(57)【要約】      （修正有）【課題】省スペースで、１ｍＬを超える比較的多量の試料を用いて、微生物の定量検査を簡便に実施することができる、微生物の培養方法、および微生物培養器の提供。【解決手段】袋状容器にシート状培地が収容されている微生物培養器に、その開口から試料液を投入し、次いで該開口を密閉し、該微生物培養器を微生物培養の条件下に置くことを含む微生物の培養方法；上記の微生物の培養方法に使用する微生物培養器であって、袋状容器にシート状培地が収容されている微生物培養器。【選択図】図１
2007124985.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
袋状容器にシート状培地が収容されている微生物培養器に、その開口から試料液を投入し、次いで該開口を密閉し、該微生物培養器を微生物培養の条件下に置くことを含む微生物の培養方法。
【請求項２】
該シート状培地が多孔質マトリックス層と水溶性高分子化合物層とを含む、請求項１記載の微生物の培養方法。
【請求項３】
該シート状培地における水溶性高分子化合物の質量（ｇ）と試料液の容量（ｍＬ）とが下記式（１）の関係にある、請求項２記載の微生物の培養方法。
式（１）：
０．０８＜水溶性高分子化合物の質量（ｇ）／試料液量（ｍＬ）＜０．５
【請求項４】
請求項１記載の微生物の培養方法に使用する微生物培養器であって、袋状容器にシート状培地が収容されている微生物培養器。
【請求項５】
該シート状培地が、多孔質マトリックス層と水溶性高分子化合物層とを含む、請求項４記載の微生物培養器。
【請求項６】
該水溶性高分子化合物が、セルロース誘導体及びポリビニルアルコールからなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項５記載の微生物培養器。
【請求項７】
ポリビニルアルコールが、鹸化度７５〜９５％、及び分子量２５，０００〜２５０，０００である、請求項６記載の微生物培養器。
【請求項８】
多孔質マトリックス層を形成する物質が、セルロース及びナイロンからなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項５記載の微生物培養器。
【請求項９】
多孔質マトリックス層が、目付４０〜１００ｇ／ｍ2、通気度７〜２４ｃｍ／ｓｅｃのナイロンメルトブロー不織布である、請求項５記載の微生物培養器。
【請求項１０】
シート状培地における水溶性高分子化合物の含有割合が、４０〜３００ｇ／ｍ2である、請求項５記載の微生物培養器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物の培養方法、及び微生物を培養するための培養器に関する。さらに詳しくは１ｍLを超える比較的多量の試料液を簡便に、定量的に検査できる省スペースな微生物の培養方法、及び培養器に関する。この培養器に、試料液を加えることにより微生物が生育する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の培養は通常、液体培地または寒天培地を用いて行われる。液体培地では試料量の制限はないが、定量性はなく、かさばる欠点がある。寒天培地では通常用いられている直径９０ｍｍのシャーレでは試料液は通常１ｍＬまでであり、１ｍＬを超える試料液の検査は難しい。
従って微生物濃度の比較的低い試料を検査するときには、１ｍＬ程度の試料液で検査するために、先ず原試料を増菌培養した後に検査に供することが行われている。サルモネラ等食中毒菌の検査には１ｃｆｕ／２５ｇの感度が要求され、近年、医療系の水の検査、例えば透析用の水（透析水）において発熱性物質のみならず微生物の検査が薦められている。しかしながら、このような試料は微生物濃度がかなり低いため、検査には多量の試料液が必要になる場合がある。例えば透析水には、試料１ｍＬ中に１個未満の細菌が検出できる高い感度が求められることがあり、１ｍＬを超える例えば１０〜２０ｍＬの試料液を直接、定量的に微生物検査することができれば簡便で望ましい。
このような多量の試料液の検査には、より大きな容器を用いれば、１ｍＬを超える試料液の検査も可能であるが、場所をとり実用的でない。例えば特許文献１に提案されるようなシート状の培地を大きな面積で使用すれば、１ｍＬを超える試料の定量検査も可能となるが、培地部分より大きな台紙とカバーフィルムが必要となるため省スペース性が損なわれ、大面積となるとカバーの開け閉め、試料液の拡散にも時間を要することになる。
