(57)【要約】    【課題】  心不全を精度良く判定し、その状態を的確に把握するための方法および試薬を提供する。    【解決手段】  本発明は被験者由来の試料中の小胞体発信アポトーシスシグナルを測定することを特徴とする、心不全の判定方法を提供する。本発明の方法においては、さらに被験者由来の試料中の小胞体発信アポトーシスシグナル以外の心疾患関連マーカーを測定してもよい。本発明はさらに、本発明の方法を実施するための心不全の判定用試薬を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者由来の試料中の小胞体発信アポトーシスシグナルを測定することを特徴とする、心不全の判定方法。
【請求項２】
被験者由来の試料中の小胞体発信アポトーシスシグナル以外の心疾患関連マーカーをさらに測定することを特徴とする、請求項１記載の心不全の判定方法。
【請求項３】
小胞体発信アポトーシスシグナルの測定が、該小胞体発信アポトーシスシグナルのｍＲＮＡ量または該小胞体発信アポトーシスシグナルのタンパク質量の測定により行われるものである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
被験者由来の試料が、心臓由来の細胞を含む試料である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
心臓由来の細胞が、心筋細胞である請求項４記載の方法。
【請求項６】
小胞体発信アポトーシスシグナルが、Ｃ／ＥＢＰホモロガスプロテイン（ＣＨＯＰ）である請求項１〜５いずれかに記載の方法。
【請求項７】
小胞体発信アポトーシスシグナル以外の心疾患関連マーカーが、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）である、請求項２〜６いずれかに記載の方法。
【請求項８】
被験者由来の試料中の小胞体発信アポトーシスシグナルを測定するための試薬を含有する、被験者の心不全の判定用試薬。
【請求項９】
さらに被験者由来野試料中に含まれる小胞体発信アポトーシスシグナル以外の心疾患関連マーカーを測定するための試薬を含有する、請求項８記載の試薬。
【請求項１０】
小胞体発信アポトーシスシグナルを測定するための試薬が、該小胞体発信アポトーシスシグナルのｍＲＮＡ量または該小胞体発信アポトーシスシグナルのタンパク質量を測定するための試薬である、請求項８または９記載の試薬。
【請求項１１】
被験者由来の試料が、心臓由来の細胞を含む試料である、請求項８〜１０のいずれかに記載の試薬。
【請求項１２】
心臓由来の細胞が、心筋細胞である請求項１１記載の試薬。
【請求項１３】
小胞体発信アポトーシスシグナルが、Ｃ／ＥＢＰホモロガスプロテイン（ＣＨＯＰ）である請求項８〜１２いずれかに記載の試薬。
【請求項１４】
小胞体発信アポトーシスシグナル以外の心疾患関連マーカーが、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）である、請求項９〜１３いずれかに記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心不全の判定方法および判定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで、慢性心不全の診断、病態の把握には自覚症状、他覚所見ならびに胸部レントゲン心臓超音波検査などを用いて行われてきた。近年では、血液サンプル指標である脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）測定が導入され、心不全の診断、治療は飛躍的に向上した。しかし、加齢、腎機能低下、心肥大等によっても血液中ＢＮＰ濃度の上昇が認められることから、ＢＮＰのみを指標とした心不全の診断は必ずしも十分であるとは言えない。
【０００３】
小胞体（ＥＲ）は分泌タンパク質や膜タンパク質をフォールディングする役割を担う細胞内小器官であり、その機能異常は糖尿病や神経変性疾患発症に関与することが明らかとなりつつある。肥大心・心不全では形態学的に小胞体が著明に発達していることが報告されており、小胞体ストレスが生じていることが予測されている。
【０００４】
ＣＨＯＰとは「Ｃ／ＥＢＰホモロガスプロテイン」の略称であり、Ｃ／ＥＢＰファミリーに属し、１６９のアミノ酸で構成されている。ＣＨＯＰは、小胞体ストレス誘導性のアポトーシス細胞死に特異的なシグナルであることが知られている。本発明者らは先に、小胞体ストレスの指標であるＧＲＰ７８およびこのＣＨＯＰの発現がヒトの不全心において認められることを報告している（非特許文献１）。しかしながら、小胞体ストレスおよび小胞体ストレスにより誘導されるアポトーシスの心不全における役割については、未だ不明である。
