(57)【要約】      （修正有）【課題】フルクトシルアミンと結合する新規結合蛋白質を提供し、フルクトシルアミン結合蛋白質の構造遺伝子をクローニングし、さらにアミノ酸配列を明らかにすること、およびその情報に従い組換えＤＮＡ技術を用い該酵素の製造方法ならびにこれを用いる分析方法を提供すること。【解決手段】以下の(a)または(b)のフルクトシルアミンと結合する蛋白質。(a)特定のアミノ酸配列からなる蛋白質(b)アミノ酸配列(a)において、1もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルアミンと結合する能力を有する蛋白質【選択図】図１
2007082540.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)または(b)のフルクトシルアミンと結合する蛋白質。
(a)  配列番号1に記載されたアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)アミノ酸配列(a)において、1もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルアミンと結合する能力を有する蛋白質
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の(c)または(d)の配列であり、フルクトシルアミン結合蛋白質をコードする遺伝子。
(c)配列番号2に記載された塩基配列からなる遺伝子
(d)上記(c)の配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されており、かつフルクトシルアミンと結合する能力を有する蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項４】
配列番号1に記載されたアミノ酸配列において、以下の残基のいずれかがシステイン（Cys）に置換されたフルクトシルアミン結合能力を有する変異フルクトシルアミン結合蛋白質。
58番目Tyr,  96番目Phe,  97番目Ser,  161番目Gly,  166番目Ile,  203番目Gln,  256番目Trp,  263番目Trp
【請求項５】
請求項４に記載の変異フルクトシルアミン結合蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項６】
請求項４に記載の変異フルクトシルアミン結合蛋白質において、導入されたCys残基のチオール基を介して、環境応答性蛍光色素が結合したことを特徴とする蛍光ラベル化フルクトシルアミン結合蛋白質。
【請求項７】
請求項２又は請求項３に記載の遺伝子であって、Agrobacterium tumefaciensまたはAgrobacteriuma属由来であるフルクトシルアミン結合蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項８】
請求項1、請求項４もしくは請求項６のいずれかに記載のフルクトシルアミン結合蛋白質をコードする遺伝子を含有する組み換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体。
【請求項１０】
請求項９記載の形質転換体を培養して、該培養物からフルクトシルアミン結合蛋白質を採取することを特徴とするフルクトシルアミン結合蛋白質の製造方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法で製造されたフルクトシルアミン結合蛋白質。
【請求項１２】
請求項１１に記載のフルクトシルアミン結合蛋白質を含むフルクトシルアミン化合物類の分光学的分析方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載のフルクトシルアミン結合蛋白質を含むフルクトシルアミン化合物類の蛍光分光学的分析方法。
【請求項１４】
糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）をアッセイする方法であって、試料中のＨｂＡ１ｃを分解してフルクトシルバリンを生成し、前記フルクトシルバリンを請求項１１に記載のフルクトシルアミン結合蛋白質を用いて定量することを含む分光学的分析方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載のフルクトシルアミン結合蛋白質を含むフルクトシルバリンの分光学的分析用アッセイキット。
【請求項１６】
請求項１１に記載のフルクトシルアミン結合蛋白質を含むＨｂＡ１ｃの分光学的分析用アッセイキット。
【請求項１７】
請求項１１に記載のフルクトシルアミン結合蛋白質を用いることを特徴とする、フルクトシルバリンの蛍光分析方法。
【請求項１８】
請求項１１に記載のフルクトシルアミン結合蛋白質を用いることを特徴とする、ＨｂＡ１ｃの蛍光分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なフルクトシルアミン結合蛋白質（ＦＡＢＰ）に関する。さらに、本発明は、フルクトシルアミン結合蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子断片を組み込んでなる組み換えベクター、該組み換えベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養することによるＦＡＢＰの製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質主鎖および側鎖のアミノ基は、グルコースなどの還元糖の還元末端と非酵素的に結合して、アマドリ化合物すなわち糖化蛋白質を生ずる。また、血中においては、ヘモグロビンが糖化されて糖化ヘモグロビン（グリコヘモグロビン；以下、ＨｂＡ１ｃ）を生ずることが知られている。
【０００３】
糖尿病患者は、健常人に比べてヘモグロビンに対するＨｂＡ１ｃの存在比率が高いこと、およびＨｂＡ１ｃの血中濃度は過去数週間の血糖値を反映することから、ＨｂＡ１ｃ血中濃度は、糖尿病の診断および糖尿病患者の血糖コントロールの指標として、臨床試験において極めて重要である。
