(57)【要約】【課題】比較的小さな光源を用いても多くの蛍光を発生させ、明るく解像度の高い蛍光画像を取得する。【解決手段】直線状の励起光Ｌを出射する光源装置２と、該光源装置２からの励起光Ｌに対して交差する方向に配置された観察光軸Ｂを有する観察光学系６とを備え、該観察光学系６の焦点位置が、光源装置２からの励起光Ｌの経路上に配置されている顕微鏡観察装置１を提供する。【選択図】      図１
2007114542.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
直線状の励起光を出射する光源装置と、
該光源装置からの励起光に対して交差する方向に配置された観察光軸を有する観察光学系とを備え、
該観察光学系の焦点位置が、前記光源装置からの励起光の経路上に配置されている顕微鏡観察装置。
【請求項２】
前記光源装置が、直線状の励起光を、該励起光および前記観察光軸に交差する方向に走査させる走査装置を備える請求項１に記載の顕微鏡観察装置。
【請求項３】
前記走査装置が、前記観察光学系の焦点面に沿って直線状の励起光を走査させる請求項２に記載の顕微鏡観察装置。
【請求項４】
前記走査装置が、前記直線状の励起光を並進移動させる並進化手段を備える請求項２または請求項３に記載の顕微鏡観察装置。
【請求項５】
前記光源装置が、前記観察光軸に交差する方向に間隔をあけた複数の直線状の励起光を出射するための複数の光源を備える請求項１に記載の顕微鏡観察装置。
【請求項６】
前記複数の直線状の励起光が、平行間隔をあけて配置される請求項５に記載の顕微鏡観察装置。
【請求項７】
試料を載置するステージと、
該ステージを観察光軸に沿う方向に移動させるステージ駆動装置とを備える請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡観察装置。
【請求項８】
試料の輪郭形状を画像化する第１の画像化手段と、
観察光学系により検出された試料からの蛍光を画像化する第２の画像化手段と、
これらの第１，第２の画像化手段により形成された輪郭画像と蛍光画像とを重ね合わせて表示する表示手段とを備える請求項１から請求項７のいずれかに記載の顕微鏡観察装置。
【請求項９】
前記第１の画像化手段が、試料を透過した励起光の強度分布を検出する強度分布検出手段と、試料を複数の方向に透過させることにより検出された励起光の複数の強度分布に基づいて試料の輪郭画像を形成する請求項８に記載の顕微鏡観察装置。
【請求項１０】
前記光源装置から出射される直線状の励起光を挟んで、前記観察光学系とは反対側に配置される第２の観察光学系を備える請求項１から請求項９のいずれかに記載の顕微鏡観察装置。
【請求項１１】
前記試料を収容する透明な容器と、
該容器内の試料との隙間に充填される、試料と同等の屈折率を有する媒体とを備え、
前記容器は、前記直線状の励起光が該容器の外面に直交して入射するように設けられている請求項１から請求項１０のいずれかに記載の顕微鏡観察装置。
【請求項１２】
前記媒体が、前記試料の表面に密着するように変形可能な袋状部材に充填された流体からなり、
前記袋状部材が、試料と同等の屈折率を有するとともに、前記光源装置と試料との間に配置されている請求項１１に記載の顕微鏡観察装置。
【請求項１３】
試料に対し、直線状の励起光を入射させ、
該励起光に対して交差する方向に観察光学系の観察光軸を配するとともに、
該観察光学系の焦点位置を前記励起光の経路上に配置し、
試料内から前記観察光軸方向に発せられる蛍光を観察光学系により検出する顕微鏡観察方法。
【請求項１４】
前記励起光を、該励起光および前記観察光軸に交差する方向に走査させる請求項１３に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項１５】
前記励起光を前記観察光学系の焦点面に沿って走査させる請求項１４に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項１６】
前記励起光を並進移動させる請求項１４または請求項１５に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項１７】
前記観察光軸に交差する方向に間隔をあけた複数の直線状の励起光を試料に入射させる請求項１３に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項１８】
前記複数の直線状の励起光が、平行間隔をあけて配置される請求項１７に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項１９】
前記試料を前記観察光軸に沿う方向に移動させる請求項１３から請求項１８のいずれかに記載の顕微鏡観察方法。
【請求項２０】
試料の輪郭形状を画像化し、
前記観察光学系により検出された試料からの蛍光を画像化し、
画像化された輪郭画像と蛍光画像とを重ね合わせて表示する請求項１３から請求項１９のいずれかに記載の顕微鏡観察方法。
【請求項２１】
前記試料の輪郭形状が、試料に対して複数の方向から透過させた励起光の複数の強度分布に基づいて画像化される請求項２０に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項２２】