【非特許文献１】岡田、南野ら、サーキュレーション（Circulation）第110巻705-712頁(2004年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、心不全を精度良く判定し、その状態をより的確に把握するための方法および試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
今般、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、被験者由来の試料中のＣＨＯＰ等の小胞体発信アポトーシスシグナルの測定が、心不全の判定に適用し得ることを見出し、本発明を完成させた。即ち、本発明は以下の［１］〜［１４］に関する。
［１］  被験者由来の試料中の小胞体発信アポトーシスシグナルを測定することを特徴とする、心不全の判定方法。
［２］  被験者由来の試料中の小胞体発信アポトーシスシグナル以外の心疾患関連マーカーをさらに測定することを特徴とする、［１］記載の心不全の判定方法。
［３］  小胞体発信アポトーシスシグナルの測定が、該小胞体発信アポトーシスシグナルのｍＲＮＡ量または該小胞体発信アポトーシスシグナルのタンパク質量の測定により行われるものである、［１］または［２］記載の方法。
［４］  被験者由来の試料が、心臓由来の細胞を含む試料である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］  心臓由来の細胞が、心筋細胞である［４］記載の方法。
［６］  小胞体発信アポトーシスシグナルが、Ｃ／ＥＢＰホモロガスプロテイン（ＣＨＯＰ）である［１］〜［５］いずれかに記載の方法。
［７］  小胞体発信アポトーシスシグナル以外の心疾患関連マーカーが、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）である、［２］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］  被験者由来の試料中の小胞体発信アポトーシスシグナルを測定するための試薬を含有する、被験者の心不全の判定用試薬。
［９］  さらに被験者由来野試料中に含まれる小胞体発信アポトーシスシグナル以外の心疾患関連マーカーを測定するための試薬を含有する、［８］記載の試薬。
［１０］  小胞体発信アポトーシスシグナルを測定するための試薬が、該小胞体発信アポトーシスシグナルのｍＲＮＡ量または該小胞体発信アポトーシスシグナルのタンパク質量を測定するための試薬である、［８］または［９］記載の試薬。
［１１］  被験者由来の試料が、心臓由来の細胞を含む試料である、［８］〜［１０］のいずれかに記載の試薬。
［１２］  心臓由来の細胞が、心筋細胞である［１１］記載の試薬。
［１３］  小胞体発信アポトーシスシグナルが、Ｃ／ＥＢＰホモロガスプロテイン（ＣＨＯＰ）である［８］〜［１２］いずれかに記載の試薬。
［１４］  小胞体発信アポトーシスシグナル以外の心疾患関連マーカーが、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）である、［９］〜［１３］のいずれかに記載の試薬。
【発明の効果】
【０００７】
本発明者らは、下記のことを確認した：
１）ヒト不全心において小胞体ストレスに起因して発せられるアポトーシス細胞死関連転写因子であるＣＨＯＰが誘導される。
２）ヒト不全心におけるＣＨＯＰの発現量はヒト不全心におけるＢＮＰの発現量と相関する。なお、ヒト不全心におけるＢＮＰの発現量はヒト血清中ＢＮＰの発現量と相関することが確認されている（Goetze JP et al, FASEB J. 2003 Jun; 17(9):1105-1107）。
３）培養ラット新生児心筋細胞へ小胞体ストレス誘導性物質を作用させると、ＣＨＯＰの発現量およびアポトーシスによる細胞死が増加する。
４）培養ラット新生児心筋細胞の小胞体ストレス誘導性アポトーシスは、該細胞中のＣＨＯＰをＲＮＡ干渉法によって抑制した場合には、弱められる。
５）肥大心から心不全に移行させる、マウス大動脈縮窄（ＴＡＣ）モデルにおいてＢＮＰは肥大心および不全心の両方において発現量が増加するが、ＣＨＯＰの発現量は肥大心では増加せず、不全心においてのみ増加する。
【０００８】
ヒト血液中ＢＮＰ量が定量的心不全マーカーとして使用し得ることについてはすでに確認されており、上記のごとく、現在臨床において用いられている。ＢＮＰ測定のためのキットとしても市販のものがある（例えばシオノリアＢＮＰ（塩野義製薬株式会社）、デタミナーＢＮＰ（協和メデックス株式会社））。今回、ヒト不全心においてＢＮＰ発現量とＣＨＯＰの発現量との間に良好な相関が認められ、またＣＨＯＰの発現が、心不全により特異的であることを確認した。上記知見より、小胞体発信アポトーシスシグナルを心不全の判定のためのマーカーとして使用する本発明の方法は、現在のＢＮＰをマーカーとする判定方法に代わって、あるいはＢＮＰをマーカーとする判定方法と併用することによって、心不全をより精度良く判定し、その状態をより的確に把握することを可能とするものである。
