(57)【要約】【課題】抽出溶媒に対する細胞毒性回避のための種々の工程を回避できる有機酸の発酵生産方法を提供する。【解決手段】有機酸の発酵生産方法を、有機酸生産酵母を、該有機酸生産酵母を培養可能な培地と、該有機酸生産酵母を培養する培地中の有機酸を抽出可能であって前記培地と二相分離可能な抽出溶媒との存在下で培養する培養工程を備えるようにする。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸の発酵生産方法であって、
有機酸生産酵母を、該有機酸生産酵母を培養可能な培地と、該有機酸生産酵母を培養する培地中の有機酸を抽出可能であって前記培地と二相分離可能な抽出溶媒との存在下で培養する培養工程を備える、発酵生産方法。
【請求項２】
前記抽出溶媒には、トリ−ｎ−オクチルアミン、トリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択される１種又は２種以上のキャリアを含有している、請求項１に記載の発酵生産方法。
【請求項３】
前記抽出溶媒には、オクチルアルコール、ラウリルアルコール及びオレイルアルコール並びにヘプタン、ヘキサン、ケロシン、イソオクタン、ヘキサデカン、トルエン、キシレン及びパラフィンオイルからなる群から選択される１種又は２種以上を前記キャリアの希釈剤として含有する、請求項１又は２に記載の発酵生産方法。
【請求項４】
前記抽出溶媒は、２０ｖｏｌ％以上のキャリアを含有している、請求項１〜３のいずれかに記載の発酵生産方法。
【請求項５】
前記抽出溶媒は、２０ｖｏｌ％以上のトリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミンを含有するオレイルアルコールである、請求項４に記載の発酵生産方法。
【請求項６】
前記培養工程は、前記培地と前記抽出溶媒とをおおよそ二相系を維持しながら培養する工程である、請求項１〜５のいずれかに記載の発酵生産方法。
【請求項７】
前記培養工程は、前記有機酸生産酵母が代謝可能な炭素源を連続的に加えて培養する工程である、請求項１〜６のいずれかに記載の発酵生産方法。
【請求項８】
前記培養工程における培養中の前記培地のｐＨは５．０以下である、請求項１〜７のいずれかに記載の発酵生産方法。
【請求項９】
前記有機酸は、乳酸である、請求項１〜８のいずれかに記載の発酵生産方法。
【請求項１０】
前記有機酸生産酵母は、遺伝子工学的に有機酸生産酵素系が導入された遺伝子組換え酵母である、請求項１〜９のいずれかに記載の発酵生産方法。
【請求項１１】
前記遺伝子組換え酵母の宿主は、サッカロマイセス・セレビシエから選択される、請求項１０に記載の発酵生産方法。
【請求項１２】
前記遺伝子組換え酵母は、ＰＤＣ１プロモーターの制御下に有機酸生産酵素をコードするコード領域を発現可能に備える酵母である、請求項１０又は１１に記載の発酵生産方法。
【請求項１３】
前記有機酸生産酵素は、乳酸脱水素酵素である、請求項１０〜１２のいずれかに記載の発酵生産方法。
【請求項１４】
有機酸生産酵母である、有機酸抽出発酵用微生物。
【請求項１５】
前記有機酸生産酵母は、ＰＤＣ１プロモーターの制御下に有機酸生産酵素をコードするコード領域を発現可能に備える酵母である、請求項１４に記載の微生物。
【請求項１６】
前記遺伝子組換え酵母の宿主は、サッカロマイセス・セレビシエＩＦＯ２２６０株である、請求項１４に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機酸の抽出発酵による生産方法及び該生産方法に用いる有機酸生産酵母に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、微生物の発酵液から有機酸を効率的に回収するために、溶媒抽出を用いることが検討されてきた。溶媒抽出はエネルギーを使わず選択的に目的成分を分離でき、また装置が簡易でスケールアップに適するため、環境負荷低減の観点からも注目されている。加えて、有機酸を発酵するのに伴って溶媒抽出により有機酸を分離回収することが出来れば、多くの有機酸発酵中に生じる生産物阻害を回避することも可能である。特に生産物阻害が問題となる乳酸菌による乳酸発酵について溶媒抽出発酵の検討が多くなされてきた。
【０００３】
例えば、直鎖Ｃ８〜１０アルキル三級アミンを含むＡｌａｍｉｎｅ３３６を使って乳酸の抽出発酵を行うことが検討された（非特許文献１）。この文献によれば、Ａｌａｍｉｎｅ３３６の乳酸菌に対する毒性は致命的であることから、乳酸菌に毒性がないことが知られるオレイルアルコール（溶媒）でＡｌａｍｉｎｅ３３６（キャリア）を希釈し毒性を弱めたが、培地の１０分の１量の３０ｖｏｌ％Ａｌａｍｉｎｅ３３６含有オレイルアルコールと攪拌しながら培養させたとき、乳酸菌は全く増殖せず、１５ｖｏｌ％Ａｌａｍｉｎｅ３３６含有オレイルアルコールを用いた場合でなんとか増殖できる程度であることが開示されている。さらに、この文献によれば、以上のことから、乳酸菌をκ−カラギーナンに固定化した上、発酵槽から発酵液を一定間隔で一部取り出し、この分取した発酵液から１５ｖｏｌ％Ａｌａｍｉｎｅ含有オレイルアルコールで乳酸を抽出し、乳酸抽出後の発酵液を発酵槽に返送するという抽出発酵方法を採ったことが開示されている。
【０００４】
また、乳酸菌へのＡｌａｍｉｎｅ３３６の細胞毒性を回避するために、菌体分離装置を使って菌体を含まない発酵液のみを取り出し、Ａｌａｍｉｎｅ３３６を用いて溶媒抽出する方法が検討された（非特許文献２）。この文献によれば、溶媒抽出操作後の発酵液には致死量のＡｌａｍｉｎｅ３３６が分配しており、そのままでは発酵槽に返送できないため、発酵液中のＡｌａｍｉｎｅ３３６を他の溶剤を用いて分配させ取り除く第２の抽出工程を設け、その後、発酵液を発酵槽に返送している。
【０００５】
また、抽出溶媒の候補についても種々の検討がなされている（非特許文献３）。主な評価基準は乳酸の抽出効率、菌への毒性の二つであり、溶媒抽出発酵を実現するためにはこの両方の評価基準を満たす必要があった。
【非特許文献１】V. M. Yabannavarら, Bioreactor system with solvent extraction for organic acid production, Ann. N.Y. Acad. Sci., 506, 523-535
【非特許文献２】H.Hondaら, Effective lactic acid production by two-stage extractive fermentation Journal of fermentation and bioengineering, 79, 589-593, 1995
【非特許文献３】A. DemirciらBioseparation7, 297-308, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、これらの抽出手法はいずれも工業レベルでの使用には耐え得るものではなかった。すなわち、これらの抽出発酵では、いずれも、細胞毒性を回避するために発酵液の一部を取り出した上で抽出溶媒と接触させるという手法を取っているために発酵中における分取操作を必要としていた。第一の方法では、Ａｌａｍｉｎｅ３３６の細胞毒性を回避するために抽出溶媒として１５ｖｏｌ％Ａｌａｍｉｎｅ３３６含有オレイルアルコールを用いているが、その抽出効率は低く、工業的に乳酸を高効率で生産しようとする場合には、使用できるものではなかった。また、第二の方法では、Ａｌａｍｉｎｅ３３６の細胞毒性を排除するために発酵液の分取に際して菌体を取り除き、さらに、溶媒抽出後の発酵液からＡｌａｍｉｎｅ３３６を除く第二の抽出工程を設けるなど極めて複雑な操作を必要としていた。
