(57)【要約】【課題】脂質付加タンパク質の一種である、脂質がチオエーテル基を介して結合したアミノ酸残基を含むタンパク質をはじめとする、修飾基がチオエーテル基を介して結合したタンパク質を主なターゲットとした質量分析法であって、当該タンパク質の質量分析による構造解析を容易に行うことができる方法を提供する。【解決手段】水酸基含有アルキル基がチオエーテル基を介して結合したアミノ酸残基を含むタンパク質（ａ）を用意し、前記タンパク質（ａ）に対して酸化剤を作用させることによって酸化を行い、前記チオエーテルの硫黄原子が酸化されたタンパク質（ｂ）を得て、前記酸化されたタンパク質（ｂ）を、質量分析装置を用いて測定する、硫黄原子含有タンパク質の質量分析法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水酸基含有アルキル基がチオエーテル基を介して結合したアミノ酸残基を含むタンパク質（ａ）を用意し、
前記タンパク質（ａ）に対して酸化剤を作用させることによって酸化を行い、前記チオエーテルの硫黄原子が酸化されたタンパク質（ｂ）を得て、
前記酸化されたタンパク質（ｂ）を、質量分析装置を用いて測定する、硫黄原子含有タンパク質の質量分析法。
【請求項２】
前記タンパク質（ａ）において、前記水酸基含有アルキル基は、炭素数が２〜１０である、請求項１に記載の硫黄原子含有タンパク質の質量分析法。
【請求項３】
前記水酸基含有アルキル基が、２，３−ジヒドロキシプロピル基（-CH2CH(OH)CH2(OH)基）又はトリヒドロキシプロピル基（-CH(OH)CH(OH)CH2(OH)基）である、請求項２に記載の硫黄原子含有タンパク質の質量分析法。
【請求項４】
前記水酸基含有アルキル基がチオエーテル基を介して結合したアミノ酸残基を含むタンパク質（ａ）は、脂質がチオエーテル基を介して結合したアミノ酸残基を含むタンパク質（ｚ）を加水分解することによって得られたものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の硫黄原子含有タンパク質の質量分析法。
【請求項５】
前記酸化剤が過酸化水素である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の硫黄原子含有タンパク質の質量分析法。
【請求項６】
前記酸化されたタンパク質（ｂ）は、前記チオエーテル基がスルフィニル基へ酸化されたものであるか、又は、前記チオエーテル基がスルフォニル基へ酸化されたものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の硫黄原子含有タンパク質の質量分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質・ペプチド化学、及び質量分析学に関する。より詳しくは、本発明は、硫黄原子を含有するタンパク質の質量分析法に関する。特に、本発明は、翻訳後修飾などによって脂質をはじめとする修飾基がチオエーテル基を介して結合したタンパク質の質量分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質のアミノ酸残基は、翻訳後に、ヒドロキシル化、リン酸化、メチル化、糖鎖付加、脂質付加といったさまざまな化学修飾を受ける。脂質による修飾には、Ｃ末端に対するグリコシルホスファジルイノシトール（ＧＰＩ）による修飾、Ｎ末端のグリシンに対するミリストイル基による修飾、Ｃ末端に対するファルネシル基による修飾、システインに対するパルミトイル基による修飾などが知られている。このような脂質付加タンパク質は、タンパク質の生体膜への結合様式や、タンパク質の局在化、情報伝達の制御などに密接に関係しているため、脂質付加によるタンパク質の構造の変化を調べることが注目されている。
【０００３】
