の添加剤の種類および濃度等により、例えば１０μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲で適宜変更することができる。好ましくは１００μｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ以下である。
【００４６】
さらに必要に応じて、通常使用されている細胞保護剤の１種以上の添加剤が添加されていてもよい。
【００４７】
細胞保護剤としてはＤＭＳＯ、グリセリン、プロピレングリコール、エチレングリコール、グルコース、スクロース、トレハロース、プロパンジオール、ブタンジオール、カルボキシメチルセルロースまたはその塩、およびポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００４８】
細胞保護剤の濃度はその種類、細胞、臓器または組織の種類、保存条件および化合物（Ｉ）の濃度等により、例えば０．０１ｍｍｏｌ／ｍｌ〜２０ｍｍｏｌ／ｍｌの範囲で適宜変更が可能である。濃度の下限は、好ましくは０．１ｍｍｏｌ／ｍｌ以上、さらに好ましくは０．５ｍｍｏｌ／ｍｌ以上、最も好ましくは１ｍｍｏｌ／ｍｌ以上である。濃度の上限は、好ましくは１０ｍｍｏｌ／ｍｌ以下、さらに好ましくは５ｍｍｏｌ／ｍｌ以下、最も好ましくは２ｍｍｏｌ／ｍｌ以下である。
【００４９】
細胞を保存する場合には、本発明溶液に細胞を懸濁した後、氷冷温にまで冷却すればよい。細胞が組織または臓器の形態である場合には、十分に本発明溶液と組織または臓器を接触させるため、一定時間、氷冷温にて本発明溶液中に浸漬または還流するか、あるいは浸漬または貫流した後に氷冷温にまで冷却することが好ましい。例えば０〜１０℃の条件下で数分〜数時間細胞や組織を浸漬または還流させればよい。
【００５０】
氷冷温保存した細胞、組織または臓器はそのまま移植等に用いることができ、良好なバイアビリティを維持するため、氷冷温から常温に戻した際、または移植後に高い生存率あるいは機能回復率を示す。
【００５１】
天然物から抽出されるＡＦＧＰはプロリン等の不純物が混入しているため、天然ＡＦＧＰを含む保存液を使用した場合、保存中に細胞、組織または臓器等に対する細胞障害等の誘因となる。しかし、本発明組成物は純度の高い合成ＡＦＧＰである化合物（Ｉ）を使用することから、不純物による影響は最小限に抑えることができる。
【００５２】
また、化合物（Ｉ）は化学合成により大量に製造することが可能であり、安価に大量の本発明組成物を調製することが可能である。
【００５３】
以下に実施例および試験例を示すが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００５４】
ヒト肝癌由来細胞株HepG2の氷冷温保存
ATCCより分譲されたヒト肝細胞癌由来細胞株HepG2を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地１００μｌを含む９６穴プレートに4x10４/wellの細胞密度で接種して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。臓器保存液Euro-Collins液（小林製薬工業、ＥＣ）に溶解した合成不凍糖タンパク質（化合物ａ）を１０、１００、５００各μｇ／ｍｌ、１、５、１０各ｍｇ／ｍｌとなるように調整し、培地を該保存液に交換したのちに４℃にて低温インキュベーター（和研薬）にて培養した。
【００５５】
２４時間低温ストレス後、３７℃インキュベーターにて１時間復温し、生存率をWST-8（同仁科学）にて測定した。また、化合物ａに代えてコントロールとしてウシ血清アルブミン（BSA）、比較例として魚由来のAFGP(nAFGP)を用いた時の細胞の生存率も同様にして測定した。この結果を図１に示す。
【００５６】
この実験により、nAFGPおよび上記式で表される合成不凍糖タンパク質は、濃度依存性に低温ストレス細胞保護作用があることが確認された。
【００５７】