【０００４】
ＨｂＡ１ｃは、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端のバリンにグルコースが結合していることから、フルクトシルバリンをＨｂＡ１ｃの低分子モデル化合物として用いることができる。すなわち、フルクトシルバリンに対して特異性を有する酵素を用いて、ＨｂＡ１ｃをアッセイすることが可能である。
【０００５】
これまでに、種々の菌株からアマドリ化合物に対して作用する酵素が単離されており、これらの酵素を用いてグリコアルブミン、ＨｂＡ１ｃおよびフルクトサミン等の糖化蛋白質を分析し得ることが示唆されている（特許文献１〜６及び非特許文献１〜８）。
【０００６】
しかし、酵素ではなく、アミノ酸のアミノ基が糖化されたフルクトシルアミンと特異的に結合し、その結合により蛋白質のコンフォメーションが変化する結合蛋白質については、その遺伝子および遺伝子を元にした組み換え生産、さらに該蛋白質を用いた分析方法については報告がまったくなかった。
【０００７】
ところで、基質との結合により蛋白質のコンフォメーションが変化する結合蛋白質は、同分子のトリプトファン残基やチロシン残基に基づく自家蛍光あるいはアミノ酸置換によって導入されたチオール基を使って、導入された蛍光色素の蛍光変化を指標として、基質結合にもとづく結合蛋白質のコンフォメーション変化が蛍光波長あるいは強度の変化となって観察される。
【０００８】
したがって、これまでにグルコースやアミノ酸などに結合する結合蛋白質を蛍光標識することによって、グルコースあるいはアミノ酸の蛍光分析方法が提案されている（非特許文献９）。
【０００９】
しかしながら、これまでにフルクトシルアミンに結合する蛋白質としては、Pseudomonas属から単離され、そのN末端配列がKDAVVAEPDAPAEYSGである分子量約４５ｋDaの蛋白質が知られているにすぎないものである（非特許文献１０）。
【００１０】
上記の同蛋白質は、その属が同定されていないことから、これを生産し、かつ応用することができないという問題点があった。しかもフルクトシルアミンに結合する蛋白質の全配列、これをコードする遺伝子、組み換え生産、蛍光修飾、およびフルクトシルアミン結合蛋白質を用いた分析方法に関してはまったく報告がない。
【００１１】
なお、本発明に関連する先行技術としては、以下のものがある。
【特許文献１】特開昭６１−２６８１７８号公報
【特許文献２】特開昭６１−２８０２９７号公報
【特許文献３】特開平  ３−１５５７８０号公報
【特許文献４】特開平  ５−１９２１９３号公報
【特許文献５】特開平  ７−２８９２５３号公報
【特許文献６】特開平  ８−１５４６７２号公報
【非特許文献１】Agric. Biol. Chem., 53(1), 103-110, 1989
【非特許文献２】Agric. Biol. Chem., 55(2), 333-338, 1991
【非特許文献３】J. Biol. Chem., 269(44), 27297-27302, 1994
【非特許文献４】Appl. Environ. Microbiol., 61(12), 4487-4489, 1995
【非特許文献５】Biosci. Biotech. Biochem., 59(3), 487-491, 1995
【非特許文献６】J. Biol. Chem., 270(1), 218-224, 1995
【非特許文献７】J. Biol. Chem., 271(51), 32803-32809, 1996
【非特許文献８】J. Biol. Chem., 272(6), 3437-3443, 1997）
【非特許文献９】Periplamic bindind proteins:a versatile superfamily for protein engineering; M.A.Dwyer and H.W.Hellinga, Current Opinigon in Structural Biology, vol.14, 495-504, 2004, Elsevier
【非特許文献１０】Isolation, purification, and characterization of an amadori product binding protein from a Pseudomonas sp. soil strain, C.Gerhardinger, S/Taneda, M.S>Marion and V.M.Monnier, J.Biol.Chem., 269(44), 27297-27302(1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
以上のような状況に鑑み、本発明の課題は、フルクトシルアミンと結合する新規結合蛋白質、フルクトシルアミン結合蛋白質の構造遺伝子をクローニングし、さらにそのアミノ酸配列を明らかにすること、およびその情報に従い組換えＤＮＡ技術を用い該酵素の製造方法ならびにこれを用いる分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、フルクトシルアミン結合蛋白質（ＦＡＢＰ ）をコードする遺伝子を含むDNA断片を組み込んでなる組み換えベクターにより微生物を形質転換することによって得られた形質転換体を培養し、該培養物からフルクトシルアミン結合蛋白質（ＦＡＢＰ） を採取することによってＦＡＢＰ を大量生産できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明は、以下の事項に関する。すなわち、
（１）以下の(a)または(b)のフルクトシルアミンと結合する蛋白質。
(a)  配列番号1に記載されたアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)アミノ酸配列(a)において、1もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフルクトシルアミンと結合する能力を有する蛋白質