前記試料を透明な容器に収容するとともに、
該容器内の試料との隙間に、試料と同等の屈折率を有する媒体を充填し、
前記励起光を該容器の外面に直交するように入射させる請求項１３から請求項２１のいずれかに記載の顕微鏡観察方法。
【請求項２３】
流体からなる前記媒体を、試料の表面に密着するように変形可能かつ試料と同等の屈折率を有する袋状部材に充填し、
前記袋状部材を介して試料に励起光を入射させる請求項２２に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項２４】
試料に対し、直線状の励起光を入射させ、
該励起光に対して交差する方向に観察光学系の観察光軸を配するとともに、
該観察光学系の焦点位置を前記励起光の経路上に配置し、
試料内から前記観察光軸方向に発せられる蛍光を観察光学系により２次元的に検出するステップと、試料を観察光軸方向に移動させるステップとを繰り返して複数の２次元的な蛍光画像を取得し、
取得された複数の２次元的な蛍光画像に基づいて試料の３次元的な蛍光画像を作成する顕微鏡観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡観察装置および顕微鏡観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、単一の光源から帯状に広げられた平坦な励起光を試料に入射させる一方、該励起光に直交する方向に配置した観察光軸を有する観察光学系により試料の内部で発生する蛍光を検出する顕微鏡観察方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】国際公開第２００４−０５３５５８Ａ１パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、励起光の照射により試料の内部で発生する蛍光は微弱であり、特に、マウスやラットのように比較的大きな試料の体内組織の状態を観察する場合には、特許文献１に開示されている顕微鏡観察方法では、蛍光が弱すぎて十分な解像度の蛍光画像を得ることができないという不都合がある。光源の発する光量を増大させることには限界があり、また装置の大型化や高コスト化を招くため好ましくない。
【０００４】
この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、比較的小さな光源を用いても多くの蛍光を発生させ、明るく解像度の高い蛍光画像を取得することを可能とする顕微鏡観察装置および顕微鏡観察方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、直線状の励起光を出射する光源装置と、該光源装置の励起光に対して交差する方向に配置された観察光軸を有する観察光学系とを備え、該観察光学系の焦点位置が、前記光源装置からの励起光の経路上に配置されている顕微鏡観察装置を提供する。
【０００６】
本発明によれば、光源装置の作動により、直線状の励起光が試料に入射されると、励起光の経路上に配される試料の各部位において、励起光により蛍光物質が励起されて蛍光が発せられる。発せられた蛍光は、全方位に向けて出射されるが、励起光に交差する方向に観察光学系の観察光軸が配置されているので、観察光軸方向に発せられた蛍光が観察光学系により取得される。
【０００７】
この場合において、観察光軸に沿う方向に配されるいずれかの部位で発生した蛍光が観察光学系によって取得されることとなるが、励起光の照射位置が観察光学系の焦点位置に一致しているので、他の部位における蛍光の発生は少なく、焦点位置近傍の極めて薄い領域から発せられた蛍光のみが取得されることになる。したがって、ピントの合った鮮明な蛍光画像を得ることができ、観察精度を向上することができる。
【０００８】
また、この場合において本発明によれば、励起光が直線状の形態を有しているので、光源として大出力の大がかりなものを使用しなくても、極めて高い格子密度の励起光を焦点位置近傍に照射することができる。したがって、得られる蛍光画像を明るくかつ解像度の高いものとすることができる。
【０００９】
上記発明においては、前記光源装置が、直線状の励起光を、該励起光および前記観察光軸に交差する方向に走査させる走査装置を備えることとしてもよい。
このようにすることで、走査装置の作動により直線状の励起光を試料の複数の箇所に通過させることができる。したがって、観察光学系によって、２次元的な範囲にわたる明るく鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記走査装置が、前記観察光学系の焦点面に沿って直線状の励起光を走査させることが好ましい。
このようにすることで、試料内を通過する励起光の経路の全ての位置において発生する蛍光にピントを合わせることができる。したがって、観察光学系を移動させることなく、各部にピントの合った明るく鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【００１１】
また、上記発明においては、前記走査装置が、前記直線状の励起光を並進移動させる並進化手段を備えることが好ましい。
