(57)【要約】【課題】標的物質への結合性が得られ、かつ安定した生産性を確保可能である標的物質の捕捉分子を提供すること。【解決手段】標的物質の異なる部位のそれぞれに特異的に結合する複数のポリペプチド鎖の会合体からなる捕捉分子を、各ポリペプチド鎖が、前記標的物質に結合する結合部位にハイパーバリアブルループ構造を有するドメインと、前記会合体形成のための会合部と、を有し、各ポリペプチド鎖の有する会合部を介して複数のポリペプチド鎖が会合してなる構造とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質の異なる部位のそれぞれに特異的に結合する複数のポリペプチド鎖の会合体からなる捕捉分子において、
各ポリペプチド鎖が、前記標的物質に結合する結合部位にハイパーバリアブルループ構造を有するドメインと、前記会合体形成のための会合部と、を有し、
各ポリペプチド鎖の有する会合部を介して複数のポリペプチド鎖が会合してなる
ことを特徴とする捕捉分子。
【請求項２】
前記ドメインが、前記標的物質のエピトープに対する抗体の少なくとも１つの可変領域を有する請求項１に記載の捕捉分子。
【請求項３】
前記ドメインが、前記標的物質のエピトープに対する抗体のハイパーバリアブルループ構造またはその一部からなる１以上のループ構造を有する請求項１に記載の捕捉分子。
【請求項４】
前記ドメインが、ラクダ重鎖抗体可変領域である請求項１に記載の捕捉分子。
【請求項５】
標的物質の異なる部位のそれぞれに特異的に結合する複数のポリペプチド鎖の会合体からなる捕捉分子において、
各ポリペプチド鎖が、前記標的物質に結合する結合部位を有するドメイン（ただし、結合部位にハイパーバリアブルループ構造を有する場合を除く）と、前記会合体形成のための会合部と、を有し、
各ポリペプチド鎖の有する会合部を介して複数のポリペプチド鎖が会合してなる
ことを特徴とする捕捉分子。
【請求項６】
前記ドメインの結合部位が、二次構造をとるポリペプチド鎖の外表面である請求項５に記載の捕捉分子。
【請求項７】
前記二次構造が、α−へリックス構造を含む請求項６に記載の捕捉分子。
【請求項８】
前記ドメインの結合部位が、少なくともポリペプチド鎖の二次構造からなる基本構造の繰り返しを有する請求項６に記載の捕捉分子。
【請求項９】
標的物質の検出方法であって、
請求項１乃至８のいずれかに記載の捕捉分子と試料を反応させる工程と、
前記試料に標的物質が含まれている場合における該標的物質と前記捕捉分子との結合を検出する工程と、
を有することを特徴とする標的物質の検出方法。
【請求項１０】
標的物質を検出するための装置であって、
標的物質と結合する請求項１乃至９のいずれかに記載の捕捉分子と、前記捕捉分子を少なくとも表面の一部に設けた検出用素子と、前記素子を保持するための保持手段と、該素子による前記標的物質を検出するための検出手段と、を有することを特徴とする標的物質の検出装置。
【請求項１１】
標的物質検出用のキットにおいて、
請求項１乃至８のいずれかに記載の捕捉分子と、
前記捕捉分子と標的物質との結合を検出するための試薬と
を有することを特徴とする標的物質検出用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質の単離や検出に有用な標的物質捕捉分子、それを用いた標的物質検出方法及びそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
標的物質と特異的に結合する生体高分子、または生体分子を標的物質とする低分子化合物は、標的物質と特異的に結合し生体内に有効な生理活性を発揮する医薬品候補物質としての利用が期待されている。また、前記と同様な標的物質に対して特異的な結合能を利用したバイオセンサの標的物質捕捉分子としてのこれらの化合物の利用も利用が期待されている。
【０００３】
上記のような生体高分子の一例として抗体を挙げることができる。抗体は、動物が自らの体液中に侵入する様々な異物に対して、その異物表面の種々の構造を認識して特異的に結合させ、その免疫系により無毒化させる自己防御機構の中で機能するタンパク質の一つである。その機構を効果的に発揮する為に、抗体は分子多様性（様様な異物に結合する為の違ったアミノ酸配列を持つ抗体数）を有しており、その抗体数は、動物個体あたり１０7乃至１０8種と見積もられている。このような抗原認識製の特異性及び高い結合能、また分子多様性が前記医薬候補物質または標的物質捕捉分子としてのこれらの化合物の利用が期待される所以となっている。
【０００４】
一般的に、抗体は、その構造は重鎖と呼ばれる約５０ｋＤａのポリペプチド鎖と、軽鎖と呼ばれる約２５ｋＤａのポリペプチド鎖との各二本ずつから形成され、約１５０ｋＤａのタンパク質である。
【０００５】
前記重鎖及び軽鎖はそれぞれ可変領域と定常領域を有している。軽鎖は、一つの可変領域（軽鎖可変領域：ＶＬ）および一つの定常領域（ＣＬ）の二ドメインから構成されるポリペプチド鎖である。一方、重鎖は一つの可変領域（重鎖可変領域：ＶＨ）と三つの定常領域（ＣＨ１乃至ＣＨ３）の四ドメインから構成されるポリペプチド鎖である。各々のドメインは、アミノ酸約１１０個からなり筒状の構造をとり、逆平行の向きに配置されたベータシート群による層状構造が形成され、この層状構造をひとつのＳＳ結合により結合し、非常に安定した構造体を形成している。
【０００６】
抗体分子群の特徴である多様な抗原種に対する結合多様性は、可変領域（ＶＨまたはＶＬ）がそれぞれ有する三つの相補的決定領域（complementarity determining region:CDR）と呼ばれるループ構造を取ったアミノ酸配列の多様性に起因するものである。
【０００７】
ＣＤＲは、超可変領域とも呼ばれ、ＶＨまたはＶＬと各ドメインにそれぞれ３つある。これらＣＤＲは、ＶＨ、ＶＬドメイン間で比較的に共通のアミノ酸配列を持つフレームワークと呼ばれる領域により分離されて抗体分子表面に配置される。そして、結合対象である標的物質の認識部位（抗原決定部位：エピトープ）の官能基の空間配置を認識することにより、より高度な特異的な分子認識を可能としている。このＣＤＲにより抗体のハイパーバリアブルループ構造が形成される。
【０００８】
上記のような抗体作製方法としては、目的の抗原物質をアジュバンドと共に被免疫動物（ウサギ、ヤギ、マウス等）に一定間隔で免疫し、その血清中に存在する抗体群を回収する方法がある。その他、被免疫動物から抗体を産出するＢ細胞を取得、株化した腫瘍細胞と融合したハイブリドーマ細胞に抗体を産出させ、精製することにより抗体を作製する方法等がある。
【０００９】
前者のようにして得られた抗体は、免疫に用いた抗原物質の表面には様々な構造を認識する複数の抗体の混合物である。このようにひとつの抗原に結合する複数の抗体を含む血清はポリクーロナル抗体と呼ばれる。後者はモノクローナル抗体と呼ばれる。これは、抗体を産生するＢ細胞は、一種類の抗体のみを産出することができ、故に上記のようなハイブリドーマ細胞の一細胞から産出される抗体は、一種類の単一抗体である為である。
【００１０】
いずれの方法においても、動物に対して標的物質である抗原を免疫しなければならず、更には目的である標的物質を捕捉する捕捉分子としての抗体が得れるか否かは抗体または血清を取得し、それらの抗体価（結合力）を確認するまでわからない。つまり、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れにおいても得られる抗体の特性は、被免疫動物の免疫システムに依存するものである。また、標的物質と結合特性を示すモノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を得ることができたとしても、得られる抗体の結合特性を改善する為の遺伝子工学的な手段で効率的な方法は未だ見出されていないのが現状である。一般に、被免疫動物の生体構成要素に対して類似構造を持つ糖、脂質に代表される標的物質に対しては、これらが非自己物質であったとしてもその個体の生体防御として機能する免疫システム上で特異的な結合をする抗体の産生は期待できない。
【００１１】
一方で、抗原に対する抗体の結合部であるＶＨ、ＶＬの少なくとも一部含む抗体断片（例えば、Fab、scFv:single chain Fv）を用い、コンビナトリアルな方法により標的物質に結合する捕捉分子を得る方法が開示されている。一例として、米国特許第５９６９１０８号明細書においては、上記のような抗体断片をファージ、特に繊維状ファージのコートタンパク質に融合し、表面に提示したファージ抗体として利用する技術が開示されている。また、抗体をコートタンパク質表面に提示したファージに関しては、国際公開第８８／０６６３０号パンフレット、国際公開第９２１５６０６号パンフレットにも、抗体断片クローンを選択する方法でこのようなファージが使用されることが開示されている。これらの方法によれば、従来の免疫による抗体取得方法に比べ、簡便に標的物質に結合するクローンを得ることが可能である。抗体を断片化し、低分子量化することにより、従来動物細胞でしか発現することが難しいと言われていた抗体生産方法を改良することが可能となった。
【００１２】
上記の方法に代表される抗体提示方法により、まず、ある選択条件圧にて標的物質に結合するリード抗体断片を取得し、遺伝子工学的な手法により変異を加える。次いで、結合実験／選択を繰り返すことで標的物質に対してより結合特性の高い抗体断片を取得することが可能となっている。また、これらの特徴として、標的物質に結合する抗体の選択において生体内の複雑な免疫システムを使用しないため、標的物質が自己／非自己であることにとらわれない。更には、抗体断片のＣＤＲ部をコードする遺伝子部を化学合成で作製することによりその遺伝子ライブラリーサイズを拡大することも可能である。
【００１３】
また、米国特許第５９１０５７３号明細書においては、ｓｃＦｖと二量体形成が可能な両親媒性へリックス・ペプチドを融合した単量体タンパク質からなる捕捉分子が開示されている。同公報には、同公報に記載の発明によれば、前記両親媒性へリックスペプチド間の相互作用により二量体化し、二価性抗体として機能することが効果として記されている。更には、同公報は、前記へリックスペプチド鎖に異なる抗原を認識するｓｃＦｖを融合した二価特異性抗体に関する技術も開示している。しかしながら、ｓｃＦｖはポリペプチド鎖に二つのジスルフィド結合を有するため、タンパク質合成時または細胞膜からの分泌の際に正しいフォールディングが誘導するための弊害となりやすく、生産性において問題が残る。
【００１４】
J.Mol.Biol.、2001、312、221-228においては、Ｆｖを構成する重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変部領域（ＶＬ）にそれぞれ前記両親媒性へリックスペプチドを融合させたタンパク質を作製している。本開示によれば、上記米国特許第５９１０５７３号明細書とは異なり、本タンパク質を構成するポリペプチド鎖にはＶＨ、またはＶＬのドメインのみを含む。これにより上記で記載した生産性における問題は改善することが期待できる。しかしながら、本件に開示された捕捉分子一分子では一つのエピトープしか結合することができない。従来の抗体や抗体断片を超えるような結合特異性を付与することは難しい。
【００１５】
また、J.Mol.Biol.、1995、246、367-373には、標的物質であるＨＥＬに対する結合特性を向上させるための一本鎖ｓｃＦｖダイマーの利用について開示されている。このダイマーは、ＨＥＬに結合するｓｃＦｖ（Ｄ１．３及びＨｙＨＥＬ１０由来）を遺伝子工学的に融合したものであり、同文献は、このダイマー化によりＨＥＬに対する結合性を向上させることを開示している。また、国際公開第０４／００３０１９号パンフレットにおいても同様に同一の標的物質分子表面上の異なる二つのエピトープを認識する標的物質捕捉分子に関する技術が示唆されているが、具体的な技術例については触れられていない。
【００１６】
しかしながら、上記のようなコンビナトリアルな方法及び遺伝子工学的な手法を用いても抗体及び抗体分子においても糖、脂質のような物質に対して結合特性の高いクローンを得ることは難しいのが現状である。
【００１７】
一方、生体内の脂質の挙動やタンパク質の翻訳後修飾が生物学的に大きな意味があることが示唆されているおり、糖や脂質などのような物質に対して結合性の高い捕捉分子は、生化学、医療分野のみならず、幅広い分野での応用が期待されている。
【特許文献１】米国特許第５９６９１０８号明細書
【特許文献２】国際公開第８８／０６６３０号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９２１５６０６号パンフレット
【特許文献４】米国特許第５９１０５７３号明細書
【特許文献５】国際公開第０４／００３０１９号パンフレット
【非特許文献１】J.Mol.Biol.、2001、312、221-228
【非特許文献２】J.Mol.Biol.、1995、246、367-373