（２）（１）の蛋白質をコードする遺伝子。
（３）以下の(c)または(d)の配列であり、フルクトシルアミン結合蛋白質をコードする遺伝子。
(c)配列番号2に記載された塩基配列からなる遺伝子
(d)上記(c)の配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されており、かつフルクトシルアミンと結合する能力を有する蛋白質をコードする遺伝子。
（４）配列番号1に記載されたアミノ酸配列において、以下の残基のいずれかがシステイン（Cys）に置換されたフルクトシルアミン結合能力を有する変異フルクトシルアミン結合蛋白質。
58番目Tyr,  96番目Phe,  97番目Ser,  161番目Gly,  166番目Ile,  203番目Gln,  256番目Trp,  263番目Trp
（５）（４）に記載の変異フルクトシルアミン結合蛋白質をコードする遺伝子。
（６）（４）に記載の変異フルクトシルアミン結合蛋白質において、導入されたCys残基のチオール基を介して、環境応答性蛍光色素が結合したことを特徴とする蛍光ラベル化フルクトシルアミン結合蛋白質。
（７）（２）又は（３）に記載の遺伝子であって、Agrobacterium tumefaciensまたはAgrobacteriuma属由来であるフルクトシルアミン結合蛋白質をコードする遺伝子。
（８）（1）、（４）もしくは（６）のいずれかに記載のフルクトシルアミン結合蛋白質をコードする遺伝子を含有する組み換えベクター。
（９）（８）に記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体。
（１０）（９）に記載の形質転換体を培養して、該培養物からフルクトシルアミン結合蛋白質を採取することを特徴とするフルクトシルアミン結合蛋白質の製造方法。
（１１）（１０）に記載の方法で製造されたフルクトシルアミン結合蛋白質。
（１２）（１１）に記載のフルクトシルアミン結合蛋白質を含むフルクトシルアミン化合物類の分光学的分析方法。
（１３）（１１）に記載のフルクトシルアミン結合蛋白質を含むフルクトシルアミン化合物類の蛍光分光学的分析方法。
（１４）糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）をアッセイする方法であって、試料中のＨｂＡ１ｃを分解してフルクトシルバリンを生成し、前記フルクトシルバリンを請求項１１に記載のフルクトシルアミン結合蛋白質を用いて定量することを含む分光学的分析方法。
（１５）（１１）に記載のフルクトシルアミン結合蛋白質を含むフルクトシルバリンの分光学的分析用アッセイキット。
（１６）（１１）に記載のフルクトシルアミン結合蛋白質を含むＨｂＡ１ｃの分光学的分析用アッセイキット。
（１７）（１１）に記載のフルクトシルアミン結合蛋白質を用いることを特徴とする、フルクトシルバリンの蛍光分析方法。
（１８）（１１）に記載のフルクトシルアミン結合蛋白質を用いることを特徴とする、ＨｂＡ１ｃの蛍光分析方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明よれば、フルクトシルアミンと特異的に結合する新規なフルクトシルアミン結合蛋白質（ＦＡＢＰ）を提供することができ、同時にその遺伝子をクローニングすることができる。また本発明によれば、上記フルクトシルアミン結合蛋白質（ＦＡＢＰ）を組み換えDNA技術により大量生産することができ、その組み換えフルクトシルアミン結合蛋白質（ＦＡＢＰ）を用いて、フルクトシルアミンを蛍光分光法により簡易かつ高感度に計測することができる。さらに、本発明によれば、フルクトシルアミン結合蛋白質（ＦＡＢＰ）にCys残基をアミノ酸置換により導入し、そこへ環境応答性蛍光色素を修飾することで、フルクトシルアミンの計測にきわめて好適に使用できる環境応答型蛍光色素標識フルクトシルアミン結合蛋白質（ＦＡＢＰ）を大量に生産することができ、また上記修飾分子を用いて、フルクトシルアミンの蛍光分析をさらに簡易かつ高感度に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００１７】
本発明のフルクトシルアミン結合蛋白質（以下、ＦＡＢＰ）は、フルクトシルアミンと結合し、そのコンフォメーション変化に基づき、蛍光特性を変化させることができることを特徴とするものである。したがって、本発明の蛋白質、その構造遺伝子、アミノ酸配列は新規であり、その組み換えDNA技術を用いた蛋白質の製造方法は、新規な方法である。
【００１８】
遺伝子の調製方法
本発明のＦＡＢＰをコードする遺伝子を含むDNA断片は、ＦＡＢＰ生産菌から得ることができる。該ＦＡＢＰ生産菌としては具体的にはAgrobacterium tumefaciensが適している
【００１９】
さらに本発明のＦＡＢＰをコードする遺伝子を含む該ＦＡＢＰ生産菌としては、Pseudomonas属等のグラム陰性細菌、Corynebacterium属, Arthorbacter属などのグラム陽性細菌を例示することができる。中でもAgrobacterium tumefaciens.由来のＦＡＢＰをコードする遺伝子が好ましい。
【００２０】
該ＦＡＢＰをコードする遺伝子はこれらの菌株から抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらにＰＣＲ法の利用によりＦＡＢＰ遺伝子を含むDNA断片を得ることができる。
【００２１】
上記ＦＡＢＰをコードする遺伝子としては、例えば（a）配列番号1に記載されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、または(b)アミノ酸配列(a)において1もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦＡＢＰ活性を有するタンパク質であるＦＡＢＰをコードする遺伝子が挙げられる。なお、本発明においては、アミノ酸をアルファベット１文字で表記することとした。