従って、省スペースで、１ｍＬを超える比較的多量の試料の微生物定量検査が簡便にできる、微生物の培養方法及び培養手段が求められる。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第０１／４４４３７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、例えば省スペースで、１ｍＬを超える比較的多量の試料を用いて、微生物の定量検査を簡便に実施することができる、微生物の培養方法を提供することを目的とする。また、そのような培養方法に使用できる、微生物培養器を提供することも本発明の目的である。より詳しくは、培地調製の手間を省き、保存性の良い、省スペースで１ｍLを超える試料の定量検査のできる微生物培養器を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、比較的多量の試料を用いて特定の培養器により微生物培養することにより、該試料の定量的な微生物検査が実施できることなどを見出し、本発明を完成させるに至った。
従って本発明は、袋状容器にシート状培地が収容されている微生物培養器に、その開口から試料液を投入し、次いで該開口を密閉し、該微生物培養器を微生物培養の条件下に置くことを含む微生物の培養方法である。本発明はまた、袋状容器にシート状培地が収容され滅菌された微生物培養器に、その開口から試料液を投入し、次いで該開口を密閉し、該微生物培養器を微生物培養の条件下に置くことを含む微生物の培養方法である。
本発明はさらに、上記微生物の培養方法に使用する微生物培養器であって、袋状容器にシート状培地が収容されている微生物培養器である。本発明はまた、袋状容器にシート状培地が収容され滅菌されている微生物培養器である。
本発明で使用する微生物培養器において、該シート状培地は積層物であることが好ましく、該シート状培地が少なくとも多孔質マトリックス層と水溶性高分子化合物層とを含む微生物培養器が特に好ましい。
また、本発明の微生物の培養方法の実施態様として、微生物培養器のシート状培地における水溶性高分子化合物の質量（ｇ）と試料の容量（ｍＬ）との関係が下記式（１）にあることが望ましい。
式（１）：
０．０８＜水溶性高分子化合物の重量（ｇ）／試料液量（ｍＬ）＜０．５
上記微生物培養器における袋状容器は、微生物の生育が観察可能な透明性を有していることが望ましい。
【０００６】
本発明の好ましい実施態様として、微生物培養器のシート状培地における水溶性高分子化合物層を形成する水溶性高分子化合物が、セルロース誘導体、ポリビニルアルコールからなる群から選ばれる少なくとも一種である、微生物培養方法あるいは微生物培養器がある。さらに該ポリビニルアルコールが、鹸化度７５〜９５％、分子量２５，０００〜２５０，０００である、微生物培養方法あるいは微生物培養器がある。
本発明の別の好ましい実施態様として、微生物培養器のシート状培地における多孔質マトリックス層を形成する物質がセルロース及びナイロンからなる群から選ばれる少なくとも一種である、微生物培養方法あるいは微生物培養器がある。さらに、多孔質マトリックス層が、目付４０〜１００ｇ／ｍ2、通気度７〜２４ｃｍ／ｓｅｃのナイロンメルトブロー不織布である微生物培養方法あるいは微生物培養器がある。
本発明の別の好ましい実施態様として、微生物培養器のシート状培地における水溶性高分子化合物の含有割合が４０〜３００ｇ／ｍ2である、微生物培養方法あるいは微生物培養器がある。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、シート状培地を袋状の容器に収容しておくことにより、１ｍLを超える比較的多量の試料液の培地への添加が容易になり、また、試料液の拡散を待つことなく該袋状容器を閉じることができる。試料液は袋を閉じた後にシート状培地全体に拡がる。
本発明の微生物培養方法及び微生物培養器によれば、１ｍLを超える試料の定量検査が簡便に省スペースででき、例えば透析水といった微生物濃度のかなり低い試料であっても、検査前に増菌培養をすることなく、直接１０〜２０ｍＬ程度の試料を微生物検査に供することができ、感度の高い検査が可能となる。検体１ｍＬあたり、１ｃｆｕ未満の感度の測定が容易に行える。
また、本発明の微生物培養方法及び微生物培養器によれば、培養に場所をとらず、省スペースで微生物を培養することができ、廃棄物量も寒天培地を使った方法と比べて大幅に減少する。さらに、本発明の微生物培養器は、保存性がよく、また、シート状培地を２枚重ね又は二つ折りにして袋状の容器に収容することによって、より省スペースとなり好ましい形態となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の微生物の培養方法及び微生物培養器について、以下に詳細に説明する。