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
しかしながら、上記のような組換え一本鎖ｓｃＦｖから構成されるタンパク質は生産性が低くなる場合（＜数ｍｇ／Ｌ・大腸菌）、分子安定性が低い場合が少なくない。抗体断片、特にＶＨ、ＶＬ、これら断片には相互が相補的に会合する疎水部位が有する。この疎水部位を介する会合によりＶＨ、ＶＬはヘテロダイマー化（Ｆｖ化）し分子として安定する。しかし、タンパク合成後、または細胞膜から分泌される際のフォールディング工程において、上記抗体断片ドメイン単体で存在する場合に上記疎水部位はタンパク質凝集等の引き金となり得る。また、上記抗体断片は抗体の定常領域部を削除した標的物質に対する結合能を最優先させた組換えタンパク質であるために構成するポリペプチド鎖の分子間会合面積も小さい為に抗体と比べると分子としての安定性も低いことが知られている。これらの生産性、分子安定性の問題は産業利用上において障害となることが予想され、技術的な課題が残る。
【００１９】
本発明の目的は、目的とする標的物質への結合性が得られ、かつ安定した生産性を確保可能である標的物質の捕捉分子を提供することにある。本発明の他の目的は、かかる捕捉分子を用いた標的物質の検出方法及びそのためのキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の捕捉分子の一態様は、標的物質の異なる部位のそれぞれに特異的に結合する複数のポリペプチド鎖の会合体からなる捕捉分子において、
各ポリペプチド鎖が、前記標的物質に結合する結合部位にハイパーバリアブルループ構造を有するドメインと、前記会合体形成のための会合部と、を有し、
各ポリペプチド鎖の有する会合部を介して複数のポリペプチド鎖が会合してなる
ことを特徴とする捕捉分子である。
【００２１】
本発明の捕捉分子の他の態様は、標的物質の異なる部位のそれぞれに特異的に結合する複数のポリペプチド鎖の会合体からなる捕捉分子において、
各ポリペプチド鎖が、前記標的物質に結合する結合部位を有するドメイン（ただし、結合部位にハイパーバリアブルループ構造を有する場合を除く）と、前記会合体形成のための会合部と、を有し、
各ポリペプチド鎖の有する会合部を介して複数のポリペプチド鎖が会合してなる
ことを特徴とする捕捉分子である。
【００２２】
本発明の標的物質の検出方法は、上記構成の捕捉分子と試料を反応させる工程と、前記試料に標的物質が含まれている場合における該標的物質と前記捕捉分子との結合を検出する工程と、を有することを特徴とする標的物質の検出方法である。
【００２３】
本発明の標的物質検出用のキットは、上記構成の捕捉分子と、この捕捉分子と標的物質との結合を検出するための試薬と、を有することを特徴とする標的物質検出用のキットである。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の捕捉分子においては、捕捉分子に、標的物質上の異なる二つの点（抗原蹴決定基：エピトープ）を認識する二以上のドメインを付与し、これらのドメインをハイパーバリアブルループ構造を有するものとする。これにより標的物質表面上の一つの抗原決定部位（エピトープ）にて結合する抗体もしくは抗体断片よりも高い親和性を付与することができる。更に、捕捉分子に、標的物質上の異なる二点を認識する二以上のドメインを付与し、これらのドメインをハイパーバリアブルループ構造以外の結合部位を有するものとする。これにより、従来の抗体もしくは抗体断片では特異的な結合をし難いような表面アミノ酸残基部と結合する捕捉分子の提供を図ることができる。すなわち、このような組み合わせを行うことにより、従来にない結合特異性を付与することが期待できる。
【００２５】
更に、本発明の捕捉分子は、複数のポリペプチド鎖を会合した会合体として構成され、ポリペプチド鎖の製造及び会合工程中、さらには、捕捉分子の所望の用途に使用する際の各種溶液中での分子安定性の向上を図ることができる。更に、個々のポリペプチド鎖の生産及び精製工程において収率の向上を図ることができる。また、ハイパーバリアブルループ構造をもつドメインを用いた捕捉分子の場合には、ドメインとして重鎖抗体可変領域を選択することにより分子安定性の更なる向上が期待できる。ハイパーバリアブルループ構造以外の結合部位をもつドメインを用いた捕捉分子の場合には、ドメインをアンキリン構造とすることにより分子認識機構の多様化を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の標的物質捕捉分子の第一の態様は、標的物質との結合部位にハイパーバリアブルループ構造を有するドメインと、会合体を形成するための会合部を有するポリペプチド鎖の複数を各ポリペプチド鎖の会合部を介して会合させた会合体としての構造を有する。すなわち、複数のドメインがともにハイパーバリアブルループ構造を有する。例えば、標的物質を認識する可変部分以外は同一構造を有する複数のドメインを用いて標的物質捕捉分子を構成することができる。
【００２７】
本発明の標的物質捕捉分子の第二の態様は、標的物質との結合部位にハイパーバリアブルループ構造以外の構造を有するドメインと、会合体を形成するための会合部を有するポリペプチド鎖の複数を各ポリペプチド鎖の会合部を介して会合させた会合体としての構造を有する。すなわち、複数のドメインがともにハイパーバリアブルループ構造以外の構造を有する。この場合も、例えば、標的物質を認識する可変部分以外は同一構造を有する複数のドメインを用いて標的物質捕捉分子を構成することができる。
【００２８】
これらの態様にかかる捕捉分子に設けられた各ドメインは、標的物質の互いに異なる部位を認識して結合する機能を有する。
【００２９】
以下、本発明の捕捉分子の構成成分として使用できる各物質やその製造方法等について更に説明する。
【００３０】
（ループ構造）
ループ構造は、一般的に、ポリペプチド鎖の離れた位置にある複数のループ形成部位が、ポリペプチド鎖が二次構造をとったときに近接して立体的に配置されることで、標的物質の標的部位を特異的に認識してそこに結合できる部分を形成している状態の構造をいう。このようなループ構造をもつものとしてはｋｕｎｉｔｚ構造が挙げられる。ポリペプチド鎖中の適切な位置にＣｙｓをニ導入することにより酸化環境下においてループ構造を形成することも可能である。
【００３１】
（ハイパーバリアブルループ構造）
ハイパーバリアブルループ構造は、一般的に、以下の状態の構造を意味する。
【００３２】
即ち、ポリペプチド鎖の離れた位置にある複数のループ形成部位が、ポリペプチド鎖が二次構造をとったときに近接して立体的に配置されることで、標的物質の標的部位を特異的に認識してそこに結合できる構造を形成した部分を形成した状態の構造をいう。
【００３３】
このような、ハイパーバリアブルループ構造としては、抗体のＣＤＲ領域を含む部分から形成されるハイパーバリアブルループ構造（３個のループの複合構造）、フィブロネクチンＩＩＩ（２〜３個のループの複合構造）、を挙げることができる。また、リポカリン（４個のループの複合構造）等を挙げることができる。抗体のＣＤＲ領域を含む部分から形成されるハイパーバリアブルループ構造は、イムノグロブリンスパーファミリーに分類されるタンパク質から得ることができる。
【００３４】
抗体のＶＨ、ＶＬの各ドメインは二つの逆並行のβ−シートのサンドイッチ構造からなる共通のフレークワークであり、β−シートサンドイッチ構造末端に位置するループ構造がその認識部位、ＣＤＲとして機能する。抗体の各ドメインには３つのループが存在し、ループを形成するアミノ酸残基の特性、残基数、そしてその立体的な配置が各抗体ドメインの標的物質に対する結合性を決定するものである。このループ構造のアミノ酸配列の多様性が、抗体分子群の結合多様性となる。この領域を抗体におけるハイパーバリアブルループ構造という。
【００３５】
（イムノグロブリンスーパーファミリー）
抗体およびこれと構造上、機能上の類似したタンパク質を指すものであり、魚類から哺乳類の体液中に存在し、リンパ系細胞により産出されるものである。
【００３６】
（抗体可変領域）
抗体は、重鎖（Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）と呼ばれる分子量約５０ｋＤａのポリペプチド鎖２本と軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）と呼ばれる分子量２５ｋＤａであるポリペプチド鎖２本により構成されている。重鎖は抗原物質との結合部位を有する可変領域と呼ばれる1つのドメイン（ＶＨ）と定常領域と呼ばれる３つのドメイン（ＣＨ１乃至３）の計４ドメインから形成されている。軽鎖は抗原物質との結合部位を有する可変領域（ＶＬ）と一つの定常領域（ＶＬ）から形成されている。重鎖と軽鎖はＶＨ／ＶＬ間及びＣＨ１／ＣＬ間で相補的に会合すると共にＣＨ／ＣＬにおいてジスルフィド結合を形成しており、また２本の重鎖同士は前記ＣＨ１とＣＨ２を繋ぐヒンジ領域においてジスルフィド結合を形成している。これらの結合により、抗体は安定な分子として存在することができる。
【００３７】
本発明においては、標的物質との結合部位を有するドメインとして、抗体可変領域のいずれかを用いることが好ましい。更には、標的物質との結合部位を有するドメインとして、ＶＨ及びＶＬの何れかを単ドメイン抗体（ｄＡｂ）として用いることも可能である。前記ＶＨ、ＶＬは抗体が抗原と結合する結合ドメインである。ＶＨ、ＶＬの各ドメインは二つの逆並行のβシートのサンドイッチ構造からなる共通のフレームワークである。βサンドイッチ構造末端に位置するループ構造がその認識部位、ＣＤＲとして機能する。各ドメインには３つのループ構造が存在し、ループを形成するアミノ酸残基の特性、残基数、そしてその立体的な配置が各ドメインの標的物質に対する結合性を決定するものである。
【００３８】
本発明の捕捉分子の有する複数のドメインをハイパーバリアブル構造を有する構成とする場合、このハイパーバリアブル構造を有する構成は、標的物質のエピトープに対する抗体の可変領域を少なくとも１つを用いて得ることができる。また、第一のドメインは、標的物質の第一のエピトープに対する抗体のハイパーバリアブル構造またはその一部の１以上のループ構造とすることもできる。なかでも、標的物質との結合部位を有するドメインは、ＶＨ、ＶＬ単体の分子安定性が高いクローンであることが望ましい。ヒト抗体断片の場合、既に種々の研究により、フレームワークとよばれる比較的に共通な領域のアミノ酸配列でサブファミリー分類がされており、サブファミリー間において様々な特徴の違いが開示されている。それら知見を踏まえて、例えば、最も安定した分子種が多いとされるＶＨ３等の安定なフレームワークのみからＤＮＡライブラリー集合体を作製する。更に安定な抗体可変領域フレームワークを有する抗体断片ＤＮＡライブラリーを作製し、ＣＤＲ部をコードする遺伝子を化学合成し前記フレームワーク部に導入する手法も採用可能である。この手法は、天然に存在しないＣＤＲ配列を創造できる可能性もあり、ライブラリーのバラエティ拡大を考えると好ましい。また、分子不安定要素となる残基、例えば、ＶＨ／ＶＬ界面等分子表面に存在する疎水性アミノ酸残基等を改良することで安定性を向上させて用いることも可能である。前記単ドメイン構造は一般的に不安定であることが多いので、そのような場合にはＰＥＧ修飾等の化学修飾による安定化を施しても良い。更に、ｄＡｂとしては、重鎖抗体としてｉｎｖｉｖｏにおいても存在し、機能することができることが知られているラクダ重鎖抗体の可変領域ＶＨＨ（J.Mol.Biol、311:p123、2001）を採用しても良い。また、Ｎｕｒｓｅｓｈａｒｋのイムノグロブリン様分子の可変領域ＩｇＮＡＲ（Molecular Immunology,2001,38,313-326）を採用しても良い。特に、ラクダ重鎖抗体可変領域であるＶＨＨは分子安定性が高いことが知られており、生産／精製工程に安定に存在し、産業上において問題ない程度の収率が期待できる。このような重鎖抗体可変領域が示す分子安定性の要因のひとつは、重鎖／軽鎖からなる抗体の可変領域に存在する重鎖／軽鎖界面に露出する疎水性部分が減少していることが挙げられる。例えば、Biochemistry 2002,41,3628-3636においてラクダ重鎖抗体可変領域は、加熱（８０℃）後においても常温に冷却することによりその結合活性が７０〜９０％回復することが示されている。その一方で比較となるヒト抗体重鎖可変領域では同操作により凝集することが同文文献に開示されている。このように幾つかのラクダ重鎖抗体可変領域は非常に安定な分子構造を有することが推察される。また、ラクダ重鎖抗体断片の特徴の一つとして３つのＣＤＲのひとつであるＣＤＲ３を構成するアミノ酸が長いことが挙げられる。マウスＨ鎖ＣＤＲ３の平均は約９アミノ酸、ヒトＨ鎖ＣＤＲ３が約１２アミノ酸であるのに対して、ラクダのそれは約１８アミノ酸であることが知られている。ラクダＨ鎖ＣＤＲ３は、軽鎖欠如によるバラエティの減少をアミノ酸残基増加により補うものであることが示唆されている。また、ラクダＨ鎖ＣＤＲは、前述の抗体の重鎖／��鎖界面に相当するラクダ抗体部位を覆うことに疎水領域の接液面積（接液面は、外表面、溶媒接触面ともいう）を小さくすることで分子安定化にも寄与するものである。更に、長いＣＤＲ３により酵素活性中心にある谷間に結合する例や低分子化合物に対する結合も示唆されており、単体として抗体断片を捕捉分子とする場合、有用な候補となる。上記のようなラクダ重鎖抗体の安定構造を付与する為に、構造安定化にかかわるアミノ酸変異をマウス、ヒトの抗体断片に導入し、分子安定化を行っても構わない。また、所望の選択圧により選ばれたリードドメインを進化工学的な変異導入により所望の性能を改善することも可能である。このようなラクダ重鎖抗体可変領域の構造的な特徴を重鎖／軽鎖からなるマウス、ヒト抗体可変部領域に採用することも可能である。具体的には、前述したＶＨ／ＶＬ界面への変異導入である。例えば、Ｖａｌ３７Ｐｈｅ、Ｇｌｙ４４Ｇｌｕ、Ｌｅｕ４５Ａｒｇ、Ｔｒｐ４７Ｇｌｙのいずれかの変異を導入することが挙げられる（数値はＫａｂａｔ  Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ、ｅｄｉｔ、１９９１に記載）。