【００２２】
さらに、（c）配列番号2に記載された塩基配列からなるDNA、または（d）上記（c）の配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されており、かつＦＡＢＰ活性を有するタンパク質をコードしているDNAがある。
【００２３】
本発明において、ＦＡＢＰをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。例えば染色体を分離、精製した後、超音波処理、制限酵素処理等を用いてDNAを切断したものと、リニアーな発現ベクターと両DNAを平滑末端または付着末端においてDNAリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、ＦＡＢＰをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。
【００２４】
次いで、上記組換えベクターを保持する微生物を培養して、該培養微生物の菌体から該組換えベクターを分離、精製し、該発現ベクターからＦＡＢＰをコードする遺伝子を採取することができる。例えば、遺伝子供与体である染色体DNAは、具体的に以下のようにして採取される。
【００２５】
まず、該遺伝子供与微生物を例えば１日から３日間攪拌培養して得られた培養液を遠心分離により集菌し、次いで、これを溶菌させることによりＦＡＢＰ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチーム等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（SDS）等の界面活性剤が併用される。さらに、凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせてもよい。
【００２６】
上記のようにして得られた溶菌物からDNAを分離精製するには、常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００２７】
微生物から分離、精製されたDNAを切断する方法は、特に制限されるものではないが、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用する２型制限酵素が適している。
【００２８】
クローニングする際のベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。上記ファージとしては、例えばEscherichia coliを宿主微生物とする場合にはLambda gt10、Lambda gt11などが例示される。
【００２９】
また、上記プラスミドとしては、例えば、Escherichia coliを宿主微生物とする場合には、pBR322、pUC18, pUC118, pUC19, pUC119, pTrc99A, pBluescript, pET28, pET30あるいはコスミドであるSuperCosI などが例示される。
【００３０】
クローニングの際、上記のようなベクターを、上述したＦＡＢＰをコードする遺伝子供与体である微生物DNAの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物DNAの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。
【００３１】
微生物DNA断片とベクターDNA断片とを結合させる方法は、公知のDNAリガーゼを用いる方法であればよく、例えば微生物DNA断片の付着末端とベクター断片の付着末端とのアニーリングの後、適当なDNAリガーゼの使用により微生物DNA断片とベクターDNA断片との組換えベクターを作成する。必要に応じて、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のDNAリガーゼを利用し組換えベクターを作製することもできる。
【００３２】
クローニングに使用する宿主微生物としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるのであれば特に制限されない。一般的には、Escherichia coli DH5 α, XL-1BlueMR , Escherichia coliBL21などを用いることができる
【００３３】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がEscherichia coliの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００３４】
上記のように得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のＦＡＢＰを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするDNAを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとＦＡＢＰ活性を同時に発現する微生物を検索すればよい。例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＦＡＢＰを生成する微生物を選択すればよい。
【００３５】
また別の観点においては、単離精製されたＦＡＢＰのアミノ酸配列を決定し、その情報をもとに該菌株から調製したｃDNAおよびゲノムDNAからＦＡＢＰ構造遺伝子をクローニングすることもできる。
【００３６】
組換え生産用ベクターの構築
上記のようにして、一度選択されたＦＡＢＰ遺伝子を保有する組換えベクターより、微生物にて複製できる組換えベクターへの移入は、ＦＡＢＰ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やPCR法によりＦＡＢＰ遺伝子であるDNAを回収し、他のベクター断片と結合させることにより容易に実施できる。
【００３７】
また、これらのベクターによる微生物の形質転換は、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００３８】