脂質付加タンパク質の構造解析は、ソフトなイオン化法であるＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）法やＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）法によってタンパク質をイオン化し、ポストソース分解、インソース分解、衝突誘起解離、タンデムＭＳ（マススペクトロメトリー）等を利用した各種ＭＳ／ＭＳ測定によって行われている。例えば、タンパク質Ｃ末端にＧＰＩによる修飾がされた、ウシ赤血球４２ｋＤタンパク質の、ＥＳＩＭＳ／ＭＳによる解析例（非特許文献１参照）や、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる解析例（非特許文献２参照）が報告されている。
【０００４】
一方、メチオニンを含むペプチドに、過酸化水素を作用させることによってメチオニンスルホキシドへ、或いは過酸化水素と蟻酸とを作用させることによってメチオニンスルホンへ酸化し、得られた酸化体をＦＡＢ−ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳ測定に供することで、スルホキシドからはCH3SOH部分が、スルホンからはCH3SO2部分が脱落したメタステーブルイオンが発生しやすくなる知見が得られている（非特許文献３参照）。
【０００５】
【非特許文献１】A.Tholey et al.,Biochemistry,40(1),225(2001)
【非特許文献２】R.Taguchi,J.Mass Spectrom.Soc.Jpn.,48(2),108(2000)
【非特許文献３】F.M.Lagerwerf et al., Rapid Communications In Mass Spectromtry, vol. 10, 1905-1910 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記非特許文献１や非特許文献２に示した質量分析による構造解析方法においては、脂質付加タンパク質の中でもパルミトイル化タンパク質やファルネシル化タンパク質など、システイン残基側鎖の硫黄原子に脂質が結合したタンパク質の場合、当該脂質の硫黄原子への結合が強いために、脂質が脱離したフラグメントの発生は困難である。その結果、質量分析による脂質付加タンパク質の構造解析は難しいのが現状である。
一方、上記非特許文献３においては、脂質修飾タンパク質の解析は行われていない。
【０００７】
そこで本発明の目的は、脂質付加タンパク質の一種である、脂質がチオエーテル基を介して結合したアミノ酸残基を含むタンパク質をはじめとする、修飾基がチオエーテル基を介して結合したタンパク質を主なターゲットとした質量分析法であって、当該タンパク質の質量分析による構造解析を容易に行うことができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討した結果、タンパク質の側鎖の硫黄原子が酸化された酸化体を質量分析に供することによって、上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）水酸基含有アルキル基がチオエーテル基を介して結合したアミノ酸残基を含むタンパク質（ａ）を用意し、
前記タンパク質（ａ）に対して酸化剤を作用させることによって酸化を行い、前記チオエーテルの硫黄原子が酸化されたタンパク質（ｂ）を得て、
前記酸化されたタンパク質（ｂ）を、質量分析装置を用いて測定する、硫黄原子含有タンパク質の質量分析法。
【００１０】
（２）前記タンパク質（ａ）において、前記水酸基含有アルキル基は、炭素数が２〜１０  である、（１）に記載の硫黄原子含有タンパク質の質量分析法。
（３）前記水酸基含有アルキル基が、２，３−ジヒドロキシプロピル基（-CH2CH(OH)CH2(OH)基）又はトリヒドロキシプロピル基（-CH(OH)CH(OH)CH2(OH)基）である、（２）に記載の硫黄原子含有タンパク質の質量分析法。
【００１１】
（４）水酸基含有アルキル基がチオエーテル基を介して結合したアミノ酸残基を含むタンパク質（ａ）は、脂質がチオエーテル基を介して結合したアミノ酸残基を含むタンパク質（ｚ）を加水分解することによって得られたものである、（１）〜（３）のいずれかに記載の硫黄原子含有タンパク質の質量分析法。
【００１２】
（５）前記酸化剤が過酸化水素である、（１）〜（４）のいずれかに記載の硫黄原子含有タンパク質の質量分析法。