【００３９】
（標的物質捕捉分子による標的物質捕捉形態）
本発明の標的物質捕捉分子は、上記のように、標的物質との結合部位が、少なくとも１つの第一のドメインと、少なくとも１つの第二のドメインとからなる構造を有する。このように２以上の結合のためのドメインを有し、かつ異なる結合様式のドメインの組合せ（第一のドメインと第二のドメイン）を有することで、一つの捕捉分子に複数のドメインに由来する複数の結合機能を付与することができる。
【００４０】
本発明の捕捉分子の複数のドメインに由来する結合機能の１つを単一で利用してもよいし、２以上を同時に利用しても良い。
【００４１】
複数のドメインの結合機能を同時に利用する場合は、捕捉分子は、複数のドメインが標的物質に略同時に結合し、標的捕捉分子−標的物質からなる複合体を形成可能なものであることがより好ましい。複数のドメインがともに標的物質と結合した状態の複合体の形成が可能となることにより、個々の結合部位でのＫDのみならずそれらの相乗効果により捕捉分子として対標的物質に対する複合体形成能（ａｖｉｄｉｔｙ）をより向上させることが可能である。
【００４２】
例えば、ドメインが抗体のハイパーバリアブルループ構造を有するものである場合に、標的物質のエピトープ部分に対する高い認識力が得られていても、結合力が十分でない場合はドメインと標的物質の結合が安定して得られない。しかし、ハイパーバリアブルループ構造を有するドメインを２以上配置することで高い認識力を維持しつつ結合力の向上を図ることが可能となる。一方、ハイパーバリアブルループ構造以外の構造により標的物質との結合部位が形成されているドメインを用いた捕捉分子の場合には、標的物質のハイパーバリアブルループ構造では認識し難い部位に対しての認識力を得ることができる。更に、１つのドメインでは目的とする結合力が得られない場合でも複数のドメインを配置することで結合力の向上を図ることが可能となる。
【００４３】
更に、ハイパーバリアブルループ構造以外の構造によるドメインの結合特性により従来の抗体／抗体断片では安定な抗原−抗体複合体の形成が難しいかった物質に対しても安定な複合体の形成を図ることができる。
【００４４】
１つの捕捉分子に配置した複数のドメインのそれぞれが標的物質の異なる部位に結合した状態の複合体を形成するには、この複合体の形成に必要な立体配置をこれらの複数のドメインが形成することが可能な構造を、捕捉分子が有していることが必要である。
【００４５】
（ポリペプチド鎖会合部）
本発明の標的物質捕捉分子は、複数のポリペプチド鎖が会合した会合体として形成される。この会合体の形成は各ポリペプチド鎖の有する会合部を介して行なわれる。ポリペプチド会合部は、それらが構成する捕捉分子と標的物質の結合を妨げない上においてはどのような位置にあっても構わない。例えば、各ドメインにおいて標的結合部位と異なる位置が前記ポリペプチド会合部位であっても構わない。また、各ポリペプチド鎖において、標的物質と結合する結合ドメインと上述したようなポリペプチド会合部を分離した部位として有しても良い。このようなポリペプチド会合部の会合は、共有結合、非共有結合のいずれであってもよい。本発明でいうところの非共有結合とは、ファン・デル・ワールスカ、水素結合、イオン結合、疎水相互作用を含み、これらは前記ポリペプチド会合部、特に会合部分のアミノ酸残基に起因するものである。
【００４６】
好ましくは、相補的な相互作用を有するペプチドを会合部として配置する。相補的な相互作用を有するものであれば、会合部はオリゴペプチドであっても、複数のドメインから形成されるタンパク質であってもどちらでもよい。具体的には、β―ガラクトシダーゼのアルファドメイン、オメガドメイン等の利用も挙げられる。抗体断片ＶＨ及びＶＬを使用しても会合部としても使用することも可能である。また、天然のタンパク質構造にも多く見られるα−ヘリカルコイルドコイル構造を利用することも可能である。α−ヘリカルコイルドコイル構造は数本のアルファ−ヘリックスが相互作用（会合）しながら巻き付き合った構造である。７残基のアミノ酸がへリックス２回転に対応し、７つの位置は図１で示すようにａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇで表記されることが多い。ａ、ｄはヘリックス間の会合に重要な疎水アミノ酸（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、）やＧｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇが挙げられる。取り分けＶａｌ、Ｉｌｅであるでことが望ましい。これら会合面のアミノ酸の選択によっては複数のアルファヘリックスから構成されるコイルドコイルを作ることも可能である。また、ａ、ｄの位置にＨｉｓを導入することにより共存する金属イオンＣｏ（II）、Ｎｉ（II）によりコイルドコイル構造形成を誘導することも可能である。
【００４７】
このようなポリペプチド会合部のモデル構造としては、いくつかの反復アミノ酸を有するペプチドからなる転写因子ＧＣＮ４、癌遺伝子Ｆｏｓ、Ｊｕｎ等のロイシンジッパ−が挙げられる。本発明の捕捉分子は、少なくとも第一の結合ドメインと第二の結合ドメインは異なる標的物質の異なる部位に結合するものあるので第一の結合ドメインと第二の結合ドメインに融合するアルファヘリカルコイルドコイルはホモダイマーを形成し難いことが望ましい。このような意味においては、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ等のヘテロダイマー、ヘテロ多量体を形成することが望ましい。また、第一の結合ドメインと融合するアルファヘリカルコイルドコイルのｅ、ｇの位置をがＧｌｕ、第二のそれらをＬｙｓとすることで安定なヘテロコイルドコイル構造を作ることが知られている。
【００４８】
また、相反した荷電を有するポリペプチド鎖からなるポリペプチド会合部とすることも可能である。このようなポリペプチド会合部には、各ポリペプチド鎖の生産性や結合ドメインの標的物質との結合に必要な構造形成を妨げないサイズがあることが必要である。具体的には、５０アミノ酸以下であり、より好ましくは１５乃至３５アミノ酸である。また、後述する表面プラズモン共鳴法、特に局在表面プラズモン共鳴法を用いた検出を行う場合、検出素子上に生じる空間的な電場の分布、強度に対応しうる最適な範囲にポリペプチド会合部の分子長を設計し、検出素子の感度を向上させることも可能である。
【００４９】
また、上記ポリペプチド会合部またはその周辺において共有結合を形成させることも本発明の捕捉分子の安定化という点において有効な手段である。例えば、ある特定位置にＣｙｓを導入することにより分子間シスフィルド結合を形成させることも可能である。こうした位置は、上記ポリペプチド会合間のペプチド鎖の会合部であるａ、ｄの位置にあるアミノ酸、またはｇ、ｅであることが好ましい。結合ドメインの標的物質との結合を妨げないように他方のポリペプチド会合部の位置に対応するアミノ酸位置である。例えば、二本鎖からなるアルファヘリカルコイルドコイルの場合、ａ−ａ'位置のジスルフィド結合よりもｄ'−ｄ位置のジスルフィド結合を形成させる方がエネルギー的に安定であることが知られている。三以上である場合においても適宜選択して導入することが可能である。また、上記と同様な考え方において光架橋基修飾や光架橋基を導入した非天然アミノ酸を導入してもよい。この場合、係わる全てのポリペプチドに各一つの光官能基等を導入することはなく、少なくとも二本のポリペプチド鎖に対して会合部及びその周辺に一つの光官能基等が導入されていることが望ましい。三以上のポリペプチド鎖による多量体を形成する場合、それらの導入位置は配置を踏まえた上で適宜検討することが好ましい。
【００５０】
会合部は、結合ドメインと標的物質の結合を妨げないような配置になるように設計されることが好ましく、一例として、前記抗体断片を結合ドメインとする場合、一般的に抗体断片Ｃ末に融合され融合タンパク質として発現することが好ましい。
【００５１】
（捕捉分子作製方法）
以下に、本発明の捕捉分子の作製方法について説明する。本発明の捕捉分子、またはその構成要素となる各々のポリペプチド鎖は、次のようにして合成できる。
【００５２】
つまり、既知のタンパク発現用の宿主細胞を、宿主細胞に応じて設計した目的タンパク質の発現用のベクターにて形質転換し、宿主細胞内のタンパク合成システムを用いて、宿主細胞内で目的とするタンパク質を合成することができる。その後、宿主細胞内に合成された、または細胞質外に分泌された目的タンパク質をそれぞれ細胞内部画分または細胞培養上清から精製することにより回収する。分泌型の発現系を用いた場合、培養上清またはペリプラズムから目的タンパク質を取得することになり、精製工程を簡素化することが可能である。
【００５３】
また、細胞内の還元状態下では安定した活性型フォールディングを形成しにくい場合が多いが、分泌型の発現系を用いることで、安定した活性型フォールディングを形成した目的タンパク質を細胞外（培養上清中）やペリプラズム中に得ることができる。従って、分泌型発現系は、例えば、分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質の発現において活性型タンパク質を安定して得る方法として好ましい。更には、細胞質内にて活性型の組換えタンパク質を高いレベルで発現させた場合、組換えタンパク質が、細胞内で不溶性顆粒（インクルージョンボディ）化する恐れもある為、速やかに細胞外に分泌させ、凝集しない濃度にすることが好ましい。
【００５４】
例えば、大腸菌を宿主細胞として用いる場合、目的タンパク質をコードする核酸の５'側にｐｅｌＢに代表される従来既知のシグナルペプチドをコードする核酸を配する。このことにより、細胞外分泌の為のＳｅｃ系を介して細胞質外に目的タンパク質の分泌発現を図ることができる。また、一つの発現用ベクター中に、本発明の捕捉分子の構成要素となる複数のポリペプチド鎖をコードした部分を配置することも可能である。その場合、構成要素となる各ポリペプチド鎖をコードする核酸の５'側にｐｅｌＢをコードする核酸を配置し、発現時に細胞質外への分泌を促すことができる。
【００５５】
このようにシグナルペプチドをＮ末端に融合した本発明のポリペプチド鎖は、ペリプラズマ画分及び培地上清画分から精製することができる。
【００５６】
同様に菌体外分泌を行う方法としては、上記Ｓａｃ分泌系とは異なるＴｗｉｎ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ−Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＡＴ）Ｓｙｓｔｅｍを利用する方法がある。この方法は、細胞質においても活性型としてフォールディングされるタンパク質には有用な方法になり得る。シグナルペプチドとしては二つのＡｒｇが含まれる従来公知のシグナルペプチドを利用することが可能である。この他、従来公知であるペリプラズム局在タンパク質Ｄｓｂ系などと融合して用いる方法を用いてもよい。
【００５７】
この場合の精製方法としては以下を挙げることができる。即ち、上記培養上清及びペリプラズム画分から硫酸アンモニウム等によりタンパク質成分を濃縮した後に再度適当なバッファーに懸濁させる。そして、例えば、従来既知の組換えタンパク質精製タグであるＨｉｓ−タグを目的のタンパク質のＮまたはＣ末に挿入した場合、ニッケル等の金属キレートカラム等を使用することにより目的のタンパク質を精製することができる。
【００５８】