また、大腸菌を用いてＦＡＢＰの組み換え生産を行うことができる。例えば、得られたＦＡＢＰの構造遺伝子配列情報からN末端、C末端に相補的なプライマーをデザインすることもできる。
【００３９】
変異型ＦＡＢＰの構築
本発明のフルクトシルアミン結合蛋白質は、そのアミノ酸配列中にCys残基を含まない。したがって、任意の位置をCysに置換することにより、Cys残基に存在するチオール基を用いて、部位特異的にチオール標識能力のある蛍光色素でラベルすることもできる。
【００４０】
例えば、フルクトシルアミン結合蛋白質の58番目Tyr,96番目Phe,97番目Ser,161番目Gly,166番目Ile,203番目Gln,256番目Trp,263番目Trpの各残基をCysに置換した、変異型ＦＡＢＰを構築することもできる。
【００４１】
変異ＦＡＢＰは、定法に構築することができ、変異箇所に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いて単離されているＦＡＢＰ構造遺伝子、あるいはpＧＥにクローニングされた該構造遺伝子、あるいはpETベクターなどの発現ベクターに挿入された該構造遺伝子に対して部位特異的に変異を導入することができる。
【００４２】
変異型ＦＡＢＰの蛍光修飾と蛍光特性
このように構築された変異ＦＡＢＰのうち、Trp256CysおよびGly161Cysの二種の変異ＦＡＢＰを精製し、FQおよびFV結合に基づく自家蛍光の変化を測定した。
これらの変異ＦＡＢＰは、野生型ＦＡＢＰと同様の方法で精製できる。
【００４３】
本発明においては、これらの変異ＦＡＢＰを用いて、該蛋白質の自家蛍光を指標としてもFAの計測が行うことができる。さらに、これらの変異ＦＡＢＰを、環境応答性蛍光色素を用いて蛍光ラベルすることもできる。このように、変異ＦＡＢＰを環境応答型の蛍光色素でラベルすることにより、フルクトシルアミンの結合によるＦＡＢＰのコンフォメーション変化をラベルした蛍光色素の蛍光強度変化により明瞭に観察することができる。
【００４４】
また、蛍光色素の蛍光強度を計測することができるので、蛍光分光法により蛍光修飾された変異ＦＡＢＰを用いることでフルクトシルアミンの新規な分析方法が開発できる。
【００４５】
本発明の変異ＦＡＢＰ修飾する蛍光色素としては、環境応答型の蛍光色素であれば特に制限されるものではないが、たとえば６−アクリロイル２ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）、バダン：６−ブロモアセチル−２―ジメチルアミノナフタール、Ｎ−（１−ピレン）マレイミド、Ｎ−（１−ピレン）ヨードアセタミド、ＰＭＩＡアミド：（Ｎ−（１−ピレンメチル）ヨードアセタミド、パナシルブロミド、 TFPAM-SS1 、 
PyMPOマレイミド、ダンシルアジリデン、ダポキシル（登録商標）、 IAANS :2-(4'-(ヨードアセトアミド)アニリノ)ナフタレン−６− サルフォニック酸ナトリウム塩などがあげられる。
【００４６】
変異ＦＡＢＰの蛍光ラベルは、例えば、以下のようにして行うことができる。所定濃度の緩衝溶液に精製した変異ＦＡＢＰを所定濃度の緩衝溶液に溶解させ、さらに蛍光色素を混合、遮光下で所定時間反応させた後、ろ過、遠心分離を行い未反応の蛍光色素を除去し、蛍光修飾ＦＡＢＰを得る。
【００４７】
さらに、本発明のフルクトシルアミン結合蛋白質、変異型ＦＡＢＰ、蛍光修飾されたＦＡＢＰは、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、フルクトシルバリンの計測用キットの他、センサーの構成物として利用も可能である。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明につき、実施例を用いて説明するが、本発明は、なんらこれに限定されるものではない。
【００４９】
（実施例１）
＜フルクトシルアミン結合蛋白質（ＦＡＢＰ）のクローニング＞
A.tumefaciens EHA株をYEP完全培地で培養後、GenomicPrep Cell and Tissue DNA Isolation kit (Amercham)を用いてA.tumefaciens EHA株のゲノム及びメガプラスミド(pTi,pAt)抽出を行った。これに対してA.tumefaciensのオパインの一種であるサントパインの資化に関与する酵素・蛋白質群をコードするオペロン、socオペロンに含まれる結合タンパクをコードすると予想されているsocA遺伝子のクローニングを行った。
【００５０】
すなわち、下記に示すPCRプライマー１及び２（配列番号３、４）を用いて、A.tumefaciens DNAをテンプレートとしPCRによって目的遺伝子の増幅を行い、精製後、TAクローニングを行った。反応条件を以下の通りに設定して、ＰＣＲ増幅を行った。
【００５１】
94℃  １分、60℃  30秒、72℃  30秒（以上を１サイクル）、
98℃  30秒、60℃  30秒、72℃  7分、72℃  8分（以上を２５サイクル）。
【００５２】
プライマーの配列
配列番号３（プライマー１）
Forward  5'- CGAAACCAATGCGATTTACCGAAGC- 3'
配列番号４（プライマー２）
Reverse  5'- GCATCACTGCTTGGGAAGATATGCCGCC- 3'  
【００５３】
Taqポリメラ‐ゼは、TaKaRa LA TaqTMを用いた。このようにして得られたPCR産物をGENE CLEAN2Kit付属のマニュアルに従いグラスミルク精製後、pGEM-T Vector System付属のマニュアルに従いサブクローニングし、カラーセレクションにより、インサートを有するベクターを保持する形質転換体を得た。得られた形質転換体をLB培地で培養(37℃、1.8ml、試験管)し、集菌、プラスミド抽出を行った。得られたプラスミドをM13プライマーフォワード、M13プライマーリバース(タカラバイオ(株))を用い、インサートの塩基配列解析を行った。サンプルの調整方法、解析法などはABIプリズム310ジェネティックアナライザー（パーキンエルマーアプライドバイオシステム社製）付属のマニュアルにしたがった。
