(57)【要約】  【課題】  空間的自由度のあるゲル網目構造中にプローブが固定された、プローブ固定化ゲルにより、ゲル網目構造に固定化されたプローブと標的試料の、効率の良い反応を提供する。  【解決手段】  プローブ及び高分子化合物を含むゲルを作成した後、該ゲルの高分子化合物を除去することにより得られるプローブ固定化ゲルにより、プローブと標的試料の、効率の良い反応が可能となる。本発明のゲルは、ＤＮＡマイクロアレイの部材としても使用されうる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブ及び高分子化合物を含むゲルを作成した後、該ゲルの高分子化合物を除去することにより得られるプローブ固定化ゲル。
【請求項２】
高分子化合物が、プローブに結合性を有するものである、請求項１記載のゲル。
【請求項３】
請求項１又は２記載のゲルが、管状体に保持されているゲル保持管状体。
【請求項４】
請求項１又は２記載のゲルの複数が、基板に固定されているゲルマイクロアレイ。
【請求項５】
複数の貫通孔を有する基板の、該貫通孔に請求項１又は２記載のゲルが保持されているゲルマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、効率よく標的試料を検出できるプローブ固定化ゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
1990年代後半にトランスクリプトーム解析を推し進める技術としてマイクロアレイが登場した。マイクロアレイはDNAチップとも呼ばれ、ガラスやシリコン製の小基盤上にDNA分子を高密度に配置したものである。マイクロアレイを用いることで様々な遺伝子発現を同時に観察することができる。
【０００３】
DNAマイクロアレイはその作成原理によりスタンフォード方式とAffymetrix社方式の２つに大別される。スタンフォード方式のＤＮＡマイクロアレイは、あらかじめ調製されたDNA断片、例えばcDNA保持プラスミドよりPCR法によって増幅させたものをスライドガラス上に高密度にスポットしたマイクロアレイである（非特許文献１）。一方、Affymetrix社方式のマイクロアレイは、フォトリソグラフィック技術と光照射化学合成を組み合わせて、基盤上で20-25mer程度のオリゴヌクレオチドを合成することにより作成されるマイクロアレイである（非特許文献２）。
【０００４】
また、近年、その他の技術として、貫通孔基板を利用した貫通孔利用型マイクロアレイも開発されている。例えば、メトリジェニックス社製のフロースルーチップは、微小な貫通孔が規則正しく配列されたシリコン製基板の表面にプローブである核酸を固定化し、その貫通孔内にターゲット核酸試料溶液を通液させることで、核酸プローブとターゲット核酸をハイブリダイズさせるものである（特許文献１）。
【０００５】
さらには、上記貫通孔利用型マイクロアレイの他の例として、本発明者も中空繊維配列体を用いたが繊維型マイクロアレイを開発している。このマイクロアレイは、複数本の中空繊維を繊維軸方向に規則正しく配列させた中空繊維配列体を用い、中空繊維配列体の各中空繊維中空部にプローブとなる核酸を固定化しておき、この中空繊維配列体を繊維軸方向と垂直な方法で薄片化することにより製造できる（特許文献２）。
【０００６】
一方、生体関連物質等のプローブを固定する方法として、ゲルにプローブを固定する方法も知られている。例えば、特許文献３には、生体関連物質の一例として、末端をアミノ化修飾した核酸を、アクロレインとゲル形成性重合性モノマーであるアクリルアミドモノマーおよびメチレンビスアクリルアミドと反応させる方法が開示されている。この方法は、アミノ化修飾した核酸とアクロレインのアルデヒド残基がシッフ塩基結合する一方で、アクロレインの片側のビニル残基がアクリルアミドと共重合することにより、アクリルアミドゲルに核酸を共有結合的に固定化する方法である。
【０００７】
上述のゲル担体へのプローブの固定化方法は、マイクロアレイ技術にも応用されている。例えば、ガラス基板上にアクリルアミドゲルをコーティングし、このゲル層に核酸プローブが固定されたマイクロアレイ（特許文献４、特許文献５）、上述の繊維型マイクロアレイの、中空繊維の中空部にゲルを保持したマイクロアレイ（特許文献６）が知られている。
【０００８】
プローブがゲルに固定されたマイクロアレイの場合、ゲルの三次元網目構造にプローブが固定化されている点で、上述のスタンフォード方式のマイクロアレイやAffymetrix方式のマイクロアレイといった２次元表面上にプローブを固定化するマイクロアレイに比べ、プローブが反応する場（空間）として三次元空間を有効に利用できる。