このようにすることで、並進化手段の作動により、直線状の励起光が並進移動させられる。すなわち、直線状の励起光が並進移動させられる領域に試料を配置することにより、観察光軸に沿う方向から見て、試料に対して均一な密度で励起光を照射することができる。
【００１２】
また、上記発明においては、前記光源装置が、前記観察光軸に交差する方向に間隔をあけた複数の直線状の励起光を出射するための複数の光源を備えることとしてもよい。
このようにすることで、走査装置の場合と同様にして直線状の励起光を試料の複数の箇所に通過させることができる。したがって、観察光学系によって、２次元的な範囲にわたる明るく鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記複数の直線状の励起光が、平行間隔をあけて配置されることとしてもよい。
このようにすることで、複数の平行な直線状の励起光を試料に通過させることにより、観察光軸に沿う方向から見て、試料に対して均一な密度で励起光を照射することができる。
【００１４】
また、上記発明においては、試料を載置するステージと、該ステージを観察光軸に沿う方向に移動させるステージ駆動装置とを備えることが好ましい。
このようにすることで、観察光軸に沿う複数の位置において、試料に対し、観察光軸に交差する方向に直線状の励起光を入射させることができる。その結果、観察光学系および光源装置を固定したままの状態で、試料の３次元的な蛍光画像を取得することが可能となる。
【００１５】
また、上記発明においては、試料の輪郭形状を画像化する第１の画像化手段と、観察光学系により検出された試料からの蛍光を画像化する第２の画像化手段と、これらの第１，第２の画像化手段により形成された輪郭画像と蛍光画像とを重ね合わせて表示する表示手段とを備えることとしてもよい。
【００１６】
このようにすることで、第１の画像化手段の作動により試料の輪郭画像が形成され、第２の画像化手段の作動により試料からの蛍光画像が形成される。そして、表示手段においてこれら輪郭画像と蛍光画像とが重ね合わせられて表示されることにより、蛍光画像と輪郭画像とを対応づけられ、試料のどの位置において蛍光が発せられているのかを簡単に確認することができる。
【００１７】
また、上記発明においては、前記第１の画像化手段が、試料を透過した励起光の強度分布を検出する強度分布検出手段と、試料を複数の方向に透過させることにより検出された励起光の複数の強度分布に基づいて試料の輪郭画像を形成することとしてもよい。
このようにすることで、強度分布検出手段の作動により、試料を透過した励起光の強度分布が、複数の方向について検出され、試料の各部の透過率を求めることが可能となる。そして、この透過率の分布に基づいて試料の輪郭形状を容易に画像化することができる。したがって、試料に励起光を照射する光源装置を利用して試料の輪郭形状を画像化するので、装置を簡易に構成することができる。
【００１８】
また、上記発明においては、前記光源装置から出射される直線状の励起光を挟んで、前記観察光学系とは反対側に配置される第２の観察光学系を備えることとしてもよい。
試料内部から発せられる蛍光は試料を透過して観察光学系に入射される過程で散乱するため、試料の表面から比較的浅い位置の蛍光画像の分解能は高いが、比較的深い位置の蛍光画像の分解能は低くなる。
【００１９】
本発明によれば、試料の一表面側においては観察光学系により蛍光画像を取得し、試料の反対の表面側においては第２の観察光学系により蛍光画像を取得することで、試料の厚さ方向の全ての領域において分解能の高い蛍光画像を取得することが可能となる。また、単一の観察光学系を試料に対して反転させて観察する場合と比較すると、大がかりな装置を必要とせず、観察光学系を固定したままで、短時間に試料の厚さ方向全体の分解能の高い蛍光画像を取得することができる。
【００２０】
また、上記発明においては、前記試料を収容する透明な容器と、該容器内の試料との隙間に充填される、試料と同等の屈折率を有する媒体とを備え、前記容器は、前記直線状の励起光が該容器の外面に直交して入射するように設けられていることが好ましい。
【００２１】
このようにすることで、光源装置から発せられた直線状の励起光は、透明な容器および媒体を通過した後に試料に入射させられる。励起光は、透明な容器の外面に直交するように入射し、また、容器と試料との間には試料と同等の屈折率を有する媒体が充填されているので、試料の表面において屈折を生ずることなく試料に入射される。したがって、観察光学系に対して正しい位置に直線状の励起光を入射させることができ、鮮明な蛍光画像を取得することが可能となる。
【００２２】
また、上記発明においては、前記媒体が、前記試料の表面に密着するように変形可能な袋状部材に充填された流体からなり、前記袋状部材が、試料と同等の屈折率を有するとともに、前記光源装置と試料との間に配置されていることとしてもよい。
このようにすることで、袋状部材を試料の表面に密着するように変形させ、容器と試料との間の空間を前記媒体で満たすことができる。したがって、励起光を屈折させることなく、試料に対して正しい位置に入射させることができるとともに、試料に媒体を直接接触させなくて済む。
【００２３】
