(57)【要約】【課題】  本発明は、がん進行の極めて重要な指標である浸潤を、遺伝子レベル、或いはタンパク質レベルで効率よく、かつ正確に検出するための新規マーカーを提供することをその課題とする。【解決手段】  上記課題の解決手段として、分化制御因子の一種であるＤｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ２（ＩＤ２）遺伝子を新規ながん浸潤マーカーとして提供する。また本発明は、ＩＤ２遺伝子の発現亢進を指標とする、がん浸潤抑制用薬剤のスクリーニング方法を提供する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ２（以下「ＩＤ２」と略し、本遺伝子がコードするタンパク質は「ＩＤ２タンパク質」と略す）遺伝子を用いた、がん浸潤マーカー。
【請求項２】
被験細胞において、ＩＤ２遺伝子の発現量を測定する事を特徴とする、がん浸潤の検査方法。
【請求項３】
被験細胞において、ＩＤ２遺伝子が抑制するＭＭＰ（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）遺伝子の転写量及び／またはＭＭＰタンパク質の発現量を測定することを特徴とする、がん浸潤の検査方法。
【請求項４】
被験細胞において、ＩＤ２タンパク質の発現量を測定する事を特徴とする、がん浸潤の検査方法。
【請求項５】
被験細胞としてがん組織から採取した細胞を用い、ＩＤ２遺伝子の発現量を測定する事を特徴とする、請求項２から請求項４のうちいずれか１項に記載の、がん浸潤の検査方法。
【請求項６】
検出対象とするがんが肝細胞がんである、請求項２から請求項５のうちいずれか１項に記載のがん浸潤検査方法。
【請求項７】
検出対象とするがんがＣ型肝炎ウィルス感染によって発生する肝細胞がんである、請求項２から請求項５のうちいずれか１項に記載のがん浸潤検査方法。
【請求項８】
対象とするがんが、中分化型のがん細胞を含んだ肝細胞がんである、請求項２から請求項５のうちいずれか１項に記載の、がん浸潤検査方法。
【請求項９】
がん浸潤が門脈浸潤である、請求項２から請求項７のうちいずれか１項に記載の、がん浸潤検査方法。
【請求項１０】
被験細胞におけるＩＤ２遺伝子の発現亢進を指標とする、がん浸潤を抑制する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
被験細胞におけるＩＤ２遺伝子の発現亢進を指標とする、がん浸潤を抑制する薬剤のスクリーニング方法であって、対象となるがん細胞に前記薬剤の候補物質を投与し、これによって誘導されるＩＤ２遺伝子の発現レベル及び／またはＩＤ２タンパク質の発現レベルをスクリーニングする工程と、がん細胞と前記候補物質を用いたＩｎｖａｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙにより、がん浸潤能力の抑制効果を検証する工程からなる、薬剤スクリーニング方法。
【請求項１２】
ＩＤ２遺伝子の発現レベルの測定が、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いる測定である、請求項９に記載の薬剤スクリーニング方法。
【請求項１３】
ＩＤ２タンパク質の発現レベルの測定が、ウェスタンブロットを利用した測定である、請求項９に記載の薬剤スクリーニング方法。
【請求項１４】
ＩＤ２遺伝子の過剰発現ベクターを組み込んだ、ヒトがん細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん進行の新規マーカーとして利用可能な遺伝子に関し、より詳しくは、分化制御因子の一種であるＤｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ２（以下「ＩＤ２」と略す）遺伝子の発現が、肝細胞がんの浸潤と密接な関連を持つことを利用した、がん浸潤検出のための新規マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞がん（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）は日本における主要ながんの一種であり、肝臓にできる「肝がん」の９０％を占める。肝がんは特に、男性の死亡者数が１位の胃がん、２位の肺がんに次ぐ第３位であり、平均発症年齢がおよそ５５歳と、「働き盛り」の年代を襲う深刻な疾患である。これらの疾患に対する早期の発見と適切な治療は、現代医学における喫緊の課題である（非特許文献１）。
【０００３】
肝がんの検査方法としては、主に「画像診断」と「腫瘍マーカー」の２つが挙げられる。画像診断にはＣＴと超音波検査があり、どちらも肝臓内部の様子から疾患を診断するものである。肝がんが血管の多い腫瘍であるという性質に着目し、造影剤などと組み合わせた検査方法も知られている（特許文献１−３）。
【０００４】
腫瘍マーカーは、がん細胞の存在の目印となる物質の総称で、主にがん発症や進行に伴い発現量が増加（陽性）し、治療の効果でがんが縮小すれば発現量も減少し正常化（陰性）するという性質を持つ遺伝子・タンパク質を利用するものである。具体的な例としては、ＡＦＰ（Ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）などが知られ、これらのタンパク質の血中濃度を指標としてがん進行度の目安としている（非特許文献２）。ＡＦＰの他にも、多くのタンパク質が「新規な腫瘍マーカー」として利用可能であるとして開示されている（特許文献４，５）。
【０００５】
肝がんの腫瘍マーカーとして利用可能なものとしては、これまでにがん抗原ＫＵ−ＴＥＳ−１、ＲＡＡＧ１０、Ｐｉｎ１などが開示されている（特許文献６−８）。また、肝がんの予後を判断するための方法としては、ＤＮＡくり返し配列中の脱メチル化ＤＮＡ数を測定し、その割合に基づいて予後の判定を行う方法などが開示されている（特許文献９）。
【０００６】