したがって、本発明の心不全の判定方法によって、心不全の判定、心機能、重篤度、治療による状態変化、心不全の予後を判定、把握することが可能となり、特に心不全の重篤度を効果的に判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の方法にて判定される心不全としては、例えば急性心筋梗塞、急性心不全、慢性心不全、拡張型心筋症、虚血性心筋症、心臓弁膜症などが挙げられる。
本発明において、「小胞体発信アポトーシスシグナル」は、小胞体がストレスを受けてアポトーシスによる細胞死に至る過程で小胞体から発信（産生）されるシグナルを意味し、例えばＣＨＯＰ、カスパーゼ１２、ＪＮＫ等が挙げられる。これらのうちでも、ＣＨＯＰが好適に用いられる。ＣＨＯＰはＣ／ＥＢＰファミリーの一部であり、Ｃ／ＥＢＰファミリーとヘテロダイマーを形成していることが報告されている。本発明においては、これらＣ／ＥＢＰファミリーや複合体もＣＨＯＰに包含されるものとする。
【００１０】
本発明において、「被験者由来の試料」とは、被験者より採取されたそのままの試料のみならず、採取された試料を適宜処理して調製された試料も含まれる。このような調製試料としては、被験者由来の試料をホモジェネートして調製した試料、被験者から採取した試料から調製した病理用切片等が挙げられる。
【００１１】
本発明において、被験者由来の試料中の小胞体発信アポトーシスシグナルを測定し、その量を心不全の判定の指標とする。
【００１２】
本発明の方法において、被験者としては特に限定的ではなく、種々の臨床所見により心不全に罹患している疑いがある患者であっても、健康診断において心不全の危険性を調べるような、現状においては心不全に罹患している兆候が見いだされていない者であってもよい。
【００１３】
本発明の方法において用いられる、被験者由来の試料としては例えば心筋細胞等の心臓由来の細胞等が挙げられる。
【００１４】
本発明における小胞体発信アポトーシスシグナルの測定方法としては、該シグナルの相対量あるいは絶対量を測定することのできる方法であれば特に制限はない。例えば被験者由来の試料中に含まれる小胞体発信アポトーシスシグナルに関連する核酸量を測定する方法、小胞体発信アポトーシスシグナルタンパク質量を測定する方法等が挙げられる。
【００１５】
小胞体発信アポトーシスシグナルに関連する核酸としては、該シグナルをコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡなどが挙げられるが、ｍＲＮＡを用いることが好ましい。核酸量を測定する方法としては、従来公知のものいずれを採用してもよく、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法が例示される。
【００１６】
小胞体発信アポトーシスシグナルタンパク質の量を測定する方法としては、従来公知のタンパク質量の測定方法いずれを用いても良く、例えば免疫組織化学分析法、免役ブロット法等が例示される。
【００１７】
下記に説明するように、本発明においてはじめて小胞体発信アポトーシスシグナルの一つであるＣＨＯＰ発現量が、従来から使用されているＢＮＰ濃度と正の相関関係を示すことが確認された。即ち、小胞体発信アポトーシスシグナルを測定することによって、心不全の有無のみならず、心不全の状態、心機能、心不全の重篤度、心不全の予後の判定・把握が可能である。
【００１８】
本発明においては、被験者由来の試料中の小胞体発信アポトーシスシグナルと、該シグナル以外の心疾患関連マーカーの両方を測定し、その測定値の組み合わせから被験者の心不全を判定してもよい。小胞体発信アポトーシスシグナル以外の心疾患関連マーカーとしては、従来から心不全のマーカーとして知られたものがいずれも用いられ、例えばＢＮＰ、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ），トロボニンＴ、トロボニンＩ、クレアチニンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、心臓由来の脂肪酸結合蛋白（Ｈ−ＦＡＢＰ）等が挙げられる。これらの中でもＢＮＰが特に好適に用いられる。
【００１９】