【０００７】
さらに、培地中から抽出溶媒に分配させるには、乳酸が未解離であることが必要であるが、そうしたｐＨ条件で乳酸を発酵する乳酸菌は見出されていない。加えて、乳酸を効率的に抽出する溶媒はいくつか見つかっているが、従来から乳酸発酵に用いられてきた乳酸菌種が実用的なキャリア濃度で耐性を持つ抽出溶媒について報告はなされていない。
【０００８】
これらの様々な理由により、有機酸の抽出発酵は未だ工業化されていないのが現状である。
【０００９】
そこで、本発明では、抽出溶媒に対する細胞毒性回避のための種々の工程を回避できる有機酸の発酵生産方法を提供することを一つの目的とする。また、本発明では、発酵液から直接かつ連続的に溶媒抽出可能な有機酸の発酵生産方法を提供することを他の一つの目的とする。さらに、本発明は、合理的な抽出発酵により有機酸を生産できる微生物を提供することを他の一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記のように、現在までのところ、乳酸菌による乳酸発酵での抽出発酵を実用可能とする有効な解決策が見出されていなかった。一方、酵母についてはこうした抽出発酵の必要性がほとんどなく、このため抽出発酵についてほとんど検討されていないとともに、酵母については、有機酸を抽出可能な溶媒に対する耐性の有無や程度も全く知られていなかった。こうした背景のなか、本発明者らは、有機酸生産酵母に着目し、有機酸生産酵母が意外にも有機酸抽出溶媒に対して優れた耐性を有していることを見出し、さらにこの溶媒耐性が合理的な抽出発酵を実現可能な程度であることを見出し、上記した課題を一挙に解決できる本発明を完成するに至った。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【００１１】
本発明の一つの形態によれば、有機酸の発酵生産方法であって、有機酸生産酵母を、該有機酸生産酵母を培養可能な培地と、該有機酸生産酵母を培養する培地中の有機酸を抽出可能であって前記培地と二相分離可能な抽出溶媒との存在下で培養する培養工程を備える、発酵生産方法が提供される。
【００１２】
この形態においては、前記抽出溶媒には、トリ−ｎ−オクチルアミン、トリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドから選択される１種又は２種以上のキャリアを含有することができる。また、前記抽出溶媒には、オクチルアルコール、ラウリルアルコール及びオレイルアルコール並びにヘプタン、ヘキサン、ケロシン、イソオクタン、ヘキサデカン、トルエン、キシレン及びパラフィンオイルからなる群から選択される１種又は２種以上を前記キャリアの希釈剤として含有することができる。さらに、前記抽出溶媒は、２０ｖｏｌ％以上のキャリアを含有することが好ましい。より好ましくは、前記抽出溶媒は、３０ｖｏｌ％以上のキャリアを含有しており、さらに好ましくは３０ｖｏｌ％以上のトリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミンを含有するオレイルアルコールである。
【００１３】
この形態においては、前記培養工程は、前記培地と前記抽出溶媒とをおおよそ二相系を維持しながら培養する工程であることが好ましく、また、前記培養工程は、前記有機酸生産酵母が代謝可能な炭素源を連続的に加えて培養する工程であることが好ましい。さらに、前記培養工程における培養中の前記培地のｐＨは５．０以下であることが好ましい。
【００１４】
また、この形態においては、前記有機酸は、乳酸であることが好ましい。また、前記有機酸生産酵母は、遺伝子工学的に有機酸生産酵素系が導入された遺伝子組換え酵母であることが好ましく、より好ましくは、前記遺伝子組換え酵母の宿主は、サッカロマイセス・セレビシエから選択される。さらに好ましくは、前記遺伝子組換え酵母は、ＰＤＣ１プロモーターの制御下に有機酸生産酵素をコードするコード領域を発現可能に備える酵母である。前記有機酸生産酵素は、乳酸脱水素酵素であることが好ましい。
【００１５】
本発明の他の一つの形態によれば、有機酸生産酵母である、有機酸抽出発酵用微生物が提供される。
【００１６】
この形態においては、前記有機酸生産酵母は、ＰＤＣ１プロモーターの制御下に有機酸生産酵素をコードするコード領域を発現可能に備える酵母であることが好ましく、前記遺伝子組換え酵母の宿主は、サッカロマイセス・セレビシエＩＦＯ２２６０株が好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は有機酸の発酵生産方法及び有機酸抽出発酵用微生物に関する。本発明の有機酸の発酵生産方法は、有機酸生産酵母を、該有機酸生産酵母を培養可能な培地と、該有機酸生産酵母を培養する培地中の有機酸を抽出可能であって前記培地と二相分離可能な抽出溶媒との存在下で培養する培養工程を備えることを特徴としている。また、本発明の有機酸抽出発酵用微生物は、有機酸生産酵母である。
【００１８】
本発明の有機酸抽出発酵用微生物によれば、上記有機酸抽出溶媒に十分な耐性を有し、上記有機酸抽出溶媒の存在下であっても良好な増殖活性を維持できる。このため、微生物が培地中に発酵生産する有機酸を共存する抽出溶媒に分配しつつ発酵するという合理的な形態で有機酸を生産させることができる。また、本発明の発酵生産方法によれば、抽出溶媒に対する細胞毒性回避のための種々の工程を回避できるとともに、発酵液から直接かつ連続的に溶媒抽出が可能となる。この結果、有機酸による生産物阻害を回避して有機酸の連続的な発酵生産が可能となり、有機酸による培地ｐＨの低下を回避するための中和操作を省略又は抑制できる。さらに、微生物の固定化や、溶媒で有機酸を抽出するための間欠的又は連続的な発酵液の分取工程や有機酸抽出後の発酵液からのキャリアの回収工程などの煩雑で余分な工程を要しないため、エネルギーコストや装置コストなど各種の環境及び価格負荷を低減できる。さらに、高濃度又は光学的な観点などから高純度な有機酸が発酵可能な場合に精製のための加熱をすることなく有機酸を抽出できるため、発酵で得られた濃度や純度の低下を抑制することができる。
【００１９】
以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
（有機酸）
本発明において「有機酸」とは、酸性を示す有機化合物であるが、有機酸が備える酸性基としては好ましくはカルボン酸基である。また、「有機酸」には、遊離の酸の他、有機酸塩を含む。このような有機酸として、具体的には、乳酸、酪酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、マロン酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、アジピン酸などを挙げることができ、好ましくは、乳酸である。乳酸には、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、及びＤＬ−乳酸があるが、これらのいずれをも含む。
【００２０】
（有機酸発酵用微生物）
本発明の発酵用微生物である有機酸生産酵母は、有機酸生産が活性化された酵母であればよい。自然界からのスクリーニング、人工突然変異及び遺伝子工学的改変などのいずれの手法によって得られた酵母であってもよい。好ましくは、遺伝子工学的に改変された酵母である。有機酸の生産が促進されるよう遺伝子工学的に改変された酵母としては、好ましくは、酵母染色体上において有機酸合成酵素が導入された組換え酵母であることが好ましい。