【００５４】
配列解析の結果、pGEMへのSocA配列の挿入（pGEM-socA）が確認された。また配列中にアミノ酸変化を伴う変異はなかった。
【００５５】
（実施例２）
＜組換え生産用ベクターの構築＞
【００５６】
ＦＡＢＰのC末端にHis Tagを付加した発現用ベクターpET-ＦＡＢＰの構築を行った。TAクローニングし得られたpGEM-socAに対して、以下のPCRプライマー３及び４（配列番号５、６）を用いて増幅したのち、NdeI及びXhoIで消化した。その後、同酵素消化したpET30（ｃ）とLigationを行い大腸菌BL21(DE3)の形質転換を行った。 
【００５７】
プライマーの配列
配列番号５（プライマー３）
Forward  5'-CGAAACATATGCGATTTACCGAAGC- 3' (NdeI)
配列番号６（プライマー４）
Reverse  5'- TAGACTC GAGTGACTGCTTGGGAAGATATGC- 3' 
(XhoI stop/Ser)
【００５８】
図３に、上記の通り作製されたpESAを示す。作製されたpESAを大腸菌に形質転換することにより、組み換えＦＡＢＰの生産を行うことができることが明らかとなった。
【００５９】
（実施例３）
＜組み換え大腸菌によるＦＡＢＰの生産・精製＞
実施例２のpＥＳＡにより生産されるＦＡＢＰは、そのC末端にHis Tagが付加する。このpＥＳＡをBL21(DE3)に形質転換した。得られたコロニーをLB+Km(50μg/l)培地に植菌後、OD660=0.6でIPTG（f.c. 0.5 mM）を添加し30度で6時間培養を行った。
【００６０】
集菌・洗浄後、20％ sucrose/30 mM Tris−HCl buffer (pH8.0)に懸濁・攪拌・遠心分離後、得られたペレットに5 mM MgCl2を加え攪拌後、遠心分離を行い、ペリプラズム画分を調整し、10 mM imidazol を含む300 mM NaCl / 50 mM Na-phosphate buffer (pH8.0)(buffer A)にて一晩透析し、Ni-NTA agarose (QIAGEN) 5 mlを充填したOpen columnを用いて組換えＦＡＢＰの精製を行った(平衡化buffer: A + 10 mM imidazol, 洗浄buffer:A + 20 mM imidazol, 溶出buffer: A + 250 mM imidazol)。
【００６１】
図４にこのようにして調製したFABP試料のSDSPAGEによる分析結果を記す。（A）には発現レベルを調べた結果を記す。発現レベルは全細胞画分、ペリプラスム画分、水溶性画分について比較している。また、目的蛋白質を発現していないネガティブコントロールとして挿入断片を有しない発現ベクターだけpET-30c (insert: -)、およびIPTGによる誘導を行っていないもの(IPTG: -).を用いている。（B）には精製段階での解析を示している。FTはNi-NTA agaroseに結合しなかった溶出画分、Wは洗浄画分、Eは目的蛋白質が回収された画分を記す。
【００６２】
図４に示されるSDS-PAGEによりPeriplasm画分に28ｋDa付近にバンドが得られたことから、ＦＡＢＰは、Periplasm画分に発現していることが明瞭に理解される。
【００６３】
分子量から予測されたN末31残基が、シグナル配列として切断されていると考えられる。またゲルろ過クロマトグラフィーにより、その分子量は約２８ｋDaであり、本発明の蛋白質が単量体として存在することが明らかとなった。またNi-NTAカラムにより精製ＦＡＢＰが得られた。ＦＡＢＰの発現レベルは約１８mg/L培地であった。
【００６４】
（実施例４）
＜ＦＡＢＰのフルクトシルアミン結合能力の検討＞
実施例３で得られた精製ＦＡＢＰ用いて、蛍光分光光度計による自家蛍光特性検討を行った。15 μM ＦＡＢＰにフルクトシルグルタミン、FQあるいはフルクトシルバリン、FV,あるいはεフルクトシルリジン、FK,を加え25℃で2.5分間インキュベート後、蛍光波長及びＦＡＢＰ配列中に有するトリプトファン残基の自家蛍光に由来する最大蛍光強度の変化を測定した（λex=295 nm）。
【００６５】
図５に示される蛍光スペクトル変化からも明らかなように、FQおよびFV濃度依存的に蛍光強度の増加が見られた。最大蛍光強度の得られる波長のシフトは確認できなかった。これに対してグルコース、フルクトースなどの糖類、グルタミンなどのアミノ酸の添加による蛍光強度の増加は見られなかったことから、本発明の蛋白質は、フルクトシルアミンに特異的であると考えられる。
【００６６】
さらにFKに対しても蛍光強度の増加が見られなかったことから、フルクトシルアミンにおいてもα位が糖化されたフルクトシルアミンに特異的であることが示された。
【００６７】
（実施例５）  
＜フルクトシルアミン類の蛍光分析＞
実施例３で得られた精製ＦＡＢＰ用いて、蛍光分光光度計によるフルクトシルアミンの蛍光測定を行った。ＦＡＢＰを含む溶液にFVあるいはFQを加え25℃で2.5分間インキュベート後、３３５nmにおける最大蛍光強度の変化を測定した(λex=295 nm)。
【００６８】
図６及び図７に示される蛍光強度変化のＦＶ及びＦＱの濃度依存性からも明らかなように、FVおよびFQの濃度とともに蛍光強度の増加が観測され、蛍光強度を指標としてFVおよびFQが蛍光分光法により計測できることがわかった。
【００６９】
（実施例６）
＜変異型ＦＡＢＰの構築＞
フルクトシルアミン結合蛋白質の58番目Tyr,96番目Phe,97番目Ser,161番目Gly,166番目Ile,203番目Gln,256番目Trp,263番目Trpの各残基をCysに置換した変異型ＦＡＢＰを構築した。
【００７０】
変異型ＦＡＢＰは定法に従い、ＦＡＢＰ構造遺伝子に対して部位特異的に変異を導入する。本実施例では、ｐETに挿入されたＦＡＢＰを対象としてクイックチェンジ（登録商標）を用いて作成した。
