(57)【要約】【課題】  抗腫瘍活性等の生理活性を有する多糖類を、多孔菌類きのこから種々の試薬を用いることなく、効率よく抽出分画することのできる、新しいきのこ由来の多糖類取得方法を提供する。【解決手段】  多孔菌類きのこから多糖類を１４０℃〜２５０℃の範囲で加圧熱水方法で分画取得する。【選択図】 なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔菌類きのこから多糖類を加圧熱水方法で分画取得する方法であって、温度条件が１４０℃〜２５０℃の範囲であるとともに、圧力条件が０．１ＭＰａ〜１０ＭＰａの範囲であることを特徴とするきのこ由来の多糖類取得方法。
【請求項２】
多孔菌類きのこが、ヒイロタケ、カワラタケまたはコフキサルノコシカケであることを特徴とする請求項１記載のきのこ由来の多糖類取得方法。
【請求項３】
多糖類が、シゾフィラン型のグルカンであることを特徴とする請求項１または２記載のきのこ由来の多糖類取得方法。
【請求項４】
多糖類が、β−（１→４）グルカン、β−（１→３）グルカンおよびβ−（１→６）グルカンの構造を有する内の１種以上であることを特徴とする請求項１または２記載のきのこ由来の多糖類取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍活性等の生理活性を有する多糖類として注目されているシゾフィランを、多孔菌類のきのこから抽出分画する取得方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
きのこ細胞壁は多糖類・たんぱく質・脂質などから構成される天然高分子の集合体である。この中で多糖類は最も主要な成分で細胞壁の約４０〜７０％を占めている。この多糖類は細胞壁に独特の形を与え、子実体を形成する骨格材料として大きな役割を果たしていると考えられているが、その組成、階層構造や化学的・物理的性質の詳細はわかっていない。例えば、堅い子実体のマイタケやハナビラタケ等の担子菌類ヒダナシタケ目のきのこや、さらに堅い表皮を有するヒイロタケやカワラタケ、コフキサルノコシカケ等の多孔菌類については、特に主要な部分の構造、組成が全く分かっていなかった。
【０００３】
一方、きのこは古くから和漢薬、民間薬として強壮・鎮静・血圧降下など数々の薬効の他に、癌などの難病にも効果があることが語り継がれてきた。近年、その抗腫瘍活性や生理活性の根拠が、β−（１→３）グルカン、β−グルカンからなる多糖構造体、つまり、シゾフィラン型のグルカンにあることが実証された。これまで幾つかのきのこから熱水抽出法、酸、アルカリを繰り返し用いた抽出法、酵素分解法など様々な抽出法が示された。しかしながら、複雑な多組成を持つきのこの細胞壁中から上記グルカンを単離する一般的方法は示されていない。特に、上記のとおり、堅い外観のヒダナシタケ目のきのこや、さらに堅い表皮を有する多孔菌類のきのこから効率的に抽出、分画する方法は示されていない。
【０００４】
このような状況において、本発明者は、種々検討した結果、マイタケ等のヒダナシタケ目のきのこについては、あらかじめアセトンで脂質を十分に除き、続いて次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ）で水素結合を予備的に破壊すると、α−グルカンが除去されて、いわゆる粘着性のある物質が除かれることと、その後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等で水素結合力を弱くすると、タンパク質やキチン質をほとんど含まない、α型とβ型の複合糖質がほぼ選択的に得られることを見出した（非特許文献１）。
【０００５】
そして、本発明者は、上記非特許文献１による知見を基に、担子菌類ヒダナシタケ目のきのこから、多糖類を選択的に取得する方法を提案している（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００５−１３３０６９号公報
【非特許文献１】高分子学会第５０回北陸支部研究発表会予稿第６１頁（２００１年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、発明者らによるこれまでの検討においては、例えば、上記非特許文献１および特許文献１いずれにおいても、ＮａＣｌＯやＤＭＳＯ等の各種試薬類を使用する必要があり、また、依然として、表皮が堅いがため、多糖の構成がわからない多孔菌類きのこから、多糖類を選択的に取得することは可能とされていなかった。
【０００７】
そこで、この出願の発明はこのような背景から、抗腫瘍活性等の生理活性を有する多糖類を、多孔菌類きのこから種々の試薬を用いることなく、効率よく抽出分画することのできる、新しいきのこ由来の多糖類取得方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記の課題を解決するきのこ由来の多糖類取得方法として、第１には、多孔菌類きのこから多糖類を加圧熱水方法で分画取得する方法であって、温度条件が１４０℃〜２５０℃の範囲であるとともに、圧力条件が０．１ＭＰａ〜１０ＭＰａの範囲であることを特徴とし、また、上記の方法について、第２には、多孔菌類きのこが、ヒイロタケ、カワラタケ、またはコフキサルノコシカケであることを特徴とする。
【０００９】
第３には、多糖類が、シゾフィラン型のグルカンであることを特徴とし、そして、本発明は、第４には、多糖類が、β−（１→４）グルカン、β−（１→３）グルカンおよびβ−（１→６）グルカンの構造を有する内の１種以上であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