また、菌体内で、目的とする活性型タンパク質を高濃度発現することが可能な場合は、菌体内でタンパク質を発現させ、細胞を破壊し、細胞質可溶画分より目的タンパク質を得ることも可能である。精製方法としては、前記Ｈｉｓ−タグの以外にＧＳＴ−タグ等従来既知の組換え精製用精製タグを利用することができる。ＧＳＴは、単体でも非常に可溶性の高いタンパク質であり、これと融合した目的タンパク質の可溶化においても効果が期待できる。菌体内に発現した本発明のポリペプチド鎖が不溶性顆粒で得ることも可能である。この場合、培養液から得られた菌体をフレンチプレスや超音波により破砕した細胞破砕液から前記不溶性顆粒を遠心分離することができる。得られた不溶性顆粒画分を尿素、塩酸グアニジン塩を含むの従来既知の変性剤を含んだ緩衝溶液で可溶化した後に、変性条件下で前記と同様にカラム精製をすることができる。得られたカラム溶出画分に対するリフォールディング作業によって、変性剤除去と活性構造再構築を行うことができる。リフォールディング方法としては、従来既知の方法から適宜用いることも可能である。例えば、段階透析法や希釈法など従来既知の方法を目的のタンパクに応じて用いることが可能である。
【００５９】
その他の作製方法としては、細胞抽出液を用いて生体外での目的のタンパク質発現をすることも可能であることが知られている。好適に用いられる細胞としては、大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球等が挙げられる。
【００６０】
しかしながら、上記無細胞抽出液によるタンパク合成は還元条件下で行われることが一般的である。必要に応じて、分子内のジスルフィド結合を形成させるために何らかの処理を行う方がより好ましい。
【００６１】
複数のポリペプチド鎖を会合させて捕捉分子を形成する場合には、各ポリペプチド鎖は、同一宿主細胞内で発現させることも可能であるし、別の宿主細胞を使用して発現した後に共存させて、会合させて複合体化させることも可能である。
【００６２】
更に、本発明には、本発明の捕捉分子であるポリペプチド鎖をコードする核酸及びそれを含む上記タンパク質発現用プラスミドを含む。
【００６３】
（標的物質）
本発明の捕捉分子における捕捉対象としての標的物質は、非生体物質と生体物質に大別される。
【００６４】
非生体物質として産業上利用価値の大きいものと以下、列記する。
【００６５】
即ち、環境汚染物質としての塩素置換数／位置の異なるＰＣＢ類、同じく塩素置換数／位置の異なるダイオキシン類、いわゆる環境ホルモンと呼ばれる内分泌撹乱物質（例：ヘキサクロロベンゼン、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、アミトロール、アトラジン、アラクロール、ヘキサクロロシクロヘキサン、エチルパラチオン、クロルデン、オキシクロルデン、ノナクロル、１，２−ジブロモ−３−クロロプロパン  、ＤＤＴ、ケルセン、アルドリン、エンドリン、ディルドリン、エンドスルファン（ベンゾエピン）、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキサイド、マラチオン、メソミル、メトキシクロル、マイレックス、ニトロフェン、トキサフェン、トリフルラリン、アルキルフェノール（炭素数５〜９）、ノニルフェノール、オクチノニルフェノール、４−オクチルフェノール、ビスフェノールＡ、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル、フタル酸ブチルベンジル、フタル酸ジ−ｎ−ブチル、フタル酸ジシクロヘキシル、フタル酸ジエチル、ベンゾ（ａ）ピレン、２，４ージクロロフェノール、アジピン酸ジ−２−エチルヘキシル、ベンゾフェノン、４−ニトロトルエン、オクタクロロスチレン、アルディカーブ、ベノミル、キーポン（クロルデコン）、マンゼブ（マンコゼブ）  、マンネブ、メチラム、メトリブジン、シペルメトリン、エスフェンバレレート、フェンバレレート、ペルメトリン、ビンクロゾリン、ジネブ、ジラム、フタル酸ジペンチル、フタル酸ジヘキシル、フタル酸ジプロピル）等である。
【００６６】
生体物質として適用できるものを以下、列記する。
【００６７】
即ち、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの複合体から選択される生体物質が含まれ、更に詳しくは、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質から選択される生体分子を含んでなるものであり、具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原、抗体、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプタ、酵素、ペプチド、スフィンゴ糖、スフィンゴ脂質の何れかから選択された物質を含むものであれば良い。更には、前記の「生体物質」を産生する細菌や細胞そのものも、本発明が対象とする「生体物質」として標的物質となり得る。
【００６８】
具体的なタンパク質としては、いわゆる疾病マーカーが挙げられる。
【００６９】
具体例を以下、列記する。
【００７０】
胎児期に肝細胞で産生され胎児血中に存在する酸性糖蛋白であり、肝細胞癌（原発性肝癌）、肝芽腫、転移性肝癌、ヨークサック腫瘍のマーカーとなるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、肝実質障害時に出現する異常プロトロンビンであり、肝細胞癌で特異的に出現することが確認されるＰＩＶＫＡ−ＩＩ、免疫組織化学的に乳癌特異抗原である糖蛋白で、原発性進行乳癌、再発・転移乳癌のマーカーとなるＢＣＡ２２５、ヒト胎児の血清、腸および脳組織抽出液に発見された塩基性胎児蛋白であり、卵巣癌、睾丸腫瘍、前立腺癌、膵癌、胆道癌、肝細胞癌、腎臓癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、大腸癌のマーカーである塩基性フェトプロテイン（ＢＦＰ）、進行乳癌、再発乳癌、原発性乳癌、卵巣癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＣＡ１５−３、膵癌、胆道癌、胃癌、肝癌、大腸癌、卵巣癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＣＡ１９−９、卵巣癌、乳癌、結腸・直腸癌、胃癌、膵癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＣＡ７２−４、卵巣癌（特に漿液性嚢胞腺癌）、子宮体部腺癌、卵管癌、子宮頸部腺癌、膵癌、肺癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＣＡ１２５、上皮性卵巣癌、卵管癌、肺癌、肝細胞癌、膵癌マーカーとなる糖蛋白であるＣＡ１３０、卵巣癌（特に漿液性嚢胞腺癌）、子宮体部腺癌、子宮頸部腺癌のマーカーとなるコア蛋白抗原であるＣＡ６０２、卵巣癌（特に粘液性嚢胞腺癌）、子宮頸部腺癌、子宮体部腺癌のマーカーとなる母核糖鎖関連抗原であるＣＡ５４／６１（ＣＡ５４６）、大腸癌、胃癌、直腸癌、胆道癌、膵癌、肺癌、乳癌、子宮癌、尿路系癌等の腫瘍関連のマーカー抗原として現在、癌診断の補助に最も広く利用されている癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、膵癌、胆道癌、肝細胞癌、胃癌、卵巣癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＤＵＰＡＮ−２、膵臓に存在し、結合組織の弾性線維エラスチン（動脈壁や腱などを構成する）を  特異的に加水分解する膵外分泌蛋白分解酵素であり、膵癌、膵嚢癌、胆道癌のマーカーとなるエラスターゼ１、ヒト癌患者の腹水や血清中に高濃度に存在する糖蛋白であり、肺癌、白血病、食道癌、膵癌、卵巣癌、腎癌、胆管癌、胃癌、膀胱癌、大腸癌、甲状腺癌、悪性リンパ腫のマーカーとなる免疫抑制酸性蛋白（ＩＡＰ）、膵癌、胆道癌、乳癌、大腸癌、肝細胞癌、肺腺癌、胃癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＮＣＣ−ＳＴ−４３９、前立腺癌のマーカーとなる糖蛋白質であるγ−セミノプロテイン（γ−Ｓｍ）、ヒト前立腺組織から抽出された糖蛋白であり、前立腺組織のみに存在し、それゆえ前立腺癌のマーカーとなる前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺から分泌される酸性ｐＨ下でリン酸エステルを水解する酵素であり、前立腺癌の腫瘍マーカーとして用いられる前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、神経組織及び神経内分泌細胞に特異的に存在する解糖系酵素であり、肺癌（特に肺小細胞癌）、神経芽細胞腫、神経系腫瘍、膵小島癌、食道小細胞癌、胃癌、腎臓癌、乳癌のマーカーとなる神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、子宮頸部扁平上皮癌の肝転移巣から抽出・精製された蛋白質であり、子宮癌（頸部扁平上皮癌）、肺癌、食道癌、頭頸部癌、皮膚癌のマーカーとなる扁平上皮癌関連抗原（ＳＣＣ抗原）、肺腺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌���膵癌、卵巣癌、子宮癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるシアリルＬｅX−ｉ抗原（ＳＬＸ）、膵癌、胆道癌、肝癌、胃癌、大腸癌のマーカーとなる糖鎖抗原であるＳＰａｎ−１、食道癌、胃癌、直腸・結腸癌、乳癌、肝細胞癌、胆道癌、膵癌、肺癌、子宮癌のマーカーであり、特に他の腫瘍マーカーと組み合わせて進行癌を推測し、再発予知・治療経過観察として有用である単鎖ポリペプチドである組織ポリペプタイド抗原（ＴＰＡ）、卵巣癌、転移性卵巣癌、胃癌、大腸癌、胆道系癌、膵癌、肺癌のマーカーとなる母核糖鎖抗原であるシアリルＴｎ抗原（ＳＴＮ）、肺の非小細胞癌、特に肺の扁平上皮癌の検出に有効な腫瘍マーカーであるシフラ（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ；ＣＹＦＲＡ）、胃液中に分泌される蛋白消化酵素であるペプシンの２種（ＰＧ  Ｉ・ＰＧ  ＩＩ  ）の不活性型前駆体であり、胃潰瘍（特に低位胃潰瘍）、十二指腸潰瘍（特に再発、難治例）、ブルンネル腺腫、ゾーリンガーエリソン症候群、急性胃炎のマーカーとなるペプシノゲン（ＰＧ）、組織障害や感染により、血漿中で変化する急性相反応蛋白であり、急性心筋梗塞等により心筋に壊死が起こると、高値を示すＣ−反応性蛋白（ＣＲＰ）、組織障害や感染により、血漿中で変化する急性相反応蛋白である血清アミロイドＡ蛋白（ＳＡＡ）、主に心筋や骨格筋に存在する分子量約１７５００のヘム蛋白であり、急性心筋梗塞、筋ジストロフィー、多発性筋炎、皮膚筋炎のマーカーとなるミオグロビン、骨格筋，心筋の可溶性分画を中心に存在し、細胞の損傷によって血液中に遊出する酵素であって、急性心筋梗塞、甲状腺機能低下症、進行性筋ジストロフィー症、多発性筋炎のマーカーとなるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）（骨格筋由来のＣＫ−ＭＭ型，脳，平滑筋由来のＣＫ−ＢＢ型，心筋由来のＣＫ−ＭＢ型の３種のアイソザイム及びミトコンドリア・アイソザイムや免疫グロブリンとの結合型ＣＫ（マクロＣＫ））、横紋筋の薄いフィラメント上でトロポニンＩ，Ｃとともにトロポニン複合体を形成し，筋収縮の調節に関与している分子量３９，０００の蛋白であり、横紋筋融解症、心筋炎、心筋梗塞、腎不全のマーカーとなるトロポニンＴ、骨格筋・心筋いずれの細胞にも含まれる蛋白であり，測定結果の上昇は骨格筋，心筋の障害や壊死を意味するため、急性心筋梗塞症、筋ジストロフィー、腎不全のマーカーとなる心室筋ミオシン軽鎖Ｉ、また、近年ストレスマーカーとして注目されてきているクロモグラニンＡ、チオレドキシン、８−ＯｈｄＧ、等が挙げられる。
【００７１】
本発明の捕捉分子を利用した標的物質の検出方法は、捕捉分子と試料を反応させる工程と、試料に標的物質が含まれている場合における標的物質と捕捉分子との結合を検出する工程と、を有する。
【００７２】
また、ことを特徴とする標的物質の検出方法。
【００７３】
また、本発明の標的物質検出用のキットは、捕捉分子と、捕捉分子と標的物質との結合を検出するための試薬とを有する。標的物質検出用のキットは、必要に応じて、捕捉分子と標的物質との反応のための試薬や装置、捕捉分子と標的物質の結合を検出するための装置などを更に有することができる。以下、標的物質の検出方法およびそれに用いる装置及び試薬などの一例について述べる。
【００７４】
（検出用キット）
本発明の捕捉分子は、標的物質の捕捉用として用いることができ、この標的物質の捕捉工程を利用した種々の用途に適用可能である。特に、本発明の捕捉分子は、標的物質の検出方法及びそのためのキットに好適に利用できる。
【００７５】
（センサ素子）
