(57)【要約】      （修正有）【課題】糖尿病を治療する方法を提供する。【解決手段】膵炎関連タンパク質（ＰＡＰ）ファミリーの遺伝子と著しい相同性を示す遺伝子ＩＮＧＡＰ。哺乳動物ＩＮＧＡＰのｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列は特定の配列で与えられ、これらＩＮＧＡＰタンパク質を含有する医薬組成物。推定されるタンパク質は、カルシウム依存性Ｃ型レクチンの炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を共有する。ＩＮＧＡＰタンパク質は膵島新生の刺激、特に膵管細胞からのβ細胞再生において役割を果たす。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病の治療に効果的な量のＩＮＧＡＰタンパク質を含有する、糖尿病の哺乳動物を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
哺乳動物がインスリン依存性の真性糖尿病である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
哺乳動物が非インスリン依存性の真性糖尿病である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＩＮＧＡＰタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含有する、哺乳動物の膵臓に投与して哺乳動物の膵島細胞の数を増やすための医薬組成物。
【請求項５】
ＤＮＡ分子が配列番号１に示される配列を有する、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＩＮＧＡＰタンパク質が配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＩＮＧＡＰタンパク質を含有する、哺乳動物の膵臓に投与して哺乳動物の膵島細胞の数を増やすための医薬組成物。
【請求項８】
ＩＮＧＡＰタンパク質が配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有し且つ膵島新生を刺激する能力を有する哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質を含有する、膵島細胞の移植を受けた哺乳動物を処置するための医薬組成物。
【請求項１０】
膵島細胞症の哺乳動物に投与して、哺乳動物のβ細胞の過度の成長を防止するためにアンチセンス構造体を含有する、膵島細胞症の治療のための医薬組成物であって、
該アンチセンス構造体は、プロモーター、ターミネーター、及び配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有し且つ膵島新生を刺激する能力を有するアミノ酸の配列をコードする哺乳動物ＩＮＧＡＰ遺伝子から成るヌクレオチド配列からなり、該ヌクレオチド配列が、該プロモーターとターミネーターとの間に有り、該ヌクレオチド配列が、該プロモーターに対して逆方向であり、それによって、該プロモーターからの発現の際に、ネイティブ哺乳動物ＩＮＧＡＰ  ｍＲＮＡに相補的なｍＲＮＡを生産する、ことからなる哺乳動物ＩＮＧＡＰ遺伝子のアンチセンス構造体である、前記医薬組成物。
【請求項１１】
薬学上許容される希釈剤又は担体中に配合された、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有し且つ膵島新生を刺激する能力を有する哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質からなる、膵臓不全の治療のための医薬組成物。
【請求項１２】
ＩＮＧＡＰタンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有し且つ膵島新生を刺激する能力を有する哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の少なくとも１５個の連続したアミノ酸からなるポリペプチド製剤と薬学上許容される希釈剤又は担体とからなる、医薬組成物。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、第２のタンパク質から誘導される第２のポリペプチドと前記配列との融合物である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、第２のポリペプチドと複合している、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、前記哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の生物活性をもっている、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記生物活性が膵管細胞の成長、増殖を刺激する能力である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが配列番号２に示される哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質における１０３〜１２２アミノ酸からなる、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが前記哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の少なくとも１３０個の連続するアミノ酸からなる、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
配列番号１に示される配列の少なくとも１０の連続するヌクレオチドを含む１つ以上のオリゴヌクレオチドを哺乳動物のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに高ストリンジェンシーな条件でハイブリダイズさせて、
１つ以上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡからＤＮＡ分子を同定する
方法により得られた、単離されたｃＤＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
ランゲルハンスの膵島は、体内でインスリンを産生する唯一の器官である。しかしながら、それらは、限られた再生能力しか有さない。この限られた再生能力が、哺乳動物に真正糖尿病を発病させ易くしている。かくして、内分泌学の分野において、真正糖尿病の症状を予防又は改善するために、ランゲルハンス島の再生を刺激できる物質についての必要性が存在する。
【０００２】
膵島細胞再生の１つのモデルは、シリアンゴールデンハムスターの膵臓をセロハンで包むことを包含する（１）。膵臓をセロハンで包むと、上皮管から起こると考えられる新たな内分泌細胞の形成が誘発される（２〜４）。当該技術分野では膵島細胞再生を司る因子を同定及び単離する必要性が存在する。
【０００３】
発明の要旨
本発明の目的は、膵島細胞新生に関与する哺乳動物タンパク質又はそのポリペプチド部分の調製物を提供することである。
【０００４】
本発明の他の目的は、膵島細胞新生に関与する哺乳動物タンパク質をコードするＤＮＡ分子を提供することである。