以上のとおりの第１〜第４の本発明によって、抗腫瘍活性等の生理活性を有する多糖類として注目されているシゾフィラン型のグルカン、具体的には、β−（１→３）グルカンやβ−（１→６）グルカン等の構造をもつβ−グルカンを、種々の試薬を用いることなく、効率よく多孔菌類のきのこから抽出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の最良の形態について説明する。
【００１２】
本発明は、多孔菌類きのこから多糖類を加圧熱水方法で分画取得する方法である。具体的には、加圧熱水の温度条件が１４０℃〜２５０℃の範囲であるとともに、圧力条件が０．１ＭＰａ〜１０ＭＰａの範囲であることを特徴としている。
【００１３】
本発明における「加圧熱水」は亜臨界水であり、この亜臨界水は、２５０℃付近で加水分解力が最大となり、有機物を高速で水に溶ける低分子に分解することができる。また、亜臨界水とすることで、水でありながら、油を抽出する力が強く、有機物中の油はほぼ１００％瞬時に抽出することもできる。通常、亜臨界水とは、水の臨界点以下の温度および圧力の水のことである。さらに説明すると、この水の臨界点とは、水の温度が３７４℃、圧力が２１８ａｔｍ（６４７Ｋ、２２．１ＭＰａ）とすることで、水と水蒸気の密度が等しくなり、水（液体）か、水蒸気（気体）かの区別がつかない状態になる。この点が臨界点である。
【００１４】
この点を考慮するとともに、さらに効率よくキノコの有効成分を抽出するために、本発明における加圧熱水（亜臨界水）の温度は、上記のとおり、１４０℃〜２５０℃の範囲とすることが好ましい。また、圧力についても、上記のとおり、０．１ＭＰａ〜１０ＭＰａの範囲とすることが好ましい。なお、加圧熱水（亜臨界水）となる原水は、通常の水道水でも使用できるが、イオン交換水や蒸留水、フィルター濾過した濾過水（たとえば、限外濾過水）等のように十分に精製した水を用いることが好ましい。
【００１５】
本発明において、対象とするきのこについては、従来、その表皮が堅いがため、多糖の構造が不明であり、抽出も容易ではなかった多孔菌類のきのこのうちの各種のものであってよい。たとえば、ヒイロタケ、カワラタケ、コフキサルノコシカケ等である。
【００１６】
いずれのきのこから抽出される多糖類は、抗癌機能を有するシゾフィラン型のグルカンであることが好ましく、また、多糖類が、β−（１→４）グルカン、β−（１→３）グルカンおよびβ−（１→６）グルカンの構造を有する内の１種以上であってもよい。
【００１７】
また、本発明においては、必要に応じて、アセトン等による前処理を行ってもよい。例えば、抽出した成分を食品等に応用する際には、色素が含まれていないほうが好ましく、そのために、アセトンを用いて前処理として脱色処理を行ってもよい。
【００１８】
そして、本発明についてさらに詳しく、多孔菌類の＜Ａ＞ヒイロタケ（Pycnoporus 
coccineus）からの多糖類の抽出、＜Ｂ＞カワラタケ（Coriolus versicolor）並びに＜Ｃ＞コフキサルノコシカケ（Elfvingia applanata）からの多糖類の加圧熱水抽出を例として説明する。いずれも１５０℃以下と、１８０〜２１０℃付近で抽出されるが、特に後者の範囲で収率が大きい。
【００１９】
なお、本発明は、以下の例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２０】
＜実施例１：ヒイロタケ（Pycnoporus coccineus）からの多糖類の抽出＞
通常の熱水抽出では抽出されない成分を加圧熱水の優れた加水分解能力を利用し、低分子化することにより水可溶化させ、種々の生理機能について検討することを目的とし、昇温パターンを低温と高温に分けた２段階昇温による抽出実験行いそれぞれのＢｒｉｘ（糖濃度）を測定し、収率を計算した。Ｂｒｉｘは、溶液の屈折率から溶質の濃度を推定するもので抽出の終点を確認するために用いた。
【００２１】
抽出処理に際し、ヒイロタケ試料としては、その子実体をハサミにて粒径２〜５ｍｍにカットしたものを実験試料とした。なお、試料中の水分は１１．３３ｗｔ％であった。また以下に示す方法により、試料の諸物性について調べた。
＜１＞  冷水可溶分
試料約２．０ｇを５００ｍＬ容ビーカに精秤し、蒸留水３００ｍＬを加えた。時々内容物をかき混ぜながら室温（２０℃）にて４８時間処理した。その後、内容物を重量既知の１Ｇ３ガラスフィルターを用い吸引濾過し、さらに室温の蒸留水にて洗浄を行い、フィルター上に抽出残留物を回収した。抽出残留物の入ったガラスフィルターは１０５℃に設定した乾燥機へ移し、恒量となるまで乾燥させた。冷水可溶分（ｗｔ％）は、次式にならって算出した。            
【００２２】
【数１】
2007204717.tif 000002
【００２３】
＜２＞  熱水可溶分
試料約２．０ｇを２００ｍＬ容三角フラスコに精秤し、蒸留水１００ｍＬを加えた。続いてフラスコに還流冷却管を取付け、沸騰水溶中へ移し、そのまま３時間保持した。その後内容物を重量既知の１Ｇ３ガラスフィルターを用いて吸引濾過し、さらに熱水にて洗浄を行い、フィルター上に抽出残留物を回収した。抽出残留物の入ったガラスフィルターは１０５℃に設定した乾燥機へ移し、恒量となるまで乾燥させた。熱水可溶分（ｗｔ％）は、以下の式にならって算出した。
【００２４】
【数２】
2007204717.tif 000003
【００２５】
＜３＞  アセトン抽出分