本発明のセンサ素子には既知の種々のセンサ素子の構造を用いることができる。しかし、蛍光色素などの標識分子を必要としない、更には標的物質と捕捉分子の結合反応の過程をリアルタイムでモニタリングできることから表面プラズモン共鳴法、局在表面プラズモン共鳴法を用いるセンサ素子が好ましい。特に、局在表面プラズモン共鳴法による検出は金属微粒子を基板表面に固定した簡単な検出用素子構成にて実施することが可能である。このようなセンサ素子装置においては、前記金属微粒子表面近傍の物質の脱吸着変化を誘電率変化として光学特性変化（特定波長での吸収変化または吸収ピークシフト）にて観察することが可能である。
【００７６】
前記局在表面プラズモンセンサに用いる好適な検出用素子としては、基板と、該基板の表面に設けられた局在表面プラズモン共鳴発生用の金属構造体からなるセンサ素子と、前記金属構造体上に配置された標的物質捕捉体と、を有する標的物質検出用素子である。
【００７７】
（金属構造体）
金属構造体としては、局在表面プラズモン共鳴を発生するものから適宜選択して用いることができる。金属構造体例としては、基板上に配置された金属微粒子または基板上に形成される金属薄膜パターン等が挙げられる。これらは、基板上の金属構造体の形状等を制御することが比較的に容易であり、これらを用いたセンサ素子の測定バラツキを抑える点においても好ましい。
【００７８】
（金属微粒子）
金属微粒子の好ましい材料としては、プラズモン共鳴現象を生じうる金属が含まれていればよく、このような金属としては、金、銀、銅が好ましい。特に銀は、耐食性が弱いものの、感度が高く、好適に用いられる。また、金は、耐食性が高く安定な検出素子を作製することができる、チオールやアミノ基等用いた表面修飾や固定化が容易であるといった利点を有し、好適に用いられる。表面をアミノ基もしくはチオールにて処理した基板を用いることで金属微粒子を固定することができる。固定密度等は処理する金属微粒子溶液の金属微粒子含有量により調整することが可能である。金属微粒子の大きさは、所望の検出を可能とする範囲から選択すればよい。
【００７９】
（金属薄膜パターン）
また、金属薄膜パターン形成に用いる材料としては、金、銀、銅及びアルミニウムのいずれかの金属、もしくはそれらの合金を用いることができる。金属薄膜パターン形状は、金属が基板に対して凸型であるドット形状が配列したものや金属薄膜パターンに凹型の孔形状を配列したもの等が挙げられる。形状としては、丸、正方形、三角、長方形のドット、孔の両パターン等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８０】
金属薄膜パターンは、基板との密着性の観点から、基板との間にクロムあるいはチタンなどの薄膜を介して、基板上に形成されていてもよい。
【００８１】
金属薄膜パターン形状は、１０ｎｍから２００ｎｍ程度の膜厚で形成されることが好ましい。
【００８２】
金属薄膜パターン形状の平面における大きさ、すなわち、外周部における任意の一点から他の点までの距離は、１０ｎｍ〜１４５０ｎｍの範囲内にあることが好ましい。更には、５０ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲内にあることが好ましい。この場合、任意の２点間の最大距離がこの範囲に入っていればよい。
【００８３】
金属薄膜パターンは、必要に応じて基板上に１個以上を設ける。複数個設ける場合には、各金属薄膜パターンの間隔は、好ましくは５０ｎｍ〜２０００ｎｍ、より好ましくは１５０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲から選択した距離とすることが好ましい。これは、金属薄膜パターン同士のプラズモンによる相互作用により空間的な電場の分布・強度に影響があるためである。また、間隔が大きくなると、金属構造体の密度が下がり、信号強度が弱くなってしまうため、特殊な光学系を適用する必要性が出てくるので、上記範囲にあることが好ましい。
【００８４】
基板上に複数の金属薄膜パターンを設ける場合には、平面形状及びその大きさの少なくとも１つにおいて異なる複数種類の金属薄膜パターンを基板上に設けることができる。
【００８５】
（基板）
本発明に用いる基板としては、金属構造体の形成が可能で、且つ、プラズモン共鳴法による検出を可能とするような光学特性を有する材料から選択することができる。具体的にはガラス基板、石英基板、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートなどのプラスチック材料基板等が挙げられる。
【００８６】
（センサ素子製造方法）
本発明にかかる金属薄膜パターン形状のセンサ素子の製造方法の一例を示す。まず、基板上に金属薄膜をスパッタ法あるいは蒸着法により成膜する。その上に電子線レジストをスピンコートにより成膜し、電子線描画装置で露光し、現像後レジストパターンを得る。その後、不要な金属薄膜をエッチングし、レジストを除去して、所望の形状のアレイ状に配置した金属構造体を形成する。電子線描画装置の他、集束イオンビーム加工装置、Ｘ線露光装置、ＥＵＶ露光装置によるパターニングで作製することもできる。更には、モールド法により作製した微細な凹凸の基板を用いた作製方法も可能である。この場合、基板上に金属薄膜をスパッタ法あるいは蒸着法により成膜する。次に表面の金属膜を研磨し、所望の金属構造体を基板上に形成する。
【００８７】
（捕捉分子の固定方法）
固定方法としては、従来既知の物理吸着法、化学架橋法から選択して用いることが可能であるが、素子上の捕捉分子を有効に利用する上では配向性を持たせる固定法が好ましい。一例として、本発明の捕捉分子を構成するポリペプチド鎖Ｃ末端にＣｙｓを導入することが挙げられる。センサー素子表面が金（Ａｕ）である場合であれば金―チオールの配位による配向を得ることができる。また、センサー素子表面にタンパク質非特異吸着防止を目的とした何らかのコーティングを行う際もコーティング表面にマレイミド基が配位されるような加工を施すことにより、捕捉分子の固定化が可能である。
【００８８】
Ｃ末端に導入したＣｙｓ残基を利用して捕捉分子の固定化を行う場合、標的物質との結合部位を有するドメインやポリペプチド鎖会合部がＣｙｓ残基を有さないか、または導入した基板結合用Ｃｙｓ残基による影響が少ないように分子設計を行うことがより好ましい。これらのドメンイン等がＣｙｓを有することにより、酸性環境下においては誤った位置でのジスルフィド形成がされる可能があり、生産量、収量において問題となることも懸念される。
【００８９】
一方、表面材料親和性ペプチドや抗体断片を本発明の捕捉分子のＮ末端またはＣ末端にを融合することも可能である。親和性ペプチドとしては、従来既知の種々のペプチド（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｖｏｌ．２、ｐｐ５７７、２００３）に記載されるペプチドを融合することができる。融合する方法としては、捕捉分子を構成するポリペプチド鎖をコードする核酸の５'末端または３'末端に前記親和性ペプチドをコードする核酸を挿入し、種々の発現ベクターに導入することにより融合タンパクを得る方法を挙げることができる。抗体断片を介する方法としては、固定用タグとして用いる抗体の抗原を予めセンサー素子上に固定しても構わない。
【００９０】
また、センサー素子表面を認識する抗体断片であっても構わない。この抗体断片を、捕捉分子の標的物質との結合を妨げない位置に配置することでセンサー素子表面への捕捉分子の固定化が可能となる。この抗体断片としては、センサー素子表面を認識する抗体のＶＨやＶＬを用いることができる。捕捉分子が複数のポリペプチド鎖を会合させた構成を有する場合には、次のようにすることもできる。
【００９１】
即ち、１つのポリペプチド鎖の会合部となる側の末端にセンサー素子表面に対して親和性のあるＶＨを配置する。そして、これに会合させるポリペプチド鎖の会合部に、このＶＨに対して相補性を有し、かつセンサー素子表面に対して親和性のあるＶＬを、直接またはリンカーとなるペプチドを介して設ける。これにより、複数のポリペプチド鎖を会合させて捕捉分子とするととともに、センシグ素子表面にこれを固定することができる。また、後述する表面プラズモン共鳴法、特に局在表面プラズモン共鳴法を用いた検出を行う場合、次のようにすることが好ましい。即ち、検出素子上に生じる空間的な電場の分布、強度に対応しうる最適な範囲において、本発明の捕捉分子が標的分子を捕捉できるように上記基板固定部位を設計することがより望ましい。
【００９２】
また、検出用素子の表面は、いわゆる非特異吸着による共雑物の吸着によるシグナルを防止するために、以下のコーティングを行うことができる。即ち、本発明の捕捉分子の結合部位の露出や自由度が妨げられない程度に、スキムミルクやカゼイン、ウシ血清アルブミン、リン脂質、ポリエチレングリコールなどによるコーティングである。
【００９３】
（検出装置）
標的物質の検出装置としては、捕捉分子と標的物質との結合の検出方式に応じた構成を有するものが使用される。例えば、上述した検出素子を金コロイドを用いた素子とした場合、検出装置は、金属の構造体を持つ検出素子と検出素子からの信号を検出するための検出手段を有する構成とすることができる。検出手段は、光源と分光器、レンズ類から構成される光学検出系と、検体（試料）を検出素子まで移動させ素子との反応を起こさせるための、反応用ウェル、流路、送液機構等からなる送液系とを有することができる。光源としては、可視領域から近赤外領域までの波長領域をカバーできるものを用いることができる。光学測定には、吸収スペクトル、透過スペクトル、散乱スペクトル、反射スペクトルを用いることができる。最も好ましくは、吸収スペクトルのピーク波長あるいは、ピークの吸収強度を利用する。金属の構造体による検出素子は、標的物質を特異的に結合すると、吸収スペクトルのピーク波長は、長波長側にシフトし、吸収強度は増大する。そのシフト量の程度によって、あらかじめ作製しておいた標的物資に対する検量線から標的物質の量を定量することができる。本発明の検出素子が、局在プラズモン共鳴を利用している場合は、金属の構造体近傍では、局所的な電場増強が起こる。この現象は、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）や表面プラズモン蛍光分光法（ＳＰＦＳ）などの測定法にも応用でき、これらの方法による標的物質の定量も可能である。
【００９４】
反応用ウェルや流路は、いわゆるμＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）型の装置で用いられているポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）基板によって、作製されるのが容易である。このＰＤＭＳ基板を検出素子を作製してある基板と貼りあわせて図２のような形状にて使用するものとする。送液機構としては、マイクロピストンポンプやシリンジポンプなどを用いる。
【実施例】
【００９５】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００９６】
（実施例１）Ｈｕｍａｎ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（ＨｕＬ）結合ＶＨＨコードＤＮＡ断片作製
Ｈｕｍａｎ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ結合ＶＨＨの配列としてＮａｔｕｒｅ、２００３、４２４、ｐ７８３−７８８、ＰＤＢ：１ＯＰ９（配列番号：１、配列番号：２）を参照しｏｖｅｒ−ｌａｐ  ＰＣＲにて合成ＤＮＡとして作製する。ＰＣＲは、ｐｆｕ−ｔｕｒｂｏ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて業者推奨の方法にて行う。'５末端にＮｃｏＩ、'３末端にはＮｏｔＩの制限酵素サイトを設計する。得られるＰＣＲ断片をＨｕＬＡとする。（配列番号：３、配列番号：４）
配列番号：２
Q V Q L Q E S G G G S V Q A G G S L R L S C S A S G Y T Y I S G W F R Q A P G K E R E G V A A I R S S D G T T Y Y A D S V K G R F T I S Q D N A K N T V Y L Q M N S L K P E D T A M Y Y C A A T E V A G W P L D I G I Y D Y W G Q G T E V T V S S
配列番号：４
P W Q V Q L Q E S G G G S V Q A G G S L R L S C S A S G Y T Y I S G W F R Q A P G K E R E G V A A I R S S D G T T Y Y A D S V K G R F T I S Q D N A K N T V Y L Q M N S L K P E D T A M Y Y C A A T E V A G W P L D I G I Y D Y W G Q G T E V T V S S A A 。
【００９７】
（実施例２）