また、本発明は、試料に対し、直線状の励起光を入射させ、該励起光に対して交差する方向に観察光学系の観察光軸を配するとともに、該観察光学系の焦点位置を前記励起光の経路上に配置し、試料内から前記観察光軸方向に発せられる蛍光を観察光学系により検出する顕微鏡観察方法を提供する。
【００２４】
本発明によれば、直線状の励起光が試料に入射されると、励起光の経路上に配される試料の各部位において、励起光により蛍光物質が励起されて蛍光が発せられる。発せられた蛍光は、全方位に向けて出射されるが、励起光に交差する方向に観察光学系の観察光軸が配置されているので、観察光軸方向に発せられた蛍光が観察光学系により取得される。
【００２５】
この場合において、観察光軸に沿う方向に配されるいずれかの部位で発生した蛍光が観察光学系によって取得されることとなるが、励起光の照射位置が観察光学系の焦点位置に一致しているので、他の部位における蛍光の発生は少なく、焦点位置近傍の極めて薄い領域から発せられた蛍光のみが取得されることになる。したがって、ピントの合った鮮明な蛍光画像を得ることができ、観察精度を向上することができる。
【００２６】
また、この場合において本発明によれば、励起光が直線状の形態を有しているので、光源として大出力の大がかりなものを使用しなくても、極めて高い格子密度の励起光を焦点位置近傍に照射することができる。したがって、得られる蛍光画像を明るくかつ解像度の高いものとすることができる。
【００２７】
上記発明においては、前記励起光を、該励起光および前記観察光軸に交差する方向に走査させることとしてもよい。
このようにすることで、直線状の励起光を試料の複数の箇所に通過させることができる。したがって、観察光学系によって、２次元的な範囲にわたる明るく鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【００２８】
また、上記発明においては、前記励起光を前記観察光学系の焦点面に沿って走査させることが好ましい。
このようにすることで、試料内を通過する励起光の経路の全ての位置において発生する蛍光にピントを合わせることができる。したがって、観察光学系を移動させることなく、各部にピントの合った明るく鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【００２９】
また、上記発明においては、前記励起光を並進移動させることが好ましい。
このようにすることで、直線状の励起光が並進移動させられる領域に試料を配置することにより、観察光軸に沿う方向から見て、試料に対して均一な密度で励起光を照射することができる。
【００３０】
また、上記発明においては、前記観察光軸に交差する方向に間隔をあけた複数の直線状の励起光を試料に入射させることとしてもよい。
このようにすることで、直線状の励起光を試料の複数の箇所に通過させることができる。したがって、観察光学系によって、２次元的な範囲にわたる明るく鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【００３１】
また、上記発明においては、前記複数の直線状の励起光が、平行間隔をあけて配置されることが好ましい。
このようにすることで、複数の平行な直線状の励起光を試料に通過させ、観察光軸に沿う方向から見て、試料に対して均一な密度で励起光を照射することができる。
【００３２】
また、上記発明においては、前記試料を前記観察光軸に沿う方向に移動させることとしてもよい。
このようにすることで、観察光軸に沿う複数の位置において、試料に対し、観察光軸に交差する方向に直線状の励起光を入射させることができる。その結果、観察光学系および直線状の励起光を固定したままの状態で、試料の３次元的な蛍光画像を取得することが可能となる。
【００３３】
また、上記発明においては、試料の輪郭形状を画像化し、前記観察光学系により検出された試料からの蛍光を画像化し、画像化された輪郭画像と蛍光画像とを重ね合わせて表示することとしてもよい。
このようにすることで、蛍光画像と輪郭画像とを対応づけられ、試料のどの位置において蛍光が発せられているのかを簡単に確認することができる。
【００３４】
また、上記発明においては、前記試料の輪郭形状が、試料に対して複数の方向から透過させた励起光の複数の強度分布に基づいて画像化されることとしてもよい。
このようにすることで、複数の方向について検出された試料を透過した励起光の強度分布から、試料の各部の透過率を求めることが可能となる。そして、この透過率の分布に基づいて試料の輪郭形状を容易に画像化することができる。
【００３５】
また、上記発明においては、前記試料を透明な容器に収容するとともに、該容器内の試料との隙間に、試料と同等の屈折率を有する媒体を充填し、前記励起光を該容器の外面に直交するように入射させることとしてもよい。
このようにすることで、直線状の励起光は、透明な容器および媒体を通過した後に試料に入射させられる。励起光は、透明な容器の外面に直交するように入射し、また、容器と試料との間には試料と同等の屈折率を有する媒体が充填されているので、試料の表面において屈折を生ずることなく試料に入射される。したがって、観察光学系に対して正しい位置に直線状の励起光を入射させることができ、鮮明な蛍光画像を取得することが可能となる。
【００３６】
また、上記発明においては、流体からなる前記媒体を、試料の表面に密着するように変形可能かつ試料と同等の屈折率を有する袋状部材に充填し、前記袋状部材を介して試料に励起光を入射させることとしてもよい。
