(57)【要約】  【課題】炎症後色素沈着の優れた予防・改善作用を有する炎症後色素沈着の予防・改善剤、及びそのような予防・改善剤を配合した化粧料、医薬部外品、医薬品を提供することを課題とする。  【解決手段】アルギン酸オリゴ糖、アルギン酸オリゴ糖の塩、アルギン酸オリゴ糖と金属イオンとの錯体、又はアルギン酸オリゴ糖の塩と金属イオンとの錯体、ローズマリー抽出物、ダイズ抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、又は柑橘類抽出物の少なくともいずれかを含有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギン酸オリゴ糖、アルギン酸オリゴ糖の塩、アルギン酸オリゴ糖と金属イオンとの錯体、アルギン酸オリゴ糖の塩と金属イオンとの錯体、ローズマリー抽出物、ダイズ抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、柑橘類抽出物の少なくともいずれかを含有することを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ−９及びエンドセリン−１の産生抑制剤。
【請求項２】
アルギン酸オリゴ糖又はその塩の重合度が２〜２０である請求項１記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−９及びエンドセリン−１の産生抑制剤。
【請求項３】
アルギン酸オリゴ糖又はその塩の重合度が７〜１２である請求項１記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−９及びエンドセリン−１の産生抑制剤。
【請求項４】
アルギン酸オリゴ糖の塩が、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、又はアルギン酸カルシウムである請求項１乃至３記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−９及びエンドセリン−１の産生抑制剤。
【請求項５】
アルギン酸オリゴ糖若しくはその塩と錯体を形成する金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、又はマンガンイオンである請求項１乃至４のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−９及びエンドセリン−１の産生抑制剤。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−９及びエンドセリン−１の産生抑制剤を配合したことを特徴とする炎症後色素沈着の予防・改善剤。
【請求項７】
請求項１乃至５のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−９及びエンドセリン−１の産生抑制剤を配合したことを特徴とする化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ−９及びエンドセリン−１の産生抑制剤、並びにその産生抑制剤を配合した炎症後色素沈着の予防・改善剤、及び化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎、傷、ニキビ等の炎症後において、患部及びその周囲に色素沈着を生ずることがあり、一般に、炎症後色素沈着と称されている。これらの色素沈着は、通常２〜３ヶ月で消退することが多いが、半年以上経過しても消失しないこともあり、特に女性にとっては美容上の悩みとなっている。従って、炎症後色素沈着を起こした皮膚を正常皮膚色に回復させることが要望されている。
【０００３】
炎症後色素沈着の発生機構は未だ明確にされていないが、病理学的研究から、表皮中のメラニン量が増加していること、時にはメラニンが真皮へ滴落していることが確認されている。一方、炎症が起こっている皮膚では様々なサイトカイン、ケミカルメディエーター等の炎症性の生理活性因子が発生しており、それらが色素沈着発生の原因となっていると推察されている。
【０００４】
たとえば、炎症が起きるとヒスタミン、プロスタグランジン、ロイコトリエン等の炎症性メディエーターが各種の細胞から放出され、またＩＬ−１α（Interleukin−1α）、ＩＬ−６（Interleukin−６）、ＴＮＦ−α（Tumor Necrosis Factor−α）などの炎症性サイトカインが各種の細胞から放出されていることが知られている。表皮中のメラニン量の増加はメラノサイトの増殖あるいはメラニン合成能の亢進が原因であると考えられ、そのメカニズムとしては、次の二つが考えられる。
【０００５】
一つは、炎症性因子がメラノサイトに直接的に作用し、メラノサイトを活性化させる機構であり、他の一つは、炎症性因子がまずケラチノサイトに作用し、そのケラチノサイトが産生するメラノサイト活性化因子がメラノサイトを活性化させる機構である。メラニンの真皮への滴落にはマトリックスメタロプロテアーゼ（以下、ＭＭＰともいう）が関与していると思われる。ＭＭＰ−２やＭＭＰ−９等のＭＭＰがケラチノサイトやメラノサイトでも産生されていることが知られており、炎症性因子によってそれらの産生が亢進されることが、メラニンの真皮への滴落の原因となっていることが考えられる。
【０００６】
このような観点から、ＭＭＰの活性を阻害する阻害剤に関する下記特許文献１乃至４のような特許出願もなされている。特許文献１は、カテキン類、プロシアニジン類、マンゴスチン類等からなるＭＭＰ阻害剤を対象とするものであり、特許文献２は、マツ科マツ属植物の樹皮抽出物を有効成分とするＭＭＰ阻害剤を対象とするものである。しかし特許文献１は皮膚の老化の予防や改善を意図したものであり、また特許文献２は皮膚弾力性を維持する化粧料への適用を意図したものであり、いずれも炎症後色素沈着を予防・改善することまで意図したものではない。
【０００７】
また特許文献３は、パルミチン酸、ステアリン酸等の脂肪酸を含有したＭＭＰ阻害剤を対象とするものであり、特許文献４は、クロレラの細胞壁破砕物を含有したＭＭＰ阻害剤を対象とするものである。しかし特許文献３や特許文献４は、ガンその他の疾患の適用について開示するものの、その効果は必ずしも試験によって裏付けられたものではなく、特に皮膚科領域の疾患については言及されておらず、炎症後色素沈着についてももちろん開示、示唆されていない。
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−２５２７４５号公報
【特許文献２】特開２００３−２７７２２３号公報
【特許文献３】特開２００３−２７７２５９号公報
【特許文献４】特開２００５−８９３０４号公報
【０００９】
このように、従来ではＭＭＰ阻害剤についての出願はなされているものの、炎症後色素沈着を十分に予防・改善できる製品は未だに開発されていないのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、このような点に鑑みてなされたもので、炎症後色素沈着の優れた予防・改善作用を有する炎症後色素沈着の予防・改善剤、及びそのような予防・改善剤を配合した化粧料、医薬部外品、医薬品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、このような課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、炎症後色素沈着の発生には種々の炎症性因子の中でヒスタミンとＴＮＦ−αが重要な役割を担っていること、また、それらは、メラノサイトへ直接作用するのではなく、ケラチノサイトを介してメラノサイトの活性化因子であるエンドセリン−１（以下、ＥＴ−１ともいう）と基底膜分解酵素であるＭＭＰ−９を多量に分泌させてメラニン量を増加させ、或いはメラニンを真皮へ滴落させることを見出した。