本発明の微生物の培養方法において、シート状培地が袋状容器に収容されている微生物培養器は、例えば該袋状容器の開口からシート状培地を挿入することにより、この微生物培養器を準備することができる。
［微生物培養器−袋状容器］
本発明で使用する袋状容器は、微生物培養器の開口を提供できるものである。
袋状容器の材質としては試料液の添加時に該試料液が漏れず、液体不浸透性であって、一方好気性細菌が生育する酸素透過性を有していることが望ましい。また、微生物の生育を観察するために透明または半透明であることが好ましい。
本発明において袋状容器の材質は特に限定されないが、実質的に無孔性であり、酸素透過率が３ｃｃ/ｍ2/２４時間以上であることが好ましい。具体的には、樹脂フィルムが挙げられる。微生物の生育にとって十分なガス透過性があるように、その際のフィルムの厚みは２０〜１２０μｍの範囲であるのが適当である。樹脂としては具体的にポリエチレン、ポリプロピレン、及びこれらの複合物などが挙げられる。例えば、ポリプロピレンを用いる場合、その厚みは１２０μｍ以下であることが望ましい。
【０００９】
袋状容器の形状は特に限定されないが、一般的に正方形又は長方形である。袋状容器の大きさは、検査する試料液量により変動させることが可能であり、例えば試料液量が１０ｍＬとすれば１００×１２０ｃｍ〜１６０×２００ｃｍ程度が適当である。袋状容器はまちを有していてもよく、後述するシート状培地が１枚、又は２枚重ね、又は二つ折りで収容できる大きさであればよい。
袋状容器が提供する開口は、容器に付属したジッパーで開閉できる開口でもよいし、ジッパーを有しない開口であってもよいし、容器の一部をカットすることにより開口ができるものでもよい。その開口からサンプルを投入する。また、袋状容器の開口はシート状培地を収容するときにも使用し得る。
シート状培地を収容した後、あるいはサンプルを投入した後は、ジッパーを閉じるか又は開口を１回以上折り畳んでクリップなどで留めて密閉すればよい。
【００１０】
［微生物培養器−シート状培地］
シート状培地の構成は、積層物であることが望ましく、とりわけ多孔質マトリックス層と水溶性高分子化合物層とを含むシート状培地が特に好ましい。シート状培地のさらなる具体的構造として、基板、水溶性高分子化合物層及び多孔質マトリックス層を含むものがある。
上記水溶性高分子層には、培養を目的とする微生物に適した栄養成分を含ませることができる。水溶性高分子層にはさらに、ｐＨ調製剤、目的以外の微生物の生育を抑制する選択剤、微生物の生育を見やすくする又は特定の微生物の生育を確認するための発色剤、色素、界面活性剤、無機塩類などから選ばれる少なくとも１種を含ませることができる。
シート状培地の製造方法として、例えば、水溶性高分子化合物、及び培養を目的とする微生物に適した栄養成分、ｐＨ調製剤、目的以外の微生物の生育を抑制する選択剤、微生物の生育を見やすくする又は特定の微生物の生育を確認するための発色剤、色素、界面活性剤、無機塩類などを含む水溶液を基板上に塗布して乾燥してフィルムを形成させる方法があり、上記の各成分を別々に含む水溶性高分子化合物の水溶液を逐次塗布し重層しても良い。
従って本発明で使用するシート状培地の実施態様は、多孔質マトリックス層、及び少なくとも１層の水溶性高分子化合物層を含み、水溶性高分子化合物層の少なくとも１層は栄養成分を含むものである。
【００１１】
シート状培地の具体的な製法として、例えば、ポリエステルなどのフィルム（基板）上に栄養成分、塩成分および、発色酵素基質を含む水溶性高分子化合物の水溶液を塗布し、乾燥フィルム化するなどが挙げられる。
さらに別の態様としては、ポリエステルなどのフィルム（基板）上に水溶性高分子の水溶液を重層し、乾燥フィルム化した後、このフィルム上に栄養成分などを含む水溶性高分子の水溶液を重層し、乾燥フィルム化する。さらにこのフィルム上に発色剤を含む水溶性高分子の水溶液（この水溶液にはさらに栄養成分およびｐＨ調整剤を含んでいても良い）を重層し乾燥フィルム化する。
【００１２】
上述のようなフィルム層の上に、さらに多孔質マトリックスを重層して乾燥する。多孔質マトリックス層があることにより試料液が拡散しやすく使いやすくなる。多孔質マトリックスを重層する場合、一番上の層が乾燥する前に多孔質マトリックスを重層してから乾燥させると良い。栄養成分、ｐＨ調製剤、選択剤、発色剤、色素、界面活性剤、無機塩類などの各種成分のすべて又は一部を、グラビアロールなどを用いて多孔質マトリックスに塗布しておいても良い。