【００１３】
（６）前記酸化されたタンパク質（ｂ）は、前記チオエーテル基がスルフィニル基へ酸化されたものであるか、又は、前記チオエーテル基がスルフォニル基へ酸化されたものである、（１）〜（５）のいずれかに記載の硫黄原子含有タンパク質の質量分析法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、脂質付加タンパク質の一種である、脂質がチオエーテル基を介して結合したアミノ酸残基を含むタンパク質をはじめとする、修飾基がチオエーテル基を介して結合したタンパク質を主なターゲットとした質量分析法であって、当該タンパク質の質量分析による構造解析を容易に行うことができる方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明では、硫黄原子を含むタンパク質を解析対象とする。硫黄原子は、タンパク質を構成するアミノ酸残基の側鎖に含まれる。
【００１６】
本発明は、硫黄原子を含むタンパク質として、非天然型の含硫アミノ酸残基を有するタンパク質に対して有用に用いることができる。このようなタンパク質としては、非天然型のシステイン誘導体や非天然型のメチオニン誘導体をアミノ酸残基として含むタンパク質などが挙げられる。
また、脂質がチオエーテル基を介して結合したタンパク質に対しても有用に用いることができる。このようなタンパク質としては、翻訳後修飾や代謝などの化学修飾によって脂質の付加を受けたタンパク質が挙げられる。より具体的には、翻訳後修飾や代謝などの化学修飾によって、システイン残基やメチオニン残基の硫黄原子に対して脂質の付加を受けたものや、翻訳後修飾や代謝などの化学修飾によって、非含硫アミノ酸残基に対して硫黄原子の導入とともに脂質の付加を受けたものなどが挙げられる。
【００１７】
硫黄原子を含むタンパク質は、場合により適切な処理（すなわち後述の加水分解処理）が行われ、酸化反応に供される。
本発明では、酸化反応に供されるタンパク質を、タンパク質（ａ）と記載する。後述のように、タンパク質（ａ）は、脂質付加タンパク質（ｚ）から得ても良い。タンパク質（ａ）の酸化により、スルホン或いはスルフィドとしてタンパク質（ｂ）を得る。得られたタンパク質（ｂ）は、質量分析に供される。
【００１８】
なお、本明細書において、タンパク質とは、オリゴペプチド、ポリペプチドを含む意味で用いる。後述するように、本発明においては、質量分析を行う前のいずかの工程において、タンパク質の断片化を行うことができる。断片化処理が行われた場合、タンパク質（ｚ）、タンパク質（ａ）、及び/又はタンパク質（ｂ）は、硫黄原子を含む側鎖を有するペプチドフラグメントとしての意味で用いられる。
【００１９】
［１．酸化反応に供されるタンパク質の準備］
本発明において、酸化反応に供されるべきタンパク質（ａ）は、ＡＳＸ−で表される基を側鎖として有する。ここで、Ａは、水酸基含有アルキル基を表し、Ｓは、チオエーテル基を表し、Ｘは、直接結合又はアルキル基を表す。このようなタンパク質（ａ）のモデル例を、下記式に示す。下記式において、点線部分はペプチド鎖を示す。
【００２０】
【化１】
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【００２１】
すなわち、酸化反応に供されるタンパク質（ａ）は、水酸基含有アルキル基が、チオエーテル基を介して直接的又は間接的に結合したアミノ酸残基を含む。このようなアミノ酸残基は、タンパク質（ａ）中において、Ｃ末端及びＮ末端を含むいずれの箇所に含まれていても良い。また、１分子のタンパク質（ａ）中に複数含まれていても良い。
【００２２】
タンパク質（ａ）の具体例としては、上述のような、非天然型の含硫アミノ酸残基を有するタンパク質（例えば、非天然型のシステイン誘導体や非天然型のメチオニン誘導体をアミノ酸残基として含むタンパク質など）が挙げられる。
【００２３】
より具体的には、タンパク質（ａ）のＡにおいて、水酸基含有アルキル基は、炭素数２〜１０程度、好ましくは３とすることができる。水酸基含有アルキル基は、複数の水酸基を有していて良い。本発明においては、水酸基含有アルキル基として、２，３−ジヒドロキシプロピル基（-CH2CH(OH)CH2(OH)基）やグリセロール鎖であるトリヒドロキシプロピル基（-CH(OH)CH(OH)CH2(OH)基）であることが特に好ましい。