【０００９】
しかし、ゲルの網目構造をプローブが反応する場として有効に利用するには、例えば、プローブの大きさ、プローブと反応する分子の大きさ、それらの複合体等の立体的な自由度を考慮し、ゲル網目構造を構築する必要がある。
【００１０】
例えば、通常のアクリルアミドゲルのポアサイズは、設定するモノマー濃度や架橋比率によるが、一般的に用いられている条件（濃度；３％〜１０％、架橋比率；５％）では、約１．５〜２．０ｎｍの範囲となる。一方、ＤＮＡの分子サイズ（直径）は、二重らせん構造をとった場合、ゲルのポアサイズとほぼ同じ２．０ｎｍ程度である。よって、上記ゲル中では、核酸の空間的自由度はかなり制限された状態にある。
【非特許文献１】Science 270,467-470 (1995)
【非特許文献２】Science 251,767-773 (1991)
【特許文献１】特許第3488456号公報
【特許文献２】特開2000-245460号公報
【特許文献３】特開平3-47097号公報
【特許文献４】特表2003-524150号公報
【特許文献５】WO2000-31148号公報
【特許文献６】特許第3510882号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明の目的は、空間的自由度のあるゲル網目構造中にプローブが固定された、プローブ固定化ゲルを提供して、該プローブ固定化ゲルのプローブと標的試料の効率の良い反応を実現させることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、ゲル化形成時に予め空間的制限を与えておき、ゲル形成後にその空間的制限を開放することにより、ゲル構造中のプローブ近傍に空間的自由度を持たせることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
即ち、本発明は、プローブ及び高分子化合物を含むゲルを作成した後、該ゲルの高分子化合物を除去することにより得られるプローブ固定化ゲルである。
【発明の効果】
【００１４】
空間的自由度のあるゲル網目構造中にプローブが固定されることにより、プローブと標的試料が効率よく反応することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を順次説明する。
【００１６】
本発明は、「プローブ及び高分子化合物を含むゲルを作成した後、該高分子化合物を除去することにより得られるプローブ固定化ゲル」である。
【００１７】
上記ゲルを得るための第１の工程として、プローブ及び高分子化合物を含むゲルを調製する。ここで「プローブ」とは、ある標的物質を検出するための探査子となるものをいい、標的物質が核酸であれば、プローブは、その核酸に相補な核酸、核酸と結合性を有するタンパク質等である。プローブは後述する方法によりゲルに固定される。
【００１８】
「高分子化合物」とは、本発明のプローブ固定化ゲルの、プローブが固定されている近傍に空間を形成するための化合物である。この高分子化合物は、後述する第２の工程により除去される。除去された部分に空間が生じる。高分子化合物の種類としては、ゲル又はその前駆体に親和性があり、且つプローブの機能を損なわない物質であればいずれも採用できる。例えば、親水性高分子化合物が採用できる。具体的にはポリエチレングリコール、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ヒドロキシメチルセルロース等である。また、タンパク質、ペプチド、糖鎖、核酸、それらの複合体等も使用できる。
【００１９】
高分子化合物として、核酸を選択した場合、核酸としては、DNA、RNA、PNA等、いずれも使用することができる。また、それらは1本鎖、２本鎖、いずれでもよい。さらにその鎖長は、ゲル中に空間を設けることが目的であることに鑑み、１〜２ｋｂが好ましい。
【００２０】
また高分子化合物としては、上記プローブと結合性を有するものが好ましい。プローブと結合性を有することにより、プローブのより近傍に空間を設けることが可能となる。さらに、その結合力は容易に解離可能な程度の結合力が好ましく、水素結合、静電的結合等が好ましい。例えば、プローブが核酸の場合は、その核酸に相補な配列を含む核酸を高分子化合物として選択することができる。そのような高分子化合物を選択することにより、意図的にプローブ近傍に空間を生じさせることができ、且つ除去も容易となる。
【００２１】