【０００５】
本発明の更なる他の目的は、哺乳動物ＩＮＧＡＰ（膵島新生関連タンパク質）タンパク質の調製物を提供することである。
【０００６】
本発明の更なる他の目的は、膵島細胞新生に関与する哺乳動物遺伝子を検出するためのヌクレオチドプローブを提供することである。
【０００７】
本発明の目的は、哺乳動物からＩＮＧＡＰ遺伝子を単離する方法を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、ＩＮＧＡＰタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体調製物を提供することである。
【０００９】
本発明の更なる他の目的は、ＩＮＧＡＰタンパク質を製造する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の目的は、真正糖尿病を治療する方法を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、膵島細胞を培養で増殖させる方法を提供することである。
【００１２】
本発明の更なる他の目的は、ポリカーボン殻内に被包された膵島細胞の寿命を伸ばす方法を提供することである。
【００１３】
本発明の目的は、哺乳動物における膵島細胞の数を増加させる方法を提供することである。
【００１４】
本発明の目的は、トランスジェニック哺乳動物を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、遺伝子操作された哺乳動物を提供することである。
【００１６】
本発明の更なる他の目的は、糖尿病の危険のある個々の哺乳動物を同定する方法を提供することである。
【００１７】
本発明の目的は、哺乳動物からのサンプル中のＩＮＧＡＰタンパク質を検出する方法を提供することである。
【００１８】
本発明の更なる他の目的は、単離した膵島細胞が細胞自滅を回避できるように処置する方法を提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、膵島細胞移植を受けている哺乳動物を処置する方法を提供することである。
【００２０】
本発明の目的は、β始原細胞の分化を誘発する方法を提供することである。
【００２１】
本発明の目的は、β始原細胞を同定する方法を提供することである。
【００２２】
本発明の他の目的は、膵臓内分泌不全症を患っている哺乳動物を治療する方法を提供することである。
【００２３】
本発明の目的は、ＩＮＧＡＰの発現を調節するためのアンチセンス構築体を提供することである。
【００２４】
本発明の更なる他の目的は、膵島細胞症を治療する方法を提供することである。
【００２５】
本発明の更なる他の目的は、哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質を検出するキットを提供することである。
【００２６】
本発明の目的は、膵臓不全症の治療のための医薬組成物を提供することである。
【００２７】
本発明のこれら及び他の目的が、以下に記載する１又はそれを越える態様により与えられる。
【００２８】
１つの態様においては、哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の調製物が提供される。この調製物は、他の哺乳動物タンパク質を実質的に含まない。
【００２９】
他の態様においては、単離したＤＮＡ分子が提供される。このＤＮＡ分子は、哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質をコードする。
【００３０】
本発明の更なる他の態様においては、哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の調製物が提供される。この調製物は、
セロハンで包むことにより哺乳動物膵臓細胞を誘発してＩＮＧＡＰタンパク質を発現させ；そして
前記ＩＮＧＡＰタンパク質を前記誘発哺乳動物膵臓細胞から精製する
方法により作られる。
【００３１】
本発明の更なる他の態様においては、ヌクレオチドプローブが提供される。このプローブは、配列番号１に示した配列の少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含む。
【００３２】
本発明の他の態様においては、哺乳動物のＩＮＧＡＰタンパク質の調製物が提供される。この調製物は、他の哺乳動物タンパク質を実質的に含まない。ＩＮＧＡＰタンパク質は、哺乳動物の膵臓をセロハンで包むことで誘発可能である。
【００３３】
本発明の更なる他の態様においては、哺乳動物からＩＮＧＡＰ遺伝子を単離する方法が提供される。この方法は、
配列番号１に示した配列の少なくとも１０の連続したヌクレオチドを含む１又はそれを越えるオリゴヌクレオチドを前記哺乳動物のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡにハイブリダイズさせ；
前記１又はそれを越えるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする前記ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡからＤＮＡ分子を同定する
ことを含む。
【００３４】
本発明の更なる他の態様においては、単離したｃＤＮＡ分子が提供される。このｃＤＮＡ分子は、
配列番号１に示した配列の少なくとも１０の連続したヌクレオチドを含む１又はそれを越えるオリゴヌクレオチドを前記哺乳動物のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡにハイブリダイズさせ；
前記１又はそれを越えるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする前記ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡからＤＮＡ分子を同定する
方法により得られる。
【００３５】
本発明の他の態様においては、抗体が提供される。この抗体は、哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質と特異的に免疫反応性である。
【００３６】
本発明の更なる他の態様によれば、哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質を製造する方法が提供される。この方法は、
哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質をコードするｃＤＮＡで形質転換された宿主細胞を準備し；
該宿主細胞を栄養培地中で培養して該ＩＮＧＡＰタンパク質を発現させ；そして
該宿主細胞又は該栄養培地から該ＩＮＧＡＰタンパク質を採取する
工程を含む。
【００３７】
本発明の更なる他の態様によれば、哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質を製造する方法が提供される。この方法は、