試料約２．０ｇを重量既知の円筒濾紙中に精秤し、ソックスレー抽出器の抽出部へ移した。アセトン約２００ｍＬを３００ｍＬ容抽出フラスコに加え、抽出器を組み立て、７０℃に設定した水浴中へ移し、ソックスレー抽出を開始させた。１２時間の抽出を行った後、抽出液を重量既知の３００ｍＬ容丸底フラスコ中へ移し、ロータリーエバポレーターを用いた減圧蒸留操作を行うことにより、フラスコ中にアセトン抽出分を得た。このフラスコのまま１０５℃に設定した乾燥機へ移し、恒量となるまで乾燥させた。アセトン抽出分（ｗｔ％）は、以下の式にならって算出した。
【００２６】
【数３】
2007204717.tif 000004
【００２７】
＜４＞  灰分
試料約１．０ｇを重量既知の磁性皿に精秤し、つづいて電気炉中に移し、７００℃にて１．５時間灰化させた。磁性皿上に残存している固形分を灰分として、以下に示す式にならって濃度を算出した。
【００２８】
【数４】
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【００２９】
＜５＞  加圧熱水処理
図１に使用した加圧熱水流通式反応装置の模式図を示した。
【００３０】
反応装置は、主として蒸留水タンク、蒸留水を高圧場へ送液するための高圧ポンプ、予熱用蛇管、パーコレーション型反応器（ＳＵＳ３１６、２４ｍｍ  ｉ．ｄ．６３ｍｍ  ｌｅｎｇｔｈ、２８ｍＬ）、反応を停止させるための冷却器、圧力を調整するための背圧弁、分解液回収受器からなる。なお、蛇管は目的温度に応じて、油浴（〜２００℃）、もしくは、溶融塩溶（例えば、ＫＣＯ３：ＮａＮＯ２：ＮａＮＯ３＝５３：４０：７、２００℃〜）中に浸漬することにより加熱した。熱水温度は、反応器両端に挿入したＸ熱伝対温度計（ＣＨＩＮＯ製）により測定し、蛇管を浸漬した加熱媒体の温度、および反応器内温度を一定に保ち、かつ、適度な昇温速度を確保するための赤外線炉による外部加熱により制御した。
（１）実験手順
１）加圧熱水分解
試料約３．０ｇをパーコレータ型反応器に仕込み、反応器両端を孔径５μｍの焼結フィルター（Ｓｗａｇｅｌｏｃｋ製、ＳＳ−１６―ＶＣＲ−２−５Ｍ）にキャップ後、反応装置に接続し、反応器内を目的とする温度の水蒸気および加圧熱水を所定の流速にて流通させることにより、試料の分解抽出を行った。この抽出実験を、Ｒｕｎ１およびＲｕｎ２として２回行った。その際のそれぞれの熱水温度、圧力の条件については、次の表１に示したとおりであった。
【００３１】
【表１】
2007204717.tif 000006
反応器より流出した分解液は経時的にＢｒｉｘ（％）を測定し、分解の目安とした。また、分解流出液は重量既知の５００ｍＬナス型フラスコへ移し、凍結乾燥させ、さらに６０℃、３時間真空乾燥させ、仕込み乾燥重量基準での水可溶分収率を算出した。反応器内残渣は冷却後に回収して、１０５℃にて恒量になるまで乾操させた。
【００３２】
水可溶化されて、反応器より流出した分解抽出液は、冷却後に背圧弁（保圧弁）を通過し受器に回収された。分解抽出液は、経時的にＢｒｉｘ（％）を測定し、およその分解目安として以下のように取り扱った。
【００３３】
すなわち、回収された水可溶分（ＷＳ：Ｗａｔｅｒ Ｓｏｌｕｂｌｅ）は減圧濃縮後、凍結乾燥法により水分除去し、さらに真空乾燥（６０℃、３０時間）後、秤量した。
【００３４】
また、反応器内残渣についてはビーカーに回収後、６０℃にて乾燥秤量した。各々（水可溶分、残渣）については、仕込み乾燥重量基準での残渣収率を算出した。
２）種々の溶媒に対する溶解性
Ｒｕｎ２において得られた乾操した１４０℃画分、および２００℃画分をスパチュラにてひとかき、６ｍＬの水、メタノール、アセトン、１ＮのＮａＯＨａｑに溶解させ、目視的に溶解性を検討した。
（２）実験結果
１）試料の諸物性
冷水可溶分、熱水可溶分、アセトン抽出分および灰分の収率を、表２に示した。
【００３５】
【表２】
2007204717.tif 000007
２）加圧熱水処理
＜色変化の検証＞
図には示していないが、ヒイロタケを水蒸気（１４０℃、０．０５ＭＰａ）、加圧熱水（１４０℃、１ＭＰａおよび２００℃、２ＭＰａ）にて順次処理した時の、分画した流出液の色変化について検証した。
【００３６】
検証結果では、まず水蒸気画分初期には、ヒイロタケ中のオレンジ色素と思われる成分が流出し、徐々に白濁した成分が回収された。続いて、加圧熱水（１４０℃、１ＭＰａ）の画分初期には、濃い茶褐色の流出液が得られ、通水時間が長くなるにつれて、徐々に薄くなっていくことを確認した。また、加圧熱水（２００℃、２ＭＰａ）にて処理した時の抽出液についても検証したところ、その色変化は１４０℃における変化と類似した。
＜流出液のＢｒｉｘ（％）と収率＞
図２および図３には、各々表１に示したＲｕｎ１およびＲｕｎ２の流出液のＢｒｉｘ（％）の経時変化を示した。いずれも、１４０℃保持時においては、通水開始と共にＢｒｉｘ（％）は増加して最大値を示した後減少し、２００℃で再び極大を示した。
【００３７】
また、表３では、図２にＢｒｉｘ（％）の経時変化を示したＲｕｎ１（表１）の場合の各フラクション等の収率を示し、表では、図３にＢｒｉｘ（％）の経時変化を示したＲｕｎ２（表１）の場合のフラクション等の収率を示した。表３のとおり、Ｒｕｎ１の収率は、水蒸気では低いが、加圧することにより増加した。また、累積収率が１００％を超えてしまったが、かなりの量を抽出することができた。また、表４に示したＲｕｎ２においても、かなりの量を抽出することができた。
【００３８】
【表３】
2007204717.tif 000008
【００３９】
【表４】
2007204717.tif 000009