【００２１】
こうした組換え酵母の宿主酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などのサッカロマイセス属酵母、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属酵母、クルイベロマイセス属酵母、キャンディダ属酵母などの酵母が挙げられる。酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属酵母が好ましい。例えば、サッカロマイセス・セレビシエＩＦＯ２２６０株を例示できる。
【００２２】
遺伝子組換え酵母においては適当なプロモーターの制御下に有機酸合成酵素をコードするコード領域を発現可能に保持している。高効率で有機酸を生産するには、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素１（ＰＤＣ１）遺伝子プロモーター、ＡＤＨ１遺伝子プロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（ＨＯＲ７遺伝子）プロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素２遺伝子（ＴＤＨ２遺伝子）プロモーター、熱ショックタンパク質３０遺伝子（ＨＳＰ３０遺伝子）プロモーター、ヘキソース輸送タンパク質７遺伝子（ＨＸＴ７遺伝子）プロモーター、チオレドキシンペルオキシダーゼ１遺伝子（ＡＨＰ１遺伝子）プロモーター、膜タンパク質１関連遺伝子（ＭＲＨ１遺伝子）プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素３（ＴＤＨ３）遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素１遺伝子（ＴＤＨ１遺伝子）プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ１遺伝子（ＴＰＩ１遺伝子）プロモーター及び細胞壁関連タンパク質１２遺伝子（ＣＣＷ１２遺伝子）及びリボゾーマルプロテインＳ３１遺伝子（ＲＳＰ３１遺伝子）プロモーターなどが挙げられる。なお、これらはいずれも酵母における内在性プロモーターであり、本発明の形質転換酵母において好ましく用いられる。こうしたプロモーター群から選択されるプロモーターとしては、少なくともＰＤＣ１遺伝子プロモーターを含むことが好ましい。ＰＤＣ１プロモーターの制御下で有機酸を合成する酵素を発現させることにより、高効率で有機酸を発酵することが期待でき、こうした酵母が本発明の微生物として有効だからである。
【００２３】
有機酸合成酵素としては、乳酸生産の場合には、Ｌ−乳酸脱水素酵素、Ｄ−乳酸脱水素酵素等の酵素、ピルビン酸生産の場合にはピルビン酸キナーゼ等、酢酸生産の場合にはピルビン酸オキシダーゼ等、コハク酸生産の場合にはスクシニルＣｏＡシンテターゼ等、リンゴ酸の場合にはフマル酸ヒドラターゼ等、クエン酸生産の場合にはクエン酸シンテターゼ等を例示できる。
【００２４】
例えば、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）としては、生物の種類に応じてあるいは生体内においても各種同族体が存在する。本発明において使用する乳酸脱水素酵素としては、天然由来のＬＤＨの他、化学合成的あるいは遺伝子工学的に人工的に合成されたＬＤＨも包含している。ＬＤＨとしては、好ましくは、乳酸菌などの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来であり、より好ましくは、植物、動物、昆虫などの高等真核生物由来であり、さらに好ましくは、ウシを始めとする哺乳類を含む高等真核生物由来である。Ｌ−ＬＤＨとしては、ウシ由来のＬＤＨ（Ｌ−ＬＤＨ）である。さらに、本発明におけるＬＤＨは、これらのＬＤＨのホモログも包含している。ＬＤＨホモログは、天然由来のＬＤＨのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸でありかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質、および、天然由来のＬＤＨとアミノ配列の相同性が少なくとも７０％、好ましくは８０％以上を有しかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質を含んでいる。また、Ｄ−ＬＤＨとしては、大腸菌、タコ及び乳酸菌由来のものなどが挙げられる。好ましくは乳酸菌由来のＤ−ＬＤＨである。なお、有機酸合成酵素をコードするコード領域は、酵母において複数コピー導入されていることが好ましい。
【００２５】
こうした組換え酵母は、通常の遺伝子組換え酵母の作製法に基づいて取得することができる。すなわち、宿主の酵母に、トランスフォーメーション法など従来公知の酵母への遺伝子導入法から選択される適切な手段により、外来遺伝子を導入することができる。外来遺伝子導入のためのＤＮＡ構築物は、例えば、適当なプロモーターとコードＤＮＡと転写調節領域等を含むＤＮＡ構築物とすることができる。こうしたＤＮＡ構築物としては、特に限定しないで、ＤＮＡそのもの、プラスミド（ＤＮＡ）、ウイルス（ＤＮＡ）バクテリオファージ（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体（ＹＡＣ）などから、外来遺伝子の導入形態（染色体外あるいは染色体内）に応じて選択される。ＤＮＡ構築物には、ターミネーター他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）を連結することができる。選択マーカーとしては、特に限定しないで、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めとする公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。なお、ＰＤＣ１遺伝子のプロモーターなど特定のプロモーターの制御下に相同組換えにより有機酸合成酵素のコード領域を導入することも当業者であれば適宜行うことができる。
【００２６】
このような有機酸生産酵母としては、例えば、特開２００３−９３０６０、特開２００３−２５９８７８、特開２００３−３３４０９２、特開２００４−１８７６４３、特開２００５−１３９２７０に記載の乳酸生産酵母等を好ましく用いることができる。
【００２７】
（有機酸の発酵生産方法）
本発明の有機酸の発酵生産方法において用いる有機酸生産酵母を培養可能な培地としては、一般に酵母に用いられる培地を利用できる。こうした培地は、当業者においては周知であり、当業者であれば適宜選択して用いることができる。
【００２８】
本発酵生産方法に用いる抽出溶媒、培地と二相分離可能である溶媒を選択する。培地との二相分離状態をおおよそ維持して発酵させることにより、発酵用微生物への細胞毒性を抑制して微生物の増殖活性を維持しつつ、同時に効率的な有機酸抽出が可能となり、さらに、発酵後に抽出溶媒の分離を容易に実現できる。こうした抽出溶媒を構成する有機溶媒としては、有機酸生産酵母が耐性のある有機溶媒であることが好ましく、例えば、Ｃ８〜Ｃ２０程度の長鎖アルキルアルコールが挙げられ、オクチルアルコール、ラウリルアルコール、オレイルアルコールなどが挙げられる。好ましくはオレイルアルコールを用いる。また、ヘプタン、ヘキサン、ケロシン、イソオクタン、ヘキサデカン、トルエン、キシレン、パラフィンオイルなどの炭化水素系溶剤も用いることができる。これらの有機溶媒は、後述するキャリアの希釈剤として機能し、これらの希釈剤を単独で又は２種類以上を組み合わせて使用することができる。また、上記アルコール系希釈剤と上記炭化水素系希釈剤とを組み合わせて用いることもできる。
