(57)【要約】【課題】  miRNAとそれらのターゲットとなる１つまたは複数のターゲット遺伝子（ターゲットmRNA）を同定または予測すること。【解決手段】  miRNAとそれらのターゲットとなる１つまたは複数のターゲットmRNAを予測又は同定する方法として、対象となる全mRNAにおける全ての部分配列がmiRNAと取り得る二本鎖RNAの最も安定な二次構造とその二次構造エネルギーを計算することにより、miRNAがmRNAとの結合において安定構造を取り得る全ての部分配列を探索し、次いで、対象部分配列または対象部分配列の周辺領域が、該当mRNAの部分配列と形成可能な最も安定な二次構造とその二次構造エネルギーを計算することにより、該当mRNAの対象部分配列がmiRNAと相互作用可能な構造であるかどうかを判定する。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子発現制御機能を持つ１６〜２５塩基長のmiRNA分子により発現が制御されるターゲットmRNAを予測又は同定する方法であって、
（１）ターゲットmRNA候補中の部分配列とmiRNA配列との二次構造エネルギーを順次計算し、miRNAと安定な結合が可能な部分配列を探索し、安定な結合が可能な部分配列が存在するターゲットmRNA候補とmiRNAの組を選択する第１ステップ、及び
（２）第１ステップにおいて選択されたターゲットmRNA候補とmiRNAの組において、ターゲットmRNA候補中でmiRNAが安定に結合可能な前記部分配列又はその近傍の部分配列がmRNA内部において取り得る最も安定な二次構造エネルギーを計算し、これを、ターゲットmRNA候補中の前記安定な結合が可能な部分配列とmiRNA配列との二次構造エネルギーと比較し、前記mRNA内部において前記部分配列又はその近傍の部分配列が取り得る最も安定な二次構造エネルギーが相対的に高い前記部分配列又は近傍の部分配列が存在するmRNAとmiRNAの組を選択する第２ステップを含み、
以上のステップにより選択された組のmRNAが当該組のmiRNA分子により発現が制御されるターゲットmRNAであると予測又は同定する方法。
【請求項２】
遺伝子発現制御機能を持つ１６〜２５塩基長のmiRNA分子により発現が制御されるターゲットmRNAを予測又は同定する方法であって、
（１）ある生物種について、ターゲットmRNA候補中の部分配列とmiRNA配列との二次構造エネルギーを順次計算し、miRNAと安定な結合が可能な部分配列を探索し、安定な結合が可能な部分配列が存在するターゲットmRNA候補とmiRNAの組を選択する第１ステップ、及び
（２）第１ステップにおいて選択されたターゲットmRNA候補とmiRNAの組において、ターゲットmRNA候補中でmiRNAが安定に結合可能な前記部分配列又はその近傍の部分配列がmRNA内部において取り得る最も安定な二次構造エネルギーを計算し、これを、ターゲットmRNA候補中の前記安定な結合が可能な部分配列とmiRNA配列との二次構造エネルギーと比較し、前記mRNA内部において前記部分配列又はその近傍の部分配列が取り得る最も安定な二次構造エネルギーが相対的に高い前記部分配列又は近傍の部分配列が存在するmRNAとmiRNAの組を選択する第２ステップ、
並びに
（３）異なる生物種を対象として第１ステップおよび第２ステップを実施し、miRNAとmRNA配列の部分構造が形成する結合環境が生物種間で保存されているmiRNAとmRNAの組を選択するステップとを含み、
以上のステップにより選択された組のmRNAが当該組のmiRNA分子により発現が制御されるターゲットmRNAであると予測又は同定する方法。
【請求項３】
前記第１ステップにおいて、mRNAの部分配列長を、miRNAの塩基長よりも３〜８塩基長くする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
部分配列をターゲットmRNA候補の３’末端から順次、１塩基ずつずらして探索する請求項３記載の方法。
【請求項５】
第１ステップにおいて、部分配列をターゲットmRNA候補の ３’-UTR領域から探索する、請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記第１ステップにおいて、結合エネルギーの計算に、Watson-Click塩基対、G-U揺らぎ塩基対、バルジループ、インターナルループのみを考慮することにより高速化した、RNA二次構造予測の手法を用いる請求項１〜５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記第２ステップにおいて、mRNA内部において取り得る最も安定な二次構造エネルギーを計算する近傍の部分配列を、（１）のステップにおいて選択された部分配列から０〜２０塩基の範囲でずらした位置とする手法を用いる請求項１〜６いずれか１項記載の方法。
【請求項８】
miRNA分子を細胞に導入し、ターゲットmRNAの発現に対する影響を確認するステップを更に含む、請求項１〜７いずれか１項記載のmiRNA分子により発現が制御されるターゲットmRNAを予測又は同定する方法。
【請求項９】
複数のターゲットmRNA候補又はその相補鎖を表面に配置した核酸チップを用いて、ターゲットmRNA候補又は対応するcDNAを検出することにより、ターゲットmRNA候補の発現の影響を調べることを更に含む、請求項１〜８いずれか１項記載のmiRNA分子により発現が制御されるターゲットmRNAを予測又は同定する方法。
【請求項１０】
miRNAが、配列番号１−２３８のいずれか１つの配列番号で表されるmiRNAである、請求項１〜９いずれか１項記載のmiRNA分子により制御されるターゲットmRNAの予測又は同定方法。
