(57)【要約】      （修正有）【課題】大腸菌の終結因子を特異的に阻害するＲＮＡアプタマーを提供する。【解決手段】大腸菌由来の終結因子（ＲＦ１）に対して阻害活性を有するＲＮＡアプタマー。Ｔ−７プロモーター配列の一部及びランダム配列をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行う。次にその増幅ＤＮＡプールをテンプレートとし、Ｔ−７ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡライブラリーを作製する。次に組換え大腸菌ＲＦ１との結合セレクションテストを行ない、上記ＲＮＡアプタマーを選択する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌由来の終結因子に対して阻害活性を有するＲＮＡアプタマー。
【請求項２】
終結因子がＲＦ１である請求項１に記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項３】
以下の(1)〜(5)のいずれか１以上の塩基配列を有するＤＮＡにコードされる請求項１又は２に記載のＲＮＡアプタマー。
(1)  配列番号１の塩基番号１０〜２３の塩基配列
(2)  配列番号１の塩基番号２５〜３６の塩基配列
(3)  配列番号１の塩基番号６２〜７７の塩基配列
(4)  配列番号１の塩基番号１〜９、及び塩基番号３７〜４４の塩基配列
(5)  配列番号１の塩基番号４５〜６１、及び塩基番号７８〜８４の塩基配列
【請求項４】
以下の(1)〜(3)のいずれか１以上の塩基配列を有するＤＮＡにコードされる請求項１又は２に記載のＲＮＡアプタマー。
(1)  配列番号１の塩基番号１０〜２３の塩基配列
(2)  配列番号１の塩基番号２５〜３６の塩基配列
(3)  配列番号１の塩基番号６２〜７７の塩基配列
【請求項５】
(1)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号１０〜１４の領域と塩基番号２０〜２３の領域とでステムを形成し、塩基番号１５〜１９の領域がループを形成するものであり、
(2)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号２５〜２７の領域と塩基番号３４〜３６の領域とでステムを形成し、塩基番号２８〜３３の領域がループを形成するものであり、
(3)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号６２〜６６の塩基配列からなる領域と塩基番号７３〜７７の塩基配列からなる領域とでステムを形成し、塩基番号６７〜７２の領域がループを形成するものである、
請求項４に記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項６】
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡにコードされる請求項３〜５のいずれかに記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項７】
以下の(6)〜(10)のいずれか１以上の塩基配列を有するＤＮＡにコードされる請求項１又は２に記載のＲＮＡアプタマー。
(6)  配列番号２の塩基番号１６〜２９の塩基配列
(7)  配列番号２の塩基番号３５〜５０の塩基配列
(8)  配列番号２の塩基番号６５〜７９の塩基配列
(9)  配列番号２の塩基番号１〜１１、及び塩基番号５２〜６４の塩基配列
(10)  配列番号２の塩基番号１２〜１５、及び塩基番号３０〜３４の塩基配列
【請求項８】
以下の(6)〜(8)のいずれか１以上の塩基配列を有するＤＮＡにコードされる請求項１又は２に記載のＲＮＡアプタマー。
(6)  配列番号２の塩基番号１６〜２９の塩基配列
(7)  配列番号２の塩基番号３５〜５０の塩基配列
(8)  配列番号２の塩基番号６５〜７９の塩基配列
【請求項９】
(6)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号１６〜１９の領域と塩基番号２６〜２９の領域とでステムを形成し、塩基番号２０〜２５の領域がループを形成するものであり、
(7)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号３５〜３８の領域と塩基番号４７〜５０の領域とでステムを形成し、塩基番号３９〜４６の領域がループを形成するものであり、
(8)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号６５〜６７の塩基配列からなる領域と塩基番号７７〜７９の塩基配列からなる領域とでステムを形成し、塩基番号６８〜７６の領域がループを形成するものである、
請求項８に記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項１０】
配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡにコードされる請求項７〜９のいずれかに記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項１１】
以下の(11)〜(14)のいずれか１以上の塩基配列を有するＤＮＡにコードされる請求項１又は２に記載のＲＮＡアプタマー。
(11)  配列番号３の塩基番号１５〜２６の塩基配列
(12)  配列番号３の塩基番号２８〜４４、及び塩基番号６８〜７７の塩基配列
(13)  配列番号３の塩基番号４５〜６７の塩基配列
(14)  配列番号３の塩基番号１〜１４、及び塩基番号７８〜８２の塩基配列
【請求項１２】
以下の(11)〜(13)のいずれか１以上の塩基配列を有するＤＮＡにコードされる請求項１又は２に記載のＲＮＡアプタマー。
(11)  配列番号３の塩基番号１５〜２６の塩基配列
(12)  配列番号３の塩基番号２８〜４４、及び塩基番号６８〜７７の塩基配列
(13)  配列番号３の塩基番号４５〜６７の塩基配列
【請求項１３】
(11)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号１５〜１８の領域と塩基番号２３〜２６の領域とでステムを形成し、塩基番号１９〜２２の領域がループを形成するものであり、
(12)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号２８〜３６の領域と塩基番号６８〜７７の領域とでステムを形成し、塩基番号３７〜４４の領域がループを形成するものであり、
(13)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号４５〜４９の塩基配列からなる領域と塩基番号６３〜６７の塩基配列からなる領域とでステムを形成し、塩基番号５０〜６２の領域がループを形成するものである、
請求項１２に記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項１４】
配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡにコードされる請求項１１〜１３のいずれかに記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載のＲＮＡアプタマーをコードする遺伝子を誘導発現できるプラスミド。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれかに記載のＲＮＡアプタマーが担体に固定されてなるＲＮＡアプタマー固定化担体。
【請求項１７】
注入口を有し、請求項１６に記載の担体が充填された担体支持槽と、液受け槽とを備え、担体支持槽と液受け槽とが、液体を通過し担体を通過しない仕切りを介して隣接している、終結因子ＲＦ１が除去された大腸菌細胞抽出液の製造装置。
【請求項１８】