【００２９】
抽出溶媒は、有機酸を抽出溶媒側に分配可能なキャリアを含有している。キャリアとしては、有機溶媒に可溶な第二級アミン又は第三級アミンが好ましく、より好ましくは第三級アミンである。こうしたキャリアとしては、ジ−ｎ−オクチルアミン、トリ−ｎ−オクチルアミン、トリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミン（商品名としてはＡｌａｍｉｎｅ３３６、コグニス社製）、トリラウリルアミン（商品名としてはＡｌａｍｉｎｅ３０４、コグニス社製）、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイド等が挙げられる。これらのキャリアから選択される１種又は２種以上を用いることができるが、好ましくは、トリ−ｎ−オクチルアミン、トリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミン、トリブチルホスフェート及びトリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイドであり、より好ましくは、トリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミン（商品名としてはＡｌａｍｉｎｅ３３６、コグニス社製）である。なお、トリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミンは、アルキル基として、オクチル基、ノニル基及びデシル基から選択される１種又は２種以上のアルキル基を全体として３個備えることができる。また、オクチル基及び／またはデシル基のみを備えることもできる。
【００３０】
抽出溶媒には、キャリアを２０ｖｏｌ％以上含有することが好ましい。この範囲のキャリア濃度を有していると、良好な抽出効率を得ることができ、高効率な有機酸発酵にも対応できる。また、本発酵生産方法で用いる有機酸生産酵母は、こうした高濃度にキャリアを含有する抽出溶媒に耐性を有することができる。より好ましくは、３０ｖｏｌ％以上であり、４０ｖｏｌ％以上である。なお、こうしたキャリアは上記希釈剤である有機溶媒で希釈されて抽出溶媒を構成する。
【００３１】
こうした有機酸の抽出溶媒としては、２０ｖｏｌ％以上のトリ−ｎ−Ｃ８〜Ｃ１０アルキルアミンを含有するオレイルアルコールを用いることが好ましく、より好ましくは、このキャリアを３０ｖｏｌ％以上含むオレイルアルコールであり、最も好ましくはこのキャリアを４０ｖｏｌ％程度含むオレイルアルコールである。
【００３２】
本発明の発酵生産方法における培養工程では、培地と抽出溶媒とをおおよそ二相系を維持しながら培養する工程とすることが好ましい。既に説明したように、抽出溶媒として培地と二相分離可能なものを用いるが、こうした混合液の攪拌混合程度によって二相分離状態を維持して培養することもできるし、懸濁状態で培養することもできる。細胞毒性をできるだけ低減する観点からは、おおよそ上下に二相分離状態を維持して培養することが好ましい。こうした培養状態は、下相に培地、上相に抽出溶媒を有する二相液体を静置培養するか、緩やかに旋回培養、攪拌培養又は回転培養することにより得ることができる。なお、こうした二相分離状態を維持した培養工程に対して、培地と抽出溶媒とを振とうなどにより強く攪拌して二相分離しない状態とする培養工程を組み合わせることもできる。
【００３３】
なお、本発明の発酵生産方法においては、抽出溶媒を培養液に添加する時期は特に限定されない。例えば、培養工程の全体を通じて抽出溶媒を添加して抽出培養することもできるし、培養工程の一部においてのみ抽出溶媒を添加して二相系を構成して抽出培養を実施することができる。後者の例としては、培養工程の途中までは、抽出溶媒を添加せずに培養し、その後抽出溶媒を添加して培養する、培養工程を実施することもできる。
【００３４】
培養工程は、有機酸生産酵母が代謝可能な炭素源を連続的に加えて培養する工程とすることが好ましい。こうすることで、培地中で炭素源を枯渇させることなく有機酸発酵を継続させることができる。この場合、生産物である有機酸による阻害がないため、効率的に有機酸を連続的に発酵させることができる。なお、制限基質である炭素源のほか、各種の栄養成分も適宜添加することができる。
【００３５】
培養工程の、培地のｐＨは５．０以下であることが好ましい。ｐＨが５．０以下であると、上記キャリアによる有機酸の抽出溶媒側への分配効率が確保されるからである。好ましくは、ｐＨは、乳酸のｐＫａである４．８以下であり、より好ましくは４．５以下である。
【００３６】
本発明の発酵生産方法の培養工程における各種の培養条件は適宜設定することができる。例えば、温度は、２５℃〜３５℃程度とすることができる。培養時間は、おおよそ２４〜７２時間程度とすることができる。なお、培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施することができる。
【００３８】
（実施例１）
（乳酸発酵液から乳酸を抽出する抽出溶媒の検討）
本実施例では、乳酸生産酵母を用いて乳酸発酵した発酵液から乳酸を抽出する場合の抽出溶媒の検討を行った。乳酸発酵液は、染色体上のＰＤＣ１プロモーター下に乳酸脱水素酵素遺伝子を導入した乳酸生産酵母（特開２００４−１８７６４３中に記載されている遺伝子組換え酵母Ｔ１６５株（ＴＤＯ−１／ＬＤＨ  ６ｃｏｐｙ））をサトウキビ由来ケインジュースを用いて非中和で乳酸発酵し、乳酸を各種濃度含んだものを調製した。なお、乳酸濃度は、初発糖濃度を変化させることにより調整した。また、抽出溶媒としては、具体的には、キャリアとしてはＡｌａｍｉｎｅ３３６を用い、希釈剤としては細胞に無毒な溶媒として知られるオレイルアルコールを用い、各種濃度（０、１０、２０、３９、４０、４５、５０、５５、６５、７０、８０、９０、１００ｖｏｌ％）でキャリアを含む抽出溶媒を調製した。
【００３９】
こうして得られた各種乳酸濃度の発酵液２ｍｌに対して抽出溶媒１ｍｌをバイアル瓶に加え、３０℃で２０分、斜めにした状態で１００ｒｐｍ回転攪拌したのち、静置し水相中の乳酸濃度を酵素法で、溶媒相の乳酸濃度をHPLCで測定した。抽出度は下記の式に従い計算した。
【数１】
2007082490.tif 000002
[HL]o；溶媒中の乳酸濃度
[HL]init；水相中に仕込んだ乳酸濃度
[HL]AT；溶媒抽出操作後に測定した水相中の乳酸濃度
VA；水相の容積
Vo；溶媒相の容積
【００４０】
結果を図１に示す。抽出溶媒におけるＡｌａｍｉｎｅ３３６濃度を横軸に、抽出度を縦軸に示す。図１に示すように、それぞれの初期乳酸濃度において効率的に抽出が行えるのは好ましくは２０ｖｏｌ％以上であり、より好ましくは３０ｖｏｌ％以上、さらに好ましくは４０ｖｏｌ％以上、一層好ましくは４５ｖｏｌ％以上であることがわかった。なお、こうした好ましい抽出度が得られるＡｌａｍｉｎｅ３３６濃度は、乳酸菌では致死的とされる濃度であった。
【００４１】
なお、本実施例で用いた乳酸生産酵母は、以下に示す特開２００４−１８７６４３の記載に基づいて構築することができる。
【００４２】
１．乳酸脱水素酵素をコードするDNA（ＬＤＨＫＣＢ配列）の全合成
ウシ由来のＬＤＨのコドン用法を改変して得たＬＤＨをコードするDNA配列とその開始コドンの上流側および終止コドンの下流側を含むＤＮＡ配列（１０５２ｂｐ）（以下、ＬＤＨＫＣＢ配列と称す。）を配列番号１に示す。
