(57)【要約】【課題】本発明は、ガドリニウムが肝臓での薬物代謝酵素の誘導を抑制して、スチレンによる毒性影響から肝を保護する化学予防剤としての希少元素ガドリニウム及びその誘導体を用いた緩和剤を提供することを目的とする。【解決手段】スチレンを単独投与したラットの肝では、グルタチオンの有意な低下と脂質過酸化物、ALTおよびAST活性の上昇がみられて軽度の肝傷害傾向が認められたが、ガドリニウムを事後投与することによりこれらの測定値はとも回復傾向を示し、ガドリニウムはスチレンにより変化した肝の酸化還元状態を改善した。これらの結果は、ガドリニウムが肝臓での薬物代謝酵素の誘導を抑制して、スチレンによる毒性影響から肝を保護する化学予防剤として利用できることを示している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スチレン由来の肝毒性を緩和することを特徴とする希少元素ガドリニウム及びその誘導体を用いた緩和剤。
【請求項２】
有機溶剤由来の肝毒性を緩和することを特徴とする希少元素ガドリニウム及びその誘導体を用いた緩和剤。
【請求項３】
酸化ストレスによる肝毒性を緩和することを特徴とする希少元素ガドリニウム及びその誘導体を用いた緩和剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スチレンによる毒性影響から肝を保護する化学予防剤としての希少元素ガドリニウム及びその誘導体を用いた緩和剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガドリニウムは希土類ランタン系に属する希少元素で、光ファイバーや磁気メモリーなどの原材料となり、またMRIや中性子補足癌治療の薬剤として医療分野での利用が拡大されており、人への暴露の機会は年々増大している。
【０００３】
ガドリニウムの代表的な生体影響として、細網内皮系マクロファージの不活性化があり、肝ではクッパー細胞の機能を抑制する強力な阻害剤として知られる。
ガドリニウムを前処置した齧歯類動物では、体外異物であるアセトアミノフェン、四塩化炭素やアルコールなどによって引き起こされる肝組織傷害が軽減し、肝機能の改善がみられた。
【０００４】
ガドリニウムによるこのような肝傷害軽減効果は、不活性化したクッパー細胞から放出されるシトクロム酵素（ＣＹＰ）の抑制作用をもつサイトカインの上昇とフリーラジカルの減少によるもので、ガドリニウム 前処理によるクッパー細胞の不活性化は、有機代謝物による肝毒性を緩和することが原因であると考えられてきた。
しかしBadgerらはクッパー細胞が全く共存しない肝細胞培養条件下、ガドリニウム単独でも四塩化炭素毒性から肝を保護する作用がみられることを報告した。
これよりガドリニウムによる有機代謝物由来の肝毒性の緩和効果に関与する未知の因子の存在が示唆されて、メカニズムの詳細について興味がもたれていた。
【０００５】
スチレンはCYP2B1をはじめとしてCYP2B2、CYP2E1、CYP3A2、CYP1A2など多くのCYPsを誘導発現する有機溶剤で、これらのCYPsによりスチレンは肝で癌原性を示す代謝中間体スチレン-7,8-oxideに変換される。
スチレンによるCYPs誘導にともない、活性酸素種の発生と細胞内グルタチオンが低下し、脂質の過酸化およびDNA付加体が形成し、その結果、肝傷害を引き起こすと考えられている。
すなわち、スチレンによる肝臓の薬物代謝酵素により、活性酸素種の発生と細胞内グルタチオンが低下し、脂質の過酸化およびDNA付加体が形成し、その結果、肝傷害を引き起こす。
【特許文献１】特開平０６−０６５１７４号公報
【特許文献２】特開平０５−３２０１４６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ガドリニウムが肝臓での薬物代謝酵素の誘導を抑制して、スチレンによる毒性影響から肝を保護する化学予防剤としての希少元素ガドリニウム及びその誘導体を用いた緩和剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、スチレン暴露後にガドリニウムを投与することにより肝傷害を軽減させるためのスチレン由来の肝毒性を緩和する希少元素ガドリニウム及びその誘導体を用いた緩和剤である。
本発明は、スチレン暴露後にガドリニウムを投与することにより肝傷害を軽減させるための有機溶剤由来の肝毒性を緩和する希少元素ガドリニウム及びその誘導体を用いた緩和剤である。
本発明は、スチレン暴露後にガドリニウムを投与することにより肝傷害を軽減させるための酸化ストレスによる肝毒性を緩和する希少元素ガドリニウム及びその誘導体を用いた緩和剤である。
【発明の効果】
【０００８】
スチレンを単独投与したラットの肝では、グルタチオンの有意な低下と脂質過酸化物、ALTおよびAST活性の上昇がみられて軽度の肝傷害傾向が認められたが、ガドリニウムを事後投与することによりこれらの測定値はとも回復傾向を示し、ガドリニウムはスチレンにより変化した肝の酸化還元状態を改善した。
【０００９】
これらの結果は、ガドリニウムが肝臓での薬物代謝酵素の誘導を抑制して、スチレンによる毒性影響から肝を保護する化学予防剤として利用できることを示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の希少元素ガドリニウム及びその誘導体を用いた緩和剤は、ガドリニウムが肝臓での薬物代謝酵素の誘導を抑制して、スチレンによる毒性影響から肝を保護する化学予防剤として有用である。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００１１】
スチレンモノマー（純度 99%）および塩化ガドリニウムGdCl3（純度99.9%）はナカライ・テスク（京都）から、グルタチオン（純度97%） およびチオバルビツール酸（純度98%）は和光純薬より購入した。