小胞体発信アポトーシスシグナルの測定に使用される被験者由来の試料と、他の心疾患関連マーカーの測定に使用される被験者由来の試料は同一であっても、異なっていてもよい。両測定において使用する被験者由来の試料が異なる場合、他の心疾患関連マーカーの測定に使用される被験者由来の試料としては、例えば血液（全血）、血漿、血清等が挙げられる。他の心疾患関連マーカーの測定は、各マーカーについて現在知られている方法、あるいは臨床にて実施されている方法に準じて行えばよい。
【００２０】
本発明の方法による被験者の心不全の判定は、例えば以下のような工程により行うことができる。
［１］  被験者由来の試料中の小胞体発信アポトーシスシグナルを測定する工程；
［２］  得られた測定値から、予め作成された測定値と評価基準の相関関係に基づいて被験者の心不全を判定する工程。
【００２１】
ここで「評価基準」とは、従来から用いられている心不全を判定し得る基準を適宜採用することができ、例えば重篤度の評価基準としてはニューヨークハートアソシエーションによる心機能分類に基づく評価基準が例示される。
【００２２】
本発明の方法においては、予め複数の試料を用いて小胞体発信アポトーシスシグナルの測定値と心不全の評価基準との関係を示す標準曲線あるいは相関表を作成しておく。次いで、被験者由来の試料を用いて、該試料中の小胞体発信アポトーシスシグナルを測定し、得られた測定値をこの標準曲線等にあてはめて、心不全を判定する。
【００２３】
本発明の心不全の判定試薬は、被験者由来の試料中の小胞体発信アポトーシスシグナル測定のための試薬を含有する。かかる試薬としては、測定対象が核酸であるか、タンパク質であるかによって、また採用する測定方法によって適宜選択すればよい。例えばリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にてＤＮＡもしくはｍＲＮＡ量を測定する場合には、必要な構成成分としてプライマー、プローブを含む試薬等が挙げられる。また小胞体発信アポトーシスシグナルタンパク質量を測定する場合には、免疫測定法、免疫組織化学分析法、免疫ブロット法等の方法が採用されるが、かかる方法にて用いられる構成成分としては、小胞体発信アポトーシスシグナルに特異的に結合する物質が挙げられるが、抗小胞体発信アポトーシスシグナル抗体等が好適に用いられる。
【００２４】
本発明の心不全の判定試薬はさらに、小胞体発信アポトーシスシグナル以外の心疾患関連マーカーを測定するための試薬を含んでいてもよい。かかる試薬としては、該マーカーの測定に現在用いられている試薬等が挙げられる。
【００２５】
本発明の心不全の判定用試薬は、保存や運搬等のためにキットの形態を取ることもできる。特に本発明の心不全の判定用試薬が、他の心疾患関連マーカーを測定するための試薬を含む場合には、キットの形態が好ましい。
以下本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はいかなる意味においても本実施例に制限されない。
【実施例１】
【００２６】
ヒト心臓試料
ヒト心臓試料は国立循環器病センター（No.14-18)および葉山ハートセンターの承認されたプロトコルに基づいて試験した。免疫組織化学分析に供した心臓試料は、拡張型心筋症（ＤＣＭ）の患者の手術時に得られたもの（２名分）、急性白血病および骨肉腫により死亡した患者２名の剖検時に得られたもの（コントロール）である。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＤＣＭ患者１０名および虚血性心筋症（ＩＣＭ）患者３名で２００1年１０月〜２００２年１２月の間に葉山ハートセンターにて左室形成術を受けた者から得た。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのためのコントロール心臓試料５体はＢＤ Biosciences社より購入した。ＲＮＡを抽出するための組織サンプルは−８０℃で使用まで保存した。免疫組織化学染色用の組織片は固定化し、パラフィンに包埋した。
葉山ハートセンターにて左室形成術を受ける直前に評価した１３名の臨床所見を表１にまとめた。
【表１】
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【００２７】
ラット新生児の心筋細胞培養
先に報告されている方法にて、ラットの新生児心筋細胞の一次培養物を調製した。実験は全て、大阪大学医学部実験動物取り扱いガイドラインおよび実験動物の使用に関するAmerican Heart Associationの指針に基づき行った。