配列番号１に示した配列の少なくとも１０の連続したヌクレオチドを含む１又はそれを越えるオリゴヌクレオチドを前記哺乳動物のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡにハイブリダイズさせ；前記１又はそれを越えるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする前記ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡからＤＮＡ分子を同定する方法により得られるＤＮＡ分子を含む宿主細胞を準備し；
該宿主細胞を栄養培地中で培養して該哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質を発現させ；そして
該宿主細胞又は該栄養培地から該哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質を採取する
工程を含む。
【００３８】
本発明の他の態様によれば、糖尿病の哺乳動物を治療する方法が提供される。
この方法は、糖尿病の哺乳動物に治療有効量のＩＮＧＡＰタンパク質を投与して膵島細胞の増殖を刺激することを含む。
【００３９】
本発明の他の態様によれば、膵島細胞を培養で増殖させる方法が提供される。
この方法は、
膵島細胞を増殖させるためにＩＮＧＡＰタンパク質を培地中に供給し；そして
ＩＮＧＡＰタンパク質を含む前記培地中で膵島細胞を増殖させる
ことを含む。
【００４０】
本発明の他の態様によれば、ポリカーボン殻内に被包された膵島細胞の寿命を伸ばす方法が提供される。この方法は、被包された膵島細胞にＩＮＧＡＰタンパク質を、前記膵島細胞の生存率又は生存時間を伸ばすのに十分な量で加えることを含む。
【００４１】
本発明の他の態様によれば、哺乳動物における膵島細胞の数を増加させる方法が提供される。この方法は、ＩＮＧＡＰタンパク質をコードするＤＮＡ分子を哺乳動物の膵臓に投与することを含む。
【００４２】
本発明の他の態様によれば、哺乳動物における膵島細胞の数を増加させる方法が提供される。この方法は、ＩＮＧＡＰタンパク質を哺乳動物の膵臓に投与することを含む。
【００４３】
本発明の他の態様によれば、トランスジェニック哺乳動物が提供される。この哺乳動物は、第２哺乳動物のＩＮＧＡＰ遺伝子を含む。
【００４４】
本発明の別の態様によれば、非ヒト哺乳動物が提供される。哺乳動物は、該哺乳動物のＩＮＧＡＰ遺伝子の挿入または欠失突然変異を含むように遺伝子工学的に処理されている。
【００４５】
本発明の別の態様によれば、糖尿病のリスクを有する個々の哺乳動物を同定する方法が提供される。この方法は、個々の哺乳動物の試料のＩＮＧＡＰ遺伝子における突然変異を同定することを含み、該突然変異は該遺伝子によりコードされるＩＮＧＡＰタンパク質に構造的異常性を引き起こすか、または該ＩＮＧＡＰ遺伝子発現の低下または抹消につながる調節欠陥を引き起こす。
【００４６】
本発明の別の態様によれば、哺乳動物からの試料中のＩＮＧＡＰタンパク質を検出する方法が提供される。この方法は、該試料を哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質に対して特異的に免疫反応性である抗体調製物と接触させることを含む。
【００４７】
本発明の別の態様によれば、哺乳動物の単離された膵島細胞を処置して該細胞のアポトーシスを回避する方法が提供される。この方法は、単離された哺乳動物の膵島細胞を、他の哺乳動物タンパク質から実質的に精製された、該単離された膵島細胞の生存率を増加させるのに十分な量の哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の調製物と接触させることを含む。
【００４８】
本発明の別の態様によれば、膵島細胞の移植を受けた哺乳動物を処置する方法が提供される。この方法は、哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の調製物を膵島細胞の移植を受けた哺乳動物に投与することを含み、ここで該投与工程は、該移植の前、間もしくは後に実施される。
【００４９】
本発明の別の態様によれば、β細胞始原細胞の分化を誘導する方法が提供される。この方法は、β細胞を含む膵管細胞の培養物を、他の哺乳動物タンパク質を実質的に含まない哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の調製物と接触させて、該β細胞始原細胞の分化を誘導させることを含む。
【００５０】
本発明のさらに別の態様においては、β細胞始原細胞を同定するための方法が提供される。この方法は、膵管細胞の集団を哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質と接触させ；そして該ＩＮＧＡＰタンパク質が特異的に結合する細胞を該集団中から検出することを含む。
【００５１】
本発明の別の態様によれば、膵臓内分泌不全を有する哺乳動物を処置する方法が提供される。この方法は、膵臓内分泌不全に苦しむ哺乳動物から単離されたβ細胞始原細胞を含む膵管細胞の調製物を、他の哺乳動物タンパク質を実質的に含まない哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の調製物と接触させて、該β細胞始原細胞の分化を誘導し；そして該処置された膵管細胞を該哺乳動物中に自家移植することを含む。
【００５２】
本発明の別の態様によれば、哺乳動物ＩＮＧＡＰ遺伝子のアンチセンス構築物が提供される。この構築物は、プロモーター、ターミネーターおよび哺乳動物ＩＮＧＡＰ遺伝子からなるヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列は該プロモーターと該ターミネーターとの間にあり、該ヌクレオチド配列は該プロモーターに関して反転されており、このことにより該プロモーターからの発現の際に元の哺乳動物ＩＮＧＡＰ  ｍＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが生成される。
【００５３】
本発明の別の態様によれば、膵島細胞症を処置する方法が提供される。この方法は、膵島細胞症を有する哺乳動物に上述のアンチセンス構築物を投与することを含み、このことにより該哺乳動物のβ細胞の過剰増殖が阻害される。
【００５４】
本発明の別の態様に従えば、哺乳動物からの試料中の哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質を検出するためのキットが提供される。このキットは、哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質に対して特異的に免疫反応性である抗体調製物；および哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の少なくとも１５個の連続するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含む。
【００５５】
本発明の別の態様によれば、膵臓機能不全を処置するための医薬組成物が提供される。この組成物は、薬学的に許容しうる希釈剤または担体中の哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質を含む。
【００５６】
本発明の別の態様によれば、医薬組成物が提供される。この組成物は、哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の少なくとも１５個の連続するアミノ酸の配列を含むポリペプチドの調製物および薬学的に許容しうる希釈剤または担体を含む。