【００４３】
この方法の原理は、１００MER程度のオリゴヌクレオチドプライマーを３’末端に１０〜１２ｍｅｒ程度のオーバーラップを持つように作製し、お互いのオリゴヌクレオチドプライマーのオーバーラップ領域を利用して、欠損部分を伸張させ、さらに両末端のプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって増幅するというものである。この操作を順次繰り返し、目的とする長鎖ＤＮＡを合成する。ＰＣＲ増幅装置には、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。なお、これらのプライマー配列は当業者であれば適宜設定できるほか、特開２００４−１８６４３にその例が挙げられている。
【００４４】
具体的には、最初に連結させたい２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを混合し、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）存在下で、９６℃、２分、６８℃２分、５４℃２分、７２℃３０分の反応条件でＤＮＡ伸張反応を行った。次に、本試料の１／１０量を鋳型にして、両末端のプライマー存在下で、９６℃２分後、９６℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃９０秒の反応を２５サイクル行い、その後４℃とするＰＣＲ反応をおこなった。反応におけるバッファ、ｄＮＴＰｍｉｘなどは、ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに附属のものを使用した。
【００４５】
合成したＬＤＨＫＣＢ配列について、塩基配列を確認した後、ＥｃｏＲＩにて制限酵素処理し、同様にＥｃｏＲＩにて酵素処理したｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｉｒｏｇｅｎ）に常法により連結した。このベクターをｐＢＴＯＰＯ−ＬＤＨＫＣＢベクターと称した。
【００４６】
２．酵母染色体導入用ベクターの構築（２コピー導入）
先に全合成したＬＤＨＫＣＢ配列を用いて、酵母染色体導入型ベクターを構築した。このベクターを、ｐＢＴＲＰ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢと称する。このプラスミドマップを図２に示す。
（１）ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢ構築のためのＰＤＣ１Ｐ断片の単離
ＰＤＣ１Ｐ断片は、サッカロマイセス・セレビシエＹＰＨ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のゲノムＤＮＡを鋳型として使用したＰＣＲ増幅法によって単離を行った。
（２）サッカロマイセス・セレビシエＹＰＨ株のゲノムＤＮＡは、ゲノム調製キットであるＦａｓｔ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ  １０１社）を用い、詳細は、附属のプロトコールに従い、調製した。ＤＮＡ濃度は分光光度計Ｕｌｔｒｏ  ｓｐｅｃ  ３０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）にて測定した。
（３）ＰＣＲ反応には、増幅酵素として、増幅断片の正確性が高いとされるＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を使用した。上記手法にて調製したサッカロマイセス・セレビシエＹＰＨ株のゲノムＤＮＡ５０ｎｇ／サンプル、プライマーＤＮＡ５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．２ユニット／サンプルを合計で５０μｌの反応系に調製した。反応溶液を、ＰＣＲ増幅装置  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｌｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）によってＤＮＡ増幅を行つた。ＰＣＲ増幅装置の反応条件は、９６℃２分の後、９６℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃９０秒の反応を２５サイクル行い、その後４℃とした。ＰＤＣｌプライマーの増幅断片を１％ＴＢＥアガロースゲル電気泳動にて遺伝子増幅断片の確認を行つた。なお反応に使用するプライマーＤＮＡは、当業者であれば適宜設定できるが、特開２００４−１８７６４３に例示されているものも用いることができる。
【００４７】
（４）プロモーター及び目的遺伝子を含む組換えベクターの構築
本組換えベクター構築のために新たに構築した染色体導入型ベクターをｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢと名付けた。以下に本ベクター構築例の詳細を記す。なお本実施例の概要を図３〜６に示す。但し、ベクター構築の手順はこれに限定されるものではない。
ベクターの構築にあたって、必要な遺伝子断片であるＰＤＣｌ遺伝子のプロモーター断片（ＰＤＣＩＰ）９７１ｂｐと、ＰＤＣｌ遺伝子下流領域断片（ＰＤＣ１Ｄ）５１８ｂｐは、上述のように、サッカロマイセス・セレビシエＹＰＨ株のゲノムＤＮＡを鋳型として使用したＰＣＲ増幅法によって単離を行った。ＰＣＲ増幅の手順は上記の通りであるが、ＰＤＣｌ遺伝子下流領域断片の増幅に使用するプライマーＤＮＡは、当業者であれば適宜設定でき、特開２００４−１８７６４３に例示されているものも用いることができる。
【００４８】
上記反応にて取得したＰＤＣ１Ｐ及びＰＤＣ１Ｄ各遺伝子増幅断片をそれぞれ、エタノール沈殿処理によって精製した後、ＰＤＣ１Ｐ増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ及びＰＤＣ１Ｄ増幅断片を制限酵素ＸｈｏＩ／ＡｐａＩにて制限酵素反応処理を行った。なお、以下に用いた酵素類はすべて宝酒造社製のものを用いた。また、エタノール沈殿処理、制限酵素処理の一連操作の詳細なマニュアルはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｌｏｎ  （Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ．１９８９）に従った。
【００４９】
ベクターの構築における一連の反応操作は、一般的なＤＮＡサブクローニング法に準じて行った。すなわち、制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ（宝酒造社）及び脱リン酸化酵素Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＢＡＰ、宝酒造社）を施したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋ベクター（東洋紡社）に、上記ＰＣＲ法にて増幅し制限酵素処理を施したＰＤＣ１Ｐ断片をＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ反応によって連結させた（図３上段）。Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ反応には、ＬｉｇａＦａｓｔ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。