請求項１６に記載のＲＮＡアプタマー固定化担体と大腸菌細胞抽出液とを接触させる工程と、大腸菌細胞抽出液を回収する工程とを含む、終結因子ＲＦ１が除去された大腸菌細胞抽出液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌の終結因子を阻害するＲＮＡアプタマー、このＲＮＡアプタマーが固定された担体、このＲＮＡアプタマーを発現可能なプラスミド、並びに終結因子が除去された細胞抽出液の製造方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
あるタンパク質の特定位置のアミノ酸を他の天然または非天然アミノ酸に置換する部位特異的変異は、そのタンパク質をコードするＤＮＡの当該アミノ酸に対応するコドンを一旦終止コドンに置き換え、次いで、その終止コドン位置にアミノ酸を導入することにより行うことができる。
【０００３】
このような部位特異的変異導入は、タンパク質の特定位置のアミノ酸を置換することにより、タンパク質の活性を向上させたり、新たな機能を付与する場合に利用される。また、タンパク質の機能解析にも利用される。また、部位特異的変異導入は、タンパク質の活性に影響を与えない位置に特異的に非天然アミノ酸を導入する場合にも利用できる。位置特異的な非天然アミノ酸の導入例として、抗体タンパク質に蛍光アミノ酸を導入してセンサーとして使用できる蛍光抗体を作製する例、チップと結合できる修飾アミノ酸をタンパク質に導入してこの修飾アミノ酸を介してタンパク質をチップ上に固定する例、タンパク医薬の体内での安定性を高めるために、タンパク質にポリエチレングリコールを結合させる例などが挙げられる。
【０００４】
従来、終止コドン対応位置へのアミノ酸の導入、即ち終止コドンの読み過ごしは、終止コドン位置にアミノ酸を運ぶことができるサプレッサーｔＲＮＡを用いて行われている。しかし、この方法は、導入しようとするアミノ酸の種類によっては導入率が低い場合がある。これは、終止コドンが終結因子により認識されるためである。
【０００５】
このため、終結因子を不活性化する技術が提案されている。例えば非特許文献１は、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス由来のエステラーゼのｍＲＮＡ中にＵＡＧ（アンバー）を導入したものを鋳型として、アンバーサプレッサーｔＲＮＡ及びＲＦ１に対する抗体を加えた細胞抽出液を用いてin vitro翻訳を行うことにより、この抗体を加えない場合に比べて、天然エステラーゼの生産量が増大することを開示している。しかし、抗体は、作製に手間がかかる、長期保存できない、細胞内翻訳には使用できないなどの難点がある。
【０００６】
また非特許文献２は、サーマス・サーモフィラスのＲＦ１に特異的に結合するＲＮＡアプタマーをＳＥＬＥＸ（in vitro selection/amplification)法で作製したことを教えている。しかし、サーマス・サーモフィラスは好熱性菌であり、生育温度が高いため、変異タンパク質の生産などには利用し難い。変異タンパク質の生産は、通常、大腸菌細胞抽出液又は大腸菌細胞を用いて行われるため、大腸菌の終結因子を特異的に阻害するＲＮＡアプタマーが望まれる。なお、終結因子ＲＦ１の活性を阻害するＲＮＡアプタマーとして従来知られているのは、上記のサーマス・サーモフィラスのＲＦ１のＲＮＡアプタマーだけである。
【非特許文献１】FEBS Letters,Vol.579,2156-2160,2005（図３脚注など）
【非特許文献２】FEBS Letters,Vol.514,90-95,2002（アブストラクト）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、大腸菌の終結因子を特異的に阻害するＲＮＡアプタマー、このＲＮＡアプタマーが固定された担体、このＲＮＡアプタマーを発現可能なプラスミド、終結因子が除去された大腸菌細胞抽出液の製造方法及び装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、大腸菌の終結因子ＲＦ１を特異的に結合する３種のＲＮＡアプタマーをin vitroセレクション法で得た。また、対象分子に結合するＲＮＡアプタマーが実際に対象分子の活性を阻害するとは限らないところ、これらのＲＮＡアプタマーがＲＦ１の活性を直交的に阻害することを見出した。
【０００９】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下のＲＮＡアプタマーなどを提供する。
【００１０】
項１．  大腸菌由来の終結因子に対して阻害活性を有するＲＮＡアプタマー。
【００１１】
項２．  終結因子がＲＦ１である項１に記載のＲＮＡアプタマー。
【００１２】
項３．  以下の(1)〜(5)のいずれか１以上の塩基配列を有するＤＮＡにコードされる項１又は２に記載のＲＮＡアプタマー。
(1)  配列番号１の塩基番号１０〜２３の塩基配列
(2)  配列番号１の塩基番号２５〜３６の塩基配列
(3)  配列番号１の塩基番号６２〜７７の塩基配列
(4)  配列番号１の塩基番号１〜９、及び塩基番号３７〜４４の塩基配列
(5)  配列番号１の塩基番号４５〜６１、及び塩基番号７８〜８４の塩基配列
項４．  以下の(1)〜(3)のいずれか１以上の塩基配列を有するＤＮＡにコードされる項１又は２に記載のＲＮＡアプタマー。
(1)  配列番号１の塩基番号１０〜２３の塩基配列
(2)  配列番号１の塩基番号２５〜３６の塩基配列
(3)  配列番号１の塩基番号６２〜７７の塩基配列
項５．  (1)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号１０〜１４の領域と塩基番号２０〜２３の領域とでステムを形成し、塩基番号１５〜１９の領域がループを形成するものであり、
(2)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号２５〜２７の領域と塩基番号３４〜３６の領域とでステムを形成し、塩基番号２８〜３３の領域がループを形成するものであり、
(3)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号６２〜６６の塩基配列からなる領域と塩基番号７３〜７７の塩基配列からなる領域とでステムを形成し、塩基番号６７〜７２の領域がループを形成するものである、
項４に記載のＲＮＡアプタマー。
【００１３】
項６．  配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡにコードされる項３〜５のいずれかに記載のＲＮＡアプタマー。
【００１４】
項７．  以下の(6)〜(10)のいずれか１以上の塩基配列を有するＤＮＡにコードされる項１又は２に記載のＲＮＡアプタマー。
(6)  配列番号２の塩基番号１６〜２９の塩基配列
(7)  配列番号２の塩基番号３５〜５０の塩基配列
(8)  配列番号２の塩基番号６５〜７９の塩基配列
(9)  配列番号２の塩基番号１〜１１、及び塩基番号５２〜６４の塩基配列
(10)  配列番号２の塩基番号１２〜１５、及び塩基番号３０〜３４の塩基配列
項８．  以下の(6)〜(8)のいずれか１以上の塩基配列を有するＤＮＡにコードされる項１又は２に記載のＲＮＡアプタマー。
(6)  配列番号２の塩基番号１６〜２９の塩基配列
(7)  配列番号２の塩基番号３５〜５０の塩基配列
(8)  配列番号２の塩基番号６５〜７９の塩基配列
項９．  (6)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号１６〜１９の領域と塩基番号２６〜２９の領域とでステムを形成し、塩基番号２０〜２５の領域がループを形成するものであり、
(7)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号３５〜３８の領域と塩基番号４７〜５０の領域とでステムを形成し、塩基番号３９〜４６の領域がループを形成するものであり、
(8)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号６５〜６７の塩基配列からなる領域と塩基番号７７〜７９の塩基配列からなる領域とでステムを形成し、塩基番号６８〜７６の領域がループを形成するものである、
項８に記載のＲＮＡアプタマー。
【００１５】
項１０．  配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡにコードされる項７〜９のいずれかに記載のＲＮＡアプタマー。