【００１２】
そして、アルギン酸オリゴ糖若しくはその塩、アルギン酸オリゴ糖若しくはその塩と金属塩との混合物、より詳しくは金属イオンとの錯体、ローズマリー抽出物、ダイズ抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、柑橘類抽出物が、ケラチノサイトからのＥＴ−１及びＭＭＰ−９の産生を抑制することにより、炎症後色素沈着の予防・改善効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、マトリックスメタロプロテアーゼ−９及びエンドセリン−１の産生抑制剤に係る請求項１記載の発明は、アルギン酸オリゴ糖、アルギン酸オリゴ糖の塩、アルギン酸オリゴ糖と金属イオンとの錯体、又はアルギン酸オリゴ糖の塩と金属イオンとの錯体、ローズマリー抽出物、ダイズ抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、又は柑橘類抽出物の少なくともいずれかを含有することを特徴とする。
【００１４】
また請求項２記載の発明は、請求項１記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−９及びエンドセリン−１の産生抑制剤において、アルギン酸オリゴ糖又はその塩の重合度が２〜２０であることを特徴とする。さらに請求項３記載の発明は、請求項１記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−９及びエンドセリン−１の産生抑制剤において、アルギン酸オリゴ糖又はその塩の重合度が７〜１２であることを特徴とする。
【００１５】
さらに請求項４記載の発明は、請求項１乃至３記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−９及びエンドセリン−１の産生抑制剤において、アルギン酸オリゴ糖の塩が、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、又はアルギン酸カルシウムであることを特徴とする。さらに請求項５記載の発明は、請求項１乃至４のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−９及びエンドセリン−１の産生抑制剤において、アルギン酸オリゴ糖若しくはその塩と錯体を形成する金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、又はマンガンイオンであることを特徴とする。
【００１６】
さらに炎症後色素沈着の予防・改善剤に係る請求項６記載の発明は、請求項１乃至５のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−９及びエンドセリン−１の産生抑制剤を配合したことを特徴とする。さらに化粧料に係る請求項７記載の発明は、請求項１乃至５のいずれかに記載のマトリックスメタロプロテアーゼ−９及びエンドセリン−１の産生抑制剤を配合したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によって、優れた炎症後色素沈着の予防・改善効果を有する予防・改善剤や、そのような予防・改善剤を配合した化粧料、医薬部外品、医薬品を提供することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明のＭＭＰ−９及びＥＴ−１の産生抑制剤は、上述のようにアルギン酸オリゴ糖、アルギン酸オリゴ糖の塩、アルギン酸オリゴ糖と金属イオンとの錯体、アルギン酸オリゴ糖の塩と金属イオンとの錯体、ローズマリー抽出物、ダイズ抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、又は柑橘類抽出物の少なくともいずれかを含有するものである。
【００１９】
ここで「含有する」とは、本発明のＭＭＰ−９及びＥＴ−１の産生抑制剤が、アルギン酸オリゴ糖、アルギン酸オリゴ糖の塩、アルギン酸オリゴ糖と金属イオンとの錯体、アルギン酸オリゴ糖の塩と金属イオンとの錯体、ローズマリー抽出物、ダイズ抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、又は柑橘類抽出物の少なくともいずれかのみからなる場合の他、これら以外の成分がＭＭＰ−９及びＥＴ−１の産生抑制剤に含有されていてもよいことを意味する。
【００２０】
アルギン酸オリゴ糖又はその塩は、アルギン酸又はその塩にアルギン酸又はその塩の分解酵素、すなわちアルギン酸リアーゼを作用させて得ることができる。アルギン酸とはＤ−マンニュロン酸とＬ−グルクロン酸を構成糖とする多糖類である。
【００２１】
また、アルギン酸オリゴ糖の塩としては、たとえばアルギン酸オリゴ糖の、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、アミン塩等又はその混合物が例示される。アルギン酸オリゴ糖又はその塩と混合する金属塩としては、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸マグネシウム等の水溶性の塩が例示できる。アルギン酸オリゴ糖又はその塩は、たとえば粉末状のものを水等に溶解し、上記のような金属塩の水溶液と混合される。混合後には、金属塩の金属イオンがアルギン酸オリゴ糖又はその塩と錯体を形成することとなる。
【００２２】
さらにアルギン酸オリゴ糖の重合度は２〜２０であることが好ましい。重合度が２１以上になると分子量が増えるので、アルギン酸オリゴ糖が表皮の最外層を通過できないおそれがあり、従って皮膚浸透性が低下するおそれがあるからである。また多糖であるアルギン酸自体は活性を持たない。すなわちＭＭＰ−９及びＥＴ−１の産生抑制効果を有しない。
一方、アルギン酸はグルクロン酸とマンヌロン酸との２種類の単糖で構成されており、従ってアルギン酸オリゴ糖には、グルクロン酸とマンヌロン酸で構成されているもの、グルクロン酸のみからなるもの、マンヌロン酸のみからなるものの３種類が存在することとなる。しかしながら、単糖であるグルクロン酸やマンヌロン酸自体、或いはグルクロン酸の塩やマンヌロン酸の塩自体には本発明のＭＭＰ−９及びＥＴ−１の産生抑制効果は認められない。従ってオリゴ糖であること、すなわち重合度が２以上であることは必要となる。
尚、活性を高める観点、すなわちＭＭＰ−９及びＥＴ−１の産生抑制効果を高める観点からは、アルギン酸オリゴ糖の重合度は、７〜１２であることがより好ましい。
【００２３】