そして、表５に示したように、Ｒｕｎ１、Ｒｕｎ２の抽出主成分はメタノール、アセトンに溶けずに沈殿したことから多糖類が抽出されたと推定でき、また、水にはよく溶けたことから水溶性多糖類であると判断することができる。
【００４０】
【表５】
2007204717.tif 000010
３）まとめ
以上の結果より、Ｒｕｎ１、Ｒｕｎ２については、ヒイロタケ子実体は２００℃の熱水処理で約５０ｗｔ％水溶化され、また、溶出液のＢｒｉｘ（％）経時変化から明らかであるようにヒイロタケ中には、１４０℃以下で分解抽出される成分と、２００℃で分解抽出される成分とが混在していると考えられる。通常試みられる熱水抽出の温度は、１００℃、高くてもオートクレーブ等による１２１℃であるため、本発明のように１４０〜２００℃で分解抽出された成分は水溶化されず、水不溶物として扱われることになる。
【００４１】
上記表３および表４に示したように、１４０〜２００画分の収率は約６０ｗｔ％と高く、通常の熱水抽出物にはない物質、具体的には有益な生理活性を有する多糖類を得ることができる。
【００４２】
つまり、ヒイロタケの抽出挙動を詳細に検討した結果、その抽出物は１４０℃以下で抽出される成分と、２００℃付近で抽出される成分と、それに残査とに区分される。通常の熱水では抽出率は１９ｗｔ％程度であるが、１４０℃加圧熱水抽出では４１ｗｔ％、２００℃では８９ｗｔ％であった。すなわち、加圧熱水法では常圧の１００℃よりも、２２ｗｔ％収率が増加し、２００℃ではさらに４８ｗｔ％収率が増加した。
＜実施例２：カワラタケ（Coriolus versicolor）からの多糖類の抽出＞
次にカワラタケを試料として、加圧熱水処理を行い、多糖類の抽出を行った。
【００４３】
加圧熱水処理に際して使用した装置および手順は、基本的には実施例１と同様であるが、温度条件は１５０℃〜２５０℃の範囲、圧力条件は０．１ＭＰａ〜１０ＭＰａの範囲、また、加圧熱水を流速１０ｍＬ／ｍｉｎで流通させて、試料の分解抽出を行った。
【００４４】
結果は、図４のとおりであった。（Ａ）は２５０℃までの等速昇温１段階抽出、（Ｂ）は１４０℃、２００℃の２段階抽出、（Ｃ）は１５０℃、１７０℃、１９０℃の３段階抽出を示している。図４（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）いずれにおいても、温度が２００℃付近からＢｒｉｘ（％）が増加することが確認できた。
＜実施例３：コフキサルノコシカケ（Elfvingia applanata）からの多糖類の抽出＞
また、コフキサルノコシカケについても検証した。コフキサルノコシカケを試料とし、加圧熱水処理を行い、多糖類の抽出を行った。加圧熱水処理に際して使用した装置および手順は、基本的には実施例１と同様であるが、温度条件は１８０℃〜２４０℃の範囲、圧力条件は０．１ＭＰａ〜１０ＭＰａの範囲、また、加圧熱水を流速１０ｍＬ／ｍｉｎで流通させて、試料の分解抽出を行った。
【００４５】
結果は、図５のとおりであった。（Ａ）は２５０℃までの等速昇温１段階抽出、（Ｂ）は１８０℃、２１０℃、２４０℃の３段階抽出を示している。コフキサルノコシカケの場合も、図５（Ａ）（Ｂ）のとおり、温度が２００℃を越えたあたりで、Ｂｒｉｘ（％）が増加することが確認できた。
＜実施例４：ヒイロタケから抽出された多糖類の特性分析＞
加圧熱水抽出による多糖と、化学的抽出による多糖との比較検討を以下のとおり行った。
（１）加圧熱水抽出、化学的抽出それぞれによる多糖のゲルクロマトグラフィー
１）装置
使用した装置は、ローラーポンプ、フラクションコレクター、ゲルろ過カラムで構成した。ゲルろ過カラムは、内径２６ｍｍ×高さ１００ｃｍのカラムにＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４３ゲルを充填した。
２）試料溶液の調整
加圧熱水抽出によるヒイロタケ抽出多糖、化学的抽出によるヒイロタケ抽出多糖それぞれ１５ｍｇを、０．３Ｍ ＮａＯＨ４ｍＬに加え、攪拌溶解し、０．４５μｍのディスポーサブルフィルターでろ過し、得られたろ液を試料溶液とした。
【００４６】
なお、ここで上記化学的抽出は、従来のような、次亜塩素酸ナトリウムを併用するアルカリ抽出による抽出方法（例えば、特開２００５−１３３０６９号公報）を利用した。
３）試料の添加、溶出
試料１．５ｍＬを、流速約３０ｍＬ／ｈで流し、同時にフラクションコレクター（５．５ｍＬ／ｔｕｂｅ）をスタートさせた。試料は、脱気処理した０．３Ｍ ＮａＯＨ水溶液で溶出した。フラクションは、５５０ｍＬ（＝１００ｔｕｂｅ分）集めた。
４）各フラクションの分析
糖分析は、フェノール硫酸法で４９０ｎｍにおける吸光度測定から行い、吸光度を溶出量に対してプロットしたクロマトグラムを得た（図６（Ａ）（Ｂ））。
５）検量線の作成
標準多糖として、ブルーデキストラン、プルランおよびグルコースを用いて作成した。
【００４７】
試料の調整、添加、溶出は上記の方法と同様に行い、クロマトグラムを得た。ブルーデキストランのクロマトグラムにおいては２６５ｎｍの吸光度から得た。そして、溶出量と分子量の関係を検量線から得た（図６（Ｃ））。
（２）抽出多糖の分子量
抽出多糖の分子量を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４３ゲルろ過クロマトグラフィーで測定した。その測定結果を、図６に示した。（Ａ）にプルランとグルコース、（Ｂ）にブルーデキストランのゲルろ過クロマトグラムを示し、これから求めた検量線を（Ｃ）に示した。
【００４８】