「ゲル」は、その種類を特に限定するものではなく、物理ゲル又は化学ゲルが利用できる。物理ゲルであれば、アガロース、アガロペクチン、アミロース、アミロペクチン、アラビアゴム、アラビナン、イソリケナン、インスリン、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カードラン、カゼイン、カラギーナン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、カロース、寒天、キサンタンガム、キチン、グアーガム、キトサン、クインスシード、クラウンゴール多糖、グリコーゲン、グルコマンナン、ケラタン硫酸、紅藻デンプン、酵母マンナン、コラーゲン、ゼラチン、デンプン、アルギン酸塩、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ジェランガム、シゾフィラン、セルロース、ゾウゲヤシマンナン、タマリンドシードガム、ツニシン、ニゲラン、ヒドロキシプロピルセルロース、プスツラン、フノラン、分解キシログルカン、ＨＭペクチン、ポリアミジン、ポリペルフルオロカーボンスルホン酸、ポリメタクリル酸−ポリエチレングリコール共重合体、ポリメトキシエチレングリコールメタクリレート、ポルフィラン、メチルセルロース、メチルデンプン、レンチナン、ローカストビーンガム、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、等が利用出来る。
【００２２】
また化学ゲルであれば、ポリアクリルアミドゲル、ポリイソプロピルアクリルアミドゲル、ジメチルアクリルアミドゲル、ポリビニルピロリドンゲル、絹フィブロイン、ケラチンタンパク質、メタクリル酸2-(ジメチルアミノ)エチル,2-ジメチルアミノエチルメタクリレートゲル、ＨＳタンパク質、デキストラン、ヒアルロン酸ゲル、ビスアクリルアミドメチルエーテルゲル、ポリ-(2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸)ゲル、ポリアクリル酸ゲル、ポリ-(N,N-アクリル酸ジメチルアミノエチルエステル)ゲル、ポリアクリル酸ナトリウム架橋体、ポリ-(N-アクリロイルアミノエトキシエタノール)ゲル、ポリ-（N-アクリロイルアミノプロパノール）ゲル、ポリアクリロキシプロパンスルホン酸ゲル、ポリイソブチレン・マレイン酸共重合体ゲル、ポリエチレンイミンゲル、ポリエチレンオキシド・プロピレンオキシド共重合体ゲル、ポリエチレンオキシド・ポリエチレングリコールゲル、ポリエチレン−酢酸ビニルコポリマーゲル、ポリジオキソランゲル、ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミドゲル、ポリ-(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)・ポリメタクリル酸2-ヒドロキシエチルゲル、ポリビニルピリジンゲル、ポリビニルメチルエーテル、ポリプロピレンオキシド、ポリ-(N-メチロールアクリルアミド)ゲルなどが利用できる。
【００２３】
上記ゲルにプローブ及び高分子化合物を包含させる方法としては、物理ゲルであれば、ゲル前駆体溶液に、これらの物質を包含させ、冷却等によりゲル化し包含する方法が挙げられる。ここで、プローブ及び／又はゲル前駆体を予め化学修飾しておくことで、プローブをゲルに化学的に固定することができる。例えば、物理ゲルとしてアガロースを選択した場合、過ヨウ素酸酸化によりアルデヒド基を露呈させ、そのアルデヒド基に対して、アミノ基修飾したプローブを反応させることにより、ゲルにプローブを共有結合により固定することができる。また、アガロースの水酸基に不飽和官能基を導入し、不飽和官能基を導入したプローブとの共重合反応により、ゲルにプローブを固定することもできる（Electrophoresis  1995, 16, p1337-1344参照）。プローブの固定方法は、プローブやゲルの安定性を考慮し、公知の種々の方法が採用できる。
【００２４】
化学ゲルであれば、そのモノマー、重合開始剤等のゲル前駆体溶液中に、プローブ及び高分子化合物を包含させ、重合反応を実施することにより、ゲルにこれらの化合物を包含させることができる。ここで、予めプローブに不飽和官能基を導入しておけば、重合反応の際に、ゲルの構成成分にプローブを共有結合することができる（特開平3-47097号公報参照）。
【００２５】
その他、プローブをゲルに固定する方法としては、予め粒子等にプローブを固定しておいて、その粒子をゲルへ包含する方法も挙げられる。この場合、使用する粒子は、ゲル中で均一に分散する材料であれば、いずれでもよい。
【００２６】
次に、第２の工程では、上記のごとく調製したゲルから高分子化合物を除去する。除去方法としては、例えば濃度勾配を利用し自然拡散により高分子化合物を除去する方法、加熱により高分子化合物をゲルの系外へ追い出す方法、電気泳動を利用して高分子化合物をゲル系外へ移動させる方法等が挙げられる。