本発明のアルギン酸オリゴ糖又はその塩は、多糖であるアルギン酸又はその塩を原料として、アルギン酸リアーゼを反応させることによって得ることができる。アルギン酸リアーゼを生産するものとしては、種々のウィルス、細菌、藻類、及び海洋動物が知られており、これらから通常の精製手法によって分離精製されたアルギン酸リアーゼや、あるいは市販されているアルギン酸リアーゼをアルギン酸オリゴ糖又はその塩の調製に用いることができる。尚、このように調製する場合、アルギン酸又はその塩とアルギン酸リアーゼとの反応温度は４５〜５５℃、反応時のｐＨが６．５〜７．５の条件が好ましく、４８〜５２℃、ｐＨ６．８〜７．２の条件で行うのが特に好ましい。
また、上記のようにアルギン酸又はその塩にアルギン酸リアーゼを反応させることによって調製されたものに限らず、アルギン酸オリゴ糖又はその塩として市販されているものを用いることも可能である。
【００２４】
さらに、このようにして得られたアルギン酸オリゴ糖又はその塩を金属塩と混合することにより、アルギン酸オリゴ糖又はその塩と金属塩の混合物とする。用いられる金属塩は、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン等の水溶性の塩が例示できる。アルギン酸オリゴ糖又はその塩と金属塩の比は、不溶性錯体を形成することのない値とする。すなわち、金属塩の濃度はアルギン酸オリゴ糖又はその塩の含有濃度の２５重量％以下であることが好ましい。尚、この場合においても、アルギン酸オリゴ糖又はその塩と金属塩との混合物として市販されているものを用いることも可能である。
【００２５】
以上のようにして得られるアルギン酸オリゴ糖、若しくはその塩、又はアルギン酸オリゴ糖若しくはその塩と金属塩の混合物の活性成分は、そのまま本発明の炎症後色素沈着予防・改善剤の有効成分として用いることができ、さらに通常用いられる方法による除蛋白及び脱塩後、凍結乾燥、噴霧乾燥、熱風乾燥等の方法で乾燥して使用することもできる。本発明で用いられる混合物は、上記のようにして得られたアルギン酸オリゴ糖又はその塩と金属塩の水溶液、その濃縮液、あるいはその乾燥末等のものである。
【００２６】
本発明で用いられるローズマリー（Rosmarinus officinalis L.）はシソ科に属し、地中海諸国に自生する植物である。ダイズ(Glycine max)は豆科に属し、世界各地で農作物として広く栽培されている一年生の植物である。緑藻類は緑色植物門(Chlorophyta)緑藻綱(Chlorophyceae)に属する藻類であるが、中でもヘマトコッカス属に属する緑藻類を用いるのが好ましい。具体的にはヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）、ヘマトコッカス・ラキュストリス（Haematococcus lacustris）、ヘマトコッカス・カペンシス (Haematococcus capensis) 、ヘマトコッカス・ドロエバケンシス (Haematococcus droebakensis) 、ヘマトコッカス・ジンバビエンシス (Haematococcus zimbabwiensis)などが挙げられる。柑橘類とはミカン科に属する植物の総称である。ダイダイ、ウンシュウミカン、グレープフルーツ、レモン等が柑橘類に該当し、ダイダイ（Sitrus Aurantium）は別名トウヒ、ビターオレンジ、オレンジビターなどとも称されることがある。ウンシュウミカン（Citrus unshiu Markovich 又は Citrus reticulata Blanco）の果皮はチンピと称される。
【００２７】
本発明で用いられる植物の使用部位は葉、茎、根、果実、果皮など特に限定されるものではないが、ローズマリーにおいては葉が、ダイズにおいては種子が、柑橘類においては果皮が、特に好ましい。また、緑藻類の使用部位はその形態の特性上、全体とすることができる。
【００２８】
本発明で用いられる抽出物（以下、各抽出物ということがある）は、ローズマリー、ダイズ、緑藻類、柑橘類の粉砕物を、常温または加温下に溶剤により抽出するか、またはソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得られる各種溶媒抽出液、その濃縮液、あるいはその乾燥末等のものである。抽出に用いる溶媒としては、通常の植物の抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができる。たとえば水、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、含水アルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、エチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン等の有機溶媒類等であり、それらは単独あるいは組み合わせて用いることができる。
【００２９】
本発明で用いられるダイズ発酵物は、大豆蛋白原料又は大豆蛋白原料抽出物又は大豆蛋白原料副産物にプロテアーゼ活性及びβ-グルコシダーゼ活性を有する酵素剤を作用させた後、水洗し、水不溶部を回収することにより得られる、イソフラボンアグリコン含有組成物である。大豆蛋白原料としては丸大豆、脱皮大豆、脱脂大豆等が、大豆蛋白原料抽出物としては分離大豆蛋白質、濃縮大豆蛋白質、豆乳、大豆イソフラボン配糖体含有抽出物等が、そして大豆蛋白原料副産物としては大豆モラセス、おから等が利用できる。
【００３０】
本発明の色素沈着予防・改善剤中のアルギン酸オリゴ糖又はその塩、アルギン酸オリゴ糖又はその塩と金属塩の混合物、ローズマリー抽出物、ダイズ抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、又は柑橘類抽出物の配合量は、通常乾燥固形分として、０．０００１〜５０重量％とすることが好ましい。０．０００１重量％未満では本発明の効果が充分に得られない可能性があり、一方、５０重量％を越えても、その増量に見合った効果の向上は認められないからである。この観点から、０．００１〜１０重量％が特に好ましい。
【００３１】
炎症後色素沈着予防・改善剤の形態の例としては、特に限定されず、例えば、乳液、クリーム、ゲル、化粧水、分散剤、パック、メーキャップ化粧料、頭皮・毛髪用品等の化粧品及び医薬部外品や、軟膏剤、クリーム剤、外用液剤等の医薬品などとすることができ、外用組成物の基剤としては、これら外用剤の形態に応じた基剤、例えば、精製水、低級アルコール、多価アルコール、油脂、界面活性剤、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、防腐剤、香料、薬効成分等を用いることができる。
【００３２】
本発明の色素沈着予防・改善剤には、上記各成分に加えて本発明の効果を損なわない範囲内で、通常の医薬品等の皮膚外用剤、医薬部外品や化粧品に用いられる他の成分、たとえば陰イオン界面活性剤（高級脂肪酸アルカリ金属塩、高級脂肪酸アミン塩、アミノ酸系界面活性剤）や非イオン界面活性剤、リン脂質ステロールエステル等の界面活性剤、炭化水素（流動パラフィン、スクワラン、ワセリン等）、油脂（動植物油、トリグリセリド、ワックスエステル、高級アルコール、高級脂肪酸、シリコーン、エステル油、ロウ類等）、潤滑剤（多価アルコール、糖類、アミノ酸、ペプチド類等）、アルコール（エチルアルコール）、皮膜形成剤（ポリビニルアルコール、ペクチン）や水溶性若しくは油溶性高分子、樹脂、紫外線吸収剤、殺菌防腐剤、抗酸化剤、金属封鎖剤、着色剤（天然色素、合成色素）、各種香料の他、各種の植物及び動物抽出物、油溶性若しくは水溶性ビタミン、美白剤としてアスコルビン酸誘導体、アルブチン、エラグ酸、胎盤抽出液、肌荒れ防止剤としてアラントイン、抗炎症剤としてグルチルレチン酸、グリチルリチン酸、アズレン、抗ヒスタミン剤等、抗老化剤としてビタミンＡパルミテート等、収歛剤としてパラフェノールスルフォン酸亜鉛や、クエン酸及びその塩等を含めた有機酸類とその塩等、そして紫外線散乱剤として有機或いは無機系粉体等を、必要に応じて適宜配合若しくは併用することができる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明の実施例について説明する。