このようにすることで、袋状部材を試料の表面に密着するように変形させ、容器と試料との間の空間を前記媒体で満たすことができる。したがって、励起光を屈折させることなく、試料に対して正しい位置に入射させることができるとともに、試料に媒体を直接接触させなくて済む。
【００３７】
また、本発明は、試料に対し、直線状の励起光を入射させ、該励起光に対して交差する方向に観察光学系の観察光軸を配するとともに、該観察光学系の焦点位置を前記励起光の経路上に配置し、試料内から前記観察光軸方向に発せられる蛍光を観察光学系により２次元的に検出するステップと、試料を観察光軸方向に移動させるステップとを繰り返して複数の２次元的な蛍光画像を取得し、取得された複数の２次元的な蛍光画像に基づいて試料の３次元的な蛍光画像を作成する顕微鏡観察方法を提供する。
このようにすることで、簡易に、明るく鮮明な３次元的な蛍光画像を作成することが可能となる。
【発明の効果】
【００３８】
比較的小さな光源を用いても多くの蛍光を発生させ、明るく解像度の高い蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡観察装置１について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察装置１は、図１に示されるように、レーザ光Ｌを出射する光源装置２と、該光源装置２から発せられる直線状のレーザ光Ｌを１次元方向に走査する走査装置３と、該走査装置３により走査されるレーザ光Ｌをほぼ平行な方向に指向させるシリンドリカルレンズ（並進化手段）４と、試料Ａを載置するステージ５と、試料Ａから発せられる蛍光Ｆを観察する観察光学系６と、これら光源装置２、走査装置３、ステージ５および観察光学系６を制御するコンピュータ４０とを備えている。
【００４０】
前記光源装置２は、例えば、異なる波長のレーザ光Ｌを出射する複数のレーザ光源７ａ〜７ｃと、該レーザ光源７ａ〜７ｃからのレーザ光Ｌを一端に入射させる光ファイバ８と、該光ファイバ８の一端に入射させる複数のレーザ光Ｌの光路を合流させるミラー９ａおよびダイクロイックミラー９ｂ，９ｃと、光ファイバ８の他端から出射されるレーザ光Ｌを集光して、十分に細い光束径を有する直線状に変換するコレクタレンズ１０とを備えている。図中、符号１１はカップリングレンズである。また、光源装置２は、レーザ光Ｌの波長選択・調光手段（図示略）を備え、前記コンピュータ４０により制御されるようになっている。
【００４１】
前記走査装置３は、コレクタレンズ１０から発せられた直線状のレーザ光Ｌを反射するガルバノミラー１２と、該ガルバノミラー１２の角度を変化させるモータ１３とを備えている。モータ１３の作動によりガルバノミラー１２を所定角度範囲にわたって往復揺動させることで、モータ１３の回転軸１３ａに直交する平面（例えば、水平面）内において直線状のレーザ光Ｌを扇状に振ることができるようになっている。
【００４２】
前記シリンドリカルレンズ４は、前記走査装置３により扇状に振られた直線状のレーザ光Ｌを透過させることにより、全ての角度位置のレーザ光Ｌが略平行となるように屈折させるようになっている。これにより、走査装置３によりレーザ光Ｌが振られると、レーザ光Ｌは一平面（例えば、水平面）内において並進移動させられるようになっている。なお、シリンドリカルレンズ４に代えて、ｆθレンズを用いてもよい。
【００４３】
前記ステージ５は、試料Ａを載置するとともに、前記シリンドリカルレンズ４によって、直線状のレーザ光Ｌが並進移動させられる領域に試料Ａを配置するように設けられている。また、このステージ５には、レーザ光Ｌが走査される平面に対して直交する方向（例えば、鉛直方向）に移動させるステージ駆動機構（図示略）が設けられている。これにより、載置した試料Ａの異なる平面に沿って、直線状のレーザ光Ｌを入射させることができるようになっている。
【００４４】
前記観察光学系６は、前記ステージ５の移動方向（例えば、鉛直方向）に沿って観察光軸Ｂを配置し、試料Ａから発せられる蛍光Ｆを集光する対物レンズ１４と、該対物レンズ１４により集められた蛍光Ｆを集光する結像レンズ１５と、該結像レンズ１５の焦点位置に撮像面１６ａを配置したＣＣＤカメラ等の撮像装置１６とを備えている。図中、符号１７は撮像する蛍光Ｆの波長を切り替えるフィルタである。
前記対物レンズ１４の焦点面Ｃは、前記レーザ光Ｌの走査平面に一致するように調節されている。
【００４５】
前記コンピュータ４０は、光源装置２、走査装置３、ステージ５および観察光学系６に接続され、光源装置２から出射されるレーザ光Ｌの調光あるいは波長の選択を行うとともに、走査装置３のモータ１３およびステージ５のステージ駆動機構を制御して試料Ａにおけるレーザ光Ｌの入射位置を調節するようになっている。また、コンピュータ４０は、観察光学系６の撮像装置１６の撮像タイミングを制御するようになっている。
【００４６】
このように構成された本実施形態に係る顕微鏡観察装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察装置１を用いて試料Ａの観察を行うには、ステージ５上に試料Ａを固定し、所定の位置にステージ５を停止する。そして、モータ１３の作動によりガルバノミラー１２を往復揺動させた状態で光源装置２からレーザ光Ｌを出射させる。