また、図７に抽出多糖のゲルろ過クロマトグラムの結果をまとめた。（Ａ）は１４０℃での加圧熱水抽出物、（Ｂ）は２００℃での加圧熱水抽出物、（Ｃ）はＮａＣｌＯを２５ｍＬ加えた時の１．２５Ｍ ＮａＯＨによる化学的抽出物、（Ｄ）はＮａＣｌＯを５０ｍＬ加えた時の１．２５Ｍ ＮａＯＨによる化学的抽出物を示した。なお、図には示していないが、（Ａ）の１４０℃加圧熱水抽出物はオレンジ色、（Ｂ）の２００℃加圧熱水抽出物は茶色を呈し、（Ｃ）の化学的抽出物および（Ｄ）の化学的抽出物はともに茶色を呈することを確認した。
【００４９】
図７のとおり、加圧熱水抽出物については、１４０℃抽出物（セルロース）の分子量のピークは１２００（重合度ＤＰ：７．４）、２００℃抽出物（シゾフィラン＋セルロース）の分子量のピークは７０００（重合度ＤＰ：４３）となり、高い抽出温度での方が大きい分子量であった。
【００５０】
また、アルカリを用いた化学的抽出物においては、ＮａＣｌＯ添加量２５ｍＬでの１．２５Ｍ ＮａＯＨ抽出物の分子量のピークは７９０００（重合度ＤＰ：４９０）、ＮａＣｌＯ添加量５０ｍＬでの１．２５Ｍ ＮａＯＨ抽出物の分子量のピークは２７０００（重合度ＤＰ：１７０）であった。つまり、ＮａＣｌＯの添加量が多い程、抽出物の分子量は小さかった。
【００５１】
以上の結果より、抽出方法によって分子量の異なる多糖が得られることがわかった。また、加圧熱水においては、高温側でシゾフィランが溶出し、アルカリ抽出においてはＮａＣｌＯによる前処理が強いものにシゾフィランが含まれていることが示された。
＜実施例５：加圧熱水分解に及ぼす温度条件、圧力条件の検討＞
実施例１では、各温度によって異なる抽出物が得られたと推察できたため、可溶化物収率について、熱水温度および圧力の影響について検討した。
【００５２】
試料はヒイロタケを用い、その子実体をハサミにて粒径２〜５ｍｍにカットした。なお、試料中の水分は１１．３３ｗｔ％であった。
（１）実験手順
基本的には、実施例１の実験手順と同様であり、熱水温度条件、圧力条件を表６に示した。
【００５３】
【表６】
2007204717.tif 000011
（２）実験結果
１）Ｒｕｎ３について
図８（Ａ）にて、上記表６のＲｕｎ３に示した実験条件で加圧熱水処理した時の、流出液のＢｒｉｘ（黒塗りの四角印）、処理温度（−）の経時的変化を示した。
【００５４】
１４０℃にて９０分間処理したＦｒａｃｔｉｏｎ １において、流出液の色は通水初期においては朱色、その後透明になった。しかし、流出液のＢｒｉｘ（％）値は、殆ど増加しなかった。続いて２５０℃に昇温を行うと、通水温度が２００℃付近に到達した所で流出液の色が黒褐色に変化し、同時にＢｒｉｘ（％）値も１．９にまで増加した。その後は、Ｂｒｉｘ（％）値は減少し、通水開始後１４０分時にはＢｒｉｘ（％）はゼロを示した。なお、ＷＳ収率については：
Ｆｒａｃｔｉｏｎ １では、４１．１ｗｔ％、
Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２では、４３．３ｗｔ％、であった。
【００５５】
また、Ｆｒａｃｔｉｏｎ １は、ＷＳ収率が４１．１ｗｔ％にも関わらず、Ｂｒｉｘ（％）値が低かった。
２）Ｒｕｎ４について
図８（Ｂ）にて、上記表６のＲｕｎ４に示した実験条件で加圧熱水処理した時の、流出液のＢｒｉｘ（黒塗りの四角印）、処理温度（−）の経時的変化を示した。
【００５６】
１４０℃、５ＭＰａにて３０分間処理を行ったＦｒａｃｔｉｏｎ Ａにおいては、通水初期にヒイロタケの色素由来と思われる朱色の液が流出し、Ｂｒｉｘ（％）値の急激な増加が確認された。その後の流出液は薄い茶褐色へと変化し、Ｂｒｉｘ（％）値も０．１にまで低下した。続いて、処理圧力を１ＭＰａに下げ、処理を行って得られたＦｒａｃｔｉｏｎ Ｂでは、流出液の色は黄味を帯び始めＢｒｉｘ（％）値は０．８にまで上昇した。さらに、通水を続けたが流出液の色は透明になり、圧力を０ＭＰａにまで下げ、１５分間処理を行ったＦｒａｃｔｉｏｎ Ｃにおいても、Ｂｒｉｘ（％）値の増加は確認されなかった。
【００５７】
そして、１４０℃での処理温度時間を長くしても、Ｂｒｉｘ（％）値の増加は見られないため、処理温度を２００℃、圧力を５ＭＰａに上げて処理を行った。流出液の色は、２００℃付近に到達すると黒くなり、同時にＢｒｉｘ（％）値も０．６にまで上昇した。さらに通水を続けたが、流出液の色は透明になり、通水開始後７５分時にはゼロを示した。
【００５８】
なお、ＷＳ収率については：
Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ａでは、２５．７ｗｔ％、
Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｂでは、１２．３ｗｔ％、
Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃでは、３．４ｗｔ％、
Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｄでは、４６．５ｗｔ％、であった。
（３）まとめ
Ｒｕｎ３における１４０℃、５ＭＰａ流出画分、すなわちＦｒａｃｔｉｏｎ １のＷＳ収率は４１．１ｗｔ％であり、この値は、Ｒｕｎ４における圧力を変化させた１４０℃流出画分、すなわちＦｒａｃｔｉｏｎ Ａ〜ＣのＷＳ收率の合計４１．４ｗｔ％に極めて近い値を示したことから、処理圧力はＷＳ収率に対して、影響を及ぼさないと考えられる。
【００５９】
しかし、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｂにおいて、Ｂｒｉｘ（％）値が一旦上昇したことから、圧力は抽出物については何らかの影響を及ぼすことも考えられる。
【００６０】