一方、肝細胞がんの予後規定因子として、門脈浸潤（Ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｉｎ  ｉｎｖａｓｉｏｎ）は極めて重要な因子である。門脈浸潤は肝細胞がんの特徴的な肝内進展形式の一つで、代表的な治療後の予後不良因子である。もう一つの予後不良因子である肝内転移と強い相関が指摘されており、肝がんは門脈浸潤を基盤として肝内に散布すると考えられている（非特許文献３）。すなわち、肝細胞がんにおける門脈浸潤を効果的に検出する事は重要であると考えられるが、これまでの所、門脈浸潤を特異的に検出するためのマーカーは報告されていない。
【特許文献１】特開２００５−００６７７２  Ｘ線診断装置及びＣＴ画像の生成方法
【特許文献２】特開２００５−０２１３８０  生体情報映像装置
【特許文献３】特開２００５−０４０４６５  Ｘ線ＣＴ装置
【特許文献４】特開２００５−０７３６２１  脳腫瘍マーカーと脳腫瘍の診断方法
【特許文献５】特開２００５−１１７９９３  カテプシンＥの腫瘍マーカーとしての用途およびカテプシンＥならびにカテプシンＤの腫瘍血管新生阻害療法のターゲットとしての用途
【特許文献６】特開２００４−２４８５８５  新規な癌精巣抗原ＫＵ−ＴＥＳ−１
【特許文献７】特表２００５−５３２０５０  新規のＲＡＡＧ１０細胞表面標的および当該標的を認識する抗体ファミリー
【特許文献８】特表２００３−５１５１７２  異常細胞増殖のマーカーとしてのＰｉｎ１
【特許文献９】特開２００２−１１２７９９  癌疾患の予後判定法
【非特許文献１】国立がんセンターホームページ「肝細胞がん」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｊｐ／ｎｃｃ−ｃｉｓ／ｐｕｂ／ｃａｎｃｅｒ／０１０２１４．ｈｔｍｌ）
【非特許文献２】国立がんセンターホームページ「腫瘍マーカー」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｊｐ／ｎｃｃ−ｃｉｓ／ｐｕｂ／ｄｉａｇｎｏｓｉｓ／０１０６０１．ｈｔｍｌ）
【非特許文献３】国立がんセンターホームページ「カンファレンスのビデオ公開  ＭＣ９９−３９」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｊｐ／ｎｃｃ−ｃｉｓ／ｐｒｏ／ｖｏｄ／ａｂｓｔｒａｃｔ／ＭＣ９９−３９．ｈｔｍｌ）
【非特許文献４】Ｋａｒａｙａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３（６）：１９２４−３４．
【非特許文献５】Ｌａｓｏｒｅｌｌａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２５（９）：３５６３−７４．
【非特許文献６】Ｉｉｚｕｋａ  Ｎ，Ｏｋａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２：３００７−１４．
【非特許文献７】Ｉｉｚｕｋａ  Ｎ，Ｏｋａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １０７：６６６−７２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上述の現状に鑑み、がん浸潤、好ましくは肝細胞がんにおける門脈浸潤を検出するための新規なマーカーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題の解決手段として、本発明者らは門脈浸潤が認められない高分化型肝細胞がんサンプルを対象から除き、中分化型肝細胞がんを用いた発現遺伝子のＤＮＡマイクロアレイ解析を行って、門脈浸潤に関連のある遺伝子を探索した。この中から、肝細胞がんに対する新たな治療戦略を提供しうる遺伝子として、ＩＤ２を見出した。
【０００９】
ＩＤ２は転写制御因子として知られ、また近年では腫瘍の成長などへの関連が指摘されているが、腫瘍マーカーとして利用できるという報告は無い（非特許文献４，５）。本発明者らは、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりマイクロアレイ解析の再現性を確認し、数種の肝細胞がん細胞株におけるＩＤ２の発現レベルを解析した。更に本発明者らは、ＩＤ２発現ベクターを構築して解析を進め、ＩＤ２の発現と門脈浸潤の間の相関を明らかにして、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明の第１の態様は、Ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ２（以下「ＩＤ２」と略し、本遺伝子がコードするタンパク質は「ＩＤ２タンパク質」と略す）遺伝子を用いた、がん浸潤マーカーを提供する。
【００１１】
本発明の第２の態様は、被験細胞において、ＩＤ２遺伝子の発現量を測定する事を特徴とする、がん浸潤の検査方法を提供する。
【００１２】
本発明の第３の態様は、被験細胞において、ＩＤ２遺伝子が抑制するＭＭＰ（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）遺伝子の転写量及び／またはＭＭＰタンパク質の発現量を測定することを特徴とする、がん浸潤の検査方法を提供する。
【００１３】
本発明の第４の態様は、被験細胞において、ＩＤ２タンパク質の発現量を測定する事を特徴とする、がん浸潤の検査方法を提供する。
【００１４】
本発明の第５の態様は、被験細胞としてがん組織から採取した細胞を用い、ＩＤ２遺伝子の発現量を測定する事を特徴とする、請求項２から請求項４のうちいずれか１項に記載の、がん浸潤の検査方法を提供する。
【００１５】
本発明の第６の態様は、検出対象とするがんが肝細胞がんである、請求項２から請求項５のうちいずれか１項に記載のがん浸潤検査方法を提供する。
【００１６】
本発明の第７の態様は、検出対象とするがんがＣ型肝炎ウィルス感染によって発生する肝細胞がんである、請求項２から請求項５のうちいずれか１項に記載のがん浸潤検査方法を提供する。
【００１７】
本発明の第８の態様は、対象とするがんが、中分化型のがん細胞を含んだ肝細胞がんである、請求項２から請求項５のうちいずれか１項に記載の、がん浸潤検査方法を提供する。
【００１８】
本発明の第９の態様は、がん浸潤が門脈浸潤である、請求項２から請求項７のうちいずれか１項に記載の、がん浸潤検査方法を提供する。