【００５７】
本発明のこれらのおよび他の態様は、膵島細胞新生を刺激または阻害する手段を当該技術分野に提供する。真性糖尿病の発症の診断方法もまた本発明により提供される。
【００５８】
好ましい態様の詳細な説明
我々はここで膵炎関連タンパク質（ＰＡＰ）ファミリーの遺伝子（７〜１１）と著しい相同性を示す遺伝子ＩＮＧＡＰの同定を報告する。推定されるタンパク質は、Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ（１２）により定義されたカルシウム依存性Ｃ型レクチンの炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を共有する。ＩＮＧＡＰタンパク質は膵島新生の刺激、特に膵管細胞からのβ細胞再生において役割を果たす。
【００５９】
哺乳動物ＩＮＧＡＰのｃＤＮＡ配列は配列番号１で与えられる。推定アミノ酸配列は配列番号２に示される。これらの配列はハムスターから単離された核酸から決定されたが、他の哺乳動物種は極めて類似したＩＮＧＡＰ遺伝子を有するであろうと考えられる。ヒトＩＮＧＡＰ  ｃＤＮＡは、配列番号１の２３〜２６８および３８９〜６０９の配列を共有しており、配列の中程に１２０ｂｐのギャップを含む。ヒトＩＮＧＡＰタンパク質の推定アミノ酸配列は配列番号２の１〜８３および１２４〜１７４であり、配列の中程に４０アミノ酸を含む。相同遺伝子は少なくとも約７０％の同一性を有するであろうと予測される。より近接した種は、少なくとも約７５％、８０％、あるいは８５％もの同一性を有すると予測される。これに対し、カルシウム依存性Ｃ型レクチンのファミリーの他のメンバーはＩＮＧＡＰと多くとも６０％の同一性を含む。
【００６０】
本明細書で提供するＤＮＡ配列を用いて、宿主細胞中で遺伝子を複製するベクターを作製し、ＩＮＧＡＰタンパク質を発現することができる。配列番号２に示すのと同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列も本発明の目的を逸脱することなく使用できる。その他の哺乳動物ＩＮＧＡＰをコードするＤＮＡ配列も本発明で意図している。真核細胞及び原核細胞に適したベクターは当業者に公知である。転写及び翻訳制御部位の下流にある興味のあるＤＮＡセグメントを発現させるためにいくつかのベクターを特別にデザインする。真核細胞で発現させるためのこのようなベクターの１つでは、インビトロジェン社から市販されているプラスミドであるＥＢＮＡ  Ｈｉｓを用いる。装填したベクターは、ヒスチジン生合成酵素の一部とＩＮＧＡＰとを含む融合タンパク質を生産する。原核細胞で使用するのに適した別のベクターはｐｃＤＮＡ３である。特定の目的に適したベクターの選択は、有用な発現制御配列などのベクターの性質や特徴の知識を用いて行うことができる。ベクターを用いて宿主細胞を安定に又は一過性に形質転換又はトランスフェクトすることができる。形質転換やトランスフェクトの方法は当業者に公知であり、特定の宿主細胞に適したものを用いることができる。トランスフェクションの目的に従って宿主細胞を選択できる。適当な原核細胞宿主は大腸菌ＤＨ５αである。適当な真核細胞宿主はアフリカミドリザル腎臓細胞株のｃｏｓ７である。いくつかの目的にとっては、ＩＮＧＡＰの正しいグリコシル化が望ましく、このような場合にはＩＮＧＡＰのグリコシル化シグナルを認識する適当な宿主細胞を用いるべきである。
【００６１】
配列番号１に示す連続配列の少なくとも１０、１５、２０又は３０ヌクレオチドを含むプローブを用いて、特定の個体又はその他の種のメンバー中のＩＮＧＡＰ遺伝子を同定することができる。同じ種のＤＮＡ又は異なる種のＤＮＡに対する適当なハイブリダイゼーション条件は、当業者にそれぞれ高ストリンジェンシー及び低ストリンジェンシーとして公知である。所望の用途に従って各種の形態においてこれを用いることができる。例えば、当業者に公知のサザンブロット、ノーザンブロット及びin situ コロニーハイブリダイゼーションを用いることができる。ブローブは典型的には少なくとも１０、１５、２０又は３０ヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡオリゴマーである。ブローブは放射性標識、蛍光標識、酵素などを含む当業者に公知の検出可能な部分で標識してもよい。プローブはその他の哺乳動物ＩＮＧＡＰ遺伝子配列由来のものであってもよい。
【００６２】
ＩＮＧＡＰ遺伝子はここに提供するヌクレオチド配列の情報を用いてその他の哺乳動物から単離することができる。（より詳細には、ハムスターＩＮＧＡＰ遺伝子の単離について下記に詳述するのと同じ方法を用いて単離できる。）ここに開示するＩＮＧＡＰのヌクレオチド配列の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを哺乳動物のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡとハイブリダイズさせる。便宜的にはＤＮＡはクローンライブラリーの形である。オリゴヌクレオチドは、放射性標識又は酵素又は蛍光標識等の都合のよい標識で標識できる。プローブとハイブリダイズするＤＮＡ分子を単離する。オーバーラップするＤＮＡセグメントを単離することによって、例えば最初に単離したＤＮＡを連続するＤＮＡのプローブとして同じライブラリー又は哺乳動物ＤＮＡの調製物中で用いることによって、完全な遺伝子を構築する。単離したＤＮＡの同定の確認は、例えばセロファンラッピングに付したときの膵臓中での遺伝子発現のパターンを観察することによって行うことができる。同様に、コードされた産物の膵管細胞に及ぼす生物的効果も該遺伝子がＩＮＧＡＰ遺伝子であることの同定に役立つであろう。
【００６３】
もしも２つのオリゴヌクレオチドが補乳動物のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡにハイブリダイズする場合には、これらを例えばポリメラーゼ連鎖反応又はリガーゼ連鎖反応を用いてＤＮＡ合成のプライマーとして用いることができる。全長遺伝子の構築及び単離遺伝子の同定の確認は上述したようにして行うことができる。
【００６４】
ＩＮＧＡＰタンパク質は、本発明に従って、セロファンラッピング法によりＩＮＧＡＰタンパク質を発現するように哺乳動物膵臓細胞を誘導することによって単離することができる。この方法は本明細書に援用する参考文献１に詳述されている。このようにして産生したＩＮＧＡＰタンパク質を、例えば免疫アフィニティ法又はタンパク質精製の分野で公知のその他の方法を用いて他の哺乳動物タンパク質から精製できる。配列番号２に示すようなＩＮＧＡＰタンパク質のアミノ酸配列の全て又は断片を免疫源として用いて哺乳動物ＩＮＧＡＰに特異的な抗体を産生できる。この免疫源を用いて免疫反応性抗体を同定し精製できる。モノクローナル又はポリクローナル抗体を当業者に公知の方法で作製できる。抗体は検出可能な標識又は固体支持体物質等のその他の部分と結合できる。このような抗体を用いて、哺乳動物膵臓細胞又は組換え細胞から単離したタンパク質を精製できる。ＩＮＧＡＰタンパク質に対する特異的抗体を分泌するハイブリドーマも本発明で意図する範囲内である。
【００６５】