【００２８】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ヒトおよびラットの心臓サンプルからのＲＴ−ＰＣＲは、Omniscript Reverse Transcription Handbook(QIAGEN Inc.)に基づいて行った。ＢＮＰとＧＲＰ７８、ＣＨＯＰおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のヒトおよびラットのプライマーとプローブは、試薬販売者のプロトコルに従って（Applied Biosystems, https://www.appliedbiosystems.com/catalog/)デザインした。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲはABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems)を用い、コントロールの全ＲＮＡの連続的希釈物を用いたrelative standard curve法にて行った。なお、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいては、コントロールとしてＧＡＰＤＨを増幅するためのプライマーを同時に用いて行い、該ＧＡＰＤＨの発現量を指標に各ｍＲＮＡの発現量を確認した。
【００２９】
免疫組織化学分析
免疫組織化学分析は先に報告されている方法によって実施した。ＧＲＰ７８（ｓｃ−１０５０）およびＣＨＯＰ（ｓｃ−７９３）を標的とする一次抗体はSanta Cruz Biotechnology Inc.より購入した。リン酸化−ＪＮＫ抗体はCell Signaling Technology, Incより購入した。ヒト大腸の腺癌の組織片スライドはBioChain Institute, Inc.より購入した。
【００３０】
免疫ブロット
免疫ブロットはMinamino, T et al., Circ Res. 2001;88:587-592.に記載の方法にて実施した。ＧＲＰ７８（ｓｃ−１０５０）およびＣＨＯＰ（ｓｃ−７９３）を標的とする一次抗体はSanta Cruz Biotechnology Inc.より購入した。ラット新生児心筋細胞へチュニカマイシン(Sigma-Aldrich)を作用させ、その４８時間後にラットの心筋細胞を回収した。
【００３１】
アポトーシスアッセイ
ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）法をOkada K,  et al., Circulation. 2004;110:705-712.に記載の手順にて実施した。
ラット新生児心筋細胞へチュニカマイシン(Sigma-Aldrich)を作用させ、その４８時間後に、細胞をＴＵＮＥＬ染色に供した。ＤＡＰＩ陽性心筋細胞（ｎ＝１００）中のＴＵＮＥＬ陽性心筋細胞数を５回数え、その比をパーセントで表示した。
【００３２】
ＭＴＴアッセイ
心筋細胞を４８時間、チュニカマイシンにて処理し、その後に細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより評価した。アッセイはセルカウンティングキット−８（和光純薬株式会社）を用い、キットの説明書に基づいて行った。生存細胞のパーセントは、未処理細胞を１００％とした場合の割合として示した。
【００３３】
ＲＮＡインターフェレンス（ＲＮＡｉ）
ＣＨＯＰのｍＲＮＡをノックダウンさせるべく、３’ｄＴｄＴを付した３本のshort interfering RNA(siRNA）を設計し、調製した。
ＣＨＯＰ  ｓｉＲＮＡ−１：  ５’−ＣＣＵＵＣＡＣＵＡＣＵＣＵＵＧＡＣＣＣ−３’
ＣＨＯＰ  ｓｉＲＮＡ−２：  ５’−ＧＡＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＵＡＧＧＡ−３’
ＣＨＯＰ  ｓｉＲＮＡ−３：  ５’−ＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＵＧＡＧＡＧＧ−３’
【００３４】
ラットの心筋細胞を単離した後、ダルベコのイーグル改変培地(Invitrogen Corporation)にて培養した。オプチ−ＭＥＭ（Opti-MEM、Invitrogen Corporation)、ｓｉＲＮＡ  オリゴヌクレオチド(ＣＨＯＰ  ｓｉＲＮＡ  １−３） (60 nmol/l)およびオプチフェクト（Optifect、 Invitrogen Corporation)は心筋細胞を単離した日に添加した。陰性コントロールとして、Photinus pyralisより取ったホタルルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（ＧＬ２  ｓｉＲＮＡ）を添加した(Elbashir SM et al., Nature. 2001;411:494-498)。ＣＨＯＰのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを、ＣＨＯＰｓｉＲＮＡ形質移入の２４及び４８時間後に測定した。