また、上記で使用した不凍糖タンパク質（化合物ａ）に代えて、化合物ｂ（式（Ｉ）のＲ１がＮアセチルグルコサミンである化合物、GlcNAc Type）ならびに化合物ｃ（式（Ｉ）のＲ１がガラクトシルＮアセチルガラクトサミンである化合物、GalGalNAc Type）をそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌの濃度で用いて、上記と同様の方法で肝由来細胞株HepG2の４８時間低温ストレス後細胞生存率を測定した。この結果を図２に示す。図中のＥＣは無添加（コントロール）の場合の生存率を、ＵＷはＥＣに代えてＵＷ液を用いた場合の生存率を、E+BSAは１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＢＳＡを添加したときの生存率を、E+nAGFPは１０ｍｇ／ｍｌとなるように魚由来AFGP（nAFGP）を添加したときの生存率を、それぞれ示す。
【００５８】
糖鎖変化による保護効果の違いをみると、不凍糖タンパク群はいずれも保護効果が認められているが、コントロール群が約２０％の生存率に対し、化合物ｃ（GalGalNAc Type）では約８０％と、より高い低温ストレス保護効果が認められた。
【実施例２】
【００５９】
不凍糖タンパク質を用いた膵島移植実験
C57BL/6Jマウスより、膵島をコラゲナーゼ灌流法によって単離し、UW液(ViaspanR)で４℃、７２時間保存した膵島（比較サンプル）と、30mg/mlとなるように化合物ｃ（GalGalNAc Typeの合成不凍糖タンパク質）を加えたUW液で４℃で７２時間保存した膵島（実施例モデル）とを用意し、それぞれ膵島移植実験に使用した。膵島移植はSTZ(Sigma)誘導糖尿病モデルC57BL/6Jマウス（同種同系統）に対し、腎皮膜下へ膵島を600個移植し、移植後血糖をモニタリングした。その結果を図３に示す。
【００６０】
その結果、実施例モデルの膵島について、中心部壊死がGalGalNAc型不凍糖タンパク質保存群で低減している傾向が認められた（図３）。
【００６１】
また移植後の血糖推移を図４に示した。図中、▲は比較サンプル群（７例）を、●は実施例モデル（７例）をそれぞれ示す。UW液にて保存した比較サンプルを移植したマウスでは全例が高血糖のままで推移したのに対し、実施例モデルを移植したマウスでは７頭中６頭で血糖改善効果がみられ、一週後の血糖正常化率（血糖<200mg/dl）は50%であった（図４）。
【００６２】
また、移植マウスに対してグルコース応答性血糖反応をIPGTT(Intraperitoneal Glucose Tolerance Test)にて行った。オーバーナイト絶食後の移植マウス腹腔内にグルコース2.0g/kgを投与し、投与前、投与後5, 15, 30, 60, 90, 120，180分で血糖を測定した。この結果を図５に示す。図中、■は比較サンプル群を、▲は実施例モデルをそれぞれ示す。また●は、コラゲナーゼ灌流法によって単離した膵島をそのまま移植に用いた場合を示す。比較サンプルを移植したマウスでは全例が無反応のまま高血糖で推移したのに対し、実施例モデルを移植したマウスでは、単離後直ちに移植を行った場合と同様の血糖反応が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の不凍糖タンパク質を用いて氷冷温保存した細胞の生存率を示す。
【図２】本発明の不凍糖タンパク質を用いて氷冷温保存した細胞の生存率を示す。
【図３】本発明を用いて保存した実験動物の膵島の顕微鏡観察写真である。
【図４】本発明を用いて保存した実験動物の膵島を移植した後のモデル動物における血糖値の変化を示す。
【図５】本発明を用いて保存した実験動物の膵島を移植した後のグルコース応答性血糖反応の測定結果を示す。
【図１】
2007217385.tif 000015
【図２】
2007217385.tif 000016
【図４】
2007217385.tif 000017
【図５】
2007217385.tif 000018
【図３】
2007217385.tif 000019