また、高温画分（２００、２５０℃）については、２５０℃にて処理したＲｕｎ３、Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２におけるＷＳ収率は４３．３ｗｔ％であり、２００℃にて処理したＲｕｎ４、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｄにおいては、４５．５ｗｔ％であったことから、２００℃から２５０℃に昇温しても、ＷＳ収率に対して影響を及ぼさないことが分かった。
＜実施例６：各処理温度における分解抽出物の分析＞
上記の実施例で、ヒイロタケを加圧熱水処理すると、１００℃以下で分解抽出される成分、１４０℃付近で分解抽出される成分、および２００℃付近で分解抽出される成分が存在することが確認できた。
【００６１】
そこで、さらに、各温度における分解抽出物を、他の温度の分解抽出物が混入していない分解抽出物を得た後、各温度における分解抽出物の構造解析も行った。
【００６２】
ヒイロタケ子実体をハサミにて粒径２〜６ｍｍにカットしたものを実験試料とした。試料中の水分、灰分濃度については、各々１１．３３ｗｔ％、３．４７ｗｔ％であった。
（１）実験手順
１）熱水（１００℃）抽出
５００ｍＬ容丸底フラスコに試料約２．０ｇを精秤し、蒸留水１００ｍＬを加えた。還流冷却器を取り付けた後、沸騰水路中に保持した。３時間後フラスコを沸騰水溶中（１００℃）より取り出し、内容物を重量既知の２Ｇ４ガラスフィルターにより吸引濾過し、残渣と濾液とに分離した。フィルター上の残渣は、フィルターごと１０５℃にて乾操した。濾液については、５００ｍＬ容ナスフラスコへと移し、凍結乾燥後、さらに６０℃、３時間真空乾燥した。
２）加圧熱水抽出（１４０℃）
１００℃抽出残渣０．４gを、パーコレーション型反応器（内容積３．８ｍＬ、ＳＵＳ３１６）に仕込み、孔径５μｍのステンレス製焼結フィルターにてキャップし、図１に例示したような加圧熱水流通式反応装置に接続し、実施例１と同様の手順で実験を行った。
３）可溶化物のＦＴ−ＩＲ分析
各温度によって得られた可溶化物約１ｍｇを、乳鉢中でＫＢｒ約２００ｍｇと混合して磨砕後、錠剤成型器により作製した錠剤を用いて、ＦＴ−ＩＲ分光計（Ｎｉｃｏｌｅｔ製、ＮＥＸＵＳ−４７０）により赤外吸収スペクトルを測定した。また、比較として１００℃抽出物の一部の５０％エタノール沈殿物として得られた粗精製多糖についても同様にスペクトルを測定した。
４）可溶化物の糖分析
回収されたＲｕｎ４における１００℃、１４０℃、２００℃それぞれの分解抽出物１ｍＬを、エッペンドルフチューブにはかり採り、１２００ｒｐｍ×１０ｍｉｎで遠心分離した後、上澄液を孔径０．４５μｍのメンブランフィルターにて濾過した。得られた濾液を、電気化学検出器を用いた高速陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ａｃｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ−Ｐｕｌｓｅｄ Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ；以下ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）に供した。
【００６３】
分析条件は、以下のとおりである。
グラジェントポンプ：ＧＰ４０、溶離液：蒸留水、０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液、１．０Ｍ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液、
グラジェント条件：カラムとしてＣａｒｂｏｐａｃ ＰＡ−１、検出器としてパルスドアンペロメトリー検出器  ＥＤ−４０、
カラムオーブン：ＬＣ−３０（３０℃）
５）可溶化物の１３Ｃ−ＮＭＲ分析
ＢＲＵＫＥＲ製ＤＳＸ３００を用い、ＣＰ−ＭＡＳ法で行った。ＣＰの接触時間は１ｍｓ、繰り返し時間は４ｓとし、ＭＡＳは４０００Ｈｚ、積算回数は１０２４回とした。化学シフトは二次標準試料としてグリシンを用い、テトラメチルシラン基準で示した。
６）可溶化物のＨＰＬＣ分析
各可溶化物の凍結乾燥物を約２０ｍｇ／ｍＬの濃度にて、ＨＰＬＣ分析に使用した溶離液中に溶解後、孔径０．４５μｍのメンブランフィルターにて濾過し、分析を行った。ＨＰＬＣ分析条件については以下のとおりであった。
カラム：Ｅｘｃｅｌｐａｃｋ ＳＥＣ−１２＋ＳＥＣ−１３、
カラムオーブン：７０℃、
溶離液：アセトニトリル：蒸留水＝３０：７０（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、
検出器：ＵＶ（２５４ｎｍ）。
【００６４】
また比較として、５−ＨＭＦ（試薬：東京化成）についても同様に分析を行い、リテンションタイムを測定し、ヒイロタケ加圧熱水可溶化物を分析することによって得られたクロマトグラムのリテンションタイムとの比較を行って、生成の有無について確認を行った。
（２）実験結果
１）可溶化物のＦＴ−ＩＲ分析結果
分析を行った原料、１００℃熱水抽出物、エタノール沈澱後の１００℃熱水抽出物、１４０℃抽出物、２００℃抽出物、２００℃抽出残渣それぞれの結果を、図９に示した。図９に示したとおり、１４０℃フラクション、２００℃フラクションの赤外吸収スペクトルは非常に類似したものであったことを確認できた。
【００６５】
そして、熱水抽出物をエタノール沈殿することにより調製した粗精製多糖（粗グルカン）の赤外吸収スペクトルとの比較も行った。その結果は、図１０に示した。（Ａ）は１４０℃抽出、（Ｂ）は２００℃抽出、（Ｃ）はエタノール沈殿後の１００℃抽出である。