【００２７】
また、高分子化合物を予め分解することにより、除去が容易となる。例えば、高分子化合物として核酸を利用する場合は、核酸分解酵素等で当該核酸を分解することにより除去が容易となる。プローブとして、DNAを選択した場合、高分子化合物として、RNAを包含させ、ゲルを作成し、RNase等によりRNAを分解することにより、プローブのDNAに何ら影響することなく、高分子化合物を分解・除去することができる。また、高分子化合物として、タンパク質を利用する場合は、プロテアーゼ等で分解することにより除去が容易となる。
【００２８】
本発明のゲルは、管状体内に保持され、遺伝子検査用のデバイスとして使用することが可能である（特開平3-47097号公報参照）。例えば、プローブ及び高分子化合物を含むゲル前駆体溶液を管状体内に導入し、管状体内でゲル化反応を実施し、次いでゲル内から高分子化合物を除去することにより、ゲルが管状体内に保持されたゲル保持管状体を製造することができる。
【００２９】
また、本発明のゲルは、マイクロアレイのプローブを保持するゲルとしても使用できる。例えば、平面基盤上にプローブ及び高分子化合物を含むゲル前駆体溶液を複数点、滴下し、該基板上でゲル化反応を実施する。ゲル化反応後、ゲル内から高分子化合物を除去することにより、マイクロアレイを製造することができる。
【００３０】
また、本発明のゲルは、複数の貫通孔を有する基板の該貫通孔に、プローブが固定されたマイクロアレイにも好適に使用されうる（特開2000-60554号公報）。即ち、プローブ及び高分子化合物を含むゲル前駆体溶液を該貫通孔に導入し、貫通孔内でゲル化反応を実施する。ゲル化反応後、ゲル内から高分子化合物を除去することにより、マイクロアレイを製造することができる。高分子化合物の除去は、マイクロアレイの表裏に電極を設置し、電気泳動により除去することが好ましい。
【００３１】
さらには、本発明のゲルは、本発明者の一部が開発している繊維型マイクロアレイのプローブを保持するゲルとしても好適に使用されうる（特許第3510882号公報）。具体的には、中空繊維の中空部にプローブ及び高分子化合物を含むゲル前駆体溶液を充填し、中空部内でゲル化反応を実施し、次いでゲル内から高分子化合物を除去することにより、繊維型マイクロアレイが製造できる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例で実施形態の詳細について説明する。
【００３３】
＜実施例１＞  核酸マイクロアレイの製造
１．プローブの調製
プローブとして、以下の塩基配列からなる5‘末端ビニル化核酸分子（65mer）を用いた。
【００３４】
配列番号１：CCGCCTGCTC CCAGAGGTGT GCCTCAAATT GATGTTACCT TTGATATCGA CGCTAATGGT ATTCT
上記プローブは以下の手順に従って合成した。まず、末端アミノ化核酸5'-O-アミノヘキシル−核酸を合成するために、アミダイト試薬を用いてＤＮＡ自動合成装置により、上記塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成した。その後、最終段階で、アミノリンクTM（ＰＥバイオシステムズ社製）を該オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより合成した。
【００３５】
２．高分子化合物（aRNA）の調製
高分子化合物としてRNAを選択した。該RNAは、以下の手順に従いTotal RNAからcDNAを調製し、これをaRNA転写することで調製した。
【００３６】
（１）Total RNAからのFirst strand cDNAの調製
0.2ml-PCR用チューブに、T7 Oligo dT Primer (Ambion社製 #5710)、Universal mouse Total RNA ５μｇ（ストラタジーン社製）及びDEPC処理水を含む溶液を調製した（表１）。
【００３７】
〔表１〕
2007114103.tif 000002
上記のRNA sampleを70℃で5分間インキュベーションし、チューブを氷上に置き、遠心後、表２に示す試薬を添加した。
【００３８】
〔表２〕
2007114103.tif 000003
次にボルテックスTMで攪拌、遠心後、45℃で2分間インキュベーションし、続いて、SuperScript II Reverse TranscriptaseTM（Invitrogen社製）1μlを静かに加え、45℃で60分間インキュベーションした。この時、チューブ内の総液量は20μlになった。反応終了後、チューブを取り出し、氷上に静置した。