【００４７】
レーザ光源７ａ〜７ｃから発せられたレーザ光Ｌはミラー９ａあるいはダイクロイックミラー９ｂ，９ｃを介して光ファイバ８の一端に入射され、光ファイバ８の他端から発せられた後にコレクタレンズ１０によって微小光束径を有する直線状のレーザ光Ｌとしてガルバノミラー１２に入射される。ガルバノミラー１２に入射されたレーザ光Ｌはガルバノミラー１２の角度に応じて決定される方向に反射されて、シリンドリカルレンズ４を経由した後、試料Ａに入射させられる。
【００４８】
レーザ光Ｌが試料Ａに入射させられると、レーザ光Ｌは、その一部が試料Ａ内において拡散されるが、その大部分が試料Ａ内を直線状に透過する。そして、レーザ光Ｌは、該レーザ光Ｌの経路に配置される蛍光物質を励起して蛍光Ｆを発生させる。レーザ光Ｌは走査装置３の作動により、水平面内を移動させられるので、レーザ光Ｌが移動した試料Ａ内の領域、すなわち、鉛直方向に極めて薄い平面上の領域から蛍光Ｆを発せさせることができる。
【００４９】
発生した蛍光Ｆは、全方向に向けて出射されるが、観察光軸Ｂに沿う方向に進行する一部の蛍光Ｆが対物レンズ１４によって集光された後、結像レンズ１５によって結像されて撮像装置１６により撮像される。本実施形態においては、撮像装置１６としてＣＣＤカメラを採用しているので、レーザ光Ｌが試料Ａを一方向に走査する時間内に発せられる蛍光Ｆを撮像することにより、１枚の蛍光画像を取得することができる。
【００５０】
本実施形態に係る顕微鏡観察装置１によれば、レーザ光Ｌが試料Ａ内を通過する平面と観察光学系６の対物レンズ１４の焦点面Ｃとが一致しているので、撮像装置１６にはレーザ光Ｌの経路を含む平面により切断した試料Ａの切断面にピントの合った蛍光画像が取得されることになる。この場合において、本実施形態によれば、蛍光Ｆは主として対物レンズ１４の焦点面Ｃのみから発せられるので、取得される蛍光画像に他の位置からの蛍光Ｆが混入することがほとんどなく、空間分解能が高くかつコントラストの高い鮮明な蛍光画像を得ることができる。
【００５１】
また、本実施形態によれば、極めて細い光束径を有する直線状のレーザ光Ｌによって各位置の蛍光物質を励起させるので、焦点面Ｃ上の各位置におけるレーザ光Ｌの格子密度を高めて、明るい蛍光Ｆを発生させることができる。したがって、帯状の励起光を入射させる従来の装置と比較して、光源装置２を大型化することなく、明るい蛍光画像を取得することができるという利点がある。
【００５２】
また、本実施形態によれば、ガルバノミラー１２により扇形状に振られた直線状のレーザ光Ｌがシリンドリカルレンズ４によって相互に平行な直線状のレーザ光Ｌとして試料Ａに入射させられる。これにより、観察光軸Ｂに沿う方向から見て、試料Ａの全ての領域に均一な格子密度のレーザ光Ｌを照射することができ、それによって輝度補正の不要な蛍光画像を取得することができる。
また、レーザ光Ｌの波長を切り替えたときには、フィルタ１７を切り替えることにより、波長の異なる蛍光画像を取得することができる。
【００５３】
また、本実施形態に係る顕微鏡観察装置１によれば、ガルバノミラー１２を一方向に揺動させることにより、直線状のレーザ光Ｌによって観察範囲全体を走査でき、１枚の蛍光画像を取得できる。したがって、その後、ステージ５を上下に微動させた後に、ガルバノミラー１２を逆方向に揺動させることにより、観察光軸Ｂ方向に異なる位置の水平面に沿った断面の蛍光画像を取得することができる。したがって、その工程を繰り返すことにより、鉛直方向に位置の異なる複数の２次元的な蛍光画像を取得でき、これらの２次元的な蛍光画像を画像処理により組み合わせることによって、３次元的な蛍光画像を取得することができる。
【００５４】
そして、このように構成することにより、観察光学系６およびレーザ光Ｌの走査される平面の上下方向の位置を変化させることなく、試料Ａの３次元的な蛍光画像を取得できる。したがって、観察光学系６の対物レンズ１４の焦点面Ｃをレーザ光Ｌの走査される水平面に固定したままの状態で、常にピントの合った２次元の蛍光画像を取得できる。
【００５５】
なお、本実施形態に係る顕微鏡観察装置１によれば、ガルバノミラー１２により扇形状に振られたレーザ光Ｌをシリンドリカルレンズ４によって並進移動するレーザ光Ｌに変換することとしたが、これに代えて、図２に示されるように、シリンドリカルレンズ４を用いることなく、ガルバノミラー１２によって扇形状に振られた直線状のレーザ光Ｌをそのまま試料Ａに入射させることにしてもよい。この場合には、観察光軸Ｂに沿う方向から見た場合に、ガルバノミラー１２から離れるに従って、レーザ光Ｌの格子密度が低くなっていくため、得られた蛍光画像においてこれを補正する必要がある。図２以降においては、コンピュータ４０を省略している。
【００５６】
また、モータ１３によって往復揺動させられるガルバノミラー１２によりレーザ光Ｌを走査することとしたが、これに代えて、図３に示されるように、例えば、モータ１８、ボールネジ１９およびスライダ２０からなる直線移動機構２１によって、傾斜角度を固定したミラー２２を直線移動させて、レーザ光Ｌを走査することにしてもよい。この場合においても、直線状のレーザ光Ｌは平行な状態を保ったまま並進移動させられるので、蛍光画像取得後に補正を行う必要がない。