【００３４】
（実施例１）
本実施例では、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液を調製した。アルギン酸ナトリウム (１０．０ｋｇ)を９０Ｌの精製水に溶解後、アルギン酸リアーゼ溶液（５００００Ｕ）を加え、４０℃で６時間撹拌しながら反応させた。反応液を、除蛋白、脱塩後、凍結乾燥してアルギン酸ナトリウムオリゴ糖末を４．０ｋｇ得た。得られたアルギン酸ナトリウムオリゴ糖末を精製水に溶解した後、硫酸亜鉛水溶液を添加することにより、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液を得た。この水溶液は、混合直後は、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖水溶液と硫酸亜鉛水溶液との混合溶液であるが、その後に硫酸イオンがアルギン酸ナトリウムオリゴ糖と錯体を形成する。従って厳密には混合溶液ではないので、以下には単に「アルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液」として説明する。
【００３５】
（実施例２）
本実施例では、アルギン酸オリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液を調製した。アルギン酸(１０．０ｋｇ)を９０Ｌの精製水に溶解後、アルギン酸リアーゼ溶液（５００００Ｕ）を加え、４０℃で６時間撹拌しながら反応させた。反応液を、除蛋白、脱塩後、凍結乾燥してアルギン酸オリゴ糖末を２．０ｋｇ得た。得られたアルギン酸オリゴ糖末を精製水に溶解した後、硫酸亜鉛水溶液を添加することにより、アルギン酸オリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液を得た。この水溶液も、上記実施例１と同様に硫酸イオンがアルギン酸オリゴ糖と錯体を形成し、厳密には混合溶液ではないので、以下には単に「アルギン酸オリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液」として説明する。
【００３６】
（実施例３）
本実施例では、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の水溶液を調製した。アルギン酸ナトリウム (１０．０ｋｇ)を９０Ｌの精製水に溶解後、アルギン酸リアーゼ溶液（５００００Ｕ）を加え、４０℃で６時間撹拌しながら反応させた。反応液を、除蛋白、脱塩後、凍結乾燥してアルギン酸ナトリウムオリゴ糖末を４．０ｋｇ得た。得られたアルギン酸ナトリウムオリゴ糖末を精製水に溶解してアルギン酸ナトリウムオリゴ糖の水溶液を得た。
【００３７】
（実施例４）
本実施例では、アルギン酸オリゴ糖の水溶液を調製した。アルギン酸 (１０．０ｋｇ)を９０Ｌの精製水に溶解後、アルギン酸リアーゼ溶液（５００００Ｕ）を加え、４０℃で６時間撹拌しながら反応させた。反応液を、除蛋白、脱塩後、凍結乾燥してアルギン酸オリゴ糖末を２．０ｋｇ得た。得られたアルギン酸オリゴ糖末を精製水に溶解してアルギン酸オリゴ糖の水溶液を得た。
【００３８】
（実施例５）
本実施例では、ローズマリー抽出物を調製した。ローズマリー（Rosmarinus officinalis L.）の葉２００ｇを粉砕後、２Ｌの５０％エタノールに浸漬し、６０℃〜８０℃で３日間抽出し、抽出液から溶媒を除去し、７．５ｇの抽出物を得た。
【００３９】
（実施例６）
本実施例では、ダイズ発酵物を調製した。市販の分離大豆蛋白質２００ｇに６Ｌの精製水を加えて沸騰水中１０分間加熱処理を行い、冷却後４５℃に加温しながら、２００ｇのプロテア-ゼ活性及びβ-グルコシダ-ゼ活性を有する酵素剤と５００ｍｌのエタノールを添加し、ｐＨ５で一晩（１６時間）撹拌しながら反応した。この液をｐＨ４に調製し、遠心処理をして不溶物を回収した。もう一度、水洗後、凍結乾燥機にて乾燥し、処理物６０ｇを得た。
【００４０】
（実施例７）
本実施例では、緑藻類抽出物を調製した。ヘマトコッカス藻体破砕物２００ｇを２Ｌの精製水に浸漬し、常温で１０日間抽出後、抽出液から溶媒を除去し、３．０ｇの抽出物を得た。
【００４１】
（実施例８）
本実施例では、トウヒ抽出物を調製した。ダイダイ（Citrus aurantium）の皮２００ｇを粉砕後、２Ｌの５０％エタノールに浸漬し、６０℃〜８０℃で３日間抽出し、抽出液から溶媒を除去し、１０ｇの抽出物を得た。
【００４２】
（実施例９）
本実施例では、チンピ抽出物を調製した。ウンシュウミカン（Citrus unshiu Markovich）の皮２００ｇを粉砕後、２Ｌの５０％エタノールに浸漬し、６０℃〜８０℃で３日間抽出し、抽出液から溶媒を除去し、１１ｇの抽出物を得た。
【００４３】
（試験例１）
上記実施例１乃至９のＭＭＰ−９及びＥＴ−１の産生抑制剤について、ＥＴ−１の産生抑制効果について試験した。
正常ヒト表皮角化細胞 (Cryo NHEK-Neo、クラボウ製)を５．０×１０4ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌになるように、２４ｗｅｌｌマイクロプレートに移し、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（クラボウ製）で４８時間培養した。さらに培養した細胞を１％非必須アミノ酸、１％ペニシリン／ストレプトマイシン混液、５μＭヒスタミン、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを含むＤＭＥＭ培地（以下、刺激培地とする）に適量のアルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液（実施例１）を加えて２４時間培養した。培養終了後、培養上清を回収した。
【００４４】
上記で得られた培養上清中のＥＴ−１を、酵素免疫測定法を用いたサンドイッチ法（Human Endothelin-1 Parameter ELISA Kit、Ｒ＆Ｄ社製）により定量した。マイクロプレート、抗体、試薬等は全てキット付属のものを用いた。すなわち、まずヒトＥＴ−１に対するラットＥＴ−１抗体を固着した９６ｗｅｌｌマイクロプレートに、抗ＥＴ−１ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗体液を添加し、さらに試料（上記培養上清）又はヒトＥＴ−１標準液を添加した後、室温で１時間反応させた。リン酸緩衝溶液でプレートを洗浄後、基質（テトラメチルベンチジン溶液）を添加した。室温で３０分間反応させた後、反応停止液（塩酸水溶液）を添加して反応を停止させた。次いでプレートリーダー（POWERSCAN HT、大日本製薬製）を用いて、４５０及び６２０ｎｍにおける吸光度を測定した。４５０ｎｍにおける吸光度から６２０ｎｍにおける吸光度を差し引いたものを測定値とした。