【００５０】
次にＬｉｇａｔｉｏｎ反応を行った溶液を用いて、コンピテント細胞への形質転換を行った。コンピテント細胞は大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従って行った。得られた培養液は抗生物質アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有したＬＢプレートにまいて一晩培養した。生育したコロニーにつき、インサート断片のプライマーＤＮＡを用いたコロニーＰＣＲ法による確認、及びミニプレップによるプラスミドＤＮＡ調製溶液に対する制限酵素処理による確認を行い、目的とするベクターｐＢＰＤＣ１Ｐベクターを単離した（図３中段）。
【００５１】
ついで、図３の中段に示すように、株式会社豊田中央研究所によって構築されたｐＢＴＯＰＯ−ＬＤＨＫＣＢベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ処理及び末端修飾酵素Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理することで得られるＬＤＨＫＣＢ遺伝子断片を、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩ処理、末端修飾酵素Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理を行ったｐＢＰＤＣ１Ｐベクター中に、上述と同様の操作でサブクローニングを行い、ｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターを作製した（図３下段）。
【００５２】
一方、図４に示すように、トヨタ自動車（株）によって構築されたｐＹＬＤｌベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＡａｔＩＩ処理及び末端修飾酵素Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理することで得られるＬＤＨ遺伝子（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来）断片を、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩ処理、末端修飾酵素Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理を行ったｐＢＰＤＣ１Ｐベクター中に、上述と同様の操作でサブクローニングを行い、ｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨ１ベクターを作製した（図４）。なお、上記のｐＹＬＤｌベクターは大腸菌に導入され（名称：  「Ｅ．ｃｏｌｌ  ｐＹＬＤ１」）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４２３としてブダベスト条約に基づき国際寄託されている（原寄託日：平成１１（１９９９）年１０月２６日）。
【００５３】
続いて、図５に示すように、このベクターをＸｈｏＩ／ＡｐａＩ処理し、同様に制限酵素処理を施した増幅ＰＤＣ１Ｄ断片を連結させてｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨベクターを作製した（図５上段）。最後にｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＩＩベクターをＥｃｏＲＶ処理したものに、ｐＲＳ４０４ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をＡａｔＩＩ／ＳｓｐＩ処理、Ｔ４  ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理して得られたＴｒｐマーカー断片を連結させて、ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣｌ−ＬＤＨベクターを構築した。
【００５４】
次に、図６に示すように、ｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターをＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩにて制限酵素処理し、一方、ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨベクターを、制限酵素ＡｐａＩおよびＳｔｕＩで処理したＴｒｐマーカーを含む断片に処理し、増幅させた断片を連結させて、最終コンストラクトである染色体導入型ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢベクターを構築した。
【００５５】
構築した染色体導入型ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢベクターの確認の為に塩基配列決定を行った。塩基配列解析装置としてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｌｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し、試料の調製法、及び機器の使用方法等の詳細は本装置付属のマニュアルに従った。試料となるベクターＤＮＡはアルカリ抽出法により調製したものを用い、これをＧＦＸ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｌｏｔｅｃｈ社）にてカラム精製した後、分光光度計Ｕｌｔｒｏ  ｓｐｅｃ  ３０００（Ａｍｅｒｓｈａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｌｏｔｅｃｈ社）にてＤＮＡ濃度を測定したものを用いた。
【００５６】
３．酵母染色体導入用ベクターの構築（４コピー導入）
次に、フレオマイシン耐性遺伝子をマーカーとして、ＬＤＨ遺伝子４コピー導入用の染色体導入型ベクターを構築した。本ベクターをｐＢＢＬＥ−ＬＤＨＫＣＢと称し、そのプラスミドベクターを図７に示す。構築の一連の手順を示すが、構築の順番はこれに限定されるものではない。
【００５７】
本ベクターの構築手順としては、まず、制限酵素ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ処理を施したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋ベクター（東洋紡社）中に、先に構築したｐＢＴＲＰ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢベクターに同様の制限酵素処理して得られるＬＤＨＫＣＢ断片を連結して、ｐＢＬＤＨＫＣＢベクターを作製した。次に、本ベクターに、ＰＣＲ増幅して得たＳＬＸ４断片、ＰＤＣ５下流断片（ＰＤＣ５Ｄ）を順次連結していき、ｐＢＬＤＨＫＣＢ−ＰＳを作製した。なお、ＳＬＸ４断片、ＰＤＣ５Ｄ断片のＰＣＲ増幅に使用するプライマーＤＮＡは、当業者であれば適宜設定できるが、特開２００４−１８７６４３に例示されているものも用いることができる。ＤＮＡ増幅酵素としては、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）を用い、ＰＣＲ装置Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にて、９６℃  ２分の処理後、９６℃  ３０秒→５３℃  ３０秒→７２℃  ９０秒の反応を２５サイクル行い、４℃で保冷することにより増幅断片を得た。