【００６６】
図１０のとおり、β−グルカンの特徴である、１０４８ｃｍ−１付近にグルコースの６員環のＣ−Ｏ−Ｃと、８９１ｃｍ−１付近にβ−グリコシド結合の吸収が確認できた。いずれの温度においてもグルカン由来と思われる糖質が得られた。
【００６７】
なお、２００℃の抽出物においては８９１ｃｍ−１吸収が若干ずれているが、これはα型の結合の可能性が考えられる。
【００６８】
図９および図１０の１４０℃抽出においては、１４０℃フラクションに１００℃以下で抽出されていたはずの画分が、１４０℃フラクション中に回収されていたため、一旦１００℃にて熱水抽出した残渣について、１４０℃の加圧熱水処理を行った。その結果を図１１に示した。（Ａ）は１００℃熱水抽出、（Ｂ）は１００℃熱水抽出した残渣について、１４０℃で加圧熱水したものを示した。
【００６９】
図１１（Ａ）（Ｂ）に示したとおり、１００℃においても、１４０℃においても構造は同じものが出てきている可能性は高いことが確認できた。
【００７０】
また、残渣の特異的吸収には１５５５ｃｍ−１付近にアミドＩＩ（Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ’）と、１１５３ｃｍ−１付近にβ−１−４グリコシド結合との二つの吸収があることによりキチンが中心と推測される。
【００７１】
そこで、試薬のキチンとの赤外スペクトルを比較した結果を図１２（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）に示した。なお、図中の（Ａ）は１００℃抽出→エタノール沈殿、（Ｂ）は残渣、（Ｃ）はキチンを示している。
【００７２】
残渣と試薬には、上記のとおり、１６５５ｃｍ−１付近にアミドＩＩ（Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ’）と、１１５３ｃｍ−１付近にβ−１−４グリコシド結合との二つの吸収があるが、１００℃の抽出物には存在しない。２００℃付近の加圧熱水ではキチンは分解されないので、残渣の主成分はキチンである可能性が示唆された。
２）可溶化物の糖分析結果
結果は、図１３に示したとおりであった。（Ａ）１００℃、（Ｂ）１４０℃、（Ｃ）２００℃の場合について示している。
【００７３】
いずれの抽出物においてもオリゴ糖が確認され、温度が上がるにつれて、オリゴ糖の吸収が顕著にみられた。２００℃でみられていたオリゴ糖は、１００℃、１４０℃に比べるとピークの数が増えており、複雑な分解が起きていることが示唆された。
３）可溶化物の１３Ｃ−ＮＭＲ分析結果
ヒイロタケを１００℃、１４０℃および２００℃で加圧熱水処理した時に得られた可溶化物を１３Ｃ−ＮＭＲ分析に供した。図１４に示したように、これらの３つのスペクトルを比較すると、ほぼ同じ位置にピークが現れた。グリコシド結合の位置が異なっているが、グルカンの元である単糖のグルコースを持っているセルロースの１３Ｃ−ＮＭＲ分析結果と比較したところ、ほぼ同一であったため、ヒイロタケ中にはグルカンが含まれていると確認することができた。
【００７４】
さらに、ヒイロタケについて１４０℃抽出物と２００℃抽出物とをより詳しいスペクトルとして図１５に示す。２００℃の抽出物についてみると、β１，３グルカンに対応して８７．６ｐｐｍ、β１，６グルカンに対応して６２．２ｐｐｍ、７０．２ｐｐｍのシグナルが現れている。６２．２ｐｐｍはグルコシル化していないＣ６に関係したシグナルで、これらのことからシゾフィラン型のグルカンが抽出されていることがわかる。一方、７９．０ｐｐｍ附近のシグナルはβ１，４グルカン（セルロース）に対応するシグナルである。このことから、セルロース関連の糖が抽出されることがわかる。この糖は多孔菌科のマイタケ、ハナビラタケには存在しないもので、次のカワラタケ、コフキサルノコシカケを含めてこぶ状の堅いきのこの特徴的な構造である。この存在は、ヒイロタケなどが熱水ではほとんど成分抽出を不可能にしている理由であろう。１４０℃抽出物では、シゾフィラン型の成分がやや不明確である。
４）可溶化物のＨＰＬＣ分析結果
その結果を図１６に示したように、ヒイロタケを（ａ）１００℃、（ｂ）１４０℃および（ｃ）２００℃で加圧熱水処理した時に得られた可溶化物をＨＰＬＣ（ＨＰ１１００）分析に供し、糖の二次分解物として得られる５−ＨＭＦ生成の確認を行った。
【００７５】
また、（ｄ）５−ＨＭＦ（試薬）の分析結果も示した。この図１６により、５−ＨＭＦのピークは約３８分に検出されることが明らかとなった。また、可溶化物については、２００℃のみ５−ＨＭＦが検出された。これは、２００℃付近では可溶化されたグルカンが、オリゴ糖、グルコースを経て５−ＨＭＦにまで分解されることによるものであった。これは、グルコース系高分子であるセルロースの加圧熱水中での分解反応経路と一致した。
＜実施例７：アセトン抽出残渣の分解特性＞
食用への応用を考慮して、アセトンを用いた脱色処理を行い、その後に加圧熱水抽出を行った。
【００７６】
試料は、ヒイロタケ子実体を用い、ハサミにて粒径２〜５ｍｍにカットした。なお、試料中の水分は１１．３３ｗｔ％であった。
（１）実験手順
基本的には、実施例１と同様の実験手順で、加圧熱水抽出を行った。この加圧熱水抽出の前処理として、アセトン抽出を行った。なお、温度条件および圧力条件は、表７に示したとおりである。
【００７７】
【表７】
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（２）実験結果