【請求項１１】
以下に示されるＸｎの遺伝子の発現を制御するため、それぞれ、Ｙｎで表される核酸を有効成分として含むＸｎ遺伝子発現制御剤（但しｎ＝１、２、３又は４）。
Ｘ１：Interleukin13（NM_002188）
Ｘ２：Cofilin 2 variant 1（NM_021914）
Ｘ３：Platelet-derived growth factor receptor, alpha polypeptide (NM_006206)
Ｘ４：Glia maturation factor, beta (NM_004124)
Ｙ１：(1) UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
Ｙ２：(2) UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUA
Ｙ３：(3) UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUA
Ｙ４：(3) UGUAAACAUCCUCGACUGGAAGC
【請求項１２】
請求項１１記載のＸｎ遺伝子発現制御剤を有効成分として含む医薬。（但し、ｎ=１，２，３又は４で、Ｘ１は、Interleukin13（NM_002188）、Ｘ２は、Cofilin 2 variant 1（NM_021914）、Ｘ３は、Platelet-derived growth factor receptor, alpha polypeptide (NM_006206) 、Ｘ４は、Glia maturation factor, beta (NM_004124)を表す。）
【請求項１３】
miRNA分子を用いて、請求項１〜１０いずれか１項記載の方法で発現が制御されると予測又は同定されたターゲットmRNAの発現を制御する方法。
【請求項１４】
miRNA分子を用いて、請求の範囲１〜１０いずれか１項記載の方法で予測又は同定されたターゲット遺伝子(ターゲットmRNA)の発現を制御することにより、（ヒト以外の）生体機能を制御する方法。
【請求項１５】
疾病の処置の開発のために、（ヒト以外の）生体機能を制御する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
疾病の処置のために（ヒト以外の）生体機能を制御する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子制御の分野に関連する。より詳細には、本発明は、核酸分子を用いて遺伝子発現制御を行うための方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
２００１年１０月に、ほぼ同時に３つのグループが、ショウジョウバエ、線虫、ヒトで、合わせて約１００種類の２１―２２塩基の小さなRNAファミリーが存在することを報告した（非特許文献１，２，３）。それらの小さいRNAは、生物の発生において特定のmRNAに作用して、タンパク質合成を阻害することが発見され、MicroRNA（miRNA）と命名された。miRNAの構造上の特徴は、前駆体である数十〜数百塩基よりなるRNAが、2本鎖RNA (dsRNA: double strand RNA)領域を含むステムループ構造（shRNA: short hairpin RNA）を取り、また、二本鎖RNA領域において塩基対のミスマッチを含むバルジ構造を持つことにある。前駆体状態で核外に運ばれたmiRNAが、Dicerによって一本鎖の成熟構造にプロセシングされ、特定のmRNAの主に3’-UTRに選択的に相互作用して、タンパク質翻訳を阻害するものと考えられている（非特許文献４）。
【０００３】
現在、miRNAは、ヒトを含む多くの生物種においてそれぞれ2〜300種類が報告され、また、幅広い生物種間で保存されていることが報告され、データベース化されている（非特許文献５）。一部の種類のmiRNAにおいては、5’側の塩基配列に共通の塩基配列構造が存在することが知られており（非特許文献６）、その配列に相補的な塩基配列をターゲットとして、作用対象であるmRNAを探索する試みが報告されている（非特許文献７）。
【０００４】
【非特許文献１】Lagos-Quintana et al. 2001 Science 294, 853-868
【非特許文献２】Lau et al. 2001 Science 294, 858-862
【非特許文献３】Lee et al. 2001 Science 294, 862-864
【非特許文献４】Hutvagner and Zamore 2002 Curr. Opin. Gen. Dev. 12:225-232
【非特許文献５】Griffiths-Jones S. 2004 NAR 32, D109-D111
【非特許文献６】Eric C.Lai 2002 Nature Genetics 30, 363-364
【非特許文献７】Lewis et al 2003 Cell 115, 787-798
【非特許文献８】Reinhart et al. 2000 Nature 403, 901-906
【非特許文献９】Zuker et al 1981 Nucl Acid Res 9: 133-148
【非特許文献１０】「RNAi実験プロトコール」実験医学別冊  p.95-110 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
miRNAと同様に短鎖のRNAとして注目されている、RNAi、及び、PTGSの生体における本来の役割は、生態防御システムとして機能し、細菌感染によって混入してくる外来RNAを破壊することが主であると考えられている。すなわち、この仕組みを用いた遺伝子発現制御は、主に人工的な制御点を対象とすることになり、非ターゲットmRNAとの相互作用等、予期せぬ副作用を伴う可能性がある。