【００１３】
［微生物培養器の製法−シート状培地の袋状容器への収容］
このようにして作製した乾燥フィルム状の培地層をポリエステルなどのフィルム（基板）から剥がし、もしくは剥がさずに、培養する試料液量に見合った大きさに切断して、シート状培地を作製する。このシート状培地を上記の袋状容器に収容して、袋状容器に付属したジッパーなどにより、あるいは袋状容器の開口を畳んで密閉する。
シート状培地を袋状容器に収容する別の方法として、以下の方法がある。上記の袋状容器の項で説明したポリエチレンなどの材質のフィルム２枚の間にシート状培地を挟み、シート状培地の周囲のフィルム２枚を加熱して熱接着させることにより、シート状培地を袋状容器に収容することができる。この方法において具体的には、シート状培地が正方形又は長方形である場合、シート状培地の３辺の周囲のフィルムは、シート状培地の該３辺のすぐ外側を熱接着させ、残りの１辺の周囲のフィルムは、その１辺から２〜５ｃｍ程度離れた箇所を熱接着させ、その後、フィルム２枚が熱接着した箇所の外側を切り取ることによって、シート状培地が袋状容器に収容された微生物培養器を作ることができる。このような培養器においては、シート状培地から離れて熱接着している袋状容器の一辺を切り取ることによって開口を提供できる。また、フィルムの３辺を熱接着し、１辺は粘着テープにより接着することによっても袋状容器を作ることができる。この袋状容器は粘着テープを剥がすことによって開口を提供できる。
上述のようにシート状培地を収容した袋状容器は、ガス滅菌、ガンマ線滅菌などの滅菌処理を施すことにより、滅菌済みの微生物培養器とすることができる。
【００１４】
本発明のシート状培地を収容した微生物培養器の一例の写真を図１に表す。このような微生物培養器は、ポリエチレン、ポリエチレンラミネートポリプロピレンなどのフィルム２枚の間にシート状培地を挟み、フィルムの３辺をシート状培地の外側で熱接着し、開口部とする１辺を粘着テープなどで接着して作製することができる。このときフィルムの一部または１枚すべてをポリエチレンラミネート紙にすることをできる。一部をポリエチレンラミネート紙にするときはあらかじめフィルムとポリエチレンラミネート紙を熱接着しておいても良く、また、粘着テープなどにより接着しても良い。粘着テープを剥がして試料液を入れた後、再び粘着テープで閉じることにより密閉することもできる。
【００１５】
［微生物培養器−シート状培地の具体的態様］
シート状培地の基板としては、加熱乾燥時の引っ張り強度が十分であれば特に限定されるものではなく、一般的には２０〜５０μｍ厚のポリエステルフィルムが使用される。
【００１６】
シート状培地の水溶性高分子化合物層を形成する水溶性高分子化合物は、試料液を加えたとき溶解して１０ｃｐｓ以上の粘度を示し、微生物の生育を阻害しないものなら良い。たとえば、ポリビニルアルコール；変性ポリビニルアルコール（酢酸ビニルの重合の際に、不飽和ジカルボン酸〔例えば、マレイン酸、フマール酸、グルタコン酸、アリルマロン酸、これらの無水物、またはこれらのモノアルキルエステル〕を共重合したもの（重合方法は例えば、特公昭６１−４２００２号公報参照）、ポリビニルアルコールに環状酸無水物を反応させたもの；セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシアルキルセルロース（例えば、ヒドロキシメチルセルロース）；澱粉およびその誘導体（例えば可溶性澱粉、カルボキシメチル化澱粉）；セルロース誘導体、澱粉およびその誘導体以外の多糖類（例えば、ヒアルロン酸、グアーガム、アラビアゴム）；アクリル酸およびその誘導体（例えば、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩、アクリル酸（塩）−ビニルアルコールコポリマー）；ポリエーテル（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール）；タンパク質、タンパク質誘導体（例えば、コラーゲン）が挙げられる。
【００１７】
水溶性高分子化合物は、オストワルド粘度計を用いて２０℃で測定した４質量％水溶液の粘度が、好ましくは１０cps以上、さらに好ましくは１５〜８０cpsを示す。このような水溶性高分子化合物を使用することにより、微生物が培地の内部に侵入することなく、また分裂を開始した微生物が培地表面を移動することなく、主としてその表面にコロニーを形成し、その計数が容易になるので好ましい。