【００１９】
本発明の第１０の態様は、被験細胞におけるＩＤ２遺伝子の発現亢進を指標とする、がん浸潤を抑制する薬剤のスクリーニング方法を提供する。
【００２０】
本発明の第１１の態様は、被験細胞におけるＩＤ２遺伝子の発現亢進を指標とする、がん浸潤を抑制する薬剤のスクリーニング方法であって、対象となるがん細胞に前記薬剤の候補物質を投与し、これによって誘導されるＩＤ２遺伝子の発現レベル及び／またはＩＤ２タンパク質の発現レベルをスクリーニングする工程と、がん細胞と前記候補物質を用いたＩｎｖａｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙにより、がん浸潤能力の抑制効果を検証する工程からなる、薬剤スクリーニング方法を提供する。
【００２１】
本発明の第１２の態様は、ＩＤ２遺伝子の発現レベルの測定が、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いる測定である、請求項９に記載の薬剤スクリーニング方法を提供する。
【００２２】
本発明の第１３の態様は、ＩＤ２タンパク質の発現レベルの測定が、ウェスタンブロットを利用した測定である、請求項９に記載の薬剤スクリーニング方法を提供する。
【００２３】
本発明の第１４の態様は、ＩＤ２遺伝子の過剰発現ベクターを組み込んだ、ヒトがん細胞を提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の新規マーカーを利用することにより、肝細胞がんにおける浸潤を効率的に検出する事が可能となる。また本発明は、「ＩＤ２の発現亢進」ががん浸潤を抑制しうるという新たな知見を提供し、これはがん浸潤に対する新たな創薬への道を拓くものである。本発明の提供する薬剤スクリーニング方法によって、がん浸潤を抑制する新規薬剤を効率的にスクリーニングすることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下に本発明を詳細に説明する。本発明の第１の態様は、ＩＤ２遺伝子を用いた新規がん浸潤マーカーを提供する。ＩＤ２それ自体は分化制御などに働くタンパク質として公知であるが、下記実施例で示す様に、本発明者らによって「がん浸潤」との強い相関が明らかとなり、ＩＤ２の発現量をがん浸潤マーカーとして利用することが可能となった。
【００２６】
本発明の第２から第４の態様においては、被験細胞におけるＩＤ２の発現量を測定することを特徴とする、がん浸潤の検査方法を提供する。本発明における「ＩＤ２の発現」を計測するための指標は、具体的にはＩＤ２遺伝子の発現量またはＩＤ２が制御するＭＭＰ遺伝子またはＭＭＰタンパク質の発現量、或いはＩＤ２タンパク質自身の発現量である。ＩＤ２は、がん浸潤の度合いに応じて発現量が変動することが本発明者らによって明らかとなったが、一方ではいわゆる転写調節因子でもあり、ＩＤ２が制御する「下流の」遺伝子発現もまたマーカーとして利用可能である。
【００２７】
本発明の第５から第９の態様においては、被験細胞としてがん組織から採取した細胞を用い、ＩＤ２遺伝子及びＩＤ２が制御する下流の遺伝子やタンパク質の発現量を測定する事を特徴とする、がん浸潤の検査方法を提供する。本発明におけるがん細胞は、好ましくは肝細胞がん、特にＣ型肝炎ウィルス感染によって発生する肝細胞がんであり、より好ましくは中分化型のがん細胞であり、また本発明を利用してより的確に判定しうるのは、門脈浸潤である。上述の通り、門脈浸潤はがん進行の指標として極めて重要な因子であるが、これまでは門脈浸潤を特異的かつ効率的に検出するための方法やマーカーは知られていなかった。本発明はこの問題を解決可能とするものである。
【００２８】
本発明の第１０から第１３の態様においては、被験細胞におけるＩＤ２遺伝子の発現亢進を指標とする、がん浸潤を抑制する薬剤のスクリーニング方法を提供する。本態様における薬剤スクリーニング方法は、対象となるがん細胞に前記薬剤の候補物質を投与し、これによって誘導されるＩＤ２遺伝子の発現レベル及び／またはＩＤ２タンパク質の発現レベルをスクリーニングする工程と、がん細胞と前記候補物質を用いたＩｎｖａｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）により、がん浸潤能力の抑制効果を検証する工程からなる薬剤スクリーニング方法であって、好ましくはＩＤ２遺伝子の発現レベルの測定が定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いる測定、またはＩＤ２タンパク質の発現レベルの測定が、ウェスタンブロットを利用した測定である、薬剤スクリーニング方法である。本発明者らによって、ＩＤ２遺伝子を過剰発現したがん細胞では、ＭＭＰ遺伝子の発現抑制を介して、ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌが低下している事が明らかとなった。この事実に基づき、被験細胞に薬剤候補物質を投与し、ＩＤ２遺伝子の発現を計測し、合わせて細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙを行うことによって、「がん浸潤を抑制する薬剤」という新たな薬剤のスクリーニングが可能となる。
【００２９】
本発明の第１４の態様においては、ＩＤ２遺伝子の過剰発現ベクターを組み込んだ、ヒトがん細胞を提供する。ここにおいてがん細胞とは、好ましくは肝細胞がんである。また本態様における過剰発現ベクターとは、ＩＤ２遺伝子をヒト細胞内で発現可能にしたベクターであればどの様なものでも良く、その種類は問わない。下記実施例で述べる通り、ＨＬＥ細胞系などのがん細胞にＩＤ２遺伝子を組み込んでＩＤ２を過剰発現させると、がん浸潤の能力が顕著に低下することが本発明者らによって明らかとなり、これを利用すればがんの予後に極めて重大な影響を持つ浸潤、特に門脈浸潤を抑制することが可能となる。
【実施例１】
【００３０】