【００５８】
選抜マーカーとして使用するフレオマイシン耐性ＢＬＥマーカー遺伝子は、次のように構築した。遺伝子データベース（ＧｅｎｅｂａｎｋおよびＳＧＤ；  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）を利用して、フレオマイシン耐性遺伝子、ＣＹＣ１プロモーター遺伝子、ＣＹＣ１ターミネーター遺伝子の配列データを入手し、本データをもとに、末端に制限酵素サイトを付加する形でプライマーを設計した。なお反応に使用したプライマーＤＮＡは、当業者であれば適宜設定できるが、特開２００４−１８７６４３に例示されているものも用いることができる。
【００５９】
フレオマイシン耐性遺伝子は、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ＆ａｐｏｓ；  Ｋａｎ株（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）のゲノムＤＮＡを鋳型に、またＣＹＣ１プロモーター遺伝子、ＣＹＣ１ターミネーター遺伝子は、ワイン酵母ＯＣ２株のゲノムＤＮＡを鋳型にして設計したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、遺伝子断片を得た。
【００６０】
ＰＣＲに鋳型として用いる大腸菌のゲノムＤＮＡは、ＬＢ培地にて一晩振盪培養を行った後、集菌、洗浄したものを９８℃  １０分間の加熱処理を加えて得た上清を、エタノール沈殿処理を行い、滅菌水５０μｌに溶解することにより調製した。また、酵母のゲノムＤＮＡは、ワイン酵母ＯＣ２株を２ｍｌ  ＹＰＤ培地で一晩振盪培養を行った後、集菌し５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５００μｌおよびガラスビース（４２５−６００ｍｉｃｒｏｎｓ  Ａｃｉｄ  Ｗａｓｈｅｄ，  ＳＩＧＭＡ社）を加え、４℃で１５分間ボルテックスを行った後、本溶液の上清にエタノール沈殿を行い、滅菌水５０μｌに溶解することにより調製した。
【００６１】
調製した各ゲノムＤＮＡ  ５μｌを鋳型として、５０μｌの反応系でＰＣＲを行った。ＤＮＡ増幅酵素としてＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）を用い、ＰＣＲ増幅装置ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にて、９６℃  ２分の処理後、９６℃  ３０秒→５５℃  ３０秒→７２℃  ９０秒の反応を２５サイクル行い、  ４℃で保冷した。増幅が確認された各遺伝子断片は、それぞれについて制限酵素反応を行い、末端に制限酵素サイトができるよう処理した。
【００６２】
上記の方法で作製した各断片を連結したｐＢＢＬＥＣＹＣを構築した。構築における一連の設計手順を以下に示す。すなわち、例えば制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ処理を施したＣＹＣ１Ｐ断片および、例えば制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ処理を施したＣＹＣ１Ｔ断片を、同じ制限酵素で処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋ベクター（東洋紡社）中に順次連結し、ｐＢＣＹＣＰＴベクターを作製した。次に本ベクターに例えば制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理したものに、同じ制限酵素サイトをもつフレオマイシン耐性遺伝子断片を連結させて、ｐＢＢＬＥＣＹＣベクターを作製した。最後に、ｐＢＢＬＥＣＹＣから例えば制限酵素ＳｐｅＩ／ＡｐａＩ処理によってマーカー遺伝子を切り出し、これを平滑末端化した後、例えばＥｃｏＲＶ処理したｐＢＬＤＨＫＣＢ−ＰＳベクターに連結し、最終目的とする染色体導入型ベクター  ｐＢＢＬＥ−ＬＤＨＫＣＢベクターを構築した。
【００６３】
ベクター構築における詳細な操作方法はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ．  １９８９）  に従った。制限酵素および修飾酵素は、宝酒造のものを使用した。Ｔ４  ＤＮＡ  ＬｉｇａｓｅによるＬｉｇａｔｉｏｎ反応には、Ｌｉｇａ  Ｆａｓｔ  Ｒａｐｉｄ  ＤＡＮ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。またプラスミドベクターの形質転換には大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡社）を用いた。
【００６４】
４．酵母染色体導入用ベクターの構築（６コピー導入）
次に、Ｇ４１８耐性遺伝子をマーカーとして、ＬＤＨ遺伝子６コピー導入用の染色体導入型ベクターを構築した。本ベクターをｐＢＧ４１８Ｇ−ＬＤＨＫＣＢと称し、そのプラスミドベクターを図２に示す。構築の一連の手順を以下に示すが、構築の順番はこれに限定されるものではない。
【００６５】
本ベクターの構築手順としては、まず、制限酵素ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ処理を施したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋ベクター（東洋紡社）中に、既に構築したｐＢＴＲＰ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢベクターに同様の制限酵素処理して得られるＬＤＨＫＣＢ断片を連結して、ｐＢＬＤＨＫＣＢベクターを作製した。次に、本ベクターに、ＰＣＲ増幅して得たＰＤＣ６断片、ＣＴＴ１断片を順次連結していき、ｐＢＬＤＨＫＣＢ−ＰＤＣ−ＣＴＴを作製した。なお、ＰＤＣ６断片、ＣＴＴ１断片のＰＣＲ増幅用いるプライマーは当業者であれば適宜設定できるが、例えば特開２００４−１８７６４３に記載のプライマーを用いることができる。ＤＮＡ増幅酵素としては、ＫＯＤｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）を用い、ＰＣＲ装置Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にて、９６℃  ２分の処理後、９６℃  ３０秒→５３℃  ３０秒→７２℃  ９０秒の反応を２５サイクル行い、４℃で保冷することにより増幅断片を得た。
【００６６】
なお、選抜マーカーとして使用するＧ４１８耐性マーカー遺伝子は、遺伝子データベース（ＧｅｎｅｂａｎｋおよびＳＧＤ；  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）を利用して、Ｇ４１８耐性遺伝子、ＧＡＰプロモーター遺伝子、ＣＹＣ１ターミネーター遺伝子の配列データを入手し、本データをもとに、末端に制限酵素サイトを付加する形でプライマーを設計した。各プライマーの配列は当業者であれば適宜設定することができるが、特開２００４−１８６４３にその例が挙げられている。
【００６７】