これらの水溶性高分子化合物の中でも、セルロース誘導体及びポリビニルアルコールからなる群から選ばれるものが好ましく、鹸化度７５〜９５％、分子量２５０００〜２５００００のポリビニルアルコールが特に好ましい。
本発明の微生物培養器のシート状培地における水溶性高分子化合物の含有量は、４０〜３００ｇ／ｍ2が適当であり、７０〜１５０ｇ／ｍ2が好ましい。
【００１８】
シート状培地の多孔質マトリックス層を形成するための材料として、合成繊維（例えば、ナイロン、ポリアクリロニトリル、ポリエステル（特に親水化処理したもの）、ポリオレフィン（特に親水化処理したもの）ポリウレタン）、半合成繊維（例えば、レーヨン等）、天然繊維（例えば、羊毛(獣毛)、絹、綿、セルロース、パルプ等）、無機繊維（例えば、ガラス繊維）等で形成された編織布、繊維ウェブ、不織布、上記繊維の構成素材で作られた多孔質フィルム、スポンジ、多孔質セラミックス等があげられる。多孔質マトリックスは必ずしも親水性である必要はないが、親水性の多孔質マトリックスまたは親水化処理した多孔質マトリックスを用いれば吸水速度が速くなり、作業の能率が上がる。親水性または親水化処理した多孔質マトリックスの表面に水溶性物質を塗布しておくと微生物の分散性が向上し、より好ましい。多孔質マトリックスのなかでは繊維ウェブや不織布が好ましい。繊維ウェブや不織布を構成する繊維としてはナイロン、コットン、セルロース、レーヨンが好ましく、ナイロンからなる繊維ウェブまたは不織布が特に好ましい。ナイロン不織布ではメルトブローン製法で作製した不織布が好ましい。
多孔質マトリックス層の好ましい例として、目付４０〜１００ｇ／ｍ2、通気度７〜２４ｃｍ／ｓｅｃのナイロンメルトブロー不織布がある。
本発明で使用する多孔質マトリックス層の具体例として、例えば国際公開第０１／４４４３７号パンフレットに開示されているものがある。
【００１９】
上述のシート状培地に用いられる栄養成分、すなわち培地成分としては、検出目的とする微生物の生育に適したものであれば本発明に用いることができる。例えば、汎用の液体培地や寒天培地から寒天を除いた培地成分等が利用できる。さらに検出目的以外の微生物の生育を抑える選択剤や、生じたコロニーを見やすくするための指示薬、発色剤等をシート状培地に加えてもよく、また特定の微生物を検出するために発色または蛍光酵素基質を加えてもよい。その他、色素、界面活性剤、無機塩類などを添加することができる。
【００２０】
微生物のための培地成分としては、例えば、一般生菌検査用としては、酵母エキス・ペプトン・ブドウ糖混合物、肉エキス・ペプトン混合物、ペプトン・大豆ペプトン・ブドウ糖混合物や、これらにリン酸塩、塩化ナトリウム、炭酸塩、マグネシウム塩などの塩類を加えた混合物が、大腸菌・大腸菌群検査用としては、デソキシコール酸ナトリウム・ペプトン・クエン酸鉄アンモニウム・塩化ナトリウム・リン酸二カリウム・乳糖・ニュートラルレッド混合物、ペプトン・乳糖・リン酸二カリウム・エオジンＹ・メチレンブルー混合物等が、ブドウ球菌検査用としては、肉エキス・ペプトン・塩化ナトリウム・マンニット・フェノールレッド・卵黄混合物、ペプトン・肉エキス・酵母エキス・ピルビン酸ナトリウム・グリシン・塩化リチウム・亜テルル酸卵黄液混合物等が、ビブリオ検査用としては、酵母エキス・ペプトン・蔗糖・チオ硫酸ナトリウム・クエン酸ナトリウム・コール酸ナトリウム・クエン酸第２鉄・塩化ナトリウム・牛胆汁・ブロムチモールブルー・チモールブルー混合物等が、腸球菌用としては、牛脳エキス・ハートエキス・ペプトン・ブドウ糖・リン酸二カリウム・窒化ナトリウム・ブロムチモールブルー・塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム混合物等が、真菌用としては、ペプトン・ブドウ糖混合物、酵母エキス・ブドウ糖混合物、ポテトエキス・ブドウ糖混合物等が、サルモネラ用としては、ペプトン、肉エキス、グリセリン、チオ硫酸ナトリウム、L−リジン、クエン酸鉄アンモニウム、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム混合物などが、水系細菌用としては、ペプトン、酵母エキス、カザミノ酸、グルコース、リン酸塩、溶性デンプン、マグネシウム塩混合物などが用いられる。
【００２１】
ｐＨ調整剤としては、リン酸塩、炭酸塩（リン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムなど）などが挙げられる。
このようなｐＨ調整剤は微生物の生育に適したｐＨを維持するように使用されるものである。
【００２２】