【００１６】
項１１．  以下の(11)〜(14)のいずれか１以上の塩基配列を有するＤＮＡにコードされる項１又は２に記載のＲＮＡアプタマー。
(11)  配列番号３の塩基番号１５〜２６の塩基配列
(12)  配列番号３の塩基番号２８〜４４、及び塩基番号６８〜７７の塩基配列
(13)  配列番号３の塩基番号４５〜６７の塩基配列
(14)  配列番号３の塩基番号１〜１４、及び塩基番号７８〜８２の塩基配列
項１２．  以下の(11)〜(13)のいずれか１以上の塩基配列を有するＤＮＡにコードされる項１又は２に記載のＲＮＡアプタマー。
(11)  配列番号３の塩基番号１５〜２６の塩基配列
(12)  配列番号３の塩基番号２８〜４４、及び塩基番号６８〜７７の塩基配列
(13)  配列番号３の塩基番号４５〜６７の塩基配列
項１３．  (11)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号１５〜１８の領域と塩基番号２３〜２６の領域とでステムを形成し、塩基番号１９〜２２の領域がループを形成するものであり、
(12)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号２８〜３６の領域と塩基番号６８〜７７の領域とでステムを形成し、塩基番号３７〜４４の領域がループを形成するものであり、
(13)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡが、塩基番号４５〜４９の塩基配列からなる領域と塩基番号６３〜６７の塩基配列からなる領域とでステムを形成し、塩基番号５０〜６２の領域がループを形成するものである、
項１２に記載のＲＮＡアプタマー。
【００１７】
項１４．  配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡにコードされる項１１〜１３のいずれかに記載のＲＮＡアプタマー。
【００１８】
項１５．  項１〜１４のいずれかに記載のＲＮＡアプタマーをコードする遺伝子を誘導発現できるプラスミド。
【００１９】
項１６．  項１〜１４のいずれかに記載のＲＮＡアプタマーが担体に固定されてなるＲＮＡアプタマー固定化担体。
【００２０】
項１７．  注入口を有し、項１６に記載の担体が充填された担体支持槽と、液受け槽とを備え、担体支持槽と液受け槽とが、液体を通過し担体を通過しない仕切りを介して隣接している、終結因子ＲＦ１が除去された大腸菌細胞抽出液の製造装置。
【００２１】
項１８．  項１６に記載のＲＮＡアプタマー固定化担体と大腸菌細胞抽出液とを接触させる工程と、大腸菌細胞抽出液を回収する工程とを含む、終結因子ＲＦ１が除去された大腸菌細胞抽出液の製造方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、終止コドンＵＡＧ（アンバー）を認識する大腸菌の終結因子ＲＦ１の活性を直交的に阻害するＲＮＡアプタマーが提供された。また、本発明のＲＮＡアプタマーは、ＲＦ２を始めとする大腸菌の転写／翻訳系の他の成分の活性には影響を与えない。
【００２３】
あるタンパク質をコードする遺伝子中にアンバー変異を導入したものを鋳型としてＩｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳によりタンパク質を得るにあたり、転写／翻訳系にアンバーサプレッサーｔＲＮＡを存在させることにより、アンバー位置に天然又は非天然のアミノ酸が導入された変異タンパク質を得ることができる。この転写／翻訳系にさらに本発明のＲＮＡアプタマーを加えれば、ＲＦ１の活性が阻害されてアンバーサプレッションの効率を向上させることができる。大腸菌は、遺伝子組み換えの宿主として汎用されている細胞であることから、そのＲＦ１を特異的に阻害するＲＮＡアプタマーの意義は大きい。
【００２４】
また、本発明のＲＮＡアプタマーは、それ単独で又は担体に結合させた状態で、細胞抽出液からＲＦ１を除去するために使用することができる。
【００２５】
また、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳では、細胞抽出液にＲＦ１に対する抗体を添加したり、ＲＦ１を含まない再構築された細胞抽出液を使用することによっても、サプレッサーｔＲＮＡによるアンバーサプレッションの効率を向上させることができる。しかし、細胞内での転写／翻訳では抗体を使用することはできない。この点、ＲＮＡアプタマーは、コードするプラスミドを用いて、細胞内で発現させることも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。
ＲＮＡアプタマー
本発明のＲＮＡアプタマーは、大腸菌の終結因子、特にＲＦ１に対して阻害活性を有するＲＮＡアプタマーである。特に、大腸菌の終結因子（中でも、ＲＦ１）の活性を直交的に阻害する。
＜第１のＲＮＡアプタマー＞
第１のＲＮＡアプタマー（ここでは「クラスＩアプタマー」と命名する）として、
(1)  配列番号１の塩基番号１０〜２３の塩基配列
(2)  配列番号１の塩基番号２５〜３６の塩基配列
(3)  配列番号１の塩基番号６２〜７７の塩基配列
(4)  配列番号１の塩基番号１〜９、及び塩基番号３７〜４４の塩基配列
(5)  配列番号１の塩基番号４５〜６１、及び塩基番号７８〜８４の塩基配列
のいずれか１以上の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるものが挙げられる。即ち、これらの少なくとも１つのＤＮＡ領域にコードされるＲＮＡ領域で終結因子、特にＲＦ１に結合してその活性を阻害する。中でも、(1)〜(3)のいずれか1以上の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるＲＮＡアプタマーが好ましく、(1)、(2)及び(3)の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるＲＮＡアプタマーがより好ましい。
【００２７】
上記(1)〜(5)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされる各ＲＮＡ領域は、細胞内又は細胞抽出液内で何らかの2次構造をとると考えられる。中でも、(1)〜(3)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされる各ＲＮＡ領域は、ステム−ループ構造を形成することが予測される。ステムは、塩基間の水素結合が連続して、又はほぼ連続して存在する領域を指す。水素結合が形成されない塩基対や、水素結合を形成する相手方が存在しない余った塩基が部分的に存在する場合も、全体として水素結合を形成する塩基対が略連続する場合はステムに含まれる。
【００２８】
具体的には、(1)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡは、塩基番号１０〜１４の領域と塩基番号２０〜２３の領域とでステムを形成し、塩基番号１５〜１９の領域がループを形成することが予測される。このステム−ループの２次構造式を以下に示す。２次構造式中の実線は水素結合を示すが、ミスマッチする場合は水素結合を形成しない。また、ｎはＡ、Ｕ、Ｇ、又はＣを表す。
【００２９】
【化１】
2007082543.tif 000003
【００３０】
(2)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡは、塩基番号２５〜２７の領域と塩基番号３４〜３６の領域とでステムを形成し、塩基番号２８〜３３の領域がループを形成することが予測される。このステム−ループの２次構造式を以下に示す。
【００３１】
【化２】
2007082543.tif 000004
【００３２】
(3)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡは、塩基番号６２〜６６の塩基配列からなる領域と塩基番号７３〜７７の塩基配列からなる領域とでステムを形成し、塩基番号６７〜７２の領域がループを形成することが予測される。このステム−ループの２次構造式を以下に示す。