【００７１】
すなわち、pＥＳＡを対象として、以下の表１に示す変異導入用のオリゴヌクレオチドプライマー５〜２０（表中上から順に、配列番号７〜２２）を用いて58番目Tyr,96番目Phe,97番目Ser,161番目Gly,166番目Ile,203番目Gln,256番目Trp,263番目TrpをそれぞれCysに相当するコドンに置換した。
【００７２】
【表１】
2007082540.tif 000003
【００７３】
その結果、表１に示した、全ての変異ＦＡＢＰをコードする遺伝子が構築できた。
【００７４】
（実施例７）
変異型ＦＡＢＰの蛍光修飾と蛍光特性
実施例６で、構築された変異ＦＡＢＰのうち、Trp256CysおよびGly161Cysの二種の変異ＦＡＢＰを精製し、FQおよびFV結合に基づく自家蛍光の変化を測定した。
【００７５】
これらの変異ＦＡＢＰを実施例３と同様の方法に精製した。Trp256CysおよびGly161Cysの二種の変異ＦＡＢＰはいずれもFQおよびFVの濃度の増加とともに、Trpに由来する自家蛍光の増加を確認することができた（図８および図９；Trp256Cysの自家蛍光のFVおよびFQ濃度依存性）。
【００７６】
つまり、本発明の変異ＦＡＢＰを用いることによって、該蛋白質の自家蛍光を指標として、FAの計測を行うことができる。
【００７７】
次にTrp256CysおよびGly161Cysの二種の変異ＦＡＢＰを、環境応答性蛍光色素を用いて蛍光ラベルした。蛍光ラベルは、以下のようにして行った。環境応答性蛍光色素として、６−アクリロイル２ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）を用い、１０mＭ リン酸緩衝液（ｐH7.0 ）中の精製変異ＦＡＢＰ（終濃度２０μM）にアクリロダン（終濃度300μM）を混合し、遮光下、室温で３時間反応させた。反応液を限外ろ過チューブに移し、５０００ｇで30分間遠心分離を行い、未反応のアクリロダンを取り除いた後、得られた蛍光修飾ＦＡＢＰを１０mＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐH7.0）で置換した。
【００７８】
（実施例８）
＜蛍光修飾ＦＡＢＰを用いるフルクトシルアミンセンシング＞
環境応答性蛍光色素であるアクリロダンは、単独の場合は、励起波長390nmで蛍光波長520nmを示す。アクリロダンが蛋白質と結合した場合は、その蛍光波長がシフトする。
【００７９】
図１０にアクリロダンでラベルされたＦＡＢＰの蛍光スペクトルを示す。このように、477nmに特徴的な蛍光波長ピークを示した。また、この蛍光波長ピークはＦＱの存在とともに、強度が高くなった。したがって、蛍光標識ＦＡＢＰを用いてＦＱをはじめとするフルクトシルアミン化合物の計測を行うことができる。
【００８０】
図１１に蛍光標識ＦＡＢＰを用いたFQの蛍光分析結果を示した。この蛍光強度の変化量からFQの濃度が高まるとともに、蛍光修飾ＦＡＢＰの蛍光強度が増加したことから、蛍光強度を指標としてフルクトシルアミンの定量が可能であった。
【００８１】
（実施例９）
＜変異型ＦＡＢＰの蛍光修飾と蛍光特性＞
実施例６で、構築された変異ＦＡＢＰのうち、Ile166Cysの変異ＦＡＢＰを精製し、FV結合に基づく自家蛍光の変化を測定した。この変異ＦＡＢＰを実施例３と同様の方法に精製した。図１２にIle166Cys自家蛍光のFV濃度依存性を示した。Ile166Cys変異ＦＡＢＰはFVの濃度の増加とともに、Trpに由来する自家蛍光の増加を確認することができた。
【００８２】
つまり、本発明の変異ＦＡＢＰを用いることによって、該蛋白質の自家蛍光を指標として、FAの計測を行うことができる。
【００８３】
次に、Ile166Cys環境応答性蛍光色素を用いて蛍光ラベルした。蛍光ラベルは、以下のようにして行った。環境応答性蛍光色素として、６−アクリロイル２ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）を用い、１０mＭ リン酸緩衝液（ｐH7.0 ）中の精製変異ＦＡＢＰ（終濃度２０μM）にアクリロダン（終濃度300μM）を混合し、遮光下、室温で３時間反応させた。反応液を限外ろ過チューブに移し、５０００ｇで30分間遠心分離を行い、未反応のアクリロダンを取り除いた後、得られた蛍光修飾ＦＡＢＰを１０mＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐH7.0）で置換した。あるいは蛍光色素として2-(4'-maleimidylanilino)naphthalene-6-sulfonic acid, sodium salt (MIANS)を用いて修飾した。精製したIle166Cys変異FABP(終濃度20μM)を10倍のモル濃度のMIANS (終濃度 200 μM)と混合し、２５℃、3時間攪拌しながらインキュベーションした。得られたサンプルをゲルろ過オープンカラム（Molecular probes）を用いて未反応の蛍光色素の除去及びbuffer交換(10 mM MOPS (pH7.0))を行い、未反応のMIANSをとりのぞき、MIANSで標識したFABPを調製した。
【００８４】
（実施例１０）
＜蛍光修飾ＦＡＢＰを用いるフルクトシルバリンセンシング＞
環境応答性蛍光色素であるアクリロダンは、単独の場合は、励起波長390nmで蛍光波長520nmを示す。アクリロダンが蛋白質と結合した場合は、その蛍光波長がシフトする。
図１３にアクリロダン蛍光標識Ile166Cys変異ＦＡＢＰを用いたＦＶの蛍光分析結果を示した。図１３によれば、この蛍光強度の変化量からＦＶの濃度が高まるとともに、蛍光修飾ＦＡＢＰの蛍光強度が増加したことから、蛍光強度を指標としてフルクトシルバリンの定量が可能であることが理解できる。このときの計測可能な最低濃度は１７nMであった（図１３中の拡大図参照）。また、同様にεフルクトシルリジン（ＦＫ）を対象としても測定を行った。しかし、ＦＫの濃度を上げても蛍光強度の増加は観察されなかった。このことから、本発明の測定はＦＶをはじめとするαフルクトシルアミノン酸に特異的であり、ＨｂＡ１ｃの計測に適していることが明らかとなった。