【０００６】
一方、miRNAは生体内において、対象となる自らのmRNAと相互作用することにより遺伝子の発現を制御していると考えられている。miRNAによるmRNAの発現制御は自然界に存在する遺伝子制御の仕組みであり、１種類のmiRNAは複数種類のmRNAを制御し、また、１種類のmRNAも複数種類のmiRNAによって制御されることがあると考えられている。そこで、miRNAとそれらのターゲットとなる１つまたは複数のターゲット遺伝子（ターゲットmRNA）を同定または予測することできれば、miRNAによって、ターゲットmRNAを対象として、生体における遺伝子発現を意図的に操作することが可能となる。
【０００７】
さらに、miRNA分子、及び、ターゲットmRNAの情報を基に実験的手法を適用することにより、生体における対象遺伝子の役割の解明や、疾病のための処置手法の開発、また、疾病のための処置そのものが可能となる。
【０００８】
幾つかの研究プロジェクトにおいて、miRNAのターゲットmRNAを探索する試みが行われているが、その手法は、塩基配列パターンを元にmRNA上の候補部位を予測し、該当候補部位のRNA分子とmiRNAの最適二次構造とその二次構造エネルギーを計算し、その妥当性を検討するものであった。しかしながら、既知のmiRNAがターゲットとするmRNAとの間の塩基配列の相補パターンは曖昧であることが知られており、大量のmRNAの持つ類似の塩基配列パターンによって、膨大な数のターゲット候補を生じてしまう欠点があった。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明においては、miRNAとそれらのターゲットとなる１つまたは複数のターゲットmRNAを予測又は同定する方法として、対象となる全mRNAにおける全ての部分配列がmiRNAと取り得る二本鎖RNAの最も安定な二次構造とその二次構造エネルギーを計算することにより、miRNAがmRNAとの結合において安定構造を取り得る全ての部分配列を探索し、次いで、対象部分配列または対象部分配列の周辺領域が、該当mRNAの部分配列と形成可能な最も安定な二次構造とその二次構造エネルギーを計算することにより、該当mRNAの対象部分配列がmiRNAと相互作用可能な構造であるかどうかを判定する。さらに、その様なmiRNAとmRNAの部分配列との関係が、異なる生物種間（例えばヒト−マウス間）で保存されていることを確認することにより、信頼性の高いmiRNAとターゲットmRNAの組み合わせを得る。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、遺伝子発現を制御することができる機能性RNA分子であるmiRNAに対して、当該miRNA分子がターゲットとして制御する、タンパク質をコードする遺伝子（ターゲットmRNA）を予測又は同定する方法を提供する。
【００１１】
本発明によって予測したターゲットmRNAは、miRNAによって遺伝子発現の制御（タンパク質翻訳の制御）をすることができる。
【００１２】
本発明によって、ターゲット遺伝子の発現を制御するための、miRNAを有効成分として含む発現制御剤、並びに該発現制御剤を含有する医薬を提供することが可能となる。
【００１３】
また、本発明は、予測したターゲットmRNAがコードするタンパク質に関連した疾病のための処置の開発、及び、予測したターゲットmRNAがコードするタンパク質に関連した疾病のための処置に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明における機能性RNA分子としては、１６から２５塩基長のRNA分子であって、遺伝子発現制御活性を持つものが含まれる。具体的にはmiRNAが含まれる。
【００１５】
本発明が対象とするmiRNA分子は、ヒト、マウス、ラット、鶏、ゼブラフィッシュ、線虫、ショウジョウバエ等、いずれの動物においても、天然に存在するものを対象とできる。また、特定の生物を対象として、人工的に設計したmiRNA分子も対象とできる。
【００１６】
［miRNAが制御する対象遺伝子の同定］
本発明のmiRNAが制御する遺伝子（ターゲットmRNA）の予測又は同定方法は、次の第１ステップ、第２ステップ、及び、第３ステップを含んでいる。
【００１７】
第１ステップは、miRNAとターゲットmRNA候補の組において、mRNAの部分配列におけるmiRNA配列との構造エネルギーを計算し、安定な結合が可能な部分配列を探索し、そうした部分配列が存在するmRNAとmiRNAの組を選択するステップである。
【００１８】
第２ステップは、第１ステップにおいて選択されたmRNAとmiRNAの組において、miRNAが安定に結合可能なmRNAの部分配列またはその周辺配列が、mRNA内部において取り得る最も安定な二次構造エネルギーを計算し、mRNA内部において安定な構造を取り得ない部分構造を探索し、そうした部分配列が存在するmRNAとmiRNAの組を選択するステップである。
【００１９】
なお、１種類のmiRNAは複数種類のmRNAを制御し、また、１種類のmRNAも複数種類のmiRNAによって制御されることがあると考えられているので、第1及び第2ステップは、それぞれ、条件を満たすmRNAとmiRNAの組すべてを見出すまで、部分配列を探索し、ターゲットmRNA候補を変えて繰り返して行うことができる。
【００２０】