【００２４】
タンパク質（ａ）におけるＸがアルキル基の場合、アルキル基の長さは特に限定されないが、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは１〜５とすることができる。
【００２５】
［加水分解処理］
ＡＳＸ−基を側鎖として有するタンパク質（ａ）は、ＢＳＸ−で表される基を側鎖として有するタンパク質（ｚ）から得てもよい。ここで、Ｂは、脂質基を表し、Ｓは、チオエーテル基を表し、Ｘは、直接結合又はアルキル基を表す。タンパク質（ｚ）（脂質付加タンパク質）において、脂質基Ｂは、上記タンパク質（ａ）のＡ基へ誘導されうる基であり、酸又はアルカリによる加水分解が可能なエステル結合を有する有機基である。このようなタンパク質（ｚ）からタンパク質（ａ）が生じることを、モデル例によって下記式に示す。
【００２６】
【化２】
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【００２７】
タンパク質（ｚ）の具体例としては、翻訳後修飾や代謝などの化学修飾によって脂質の付加を受けたタンパク質（例えば、翻訳後修飾や代謝などの化学修飾によって、システイン残基やメチオニン残基の硫黄原子に対して脂質の付加を受けたものや、翻訳後修飾や代謝などの化学修飾によって、非含硫アミノ酸残基に対して硫黄原子の導入とともに脂質の付加を受けたものなど）が挙げられる。
【００２８】
より具体的には、脂質基Ｂとしては、アシルグリセロール、グリセロリン脂質、糖脂質が挙げられる。アシルグリセロールは、各種脂肪酸とグリセロールとのエステルであるが、グリセロールに結合する脂肪酸の種類や数、及び、グリセロール鎖における脂肪酸の結合位置は特に限定されない。
グリセロリン脂質は、sn-1,2-ジアシルグリセロールの３位にリン酸を介してエタノールアミン、グリセリンなどのアルコールがエステル結合したものである。
糖脂質はsn-1,2-ジアシルグリセロールの３位に糖が結合したものである。
これらの脂質基は、グリセロール骨格の１〜３位のいずれかの炭素原子が、硫黄原子（すなわちタンパク質（ｚ）式中のＳ）に結合している。
【００２９】
このようなタンパク質（ｚ）に対し、脂質基Ｂの加水分解を行い、タンパク質（ａ）を得る。加水分解は、酸によるもの及びアルカリによるものを問わないが、アルカリによる加水分解（ケン化）を行うことがより好ましい。加水分解の条件としては、タンパク質（ｚ）における脂質基Ｂの種類により、試薬（例えばアルカリ）の種類・濃度、反応時間、温度条件などを当業者が適宜決定することができる。たとえばケン化を行う場合は、水酸化カリウムを用いることが好ましい。この場合、使用する水酸化カリウム水溶液の濃度や使用量は当業者が適宜決定することができる。
【００３０】
本発明において、タンパク質（ｚ）を用いる場合に、脂質Ｂの加水分解を行いタンパク質（ａ）に変換することは、以下の点で好ましい。
もしタンパク質（ａ）への加水分解を行っていなければ、引き続く酸化工程（後述）において、脂質基Ｂの存在が酸化反応を阻害する可能性がある。例えば、チオエーテル基である硫黄原子と、脂質基Ｂに含まれる水素との間に形成される水素結合などが、硫黄原子における酸化反応の阻害要因となることがある。加水分解を行うことは、その要因が排除される点で好ましい。
【００３１】
［２．酸化反応］
酸化反応の工程においては、タンパク質（ａ）に対して酸化剤を作用させることによって、酸化を行う。酸化反応を行うことにより、タンパク質（ａ）中の硫黄原子が酸化され、タンパク質（ｂ）へ変換される。タンパク質（ｂ）は、前記タンパク質（ａ）におけるチオエーテル基がスルフィニル基へ酸化されることによってスルホキシドとして生じる場合と、前記タンパク質（ａ）におけるチオエーテル基がスルフォニル基へ酸化されることによりスルホンとして生じる場合とがある。酸化反応によって、タンパク質（ａ）からタンパク質（ｂ）が生じることを、モデル例によって下記式に示す。下記式では、タンパク質（ｂ）としてスルホキシドが生じることを示している。