【００３５】
マウスのマウス大動脈縮窄（ＴＡＣ）モデル
マウスの大動脈縮窄手術（ＴＡＣ）を施し、経時的に心エコー検査により観察した。コントロールとして偽手術を施したマウスを用いた。ＴＡＣ手術１週間後には、マウスは肥大心を発症しており、４週間後には心不全を発症していることが確認された。ＴＡＣ手術１週間後（肥大心モデル）、およびＴＡＣ手術後４週間（不全心モデル）における、心臓でのＧＲＰ７８ｍＲＮＡの発現量（ノーザンブロット法により解析）、ＣＨＯＰ蛋白の発現量（ウエスタンブロット法により解析）およびＢＮＰｍＲＮＡの発現量（ＲＴ−ＰＣＲ法により解析）を測定した。
【００３６】
統計解析
データは平均±ＳＥＭで示す。非対称ｔ−試験をコントロールと不全心のＢＮＰ、ＧＲＰ７８およびＣＨＯＰのｍＲＮＡレベルの差を比べるのに用いた。個々人のＢＮＰのｍＲＮＡレベルと、ＧＲＰ７８またはＣＨＯＰとの間の関係を相関係数分析によって調べた。培養ラット心筋細胞を用いたＲＮＡｉ法の結果の統計解析は、ボンフェロニの１方向ＡＮＯＶＡにて行った。全ての分析において、ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとした。
【結果】
【００３７】
小胞体の形態学的進展および不全心臓試料におけるＧＲＰ７８とＣＨＯＰの発現量の増加
ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色部を調べたが、コントロール患者から取った心臓試料には空胞の生成は認められなかった（図１、ａおよびｂ）。一方、心不全患者からの心臓試料には、核周囲の領域の空胞の生成が顕著に認められた（図１、ｃおよびｄ）。免疫組織化学分析により、ＧＲＰ７８の発現はＤＣＭの患者において増加していたが（図１、ｇおよびｈ）、コントロール患者には増加していなかった（図１、ｅおよびｆ）。ＣＨＯＰの発現もまた、ＤＣＭ患者の心臓試料で増加していた（図１、ｋおよびｌ）が、コントロール患者ではそうではなかった（図１、ｉおよびｊ）。ＨＥ染色における空胞の局在が小胞体のシャペロンであるＧＲＰ７８の局在状況と一致することから、不全心における空胞の生成は不全心の心筋細胞内の小胞体ルーメンの拡張を意味することが示唆される。これに対して、ＪＮＫのリン酸化は心不全患者において認められなかった（図１、ｏおよびｐ）。これらの結果は小胞体誘導性アポトーシスシグナル伝達系のうちＣＨＯＰはヒト不全心において誘導されるが、ＪＮＫは誘導されないことを示唆する。
ヒト大腸癌のアデノカルシノ−マ部分を抗リン酸ＪＮＫ抗体の陽性コントロールとして用いた（図１、ｑ）。陰性コントロールは一次抗体として抗ＩｇＧ血清を、抗ＣＨＯＰの代わりに用いて、核、核周辺領域および細胞質において免疫応答性のないことを確認した（図１、ｒ〜ｕ）。抗ＩｇＧ（抗ヤギ）血清を抗ＧＲＰ７８の代わりに一次抗体として用いた場合にも、免疫応答性は認められなかった。小胞体の形態上の変化およびＧＰＲ７８およびＣＨＯＰ遺伝子の発現量の増加は、小胞体ストレスが誘導され、該ストレスにより小胞体より発信されるアポトーシスシグナル（小胞体発信アポトーシスシグナル）がヒト不全心にて活性化されていることを示唆する。
【００３８】
不全心臓試料における小胞体ストレスマーカーとＢＮＰの相関関係
組織片を提供した患者の臨床症状を表１に示している。１３名の患者全ての血清ＢＮＰレベル（６３７．５±１４２．９ｐｇ／ｍｌ）は、正常範囲の上限値からかなりはずれたものであった（図２Ａ）。小胞体ストレスマーカーとＢＮＰの関係をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にて調べた。ＢＮＰのｍＲＮＡの発現はＤＣＭまたはＩＣＭの患者１３名全てにおいて顕著に増加していたが、５名のコントロール患者の心臓にはＢＮＰの発現は認められなかった。（図２Ｂ）。ＣＨＦ患者において血清ＢＮＰレベルと心臓のＢＮＰｍＲＮＡのレベルには有意な相関が認められた（Ｒ＝０．６７，  ｐ＝０．０５  図２Ｃ）。このことから血清ＢＮＰはヒト不全心におけるＢＮＰの産生量を反映していることが確認される。
【００３９】
さらにＧＲＰ７８とＣＨＯＰ発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にて調べた。ＧＲＰ７８発現はコントロールの患者（ＧＰＲ７８／ＧＡＰＤＨ：１．０±０．１）と比べて１３名の患者全てにおいて（ＧＰＲ７８／ＧＡＰＤＨ：３．４±０．６）と有意に（ｐ＜０．０５）増加した（図２Ｄ）。ＣＨＯＰ発現もまた、コントロールの５名の患者（ＣＨＯＰ／ＧＡＰＤＨ：１．０±０．１）と比べて１３名の患者全てにおいて（ＣＨＯＰ／ＧＡＰＤＨ：１４．２±２．９）と、有意に（ｐ＜０．０５）増加していた。また、ＧＲＰ７８遺伝子とＣＨＯＰ遺伝子の発現量の間に有意な相関があることを確認した（ｒ＝０．６８、ｐ＜０．０５）（図２Ｈ）。