第３ステップは、異なる生物種を対象として第１ステップおよび第２ステップを実施し、生物種間で塩基配列構造が保存されたmiRNAに対して、同じく生物種間で塩基配列構造が保存されたmRNAが、それぞれの生物種においてターゲットmRNAとして選択されるもの、即ち、miRNAとmRNA配列の部分構造が形成する結合環境が生物種間で保存されている組を選択するステップである。
【００２１】
第１ステップにおける構造エネルギーの計算には、ＲＮＡ二次構造計算アルゴリズムを用いることが望ましい。これは、miRNAのmRNAとの結合において形成される塩基配列ペアが完全一致ではなく、ギャップを含むあいまいな結合であることが知られているためであり、単なる相補塩基配列のエネルギー計算では求める構造エネルギーが得られないためである。同じ理由により、計算対象であるmRNAの部分配列は、miRNA長と同じではなく、3〜8塩基程度長い領域であることが望ましい。例えば、この部分配列は、mRNAの末端、好ましくは3'末端から、miRNAの長さに3〜8塩基を加えた長さの部分断片を、順次計算対象として選択することができる。また、必要に応じ、他の予測方法により、探索されたターゲットmRNA候補 又はターゲットmRNA候補中の部分配列をステップ1における計算対象として選択することもできる。ＲＮＡ二次構造計算アルゴリズムにおいては、一般的なＲＮＡ二次構造計算アルゴリズムを用いることができるが、例えば、非特許文献９記載のもの、又は非特許文献９をベースに開発された各種プログラムやプログラムライブラリ（例：Vienna RNA package : http://www.tbi.univie.ac.at/~ivo/RNA/）により容易に実現可能である。更に、計算対象を短いＲＮＡの二本鎖が形成可能な二次構造に限定することにより、計算を高速化することが効果的である。即ち、ヘアピンループ、テトラループ、トリループ、マルチブランチループ等は、例え形成可能である場合でも、探索対象であるmiRNAとmRNA間の二本鎖での安定構造を満たすことはないため、計算アルゴリズムより除去することが可能である。例えば、結合エネルギーの計算に、Watson-Click塩基対、G-U揺らぎ塩基対、バルジループ、インターナルループのみを考慮することにより高速化した計算をすればよい。
【００２２】
なお、mRNAの部分配列におけるmiRNA配列との二次構造エネルギーを計算し、探索により見出されるべき安定な結合が可能な部分配列とは、いかなる条件か当業者に明らかであるが、例えば、上記Vienna RNA packageのパラメーターを用いた場合には、-18.0Kcal〜-22.0Kcal又はそれ以下であり、また、７塩基のポリC及び７塩基のポリGの間で形成されるWatson-Click構造（２本鎖相補構造）の二次構造エネルギーよりも低い値を包含している。
【００２３】
本発明において用いるmiRNAの配列は、各種データベースに既に収集されている任意のmiRNAの配列を用いることができる。また、あるmiRNAが制御の標的とする遺伝子mRNAの候補は、既に、mRNAに対応するcDNAについて、 多数の遺伝子の配列（cDNA）がデータベースに保存されていることから、ＤＤＢＪ、ＥＢＩ、ＮＣＢＩ等任意のデータベースに保存されているcDNA配列を用いることができる。特に好適には、NCBI（米国National Center for Biotechnology Information、以下NCBIと略すことあり）の構築しているcDNA配列データベースであるRefSeqに保存されているcDNA配列を利用することができる。
【００２４】
第１ステップにおけるmiRNAのターゲットmRNA候補検索においては、ターゲットmRNA上の相互作用部位の探索範囲を3’-UTR領域に絞ることで、計算時間を短縮することが可能である。これは、翻訳開始シグナル等のシスエレメントを含む5'UTR、及び、翻訳制御のための機能性配列をコードする余地が少ないと考えられるからである。具体的には、収集したcDNA配列から、3’-UTRをもつcDNAを抽出する。そして、抽出されたcDNAについて、それぞれ、3’-UTRの開始位置からcDNAの末尾までを探索対象の配列とすることができる。
【００２５】
第２ステップにおいてmRNA内部で安定構造を取らない部分配列を探索する理由は、mRNA内部で安定な二次構造を形成できない部分配列においては、miRNAが作用しやすいことを前提としている。これは、既知のmiRNAとmRNAのペアであるLet-7とLin-41の組における発見に基づく発明である。Let-7がLin-41に作用して、翻訳を阻害することは、最も早く報告されたmiRNAの例であり（非特許文献８）、Let-7は、Lin-41の3’-UTRに相互作用することが知られている。図１は、RNA二次構造エネルギーパラメータとしては、上記Vienna RNA packageのものを用いて計算した結果を、横軸(101)をLin-41の3’-UTR配列上の位置、縦軸(102)を二次構造エネルギー値として、Lin-41の3’-UTR配列上の部分配列がLet-7と形成可能な二次構造エネルギー値(103)と、部分配列がLin-41内部で形成可能な二次構造エネルギー値(104)を折れ線グラフで表したものである。矢印(105)で示した２箇所が3’-UTRの塩基配列上のLet-7結合部位であり、Let-7とLin-41の間で形成可能な二次構造エネルギーが非常に低く(106)、反対にLin-41内部で形成可能な二次構造エネルギーが高い(107)ため、Let-7とLin-41の間で容易に、より安定な結合が可能であることが明らかとなった。Let-7とLin-41の部分配列は、Lin-41内部で二次構造が形成されにくい部分の近傍にLet-7結合部分が存在する可能性を示している。