（ＤＮＡマイクロアレイ）  以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。本発明に係る研究に際してはまず、全ての患者さんから本人自筆によるインフォームドコンセントを得た。また実験方法については、山口大学医学部の公式な承認を得て行った。本発明者らはまず、７６例の肝細胞がんからオリゴヌクレオチドのａｒｒａｙ  ｄａｔａｓｅｔｓ（ＤＮＡ  Ｃｈｉｐｓ；  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，  ＣＡ）を作成した。７６例の臨床病理学的形質は非特許文献６に示されている。本発明者らは、門脈浸潤に関わる遺伝子を同定するために、これらのデータセットの中から３５例のＣ型肝炎ウィルス陽性中分化型肝細胞がんからのＤＮＡマイクロアレイ（約１２６００遺伝子を対象）によって網羅的解析を行った。この１２６００遺伝子のうち、全肝臓組織での発現レベル（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔｓ  ｂｙ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）が４０より大きかった３５５９遺伝子を、更なる解析に用いた。これは、本発明者らが非特許文献７で示した様に、発現レベルが４０以下のものは生物学的に有意でないという見地に基づくものである。
【００３１】
（門脈浸潤に関わる遺伝子の同定）  組織学的な検査により、３５例の肝細胞がんのうち４０％に当たる１４例で門脈浸潤が見られた。この１４例と非門脈浸潤の２１例における遺伝子発現を、Ｆｉｓｈｅｒ  ｒａｔｉｏを用いて比較し、３５５９遺伝子をＦｉｓｈｅｒ  ｒａｔｉｏの高い順にランク付けし、合わせてＲａｎｄｏｍ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔを行って確認した。ランダム化されたデータに基づくＦｉｓｈｅｒ  ｒａｔｉｏの分布から、Ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ（ｐ＜０．００４）を通った全ての遺伝子を選択した。その結果、門脈浸潤有りの肝細胞がんと無しの肝細胞がんの間でＦｉｓｈｅｒ  ｒａｔｉｏの差が１．１０を超えた３５遺伝子（＝門脈浸潤で特異的に発現が変化していると考えられる遺伝子）を見出した（表１）。
【表１】
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【実施例２】
【００３２】
（ＨＣＣ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）  本実施例においては、ヒト肝細胞がんの細胞系であるＨＬＥ，Ｈｅｐ  ３Ｂ，Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨｕＨ−６，ＨｕＨ−７を用いた。これらの細胞は研究室ストックまたは（財）ヒューマンサイエンス振興財団の研究資源バンク（Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｓｅｓ  Ｂａｎｋ，Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）から分譲されたものである。細胞培養には１０％  熱不活性化ＦＢＳ（Ｆａｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）とペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）及び、１．５ｇ／ｌの炭酸水素ナトリウムを含んだＤＭＥＭ（Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ＪＰＮ）を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。
【実施例３】
【００３３】
（プラスミド設計とヒトＩＤ２の形質転換）  ヒトＩＤ２遺伝子の全長ｃＤＮＡを、ヒト肝臓由来のＲＮＡストックからＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入してクローニングし、ＩＤ２発現ベクターｐＩＤ２を作成した。得られたプラスミド内のインサート塩基配列のダイレクトシークエンスを行い、既知のＩＤ２シークエンス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ．ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｖａｌ＝３３９４６３３５）と一致する事を確認した。６０％コンフルエンス状態のＨＬＥ細胞にｐＩＤ２をＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）存在下で導入した。安定した形質転換細胞を得るために、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を加え耐性クローンを選別した。１週間後、２つのクローンを単離し、それぞれＨＬＥ／ｐＩＤ２−１、ＨＬＥ／ｐＩＤ２−２と名付けた。インサートを含まない空のベクターで形質転換したＨＬＥ細胞を対照（ｍｏｃｋ）とした。
【実施例４】
【００３４】
（Ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）  がん細胞の転移浸潤能の評価系としてＩｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙを用いた。アッセイにはマトリゲルでコートし、２４穴ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｃｈａｍｂｅｒ  のサイズに合わせたＦｉｌｔｅｒ  ｉｎｓｅｒｔ（直径８μｍ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）を用いた。細胞を無血清ＤＭＥＭに懸濁し、Ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｃｈａｍｂｅｒの上部に加え（２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを下部に加えた。３７℃で２２時間培養した後、マトリゲルを通過した細胞をＰｈｏｔｏｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＩＸ７１：Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＪＰＮ）にて計測した。対照として、マトリゲルチャンバーの代わりにコートされていない口径８μｍのポリカーボネイト膜（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）を用いた。浸潤の評価は、パーセンテージ（マトリゲル膜を通過した細胞数／対照の膜を通過した細胞数×１００）の形で表現した。各々のアッセイでは３つのウェルで試験を行い、またアッセイは少なくとも２回はくり返した。