Ｇ４１８耐性遺伝子は、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’Ｋａｎ株（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）のゲノムＤＮＡを鋳型に、またＧＡＰプロモーター遺伝子、ＣＹＣ１ターミネーター遺伝子は、ワイン酵母ＯＣ２株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、上記プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、遺伝子断片を得た。
【００６８】
各断片を連結してｐＢＧ４１８Ｇを構築した。構築における一連の設計手順を一例を示す。すなわち、例えば制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ処理を施したＧＡＰＰ断片および、例えば制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ処理を施したＣＹＣ１Ｔ断片を、同じ制限酵素で処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋ベクター（東洋紡社）中に順次連結し、ｐＢＣＹＣＰＴベクターを作製した。次に本ベクターに、例えば制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＡｆｌＩＩ処理したものに、同じ制限酵素サイトをもつＧ４１８耐性遺伝子断片を連結させて、ｐＢＧ４１８Ｇベクターを作製した。
【００６９】
次に、ＰＢＧ４１８Ｇから例えば制限酵素ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩＩ処理によってマーカー遺伝子を切り出し、これを平滑末端化した後、ＨｉｎｃＩＩ処理したｐＢＬＤＨＫＣＢ−ＰＤＣ−ＣＴＴベクターに連結し、最終目的とする染色体導入型ベクター  ｐＢＧ４１８Ｇ−ＬＤＨＫＣＢベクターを構築した。
【００７０】
ベクター構築における詳細な操作方法はMolecular Cloning ~A Laboratory Manual second edition (Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory press. 1989) に従った。制限酵素および修飾酵素は、宝酒造のものを使用した。Ｔ４  ＤＮＡ  ＬｉｇａｓｅによるＬｉｇａｔｉｏｎ反応には、Ｌｉｇａ  Ｆａｓｔ  Ｒａｐｉｄ  ＤＡＮ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。またプラスミドベクターの形質転換には大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡社）を用いた。
【００７１】
５．酵母への形質転換
酵母への遺伝子導入法は、Itoらの手法（Ito,H., Y.Fukuda, K.Murata and A.Kimura, Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J.Bacteriol. Vol.153, p163-168, 1983）に従った。すなわち、作製したベクターを順次導入した。酵母を１０ｍｌ  ＹＰＤ培地にて３０℃で対数増殖期まで培養を行い、集菌およびＴＥバッファーによる洗浄を行った。
【００７２】
次に、０．５ｍｌ  ＴＥバッファーと０．５ｍｌの０．２Ｍ酢酸リチウムを加え、３０℃にて１時間の振盪培養を行った後に、ベクターを添加した。本酵母懸濁液を３０℃で３０分間振盪培養後、１５０μｌの７０％ポリエチレングリコール４０００（和光純薬工業）を加え、よく攪拌した。さらに３０℃にて１時間振盪培養した後、４２℃にて５分間ヒートショックを与え、菌体を洗浄した。本試料を５００μｌのＹＰＤ培養液にて３０℃、２０時間振盪培養後、これを集菌および洗浄し、５００μｌの滅菌水に溶解した。Ｇ４１８濃度２００μｇ／ｍｌ含有のＹＰＤ培地に５０μｌ塗沫し、３０℃  静置培養にて選抜を行った。
【００７３】
得られたコロニーを新たなＧ４１８選抜培地に画線培養し、安定性が確認できた選抜株について、遺伝子導入の有無をＰＣＲ解析によって確認した。
【００７４】
（実施例２）
乳酸抽出溶媒として知られるＡｌａｍｉｎｅ３３６、ＴＯＡ（トリ−ｎ−オクチルアミン）、ＴＯＰＯ（トリ−ｎ−オクチルホスフィンオキサイド）及びＴＢＰ（トリブチルホスフェート）をそれぞれ４０％含む抽出溶媒（オレイルアルコールで希釈）を培地に重層し、二相系の状態で菌体増殖を観察した。なお、培養条件を以下に示す。
＜前培養条件＞
使用酵母：乳酸生産酵母（特開２００４−１８７６４３中に記載されている遺伝子組換え酵母Ｔ１６５株（ＴＤＯ−１／ＬＤＨ６ｃｏｐｙ））
前培養容器；三角フラスコ（１００ｍＬバッフル付）
前培養；グリセロールストック５００μｌをＹＰＤ培地１０ｍｌ（イーストエキス１００ｍｇ、バクトペプトン２００ｍｇ、グルコース２００ｍｇを１０ｍｌに含む）に植菌して好気培養（旋回培養１００ｒｐｍ）。
前培養時間；１日
＜本培養条件＞
培養器；三角フラスコ（１００ｍＬバッフル付）
本培養培地；１０ｍｌ糖蜜培地（調整糖蜜※１．２ｇ、尿素２８ｍｇ、リン酸二水素１カリウム４ｍｇを１０ｍｌに含む）
※調整糖蜜の作り方（糖蜜１０：温水４．１５：１Ｎ硫酸２の比で混ぜて作製する。）
溶媒；１ｍｌ添加（１０％添加）
植菌量；前培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）して菌体回収し、スタート時ＯＤ６６０が０．２スタートになるように培地で希釈して植菌した。
培養温度；３０℃
回転数；１００ｒｐｍ
菌体濃度測定；菌体を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）し、除去した上清（溶媒と培地）と同量のリン酸バッファーで希釈してＯＤ６６０を測定。培養サンプルは１２フラスコ分を用意し、ＯＤ測定ごとに３フラスコを使用した。
【００７５】
結果を図９に示す。図９に示すように、乳酸生産酵母は抽出発酵に適したキャリア濃度でも問題なく増殖し、乳酸発酵を行うことができた。また最高で８０％までのＡｌａｍｉｎｅ３３６を含む抽出溶媒に対しても溶媒の重層により乳酸生産酵母が死滅しないことが確認された。
【配列表フリーテキスト】
【００７６】
配列番号１：ウシＬＤＨの改変ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】各種濃度のキャリアを含む抽出溶媒を用いた乳酸発酵液からの抽出度を示す図。
【図２】ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢのプラスミドマップである。
【図３】図２に示すベクターの構築例の一部を示す図である。
【図４】ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨの構築例の一部を示す図である。
【図５】ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨの構築例の一部を示す図である。
【図６】ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨの構築例の一部を示す図である。
【図７】ｐＢＢＬＥ−ＬＤＨＫＣＢのプラスミドマップである。
【図８】ｐＢＧ４１８Ｇ−ＬＤＨＫＣＢのプラスミドマップである。
【図９】各種のキャリアを含む抽出溶媒を用いた抽出発酵における酵母の増殖を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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