【００２６】
第２ステップにおいて、mRNA内部で安定構造を取らない部分配列を探索する際、第１ステップにおいて探索された部分配列から、０〜２０塩基の範囲でずらした位置の近傍の部分配列について、mRNA内部で安定構造を取らない部分配列を探索することにより、こうした構造が探索可能である。結局、第２ステップでは、mRNA内部において部分配列又はその近傍の配列が取り得る最も安定な二次構造エネルギーが相対的に高く、且つmiRNAとmRNAの二次構造エネルギーが低い前記miRNAと安定な結合が可能な部分配列を選択する。この場合、また、第２ステップにおける部分配列の探索基準を、miRNAとの二次構造エネルギーとの相対値とすることにより、判定を容易にすることが可能である。例えば、miRNAとの構造エネルギーが低い部分配列又はその近傍配列がmRNA内部の他の部分配列と形成する最も安定な二次構造エネルギーを計算し、その値が、前記miRNAと安定な結合が可能な部分配列がmiRNAとの結合において取り得る二次構造エネルギーよりも5kcal以上高い場合を選択できる。
【００２７】
第3ステップにおいては、公知のデータベースに保存されている配列を利用して、少なくとも第1-2ステップで検討した生物種とは異なる種1種について計算すればよい。また、第3ステップにおいては、ある種において、第2ステップで選択されたmiRNAとmRNAの組について、別の種における対応するmiRNA とmRNAの組について、第2ステップの要件を満たすかどうかを検討することによって行うこともできる。
【００２８】
ここで、ある種におけるmiRNAに対応する異なる種のmiRNAは、例えば、miRNAのリソース（生物間で保存されたmiRNAに関する情報を含む）としては、「The miRNA Registry (http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml)」Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, Database Issue, D109-D111  を用いて、得ることができる。
【００２９】
また、異なる種における対応するmRNAは、生物間で保存されたmRNAのリソースである、(1)「Homologene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=homologene)」（Nucleic Acids Research, 2001, Vol. 29, No. 1 137-140 米国生物情報技術センター(NCBI)の作成する、多生物にわたる、種間で保存された遺伝子のデータベース)又は  (2)「The Mouse Genome Database (http://nar.oupjournals.org/cgi/content/full/33/suppl_1/D471)」（Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, Database issue D471-D475  ネズミのデータベース、ヒト−ネズミの間で保存された遺伝子のデータ）を用いて、得ることができる。
【００３０】
また、本方法は、他の同定予測方法と組み合わせて使用することもできる。更に、本方法で同定又は予測した後、実際に実験により、miRNAを細胞に導入することにより、本方法で予想されたmRNAの発現が影響されているかどうか測定することにより、確認することもできる。
【００３１】
さらに、miRNAによりターゲットmRNA候補の発現が阻害されたか否かを調べるために、細胞内にmiRNAを導入した場合と導入しない場合について、複数のターゲットmRNA候補又はその相補鎖を表面に配置した核酸チップを用いて、細胞内のターゲットmRNA候補又は対応するcDNAを検出することにより、ターゲットmRNA候補の発現への影響を調べることもできる。
【００３２】
［miRNAの使用方法］
［標的遺伝子の発現抑制剤］
miRNAにより発現が制御される標的遺伝子が同定されれば、当該miRNAを用いてその標的遺伝子の発現を制御することができ、miRNAは、当該標的遺伝子の発現制御剤として用いることができる。
【００３３】
例えば、miRNAは、そのまま細胞に導入するほか、miRNAを生成する発現ベクターを調製することができる。標的遺伝子の発現抑制剤は、miRNA又はmiRNA発現ベクター、及び、必要があれば、対象生物への導入に有効な他の添加剤、例えば、リン酸カルシウム、リポフェリン、ポリリジン、その他の添加剤を含有することができる。
【００３４】
miRNA発現ベクターの調製には、通常その対象生物種により採用されている遺伝子組み換え法を用いることができる。一般的な動物を対象としては、siRNA発現ベクター法を用いることができる。siRNAを発現させる系としては、RNApolymeraseIIIを用いることができ、タンデムタイプと、ステムループタイプがある。例えば、piGENETMhU６、piGENETMtRNA（iGENE  Therapeutics）を用いることができ、好適には、(i)選択されたmiRNAに対応するsiRNAをセンス、アンチセンス配列を含むプライマーで増幅し、増幅断片を制限酵素で切断し、U６プロモータの下流に挿入し、タンデムタイプとするか、（ii）センス、ループ、アンチセンス配列を含むオリゴヌクレオチドをアニールし、U６プロモータの下流に挿入することができる（非特許文献１０）。発現ベクターは、EffectinTMなどの細胞導入用キットを用いて、細胞に導入することができる。