【００３２】
【化３】
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【００３３】
酸化反応に用いられる酸化剤は、一般的に用いられるものを特に限定することなく用いることができる。例えば、過酸化水素や過ヨウ素酸などの酸化剤；Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、クロラミンＴ、トリクロロメタンスルホニルクロリド（ＣＣｌ３ＳＯ２Ｃｌ）などの活性ハロゲンを持つ酸化剤；メチレンブルー、ローズベンガル、プロフラビン、クレゾールレッド、ヘマトポルフィリンなどの光増感酸化剤；オゾンなどが挙げられる。
【００３４】
これら酸化剤の中で、たとえば光増感酸化剤を用いる場合は、タンパク質の希釈溶液に光増感剤を共存させ、酸素又は空気を供給しながら可視光線を照射することによって酸化を行うことができる。使用する溶媒、ｐＨ、反応温度、反応時間などは、メチオニン残基やシステイン残基中の硫黄原子に対する酸化条件を元に当業者が適宜決定することができる。
【００３５】
これら酸化剤の中で、たとえばオゾンを用いる場合は、タンパク質を適当な溶媒に溶解し、オゾン発生機より発生されたオゾンを直接タンパク質溶液に吹き込むことによって酸化を行うことができる。
【００３６】
これら酸化剤の中でも、条件設定の容易さ、反応後の処理工程の少なさなどの点から、過酸化水素を用いることが特に好ましい。過酸化水素は、水溶液として用いることができ、過酸化水素水の濃度や使用量は適宜選択することができる。たとえば、重量基準で、過酸化水素が対象とするタンパク質の１／１００〜１／６倍量となるように用いることができる。
過酸化水素を用いた場合の酸化反応の温度としては、たとえば、１５℃〜３０℃とすることが好ましい。また反応時間としては、１０分〜１時間とすることができる。
【００３７】
酸化剤として過酸化水素を用いた場合は、ＭＳプレート上での酸化処理を行っても良い。この場合、まず、本発明の解析対象となるタンパク質を含むサンプルをＭＳプレートに滴下し、その後、滴下したサンプル上にさらに過酸化水素水を重ねて滴下すると良い。酸化反応を終えた後、直接当該ＭＳプレートによって質量分析が可能となる。このように、酸化剤として過酸化水素を用いる方法は、反応後の処理工程が少ない点で特にこのましい。
【００３８】
上述の方法によって、当該硫黄原子がスルホキシドに酸化されたタンパク質（ｂ）を得ることができる。
本発明では、タンパク質（ｂ）を、当該硫黄原子がスルホンに酸化されたものとして得ても良い。スルホンへの酸化条件としては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。たとえば、スルホキシドへ酸化するための上述の条件に加え、過ギ酸などの強酸を共存させるか、温度条件を上げるかなどの処置を行うと良い。
【００３９】
すでに述べたように、タンパク質（ｚ）を解析対象とする場合、タンパク質（ｚ）が、上記の加水分解処理によってタンパク質（ａ）へ変換されているため、脂質基Ｂの酸化反応への悪影響の心配がない。従って、確実な酸化を行うことが可能である。
【００４０】
［断片化処理］
解析の対象とするタンパク質の分子量が大きい場合は、質量分析を行う前のいずれかの段階、すなわち、加水分解の前後、及び酸化反応の前後のいずれかの段階において、断片化処理を行うと良い。断片化処理によって、タンパク質は、硫黄原子を含む側鎖を有するペプチドフラグメントと、その他のペプチドフラグメントとに断片化される。断片化の手法としては、化学的手法及び生化学的手法を問わず、断片化の対象となる物質に応じて各種酵素や化学試薬、反応時間、温度条件等を、当業者が適宜決定することができる。例えば、酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、Ｖ８エンドプロテアーゼ等が挙げられる。化学試薬としては、シアン化臭素、ヒドロキシルアミン等が挙げられる。
【００４１】