上述した宿主細胞を用いて哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質を生産できる。宿主細胞は哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む。該ＤＮＡは配列番号１に従うものであるか、あるいは上述の方法でその他の哺乳動物から単離できる。宿主細胞は、ＩＮＧＡＰタンパク質が発現する条件下に栄養培地中で培養できる。ＩＮＧＡＰタンパク質が宿主細胞から分泌されると、宿主細胞又は栄養培地からＩＮＧＡＰタンパク質を単離できる。
【００６６】
ＩＮＧＡＰ及びその断片が島細胞の成長を誘導及び刺激できることが今や見いだされた。さらにこれらは、膵管細胞の分化を誘導し、このような細胞がアポトーシス経路を避けることができるようにすることができる。従って、ＩＮＧＡＰ、その断片、及びＩＮＧＡＰをコードするヌクレオチド配列を用いて多くの治療様式が可能となる。治療的有効量のＩＮＧＡＰを患者膵臓、単離した島細胞、及びポリカーボンシェルなどに封入した膵島細胞に供給する。治療目的に適当なＩＮＧＡＰの量は、１〜１５０μｇ／ｋｇ体重又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで１〜１００００μｇ／ｍｌの範囲である。このような投与量の最適量は日常的試験によって確認できる。哺乳動物にＩＮＧＡＰを投与する方法は当業者に公知であり、皮下投与、門静脈経由、局部灌流経由などを含む。
【００６７】
本発明に従ってＩＮＧＡＰ供給により治療できる症状にはインスリン依存性及びインスリン非依存性の糖尿病、膵臓不全、膵臓障害などを含む。ＩＮＧＡＰの発現阻害を島細胞腫の治療に用いることができる。
【００６８】
本発明によると、生物活性を与えるにはＩＮＧＡＰの小部分で十分であることが今や見いだされた。配列番号２の配列の２０アミノ酸の断片、アミノ酸＃１０３〜＃１２２が、膵管細胞の成長及び増殖を刺激するのに十分である。ラット腫瘍管細胞株、ハムスター管細胞株、ハムスターインスリノーマ細胞株、及びラットインスリノーマ細胞株で効果が観察された。その他の哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の類似部分が同様の活性をもつ可能性が高い。タンパク質のこの部分は膵臓関連タンパク質（ＰＡＰ）ファミリーのその他のメンバーと似ていない。これにはグリコシル化部位を含み、またタンパク質の主要抗原部位でもあるらしい。この断片を用いてマウスを免疫し、モノクローナル抗体を作製した。
【００６９】
ＩＮＧＡＰ発現の生理学的部位を決定した。ＩＮＧＡＰは膵臓の外分泌部分において、腺房組織中で発現する。ＩＮＧＡＰは管細胞又は島細胞、即ち膵臓のパラクリン部位では発現しない。セロファンラッピングによる誘導の２４〜４８時間以内に発現が起こる。
【００７０】
本発明によるトランスジェニック動物は異なる哺乳動物由来のＩＮＧＡＰ遺伝子をもつ哺乳動物である。転写制御領域をうまく選択することによって、内在性ＩＮＧＡＰ遺伝子よりも高レベルで外来遺伝子を発現させることができる。トランスジェニック動物の作製法は当業者に公知であり、そのような方法のいずれを用いてもよい。挿入、欠失又はＩＮＧＡＰタンパク質の構造又はＩＮＧＡＰの発現制御を変更するその他の突然変異を有するように遺伝子操作された動物も本発明で意図している。これらの突然変異を行う方法は当業者に公知である。
【００７１】
診断アッセイも本発明の意図する範囲内にある。ＩＮＧＡＰの突然変異を血液、羊水、絨毛膜の絨毛、胚盤胞、及び膵臓細胞などのサンプル中で確認できる。このような突然変異は糖尿病の危険にさらされた個体を同定する。突然変異は、ヌクレオチド配列をＩＮＧＡＰ遺伝子の野生型配列と比較することにより同定できる。当業者に公知のいかなる方法でこれを行ってもよく、制限断片長多型の比較、ポリメラーゼ連鎖反応産物の比較、ヌクレアーゼ保護アッセイなどを含む。あるいは、改変タンパク質を例えば免疫学的又は生物学的に同定することができる。
【００７２】
本発明はまた、ＩＮＧＡＰアンチセンス構築物を、β細胞の過増殖によって特徴づけられる状態である、膵島細胞症（nesidioblastosis）の治療に使用することも意図している。アンチセンス構築物を膵島細胞症を有する哺乳動物に投与し、よって、β細胞の過増殖を抑制する。アンチセンス構築物は、典型的にはプロモーター、ターミネーターおよび哺乳類ＩＮＧＡＰ遺伝子からなる核酸配列を含む。ＩＮＧＡＰ遺伝子はプロモーターとターミネーターとの間にあり、そして、プロモーターに対して天然に発現する場合とは逆さになっている。当該プロモーターからの発現に際し、天然の哺乳類ＩＮＧＡＰとは相補的なｍＲＮＡが産生される。
【００７３】
哺乳動物由来の試料中のＩＮＧＡＰを分析するための免疫学的方法は、例えば、ＩＮＧＡＰの治療上の投与をモニターするのに有用である。典型的には、ＩＮＧＡＰに特異的な抗体を試料に接触させ、そして抗体と試料中に存在するあらゆるＩＮＧＡＰとの結合を検出できるであろう。これは、便利には検出可能なように標識されていてもよい既知の量の標準ＩＮＧＡＰ調製物と、インキュベーション混合物をスパイクさせる（ｓｐｉｋｅｄ）、競合結合アッセイでもよい。あるいは、ＩＮＧＡＰのポリペプチド断片を競合因子として使用することもできる。ある特定のアッセイ形式では、ビーズ、ポリマーマトリックス、もしくはマイクロタイタープレート等の固相または支持体に抗体を結合させる。
【００７４】
本発明において、膵臓内分泌疾患を伴う哺乳動物の膵管細胞を体内から取り出し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理することができる。膵管細胞は典型的にはβ細胞前駆体を含む。よって、哺乳類ＩＮＧＡＰタンパク質の調製物による処理は、β細胞前駆体の分化を誘導するであろう。管細胞を、実質的に他の哺乳類タンパク質を含まない哺乳類ＩＮＧＡＰタンパク質の調製物と接触させる。次いで、処理された細胞は、それらが由来した哺乳動物への自家移植として用いることができる。このような自己治療は、移植に伴う不都合な対宿主移植片反応を最小化する。
【００７５】
ＩＮＧＡＰタンパク質はまた、ＩＮＧＡＰに対する受容体を生じるそれらの細胞を同定するために用いることもできる。それらの細胞は、ＩＮＧＡＰの生物学的作用に感受性を有するβ細胞前駆体であると思われる。放射標識、または蛍光標識等によってＩＮＧＡＰタンパク質を検出可能なように標識し、そして、膵管由来の細胞集団と接触させることができる。標識タンパク質に結合する細胞は、ＩＮＧＡＰに対する受容体を産生する細胞、よってβ細胞前駆体として同定させるであろう。また、ＩＮＧＡＰの断片もこの目的のために使用でき、さらに、混合された細胞集団から固相支持体に細胞を分離するために、固定化したＩＮＧＡＰを用いることもできる。ＩＮＧＡＰは、表面への吸着、抗体、あるいは結合（conjugation）によって、固相または支持体に固定化することができる。当該技術分野において知られている他のいかなる方法を用いてもよい。
【００７６】