【００４５】
アルギン酸オリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液（実施例２）、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の水溶液（実施例３）、アルギン酸オリゴ糖の水溶液（実施例４）、ローズマリー抽出物（実施例５）、ダイズ発酵物（実施例６）、緑藻類抽出物（実施例７）、トウヒ抽出物（実施例８）、及びチンピ抽出物（実施例９）についても、同様に上記刺激培地に加えて２４時間培養した後、培養上清を回収し、Human Endothelin-1 Parameter ELISA Kit (Ｒ＆Ｄ社製)を用いてＥＴ−１量を測定した。また、これら実施例１乃至９のＭＭＰ−９及びＥＴ−１の産生抑制剤（以下、単に産生抑制剤ともいう）を含まない刺激培地で培養したケラチノサイト（ヒト表皮角化細胞）から産生されたＥＴ−１量も同様に測定した。さらに５μＭヒスタミン、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを含まない無刺激の培地で培養したケラチノサイトから産生されたＥＴ−１量も同様に測定した。
【００４６】
実施例１乃至９の産生抑制剤のＥＴ−１産生抑制効果は、これらの産生抑制剤を含まない刺激培地で培養した場合のＥＴ−１量を１００とした場合の値（比率）で示した。その結果を表１〜９に示す。表１〜９においてＥＴ−１量／ｃｅｌｌ（重量％）とは、単位細胞当たりのＥＴ−１量を意味する。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
【表２】
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【００４９】
【表３】
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【００５０】
【表４】
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【００５１】
【表５】
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【００５２】
【表６】
2007204449.tif 000007
【００５３】
【表７】
2007204449.tif 000008
【００５４】
【表８】
2007204449.tif 000009
【００５５】
【表９】
2007204449.tif 000010
【００５６】
表１〜９からも明らかなように、実施例１乃至９の産生抑制剤を含む刺激培地で培養したケラチノサイトから産生されたＥＴ−１量は、これらの産生抑制剤を含まない刺激培地で培養したケラチノサイトから産生されたＥＴ−１量よりも減少していた。このことからアルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液、アルギン酸オリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の水溶液、アルギン酸オリゴ糖の水溶液、ローズマリー抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、柑橘類抽出物はケラチノサイトによるＥＴ−１産生を抑制するものと認められた。
【００５７】
また、実施例１〜７、９の産生抑制剤の濃度が高くなる程、産生されるＥＴ−１量が減少し、これら実施例１〜７、９の産生抑制剤の濃度を高くすることで、ＥＴ−１の産生抑制効果が高まることが分かった。特に、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液の場合には０．１２５容量％以上とすることで、無刺激の場合と同等若しくはそれ以上にＥＴ−１量を減少させることができ、ローズマリー抽出液の場合には０．５０容量％、緑藻類抽出物の場合には０．１２５容量％以上とすることで、無刺激の場合と同等若しくはそれ以上にＥＴ−１量を減少させることができた。
一方、実施例８の産生抑制剤（トウヒ抽出物）の場合には、逆に産生抑制剤の濃度を高くすることで低下したが、その理由は定かではない。しかしながら、実施例８の産生抑制剤を含まない刺激培地で培養したケラチノサイトから産生されたＥＴ−１量よりも明らかに減少していた。従ってトウヒ抽出物にも、ケラチノサイトによるＥＴ−１産生を抑制する効果があることは明らかである。
【００５８】
（試験例２）
上記実施例１乃至９の産生抑制剤について、ＭＭＰ−９の産生抑制効果について試験した。
正常ヒト表皮角化細胞 (Cryo NHEK-Neo、クラボウ製)を５．０×１０4ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌになるように、２４ｗｅｌｌマイクロプレートに移し、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（クラボウ製）で４８時間培養した。さらに培養した細胞を上記刺激培地に適量のアルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液（実施例１）を加えて２４時間培養した。培養終了後、培養上清を回収した。
【００５９】
上記で得られた培養上清中のＭＭＰ−９量をゼラチンザイモグラフィー法により測定した。すなわち、０．１重量％ゼラチンを含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（７．５％Ｔ）を作製し、全レーンにヒト細胞由来のＭＭＰ−９標準溶液又は試料（上記培養上清を、Laemmli Sample Buffer（バイオ・ラッド社製）で２倍希釈したもの）を一定量アプライし、電気泳動を行った。泳動後のゲルを２．５重量％「TritonＸ−100」で洗浄し、十分にＳＤＳを除いた。そのゲルを、インキュベーション用緩衝液（０．０１ｍＭＣａＣｌ2を含むｐＨ７．６の５０ｍＭトリス）に浸して、３７℃で一晩インキュベートした。
【００６０】
インキュベーション後のゲルを、前固定液（２０％メタノール、７．５％酢酸の水溶液）で処理した後、クーマシー・ブリリアント・ブルー染色し、脱色後に現れるバンドの太さをレーン・スポットアナライザー（アトー社製）で定量化した。
【００６１】
アルギン酸オリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液（実施例２）、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の水溶液（実施例３）、アルギン酸オリゴ糖の水溶液（実施例４）、ローズマリー抽出物（実施例５）、ダイズ発酵物（実施例６）、緑藻類抽出物（実施例７）、トウヒ抽出物（実施例８）、及びチンピ抽出物（実施例９）についても、同様に上記刺激培地に加えて２４時間培養した後、培養上清を回収し、ゼラチンザイモグラフィー法を用いてＭＭＰ−９量を測定した。また、これら実施例１乃至９のＭＭＰ−９及びＥＴ−１の産生抑制剤を含まない刺激培地で培養したケラチノサイトから産生されたＭＭＰ−９量も同様に測定した。さらに５μＭヒスタミン、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを含まない無刺激の培地で培養したケラチノサイトから産生されたＭＭＰ−９量も同様に測定した。