【実施例５】
【００３５】
（ＩＤ２のｍＲＮＡレベルの定量的解析）  プラスミドｐＩＤ２（１０３−１０７コピー）を鋳型として用いた。ＲＮＡ抽出とＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法は次の方法で行った。トータルＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）で抽出し、１μｇのトータルＲＮＡを５ＵのＡｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，ＪＰＮ）を用いて逆転写（４５℃、３０ｍｉｎ）した。１０ｐｍｏｌのプライマー（表２）と１０ｎｇ  ｉｎｉｔｉａｌ  ＲＮＡに相当するｃＤＮＡ、Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）及び４ｍＭ  ＭｇＣｌ２でＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｖｅｒ．３，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｇｅｒ．）を行った。ＰＣＲのサイクル（４０）は以下の通りである；９５℃−１０ｓ：５５℃−１０ｓ：７２℃−２０ｓ。ＰＣＲ産物はＬｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ  Ｆ１（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で定量し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で解析した。ＰＣＲ産物定量の対照として、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−Ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ＧＡＰＤＨ（Ｓｅａｒｃｈ−Ｌｃ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒ．）を用いた。ＩＤ２のｍＲＮＡレベルは１０３コピーのＧＡＰＤＨのｍＲＮＡとの相対コピー数の形で算出した。
【表２】
2007135529.tif 000004
【実施例６】
【００３６】
（半定量的ＲＴ−ＰＣＲ）  半定量的ＲＴ−ＰＣＲを、以下の要領で行った。５μｌのｃＤＮＡ（１０ｎｇ  ｉｎｉｔｉａｌ  ＲＮＡに相当）を、１０ｐｍｏｌプライマーセットを含む１５μｌ  ＰＣＲ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）にて増幅した（表３）。ＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲルにて電気泳動を行い、臭化エチジウムで染色して紫外線照射によってバンドを確認した。
【表３】
2007135529.tif 000005
【実施例７】
【００３７】
（タンパク質解析）  発現タンパク質を解析するために、細胞をＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１６５ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，１０ｍＭ  ＮａＦ，１０ｍＭ  バナジウム酸，１０μｇ／ｍｌ  アプロチニン，１０μｇ／ｍｌ  ロイペプチン，０．１％  ＮＰ−４０）中で破砕した。全細胞溶解液から得られた２０μｇタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、Ｈｏｅｆｅｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。ＩＤ２、ＭＭＰ−１、ＧＡＰＤＨの各タンパク質を検出するために、前記膜を抗ＩＤ２（Ｃ−２０，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）、抗ＭＭＰ−１（Ｍ４１７７，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、抗ＧＡＰＤＨ（ＦＬ−３３５，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）ウサギポリクローナル抗体でインキュベートし、２次抗体処理としてセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギ抗体で処理を行い、ＥＣＬ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）にて検出を行った。
【００３８】