調製miRNA又はsiRNA発現ベクターは、周知の方法で、例えば、エレクトロポレーション、ca+ポリリン酸法、パーティクルガン法等により、細胞又は、生物体に導入される。
【００３５】
次に、このように特定された制御対象遺伝子の発現が実際にmiRNAの導入により、阻害されるかどうかを確認する。制御対象遺伝子の機能が、確認されていない場合については、阻害された結果の表現型の変化を確認する。
【００３６】
［標的配列に対する人工miRNAの設計］
本発明により、人工miRNAを作成するさいの、ターゲットmRNAにおけるターゲット部位(相互作用部位)の選択を行うことが可能となる。例えば、遺伝子発現を制御したいmRNAの3’-UTR上において、mRNA内部で安定な二次構造を形成しない領域、あるいはその周辺領域、あるいはその3’側領域を対象として、miRNAを設計することが可能である。その際、mRNA上の対象領域に相補なRNAに任意の数の突然変異を挿入することによって、候補miRNA群を作成し、その中から、対象領域に対して選択的、かつ、安定に結合可能であるmiRNAを選択することにより、人工miRNAの設計が可能となる。
【実施例１】
【００３７】
本特許におけるmiRNAのターゲットmRNA探索の実施例を、フローチャート（図３）に沿って説明する。まず、国際DNAデータバンク、及び、論文より、ヒト・マウス間で保存されている既知のmiRNA の組119種類 (図２−１から図２−４) を収集した(302)。
【００３８】
続いて、miRNAのターゲットmRNAの候補探索のため、対応するターゲットcDNAの候補探索を各生物種において実施する(303)。ターゲットcDNAは、米国National Center for Biotechnology InformationにおけるReference Sequence Projectが構築しているRefSeqデータベース（Release6）より収集し、ヒトcDNA配列28,176種類、及び、マウスcDNA配列26,561種類を収集した(307)。その内、3’-UTRを持つヒトcDNA25,284種類、及び、マウスcDNA配列19,287種類をターゲットcDNA候補(308)とした。
【００３９】
各生物種において、各miRNAについて(309)、各mRNAの3’-UTRについて(310)、各部分配列を対象として(311)、miRNAと部分配列との間の二次構造エネルギー計算を行い(312)、-22kcal以下の二次構造を取り得る部分配列をmiRNA安定結合部分配列とした(313)。ここで、部分配列長は、対象miRNAの塩基配列長に３塩基長加えたものとした。
【００４０】
続いて、miRNA安定結合部分配列がmRNA内部の他の部分配列と形成する最も安定な二次構造エネルギーを計算し(314)、その値が、miRNA安定結合部分配列がmiRNAとの結合において取り得る二次構造エネルギーよりも5kcal以上高い場合(315)、その部分配列を、結合候補部分配列（MRE: miRNA Responsive Element）とした(316)。以上を、ヒト・マウスについてそれぞれ実行し、ヒト・マウス間で塩基配列構造が保存されたmiRNAが、ヒト・マウス間で塩基配列構造が保存されたmRNAにそれぞれMREを持つ組み合わせを収集し(304)、その結果、119種類のヒトmiRNAに対応する1,092種類のヒトターゲット遺伝子（ターゲットmRNA） との組み合わせ(図４−１から図４−１６)が得られた(305)。ここで、ヒト・マウス間で塩基配列構造が保存されたmiRNAとしては、miRNAのファミリーを対象とし、また、ヒト・マウス間で塩基配列構造が保存されたmRNAとしては、MGI (Mouse Genome Informatics: http://www.informatics.jax.org/)の提供するオルソログ情報を対象とした。
【００４１】
なお、図４−１から図４−１６においてmRNAをあらわす識別子(NM_001949, NM_020390, NM_004496等)は、ＮＣＢＩのRefSeqで付与されているmRNAの登録番号（アクセッション番号）であり、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotideで参照することができる。
【実施例２】
【００４２】
実施例１で得られた結果より、ヒトmiRNAとそのターゲットmRNAの組を計４種類、即ち、let7a及びNM_002188、miR-20及びNM_021914、miR-20及びNM_006206、並びにmiR-30a-5p及びNM_004124の組を選択し（図５）、実験により、miRNAによる各ターゲットmRNAの翻訳阻害活性を調べた。選択した４種類のmiRNAとターゲットmRNAの組における、miRNAとMRE間の二次構造エネルギー(M-T)、及び、MREがmRNA内部の部分配列と形成可能な最安定二次構造エネルギー(T-T)、及び、”M-T”と”T-T”の差(DiffVal)を図６に示す。
【００４３】
(1)Dual Luciferase assay
選択した４種類のmiRNAとターゲットmRNAの組に対する翻訳阻害活性を簡便に検出するために、予測された各MREを、プラスミドpRL-TK上のルシフェラーゼのコード領域の直下（XbaI/NotI 部位）に1コピー挿入した。MREの挿入がこれらの指標蛋白の発現に与える影響を見ることにより内在性miRNAによるタンパク質翻訳阻害活性を調べた。
【００４４】