また、ガルバノミラー１２に代えてポリゴンミラーを用いてもよいことは言うまでもない。
【００５７】
また、１本の直線状のレーザ光Ｌを走査させることとしたが、これに代えて、複数本の直線状のレーザ光Ｌを走査させることにしてもよい。また、直線状のレーザ光Ｌを走査させることなく、レーザダイオードのような小型のレーザ光源（図示略）を複数用意して、平行な間隔をあけて複数本のレーザ光Ｌを照射することにしてもよい。
【００５８】
また、本実施形態に係る顕微鏡観察装置１においては、試料Ａに対して上方に観察光学系６を配置した例を示したが、これに代えて、ステージ５を透明な材料により構成し、試料Ａを挟んで下方にも第２の観察光学系（図示略）を備えることとしてもよい。このようにすることで、試料Ａの上下から同時に試料Ａの同一水平面に沿う断面の蛍光画像を取得することができる。
【００５９】
一般に、試料Ａの上側半分については上側の観察光学系６により取得される蛍光画像の方が明るく鮮明であり、試料Ａの下側半分については下側の第２の観察光学系により取得される蛍光画像の方が明るく鮮明である。したがって、ステージ５の作動により試料Ａを上下方向に移動させて３次元の蛍光画像を取得する場合に、試料Ａの上下から撮像される蛍光画像のうちの鮮明な画像を選択でき、鮮明な３次元の蛍光画像を構築することができる。
この場合に、単一の観察光学系６を回転させて試料Ａの上下から撮像する場合と比較すると、観察光学系６を回転移動させるための大がかりな装置を使用することなく、短時間で鮮明な３次元の蛍光画像を取得することができる。
【００６０】
また、本実施形態に係る顕微鏡観察装置１は、試料Ａから発せられる蛍光Ｆを撮像して蛍光画像を取得する場合について説明したが、現実には、試料Ａのどの部位の蛍光画像であるのかを明らかにすることが望まれる場合が多い。例えば、試料Ａがマウス等の実験小動物である場合に、得られた蛍光画像がどの臓器のどの部位から発せられたものであるのか等を知ることができれば便利である。試料Ａの外形との関係で蛍光画像を表示したい場合には、試料Ａ全体の外形をＣＣＤカメラで撮像し、得られた輪郭画像を蛍光画像と重ね合わせて表示することができる。一方、臓器のように外部から見ることができない部位の輪郭画像を取得するためには、通常、Ｘ線撮影やＭＲＩあるいはＣＴ等の装置が用いられるが、装置が大がかりとなる不都合がある。
【００６１】
そこで、本実施形態において、図４に示されるように、試料Ａを透過した後のレーザ光Ｌの強度を検出するフォトダイオードのような強度分布検出器２３を配置してもよい。強度分布検出器２３は、レーザ光Ｌの走査方向に沿って複数の検出部を１列に配列した状態に備えており、試料Ａを透過するレーザ光Ｌの経路毎に透過後の強度を検出できるようになっている。
【００６２】
また、この場合に、ステージ５を観察光軸Ｂ回りに回転させることができるようにしておく。そして、ステージ５を固定して一方向に透過するレーザ光Ｌの強度を一列分検出した後に、図５に示されるように、ステージ５を観察光軸Ｂ回りに回転させて、試料Ａに対し、他の方向からレーザ光Ｌを入射させて、その方向に透過するレーザ光Ｌの強度を一列分検出する。
【００６３】
このようにして検出された複数方向のレーザ光Ｌの強度情報に基づいて、試料Ａの各部位の透過率を演算し、その透過率に基づいて、臓器等、外部から見えない部位の輪郭形状を抽出することができる。抽出された輪郭形状を表す輪郭画像は、画像処理部２４において、蛍光画像と対応づけて重ね合わせられ、モニタ２５に表示される。これにより、観察者は、取得された蛍光画像が、試料Ａのどの部位の蛍光画像であるのかを簡単に判別することができ、観察容易性を向上することができる。
【００６４】
次に、本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡観察装置３０について、図６および図７を参照して説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る顕微鏡観察装置１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００６５】
本実施形態に係る顕微鏡観察装置３０は、水３１を貯留した容器３２内に試料Ａを収容し、試料Ａの側方から直線状のレーザ光Ｌを照射し、試料Ａの側方に配置した水平な観察光軸Ｂを有する観察光学系６により蛍光画像を取得するものである。
容器３２は、一定の厚さ寸法を有する透明の円筒容器であって、ステージ５上に鉛直上方に開口を向けて載置されるようになっている。容器３２内には試料Ａが収容され、容器３２と試料Ａとの間には、水（媒体）３１が貯留されている。
【００６６】
水３１は、試料Ａの屈折率とほぼ同等の屈折率を有し、容器３２と試料Ａとの間の空間を埋めるように配置されている。実験小動物等の試料Ａを生きたまま観察する場合には、試料Ａの頭部を水面上に露出させて呼吸を確保するようにすればよい。
【００６７】