【００３９】
（２）Second strand cDNAの調製
（１）で得たFirst strand cDNA sample(20μl)の入ったチューブを氷上に置き、表３に示す試薬を添加した。添加後、静かに撹拌し、16℃で2時間インキュベーションした。
【００４０】
〔表３〕
2007114103.tif 000004
次にT4 DNA polymeraseを2μｌ添加し、さらに16℃で15分間インキュベーションした。反応が終了したら、チューブを取り出し、氷上に静置した。
【００４１】
（３）Second strand cDNAの精製
精製には、QIAquickTM PCR Purification Kit (QIAGEN社製 #28104)を使用した。
【００４２】
滅菌済みのチューブ（1.5ml容）に（２）で調製したSecond strand cDNA溶液（150μl）をすべて移し、次に750μl（５倍量）のBufferPBを加え、ボルテックスTMで攪拌後、遠心した。
【００４３】
QIAquickTMスピンカラムを、2mlのcollection tubeに差し込み、QIAquickTMスピンカラムにSecond strand cDNA混合液の半量450μlを入れ、30〜60秒間、13,000rpmで遠心した。溶出液を捨て、再度、QIAquickTM スピンカラムをcollection tubeに差し込み、QIAquickTMスピンカラムに前記混合液の残り（450μl）を入れ、30〜60秒間、13,000rpmで遠心した。
【００４４】
溶出液を捨て、再度QIAquickTM スピンカラムをcollection tubeに差し込み、700μlのBufferPEを加え、30〜60秒間、13,000rpmで遠心した。
【００４５】
溶出液を捨て、再度QIAquickTMスピンカラムをcollection tubeに差し込み、フィルター上の余分なBufferPEを完全に除くため、30〜60秒間、13,000rpmで遠心した。
【００４６】
新しい1.5mlチューブにQIAquickTM スピンカラムを差し込み、20μlのDEPC処理水（またはBufferEB）を加え、1分間放置後、30〜60秒間、13,000rpmで遠心して、Second strand cDNA溶液を回収した。回収液を1.5mlPCR用チューブに移し、氷上に静置した。
【００４７】
（４）aRNAの転写合成
転写合成には、Ambion社のMEGAscript T7 Kit (Ambion社製 #1334)を使用した。
【００４８】
0.2ml-PCR用チューブに表４の試薬を加え、37℃で6時間〜overnightインキュベーションした。
【００４９】
〔表４〕
2007114103.tif 000005
（５）aRNAの精製
aRNAの精製には、RNeasy QIAGEN MiniEluteTM Purification Kit (QIAGEN社製 #74204)を使用した。（４）で得られたaRNAに80μｌのDEPC処理水を加えて、100μｌにメスアップした。滅菌済みの空の1.5mlチューブにこの溶液をすべて移し入れ、350μｌのBuffer RLTを加えて、よく混合した。さらに250μｌの99.5%エタノールを加えて、ピペッティングにより混合した。RNeasy MiniEluteTM スピンカラムを2mlのcollection tubeに差し込み、上記の混合液を入れ、15秒間、10,000rpmで遠心した。溶出液を捨て、再度そのRNeasy MiniEluteTMスピンカラムを新しいcollection tubeに差し込み、500μｌのBuffer RPEを加え、15秒間、10,000rpmで遠心した。溶出液を捨て、500μｌの80%エタノールを加え、2分間、10,000rpmで遠心した。フィルター上の余分なエタノールを完全に除くため、５分間、13,000rpmで遠心した。新しい1.5mlチューブにそのRNeasy MiniEluteTM スピンカラムを差し込み、14μlのDEPC処理水を加え、1分間放置後、3分間、13,000rpmで遠心して、液を回収した。次に分光光度計で濃度を測定し、3.2μg/μlのaRNAを得た。
【００５０】
３．中空繊維束の製造
図１に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。
【００５１】