試料中の哺乳類ＩＮＧＡＰタンパク質を検出するためのキットも、本発明によって提供される。これは、とりわけ、ＩＮＧＡＰの哺乳動物への投与を含む治療の際にＩＮＧＡＰの代謝をモニターするのに有用でありうる。キットは、典型的には、哺乳類ＩＮＧＡＰタンパク質に特に免疫反応性の抗体調製物を含むであろう。抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。ポリクローナルの場合、それらを単特異的にするためにアフィニティ精製することができる。キットはさらに、哺乳類ＩＮＧＡＰタンパク質の少なくとも１５の連続するアミノ酸を有するポリペプチドを含むであろう。ポリペプチドは、抗体への結合について試料中のＩＮＧＡＰタンパク質と競合させるのに使用する。好ましくは、ポリペプチドは検出可能なように標識されるであろう。ポリペプチドは、抗体が結合するＩＮＧＡＰ部分を含むであろう。よって、抗体がモノクローナルな場合、ポリペプチドは抗体のエピトープを含むために、ＩＮＧＡＰと首尾よく競合するであろう。また、ポリマービーズ、棒、プレート等の固相または支持体に抗体を結合させることも好ましいであろう。
【００７７】
哺乳類ＩＮＧＡＰタンパク質を含む薬剤組成物を、膵臓不全の治療に用いることができる。あるいは、組成物は、哺乳類ＩＮＧＡＰタンパク質の少なくとも１５の連続するアミノ酸の配列を含むポリペプチドを含んでもよい。ポリペプチドは、タンパク質の他の部分を欠いても生物学的に活性であるＩＮＧＡＰの部分を含むであろう。ポリペプチドは、例えば第２のタンパク質またはポリペプチドとの遺伝融合物等の、より大きなタンパク質の一部であってもよい。あるいは、例えば架橋剤によって、ペブチドを第２のタンパク質に結合させてもよい。
【００７８】
ＩＮＧＡＰタンパク質の適当な部分は、配列番号２のアミノ酸＃１０３〜＃１２２との相同性によって、あるいは被験ポリペプチドが膵管細胞の成長および増幅を刺激する能力によって、決定することができる。当該技術分野において知られているように、活性を損なうことなく、タンパク質のいずれかの端から比較的少数のアミノ酸を除くことができることはしばしばある。従って、タンパク質の約１０％までを削除することができ、そして、なおＩＮＧＡＰの全ての機能を本質的に提供することも本発明の範囲に意図される。ハムスターＩＮＧＡＰの場合、そのようなタンパク質は少なくとも１３０アミノ酸を含む。
【００７９】
薬剤組成物は、薬剤学的に可能な希釈剤または担体を含むであろう。一般に液体処方が好ましい。ＩＮＧＡＰは異なる濃度で、または異なる剤型を用いて処方することができる。例えば、これらの調剤は、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤または増量剤（bulking agent）を含むことができる。好ましくは、炭水化物は単糖、二糖または多糖、あるいは水溶性グルカン等の糖または糖アルコールを含む。サッカライドは、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、αもしくはβシクロデキストリン、溶解性澱粉、ヒドロキシエチル澱粉、並びにカルボキシメチルセルロース、あるいはこれらの混合物を含む。スクロースが最も好ましい。糖アルコールは、−ＯＨ基を有するＣ4〜Ｃ8の炭化水素として定義され、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロールおよびアラビトールを含む。マンニトールが最も好ましい。上述された糖または糖アルコールは、単独で用いても、あるいは組み合わせて用いてもよい。糖または糖アルコールが水性調製物に溶解しうる限り、用いられる量に定められた限界はない。好ましくは、糖または糖アルコール濃度は、１.０ｗ／ｖ％と７.０ｗ／ｖ％の間であり、より好ましくは２.０ｗ／ｖ％と６.０ｗ／ｖ％の間である。好ましくは、アミノ酸は左旋性（levorotary）（Ｌ）型のカルニチン、アルギニン、およびベタインを含むが、他のアミノ酸を加えてもよい。好ましいポリマーは、２０００〜３０００の間の平均分子量を有するポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、あるいは３０００〜５０００の間の平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。これらを用いる場合、凍結乾燥前または再構成後の溶液中のｐＨ変化を最小にするために、組成物中に緩衝剤も用いるのが好ましい。ほとんどいかなる生理学的緩衝剤も使用できるが、クエン酸、リン酸、コハク酸およびグルタミン酸緩衝剤、あるいはそれらの混合物が好ましい。好ましくは、濃度は０．０１〜０．３モルである。界面活性剤も調剤に加えてもよい。
【００８０】
さらに、ＩＮＧＡＰまたはそのポリペプチド部分を、例えば、そのサイクル半減期を延ばすために、ポリマーに対する共有結合によって化学的に修飾することができる。好ましいポリマー、並びにそれらをペプチドに結合させる方法は、米国特許第４,７６６,１０６号、第４,１７９,３３７号、第４,４９５,２８５号および第４,６０９,５４６号に示されている。好ましいポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、室温で水に溶解性であり、以下のような一般式を有する：Ｒ（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）nＯ−Ｒ［式中、Ｒは、水素でもよく、あるいはアルキル基もしくはアルカノル基等の保護基でもよい］。好ましくは、保護基は１〜８の間の炭素を有し、より好ましくはメチルである。記号ｎは正の整数であり、好ましくは１〜１,０００の間であり、より好ましくは２〜５００の間である。ＰＥＧは好ましくは平均分子量が１０００〜４０,０００の間であり、より好ましくは２０００〜２０,０００の間であり、最も好ましくは３０００〜１２,０００の間である。好ましくは、ＰＲＧは少なくとも１つの水酸基を有し、より好ましくはそれは末端水酸基である。抑制因子上の遊離のアミノ基と反応するために好ましくは活性化されるのは、この水酸基である。
【００８１】
液体薬剤組成物を調製後、分解を防ぎ無菌状態（sterility）を保持するために好ましくはそれを凍結乾燥させる。液体組成物を凍結乾燥する方法は当業者に知られている。使用直前に、追加の成分を含んでもよい無菌希釈剤（例えば、リンガー溶液、滅菌水または無菌食塩水）を用いて組成物を再構成することができる。再構成後、組成物を好ましくは、当業者に公知のそれらの方法を用いて対象に投与する。
【００８２】
以下の実施例は、本発明の限定を意図するものではなく、先に開示されたそれを単に例示するためのものである。
【実施例１】
【００８３】
この実施例は新規な、発生学的に調節された膵臓タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングおよび単離を説明する。
【００８４】
特有の局部的に産生された因子が島細胞発生に関係すると仮定した。最近開発されたｍＲＮＡディファレンシャルディスプレイ技術（５、６）を使用してセロファンで包んだ状態（ＣＷ）で発現された遺伝子と対照の膵臓（ＣＰ）で発現された遺伝子とを弁別的に比較したところ、セロファンで包んだ膵臓で特有の発現をするｃＤＮＡクローン（ＲＤ１９−２）を特定できた。
【００８５】