図１７に、上記表７に示した実験条件で加圧熱水処理した時の、流出液のＢｒｉｘ（黒塗りの四角印）、処理温度（−）の経時的変化を示した。
【００７８】
１４０℃にて４５分間処理し、開始５分間でＢｒｉｘ（％）値の０．１までの増加が確認された。流出液は、ヒイロタケ色素をアセトン抽出処理で抜いたため、朱色ではなく薄い茶褐色だった。通水を続けたが、Ｂｒｉｘ（％）値が０．０だったため、その後、処理温度を２００℃に上げ、処理を行った。流出液の色は、２００℃付近に到達すると黒くなり、同時にＢｒｉｘ（％）値も１．１にまで上昇した。さらに、通水を続けたが、流出液の色は透明になり、通水開始後８５分時にはゼロを示した。
【００７９】
なお、ＷＳ収率については：
Ｆｒａｃｔｉｏｎ １では、２５．５ｗｔ％、
Ｆｒａｃｔｉｏｎ ２では、６４．２ｗｔ％、であった。
（３）まとめ
アセトン抽出残渣を試料とした場合、１４０℃の収率は２６ｗｔ％とこれまでの抽出と比較すると若干低かった。これはアセトンによる抽出処理が影響したと考えられる。２００℃で抽出率が多かったのは、１４０℃で抽出されなかった成分が抽出したためだと考えられる。
＜実施例８：ＮＭＲ分析＞
実施例２のカワラタケ並びに実施例３のサルノコシカケの１４０℃および２００℃抽出物可溶化物の１３Ｃ−ＮＭＲ分析を行い、そのスペクトルを各々、図１８および図１９に示した。
カワラタケについてもヒイロタケ同様のピークが観測される。すなわち、２００℃の抽出物ではβ１，３グルカンに対応して８７．６ｐｐｍ、β１，６グルカンに対応して６２．２ｐｐｍ、７０．２ｐｐｍのシグナルが現れこれらのことからシゾフィラン型のグルカンが抽出されていることがわかる。一方、８０ｐｐｍ附近のシグナルはβ１，４グルカン（セルロース）に対応するシグナルである。コフキサルノコシカケでもその傾向はかわらないが、β１，４グルカン（セルロース）に対応するピークは１４０℃で見られる。いずれにしても、これらのきのこはこのセルロース構造によって通常の方法での多糖の抽出を困難にしている。この構造を破壊することによる加圧熱水方法ではじめて、シゾフィラン型構造の多糖を抽出できる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】本発明において使用した加圧熱水流通式反応装置の一例を示した模式図である。
【図２】実施例１における、Ｒｕｎ１のＢｒｉｘ（％）の経時変化を示した図である。
【図３】実施例１における、Ｒｕｎ２のＢｒｉｘ（％）の経時変化を示した図である。
【図４】実施例２における、カワラタケのＢｒｉｘ（％）の経時変化を示した図であり、（Ａ）は２５０℃までの等速昇温１段階抽出、（Ｂ）は１４０℃、２００℃の２段階抽出、（Ｃ）は１５０℃、１７０℃、１９０℃の３段階抽出を示している。
【図５】実施例３における、コフキサルノコシカケのＢｒｉｘ（％）の経時変化を示した図であり、（Ａ）は２５０℃までの等速昇温１段階抽出、（Ｂ）は１８０℃、２１０℃、２４０℃の３段階抽出を示している。
【図６】実施例４における、抽出多糖の分子量をゲルろ過クロマトグラフィーで測定した結果を示した図であり、（Ａ）はプルランとグルコースのゲルろ過クロマトグラム、（Ｂ）はブルーデキストランのゲルろ過クロマトグラムを示し、（Ｃ）はこれらクロマトグラムから求めた検量線を示している。
【図７】図６の結果を基に、分子量ＭＷと重合度ＤＰを例示した図であり、（Ａ）は１４０℃での加圧熱水抽出物、（Ｂ）は２００℃での加圧熱水抽出物、（Ｃ）はＮａＣｌＯを２５ｍＬ加えた時の１．２５Ｍ ＮａＯＨによる化学的抽出物、（Ｄ）はＮａＣｌＯを５０ｍＬ加えた時の１．２５Ｍ ＮａＯＨによる化学的抽出物を示している。
【図８】実施例５における、流出液のＢｒｉｘ（％）の経時的変化を示した図であり、（Ａ）はＲｕｎ３のＢｒｉｘ（％）、（Ｂ）はＲｕｎ４のＢｒｉｘ（％）を示している。
【図９】実施例６における、可溶化物のＦＴ−ＩＲスペクトルを示した図である。
【図１０】実施例６における、粗グルカンと加圧熱水抽出で得られた可溶化物との比較検討におけるＦＴ−ＩＲスペクトルを示した図であり、（Ａ）は１４０℃抽出、（Ｂ）は２００℃抽出、（Ｃ）１００℃抽出→エタノール沈殿（粗グルカン）は示している。
【図１１】図９および１０における１４０℃抽出物について、ＦＴ−ＩＲスペクトルを示した図であり、（Ａ）は１００℃熱水抽出、（Ｂ）は１００℃熱水抽出した残渣について、１４０℃の加圧熱水したものを示している。
【図１２】図１１に示したＦＴ−ＩＲスペクトルと、キチンのＦＴ−ＩＲスペクトルを比較検討した結果を示した図である。
【図１３】実施例６における、ＨＰＡＥ−ＰＡＤによる可溶化物の糖分析結果を示した図である。
【図１４】実施例６における、可溶化物の1３Ｃ−ＮＭＲ分析結果を示した図である。
【図１５】ヒイロタケの１４０℃と２００℃抽出物についてより１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを詳しく示した図である。
【図１６】実施例６におけるＨＰＬＣによる可溶化物の分析結果を示した図である。
【図１７】実施例７における、ヒイロタケのＢｒｉｘ（％）の経時変化を示した図である。
【図１８】カワラタケの１４０℃と２００℃抽出物についての１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１９】サルノコシカケの２００℃抽出物についての１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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