まず、直径０．３２ｍｍの孔（５２）が、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦横各１２列で合計１４４個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板（５０）を２枚準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維（５４）（三菱エンジニアリングプラスチック社製  カーボンブラック1質量%添加）を１本づつ、通過させた。
【００５２】
Ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。
【００５３】
次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物（５６）で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。
【００５４】
次に、この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン4276、コロネート4403）の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。この中空糸束の繊維端の内、一方を封止し、もう一方を開放の状態にしておいた。
【００５５】
４．プローブ及び高分子化合物を含むのゲル前駆体溶液の調製
表５に示した組成のゲル前駆体溶液を調製した。なお、表５中、参考例１及び２は後述するaRNAの除去を確認するための基準として設定した。
【００５６】
〔表５〕
2007114103.tif 000006
５．ゲル充填中空繊維束の製造
４．にて調製したゲル前駆体溶液を、３８４マイクロタイタープレートの所定位置のウェルに図２に示した通りに、各条件につき３ウェルに８０μｌ分注した。
【００５７】
次に中空繊維束の開放してある繊維末端をゲル前駆体溶液に浸漬した状態で、固定し、デシケーター内に設置した。次にデシケーター内を減圧状態にしたのち、デシケーター内に窒素ガスを封入し、系内を常圧に戻して、ゲル形成溶液を中空繊維中空部へ導入した。次いで、容器内を70℃とし、３時間重合反応を行った。このようにしてプローブがゲルに固定化されたゲル充填中空繊維束を得た。
【００５８】
６．薄片化
５．で得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．５ｍｍのマイクロアレイ５０枚を得た。
【００５９】
７．aRNAのゲルからの除去
次に、以下のａ）〜ｄ）の工程に従って、６．で得られた薄片のゲル中のaRNA除去処理を行った。
【００６０】
ａ）シャーレにAmbion社製の10×RNA  Fragment  reagent  500μl、滅菌水  9.5mlを混合し70℃に加温する。
【００６１】
ｂ）チップ6枚をこの溶液中に浸漬し70℃でインキュベーションする。
【００６２】
ｃ）60分ごとにチップを取り出して、取り出したチップを2×SSC中に1時間浸漬する。
【００６３】
ｄ）さらに、上記ｂ）及びｃ）の操作を３回繰り返し、計１８０分間処理を行う。
【００６４】
aRNAが除去されているかを確認するために、2×SSC溶液8mlにSYBR  Goldを1万倍希釈で溶解させた溶液を調製し、処理したチップを染色した。2×SSCに３０分間浸漬後、ＣＣＤカメラを具備した蛍光顕微鏡を使って、CyTM3のフィルターを使用し、露光時間10msecで検出蛍光強度を測定した。測定結果は図３に示した。１２０分処理後には、参考例１の蛍光強度は参考例２の蛍光強度と同等になり、aRNAがほぼ除去されていると判断した。よって、aRNAの除去処理は、120分間、行うことし、６．で得られたマイクロアレイを処理した。
【００６５】
８．検体の調製
次にハイブリダイゼーションに供する検体の調製を行った。
【００６６】
（１）TotalＲＮＡからFirst Strand cＤＮＡの合成
今回の実験では、酵母由来のTotalＲＮＡ５μｇ（クロンテック社製）から、上記２．（１）と同様の操作により、First Strand cＤＮＡを合成した。
【００６７】
（２）cＤＮＡのＰＣＲ増幅
次にこのFirst Strand cＤＮＡを鋳型にして、下記プライマー（配列番号２及び３）でＰＣＲ増幅を行った。
【００６８】
プライマー１（配列番号２）；TAATACGACT CACTATAGGG TTCTATCAAC CCGGATGAGG
プライマー２（配列番号３）；CCAGCACCGTA AAATTCGT
PCRは以下の条件で行った。
【００６９】
〔表６〕
2007114103.tif 000007