【００８５】
環境応答性蛍光色素MIANSは蛋白質に結合すると励起波長327nmにおいて420nm付近に蛍光スペクトル極大を示す。上記のようにして調製したMIANS蛍光標識Ile166Cys変異ＦＡＢＰは図１４に示すように４２５nmに蛍光極大を示した。そこで励起波長327 nmのときのMIANS蛍光標識Ile166Cys変異ＦＡＢＰの蛍光強度変化のFV濃度依存性を検討した。図１５に示すように、ＦＶ濃度の増加とともにMIANS蛍光標識Ile166Cys変異ＦＡＢＰの４２５nmにおける蛍光強度が増加し、蛍光強度のＦＶ濃度依存性が示された。
【００８６】
図１６にMIANS蛍光標識Ile166Cys変異ＦＡＢＰを用いたＦＶの蛍光分析結果を示した。この蛍光強度の変化量からＦＶの濃度が高まるとともに、蛍光修飾ＦＡＢＰの蛍光強度が増加したことから、蛍光強度を指標としてフルクトシルバリンの定量が可能であった
【００８７】
（実施例１１）
＜蛍光修飾ＦＡＢＰを用いるＨｂＡ１ｃの計測＞
本実施例に用いたＨｂＡ１ｃの計測をアクリロダンで修飾したIle166Cys変異FABPを用いて行った。血液より調製したHbA0及びHbA1c画分をそれぞれ80 mg/mlに調製し蛋白質分解酵素であるサーモライシンおよびカルボキシペプチダーゼＹを用いて加水分解した。この試料(100 mg/ml Hb)を、100倍希釈後、任意の比率になるように混合した。混合試料(終濃度 0.1 mg/ml)をアクリロダンで修飾したIle166Cys変異FABP溶液(終濃度 1.8 μM, 10 mM MOPS(pH7.2)中)に加え2分間25℃でインキュベート後、蛍光強度の測定を行った。
【００８８】
計測の結果を図１７に示す。アクリロダンで修飾したIle166Cys変異FABP に緩衝液を添加した時の蛍光強度をHbA1c 0%試料を添加したときの蛍光強度さはほとんど見られなかったことから、HbA1c 0%試料を添加したときの蛍光強度を100 %とした混合溶液中のHbA1c プロテアーゼ消化試料の割合が増加するにしたがって蛍光強度変化の増大が見られた。本方法によって健常人と糖尿病患者の閾値であるＨｂＡ１ｃ７％近辺においても正確に計測することができ、本方法がＨｂＡ１ｃの計測に応用できることが示された。アクリロダンで修飾したIle166Cys変異FABP蛍光強度変化率のＦＶに対する検量線を用いて、混合溶液中に含まれる糖化物の量を算出し酵素法で得られた値と比較してもすぐれた相関が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明の新規なフルクトシルアミン結合蛋白質（ＦＡＢＰ）及びこれを用いたフルクトシルアミンの蛍光分光学的分析方法は、糖尿病の診断や臨床検体の分析等の臨床試験に大きく貢献することができるものであり、医療分野の技術革新に寄与することができる。すなわち本発明は、糖尿病に代表される生活習慣病等の医療技術の進歩に寄与することができる革新的な技術である。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】フルクトシルアミン結合蛋白質のアミノ酸配列を示した配列番号１を示す。
【図２】フルクトシルアミン結合蛋白質の遺伝子配列を示した配列番号２を示す。
【図３】発現ベクターｐＥＳＡを示す。
【図４】組換えＦＡＢＰの電気泳動写真を示す。
【図５】組換えＦＡＢＰの自家蛍光特性を示す。
【図６】組み換えＦＡＢＰの自家蛍光に基づくフルクトシルグルタミンFQの蛍光測定を示す。
【図７】組み換えＦＡＢＰの自家蛍光に基づくフルクトシルバリンFVの蛍光測定を示す。
【図８】組み換え変異ＦＡＢＰ（Trp354Cys）の自家蛍光に基づくフルクトシルグルタミンFQの蛍光測定を示す。
【図９】組み換え変異ＦＡＢＰ（Trp354Cys）の自家蛍光に基づくフルクトシルバリンFVの蛍光測定を示す。
【図１０】蛍光修飾組み換え変異ＦＡＢＰ（Trp354Cys）の蛍光スペクトルを示す。
【図１１】蛍光修飾組み換え変異ＦＡＢＰ（Trp354Cys）の蛍光に基づくフルクトシルグルタミンFQの蛍光測定を示す。
【図１２】Ile166Cys変異ＦＡＢＰの自家蛍光に基づくフルクトシルバリンＦＶの蛍光測定を示す。
【図１３】アクリロダン蛍光標識Ile166Cys変異ＦＡＢＰを用いたＦＶの蛍光測定の結果を示す。
【図１４】MIANS蛍光標識Ile166Cys変異ＦＡＢＰの蛍光スペクトルを示す。
【図１５】MIANS蛍光標識Ile166Cys変異ＦＡＢＰの蛍光スペクトルの強度のフルクトシルバリンＦＶの濃度依存性を示す。
【図１６】MIANS蛍光標識Ile166Cys変異ＦＡＢＰを用いるフルクトシルバリンＦＶの蛍光測定を示す。
【図１７】アクリロダン蛍光標識Ile166Cys変異ＦＡＢＰを用いたＨｂＡ１ｃの蛍光測定の結果を示す。
【図１】
2007082540.tif 000004
【図２】
2007082540.tif 000005
【図３】
2007082540.tif 000006
【図６】
2007082540.tif 000007
【図７】
2007082540.tif 000008
【図８】
2007082540.tif 000009
【図９】
2007082540.tif 000010
【図１０】
2007082540.tif 000011
【図１１】
2007082540.tif 000012
【図１２】
2007082540.tif 000013
【図１３】
2007082540.tif 000014
【図１４】
2007082540.tif 000015
【図１５】
2007082540.tif 000016
【図１６】
2007082540.tif 000017
【図１７】
2007082540.tif 000018
【図４】
2007082540.tif 000019
【図５】
2007082540.tif 000020
【配列表】
2007082540000001.app