【００６２】
実施例１乃至９の産生抑制剤のＭＭＰ−９産生抑制効果は、これらの産生抑制剤を含まない刺激培地で培養した場合のＭＭＰ−９量を１００とした場合の値（比率）で示した。この結果を表１０〜１８に示す。表１０〜１８においてＭＭＰ−９量／ｃｅｌｌ（重量％）とは、単位細胞数当たりのＭＭＰ−９量を意味する。
【００６３】
【表１０】
2007204449.tif 000011
【００６４】
【表１１】
2007204449.tif 000012
【００６５】
【表１２】
2007204449.tif 000013
【００６６】
【表１３】
2007204449.tif 000014
【００６７】
【表１４】
2007204449.tif 000015
【００６８】
【表１５】
2007204449.tif 000016
【００６９】
【表１６】
2007204449.tif 000017
【００７０】
【表１７】
2007204449.tif 000018
【００７１】
【表１８】
2007204449.tif 000019
【００７２】
表１０〜１８からも明らかなように、実施例１乃至９の産生抑制剤を含む刺激培地で培養したケラチノサイトから産生されたＭＭＰ−９量は、これらの産生抑制剤を含まない刺激培地で培養したケラチノサイトから産生されたＭＭＰ−９量よりも減少していた。このことからアルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液、アルギン酸オリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の水溶液、アルギン酸オリゴ糖の水溶液、ローズマリー抽出物、ダイズ発酵物、緑藻類抽出物、柑橘類抽出物はケラチノサイトによるＭＭＰ−９産生をも抑制するものと認められた。
【００７３】
また、実施例１〜９の産生抑制剤の濃度が高くなる程、産生されるＭＭＰ−９量が減少し、これら実施例１〜９の産生抑制剤の濃度を高くすることで、ＭＭＰ−９の産生抑制効果が高まることが分かった。特に、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液の場合には０．１２５容量％以上、ローズマリー抽出液の場合には０．５０容量％、ダイズ発酵物の場合には１００μｇ／ｍｌ、緑藻類抽出物の場合には０．１２５容量％、チンピ抽出物の場合には０．５０容量％以上とすることで、無刺激の場合と同等若しくはそれ以上にＭＭＰ−９量を減少させることができた。
【００７４】
（処方例１）
本処方例は、クリームの処方例であり、その組成は次のとおりである。
【００７５】
配合成分                                          配合量（重量％）
アルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液          ３．０
マイクロクリスタリンワックス                                   ０．５
流動パラフィン                                                 ２．０
ミリスチン酸オクチルドデシル                                   ２．０
オリーブ油                                                     ５．０
親油型モノステアリン酸グリセリン                        ３．５
モノステアリン酸ポリオキシエチレン                      ０．５
モノステアリン酸ソルビタン                              １．５
メチルポリシロキサン                                    ０．４
セタノール                                                     ２．５
１，３−ブチレングリコール                              ５．０
グリセリン                                                     ８．０
香料                                                           適量
防腐剤                                                         適量
精製水                                                         残量
【００７６】
（処方例２）
本処方例は、ジェルの処方例であり、その組成は次のとおりである。
【００７７】
配合成分                                          配合量（重量％）
アルギン酸ナトリウムオリゴ糖の水溶液                           ３．０
酢酸トコフェロール                                             ０．１
１，３−ブチレングリコール                              ６．０
グリセリン                                                     ２．０
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体                ０．２
クエン酸                                                       ０．０１
クエン酸ナトリウム                                             ０．０３
水酸化ナトリウム                                               ０．０８
香料                                                           適量
防腐剤                                                         適量
精製水                                                         残量
【００７８】
（処方例３）
本処方例は、ジェルの処方例であり、その組成は次のとおりである。
【００７９】
配合成分                                          配合量（重量％）
アルギン酸オリゴ糖の水溶液                              ３．０
酢酸トコフェロール                                             ０．１
１，３−ブチレングリコール                              ６．０
グリセリン                                                     ２．０