（条件）［94℃：10min］→［94℃：30秒］→［62℃：30秒（30サイクル）］→［72℃：30秒］→［72℃：5min］→［4℃：∞］。ＰＣＲ反応終了後、QIAGEN  PCR  purification  Kitで精製  50μlのcＤＮＡ溶液を得た。
【００７０】
（３）aＲＮＡの転写合成
Ambion社のMEGAscript T7 Kit (Ambion #1334)を使用し、0.2ml-PCR用チューブに表７の試薬を加え、37℃で6時間〜overnight、インキュベーションした。
【００７１】
〔表７〕
2007114103.tif 000008
（４）aＲＮＡの精製
２．（５）と同様の操作により、aＲＮＡを精製して、検体aＲＮＡを得た。
【００７２】
９．ａＲＮＡ検体を用いたハイブリダイゼーション
（１）aＲＮＡ検体の断片化
Ambion社のRNA Fragmentation Reagents (Ambion #8740)を使用し、表８に示す条件で断片化を行った。70℃で５分間インキュベーションした後、キット付属のStop Solutionを2μｌ添加した。
【００７３】
〔表８〕
2007114103.tif 000009
（２）検体溶液の調整とハイブリダイゼーション操作
（１）で調製した断片化aRNA溶液に、表９に記載の各溶液を混合し、100μlとした。
【００７４】
溶液中のSSC及びSDSの最終濃度は、2×SSC、0.2％ SDSとなる。
【００７５】
〔表９〕
2007114103.tif 000010
この溶液を94℃で2分間加熱した後、37℃まで冷却した。次いで、７．で処理したマイクロアレイと共にハイブリパックに封入し、65℃の遮光されたインキュベーター内で17時間、静置し、ハイブリダイゼーションを行った。
【００７６】
（３）洗浄操作
ハイブリパックからチップを取り出し、あらかじめ45℃にしておいた2×SSC・0.2％ SDS溶液15mlの入った円筒ケースに浸漬させ、45℃に保温して20分間静置した。次に、45℃にしておいた新たな2×SSC・0.2％ SDS溶液15mlの入った円筒ケースに入れ替えて、さらに45℃で20分間洗浄した。最後に、45℃にしておいた2×SSC溶液15mlの入った円筒ケースに入れ替えて、45℃で10分間洗浄した。
【００７７】
１０．検出操作
上記ハイブリダイゼーション処理後、蛍光検出装置を用いて、核酸ハイブリッドの検出を行った。
【００７８】
（１）マイクロアレイの染色処理
検出装置で検出する前に、アマシャム社製ストレプトアビジン-CyTM5標識試薬を使って染色を行った。ストレプトアビジン-CyTM5標識試薬バッファーにマイクロアレイを浸漬して、室温で３０分間染色した。染色後、表１０に示す洗浄バッファーに室温で、５分間の浸漬操作を４回行った。
【００７９】
〔表１０〕
2007114103.tif 000011
（２）蛍光検出
（１）で蛍光標識されたマイクロアレイを三菱レイヨン社製冷却ＣＣＤ式蛍光検出装置で各スポットの蛍光強度を測定した。
【００８０】
＜検出条件＞
・蛍光フィルター；  CyTM5フィルター
・露光時間    ；  340msec
（３）検出結果
蛍光検出結果を図４に示した。図中「Ｂ」とは、ブランクスポットの結果を示す。なお、図中の蛍光強度は、3スポットの平均値で示した。図４の結果から、aRNAにより空間を設けなかったゲル（比較例１）に対して、aRNAにより空間を設けたゲル（実施例１及び２）の方が、約2〜3.5倍、蛍光強度が高い結果となった。また、実施例１及び２の結果から、aＲＮＡの添加割合に比例して蛍光強度が高くなることが確認された。この結果は、aＲＮＡをゲル化の際に添加したことによって、ゲルマトリックスにおける空間的自由度が向上したことを示唆するものである。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】配列固定器具を示した斜視図である。
【図２】プローブの固定位置を示した図である。
【図３】aRNAの除去処理結果を示した図である。
【図４】マイクロアレイの蛍光検出結果を示した図である。
【符号の説明】
【００８２】
５０・・・多孔板
５２・・・孔
５４・・・中空繊維
５６・・・板状物
【配列表フリーテキスト】
【００８３】
配列番号１・・・合成ＤＮＡ
配列番号２・・・合成ＤＮＡ
配列番号３・・・合成ＤＮＡ
【図１】
2007114103.tif 000012
【図２】
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【図３】
2007114103.tif 000014
【図４】
2007114103.tif 000015
【配列表】
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