ヒトHeLa S3 (SC)細胞は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）添加ダルベッコのイーグル改変培地（DMEM：Dulbecco's modified Eagle's Medium）で培養した。HeLa S3(SC)細胞においてlet7a、miR-20、及びmiR-30a-5pが発現していることをmirVana miRNA isolation kit (Ambion)で調整した小分子RNA分画を用いたノーザンブロット解析で確認した。各ターゲットmRNAのMRE配列（野生型）、及び、ＭＲＥ配列に突然変異を加えた配列（変異型）を持つオリゴDNA（図７）をそれぞれ合成し、プラスミドpRL-TK上のオワンクラゲルシフェラーゼコード領域の下流（XbaI/NotI 部位）に挿入した。接着した HeLa S3 (SC)細胞は10% FBS含有 DMEM 培地で50乃至 80 %コンフルエントになるまで、96穴培養皿又は 24穴培養皿で培養した。 96穴培養皿では、上記それぞれの組換えプラスミド100ngに加え、規準化を目的として、ホタルルシフェラーゼを一定量発現するプラスミドpGL３15ngを、CalPhos mammalian transfection kit(Clontech)を用いて、共にヒトHeLa S3 (SC)細胞に導入した。
【００４５】
20から24時間後導入細胞のライセートを作製し、2種類のルシフェラーゼ活性をDual Luciferase Reporter Assay System (Promega)を用いて測定した。ホタルルシフェラーゼ活性の値でオワンクラゲルシフェラーゼ活性の値を規準化し、野生型と変異型での規準化オワンクラゲルシフェラーゼ活性を比較した結果、それぞれのMREは野生型に比べ変異型の活性が高かった（図８）。これは、内在性の対応するmiRNAがMREと相互作用し、ターゲットmRNAにおける翻訳過程が抑制されたことを示している。
【００４６】
（2）GFP reporter assay
HeLa S3(SC)細胞は上記ルシフェラーゼアッセイと同様に１２穴培養皿で培養した。次に、pEGFP-C1 ベクター (Clontech)のSmaI/BclI 部位に合成DNA  (5’gggatccACCGGATAATCTAGAGCGGCCGCT3’)及び5’GATCAGCGGCCGCTCTAGATTATCCGGTGGATCCC3’) をアニールすることによりpEGFP-C1 vector (Clontech)のストップコドンの後に XbaI/NotI 部位を形成するように修飾し、修飾されたpEGFP-C1 ベクターは、pEGFP-C1-NotI と名づけられた。let-7a及びNM_002188、並びに、miR-20及びNM_021914の組について、前記プラスミドpEGFP-C1-NotI上の緑色蛍光蛋白（GFP）コード領域の下流のXbaI/NotI部位に、上記2種類のMREをそれぞれ1コピー挿入した。これらをCalPhos mammalian transfection kit(Clontech)を用いてヒトHeLa S3(SC)細胞に導入した。導入から24時間後、トランスフェクトされたHeLa S3(SC)細胞からPARIS Protein and RNA Isolation System (Ambion)を用いて、プロトコールどおりにタンパク質及びRNAを調製した。
【００４７】
ヒトHeLaS3 (SC)細胞から回収した全タンパク質を、１０％ポリアクリルアミドゲルでSDＳ電気泳動し、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロティングにより移した。GFPに対するポリクローナルウサギ抗体（BD living Colors A.V. peptide antibody (Clontech)） 及び抗アクチンウサギ抗体で処理し、更にホースラディッシュ  ペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗ウサギイミュノグロブリンG抗体で処理した。免疫複合体のペルオキシダーゼ活性は、ECＬ検出キット（アマシャム）で可視化し、LAS-1000 plus lumino-image analyzer(Fuji Film) で分析した(図９)。
【００４８】
また、ヒトHeLa S3(SC)細胞から回収した全mRNAをDnaseIで処理し2-4ng, 4ng 又は 8 ng鋳型として、SuperScript One-Step RT-PCR with Platinum Taq kit (Invitrogen)を用いて、それぞれ、GFP, b-Actin 又はNeomycinについて増幅した。なお、用いたプライマーは次のとおりである。
【００４９】
1) Primers
1a) EGFP 用プライマー:
Forward: 5’ACTACCTGAGCACCCAGTCCG 
Reverse: 5’CGGACTTCTACAGCTCGTCCAT 
増幅断片サイズ（Amplicon size）: 123 bp
1b) Neomycin 用プライマー:
Forward: 5’GACCGCTATCAGGACATAGCGTT 
Reverse: 5’AAGAACTCGCAAGAAGGCGATAGA  
Amplicon size: 144 bp
1c) アクチン用プライマー:
Forward: 5’GCTCACCATGGATGATGATATCGC 
Reverse: 5’GACCTGGCCGTCAGGCAGCTCG 
Amplicon size: 748 bp
【００５０】
逆転写は55℃で20分間された。PCR増幅は、25サイクル（95℃ 30秒、60℃ 30秒、及び72℃ 1分）行った。PCR産物は、アガロースゲル上又はポリアクリルアミドゲル上で分離し、エチジウムブロマイド又はサイバーグリーンで染色し、LAS-1000 plus lumino-image analyzer(Fuji Film) で分析した。