【００３３】
【化３】
2007082543.tif 000005
【００３４】
＜第２のＲＮＡアプタマー＞
第２のＲＮＡアプタマー（ここでは「クラスＩIアプタマー」と命名する）として、
(6)  配列番号２の塩基番号１６〜２９の塩基配列
(7)  配列番号２の塩基番号３５〜５０の塩基配列
(8)  配列番号２の塩基番号６５〜７９の塩基配列
(9)  配列番号２の塩基番号１〜１１、及び塩基番号５２〜６４の塩基配列
(10)  配列番号２の塩基番号１２〜１５、及び塩基番号３０〜３４の塩基配列
のいずれか1以上の塩基配列を有するＤＮＡにコードされるものが挙げられる。即ち、これらの少なくとも１つのＤＮＡ領域にコードされるＲＮＡ領域で終結因子、特にＲＦ１に結合してその活性を阻害する。中でも、(6)〜(8)のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡにコードされるＲＮＡアプタマーが好ましく、(6)、(7)及び(8)の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるＲＮＡアプタマーがより好ましい。
【００３５】
上記(6)〜(10) の塩基配列からなるＤＮＡにコードされる各ＲＮＡ領域は、細胞内又は細胞抽出液内で何らかの２次構造をとると考えられる。中でも、(6)〜(8)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされる各ＲＮＡ領域は、ステム−ループ構造を形成することが予測される。
【００３６】
具体的には、(6)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡは、塩基番号１６〜１９の領域と塩基番号２６〜２９の領域とでステムを形成し、塩基番号２０〜２５の領域がループを形成すると予測される。このステム−ループの２次構造式を以下に示す。
【００３７】
【化４】
2007082543.tif 000006
【００３８】
(7)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡは、塩基番号３５〜３８の領域と塩基番号４７〜５０の領域とでステムを形成し、塩基番号３９〜４６の領域がループを形成すると予測される。このステム−ループの２次構造式を以下に示す。
【００３９】
【化５】
2007082543.tif 000007
【００４０】
また、(8)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡは、塩基番号６５〜６７の塩基配列からなる領域と塩基番号７７〜７９の塩基配列からなる領域とでステムを形成し、塩基番号６８〜７６の領域がループを形成すると予測される。このステム−ループの２次構造式を以下に示す。
【００４１】
【化６】
2007082543.tif 000008
【００４２】
＜第３のＲＮＡアプタマー＞
第３のＲＮＡアプタマー（ここでは「クラスＩIIアプタマー」と命名する）として、
(11)  配列番号３の塩基番号１５〜２６の塩基配列
(12)  配列番号３の塩基番号２８〜４４、及び塩基番号６８〜７７の塩基配列
(13)  配列番号３の塩基番号４５〜６７の塩基配列
(14)  配列番号３の塩基番号１〜１４、及び塩基番号７８〜８２の塩基配列
のいずれか1以上の塩基配列を有するＤＮＡにコードされるものが挙げられる。即ち、これらの少なくとも１つのＤＮＡ領域にコードされるＲＮＡ領域で終結因子、特にＲＦ１に結合してその活性を阻害する。中でも、(11)〜(13) のいずれかの塩基配列を有するＤＮＡにコードされるＲＮＡアプタマーが好ましく、(11)、(12)及び(13)の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるＲＮＡアプタマーがより好ましい。
【００４３】
上記(11)〜(14)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされる各ＲＮＡ領域は、細胞内又は細胞抽出液内で何らかの２次構造をとると考えられる。中でも、(11)〜(13)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされる各ＲＮＡ領域は、ステム−ループ構造を形成することが予測される。
【００４４】
具体的には、(11)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡは、塩基番号１５〜１８の領域と塩基番号２３〜２６の領域とでステムを形成し、塩基番号１９〜２２の領域がループを形成すると予測される。このステム−ループの２次構造式を以下に示す。
【００４５】
【化７】
2007082543.tif 000009
【００４６】
(12)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡは、塩基番号２８〜３６の領域と塩基番号６８〜７７の領域とでステムを形成し、塩基番号３７〜４４の領域がループを形成すると予測される。このステム−ループの２次構造式を以下に示す。
【００４７】
【化８】
2007082543.tif 000010
【００４８】
(13)の塩基配列からなるＤＮＡにコードされるＲＮＡは、塩基番号４５〜４９の塩基配列からなる領域と塩基番号６３〜６７の塩基配列からなる領域とでステムを形成し、塩基番号５０〜６２の領域がループを形成すると予測される。このステム−ループの２次構造式を以下に示す。
【００４９】
【化９】
2007082543.tif 000011
【００５０】
以上説明したＲＮＡアプタマーの２次構造は、Ｍｆｏｌｄプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｗｅｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｓｅｑａｎａｌ／ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ／ｍｆｏｌｄ−ｓｉｍｐｌｅ．ｈｔｍｌ）を用いた計算により予測されたものである。また、クラスIIアプタマーについては、後に実施例で説明する通り、特定ヌクレオチドの位置で１本鎖ＲＮＡを特異的に分解するＲＮａｓｅにより開裂する位置を検出することにより、塩基対を形成しないループ部分の位置を確認した。また、このＲＮａｓｅによる開裂がＲＦ１の存在下で阻害されたことから、これらのループ部分はＲＦ１との相互作用に必須の部分であると考えられた。
製造方法
本発明のＲＮＡアプタマーは、ＲＦ１に結合するＲＮＡを、例えばＩｎ  ｖｉｔｒｏセレクション法で選択することにより得ることができる。但し、ＲＦ１との結合力の強いアプタマーを例えばＩｎ  ｖｉｔｒｏセレクション法により選択しても、ＲＦ１中の結合位置はコントロールできない。従って、実際にＲＦ１の活性を阻害するとは限らないため、実際にＲＦ１の活性を阻害することを、例えばアンバーサプレッション法による終止コドンの読み過ごし効率の向上を見ることで確認すればよい。
【００５１】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクション法は、ＲＮＡライブラリーの中から、ＲＦ１とのアフィニティクロマトグラフィーによる選択ならびにアフィニティメンブランフィルターによる選択と、選択されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる増幅及びＲＮＡへの転写とを繰り返すことにより、大腸菌ＲＦ１と結合するＲＮＡを選択及び濃縮する方法である。
【００５２】
アンバーサプレッション法は、知られた方法である。あるタンパク質をコードする遺伝子中に終止コドンＵＡＧ（アンバー）を導入したＤＮＡを鋳型として、アンバーサプレッサーｔＲＮＡ（アミノ酸を結合して運搬するｔＲＮＡのアンチコドンを終止コドンＵＡＧに対応するＣＵＡに置換したｔＲＮＡ）を含む大腸菌細胞抽出液を用いて転写／翻訳を行い、アンバーを読み過ごしてその位置にアミノ酸を導入する方法である。このとき、細胞抽出液に選択されたＲＮＡアプタマー候補を添加し、アンバーサプレッションの効率を向上させる候補を、ＲＮＡアプタマーとすればよい。