オリゴｄ（Ｔ）活性化合成およびｐｃＤＮＡ３ベクター（インビトロジェン）に結合させることによってセロファンで包んだハムスター膵臓から単離されたｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築した。該ライブラリーの１次組換え体数は１．２×１０6で、平均サイズは１．１ｋｂであった。このｃＤＮＡライブラリーを、高密度コロニー平板培養技術を使用して目的クローンについてスクリーニングした。コロニーをナイロン膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）にのせてプロテアーゼＫ（５０ｇ／ｍｌ）で分解した。処理された膜を８０℃で１時間焼き、５０℃で１６〜１８時間、１〜５×１０6ｃｐｍ／ｍｌの［３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（デュポン−ニューイングランドニュクレアー）で標識したＲＤ１９−２プローブとハイブリダイズした。陽性のハイブリダイゼーション信号を発するコロニーを単離してノーザンｍＲＮＡ転写物とサイズ比較し、配列決定してＲＤ１９−２配列との同一性を確認した。
【実施例２】
【００８６】
この実施例はＩＮＧＡＰの配列をこれと相同性を共有している他のタンパク質と比較したものである。
【００８７】
最長ｃＤＮＡ挿入物を有するハムスターＩＮＧＡＰクローンのヌクレオチド配列を決定した。図１に示すようにハムスターｃＤＮＡは、ポリ（Ａ）尾を除く７４７ヌクレオチド（ｎｔ）からなり、１７５アミノ酸タンパク質をコードする主オープン・リーデイング・フレームを含む。このオープン・リーデイング・フレームの次は２０６ｎｔの３’−未翻訳領域である。典型的ポリアデニル化信号が上記ポリ（Ａ）尾の１１ｎｔ上流に存在する。予測されたＩＮＧＡＰタンパク質は膵臓炎または肝臓腺癌（７〜１１）に伴うＰＡＰ／ＨＩＰファミリーの遺伝子および膵臓β細胞生育を促す（１４）と見られ膵島再生に役立つＲｅｇ／ＰＳＰ／リトスタチンファミリーの遺伝子の両方に対してＰＡＰ構造相同性を示す。ヌクレオチド配列およびそれらの推定されたアミノ酸をハムスターＩＮＧＡＰとラットＰＡＰ−Ｉで比較したところ、コード領域で高度の相同性（ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列で各々６０および５８％）を示した。ハムスターＩＮＧＡＰの予測アミノ酸配列はＰＡＰＩＩに対して４５％およびＰＡＰＩＩＩに対して５０％（ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰＩＩＩは急性膵臓炎に関連する）、および肝細胞性肝癌に見られたＨＩＰに対して５４％の同一性を示した。ＩＮＧＡＰはラットＲｅｇ／ＰＳＰ／リソスタチンに対して４０％の同一性をも示した（図２）。Ｒｅｇは膵臓石タンパク質（ＰＳＰ）（１５、１６）または膵臓糸タンパク質（ＰＴＰ）（１７）と考えられている。ＩＮＧＡＰタンパク質の予測配列のＮ末端は高度に疎水性であるのでタンパク質を排泄させるようにし得るシグナルペプチドの良好な候補である。ＰＡＰ／ＨＩＰに類似であるがＲｅｇ／ＰＳＰ／リソスタチンタンパク質とは異なり、潜在性Ｎ−グリコシル化部位はＩＮＧＡＰ配列の１３５位と仮定されている。ＩＮＧＡＰに特有なのは、１１５位と仮定されたもう１つの潜在性Ｎ−グリコシル化部位である。２つのジスルフィド結合を有する４つの完全保存システイン類を含むＤｒｉｋａｍｅｒによって測定することによって、ＩＮＧＡＰはまたカルシウム依存性（Ｃ型）動物レクチンの膜の一致した特徴と高度の相同性（１２／１８）（図２）を示す（１２）。ＩＮＧＡＰのアミノ末端に見られるさらに２つのシステイン類（図２）もＲｅｇ／ＰＳＰおよびＰＡＰ／ＨＩＰに存在する。しかし、生物学的有意性がどのようなものかは不明である。
【実施例３】
【００８８】
この実施例はセロファン包みでのＩＮＧＡＰの一時的発現パターンを示す。
【００８９】
ＩＮＧＡＰの一時的発現を決定するため、ＣＰおよびＣＷ膵臓から抽出された総ＲＮＡをノーザンブロット解析においてハムスターＩＮＧＡＰ  ｃＤＮＡクローンでプローブした。セロファン包みの１及び２日後、９００ｂｐの強力な単一転写物を検出した（図３）。これは６ないし４２日までに消失し、ＣＰからは存在しなかった。ＩＮＧＡＰ  ｍＲＮＡはＣＷ後のみに存在するので、ＣＷ誘導膵島新生に関連している。ＰＡＰファミリーの遺伝子のようにＩＮＧＡＰの発現増加が急性膵臓炎に関連することはないらしい。膵臓炎の急性期の間に、アミラーゼを含む膵臓酵素をコードする大部分のｍＲＮＡの濃度は有意に減少した（１６、１８）。反対に、高度のＩＮＧＡＰ発現が見られた島新生のＣＷモデルにおいては、アミラーゼ遺伝子発現は低下するよりむしろ同時に正常より増加し（図３）、ＩＮＧＡＰ発現は膵臓炎に関連するのではなく、むしろ島新生に関連することを示唆している。ＣＷ１および２日後増加したアミラーゼ遺伝子発現の原因は未だ不明であり、このテーマを解明するためさらなる研究が必要である。
【実施例４】
【００９０】
この実施例はＩＮＧＡＰタンパク質をコードするヒトｃＤＮＡのクローニングおよび部分的配列を説明する。
【００９１】
ヒトポリＡ＋ＲＮＡを正常ヒト膵臓から、キアゲンから市販のポリＡ＋抽出キットを使用して単離した。次いで、５００ｎｇのポリＡ＋ＲＮＡを逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の鋳型として使用した。実験条件をパーキンエルマーからのＲＴ−ＰＣＲキットの指示によりセットした。オリゴｄ（Ｔ）を逆転写のプライマーとして使用した。配列番号１においてヌクレオチド４〜２３および６１０〜６２９に相当するプライマーをポリメラーゼ連鎖反応の特異的プライマーとして使用した。６２６ｂｐ  ＰＣＲ断片をインビトロジェンからのＴＡクローニングキットを使用してクローニングした。ヒトクローンの部分配列は配列の中間に１２０ｂｐギャップを有する４６６ｂｐからなる。ヒトＩＮＧＡＰ  ｃＤＮＡは、ハムスターＩＮＧＡＰ  ｃＤＮＡ配列と、配列番号１のヌクレオチド４〜２６８、ヌクレオチド３８９〜６２９が１００％同一である。中間部の１２０ｂｐの配列は未だ同定されていない。
【実施例５】
【００９２】
この実施例はＩＮＧＡＰからの合成ペプチドが島新生の促進の役割を演じ、ヒトＩＮＧＡＰの配列が未だ決定されない１２０ｂｐ断片によってコードされた少なくとも１つのエピトープがハムスターＩＮＧＡＰと共有されていることを示す。
【００９３】
推定されたアミノ酸１０４〜１１８に相当する合成ペプチドを免疫原として使用してウサギのポリクローナル抗体を上昇させた。次いで抗血清を免疫組織化学検定においてアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）法によって使用した。新島形成したヒト末梢島領域の細胞はＩＮＧＡＰに対して陽性に染色され、ヒトとハムスターＩＮＧＡＰが共通のエピトープを配列番号２のアミノ酸１０４〜１１８の間で共有することを示した。
【００９４】
同一の合成ペプチドを３Ｈ−チミジンのラット膵臓腫瘍管細胞（ＡＲＩＰ）およびハムスターインスリノーマ腫瘍細胞（ＨＩＴ）への取り込み能力について試験した。１０μＣｉの３Ｈ−チミジン（８０．４Ｃｉ／ミリモル濃度）をＨａｍのＦ−１２Ｋ培地で培養された約１０６個の細胞に加えた。２４時間後、細胞を回収し溶解した。トリクロル酢酸（ＴＣＡ）で核酸の分別沈殿をＲｏｓｅｎｂｅｒｇらの変法により行い、３Ｈ−チミジン取り込み割合を計算した。培養物中のＡＲＩＰに合成ペプチドを添加すると該合成ペプチド不存在の２．４倍の３Ｈ−チミジンを取り込んだ。この合成ペプチドは対照細胞株ＨＩＴに対して何ら作用を有しなかった。この結果はＩＮＧＡＰが島新生を促進する役割を演じていることを示唆する。
【００９５】
【化１】