（ＭＭＰタンパク質のイムノアッセイ）  細胞が８０％コンフルエンスに達した段階で、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭを無血清ＤＭＥＭに置き換え、２４時間培養した。培養液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−２０遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．ＵＳＡ）にかけ、溶液中に分泌されたＭＭＰ−１，ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−３タンパク質の活性をＢｉｏｔｒａｋ  ａｓｓａｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて測定するため、それぞれのＭＭＰタンパク質に対する抗体をマイクロプレート上にコートした。活性化ＭＭＰが結合して前検出酵素が活性化され、これが基質と反応して色原体ペプチドが遊離した後４０５ｎｍ吸光度を測定した。トータルの活性を計測するために、結合したＭＭＰをｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌｍｅｒｃｕｒｉｃ  ａｃｅｔａｔｅを加えて活性化した。本アッセイによる検出限界は、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−３で０．１ｎｇ、ＭＭＰ−２で０．２ｎｇである。
【実施例８】
【００３９】
（ルシフェラーゼレポーターアッセイ）  ＭＭＰ−１プロモーター−オペレーター領域（ＭＭＰ−１遺伝子のプロモーター−オペレーター領域１．３ｋｂｐをＰＣＲで増幅したもの）を結合したホタルルシフェラーゼ遺伝子を、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．ＵＳＡ）に導入し、ＭＭＰ−１プロモーター活性のアッセイを行った。ＭＭＰ−１プロモーター領域の増幅は、ＨＬＥ細胞より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表４に示すプライマーを用いてＭＭＰ−１遺伝子の５’上流（コード領域の直前）部分を増幅した。得られたＰＣＲ断片をｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクターのＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、ｐＭＭＰ１−Ｌｕｃベクターとした。作成したプラスミドはダイレクトシークエンスを行ってその配列を確認した。
【表４】
2007135529.tif 000006
【００４０】
２４穴プレート中で６０％コンフルエンスまで増殖した細胞を、４μｌ／ｗｅｌｌのＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ  ｒｅａｇｅｎｔ存在下において、５００ｎｇ／ｗｅｌｌのホタルルシフェラーゼレポータープラスミドと１０ｎｇ／ｗｅｌｌのｐｈＲＬ−ＴＫ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を遺伝子移入した。移入２４時間後、細胞を回収し、細胞溶解液のホタル及びウミシイタケのルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）によって計測した。ホタルルシフェラーゼ活性は、共移入したｐｈＲＬ−ＴＫによるウミシイタケルシフェラーゼ活性に標準化した。
【実施例９】
【００４１】
（統計的解析）  本実施例のデータは平均値±標準偏差で表す。２グループ間の有意差はＳｔｕｄｅｎｔｓ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔまたはＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔによって算出した。３またはそれ以上のグループ間の有意差はＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  Ｓｃｈｅｆｆｅ’ｓ  ｏｒ  Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔによって算出した。Ｐｅａｒｓｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓはＩＤ２遺伝子の発現レベルの算定（ＤＮＡマイクロアレイと定量的ＲＴ−ＰＣＲとの間）のために用いた。計算はＤｒ．ＳＰＳＳ  ＩＩ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて行った。Ｐ＜０．０５を示したものを統計的に有意と判定した。
【実施例１０】
【００４２】
（門脈浸潤に関与する遺伝子の同定）  Ｃ型肝炎ウィルス陽性肝がん細胞を用い、本発明者らは門脈浸潤で特異的に発現量が変化（増加または減少）する遺伝子３５種類を同定した（図１、表１）。これらの遺伝子中で、１３遺伝子は発現が増加し、２２遺伝子は減少していた。発現が減少した２２遺伝子の中で、本発明者らはＩＤ２遺伝子に着目し、更に解析を進めた。ＩＤ２遺伝子のマイクロアレイデータを、定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにて再現した（図２）。一方で、Ｃ型肝炎ウィルス陰性の中分化型肝がん細胞１８例におけるＩＤ２の発現レベルは、門脈浸潤との相関が見られなかった（図３）。
【００４３】
（ＨＣＣ細胞系におけるＩＤ２の発現）  ＩＤ２の臨床病理学的性質を確証するために、本発明者らは分化型／非分化型肝細胞がんから得られた５つの肝がん細胞におけるＩＤ２遺伝子の発現レベルを定量的Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲで検証した（表５上段）。ＩＤ２の発現レベルは、非分化型肝がん細胞（ＨＬＥ，Ｈｅｐ３Ｂ）の方が分化型（ＨｕＨ−６，ＨｕＨ−７，Ｈｅｐ  Ｇ２）で有意に低かった（ｐ＜０．０５）。この中で特に、ＨＬＥのＩＤ２発現レベルは分化型の細胞に比べ６．９−１５．８倍も低く、その後の標的遺伝子組み換え実験（Ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｔｕｄｙ）にはこのＨＬＥ細胞を用いた。
【表５】
2007135529.tif 000007
【実施例１１】
【００４４】