ＲＮＡアプタマー固定化担体
本発明のＲＮＡアプタマー固定化担体は、本発明のＲＮＡアプタマーがゲル状のアガロース；磁気ビーズ；シリコンやポリエチレンなどからなるビーズ等に保持ないしは固定されたものである。ＲＮＡアプタマーは、3'末端又は5'末端のいずれが担体と結合していてもよい。また、ＲＮＡアプタマーは、担体との結合末端に５〜５０塩基程度の任意の配列が付加されてもよい。これにより、担体からの距離が離れ、固定化担体による結合阻害が少なくなる。このような配列としてポリＡ等が挙げられる。ポリＡは、二次構造をとらない点で好ましい。
【００５３】
ＲＮＡ分子と担体との結合方法は周知である。例えば、Chem.Biol.2003,10,1077-1084に記載されているように、ＲＮＡアプタマーの3'末端のシスジオールを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化することにより得られるジアルデヒドと、ヒドラジドアガロースとをＮａＣＮＢＨ３の存在下で反応させる方法によりＲＮＡアプタマーと担体とを結合することができる。
ＲＮＡアプタマーをコードするプラスミド
本発明のプラスミドは、本発明のＲＮＡアプタマーをコードするＤＮＡを誘導により発現可能なプラスミドである。このようなプラスミドとして、例えば、ラクトースリプレッサー構造遺伝子、プロモーター、及びオペレーターからなるラクトース調節遺伝子の支配下に本発明のＲＮＡアプタマーをコードする遺伝子が存在するプラスミドが挙げられる。本発明のＲＮＡアプタマーをコードする遺伝子がラクトース調節遺伝子の支配下にある場合は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によりＲＮＡアプタマー遺伝子の転写が誘導される。
【００５４】
大腸菌細胞内で本発明のＲＮＡアプタマーが常に発現すると、ＲＦ１の阻害により全てのタンパク質の転写が阻害されて細胞が生存することができない。従って、本発明のプラスミドは、ＲＮＡアプタマーをコードする遺伝子の発現が負の調節を受けており、誘導物質により転写が誘導されるものであればよい。
ＲＦ１フリーの細胞抽出液の製造装置
本発明のＲＦ１が除去された細胞抽出液の製造装置は、注入口を有し、本発明のＲＮＡアプタマーを保持する担体が充填された担体支持槽と、液受け槽とを備え、担体支持槽と液受け槽とが、液体を通過し担体を通過しない仕切りを介して隣接している装置である。
【００５５】
担体支持槽には、本発明のＲＮＡアプタマーが固定されたアガロースゲルやビーズ等の担体が充填されている。担体支持槽は、その全容量に担体が充填されていてもよく、又は、細胞抽出液を担体と混合するだけの余剰の容積を有していてもよい。また、担体支持槽は、細胞抽出液を注入するための開口を有する。開口面積は細胞抽出液を注入できるだけの大きさであればよい。
【００５６】
液受け部は、細胞抽出液を溜めるだけの容積を有していればよい。
【００５７】
仕切りは、ゲルやビーズを通過させず細胞抽出液を通過させる孔を有する膜ないしはメッシュであればよい。
【００５８】
この装置を用いて大腸菌細胞抽出液からＲＦ１を除去するに当たっては、担体支持槽に開口部から大腸菌細胞抽出液を注入し、担体と細胞抽出液とを混合する。次いで、装置ごと、例えば５００〜３０００ｇ程度で０．５〜１分間程度遠心することにより、細胞抽出液を担体と分離して液受け部に溜めることができる。液受け部に溜められた細胞抽出液はＲＦ１が除去されたものである。
【００５９】
また、担体と細胞抽出液との分離は、押圧によっても行える。担体支持槽に細胞抽出液を注入して担体と混合した後、担体支持槽の開口部からコンプレッサー等を用いて空気圧をかけることにより、細胞抽出液を液受け槽に移動させることができる。さらに、担体支持槽の開口を注射器と嵌合する大きさとし、注射器を用いて細胞抽出液を担体支持槽に注入しつつ、細胞抽出液を担体層を通過させて液受け槽に移動させることもできる。担体と細胞抽出液との接触時間がこの程度であっても、ＲＦ１がほぼ除去された大腸菌細胞抽出液が得られる。
ＲＦ１フリーの細胞抽出液の製造方法
本発明のＲＮＡアプタマーを保持ないしは固定した担体と大腸菌細胞抽出液とを接触させる工程と、この担体を除去する工程、即ち大腸菌細胞抽出液を回収する工程とを経ることにより、ＲＦ１が除去された大腸菌細胞抽出液が得られる。ＲＮＡアプタマー固定化担体の使用量は、ＲＦ１を十分除去できるように設定すればよい。両者の混合は、４〜１０℃程度で行えばよく、３０〜１２０分間も行えば十分である。また前述したように、混合工程として、細胞抽出液を担体中を通過させるだけでもＲＦ１を除去することができる。担体の除去は、遠心分離、ろ過などにより行える。
【００６０】
本発明のＲＮＡアプタマーは、担体と結合させた状態でも、大腸菌由来の終結因子ＲＦ−１に特異的に結合し、その活性を直交的に阻害する。従って、担体の材料及び量を適宜選択すれば、細胞抽出液の翻訳活性を実質的に低下させずに、ＲＦ−１が除去された細胞抽出液を得ることができる。
実施例
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６１】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクション
＜最初のＲＮＡプール＞
フォワードプライマー（5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGACCGAGAAGTTACCC-3’：配列番号４）、及びリバースプライマー（5’-GTTGCTGCGATGTGCGT-3’：配列番号５）を用いて、１本鎖ＤＮＡプール (5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGACCGAGAAGTTACCC（配列番号６）-[N]50-ACGCACATCGCAGCAAC-3’(配列番号７））を鋳型としてＰＣＲにより２本鎖ＤＮＡプールを得た。配列番号４及び６において下線部は、Ｔ７プロモーター配列に対応している。また、１本鎖ＤＮＡにおいて、配列番号６と配列番号７との間には５０塩基からなるランダム配列が存在する。
【００６２】
Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼを用いてＩｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行い、次いで８％ＰＡＧＥで精製することにより、ＲＮＡライブラリー（60 nmol、コンプレキシティ約1015)を得た。 
＜Ｎ-末端にＨｉｓ６タグを結合した大腸菌ＲＦ１及びＲＦ２＞
E. coli(K12 MG1655株) ゲノムから E. coli RF1 (prfA) 及びRF2 (prfB) 遺伝子配列をＰＣＲ増幅し、pQE30ベクター (Qiagen) のBamHI- HindIIIサイト（RF1）及び BamHI-PstIサイト（RF2）にそれぞれクローニングし、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG) 誘導によりN-末端His6-タグRF1及びRF2をE. coli M15[pREP4] で誘導した。発現したHis6-タグRFをNi-NTAアガロースで精製し、Ｌｏｗｒｙ法でHis6-RF1又はHis6-RF2の濃度を測定した。
【００６３】
RF1遺伝子のためのフォワードプライマーとして、5’-ATTACGGATCCAAGCCTTCTATCGTTGCCAAAC-3’(配列番号８；下線部はBamHIサイト）を用い、リバースプライマーとして5’-ATATGAAGCTTGTTCCTGCTCGGACAACG-3’(配列番号９；下線部はHindIIIサイト）を用いた。
【００６４】
RF2遺伝子のための1回目のPCRのフォワードプライマーとしては、5’-TTAATCCGGTAAATAATCGCA-3’（配列番号１０）を用い、リバースプライマーとして5’-AGACATGTTGGTTCCTCATAA-3’(配列番号１１）を用いた。また、２回目のPCRのフォワードプライマーとして5’-GTCAAGGATCCTTTGAAATTAATCCGGTAAATAATCGC-3’（配列番号１２；下線部はBamHIサイト）を用い、リバースプライマーとして5’-CCATTCTGCAGTGGTTCCTCATAACCCTG-3’ （配列番号１３；下線部はPstIサイト）を用いた。