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【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１Ａ】ハムスターＩＮＧＡＰのヌクレオチド配列およびコードされる未成熟タンパク質の推定配列。非コード配列は小文字で表され、ポリアデニル化シグナルには下線が施されている。
【図１Ｂ】ハムスターＩＮＧＡＰのヌクレオチド配列およびコードされる未成熟タンパク質の推定配列。非コード配列は小文字で表され、ポリアデニル化シグナルには下線が施されている。
【図２】ＩＮＧＡＰ、ラットＰＡＰ−Ｉ（ＰＡＰ−Ｉ）（１８）、ヒトＰＡＰ／ＨＩＰ（ＰＡＰ−Ｈ／ＨＩＰ）（１０、１１）、ラットＰＡＰ−ＩＩＩ（ＰＡＰ−ＩＩＩ）（９）、ラットＰＡＰ−ＩＩ（ＰＡＰ−ＩＩ）（８）、ラットＲｅｇ／ＰＳＰ／リソスタチン(Ｌｉｔｈｏｓｔａｔｉｎｅ)（ＲＥＧ／ＬＩＴＨ）（１３、１５）およびＤｒｉｃｋａｍｅｒによりＣ型レクチンのすべてのメンバーに見いだされた不変モチーフ（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ）（１２）のアミノ酸配列の比較。６個の保存的システインはアスタリスクにより示され、ＩＮＧＡＰ中の２個の推定上のＮ−グリコシル化部位は下線および太字で示される。
【図３】対照および包まれた（ｗｒａｐｐｅｄ）ハムスター膵臓からの膵臓組織におけるＩＮＧＡＰおよびアミラーゼ遺伝子発現のノーザンブロット解析。３０ｇの熱変性させた全ＲＮＡを、１．２％アガロース、０．６％ホルムアルデヒド／ＭＯＰＳ変性ゲル上で電気泳動することにより分離し、ナイロン膜に移した。膜は、７４７ｂｐのハムスターＩＮＧＡＰ  ｃＤＮＡプローブ（我々の研究室においてクローニングした）（Ａ）、１０００ｂｐのラットアミラーゼｃＤＮＡプローブ（Ｃｈｒｉｓ  Ｎｅｗｇａｒｄ（Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ）により寛大に供与された）（Ｂ）、およびＲＮＡの一体性および負荷の対照として１８Ｓリボソーム２４量体合成オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃ）とハイブリダイズさせた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2007291114.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月8日(2007.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病の治療に効果的な量のＩＮＧＡＰタンパク質を含有する、糖尿病の哺乳動物を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
哺乳動物がインスリン依存性の真性糖尿病である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
哺乳動物が非インスリン依存性の真性糖尿病である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＩＮＧＡＰタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含有する、哺乳動物の膵臓に投与して哺乳動物の膵島細胞の数を増やすための医薬組成物。
【請求項５】
ＤＮＡ分子が配列番号１に示される配列を有する、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＩＮＧＡＰタンパク質が配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＩＮＧＡＰタンパク質を含有する、哺乳動物の膵臓に投与して哺乳動物の膵島細胞の数を増やすための医薬組成物。
【請求項８】
ＩＮＧＡＰタンパク質が配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有し且つ膵島新生を刺激する能力を有する哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質を含有する、膵島細胞の移植を受けた哺乳動物を処置するための医薬組成物。
【請求項１０】
膵島細胞症の哺乳動物に投与して、哺乳動物のβ細胞の過度の成長を防止するためにアンチセンス構造体を含有する、膵島細胞症の治療のための医薬組成物であって、
該アンチセンス構造体は、プロモーター、ターミネーター、及び配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有し且つ膵島新生を刺激する能力を有するアミノ酸の配列をコードする哺乳動物ＩＮＧＡＰ遺伝子から成るヌクレオチド配列からなり、該ヌクレオチド配列が、該プロモーターとターミネーターとの間に有り、該ヌクレオチド配列が、該プロモーターに対して逆方向であり、それによって、該プロモーターからの発現の際に、ネイティブ哺乳動物ＩＮＧＡＰ  ｍＲＮＡに相補的なｍＲＮＡを生産する、ことからなる哺乳動物ＩＮＧＡＰ遺伝子のアンチセンス構造体である、前記医薬組成物。
【請求項１１】
薬学上許容される希釈剤又は担体中に配合された、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有し且つ膵島新生を刺激する能力を有する哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質からなる、膵臓不全の治療のための医薬組成物。
【請求項１２】
ＩＮＧＡＰタンパク質が、配列番号２に示されるアミノ酸配列である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有し且つ膵島新生を刺激する能力を有する哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の少なくとも１５個の連続したアミノ酸からなるポリペプチド製剤と薬学上許容される希釈剤又は担体とからなる、医薬組成物。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、第２のタンパク質から誘導される第２のポリペプチドと前記配列との融合物である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、第２のポリペプチドと複合している、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、前記哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の生物活性をもっている、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記生物活性が膵管細胞の成長、増殖を刺激する能力である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが配列番号２に示される哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質における１０３〜１２２アミノ酸からなる、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが前記哺乳動物ＩＮＧＡＰタンパク質の少なくとも１３０個の連続するアミノ酸からなる、請求項１３に記載の医薬組成物。