【００４０】
興味深いことに、ヒト不全心におけるＢＮＰ発現量とＧＲＰ７８またはＣＨＯＰの発現量の間に有意な相関が認められた（それぞれｒ＝０．６０、ｐ＜０．０５；ｒ＝０．５３、ｐ＜０．０５）（図２ＦおよびＧ）すなわち、不全心における小胞体ストレスと小胞体が惹起するアポトーシスシグナルはいずれも、心不全の進行に応じて増強されることが示唆される。
【００４１】
ＣＨＯＰ遺伝子の抑制による、小胞体ストレス誘導性心筋細胞アポトーシスの減弱化
小胞体ストレス誘導物質が心臓へＣＨＯＰ遺伝子の発現の増加を導くかどうかを調べるため、小胞体ストレス誘導作用を有することが知られている（Kaufman RJ, Genes Dev. 1999;13:1211-1233.，Breckenridge DG et al., Oncogene 2003;22:8608-8618）チュニカマイシンで処理した培養ラット胎児心筋細胞上へのＣＨＯＰ遺伝子の発現を調べた。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により、チュニカマイシンが培養心筋細胞におけるＣＨＯＰ遺伝子の発現量を増加させることを確認した（図３Ａ）。チュニカマイシン以外の小胞体ストレス誘導性物質であるタプシガルジン（thapsigargin）処理後４８時間後（ＣＨＯＰ／ＧＡＰＤＨ：  １．０±０．１  ｖｓ．  １９．０±０．３）およびブレフェルジンＡ（brefeldin A）処理４８時間後（ＣＨＯＰ／ＧＡＰＤＨ：  １．０±０．３  ｖｓ．  ８．１±０．７）それぞれのＣＨＯＰ遺伝子の発現もまた増加した。
【００４２】
ＣＨＯＰの心筋細胞の小胞体ストレス誘導性アポトーシスにおける役割を調べるため、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いてＣＨＯＰ遺伝子の翻訳後抑制を行った。第１に、３つのＣＨＯＰ遺伝子に対するｓｉＲＮＡによるトランスフェクション後のＣＨＯＰ遺伝子のmRNAを調べた。３つのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは有意にＣＨＯＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルを下げた（図３Ｂ）。また、ＣＨＯＰのｓｉＲＮＡ−２の形質移入が有意に（ｐ＜０．０５）thapsigarginによるＣＨＯＰ遺伝子の発現（ＧＨＯＰ／ＧＡＰＤＨ：１９．３±０．３ｖｓ．２．１±１．０）、またはbrefeldinA によるＣＨＯＰ遺伝子の発現（ＣＨＯＰ／ＧＡＰＤＨ：  ８．１±０．７  ｖｓ．  ２．２±０．８）を弱めた。タンパク質レベルでは、ＣＨＯＰｓｉＲＮＡ−２を心筋細胞へ形質移入した場合にはＣＨＯＰの発現はほとんど完全に押さえられていた（図３Ｃ）。
【００４３】
チュニカマイシンはＴＵＮＥＬ−陽性心筋細胞を増加させたが、これはＣＨＯＰに対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドによって有意に（ｐ＜０．０５）弱められ、一方、ＧＬ２に対するｓｉＲＮＡでは変わらなかった（図３Ｄ，Ｅ）。さらに、チュニカマイシンは細胞の生存率を減少させたが、この減少もＣＨＯＰに対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドによって有意に（ｐ＜０．０５）弱められ、ＧＬ２に対するｓｉＲＮＡでは変わらなかった（図３Ｆ）。これらの結果は小胞体ストレスはＣＨＯＰ依存性パスウエイによって心筋細胞アポトーシスを誘導することを示唆する。
【００４４】
マウスＴＡＣモデル
マウス大動脈縮窄モデルでは、１週間後には肥大心を発症しており、これが４週間後には心不全へと進行していることが確認された。ＴＡＣ手術後１週間後および４週間後の心臓におけるＧＲＰ７８、ＢＮＰ、ＣＨＯＰの発現を調べたところ、１週間後、４週間後のいずれにおいてもＧＲＰ７８およびＢＮＰはコントロールと比して顕著に発現が増加していた。一方、ＣＨＯＰの発現はＴＡＣ手術１週間後においてはコントロールとほぼ同等であったが、４週間後、すなわち心不全を発症している心臓においては、顕著に増加していた（図４）。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本願において出願人らはヒト不全心において小胞体ストレスが誘導され、該ストレスにより小胞体より発信されるアポト−シスシグナル（小胞体発信アポトーシスシグナル）が活性化されることを明らかにした。