＜Ｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクション＞
ポジティブセレクションの前にネガティブセレクションを行った。即ち、ニトロセルロースフィルターもしくはアガロースに吸着ないしは結合するＲＮＡを取り除いた。ネガティブセレクションとして、アニールさせたＲＮＡライブラリー（第１ラウンドには60nmolまで、第２〜２２ラウンドには1000pmolまで）をSWINEX (Millipore)を備えるニトロセルロースフィルター (HAWPフィルター) に通し、RF1-フリー Ni-NTAアガロース (QIAGEN)を充填したカラムにアプライした。フィルターにもアガロースにも結合しなかったＲＮＡを回収し、ポジティブセレクションに供した。
【００６５】
回収したＲＮＡを、結合／洗浄(ＢＷ)バッファー(pH 7.3, 50 mMリン酸カリウム, 2.5 mM MgCl2, 6.5 mM Mg(OAc)2, 5 mM NH4OAc)中でＲＦ１を固定したNi-NTAアガロースと２時間インキュベートした。ＢＷバッファーで洗浄した後、溶出バッファー(pH 7.3, 50 mMリン酸カリウム, 2.5 mM MgCl2, 6.5 mM Mg(OAc)2, 5 mM NH4OAc, 250 mMイミダゾール)を用いて、アプタマー−ＲＦ１複合体をNi-NTAアガロースから脱離させた。溶出した複合体をニトロセルロースフィルターに直接アプライし、ＢＷバッファーで洗浄した。変性溶液 (7 M尿素, 10 mM EDTA, 100 mM酢酸ナトリウム)中で95℃で5分間加熱することによりＲＮＡをＲＦ１との複合体から脱離させ、回収した。回収したＲＮＡは、フェノール−クロロフォルム抽出により精製し、Microcon YM-30 (Millipore)でろ過し、ＲＴ−ＰＣＲで増幅した。
【００６６】
増幅産物から転写したＲＮＡプールを次のセレクションラウンドに用いた。１１ラウンド実施後、モノクローン化を行いアプタマー配列の確認を行った。しかし、さらに優れたアプタマーを探索するため、１１ラウンド終了後のプールとイニシャルプールを混合し、更なるセレクションサイクルを１１サイクル（合計２２ラウンド）実施した。変異ＰＣＲを12〜15ラウンドのときに行い、ランダムポイント変異を導入した。セレクションの間、RF1-固定アガロースを用いたラフな結合アッセイによりアプタマーの濃縮を確認した。
【００６７】
簡単に説明すると、N-末端His6-タグRF1に対するＲＮＡアプタマーを、50ヌクレオチド(nt) (全長 84ヌクレオチド；約1015の異なるＲＮＡ分子)のランダム配列のＲＮＡプールの中から選択した。２２ラウンドから４３クローンを分離した。４３クローン中の２６クローンを３タイプに分類した(図１（ａ）のクラスI、 II、及びIII)。
【００６８】
図１（ａ）に示すクラスIの中で分離数の多かったクラスI-1アプタマーのＤＮＡ配列を配列番号１４に示す。また、予測される2次構造を以下の式に示す。
【００６９】
【化１０】
2007082543.tif 000012
【００７０】
クラスIIの中で分離数の多かったクラスII-1アプタマーのＤＮＡ配列を配列番号１５に示す。また、予測される2次構造を以下の式に示す。
【００７１】
【化１１】
2007082543.tif 000013
【００７２】
クラスIIIの中で分離数の多かったクラスIII-1アプタマーのＤＮＡ配列を配列番号１６に示す。また、予測される2次構造を以下の式に示す。
【００７３】
【化１２】
2007082543.tif 000014
【００７４】
RF-1を固定したアガロースを用いた結合親和性のラフな評価により、3タイプの全てがE. coli RF1に結合できることが分かった。特に、クラスIIアプタマーは強い結合を示した（データ示さず）。アプタマークラスIIの中でアプタマークラスII-1は最も数が多かったため、さらなる検討に用いた。
【実施例２】
【００７５】
ＲＮＡアプタマーの特徴
＜２次構造解析＞
転写されたクラスII-1アプタマーの3’末端に、5’-リン酸化され、3’-テキサスレッド(TexR)-ラベルされた11merの 5’-p(AAAAAAAAAAA)-TexR-3’（配列番号１７）をT4 DNAリガーゼ (NEB)とスプリントDNA (5’-TTTTTTTTTTTGTTGCTGCGATG-3’；配列番号１８）を用いて連結し、3’-TexR-ラベルアプタマーを得た。RNA消化はRNase A (Ambion)を用いて添付マニュアルに従い行った。簡単に説明すると、10 μLの1× RNAストラクチャーバッ
ファー(Ambion)の中で、3’-TexR-ラベルアプタマー(13 pmol)とHis-タグRF1 (0-13 μM)とを4 ℃で1時間混合し、RNase A (10 pg) (Ambion)を用いて室温で15分間消化し、20 μLの不活性化／沈殿バッファーを用いて終了させた。
【００７６】
消化したアプタマーをエタノールで沈殿させ、7μLのローディングダイ(ニューフクシンダイを加えたフォルムアミド) 及び7μLの水に再溶解させ、95 ℃で3分間変性させた。2μLをHITACHI 5500-Sシークエンサーを用いた12% 変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
＜表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；surface plasmon resonance）解析＞
RF1アプタマークラスII-1との正確な結合親和性をSPR解析により評価した。クラスII-1アプタマーをコードするプラスミドから、フォワードプライマーとして5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGACCGAGAAGTTACCC-3’（配列番号１９）を、リバースプライマーとして5’-GUTGCTGCGATGTGCGT-3’（配列番号２０；下線部の２ヌクレオチドは、T7 RNAポリメラーゼによりＲＮＡの3'末端に鋳型非依存的にヌクレオチドが添加されるのを防止するため、C2’-メトキシ修飾されている。）を用いて、PCRによりアプタマーのランオフ転写のためのDNA鋳型を調製した。転写されたＲＮＡアプタマーの3’末端に、 5’-リン酸化され、3’-
ビオチンラベルされた11merの 5’-p(AAAAAAAAAAA)-ビオチン-3’(配列番号１７）をT4 DNAリガーゼ(NEB)とスプリントDNA 5’-d(TTTTTTTTTTTGTTGCTGCGATG)-3’（配列番号１８）を用いて連結した。連結産物は8% 変性PAGEにより精製されてクラスII-1-bioアプタマーを得た。SPR測定はビアコアＸシステム（BIAcore X system ；BIAcore社)を用いて行った。クラス II-1-bioアプタマーの固定は、ストレプトアビジンでコートされたセンサーチップSA上、150 mMのNaClを含む HBS-Nバッファー(10 mM HEPES, pH = 7.4)の流速10 μL/分の連続流の中で行った。濃度1.0μMのクラスII-1-bioアプタマー溶液60μLをストレプトアビジンでコートした金表面に注入し、非特異的な結合物を0.5% SDSで洗浄した。種々の濃度RF1及び RF2（60μL)との結合実験を25℃で、ランニングバッファー(10 mM Mg2+を含むHBS-N)の流速20μL/分の連続流の中で行った。動力学的解析をBIAevaluation software ver. 3.1 (BIAcore社)を用いて行った。
【００７７】