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体                ０．２
クエン酸                                                       ０．０１
クエン酸ナトリウム                                             ０．０３
水酸化ナトリウム                                               ０．０８
香料                                                           適量
防腐剤                                                         適量
精製水                                                         残量
【００８０】
（処方例４）
本処方例は、エッセンスの処方例であり、その組成は次のとおりである。
【００８１】
配合成分                                          配合量（重量％）
アルギン酸オリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液                           ３．０
１，３−ブチレングリコール                              ５．０
グリセリン                                                     ４．０
ヒアルロン酸ナトリウム                                         ０．１
エタノール                                                     ３．０
クエン酸                                                       ０．１
クエン酸ナトリウム                                             ０．１
香料                                                           適量
防腐剤                                                         適量
精製水                                                         残量
【００８２】
（処方例５）
本処方例は、乳液の処方例であり、その組成は次のとおりである。
【００８３】
配合成分                                          配合量（重量％）
アルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液          ３．０
サフラワー油                                                   ３．０
オリーブ油                                                     ３．０
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン                   １．０
モノステアリン酸ソルビタン                              ０．５
ステアリルアルコール                                    ０．４
セタノール                                                     ０．６
１，３−ブチレングリコール                              ３．０
グリセリン                                                     ５．０
ヒアルロン酸ナトリウム                                         ０．５
クエン酸                                                       ０．１
クエン酸ナトリウム                                             ０．５
香料                                                           適量
防腐剤                                                         適量
精製水                                                         残量
【００８４】
（処方例６）
本処方例は、エッセンスの処方例であり、その組成は次のとおりである。
【００８５】
配合成分                                          配合量（重量％）
アルギン酸ナトリウムオリゴ糖と硫酸亜鉛の水溶液          ２．５
１，３−ブチレングリコール                              ５．０
グリセリン                                                     ４．０
ヒアルロン酸ナトリウム                                         ０．１
エタノール                                                     ３．０
クエン酸                                                       ０．１
クエン酸ナトリウム                                             ０．１
香料                                                           適量
防腐剤                                                         適量
精製水                                                         残量
【００８６】
（処方例７）
本処方例は、クリームの処方例であり、その組成は次のとおりである。
【００８７】
配合成分                                          配合量（重量％）
ダイズ発酵物                                                   ２．０
マイクロクリスタリンワックス                                   ０．５
流動パラフィン                                                 ２．０
ミリスチン酸オクチルドデシル                                   ２．０