断片化により生じたペプチドフラグメント混合物からは、硫黄原子を含む側鎖を有するペプチドフラグメントを回収することができる。当該ペプチドフラグメントの回収方法としては特に限定されず、公知の濃縮／抽出法を用いることができる。
【００４２】
［３．質量分析］
質量分析工程においては、上記により得られたタンパク質（ｂ）が、質量分析装置を用いて測定される。
なお、前記酸化処理によってタンパク質（ｂ）が得られたことは、タンパク質（ｂ）についてのＭＳ測定の結果において、分子量関連イオンの質量電荷比が、タンパク質（ａ）に比べて１６Ｄａ或いは３２Ｄａ増加していることで確認することができる。より具体的には、タンパク質（ｂ）がスルホキシドとして得られた場合は１６Ｄａの増加が見られ、タンパク質（ｂ）がスルホンとして得られた場合は、３２Ｄａの増加が見られる（ただし、測定対象のタンパク質又は断片化によって得られたペプチドフラグメント中に、硫黄原子を含むアミノ酸残基が１つ含まれる場合）。
【００４３】
本発明では、質量分析により、タンパク質（ｂ）に関するイオンと、タンパク質（ｂ）から硫黄原子を含む基が脱離して生成したイオン（ｃ）との検出を行うことによって解析を行う。ここで、硫黄原子を含む基とは、タンパク質（ｂ）がスルホキシドである場合は−ＳＯＡ基をいい、タンパク質（ｂ）がスルホンである場合は−ＳＯ２Ａ基をいう。
【００４４】
イオン（ｃ）を検出するためには、タンパク質（ｂ）について少なくともＭＳ測定及びＭＳの２乗（ＭＳ/ＭＳ）測定を行う。より詳細な情報を得るために、ＭＳの３乗以上の多段階測定を行うこともできる。  
イオン（ｃ）は、タンパク質（ｂ）の分子量関連イオンをプリカーサイオンとしてＭＳの２乗測定を行った際に、当該プリカーサイオンのメタステーブル分解により、前記硫黄原子を含む基が脱落して生じたイオンである。タンパク質（ｂ）からメタステーブルイオン（ｃ）が生じることを、モデル例によって下記式に示す。
【００４５】
【化４】
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【００４６】
本発明では、このようにメタステーブルイオン（ｃ）が効率よく発生するため、硫黄を含有する側鎖を有するタンパク質の構造解析が容易となる。
【００４７】
本発明において、質量分析のイオン化法としては特に限定されるものではないが、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化法）、ＦＡＢ（高速原子衝撃法）、ＬＳＩＭＳ（液体二次イオン質量分析法）、ＬＩ（液体イオン化法）等が挙げられる。特に、ＥＳＩやＭＡＬＤＩはソフトなイオン化であるため好ましい。
ＭＡＬＤＩによってイオン化を行う際に使用するマトリックスとしては、特に制限されず、当技術分野で通常用いられるマトリックスから、ペプチド又はタンパク質の化学的・物理的性質等の違いを考慮して、当業者が適宜選択することができる。
【００４８】
質量分析の分析計としては、二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計などが挙げられる。
ＭＳ（マススペクトロメトリー）の２乗測定としては、タンデム型、ＰＳＤ（ポストソース分解）法、ＩＳＤ（インソース分解）法、ＣＩＤ（衝突誘起解離）法、ＩＴ（イオントラップ型）−ＭＳ、ＦＴ（フーリエ変換型）−ＭＳなどを用いることができる。
ＭＳのｎ乗測定としては、ＩＴ−ＭＳやＦＴ−ＭＳなどを用いることができる。
【実施例】
【００４９】
以下に、本発明の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００５０】
解析試料として、下記式（ｚ−１）に示す構造を有するペプチドを用意した。
【００５１】
【化５】
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【００５２】
このペプチドは、２,３−ジアシルオキシプロピル基がチオエーテル基を介して結合した構造を有する。
【００５３】