Ｈｕｍａｎ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（ＨｕＬ）結合ＶＨコードＤＮＡ断片作製実施例１と異なる部位にてＨｕＬと結合するＦｖ（ＰＤＢ：1ＢＶＫ）のＶＨドメインを参照して、（配列番号：５、配列番号：６）に示すＶＨドメインコードＤＮＡをｏｖｅｒ−ｌａｐ  ＰＣＲにて合成ＤＮＡとして作製する。ＰＣＲは、ｐｆｕ−ｔｕｒｂｏ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて業者推奨の方法にて行う。'５末端にＮｃｏＩ、'３末端にはＮｏｔＩの制限酵素サイトを設計する。得られるＰＣＲ断片をＨｕＬＢとする。
配列番号：６
Q V Q L Q E S G P G L V R P S Q T L S L T C T V S G F S L T G Y G V N W F R Q P P G R E R E W I G M I W G D G N T D Y N S A L K S R V T M L K D T S K N Q F S L R L S S V T A A D T A V Y Y C A R E R D Y R L D Y W G Q G S L V T V S S G 。
【００９８】
（実施例３）ＨｕＬ結合ＶＨタンパク質ＨｕｌＡ／ＨｕｌＢ発現プラスミドの作製
実施例１及び２で得られるＰＣＲ断片ＨｕｌＡ／ＨｕＬＢを用いてＨｕＬ結合ＶＨタンパク質発現プラスミドをそれぞれ作製する。ここで用いるベクターとしては、ｐＥＴ−２４ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）とする。
（１）実施例１で得られるＨｕＬＡ、実施例２で得られるＨｕＬＢ及びｐＥＴ−２４ｄについてＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ（ともにＮｅｗ  Ｅｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて、切断反応を行う。具体的には、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｉｔｅｎ記載の業者推奨の方法にて制限酵素による切断反応をそれぞれ行う。
（２）上記の結果得られる酵素反応溶液をアガロースゲル電気泳動をそれぞれ行う。
（３）ＨｕＬ−Ｂ反応液の約０．４ｋｂｐ及びｐＥＴ−２４ｄ反応液の５．３ｋｂｐを切り出し、精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製：商品名Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ）にてそれぞれ精製する。
（４）次、上記にて得られたＤＮＡ断片（ＨｕＬＡ断片とｐＥＴ−２４ｄの組み合わせ、ＨｕＬＢ断片とｐＥＴ−２４ｄの組み合わせ）をＴ４−Ｌｉｇａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）にて業者推奨の方法にて２時間ライゲーションを行う。
（５）得られるライゲーション溶液を用いて、ＪＭ１０９コンピテントセル（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をヒートショック法（氷中→４２℃×９０ｓｅｃ→氷中）により形質転換を行う。ヒートショック後の溶液にＬＢ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス  ５ｇ、塩化ナトリウム  １０ｇ／Ｌ）７５０μＬを添加し、３７℃にて１時間振盪培養する。得られる培養液を６０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上清を７００μＬ廃棄する。
（６）残りの培養液と沈殿を攪拌し、ＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）寒天プレートに展開し、３７℃にて１６時間静置する。
（７）得られるコロニーを液体ＬＢ／アンピシリン培地にて一晩培養する。
（８）得られる菌体からＭｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＳＶ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、業者推奨の方法にてプラスミドを回収する。
（９）得られるプラスミドのシークエンス解析を行い、目的のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認する。ここで得られるプラスミドをｐＥＴ−ＨｕＬＡ及びｐＥＴ−ＨｕＬＢとする。
【００９９】
（実施例４）ＨｕＬ結合ＶＨタンパク質ＨｕＬＡ／ＨｕＬＢ発現
（１）形質転換
実施例３で得られるｐＥＴ−ＨｕＬＡ及びｐＥＴ−ＨｕＬＢにてＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換を行う。形質転換方法は、実施例３に用いたヒートショック法により行う。同様にＬＢ／アンピシリン寒天プレートに展開し、２８℃にて１６時間静置する。以下、ＨｕＬＡ及びＨｕＬＢに対してそれぞれ行う。
（２）予備培養
プレート上のコロニーを無作為に選択し、３．０ｍＬ  ＬＢ／ａｍｐ．培地にて２８℃にて一晩振盪培養を行なう。
（３）本培養
上記予備培養溶液を２×ＹＴ培地  ７５０ＭＬに植え継ぎ、更に培養を２８℃にて継続する。ＯＤ６００が０．８を越えた時点で、終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、更に２８℃にて終夜培養を行なう。
（４）精製
（４−１）細胞質画分の取得
得られる培養液を６０００ｒｐｍ、３０分間、４℃にて遠心する。培養上清を廃棄した後、菌体画分を得る。得られる菌体画分を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．９）、以下  Ｔｒｉｓ溶液、１５ｍＬを加え、十分に再懸濁させ、更にフレンチプレスにより菌体破砕を行う。菌体破砕溶液として細胞質画分を得る。
（４−２）金属キレートカラム
目的タンパク質のＣ末端に融合されたＨｉｓタグにより細胞質画分より目的タンパク質を精製する。
【０１００】
金属キレートカラム担体として、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いる。
カラム調整やサンプル負荷、及び洗浄工程は、前記業者の推奨方法に準拠し、４℃にて行った。目的であるＨｉｓタグ融合タンパク質の溶出は５００ｍＭイミダゾール／Ｔｒｉｓ溶液にて行なう。
（４−３）ゲルクロマトグラフィー
続いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ７５（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて、ゲルろ過による精製（バッファー条件：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、1ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ8.0、流速：０.７ｍＬ／ｍｉｎ）を４℃にて行う。ＨｕＬＡ及びＨｕＬＢともに約１.３ｋＤａの単量体タンパク質であることを示唆するピークを分取し、以下の評価を行う。
【０１０１】
上記溶出液に対して、外液をＴｒｉｓ溶液として再び透析を行い、溶出液中のイミダゾールの除去を行なう。更に、外液をリン酸バッファー（以下、ＰＢＳ）に替え、バッファー置換を行い、ＳＰＲ評価用溶液とする。
【０１０２】
（実施例５）ＳＰＲ評価
基板としてはＣＭ５（ビアコア社製）を用いて、業者推奨の方法にてＨｕＬを固定してＨｕＬ固定化チップとして評価に用いる。条件は以下の通り、ＲｕｎｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒ：０.１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ、流速：２０ｕＬ／ｍｉｎ、温度２５℃とする。ＳＰＲにて解離定数を評価した結果、ＨｕＬＡ：１０-7Ｍ、ＨｕＬＢ：１０-6Ｍとなり、共に固定化されたＨｕＬに対しての結合することが示される。
【０１０３】
（実施例６）Ｈｕｍａｎ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（ＨｕＬ）結合ＶＨＨコードＤＮＡ断片作製
Ｈｕｍａｎ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ結合ＶＨＨの配列としてＮａｔｕｒｅ、２００３、４２４、ｐ７８３−７８８、ＰＤＢ：１ＯＰ９（配列番号：１、配列番号：２）を参照しｏｖｅｒ−ｌａｐ  ＰＣＲにて合成ＤＮＡとして作製する。ＰＣＲは、ｐｆｕ−ｔｕｒｂｏ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて業者推奨の方法にて行う。'５末端にＮｃｏＩ、'３末端にはＥｃｏＲＩの制限酵素サイトを設計する。得られるＰＣＲ断片をＨｕＬＡ２とする。（配列番号：７、配列番号：８）
配列番号：８
P W Q V Q L Q E S G G G S V Q A G G S L R L S C S A S G Y T Y I S G W F R Q A P G K E R E G V A A I R S S D G T T Y Y A D S V K G R F T I S Q D N A K N T V Y L Q M N S L K P E D T A M Y Y C A A T E V A G W P L D I G I Y D Y W G Q G T E V T V S S E F 。
【０１０４】
（実施例７）
Ｈｕｍａｎ−Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（ＨｕＬ）結合ＶＨコードＤＮＡ断片作製実施例１と異なる部位にてＨｕＬと結合するＦｖ（ＰＤＢ：1ＢＶＫ）のＶＨドメインを参照して、（配列番号：９、配列番号：１０）に示すＶＨドメインコードＤＮＡをｏｖｅｒ−ｌａｐＰＣＲにて合成ＤＮＡとして作製する。ＰＣＲは、ｐｆｕ−ｔｕｒｂｏ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて業者推奨の方法にて行う。'５末端にＮｃｏＩ、'３末端にはＥｃｏＲＩの制限酵素サイトを設計する。得られるＰＣＲ断片をＨｕＬＢ２とする。
配列番号：１０
P W Q V Q L Q E S G P G L V R P S Q T L S L T C T V S G F S L T G Y G V N W F R Q P P G R E R E W I G M I W G D G N T D Y N S A L K S R V T M L K D T S K N Q F S L R L S S V T A A D T A V Y Y C A R E R D Y R L D Y W G Q G S L V T V S S G E F 。
【０１０５】
（実施例８）ＨｕＬ結合ＶＨタンパク質ＨｕｌＡ／ＨｕｌＢ発現プラスミドの作製
実施例１及び２で得られるＰＣＲ断片ＨｕｌＡ２／ＨｕＬＢ２を用いてＨｕＬ結合ＶＨタンパク質発現プラスミドをそれぞれ作製する。ここで用いるベクターとしては、ｐＥＴ−２４ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）とする。
（１）実施例１で得られるＨｕＬＡ、実施例２で得られるＨｕＬＢ及びｐＥＴ−２４ｄをＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ（ともにＮｅｗ  Ｅｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）にてＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｉｔｅｎ記載の業者推奨の方法にて制限酵素による切断反応をそれぞれ行う。
（２）上記の結果得られる酵素反応溶液をアガロースゲル電気泳動をそれぞれ行う。
（３）ＨｕＬ−Ｂ反応液の約０．４ｋｂｐ及びｐＥＴ−２４ｄ反応液の５．３ｋｂｐを切り出し、精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製：商品名Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ）にてそれぞれ精製する。
（４）次、上記にて得られたＤＮＡ断片（ＨｕＬＡ断片とｐＥＴ−２４ｄの組み合わせ、ＨｕＬＢ断片とｐＥＴ−２４ｄの組み合わせ）をＴ４−Ｌｉｇａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）にて業者推奨の方法にて２時間ライゲーションを行う。