小胞体ストレスと小胞体発信アポトーシスシグナルは心機能不全が進行するにつれて活性化されることから、小胞体ストレス誘導性心筋細胞アポトーシスが高い血清ＢＮＰレベルのＣＨＦ患者の予後の悪化の原因となっていると考えられる。さらに、ＣＨＯＰがヒト不全心において誘導され、小胞体ストレス誘導性心筋細胞アポトーシスが、ＣＨＯＰの抑制により減弱化されたことから、ＣＨＯＰは不全心における心筋細胞アポトーシスの治療薬を創出する上での理論的なターゲットである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ヒト不全心臓試料における小胞体ストレスの誘導および小胞体発信アポトーシスシグナルの活性化。コントロール１（ａ、ｅ、ｉ、ｍ、ｒ）およびコントロール２（ｂ、ｆ、ｊ、ｎ、ｓ）はそれぞれ白血病および骨肉腫患者の剖検時に得られた組織試料である。ＤＣＭ１（ｃ、ｇ、ｋ、ｏ、ｔ）およびＤＣＭ２（ｄ，ｈ，ｌ，ｐ，ｕ）はそれぞれ２名のＤＣＭ患者の手術時に得た組織片である。図１ｅ−ｌはＧＲＰ７８（ｅ−ｈ）およびＣＨＯＰ（ｉ−ｌ）の免疫組織化学分析結果を示す。スケールバーは４０μｍを示す。
【図２】ＢＮＰ、ＧＲＰ７８およびＣＨＯＰのｍＲＮＡのヒト不全心臓への発現を示す。Ａ：１３名の心不全患者の血清ＢＮＰレベル。点線はＢＮＰの正常範囲の上限（１８．４ｐｇ／ｍＬ）を示す。Ｂ：リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて定量したＢＮＰのｍＲＮＡ発現量を示す。心不全患者１３名（ＤＣＭおよびＩＣＭ）はいずれも高いＢＮＰのｍＲＮＡレベルを示したが、５名のコントロールにおいてはＢＮＰのｍＲＮＡは検出されなかった。Ｃ：ＣＨＦ患者の血清ＢＮＰレベルと心臓ＢＮＰｍＲＮＡレベルとは、正の相関関係を示す。Ｄ：リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した心不全患者の心臓におけるＧＲＰ７８の発現量。Ｅ：リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した心不全患者の心臓におけるＣＨＯＰの発現量。Ｆ〜Ｈ：ＢＮＰと小胞体発信アポトーシスシグナルの発現量はいずれもお互い相関関係を示す。
【図３−１】小胞体ストレス誘導性アポトーシスにおいてＣＨＯＰ遺伝子を抑制した場合の作用Ａ：培養ラット新生児心筋細胞をチュニカマイシン（Ｔｕ）で刺激した際のＣＨＯＰの発現量の経時変化。＊ｐ＜０．０５対０時間。Ｂ：ＣＨＯＰに対する３種類のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを形質移入した後のチュニカマイシン誘導性ＣＨＯＰ発現量。＊ｐ＜０．０５対コントロール（チュニカマイシン処理無し）Ｃ：ＣＨＯＰのｓｉＲＮＡ−２を形質移入した後のＣＨＯＰタンパク質の発現。ＣＨＯＰノックダウン心筋細胞ではＣＨＯＰタンパク質の発現はほぼ完全に抑制された。Ｄ：ＣＨＯＰ遺伝子を抑制した培養心筋細胞を用いたＴＵＮＥＬアッセイの結果。スケールバーは２０μｍを示す。Ｅ：ＴＵＮＥＬ陽性細胞％チュニカマイシンにて誘導されたＴＵＮＥＬ陽性細胞は、ＣＨＯＰに対するｓｉＲＮＡ−２によって有意に減少したが、ＧＬ２に対するｓｉＲＮＡによっては変わらなかった。＊ｐ＜０．０５対コントロール（チュニカマイシン処理無し）、＃ｐ＜０．０５対ＣＨＯＰのｓｉＲＮＡ−２Ｆ：チュニカマイシン処理後の培養心筋細胞の生存率％チュニカマイシンにより細胞生存率が低下したが、その低下の程度はＣＨＯＰのｓｉＲＮＡ−２によって有意に減弱化された。＊ｐ＜０．０５対コントロール（チュニカマイシン処理無し）、＃ｐ＜０．０５対ＣＨＯＰのｓｉＲＮＡ−２。
【図３−２】図３Ｄの拡大図である。
【図４】マウスＴＡＣモデルにおいて、肥大心（ＴＡＣ後１週間）と不全心（ＴＡＣ後４週間）におけるＧＲＰ７８、ＢＮＰおよびＣＨＯＰの発現を示す。Ａ：肥大心および不全心における、ＧＲＰ７８ｍＲＮＡの発現量（ノーザンブロット法による解析）を示す。ＧＲＰ７８の発現量は肥大心、不全心において偽手術群と比して顕著に増加した。Ｂ：肥大心および不全心における、ＣＨＯＰ蛋白発現量（ウエスタンブロット法による解析）。肥大心においてもＣＨＯＰ発現は認められたが、不全心においてその発現量は明らかに増加していた。Ｃ：肥大心および不全心におけるＢＮＰｍＲＮＡの発現量（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法による解析）。肥大心および不全心においてＢＮＰの顕著な発現が認められた。＊ｐ＜０．０５対偽手術群。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【配列表】
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