ビアコアシステムを用いたＳＰＲ解析によるクラスII-1アプタマーのE.coli RF1との結合の検討を簡単に説明すると、ビオチン−アビジン結合を利用してクラスII-1ビオチンアプタマー(図１（ｃ）のクラス II-1-bio)をSPRセンサーチップに固定し、種々の濃度のE.coli RF1 (10〜100 nM)をチップに注入して、明らかな結合及び解離曲線を得た (図1（ｄ）)。結合データを、マストランスファーバイモレキュラー平衡式に当てはめたところ、ｎＭオーダーの解離定数を得た。アプタマークラスII-1は非常に高い結合特異性を示した。UAA及びUGA終止コドンに対応する E. coli RF2の場合をアプタマー固定したセンサーに注入すると、100nMにおいても結合反応は殆ど全く観察されなかった (図１（ｄ）)。加えて、このアプタマーは、他のタンパク質の翻訳機構に少なくとも低μM濃度で阻害効果を示さなかった。このことは、このアプタマーとE. coli RF1との識別力のある、直交性の相互作用を示している。
【００７８】
クラスII-1アプタマーの２次構造をMfoldプログラムによる計算、及び１本鎖C又はUに特異的なRNase Aによるマッピングにより予測したものを図１（ｃ）に示す。5’末端Texas Red-ラベルされたアプタマー (図１（ｃ）のクラスII-1-TexR)は 、U13, U20, U23, U26, C38, U40, U43, U45, 及びC51の予測された１本鎖領域で主な開裂バンドを与えた。一方、C5 or U53-56のような予測された２本鎖領域では効果的な開裂は見られなかった。このことは、計算された２次構造と一致している。また、RF1を加えることにより、特にU20, U23, U40, 及び U43での開裂は阻害された (図１（ｂ）のレーン3〜8）。図１（ｃ）においてこれらのヌクレオチドは○で囲って示している。このことは、クラスII-1アプタマーはRF1と、塩基対形成していない２つのヘアピン領域の双方又は一方と相互作用していることを示す。
【００７９】
また、図１（ａ）に示すクラスI-1アプタマー、及びクラスIII-1アプタマーの２次構造をMfoldプログラムにより計算したものを図６に示す。
【実施例３】
【００８０】
クラスII-1アプタマーによる大腸菌ＲＦ１のＩｎ  ｓｉｔｕ阻害
＜サプレッサーtRNALeu5CUAの調製＞
E. coliサプレッサー tRNALeu5CUAをランオフin vitro転写により調製した。鋳型DNAを、20 pmolのフォワードプライマー5’-d(TAA TAC GAC TCA CTA TAG CCC GGA TGG TGG AAT CGG TAG ACA)-3’（配列番号２１）、 20 pmolのリバースプライマー5’-d(TGG TAC CCG GAG CGG GAC TTG AAC CCG CAC AGC GCG AAC)-3’（配列番号２２）、100 fmolの鋳型DNA 5’-d(TG GTA CCC GGA GCG GGA CTT GAA CCC GCA CAG CGC GAA CGC CGA GGG ATT TAG AAT CCC TTG TGT CTA CCG ATT CCA CCA TCC GGG CTA)-3’（配列番号２３）、 1.25 UのPfu Ultra HF DNAポリメラーゼ(Stratagene社)、10 nmolの各dNTPs (TOYOBO社)、及び2μLの10× Pfu UltraHF反応バッファーを含む20μlの反応混合物中でPCRを行うことにより調製した。得られたPCR溶液を精製せずに転写反応に供した。
【００８１】
転写は、2,500 UのT7 RNAポリメラーゼ(TOYOBO社)、2μmoLの各NTPs (Fermentas社)、5μmoLのGMP (Sigma社)、1 Uの無機ピロフォスファターゼ (Calbiochem-Novabiochem社)、80 UのRNaseインヒビター(TOYOBO社)、18μLの鋳型DNAのPCR溶液、及び50μLの10×反応バッファーを含む500μLの反応混合物中で37℃で 18時間行った。翻訳されたtRNAは8% 変性PAGEで精製し、次いでエタノール沈殿し、500μLの水に再溶解させた。得られたtRNAを、Microcon YM-30 (Millipore) 及び G-25 Microspin Columns (Amersham)に連続して通すことによりさらに精製した。
＜In Vitro転写／翻訳＞
in vitro 転写／翻訳をRTS 100 E. coli HY Kit (Roche社)を用いて添付マニュアルに従い行った。
【００８２】
N-末端HA-タグGFPs (野生型、及び141UAG)をコードする鋳型２本鎖ＤＮＡはコントロールベクターGFP (Roche社) 及びその変異体から、E. coli Linear Template Generation Set HA-tag Kit (Roche社)を用いてPCRにより調製した。
【００８３】
転写／翻訳は、10 ngの鋳型DNA、及びアプタマー(0〜60 pmol)を含む10μLの反応混合物中で、サプレッサーE. coli tRNALeu5CUA(0〜0.6μg)の存在下で、30℃で４時間行った。インキュベーション後、1μLの反応溶液を5μLのサンプルローディングバッファー（125 mM Tris-HCl (pH 6.8)、 4% (w/v) SDS、 20% (w/v)グリセロール、0.002% (w/v)ブロモフェノールブルー、及び10% (v/v) 2-メルカプトエタノール)、及び4μLの水と混合した。得られた溶液10μLを95℃で5分間インキュベートし、SDS-PAGEにアプライした。ウェスタンブロット解析をPVDFメンブレン(HybondTM-P；Amersham社)を用いて行った。 HA-タグタンパク質を抗 (HA-タグ)-HRP複合体抗体(Roche社),及びECL PlusTM Western Blotting Detection Reagent(Amersham社)を用いて可視化した。サプレッション (リードスルー)効率を、野生型GFPをコードする鋳型から翻訳された全長GFPの段階的希釈系列 (20, 40, 60, 80, 100%)のバンドの濃さを比較することにより評価した。
【００８４】
簡単に説明すると、アンバーコドンサプレッション実験により、共存するRF-1結合性アプタマーによるE. coli RF1のin situ阻害を試み、このアプタマーの阻害活性を評価した。野生型GFP遺伝子 (GFPwild)、及びアンバー変異GFP遺伝子 (GFPamber141)をT7プロモーターによるコントロールの下で、転写及び翻訳のための鋳型として調製した。転写されたGFPamber141のmRNAはUAG終止コドンをAUG開始コドンから１４１番目の位置に有している(図2（ａ）)。ペプチド伸長の停止のために、RF1不活性化条件下でもRF2により認識されるUAA終止コドンを挿入した。全長又は合成が途中で終了したタンパク質を検出するために、両mRNAsはHA-タグ配列をN-末端に有している。アンバーサプレッサーtRNAとして、ランオフ転写したE. coli tRNALeu5 （変化したCUAアンチコドン(tRNALeu5CUA)を有する）を用いた (図２（ｂ）)。tRNALeu5のアンチコドンは、対応する内在性のロイシルtRNAシンテターゼ(Leu RS)により認識される領域には関係しないと考えられることから、アンチコドンが変化したtRNALeu5CUAはなおLeu-RSの基質になり得て、in situ翻訳システム中で触媒的にアシル化されると考えられる。
【００８５】
GFP遺伝子からのIn vitro転写／翻訳を30 ℃で4時間行い、次いでSDS-PAGE解析を行い、翻訳されたタンパク質は、HA-タグ抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出した (図３)。GFPwild遺伝子は全長GFPを生産した (図３レーン６)。アンバー変異したGFPamber141遺伝子は合成が途中で終了した産物を生産し、全長GFPは検出されなかった (データは示さない)。
【００８６】
アプタマーとRF1との直交性の相互作用は、ナンセンスサプレッションにおいて極めて重要である。クラスII-1アプタマーのE. coli.の他の翻訳機構に対する識別性を検討した結果を図３に示す。2、4、及び6μMのアプタマーは、GFPwildmRNAからの全長GFPの生産量を減少させなかった(レーン7〜9とレーン6との比較)。このことは、選択されたクラスII-1アプタマーは、少なくとも低μM範囲では E. coli RF1に高い特異性を有し、終結因子RF2のような他の翻訳機構の活性にダメージを与えないことを示している。