（５）得られるライゲーション溶液を用いて、ＪＭ１０９コンピテントセル（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をヒートショック法（氷中→４２℃×９０ｓｅｃ→氷中）により形質転換を行う。ヒートショック後の溶液にＬＢ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス  ５ｇ、塩化ナトリウム  １０ｇ／Ｌ）７５０μＬを添加し、３７℃にて１時間振盪培養する。得られる培養液を６０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上清を７００μＬ廃棄する。
（６）残りの培養液と沈殿を攪拌し、ＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）寒天プレートに展開し、３７℃にて１６時間静置する。
（７）得られるコロニーを液体ＬＢ／アンピシリン培地にて一晩培養する。
（８）得られる菌体からＭｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＳＶ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、業者推奨の方法にてプラスミドを回収する。
（９）得られるプラスミドのシークエンス解析を行い、目的のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認する。ここで得られるプラスミドをｐＥＴ−ＨｕＬＡ２及びｐＥＴ−ＨｕＬＢ２とする。
【０１０６】
（実施例９）アルファヘリカルコイルドコイルＤＮＡ断片の作製
Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５４，５３９−５４４に示されているＪｕｎタンパク質ジッパー配列を参照してそれらをコードする合成ＤＮＡをｏｖｅｒ−ｌａｐ  ＰＣＲにて作製する。ＰＣＲは、ｐｆｕ−ｔｕｒｂｏ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて業者推奨の方法にて行う。作製される合成ＤＮＡの'５末端にＥｃｏＲＩ、'３末端にはＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素サイトを挿入する。（配列番号：１１、配列番号：１２）同様にして、Ｃｅｌｌ，１９９２，６８，６９９−７０８に示されたＦｏｓタンパク質に対しても同様な合成ＤＮＡを作製する。作製される合成ＤＮＡの'５末端にＥｃｏＲＩ、'３末端にはＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素サイトを挿入する。（配列番号：１３、配列番号：１４）それぞの合成ＤＮＡ断片をＧ３ｊｕｎ、Ｇ３ｆｏｓとする。
配列番号：１２
E F G G G G S G G G G S G G G G S R I A R L E E K V K T L K A Q N S E L A S T A N M L R E Q V A Q L K Q K V M N Y R L C 
配列番号１４：
E F G G G G S G G G G S G G G G S L T D T L Q A E T D Q L E D K K S A L Q T E I A N L L K E K E K L E F I L A A Y R L C 。
【０１０７】
（実施例１０）ＨｕＬＡ−Ｊｕｎ融合タンパク質発現プラスミドの作製
実施例８で得られるｐＥＴ−ＨｕＬＡ２に実施例９で得られるＰＣＲ断片Ｇ３ｊｕｎを挿入してＨｕＬＡ−Ｊｕｎ  融合タンパク質発現プラスミドを作製する。
（１）実施例８で得られるｐＥＴ−ＨｕＬＡ２及び実施例９で得られる合成ＤＮＡ  Ｇ３ｊｕｎについてＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（ともにＮｅｗ  Ｅｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて、制限酵素による切断反応を行う。具体的には、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｉｔｅｎ記載の業者推奨の方法を用いて行う。
（２）上記の結果得られる酵素反応溶液をアガロースゲル電気泳動を行う。
（３）Ｇ３−ｊｕｎ反応液の約０．５ｋｂｐ及びｐＥＴ−ＨｕＬＡ２反応液の５．７ｋｂｐを切り出し、精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製：商品名Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ）にて精製する。
（４）次、上記にて得られたＤＮＡ断片をＴ４−Ｌｉｇａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）にて業者推奨の方法にて２時間ライゲーションを行う。
（５）得られるライゲーション溶液を用いて、ＪＭ１０９コンピテントセル（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をヒートショック法（氷中→４２℃×９０ｓｅｃ→氷中）により形質転換を行う。ヒートショック後の溶液にＬＢ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス  ５ｇ、塩化ナトリウム  １０ｇ／Ｌ）７５０μＬを添加し、３７℃にて１時間振盪培養する。得られる培養液を６０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上清を７００μＬ廃棄する。
（６）残りの培養液と沈殿を攪拌し、ＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）寒天プレートに展開し、３７℃にて１６時間静置する。
（７）得られるコロニーを液体ＬＢ／アンピシリン培地にて一晩培養する。
（８）得られる菌体からＭｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＳＶ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、業者推奨の方法にてプラスミドを回収する。
（９）得られるプラスミドのシークエンス解析を行い、目的のＤＮＡ断片（配列番号：１５、配列番号：１６）が挿入されていることを確認する。ここで得られるプラスミドをｐＥＴ−ＶＡ２Ｊとする。
配列番号：１６
P W Q V Q L Q E S G P G L L K P S E T L F L T C T V S G F S I S G G Y Y W G W F R Q P P G K E R E W I G S V Y H S G S T Y Y N K S L E S R V T I S I H T S E S Q I S L K L N S V T A A D T A V Y S C A R Y R T A H P L W G Q G T M V T V S S E F G G G G S G G G G S G G G G S R I A R L E E K V K T L K A Q N S E L A S T A N M L R E Q V A Q L K Q K V M N Y F G C 。
【０１０８】
（実施例１１）ＨｕＬＡ−Ｊｕｎ融合タンパク質／ＨｕＬＢ−Ｆｏｓ融合タンパク質共発現プラスミドの作製
実施例７及び実施例９で得られるＰＣＲ断片を用いてＨｕＬＢ−Ｆｏｓ融合タンパク質発現プラスミドを作製する。ここで用いるベクターとしては、ｐＥＴ−２４ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）とする。
（１）実施例７で得られる合成ＤＮＡ  ＨｕＬＢ２及びｐＥＴ−２４ｄをＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ（ともにＮｅｗ  Ｅｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）にてＴｅｃｈｎｉｃａｌＢｕｌｌｉｔｅｎ記載の業者推奨の方法にて制限酵素による切断反応を行う。
（２）上記の結果得られる酵素反応溶液をアガロースゲル電気泳動を行う。
（３）ＨｕＬＢ２反応液の約０．４ｋｂｐ及びｐＥＴ−２４ｄ反応液の５．３ｋｂｐを切り出し、精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製：商品名Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ）にて精製する。
（４）次、上記にて得られたＤＮＡ断片をＴ４−Ｌｉｇａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）にて業者推奨の方法にて２時間ライゲーションを行う。
（５）得られるライゲーション溶液を用いて、ＪＭ１０９コンピテントセル（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をヒートショック法（氷中→４２℃×９０ｓｅｃ→氷中）により形質転換を行う。ヒートショック後の溶液にＬＢ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス  ５ｇ、塩化ナトリウム  １０ｇ／Ｌ）７５０μＬを添加し、３７℃にて１時間振盪培養する。得られる培養液を６０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上清を７００μＬ廃棄する。
（６）残りの培養液と沈殿を攪拌し、ＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）寒天プレートに展開し、３７℃にて１６時間静置する。
（７）得られるコロニーを液体ＬＢ／アンピシリン培地にて一晩培養する。
（８）得られる菌体からＭｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＳＶ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、業者推奨の方法にてプラスミドを回収する。
（９）得られるプラスミドのシークエンス解析を行い、目的のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認する。ここで得られるプラスミドをｐＥＴ−ＨｕＬＢ２とする。
（１０）得られるｐＥＴ−ＨｕＬＢ２及び実施例９で得られる合成ＤＮＡ断片であるＧ３ｆｏｓをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（ともにＮＥＢ社製）で業者推奨の方法により制限酵素反応を行う。
（１１）上記の結果得られる酵素反応溶液をアガロースゲル電気泳動を行う。
（１２）Ｇ３−ｆｏｓ反応液の約０．５ｋｂｐ及びｐＥＴ−ＨｕＬＢ２反応液の５．７ｋｂｐを切り出し、精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製：商品名Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ）にて精製する。以下の上記（４）−（８）と同様の作業を行う。
（１３）得られるプラスミドのシークエンス解析を行い、目的のＤＮＡ断片（配列番号：１７、配列番号：１８）が挿入されていることを確認する。ここで得られるプラスミドをｐＥＴ−ＶＢ２Ｆとする。
配列番号：１８
P W N A A D N T G T T P L H L A A Y S G H L E I V E V L L K H G A D V D A S D V F G Y T P L H L A A Y W G H L E I V E V L L K N G A D V N A M D S D G M T P L H L A A K W G Y L E I V E V L L K H G A D V N A Q D K F G K T A F D I S I D N G N E D L A E I L Q E F G G G G S G G G G S G G G G S L T D T L Q A E T D Q L E D K K S A L Q C
（１４）ｐＥＴ−ＡＦを鋳型としてプライマーＢＦ−ｆｗ、ＡＦ−Ｂｋを用いて、ｐｆｕ−ｔｕｒｂｏ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて業者推奨の方法にてＰＣＲを行い、約０．７ｋｂｐの断片ｄｎａ＿ｖｂ２ｆを得る。
（１５）実施例１０で得られるｐＥＴ−ＶＢ２Ｊ及び（１４）で得られる合成ＤＮＡ断片であるｄｎａ＿ｖｂ２ｆをＳｐｈＩ及びＢｇｈＩ（ともにＮＥＢ社製）で業者推奨の方法により制限酵素反応を行う。
（１６）上記の結果得られる酵素反応溶液をアガロースゲル電気泳動を行う。
（１７）ｄｎａ＿ｖｂ２ｆ反応液の約０．７ｋｂｐ及びｐＥＴ−ＶＡ２Ｊ反応液の６．１ｋｂｐを切り出し、精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製：商品名Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ）にて精製する。以下の上記（４）−（８）と同様の作業を行う。