本発明で用いられる選択剤としては、抗生物質，合成抗菌剤等の抗生剤、色素、界面活性剤、無機塩等が用いられる。抗生物質としては、メチシリン、セフタメタゾール、セフィキシム、セフタジジム、セフスロジン、バシトラシン、ポリミキシンＢ、リファンピシン、ノボビオシン、コリスチン、リンコマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等が例示でき、合成抗菌剤としては、サルファ剤、ナリジクス酸、オラキンドックス等が例示できる。
また、色素としては、静菌または殺菌作用のあるクリスタルバイオレット、ブリリアントグリーン、マラカイトグリーン、メチレンブルー等が例示できる。
また、界面活性剤としては、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ７，ドデシル硫酸塩，ラウリル硫酸塩等が例示できる。
また、無機塩類としては、亜セレン酸塩、亜テルル酸塩、亜硫酸塩、窒化ナトリウム、塩化リチウム、シュウ酸塩、高濃度の塩化ナトリウム等が例示できる。
これら以外にもタウロコール酸塩、グリシン、胆汁末、胆汁酸塩、デオキシコール酸塩等を用いることができる。
【００２３】
生じたコロニーを見やすくするために、水溶性高分子化合物層にテトラゾリム塩またはエステラーゼ、フォスファターゼなどの発色または蛍光酵素基質を加えておくことで、微生物の生育を発色または蛍光スポットして容易に観察できる。また、特定の微生物が有する酵素の発色または蛍光酵素基質を加えておくことで、特定の微生物が検出できる利点がある。例えば５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド、６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸などがある。
【００２４】
シート状培地の形状は正方形又は長方形が一般的である。その面積、厚みは、検査する試料液量及びシート状培地に使用する水溶性高分子化合物、多孔質マトリックス及びそれらの量によって変動するものである。シート状培地は望ましくは、式（１）に示される水溶性高分子化合物の質量と検体となる試料液量の関係を満たし、及び上述したようにシート状培地における水溶性高分子化合物の含有量４０〜３００ｇ／ｍ2を満たすような大きさである。
本発明で使用するシート状培地の好ましい構成として、基板（例えばポリエステルフィルム）上に、水溶性高分子化合物層、栄養成分を含む水溶性高分子化合物層、水溶性高分子化合物層、及び多孔質マトリックス層がこの順で積層されているものがある。また別の好ましい構成として、基板（例えばポリエステルフィルム）上に、水溶性高分子化合物層、栄養成分を含む水溶性高分子化合物層、発色剤を含む水溶性高分子化合物層、及び多孔質マトリックス層がこの順で積層されているものがある。上記の多孔質マトリックス層には、栄養成分、ｐＨ調製剤、選択剤、発色剤、色素、界面活性剤、無機塩類などの各種成分のすべて又は一部を塗布してもよい。
本発明で使用するシート状培地としては、例えば国際公開第９７／２４４３２号パンフレットに開示された微生物培養器材を使用することもできる。
上記のシート状培地を収容した使用前の微生物培養器を保存する条件は、栄養成分や発色剤の種類や安定性などによって適宜選ぶことができ、一般的に低温から常温の範囲である。
【００２５】
［培養方法］
上述のようにして得られた微生物培養器の袋状容器を開口し、この開口から該微生物培養器に試料を投入することができる。
培養にあたって、微生物培養器のシート状培地における水溶性高分子化合物の質量（ｇ）と試料液の容量（ｍＬ）とが下記式（１）の関係にあることが望ましい。
式（１）：
０．０８＜水溶性高分子化合物の重量（ｇ）／試料液量（ｍＬ）＜０．５
微生物培養器に試料液を投入した後、該容器を密閉する。この密閉の程度は水分が漏れず、かつ雑菌が入らないことが望ましい。その後、該微生物培養器を培養の目的とする微生物に適した温度及び時間などの条件下で培養する。本発明の微生物培養器は好気性菌の培養に適しているが、微生物培養器を嫌気性雰囲気に置くことによって嫌気性菌の培養を行うことができる。
次に実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
［実施例１］