前記ガルバノミラー１２は、容器３２の側方に配置され、直線状のレーザ光Ｌを鉛直方向に走査させるように水平な回転軸１３ａ回りに往復揺動させられるようになっている。また、ガルバノミラー１２により走査されるレーザ光Ｌは、図７に示されるように、円筒状の容器３２の中心軸を通過するように容器３２の外面に入射される。すなわち、容器３２の外面に対して垂直な入射方向となるように設定されている。
観察光学系６は、第１の実施形態と同様であり、レーザ光Ｌの走査平面に観察光軸Ｂが直交しかつ、該レーザ光Ｌの走査平面に対物レンズ１４の焦点面Ｃが一致するように配置されている。
【００６８】
本実施形態に係る顕微鏡観察装置３０によれば、ガルバノミラー１２によって振られた直線状のレーザ光Ｌは、シリンドリカルレンズ４によって水平方向に指向され、容器３２の外面に垂直に入射する。容器３２は透明かつ一定の肉厚を有しているので、レーザ光Ｌは屈折を生ずることなく透過して容器３２内に入る。容器３２内に入射したレーザ光Ｌは、水３１中を進行し、水３１中に配置されている試料Ａに入射する。
【００６９】
この場合において、本実施形態においては、水３１が試料Ａと同等の屈折率を有し、試料Ａの表面に密着しているので、試料Ａと水３１との界面における屈折もほとんど発生せず、レーザ光Ｌはそのまま直進して試料Ａ内を通過する。
このように、本実施形態に係る顕微鏡観察装置３０によれば、レーザ光Ｌが試料Ａの表面に対して斜めに入射しても、屈折することなく直進するので、試料Ａの姿勢や入射位置にかかわらず、レーザ光Ｌが対物レンズ１４の焦点面Ｃ内を通るように配置することができる。したがって、対物レンズ１４の焦点面Ｃにおいて明るい蛍光を発生させることが可能となり、明るく鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【００７０】
また、本実施形態に係る顕微鏡観察装置３０において、３次元の蛍光画像を取得するためには、ステージ５を容器３２の中心軸回りに回転させる。これにより、図７に示されるように、レーザ光Ｌは試料Ａの異なる断面を通過することになり、複数の２次元の蛍光画像を得ることができ、得られた複数の蛍光画像を処理することにより３次元の蛍光画像を構築することが可能となる。
【００７１】
この場合において、容器３２がその中心軸回りに回転させられても、容器３２の外面へのレーザ光Ｌの入射角度は変化しないため、容器３２におけるレーザ光Ｌの屈折は生じない。また、容器３２が回転されると内部に配置されている試料Ａの外面へのレーザ光Ｌの入射角度が変化するが、試料Ａの周囲には試料Ａと同等の屈折率を有する水３１が充填されているので、水３１と試料Ａとの界面においてレーザ光Ｌの屈折が生ずることはない。したがって、試料Ａに入射されるレーザ光Ｌは常に屈折することなく直進して、対物レンズ１４の焦点面Ｃにおいて蛍光を発生させるので、常に明るく鮮明な蛍光画像を取得することができる。
【００７２】
なお、本実施形態においては、容器３２内に水３１を貯留してその水３１中に試料Ａを浸漬することとしたが、これに代えて、図８に示されるように、水３１を封入したシリコーンゴム等の薄膜からなる袋状部材３３を容器３２と試料Ａとの間に挟むことにしてもよい。このようにすることで、容器３２内面および試料Ａの外面に袋状部材３３を隙間なく密着させ、試料Ａと容器３２との間の空間を水３１によって埋めることができ、試料Ａを水３１で濡らすことなく、上記と同様の効果を得ることができる。試料Ａを水３１で濡らすことが望まれない場合に好適である。
また、上記実施形態においては、試料Ａと同等の屈折率を有する媒体として水３１を選択したが、これに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡観察装置の全体構成を概略的を示す斜視図である。
【図２】図１の顕微鏡観察装置の第１の変形例を示す斜視図である。
【図３】図１の顕微鏡観察装置の第２の変形例を示す斜視図である。
【図４】図１の顕微鏡観察装置の第３の変形例を示す斜視図である。
【図５】図４の顕微鏡観察装置におけるレーザ光の入射例を示す平面図である。
【図６】本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡観察装置の全体構成を概略的に示す斜視図である。
【図７】図６の顕微鏡観察装置における容器内の試料とレーザ光との関係を示す平面図である。
【図８】図７の変形例を示す平面図である。
【符号の説明】
【００７４】
Ａ  試料
Ｂ  観察光軸
Ｃ  焦点面
Ｌ  レーザ光（励起光）
１，３０  顕微鏡観察装置
２  光源装置
３  走査装置
４  シリンドリカルレンズ（並進化手段）
５  ステージ
６  観察光学系
１６  撮像装置（第２の画像化手段）
２３  強度分布検出器（強度分布検出手段：第１の画像化手段）
２４  画像処理装置（第１の画像化手段）
２５  モニタ（表示手段）
３１  水（媒体）
３２  容器
３３  袋状部材
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2007114542.tif 000006
【図５】
2007114542.tif 000007
【図６】
2007114542.tif 000008
【図７】
2007114542.tif 000009
【図８】
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