（１８）得られるプラスミドのシークエンス解析を行い、目的のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認する。ここでＨｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ結合ＨｕＬＡ−ＪＵＮ融合タンパク質とＨｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ結合ＨｕＬＢ−Ｆｏｓ融合タンパク質を共発現系で得られるプラスミドをｐＥＴ−ＶＡ２ＦＶＢ２Ｊをとする。
【０１０９】
（実施例１２）ＨｕＬＡ−Ｊｕｎ融合タンパク質／ＨｕＬＢ−Ｆｏｓ融合タンパク質共発現プラスミド発現
（１）形質転換
実施例１１で得られるｐＥＴ−ＶＡ２ＦＶＢ２ＪにてＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換を行う。形質転換方法は、実施例３に用いたヒートショック法により行う。同様にＬＢ／アンピシリン寒天プレートに展開し、２８℃にて１６時間静置する。
（２）予備培養
プレート上のコロニーを無作為に選択し、３．０ｍＬ  ＬＢ／ａｍｐ．培地にて２８℃にて一晩振盪培養を行なう。
（３）本培養
上記予備培養溶液を２×ＹＴ培地  ７５０ＭＬに植え継ぎ、更に培養を２８℃にて継続する。ＯＤ６００が０．８を越えた時点で、終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、更に２８℃にて終夜培養を行なう。
（４）精製
（４−１）細胞質画分の取得
得られる培養液を６０００ｒｐｍ、３０分間、４℃にて遠心する。培養上清を廃棄した後、菌体画分を得る。得られる菌体画分を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．９）、以下  Ｔｒｉｓ溶液、１５ｍＬを加え、十分に再懸濁させ、更にフレンチプレスにより菌体破砕を行う。菌体破砕溶液として細胞質画分を得る。
（４−２）金属キレートカラム
目的タンパク質のＣ末端に融合されたＨｉｓタグにより細胞質画分より目的タンパク質を精製する。
金属キレートカラム担体として、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いる。
カラム調整やサンプル負荷、及び洗浄工程は、前記業者の推奨方法に準拠し、４℃にて行った。目的であるＨｉｓタグ融合タンパク質の溶出は５００ｍＭイミダゾール／Ｔｒｉｓ溶液にて行なう。
（４−３）ゲルクロマトグラフィー
続いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ７５（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて、ゲルろ過による精製（バッファー条件：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、1ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ8.0、流速：０.７ｍＬ／ｍｉｎ）を４℃にて行う。約２０ｋＤａの単量体タンパク質であることを示唆するピークを分取し、以下の評価を行う。上記溶出液に対して、外液をＴｒｉｓ溶液として再び透析を行い、溶出液中のイミダゾールの除去を行なう。更に、外液をリン酸バッファー（以下、ＰＢＳ）に替え、バッファー置換を行い、ＳＰＲ評価用溶液とする。
【０１１０】
（実施例１３）
実施例１２で得られるＨｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ結合ＨｕＬＡ−Ｊｕｎ／Ｈｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ結合ＨｕＬＢ−Ｆｏｓ  ヘテロダイマ−について、実施例５と同様にＳＰＲ（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）にて評価した。基板としてはＣＭ５を用いて、業者推奨の方法にてＨｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅを固定してＨｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ固定化チップとして評価に用いる。条件は以下の通り、ＲｕｎｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒ：０.１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ、流速：２０ｕＬ／ｍｉｎ、温度２５℃とする。ＳＰＲにて解離定数を評価した結果、１０-9Ｍとなる。本発明に基づく捕捉分子は標的物質を１エピトープ（もしくは一箇所）で結合する従来の捕捉分子に比べ、結合性が高いことが示される。
【０１１１】
（実施例１４）  ＬＳＰＲセンサ素子作製（１）
センサ素子として、アミノ処理したタイタープレート（住友ベークライド社製）の各ウェルに金コロイド溶液（１００ｎｍφ、田中貴金属社製）２００μＬを添加し、室温にて２４時間静置する。次に、各ウェルから金コロイド溶液を取り除き、純水に２００μＬを加え、１０分間振盪し、加えた純水を取り除く。この操作を三回繰り返す。その後、窒素ガスにて乾燥させる。上記作業により、各ウェル底面積の２０−２５％が金微粒子により被覆されるていることを確認する。また、本実施例のセンサ素子の各ｗｅｌｌにＰＢＳ溶液を２００μＬ添加後の吸収スペクトルは、５１０ｎｍ近傍にピーク波長を持っている。
【０１１２】
（実施例１５）ＬＳＰＲ検出用素子作製（１）
実施例１４により作製されるセンサ素子に標的物質捕捉能を付与するため、本実施例では標的物質捕捉体として実施例１２で得られるタンパク質を用いる。以下に、金の構造体表面に固定する方法を示す。本実施例の構造体の材質である金と親和性の高いチオール基をカルボキシ末端に持つ本実施例１２で得られるタンパク質を１μＭとなるように０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液を調整する。得られるタンパク質溶液を実施例１４で得られる検出素子の各ウェルに２００μＬずつ分注し、室温にて二時間静置した後に、各ウェルから溶液を取り除く。続いて、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液  ２００μＬを各ウェルに１０分間振盪し、加えた０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液を取り除く。この操作を三回繰り返す。上記作業により、検出用素子の各ｗｅｌｌにＰＢＳ溶液を２００μＬ添加後の吸収スペクトルのピークは、５３０ｎｍ近傍にシフトする。
【０１１３】
本実施例で得られる検出用素子を次の操作により、特異的に検体中のＨｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ濃度を測定することができる。本実施例の検出用素子の各ウェルに標的物質であるＨｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅを含んだ検体を添加し、２時間静置し、ヒトリゾチームを捕捉させる。検体を各ウェルから取り除き、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液  ２００μＬを各ウェルに５分間振盪し、加えた０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液を取り除く。この操作を三回繰り返し、更に、溶液をＰＢＳ溶液として同様の作業を３回繰り返し、洗浄工程とする。最後にＰＢＳ溶液をウェルに添加して、吸収スペクトルを測定する。
【０１１４】
吸収スペクトルは、反応前と反応後を比較すると、特異的な抗原体反応によって、標的物質が検出素子表面に結合することでシフトする。ここで、吸収スペクトルのピーク強度、あるいはピーク波長のシフト量とＨｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ濃度の相関は、あらかじめ既知のＨｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅコントロール溶液により求められている。これにより濃度未知の検体の微量Ｈｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ濃度を求めることができる。
【０１１５】
（実施例１６）ＬＳＰＲセンサ素子作製（２）
図２に本実施例で用いた検出装置の概略の構造を示す。検出素子４は、膜厚２０ｎｍの金薄膜を６２５μｍ厚の石英基板上に形成し、これを所定のパターンに電子線描画装置を用いてパターニングすることで製作した。図３の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像にあるように、金属構造体の平面形状の外形は２００ｎｍ×２００ｎｍの正方形状である。解像性の高低により、内側の開口部の形状は、外形とは必ずしも同じに作製できるとは限らない。各パターンは、２５０ｎｍのスペースを開けてアレイ状に３ｍｍ×３ｍｍの領域に配置されている。本実施例の構造体の吸収スペクトルは、８００ｎｍ近傍にピーク波長を持っている。
【０１１６】
（実施例１７）ＬＳＰＲ検出用素子作製（２）
次に、実施例１６の金属構造体の表面に本発明実施例１２の捕捉分子を固定する。以下に、金の構造体表面に固定する方法を示す。
【０１１７】
実施例１６の構造体の材質である金と親和性の高いチオール基をカルボキシ末端に持つ本実施例１２で得られるタンパク質を１μＭとなるように０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液を調整する。得られるタンパク質溶液を実施例１６で得られる検出用素子のアレイに２００μＬずつ分注し、室温にて二時間静置した後に、アレイから溶液を取り除く。続いて、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液  ２００μＬをアレイに１０分間振盪し、加えた０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液を取り除く。この操作を三回繰り返す。
これにより、構造体表面が本実施例１２の捕捉分子で修飾される。
【０１１８】
（実施例１８）ＬＳＰＲ評価（２）
以下の操作により、特異的に検体中のＨｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅの濃度を測定することができる。
（１）作製した素子に標的物質であるＨｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅを含んだ検体をインレット８より導入し、Ｈｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅを構造体上に捕捉させる。
（２）検体を排出し、リン酸緩衝液をインレット８より導入し、反応ウェル７内部を洗浄する。
（３）最後にリン酸緩衝液を充填して、金の構造体の吸収スペクトルを測定する。
【０１１９】
吸収スペクトルについて反応前と反応後を比較すると、特異的な抗原体反応によって標的物質が検出素子表面に結合することで吸収スペクトルがシフトする。
【０１２０】
ここで、吸収スペクトルのピーク強度、あるいはピーク波長のシフト量とＨｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ濃度の相関は、あらかじめ既知のＨｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅコントロール溶液により求められている。これにより、濃度未知の検体の微量Ｈｕｍａｎ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ濃度を求めることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】α−ヘリカルコイルドコイル構造を説明するための図である。
【図２】本実施例１７乃至１８に用いられる検出装置の概略模式図である。
【図３】実施例１６におけるセンサ素子のＳＥＭ写真である。
【符号の説明】
【０１２２】
１  基板
２  インレット
３  アウトレット
４  素子
５  反応ウエル
６  タングステンランプ
７  コリメートレンズ
８  分光光度計
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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