水０．２５Ｌに鹸化度８９％重合度１７００のポリビニルアルコール３０ｇを加え加熱溶解後、２０μｍ厚０．５×１ｍポリエステルフィルム上に塗布し、１２０℃、５分間乾燥しフィルム化した。このフィルム上に、鹸化度８９％、重合度１７００のポリビニルアルコール１６ｇ、ペプトン０．１２５ｇ、酵母エキス０．１２５ｇ、カザミノ酸０．１２５ｇ、グルコース０．１２５ｇ、炭酸ナトリウム０．０５ｇ、リン酸二カリウム０．０７５ｇ、溶性デンプン０．１２５ｇ、硫酸マグネシウム０．０１２５ｇを水０．２５Ｌに溶解して、１１０℃、7分間乾燥した。このフィルム上に、ポリビニルアルコール５ｇ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート０．１５ｇ、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド０．０１５ｇを水０．１Ｌに溶解して重層し、目付６５ｇ／ｍ2、通気度１１０Ｌ/ｍ2ｓｅｃのナイロンメルトブロー不織布を張り合わせ１００℃３０秒間乾燥した。ペプトン１ｇ、リン酸二ナトリウム４ｇを水１Ｌに溶解し、６０メッシュ四角錐グラビアロールを用いて、不織布上に塗布し、１００℃２０秒間、乾燥し、シート状培地を作製した。
該シート状培地を１６０×１０５ｍｍに切断して（株）生産日本社製ユニパックＦ−４（大きさ：１２０×１７０ｃｍ）に入れ、エチレンオキサイドガス滅菌を行い、微生物培養器を作製した。浄水器より採取した水１０ｍＬを作製した培地に加え開口を閉じて、２５℃で培養した。培養２日目より青色、赤色および紫色のスポットが認められた。
【００２７】
［実施例２］
実施例１で作製したシート状培地を８０×１０５ｍｍに切断し、２枚を不織布側が外側になるように重ね合わせて、（株）生産日本社製ユニパックＤ−４に入れ、エチレンオキサイドガス滅菌を行い、微生物培養器を作製した。実施例１に比べ約半分の大きさとなり、より使いやすくなった。実施例１と同様に浄水器より採取した水１０ｍＬを作製した培地に加え開口を閉じて、２５℃で培養した。培養２日目より青色、赤色および紫色のスポットが認められた。
【００２８】
［実施例３］
水０．２５Ｌに鹸化度８９％、重合度１７００のポリビニルアルコール３５ｇ加え加熱溶解後、２０μｍ厚０．５×１ｍポリエステルフィルム上に塗布し、１２０℃、５分間乾燥フィルム化した。このフィルム上に、鹸化度８９％、重合度１７００のポリビニルアルコール１６ｇ、ペプトン１．５ｇ、肉エキス０．５ｇ、グリセリン１．２５ｇ、マンニトール０．８ｇ、チオ硫酸ナトリウム１．２ｇ、L−リジン塩酸塩１．２ｇ、炭酸ナトリウム０．２ｇ、クエン酸鉄アンモニウム０．２５ｇを水０．２５Ｌに溶解して重層し、１１０℃、7分間乾燥した。このフィルム上に、ポリビニルアルコール３ｇを水０．１Ｌに溶解して重層し、目付６５ｇ／ｍ2、通気度１１０Ｌ/ｍ2ｓｅｃのナイロンメルトブロー不織布を張り合わせ１００℃３０秒間乾燥した。ペプトン１ｇ、デオキシコール酸ナトリウム０．５ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム０．００２５ｇを水１Ｌに溶解し、６０メッシュ四角錐グラビアロールを用いて、不織布上に塗布し、１００℃２０秒間、乾燥した。８０×２１０ｍｍに切断し、不織布側が外側になるように二つ折りにして、（株）生産日本社製ユニパックＤ−４に入れた。
【００２９】
［実施例４］
バシルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＦＯ３１３４株、バシルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）ＩＦＯ１３４９４２株、サイトロバクタ・ディバーサス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉｖｅｒｓｕｓ）ＪＣＭ１６５９株、サイトロバクタ・フレンディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｕｅｎｄｉｉ）ＩＦＯ１２６８１株、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｕｅｎｄｉｉ ＩＩＤ９７６株、エンテロバクタ・クロアシエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）ＪＣＭ１２３２株、エスシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＩＦＯ１３５００株、クレブシエラ・テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）ＪＣＭ１６８７株、プロテウス・ミラビィリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）ＩＦＯ１３３００株、シュードモナス・エアロギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＩＦＯ３４４６株、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）ＩＦＯ３１３３株、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＪＣＭ１６５２株、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＩＩＤ１０００株、食品分離硫化水素産生Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属２株、およびロードコッカス・エキ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）ＪＣＭ１３１１株を普通ブイヨンで培養後、滅菌生理食塩水で約１ｃｆｕ／ｍＬとなるように希釈し、その１０ｍＬを実施例２で作製した培養器に加えて３５℃で培養した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属の５株すべては、約２０〜２８時間後には一つ培養器あたり５〜１３個の黒色スポットを形成した。これ以外の菌株で黒色スポットは観察されなかった。
【００３０】
［実施例５］
水０．２５Ｌに鹸化度８９％、重合度１７００のポリビニルアルコール３２ｇを加え加熱溶解後、２０μｍ厚０．５×１ｍポリエステルフィルム上に塗布し、１２０℃、５分間乾燥しフィルム化した。このフィルム上に、鹸化度８９％重合度１７００のポリビニルアルコール１６ｇ、ペプトン０．２５ｇ、肉エキス２ｇ、胆汁末０．４ｇ、硝酸カリウム０．２５ｇ、炭酸ナトリウム０．０５ｇ、リン酸二カリウム０．１２５ｇ、溶性デンプン０．１２５ｇ、硫酸マグネシウム０．０１２５ｇを水０．２５Ｌに溶解して重層し、１１０℃、7分間乾燥した。このフィルム上に、ポリビニルアルコール３ｇを水０．１Ｌに溶解して重層し、目付６５ｇ／ｍ2、通気度１１０Ｌ/ｍ2ｓｅｃのナイロンメルトブロー不織布を張り合わせ１００℃３０秒間乾燥した。ペプトン１ｇ、デオキシコール酸ナトリウム０．２５ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム０．３７ｇ、６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸０．１ｇを水１Ｌに溶解し、６０メッシュ四角錐グラビアロールを用いて、不織布上に塗布し、１００℃２０秒間、乾燥した。８０×１０５ｍｍに切断したシート状培地２枚を不織布が外側になるように重ね合わせて、４０μｍ厚ポリエチレンフィルムの間に挟み、３辺はシート状培地のすぐ外側を、１辺はシート状培地の外側２ｃｍのところを熱接着して、その周りをカットして袋状とし、エチレンオキサイドガス滅菌を行い、培養器を作製した。
【００３１】
［実施例６］
エスシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＩＦＯ１３５００株、ＩＩＤ５２０８株を普通ブイヨンで培養後、滅菌生理食塩水で約５００ｃｆｕ／ｍＬとなるように希釈し、１ｍＬを豚挽肉または牛豚合挽肉１００ｇに加えた。肉を良く混合後、２５ｇを秤とり、滅菌生理食塩水２２５ｍＬを加えて、１０倍乳剤を作製した。実施例５で作製した培養器の一角を切り、１０倍乳剤１０ｍＬを加え、切った部分を１回折りゼムクリップで閉じて、３５℃２４時間培養した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株を添加した肉では１〜８個の藤色のスポットが観察された。
【００３２】
［実施例７］
実施例３で作製したシート状培地を１６０×２００ｍｍに切断し、不織布側が外側になるように二つ折りにして、（株）生産日本社製ユニパックＦ−４に入れ培養器を作製した。鶏肉２５ｇに２２５ｍＬの滅菌生理食塩水を加えて１０倍乳剤を作製した。１０倍乳剤２０ｍＬずつを１試料あたり１０個の培養器に入れ、３５℃２４〜３０時間培養した。鶏肉試料３０検体中１検体は１つの培養器に１個の黒色スポットが、１検体は２つの培養器にそれぞれ１個および２個の黒色スポットが観察された。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明のシート状培地を収容した微生物培養器の一例の写真である。
【図１】
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