【００８７】
0.6μgのサプレッサーの存在下で、１４±１%の全長GFPだけがGFPamber141 mRNAから生産された (図３レーン16）。 他の同じ条件下で、クラスII-1アプタマーはサプレッション効果の増大を誘起し (レーン16〜19)、６μMのアプタマーの存在により、最終的に＞４０％ の（レーン19）サプレッション効率が認められた。このことから、選択されたアプタマークラスII-1はE. coli RF1のインヒビターとして直交性に作用することができ、ナンセンスサプレッション効果を向上させることが分かる。
【実施例４】
【００８８】
固相アプタマーを用いたRF1欠損転写システムの調製
＜2-ベンジル-2-ヒドロキシ酢酸でミスアシル化されたtRNAPheCUA＞
Methods Enzymol.1991,202,301-336に記載の方法により化学的にミスアシル化されたtRNAを調製した。
＜ゲル固定したアプタマーの調製＞
クラスII-1-A20アプタマーのランオフ転写のための鋳型DNAは、クラスII-1アプタマーをコードするプラスミドから、フォワードプライマーとして5’-TTCTAA TACGACTCACTATAGGACCGAGAAGTTACCC-3’（配列番号２４)を、リバースプライマーとして5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTGCTGCGA TGTGCGT-3’(配列番号２５）を使用したPCR増幅により調製した。アジピン酸ジヒドラジドアガロースへのアプタマーの固定は、Chem.Biol.2003,10,1077-1084に記載の方法により行った。典型的には、1,000 pmolのRNAアプタマーをアガロースの120μL懸濁液に固定した。
＜RF1減少翻訳システムの調製＞
約1,000 pmolのアプタマーを固定した、又はアプタマーフリーのアジピン酸ジヒドラジドアガロースは300μLのRNaseフリー水で3回予備洗浄され、RTS翻訳溶液（典型的には70μL)とスピンフィルターカラム中でインキュベートされた。4℃で2時間 静かに上下に反転させた後、ゲルはスピンダウンろ過により除去した。転写／翻訳は、回収した細胞フリー抽出液を8μL含む10μLの反応溶液の中で、サプレッサーtRNAの存在下又は非存在下で、30℃で4時間行った。
【００８９】
簡単に説明すると、入手した直交性のRF-1結合アプタマーを用いて、RF-1が減少したセルフリーの翻訳システムの迅速な調製装置の開発を行った。
【００９０】
我々は、通すだけで細胞フリー溶液からE. coli RF1を除去できるRNAアプタマー固定化ゲルを作製した。この固相アプタマー法は、in situ阻害法に比べて、RF1活性除去が結合サイトにかかわらず、アプタマーの単なる結合能に従い行われる点で有利である。
【００９１】
我々は、アルデヒドとヒドラジンとの間の還元的アミノ化に基づく固定を選んだ。RNAの3’-末端 cis-ジオールの酸化によりジアルデヒドが得られた。ジアルデヒドは、NaCNBH3の存在下でヒドラジドアガロースと複合させることができ、それにより位置特異的に(3’-末端特異的に)固定できた。先に示したように、アプタマークラスII-1は3'末端にさらに20個のアデニンを付加することにより延長して、図１（ｃ）のクラスII-1-A20が得られ、修飾されたアプタマーがヒドラジドアガロースに固定された。
【００９２】
固定化されたRF1-アプタマークラスII-1は精製されたHis6-タグ E. coli RF1を用いて確認した。アプタマーを固定化したアガロース (約1,000 pmol)は精製されたE. coli RF1 (約200 pmol)に結合され、捕捉されたRF1を数回洗浄し、尿素及びEDTAを含む変性バッファーで溶出した。
【００９３】
図４（ａ）は、各ステップの溶出物をクマシーブルー染色したものである。RNA-フリー、もしくは、最初のRNAプール(約1,000 pmol)を固定化したアガロースをコントロールとして用いた。図に示されるように、RF1はアプタマー固定化ゲルに効果的に捉えられ (図４（ａ）のレーン１、７とレーン２、８との比較) 、洗浄中も十分強く補足される程度に結合しており(レーン３，９) 、変性によりRF1が回収された (レーン６、12)。これにより、クラスII-1アプタマーが固定化条件下でも結合活性を維持していることが分かる。E. coli RF2がアプタマーが固定化ゲルに結合しないことにより、このアプタマーの特異
性が確認された (図４（ｂ）)。
【００９４】
次いで、RF-1減少セルフリー翻訳システムを用いてナンセンスサプレッション実験を行った。 E. coli細胞抽出物をアプタマー固定化ゲルに通し、ろ液を直接ナンセンスサプレッション実験（図５）に供した。典型的には、70μLの翻訳溶液 (RTS HY100, Roche)を、〜1,000 pmolのRNAアプタマーを固定化したアガロースゲルにアプライした。単純なスピンダウンろ過によりゲルを除去した後、後処理を行わずに、鋳型DNA及びサプレッサーtRNALeuCUAを添加することにより、in vitro翻訳を開始した。吸着能を有するアガロースゲルは、量及び素材をコントロールすれば、翻訳機構にダメージを与えないと考えられる。
【００９５】
GFPamber遺伝子についてアンバーサプレッション効率を評価するために細胞フリーの溶液の中で転写／翻訳が行われた（図５（ａ））。正常（オリジナル）細胞フリーの翻訳溶液は、アプタマーフリーアガロースで処理されたものであるが、0.3μg及び0.6μgのサプレッサーtRNAの存在下で、 GFPamberから全長GFPの5%及び5−10%を生産した（レーン1〜3)。アプタマー固定したゲルを通したシステムの中で翻訳が行われるとき、0.3μg及び0.6μgのサプレッサーの存在下でのサプレッション収率は、それぞれ＞40%に向上した(レーン4〜6)。
【００９６】
汎用性を示すため、178番目に位置するアンバーコドンについて他の同様の条件で同様の実験を行った。アプタマー処理された翻訳システム及びアプタマーフリーアガロースで処理された翻訳システムは、0.6μgのサプレッサーtRNAの存在下で、それぞれ、約３０％、及び＜５％のサプレッション効率を示した (図５（ｂ）)。
【００９７】
最後に、非天然の2-ベンジル-2-ヒドロキシ酢酸の取り込みについて検討した。ヒドロキシ酢酸は酵母tRNAPheCUAにより化学的にミスアシル化されており、これをアンバーサプレッション実験に用いた (図５（ｃ））。アプタマーフリーアガロースで処理された翻訳システムにおいて、修飾エステルを有する全長GFPの収率は、ミスアシル化されたtRNAの現在の濃度では検出できない程度であった (＜５％、レーン6）。これに対して、アプタマーゲル処理により、非天然ヒドロキシ酸が効果的に取り込まれ、収率が40−60％に向上した（レーン８）。このことから、非天然アミノ酸の位置特異的な取り込みにも固相アプタマーが有用であることが分かる。
【００９８】
これらの結果、選択されたRNAがE. coli RF1に対して親和性及び識別性を有することが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】実施例１で得た各ＲＮＡアプタマーをコードするＤＮＡ配列と、クラスII-1アプタマーの性質を示す図である。
【図２】構築したＧＦＰのｍＲＮＡとサプレッサーｔＲＮＡを示す図である。
【図３】クラスII-1ＲＮＡアプタマーとＲＦ１との直交性を示す図である。
【図４】クラスII-1ＲＮＡアプタマーが担体に結合した状態でＲＦ１に対する結合活性を有することを示す図である。
【図５】クラスII-1アプタマーがアンバーサプレッションを促進することを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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