（ＩＤ２遺伝子の過剰発現）  ＨＬＥ細胞におけるＩＤ２過剰発現を、定量的Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロット解析によって遺伝子、タンパク質それぞれについて検証した（表５下段、図４）。ＩＤ２遺伝子を導入したＨＬＥ／ｐＩＤ２−１とＨＬＥ／ｐＩＤ２−２細胞におけるＩＤ２のｍＲＮＡレベルはＨＬＥ及びＨＬＥ／ｍｏｃｋ細胞の８倍の値を示した（Ｐ＜０．００１）。ＨＬＥ細胞におけるｍＲＮＡレベルの上昇は分化型Ｈｅｐ  Ｇ２と類似していた。ウェスタンブロット解析の結果も同様に、ＩＤ２を導入したＨＬＥ細胞でのＩＤ２タンパク質の発現が、ＨＬＥ及びＨＬＥ／ｍｏｃｋ細胞におけるＩＤ２タンパク質の発現の約２倍である事を示した。
【００４５】
細胞の増殖に関しては、ＩＤ２を過剰発現させたＨＬＥ（ｐＩＤ２−１，２−２）で若干速いという傾向を示したが、統計的にはＨＬＥ／ｐＩＤ２−１，２−２，ｍｏｃｋ，及びＨＬＥの間で有意な差は無かった（図５）。同様に、ＩＤ２遺伝子導入は細胞周期にはほとんど影響しなかった（Ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。これらの事実は、２倍程度のＩＤ２タンパク質の過剰発現はＨＬＥ細胞の増殖等にはほとんど影響しない事を示した。
【００４６】
ＩＤ２を導入したＨＬＥ細胞（ＨＬＥ／ｐＩＤ２−１，２−２）におけるがん浸潤能力を、細胞外マトリクス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ＝ＥＣＭ）を含むマトリゲルを用いたＩｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙにて検証した。その結果、ＨＬＥ／ｍｏｃｋ細胞に比べ１．８−３．２倍浸潤能力が低下している事が示され（表６，Ｐ＜０．０５）、この結果はまた、ＩＤ２がＥＣＭ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎに関与している事も示した。
【表６】
2007135529.tif 000008
【実施例１２】
【００４７】
（ＭＭＰ遺伝子の発現に対するＩＤ２過剰発現の影響）  ＩＤ２遺伝子とがん浸潤能力の相関が示唆されたため、本発明者らはＩＤ２過剰発現系におけるＭＭＰ（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）や他の関連遺伝子の発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲにて解析した（図６）。ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−３の発現レベルは、ＩＤ２過剰発現系においてＨＬＥやｍｏｃｋ  ｃｅｌｌｓに比べて顕著に低下していた。ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−７においては過剰発現系で緩やかな低下を示した。ＭＭＰの阻害因子であるＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２については、発現レベルの変動は見られなかった。Ｂｉｏｔｒａｋ  ａｓｓａｙの結果も遺伝子発現解析の結果と同様であり、ＩＤ２過剰発現系においてＭＭＰ−１，ＭＭＰ−２，ＭＭＰ−３のレベルが明確に低下していた（表７）。ＭＭＰ−１については、ウェスタンブロット解析を行い、ＭＭＰ−１タンパク質の発現量がＩＤ２過剰発現系で減少している事を確認した（Ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。
【表７】
2007135529.tif 000009
【実施例１３】
【００４８】
（ＩＤ２のＭＭＰ−１プロモーター活性への影響）  ＩＤ２過剰発現により最も発現が抑制されたＭＭＰ−１のプロモーター活性を、Ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙにて解析した（表８）。ｐＩＤ２を導入した細胞におけるＭＭＰ−１プロモーターのルシフェラーゼ活性は、ｍｏｃｋ細胞に比べ１／１０以下に低下していた（Ｐ＜０．０１）。これは、ＩＤ２がＭＭＰ−１の発現を転写レベルで抑制している事を示している。
【表８】
2007135529.tif 000010
【００４９】
（肝細胞がん組織におけるＩＤ２とＭＭＰ−１タンパク質レベル）  肝細胞がん組織におけるＩＤ２とＭＭＰ−１タンパク質の発現を解析した結果、門脈浸潤無しの肝細胞がんでは多量のＩＤ２タンパク質が発現しＭＭＰ−１タンパク質がほとんど見られなかったのに対して、門脈浸潤有りの肝細胞がんではＩＤ２タンパク質はほとんど発現しておらず、代わりにＭＭＰ−１タンパク質が大量に発現していた（図７）。この結果は、本発明によるがん浸潤の検査方法が臨床レベルでも活用可能である事を示すとともに、ＩＤ２遺伝子やＩＤ２タンパク質の発現を亢進することで、がん浸潤を抑制しうるという可能性も示している。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、被験細胞のがん浸潤、特に肝細胞がんにおける門脈浸潤を遺伝子或いはタンパク質レベルで検出するものであり、産業上利用可能性としては検査試薬や検査キットの形で利用することが可能である。また本発明は、ＩＤ２遺伝子の過剰発現ががん浸潤能力を低下させるという新たな事実を明らかにし、これによってＩＤ２遺伝子の発現を亢進する物質を、がん浸潤の抑制剤としてスクリーニングする事も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明におけるＤＮＡマイクロアレイの結果を示し、Ｃ型肝炎ウィルス陽性肝細胞がんにおける門脈浸潤に関与する３５遺伝子をリストした。上位３５遺伝子はＦｉｓｈｅｒ  ｒａｔｉｏにより選択し、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ及びＥｎｔｒｅｚ  ｇｅｎｅ  ｓｙｍｂｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｇｅｎｅ）でリストした。
【図２】ＩＤ２のマイクロアレイデータの有効性を定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析にて確認した。ＩＤ２のｍＲＮＡ発現レベルは、ＧＡＰＤＨの発現レベルの相対値として算出した。ＲＴ−ＰＣＲのデータとマイクロアレイのデータは一致した。
【図３】Ｃ型肝炎ウィルス陽性肝細胞がんと陰性肝細胞がんにおけるＩＤ２のｍＲＮＡレベルを示す。ＩＤ２発現のデータは、本発明者らが行った７６肝細胞がんのマイクロアレイデータセットから抽出した。Ｃ型肝炎ウィルス陽性肝細胞がんでは門脈浸潤とＩＤ２発現レベルとの間に相関が見られたが（Ｐ＜０．０５）、非感染性では有意差が見られなかった。
【図４】ＩＤ２タンパク質のレベルを、形質転換細胞と対照とで比較した。ｐＩＤ２を導入した２つの細胞では、対照に比べＩＤ２バンドが濃くなっており、ＩＤ２タンパク質レベルが上昇している事を示した。一方ＧＡＰＤＨのバンドについては、４者で差は見られなかった。
【図５】ＩＤ２遺伝子導入が細胞の生存や細胞周期などに与える影響を検討した。それぞれのＨＬＥ細胞を９６穴マルチプレートに２×１０３細胞／ウェルになるように蒔き、適当な時間をおいた後指示薬としてＭＴＴをウェルに加え、３７℃で４時間インキュベートした。生細胞によって形成される色素を、０．０４Ｎ  ＨＣｌを含むイソプロパノールの滴下により抽出した。光学密度は５７０／６２０ｎｍの吸光度より測定した（ｎ＝６，３回のくり返し，値は平均値±標準偏差）。白三角と黒三角はＨＬＥ／ｐＩＤ２−１と２−２をそれぞれ示し、白丸は非導入ＨＬＥを、黒丸はｍｏｃｋをそれぞれ示す。ＩＤ２遺伝子の導入によっても、細胞の生存などには影響が見られなかった。
【図６】ＨＬＥ細胞系におけるＭＭＰとＴＩＭＰのＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。ＭＭＰ−１，２，３，７の転写に対しては、ＩＤ２の過剰発現が抑制的効果を示した（ｐＩＤ２−１，２）。一方ＴＩＭＰについては、転写量に差はＩＤ２過剰発現の影響は見られなかった。
【図７】ＩＤ２とＭＭＰ−１のタンパク質レベルを、Ｃ型肝炎陽性肝細胞がん組織で調べた。ウェスタンブロッティング解析の結果、門脈浸潤がある肝細胞がん（ＨＣＶ２０，４３Ｔ，５８Ｔ）では門脈浸潤が無い肝細胞がん（ＨＣＶ１６Ｔ，３４Ｔ，９０Ｔ）よりもＩＤ２タンパク質のレベルが低かった。一方ＭＭＰ−１タンパク質については、ＩＤ２と反対の結果を示した。ＧＡＰＤＨ（対照）のタンパク質レベルは、それぞれの肝細胞がん組織で差は見られなかった。
【図１】
2007135529.tif 000011
【図２】
2007135529.tif 000012
【図３】
2007135529.tif 000013
【図４】
2007135529.tif 000014
【図５】
2007135529.tif 000015
【図６】
2007135529.tif 000016
【図７】
2007135529.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成18年9月20日(2006.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
（ＩＤ２のｍＲＮＡレベルの定量的解析）  プラスミドｐＩＤ２（１０３−１０７コピー）を鋳型として用いた。ＲＮＡ抽出とＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法は次の方法で行った。トータルＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）で抽出し、１μｇのトータルＲＮＡを５ＵのＡｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，ＪＰＮ）を用いて逆転写（４５℃、３０ｍｉｎ）した。１０ｐｍｏｌのプライマー（表２）と１０ｎｇ  ｉｎｉｔｉａｌ  ＲＮＡに相当するｃＤＮＡ、Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）及び４ｍＭ  ＭｇＣｌ２でＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  Ｖｅｒ．３，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｇｅｒ．）を行った。ＰＣＲのサイクル（４０）は以下の通りである；９５℃−１０ｓ：５５℃−１０ｓ：７２℃−２０ｓ。ＰＣＲ産物はＬｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ  Ｆ１（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で定量し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で解析した。ＰＣＲ産物定量の対照として、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−Ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ＧＡＰＤＨ（Ｓｅａｒｃｈ−Ｌｃ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒ．）を用いた。ＩＤ２のｍＲＮＡレベルは１０３コピーのＧＡＰＤＨのｍＲＮＡとの相対コピー数の形で算出した。
【表２】
2007135529.tif 000018
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
（実施例６）
（半定量的ＲＴ−ＰＣＲ）  半定量的ＲＴ−ＰＣＲを、以下の要領で行った。５μｌのｃＤＮＡ（１０ｎｇ  ｉｎｉｔｉａｌ  ＲＮＡに相当）を、１０ｐｍｏｌプライマーセットを含む１５μｌ  ＰＣＲ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）にて増幅した（表３）。ＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲルにて電気泳動を行い、臭化エチジウムで染色して紫外線照射によってバンドを確認した。
【表３】
2007135529.tif 000019
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007135529000001.app