オリーブ油                                                     ５．０
親油型モノステアリン酸グリセリン                        ３．５
モノステアリン酸ポリオキシエチレン                      ０．５
モノステアリン酸ソルビタン                              １．５
メチルポリシロキサン                                    ０．４
セタノール                                                     ２．５
１，３−ブチレングリコール                              ５．０
グリセリン                                                     ８．０
香料                                                           適量
防腐剤                                                         適量
精製水                                                         残量
【００８８】
（処方例８）
本処方例は、乳液の処方例であり、その組成は次のとおりである。
【００８９】
配合成分                                          配合量（重量％）
ローズマリー抽出物                                             ３．０
サフラワー油                                                   ３．０
オリーブ油                                                     ３．０
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン                   １．０
モノステアリン酸ソルビタン                              ０．５
ステアリルアルコール                                    ０．４
セタノール                                                     ０．６
１，３−ブチレングリコール                              ３．０
グリセリン                                                     ５．０
ヒアルロン酸ナトリウム                                         ０．５
クエン酸                                                       ０．１
クエン酸ナトリウム                                             ０．５
香料                                                           適量
防腐剤                                                         適量
精製水                                                         残量
【００９０】
（処方例９）
本処方例は、エッセンスの処方例であり、その組成は次のとおりである。
【００９１】
配合成分                                          配合量（重量％）
緑藻抽出物                                                     ３．０
１，３−ブチレングリコール                              ５．０
グリセリン                                                     ４．０
ヒアルロン酸ナトリウム                                         ０．１
エタノール                                                     ３．０
クエン酸                                                       ０．１
クエン酸ナトリウム                                             ０．１
香料                                                           適量
防腐剤                                                         適量
精製水                                                         残量
【００９２】
（処方例１０）
本処方例は、クリームの処方例であり、その組成は次のとおりである。
【００９３】
トウヒ抽出物                                                   １．５
チンピ抽出物                                                   １．５
マイクロクリスタリンワックス                                   ０．５
流動パラフィン                                                 ２．０
ミリスチン酸オクチルドデシル                                   ２．０
オリーブ油                                                     ５．０
親油型モノステアリン酸グリセリン                        ３．５
モノステアリン酸ポリオキシエチレン                      ０．５
モノステアリン酸ソルビタン                              １．５
メチルポリシロキサン                                    ０．４
セタノール                                                     ２．５
１，３−ブチレングリコール                              ５．０
グリセリン                                                     ８．０
香料                                                           適量
防腐剤                                                         適量
精製水                                                         残量