このペプチド（ｚ−１）５μｇに、０．１Ｍの水酸化カリウム水溶液２０μｌを添加して、３７℃で２時間反応させることによりケン化処理を行った。ＭＳプレートに、ケン化処理後の反応溶液１μｌを滴下し、３v/v％の過酸化水素水１μｌを重層し、室温で２０分間反応させることにより酸化処理を行った。この一連の反応は、以下の式で表される。
【００５４】
【化６】
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【００５５】
酸化処理によって得られたペプチド（ｂ−１）に、１μｌのマトリックス水溶液（０．１w/w％トリフルオロ酢酸水溶液に、１０ｍｇ／ｍｌの濃度でジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を溶解して調製したもの）をさらに重層し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析装置であるＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ装置（(株)島津製作所製）を用いて、ＭＳ及びＭＳの２乗解析を行った。
【００５６】
図１に、得られたＭＳスペクトルを示す。図１中、上段がペプチド（ｂ−１）のＭＳスペクトル、下段がペプチド（ａ−１）のＭＳスペクトルを示す。図１において、横軸は質量電荷比（Mass/Charge）、縦軸はイオンの相対強度（%Int.）を表す。酸化処理を行っていないペプチド（ａ−１）の分子量関連イオンの質量電荷比が２０７８．４Ｄａであったのに対して、酸化処理を行ったペプチド（ｂ−１）の分子量関連イオンの質量電荷比は、ペプチド（ａ−１）の分子量関連イオンの質量電荷比から＋１６Ｄａ増加し、２０９４．４Ｄａであった。このことにより、過酸化水素存在下で酸化を行うことによって、システイン残基側鎖の硫黄原子がスルホキシドに酸化された酸化体を得られることが確認された。
【００５７】
次に、図１で得られた２０９４．４Ｄａのイオンを親イオンとして、ＭＳの２乗測定を行った。その結果を図２に示す。図２において、横軸は質量電荷比（Mass/Charge）、縦軸はイオンの相対強度（%Int.）を表す。下段が、ペプチド（ｂ−１）のＭＳスペクトルであり、上段が、ＭＳ／ＭＳスペクトルである。ＭＳ／ＭＳスペクトルでは、親イオンから１２４．１６Ｄａ減少したフラグメントが観測された。すなわち、下記式に示すように、１２４．１６Ｄａの分子量を有する側鎖CH2OH-CHOH-CH2-S=Oが脱落したメタステーブルイオン（ｃ−１）が生じたことが分かった。なお、下記式では、ペプチド中の硫黄含有アミノ酸残基のみを記載し、その他の部分は点線によって省略している。
【００５８】
【化７】
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【００５９】
一方、図３に、過酸化水素による酸化を行っていないペプチド（ａ−１）について、分子量関連イオンを親イオンとしてＭＳ／ＭＳ測定した結果を示す。図３において、横軸は質量電荷比（Mass/Charge）、縦軸はイオンの相対強度（%Int.）を表す。図３が示すように、ペプチド（ａ−１）のＭＳ／ＭＳ測定では、上記（ｃ−１）に対応するメタステーブルイオンは観測されなかった。
【００６０】
上記の実施例により、アミノ酸側鎖中の硫黄原子を酸化することによって、当該硫黄原子にチオエーテル結合を介して結合した修飾基が、硫黄原子とともに脱離したメタステーブルイオンが発生しやすくなり、これによって、構造解析を容易に行うことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】実施例における、酸化処理前のペプチド（ａ−１）のマススペクトル（下段）、及び、酸化処理後のペプチド（ｂ−１）のマススペクトル（上段）である。
【図２】実施例における、酸化処理後のペプチド（ｂ−１）のMS測定及びMS/MS測定によるマススペクトル。
【図３】実施例における、酸化処理前のペプチド（ａ−１）のMS/MS測定によるマススペクトル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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