【００１２】
RNA抽出とRT-PCR解析は、日本ジーン社ISOGEN kitを使用し、マニュアル通りに培養細胞からtotal RNAを抽出した。
その後、RNA分子解析のため、各遺伝子に特異的なプライマーを用いてRT-PCRを行った。
PCR産物は1.5%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。
また、PCR産物はDNAシーケンスあるいは制限酵素処理によって確認した。
【００１３】
７週齢の雄SDラットは日本SLC（浜松）から購入した。
動物は23±1℃、12 h 明暗、湿度40-70%の環境条件下で飼育し、飼料および水は自由摂取させた。
１週間の慣らし飼育の後、ラットは１群３匹、全４群に分け、１）スチレン群、２）スチレン+ガドリニウム群、３）ガドリニウム群および４）対照群とした。
スチレン投与量は600mg/kg、またGdCl3は25 mg/kg投与で、いずれも腹腔内に投与した。
対照ラットには0.9 % NaClおよびcorn oilを投与した。
【００１４】
ガドリニウムの影響を検討するため、25mg/kgのGdCl3を0.9% 塩化ナトリウムに溶解してスチレン投与後４時間目に腹腔内投与した。
スチレン投与後24時間目に、ラットをエーテル麻酔下で屠殺して、血液と肝を採取した。
血液は室温放置して凝固させた後、3000rpmで遠心分離して血清を採取した。
得られた血清は分析時まで4℃に保存した。
肝は組織小片（〜0.2g）数片を切り出し、mRNA発現、グルタチオン測定および脂質過酸化物測定試料として使用時まで-80℃に保存した。
残りの試料は全量をミクロソーム 精製用試料に供した。
【００１５】
遠心分離操作によって肝ミクロソーム画分を得た。
肝に４倍量の冷0.1M Tris-HCl（pH7.4）buffer（0.1M KCl, 1mM EDTA-2Na）を加え、Potter-Elvehjem homogenizerで均質化した。
ホモジネートは9000gで20min、105000gで60min（２回）遠心分離してミクロソーム画分を得た。
得られたミクロソーム画分はTris-KCl buffer（20% glycerol含有）に溶解した後、使用時まで-80℃に保存した。
【００１６】
血清ALTおよびAST活性は肝傷害の指標として測定した。
これらの酵素はAlfresa Pharma製キットにより、メーカー指定の取り扱い説明書に従い定量した。
還元型グルタチオンはHissin and Hill らの方法に従って肝ホモジネートについて定量した。
肝ホモゲネートにおける肝過酸化脂質はOkawaらの方法に従い、チオバルビツール酸を反応基質として測定した。  
【００１７】
実験群間のデータの比較はSTAT View 4.5.1 program Fisherのprotected least significant difference（PLSD）によって実施した。
有意レベルはｐ＜0.05 とした。
【００１８】
図１に示すように、スチレンとガドリニウム投与による肝傷害度を血清ASTとALT活性を用いて測定した。
スチレン単独投与したラットにおいて、ASTおよびALT活性は有意に上昇した。
ASTは肝傷害を反映する酵素であり、スチレンの単独投与により対照群値の約３倍に上昇（273 IU/L）して軽度の肝傷害傾向を示した。
スチレン+ガドリニウム群ではスチレン単独投与で観察された活性値の70%まで有意に抑制され（192 IU/L）、ガドリニウムによる肝傷害の回復効果が示唆された。
【００１９】
ALTも肝特異性の高い酵素で、肝傷害の程度を強く反映する。
ALT活性はスチレン単独投与により対照群値の約1.7倍まで上昇したが（p<0.01）、ガドリニウムの併用によって対照群と同値まで低下し、スチレンによって引き起こされた肝傷害からの回復傾向が示唆された。
【００２０】
ASTおよびALT活性とも、ガドリニウム単独投与では対照群に比べて有意な上昇傾向がみられないことから、スチレン＋ガドリニウム群でみられたASTおよびALT活性の抑制は、スチレンによって発生した肝傷害に対するガドリニウムによる特異的な保護的効果であることが示唆された。
【００２１】
そこで図２に示すように、肝臓におけるグルタチオン濃度と脂質過酸化物の産生についてスチレン投与後のガドリニウムの効果を検討した。
ガドリニウムを単独投与したラットの肝では、グルタチオンおよび脂質過酸化物の変動はほとんど観察されなかったが、スチレン単独投与によって、グルタチオンの有意な低下（70.6%）と脂質過酸化物TBARSの有意な上昇（163.7%）が認められた。
スチレン+ガドリニウム群では、グルタチオンは対照群値の87.5%まで上昇して回復傾向を示し、またTBARSは対照群値の146.7%まで低下したことから、ガドリニウムはスチレンにより増悪傾向に陥った肝臓の酸化還元状態を改善することが示唆された。
【００２２】
本発明ではスチレンによる酸化ストレスの上昇を示唆するグルタチオンの有意な低下と脂質過酸化物の有意な上昇が観察され、さらに軽度ながら肝傷害傾向を示すASTおよびALT活性の上昇も観察された。
これらの変化はガドリニウム投与により明らかに改善されたことから、ガドリニウムは、スチレン投与による急性期で発生する酸化ストレス由来の肝傷害に対して緩和剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】スチレンによって惹起された肝傷害の指標としてのラット血清のAST及びALT活性に対するガドリニウムの効果を示すグラフ図である。
【図２】ラット肝臓におけるグルタチオンと脂質過酸化物に対するガドリニウムの効果を示すグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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