【００５１】
野生型MREを挿入したプラスミド（wt）を導入した細胞と、変異型MREを挿入したプラスミド（mut）を導入した細胞においては、定量的なRT-PCR の結果より、GFP、及び、ActinをコードしたmRNA、gfp、及び、actinはいずれも同様に転写されているが、Westernブロットの結果より、タンパク質の発現量は、Actinは同等であるが、GFPにおいては、mutの方が明らかに高いことがわかる。図９の結果を定量化すると、let-7aとNM_002188の組においては、変異型は野生型の3.1倍、miR-20のNM_021914の組においては、変異型は野生型の8.6倍の発現量である（図１０）。即ち、GFPは、MREの存在によりlet-7aとmiR-20によって発現を抑制され、しかも、発現の抑制が転写の段階ではなく、翻訳の段階で働いていることが確認できた。
【００５２】
以上により、本発明の手法よって予測したmiRNAとターゲットmRNAにおいて、タンパク質の翻訳が制御されることを確認し、同時に、タンパク質の発現が制御可能であることを示した。これらの結果はまた、本発明が、上記タンパク質に関連した疾病のための処置の開発、及び、疾病のための処置そのものに有用であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明によれば、本発明における機能性RNAのターゲットmRNA探索手法によって予測されたmiRNAとターゲットmRNAの組み合わせによって、ターゲットmRNAにコードされたタンパク質の発現の制御が可能であり、遺伝子工学の技術分野において利用することができる。
【００５４】
さらに本発明によれば、let-7a、 miR-20、及び、miR-30a-5pによって、タンパク質、Interleukin 13、Cofilin 2 variant 1、Platelet-derived growth factor receptor, alpha polypeptide、及び、Glia maturation factor, betaの発現を制御することが可能である。
【００５５】
また、本発明におけるタンパク質発現制御を利用した疾病のための処置の開発、及び、疾病のための処置が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】Lin-41の3’-UTRとLet-7の形成する二次構造エネルギーパターン
【図２−１】既知のヒト、マウス間で保存されたmiRNAのリスト
【図２−２】既知のヒト、マウス間で保存されたmiRNAのリスト
【図２−３】既知のヒト、マウス間で保存されたmiRNAのリスト
【図２−４】既知のヒト、マウス間で保存されたmiRNAのリスト
【図３】miRNAのターゲットmRNA探索手順のフローチャート
【図４−１】miRNAと予測されたターゲットmRNAのリスト
【図４−２】miRNAと予測されたターゲットmRNAのリスト
【図４−３】miRNAと予測されたターゲットmRNAのリスト
【図４−４】miRNAと予測されたターゲットmRNAのリスト
【図４−５】miRNAと予測されたターゲットmRNAのリスト
【図４−６】miRNAと予測されたターゲットmRNAのリスト
【図４−７】miRNAと予測されたターゲットmRNAのリスト
【図４−８】miRNAと予測されたターゲットmRNAのリスト
【図４−９】miRNAと予測されたターゲットmRNAのリスト
【図４−１０】miRNAと予測されたターゲットmRNAのリスト
【図４−１１】miRNAと予測されたターゲットmRNAのリスト
【図４−１２】miRNAと予測されたターゲットmRNAのリスト
【図４−１３】miRNAと予測されたターゲットmRNAのリスト
【図４−１４】miRNAと予測されたターゲットmRNAのリスト
【図４−１５】miRNAと予測されたターゲットmRNAのリスト
【図４−１６】miRNAと予測されたターゲットmRNAのリスト
【図５】実験により実証したmiRNA、ターゲットmRNA、対象タンパク質の組み合わせ
【図６】実験により実証したmiRNAとmRNAの組み合わせにおける二次構造エネルギー
【図７】実験に用いたmRNAの部分配列とその改変配列
【図８】実験結果１  Dual Luciferase assay
【図９】実験結果２  RT-PCR及びウエスタンブロット
【図１０】実験結果３（図９の結果の定量化）
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図４−１０】
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【図４−１１】
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【図４−１２】
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【図４−１３】
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【図４−１４】
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【図４−１５】
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【図４−１６】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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